(57)【要約】  粒子担体からの粒子核成分の流出を防止し、生理活性物質を安定に結合できる粒子担体を提供することを目的とする。本発明は、磁性体を含む粒子核成分が銀で被覆されてなる銀被覆磁性粒子に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性体を含む粒子核成分が銀で被覆されてなる銀被覆磁性粒子。
【請求項２】
粒子核成分が、強磁性体、強磁性体を含む合金またはこれらを含む高分子材料を含む、請求項１記載の銀被覆磁性粒子。
【請求項３】
表面にアフィニティーリガンドを有する、請求項１または２記載の銀被覆磁性粒子。
【請求項４】
表面に生体物質または生理活性物質が結合した、請求項１〜３のいずれか１項記載の銀被覆磁性粒子。
【請求項５】
表面にペプチド、核酸、糖質および脂質からなる群から選択される生体物質が結合した、請求項４記載の銀被覆磁性粒子。
【請求項６】
表面に生体物質または生理活性物質が結合した銀被覆粒子。
【請求項７】
生体物質がアフィニティーリガンドを介して粒子表面に結合している、請求項６記載の銀被覆粒子。
【請求項８】
表面にペプチド、核酸、糖質および脂質からなる群から選択される生体物質が結合している、請求項６または７記載の銀被覆粒子。
【請求項９】
生体物質または生理活性物質を結合するための、銀被覆粒子。
【請求項１０】
酵素がその表面に結合した銀被覆粒子を用いて酵素反応を行う方法。
【請求項１１】
生体物質がその表面に結合した銀被覆粒子を用いて、該生体物質と相互作用する物質を検出する方法。
【請求項１２】
混合物から目的の物質を分離する方法であって、該目的の物質を結合する物質をその表面に有する銀被覆粒子を用いることを特徴とする、前記方法。
【請求項１３】
生体物質または生理活性物質を銀被覆粒子の表面に結合させることにより、該生体物質または生理活性物質を保存する方法。
【請求項１４】
銀被覆粒子の核成分が磁性体を含む、請求項１０〜１３のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、銀被覆粒子、生体物質または生理活性物質が結合した銀被覆粒子、銀被覆粒子を用いて酵素反応を行う方法、ならびに銀被覆粒子を用いて物質を分離、検出または保存する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、核酸、ペプチド、糖質および脂質などを含有する試料から、目的とする生体物質を単離する方法が種々検討されている。かかる方法としては、有機溶媒を用いて抽出分離する方法、分子ふるい（フィルター）を用いて分子の大きさを基に目的物質を単離する方法、特定の生体物質が可逆的に結合し得る担体を利用して単離する方法などが知られている。中でも粒子担体を利用して単離する方法は、多数の試料を同時に扱う際に利点が多い（例えば、特許文献１）。また、粒子担体に酵素を結合させて酵素反応を行い、反応終了後、担体に結合した酵素を分離・回収して再利用することもできるため、粒子担体は、酵素反応においても有用である。【０００３】
上記のような粒子担体の中でも、磁性を有する粒子担体（磁性粒子）は、磁場を与えることで簡便に回収できるため、遠心分離機などの装置が不要であり、利便性に優れている（例えば、特許文献２）。磁性粒子の使用にあたっては、粒子から磁性体成分が流出することにより反応系が汚染され、生体物質または生理活性物質の活性が阻害されることが問題であった。このような磁性体成分の流出防止には、もっぱらポリマーによる被覆技術が利用されてきた。しかし、ポリマーによって被覆された粒子担体においては、目的とする物質以外の物質が吸着するという非特異的吸着の問題があった。また、磁性体成分の流出を十分に防止することはできなかった。磁性体を金で被覆した微粒子（例えば、非特許文献１）についても磁性体成分の流出を十分に防止することが難しく、さらに、金表面への生体分子の非特異的吸着などを低減する効果も低かった。【０００４】
一方、導電性材料または電磁波シールド材料として、銀で被覆した粒子の使用が報告されている（例えば、特許文献３および４）。しかし、銀で被覆した粒子を生体物質や生理活性物質を結合させる目的で利用した例はない。
【特許文献１】特開２００３−１１６５１５号公報
【特許文献２】特開平７−８２３０２号公報
【特許文献３】特開平４−９７９１２号公報
【特許文献４】特開平２−１１８０７９号公報
【非特許文献１】IEEE.Transaction on Magnetics, Vol. 35, No. 5 (1999), p3496-3498
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、粒子担体からの粒子核成分の流出を防止し、生体物質または生理活性物質を安定に結合できる粒子担体を提供することを目的とする。
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、粒子核成分を銀で被覆することにより、粒子核成分の流出を防止できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
【０００８】
（１）磁性体を含む粒子核成分が銀で被覆されてなる銀被覆磁性粒子。
【０００９】
（２）粒子核成分が、強磁性体、強磁性体を含む合金またはこれらを含む高分子材料を含む、（１）記載の銀被覆磁性粒子。
【００１０】
（３）表面にアフィニティーリガンドを有する、（１）または（２）記載の銀被覆磁性粒子。
【００１１】
（４）表面に生体物質または生理活性物質が結合した、（１）〜（３）のいずれかに記載の銀被覆磁性粒子。
【００１２】
（５）表面にペプチド、核酸、糖質および脂質からなる群から選択される生体物質が結合した、（４）記載の銀被覆磁性粒子。
【００１３】
（６）表面に生体物質または生理活性物質が結合した銀被覆粒子。
【００１４】
（７）生体物質がアフィニティーリガンドを介して粒子表面に結合している、（６）記載の銀被覆粒子。
【００１５】
（８）表面にペプチド、核酸、糖質および脂質からなる群から選択される生体物質が結合した、（６）または（７）記載の銀被覆粒子。
【００１６】
（９）生体物質または生理活性物質を結合するための、銀被覆粒子。
【００１７】
（１０）酵素がその表面に結合した銀被覆粒子を用いて酵素反応を行う方法。
【００１８】
（１１）生体物質がその表面に結合した銀被覆粒子を用いて、該生体物質と相互作用する物質を検出する方法。
【００１９】
（１２）混合物から目的の物質を分離する方法であって、該目的の物質を結合する物質をその表面に有する銀被覆粒子を用いることを特徴とする、前記方法。
【００２０】
（１３）生体物質または生理活性物質を銀被覆粒子の表面に結合させることにより、該生体物質または生理活性物質を保存する方法。
【００２１】
（１４）銀被覆粒子の核成分が磁性体を含む、（１０）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
【００２２】
本発明により、粒子担体からの粒子核成分の流出が防止され、生体物質または生理活性物質を安定に結合できる粒子担体が提供される。
【００２３】
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願第２００５−１４９９３８号の明細書、請求の範囲および／または図面に記載された内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】銀被覆を有しない磁性粒子の存在下でペプチドをインキュベートした場合のＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図２】銀被覆を有しない磁性粒子の存在下でペプチドをインキュベートした場合のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳのスペクトルを示す。
【図３】銀被覆磁性粒子または銀被覆を有しない磁性粒子の存在下におけるペプチドの切断率と時間の関係を示す。
【図４ａ】銀被覆磁性粒子の存在下でインキュベートしたペプチド溶液のＨＰＬＣチャートを示す。
【図４ｂ】銀被覆磁性粒子の存在下でインキュベートしたペプチド溶液のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルを示す。
【図５】ＭＢＰ−ＧａｌＴ結合銀被覆磁性粒子およびＵＤＰ−Ｇａｌの存在下、糖ペプチドをインキュベートした場合の、インキュベーション時間とガラクトースの転移率の関係を示す。
【図６】ＭＢＰ−ＧａｌＴ結合銀被覆磁性粒子およびＵＤＰ−Ｇａｌの存在下、糖ペプチドをインキュベートした場合の、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルの変化を示す。
【図７】本発明の銀被覆粒子の模式図を示す。（ａ）は、粒子核成分が銀で被覆された銀被覆粒子を示す。（ｂ）は、生体物質が結合した銀被覆粒子を示す。（ｃ）は、表面にアフィニティーリガンドを有する銀被覆粒子を示す。（ｄ）は、生体物質がアフィニティーリガンドを介して結合した銀被覆粒子を示す。（ｅ）は、粒子核成分を含む粒子全体が銀からなる粒子にアフィニティーリガンドが結合した粒子を示す。
【符号の説明】
【００２５】
１・・・銀被覆層、２・・・粒子核成分、３・・・生体物質、４・・・アフィニティーリガンド、５・・・銀からなる粒子核成分
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の銀被覆粒子は、粒子核成分が銀で被覆された粒子である。核成分は、粒子を実質的に構成する成分であって、銀被覆層以外の成分である。粒子核成分としては、当技術分野で通常用いられるものを使用でき、特に制限されず、無機材料および有機材料のいずれも使用できる。【００２７】
無機材料としては、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、コバルト、モリブデン、クロム、白金、チタンおよびニッケル等の金属、ステンレス、ハステロイ、インコネル、モネルおよびジュラルミン等の合金、マグネタイトおよびフェライト等の金属酸化物、上記金属とセラミックスとの積層体、シリコン、シリカ、ガラス、溶融石英、合成石英、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライトならびに感光性ガラス等が挙げられる。【００２８】
有機材料としては、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）およびポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）などのフッ素樹脂、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブテン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリビニルアルコールおよびポリ酢酸ビニルなどのポリオレフィン、ナイロン（例えば、ナイロン６、ナイロン６６、ナイロン１１、ナイロン１２、ナイロンＭＸＤ６）などのポリアミド、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレートおよびポリトリメチレンテレフタレートなどのポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ乳酸、ＡＢＳ樹脂（Ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ Ｂｕｔａｄｉｅｎｅ Ｓｔｙｒｅｎｅ樹脂）、アクリル樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂およびエポキシ樹脂などの高分子材料が挙げられる。【００２９】
本発明においては、粒子核成分は、磁性体を含む成分が好ましい。磁性体を含む成分としては、強磁性体を含む成分が好ましい。強磁性体としては、鉄、コバルト、ニッケル、ガドリウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウムおよびツリウム、ならびにこれらを含む合金（例えば、鉄−コバルト合金）、酸化物および複合酸化物（例えば、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）、マグヘマイト（γ−Ｆｅ２Ｏ３）、マンガン亜鉛フェライト（Ｍｎ１−ｘＺｎｘＦｅ２Ｏ４）、バリウムフェライト粒子（ＢａＦｅ１２Ｏ１９））が挙げられる。磁性体を含む成分は、上記磁性体を含む高分子材料の形態とすることもできる。高分子材料としては、上記と同様のものを使用できる。本発明においては、磁性体を含む粒子核成分が銀で被覆されてなる粒子を、銀被覆磁性粒子と称し、本発明において銀被覆粒子には、銀被覆磁性粒子も包含される。また銀被覆粒子には、粒子核成分を含めた粒子全体が銀で構成される粒子も包含される。粒子核成分として磁性体を含む粒子は、磁石と組み合わせることにより、簡便に操作することができるため有利である。【００３０】
本発明の銀被覆粒子は、上記粒子核成分が銀で被覆されていることを特徴とする。核成分を銀で被覆する方法としては、当技術分野で通常用いられている方法を使用でき特に制限されない。例えば、粒子核成分からなる粒子を無電解めっき処理に付すことによって実施することができる。無電解めっき処理としては、（１）錯化剤、還元剤等を含む溶液中に粒子を浸漬し銀イオンを含む溶液を滴下する方法、（２）銀イオン、錯化剤等を含む溶液に粒子を浸漬し還元剤溶液を滴下する方法、（３）銀イオン、錯化剤、還元剤等を含む溶液に浸漬し苛性アルカリを滴下する方法等が用いられる。【００３１】
銀イオンを含む溶液としては、例えば、硝酸銀溶液、硫酸銀溶液、酢酸銀溶液、銀を硝酸に溶解した溶液、銀を硫酸に溶解した溶液等が用いられる。錯化剤としては、アンモニアおよび／またはエチレンジアミン四酢酸、ニトロ三酢酸、トリエチレンテトラミン六酢酸等の塩類が用いられ、還元剤としては、ホルマリン、ヒドラジンおよびその誘導体、酒石酸、ブドウ糖、アルキルメルカプタンおよびその誘導体、ならびにアリルメルカプタンおよびその誘導体等が用いられる。【００３２】
磁性体としてマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）を含む核成分が銀で被覆された粒子の製造方法の一実施態様を以下に示す。【００３３】
マグネタイト粒子の調製：１０ｇの硫酸化第一鉄(ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ)を１００ｍｌの蒸留水に溶解する。この硫酸第一鉄と等モルの水酸化ナトリウムを５０ｍｌの蒸留水に溶解する。次に硫酸化第一鉄水溶液に水酸化ナトリウム水溶液を撹拌しながらゆっくり滴下し水酸化第一鉄の沈殿物を生成させる。滴下後、撹拌しながらこの懸濁液の温度を８５℃まで上げその後２００Ｌ／ｈｒの速度でエアーポンプを使用して空気を吹き込みながら８時間酸化してマグネタイト粒子を生成させる。【００３４】
銀被覆粒子の調製：マグネタイト粒子１０ｇとドデシル硫酸ナトリウム０．１ｇを蒸留水３０ｍｌに加えた均一な分散液に、硝酸銀０．７５ｇを加え、１０％アンモニア水でｐＨ８に調製する。この懸濁液を６０℃まで昇温した後、３６％ホルムアルデヒド溶液１ｍｌを滴下し２時間攪拌する。微粒子をろ取洗浄した後、１００℃で３時間乾燥する。得られる微粒子の銀被覆量は約５質量％である。【００３５】
本発明の銀被覆粒子において、銀の被覆量は、通常０．１〜２０質量％、好ましくは１〜１０質量％である。上記の被覆量とすることにより銀イオンの溶出を確実に防止することができるとともに、磁性体としての能力も効果的に維持することができる。本発明の銀被覆粒子の平均粒径は、通常０．０５〜２０μｍ、好ましくは０．１〜１０μｍである。【００３６】
粒子を銀で被覆することにより、粒子核成分の流出を効果的に防止することができる。また、銀は他の金属に比べ、安定であり副反応の原因となりにくいという特徴を有する。さらに、銀は殺菌効果があるため、生体物質を取り扱う場合その微生物分解を防ぐことができる。たとえ銀イオンが溶出した場合も塩化物イオンを添加することにより極めて簡便に沈澱処理・分離することが可能である。また、他の金属被覆等と比較して非特異的吸着が極めて少ないという利点を併せ持つ。【００３７】
従って、本発明の銀被覆粒子は、生体物質または生理活性物質をその表面に結合するために好適である。生理活性物質には、生体内において生物学的活性を有する各種薬剤が含まれ、例えば、細胞内または細胞膜にあるレセプターと特異的に結合して生物学的活性を生じる化合物などが挙げられる。生体物質には、ペプチド、核酸、脂質、糖質、細胞およびウイルス小胞等が包含される。ペプチドには、オリゴペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質、ならびにペプチド誘導体が包含される。タンパク質には、抗体、酵素およびレセプター等が包含される。ペプチド誘導体としては、その他のペプチドと融合した融合ペプチド、糖ペプチド、ポリエチレングリコールなどのポリマーに結合させた化学修飾ペプチド、および翻訳後修飾されたペプチドなどが含まれる。ペプチドの翻訳後修飾としては、リン酸化、アセチル化、メチル化、ミリストイル化、グリコシル化、アミド化およびユビキチン化などが挙げられる。核酸には、ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびに１本鎖核酸および２本鎖核酸が包含される。糖質には単糖、オリゴ糖、多糖、糖脂質、糖ペプチド、糖タンパク質、配糖体等が包含される。細胞およびウイルス小胞等には細胞内小器官、菌類、リポソーム等が包含される。【００３８】
生体物質または生理活性物質は、当技術分野で通常用いられる方法により、銀被覆粒子に結合させることができる。結合は、共有結合でもよく、静電結合などの非共有結合でもよい。例えば、生体物質または生理活性物質と反応性の化学修飾基を粒子表面に導入し、該化学修飾基を介して生体物質または生理活性物質を粒子表面に結合させることができる。粒子表面に導入する化学修飾基としては、例えば、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ホルミル基、ヒドロキシル基および活性化エステル基が挙げられる。また、ニッケルキレート、コバルトキレート等の金属キレート基を導入することも有効である。金属キレート基はペプチドの結合に好適である。化学修飾基は、スペーサーを介して粒子表面に導入してもよい。【００３９】
生体物質は、アフィニティーリガンドを介して粒子表面に結合させることもできる。従って、本発明はまた、粒子表面にアフィニティーリガンドを有する銀被覆粒子、ならびに生体物質がアフィニティーリガンドを介して粒子表面に結合した銀被覆粒子に関する。アフィニティーリガンドは、目的の生体物質を吸着する性質を有する物質であり、当業者であれば粒子に結合させようとする物質の種類により適宜選択できる。アフィニティーリガンドの具体例としては、例えば、アミロース、抗体、ヒスチジンタグ、シランカップリング剤、ニトロセルロースなどのセルロース誘導体、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリエチレンイミン等）、反応性末端を有するリンカー分子等が挙げられる。【００４０】
本発明はまた、酵素がその表面に結合した銀被覆粒子を用いて酵素反応を行う方法に関する。本発明の方法は、通常、酵素結合銀被覆粒子を基質と接触させる工程、酵素結合銀被覆粒子を反応系から分離する工程を含む。酵素結合銀被覆粒子の反応系からの分離は、ろ過、遠心分離または磁石を用いる方法により実施できる。核成分に磁性体を含む銀被覆粒子の場合は、磁石を用いる方法により遠心分離等を実施することなく粒子をより簡便に分離できる。分離した酵素結合銀被覆粒子は、再度、酵素反応に使用することができるためコストの面からも有利である。【００４１】
本発明の銀被覆粒子を用いた酵素反応では、粒子核成分の反応系への流出が防止されるため、当該成分によって酵素が分解されたり、酵素反応が阻害されたりすることがなく、特に核成分にペプチドを分解する活性を有する磁性体、例えばマグネタイトを含む粒子を用いる場合に有利である。また銀は安定であり副反応の原因となりにくいため、酵素反応が阻害されることもない。【００４２】
本発明の酵素反応に使用できる酵素は、特に制限されず、転移酵素、酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、リガーゼのいずれも使用できる。例えば、転移酵素としては、糖転移酵素、具体的には、シアル酸転移酵素、ガラクトース転移酵素、Ｎ-アセチルグルコサミン転移酵素、Ｎ-アセチルガラクトサミン転移酵素、マンノース転移酵素、グルコース転移酵素、フコース転移酵素、キシロース転移酵素、グルクロン酸転移酵素糖等が挙げられる。【００４３】
本発明はまた、混合物から目的の物質を分離する方法であって、該目的の物質を結合する物質をその表面に有する銀被覆粒子を用いることを特徴とする方法に関する。目的の物質を結合する物質としては、目的の物質と特異的に相互作用して結合する物質および目的の物質を吸着する物質が挙げられる。特異的相互作用としては、抗原抗体反応、アビジン−ビオチンの結合反応、酵素と基質の結合反応、核酸相補鎖間のハイブリダイゼーション、リガンドとレセプターの結合反応、核酸と転写因子の結合反応および細胞接着因子の結合反応、カルボニル基とオキシアミノ基またはヒドラジド基との結合形成反応等が挙げられる。目的の物質を吸着する物質としては、上記アフィニティーリガンドなどが挙げられる。本発明においては、目的の物質を結合するアフィニティーリガンド、例えばアミロースをその表面に有する銀被覆粒子を用いるのが好ましい。【００４４】
分離する対象となる混合物としては、銀被覆粒子に結合した物質と結合しうる物質を含みうるものであれば特に制限されないが、例えば、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられる。【００４５】
本発明の分離方法は、目的の物質を結合する物質をその表面に有する銀被覆粒子と混合物とを接触させる工程、および目的の物質が結合した銀被覆粒子を分離する工程を含む。粒子の分離は、酵素結合銀被覆粒子の場合と同様に、ろ過、遠心分離および磁石を用いる方法等により実施できる。銀被覆粒子は非特異的吸着が極めて少ないため、本発明の分離方法では目的の物質のみを分離でき、選択性に優れている。【００４６】
本発明はまた、生体物質がその表面に結合した銀被覆粒子を用いて、該生体物質と相互作用する物質を検出する方法に関する。生体物質の相互作用としては、抗原抗体反応、アビジン−ビオチンの結合反応、酵素と基質の結合反応、核酸相補鎖間のハイブリダイゼーション、リガンドとレセプターの結合反応、核酸と転写因子の結合反応および細胞接着因子の結合反応等の特異的相互作用が挙げられる。本発明の検出方法は、生体物質がその表面に結合した銀被覆粒子を試料と接触させる工程、および銀被覆粒子上の生体物質と相互作用した物質を検出する工程を含む。本発明の検出方法により、銀被覆粒子に結合させた生体物質と相互作用する物質をスクリーニングすることもできる。ここで用いる試料としては、特に制限されないが、例えば、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられる。【００４７】
特異的相互作用は、例えば、当技術分野で通常用いられる方法によって検出できる。例えば、質量分析法や標識を用いる方法が挙げられる。標識を用いる方法としては、放射性同位元素、酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよびルシフェラーゼ、ならびに蛍光剤、例えば、フルオレセイン、ローダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、化学発光分子等が挙げられる。また、免疫沈降法によって検出することもできる。質量分析法としては、例えば、ＴＯＦ−ＭＳ法を使用できる。【００４８】
銀被覆粒子は非特異的吸着が極めて少ないため、本発明の検出方法では目的の相互作用のみを検出することができ、選択性に優れている。【００４９】
本発明はまた、銀被覆粒子の表面に生体物質または生理活性物質を結合することにより、該生体物質または生理活性物質を保存する方法に関する。銀被覆粒子においては、粒子核成分の流出が防止され、また、銀は安定であるとともに副反応の原因となりにくいため、粒子に結合した生体物質または生理活性物質が保存中に分解することもない。また、銀は殺菌効果があるため、生体物質または生理活性物質の微生物による分解を防止することもできる。本発明の保存方法においては、生体物質または生理活性物質を結合させた銀被覆粒子を不凍液などの保存液中で保存するのが好ましい。
【実施例】
【００５０】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例の範囲に限定されるものではない。【００５１】
（比較例）表面にアミロースを有する磁性粒子によるペプチド鎖の切断
アミロースに吸着するペプチド（Ｍａｓｔｏｐａｒａｎ（Ｐｏｌｉｓｔｅｓ）：ＶＤＷＫＫＩＧＱＨＩＬＳＶＬ−ＮＨ２）０．１ｍＭを、アフィニティーリガンドとして表面にアミロースを有する磁性粒子（ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＭＢＰ−磁性ビーズ、東洋紡績製）５０ｍｇを含む５００μｌの１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ７．４、０．１％ＮａＮ３、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００）中、４８時間室温でインキュベートした。ペプチドのＨＰＬＣ分析の結果を図１に示す。その時のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳのスペクトルを図２に示す。矢印で示した部分がペプチドが切断されて生じたフラグメントを表している。【００５２】
上記の結果から、従来の銀被覆を有しない磁性粒子では、粒子核成分であるマグネタイトが溶出し、そのマグネタイトの作用によってペプチドが切断されることがわかる。【００５３】
（実施例１）従来の磁性粒子と銀被覆磁性粒子の比較
比較例１と同様の条件で、ペプチド（ＶＤＷＫＫＩＧＱＨＩＬＳＶＬ−ＮＨ２）を、アフィニティーリガンドとして表面にアミロースを有する各種磁性粒子の存在下、約４日間インキュベートした。用いた磁性粒子を表１に示す。
【表１】
2006126504.tif 000002
【００５４】
ＨＰＬＣの分析結果から求めたペプチドの切断率と時間の関係を図３に示す。図３から従来の磁性粒子よりも銀を被覆した磁性粒子を用いる方が、ペプチドが切断されにくく、いずれの粒子も存在しないコントロールに近い値を示していることが分かる。【００５５】
図４ａおよび図４ｂに銀被覆磁性粒子２の存在下、２日間インキュベートしたペプチド溶液のＨＰＬＣチャートとＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルをそれぞれ示す。図から、銀被覆磁性粒子の存在下でインキュベートしたペプチドは、４日後においてもほとんど切断されていないことが分かる。また、銀被覆磁性粒子１を用いた場合も銀被覆磁性粒子２を用いた場合とほぼ同様な結果であった。【００５６】
上記の結果は、銀を被覆した磁性粒子では、核成分であるマグネタイトが溶出しにくく、ペプチドが切断されにくいことを示している。【００５７】
（実施例２）固定化ガラクトース転移酵素を用いた糖ペプチドに対するガラクトースの伸長反応
０．１ｍＭの糖ペプチド（ｄＷｄＫｄＫＧＥ（ＧｌｃＮＡｃ）ｄＨｄＬｄＳｄＶｄＬ−ＮＨ２）（ここでｄＷはＴｒｐのＤ体を表す）を、約３６μｇのＭＢＰ−ＧａｌＴ（マルトース結合タンパク質−ガラクトース転移酵素の組換えタンパク質）を結合した銀被覆磁性粒子（２０ｍｇ、実施例１の銀被覆磁性粒子１）および１ｍＭ  ＵＤＰ−Ｇａｌを含む５００μｌの１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．１％ＮａＮ３、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００）中、室温でインキュベートした。【００５８】
図５にインキュベーション時間とガラクトースの転移率を示す。時間経過とともにガラクトースが転移され８時間後にはほぼ１００％の転移率を示した。図６に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルの変化を示す。反応前と反応後ではガラクトースの分子量差にあたる１６２の差のピークが現れることがわかる。これによって銀被覆磁性粒子に結合したガラクトース転移酵素が機能していることが示された。すなわち、本発明の銀被覆磁性粒子では磁性体を含む核成分が流出しにくいため、粒子に結合した酵素が分解されたり、酵素反応が阻害されることなく、酵素反応が進行することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明は、生体分子自動精製装置、生体分子の迅速分析、生体分子および生分解性物質の長期保存、酵素反応における迅速分離精製・繰り返し使用、連続酵素反応自動化装置、糖鎖自動合成装置、分析前処理自動化装置などに適用できる。【００６０】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【図１】
2006126504.tif 000003
【図２】
2006126504.tif 000004
【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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