(57)【要約】  短時間かつ高効率で任意の場所へ生体分子等を固定し得るビーズを配置し、さらに任意の場所から脱離を起こすことのない安定した配置をとることが可能であるビーズ配置用基板およびそれを用いたビーズ配置方法を提供する。  磁気ビーズ１１を微小反応槽５内に固定化するためのビーズ配置用基板１０であって、基板材料１と、基板材料１上に配設された磁性体薄膜３と、磁性体薄膜３上に配設された複数の微小反応槽５と、を具備する磁気ビーズ配置用基板１０および、ビーズ配置用基板１０の微小反応槽５内に磁気ビーズ１１を固定化するにあたり、ビーズ配置用基板１０の下部に磁石１３を配置し、基板１０上に、磁気ビーズ１１を分散させた分散液１２を滴下する工程を含むビーズ配置方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁気ビーズを微小反応槽内に配置するためのビーズ配置用基板であって、基板材料と、該基板材料上に配設された磁性体薄膜と、該磁性体薄膜上に配設された複数の微小反応槽と、を具備することを特徴とするビーズ配置用基板。
【請求項２】
前記基板材料と磁性体薄膜との間に接着層を有する請求項１記載のビーズ配置用基板。
【請求項３】
前記基板材料が透明なガラスまたはプラスチック材であり、かつ蛍光を発しない材料である請求項１記載のビーズ配置用基板。
【請求項４】
前記微小反応槽の径が磁気ビーズの直径の１〜２倍である請求項１記載のビーズ配置用基板。
【請求項５】
前記微小反応槽の深さが磁気ビーズの直径の１〜２倍である請求項１記載のビーズ配置用基板。
【請求項６】
前記微小反応槽が透明なフォトレジストまたはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）により形成されている請求項１記載のビーズ配置用基板。
【請求項７】
前記磁性体薄膜がニッケル、ニッケル合金、鉄および鉄合金からなる群から選択される磁性体である請求項１記載のビーズ配置用基板。
【請求項８】
基板表面および前記微小反応槽内壁に生体分子の非特異吸着防止用ブロッキング剤が被覆されている請求項１記載のビーズ配置用基板。
【請求項９】
前記微小反応槽が親水化されている請求項１記載のビーズ配置用基板。
【請求項１０】
前記微小反応槽底部の磁性体薄膜が除去されている請求項１記載のビーズ配置用基板。
【請求項１１】
請求項１記載のビーズ配置用基板の微小反応槽内に磁気ビーズを配置するにあたり、前記ビーズ配置用基板の下部に磁石を配置し、該基板上に、磁気ビーズを分散させた分散液を滴下する工程を含むことを特徴とするビーズ配置方法。
【請求項１２】
前記磁石を基板に対して平行方向に適宜移動させ、磁気ビーズを前記微小反応槽に誘導する請求項１１記載のビーズ配置方法。
【請求項１３】
前記磁石によりビーズ配置用基板に印加する磁場の強さが１００〜１００００ガウスである請求項１１記載のビーズ配置方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はビーズ配置用基板およびそれを用いたビーズ配置方法に関し、詳しくは、ビーズを高効率でビーズ配置用基板における複数の微小反応槽へ配置し、かつ安定した配置をとることが可能であるビーズ配置用基板およびそれを用いたビーズ配置方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
半導体産業で培われたマイクロ、ナノ微細加工技術をモダンバイオテクノロジーに応用し、従来試験管内で行ってきた反応プロセスを飛躍的に高速化したり、大規模並列化する技術の開発が近年、急速に進んでいる。例えば、ガラス基板上に構造の異なるＤＮＡや酵素を多数配列して、大規模並列分析を可能にするＤＮＡチップやプロテインチップは既に製品化され、先端バイオ研究の分野で広く用いられている。ＤＮＡチップは生体分子を基板上に直接固定化することにより作られる。【０００３】
これに対し、Ｙｅｈらは、微小半導体ブロックを元基板から切り離し、これを液体中でターゲット基板上に散布することにより、基板上の任意の位置に配置する技術を非特許文献１に開示している。微小半導体ブロックに生体分子を固定し、非特許文献１記載の方法を用いることにより、基板上の任意の位置に生体分子を配置させることが可能になると報告されている。
【非特許文献１】H.Yeh and J.Smith, IEEE Photon.Tech.Lett.,Vol.6,p.706,1994
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来の方法に従い基板上に生体分子を直接固定する方法では、短時間で大量の生体分子を自己組織化により基板上に配列することは困難であり、更に、配列後に所望の位置の生体分子を基板から回収することも困難であった。また、非特許文献１に記載の方法を用いた場合でも、微小半導体ブロックは基板上へ誘引および固定されておらず、配置に要する時間も長時間であり、更に、配置後も微小ブロックの脱離が起き、安定した配置を維持することは容易ではなかった。【０００５】
そこで本発明の目的は、生体分子等を固定し得るビーズを短時間かつ高効率で任意の場所へ配置し、さらに任意の場所から脱離を起こすことのない安定した配置をとることが可能であるビーズ配置用基板およびそれを用いたビーズ配置方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、磁気ビーズと、磁性体薄膜を備えたビーズ配置用基板との組み合わせにより上記目的を達成し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
即ち、本発明のビーズ配置用基板は、磁気ビーズを微小反応槽内に配置するためのビーズ配置用基板であって、基板材料と、該基板材料上に配設された磁性体薄膜と、該磁性体薄膜上に配設された複数の微小反応槽と、を具備することを特徴とするものである。【０００８】
また、本発明のビーズ配置方法は、上記ビーズ配置用基板の微小反応槽内に磁気ビーズを配置するにあたり、前記ビーズ配置用基板の下部に磁石を配置し、該基板上に、磁気ビーズを分散させた分散液を滴下する工程を含むことを特徴とするものである。【０００９】
本発明においては、磁気ビーズおよび磁性体薄膜による磁力の作用により微小反応槽内へ磁気ビーズが誘引されることにより配置され易く、また、安定した配置を得ることができる。また、磁石を取り除いた後も磁性体薄膜の磁化は残るため、磁気ビーズは安定した配置を保持し続けることが可能である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、例えば、生体分子が固定化された磁気ビーズでも外部磁場で制御して微小反応槽内に容易にかつ確実に充填することが可能となり、限られた領域に多数の微小反応槽の形成が可能となる。【００１１】
また、基板上に磁性体薄膜を被覆し、磁性体薄膜の磁化現象を利用することで、大量の磁気ビーズを同時に磁気ビーズ配置用基板上の複数の微小反応槽に充填することができる。このように、磁気ビーズを効率よく複数の微小反応槽に充填できることにより、従来法に比べて充填の簡略化・高速化を実現することができる。また、磁性体薄膜の残留磁化により、基板表面への磁気ビーズの保持力が増し、流水などによる磁気ビーズの脱離を防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の一実施形態に係るビーズ固定用基板の作製工程を示す模式図である。
【図２】ビーズ配置用基板に形成した微小反応槽の拡大写真である。
【図３】光学顕微鏡による磁気ビーズの配列の観察に使用した装置の模式図である。
【図４】本発明の他の実施形態に係るビーズ固定用基板の作製工程を示す模式図である。
【図５】実施例４における（ａ）白色光照射下の磁気ビーズの顕微鏡写真であり、（ｂ）緑色光照射下の磁気ビーズの顕微鏡写真である。
【符号の説明】
【００１３】
１  基板材料
２  接着層
３  磁性体薄膜
４  ネガティブフォトレジストＳＵ−８
５  微小反応槽
１０  基板
１１  磁気ビーズ
１２  分散液
１３  磁石
１４  光学顕微鏡
１５  演算処理装置
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態につき具体的に説明する。
本発明のビーズ配置用基板に使用し得る基板材料は、透明なガラスまたはプラスチック材であることが好ましく、より好ましくは蛍光を発しない材料とする。透明な基板材料を用いることで、磁気ビーズ表面に任意に吸着させた生体高分子の光学的観察が可能となる。また、基板材料に蛍光を発しない材料を使用することで、光学的測定の精度を高めることができる。【００１５】
次に、かかる基板材料上に積層される磁性体薄膜は、これを磁化させることにより微小反応槽内に磁気ビーズを固定することが可能となる。磁性体薄膜の材料としては、ニッケル、ニッケル合金、鉄および鉄合金などの金属を好適に用いることができ、本発明においては残留磁化の大きな磁性材料を用いることが好ましい。磁性体薄膜の膜厚は、その目的から、好ましくは０．２〜２μｍである。【００１６】
なお、本発明においては、基板材料とその上に配設される磁性体薄膜との間に両者の接着性を高めるためにクロム等の接着層を設けることができる。【００１７】
磁性体薄膜上に配設される複数の微小反応槽は、半導体産業で培われた微細加工技術である既知のフォトリソグラフィ技術を用いることにより形成することができる。微小反応槽の形成材料としては、透明なフォトレジスト、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等を好適に採用することができる。【００１８】
磁気ビーズの反応槽内への充填率は反応槽の直径に依存し、反応槽の直径が磁気ビーズの直径よりも若干広い方が充填率が高く、好ましくは微小反応槽の径は磁気ビーズの直径の１〜２倍である。また、１個の微小反応槽に１個の磁気ビーズを充填する上で、微小反応槽の深さは、好ましくは磁気ビーズの直径の１〜２倍である。【００１９】
また、本発明のビーズ配置用基板表面および微小反応槽内壁を、生体分子の非特異吸着防止用ブロッキング剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）や２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）で好適にコーティングすることができる。かかるブロッキング剤をコーティングすることで、基板表面や微小反応槽の内壁への生体分子の非特異吸着を抑制することができる。【００２０】
さらに、微小反応槽は、親水化されていることが好ましい。微小反応槽を酸素プラズマ照射などにより親水化処理することにより、反応槽内部への液（磁気ビーズを分散させた液）の充填が容易になり、充填率が向上する。【００２１】
さらにまた、微小反応槽底部の磁性体薄膜はウエットエッチング等の既知の手法により除去してもよく、除去することにより、基板の下方（裏面）からも微小反応槽内の光学観察が可能となる。例えば、蛍光による細胞やたんぱく質の発現の判定が可能となる。【００２２】
次に、本発明のビーズ配置方法においては、上述のビーズ配置用基板の微小反応槽内に磁気ビーズを配置するにあたり、ビーズ配置用基板の下部に磁石を配置し、該基板上に、磁気ビーズを分散させた分散液を滴下する。これにより、磁石の引力により微小反応槽へ磁気ビーズが誘引される。さらに、磁石を適宜基板に対し平行方向に動かすことで磁気ビーズが分散し、反応槽内への充填率が向上する。磁石によりビーズ配置用基板に印加する磁場の強さは、所望の効果を得る上で、好ましくは１００〜１００００ガウスである。【００２３】
なお、上記のように、微小反応槽を親水化することにより反応槽内部への液の充填が容易となるが、同様の効果を界面活性剤を利用しても得ることができる。【００２４】
また、本発明においては、基板下部に配した磁石により磁性体薄膜が磁化し、磁気ビーズを反応槽に引き付け、磁石を取り除いた後も磁性体薄膜の磁化は残るため、磁気ビーズを固定し続けることが可能である。
【実施例】
【００２５】
以下に本発明の実施例を挙げ、更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１
先ず、図１（ａ）に示すように、２０ｍｍ×２０ｍｍの透明ガラス基板材料１上に、接着層２としてクロムを成膜し、その上に磁性体であるニッケルを膜厚が０．５μｍとなるように成膜し、磁性体薄膜３を得た。その後、図中の符号４として示すネガティブフォトレジストＳＵ−８を厚さ３μｍになるように塗布した（図１（ｂ））。更に、１００００個の直径３μｍ円形微小反応槽のパターンをコンタクト露光により転写し、現像液で円形パターンを取り除くことにより、微小反応槽５を形成した（図１（ｃ））。最後に、平板型誘導結合プラズマ発生装置を用いて、表面に１００ｍＴｏｒｒ、２００Ｗで５分間、酸素プラズマ照射を行うことにより親水化処理を行い、ビーズ配置用基板を作製した（図１（ｄ））。図２に作製したビーズ配置用基板の拡大写真図を示す。【００２６】
次に、図３に模式的に示すように、作製した基板１０上に、直径２．８μｍの磁気ビーズ１１を分散させた分散液１２を滴下し、その際、微小反応槽５内へ磁気ビーズ１１を誘導するため、基板１０の裏面に磁束密度２０００ガウスの磁石１３を配置した。さらにその磁石１３を基板１０と平行方向に適宜移動させることにより、微小反応槽５内への磁気ビーズ１１の誘導を促進させた。【００２７】
基板１０の裏面に磁石１３を固定した状態で基板１０の表面を純水で洗浄した後、磁気ビーズ１１の配列の様子を、演算処理装置１５に接続された光学顕微鏡１４で観察した。光学顕微鏡１４で観察した結果、９５％以上の高い確率で各微小反応槽５に１個ずつ磁気ビーズ１１が充填されていることが確認できた。【００２８】
比較例１
磁性体薄膜３としてニッケルを成膜しなかった以外は実施例１と同様にして基板１０を作製し、上記と同様の試験を行った結果、微小反応槽５内への充填率は１０％以下と低い値を示した。このことから、ニッケル膜の効果により充填率が向上していることが確認された。【００２９】
実施例２
実施例１と同様に、先ず、２０ｍｍ×２０ｍｍの透明ガラス基板材料１上に接着層２としてクロムを成膜し、さらに磁性体であるニッケルを膜厚が０．５μｍとなるように成膜した（図１（ａ））。そのニッケルの磁性体薄膜３上に、図中の符号４として示すネガティブフォトレジストＳＵ−８を厚さが３〜１０μｍになるように塗布した（図１（ｂ））。次に、直径が３、４、５、６、７、１０μｍの円形微小反応槽５のパターンをコンタクト露光により転写し、現像液で円形パターンを取り除くことにより微小反応槽５を形成した（図１（ｃ））。最後に、平板型誘導結合プラズマ発生装置を用いて、表面に１００ｍＴｏｒｒ、２００Ｗで５分間、酸素プラズマ照射を行うことにより親水化処理を行い、ビーズ配置用基板を作製した（図１（ｄ））。【００３０】
次に、図３に模式的に示すように、作製した基板１０上に４×１０6個の直径２．８μｍの磁気ビーズ１１を分散させた分散液１２を滴下し、微小反応槽５内へ磁気ビーズ１１を誘導するため、基板１０裏面に磁石１３を固定した。さらにその磁石１３を動かすことにより、微小反応槽５内への磁気ビーズ１１の誘導を促進させた。【００３１】
基板１０裏面に磁石１３を固定した状態で表面を純水で洗浄した後、実施例１と同様に磁気ビーズ１１の配列の様子を、演算処理装置１５に接続された光学顕微鏡１４で観察した。光学顕微鏡１４で観察した結果、磁気ビーズ１１の充填率は微小反応槽５の直径に比例して上昇することが明らかになった。また、直径が大きい微小反応槽には複数の磁気ビーズ１１が充填された。【００３２】
また、微小反応槽５の深さが６μｍ以上では縦方向に複数の磁気ビーズ１１が混入した。微小反応槽５の直径が６μｍ以下では一つの微小反応槽５に対し一つの磁気ビーズ１１が充填された。また、直径の大きな微小反応槽５では、洗浄の際に磁気ビーズ１１が脱離したが、磁気ビーズ１１とほぼ同じサイズの直径である微小反応槽５からは磁気ビーズ１１の脱離は観察されなかった。以上のことから、微小反応槽５の深さ、直径ともに６μｍ以下が適していることが判明した。  【００３３】
実施例３
実施例１および２と同様に、先ず、図４（ａ）に示すように、２０ｍｍ×２０ｍｍの透明ガラス基板材料１上に磁性体であるニッケルを膜厚が０．５μｍとなるように成膜し、磁性体薄膜３を得た。その後、図中の符号４として示すネガティブフォトレジストＳＵ−８を厚さ３μｍになるように塗布した（図４（ｂ））。更に、１００００個の直径３μｍの円形微小反応槽５のパターンをコンタクト露光により転写し、現像液で円形パターンを取り除くことにより、微小反応槽５を形成した（図４（ｃ））。磁気ビーズの充填の様子を倒立顕微鏡で観察するため、微小反応槽５底部の磁性体薄膜３（ニッケル膜）をウェットエッチングにより除去した（図４（ｄ））。最後に、平板型誘導結合プラズマ発生装置を用いて、表面に１００ｍＴｏｒｒ、２００Ｗで５分間、酸素プラズマ照射を行うことにより親水化処理を行い、ビーズ配置用基板を作製した（図４（ｅ））。【００３４】
次に、作製した基板上に４×１０6個の直径２．８μｍの磁気ビーズを分散させた水分散液を滴下し、磁気ビーズの配列の様子を基板の底部から光学顕微鏡で観察した。倒立型光学顕微鏡で観察した結果、磁気ビーズが微小反応槽内に充填される様子を観察することができた。【００３５】
実施例４
水溶液中でのアフィニティーによる生体分子スクリーニングのモデル実験として、以下の実験を行った。まず、実施例１に示す方法でビーズ配置用基板を作製した。基板の基板材料には紫外線の透過率が高く、可視光領域の蛍光を発しない石英ガラスを用いた。また、タンパク質の非特異吸着を防止するために、基板表面にＰＥＧ（ポリエチレングリコール）膜を被膜した。【００３６】
次に、得られたビーズ配置用基板に、表面にＰＥＧを用いてビオチンを修飾した磁気ビーズを充填し、ターゲット分子となるストレプトアビジンを分散させた水溶液を流し込んだ。光学観察を容易に行えるように、ストレプトアビジンはテキサスレッドで蛍光標識しているものを使用した。最後に、純水でストレプトアビジンを分散させた水溶液を洗浄した。【００３７】
洗浄後の磁気ビーズを蛍光顕微鏡で観察を行った。その結果を図５に示す。図５の（ａ）は白色光照射下の磁気ビーズの顕微鏡写真であり、（ｂ）は緑色光照射下の磁気ビーズの顕微鏡写真である。磁気ビーズから赤色の強い蛍光が観察され、微小反応槽内に固定された磁気ビーズ上でターゲット分子であるストレプトアビジンが配置されていることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明は、生体分子をＤＮＡチップのように基板上に直接固定するのではなく、磁気ビーズ表面に生体分子を固定化したのち基板上に配置するために適した基板構造と配置方法を提供する。この方法を用いると、短時間で大量の生体分子を自己組織化により基板上に配列することが可能であり、さらに、配列後に所望の位置の生体分子を基板から回収することも容易である。この技術は、生体高分子を高速進化させて有用分子の創製を行う進化分子工学で必要とされる大規模並列スクリーニングに応用することが可能である。したがって、本発明は進化分子工学理論を実現する進化分子リアクターの基盤要素技術として、新薬開発、環境、バイオプロセス、食品などの広範な産業分野に貢献することが期待される。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図２】
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【図５】
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【国際調査報告】
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