(57)【要約】  本発明は、高感度のＳＮＰｓ解析方法を提供することを目的し、微量の被検体ＤＮＡにより大量のＳＮＰｓを迅速に解析することができるＳＮＰ解析方法を提供することを目的としている。さらに、本発明は、ＳＮＰｓ解析法において、高感度の発色色素と消光物質で構成されたフレットプローブなどの高感度核酸プローブ、及びこれを用いた時間分解蛍光測定による最も高感度なＳＮＰ解析法を提供することにある。  本発明は、Ｅｕ３＋錯体及び蛍光消光物質を核酸に結合させたことを特徴とする核酸プローブに関する。より詳細には、本発明は、ターピリジル又はジピラゾリルピリジン骨格を有するテトラキス酢酸型の配位子を有するＥｕ３＋錯体、及びアゾベンゼン型の蛍光消光物質を核酸に結合させたことを特徴とする高感度の核酸プローブに関する。さらに、本発明は、これらの核酸プローブを用いた核酸の解析方法、より詳細にはＳＮＰｓの解析方法、及びそのための解析用のキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅｕ３＋錯体及び蛍光消光物質を核酸に結合させたことを特徴とする核酸プローブ。
【請求項２】
Ｅｕ３＋錯体が、次の一般式（１）
【化２１】
2006106930.tif 000025
（式中、Ｒは置換基を有してもよいアリール基を示し、Ｑは−Ｃ＝Ｃ又は−Ｎを示し、Ｙ１〜Ｙ３はそれぞれ独立して−ＯＨ基、又は−Ｏ−基、Ｙ４は−ＯＨ基、−Ｏ−基、又は−Ｚ基を示し、Ｚは核酸との結合のためのリンカー基を示す。）
で表される配位子を有する錯体である請求項１に記載の核酸プローブ。
【請求項３】
Ｅｕ３＋錯体の配位子が、次の一般式（２）
【化２２】
2006106930.tif 000026
（式中、Ｒは置換基を有してもよいアリール基を示し、Ｙ１〜Ｙ３はそれぞれ独立して−ＯＨ基、又は−Ｏ−基を示し、Ｙ４は−ＯＨ基、−Ｏ−基、又は−Ｚ基を示し、Ｚは核酸との結合のためのリンカー基を示す。）
で表される配位子である請求項２に記載の核酸プローブ。
【請求項４】
Ｅｕ３＋錯体の配位子が、次の一般式（３）
【化２３】
2006106930.tif 000027
（式中、Ｒは置換基を有してもよいアリール基を示し、Ｙ１〜Ｙ３はそれぞれ独立して−ＯＨ基、又は−Ｏ−基を示し、Ｙ４は−ＯＨ基、−Ｏ−基、又は−Ｚ基を示し、Ｚは核酸との結合のためのリンカー基を示す。）
で表される配位子である請求項２に記載の核酸プローブ。
【請求項５】
蛍光消光物質が、次の一般式（４）
【化２４】
2006106930.tif 000028
（式中、Ｘは核酸との結合のためのリンカー基を示す。）
で表される化合物である請求項１〜４のいずれかに記載の核酸プローブ。
【請求項６】
蛍光消光物質が、次の一般式（５）
【化２５】
2006106930.tif 000029
（式中、Ｒ１〜Ｒ１３は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、又はニトロ基を示し、Ｘは核酸との結合のためのリンカー基を示す。）
で表される化合物である請求項１〜４のいずれかに記載の核酸プローブ。
【請求項７】
Ｅｕ３＋錯体の配位子が、次の一般式（２）
【化２６】
2006106930.tif 000030
（式中、Ｒは置換基を有してもよいアリール基を示し、Ｙ１〜Ｙ３はそれぞれ独立して−ＯＨ基、又は−Ｏ−基を示し、Ｙ４は−ＯＨ基、−Ｏ−基、又は−Ｚ基を示し、Ｚは核酸との結合のためのリンカー基を示す。）
で表される配位子であり、蛍光消光物質が、次の一般式（５）
【化２７】
2006106930.tif 000031
（式中、Ｒ１〜Ｒ１３は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、又はニトロ基を示し、Ｘは核酸との結合のためのリンカー基を示す。）
で表される化合物である請求項１に記載の核酸プローブ。
【請求項８】
一般式（２）におけるＲが、−Ｚ基（Ｚは、核酸との結合のためのリンカー基を示す。）で置換されたアリール基であり、Ｙ１〜Ｙ３はそれぞれ独立して−ＯＨ基、又は−Ｏ−基であり、Ｙ４は−ＯＨ基、又は−Ｏ−基である請求項７に記載の核酸プローブ。
【請求項９】
一般式（５）において、Ｒ７がニトロ基であり、Ｒ４及びＲ１１がメトキシ基であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ１３が水素原子である請求項７又は８に記載の核酸プローブ。
【請求項１０】
核酸プローブが、インベーダー法によるＳＮＰｓ解析用のフレットプローブである請求項１〜９にいずれかに記載の核酸プローブ。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の核酸プローブを用いて核酸を解析する方法。
【請求項１２】
核酸の解析が、遺伝子発現の解析である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
核酸の解析が、核酸中の特定の塩基の存在又は不存在の解析である請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
核酸の解析が、一塩基多型（ＳＮＰｓ）の解析である請求項１１又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
一塩基多型（ＳＮＰｓ）の解析が、インベーダー法によるものである請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれかに記載の核酸プローブを用いて、一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出若しくは同定、又はタイピングする方法。
【請求項１７】
一塩基多型（ＳＮＰｓ）の検出若しくは同定、又はタイピングする方法が、インベーダー法によるものである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
一塩基多型（ＳＮＰｓ）の検出若しくは同定、又はタイピングする方法が、請求項１〜８のいずれかに記載のＥｕ３＋錯体とは異なる色の蛍光を発色する蛍光物質をさらに用いるものである請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
蛍光物質が、蛍光錯体である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１０のいずれかに記載のＥｕ３＋錯体とは異なる色の蛍光を発色する蛍光錯体が、緑色の蛍光を発色するＴｂ３＋錯体である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の核酸プローブを含有してなる核酸解析用キット。
【請求項２２】
核酸解析用キットが、遺伝子発現の解析用である請求項２１に記載の核酸解析用キット。
【請求項２３】
核酸解析用キットが、一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出若しくは同定、又はタイピングするためのキットである請求項２１に記載のキット。
【請求項２４】
核酸解析用キットが、請求項１〜１０のいずれかに記載のＥｕ３＋錯体とは異なる色の蛍光を発色する蛍光物質をさらに含有するものである請求項２１又は２２に記載のキット。
【請求項２５】
蛍光物質が、蛍光錯体である請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
請求項１〜１０のいずれかに記載のＥｕ３＋錯体とは異なる色の蛍光を発色する蛍光錯体が、緑色の蛍光を発色するＴｂ３＋錯体である請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
一塩基多型（ＳＮＰｓ）の検出若しくは同定、又はタイピングする方法が、インベーダー法によるものである請求項２３〜２６のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｅｕ３＋錯体及び蛍光消光物質を核酸に結合させたことを特徴とする核酸プローブに関する。より詳細には、本発明は、ターピリジル又はジピラゾリルピリジン骨格を有するテトラキス酢酸型の配位子を有するＥｕ３＋錯体、及びアゾベンゼン型の蛍光消光物質を核酸に結合させたことを特徴とする高感度の核酸プローブに関する。さらに、本発明は、これらの核酸プローブを用いた核酸の解析方法、より詳細にはＳＮＰｓの解析方法、及びそのための解析用のキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムＤＮＡの１塩基多型（ＳＮＰｓと略す）の解析は、遺伝病などだけでなく薬の効きやすさや副作用の違いといった個人差を考慮に入れた医療（テーラーメード医療）の基礎となる技術であり、今後の発展が期待される分野である。従来から、ＳＮＰｓの解析法として、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、ＤＮＡチップ法、インベーダー（Invader）法、ＵＣＡＮ法（特許文献１参照。）、ＲＣＡ（rolling circle amplification）を利用した方法などの方法がある。これらの方法はそれぞれの特徴を持ち、様々なＳＮＰｓ解析に用いられている。
ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法は、ＰＣＲ反応を用いたＳＮＰｓ解析法であり、解析のステップが少ないという利点がある（非特許文献１及び２参照）。しかし、この方法では１種類のＳＮＰｓを解析するには、２種類の蛍光標識プローブが必要であるため、標識プローブ作製のコストが高いという欠点がある。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（Matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight/mass spectrometry）法は、１ＳＮＰｓ解析にあたり１本の標識不要のプライマーを使うだけで済むという利点があるが(非特許文献３及び４参照。)、作業のステップは、ターゲット領域のＰＣＲ増幅、ＰＣＲ産物の精製、プライマー伸長反応、プライマー伸長反応産物の精製、質量測定試料のスポット、質量分析など非常に多いという欠点がある。
ＤＮＡチップ法は、一度に大量のＳＮＰｓを解析することができるという利点がある(非特許文献５〜７参照。)。この方法は、ＤＮＡチップ上でハイブリダイゼーションを行う前に、ＰＣＲが必要なので、大量のＳＮＰｓを解析するには、大量のＰＣＲを事前に行わなければならないという欠点がある。【０００３】
インベーダー法（特許文献２及び３、並びに非特許文献８参照。）は、ＳＮＰｓ解析のステップが少なく、ＰＣＲと蛍光標識アレル特異オリゴが必要でなく、各アレル特異オリゴに共通のフラップ（ｆｌａｐ）を加えるだけでよい。
図１にインベーダー法による核酸一塩基多型解析法の概略を模式図として示す。この方法は、被検体ＤＮＡ（target DNA）のなかに図１に示されるように「Ｎ」の位置でＳＮＰｓになっている塩基が存在していることを判定する方法である。このためにレポータープローブ（primary probe）とインベータープローブ（secondary probe）、及び検出用のフレットプローブ（FRET probe）（蛍光共鳴エネルギー移動プローブ（ＦＲＥＴ（Fiorescence Resonance Energy Transfer）プローブ））を用いる。プライマリープローブ（レポータープローブ）は被検体ＤＮＡのＳＮＰｓの位置から５’側において相補的な塩基配列を有し、さらに「フラップ（flap）」と呼ばれる塩基配列部分を有している。このフラップの部分の塩基配列は、フレットプローブの３’側の塩基配列と相補的な塩基配列となっている。また、インベーダープローブ（セカンダリープローブ）は被検体ＤＮＡの３’側において相補的な塩基配列を有するものである。ＳＮＰｓの位置（第１図中の「Ｎ」で示されている位置。）における被検体ＤＮＡの塩基「Ｎ」は１塩基多型部位の塩基、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのひとつであり、プライマリープローブの塩基「Ｎ１」はＮと正常な塩基対を形成できる塩基であり、そして、インベーダープローブの塩基「Ｎ２」は任意な塩基である。
フレットプローブは、３’側にフラップ部分が結合するための１本鎖部分を有するプローブであり、フレットプローブの５’側はその全部又は一部が２本鎖を形成するようになっている。図１では５’側の全部が２本鎖を形成するように示されているが必ずしも全部が２本鎖になる必要はないが、ここでは説明のために図１に従って説明する。そして、フレットプローブの５’側の末端部分には発光色素「Ｌｎ」及び消光物質「Ｑ」が結合されている。消光物質「Ｑ」が発光色素「Ｌｎ」の一定の距離内に存在しているときは、発光色素の発光が消光され、発光を観察することはできない。【０００４】
インベーダー法では、まず、被検体ＤＮＡにプライマリープローブ及びインベーダープローブが結合するが、この際にプライマリープローブの塩基「Ｎ１」と被検体ＤＮＡの塩基「Ｎ」との塩基対の間にインベーダープローブの塩基「Ｎ２」がインベーダー（侵入者）のように割り込んでくるようになる。このような状態を示しているのが図１の最上段に示している状態である。
このような３塩基がからんでいる状態に特異的に作用する解裂酵素（structure-specific 5' nuclease）を作用させると、この解裂酵素はプライマリープローブを塩基「Ｎ１」の位置で切断して、フラップ部分のみの断片を形成させる。そして、このフラップ部分はフレットプローブの３’側に結合する。この状態を示しているのが、図１の中段である。このとき、フラップ部分の塩基「Ｎ１」を含む先端部分が、フレットプローブの２本鎖の部分に割り込むような状態になる。この状態は先程のインベーダーの状態と同様であり、解裂酵素による特異的な切断位置になる。そして、当該解裂酵素によりフレットプローブの５’末端側がフラップ部分に割り込まれた部分から切断される。
切断されたフレットプローブの５’側には、発光色素「Ｌｎ」が結合されており、この切断により発光色素「Ｌｎ」は消光物質「Ｑ」から離れることになり、その結果発光色素「Ｌｎ」の発光を観察することができるようになる。このような状態を示しているのが第１図の最下段に示している状態である。発光色素「Ｌｎ」は消光物質「Ｑ」から開放され、本来の発光を示すことになる。
プライマリープローブの塩基「Ｎ１」が被検体ＤＮＡの塩基「Ｎ」と正常な塩基対を形成することができない場合には、インベーダーのような状態にならないので、解裂酵素による切断は起こらない。したがって、被検体ＤＮＡの塩基「Ｎ」がプライマリープローブの塩基「Ｎ１」と正常な塩基対を形成することができる塩基であるか否かを発光により判定することができることになる。
このように、インベーダー法では、被検体ＤＮＡは勿論のこと、プライマリープローブもインベーダープローブにも標識化は必要でなく、標識化を必要とするものはフレットプローブのみである。そして、当該フレットプローブは、フラップ部分の塩基配列だけと関わり、とりわけフラップ部分の塩基「Ｎ１」とも無関係であり、被検体ＤＮＡの塩基配列に全く影響されず、被検体と関係無く任意に決定できるフラップ部分の塩基に基づくものであることから、大量生産ができ、プローブ作製コストを大幅に減少することができるという利点がある。【０００５】
しかし、従来の方法では、測定感度が不充分なため、１個のＳＮＰｓを解析するために、数十ナノグラムのゲノムＤＮＡが必要であり、大量のＳＮＰを解析するには、大量のゲノムＤＮＡが必要となるという欠点があった。例えば、現在幾つか市場に出ているＳＮＰｓ解析技術では、フルオレッセインやレッドモンドレッドといった有機蛍光色素が使われているが、フルオレッセインの信号（Ｓ）とバックグランド信号強度（Ｂ）の比（Ｓ／Ｂ）の最大値は５〜６であり、十分な感度は得られていない。また、本発明者らは、より高感度なＳＮＰｓの解析のための方法を開発してきており（特許文献４参照。）、特に、Ｔｂ３＋錯体で、Ｓ／Ｂが最大３０と良好な結果を与えていたが、Ｅｕ３＋錯体では、Ｓ／Ｂが最大でも約５と満足の行く結果ではなかった。【０００６】
また、蛍光消光物質として図２に示されるようなＢＨＱＴＭ（Black Hole Quencher）が開発されてきている（特許文献５、及び非特許文献９参照。）。ＢＨＱＴＭは効率よい蛍光消光剤といわれており消光のみの目的では非常に有効であるとされている。しかし、インベーダー法や、Ｔａｑｍａｎ法、及びＵＣＡＮ法等に代表されるＳＮＰｓ解析法では酵素を用いるため、この酵素の働きに干渉を与えないことが必要であり、このような酵素に対する影響については予測性が無く、いかに優れた蛍光消光物質であるとしても、酵素に対して悪影響を与える場合には、これらの方法に使用することはできなくなる。
さらに、ＳＮＰｓタイピングでは、ＳＮＰｓ部位の塩基の違いを色の違いとして観測することが良く行われており（例えば、非特許文献１０参照）、最低２色の使用が必要であったが、これまで希土類蛍光錯体の中で十分な信号／バックランド比（Ｓ／Ｂ）が実現していたものは、前記したＴｂ３＋錯体しかなく、緑色の１色による解析しかできなかった。【０００７】
【特許文献１】特開２００４−２９８２００号公報
【特許文献２】特表２００１−５１８８０５号公報
【特許文献３】特表２００２−５１５７３７号公報
【特許文献４】ＷＯ  ０３／０７６６１５号公報
【特許文献５】ＷＯ  ０１／８６００１号公報
【非特許文献１】T. Morris, et al., J. Clin. Microbiol., 1996, 34, 2933.
【非特許文献２】K. J. Livak, et al., Genet. Anal., 1999, 14, 143
【非特許文献３】L, A. Haff, et al., Genome Res., 1997, 7, 378.
【非特許文献４】P. Ross, et al., Nat. Biotechnol., 1998, 16, 1347
【非特許文献５】D. G. Wang, et al., Science, 1998, 280, 1077.
【非特許文献６】J. G. Hacia, et al., Nat. Genet., 1999, 22, 164.
【非特許文献７】P. N. Gilles, et al., Nat. Biotechnol., 1999, 17, 365
【非特許文献８】J. G. Hall, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97, 8272-8277
【非特許文献９】M. Katherine, et al., J. Am. Chem. Soc., 2004, 126, 16451-16455
【非特許文献１０】中村祐輔著、「改訂  先端のゲノム医学を知る」羊土社、２０００年９月１０日第１版
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、高感度のＳＮＰｓ解析方法を提供することを目的とし、微量の被検体ＤＮＡにより大量のＳＮＰｓを迅速に解析することができるＳＮＰ解析方法を提供することを目的としている。より詳細には、本発明は、高感度のＥｕ３＋錯体発光色素と消光物質からなる蛍光発色組成物を提供することを目的とし、使用する酵素に悪影響を与えることなく、しかも従来のＴｂ３＋錯体とは異なる色を発色し、少なくとも２色によるＳＮＰｓ解析を可能とする蛍光発色組成物を提供することを目的としている。さらに、本発明は、ＳＮＰｓ解析法において、高感度の発色色素と消光物質で構成されたフレットプローブなどの高感度核酸プローブ、及びこれを用いた時間分解蛍光測定による最も高感度なＳＮＰ解析法、そのための解析用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、希土類蛍光錯体ラベル剤と蛍光クエンチャーラベル剤との組み合わせによる発光の制御について検討してきており（特許文献４参照。）、これを用いたＳＮＰｓの効率的な解析法を開発してきた。しかし、従来の方法では、高感度の錯体としては緑色のＴｂ３＋錯体しか得られておらず、他の色のもの、特に赤色又は青色のような光の三原色を構成する色による錯体の開発が求められていた。また、本発明者らが開発してきたＴｂ３＋錯体の信号（Ｓ）とバックグランド信号強度（Ｂ）の比（Ｓ／Ｂ）の最大値は３０と比較的良好なものではあったが、さらに高感度に錯体が求められていた。
そこで、本発明者らは、（１）蛍光寿命が長い、（２）ストークスシフトが大きい、という特徴を持ち、夾雑物や迷光に影響されない高感度かつ信頼性の高い遺伝子解析が可能となる錯体及びその消光物質の開発を行ってきたところ、特定のＥｕ３＋錯体ではＳ／Ｂの最大値が５０となることを見出し、また、この錯体が赤色の蛍光出すこと、さらに、この錯体と図２に示されるようなるようなＢＨＱＴＭ（Black Hole Quencher）を消光物質として使用することにより、赤色による高感度かつ信頼性の高い遺伝子解析が可能となる特定の希土類蛍光錯体ラベル剤と特定の蛍光クエンチャーラベル剤との組み合わせを見出した。【００１０】
即ち、本発明は、Ｅｕ３＋錯体及び蛍光消光物質を核酸に結合させたことを特徴とする核酸プローブに関する。より詳細には、本発明は、Ｅｕ３＋錯体が、次の一般式（１）【００１１】
【化１】
2006106930.tif 000002
【００１２】
（式中、Ｒは置換基を有してもよいアリール基を示し、Ｑは−Ｃ＝Ｃ又は−Ｎを示し、Ｙ１〜Ｙ３はそれぞれ独立して−ＯＨ基、又は−Ｏ−基、Ｙ４は−ＯＨ基、−Ｏ−基、又は−Ｚ基を示し、Ｚは核酸との結合のためのリンカー基を示す。）
で表される配位子を有する錯体であって、蛍光消光物質が、次の一般式（４）【００１３】
【化２】
2006106930.tif 000003
【００１４】
（式中、Ｘは核酸との結合のためのリンカー基を示す。）
で表される化合物、又は次の一般式（５）【００１５】
【化３】
2006106930.tif 000004
【００１６】
（式中、Ｒ１〜Ｒ１３は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、又はニトロ基を示し、Ｘは核酸との結合のためのリンカー基を示す。）
で表される化合物である核酸プローブに関する。
また、本発明は、前記した本発明の核酸プローブを用いて核酸を解析する方法、及びそのための核酸解析用キットに関する。
さらに、本発明は、前記した本発明の核酸プローブを用いて、一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出若しくは同定、又はタイピングする方法、及びそのためのキットに関する。【００１７】
本発明は、核酸の解析に使用される核酸プローブ、特にフレットプローブを用いるインベーダー法や、ヘアピン構造のプローブを用いるモレキュラービーコン（molecular beacon）法などに使用される核酸プローブ、より詳細にはこのような解析用核酸プローブに結合して使用される高感度蛍光錯体及び当該蛍光の消光物質、さらに詳細には、当該高感度蛍光錯体と消光物質の組合せに関する。
本発明は、図１に示されるフレットプローブなどの核酸プローブにおける発光色素「Ｌｎ」と、消光物質「Ｑ」との新規な特定の組合せを提供するものである。図１のフレットプローブは本発明の核酸プローブの例を示すものである。この例では発光色素「Ｌｎ」はプローブの５’末端に示されており、消光物質「Ｑ」が発光色素「Ｌｎ」による蛍光を消光するに十分な近傍に位置しており、発光色素「Ｌｎ」による蛍光は消光物質「Ｑ」により消光されている。そして、インベーダー状態になったときに両者が分離され、発光色素「Ｌｎ」による蛍光を消光することができなくなり、発光色素「Ｌｎ」の蛍光を外部から観察することができるようになる。本発明は、このような発光と消光による標識化ができる核酸プローブを提供するものである。【００１８】
次に示す塩基配列を有する３９ｍｅｒの核酸を例にして本発明をより具体的に説明する。
5’- GCTTG TCTCG GTTTT TCCGA GACAA GCGTG CGCCT CGTT -3’ 
この核酸の５’末端には−Ｃ６Ｈ１２−を介してアミノ基が結合しており、また、５’末端から３番目の塩基（この例では、Ｔ）には、次式【００１９】
【化４】
2006106930.tif 000005
【００２０】
で示されるようにリンカー基を介したＤａｂｃｙｌ基、又は次式【００２１】
【化５】
2006106930.tif 000006
【００２２】
で示されるようにリンカー基を介したＢＨＱ２が結合している。
この例ではチミン（Ｔ）の５−メチル−ウラシル基のメチル基にリンカー基が結合している場合を示している。以下、前記核酸の５’−末端から３番目の塩基（この例では、Ｔ）に前記した式で示されるリンカー基を介したＤａｂｃｙｌ基が結合した核酸プローブを「Ｎ６−３−ＤＢＬ」と称し、前記核酸の５’−末端から３番目の塩基（この例では、Ｔ）に前記した式で示されるＢＨＱ２が結合した核酸プローブを「Ｎ６−３−ＢＨＱ２」と称する。
これらの核酸プローブの５’−末端に次式【００２３】
【化６】
2006106930.tif 000007
【００２４】
で示されるようにリンカー基を介したＢＴＴＡのＥｕ錯体、又は次式【００２５】
【化７】
2006106930.tif 000008
【００２６】
で示されるようにリンカー基を介してＤＴＢＴＡのＥｕ錯体が結合した核酸プローブをそれぞれ調製した。
前記した核酸の５’−末端にＢＴＴＡのＥｕ錯体が結合した核酸プローブを、それぞれ「Ｅｕ−ＢＴＴＡ−Ｎ６−３−ＤＢＬ」及び「Ｅｕ−ＢＴＴＡ−Ｎ６−３−ＢＨＱ２」と称し、前記した核酸の５’−末端にＤＴＢＴＡのＥｕ錯体が結合した核酸プローブを、それぞれ「Ｅｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−３−ＤＢＬ」及び「Ｅｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−３−ＢＨＱ２」と称する。
これらの核酸プローブを用いて、標的の核酸として４３ｍｅｒの次の塩基配列（Ｔ）及び（Ｃ）
5’- GTGTC TGCGG GAGTC GATTT CATCA TCACG CAGCT TTTCT TTG -3’  （Ｔ）
5’- GTGTC TGCGG GAGCC GATTT CATCA TCACG CAGCT TTTCT TTG -3’  （Ｃ）
についてインベーダー法による解析を行った。（Ｔ）と（Ｃ）では、５’−末端から１４番目の塩基が１塩基だけ相違している。
プライマリープローブとして２６ｍｅｒの次の塩基配列
5’- AACGA GGCGC ACACT CCCGC AGACA C -3’
を有する核酸を使用し、インベーダープローブとして、３０ｍｅｒの次の塩基配列
5’ - CAAAG AAAAG CTGCG TGATG ATGAA ATCGC -3’
を有する核酸を使用した。【００２７】
まず、フレットプローブとして「Ｅｕ−ＢＴＴＡ−Ｎ６−３−ＤＢＬ」を用いたインベーダーアッセイを行った。標的の核酸濃度は、１ｎＭで固定して、４時間反応させた。
結果を図３に示す。図３中、ＢはターゲットＤＮＡの濃度がゼロ（Ｂｌａｎｋ）を示し、Ｔは標的のＤＮＡが前記した（Ｔ）のものである場合を示し、そしてＣは標的のＤＮＡが前記した（Ｃ）のものであることを表す。標的のＤＮＡが（Ｔ）の場合に解裂酵素による切断が起こり、蛍光が観測されるよう他のプローブ配列を設計している。
フレットプローブが、「Ｅｕ−ＢＴＴＡ−Ｎ６−３−ＤＢＬ」の場合には、信号とバックグランドの比は、Ｔ／Ｂ＝３．６で、Ｔ／Ｃ＝４．７であり、ＳＮＰｓアッセイに使用可能ではあるが、検出感度は必ずしも十分ではなかった。ちなみに、市販のフルオレッセインで同様の実験を行った場合には、Ｔ／Ｂ及びＴ／Ｃの比は５〜６であった。【００２８】
次にフレットプローブとして、「Ｅｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−３−ＤＢＬ」を用いたインベーダーアッセイを同様な方法で行った。この結果を図４に示す。図４における、Ｂ、Ｔ、及びＣは前記した図３と同じである。
このフレットプローブ「Ｅｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−３−ＤＢＬ」を用いた場合の信号とバックグランドの比は、前記とほぼ同様に、Ｔ／Ｂ＝４．８、Ｔ／Ｃ＝３．５であった。【００２９】
同様に、フレットプローブとして「Ｅｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−３−ＢＨＱ２」を用いてインベーダーアッセイを行った。この結果を図５に示す。図５における、Ｂ、Ｔ、及びＣは前記した図３と同じである。
「Ｅｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−３−ＢＨＱ２」をフレットプローブとして使用した場合には、信号とバックグランドの比として、Ｔ／Ｂ＝４８．３、Ｔ／Ｃ＝４３．４となり、大幅な感度の向上を達成することができることがわかった。
これらの結果をまとめて次の表１に示す。【００３０】
【表１】
2006106930.tif 000009
【００３１】
注：１）フレットプローブとして「Ｎ６−３−ＤＢＬ」を用いた結果の平均。２）フレットプローブとして「Ｅｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−３−ＢＨＱ２」を用いた結果。３）前二者の比。
この結果、フレットプローブとして「Ｅｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−３−ＢＨＱ２」を用いた場合には、信号（Ｓ）とバックグランド信号強度（Ｂ）の比（Ｓ／Ｂ）の値が、４８．３となり驚異的な高感度となることがわかる。また、このプローブでは約１０倍以上の感度の向上ができたことがわかった。【００３２】
さらに、フレットプローブとして「Ｅｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−３−ＢＨＱ２」を用いたインベーダーアッセイで、標的のＤＮＡの濃度を変えて行うことにより、一塩基変異の検出限界の評価を行った。標的のＤＮＡの濃度は、塩基配列（Ｔ）のＤＮＡ、及び塩基配列（Ｃ）のＤＮＡともに、１００ｆＭ（０．１ｐＭ）から１ｎＭ（１０００ｐＭ）まで変化させ、インキュベーション時間も２時間、４時間、およびオーバーナイトと変化させた。測定数は各実験点につき４回行った（ｎ＝４）。結果を図６に示す。図６は、上からインキュベーション時間が２時間の場合、４時間の場合、及びオーバーナイトの場合を示している。図６の各グラフの縦軸は蛍光強度を示し、横軸は標的ＤＮＡの濃度（ｐＭ）を示す。各グラフの丸印（●）は塩基配列が（Ｔ）のＤＮＡを標的した場合を示し、三角印（▲）は塩基配列が（Ｃ）のＤＮＡを標的とした場合を示し、横線は標的ＤＮＡが存在しない場合を示す。
これらのデータに基づいて検出限界を検討した。検出限界は以下の式により計算した。
＜Ｔ＞  −  ＜Ｃ＞  ≧  ３σ（Ｃ）
ここで、＜Ｔ＞  は塩基配列が（Ｔ）のＤＮＡに対する検量線を示す一次式を示し、＜Ｃ＞は塩基配列が（Ｃ）のＤＮＡに対する平均値、そしてσ（Ｃ）は塩基配列が（Ｃ）のＤＮＡに対するプールされた標準偏差である。
比較のために、現在のインベーダーアッセイによく使われる有機色素であるＦＡＭを用いたフレットプローブ「ＦＡＭ−Ｎ６−３−ＤＢＬ」で同様な実験を行った。
これらの結果をまとめて次の表２に示す。【００３３】
【表２】
2006106930.tif 000010
【００３４】
表２の検出限界の数値の単位はｐＭである。
この結果、本発明のプローブ「Ｅｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−３−ＢＨＱ２」は、ＦＡＭ−Ｎ６−３−ＤＢＬと同程度の検出限界が得られた。この実験はモデル実験であるので、夾雑物等のない系でのアッセイである。夾雑物の含まれる系でアッセイを行った場合は、希土類蛍光錯体の特長が生かされ、有機色素を使った場合より検出感度の低い測定が可能であると期待される。
次に、前記した核酸プローブ「Ｎ６−３−ＤＢＬ」の５’−末端に次式【００３５】
【化８】
2006106930.tif 000011
【００３６】
で表されるＴｂのＢＰＴＡ錯体が結合した核酸プローブ「Ｔｂ−ＢＰＴＡ−Ｎ６−３−ＤＢＬ」を、Ｔｂ３＋を含むフレットプローブとして用い、そして、前記した本発明の「Ｅｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−３−ＢＨＱ２」をＥｕ３＋を含むフレットプローブとして用いた場合の赤（Ｅｕ３＋）および緑（Ｔｂ３＋）による二色のインベーダーアッセイを同様にして行った。結果を図７に示す。図７の左側はＴｂ３＋（緑色）の場合を示し、右側はＥｕ３＋（赤色）の場合を示す。図７の各グラフの３つの柱はそれぞれ左側からＢ、Ｔ、及びＣを示し、これは図３におけるＢ、Ｔ、及びＣと同じである。
これらの核酸プローブの塩基配列は両プローブとも同じなので同じように信号が観測されるはずである。実際、二つのプローブ由来の蛍光が観測され、希土類蛍光錯体を用いた二色インベーダーアッセイが可能であることが示された。【００３７】
以上のように、本発明のＥｕ３＋錯体、特に一般式（１）で表される配位子を有するＥｕ３＋錯体は核酸解析用の核酸プローブにおける蛍光標識として極めて優れた特性を有していることが明らかにされた。
本発明の好ましいＥｕ３＋錯体としては、前記した一般式（１）で表される化合物又はその塩を配位子とするものである。一般式（１）におけるアリール基としては、フェニル基、ナフチル基、ビフェニル基などの炭素数６〜３０、好ましくは６〜１２の炭素環式芳香族基や、環中に１〜３個の窒素原子、酸素原子又は硫黄原子を有する５〜７員の複素環式芳香族基が挙げられる。これらのアリール基は単環式、多環式、又は縮合環式のものであってもよい。好ましいアリール基としては、フェニル基、ビフェニル基、チエニル基、ピリジル基などが挙げられる。当該アリール基は１個以上の置換基を有していてもよく、このような置換基としては、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基などの炭化水素基やその誘導体であってもよいが、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、イソチオシアネト基などの極性の官能基が好ましい。また、これらの官能基のアルキル誘導体やハロゲン化誘導体であってもよい。より好ましい置換基としては、アミノ基、カルボキシル基、イソチオシアネト基、これらのアルキル置換体などが挙げられる。また、当該アリール基の置換基は、後述するリンカー基Ｚに結合する置換基、例えば、アミノ基や水酸基やカルボキシル基であってもよい。このように、アリール基の置換基がリンカー基を介して核酸に結合する場合には、一般式（１）におけるＲは、Ｒ−Ｚ−核酸という化学結合を形成することになる。
一般式（１）におけるＱは、−Ｃ＝Ｃ又は−Ｎを示す。即ち、Ｑが−Ｃ＝Ｃの場合には、ピリジン環を形成し、２−ピリジル基となり、Ｑが−Ｎの場合にはピラゾール環を形成し、１−ピラゾリル基となる。一般式（１）におけるＹ１〜Ｙ４は、いずれもカルボキシル基の残基であり、Ｙ１〜Ｙ３はそれぞれ独立して−ＯＨ基、又は−Ｏ−基（即ち、カルボキシル基の塩であるカルボキシレート）を示し、Ｙ４も同様に−ＯＨ基、又は−Ｏ−基であるが、Ｙ４は核酸に結合するためのリンカー基Ｚであってもよい。【００３８】
核酸に結合するためのリンカー基Ｚとしては、一般式（１）で表される配位子を核酸に固定するための適度な長さと固定化のための反応性の基を有するものであればよく、核酸の種類に応じて適宜選択することができる。このようなリンカー基としては炭素数３〜３０、炭素数５〜２０、好ましくは炭素数５〜１５の直鎖状のアルキレン基によって目的の核酸に結合するものであって、これらのアルキレン基の１個又は２個以上の炭素原子が、酸素原子、窒素原子、硫黄原子などの他の原子で置換されていてもよく、また、これらのアルキレン基の１個又は２個以上の炭素原子、窒素原子、又は硫黄原子に結合する水素原子は、オキソ基（＝Ｏ）、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、アルキル基などで置換されていてもよい。また、このようなアルキレン鎖中に１，３，５−トリアジン環やピリミジン環などの複素環（これらの複素環は、水酸基、アミノ基、オキソ基などで置換されていてもよい。）を含有することもできる。
一般式（１）で表される配位子を核酸に結合する場合には、これを核酸プローブの５’−末端や３’−末端に結合させるときには、当該末端の核酸のリン酸エステルとして結合させればよく、末端の核酸ではなく途中の核酸に結合させるときには、核酸の塩基部分と結合させることもできる。
本発明のＥｕ３＋錯体における、より好ましい配位子としては次の一般式（２）【００３９】
【化９】
2006106930.tif 000012
【００４０】
（式中、Ｒ及びＹ１〜Ｙ４は、前記の一般式（１）と同じである。）
で表される配位子、又は次の一般式（３）【００４１】
【化１０】
2006106930.tif 000013
（式中、Ｒ及びＹ１〜Ｙ４は、前記の一般式（１）と同じである。）
で表される配位子が挙げられるが、前記の一般式（２）で表される配位子がさらに好ましい。本発明のＥｕ３＋錯体の特に好ましい配位子としては、一般式（２）で表される配位子のうちで、Ｒがリンカー基Ｚに結合する置換基を有するアリール基であり、Ｙ１〜Ｙ４が、それぞれ独立して−ＯＨ基、又は−Ｏ−基（即ち、カルボキシル基の塩であるカルボキシレート）を示すものが挙げられる。
本発明の好ましいＥｕ３＋錯体としては、次式【００４２】
【化１１】
2006106930.tif 000014
【００４３】
（式中、Ｙ４は−ＯＨ基、又は−Ｏ−基を示し、Ｚは核酸との結合のためのリンカー基を示す。）
で表される錯体が挙げられる。この配位子を含有するＥｕ３＋錯体を、本明細書では「Ｅｕ−ＤＴＢＴＡ」と称する。また、本発明の「Ｅｕ−ＤＴＢＴＡ」錯体をリンカー基Ｚをより具体的に表すと、例えば、次式【００４４】
【化１２】
2006106930.tif 000015
【００４５】
（式中、Ｙ４は−ＯＨ基、又は−Ｏ−基を示し、Ｂａｓｅは核酸プローブ中のヌクレオチドとの結合を示す。）
で表されるＥｕ３＋錯体が挙げられる。
本発明の核酸プローブに結合する蛍光消光物質としては、前記した本発明のＥｕ３＋錯体による蛍光を消光することができる物質であれば特に制限はないが、好ましい蛍光消光物質としては、次の一般式（４）【００４６】
【化１３】
2006106930.tif 000016
【００４７】
（式中、Ｘは核酸との結合のためのリンカー基を示す。）
で表される化合物（本明細書では、これを「ＤＢＬ」と称する。）、又は、次の一般式（５）【００４８】
【化１４】
2006106930.tif 000017
【００４９】
（式中、Ｒ１〜Ｒ１３は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、又はニトロ基を示し、Ｘは核酸との結合のためのリンカー基を示す。）
で表される化合物（本明細書では、これを「ＢＨＱ」と称する。）が挙げられるが、より好ましい蛍光消光物質としては、前記した一般式（５）で表される化合物が挙げられる。
一般式（５）におけるアルキル基としては、炭素数１〜６の直鎖状又は分枝状のアルキル基であり、好ましいアルキル基としてはメチル基、エチル基、イソプロピル基などが挙げられる。アルコキシ基としては、炭素数１〜６の直鎖状又は分枝状のアルコキシ基であり、好ましいアルコキシ基としてはメトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基などが挙げられる。また、一般式（４）及び（５）におけるリンカー基Ｘとしては、一般式（４）又は（５）で表される蛍光消光物質を核酸に固定するための適度な長さと固定化のための反応性の基を有するものであればよく、核酸の種類に応じて適宜選択することができる。このようなリンカー基としては炭素数３〜３０、炭素数５〜２０、好ましくは炭素数５〜１５の直鎖状のアルキレン基によって目的の核酸に結合するものであって、これらのアルキレン基の１個又は２個以上の炭素原子が、酸素原子、窒素原子、硫黄原子などの他の原子で置換されていてもよく、また、これらのアルキレン基の１個又は２個以上の炭素原子、窒素原子、又は硫黄原子に結合する水素原子は、オキソ基（＝Ｏ）、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、アルキル基などで置換されていてもよい。
一般式（４）又は（５）で表される蛍光消光物質を核酸に結合する場合には、これを核酸プローブの５’−末端や３’−末端に結合させるときには、当該末端の核酸のリン酸エステルとして結合させればよく、末端の核酸ではなく途中の核酸に結合させるときには、核酸の塩基部分と結合させることもできる。
本発明の好ましい蛍光消光物質としては、次式【００５０】
【化１５】
2006106930.tif 000018
【００５１】
（式中、Ｘは核酸との結合のためのリンカー基を示す。）
で表される物質が挙げられる。この蛍光消光物質を、本明細書では「ＢＨＱ２」と称する。また、本発明の「ＢＨＱ２」のリンカー基Ｘをより具体的に表すと、例えば、次式【００５２】
【化１６】
2006106930.tif 000019
【００５３】
（式中、Ｂａｓｅは核酸プローブ中のヌクレオチドとの結合を示す。）
で表される蛍光消光物質が挙げられる。
本発明のＥｕ３＋錯体と蛍光消光物質との組み合わせでは、前記してきた一般式（１）で表される配位子を有するＥｕ３＋錯体と、一般式（４）又は（５）で表される蛍光消光物質とを適宜組み合わせ使用することができるが、なかでも、Ｅｕ３＋錯体として「Ｅｕ−ＤＴＢＴＡ」錯体を、蛍光消光物質として一般式（５）で表される化合物、なかでも「ＢＨＱ２」との組み合わせが特に好ましい。
本発明のＥｕ３＋錯体及び蛍光消光物質を核酸に結合させた核酸プローブの調製法は何れも自体公知の核酸プローブの調製法に準じてこれを行うことができる。例えば、オリゴヌクレオチドの合成は何れもホスホロアミダイト法によりＤＮＡ自動合成装置を用いて行うことができる。精製は逆相ＨＰＬＣにより行うことができる。また、蛍光消光物質の導入は、例えば下記の化学式【００５４】
【化１７】
2006106930.tif 000020
【００５５】
で示されるＤａｂｃｙｌ−ｄＴや、下記の化学式【００５６】
【化１８】
2006106930.tif 000021
【００５７】
で示されるＢＨＱ２−ｄＴなどのように常法に従ってこれを行うことができる。
また、Ｅｕ３＋錯体の導入は、５’末端などにアミノ修飾したオリゴヌクレオチドを用いて、一般式（１）などで表される配位子とＥｕイオンとからなるＥｕ３＋錯体との反応を行えばよく、精製は逆相ＨＰＬＣや電気泳動、ゲル濾過クロマトグラフィーにより行うことができる。【００５８】
本発明の核酸プローブにおける核酸としては、ＤＮＡでもＲＮＡのいずれであってもよい。核酸の長さとしては、プローブとして使用することができる長さであれば特に制限はなく、通常は１０〜１５０ｍｅｒ、好ましくは１０〜１００ｍｅｒ、より好ましくは１０〜５０ｍｅｒが挙げられる。このような核酸の塩基配列もプローブとして使用することができれば特に制限はなく、任意の塩基配列を選定することができる。本発明の核酸プローブをインベーダー法におけるフレットプローブ、又はタックマン法におけるタックマンプローブなどとして使用する場合には、５’−末端側又は３’−末端側のいずれかにループを形成できるような相補的な塩基配列を有するものが好ましい。
また、本発明のＥｕ３＋錯体と蛍光消光物質（クエンチャー）の相対位置は充分な消光が得られるように適宜選定することができるが、好ましい蛍光消光物質（クエンチャー）の相対位置としては、Ｅｕ３＋錯体が結合された塩基を１番目としたときに、３〜６番目の塩基、より好ましくは３〜５番目の塩基、さらに好ましくは４番目の塩基が挙げられる。後述する実施例９に示されるように、例えばＥｕ−ＤＴＢＴＡ−ＢＨＱの組み合わせでは、４番目の塩基に蛍光消光物質（クエンチャー）のＢＨＱを結合させた場合が極めて優れた効果を奏することがわかった。【００５９】
本発明の核酸プローブは、極めて高感度であり、極めて少量の試料であっても確実な測定が可能である。また、ＳＮＰｓなどのアッセイでは酵素を用いるため、核酸プローブに結合される錯体や消光物質がアッセイで使用される酵素の働きに干渉を与えないことが必要であり、これは先験的に予期することができない。例えば、タックマン（Taqman）５’→３’−エクソヌクレアーゼ活性については、Ｔｂ錯体を使ったプローブ（但し、このプローブには蛍光消光剤は付いていない。）に対して有効であることが報告されているが（Nucleic Acids Research, 2000, 28, e28）、それ以外については報告例はない。本発明の錯体や消光物質、例えばＥｕ−ＤＴＢＴＡ−ＢＨＱの組み合わせでは、酵素作用への干渉はほとんど観察されず、仮にあったとしても問題にならないレベルであることが確認された。
そして、本発明のさらに重要な点は、Ｔｂ錯体（特許文献４参照）に続いて、本発明によりＥｕ錯体の遺伝子解析法への適用が現実的に可能であることが示されたことである。これにより、例えば、希土類錯体としてＴｂ−ＢＰＴＡ（特許文献４参照）を含む核酸プローブと、本発明のＥｕ−ＤＴＢＴＡを含むもうひとつのプローブを同時に用いることにより、Ｔｂ３＋（緑色）およびＥｕ３＋（赤色）の２色の蛍光発色を用いた遺伝子解析が実現可能となったのである。ＳＮＰｓタイピングでは、ＳＮＰｓ部位の塩基の違いを色の違いとして観測することが良く行われており（例えば、非特許文献１０参照）、最低２色の蛍光発色をする錯体の使用が必要とされていたが、これまで希土類蛍光錯体の中で十分な信号／バックランド比（Ｓ／Ｂ）が実現していたものは、Ｔｂ錯体しかなく、希土類蛍光錯体による２色のＳＮＰｓの解析はできなかった。しかし、本発明により、今後はＴｂ３＋（緑色）およびＥｕ３＋（赤色）の２色を使うことにより、あるＳＮＰｓ（仮に塩基がＡかＢかのＳＮＰｓとする。）について、Ａ／Ａのホモ接合型であれば赤色（Ｅｕ３＋）、Ｂ／Ｂのホモ接合型なら緑色（Ｔｂ３＋）、そして、Ａ／Ｂのヘテロ接合型であれば黄色（Ｅｕ３＋＋Ｔｂ３＋）に発色するというような発色の色による判定が可能となり、核酸プローブを用いたＳＮＰｓの解析が少量の試料で極めて簡便に行うことができるようになる。
したがって、本発明の核酸プローブは、ＳＮＰｓ解析などの核酸の解析用の核酸プローブとして使用することができる。本発明の核酸プローブの使用例としては、例えば、インベーダー法におけるフレットプローブ、モレキュラービーコン法におけるヘアピン構造をとるプローブ、タックマン（TaqMan）ＰＣＲ法におけるタックマンプローブなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。【００６０】
したがって、本発明は、前記してきた本発明の核酸プローブを用いて核酸を解析する方法、より詳細には、標的となる核酸の塩基配列を解析する方法を提供するものである。また、本発明の核酸プローブをモレキュラービーコン法のようにループ状の状態で使用し、これが他の核酸にハイブリダイズしたときには線状となることや、又はハイブリダイズしない部分を酵素的に解裂させることにより、本発明の核酸プローブにおける錯体と消光物質の距離を変化させて、遺伝子の発現などを解析することも可能となる。また、インベーダー法などの方法により、標的となる核酸中の特定の位置の特定の塩基の存在又は不存在を解析することも可能となる。
これらの解析方法のなかでも、本発明の核酸プローブは、インベーダー法などによる一塩基多型（ＳＮＰｓ）の解析のためのプローブ、特にフレットプローブとして極めて有用なものである。前記した具体例、及び後述する具体例に記載されているように、本発明の核酸プローブは、インベーダー法において使用される酵素の活性に悪影響を与えるものではなく、本発明の核酸プローブの存在下においても十分な酵素活性が確認できたことから、本発明の核酸プローブは、インベーダー法などによる一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出若しくは同定、又はタイピングする方法に使用することができる。
さらに、本発明の核酸プローブは、希土類蛍光錯体として赤色の蛍光を発色するＥｕ３＋錯体を使用していることから、Ｅｕ３＋錯体とは異なる色の蛍光を発色する蛍光物質が結合した核酸プローブと組み合わせて使用することにより、観測される蛍光の色によりさらに簡便なＳＮＰｓの解析が可能となる。Ｅｕ３＋錯体とは異なる色としては、目視して色の相違が確認できるものであれば特に制限はないが、好ましくは光の三原色を構成する他の色、即ち、緑色又は青色が挙げられる。また、蛍光物質としては、蛍光錯体が好ましいが、これに限定されるものではなく、有機色素などの有機蛍光物質などであってもよい。例えば、本発明のＥｕ３＋錯体が結合した核酸プローブと、緑色の蛍光を発色する従来のＴｂ３＋錯体が結合した核酸プローブを組み合わせて使用することにより、赤色の蛍光、緑色の蛍光、及びこれらが混合してできる黄色の発色により、より効率的な核酸の解析が可能となる。【００６１】
また、本発明は、本発明の核酸プローブを含有してなる核酸解析用キットを提供するものである。本発明の核酸解析用キットは、本発明の核酸プローブ、又はその場で本発明の核酸プローブを形成することができる材料（例えば、本発明の配位子が結合した核酸プローブと、Ｅｕ３＋錯体を形成するためのユーロピウム化合物）を含有していることを特徴とするものであり、その余に核酸解析用の各種の材料、例えば、バッファー溶液や各種の酵素などを含有することができる。このような核酸解析用キットとしては、遺伝子発現の解析用のキット、一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出若しくは同定、又はタイピングするためのキットなどが挙げられる。本発明の核酸プローブは、インベーダー法におけるフレットプローブとして有用であり、インベーダー法用のフレットプローブとして本発明の核酸プローブを含有するキットは、本発明の好ましい核酸解析用キットのひとつである。
さらに、本発明の核酸解析用キットは、本発明の核酸プローブに結合しているＥｕ３＋錯体とは異なる色の蛍光を発色する蛍光物質が結合した核酸プローブを、さらに含有するもの核酸解析用キットが好ましい。このような、Ｅｕ３＋錯体とは異なる色の蛍光を発色する蛍光物質としては、蛍光錯体が好ましいが、これに限定されるものではなく、有機色素などの有機蛍光物質などであってもよい。好ましい蛍光錯体としては、緑色の蛍光を発色するＴｂ３＋錯体などが挙げられる。
【発明の効果】
【００６２】
本発明は、Ｅｕ３＋錯体及び蛍光消光物質を核酸に結合させた新規な核酸プローブを提供するものである。本発明の核酸プローブは、Ｅｕ３＋錯体という希土類蛍光錯体を使用しているものであり、蛍光の測定に当たっては高感度の時間分解蛍光測定法を採用することができる。さらに、本発明の核酸プローブは、従来の有機色素を用いた核酸プローブに比べて約１０倍もの高感度であり、極めて少量の試料による核酸の解析が可能となった。また、本発明の核酸プローブは、核酸の解析において使用される酵素に対して悪影響を与えるものではなく、各種の酵素を使用した核酸の解析に適用が可能である。さらに、本発明の核酸プローブは、蛍光発色用の錯体としてＥｕ３＋錯体を使用していることから、光の三原色のひとつである赤色の蛍光を発色し、他の色を発色する蛍光錯体との組み合わせ使用が容易である。
以上のように、本発明の核酸プローブにより、標的とする核酸に対する解析が極めて容易となり、特にインベーダー法によるＳＮＰｓの解析が極めて簡便かつ容易となり、本発明はヒトゲノムにおけるＳＮＰｓの解析や診断において極めて重要な素材を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、インベーダー法によるＳＮＰ解析法の概要を模式的に示したものである。
【図２】図２は、本発明の核酸プローブで使用される蛍光消光物質を例示したものである。
【図３】図３は、本発明の核酸プローブＥｕ−ＢＴＴＡ−Ｎ６−３−ＤＢＬを使用したときの、Ｓ／Ｂ比をグラフにして示したものである。図３中のＢは標的ＤＮＡの濃度がゼロ（Ｂｌａｎｋ）の場合を示し、Ｔは標的のＤＮＡが標的（Ｔ）の場合を示し、そしてＣは標的のＤＮＡが標的（Ｃ）の場合を示す。
【図４】図４は、本発明の核酸プローブＥｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−３−ＤＢＬを使用したときの、Ｓ／Ｂ比をグラフにして示したものである。図４中のＢは標的ＤＮＡの濃度がゼロ（Ｂｌａｎｋ）の場合を示し、Ｔは標的のＤＮＡが標的（Ｔ）の場合を示し、そしてＣは標的のＤＮＡが標的（Ｃ）の場合を示す。
【図５】図５は、本発明の核酸プローブＥｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−３−ＢＨＱ２を使用したときの、Ｓ／Ｂ比をグラフにして示したものである。図５中のＢは標的ＤＮＡの濃度がゼロ（Ｂｌａｎｋ）の場合を示し、Ｔは標的のＤＮＡが標的（Ｔ）の場合を示し、そしてＣは標的のＤＮＡが標的（Ｃ）の場合を示す。
【図６】図６は、本発明の核酸プローブＥｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−３−ＢＨＱ２を使用して、標的のＤＮＡの濃度を０．１ｐＭから１０００ｐＭまで変化させたときの各々の蛍光強度の変化を示すグラフである。図６は、上からインキュベーション時間が２時間の場合、４時間の場合、及びオーバーナイトの場合を示している。図６の各グラフの縦軸は蛍光強度を示し、横軸は標的ＤＮＡの濃度（ｐＭ）を示す。各グラフの丸印（●）は塩基配列が（Ｔ）のＤＮＡを標的した場合を示し、三角印（▲）は塩基配列が（Ｃ）のＤＮＡを標的とした場合を示し、横線は標的ＤＮＡが存在しない場合を示す。
【図７】図７は、本発明の「Ｅｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−３−ＢＨＱ２」をＥｕ３＋を含むフレットプローブとして用い、ＴｂのＢＰＴＡ錯体が結合した核酸プローブ「Ｔｂ−ＢＰＴＡ−Ｎ６−３−ＤＢＬ」をＴｂ３＋を含むフレットプローブとして用いた場合の赤（Ｅｕ３＋）および緑（Ｔｂ３＋）による二色のインベーダーアッセイの結果をグラフ化して示したものである。図７の左側はＴｂ３＋（緑色）の場合を示し、右側はＥｕ３＋（赤色）の場合を示す。図７の各グラフの３つの柱はそれぞれ左側からＢ、Ｔ、及びＣを示し、これは図３におけるＢ、Ｔ、及びＣと同じである。
【図８】図８は、本発明のＥｕ−ＤＴＢＴＡ錯体による蛍光、及び従来のＴｂ−ＢＰＴＡ錯体による蛍光のそれぞれの蛍光の発光色、及びこれらを混合したときの蛍光の発光色を写した結果を示す図面に代わるカラー写真である。図８の左側はＴｂ−ＢＰＴＡによるものであり、緑色の蛍光であることがわかる。図８の中央はＴｂ−ＢＰＴＡとＥｕ−ＤＴＢＴＡを混合したときの蛍光で黄色になっているのがわかる。図８の右側はＥｕ−ＤＴＢＴＡによるもので赤色の蛍光であることがわかる。
【図９】図９は、本発明の「Ｅｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−ｎ−ＢＨＱ２」（ｎ＝３，４，５，６）それぞれについて、標的ＤＮＡの濃度を０．１〜１０００ｐＭの範囲で変化させインベーダーアッセイを行った時の蛍光強度の変化を示すグラフである。ここでインキュベーション時間は１時間である。各グラフの縦軸はＥｕ３＋の蛍光強度を、横軸は標的ＤＮＡの濃度（ｐＭ）を示す。各グラフの黒丸印（●）は標的ＤＮＡが（Ｔ）の時、および白三角印（△）は標的ＤＮＡが（Ｃ）の時の結果を示す。また、バーは標準偏差（Ｎ＝４）を示す。式より算出した検出限界を矢印で示した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
以下に記載する実施例において共通する操作は以下のように行った。
（１）逆相ＨＰＬＣ
機器：日本分光製ＧＵＬＬＩＶＥＲシリーズＨＰＬＣ装置
溶離液
Ａ：酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）バッファー（１００ｍＭ，ｐＨ＝７．０）
Ｂ：アセトニトリル
溶出時間が０〜２分は、Ａ：Ｂが９５：５の溶出液を使用し、溶出時間が２〜４５分は、Ａ：Ｂが９７−（ｔ／ｍｉｎ）：３＋（ｔ／ｍｉｎ）とした（ｔは時間（分））。
流量：１ｍＬ／分
カラム：Ｗａｔｅｒｓ社製Ｘｔｅｒｒａ  ＭＳＣ１８カラム
カラム温度：６０℃
検出
紫外可視：２６０ｎｍ吸光度
蛍光：Ｔｂ３＋錯体またはＴｂ３＋を含むプローブの場合は、３２０ｎｍで励起、５４５  ｎｍ発光
：Ｅｕ３＋錯体またはＥｕ３＋を含むプローブの場合は、３４０ｎｍで励起、６１５  ｎｍ発光
（２）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）
機器：バイオラッド社製ミニプロティアン３（０．７５ｍｍ又は１．５ｍｍ厚ゲル）
泳動バッファー：ＴＢバッファー（ＴＲＩＳ１０．８ｇ／Ｌ、ホウ酸５．５ｇ／Ｌ、及び純水よりなるバッファー）
ゲル組成：ポリアクリルアミド濃度＝２０％
尿素  ４０％
バッファー：ＴＢバッファー
泳動方式：定電流  １０ｍＡ
（３）プレートリーダーによる蛍光測定
機器：パーキンエルマー社製Ｗａｌｌａｃ１４２０ＡＲＶＯＴＭ  ＳＸ蛍光プレートリーダー
測定条件：
１．Ｔｂ３＋錯体またはＴｂ３＋を含むプローブの場合は、励起波長３２０ｎｍ；検出波長５４５ｎｍ、時間分解測定（遅延時間（Delay time）５００μｓ；ウインドウ時間（Window time）１０００μｓ；サイクル時間（Cycle Time）２０００μｓ）
２．Ｅｕ３＋錯体またはＥｕ３＋を含むプローブの場合は、励起波長３４０ｎｍ；検出波長６１５ｎｍ、時間分解測定（遅延時間（Delay time）１００μｓ；ウインドウ時間（Window time）１５００μｓ；サイクル時間（Cycle Time）２０００μｓ）
３．ＦＡＭまたはＦＡＭを含むプローブの場合は、励起波長４８５ｎｍ；検出波長５３５ｎｍ、連続波測定（測定時間（Measurement time）１．０ｓ）
【実施例１】
【００６５】
フレットプローブ「Ｅｕ−ＢＴＴＡ−Ｎ６−３−ＤＢＬ」の合成と精製
まず、５’−末端にＣ６Ｈ１２を介しアミノ基が結合したヌクレオシドと、Ｄａｂｃｙｌで修飾したＤＮＡオリゴヌクレオチドをＤＮＡ自動合成装置により合成したオリゴヌクレオチドＮ６−３−ＤＢＬを製造した。
次式【００６６】
【化１９】
2006106930.tif 000022
【００６７】
で表されるＨ４ＢＴＴＡのＥｕ３＋錯体０，７１ｍｇ（０．８７６μｍｏｌ）を真空ラインで良く乾燥し、アルゴン雰囲気下で、これに乾燥ＤＭＦ５０μＬを加えて溶解し、この溶液にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）０．１０ｍｇ（０．８７６μｍｏｌ）、及びジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）０．１８ｍｇ（０．８７６μｍｏｌ）を加え、この溶液を一晩攪拌した。
得られた反応混合物１１．４μＬに、純水２６．２μＬ、炭酸バッファー（５００ｍＭ，ｐＨ＝９．１）１２．０μＬ、及びオリゴヌクレオチドＮ６−３−ＤＢＬの１００μＭ水溶液１０．０μＬを加え、これを再び一晩反応させた。
一晩反応後、ＴＲＩＳバッファー（１００ｍＭ，ｐＨ＝７．４）１２０μＬを加えた後、限外濾過（ミリポア社ＹＭ−３）を行った。得られた粗生成物を逆相ＨＰＬＣにより精製し、最終的に２０．５ｐｍｏｌのＥｕ−ＢＴＴＡ−Ｎ６−３−ＤＢＬを得た。
【実施例２】
【００６８】
フレットプローブ「Ｅｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−３−ＤＢＬ」の製造
Ｎ６−３−ＤＢＬの１００μＭ水溶液５μＬと、次式【００６９】
【化２０】
2006106930.tif 000023
【００７０】
で表されるＨ４ＤＴＢＴＡを用いて製造されたＥｕ−ＤＴＢＴＡ錯体の２．０ｍＭのＤＭＳＯ溶液５μＬとを、Ｎ６−３−ＤＢＬ：Ｅｕ−ＤＴＢＴＡ＝１：２０のモル比で、炭酸バッファー（５００ｍＭ，ｐＨ＝９．１）２．５μＬと共に混合し、それを一昼夜室温で攪拌した。
一昼夜反応後、反応混合物を陰イオン交換樹脂で精製し、塩化ナトリウム（０．５Ｍ）含有ＴＲＩＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ＝８．０）で樹脂に吸着された核酸プローブを溶出させた。溶出液を濃縮した後、少量の純水に再溶解し限外濾過（ミリポア社ＹＭ−３）した。得られた溶液を、さらにポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で精製した。約１時間の泳動の後、ＵＶシャドウイングによりバンドを確認し、Ｅｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−３−ＤＢＬのバンドを切り出した。切り出したゲルを、ＴＲＩＳバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ＝７．８）に懸濁させ、その上清部を濾過により取り出し、当量のＥｕＣｌ３と、炭酸バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ＝９．１）中又はＴＲＩＳバッファー（１００ｍＭ、ｐＨ＝８．０）中で混合した。一時間攪拌後、限外濾過（ミリポア製ＹＭ−３）を行い、過剰のＥｕＣｌ３を含む浸出液の蛍光強度を蛍光プレートリーダーでチェックした。限外濾過膜上に残った液には、ＴＲＩＳバッファー（１０  ｍＭ、ｐＨ  ＝  ７．４）を加え、再び限外濾過を行った。この操作は、得られた浸出液の蛍光強度が一定となるまで繰り返した。最終的に、約２５％収率で目的物Ｅｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−３−ＤＢＬが得られた。
【実施例３】
【００７１】
フレットプローブ「Ｅｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−３−ＢＨＱ２」の製造
まず、５’−末端用の末端のＣ６Ｈ１２を介しアミノ基が結合したヌクレオシドと、ＢＨＱ２で修飾したＤＮＡオリゴヌクレオチドをＤＮＡ自動合成装置により合成したオリゴヌクレオチドＮ６−３−ＢＨＱ２を製造した。
このＮ６−３−ＢＨＱ２を用いて、実施例２と同様の方法で、Ｎ６−３−ＢＨＱ２：Ｅｕ−ＤＴＢＴＡ＝１：２０のモル比の条件で反応させ、実施例２と同様に精製して目的のＥｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−３−ＢＨＱ２を収率約２５％で製造した。【００７２】
参考例１
フレットプローブＴｂ−ＢＰＴＡ−Ｎ６−ＤＢＬ、及びＴｂ−ＢＰＴＡ−Ｎ６−ＢＨＱ２の製造
実施例１で製造したＮ６−３−ＤＢＬ又は実施例３で製造したＮ６−３−ＢＨＱ２、及び実施例１と同様にして製造したスクシンイミド化ＢＰＴＡ（ＢＰＴＡ−ＯＳｕ）のＴｂ３＋錯体を用いて、実施例１又は実施例３と同様にして、目的のＴｂ−ＢＰＴＡ−Ｎ６−ＤＢＬ、及びＴｂ−ＢＰＴＡ−Ｎ６−ＢＨＱ２をそれぞれ製造した。
【実施例４】
【００７３】
Ｅｕ−ＢＴＴＡ−Ｎ６−３−ＤＢＬを用いたインベーダーアッセイ
フレットプローブとしてＥｕ−ＢＴＴＡ−Ｎ６−３−ＤＢＬを用い、インベーダーアッセイを行った。
（１）インベーダーアッセイ用バッファー（インベーダーバッファー）の調製
インベーダーアッセイに用いるインベーダーバッファーの１０倍濃縮液  １０×インベーダーバッファーは以下のように調製した。
ＴＲＩＳバッファー（２００ｍＭ、ｐＨ＝７．４）    ５００ｍＬ
ＭｇＣｌ２（１５０ｍＭ）／純水                     ５００ｍＬ
Ｔｗｅｅｎ２０                                      ５ｇ
を混合し、０．２μｍフィルター（ナルゲン）で滅菌濾過した。
（２）インベーダーアッセイ
典型的には、１ウェル（２０μＬ）当たり以下の割合でプローブ類、酵素、バッファー等を混合した。
（終濃度）
標的オリゴヌクレオチド（１０×ｘ  Ｍ）／純水      ２μＬ      （ｘ  Ｍ）
フレットプローブ（１．２５μＭ）／純水              ２μＬ  （１２５ｎＭ）
１０×ＰＩミックス                                    ２μＬ
プライマリープローブ                                  （２５０ｎＭ）
インベーダープローブ                                  （５０ｎＭ）
ｔＲＮＡ（１００ｎｇ／μＬ）／純水                １μＬ  （５ｎｇ／μＬ）
フラップエンドヌクレアーゼ（２００ｎｇ／μＬ）溶液１μＬ（１０ｎｇ／μＬ）
１０×インベーダーバッファー                      ２μＬ
純水                                                  １０μＬ
ここで、標的オリゴヌクレオチドとして、次の塩基配列（Ｔ）又は（Ｃ）
5’- GTGTC TGCGG GAGTC GATTT CATCA TCACG CAGCT TTTCT TTG -3’  （Ｔ）
5’- GTGTC TGCGG GAGCC GATTT CATCA TCACG CAGCT TTTCT TTG -3’  （Ｃ）
を有するオリゴヌクレオチドを用いた。以下では、それぞれのオリゴヌクレオチドを標的（Ｔ）及び標的（Ｃ）とそれぞれ称する。それぞれ、様々な終濃度ｘについてアッセイを行った。また、プライマリープローブ及びインベーダープローブは、それぞれ次に示す、
プライマリープローブ  ：  5’- AACGA GGCGC ACACT CCCGC AGACA C -3’
インベーダープローブ  ：  5’ - CAAAG AAAAG CTGCG TGATG ATGAA ATCGC -3’
配列を有する、ＨＰＬＣグレードのオリゴヌクレオチドを用いた。解裂酵素としては、アエルピルムペルニックス（Aeropyrum pernix）由来フラップエンドヌクレアーゼを用いた。上記の組成の溶液を、６３℃で２時間又は４時間インキュベートした後、蛍光プレートリーダーにて、使用したフレットプローブに対応してＴｂ、Ｅｕ，またはＦＡＭ由来の蛍光を測定することにより行った。【００７４】
この例では、標的オリゴヌクレオチドの濃度は、１ｎＭで固定し、４時間反応させた。結果を図３に示す。図中、ＢはターゲットＤＮＡの濃度がゼロ（Ｂｌａｎｋ）、Ｔは標的ＤＮＡが標的（Ｔ）、そしてＣは標的ＤＮＡが標的（Ｃ）であることを表す。Ｔの場合に解裂酵素による切断が起こり、蛍光が観測されるよう他のプローブ配列を設計している。
このフレットプローブＥｕ−ＢＴＴＡ−Ｎ６−３−ＤＢＬは、特許文献４（ＷＯ  ０３／０７６６１５号公報参照）に好ましい例として記載されている希土類蛍光錯体−消光剤の組み合わせに対応し、かつ当該特許文献４に記載の実施例に準じた方法で製造した。しかし、信号とバックグランドの比は、Ｔ／Ｂ＝３．６、及びＴ／Ｃ＝４．７であり、ＳＮＰｓアッセイに使用可能ではあるが、検出感度は必ずしも十分ではなかった。ちなみにフルオレッセインで同様の実験を行ったところ、Ｔ／Ｂ＝Ｔ／Ｃ＝５〜６であった。
【実施例５】
【００７５】
Ｅｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−３−ＤＢＬを用いたインベーダーアッセイ
フレットプローブとしてＥｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−３−ＤＢＬを用い、実施例４と同様にしてインベーダーアッセイを行った。実施例４と同様に、標的オリゴヌクレオチドの濃度は１ｎＭで固定し４時間反応させた。結果を図４に示す。
このフレットプローブＥｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−３−ＤＢＬは、実施例４で使用したＥｕ−ＢＴＴＡ−Ｎ６−３−ＤＢＬと比べて、錯体と核酸を結ぶリンカー分子および錯体上でリンカーの結合する位置が異なっている。しかし、信号とバックグランドの比は、実施例４とほぼ同じで、Ｔ／Ｂ＝４．８、及びＴ／Ｃ＝３．５であった。
【実施例６】
【００７６】
Ｅｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−３−ＢＨＱ２を用いたインベーダーアッセイ
フレットプローブとしてＥｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−３−ＢＨＱ２を用い、実施例４と同様にしてインベーダーアッセイを行った。標的オリゴヌクレオチドの濃度は、同じく１ｎＭで固定し、４時間反応させた。結果を図５に示す。
このフレットプローブでは、信号とバックグランドの比として、Ｔ／Ｂ＝４８．３、及びＴ／Ｃ＝４３．４が得られ、大幅な感度の向上が達成された。これらの結果をまとめて前記表１に示した。
【実施例７】
【００７７】
Ｅｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−３−ＢＨＱ２を用いたインベーダーアッセイの検出限界
実施例６で行ったＥｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−３−ＢＨＱ２を用いて実施例４と同様な方法によるインベーダーアッセイで、標的オリゴヌクレオチドの濃度を変えて行うことにより、一塩基変異の検出限界の評価を行った。
標的オリゴヌクレオチドの濃度は、標的（Ｔ）と標的（Ｃ）のいずれも、それぞれ１００ｆＭから１ｎＭまで変化させ、インキュベーション時間も２時間、４時間、及びオーバーナイトと変化させて実験を行った。測定数は各実験点につき４回である（ｎ＝４）。結果を図６に示す。これらの結果から、検出限界を計算した。
また、比較のため、インベーダーアッセイによく使われる有機色素であるＦＡＭを用いて、同様な実験を行った。
これらの結果をまとめて前記した表２に示した。
【実施例８】
【００７８】
二色（Ｅｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−３−ＢＨＱ２及びＴｂ−ＢＰＴＡ−Ｎ６−３−ＤＢＬ）を用いたインベーダーアッセイ
Ｅｕ３＋錯体を含むフレットプローブとしてＥｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−３−ＢＨＱ２を、そして、Ｔｂ３＋錯体を含むフレットプローブとしてＴｂ−ＢＰＴＡ−Ｎ６−３−ＤＢＬ  を用い、赤（Ｅｕ３＋）および緑（Ｔｂ３＋）による二色インベーダーアッセイを行った。結果を図７に示す（標的オリゴヌクレオチドの濃度は１ｎＭ）。また、それぞれの蛍光の発光色、及びこれらを混合したときの蛍光の発光色を写したカラー写真を図８として添付する。図８の左側はＴｂ−ＢＰＴＡによるものであり、緑色の蛍光であることがわかる。図８の中央はＴｂ−ＢＰＴＡとＥｕ−ＤＴＢＴＡを混合したときの蛍光で黄色になっているのがわかる。図８の右側はＥｕ−ＤＴＢＴＡによるもので赤色の蛍光であることがわかる。
これらの結果、希土類蛍光錯体を用いた二色インベーダーアッセイが可能であることが確認された。
【実施例９】
【００７９】
クエンチャーの最適位置
クエンチャーの結合する塩基の位置がそれぞれ異なるプローブＥｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−ｎ−ＢＨＱ２（ｎ＝３，４，５，６）を製造し、クエンチャーの結合する塩基の位置による感度を試験した。これらのプローブの製造は、前記したＥｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−３−ＢＨＱ２の製造法と同じ方法で行った。ここで、プローブはそれぞれ以下のような配列を有する。下記の式における配列中の「ｔ」は、ＢＨＱ２化デオキシチミジンを示す。
Eu-DTBTA-N6-3-BHQ2: 
5’- Eu-DTBTA - GCtTG TCTCG GTTTT TCCGA GACAA GCGTG CGCCT CGTT -3’
Eu-DTBTA-N6-4-BHQ2: 
5’- Eu-DTBTA - GCTtG TCTCG GTTTT TCCGA GACAA GCGTG CGCCT CGTT -3’
Eu-DTBTA-N6-5-BHQ2: 
5’- Eu-DTBTA - GCTGt TCTCG GTTTT TCCGA GACAA GCGTG CGCCT CGTT -3’
Eu-DTBTA-N6-6-BHQ2: 
5’- Eu-DTBTA - GCTTG tCTCG GTTTT TCCGA GACAA GCGTG CGCCT CGTT -3’
以上のプローブそれぞれをフレットプローブとして用いインベーダーアッセイを行った。インベーダーアッセイ条件は、フレットプローブの種類が異なる以外、実施例４と同じである。標的ＤＮＡ（Ｔ）および（Ｃ）の濃度を０．１〜１０００ｐＭの範囲で変化させた時の、インキュベーション時間１時間後に観測されたＥｕ蛍光強度の変化を図９に示す。これらのデータから算出した検出限界もあわせて図９中に示した。検出限界は先の実施例と同じく以下の式から計算した。
＜Ｔ＞  ー  ＜Ｃ＞  ≧ ３σ（Ｃ）
ここで、＜Ｔ＞は標的ＤＮＡ（Ｔ）に対する検量線を示す一次式、＜Ｃ＞は標的ＤＮＡ（Ｃ）に対する平均値、そしてσ（Ｃ）は標的ＤＮＡ（Ｃ）に対するプールされた標準偏差である。Ｅｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−ｎ−ＢＨＱ２（ｎ＝３，４，５，６）をフレットプローブとして用いたインベーダーアッセイの検出限界（検出限界標的ＤＮＡ濃度／ｐＭ）の結果を次の表３に示す。【００８０】
【表３】
2006106930.tif 000024
【００８１】
なお、Ｅｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−３−ＢＨＱ２に対する検出限界の値が、先の実施例７の表２に示した値と少し異なっているが、これは二つの実施例に対応する実験が全く違う日に違うロットのプローブを用いて行われたからである。逆に、この二つの実験結果の差が少ないことから、アッセイ間のばらつきは小さく、再現性も良いと言える。フレットプローブＥｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−ｎ−ＢＨＱ２（ｎ＝３，４，５，６）の検出限界を比較すると、ｎ＝３，５，および６に対する検出限界は三つとも１０−４０ｐＭ程度で、大きな差異は見られないが、ｎ＝４の場合だけ特異的に検出限界が一桁近く下がっている。インキューべーション時間を２−４時間と変えて実験を行ったが、同じような傾向であった（表３参照）。
これらの結果からＥｕ−ＤＴＢＴＡ−Ｎ６−４−ＢＨＱ２をフレットプローブとして用いた時の検出限界が特異的に低く、性能が良いことが分かった。以上のことより、クエンチャーの最適位置はＥｕ錯体から４番目の塩基の位置であると結論された。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明は、ＳＮＰｓなどの核酸の解析に有用な核酸プローブを提供するものであり、ヒトゲノムにおけるＳＮＰｓの検出や同定のための試薬として産業上利用されるものである。また、本発明の核酸プローブは、極めて高感度であるだけでなく、核酸の解析において使用される酵素類の活性を阻害することもなく、かつ従来の希土類蛍光錯体とは異なる色の蛍光を発色するものであり、従来の希土類蛍光錯体と組み合わせて使用することにより、さらに高感度で、簡便かつ確実な核酸の解析が可能となり、産業上極めて有用なものである。
【配列表フリーテキスト】
【００８３】
配列番号１  ：  本明細書に記載の試験例においてフレットプローブとして使用した３９ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを示す。
5’- GCTTG TCTCG GTTTT TCCGA GACAA GCGTG CGCCT CGTT -3’ 
配列番号２  ：  本明細書に記載の試験例において標的（Ｔ）として標的プローブとして使用した４３ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを示す。
5’- GTGTC TGCGG GAGTC GATTT CATCA TCACG CAGCT TTTCT TTG -3’
配列番号３  ：  本明細書に記載の試験例において標的（Ｃ）として標的プローブとして使用した４３ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを示す。
5’- GTGTC TGCGG GAGCC GATTT CATCA TCACG CAGCT TTTCT TTG -3’
配列番号４  ：  本明細書に記載の試験例においてプライマリープローブとして使用した２６ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを示す。
5’- AACGA GGCGC ACACT CCCGC AGACA C -3’
配列番号５  ：  本明細書に記載の試験例においてインベーダープローブとして使用した３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを示す。
5’ - CAAAG AAAAG CTGCG TGATG ATGAA ATCGC -3’
【図１】
2006106930.tif 000032
【図２】
2006106930.tif 000033
【図３】
2006106930.tif 000034
【図４】
2006106930.tif 000035
【図５】
2006106930.tif 000036
【図６】
2006106930.tif 000037
【図７】
2006106930.tif 000038
【図９】
2006106930.tif 000039
【図８】
2006106930.tif 000040
【配列表】
2006106930000001.app
【国際調査報告】
2006106930.tif 000041
2006106930.tif 000042
2006106930.tif 000043
2006106930.tif 000044
2006106930.tif 000045
2006106930.tif 000046