(57)【要約】  プリオンすなわち異常プリオン蛋白質により中枢神経系が障害されて発症する神経疾患であり、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ）、動物のスクレイピーやウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）や慢性消耗性疾患（ＣＷＤ）などのプリオン病は、これまでに実質的に有効な治療方法や予防方法が見いだされていない。日常生活において経口摂取している天然食材を用いて、異常プリオン蛋白質の増殖を抑制する効果を有するプリオン病発症予防剤、食品添加剤、飼料添加剤を提供する。プリオン病発症予防剤は、フコイダンを有効成分として含有する。食品添加剤、或いは飼料添加剤は、プリオン病発症予防剤を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フコイダンを有効成分として含有することを特徴とするプリオン病発症予防剤。
【請求項２】
前記フコイダンが、海藻よりの抽出物であることを特徴とする請求項１記載のプリオン病発症予防剤。
【請求項３】
前記フコイダンが、オキナワモズクよりの抽出物であることを特徴とする請求項１又は２に記載のプリオン病発症予防剤。
【請求項４】
経口用剤として使用することを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のプリオン病発症予防剤。
【請求項５】
請求項１記載のプリオン病発症予防剤を含むことを特徴とする食品添加剤。
【請求項６】
請求項１記載のプリオン病発症予防剤を含むことを特徴とする飼料添加剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロイツフェルト・ヤコブ病、ウシ海綿状脳症など異常プリオン蛋白質に係るプリオン病発症予防剤とそれを含む食品添加剤及び飼料添加剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトのクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ：Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ  Ｊａｋｏｂ  Ｄｉｓｅａｓｅ）、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ：Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、動物のスクレイピーやウシ海綿状脳症（狂牛病、ＢＳＥ：Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）や慢性消耗性疾患（ＣＷＤ：Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｗａｓｔｉｎｇ  Ｄｉｓｅａｓｅ）などのプリオン病は、プリオンと呼ばれる感染性の異常プリオン蛋白質により中枢神経系が障害されて発症するとされる神経疾患であり、これまでに有効な治療方法や予防方法が見いだされていない。【０００３】
異常プリオン蛋白質による感染の様式は、詳細には判明していないが、異常プリオン蛋白質は蛋白質でありながら一般的な高圧滅菌、乾燥滅菌によってもその感染性がなくなることがなく、ホルマリンやアルコールなどによって変性不活化されない。従って、現状では異常プリオン蛋白質の増殖を抑えることによってのみ治療や予防が可能であり、これまでにペントサンポリサルフェート、キニーネ類、ライソゾーム親和性薬剤、リアクティブ・ダイ（リアクティブ・グリ−ン、リアクティブ・レッド）〔例えば、特許文献１参照〕、ロイシン、イソロイシン、バリンなど分岐鎖を有する必須アミノ酸、またはトレハロース〔例えば、特許文献２参照〕、キノリン誘導体、またはナフチリジン誘導体〔例えば、特許文献３参照〕などを異常プリオン蛋白質増殖抑制剤として用いることが報告されている。【０００４】
一方、本発明は、フコイダンを異常プリオン蛋白質増殖抑制剤として用いることを提案している。フコイダンは、コンブ、ワカメ、モズクなど海藻のヌメリ成分の一つであり、構造としてフコースに硫酸基が結合し、これが数多く連結した硫酸化多糖類である。これまで、フコイダンには、がんの予防としてのアポトーシス誘発剤〔例えば、特許文献４参照〕、創傷治癒促進などの細胞増殖促進剤〔例えば、特許文献５参照〕、免疫強化剤〔例えば、特許文献６参照〕、高脂血症の予防治療剤〔例えば、特許文献７参照〕、悪酔いや二日酔いの予防改善剤〔例えば、特許文献８参照〕、皮膚の弾性維持向上、皮膚肥厚改善を行うコラーゲン産生増強剤〔例えば、特許文献９参照〕などの医薬品として、さらに体重抑制効果と脂肪組織重量、血清中性脂質（トリグリセリド）、低密度リポタンパク、全コレステロール含量を減らす健康食品〔例えば、特許文献１０参照〕、血清中の全コレステロール、中性脂肪を低下させ、ＨＤＬ−コレステロールを増加させ、さらに有用腸内細菌を増加させ便秘解消、美肌促進の効果を有する機能性食品〔例えば、特許文献１１参照〕などの提案があり、医薬品、健康食品としての用途開発が期待されている。【０００５】
【特許文献１】特開２００３−４０７７８号公報
【特許文献２】特開２００４−２９２４３７号公報
【特許文献３】特開２００４−９９５５３号公報
【特許文献４】特開２００１−２２６４０７号公報
【特許文献５】特開平１０−１７４９８号公報
【特許文献６】特開平１１−２２８６０２号公報
【特許文献７】特開２００３−１５５２４４号公報
【特許文献８】特開２００４−２４４３８６号公報
【特許文献９】特開２００３−３１３１３１号公報
【特許文献１０】特開２００４−２４０５４号公報
【特許文献１１】特開２００２−２２３７２７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記異常プリオンタンパク質によるプリオン病の社会的問題の深刻化に鑑み、本発明の目的は、日常生活において経口摂取している天然食材を用いて、異常プリオン蛋白質の増殖を抑制する効果を有する食品添加剤、飼料添加剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するため、本発明によるプリオン病発症予防剤は、フコイダンを有効成分として含有することを特徴とする。このプリオン病発症予防剤においては、フコイダンが、海藻よりの抽出物であることが好ましく、また、フコイダンが、オキナワモズクよりの抽出物であることが好適であり、さらに、経口用剤として使用することが良い。【０００８】
そして、本発明による食品添加剤は、上述のようなプリオン病発症予防剤を含むことを特徴としており、また、本発明による飼料添加剤は、上述のようなプリオン病発症予防剤を含むことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によりプリオン病の発症を防止又は遅らせることが出来、しかも日常食している天然物を素材としていることから、副作用の心配のないプリオン病の発症予防食材、発症予防動物飼料が実現される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明のプリオン病発症予防剤について、プリオン持続感染細胞（ＳｃＮ２ａ細胞）を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験におけるウェスタンブロット解析像の一例を示す図面代用写真である。
【図２】同、プリオン病発症予防剤について、プリオン持続感染細胞（Ｆ−３細胞）を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験におけるウェスタンブロット解析像の一例を示す図面代用写真である。
【図３】同、プリオン病発症予防剤を各種濃度添加した感染材料（１％２６３Ｋ脳ホモジネート）を用い、Ｔｇ７マウスに脳内感染させるｉｎ  ｖｉｖｏ試験における添加濃度と潜伏期間との関係の一例を示すグラフである。
【図４】同、プリオン病発症予防剤を各種濃度添加した感染材料（０．１％２６３Ｋ脳ホモジネート）を用い、Ｔｇ７マウスに脳内感染させるｉｎ  ｖｉｖｏ試験における添加濃度と潜伏期間との関係の一例を示すグラフである。
【図５】本発明の飼料添加剤を各種濃度添加した餌（フコイダン添加飼料）を用い、１０％２６３Ｋ脳ホモジネートで経口感染させたＴｇ７マウスに、フコイダン添加飼料を経口投与するｉｎ  ｖｉｖｏ試験における投与時期／添加濃度と潜伏期間との関係の一例を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のプリオン病発症予防剤は、フコイダンを有効成分として含有している。本発明は、さらにこのプリオン病発症予防剤を含む食品添加剤、飼料添加剤であるが、ここで、食品添加剤は人が食する食品に添加されるもの、飼料添加剤は動物が食する飼料に添加されるものである。【００１２】
ここで、プリオン病は、人におけるクロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致死性家族性不眠症など、牛、羊、鹿などの動物におけるスクレイピー、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）、慢性消耗性疾患など異常プリオン蛋白質増殖による疾患である。【００１３】
本発明の有効成分であるフコイダンは、前述したようにコンブ、ワカメ、モズクなど海藻に多く含まれる成分であり、化学的にはフコースに硫酸基が結合し、これが数多く連結した硫酸化多糖類である。本発明で用いるフコイダンは、その採取源を限定するものではないが、好ましくはコンブ、ワカメ、モズクなど海藻類（褐藻類）、さらに好ましくはオキナワモズク（学名；Ｃｌａｄｏｓｉｐｈｏｎ  ｏｋａｍｕｒａｎｕｓ  Ｔｏｋｉｄａ）より抽出される。【００１４】
フコイダンは、海藻類抽出物として精製され粉体となるが、本発明のプリオン病発症予防剤は精製粉体であっても抽出液の液状濃縮物であってもよい。この精製粉体あるいは抽出液状濃縮物をそのまま、あるいは錠剤、粉末製剤（散剤）、顆粒剤、液剤などとして経口摂取される。摂取量は、症状、目的や意図する効果等によって異なり一律に限定し得ない。フコイダンは、各種機能性食品、健康食品などとして市販されており、それ自体有害なものではないので、大量に摂取しても実害はない。【００１５】
また、このプリオン病発症予防剤は、人が食する食品に添加しても動物が食する飼料に添加してもよい。この場合の添加量は、人あるいは動物における上記プリオン病発症予防剤の摂取量と食品あるいは飼料の量とを考慮して決められる。
【実施例】
【００１６】
１）フコイダン
（株）トロピカルテクノセンターから分与されたオキナワモズク由来の低分子画分フコイダン粉末（Ｌ−ＦＫ粉末）及び高分子画分フコイダン粉末（Ｈ−ＦＫ粉末）を用いた。これらのＦＫ粉末は、表１に示すような品質を有しており、また、無菌粉末ではないが、一般細菌数、大腸菌数、カビ・酵母数について、食品衛生検査指針、微生物編２００４に適合することが確認されている。【００１７】
【表１】
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【００１８】
〔抗プリオン効果のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価〕
表１に示した低分子画分フコイダン粉末（Ｌ−ＦＫ粉末）及び高分子画分フコイダン粉末（Ｈ−ＦＫ粉末）につき、プリオン持続感染細胞を用いるＩｓｈｉｋａｗａ，Ｄｏｈ−ｕｒａらの検定評価法〔Ｋｅｎｓｕｋｅ  Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｋａｔｓｕｍｉ  Ｄｏｈ−ｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００４），Ｖｏｌ．８５，ｐｐ１７８５−１７９０〕に準じ、抗プリオン効果のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価を行った。ここでは、プリオン持続感染細胞として、ＳｃＮ２ａ細胞：スクレイピープリオンであるＲＭＬ株が持続感染した神経芽細胞腫細胞（Ｎ２ａ）、及びＦ−３細胞：ＧＳＳ患者由来プリオンである福岡１株が持続感染したマウス型プリオン蛋白を過剰発現した神経芽細胞腫細胞（Ｎ２ａ＃５８）、の２種類の細胞を用い、それぞれコンフルエントに生えた細胞数の１０分の１を新たなフラスコ内に継代する際に、Ｌ−ＦＫ粉末、又はＨ−ＦＫ粉末の水溶液を以下に示す各種濃度となるよう培養液に加え、３．５日間培養した。培地（培養液）として、１０％胎児牛血清添加ＭＥＭ（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）を用い、Ｌ−ＦＫ又はＨ−ＦＫの培養液中添加濃度は、１、２．５、５、７．５、１０μｇ／ｍＬ、又は、０．０１、０．１、１、１０、１００μｇ／ｍＬとした。次に、それぞれコンフルエントとなった細胞をリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄した後、細胞溶解バッファー〔０．５％ポリオキシエチレン−ｐ−オクチルフェノール（商品名ＮＰ−４０）及び０．５％デオキシコール酸ナトリウム添加ＰＢＳ〕で細胞を溶解し、溶解液を軽遠心して核酸成分を除いた後に、プロティナーゼＫ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ）を１０μｇ／ｍＬとなるように加え、３７℃で３０分間消化した。この消化液にフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を０．００１Ｍとなるように加え酵素反応を止めた。その後、超遠心（４１５０００×ｇ、４℃、３０分間）にて異常型プリオン蛋白を沈査として回収し、ウエスタンブロット法にてプリオン蛋白を解析した。ウエスタンブロット法による試験結果は、ＳｃＮ２ａ細胞を用いた場合についてドデシル硫酸ナトリウム加ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の泳動像を図１に、Ｆ−３細胞を用いた場合についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動像を図２に示したとおり、Ｌ−ＦＫ、Ｈ−ＦＫ共に、培地への添加濃度に依存して異常型プリオン蛋白の産生を阻害することが確認された。また、異常型プリオン蛋白の産生を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０）を求め、この結果を表２に示した。【００１９】
【表２】
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【００２０】
〔抗プリオン効果のｉｎ  ｖｉｖｏ評価（Ｉ−１）〕
高分子画分フコイダン粉末（Ｈ−ＦＫ粉末）につき、Ｔｇ７マウス（ハムスター型プリオン蛋白を過剰発現した遺伝子改変マウス）と２６３Ｋ（ハムスターで継代されているスクレイピーのプリオン株）脳ホモジネートを用いるＤｏｈ−ｕｒａ，Ｉｓｈｉｋａｗａらの検定評価法〔Ｋａｔｓｕｍｉ  Ｄｏｈ−ｕｒａ，Ｋｅｎｓｕｋｅ  Ｉｓｈｉｋａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００４），Ｖｏｌ．７８，ｐｐ４９９９−５００６〕に準じ、抗プリオン効果のｉｎ  ｖｉｖｏ評価を行った。ここでは、生理食塩水で１％（Ｗ／Ｖ）濃度とした２６３Ｋ脳ホモジネートに、Ｈ−ＦＫ粉末を添加混合し、それぞれ０．０２、０．２、２、２０、２００（μｇ／２０μＬ）のＨ−ＦＫ濃度とした感染材料をＴｇ７マウスの脳内に２０μＬづつ投与し、脳内感染させた。Ｔｇ７マウスは８週齢以上で各群内で雌雄がほぼ同数となるように調整し、脳内感染から死亡するまでの潜伏期間を測定した。この結果は、表３及び図３に示すとおりである。また、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）及びチュキィ−クレイマー法（Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法）による多重比較検定を行った結果、フコイダン（Ｈ−ＦＫ）を２００μｇ／２０μＬ添加混合した群は、対照群に比して有意（ｐ＜０．０５）な潜伏期間延長を示すことが確認された。【００２１】
【表３】
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【００２２】
〔抗プリオン効果のｉｎ  ｖｉｖｏ評価（Ｉ−２）〕
感染材料として、１％２６３Ｋ脳ホモジネートに替えて、生理食塩水で０．１％（Ｗ／Ｖ）濃度とした２６３Ｋ脳ホモジネート（０．１％２６３Ｋ脳ホモジネート）を用い、Ｈ−ＦＫ粉末を添加混合し、室温にて一晩放置した後、Ｔｇ７マウスに脳内感染させた以外は、抗プリオン効果のｉｎ  ｖｉｖｏ評価（Ｉ−１）の場合と同様にｉｎ  ｖｉｖｏ評価を行った。この結果は、表４及び図４に示すとおりである。また、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）及びチュキィ−クレイマー法による多重比較検定を行った結果、フコイダン（Ｈ−ＦＫ）を２００μｇ／２０μＬ添加混合した群は、対照群やフコイダン（Ｈ−ＦＫ）を０．０２μｇ／２０μＬ添加混合した群に比して有意（ｐ＜０．０１）な潜伏期間延長を示すことが確認された。【００２３】
【表４】
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【００２４】
〔抗プリオン効果のｉｎ  ｖｉｖｏ評価（ＩＩ）〕
マウス飼育用の一般粉末飼料（ＭＦ、オリエンタル酵母工業社製）に、２．５％、５％、１０％（Ｗ／Ｗ）となるように飼料添加剤としてフコイダン（Ｈ−ＦＫ粉末）を添加混合しフコイダン添加飼料を調製した。また、生理食塩水で１０％（Ｗ／Ｖ）濃度とした２６３Ｋ脳ホモジネート（１０％２６３Ｋ脳ホモジネート）２００μＬを経口ゾンデを用い、Ｔｇ７マウスの胃内に投与することにより経口感染させた。このような経口感染モデルマウスに対し、（ｉ）経口感染直前までの６日間、又は（ｉｉ）経口感染直後より６日間、各濃度のフコイダン添加飼料を餌として与えた。フコイダン無添加飼料を餌として与えた対照を含めて、一匹あたりの一日餌摂取量は４〜６ｇであった。Ｔｇ７マウスは８週齢以上で各群内で雌雄がほぼ同数となるように調整し、経口感染から死亡するまでの潜伏期間を測定した。この結果は、表５及び図５に示すとおりである。また、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）及びチュキィ−クレイマー法による多重比較検定を行った結果、経口感染後にフコイダン添加飼料を経口摂取した群は、対照（フコイダン非摂取）群や感染前摂取群に比して有意（ｐ＜０．０１）な潜伏期間延長を示すことが確認された。なお、フコイダン経口摂取量（２．５％、５％、１０％）の間に有意差は認められなかった。【００２５】
【表５】
2006090815.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明によりプリオン病の発症を遅らせることが出来、牛においては食肉の安全性が確保され、人においては社会生活を営むに支障ない期間が延長されて福祉的にも社会経済的にも利することが多い。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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