(57)【要約】抗ヒトＭｐｌ抗体を作製し、その中で結合活性が高かった３種類の抗体について、遺伝子工学的手法により一本鎖抗体の発現系を構築した。ＴＰＯ依存性増殖を示すＢａＦ３−ｈｕｍａｎ  Ｍｐｌを用いて、抗ヒトＭｐｌ抗体および抗ヒトＭｐｌ一本鎖抗体のＴＰＯ様アゴニスト活性の評価を行なったところ、抗ヒトＭｐｌ抗体はアゴニスト活性を示さなかったのに対し、抗ヒトＭｐｌ一本鎖抗体ではアゴニスト活性を示すことが分かった。  このことは、アゴニスト活性を有する改変抗体のスクリーニングにおいて、抗原結合活性を有する抗体を改変した後に、アゴニスト活性を測定することが有効であることを示している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、アゴニスト抗体のスクリーニング方法。
（ａ）被験抗体の結合活性を測定し、結合活性を有する抗体を選択する工程、
（ｂ）（ａ）で選択された抗体を改変する工程、
（ｃ）（ｂ）の改変抗体のアゴニスト活性を測定し、アゴニスト活性を有する改変抗体を選択する工程
【請求項２】
改変抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
低分子化抗体がｓｃ（Ｆｖ）２であることを特徴とする、請求項２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
被験抗体を改変する前に、アゴニスト活性を測定しないことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
抗体が細胞膜上に発現するタンパク質に対する抗体であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法により得られた抗体。
【請求項７】
以下の工程を含む、アゴニスト活性を有する抗体の製造方法。
（ａ）抗体の結合活性を測定し、結合活性を有する抗体を選択する工程、
（ｂ）（ａ）で選択された抗体を改変する工程、
（ｃ）（ｂ）の改変抗体のアゴニスト活性を測定し、アゴニスト活性を有する抗体を選択する工程、
（ｄ）（ｃ）で選択された抗体をコードするＤＮＡを含むベクターを宿主細胞に導入する工程、
（ｅ）（ｄ）の宿主細胞を培養する工程
【請求項８】
改変抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
低分子化抗体がｓｃ（Ｆｖ）２であることを特徴とする、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
抗体を改変する前に、アゴニスト活性を測定しないことを特徴とする、請求項７〜９のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１１】
抗体が細胞膜上に発現するタンパク質に対する抗体であることを特徴とする、請求項７〜１０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１２】
以下の工程を含むアゴニスト抗体のスクリーニング方法であって、（ａ）の工程の前に被験抗体のアゴニスト活性を測定しないことを特徴とする方法。
（ａ）被験抗体を改変する工程、
（ｂ）（ａ）の改変抗体のアゴニスト活性を測定し、アゴニスト活性を有する改変抗体を選択する工程
【請求項１３】
改変抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、請求項１２に記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
低分子化抗体がｓｃ（Ｆｖ）２であることを特徴とする、請求項１３に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、アゴニスト活性を有する改変抗体のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  抗体は血中での安定性が高く、抗原性も少ないことから医薬品として注目されている。その中でも、受容体などの細胞表面に発現するタンパク質を認識し、特異的反応を細胞に生じさせることが可能なアゴニスト抗体は医薬品として有用であると考えられている。エリスロポエチン受容体に対するアゴニスト抗体（非特許文献１参照）、トロンボポエチン受容体に対するアゴニスト抗体やＣＤ４７に対するアゴニスト抗体（特許文献１および２参照）など、既に幾つかのアゴニスト抗体が報告されている。【０００３】  又、近年、ヒトに対する抗原性、血中半減期、製造における簡便性、などの観点からアミノ酸配列の置換など、何らかの改変が行われた改変抗体が医薬品として開発されている。例えば、低分子化抗体や、ヒト化・キメラ化抗体など、改変抗体は医薬品として優れた性質を有していると考えられている。
以上のようにアゴニスト活性を有する改変抗体は疾患の治療・診断などに非常に有用であると考えられており、そのような抗体を取得する為の効率的なスクリーニング方法が望まれている。【０００４】  従来のアゴニスト活性を有する改変抗体のスクリーニングは、通常、（１）抗体作製、（２）作製された抗体の結合活性及びアゴニスト活性の測定、（３）結合活性及びアゴニスト活性を有する抗体の選択、（４）抗体の改変、（５）改変抗体の結合活性及びアゴニスト活性の測定、（６）結合活性及びアゴニスト活性を有する抗体の選択、という流れで行われており、抗体を改変する前の段階でアゴニスト活性がない又は低い抗体は、その段階で除外されてしまい、改変されることはなかった。
従って、改変前の段階ではアゴニスト活性を有していないが、潜在的にアゴニスト活性を有する抗体を、従来のスクリーニング方法で見出すことは不可能であった。【０００５】
【特許文献１】国際公開第０２／３３０７２号
【特許文献２】国際公開第０２／３３０７３号
【非特許文献１】Ｅｌｌｉｏｔｔ  Ｓら著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６年、Ｖｏｌ．２７１（４０）、ｐ．２４６９１−２４６９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  本発明はこのような状況に鑑みて為されたものであり、その目的は、アゴニスト活性を有する改変抗体のスクリーニング方法を提供することにある。より具体的には、抗原結合活性を指標にスクリーニングした抗体を改変した後に、アゴニスト活性を測定することを特徴とするスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行なった。詳しくは抗ヒトＭｐｌ抗体を作製し、その中で結合活性が高かった抗体について、遺伝子工学的手法により一本鎖抗体の発現系を構築した。ＴＰＯ依存性増殖を示すＢａＦ３−ｈｕｍａｎ  Ｍｐｌを用いて、全長抗ヒトＭｐｌ抗体および低分子化抗ヒトＭｐｌ一本鎖抗体のＴＰＯ様アゴニスト活性の評価を行なったところ、全長抗ヒトＭｐｌ抗体はアゴニスト活性を示さなかったのに対し、低分子化抗ヒトＭｐｌ一本鎖抗体ではアゴニスト活性を示していた。【０００８】  本発明者らは、抗体の改変前と改変後ではアゴニスト活性に差があり、改変前にアゴニスト活性を有していない抗体でも、抗体に低分子化などの改変をすることによりアゴニスト活性を有するようになることに着目し、アゴニスト活性を有する改変抗体のスクリーニングにおいて、抗原結合活性を有する抗体を改変した後に、アゴニスト活性を測定することで、従来のスクリーニングでは選択が不可能であった抗体も選択することが可能であることを見出した。【０００９】  つまり、抗体を改変する前にアゴニスト活性を測定し、その時点でアゴニスト活性がない抗体を除外するという従来のスクリーニング方法では、改変前にはアゴニスト活性を有していないが改変によりアゴニスト活性を有するようになる抗体を見出すことは不可能であったのに対し、抗体の改変前にはアゴニスト活性を指標として抗体を除外しないスクリーニング方法であれば、従来の方法では見落とされてしまう抗体を見出すことが可能となる。【００１０】  すなわち本発明はアゴニスト抗体のスクリーニング方法に関し、より具体的には、
〔１〕以下の工程を含む、アゴニスト抗体のスクリーニング方法、
（ａ）被験抗体の結合活性を測定し、結合活性を有する抗体を選択する工程、
（ｂ）（ａ）で選択された抗体を改変する工程、
（ｃ）（ｂ）の改変抗体のアゴニスト活性を測定し、アゴニスト活性を有する改変抗体を選択する工程
〔２〕改変抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、〔１〕に記載のスクリーニング方法、
〔３〕低分子化抗体がｓｃ（Ｆｖ）２であることを特徴とする、〔２〕に記載のスクリーニング方法、
〔４〕被験抗体を改変する前に、アゴニスト活性を測定しないことを特徴とする、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のスクリーニング方法、
〔５〕抗体が細胞膜上に発現するタンパク質に対する抗体であることを特徴とする、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のスクリーニング方法、
〔６〕〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法により得られた抗体、
〔７〕以下の工程を含む、アゴニスト活性を有する抗体の製造方法、
（ａ）抗体の結合活性を測定し、結合活性を有する抗体を選択する工程、
（ｂ）（ａ）で選択された抗体を改変する工程、
（ｃ）（ｂ）の改変抗体のアゴニスト活性を測定し、アゴニスト活性を有する抗体を選択する工程、
（ｄ）（ｃ）で選択された抗体をコードするＤＮＡを含むベクターを宿主細胞に導入する工程、
（ｅ）（ｄ）の宿主細胞を培養する工程
〔８〕改変抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、〔７〕に記載の製造方法、
〔９〕低分子化抗体がｓｃ（Ｆｖ）２であることを特徴とする、〔８〕に記載の製造方法、
〔１０〕抗体を改変する前に、アゴニスト活性を測定しないことを特徴とする、〔７〕〜〔９〕のいずれかに記載の製造方法、
〔１１〕抗体が細胞膜上に発現するタンパク質に対する抗体であることを特徴とする、〔７〕〜〔１０〕のいずれかに記載の製造方法、
〔１２〕以下の工程を含むアゴニスト抗体のスクリーニング方法であって、（ａ）の工程の前に被験抗体のアゴニスト活性を測定しないことを特徴とする方法、
（ａ）被験抗体を改変する工程、
（ｂ）（ａ）の改変抗体のアゴニスト活性を測定し、アゴニスト活性を有する改変抗体を選択する工程
〔１３〕改変抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、〔１２〕に記載のスクリーニング方法、
〔１４〕低分子化抗体がｓｃ（Ｆｖ）２であることを特徴とする、〔１３〕に記載のスクリーニング方法、に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】一本鎖抗体ｓｃ（Ｆｖ）２の作製過程を示す図である。
【図２】Ｍｐｌ発現ＣＨＯ細胞株を用いたＶＡ１３０  ｓｃ（Ｆｖ）２の結合活性評価の結果を示すグラフである。ＶＡ１３０  ｓｃ（Ｆｖ）２精製品を使用した。
【図３】ＢａＦ３−ｈｕｍａｎ  Ｍｐｌを用いたＶＡ１３０抗体のアゴニスト活性評価の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】  本発明は、アゴニスト活性を有する改変抗体のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、抗原結合活性を指標にスクリーニングした抗体を改変した後に、該改変抗体のアゴニスト活性を測定し、アゴニスト活性を有する改変抗体を選択することを特徴とする。【００１３】  本発明の方法は、まず、被験抗体の抗原結合活性を測定し、抗原結合活性を有する抗体を選択する。次いで、選択された抗体を改変する。次いで、該改変抗体のアゴニスト活性を測定し、アゴニスト活性を有する改変抗体を選択する。【００１４】  本発明において、抗体の改変とは、抗体のアミノ酸配列、分子量、立体構造などを変化させることをいう。抗体の改変の具体例としては、例えば、低分子化、キメラ化・ヒト化、修飾、糖鎖の置換・付加・欠失などを挙げることができる。抗体の改変は、複数の改変が行われていてもよいし、単一の改変が行われてもよい。【００１５】  本発明においては好ましい改変は、抗体の低分子化である。低分子化の好ましい態様としては、Ｄｉａｂｏｄｙ化又はｓｃ（Ｆｖ）２化であり、特に好ましくはｓｃ（Ｆｖ）２化である。【００１６】  低分子化抗体は、全長抗体（ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、例えばｗｈｏｌｅ  ＩｇＧ等）の一部分が欠損している抗体断片を含み、抗原への結合能を有していれば特に限定されない。本発明の抗体断片は、全長抗体の一部分であれば特に限定されないが、重鎖可変領域（ＶＨ）又は／及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含んでいることが好ましい。ＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び／又は挿入がされていてもよい。さらに抗原への結合能を有する限り、ＶＨ又は／及びＶＬの一部を欠損させてもよい。又、可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。【００１７】  抗体断片の具体例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等を挙げることができる。【００１８】  低分子化抗体の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（シングルチェインＦｖ）、Ｄｉａｂｏｄｙ、ｓｃ（Ｆｖ）２などを挙げることができるが、好ましくはＤｉａｂｏｄｙ又はｓｃ（Ｆｖ）２であり、特に好ましくはｓｃ（Ｆｖ）２である。このような低分子化抗体は、当業者に公知の方法によって製造することができる。【００１９】  Ｄｉａｂｏｄｙは、可変領域と可変領域をリンカー等で結合したフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ等）を２つ結合させて二量体化させたものであり、通常、２つのＶＬと２つのＶＨを含む（Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，６４４４−６４４８（１９９３）、ＥＰ４０４０９７号、ＷＯ９３／１１１６１号、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３，８８−９８，（１９９１）、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９，２９９−３０５，（１９９６）、Ｐｅｒｉｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２，１２１７−１２２６，（１９９４）、Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１２（７），５９７−６０４，（１９９９）、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，．Ｐｒ��ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９０，６４４４−６４４８，（１９９３）、Ａｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３，１３０１−１３１２，（１９９６））。【００２０】  ｓｃ（Ｆｖ）２は、２つの重鎖可変領域及び２つの軽鎖可変領域をリンカー等で結合し、一本鎖ポリペプチドにした抗体であり（Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９９；２３１：１７７−１８９）、例えば、２つのｓｃ（Ｆｖ）をリンカーで結合すること等により作製することが可能である。【００２１】  結合される２つの重鎖可変領域と２つの軽鎖可変領域の順序は特に限定されず、どのような順序で並べられていてもよく、例えば、以下のような配置を挙げることができる。
［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］
［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］
［ＶＨ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＬ］
［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］
［ＶＬ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＨ］
［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］【００２２】  本発明においては、［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］の配置を有するｓｃ（Ｆｖ）２が好ましい。【００２３】  リンカーは、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、又は合成化合物リンカー（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９（３），２９９−３０５，１９９６参照）に開示されるリンカーを用いることができる。【００２４】  本発明において好ましいリンカーはペプチドリンカーである。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能であるが、通常、１〜１００アミノ酸、好ましくは５〜３０アミノ酸、特に好ましくは１２〜１８アミノ酸（例えば、１５アミノ酸）である。【００２５】  ペプチドリンカーのアミノ酸配列としては、例えば、以下のような配列を挙げることができる。
Ｓｅｒ
Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
（Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ）ｎ
（Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ）ｎ
［ｎは１以上の整数である］等を挙げることができる。【００２６】  合成化学物リンカー（化学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋剤、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−ＥＧＳ）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ−ＤＳＴ）、ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、ビス［２−（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ）などであり、これらの架橋剤は市販されている。【００２７】  抗体断片又は低分子化抗体を得るには、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンなどで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４７６−４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６５２−６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
本発明における低分子化抗体は、全長抗体よりも分子量が小さくなることが好ましいが、例えば、ダイマー、トリマー、テトラマーなどの多量体を形成すること等もあり、全長抗体よりも分子量が大きくなることもある。【００２８】  キメラ抗体は、異なる動物由来の配列を組み合わせて作製される抗体であり、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体などである。キメラ抗体の作製は公知の方法を用いて行うことができ、例えば、抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。【００２９】  ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ  １２５０２３号公報、ＷＯ  ９６／０２５７６号公報参照）。【００３０】  具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）とを連結するように設計したＤＮＡ配列を、ＣＤＲ及びＦＲ両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ法により合成する（ＷＯ９８／１３３８８号公報に記載の方法を参照）。
ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。【００３１】  キメラ抗体及びヒト化抗体のＣ領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばＨ鎖では、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４を、Ｌ鎖ではＣκ、Ｃλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。
一般的に、キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域およびＣ領域とからなる。
なお、キメラ抗体やヒト化抗体を作製した後に、さらに可変領域（例えば、ＦＲ）や定常領域中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換等することも可能である。【００３２】  抗体に他の分子を付加することにより、抗体を修飾し、改変することも可能である。抗体の修飾は当業者に公知の方法により行うことができる。抗体の修飾の具体例としては、例えば、ＰＥＧなどの高分子の付加を挙げることができる。
又、抗体の糖鎖を置換・付加・欠失させることにより改変することも可能であり、糖鎖改変技術は当業者に既に知られている（例えば、ＷＯ００／６１７３９、ＷＯ０２／３１１４０など）【００３３】  本発明のスクリーニング方法において、被験抗体は特に限定されず、どのような抗体を用いてもよい。
被験抗体は、その由来等で限定されず、例えば、マウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ラクダ抗体など、どのような動物由来の抗体でもよい。
本発明において被験抗体は、非改変抗体（例えば、全長抗体）であることが好ましいが、改変された抗体を被験抗体としてもよい。改変抗体を被験抗体として用いる場合、本発明のスクリーニングの過程において、さらに他の改変が行われる。この場合、同じ種類の改変がおこなわれてもよいし、異なる種類の改変がおこなわれてもよい。【００３４】  従って、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体などのアミノ酸配列を置換した抗体、各種分子を結合させた抗体修飾物、糖鎖の付加を制御した抗体、低分子化抗体などを被験抗体とすることも可能である。但し、低分子化抗体を被験抗体として用いる場合には、改変後はＤｉａｂｏｄｙ又はｓｃ（Ｆｖ）２とすることが好ましい。従って、改変前の被験抗体は、Ｄｉａｂｏｄｙ又はｓｃ（Ｆｖ）２以外であることが好ましい。【００３５】  本発明の抗体が認識する抗原は特に限定されず、どのような抗原を認識してもよいが、例えば、細胞膜上又は細胞内に発現するタンパク質を挙げることができる。細胞膜上又は細胞内に発現するタンパク質としては、例えば、受容体、細胞表面抗原、主要組織適合抗原などを挙げることができる。【００３６】  受容体としては、例えば、造血因子受容体ファミリー、サイトカイン受容体ファミリー、チロシンキナーゼ型受容体ファミリー、セリン／スレオニンキナーゼ型受容体ファミリー、ＴＮＦ受容体ファミリー、Ｇタンパク質共役型受容体ファミリー、ＧＰＩアンカー型受容体ファミリー、チロシンホスファターゼ型受容体ファミリー、接着因子ファミリー、ホルモン受容体ファミリー、等の受容体ファミリーに属する受容体などを挙げることができる。これら受容体ファミリーに属する受容体、及びその特徴に関しては多数の文献が存在し、例えば、Ｃｏｏｋｅ  ＢＡ．，Ｋｉｎｇ  ＲＪＢ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｏｌｅｎ  ＨＪ．ｅｄ．Ｎｅｗ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｓｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．１８Ｂ″Ｈｏｒｍｏｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ａｃｔｉｏｎｓ  Ｐａｒｔ  ＩＩ″ｐｐ．１−４６（１９８８）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  ＢＶ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ、Ｐａｔｔｈｙ  Ｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ，６１：１３−１４．、Ｕｌｌｒｉｃｈ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ，６１：２０３−２１２．、Ｍａｓｓａｇｕｌ  Ｊ．（１９９２）Ｃｅｌｌ，６９：１０６７−１０７０．、Ｍｉｙａｊｉｍａ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０：２９５−３３１．、Ｔａｇａ  Ｔ．ａｎｄ  Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｔ．（１９９２）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，７：３３８７−３３９６．、Ｆａｎｔｌ  ＷＩ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６２：４５３−４８１．、Ｓｍｉｔｈ  ＣＡ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ，７６：９５９−９６２．、Ｆｌｏｗｅｒ  ＤＲ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４２２：２０７−２３４．、宮坂昌之監修，細胞工学別冊ハンドブックシリーズ「接着因子ハンドブック」（１９９４）（秀潤社，東京，日本）等が挙げられる。【００３７】  上記受容体ファミリーに属する具体的な受容体としては、例えば、ヒト又はマウスエリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体、ヒト又はマウス顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）受容体、ヒト又はマウストロンボポイエチン（ＴＰＯ）受容体、ヒト又はマウスインスリン受容体、ヒト又はマウスＦｌｔ−３リガンド受容体、ヒト又はマウス血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体、ヒト又はマウスインターフェロン（ＩＦＮ）−α、β受容体、ヒト又はマウスレプチン受容体、ヒト又はマウス成長ホルモン（ＧＨ）受容体、ヒト又はマウスインターロイキン（ＩＬ）−１０受容体、ヒト又はマウスインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ受容体、ヒト又はマウス白血病抑制因子（ＬＩＦ）受容体、ヒト又はマウス毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体等を例示することができる（ｈＥＰＯＲ：Ｓｉｍｏｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ  ７６，３１−３５．；ｍＥＰＯＲ：Ｄ’Ａｎｄｒｅａ，ＡＤ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５７，２７７−２８５．；ｈＧ−ＣＳＦＲ：Ｆｕｋｕｎａｇａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８７，８７０２−８７０６．；ｍＧ−ＣＳＦＲ：Ｆｕｋｕｎａｇａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６１，３４１−３５０．；ｈＴＰＯＲ：Ｖｉｇｏｎ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）８９，５６４０−５６４４．；ｍＴＰＯＲ：Ｓｋｏｄａ，ＲＣ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）１２，２６４５−２６５３．；ｈＩｎｓＲ：Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３，７５６−７６１．；ｈＦｌｔ−３：Ｓｍａｌｌ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１，４５９−４６３．；ｈＰＤＧＦＲ：Ｇｒｏｎｗａｌｄ，ＲＧＫ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５，３４３５−３４３９．；ｈＩＦＮ  α／βＲ：Ｕｚｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６０，２２５−２３４．及びＮｏＶｉｃｋ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７７，３９１−４００．）。【００３８】  主要組織適合抗原の例としては、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ抗原（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−Ｈ）、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ抗原（ＨＬＡ−ＤＲ，−ＤＱ，−ＤＰ）を挙げることができる。
細胞表面抗原の例としては、例えば、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５ｓ、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４１ｂ、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５１、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６４、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９５、ＣＤ１０２、ＣＤ１０６、ＣＤ１２２、ＣＤ１２６、ＣＤｗ１３０などを挙げることができる。【００３９】  本発明のスクリーニング方法において、例えば被験抗体の数が少ない場合などには、結合活性を測定する前に抗体を改変し、その後アゴニスト活性や結合活性を測定し、アゴニスト活性を有する改変抗体を選択してもよい。その場合、アゴニスト活性と結合活性の測定の順序は限定されず、又、アゴニスト活性のみの測定でもよい。【００４０】  本発明のスクリーニング方法の好ましい態様の一つとして、被験抗体として低分子化されていない全長抗体を用い、改変の工程において低分子化（例えば、Ｄｉａｂｏｄｙ又はｓｃ（Ｆｖ）２）するスクリーニング方法が挙げられる。【００４１】  本発明において、アゴニスト活性とは、抗体が結合することにより、特異的反応を細胞に生じさせる（例えば、細胞内にシグナルが伝達される等して、何らかの生理的活性の変化を誘導する）活性である。生理的活性としては、例えば、増殖活性、増殖誘導活性、生存活性、分化活性、分化誘導活性、転写活性、膜輸送活性、結合活性、タンパク質分解活性、リン酸化／脱リン酸化活性、酸化還元活性、転移活性、核酸分解活性、脱水活性、細胞死誘導活性、アポトーシス誘導活性、などを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。【００４２】  アゴニスト活性の測定は当業者に公知の方法により行うことが可能である。
例えば、実施例に記載のように細胞増殖を指標にアゴニスト活性を測定する方法により判定することが可能である。より具体的には、アゴニスト依存性増殖を示す細胞にアゴニスト活性を測定したい抗体を添加し、培養する。その後、ＷＳＴ−８のような生細胞数に応じて特定の波長において発色反応を呈する試薬を添加して吸光度を測定し、得られた吸光度を指標にアゴニスト活性を測定することが可能である。【００４３】  アゴニスト依存性増殖を示す細胞も当業者に公知の方法により作製することが可能であり、例えば、抗原が細胞増殖シグナルを発する受容体である場合には、該受容体を発現している細胞を用いればよい。又、抗原が細胞増殖シグナルを出さない受容体である場合には、細胞増殖シグナルを発する受容体の細胞内領域と、細胞増殖シグナルを出さない受容体の細胞外領域からなるキメラ受容体を作製し、該キメラ受容体を細胞で発現させればよい。細胞増殖シグナルを発する受容体の例としては、例えば、Ｇ−ＣＳＦ受容体、ｍｐｌ、ｎｅｕ、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、ＥＰＯ受容体、ｃ−ｋｉｔ、ＦＬＴ−３等を挙げることができる。受容体を発現させる細胞としては、例えば、ＢａＦ３、ＮＦＳ６０、ＦＤＣＰ−１、ＦＤＣＰ−２、ＣＴＬＬ−２、ＤＡ−１、ＫＴ−３等を挙げることができる。【００４４】  その他、アゴニスト活性を測定する為に用いる検出指標としては、量的及び／又は質的な変化が測定可能である限り使用することができる。例えば、無細胞系（ｃｅｌｌ  ｆｒｅｅ  ａｓｓａｙ）の指標、細胞系（ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙ）の指標、組織系の指標、生体系の指標を用いることができる。無細胞系の指標としては、酵素反応やタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡの量的及び／又は質的な変化を用いることができる。酵素反応としては、例えば、アミノ酸転移反応、糖転移反応、脱水反応、脱水素反応、基質切断反応等を用いることができる。また、タンパク質のリン酸化、脱リン酸化、二量化、多量化、分解、乖離等や、ＤＮＡ、ＲＮＡの増幅、切断、伸長を用いることができる。例えばシグナル伝達経路の下流に存在するタンパク質のリン酸化を検出指標とすることができる。細胞系の指標としては、細胞の表現型の変化、例えば、産生物質の量的及び／又は質的変化、増殖活性の変化、細胞数の変化、形態の変化、特性の変化等を用いることができる。産生物質としては、分泌タンパク質、表面抗原、細胞内タンパク質、ｍＲＮＡ等を用いることができる。形態の変化としては、突起形成及び／又は突起の数の変化、偏平度の変化、伸長度／縦横比の変化、細胞の大きさの変化、内部構造の変化、細胞集団としての異形性／均一性、細胞密度の変化等を用いることができる。これらの形態の変化は検鏡下での観察で確認することができる。特性の変化としては、足場依存性、サイトカイン依存応答性、ホルモン依存性、薬剤耐性、細胞運動性、細胞遊走活性、拍動性、細胞内物質の変化等を用いることができる。細胞運動性としては、細胞浸潤活性、細胞遊走活性がある。また、細胞内物質の変化としては例えば、酵素活性、ｍＲＮＡ量、Ｃａ２＋やｃＡＭＰ等の細胞内情報伝達物質量、細胞内タンパク質量等を用いることができる。また、細胞膜受容体の場合には、受容体��刺激によって誘導される細胞の増殖活性の変化を指標とすることができる。組織系の指標としては、使用する組織に応じた機能変化を検出指標とすることができる。生体系の指標としては組織重量変化、血液系の変化、例えば血球細胞数の変化、タンパク質量や、酵素活性、電解質量の変化、また、循環器系の変化、例えば、血圧、心拍数の変化等を用いることができる。【００４５】  これらの検出指標を測定する方法としては、特に制限はなく、吸光、発光、発色、蛍光、放射活性、蛍光偏光度、表面プラズモン共鳴シグナル、時間分解蛍光度、質量、吸収スペクトル、光散乱、蛍光共鳴エネルギー移動、等を用いることができる。これらの測定方法は当業者にとっては周知であり、目的に応じて、適宜選択することができる。例えば、吸収スペクトルは一般的に用いられるフォトメータやプレートリーダ等、発光はルミノメータ等、蛍光はフルオロメータ等で測定することができる。質量は質量分析計を用いて測定することができる。放射活性は、放射線の種類に応じてガンマカウンターなどの測定機器を用いて、蛍光偏光度はＢＥＡＣＯＮ（宝酒造）、表面プラズモン共鳴シグナルはＢＩＡＣＯＲＥ、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動などはＡＲＶＯなどにより測定できる。さらに、フローサイトメータなども測定に用いることができる。これらの測定方法は、一つの測定方法で２種以上の検出指標を測定しても良く、簡便であれば、２種以上の測定を同時及び／又は連続して測定することによりさらに多数の検出指標を測定することも可能である。例えば、蛍光と蛍光共鳴エネルギー移動を同時にフルオロメータで測定することができる。【００４６】  抗体の結合活性の測定は当業者に公知の方法により行うことが可能である。例えば、抗体の抗原結合活性を測定する方法として、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。例えば、酵素免疫測定法を用いる場合、抗原をコーティングしたプレートに、抗体を含む試料、例えば、抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベートし、洗浄した後、ｐ−ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。【００４７】  本発明はアゴニスト活性を有する抗体の製造方法もまた提供する。本発明の製造方法は、まず、アゴニスト活性を有する改変抗体を上述のようにスクリーニングする。次いで、該改変抗体をコードするＤＮＡを含むベクターを作製し、該ベクターを宿主細胞に導入する。次いで、宿主細胞を培養する。【００４８】  本発明のベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ）などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ｏｒｉ」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。ベクターの例としては、���１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔなどが挙げられる。また、ｃＤＮＡのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７などが挙げられる。【００４９】  本発明のベクターとしては、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）、またはＴ７プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にｐＧＥＸ−５Ｘ−１（ファルマシア社製）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｙｓｔｅｍ」（キアゲン社製）、ｐＥＧＦＰ、またはｐＥＴ（この場合、宿主はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現しているＢＬ２１が好ましい）などが挙げられる。【００５０】  また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。タンパク質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。【００５１】  大腸菌以外にも、例えば、本発明のベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ  ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ」（ギブコＢＲＬ社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ」（インビトロゲン社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）が挙げられる。【００５２】  ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、ＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、ＣＭＶプロモーターなどを��っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３などが挙げられる。【００５３】  さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するＤＨＦＲ遺伝子を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩなど）を導入し、メトトレキセート（ＭＴＸ）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製起点を持つベクター（ｐｃＤなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。【００５４】  本方法においては次いで、該ベクターを宿主細胞に導入する。ベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。宿主細胞は、例えば本発明の抗体の製造や発現のための産生系として使用することができる。抗体製造のための産生系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。【００５５】  真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１０８，９４５）、ＣＯＳ、３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９１，３３８−３４０）、あるいは昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５が知られている。本発明においては、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１、ＣＯＳ７細胞、ＢＨＫが好適に用いられる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。【００５６】  植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞がタンパク質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞とし���は、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ポンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）が知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。【００５７】  本方法においては次いで上記宿主細胞を培養する。目的とするＤＮＡにより形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより、抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができる。その際、ＦＢＳ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のｐＨは、約６〜８であるのが好ましい。培養は、通常、約３０〜４０℃で約１５〜２００時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。【００５８】  一方、ｉｎ  ｖｉｖｏでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするＤＮＡを導入し、動物又は植物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。【００５９】  動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ  Ｇｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
例えば、目的とするＤＮＡを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的の抗体を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生される抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。【００６０】  また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的の抗体をコードするＤＮＡを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的の抗体を得ることができる（Ｓｕｓｕｍｕ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−５９４）。【００６１】  さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とする抗体をコードするＤＮＡを植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ  ５３０に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）に感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得ることができる（Ｊｕｌｉａｎ  Ｋ．−Ｃ．Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。【００６２】  これにより得られた抗体は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一な抗体として精製することができる。抗体の分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせれば抗体を分離、精製することができる。【００６３】  クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えば、プロテインＡを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等が挙げられる。【００６４】  なお、抗体の精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。【００６５】  また、本発明は、本発明のスクリーニング方法により得られるアゴニスト活性を有する改変抗体、および本発明の製造方法によって製造された改変抗体を提供するものである。
さらに本発明のスクリーニング方法又は製造方法は、アゴニスト活性を有する抗体のスクリーニング又は製造のみならず、中和活性、細胞傷害活性、結合活性、アンタゴニスト活性、酵素活性などの他の活性を有する抗体のスクリーニング又は製造に用いることも可能である。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００６６】  以下、実施例に基づいて本発明を更に具体的に説明する。【００６７】〔実施例１〕  抗ヒトＭｐｌ抗体の作製
１．１  Ｍｐｌ発現ＢａＦ３細胞株の樹立
ＴＰＯ依存増殖性細胞株を得るために、全長Ｍｐｌ遺伝子を発現するＢａＦ３細胞株の樹立を行った。全長ヒトＭｐｌ  ｃＤＮＡ（Ｐａｌａｃｉｏｓら、Ｃｅｌｌ  １９８５；４１：７２７−７３４）（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＮＭ＿００５３７３）をＰＣＲにより増幅し、ｐＣＨＯＩ（Ｈｉｒａｔａら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ  １９９４；３５６：２４４−２４８）のＤＨＦＲ遺伝子発現部位を除去し、ＨＥＦ−ＶＨ−ｇγ１（Ｓａｔｏら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４；３１：３７１−３８１）のＮｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子発現部位を挿入した発現ベクターｐＣＯＳ２にクローニングし、ｐＣＯＳ２−ｈＭｐｌｆｕｌｌを構築した。【００６８】  作製した各ベクター（２０μｇ）をＰＢＳに懸濁したＢａＦ３細胞（１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）に混合し、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒキュベットに加え、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて０．３３ｋＶ，９５０μＦＤの容量でパルスを加えた。エレクトロポーレーション処理により遺伝子導入したＢａＦ３細胞を１ｎｇ／ｍＬマウスインターロイキン３（以下、ｍＩＬ−３、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、５００μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、１０％  ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に加えて選抜し、ヒトＭｐｌ発現ＢａＦ３細胞株（以下、ＢａＦ３−ｈｕｍａｎ  Ｍｐｌ）を樹立した。選抜後は、１ｎｇ／ｍＬ  ｒｈＴＰＯ（Ｒ＆Ｄ社製）、１０％  ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて培養、維持した。【００６９】１．２  Ｍｐｌ発現ＣＨＯ細胞株の樹立
Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを用いた結合活性評価用の細胞株を得るために、全長Ｍｐｌ遺伝子を発現するＣＨＯ細胞株の樹立を行った。はじめに、ｐＣＸＮ２（Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ  １９９１；１０８：１９３−１９９）のＨｉｎｄＩＩＩ部位にｐＣＨＯＩのＤＨＦＲ遺伝子発現部位を挿入して、発現ベクターｐＣＸＮＤ３を作製した。ｐＣＯＳ２−ｈＭｐｌｆｕｌｌ、ｐＣＯＳ２−ｍｏｎｋｅｙＭｐｌｆｕｌｌおよびｐＣＯＳ２−ｍｏｕｓｅＭｐｌｆｕｌｌを鋳型にして、Ｈｉｓ−ｔａｇ配列を含むＰｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲにより増幅した各Ｍｐｌ遺伝子をｐＣＸＮＤ３にクローニングし、ｐＣＸＮＤ３−ｈＭｐｌ−ＨｉｓおよびｐＣＸＮＤ３−ｍｏｎｋｅｙ  Ｍｐｌ−Ｈｉｓを構築した。【００７０】  作製した各ベクター（２５μｇ）をＰＢＳに懸濁したＣＨＯ−ＤＧ４４細胞（１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）に混合し、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒキュベットに加え、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて１．５ｋＶ，２５μＦＤの容量でパルスを加えた。エレクトロポーレーション処理により遺伝子導入したＣＨＯ細胞を５００μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、１ｘＨＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に加えて選抜し、ヒトＭｐｌ発現ＣＨＯ細胞株（以下、ＣＨＯ−ｈｕｍａｎ  Ｍｐｌ）およびサルＭｐｌ発現ＣＨＯ細胞株（以下、ＣＨＯ−ｍｏｎｋｅｙ  Ｍｐｌ）を樹立した。【００７１】１．３  可溶型ヒトＭｐｌタンパク質の調製
可溶型ヒトＭｐｌタンパク質を調製するため、昆虫細胞Ｓｆ９細胞で分泌産生する発現系を以下のように構築した。【００７２】  ヒトＭｐｌの細胞外領域（Ｇｌｎ２６からＴｒｐ４９１）の下流にＦＬＡＧタグを付加した遺伝子を作製し、ｐＢＡＣＳｕｒｆ−１  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＰｓｔＩ−ＳｍａＩ位に挿入し、ｐＢＡＣＳｕｒｆ１−ｈＭｐｌ−ＦＬＡＧを作製した。続いて、Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、４μｇのｐＢＡＣＳｕｒｆ１−ｈＭｐｌ−ＦＬＡＧをＳｆ９細胞に導入した。培養３日後に培養上清を回収し、プラークアッセイにより組換えウイルスを単離した。ウイルスストックを調製後にＳｆ９細胞に感染させて培養上清を回収した。【００７３】  得られた培養上清を用いて、以下のように可溶型ヒトＭｐｌタンパク質を精製した。培養上清をＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に吸着させた後に、５０ｍＭ  Ｎａ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ，０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，５００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）を用いて溶出した。溶出液をＦＬＡＧＭ２−Ａｇａｒｏｓｅ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）に吸着させた後に、１００ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ，０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ３．５）を用いて溶出した。溶出後、直ちに１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）により中和し、ＰＤ−１０ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、ＰＢＳ（−），０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０に置換を行った。精製した可溶型Ｍｐｌタンパク質をｓｈＭｐｌ−ＦＬＡＧと称する。【００７４】１．４  ヒトＭｐｌ−ＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質の調製
ヒトＭｐｌ−ＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質遺伝子はＢｅｎｎｅｔｔらの方法（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１；２６６：２３０６０−２３０６７）に従って作製した。ヒトＭｐｌの細胞外領域（Ｇｌｎ２６からＴｒｐ４９１）をコードする塩基配列をヒトＩｇＧ−γ１のＦｃ領域（Ａｓｐ２１６よりの下流の領域）をコードする塩基配列に連結し、連結部にＦｕｓｉｏｎ  ＬｉｎｋｅｒとしてＢｓｔＥＩＩ配列（アミノ酸Ｖａｌ−Ｔｈｒ）を付加した。シグナル配列は、ヒトＩｇＧ  Ｈ鎖可変領域のシグナルペプチド１９アミノ酸を使用した。得られたヒトＭｐｌ−ＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質遺伝子をｐＣＸＮＤ３にクローニングし、ｐＣＸＮＤ３−ｈＭｐｌ−Ｆｃを構築した。【００７５】  作製した各ベクター（２５μｇ）をＰＢＳに懸濁したＣＨＯ−ＤＧ４４細胞（１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）に混合し、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒキュベットに加え、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて１．５ｋＶ，２５μＦＤの容量でパルスを加えた。エレクトロポーレーション処理により遺伝子導入したＣＨＯ細胞を５００μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、１ｘＨＴを含むＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地に加えて選抜し、ｓｈＭＰＬ−Ｆｃ発現ＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ−ｈＭｐｌ−Ｆｃ）を樹立した。【００７６】  得られた培養上清を用いて、以下のようにヒトＭｐｌ−ＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質を精製した。培養上清をＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に吸着させた後に、５０ｍＭ  Ｎａ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ，０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，１Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．６）を用いて溶出した。溶出液をＨｉＴｒａｐ  ｐｒｏｔｅｉｎＧ  ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に吸着させた後に、０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ２．７）を用いて溶出した。溶出後、直ちに１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）により中和し、ＰＤ−１０ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、ＰＢＳ（−），０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０に置換を行った。精製した可溶型Ｍｐｌタンパク質をｈＭｐｌ−Ｆｃと称する。【００７７】１．５  ｓｈＭｐｌ−ＦＬＡＧの免疫およびハイブリドーマの選抜
ＭＲＬ／ＭｐＪＵｍｍＣｒｊ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウス（以下、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス、日本チャールス・リバーより購入）を用いて、８週令より免疫を開始した。初回免疫は１００μｇ／匹のｓｈＭＰＬ−ＦＬＡＧにフロイント完全アジュバント（Ｈ３７  Ｒａ、ベクトン・ディッキンソン社製）を加え、エマルジョン化したものを皮下に投与した。追加免疫は５０μｇ／匹のｓｈＭＰＬ−ＦＬＡＧにフロイント不完全アジュバント（ベクトン・ディッキンソン社製）を加え、エマルジョン化したものを皮下に投与した合計６回免疫を行ったマウス３匹に対し、５０μｇ／匹のｓｈＭＰＬ−ＦＬＡＧを尾静脈内投与することにより最終免疫を行った。マウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１（Ｐ３Ｕ１、ＡＴＣＣより購入）とマウス脾臓細胞を混合し、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  １５００（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を加えながら混合することにより細胞融合を行った。翌日よりＨＡＴ培地を用いて選抜を行い、培養上清を用いてｓｈＭｐｌ−ＦＬＡＧまたはｈＭｐｌ−Ｆｃを固相化したイムノプレートを用いたＥＬＩＳＡおよびＢａＦ３−ｈＭｐｌを用いた細胞増殖活性を指標としたスクリーニングを実施した。陽性クローンについて、限界希釈法によりモノクローン化した後に、拡大培養を行い、培養上清を回収した。【００７８】１．６  ヒトＭｐｌ抗体の解析
抗体濃度はヤギ抗マウスＩｇＧ（ｇａｍｍａ）（ＺＹＭＥＤ社製）とアルカリフォスファターゼ−ヤギ抗マウスＩｇＧ（ｇａｍｍａ）（ＺＹＭＥＤ社製）を用いたマウスＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡを行い、Ｉｓｏｔｙｐｅの等しい市販抗体をスタンダードにして、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＵＳＡ）を用いて検量線を作成し、抗体濃度の換算を行った。【００７９】  抗体のアイソタイプは、アイソタイプ特異的な二次抗体を用いた抗原依存的ＥＬＩＳＡにて決定した。ｈＭｐｌ−Ｆｃを１μｇ／ｍＬとなるようにｃｏａｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（０．１ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．６），０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３）で希釈したものを加え、４℃にて一晩反応し、コーティングした。Ｄｉｌｕｅｎｔ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．１），１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３，１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）にてブロッキング処理を行った後、ハイブリドーマの培養上清を加え、室温で１時間放置した。Ｒｉｎｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，ＰＢＳ）にて洗浄した後、Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ標識したアイソタイプ特異的二次抗体を加え、室温で１時間放置した。発色はＳＩＧＭＡ１０４（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を１ｍｇ／ｍＬとなるようにＳｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．８），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に希釈したものを用い、４０５ｎｍの吸光度をＢｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｐｌｕｓ（ＢｉｏＲａｄ社製）にて測定した。【００８０】  ｓｈＭｐｌ−ＦＬＡＧおよびｈＭＰＬ−Ｆｃに対する結合活性は、ＥＬＩＳＡにより評価した。精製したｓｈＭｐｌ−ＦＬＡＧおよびｈＭＰＬ−Ｆｃを１μｇ／ｍＬになるようにコーティングし、Ｄｉｌｕｅｎｔ  ｂｕｆｆｅｒにてブロッキング処理を行った。ハイブリドーマの培養上清を加え、室温で１時間放置した後、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ社製）を加え、上記方法と同様に発色を行った。室温で１時間発色させた後に４０５ｎｍの吸光度を測定し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いてＥＣ５０値を算出した。【００８１】  ＣＨＯ−ｈｕｍａｎ  ＭｐｌまたはＣＨＯ−ｍｏｎｋｅｙ  Ｍｐｌを回収し、１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（１％  ＦＢＳ／ＰＢＳ）に懸濁した。１００μＬ／ｗｅｌｌとなるようにＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に分注し、遠心操作にて培養上清を除去した。５μｇ／ｍＬになるように希釈した培養上清を加え、氷上にて３０分間反応させた。細胞をＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒにて１回洗浄し、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を添加し、氷上にて３０分間反応させた。反応後、５００ｒｐｍで１分間遠心し、上清を除き、ＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒ４００μＬに懸濁し、ＥＰＩＣＳ  ＥＬＩＴＥ  ＥＳＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてフローサイトメトリーを行った。前方散乱光（ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ）及び側方散乱光（ｓｉｄｅ  ���ｃａｔｔｅｒ）のヒストグラムにて生細胞集団にゲートを設定した。【００８２】  Ｍｐｌ−Ｆｃを固相化したプレートを用いたＥＬＩＳＡおよびＣＨＯ−ｈｕｍａｎ  Ｍｐｌ，ＣＨＯ−ｍｏｎｋｅｙ  Ｍｐｌを用いたＦｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙによる結合活性評価により、Ｍｐｌに結合するマウスモノクローナル抗体ＶＡ１３０，ＶＢ１６，ＶＢ１５７を取得した。【００８３】１．７  抗ヒトＭｐｌ抗体の精製
ハイブリドーマの培養上清を用いて、以下のように抗ヒトＭｐｌ抗体を精製した。培養上清をＨｉＴｒａｐ  ｐｒｏｔｅｉｎＧ  ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に吸着させた後に、０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．７）を用いて溶出した。溶出後、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ９．０）により直ちに中和し、ＰＢＳで一昼夜透析を行い、バッファー置換を行った。【００８４】〔実施例２〕  抗ヒトＭｐｌ一本鎖抗体の作製
取得した抗ヒトＭｐｌ抗体の中で、結合活性が高かった３種類の抗体について、遺伝子工学的手法により一本鎖抗体の発現系を構築した。以下に抗ヒトＭｐｌ抗体ＶＡ１３０の一本鎖抗体作製例について示す。
２．１  抗ヒトＭｐｌ抗体可変領域のクローニング
抗ヒトＭｐｌ抗体を産生するハイブリドーマより抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて１ｘ１０７細胞のハイブリドーマより抽出した。【００８５】  １μｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡを使用して、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いて、マウスＩｇＧ１定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドＭＨＣ−ＩｇＧ１（配列番号：１）またはマウスκ鎖定常領域塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドｋａｐｐａ（配列番号：２）を用いて、５’末端側遺伝子断片を増幅した。逆転写反応は４２℃で１時間３０分間反応させた。【００８６】  ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、
５μＬの１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ  Ｍｉｘ、
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
１μＬのＡｄｖａｎｔａｇｅ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ
（以上の成分はいずれもＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）
２．５μＬの逆転写反応産物、
１０ｐｍｏｌｅの合成オリゴヌクレオチドＭＨＣ−ＩｇＧ１またはｋａｐｐａ【００８７】  また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて３０秒間、
９４℃／５秒間、７２℃／３分間のサイクルを５回反復
９４℃／５秒間、７０℃／１０秒間、７２℃／３分間のサイクルを５回反復、
９４℃／５秒間、６８℃／１０秒間、７２℃／３分間のサイクルを２５回反復
最後に反応産物を７２℃で７分間加熱した。【００８８】  ＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、アガロースゲルから精製した後、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）へクローニングした。さらに、ＡＢＩ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて塩基配列を決定した。クローニングしたＶＡ１３０Ｈ鎖可変領域（以下、ＶＡ１３０−ＶＨ）の塩基配列を配列番号：３、アミノ酸配列を配列番号：４、およびＬ鎖可変領域（以下、ＶＡ１３０−ＶＬ）の塩基配列を配列番号：５、アミノ酸配列を配列番号：６に示す。【００８９】２．２  抗ヒトＭｐｌ抗体Ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターの作製
５アミノ酸からなるリンカー配列を用いたＶＡ１３０一本鎖Ｆｖ（以下、ＶＡ１３０  Ｄｉａｂｏｄｙ）をコードする遺伝子は、ＶＡ１３０−ＶＨをコードする遺伝子の３’末端およびＶＡ１３０−ＶＬをコードする遺伝子の５’末端に（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１から成るリンカーをコードする塩基配列を付加させた遺伝子について、それぞれＰＣＲ法を用いて増幅し、連結することにより構築した。【００９０】  ＶＡ１３０−ＶＨの前方プライマーＶＡ２６４−ｆｅｃｏ（配列番号：７）は、ＥｃｏＲＩ部位を有するように設計し、ＶＡ１３０−ＶＨの後方プライマーＶＡ２６４−ｒＬ５（配列番号：８）は、ＶＡ１３０−ＶＨのＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、かつ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１から成るリンカーをコードする塩基配列ならびにＶＡ１３０−ＶＬのＮ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズする塩基配列を有するように設計した。ＶＡ１３０−ＶＬの前方プライマーＶＡ２６４−ｆＬ５（配列番号：９）は、ＶＡ１３０−ＶＬのＮ末端をコードする塩基配列ならびに（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１から成るリンカーをコードする塩基配列、ＶＡ１３０−ＶＨのＣ末端をコードする塩基配列を有するように設計した。ＶＡ１３０−ＶＬの後方プライマーＶＡ２６４−ｒｆｌａｇ（配列番号：１０）は、ＶＡ１３０−ＶＬのＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、かつＦＬＡＧタグ（ＡｓｐＴｙｒＬｙｓＡｓｐＡｓｐ  ＡｓｐＡｓｐＬｙｓ／配列番号：１１）をコードする塩基配列を有し、さらにＮｏｔＩ部位を有するように設計した。【００９１】  第一ＰＣＲにおいて、ＶＡ１３０−ＶＨおよびリンカー配列とＶＡ１３０−ＶＬおよびリンカー配列を含む２つのＰＣＲ反応物を以下のように合成した。
ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、
０．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
２．５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ
（以上の成分はいずれも宝酒造社製）、
１０ｎｇのＶＡ１３０−ＶＨまたはＶＡ１３０−ＶＬ遺伝子を含むｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター、
１０ｐｍｏｌｅの合成オリゴヌクレオチドＶＡ２６４−ｆｅｃｏ、ＶＡ２６４−ｒＬ５またはＶＡ２６４−ｆＬ５、ＶＡ２６４−ｒｆｌａｇ【００９２】  また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて３０秒間、
９４℃／１５秒間、７２℃／２分間のサイクルを５回反復
９４℃／１５秒間、７０℃／２分間のサイクルを５回反復、
９４℃／１５秒間、６８℃／２分間のサイクルを２８回反復
最後に反応産物を７２℃で５分間加熱した。【００９３】  約４００ｂｐのＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、アガロースゲルから精製した後、各ＰＣＲ産物の一部を用いて以下のように第二ＰＣＲを行った。
ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、
０．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
２．５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ
（以上の成分はいずれも宝酒造社製）、
１μＬの第一ＰＣＲ産物（２種類）、
１０ｐｍｏｌｅの合成オリゴヌクレオチドＶＡ２６４−ｆｅｃｏ、ＶＡ２６４−ｒｆｌａｇ【００９４】  また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて３０秒間、
９４℃／１５秒間、７２℃／２分間のサイクルを５回反復
９４℃／１５秒間、７０℃／２分間のサイクルを５回反復、
９４℃／１５秒間、６８℃／２分間のサイクルを２８回反復
最後に反応産物を７２℃で５分間加熱した。【００９５】  約８００ｂｐのＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、アガロースゲルから精製した後、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）で消化した後に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、ｐＣＸＮＤ３にクローニングし、ｐＣＸＮＤ３−ＶＡ１３０  ｄｂを作製した。【００９６】２．３  抗ヒトＭｐｌ抗体ｓｃ（Ｆｖ）２発現ベクターの作製
ＶＡ１３０由来の２つのＨ鎖可変領域および２つのＬ鎖可変領域を含む改変抗体［ｓｃ（Ｆｖ）２］を発現するプラスミドを作製するために、前述のｐＣＸＮＤ３−ＶＡ１３０  ｄｂを用いて以下のようにＰＣＲ法により修飾した。ｓｃ（Ｆｖ）２遺伝子の構築過程について、図１に示した。【００９７】  はじめに、ＶＡ１３０−ＶＨをコードする遺伝子の３’末端およびＶＡ１３０−ＶＬをコードする遺伝子の５’末端に１５アミノ酸から成るリンカー（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３をコードする塩基配列を付加させた遺伝子について、それぞれＰＣＲ法を用いて増幅し、連結することにより構築した。この構築過程において、２種類のプライマーを新たに設計した。ＶＡ１３０−ＶＨの後方プライマーｓｃ−ｒＬ１５（プライマーＢ，配列番号：１２）は、ＶＡ１３０−ＶＨのＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、かつ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３から成るリンカーをコードする塩基配列ならびにＶＡ１３０−ＶＬのＮ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズする塩基配列を有するように設計した。ＶＡ１３０−ＶＬの前方プライマーｓｃ−ｆＬ１５（プライマーＣ，配列番号：１３）は、ＶＡ１３０−ＶＬのＮ末端をコードする塩基配列ならびに（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３から成るリンカーをコードする塩基配列、ＶＡ１３０−ＶＨのＣ末端をコードする塩基配列を有するように設計した。【００９８】  第一ＰＣＲにおいて、ＶＡ１３０−ＶＨおよびリンカー配列とＶＡ１３０−ＶＬおよびリンカー配列を含む２つのＰＣＲ反応物を以下のように合成した。
ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、
０．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
２．５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ
（以上の成分はいずれも宝酒造社製）、
１０ｎｇのｐＣＸＮＤ３−ＶＡ１３０  ｄｂ、
１０ｐｍｏｌｅの合成オリゴヌクレオチドＶＡ２６４−ｆｅｃｏ（プライマーＡ）、ｓｃ−ｒＬ１５またはｓｃ−ｆＬ１５、ＶＡ２６４−ｒｆｌａｇ（プライマーＤ）【００９９】  また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて３０秒間、
９４℃／１５秒間、７２℃／２分間のサイクルを５回反復
９４℃／１５秒間、７０℃／２分間のサイクルを５回反復、
９４℃／１５秒間、６８℃／２分間のサイクルを２８回反復
最後に反応産物を７２℃で５分間加熱した。【０１００】  約４００ｂｐのＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、アガロースゲルから精製した後、各ＰＣＲ産物の一部を用いて以下のように第二ＰＣＲを行った。
ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、
０．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
２．５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ
（以上の成分はいずれも宝酒造社製）、
１μＬの第一ＰＣＲ産物（２種類）、
１０ｐｍｏｌｅの合成オリゴヌクレオチドＶＡ２６４−ｆｅｃｏ、ＶＡ２６４−ｒｆｌａｇ【０１０１】  また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて３０秒間、
９４℃／１５秒間、７２℃／２分間のサイクルを５回反復
９４℃／１５秒間、７０℃／２分間のサイクルを５回反復、
９４℃／１５秒間、６８℃／２分間のサイクルを２８回反復
最後に反応産物を７２℃で５分間加熱した。【０１０２】  約８００ｂｐのＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、アガロースゲルから精製した後、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）で消化した後に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、ｐＢａｃＰＡＫ９（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）にクローニングし、ｐＢａｃＰＡＫ９−ｓｃＶＡ１３０を作製した。【０１０３】  次に、ｐＢａｃＰＡＫ９−ｓｃＶＡ１３０のＰｖｕＩＩ部位に挿入する断片を作製した。すなわちＮ末端が欠けたＶＡ１３０−ＶＨとＶＡ１３０−ＶＬを（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３から成るリンカーで連結したアミノ酸をコードする遺伝子を、さらにＶＡ１３０−ＶＨのＮ末端をコードする遺伝子と（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３から成るリンカーをコードする塩基配列で連結する断片で、両末端がＰｖｕＩＩ認識配列となる断片である。２種類のプライマーを新たに設計し、ＰＣＲ法を用いて、この断片を作製した。目的断片の前方プライマーＦｖ２−ｆ（プライマーＥ，配列番号：１４）は、５’末端にＰｖｕＩＩ部位を有し、ＶＡ１３０−ＶＨの５’末端側の配列を持つように設計した。目的断片の後方プライマーＦｖ２−ｒ（プライマーＦ，配列番号：１５）は、ＶＡ１３０−ＶＬのＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、かつ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３から成るリンカーをコードする塩基配列ならびにＶＡ１３０−ＶＨのＮ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズする塩基配列、さらにＰｖｕＩＩ部位を有するように設計した。ｐＢａｃＰＡＫ９−ｓｃＶＡ１３０を鋳型にして、以下のようにＰＣＲを行った。【０１０４】  ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、
０．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
２．５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ
（以上の成分はいずれも宝酒造社製）、
１０μｇのｐＢａｃＰＡＫ９−ｓｃＶＡ１３０、
１０ｐｍｏｌｅの合成オリゴヌクレオチドＦｖ２−ｆ、Ｆｖ２−ｒ【０１０５】  また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて３０秒間、
９４℃／１５秒間、７２℃／２分間のサイクルを５回反復
９４℃／１５秒間、７０℃／２分間のサイクルを５回反復、
９４℃／１５秒間、６８℃／２分間のサイクルを２８回反復
最後に反応産物を７２℃で５分間加熱した。【０１０６】  約８００ｂｐのＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、アガロースゲルから精製した後、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）へクローニングした。塩基配列の決定後、制限酵素ＰｖｕＩＩ（宝酒造社製）で消化した後に、目的断片を回収した。ｐＢａｃＰＡＫ９−ｓｃＶＡ１３０を制限酵素ＰｖｕＩＩ（宝酒造社製）で消化した後に、回収した断片を連結し、ｐＢａｃＰＡＫ９−ＶＡ１３０  ｓｃ（Ｆｖ）２を作製した。作製したベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）で消化した後に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約１８００ｂｐの断片をアガロースゲルから精製し、発現ベクターｐＣＸＮＤ３にクローニングし、ｐＣＸＮＤ３−ＶＡ１３０  ｓｃ（Ｆｖ）２を作製した。【０１０７】２．４  動物細胞を用いた抗ヒトＭｐｌ一本鎖抗体の発現
ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を用いた一本鎖抗体の安定発現細胞株の作製は次のようにして行った。Ｇｅｎｅ  ＰｕｌｓｅｒＩＩ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いたエレクトロポレーション法により遺伝子導入した。発現ベクター（２５μｇ）とＰＢＳに懸濁したＣＨＯ−ＤＧ４４細胞（１×１０７細胞／ｍＬ）の０．７５ｍＬを混合したものを氷上で１０分間冷却し、キュベットに移した後に１．５ｋＶ、２５μＦＤの容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、５００μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に加えて選抜し、発現ＣＨＯ細胞株を樹立した。ＶＡ１３０  ｓｃ（Ｆｖ）２は、この方法で安定発現細胞株およびその培養上清を調製した。【０１０８】  ＣＯＳ７細胞を用いた一本鎖抗体の一過性発現は次のようにして行った。発現ベクター（１０μｇ）とＰＢＳに懸濁したＣＨＯ−ＤＧ４４細胞（１×１０７細胞／ｍＬ）の０．７５ｍＬを混合したものを氷上で１０分間冷却し、キュベットに移した後に１．５ｋＶ、２５μＦＤの容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に加え、一晩培養した後に、ＰＢＳで洗浄後にＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地を加えて約３日間培養した。ＶＡ１３０  Ｄｉａｂｏｄｙは、この方法で培養上清を調製した。【０１０９】２．５  培養上清中の抗ヒトＭｐｌ一本鎖抗体の定量
ＣＯＳ細胞に一過性発現させた抗ヒトＭｐｌ一本鎖抗体の培養上清中の濃度は、表面プラズモン共鳴を利用して測定した。すなわちＢＩＡｃｏｒｅ２０００（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）にＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）をセットし、ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を結合した。流速５ｍＬ／ｓｅｃで適濃度のサンプルを流し、５０ｍＭジエチルアミンを流して結合した抗体を解離させた。サンプルを流したときの質量変化を測定し、標準品の質量変化に基づいて作成した検量線を用いて、濃度を算出した。Ｄｉａｂｏｄｙについての標準品は、ｄｂ１２Ｅ１０（ＷＯ  ０２／３３０７２およびＷＯ  ０２／３３０７３参照）を使用し、ｓｃ（Ｆｖ）２についての標準品は同じ遺伝子構造を持つ１２Ｅ１０  ｓｃ（Ｆｖ）２を使用した。【０１１０】２．６  抗Ｍｐｌ  Ｄｉａｂｏｄｙおよび一本鎖抗体の精製
ＶＡ１３０  Ｄｉａｂｏｄｙ発現ＣＯＳ７細胞あるいはＣＨＯ細胞の培養上清を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で平衡化したＡｎｔｉ−Ｆｌａｇ  Ｍ２  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）カラムに吸着させ、１００ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３．５）で溶出させた。溶出画分は、直ちに１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和を行い、ＨｉＬｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）カラムを用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行った。ゲルろ過クロマトグラフィーのバッファーは、ＰＢＳ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０を使用した。【０１１１】  ＶＡ１３０  ｓｃ（Ｆｖ）２発現ＣＯＳ７細胞あるいはＣＨＯ細胞の培養上清をＤｉａｂｏｄｙ精製と同一条件で精製を行った。各精製ステップにおいて、Ｄｉａｂｏｄｙおよびｓｃ（Ｆｖ）２の確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｆｌａｇ抗体（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＬＩＣＨ社）を用いたＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇを用いて行った。
それぞれ、分取したピーク画分をＬａｅｍｌｉの方法に準じて電気泳動し、クマシーブリリアントブルーで染色した結果、Ｄｉａｂｏｄｙでは、見かけ上の分子量約２８ｋＤａに、またｓｃ（Ｆｖ）２では、見かけ上の分子量約５８ｋＤａに、それぞれ単一のバンドが検出された。【０１１２】２．７  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙによる抗ヒトＭｐｌ一本鎖抗体の結合活性の評価
ＣＨＯ−ｈｕｍａｎ  Ｍｐｌ、ＣＨＯ−ｍｏｎｋｅｙ  ＭｐｌおよびＣＨＯ−ｍｏｕｓｅ  Ｍｐｌを回収し、１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（１％  ＦＢＳ／ＰＢＳ）に懸濁した。１００μＬ／ｗｅｌｌとなるようにＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ−ＨＶ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｔｅｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に分注し、遠心操作にて上清を除去した。適濃度のＤｉａｂｏｄｙまたはｓｃ（Ｆｖ）２を加え、氷上にて３０分間反応させた。細胞を２００μＬのＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒにて１回洗浄し、１０μｇ／ｍＬのＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を添加し、氷上にて３０分間反応させた。【０１１３】  次に２００μＬのＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒにて細胞を１回洗浄した後、１００倍希釈したＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を添加し、氷上にて３０分間反応させた。最後に遠心し上清を除き、ＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４００μＬに懸濁し、ＥＰＩＣＳ  ＥＬＩＴＥ  ＥＳＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を用いてＦｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙに供した。前方散乱光（ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ）及び側方散乱光（ｓｉｄｅ  ｓｃａｔｔｅｒ）のヒストグラムにて生細胞集団にゲートを設定した。【０１１４】  精製したＶＡ１３０  ｓｃ（Ｆｖ）２を用いて、各種Ｍｐｌを発現させたＣＨＯ細胞に対する結合活性を評価した結果を図２に示す。宿主細胞であるＣＨＯに対しては結合活性を示さず、ＣＨＯ−ｈｕｍａｎ  ＭｐｌおよびＣＨＯ−ｍｏｎｋｅｙ  Ｍｐｌに特異的に結合することが確認された。この結合活性の傾向は、ＶＡ１３０  ＩｇＧと変わらないことから、低分子化により抗体の結合部位は変化していないことが推測された。【０１１５】２．８  ＥＬＩＳＡによる抗ヒトＭｐｌ一本鎖抗体の結合活性の評価
ＥＬＩＳＡにより抗ヒトＭｐｌ一本鎖抗体のｈＭＰＬ−Ｆｃに対する結合活性を評価した。精製したｈＭＰＬ−Ｆｃを０．５μｇ／ｍＬになるようにコーティングし、Ｄｉｌｕｅｎｔ  ｂｕｆｆｅｒにてブロッキング処理を行った。適濃度に希釈したＶＡ１３０精製品を加え、室温で１時間放置した後、Ｒｉｎｓｅ  ｂｕｆｆｅｒにて洗浄した後、１０００倍希釈したＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を加え、室温で１時間反応させた。さらにＲｉｎｓｅ  ｂｕｆｆｅｒにて洗浄した後、１０００倍希釈したＡｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ社製）を加え、室温で１時間放置した。Ｒｉｎｓｅ  ｂｕｆｆｅｒにて洗浄した後、発色はＳＩＧＭＡ１０４（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を１ｍｇ／ｍＬとなるようにＳｕｂｓｔｒａｔｅ）に希釈したものを用い、室温で１５分間発色させた後に４０５ｎｍの吸光度をＢｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｐｌｕｓにて測定した。【０１１６】２．９  抗ヒトＭｐｌ一本鎖抗体のＴＰＯ様アゴニスト活性の評価
ＴＰＯ依存性増殖を示すＢａＦ３−ｈｕｍａｎ  Ｍｐｌを用いてＴＰＯ用アゴニスト活性を評価した。各細胞を１％  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で２回洗浄した後、４ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０％  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍを含むＲＰＭＩ１６４０に懸濁し、６０μＬ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに分注した。ｒｈＴＰＯ（Ｒ＆Ｄ社製）、ＣＯＳ７培養上清または精製品の濃度を振り、各ｗｅｌｌに４０μＬ加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下で、２４時間培養した。１０μＬ／ｗｅｌｌでＷＳＴ−８試薬（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＳＦ、ナカライテスク社製）を加え、直後にＢｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｐｌｕｓを用いて４５０ｎｍの吸光度（対照６５５ｎｍ）を測定し、２時間培養後に、再度４５０ｎｍの吸光度（対照６５５ｎｍ）を測定した。ＷＳＴ−８試薬は生細胞数に応じて４５０ｎｍの発色反応を呈することから、２時間の吸光度変化を指標にＴＰＯ様アゴニスト活性を評価した。また、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いてＥＣ５０値を算出した。【０１１７】  精製したＶＡ１３０  ＩｇＧ、ＶＡ１３０  ＤｉａｂｏｄｙおよびＶＡ１３０  ｓｃ（Ｆｖ）２を使用して、ＢａＦ３−ｈｕｍａｎ  Ｍｐｌ、を用いてＴＰＯ様アゴニスト活性を評価した結果を図３に示す。【０１１８】  ＶＡ１３０  ＩｇＧは、全くアゴニスト活性が見られない（ＢａＦ３−ｈｕｍａｎ  Ｍｐｌ  ＥＣ５０：＞１００ｎＭ）のに対して、低分子化抗体に変換することにより、ＶＡ１３０  ＤｉａｂｏｄｙおよびＶＡ１３０  ｓｃ（Ｆｖ）２ではアゴニスト活性（ＢａＦ３−ｈｕｍａｎ  Ｍｐｌ  ＥＣ５０：それぞれ２２２ｐＭ，１０２３ｐＭ）が検出された。また、ＶＡ１３０，ＶＢ１６，ＶＢ１５７の活性評価について表１に示した。ＶＢ１６，ＶＢ１５７もＶＡ１３０と同様にＩｇＧで強い結合活性を示し、アゴニスト活性は検出されないものの、低分子化抗体に変換することにより、アゴニスト活性が認められる性質を持つことが分かった。【０１１９】  この結果から、アゴニスト抗体の創製において、ハイブリドーマが産生するＩｇＧを用いたアゴニスト活性を指標にしたスクリーニングは重要ではなく、受容体に結合する抗体を低分子化抗体に変換することによりアゴニスト抗体をスクリーニングすることが重要であるといえる。【０１２０】［表１］
ＶＡ１３０，ＶＢ１６，ＶＢ１５７の活性結果
【表１】
2005056602.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【０１２１】  全長抗体を改変する前にアゴニスト活性を測定し、その時点でアゴニスト活性がない抗体を除外するという従来のスクリーニング方法では、改変前にアゴニスト活性を有していないものは、その時点で除外され、活性のあるもののみが改変されていた。その場合には、低分子に改変することによって初めてアゴニスト活性を有するようになる抗体を見出すことは不可能であるため、結果として、そのような抗体由来の低分子化抗体も選択されることはなかった。本発明者らは、それらの完全長ではアゴニスト活性が弱いか、あるいはほとんど検出されないものでも、低分子化することによって、活性を上昇させることが可能であることを見出した。【０１２２】  一方、当方法によるスクリーニング法であれば、抗体の改変前にはアゴニスト活性を指標として選択を行わないため、全長ではアゴニスト活性が検出されないか、あるいは活性が弱い抗体も除外されない。従って、従来の方法では見落とされていた潜在的に活性上昇の能力を持つ抗体を見出すことが可能となる。
【図１】
2005056602.tif 000003
【図２】
2005056602.tif 000004
【図３】
2005056602.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成19年12月6日(2007.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート（MTX）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター（pcDなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
なお、抗体の精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
COS7細胞を用いた一本鎖抗体の一過性発現は次のようにして行った。発現ベクター（10μg）とPBSに懸濁したCOS7細胞（1×107細胞/mL）の0.75mLを混合したものを氷上で10分間冷却し、キュベットに移した後に1.5kV、25μFDの容量にてパルスを与えた。室温にて10分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、10% FBSを含むDMEM培地（Invitrogen社製）に加え、一晩培養した後に、PBSで洗浄後にCHO-S-SFMII培地を加えて約3日間培養した。VA130 Diabodyは、この方法で培養上清を調製した。
【国際調査報告】
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