(57)【要約】  癌細胞において目的タンパク質を発現させることが可能な組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を、迅速かつ確実に作成する方法を提供する。本発明に係る組換えＨＳＶの作製方法は、ｌｏｘＰ部位およびＦＲＴ部位を有し、ｌｏｘＰ部位とＦＲＴ部位との間にマーカー遺伝子の発現カセットが少なくとも１種類挿入されたＢＡＣプラスミドを、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノムに挿入する第一工程と、目的タンパク質をコードする遺伝子の発現カセットが少なくとも１種類と、少なくとも１種類のマーカー遺伝子と、ｌｏｘＰ部位およびＦＲＴ部位と、がそれぞれ挿入されたシャトルベクターを作製し、Ｃｒｅリコンビナーゼを用いてシャトルベクターをＨＳＶゲノムのｌｏｘＰ部位に挿入する第二工程と、ＨＳＶゲノムと、Ｆｌｐリコンビナーゼを発現可能なベクターと、を宿主に共感染させ、該ゲノム上のＦＲＴ部位に挟まれた領域を切り出し、目的の遺伝子組換えＨＳＶを産生させる第三工程と、を含むものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌細胞において目的タンパク質を発現させることが可能な組換え単純ヘルペスウイルスの作製方法であって、
ｌｏｘＰ部位およびＦＲＴ部位を有し、前記ｌｏｘＰ部位とＦＲＴ部位との間に、プロモーターの下流にマーカー遺伝子が機能的に結合された構造を有するマーカー遺伝子の発現カセットが少なくとも１種類挿入されたＢＡＣプラスミドを、単純ヘルペスウイルスゲノムに挿入する第一工程と、
プロモーターの下流に前記目的タンパク質をコードする遺伝子が機能的に結合した構造を有する目的タンパク質をコードする遺伝子の発現カセットが少なくとも１種類と、少なくとも１種類のマーカー遺伝子と、ｌｏｘＰ部位およびＦＲＴ部位と、がそれぞれ挿入されたシャトルベクターを作製し、Ｃｒｅリコンビナーゼを用いて、前記目的タンパク質をコードする遺伝子と前記マーカー遺伝子とが発現可能な構成となるように該シャトルベクターを前記単純ヘルペスウイルスゲノムのｌｏｘＰ部位に挿入する第二工程と、
前記第二工程で得られた前記単純ヘルペスウイルスゲノムと、Ｆｌｐリコンビナーゼを発現可能なベクターと、を宿主に共感染させ、該ゲノム上のＦＲＴ部位に挟まれた領域を切り出し、目的の遺伝子組換え単純ヘルペスウイルスを産生させる第三工程と、を含む方法。
【請求項２】
前記第二工程を液相中で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一工程に先立ち、前記単純ヘルペスウイルスのγ３４．５遺伝子およびＩＣＰ６遺伝子が欠失または不活化されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
さらに、前記単純ヘルペスウイルスのＩＣＰ４７遺伝子が欠失または不活化されている、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＢＡＣプラスミドに挿入されたマーカー遺伝子が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子および／または抗生物質耐性遺伝子である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１種類の目的タンパク質をコードする遺伝子の発現カセットに含まれるプロモーターが、天然単純ヘルペスウイルスゲノムに存在しない塩基配列からなるプロモーターである、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記単純ヘルペスウイルスのゲノムに存在しない塩基配列からなるプロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記シャトルベクターに挿入されたマーカー遺伝子が、ｌａｃＺ遺伝子および／または抗生物質耐性遺伝子である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記シャトルベクターに挿入されたマーカー遺伝子が、前記ＢＡＣプラスミドに挿入された抗生物質耐性遺伝子とは異なる抗生物質耐性遺伝子を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記目的タンパク質をコードする遺伝子が、免疫刺激性遺伝子、抗血管新生作用性タンパク質、細胞膜融合タンパク質をコードする遺伝子および癌抑制遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子である、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記免疫刺激遺伝子が、共刺激因子、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７およびtransporter associated with antigen processing（ＴＡＰ）からなる群から選択される１以上のタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗血管新生作用タンパク質をコードする遺伝子が、エンドスタチン、アンジオスタチン、dominant negative FGF receptorおよび血小板因子４からなる群から選択される１以上のタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞膜融合タンパク質をコードする遺伝子が、ウイルス表面タンパク質である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記癌抑制遺伝子が、ｐ５３遺伝子である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記シャトルベクターが、スタッファ配列を含む、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記スタッファ配列が、約５０００塩基長以上である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法によって作製された組換え単純ヘルペスウイルス。
【請求項１８】
請求項１７に記載の組換え単純ヘルペスウイルスを含む医薬組成物。
【請求項１９】
各種癌疾患の治療剤または予防剤である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１８に記載の医薬組成物を投与することを含む、癌の予防または治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的細胞において目的のタンパク質を発現させることが可能な遺伝子組換え単純ヘルペスウイルスの作製方法、およびこの組換えヘルペスウイルスを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ウイルス感染の分子細胞的機構および癌発生に関する遺伝学的機序や癌細胞増殖の分子生物学的機構などの知見に基づいて、ウイルスゲノムを遺伝子工学的に改変し、癌細胞で選択的に複製するウイルスを作製して、癌治療に応用する試みがなされている。【０００３】
遺伝子組換えウイルスを癌治療に応用するという概念は、１９９１年にMartuzaらにより提唱された（例えば、非特許文献１を参照。）。ウイルスはそれ自体病原性を有するものが多く、そのままヒト等に投与すると正常細胞にも悪影響を及ぼす。しかし、遺伝子組換えで特定の遺伝子を欠失または変異させることによって、正常細胞ではウイルス複製ができないが、増殖が盛んな腫瘍細胞では欠落した遺伝子の機能が補償されるなどにより複製できるウイルスを作製することができる。【０００４】
遺伝子組換えによって癌細胞内のみで選択的に複製するよう改変された癌治療ウイルスは、癌細胞に感染するとin situで複製し、その過程で宿主の癌細胞を死滅させる。複製したウイルスは周囲に散らばって再び癌細胞に感染し、その後、複製→細胞死→感染を繰り返して抗腫瘍効果を現す。一方、正常細胞に感染した治療用ウイルスは複製しないため、正常組織には害が生じない。【０００５】
このような変異ウイルスとして、これまでに、単純ヘルペスウイルスＩ型（以下「ＨＳＶ−１」という。）ゲノムから、チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を欠失させた変異ウイルス（例えば、上記非特許文献１を参照。）、γ３４．５遺伝子を欠失させ、ＩＣＰ６遺伝子を不活化させたＨＳＶ−１（以下「Ｇ２０７」と言う。）（例えば、非特許文献２〜１４を参照）、γ３４．５遺伝子およびＩＣＰ６遺伝子に加え、ＩＣＰ４７遺伝子（α４７遺伝子ともいう）も不活化させたＨＳＶ−１（以下「Ｇ４７Δ」という。例えば、特許文献１および非特許文献１５を参照。）等が開発されている。これらの変異ウイルスは、正常細胞では複製できないが、腫瘍細胞では複製する能力を保持する。特にＧ４７Δは、３つの遺伝子を変異させたことにより、腫瘍特異性および安全性が高く治療用ウイルスとして非常に有用である。【０００６】
一方、癌治療用ウイルスは、殺細胞効果を示すだけではなく、抗腫瘍免疫を惹起する機能も有している。本発明者らは、免疫系が正常なマウスを用いた研究により、腫瘍内投与された遺伝子組換えＨＳＶ−１が、腫瘍内で増殖して殺細胞効果を示すばかりでなく、特異的抗腫瘍免疫を惹起して、その抗腫瘍効果を増強することを明らかにした（例えば非特許文献６、７および１６を参照）。例えば、Ａ／Ｊマウスの皮下に作成したＮ１８腫瘍（神経芽腫）へＧ２０７を腫瘍内投与すると、Ｎ１８細胞に対する特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（cytotoxic T lymphocytes; ＣＴＬ）の活性上昇を伴う全身性抗腫瘍免疫が誘導され、遠隔の皮下腫瘍あるいは脳内腫瘍の増大も抑制された。Ｇ２０７治療で治癒したマウスは腫瘍特異的な防御免疫を獲得し、Ｎ１８細胞特異的ＣＴＬ活性上昇は１年以上維持された。すなわち、癌治療用ＨＳＶ−１の腫瘍内投与はin situの癌ワクチンとしても作用し、腫瘍抗原の同定を必要とせず、腫瘍細胞などの培養を必要とするex vivo法に比べて簡便であり、原発巣を治療することで、全身性抗腫瘍免疫を介して転移巣をも制御できる可能性もあって臨床上非常に有利である。【０００７】
本発明者らは、癌治療用ウイルスを免疫刺激性遺伝子発現と組み合わせると抗腫瘍効果が増強されることを、非増殖性ＨＳＶ−１ベクターであるＨＳＶ−１アンプリコン（amplicon）を用いて確認した。分泌型のＴ細胞共刺激因子Ｂ７．１−Ｉｇを発現するアンプリコンを、Ｇ２０７をヘルパーとして作製し、得られた混合ベクターを、免疫原性の低いＮｅｕｒｏ２ａ（マウス神経芽腫）の脳腫瘍あるいは皮下腫瘍に直接投与した。その結果、Ｇ２０７は腫瘍細胞内で複製しながら殺細胞効果を示す一方で、アンプリコンが感染腫瘍細胞から持続的にＢ７．１−Ｉｇを周囲に分泌するため、強力な抗腫瘍効果と特異的抗腫瘍免疫の惹起が得られた（例えば、非特許文献１７を参照）。また、インターロイキン（ＩＬ）−１２発現アンプリコンとＧ２０７の組み合わせでも抗腫瘍効果の増強が得られている(例えば非特許文献１８を参照）。【０００８】
ウイルス療法の抗腫瘍免疫を増強する方法としては、アンプリコンを用いる方法のほかに、治療用組換えＨＳＶ−１のゲノムに、癌の治療に関与するタンパク質をコードする遺伝子を直接組み込むことにより、ウイルスを増幅型ベクターとして機能させる方法も考えられる。アンプリコンとの組合せではなく、Ｇ２０７やＧ４７Δ等の治療用組換えＨＳＶ−１ゲノムに治療関連タンパク質をコードする遺伝子を組み込めば、腫瘍で増幅された遺伝子配分が得られることに加え、安定して大量のベクターを常に得られるという利点がある。【０００９】
遺伝子組換えＨＳＶ−１の作成は、従来相同組換え法によって行われてきた。相同組換えとは、外来遺伝子がゲノムに組み込まれる際、相同性の高い場所により高い確率で組み込まれる組換えをいう。従って、一つのゲノムに相同性の高い場所が複数箇所存在する場合には、外来遺伝子がどこに組み込まれるかを制御するのが困難である。特に、ＨＳＶ−１の場合ゲノムが大きく、目的とする遺伝子組換え体を得るためには、何万もの候補ウイルス株のスクリーニング、選択、精製、分子細胞レベルの確認等、多大な労力が必要とされ、通常１つの遺伝子組換えＨＳＶ−１を作製するのに１〜２年を要していた。【００１０】
これに対し、Ｇ２０７と構造が類似したＭＧＨ−１と呼ばれる遺伝子組換え型癌治療用ウイルスのゲノムに、免疫刺激性遺伝子などの癌治療用遺伝子を効率よく組み込む方法として、バクテリア人工染色体（Bacterial Artificial chromosome; ＢＡＣ）を用いる方法が提案されている（非特許文献１９）。この方法では、まず、癌治療用ウイルスのゲノムに、治療用遺伝子と、Ｃｒｅリコンビナーゼの標的配列であるｌｏｘＰ部位と、Ｆｌｐリコンビナーゼの標的配列であるＦＲＴ部位と、少なくとも１つのマーカー遺伝子等を組み込んだＢＡＣプラスミドを挿入する。次に、目的の治療用遺伝子を組み込んだシャトルベクターをこのゲノムに挿入するが、その際、相同組換えではなく、Ｆｌｐ−ＦＲＴシステムを利用する。これにより、目的の組換え体を得られる確率が高くなる。こうして得られたウイルスゲノムをベロ細胞に形質転換させ、さらにＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムを利用してゲノムの不要な領域を切り出し、ウイルスを産生させる。
【特許文献１】ＵＳ２００２／０１８７１６３Ａ１号公報
【非特許文献１】Martuza, R.L. et al.; Science 252: 854-6 (1991)
【非特許文献２】Chahlavi, A. et al.; Neoplasia 1: 162-169 (1999)
【非特許文献３】Hunter, W. D. et al.; J Virol 73: 6319-6326 (1999)
【非特許文献４】Chahlavi, A. et al.; Gene Ther 6: 1751-1758 (1999)
【非特許文献５】Nakamura, S. et al.; Glia 28: 53-65 (1999)
【非特許文献６】Todo, T. et al,; Hum Gene Ther 10: 2741-2755 (1999)
【非特許文献７】Todo, T. et al,; Hum Gene Ther 10: 2869-2878 (1999)
【非特許文献８】Todo, T. et al,; Cancer Gene Ther. 7: 939-946 (2000)
【非特許文献９】Markert, JM. et al,; Gene Ther. 7: 867-874 (2000)
【非特許文献１０】Todo, T. et al,; Mol. Ther. 2: 588-595 (2000)
【非特許文献１１】Nakano, K. et al,; Mol. Ther. 3: 431-437 (2001)
【非特許文献１２】Varghese, S. et al,; Hum. Gene Ther. 12: 999-1010 (2001)
【非特許文献１３】Jorgensen, TJ. et al,; Neoplasia 3: 451-456 (2001)
【非特許文献１４】Todo, T. et al,; Tumor Suppressing Viruses, Genes, and Drugs- Innovative Cancer Therapy Approaches. San Diego, Academic Press:45-75 (2001)
【非特許文献１５】Todo, T. et al,; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6396-6401 (2001)
【非特許文献１６】Toda, M. et al,; Hum. Gene Ther., 10: 385-393 (1999)
【非特許文献１７】Todo, T. et al.; Cancer Res 61:153-161 (2001）
【非特許文献１８】Toda, M. et al.; J Immunol 160:4457-4464 (1998）
【非特許文献１９】Saeki, Y. et al.; Mol. Ther. 3:S45-46 (2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、非特許文献１９の方法では、シャトルベクターを挿入する際にＦｌｐ−ＦＲＴシステムを利用するので、この反応を、Ｆｌｐリコンビナーゼを発現するプラスミドを有する大腸菌内で行わせなければならない。そのため、Ｆｌｐリコンビナーゼを発現するプラスミドと、シャトルベクタープラスミドの両方を大腸菌に形質転換させなければならないが、大腸菌への形質転換率は高くない。２種類のプラスミドを形質転換させる確率は、２個の独立した事象の確率の積となり、両者を含む大腸菌を得られる確率は非常に低い。また、該大腸菌は、上述のＢＡＣプラスミドが挿入されたウイルスゲノムも有していなければならず、このように特殊な大腸菌を大量に調整するのは困難である。【００１２】
また、非特許文献１９の方法によれば、最終産物であるウイルスゲノム上に緑色蛍光タンパク質（以下「ＧＦＰ」という。）をコードする遺伝子が残されるが、ＧＦＰは免疫原性が高く、毒性もあるため、ヒトの癌治療に応用するためには大きな支障となりうる。【００１３】
さらに、この方法では、最後にＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムが機能して切り出される部分に赤色蛍光タンパク質（以下「ＲＦＰ」という。）遺伝子を組み込んでおき、赤色の蛍光の消失によって、最終産物の選択と確認を行っている。しかしながら、ＲＦＰは発現のタイミングが遅く、しかも蛍光も十分に明るくないため検知に最適であるとはいえない。その結果、例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰが正常に機能せず、不要な配列が切り出されていないウイルスゲノムも、目的のゲノムとして選択されてしまう可能性がある。このことは、特に、切り出される予定の配列中に、免疫原性や毒性のあるタンパク質をコードする遺伝子が含まれる場合、人体への応用の障害となる。【００１４】
非特許文献１９の方法ではまた、治療用遺伝子のプロモーターとして、ヘルペスウイルスに固有の配列を利用したことから、相同組換えによる不測の変異が生じる可能性が高いという問題もあった。【００１５】
そこで、本発明は上記の問題を解決し、癌細胞において目的タンパク質を発現させることが可能で、安全性、癌細胞におけるウイルスの複製能および抗腫瘍効果の点でも飛躍的に進歩した実用的な組換え単純ヘルペスウイルスを、迅速かつ確実に、作製する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記課題に鑑みて、鋭意研究を重ねた結果、ＨＳＶゲノムにシャトルベクターを挿入する際にＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムを利用することにより、従来法と比較して飛躍的に速く、目的タンパク質を発現させることが可能な組換えＨＳＶを得られることを見出した。本発明者らは、また、最終産物のウイルスがＧＦＰではなくｌａｃＺ遺伝子をマーカー遺伝子として有する；最終産物の選択と確認にＧＦＰの消失を用いる；治療用遺伝子のプロモーターとして、天然のヘルペスウイルスゲノムに存在しない配列を用いる；最終段階でＦｌｐ−ＦＲＴシステムによって切り出される領域にスタッファ配列を組み込んでおく等の設計をすることにより、本発明に係る方法をより有用なものにできることを見出した。【００１７】
さらに、本発明に係る方法を用いる際、基本骨格としてＧ２０７をさらに改変した第三世代のＧ４７Δウイルスゲノムを利用することにより、安全性、癌細胞におけるウイルスの複製能、抗腫瘍効果の点で非常に優れた、実用的な組換え単純ヘルペスウイルスが得られることを確認し、本発明を完成するに至った。【００１８】
即ち、本発明は、〔１〕癌細胞において目的タンパク質を発現させることが可能な組換え単純ヘルペスウイルスの作製方法であって、ｌｏｘＰ部位およびＦＲＴ部位を有し、前記ｌｏｘＰ部位とＦＲＴ部位との間に、プロモーターの下流にマーカー遺伝子が機能的に結合された構造を有するマーカー遺伝子の発現カセットが少なくとも１種類挿入されたＢＡＣプラスミドを、単純ヘルペスウイルスゲノムに挿入する第一工程と、プロモーターの下流に前記目的タンパク質をコードする遺伝子が機能的に結合した構造を有する目的タンパク質をコードする遺伝子の発現カセットが少なくとも１種類と、少なくとも１種類のマーカー遺伝子と、ｌｏｘＰ部位およびＦＲＴ部位と、がそれぞれ挿入されたシャトルベクターを作製し、Ｃｒｅリコンビナーゼを用いて、前記目的タンパク質をコードする遺伝子と前記マーカー遺伝子とが発現可能な構成となるように該シャトルベクターを前記単純ヘルペスウイルスゲノムのｌｏｘＰ部位に挿入する第二工程と、前記第二工程で得られた前記単純ヘルペスウイルスゲノムと、Ｆｌｐリコンビナーゼを発現可能なベクターと、を宿主に共感染させ、該ゲノム上のＦＲＴ部位に挟まれた領域を切り出し、目的の遺伝子組換え単純ヘルペスウイルスを産生させる第三工程と、を含む方法；〔２〕前記第二工程を液相中で行う、上記〔１〕に記載の方法；〔３〕前記第一工程に先立ち、前記単純ヘルペスウイルスのγ３４．５遺伝子およびＩＣＰ６遺伝子が欠失または不活化されている、上記〔１〕または〔２〕に記載の方法；〔４〕さらに、前記単純ヘルペスウイルスのＩＣＰ４７遺伝子が欠失または不活化されている、上記〔３〕に記載の方法；〔５〕前記ＢＡＣプラスミドに挿入されたマーカー遺伝子が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子および／または抗生物質耐性遺伝子である、上記〔１〕から〔４〕のいずれか１項に記載の方法；〔６〕前記少なくとも１種類の目的タンパク質をコードする遺伝子の発現カセットに含まれるプロモーターが、天然単純ヘルペスウイルスゲノムに存在しない塩基配列からなるプロモーターである、上記〔１〕から〔５〕のいずれか１項に記載の方法；〔７〕前記単純ヘルペスウイルスのゲノムに存在しない塩基配列からなるプロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、上記〔１〕から〔６〕のいずれか１項に記載の方法；〔８〕前記シャトルベクターに挿入されたマーカー遺伝子が、ｌａｃＺ遺伝子および／または抗生物質耐性遺伝子である、上記〔１〕から〔７〕のいずれか１項に記載の方法；〔９〕前記シャトルベクターに挿入されたマーカー遺伝子が、前記ＢＡＣプラスミドに挿入された抗生物質耐性遺伝子とは異なる抗生物質耐性遺伝子を含む、上記〔８〕に記載の方法；〔１０〕前記目的タンパク質をコードする遺伝子が、免疫刺激性遺伝子、抗血管新生作用性タンパク質、細胞膜融合タンパク質をコードする遺伝子および癌抑制遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子である、上記〔１〕から〔９〕のいずれか１項に記載の方法；〔１１〕前記免疫刺激遺伝子が、共刺激因子、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７およびtransporter associated with antigen processing（ＴＡＰ）からなる群から選択される１以上のタンパク質をコードする遺伝子である、上記〔１０〕に記載の方法；〔１２〕前記抗血管新生作用タンパク質をコードする遺伝子が、エンドスタチン、アンジオスタチン、dominant negative FGF receptorおよび血小板因子４からなる群から選択される１以上のタンパク質をコードする遺伝子である、上記〔１０〕に記載の方法；〔１３〕前記細胞膜融合タンパク質をコードする遺伝子が、ウイルス表面タンパク質である、上記〔１０〕に記載の方法；〔１４〕前記癌抑制遺伝子が、ｐ５３遺伝子である、上記〔１０〕に記載の方法；〔１５〕前記シャトルベクターが、スタッファ配列を含む、上記〔１〕から〔１４〕のいずれか１項に記載の方法；〔１６〕前記スタッファ配列が、約５０００塩基長以上である、上記〔１５〕に記載の方法；〔１７〕上記〔１〕から〔１６〕のいずれか１項に記載の方法によって作製された組換え単純ヘルペスウイルス；〔１８〕上記〔１〕から〔１７〕のいずれか１項に記載の方法で作製された組換え単純ヘルペスウイルスを含む医薬組成物；〔１９〕各種癌疾患の治療剤または予防剤である、上記〔１８〕に記載の医薬組成物；〔２０〕上記〔１８〕に記載の医薬組成物を投与することを含む、癌の予防または治療方法、に関する。【００１９】
本発明によれば、短期間に高い収率で目的の組換えＨＳＶを得ることが可能となった。本方法によれば、従来１〜２年を要した組換えウイルスの作製を、例えば２〜３ヶ月で行うことができ、しかも４〜５種類の異なる遺伝子組換えＨＳＶを同時に作製することができる。【００２０】
また、本発明の効果は、骨格にＧ４７ΔＨＳＶ−１ゲノムを用いることによってさらに高められ、安全性および抗腫瘍効果がさらに高い実用的な癌治療用ＨＳＶを得ることができる。【００２１】
さらに、本発明によれば、腫瘍細胞において殺細胞効果を発揮する組換えＨＳＶに、in situでの抗腫瘍免疫を惹起する効果、癌抑制効果、抗血管新生作用効果等を付与することが可能となり、ウイルス療法の抗腫瘍効果を増強することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下に、本発明に用いられる用語等の意義を明確にし、本発明を詳細に説明する。【００２３】
本発明に係る組換えＨＳＶの作製方法では、まず、ＨＳＶゲノムに、ＢＡＣシステムを用いてｌｏｘＰ部位とＦＲＴ部位を挿入する。一方、癌細胞で発現させたい目的タンパク質をコードする遺伝子は機能的に結合されたプロモーターと共にシャトルベクターに挿入しておく。このシャトルベクターにもｌｏｘＰ部位およびＦＲＴ部位を適当な配置に挿入しておくことにより、まずＣｒｅリコンビナーゼを用いて、シャトルベクターをＨＳＶゲノムに挿入し、続いてＦｌｐリコンビナーゼを用いて、このＨＳＶゲノムから不要な部分を切り出し、目的とする変異を持ったＨＳＶゲノムを得ることができる。【００２４】
シャトルベクターをＨＳＶゲノムに組み込む第二工程でＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムを利用し、Ｆｌｐ−ＦＲＴシステムを不要な領域を切り出す第三工程で利用することによって、第二工程まで溶液中で、例えば試験管やエッペンドルフチューブ中等で行うことができ、単純な操作で、迅速かつ高精度に組換えを行うことができる。また、第二工程でシャトルベクターを宿主細胞中に導入する必要がなくなるので、収率を顕著に高くすることができる。【００２５】
本発明において、「組換え単純ヘルペスウイルス」とは、遺伝子組換え技術によって、癌細胞で目的タンパク質を発現させることができるように改変された単純ヘルペスウイルス（以下「ＨＳＶ」という。）である限り特に限定されず、天然のＨＳＶの遺伝子のうち、どの遺伝子を改変したものであっても、またいかなる外来遺伝子を挿入したものであってもよい。また、血清型はＩ型（ＨＳＶ−１）であってもＩＩ型（ＨＳＶ−ＩＩ）であってもよいが、好ましくはＨＳＶ−１が用いられる。【００２６】
ＨＳＶ−１は、エンベロープを有する二本鎖ＤＮＡウイルスに分類され、癌治療に有利な以下の特徴を備えている。１）ヒトのあらゆる種類の細胞に感染可能である；２）ウイルスの生活環とゲノム配列が解明されている；３）ウイルス遺伝子の大半は機能が判明しており、遺伝子操作を加えることが可能である；４）ウイルスゲノムが大きい（約１５２ｋｂ）為に、大きな遺伝子や複数の遺伝子を組み込むことができる。さらに、ＨＳＶ−１は臨床応用に適した以下の利点を備える；５）比較的低いmultiplicity of infection（ＭＯＩ）で全ての細胞の死滅が可能である；６）増殖を抑制する抗ウイルス薬が存在する；７）血中抗ＨＳＶ−１抗体は、ウイルスの細胞から細胞への感染拡大に影響しない；８）ＨＳＶ−１に感受性を示すマウスやサルが存在するために、動物で安全性や効果の前臨床的評価を行える；９）ウイルスＤＮＡが宿主細胞のゲノムに取り込まれず染色体外に存在する。【００２７】
本発明に用いられるＨＳＶは、第一工程に先立って、正常細胞では増殖できず、癌細胞でのみ増殖できるよう、遺伝子組換え技術により改変された、もしくは自然に変異したＨＳＶ（以下、単に「組換えＨＳＶ」という。）が好ましい。非増幅性アンプリコンを用いる場合に比較して、組換えＨＳＶは癌細胞で増幅するので、より多くの目的タンパク質を発現することができる。【００２８】
このようなウイルスとしては、γ３４．５遺伝子およびＩＣＰ６遺伝子が欠失または不活化されているＨＳＶ、これら２つの遺伝子に加えて、さらにＩＣＰ４７遺伝子が欠失または不活化されているＨＳＶ等が挙げられる。【００２９】
γ３４．５遺伝子産物は、double-stranded RNA-activated protein kinase（ＰＫＲ）の機能に拮抗するタンパク質である。正常細胞では、ＨＳＶ−１感染に呼応してＰＫＲがリン酸化され、それが翻訳開始因子ｅＩＦ−２αをリン酸化し、その結果ウイルスのタンパク質合成が抑制される。従って、γ３４．５遺伝子が機能しないと、正常細胞ではウイルスの複製が抑制されることになる。しかし、癌細胞、特にＲａｓシグナル伝達経路が活性化している細胞ではＰＫＲがすでに抑制されているため、γ３４．５を欠失した変異ＨＳＶ−１でもウイルスの複製が可能となる。【００３０】
ＩＣＰ６遺伝子は、リボヌクレオチド還元酵素（ribonucleotide reductase; ＲＲ）の大サブユニットをコードする遺伝子である。ＲＲ遺伝子を除去または不活化すると、ＨＳＶ−１は非分裂細胞（正常細胞）では複製できない。しかし、分裂が盛んでＲＲ活性が上昇した細胞では、ウイルスの欠落酵素が補われて複製が可能となる。【００３１】
ＩＣＰ４７タンパク質は、transporter associated with antigen processing （ＴＡＰ）を阻害することによって、感染細胞のMHC Class Iの発現を低下させ、ウイルスが宿主の免疫サーベイランスから逃れるように作用する。このため、ＩＣＰ４７遺伝子を不活化すると、感染癌細胞のMHC Class I発現が維持されるため、抗腫瘍免疫が増強される。【００３２】
γ３４．５遺伝子およびＩＣＰ６遺伝子が欠失または不活化されたＨＳＶとしては、例えば上述のＧ２０７やＧ２０７と構造が類似したＭＧＨ−１が挙げられ、γ３４．５、ＩＣＰ６およびＩＣＰ４７遺伝子の３つが欠失若しくは不活化されたＨＳＶとしては、例えば上述のＧ４７Δが挙げられる。中でも、Ｇ４７Δは三重変異により、複製の腫瘍特異性および安全性が高く、ウイルス療法に好適である。【００３３】
なお、本発明において、上記遺伝子（γ３４．５遺伝子、ＩＣＰ６遺伝子、ＩＣＰ４７遺伝子等）の発現の抑制方法は特に限定されず、遺伝子を欠失させる方法、遺伝子の途中に他のＤＮＡを挿入して不活化させる方法等、当業者は適宜方法を選択することができる。【００３４】
本発明に係る組み換えＨＳＶの作製方法では、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系および、Ｆｌｐ−ＦＲＴ系を利用するために、ＨＳＶゲノムにｌｏｘＰ部位およびＦＲＴ部位を予め組み込んでおく必要があり、このためにＢＡＣシステムを利用する。ＢＡＣプラスミドは、大腸菌のＦ因子プラスミドをシングルコピーで持つ人工染色体であり、比較的大きなＤＮＡ断片を安定に保持することができるので、ある生物のゲノムＤＮＡに所望の外来遺伝子を組み込むのに有用である。所望の外来遺伝子が組み込まれたＢＡＣプラスミドは大腸菌で増殖させることができ、さらに、直線化してＨＳＶゲノムと共に宿主（例えばＶｅｒｏ細胞や大腸菌等）にco-transfectすれば、相同組換えによってＨＳＶゲノムに組み込むことができる。ｌｏｘＰ部位およびＦＲＴ部位をＢＡＣプラスミドに組み込む操作、および直線化ＢＡＣプラスミドおよびＨＳＶのco-transfectは、当業者であれば自体公知またはそれに準ずる方法に従って容易に行うことができる。【００３５】
ＢＡＣプラスミドがＨＳＶゲノムに組み込まれたかどうかを確認するために、上記ＢＡＣプラスミドには少なくとも１種類のマーカー遺伝子を挿入しておくことが好ましい。マーカー遺伝子としては、例えば、その遺伝子産物が発光するものや、薬剤耐性遺伝子を用いることができる。【００３６】
遺伝子産物の発光を検出することにより、マーカーとして使用できる遺伝子としては、ＧＦＰ遺伝子、ＲＦＰ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。また、薬剤耐性遺伝子としては、抗生物質耐性のものが好ましく、例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。また、β−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子、β−グルクロニダーゼをコードするｇｕｓＡ遺伝子も、マーカー遺伝子として用いることができる。これらの遺伝子の産物であるβ−ガラクトシダーゼまたはβ−グルクロニダーゼは、それぞれ基質を分解する反応が呈色反応であるため検出が容易で好ましい。【００３７】
本発明に係るＨＳＶの作製方法では、これらのマーカー遺伝子を、ＢＡＣプラスミド上のｌｏｘＰ部位とＦＲＴ部位の間に挿入しておけば、第三工程でＦｌｐ−ＦＲＴシステムにより該マーカー遺伝子がＨＳＶゲノムから切り出される。従って、これらのマーカー遺伝子産物が消失したことを検出することによって、Ｆｌｐ−ＦＲＴシステムが機能したかどうかの確認にも用いることができる。また、最終的に、ＨＳＶゲノムから切り出されるので、マーカータンパク質がヒト等の生体に有害なものであってもよい。【００３８】
以上から、ＢＡＣプラスミドに挿入されるマーカー遺伝子は、ヒトに有害であるか否かに関わらず、目的ウイルスを選択しやすいものが有用であると言え、かかるマーカー遺伝子として、発現が速く、蛍光が明るいＧＦＰをコードする遺伝子が最も好ましい。【００３９】
本発明で用いられるＢＡＣプラスミドには、上述のマーカー遺伝子が、プロモーターの下流に機能的に結合した構造を有するマーカー遺伝子の発現カセットが挿入される。本発明において「機能的に結合した」とは、転写因子がプロモーターに結合することにより、その下流の遺伝子の転写が開始されるように、プロモーターと遺伝子が結合していることを意味する。【００４０】
本発明で用いられるプロモーター配列は、発現させたいマーカー遺伝子の種類等により、公知のプロモーターから適宜選択して用いることができる。例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来プロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、βアクチンプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＴＫプロモーター、ＰLプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＲＮＡ１．８プロモーターなどが挙げられる。【００４１】
なお、ＢＡＣプラスミドへのｌｏｘＰ部位、ＦＲＴ部位、およびマーカー遺伝子発現カセットの挿入は、例えばKimらの方法（Kim SY. et al.; Genome Res. 8:404-12, 1998.）、Kanameらの方法（Kaname T., Huxley C.; Gene 266:147-53, 2001.）、Leeらの方法（Lee EC. et al.; Genomics 73:56-65, 2001.）等、自体公知またはそれに準ずる方法により、適宜行うことができる。【００４２】
本発明においてシャトルベクターには、「目的タンパク質をコードする遺伝子」が挿入されている。本発明において「目的タンパク質をコードする遺伝子」とは、癌細胞において発現させることにより、癌の治療または予防に有利な効果を示すタンパク質をコードする遺伝子であれば特に限定されない。このような遺伝子としては、例えば免疫刺激性遺伝子、癌の血管新生を阻害して癌の増殖を効果的に抑制する抗血管新生作用性タンパク質をコードする遺伝子、癌抑制遺伝子、細胞膜融合タンパク質をコードする遺伝子などが挙げられる。【００４３】
免疫刺激性遺伝子としては、分泌型Ｂ７．１（Ｂ７．１−Ｉｇ）を含む共刺激因子、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７等のインターロイキン、transporter associated with antigen processing（ＴＡＰ）等をそれぞれコードする遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子が癌細胞で発現することにより、抗腫瘍免疫が惹起され、ウイルス療法の抗腫瘍効果が増強される。【００４４】
抗血管新生作用タンパク質をコードする遺伝子としては、エンドスタチン（endostatin）、アンジオスタチン（angiostatin）、dominant negative FGF receptor、血小板因子４等が挙げられる。これらのタンパク質が癌細胞で発現することにより、癌組織における血管新生を阻害し、癌の増殖を抑制することができる。【００４５】
癌抑制遺伝子としては、ｐ５３、ＲＢ、ＷＴ１、ＮＦ１、ＮＦ２、ＤＣＣ、ＡＰＣ、プロヒビチン、ｐ１６、ＢＲＣＡ１、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＶＨＬ、ＩＲＦ−１等の遺伝子およびこれらを含んで融合タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。癌細胞では、癌抑制遺伝子が不活化し、細胞の増殖が制限されない状態になっているため、これらの遺伝子を癌細胞に導入することによって、癌細胞の無制限な増殖を抑制することが可能となる。【００４６】
細胞膜融合タンパク質をコードする遺伝子としては、ウイルス表面タンパク質をコードする遺伝子等を用いることができ、このような遺伝子として、例えば、ギボン白血病ウイルス由来の膜融合タンパク質であるGALVあるいはその変異型であるGALV. fus（GALV-FMG）をコードする遺伝子（X, Fu et al., Molecular Therapy Vol. 7, No. 6, June 2003）；麻疹ウイルスタンパク質ＦおよびＨ（ＭＶ−ＦおよびＭＶ−Ｈ）をコードする遺伝子（Bateman A. et al., Cancer Res 60:1492-1497, 2000）；水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質をコードする遺伝子（ラブドウイルスＶＳＶ−Ｇエンベロープ遺伝子；Eslahi NK, Cancer Gene Ther 8:55-62, 2001）；ニューカッスル病ウイルス由来の変異Ｆタンパク質（ＮＤＶ融合タンパクの７回繰り返しモチーフ（ＨＲ３）中の１アミノ酸置換変異（Ｌ２８９Ａ））をコードする遺伝子；パラミクソウイルスＳＶ５の細胞膜融合タンパク質（ＳＶ５Ｆタンパク質）をコードする遺伝子（Gomez-Trevino A. et al., J Gene Med 5:483-492, 2003）等が挙げられる。
ゲノムＤＮＡに細胞膜融合タンパク質をコードする遺伝子を挿入することによって、組換えＨＳＶに感染した細胞が速やかに周囲細胞と融合するため、殺細胞効果が向上することが報告されている。【００４７】
上述の目的タンパク質をコードする遺伝子は、該遺伝子がプロモーターの下流に機能的に結合した構造を有する発現カセットとして、シャトルベクターに挿入される。目的タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターとしては、天然のＨＳＶのゲノムＤＮＡには存在しないプロモーターを用いることが好ましい。かかるプロモーターとしては、上述のＢＡＣプラスミドに挿入するプロモーターが使用可能であるが、中でもＣＭＶプロモーターが好ましい。天然ＨＳＶゲノムには存在しないプロモーター配列を用いることにより、相同組換えによる不測の変異が生じにくく、目的の組換えＨＳＶを得られる確率をさらに高めることができる。【００４８】
本発明で用いられるシャトルベクターには、上述のようにｌｏｘＰ部位およびＦＲＴ部位が組み込まれている。これにより、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを使用してシャトルベクターをＨＳＶゲノムに組み込むことが可能となり、Ｆｌｐ−ＦＲＴシステムを使用してこのＨＳＶゲノムから不要な配列を切り出すことができる。【００４９】
また、本発明に係るシャトルベクターには、シャトルベクターがＨＳＶウイルスに組み込まれたことを確認するために、１種類以上のマーカー遺伝子も挿入しておくことが好ましい。マーカー遺伝子としては、例えば、その遺伝子産物が発光するものや、薬剤耐性遺伝子を用いることができる。【００５０】
マーカー遺伝子は特に限定されず、上述のＢＡＣプラスミドに挿入するマーカー遺伝子と同様のものを適宜選択して用いることができ、ｌａｃＺ遺伝子、ｇａｓＡ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子、ＲＦＰ遺伝子などを用いることができる。なお、シャトルベクターに組み込まれるマーカーは、Ｆｌｐ−ＦＲＴシステムによってＨＳＶゲノムから切り出されず、最終産物にも残存するため、ヒトに有害なタンパク質をコードする遺伝子でないものが好ましい。ヒトに無害であって、マーカー遺伝子としての目的を果たすものとしては、例えば、ｌａｃＺ遺伝子が挙げられる。【００５１】
なお、シャトルベクターに挿入されるマーカー遺伝子と、ＢＡＣプラスミドに挿入されるマーカー遺伝子は異なる性質を有するものが好ましい。これにより、シャトルベクターが挿入されたか否かの確認を明確に行うことができる。【００５２】
これらのマーカー遺伝子は、機能的に結合されたプロモーターを含むマーカー遺伝子発現カセットとしてシャトルベクターに挿入してもよいし、シャトルベクターにはマーカー遺伝子のみ挿入し、ＨＳＶゲノムのプロモーターを利用して発現させてもよい。【００５３】
また、本発明に係る組換えＨＳＶ作製方法に用いられるシャトルベクターは、スタッファ配列を有することが好ましい。スタッファ配列とは、ウイルスの生育に不要な、何の作用も及ぼさないＤＮＡ配列をいう。天然のＨＳＶのゲノムは約１５２ｋｂであり、ゲノムの大きさが約１７０ｋｂ以上になるとウイルスとして形を成さなくなる性質がある。本発明に係る組換えＨＳＶ作製方法の第三工程では、Ｆｌｐ−ＦＲＴシステムによって、ＨＳＶゲノムから不要な部分を切り出す。ここで、Ｆｌｐ−ＦＲＴシステムがうまく機能しなかった場合も、スタッファ配列がなければ、ゲノムの全長は１７０ｋｂ未満であり、ゲノム上に不要な配列を含んだままウイルスが形成される。しかし、スタッファ配列を挿入しておけば、Ｆｌｐ−ＦＲＴシステムが機能しなかった場合はゲノム全長が１７０ｋｂを超えるため、ウイルスが形成されなくなる。従って、本発明で挿入されるスタッファ配列は、好ましくは約５０００塩基長以上、さらに好ましくは約５５００塩基長以上、より好ましくは約５７００塩基長以上、最も好ましくは５７９０塩基長以上である。組換えウイルスの作製においては、組換えがうまく起こったものと起こらなかったものを選別する工程に膨大な時間と労力が費やされるため、スタッファ配列の挿入により、組換えが起こらなかったウイルスを自動的に除去できる本方法は非常に有用である。【００５４】
目的タンパク質をコードする遺伝子の発現カセット、ｌｏｘＰ部位、ＦＲＴ部位、マーカー遺伝子の発現カセットおよびスタッファ配列は、当業者が自体公知またはそれに準ずる方法によって、シャトルベクターに挿入することが可能である。【００５５】
上述のように、シャトルベクターは、ＢＡＣプラスミドを挿入されたＨＳＶゲノムに、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを利用して組み込まれ、得られたＨＳＶゲノムは、Ｆｌｐリコンビナーゼを発現可能なベクターと共に宿主に共感染させる。宿主細胞としては、ＨＳＶが感染可能で、培養できる細胞であれば特に限定されず、腫瘍細胞や、Ｖｅｒｏ細胞等を用いることができ、好ましくはヒト、サル等の哺乳動物由来の細胞が挙げられる。【００５６】
Ｖｅｒｏ細胞中で、Ｆｌｐリコンビナーゼが発現すると、ＨＳＶゲノム上の２箇所のＦＲＴ部位に作用して、両ＦＲＴ部位に挟まれた領域をＨＳＶゲノムから切り出す。これによって、目的の組換えＨＳＶゲノムが得られ、ＨＳＶが産生される。最終的なウイルス株は、例えばlimiting dilution法によって単離することができ、ウイルスＤＮＡを制限酵素で切断してサザンブロット法で解析し、確認することができる。【００５７】
本発明はまた、本発明に係る組換えＨＳＶ作製方法により作製された組換えＨＳＶを含む医薬組成物も提供する。本発明に係る医薬組成物は、上記組換えＨＳＶを有効成分として含有し、各種癌疾患の治療や予防に有用である。【００５８】
本発明に係る医薬組成物を医薬として使用する場合は、投与形態は特に限定されず、経口でも非経口的投与でもよい。哺乳類（例えばヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ウマ、サル、等）、特にヒトに投与する場合の投与量は、症状の程度、患者の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与時期、投与間隔、医薬製剤の性質、調剤、種類、有効成分の種類等によって異なり特に限定されないが、約１０3ｐｆｕないし約１０12ｐｆｕ、好ましくは約１０7ｐｆｕないし約１０10ｐｆｕ、さらに好ましくは約１０8ｐｆｕないし約５×１０9ｐｆｕを、注射投与でそれぞれ1回または数回に分けて投与することができる。【００５９】
本発明に係る医薬組成物は、組換えＨＳＶをそのまま用いてもよいし、自体公知の薬学的に許容できる担体や安定化剤、乳化剤等と混合し、慣用される方法により製剤化してもよい。剤形は特に限定されず、カプセル剤、シロップ剤、吸入剤、注射剤、軟膏剤、眼軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、ローション剤等が挙げられるが、特に好ましくは注射剤である。【００６０】
経口製剤は、賦形剤、さらに必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法により散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤等とする。【００６１】
錠剤・顆粒剤の場合には、糖衣、ゼラチン衣、その他必要により適宜コーティングすることはもちろん差支えない。【００６２】
注射剤の場合、凍結乾燥物とすることも可能で、また、注射剤は腫瘍、静脈、動脈、皮下、筋肉、腹腔、胸腔内に投与することができる。【００６３】
上述の医薬組成物は、各種癌疾患の予防または治療に有用である。組換えＨＳＶを用いたウイルス療法があらゆる種類の固形癌に有効であることがすでに知られており（例えば、上記非特許文献１４を参照）、本発明に係る医薬組成物は、これらの癌すべてに用いることができる。具体的疾患としては、例えば脳腫瘍、頭頸部癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌、膵癌、肺癌、乳癌、皮膚癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、黒色腫、神経芽腫等が挙げられる。【００６４】
以下に示す本発明の参考例、実施例および試験例は例示的なものであり、本発明は以下に示す具体例に制限されるものではない。当業者は、以下に示す実施例に様々な変更を加えて本発明を最大限に実施することができ、かかる変更は本願特許請求の範囲に包含される。
【実施例１】
【００６５】
〔組換えＨＳＶ−１の作製〕
図１に、本発明に係る組換えＨＳＶ作製方法の概略を示す。図１では、目的タンパク質をコードする遺伝子を「transgene」で表している。図１上段は、Ｇ４７ΔウイルスゲノムよりＩＣＰ６遺伝子とｌａｃＺ遺伝子を欠失させＢＡＣ配列を挿入したプラスミドのｌｏｘＰ部位に、ＣＭＶプロモーター下流にtransgeneが機能的に結合した発現カセットと、マーカー遺伝子（ｌａｃＺおよびＫａｎ）と、ｌｏｘＰ部位およびＦＲＴ部位とが挿入されたシャトルベクターを挿入する工程の概略を示している。図１中段および下段は、こうして作製された構築物から、ＦＲＴ部位に挟まれた不要な領域をＦｌｐリコンビナーゼによって切り出す工程の概略を示している。以下、各工程を詳細に説明する。
本実施例では、組換えＨＳＶの骨格としてＧ４７Δウイルスゲノムを利用し、目的タンパク質をコードする遺伝子として、ＩＬ−１８および／またはＢ７．１−Ｉｇの遺伝子を挿入した。
（ＢＡＣプラスミドの調製）
ＲｅｓＧｅｎ社より購入したｐＢｅｌｏｂａｃ１１（７５０７塩基対）に以下の操作を加えた。ｐＢｅｌｏｂａｃ１１プラスミドはｌｏｘＰ部位およびマーカー遺伝子としてクロラムフェニコール（Ｃｍ）耐性遺伝子を有している。ＦＲＴ部位、ＧＦＰ遺伝子およびＧ４７ΔＤＮＡのＩＣＰ６遺伝子を含む配列をｐＢｅｌｏｂａｃ１１プラスミドに挿入することにより、ＢＡＣプラスミド（ｐＢＡＣ−ＩＣＰ６ＥＦ）を作製した。図２にｐＢＡＣ−ＩＣＰ６ＥＦの構造を示す。このｐＢＡＣ−ＩＣＰ６ＥＦプラスミドからは、制限酵素Ａｓｃ１で切断することにより、両端にＩＣＰ６遺伝子の５'末端（約１３００塩基対）および３'末端（約１２００塩基対）を有する配列を得ることができる。そのＩＣＰ６遺伝子間には、ｌｏｘＰ部位とＦＲＴ部位に挟まれるように、ＢＡＣプラスミドの複製部位、Ｃｍ耐性遺伝子およびＧＦＰ遺伝子が配置されている。  【００６６】
（ＢＡＣプラスミドのＧ４７Δゲノムへの挿入）
Ｇ４７ΔＤＮＡとｐＢＡＣ−ＩＣＰ６ＥＦとを大腸菌に共感染させ、相同組換えにより、ＢＡＣプラスミドをＧ４７ΔＤＮＡのＩＣＰ６部位に挿入した。ｐＢＡＣ−ＩＣＰ６ＥＦプラスミドはＩＣＰ６部位の５'および３'末端しか有さないため、Ｇ４７Δ／ＢＡＣ構築物（図１上段。以下「Ｔ−ＢＡＣ」と称する。）はＩＣＰ６部位の中央約１ｋｂを欠損している。Ｇ４７Δは１５３ｋｂであったところ、Ｔ−ＢＡＣは、１５７．７ｋｂであった。相同組換えの結果生じたウイルスプラークを蛍光顕微鏡で観察し、ＧＦＰが発現しているＴ−ＢＡＣを選択した。続いて、electrocompetentな大腸菌ＤＨ１０Ｂに挿入し、Ｃｍ耐性株を選択増殖させた。得られたＴ−ＢＡＣを精製、制限酵素を用いて、構造を確認した。【００６７】
（シャトルベクターの調製）
シャトルベクターは、癌細胞で発現させようとする目的タンパク質の種類に応じて３種類作製した。目的タンパク質をコードする遺伝子を挿入する前のプラスミド（ｐＶｅｃ９；１０５６９ｂｐ）を図３に示す。マーカー遺伝子としてのｌａｃＺ遺伝子およびカナマイシン（Ｋａｎ）耐性遺伝子がそれぞれ発現可能に組み込まれ、ｌｏｘＰ部位およびＦＲＴ部位、スタッファ領域を含む。スタッファ領域としてラムダ配列の一部を利用した。図中右上のＣＭＶプロモーターの下流に位置する制限酵素の認識領域に、目的タンパク質をコードする遺伝子を組み込むことができる。制限酵素の認識領域には、BamHI、AvrII、StuI、NotI、SacIIの制限酵素部位を含み、多くの遺伝子を組み込むことが可能なように工夫されている。【００６８】
図４に、目的タンパク質としてｍＩＬ−１８をコードする遺伝子を組み込んだシャトルベクターを、図５に、目的タンパク質として、Ｂ７．１−Ｉｇを組み込んだシャトルベクターを、図６に、ｍＩＬ−１８とＢ７．１−Ｉｇの融合タンパク質をコードする遺伝子を挿入したシャトルベクターを示す。複数の遺伝子を同時に発現させるために、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）のinternal ribosomal entry site（ＩＲＥＳ）を使用した。  【００６９】
（シャトルベクターのＴ−ＢＡＣへの挿入）
続いてＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムを利用して、シャトルベクターを、Ｔ−ＢＡＣのｌｏｘＰ部位に挿入した（図１上段および中段を参照）。まず、目的の遺伝子を組み込んだシャトルベクター１５０ｎｇとＴ−ＢＡＣ１５００ｎｇおよびNewEngland社より購入したＣｒｅリコンビナーゼを１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに混じて３０分間３７℃に置いた。この課程のみで反応が終了し、このまま型通り大腸菌に形質転換した。本方法により、大腸菌内での組み換えという手間を要し、かつ複雑な段階が省略可能となった。この溶液中での反応という方法は、迅速性のみならず、間違ったウイルスを選択するリスクの軽減にも寄与していると考えられる。【００７０】
得られた組換え体から、ＬＢプレート上で、Ｋａｎ耐性およびＣｍ耐性によって、目的産物を選択した。約８０％に目的の組換えが生じていたことが確認された。  【００７１】
（不要配列の除去）
シャトルベクターが挿入されたＴ−ＢＡＣを、ＦＬＰｅを発現するプラスミド（pCAGGSFlpeIRESpuro）と共に、Ｖｅｒｏ細胞に共感染させ、ＦＲＴ部位に挟まれた領域（１４．６ｋｂ）を切り出した（図１中段および下段を参照）。ＦＬＰｅは、Saccharomyces cerevisiaeinに由来する、in vitroで開発された部位特異的リコンビナーゼである。【００７２】
Ｖｅｒｏ細胞に感染し、複製されたウイルスプラークを蛍光顕微鏡で観察することにより、ＧＦＰが発現していないプラークを目的プラークとして選択した。Ｆｌｐ−ＦＲＴシステムを用いた切り出しにより、組換えＨＳＶ−１ゲノムから、ＢＡＣ配列は完全に除去される。これは、免疫原性および毒性を有するＧＦＰ遺伝子はウイルスゲノムから除去されることを意味する。この段階で回収されたウイルスの中で、ＧＦＰを発現していない目的のウイルスは９９％以上を占めていた。さらに、複製させて得られたウイルスを再度Ｖｅｒｏ細胞に感染させ、ＧＦＰが発現していないプラークを選択していくという、限界希釈法により精製を２回施行し、目的のウイルスを得た。このウイルスが目的のウイルスであるかどうかについては、制限酵素を使用してサザンブロッティングにより配列を確認した。  【００７３】
（ウイルスの複製）
６ウェルのプレートに各ウェル３×１０5個ずつ細胞を播種したものを２つ用意し、一方に、ＭＯＩ＝０．０１でウイルスを感染させた。感染後、３７．０℃で４８時間静置した後、細胞を採取し、凍結−溶解を３回繰り返してライゼートを得た。こうして増えたウイルスの力価をＶｅｒｏ細胞中で測定した。【００７４】
また、６ウェルのプレートに各ウェル１×１０6個ずつ細胞を播種し、ＭＯＩ＝１でウイルスを感染させ２４時間静置した後、ガンシクロビル（２００ｎｇ／ｍｌ）存在下で、３９．５℃、４８時間インキュベートし、ＥＬＩＳＡアッセイおよびＢ７染色を行った。ＩＬ−１８のＥＬＩＳＡの測定にはＭＢＬ社のキットを用いた。【００７５】
これらの結果を表１に示す。【００７６】
【表１】
2005103237.tif 000002
Ｇ４７Δemptyは、目的タンパク質をコードする遺伝子を含まない、図３に示されるプラスミドにより産生されたウイルスを意味する。【００７７】
ウイルスの増殖能は、Ｇ４７Δに比較すると多少劣るものの、ウイルス療法に使用するために十分な増殖能が確認された。【００７８】
Ｇ４７ΔゲノムにＩＬ−１８およびＢ７．１−Ｉｇ遺伝子を組み込んで作製したウイルスでは、両方のタンパク質が同時に発現し、いずれか一方の遺伝子を組み込んだウイルスでは、それぞれのタンパク質が発現しているのが確認された。
【実施例２】
【００７９】
〔殺細胞効果の確認〕
Ｇ４７Δ／ＩＬ１８、Ｇ４７Δ／Ｂ７、Ｇ４７Δ／ＩＬ１８／Ｂ７のin vitroにおける様々な癌細胞に対する殺細胞効果を、Ｇ４７Δemptyと比較した。【００８０】
図７に、マウス神経芽腫の細胞株（Ｎｅｕｒｏ２ａ）に対する試験結果を示す。低ＭＯＩ（ＭＯＩ＝０．１）で、Ｇ４７Δ／ＩＬ１８、Ｇ４７Δ／Ｂ７、Ｇ４７Δ／ＩＬ１８／Ｂ７のいずれも、Ｇ４７ΔまたはＧ４７Δemptyと同等の速さの殺細胞効果を示した。【００８１】
図８に、マウス前立腺癌の細胞株（ＴＲＡＭＰ）に対する試験結果を示す。低ＭＯＩ（ＭＯＩ＝０．１および０．０１）で、Ｇ４７Δ／ＩＬ１８、Ｇ４７Δ／Ｂ７、Ｇ４７Δ／ＩＬ１８／Ｂ７のいずれも、Ｇ４７ΔまたはＧ４７Δemptyと同等の速さの殺細胞効果を示した。【００８２】
以上から、目的タンパク質を発現させるように改変しても、Ｇ４７Δ細胞に匹敵する細胞毒性を維持することが確認された。【００８３】
また、Ｎｅｕｒｏ２ａ、Ｐｒ１４−２（マウス前立腺癌細胞株）およびＴＲＡＭＰにおける、ＩＬ−１８に対するＥＬＩＳＡアッセイを行った。結果を表２に示す。【００８４】
【表２】
2005103237.tif 000003
いずれのウイルスも、５００−８００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１８を発現していることを確認した。
【実施例３】
【００８５】
〔抗腫瘍効果の確認〕
上述のウイルスを用いて、マウスの腫瘍モデルに対する抗腫瘍効果を試験した。【００８６】
５×１０6個のＴＲＡＭＰ−Ｃ２マウス前立腺癌細胞を、同系のマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６；雄）に、皮下注射した。７日後、マウスをランダムにグループ分けし、この日を０日として、それぞれのウイルスによる治療を行った。それぞれのグループのマウスに、０日目および３日目に、５×１０6ｐｆｕ／２０μｌのＧ４７Δ、Ｇ４７Δempty、Ｇ４７Δ／ＩＬ１８、Ｇ４７Δ／Ｂ７、Ｇ４７Δ／ＩＬ１８／Ｂ７を、腫瘍組織内に注射投与した。【００８７】
結果を図９に示す。Ｇ４７Δ／ＩＬ１８／Ｂ７を投与したグループは、ＴＲＡＭＰ−Ｃ２癌の体積が顕著に減少した。ｔ検定にて統計的有意差を調べた。Ｇ４７Δ／ＩＬ１８／Ｂ７を投与したグループは、Ｇ４７Δ／ＩＬ１８を投与したグループと比較して、１９日目にＴＲＡＭＰ−Ｃ２癌の体積が顕著に減少していることが有意水準５％で結論された。同様に、Ｇ４７Δ／ＩＬ１８／Ｂ７を投与したグループは、Ｇ４７Δ／Ｂ７を投与したグループと比較して、２１日目にＴＲＡＭＰ−Ｃ２癌の体積が顕著に減少していることが有意水準５％で結論された。【００８８】
５×１０6個のＮｅｕｒｏ２ａ細胞１００μＬを、Ａ／Ｊマウスの両側に注射投与した。ＴＲＡＭＰ−Ｃ２モデルと同様に、５×１０5ｐｆｕ／２０μｌのＧ４７Δ、Ｇ４７Δempty、Ｇ４７Δ／ＩＬ１８、Ｇ４７Δ／Ｂ７、Ｇ４７Δ／ＩＬ１８／Ｂ７を、腫瘍組織内に注射投与した。腫瘍抑制効果は、ＴＲＡＭＰ−Ｃ２の結果と同様であった。
【実施例４】
【００８９】
〔ＩＬ−１２の発現〕
２４ウェルのプレートにＶｅｒｏ細胞を１×１０5個ずつ播種して一晩培養し、Ｔ−ＢＡＣを用いて作製したＧ４７ΔのＩＣＰ６遺伝子が欠失したウイルス（Ｔ−ｅｍｐｔｙ）とＧ４７ΔのＩＣＰ６遺伝子部位にマウスＩＬ−１２遺伝子を挿入したウイルス（Ｔ−ｍｆＩＬ１２）のそれぞれ３クローンについて、各２ウェルずつＭＯＩ＝２で１時間感染させた。３７℃と３９．５℃にて１８時間培養後にその培養液を回収し、マウスＩＬ−１２の含有量をＥＬＩＳＡアッセイにて測定した。Ｔ−ｅｍｐｔｙの感染ではまったくＩＬ−１２の発現は見られなかったが、Ｔ−ｍｆＩＬ１２の感染では、強力なＩＬ−１２の発現が見られた。特にウイルス複製の盛んな３７℃では、３９．５℃に比較して高い発現量が認められた。結果を表３に示す。
【表３】
2005103237.tif 000004
【実施例５】
【００９０】
〔マウス皮下腫瘍モデルにおけるT-mfIL12の抗腫瘍効果〕
左右両側の腹部に直径約５ｍｍのＮｅｕｒｏ２ａ皮下腫瘍を有するＡ／Ｊマウスを用い、Ｇ４７ΔのＩＣＰ６遺伝子が欠失したウイルス（T-empty）、Ｇ４７ΔのＩＣＰ６遺伝子部位にマウスＩＬ−１２遺伝子を挿入したウイルス（T-mfIL12）および対照として１０％グリセロールを含むＰＢＳ（Mock）を左側の腫瘍組織内にのみ、それぞれ０日目と３日目の２回、注射投与した（各５?６匹ずつ）。腫瘍組織を測定し、長さ×幅×高さ（ｍｍ）により体積を求めた。
結果を図に示す。左側の腫瘍に関しては、Mock投与群（◆）に比べ、T-empty投与群（■）およびT-mfIL12投与群（▲）は腫瘍増大が有意に抑制された。更にT-mfIL12投与群は、T-empty投与群に比べ有意に強い抗腫瘍効果を示した。また右側の遠隔腫瘍に関しては、T-empty投与群はMock投与群に比べ有意な腫瘍増大抑制効果を示さなかったが、T-mfIL12投与群は、Mock投与群、T-empty投与群いずれに比べても有意な腫瘍増大抑制を示した。
この結果から、ＩＬ−１２遺伝子を組み込んだ組換え単純ヘルペスウイルスは、transgeneを組み込んでいない組換え単純ヘルペスウイルスに比べ抗腫瘍効果が増強されることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】本発明に係る組換えＨＳＶ−１の作製方法の概要を示す説明図である。
【図２】本発明に係る組換えＨＳＶ−１の作製に用いられるＢＡＣプラスミドを示す。
【図３】本発明で用いられるシャトルベクターを示す。
【図４】ＩＬ−１８遺伝子を組み込んだシャトルベクターを示す。
【図５】Ｂ７−１−Ｉｇ遺伝子を組み込んだシャトルベクターを示す。
【図６】ＩＬ−１８遺伝子およびＢ７−１−Ｉｇ遺伝子を組み込んだシャトルベクターを示す。
【図７】Ｎｅｕｒｏ２ａに対する殺細胞効果の試験結果を示す。
【図８】ＴＲＡＭＰに対する殺細胞効果の試験結果を示す。
【図９】ＩＬ−１８および／またはＢ７を発現するＧ２７Δのマウス腫瘍モデルに対する抗腫瘍効果の試験結果を示す。
【図１０】ＩＬ−１２を発現するＧ２７Δのマウス腫瘍モデルに対する抗腫瘍効果の試験結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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