(57)【要約】本発明は、カバノアナタケの液体培養方法および該液体培養方法により得られる培養物、並びにそれらに関連する発明に関する。本発明を用いることにより、カバノアナタケ、カバノアナタケの培養液等の培養物を、安価で、安全に、工業規模で得ることができるという効果が奏される。また、本発明の培養方法で得られた培養物等は高い生理活性を有することから、各種用途に利用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カバノアナタケの菌糸体を水系培地中で培養する工程を有し、該水系培地中のカリウムとナトリウムの重量比（カリウム／ナトリウム）が１／１〜５０／１であることを特徴とするカバノアナタケの液体培養方法。
【請求項２】
水系培地中におけるカリウムの含有量が、０．００５〜１．０％（ｗ／ｖ）であり、ナトリウムの含有量が０．０００１〜１．０％（ｗ／ｖ）である、請求項１に記載の液体培養方法。
【請求項３】
水系培地中におけるマグネシウムの含有量が０．００１〜１．０％（ｗ／ｖ）である、請求項１又は２に記載の液体培養方法。
【請求項４】
水系培地が、銅、亜鉛、チロシン及びフェニルアラニンからなる群より選択された少なくとも１種をさらに含有する請求項１〜３いずれか記載の液体培養方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の液体培養方法で得られた培養物。
【請求項６】
請求項５記載の培養物を含む、スーパーオキシド消去用組成物。
【請求項７】
化粧料、医薬組成物、又は食品である請求項６記載のスーパーオキシド消去用組成物。
【請求項８】
スーパーオキシド消去用組成物の製造のための、請求項５記載の培養物の使用。
【請求項９】
請求項５記載の培養物を用いてスーパーオキシドを消去する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、カバノアナタケ（学名：Ｆｕｓｃｏｐｏｒｉａ  ｏｂｌｉｑｕａまたはＩｎｏｎｏｔｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｕｓ）の液体培養方法および該液体培養方法により得られる培養物、並びにそれらに関連する発明に関する。
【背景技術】
【０００２】  カバノアナタケは、ヒダナシタケ目タバコウロコタケ科のキノコで、北海道やロシアなどの寒冷地で、成熟したシラカバに寄生する癌腫菌であり、中身は褐色、外見は黒く硬い石炭状の塊で、直径１０〜２０ｃｍの大きさに成長するのに１０年以上かかることが確認されている。このカバノアナタケは、従来、ロシアでは健康維持・風邪の予防や二日酔いに効く健康茶として、また、日本でもアイヌ民族が健康茶として煎じて飲用してきた経緯があり、近年の研究では腫瘍細胞増殖抑制作用、抗ウイルス作用等があることも報告されている。【０００３】  そのため、近年の健康ブームでカバノアナタケへの需要が増加することにより、天然に存在するカバノアナタケの乱獲が進み、現在ではカバノアナタケが寄生するシラカバの数が「１山に１本」、「２万本に１本」と言われるまでに激減している上に、主にロシアから輸入されるカバノアナタケについてはその産地の特定が不明確である等、安全性の点でも問題が生じている。【０００４】  そこで、カバノアナタケの人工培養方法について種々検討されている（例えば、特許文献１〜３を参照）。
【特許文献１】特許第３００８２９２号公報
【特許文献２】特公昭５２−４４６１３号公報
【特許文献３】特開平１０−１９１７８３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  しかしながら、前記の公知の培養方法で得られるカバノアナタケの培養物、中でも液体培養物は、腫瘍細胞増殖抑制活性、抗ウイルス活性、スーパーオキシド消去活性等が十分に高いものではなかった。【０００６】  そこで本発明者らは、これらの生理活性のうちスーパーオキシド消去活性に着目して鋭意研究を進めたところ、従来着目されていなかった培地中のカリウムとナトリウムの重量比を特定の範囲に調整してカバノアナタケを液体培養した場合に、培養物のスーパーオキシド消去活性が顕著に高くなること、中でも、菌糸体重量に対するスーパーオキシド消去活性の比率（比活性）が顕著に高くなることを初めて見出した。本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。【０００７】  即ち、本発明の目的は、スーパーオキシド消去活性などの生理活性を有するカバノアナタケの培養物を、安価で、安全に、しかも工業的な規模で得るための、カバノアナタケの液体培養方法、ならびに該液体培養方法を用いて得られる、高い生理活性を有するカバノアナタケの培養物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  本発明の要旨は、
〔１〕  カバノアナタケの菌糸体を水系培地中で培養する工程を有し、該水系培地中のカリウムとナトリウムの重量比（カリウム／ナトリウム）が１／１〜５０／１であることを特徴とするカバノアナタケの液体培養方法、
〔２〕  前記〔１〕記載の液体培養方法で得られた培養物、
〔３〕  前記〔２〕記載の培養物を含む、スーパーオキシド消去用組成物、
〔４〕  スーパーオキシド消去用組成物の製造のための、前記〔２〕記載の培養物の使用、および
〔５〕  前記〔２〕記載の培養物を用いてスーパーオキシドを消去する方法
に関する。
【発明の効果】
【０００９】  本発明を用いることにより、カバノアナタケ、カバノアナタケの培養液等の培養物を、安価で、安全に、工業規模で得ることができるという効果が奏される。また、本発明の培養方法で得られた培養物は高い生理活性を有することから、各種用途に利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】  本発明のカバノアナタケの液体培養方法は、前記のように、カバノアナタケの菌糸体を水系培地中で培養する工程を有し、該水系培地中のカリウムとナトリウムの重量比（カリウム／ナトリウム）が１／１〜５０／１であることを特徴とする。かかる特徴を有することにより、生理活性の高いカバノアナタケの培養液等の培養物を安価で、工業的規模で得ることができるという効果が奏される。また、本発明は、液体培養であるため、固体培養に比べて工業的規模での大量培養が容易であり、また培養物の処理も容易であるという利点もある。【００１１】  本発明において、カバノアナタケ（学名：Ｆｕｓｃｏｐｏｒｉａ  ｏｂｌｉｑｕａまたはＩｎｏｎｏｔｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｕｓ）とは、ヒダナシタケ目タバコウロコタケ科のキノコをいう。本発明に使用する場合、自然界でシラカバに寄生しているカバノアナタケの菌糸体をそのまま使用してもよいし、独立行政法人製品評価技術基盤機構〔バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）〕（ＮＢＲＣ番号８６８１）から入手した菌糸体を培養したものを使用することもできる。また、水系培地への植菌時の菌糸体の植え傷みを防ぐために、菌糸体を前培養してから、水系培地に添加することもできる。【００１２】  本発明に用いられる水系培地は、該水系培地中のカリウムとナトリウムの含有量が、重量比（カリウム／ナトリウム）１／１〜５０／１であるものである。ここでの重量比は、水系培地中のカリウムイオン、イオン化していないカリウムの総重量と、同じくナトリウムの総重量の比である。かかる比率でカリウムとナトリウムが存在することで、スーパーオキシド消去活性が有意に高くなるという利点がある。中でも、前記重量比（カリウム／ナトリウム）は、実用的な観点から、３／１〜５０／１であることが好ましく、６／１〜４５／１であることがより好ましい。【００１３】  前記重量比は、培養を行う際に使用される水系培地中での比率であり、前培養に用いられる水系培地や培養時に継続的に追加される水系培地も同様の重量比であることが好ましい。なお、水系培地中のカリウム及びナトリウムの含有量は、培地原料中のカリウム、ナトリウムからそれぞれ算出してもよいが、好ましくは水系培地中の各含有量を、後述の方法で測定して算出できる。【００１４】  また、前記の水系培地中におけるカリウム／ナトリウムの重量比は、カバノアナタケを培養している間のいずれかの時点で達成されていればよいが、培養期間中、常に前記重量比が達成されていることが好ましい。この場合、水系培地をサンプリングしてその中のカリウムまたはナトリウムの含有量を直接測定することで算出することができる。この場合、サンプリングした水系培地を原子吸光分析、誘導結合型プラズマ発光分析、イオン選択電極法等の公知の元素分析方法を用いて、その含有量を測定することができる。【００１５】  水系培地中のカリウムの含有量としては、生理活性への関与を考慮して、０．００５〜１．０％（ｗ／ｖ）が好ましく、０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）がより好ましく、０．１〜０．５％（ｗ／ｖ）がさらに好ましい。また、水系培地中のナトリウムの含有量としては、生理活性ならびにカリウムとの比率を考慮して、０．０００１〜１．０％（ｗ／ｖ）が好ましく、０．００１〜０．１％（ｗ／ｖ）がより好ましく、０．０１〜０．１％（ｗ／ｖ）がさらに好ましい。【００１６】  さらに、生理活性への最適な関与を考慮して、水系培地中にマグネシウム、銅、亜鉛等のミネラル及びチロシン、フェニルアラニン等のアミノ酸からなる群より選択される１種又は２種以上を含有することが好ましい。マグネシウム又は銅の含有量としては、水系培地中、０．０００１〜１．０％（ｗ／ｖ）が好ましく、０．００１〜１．０％（ｗ／ｖ）がより好ましく、０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）がさらに好ましい。亜鉛の含有量としては、水系培地中、０．００１〜５．０％が好ましく、０．００１〜３．０％（ｗ／ｖ）がより好ましく、０．０１〜３．０％（ｗ／ｖ）がさらに好ましい。また、チロシン又はフェニルアラニンの含有量としては、水系培地中、０．０００１〜５．０％（ｗ／ｖ）が好ましく、０．００１〜１．０％（ｗ／ｖ）がより好ましく、０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）がさらに好ましい。【００１７】  主なカリウム源としては、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化カリウム等が挙げられる。主なナトリウム源としては、塩化ナトリウム等が挙げられる。また、カリウムとナトリウムとを共に含有する原料としては、各種ペプトン、酵母エキス等が挙げられる。【００１８】  本発明に用いられる水系培地としては、製造コストの観点及び取り扱い性の観点から、水とともに、グルコース、各種ペプトン（大豆製ペプトン等）、酵母エキス、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、チロシン、銅及びマグネシウムからなる群より選択される少なくとも１種を含有しているものが好ましく、これらを全て含有しているものがより好ましい。かかる水系培地としては、例えば、水、グルコース、大豆製ペプトン、酵母エキス、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム及び硫酸マグネシウムを含有しているものが挙げられる。【００１９】  前記水系培地中には、上記以外の成分を添加剤として混含してもよい。例えば、スクロース、マンニトール、ガラクトース、トレハロース、マルトース、ラクトース、デキストリン、コーンスターチ、グリセロール等を使用することができる。また、各種ペプトン（カゼイン製ペプトン等）、モルトエキス、ソイトン、カシトン、カザミノ酸、硝酸カルシウム、硫酸アンモニウム、米ぬか等を使用することができる。また、チアミン、ビオチン、葉酸、塩化カルシウム等も前記水系培地中に含ませることができる。【００２０】  中でも水系培地としては、水９０〜９６％（ｗ／ｖ）とともに、グルコース０．４〜４％（ｗ／ｖ）、各種ペプトン０．０１〜１％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．０１〜３％（ｗ／ｖ）、リン酸水素二カリウム０．０５〜０．５％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム０．０１〜１％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）、銅０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）、及びチロシン０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）からなる群より選択される少なくとも１成分を含有してなるものがより好ましく、これらを全て含有してなるものがさらに好ましい。かかる水系培地としては、例えば、水９０〜９６％（ｗ／ｖ）、グルコース０．４〜４��（ｗ／ｖ）、大豆製ペプトン０．０１〜１％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．０１〜３％（ｗ／ｖ）、リン酸水素二カリウム０．０５〜０．５％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム０．０１〜１％（ｗ／ｖ）、及び硫酸マグネシウム０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）を含有してなるもの、水９０〜９６％（ｗ／ｖ）、グルコース０．４〜４％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．０１〜３％（ｗ／ｖ）、リン酸水素二カリウム０．０５〜０．５％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム０．０１〜１％（ｗ／ｖ）、及びチロシン０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）を含有してなるもの、水９０〜９６％（ｗ／ｖ）、グルコース０．４〜４％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．０１〜３％（ｗ／ｖ）、リン酸水素二カリウム０．０５〜０．５％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム０．０１〜１％（ｗ／ｖ）、チロシン０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）、及び銅０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）を含有してなるもの等が挙げられる。【００２１】  水系培地のｐＨとしては、生理活性への関与を考慮して、４〜８が好ましく、５〜７．５がより好ましい。【００２２】  水系培地は、前記各成分を適宜混含した後、殺菌することで調製される。培地の殺菌方法としては、液体培養方法で通常使用される方法であれば、特に限定はない。【００２３】  本発明の液体培養方法においては、好ましくは、カリウムとナトリウムの重量比（カリウム／ナトリウム）が１／１〜５０／１であることを特徴とする水系培地中に、植菌して培養を開始する。ここで植菌とは、水系培地に種菌としてカバノアナタケの菌糸体を植えつける工程をいい、具体的には、菌糸の成育した寒天平板培地より４ｍｍ径のコルクボーラ等で寒天ごと菌糸体を打ち抜き、前記水系培地に植えつける方法や菌糸体を水系培地中で前培養し、この培養液を前記水系培地に添加する方法、又は、天然のカバノアナタケ菌糸体をそのまま直接に前記水系培地に添加する方法等が挙げられる。【００２４】  また、本発明において、工業的規模での製造を行なう場合には、前記のようにして得られた水系培地をスケールアップして培養することができる。中でも、生理活性が高くなるという観点から、植菌した水系培地を１５〜３０℃、好ましくは１５〜２７℃、より好ましくは１８〜２７℃で培養するのが望ましい。【００２５】  また、培養スケールとしては、前記条件を満たすものであれば、特に限定はない。例えば、フラスコ中で培養する小規模のもの、サイロを用いた大規模のものなど通常の液体培養に使用される装置であればいずれでも実施可能である。また、培養スケールに応じて、振とう培養、撹拌培養などの方式を適宜選択することができる。振とう条件としては、例えば、１００〜１５０ｒｐｍが挙げられる。【００２６】  培養期間としては特に限定はないが、培養物中の生理活性が高くなる、製造コストを低減する等の観点から、例えば、７〜６０日間であり、７〜５０日間が好ましく、１５〜５０日間がより好ましく、３０〜４５日間がさらに好ましい。なお、これ以外の培養条件については、特に限定はない。【００２７】  かかる方法により、カバノアナタケの生理活性の高い培養物が得られる。たとえば、該培養ろ液中のスーパーオキシド消去活性値が４０％以上のような高いスーパーオキシド消去活性を有する培養ろ液が得られる。また、たとえば、スーパーオキシド消去比活性（菌糸体乾燥重量に対するスーパーオキシド消去活性の大きさ）が３５％／ｇ以上のような高いスーパーオキシド消去比活性を有する培養物が得られる。なお、スーパーオキシド消去活性の測定方法については、後述の実施例に記載の方法が挙げられる。【００２８】  得られる培養物は高いスーパーオキシド消去活性などの生理活性を示し、天然のカバノアナタケ自体は、歴史的には人体に対して副作用が極めて小さいものであったため、スーパーオキシドを消去するために、かかる培養物を直接服用することができ、また食品添加剤としても安全であると考えられる。例えば、前記の培養物は、抗がん、免疫力増強化、血糖値降下、血圧降下、コレステロール低下、抗血栓、抗ウイルス作用、活性酸素消去、精力回復、アトピー性皮膚炎、花粉症、鼻炎、病原菌の感染、肌のシミ等の種々の治療剤、予防剤等の化粧料、医薬組成物、食品又はそれらの原料としても好適に使用され得る。【００２９】  また、前記培養物は、培養によって得られた培地等を総称するもので、培養液、培養ろ液（培養液から菌体を分離したもの）、菌体（生菌、死菌を含む）、菌体の抽出物、これらの精製物、活性画分、希釈物、濃縮物または乾燥物等を含む。この精製物、活性画分、希釈物、濃縮物および、乾燥物の製造方法としては、公知の方法であれば特に限定は無い。【００３０】  本発明はまた、前記培養物を含むことを特徴とするスーパーオキシド消去用組成物を提供する。かかる特徴を有することにより、該組成物は、高いスーパーオキシド消去活性などの生理活性を有するため、スーパーオキシド消去を必要とする場合に好適に用いられ得る。例えば、該組成物は、化粧料、医薬組成物、食品、研究用試薬等として、好適に使用され得る。従って、本発明はまた、前記培養物を含むことを特徴とする化粧料、医薬組成物、及び食品を提供する。【００３１】  本発明のスーパーオキシド消去用組成物中の前記培養物の含有量としては、特に限定はなく、前記培養物そのものであってもよい。【００３２】  本発明のスーパーオキシド消去用組成物の製造法としては、スーパーオキシド消去活性が維持される限り特に限定はなく、前記の液体培養方法を用いて得られた培養物と任意成分から公知の製造方法を用いて製造することができる。【００３３】  本発明の化粧料の剤型としては、特に限定されず、化粧水、乳液、クリーム等の基礎化粧料、メークアップ料、頭髪用化粧料等を例示できる。これらの化粧料は、前記の培養物と化粧料用の任意成分を常法により製剤化することにより得ることができる。かかる任意成分としては、例えば、炭化水素類、トリグリセライド類、脂肪酸類、界面活性剤、多価アルコール、増粘剤、紫外線吸収剤等を例示できる。【００３４】  本発明の化粧料は、スーパーオキシドを消去することによって、シワやシミの予防や改善、脱毛の予防や改善、体臭発生の防止等に使用され得る。本発明の化粧料中の前記培養物の含有量としては、好ましくは０．００１〜８０重量％、より好ましくは０．００１〜５０重量％、さらに好ましくは０．０１〜３０重量％である。本発明の化粧料は、前記培養物が、例え���、成人１人１日当たり、５ｍｇ〜５０ｇ適用されるように使用され得る。【００３５】  本発明の医薬組成物の剤型としては、特に限定されないが、例えば、注射剤、錠剤、液剤等を例示できる。これらの医薬組成物は、前記の培養物と医薬組成物用の任意成分を常法により製剤化することにより得ることができる。かかる任意成分としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、コーティング剤等を例示できる。【００３６】  医薬組成物の投与量は、疾患の種類、症状、患者の年齢、体重等により異なる。かかる投与量としては、成人１人あたり、前記の培養物を、例えば、１ｍｇ〜２０ｇ／ｋｇ体重を１田こ１回ないしは数回に分けて経口投与するか、例えば、５ｍｇ〜５０ｇを１日に１回ないしは数回に分けて経皮吸収で投与すればよい。【００３７】  本発明の食品の形態としては特に限定されない。かかる形態としては、例えば、キャンディー、グミ、ゼリー、ドリンク、パン等を例示でき、剤型としては、錠剤状、カプセル状、ゼリー状、液状等を例示できる。これらの食品は、前記の培養物と食品用の任意成分を常法により配合し、加工することにより得ることができる。【００３８】  これらの食品中の前記の培養物の含有量としては、食品の種類により異なるが、好ましくは０．００１〜６０重量％、より好ましくは０．００１〜４０重量％、さらに好ましくは０．０１〜２０重量％である。本発明の食品は、前記培養物が、例えば、成人１人１日当たり、１ｍｇ〜２０ｇ／ｋｇ体重摂取されるように摂取され得る。【００３９】  一般的に、スーパーオキシドが生体に及ぼす影響として、ラジカルの発生による組織の損傷が挙げられる。その結果として、シワ、タルミ、シミ、脱毛等の皮膚の老化症状、体臭の発生や、花粉症、鼻炎、気管支喘息、アトピー性皮膚炎等のアレルギー反応の惹起、心筋梗塞、動脈硬化、不整脈、肺炎、胃潰瘍、肝硬変、膵炎、認知症、白血病、高脂血症、糖尿病、自律神経障害、白内障、膠原病、関節リューマチ等が引き起こされることが知られている。ここで、天然のカバノアナタケは、実際に、抗がん作用、免疫増強作用等の優れた効果を奏し、スーパーオキシド消去を必要とする被験体において、スーパーオキシド消去作用を発揮することが分かっている。従って、天然のカバノアナタケに由来する前記培養物を含有する本発明のスーパーオキシド消去用組成物（化粧料、医薬組成物、食品等）は、その優れたスーパーオキシド消去作用により、一般的にスーパーオキシドが関与しているとされている上記の疾患等や皮膚の老化症状、体臭の発生等の改善や予防、遅延化に対して有効に使用され得る。【００４０】  本発明はさらに、前記培養物を用いてスーパーオキシドを消去する方法を提供する。【００４１】  本発明の方法においては、前記培養物をスーパーオキシド消去作用が得られる有効量以上用いればよい。
【実施例】
【００４２】  以下に、本発明によるカバノアナタケの液体培養方法を実施例でもって具体的に示すが、本発明はかかる実施例の範囲に限定することを意図するものではない。【００４３】（実施例１〜５、比較例１〜４）
表１に示す組成を有する水系培地２００ｍＬを培養容器（三角フラスコに綿栓をした容器）にそれぞれ入れた後、１２１℃１５分間加熱滅菌し、北海道産天然カバノアナタケから単離して、寒天平板培養した菌糸体を各培養容器中に無菌的に植菌した。なお、表１中、カリウムとナトリウムの重量比率は培養初発培地の原料中のカリウム、ナトリウム含有量より算出した。【００４４】  次いで２３℃で振とう培養（条件：１２０ｒｐｍ）を３０日間行った後、各培養容器から培養物を取り出し、菌糸体をろ別して培養ろ液を得た。【００４５】  表１に得られたカバノアナタケ菌糸体の乾燥重量、培養ろ液（３倍希釈液）のスーパーオキシド消去活性値を示す。また、以下に、これらの測定方法を示す。【００４６】（カバノアナタケ菌糸体の乾燥重量測定）
菌糸体をろ過後、蒸留水で洗浄して、３０〜８０℃、好ましくは３０〜６０℃で２４時間乾燥したものを秤量する。本試験では、３０〜６０℃で２４時間乾燥したものを秤量した。【００４７】（スーパーオキシド消去活性測定およびスーパーオキシド消去比活性値）
「ＳＯＤ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ−ＷＳＴ」（同仁化学研究所）を用いて、上記で得られた培養ろ液を３倍に希釈した液のスーパーオキシド消去活性を測定した。校正にはウシ赤血球由来のスーパーオキシドジスムターゼ（和光純薬工業（株）製）を標準サンプルとした。測定した３倍希釈の培養ろ液のスーパーオキシド消去活性値（ＳＯＤ活性値）を、乾燥菌糸体重量で割ることでスーパーオキシド消去比活性（ＳＯＤ比活性値）を算出した。結果を表１に示す。【００４８】
【表１】
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【００４９】  なお、表１中、グルコースは株式会社ニッシ製（商品名：グル・ファイナル）、ポリペプトン（登録商標）、粉末酵母エキスＳは日本製薬株式会社製のもの、リン酸水素二カリウム・リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム７水和物は、和光純薬工業株式会社製（食品添加物）である。【００５０】（実施例６及び７）
表２に示す組成を有する水系培地２００ｍＬを培養容器（三角フラスコに綿栓をした容器）にそれぞれ入れた後、１２１℃１５分間加熱滅菌し、北海道産天然カバノアナタケから単離して、寒天平板培養した菌糸体を各培養容器中に無菌的に植菌した。なお、表２中、カリウムとナトリウムの重量比率は培養初発培地の原料中のカリウム、ナトリウム含有量より算出した。【００５１】  次いで２８℃で振とう培養（条件：１２０ｒｐｍ）を３０日間行った後、各培養容器から培養物を取り出し、菌糸体をろ別して培養ろ液を得た。【００５２】  表２に得られた培養ろ液（３倍希釈液）のスーパーオキシド消去活性値を示す。なお、スーパーオキシド消去活性値の測定方法は上記の通りである。【００５３】
【表２】
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【００５４】  表２中、グルコースは株式会社ニッシ製（商品名：グル・ファイナル）、酵母エキスは日本製紙ケミカル株式会社製（商品名：ＳＫ酵母エキスＳ−２）、リン酸水素二カリウム・リン酸二水素カリウムは米山化学株式会社製、Ｌ−チロシンは協和発酵株式会社製、ミネラル酵母は、オリエンタル酵母株式会社製（商品名：ミネラル酵母Ｃｕ）である。なお、ミネラル酵母は、銅を豊富に含むため、実施例７のようにミネラル酵母を０．１重量％含有させた場合の水系培地は、約０．０３重量％の銅を含有している。【００５５】  表１及び２の結果より、実施例１〜７では、比較例１〜４に比べて、いずれも培養ろ液中のスーパーオキシド消去活性値が極めて高いことがわかる。特に、実施例１〜５では、比較例１〜４に比べて、いずれもスーパーオキシド消去比活性が極めて高いものであることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００５６】  本発明のカバノアナタケの液体培養方法を用いることで、カバノアナタケを大量に安定培養できる。また、本発明により得られるカバノアナタケの培養物及び該培養物を含むスーパーオキシド消去用組成物は、高い生理活性を有し、スーパーオキシド消去を必要とする場合に好適に用いられ得る。前記培養物及び組成物は、例えば、抗がん、免疫力増強化、血糖値降下、血圧降下、コレステロール低下、抗血栓、抗ウイルス作用、活性酸素消去、精力回復、アトピー性皮膚炎、花粉症、鼻炎、病原菌の感染、肌のシミ等の種々の治療剤、予防剤等の化粧料、医薬品、食品又はそれらの原料としても好適に使用され得る。
【国際調査報告】
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