(57)【要約】本発明は、シノビオリン遺伝子のプロモーターに対するデコイ核酸である。また、シノビオリン遺伝子のプロモーターの転写因子と結合してプロモーター活性を阻害することができるデコイ核酸、並びに以下の（ａ）配列番号１１若しくは１２に示される塩基配列からなるデコイ核酸、又は、（ｂ）配列番号１１若しくは１２に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、プロモーター活性を阻害する機能を有するデコイ核酸である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シノビオリン遺伝子のプロモーターの転写因子と結合してプロモーター活性を阻害することができるデコイ核酸。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のデコイ核酸。
（ａ）配列番号１１若しくは１２に示される塩基配列からなるデコイ核酸
（ｂ）配列番号１１若しくは１２に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、シノビオリン遺伝子のプロモーター活性を阻害する機能を有するデコイ核酸
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のデコイ核酸。
（ａ）配列番号１１及び１２に示される塩基配列からなるデコイ核酸
（ｂ）配列番号１１及び１２に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、シノビオリン遺伝子のプロモーター活性を阻害する機能を有するデコイ核酸
【請求項４】
シノビオリン遺伝子のプロモーター活性を阻害する機能が、シノビオリン遺伝子のプロモーターの転写因子と結合する機能である、請求項２又は３記載の核酸。
【請求項５】
ＥＢＳ、ＳＢＳ及びＡＢＳからなる群から選ばれるいずれかの転写因子結合部位の塩基配列に基づいて設計された請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項６】
滑膜細胞、又は癌細胞にアポトーシスを誘導することができる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸を含む、シノビオリン遺伝子の発現に起因する疾患を治療又は予防するための医薬組成物。
【請求項８】
さらに、薬学的に許容可能なキャリアーを含む、請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
疾患が、関節リウマチ、線維症、癌及び脳神経疾患からなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項７又は８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸を用いて、シノビオリンの転写因子の転写活性を阻害する方法。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸を用いて、シノビオリンのプロモーター活性を阻害する方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸を用いて、シノビオリンのプロモーター活性を阻害することにより、シノビオリンの発現を抑制する方法。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸を用いて、滑膜細胞、又は癌細胞にアポトーシスを誘導する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、シノビオリン遺伝子のプロモーターに対するデコイ核酸に関する。
【背景技術】  関節リウマチ（以下、ＲＡという）は、関節の滑膜組織に異常な増殖が見られる全身性の慢性炎症性疾患である。本発明者は、この滑膜組織の異常増殖に必須の遺伝子としてシノビオリン（Ｓｙｎｏｖｉｏｌｉｎ）遺伝子を同定している（ＷＯ  ０２／０５２００７）。
シノビオリン遺伝子がコードしているシノビオリンは、関節リウマチ患者の滑膜細胞ライブラリーから、抗滑膜細胞抗体を用いた免疫スクリーニングによりクローニングされた膜タンパク質である。シノビオリンをマウスで過剰発現させた場合、関節では、滑膜の増生、骨、軟骨破壊が認められ、関節炎と酷似した症状が確認されたため、軟骨・骨組織の発生、分化、再生および代謝へのシノビオリンの関与が示唆されている。また、最近では、シノビオリンが線維症、癌又は脳神経疾患の発症にも関与することが見出されている（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２００３  Ｖｏｌ．１７：ｐ．２４３６−４９）。
シノビオリンの発現量は上記の疾患において重要であると考えられるため、シノビオリンプロモーターの転写領域を検索するために、マウスシノビオリン遺伝子の上流プロモーター領域を切断して種々の長さを有する断片についてプロモーター活性を調べた結果、そのコア領域が特定され、転写因子と相互作用することが確認されている（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２０００  Ｖｏｌ．１９：ｐ．６５３３−４８）。
【発明の開示】
本発明は、シノビオリン遺伝子のプロモーターの転写調節領域をコードする部位に対するデコイ核酸を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして、シノビオリン遺伝子の上記の部位に対するデコイ核酸を作製することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）シノビオリン遺伝子のプロモーターの転写因子転写因子と結合してプロモーター活性を阻害することができるデコイ核酸。
本発明のデコイ核酸は、例えば以下の（ａ）又は（ｂ）のデコイ核酸を例示することができる。
（ａ）配列番号１１若しくは１２に示される塩基配列からなるデコイ核酸
（ｂ）配列番号１１若しくは１２に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、シノビオリン遺伝子のプロモーター活性を阻害する機能を有するデコイ核酸
また、本発明のデコイ核酸は、例えば以下の（ａ）又は（ｂ）のデコイ核酸を例示することができる。
（ａ）配列番号１１及び１２に示される塩基配列からなるデコイ核酸
（ｂ）配列番号１１及び１２に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、シノビオリン遺伝子のプロモーター活性を阻害する機能を有するデコイ核酸
シノビオリン遺伝子のプロモーター活性を阻害する機能としては、例えばプロモーターの転写因子と結合する機能が挙げられる。
本発明のデコイ核酸は、プロモーターの転写因子の結合部位であるＥＢＳ（Ｅｔｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）、ＳＢＳ（Ｓｐ１  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）及びＡＢＳ（ＡＭＬ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）からなる群から選ばれるいずれかの部位の塩基配列に基づいて設計することができる。
また、本発明のデコイ核酸は、滑膜細胞、又は癌細胞にアポトーシスを誘導することができる。
（２）上記デコイ核酸を含む、シノビオリン遺伝子の発現に起因する疾患を治療又は予防するための医薬組成物。
本発明の医薬組成物は、さらに、薬学的に許容可能なキャリアーを含むものでもよい。本発明の医薬組成物の適用の対象となる疾患としては、例えば、関節リウマチ、線維症、癌及び脳神経疾患からなる群から選ばれる少なくとも１つが挙げられる。
（３）上記デコイ核酸を用いて、シノビオリンの転写因子の転写活性を阻害する方法。
（４）上記デコイ核酸を用いて、シノビオリンのプロモーター活性を阻害する方法。
（５）上記デコイ核酸を用いて、シノビオリンのプロモーター活性を阻害することにより、シノビオリンの発現を抑制する方法。
（６）上記デコイ核酸を用いて、滑膜細胞、又は癌細胞にアポトーシスを誘導する方法。
【図面の簡単な説明】  図１Ａは、切断型シノビオリンプロモーターの活性を示す図である。
図１Ｂは、切断型シノビオリンプロモーターの活性を示す図である。
図１Ｃは、シノビオリンプロモーターのＥｔｓ結合部位及びコア領域を示す図である。
図１Ｄは、プロモーターに変異を導入したときの転写活性を示す図である。
図２Ａは、ゲルシフトアッセイを行なった結果を示す写真である。
図２Ｂは、ゲルシフトアッセイを行なった結果を示す写真である。
図２Ｃは、ゲルシフトアッセイを行なった結果を示す写真である。
図２Ｄは、ゲルシフトアッセイを行なった結果を示す写真である。
図３Ａは、シノビオリンプロモーターの転写活性を示す図である。
図３Ｂは、シノビオリンプロモーターの転写活性を示す図である。
図３Ｃは、ＲＮＡｉを利用してノックアウトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるシノビオリンプロモーターの転写活性を示す図である。
図４Ａは、２．２ｋと１ｋのシノビオリンプロモーターにＬａｃＺを結合したプラスミドの構築図である。
図４Ｂは、マウス胚におけるシノビオリンプロモーターの発現を示す写真である。
図４Ｃは、マウス胚におけるシノビオリンプロモーターの発現を示す写真である。
図５は、デコイ核酸の配列を示す図である。
図６は、滑膜細胞中のシノビオリンの発現抑制確認試験のタイムスケジュールを示す図である。
図７Ａは、ＲＡ滑膜細胞におけるシノビオリンプロモーターの発現を示す写真である。
図７Ｂは、滑膜細胞中のシノビオリンの発現抑制を測定したＷＳＴ−８アッセイの結果を示す図である。
図７Ｃは、滑膜細胞中のシノビオリンの発現をウエスタンブロッティングで確認した結果を示す写真である。
図８Ａは、ルシフェラーゼアッセイを行った結果を示す図である。
図８Ｂは、デコイＯＤＮを利用してシノビオリンをノックダウンしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるアポトーシスを示す写真及びウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
図８Ｃは、ＲＮＡｉを利用してシノビオリンをノックダウンしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるアポトーシスを示す写真及びウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
図９Ａは、ＥＢＳ−１デコイＯＤＮによるシノビオリンの発現抑制を示す写真である。
図９Ｂは、シノビオリンを過剰発現したＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＥＢＳ−１デコイＯＤＮ処理によるアポトーシスを示す。
図１０は、ＥＢＳ−１デコイを用いた、ＲＡ滑膜細胞におけるシノビオリンＲＮＡに対する抑制効果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、シノビオリン遺伝子のプロモーターの転写調節領域をコードする部位に対するデコイ核酸を提供することを特徴とするものである。
１．概要
本発明者は、シノビオリンを中心とした関節リウマチ病態解析を行っている。最近、シノビオリンノックアウトマウスを用いた解析において、ＥＲストレスによるアポトーシス誘導の域値にＥＲＡＤの機能を担うシノビオリンの量が関与していることを見出した。
そこで、アポトーシス誘導の感受性を決定するシノビオリンの量を調節する転写機構を解明するためにプロモーター解析を行い、マウス細胞株及びマウス胚を用いてシノビオリンの構成的発現を担うＥｔｓ結合部位（ＥＢＳ；Ｅｔｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）を同定し、そのエレメントがインビボにおいてシノビオリンの発現に必須であることを証明した。Ｅｔｓは、酵母からヒトまで保存されている転写因子である。Ｅｔｓドメインは、３０種類以上のファミリーを形成し、その多くが分化・増殖・アポトーシスを担う分子の転写活性を担っている（Ｄ．Ｋ．Ｗａｔｏｓｏｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｓｅｔｈ，；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．ｒｅｖｉｅｗ  ｉｓｓｕｅ．Ｄｅｃ  １８；１９（５５）；２０００）。また、ＮＩＨ３Ｔ３細胞において、そのＥＢＳを介しＥｔｓファミリーの一つＧＡＢＰα／β複合体がその転写制御に関与していることを示した。
シノビオリンの発現は、ヘテロノックアウト（ＬａｃＺ  ｋｎｏｃｋ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ）の発現解析、ノーザン、ウエスタンによる解析によればユビキタスであり、多くの細胞においてシノビオリンの発現が必要とされていることが考えられる。このことは、シノビオリンノックアウトマウスが全身性のアポトーシス亢進にて胎生致死であることからも推察される。但し、その発現には強弱があり、特に分泌能力の高い細胞（膵臓、精巣、神経細胞）においてその発現が強い。このことは、一部の細胞においては、シノビオリンの発現が非常に高く要求されていると考えられる。
転写制御機構には、（ｉ）基本転写複合体を含む構成的遺伝子発現と、（ｉｉ）ある刺激に対する誘導的遺伝子発現とがある。シノビオリンのプロモーターにはＴＡＴＡボックス、イニシエーター配列が存在しない。このようなプロモーター構成の場合、ＳＰ１やＥｔｓファミリー等の転写因子がその転写誘導において重要である（Ｒｕｄｇｅ，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．Ｍａｒ  １０；２７４（１）：４５−５５．２００２）。
具体的な転写因子としては、ＧＡＢＰα、ＧＡＢＰβ、ＧＡＢＰαとＧＡＢＰβとの複合体、Ｅｔｓ１、Ｔｅｌ、Ｆｌｉ−１などが挙げられる。
ＧＡＢＰαは、ＥｔｓドメインをもつＥｔｓファミリーの一つであり、４５４アミノ酸を有するタンパク質である。ＧＡＢＰαは、細胞においてユビキタスに発現し、Ｅｔｓドメインを介し、ＧＡＢＰβとヘテロ２量体を形成する。さらに、ＧＡＢＰαは、２つのＥｔｓ結合部位を使用して、ヘテロ４量体を形成することが知られている。また、ターゲット遺伝子の転写制御においていくつかの特徴を有する。まず、ＧＡＢＰαはＥｔｓドメインによるＤＮＡ結合能は有するが、転写活性化能は有しない。これに対し、ＧＡＢＰβは、ＤＮＡ結合能は有しないが、ＧＡＢＰαと２量体を形成することにより転写活性を誘導し、ヘテロ４量体を形成することによりさらに高い転写活性化能を発揮する（Ｙｕ  Ｍ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｎｏｖ  １４；２７２（４６）：２９０６０−７．１９９７）。また、ＧＡＢＰαは、ＴＡＴＡボックスを持たない遺伝子や、複数の転写開始点をもつ遺伝子の発現においてイニシエーターとして働くことができる（Ｙｕ  Ｍ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｎｏｖ  １４；２７２（４６）：２９０６０−７．１９９７；Ｋａｍｕｒａ  Ｔ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ａｐｒ  ２５；２７２（１７）：１１３６１−８．１９９７）。さらに、ＧＡＢＰαはその発現がユビキタスであるにも関わらず、他の部位に結合するパートナーの転写因子と相乗的に働くことにより、細胞特異的な分化・増殖に関与する遺伝子の発現を担う（Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ  Ｌ，ＥＭＢＯ  Ｊ．Ｊｕｎ  １；１７（１１）：３０７８−９０．１９９８）。
ＧＡＢＰβはＥｔｓファミリーではないが、３８２アミノ酸を有するＧＡＢＰαのコファクターであり、Ａｎｋｙｒｉｎリピート配列を介しＧＡＢＰαとヘテロ２量体を形成し、転写活性ドメインを有する。
Ｅｔｓ１は、１９８３年に鶏に赤芽球症を起こすレトロウイルスＥ２６の癌原遺伝子として発見されたｖ−Ｅｔｓのヒトホモログであり、４４１アミノ酸を有するタンパク質である。
Ｔｅｌは、４５２アミノ酸を有するタンパク質であり、Ｅｔｓファミリーの中でも、転写抑制に働くことが報告されている。臨床的には、ｔ（１２；２１）の染色体転座によりＡＭＬ１と癒合遺伝子を形成し、白血病を起こすことが知られている。
Ｆｌｉ−１は、４５２アミノ酸からなり、ｔ（１１；２２）染色体転座によりＥＷＳと癒合遺伝子を形成し、ユーイング肉腫を起こすことが知られている。
Ｅｔｓファミリーは、酵母からヒトまで保存されたＥｔｓと呼ばれるドメインをもつ転写因子である。このドメインは、３０種類以上のファミリーを形成し、その多くが分化・増殖・アポトーシスを担う分子の転写活性を担っている（Ｄ．Ｋ．Ｗａｔｏｓｏｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｓｅｔｈ，；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．ｒｅｖｉｅｗ  ｉｓｓｕｅ．Ｄｅｃ  １８；１９（５５）；２０００）。
プロモーター領域を得るには、シノビオリン遺伝子又はマウスやヒトゲノム配列等から、制限酵素を用いて切り出す方法がある。しかしながら、一般的に都合のよい制限酵素部位が適切な位置に存在するとは限らないため、予め制限酵素認識部位を設けたプライマーを用いることにより、ＰＣＲで所望のプロモーター領域を増幅することにより得ることができる。また、既に判明しているプロモーター領域の塩基配列情報をもとにして、所望のプロモーター領域を化学合成することも可能である。このようにして、転写因子結合部位としてＥＢＳの他にＡＢＳ及びＳＢＳの存在が示唆される。実際に転写因子がその部位に結合するかどうかは、それぞれの部位を変異させ、その転写活性が低下することや、ゲルシフトアッセイ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｓｈｉｆｔ  ａｓｓａｙ：ＥＭＳＡ）で解析して、転写因子が元来のプローブには結合するが、一塩基変異導入後では結合しないことを確認することにより判断する。
ここで、配列番号１にマウスシノビオリン遺伝子の全長プロモーター配列を、配列番号２にヒトシノビオリン遺伝子の全長プロモーター配列を例示する。
また、配列番号８にプロモーターコア領域であるＥＢＳ−１をコードする塩基配列を、配列番号９にＡＢＳ−１をコードする塩基配列を、配列番号１０にＳＢＳ−１をコードする塩基配列を示す。
２．デコイ核酸
本発明は、上記転写因子に結合し、プロモーター活性を抑制することができるデコイ核酸（デコイオリゴヌクレオチド）である。本発明のデコイ核酸は、転写因子の結合部位を含む短いおとり核酸を意味し、この核酸を細胞内に導入し、転写因子がこの核酸に結合することにより、転写因子の本来のゲノム結合部位への結合が競合的に阻害され、その結果、その転写因子の発現が抑制されるような機能を有する。代表的には、デコイ核酸は核酸又はその類似体であり、標的結合配列に結合しうる核酸配列を少なくとも一つ含む。
本発明の好ましいデコイ核酸の例は、例えばプロモーターのＥＢＳ−１に結合する転写因子と結合し得る核酸、プロモーターのＡＢＳに結合する転写因子と結合し得る核酸、プロモーターのＳＢＳ−１に結合する転写因子と結合し得る核酸、これらの相補体を含むオリゴヌクレオチド、これらの変異体、又はこれらを分子内に含む核酸などが挙げられる。デコイ核酸は、上記ＥＢＳ−１、ＡＢＳ又はＳＢＳ−１の配列をもとに、１本鎖、又はその相補鎖を含む２本鎖として設計することができる。長さは特に限定されるものではなく、１５〜６０塩基、好ましくは２０〜３０塩基である。
本発明においては、例えばＥＢＳ−１に結合する転写因子と結合し得る核酸（配列番号１１）及び／又はその相補鎖（配列番号１２）をデコイ核酸として好ましく使用することができる。
核酸は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、またはその核酸内に修飾された核酸及び／又は擬核酸を含んでいてもよい。またこれらの核酸、その変異体、又はこれらを分子内に含む核酸は、１本鎖又は２本鎖であってもよく、また環状でも線状でもよい。変異体とは、上記デコイ核酸配列の１又は数個（例えば１個〜１０個、１個〜５個又は１個〜２個等）の塩基が、欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつ、シノビオリン遺伝子のプロモーター活性を阻害する機能、すなわち、転写因子と結合する機能を有する核酸をいう。上記塩基配列を１つまたはそれ以上含む核酸であってもよい。
本発明で用いられるデコイ核酸は、当業界で公知の化学合成法又は生化学的合成法を用いて製造することができる。例えば、遺伝子組換え技術として一般的に用いられるＤＮＡ合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となる塩基配列を単離又は合成した後に、ＰＣＲ法又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を使用することもできる。さらに、これらの方法により得られた核酸を、制限酵素等を用いて切断し、ＤＮＡリガーゼを用いて結合することにより所望の核酸を製造してもよい。さらに、細胞内でより安定なデコイ核酸を得るために、塩基等にアルキル化、アシル化等の化学修飾を付加することができる。デコイ核酸の変異体の作製方法は、当業界で公知の方法を用いて、たとえば、部位特異的突然変異誘発法等によって合成することもできる。部位特異的突然変異誘発法は当分野において周知であり、市販のキット、例えばＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等（タカラバイオ社製））を使用することができる。などを用いることができる。
デコイ核酸を使用した場合のプロモーターの転写活性の解析は、一般的に行なわれるルシフェラーゼアッセイ、ゲルシフトアッセイ、ＣＡＴアッセイ、アポトーシスの特異的マーカーであるアネキシンＶを用いた染色方法、ウェスタンブロッティング法、ＦＡＣＳ解析法、ＲＴ−ＰＣＲ等を採用することができる。これらのアッセイを行なうためのキットも市販されている（例えばｐｒｏｍｅｇａ  ｄｕａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ）。
例えばルシフェラーゼアッセイの場合は、目的遺伝子の転写開始点の上流にレポーターとしてホタルルシフェラーゼ遺伝子を連結する。また、アッセイの対象となる細胞間の導入効率を補正するために、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）βガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）遺伝子をレポーターとしてプロモーターの下流につないだベクターを細胞に同時に導入してもよい。細胞への導入は、例えばリン酸カルシウム法等を採用することができる。ベクターを導入した細胞は所定時間培養した後に回収し、凍結−融解等によって細胞を破壊した後、一定量の細胞抽出液を用いてルシフェラーゼ及びβ−ｇａｌ活性を測定する。
これらの解析により、デコイ核酸を使用した場合には、シノビオリンの転写活性が阻害され、滑膜細胞、癌細胞などのアポトーシスが誘導されることが示される。
３．デコイ核酸を含む医薬組成物
本発明は、上記のデコイ核酸を１又はそれ以上含む、シノビオリン遺伝子の発現に起因する疾患を治療又は予防するための医薬組成物に関する。本発明のデコイ核酸は、標的結合配列への結合活性を有する限り、本発明の医薬組成物として用いられる。
本発明の医薬組成物の適用疾患としては、関節リウマチ、線維症、癌及び脳神経疾患などの細胞増殖性疾患及び／又は脳神経疾患が挙げられる。本発明の医薬組成物を疾患に適用するにあたり、上記疾患は単独の場合であっても複数の疾患が併発した場合であってもよい。
本発明の医薬組成物を癌の治療剤として使用する場合は、癌の種類は特に限定されず、脳腫瘍、舌癌、咽頭癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、胆嚢癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、皮膚癌、各種白血病（例えば急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、成人型Ｔ細胞白血病、悪性リンパ腫）等を対象として適用される。
上記癌は、原発巣であっても、転移したものであっても、他の疾患と併発したものであってもよい。
脳神経系疾患としては、例えばアルツハイマー、パーキンソン病、ポリグルタミン病が挙げられる。
本発明の医学的組成物は、デコイが患部の細胞内または目的とする組織の細胞内に取り込まれるような形態で用いられる。
本発明のデコイ核酸を含有する医薬組成物の投与形態は、経口、非経口投与のいずれでも可能である。経口投与の場合は、適当な剤型、例えば錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物により投与が可能である。非経口投与の場合は、経肺剤型（例えばネフライザーなどを用いたもの）、経鼻投与剤型、経皮投与剤型（例えば軟膏、クリーム剤）、注射剤型等が挙げられる。注射剤型の場合は、例えば点滴等の静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等により全身又は局部的に直接的又は間接的に患部に投与することができる。
本発明の医薬組成物を遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の医薬組成物を注射により直接投与する方法のほか、核酸が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。
また、本発明の医薬組成物をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。本発明の医薬組成物を保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例えば静脈内、動脈内等から全身投与する。脳等に局所投与することもできる。本発明の医薬組成物を目的の組織又は器官に導入するために、市販の遺伝子導入キット（例えばアデノエクスプレス：クローンテック社）を用いることもできる。リポソーム構造を形成するための脂質としては、リン脂質、コレステロール類や窒素脂質等が用いられるが、一般に、リン脂質が好適であり、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、リゾレシチン等の天然リン脂質、あるいはこれらを定法に従って水素添加したものが挙げられる。また、ジセチルホスフェート、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、エレオステアロイルホスファチジルコリン、エレオステアロイルホスファチジルエタノールアミン等の合成リン脂質を用いることができる。
リポソームの製造方法は、デコイが保持されるものであれば特に限定されるものではなく、慣用の方法、例えば、逆相蒸発法（Ｓｚｏｋａ、Ｆら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、Ｖｏｌ．６０１  ５５９（１９８０））、エーテル注入法（Ｄｅａｍｅｒ、Ｄ．Ｗ．：Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．３０８  ２５０（１９７８））、界面活性剤法（Ｂｒｕｎｎｅｒ、Ｊら：Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．４５５  ３２２（１９７６））等を用いて製造できる。
これらのリン脂質を含む脂質類は単独で用いることができるが，２種以上を併用することも可能である。このとき、エタノールアミンやコリン等の陽性基をもつ原子団を分子内に有するものを用いることにより、電気的に陰性のデコイ核酸の結合率を増加させることもできる。これらリポソーム形成時の主要リン脂質の他に一般にリポソーム形成用添加剤として知られるコレステロール類、ステアリルアミン、α−トコフェロール等の添加剤を用いることもできる。このようにして得られるリポソームには、患部の細胞又は目的とする組織の細胞内への取り込みを促進するために、膜融合促進物質、例えば、センダイウイルス、不活化センダイウイルス、センダウイルスから精製された膜融合促進タンパク質、ポリエチレングルコール等を添加することができる。
本発明の医薬組成物は、常法にしたがって製剤化することができ、医薬的に許容されるキャリアーを含むものであってもよい。このようなキャリアーは添加物であってもよく、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
上記添加物は、本発明の治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれる。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製されたデコイ核酸を溶剤（例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等）に溶解し、これにＴｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥用賦形剤としては、例えば以下のものが挙げられる。すなわち、マンニトール、ブドウ糖、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール等の糖類、トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモまたは他の植物由来のデンプン等のデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はカルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース、アラビアゴム、トラガカントゴム等のゴム、ゼラチン、コラーゲン等などである。
所望により、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）等の崩壊剤又は可溶化剤を使用することができる。
本発明の医薬組成物の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なる。投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択する。有効投与量は、疾患の徴候又は状態を軽減するデコイ核酸の量である。このような核酸の治療効果及び毒性は、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手順、例えばＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）、あるいはＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的である用量）によって決定され得る。
治療効果と毒性効果との間の用量比は治療係数であり、ＥＤ５０／ＬＤ５０として表され得る。本発明の医薬組成物の投与量は、例えば１回につき体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１００ｍｇ、好ましくは１〜１０μｇである。但し、上記治療剤はこれらの投与量に制限されるものではない。アデノウイルスを投与する場合の投与量は、１日１回あたり１０６〜１０１３個程度であり、１週〜８週間隔で投与される。但し、本発明の医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】  本実施例は、シノビオリンプロモーターの作製のためのプラスミド構築に関する実施例である。
マウス（Ｃ５７Ｂｌ／６系）のゲノムより、シノビオリン遺伝子を含む５’から３’まで約７．５ｋのゲノムをＳｙＢ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした。その後、シノビオリン遺伝子のプロモーター領域をＸｈｏＩとＮｃｏＩで処理し、約２．２ｋの断片を抜き出し、ＰＧＶ−Ｂ２（ＴＯＹＯ  ＩＮＫ  ＧＲＯＵＰ社）の中に挿入した（ＳｙＧ−２．２ｋ）。この約２．２ｋの断片を全長プロモーターとした（配列番号１）。さらに、全長プロモーターの５’側から一部の領域を削除し、プロモーター領域を短くしたコンストラクトを作製した。作製したプロモーターをまとめると表１の通りである。
【表１】
2005093067.tif 000002
なお、ヒトのシノビオリン遺伝子の切断型プロモーターも、マウスの場合と同様に作成することができる（配列番号２）。この場合の切断部位の位置を表２に示す。
【表２】
2005093067.tif 000003
次に上記マウス由来プロモーターの変異体を作製するため、オーバーラップ伸長による部位特異的変異誘発法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１年，ｃｈａｐｔｅｒ  １３）を用いてＳｙＧ−２．２  ｋＧ−７６Ｔ／ＢＶ２を作製した。使用したプライマーを以下に示す。
１．ＥＢＳ−１ｍ（Ｇ−７６Ｔ）：ＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＡＡＧＴＧＡＧＧＴ（配列番号３）
２．ＡＢＳｍ（Ｇ−６８Ｔ）：ＡＡＧＴＧＡＧＴＴＧＴＣＴＴＡＣＣＣＣＣ（配列番号４）
３．ＳＢＳ−１ｍ（Ｇ−９２Ａ，Ｃ−９１Ａ）：ＡＣＴＣＣＧＣＣＡＡＧＣＣＣＣＧＣＧＣＣ（配列番号５）
ＰＣＲは、反応液５０μｌ中、１ｐｍｏｌ  ＳｙＢ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、１００ｐｍｏｌプライマー、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、５Ｕポリメラーゼ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）及び５０ｍＭ  ＫＣｌを含む反応組成液を用いて、以下のＰＣＲ条件で行なった。
ＰＣＲ条件
第一段階：９４℃、１分→（９４℃、３０秒→５５℃、３０秒→７２℃、１分）×２５回
第二段階：１サイクル目：９４℃、１分→５５℃、３０秒→２９分かけて３０℃まで冷やす→３０℃、１分→９分かけて７２℃に→７２℃、１分→（９４℃、３０秒→５５℃、３０秒→７２℃、１分）×２５回
ＥＢＳ−１ｍ（Ｇ−７６Ｔ）は、配列番号１に示す塩基配列の第２１２５番目（ＴＳから上流に向かって７６番目（−７６））のＧをＴに変異させるためのプライマーであり、ＡＢＳｍ（Ｇ−６８Ｔ）は、配列番号１に示す塩基配列の第２１３３番目（ＴＳから上流に向かって６８番目（−６８））のＧをＴに変異させるためのプライマーであり、ＳＢＳ−１ｍ（Ｇ−９２Ａ，Ｃ−９１Ａ）は、配列番号１に示す塩基配列の第２１１２番目（ＴＳから−９１番目）のＣをＡに、かつ、配列番号１に示す塩基配列の第２１１１番目（ＴＳから−９２番目）のＧをＡに変異させるためのプライマーである。
【実施例２】  本実施例は、シノビオリンプロモーターの機能解析に関する実施例である。
シノビオリンの量の調節機構を解明するために、プロモーター解析を行った。なお、シノビオリンは、トランスジェニックマウス（ＬａｃＺ  ｋｎｏｃｋ  ｉｎ）の解析、並びにノーザン及びウエスタンの結果よりユビキタスに発現していることがわかっている。
まず、シノビオリンプロモーターのクローニング後、翻訳開始点より２．２ｋを含む領域をルシフェラーゼベクターに結合させた。様々な細胞（下記）を用いて、上流側から削ったコンストラクションにてその転写活性を調べた。なお、細胞は、１０％不活化ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて培養した。
使用した細胞
ＡＴＤＣ５：マウスｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ細胞ＡＴ８０５由来の亜株。軟骨および色素細胞特異的。アルカリフォスファターゼ陽性。
ＨＥＫ２９３：ヒト胎児腎臓由来細胞
ＮＩＨ３Ｔ３：マウス胎仔由来線維芽細胞
トランスフェクションとレポーターアッセイは以下の通り行なった。
細胞を２×１０４／ウェルにて２４ウェルプレートに準備した。その２４時間後、ＦＵＧＥＮＥ６キットを使用し、キット（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒｏｃｈｅ社）のマニュアルに従って発現した。
またトランスフェクション効率の補正のため、ＣＭＶ−β−ｇａｌを各５０ｎｇ使用し、さらに全ベクターのみを入れて全量を２００ｎｇにそろえた。
トランスフェクション後３０時間でタンパク質を回収した。まず、培地を捨てた後、ＰＢＳで洗い、Ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒＴＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を１００μｌ用いて細胞溶解物を回収した。次にその細胞溶解物の２０μｌを９６ウェルプレートに移した後、ルミノメーターにてルシフェラーゼ活性を測定した。さらに、β−ｇａｌ活性をプレートリーダーにて測定した後、β−ｇａｌ値でＬｕｃ値を割り補正した。なお、β−ｇａｌ染色は以下のとおり行なった。すなわち、β−ガラクトシダーゼはＸ−ｇａｌを用い、染色した（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドＳｉｇｍａ社）。胚を４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定し、Ｘ−ｇａｌ溶液に浸した後、３７℃で１２時間〜２４時間染色した。染色後、ＰＢＳで洗浄し、再度４％パラホルムアルデヒドで固定した。
その結果、−８４から−７３ｂｐの１２塩基においてその転写活性が１０％から３０％に低下した（図１Ａ、Ｂ）。
その領域を含む−１１４から−１においては、マウスとヒトで９４％の相同性を有し、さらに１２塩基においては、１００％の相同性であった。コンピュータを用いたバイオインフォマティクス解析ソフト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｒｃ．ｊｐ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｄｂ／ＴＦＳＥＡＲＣＨＪ．ｈｔｍｌ）にて解析を行った結果、その１２塩基にＥＢＳ（Ｅｔｓ結合部位）が存在することが判明した（図１Ｃ）。
次に本発明者は、その領域を含む前後の領域における転写因子結合配列に変異を導入し、いくつかの細胞系を用いて、その部位の転写に及ぼす影響について検討した。
図１ＤにみられるようにＥＢＳの点変異により、ほぼすべての細胞系にてその活性が約９％から４０％程度に低下した。これらのことから、このＥＢＳは、シノビオリンの構成的発現を担う必須のエレメントであると考えられた（以後ＥＢＳ−１とする）。
【実施例３】  本実施例は、ＥＢＳ−１（−８９から−６５）に結合する転写因子を同定したものである。
Ｅｔｓファミリーは３０種類以上のファミリーを形成し、すべてＤＮＡ結合ドメインであるＥｔｓドメインを有する。またその中心配列はＧＧＡＡであり、その配列への結合にはその配列に続く配列が重要であると考えられている。
まず、その１２塩基配列を含んだプローブを使用し、実際にその配列に転写因子が結合するかどうか検討した。この転写因子の結合試験は、ゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡ）により行った。
ＥＭＳＡは以下の通り行った。
プローブ
ＥＢＳ−１  ＷＴ（−８９から−６５）：ＣＣＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＧＡＡＧＴＧＴ（配列番号６）
ＥＢＳ−１  ＭＴ（−８９から−６５）：ＣＣＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＡＡＧＴＧＴ（配列番号７）
ＥＭＳＡ用のプローブは、２５塩基配列のセンス鎖とアンチセンス鎖を９０℃で１０分アニーリングさせることにより作製した。
次に、Ｔ４ヌクレアーゼキナーゼ、バッファーおよびγ３２Ｐを混合し、混合液を室温で３０分反応させた。反応液をＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に通し、採取されたカラムのフラクションを遠心にて分離し、標識したプローブを得た。放射活性は１μｌあたり３００００ｃｐｍ以上のものを使用した。
１０μｇのタンパク質、反応バッファー及びプローブを混ぜ、室温で３０分反応させた。スーパーシフトの場合は、プローブと反応させる前に１時間４℃で反応させた。その反応液を非変性ゲルにて１００ｖ、５０ｍＡで３時間程度泳動させた。ゲルを乾燥させた後、Ｆｕｊｉ  ＢＡＳ２０００を用いオートラジオグラフィーにて解析した。
その結果、ＮＩＨ３Ｔ３の核抽出液を使用したゲルシフトにより、４つのバンド（図２Ａのａ、ｂ、ｃ、ｄの位置のバンド）が形成されることが判明した。さらにｃｏｌｄ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ（標識していないプローブを用いた競合試験）により、そのすべてのバンドが消失し、１塩基変異を入れたプローブにおいてはその阻害が見られなかった（図２Ａ）。
次に、どのＥｔｓファミリーが結合するかを検討するため、Ｅｔｓ１／Ｐｅａ３、Ｅｔｓプローブのｃｏｌｄ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎを行ったところ、Ｅｔｓ１／Ｐｅａ３のプローブで競合阻害され、その変異によりその阻害が消失した（図２Ｂ、５と６番のレーン）。
このことは、Ｅｔｓ１／Ｐｅａ３プローブ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）に結合する因子であるＥｔｓ１、Ｐｅａ３、ＧＡＢＰα等の転写因子である可能性が考えられた。さらにさまざまな抗体を使用して、スーパーシフト試験を行ったところ、ＧＡＢＰαとＴｅｌがスーパーシフトし、Ｆｌｉ−１は阻害効果を示した（図２Ｂの５，６番のレーン、図２Ｃの６、７、８と１０、１１、１２番のレーン）。また、ＧＡＢＰα、Ｆｌｉ−１、Ｅｔｓ１のインビトロ翻訳産物でゲルシフト試験を行ったところ、そのすべてにスーパーシフトが見られた。これらのことから、この配列には複数のＥｔｓファミリーが結合することが示された。
次に、スーパーシフトしたＧＡＢＰαによるＧＡＢＰβとの複合体形成について検討を行なった。それぞれインビトロ翻訳産物を用い、ゲルシフト試験を行ったところ、ＧＡＢＰαタンパク質にＧＡＢＰβタンパク質を加えたレーン７において、新たなバンドａ、ｂ（複合体）の形成が認められた（図２Ｄ）。さらに、ＧＡＢＰα抗体を加えるとその複合体ａ、ｂが消失しスーパーシフトした（図２Ｄ、レーン８、９）。またＧＡＢＰβ抗体を加えたところ、複合体ａの形成が阻害された（図２Ｄ、レーン１０、１１）。
これらのことから、ＧＡＢＰα／βは、シノビオリンプロモーターのＥＢＳ−１にて複合体を形成することがわかった（図２Ｄ）。
【実施例４】  本実施例は、ＮＩＨ３Ｔ３におけるＥｔｓファミリーによる転写制御およびＧＡＢＰαとＦｌｉ−１、Ｅｔｓ１のシノビオリン転写活性に対する効果を確認したものである。
それぞれＥＢＳ−１に結合する転写因子の細胞内でのシノビオリンの転写活性化能を評価するため、転写活性化アッセイを行った。
（１）ＯＤＮのオリゴ作製と細胞抽出液の作製
２０ヌクレオチド長のオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）は化学合成により得た。ｄｅｃｏｙ（デコイ）ＯＤＮはセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドのアニーリングにより作製した。対数増殖期の細胞をトリプシン処理し、９６−ウェルプレート（１×１０３細胞／ウェル）に移した。２４時間後、１ウェルあたり２０ｐｍｏｌのデコイＯＤＮをウェルに入れ、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いてキットの説明書に従って３日間トランスフェクションを行った。デコイＯＤＮを有する細胞の増殖を決定するために、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）を用いて、キットの説明書に従って細胞増殖アッセイを行った。
（２）ＲＮＡｉのオリゴ作製と細胞抽出液の作製
２１ヌクレオチド長のＲＮＡは化学合成により得た。ｓｉＲＮＡはＥｌｂａｓｈｉｒらのプロトコール（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８．２００１）に従って作製した。対数増殖期の細胞をトリプシン処理し、９６−ウェルプレート（１×１０３細胞／ウェル）に移した。２４時間後、１ウェルあたり２０ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡをウェルに入れ、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてキットの説明書に従って３日間トランスフェクションを行った。ｓｉＲＮＡ細胞の増殖を決定するために、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）を用いて、キットの説明書に従って細胞増殖アッセイを行った（図７Ｂ）。
（３）結果
ＮＩＨ３Ｔ３において、Ｆｌｉ−１はシノビオリン転写活性を抑制し、ＧＡＢＰαはその転写活性を増加させる結果が得られた（図３Ａ、Ｂ）。また、ＧＡＢＰα、ＧＡＢＰβのＲＮＡｉにてノックアウトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞では、シノビオリンの転写も低下が認められた（図３Ｃ）。これらのことからＮＩＨ３Ｔ３において、ＧＡＢＰα／β複合体がシノビオリンの発現を担っていることが考えられた。
さらに、そのＧＡＢＰα／β複合体がＥＢＳ−１を介してシノビオリンの転写活性を担っていることを証明するため、ＥＢＳ−１（Ｇ−７６Ｔ）変異体およびＥＢＳ−１野生型の有するプロモーター（−２００から＋８４３）を使用し転写活性アッセイを行った。
その結果、変異体が全く活性化されないにもかかわらず、野生型では約３倍の転写活性化がみられた。
（４）ウエスタンブロッティング
最後にＮＩＨ３Ｔ３を２００ｎＭのデコイで処理した後、シノビオリンの発現をウエスタンブロッティングにて評価した。
ウエスタンブロッティング解析は以下の通り行った。すなわち、細胞培養物を回収し、１％ＮＰ−４０、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、０．２５％ＳＤＳ、０．０５％２−メルカプトエタノール及び０．１％グリセロールを含む溶液中で溶解させた。透明な細胞溶解物のアリコートをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離した。分離したタンパク質をニトロセルロース膜に移し、抗シノビオリンモノクローナル抗体を用いてイムノブロットを行った。結合した抗体を、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン及びＥＣＬ検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）により検出した。
その結果、ＥＢＳ−１野生型で処理したシノビオリンの発現は約半分に低下した。
これらのデータからＧＡＢＰα／βによりＥＢＳ−１を介して、シノビオリンの転写が制御されていることが示された。
【実施例５】  本実施例は、マウス胚におけるシノビオリンの発現に必須の部位の同定に関するものである。
次に、マウスの胚においてインビボにおけるＥＢＳ−１の効果を確認するため、シノビオリンプロモーターにＬａｃＺを結合したプラスミドを過剰発現させたトランスジェニックマウスを作製した。Ｔｇは全長２．２ｋと１ｋのプロモーターとそれぞれ１塩基変異を入れたプロモーターを過剰発現させた４種類を作製した（図４Ａ）。
トランスジェニック（Ｔｇ）マウス用のコンストラクションとＴｇマウスの作製は以下の通り行なった。
ＳｙＧ−２．２ｋ／ＢＶ２からＮｏｔＩとＮｃｏＩで約２．２ｋの断片を抜き出した後、ＳｙＴＢ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔへ挿入し、ＳｙＬ−２．２ｋｗｔ／Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔを作製した。さらに、ＳｙＬ−２．２ｋｍＧ−７６Ｔ／ｐｂｓ、ＳｙＬ−２００ｗｔ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ及びＳｙＬ−２００ｍＧ−７６Ｔ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを、それぞれＳｙＧより取り出した断片を用いて作製した。各構築物について、それぞれＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用し精製後、ＳｃａＩにて線状化したＤＮＡをＢＤＦマウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＮとＤＢＡ／２Ｎの交配による仔マウス）の受精卵の核内に直接マイクロインジェクションし、仮親の卵管に移植した。それぞれ、８から９母胎より誕生したマウスの尾からゲノムを抽出し、サザンブロット法にてＴｇマウスであることの確認を行った。
これらのＴｇマウスからシノビオリンの発現を検討するため、胚によるＸ−ｇａｌ染色を行った。そのＬａｃＺをノックインしたノックアウトマウスの胚におけるＬａｃＺの発現と今回作製した４つのＴｇマウスの発現を比較検討した。
シノビオリンの１１．５から１４．５ｄ．ｐ．ｃ（ｄａｙｓ  ｐｏｓｔ  ｃｏｉｔｕｓ：胎齢）の胚を使用し、ＬａｃＺ染色を行った。２．２ｋと１ｋのプロモーターを導入したトランスジェニックマウスは、ヘテロノックアウトマウスとほぼ同じ部位に染色がみられた。驚いたことに、１塩基変異を導入した２．２ｋと１ｋのプロモーターを導入したトランスジェニックマウスは、そのどちらも発現部位がその系によりランダムになることが確認された（図４Ｂ）。
転写活性化に必要な領域がなくなると、上記結果と同様の結果が得られることが報告されている（ｐａｘ５、ｃｏｌ１１ａ２等）。これらのことから、ＥＢＳ−１は、シノビオリンの転写に必須の部位であることが判明した。
さらに、その発現とＧＡＢＰαの発現を１３．５ｄ．ｐ．ｃの胚を用いて比較したところ、ほぼ同様の部位に発現していることが判明した（図４Ｃ）。以上の結果より、胚発生においても、インビトロの結果と同様、ＧＡＢＰαがＥＢＳ−１を介してシノビオリンの発現を制御していることが示された。
【実施例６】  本実施例は、ＲＡ滑膜細胞におけるシノビオリンの発現抑制を確認したものである。
関節リウマチの滑膜細胞におけるＥＢＳ−１を介したＧＡＢＰαの効果について検討を行ったところ、滑膜細胞の核抽出液を用いたゲルシフトにおいても、ＮＩＨ３Ｔ３の各抽出液のときと同様にＧＡＢＰαにてスーパーシフトが得られた。さらにそのＥＢＳ−１のリウマチ滑膜細胞における意義、すなわちＧＡＢＰαによるＥＢＳ−１を介した転写制御がシノビオリンの発現抑制につながり、最終的に滑膜細胞の増殖抑制となるかことを確認するため、ＥＢＳ−１デコイによるシノビオリンの発現抑制について検討した。
まず、上記のＥＢＳ−１に結合するＧＡＢＰαと結合するデコイ核酸（配列番号１１、１２）およびネガティブコントロールのデコイ核酸（配列番号１３、１４）も設計した（図５）。２０ヌクレオチド長のＯＤＮは化学合成により得た。デコイＯＤＮはセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドのアニーリングにより作製した。
以下のように、デコイ核酸を細胞に導入した。すなわち、対数増殖期のヒトリウマチ滑膜細胞をトリプシン処理し、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭにて９６ウェルプレートに１．０×１０３細胞／ウェルで培養した。１８〜２４時間後、ＦＣＳ無し、抗生物質無しのＤＭＥＭで一度洗浄し、ＦＣＳ無し、抗生物質無しのＤＭＥＭ９０μＬを添加した。ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ  ４５μＬ、上記のデコイＯＤＮ（２０μＭ）５μｌを混ぜたものをＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ  ５０μＬ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  １μＬを混ぜたものに加え、弱くピペッティングした後１０分間放置した。これを細胞に１０μＬずつまんべんなく添加した。２４時間培養後、ＦＣＳを１０μＬ加え、軽くかき混ぜて放置して３日間トランスフェクションを行った（図６）。この細胞を用いてキットの説明書に従って細胞増殖アッセイに供した。
ＨＲＰ活性の検出にはＥＣＬ  Ｐｌｕｓキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いた。
その結果、約半分にその発現の低下が認められた（図７Ａ）。
上記の細胞を２４時間培養後、ＷＳＴ−８アッセイに供するとともに、この２４時間後細胞破砕液にて細胞を溶解し、ウエスタンブロッティングを行った。ＷＳＴ−８アッセイはＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を用いて上記２４時間培養後の細胞にＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社、ＷＳＴ−８）を添加し、４時間後の吸光度（４５０ｎｍ）を測定して行った。ウエスタンブロッティングは、細胞破砕液１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ４０、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、２μｇ／ｍＬリューペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）、２μｇ／ｍＬアプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）、２μｇ／ｍＬペプスタチン（ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）にて調製後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、エレクトロブロッティング法によりニトロセルロース（ＮＣ）膜に転写した。このＮＣ膜に対し、５％スキムミルクを加えた０．０３％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＴＢＳで室温、１時間ブロッキングした後、抗シノビオリン抗体又は抗βアクチン抗体を０．５％スキムミルクを加えた０．０３％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＴＢＳで室温、１時間免疫反応させた。反応後のＮＣ膜を０．０３％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳで洗浄し、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を２次抗体として、室温、１時間免疫反応させ、０．０３％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳで洗浄し、ＨＲＰ活性を検出することにより目的抗原を検出した。
ＷＳＴ−８アッセイの結果を図７Ｂに、ウエスタンブロッティングの結果を図７Ｃに示す。図７Ｂに示すとおり、スクランブルデコイ核酸導入細胞（ネガティブコントロール）に比べ、ＥＢＳ−１デコイ核酸導入細胞では優位に細胞増殖活性が抑制されており、図７Ｃに見られるとおり、ウエスタンブロッティングにおいてもシノビオリンタンパク質生成量の減少が見られた。
以上の結果から、ＲＡ滑膜細胞において、上記デコイ核酸を用いるとプロモーター活性が抑制されることが示された。
【実施例７】  本実施例は、シノビオリン発現におけるＥＢＳ−１の機能的な効果を確認したものである。
（１）ルシフェラーゼアッセイ
シノビオリン発現におけるＥＢＳ−１の機能的な効果の検討を行った。まず、ＥＢＳ−１（−７７／−７２）を標的とするデコイＯＤＮ（以下、『ＥＢＳ−１デコイ』という）を合成し、このＥＢＳ−１デコイをＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入することにより、シノビオリンの調節におけるＥＢＳ−１デコイの効果をルシフェラーゼアッセイにより確認した。ＦＩＴＣを用いた免疫化学分析により、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入されたＥＢＳ−１デコイの効果は８０％以上であることを確認してからアッセイを行った。
ＮＩＨ３Ｔ３細胞への一過性トランスフェクションを行うため、試料プラスミド（１００ｎｇ）及び内在コントロールＤＮＡ（ＣＭＶ−β−ガラクトシダーゼ発現ベクター５０ｎｇ）をＦＵＧＥＮＥ６ＴＭ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、マニュアル（Ｒｏｃｈｅ社）に従ってトランスフェクションして、２４ウェルプレートに添加した。３０時間培養後、培養液を吸引し、ＰＢＳで洗い、細胞にＰａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒＴＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を１００μＬを加えた。その細胞溶解物の残渣をペレットとして沈殿させ、上清を回収し、すぐにルシフェラーゼ活性及びβ−ｇａｌ活性を測定した。細胞抽出物中のルシフェラーゼ活性を測定するために、細胞溶解液２０μＬをアッセイバッファ（０．２５ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．８）１００μＬに添加した。発光はＭｉｃｏＬｕｍａｔ  Ｐｌｕｓ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ社）で測定した。β−ｇａｌアッセイは以下のとおり行った。すなわち、細胞抽出物７μＬにアッセイバッファ（６０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、４０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ  β−メルカプトエタノール、０．６６５ｍｇ／ｍｌ  ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド）を１００μＬ加えた後、３７℃で３０分間インキュベーションした。１．０Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３を１６０μＬ加えて反応を停止させて、４２０ｎｍで吸光度を測定した。ルシフェラーゼ測定値は全て、プラスミドＣＭＶ−β−ガラクトシダーゼで発現したβ−ガラクトシダーゼに対するトランスフェクション効率で標準化（補正）し、得られた値を相対ルシフェラーゼ活性とした。さらに、これらの値をＳｙＧ−２００／＋８４３に対して相対化し、平均を求めた。
その結果、ＥＢＳ−１デコイを導入した細胞の抽出物を用いたルシフェラーゼアッセイでは、トランスフェクション試薬のみの場合と比べて、ＥＢＳ−１デコイでは、２８．４％まで低下しており、それにより、転写が抑制された（図８Ａ）ことが示された。
（２）アネキシンＶによる染色
ＮＩＨ３Ｔ３細胞をトリプシン処理し、冷ＰＢＳで２回洗浄し、１×アネキシン結合バッファ（Ｖｙｂｒａｎｔ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に懸濁し、１×１０６細胞／ｍｌの濃度となるように調製した。１試験あたり、細胞懸濁液１００μｌを使用した。５μｇのＦＩＴＣ標識アネキシンＶおよび１μｌのＰＩ検量線用溶液を加え、室温で１５分間インキュベートした後、４００μｌの１×アネキシン結合バッファを加え、ゆっくり撹拌した後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）により解析を行なった。
また、シノビオリンはＥＲストレスにより誘導されるアポトーシスに抵抗性を有することから、シノビオリンの量とアポトーシスの関係を明らかにするために以下の実験を行なった。
ＮＩＨ３Ｔ３細胞を調製し、２４時間後にＧＦＰ又はシノビオリンのｓｉＲＮＡ（２５ｎＭ）を、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクションし、８４時間インキュベートした。また、上記と同様にしてＥＢＳ−１デコイＯＤＮを作製し、これをＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクションした。
その結果、ＥＢＳ−１デコイ核酸を用いてシノビオリンの転写阻害による影響をみたところ、ＮＩＨ３Ｔ３細胞においてアポトーシスが誘導された（図８Ｂ）。図８Ｂにおいて、上パネルはウエスタンブロッティングの結果を示し、下パネルはＮＩＨ３Ｔ３細胞の顕微鏡写真である（１００倍）。同様に、ＮＩＨ３Ｔ３細胞において、シノビオリンのＲＮＡｉによりシノビオリンの発現量を低下させたところ、アポトーシスが誘導された（図８Ｃ）。図８Ｃにおいて、上パネルはウエスタンブロッティングの結果を示し、下パネルはＮＩＨ３Ｔ３細胞の顕微鏡写真である（１００倍）。
（３）ＦＡＣＳ解析
さらに、シノビオリンを過剰発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を作製し、ＥＢＳ−１デコイ核酸による影響を検討した。
シノビオリンを過発現する安定細胞株の樹立については、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によるＮＩＨ３Ｔ３細胞へのトランスフェクションから２４時間後、細胞を新鮮増殖培地で１０倍希釈して継代した。翌日、選択培地（Ｇ４１８を０．５μｇ／ｍｌ含有）を添加し、ＨＡ−Ｓｙｎｏｖｉｏｌｉｎ−ＨＡＨＡ／ｐｃＤＮＡ３発現ベクターを安定発現するクローンを得た。なお、対照として又はＨＡ−ｐｃＤＮＡ３空ベクターを使用した。各細胞株においてプラスミドからの発現を確認するため、ＨＡタグに対する抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。
ＥＢＳ−１デコイＯＤＮによるアポトーシス誘導については、次の通り実験を行った。
ＦＵＧＥＮＥ６ＴＭ（Ｒｏｃｈｅ社）試薬によるＥＢＳ−１デコイのトランスフェクションを行って８４時間後に、細胞を回収してマイクロチューブに入れ、アネキシンＶ−ＦＩＴＣでラベルした。ＦＡＣＳ分析により、生細胞とアポトーシスを起こした細胞との分布状態を測定した。さらに、シノビオリン抗体を用いたウエスタンブロッティングも行った。なお、対照としてβ−アクチン抗体を使用し、安定発現の確認用としてＨＡ−抗体を使用した。
結果を図９Ａ及び図９Ｂに示す。シノビオリン過剰発現細胞では、ＥＢＳ−１デコイによるアポトーシスに対する抵抗性が獲得された（図９Ａ、図９Ｂ）。加えて、アネキシンＶを用いたＦＡＣＳによるアポトーシスの定量化を行なったところ、通常のＮＩＨ３Ｔ３細胞においては５１．１％がアポトーシスを起こしていたが、シノビオリン過剰発現細胞では、その割合が２９．８％であった（図９Ｂ）。図９ＢのスクランブルとＥＢＳ−１デコイのパネルのうち、左側の写真は、１００倍の倍率によるＮＩＨ３Ｔ３細胞の顕微鏡写真である。
以上のことから、ＥＢＳ−１を介して転写調節を抑制すると、シノビオリンの発現が抑制され、ＮＩＨ３Ｔ３細胞のアポトーシスが誘導されることが示された。
【実施例８】  本実施例は、ＥＢＳ−１デコイがシノビオリンＲＮＡの発現を抑制することを、リアルタイムＰＣＲにより確認したものである。
対数増殖期のヒトリウマチ滑膜細胞（ＲＡＳＣｓ）をトリプシン処理し、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭにて６ウェルプレートに１．５×１０４細胞／ウェルで培養した。１８〜２４時間後、ＦＣＳ有り、抗生物質無しのＤＭＥＭで一度洗浄し、ＦＣＳ無し、抗生物質無しのＤＭＥＭ  １０００μＬを添加した。ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ  ４７．５μＬ、上記のＥＢＳ−１デコイＯＤＮ（ｆｉｎａｌ  １００μＭ）２．５μｌ、あるいはシノビオリンｓｉＲＮＡ（ｆｉｎａｌ  ２０μＭ）２．５μｌを混合したものをＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ  ４９μＬ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００  １μＬの混合物に加え、弱くピペッティングした後１０分間放置した。これを細胞に１００μＬずつまんべんなく添加した。２４時間培養後、軽くかき混ぜて放置し、以下の方法により、トランスフェクションを行った。
トランスフェクション試薬添加８４時間後、細胞からＩｓｏｇｅｎｅ（ニッポンジーン社）を用いたフェノール抽出法で全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ）−ＰＣＲを行った。
試薬はＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ社）及びＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社より購入した以下のプローブを用いた。
シノビオリン：ＨＳ００３８１２１１＿ｍ１  ＨＲＤ１
ｈｓＧＡＰＤＨ：Ｈｕｍａｎ  ＧＡＰＤＨ
すなわちプローブ０．５μＬ、ＲＮＡ１μＬ、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ５μＬ、精製水３．５μＬをＰＣＲチューブに分注後混合し、アプライドバイオＲＴ−ＰＣＲ７５００を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。
サイクルは、ｃＤＮＡ伸長反応として５０℃２分、９５℃１０分を１回、続けてＰＣＲ増幅反応として９５℃１５秒、６０℃１分を５０回行い、最後に７２℃５分最終伸長反応を行った後４℃で保存した。
ＲＮＡ量発現の解析はリアルタイムＰＣＲ装置付属の解析ソフトを用いて行った。シノビオリン遺伝子発現量はｈｓＧＡＰＤＨの発現量で割ることにより値を補正した。
その結果、ＥＢＳ−１デコイを用いた場合、シノビオリンＲＮＡの発現が抑制されたことが明らかとなった（図１０）。
【産業上の利用可能性】  本発明により、シノビオリン遺伝子のプロモーターに関するデコイ核酸が提供される。本発明のデコイ核酸は、シノビオリンの転写因子結合部位において、この転写因子と競合的に結合することができ、その結果、シノビオリンプロモーターの活性を抑えることができる。このことは、本発明のデコイ核酸がリウマチ等の各種疾患の治療に有用であることを意味する。
【配列表フリーテキスト】  配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号１１：合成ＤＮＡ
配列番号１２：合成ＤＮＡ
配列番号１３：合成ＤＮＡ
配列番号１４：合成ＤＮＡ
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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