(57)【要約】  血中等、生体試料検体中のβ−アミロイドの測定手法を工夫し、アルツハイマー病の診断に応用することにある。  β−アミロイド１−４２のＣ末端部分を認識する抗体を用いる免疫測定法によって、生体試料検体中の、β−アミロイド１−４２とβ−アミロイド１−４２のＣ末端部分を保有するβ−アミロイド１−４２断片のトータル量を測定することによりアルツハイマー病の検定を可能とした。前記免疫測定法が、競合的免疫測定法であることが好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−アミロイド１−４２のＣ末端部に特異的な抗体を使用する免疫測定法により、生体試料検体中の、β−アミロイド１−４２とβ−アミロイド１−４２のＣ末端部を保有するβ−アミロイド１−４２断片のトータル量を測定することを特徴とするアルツハイマー病の検定方法。
【請求項２】
前記免疫測定法が、競合的免疫測定法であることを特徴とする請求項１記載のアルツハイマー病の検定方法。
【請求項３】
前記抗体がポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１又は２記載のアルツハイマー病の検定方法。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体が、β−アミロイド１−４２は認識するがβ−アミロイド１−４０は認識しない抗体であることを特徴とする請求項３記載のアルツハイマー病の検定方法。
【請求項５】
前記抗体が、β−アミロイド１−４２の３３−４２アミノ酸部位を免疫原とし、Ａβ１−４２のＣ末端部分に特異性を有するマウスモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載のアルツハイマー病の検定方法。
【請求項６】
前記競合的免疫測定法が下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含むことを特徴とする請求項２記載のアルツハイマー病の検定方法。
（ａ）β−アミロイド１−４２のＣ末端部を保有するペプチドを固相化した支持体と生体試料検体及び標識物質で標識した、β−アミロイド１−４２のＣ末端部を認識する抗体を反応させる工程、及び
（ｂ）洗浄後、固相化したβ−アミロイド１−４２のＣ末端部を保有するペプチドに結合した標識抗体量を測定して、β−アミロイド１−４２とβ−アミロイド１−４２のＣ末端部を保有するβ−アミロイド１−４２断片のトータル量を測定する工程。
【請求項７】
前記競合的免疫測定法が下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含むことを特徴とする請求項２記載のアルツハイマー病の検定方法。
（ａ）β−アミロイド１−４２のＣ末端部を認識する抗体を固相化した支持体と生体試料検体及び標識物質で標識した、β−アミロイド１−４２のＣ末端部を保有するペプチドを反応させる工程、及び
（ｂ）洗浄後、固相化した抗体に結合した標識β−アミロイド１−４２のＣ末端部を保有するペプチド量を測定して、β−アミロイド１−４２とβ−アミロイド１−４２のＣ末端部を保有するβ−アミロイド１−４２断片のトータル量を測定する工程。
【請求項８】
前記標識物質で標識した、β−アミロイド１−４２のＣ末端部を保有するペプチドが、キャリアー物質を結合させたペプチド複合体であることを特徴とする請求項７記載のアルツハイマー病の検定方法。
【請求項９】
前記キャリアー物質が、ポリリジン、デキストラン、ウシ血清アルブミン又は遊離アミノ基を多く保有するポリペプチドであることを特徴とする請求項８記載のアルツハイマー病の検定方法。
【請求項１０】
前記標識物質がルテニウム錯体であることを特徴とする請求項６〜９のいずれか１項記載のアルツハイマー病の検定方法。
【請求項１１】
前記支持体が磁気ビーズであることを特徴とする請求項６〜１０のいずれか１項記載のアルツハイマー病の検定方法。
【請求項１２】
前記生体試料検体が血清又は血漿であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項記載のアルツハイマー病の検定方法。
【請求項１３】
β−アミロイド１−４２のＣ末端部に特異的な抗体を必須の構成成分とし、生体試料検体中のβ−アミロイド１−４２とβ−アミロイド１−４２のＣ末端部を保有するβ−アミロイド１−４２断片のトータル量を測定することによりアルツハイマー病を検定するための試薬であることを特徴とするアルツハイマー病の診断試薬。
【請求項１４】
固相化したβ−アミロイド１−４２のＣ末端部を保有するペプチドと標識物質で標識した、β−アミロイド１−４２のＣ末端部に特異的な抗体を必須の構成成分とし、競合的免疫測定法に用いることを特徴とする請求項１３記載のアルツハイマー病の診断試薬。
【請求項１５】
固相化したβ−アミロイド１−４２のＣ末端部に特異的な抗体と標識物質で標識した、β−アミロイド１−４２のＣ末端部を保有するペプチドを必須の構成成分とし、競合的免疫測定法に用いることを特徴とする請求項１３記載のアルツハイマー病の診断試薬。
【請求項１６】
前記固相化する支持体が磁気ビーズであることを特徴とする請求項１４又は１５記載のアルツハイマー病の診断試薬。
【請求項１７】
前記標識物質で標識した、β−アミロイド１−４２のＣ末端部を保有するペプチドが、キャリアー物質を結合させたペプチド複合体であることを特徴とする請求項１５記載のアルツハイマー病の診断試薬。
【請求項１８】
前記キャリアー物質が、ポリリジン、デキストラン、ウシ血清アルブミン又は遊離アミノ基を保有するポリペプチドであることを特徴とする請求項１７記載のアルツハイマー病の診断試薬。
【請求項１９】
前記標識物質がルテニウム錯体であることを特徴とする請求項１４〜１７のいずれか１項記載のアルツハイマー病の診断試薬。
【請求項２０】
前記抗体がポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１３〜１９のいずれか１項記載のアルツハイマー病の診断試薬。
【請求項２１】
前記モノクローナル抗体がβ−アミロイド１−４２は認識するが、β−アミロイド１−４０は認識しない抗体であることを特徴とする請求項２０記載のアルツハイマー病の診断試薬。
【請求項２２】
前記抗体がβ−アミロイド１−４２の３３−４２アミノ酸部位を免疫原とし、Ａβ１−４２のＣ末端部分に特異性を有するマウスモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１３〜２１のいずれか１項記載のアルツハイマー病の診断試薬。
【請求項２３】
前記生体試料検体が血清又は血漿であることを特徴とする請求項１３〜２２のいずれか１項記載のアルツハイマー病の診断試薬。
【請求項２４】
β−アミロイド１−４２のＣ末端部に特異的な抗体を使用する免疫測定法により、生体試料検体中の、β−アミロイド１−４２とβ−アミロイド１−４２のＣ末端部を保有するβ−アミロイド１−４２断片のトータル量を測定することにより、生体試料検体中のβ−アミロイド１−４２含量を測定することを特徴とするβ−アミロイド１−４２の測定方法。
【請求項２５】
前記生体試料検体が血清又は血漿であることを特徴とする請求項２４記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料、特に血液中のβ−アミロイド１−４２とβ−アミロイド１−４２Ｃ末端部を保有するβ−アミロイド１−４２断片のトータル量を測定することによる、アルツハイマー病などβ−アミロイドが関与する疾患の検定方法及び診断試薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
β−アミロイド（以下、Ａβと記す）は、アルツハイマー病（ＡＤ）患者脳に特徴的に認められるアミロイドプラークの主な構成成分であり、Ａβは、その前駆体タンパク質（ＡＰＰ）Ｎ−末端のβ部位を切断するβセクレターゼ作用と、細胞膜内に存在するＡＰＰ−Ｃ−末端を切断するプレセリニンのγ−セクレターゼ作用により産生されることが知られている。
Ａβの分子種は、様々な分子量サイズのものが知られているが、それらの中で神経細胞毒性と関連して最もよく知られているのが、４０個のアミノ酸からなるＡβ（以下、Ａβ１−４０と記す）と４２個のアミノ酸からなるＡβ（以下、Ａβ１−４２と記す）である。Ａβ１−４２は、容易に繊維化する性質を持っており、ＡＤの早期から沈着しアミロイドプラークを形成することが知られている。
上記のごとく、Ａβの沈着は、ＡＤ患者脳の特徴的な病理学的特徴であるとともに、脳脊髄液や血中にも見出されている。脳脊髄液中のＡβ１−４２濃度はＡＤ患者において、低下していることが報告されている（非特許文献１〜４）。また、家族性ＡＤ患者血漿中に存在するＡβ１−４２は増加しており、孤発性ＡＤ患者の血漿中Ａβ１−４０あるいはＡβ１−４２濃度は増加しているという報告（非特許文献５、６）がある一方、ほとんど健常人群と同等という報告（非特許文献７〜９）もあり、その挙動は、不明である。【０００３】
これまでの生体試料中のＡβ測定は、主に、二抗体サンドイッチ法が実施されている。鈴木らは、Ａβの各種ペプチドフラグメントを免疫原として、認識部位の異なる複数のモノクローナル抗体を作製し、それら抗体を組み合わせたサンドイッチ測定法を報告している（特許文献１）。その手法によりＡＤ患者の脳脊髄液中のＡβを測定し、Ａβ１−４０が主な成分であること、ＡＤ患者脳の蟻酸抽出物においては、Ａβ１−４０、Ａβ１−４２及びＡβ３−４２が主成分であることを開示している。
競合的免疫測定法を採用している報告もある。非特許文献１８は、高脂血漿患者の血清中のＡβを、Ａβ１−４０に特異的な兎ポリクローナル抗体を用いる競合的免疫測定法によって測定し、加齢とともにＡβ１−４０が増加傾向にあることを開示している。また、グラハムポールらは、Ａβ１−４０及びＡβ１−４３に反応せず、Ａβ１−４２に特異的なモノクローナル抗体を作製し、該抗体がＡＤ患者脳組織の線維アミロイドや血管アミロイド等のプラークを免疫組織染色しえることを開示している（特許文献２）。【０００４】
脳脊髄液中のＡβ濃度を定量する二抗体ＥＬＩＳＡ試薬は２社から市販されているが、これらＥＬＩＳＡによる定量値は相関しているものの、それぞれの定量値はかなり異なっている（非特許文献１０）。これら定量値が異なる理由としては、測定対象となる臨床検体、測定に使用している抗体、測定法、測定法の感度、検量線に用いるＡβ１−４２の調整法の違い等が挙げることができる。
さらに、臨床検体が血漿や血清である場合、Ａβ分子と相互作用する血漿や血清中の干渉物質の存在が知られており、これらの物質をあらかじめ除去するか分離する必要がある（非特許文献１１〜１３）。しかしながら、血漿や血清を臨床検体に用いた場合、これらの干渉物質の除去法、除去操作による測定誤差、希釈の影響、使用している抗体の力価、測定感度等が測定値に大きく影響することは容易に推測することができる。【０００５】
脳脊髄液中のＡβは、一般的測定手法、たとえばＡβに特異的に結合する抗体を使用した、二抗体サンドイッチ測定法によって測定でき、特にＡβ１−４２の測定は臨床的有用性も認められている（非特許文献１，３，４，７及び１５〜１７）。しかし脳脊髄液を検体とするのは、検体採取時の患者への身体的負担・身体機能損傷のリスクが大きく、実際上は脳脊髄液を検体として使用することは現実的ではない。
体外診断薬として最も一般的で、且つ身体的負担・リスクが低い検体として、血液検体（血清又は血漿）が考えられる。しかし血清中でのＡβ測定は、これまで行われてきた一般的測定手法、たとえば二抗体サンドイッチ測定法では血液中からはほとんど検出されず、臨床的有用性も見出せなかった（非特許文献７）。これは、Ａβは脳脊髄液中から、血中へと移行してくるＡβ量が極めて微量であるからであると考えられてきた。
このようにＡＤ患者の脳脊髄液中のＡβ１−４２量は、健常者に比較して低下傾向にあるが、血中のＡβ１−４２量についてはいまだに一定の認識はなされておらず、ＡＤの病理学的、診断学的研究において大きな課題となっている。
【特許文献１】ＷＯ９４／１７１９７
【特許文献２】ＷＯ９６／２５４３５
【非特許文献１】Tamaoka A, et al., J. Neurol. Sci.1997; 148:41-45.
【非特許文献２】Andreasen N, et al., Arch.Neurol.1999; 56:673-680.
【非特許文献３】Galasko D, et al., Arch. Neurol. 1998; 55:937-945.
【非特許文献４】Motter R, et al., Ann Neurol 1995; 38:643-648.
【非特許文献５】Mayeux R, Ann. Neurol. 1999; 46:412-416.
【非特許文献６】Mehta PD, Arch. Neurol.2000; 57;100-105.
【非特許文献７】Tamaoka A, et al., J.Neurol. Sci.1996; 141:65-68.
【非特許文献８】Vanderstichele H, et al., Amyloid 2000; 7:245-258.
【非特許文献９】Fukumoto H, et al., Arch. Neurol 2003; 60:958-964.
【非特許文献１０】Suzuki N, et al., Science 1994; 264:1336-1340.
【非特許文献１１】Chan W, et al., Biochemstry 1996; 35:7123-1230.
【非特許文献１２】Biere Al,et al., J. Biol.Chem.1996 271;32916-32922.
【非特許文献１３】Kuo YM et al., Biocem Biophys Res Commun. 2000, 268;750-756.
【非特許文献１４】難波et al.、電気化学発光法（Electrochemiluminescence：ＥＣＬ）による好感度免疫学的測定法の検討、日本臨床自動学会（ＪＪＣＬＡ）、1996, Vol. 21 No.5.
【非特許文献１５】Tero T, et al., Neurobiology of Aging 21 (2000) 735-740
【非特許文献１６】Kanai M, et al., Ann Neurol 1998; 44:17-26.
【非特許文献１７】Schro¨der J, et al., Mol Psychiatry 1997; 2:505-7.
【非特許文献１８】Christopher C.T. Smith et al., Neuroscience Letters, 362(2004) 48-50
【非特許文献１９】G. Zhu et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 24, 281-290(2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記問題に鑑みなされたものであり、ＡＤ患者血中のＡβの測定手法を工夫することにより、アルツハイマー病の診断に応用することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために本発明者らは鋭意研究を行った。本発明者らはまず、高感度・広測定レンジ機能を有する電気化学発光法（非特許文献１４）を利用する二抗体サンドイッチ法を用いて、感度よくＡＤ患者血清中Ａβ１−４２が測定できるかどうかを検討した。一次抗体としてＡβ１−４２のＣ末端部分に特異性を有する抗体２１Ｆ１２（イノジェネティクス社製）を用い、第二抗体としてＡβ１−４２の１−５アミノ酸部位に特異的な抗体を使用して、ＡＤ患者及び健常者血清中のＡβ１−４２を測定した。その結果、感度は従来法に比較してかなり優れていたが、ＡＤ患者と健常者との血清中のＡβ１−４２量に有意差は認められなかった（下記実験例１、２及び図４参照）。【０００８】
そこで本発明者らは、Ａβ１−４２合成ペプチドの血清中での安定性を確認するために、Ａβ１−４２合成ペプチドを血清と共存させたところ、経時的にＡβ１−４２含量が低下していくことを確認した。また、Ａβ１−４２合成ペプチドを血清と共存させる際に、血清中にプロテアーゼインヒビターをあらかじめ投入しておくと、時間経過によるＡβ１−４２含量低下が起こらないことを確認した（下記実験例３及び図５参照）。この事実は、Ａβが脳脊髄液や血液中などの生体液中で、速やかにプロテアーゼにより分解・断片化していることを意味し、よってＡβは血中への移行量が微量であるからして測定できないのではなく、血液中などで断片化されることにより全長Ａβ１−４２の正確な測定は不可能となっていることが示唆された。【０００９】
このことは、脳脊髄液から血液に移行したＡβ１−４２が、血中で短時間のうちに分解されること、更に血清検体の保存中にもＡβ１−４２の分解が進むことを意味するものであり、正確な測定が不可能であることの大きな原因であることが示唆された。これすなわち、Ａβ１−４２は血液中などで断片化するゆえ、二抗体サンドイッチ法では、正確なＡβ１−４２の測定はできないことになる。
しかし、Ａβ１−４２は分解されて含量は低下してくるが、分解されたＡβ１−４２断片は存在することになる。そこで、蛋白分解酵素処理したＡβ１−４２サンプルを２種の測定法、すなわち、Ａβ１−４２のＣ末端部分を認識する抗体を用いた競合的免疫測定法及び上記の電気化学発光二抗体サンドイッチ法で測定したところ、二抗体サンドイッチ法ではほとんど検出されなかったが（下記実験例４及び表２参照）、競合的免疫測定法では初期のＡβ１−４２量に近い値を示すことが確認された（下記実験例５及び表３参照）。すなわち、競合的免疫測定法によってＡβ１−４２とＡβ１−４２のＣ末端部を保有するＡβ１−４２断片のトータル量（以下このトータル量を、Ａβｘ−４２、と記す）を測定することにより、Ａβ１−４２含量を正確に測定しえることを初めて見出したものである。【００１０】
次いで、ＡＤ患者と健常者血清中のＡβｘ−４２を測定した結果、両者の測定値に有意差があり、ＡＤ診断に利用しえる可能性があることを確認し、本発明を完成するに至った。
本発明の一つである競合的免疫測定法によるＡＤの検定方法は、血漿や血清中のＡβ１−４２と相互作用する物質の除去操作が不要であり、且つ、Ａβｘ−４２を効率よく検出できる優れた方法である。これまで、Ａβ１−４０を認識する抗体を用いる競合的免疫測定法の報告はあるが（非特許文献１８）、本発明のＡβ１−４２のＣ末端部分を認識する抗体を用いる免疫測定法に関する記載及びその効果についての報告はなく、さらに、本発明の方法が、血中のＡβ１−４２含量を正確に反映するという優れた効果を奏し、ＡＤ診断に有用であることを、本発明者らが初めて見出したものである。【００１１】
なお、Ａβｘ−４２を測定することによりＡＤ診断に利用しえることを本発明者らが初めて見出したものであるから、Ａβｘ−４２の測定方法は上記の競合的免疫測定法に限らず、例えばＡβ１−４２Ｃ末端部に特異的な抗体を使用する表面プラズモン共鳴法による検出（非特許文献１９）、Ａβ１−４２Ｃ末端部に特異的な抗体を用いるアフィニティクロマトグラフィによりＡβ１−４２Ｃ末端部を保有するペプチドを分離して測定する方法など、いずれも使用することが可能である。本発明の趣旨はＡβｘ−４２を測定することにより、ＡＤ診断に利用することにある。【００１２】
本発明は、Ａβ１−４２のＣ末端部位を認識する抗体によって、Ａβｘ−４２の測定の有用性を確認したものであるが、同様にＡβ１−ｘを測定することの有用性についても確認を行った。Ａβ１−ｘとはＡβ１−４０、Ａβ１−３７等、ＡβのＮ末端部を保有するさまざまなＡβアイソタイプの断片のトータル量を意味する。ＡβのＮ末端部位を認識する抗体を本発明の競合測定法に使用することで、これらＡβアイソタイプに関して、タイプを限らず一括して測定することが可能である。具体的には、Ａβ１−５を免疫して作製したモノクローナル抗体３Ｄ６（イノジェネティクス社製）又はＡβ１−１７を免疫して作製したモノクローナル抗体６Ｅ１０（ケミコン社製）を使用した競合的免疫測定法で測定をおこなった。その結果、ＡＤ患者と健常者血清の測定値において有意差は認められなかった。このことはＡＤの診断における、血中Ａβｘ−４２の断片を特異的に測定することの重要性を示している。
これらのことより、本発明はＡβｘ−４２を測定することにより正確に血中Ａβ１−４２量を反映し、さらにＡＤ患者と健常者の血清検体間での臨床的有用性を証明したことにより、ＡＤの血液検体での診断を可能にしたものである。また、Ａβが原因の一つとなる疾患の診断にも利用できる可能性がある。【００１３】
すなわち本発明のアルツハイマー病の検定方法は、β−アミロイド１−４２のＣ末端部に特異的な抗体を使用する免疫測定法により、生体試料検体中の、β−アミロイド１−４２とβ−アミロイド１−４２のＣ末端部を保有するβ−アミロイド１−４２断片のトータル量を測定し、それによりアルツハイマー病を検定することを特徴とする。
β−アミロイド１−４２のＣ末端部を保有するβ−アミロイド１−４２断片は、β−アミロイド１−４２断片のうち、特にβ−アミロイド１−４２のＣ末端部を保有するペプチドであり、好ましくはβ−アミロイド１−４２Ｃ末端部から１アミノ酸残基以上、好ましくは２アミノ酸残基以上、更に好ましくは３アミノ酸残基以上を保有するβ−アミロイド１−４２断片である。β−アミロイド１−４２のＣ末端部を保有するβ−アミロイド１−４２断片は、好ましくは、Ａβ１−４２のＣ末端部に特異的な抗体と結合することが望ましい。以下ではＡβ１−４２Ｃ末端部保有ペプチドと記す場合があり、また、β−アミロイド１−４２とＡβ１−４２Ｃ末端部保有ペプチドを合わせて、Ａβｘ−４２と記す場合がある。【００１４】
前記免疫測定法が、競合的免疫測定法であることが好ましい。この競合的免疫測定法の手法は、例えば固相化したＡβ１−４２Ｃ末端部保有ペプチド又は固相化抗体を使用する下記の２種の手法により実施することができる。
競合的免疫測定法による本発明方法の第１の例は、下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含むことを特徴とする。
（ａ）Ａβ１−４２Ｃ末端部保有ペプチドを固相化した支持体と生体試料検体及び標識物質で標識した抗体（Ａβ１−４２のＣ末端部を認識する抗体）を反応させる工程、及び
（ｂ）洗浄後、固相化したＡβ１−４２Ｃ末端部保有ペプチドに結合した標識抗体量を測定して、Ａβｘ−４２を定量する工程。
上記工程は、更に
（ｃ）生態試料中のＡβｘ−４２定量値を健常人のＡβｘ−４２定量値と比較し、アルツハイマー病であるか否かを検定する工程、
を含んでも良い。【００１５】
競合的免疫測定法による本発明方法の第２の例は、下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含むことを特徴とする。
（ａ）Ａβ１−４２のＣ末端部を認識する抗体を固相化した支持体と生体試料検体及び標識物質で標識したＡβ１−４２Ｃ末端部保有ペプチドを反応させる工程、及び
（ｂ）洗浄後、固相化した抗体に結合した標識Ａβ１−４２Ｃ末端部保有ペプチド量を測定して、Ａβｘ−４２を定量する工程。
上記工程は、更に
（ｃ）生態試料中のＡβｘ−４２定量値を健常人のＡβｘ−４２定量値と比較し、アルツハイマー病であるか否かを検定する工程、
を含んでも良い。
標識するＡβ１−４２Ｃ末端部保有ペプチドは、合成ペプチドそのものも使用できるが、Ａβ１−４２Ｃ末端部保有ペプチドにキャリアー物質を結合させたＡβ１−４２Ｃ末端部保有ペプチド複合体（以下、ペプチド複合体と称す）も使用することができる。キャリアー物質とは、ルテニウム錯体などの標識物質を標識しえる化合物を意味し、ポリリジン（poly-L-Lysine）、デキストラン、ウシ血清アルブミン、遊離アミノ基を多く保有するポリペプチド等が挙げられる。キャリアー物質は、前記抗体との結合性を損なわなければ、前記ペプチドの何処の位置に付けても許されるが、好ましくはＮ端部が望ましい。【００１６】
本発明のＡＤの診断試薬（キット）は、Ａβ１−４２のＣ末端部を認識する抗体を必須の構成成分とする、生体試料検体中のＡβｘ−４２を測定するＡＤの診断試薬である。該診断試薬は、採用する免疫測定方法により試薬の構成は異なるが、競合的免疫測定法の場合、例えば固相化したＡβ１−４２Ｃ末端部保有ペプチド又は固相化した抗体を使用する。固相化したＡβ１−４２Ｃ末端部保有ペプチドを使用する場合は標識物質で標識した抗体を構成成分とし、固相化した抗体を使用する場合は標識物質で標識したＡβ１−４２Ｃ末端部保有ペプチドを構成成分とする。標識するＡβ１−４２Ｃ末端部保有ペプチドは、キャリアー物質を結合させたペプチド複合体も使用することができる。キャリアー物質としてポリリジン、デキストラン、ウシ血清アルブミン、遊離アミノ基を多く保有するポリペプチド等が挙げられる。キャリアー物質は、前記抗体との結合性を損なわなければ、前記ペプチドの何処の位置に付けても許されるが、好ましくはＮ端部が望ましい。【００１７】
本発明の検定方法及び試薬において、前記抗体として、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を用いることができる。また、前記抗体が、Ａβ１−４２は認識するが、Ａβ１−４０は認識しない抗体であることが好ましく、β−アミロイド１−４２の３３−４２アミノ酸部位を免疫原とし、Ａβ１−４２のＣ末端部分に特異性を有するマウスモノクローナル抗体がより好ましい。具体的には、２１Ｆ１２（イノジェネティクス社製）、ＡＢ５０７８Ｐ（ケミコン社製）、８Ｇ７（ナノツール社製）などが挙げられる。
前記生体試料検体が血清又は血漿であることが好適である。
標識物質として、蛍光物質、酵素、色素、発光物質等挙げられるが、ルテニウム錯体が好ましい。固定化する支持体は磁気ビーズであることが好ましい。【００１８】
本発明のβ−アミロイド１−４２の測定方法は、β−アミロイド１−４２のＣ末端部に特異的な抗体を使用する免疫測定法により、生体試料検体中の、β−アミロイド１−４２とβ−アミロイド１−４２のＣ末端部を保有するβ−アミロイド１−４２断片のトータル量を測定することにより、生体試料検体中のβ−アミロイド１−４２含量を測定することを特徴とする。前記生体試料検体が血清又は血漿であることが好適である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、Ａβ１−４２のＣ末端部分を特異的に認識する抗体を用いる免疫測定法を用いて、生体試料中のＡβｘ−４２を測定することにより、ＡＤを診断することを可能としたものである。本発明によれば、血漿や血清中のＡβ１−４２と相互作用する物質の除去操作が不要であり、且つ、Ａβｘ−４２を正確に効率よく検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明のアルツハイマー病の検定方法の第１の例を示す概略説明図である。
【図２】本発明のアルツハイマー病の検定方法の第２の例を示す概略説明図である。
【図３】実験例１の結果を示すグラフである。
【図４】実験例２の結果を示すグラフである。
【図５】実験例３の結果を示すグラフである。
【図６】血中でのＡβ１−４２の代謝概念を示す概略説明図である。
【図７】実験例６及び７の結果を示すグラフである。
【図８】実施例１の結果を示すグラフである。
【図９】実施例２の結果を示すグラフである。
【図１０】実施例３の標準品による検量線を示すグラフである。
【図１１】実施例３の結果を示すグラフである。
【図１２】実験例８の標準品による検量線を示すグラフである。
【図１３】実験例８の電気泳動の結果を示す写真である。
【図１４】実験例９の１回目の結果を示すチャートである。
【図１５】実施例９の１回目の結果を示すグラフである。
【図１６】実験例９で得られた検量線を示すグラフである。
【図１７】実験例９の２回目の結果を示すチャートである。
【図１８】実験例１０の結果を示すチャートである。
【符号の説明】
【００２１】
１０，２０：支持体、磁気ビーズ、１２，２４：Ａβ１−４２合成ペプチド、１３：Ａβ１−４２合成ペプチド結合支持体、Ａβ１−４２合成ペプチド結合磁気ビーズ、１４，２２：Ａβ１−４２のＣ末端に特異的な抗体、１６，２６：標識物質、１７：標識抗体、２３：Ａβ１−４２抗体結合支持体、Ａβ１−４２抗体結合磁気ビーズ、２７：標識Ａβ１−４２合成ペプチド、３０：生体試料検体中のＡβｘ−４２、３２：反応容器、３４：反応液、４０：標識物質の発光。
【発明の実施するための最良の形態】
【００２２】
以下に本発明の実施の形態を説明するが、本発明の技術思想から逸脱しない限り種々の変形が可能であることはいうまでもない。
【００２３】
本発明のアルツハイマー病の検定方法は、Ａβ１−４２のＣ末端部に特異的な抗体を使用する免疫測定法により、生体試料検体中の、Ａβ１−４２とＡβ１−４２のＣ末端部を保有するＡβ１−４２断片のトータル量（Ａβｘ―４２）を測定することにより、アルツハイマー病の罹患の有無を検定するものである。
【００２４】
本発明方法に用いられる免疫測定法としては、生体試料中のＡβｘ―４２を測定することができる方法であれば特に限定されず、例えば、競合的免疫測定法、表面プラズモン共鳴法による検出（非特許文献１９）、アフィニティクロマトグラフィによりＡβ１−４２Ｃ末端部を保有するペプチドを分離して測定する方法等、いずれも使用することが可能であるが、競合的免疫測定法を用いることが好ましい。
前記生体試料検体は、例えば、血清、血漿、脳脊髄液、骨髄液、組織及び細胞抽出物、細胞培養液などが含まれるが、好ましくは血清、血漿である。
【００２５】
本発明で用いられる前記抗体は、Ａβ１−４２のＣ末端部分を特異的に認識する抗体であればモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体いずれも使用することが可能である。好ましくは、Ａβ１−４２に反応するが、Ａβ１−４０に反応しない抗体が好ましく、市販品としては、例えば、Ａβ１−４２の３３−４２アミノ酸部位を免疫原とし、Ａβ１−４２のＣ末端部分に特異性を有するマウスモノクローナル抗体２１Ｆ１２（イノジェネティクス社製）、ＡＢ５０７８Ｐ（ケミコン社製）、８Ｇ７（ナノツール社製）などが挙げられ、好ましくは２１Ｆ１２である。Ａβ１−４０に反応しない抗体とは、弱い反応性があってもＡβ１−４２Ｃ末端部トータル量の測定に実質的に影響しない抗体も含まれる。また、Ａβ１−４３に反応性を有していても差し支えない。
【００２６】
本発明に使用する前記抗体は、常法により調製することができる。
モノクローナル抗体の調製は、Ａβ１−４２のＣ末端部を保有するペプチドを抗原として、必要に応じてキャリアー蛋白質との複合体を作り、これを動物に接種して免疫する。上記免疫動物の脾臓あるいはリンパ節から得られた抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合し、Ａβ１−４２のＣ末端部に強い特異性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより調製される。その操作は従来既知の方法に準ずればよい。
【００２７】
免疫抗原はＡβ１−４２も使用できるが、目的の抗体がＡβ１−４２のＣ末端部に特異性を有する抗体であるので、Ａβ１−４２のＣ末端部を保有するペプチド、例えば、Ａβ３３−４２など適宜選択することができる。通常、キャリアー蛋白質との複合体を抗原として使用するが、その調製は種々の縮合剤、例えばグルタルアルデヒド、カルボジイミド、マレイミド活性エステル等が使用される。キャリアー蛋白質はウシ血清アルブミン、サイログロブリン、ヘモシアニン等を使用し、通常１〜５倍量の割合でカップリングさせる方法が用いられる。
【００２８】
免疫される動物としてはマウス、モルモットなどがあげられ、接種方法は皮下、筋肉あるいは腹腔内に投与される。投与に際しては、完全フロイントアジュバンドや不完全フロイントアジュバンドと混和して投与してもよく、投与は通常２〜５週毎に１回ずつ行われる。免疫された動物の脾臓あるいはリンパ節から得られた抗体産生細胞は骨髄腫細胞と細胞融合させられ、ハイブリドーマとして単離される。骨髄腫細胞としてはマウス、ラット、ヒト等由来のものが使用され、抗体産生細胞と同種由来のものであることが好ましいが、異種間においても可能な場合もある。
【００２９】
細胞融合の操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法（Nature, 256, 495-497(1975)）に従い実施できる。融合促進剤としては、ポリエチレングリコールやセンダイウイルスなどが挙げられ、通常２０〜５０％程度の濃度のポリエチレングリコール（平均分子量１０００〜４０００）を用いて２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃の温度下、抗体産生細胞数と骨髄腫細胞数の比は通常１：１〜１０程度、約１〜１０分間程度反応させることにより細胞融合を実施することができる。
【００３０】
Ａβ１−４２のＣ末端部に特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングは、種々の免疫化学的方法が使用できる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法、競合法等があげられる。また、Ａβ１−４２ペプチド及びＡβ１−４０ペプチドを使用することにより、Ａβ１−４２に反応しＡβ１−４０に反応しない抗体を選択することができる。
【００３１】
このように選択されたウエルから更に、例えば限界希釈法によってクローニングを行い、目的とするクローンを得ることができる。ハイブリドーマの選択、育種は、通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、１０〜２０％ウシ胎児血清を含む動物細胞用培地（例、ＲＰＭＩ１６４０）で行われる。このようにして得られたクローンは、あらかじめブリスタンを投与したＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内へ移植し、１０〜１４日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取し、抗体精製の原料とすることができる。また、該クローンを培養し、その培養液を抗体精製の原料とすることもできる。モノクローナル抗体の回収は、免疫グロブリンの精製法として既知の方法を用いればよく、例えば、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法、陰イオン交換体の利用、さらにアフィニティクロマトグラフィなどの手段により達成することができる。
【００３２】
ポリクローナル抗体も常法により調製することができる。抗原はＡβ１−４２のＣ末端部を主な構成とするペプチドを採用し、前記と同様な手法により、複合体としてウサギ、モルモットなどの動物に免疫して調製することができる。適宜採決して抗体力価を測定し、高力価の血清を抗体の精製原料として、前記の手法により精製することによりポリクローナル抗体を得ることができる。
【００３３】
以下に、本発明のアルツハイマー病の検定方法について、免疫測定法として競合的免疫測定法を用いた場合を例に説明する。
競合的免疫測定法を用いた本発明方法について説明する。本発明方法に用いられる競合的免疫測定法（competitive immunological assay）は、Ａβ１−４２のＣ末端部分に特異的な抗体とＡβ合成ペプチドを用いた、血液検体等、生体試料検体中のＡβ１−４２Ｃ末端部を保有するＡβ１−４２ペプチドとＡβ合成ペプチドの抗体への競合結合反応を反応基盤とする競合的免疫測定法である。
【００３４】
本発明方法において、使用するＡβ合成ペプチドは、Ａβ１−４２のＣ末端部を認識する抗体と反応するペプチドであればいずれも使用可能であり、具体的には、Ａβ１−４２のＣ末端部を保有するペプチドを使用することができる。該Ａβ１−４２Ｃ末端部保有ペプチドとしては、全長Ａβ１−４２のみならず、例えば、Ａβ３３−４２やＡβ１７−４２などの合成ペプチドなどを使用することができ、特に限定されない。前記ペプチドは、固相合成法など常法に従い合成することができる。以下、Ａβ合成ペプチドとして、Ａβ１−４２合成ペプチドを使用した場合を例に具体的に説明する。
【００３５】
図１は、本発明のアルツハイマー病の検定方法の第１の例を示す概略説明図であり、免疫測定法として、Ａβ１−４２Ｃ末端部保有ペプチドを支持体に固相化した競合的免疫測定法を用いた場合の例である。
図１において、１０は支持体、１２はＡβ１−４２合成ペプチド、３２は反応容器（反応カップ）、３４は反応液（例えば、緩衝液等）である。図１（ａ）に示した如く、Ａβ１−４２合成ペプチド１２を支持体１０に結合させ（固相化）、Ａβ１−４２合成ペプチド結合支持体１３を調製する。
【００３６】
前記支持体１０の材料としては、例えば、ガラス、プラスティック（例えば、ポリスチレン、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレンなど）、金属などが挙げられる。支持体の形状は、カップ型、平板、粒子など、特に限定されない。前記支持体１０は、好ましくはマグネティックマイクロビーズ（磁気ビーズ）である。
Ａβ合成ペプチドを支持体に固相化する方法は、常法に準ずればよい。支持体として磁気ビーズを使用する場合、該ビーズとＡβ１−４２合成ペプチドを緩衝液中で反応させた後、磁気ビーズをブロッキング剤で処理した後、ブロッキング剤下で保存することが好ましい。以下、支持体として磁気ビーズを用いた場合を例に説明する。
【００３７】
前記調製したＡβ１−４２合成ペプチド結合磁気ビーズ１３に対し、Ａβ１−４２のＣ末端部に特異的な抗体１４を標識物質１６で標識した抗体１７（以下、標識抗体と称する）と生体試料検体とを共に混合し、磁気ビーズに結合したＡβ１−４２合成ペプチド１２と検体中のＡβ１−４２及びＡβ１−４２Ｃ端部を保有する断片３０とを標識抗体１７と競合反応させ、競合的に結合させる［図１（ｂ）］。
【００３８】
本発明に使用する標識物質１６は、酵素、発光物質、蛍光物質、同位元素など特に限定されず、好ましくはルテニウム錯体である。
標識抗体の調製方法は常法に準ずる。例えば、抗体とルテニウム錯体（ＩＧＥＮ社製、ORIGEN TAG-NHS ESTER）を緩衝液中、反応させた後、２Ｍグリシンを加えてさらに反応させる。次いで、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより標識抗体を精製することにより調製できる。
【００３９】
前記競合反応後、反応液を吸い取り、磁気ビーズを洗浄することで磁気ビーズと結合していない遊離の反応液中物質を除去する（ＢＦ分離）。
次いで、磁気ビーズに結合している標識物質を測定する。標識物質の測定方法は常法に準ずる。例えば、標識物質としてルテニウム錯体を用いた場合、図１（ｃ）に示した如く、磁気ビーズに結合しているルテニウム錯体標識抗体をトリプトピルアミン存在下で電気エネルギーを加えることで発光させ、ルテニウム錯体発光４０の強度を測定する（非特許文献１４）。
【００４０】
この際、検体中のＡβｘ−４２が多ければ、競合反応により標識抗体のビーズ結合ペプチドへの結合量は低下するので、競合物質の無い場合の発光強度に比較して発光強度は低下する。この発光強度の低下度合い（下記実施例では阻害率（％）として表示）により、検体中のＡβｘ−４２を定量することができる。アルツハイマー病患者の検体中、特に血中のＡβｘ−４２量は健常人の検体に比べて著しく減少しているため、本発明方法により検体中のＡβｘ−４２を測定することにより、アルツハイマー病の検定が可能である。
【００４１】
図２は、本発明のアルツハイマー病の検定方法の第２の例を示す概略説明図であり、免疫測定法として、Ａβ１−４２のＣ末端部を特異的に認識する抗体を支持体に固相化した競合的免疫測定法を用いた場合の例である。
図２において、２０は支持体、２２はＡβ１−４２のＣ末端部を特異的に認識する抗体である。図２（ａ）に示した如く、前記Ａβ１−４２抗体２２を磁気ビーズ等の支持体２０に結合させ（固相化）、Ａβ１−４２抗体結合支持体２３を調製する。抗体の支持体への固相化の手法は、常法に準ずればよい。以下、支持体として磁気ビーズを用いた場合を例に説明する。
【００４２】
前記調製した抗体結合磁気ビーズに、Ａβ１−４２合成ペプチド２４を標識物質２６で標識した標識Ａβ１−４２合成ペプチドと生体試料検体とを共に混合し、競合反応させ、競合的に結合させる［図２（ｂ）］。
競合反応後は、前記第１の例と同様の操作を行い、磁気ビーズに結合した標識物質を測定し［図２（ｃ）］、検体中のＡβｘ−４２を定量することができる。
【００４３】
前記標識するＡβ１−４２合成ペプチドは、そのものの使用も可能であるが、Ａβ１−４２にキャリアー物質を結合させたペプチド複合体を使用することもできる。キャリアー物質とは、標識物質が結合しえる化合物を意味し、例えば、ポリリジン（poly-L-Lysine）、デキストラン、ウシ血清アルブミン、遊離アミノ基を多く保有するポリペプチドなどが挙げられ、好ましくはポリリジンである。キャリアー物質を使用することによりＡβ１−４２ペプチド当たりの標識物質の量を増加させることができ、感度の上昇が期待されるのでこれらペプチド複合体を使用することが好ましい。
【００４４】
標識したペプチド複合体は、標識物質で標識したキャリアー物質とＡβ１−４２合成ペプチドを、例えば架橋剤等を介して結合させることによりできる。この際、必要に応じて、前もってＡβ１−４２のＮ端部にスペーサー、例えば１５個のリジンからなるリジンペプチドなどを結合させておくことも自由である。また、ペプチド複合体を作製した後に、標識物質で標識することも可能であり、いずれの手法も自由に採用でき、限定されるものではない。
【００４５】
本発明の免疫測定法に基づく診断試薬（キット）は、Ａβ１−４２のＣ末端部分に特異性を有する抗体を必須の構成成分とし、さらにＡβ１−４２Ｃ末端部保有合成ペプチドを構成成分とする。
採用する免疫測定法により試薬の構成成分の形態は適宜設計すればよい。例えば、競合的免疫測定法においては、前述した如く、Ａβ１−４２Ｃ末端部保有合成ペプチドを固相化した支持体（好ましくは、磁気ビーズ）と標識抗体を構成成分とするか、又は抗体を固相化した支持体（好ましくは、磁気ビーズ）と標識したＡβ１−４２Ｃ末端部保有合成ペプチドを構成成分とすることが好ましい。標識したＡβ１−４２Ｃ末端部保有合成ペプチドは、前記本発明方法の第２の例の項で記載したように、Ａβ１−４２Ｃ末端部保有ペプチドにキャリアー物質を結合させたペプチド複合体を構成成分とすることが好ましい。
なお、反応に使用する緩衝液、測定器具などを試薬に添付することは自由である。
【実施例】
【００４６】
以下に実施例に基づき本発明を具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限定されるものではない。【００４７】
（実験例１及び２）電気化学発光二抗体サンドイッチ測定法
実験例１及び２は、Ａβに特異的な抗体２種類を用いた電気化学発光二抗体サンドイッチ測定法による分析である。一次抗体としてＡβ１−４２の３３−４２アミノ酸部位をマウスに免疫して作製したＡβ１−４２特異反応抗体である２１Ｆ１２マウスモノクローナル抗体（イノジェネティクス社製）を使用し、二次抗体としてＡβ１−４２の１−５アミノ酸部位をマウスに免疫して作製した３Ｄ６マウスモノクローナル抗体（イノジェネティクス社製）をルテニウム錯体標識して使用した。【００４８】
以下に試薬の各構成成分の調製方法について記す。
（１）２１Ｆ１２抗体結合磁気ビーズの調製方法
２１Ｆ１２マウスモノクローナル抗体を１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）で１ｍｇ／ｍＬ抗体濃度に希釈し、この抗体０．５ｍＬを、３０ｍｇ／ｍＬの磁気ビーズ（ＤＹＮＡＬ社製、DYNABEADS M-450 Epoxy）０．５ｍＬと混合した。混合液を２５℃、１６時間攪拌し、磁気ビーズと抗体を結合させた。その後、この磁気ビーズ溶液より溶液のみを抜き取ることで、溶液中に残存していた磁気ビーズ未結合の遊離抗体を除去した。次にブロッキング剤として１ｍＬの４％ブロックエース試薬（大日本製薬社製）を抗体結合磁気ビーズに加え、２５℃、３時間攪拌した。その後、前述の４％ブロックエース試薬１０ｍＬで磁気ビーズを洗浄（２ｍＬの４％ブロックエース／５回洗浄）した。洗浄後の２１Ｆ１２抗体結合磁気ビーズは前述の４％ブロックエース試薬０．５ｍＬと混合し、使用時まで４℃で保存した。【００４９】
（２）ルテニウム錯体標識３Ｄ６抗体の調製方法
３Ｄ６マウスモノクローナル抗体（イノジェネティクス社製）を１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）で１ｍｇ／ｍＬ抗体濃度に希釈した。１ｍｇ／ｍＬ抗体０．５ｍＬに１０ｍｇ／ｍＬのルテニウム錯体（ＩＧＥＮ社製、ORIGEN TAG-NHS ESTER）を１７．６μＬ加え、２５℃、３０分間攪拌した。その後、２ｍｏｌ／Ｌグリシンを３０μＬ添加し、２５℃、３０分間攪拌した。
次いで、直径１ｃｍ、高さ３０ｃｍのガラス管に充填したゲルろ過カラムクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス社製、sephadexG-25）にルテニウム錯体標識抗体液をアプライし、未標識のルテニウム錯体とルテニウム錯体標識抗体を単離精製した。溶出は１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）にて行った。【００５０】
（実験例１）Ａβ１−４２合成ペプチドの測定
５００μＬ容ポリスチレンカップ（以下、反応カップと記述）に１５０μＬの反応用溶液［50mmol/L Tris HCl, 1%BSA, 0.15mol/L NaCl, 0.01%(W/V) Tween20, 10mmol/L EDTA2Na, 0.1%正常マウス血清, pH7.5］（以下、サンドイッチ測定反応用溶液と記述）を入れた物を７つ用意し、その各反応カップにＡβ１−４２合成ペプチドをサンドイッチ測定反応用溶液で０、０．５、１、５、１０、２５、５０又は１００ｐｇ／ｍＬに希釈したサンプルをそれぞれ５０μＬずつ混合した。そこにサンドイッチ測定反応用溶液で２ｍｇ／ｍＬ濃度に希釈した２１Ｆ１２抗体結合磁気ビーズを２５μＬずつ添加し、３０℃で９分間反応させた（第一反応）。
その後、磁気ビーズを磁石でトラップしておいてから反応カップ中の液体を抜き取り、洗浄液［50mmol/L Tris HCL, 0.01%(W/V) tween20, 0.15mol/L NaCl, pH7.5］３５０μＬで２回磁気ビーズを洗浄し、抗原抗体反応以外の非特異結合物質を除去した（ＢＦ分離）。【００５１】
次にサンドイッチ測定反応用溶液で４μｇ／ｍＬ濃度に希釈したルテニウム錯体標識３Ｄ６抗体を２００μＬ加えて３０℃で９分間反応させた（第二反応）。反応後の磁気ビーズを磁石でトラップしておいてから反応カップ中の液体を抜き取り、洗浄液３５０μＬで２回磁気ビーズを洗浄し、抗原抗体反応以外の非特異結合物質を除去した（ＢＦ分離）。【００５２】
その後、反応カップに３００μＬのトリプトピルアミンを入れ、磁気ビーズと混合した。この状態で電気エネルギーを与えることでルテニウム錯体が発光し、その発光強度を検出機で検出した。なお、上記の反応カップへの磁気ビーズ添加測定操作以降は、ルテニウム錯体発光自動測定機であるピコルミ８２２０（三光純薬（株）製）上で行った。結果を表１及び図３に示す。なお、図３は、ルテニウム錯体発光強度測定値からＡβ１−４２合成ペプチド濃度０の時の測定値を差引いた値をＥＣＬ値として示した。【００５３】
【表１】
2006046644.tif 000002
ＥＣＬ値：ルテニウム錯体発光強度測定値
ブランク差引値：ＥＣＬ値−サンプル濃度０の時のＥＣＬ【００５４】
表１及び図３に示した如く、電気化学発光二抗体サンドイッチ測定法では、Ａβ１−４２合成ペプチドを０．５ｐｇ／ｍＬまで測定可能な測定系であった。これまでに一般的に知られているＡβ１−４２サンドイッチ測定試薬の内、もっとも感度の高い部類の試薬と比較しても１０倍以上の感度が得られる測定系であった。【００５５】
（実験例２）ＡＤ患者及び健常人血清の電気化学発光二抗体サンドイッチ測定法による測定
反応カップに１５０μＬのサンドイッチ測定反応用溶液を入れた物を必要量用意し、その各反応カップにＡβ１−４２合成ペプチドをサンドイッチ測定反応用溶液で０、０．５、１、５、１０、２５、５０又は１００ｐｇ／ｍＬに希釈したサンプル（検量線作成用標準品）、ＡＤ患者血清検体２５例、及び健常人血清検体２５例をそれぞれ５０μＬずつ混合した。そこにサンドイッチ測定反応用溶液で２ｍｇ／ｍＬ濃度に希釈した２１Ｆ１２抗体結合磁気ビーズを２５μＬずつ添加し、３０℃で９分間反応させた（第一反応）。
その後、磁気ビーズを磁石でトラップしておいてから反応カップ中の液体を抜き取り、洗浄液［50mmol/L Tris HCL, 0.01%(W/V) tween20, 0.15mol/L NaCl, pH7.5］３５０μＬで２回磁気ビーズを洗浄し、抗原抗体反応以外の非特異結合物質を除去した（ＢＦ分離）。【００５６】
次にサンドイッチ測定反応用溶液で４μｇ／ｍＬ濃度に希釈したルテニウム錯体標識３Ｄ６抗体を２００μＬ加えて３０℃で９分間反応させた（第二反応）。
反応後の磁気ビーズを磁石でトラップしておいてから反応カップ中の液体を抜き取り、洗浄液３５０μＬで２回磁気ビーズを洗浄し、抗原抗体反応以外の非特異結合物質を除去した（ＢＦ分離）。【００５７】
その後、反応カップに３００μＬのトリプトピルアミンを入れ、磁気ビーズと混合した。この状態で電気エネルギーを与えることでルテニウム錯体が発光し、その発光強度を検出機で検出した。なお、上記の反応カップへの磁気ビーズ添加測定操作以降は、ルテニウム錯体発光自動測定機であるピコルミ８２２０（三光純薬（株）製）上で行った。標準品Ａβ１−４２合成ペプチドの測定結果より検量線を作成し、該検量線を用いてＡＤ患者及び健常者のＡβ１−４２濃度を算出した。結果を図４に示す。【００５８】
図４に示した如く、ＡＤ患者では２５例中８例、健常人では２５例中３例が測定最低感度である０．５ｐｇ／ｍＬ以上の値であり、残りの検体はいずれも測定感度以下の結果であった。また、測定可能であった検体のｔ検定により、ＡＤと健常人の二群の間には有意差はないと判定された（ｐ＞０．０５）。【００５９】
（実験例３）血清によるＡβ１−４２の断片化実験
１ｍＬの健常人血清を０．５ｍＬずつに小分けして、一方にはプロテアーゼ溶液［プロテアーゼインヒビターカクテル（Roche社製、complete mini）１錠を１ｍＬの緩衝液（10mmol/L Tris HCl, pH7.5）に溶解した溶液］を１０μＬ混合した（実験例３−１）。他方の血清には対照として緩衝液（10mmol/L Tris HCl, pH7.5）を１０μＬ混合した（実験例３−２）。
それぞれの血清に１０００ｎｇ／ｍＬのＡβ１−４２合成ペプチド（（株）ペプチド研究所製）を５μＬ添加した。各物質を添加した血清は、２０℃で静置し、経時的に前述の電気化学発光二抗体サンドイッチ測定法で、時間経過による添加Ａβ１−４２合成ペプチドの測定値変化を測定した。【００６０】
図５は、血清へのＡβ１−４２合成ペプチド添加直後の測定値を１００％としたときの、時間経過による測定値の変化率を相対比で表示したグラフである。図５に示した如く、対照である実験例３−２に比べて、実験例３−１のプロテアーゼインヒビターを加えてからＡβ１−４２合成ペプチドを添加した血清の方が、明らかに時間経過による測定値の低下を抑えられるという結果が得られた。よって血清中において生体内Ａβ１−４２も、血中プロテアーゼによって速やかに断片化されていることが示唆された。
図６は血中でのＡβ１−４２の代謝概念図を示す概略説明図であり、（ａ）はＡβ１−４２のアミノ酸配列（配列番号１）を示し、（ｂ）は血中のＡβ１−４２の代謝を示す。Ａβ１−４２は脳内で発現し、脳髄液（ＣＳＦ）に移行する。その後、血中に漏出されたＡβ１−４２は、血中のプロテアーゼにて速やかに断片化される。【００６１】
（実験例４及び５）
電気化学発光二抗体サンドイッチ測定法（実験例４）、及び抗原（Ａβ１−４２合成ペプチド）を固相化した競合的免疫測定法（実験例５）により、Ａβ１−４２合成ペプチドの酵素分解物の測定を行った。
（ａ）各サンプルの調製方法
酵素処理サンプルとして、１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）で１０μｇ／ｍＬに調製したＡβ１−４２合成ペプチド（（株）ペプチド研究所製）２０μＬに、１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）で１ｍｇ／ｍＬに調製したトリプシン（ＳＩＧＭＡ社製、１：２５０トリプシン）を５μＬ添加し、サンプルを調製した。また、対照サンプルとして、同一濃度のＡβ１−４２合成ペプチド（（株）ペプチド研究所製）２０μＬに１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）を５μＬ添加したサンプルを用意した。さらに、ブランクサンプルとして、Ａβ１−４２合成ペプチド無添加の１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）を用いた。【００６２】
（ｂ）Ａβ１−４２合成ペプチドの酵素分解物の測定
それぞれのサンプルを３０分保温後、実験例１と同様の電気化学発光二抗体サンドイッチ測定法（実験例４）、および下記に示す競合的免疫測定法（実験例５）で測定した。
実験例５の競合的免疫測定法の手順を以下に示す。【００６３】
（１）試薬の各構成成分の調製方法
（１−１）Ａβ１−４２合成ペプチド結合磁気ビーズの調製方法
５０ｎｇ／ｍＬのＡβ１−４２合成ペプチド（（株）ペプチド研究所製）０．３ｍＬを、３０ｍｇ／ｍＬの磁気ビーズ（ＤＹＮＡＬ社製、DYNABEADS M-450 Epoxy）０．３ｍＬと混合した。混合液を２５℃、１６時間攪拌し、磁気ビーズと合成ペプチドを結合させた。その後、この磁気ビーズ溶液より溶液のみを抜き取ることで、溶液中に残存していたビーズ未結合の遊離合成ペプチドを除去した。次にブロッキング剤として１ｍＬのリン脂質ポリマー試薬（日本油脂社製、S101E）をペプチド結合磁気ビーズに加え、２５℃、３時間攪拌した。その後、前述の１０ｍＬのリン脂質ポリマー試薬で磁気ビーズを洗浄（２ｍＬリン脂質ポリマー／５回洗浄）した。洗浄後のＡβ１−４２合成ペプチド結合磁気ビーズは前述のリン脂質ポリマー試薬０．３ｍＬと混合し、使用時まで４℃で保存した。【００６４】
（１−２）ルテニウム錯体標識２１Ｆ１２抗体の調製方法
Ａβ１−４２のＣ末端部に特異的な抗体である２１Ｆ１２マウスモノクローナル抗体（イノジェネティクス社）を１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）で１ｍｇ／ｍＬ抗体濃度に希釈した。１ｍｇ／ｍＬ抗体０．５ｍＬに１０ｍｇ／ｍＬのルテニウム錯体（ＩＧＥＮ社製、ORIGEN TAG-NHS ESTER）を１７．６μＬ加え、２５℃、３０分間攪拌した。その後、２ｍｏｌ／Ｌグリシンを３０μＬ添加し、２５℃、３０分間攪拌した。
次に、直径１ｃｍ、高さ３０ｃｍのガラス管に充填したゲルろ過カラムクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス社製、sephadexG-25）にルテニウム錯体標識抗体液をアプライし、未標識のルテニウム錯体とルテニウム錯体標識抗体を単離精製した。溶出は１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）にて行った。【００６５】
（２）サンプル中のＡβｘ−４２の測定方法
反応カップに５０μＬの反応用溶液［50mmol/L Tris HCl, 10% BSA, 0.15mol/L NaCl, 0.01%(W/V) Tween20, 10mmol/L EDTA2Na, 0.1% 正常マウス血清, pH7.5］を入れたものを必要量用意した。そこにＡβ１−４２合成ペプチドの酵素処理サンプル及び対照サンプルをそれぞれ５０μＬ混合した。そこに反応用溶液で１．５ｍｇ／ｍＬ濃度に希釈したＡβ１−４２合成ペプチド結合磁気ビーズを２５μＬ添加し、更に反応用溶液で０．１μｇ／ｍＬ濃度に希釈したルテニウム錯体標識２１Ｆ１２マウスモノクローナル抗体（以下、標識抗体と記述）を２００μＬ添加した。３０℃で２６分攪拌し、サンプル中のＡβ１−４２及びＡβ１−４２断片と、磁気ビーズ結合Ａβ１−４２合成ペプチドにルテニウム錯体標識２１Ｆ１２マウスモノクローナル抗体を競合反応させた。【００６６】
その後、磁気ビーズを磁石でトラップしておいてから反応カップ中の液体を抜き取り、洗浄液［50mmol/L Tris HCl, 0.01%(W/V) tween20, 0.15mol/L NaCl, pH7.5］３５０μＬで２回磁気ビーズを洗浄し、抗原抗体反応以外の非特異結合物質を除去した（ＢＦ分離）。その後、反応カップに３００μＬのトリプトピルアミンを入れ、ビーズと混合した。この状態で電気エネルギーを与えることでルテニウム錯体が発光し、その発光強度を検出機で検出した。なお、上記の反応カップへの磁気ビーズ添加測定操作以降は、ルテニウム錯体発光自動測定機であるピコルミ８２２０（三光純薬（株）製）上で行った。【００６７】
（ｃ）結果
実験例４の電気化学発光二抗体サンドイッチ測定法による測定結果を表２に示し、実験例５の競合的免疫測定法による測定結果を表３に示す。表中、“ＥＣＬ値”はルテニウム錯体発光強度測定値であり、“％”は対照サンプルの測定値を１００％としたときの測定値の相対比を示したものである。また、表３において、サンプル中に競合物質なしの時の値（ブランク値）を１００％としたときの競合反応による測定値低下の相対比を阻害率として表示した。【００６８】
【表２】
2006046644.tif 000003
【００６９】
【表３】
2006046644.tif 000004
【００７０】
表２に示した如く、二抗体サンドイッチ測定法では、トリプシン処理したＡβ１−４２合成ペプチドは、トリプシン処理しなかった対照サンプルに対して１／１０量しかＡβ１−４２を検出できなかった。しかし、表３に示した如く、同一サンプルを競合的免疫測定法で測定した結果、トリプシン処理しなかった対照サンプルとほぼ同一の競合反応が見られ、断片化したＡβ１−４２であっても全長Ａβ１−４２と同様に測定可能であることが証明された。すなわち、競合的免疫測定法はサンプル中の断片化したＡβ１−４２量も正確に反映していることが確認された。【００７１】
（実験例６及び７）抗体２１Ｆ１２の特性試験
１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）でそれぞれ０（ブランク）、１０、１００、１０００又は１００００ｎｇ／ｍＬに調製したＡβ１−４２合成ペプチド（（株）ペプチド研究所製）（実験例６）及びＡβ１−４０合成ペプチド（（株）ペプチド研究所製）（実験例７）を競合的免疫測定法で測定した。競合的免疫測定は実験例５に記載の手順で行った。結果を図７に示す。なお、図７のグラフ中の阻害率は、サンプル中に競合物質なしの時の値（ブランク値）を１００％としたときの競合反応による測定値低下を相対比で表示した。【００７２】
結果は図７に示した如く、実験例６のＡβ１−４２合成ペプチドは濃度の増加に伴って競合反応が増加したのに対して、実験例７のＡβ１−４０合成ペプチドは濃度が増加しても競合反応は生じなかった。したがって、本発明の競合的免疫測定法に使用した抗体２１Ｆ１２は、Ａβ１−４２に特異的に反応する抗体であり、Ａβ１−４０にはほぼ反応しない抗体であることが判明した。【００７３】
（実施例１）ＡＤ患者及び健常人血清の競合的免疫測定法での測定
反応カップに５０μＬの反応用溶液を入れたものを必要量用意した。そこに検体としてＡＤ患者血清２５例、健常人血清１５例及び反応用溶液（ブランク）をそれぞれ５０μＬ混合した。そこに反応用溶液で１．５ｍｇ／ｍＬ濃度に希釈したＡβ１−４２合成ペプチド結合磁気ビーズを２５μＬ添加し、実験例５に記載の手順に従い競合的免疫測定法により測定した。結果を図８に示す。【００７４】
測定の結果、得られた検体ごとの発光強度は、検体中Ａβｘ−４２が多ければ、競合反応によりルテニウム錯体標識抗体の磁気ビーズ結合ペプチドへの結合量は低下するので、競合物質の無い検体として反応用溶液を使用した場合の発光強度に比較して発光強度は低下する。
得られた発光強度は以下の計算式により阻害率に換算した。
阻害率（％）＝［１−各検体の発光強度÷反応用溶液を検体としたときの発光強度（競合反応なしの時の発光強度）］×１００
その結果は図８に示した如く、ｔ検定においてＡＤ患者と健常人の二群の間には９５％以上の確率で有意差があると判定された（ｐ＜０．０００２）。【００７５】
（実施例２）ポリクローナル抗体を使用する競合的免疫測定
ルテニウム錯体標識２１Ｆ１２抗体の代わりにＡβ１−４２のＣ末端部分に特異的に反応するポリクローナル抗体ＡＢ５０７８Ｐ（ケミコン社製）をルテニウム錯体で標識したルテニウム錯体標識ＡＢ５０７８Ｐ抗体を用いた以外は実施例１と同手法の競合的免疫測定法により、ＡＤ患者２０例及び健常人１８例の血清検体を測定した。結果を図９に示す。
その結果、実施例１と同様、ｔ検定においてＡＤ患者と健常人の二群の間には９５％以上の確率で有意差があると判定された（ｐ＜０．０００２）。この結果から、Ａβ１−４２のＣ末端部に特異的な抗体であれば、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体いずれも使用することができることが判明した。【００７６】
（実施例３）抗体を固相化した競合的免疫測定法
（ａ）試薬の各構成成分の調製方法
（１）ルテニウム錯体標識されたＡβ１−４２Ｃ末端部保有ペプチドの調製方法
（１−１）チオール化ＳＰＤＰ結合ルテニウム錯体標識ポリリジンの調製
２．５ｍｌのポリリジン（poly-L-Lysine、平均分子量：３８０００、シグマ社製）を２ｍＬリン酸バッファー（ｐＨ７．８）に溶解させ、そこに４５０μＬの１０ｍｇ／ｍＬルテニウム錯体（ＩＧＥＮ社製、ORIGEN TAG-NHS ESTER）を加え、２５℃で６０分間混合させた。混合物に２００μＬの２ｍｏｌ／Ｌグリシンを加え、２５℃で３０分間混合させた。混合物を直径２ｃｍ、高さ４０ｃｍのガラス管に充填したゲルろ過カラムクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス社、Sephadex G-25）にアプライし、未標識のルテニウム錯体とルテニウム錯体標識ポリリジンを単離精製した。溶出は１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）にて行った。【００７７】
このルテニウム錯体標識ポリリジン２ｍｇ／ｍＬに２０ｍｍｏｌ／Ｌのタンパク質架橋剤（ピアス社製、ＳＰＤＰ）を８．３μＬ混合させ、窒素ガスを吹きかけながら２５℃、１時間攪拌した。攪拌後、直径２ｃｍ、高さ４０ｃｍのガラス管に充填したゲルろ過カラムクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス社製、Sephadex G-25）にアプライし、未結合ＳＰＤＰとＳＰＤＰ結合ルテニウム錯体標識ポリリジンを単離精製した。溶出は１ｍｍｏｌ／Ｌのエチレンジアミン四酢酸２ナトリウムを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）にて行った。【００７８】
このＳＰＤＰ結合ルテニウム錯体標識ポリリジンに１ｍｏｌ／Ｌのジチオトレイトールと１ｍｍｏｌ／Ｌのエチレンジアミン四酢酸２ナトリウムを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を５５μＬ加え、窒素ガスを吹きかけながら２５℃、３０分間攪拌することでＳＰＤＰの２−ピリジル−ジスルフィド基をチオール化した。攪拌後、直径１ｃｍ、高さ３０ｃｍのガラス管に充填したゲルろ過カラムクロマトグラフィー（バイオラッド社製、Bio-Gel P-4）にアプライし、ジチオトレイトール及びチオール化の副産物であるピリジン−２−チオンとチオール化ＳＰＤＰ結合ルテニウム錯体標識ポリリジンを単離精製した。溶出は１ｍｍｏｌ／Ｌのエチレンジアミン四酢酸２ナトリウムを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）にて行った。【００７９】
（１−２）ＳＰＤＰ結合１５Ｌ−β３３−４２ペプチドの調製
Ｎ末端側にリジンが１５個結合した形のＡβ３３−４２合成ペプチド（アミノ酸配列：KKKKKKKKKKKKKKKGLMVGGVVIA（配列番号２）、以下１５Ｌ−β３３−４２と表記）０．５ｍｇを５０μＬのＤＭＳＯに溶解させ、更に０．４５ｍＬの１ｍｍｏｌ／Ｌのエチレンジアミン四酢酸２ナトリウムを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に希釈し、１５Ｌ−β３３−４２ペプチド液とした。
この１５Ｌ−β３３−４２ペプチド液に２０ｍｍｏｌ／Ｌのタンパク質架橋剤（ピアス社製、ＳＰＤＰ）を５０μＬ混合させ、窒素ガスを吹きかけながら２５℃、１時間攪拌した。攪拌後、直径１ｃｍ、高さ３０ｃｍのガラス管に充填したゲルろ過カラムクロマトグラフィー（バイオラッド社製、Bio-Gel P-4）にアプライし、未結合ＳＰＤＰとＳＰＤＰ結合１５Ｌ−β３３−４２ペプチドを単離精製した。溶出は１ｍｍｏｌ／Ｌのエチレンジアミン四酢酸２ナトリウムを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）にて行った。【００８０】
（１−３）ＳＰＤＰ結合１５Ｌ−β３３−４２ペプチドとチオール化ＳＰＤＰ結合ルテニウム錯体標識ポリリジンの結合
０．２ｍｇのＳＰＤＰ結合１５Ｌ−β３３−４２ペプチドに０．３ｍｇのチオール化ＳＰＤＰ結合ルテニウム錯体標識ポリリジンを加え、４℃、１６時間静置することで、１５Ｌ−β３３−４２ペプチド結合ＳＰＤＰの２−ピリジル−ジスルフィド基と、チオール化ＳＰＤＰ結合ルテニウム錯体標識ポリリジンのチオール基を介して１５Ｌ−β３３−４２ペプチドとルテニウム錯体標識ポリリジンを結合させた。混合物を直径１ｃｍ、高さ３０ｃｍのガラス管に充填したゲルろ過カラムクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス社製、Sephadex G-25）にアプライし、遊離のＳＰＤＰ結合１５Ｌ−β３３−４２ペプチド及び遊離のチオール化ＳＰＤＰ結合ルテニウム錯体標識ポリリジンと１５Ｌ−β３３−４２ペプチド＋ルテニウム錯体標識ポリリジン結合体（以下、標識ペプチド複合体と称する。）を単離精製した。溶出は１ｍｍｏｌ／Ｌのエチレンジアミン四酢酸２ナトリウムを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）にて行った。
なお、使用するペプチドは上記１５Ｌ−β３３−４２ペプチド以外にもＡβ１−４２合成ペプチドやＡβ１−４２Ｃ端部を保有する他の断片ペプチドでも同様の方法でペプチドとルテニウム錯体標識ポリリジンの結合体を作製することが可能である。【００８１】
（２）Ａβ１−４２のＣ末端部分に特異的な抗体を結合させた磁気ビーズの調製方法
実験例１と同様の手順により２１Ｆ１２抗体結合磁気ビーズを調製した。
なお、２１Ｆ１２抗体以外にもＡβ１−４２のＣ末端部分に特異的な抗体であれば同様に使用することが可能である。【００８２】
（ｂ）ＡＤ患者及び健常者血清の測定
５００μＬ容ポリスチレンカップ（以下、反応カップと記述）に５０μＬの反応用溶液［10mmol/L リン酸ナトリウム, 1%ブロックエース, 0.15mol/L NaCl, 0.01%(W/V) Tween20, 10mmol/L EDTA2Na, 0.25%(W/V)トレハロース, 0.1%正常マウス血清, pH7.2］を入れた物を必要量用意した。その各反応カップに検量線作成用標準品として、０、３１．２５、６２．５、１２５、２５０、５００、１０００ｎｇ／ｍＬの濃度のＡβ１−４２合成ペプチドを２０μＬずつ混合し、又は測定検体としてＡＤ患者１５例及び健常者１５例の血清をそれぞれ２０μＬずつ混合した。そこに反応用溶液で０．３ｍｇ／ｍＬ濃度に希釈した２１Ｆ１２抗体結合磁気ビーズを２５μＬずつ添加し、更に１μｇ／ｍＬ濃度に反応用溶液で希釈した標識ペプチド複合体を２００μＬ加え、３０℃で２６分間反応させた。【００８３】
その後、磁気ビーズを磁石でトラップしておいてから反応カップ中の液体を抜き取り、洗浄液［50mmol/L Tris HCl, 0.1%(W/V) tween20, 0.15mol/L NaCl, pH7.5］３５０μＬで２回磁気ビーズを洗浄し、非特異結合物質を除去した。
その後、反応カップに３００μＬのトリプトピルアミンを入れ、磁気ビーズと混合した。この状態で電気エネルギーを与えることでルテニウム錯体が発光し、その発光強度を検出機で検出した。なお、上記の反応カップへの磁気ビーズ添加測定操作以降は、ルテニウム錯体発光自動測定機であるピコルミ８２２０（三光純薬社製）上で行った。【００８４】
表４に、標準品Ａβ１−４２合成ペプチドの競合反応による阻害率を示し、図１０に検量線（ｙ＝−３１０７．３Ｌｎ（ｘ）＋２６２２７  Ｒ2＝０．９９０９）を示した。また、ＡＤ患者及び健常者の血清の測定結果を表５、表６及び図１１に示した。なお、定量値は図１０の検量線に各検体のＥＣＬ値を当てはめて算出した。この結果、血清中のＡβ１−４２Ｃ末端部トータル量は、ＡＤ患者は健常者に比較して有意に低下しており、本発明の手法はＡＤの診断に使用しえることが確認された。【００８５】
【表４】
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＊表中の阻害率とは、阻害なし（投入Ａβ１−４２ペプチド濃度０、ブランク）のルテニウム錯体発光強度測定値（ＥＣＬ値）を１００％としたときの、各濃度のＡβ１−４２を投入した際のＥＣＬ値の低下率を％表示したものである。【００８６】
【表５】
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【００８７】
【表６】
2006046644.tif 000007
【００８８】
なお、本手法における検量線は、標識抗原としてＡβ３３−４２合成ペプチドを使用したが、Ａβ１−４２合成ペプチドを標識抗原として使用した場合の検量線も図１０と同様な結果を示したことを確認している。また、使用した抗体は実施例１と同じ２１Ｆ１２であるので、Ａβ１−４２合成ペプチド及びＡβ３３−４２合成ペプチドとは競合反応を示すが、Ａβ１−４０合成ペプチドとは反応しないことを確認している。【００８９】
（実験例８）Ａβ１−４２の血清中断片化確認実験
血清に添加したＡβ１−４２合成ペプチドの添加後の分子変化についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法を使用しての検討を行った。
１．サンプルの調製
実験例８−１では、５０μＬの健常人血清検体を用意し、そこに５０μｇ／ｍＬ濃度のＡβ１−４２合成ペプチド（ペプチド研究所社製）を５００μＬ混合し、良く攪拌した後、２５℃で９０時間保温し、得られたサンプルを下記方法にて精製、脱塩濃縮を行い、精製脱塩サンプル（３０μＬ）を調製した。
実験例８−２では、５０μＬの健常人血清検体に５０μｇ／ｍＬ濃度のＡβ１−４２合成ペプチド（ペプチド研究所社製）を５００μＬ混合し、良く攪拌し、得られたサンプルを直ちに下記方法にて精製、脱塩濃縮を行い、精製脱塩サンプル（３０μＬ）を調製した。
実験例８−３では、血清中での生体内Ａβがどの程度の分子量となっているかを確認する為に、１ｍＬの健常人pool血清を用意し、この血清を下記方法にて精製、脱塩濃縮を行い、精製脱塩サンプル（３０μＬ）を調製した。【００９０】
サンプルの精製・脱塩濃縮方法は次の通りである。サンプルをＡβ１−４２のＣ末端を認識する２１Ｆ１２抗体（イノジェネティクス社製）をセファロースゲル（CNBr-activated sepharose4B：ファルマシアバイオサイエンス社製）に結合させたアフィニティーゲルにより精製した。精製は０．２ｍＬの２１Ｆ１２抗体アフィニティーゲルをUltrafree-MC（ミリポア社製）に充填して使用し、Ａβ１−４２合成ペプチドを添加したサンプルをアプライした。その後、１０ｍＭリン酸ナトリウム／０．１５Ｍ  ＮａＣＬ（ｐＨ７．８）をカラムに流し、カラムから出てくる排出液のＡ２８０ｎｍの吸光度が０．０００になるまで洗浄を行った。その後、０．１Ｍクエン酸（ｐＨ５．０）をカラムに流し、カラムから出てくる排出液のＡ２８０ｎｍの吸光度が０．０００になるまで洗浄をおこなった。２１Ｆ１２カラムに結合したＡβの溶出は０．６ｍＬの４Ｍグアニジンにて行い、溶出液はZip-Tip C18（ミリポア社製）にて脱塩と濃縮を行い３０μＬの精製サンプルが得られた。【００９１】
２．競合的免疫測定法による測定
脱塩濃縮後のサンプルは実施例３に記載した競合的免疫測定法で測定した。測定は精製サンプル２μＬを反応用溶液で１０倍希釈し、この希釈液２０μＬを検体として測定を行った。各精製脱塩サンプルの測定結果を表８に示す。また、標準品Ａβ１−４２合成ペプチドの測定結果を表７に示し、検量線（ｙ＝−３５４５．７Ｌｎ（ｘ）＋３０５０７  Ｒ2＝０．９８５６）を図１２に示す。
測定の結果、実験例８−１では４５２ｎｇ／ｍＬの定量値が得られた。あらかじめ１０倍希釈していることから精製サンプル中Ａβｘ−４２濃度は４５２０ｎｇ／ｍＬであり、精製サンプルが３０μＬであったのでサンプルに含まれるＡβｘ−４２の量は１３６ｎｇと算出された。【００９２】
【表７】
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【００９３】
【表８】
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実験例８−１：血清へＡβ１−４２合成ペプチドを添加し９０時間経過後に精製したサンプル
実験例８−２：血清へＡβ１−４２合成ペプチドを添加後、直ちに精製したサンプル
実験例８−３：１ｍＬの血清を精製したサンプル【００９４】
３．電気泳動法
次に、精製脱塩サンプルについて電気泳動を行い、出現バンドの確認を行った。電気泳動用ゲルには４−１２％グラジエントのNu-PAGE Bis-Trisゲル（インビトロジェン社製）を用い、分子量マーカーはMark12（インビトロジェン社製）を用いた。精製脱塩サンプルは競合的免疫測定法にて得られた定量値より、いずれのサンプルもゲルにアプライする量が５０ｎｇになるようにサンプル希釈バッファーであるLDS sample buffer（インビトロジェン社製）と混合しゲルにアプライした。同時にＡβ１−４２合成ペプチド（ペプチド研究所社製）及びＡβ３４−４２合成ペプチド（SIGMA社製）についても任意の量をLDS sample bufferと混合してゲルにアプライし、分子量マーカーは５μＬをゲルにアプライした。泳動は１５ｍＡにて行い、LDS sample bufferに含まれる青色色素がゲル下端に達するまで泳動を続けた。泳動後のゲルは銀染色IIキットワコー（和光純薬社製）を用い銀染色法によるタンパク質バンド染色を行った。染色した電気泳動のゲル写真を図１３に示す。【００９５】
電気泳動の結果、Ａβ１−４２合成ペプチドは分子量マーカーの結果より、分子量４．５ＫＤａ付近にバンドが得られた。一方、分子量０．８５８１ＫＤａであるＡβ３４−４２合成ペプチドに関しては、バンドは見られなかった。分子量マーカーの泳動結果より、分子量３．５ＫＤａまでは検出できているが更に小分子量のＡβ３４−４２はゲル下端まで流れ切ってしまった為、ゲル上にバンドとして検出されなかったものと考えられた。
血清へＡβ１−４２を添加後、すぐに２１Ｆ１２抗体アフィニティーカラムにて精製したサンプル（実験例８−２）については、Ａβ１−４２合成ペプチドと同じ移動位置にバンドが検出された。尚且つ４．５ＫＤａ付近以外の分子量領域にはバンドが一切検出されなかったことから、２１Ｆ１２抗体アフィニティーカラムを使用した本精製法により、添加したＡβ１−４２は血清中から単一にまで精製可能であることが確認できた。【００９６】
一方、添加して９０時間保温後に２１Ｆ１２抗体アフィニティーカラムにて精製したサンプル（実験例８−１）及び１ｍＬ血清を精製して得られたサンプル（実験例８−３）に関しては４．５ＫＤａ付近にバンドは現れず、それ以外の分子量領域にもバンドは検出できなかった。いずれのサンプルも競合的測定方法で測定した測定値より、５０ｎｇをゲルにアプライしていることから、Ａβ１−４２合成ペプチドを血清に添加後、血清中の合成ペプチドは時間経過と共に断片化して低分子化してしまったと考えられ、Ａβ３４−４２合成ペプチドでバンドが現れなかったことと同様の理由でゲル上のバンドとして検出できなくなったと考えられた。【００９７】
（実験例９）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出不可能な３．５ＫＤａ以下の分子量領域におけるＡβｘ−４２断片の有無を確認する方法として、低分子ペプチド分離ゲルろ過カラムを使用した方法を検討した。
ゲルろ過カラムであるバイオゲルP-4ゲル（バイオラット社製）をφ１．０、高さ１２０ｃｍのガラスカラム管（バイオラット社製）にゲル容積８４ｍＬ充填した。8M Urea/50mM Tris（pH7.5）を移動相としてＨＰＬＣポンプCCPM（東洋ソーダ社製）にて流速０．１ｍＬ／分で送液した。カラムからの溶出液はSPD-6AV分光器（島津製作所社製）にてＡ２２５ｎｍの吸収を測定し、測定データはC-R3Aクロマトパック（島津製作所社製）にてチャートを作成した。なおSPD-6AV分光器はレンジ０．００５、レスポンスはSTDモードに設定した。C-R3Aクロマトパックはピーク検出感度（SLOPE）を１９３．６８、最小ピーク面積設定値を１０、チャートスピードは１ｍｍ／分に設定した。【００９８】
このゲルろ過カラム装置にジメチルスルホキシド（以後ＤＭＳＯと記す。シグマ社製）に溶解させたペプシンＡ（分子量３５ＫＤａ、シグマ社製）、Ａβ１−４２（分子量４．５１４ＫＤａ、ペプチド研究所社製）、Ａβ１−２８（分子量３．２６２５ＫＤａ、BACHEM社製）、Ａβ１２−２８（分子量１．９５５２ＫＤａ、シグマ社製）、Ａβ１−１１（分子量１．３２５３ＫＤａ、BACHEM社製）、Ａβ３４−４２（分子量０．８５８１ＫＤａ、シグマ社製）、Ｓｕｃ−Ｄ−Ａｓｐ−ＭＣＡ（分子量０．３９０３ＫＤａ、ペプチド研究所社製）、Ｅ−６４−ｃ（分子量０．３１４３８ＫＤａ、ペプチド研究所社製）、及びＤＭＳＯ単品（分子量０．０７８１ＫＤａ、シグマ社製）を順次アプライして行き、溶出液のＡ２２５ｎｍの吸収からクロマトパック上でチャート作製した。このチャートを図１４に示す。また、チャートのピーク出現時間と既知分子量より作製したグラフを図１５に示す。【００９９】
図１５に示したグラフの直線性よりペプシンＡ（分子量３５ＫＤａ）及びＡβ１−４２（分子量４．５１４ＫＤａ）に関してはカラムの排除限界値（Voidボリューム）で溶出していると考えられ、本ゲルろ過カラム装置での分画分子量を３．２６２５ＫＤａ（Ａβ１−２８）〜０．０７８１ＫＤａ（ＤＭＳＯ）とし、この分子量範囲内で検量線を作製した。作製した検量線グラフ（ｙ＝−３５４５．７Ｌｎ（ｘ）＋３０５０７，Ｒ2＝０．９８５６）を図１６に示す。
また装置の再現性を検討する為に、再度Ａβ１−２８、Ａβ１−１１、Ｓｕｃ−Ｄ−Ａｓｐ−ＭＣＡをカラムにアプライし、１度目と２度目の溶出時間の差を確認したところ、良好な再現性を得ることが出来た。チャートを図１７に示す。また再現性データを表９に示す。【０１００】
【表９】
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表９中、相対比は一回目の測定値を１００としたときの二回目の測定値を％で表記した。【０１０１】
（実験例１０）
血清中での生体内Ａβがどの程度の分子量となっているかを確認する為に、１ｍＬの健常人pool血清を用意し、Ａβ１−４２のＣ末端を認識する２１Ｆ１２抗体をセファロースゲル（CNBr-activated sepharose4B）に結合させたアフィニティーゲルにより精製した。精製は０．２ｍＬの抗体アフィニティーゲルをUltrafree-MC（ミリポア社製）に充填して使用し、サンプルをアプライした後、素通り画分は−２０℃で保存した。その後、１０ｍＭリン酸ナトリウム／０．１５Ｍ  ＮａＣＬ（ｐＨ７．８）をカラムに流し、カラムから出てくる排出液のＡ２８０ｎｍの吸光度が０．０００になるまで洗浄を行った。その後、０．１Ｍクエン酸（ｐＨ５．０）をカラムに流し、カラムから出てくる排出液のＡ２８０ｎｍの吸光度が０．０００になるまで洗浄をおこなった。２１Ｆ１２カラム結合画分の溶出は０．４ｍＬの８Ｍ  Ｕｒｅａ／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）にて行った。
精製サンプルはＤＭＳＯを５μＬ加えた後、ゲルろ過カラム装置にアプライし、溶出液のＡ２２５ｎｍの吸収からクロマトパック上でチャート作製した。得られたチャートを図１８に示す。【０１０２】
サンプルに添加したＤＭＳＯピーク出現時間は６７８．８分であり、検量線作成時のＤＭＳＯのピーク出現時間である６７６．５６７分と比較して良好な再現性が得られていることを確認した。得られたサンプルのメインピークは５１２．１６７分であった。またメインピークの前側にメインピークと分離不十分なショルダーピークが存在しており、その出現時間はチャートスピードとショルダーピークまでの距離から換算すると約４７０分であった。またそれ以外にも目視上は確認できないものの、クロマトパックのピーク自動検出機構で検出されるごく微小な検出ピークも複数検出された。メインピーク及びショルダーピークの出現時間をあらかじめ作製した図１９の検量線の式に当てはめ溶出物質の分子量を算出したところ、メインピークは分子量０．３５７ＫＤａとなり、ショルダーピークは分子量０．５２６ＫＤａであった。【０１０３】
また、回収したアフィニティーカラムの素通り画分及び精製処理しなかった健常人pool血清（精製したものと同一品）を実施例３に記載した競合的免疫測定法で測定した。測定の結果、アフィニティー精製処理前の血清の測定値は８７５ｎｇ／ｍＬであったが、この血清を２１Ｆ１２カラムに通した後の素通り画分の測定値は２９３ｎｇ／ｍＬであり、カラムに通すことにより約３割程度まで低下していた。よって残りの約７割（５８２ｎｇ）は２１Ｆ１２アフィニティーカラムに結合したと考えられ、ゲルろ過カラム装置のチャートに現れた低分子ピークは競合的免疫測定法での値の低下分である約７割（５８２ｎｇ）が反映していると考えられる。【０１０４】
これらの結果から、メインピークより予測されるＡβｘ−４２断片はそのＣ末端ペプチドＶａｌ−Ｉｌｅ−Ａｌａ（分子量０．３３７４２ＫＤａ）、ショルダーピークより予測されるＡβｘ−４２断片はそのＣ末端ペプチドＧｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｌａ（０．５２９６４ＫＤａ）となる。
また、クロマトパックの自動ピーク検出で、複数の微小ピークが検出されていることから、血清より２１Ｆ１２抗体アフィニティーカラムで精製したサンプル中にはメインピーク、ショルダーピーク以外にも複数のＡβｘ−４２断片が存在している可能性がある。【０１０５】
以上、実験例８のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる検討、実験例９及び１０のゲルろ過カラム装置による検討及び実験例３に記載したプロテアーゼインヒビターを使った代謝確認実験の結果から、Ａβ１−４２は血液中で酵素分解され、断片化しているという考えを強く支持する結果が得られた。この事は血清・血漿等の血液検体でＡβｘ−４２断片を測定する事の有効性を初めて証明した事となり、本発明が開示する競合的測定法のみならず、血清・血漿等の血液検体でＡβ断片を測定するすべての方法において本発明が有効性を持つことを意味するものである。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
Ａβ１−４２のＣ末端部分に特異性を有する抗体を用いる免疫測定法によって、生体試料中のＡβ１−４２及びＡβ１−４２Ｃ末端部を保有するペプチド断片のトータル量（Ａβｘ−４２）を測定することにより、アルツハイマー病の診断に利用しえる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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