(57)【要約】  本発明は、ＧＳＴタンパク質−目的タンパク質の融合タンパク質において、そのＮ末側融合パートナーのＧＳＴタンパク質部分に対して、特異的な結合性を有する「核酸アダプター分子」を提供する。本発明にかかる「ＧＳＴタンパク質に対する核酸アダプター分子」は、  下記の塩基配列Ｉ（配列番号：１）：GGUAGAUACGAUGGAUGGUUGUGUAAAGGUGGUCGUAUCCGCCGA CAUGACGCGCAGCCAA   61  下記の塩基配列ＩＩ（配列番号：２）：GGUAGAUACGAUGGACUAACUGCGCAAAUUACUCGUAUUAGCCGA CAUGACGCGCAGCCAA    61  下記の塩基配列ＩＩＩ（配列番号：３）：GGUAGAUACGAUGGA UACCGAAAAAUUAGUGUCGUUGACUGCAA CAUGACGCGCAGCCAA    60のいずれかを有するＲＮＡアプタマー分子である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  由来のＧＳＴタンパク質に対して、結合可能なＲＮＡアプタマー分子であって、
該ＲＮＡアプタマー分子は、下記の塩基配列Ｉ（配列番号：１）：
ＧＧＵＡＧＡＵＡＣＧＡＵＧＧＡ  ＵＧＧＵＵＧＵＧＵＡＡＡＧＧＵＧＧＵＣＧＵＡＵＣＣＧＣＣＧＡ  ＣＡＵＧＡＣＧＣＧＣＡＧＣＣＡＡ      ６１
を有する一本鎖ＲＮＡで構成されている
ことを特徴とするＲＮＡアプタマー分子。
【請求項２】
Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  由来のＧＳＴタンパク質に対して、結合可能なＲＮＡアプタマー分子であって、
該ＲＮＡアプタマー分子は、下記の塩基配列ＩＩ（配列番号：２）：
ＧＧＵＡＧＡＵＡＣＧＡＵＧＧＡ  ＣＵＡＡＣＵＧＣＧＣＡＡＡＵＵＡＣＵＣＧＵＡＵＵＡＧＣＣＧＡ  ＣＡＵＧＡＣＧＣＧＣＡＧＣＣＡＡ        ６１
を有する一本鎖ＲＮＡで構成されている
ことを特徴とするＲＮＡアプタマー分子。
【請求項３】
Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  由来のＧＳＴタンパク質に対して、結合可能なＲＮＡアプタマー分子であって、
該ＲＮＡアプタマー分子は、下記の塩基配列ＩＩＩ（配列番号：３）：
ＧＧＵＡＧＡＵＡＣＧＡＵＧＧＡ    ＵＡＣＣＧＡＡＡＡＡＵＵＡＧＵＧＵＣＧＵＵＧＡＣＵＧＣＡＡ  ＣＡＵＧＡＣＧＣＧＣＡＧＣＣＡＡ        ６０
を有する一本鎖ＲＮＡで構成されている
ことを特徴とするＲＮＡアプタマー分子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のＲＮＡアプタマー分子の使用であって、
該ＲＮＡアプタマー分子を、
Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  由来のＧＳＴタンパク質、あるいは、該ＧＳＴタンパク質を融合パートナーとする、ＧＳＴタンパク質のＣ末に他のタンパク質を連結してなる融合タンパク質のアフィニティー・カラム精製を目的とする、アフィニティー・カラム作製において、前記ＧＳＴタンパク質に特異的な結合性を有する核酸リガンド基材として使用する
ことを特徴とするＲＮＡアプタマー分子の使用。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のＲＮＡアプタマー分子の使用であって、
該ＲＮＡアプタマー分子を、
Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  由来のＧＳＴタンパク質を融合パートナーとする、ＧＳＴタンパク質のＣ末に他のタンパク質を連結してなる融合タンパク質の検出を目的とする、標識物質の調製において、前記ＧＳＴタンパク質に特異的な結合性を有する核酸リガンド基材として使用する
ことを特徴とするＲＮＡアプタマー分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ：Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−Ｔａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＥＣ  ２．５．１．１８）タンパク質に対して、高い親和性を示すＲＮＡアプタマー分子に関する。特には、融合タンパク質の創製において、その融合パートナーとして広く利用されている、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  由来のＧＳＴタンパク質に対して、高アフィニティーで結合可能なＲＮＡアプタマー分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ・タンパク質自体は、原核生物から真核生物まで、広範な生物中において、共通的にその存在が知られている。その酵素活性は、グルタチオン（Ｎ−（Ｎ−γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニル）グリシン）中含まれるシステイン残基側鎖のスルファニル基（−ＳＨ）を介する結合形成を利用し、グルタチオンの転移反応を触媒するものである。このＧＳＴタンパク質本体の酵素活性自体も、毒性物質の解毒機構の一つ、グリシン、グルタミン、オルニチン、システインなどとの結合に相当する、グルタチオンとの結合を介する解毒過程に関与するという観点で重要ではある。【０００３】
一方、ＧＳＴタンパク質は、異種の宿主において、その本来の立体構造を有する、酵素活性を保持した可溶性タンパク質として、組換え発現可能である点、また、基質グルタチオンと特異的かつ高いアフィニティーで結合する性質を応用することで、アフィニティー・カラム精製が容易である点に着目して、融合タンパク質の形成用融合パートナーとして利用されている。例えば、大腸菌を宿主とする発現系において、融合パートナーとして、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  由来のＧＳＴタンパク質を利用し、そのＣ末にリンカー配列を介して、目的のタンパク質を連結した融合タンパク質の発現がなされている。その際、Ｎ末側融合パートナーのＧＳＴタンパク質自体、宿主大腸菌において、可溶性タンパク質として組換え発現されることに付随して、大半の場合、発現される融合タンパク質も、可溶性タンパク質となる。この特長は、目的のタンパク質自体を宿主大腸菌において、組換え発現した際には、封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）を形成する場合であっても、融合タンパク質とすることで、可溶性タンパク質を得る目的で利用される。【０００４】
同時に、組換え発現された融合タンパク質の単離、精製を進める際、Ｎ末側融合パートナーのＧＳＴタンパク質部分は、基質グルタチオンと特異的な結合性を有するので、この結合性を応用したアフィニティー・カラム精製が利用されている。まず、基質グルタチオンを固定するカラム上に、ＧＳＴタンパク質−目的タンパク質の融合タンパク質を結合させ、夾雑タンパク質を溶出させる。その後、基質グルタチオンを含む溶出液を供給することで、カラム上に固定されている基質グルタチオン／ＧＳＴタンパク質部分の間の結合を解消させ、ＧＳＴタンパク質−目的タンパク質の融合タンパク質を回収する。基質グルタチオン／ＧＳＴタンパク質の結合性を利用する精製手段は、高い選択性を有するので、例えば、組換え発現自体の培養物が少ない際でも、ＧＳＴタンパク質−目的タンパク質の融合タンパク質を高い収率で回収することが可能であり、各種の目的タンパク質の酵素活性の研究において利用されている。
一方、塩基長が１５〜６０程度の一本鎖核酸分子は、その塩基配列によっては、分子内で、相補的な塩基間；Ｇ−Ｃ、Ａ−Ｕ、Ａ−Ｔの塩基対によって、部分的に二本鎖状の構造を構成し、全体として、三次元構造を構成することもある。例えば、かかる分子内における、部分的に二本鎖状の構造形成に伴い、全体として、三次元構造を構成する、天然の一本鎖核酸分子の代表例として、ｔ−ＲＮＡ分子を挙げることができる。その他、各種のｍＲＮＡ分子においても、分子内で、部分的に二本鎖状の構造形成が起こり、さらに、全体として、三次元構造を構成する可能性を示唆する報告がなされている。【０００５】
また、ある種のタンパク質は、本来、核酸との結合性を有していないにも係わらず、特定の塩基配列を有する一本鎖核酸分子が、このタンパク質表面に高いアフィニティーで結合するという現象が報告されている。具体的には、特定の塩基配列を有する一本鎖核酸分子では、少なくとも、その分子内において、部分的に二本鎖状の構造形成がなされ、全体として、何らかの三次元的な構造を構成している際、ある種のタンパク質が有する三次元構造表面上の複数の部位に対して、かかる三次元的な構造を構成している一本鎖核酸分子が、相互作用を行うこともある。ある種のタンパク質が有する三次元構造表面上、三次元的な構造を構成している一本鎖核酸分子が、複数の部位における相互作用を介して、安定なマクロな分子間結合を形成しているような場合、かかる一本鎖核酸分子は、「当該タンパク質に対する核酸リガンド」あるいは、「当該タンパク質に対する核酸アダプター分子」と称されている。【０００６】
勿論、タンパク質が有する三次元構造自体、様々な立体構造が存在しており、それら様々な立体構造に対して、安定なマクロな分子間結合を形成可能な、三次元的な構造を構成している一本鎖核酸分子が存在するか否かは、一般に、予測することは困難である。すなわち、様々な立体構造を有するタンパク質に対して、かかる立体構造に由来して形成される「三次元的なエピトープ」を認識して結合する形態の「特異的な抗体」が存在するか、否かに関して、一般に、予測することは困難であるように、様々な立体構造を有するタンパク質に対して、かかる立体構造に由来して形成される「三次元的な配置を示す、複数の部位」を認識して、安定なマクロな分子間結合を形成する「特異的な、三次元的な構造を有する核酸アダプター分子」が存在するか、否かに関して、一般に、予測することは困難である。【０００７】
従って、個々のタンパク質に対して、「当該タンパク質に対する核酸アダプター分子」が実際に存在するか否かを、ランダム・スクリーニングに類する手法を適用して、実験的に確認するアプローチが利用されている。具体的には、候補の一本鎖核酸分子として、５’末端の固定領域と、３’末端の固定領域との間に、ランダムな塩基配列を有する、特定の塩基長（Ｎ）部分が挿入されている形態の、「ランダム一本鎖核酸分子ライブラリー」を作製した上で、対象となるタンパク質に対して、結合能を有する「一本鎖核酸分子」の有無を、実際のスクリーニングにより確認するアプローチが利用されている。
例えば、ファージ・ディスプレイ型「ランダム・ペプチド・ライブラリー」を利用して、ある抗体との結合能を有する「ペプチド」の選択手法では、対象となる「抗体」は、その「エピトープ」として、その抗原タンパク質を構成するペプチド鎖中の一部分、すなわち、「特定のアミノ酸配列からなるペプチド断片」型の「エピトープ配列」を有することを前提としている。すなわち、抗原タンパク質が、本来の三次元構造ではなく、変性されて一次元状のペプチド鎖となった状態でも、対象の「抗体」と抗原抗体反応によって結合可能な「エピトープ配列」を有することを前提としている。その前提を満足する「抗体」に対しては、Ｎ末側の固定領域と、Ｃ末側の固定領域との間に、ランダムなアミノ酸配列を有する、特定のアミノ酸長（Ｎ）の「ランダム・ペプチド」部分が挿入されている形態のファージ・ディスプレイ型「ランダム・ペプチド・ライブラリー」中には、対象の「抗体」が本来有している「エピトープ配列」に相当するアミノ酸配列の「ランダム・ペプチド」部分を有するものが、確実に一つ存在している。さらに、対象の「抗体」が本来有している「エピトープ配列」に対して、一アミノ酸置換された「一アミノ酸置換変異体」に相当するアミノ酸配列の「ランダム・ペプチド」部分を有するものが、確実に複数個（Ｎ×（２０−１）個）存在している。その際、本来の「エピトープ配列」に相当するアミノ酸配列の「ランダム・ペプチド」部分を有するものは、対象の「抗体」と最も高い結合性を示すが、「一アミノ酸置換変異体」に相当するアミノ酸配列の「ランダム・ペプチド」部分を有する複数個（Ｎ×（２０−１）個）のうち、幾つかは、対象の「抗体」と相当に高い結合性を示す。【０００８】
ファージ・ディスプレイ型「ランダム・ペプチド・ライブラリー」では、先ず、Ｎ末側の固定領域と、Ｃ末側の固定領域との間に、ランダムなアミノ酸配列を有する、特定のアミノ酸長（Ｎ）の「ランダム・ペプチド」部分が挿入されているペプチド鎖をコードする「ランダム・ペプチドのコード遺伝子」をファージ・ベクターに組み込む。この「ランダム・ペプチドのコード遺伝子」を組み込んだファージ・ベクターを、宿主大腸菌に感染させ、培養して、「ランダム・ペプチド」部分が挿入されているペプチド鎖を発現させる。対象「抗体」の「エピトープ配列」の選択手法では、このファージ・ベクターに感染させた宿主大腸菌で発現される「ランダム・ペプチド」部分が挿入されているペプチド鎖と、対象「抗体」との結合能に基づき、一次スクリーニングを行う。対象「抗体」と結合している、「ランダム・ペプチド」部分が挿入されているペプチド鎖を発現する宿主大腸菌として、本来の「エピトープ配列」に相当するアミノ酸配列の「ランダム・ペプチド」部分を有するもの、ならびに、「一アミノ酸置換変異体」に相当するアミノ酸配列の「ランダム・ペプチド」部分を有する複数個を含む、小さな「一次スクリーニング群」が選択される。この「スクリーニング群」に含まれる宿主大腸菌を培養し、同様のスクリーニング操作を施すと、得られる「二次スクリーニング群」中では、本来の「エピトープ配列」に相当するアミノ酸配列の「ランダム・ペプチド」部分を有するものを発現する宿主大腸菌の含有比率が、増大している。従って、「スクリーニング」の次数を重ねるごとに、本来の「エピトープ配列」に相当するアミノ酸配列の「ランダム・ペプチド」部分を有するものを発現する宿主大腸菌の含有比率を、「指数関数的に」上昇させることが、効率的に達成される「パニング（ｐａｎｎｉｎｇ）」の手法が利用されている。
ファージ・ディスプレイ型「ランダム・ペプチド・ライブラリー」から、対象「抗体」の「エピトープ配列」を選択する際に利用される「パニング（ｐａｎｎｉｎｇ）」の手法に対応する、個々のタンパク質に対して、「当該タンパク質に対する核酸アダプター分子」が実際に存在するか否かを確認するための「ランダム・スクリーニング」に類する手法として、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）の手法がある（米国特許第５、４７５、０９６号明細書、米国特許第５、２７０、１６３号明細書を参照）。【０００９】
ＳＥＬＥＸ法では、５’末端の固定領域と、３’末端の固定領域との間に、ランダムな塩基配列を有する、特定の塩基長（Ｎ）部分が挿入されている形態の、「ランダム一本鎖核酸分子ライブラリー」を作製した上で、対象となるタンパク質に対する結合能を示す「一本鎖核酸分子」の小さな「一次スクリーニング群」を選択する。この「一次スクリーニング群」に含まれる「一本鎖核酸分子」を鋳型として、相補的な塩基配列を有するｃＤＮＡを調製し、さらに、このｃＤＮＡを鋳型として、５’末端の固定領域と、３’末端の固定領域の末端部分に相当するＰＣＲプライマー対を用いて、ＰＣＲ増幅を行う。このＰＣＲ増幅産物に含まれる、ｃＤＮＡに基づき、二次スクリーニングに使用する「一本鎖核酸分子」を調製する。この二次スクリーニング用の「一本鎖核酸分子」の集団に、同様のスクリーニング操作を施すと、得られる「二次スクリーニング群」中では、対象タンパク質に対する結合能が優る「一本鎖核酸分子」の含有比率が、増大している。従って、「スクリーニング」の次数を重ねるごとに、対象タンパク質に対する結合能がより優れている「一本鎖核酸分子」の含有比率が、「指数関数的に」上昇されていく。【００１０】
なお、ＳＥＬＥＸ法における、前記の多段スクリーニング過程では、対象タンパク質に対する結合能がより優れている「一本鎖核酸分子」の含有比率が、「指数関数的に」上昇するものの、元々、対象タンパク質に対して、一定以上の結合能を示す「当該タンパク質に対する核酸アダプター分子」が存在していない場合には、スクリーニング段数を増しても、その「スクリーニング群」中には、相当種類の「一本鎖核酸分子」が含まれている状態のままである。その点が、対象「抗体」の本来の「エピトープ配列」が、確実に、最終的には選択されてくる「パニング（ｐａｎｎｉｎｇ）」の手法と、かかるＳＥＬＥＸ法との本質的な相違点である。すなわち、「ランダム一本鎖核酸分子ライブラリー」中に、元々、一定以上の結合能を示す「一本鎖核酸分子」が存在しているか、否かは、「スクリーニング条件」には、本質的に依存せず、対象タンパク質が有する三次元構造に依存している。
この対象タンパク質に対して、一定以上の結合能を示す「当該タンパク質に対する核酸アダプター分子」が実際に存在するか否かは、対象タンパク質が有する三次元構造に依存しており、また、対象タンパク質が有する三次元構造によっては、一定以上の結合能を示す「当該タンパク質に対する核酸アダプター分子」が存在しないことも相当の確率で見出される点は、対象タンパク質が有する三次元構造によっては、免疫原として有効に機能せず、モノクローナル抗体の取得ができないことも相当の確率で見出される、対象タンパク質と「モノクローナル抗体」の関係に似ている。また、仮に、対象タンパク質に対して、前記ＳＥＬＥＸ法を適用して、一定以上の結合能を示す「当該タンパク質に対する核酸アダプター分子」が実際に存在することが確認され、その際、取得される「当該タンパク質に対する核酸アダプター分子」は、対象タンパク質に対して特異的な「高アフィニティーな核酸アダプター分子」であるという特徴は、「免疫原性」を有する対象タンパク質と、その特異的な「モノクローナル抗体」の関係に似ている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
各種の目的タンパク質を、Ｎ末側融合パートナーのＧＳＴタンパク質のＣ末にリンカーを介して連結した、ＧＳＴタンパク質−目的タンパク質の融合タンパク質として、組換え発現することで、その酵素活性を保持する目的タンパク質が比較的に容易に作製できる。また、このＧＳＴタンパク質−目的タンパク質の融合タンパク質は、Ｎ末側融合パートナーのＧＳＴタンパク質部分と、基質グルタチオンとの特異的な結合性を利用することで、アフィニティー・カラム精製を施すことで、容易に精製することが可能である。なお、かかるアフィニティー・カラム精製後、溶出・回収されるＧＳＴタンパク質−目的タンパク質の融合タンパク質は、Ｎ末側融合パートナーのＧＳＴタンパク質部分に、基質グルタチオンが結合した状態となっており、最終的に、この基質グルタチオンの離脱処理を施す必要がある。【００１２】
確かに、ＧＳＴタンパク質−目的タンパク質の融合タンパク質に対して、基質グルタチオンとの結合性を利用するアフィニティー・カラム精製法は有用な精製手段であるが、目的タンパク質によっては、ＧＳＴタンパク質から、基質グルタチオンを離脱する処理条件において、変性を被るものも存在する。その際には、この手法に代えて、別のアフィニティー・カラム精製法を利用して、ＧＳＴタンパク質−目的タンパク質の融合タンパク質の単離を図る必要がある。すなわち、基質グルタチオンとの結合性を利用するアフィニティー・カラム精製法を代替可能な、Ｎ末側融合パートナーのＧＳＴタンパク質部分に対して、高い選択性を有する、新たなアフィニティー・カラム精製手段の提案が望まれている。【００１３】
仮に、「ＧＳＴタンパク質に対する核酸アダプター分子」が入手可能であれば、この「核酸アダプター分子」を「ＧＳＴタンパク質に特異的な結合性を有するリガンド基材」として使用することで、抗体アフィニティー・カラム精製に相当するように、高い選択性を示す、アフィニティー・カラム精製法を構築することが可能となる。【００１４】
本発明は、前記の課題を解決するもので、本発明の目的は、ＧＳＴタンパク質−目的タンパク質の融合タンパク質において、そのＮ末側融合パートナーのＧＳＴタンパク質部分に対して、特異的な結合性を有する「核酸アダプター分子」を提供することにある。また、Ｎ末側融合パートナーのＧＳＴタンパク質部分に対して、特異的な結合性を有する「核酸アダプター分子」を、「当該ＧＳＴタンパク質に対する核酸リガンド」として応用し、ＧＳＴタンパク質部に対して高い選択性を有する、新たなアフィニティー・カラム精製法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、前記の課題を解決するため、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  由来のＧＳＴタンパク質に対して、一定以上の結合能を示す「ＧＳＴタンパク質に対する核酸アダプター分子」が実際に存在するか否かを確認するとともに、仮に、「ＧＳＴタンパク質に対する核酸アダプター分子」が存在する際には、その「ＧＳＴタンパク質に対する核酸アダプター分子」を構成する一本鎖核酸分子の塩基配列を特定することを試みた。【００１６】
具体的には、５’末端の固定領域と、３’末端の固定領域との間に、ランダムな塩基配列を有する、３０塩基長の部分（Ｎ３０）が挿入されている形態の「ランダム一本鎖核酸分子ライブラリー」を作製し、一方、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  由来のＧＳＴタンパク質を組換え生産し、この組換え型ＧＳＴタンパク質を利用し、ＳＥＬＥＸ法を適用して、一定以上の結合能を示す「当該タンパク質に対する核酸アダプター分子」が実際に存在するか否かの検証を進めた。【００１７】
その結果、ＳＥＬＥＸ法を適用するスクリーニング過程において、前記「ランダム一本鎖核酸分子ライブラリー」を構成するＤＮＡ分子から転写される一本鎖ＲＮＡ分子中から、組換え型ＧＳＴタンパク質に対して、一定以上の結合能を示す一本鎖ＲＮＡ分子複数種が選択された。加えて、ＧＳＴタンパク質−目的タンパク質型の融合タンパク質を利用して、同様にＳＥＬＥＸ法を適用するスクリーニングを行った際にも、かかる選択された一本鎖ＲＮＡ分子複数種は、ＧＳＴタンパク質−目的タンパク質型の融合タンパク質に対して、一定以上の結合能を示す一本鎖ＲＮＡ分子であることが確認された。すなわち、選択された一本鎖ＲＮＡ分子複数種は、ＧＳＴタンパク質−目的タンパク質型の融合タンパク質において、そのＮ末側融合パートナーのＧＳＴタンパク質部分に対して、特異的な結合性を有する「核酸アダプター分子」に相当することを確認した。【００１８】
本発明者は、以上の知見に加えて、選択された一本鎖ＲＮＡ分子複数種の塩基配列の解析を行い、それらの結果に基づき、本発明を完成するに到った。【００１９】
すなわち、本発明にかかる「ＧＳＴタンパク質に対する核酸アダプター分子」は、下記の三種の塩基配列を有する一本鎖ＲＮＡ分子であり、
第一の形態にかかる「ＧＳＴタンパク質に対する核酸アダプター分子」は、
Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  由来のＧＳＴタンパク質に対して、結合可能なＲＮＡアプタマー分子であって、
該ＲＮＡアプタマー分子は、下記の塩基配列Ｉ（配列番号：１）：
ＧＧＵＡＧＡＵＡＣＧＡＵＧＧＡ  ＵＧＧＵＵＧＵＧＵＡＡＡＧＧＵＧＧＵＣＧＵＡＵＣＣＧＣＣＧＡ  ＣＡＵＧＡＣＧＣＧＣＡＧＣＣＡＡ      ６１
を有する一本鎖ＲＮＡで構成されている
ことを特徴とするＲＮＡアプタマー分子であり；
第二の形態にかかる「ＧＳＴタンパク質に対する核酸アダプター分子」は、
Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  由来のＧＳＴタンパク質に対して、結合可能なＲＮＡアプタマー分子であって、
該ＲＮＡアプタマー分子は、下記の塩基配列ＩＩ（配列番号：２）：
ＧＧＵＡＧＡＵＡＣＧＡＵＧＧＡ  ＣＵＡＡＣＵＧＣＧＣＡＡＡＵＵＡＣＵＣＧＵＡＵＵＡＧＣＣＧＡ  ＣＡＵＧＡＣＧＣＧＣＡＧＣＣＡＡ        ６１
を有する一本鎖ＲＮＡで構成されている
ことを特徴とするＲＮＡアプタマー分子であり；
第三の形態にかかる「ＧＳＴタンパク質に対する核酸アダプター分子」は、
Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  由来のＧＳＴタンパク質に対して、結合可能なＲＮＡアプタマー分子であって、
該ＲＮＡアプタマー分子は、下記の塩基配列ＩＩＩ（配列番号：３）：
ＧＧＵＡＧＡＵＡＣＧＡＵＧＧＡ    ＵＡＣＣＧＡＡＡＡＡＵＵＡＧＵＧＵＣＧＵＵＧＡＣＵＧＣＡＡ  ＣＡＵＧＡＣＧＣＧＣＡＧＣＣＡＡ        ６０
を有する一本鎖ＲＮＡで構成されている
ことを特徴とするＲＮＡアプタマー分子である。【００２０】
また、本発明は、上述の「ＧＳＴタンパク質に対する核酸アダプター分子」の用途として、下記する二つの形態の「ＧＳＴタンパク質に対する核酸アダプター分子」の使用方法を提供しており、
すなわち、本発明の第一の形態にかかる「ＧＳＴタンパク質に対する核酸アダプター分子」の使用方法は、
上記の三種のＲＮＡ分子から選択される、いずれかのＲＮＡアプタマー分子の使用であって、
該ＲＮＡアプタマー分子を、
Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  由来のＧＳＴタンパク質、あるいは、該ＧＳＴタンパク質を融合パートナーとする、ＧＳＴタンパク質のＣ末に他のタンパク質を連結してなる融合タンパク質のアフィニティー・カラム精製を目的とする、アフィニティー・カラム作製において、前記ＧＳＴタンパク質に特異的な結合性を有する核酸リガンド基材として使用する
ことを特徴とするＲＮＡアプタマー分子の使用であり；
本発明の第二の形態にかかる「ＧＳＴタンパク質に対する核酸アダプター分子」の使用方法は、
上記の三種のＲＮＡ分子から選択される、いずれかのＲＮＡアプタマー分子の使用であって、
該ＲＮＡアプタマー分子を、
Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  由来のＧＳＴタンパク質を融合パートナーとする、ＧＳＴタンパク質のＣ末に他のタンパク質を連結してなる融合タンパク質の検出を目的とする、標識物質の調製において、前記ＧＳＴタンパク質に特異的な結合性を有する核酸リガンド基材として使用する
ことを特徴とするＲＮＡアプタマー分子の使用である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明にかかるＲＮＡアプタマー分子は、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  由来のＧＳＴタンパク質に対して、特異的な結合能を示す一本鎖ＲＮＡ分子であり、特に、該ＧＳＴタンパク質をＮ末側融合パートナーとする融合タンパク質においても、そのＮ末側融合パートナーのＧＳＴタンパク質部分に対して、特異的な結合能を示す。その際、ＧＳＴタンパク質の表面に対する該ＲＮＡアプタマー分子の結合は、かかる一本鎖ＲＮＡ分子が、その分子内における、塩基対による二本鎖構造の形成を介する立体構造を構成する時に達成され、一方、その塩基対による二本鎖構造を解消すると、該ＲＮＡアプタマー分子の結合も解消する。さらに、かかる一本鎖ＲＮＡ分子が、その分子内における、塩基対による二本鎖構造の形成を介する立体構造をとる状態と、その塩基対による二本鎖構造を解消し、前記の立体構造を示さない状態との選択は、その一本鎖ＲＮＡ分子が置かれる液相中に存在する、変性剤の濃度を変化させることで、可逆的に行うことができる。従って、一本鎖ＲＮＡ分子の構造変化により、結合能を可逆的に変化することが可能である特徴を持ち、アフィニティー・カラム精製における、前記ＧＳＴタンパク質に特異的な結合性を有する核酸リガンド基材、あるいは、該ＧＳＴタンパク質をＮ末側融合パートナーとする融合タンパク質の検出を目的とする、標識物質の調製において、前記ＧＳＴタンパク質に特異的な結合性を有する核酸リガンド基材として利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  由来のＧＳＴタンパク質の組換え発現、ならびに、ＧＳＴタンパク質／目的タンパク質型融合タンパク質の組換え発現に利用される、市販のＧＳＴタンパク質発現用プラスミド・ベクター；ｐＧＥＸ  ６ｐ−２  ベクターの構成を示す図である。
【００２３】
【図２】図２は、宿主大腸菌において組換え発現されたＧＳＴタンパク質のアフィニティー・カラム：ＧＳＴｒａｐ  ＦＦカラムによる精製工程における、該ＧＳＴｒａｐ  ＦＦカラムからの溶出曲線中、グルタチオンを利用する、ＧＳＴタンパク質の溶出を示す図である。
【００２４】
【図３】図３は、ＧＳＴｒａｐ  ＦＦカラムによる精製後、ゲル濾過：ＨｉＬｏａｄ  １６／１０  ２００  ｐｇによる精製工程における、該ゲル濾過カラムからの溶出曲線中、ＧＳＴタンパク質を含む溶出画分を示す図である。
【００２５】
【図４】図４は、ゲル濾過カラムを利用する精製において採取される、ＧＳＴタンパク質を含む溶出画分に関し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った結果を示す図である。
【００２６】
【図５】図５は、一連のＳＥＬＥＸ法による選別過程により採取される、ＧＳＴタンパク質に対して、特異的かつ高い結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子群（１８回目ＲＮＡプール）に関して、そのＧＳＴタンパク質に対する結合能について、Ｆｉｌｔｅｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｓｓａｙにより検証した結果を示す図である。
【００２７】
【図６】図６は、一連のＳＥＬＥＸ法による選別過程により採取された、ＧＳＴタンパク質に対して、特異的かつ高い結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子（Ｎｏ．３クローン）に関して、そのＧＳＴタンパク質との複合体生成過程、複合体の解離過程を、表面プラズモン共鳴装置を利用して評価した結果を示す図である。
【００２８】
【図７】図７は、一連のＳＥＬＥＸ法による選別過程により採取された、ＧＳＴタンパク質に対して、特異的かつ高い結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子（Ｎｏ．５クローン）に関して、そのＧＳＴタンパク質との複合体生成過程、複合体の解離過程を、表面プラズモン共鳴装置を利用して評価した結果を示す図である。
【００２９】
【図８】図８は、一連のＳＥＬＥＸ法による選別過程により採取された、ＧＳＴタンパク質に対して、特異的かつ高い結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子（Ｎｏ．２６クローン）に関して、そのＧＳＴタンパク質との複合体生成過程、複合体の解離過程を、表面プラズモン共鳴装置を利用して評価した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明にかかる「ＧＳＴタンパク質に対する核酸アダプター分子」に関して、より詳細に説明する。【００３１】
本発明にかかる「ＧＳＴタンパク質に対する核酸アダプター分子」は、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  由来のＧＳＴタンパク質、あるいは、該ＧＳＴタンパク質をＮ末側融合パートナーとして、そのＣ末に目的たんぱく質を連結した、ＧＳＴタンパク質／目的たんぱく質型融合タンパク質に対して、そのＧＳＴタンパク質の表面に、特異的で高い結合能を示す一本鎖ＲＮＡ分子である。具体的には、候補一本鎖ＲＮＡ分子として、下記の塩基配列Ｒｃａｎｄｉｄａｔｅ０：
５’−ＧＧＵＡＧＡＵＡＣＧＡＵＧＧＡ  
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ  ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ  ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ  
ＣＡＵＧＡＣＧＣＧＣＡＧＣＣＡＡ−３’
を有し、両端の固定領域と、それに挟まれる、３０塩基長の「ランダム塩基配列領域」を有する一本鎖ＲＮＡ分子で構成されるＲＮＡプールから、ＳＥＬＥＸ法を適用して、実際に選択されたものである。【００３２】
具体的には、後述する実施例に説明するように、
まず、Ｆｉｌｔｅｒ分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドを１３ラウンド繰り返し、
さらに、表面プラズモン共鳴バイオセンサーを利用する、ＳＥＬＥＸ選択ラウンドを２ラウンド行い、
最終的に、ＧＳＴアフィニティービーズ上を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドを２ラウンド行い、
当初の両端の固定領域と、それに挟まれる、３０塩基長の「ランダム塩基配列領域」を有する一本鎖ＲＮＡ分子で構成されるＲＮＡプールから、選択ラウンドを重ねるとともに、ＧＳＴタンパク質に対する結合能に乏しいものを段階的に除去し、一方、ＧＳＴタンパク質に対して優れた結合能を示すものの含有比率を段階的に増加させる結果、
最終的に、ＧＳＴタンパク質に対して優れた結合能を示す一本鎖ＲＮＡ分子として、選別されたものである。【００３３】
本発明にかかるＲＮＡアプタマー分子は、下記の二本鎖ＤＮＡ分子を転写テンプレートとして利用して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって調製することができる。【００３４】
すなわち、Ｎｏ．３クローン中に保持されるプラスミド・ベクター「ｐＣＲ−ＧＳＴ  Ｎｏ．３」中に挿入されている、下記の塩基配列（配列番号：４）：
ＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ  ＧＧＴＡＧＡＴＡＣＧＡＴＧＧＡ  ＴＧＧＴＴＧＴＧＴＡＡＡＧＧＴＧＧＴＣＧＴＡＴＣＣＧＣＣＧＡ  ＣＡＴＧＡＣＧＣＧＣＡＧＣＣＡＡ
を有する転写テンプレートから、「Ｔ７プロモーター領域」（ＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ）を利用して、下記の塩基配列Ｉ（配列番号：１）：
ＧＧＵＡＧＡＵＡＣＧＡＵＧＧＡ  ＵＧＧＵＵＧＵＧＵＡＡＡＧＧＵＧＧＵＣＧＵＡＵＣＣＧＣＣＧＡ  ＣＡＵＧＡＣＧＣＧＣＡＧＣＣＡＡ      ６１
を有する一本鎖ＲＮＡ分子が作製される。【００３５】
Ｎｏ．５クローン中に保持されるプラスミド・ベクター「ｐＣＲ−ＧＳＴ  Ｎｏ．５」中に挿入されている、下記の塩基配列（配列番号：５）：
ＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ  ＧＧＴＡＧＡＴＡＣＧＡＴＧＧＡ  ＣＴＡＡＣＴＧＣＧＣＡＡＡＴＴＡＣＴＣＧＴＡＴＴＡＧＣＣＧＡ  ＣＡＴＧＡＣＧＣＧＣＡＧＣＣＡＡ
を有する転写テンプレートから、「Ｔ７プロモーター領域」（ＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ）を利用して、下記の塩基配列ＩＩ（配列番号：２）：
ＧＧＵＡＧＡＵＡＣＧＡＵＧＧＡ  ＣＵＡＡＣＵＧＣＧＣＡＡＡＵＵＡＣＵＣＧＵＡＵＵＡＧＣＣＧＡ  ＣＡＵＧＡＣＧＣＧＣＡＧＣＣＡＡ        ６１
を有する一本鎖ＲＮＡ分子が作製される。【００３６】
Ｎｏ．２６クローン中に保持されるプラスミド・ベクター「ｐＣＲ−ＧＳＴ  Ｎｏ．２６」中に挿入されている、下記の塩基配列（配列番号：６）：
ＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ  ＧＧＴＡＧＡＴＡＣＧＡＴＧＧＡ  ＴＡＣＣＧＡＡＡＡＡＴＴＡＧＴＧＴＣＧＴＴＧＡＣＴＧＣＡＡ  ＣＡＴＧＡＣＧＣＧＣＡＧＣＣＡＡ
を有する転写テンプレートから、「Ｔ７プロモーター領域」（ＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ）を利用して、下記の塩基配列ＩＩＩ（配列番号：３）：
ＧＧＵＡＧＡＵＡＣＧＡＵＧＧＡ    ＵＡＣＣＧＡＡＡＡＡＵＵＡＧＵＧＵＣＧＵＵＧＡＣＵＧＣＡＡ  ＣＡＵＧＡＣＧＣＧＣＡＧＣＣＡＡ        ６０
を有する一本鎖ＲＮＡ分子が作製される。
なお、上記の三種のクローン；Ｎｏ．３クローン、Ｎｏ．５クローン、Ｎｏ．２６クローンが保持しているプラスミドは、それぞれ、識別のための表示として、「ｐＣＲ−ＧＳＴ  Ｎｏ．３」を付し、受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４３９、「ｐＣＲ−ＧＳＴ  Ｎｏ．５」を付し、受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４４０、「ｐＣＲ−ＧＳＴ  Ｎｏ．２６」を付し、受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４４１として、平成１７年３月７日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６、郵便番号３０５−８５６６）に国内寄託がなされている。
なお、上述の転写テンプレートの塩基配列中、「Ｔ７プロモーター領域」（ＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ）は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写に利用されるが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列として利用可能な他の塩基配列への置き換えも可能である。また、「Ｔ７プロモーター領域」（ＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ）と、５’固定領域の「ＧＧＴＡＧＡＴＡＣＧＡＴＧＧＡ」との間に、例えば、ｐｏｌｙＡ配列（Ａｎ）などを挿入し、５’末端に、このｐｏｌｙＡ配列（Ａｎ）などが付加された一本鎖ＲＮＡ分子とすることもできる。加えて、本発明にかかるＲＮＡアダプター分子は、前記のｐｏｌｙＡ配列（Ａｎ）などの付加塩基配列を含めて、塩基数は１００以下の一本鎖ＲＮＡ分子であり、全体を化学合成により作製することも可能である。
また、本発明にかかるＲＮＡアダプター分子は、その塩基配列を保持しつつ、構成される塩基に対して、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＣＨ３）などの修飾を施す形態とすることもできる。加えて、一本鎖ＲＮＡ分子を構成する主鎖に対して、５’及び３’ホスホロチオエートキャッピング、３’末端での３’−３’逆ホスホジエステル連結などの修飾を施すことも可能である。これらの修飾は、ＲＮａｓｅによるＲＮＡ分子の分解に対する耐性を付加する機能を有し、一本鎖ＲＮＡ分子の安定性を向上する効果を有する。
本発明にかかるＲＮＡアダプター分子は、ＧＳＴタンパク質のみでなく、該ＧＳＴタンパク質をＮ末側融合パートナーとする融合タンパク質中の該ＧＳＴタンパク質部分に対して、特異的で高い結合性を示す。この利点から、アフィニティー・カラム精製における、前記ＧＳＴタンパク質に特異的な結合性を有する核酸リガンド基材、あるいは、該ＧＳＴタンパク質をＮ末側融合パートナーとする融合タンパク質の検出を目的とする、標識物質の調製において、前記ＧＳＴタンパク質に特異的な結合性を有する核酸リガンド基材として利用可能である。
【実施例】
【００３７】
以下に、ＳＥＬＥＸ法を適用して、本発明にかかる「ＧＳＴタンパク質に対するＲＮＡアダプター分子」を選択する一連のプロセスを具体的に説明する。
「ランダム一本鎖核酸分子ライブラリー」
ＳＥＬＥＸ法を適用する「ＧＳＴタンパク質に対するＲＮＡアダプター分子」の採取を進める際、スクリーニングの対象とする「ランダム一本鎖核酸分子ライブラリー」は、下記の塩基配列を有する「ランダムＤＮＡ分子ライブラリー」を使用して、転写される一本鎖ＲＮＡ分子のプールを用いる。【００３８】
この「ランダムＤＮＡ分子ライブラリー」は、ランダムな塩基配列領域を内在するＤＮＡ分子で構成されており、各ＤＮＡ分子の塩基配列は、下記の塩基配列Ｄｒａｎｄｕｍ０：
５’−ＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ  ＧＧＴＡＧＡＴＡＣＧＡＴＧＧＡ  
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ  ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ  ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ  
ＣＡＴＧＡＣＧＣＧＣＡＧＣＣＡＡ−３’
で表記され、
５’固定領域：ＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ  ＧＧＴＡＧＡＴＡＣＧＡＴＧＧＡ
３０塩基のランダム領域：Ｎ３０
３’固定領域：ＣＡＴＧＡＣＧＣＧＣＡＧＣＣＡＡ
の三種の領域で構成されている。【００３９】
その５’固定領域中のＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写の際、プロモーター領域として機能する「Ｔ７プロモーター領域」であり、このＤＮＡ分子（転写テンプレート）から、該プロモーター領域の下流部分が転写される。すなわち、転写される一本鎖ＲＮＡ分子は、下記の塩基配列Ｒｃａｎｄｉｄａｔｅ０：
５’−ＧＧＵＡＧＡＵＡＣＧＡＵＧＧＡ  
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ  ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ  ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ  
ＣＡＵＧＡＣＧＣＧＣＡＧＣＣＡＡ−３’
を有するものとなる。
なお、ＳＥＬＥＸ法を適用する際、各回のラウンドにおいて、選択される一本鎖ＲＮＡ分子から、ＲＴ−ＰＣＲ法を利用して、次回のラウンドで使用されるｃＤＮＡ分子（転写テンプレート）を、増幅産物として調製する。その際、逆転写の工程では、前記一本鎖ＲＮＡ分子の３’末端固定領域の塩基配列と相補的なＤＮＡプライマー、すなわち、下記の塩基配列を有する３’プライマー：
３’プライマー
５’−ＴＴＧＧＣＴＧＣＧＣＧＴＣＡＴＧ−３’
を用いて、その３’側に、各一本鎖ＲＮＡ分子と相補的なＤＮＡ鎖の伸長を行う。この逆転写工程で得られる一本鎖ＤＮＡ分子は、下記の塩基配列：
５’−ＴＴＧＧＣＴＧＣＧＣＧＴＣＡＴＧ
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ  ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ  ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ  
ＴＣＣＡＴＣＧＴＡＴＣＴＡＣＣ−３’
を有するものである。その後、この一本鎖ＤＮＡ分子の３’末端の「ＴＣＣＡＴＣＧＴＡＴＣＴＡＣＣ−３’」部分に対して、相補的な塩基配列部分を含む、上流側ＰＣＲプライマー：
５’-TGTAATACGACTCACTATA  GGTAGATACGATGGA−３’
３’−CCATCTATGCTACCT−Ｎ３０−
ならびに、その５’末端の「ＴＴＧＧＣＴＧＣＧＣＧＴＣＡＴＧ」部分と同じ塩基配列を有する、下流側ＰＣＲプライマー：
５’−TTGGCTGCGCGTCATG−３’
３’−AACCGACGCGCAGTAC−Ｎ３０−
を利用して、ＰＣＲ反応を行う。最終的に、次回のラウンドで使用されるｃＤＮＡ分子（転写テンプレート）として、下記の塩基配列ＤｒａｎｄｕｍＩ：
５’−ＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ  ＧＧＴＡＧＡＴＡＣＧＡＴＧＧＡ  
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ  ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ  ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ  
ＣＡＴＧＡＣＧＣＧＣＡＧＣＣＡＡ−３’
で表記されるものが調製される。
最初の「ランダムＤＮＡ分子ライブラリー」は、エスペック株式会社により合成されたものを利用している。その際、３０塩基のランダム領域：Ｎ３０部分は、少なくとも、
３’プライマー（下流側ＰＣＲプライマー）の塩基配列である「５’−ＴＴＧＧＣＴＧＣＧＣＧＴＣＡＴＧ−３’」、ならびに、上流側ＰＣＲプライマーの「５’−ＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ  ＧＧＴＡＧＡＴＡＣＧＡＴＧＧＡ−３’」中に含まれる、部分塩基配列「５’−ＧＧＴＡＧＡＴＡＣＧＡＴＧＧＡ−３’」と同じ塩基配列、あるいは、それらに相補的な塩基配列を、その内部に含まないように、そのランダムな塩基配列が構築されている。すなわち、次回のラウンドで使用されるｃＤＮＡ分子（転写テンプレート）を、ＲＴ−ＰＣＲ法を利用して調製する際、３０塩基のランダム領域：Ｎ３０部分に対して、これらプライマーがハイブリダイズする不具合を、予め回避するように、３０塩基のランダム領域：Ｎ３０部分の「ランダム配列の範囲」の設計がなされている。
標的タンパク質の調製
ＳＥＬＥＸ法を適用する際、標的タンパク質として利用する、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  由来のＧＳＴタンパク質は、当該ＧＳＴタンパク質のコード遺伝子を含む、組換え発現用プラスミド・ベクターとして市販されている、ｐＧＥＸ  ６ｐ−２  ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を用いて、宿主大腸菌  ＢＬ２１株（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｇｅｎｅ）を形質転換し、得られる形質転換株において、組換えタンパク質として生産する。なお、ｐＧＥＸ  ６ｐ−２  ベクターは、図１に示す構成であり、選択マーカーとして、薬剤耐性遺伝子Ａｍｐｒを内在しており、形質転換株の選択は、この選択マーカーを利用して行う。アンピシリンを添加する培地上でコロニーを形成させ、薬剤耐性遺伝子Ａｍｐｒを保有する形質転換株を選別する。このコロニー選別を繰り返し、目的のｐＧＥＸ  ６ｐ−２  ベクターを保持する形質転換株を単離する。
取得される形質転換株を、３７℃で、培養し、培地中の菌体密度の指標；ＯＤ６００＝０．５に達したところで、その培地中に、ＩＰＴＧ（終濃度０．１ｍＭ）を添加し、２時間培養する。ＩＰＴＧ添加により、該ｐＧＥＸ  ６ｐ−２  ベクターのｔａｃプロモーターから、当該ＧＳＴタンパク質のコード遺伝子の発現が誘導され、菌体内に組換え発現型ＧＳＴタンパク質が蓄積される。培養菌体を回収し、菌体破砕後、遠心（１５，０００ｒｐｍ；１８，８００×ｇ）により、可溶性画分（細胞質成分）ならびに不溶性画分（膜成分）を分離する。ＰＢＳ緩衝液中に、組換え発現型ＧＳＴタンパク質を含む可溶性画分（細胞質成分）が溶解している上清を回収する。【００４０】
可溶性画分（細胞質成分）中に含まれる、組換え発現型ＧＳＴタンパク質の単離は、当該ＧＳＴタンパク質を対象とするアフィニティー・カラム：ＧＳＴｒａｐ  ＦＦカラムを利用して行う。該ＧＳＴｒａｐ  ＦＦカラムに、ＰＢＳ緩衝液中に可溶性画分（細胞質成分）が溶解している上清を載せると、組換え発現型ＧＳＴタンパク質以外の夾雑タンパク質は、当初のｒｕｎ−ｔｈｒｏｕｇｈ部分中に含まれる。一方、組換え発現型ＧＳＴタンパク質は、このＧＳＴｒａｐ  ＦＦカラムに一旦捕捉される。カラムから流出するＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．３）中に含まれるタンパク質濃度を、波長２８０ｎｍにおける吸光度ＯＤ２８０によりモニターし、夾雑タンパク質の流出が完了した時点で、溶出バッファー；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  （ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  グルタチオンを流し、組換え発現型ＧＳＴタンパク質を溶出させる。カラムから流出する、溶出バッファー中に含有されるタンパク質濃度を、吸光度ＯＤ２８０によりモニターしつつ、かかる溶出条件において、ＧＳＴｒａｐ  ＦＦカラムから溶出されるタンパク質を含む画分を採取する。図２に、かかるアフィニティー・カラムから流出する液中に含まれるタンパク質濃度（吸光度ＯＤ２８０）の経時的にモニターする際、前記ＧＳＴｒａｐ  ＦＦカラム精製により、単離される組換え発現型ＧＳＴタンパク質を含む画分に相当するタンパク質濃度（吸光度ＯＤ２８０）ピークを示す。【００４１】
採取される溶出画分を、ゲル濾過：ＨｉＬｏａｄ  １６／１０  ２００  ｐｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）にかけ、溶出バッファー；ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．３）より溶出される各画分中に含有されるタンパク質濃度を吸光度ＯＤ２８０によりモニターしつつ、主要なタンパク質濃度ピークに相当する一連の画分を分離する。図３に、かかるゲル濾過カラムから流出する液中に含まれるタンパク質濃度（吸光度ＯＤ２８０）の経時的にモニターする際、組換え発現型ＧＳＴタンパク質を含む画分に相当するタンパク質濃度（吸光度ＯＤ２８０）ピークを示す。図４に、前記ゲル濾過条件において、採取される、主要なタンパク質濃度ピークに相当する一連の画分について、各画分に含まれるタンパク質に関して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において見出されるバンドを示す。図４に示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果において、各レーン（各画分）において、目的とするＧＳＴタンパク質に対応する２６ｋＤａのバンドの強度（タンパク質量）は、図３に示す、各画分に含まれるタンパク質濃度（吸光度ＯＤ２８０）と対応している。この２６ｋＤａのバンド以外に、この分子量領域において、明確に認識可能なバンドは見出されない。なお、カラム精製における、各溶出画分中に含まれるタンパク質濃度（吸光度ＯＤ２８０）の測定は、ＡＫＴＡ自動精製装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を利用して行われる。
加えて、Ｎ末側融合パートナーのＧＳＴタンパク質部分のＣ末に他のタンパク質を連結した、ＧＳＴタンパク質−目的タンパク質の融合タンパク質をも、組換えタンパク質として生産する。ｐＧＥＸ  ６ｐ−２  ベクターは、本来、ＧＳＴタンパク質−目的タンパク質の融合タンパク質の組換え発現に利用されるベクターであり、ＧＳＴタンパク質のコード領域の下流に、目的タンパク質のコード遺伝子を挿入するクローニング・サイトを具えている。このクローニング・サイトを利用して、目的タンパク質のコード遺伝子を挿入し、ＧＳＴタンパク質−目的タンパク質の融合タンパク質発現用ベクターを構築する。構築されるＧＳＴタンパク質−目的タンパク質の融合タンパク質発現用ベクターを用いて、宿主大腸菌  ＢＬ２１株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換し、得られる形質転換株において、組換えタンパク質として生産する。【００４２】
形質転換株の選別、組換えタンパク質の産生、ならびに、組換えタンパク質の単離、精製は、上述のＧＳＴタンパク質において利用する手法に準じて行う。
ＳＥＬＥＸ法を適用するＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  由来のＧＳＴタンパク質に対して、特異的な結合能を示す一本鎖ＲＮＡ分子の選択
（１）初回の選択ラウンドに利用する、候補一本鎖ＲＮＡ分子のプール（初回ＲＮＡプール）の調製
上記の「ランダムＤＮＡ分子ライブラリー」を構成する各ＤＮＡ分子を、転写テンプレートとして利用して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を行い、上記塩基配列Ｒｃａｎｄｉｄａｔｅ０で示されるランダムな塩基配列部分を内在する、一群の候補一本鎖ＲＮＡ分子を作製する（Ｆｉｔｚｗａｔｅｒ  ａｎｄ  Ｐｏｌｉｓｋｙ  （１９９６）  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚ．  ２６７：  ２７５−３０１を参照）。転写された一群の候補一本鎖ＲＮＡ分子を含む反応液中から、アルコール沈澱されるＲＮＡ分子を遠心して、沈澱画分として分離回収する。回収される一群の候補一本鎖ＲＮＡ分子は、Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に再溶解し、所定のＲＮＡ分子含有濃度の初回ＲＮＡプールとする。その際、初回ＲＮＡプールのＲＮＡ分子含有濃度は、１５μＭに選択されている。
（２）Ｆｉｌｔｅｒ分離法を利用する、ＧＳＴタンパク質に対して結合能を示す一本鎖ＲＮＡ分子の選択
対象タンパク質のＧＳＴタンパク質に対して、結合能を示す一本鎖ＲＮＡ分子を下記の手順により選択する。【００４３】
精製済みの組換えＧＳＴタンパク質と、前記初回ＲＮＡプール中に含まれる一群の候補一本鎖ＲＮＡ分子とを、前記Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ中に溶解する液を、室温でインキュベーションする。この間に、ＧＳＴタンパク質に対して、結合能を示す一本鎖ＲＮＡ分子は、その結合能に応じて、一定の比率で、ＧＳＴタンパク質と複合体を形成する。【００４４】
次いで、濾過マニフォールド（ミリポア社）を使用して、１３ｍｍφニトロセルロースフィルターにより、インキュベーション液中に含まれる、組換えＧＳＴタンパク質、ならびに一本鎖ＲＮＡ分子／ＧＳＴタンパク質複合体を濾別する。初回ＲＮＡプール中に含まれる一群の候補一本鎖ＲＮＡ分子中、一本鎖ＲＮＡ分子／ＧＳＴタンパク質複合体の形成していないものは、前記ニトロセルロースフィルターを透過し、この濾液中に回収される。【００４５】
その際、濾液中に回収される一本鎖ＲＮＡ分子の量を測定し、インキュベーション液中に添加されていた一本鎖ＲＮＡ分子の総量と比較し、その比率が５％〜５０％の範囲に収まるように、インキュベーション液中に配合されるＧＳＴタンパク質の含有濃度を調整する。【００４６】
一方、ニトロセルロースフィルター上に濾別されている、組換えＧＳＴタンパク質、ならびに一本鎖ＲＮＡ分子／ＧＳＴタンパク質複合体は、溶出液；６Ｍ尿素を含むＢｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを用いて、溶出処理を施す。この溶出処理により、前記フィルター上の一本鎖ＲＮＡ分子／ＧＳＴタンパク質複合体から溶出される一本鎖ＲＮＡ分子を含む液を回収する。この回収された溶出液中に含まれる一本鎖ＲＮＡ分子は、エタノール沈澱処理を施し、遠心して、沈澱画分として分離回収する。分離回収される、初回ラウンドにおいて、選択される一群の一本鎖ＲＮＡ分子から、トリ骨髄芽球症ウィルス由来の逆転写酵素（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を利用して、逆転写を行ってｃＤＮＡを調製する。【００４７】
初回ラウンドにおいて選択される、一群の一本鎖ＲＮＡ分子は、いずれも、その３’固定領域として、「ＣＡＵＧＡＣＧＣＧＣＡＧＣＣＡＡ−３’」の塩基配列を保持している。従って、前記逆転写では、この３’固定領域の塩基配列に対して、相補的な塩基配列の３’プライマー「５’−ＴＴＧＧＣＴＧＣＧＣＧＴＣＡＴＧ−３’」を利用して、その３’末端へ、各一本鎖ＲＮＡ分子の「３０塩基のランダム領域」、ならびに、５’固定領域「５’−ＧＧＵＡＧＡＵＡＣＧＡＵＧＧＡ」に相補的な塩基配列を有するＤＮＡ鎖の伸長がなされる。【００４８】
さらに、前記逆転写で得られるｃＤＮＡを鋳型として、下記ＰＣＲプライマー対；
３’プライマー（下流側ＰＣＲプライマー）：５’−ＴＴＧＧＣＴＧＣＧＣＧＴＣＡＴＧ−３’
上流側ＰＣＲプライマー：５’−ＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ  ＧＧＴＡＧＡＴＡＣＧＡＴＧＧＡ−３’
ならびに、ＤＮＡポリメラーゼ酵素：Ｅｘ−Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）を利用して、合計１５サイクルのＰＣＲ反応を行う。得られるＰＣＲ増幅産物は、両端に３’プライマー（下流側ＰＣＲプライマー）、上流側ＰＣＲプライマーに由来する固定領域を持ち、その間に初回ラウンドにおいて選択される、一群の一本鎖ＲＮＡ分子一本鎖ＲＮＡ分子中の「３０塩基のランダム領域」の転写に利用可能な「３０塩基の選択塩基配列領域」を有するものとなる。【００４９】
得られるＰＣＲ増幅産物は、このＰＣＲ反応液中に含まれる相補鎖相互のハイブリダイズを行い、二本鎖ＤＮＡ分子として、分離回収する。分離回収される一群の二本鎖ＤＮＡ分子（初回スクリーニングＤＮＡ分子グループ）は、次の選択ラウンドにおいて利用する候補一本鎖ＲＮＡ分子のプール（ＲＮＡプール）の調製において、転写テンプレートとして使用される。
初回ＲＮＡプールの調製に利用する「ランダムＤＮＡ分子ライブラリー」では、各転写テンプレート（二本鎖ＤＮＡ分子）の含有比率は、原理的には、同じ比率となるように、設計されているが、２回目選択ラウンド用ＲＮＡプールの調製に利用する「初回スクリーニングＤＮＡ分子グループ」では、ＧＳＴタンパク質に対して結合能を示す一本鎖ＲＮＡ分子由来の各転写テンプレート（二本鎖ＤＮＡ分子）の含有比率は、その一本鎖ＲＮＡ分子が有する結合能の高低に対応するものとなる。すなわち、高い結合能を示す一本鎖ＲＮＡ分子の転写に利用される転写テンプレート（二本鎖ＤＮＡ分子）が、「濃縮」された状態となる。
２回目選択ラウンド用ＲＮＡプールの調製は、「初回スクリーニングＤＮＡ分子グループ」を構成する各転写テンプレート（二本鎖ＤＮＡ分子）から、上記（１）初回ＲＮＡプールの調製に記載する手順に準じて、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により行う。同様の分離、回収、再溶解手順に従って、Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒに再溶解し、所定のＲＮＡ分子含有濃度の２回目ＲＮＡプールとする。その際、２回目ＲＮＡプールのＲＮＡ分子含有濃度は、１０μＭに選択されている。【００５０】
また、２回目選択ラウンドも、初回目選択ラウンドと同様の操作により行う。その際、濾液中に回収される一本鎖ＲＮＡ分子の量を測定し、インキュベーション液中に添加されていた一本鎖ＲＮＡ分子の総量と比較し、その比率が５％〜５０％の範囲に収まるように、インキュベーション液中に配合されるＧＳＴタンパク質の含有濃度を調整する。すなわち、２回目選択ラウンド用ＲＮＡプール中では、ＧＳＴタンパク質に対する結合能を示す一本鎖ＲＮＡ分子の含有比率が上昇しており、それに対応させて、初回目選択ラウンドの場合と比較して、２回目選択ラウンドにおけるインキュベーション液中に配合されるＧＳＴタンパク質の含有濃度を低下させる。この２回目選択ラウンドにおいて、選択されるＧＳＴタンパク質に対して結合能を示す一本鎖ＲＮＡ分子より、同様の手順で、逆転写、ＰＣＲ反応を行い、「２回目スクリーニングＤＮＡ分子グループ」を調製する。この「２回目スクリーニングＤＮＡ分子グループ」では、「初回スクリーニングＤＮＡ分子グループ」と比較して、高い結合能を示す一本鎖ＲＮＡ分子の転写に利用される転写テンプレート（二本鎖ＤＮＡ分子）が、「濃縮」された状態となる。【００５１】
以下、順次、スクリーニング・ラウンドを重ね、合計ラウンド数（回数）が１３に達した時点、すなわち、初回〜１３回目のラウンドを終えた時点で、「１３回目スクリーニングＤＮＡ分子グループ」を、Ｆｉｌｔｅｒ分離法を用いたＳＥＬＥＸ法により選別される、より高い結合能を示す一本鎖ＲＮＡ分子の転写に利用される転写テンプレート（二本鎖ＤＮＡ分子）群として、採取する。【００５２】
なお、選択ラウンド各回において、「濃縮」比率を所望の範囲に維持するため、上で説明するように、インキュベーション液中に配合されるＧＳＴタンパク質の含有濃度を、回数を重ねる毎に減少させている。但し、一本鎖ＲＮＡ分子の合計／ＧＳＴタンパク質の濃度比率が極端に大きくならないように、一本鎖ＲＮＡ分子の合計含有濃度も回数を重ねる毎に徐々に減少させている。具体的には、初回選択ラウンド〜１３回目選択ラウンドに到る間に、インキュベーション液中に配合されるＧＳＴタンパク質の含有濃度は、初回選択ラウンド時の１５μＭから、１３回目選択ラウンド時の１ｎＭへと低下させている。一方、一本鎖ＲＮＡ分子の合計含有濃度は、初回選択ラウンド時の１５μＭから、１３回目選択ラウンド時の１００ｎＭへと低下させている。従って、インキュベーション液中における、一本鎖ＲＮＡ分子の合計／ＧＳＴタンパク質の濃度比率は、初回選択ラウンド時１：１、１３回目選択ラウンド時１００：１であり、その間の選択ラウンドでは、１：１〜１００：１の範囲となっている。
（３）表面プラズモン共鳴バイオセンサーを利用する、ＧＳＴタンパク質に対して結合能を示す一本鎖ＲＮＡ分子の選択
１３回目選択ラウンドを終えた時点で、Ｆｉｌｔｅｒ分離法を用いたＳＥＬＥＸ法による選別に必要な「濃縮」比率を維持する上で、インキュベーション液中に配合されるＧＳＴタンパク質の含有濃度をさらに低減することが困難となっているため、表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用いたＳＥＬＥＸ法による選別に移行する。【００５３】
使用した表面プラズモン共鳴装置は、ＢＩＡｃｏｒｅモデル２０００（ビアコア株式会社）である。Ｂｉａｃｏｒｅアミンカップリングキットを利用して、該表面プラズモン共鳴装置用のＣＭ４  ＢＩＡＣＯＲＥチップ（ビアコア社）表面に、ＥＤＣ−ＮＨＳ活性化処理を施す。前記アミンカップリング剤を利用して、このＥＤＣ−ＮＨＳ活性化処理を施したチップ表面上にＧＳＴタンパク質を固定化する。【００５４】
一方、選択に利用するＲＮＡプールは、「１３回目スクリーニングＤＮＡ分子グループ」を構成する各転写テンプレート（二本鎖ＤＮＡ分子）から、上記（１）初回ＲＮＡプールの調製に記載する手順に準じて、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により行う。同様の分離、回収、再溶解手順に従って、Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒに再溶解し、所定のＲＮＡ分子含有濃度の１４回目ＲＮＡプールとする。その際、表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用いたＳＥＬＥＸ法による選別に利用する、１４回目ＲＮＡプールのＲＮＡ分子含有濃度は、１００ｎＭに選択されている。【００５５】
該表面プラズモン共鳴装置では、表面にＧＳＴタンパク質を固定化したチップ上に、４つのフローセルが構成されている。この各フローセルに対して、１４回目ＲＮＡプールの液を、流速３０μＬ／分で流入し、チップ上に固定されているＧＳＴタンパク質に結合させる。各フローセルに注入した１４回目ＲＮＡプールの液量が、１００μＬに達した時点で、Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒに切換え、流速３０μＬ／分で流入させ、ＧＳＴタンパク質に結合させた一本鎖ＲＮＡ分子を解離させ、溶出させる。この一旦、ＧＳＴタンパク質と結合した後、解離して、溶出される一本鎖ＲＮＡ分子を含む溶出液を、各３００μＬの画分（各１０分間）に分けて、５画分を回収する。始めの１画分を除いた４画分を同様の手順で、逆転写、ＰＣＲ反応を行い、「１４回目スクリーニングＤＮＡ分子グループ」を調製する。
この「１４回目スクリーニングＤＮＡ分子グループ」を構成する各転写テンプレート（二本鎖ＤＮＡ分子）から、上記（１）初回ＲＮＡプールの調製に記載する手順に準じて、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により行う。同様の分離、回収、再溶解手順に従って、Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒに再溶解し、所定のＲＮＡ分子含有濃度の１５回目ＲＮＡプールとする。その際、１５回目ＲＮＡプールのＲＮＡ分子含有濃度は、１００ｎＭに選択されている。【００５６】
この１５回目ＲＮＡプールを用いて、同様に手順に従って、表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用いたＳＥＬＥＸ法による選別を行う。すなわち、チップ上に固定されているＧＳＴタンパク質に一旦結合させ、その後、解離され、溶出される一本鎖ＲＮＡ分子を含む溶出液と、溶出剤によって、最終的に溶出される一本鎖ＲＮＡ分子を含む最終画分を回収し、併せる。この１５回目選択ラウンドにおいて、選択されるＧＳＴタンパク質に対して結合能を示す一本鎖ＲＮＡ分子より、同様の手順で、逆転写、ＰＣＲ反応を行い、「１５回目スクリーニングＤＮＡ分子グループ」を調製する。
（４）ＧＳＴアフィニティービーズ上に結合しているＧＳＴタンパク質を利用した、ＧＳＴタンパク質に対して結合能を示す一本鎖ＲＮＡ分子の選択
市販のＧＳＴアフィニティービーズ（アマシャムバイオサイエンス社）上に、基質グルタチオンとの結合を介して、固定化されているＧＳＴタンパク質を利用して、更なる選択を行う。【００５７】
選択に利用するＲＮＡプールは、「１５回目スクリーニングＤＮＡ分子グループ」を構成する各転写テンプレート（二本鎖ＤＮＡ分子）から、上記（１）初回ＲＮＡプールの調製に記載する手順に準じて、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により行う。同様の分離、回収、再溶解手順に従って、Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒに再溶解し、所定のＲＮＡ分子含有濃度の１６回目ＲＮＡプールとする。その際、表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用いたＳＥＬＥＸ法による選別に利用する、１６回目ＲＮＡプールのＲＮＡ分子含有濃度は、１００ｎＭに選択されている。【００５８】
一方、ＧＳＴアフィニティービーズを、タンパク質濃度１ｎＭのＧＳＴタンパク質を含む液中に浸漬することで、ＧＳＴアフィニティービーズ上に基質グルタチオンとの結合を介して、ＧＳＴタンパク質が固定化された状態とする。このＧＳＴアフィニティービーズをＢｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、固定化されていないＧＳＴタンパク質を除去する。【００５９】
このＧＳＴタンパク質を結合させたＧＳＴアフィニティービーズに対して、１６回目ＲＮＡプールを加えて、初期ＲＮＡ分子含有濃度、１００ｎＭの混合液中で、ＧＳＴアフィニティービーズ上に結合されているＧＳＴタンパク質に対して、一本鎖ＲＮＡ分子をさらに結合させる。すなわち、ＧＳＴタンパク質に対する、グルタチオンの結合の有無に依らず、ＧＳＴタンパク質に対して、結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子が選別される。【００６０】
その後、一本鎖ＲＮＡ分子を含む液相を濾過により除去し、ＧＳＴアフィニティービーズをＢｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、残余する一本鎖ＲＮＡ分子を含む液を除く。このリンス洗浄処理後、ＧＳＴアフィニティービーズを、グルタチオン（濃度１０ｍＭ）を含むＢｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ中に浸漬し、ＧＳＴアフィニティービーズ上に結合されているＧＳＴタンパク質を溶出させる。次いで、この溶出されたＧＳＴタンパク質に結合している一本鎖ＲＮＡ分子を、ＧＳＴタンパク質から解離させる。解離された一本鎖ＲＮＡ分子は、エタノール沈澱処理を施し、遠心して、沈澱画分として分離回収する。この１６回目選択ラウンドにおいて、選択されるＧＳＴタンパク質に対して結合能を示す一本鎖ＲＮＡ分子より、同様の手順で、逆転写、ＰＣＲ反応を行い、「１６回目スクリーニングＤＮＡ分子グループ」を調製する。【００６１】
この「１６回目スクリーニングＤＮＡ分子グループ」を構成する各転写テンプレート（二本鎖ＤＮＡ分子）から、上記（１）初回ＲＮＡプールの調製に記載する手順に準じて、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により行う。同様の分離、回収、再溶解手順に従って、Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒに再溶解し、所定のＲＮＡ分子含有濃度の１７回目ＲＮＡプールとする。その際、１７回目ＲＮＡプールのＲＮＡ分子含有濃度は、１００ｎＭに選択されている。【００６２】
この１７回目ＲＮＡプールを用いて、同様に手順に従って、ＧＳＴアフィニティービーズ上に結合されているＧＳＴタンパク質を用いたＳＥＬＥＸ法による選別を行う。すなわち、ＧＳＴアフィニティービーズ上に固定されているＧＳＴタンパク質に一旦結合させ、その後、ＧＳＴタンパク質を溶出し、そのＧＳＴタンパク質上から解離される一本鎖ＲＮＡ分子を、エタノール沈澱処理を施し、遠心して、沈澱画分として分離回収する。この１７回目選択ラウンドにおいて、選択されるＧＳＴタンパク質に対して結合能を示す一本鎖ＲＮＡ分子より、同様の手順で、逆転写、ＰＣＲ反応を行い、「１７回目スクリーニングＤＮＡ分子グループ」を調製する。
Ｆｉｌｔｅｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｓｓａｙ
次いで、この「１７回目スクリーニングＤＮＡ分子グループ」を構成する各転写テンプレート（二本鎖ＤＮＡ分子）から、上記（１）初回ＲＮＡプールの調製に記載する手順に準じて、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により行う。同様の分離、回収、再溶解手順に従って、Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒに再溶解し、所定のＲＮＡ分子含有濃度の１８回目ＲＮＡプールとする。その際、１８回目ＲＮＡプールのＲＮＡ分子含有濃度は、４０ｎＭに選択されている。その際、転写反応に利用する基質ＮＴＰのうち、ＡＴＰとして、α−３２Ｐ  ＡＴＰ（アマシャムバイオサイエンス社）を利用することで、一本鎖ＲＮＡ分子に放射ラベルを施す。【００６３】
この１８回目ＲＮＡプール中に含有されている、一群の一本鎖ＲＮＡ分子は、ＧＳＴタンパク質に対して、特異的で高い結合能を示すことは、上記の一連の選別の結果から、十分に予測されるが、その平衡解離定数は、その程度であるかを推定するため、下記の手順に従って、Ｆｉｌｔｅｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｓｓａｙを行う。【００６４】
放射ラベル化されている１８回目ＲＮＡプールと、ＧＳＴタンパク質とを含むインキュベーション液中、一群の一本鎖ＲＮＡ分子の合計濃度は、２０ｎＭとし、一方、ＧＳＴタンパク質の濃度は、１０００ｎＭから６２．５ｎＭまで、２倍希釈系列濃度を選択し、室温で１０分間インキュベーションを行う。次に、ニトロセルロースフィルター上に、各インキュベーション液１００μＬをスポットする。フィルター上に、ＧＳＴタンパク質ならびに一本鎖ＲＮＡ分子／ＧＳＴタンパク質複合体を吸着させた後、Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、複合体を形成していない一本鎖ＲＮＡ分子を除去する。【００６５】
放射ラベルから発するγ線量の測定には、富士写真フィルム株式会社製のイメージングプレート、およびバイオイメージングアナライザーＢＡＳ２５００を使用する。フィルター上の各スポット点において、発するγ線により、イメージングプレートを露光させ、その露光量をＢＡＳ２５００上で測定する。具体的には、ＩｍａｇｅＲｅａｄｅｒ（富士写真フィルム株式会社）で露光量を可視化し、ＩｍａｇｅＧａｕｇｅ  ｖｅｒ．４．０（富士写真フィルム株式会社）で、露光量を数値化する。【００６６】
図５に、Ｆｉｌｔｅｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｓｓａｙの測定結果の一例を示す。また、１８回目ＲＮＡプール中に含有されている、一群の一本鎖ＲＮＡ分子は、見掛けの平衡解離定数として、ＫＤ＝約４００ｎＭを示すと算定された。
クローニング
前記一連のＳＥＬＥＸ法により選別される「１７回目スクリーニングＤＮＡ分子グループ」に含まれる転写テンプレート（二本鎖ＤＮＡ分子）群は、市販のＴＡクローニング・キット（インビトロジェン株式会社）を利用して、クローニングする。具体的には、当該キットに添付される標準プロトコルに従って、上記ＲＴ−ＰＣＲによる増幅産物（二本鎖ＤＮＡ分子）群を、クローニングベクター；ｐＣＲ２．１  ベクターへ、ライゲーションする。このライゲーション後、クローニングベクターにより、大腸菌株ＴＯＰ１０を形質転換させる。【００６７】
次いで、前記クローニングベクター由来の選択マーカーを利用し、定法に従って、クローニングベクターを保持する形質転換株をコロニー選別する。
ベクターの精製・挿入ＤＮＡ断片の塩基配列の決定
コロニー選別された形質転換株から、計４０クローンを無作為に選択した上で、当該クローニングベクターに挿入されているＤＮＡ断片の塩基配列を解析する。【００６８】
選択された各クローンを別途培養し、かかるクローンが保持するプラスミド・ベクターを、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用して、分離精製する。この精製された各クローンが保持するプラスミド・ベクター中に挿入されているＤＮＡ断片部分中、５’側の上流側ＰＣＲプライマーに由来する固定領域と、３’側の下流側ＰＣＲプライマーに由来する固定領域との間に存在する、各クローンに固有の「３０塩基の選択塩基配列領域」の塩基配列を解析する。具体的には、挿入されているＤＮＡ断片部分中、５’側の上流側ＰＣＲプライマーに由来する固定領域のうち、「ＧＧＴＡＧＡＴＡＣＧＡＴＧＧＡ」に相当する配列決定プライマー：
５’−ＧＧＴＡＧＡＴＡＣＧＡＴＧＧＡ−３’
を利用し、ＢｉｇＤｙｅキット（アプライドバイオシステム株式会社）を用い、挿入されているＤＮＡ断片部分を鋳型として、配列決定用の核酸鎖伸長反応を行う。作製される配列決定用生成物をＡＢＩモデル３１０シークエンサーで分析し、各クローンに固有の「３０塩基の選択塩基配列領域」、ならびに、その３’側の下流側ＰＣＲプライマーに由来する固定領域について、その塩基配列を解析する。
前記計４０クローンが有する、「３０塩基の選択塩基配列領域」の塩基配列を比較すると、同じ塩基配列を有する多数のクローンが含まれていることが確認された。具体的には、各クローンに固有の「３０塩基の選択塩基配列領域」の塩基配列として、計４０クローン中には、三種のものが存在するのみであった。見出された三種の塩基配列は、配列決定プライマーとして利用する、５’側の上流側ＰＣＲプライマーに由来する固定領域のうち、「ＧＧＴＡＧＡＴＡＣＧＡＴＧＧＡ」の領域と、「３０塩基の選択塩基配列領域」、ならびに、その３’側の下流側ＰＣＲプライマーに由来する固定領域の塩基配列として表記すると、以下のＮｏ．３クローン、Ｎｏ．５クローン、ならびにＮｏ．２６クローンに挿入されているＤＮＡ断片の部分塩基配列である。【００６９】
Ｎｏ．３クローンに挿入されているＤＮＡ断片の部分塩基配列：
ＧＧＴＡＧＡＴＡＣＧＡＴＧＧＡ  ＴＧＧＴＴＧＴＧＴＡＡＡＧＧＴＧＧＴＣＧＴＡＴＣＣＧＣＣＧＡ  ＣＡＴＧＡＣＧＣＧＣＡＧＣＣＡＡ
Ｎｏ．５クローンに挿入されているＤＮＡ断片の部分塩基配列：
ＧＧＴＡＧＡＴＡＣＧＡＴＧＧＡ  ＣＴＡＡＣＴＧＣＧＣＡＡＡＴＴＡＣＴＣＧＴＡＴＴＡＧＣＣＧＡ  ＣＡＴＧＡＣＧＣＧＣＡＧＣＣＡＡ
Ｎｏ．２６クローンに挿入されているＤＮＡ断片の部分塩基配列：
ＧＧＴＡＧＡＴＡＣＧＡＴＧＧＡ  ＴＡＣＣＧＡＡＡＡＡＴＴＡＧＴＧＴＣＧＴＴＧＡＣＴＧＣＡＡ  ＣＡＴＧＡＣＧＣＧＣＡＧＣＣＡＡ
従って、「１７回目スクリーニングＤＮＡ分子グループ」に含まれている転写テンプレート（二本鎖ＤＮＡ分子）群中には、対応する転写テンプレート（二本鎖ＤＮＡ分子）として、５’側の上流側ＰＣＲプライマーに由来する固定領域「５’−ＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ  ＧＧＴＡＧＡＴＡＣＧＡＴＧＧＡ−３’」を具える、以下のＮｏ．３クローン、Ｎｏ．５クローン、ならびにＮｏ．２６クローンの塩基配列で示される転写テンプレート（二本鎖ＤＮＡ分子）が含まれている。【００７０】
Ｎｏ．３クローンに挿入されているＤＮＡ断片の塩基配列：
ＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ  ＧＧＴＡＧＡＴＡＣＧＡＴＧＧＡ  ＴＧＧＴＴＧＴＧＴＡＡＡＧＧＴＧＧＴＣＧＴＡＴＣＣＧＣＣＧＡ  ＣＡＴＧＡＣＧＣＧＣＡＧＣＣＡＡ
Ｎｏ．５クローンに挿入されているＤＮＡ断片の塩基配列：
ＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ  ＧＧＴＡＧＡＴＡＣＧＡＴＧＧＡ  ＣＴＡＡＣＴＧＣＧＣＡＡＡＴＴＡＣＴＣＧＴＡＴＴＡＧＣＣＧＡ  ＣＡＴＧＡＣＧＣＧＣＡＧＣＣＡＡ
Ｎｏ．２６クローンに挿入されているＤＮＡ断片の塩基配列：
ＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ  ＧＧＴＡＧＡＴＡＣＧＡＴＧＧＡ  ＴＡＣＣＧＡＡＡＡＡＴＴＡＧＴＧＴＣＧＴＴＧＡＣＴＧＣＡＡ  ＣＡＴＧＡＣＧＣＧＣＡＧＣＣＡＡ
なお、上記の三種のクローン；Ｎｏ．３クローン、Ｎｏ．５クローン、Ｎｏ．２６クローンが保持しているプラスミドは、それぞれ、識別のための表示として、「ｐＣＲ−ＧＳＴ  Ｎｏ．３」を付し、受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４３９、「ｐＣＲ−ＧＳＴ  Ｎｏ．５」を付し、受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４４０、「ｐＣＲ−ＧＳＴ  Ｎｏ．２６」を付し、受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４４１として、平成１７年３月７日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６、郵便番号３０５−８５６６）に国内寄託がなされている。
なお、ＧＳＴタンパク質に代えて、ＧＳＴタンパク質／目的タンパク質型の融合タンパク質を利用して、上述の「Ｆｉｌｔｅｒ分離法を利用する、ＧＳＴタンパク質に対して結合能を示す一本鎖ＲＮＡ分子の選択」と同様の手順によって、該融合タンパク質に対して結合能を示す一本鎖ＲＮＡ分子群を選択した。選別された一群の一本鎖ＲＮＡ分子中には、上記の三種のクローン；Ｎｏ．３クローン、Ｎｏ．５クローン、Ｎｏ．２６クローン中にクローニングされている、転写テンプレート（二本鎖ＤＮＡ分子）から転写される一本鎖ＲＮＡ分子と同一の塩基配列を有するものが含まれていることが確認された。すなわち、上記の三種のクローン；Ｎｏ．３クローン、Ｎｏ．５クローン、Ｎｏ．２６クローン中にクローニングされている、転写テンプレート（二本鎖ＤＮＡ分子）から転写される一本鎖ＲＮＡ分子は、ＧＳＴタンパク質／目的タンパク質型の融合タンパク質に対して、そのＮ末側の融合パートナーのＧＳＴタンパク質部分に対して、結合能を示すものであることが確認される。
平衡解離定数の決定
上記の三種のクローン；Ｎｏ．３クローン、Ｎｏ．５クローン、Ｎｏ．２６クローン中にクローニングされている、転写テンプレート（二本鎖ＤＮＡ分子）から転写される一本鎖ＲＮＡ分子の示す、ＧＳＴタンパク質に対する結合能の指標として、一本鎖ＲＮＡ分子／ＧＳＴタンパク質複合体の平衡解離定数を評価する。
各クローンが保持するプラスミド・ベクター；「ｐＣＲ−ＧＳＴ  Ｎｏ．３」、「ｐＣＲ−ＧＳＴ  Ｎｏ．５」、「ｐＣＲ−ＧＳＴ  Ｎｏ．２６」を鋳型として、
下流側プライマー（３’プライマー）：
５’−ＴＴＧＧＣＴＧＣＧＣＧＴＣＡＴＧ−３’
ならびに、５’プライマー「ＧＧＴＡＧＡＴＡＣＧＡＴＧＧＡ」の上流側にｐｏｌｙＡ（Ａｎ）を付加し、その５’側に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写の際、プロモーター領域として機能する「Ｔ７プロモーター領域（ＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ）」を配している、上流側プライマー：
５’−ＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ  Ａｎ  ＧＧＴＡＧＡＴＡＣＧＡＴＧＧＡ−３’
を用いて、ＰＣＲ反応を行う。得られるＰＣＲ産物は、５’側に、前記上流側プライマーに由来する、「Ｔ７プロモーター領域」、「ｐｏｌｙＡ（Ａｎ）部分」、「５’プライマー部分」、一方、３’側に、上流側プライマーに由来する「５’プライマー部分」を、それぞれ固定領域として含むものとなる。【００７１】
このＰＣＲ産物を精製した後、精製されたＰＣＲ産物を転写テンプレートとして、上述の転写条件に従って、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応により、一本鎖ＲＮＡ分子を調製する。転写される一本鎖ＲＮＡ分子は、ＧＳＴタンパク質に対する高い結合能を示す一本鎖ＲＮＡ分子（ＲＮＡアダプター分子）の５’側に、ｐｏｌｙＡ（Ａｎ）が付加されたものとなる。【００７２】
ＳＡ  ＢＩＡＣＯＲＥ  チップ（ビアコア社）の表面に、合成ビオチン化ｐｏｌｙｄＴ（北海道システムサイエンス）を結合させる。チップ表面に固定化されている、合成ビオチン化ｐｏｌｙｄＴに対して、５’側にｐｏｌｙＡ（Ａｎ）が付加されている一本鎖ＲＮＡ分子（ＲＮＡアダプター分子）をアニールさせ、ｐｏｌｙｄＴとｐｏｌｙＡ（Ａｎ）とのハイブリッド結合を介して、一本鎖ＲＮＡ分子（ＲＮＡアダプター分子）を固定化する。【００７３】
表面プラズモン共鳴装置によって、この一本鎖ＲＮＡ分子（ＲＮＡアダプター分子）が固定化されているチップを利用し、一本鎖ＲＮＡ分子（ＲＮＡアダプター分子）とＧＳＴタンパク質との複合体形成過程、その解離過程を測定する。その結果を解析することで、複合体の平衡解離定数を求める。【００７４】
表面プラズモン共鳴装置：ＢＩＡｃｏｒｅモデル２０００において、チップのフローチャンネルに、ＧＳＴタンパク質を種々の含有濃度で含む緩衝液を流速３０μＬ／分で流入させ、チップ上に固定化されている一本鎖ＲＮＡ分子（ＲＮＡアダプター分子）とＧＳＴタンパク質の複合体形成を行う。この複合体形成過程（結合過程）における、複合体量の増加に伴う信号強度の時間変化を２分間観察する。次いで、ＧＳＴタンパク質を含まない緩衝液に切換え、同じく、流速３０μＬ／分で流入させ、形成された複合体の解離を進める。この解離過程における、複合体量の減少に伴う信号強度の時間変化を３分間観察する。【００７５】
流入されたＧＳＴタンパク質溶液中のＧＳＴタンパク質濃度、その際、測定される信号強度の時間変化に対して、ＢＩＡ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｖｅｒ．３．１を用いて、パラメーター・フィッティングを行い、平衡解離定数ＫＤを求める。【００７６】
図６、図７、図８に、三種のクローン；Ｎｏ．３クローン、Ｎｏ．５クローン、Ｎｏ．２６クローン中に挿入されているＤＮＡ断片に由来する、各一本鎖ＲＮＡ分子（ＲＮＡアダプター分子）に付いて、ＧＳＴタンパク質との複合体形成過程、その解離過程を測定した結果をそれぞれ示す。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明にかかるＲＮＡアプタマー分子は、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  由来のＧＳＴタンパク質に対して、特異的な結合能を示すので、該ＧＳＴタンパク質をＮ末側融合パートナーとする融合タンパク質のアフィニティー・カラム精製における、前記ＧＳＴタンパク質に特異的な結合性を有する核酸リガンド基材、あるいは、該ＧＳＴタンパク質をＮ末側融合パートナーとする融合タンパク質の検出を目的とする、標識物質の調製において、前記ＧＳＴタンパク質に特異的な結合性を有する核酸リガンド基材として利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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