(57)【要約】膵β細胞特異的遺伝子のプロモーター領域の支配下にレポーター遺伝子を連結した組換え発現ベクターを導入した生体試料を用いて、膵β細胞量及び／又は膵β細胞機能を解析する方法によれば、リアルタイムに、そして簡便かつ正確に膵β細胞量及び／又は膵β細胞機能を解析することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵β細胞特異的遺伝子のプロモーター領域の支配下にレポーター遺伝子を連結した組換え発現ベクターを導入した生体試料を用いて、膵β細胞量及び／又は膵β細胞機能を解析することを特徴とする解析方法。
【請求項２】
上記解析方法は、上記組換え発現ベクターを生体試料に導入する形質転換工程と、
上記形質転換工程によって得られる、上記組換え発現ベクターを導入した生体試料において発現するレポーター遺伝子の遺伝子産物を検出する検出工程と、
上記検出工程によって得られる検出結果に基づき、膵β細胞量及び／又は膵β細胞機能を解析する解析工程と、を含むことを特徴とする請求項１に記載の解析方法。
【請求項３】
上記レポーター遺伝子は、細胞外分泌型の遺伝子産物をコードする遺伝子である場合、
上記検出工程は、上記形質転換工程によって得られる、上記組換え発現ベクターを導入した生体試料から抽出液を抽出する抽出工程と、
上記抽出工程によって得られる抽出液中に含まれるレポーター遺伝子の遺伝子産物を検出する抽出液検出工程と、を含むことを特徴とする請求項２に記載の解析方法。
【請求項４】
さらに、上記組換え発現ベクターを構築する発現ベクター構築工程を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の解析方法。
【請求項５】
上記組換え発現ベクターは、さらにエンハンサー領域を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の解析方法。
【請求項６】
上記膵β細胞特異的遺伝子とは、ｐｄｘ−１遺伝子、ＮｅｕｒｏＤ１遺伝子、Ｎｋｘ２．２遺伝子、Ｎｋｘ６．１遺伝子、Ｐａｘ４遺伝子、Ｐａｘ６遺伝子、インスリン遺伝子、グルコキナーゼ遺伝子、ＧＬＵＴ２遺伝子、およびアミリン遺伝子からなる群より選択される、少なくとも１つの遺伝子であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の解析方法。
【請求項７】
膵β細胞特異的遺伝子のプロモーター領域の支配下にレポーター遺伝子を連結したことを特徴とする組換え発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の組換え発現ベクターを導入したことを特徴とする形質転換体。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の解析方法を実施するための解析キット。
【請求項１０】
上記解析キットは、以下の（ａ）〜（ｄ）のうち、少なくとも１つの物質を含むことを特徴とする請求項９に記載の解析キット。
（ａ）膵β細胞特異的遺伝子のプロモーター領域の支配下にレポーター遺伝子を連結した組換え発現ベクター。
（ｂ）（ａ）の組換え発現ベクターを導入した形質転換体。
（ｃ）（ａ）の組換え発現ベクターを動物細胞に導入するための試薬類。
（ｄ）（ａ）のレポーター遺伝子の遺伝子産物を検出するための試薬類。
【請求項１１】
抗糖尿病薬の候補物質をスクリーニングするスクリーニング方法であって、
膵β細胞特異的遺伝子のプロモーター領域の支配下に細胞外分泌型の遺伝子産物をコードするレポーター遺伝子を連結した組換え発現ベクターを導入した生体試料に被験物質を投与す投与過程と、
上記投与過程によって被験物質を付与した生体試料において発現するレポーター遺伝子の遺伝子産物を検出する検出過程と、
上記検出過程によって得られる検出結果に基づき、膵β細胞量及び／又は膵β細胞機能を解析する解析過程と、
上記解析過程によって得られた解析結果について、膵β細胞量及び／又は膵β細胞機能が改善していることを指標として、上記被検物質が抗糖尿病薬の候補物質であると判定する判定過程と、を含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１２】
被験物質の投与により糖尿病が治癒または改善されたか否かを判定する判定方法であって、
膵β細胞特異的遺伝子のプロモーター領域の支配下に細胞外分泌型の遺伝子産物をコードするレポーター遺伝子を連結した組換え発現ベクターを導入した生体試料に被験物質を投与する投与過程と、
上記投与過程によって被験物質を付与した生体試料において発現するレポーター遺伝子の遺伝子産物を検出する検出過程と、
上記検出過程によって得られる検出結果に基づき、膵β細胞量及び／又は膵β細胞機能を解析する解析過程と、
上記解析過程によって得られた解析結果について、膵β細胞量及び／又は膵β細胞機能が改善していることを指標として、上記被検物質の投与により糖尿病が治癒または改善されたと判定する判定過程と、を含むことを特徴とする判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、膵β細胞量及び／又は膵β細胞機能の解析方法およびその利用に関するものであり、特に、膵β細胞の細胞量や機能をリアルタイムにモニタリングすることができる膵β細胞量及び／又は膵β細胞機能の解析方法およびその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  糖尿病は、膵のインスリン産生細胞（β細胞）のインスリン分泌不全ないしインスリンの標的細胞での作用不全の結果生じる糖、タンパク質、脂質の代謝異常である。本疾患は、複数の遺伝子異常に起因するものであるが、感染、肥満、運動不足などの環境因子が加わって発症し、共通して多飲、多尿、体重減少などの特徴ある症状を呈するに至る。【０００３】  本疾患のわが国での患者総数は年々増加の傾向にあり、１９９０年代では数百万人を数え、４０歳以上の成人の５〜１０％を占めるに至っている。このような糖尿病の病型は、臨床上、インスリン依存性糖尿病（１型糖尿病、ＩＤＤＭ）、インスリン非依存性糖尿病（２型糖尿病、ＮＩＤＤＭ）、およびその他に大別される。【０００４】  インスリン依存性の１型糖尿病とは、インスリン注射を欠くと直ちに生命に危険がおよぶことを意味し、ウイルス感染、ストレスそのほかの原因により誘発される抗原に対する自己抗体が膵β細胞を破壊し、インスリン産生が著しく低下して発症する疾患である。この１型糖尿病の発症は、２５歳以下の若年者に多く、わが国でのこの病型の頻度は全患者の３％以下である。【０００５】  また、インスリン非依存性の２型糖尿病とは、特殊型を除き、インスリン依存性以外を網羅する。原因は単一でないが、遺伝に基づく膵のインスリン分泌不足とインスリンの作用不足の結果、肝よりの糖放出の抑制低下と筋肉、脂肪組織での糖取込みの低下および脂肪酸、グリセロール、アミノ酸、糖中間代謝物の産生増加とこれによる肝の糖新生と脂肪、ケトン体の産生増加を招く。このため、高血糖〔症〕、ケトーシス（ケトン血症）、高脂血症を惹起する。【０００６】  高血糖は腎の再吸収能を超えると尿糖排出、浸透圧性利尿、脱水を伴う。このため、高血糖が長期に持続すると、血管壁の変性や血管腔の狭窄を呈し、細胞内でソルビトール代謝を促進し、網膜症、腎症、末梢神経障害、心筋梗塞、脳梗塞などの血管合併症を生じることになる。【０００７】  すなわち、１型糖尿病では、膵β細胞の広範な細胞死による、膵β細胞の絶対的な機能低下が直接の発症成因となり、また２型糖尿病では、先天的あるいは後天的な膵β細胞数の減少が糖尿病の発症・進展に関わる。【０００８】  このように糖尿病とインスリンとは密接な関係を有するものであって、このインスリンを生体内において産生・分泌する唯一の器官が膵β細胞である。このため、糖尿病治療を目的として、膵β細胞の数を回復（増加）させたり、機能を高めたりする膵β細胞再生治療の開発が待たれている。そして現在、この膵β細胞再生治療の開発の前段階として、膵β細胞の機能解析、遺伝子の発現制御機構、酸化ストレスと糖尿病との関連性等の研究が数多く行われ、その成果が報告されている（例えば、非特許文献１、２参照）。なかでも、膵臓特異的遺伝子の発現を活性化し、膵臓の発生・分化に関与する因子として複数の転写因子が報告されている（例えば、非特許文献３参照）。
【非特許文献１】  Ｈｉｄｅａｋｉ  Ｋａｎｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ  ｉｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ．−Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  β−Ｃｅｌｌｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ−”，ＤＩＡＢＥＴＥＳ，ＶＯＬ．４８，ｐ２３９８−ｐ２４０６，ＤＥＣＥＭＢＥＲ  １９９９
【非特許文献２】  梶本佳孝著、「膵β細胞特異的遺伝子の発現制御機構の解析」、糖尿病４３（３）：１７９〜１８１、２０００年
【非特許文献３】  梶本佳孝、山崎義光、堀正二共著、「膵臓の形態形成遺伝子とその異常」、Ｇ．Ｉ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｖｏｌ．９  ｎｏ．３，ｐ５７（２４１）〜ｐ６４（２４８），２００１
上述したように、糖尿病の治療を目的に、膵β細胞の細胞数（または細胞量）を増加させたり膵β細胞の機能を回復させたりする治療法または治療薬等の開発が望まれているが、これら治療法等の開発・評価に必須の技術である、膵β細胞量が増加したか否か、または機能が回復したか否かをリアルタイムに解析する技術は未だ開発されていない。【０００９】  つまり、これまでも糖尿病の診断や評価の手法として、死体から膵臓を取り出し、膵β細胞の細胞数（細胞量）の増減を観察することは行われていたが、生存している生物において、リアルタイムに膵β細胞の細胞数（または細胞量）の増減や膵β細胞の機能等を解析する技術は開発されていなかった。【００１０】  したがって、糖尿病の治療方法や治療薬等の開発のために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏにて膵β細胞の細胞数（または細胞量）の増減や膵β細胞の機能等を、リアルタイムに、そして簡便かつ正確に解析する方法の開発が強く求められていた。【００１１】  本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏあるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏにて膵β細胞の細胞数、細胞量の増減、または膵β細胞の機能等をリアルタイムに解析する方法、およびその利用を提供することにある。
【発明の開示】
【００１２】  本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、膵臓特異的遺伝子の発現を活性化する転写因子ｐｄｘ−１のプロモーターの支配下に、レポーター遺伝子（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ）として分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ；ｈｕｍａｎ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）を連結したプラスミドコンストラクトを調製し、これを導入した形質転換細胞またはトランスジェニック動物を作製したところ、ＳＥＡＰ活性を指標としてｐｄｘ−１の発現量をリアルタイムに解析することができることを見出した。そして、膵β細胞の細胞量が増加に伴いｐｄｘ−１の発現量も増加するという公知事実等と本現象とに基づき、膵β細胞の細胞量または細胞機能をリアルタイムに評価・解析できるという本発明を完成させるに至った。
【００１３】  すなわち、本発明は産業上有用な方法または物質として、下記１）〜１２）の発明を含むものである。
【００１４】  １）膵β細胞特異的遺伝子のプロモーター領域の支配下にレポーター遺伝子を連結した組換え発現ベクターを導入した生体試料を用いて、膵β細胞量及び／又は膵β細胞機能を解析する解析方法。
【００１５】  ２）上記解析方法は、上記組換え発現ベクターを生体試料に導入する形質転換工程と、上記形質転換工程によって得られる、上記組換え発現ベクターを導入した生体試料において発現するレポーター遺伝子の遺伝子産物を検出する検出工程と、上記検出工程によって得られる検出結果に基づき、膵β細胞量及び／又は膵β細胞機能を解析する解析工程と、を含む１）に記載の解析方法。
【００１６】  ３）上記レポーター遺伝子は、細胞外分泌型の遺伝子産物をコードする遺伝子である場合、上記検出工程は、上記形質転換工程によって得られる、上記組換え発現ベクターを導入した生体試料から抽出液を抽出する抽出工程と、上記抽出工程によって得られる抽出液中に含まれるレポーター遺伝子の遺伝子産物を検出する抽出液検出工程と、を含む２）に記載の解析方法。
【００１７】  ４）さらに、上記組換え発現ベクターを構築する発現ベクター構築工程を含むことを特徴とする１）〜３）のいずれかに記載の解析方法。
【００１８】  ５）上記組換え発現ベクターは、さらにエンハンサー領域を有する１）〜４）のいずれかに記載の解析方法。
【００１９】  ６）上記膵β細胞特異的遺伝子とは、ｐｄｘ−１遺伝子、ＮｅｕｒｏＤ１遺伝子、Ｎｋｘ２．２遺伝子、Ｎｋｘ６．１遺伝子、Ｐａｘ４遺伝子、Ｐａｘ６遺伝子、インスリン遺伝子、グルコキナーゼ遺伝子、ＧＬＵＴ２遺伝子、およびアミリン遺伝子からなる群より選択される、少なくとも１つの遺伝子である１）〜５）のいずれかに記載の解析方法。
【００２０】  ７）膵β細胞特異的遺伝子のプロモーター領域の支配下にレポーター遺伝子を連結した組換え発現ベクター。
【００２１】  ８）上記７）に記載の組換え発現ベクターを導入した形質転換体。
【００２２】  ９）上記１）〜６）のいずれかに記載の解析方法を実施するための解析キット。
【００２３】  １０）上記解析キットは、以下の（ａ）〜（ｄ）のうち、少なくとも１つの物質を含む９）に記載の解析キット：
（ａ）膵β細胞特異的遺伝子のプロモーター領域の支配下にレポーター遺伝子を連結した組換え発現ベクター；
（ｂ）（ａ）の組換え発現ベクターを導入した形質転換体；
（ｃ）（ａ）の組換え発現ベクターを動物細胞に導入するための試薬類；
（ｄ）（ａ）のレポーター遺伝子の遺伝子産物を検出するための試薬類。
【００２４】  １１）抗糖尿病薬の候補物質をスクリーニングするスクリーニング方法であって、膵β細胞特異的遺伝子のプロモーター領域の支配下に細胞外分泌型の遺伝子産物をコードするレポーター遺伝子を連結した組換え発現ベクターを導入した生体試料に被験物質を投与す投与過程と、上記投与過程によって被験物質を付与した生体試料において発現するレポーター遺伝子の遺伝子産物を検出する検出過程と、上記検出過程によって得られる検出結果に基づき、膵β細胞量及び／又は膵β細胞機能を解析する解析過程と、上記解析過程によって得られた解析結果について、膵β細胞量及び／又は膵β細胞機能が改善していることを指標として、上記被検物質が抗糖尿病薬の候補物質であると判定する判定過程と、を含むスクリーニング方法。
【００２５】  １２）被験物質の投与により糖尿病が治癒または改善されたか否かを判定する判定方法であって、膵β細胞特異的遺伝子のプロモーター領域の支配下に細胞外分泌型の遺伝子産物をコードするレポーター遺伝子を連結した組換え発現ベクターを導入した生体試料に被験物質を投与する投与過程と、上記投与過程によって被験物質を付与した生体試料において発現するレポーター遺伝子の遺伝子産物を検出する検出過程と、上記検出過程によって得られる検出結果に基づき、膵β細胞量及び／又は膵β細胞機能を解析する解析過程と、上記解析過程によって得られた解析結果について、膵β細胞量及び／又は膵β細胞機能が改善していることを指標として、上記被検物質の投与により糖尿病が治癒または改善されたと判定する判定過程と、を含む判定方法。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の実施例において用いたプラスミドコンストラクトの要部の構成を模式的に示す図である。
【図２】本発明の実施例において用いたｐｄｘ−１遺伝子のプロモーター領域の構成を模式的に示す図である。
【図３（ａ）】本発明の実施例において用いたプラスミドベクター：ｐＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−１ａの構成を模式的に示す図である。
【図３（ｂ）】本発明の実施例において用いたプラスミドベクター：ｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃの構成を模式的に示す図である。
【図４】本発明の実施例においてＳＥＡＰ活性を測定した結果を示す図である。
【図５】本発明の実施例において内因性ＡＬＰがＳＥＡＰ活性の測定に及ぼす影響を調べた結果を示す図である。
【図６】本発明の実施例においてトランスジェニックマウス（１３Ｌｉｎｅとネガティブコントロール）におけるＳＥＡＰ活性の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】  本発明は、糖尿病の発症・進展に関与する膵β細胞の細胞量及び／又は膵β細胞の機能について、膵β細胞特異的遺伝子のプロモーター領域下流に配置したレポーター遺伝子の遺伝子産物を検出することにより、リアルタイムに、そして簡便かつ正確に解析する方法およびその利用を提供するものである。このため、以下の説明では、まず本発明に係る解析方法について説明し、続いてその利用として、解析キット、およびスクリーニング方法について順に説明する。なお、本発明に係る組換え発現ベクター、形質転換体については、解析方法と密接に関連するため、解析方法と共に説明する。【００２８】  〔１〕解析方法
本発明に係る解析方法は、膵β細胞特異的遺伝子のプロモーター領域の支配下にレポーター遺伝子を連結した組換え発現ベクターを導入した生体試料を用いて、膵β細胞量及び／又は膵β細胞機能を解析する方法であればよく、その他の具体的な工程、材料、条件等は特に限定されるものではない。【００２９】  ここでいう「膵β細胞特異的遺伝子」とは、膵臓の実質内に散在する内分泌腺であるランゲルハンス島（ラ島、膵島）の約７０％を占めるβ細胞（Ｂ細胞）において、特異的に発現する遺伝子であることが好ましいが、膵β細胞でのみ発現する遺伝子でなくとも、その遺伝子発現と膵β細胞の細胞量あるいは膵β細胞の機能とが密接に関連しており、該遺伝子の発現状態をモニター（検出・評価）することにより、膵β細胞の細胞量あるいは機能を解析することができる特徴的な遺伝子であればよい。具体的には、例えば、各種哺乳動物におけるｐｄｘ−１（ＩＰＦ１、ＳＴＦ−１、ＩＤＸ−１、またはＸＩＨｂｏｘ８と称される場合もある）遺伝子（Ｏｈｌｓｓｏｎ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ，ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：４２５１−４２５９，１９９３）、ＮｅｕｒｏＤ１遺伝子、Ｎｋｘ２．２遺伝子、Ｎｋｘ６．１遺伝子、Ｐａｘ４遺伝子、Ｐａｘ６遺伝子等の転写因子や、インスリン遺伝子、グルコキナーゼ遺伝子、ＧＬＵＴ２遺伝子、アミリン遺伝子、などを挙げることができる。【００３０】  これら膵β細胞特異的遺伝子のなかでも、ｐｄｘ−１遺伝子が好ましい。このｐｄｘ−１遺伝子は、インスリン遺伝子、グルコキナーゼ遺伝子、ＧＬＵＴ２遺伝子、アミリン遺伝子の４つの膵β細胞特異的（あるいは特徴的）遺伝子とソマトスタチン遺伝子やＨＢ−ＥＧＦ遺伝子の各転写に共通して関わることが示されており、非常に重要な転写因子である。また、膵の初期発生にも関与することが知られており、ｐｄｘ−１遺伝子ノックアウトマウス（ホモ欠損）では膵が欠失し、出生後早期に糖尿病により死亡することが報告されている（Ｊｏｎｓｓｏｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７１：６０６−６０９，１９９４）。【００３１】  また「プロモーター領域」とは、いわゆる転写プロモーター（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）のことをいい、遺伝子の転写開始を調節するＤＮＡ上の領域をいう。本発明に用いられる「膵β細胞特異的遺伝子のプロモーター領域」としては、上述の遺伝子のプロモーター領域であればよく、その具体的な塩基配列などは限定されるものではないが、例えば、後述する実施例に示すように、ｍｏｕｓｅ  ＰＤＸ−１  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ａｃｃ．Ｎｏ．：ＮＴ＿０３９３２４  ＲＥＧＩＯＮ：１４０８９７２…１４１８１４１）などを用いることができるであろう。【００３２】  また「プロモーター領域の支配下にレポーター遺伝子を連結した組換え発現ベクター」とは、上記プロモーターが、レポーター遺伝子を発現しうるように連結され、ベクター内に導入されていればよく、組換え発現ベクターとしての具体的な構造は特に限定されるものではない。なお、組換え発現ベクターの構築については後述する。【００３３】  ここでいう「レポーター遺伝子」とは、遺伝子発現の指標となる遺伝子のことであり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかの状態において、その遺伝子発現を簡便に検出することができる遺伝子のことである。このようなレポーター遺伝子としては、例えば、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子等が挙げられる。なお、レポーター遺伝子としては、バックグラウンドがないこと、遺伝子発現を定量的に検出できる高感度の検出方法が確立していること、形質転換細胞への影響が少ないこと、等の諸性質を有することが好ましい。具体的には、例えば、トランスポゾンＴｎ９由来のクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ；ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）、大腸菌由来のβ−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ；β−Ｄ−ｇｌｕｃｒｏｎｉｄａｓｅ）、ホタルや海洋性発光細菌Ｖｉｂｒｉｏ細菌由来のルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、クラゲ由来のイクオリン、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ；ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）などが挙げられる。なお、後述する実施例では、ヒト由来の細胞外分泌型のＡＬＰ（ＳＥＡＰ）を使用している。【００３４】  また「組換え発現ベクターを導入した生体試料」とは、上記組換え発現ベクターを導入した形質転換体のことをいい、「生体試料」とは細胞、組織、器官、動物個体等が含まれる意である。なお、後述する実施例に示すように、本発明に係る方法は、トランスジェニック動物においても実施可能であることが示されている。したがって、かかる形質転換体には、形質転換細胞以外にも、トランスジェニック動物が含まれる。ここでいう動物とはヒト以外の哺乳動物（非ヒト哺乳動物）およびその他の脊椎動物をいい、特に実験動物として好適なマウス、ラット、モルモット、イヌ、ウサギ、サル、チンパンジー等が好ましい。【００３５】  例えば、形質転換した細胞、組織、器官を用いることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏにて本発明に係る解析方法を実施することができるであろうし、形質転換した実験動物（トランスジェニック動物）を用いることにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにて本発明に係る解析方法を実施することができる。なかでも、形質転換した実験動物を用いる解析方法の場合、生体において、リアルタイムに膵β細胞量及び／又は膵β細胞の機能を解析することができ、非常に有用であるといえる。【００３６】  さらに「膵β細胞量」とは膵島におけるβ細胞の量（または細胞の数）のことであり、「膵β細胞機能」とは膵β細胞のホルモン分泌機能等のことであり、例えば、最も重要な代謝ホルモンであるインスリンの産生・分泌機能を挙げることができる。【００３７】  上述したように、本発明に係る解析方法では、膵β細胞において特異的に発現する遺伝子のプロモーター下流にレポーター遺伝子を連結しているため、レポーター遺伝子の発現量をモニターすることにより、該膵β細胞特異的遺伝子の発現量をモニターすることができる。ここで、膵島細胞量（膵β細胞量）が増加する場合、膵β細胞特異的遺伝子（例えば、ｐｄｘ−１遺伝子）の発現量が増加す���という事実が知られている。また、糖尿病状態（膵β細胞糖毒性）において膵のインスリン産生能が低下した場合には、膵β細胞特異的遺伝子（例えば、ｐｄｘ−１遺伝子）の発現量が低下することが報告されている。なお、上記２つの公知事実は、以下の文献（ｉ）〜（ｖ）に記載されている（（ｉ）Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  β−Ｃｅｌｌ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ＤＩＡＢＥＴＥＳ，ＶＯＬ  ４８，Ｐ２３９８−２４０６，１９９９、（ｉｉ）Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｎ  β−Ｃｅｌｌｓ：Ｔｙｐｅ  ２  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，Ｇｏｏｄ  Ｒａｄｉｃａｌｓ  Ｇｏｎｅ  Ｂａｄ，ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ  ＤＩＡＢＥＴＥＳ，ＶＯＬ  ５２，Ｐ５８１−５８７，２００３、（ｉｉｉ）Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ＨＩＴ−Ｔ１５  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｚｕｃｋｅｒ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｒａｔｓ  ｂｙ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  Ｖｏｌ．９６，Ｐ１０８５７−１０８６２  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９９、（ｉｖ）Ｂｅｔａ−ｃｅｌｌ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｅｓ．ＤＩＡＢＥＴＥＳ，ＶＯＬ  ５０，Ｐ５８１−５８７，２００１、（ｖ）Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｓｐｅｃｉｅｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ＨＩＴ  Ｃｅｌｌｓ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｖｏｌｕｍｅ  ９９，Ｎｕｍｂｅｒ  １、Ｐ１４４−１５０  １９９７）。【００３８】  したがって、本解析方法によれば、膵β特異的遺伝子の発現量を、レポーター遺伝子を通じて評価することにより、リアルタイムに、これら膵β細胞の量（または細胞数）の増減や、膵β細胞のインスリン産生能の状態（インスリン産生能が高いか低いか）などを解析・評価することができる。つまり、「膵β細胞量及び／又は膵β細胞機能を解析する」ことができる。【００３９】  本発明に係る解析方法の具体的な工程として、例えば、形質転換工程、検出工程（抽出工程、抽出液検出工程）、解析工程を挙げることができる。かかる工程を含む解析方法によって、リアルタイムに、そして簡便かつ正確に膵β細胞の細胞量や機能を解析することができる。なお、本解析方法は、組換え発現ベクターを構築する発現ベクター構築工程を含んでいてもよい。以下、各工程について説明する。【００４０】  〔１−１〕発現ベクター構築工程
本発明において行われる発現ベクター構築工程は、上述した「膵β細胞特異的遺伝子のプロモーター領域」の支配下に、上述した「レポーター遺伝子」を連結した組換え発現ベクターを構築する工程であれば特に限定されるものではない。つまり、上記プロモーターによって上記レポーター遺伝子が発現するように組換え発現ベクターを構築する工程であればよい。このため、導入する宿主細胞、組織、器官、動物個体等に応じて、その配列の順序やベクターの材料等を好適に選択することができる。【００４１】  上記組換え発現ベクターの母体となるベクターとしては、従来公知の種々のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ、またはコスミド等を用いることができ、導入する宿主細胞（動物細胞）や導入方法に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐＢＩ系のベクター等を挙げることができる。【００４２】  上記組換え発現ベクターは、上記プロモーターおよび上記レポーター遺伝子に加えて、さらに他のＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。当該他のＤＮＡセグメントは特に限定されるものではないが、ターミネーター、選別マーカー、エンハンサー、翻訳効率を高めるための塩基配列等を挙げることができる。【００４３】  ターミネーターは転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよい。上記組換え発現ベクターにおいては、ターミネーターを適当な位置に配置することにより、動物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成したり、強力なプロモーターがプラスミドのコピー数を減少させたりするような現象の発生を防止することができる。【００４４】  上記選別マーカーとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。かかる薬剤耐性遺伝子の具体的な一例としては、例えば、アンピシリン、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。これにより、上記抗生物質を含む培地中で生育する形質転換体を選択することによって、上記組換え発現ベクターが導入された形質転換体を容易に選別することができる。また、後述する実施例に示すように、上記レポーター遺伝子の下流にＧＦＰ等のレポーター遺伝子をさらに連結することも可能である。【００４５】  また、エンハンサーは、一本のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）鎖上の、すなわちｃｉｓの位置にある、近傍の遺伝子の転写開始を促進するＤＮＡ上の塩基配列部分であればよい。例えば、サル由来のウイルスｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ  ４０（ＳＶ  ４０）の複製開始点の近くに存在する７２塩基の反復配列をエンハンサーとして利用することができる。なお、これ以外にも、従来公知のエンハンサー配列を用いることができる。このようなエンハンサーを用いると、プロモーター領域のみではレポーター遺伝子の発現が弱い場合でも転写活性を高めることができる。このため、確実にレポーター遺伝子の遺伝子産物を検出することができるようになる。このように、上記組換え発現ベクターには、その目的や導入する細胞等の種類に応じて、さまざまなＤＮＡセグメントを含ませることができる。【００４６】  上記組換え発現ベクターの構築方法についても特に限定されるものではなく、適宜選択された母体となるベクターに、上記プロモーター、レポーター遺伝子、および必要に応じて上記他のＤＮＡセグメントを所定の順序となるように導入すればよい。例えば、上記レポーター遺伝子とプロモーターと（必要に応じてエンハンサー、ターミネーター等）とを連結して発現カセットを構築し、これをベクターに導入すればよい。【００４７】  発現カセットの構築では、例えば、各ＤＮＡセグメントの切断部位を互いに相補的な突出末端としておき、ライゲーション酵素で反応させることで、当該ＤＮＡセグメントの順序を規定することが可能となる。なお、発現カセットにターミネーターが含まれる場合には、上流から、上記プロモーター、上記レポーター遺伝子、ターミネーターの順となっていればよい。さらに、発現カセットにエンハンサーが含まれる場合には、上流から、上記プロモーター、エンハンサー、上記レポーター遺伝子の順となっていればよい。また、組換え発現ベクターを構築するための試薬類、すなわち制限酵素やライゲーション酵素等の種類についても特に限定されるものではなく、市販のものを適宜選択して用いればよい。【００４８】  また、上記組換え発現ベクターの増幅（増殖）方法（生産方法）も特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。一般的には大腸菌をホストとして当該大腸菌内で増殖させればよい。このとき、ベクターの種類に応じて、好ましい大腸菌の種類を選択してもよい。【００４９】  〔１−２〕形質転換工程
本発明において行われる形質転換工程は、上記〔１−１〕欄で説明した組換え発現ベクターを生体試料に導入して形質転換体を得て、該形質転換体において上記レポーター遺伝子を発現させる工程であればよい。【００５０】  上記組換え発現ベクターを宿主細胞に導入する方法（形質転換方法）は特に限定されるものではなく、宿主の動物細胞に応じた適切な従来公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、塩化カルシウムで処理し、人為的にコンピテントセルを作製する方法や直接動物細胞に導入する方法を用いることができる。組換え発現ベクターを直接細胞に導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法等を用いることができる。【００５１】  上記組換え発現ベクターが導入される宿主細胞としては、例えば、哺乳動物の胚性幹細胞や体性幹細胞、体細胞（骨髄、肝、腸管の細胞など）などを好適に用いることができるが、特に、膵臓のβ細胞や膵臓における未分化細胞が好適である。これは、上述したように、導入する組換え発現ベクター上のプロモーターが、膵β細胞に特異的な遺伝子のプロモーターであって、この発現を指標として膵β細胞の細胞量及び／又は機能を解析することが本願発明の目的だからである。【００５２】  ここで、本発明に係る解析方法においては、上記組換え発現ベクターは、解析しようとする動物の種類に合わせて適切なものを適宜構築してもよいが、汎用的な組換え発現ベクターを予め構築しておき、それを動物細胞に導入してもよい。すなわち、本発明に係る解析方法においては、上記〔１−１〕欄で説明した組換え発現ベクター構築工程が含まれていてもよいし、含まれていなくてもよい。【００５３】  また、上記形質転換工程によって得られた形質転換体が市販されていたり、または別の場所で作製された形質転換体を用いたりして、以下の検出工程以降の工程を行い、本解析方法を実施することもできる。この場合、形質転換工程と検出工程以降の工程とが連続していないようにも見受けられるが、巨視的に捉えると、各工程は一連の流れに沿って行われていると考えられる。したがって、このように本解析方法の各工程が時間・場所を異にして行われる場合であっても、本願発明の技術的範囲に属することに留意すべきである。【００５４】  〔１−３〕検出工程
本発明において行われる検出工程は、上記〔１−２〕欄で説明した形質転換体において発現するレポーター遺伝子の遺伝子産物を検出する工程であればよい。かかる遺伝子産物としては、例えば、ｍＲＮＡ、タンパク質などが挙げられるが、レポーター遺伝子として発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子を選択している場合は、タンパク質がより好適である。【００５５】  かかるレポーター遺伝子の遺伝子産物を検出するための方法としては、レポーター遺伝子に応じた従来公知の方法を好適に利用可能である。例えば、レポーター遺伝子としてＧＦＰを用いた場合は、その発光強度を測定することにより、レポーター遺伝子の遺伝子産物を定量的に検出可能である。また、後述の実施例に示すように、レポーター遺伝子としてＡＬＰを用いた場合、ＡＬＰ活性を測定することでレポーター遺伝子の遺伝子産物を定量的に検出可能である。この際、例えば、市販のＡＬＰ活性検出キット等を用いることにより、より一層簡便に検出を行うことができるであろう。【００５６】  また、上記遺伝子産物がｍＲＮＡである場合、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行うことも可能である。かかる定量的ＲＴ−ＰＣＲとして、いわゆるリアルタイムＰＣＲを行うことも可能である。リアルタイムＰＣＲとしては、インカレーター法、ＴａｑＭａｎプローブ法、サイクリングプローブ法等の従来公知の手法を用いることができる。定量的ＰＣＲ等を行わない場合、最も一般的には、核酸を含む試料を電気泳動にかけ、サザンブロットやノーザンブロットを行った後、検出可能な標識物質でラベルされたプローブを用いて定量することも可能である。また、多種類の核酸を同時に定量する場合には、これらの手法と共に、又はこれらの手法に代えて、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイを用いてもよい。【００５７】  また、本発明に係る解析方法では、上記レポーター遺伝子として、細胞外分泌型の遺伝子産物をコードする遺伝子を用いることが好ましい。このようなレポーター遺伝子としては、例えば、もともと細胞外分泌のためのシグナルペプチドを有するタンパク質をコードする遺伝子や、該シグナルペプチドとレポーター遺伝子とを融合させたキメラタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。【００５８】  この場合、レポーター遺伝子にコードされるタンパク質（遺伝子産物）は、形質転換された細胞の外に分泌されるため、例えば、形質転換細胞の培養液上清やトランスジェニック動物の血液や尿を回収することにより、細胞や動物に損傷を与えることなく、レポーター遺伝子産物を回収・検出することができる。したがって、上記レポーター遺伝子として、細胞外分泌型の遺伝子産物をコードする遺伝子を用いる場合、本検出工程には、少なくとも以下の抽出工程、抽出液検出工程が含まれることになる。【００５９】  〔１−３−１〕抽出工程
本発明において行われる抽出工程は、上記〔１−２〕欄で説明した形質転換体から抽出液を抽出する工程であればよい。ここで「抽出液を抽出する」とは、生体試料が細胞、組織、器官等である場合、レポーター遺伝子の遺伝子産物が含まれる抽出液、例えば、細胞や組織等の培養液上清を回収することをいう。一方、生体試料が動物個体である場合、レポーター遺伝子の遺伝子産物が含まれる、該動物個体における末梢血液、末梢体液、尿等を回収することをいう。したがって、レポーター遺伝子としては、細胞外分泌型であって、培養液上清や尿等に分泌されるものを適宜選択することが好ましい。【００６０】  このような抽出工程を設けることにより、細胞や組織、そして動物個体を損傷させることなく、リアルタイムにレポーター遺伝子の遺伝子産物を回収することができる。【００６１】  なお、上記抽出液を抽出（回収）する工程の具体的手法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。例えば、細胞培養液上清を回収する場合は、遠心分離や濾過等の方法を用いることができるであろうし、血液を回収する場合は、注射器によって採血すればよい。また、尿を回収する場合は動物の排泄物を回収すればよく、より一層簡易であるといえる。【００６２】  〔１−３−２〕抽出液検出工程
本発明において行われる検出工程は、上記〔１−３−１〕欄で説明した抽出液（培養液上清や尿、血液等）を用いて、該抽出液中に含まれるレポーター遺伝子の遺伝子産物を検出する工程であればよい。【００６３】  なお、抽出液中のレポーター遺伝子の遺伝子産物を検出する工程は、上述の検出工程と同様に行うことができるため、ここではその説明を省略する。【００６４】  〔１−４〕解析工程
本発明において行われる検出工程は、上記〔１−３〕欄で説明した検出工程において得られた検出結果に基づき、膵β細胞量及び／又は膵β細胞機能を解析する工程であればよい。すなわち、上記検出工程においてレポーター遺伝子の遺伝子産物についての定量的な検出を行った後、その定量値に基づき、膵β細胞の細胞量や機能を解析・評価することになる。例えば、本解析工程では、レポーター遺伝子の遺伝子産物の定量値が増加していれば、膵β細胞の細胞量が増加及び／又は膵β細胞の機能が改善（回復）していると判断することができる。一方、レポーター遺伝子の遺伝子産物の定量値が減少していれば、膵β細胞の細胞量が減少及び／又は膵β細胞の機能が悪化していると判断することができる。【００６５】  また、本願明細書において、本解析工程とは、例えば、「検出工程によって得られた検出結果（定量値）を統計学的に解析する解析工程」と換言することができる。なお、この統計学的に解析する工程とは、例えば、ｔ検定やノンパラメトリック検定等の従来公知の検定手法によって行うことができる。【００６６】  〔１−５〕その他の工程、その他の方法
本発明に係る解析方法においては、上記形質転換工程や、さらに上記組換え発現ベクター構築工程が含まれていてもよいが、さらに他の工程が含まれていてもよい。具体的には、形質転換後の生体試料から適切な形質転換体を選抜する選抜工程等を挙げることができる。【００６７】  選抜の方法は特に限定されるものではなく、例えば、アンピシリン耐性等の薬剤耐性を基準として選抜してもよいし、形質転換体を培養・育成した後に、レポーター遺伝子の遺伝子産物を指標として選抜してもよい。【００６８】  なお、本発明の主題は、膵β細胞の細胞量や細胞機能の客観的な解析（評価）方法を提供することに存するのであって、本明細書中に具体的に記載した個々の形質転換操作、抽出操作、検出操作、および解析操作に存するのではない。したがって、上記各操作以外の操作を用いた解析方法も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。【００６９】  〔２〕利用
本発明に係る解析方法は、上述の利点を有するため、種々の利用が本発明には含まれる。以下、本発明に係る解析方法の利用法として、解析キット、スクリーニング方法、および判定方法について順に説明する。【００７０】  〔２−１〕解析キット
本発明に係る解析キットは、上記〔１〕欄で説明した解析方法を実施するためのものであればよく、これに含まれる具体的な構成、材料、機器等は、特に限定されるものではない。具体的には、上記解析方法の各工程を実施するための物が含まれていればよい。【００７１】  例えば、上記形質転換工程を実施するために、（ａ）膵β細胞特異的遺伝子のプロモーター領域の支配下にレポーター遺伝子を連結した組換え発現ベクターが挙げられよう。また、（ｂ）上記（ａ）の組換え発現ベクターを導入した形質転換体が本解析キットに含まれていれば、形質転換工程を行う必要がなく、より簡易であるといえる。さらに、形質転換工程を実施するためには、（ｃ）上記（ａ）の組換え発現ベクターを動物細胞に導入するための試薬類が含まれていることが好ましい。本明細書でいう「試薬類」とは、各種試薬や実験器具、機器等を含む意である。かかる形質転換用の試薬類としては従来公知のものを利用でき、その具体的な構成は限定されるものではないが、例えば、形質転換の種類に応じた酵素やバッファー等を挙げることができる。その他、必要に応じてマイクロ遠心チューブ等の実験用素材を添付してもよいし、コンピテントセル作製用試薬や、ヒートブロック等の機器を含めることもできる。また、検出工程を実施するためには、（ｄ）上記（ａ）のレポーター遺伝子の遺伝子産物を検出するための試薬類が含まれることが好ましい。これのレポーター遺伝子の種類に合わせて各種検出用の試薬や実験器具を好適に組み合わせることができよう。【００７２】  さらに、これら以外にも、例えば、発現ベクター構築工程を実施するための、各種材料や試薬が挙げられる。また、上記抽出工程に使用する採血するための機器として、注射器等が挙げられる。また、検出工程の場合は、上記レポーター遺伝子の遺伝子産物の検出を実施するために必要な物、例えば、各種試薬や実験器具、検出機器等が挙げられる。また、解析工程の場合は、上記解析工程を行うために必要な各種演算装置（例えば、コンピュータ等）が挙げられよう。【００７３】  上記の構成のような解析キットによれば、簡便かつ確実に本発明に係る解析方法を実施することができる。【００７４】  〔２−２〕スクリーニング方法
本発明の解析方法は、実験動物等を用いた薬物スクリーニングにおいて、薬物候補物質の有効性を判定する方法に応用し得る。すなわち、本発明に係るスクリーニング方法は、上記組換え発現ベクターを導入した生体試料に被験物質を投与する投与過程と、この投与過程によって被験物質を付与した生体試料において発現したレポーター遺伝子の遺伝子産物を検出する検出過程と、この検出過程によって得られる検出結果に基づき、膵β細胞量及び／又は膵β細胞機能を解析する解析過程と、この解析過程によって得られた解析結果が、膵β細胞量及び／又は膵β細胞機能を改善していることを指標として、上記被検物質が抗糖尿病薬の候補物質であると判定する判定過程と、を含んでいればよく、その他の具体的な構成や条件などは特に限定されるものではない。すなわち、本スクリーニング方法は、上記本発明に係る解析方法を利用していればよいともいえる。【００７５】  例えば、本スクリーニング方法において、上記レポーター遺伝子の遺伝子産物の定量値が増加していれば、該候補物質は、膵β細胞特異的遺伝子の発現量を増加させる作用を有すると判断することができる。また上述したように、膵島細胞量（膵β細胞量）が増加する場合、膵β細胞特異的遺伝子（例えば、ｐｄｘ−１遺伝子）の発現量が増加するという事実、および糖尿病状態（膵β細胞糖毒性）において膵のインスリン産生能が低下した場合には、膵β細胞特異的遺伝子（例えば、ｐｄｘ−１遺伝子）の発現量が低下する事実が報告されている。このため、膵β細胞特異的遺伝子の発現量を増加させる物質は、膵β細胞量を増加させる物質、及び／又は、膵β細胞機能を改善させる物質であると判定することができる。【００７６】  より詳細には、上記生体試料として形質転換細胞や組織を用いることによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、膵β細胞の細胞量を増加させる物質、または細胞機能を改善させる物質（因子）をスクリーニングすることができる。また、生体試料としてトランスジェニック動物を用いることによって、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、膵β細胞の細胞量を増加させる物質、または細胞機能を改善させる物質（因子）をスクリーニングすることができる。【００７７】  したがって、本発明の解析方法を利用すれば、抗糖尿病薬の候補物質を容易かつ確実にスクリーニングすることができる。なお、ここでいう「抗糖尿病薬の候補物質」は、試験者が所望する任意の物質であり得る。また、「抗糖尿病薬の候補物質」は、膵β細胞量を増加させる物質、及び／又は、膵β細胞機能を改善させる物質であるといえる。【００７８】  〔２−３〕判定方法
本発明の解析方法は、実験動物等に対して被験物質を投与することにより糖尿病が治癒または改善されたか否かを判定する方法に応用し得る。すなわち、本発明に係る判定方法は、上記組換え発現ベクターを導入した生体試料に被験物質を投与する投与過程と、この投与過程によって被験物質を付与した生体試料において発現するレポーター遺伝子の遺伝子産物を検出する検出過程と、この検出過程によって得られる検出結果に基づき、膵β細胞量及び／又は膵β細胞機能を解析する解析過程と、この解析過程によって得られた解析結果について、膵β細胞量及び／又は膵β細胞機能が改善していることを指標として、上記被検物質の投与により糖尿病が治癒または改善されたと判定する判定過程と、を含んでいればよく、その他の具体的な工程、条件等は特に限定されるものではない。すなわち、本判定方法は、上記本発明に係る解析方法を利用していればよいともいえる。【００７９】  例えば、本判定方法において、上記レポーター遺伝子の遺伝子産物の定量値が増加していれば、該候補物質は、膵β細胞特異的遺伝子の発現量を増加させる作用を有すると判断することができる。このため、膵β細胞特異的遺伝子の発現量が増加している場合、その物質の投与によって、膵β細胞量が増加、及び／又は、膵β細胞機能が改善していると判断でき、ひいては糖尿病が治癒または改善されたと判定することができる。【００８０】  より詳細には、上記生体試料として形質転換細胞や組織を用いることによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、糖尿病の治癒または改善を評価することができる。また、生体試料としてトランスジェニック動物を用いることによって、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、糖尿病の治癒または改善を評価することができる。【００８１】  したがって、本発明の解析方法を利用すれば、糖尿病の治癒または改善効果を容易かつ確実に評価（判定）することができる。このため、本発明を用いることにより、血糖値の低減や糖尿病の改善を謳う食品あるいは医薬品の治療（改善）効果を簡便かつ正確に評価することができる。【００８２】  以下実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】  ｐｄｘ−１遺伝子は、膵β細胞特異的遺伝子の発現を活性化し、膵臓の発生に不可欠な分化誘導因子として知られている。また、以下のようにｐｄｘ−１遺伝子のプロモーター活性やｐｄｘ−１遺伝子の発現に影響を与える種々の因子として、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ｉｎｓｕｌｉｎ、ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｕｔｉｄｅ−１（ＧＬＰ１）、ｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ｈｅｐａｒｉｎｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ−ｌｉｋｅ  ｆａｃｔｏｒ（ＨＢ−ＥＧＦ）、ＴＮＦ−αがｐｄｘ−１遺伝子のプロモーター活性を上昇させることが示されている（Ｓｕｓａｎ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２００２，２７７−２８４）。同様にｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、レチノイン酸投与により、ｐｄｘ−１遺伝子の発現量が上昇することが報告されている（Ｓｉｄｈａｒｔｈａ  Ｓｉｎｇｏ  Ｔｕｌａｃｈａｎ，ｅｔ  ａｌ．ＤＩＡＢＥＴＥＳ  ２００３，７６−８４）。また同じくｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＧＬＰ−１により、ｐｄｘ−１タンパク質の発現量が上昇することも報告されている（Ｊ．Ｂｕｔｅａｕ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  １９９９，８５６−８６４）。【００８３】  このように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて様々な物質がｐｄｘ−１遺伝子の発現量を上昇させることについて報告されている一方、今までにｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ｐｄｘ−１遺伝子の発現量を上昇させる物質および現象の報告はされていない。また、ｐｄｘ−１遺伝子の発現の変化を簡便かつリアルタイムに解析する方法は開発されていない。【００８４】  このため、ｐｄｘ−１遺伝子の発現の変化を簡便かつリアルタイムに解析する方法を開発し、最終的には、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｐｄｘ−１遺伝子の発現変化を解析するために、ｐｄｘ−１遺伝子のプロモーターの支配下にレポーター遺伝子を連結したトランスジェニックマウスを作製することとした。具体的には以下のように行った。【００８５】  （１）プラスミドコンストラクトの構築
まず、ｐｄｘ−１遺伝子のプロモーター領域の支配下に分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ；ｈｕｍａｎ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）を連結したプラスミドコンストラクトを作製した。具体的には、Ｃ５７ＢＬ６マウスの脾臓からｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを採取し、ｐｄｘ−１遺伝子のプロモーター領域（ｍｏｕｓｅ  ＰＤＸ−１  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃：ＮＴ＿０３９３２４  ＲＥＧＩＯＮ：１４０８９７２…１４１８１４１）を複製した。なお、複製は、図２に示すように、領域Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶのすべてが含まれるように、ｐｄｘ−１のＯＲＦの上流約−６．５ｋｂまでを複製した。この際使用したプライマーは、以下に示す。なお、複製後、シークエンスを確認した。
・プライマーＰＤＸ１ｐｒｏ＿ｆ＿Ｈｉｎｄ３＿Ｓｐｅ１：
５’−ＡＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＣＴＡＧＴＣＡＧＧＡＴＣＣＡＧＧＴＴＴＡ−３’
・プライマーＰＤＸ１ｐｒｏ＿ｒ＿Ｐｓｔ１：５’−ＧＴＧＴＧＴＧＴＧＡＧＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＡＣＴＧＣＡ−３’
・プライマーＰＤＸ１ｐｒｏ＿ｆ＿Ｍｌｕ１＿Ｐｓｔ１：
５’−ＧＧＡＣＧＡＣＧＣＧＴＧＡＣＴＡＧＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＧＡＣＧＴＧＣＡＣ−３’
・プライマーＰＤＸ１ｐｒｏ＿ｒ＿Ｓｍａ１＿Ｎｏｔ１：
５’−ＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＣＣＣＧＧＧＴＣＧＧＡＧＣＴＡＣＡＡ−３’
次に、図３（ａ）に示すプラスミドベクターｐＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−１ａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）のＣＭＶプロモーター領域を制限酵素ＸｂａＩとＮｏｔＩにて切り出した。そして、その切り出したＸｂａＩ−ＮｏｔＩ間に、上記複製したｐｄｘ−１遺伝子のプロモーター領域を挿入した。【００８６】  次いで、図３（ｂ）に示すプラスミドベクターｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃：Ｕ８９９３７）を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｓｍＩにて処理し、ＳＥＡＰの構造遺伝子を含む断片を切り出した。続いて、このＳＥＡＰ断片を、図３（ａ）に示すプラスミドベクターｐＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−１ａのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）におけるＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ間に挿入した。こうして構築したプラスミドコンストラクトを以下ｐＰＤＸ１ｐｒｏ−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰと称する。【００８７】  （２）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるｐＰＤＸ１ｐｒｏ−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰの機能確認
次に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるｐＰＤＸ１ｐｒｏ−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰの機能確認を行った。すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ｐｄｘ−１遺伝子のプロモーターの支配下に発現した分泌型ＡＬＰの活性（ＳＥＡＰ活性）を測定した。具体的には、まず、このｐＰＤＸ１ｐｒｏ−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰをβ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅとｎｏｎ  β  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅとに導入した形質転換体を作製した。なお、ネガティブコントロールとして、ｐＰＤＸ１ｐｒｏ−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰからプロモーターを欠失させたプラスミドｐ−ｐｒｏｍｏｔｅｒｌｅｓｓ−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを構築し、同じくβ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（Ｍ６）とｎｏｎ  β  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（ＨｅｐＧ２）とに導入し、形質転換体を得た。【００８８】  これらの形質転換体における、７２時間後のアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性をそれぞれ測定した。測定は、Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅａｃｅｎｔ  ＳＥＡＰ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を用いて、添付のプロトコールに従い行った。その結果を図４に示す。なお、図中「ＰＤＸ１−ＳＥＡＰ−ＧＦＰ」はｐＰＤＸ１ｐｒｏ−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを有する形質転換体であり、「ｐｒｏｍｏｔｅｒｌｅｓｓ−ＳＥＡＰ−ＧＦＰ」はｐ−ｐｒｏｍｏｔｅｒｌｅｓｓ−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを有する形質転換体である。【００８９】  図４に示すように、ｐＰＤＸ１ｐｒｏ−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを導入したβ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅでは、ＡＬＰ活性がＲＬＵ２７８６８７であるのに対して、ｐＰＤＸ１ｐｒｏ−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを導入したｎｏｎβ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅでは、ＲＬＵ６１０９８であった。また、ネガティブコントロールとしてｐ−ｐｒｏｍｏｔｅｒｌｅｓｓ−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを導入したβ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅおよびｎｏｎ  β  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅはそれぞれ、ＲＬＵ７７６１０、ＲＬＵ６９２９８であった。この結果より、ｐＰＤＸ１ｐｒｏ−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰは、膵β細胞でのみ特異的に発現していることがわかった。このため、ｐＰＤＸ１ｐｒｏ−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰは、有効に機能していることが示された。【００９０】  （３）内因性ＡＬＰ活性の影響
続いて、内因性ＡＬＰ活性が上記（２）欄で行ったＳＥＡＰ  Ａｓｓａｙに及ぼす影響を検討した。具体的には、ｎｏｎ  β  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（ＨｅｐＧ２）およびマウス血漿中の内因性ＡＬＰがＳＥＡＰ活性の測定に及ぼす影響について検討すべく、Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅａｃｅｎｔ  ＳＥＡＰ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔの実施の過程で行う６５℃、３０分間のインキュベーションにより、ｎｏｎ  β  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（ＨｅｐＧ２）およびマウス血漿中の内因性ＡＬＰが失活するか否か検討した。【００９１】  その結果を図５に示す。なお、図中「ｐｌａｓｍａ  ＡＬＰ１」、「ｐｌａｓｍａ  ＡＬＰ２」はマウス血漿中の内因性ＡＬＰを示し、「ＨｅｐＧ２ＡＬＰ」はｎｏｎ  β  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（ＨｅｐＧ２）中の内因性ＡＬＰを示す。【００９２】  図５に示すように、ｎｏｎ  β  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（ＨｅｐＧ２）およびマウス血漿中の内因性ＡＬＰは全て、６５℃、３０分間のインキュベーションにより失活することがわかった。このことから、内因性ＡＬＰ活性が上記（２）欄で行ったＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅａｃｅｎｔ  ＳＥＡＰ  Ａｓｓａｙには全く影響を及ぼさないことが確認できた。したがって、上記（２）欄の結果は、ｐｄｘ−１遺伝子のプロモーターの支配下で発現した分泌型ＡＬＰ（ＳＥＡＰ）の活性のみを測定した結果であるといえる。【００９３】  （４）ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｐＰＤＸ１ｐｒｏ−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰの機能確認
（４−１）ｐＰＤＸ１ｐｒｏ−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰトランスジェニックマウスの作成
上記実施例の（１）欄で構築したプラスミドコンストラクトｐＰＤＸ１ｐｒｏ−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを用いて、ｐＰＤＸ１ｐｒｏ−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを有するトランスジェニックマウスの作出を行った。作出はトランスジェニックマウス作成会社である（株）ＳＬＣ（Ｊａｐａｎ  ＳＬＣ  Ｉｎｃ．浜松）に依頼した。（株）ＳＬＣからは２４ｌｉｎｅのマウスが搬入された。それらのマウスにおいてジェノタイピングを行った結果、２４ｌｉｎｅ中、１３ｌｉｎｅ（以下、Ｌｉｎｅ  Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｏと称する場合もある）がトランスジーン陽性を示した。なお、ネガティブコントロールとしてｔｒａｎｓｇｅｎｅを有さない同胞マウス（以下、「ＳＥＡＰ（−）」と称する場合もある）を用いた。【００９４】  （４−２）ｐＰＤＸ１ｐｒｏ−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰの機能確認
次に上記トランスジェニックマウスにおけるｐＰＤＸ１ｐｒｏ−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰの機能確認をおこなった。上記（４−１）においてトランスジーン陽性を示した１３ｌｉｎｅについて、ＳＥＡＰ活性を測定した。ＳＥＡＰ活性の測定方法は以下のとおりである。
・ＳＥＡＰ活性の測定方法
測定は、Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅａｃｅｎｔ  ＳＥＡＰ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｎｅｃｅｓ製）を用いて行った。【００９５】  （ｉ）Ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ
１．血液２０μｌをＰＢＳ１８０μｌと混和し、遠心後に上清を分離した。
２．上清１６０μｌを新しいチューブに移した（保存する場合は、−２０℃）。【００９６】  （ｉｉ）Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅａｃｅｎｔ  ＳＥＡＰ  Ａｓｓａｙ
１．十分量のＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅａｃｅｎｔ  ＥｎｈａｎｃｅｒとＡｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒを室温放置した。
２．必要量の１×Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（付属の５×Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ：ｄＨ２Ｏ＝１：４）を準備し、室温放置した。
３．溶かしたサンプル２０μｌを透明な０．５ｍｌチューブに移した。
４．上記３．のチューブに１×Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ３０μｌを加え、丁寧に混和した。
５．上記４．のサンプルを６５℃３０ｍｉｎ（以上）にて定温放置した（内因性ＡＬＰの不活化）。
６．上記５．のサンプルを氷上にて冷却し室温まで冷ました。
７．Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ５０μｌを各サンプルに加えて、５分間、室温放置した。
８．１．２５ｍＭ  ＣＳＰＤを準備（付属の２５ｍＭ  ＣＳＰＤ：Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅａｃｅｎｔ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ＝１：１９）した。
９．上記８．で準備したＣＳＰＤ５０μｌを各サンプルに加え１０分間、室温放置した。
１０．ＣＳＰＤ添加後、１０〜６０分の間に測定した。【００９７】  （ｉｉｉ）結果
トランスジーン陽性を示したＬｉｎｅＢ，Ｃ，Ｄ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，ＯにおけるＳＥＡＰ活性の結果を図６に示す。同図より、いずれのＬｉｎｅにおいても、ネガティブコントロールのＳＥＡＰ（−）と比較して、ＳＥＡＰ活性の著名な上昇が認められた。したがって、ｐＰＤＸ−１ｐｒｏ−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても有効に機能していることが確認された。【００９８】  以上の結果から、上記トランスジェニックマウスを用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても本発明に係る解析方法を実施することができることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００９９】  本発明に係る解析方法によれば、膵β細胞特異的遺伝子のプロモーター領域の下流に配置されたレポーター遺伝子の発現を検出することにより、膵β細胞特異的遺伝子の発現量を間接的にモニターすることができる。膵β細胞の細胞量が増加するか、あるいは膵β細胞の機能が改善すると、膵β細胞特異的遺伝子（例えば、ｐｄｘ−１遺伝子）の発現量が増加することが知られている。このため、本発明に係る解析方法によって膵β細胞特異的遺伝子の発現量をモニターすることにより、リアルタイムに、そして簡便かつ正確に膵β細胞量及び／又は膵β細胞機能を解析することができるという効果を奏する。そして、本発明に係る解析方法は、例えば、抗糖尿病薬のスクリーニング方法や糖尿病の改善効果の評価判定方法等の有用な応用が可能である。【０１００】  以上のように、本発明に係る解析方法等は、膵β細胞の細胞量やその機能をリアルタイムに、そして簡便かつ正確に解析することができるため、例えば、糖尿病に対する治療薬や治療方法、診断薬、診断方法等の開発に利用可能であろうし、また、糖尿病に対する治療効果を謳う健康食品や医薬品等の機能を評価することも可能である。このように、本願発明は、医療業、食品業等の幅広い分野に産業上の利用可能性を有するものである。
【図１】
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【図２】
2005093061.tif 000003
【図３（ａ）】
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【図３（ｂ）】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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