(57)【要約】  EZI遺伝子を標的とする合成オリゴsiRNAまたはベクターより発現させたsiRNAを用いて、EZI遺伝子の発現を抑制した結果、STAT３の核移行およびSTAT3依存性遺伝子発現活性化が抑制された。α2−マクログロブリンプロモーター領域中のEZIタンパク質およびSTAT３タンパク質が結合するAPRE配列を改変した核酸が、EZIタンパク質によるSTATタンパク質の核移動/核局在化を阻害し、さらにはSTAT依存的な遺伝子発現活性化をも抑制した。また、EZIタンパク質上のSTAT３結合ペプチドに細胞膜浸透シグナルを結合させた合成ペプチドはEZIタンパク質によるSTATの核移動/核局在化、STAT依存的な遺伝子発現活性化を抑制し、さらには、がん細胞増殖を抑制することを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）または（２）のいずれかを含む、STAT核移動/核局在阻害剤。
（１）EZI遺伝子の転写または翻訳産物に結合し得る物質
（２）配列番号：２２または２３に記載されたアミノ酸配列からなるEZI部分ペプチドもしくはその一部またはそれらの改変体
【請求項２】
EZI遺伝子の転写または翻訳産物に結合し得る物質が核酸である、請求項１記載のSTAT核移動/核局在阻害剤。
【請求項３】
核酸がEZI遺伝子の転写産物に結合し得るリボヌクレオチドまたはこれをコードしたDNAを担持したベクターである、請求項２記載のSTAT核移動/核局在阻害剤。
【請求項４】
リボヌクレオチドが二重鎖である、請求項３記載のSTAT核移動/核局在阻害剤。
【請求項５】
リボヌクレオチドがEZI遺伝子中の連続する１６塩基以上の配列に対応した配列を有する、請求項３または４記載のSTAT核移動/核局在阻害剤。
【請求項６】
配列番号１〜４または１１〜１３のいずれかの配列に対応した配列を有する、請求項５記載のSTAT核移動/核局在阻害剤。
【請求項７】
核酸が、EZI遺伝子翻訳産物が結合し得る遺伝子制御領域中のオリゴヌクレオチドまたはその改変体である、請求項２記載のSTAT核移動/核局在阻害剤。
【請求項８】
α2−マクログロブリンプロモーター領域中のAPREもしくはその一部、またはこれらを改変したオリゴヌクレオチドのいずれかである、請求項７記載のSTAT核移動/核局在阻害剤。
【請求項９】
配列番号１５〜２０のいずれかの配列を有する、請求項８記載のSTAT核移動/核局在阻害剤。
【請求項１０】
配列番号１６、１７または２０のいずれかの配列を有する、請求項８記載のSTAT核移動/核局在阻害剤。
【請求項１１】
EZI部分ペプチドがSTAT結合領域またはその一部である、請求項１記載のSTAT核移動/核局在阻害剤。
【請求項１２】
STAT結合領域の一部には、配列番号３４または３６に記載のアミノ酸配列における99番から101番、106番から108番、または163番から164番のいずれか一つ以上の領域を含む、請求項１１記載のSTAT核移動/核局在阻害剤。
【請求項１３】
改変体がEZI部分ペプチドまたはその一部に核移行シグナルを付加したペプチドである、請求項１、１１、１２のいずれかに記載のSTAT核移動/核局在阻害剤。
【請求項１４】
配列番号２５〜２７、２９〜３１のいずれかに記載の配列からなる、請求項１３記載のSTAT核移動/核局在阻害剤。
【請求項１５】
STATがSTAT3である、請求項１〜１４のいずれかに記載のSTAT核移動/核局在阻害剤。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載のSTAT核移動/核局在阻害剤を含む、STAT依存性遺伝子発現調節阻害剤。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれかに記載のSTAT核移動/核局在阻害剤を含む、がん細胞増殖抑制剤。
【請求項１８】
請求項１〜１５のいずれかに記載のSTAT核移動/核局在阻害剤を含む、STAT依存性遺伝子発現調節に起因する疾患の治療・予防用医薬組成物。
【請求項１９】
(i)  被験物質とEZIとの結合活性を測定する工程、または  (ii)被験物質とEZIならびにSTATとのそれぞれの結合活性を測定する工程を含む、STAT核移動/核局在化阻害剤、STAT依存性遺伝子発現抑制剤、STAT依存性遺伝子発現が起因する疾患の治療・予防用医薬組成物のスクリーニング方法。
【請求項２０】
以下（１）〜（４）の一つ以上の工程をさらに含む、請求項１９記載のスクリーニング方法。
（１）被験物質存在下でのEZIとSTATとの結合能を測定する工程
（２）EZIが発現している細胞に被験物質を作用させ、STAT刺激因子添加後のEZIの局在を測定する工程
（３）EZIおよびSTATが発現している細胞に被験物質を作用させ、STAT刺激因子添加後のSTATの局在を測定する工程
（４）EZIおよびSTATが発現している細胞に被験物質を作用させ、STAT刺激因子添加後のSTAT依存的な遺伝子発現を測定する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、STAT(signal transducer and activator of transcription)タンパク質と結合し得るEZIタンパク質 (endothelial cell-derived zinc-finger protein)の発現もしくはその機能を抑制し得る物質またはSTATタンパク質とEZIタンパク質との相互作用を阻害し得る物質を利用したSTAT核移動/局在化の阻害剤、STAT依存性遺伝子発現調節阻害剤、がん細胞増殖抑制剤およびこれらの応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
STAT転写因子ファミリーは、サイトカイン受容体およびインターフェロン受容体ならびにいくつかの成長因子に対する受容体の下流で主な役割を果たしている。STATタンパク質は、いわゆる「潜在的」転写因子であり、定常状態(すなわち、刺激されていない状態)で細胞質内に存在する。リガンドにより刺激されると、STATタンパク質は、サイトカイン/インターフェロン受容体に結合しているJAKファミリーチロシンキナーゼまたは成長因子受容体内にコードされている内在性キナーゼドメインの作用によってチロシンリン酸化を受ける。チロシンリン酸化を受けたSTATタンパク質は、一方のSTAT分子のホスホチロシン残基と他方のSTAT分子のSH2ドメインとの相互作用によってホモ二量体またはヘテロ二量体を形成する。次いで、二量体化したSTATは核に移動し、そこで特定のDNA配列に結合し、標的遺伝子の転写を調節する。【０００３】
哺乳動物には7種類のSTAT分子があり、そのうちSTAT3は最もプロトタイプのものであると考えられている。STAT3は、オンコスタチンM(OSM)を含むインターロイキン(IL)-6ファミリーなどの多くのサイトカインや、上皮細胞成長因子(EGF)などの増殖因子によって活性化されることが知られている（非特許文献２−６）。STAT3は、その発現する細胞の状態に応じて、多くの異なる生物学的機能を発揮するが、その主な役割は、c-mycおよびbcl-xLを含む様々な重要な標的遺伝子を誘導することによって細胞の増殖の促進やアポトーシスの抑制に関わる（非特許文献８、９、１０）。【０００４】
実際に、STAT3の恒常的な活性化が前立腺がん、乳がん、頭頸部がん、白血病など多くの癌細胞において認められ、逆にSTAT3の活性を抑えることで癌化を抑制できる例が報告されている。同様に、皮膚の乾癬疾患部位においてもSTAT3の恒常的な活性化が認められること、皮膚角質細胞でのSTAT3の恒常的な活性化により乾癬様の症状が引き起こされること、さらにSTAT3の活性を抑えることで、この症状を軽減もしくは抑制しうることが報告されている（非特許文献７）。また、人為的に改変されたSTAT3二量体は恒常的に活性化され、これにより癌化が誘導されることが検証されている（非特許文献１１）。つまり、STAT3の異常な活性化は癌化の誘導などとして示されているように、生体にとって有害である。したがって、このSTAT3活性化を阻害することにより、腫瘍が発生することを阻害または抑制し得ることが期待される。そのため、STAT3は抗がん剤や、免疫疾患に対する治療薬などの創薬開発の標的分子として注目されている（非特許文献１２、１３、１４）。【０００５】
一方、本願発明者らは、STAT3相互作用分子としてEZI(endothelial cell-derived zinc-finger protein)を同定し、報告している（非特許文献１）。EZIは、主に核に局在するタンパク質であり、N末端ドメインおよびC末端ドメインの間にC2H2型ジンクフィンガーモチーフが１２回反復した領域を備えた約600アミノ酸からなる。EZIの欠失変異体を用いた解析から、ジンクフィンガードメインは核局在化に必須であり、N末端ドメインはSTAT3との相互作用に必須であることが明らかになっている。ジンクフィンガードメインが欠失されたEZI変異型(EZI-ZF)は核に局在することはできないが、STAT3との結合活性は維持される。さらに、EZI-ZF は、STAT３タンパク質の核局在をも阻害し、さらにはSTAT３タンパク質に起因した転写活性化を阻害することも確認されている。おそらく、EZI-ZFは、STAT３の細胞質から核への移動を妨げることによって、核内で生じるSTAT3シグナル伝達を阻害しているのであろう。換言すれば、EZIタンパク質は、STAT3タンパク質と結合し、STAT３タンパク質を核へ移行させ、核内でのSTAT3タンパク質による転写活性化を誘導し得るであろうことが予想された。【０００６】
【非特許文献１】Nakayama, K., Kim, K.-W., and Miyajima, A. (2002) EMBO J., 21:6174.
【非特許文献２】Akira, S., Nishio, Y., Inoue, M., Wang, X.J., Wei, S., Matsusaka, T., Yoshida, K., Sudo, T., Naruto, M. and Kishimoto, T. (1994) Cell, 77, 63-71.
【非特許文献３】Raz, R., Durbin, J.E. and Levy, D.E. (1994) J. Biol. Chem., 269, 24391-24395
【非特許文献４】Wegenka, U.M., Lutticken, C., Buschmann, J., Yuan, J., Lottspeich, F., Muller-Esterl, W., Schindler, C., Roeb, E., Heinrich, P.C. and Horn, F. (1994) Mol. Cell. Biol., 14, 3186-3196
【非特許文献５】Zhong, Z., Wen, Z. and Darnell, J.E., Jr. (1994) Science, 264, 95-98
【非特許文献６】Cantwell, C.A., Sterneck, E. and Johnson, P.F. (1998)  Mol. Cell. Biol., 18, 2108-2117
【非特許文献７】Sano S, Chan KS, Carbajal S, Clifford J, Peavey M, Kiguchi K, Itami S, Nickoloff BJ, DiGiovanni J.,  Nat Med (2005) Vol.11, pp.43-49.
【非特許文献８】Levy DE, Lee CK.  J Clin Invest (2002) Vol.109, pp.1143-1148.
【非特許文献９】Kisseleva T, Bhattacharya S, Braunstein J, Schindler CW.  Gene (2002) Vol.285, pp.1-24.
【非特許文献１０】Hirano T, Ishihara K, Hibi M.  Oncogene (2000) Vol.19, pp.2548-2556.
【非特許文献１１】Bromberg JF, Wrzeszczynska MH, Devgan G, Zhao Y, Pestell RG, Albanese C, Darnell JE Jr.  Cell (1999) Vol.98, pp.295-303. Erratum in: Cell (1999) Vol.99, p.239.
【非特許文献１２】Bowman T, Garcia R, Turkson J, Jove R.  Oncogene (2000) Vol.19, pp.2474-2488.
【非特許文献１３】Turkson J, Jove R.  Oncogene (2000) Vol.19, pp.6613-6626.
【非特許文献１４】Bromberg J.  J Clin Invest (2002) Vol.109, pp.1139-1142.
【非特許文献１５】Ma J, Zhang T, Novotny-Diermayr V, Tan AL, Cao X.  J Biol Chem (2003) Vol.278, pp.29252-29260.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、EZIタンパク質の核移動/核局在化作用やSTATとの結合能を阻害することによりSTAT３の機能を抑制し得る物質およびこれを含む組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは上記課題に鑑み、EZIタンパク質によるSTAT核移動/核局在化、STAT依存性遺伝子発現活性化の誘導の機構を明らかにするために鋭意研究を重ねた。先ず、EZI遺伝子を標的とするsiRNA（低分子干渉RNA）によりEZIタンパク質の核移動/核局在化作用を確認した。EZI遺伝子を標的とする合成オリゴsiRNAまたはベクターより発現させたsiRNAを用いて、EZI遺伝子の発現を抑制した結果、STAT３タンパク質の核移行およびSTAT3依存性遺伝子発現活性化が抑制された。EZIタンパク質およびSTAT３タンパク質が結合するα2−マクログロブリンプロモーター領域中のAPREの一部配列およびこの配列を改変した核酸を合成した。APRE配列よりも強い結合活性を有する改変核酸は、EZIタンパク質によるSTATタンパク質の核移動/核局在化を阻害し、さらにはSTAT依存的な遺伝子発現活性化をも抑制した。【０００９】
また、既に報告されている論文（非特許文献１; Fig. 4Bおよび4C）に示されているように、N末端の182アミノ酸からなる領域（アミノ酸1-182）を欠失させたEZI変異体（EZI-NおよびEZI-NC）はSTAT3タンパク質と結合できず、逆にこの領域を含むような変異体（EZI-CおよびEZI-ZF）は野生型（全長）のEZIと同様にSTAT3タンパク質と結合できることから、EZI分子中ではこのN末端領域がSTAT3タンパク質との結合に関与していることが明らかとされている。本願では、さらにN末端の91アミノ酸を欠失したEZI変異体を作製して同様の解析を行ったところ、この変異体ではSTAT3タンパク質との結合活性が認められた。したがって、EZI分子中では92番目のメチオニン残基から182番目のグルタミン残基までを含む91アミノ酸からなる領域がSTAT3タンパク質との結合に関与する（十分である）ことが明らかとなった。【００１０】
この領域（STAT3結合ドメイン）中には、酸性アミノ酸（アスパラギン酸もしくはグルタミン酸）に富む、4〜5残基から成るアミノ酸モチーフが3箇所見いだされた。
これら３箇所の酸性アミノ酸モチーフに着目し、それぞれに点変異を導入したEZI変異体を作製して、これらとSTAT3との結合についての解析を行った。作製した変異体は、全長のEZI分子中で 99番目のグルタミン酸から102番目のアスパラギン酸までの４アミノ酸を全てグリシンに置換したもの（ES-1）、同じく104、106、107および108番目の４箇所のグルタミン酸を全てグリシンに置換したもの（ES-2）および、同じく 162および165番目の２箇所のシステインをグリシンに置換したもの（ES-3）、の３種類である。これらの変異体のSTAT3タンパク質に対する結合能を、COS7細胞での共発現と免疫沈降の実験系を用いて解析したところ、変異体(a)ではSTAT3タンパク質との結合がほとんど観察されず、また変異体(c)においても、野生型のEZIタンパク質と比較して顕著なSTAT3結合能の低下が認められた。【００１１】
以上の結果から、EZI分子の92番目のメチオニン残基から182番目のグルタミン残基までを含む領域がSTAT3タンパク質との結合に関与するドメインであり、このドメイン中に含まれる酸性アミノ酸に富んだアミノ酸モチーフ、とりわけ99番目のグルタミン酸から102番目のアスパラギン酸までの４アミノ酸を含むモチーフ（阻害ペプチドE-1に対応）が結合に重要であることが明らかとなった。
さらに、ここで同定されたSTAT３結合ぺプチドに細胞膜浸透シグナルを結合させたペプチドを合成した。これら合成ペプチドの中に、EZIタンパク質によるSTATタンパク質の核移動/核局在化、STAT依存的な遺伝子発現活性化を抑制し、さらには、がん細胞増殖を抑制することを見出した。本発明はこれら知見に基づくものであり、具体的には以下に示す通りである。【００１２】
１．  下記（１）または（２）のいずれかを含む、STAT核移動/核局在阻害剤。
（１）EZI遺伝子の転写または翻訳産物に結合し得る物質
（２）配列番号：２２または２３に記載されたアミノ酸配列からなるEZI部分ペプチドもしくはその一部またはそれらの改変体。
２．  EZI遺伝子の転写または翻訳産物に結合し得る物質が核酸である、上記１記載のSTAT核移動/核局在阻害剤。
３．  核酸がEZI遺伝子の転写産物に結合し得るリボヌクレオチドまたはこれをコードしたDNAを担持したベクターである、上記２記載のSTAT核移動/核局在阻害剤。
４．  リボヌクレオチドが二重鎖である、上記３記載のSTAT核移動/核局在阻害剤。
５．  リボヌクレオチドがEZI遺伝子中の連続する１６塩基以上の配列に対応した配列を有する、上記３または４記載のSTAT核移動/核局在阻害剤。
６．  配列番号１〜４または１１〜１３のいずれかの配列に対応した配列を有する、上記５記載のSTAT核移動/核局在阻害剤。
７．  核酸が、EZI遺伝子翻訳産物が結合し得る遺伝子制御領域中のオリゴヌクレオチドまたはその改変体である、上記２記載のSTAT核移動/核局在阻害剤。
８．  α2−マクログロブリンプロモーター領域中のAPREもしくはその一部、またはこれらを改変したオリゴヌクレオチドのいずれかである、上記７記載のSTAT核移動/核局在阻害剤。
９．  配列番号１５〜２０のいずれかの配列を有する、上記８記載のSTAT核移動/核局在阻害剤。
１０．  配列番号１６、１７または２０のいずれかの配列を有する、上記８記載のSTAT核移動/核局在阻害剤。
１１．  EZI部分ペプチドがSTAT結合領域またはその一部である、上記１記載のSTAT核移動/核局在阻害剤。
１２．  STAT結合領域の一部には、配列番号３４または３６に記載のアミノ酸配列における99番から101番、106番から108番、または163番から164番のいずれか一つ以上の領域を含む、上記１１記載のSTAT核移動/核局在阻害剤。
１３．  改変体がEZI部分ペプチドまたはその一部に核移行シグナルを付加したペプチドである、上記１、１１、１２のいずれかに記載のSTAT核移動/核局在阻害剤。
１４．  配列番号２５〜２７、２９〜３１のいずれかに記載の配列からなる、上記１３記載のSTAT核移動/核局在阻害剤。
１５．  STATがSTAT3である、上記１〜１４のいずれかに記載のSTAT核移動/核局在阻害剤。
１６．  上記１〜１５のいずれかに記載のSTAT核移動/核局在阻害剤を含む、STAT依存性遺伝子発現調節阻害剤。
１７．  上記１〜１５のいずれかに記載のSTAT核移動/核局在阻害剤を含む、がん細胞増殖抑制剤。
１８．  上記１〜１５のいずれかに記載のSTAT核移動/核局在阻害剤を含む、STAT依存性遺伝子発現調節に起因する疾患の治療・予防用医薬組成物。
１９．  (i)  被験物質とEZIとの結合活性を測定する工程、または  (ii)被験物質とEZIならびにSTATとのそれぞれの結合活性を測定する工程を含む、STAT核移動/核局在化阻害剤、STAT依存性遺伝子発現抑制剤、STAT依存性遺伝子発現が起因する疾患の治療・予防用医薬組成物のスクリーニング方法。
２０．  以下（１）〜（４）の一つ以上の工程をさらに含む、上記１９記載のスクリーニング方法。
（１）被験物質存在下でのEZIとSTATとの結合能を測定する工程
（２）EZIが発現している細胞に被験物質を作用させ、STAT刺激因子添加後のEZIの局在を測定する工程
（３）EZIおよびSTATが発現している細胞に被験物質を作用させ、STAT刺激因子添加後のSTATの局在を測定する工程
（４）EZIおよびSTATが発現している細胞に被験物質を作用させ、STAT刺激因子添加後のSTAT依存的な遺伝子発現を測定する工程
なお、STAT、EZIなどの名称は、学術的にはヒトであれば全て大文字表記、マウスであれば、頭文字のみ大文字標記というように区別することが行なわれているが、本明細書ではこれらを全て大文字標記とした。また、由来する生物種を特に区別して用いる場合には、その生物種を遺伝子名称とともに明記することとする。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１−１】マウスEZImRNAに対するオリゴsiRNA配列（４種）、マウスSTAT3あるいはルシフェラーゼに対する既知のsiRNA配列、およびランダムな19残基の配列からなるスクランブル・オリゴヌクレオチド配列を示す図である。これらはいずれもセンス鎖のみを示す。なお、配列中、「T」と示されている部分は「U」として合成した。
【図１−２】上図は図１−１に示す配列のオリゴsiRNA存在下での、オンコスタチン刺激に起因したSTAT3によるAPREからのルシフェラーゼ遺伝子発現誘導を測定した結果を示すグラフである。下図は、上図で抑制活性が高かったｍE-1を選択し、これと対照のSTAT3およびスクランブルsiRNAを用いて、導入量を変えて抑制活性に与える影響を解析した結果を示すグラフである。
【図２−１】EZIsiRNA発現レトロウイルスベクターを用いて、OSM刺激に起因したSTAT3による発現誘導への影響を解析する系に用いた配列およびその結果を示すグラフである。上図は解析に用いたsiRNAをコードした配列（センス鎖のみ）を示す。これらsiRNAをコードした配列をレトロウイルスベクターにつなぎ、細胞内においてベクターからsiRNAが発現するように構築した。下図は、上図に示すEZI、STAT3siRNAをコードした配列をインサートとして含むレトロウイルスベクター、および、インサートを含まないレトロウイルスベクターをNIH3T3細胞に感染させた。これら感染細胞にAPRE-luciferaseレポータープラスミド（図中「APRE」と表示）、対照のAPREを含まないluciferaseレポータープラスミド（図中「ｐGL3」と表示）をリポフェクション法により導入した。リポフェクション法は「Lipofectamine Reagent」（Invitrogen社）と「Plus Reagent」（Invitrogen社）を組み合わせて実施した。また、インターナルコントロールとして全てウミシイタケ由来ルシフェラーゼの発現プラスミドを同時に導入した。これら細胞を、オンコスタチンM（10ng/ml）存在下で、４８時間培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性の測定は、試薬「Dual-Luciferase Reporter Assay System」（Promega社）と、「Microlumat」ルミノメーター（Perkin Elmer社）を使用した。結果はレトロウイルスベクターのみが導入された群のルシフェラーゼ活性を100％とし、他の群の相対的な活性を示した。
【図２−２】刺激因子をOSMに変えてｖ−Srcを用いた場合のEZIsiRNAの影響を解析した結果を示すグラフである。実験系はv-Src遺伝子が導入されたNIH3T3細胞を用いる点およびレポーター遺伝子導入後の培地にOSMを添加しない点を除いて、図２−１と同様の方法を用いた。すなわち、培地に添加したOSMに代えて、細胞内で発現するv-SrcによりSTAT3が刺激を受けることになる。
【図２−３】図２−１と同様の実験系で、感染させるレトロウイルスベクター量を段階的に変えて行った結果を示すグラフである。EZ1siRNAはSTAT3siRNAと同様に感染ウイルスの用量依存的な発現抑制が観察されている。
【図３】EZIsiRNAによるSTAT3タンパク質の細胞局在に与える影響を解析した結果を示す写真である。図中左は感染させたウイルスベクターの種類（EZI：EZIsiRNA発現ウイルス、mutEZI：mutEZIsiRNA発現ウイルス、ベクター：ベクターのみ）を示し、上方には染色方法（STAT3：抗STAT3抗体（「Stat3 C-20 (Cat. # sc-482)」、Santa Cruz Biotechnology社）を用いた蛍光免疫染色、DAPI:DAPI染色、Merge：蛍光免疫染色とDAPI染色とを重ねた像）を示す。
【図４】ヒトEZImRNAに対するオリゴsiRNA配列（３種）を用いて、STAT3依存性の転写誘導に与える影響を解析した結果を示すグラフである。AはヒトEZIsiRNAとして具体的に用いた配列、３種（E-1、E-2、およびE-3）を示す。これらはいずれもセンス鎖のみを示す。siRNAはpSilencerベクターを用いて発現させた。BはヒトEZIsiRNA発現ベクターおよびAPRE-luciferaseレポータープラスミドをヒト細胞株（KB細胞、YCU-H891細胞、HepG2細胞）にリポフェクション法により導入し、２日間培養した後のルシフェラーゼの相対活性を示す。ヒトEZIsiRNAインサートを含まないベクターのみを導入した細胞のルシフェラーゼ活性を１００％として、相対活性を求めた。HepG2細胞に関しては、ベクター導入後、培地にIL-6（20 ng/ml）添加、非添加で２日間培養を行った後のルシフェラーゼ活性を測定した結果を示す。ベクターのみ導入した細胞でのルシフェラーゼ活性に比して、KB細胞ではE-2、E-3によりルシフェラーゼ活性が低下し、YCU−H８９１細胞ではE-1〜E-3の全てでルシフェラーゼ活性が低下した。HepG2細胞については、E-3 siRNAによりIL-6の有無に関わらず、E-3によりルシフェラーゼ活性が低下した。
【図５】APRE配列に類似した配列をもつオリゴヌクレオチドのデザインおよびこれらオリゴヌクレオチドによるSTAT3の核移行への影響を調べた結果を示す図である。Aはデザインされた具体的な配列（mut-1からmut-6）およびコントロールのAPRE配列を示す。なお、これらはいずれもセンス鎖のみを示す。APRE配列と比べて変異が導入されている塩基は二重下線で示した。また、Bioはビオチン標識を表している。BはAに示すオリゴヌクレオチドDNAとEZIおよびSTAT3との結合についての解析を行った結果を示す。各レーン番号はAに示す番号と対応している。mut-2、mut-3、あるいはmut-6のオリゴヌクレオチドは、STAT３タンパク質ともEZIタンパク質とも野生型のAPREオリゴヌクレオチドよりも強く結合することが示された。
【図６−１】EZI decoy ODNによるSTAT3タンパク質の核移行への影響を調べた結果を示す写真である。パネルの上部には染色方法などを、左側に導入したオリゴヌクレオチド、OSM存在の有無を示した。オリゴヌクレオチドを導入せずにOSM刺激を与えた群、およびEZI mut-decoy ODN導入群では、STAT3タンパク質の染色像とDAPI染色像は一致して核であるが、EZI decoy ODN 導入群では、OSM存在下でもSTAT3は大部分が核には移行せずに細胞質に留まっていることが明らかとなった。
【図６−２】EZI decoy ODNを導入したNIH3T3細胞をOSM存在下で培養した後、EZIタンパク質の細胞内での局在を検討した結果を示す写真である。STAT3タンパク質およびEZIタンパク質を、それぞれ当該タンパク質に特異的な抗体を用いて免疫染色した（対応して左パネル、右パネル）。STAT3およびEZIの両タンパク質は、細胞質に主に局在し、EZI decoy ODNの導入により、核への局在が阻害されることが示されている。
【図７】EZI decoy ODNによりSTAT3による転写誘導に与える影響を調べた結果を示すグラフである。EZI decoy ODN、EZI mut-decoy ODN、STAT3 (APRE) ODN、もしくはSTAT3 mut-ODNをAPRE-luciferaseレポータープラスミドと共に、リポフェクション法によりNIH3T3細胞もしくはCOS7細胞に導入した。対照の細胞にはレポータープラスミドのみを導入した。導入後、NIH3T3細胞についてはOSM（10ng/ml）の存在下・非存在下で（４８時間）培養を行った。一方、COS細胞についてはOSM非存在下での（４８時間）培養を行った。培養後のそれぞれの細胞中でのルシフェラーゼ遺伝子の発現量を測定した。ルシフェラーゼの活性を示す単位は任意の単位で示した。NIH3T3細胞において、ベクターのみ導入した細胞では、OSM刺激によりルシフェラーゼ活性は上昇したが、EZI decoy ODNを導入した細胞ではOSM刺激の有無に関わらずSTAT3によるAPREからの遺伝子発現誘導を強く抑制し、その抑制効果はSTAT3 decoy  ODNと比べても高く、確実である。
【図８−１】ヒトおよびマウスEZIにおけるSTAT3結合領域および結合に関与するアミノ酸残基を示す模式図である。
【図８−２】EZIタンパク質のSTAT3結合ドメイン・モチーフを同定した結果を示す図である。FLAG-tag を付加したEZI遺伝子の野生型（全長；WT）あるいはN末端領域の欠失変異体（△N、アミノ酸1-182の欠失変異体；△FN、アミノ酸1-91の欠失変異体）をコードしたDNA、あるいは発現ベクターのみ（Con.）を、HA-tagを付加したSTAT3遺伝子と共にCOS7細胞にトランスフェクションし、発現させた。細胞抽出液中から、抗FLAG-tag抗体を用いてEZIタンパク質を免疫沈降し、これと共沈するSTAT3タンパク質の有無を、抗HA-tag抗体を用いたウェスタンブロット法により解析した。
【図９−１】STAT3核移行の阻害実験に用いた合成ペプチド配列を示す図である。これらはEZI上のSTAT3結合領域に由来する７アミノ酸（図８下線で示す３箇所の７アミノ酸）からなるペプチドそれぞれに細胞膜透過活性を有することが知られているアミノ酸配列（AAVLLPVLLAAP／配列番号：２８）を融合させた形で合成した（E-1、E-2、E-3）。陽性対照には、STAT3タンパク質のチロシンリン酸化部位に由来するペプチドが同様の細胞膜透過活性ペプチド（配列番号：２８）と融合したSTAT3活性阻害ペプチド（Calbiochem社：Cat. # 573096）を用いた。なお、図には示していないが、E-1、E-2、E-3は全てC末端にビオチン化されている。
【図９−２】図9-1に示す合成ペプチド（E-1、E-2、E-3）によるSTAT3発現誘導およびSTAT3タンパク質の核移行に与える影響を解析した結果を示すグラフおよび写真である。上図：APRE-luciferaseレポータープラスミドが導入されたNIH3T3細胞を合成ペプチド（E-1、E-2、E-3）存在下・非存在下で培養した後、OSM刺激を１時間与えた。OSM刺激の後に細胞抽出液を調製してルシフェラーゼ遺伝子産物の発現量を測定した。下図：上図においてSTAT3依存性の転写活性化をわずかながら抑制したE-1を用いてSTAT3タンパク質の核移行に与える影響を解析した結果を示す。NIH3T3細胞の培養液中にペプチドE-1を添加し、さらにOSM（10ng/ml）存在下で培養を行った。培養後、細胞を抗STAT3抗体により免疫染色して、内在性のSTAT3タンパク質の細胞内局在を観察した（図中「STAT3」と表示）。核の位置を確認するためにDAPI染色を行った。合成ペプチドの細胞内局在は、E-1、E-2、E-3の末端に結合しているビオチンと反応性を有するストレプトアビジンに蛍光色素Phycoerythrin（PE）を共役させたストレプチアビジン融合PEを用いて解析した。ペプチドは細胞質に局在していることが示されている。STAT3タンパク質はOSM刺激により、通常、核に局在することになるが、ペプチドの存在によりSTAT3タンパク質は細胞質に多く観察され、STAT3タンパク質の核移行を阻害することが示されている。
【図１０−１】細胞膜透過シグナル配列（RRRRRRRRRRR／配列番号：３２）と融合させたSTAT3結合ペプチドを用いて、OSM刺激に伴うSTAT依存性転写活性化に対する抑制効果を再検討した結果を示すグラフである。上図：  新たに調製した融合ペプチドの配列を示す。下図：  APRE-luciferaseレポータープラスミドを保持したNIH3T3細胞を異なる濃度（１〜１０００nM）のペプチド存在下で48時間培養し、さらに１時間OSM刺激を加えた後、ルシフェラーゼ活性を測定した結果である。ルシフェラーゼ活性は細胞抽出液を用いて測定した。Mockは合成ペプチドなしで培養したコントロール細胞である。
【図１０−２】APRE-luciferaseレポータープラスミドを保持したNIH3T3/v-Src細胞を異なる濃度（１〜１０００nM）のペプチド存在下で48時間培養した後、ルシフェラーゼ活性を測定した結果を示す図である。E-1〜３ペプチドは、図１０−１上図に示す融合ペプチドである。Mockは合成ペプチドなしで培養したコントロール細胞である。ルシフェラーゼ活性は細胞抽出液に基づき測定した。
【図１１】STAT3結合ドメイン由来ペプチドの細胞増殖に対する抑制効果を解析した結果を示すグラフである。NIH3T3細胞、B16細胞、NIH3T3-L1細胞（1x104個/well）をペプチド（E-1、E-2、およびE-3）存在下で４８時間培養した後の生細胞数を測定した。陰性コントロールにはDMSOを、陽性コントロールにはJAKファミリーキナーゼ阻害剤AG490を用いて、これら存在下で同様に培養を行った。NIH3T3細胞およびB16細胞の単位はx 105個、NIH3T3-L1細胞の単位はx104個である。
【図１２】STAT3結合ドメイン由来ペプチドによるヒトがん組織由来細胞株（KB細胞およびYCU-H891細胞）に対する経時的な増殖抑制効果を示すグラフである。KB細胞およびYCU-H891細胞（1x104個/well）を播種し、図１０−１Aに示したペプチド（１μM）存在下・非存在下で培養を行い、培養開始後1、3、5、および7日目に生細胞数を測定した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は第一にSTAT核移動/核局在阻害剤に関する。本発明のSTAT核移動/核局在阻害剤は、（１）EZI遺伝子、または転写もしくは翻訳産物に結合し得る物質、または（２）EZI部分ペプチドまたはその改変体、が含まれる。【００１５】
本発明は、EZIタンパク質と結合するSTATタンパク質が、EZIタンパク質の作用により核へ移行することを見出したことに基づくものである。従って、本発明の対象となるSTATは、EZIが結合し得るSTAT、例えば、STAT３、STAT４を挙げることができる。このうち好適な対象としては、STAT３である。【００１６】
（１）EZI遺伝子、または転写もしくは翻訳産物に結合し得る物質
本発明における「EZI遺伝子」の代表的なものとして、ヒトEZI遺伝子（配列番号：３３）、マウスEZI遺伝子（配列番号：３５）などの哺乳動物由来のEZI遺伝子を挙げることができるが、本発明はこれらに限定されるものでない。例えば、ヒト由来のEZI遺伝子には上記以外にGenBankにアクセッション番号「BC052625」（対応するアミノ酸配列「AAH52625」）として登録されているもの、マウス由来のEZI遺伝子には上記以外にGenBankにアクセッション番号「BC029859」（対応するアミノ酸配列「AAH29859」）、「NM_020589」（対応するアミノ酸配列「NP_065614」）として登録されているものも存在し、これらも本発明のEZI遺伝子に包含し得る。また、ヒト、マウス以外の哺乳動物由来のEZI遺伝子も含めることができる。さらに、ここで具体的に示した配列以外にも、これら配列と類似の配列を保持し、STATの核への移動を誘導する活性またはSTATとの結合活性をコードした遺伝子は、本発明のEZI遺伝子に包含し得る。ここで「類似の配列」とは、配列番号：３３または配列番号：３５とあるいはこれらの一部配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る配列を有するものと定義することができる。ストリンジェントな条件とは、一般に、ハイブリダイズの際または洗浄の際に使用される緩衝液の塩濃度や温度により規定される。塩濃度としては、通常は「1xSSC、0.1% SDS」、より厳しい条件としては「0.5xSSC、0.1% SDS」、さらに厳しい条件として「0.1xSSC、0.1% SDS」と示すことができる。温度としては通常37℃、厳しい条件としては42℃、より厳しい条件として55℃、さらに厳しい条件としては65℃を示すことができる。また、「類似の配列」とは、別の視点から定義すると、配列番号：３４または配列番号：３６のアミノ酸配列において、一つ以上のアミノ酸の欠失、付加、置換または挿入を有し、かつ、STATの核への移動を誘導する活性またはSTATとの結合活性を有するタンパク質をコードした遺伝子は本発明のEZI遺伝子に包含し得る。同等の機能を有する限り、配列番号：３４または配列番号：３６と比較した際の異なるアミノ酸の数に限定はない。【００１７】
「EZI遺伝子の転写産物」とは、具体的にはEZIｍRNAおよび前駆RNAである。これら転写産物に結合し、EZI遺伝子の翻訳を抑制し得れば、EZIタンパク質によるSTATの核移動/核局在を抑制し得る。こうしたEZI転写産物に結合して、EZI遺伝子の発現を抑制し得る物質として、EZI  遺伝子配列の一部と相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドや二重鎖RNAなどの核酸を挙げることができる。これら以外にも、転写産物に結合し得る低分子化合物、天然高分子などを含めてもよい。【００１８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記EZI遺伝子転写産物の配列に基づき、該転写産物と対合し得るように配列をデザインすることができる。アンチセンスヌクレオチドはデオキシリボ核酸またはリボ核酸のいずれから構成されてもよい。また、天然には存在しない人工的な核酸から構成してもよい。また、配列の長さは、特に制限はないが、少なくとも特異性を保持し得る長さを有していればよく、長さの上限はｍRNAと同等の長さとしてもよい。一般には、１４塩基〜２００塩基、好ましくは１５塩基から５０塩基とすることができる。【００１９】
二重鎖RNA（以下、dsRNAという）とは、RNAi（RNA interferaence、RNA干渉）に使用し得るRNAを指す。哺乳動物細胞のRNAiを誘導するdsRNAにはsiRNA（低分子干渉RNA）、shRNA（低分子ヘアピンRNA）、マイクロRNAなどの形態が知られており、本発明はこれら全てを包含し得る。dsRNAは、上記EZI遺伝子の転写産物の一部領域と相補し得るアンチセンス鎖と、このアンチセンス鎖と対合し得る配列からなるセンス鎖とから構成される。すなわち、dsRNAの二重鎖領域は、EZI遺伝子上の標的とする領域のDNA配列をリボ核酸に変更した配列に相当する。なお、EZIの発現を抑制し得る限り、アンチセンス鎖の配列中に標的とするEZI 遺伝子と相補しない配列を有していてもよく、また、センス鎖配列中にアンチセンス鎖と対合しない配列を有していてもよい。【００２０】
上記dsRNAの二重鎖領域の長さは、一例を示せば、16〜49塩基対、好適には16〜30塩基対、さらに好適には19〜21塩基対とすることができる。長いdsRNAは、細胞毒性を有することから、この毒性を与えない範囲で、長さの上限を決定することができる。また、dsRNAの長さの下限は、特異性を保持し得る範囲で調整することができる。【００２１】
上記dsRNA末端構造は、平滑末端あるいは粘着（突出）末端のいずれでもよい。また、粘着（突出）末端構造は、siRNAとして報告されたような3'末端側が突出している構造だけでなく（Elbashir, S. M et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411, 494-498 (2001)、Caplen, N. J. et al. Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 9742-9747 (2001)）、EZI遺伝子発現を抑制し得る限り、5'末端側が突出している構造も含めることができる。また、突出する塩基数は、例えば、１〜５塩基、好適には、２、３塩基とすることができる。【００２２】
dsRNAによりEZI遺伝子発現を効果的に抑制し得るEZI遺伝子上の標的領域または具体的なdsRNA配列は、次のようなデザインツールを利用してデザインすることもできる。
「siDESIGN Center」（DHARMACON社、http://design.dharmacon.com）
「siRNA Target Finder」（Ambion社、http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html）
「siRNA Design Support System」（タカラバイオ株式会社）、http://www.takara-bio.co.jp/rnai/intro.htm
「PSICOLIGOMAKER 1.5（Mac用）」（Andrea Ventura, MD/PhD 、MIT Center for Cancer Research）
EZI遺伝子上でdsRNAの標的とし得る具体的配列は、例えば、配列番号１〜４（mE-1〜４）または１１〜１３（E-1〜３）等を挙げることができる。【００２３】
dsRNA は、合成器などにより人工的に合成した合成オリゴdsRNAとして調製してもよい。または、dsRNAをコードしたDNAを担持した発現ベクターから細胞内でsiRNAを発現させる構成としてもよい。細胞内でdsRNAを発現させる際のベクターは、導入したい細胞などにより任意に選択することができる。例えば、哺乳動物細胞では、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、EBウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、フォーミーウイルスベクターなどのウイルスベクターなどが挙げられる。これら発現ベクターにはdsRNAを転写させるためのプロモータを備え、その下流にdsRNAをコードしたDNAを連結する。また、プロモータやdsRNAの構築方法などは、例えば、「RANi実験プロトコール」（羊土社）やWO０３/０４６１８６パンフレットなどを参照することができる。また、こうしたdsRNAを発現させるためのベクターは、siRNA発現ベクターとして開発された市販のベクター（例えば、ｐSIREN-RetroQ（BD-Biosciences社）など）を用いてもよい。
上記EZI転写産物に結合し得るアンチセンス核酸、siRNAは、EZIタンパク質の合成を抑制し、結果として、EZIタンパク質によるSTATタンパク質の核移動/核局在化を抑制し得る。【００２４】
本発明のSTAT核移動/核局在化阻害剤は、EZI遺伝子の翻訳産物と結合し得る物質を成分とすることもできる。本発明はEZIタンパク質に結合し得る核酸がEZIによるSTAT、とりわけSTAT3の核移動を阻害したとの知見に基づくものである。したがって、この物質は、好適には核酸である。また、EZI遺伝子の翻訳産物とは、具体的にはEZIタンパク質である。その具体的なアミノ酸配列を配列番号３４、３６に示すことができるが、この配列に限定されず、この配列と類似しEZIと同等の機能を有するタンパク質はEZI遺伝子の翻訳産物に含めることができる。EZI遺伝子の翻訳産物に結合し得る核酸としては、EZIタンパク質が結合し得る遺伝子の制御領域中のオリゴヌクレオチドまたはその改変体を挙げることができる。【００２５】
EZIタンパク質が結合し得る遺伝子の制御領域としては、例えば、α2−マクログロブリンプロモーター領域、特に、本領域中のAcute phase response element(APRE, 配列番号：１４)またはこのAPRE配列を改変したオリゴヌクレオチド（以下、「APREデコイ核酸」という）を挙げることができる。APREデコイ核酸は、野生型のAPRE配列中に一つ以上の塩基を任意に欠失、置換、付加あるいは挿入して作成することができる。ここで作成したAPREデコイ核酸がEZIタンパク質と結合し得るかは、後述する実施例にも示すようにEZIタンパク質と、作成したデコイ核酸とを接触させ、EZIタンパク質またはデコイ核酸を回収した際にデコイ核酸またはEZIタンパク質をそれぞれ共に回収し得るかを指標に確認することができる。APREデコイ核酸としては、例えば、配列番号１５〜２０のいずれかに記載の配列を有する核酸を挙げることができ、このうち好ましいものとして、配列番号１６、１７または２０に記載の配列を有する核酸が挙げられる。【００２６】
α2−マクログロブリンプロモーター領域内のAPREにはSTAT３結合部位があることが知られている。こうしたSTAT３との結合部位を有するAPREがEZIタンパク質とも結合したことから、このようなSTAT３結合部位を備えた核酸は、STAT３とともにEZIタンパク質と結合し得る核酸の候補になり得る。このようなSTAT３との結合部位を備えた遺伝子制御領域としては、c-Fos、junB、インターフェロン制御因子１（IRF-1）、およびアンジオテンシノーゲンなどの制御領域が挙げられる。したがって、APRE以外にも、ここに示す制御領域中の配列からEZIタンパク質に結合し得る核酸を選択してもよく、また選択された核酸を改変してデコイ核酸を作成してもよい。【００２７】
（２）EZI部分ペプチドもしくはその一部またはそれらの改変体
本発明における「EZI部分ペプチドまたはその改変体」とは、配列番号３４または３６に記載されたアミノ酸配列中、９２―１８２のアミノ酸（この部分配列を配列番号：２２または２３として示す）からなるEZI部分ペプチドまたは、EZIによるSTATの核への移動を阻害し得るその一部またはそれらの改変体である。後述する実施例に示す通り、上記配列（配列番号：２２または２３）中酸性アミノ酸が富むモチーフ、例えば、アミノ酸配列の99番から101番、106番から108番、163番から164番の三箇所に点在するモチーフにSTAT３が結合し、これら点在するモチーフのいずれかを含むペプチド断片がEZIによるSTAT３の核移動/核局在化を阻害し得ることを確認している。すなわち、上記本発明のEZI部分ペプチドの一部として、これら3箇所に点在するモチーフ（以下、「（STAT）結合ペプチド」という）のいずれか一つ、二つ、もしくは全てを含むペプチドを挙げることができる。「EZI部分ペプチドの一部」の長さは、特に制限はない。【００２８】
また、EZI部分ペプチドまたはその一部の「改変体」として、STAT核移動/核局在化を阻害し得る活性が維持できる範囲で、配列番号：２２または２３に記載のアミノ酸配列からなるEZI部分ペプチドにおいて、一つ以上のアミノ酸を欠失、付加、置換もしくは挿入を加えて作製することができる。このようにアミノ酸配列に修飾を加える場合には、例えば、上記STAT結合ペプチドが存在する部分を避けて、修飾することが考えられる。また逆に、STAT結合ペプチドの選択した一つもしくは二つまたは全部に任意のアミノ酸を付加して作製してもよい。さらには、STAT核移動/核局在化を阻害し得る活性が維持できる範囲で、上述した３つのSTAT結合ペプチドについてそれぞれアミノ酸の欠失、置換などの変更を加えてもよい。したがって、STAT結合ペプチドを含むEZI部分ペプチドにおいて、STAT結合ペプチド以外の配列は必ずしも結合ペプチドと連続した野生型のアミノ酸配列から構成する必要はなく、上述した活性が維持し得る範囲で任意の配列に改変することもできる。【００２９】
「改変体」には、EZIの部分ペプチド断片に適宜、他の機能的なペプチドを付加して修飾したものも含まれる。例えば、EZI部分ペプチド、あるいはSTAT結合ペプチドに細胞膜透過シグナルの付加、標識物質の付加などが挙げられる。細胞膜透過シグナルは種々存在し、部分ペプチドが有するSTAT核移動/核局在化阻害作用を実現あるいは誘導し得るものであればよく、例えば、配列番号２８、３２が挙げられるが、好ましくは配列番号３２である。こうした細胞膜透過シグナルを付加することにより、細胞内へ部分ペプチドを浸透させ、細胞質のSTATとの接触を可能とし、STATの核への移動や核局在化を効果的に阻害することができる。なお、こうした細胞膜透過シグナルを付加したSTAT結合ペプチドの例を配列番号２５〜２７、２９〜３１に示す。【００３０】
上記種々の成分のいずれかを含むSTAT核移動/核局在化阻害剤を使用する場合、成分が核酸、ペプチドかによって使用方法は異なる。例えば、成分が核酸の場合には、本薬剤を作用させたい細胞内に本成分を導入することが好ましい。導入手法としては、合成オリゴsiRNA、デコイ核酸、アンチセンス核酸など、そのもの自身が細胞に対する侵入する能力を有していない場合には、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポーレション、ジーンガンなど、その他開発されている遺伝子導入技術、市販の遺伝子導入試薬またはキットを利用することができる。また、感染力を保持したウイルスベクターを用いたdsRNA発現ベクターなどの場合には、ウイルスの感染力により細胞にベクターを導入することができる。一方、ペプチドの場合には、細胞の食作用を利用したデリバリーシステムを利用してもよいが、上述したような細胞膜浸透シグナルを備えたペプチドの場合には細胞の培養液に添加することにより、ペプチドを細胞内に浸透させることができる。本成分が細胞内に導入されると、本薬剤の成分が細胞内のEZI転写・翻訳産物に作用して、EZIによるSTAT核移動/核局在化が抑制される。【００３１】
本発明は第二にSTAT依存性遺伝子発現調節阻害剤に関する。上記STAT核移動/核局在化阻害剤は、STATが活性化された際の初期の反応、すなわち核移動を抑制する。従って、STAT核移動/核局在化阻害剤は、このSTATが活性化された際の初期の反応である核移動を阻害することから、この反応に続く反応をも阻害し得る。実際に、本発明者らは、上述したSTAT核移動/核局在化を阻害する活性を有する成分は、STAT依存的な遺伝子発現活性化を抑制することを確認している。したがって、STAT核移動/核局在阻害剤はSTAT依存的な遺伝子発現の調節を制御し得る薬剤としても利用することができる。また、STAT依存的な遺伝子発現調節は、遺伝子の発現を活性化するばかりでなく、STAT依存的に遺伝子発現が下方制御される場合が知られている。例えば、活性化されたSTAT3（とc-Junとの協調作用）によってFasの発現が抑制され、その結果、Fas-L（Fasリガンド）によるアポトーシス誘導への感受性が低下（もしくは損失）し、細胞死を免れる場合がある（Ivanov VN, Bhoumik A, Krasilnikov M, Raz R, Owen-Schaub LB, Levy D, Horvath CM, Ronai Z.,  Mol Cell (2001) Vol.7, pp.517-28.、Wang T, Niu G, Kortylewski M, Burdelya L, Shain K, Zhang S, Bhattacharya R, Gabrilovich D, Heller R, Coppola D, Dalton W, Jove R, Pardoll D, Yu H.,  Nat Med (2004) Vol.10, pp.48-54.）。このようなSTAT依存的に他の遺伝子の発現抑制を阻害する場合にも、本発明の薬剤を応用し得る。なお、STAT依存性遺伝子発現調節阻害剤として利用する場合も、使用方法は、上述したSTAT核移動/核局在化阻害剤と同様である。【００３２】
上記本発明の薬剤により抑制し得る遺伝子は、STAT依存的に発現が活性化される遺伝子であり、好適にはSTAT３依存的に発現が活性化される遺伝子である。STAT３依存的に発現が活性化される遺伝子には、上述した制御領域にSTATの結合部位を備えた遺伝子、具体的には、c-Fos、junB、インターフェロン制御因子１（IRF-1）、アンジオテンシノーゲン、c-myc、Cyclin D1、Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、VEGF（vascular endothelial cell growth factor）、およびIL-10（interleukin-10）などが挙げられる。また、本発明におけるSTAT3依存的に発現が活性化される遺伝子は、制御領域にSTAT３が直接作用して、その発現を活性化するものに限定されず、STAT３が直接作用して発現誘導された一次遺伝子から二次的にあるいは副次的に発現が誘導される遺伝子をも含めることができる。本薬剤は、こうしたSTATにより直接的にまたは二次的に発現が活性化される遺伝子の発現を抑制するために使用することができる。
なお、本薬剤は、上述したSTAT核移動/核局在化阻害剤と同様の方法で細胞あるいは組織に使用することができる。【００３３】
本発明は、第三にがん細胞増殖抑制剤に関する。STATによる他の遺伝子の発現活性化によって、がんが誘導されることが知られている。そこで、上記STAT核移動/核局在化阻害剤をがん細胞に作用させたところ、その増殖を抑制し得ることを見出している。したがって、上述したSTAT核移動/核局在化阻害剤はがん細胞の増殖を抑制する薬剤としても利用することができる。【００３４】
本発明の薬剤が標的とするがん細胞は、STAT、とりわけSTAT３により増殖が誘導されるがん細胞を挙げることができる。具体的には、前立腺がん細胞、乳がん、頭頸部がん、黒色腫（メラノーマ）、卵巣がん、肺がん、脳がん、膵臓がん、肝細胞がん、腎細胞がん、皮膚がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫（多発性骨髄腫）、等に由来するがん細胞を挙げることができる。
上記STAT核移動/核局在化阻害剤を癌細胞増殖抑制の目的で使用する場合も、上記STAT核移動/核局在化阻害剤で説明した同様の方法によりがん細胞に作用させて使用することができる。【００３５】
上述したSTAT核移動/核局在化阻害剤は、活性化されたSTATの初期反応を抑制することにより、STATの活性化により誘導される他の遺伝子発現活性化さらには癌細胞増殖などをも抑制する。したがって、STAT核移動/核局在化阻害剤はSTATが起因する疾患の治療・予防用医薬組成物として応用し得る。ここで、STAT、とりわけSTAT３が起因する疾患としては、例えば、前立腺がん、乳がん、頭頸部がん、白血病などのがん、関節炎、などの炎症性疾患、乾癬などの免疫疾患、さらに、脊髄損傷、疼痛等の神経性疾患などが挙げられる。また、腎臓のメサンギウム細胞（糸球体間質細胞）の増殖誘導においてもSTAT3の活性化が重要であることが、モデルマウス等を用いた実験により示されている（Takahashi T, Abe H, Arai H, Matsubara T, Nagai K, Matsuura M, Iehara N, Yokode M, Nishikawa S, Kita T, Doi T.,  J Biol Chem (2005) Vol.280, pp.7100-7106.、Yanagita M, Arai H, Nakano T, Ohashi K, Mizuno K, Fukatsu A, Doi T, Kita T.,  J Biol Chem (2001) Vol.276, pp.42364-42369.）。したがって、STAT3の活性化を阻害することにより、メサンギウム細胞の増殖により引き起こされる糸球体腎炎や糸球体硬化症等の腎疾患の治療につながる可能性がある。【００３６】
これら疾患の治療・予防用医薬組成物として、上記STAT核移動/核局在化阻害剤の成分を利用する場合には、本成分に必要に応じて、他の成分を混合処方してもよい。また、本医薬組成物も公知の製剤学的製造法を利用して製剤化することができる。主成分に応じて蛋白質製剤として、核酸製剤として、また低分子化合物製剤として製剤化され得る。製剤化する場合は、例えば、薬剤として一般的に用いられる媒体または担体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤などと適宜組み合わせて製剤化して投与することができる。投与形態や投与量は、例えば文献「Gregoriadis, 1979, Drug Carriers in Biology and Medicine, Academic Press」、「Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 第６版」、「Anselら、Pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems, 第５版, Lea & Febiger社, 1990」、および「Gennaro編, Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版, Mack Publishing Company, 1990」等により決定することもできる。【００３７】
本発明は、STAT核移動/核局在化阻害剤またはSTAT依存性遺伝子発現調節阻害剤のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は  (i)被験物質とEZIタンパク質との結合活性または  (ii)被験物質とEZIタンパク質ならびにSTATタンパク質との結合活性を測定する工程が含まれる。【００３８】
被験物質とEZIタンパク質との結合活性を測定する場合、EZIタンパク質としては、全長タンパク質である必要はなく、部分ペプチドであってもよい。部分ペプチドとしては、一例としてSTAT３結合ペプチド、具体的には、EZIタンパク質の第99番から第101番のペプチド、106番から108番のペプチド、または163番から164番のペプチドのいずれかを含む領域から構成することができる。こうしたSTAT結合ペプチドを含む部分ペプチドをスクリーニングツールとして用いて候補物質を選抜した場合には、EZIタンパク質とSTAT３タンパク質との相互作用を阻害し得る物質の候補を得ることができる。【００３９】
STATタンパク質またはEZIタンパク質それぞれに対する結合活性を測定する場合、STATタンパク質として、好ましくはSTAT３、STAT４を用いる。このようにスクリーニングツールとしてEZIタンパク質およびSTAT３若しくはSTAT４タンパク質を用い、EZIタンパク質との結合活性、STAT３またはSTAT４との結合活性を測定することにより、EZIとSTAT３との相互作用、あるいはEZIとSTAT４との相互作用を阻害する可能性の高い候補物質を選抜することが可能となる。なお、結合活性の測定は、免疫沈降反応、プルダウンアッセイなどを挙げることができる。【００４０】
ここでEZIタンパク質やSTATタンパク質との結合が確認された被験物質は以下（１）〜（４）のいずれかの工程またはこれら工程の組合せにより、さらに選抜してもよい。
（１）被験物質存在下でのEZIタンパク質とSTATタンパク質との結合能を測定する工程
EZIタンパク質とSTATタンパク質との結合能の測定は、免疫沈降反応、プルダウンアッセイ、two-ハイブリッド法、フローサイトメトリーなどにより測定することができる。これらの測定を被験物質存在下または非存在下で実施し、非存在下に比べて存在下においてEZIタンパク質とSTATタンパク質との結合活性が低下した場合に、当該被験物質をSTAT核移動/核局在化阻害剤の有力な候補として選抜し得る。
（２）EZI遺伝子が発現している細胞に被験物質を作用させ、STAT刺激因子添加後のEZIタンパク質の局在を測定する工程
STAT刺激因子として、例えば、オンコスタチンM(OSM)、v-Srcを用いることができる。EZIタンパク質の局在は、抗EZI抗体を用いた免疫染色などにより測定することができる。また、測定対象のEZIタンパク質を蛍光タンパク質（GFPなど）との融合タンパク質として細胞内で発現させることにより、抗体等を用いずにEZIタンパク質の局在を検出することができる。被験物質存在下または非存在下でEZI遺伝子を発現している細胞にSTAT刺激因子を作用させた際に、被験物質非存在下に比して存在下のEZIタンパク質の細胞質の存在割合が多い場合に、被験物質はSTAT核移動/核局在化阻害剤の有力な候補となる。
（３）EZI遺伝子およびSTAT遺伝子が発現している細胞に被験物質を作用させ、STAT刺激因子添加後のSTATタンパク質の局在を測定する工程
上記（２）と類似しているが、本工程ではSTATタンパク質の局在を指標とする。本工程においても、STAT刺激因子として、例えば、OSMやv-Srcを用いることができる。STATタンパク質の局在は、抗STAT抗体を用いた免疫染色などにより測定することができる。あるいは、測定対象のSTATタンパク質を蛍光タンパク質（GFPなど）との融合タンパク質として細胞内で発現させることにより、抗体等を用いずにSTATタンパク質の局在を検出することができる。被験物質存在下または非存在下でEZI遺伝子およびSTAT遺伝子を発現している細胞にSTAT刺激因子を作用させた際に、被験物質非存在下に比して存在下におけるSTATタンパク質の細胞質の存在割合が多い場合に、被験物質はSTAT核移動/核局在化阻害剤として選抜される。
（４）EZI遺伝子およびSTAT遺伝子が発現している細胞に被験物質を作用させ、STAT刺激因子添加後のSTAT依存的な遺伝子発現を測定する工程
STAT刺激因子は上記（２）、（３）工程と同様である。被験物質存在下または非存在下でEZI遺伝子およびSTAT遺伝子が発現している細胞にSTAT刺激因子を作用させる。作用後のSTAT依存的な遺伝子発現を測定する。被験物質非存在下に比べて存在下においてSTAT依存的な遺伝子発現が低下している場合に、STAT核移動/核局在化の阻害の可能性、STAT依存的遺伝子発現抑制の確認を行うことができる。【００４１】
上記STAT依存的に発現誘導される遺伝子としては、α2-マクログロブリンなどを挙げることができる。こうした遺伝子の発現を指標として、評価することができる。また、評価を簡便にするためには、STAT結合部位を備えた制御領域の下流にレポーター遺伝子を接続させたレポーターを指標とすることができる。STAT結合部位を備えた制御領域としては、α2-マクログロブリンの制御領域、またはその一部配列であるAPREの下流にレポーター遺伝子を接続してもよい。レポーター遺伝子は特に限定はなく、ルシフェラーゼ遺伝子、GFP遺伝子、BFP遺伝子、YFP遺伝子などのその発現産物による発光を指標とするもの、酵素活性を指標とするもの、薬剤感受性を指標とするものなどを用いることができる。
なお、上記各工程におけるSTATとして、STAT３、STAT４を用いることができ、好適にはSTAT３である。
STAT核移動/核局在化阻害剤の候補として選抜された被験物質は、STATタンパク質の核移動を阻害することによりSTAT依存的遺伝子発現を抑制し得る可能性を有し、さらにはがん細胞増殖抑制の可能性を有する。こうしたSTAT核移動/核局在化阻害剤やSTAT依存的遺伝子発現抑制剤の候補物質は、STAT依存的遺伝子発現活性化に起因した疾患の治療・予防用医薬品そのもの、あるいはリード物質となり得ると期待される。【００４２】
また、本発明の被験物質は、特に限定はなく、低分子化合物、核酸、タンパク質などを含めることができる。低分子化合物には、本発明で示したAPRE配列を改変した核酸やEZIタンパク質におけるSTAT結合ペプチドと構造が類似した模倣物などを含めることができる。また、結合活性の測定は、免疫沈降反応、プルダウンアッセイ、酵母two-ハイブリッド法、アルファスクリーン（「AlphaScreen」、化学増幅型ルミネッセンス プロキシミティー ホモジニアスアッセイ、ttp://www.perkinelmer.co.jp/products_ls/assays/assays_0010.html）、BIAcore system （表面プラズモン共鳴、http://www.biacore.co.jp/c.shtml）などを挙げることができる。上記スクリーニング方法におけるSTATはSTAT３、STAT４であり、好ましくはSTAT３である。
なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例を用いて、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
[実施例１]  EZI siRNA
siRNAを用いてEZI遺伝子の発現を抑制することで、EZIの機能阻害によるSTAT3シグナルへの影響を検討した。【００４４】
(i)マウスEZIに対するsiRNAの作成
マウスEZI遺伝子のcDNA配列情報（NCBI RefSeq: AB076746）に基づき、siRNAの候補となる４種類の配列を選び出した（mE-1、mE-2、mE-3およびmE-4；図１-１；  配列番号：１〜４）。これらの配列に対応する二重鎖RNA（dsRNA）型のsiRNAを合成した（Greiner Bio-One社）。この時、二重鎖RNAのセンス鎖、アンチセンス鎖ともに、図に示した配列（センス鎖のみ示してある）の3’側にさらに2残基のUが付加された状態で合成している。対照として、マウスSTAT3あるいはルシフェラーゼに対する既知のsiRNA、およびランダムな19残基の配列からなるスクランブル・オリゴヌクレオチドも、EZI siRNAと同様に合成して実験に使用した。
合成したsiRNAを、STAT3シグナルに応答するAPRE-luciferaseレポータープラスミドと共にNIH3T3細胞にリポフェクション法で導入し、OSM存在下で培養した場合のルシフェラーゼ遺伝子産物の発現を測定した。
いずれのEZI siRNAを導入した場合にもOSM刺激に伴うレポーター遺伝子の発現に抑制が認められた（図１-２上図）。中でもmE-1が最も強く、STAT3 siRNAの場合と同程度の抑制効果を示した。
さらに、同様の実験をトランスフェクションに用いるsiRNA（EZI mE-1、STAT3、およびN.C.）の量を変えて行ったところ、用量依存性の抑制効果が認められた（図１-２下図）。【００４５】
(ii)マウスEZI遺伝子の発現抑制
EZI遺伝子の発現抑制による効果を観察する実験を、合成した二重鎖RNA型のsiRNAではなく、ベクター型のsiRNAを用いて行った。上記の結果に基づき、mE-1に相当する配列（図２-１上図）のsiRNAを発現可能なレトロウイルスベクターを構築した。レトロウイルスベクターとしては、pSIREN-RetroQ（BD Biosciences社）を用いた。対照として、STAT3mRNAに対するsiRNA（図２-１上図）を発現するようなレトロウイルスベクター、およびインサートを含まないレトロウイルスベクターを使用した。これらのベクターをPLAT-E細胞にトランスフェクションし、培養上清としてレトロウイルスを回収した。
これらのレトロウイルスをNIH3T3細胞培養液中に添加し、これに感染させた。さらに、APRE-luciferaseレポータープラスミド、もしくは対照としてAPREを含まない空のluciferaseレポータープラスミド（pGL3）をリポフェクション法により導入した後、OSM存在下で培養を行い、ルシフェラーゼ遺伝子産物の発現を測定した。その結果、EZI siRNAを発現させた場合には、STAT3 siRNAの場合と同程度に、OSM刺激に伴うSTAT3依存性の転写活性化が抑制された（図２-１下図）。また、NIH3T3細胞に感染させるレトロウイルスの量を変えて実験を行ったところ、用量依存性の抑制効果が認められた（図２-３）
v-SrcでトランスフォームしたNIH3T3細胞（NIH3T3/v-Src）ではSTAT3の恒常的な活性化が引き起こされることが知られている。そこで、EZI siRNAがv-Src依存性のSTAT3シグナル活性化をも抑制することが可能かについて検討した。上述のレトロウイルスをNIH3T3/v-Src細胞に感染させた後、レポータープラスミド（APRE-luciferaseもしくはpGL3）をリポフェクション法にて導入し、ルシフェラーゼ遺伝子産物の発現を測定した。その結果、NIH3T3細胞をOSM刺激した場合と同様に、v-Src依存性のSTAT3シグナルについても、EZI siRNAにより抑制されることが明らかとなった（図２-２）。【００４６】
(iii)STAT3タンパク質の細胞内局在の確認
これまでに観察された、EZI遺伝子の発現抑制によるSTAT3シグナルの阻害効果が、実際にSTAT3タンパク質の核への移行を阻害することによるものなのかを明らかにするために、STAT3タンパク質の細胞内局在についての解析を行った。
EZI siRNA（mE-1配列）、および、mE-1配列に変異を導入したsiRNA（mutEZI siRNA；5’-TCCGAAGGGTAAAGGCCGA-3’／配列番号：１０）を発現するレトロウイルス、あるいはsiRNAを発現しない（ベクターのみの）レトロウイルスを、NIH3T3細胞に感染させた。このレトロウイルスベクターには選択マーカーとしてpuromycin耐性遺伝子が組み込んであるので、ウイルス感染後にpuromycin存在下で培養を行うことで、siRNA導入細胞を選別した。これらを血清飢餓状態で培養した後、さらにOSMの存在下・非存在下で培養を行った。培養した細胞を固定して、抗STAT3抗体（C-20：Santa Cruz社）を用いた免疫染色と、DAPIによる核染色を行った後、蛍光顕微鏡を用いて観察した。
その結果、EZI siRNAを発現するNIH3T3細胞では、OSM刺激に伴うSTAT3の核移行が阻害されている様子が観察された（図３）。これに対し、mutEZI siRNAもしくはベクターのみを導入した細胞では、OSM刺激後にSTAT3は核へと移行していた。したがって、機能的なEZI siRNAは、STAT3の核への移行を阻害することでこのシグナルを抑制していることが明らかとなった。【００４７】
(iv)ヒトEZIの発現抑制
これまではマウスのEZI遺伝子に対するsiRNAを用いた解析を行ってきたが、次にヒトのEZI遺伝子に関しても、その発現を抑制した場合にSTAT3シグナルへの阻害効果がみられるかを解析した。ヒトEZI遺伝子のcDNA配列情報（NCBI RefSeq: NM_207336）に基づき、3種類のsiRNAをデザインした（E-1、E-2、およびE-3；図４（Ａ）；配列番号：１１〜１３）。これらのsiRNAを発現するようなプラスミドを、pSilencerベクター（Ambion社）を用いて構築した。
細胞として、ヒトの頭頸部がん由来の細胞株であるKB細胞（nasopharyngeal epidermal carcinoma）およびYCU-H891細胞（hypopharynx carcinoma）、および肝細胞がん（hepatocellular carcinoma）由来の細胞株であるHepG2細胞を使用した。これらの細胞にEZI siRNA発現ベクターおよびAPRE-luciferaseレポータープラスミドをリポフェクション法により導入した後、さらに2日間培養した。この時、HepG2細胞に関してはIL-6存在下・非存在下での培養を行った。培養後に、それぞれの細胞でのルシフェラーゼ遺伝子産物の発現量を測定した。
その結果、KB細胞においてはE-2およびE-3 siRNAによって、H891細胞においては3種類全てのsi RNAによって、STAT3依存性の転写活性化への抑制効果が認められた（図４（Ｂ））。またHepG2細胞についてもE-3 siRNAにより、IL-6刺激に伴うSTAT3依存性の転写活性化上昇に対する影響が観察された。【００４８】
以上の様に、マウスおよびヒトいずれの系においても、siRNAを用いてEZI遺伝子の発現を阻害した場合にはSTAT3タンパク質による転写活性化が抑制されることから、EZIタンパク質はSTAT3タンパク質の活性化と機能に中心的な役割を果たす分子であると考えられる。【００４９】
[実施例２]  EZI decoy ODN
EZIタンパク質はDNAに直接結合する分子であり、STAT3タンパク質と同様にAPRE配列（5’-CTTCTGGGAAGA-3’／配列番号：１４）を認識し、これに結合することができる。本発明者らはこのAPRE配列に様々な変異を導入した一連のオリゴヌクレオチド（ODN）を用いた解析により、mut-2と名付けた配列（5’-CTTCTTCTTCGA-3’／配列番号：１６；下線部分が変異を導入した塩基）が野生型のAPRE配列に比較してより強くEZIと結合することをすでに報告している（Nakayama, et al., 2002）。本実施例では、EZIと強く結合し得るmut-2配列を持つオリゴヌクレオチドを細胞に導入することにより、内在性のEZIの核局在を阻害し、さらにSTAT3の活性化を抑制し得るかを検討した。【００５０】
(i)変異APRE配列のEZIタンパク質およびSTAT3タンパク質との結合
STAT3の認識・結合配列であることが知られているAPRE配列を元にして、これに種々の塩基置換を導入した変異オリゴヌクレオチド配列を６種類デザインした（mut-1からmut-6；図５（Ａ））。これらのうち、mut-1からmut-3については、すでに論文発表しているものと同一である。これらの配列を有する二重鎖DNAを、センス鎖、アンチセンス鎖共に5’末端がビオチン修飾された形で合成した（北海道システムサイエンス社）。
これらの二重鎖オリゴヌクレオチドDNAとEZIタンパク質およびSTAT3タンパク質との結合についての解析を行った。Myc-tagを融合させたEZI、あるいはHA-tagを融合させたSTAT3遺伝子を発現するプラスミドをCOS7細胞にリポフェクション法により導入し、これらの細胞の抽出液を調製した。上記のビオチン化オリゴヌクレオチドを予めストレプトアビジン結合磁気ビーズ（Dynabeads M280 streptavidin；Dynal社）と結合させておき、これを細胞抽出液に加えて撹拌した。磁石を用いて、オリゴヌクレオチドと結合する分子を磁気ビーズと共に沈降させた。結合分子を溶出した後、SDS-PAGEにて分離し、PVDF膜に転写したものを用いて、抗Myc-tag抗体あるいは抗HA-tag抗体によるウェスタンブロット解析を行った。
mut-2、mut-3、あるいはmut-6のオリゴヌクレオチドでは、野生型のAPREオリゴヌクレオチドに比較してより強くEZIが結合していた（図５（Ｂ））。さらに、mut-2あるいはmut-6の場合には、STAT3もより強く結合していた。【００５１】
(ii)EZI decoy ODNを用いたSTAT3核移行の阻害
上記のmut-2配列を持つ二重鎖オリゴヌクレオチドDNA（以下、「EZI decoy ODN」と称する）を細胞に導入することにより、内在性のEZIタンパク質の核局在を阻害し、さらにSTAT3タンパク質の活性化を抑制し得るか検討した。EZI decoy ODN、あるいは、先の実験結果からEZIタンパク質には結合しないことが明らかとなったmut-1オリゴヌクレオチド（以下、「EZI mut-decoy ODN」と称する）を、Oligofectamine（Invitrogen社）を用いたリポフェクション法によりNIH3T3細胞に導入した。対照として、オリゴヌクレオチドを導入していないNIH3T3細胞も用意した。これらの細胞を24時間培養し、さらにOSM（10 ng/ml）の存在下あるいは非存在下にて24時間培養を行った。培養後、固定して、抗STAT3抗体を用いた免疫染色を行いSTAT3タンパク質の細胞内での局在を確認した。また、ストレプトアビジン結合FITCを用いてオリゴヌクレオチドの局在を、DAPIを用いて細胞の核を染色した。蛍光顕微鏡を用いてSTAT3タンパク質の細胞内での局在を調べた結果、オリゴヌクレオチドを導入していない対照では、OSM刺激に伴うSTAT3タンパク質の核への移行が観察された。しかしながら、EZI decoy ODNを導入した細胞では、OSM存在下でもSTAT3タンパク質は大部分が核には移行せずに細胞質に留まっていることが明らかとなった（図６-１）。このようなSTAT3核移行に対する阻害効果は、EZI mut-decoy ODNを用いた場合には見られなかった。
同様に、EZI decoy ODNを導入したNIH3T3細胞をOSM存在下で培養した後、EZIタンパク質の細胞内での局在についても検討を行った。この場合、EZIタンパク質およびSTAT3タンパク質を、それぞれ当該タンパク質に特異的な抗体を用いて免疫染色した。その結果、STAT3タンパク質と同様にEZIタンパク質についても、EZI decoy ODNの導入により、核への局在が阻害されていることが確認された（図６-２）。【００５２】
(iii)EZI decoy ODNのSTAT3転写活性化に対する阻害効果
EZI decoy ODNによりSTAT3タンパク質の核局在が阻害されることが明らかとなったので、これがSTAT3タンパク質による転写活性化に対しても阻害効果を示すかを検討した。EZI decoy ODN、EZI mut-decoy ODN、STAT3 (APRE) ODN（図５A中にコントロールとして表示;配列番号：１４）、もしくはSTAT3 mut-ODN（5’-Bio-CTTCTGGGCCGA-3’／配列番号：２１）を、APRE-luciferaseレポータープラスミドと共に、リポフェクション法によりNIH3T3細胞もしくはCOS7細胞に導入した。対照の細胞にはレポータープラスミドのみを導入した。導入後、NIH3T3細胞についてはOSMの存在下・非存在下で培養を行った。一方、COS細胞については、STAT3の定常的な活性化が認められることから、APRE-ルシフェラーゼレポーターを導入後もOSM非存在下で培養を行った。培養後のそれぞれの細胞中でのルシフェラーゼ遺伝子の発現量を測定した。
EZI decoy ODNの導入により、STAT3依存性の転写活性化が顕著に抑制されることが明らかとなった（図７）。また、EZI decoy ODN によるSTAT3発現活性化に対する抑制効果はSTAT3 decoy  ODNと比べても高く、OSM存在下でも確実にその抑制効果を発揮し得ることが示された。EZI decoy ODNの作用は、COS細胞を用いた実験でも同様の結果が示されている。【００５３】
[実施例３]  結合ドメイン由来ペプチド
EZIタンパク質の構造は、既に報告されている通り、N末にSTAT3結合ドメインがあり、そのC末側に隣接して核局在に必要なドメイン（ジンクフィンガードメイン）が存在する（前掲Nakayama K.ら,  2002）。したがって、N末ドメインは有するがジンクフィンガードメインを欠くEZI変異体では、細胞質に局在してSTAT3タンパク質と結合することによりSTAT3の核への移行を阻害し、結果としてSTAT3依存性の転写活性化は抑制されることがわかっている（前掲Nakayama K.ら,  2002）。
本発明者らは、このN末のSTAT3結合ドメインについて詳細な解析を行なった。解析は、EZIタンパク質の各種変異体（deletionおよびpoint mutation）を作成して、STAT3タンパク質との結合能を測定することで実施した。EZIの全長あるは変異体（全てMyc-tag付き）を、HA-tag付きSTAT3と共にCOS7細胞に導入（リポフェクション）した後、抗HA-tag抗体を用いてSTAT3タンパク質を免疫沈降し、これと共沈するEZIタンパク質の有無を抗Myc-tag抗体を用いたウェスタンブロット法により検出した。
上記解析により、92番目のメチオニン残基から179番目のグルタミン残基までを含む88アミノ酸からなる領域がSTAT3タンパク質との結合に関与することが明らかになった（図８−１および２）。さらに、この領域の中でも特に、99番目のグルタミン酸から101番目のグルタミン酸の3残基、106番目のグルタミン酸から108番目のグルタミン酸の3残基、および163番目のグルタミン酸と164番目のグルタミン酸の2残基、の3箇所のアミノ酸モチーフが、STAT3との結合に必要であることが明らかになった（図８−１）。【００５４】
(i)結合ドメイン由来ペプチドを用いたSTAT3核移行の阻害
上記で同定されたEZIタンパク質中のSTAT3結合領域に由来するペプチドが、STAT3タンパク質のEZIタンパク質への結合を阻害し、結果的にSTAT3シグナルを遮断することが可能かを次に示す系を用いて解析を行った。
EZIタンパク質のSTAT3結合領域に由来する７アミノ酸からなるペプチドをそれぞれ、細胞膜透過活性を有することが知られているアミノ酸配列（AAVLLPVLLAAP／配列番号：２８）と融合したアミノ配列として合成した（図９-１）。対照として、STAT3のチロシンリン酸化部位に由来する、既知のSTAT3活性阻害ペプチド（Calbiochem社）を用いた。一方で、APRE-luciferaseレポータープラスミドをNIH3T3細胞にリポフェクション法により導入した細胞を調製した。このレポータープラスミドを保持した細胞を上記合成ペプチドの存在下・非存在下で２日間培養し、さらにOSMの存在下・非存在下で1時間培養した。OSM刺激の後、細胞抽出液を調製してルシフェラーゼ遺伝子産物の発現量を測定した。
OSM刺激により誘導されるSTAT3依存性の転写活性化は、EZI由来ペプチドのうちE-1によりわずかながら抑制されることを見いだした（図９-２上図）。
上記ペプチドE-1によりSTAT3タンパク質の核への局在が阻害されるかを検討した。NIH3T3細胞の培養液中にペプチドE-1を添加し、さらにOSM（10ng/ml）存在下で培養を行った後、内在性のSTAT3タンパク質の細胞内局在を抗STAT3抗体を用いた免疫染色により観察した。この時、ストレプトアビジン結合PEを用いてペプチドE-1を、DAPIを用いて核を、それぞれ染色した。その結果、ペプチドE-1の存在下で培養した細胞においてはSTAT3の核への移行が阻害されていることが明らかとなった（図９-２下図）。【００５５】
(ii)STAT依存性転写活性抑制効果の再検討
ペプチドE-1は、STAT3タンパク質の核移行を顕著に阻害していたが、STAT3依存性の転写活性化に対する抑制効果は十分ではなかった。そこで、E-1、E-2、E-3を別の細胞膜透過シグナル配列（RRRRRRRRRRR／配列番号：３２）に変えて合成した（Greiner Bio-One社）。この時、ペプチドのアミノ末端はFITCを用いて標識した（図１０-１上図）。
これらの新たな融合ペプチドを用いて、STAT3依存性の転写活性化への抑制効果を再度検討した。細胞としては、NIH3T3細胞（図１０-１下図）、もしくはNIH3T3/v-Src細胞を用いた。これら細胞にAPRE-luciferaseレポータープラスミドをリポフェクション法により導入した。レポータープラスミドを保持した細胞を、異なる濃度の合成ペプチド存在下で培養した。コントロールは、合成ペプチド非存在下で培養を行った。その後、NIN3T3細胞はOSM存在下で、NIH3T3/v-Src細胞は非存在下で、さらに４８時間培養を行った後、細胞抽出液を調製してルシフェラーゼ遺伝子の発現量を測定した。
OSM刺激したNIH3T3細胞では3種類全てのペプチドにより、STAT3依存性の転写活性化に対する阻害効果が認められた（図１０-１下図）。NIH3T3/v-Src細胞ではペプチドE-1によりSTAT3依存性の転写活性化に対する阻害効果が認められた（図１０-２）。また、これらの阻害効果は、使用したペプチドの用量に依存していた。【００５６】
(iii)結合ドメイン由来ペプチドの細胞増殖に対する抑制効果
EZIタンパク質中のSTAT3結合ペプチドが、細胞の増殖に対して及ぼす効果を検討した。NIH3T3細胞、B16細胞、あるいはNIH3T3-L1細胞を6-wellプレートに1 wellあたり1x104個ずつ播種し、これらの培養液中にペプチド（E-1、E-2、およびE-3）あるいはコントロールとしてJAKファミリーキナーゼ阻害剤AG490を添加し、48時間培養を行った。培養後の生細胞数をトリバンブルー染色により計測した。
いずれの細胞株においても、特にE-1ペプチドの添加により、細胞増殖に対する顕著な抑制効果が認められた（図１１）。E-1ペプチドによる抑制効果は、AG490を用いた場合の抑制効果とほぼ同等、あるいはそれ以上であった。【００５７】
(iv)ヒトのがん組織由来細胞株に対する増殖抑制効果
EZIタンパク質中のSTAT3結合ペプチドによる増殖抑制効果が、ヒトのがん組織由来細胞株に対しても認められるかを、KB細胞およびYCU-H891細胞を用いて検討した。これらの細胞を6-wellプレートに1 wellあたり1x104個ずつ播種し、ペプチド（図１０−１Aに示すペプチド）の存在下・非存在下で培養を行った。培養開始後1、3、5、および7日目に、トリパンブルー染色により生細胞数を測定した。その結果、KB細胞に対してペプチドE-1を用いた場合に、顕著な増殖抑制の効果が観察された（図１２）。【００５８】
以上の、（１）EZI siRNA、（２）EZI decoy ODN、および（３）EZIペプチドの技術を用いることにより、STAT3の活性化を生体内で人為的に制御することが可能である。また、EZIペプチド配列を基にして、類似の阻害活性を有する低分子化合物を開発することも可能であると考える。
このような手法を用いてSTAT3の活性化を人為的に制御することで、STAT3の活性化の関与する種々の疾患に対して、新規の治療法あるいは予防法を提供できると考えられる。同様に、シグナル伝達経路としてSTAT3の活性化を誘導するような各種サイトカインおよび増殖因子、とりわけIL-6やEGFの関わる疾患に対しても、新規の治療法あるいは予防法を提供できると考えられる。例として、前立腺がん、乳がん、頭頸部がん、白血病等の各種がん組織・がん細胞の増殖を阻害したり、あるいはこれらにアポトーシスを誘導したりすることが期待される。また、関節炎、乾癬等の免疫疾患に対する治療効果も期待できる。さらに、脊髄損傷、疼痛等の神経性疾患に対する治療法も提供しうると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明により、STAT核移動/核局在阻害剤が提供された。STAT作用を阻害する目的で、STAT自身をターゲットとして、その発現を調節し得る物質の探索が研究されているが、本発明では、STATによる遺伝子発現活性化のメカニズムに必須となるEZI分子をターゲットとし、EZIの機能阻害を介してSTATの機能を阻害する。本発明のSTAT核移動/核局在阻害剤は、STATによる遺伝子発現の活性化、これにより種々の生物反応を引き起こす際の初期の反応であるSTATタンパク質が核に移動することを阻害する。STATタンパク質の核への移動が阻害されると、STATタンパク質が核内の遺伝子にアクセスすることができず、結果として、STAT依存的な遺伝子発現活性化、さらにはSTATタンパク質が関与するがん細胞の増殖あるいは細胞機能発現が阻害される。したがって、本発明のSTAT核移動/核局在阻害剤はSTAT依存的な遺伝子発現の活性化を阻害する薬剤としても、またがん細胞増殖抑制剤あるいは種々の免疫疾患治療薬としても利用し得る。【００６０】
本発明の薬剤によれば、STATタンパク質とEZIタンパク質との相互作用により誘導される種々の分子メカニズムの解明に寄与することが期待される。また、研究分野以外にも本発明は医療分野にも寄与し得る。STAT、とりわけSTAT3の恒常的な活性化は前立腺がん、乳がん、頭頸部がん、白血病など多くの癌細胞において認められていること、また、皮膚の乾癬疾患部位においてもSTAT3の恒常的な活性化が認められること、皮膚角質細胞でのSTAT3の恒常的な活性化により乾癬様の症状が引き起こされることなどが報告されている。一方、活性化されたSTAT3タンパク質（とc-Junとの協調作用）によってFASの発現が抑制され、その結果、FAS-L（FASリガンド）によるアポトーシス誘導への感受性が低下（もしくは損失）して細胞死を免れ、癌化が誘導され得るということも知られている。そのため、本発明はこうしたSTAT依存的な遺伝子発現調節に関与する疾患の治療・予防用医薬組成物としても応用が期待される。【００６１】
本発明により、EZIタンパク質やSTATタンパク質との結合活性を指標とした、STAT核移動/核局在阻害剤ならびにSTAT依存的遺伝子発現調節阻害剤の簡易な選抜方法が提供された。また、EZIタンパク質やSTATタンパク質との結合活性を指標として、あるいは、STAT核移動/核局在阻害活性ならびにSTAT依存的遺伝子発現活性化阻害活性を指標として、癌細胞増殖抑制剤やSTATが関与する疾患の治療・予防用医薬組成物の候補を選抜し得る方法も提供された。本発明のスクリーニング方法は、STATが関与する数々の疾患に対する創薬開発に役立つ。
【図１−１】
2006126505.tif 000002
【図１−２】
2006126505.tif 000003
【図２−１】
2006126505.tif 000004
【図２−２】
2006126505.tif 000005
【図２−３】
2006126505.tif 000006
【図４】
2006126505.tif 000007
【図７】
2006126505.tif 000008
【図８−１】
2006126505.tif 000009
【図９−１】
2006126505.tif 000010
【図１０−１】
2006126505.tif 000011
【図１０−２】
2006126505.tif 000012
【図１１】
2006126505.tif 000013
【図１２】
2006126505.tif 000014
【図３】
2006126505.tif 000015
【図５】
2006126505.tif 000016
【図６−１】
2006126505.tif 000017
【図６−２】
2006126505.tif 000018
【図８−２】
2006126505.tif 000019
【図９−２】
2006126505.tif 000020
【配列表】
2006126505000001.app
【国際調査報告】
2006126505.tif 000021
2006126505.tif 000022
2006126505.tif 000023
2006126505.tif 000024
2006126505.tif 000025
2006126505.tif 000026
2006126505.tif 000027
2006126505.tif 000028
2006126505.tif 000029
2006126505.tif 000030
2006126505.tif 000031
2006126505.tif 000032
2006126505.tif 000033
2006126505.tif 000034
2006126505.tif 000035
2006126505.tif 000036
2006126505.tif 000037
2006126505.tif 000038
2006126505.tif 000039
2006126505.tif 000040
2006126505.tif 000041
2006126505.tif 000042
2006126505.tif 000043
2006126505.tif 000044
2006126505.tif 000045
2006126505.tif 000046
2006126505.tif 000047
2006126505.tif 000048
2006126505.tif 000049
2006126505.tif 000050
2006126505.tif 000051
2006126505.tif 000052
2006126505.tif 000053
2006126505.tif 000054
2006126505.tif 000055
2006126505.tif 000056
2006126505.tif 000057
2006126505.tif 000058
2006126505.tif 000059
2006126505.tif 000060
2006126505.tif 000061
2006126505.tif 000062
2006126505.tif 000063