(57)【要約】  本発明は、試験物質が、アンジオポエチン関連増殖因子の発現及び／又は機能を亢進するか否かを分析する工程を含む、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬をスクリーニングする方法に関する。また、アンジオポエチン関連増殖因子の発現亢進剤及び／又は機能亢進剤をスクリーニングする方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験物質が、アンジオポエチン関連増殖因子の発現及び／又は機能を亢進するか否かを分析する工程を含む、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬をスクリーニングする方法。
【請求項２】
分析する工程が、
ｉ）細胞に試験物質を接触させる工程、及び
ii）前記細胞における内在性のアンジオポエチン関連増殖因子のタンパク質量又は遺伝子量を測定し、試験物質依存的な内在性のアンジオポエチン関連増殖因子のタンパク質量又は遺伝子量の変化を分析する工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アンジオポエチン関連増殖因子のタンパク質量又は遺伝子量の測定が、アンジオポエチン関連増殖因子のタンパク質量の測定である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
アンジオポエチン関連増殖因子のタンパク質量又は遺伝子量の測定が、アンジオポエチン関連増殖因子の遺伝子量の測定である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
分析する工程が、
ｉ）配列番号１で表される塩基配列における第６７２番〜第５５７２番の塩基からなる配列において、１〜１０個の塩基が欠失、置換、及び／若しくは挿入された配列を含み、且つアンジオポエチン関連増殖因子のプロモーター活性を有するＤＮＡ、又は配列番号１で表される塩基配列における第６７２番〜第５５７２番の塩基からなる配列との同一性が９０％以上である塩基配列を含み、且つアンジオポエチン関連増殖因子のプロモーター活性を有するＤＮＡの下流にレポーター遺伝子が融合されたベクターにより形質転換された細胞に、試験物質を接触させる工程、及び
ii）レポーター遺伝子の発現を測定し、試験物質依存的な前記発現の変化を分析する工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
分析する工程が、
ｉ）細胞に試験物質を接触させる工程、及び
ii）マイトジェン活性化プロテインキナーゼのリン酸化を測定し、試験物質依存的な前記リン酸化の変化を分析する工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
分析する工程が、
ｉ）細胞に、試験物質及びアンジオポエチン関連増殖因子を接触させる工程、及び
ii）アンジオポエチン関連増殖因子の細胞への結合量を測定し、試験物質依存的な前記結合量の変化を分析する工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
試験物質が、アンジオポエチン関連増殖因子の発現及び／又は機能を亢進するか否かを分析する工程、及び
前記工程で選択した試験物質の、体重変動、血糖値、及び／又は血中脂質含量に与える作用を分析する工程
を含む、アンジオポエチン関連増殖因子の発現亢進剤及び／又は機能亢進剤をスクリーニングする方法。
【請求項９】
アンジオポエチン関連増殖因子の発現及び／又は機能を亢進するか否かを分析する工程が、
ｉ）細胞に試験物質を接触させる工程、及び
ii）前記細胞における内在性のアンジオポエチン関連増殖因子のタンパク質量又は遺伝子量を測定し、試験物質依存的な内在性のアンジオポエチン関連増殖因子のタンパク質量又は遺伝子量の変化を分析する工程
を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
アンジオポエチン関連増殖因子のタンパク質量又は遺伝子量の測定が、アンジオポエチン関連増殖因子のタンパク質量の測定である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
アンジオポエチン関連増殖因子のタンパク質量又は遺伝子量の測定が、アンジオポエチン関連増殖因子の遺伝子量の測定である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
アンジオポエチン関連増殖因子の発現及び／又は機能を亢進するか否かを分析する工程が、
ｉ）配列番号１で表される塩基配列における第６７２番〜第５５７２番の塩基からなる配列において、１〜１０個の塩基が欠失、置換、及び／若しくは挿入された配列を含み、且つアンジオポエチン関連増殖因子のプロモーター活性を有するＤＮＡ、又は配列番号１で表される塩基配列における第６７２番〜第５５７２番の塩基からなる配列との同一性が９０％以上である塩基配列を含み、且つアンジオポエチン関連増殖因子のプロモーター活性を有するＤＮＡの下流にレポーター遺伝子が融合されたベクターにより形質転換された細胞に、試験物質を接触させる工程、及び
ii）レポーター遺伝子の発現を測定し、試験物質依存的な前記発現の変化を分析する工程
を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
アンジオポエチン関連増殖因子の発現及び／又は機能を亢進するか否かを分析する工程が、
ｉ）細胞に試験物質を接触させる工程、
ii）マイトジェン活性化プロテインキナーゼのリン酸化を測定し、試験物質依存的な前記リン酸化の変化を分析する工程
を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
アンジオポエチン関連増殖因子の発現及び／又は機能を亢進するか否かを分析する工程が、
ｉ）細胞に、試験物質及びアンジオポエチン関連増殖因子を接触させる工程、及び
ii）アンジオポエチン関連増殖因子の細胞への結合量を測定し、試験物質依存的な前記結合量の変化を分析する工程
を含む、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗肥満薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満の有害性は広く知られているにもかかわらず、近年肥満が顕著に増加している。肥満つまり脂肪組織の過剰蓄積が多彩な疾患の原因となっていることは周知の事実であり、疾患としての肥満症を治療対象にすることが提唱されている。肥満を原因の一つとして発症する疾患として、例えば、腰痛、膝関節痛、及び変形性関節症がある。これらの整形外科学的疾患は肥満による体重増加が直接の原因となりうる。肥満に伴う脂肪の過剰蓄積は、糖尿病、高脂血症、高血圧、又は動脈硬化性疾患の原因となっている。特に内臓脂肪の蓄積がこれらの疾患の発症に関与していることが明らかにされている（非特許文献１）。【０００３】
基本的な肥満改善方法としては、運動療法と食事療法があるが、どちらも継続的な実施が困難である。また、運動又は食事療法以外の改善方法としては医薬品の使用があり、現時点では、世界的に見ると、シブトラミンとオルリスタットが主に使用されている。しかし、それらの効果は弱く、どちらも副作用の問題がある。日本ではマジンドールのみが認可されているが、適用が高度肥満者に限定されており、投与期間も限定されている（非特許文献２）。【０００４】
社会の近代化に伴い、日本のみならず世界的に糖尿病患者は急増している。特に、患者数の多いII型糖尿病は、肥満や脂肪の過剰蓄積が発症に関与していることが知られている。II型糖尿病の治療としては、肥満症と同様に運動療法と食事療法があるが、継続的な実施が困難であり、医薬品が使用されている。重度の糖尿病患者ではインスリン療法が行なわれている。しかし、インスリン療法には低血糖の副作用の危険性が常にある。経口血糖降下薬として、チアゾリジン系薬剤又はスルホニルウレア（ＳＵ）薬等が多く使用されている。しかしながら、チアゾリジン系薬剤には、肝障害・浮腫・心不全という副作用があり、ＳＵ薬には肥満を助長する副作用が危惧され、安全で、体重増加を伴わないインスリン抵抗性改善薬が強く求められている（非特許文献３）。【０００５】
肥満の糖尿病患者の内臓脂肪では脂肪細胞の肥大化が観察される。この肥大化した脂肪細胞からは、インスリン抵抗性を惹起するようなアディポサイトカイン類が産生及び分泌され、近傍の脂肪細胞及び／又は筋細胞に作用して、インスリン抵抗性を引き起こしていると考えられる。このように、脂肪組織は、糖尿病病態において、インスリン抵抗性を増強する方向に関わる組織へと変化する（非特許文献４及び５）。【０００６】
肥満や糖尿病の原因となる脂肪組織の蓄積に関与する因子としては、レプチンがよく知られている。レプチンは、体重増加抑制ホルモンであり、レプチンを欠失することで食欲が亢進し、エネルギー消費が減弱し肥満となることが知られている。このような脂肪組織の蓄積、及び脂肪細胞の肥大化に関与する因子の発見は、肥満症、糖尿病、又は高脂血症等の疾患の治療薬開発に非常に有用である（非特許文献６）。【０００７】
アンジオポエチン関連増殖因子（ＡＧＦ）は、Ｎ末端側にコイルドコイル（Coiled-coil）ドメインを、Ｃ末端側にフィブリノーゲン様（Fibrinogen-like）ドメインを持つ分泌タンパク質である。ＡＧＦは、特許文献１で報告されたＮＬ８と同一であり、ＮＬ８をＣＨＯ細胞に安定発現させて、ヌードマウスに皮下移植すると、ＣＨＯが腫瘍形成能を持つようになることが報告されている。また、ＡＧＦをＫ１４プロモーターを用いて表皮細胞に強制発現させたトランスジェニック（Ｔｇ）マウス等を用いて、ＡＧＦに、血管新生活性、表皮細胞増殖活性、軟骨細胞増殖活性、創傷治癒促進活性、及び組織再生活性があることが示されている（特許文献１、非特許文献７）。更に、特許文献３〜１３には、本明細書のヒトＡＧＦと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドが開示されている。発現分布解析（特許文献３及び特許文献４）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）刺激による増殖阻害活性（特許文献４）、増殖因子処理したヒト臍帯静脈血管内皮細胞ＨＵＶＥＣにおける過剰発現（特許文献５及び特許文献６）から、ＡＧＦと同一のポリペプチドが血管形成、血管新生の促進又は阻害に関することが記載され、前記ポリペプチドによって処置される心臓血管、内皮、及び血管新生の疾患として多数の疾患が列挙されている（特許文献３〜９）。また、特許文献１０〜１３には、ＡＧＦを上皮細胞等の増殖や創傷治癒に用いることが示唆されている。【０００８】
【非特許文献１】「メタボリズム（Metabolism）」，(米国)，１９８７年，３６巻，ｐ.５４−５９
【非特許文献２】「日本臨床」，２００３年，６１巻，増刊号６，肥満症，ｐ.６４９−６５４
【非特許文献３】「日本臨床」，２００２年，６０巻，増刊号９，新時代の糖尿病学３，ｐ.３１０−３３１
【非特許文献４】「医学のあゆみ」,２０００年，１９２巻，ｐ.５１３−５１８
【非特許文献５】「医学のあゆみ」,２０００年，１９２巻，ｐ.５４１−５４５
【非特許文献６】「トレンズ・イン・モレキュラー・メディスン（Trends inMolecular Medicine）」，（オランダ），２００２年，８巻，９号，ｐ．４４２−４４７
【非特許文献７】「プロシディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイティッド・ステート・オブ・アメリカ（Proceedings of the national academy of sciences of the United Statesof America）」，（米国），２００３年，１００巻，ｐ．９４９４−９４９９
【特許文献１】国際公開第99/15653号パンフレット
【特許文献２】国際公開第03/083114号パンフレット
【特許文献３】国際公開第00/32221号パンフレット
【特許文献４】国際公開第00/53753号パンフレット
【特許文献５】国際公開第02/00690号パンフレット
【特許文献６】国際公開第02/08284号パンフレット
【特許文献７】米国特許出願公開第2004/0043927号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第2003/0105012号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第2003/0105011号明細書
【特許文献１０】米国特許第6350450号明細書
【特許文献１１】米国特許第6413770号明細書
【特許文献１２】特開2000-300263号公報
【特許文献１３】米国特許第6420542号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬の新規スクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは鋭意検討した結果、ＡＧＦノックアウト（ＫＯ）マウス及びＡＧＦトランスジェニック（Ｔｇ）マウスの作製及び解析により、ＡＧＦが抗肥満、抗糖尿、及び抗高脂血症の作用を有することを明らかにした。すなわち、ＡＧＦ  ＫＯマウスが顕著な肥満を示し、肥満に伴う脂肪組織の重量が増加、脂肪細胞が肥大化、肥満で増加することが知られている骨格筋及び肝臓組織中のトリグリセリド量が増加すること、抗インスリン血症となり、耐糖能が悪化することを見出した（参考例４〜８）。一方、ＡＧＦ  Ｔｇマウス（ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス；全身にＡＧＦを強制発現したマウス）は体重増加が抑制され、脂肪組織の重量増加が抑制され、脂肪細胞の肥大化は抑制され、骨格筋及び肝臓組織中トリグリセリド量は減少されること、更には、インスリン感受性の向上、並びに脂質代謝及び耐糖能が改善されることを見出した（参考例４〜７及び参考例１５〜１６）。更に、ＡＧＦ発現アデノウイルス投与マウスにおいて、体重増加が抑制され、且つ耐糖能が改善されたこと（参考例１４及び参考例１９）、別のＡＧＦ  Ｔｇマウス（Ｋ１４−ＡＧＦ  Ｔｇマウス；表皮にＡＧＦを強制発現したマウス）において、抗肥満作用、脂肪組織減少作用、インスリン感受性亢進作用を有すること（参考例１７及び参考例１８）を見出した。【００１１】
これらの知見は、ＡＧＦが抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬の有効成分となることを明らかにしたばかりでなく、ＡＧＦの発現亢進剤並びにＡＧＦ機能亢進剤（すなわち、ＡＧＦアゴニスト活性を有する物質、及びＡＧＦと細胞との結合促進剤）が、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬の有効成分として有用であることを示している。【００１２】
本発明者らは、ＡＧＦのタンパク質量を測定できるＥＬＩＳＡ（enzyme-linked
immunosorbent assay）系を構築し（実施例３、４、７、１０）、ＡＧＦ遺伝子量を測定する定量ＰＣＲ法を確立した（実施例１３）。また、マウスＡＧＦプロモーター領域のＤＮＡを取得して、そのＤＮＡを利用したＡＧＦ発現亢進剤をスクリーニングする方法を構築した（実施例１５）。更に、ＡＧＦによりマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のリン酸化が亢進することを見出し、ＭＡＰＫのリン酸化を分析することによるＡＧＦ機能亢進剤のスクリーニング方法を構築した（実施例１６）。加えて、ＡＧＦは細胞表面に結合することを見出し、ＡＧＦの細胞への結合を分析することによるＡＧＦ機能亢進剤のスクリーニング方法を構築した（実施例１７）。すなわち、本発明者らは、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬の新規スクリーニング方法を構築し（実施例３、４、７、１０、１３、及び１５〜１７）、提供して本発明を完成させた。【００１３】
すなわち、本発明は、
［１］試験物質が、アンジオポエチン関連増殖因子の発現及び／又は機能を亢進するか否かを分析する工程を含む、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬をスクリーニングする方法；
［２］分析する工程が、
ｉ）細胞に試験物質を接触させる工程、及び
ii）前記細胞における内在性のアンジオポエチン関連増殖因子のタンパク質量又は遺伝子量を測定し、試験物質依存的な内在性のアンジオポエチン関連増殖因子のタンパク質量又は遺伝子量の変化を分析する工程
を含む、［１］の方法；
［３］アンジオポエチン関連増殖因子のタンパク質量又は遺伝子量の測定が、アンジオポエチン関連増殖因子のタンパク質量の測定である、［２］の方法；
［４］アンジオポエチン関連増殖因子のタンパク質量又は遺伝子量の測定が、アンジオポエチン関連増殖因子の遺伝子量の測定である、［２］の方法；
［５］分析する工程が、
ｉ）配列番号１で表される塩基配列における第６７２番〜第５５７２番の塩基からなる配列において、１〜１０個の塩基が欠失、置換、及び／若しくは挿入された配列を含み、且つアンジオポエチン関連増殖因子のプロモーター活性を有するＤＮＡ、又は配列番号１で表される塩基配列における第６７２番〜第５５７２番の塩基からなる配列との同一性が９０％以上である塩基配列を含み、且つアンジオポエチン関連増殖因子のプロモーター活性を有するＤＮＡの下流にレポーター遺伝子が融合されたベクターにより形質転換された細胞に、試験物質を接触させる工程、及び
ii）レポーター遺伝子の発現を測定し、試験物質依存的な前記発現の変化を分析する工程
を含む、［１］の方法；
［６］分析する工程が、
ｉ）細胞に試験物質を接触させる工程、及び
ii）マイトジェン活性化プロテインキナーゼのリン酸化を測定し、試験物質依存的な前記リン酸化の変化を分析する工程
を含む、［１］の方法；
［７］分析する工程が、
ｉ）細胞に、試験物質及びアンジオポエチン関連増殖因子を接触させる工程、及び
ii）アンジオポエチン関連増殖因子の細胞への結合量を測定し、試験物質依存的な前記結合量の変化を分析する工程
を含む、［１］の方法；
［８］試験物質が、アンジオポエチン関連増殖因子の発現及び／又は機能を亢進するか否かを分析する工程、及び
前記工程で選択した試験物質の、体重変動、血糖値、及び／又は血中脂質含量に与える作用を分析する工程
を含む、アンジオポエチン関連増殖因子の発現亢進剤及び／又は機能亢進剤をスクリーニングする方法；
［９］アンジオポエチン関連増殖因子の発現及び／又は機能を亢進するか否かを分析する工程が、
ｉ）細胞に試験物質を接触させる工程、及び
ii）前記細胞における内在性のアンジオポエチン関連増殖因子のタンパク質量又は遺伝子量を測定し、試験物質依存的な内在性のアンジオポエチン関連増殖因子のタンパク質量又は遺伝子量の変化を分析する工程
を含む、［８］の方法；
［１０］アンジオポエチン関連増殖因子のタンパク質量又は遺伝子量の測定が、アンジオポエチン関連増殖因子のタンパク質量の測定である、［９］の方法；
［１１］アンジオポエチン関連増殖因子のタンパク質量又は遺伝子量の測定が、アンジオポエチン関連増殖因子の遺伝子量の測定である、［９］の方法；
［１２］アンジオポエチン関連増殖因子の発現及び／又は機能を亢進するか否かを分析する工程が、
ｉ）配列番号１で表される塩基配列における第６７２番〜第５５７２番の塩基からなる配列において、１〜１０個の塩基が欠失、置換、及び／若しくは挿入された配列を含み、且つアンジオポエチン関連増殖因子のプロモーター活性を有するＤＮＡ、又は配列番号１で表される塩基配列における第６７２番〜第５５７２番の塩基からなる配列との同一性が９０％以上である塩基配列を含み、且つアンジオポエチン関連増殖因子のプロモーター活性を有するＤＮＡの下流にレポーター遺伝子が融合されたベクターにより形質転換された細胞に、試験物質を接触させる工程、及び
ii）レポーター遺伝子の発現を測定し、試験物質依存的な前記発現の変化を分析する工程
を含む、［８］の方法；
［１３］アンジオポエチン関連増殖因子の発現及び／又は機能を亢進するか否かを分析する工程が、
ｉ）細胞に試験物質を接触させる工程、
ii）マイトジェン活性化プロテインキナーゼのリン酸化を測定し、試験物質依存的な前記リン酸化の変化を分析する工程
を含む、［８］の方法；並びに
［１４］アンジオポエチン関連増殖因子の発現及び／又は機能を亢進するか否かを分析する工程が、
ｉ）細胞に、試験物質及びアンジオポエチン関連増殖因子を接触させる工程、及び
ii）アンジオポエチン関連増殖因子の細胞への結合量を測定し、試験物質依存的な前記結合量の変化を分析する工程
を含む、［８］の方法
に関する。【００１４】
本願優先日後に公開された国際公開第04/108920号パンフレットには、ＡＧＦに抗肥満、糖尿病及び／又は高脂血症治療効果があることが開示されている。また、本願優先日後に出版されたNature
Medicine, 11(4), 400-408, 2005には、ＡＧＦと肥満及びインスリン抵抗性との関係が開示されている。しかしながら、本願優先日においては、特許文献３〜９にＡＧＦが関与するとして多数列挙された疾患の中に糖尿病が含まれるものの、ＡＧＦと糖尿病との関係について裏づけは示されておらず、ＡＧＦと抗肥満及び／又は高脂血症との関係は全く知られていなかった。【００１５】
本明細書における「抗肥満薬」には、肥満患者の治療のために使用する薬剤と、肥満傾向にある対象に予防的に使用する薬剤との両方が含まれる。本明細書における「糖尿病治療薬」には、糖尿病である患者の治療のために使用する薬剤と、糖尿病傾向にある対象に予防的に使用する薬剤との両方が含まれる。本明細書における「高脂血症治療薬」には、高脂血症である患者の治療のために使用する薬剤と、高脂血症傾向にある対象に予防的に使用する薬剤との両方が含まれる。【００１６】
本明細書における「スクリーニング」とは、多数の試験物質の中から目的の活性を有する物質を篩い分けること、及び、ある試験物質について、その物質が目的の性質を有する物質であるか否かを検出することの両方を含む。【００１７】
本明細書における「ＡＧＦの発現亢進剤」とは、ＡＧＦのタンパク質量又は遺伝子の量を亢進させる物質をいう。「ＡＧＦの機能亢進剤」とは、ＡＧＦの機能を亢進させる物質をいう。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のスクリーニング方法によれば、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬として有用な物質をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】プラスミドｐＢＳ−ｌｏｘＰ−ｌｏｘ７１−ｍＡＧＦ−βｇｅｏの構造を模式的に示す図面である。記号「ｐｒｏ．」及び「ｐｒｉ．」は、それぞれ、プロモーター及びプライマーを意味する。
【図２】ＡＧＦ  ＫＯマウスの体重変化を示すグラフである。横軸は週齢（週）を、縦軸は体重（ｇ）を示す。また、記号「ＷＴ」、「ＨＴＲ」、及び「ＨＭ」は、それぞれ、ＷＴマウス、ヘテロＫＯマウス、及びホモＫＯマウスを意味する。
【図３】ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス（標準食）の生殖器脂肪（白色脂肪組織）重量変化を示すグラフである。縦軸は、白色脂肪組織重量（ｇ）／体重（ｇ）を示す。また、記号「ＷＴ」及び「Ｔｇ」は、それぞれ、ＷＴマウス及びＴｇマウスを意味する。
【図４】ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス（高脂肪食負荷）の生殖器脂肪（白色脂肪組織）重量変化を示すグラフである。縦軸は、白色脂肪組織重量（ｇ）／体重（ｇ）を示す。また、記号「ＷＴ」及び「Ｔｇ」は、それぞれ、ＷＴマウス及びＴｇマウスを意味する。
【図５】ＡＧＦ  ＫＯマウスの生殖器脂肪（白色脂肪組織）重量変化（白色脂肪組織重量）を示すグラフである。縦軸は、白色脂肪組織重量（ｇ）を示す。また、記号「ＷＴ」、「ＨＴＲ」、及び「ＨＭ」は、それぞれ、ＷＴマウス、ＡＧＦヘテロＫＯマウス、及びＡＧＦホモＫＯマウスを意味する。
【図６】ＡＧＦ  ＫＯマウスの生殖器脂肪（白色脂肪組織）重量変化（白色脂肪組織重量／体重）を示すグラフである。縦軸は、白色脂肪組織重量（ｇ）／体重（ｇ）を示す。また、記号「ＷＴ」、「ＨＴＲ」、及び「ＨＭ」は、それぞれ、ＷＴマウス、ＡＧＦヘテロＫＯマウス、及びＡＧＦホモＫＯマウスを意味する。
【図７】ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの脂肪細胞の形態を示す図面である。また、記号「ＴＧ」及び「ＮＴＧ」は、それぞれ、Ｔｇマウス及びＷＴマウスを意味する。
【図８】ＡＧＦホモＫＯマウスの脂肪細胞の形態を示す図面である。
【図９】リターメイトＷＴマウスの脂肪細胞の形態を示す図面である。
【図１０】ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの組織（肝臓）中ＴＧ含量を示すグラフである。横軸は高脂肪食負荷（箇月間）を、縦軸はＴＧ含量（ｍｇ／ｇ組織）を示す。また、記号「ＷＴ」及び「Ｔｇ」は、それぞれ、ＷＴマウス及びＴｇマウスを意味する。
【図１１】ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの組織（骨格筋）中ＴＧ含量を示すグラフである。横軸は高脂肪食負荷（箇月間）を、縦軸はＴＧ含量（ｍｇ／ｇ組織）を示す。また、記号「ＷＴ」及び「Ｔｇ」は、それぞれ、ＷＴマウス及びＴｇマウスを意味する。
【図１２】ＡＧＦ  ＫＯマウスの組織中ＴＧ含量を示すグラフである。縦軸はＴＧ含量（ｍｇ／ｇ組織）を示す。また、横軸の記号「Ｌ」及び「ＳＭ」は、それぞれ、肝臓及び骨格筋を意味し、記号「ＷＴ」、「ＨＴＲ」、及び「ＨＭ」は、それぞれ、ＷＴマウス、ヘテロＫＯマウス、及びホモＫＯマウスを意味する。
【図１３】ＡＧＦ  ＫＯマウスの糖負荷試験の結果（血糖値）を示すグラフである。横軸は時間（分）を、縦軸は血糖値（ｍｇ／ｄＬ）を示す。また、記号「ＷＴ」及び「ＨＭ」は、それぞれ、ＷＴマウス及びホモＫＯマウスを意味する。
【図１４】ＡＧＦ  ＫＯマウスの糖負荷試験の結果（血漿インスリン）を示すグラフである。横軸は時間（分）を、縦軸は血漿インスリン（ｎｇ／ｍＬ）を示す。また、記号「ＷＴ」及び「ＨＭ」は、それぞれ、ＷＴマウス及びホモＫＯマウスを意味する。
【図１５】マウスＡＧＦ発現アデノウイルス投与マウスの糖代謝試験の結果を示すグラフである。黒丸は、ｍＡＧＦ−Ａｄｅｎｏ投与マウスの結果であり、白丸は、Ｃｏｎｔ−Ａｄｅｎｏ投与マウスの結果である。また、横軸は経過時間（分）であり、縦軸は血糖値（ｍｇ／ｄＬ）である。
【図１６】高脂肪食で飼育したＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスの血漿中インスリン濃度（縦軸；ｎｇ／ｍＬ）を示すグラフである。記号「ＴＧ」及び「ＮＴＧ」は、それぞれ、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスを意味する。
【図１７】高脂肪食で飼育したＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスの血清コレステロール濃度（縦軸；ｍｇ／ｄＬ）を示すグラフである。記号「ＴＧ」及び「ＮＴＧ」は、それぞれ、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスを意味する。
【図１８】高脂肪食で飼育したＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスの血清遊離脂肪酸濃度（縦軸；μＥｑ／Ｌ）を示すグラフである。記号「ＴＧ」及び「ＮＴＧ」は、それぞれ、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスを意味する。
【図１９】ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスの糖代謝試験の結果を示すグラフである。記号「ＴＧ」及び「ＮＴＧ」は、それぞれ、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスを意味する。また、横軸は経過時間（分）であり、縦軸は血糖値（ｍｇ／ｄＬ）である。
【図２０】ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスのインスリン感受性試験の結果を示すグラフである。記号「ＴＧ」及び「ＮＴＧ」は、それぞれ、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスを意味する。また、横軸は経過時間（分）であり、縦軸は、インスリン投与前の血糖値に対する、投与後の血糖値の割合（％）である。
【図２１】Ｋ１４−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスにおける内臓脂肪組織重量を示すグラフである。記号「Ｋ１４−ＡＧＦ」及び「ＮＴＧ」は、それぞれ、Ｋ１４−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスを意味する。また、縦軸は、体重当たりの内蔵脂肪組織重量の百分率（％）である。
【図２２】Ｋ１４−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスにおける皮下脂肪組織重量を示すグラフである。記号「Ｋ１４−ＡＧＦ」及び「ＮＴＧ」は、それぞれ、Ｋ１４−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスを意味する。また、縦軸は、体重当たりの皮下脂肪組織重量の百分率（％）である。
【図２３】Ｋ１４−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスのインスリン感受性試験の結果を示すグラフである。記号「Ｋ１４−ＡＧＦ」及び「ＮＴＧ」は、それぞれ、Ｋ１４−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスを意味する。また、横軸は経過時間（分）であり、縦軸は、インスリン投与前の血糖値に対する、投与後の血糖値の割合（％）である。
【図２４】ヒトＡＧＦ発現アデノウイルス投与マウスの糖代謝試験の結果を示すグラフである。黒丸は、ｈＡＧＦ−Ａｄｅｎｏ投与マウスの結果であり、白丸は、Ｃｏｎｔ−Ａｄｅｎｏ投与マウスの結果である。また、横軸は経過時間（分）であり、縦軸は血糖値（ｍｇ／ｄＬ）である。
【図２５】ＦａＯ細胞でのマウスＡＧＦプロモーター活性を示すグラフである。縦軸は活性（補正値）である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明のスクリーニング方法は、ＡＧＦが抗肥満、抗糖尿病、及び抗高脂血症の作用を有し、従って、ＡＧＦ発現亢進剤及び／又はＡＧＦ機能亢進剤が、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬の有効成分として有用であるとの新規知見に基づくものであり、その具体的なスクリーニング手法の違いにより、本発明のスクリーニング方法には、
（１）ＡＧＦのタンパク質量又は遺伝子量の変化を指標とするスクリーニング方法（以下、ＡＧＦ型スクリーニング方法と称する）、
（２）マウスＡＧＦプロモーターを利用するスクリーニング方法（以下、プロモーター型スクリーニング方法と称する）、
（３）ＭＡＰＫのリン酸化の変化を指標とするスクリーニング方法（以下、ＭＡＰＫ型スクリーニング方法と称する）、
（４）ＡＧＦの細胞への結合量の変化を指標とするスクリーニング方法（以下、細胞結合型スクリーニング方法と称する）
が含まれる。【００２１】
本発明のスクリーニング法で使用する試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、市販の化合物（ペプチドを含む）、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Terrettら, J.Steele.Tetrahedron, 第51巻, 第8135−8173頁, 1995年）によって得られた化合物群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、あるいは、本発明のスクリーニング法により選択された化合物（ペプチドを含む）を化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を挙げることができる。【００２２】
（１）ＡＧＦ型スクリーニング方法
本発明のＡＧＦ型スクリーニング方法は、
ｉ）細胞に試験物質を接触させる工程、及び
ii）前記細胞における内在性のＡＧＦのタンパク質量又は遺伝子量を測定し、試験物質依存的な内在性のＡＧＦのタンパク質量又は遺伝子量の変化を分析する工程
を含み、所望により、
前記工程ii）でＡＧＦ発現亢進活性を有する試験物質の、体重変動、血糖値、及び／又は血中脂質含量に与える作用を分析する工程
を更に含むことができる。【００２３】
本発明のＡＧＦ型スクリーニング方法によれば、ＡＧＦ発現亢進剤をスクリーニングすることができ、本発明のＡＧＦ型スクリーニング方法によりスクリーニングされたＡＧＦ発現亢進剤は、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬の有効成分として使用することができる。【００２４】
本発明のＡＧＦ型スクリーニング方法で用いる細胞は、内在性のＡＧＦを発現しているか、あるいは、発現する可能性のある細胞である限り、特に限定されるものではないが、ＡＧＦを発現している細胞であることが好ましく、例えば、マウス骨格筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２細胞（ATCC番号：CRL-1772）、ヒト肝臓癌細胞株ＨｅｐＧ２（ATCC番号：HB-8065）を挙げることができる。また、細胞は、培養細胞に限定されず、動物に試験物質を投与することにより動物の細胞に試験物質を接触させることもＡＧＦ型スクリーニング方法に含まれる。試験物質を接触させた細胞の培養上清、細胞溶解液、又は試験物質を投与した動物から得た検体（血清、組織由来細胞など）等を試料（サンプル）として用いて、試験物質を接触させた細胞における内在性のＡＧＦのタンパク質量又は遺伝子量を測定し、試験物質依存的な内在性のＡＧＦのタンパク質量又は遺伝子量の変化を分析する。【００２５】
ＡＧＦのタンパク質量の測定は、公知の方法、例えば、イムノアッセイ又はウエスタンブロッティングにより実施することができ、イムノアッセイにより実施することが好ましく、実施例３、実施例４、実施例７、又は実施例１０に記載のＥＬＩＳＡにより実施することが特に好ましい。
例えば、ＡＧＦのタンパク質量の測定が、
ｉ）ＡＧＦに結合する固定化抗体又はそのフラグメントに試料を反応させる工程、及び
ii）前記固定化抗体又はそのフラグメントと前記試料中に含まれるＡＧＦとの結合により形成される複合体に、非標識又は標識ＡＧＦ抗体又はそのフラグメントを反応させる工程
を含むイムノアッセイによる測定である、ＡＧＦ型スクリーニング方法も、本発明に含まれる。【００２６】
ＡＧＦの遺伝子量（ｍＲＮＡ量）の測定は、公知の方法、例えば、定量ＰＣＲ（polymerase
chain reaction）法又はノーザンブロッティングなどにより実施することができ、定量ＰＣＲ法により実施することが好ましい。マウスＡＧＦ遺伝子量の測定には、実施例１３に記載の定量ＰＣＲ法による測定が特に好ましい。また、ヒトＡＧＦ遺伝子量の測定には、プライマーとして配列番号４３及び配列番号４４で表されるオリゴヌクレオチド対を用いること以外は、ラットＡＧＦ遺伝子量の測定には、プライマーとして配列番号５１と配列番号５２で表されるオリゴヌクレオチド対を使用すること以外は、実施例１３に記載と同様の方法を用いた定量ＰＣＲによる測定が特に好ましい。【００２７】
定量ＰＣＲ法に用いるプライマーセットとしては、ＡＧＦ遺伝子を特異的に増幅することができるように設計した順方向及び逆方向プライマーセットであれば特に限定はされず、そのようなプライマーの設定は、例えば、ＡＧＦ遺伝子配列［例えば、GenBankデータベースアクセッション番号NM_145154（マウス）、NM_031917（ヒト）、XM_216613（ラット）の配列］を元に、解析ソフト（Primer
Express; Applied Biosystems社）を用いて適切な位置を検索し、設定することができる。より好ましいプライマーセットとしては、配列番号２９及び３０（マウスＡＧＦ量測定；実施例１３で用いたプライマーセット）、配列番号４３及び４４（ヒトＡＧＦ量測定；前記プライマー）、配列番号５１及び５２（ラットＡＧＦ量測定；前記プライマー）が挙げられる。【００２８】
本発明のＡＧＦ型スクリーニング方法では、例えば、実施例３、実施例４、実施例７、又は実施例１０に記載の条件（ＥＬＩＳＡ）、あるいは、実施例１３に記載の条件（定量ＰＣＲ法）で、ＡＧＦの発現量（タンパク質量又は遺伝子量）が１．５倍以上（好ましくは２倍以上、より好ましくは４倍以上）となる物質を、ＡＧＦ発現亢進活性を有する物質として、選択し、物質が化合物の場合は、１０μｍｏｌ／Ｌの濃度（好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．１μｍｏｌ／Ｌ）で前記活性を持つ物質を、ＡＧＦ発現亢進活性を有する物質として、選択する。【００２９】
（２）プロモーター型スクリーニング方法
本発明のプロモーター型スクリーニング方法は、
ｉ）配列番号１で表される塩基配列における第６７２番〜第５５７２番の塩基からなる配列において、１〜１０個の塩基が欠失、置換、及び／若しくは挿入された配列を含み、且つアンジオポエチン関連増殖因子のプロモーター活性を有するＤＮＡ、配列番号１で表される塩基配列における第６７２番〜第５５７２番の塩基からなる配列との同一性が９０％以上である塩基配列を含み、且つアンジオポエチン関連増殖因子のプロモーター活性を有するＤＮＡ、あるいは、配列番号１で表される塩基配列における第６７２番〜第５５７２番、第５４８番〜第５５７２番、第２３９番〜第５５７２番、若しくは第１６番〜第５５７２番、又は配列番号２で表される塩基配列における第１６番〜第６６８４番の塩基からなる配列からなるＤＮＡの下流にレポーター遺伝子が融合されたベクターにより形質転換された細胞に、試験物質を接触させる工程、及び
ii）レポーター遺伝子の発現を測定し、試験物質依存的な前記発現の変化を分析する工程
を含み、所望により、
前記工程ii）でＡＧＦ発現亢進活性を有する試験物質の、体重変動、血糖値、及び／又は血中脂質含量に与える作用を分析する工程
を更に含むことができる。【００３０】
本発明のプロモーター型スクリーニング方法によれば、ＡＧＦ発現亢進剤をスクリーニングすることができ、本発明のプロモーター型スクリーニング方法によりスクリーニングされたＡＧＦ発現亢進剤は、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬の有効成分として使用することができる。【００３１】
配列番号１で表される塩基配列における第６７２番〜第５５７２番の塩基からなる配列において、１〜１０個の塩基が欠失、置換、及び／若しくは挿入された配列を含み、且つアンジオポエチン関連増殖因子のプロモーター活性を有するＤＮＡ、配列番号１で表される塩基配列における第６７２番〜第５５７２番の塩基からなる配列との同一性が９０％以上である塩基配列を含み、且つアンジオポエチン関連増殖因子のプロモーター活性を有するＤＮＡ、あるいは、配列番号１で表される塩基配列における第６７２番〜第５５７２番、第５４８番〜第５５７２番、第２３９番〜第５５７２番、若しくは第１６番〜第５５７２番、又は配列番号２で表される塩基配列における第１６番〜第６６８４番の塩基からなる配列からなるＤＮＡの、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬スクリーニングのための使用も本発明に含まれる。【００３２】
本発明のプロモーター型スクリーニング方法では、プロモーターとして、好ましくは、
配列番号１で表される塩基配列における第６７２番〜第５５７２番の塩基からなる配列において、１〜１０個の塩基が欠失、置換、及び／若しくは挿入された配列を含み、且つアンジオポエチン関連増殖因子のプロモーター活性を有するＤＮＡ、又は
配列番号１で表される塩基配列における第６７２番〜第５５７２番の塩基からなる配列との同一性が９０％以上である塩基配列を含み、且つアンジオポエチン関連増殖因子のプロモーター活性を有するＤＮＡ
を用いるが、更に好ましくは、第６７２番〜第５５７２番の塩基からなる配列を含む第１６番〜第５５７２番の内の任意の長さの配列からなるＤＮＡを、特に好ましくは、
配列番号１で表される塩基配列における第６７２番〜第５５７２番の塩基からなる配列からなるＤＮＡ、
配列番号１で表される塩基配列における第５４８番〜第５５７２番の塩基からなる配列からなるＤＮＡ、
配列番号１で表される塩基配列における第２３９番〜第５５７２番の塩基からなる配列からなるＤＮＡ、
配列番号１で表される塩基配列における第１６番〜第５５７２番の塩基からなる配列からなるＤＮＡ、又は
配列番号２で表される塩基配列における第１６番〜第６６８４番の塩基からなる配列からなるＤＮＡ
を用いる。【００３３】
配列番号１で表される塩基配列は、マウスＡＧＦ遺伝子のエクソン１上流の約５．６ｋｂの長さのマウスＡＧＦプロモーター領域の配列である。また、配列番号２で表される塩基配列は、マウスＡＧＦ遺伝子のエクソン２上流の約６．７ｋｂ（エキソン１上流約５．６ｋｂ、エキソン１約１００ｂ、及びイントロン１約１ｋｂからなる）の長さのマウスＡＧＦプロモーター領域の配列である。【００３４】
レポーター遺伝子アッセイ（田村ら、転写因子研究法、羊土社、1993年）は、レポーター遺伝子の発現をマーカーとして遺伝子の発現調節を分析（検出又は測定）する方法である。一般に遺伝子の発現調節はその５’上流域に存在するプロモーター領域と呼ばれる部分で制御されており、転写段階での遺伝子発現量はこのプロモーターの活性を測定することで推測することができる。試験物質がプロモーターを活性化すれば、プロモーター領域の下流に配置されたレポーター遺伝子の転写を活性化する。このようにプロモーター活性化作用すなわち発現亢進作用をレポーター遺伝子の発現に置き換えて検出することができる。従って、ＡＧＦプロモーター領域を用いたレポーター遺伝子アッセイにより、ＡＧＦの発現調節に対する試験物質の作用はレポーター遺伝子の発現に置き換えて検出することができる。【００３５】
前記プロモーターと融合される「レポーター遺伝子」は、一般に用いられるものであれば特に限定されないが、定量的測定が容易な酵素遺伝子などが好ましい。例えば、バクテリアトランスポゾン由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）、ホタル由来又はウミシイタケ由来のルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、又はクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）等が挙げられる。レポーター遺伝子は、前記プロモーターと機能的に融合されていればよい。前記プロモーターと融合されたレポーター遺伝子を細胞（例えば、動物細胞又は酵母）に安定あるいは一過性に発現させる。ついで形質転換された細胞に試験物質を培養液中で接触した場合と接触しなかった場合のレポーター遺伝子の発現量を比較することにより、試験物質依存的なプロモーター活性の変化を分析することができる。【００３６】
プロモーターの下流にレポーター遺伝子が融合されたベクターによる形質転換細胞の作製方法は、常法により実施することができ、例えば、実施例１５に記載の方法を用いることができる。また、レポーター遺伝子の発現量の解析方法としては、前記レポーター遺伝子がコードするタンパク質により適宜選択される。例えば、レポーター遺伝子が蛍光タンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする場合、導入細胞を適当な方法により溶解し、この細胞溶解液の上清中に基質となるルシフェリンを添加した後、適当な蛍光検出器（例えば、ML3000；ダイナテックラボラトリーズ社等）を用いて蛍光を測定し、レポーター遺伝子の発現量とする。また、この反応は適当な市販の検出キット、具体的には、例えば、ルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ社）等を用いて行うこともできる。【００３７】
本発明のプロモーター型スクリーニング方法では、例えば、実施例１５に記載の条件で、レポーター活性が１．５倍以上（好ましくは２倍以上、より好ましくは４倍以上）となる物質を、ＡＧＦ発現亢進活性を有する物質として選択し、物質が化合物の場合は、１０μｍｏｌ／Ｌの濃度（好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．１μｍｏｌ／Ｌ）で前記活性を持つ物質を、ＡＧＦ発現亢進活性を有する物質として選択する。【００３８】
（３）ＭＡＰＫ型スクリーニング方法
本発明のＭＡＰＫ型スクリーニング方法は、
ｉ）細胞に試験物質を接触させる工程、
ii）ＭＡＰＫのリン酸化を測定し、試験物質依存的な前記リン酸化の変化を分析する工程、及び
iii）前記工程ii）でＡＧＦアゴニスト活性を有する試験物質の、体重変動、血糖値、及び／又は血中脂質含量に与える作用を分析する工程
を含む。【００３９】
実施例１６に示すように、細胞へのＡＧＦ添加により、ＭＡＰＫ  ｐ３８、ＭＡＰＫ  ｐ４２、及びＭＡＰＫ  ｐ４４のリン酸化が亢進されることが判明した。この結果は、ＭＡＰＫのリン酸化の変化を分析することにより、ＡＧＦの機能亢進を判定することが可能であることを示している。従って、本発明のＭＡＰＫ型スクリーニング方法によれば、ＡＧＦ機能亢進剤をスクリーニングすることができ、本発明のＭＡＰＫ型スクリーニング方法によりスクリーニングされたＡＧＦ機能亢進剤は、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬の有効成分として使用することができる。【００４０】
本発明のＭＡＰＫ型スクリーニング方法で用いる細胞は、ＭＡＰＫの少なくとも１つを発現し、ＡＧＦが結合する細胞であることが好ましく、例えば、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞ＨＵＶＥＣ（CAMBREX社）、筋分化Ｃ２Ｃ１２細胞、前駆軟骨細胞株ＡＴＤＣ５細胞（Cell Differ.Dev., 1990, 30(2),
109-116）を挙げることができる。試験物質を接触させた細胞の、例えば、培養上清又は細胞溶解液を調製し、ＭＡＰＫのリン酸化を測定し、試験物質依存的な前記リン酸化の変化を分析する。【００４１】
ＭＡＰＫのリン酸化の測定は、例えば、抗リン酸化ＭＡＰＫ抗体を用いるウエスタンブロッティング又はイムノアッセイにより実施することができ、ウエスタンブロッティングにより実施することが好ましく、実施例１６に記載のウエスタンブロッティングにより実施することが特に好ましい。【００４２】
ＭＡＰＫとしては、ＭＡＰＫ  ｐ３８、ＭＡＰＫ  ｐ４２、又はＭＡＰＫ  ｐ４４を挙げることができ、本発明のＭＡＰＫ型スクリーニング方法では、少なくとも１つのＭＡＰＫ（好ましくは２種類以上のＭＡＰＫ）を分析する。【００４３】
本発明のＭＡＰＫ型スクリーニング方法では、ＡＧＦアゴニスト活性を有する物質、例えば、実施例１６に記載の条件で、リン酸化タンパク質量が１．５倍以上（好ましくは２倍以上、より好ましくは４倍以上）となる物質を、ＡＧＦ機能亢進活性を有する物質として選択し、物質が化合物の場合は、１０μｍｏｌ／Ｌの濃度（好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．１μｍｏｌ／Ｌ）で前記活性を持つ物質を、ＡＧＦ機能亢進活性を有する物質として選択する。【００４４】
（４）細胞結合型スクリーニング方法
本発明の細胞結合型スクリーニング方法は、
ｉ）細胞に、試験物質及びＡＧＦを接触させる工程、及び
ii）ＡＧＦの細胞への結合量を測定し、試験物質依存的な前記結合量の変化を分析する工程
を含み、所望により、
iii）前記工程ii）でＡＧＦと細胞との結合を促進する試験物質の、体重変動、血糖値、及び／又は血中脂質含量に与える作用を分析する工程
を更に含むことができる。【００４５】
実施例１７に示すように、ＡＧＦは細胞表面に結合することが判明した。この結果は、ＡＧＦの細胞への結合を促進する物質は、ＡＧＦの機能亢進剤となることを示している。従って、本発明の細胞結合型スクリーニング方法によれば、ＡＧＦ機能亢進剤をスクリーニングすることができ、本発明の細胞結合型スクリーニング方法によりスクリーニングされたＡＧＦ機能亢進剤は、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬の有効成分として使用することができる。【００４６】
本発明の細胞結合型スクリーニング方法で用いる細胞は、ＡＧＦが結合する細胞であることが好ましく、例えば、前駆軟骨細胞株ＡＴＤＣ５細胞を挙げることができる。【００４７】
ＡＧＦの細胞への結合量は、公知の結合アッセイ、例えば、フローサイトメトリー、セルエライザ（cell ELISA）、又は標識ＡＧＦの結合量を測定するバインディングアッセイ等により測定することができ、実施例１７に記載のフローサイトメトリーにより実施することが特に好ましい。【００４８】
本発明の細胞結合型スクリーニング方法では、ＡＧＦと細胞との結合促進剤、例えば、実施例１７に記載の条件で、細胞へのＡＧＦタンパク質の結合量が１．５倍以上（好ましくは２倍以上、より好ましくは４倍以上）となる物質を、ＡＧＦ機能亢進活性を有する物質として選択し、物質が化合物の場合は、１０μｍｏｌ／Ｌの濃度（好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．１μｍｏｌ／Ｌ）で前記活性を持つ物質を、ＡＧＦ機能亢進活性を有する物質として選択する。【００４９】
（５）抗肥満作用、抗糖尿病作用、及び抗高脂血症作用の確認方法
本発明のスクリーニング方法（ＡＧＦ型スクリーニング方法、プロモーター型スクリーニング方法、ＭＡＰＫ型スクリーニング方法、及び細胞結合型スクリーニング方法を含む）では、前記工程ｉ）及びii）を実施することにより、ＡＧＦ発現亢進活性を有する、ＡＧＦアゴニスト活性を有する、又はＡＧＦと細胞との結合を促進する試験物質の抗肥満、抗糖尿病、及び／又は抗高脂血症の各作用を、所望により、例えば、前記試験物質の投与による実験動物での体重変動、血糖値、及び／又は血中脂質含量を分析することによって確認することができる。【００５０】
例えば、試験物質の抗肥満作用は、試験物質投与による小動物での体重変動、脂肪重量、又は脂肪重量の変化を調べることで確認することができる。小動物としては、例えば、マウス、ラットなどを使用することができ、正常動物に加えて肥満モデル動物も利用が可能である。肥満モデルとしては、例えば、ｏｂ／ｏｂマウス、ｄｂ／ｄｂマウス、Ｚｕｃｋｅｒラットなどの肥満モデル動物で利用可能なものが多く知られているのに加え、高脂肪食、高カロリー食などの負荷を与えて体重増加や脂肪重量の増加を促進させた肥満モデルの利用が可能である。【００５１】
試験物質の体重変動に与える作用は、例えば、経時的に体重を測定し、試験物質投与群とコントロール群との体重の変化量を比較することで分析することができる。脂肪重量は、例えば、安楽死させたマウスを解剖し、生殖器脂肪を全摘し重量を測定し、試験物質投与群とコントロール群との脂肪重量を比較することで調べられる。脂肪重量の変化は、例えば、麻酔下で、実験動物用Ｘ線ＣＴ（アロカ社）を用いて横隔膜から腹腔の最下部までの領域を２ｍｍ間隔で撮影し、内臓脂肪組織重量及び皮下脂肪組織重量を計測し、試験物質投与群とコントロール群との各脂肪重量を比較することで調べられる。正常動物又は肥満モデル動物に試験物質を投与すること以外の方法は、参考例４、参考例５、又は参考例１７と同様に実施することができる。【００５２】
また、試験物質の抗糖尿病作用は、試験物質投与による小動物の血糖値の変化を調べることで確認することができる。小動物としては、例えば、マウス、ラットなどを使用することができ、正常動物に加えて糖尿病モデル動物の利用が可能である。糖尿病モデル動物としては、例えば、ＫＫ／Ａｙマウス、ｄｂ／ｄｂマウスなど多くの利用可能なモデル動物が知られている。更に、ストレプトゾトシン誘発糖尿病モデルなどの糖尿病モデルが利用可能である。試験物質の血糖値に与える作用は、随時血糖値、絶食時血糖値を測定し、試験物質投与群とコントロール群との血糖値の変化を分析することで調べられる。更に、糖負荷試験や、インスリン抵抗性試験で血糖値を測定することで、試験物質投与群とコントロール群との耐糖能やインスリン感受性を調べることが可能である。正常動物又は糖尿病モデル動物に試験物質を投与すること以外の方法は、参考例８、参考例１６、又は参考例１８と同様に実施することができる。【００５３】
更に、試験物質の抗高脂血症作用は、試験物質投与による小動物の血中脂質含量の変化を調べることで確認できる。小動物としては、例えば、マウス、ラット、ラビットなどを使用することができ、正常動物に加えて高脂血症モデル動物の利用が可能である。高脂血症モデル動物としては、例えば、Ｚｕｃｋｅｒラット、ＷＨＨＬラビットなどの多くの利用可能なモデル動物が知られている。試験物質の血中脂質含量に与える作用は、血中トリグリセリド、血中コレステロール、血中遊離脂肪酸の濃度を測定し、試験物質投与群とコントロール群との血中脂質含量の変化を分析することで調べられる。正常動物又は高脂血症モデル動物に試験物質を投与すること以外の方法は、参考例１５と同様に実施することができる。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法（「Molecular Cloning」, Sambrook, J.ら, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1989年など）に従って実施可能である。また、市販の試薬やキットを用いる場合には、市販品の指示書に従って実施可能である。【００５５】
ＫＯ動物及びＴｇ動物の作製については、特に断りがない場合は、Manipulating
the Mouse Embryo. A Laboratory Manual. 2nd Edition, B. Hogan, R. Beddington, F.
Costantini, E. Lacy, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1994に従って、ＥＳ細胞を用いたキメラマウス作製については、AL Joyner: Gene Targeting, A
Practical Approach, OXFORD UNIVERSITY PRESS, 1993又はバイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲッティング  ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，相沢慎一／著，羊土社，1994等に従って実施可能である。【００５６】
《参考例１：ＡＧＦ  ＫＯマウスの作製》
（１）ターゲッティングベクターの作製
マウスＡＧＦ遺伝子の５’側のゲノム配列（5’long arm）、ｐｇｋプロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子、マウスＡＧＦ遺伝子のエクソン（exon）２の一部とエクソン３を含むゲノム配列（3’short
arm）、及びＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を順にもつターゲッティングベクターを以下の方法で作製した。【００５７】
すなわち、WO03/083114号公報の実施例１と同様に作製したマウスＡＧＦのタンパク質コード領域全長に対応するｃＤＮＡをプローブとして、添付マニュアルに従ってマウスゲノミックライブラリー（Mouse
Genomic, 129 SVJ Library；ストラタジーン社）のスクリーニングを行い、約１７．９ｋｂｐの配列（ＡＧＦ遺伝子を含む、mouse-pub-genome配列ACO73775.2の90644〜108544）を持つファージクローンを単離し、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン社）にサブクローニングした。このプラスミドクローン（ｐＢＮ２）を制限酵素ＳａｌＩ及びＭｆｅＩで切断することで、約６．２ｋｂｐの５’ロングアーム（mouse-pub-genome配列ACO73775.2の90664〜96900を含む）を切り出した。また、前記プラスミドｐＢＮ２を鋳型にして、配列番号６及び配列番号７で表される塩基配列からなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、約２．０ｋｂｐの３’ショートアーム（mouse-pub-genome配列ACO73775.2の105903〜107914を含む）を得た。５’ロングアーム及び３’ショートアームを、それぞれ、プラスミドｐＰＮＴ（Cell,
1991, 65(7), 1153-1163）のＸｈｏＩサイト及びＸｂａＩサイトへ挿入してターゲッティングベクターを完成した。【００５８】
（２）相同組み換えＥＳ細胞の取得
得られたターゲッティングベクターを制限酵素ＮｏｔＩで切断し、ＥＳ細胞株Ｒ１（Proceedings
of the National Academy of Sciences, Vol 90, 8424-8428, 1993）へ電気穿孔法で導入した。Ｇ４１８を含んだ培地でＥＳ細胞を培養し、耐性株を得た。ＥＳ細胞からＤＮＡを抽出し、相同組み換えのみが起きているクローンをサザンブロット解析によって同定した。具体的には、ＡＧＦのエクソン４とエクソン５を含む、配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断したＤＮＡを用いてサザンブロット解析を行った。その結果、野生型の４．６Ｋｂに対して相同組換えでは６．５ＫｂのＤＮＡ断片を検出することができた。【００５９】
（３）ＡＧＦ  ＫＯマウスの作製
得られたＥＳ細胞株を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとＤＢＡ／２マウス交雑第２代であるＢＤＦ２マウスより得た胚盤胞へマイクロインジェクションし、操作胚を子宮へ移植した。操作胚を移植し妊娠したマウスより、キメラマウスを出産させた。キメラマウスをＣ５７ＢＬ／６マウスと交配することによって、ＡＧＦの開始コドンを欠失した変異アレルを持つヘテロ接合体マウス（以下、ＡＧＦヘテロＫＯマウスと称する）を得た。ＡＧＦヘテロＫＯマウス同士の交配によってホモ接合体マウス（以下、ＡＧＦホモＫＯマウスと称する）を得た。仔マウスの尻尾より単離したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、マウスの遺伝子型を、ＰＣＲによって生じるＤＮＡ断片のサイズによって確かめた。すなわち、尻尾をプロテイナーゼＫで処理し、ＤＮＡをフェノール・クロロホルム抽出した。抽出したＤＮＡは、イソプロパノール沈殿及びエタノール沈殿によって回収し、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）（以下、ＴＥ溶液と称する）に溶解した。ネオマイシン耐性遺伝子配列及びターゲッティングによって欠失するゲノム配列に基づいて次の塩基配列からなるプライマーをデザインした。
（ネオマイシン耐性遺伝子）
フォワードプライマー：配列番号９
リバースプライマー：配列番号１０
（ゲノムDNA）
フォワードプライマー：配列番号１１
リバースプライマー：配列番号１２【００６０】
得られた仔マウス由来ゲノムＤＮＡについて、前記プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼ（ExTaq；Takara社）を用いて、９５℃（５分間）の熱変性を行った後、９５℃（１分間）、６０℃（１分間）、及び７２℃（１分間）からなるサイクルを３０サイクル実施し、更に７２℃（７分間）の伸長反応を行い、増幅される断片のサイズを調べた。変異アレルがある場合は、ネオマイシン耐性遺伝子を検出するＰＣＲにおいて５４５ｂｐのバンドが検出され、野生型アレルがある場合は、マウスＡＧＦエクソン１を含むゲノムＤＮＡを検出するＰＣＲにおいて３２２ｂｐのバンドが検出される。これらの結果より、マウスの遺伝子型を判定した。その結果、ＡＧＦホモＫＯマウスでは、変異アレルのバンドが検出され、野生型アレルのバンドが検出されず、ＡＧＦヘテロＫＯマウスでは、変異アレルのバントと野生型アレルのバンドが共に検出され、野生型マウス［以下、リターメイト（Littermate）ＷＴマウスと称する］では変異アレルのバンドが検出されず、野生型アレルのバンドが検出された。【００６１】
また、前記参考例１（２）のサザンブロット解析を行なうことでも、マウスの遺伝子型を調べた。その結果、ＡＧＦホモＫＯマウスでは、変異アレルの６．５ｋｂｐのバンドが検出され、ＡＧＦヘテロＫＯマウスでは、変異アレルの６．５ｋｂｐのバントと野生型アレルの４．６ｋｂｐのバンドが共に検出され、リターメイトＷＴマウスでは野生型アレルの４．６ｋｂｐのバンドが検出された。【００６２】
更に、ＡＧＦ  ＫＯマウスから採血した血液を３７℃に３０分間静置後、遠心し、その上清から血清を得た。血清をリシス（lysis）バッファー［0.5mol/L HEPES (pH7.2), 1% TritonX-100, 10%グリセロール,
10mmol/L Na4P2O7, 0.1mol/L NaF, 0.1mmol/L Na3VO4,
4mmol/L EDTA (pH8) , 0.05mg/mL アプロチニン, 1mmol/L PMSF, 0.1mmol/L ロイペプチン,
0.025mmol/L ペプスタインA］で２０倍希釈したものを２×ＳＤＳサンプルバッファーで倍量希釈した。１レーン当たり２０μＬを１０％アクリルアミドゲルにて電気泳動を行い、ウエスタンブロッティングを行なった。ウエスタンブロッティングは、ブロッキング剤として５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＴＢＳ−Ｔ［20mmol/L
Tris-HCl (pH 7.5), 150mmol/L NaCl, 0.05%(w/v) Tween20］を、１次抗体として抗マウスＡＧＦ抗体（WO03/083114号公報）を、２次抗体として抗ラビット抗体（ALI3404；BIO
SourCE社）を３％ＢＳＡ含有ＴＢＳ−Ｔで５０００倍に希釈したものを各々使用した。ＡＧＦホモＫＯマウスでは、ＡＧＦのバンドが欠失していることよりＡＧＦの欠損を確認した。【００６３】
《参考例２：ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの作製》
本実施例では、ＣＡＧ（modified chicken beta-actin
promoter with CMV-IE enhancer）プロモーター［GENE, 108(1991) 193-200］制御下に全身にマウスＡＧＦを強制発現させたＡＧＦ  Ｔｇマウス（以下、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスと称する）を作製した。プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII  ＫＳ（＋）（ストラタジーン社）のマルチクローニングサイトに、ＣＡＧプロモーター（１．７ｋｂ）、ｌｏｘ７１配列、ブラストサイジン遺伝子（ｂｓｒ）、ポリＡシグナル配列（０．５ｋｂ）、ｌｏｘ  Ｐ配列、マウスＡＧＦ  ｃＤＮＡ配列、及びＩＲＥＳ（internal
ribosomal entry site）−β−ｇｅｏ−ポリＡ配列（４．５ｋｂ）を順に挿入したプラスミドを以下の方法で作製した。【００６４】
マウスＡＧＦ全長ｃＤＮＡ（WO03/083114号公報）を鋳型に、配列番号１３及び配列番号１４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲ（９５℃で１０分間の反応後、９４℃で１５秒間、６０℃で３０秒間、及び７２℃で２分間からなる反応を４５サイクル実施）を行い、得られたＰＣＲ産物をｐＺＥｒＯ−２クローニングベクター（インビトロジェン社）にサブクローニングした。得られたプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄIIIとＳａｌＩで切断し、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII  ＳＫ（ストラタジーン社）のＨｉｎｄIIIとＳａｌＩサイトへ挿入してマウスＡＧＦ全長遺伝子をもつプラスミドｐＢＳ−ｍＡＧＦを作製した。次に、プラスミドｐＢＳ−ｍＡＧＦにＩＲＥＳ−β−ｇｅｏ−ポリＡ遺伝子を導入するために、この遺伝子を持つプラスミドｐＵ−Ｓａｎ（Hum
Mol Genet 8:387-396 1999）を制限酵素ＳａｌＩとＢｇｌIIで切断してＩＲＥＳ−β−ｇｅｏ−ポリＡ遺伝子を切り出し、ｐＢＳ−ｍＡＧＦのＢｇｌIIとＳａｌＩサイトへ挿入し、マウスＡＧＦ  ｃＤＮＡ配列及びＩＲＥＳ−β−ｇｅｏ−ポリＡ配列を持つプラスミドｐＢＳ−ｍＡＧＦ−βｇｅｏを作製した。【００６５】
ＣＡＧプロモーター、ｌｏｘ７１配列、ｂｓｒ、及びポリＡシグナル配列を持つプラスミドｐＣＡＧｌｏｘ７１ｂｓｒ（Nucleic Acids Res. 1997;25(4):868-872）の、ポリＡシグナルの３’側に、ｌｏｘＰ配列を挿入して、ｂｓｒとｐｏｌｙＡシグナルをｌｏｘ７１配列とｌｏｘＰ配列で挟んだ構造を持つプラスミドを作製した。すなわち、ｌｏｘＰを含むリン酸化（kination）処理した８１ｂｐの断片（配列番号１５）を、制限酵素ＳｍａＩでの切断後ＢＡＰ（bacterial
alkaline phosphatase）処理したプラスミドｐＣＡＧｌｏｘ７１ｂｓｒへ挿入し、プラスミドｌｏｘＰ−ｌｏｘ７１を作製した。プラスミドｌｏｘＰ−ｌｐｘ７１に挿入されたｌｏｘＰ配列を確認するために、Ｔ３プライマー（配列番号１６）を用いてシークエンシングを行い、挿入したｌｏｘＰ配列を含む領域の塩基配列を調べた。その結果、Ｔ３プライマーで読んだ塩基配列が、前記配列番号１５で表される塩基配列と一致し、ｌｏｘＰとｌｏｘ７１が同じ方向であることを確認した。プラスミドｌｏｘＰ−ｌｏｘ７１を制限酵素ＳｐｅＩで切断し、得られたＣＡＧプロモーター、ｌｏｘ７１配列、ｂｓｒ、ポリＡシグナル配列、及びｌｏｘＰ配列を含む断片を、プラスミドｐＢＳ−ｍＡＧＦ−βｇｅｏのＳｐｅＩサイトへ挿入し、目的のプラスミドｐＢＳ−ｌｏｘＰ−ｌｏｘ７１−ｍＡＧＦ−βｇｅｏを作製した。得られたプラスミドｐＢＳ−ｌｏｘＰ−ｌｏｘ７１−ｍＡＧＦ−βｇｅｏの構造を図１に示す。このプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩで切断し、直鎖ＤＮＡ断片［ＣＡＧプロモーター（promoter）、ｌｏｘ７１配列、ｂｓｒ、ポリＡシグナル配列（ｐＡ）、ｌｏｘ  Ｐ配列、マウスＡＧＦ  ｃＤＮＡ配列、及びＩＲＥＳ−β−ｇｅｏ−ポリＡ配列（ｐＡ）を含む］を得た。【００６６】
ＴＴ２  ＥＳ細胞［Anal. Biochem., 1993, 214(1):
70-76］に電気穿孔法で前記直鎖ＤＮＡ断片を導入した（０．８Ｖ，３μＦ）。４μｇ／ｍＬブラストサイジン存在下でＥＳ細胞を培養して、遺伝子が導入された細胞を選択し、２０クローンを樹立した。これらの細胞にＣＡＧ−Ｃｒｅベクター（Blood,
1326-1333, Vol100, 2002）をサークルのまま電気穿孔法で導入した（０．８Ｖ，３μＦ）。【００６７】
ＣＡＧプロモーターによって発現したＣｒｅリコンビナーゼが、ｌｏｘ７１−ｌｏｘＰ間の遺伝子を除去すれば、ＡＧＦ及びβ−ｇｅｏがＣＡＧプロモーター活性によって発現する。そこで、β−ｇｅｏ発現クローンを選択するために、Ｇ４１８（２００μｇ／ｍＬ）存在下でＥＳ細胞を培養し、ｌｏｘ７１−ｌｏｘＰ間が除去された遺伝子構造を持つ細胞を選択した。この段階で選ばれた１５クローンの細胞は、ＣＡＧプロモーター（１．７ｋｂ）、ｌｏｘ７１配列、マウスＡＧＦ  ｃＤＮＡ配列、及びＩＲＥＳ−β−ｇｅｏ−ポリＡ配列（４．５ｋｂ）をもち、ＣＡＧプロモーターの制御下にＡＧＦが恒常的に発現しているＥＳ細胞となる。ＣＡＧ−Ｃｒｅベクターを導入する前のｌｏｘ７１−ｌｏｘＰ間が除去されていない各クローンのＥＳ細胞をネガティブコントロールとして、選ばれた１５クローンのＥＳ細胞でＡＧＦが発現していることを、参考例１（３）と同様の抗ＡＧＦ抗体を用いたウエスタンブロッティングで確認した。すなわち、ＥＳ細胞をリシスバッファー及び２×ＳＤＳサンプルバッファーで２倍希釈したものをサンプルとしてウエスタンブロッティングを行い、ＡＧＦが発現していることを確認した。ＡＧＦの発現を確認したＥＳ細胞の中から、８−１、８−２、及び９−１の３ラインを選び、これを各々胚盤胞へマイクロインジェクションし、操作胚を子宮へ移植した。操作胚を移植し妊娠したマウスより、キメラマウスを出産させた。キメラマウスをＣ５７ＢＬ／６マウスと交配することによってＣＡＧプロモーターの制御下にＡＧＦが恒常的に発現しているＴｇマウスを得た。Ｔｇマウスを同定するため、仔マウスの尻尾より単離したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。尻尾をプロテイナーゼＫで処理し、ＤＮＡをフェノール・クロロホルム抽出した。抽出したＤＮＡは、イソプロパノール沈殿及びエタノール沈殿によって回収し、ＴＥ溶液に溶解した。【００６８】
マウスＡＧＦ  ｃＤＮＡ配列及びＬａｃＺ配列に基づいて次の塩基配列からなるプライマーをデザインした。
（ＡＧＦ）
フォワードプライマー：配列番号１７
リバースプライマー：配列番号１８
（ＬａｃＺ）
フォワードプライマー：配列番号１９
リバースプライマー：配列番号２０
このプライマーを用いてＰＣＲを行うと、導入遺伝子からは、ＡＧＦ  ｃＤＮＡを検出するＰＣＲにおいて３２５ｂｐ断片が増幅され、ＬａｃＺを検出するＰＣＲにおいては３２０ｂｐ断片が増幅され、マウスゲノムＤＮＡからはこれらのサイズの断片は増幅されないはずである。前記プライマーを用いて、得られた仔マウス由来ゲノムＤＮＡについてＰＣＲを行った。ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼ（ExTaq；Takara社）を用いて、９４℃（５分間）熱変性を行った後、９４℃（１分間）、６２℃（１分３０秒間）、及び７２℃（１分３０秒間）からなるサイクルを２８サイクル実施し、更に７２℃（７分間）の伸長反応を行い、増幅される断片のサイズを調べた。その結果、３ラインとも、ＡＧＦ  ｃＤＮＡを検出するＰＣＲ及びＬａｃＺを検出するＰＣＲ共にバンドが確認された。すなわち、３ラインともジャームライントランスミッションを確認し、それぞれＣＡＧプロモーターの制御下にＡＧＦが恒常的に発現しているＴｇマウスであることが確認された。【００６９】
《参考例３：ＣＡＧ−ＡＧＦ  ＴｇマウスのＡＧＦ遺伝子発現》
参考例２で作製したＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスで、ＡＧＦ遺伝子がどの程度発現しているかを調べた。ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及び同腹の野生型マウス（リターメイトＷＴマウス）の白色脂肪（ＷＡＴ）、褐色脂肪（ＢＡＴ）、大脳、小脳、視床下部、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、骨格筋、及び膵臓の各組織よりトリゾール試薬（Invitrogen社）を用いて総ＲＮＡを調製した。市販のＲＮＡ精製試薬（RNeasy；キアゲン社）及びＤＮアーゼ（キアゲン社）を用いて総ＲＮＡをＤＮアーゼ処理及びクリーンアップした。ＤＮアーゼ処理した総ＲＮＡ０．５μｇを、スーパースクリプト・ファーストストランドシステム（ＲＴ−ＰＣＲ用）（LIFE
TECHNOLOGIES社）を用いてｃＤＮＡに変換した。【００７０】
ＡＧＦ及び内部標準の１８ＳリボゾーマルＲＮＡ（18SrRNA）の発現量は定量ＰＣＲ法で行なった。定量ＰＣＲは、シークエンスディテクションシステム（ABI
PRISM 7900HT Sequence Detection System；Applied Biosystems社）を用いて、リアルタイムの蛍光量を計測することで測定した。鋳型としてｃＤＮＡを、プライマーとして各遺伝子毎にデザインしたプライマー及びタックマンプローブ（Taq
Man probe）を使用した。ＡＧＦ遺伝子の発現量測定には、プライマーとして配列番号２１と配列番号２２を用い、ＰＣＲ試薬として市販の試薬（SYBR
Green PCR Master Mix；アプライドバイオシステムズ社）を用いてＰＣＲを行った。１８ＳｒＲＮＡの発現量測定には、プライマーとして配列番号２３と配列番号２４を、タックマンプローブとして配列番号２５を用い、ＰＣＲ試薬として市販の試薬（TaqMan
Universal PCR Master Mix；アプライドバイオシステムズ社）を使用してＰＣＲを行った。【００７１】
ＰＣＲの反応は、９５℃（１０分間）の初期変性反応を実施した後、９４℃（１５秒間）と６０℃（６０秒間）からなるサイクル反応を４５回繰り返すことにより実施した。遺伝子発現量算出の標準曲線は、上記ｃＤＮＡ又はマウスゲノムＤＮＡを鋳型として用いて同様の反応を行ない、遺伝子の発現量はサンプル間の相対値で算出した。
その結果、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの組織では、ＷＴマウスの組織に比べてＡＧＦ遺伝子の発現量が上昇していることが判った。特に、骨格筋、ＢＡＴ、心臓での発現上昇が顕著であった。【００７２】
《参考例４：遺伝子改変マウスの体重変化》
（１）ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの体重変化
ＣＡＧ−ＡＧＦ  ＴｇマウスをＣ５７ＢＬ／６に２世代戻し交配し、Ｆ２のＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスを得た。ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスを標準食（CE-2；クレア社）で通常に飼育した。６週齢の雌マウスの体重を比較したところ、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスは１５．７ｇ±０．８ｇ（ＳＤ）、ＷＴマウスは１７．８ｇ±０．５ｇ（ＳＤ）であり、１２週齢の雌マウスの体重を比較したところ、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスは１９．５ｇ±０．７ｇ（ＳＤ）、ＷＴマウスは２３．５ｇ±２．５ｇ（ＳＤ）であり、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの方が体重が少ないことが判った。【００７３】
次に、同じマウスを引き続き高脂肪食負荷して体重の変動を調べた。高脂肪食（high
fat diet 32；クレア社）で通常に１２週間飼育し、体重の変動を調べた。その結果、１２週間での体重増加量が、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスは、７．１ｇ±１ｇ（ＳＤ）であったのに対して、ＷＴマウスは２１．８ｇ±４ｇ（ＳＤ）であった。これらのことより、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスでは、標準食での体重増加抑制、高脂肪食での顕著な体重増加抑制があることが判り、ＡＧＦに体重増加抑制作用があることが判った。【００７４】
（２）ＡＧＦ  ＫＯマウスの体重変化
ＡＧＦホモＫＯマウス、ＡＧＦヘテロＫＯマウス、及びリターメイトＷＴマウスを標準食で通常に飼育した。１週間毎に２４週齢まで各マウスの体重を測定した。結果を図２に示す。図２に示すように、ＡＧＦホモＫＯマウスでは、約１２週齢より、ＷＴマウスに比べて体重が重くなり始め、その後も体重増加が続き、顕著な肥満となることが判った。ＡＧＦヘテロＫＯマウスでは、ＡＧＦホモＫＯマウスとリターメイトＷＴマウスの中間的な表現型となった。【００７５】
《参考例５：遺伝子改変マウスの臓器重量変化》
（１）ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの臓器重量変化
ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスでは体重増加が抑制されていることが判ったが、その原因を明らかにするために、臓器の重量を測定した。ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスの、生殖器脂肪（ＷＡＴ）、褐色脂肪（ＢＡＴ）、肝臓、心臓、腎臓、及び脾臓の各組織を採取し、体重当たりの組織重量を計測した。標準食で飼育した１２週齢のマウスと、高脂肪食で１２週齢〜２４週齢の１２週間飼育したマウスで調べた。その結果、褐色脂肪、肝臓、心臓、腎臓、及び脾臓では、標準食飼育及び高脂肪食飼育共に、ＣＡＧ−ＡＧＦ  ＴｇマウスとＷＴマウスで組織重量の変化はなかった。一方、生殖器脂肪（白色脂肪組織）は、標準食飼育及び高脂肪食飼育共に、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの方が、ＷＴマウスよりも体重当たりの組織重量が減少していた。すなわち、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスで体重増加が抑制されていたのは、白色脂肪組織の重量増加が抑制されていたためであることが示された。すなわち、ＡＧＦは、他の臓器重量には何ら影響を与えず、肥満などに伴う脂肪組織重量の増加を抑制する作用があることが判った。白色脂肪組織に関する結果を図３（標準食）及び図４（高脂肪食負荷）に示す。【００７６】
（２）ＡＧＦ  ＫＯマウスの臓器重量変化
ＡＧＦ  ＫＯマウスでは体重が増加していることが判ったが、その原因を明らかにするために、臓器の重量を測定した。標準食で飼育した２０週齢雌のＡＧＦホモＫＯマウス、ＡＧＦヘテロＫＯマウス、及びリターメイトＷＴマウスの、生殖器脂肪（ＷＡＴ）、褐色脂肪（ＢＡＴ）、肝臓、心臓、腎臓、及び脾臓の各組織を採取し、体重当たりの組織重量を計測した。その結果、褐色脂肪、肝臓、心臓、腎臓、及び脾臓は、ＡＧＦホモＫＯマウス、ＡＧＦヘテロＫＯマウス、及びＷＴマウスで組織重量の変化はなかった。一方、生殖器脂肪は、ＡＧＦホモＫＯマウスの方が、ＷＴマウスよりも、マウス個体当たり及び体重当たりの組織重量が増加していた。ＡＧＦヘテロＫＯマウスは、ＡＧＦホモＫＯマウスとＷＴマウスの中間的な組織重量となった。すなわち、ＡＧＦ  ＫＯマウスで体重が増加していたのは、生殖器脂肪組織等の白色脂肪組織の重量が増加していたためであることが示された。このことより、ＡＧＦ  ＫＯマウスは、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスと逆の表現型となることが明らかとなり、ＡＧＦの生理活性として他の臓器重量には影響を与えずに脂肪組織の重量増加抑制作用があることが明らかとなった。生殖器脂肪組織（白色脂肪組織）に関する結果を図５（白色脂肪組織重量）及び図６（白色脂肪組織重量／体重）に示す。【００７７】
《参考例６：遺伝子改変マウスの脂肪細胞形態変化》
（１）ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの脂肪細胞形態変化
高脂肪食負荷することで白色脂肪組織の重量が増大し、更に脂肪細胞が肥大化することが知られている。脂肪細胞の肥大化は糖尿病の悪性化と関連があることが知られている（医学のあゆみ，１９２，５１３−５１８，２０００；医学のあゆみ，１９２，５４１−５４５，２０００）ため、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの脂肪細胞の形態を調べた。高脂肪食で１２週齢〜２４週齢の１２週間飼育したＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスの生殖器脂肪組織を採取し、１０％中性緩衝ホルマリン液（Wako）で固定し、パラフィン包埋後、薄切切片の作製及びヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を行なった。結果を図７に示す。リターメイトＷＴマウス（ＮＴＧ）では、脂肪細胞が肥大化していたが、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス（ＴＧ）では、脂肪細胞の肥大化が抑制されて、ほぼ正常の大きさに維持されていた。【００７８】
（２）ＡＧＦ  ＫＯマウスの脂肪細胞形態変化
糖尿病モデルマウスや肥満モデルマウスでは、脂肪組織の重量増大に伴って脂肪細胞が肥大化していることが知られている［Diabetologia, 14(3), 141-148, 1978］。脂肪細胞の肥大化は糖尿病の悪性化と関連があることが知られているため、ＡＧＦ  ＫＯマウスの脂肪細胞の形態を調べた。ＡＧＦホモＫＯマウス及びリターメイトＷＴマウスの生殖器脂肪組織（ＷＡＴ）及び褐色脂肪組織（ＢＡＴ）を採取し、１０％中性緩衝ホルマリン液で固定し、パラフィン包埋後、薄切切片の作製及びヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を行なった。結果を図８（ＡＧＦホモＫＯマウス）及び図９（リターメイトＷＴマウス）に示す。リターメイトＷＴマウスのＷＡＴは、脂肪細胞が正常の大きさであったが、ＡＧＦホモＫＯマウスのＷＡＴは、脂肪細胞が肥大化していることが判った。更に、ＡＧＦホモＫＯマウスではリターメイトＷＴマウスに比べてＢＡＴでの脂肪の蓄積が観察された。【００７９】
《参考例７：遺伝子改変マウスの組織中トリグリセリド含量変化》
（１）ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの組織中トリグリセリド含量変化
肥満では、脂肪組織の増大に加えて、骨格筋や肝臓中でのトリグリセリド（ＴＧ）含量の増加が起きることが知られている（日本臨床、1995年、53巻、1995年特別号、肥満症、p354-p358）。そこでＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの骨格筋（腓腹筋）及び肝臓組織中のＴＧ含量を調べた。ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス（Ｔｇ）及びリターメイトＷＴマウス（ＷＴ）を高脂肪食（high
fat diet 32；クレア社）で１箇月間及び３箇月間飼育し、各マウスの骨格筋及び肝臓組織から、クロロホルム−メタノール溶液を用いて、組織中のＴＧを抽出した（生化学実験講座３、脂質の化学、東京化学同人）。抽出したＴＧの濃度をキット（トリグリセライドＥテストワコー；和光純薬工業社）を用いて測定し、組織中のＴＧ含量を求めた。結果を図１０（肝臓）及び図１１（骨格筋）に示す。骨格筋と肝臓共にＣＡＧ−ＡＧＦ  ＴｇマウスはＷＴマウスに比べて、組織中のＴＧ含量が減少していることが判った。このことより、肥満によって増加することが知られている骨格筋や肝臓中のＴＧ含量を、ＡＧＦが減少させる活性があることが明らかとなった。【００８０】
（２）ＡＧＦ  ＫＯマウスの組織中ＴＧ含量
ＡＧＦ  ＫＯマウスの骨格筋（腓腹筋）及び肝臓組織中のＴＧ含量を調べた。ＡＧＦ  ＫＯマウス及びリターメイトＷＴマウスの骨格筋及び肝臓組織から前記（１）の方法で、組織中のＴＧを抽出した。抽出したＴＧの濃度をキット（トリグリセライドＥテストワコー；和光純薬工業社）を用いて測定し、組織中のＴＧ含量を求めた。結果を図１２に示す。ＡＧＦ  ＫＯマウスはＷＴマウスに比べて、骨格筋及び肝臓組織中のＴＧ含量が顕著に増加していることが判った。ＡＧＦ  ＫＯマウスはＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスと逆の表現型となることが判り、ＡＧＦの生理活性として、骨格筋や肝臓中のＴＧ含量を減少させる活性があることが明らかとなった。【００８１】
《参考例８：ＡＧＦ  ＫＯマウスの血糖値及び血中インスリン濃度変化》
ＡＧＦホモＫＯマウス及びリターメイトＷＴマウスの糖負荷試験を行い、血糖値及び血中インスリン濃度を調べた。マウスを１６時間絶食後、１ｇ／ｋｇのＤ−グルコースを腹腔内注射（ｉｐ）による投与し、投与前、並びに投与後１５、３０、６０、及び１２０分後に眼静脈より採血した。グルテストエース（三和化学研究所）を用いて血糖値を、ＲＩＡ２抗体法（ＳＲＬ社）を用いて血中インスリン濃度を測定した。結果を図１３（血糖値）及び図１４（血漿インスリン）に示す。【００８２】
ＷＴマウスは、糖負荷により上昇した血糖値が投与後３０分後から減少し始めるのに対して、ＡＧＦホモＫＯマウスは、糖負荷によって血糖値がより大きく上昇し、投与後６０分後でも血糖値は減少し始めなかった。これらのことより、ＡＧＦホモＫＯマウスでは耐糖能異常が起きていることが判った。血中インスリン濃度は、ＷＴマウスでは、糖負荷によりインスリン濃度が上昇したが、ＡＧＦホモＫＯマウスでは、糖負荷前から血中インスリン濃度が顕著に高値であり、高インスリン血症の状態にあることが判った。これらのことより、ＡＧＦ遺伝子を欠失したＡＧＦホモＫＯマウスでは、糖尿病が惹起されることが判り、ＡＧＦに抗糖尿病作用があることが明らかとなった。【００８３】
《参考例９：マウスＡＧＦとヒトＡＧＦの発現及び精製》
ヒトＡＧＦ及びマウスＡＧＦをWO03/083114号公報（実施例１９）に記載の方法に従って発現し、精製した。すなわち、ＰＣＲにより得られた約１．４ｋｂｐ（ヒト）又は約１．３ｋｂｐ（マウス）のＤＮＡ断片をプラスミドｐｃＤＮＡ−Ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧに挿入して得られた発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞に導入した。ヒトＡＧＦ及びマウスＡＧＦの発現細胞株の培養上清を、抗ＦＬＡＧ−Ｍ２モノクローナル抗体アガロースアフィニティーゲル（ANTI-FLAG
M2 Monoclonal Antibody Agarose Affinity Gel；シグマ社）を用いてアフィニティー精製してヒト及びマウスのリコンビナントＡＧＦタンパク質を得た。【００８４】
《参考例１０：マウスＡＧＦ発現アデノウイルスの作製》
マウスＡＧＦの全長ｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＣＲ２．１−ｍＮｅｗ（WO03/083114号公報の実施例１）を鋳型として、フォワードプライマー（配列番号４５）とリバースプライマー（配列番号４６）を使用してＰＣＲ（ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを用い、９５℃１０分間の後、９４℃１５秒、６０℃３０秒、７２℃２分のサイクルを４５回）を実施した。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）にサブクローニング後、制限酵素ＸｂａＩとＮｏｔＩで切断し、ＸｂａＩとＮｏｔＩで切断したＣ末端ＦＬＡＧ付加型発現ベクターｐＣＥＰ４ｄＥ２−ＦＬＡＧ（WO02/42448号公報の実施例２と同様に作製）に挿入して、ｐＣＥＰｄＥ２−ｍＡＧＦ−ＦＬＡＧを得た。ｐＣＥＰｄＥ２−ｍＡＧＦ−ＦＬＡＧを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号４７）とリバースプライマー（配列番号４８）を使用してＰＣＲ（ＰｙｒｏＢｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを用い、９５℃２分間の後、９８℃２０秒、６０℃３０秒、７２℃１分３０秒のサイクルを２０回、続いて７２℃７分）を実施した。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）にサブクローニング後、制限酵素ＢｇｌIIとＸｈｏＩで切断し生じた約１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を、アデノウイルス作製用シャトルベクターｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶ（Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 95:2509-2514, 1998）のＢｇｌII、ＸｈｏＩ部位に挿入して、ｐＡｄＴｒａｃＫ−ＣＭＶ−ｍＡＧＦを完成させた。このプラスミド又はコントロールとしてｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶ（空ベクター）を用い、ウイルス粒子を調製した。具体的には、以下の方法により調製した。【００８５】
大腸菌ＢＪ５１８３（ストラタジーン社）を、プラスミドｐＡｄＥａｓｙ−１（He
T.-C.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 2509-2514, 1998）でトランスフォームして、プラスミドｐＡｄＥａｓｙ−１を含む大腸菌ＢＪ５１８３［以下、大腸菌ＢＪ５１８３（ｐＡｄＥａｓｙ−１）と称する］を作製した。先に調製したプラスミドｐＡｄＴｒａｃＫ−ＣＭＶ−ｍＡＧＦ又はｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶを制限酵素ＰｍｅＩで切断し、これを用いて大腸菌ＢＪ５１８３（ｐＡｄＥａｓｙ−１）をトランスフォームした。プラスミドｐＡｄＥａｓｙ−１とプラスミドｐＡｄＴｒａｃＫ−ＣＭＶ−ｍＡＧＦ又はｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶとがリコンビネーションしたクローンを選択するために、得られたトランスフォーマントのクローンからプラスミドを調製して、制限酵素ＰａｃＩによる切断パターンを調べた。３ｋｂ又は４．５ｋｂのエキストラバンド（extra
band）が出現するクローンを選択することにより、プラスミドのアーム部位で、デザインどおりにリコンビネーションを起こしたクローンを得た。
得られたウイルス粒子濃度は、WO02/42448号公報の実施例１５と同様の方法で求めた。【００８６】
《参考例１１：アデノウイルスを用いたマウスＡＧＦタンパク質の発現》
参考例１０にて調製したマウスＡＧＦタンパク質発現アデノウイルス及びｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶコントロールアデノウイルスをヒト胎児腎臓細胞株２９３（ATCC番号：CRL-1573）に、細胞１個当たりおよそ１００個のウイルス粒子になるように感染させた。具体的には、Ｉ型コラーゲンでコートした６穴プレート（旭テクノグラス）に３×１０５で２９３細胞を蒔き、２ｍＬの１０％ＦＢＳ／ペニシリン１００ＩＵ／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ／ＤＭＥＭ培地で１晩培養した後、アデノウイルス６×１０７粒子を添加し、１晩培養し、２ｍＬのペニシリン１００ＩＵ／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ／ＤＭＥＭ培地に置換した。感染後２日目に培養上清を回収し、３，０００回転／分で５分間の遠心分離を行い、上清をゲル濃度４−２０％のグラジェントゲル（第一化学薬品）でＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を実施した。一次抗体として抗マウスＡＧＦ抗体（WO03/083114号公報の実施例５）、二次抗体として西洋わさびパーオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（Biosource社）を用いたウエスタンブロッティングを行った。コントロールアデノウイルスにより感染させた上清をサンプルとした場合には検出されず、マウスＡＧＦタンパク質発現アデノウイルスにより感染させた上清をサンプルとした場合にのみ、予想されるマウスＡＧＦ分子量にバンドが検出され、参考例１０で作製したマウスＡＧＦタンパク質発現アデノウイルスにより、参考例１１の方法でマウスＡＧＦタンパク質が発現されることがわかった。【００８７】
《参考例１２：ヒトＡＧＦ発現アデノウイルスの作製》
ヒトＡＧＦの全長ｃＤＮＡを含有するプラスミド（WO03/083114号公報の実施例１８で作製；以下、ｐＣＲ２．１−ｈＮｅｗ）を鋳型として、フォワードプライマー（配列番号４９）とリバースプライマー（配列番号５０）を使用してＰＣＲ（ＰｙｒｏＢｅｓｔＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）を用い５％ホルムアミド存在下で９８℃２０秒、６４℃３０秒、７４℃３分のサイクルを３５回繰り返した）を実施した。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）にサブクローニング後、制限酵素ＨｉｎｄIIIとＸｈｏＩで切断し、ＨｉｎｄIIIとＸｈｏＩで切断したｐＣＥＰ４（Invitrogen）に挿入して、ｐＣＥＰ−ｈＡＧＦを得た。ｐＣＥＰ−ｈＡＧＦを制限酵素ＫｐｎＩ及びＭｌｕＩで切断し生じた約０．４３ｋｂｐのＤＮＡ断片、全長ヒトＡＧＦ  ｃＤＮＡを含む発現プラスミド（WO03/083114号公報の実施例１９で作製；以下、ｐｃＤＮＡ−ＳＦ−ｈＡＧＦ）を制限酵素ＭｌｕＩ及びＸｈｏＩで切断し生じた約０．９８ｋｂｐのＤＮＡ断片を、アデノウイルス作製用シャトルベクターｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶ（Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 95:2509-2514, 1998）のＫｐｎＩ、ＸｈｏＩ部位に挿入して、ｐＡｄＴｒａｃＫ−ＣＭＶ−ｈＡＧＦを完成させた。このプラスミド又はコントロールとしてｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶを用い、WO02/42448号公報の実施例１４及び実施例１５と同様の方法でｐＡｄＥａｓｙシステム（Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 95:2509-2514, 1998）を利用して、ウイルス粒子を調製した。得られたウイルス粒子濃度は、WO02/42448号公報の実施例１５と同様の方法で求めた。【００８８】
《参考例１３：アデノウイルスを用いたヒトＡＧＦタンパク質の発現》
参考例１０及び参考例１２にて調製したヒトＡＧＦタンパク質発現アデノウイルス及びｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶコントロールアデノウイルスをヒト胎児腎臓細胞株２９３に、参考例１１と同様の方法で感染させ培養上清を得た。一次抗体として実施例１で作製した抗ＳＦ−ＹＰ−０３０  ＩｇＧを使用すること以外は参考例１１と同じ方法を用いて、培養上清中のヒトＡＧＦタンパク質発現を検出した。その結果、コントロールアデノウイルスにより感染させた上清をサンプルとした場合には検出されず、ヒトＡＧＦタンパク質発現アデノウイルスにより感染させた上清をサンプルとした場合にのみ、予想されるヒトＡＧＦ分子量にバンドが検出され、参考例１２で作製したヒトＡＧＦタンパク質発現アデノウイルスにより、参考例１３の方法でヒトＡＧＦタンパク質が発現されることがわかった。【００８９】
《参考例１４：高脂肪食負荷マウスへのマウスＡＧＦ発現アデノウイルス投与》
雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（クレア社）に８週齢から高脂肪食（high fat
diet 32；クレア社）を与えた。高脂肪食負荷マウスは体重が増加し、本試験のウイルス投与時である３８週齢時で約５４ｇと、肥満となった。これらのマウス各４匹に、参考例１０で作製した、マウスＡＧＦ発現アデノウイルス（ｍＡＧＦ−Ａｄｅｎｏ）又はコントロールアデノウイルス（Ｃｏｎｔ−Ａｄｅｎｏ）を、５×１０９ＰＦＵ／マウス／週ずつ、尾静脈注射にて投与した。最初にアデノウイルスを投与してから１２日後の体重が、ｍＡＧＦ−Ａｄｅｎｏ投与マウスで、平均７．３ｇ減少し、Ｃｏｎｔ−Ａｄｅｎｏ投与マウスで１．４ｇ減少した。ｍＡＧＦ−Ａｄｅｎｏ投与マウスでは、ＡＧＦ遺伝子を持つウイルスを投与することで生体内でＡＧＦタンパク質が発現して、このＡＧＦタンパク質が体重減少を引き起こしたことが判った。【００９０】
更にこれらのマウスを用いて、糖代謝試験を実施した。これらのマウスを１６時間絶食後、０．４ｇ／ｋｇのＤ−グルコースを腹腔内注射（ｉｐ）により投与し、投与前、並びに投与後１５、３０、６０、９０、及び１２０分後に眼静脈より採血した。グルテストエース（三和化学研究所）を用いて血糖値を測定した。その結果を図１５に示す。
ｍＡＧＦ−Ａｄｅｎｏ投与マウスは、グルコース投与後のすべての時間においてＣｏｎｔ−Ａｄｅｎｏ投与マウスよりも血糖値が低く、耐糖能が改善していることが明らかとなった。すなわち、ｍＡＧＦ−Ａｄｅｎｏ投与マウスで高発現されたＡＧＦタンパク質の作用により、耐糖能が改善されたことが明らかとなった。【００９１】
《参考例１５：高脂肪食負荷によるＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの血中インスリン及び脂質濃度》
６週齢のＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス（参考例２）及びリターメイトＷＴマウス（雌）を、高脂肪食で１２週間飼育した。眼静脈より採血し、インスリンイムノアッセイ（栄研化学）を用いて血漿中インスリン濃度を、Ｌタイプワコー  コレステロール（和光純薬）を用いて血清コレステロール濃度を、及びＮＥＦＡ  Ｃ−テストワコー（和光純薬）を用いて血清遊離脂肪酸濃度を、各キットに添付のプロトコールに従って測定した。結果を図１６（血漿中インスリン濃度、ｎｇ／ｍＬ）、図１７（血清コレステロール濃度、ｍｇ／ｄＬ）、図１８（血清遊離脂肪酸濃度、μＥｑ／Ｌ）に示す。
その結果、インスリン濃度、コレステロール濃度、遊離脂肪酸濃度の何れも、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス（ＴＧ）の方が、リターメイトＷＴマウス（ＮＴＧ）よりも低いことがわかった。このことより、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスで高発現されたＡＧＦタンパク質の作用により、インスリン感受性が亢進したこと、脂質代謝が改善したことが明らかとなった。【００９２】
《参考例１６：ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの糖代謝試験》
ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス（参考例２）の糖負荷試験を行い、ＡＧＦによる耐糖能改善効果を調べた。４ヶ月齢の雌のＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスを１６時間絶食後、１ｇ／ｋｇのＤ−グルコースを腹腔内注射（ｉｐ）により投与し、投与前、並びに投与後１５、３０、６０、及び１２０分後に眼静脈より採血した。グルテストエース（三和化学研究所）を用いて血糖値を測定した。結果を図１９に示す。
ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスは、グルコース投与後のすべての時間においてリターメイトＷＴマウスよりも血糖値が低く、耐糖能が改善していることが明らかとなった。すなわち、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスで高発現されたＡＧＦタンパク質の作用により、耐糖能が改善されたことが明らかとなった。【００９３】
次に、４ヶ月齢の雌のＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスに、０．７５単位／ｋｇのインスリンを腹腔内投与した。インスリン投与後、２０、４０、及び６０分後に眼静脈より採血し、グルテストエース（三和化学研究所）を用いて血糖値を測定した。インスリン投与前の血糖値に対する、投与後の血糖値の割合を図２０に示す。
ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスはインスリン投与後すべての時間においてリターメイトＷＴマウスよりも血糖値の低下が大きく、インスリン感受性が亢進していたことが判った。すなわち、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスで高発現されたＡＧＦタンパク質の作用により、インスリン感受性が亢進したことが明らかとなった。【００９４】
《参考例１７：Ｋ１４−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの体重及び脂肪重量変化》
Ｋ１４プロモーター制御下にＡＧＦを強制発現させたＴｇマウス（WO03/083114号公報の実施例８）を作製した。
このマウスは、表皮細胞からＡＧＦタンパク質を高発現し、発現したＡＧＦの作用により血管新生、組織再生が引き起こされることが判っている。全身にＡＧＦを高発現したマウスを用いて参考例４、参考例５、及び参考例１６で示したのと同様に、表皮細胞で高発現されたＡＧＦが抗肥満、及び抗糖尿病の作用を示すことを確認した。【００９５】
８ヶ月齢雌のＫ１４−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウス各５匹の体重を測定したところ、Ｋ１４−ＡＧＦ  Ｔｇマウスは平均約２１ｇであり、リターメイトＷＴマウスの平均約３１ｇと比べて、体重が減少していることが明らかとなった。次に、Ｋ１４−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスの横隔膜から腹腔の最下部までの領域を２ｍｍ間隔で、実験動物用Ｘ線ＣＴ（アロカ社）で撮影し、内臓脂肪組織重量及び皮下脂肪組織重量を計測した。結果を図２１（内臓脂肪組織重量）及び図２２（皮下脂肪組織重量）に示す。
内臓脂肪及び皮下脂肪共にＫ１４−ＡＧＦ  ＴｇマウスのほうがリターメイトＷＴマウスに比べて、顕著に脂肪組織重量が減少していることが明らかとなった。すなわち、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの場合と同様に、発現したＡＧＦに抗肥満作用、及び脂肪組織を減少する作用があることが判った。【００９６】
《参考例１８：Ｋ１４−ＡＧＦ  Ｔｇマウスのインスリン感受性試験》
Ｋ１４−ＡＧＦ  Ｔｇマウスのインスリン感受性を調べた。８ヶ月齢雌のＫ１４−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスに、０．７５単位／ｋｇのインスリンを腹腔内投与した。インスリン投与後、２０、４０、６０、８０、及び１００分後に眼静脈より採血し、グルテストエース（三和化学研究所）を用いて血糖値を測定した。インスリン投与前の血糖値に対する、投与後の血糖値の割合を図２３に示す。
Ｋ１４−ＡＧＦ  Ｔｇマウスはインスリン投与後すべての時間においてリターメイトＷＴマウスよりも血糖値の低下が大きく、インスリン感受性が亢進していたことが判った。すなわち、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスで高発現されたＡＧＦタンパク質の作用により、インスリン感受性が亢進したことが明らかとなった。【００９７】
《参考例１９：高脂肪食負荷マウスへのヒトＡＧＦ発現アデノウイルス投与》
参考例１４では、マウスＡＧＦの体重減少抑制作用及び耐糖能改善作用を示した。そこで、ヒトＡＧＦに同様の作用があることを以下の試験を実施することで確認した。参考例１２で作製したヒトＡＧＦ発現アデノウイルス（ｈＡＧＦ−Ａｄｅｎｏ）及びコントロールアデノウイルス（Ｃｏｎｔ−Ａｄｅｎｏ）を各３匹のマウスに、参考例１４と同様に投与したところ、１３日後の体重が、ｈＡＧＦ−Ａｄｅｎｏ投与マウスで平均４．６ｇ減少し、Ｃｏｎｔ−Ａｄｅｎｏ投与マウスで平均０．１ｇ増加した。更に、腹腔内注射したＤ−グルコースが０．５ｇ／ｋｇ、投与後の採血を３０、６０、９０、及び１２０分後に行ったこと以外は、参考例１４と同様に糖代謝試験を実施したところ、図２４に示すように、ｈＡＧＦ−Ａｄｅｎｏ投与マウスは、グルコース投与後の全ての時間においてＣｏｎｔ−Ａｄｅｎｏ投与マウスよりも血糖値が低く、耐糖能が改善していることが明らかになった。すなわち、ｈＡＧＦ−Ａｄｅｎｏ投与マウスで高発現されたｈＡＧＦタンパク質の作用により、体重減少が引き起こされたこと、及び耐糖能が改善されたことが明らかとなった。【００９８】
《実施例１：抗ヒトＡＧＦ抗体作製》
前記参考例９で作製した全長ヒトＡＧＦ精製タンパク質を、ウサギに免疫して抗体を得た。初回免疫に５００μｇ、２回目〜４回目の免疫に２５０μｇを使用して２週間毎に免疫した。最終免疫後２週間目に、全採血により抗血清を得た。抗血清をプロテインＡカラム（アマシャムバイオサイエンス）を用いて精製し、ＩｇＧ抗体（以下、抗ＳＦ−ＹＰ−０３０  ＩｇＧ）を得た。【００９９】
ヒトＡＧＦの部分配列であるペプチド（配列番号３）のＮ末端にＣｙｓ残基を付加したペプチド（配列番号４）（以下、ペプチドＡ）を合成及び精製した。ペプチドＡをキャリアタンパク質のウシサイログロブリン（シグマ社）に結合して抗原を作製し、１００μｇのペプチドを２週間毎に、合計８回ウサギに免疫した。最終免疫後１週間目に全採血を行い、血清を得た。ペプチドＡでアフィニティーカラムを作製した。アフィニティーカラムを用いて血清をアフィニティー精製し、ペプチドＡに結合するＩｇＧ抗体（以下、抗ＹＰ−０３０−Ａ  ＩｇＧ）を得た。抗体の濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定して、分子吸光係数を１．３８として求めた。【０１００】
《実施例２：抗ＳＦ−ＹＰ−０３０  ＩｇＧのＨＲＰ標識》
０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液に透析した抗ＳＦ−ＹＰ−０３０  ＩｇＧに、攪拌しながら、ペプシン（シグマ）を添加し、３７℃で１時間反応して抗体を部分切断した。反応液を０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １６／６０ＨＲカラム（アマシャムバイオサイエンス）を用いたゲルろ過によりＦ（ａｂ’）２を採取した。得られたＦ（ａｂ’）２に２−メルカプトエチルアミン塩酸塩（ナカライテスク）を添加後３７℃で９０分間反応して還元し、ＵＬＴＲＯＧＥＬ  ＡＣＡ５４カラム（BIOSEPRA社）を用いたゲルろ過によりＦａｂ’を採取した。架橋剤ＥＭＣＳ［N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimide；DOJINDO社］と西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ；東洋紡）を混合し、３７℃６０分間反応させ、０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＰ６−ＤＧカラム（BIORAD社）を用いたゲルろ過によりＥＭＣＳとＨＲＰのコンジュゲート画分（以下、ＥＭＣＳ−ＨＲＰ）を採取した。続いて、Ｆａｂ’とＥＭＣＳ−ＨＲＰを混合し４℃１６時間反応させた後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １６／６０ＨＲカラムを用いたゲルろ過にてＦａｂ’とＨＲＰとの結合画分を採取し、ＨＲＰ標識抗ヒトＡＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント（ＨＲＰ−抗ＳＦ−ＹＰ−０３０  Ｆａｂ’）を得た。抗体の濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定して、分子吸光係数を１．３８として求めた。【０１０１】
《実施例３：ヒトＡＧＦ検出ＥＬＩＳＡ系構築》
実施例１で作製した抗ＹＰ−０３０−Ａ  ＩｇＧを２０μｇ／ｍＬで、ＥＬＩＳＡ用マイクロプレート（NUNC社）に１００μＬ／ウェル入れ、４℃で一晩静置した。ウェル内の溶液を吸引除去し、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）で２回洗浄後、ブロッキング液（１％ＢＳＡ、０．０５％ＮａＮ３、ＰＢＳ）を３００μＬ／ウェル添加し、４℃で一晩静置し、ブロッキングした。洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０添加１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液）で２回洗浄後、標準ヒトＡＧＦ精製タンパク質を希釈液（１％ＢＳＡ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で１００〜０．３９ｎｇ／ｍＬまで２倍連続希釈し、１００μＬ／ウェルずつ添加し、３７℃で１時間反応した。洗浄液で７回洗浄後、実施例２で作製したＨＲＰ標識抗体（ＨＲＰ−抗ＳＦ−ＹＰ−０３０  Ｆａｂ’）を希釈液で１μｇ／ｍＬに調製し、１００μＬ／ウェルずつ添加後、３７℃で０．５時間反応した。洗浄液で９回洗浄後、ＴＭＢＺ基質液（IBL社）を１００μＬ／ウェルずつ添加後、室温で３０分間反応した。反応停止液（１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）を１００μＬ／ウェル添加し、発色反応を停止した。吸光光度計（スペクトラマックス）を用いてＡ４５０ｎｍでの吸光度を測定した。スペクトラマックスに添付のプログラムを用いて解析したところ、直線性が得られる濃度領域があり、検量線を作成することができた。以上のようにしてヒトＡＧＦを検出するＥＬＩＳＡ系を構築することができた。【０１０２】
《実施例４：細胞培養上清中及びヒト血清中のＡＧＦタンパク質濃度測定》
参考例１３にて、Ａｄｅｎｏ−ＡＧＦ又はＡｄｅｎｏ−Ｃｏｎｔを感染させた２９３細胞の培養上清中のＡＧＦタンパク質量を測定した。各培養上清を希釈液で２〜３２倍希釈し、前記ＥＬＩＳＡ系を用いて標準ヒトＡＧＦ精製タンパク質の添加時に、サンプルとして培養上清を添加することによって、サンプル中のヒトＡＧＦ濃度を測定した。その結果、Ａｄｅｎｏ−Ｃｏｎｔを感染させた細胞の培養上清からはＡＧＦタンパク質は検出されなかったが、Ａｄｅｎｏ−ＡＧＦを感染させた細胞の培養上清からは、約６４０μｇ／ｍＬの濃度のＡＧＦタンパク質が検出された。【０１０３】
また、ヒト血清（ケミコン社）を希釈液で２０倍希釈して、前記ＥＬＩＳＡ系を用いて標準ヒトＡＧＦ精製タンパク質の添加時に、サンプルとしてヒト血清を添加することによって、血清中のＡＧＦ濃度を調べた。その結果、ＡＧＦタンパク質がＥＬＩＳＡにて検出されて、血清中のＡＧＦ濃度は約１００ナノグラム／ｍＬであることが判った。【０１０４】
以上のように、実施例３で構築したＥＬＩＳＡ系は、サンプル中のヒトＡＧＦ濃度の測定に利用可能であることがわかった。従って、試験物質を接触させた細胞の培養上清又は細胞溶解液をサンプルとして用いて本ＥＬＩＳＡ系によりサンプル中のＡＧＦ濃度を測定することにより、ＡＧＦ発現亢進剤（すなわち、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬）をスクリーニングすることができる。【０１０５】
《実施例５：ヒトＡＧＦフィブリノージェンドメインタンパク質の発現及び精製》
ヒトＡＧＦフィブリノージェンドメイン（以下、ｈＡＧＦ−Ｆｇと記す）タンパク質を抗体作製の免疫原として利用するために、ｈＡＧＦ−Ｆｇの発現ベクターを構築した。まず、ｐｃＤＮＡ３．１−ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧ（WO01/34785の実施例７−１)のクローニングサイトであるＢａｍＨＩサイトの位置を、挿入するｃＤＮＡの直前となるように改良したベクターｐｃＤＮＡ３．１−ＳＦ−Ｂａｍを作製した。すなわち、オリゴヌクレオチド（配列番号５３）とオリゴヌクレオチド（配列番号５４）をプライマーとして用い、市販キット（Quickchange
Site-Directed Mutagenesis Kit；ストラタジーン社）を使用して、ｐｃＤＮＡ３．１−ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧを鋳型として、添付文書に従ってｐｃＤＮＡ３．１−ＳＦ−Ｂａｍを作製した。【０１０６】
次に、ヒトＡＧＦの全長ｃＤＮＡを含有するプラスミドｐｃＤＮＡ−ＳＦ−ｈＡＧＦ（参考例１２参照）を鋳型とし、ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社）を用い、９５℃１０分、続いて、９４℃１５秒、５５℃１分、及び７２℃１分３０秒のサイクルを４０回繰り返すＰＣＲを行った。この際のプライマーとして、配列番号５５及び配列番号５６を用いた。生成した断片を一度ｐＺＥｒＯ２．１（インビトロジェン社）のＥｃｏＲＶ部位にサブクローンした後、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで切断し、生成した約０．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をｐｃＤＮＡ３．１−ＳＦ−ＢａｍのＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ部位に挿入することによりｈＡＧＦ−Ｆｇの発現プラスミドを完成させた。【０１０７】
続いて、この発現プラスミドを、トランスフェクション試薬（FuGENETM6
Transfection Reagent；ロシュ社）を用いて、添付指示書に従い、ヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ２９３細胞（インビトロジェン社）に導入した。プラスミド導入の翌日に１ｍｇ／ｍＬジェネティシン含有の培地に置換して培養を継続し、薬剤耐性の安定発現株（以下、２９３／ｈＡＧＦＦｇ）を得た。【０１０８】
２９３／ｈＡＧＦＦｇを、タイプＩコラーゲンでコートしたローラーボトル（コーニング社）で、培養培地（１０％ＦＢＳ，ＤＭＥＭ，及び抗生物質）を用いてコンフルエントになるまで培養した。無血清培地に置換して、４日間培養し、培養上清を回収した。培養上清を遠心後、フィルトレーションし、Ｍ２アフィニティーゲル（シグマ社）を用いてアフィニティー精製した。精製タンパク質を０．１％ＣＨＡＰＳ含有５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に透析し、陰イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰカラム）に吸着させ、０〜２５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ濃度勾配で分離精製した。得られたｈＡＧＦ−Ｆｇタンパク質画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＣＢＢ（Coomassie brilliant blue）染色し、高純度のｈＡＧＦ−Ｆｇタンパク質が得られたことを確認した。市販キット（Micro
BCA Protein Assay Kit；ピアス社）を用いてタンパク質濃度を定量した。【０１０９】
《実施例６：抗ｈＡＧＦ−Ｆｇ抗体作製》
精製ｈＡＧＦ−Ｆｇタンパク質を抗原として用いて、常法によりモノクローナル抗体（抗ｈＡＧＦＦｇＭｏＡｂ）産生クローンを得た。すなわち、精製ｈＡＧＦ−Ｆｇタンパク質に同量のフロイドコンプリートアジュバント（Freund’s Complete Adjuvant；DIFCO社）を加えて作製したエマルジョンを、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに、タンパク質量として５０μｇ／マウスとなるように皮下及び皮内に注射した。以後７日間毎に、合計４回免疫した。４回免疫後の４日後に尾静脈より試採血して血清を得た。ｈＡＧＦ−Ｆｇタンパク質に対する血清の結合活性を調べて、力価が上昇していることを確認した。試採血８日後に、上記と同様の方法で最終免疫を行い、その４日後に脾臓を採取して細胞融合に用いた。脾臓細胞とＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（ATCC社）をポリエチレングリコールを用いて細胞融合し、ＨＡＴ選択培地にて９６ウェルプレートで培養した。培養上清を用いてｈＡＧＦ−Ｆｇタンパク質に対する結合活性を調べ、陽性ウェルを選択した。結合活性は次の方法で調べた。ｈＡＧＦ−Ｆｇタンパク質を５０ｎｇ／ｍＬで、ＥＬＩＳＡ用マイクロプレート（NUNC社）に５０μＬ／ウェル入れ、４℃で一晩静置した。ウェル内の溶液を吸引除去し、ＰＢＳで２回洗浄後、ブロッキング液（０．１％ＢＳＡ，０．０５％ＮａＮ３，ＰＢＳ）を２００μＬ／ウェル添加し、４℃で一晩静置し、ブロッキングした。洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０添加１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液）で２回洗浄後、ハイブリドーマの培養上清を希釈用緩衝液（０．１％ＢＳＡ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で２倍希釈し、５０μＬ／ウェルずつ添加し、３７℃で１時間反応した。洗浄液で４回洗浄後、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Biosource社）を希釈用緩衝液で５０００倍希釈し、５０μＬ／ウェルずつ添加後、３７℃で０．５時間反応した。洗浄液で６回洗浄後、基質用緩衝液［Ｋ２ＨＰＯ４−クエン酸緩衝液（０．０３％Ｈ２Ｏ２）ｐＨ５．１］で溶解したオルトフェニレンジアミン（OPD Tablet；シグマ社）を１００μＬ／ウェルずつ添加後、室温で１５分間反応した。反応停止液（１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）を１００μＬ／ウェル添加し、発色反応を停止した。吸光光度計を用いてＡ４９０ｎｍでの吸光度を測定した。【０１１０】
選択したウェルの細胞を限界希釈法により１次クローニングした。上記と同様にｈＡＧＦ−Ｆｇタンパク質に対する結合活性を調べ、陽性ウェルを選択した。
得られた各クローンを大量培養して、培養上清から抗マウスＩｇＧアガロースビーズ（American
Qualex社）を用いてＩｇＧ抗体を精製した。ＩｇＧ抗体溶液の２６０ｎｍの吸光度を測定して、分子吸光係数を１．３としてタンパク質濃度を求めた。【０１１１】
《実施例７：ヒトＡＧＦ検出ＥＬＩＳＡ系構築》
実施例６で作製したＩｇＧ抗体（抗ｈＡＧＦＦｇＭｏＡｂ  ＃７Ａ）を２．５μｇ／ｍＬとなるように５０ｍｍｏｌ／Ｌ炭酸バッファー（ｐＨ９．６）に希釈して、ＥＬＩＳＡ用マイクロプレート（NUNC社）に１００μＬ／ウェル入れ、４℃で一晩静置した。ウェル内の溶液を吸引除去し、ＰＢＳで２回洗浄後、ブロッキング液（１％ＢＳＡ，ＰＢＳ）を３００μＬ／ウェル添加し、４℃で一晩静置し、ブロッキングした。洗浄液（０．０２％ＣＨＡＰＳ添加ＰＢＳ）で２回洗浄後、標準ヒトＡＧＦ精製タンパク質を希釈液（１％ＢＳＡ，０．０２％ＣＨＡＰＳ含有ＰＢＳ）で３０〜０．３ｎｇ／ｍＬまで連続希釈し、１００μＬ／ウェルずつ添加し、室温で１．５時間反応した。洗浄液で５回洗浄後、実施例１で作製した１次抗体「抗ＹＰ−０３０−Ａ  ＩｇＧ」を希釈液で１．５μｇ／ｍＬに調製し、１００μＬ／ウェルずつ添加後、室温で１時間反応した。洗浄液で５回洗浄後、ＨＲＰ標識した２次抗体（HRP標識Anti-rabbit
IgG；ＭＢＬ社）を希釈液で２０００倍希釈し、１００μＬ／ウェルずつ添加後、室温で１時間反応した。洗浄液で５回洗浄後、基質反応液（R&D社）を１００μＬ／ウェルずつ添加後、室温で２０分間反応した。反応停止液（１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）を１００μＬ／ウェル添加し、発色反応を停止した。吸光光度計（サファイア；ＴＡＣＡＮ社）を用いてＡ４５０ｎｍでの吸光度を測定した。その結果、直線性を有する検量線を作成することができた。以上のように、ヒトＡＧＦフィブリノージェンドメインに対するモノクローナル抗体を用いても、ヒトＡＧＦを検出するＥＬＩＳＡ系の構築が可能であった。【０１１２】
《実施例８：抗マウスＡＧＦ抗体作製》
マウスＡＧＦの部分配列であるペプチド（配列番号５及び配列番号２６）のＣ末端及びＮ末端にＣｙｓ残基をそれぞれ付加したペプチド（配列番号２７及び配列番号２８）を合成及び精製し、ペプチドＹＰ−１２６及びＹＰ−１２７−Ｂを得た。各ペプチドをキャリアタンパク質のウシサイログロブリン（シグマ社）に結合して抗原を作製し、１００μｇのペプチドを２週間毎に、合計８回ウサギに免疫した。最終免疫後１週間目に全採血を行い、血清を得た。各ペプチドでアフィニティーカラムを作製した。アフィニティーカラムを用いて血清をアフィニティー精製し、ペプチドＹＰ−１２６に対するＩｇＧ抗体（以下、抗ＹＰ−１２６  ＩｇＧ）及びペプチドＹＰ−１２７−Ｂに対するＩｇＧ抗体（以下、抗ＹＰ−１２７−Ｂ  ＩｇＧ）を得た。【０１１３】
《実施例９：抗ＹＰ−１２６  ＩｇＧのＨＲＰ標識》
実施例８の抗ＹＰ−１２６  ＩｇＧと実施例２と同様に作製したＥＭＣＳ−ＨＲＰとを反応させ、ゲルろ過にてＨＲＰにより標識された抗体画分を採取し、ＨＲＰ−抗ＹＰ−１２６  ＩｇＧと名づけた。【０１１４】
《実施例１０：マウスＡＧＦ検出ＥＬＩＳＡ系の構築》
実施例８で作製した抗ＹＰ−１２７−Ｂ  ＩｇＧを２０μｇ／ｍＬで、ＥＬＩＳＡ用マイクロプレート（NUNC社）に１００μＬ／ウェル入れ、４℃で一晩静置した。ウェル内の溶液を吸引除去し、ＰＢＳで２回洗浄後、ブロッキング液を３００μＬ／ウェル添加し、４℃で一晩静置し、ブロッキングした。洗浄液で２回洗浄後、標準マウスＡＧＦ精製タンパク質を希釈液で１００〜０．３９ｎｇ／ｍＬまで２倍連続に希釈し１００μＬ／ウェルずつ添加し、３７℃で１時間反応した。洗浄液で７回洗浄後、実施例９で作製したＨＲＰ標識抗体（ＨＲＰ−抗ＹＰ−１２６  ＩｇＧ）を希釈液で１μｇ／ｍＬに調製し、１００μＬ／ウェルずつ添加後、３７℃で０．５時間反応した。洗浄液で９回洗浄後、ＴＭＢＺ基質液（IBL社）を１００μＬ／ウェルずつ添加後、室温で３０分間反応した。反応停止液（１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）を１００μＬ／ウェル添加し、発色反応を停止した。吸光光度計（スペクトラマックス）を用いてＡ４５０ｎｍでの吸光度を測定した。なお、ブロッキング液、洗浄液及び希釈液は、実施例３と同じものを用いた。スペクトラマックスに添付のプログラムを用いて、標準曲線を描き、直線性が得られた濃度領域で、検量線を作成することができた。以上のようにしてマウスＡＧＦを検出するＥＬＩＳＡ系を構築することができた。【０１１５】
《実施例１１：３Ｔ３−Ｌ１の脂肪細胞への分化》
１０％ウシ血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養したマウス３Ｔ３−Ｌ１細胞（ATCC番号：CL-173）の脂肪細胞への分化法は、基本的に、公知の方法（江崎ら、医学のあゆみ、503-506、1998）に従った。なお、３Ｔ３−Ｌ１細胞は、白色脂肪細胞のモデル細胞としてよく使われるマウス由来の培養細胞株である。
３Ｔ３−Ｌ１細胞を２４穴コラーゲンコートプレート（旭テクノグラス社）に１穴当たり５００００個になるように撒き、ほぼコンフルエントとなった後に、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ−３−イソブチル−１−メチルキサンチン、０．２５μｍｏｌ／Ｌデキサメタゾン、及び１０μｇ／ｍＬインスリンを添加した１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に培地を変更し、脂肪細胞への分化を開始した。更に２日後、培地を１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭに変更し、その後、２日おきに培地を入れ替え、分化誘導を開始した。分化誘導開始後６日目から８日目までの培養上清を回収し、脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１の培養上清とした。【０１１６】
《実施例１２：鋳型ｃＤＮＡの調製》
２４穴コラーゲンコートプレート（旭テクノグラス社）にＣ２Ｃ１２細胞（ATCC番号：CRL-1772）を１穴あたり２００００個になるように撒き、１５％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で１昼夜培養した。翌日にインスリン（Biomedical
Technologies Inc社）を終濃度１００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度で添加、あるいは培地を上記方法で取得した３Ｔ３−Ｌ１培養上清に変更し、そのまま４８時間培養した。対照群としては、Ｃ２Ｃ１２細胞を刺激剤を加えない１５％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）でそのまま４８時間培養した。各処理群からＲＮｅａｓｙミニキット（RNeasy
Mini Kit；キアゲン社）を用いて添付文書に従いトータルＲＮＡを調製し、各群５００ｎｇをサーモスクリプトＲＴ−ＰＣＲシステムキット（インビトロジェン社）を用いてｃＤＮＡに変換した。【０１１７】
《実施例１３：定量ＰＣＲによるＣ２Ｃ１２細胞におけるＡＧＦ遺伝子発現量の測定》
マウスＡＧＦ増幅プライマーとして配列番号２９で表される塩基配列からなるＤＮＡ及び配列番号３０で表される塩基配列からなるＤＮＡを、鋳型として実施例１２で得たＣ２Ｃ１２細胞培養上清由来の各ｃＤＮＡを用い、シークエンスディテクター（ABI PRISM 7900；Applied Biosystems社）を用いて、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるＡＧＦ遺伝子発現量の測定を定量ＰＣＲで行った。ＰＣＲはＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ  ＰＣＲマスターミックス（SYBR
GREEN PCR Master Mix；Applied Biosystems社）を用い、９５℃、１０分間の反応のあと、９５℃、１５秒、６０℃、１分のサイクルを５０回繰り返した。また内部標準としてマウスサイクロフィリンの発現量を算出するため、上記ｃＤＮＡを鋳型として、配列番号３１で示されるオリゴヌクレオチドと配列番号３２で示されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして同条件のＰＣＲを行った。また、マウスゲノム（クロンテック社）を鋳型として、上記マウスＡＧＦ及びサイクロフィリンのプライマーセットを用いた同条件のＰＣＲを行い、ｍＲＮＡ発現量算出の標準曲線を得た。各サンプルにおけるＡＧＦの発現量は、サイクロフィリンの発現量で補正することにより算出した。その結果、Ｃ２Ｃ１２細胞において、刺激剤がない場合に比べ、ＡＧＦは、インスリンにより約６倍に発現が誘導され、また脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１培養上清により約８倍に発現が誘導されることが判明した。【０１１８】
以上により、試験物質を接触させたＣ２Ｃ１２細胞の培養上清から調製したｃＤＮＡを鋳型として定量ＰＣＲを行うことにより、ＡＧＦ発現亢進薬（すなわち抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬）をスクリーニングすることができることがわかった。【０１１９】
《実施例１４：マウスＡＧＦプロモーター領域のクローニング及びレポータープラスミド構築》
マウスＡＧＦプロモーター領域としてエキソン１上流の約５．６ｋｂの長さの領域をクローニングするために、フォワードプライマー（配列番号３３）、リバースプライマー（配列番号３４）を利用し、マウスＢＡＣクローン（RP23-369H22；Children’s Hospital Oakland）を鋳型にし、ＤＮＡポリメラーゼ（TaKaRa Ex
taqTM；宝酒造社）を用い、９４℃５分間の後、９４℃１分、５８℃１分３０秒間、及び７２℃３分間のサイクルを３２回、続いて７２℃１０分間の条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をクローニングベクター（pGEMR-T
Easy Vector Systems；プロメガ社）にサブクローニングしてｐＧＥＭ−５．６ｋｂを得た。ＤＮＡシーケンス試薬（BigDye3.1；アプライドバイオシステムズ）を用い、添付の説明書に従い、ＤＮＡシーケンサー（モデルPRISM3700；アプライドバイオシステムズ）を用いて、ＤＮＡ配列を解析し、配列番号１で表される塩基配列における第１番〜第５５７２番の塩基配列を決定した。【０１２０】
エキソン１上流約２．８ｋｂのＸｈｏＩサイトより更に上流の約０．５ｋｂ，約０．９ｋｂ，約１．４ｋｂ，約２ｋｂ，約２．１５ｋｂ，及び約２．５ｋｂのフラグメントを下記のプライマーを用い、ｐＧＥＭ−５．６ｋｂを鋳型としてＰＣＲ（ＤＮＡポリメラーゼＴａＫａＲａ  Ｅｘ  ｔａｑを用い、９４℃５分間の後、９４℃１分、６０℃２分、７２℃２分のサイクルを２５回、続いて７２℃１０分間）を行い作製した。最終的にエキソン１上流約２．８ｋｂの先につなげて各々約３．３ｋｂ，約３．７ｋｂ，約４．２ｋｂ，約４．８ｋｂ，約５ｋｂ，及び約５．３ｋｂのフラグメントを作製するためである。【０１２１】
【表１】
2006059691.tif 000002
【０１２２】
ＰＣＲで得られた各断片をクローニングベクター（pGEMR-T
Easy Vector Systems；プロメガ社）に各々サブクローニングし、プラスミド３．３ｋｂ，プラスミド３．７ｋｂ，プラスミド４．２ｋｂ，プラスミド４．８ｋｂ，プラスミド５ｋｂ，及びプラスミド５．３ｋｂを得た。
ｐＧＥＭ５．６ｋｂを制限酵素ＢａｍＨＩで処理し、得られた配列番号１の第１６番〜第５５７２番を含む断片を、制限酵素ＢｇｌIIで処理したルシフェラーゼアッセイシステム用ベクターｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（プロメガ社）に挿入し、ｐＧＬ−５．６ｋｂ及びｐＧＬ−５．６ｋＲを得た。ｐＧＬ５．６ｋｂは、インサートが正方向に挿入されて挿入したプロモーター配列の下流（３’側）にルシフェラーゼ遺伝子が存在し、ｐＧＬ５．６ｋＲは、インサートが逆方向に挿入されて挿入したプロモーター配列の上流（５’側）にルシフェラーゼ遺伝子が存在する。ｐＧＥＭ５．６ｋｂを制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍＨＩで処理し、得られた配列番号１の第２７４１番〜第５５７２番を含む断片を、制限酵素ＸｈｏＩとＢｇｌIIで処理したｐＧＬ３−ｂａｓｉｃに挿入し、ｐＧＬ−２．８ｋｂを得た。ｐＧＥＭ５．６ｋｂを制限酵素ＫｐｎＩとＢａｍＨＩで処理し、得られた配列番号１の第５１２１番〜第５５７２番を含む断片を、制限酵素ＫｐｎＩとＢｇｌIIで処理したｐＧＬ３−ｂａｓｉｃに挿入し、ｐＧＬ−０．５ｋｂを作製した。次にサブクローニングしたプラスミド３．３ｋｂ，プラスミド３．７ｋｂ，プラスミド４．２ｋｂ，プラスミド４．８ｋｂ，プラスミド５ｋｂ，及びプラスミド５．３ｋｂを制限酵素ＸｈｏＩで処理し、得られた断片を、制限酵素ＸｈｏＩで処理したｐＧＬ−２．８ｋｂに挿入し、各々配列番号１の第２１７４番〜第５５７２番を含むｐＧＬ−３．３ｋｂ、配列番号１の第１７６０番〜第５５７２番を含むｐＧＬ−３．７ｋｂ、配列番号１の第１２６７番〜第５５７２番を含むｐＧＬ−４．２ｋｂ、配列番号１の第６７２番〜第５５７２番を含むｐＧＬ−４．８ｋｂ、配列番号１の第５４８番〜第５５７２番を含むｐＧＬ−５ｋｂ、配列番号１の第２３９番〜第５５７２番を含むｐＧＬ−５．３ｋｂを得た。【０１２３】
更に、エキソン１上流約５．６ｋｂ、エキソン１約１００ｂ、及びイントロン１約１ｋｂからなる、エキソン２上流約６．７ｋｂの領域をクローニングするために、前記と同様のＰＣＲを、フォワードプライマー（配列番号３３）及びリバースプライマー（配列番号４２）を使用して実施した。得られた６．７ｋｂの断片をサブクローニングし、塩基配列を解読し、配列番号２で表される塩基配列における第１番〜第６６８４番の塩基配列を決定した。得られたクローンを制限酵素ＢａｍＨＩで処理した。この断片をｐＧＬ３−ｂａｓｉｃを、制限酵素ＢｇｌIIで処理したものに挿入し、エキソン１上流約５．６ｋｂを含むエキソン２上流領域約６．７ｋｂである配列番号２で表される塩基配列における第１６番〜第６６８４番を含む発現プラスミドｐＧＬ−６．７ｋｂを得た。【０１２４】
《実施例１５：マウスＡＧＦプロモーター領域ＤＮＡ配列の解析》
ｐＧＬ−ｂａｓｉｃ（空ベクター）、又は実施例１４で得られたレポータープラスミドのレポーター活性を測定するために、ＦａＯ細胞（J.Cell Science, 2000, 113, 1069-1074）へ、ウミシイタケ（renilla）由来ルシフェラーゼ発現ベクターであるｐｈＲＬ−ＴＫ（プロメガ社）とこれらのレポータープラスミド各々をコトランスフェクションした。すなわち、ＦａＯ細胞を増殖培地［低グルコース（low
glucose）ＤＭＥＭ、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）］で、タイプＩコラーゲンコートした１２ウェルプレートにサブコンフルエントまで培養し、無血清のＯｐｔｉ−ＭＥＭＲＩ（インビトロジェン社）に培地交換後、トランスフェクション試薬（LipofectamineTMReagent；インビトロジェン社）を用いて、前記プラスミドをトランスフェクションした。トランスフェクション後３時間で等量の低グルコースＤＭＥＭ、２０％ＦＣＳを添加し、更に１２時間後に培地を低グルコースＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳに置換した。更に１２時間培養後、ルシフェラーゼ活性を、Ｄｕａｌ−ＧｌｏＴＭルシフェラーゼアッセイシステム（Dual-GloTM
Luciferase Assay System；プロメガ社）を使用して、添付プロトコールに従って測定した。プロモーターを導入したプラスミドから発現するホタルルシフェラーゼ活性を、内部補正用のプラスミドｐｈＲＬ−ＴＫから発現するウミシイタケルシフェラーゼ活性で割った値を、レポーター活性として、結果を図２５に示す。その結果、ｐＧＬ−３．３ｋｂ、ｐＧＬ−３．７ｋｂ、及びｐＧＬ−４．２ｋｂを導入した場合、活性が観察されず、ｐＧＬ−４．８ｋｂ、ｐＧＬ−５ｋｂ、ｐＧＬ−５．３ｋｂ、ｐＧＬ−５．６ｋｂ、及びｐＧＬ−６．７ｋｂを導入した場合には観察されることがわかった。エキソン１上流５．６ｋｂを逆方向につないだ場合はプロモーター活性がなくなることが判った。更に、ｐＧＬ−０．５ｋｂ及びｐＧＬ−２．８ｋｂを用いて同じ実験をしたところ、いずれもプロモーター活性は見出されなかった。すなわち、配列番号１で表される塩基配列における第６７２番〜第５５７２番、第５４８番〜第５５７２番、第２３９番〜第５５７２番、若しくは第１６番〜第５５７２番、又は配列番号２で表される塩基配列における第１６番〜第６６８４番の塩基からなる配列は、ＡＧＦプロモーター活性を有することがわかった。
これらのＤＮＡ配列を利用したレポーターアッセイを構築することができ、前記領域にＡＧＦプロモーター活性が含まれることを見出した。本アッセイ系において、ＡＧＦプロモーター活性を有するＤＮＡ配列を含むプラスミド導入後の細胞に試験物質を添加し、ルシフェラーゼ活性の変化を分析することにより、ＡＧＦ遺伝子のプロモーター活性を促進し、ＡＧＦの発現を亢進する物質である抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬をスクリーニングすることができる。【０１２５】
《実施例１６：ＡＧＦ刺激によるＭＡＰＫリン酸化亢進》
Ｃ２Ｃ１２細胞を、タイプＩコラーゲンコートした１２ウェルプレートに増殖培地（ＤＭＥＭ，１０％ＦＣＳ）でコンフルエントまで培養後、分化培地（ＤＭＥＭ，２％ウマ血清）に置換して７日間培養することで筋分化させた。１％ＢＳＡを含む無血清培地で１２時間培養後に同培地に置換し、最終１μｇ／ｍＬとなるようにＡＧＦタンパク質を添加又は同量のＰＢＳを添加した。添加１０分間後に培養液を吸引除去し、５０μＬの細胞溶解液［５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２），１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１０％グリセロール，１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ４Ｐ２Ｏ７，１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＦ，１００μｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ３ＶＯ４，４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ，５０μｇ／ｍＬアプロチニン，１ｍｍｏｌ／Ｌフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ），０．１ｍｍｏｌ／Ｌロイペプチン，２５μｍｏｌ／Ｌ  ペプスタチンＡ］を添加することで反応を停止して細胞を溶解した。得られたサンプルにＳＤＳ−サンプル緩衝液［２０％グリセロール，１３０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８），１０％２−メルカプトエタノール，６％ＳＤＳ，０．２ｍｇ／ｍＬブロモフェノールブルー］を添加して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜へブロッティングした。一次抗体として、抗リン酸化ＭＡＰＫ  ｐ３８抗体（Cell signaling #9211）、抗リン酸化ＭＡＰＫ  ｐ４２／ｐ４４抗体（Cell signaling #9101）、抗ＭＡＰＫ  ｐ３８抗体（Cell
signaling #9212）、又は抗ＭＡＰＫ  ｐ４２／４４抗体（Cell signaling #9102）を使用、二次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（実施例９）を使用してウエスタンブロッティングを行い、ＭＡＰＫ  ｐ３８、ＭＡＰＫ  ｐ４２、及びＭＡＰＫ  ｐ４４のリン酸化状態を検出した。スキャナーでウエスタンブロッティングの結果を取り込み、画像解析ソフトを用いて各リン酸化バンドの濃度を定量した。その結果、ＡＧＦタンパク質の添加により、リン酸化ＭＡＰＫ  ｐ３８は１．６倍、リン酸化ＭＡＰＫ  ｐ４２は３．４倍、リン酸化ＭＡＰＫ  ｐ４４は４．３倍に各々リン酸化が亢進されることを見出した。【０１２６】
すなわち、ＡＧＦアゴニスト刺激による細胞での反応を検出するアッセイ系を構築することができた。本アッセイ系において、細胞に試験物質を添加し、ＭＡＰＫのリン酸化の変化を分析することにより、ＡＧＦアゴニスト活性を持つ物質である抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬をスクリーニングすることができる。
更に、筋分化Ｃ２Ｃ１２細胞以外に、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞ＨＵＶＥＣ、前駆軟骨細胞株ＡＴＤＣ５細胞においても同様の試験を実施し、ＭＡＰＫリン酸化がＡＧＦ刺激によって亢進されることを確認した。ＨＵＶＥＣは増殖培地（旭テクノ硝子）で、ＡＴＤＣ５細胞は増殖培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２，５％ＦＣＳ）で各々サブコンフルエントまで培養して前記アッセイに使用した。【０１２７】
《実施例１７：細胞株へのＡＧＦタンパク質の結合》
ＡＴＤＣ５細胞を、増殖培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２，５％ＦＣＳ）でサブコンフルエントまで培養して、セルスクレパーを使用して細胞をプレートより剥がした。ＦＣＭ緩衝液（０．１％ＢＳＡ／１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２／１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２／ＰＢＳ）で細胞を２回洗浄後、無添加、又は最終１０μｇ／ｍＬとなるようにマウスＡＧＦタンパク質又はヒトＡＧＦタンパク質を添加し４℃で３０分間反応させた。ＦＣＭ緩衝液で細胞を洗浄後、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識Ｍ２抗体（シグマ社）を最終１０μｇ／ｍＬとなるように添加して４℃で３０分間反応させた。更に、ＦＣＭ緩衝液で細胞を３回洗浄後、１μｇ／ｍＬとなるようにヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を添加して死細胞を染色した。細胞をフローサイトメーター（Cytomics FC 500；ベックマン・コールター社）で解析し、死細胞を除去したＰＩ陰性細胞のＦＩＴＣ強度を計測した。【０１２８】
ヒトＡＧＦタンパク質及びマウスＡＧＦタンパク質にはＦＬＡＧ配列が付加されているので、ＦＬＡＧ配列を認識するＭ２抗体を反応させることで、細胞に結合したＡＧＦタンパク質にＦＩＴＣ標識Ｍ２抗体が結合し、ＡＧＦタンパク質が結合した細胞の蛍光強度が強くなる。測定の結果、マウスＡＧＦタンパク質を添加した場合に蛍光強度が１．５倍に、ヒトＡＧＦタンパク質を添加した場合に細胞では蛍光強度が８．１倍となり、細胞にＡＧＦタンパク質が結合したことが判った。細胞へのＡＧＦタンパク質の結合量を多くする物質は、ＡＧＦのシグナルを強くするため、ＡＧＦ機能亢進剤となる。本結合アッセイ系にて、細胞へ、事前又はＡＧＦタンパク質添加と同時に試験物質を反応させることで、試験物質のＡＧＦ機能亢進活性を測定することができ、ＡＧＦ機能亢進剤（すなわち、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬）をスクリーニングすることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１２９】
本発明のスクリーニング方法は、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬のスクリーニングの用途に適用することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表フリーテキスト】
【０１３０】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Artificial Sequence」の説明を記載する。配列番号６、７、９、１０、１３、１４、１６、１９、２０、３４〜４０、４２、４５〜５０、及び５３〜５６で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列であり、配列番号４の配列で表されるアミノ酸配列は、ペプチドＡの配列であり、配列番号１５の配列で表される塩基配列は、ｌｏｘＰを含む配列であり、配列番号２７の配列で表されるアミノ酸配列は、ペプチドＹＰ−１２６の配列であり、配列番号２８の配列で表されるアミノ酸配列は、ペプチドＹＰ−１２７−Ｂの配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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