(57)【要約】本発明は、骨髄幹細胞を利用した再生治療、特に移植された骨髄幹細胞を利用した皮膚疾患の再生治療に有効な、ＣＴＡＣＫ（Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｔｔｒａｃｔｉｎｇ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）を有効成分とする医薬を提供するものである。特に本発明は、根本的治療が困難とされてきた先天性皮膚疾患、例えば先天性表皮水疱症に対して、新たな治療法を提供するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＴＡＣＫを有効成分とする、骨髄幹細胞を利用した再生治療用医薬。
【請求項２】
移植された骨髄幹細胞を利用した再生治療である、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
再生治療が皮膚再生治療である、請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項４】
移植された骨髄幹細胞を表皮細胞に分化させて皮膚再生を行う治療である、請求項３に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、これまで難病として報告されてきた先天性皮膚疾患、例えば先天性表皮水疱症に対する、皮膚細胞再生による新たな治療法における、ケモカインの利用に開する。
【背景技術】
【０００２】  先天性すなわち遺伝性の疾患は、その殆どが、正常な生体の維持に必要とされる蛋白質あるいは遺伝子に、その本来の機能が損なわれるような変異あるいは欠失が存在することで発症する疾患である。そのため、一般に、外科的治療あるいは薬物等の投与による薬学的治療によって根本的に治癒することは難しいとされている。【０００３】  皮膚組織におけるこの様な先天性疾患の一つに、先天性表皮水疱症（ｅｐｉｄｅｒｍｏｙｓｉｓ  ｂｕｌｌｏｓａ、以下ＥＢとする）がある。ＥＢは、先天的に皮膚が脆弱であり、弱い外力でも表皮真皮の結合が解離し、皮膚に容易に水疱をきたす先天性疾患の総称として理解されている（例えば斎田俊明ら編集、「今日の皮膚疾患治療方針」、第３版、医学書院発行、第３０８〜３０９頁・非特許文献１）。【０００４】  ＥＢは遺伝子性の非常に多様な疾患であり、水疱形成が電子顕微鏡観察下でどの部位に生ずるかを基に、表皮細胞内水疱形成（単純型）、水疱形成（接合部型）および直下の真皮内水疱形成（栄養障害型）に大別される（清水  宏、「表皮水疱症の分類」、前実績研修講習会必須Ａコース用資料、日本皮膚科学会研修医委員会発行、２００２年・非特許文献２）。単純型ではケラチン５あるいはケラチン１４遺伝子に、接合部型ではラミニン５遺伝子に、栄養障害型ではＶＩＩ型コラーゲン遺伝子に、それぞれ変異あるいは傷害が生じていることが発症原因であると考えられている。【０００５】  このＥＢという遺伝性疾患に対して、これまでには有効な根治的治療法はなく、対症的な外用療法として抗生物質あるいは抗炎症剤を与える程度の療法しかないのが現状である。そのため、有効な治療法としては、異常が確認された遺伝子の機能を復活させる、いわゆる遺伝子治療の開発が持たれている（澤村大輔ら、「表皮水疱症に対する遺伝子治療の可能性」、２００２年、西日本皮膚科別冊、第６４巻、第３号、第２７７〜２８０頁・非特許文献３）。【０００６】
【非特許文献１】斎田俊明ら編集、「今日の皮膚疾患治療方針」、第３版、医学書院発行、第３０８〜３０９頁。
【非特許文献２】清水  宏、「表皮水疱症の分類」、前実績研修講習会必須Ａコース用資料、日本皮膚科学会研修医委員会発行、２００２年。
【非特許文献３】澤村大輔ら、「表皮水疱症に対する遺伝子治療の可能性」、２００２年、西日本皮膚科別冊、第６４巻、第３号、第２７７〜２８０頁。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  しかしながら、遺伝子治療は日常的に行い得る治療法であるとは言い難く、より汎用性の高い、新しいＥＢ治療法の開発が望まれている。【０００８】  本発明は、特に、有効な薬学的治療法のない遺伝性疾患、例えば先天性表皮水疱症を、遺伝子治療以外の方法によって有効に治療あるいは症状を改善させる方法と、該方法に有用な医薬を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】  本発明者らは、皮膚で発現するケモカインであるＣＴＡＣＫ（Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｔｔｒａｃｔｉｎｇ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）が、これを投与された皮膚組織に骨髄幹細胞を誘引（ケモアトラクト）し、最終的に表皮細胞（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｄｅｒｉｖｅｄ−ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ、ＢＭＤＫ）へと分化させる機能を有していることを見出し、これを骨髄幹細胞の移植と組み合わせることで、皮膚疾患、例えばＥＢの治療が可能となり得ること等を見出し、本発明を完成した。【００１０】  すなわち本発明は、ＣＴＡＣＫを有効成分とする骨髄幹細胞を利用した再生治療用医薬、特に移植された骨髄幹細胞を利用した再生治療用医薬に関する。特に、移植された骨髄幹細胞を表皮細胞に分化させるＣＴＡＣＫを有効成分とする医薬に関する。【００１１】  骨髄幹細胞を用いた再生治療は、血管新生療法、心不全、肝臓再生など、様々な疾患の治療法として期待されており、財団法人骨髄移植推進財団（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｍｄｐ．ｏｒ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）がいわゆる骨髄バンクを設立して、骨髄幹細胞の有効利用を推進している。皮膚疾患に対しても、骨髄幹細胞から皮膚を再生させることで治療を行おうとする試みがなされているが、ＣＴＡＣＫの骨髄幹細胞に対するケモアトラクト作用ならびに表皮細胞への分化誘導作用、ならびにその骨髄幹細胞移植治療への利用については報告がない。【００１２】  本発明は、皮膚疾患治療としての皮膚再生医療においてその効率を向上させるためにＣＴＡＣＫを利用するものである。【００１３】  本発明におけるＣＴＡＣＫは、国際特許公開公報ＷＯ９８／２３７５０号に記載された全１１２アミノ酸残基からなる蛋白質、あるいはそのアミノ酸残基の一部が同公報記載のものとは異なっているが、なお骨髄幹細胞に対するケモアトラクト活性ならびにＢＭＤＫへの分化誘導活性を保持している蛋白質を意味する。【００１４】  これまでに、ＣＴＡＣＫの機能としては、ＣＬＡ＋記憶Ｔ細胞の選択的な誘引活性、皮膚樹状細胞（ランゲルハンス細胞）およびこれらの前駆体への作用などが知られており、特に免疫系が関与する皮膚障害、例えば乾癬、皮膚癌、炎症、アレルギー、皮膚炎、創傷治癒、感染などに対して、一定の治癒効果が期待されることが報告されている（前記国際特許公開公報ＷＯ９８／２３７５０号、Ｊａｎｉｎｅ  Ｍｏｒａｌｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、第９６巻、第２５号、第１４４７０〜１４４７５頁、１９９９年、Ｂｅｒｎｈａｒｄ  Ｈｏｍｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第８巻、第２号、第１５７〜１６５頁、２００２年）。【００１５】  これらの報告によれば、ＣＴＡＣＫは、ケモカインレセプターであるＣＣＲ１０に結合し、ＣＬＡ＋細胞、Ｔ細胞、樹状細胞または樹状細胞前駆体等の細胞をケモアトラクトして、これらを皮膚の真皮層内および／または表皮層内に移動させることで、免疫系細胞に関連した皮膚疾患の治療効果を示すことが報告されている。しかしながら、ＣＴＡＣＫが、免疫系細胞とは異なる骨髄幹細胞をケモアトラクトし、さらにこれを表皮細胞へと分化誘導する機能を有していることについては、何ら報告されていない。【０��１６】  本発明は、ＣＴＡＣＫの骨髄幹細胞に対する分化誘導機能を活用することで、ＣＴＡＣＫについての用途を、従来提唱されていた免疫系細胞が関与する皮膚疾患の治療という適用枠の外に位置する新たな皮膚疾患の治療へと、拡大するものである。【００１７】  本発明は、骨髄幹細胞の表皮細胞への分化誘導を、皮膚損傷の場において行うことができ、特に根本的治癒が困難であるとされてきた先天性皮膚疾患、例えば先天性表皮水疱症に対して、新たな治療法ならびに該治療のための医薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、インビトロ試験による、ＣＴＡＣＫの骨髄幹細胞に対するケモアトラクト活性を示す。
【図２】図２は、インビボ試験による、ＣＴＡＣＫの骨髄幹細胞に対する表皮細胞への分化誘導活性を示す。
【図３】図３は、Ｇ−ＣＳＦで前処理したマウスにおける、ＣＴＡＣＫの骨髄幹細胞に対する表皮細胞への分化誘導活性を示す。
【図４】図４は、末梢血中のＣＤ３４陽性骨髄幹細胞数を増加させたマウスにおける、ＣＴＡＣＫの骨髄幹細胞に対する表皮細胞への分化誘導活性を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】  本発明で使用するＣＴＡＣＫは、国際特許公開公報ＷＯ９８／２３７５０号あるいは前記Ｍｏｒａｌｅｓらの文献の記載に従って、組換え的に調製することができる。【００２０】  例えば、国際特許公開公報ＷＯ９８／２３７５０号に記載されたＣＴＡＣＫをコードする遺伝子の塩基配列の全部または一部からなるプローブを用いて、同公報の記載に従ってクローニングすればよい。また、ＣＴＡＣＫの全長をコードするＤＮＡをＤＮＡ合成機などを用いて合成し、これを用いて組換え的に調製することができる。また、米国ミネアポリスのＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社あるいはその他の機関から市販されているＣＴＡＣＫを利用しても良い。【００２１】  また、同国際公報等に具体的に記載されたアミノ酸配列あるいはＤＮＡ配列以外であっても、例えば１以上のアミノ酸が置換、欠失、および／若しくは付加したアミノ酸配列からなる、骨髄幹細胞に対するケモアトラクト活性ならびにＢＭＤＫへの分化誘導活性を有するポリペプチドも、本発明において利用することができる。【００２２】  例えば、アミノ酸残基の電荷、大きさ、疎水性等の物理化学的性質について保存性の高い変異、例えばグリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）との間の、それぞれの置換等が挙げられる。【００２３】  同様に、かかるＣＴＡＣＫあるいはその変異体をコードする遺伝子も、ＣＴＡＣＫ等の組み換え的生産に利用することができる。【００２４】  またＣＴＡＣＫをコードするＤＮＡを保持するベクター、該ベクターを用いて形質転換させる宿主等も、先行する文献に記載の組み合わせあるいはその他の汎用の組み合わせを選択して使用すればよい。また、プラスミドの他に、バキュロウィルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス等の種々のウィルスを用いることも可能である。【００２５】  発現は、ＣＴＡＣＫ遺伝子固有のプロモーター配列の制御下に発現させてもよく、あるいは、別の適当な発現プロモーターをＣＴＡＣＫ遺伝子固有のプロモーター配列に接続あるいは置き換えて使用することもできる。この場合に使用するプロモーターは、宿主及び発現の目的に応じて適宜選択すればよく、例えば宿主が大腸菌である場合にはＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λＰＬプロモーターなどが、宿主が酵母である場合にはＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合にはＳＶ４０由来プロモーター、レトロウィルスプロモーター等を例示できるが、当然ながらこれらには限定されない。【００２６】  骨髄幹細胞移植を受けた患者へのＣＴＡＣＫの投与形態としては、ＣＴＡＣＫを適当な緩衝液、例えば生理食塩水等に溶解した溶液の形態、適当な乳化剤を添加したエマルジョンの形態、これらの溶液あるいはエマルジョンを保持した不織布などのシートの形態など、いずれも採るこ���ができる。これらは患部に直接塗布あるいは貼付して使用することができる。【００２７】  以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２８】  ＣＴＡＣＫの骨髄幹細胞に対するケモアトラクト活性を、インビトロ試験により確認した。【００２９】  マウス（Ｃ５７ＢＬ６）の骨髄からＷｉｌｅｙらの方法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ＩＳＳＮ  ０−４７１−５２２７６−７）に従って骨髄細胞を分離した。次いで、細胞表面に発現しているＣＤ３４抗原に特異的な抗体を用いた抗体染色（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）を行い、ＣＤ３４陽性骨髄幹細胞をＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて分離した。【００３０】  孔径３μｍのインサート（倉敷紡績社製）の上部インサートにＤＭＥＭ培地に懸濁したＣＤ３４陽性骨髄幹細胞１×１０５個を、下部プレートに同培地に溶解した０〜５００ｎｇ／ｍｌのＣＴＡＣＫ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社製）またはストロマ細胞由来因子−１（ｓｔｒｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ−１、ＳＤＦ−１）をそれぞれ加え、３７℃でインキュベートした。４時間後、下部プレートに遊走したＣＤ３４陽性骨髄幹細胞の個数をヘモサイトメーターで計測した。【００３１】  この結果、１０ｎｇ／ｍｌ以上の濃度において、ＣＴＡＣＫは濃度依存的にＣＤ３４陽性骨髄幹細胞をケモアトラクトした（図１）。
【実施例２】
【００３２】  ＣＴＡＣＫの皮膚損傷部位における骨髄幹細胞の誘導分化活性を、インビボ試験により確認した。【００３３】  βアクチンプロモーターの制御下にＧＦＰ蛋白質遺伝子を置いた組換え遺伝子を用いて作成されたトランスジェニックマウス（ＧＦＰマウス、米国Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより分与）から、実施例１と同様にして骨髄幹細胞を分離した。【００３４】  この細胞を、８５０ｃｒａｄの放射線処理によって骨髄細胞を破壊したマウス野生株（Ｃ５７ＢＩ／６）の骨髄内に注射した後、４週間、標準的な条件下で飼育して、骨髄由来細胞のみがＧＦＰの蛍光を発する、ＧＦＰキメラマウスを作成した。【００３５】  キメラマウスを４群に分け、それぞれのキメラマウスの背部に直径６ｍｍの皮膚欠損創を作成した直後に、１群にはＣＴＡＣＫ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社製、１ｎｇ／リン酸緩衝食塩水３０μｌ）を、２群にはＳＤＦ−１（１ｎｇ／リン酸緩衝食塩水３０μｌ）を、３群には２次リンパ球組織ケモカイン（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ、１ｎｇ／リン酸緩衝食塩水３０μｌ）を、４群には同緩衝液のみをそれぞれ創部周辺に局所投与し、さらに創傷が完全に治癒するまで（約２８日）標準的な条件下で飼育した。【００３６】  飼育後、創部を切除し、ＯＣＴｃｏｍｐｏｕｎｄに包埋し、厚さ５μｌの組織片を作成し、ケラチン１４、ＣＴＡＣＫ、ならびに他のケモカインに対する抗体および蛍光色素（ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣ）が結合した２次抗体を用いて、いずれの抗体反応も濃度１００倍希釈、作用時間１時間、室温の条件下で行って蛍光組織染色を行った。【００３７】  染色した組織片を、共焦点レーザー顕微鏡（Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＭＲＣ  １０２４、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて観察し、ＧＦＰ陽性かつケラチン１４陽性である細胞を骨髄幹細胞から分化した表皮細胞として、全表皮細胞中の割合を計測した。【００３８】  その結果、ＣＴＡＣＫ投与を行った群において、有意に骨髄幹細胞由来の表皮細胞の割合が増加した（図２）。
【実施例３】
【００３９】  ＣＴＡＣＫ投与前に、１５０μｇ／ｋｇ／日のＧ−ＣＳＦを３日間連続投与して、末梢血中のＣＤ３４陽性骨髄幹細胞数を増加させた（約１００倍）以外は、実施例１と同様にして行い、骨髄幹細胞から分化した表皮細胞の全表皮細胞中の割合を計測した（図３）。【００４０】  また、ＧＦＰマウスの骨髄細胞内から、ＭＡＣＳ法（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ、Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いてＣＤ３４陽性細胞を分離し、この細胞（５×１０５個）を正常マウスの尾部から静脈内注射して、末梢血中のＣＤ３４陽性骨髄幹細胞数を増加させた以外は、実施例１と同様にして行い、骨髄幹細胞から分化した表皮細胞の全表皮細胞中の割合を計測した（図４）。【００４１】  その結果、実施例１の場合よりも、より多い数の骨髄幹細胞由来表皮細胞を確認することができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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