(57)【要約】  本発明の課題は、Alicyclobacillus属細菌を他の細菌と区別して特異的に検出するための迅速、簡便、且つ低コストな方法を提供することである。（１）被験試料について、配列番号１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、または配列番号３に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いてPCRを行う工程、（２）得られたPCR産物を、配列番号５または６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブとハイブリダイズさせる工程、及び（３）上記で得られたハイブリダイズ産物を検出する工程を有する、Alicyclobacillus属細菌の特異的検出方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）被験試料について、配列番号１に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、または配列番号３に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号４に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いてPCRを行う工程、
（２）得られたPCR産物を、配列番号５または６に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブとハイブリダイズさせる工程、及び
（３）上記で得られたハイブリダイズ産物を検出する工程
を有する、Alicyclobacillus属細菌の特異的検出方法。
【請求項２】
（１）被験試料について、配列番号１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、または配列番号３に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いてPCRを行う工程、
（２）得られたPCR産物を、配列番号５または６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブとハイブリダイズさせる工程、及び
（３）上記で得られたハイブリダイズ産物を検出する工程
を有する、請求項１に記載のAlicyclobacillus属細菌の特異的検出方法。
【請求項３】
前記プローブが固相に固定化されている、請求項１に記載のAlicyclobacillus属細菌の特異的検出方法。
【請求項４】
上記（３）検出工程の前に、ハイブリダイズ産物を固相に固定化する工程
を有する、請求項１に記載のAlicyclobacillus属細菌の特異的検出方法。
【請求項５】
Alicyclobacillus属細菌が、バニリン資化性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Alicyclobacillus属細菌が、Alicyclobacillus acidoterrestrisである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（1'）被験試料について、配列番号１に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いてPCRを行う工程、
（2'）得られたPCR産物を、配列番号６に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブとハイブリダイズさせる工程、及び
（3'）上記で得られたハイブリダイズ産物を検出する工程
を有するか、または
（1''）被験試料について、配列番号３に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号４に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いてPCRを行う工程、
（2''）得られたPCR産物を、配列番号５または６に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブとハイブリダイズさせる工程、及び
（3''）上記で得られたハイブリダイズ産物を検出する工程
を有する、Alicyclobacillus acidoterrestrisの特異的検出方法。
【請求項８】
（1'）被験試料について、配列番号１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いてPCRを行う工程、
（2'）得られたPCR産物を、配列番号６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブとハイブリダイズさせる工程、及び
（3'）上記で得られたハイブリダイズ産物を検出する工程
を有するか、または
（1''）被験試料について、配列番号３に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いてPCRを行う工程、
（2''）得られたPCR産物を、配列番号５または６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブとハイブリダイズさせる工程、及び
（3''）上記で得られたハイブリダイズ産物を検出する工程
を有する、請求項７に記載のAlicyclobacillus acidoterrestrisの特異的検出方法。
【請求項９】
前記プローブが固相に固定化されている、請求項７に記載のAlicyclobacillus acidoterrestrisの特異的検出方法。
【請求項１０】
上記（3'）または（3''）の検出工程の前に、ハイブリダイズ産物を固相に固定化する工程を有する、請求項７に記載のAlicyclobacillus acidoterrestrisの特異的検出方法。
【請求項１１】
被験試料が飲食物、化粧品、ヘアケア化粧品、デンタルケア製品またはそれらの原料である、請求項７に記載のAlicyclobacillus acidoterrestrisの特異的検出方法。
【請求項１２】
（1'''）被験試料について、配列番号１に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いてPCRを行う工程、
（2'''）得られたPCR産物を、配列番号５に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブとハイブリダイズさせる工程、及び
（3'''）上記で得られたハイブリダイズ産物を検出する工程
を有する、バニリン資化性を有するAlicyclobacillus属細菌の特異的検出方法。
【請求項１３】
（1'''）被験試料について、配列番号１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いてPCRを行う工程、
（2'''）得られたPCR産物を、配列番号５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブとハイブリダイズさせる工程、及び
（3'''）上記で得られたハイブリダイズ産物を検出する工程
を有する、請求項１２に記載のバニリン資化性を有するAlicyclobacillus属細菌の特異的検出方法。
【請求項１４】
前記プローブが固相に固定化されている、請求項１２に記載のバニリン資化性を有するAlicyclobacillus属細菌の特異的検出方法。
【請求項１５】
上記（３ '''）の検出工程の前に、ハイブリダイズ産物を固相に固定化する工程を有する、請求項１２に記載のバニリン資化性を有するAlicyclobacillus属細菌の特異的検出方法。
【請求項１６】
被験試料が飲食物、化粧品、ヘアケア化粧品、デンタルケア製品またはそれらの原料である、請求項１２に記載のバニリン資化性を有するAlicyclobacillus属細菌の特異的検出方法。
【請求項１７】
配列番号１に示される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、配列番号２に示される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、配列番号３に示される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号４に示される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドからなる、Alicyclobacillus属細菌に特異的なDNA配列を増幅するためのプライマー。
【請求項１８】
配列番号１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、配列番号３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドからなる、請求項１７に記載のAlicyclobacillus属細菌に特異的なDNA配列を増幅するためのプライマー。
【請求項１９】
下記（ａ'）または（ｂ'）のいずれかの、Alicyclobacillus属細菌に特異的なDNA配列を増幅するためのプライマーセット：
（ａ'）配列番号１に示される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるforwardプライマー、及び配列番号２に示される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるreverseプライマーを有するプライマーセット、
（ｂ'）配列番号３に示される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるforwardプライマー、及び配列番号４に示される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるreverseプライマーを有するプライマーセット。
【請求項２０】
下記（ａ）または（ｂ）のいずれかの、請求項１９に記載のAlicyclobacillus属細菌に特異的なDNA配列を増幅するためのプライマーセット：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるforwardプライマー、及び配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるreverseプライマーを有するプライマーセット、
（ｂ）配列番号３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるforwardプライマー、及び配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるreverseプライマーを有するプライマーセット。
【請求項２１】
下記（ｃ'）または（ｄ'）のいずれかの、Alicyclobacillus属細菌に特異的なDNA配列を標識するためのプローブ：
（ｃ'）配列番号５に示される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ、
（ｄ'）配列番号６に示される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ。
【請求項２２】
下記（ｃ）または（ｄ）のいずれかの、請求項２１に記載のAlicyclobacillus属細菌に特異的なDNA配列を標識するためのプローブ：
（ｃ）配列番号５に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ、
（ｄ）配列番号６に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ。
【請求項２３】
請求項１７に記載する（ａ）及び（ｂ）並びに請求項１８に記載する（ａ’）及び（ｂ’）からなる群より選択される少なくとも１つのプライマーセットと、請求項１９に記載する（ｃ）及び（ｄ）並びに請求項２０に記載する（ｃ’）及び（ｄ’）からなる群より選択される少なくとも１つのプローブを有する、Alicyclobacillus属細菌を特異的に検出するための試薬キット。
【請求項２４】
配列番号１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、配列番号３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの、Alicyclobacillus属細菌に特異的なDNA配列を増幅するためのＰＣＲにおけるプライマーとしての使用。
【請求項２５】
下記（ａ）または（ｂ）のいずれかのプライマーセットの、Alicyclobacillus属細菌に特異的なDNA配列を増幅するためのＰＣＲにおける使用：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるforwardプライマー、及び配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるreverseプライマーを有するプライマーセット、
（ｂ）配列番号３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるforwardプライマー、及び配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるreverseプライマーを有するプライマーセット。
【請求項２６】
下記（ｃ）または（ｄ）のいずれかのプローブの、Alicyclobacillus属細菌に特異的なDNA配列を標識するための使用：
（ｃ）配列番号５に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ、
（ｄ）配列番号６に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ。
【請求項２７】
配列番号１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるforwardプライマー、及び配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるreverseプライマーを有するプライマーセット、並びに、配列番号６に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ、或いは、
配列番号１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるforwardプライマー、及び配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるreverseプライマーを有するプライマーセット、並びに、配列番号５又は６に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ、
のAlicyclobacillus acidoterrestrisの特異的検出のための使用。
【請求項２８】
配列番号１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるforwardプライマー、及び配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるreverseプライマーを有するプライマーセット、並びに、配列番号６に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ、のバニリン資化性を有するAlicyclobacillus属細菌の特異的検出のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Alicyclobacillus属細菌、特に、Alicyclobacillus acidoterrestrisを特異的に検出するための方法に関する。さらに、本発明は、Alicyclobacillus属細菌、特に、Alicyclobacillus acidoterrestrisに特異的なDNA配列を増幅するためのプライマー及び当該DNA配列を特異的に標識するためのプローブ、並びに該プライマー及び該プローブの組み合わせに関する。
【背景技術】
【０００２】
Alicyclobacillus属細菌は、酸性および高温の条件下でよく生育し芽胞を形成するという特徴をもつ細菌である。Alicyclobacillus属細菌は、芽胞を形成することからBacillus属に分類されていたが、その特異な性質及び１６S rDNAの遺伝子配列から、１９９２年にBacillusとは独立した新しい属に分類されるものとして提案された。【０００３】
前述のように高温条件下で酸性を好むという特異な性質を持つことから、当初Alicyclobacillus属細菌は基礎的な研究材料として非常に注目されていた。しかし、１９８４年に西ドイツで起ったリンゴジュースの大規模な微生物汚染の原因がAlicyclobacillus acidoterrestris(A. acidoterrestris)であることが判明すると、当該細菌は、食品事故を引き起こす細菌として問題視されるようになった。その後、日本においてもA.acidoterrestrisによる酸性飲料の汚染事故（異臭）が報告されるようになった（非特許文献１）。【０００４】
従来、A.acidoterrestrisを検出するための方法として、ペルオキシダーゼ法（（社）日本果汁協会  耐熱性好酸性菌統一検査法  平成15年3月17日、および、特許文献１を参照のこと）と温度差法（（社）日本果汁協会  耐熱性好酸性菌統一検査法  平成15年3月17日を参照のこと）が採られてきた。【０００５】
ペルオキシダーゼ法は、A. acidoterrestrisがバニリン酸を資化してグアイアルコールを生産する能力を有することに基づく方法である。当該方法は、グアイアルコールを過酸化水素とペルオキシダーゼで処理することにより生成されたテトラグアイアルコールの吸光度を測定することによって判定を行う。しかしながら、この方法は、菌の活性に左右されるため、判定結果が偽陽性又は偽陰性になりやすいという欠点をもつ。【０００６】
温度差法は、A. acidoterrestrisと他の耐熱性好酸性菌の生育至適温度が異なることに基づく方法である。当該方法では、被験菌を異なる温度で同時に培養し、各培養温度でのコロニー形成の有無を観測することによって判定を行う。しかしながら、この方法は、結果が得られるまでに３〜４日の時間を必要とするという欠点を有する。【０００７】
また、細菌の汚染の有無を検出する方法として慣例的に用いられているのが、シークエンス法である。この方法では、被験菌のDNA（例えば、16S rDNA）の塩基配列を決定し、得られた配列をデータベースと照らし合わせ、それらの相同性から菌種を同定する（例えば、非特許文献２）。しかし、このような塩基配列を基にした菌種の同定法は、ほぼ間違いなく細菌の特定ができる一方で、結果が得られるまでに３〜４日の時間を必要とし、又操作が煩雑であり且つ高コストであるという問題をもつ。【０００８】
昨今、食品の安全性に対する消費者の意識が高まっている中で、食品事故を未然に防ぐための対策を講ずることが一層重要とされている。そこで、A. acidoterrestrisをはじめとする食品汚染の原因菌となり得るAlicyclobacillus属細菌を特異的に検出するためのより迅速且つ低コストな手段が強く求められている。
【特許文献１】特開2004-201668公報
【非特許文献１】後藤慶一  高温性好酸性芽胞形成細菌：Alicyclobacillus属細菌防菌防黴 Vol.28 No.8 499-508 (2000)
【非特許文献２】佐々木次雄、棚元憲一、平成13年度「日本薬局方の試験法に関する研究」研究報告−遺伝子解析による微生物の迅速同定法−  医薬品研究  33(12) 763-769(2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、Alicyclobacillus属細菌を他の細菌と区別して特異的に検出するための迅速且つ簡便な方法を提供することである。又、本発明は、かかる方法を好適に実施するために用いられるツールを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、Alicyclobacillus属細菌を特異的に検出するための新規な方法を開発すべく鋭意研究を行った。その結果、ある特定の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてPCRを実施することにより、Alicyclobacillus属細菌が特異的に有するDNA配列を増幅することができ、又、ある特定の配列を有するオリゴヌクレオチドをプローブとして用いることにより、得られた増幅DNA産物（PCR産物）を選択的に標識することができることを見出し、これにより、Alicyclobacillus属細菌を、大腸菌、枯草菌、黄色ブドウ球菌及びサルモネラ菌といった他の属に属する細菌と区別して特異的に検出することが出来ることを確認した。更に、本発明者らは、かかるプライマー及びプローブを用いることにより、Alicyclobacillus属細菌の中でも、特に食品事故を引き起こす細菌として問題視されている、A. acidoterrestrisを特異的に検出することが出来ることを確認した。本発明は、かかる知見に基づいて完成するに至ったものである。【００１１】
すなわち、本発明は、以下の態様を有する。
項１．
（１）被験試料について、配列番号１に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、または配列番号３に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号４に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いてPCRを行う工程、
（２）得られたPCR産物を、配列番号５または６に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブとハイブリダイズさせる工程、及び
（３）上記で得られたハイブリダイズ産物を検出する工程
を有する、Alicyclobacillus属細菌の特異的検出方法。
項２．
（１）被験試料について、配列番号１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、または配列番号３に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いてPCRを行う工程、
（２）得られたPCR産物を、配列番号５または６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブとハイブリダイズさせる工程、及び
（３）上記で得られたハイブリダイズ産物を検出する工程
を有する、項１に記載のAlicyclobacillus属細菌の特異的検出方法。
項３．
前記プローブが固相に固定化されている、項１に記載のAlicyclobacillus属細菌の特異的検出方法。
項４． 
上記（３）検出工程の前に、ハイブリダイズ産物を固相に固定化する工程
を有する、項１に記載のAlicyclobacillus属細菌の特異的検出方法。
項５．
Alicyclobacillus属細菌が、バニリン資化性を有する、項１に記載の方法。
項６．
Alicyclobacillus属細菌が、Alicyclobacillus acidoterrestrisである、項５に記載の方法。
項７．
（1'）被験試料について、配列番号１に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いてPCRを行う工程、
（2'）得られたPCR産物を、配列番号６に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブとハイブリダイズさせる工程、及び
（3'）上記で得られたハイブリダイズ産物を検出する工程
を有するか、または
（1''）被験試料について、配列番号３に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号４に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いてPCRを行う工程、
（2''）得られたPCR産物を、配列番号５または６に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブとハイブリダイズさせる工程、及び
（3''）上記で得られたハイブリダイズ産物を検出する工程
を有する、Alicyclobacillus acidoterrestrisの特異的検出方法。
項８．
（1'）被験試料について、配列番号１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いてPCRを行う工程、
（2'）得られたPCR産物を、配列番号６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブとハイブリダイズさせる工程、及び
（3'）上記で得られたハイブリダイズ産物を検出する工程
を有するか、または
（1''）被験試料について、配列番号３に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いてPCRを行う工程、
（2''）得られたPCR産物を、配列番号５または６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブとハイブリダイズさせる工程、及び
（3''）上記で得られたハイブリダイズ産物を検出する工程
を有する、項７に記載のAlicyclobacillus acidoterrestrisの特異的検出方法。
項９．
前記プローブが固相に固定化されている、項７に記載のAlicyclobacillus acidoterrestrisの特異的検出方法。
項１０．
上記（3'）または（3''）の検出工程の前に、ハイブリダイズ産物を固相に固定化する工程を有する、項７に記載のAlicyclobacillus acidoterrestrisの特異的検出方法。
項１１．
被験試料が飲食物、化粧品、ヘアケア化粧品、デンタルケア製品またはそれらの原料である、項７に記載のAlicyclobacillus acidoterrestrisの特異的検出方法。
項１２．
（1'''）被験試料について、配列番号１に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いてPCRを行う工程、
（2'''）得られたPCR産物を、配列番号５に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブとハイブリダイズさせる工程、及び
（3'''）上記で得られたハイブリダイズ産物を検出する工程
を有する、バニリン資化性を有するAlicyclobacillus属細菌の特異的検出方法。
項１３．
（1'''）被験試料について、配列番号１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いてPCRを行う工程、
（2'''）得られたPCR産物を、配列番号５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブとハイブリダイズさせる工程、及び
（3'''）上記で得られたハイブリダイズ産物を検出する工程
を有する、項１２に記載のバニリン資化性を有するAlicyclobacillus属細菌の特異的検出方法。
項１４．
前記プローブが固相に固定化されている、項１２に記載のバニリン資化性を有するAlicyclobacillus属細菌の特異的検出方法。
項１５．
上記（３ '''）の検出工程の前に、ハイブリダイズ産物を固相に固定化する工程を有する、項１２に記載のバニリン資化性を有するAlicyclobacillus属細菌の特異的検出方法。
項１６．
被験試料が飲食物、化粧品、ヘアケア化粧品、デンタルケア製品またはそれらの原料である、項１２に記載のバニリン資化性を有するAlicyclobacillus属細菌の特異的検出方法。
項１７．
配列番号１に示される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、配列番号２に示される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、配列番号３に示される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号４に示される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドからなる、Alicyclobacillus属細菌に特異的なDNA配列を増幅するためのプライマー。
項１８．
配列番号１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、配列番号３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドからなる、項１７に記載のAlicyclobacillus属細菌に特異的なDNA配列を増幅するためのプライマー。
項１９．
下記（ａ'）または（ｂ'）のいずれかの、Alicyclobacillus属細菌に特異的なDNA配列を増幅するためのプライマーセット：
（ａ'）配列番号１に示される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるforwardプライマー、及び配列番号２に示される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるreverseプライマーを有するプライマーセット、
（ｂ'）配列番号３に示される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるforwardプライマー、及び配列番号４に示される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるreverseプライマーを有するプライマーセット。
項２０．
下記（ａ）または（ｂ）のいずれかの、項１９に記載のAlicyclobacillus属細菌に特異的なDNA配列を増幅するためのプライマーセット：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるforwardプライマー、及び配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるreverseプライマーを有するプライマーセット、
（ｂ）配列番号３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるforwardプライマー、及び配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるreverseプライマーを有するプライマーセット。
項２１．
下記（ｃ'）または（ｄ'）のいずれかの、Alicyclobacillus属細菌に特異的なDNA配列を標識するためのプローブ：
（ｃ'）配列番号５に示される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ、
（ｄ'）配列番号６に示される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ。
項２２．
下記（ｃ）または（ｄ）のいずれかの、項２１に記載のAlicyclobacillus属細菌に特異的なDNA配列を標識するためのプローブ：
（ｃ）配列番号５に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ、
（ｄ）配列番号６に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ。
項２３．
項１７に記載する（ａ）及び（ｂ）並びに項１８に記載する（ａ’）及び（ｂ’）からなる群より選択される少なくとも１つのプライマーセットと、項１９に記載する（ｃ）及び（ｄ）並びに項２０に記載する（ｃ’）及び（ｄ’）からなる群より選択される少なくとも１つのプローブを有する、Alicyclobacillus属細菌を特異的に検出するための試薬キット。
項２４．
配列番号１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、配列番号３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの、Alicyclobacillus属細菌に特異的なDNA配列を増幅するためのＰＣＲにおけるプライマーとしての使用。
項２５．
下記（ａ）または（ｂ）のいずれかのプライマーセットの、Alicyclobacillus属細菌に特異的なDNA配列を増幅するためのＰＣＲにおける使用：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるforwardプライマー、及び配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるreverseプライマーを有するプライマーセット、
（ｂ）配列番号３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるforwardプライマー、及び配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるreverseプライマーを有するプライマーセット。
項２６．
下記（ｃ）または（ｄ）のいずれかのプローブの、Alicyclobacillus属細菌に特異的なDNA配列を標識するための使用：
（ｃ）配列番号５に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ、
（ｄ）配列番号６に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ。
項２７．
配列番号１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるforwardプライマー、及び配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるreverseプライマーを有するプライマーセット、並びに、配列番号６に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ、或いは、
配列番号１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるforwardプライマー、及び配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるreverseプライマーを有するプライマーセット、並びに、配列番号５又は６に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ、
のAlicyclobacillus acidoterrestrisの特異的検出のための使用。
項２８．
配列番号１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるforwardプライマー、及び配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるreverseプライマーを有するプライマーセット、並びに、配列番号６に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ、のバニリン資化性を有するAlicyclobacillus属細菌の特異的検出のための使用。【００１２】
以下、本発明をより詳細に説明する。【００１３】
本発明は、被験試料を対象として、Alicyclobacillus属に属する細菌（本書において、単に、Alicyclobacillus属細菌ともいう）を特異的に検出する方法を提供する。当該本発明の方法は、基本的に、（１）PCR（Polymerase Chain Reaction）を利用してAlicyclobacillus属細菌が特有に保有するDNA配列を増幅するための工程（PCR工程）、（２）当該PCR工程によって増幅されたAlicyclobacillus属細菌特有のDNA配列（PCR産物）を、プローブとハイブリダイズする工程（ハイブリダイゼーション工程）、及び（３）当該ハイブリダイゼーション工程で得られたハイブリダイズ産物（PCR産物-プローブ）を検出する工程（検出工程）を有する。【００１４】
（１）PCR工程
PCR工程は、基本的に少なくとも(I)変性、(II)アニーリング、及び(III)伸長の３つのステップを繰り返し実施することによって行なわれる。本発明の方法で用いられるPCR工程は、上記(II)アニーリングのステップにおいて、配列番号１に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーと配列番号２に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー、または配列番号３に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーと配列番号４に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーをそれぞれプライマーセットとして、さらに好ましくは、配列番号１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーと配列番号２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー、または配列番号３に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーと配列番号４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーをそれぞれプライマーセットとして用いることを特徴とする。【００１５】
なお、これらのプライマーは5'末端が標識されているオリゴヌクレオチドであってもよい。プライマーとしてかかる5'末端が標識されているオリゴヌクレオチドを用いると、5'末端が標識された態様でPCR産物を取得することができる。5'末端の標識には、制限はされないが、例えば、ジゴキシゲニン（DIG）、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、酵素（西洋わさびパーオキシダーゼ（HRP）、アルカリフォスファターゼ（AP）等）、放射性同位体（32P、131I、35S、45Ca、3H、14C等）、蛍光色素（例えば、CyDye、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）等）等の当該分野で使用される標識剤を同様に使用することができる。好ましくは、ジゴキシゲニン、ビオチンである。【００１６】
最も好適なプライマーセットとしては、下記(A)または(B)に示す、forwardプライマーとreverseプライマーからなるプライマーセットを挙げることができる。またこれらのforwardプライマー及びreverseプライマーも、上記と同様に、各々5'末端が標識されているオリゴヌクレオチドであってもよい。
(A)プライマーセット
forwardプライマー：cacgtgggcaatctgccttt（配列番号１）
reverseプライマー：gagccgttacctcaccaact（配列番号２）
(B)プライマーセット
forwardプライマー：cagactggaataacactcgg（配列番号３）
reverseプライマー：ctacgcatcgtcgccttggt（配列番号４）
これらの各プライマーは、常法（例えば、ホルムアミド法（Beaucage and Carruthers,
Tetra. Letts. 22:1859-1862, 1981）又はトリエステル法（Matteucci and Caruthers,J. Amer. Chem. Soc., 103, 3185, 1981））により合成することができる。簡便には、自動合成装置を用いて合成したり、受託業者から合成品を入手することもできる。【００１７】
ここで、PCRを行う被験試料は、Alicyclobacillus属細菌を含み得るものであればよく、特に制限されない。なお、「含み得る」とはAlicyclobacillus属細菌を含む可能性のあるものであればよく、実際にAlicyclobacillus属細菌を含んでいる必要はない。かかる被験試料としては、特に制限されないが、飲食物、化粧品、ヘアケア化粧品、デンタルケア製品またはそれらの原料等といったAlicyclobacillus属細菌を含むことによって商品価値や安全性が損なわれる製品である。特に好ましくは飲食物である。【００１８】
なお、かかる被験試料は、PCR工程に供される前に、必要に応じて、DNA抽出、溶菌、インキュベーション、静置培養、振とう培養、濃縮、希釈、均質化等の操作を行ってもよい。【００１９】
PCR工程において、(I)変性は、二重鎖のDNAを一本鎖DNAに解離させるステップである。その限りにおいて制限されないが、通常92〜96℃、好ましくは94℃前後で0.5〜1分、好ましくは0.5分程度処理することによって実施することができる。次いで行われる(II)アニーリングは、変性によって解離した一本鎖DNAに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを結合させて二本鎖を形成する反応である。かかる(II)アニーリングは、前述するプライマーセット、最も好ましくは上記 (A)または(B)のプライマーセットのforwardプライマー及びreverseプライマーの存在下で行われる。制限はされないが、当該(II)アニーリングステップは通常50〜68℃、好ましくは60℃前後で0.5〜1分、好ましくは0.5分程度処理することによって実施することができる。この際、上記(I)変性ステップで形成された一本鎖DNA上に、上記使用のプライマーの塩基配列と相補的な塩基配列がある場合に、当該プライマーは、その一本鎖DNAの相補的な塩基配列部位に結合する。次いで行われる(III)伸長ステップは、上記一本鎖DNAに結合したプライマーを起点として、当該一本鎖DNAを鋳型に、塩基配列を伸長していくステップである。かかるステップはDNAポリメラーゼと四種類の塩基〔デオキシヌクレオシド三リン酸（dNTP mixture）:dATP、dCTP、dGTP及びdTTP〕の存在下で行われる。特に制限されないが、当該(III)伸長ステップは、通常70〜74℃、好ましくは72℃前後で0.5〜2分間、好ましくは1分程度処理することによって実施することができる。【００２０】
なお、通常上記のステップ(I)〜(III)を含むPCR工程は、少なくとも、鋳型DNAとなり得るDNAを含む被験試料、PCRバッファー、プライマーセット、dNTP mixture、及びDNAポリメラーゼを含む一反応液中で、温度の上下（例えば、94℃前後→55℃前後→72℃前後→94℃前後）等のサイクルを繰り返すことによって実施することができ、斯くしてDNA合成の連鎖反応が起こり、当該反応液内で、被験試料に含まれるDNAを鋳型としてforwardプライマー及びreverseプライマーの間に挟まれた特定の塩基配列を有するDNAを増幅することが可能となる。なお、上記PCRのサイクル数は、特に制限されないが、通常20〜40回、好ましくは25〜35回を挙げることができる。【００２１】
なお、上記反応においてDNAポリメラーゼは、PCRで一般に使用されるDNAポリメラーゼを広く使用することができるが、市販の耐熱性ポリメラーゼ、例えば、Taq(Promega社製)、KOD(TOYOBO社製) 、Pfu(Promega社製) 、Vent(NEB社製)等を好適に用いることができる。【００２２】
また、PCR産物を標識された形態で取得する場合には、前述するようにプライマーとして5'末端が標識されてなるオリゴヌクレオチドを使用してもよいが、それ以外に、上記反応で使用するdNTP mixture（デオキシヌクレオシド三リン酸の混合物）として、dATP（5'-デオキシアデノシン5'-三リン酸）、dCTP（5'-デオキシシチジン5'-三リン酸）、dGTP（5'-デオキシグアノシン5'-三リン酸）及びdTTP（5'-デオキシチミジン5'-三リン酸）に加えて、例えばジゴキシゲニン（DIG）やビオチン（Biotin）で標識してなるDIG-11-dUTP（5'-デオキシウリジン5'-三リン酸）やBiotin-16-dUTP等のように、任意の標識剤で標識されてなるdUTPを含むものを使用することもできる。またdNTP mixture としてdATP、dCTP、dGTP及びdTTPのいずれか少なくとも１つが放射性同位体（RI）、化学発光剤、または蛍光色素などの任意の標識剤で標識されてなるものを使用することもできる。【００２３】
PCRバッファーは、使用するDNAポリメラーゼの種類等に応じて、適宜調製することができる。簡便には市販品を用いることもできる。【００２４】
また上述するPCRの反応条件（反応温度、反応時間、反応サイクル等）は一例であって、使用するDNAポリメラーゼの種類、目的PCR産物の大きさ、各プライマーのTm値などに応じて、適宜設定し調整することが可能である。【００２５】
なお、PCR反応の温度制御は、簡便には、市販のサーマルサイクラー（例えば、iCycler Thermal Cycler(Bio-Rad Laboratory社製) 、TaKaRa PCR Thermal Cycler(TaKaRa社製)等を用いて行うことができる。【００２６】
（２）ハイブリダーゼーション工程
本発明でいうハイブリダーゼーション工程は、上記PCR工程によって増幅されたDNA配列（PCR産物）を、当該DNA配列を特異的に認識するオリゴヌクレオチドプローブ（ハイブリダーゼーションプローブ）とハイブリダイズさせる工程である。【００２７】
ここでプローブとして用いられるオリゴヌクレオチドとしては、配列番号５に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号６に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、より好ましくは、配列番号５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができる。最も好適なプローブとしては、下記(C)または(D)に示すオリゴヌクレオチドからなるプローブを挙げることができる：
(C) プローブ：gtgctaatgccggataatacacggg（配列番号５）
(D) プローブ：acttgtgttgaaagatgcaac（配列番号６）。【００２８】
なお、これらのプローブは、適当な標識剤で標識されていてもよい。ここで標識剤としては、前述するようにジゴキシゲニン（DIG）、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、酵素（西洋わさびパーオキシダーゼ（HRP）、アルカリフォスファターゼ（AP）等）、放射性同位体（32P、131I、35S、45Ca、3H、14C等）、蛍光色素（例えば、CyDye、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）等）等の当該分野で一般的に使用される標識剤を広く挙げることができる。【００２９】
プローブは前述するプライマーセットとの特定の組み合わせで使用されることが好ましい。Alicyclobacillus属細菌を他の属に属する細菌から区別して特異的に検出する方法において、上記のプローブはいずれも、前述するプライマーセット、最も好ましくは上記 (A)または(B)のプライマーセットを用いたPCR工程で得られるPCR産物とのハイブリダイゼーションに好適に使用することができる。【００３０】
ここでAlicyclobacillus属以外の細菌としては、大腸菌、枯草菌、黄色ブドウ球菌、サルモネラ菌等を挙げることができる。またAlicyclobacillus属細菌としては、好適にはAlicyclobacillus acidoterrestris（A. acidoterrestris）を挙げることができる。当該A. acidoterrestrisは、バニリン資化性を有し、しかも高温条件で酸性を好むという性質をもつことから、特に食品分野では、従来より酸性飲料の汚染（悪臭）の原因菌として問題とされている細菌である。また、A. acidoterrestrisはそのバニリン資化性に基づいて悪臭を発生しえる菌であることから、飲食物だけでなく、化粧品、ヘアケア製品、デンタルケア製品、香料などの、香りが重要とされる製品においても、当該A. acidoterrestrisのコンタミネーションは問題となる。【００３１】
Alicyclobacillus属細菌の中でも特にA. acidoterrestrisを特異的に検出するためには、配列番号１に示される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、より好ましくは配列番号１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、最も好ましくは上記（A）のプライマーセットを用いたPCR工程で得られるPCR産物に対して、配列番号６に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ、より好ましくは配列番号６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ、最も好ましくは上記（D）のプローブを用いることが好適であり、また、配列番号３に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号４に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、より好ましくは配列番号３に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、最も好ましくは上記（B）のプライマーセットを用いたPCR工程で得られるPCR産物に対して、配列番号５または６に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ、より好ましくは配列番号５または６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ、最も好ましくは上記（C）または（D）のプローブを用いることが好適である。【００３２】
また、Alicyclobacillus属細菌の中で、バニリン資化性を有し悪臭の原因となり得るA. acidoterrestris、A. hesperidumおよびA. hesperidensisを、Alicyclobacillus属以外の細菌やバニリン資化性のないAlicyclobacillus属細菌と区別して特異的に検出するためには、配列番号１に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２に示す塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、より好ましくは配列番号１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、最も好ましくは上記（A）のプライマーセットを用いたPCR工程で得られるPCR産物に対して、配列番号５に示される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ、より好ましくは配列番号５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ、最も好ましくは上記（C）のプローブを用いるのが好適である。【００３３】
（３）検出工程
当該検出工程は、上記ハイブリダーゼーション工程によって得られたハイブリダイズ産物（PCR産物-プローブ）を検出する工程である。当該検出は、例えば、(1)PCR工程において、5'末端を標識したプライマー若しくは標識核酸を含むdNTP mixtureを用いることによって、標識PCR産物を得ている場合には、当該PCR産物（標識PCR産物-プローブ）の標識を指標として、また(2)ハイブリダーゼーション工程において、ハイブリダイゼーションプローブとして標識プローブを用いることによって、標識ハイブリダイズ産物（PCR産物-標識プローブ）を得ている場合には、当該プローブの標識を指標として行うことができる。当該検出のために使用される標識剤としては、ジゴキシゲニン（DIG）、放射性同位体（32P、131I、35S、45Ca、3H、14C等）、蛍光色素（例えば、CyDye、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）等）を用いることが好ましい。かかる標識剤の検出は、使用する標識剤に応じて慣例的な方法により行うことができる。例えば、ハイブリダイズ産物がジゴキシゲニン（DIG）で標識されている場合には、当該標識ハイブリダイズ産物をアルカリフォスファターゼ（AP）やパーオキシダーゼ（POD）などの酵素で標識した抗ジゴキシゲニン抗体と反応させ、次いで当該酵素の基質（APの場合は、Nitroblue tetrazolium chloride及び5-blomo-4-chloro-3-indolyl phosphate：PODの場合は、TMBまたは2,2'-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸（ABTS）)と反応させて発色を検出する方法を；ハイブリダイズ産物が蛍光色素で標識されている場合は当該標識ハイブリダイズ産物の蛍光強度を検出する方法を；ハイブリダイズ産物が放射性同位体で標識されている場合は、当該標識ハイブリダイズ産物の放射能の有無をオートラジオグラフィーを用いて検出する方法を挙げることができる。【００３４】
（４）固定化工程
なお、本発明の方法は、上記（２）ハイブリダイゼーション工程に先だって、プローブを任意の固相に固定化する固定化工程、または上記（３）検出工程に先だって、（２）ハイブリダイゼーション工程で得られたハイブリダイズ産物を任意の固相に固定化する固定化工程を有することもできる。【００３５】
当該プローブ又はハイブリダイズ産物の固相への固定化は、制限はされないが、好ましくはビオチンとアビジン（またはストレプトアビジン）との結合反応を利用して行うことができる。具体的には、ビオチンで標識したプローブを、或いはビオチンで標識したPCR産物を用いて調製されたハイブリダイズ産物（ビオチン標識PCR産物-プローブ）またはビオチンで標識したプローブを用いて調製されたハイブリダイズ産物（PCR産物-ビオチン標識プローブ）を、予めアビジン（またはストレプトアビジン）を結合させておいた固相と反応させることによって、ビオチンとアビジン（またはストレプトアビジン）との結合を介して、固相に固定化することができる。プローブを固定化する場合、当該プローブにハイブリダイズさせるPCR産物は、前述する検出のために好適に用いられる標識剤で標識されていることが好ましい。ハイブリダイズ産物を固定化する場合、ハイブリダイズ産物のビオチンで標識されていない側（すなわちPCR産物がビオチンで標識されている場合はプローブ、プローブがビオチンで標識されている場合はPCR産物）は、前述する検出のために好適に用いられる標識剤で標識されていることが好ましい。斯くして、固相に固定化させた特定のハイブリダイズ産物を特異的に検出することが可能となる。【００３６】
すなわち、本発明のAlicyclobacillus属細菌、特にA. acidoterrestrisを特異的に検出する方法は、好適にはPCR ELISAの原理を利用して行うことができる。PCR ELISAとは、PCRにより増幅された産物の有無をELISAにより検出する方法である。PCR ELISAでは、予めPCR産物及びプローブをそれぞれ別の標識剤で標識しておく。次いで、プローブとPCR産物をハイブリダイズさせてハイブリダイズ産物を形成させ、当該ハイブリダイズ産物のPCR産物またはプローブのいずれかの標識剤を介して固相に固定化する。その後、固相に固定化されなかった物質を取り除き、次いで、ハイブリダイズ産物の標識剤（固定化に使用しない別の標識剤）を任意の検出用物質（例えば、抗体など）で検出する。なお、かかる説明は、本発明の1つの実施形態として使用するPCR ELISA法の原理についてより容易に理解するための単なる説明であり、この方法に限定されるものではない。PCR ELISA法の詳細な手順については、Roche Molecular Biochemicals PCR Applications Manual 2nd edition 等を参照することができる。【００３７】
なお、上記固定化に使用される固相としては、特に制限されることなく、当該分野で使用されるシャーレやプレート（マイクロプレートを含む）、ストリップ、ビーズ等を広く用いることができる。【００３８】
本発明は、また上記Alicyclobacillus属細菌、特にA. acidoterrestrisを特異的に検出する方法に利用されるプライマー（プライマーセット）及びプローブを提供する。これらのプライマー（プライマーセット）及びプローブについては、前述の通りである。【００３９】
本発明は、本発明のAlicyclobacillus属細菌、特にA. acidoterrestrisを特異的に検出する方法を簡便に実施するために好適に利用される試薬キットを提供する。当該試薬キットは、キットの構成成分として、少なくとも上記プライマー（プライマーセット）及びプローブを含むことを特徴とするが、他の成分として、例えばPCRバッファー、DNAポリメラーゼ、DIG-11-dUTPやBiotin-16-dUTPを含んでいてもよいdNTP mixture、滅菌水、固相（マイクロプレートなど）等を１種または２種以上組み合わせて含むものであってもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
以下に本発明の実施例を示すが、かかる実施例は本発明をより容易に理解するための単なる例示であって、本発明を限定することを意図しない。
【実施例１】
【００４１】
１．微生物からのDNA溶液の調製
単離したAlicyclobacillus acidoterrestris、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）及びサルモネラ菌（Salmonella enteritidis）を白金耳で釣菌し、PrepManTMUltra(Applied Biosystems)200μＬに懸濁した。この懸濁液を１００℃で１０分間加熱することにより、細胞を溶菌した。３０００ｒｐｍで５分間遠心した後、上清を回収し、DNA溶液とした。
２．PCR ELISA法
PCR ELISA法には、以下の表１に示す組み合わせのforwardプライマー、reverseプライマー及びプローブを用いた。このプローブは、３’末端をビオチン標識して用いた。３’末端のビオチン標識は、市販のキットBiotin-16-2',3'-dideoxy-uridine-5'-triphosphate（Roche社）を用いて行った。また、標識方法については、Schmitz, G.G. et al. (1990) Anal. Biochem. 192, 222.を参照のこと。なお、プライマー名のＦ及びＲは、それぞれforward（順方向）及びreverse（逆方向）を意味する。また、プローブ名のＰは、probe（プローブ）を意味する。【００４２】
【表１】
2005118804.tif 000002
【００４３】
２−１．PCR
先ず、上記の表１に示すＮｏ．１〜Ｎｏ．４のforwardプライマー及びreverseプライマーのセットを用いて、PCRを行った。ジゴキシゲニン（DIG）標識には、dATP、dCTP、dGTP、dTTP及びDIG-11-dUTPを含む試薬を備える市販のキットPCR ELISA (DIG-Labeling)（Roche社製）を用いた。このPCR ELISA (DIG-Labeling)を用いてPCRを行うことにより、増幅産物中にDIG-11-dUTPが取り込まれ、DIG標識された増幅産物が得られる。【００４４】
PCRの反応溶液を、以下の組成になるように調製した。
2005118804.tif 000003
PCRの反応条件は、以下の表２に示す通りである。【００４５】
【表２】
2005118804.tif 000004
【００４６】
２−２．ELISA(DIGの検出)
DIG標識されたPCR産物の検出のために、市販のキットPCR ELISA (DIG Detection) (Roche社製)を用いて、以下の操作を行った。【００４７】
先ず、DIG標識されたPCR産物を変性させて１本鎖にした後、３’末端をビオチン標識したプローブと混合し、５０℃にて９０分間振とうした。この反応液をストレプトアビジン固相化マイクロプレート（Roche社製）に加え、５０℃で９０分間振とうを行った。キット付属の洗浄液で5回洗浄を行った。次いで、ペルオキシダーゼ（POD）（Roche社製）で標識された抗DIG抗体（Roche社製）を加え、次いで、37℃で30分間振とうした。その後、キット付属の洗浄液で5回洗浄を行った。PODの基質である2,2'-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸（ABTSTM）を添加し（ここでは、キット付属のABTSTM1錠を5 mlの基質バッファーに溶解したものを使用した）、３７℃で３０分間振とうを行った。得られたサンプルについて、主波長４９２ｎｍ及び副波長６２０ｎｍにて、吸光度を測定した。吸光度が１．０以上である場合＋＋、１．０〜０．２である場合＋、０．２以下である場合−として判定を行った。
３．PCR ELISAの結果
結果を以下の表３に示す。【００４８】
【表３】
2005118804.tif 000005
【００４９】
表３に示されるように、Ｎｏ．１〜Ｎｏ．４の全ての組み合わせにおいて、A.acidoterrestrisが検出されたが、大腸菌、枯草菌、黄色ブドウ球菌及びサルモネラ菌は検出されなかった。
４．考察
Ｎｏ．１〜Ｎｏ．４の全ての組み合わせにおいて、A.acidoterrestrisを他の属の細菌から区別して特異的に検出することができた。中でも、Ｎｏ．１及び２のプライマー及びプローブの組み合わせについては、A.acidoterrestrisと他の属の細菌との判定結果の差が大きく、非常に特異的にA.acidoterrestrisを検出することができることが分かる。
【実施例２】
【００５０】
１．DNA溶液の調製
Alicyclobacillus属に属する4種類の細菌であるA.acidoterrestris、A.acidocaldarius、A.hesperidensis及びA.hesperidumを用いて、実施例１と同様の手順に従って、DNA溶液を調製した。
２．PCR ELISA法
実施例１と同様に、PCR ELISA法を行った。プライマー及びプローブについては、前記表１のＮｏ．１〜Ｎｏ．４に示す組み合わせのforwardプライマー、reverseプライマー及びプローブを用いた。【００５１】
３．PCR ELISAの結果
結果を以下の表４に示す。【００５２】
【表４】
2005118804.tif 000006
【００５３】
表４に示されるように、Ｎｏ．２〜４のプライマー及びプローブの組み合わせにおいては、A.acidoterrestrisのみが検出され、他のAlicyclobacillus属細菌は検出されなかった。Ｎｏ．１の組み合わせにおいては、A.acidoterrestrisに加え、A.hesperidum及びA.hesperidensisも検出され、A.acidocaldariusについては検出されなかった。
４．考察
Ｎｏ．１〜Ｎｏ．４の全ての組み合わせにおいて、バニリン資化性を有し汚染の原因菌として多数報告されているA.acidoterrestrisが検出され、バニリン資化性を有さず汚染の原因菌としても報告されていないA.acidocaldariusについては検出されなかった。【００５４】
特に、Ｎｏ．２〜４のプライマー及びプローブの組み合わせでは、A.acidoterrestrisを他の全てのAlicyclobacillus属細菌から区別して特異的に検出した。それゆえ、Ｎｏ．２〜４の組み合わせは、A.acidoterrestrisのみを特異的に検出する組み合わせとして有用である。【００５５】
一方、Ｎｏ．１プライマー及びプローブの組み合わせは、A.acidoterrestrisと比べて低レベルではあるが、バニリン資化性を有し汚染の原因菌となり得るA.hesperidum及びA.hesperidumの近縁種であるA.hesperidensisをも検出する。それゆえ、Ｎｏ．１の組み合わせは、バニリン資化性を有し異臭を引き起こし得る種類のAlicyclobacillus属細菌を包括的に検出する場合に有用である。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明は、迅速、簡便、且つ低コストなAlicyclobacillus属細菌の特異的検出方法を提供する。【００５７】
本発明では、Alicyclobacillus属細菌に特異的なDNA配列を増幅するプライマー及び当該DNA配列を特異的に標識するプローブを用いるため、Alicyclobacillus属細菌に特異的なDNA配列に基づいて、該細菌を他の属の細菌から区別して特異的に検出することが可能である。それゆえ、本発明を用いれば、菌の活性に影響されることなく、Alicyclobacillus属細菌を検出することができる。【００５８】
本発明の方法は、PCRを利用する方法であるため、被験試料中のAlicyclobacillus属細菌が少量であっても検出することができ、検出感度が高い。【００５９】
また、本発明のプライマー及びプローブの組み合わせによっては、バニリン資化性を有するAlicyclobacillus属細菌を包括的に検出したり、Alicyclobacillus acidoterrestrisのみを特異的（又は、選択的）に検出したりすることができる。【００６０】
本発明の方法は、菌の培養やDNA配列決定といった時間のかかる操作を必要としないので、迅速にAlicyclobacillus属細菌を検出することができる。また、本発明の方法は、配列決定のための高価な試薬や機器を必要としないので、低コストで行うことが可能である。
【配列表】
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【国際調査報告】
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