(57)【要約】  ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤の薬効を評価する方法であって、該方法は、以下：（ａ）ＣＰＳＦ５タンパク質を発現する細胞を調製する工程；（ｂ）該細胞にＨＤＡＣ阻害剤を接触させる工程；（ｃ）該細胞のＣＰＳＦ５タンパク質のアセチル化レベルを測定する工程；および（ｄ）工程（ｃ）において測定した該アセチル化レベルを、該ＨＤＡＣ阻害剤を接触させないコントロール細胞について測定した該細胞のＣＰＳＦ５タンパク質のアセチル化レベルと比較する工程を包含する、方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤の薬効を評価する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ＣＰＳＦ５タンパク質を発現する細胞を調製する工程；
（ｂ）該細胞にＨＤＡＣ阻害剤を接触させる工程；および
（ｃ）該細胞のＣＰＳＦ５タンパク質のアセチル化レベルを測定する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記細胞が、末梢血単核球である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記末梢血単核球が、ヒト末梢血単核球である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＨＤＡＣ阻害剤の薬効が、免疫抑制効果である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＰＳＦ５タンパク質のアセチル化レベルが、抗アセチル化リジン抗体を用いる免疫測定法によって測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤の薬効を評価する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）哺乳動物にＨＤＡＣ阻害剤を投与する工程；
（ｂ）該哺乳動物からＣＰＳＦ５タンパク質を発現する細胞を採取する工程；および
（ｃ）該細胞のＣＰＳＦ５タンパク質のアセチル化レベルを測定する工程
を包含する、方法。
【請求項７】
前記工程（ｂ）において、前記細胞の採取を経時的に複数回行い、前記工程（ｃ）において、各回にて採取した細胞毎に、該細胞のＣＰＳＦ５タンパク質のアセチル化レベルを測定する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、末梢血単核球である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記哺乳動物が、非ヒト哺乳動物である、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＨＤＡＣ阻害剤の薬効が、免疫抑制効果である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＣＰＳＦ５タンパク質のアセチル化レベルが、抗アセチル化リジン抗体を用いる免疫測定法によって測定される、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ＣＰＳＦ５タンパク質を発現する細胞を調製する工程；
（ｂ）該細胞に被験物質を接触させる工程；および
（ｃ）該細胞のＣＰＳＦ５タンパク質のアセチル化レベルを測定する工程
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の新規ＰＤマーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、臓器移植後の急性拒絶反応を抑制する為に臨床現場で広く用いられている主要な免疫抑制剤であるシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）及びタクロリムス（ＦＫ５０６）は、それぞれに特異的なイミュノフィリン（ｉｍｍｕｎｏｐｈｉｌｉｎｓ：例えばＣｓＡの場合にはシクロフィリン、ＦＫ５０６の場合は、ＦＫＢＰ１２）との結合を通じて、Ｃａ2+／カルモジュリン依存性プロテインホスファターゼであるカルシニューリンの活性を阻害する。その結果、ＮＦ−ＡＴ（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ）の脱リン酸化反応が阻害されることによって、ＮＦ−ＡＴの核内移行が阻害され、ＩＬ−２遺伝子の転写活性が抑制されることが知られている。このような作用メカニズムの研究から、活性化されたＴ細胞においてＩＬ−２遺伝子の転写レベルでの発現が特異的に抑制されることが、臓器移植片の拒絶を抑制し、様々な自己免疫疾患等への治療効果を示す上で、極めて重要であることが明らかになっている。【０００３】
ところで、ヒストンの脱アセチル化を触媒するヒストン脱アセチル化酵素（ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ、以下、ＨＤＡＣと称す）は、細胞核内で、ヒストンアセチル化酵素と競合的に働き、クロマチン構造の変換を通じて、様々な遺伝子の発現レベルを制御していることが知られている。これまでの精力的なスクリーニングからＨＤＡＣ阻害活性を示す化合物が数多く得られているが、それらの中には顕著なＩＬ−２の産生阻害活性を示す化合物が含まれおり（非特許文献１参照）、シクロスポリンやタクロリムスを補完する免疫抑制剤の候補として注目されている。実際、このようにして選択された化合物の中にはインビボにおいて優れた免疫抑制作用を示すものが見出されている。例えば、ＷＯ００／０８０４８（特許文献１）に開示されているように、ＦＲ２２５４９７は、その強力な免疫抑制作用によって、臓器移植片拒絶、自己免疫疾患の治療剤や予防剤として優れた効果を示すことが見出されているが、それに加えて、遺伝子発現の異常によって発症すると考えられている他の数多くの疾患の治療剤や予防剤としての有用性も示唆されている。それらの疾患の中には、例えば、炎症性疾患、糖尿病、糖尿病性合併症、ホモ接合型サラセミア、繊維症、肝硬変、急性前骨髄球性白血病、原虫感染症、癌などが含まれる。このように、現在、ＨＤＡＣ阻害剤は、多くの疾患に対する治療剤または予防剤として有用なものと考えられており、臨床段階で精力的に研究されている薬剤の１つとなっている。【０００４】
しかし、現在の臨床段階でのＨＤＡＣ阻害剤の有効用量の評価は、インビトロ活性やタンパク質結合率などのＰＫ（薬物動態）ベースでの有効用量推定のみに基づくものであり、有効用量（血中濃度）と薬効との関係を明らかにするＰＤ（薬力学）ベースでＨＤＡＣ阻害剤の薬効を予測する系の確立が求められてきた。【０００５】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ００／０８０４８号パンフレット
【非特許文献１】Ｉ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ４９，４５３−４５７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の状況を鑑みて、本発明者らは、ＰＤベースでＨＤＡＣ阻害剤の薬効を予測する系を確立するための、ＨＤＡＣ阻害剤の新規ＰＤマーカータンパク質を同定した。本タンパク質は、ｍＲＮＡのプロセシングに関与する、ＣＰＳＦ５というタンパク質であり、ＨＤＡＣの基質としては新規なタンパク質である。ＣＰＳＦ５は、ＨＤＡＣの代表的基質であるヒストンよりも容易に調製可能であり、また、ＣＰＳＦ５は、ＣＰＳＦ５のアセチル化レベルがＨＤＡＣ阻害剤の薬効と生物学的に相関する点、臨床で容易に入手可能なサンプル（例えば、ＰＢＭＣ、バイオプシー）において感度よく簡便に検出できる点、免疫アッセイなどで定量的に検出され得る点、動物間種差が認められない点など、ＰＤマーカーとして要求される条件を十分に満たすものである。このようなＰＤマーカーを用いた、ＰＫ／ＰＤベースのＨＤＡＣ阻害剤の薬効予測は、臨床試験の早期において臨床効果を正確に予測し、かつ臨床現場での個々人に最適な投与量を設定することも可能となり、ＨＤＡＣ阻害剤の薬効を最小限のリスクで最大限に引き出すことができると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
１つの局面において、本発明は、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤の薬効を評価する方法を提供し、該方法は、以下：
（ａ）ＣＰＳＦ５タンパク質を発現する細胞を調製する工程；
（ｂ）該細胞にＨＤＡＣ阻害剤を接触させる工程；および
（ｃ）該細胞のＣＰＳＦ５タンパク質のアセチル化レベルを測定する工程
を包含する。【０００８】
１つの実施形態において、前記細胞は、末梢血単核球である。【０００９】
１つの実施形態において、前記末梢血単核球は、ヒト末梢血単核球である。【００１０】
１つの実施形態において、前記ＨＤＡＣ阻害剤の薬効は、免疫抑制効果である。【００１１】
１つの実施形態において、前記ＣＰＳＦ５タンパク質のアセチル化レベルは、抗アセチル化リジン抗体を用いる免疫測定法によって測定される。【００１２】
別の局面において、本発明は、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤の薬効を評価する方法を提供し、該方法は、以下：
（ａ）哺乳動物にＨＤＡＣ阻害剤を投与する工程；
（ｂ）該哺乳動物からＣＰＳＦ５タンパク質を発現する細胞を採取する工程；および
（ｃ）該細胞のＣＰＳＦ５タンパク質のアセチル化レベルを測定する工程
を包含する。【００１３】
１つの実施形態において、前記工程（ｂ）において、前記細胞の採取を経時的に複数回行い、前記工程（ｃ）において、各回にて採取した細胞毎に、該細胞のＣＰＳＦ５タンパク質のアセチル化レベルを測定する。【００１４】
１つの実施形態において、前記細胞は、末梢血単核球である。【００１５】
１つの実施形態において、前記哺乳動物は、ヒトである。【００１６】
１つの実施形態において、前記哺乳動物は、非ヒト哺乳動物である。【００１７】
１つの実施形態において、前記ＨＤＡＣ阻害剤の薬効は、免疫抑制効果である。【００１８】
１つの実施形態において、前記ＣＰＳＦ５タンパク質のアセチル化レベルは、抗アセチル化リジン抗体を用いる免疫測定法によって測定される。【００１９】
別の局面において、本発明は、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤をスクリーニングする方法を提供し、該方法は、以下：
（ａ）ＣＰＳＦ５タンパク質を発現する細胞を調製する工程；
（ｂ）該細胞に被験物質を接触させる工程；および
（ｃ）該細胞のＣＰＳＦ５タンパク質のアセチル化レベルを測定する工程
を包含する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明を利用するＰＫ／ＰＤベースのＨＤＡＣ阻害剤の薬効予測によって、臨床試験の早期において臨床効果を正確に予測し、かつ臨床現場での個々人に最適な投与量を設定することも可能となり、ＨＤＡＣ阻害剤の薬効を最小限のリスクで最大限に引き出すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】正常ラットＰＢＭＣへのＨＤＡＣ阻害剤添加後４時間後におけるアセチル化亢進が認められたタンパク質（ｐ２５）の検出を示す。
【図２】ｐ２５タンパク質の同定方法を示す。
【図３】ｐ２５タンパク質の同定結果を示す。
【図４】ｐ２５タンパク質のＭａｓｃｏｔ  ｓｅａｒｃｈの結果を示す。
【図５】ＣＰＳＦ５のアミノ酸配列およびその機能の概略図を示す。
【図６】ＨＤＡＣ阻害剤投与後のラットＰＢＭＣにおけるＣＰＳＦ５のアセチル化レベルの経時的変化（ＨＤＡＣ阻害剤の血漿中濃度との対応）を示す。
【図７】ＨＤＡＣ阻害剤投与４時間後でのラットＰＢＭＣにおけるＣＰＳＦ５のアセチル化（ｉｎ  ｖｉｖｏ用量依存性）を示す。
【図８】臨床材料におけるＣＰＳＦ５のアセチル化を示す。
【図９】移植モデルにおけるＣＰＳＦ５のアセチル化レベルの変化とＨＤＡＣ阻害剤の薬効との相関を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下に、本発明について詳述する。【００２３】
本明細書中で使用される場合、用語「ＣＰＳＦ５タンパク質」または「ＣＰＳＦ５」とは、ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ５，  ２５ｋＤ  ｓｕｂｕｎｉｔと名付けられた、ｍＲＮＡプロセシングに関与する核内タンパク質である。現在までに、ヒト、ラット、マウスなどにおいてＣＰＳＦ５タンパク質が同定されており、そのアミノ酸配列は、各種間で高度に保存されている。本発明の方法で使用されるＣＰＳＦ５タンパク質としては、このような天然由来のＣＰＳＦ５タンパク質やその改変体（例えば、対立遺伝子改変体、多型改変体など）、あるいは遺伝子工学的手法または化学修飾などの方法で人為的に、１または数個のアミノ酸を欠失、付加、置換または挿入するか、もしくはアミノ酸を修飾することによって作製される改変体または変異体が挙げられる。上記のように、ＣＰＳＦ５は、ｍＲＮＡプロセシングに関与する核内タンパク質であり、血液およびほぼ全ての組織（例えば、血管、心臓、脳、肺、肝臓、腎臓、小腸、大腸、膀胱、精巣、卵巣、脾臓、胸腺などの組織）由来の細胞（例えば、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、脾細胞、血管平滑筋細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＴＨＰ−１細胞、ＨＥＬ細胞、ＨＥＫ２９３細胞など）において発現されている。本発明の方法で使用され得る「ＣＰＳＦ５タンパク質を発現する細胞」は、例えば、公知のＣＰＳＦ５をコードするポリヌクレオチドを利用するサザンブロット分析またはノーザンブロット分析、あるいはＣＰＳＦ５タンパク質に対する抗体を利用するウェスタンブロット分析などの、当業者に公知の発現分析法を利用して、任意の種々の体液または組織生検から容易に選択され得る。好ましくは、簡便性および正確性の観点から、本発明の方法において使用される「ＣＰＳＦ５タンパク質を発現する細胞」は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。あるいは、任意の細胞内においてＣＰＳＦ５遺伝子を組換え発現させることによって、ＣＰＳＦ５タンパク質を発現する細胞を作製して、本発明において使用してもよい。【００２４】
本発明の方法において使用される「ＨＤＡＣ阻害剤」としては、当該分野で公知の任意のＨＤＡＣ阻害剤が挙げられ、例えば、ＷＯ０１／３８３２２、ＷＯ０１／０７０６７５、ＷＯ００／０７１７０３、ＷＯ００／０８０４８、ＷＯ０３／０１５８１９、ＷＯ０３／０５７７２２、ＷＯ０４／０６３１６９などに記載される。ＨＤＡＣは、ヒストンのアセチル化リジン残基のアセチル基を加水分解してリジンに変換する酵素であり、クロマチン構造の変換を介して遺伝子転写の制御に関与する重要なタンパク質である。このようなＨＤＡＣの活性を阻害するＨＤＡＣ阻害剤は、遺伝子発現の異常によって発症すると考えられる多くの疾患に対する治療剤または予防剤として効果を有することが示唆されており、これらの疾患としては、炎症性疾患、糖尿病、糖尿病性合併症、ホモ接合型サラセミア、繊維症、肝硬変、急性前骨髄球性白血病、原虫感染症、癌等の疾患が挙げられる。また、ＨＤＡＣ阻害剤は、活性化されたＴ細胞においてＩＬ−２遺伝子の転写レベルでの発現を抑制して、免疫抑制効果を示すことも確認されており、心臓、腎臓、肝臓、骨髄、皮膚、角膜、肺、膵臓、小腸、手足、筋肉、神経、椎間板、気管、筋芽細胞、軟骨等の臓器または組織の移植の際の拒絶反応、骨髄移植による移植片対宿主反応、自己免疫疾患等の治療や予防にも有用である。ＣＰＳＦ５タンパク質のアセチル化を指標とする本発明の方法は、上記のような種々の疾患に対するＨＤＡＣ阻害剤の薬効の評価に利用され得る。１つの実施形態において、本発明の方法を使用して評価され得るＨＤＡＣ阻害剤の薬効は、臓器移植片拒絶、自己免疫疾患等に対する、免疫抑制効果である。【００２５】
ＨＤＡＣによるＣＰＳＦ５タンパク質の脱アセチル化反応は、ＣＰＳＦ５中のリジン残基を脱アセチル化する反応であり、ＣＰＳＦ５タンパク質のアセチル化レベルは、当業者に公知の種々の方法で測定され得る。例えば、以下の実施例に記載するように、ＣＰＳＦ５タンパク質のアセチル化レベルは、抗アセチル化リジン抗体を用いるウェスタンブロットアッセイなどの免疫測定法によって定量的に測定され得る。あるいは、3Ｈや14Ｃなどの放射性同位体を用いて標識したアセチル基を使用する測定法、ＥＩＡ／ＥＬＩＳＡ法を利用する測定法によっても、アセチル化反応が定量的に測定され得る。前者では、例えば、3Ｈや14Ｃで標識した酢酸ナトリウムなど（アセチル基のドナー）を細胞に取り込ませて細胞内のアセチル化タンパク質を3Ｈや14Ｃで標識する。その後、免疫沈降法などを利用してＣＰＳＦ５を精製し、ＣＰＳＦ５のアセチル化が検出され得る。後者（例えば、抗ＣＰＳＦ５抗体および抗アセチル化リジン抗体によるサンドイッチＥＬＩＳＡ法）では、例えば、抗ＣＰＳＦ５抗体を固相化した９６ウェルプレートに、サンプルを添加させて反応させる。その後プレートを洗浄し、次いで、抗アセチル化リジン抗体を添加して反応させた後、プレートを洗浄し、発色させて、ＣＰＳＦ５のアセチル化が検出され得る。【００２６】
別の局面では、ＨＤＡＣ阻害剤を哺乳動物に投与し、投与後の哺乳動物からＣＰＳＦ５タンパク質を発現する細胞を採取して、このＣＰＳＦ５タンパク質のアセチル化レベルを測定してもよい。本発明の方法において使用される「哺乳動物」としては、ヒト、サル、イヌ、ラット、マウスまたは他の適切な哺乳動物が使用され得、哺乳動物へのＨＤＡＣ阻害剤の投与は、当該分野で公知の任意の投与方法によって、経口的または非経口的に行われ得る。例えば、前臨床または臨床試験早期においては、非ヒト哺乳動物を本発明の方法において使用することによって、ヒトに対するＨＤＡＣ阻害剤の薬効を予測してもよく、あるいは、本発明の方法においてＨＤＡＣ阻害剤をヒトに投与することによって、個々人に対するＨＤＡＣ阻害剤の最適投与量を決定することも可能である。好ましい実施形態において、哺乳動物へのＨＤＡＣ阻害剤の投与後に、ＣＰＳＦ５タンパク質を発現する細胞の採取を経時的に複数回行い、各回にて採取した細胞毎にＣＰＳＦ５タンパク質のアセチル化レベルを測定する。【００２７】
本発明の方法においては、ＨＤＡＣ阻害剤を接触または投与した生物学的サンプルまたは哺乳動物と同じ種類の生物学的サンプルまたは哺乳動物であって、ＨＤＡＣ阻害剤が接触または投与されない、コントロールサンプルまたはコントロール哺乳動物を、ＣＰＳＦ５のアセチル化レベルについての比較対照として使用してもよい。コントロールサンプル由来のＣＰＳＦのアセチル化レベルと比較した、試験サンプル由来のＣＰＳＦのアセチル化レベルが高いほど、ＨＤＡＣ阻害剤の薬効が高いと評価される。【００２８】
あるいは、本発明の方法を用いて、ＨＤＡＣ阻害剤をスクリーニングすることも可能である。スクリーニング方法における被験物質としては、公知又は新規な合成化合物、ペプチド、タンパク質等の他、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清等が用いられる。【００２９】
以下に、本発明をより詳細に説明するために実施例を記載するが、本発明はこれらの実施例によって限定されない。
【実施例】
【００３０】
（実施例１）
（ラットＰＢＭＣにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨＤＡＣ阻害剤処理によりアセチル化亢進が認められるタンパク質の検出）
ＨＤＡＣ阻害剤の薬効と用量の関係を明らかにできるＰＤアッセイ系を確立するために、ＨＤＡＣ阻害剤の新規ＰＤマーカーの探索を行った。ＰＤマーカーは、臨床で入手可能なサンプルで簡便に感度よく検出できなければならない。そこで、ＨＤＡＣ阻害剤処理による末梢血単核球（ＰＢＭＣ）での細胞内タンパク質のアセチル化の変化について調べることにした。【００３１】
Ｌｅｗｉｓラットから末梢血を採取し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＰＢＭＣを単離した。単離したＰＢＭＣを、１０％  ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ）で１×１０6細胞／ｍＬとした後、６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ）に播種した。３７℃、５％  ＣＯ2、飽和湿度条件下にてＤＭＳＯ（コントロール）、免疫抑制活性を有するＨＤＡＣ阻害剤である化合物Ｘ（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｘ）（１０、３０、１００、３００ｎＭ）およびＨＤＡＣ阻害活性を有さない免疫抑制剤である化合物Ｙ（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｙ）（１００ｎＭ）存在下で培養し、４時間後にサンプリングした。各サンプルをＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．０％  ＮＰ−４０、０．５％デオキシコレート、０．１％  ＳＤＳ、プロテアーゼ阻害剤）で溶解し、全細胞溶解物を調製した。得られた全細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ  ４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ、ＭＥＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）使用）後、ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））にセミドライ方式でトランスファーし（ＴＲＡＮＳ−ＢＬＯＴ  ＳＤ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）使用）、抗アセチル化リジン抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、１０００倍希釈で使用）を用いたウェスタンブロッティングを行った。泳動した各レーンのタンパク量が均一であることを確認するために抗アクチン抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、１０００倍希釈で使用）によるウェスタンブロッティングも行った。【００３２】
ＨＤＡＣ阻害剤（化合物Ｘ）処理によって用量依存的にアセチル化の亢進が認められるタンパク質が幾つか見出された（図１）。その中でも特に、約２５ｋＤタンパク質（ｐ２５）のアセチル化が最も高感度に検出され、ＨＤＡＣ阻害剤の新規ＰＤマーカー候補としてさらなる解析を行うことにした。なお、ｐ２５のアセチル化はＨＤＡＣ阻害活性を有さない免疫抑制剤（化合物Ｙ）処理によっては全く変化しなかった。【００３３】
（実施例２）
（アセチル化２５ｋＤタンパク質の同定）
ラットＰＢＭＣにおいてＨＤＡＣ阻害剤の新規ＰＤマーカー候補として見出した２５ｋＤタンパク質（ｐ２５）の同定を試みた。タンパク質の同定は、標的タンパク質の精製および単離、ｎａｎｏ  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、Ｍａｓｏｔ  ｓｅａｒｃｈによる質量分析とデータベース検索による手法で行うことにした（図２）。また、ラットよりもデータベース情報の豊富なヒト由来のサンプルを用いることにした。【００３４】
ヒトＴ細胞系Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ：ＴＩＢ−１５２）を３７℃、５％  ＣＯ2、飽和湿度条件下にて化合物Ｘ  ３０００ｎＭの存在下で培養し、８時間後にサンプリングした。細胞質画分（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  ＮＰ−４０により溶解）および核画分（細胞質画分を除いた後、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により溶解）を調製した。抗アセチル化リジン抗体を用いたウェスタンブロッティングを行ったところ、核画分にアセチル化された約２５ｋＤのタンパク（ｐ２５）が検出された。そこで、核画分をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（ＹＭ−１０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にて濃縮し、ゲルろ過クロマトグラフィー（ＡＫＴＡ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００ｈｒ、ＰＢＳ）により精製した。さらに逆相クロマトグラフィー（Ｐｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ）により精製し、抗アセチル化リジン抗体を用いたウェスタンブロッティングによりアセチル化ｐ２５の検出されるフラクションを確認した（図３）。そのフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、銀染色し、ウェスタンブロッティングにより検出されるアセチル化ｐ２５とサイズが一致するバンドを切り出し、ＭＳ解析用サンプルを調製した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析およびＭａｓｃｏｔ  ｓｅａｒｃｈの結果、ｐ２５はＣＰＳＦ５（ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ５，  ２５ｋＤ  ｓｕｂｕｎｉｔ）であることが明らかになった（図４、図５）。【００３５】
（実施例３）
（ＨＤＡＣ阻害剤投与後のラットＰＢＭＣにおけるＣＰＳＦ５のアセチル化の経時変化（薬物の血漿中濃度との対応））
ＰＢＭＣでのＣＰＳＦ５のアセチル化がｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＨＤＡＣ阻害剤の血漿中濃度の上昇に対応するかどうかを確かめ、投与後どの時点でＣＰＳＦ５のアセチル化レベルを検出することが可能であるかを調べる目的で、ラットにおける化合物Ｘ  ２０ｍｇ／ｋｇ投与後のＰＢＭＣのＣＰＳＦ５のアセチル化レベルを経時的に確認し、ＰＫパラメーター（血漿中濃度推移）との比較を行った。【００３６】
Ｌｅｗｉｓラットに化合物Ｘ  ２０ｍｇ／ｋｇを単回投与し、１、２、４、８、２４時間後に血液を採取し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＰＢＭＣを単離した。対照群としてＮｏｒｍａｌラットのＰＢＭＣを用いた。以降の操作は実施例１と同様。【００３７】
化合物Ｘ  ２０ｍｇ／ｋｇ投与後のＣＰＳＦ５のアセチル化レベルの推移は血漿中濃度推移とほぼ同じ挙動を示した（図６）。【００３８】
以上から、ＣＰＳＦ５のアセチル化レベルの変化を正確に数値化するには投与前および薬剤の血漿中濃度が高い時点での測定が必要であることが明らかになった。【００３９】
（実施例４）
（ＨＤＡＣ阻害剤投与４時間後でのラットＰＢＭＣにおけるＣＰＳＦ５のアセチル化（ｉｎ  ｖｉｖｏ用量依存性））
ＰＢＭＣでのＣＰＳＦ５のアセチル化について、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＨＤＡＣ阻害剤の用量依存性の確認を行った。【００４０】
Ｌｅｗｉｓラットにビヒクル（０．５％  ＭＣ）および化合物Ｘ（５、１０、２０、４０  ｍｇ／ｋｇ）を単回投与し、４時間後に血液および脾臓を単離した。血液についてはＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＰＢＭＣを単離し、脾臓についてはガラスホモジナイザーで破砕後、溶血処理を行い、遠心分離によって脾細胞を調製した。以降の操作は実施例１と同様。【００４１】
化合物Ｘの単回投与４時間後において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏと同様にｉｎ  ｖｉｖｏでも化合物Ｘの用量依存的なＣＰＳＦ５のアセチル化の亢進が認められた（図７）。【００４２】
（実施例５）
（臨床材料におけるＣＰＳＦ５のアセチル化）
臨床で実際に評価に用いることになるヒトＰＢＭＣでＣＰＳＦ５のアセチル化が検出できるかどうかを検討した。【００４３】
健常人３人（ボランティア）から末梢血を各人３０ｍＬずつ採取し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＰＢＭＣを単離した。単離したＰＢＭＣを１０％  ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ）で１ｘ１０6細胞／ｍＬとした後、６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ）に播種した。３７℃、５％  ＣＯ2、飽和湿度条件下にてＤＭＳＯ（コントロール）、化合物Ｘ（１０、３０、１００、３００  ｎＭ）または化合物Ｙ（１００ｎＭ）存在下で培養し、４時間後にサンプリングした。以降の操作は実施例１と同様。【００４４】
ラットＰＢＭＣと同様にヒトＰＢＭＣにおいてもＨＤＡＣ阻害剤（化合物Ｘ）の用量依存的なＣＰＳＦ５のアセチル化の亢進が認められた。また、ＨＤＡＣ阻害活性を有さない免疫抑制剤である化合物Ｙ処理ではＣＰＳＦ５のアセチル化レベルは変化しなかった（図８）。【００４５】
以上から、ＣＰＳＦ５のアセチル化が臨床においてもＰＤマーカーとしてＨＤＡＣ阻害剤（化合物Ｘ）の作用を評価し得るものであることが示された。【００４６】
（実施例６）
（ＣＰＳＦ５のアセチル化と薬効との相関）
ＰＢＭＣでのＣＰＳＦ５のアセチル化とｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＨＤＡＣ阻害剤の薬効（有効性）の関係について調べた。【００４７】
化合物Ｘおよび化合物Ｚ（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｚ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてはほぼ同等のＨＤＡＣ阻害活性およびＴ細胞増殖阻害活性を有しており、ラットでの経口吸収性は化合物Ｚが化合物Ｘより良好である。しかしながら、ラット心移植モデルにおいて化合物Ｘ  ２０ｍｇ／ｋｇは単剤で著明な生着延長効果を示し、化合物Ｚ  ２０ｍｇ／ｋｇは生着延長効果を示さない。【００４８】
これらの両化合物を用いてラット心移植モデルでの単剤による生着延長効果とＰＢＭＣのＣＰＳＦ５のアセチル化レベルとの相関を調べた。【００４９】
Ｌｅｗｉｓラットに化合物Ｘ  ２０ｍｇ／ｋｇまたは化合物Ｚ  ２０ｍｇ／ｋｇを単回投与し、２および４時間後に血液を採取し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＰＢＭＣを単離した。対照群としてＮｏｒｍａｌラットのＰＢＭＣを用いた。以降の操作は実施例１と同様。【００５０】
移植モデルで有効性を示す化合物Ｘ  ２０ｍｇ／ｋｇ投与群のＰＢＭＣのＣＰＳＦ５のアセチル化レベルは、同モデルで有効性を示さない化合物Ｚ  ２０ｍｇ／ｋｇ投与群に比べて、投与２および４時間後のいずれにおいても高いものであった（図９）。【００５１】
以上から、ＣＰＳＦ５のアセチル化レベルの変化は、ＨＤＡＣ阻害剤の薬効と相関しており、ＰＤマーカーとしてＨＤＡＣ阻害剤の作用を評価し得るものであることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明は、ＰＫ／ＰＤベースのＨＤＡＣ阻害剤の薬効予測によって、臨床試験の早期において臨床効果を正確に予測し、かつ臨床現場での個々人に最適な投与量を設定することも可能となり、ＨＤＡＣ阻害剤の薬効を最小限のリスクで最大限に引き出すことを可能とする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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