(57)【要約】  本発明は、インターフェロン産生細胞(Interferon Producing Cell;IPC)の活性抑制物質を有効成分として含有する、RAの治療剤を提供する。IPC活性抑制物質には、たとえばIPCの細胞表面抗原を認識する抗体が用いられる。たとえばBST2またはそのホモログを認識する抗体は、本発明に有用である。また本発明は、IPCの活性を調節する作用を有する物質を選択する工程を含む、RAの治療剤をスクリーニングするための方法を提供する。  本発明によって、IPCの活性を抑制することで、RA患者の免疫バランスを調節できることが明らかにされた。すなわち本発明は、自己免疫疾患を伴う関節炎の新たな治療戦略を提供した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェロン産生細胞の活性抑制物質を有効成分として含有する自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤。
【請求項２】
インターフェロン産生細胞の活性抑制物質が、インターフェロン産生細胞のインターフェロン産生および細胞の生存のいずれか、または両方を抑制する作用を有する物質である請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
インターフェロン産生細胞の活性抑制物質が、インターフェロン産生細胞のインターフェロン産生および細胞の生存のいずれか、または両方を抑制する作用を有する抗体である請求項２に記載の治療剤。
【請求項４】
抗体が、BST2およびそのホモログのいずれか、または両方を認識する抗体、またはその少なくとも抗原結合領域を含む抗体断片である請求項３に記載の治療剤。
【請求項５】
抗体が、FERM BP-10339として寄託されたハイブリドーマ3D3#7、またはFERM BP-10340として寄託されたハイブリドーマ3G7#6が産生するモノクローナル抗体の、少なくとも抗原結合領域を含む抗体である請求項４に記載の治療剤。
【請求項６】
インターフェロン産生細胞の活性を抑制する工程を含む、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療方法。
【請求項７】
抑制すべきインターフェロン産生細胞の活性が、インターフェロン産生細胞のインターフェロン産生および細胞の生存のいずれか、または両方である請求項６に記載の治療方法。
【請求項８】
インターフェロン産生細胞の活性を抑制する工程が、インターフェロン産生細胞のインターフェロン産生および細胞の生存のいずれか、または両方を抑制する作用を有する抗体を投与する工程を含む、請求項７に記載の治療方法。
【請求項９】
抗体が、BST2およびそのホモログのいずれか、または両方を認識する抗体、またはその少なくとも抗原結合領域を含む抗体断片である、請求項８に記載の治療方法。
【請求項１０】
抗体が、FERM BP-10339として寄託されたハイブリドーマ3D3#7、またはFERM BP-10340として寄託されたハイブリドーマ3G7#6が産生するモノクローナル抗体の、少なくとも抗原結合領域を含む抗体である請求項９に記載の治療方法。
【請求項１１】
次の工程を含む、被験化合物の自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果の検出方法。
(1) インターフェロン産生細胞とインターフェロン産生細胞のインターフェロン産生誘導物質を、以下のi)-iii)のいずれかの順序で接触させる工程、
i) 被験化合物とインターフェロン産生細胞を接触後に、インターフェロン産生を誘導する細胞刺激剤をインターフェロン産生細胞に接触させる、
ii)被験化合物とインターフェロン産生を誘導する細胞刺激剤を同時にインターフェロン産生細胞に接触させる、または
iii)インターフェロン産生を誘導する細胞刺激剤をインターフェロン産生細胞に接触させた後に、被験化合物とインターフェロン産生細胞を接触させる
(2) インターフェロン産生細胞の活性を測定する工程、および
(3) 対照と比較して、インターフェロン産生細胞の活性が抑制されたとき、被験化合物の関節炎の治療効果が検出される工程
【請求項１２】
細胞刺激剤がウイルス、ウイルスの構成要素、およびバクテリアのDNAからなる群から選択される少なくとも１つの細胞刺激剤である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
被験化合物が、インターフェロン産生細胞を認識する抗体またはその少なくとも抗原結合領域を含む抗体断片である請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の方法によって自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果が検出された被験化合物を選択する工程を含む、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果を有する化合物のスクリーニング方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載のスクリーニング方法によって選択された化合物を有効成分として含有する自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患を伴う関節炎(arthritis with autoimmune disease)の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性関節リウマチ(Rheumatoid arthritis; RA)は、リウマチ性疾患の代表的な疾患の一つである。RAの罹患率は人口の約１％程度と考えられている。日本においても、７０万人程度の患者が存在すると予測されている。RAは慢性の全身性疾患で、リウマチ様関節炎とも呼ばれる。RAの病態は主に慢性の関節炎である。関節炎に伴う痛みは移動しやすく、関節炎の病変は、指、腕、手、足の指（趾）、ひざ関節、あるいは頚椎関節などの全身に及ぶ。RAの慢性的な関節炎は、主に、以下のような病変、並びにそれに起因する慢性的な炎症と骨組織破壊によってもたらされると考えられている。【０００３】
RAの炎症症状は、T細胞あるいはマクロファージの関節腔内への浸潤などによって誘導される。関節腔内に浸潤した炎症性の細胞は、炎症性サイトカインおよび血管新生因子を産生する。一方、炎症性サイトカインなどの刺激を受けて、滑膜細胞が軟骨組織に向かって増殖を開始する。滑膜組織は、正常な関節構成組織の一つである。正常な関節組織は、滑膜組織に包まれている。そして、関節腔内は滑膜組織が産生する滑液によって満たされている。RAにおいては、関節腔内の滑膜細胞の増殖に伴って、肉芽組織が形成される。この肉芽組織は、滑膜パンヌス(synovial pannus)と呼ばれるRAに特徴的な病変である。滑膜パンヌスの中の滑膜細胞はプロテアーゼを産生する。関節内の軟骨組織を構成するコラーゲン繊維は、滑膜細胞が産生するプロテアーゼの作用によって分解される。軟骨組織の分解は、関節腔内の炎症の原因となる。
一方、滑膜細胞の関節腔内における増殖は、血管新生を誘導する。血管新生もまた、炎症の原因となると共に、T細胞あるいはマクロファージのような炎症性細胞の遊走をもたらす。このような一連の関節組織の障害によって、関節の腫大(swelling)、あるいは痛みなどのRA特有の症状がもたらされる。そして症状の進行に伴って、軟骨組織の破壊が進み、やがて運動機能障害が現れるようになる。【０００４】
現在のところ、RAの原因や発症機構の詳細は明らかにされていない。ただRAが、自己免疫性疾患の特徴を有することは、様々な知見によって裏付けられている。たとえば、多くのRA患者の血液中には、自己のIgGを認識する自己抗体が検出される。この自己抗体はリウマチ因子(Rheumatoid factor; RF)と呼ばれる。RFは古くからRAの診断マーカーとして利用されてきた。【０００５】
RAの治療目標は、患者のQOLの改善と組織破壊の抑制である。RA患者のQOLの改善とは、具体的には、組織の運動障害と痛みの軽減が主な課題となる。現在、日常的に採用されているもっとも一般的な治療方法は、消炎鎮痛剤の投与である。たとえば、シクロオキシゲナーゼ(Cycro-oxygenase;COX)阻害剤である非ステロイド性抗炎症薬(nonsteroidal antiinflammatory drug; NSAIDs)が、しばしばRAの症状の緩和のために患者に投与される。特にCOX-2は、炎症性メディエーターによって誘導され、炎症病巣でプロスタグランディンの産生に関与する酵素である。NSAIDsは、COX-2の阻害を通じて炎症症状を緩和する。【０００６】
RA治療のための消炎鎮痛剤としてステロイド剤が選択される場合もある。RA患者に対するステロイド剤の投与によって、短時間のうちに確実な消炎作用を期待できる。ステロイド剤の投与は、RAにおいては、効果的な治療方法の一つである。しかしRAは慢性疾患である。したがってステロイド剤投与を治療法として選択した場合には、ステロイド剤が長期的に反復投与される。その結果、ステロイド剤の副作用が問題となる場合がある(非特許文献１／Saag K.G. et al., AM.J.Med.,96, 115, 1994)。たとえばステロイド剤によって患者の免疫機能が抑制され、患者が感染症に罹患する可能性が高まる恐れがあることが指摘されている。したがって、通常ステロイド剤は、短期的に治療効果を得る必要がある場合に、一時的に使用される。【０００７】
更にRA患者の免疫異常の修飾によって、RAの活動性を調節することができる薬剤が実用化されている。この種の薬剤は、抗リウマチ薬、あるいは疾患修飾リウマチ薬(disease modifying antirheumatic drugs; DMARDs)と呼ばれる(非特許文献２／三森経世 Medicina, 38, 430, 2001)。DMARDsの投薬は、NSAIDsで十分な治療効果が見られない患者においてもしばしば有効である。またDMARDsには、寛解導入作用、あるいは関節保護作用が期待できることから、早期からの導入が奨められるようになっている。しかし、一方で、治療効果が見られない患者(non-responder)の存在も明らかにされている。また、副作用の発現率も高いことが指摘されている。【０００８】
RAの滑膜細胞では炎症性サイトカインが産生され、関節破壊が進行している。そこで炎症性サイトカインが治療標的として着目された。たとえば腫瘍壊死因子(TNF-α)、インターロイキン(IL-1あるいはIL-6)を標的とする治療方法が試みられている。具体的には、以下の抗体、あるいは融合蛋白質の有効性が治験により評価されている。
抗TNF-αキメラ抗体c2A（Remicade/Centocor社の登録商標）
抗TNF-αヒト抗体D2E7(非特許文献３／Peter C., Curr.Opin.in Rheumatol.,12,164-169,2001)
TNF-α受容体Fc融合蛋白質（Enbrel：etanercept／Amgen社、Wyeth社の商品名）
抗IL-6受容体ヒト化抗体（MRA：Atlizumab;非特許文献４／ Arthritis Rheum. 2002 Dec;46(12):3143-50.)【０００９】
またRA患者のヘルパーT細胞には偏りがあることも明らかにされている。すなわち、IFN-γの刺激によるナイーブT細胞のヘルパーTh1細胞への分化が観察される。ヘルパーTh1細胞はTh1サイトカインであるIFN-γの産生を介して、RAのような臓器特異的自己免疫疾患症状に関与する。RA患者においては、浸潤T細胞からIFN-γを産生するTh1細胞あるいはTh0細胞が見られ、T細胞のバランスはTh1側にシフトしている。更に、リンパ球浸潤部位で検出されるマクロファージがIL-12あるいはIL-18を産生している。これらのサイトカインは、IFN-γ産生を誘導する。このように、RA患者においては、炎症性サイトカインの産生が亢進する状態が見られる。Th1側に偏ったRA患者の免疫バランスを調節することでRAの治療効果を達成する試みがある。すなわちTh1細胞応答を増強するサイトカインの作用を、その拮抗剤によって抑制し、免疫学的なバランスを調節して、RAを治療する試みである。【００１０】
このようなアプローチを実現するためのサイトカイン拮抗剤として、タイプ１インターフェロンに対する抗体が用いられた（特許文献１／WO 01/054721)。すなわち、IFN-αに対する抗体によるRAの治療が提案された。実際、RA患者においてはIFN-αの産生が亢進していることが知られている(非特許文献５／Hopkins et al.,Clin Exp Immunol. 1988 Jul;73(1):88-92.)。また、IFN-α製剤投与の副作用としてRAの増悪あるいは発症が認められることも報告されている。【００１１】
【特許文献１】WO 01/054721
【非特許文献１】Saag K.G. et al., AM.J.Med.,96, 115, 1994
【非特許文献２】三森経世(Mimori Tsuneyo) Medicina, 38, 430, 2001
【非特許文献３】Peter C., Curr.Opin.in Rheumatol.,12,164-169,2001
【非特許文献４】Choy E.H. et al., Arthritis Rheum. 2002 Dec;46(12):3143-50.
【非特許文献５】Hopkins et al.,Clin Exp Immunol. 1988 Jul;73(1):88-92.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
タイプ１インターフェロンの活性の抑制によって、RAの治療効果が期待できると考えられている。たとえばタイプ１インターフェロンの拮抗剤は、インターフェロンの活性を抑制する。これに対して、もしもインターフェロン産生そのものを調節することができれば、拮抗剤と同様に、RAの治療効果が期待できる。インターフェロン産生の調節によるRAの治療は、拮抗剤による治療と比較して、より本質的な治療戦略であると言うことができる。すなわち本発明は、インターフェロンの産生調節による、RAの治療技術の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
ヒトにおいて、免疫システムのバランスが偏る原因の一つは、タイプ１インターフェロンの作用である。タイプ１インターフェロンには、インターフェロンα（IFNα）およびインターフェロンβ（IFNβ）が含まれる。IFNαあるいはIFNβは、抗ウイルス活性、あるいは抗腫瘍活性を有するインターフェロンとして知られている。ウイルス感染に伴って、これらのインターフェロンを大量に産生する細胞として同定されたのがインターフェロン産生細胞（以下、IPCと省略する場合がある）である。IPCは血中にわずかしか存在していない。末梢血リンパ球に占めるIPCの割合は、１%以下と考えられている。しかしIPCは、きわめて高いインターフェロンの産生能を有する。IPCのIFN産生能は、たとえば3000pg/mL/106cellsに達する。つまり、細胞の数は少ないが、血中IFNαあるいはIFNβの大部分は、IPCによってもたらされていると言って良い。【００１４】
したがって、IPCのインターフェロン産生、あるいはIPCの細胞数そのものを抑制することができれば、生体内のタイプ１インターフェロンの量を制御することができる。その結果、偏った免疫バランスを調節し、RAをはじめとする自己免疫疾患を伴う関節炎のより本質的な治療を実現できる可能性がある。【００１５】
本発明者らは、生体内においてIPCの活性を調節することができれば、自己免疫疾患を伴う関節炎の症状を改善できると考えた。そして本発明者らは、IPCの細胞表面抗原を認識する数多くの抗体を作成し、IPCの活性に及ぼす影響を解析した。その結果、特定の抗原を認識する抗体は、IPCの活性を調節する作用を有することを明らかにした。更に、その自己免疫疾患を伴う関節炎治療効果を解析した。そしてIPCの活性を抑制する抗体によって、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果が得られることを確認して本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の自己免疫疾患を伴う関節炎療剤、治療方法、並びに治療剤のスクリーニング方法に関する。
〔１〕インターフェロン産生細胞の活性抑制物質を有効成分として含有する自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤。
〔２〕インターフェロン産生細胞の活性抑制物質が、インターフェロン産生細胞のインターフェロン産生および細胞の生存のいずれか、または両方を抑制する作用を有する物質である〔１〕に記載の治療剤。
〔３〕インターフェロン産生細胞の活性抑制物質が、インターフェロン産生細胞のインターフェロン産生および細胞の生存のいずれか、または両方を抑制する作用を有する抗体である〔２〕に記載の治療剤。
〔４〕抗体が、BST2およびそのホモログのいずれか、または両方を認識する抗体、またはその少なくとも抗原結合領域を含む抗体断片である〔３〕に記載の治療剤。
〔５〕抗体が、FERM BP-10339として寄託されたハイブリドーマ3D3#7、またはFERM BP-10340として寄託されたハイブリドーマ3G7#6が産生するモノクローナル抗体の、少なくとも抗原結合領域を含む抗体である〔４〕に記載の治療剤。
〔６〕インターフェロン産生細胞の活性を抑制する工程を含む、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療方法。
〔７〕抑制すべきインターフェロン産生細胞の活性が、インターフェロン産生細胞のインターフェロン産生および細胞の生存のいずれか、または両方である〔６〕に記載の治療方法。
〔８〕インターフェロン産生細胞の活性を抑制する工程が、インターフェロン産生細胞のインターフェロン産生および細胞の生存のいずれか、または両方を抑制する作用を有する抗体を投与する工程を含む、〔７〕に記載の治療方法。
〔９〕抗体が、BST2およびそのホモログのいずれか、または両方を認識する抗体、またはその少なくとも抗原結合領域を含む抗体断片である、〔８〕に記載の治療方法。
〔１０〕抗体が、FERM BP-10339として寄託されたハイブリドーマ3D3#7、またはFERM BP-10340として寄託されたハイブリドーマ3G7#6が産生するモノクローナル抗体の、少なくとも抗原結合領域を含む抗体である〔９〕に記載の治療方法。
〔１１〕次の工程を含む、被験化合物の自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果の検出方法。
(1) インターフェロン産生細胞とインターフェロン産生細胞のインターフェロン産生誘導物質を、以下のi)-iii)のいずれかの順序で接触させる工程、
i) 被験化合物とインターフェロン産生細胞を接触後に、インターフェロン産生を誘導する細胞刺激剤をインターフェロン産生細胞に接触させる、
ii)被験化合物とインターフェロン産生を誘導する細胞刺激剤を同時にインターフェロン産生細胞に接触させる、または
iii)インターフェロン産生を誘導する細胞刺激剤をインターフェロン産生細胞に接触させた後に、被験化合物とインターフェロン産生細胞を接触させる
(2) インターフェロン産生細胞の活性を測定する工程、および
(3) 対照と比較して、インターフェロン産生細胞の活性が抑制されたとき、被験化合物の関節炎の治療効果が検出される工程
〔１２〕細胞刺激剤がウイルス、ウイルスの構成要素、およびバクテリアのDNAからなる群から選択される少なくとも１つの細胞刺激剤である〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕被験化合物が、インターフェロン産生細胞を認識する抗体またはその少なくとも抗原結合領域を含む抗体断片である〔１１〕に記載の方法。
〔１４〕〔１１〕に記載の方法によって自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果が検出された被験化合物を選択する工程を含む、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果を有する化合物のスクリーニング方法。
〔１５〕〔１４〕に記載のスクリーニング方法によって選択された化合物を有効成分として含有する自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤。【００１６】
あるいは本発明は、インターフェロン産生細胞の活性抑制物質の、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤の製造における使用に関する。あるいは本発明は、上記スクリーニング方法によって選択された化合物の、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤の製造における使用に関する。
ところで、IPCを認識する既知のモノクローナル抗体である抗BDCA-2モノクローナル抗体(Dzionek, A. et al. J.Immunol. 165: 6037-6046, 2000.)は、ヒトIPCのIFN産生を抑制する作用を有することが明らかにされている。その他にもマウスのインターフェロン産生細胞を認識するモノクローナル抗体が、インターフェロンの産生を抑制することも報告されている(Blood 2004 Jun 1;103/11:4201-4206. Epub 2003 Dec)。マウスのプラズマ細胞様樹状細胞(Plasmacytoid Dendritic Cell)に対するモノクローナル抗体による樹状細胞数の減少が報告された(J. Immunol. 2003, 171:6466-6477)。しかしこれらの抗体の自己免疫疾患を伴う関節炎の治療に対する治療効果は未知である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、IPCを標的とする自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤が提供された。すなわちIPCの活性抑制剤によって、自己免疫疾患を伴う関節炎を治療しうることが明らかとなった。IPCは、たとえばIPCの細胞表面抗原を認識する抗体などの投与によってその活性が抑制される。たとえば、BST2並びにそのホモログに対する抗体は、IPCに結合してそのIFN産生および細胞の生存そのものに対して抑制的に作用する。そしてBST2に結合する抗体は、生体内に投与した場合に、実際にRAに対する治療効果が確認された。【００１８】
本発明においては、IPCの機能調節によって自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果を達成した。既にType 1 IFNの拮抗剤について、RAの治療効果を示す可能性が開示されているが、十分な効果は示されていない。一方本発明は、IFNの機能調節ではなく、IFNを産生する細胞を標的とする治療戦略を提供した。つまり本発明のアプローチは、より本質的なRA治療を可能とする。より具体的には、たとえば、本発明においては次のようなメリットが期待できる。【００１９】
まず、IPCの活性抑制剤は、少量でも高度な治療効果を達成することができる。IPCは、わずかな細胞が多量のIFNを産生する。IFNの中和には、IFNの分子数に応じた抗体が必要である。しかし本発明においては、産生細胞の活性が直接抑制される。その結果、抗IFN抗体による中和と比較して、より少量の抗体で強力なIFNの抑制効果を期待できる。抗体あるいは可溶性受容体などによってIFNの機能を調節する場合、IFNの濃度に応じた治療剤が必要となる。一方、IPCの活性調節剤は、きわめて多量のIFNを産生しているIPCに直接作用する。そのため、IFNの産生を効率的に抑制することができる。一般的に、抗体医薬の製造コストは高い。現在のところ、製造コストの大幅な抑制を実現できる方法は確立されていない。したがって、治療に必要な抗体の投与量が少ないことは、経済的な大きな利点である。また投与量が少ないことは、経済的に有利なだけでなく、副作用の危険性を小さくすることにもつながる。【００２０】
更に、持続的にIFNが産生されている場合には、IFNの抗体による中和は、一過的な抑制に留まると予想される。IFNに結合した抗体は免疫複合体を形成し、貪食細胞などの作用によって速やかに除去される。そして、抗体のIFN活性中和作用は失われる。IPCは高度なIFN産生機能を有する細胞である。したがって、抗IFN抗体の作用によって一時的にIFN濃度を低下させたとしても、IFNは再び速やかに補充されてしまう可能性が高い。
一方、本発明においては、IPCの活性を抑制することから、長期間にわたるIFN産生抑制効果が期待できる。特に、本発明の望ましい態様によれば、BST2あるいはそのホモログを認識する抗体は、IPCのIFN産生のみならず、細胞数をも抑制する。つまり、新たなIPCが供給されるまでは、IFN産生の抑制効果が持続する。またIPCが産生し得る他の炎症性サイトカインの産生も直接的あるいは間接的に抑制されることになる。これらの効果が相乗的に作用し、IFNの産生は効果的に抑制される。その結果、RAの高度な治療効果が達成される。特にRAのような慢性の疾患の治療方法においては、治療効果の持続性が大きな利点となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】FLT-3リガンド添加後、10日間培養したマウスの骨髄細胞（IPCが濃縮されている）の細胞表面を、作製した抗体及び他のマーカーで染色したFACS解析像である。培養上清陽性分画、陰性分画をそれぞれR2、R3とした。グラフ内の、R1＆R2は抗体陽性の細胞集団、R1＆R3は抗体陰性の細胞集団を表わす。
【図２】各モノクローナル抗体で抽出した細胞の形態を表わす顕微鏡写真（x400）である。（a）はインフルエンザウイルスPR8に感染させる前の形態、(b)はインフルエンザウイルスPR8と24時間培養した後の形態を示す。感染後の細胞は樹状突起を持ち、樹状細胞に典型的な形態を示した。
【図３】モノクローナル抗体SNK01を用いて分離した細胞のインターフェロン産生能を示すグラフである。図中、横軸は細胞の処理の種類を、縦軸は培養上清中のIFNα濃度(pg/mL)を示す。横軸のP(＋)はモノクローナル抗体に結合した細胞にウイルスを感染させた場合、N(＋)はモノクローナル抗体に結合しなかった細胞にウイルスを感染させた場合、そしてN(−)はモノクローナル抗体に結合しなかった細胞にウイルスを感染させなかった場合の結果を示す。
【図４】モノクローナル抗体SNK01のインターフェロン産生能への影響を示すグラフである。図中、横軸は処理に用いた抗体の濃度(μg/ｍL)を、縦軸は培養上清中のIFNα濃度(pg/ｍL)を示す。横軸の(-)はウイルス処理していない場合の結果を示す。SNK01は濃度依存的にインターフェロン産生抑制活性を示した。
【図５】モノクローナル抗体SNK01によるウェスタンブロッティングアッセイの結果を示す写真である。写真上は抗Hisタグ抗体、下は本発明のモノクローナル抗体SNK01による結果を示す。写真左側がpcDNA3.1-mBST2DHis、右側がpcDNA3.1-mBST2H-Hisで形質転換したCOS7細胞の結果である。培養した細胞を溶解処理した際の沈殿物(P)と上清(S)についての結果を示した。
【図６】マウスBST2のmRNA発現レベルを組織、細胞間で比較した結果を示す写真である。レーンはそれぞれ解析した組織、細胞を示す。
【図７】マウスBST2及びそのホモログのアミノ酸配列とゲノム構造を示す図である。(a)は各アイソフォームのアミノ酸配列のアライメントを、(b)はエキソンマッピングを示す。
【図８】ヒトBST2及びそのホモログのアミノ酸配列とゲノム構造を示す図である。(a)は各アイソフォームのアミノ酸配列のアライメントを、(b)はエキソンマッピングを示す。
【図９】ヒトBST2のｍRNA発現レべルを組織、細胞間で比較した結果を示す写真である。
【図１０】作製したマウスBST2に対するモノクローナル抗体のインターフェロン産生能への影響を示すグラフである。図中、横軸は処理に用いたハイブリドーマ培養上清の種類を、縦軸は培養上清中のIFNα濃度(pg/ｍL)を示す。CpGはCpGで処理した際、PR8はインフルエンザウイルスPR8を感染させた際の結果を示す。
【図１１】作製したヒトBST2に対するモノクローナル抗体のインターフェロン産生能への影響を示すグラフである。図中、横軸は処理に用いた抗体の種類と濃度、縦軸はヒトIPCをHSVで刺激した際の培養上清中のIFNα濃度（pg/mL）を示す。
【図１２ａ】野生型マウス（WT）あるいはIFNレセプターノックアウトマウス（IFNR-KO）の各種細胞をCpGあるいはインフルエンザウイルスPR8で刺激した後、蛍光色素Alexa488で標識したSNK01抗体で染色した図である。横軸はSNK01の蛍光強度、すなわちBST2の発現強度を、縦軸は細胞数を示す。（a）は全脾臓細胞を解析した図である。
【図１２ｂ】（b）は各細胞を分画して解析した図である。
【図１２ｃ】（c）はIPCを分画して解析した図である。
【図１３】ヒトIPCのマーカーとして抗BDCA-4、BDCA-2抗体を用いて、ヒトIPCをIFNαにて刺激した際のBST2の発現を検討した図である。横軸は5C11#7抗体の蛍光強度、すなわちBST2の発現強度を、縦軸は細胞数を示す。
【図１４】ヒトIPCをCpGにて刺激した際のBST2の発現を検討した図である。横軸は、抗ヒトBST2抗体3E2#8、5C11#7の蛍光強度、すなわちBST2の発現強度を、縦軸は細胞数を示す。それぞれ太線はCpGで刺激した場合、点線は未刺激の場合のパターンを示す。
【図１５】抗マウスBST2抗体SNK01を投与したマウスから採取した細胞を用いて解析した図である。（a）は投与のスケジュールを示す。（b）は各臓器中のIPC割合を示し、横軸が投与した抗体を、縦軸がIPCの割合を示す。（-)は抗体のかわりにPBSのみを投与した群を示す。（c）は骨髄細胞をCpGあるいはインフルエンザウィルスPR8で刺激した際に産生したIFNの濃度を示す。横軸が投与した抗体を示す。
【図１６】抗マウスBST2抗体SNK01を投与し、ウィルス感染させたマウスを用いて解析した図である。（a）は投与のスケジュールを示す。（b）は血清中のIFNαの濃度を示し、横軸が投与した抗体を示す。（c）は脾臓中のIPC割合を示し、横軸が投与した抗体を、縦軸がIPCの割合を示す。（-)は抗体のかわりにPBSのみを投与した群を示す。
【図１７ａ】関節炎惹起抗体カクテルを用いて作成したマウス関節リウマチモデルを用いて抗体の効果を検討した(n=15)。（a）は抗体投与のスケジュールを示す図である。
【図１７ｂ】（b）は関節炎を発症した割合を示す図である。縦軸が発症率、すなわち発症したマウスの数を生存しているマウスの数で割った値を示し、横軸は抗体カクテル投与後の日数を示す。
【図１７ｃ】（c）は関節炎スコアの平均値を示す図である。横軸は抗体カクテル投与後の日数を示す。IgGはコントロールのラットIgGを示す。
【図１８】抗体を投与した関節リウマチモデルマウス(n=10)において、関節炎惹起抗体カクテル投与16日目の血清中のリウマチ因子を測定した図である。縦軸が各個体のELISAの吸光度値、すなわち、リウマチ因子の量を示し、横軸は投与した抗体を示す。
【図１９】抗体を投与した関節リウマチモデルマウス(n=10)において、関節炎惹起抗体カクテル投与16日目の血清中のIFNαの濃度をELISAによって測定した結果である。縦軸は各個体の血清中のIFNαの濃度（pg/mL）を、横軸は投与した抗体を示す。
【図２０】抗体を投与した関節リウマチモデルマウス(n=10)において、関節炎惹起抗体カクテル投与16日目の血清中のTNFαの濃度をELISAによって測定した結果である。縦軸は各個体の血清中のTNFαの濃度（pg/mL）を、横軸は投与した抗体を示す。
【図２１】抗体を投与した関節リウマチモデルマウスにおいて、関節炎惹起抗体カクテル投与16日目の脾臓及び末梢血中のIPCの割合をFACSにより解析した図である。（a）はFACSの解析像の例を示し、上段が末梢血、下段が脾臓のパターンを示す。左側がコントロール抗体を投与したマウス、右側がSNK01を投与したマウスのパターンである。四角で囲んだ細胞集団がIPCで上の数値はその細胞群の割合（％）を示す。（b）は複数のマウスの結果をグラフに示したもので、縦軸がIPCの割合を示し、横軸は投与した抗体を示す。No Abは抗体を投与していないマウスの結果である。
【図２２】関節炎惹起抗体カクテルを用いて作成した関節リウマチモデルマウスを用いて、発症後の抗体の効果を検討した図である（n=5）。縦軸は関節炎スコアの平均値を示し、横軸は抗体カクテル投与後の日数を示す。図中の矢印は抗体を投与したタイミングを示し、IgGはコントロールとして投与したラットIgGを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、インターフェロン産生細胞の活性抑制物質を有効成分として含有する自己免疫疾患をともなう関節炎の治療剤に関する。本発明において、自己免疫疾患とは、免疫機能によって組織の障害や炎症がもたらされていることを言う。免疫機能には、抗体による液性免疫と、免疫担当細胞による細胞性免疫が含まれる。本発明における自己免疫疾患は、自己抗原に対する免疫機構の発動によって定義することもできる。ここでいう自己抗原には、健常者の組織に存在する抗原に加えて、宿主に何らかの手段によって導入された外来性の抗原も含まれる。たとえば、感染、移植、あるいは接触などによって生体に導入された外来性の抗原に対する免疫機能の攻撃が細胞あるいは組織を障害することがある。このような障害は、本発明における自己免疫疾患に含まれる。生体が自己免疫疾患を有していることは、自己抗原に対する免疫機構の反応性を指標として検出することができる。自己免疫疾患の指標とすることができる自己抗原としてIgGなどが知られている。【００２３】
一方、関節炎(arthritis)は、関節組織の炎症によって定義される病態である。関節における炎症は、疼痛および関節の腫脹によって知ることができる。すなわち本発明における自己免疫疾患を伴う関節炎とは、自己免疫機構による細胞または組織の障害が観察され、かつ関節における炎症が見られる状態と言うこともできる。本発明における関節炎は、自己免疫機構による直接的な障害のみならず、間接的な障害も含まれる。たとえば、免疫担当細胞の機能亢進による炎症性サイトカインの産生過剰に起因する関節炎は、自己免疫疾患を伴う関節炎の体表的な病態である。更に、自己免疫疾患を含む、複合的なメカニズムによってもたらされる関節炎は、本発明における治療の対象である関節炎に含まれる。たとえばRAは、本発明における自己免疫疾患を伴う関節炎の代表的な疾患である。RAの病態は、炎症性サイトカインや滑膜細胞の増殖などの複合的な要因によって構成される。より具体的には、以下のような関節炎は、本発明における治療の対象として好ましい。
慢性関節リウマチ (Rheumatoid arthritis；RA)
若年性関節リウマチ (Juvenile Idiopathic Arthritis;JIA)
乾癬性関節炎 (psoriatic arthritis;PsA)
強直性脊椎炎(ankylosing spondylitis)
実際、RAや乾癬性関節炎 (psoriatic arthritis;PsA。またはPA)の患者においては、滑液や滑膜組織に多くのIPCが存在していて、病態形成に関与していることも示唆されている(Lande et al., J. Immunol. 173:2815-2824, 2004)。このような事実からも、本発明に基づくIPCの活性の制御による関節炎の治療が有用であることが裏付けられる。【００２４】
本発明において、慢性関節リウマチ(RA)とは、リウマチ性疾患のうち、特に慢性の関節炎を伴う疾患をいう。より具体的には、自己免疫性疾患の症状と、関節炎を伴う疾患が、慢性関節リウマチに含まれる。自己免疫性疾患の症状は、たとえば、血中のRFの存在によって確認することができる。あるいは、Th1リンパ球の増加、あるいは関節組織への浸潤を指標として、自己免疫疾患症状を確認することもできる。RAは本発明における自己免疫疾患を伴う関節炎として好ましい。【００２５】
若年性関節リウマチ（Juvenile Idiopathic Arthritis JIA）は、症状が関節リウマチに類似する16歳未満の小児に発症する慢性関節炎である。乾癬性関節炎（Psoriatic Arthritis）は、種々の免疫異常によって生じる皮膚の慢性再発性炎症性角化症である乾癬に合併して見られる多発性関節炎である。また、強直性脊椎炎（Ankylosing spondylitis）は、症状は関節リウマチに類似しているが、HLA-B27陽性者が高頻度であり、微生物抗原とHLA-B27分子に共通抗原があって、異常な免疫応答の原因となると考えられている疾患である。【００２６】
以上のような疾患は、いずれもIPCによって自己免疫機構の亢進がもたらされていると考えられる。したがって、IPCの機能抑制に基づく自己免疫疾患の調節によって治療効果が期待できる。したがって、本発明においては、これらの疾患を、IPCの機能亢進による自己免疫疾患を有する関節炎と言うこともできる。【００２７】
また、本発明におけるインターフェロン産生細胞(IPC)とは、IFN産生能を有する細胞を言う。たとえば、インターフェロンを産生し、細胞表面にBST2およびそのホモログのいずれかまたは両方を発現する細胞は、本発明におけるIPCに含まれる。本発明において、BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方の発現とは、これらの分子が細胞の活性化に伴って発現する場合を含む。たとえばヒト並びにマウスにおいて、樹状細胞の前駆細胞であって、刺激によりIFNを産生する細胞は、IPCとして好ましい。以下、特に断りの無い場合には、IPCは、樹状細胞の前駆細胞である細胞のみならず、IFN産生能を有し、かつ細胞表面にBST2およびそのホモログのいずれかまたは両方を発現する細胞を含む。このようなIPCの同定方法は公知である。たとえばいくつかの細胞表面マーカーを指標としてIPCを他の血液細胞と識別することができる。具体的には、ヒトIPCの細胞表面マーカーのプロファイルは次のとおりである(Shortman,K. and Liu, YJ. Nature Reviews 2: 151-161, 2002)。近年になって、BDCA-2陽性細胞をIPCと位置づける報告もある(Dzionek, A. et al. J.Immunol. 165: 6037-6046, 2000.)。したがって、BDCA-2陽性細胞は、本発明におけるIPCとして好ましい。
［ヒトIPCの細胞表面抗原のプロファイル］
CD4陽性、CD123陽性、
Lineage(CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56)陰性、CD11c陰性【００２８】
あるいはマウスIPCは、以下のプロファイルによって定義されている。
［マウスIPCの細胞表面抗原のプロファイル］
−CD11c、B220、Ly6C、およびCD45RBが陽性
−CD11b、CD3、CD19が陰性
更に、ヒトあるいはマウスのIPCに共通して見られる特徴として、以下のような特徴を示すことができる。
［細胞の形態上の特徴］ 
−プラズマ細胞に似ている
−細胞表面が平滑な丸い細胞
−核が比較的大きい
［細胞の機能的な特徴］
−ウイルス感染時に、短期間に大量のType-1 interferonを産生する
−ウイルス感染後、樹状細胞に分化する【００２９】
本発明において、IPCの活性抑制とは、IPCが有する機能の少なくとも一つを抑制することを言う。すなわち、IPCの活性抑制剤には、IPCが有する機能の少なくとも一つを抑制する任意の物質が含まれる。IPCの機能として、IFNの産生と細胞生存を示すことができる。細胞の生存は、細胞数と言い換えることもできる。したがって、これらの機能の両方あるいはいずれかを抑制する場合に、IPCの活性を抑制すると言う。そして、これらの機能の両方あるいはいずれかを抑制する物質を、IPCの活性抑制剤として利用することができる。【００３０】
IPCによって産生されるタイプ１IFNが種々の疾患の原因となっていることが明らかにされている。したがってその産生を抑制することは、それらの疾患の治療戦略として有用である。たとえば、自己免疫性の疾患の病態とIFNαの関連性が指摘されている。IFNαの大部分がIPCによって産生されている。したがってその産生を抑制すれば、IFNαによってもたらされる病態を緩和することができる。なお本発明において、IPCによるIFN産生抑制とは、IPCが産生するIFNの少なくとも１種類のIFN産生を抑制することを言う。本発明における好ましいIFNは、タイプ１IFNである。中でもIFNαは重要である。【００３１】
IPCには、少数の細胞で大量のIFNを産生する細胞が含まれる。たとえば、ウイルスなどで刺激を受けた樹状細胞の前駆細胞は、生体が産生するIFNの大部分を産生する。大量のIFNを産生するIPCの細胞数を抑制することは、結果としてIFNの産生量を抑制することになる。したがって、IPCの細胞数の抑制によっても、IFNαによってもたらされる病態を緩和することができる。【００３２】
本発明において、好ましいIPCの活性抑制剤は、IPCの細胞表面抗原を認識し、その活性を抑制する抗体である。具体的には、IPCのインターフェロン産生能、およびIPCの細胞の数のいずれか、または両方を抑制する抗体である。ある抗体が、IPCの活性を抑制することは、たとえば後に述べる自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果の検出方法などによって確認することができる。たとえば本発明者らは、BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方を認識する抗体が、IPCの活性を抑制することを確認した。
すなわち本発明は、BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方を認識する抗体、またはその少なくとも抗原結合領域を含む抗体断片を有効成分として含有する自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤に関する。また本発明は、BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方を認識する抗体、またはその少なくとも抗原結合領域を含む抗体断片を投与する工程を含む、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療方法に関する。あるいは本発明は、BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方を認識する抗体、またはその少なくとも抗原結合領域を含む抗体断片の、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤の製造における使用に関する。【００３３】
本発明において、IPCはBST2およびそのホモログのいずれかまたは両方を発現し、かつIFNを産生する細胞であれば特に限定されない。たとえば、ヒト、およびマウスにおいては、IPCがBST2およびそのホモログのいずれかまたは両方を発現していることが確認された。したがって、ヒト、およびマウスのIPCは、本発明におけるIPCとして好ましい。特にヒトIPCにおいては、その活性化に伴ってBST2およびそのホモログの発現レベルが顕著に上昇する。そのため、BST2およびそのホモログを認識する抗体は、ヒトにおいては、活性化されたIPCに対して特異的に作用する。したがって、ヒトIPCは本発明のIPCとして特に好ましい。
本発明者らは、BST2あるいはそのホモログに対する抗体が、IPCの活性を抑制することを明らかにした。そして、IPCの活性抑制を通じて、RAの症状を緩和しうることを確認した。すなわち本発明者らは、IPCの活性を抑制する方法を見出し、そして実際にその方法によってIPCの活性を抑制することによってRAの治療を実現できることを確認した。これらの知見に基づいて、IPCの機能の抑制が、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療戦略として有用であることが明らかにされた。【００３４】
その他、BDCA-2に対する抗体(Dzionek, A. et al. J.Immunol. 165: 6037-6046, 2000.)も、IPCの機能を抑制することが明らかにされている(Dzionek, A. et al. J. Exp. Med. 194;1823-34. 2001.)。したがって、BDCA-2に結合する抗体も、本発明における「IPC活性抑制物質」として利用することができる。【００３５】
本発明において、BST2遺伝子は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列によって定義されるヒト由来の蛋白質である。配列番号：２に記載のアミノ酸配列は配列番号：１に記載の塩基配列からなるcDNAによってコードされている。ヒトBST2のcDNAのクローニングと、モノクローナル抗体についての報告がある(Ishikawa J. et al. Genomics 26:527, 1995; GenBank Acc#.D28137)。BST2は、プレB細胞増殖支持能を有する膜蛋白質であるとされた(特開平7-196694)。BST2のゲノム遺伝子とプロモーターについての知見も得られている(WO99/43803)。また、ヒトBST2は、ミエローマに対するモノクローナル抗体である抗HM1.24抗体が認識している抗原であることが明らかにされている(Ohmoto T. et al. B.B.R.C 258: 583, 1999)。抗HM1.24抗体は、ヒトプラズマセルラインを免疫原として樹立されたモノクローナル抗体である(Goto T. et al. Blood 84:1992, 1994)。その後ミエローマを特異的に認識することが明らかにされ、ミエローマの治療を目的としてヒト化抗体が作成された(Ozaki S. et al. Blood 93: 3922, 1999; ：WO98/14580)。ヒト化抗HM1.24抗体は、造血組織の癌に対する治療効果を有している(WO02/064159)。現在はその実用化を目指して臨床試験が進められている。以上のようにヒトBST2は、造血器系の腫瘍におけるマーカーとして利用されている。また、ヒトBST2に特異的に結合する抗体が、Ｔ細胞やＢ細胞の活性化を抑制し、自己免疫疾患などの治療薬となりうることが示唆されている（特開平10-298106）。しかし現在のところBST2を認識する抗体とIPCの関連を示唆する報告は無い。【００３６】
本発明において、BST2はそのホモログを含む。BST2のホモログとは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質と定義することができる。このような蛋白質は、天然に存在する蛋白質を含む。一般に真核生物の遺伝子は、IFN遺伝子等で知られているように、多型現象(polymorphism)を有する。この多型現象によって生じた塩基配列の変化によって、１または複数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加される場合がある。このようにヒトに由来する蛋白質であって、かつ配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、本発明のBST2ホモログに含まれる。【００３７】
具体的には、たとえばBST2のスプライシングバリアント、あるいは遺伝子多型によって生じる変異体は、BST2ホモログに含まれる。たとえば本発明者らは、配列番号：１の塩基配列からなるcDNAに対するスプライシングバリアントの存在を明らかにした。このスプライシングバリアントは、配列番号：３または配列番号：５に示す塩基配列からなり、配列番号：４または配列番号：６に記載のアミノ酸配列をコードしていた。【００３８】
あるいは多型現象によって塩基配列に変化はあっても、アミノ酸配列が変わらない場合もある。このような塩基配列の変異は、サイレント変異と呼ばれる。サイレント変異を有する塩基配列からなる遺伝子も、本発明に含まれる。なおここで言う多型現象とは、集団内において、ある遺伝子が個体間で異なる塩基配列を有することを言う。一般に、遺伝学的には多型と変異は遺伝子型の分布率によって定義されている。しかしここで言う多型は、異なる塩基配列が見出される割合（分布率）とは無関係である。【００３９】
BST2のホモログは、ヒト以外の種における機能的に同等な蛋白質を含む。BST2と機能的に同等な蛋白質は、たとえばハイブリダイゼーションを利用して同定することができる。すなわち、配列番号：１に示すようなBST2をコードするポリヌクレオチド、あるいはその断片をプローブとし、これとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを単離するのである。ハイブリダイゼーションをストリンジェントな条件下で実施すれば、塩基配列としては相同性の高いポリヌクレオチドが選択され、その結果として単離される蛋白質にはBST2と機能的に同等なタンパク質が含まれる可能性が高まる。【００４０】
本発明者らは、BST2のマウスにおけるホモログに対する抗体が、ヒトにおける抗体と同様にマウスIPCの活性を抑制することを確認した。マウスBST2は、配列番号：９に記載の塩基配列を有し配列番号：１０に記載のアミノ酸配列をコードしていた。更に本発明者らは、BST2のスプライシングバリアントであるBST2Hについても同様に、マウスにおけるホモログの存在を確認した。マウスBST2Hの塩基配列は配列番号：７に、この塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号：８に示した。マウスのBST2Hに対する抗体も、IPCの活性を抑制することが確認された。
本発明において明らかにされたヒトとマウスのBST2とそのホモログの塩基配列情報、およびアミノ酸配列情報を以下にまとめた。
塩基配列      アミノ酸配列    アミノ酸配列の長さ
ヒトBST2D    配列番号：１    配列番号：２      （１８０）
ヒトBST2H    配列番号：３    配列番号：４      （１５８）
ヒトBST2HS   配列番号：５    配列番号：６      （１００）
マウスBST2H    配列番号：７    配列番号：８      （１７８）
マウスBST2D    配列番号：９    配列番号：１０    （１７２）
マウスBST2HS   配列番号：２２  配列番号：２３    （１０５）【００４１】
なおストリンジェントな条件とは、具体的には例えば 6×SSC、40%ホルムアミド、25℃でのハイブリダイゼーションと、1×SSC、55℃での洗浄といった条件を示すことができる。ストリンジェンシーは、塩濃度、ホルムアミドの濃度、あるいは温度といった条件に左右される。当業者は、これらの条件を必要なストリンジェンシーを得られるように適宜調節することができる。【００４２】
ハイブリダイゼーションを利用することによって、たとえばヒト以外の動物種におけるBST2のホモログをコードするポリヌクレオチドの単離が可能である。ヒト以外の動物種、すなわちマウス、ラット、ウサギ、ブタ、あるいはヤギ等の動物種から得ることができるポリヌクレオチドがコードするBST2のホモログは、本発明における機能的に同等な蛋白質を構成する。【００４３】
ハイブリダイゼーション技術等を利用して単離されるポリヌクレオチドがコードする蛋白質は、通常、ヒトBST2D（配列番号：２）とアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも30％以上、好ましくは50％以上、さらに好ましくは80％以上（例えば、95％以上、あるいは98％、更には99％以上）の配列の同一性を指す。塩基配列やアミノ酸配列の同一性は、インターネットを利用したホモロジー検索サイトを利用して調べることができる［例えば日本DNAデータバンク（DDBJ）において、FASTA、BLAST、PSI-BLAST、および SSEARCH 等の相同性検索が利用できる［例えば日本DNAデータバンク（DDBJ）のウェブサイトの相同性検索（Search and Analysis）のページ ; http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology-j.html］。また、National Center for Biotechnology Information (NCBI) において、BLASTを用いた検索を行うことができる（例えばNCBIのホームページのウェブサイトのBLASTのページ; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/; Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol., 1990, 215(3):403-10; Altschul, S.F. & Gish, W., Meth. Enzymol., 1996, 266:460-480; Altschul, S.F. et al., Nucleic Acids Res., 1997, 25:3389-3402）。【００４４】
例えば Advanced BLAST 2.1におけるアミノ酸配列の同一性の算出は、プログラムにblastpを用い、Expect値を10、Filterは全てOFFにして、MatrixにBLOSUM62を用い、Gap existence cost、Per residue gap cost、および Lambda ratioをそれぞれ 11、1、0.85（デフォルト値）に設定して検索を行い、同一性（identity）の値（%）を得ることができる（Karlin, S. and S. F. Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68; Karlin, S. and S. F. Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7）。【００４５】
更に既に構造が明らかにされているcDNA、あるいはゲノムDNAの塩基配列情報の検索によって、他の種におけるBST2ホモログを見出すこともできる。すなわち、公知の塩基配列情報あるいはアミノ酸配列情報を蓄積したデータベースを対象として、ヒトBST2の塩基配列情報および／またはアミノ酸配列情報をクエリーとする相同性検索によって、類似の配列情報が検索される。もしも他の種に由来する相同性の高い既知の遺伝子並びに蛋白質がデータベース中に存在すれば、相同性検索によって、それを見出すことができる。遺伝子の全長が同定されていなくても、ESTなどの断片配列情報が得られれば、インシリコクローニングによって、遺伝子の全長配列を構成できる場合もある。こうして明らかにされた他の種に由来するホモログについて、実際に当該動物種のIPCにおける発現が確認できれば、本発明におけるBST2のホモログとして利用することができる。【００４６】
本発明に用いるBST2およびそのホモログのいずれかまたは両方を認識する抗体は、BST2およびそのホモログ、あるいはそれらの断片を免疫原として調製することができる。本発明における抗体は、任意のクラスであってよい。また抗体が由来する生物種も限定されない。更に、抗体の抗原結合領域を含む断片を抗体として用いることができる。たとえばIgGの酵素的な消化によって生成される、抗原結合部位を含む抗体断片も、本発明における抗体として利用することができる。具体的には、パパインあるいはトリプシンによる消化によって、FabあるいはF(ab')2などの抗体断片を得ることができる。これらの抗体断片は、抗原との結合親和性を有する抗体分子として利用しうることは周知である。あるいは、必要な抗原結合活性を維持している限り、遺伝子組み換えによって構築された抗体を用いることもできる。遺伝子組み換えによって構築された抗体とは、たとえばキメラ抗体、CDR移植抗体、あるいはシングルチェインFv等を示すことができる。任意の免疫原を利用してこれらの抗体を得る方法は公知である。
本発明において、ある抗体の抗原結合領域を他の抗体の定常領域に接合したキメラ抗体や、ある抗体のCDRを他の抗体に移植したCDRグラフト抗体を、少なくとも抗原結合領域を含む抗体という。更に、抗原結合活性を維持した抗原結合領域を含む抗体断片も、少なくとも抗原結合領域を含む抗体に含まれる。【００４７】
本発明において、抗体は、必要に応じて修飾することができる。本発明によれば、BST2またはそのホモログのいずれかまたは両方を認識する抗体は、IPCの細胞数を抑制する作用を有する。すなわち、抗体そのものがIPCに対する細胞傷害性を有していると考えられた。強いエフェクター作用を示す抗体のサブクラスは公知である。あるいは、抗体を細胞傷害物質(cytotoxic agent)によって修飾することによって、IPCの活性抑制効果を更に増強することができる。細胞傷害物質としては、以下のような物質を示すことができる。
トキシン類：緑膿菌毒素(Pseudomonas Endotoxin; PE)、ジフテリアトキシン、リシン
放射性同位元素：Tc99m、Sr89、I131、Y90
抗癌剤：カリキアマイシン、マイトマイシン、パクリタキセル
蛋白質からなるトキシン類は、２官能性試薬によって抗体あるいはその断片などに結合することができる。あるいは、抗体をコードする遺伝子にトキシン類をコードする遺伝子を接合し、両者の融合蛋白質を得ることもできる。放射性同位元素を抗体に結合する方法も公知である。たとえば、キレート剤を利用して、抗体を放射性同位元素で標識する方法が公知である。更に抗癌剤は、糖鎖あるいは２官能性試薬などの利用により、抗体に結合することができる。【００４８】
本発明において用いられる抗体は、人為的に構造を改変された抗体であっても良い。たとえば、抗体の細胞障害作用や安定性を改善するための様々な修飾方法が公知である。具体的には、重鎖の糖鎖が改変されたイムノグロブリンが知られている(Shinkawa, T. et al. J. Biol. Chem.278:3466-3473. 2003.)。糖鎖の改変によって、イムノグロブリンのADCC（抗体依存性の細胞障害;Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxicity）活性が増強された。あるいは、Fc領域のアミノ酸配列を改変されたイムノグロブリンも公知である。すなわち、イムノグロブリンのFc受容体との結合活性を人為的に高めることによって、ADCC活性が増強された (Shield,RL.et al. J.Biol.Chem. 276;6591-6604, 2001.)。
また、Fc受容体に結合したIgGは、細胞内にいったん取り込まれる。その後、エンドソームに発現したFc受容体と結合して、再び血中に放出される現象が明らかにされている。Fc受容体との結合活性が高いIgGは、細胞に取り込まれた後に再び血中に放出される可能性が高まる。その結果、IgGの血中における滞留期間が延長される(Hinton,PR. et al. J Biol Chem. 279:6213-6216. 2004)。その他、Fc領域のアミノ酸配列の改変は、CDC（補体依存性の細胞障害作用;Complement Dependent Cytotoxicity）活性の変化をもたらすとも言われている。これらの改変を施した抗体を本発明における抗体として用いることができる。【００４９】
たとえばモノクローナル抗体は、当該モノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞から採取することができる。本発明に用いることができるモノクローナル抗体の産生細胞は、たとえばBST2またはそのホモログ、その断片、あるいはそれらを産生する細胞またはその細胞膜分画を免疫原として免疫動物に投与し、その抗体産生細胞をクローニングすることによって取得することができる。より具体的には、本発明に用いる抗体は、たとえば次の工程を含む方法によって得ることができる。
(1)BST2またはそのホモログを免疫原として免疫動物に投与する工程
(2)(1)の免疫動物の抗体産生細胞から、BST2を認識する抗体を産生する抗体産生細胞を選択する工程、
(3)(2)で選択された抗体産生細胞を培養するか、または当該抗体産生細胞が産生する抗体をコードする遺伝子を単離し、この遺伝子を発現可能に保持する細胞を培養する工程、および
(4)(3)の培養物からインターフェロン産生細胞の活性を抑制する抗体を回収する工程。【００５０】
一般的なモノクローナル抗体の製造方法においては、免疫細胞と腫瘍細胞との細胞融合によって得られるハイブリドーマが抗体産生細胞として利用される。本発明における免疫原には、BST2またはそのホモログ、あるいはその断片を用いることができる。免疫原は、それをコードする遺伝子で形質転換した細胞から精製することができる。更に、BST2またはそのホモログを発現している細胞を免疫原として利用することができる。このような細胞としては、具体的には以下のような細胞を示すことができる。これらの細胞の細胞膜分画を免疫原とすることもできる。
−生体から採取されたIPC
−造血幹細胞などから分化誘導されたIPC
−外来性のBST2またはそのホモログ遺伝子を発現可能に保持する細胞
生体からIPCを採取するためには、たとえば先に述べたような細胞表面マーカーの発現プロファイルに基づいて、目的とする細胞を採取すればよい。複数の細胞表面マーカーを指標として特定の細胞を集めるための方法は公知である。たとえば免疫染色とセルソーターを利用することによって、目的とする発現プロファイルに適合する細胞を容易に分取することができる。たとえばヒトのIPCは、BDCA-2陽性細胞を選択することにより、IPCが濃縮される。ヒトから採取されたIPCは、必要に応じて活性化された後に免疫原として利用される。
IPCは、生体の末梢血あるいは造血組織以外に、培養細胞として得ることもできる。たとえばヒトおよびマウスの造血幹細胞を培養し、IPCに分化させることによって大量に得ることができる。ヒトおよびマウス造血幹細胞をin vitroでIPCに分化させるための条件は公知である。【００５１】
たとえば、in vitroにおける造血幹細胞からのヒト(Blom, B. et al.J.Exp.Med. 192: 1785-1796, 2000.; Chen, W. et al. Blood 103: 2547-2553, 2004.)、およびマウス(Gilliert et al 2002, J. Exp. Med. 958-953)のIPCの誘導が報告されている。あるいはin vivoでのマウスIPCの誘導も公知である(Bjorck らのBlood 2001, 3520-3526)。in vitroで分化させたIPCは、IPCを認識するモノクローナル抗体を得るための免疫原として有利である。【００５２】
具体的には、造血幹細胞を含む細胞集団をIPC誘導剤の存在下で培養することにより、IPCへの分化が誘導される。造血幹細胞を含む細胞集団としては、たとえば骨髄細胞を用いることができる。またIPC誘導剤には、FLT-3リガンド、あるいはFLT-3リガンドとトロンボポエチン(TPO)の組み合わせを用いることができる。培地中のFLT-3リガンドの濃度は、通常１〜１００ng/mLとすることができる。その他の培養条件は、一般的な血液細胞の培養条件を応用すればよい。すなわち基礎培地としては、RPMI1640等を用い、更に10%程度の牛胎児血清を加えることができる。あるいはヒトIPCの誘導においては、Yssel's Mediumが用いられた。in vitroにおけるIPCへの分化は、ヒトでは、たとえば２５日前後にピークを迎える。【００５３】
培養された造血幹細胞から、IPCに分化した細胞を取得すれば、免疫原のためのIPCを得ることができる。実際には、いくつかの細胞表面マーカーを利用して、IPCに特徴的な細胞表面抗原を有する細胞を分取する。すなわち、たとえばBDCA-2陽性細胞をヒトIPCとして取得することができる。あるいは、CD11c陽性、CD11b陰性、およびB220陽性の細胞分画をセルソーターで分取しマウスIPCを得ることができる。
あるいは、既にIPC特異的であることが明らかな抗体を利用して、当該抗体陽性の細胞をIPCとして分取することもできる。本発明者らが樹立した、マウスIPC特異抗原を認識するモノクローナル抗体産生細胞2E6(WO 2004/013325, FERM-BP-8445)が産生するモノクローナル抗体を、マウスIPCの分取に利用することができる。【００５４】
IPCは、末梢血から分取することもできる。しかし先に述べたようにIPCの末梢血におけるポピュレーションは極めて低いので、末梢血からIPCを採集するには多量の血液が必要となる。したがって、免疫原とするIPCには、造血幹細胞から分化させた細胞を利用するのが有利である。【００５５】
本発明に用いるモノクローナル抗体の調製においては、IPCのみならず、配列番号：２、配列番号：４、および配列番号：６からなる群から選択されるいずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質、またはその断片を免疫原として利用することもできる。本発明のモノクローナル抗体は、配列番号：２、配列番号：４、および配列番号：６からなる群から選択されるいずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質を抗原として認識していることが明らかにされた。したがって、これらの蛋白質を免疫原として用いることによって、本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。【００５６】
配列番号：２、配列番号：４、および配列番号：６からなる群から選択されるいずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質は、組み換え体として得ることができる。たとえば配列番号：１に記載の塩基配列は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードしている。また配列番号：３に記載の塩基配列は配列番号：４に記載のアミノ酸配列をコードしている。したがって、これらの塩基配列からなるDNAを適当な宿主−ベクターを使って発現させれば、目的とする蛋白質を得ることができる。【００５７】
あるいは、配列番号：２、配列番号：４、および配列番号：６からなる群から選択されるいずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列から選択された連続するアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを免疫原とすることもできる。免疫原として選択すべきアミノ酸配列は、たとえば５−５０、好ましくは７−２０程度のアミノ酸からなる。任意のアミノ酸配列を有するオリゴペプチドを得る方法は公知である。たとえば、化学的にアミノ酸を結合させて、目的とするアミノ酸配列を有するオリゴペプチドを得ることができる。あるいは、上記組み換え体として得られた全長アミノ酸配列を有する蛋白質を切断することによって、所定のアミノ酸配列を有する断片を得ることもできる。得られたオリゴペプチドは、適当なキャリアー蛋白質と結合することによって、より免疫原性を高めることができる。キャリアー蛋白質には、キーホールリンペットヘモシアニンやウシ血清アルブミンなどが用いられる。【００５８】
配列番号：２と、配列番号：４および配列番号：６のアミノ酸配列の大部分は一致している。したがって、共通のアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列を利用することによって、これらの蛋白質の全てを認識するモノクローナル抗体を得ることができる。また３種類の蛋白質のそれぞれについて、２種類が共有するアミノ酸配列を利用することによって、特定の２つの蛋白質を、他の１つと識別することができる。あるいは各アミノ酸配列に固有のアミノ酸配列を利用することによって、各蛋白質を特異的に識別するモノクローナル抗体を取得することもできる。たとえば、配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、N末端から１３９〜１５８のアミノ酸配列は、配列番号：４に固有のアミノ酸配列である。同様に、配列番号：６に記載のアミノ酸配列においては、N末端から９６〜１００のアミノ酸配列が、配列番号：６に固有のアミノ酸配列である。【００５９】
続いて免疫原を、適当な免疫動物に免疫する。IPCは適当なアジュバントとともに免疫動物へ投与することができる。あるいは、配列番号：２、配列番号：４、および配列番号：６からなる群から選択されるいずれかの配列番号に記載の蛋白質、若しくはその部分アミノ酸配列からなるペプチドを、アジュバントとともに免疫動物に投与することができる。【００６０】
更に、配列番号：２、配列番号：４、および配列番号：６からなる群から選択されるいずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列をコードするDNAを発現可能に保持した形質転換細胞を免疫原として利用することができる。たとえば配列番号：１、配列番号：３、および配列番号：５からなる群から選択されるいずれかの配列番号に記載の塩基配列のコード領域を構成する塩基配列を含むDNAは、上記DNAとして好ましい。これらのDNAを適当な発現ベクターに組み込み、宿主細胞を形質転換すれば免疫原として有用な形質転換細胞を得ることができる。【００６１】
免疫原とするための宿主細胞は、免疫動物と同じ種に由来する細胞とすることができる。同種の細胞を用いることにより、外来性の蛋白質に対する特異的な免疫応答を誘導することができる。たとえば、免疫動物にラットを用いるのであれば、ラットに由来する宿主細胞を用いるのが有利である。上記蛋白質を含む形質転換細胞の分画を免疫原として用いることもできる。実施例に示したように、配列番号：２、配列番号：４、および配列番号：６からなる群から選択されるいずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列には、膜貫通ドメインが見られた（図８の膜貫通領域;transmembrane region）。したがって、これらのアミノ酸配列を有する蛋白質は、細胞膜に発現する可能性がある。実際にCOS細胞に発現させた場合には、配列番号：８および配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質は、形質転換体培養物の沈殿分画においてより多くの蛋白質が検出された。したがって、上記蛋白質を発現する細胞の、細胞膜分画を免疫原として利用できる。【００６２】
本発明における免疫動物は、IPCを異物と認識するあらゆる非ヒト脊椎動物を利用することができる。モノクローナル抗体を得るためには、ハイブリドーマとするための融合パートナーの入手が容易な動物が有利である。たとえば、マウス、ラット、ラビット、ウシ、ヤギなどの細胞に由来するハイブリドーマの樹立が確立されている。これらの免疫動物を、本発明に用いることができる。一方アジュバントには、フロイントの完全アジュバントやフロイントの不完全アジュバント等が用いられる。【００６３】
免疫動物は、３〜１０日間隔で複数回免疫される。１回の免疫に用いられるIPCの数は、任意である。通常、１０３〜１０８、たとえば１０６のIPCが免疫される。また蛋白質やペプチドによる免疫においては、一般に１〜１００μgが免疫される。複数回の免疫を経た免疫動物から免疫担当細胞を回収し、目的とする抗体を産生する細胞をクローニングすることにより、本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。免疫担当細胞とは、免疫動物において抗体産生能を有する細胞を言う。【００６４】
免疫担当細胞は、たとえばハイブリドーマ法によってクローニングすることができる。免疫担当細胞は、１つの細胞が１種類の抗体を産生している。したがって、１つの細胞に由来する細胞集団を確立すること（すなわちクローニング）ができれば、モノクローナル抗体を得ることができる。ハイブリドーマ法とは、免疫担当細胞を適当な細胞株と融合させ、不死化する(immortalize)した後にクローニングする方法を言う。ハイブリドーマ法に有用な多くの細胞株が知られている。これらの細胞株は、リンパ球系細胞の不死化効率に優れ、かつ細胞融合に成功した細胞の選択に必要な各種の遺伝マーカーを有している。更に抗体産生細胞の取得を目的とする場合には、抗体産生能を欠落した細胞株を用いることもできる。【００６５】
たとえばマウスミエローマP3x63Ag8.653(ATCC CRL-1580)は、マウスやラットの細胞融合法に有用な細胞株として広く用いられている。本発明においては、マウスのIPCを免疫原としているので、免疫動物はマウス以外の動物となる。一般にハイブリドーマは、同種の細胞の融合によって作成されるが、近縁の異種間でのヘテロハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得することもできる。【００６６】
細胞融合の具体的なプロトコルは公知である。すなわち、免疫動物の免疫担当細胞を適当な融合パートナーと混合し、細胞融合させる。免疫担当細胞には、脾細胞や末梢血B細胞などが用いられる。融合パートナーとしては、先に述べた各種の細胞株を利用することができる。細胞融合には、ポリエチレングリコール法や、電気融合法が用いられる。
次に、融合細胞が有する選択マーカーに基づいて、細胞融合に成功した細胞が選択される。たとえばHAT感受性の細胞株を細胞融合に用いた場合には、HAT培地において成育する細胞を選択することによって、細胞融合に成功した細胞が選択される。更に選択された細胞が産生する抗体が、目的とする反応性を有していることを確認する。【００６７】
各ハイブリドーマは、抗体の反応性に基づいて、スクリーニングされる。すなわち、BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方に結合する抗体を産生するハイブリドーマが選択される。好ましくは、選択されたハイブリドーマをサブクローニングし、最終的に目的とする抗体の産生が確認された場合に、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして選択する。【００６８】
具体的には、たとえば配列番号：２、配列番号：４、および配列番号：６からなる群から選択されるいずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質や、その部分アミノ酸配列からなるペプチドを抗原としてスクリーニングすることができる。抗原を適当な固相に結合し、抗原に結合するモノクローナル抗体を、免疫動物のイムノグロブリンを認識する標識抗体によって検出することができる。マイクロプレートの内壁に抗原を結合させ、酵素標識抗体を使ったELISA法を利用すれば、モノクローナル抗体を迅速にスクリーニングすることができる。抗原に対する結合活性が確認されたモノクローナル抗体は、必要に応じて実際にIPCの活性に与える影響が確認される。IPCに対する影響は、たとえば後に述べるような方法によって確認することができる。【００６９】
このようなモノクローナル抗体は、当該ハイブリドーマから抗体の抗原結合領域をコードするcDNAを取得し、これを適当な発現ベクターに挿入することによって発現させることができる。抗体の可変領域をコードするcDNAを取得し、適当な宿主細胞に発現させる技術は公知である。また抗原結合領域を含む可変領域を、定常領域と結合させることによってキメラ抗体とする手法も公知である。【００７０】
更に、モノクローナル抗体の抗原結合活性を他のイムノグロブリンに移植することもできる。イムノグロブリンの抗原結合領域は、相補性決定領域（CDR)と、フレーム領域で構成されている。各イムノグロブリンの抗原結合特性はCDRによって決定されており、フレームは抗原結合領域の構造を維持している。CDRのアミノ酸配列がきわめて多様性に富むのに対して、フレーム部分のアミノ酸配列は高度に保存されている。CDRを構成するアミノ酸配列を他のイムノグロブリン分子のフレーム領域に組み込むことによって、抗原結合活性も移植できることが知られている。この方法を利用して、異種のイムノグロブリンが有する抗原結合特性をヒト・イムノグロブリンに移植する方法が確立されている。【００７１】
このようにして作成されたモノクローナル抗体はいずれも本発明に利用することができる。すなわち、当該モノクローナル抗体の抗原結合領域をコードするcDNAに由来するポリヌクレオチドによってコードされた抗原結合領域を含むイムノグロブリンからなるモノクローナル抗体を本発明に利用することができる。
本発明に利用することができるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして、たとえば、ハイブリドーマ3D3#7あるいは3G7#6を示すことができる。ハイブリドーマ3D3#7およびハイブリドーマ3G7#6は、２００５年５月２７日付けで独立行政法人産業技術総合研究所内特許生物寄託センターに対して、受託番号FERM BP-10339および受託番号FERM BP-10340として寄託されている。以下に、寄託を特定する内容を記載する。
(a)寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号中央第６（郵便番号305-8566）
(b)寄託日：２００５年５月２７日
(c)受託番号：BP-10339 （ハイブリドーマ3D3#7）
(c)受託番号：BP-10340 （ハイブリドーマ3G7#6）【００７２】
本発明に利用するためのモノクローナル抗体は、それを産生するハイブリドーマを培養しその培養物から回収することができる。ハイブリドーマは、in vitroまたはin vivoで培養することができる。in vitroにおいては、RPMI1640などの公知の培地を用いて、ハイブリドーマを培養することができる。培養上清には当該ハイブリドーマが分泌したイムノグロブリンが蓄積される。したがって、培養上清を採取し、必要に応じて精製することにより、本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。培地には、血清を添加しない方が、イムノグロブリンの精製が容易である。しかし、ハイブリドーマのより迅速な増殖と、抗体産生の促進を目的として、１０%程度のウシ胎児血清を培地に加えることもできる。【００７３】
ハイブリドーマは、in vivoにおいて培養することもできる。具体的には、ヌードマウスの腹腔にハイブリドーマを接種することにより、腹腔内でハイブリドーマを培養することができる。モノクローナル抗体は、腹水中に蓄積する。したがって、腹水を採取し、必要に応じて精製すれば、必要なモノクローナル抗体を得ることができる。得られたモノクローナル抗体は、目的に応じて適宜、修飾、あるいは加工することができる。【００７４】
BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方に結合する抗体は、IPCに接触させるとその活性を抑制する。したがってこれらの抗体を、本発明におけるIPCの活性抑制剤に利用することができる。すなわち本発明は、下記(a)-(c)からなる群から選択される少なくとも１種類の成分を有効成分として含む、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤を提供する。あるいは本発明は、下記(a)-(c)からなる群から選択される少なくとも１種類の成分を投与する工程を含む自己免疫疾患を伴う関節炎の治療方法に関する。更に本発明は、下記(a)-(c)からなる群から選択される少なくとも１種類の成分の自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤の製造における使用に関する。
(a)BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方に結合する抗体、またはその抗原結合領域を含む断片
(b)(a)の抗体の相補性決定領域を移植したイムノグロブリン、またはその抗原結合領域を含む断片、および
(c)(a)または(b)に記載の成分をコードするポリヌクレオチド
本発明において、IPCの活性を抑制するモノクローナル抗体としては、配列番号：２、配列番号：４、および配列番号：６からなる群から選択されるいずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識するモノクローナル抗体を利用することができる。【００７５】
抗体がIPCのIFN産生活性の抑制作用を有することは次のようにして確認することができる。IPCはウイルスの刺激によってIFNを大量に産生する。IPCに対するウイルス刺激の前、後、あるいはウイルス刺激と同時に抗体を与え、抗体を与えないIPCを対照として、IFNの産生能を比較する。IFN産生能は、IPCの培養上清中に含まれるIFN-αやIFN-βを測定することによって評価することができる。比較の結果、抗体の添加によって、上清中のIFNの量が有意に低下すれば、試験された抗体は、IFN産生能を抑制する作用を有することが確認できる。これらIFNの測定方法は公知である。IPCは、生体におけるIFNの大部分を産生する細胞である。したがって、IPCのIFN産生能の抑制によって、生体のIFNの産生状態を調節することができる。【００７６】
本発明において、IPC活性にはIPCの細胞数の維持が含まれる。したがって本発明におけるIPCの活性の抑制は、IPCの細胞数の抑制を含む。IFN産生と同様に、感染性のウイルスなどの刺激によってIPCの活性化が誘導される。活性化されたIPCの細胞数が、抗体の存在下で抑制されることを確認すれば、当該抗体がIPCの活性を抑制していることがわかる。比較対照としては、IFN産生と同様に、活性を確認すべき抗体と同じ動物種に由来する不活性なイムノグロブリンを用いることができる。IPCの細胞数は、細胞の計数によって定量的に比較することができる。細胞数は、FACSや顕微鏡によって計数することができる。【００７７】
BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方を認識する抗体を、その抗体が由来する生物種とは異なる宿主に投与する場合には、当該宿主にとって異物と認識されにくい形に加工するのが望ましい。たとえば、次のような分子に加工することにより、イムノグロブリンを異物として認識されにくくすることができる。イムノグロブリン分子を以下のように加工する手法は公知である。
−定常領域を欠失した抗原結合領域を含む断片(Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, third edition, Academic Press Limited. 1995; Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996)
−モノクローナル抗体の抗原結合領域と宿主のイムノグロブリンの定常領域とで構成されるキメラ抗体(遺伝子発現実験マニュアル  講談社  1994年  （石田  功、安東  民衛  編）)
−宿主のイムノグロブリンにおける相補性決定領域(CDR)をモノクローナル抗体のCDRに置換したCDR置換抗体(遺伝子発現実験マニュアル  講談社  1994年  （石田  功、安東  民衛  編）)【００７８】
あるいはヒト抗体遺伝子を組み込まれた非ヒト動物を免疫動物として用いることにより、非ヒト動物を用いながら、ヒト抗体を得ることができる。たとえば、ヒト抗体遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウスが、ヒト抗体を製造するための免疫動物として実用化されている(Ishida et al., Cloning and Stem Cells, 4:85-95,2002)。このような動物を用いることにより、ヒトのBST2を抗原として、BST2を認識するヒト抗体を得ることができる。ヒト抗体は、ヒトに投与する抗体として好ましい抗体である。【００７９】
あるいは、ファージディスプレー法(McCafferty J. et al., Nature 348:552-554,1990; Kretzschmar T et.al., Curr Opin Biotechnol. 2002 Dec;13(6):598-602.)によって、ヒトのイムノグロブリン可変領域遺伝子を取得することもできる。ファージディスプレー法においては、ヒトイムノグロブリン可変領域をコードする遺伝子がファージ遺伝子に組み込まれる。多様なイムノグロブリン遺伝子をソースとして、ファージライブラリーを作成することもできる。ファージは自身を構成する蛋白質の融合蛋白質として、当該可変領域を発現する。ファージによって発現されたファージ表面の可変領域は、抗原との結合活性を維持している。したがって、抗原あるいは抗原を発現した細胞などに結合するファージを選択することによって、ファージライブラリーから、目的とする結合活性を有する可変領域を発現したファージをスクリーニングすることができる。更に、こうして選択されたファージ粒子の中には、目的とする結合活性を有する可変領域をコードする遺伝子が保持されている。すなわち、ファージディスプレー法においては、可変領域の結合活性を指標として、目的とする結合活性を有する可変領域をコードしている遺伝子を取得することができる。【００８０】
本発明による自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤、または治療方法において、BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方を認識する抗体またはその断片、あるいはその少なくとも抗原結合領域を含む抗体は、蛋白質として、あるいはそれをコードするポリヌクレオチドとして、投与することができる。ポリヌクレオチドを投与するには、目的とする蛋白質を発現できるように、適当なプロモーターの制御下に目的とする蛋白質をコードするポリヌクレオチドを配置したベクターを利用するのが望ましい。ベクターには、エンハンサーやターミネーターを配置することもできる。イムノグロブリンを構成する重鎖と軽鎖の遺伝子を保持し、イムノグロブリン分子を発現することができるベクターが公知である。
イムノグロブリンを発現することができるベクターは、細胞に導入することにより投与することができる。生体への投与にあたっては、生体への投与によって細胞に感染させることができるものはそのまま投与することができる。あるいは、いったん生体から分離したリンパ球にベクターを導入して再び生体に戻すこともできる(ex vivo)。 【００８１】
本発明に基づく自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤、または治療方法において、生体に投与されるモノクローナル抗体の量は、イムノグロブリンとして体重１kgあたり、通常０．５mg〜１００mg、たとえば１mg〜５０mg、好ましくは２mg〜１０mgである。生体への抗体の投与間隔は、治療期間中の生体内におけるイムノグロブリンの有効濃度が維持できるように適宜調節することができる。具体的には、たとえば、１〜２週間間隔で投与することができる。投与経路は、任意である。当業者は、治療に際して効果的な投与経路を適宜選択することができる。具体的には、経口的に、あるいは非経口的な投与を示すことができる。たとえば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、あるいは皮下注射等により、全身あるいは局所に抗体を投与することができる。本発明における非経口投与に適当な製剤として、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。また細胞に与える場合には、培養液中に通常１μg/mL、好ましくは１０μg/mL以上、より好ましくは５０μg/mL以上、更に好ましくは０．５mg/mL以上のイムノグロブリンを与える。【００８２】
本発明の自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤、または治療方法において、モノクローナル抗体は、任意の方法により生体に投与することができる。通常モノクローナル抗体は、薬学的に許容される担体と配合される。モノクローナル抗体には、必要に応じて増粘剤、安定剤、防腐剤および可溶化剤などの添加剤を配合することができる。このような担体または添加剤としては、ラクトース、クエン酸、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、スクロース、デンプン、タルク、ジェラチン、寒天、植物油、エチレングリコールなどが挙げられる。「薬学的に許容される」という用語は、各国政府の監督当局により承認されているか、または各国の薬局方もしくは一般的に認知されている薬局方に動物、哺乳動物、および特にヒトへの使用に関して列記されていることを言う。本発明の自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤は、1回または複数回の用量の凍結乾燥粉末または錠剤の形態で供給することもできる。凍結乾燥粉末または錠剤には、更に、投与の前に該組成物を所望の濃度となるように溶解するための注射用の滅菌済みの水、生理的食塩水または緩衝液を組み合わせることもできる。【００８３】
更に、イムノグロブリンを発現するベクターとして投与する場合には、重鎖と軽鎖を別のプラスミドとしてコトランスフェクトするとして、体重１kgあたり各プラスミドを０．１〜１０mg、たとえば１〜５mgを投与することができる。またin vitroにおいて細胞に導入するためには、１〜５μg/106cellのベクターが用いられる。【００８４】
更に本発明は、次の工程を含む被験化合物の自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果の検出方法に関する。
(1) インターフェロン産生細胞とインターフェロン産生細胞のインターフェロン産生誘導物質を、以下のi)-iii)のいずれかの順序で接触させる工程、
i) 被験化合物とインターフェロン産生細胞を接触後に、インターフェロン産生を誘導する細胞刺激剤をインターフェロン産生細胞に接触させる、
ii)被験化合物とインターフェロン産生を誘導する細胞刺激剤を同時にインターフェロン産生細胞に接触させる、または
iii)インターフェロン産生を誘導する細胞刺激剤をインターフェロン産生細胞に接触させた後に、被験化合物とインターフェロン産生細胞を接触させる
(2) インターフェロン産生細胞の活性を測定する工程、および
(3) 対照と比較して、インターフェロン産生細胞の活性が抑制されたとき、被験化合物の自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果が検出される工程【００８５】
本発明の方法において、細胞刺激剤とはIPCの活性化およびインターフェロン産生を誘導しうる物質を言う。たとえば、ウイルスやウイルスの構成成分を、細胞刺激剤として示すことができる。具体的には、単純ヘルペスウイルス(Herpes simplex virus;HSV)、あるいはインフルエンザウイルス(Influenza virus)などのウイルスの投与によりIPCが活性化することが知られている。その他、バクテリア中のDNAであるCpGのIPC活性化作用も公知である。これらの細胞刺激剤は、単独で用いても良いし、異なる細胞刺激剤を組み合わせて用いることもできる。細胞刺激剤と被験化合物とは同時にIPCに接触させても良いし、細胞刺激剤との接触の前あるいは後にIPCと被験化合物を接触させることもできる。【００８６】
本発明において、細胞刺激剤、IPC、および被験化合物は、生体外(in vitro)、生体内(in vivo)、あるいはex vivoにおいて接触させることができる。生体外(in vitro)においては、IPCを培養可能な条件下で、先に述べたような任意の順番で細胞刺激剤および被験化合物をIPCと接触させることができる。また生体内(in vivo)においては、生体内のIPCに対して、被験化合物あるいは細胞刺激物質を投与した後に、IPCを採取する。採取されたIPCを生体外において細胞刺激物質あるいは被験化合物に接触させた後、細胞の活性化のレベルを評価することができる。細胞の活性化のレベルは、細胞が産生するIFNの濃度の変化などによって評価することができる。
更にex vivoでの評価においては、生体外で調製されたIPCに対して、細胞刺激剤または被験化合物を接触させる。接触後のIPCを生体に投与し、更に被験化合物または細胞刺激剤を投与する。生体内におけるIPCの活性化のレベルを評価し、被験化合物の作用が評価される。IPCの活性化のレベルは、たとえば血中のIFNのレベルを指標として評価することができる。なお生体外におけるIPCの調製とは、生体からIPCを採取すること、あるいはIPCの前駆細胞の分化誘導によって人工的にIPCを調製することを言う。【００８７】
なお本発明の方法における対照としては、被験化合物に代えて自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果が予め知られている物質を用いることができる。たとえば、生理食塩水は治療効果の無い物質である。あるいは自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果を有することが確認されている物質を対象として用い、その物質との相対的な比較によって被験化合物の作用を評価することもできる。【００８８】
本発明による自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果の検出方法において、IPCの活性とは、たとえばIFNの産生レベル、およびIPCの数の、いずれか、または両方を言う。特に好ましい活性は、IPCによるIFNの産生能である。IPCのIFN産生能は、細胞の培養物中に含まれるIFNの量、あるいは濃度を決定することによって比較することができる。各種のIFNを測定するための試薬、あるいはキットが市販されている。あるいは、IPCの細胞数は、IPCの培養物中に存在する細胞数を計数することによって比較することができる。細胞数は、IPCの細胞表面抗原を認識する抗体を使ったFACSによって明らかにすることができる。IPCの細胞表面抗原には、たとえばBST2やBDCA-2などを利用することができる。その他、CD4並びにCD123を、IPCを計数するためのマーカーとすることもできる。【００８９】
本発明において、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果を検出するために必要な試薬には、更にIPCを活性化するための細胞刺激剤、IPCの培養のための培地や培養容器などを組み合わせることもできる。また、IPCの活性化作用に与える影響が明らかな物質を対照として組み合わせることもできる。【００９０】
更に本発明の自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果を測定する方法を利用して、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤の候補化合物のスクリーニング方法が提供される。すなわち本発明は、次の工程を含む、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果を有する被験化合物のスクリーニング方法に関する。
(1)本発明の自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果を測定する方法によって、被験化合物が有している自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果を測定する工程、および
(2)対照と比較して前記効果が大きい被験化合物を選択する工程
本発明のスクリーニング方法に用いる被験化合物としては、IPCの細胞表面抗原を認識する抗体、その少なくとも抗原結合領域を含む抗体、あるいはその可変領域を含む断片を用いることができる。抗体として、可変領域を発現させたファージライブラリーを用いることもできる。あるいは、コンビナトリアルケミストリーにより合成された化合物標品のほか、動・植物組織の抽出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、またそれらから精製された標品などを候補化合物として用いることもできる。【００９１】
本発明に基づいて、IPC表面抗原を認識する抗体の、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果を見出すためには、たとえば次の工程を含む検出方法を実施することができる。
(1) インターフェロン産生細胞とインターフェロン産生細胞のインターフェロン産生誘導物質を、以下のi)-iii)のいずれかの順序で接触させる工程、
i) 抗体とIPCを接触後に、IFN産生を誘導する細胞刺激剤をIPCに接触させる、
ii)抗体とIFN産生を誘導する細胞刺激剤を同時にIPCに接触させる、または
iii)IFN産生を誘導する細胞刺激剤をIPCに接触させた後に、抗体とIPCを接触させる
(2) IPCの活性を測定する工程、および
(3) 対照と比較して、IPCの活性が抑制されたとき、抗体の自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果が検出される工程
本発明に基づく、抗体の自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果の検出方法は、更に当該活性を有する抗体のスクリーニング方法を可能とする。すなわち本発明は、以下の工程を含む、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果を有する抗体のスクリーニング方法に関する。
(1)本発明の自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果を測定する方法によって、抗体が有している自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果を測定する工程、および
(2)対照と比較して前記効果が大きい抗体を選択する工程
本発明の検出方法並びにスクリーニング方法において、抗体とは、天然のイムノグロブリン分子、その抗原結合領域を含む断片、アミノ酸配列や糖鎖が修飾された変異体、および化学的な修飾を施した誘導体が含まれる。抗体の抗原結合領域を含む断片は、イムノグロブリンを酵素的に消化することによって得ることができる。あるいは、当該領域をコードする遺伝子を単離し、適当な発現系において発現させることにより、遺伝子工学的に得ることもできる。このようなイムノグロブリンの組み換え体として、たとえばファージ抗体ライブラリーを示すことができる。一方、IPCおよび細胞刺激剤は、先に示したようなものを利用することができる。【００９２】
IPCに対する刺激はIFNの産生を誘導することから、その活性化の調節によってIFN産生を調節することができる。そして本発明者らは、IPCの活性の抑制を通じて、RAの治療効果を得られることを明らかにした。したがって、IPCの活性を抑制することができる物質はRAの治療剤として用いることができる。すなわち、本発明のスクリーニング方法によって選択することができる化合物は、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤として有用である。【００９３】
本発明のスクリーニング方法において、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果を有することが明らかな物質を接触させたIPCを対照として用いれば、この物質よりも治療効果の大きい物質を見出すことができる。IPCは生体中のIFNの大部分を産生する重要な細胞である。したがって、本発明のスクリーニング方法によって得ることができる化合物は、免疫バランスの調節による自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤として重要である。あるいは、本発明のスクリーニング方法によって得ることができる化合物は、免疫バランスの調節による自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤の製造に使用することができる。【００９４】
本発明のスクリーニングによって選択された化合物を、必要に応じて、IPC以外の様々な細胞に接触させることにより、他の細胞に対する作用を確認することができる。IPC以外の細胞に対して顕著な増殖抑制や細胞障害作用が検出されなければ、その化合物は安全な治療薬として使用できる可能性が高まる。あるいは、特定の細胞に対する障害作用が確認された場合であっても、局所投与など、投与形態を選択することにより、治療薬として利用できる可能性はある。更に、リウマチモデル動物などに投与して、より詳細にRAの治療効果を評価することができる。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。
【実施例１】
【００９５】
モノクローナル抗体作成プロトコール
免疫原とする細胞は以下のようにして調製した。Balb/cマウス雌（4〜6週令）の骨髄細胞を、10ng/mlのFLT-3リガンド（R&D Systems社製）を添加した10％FCS-RPMI1640培地〔10％牛胎児血清（FCS）、およびペニシリン、ストレプトマイシンを含むRPMI1640培地〕にて10日間培養した。10日後、IPC（Interferon producing cell）を、CD11c陽性、CD11b陰性、B220陽性分画としてセルソーター（FACSVantage, Becton Dickinson社製）で分離した。抗体はBecton Dickinson社製のものを用いた。
上記の分離した細胞を、0、4、11日目に、片足あたり1x106個ずつ、完全フロインドアジュバント（CFA:ヤトロン社製）と共にラットのフットパッド（foot pad）へ注入した。12日目に免疫ラットのリンパ節を分離し、リンパ球を採取した。マウスのミエローマ細胞P3x63Ag8.653とラットのリンパ球を４：５の割合で混合し、ポリエチレングリコール（PEG）を加えて細胞を融合した。融合後の細胞を十分に洗浄してHAT培地に分散させ、1ウェルあたり5x104個の細胞を含むように96 well plateにまいた。【００９６】
細胞が増殖したウェルの細胞を回収して希釈して、その培養上清をマウス脾臓細胞、及び培養骨髄細胞に対する反応性を指標としてスクリーニングした。スクリーニング方法の詳細は実施例２のとおりである。陽性反応を示したウェルの細胞を限外希釈によりクローニングし、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを確立した。更に、ハイブリドーマの培養上清、あるいはハイブリドーマをマウスの腹腔内に移植して得られた腹水より精製された抗体の反応性を解析した。
【実施例２】
【００９７】
培養上清のスクリーニング
Balb/cマウス雌（4〜6週令）の骨髄細胞を、10ng/mlのFLT-3リガンドを添加した10％FCS-RPMI1640培地にて10日間培養した。10日目には約40％の細胞がIPCになった。この細胞を用い、ハイブリドーマ培養上清を１次抗体とし、2次抗体にFITC標識抗ラットIg抗体（BD Pharmingen社製）を用いて染色した。その後、各種抗体（CD11b、CD11c、CD3、CD19、CD45RB、B220、Ly6C；いずれもBecton Dickinson社製）により二重染色し、フローサイトメトリー法により解析（FACS解析）した。【００９８】
培養上清陽性分画、陰性分画をそれぞれR2、R3とし各々のGate内での各種抗原の発現をヒストグラムで示した（図１）。作成した数種類の抗体によって染色される細胞群は、文献上で定義されているマウスIPC（Nature Immunol., 2001; 2, 1144-1150.）の細胞表面抗原プロファイルが一致した。したがって、これらの抗体はマウスIPCに特異的に結合する抗体であると考えられた。
【実施例３】
【００９９】
抗体で分離した細胞の形態
実施例２と同様に培養した骨髄細胞を、培養上清を1次抗体とし、2次抗体にFITC標識抗ラットIg抗体を用いて染色した。その後、セルソーター（FACSVantage, Becton Dickinson社製）を用いて陽性細胞を分離した。サイトスピン後、ギムザ染色し、顕微鏡下にて観察したところ、IPCに特異的な形態を示した（図２a）。すなわち、この細胞の形は丸く、大きな核を有していた。【０１００】
1x105個の細胞を96 well 丸底プレートにてインフルエンザウイルスPR8と共に24時間37℃にて培養し、同様にギムザ染色した後、顕微鏡下にて観察したところ、形態的に典型的な樹状細胞に分化した（図２ｂ）。この結果から、上記抗体によって分離された細胞は、ウイルス感染によって樹状細胞に分化するというマウスIPCの特徴を有していることが確認された。このようなマウスIPC特異的なモノクローナル抗体およびその抗体を産生するハイブリドーマのうち、SNK01を選択して以降の実験に用いた。
【実施例４】
【０１０１】
抗体で分離した細胞のインターフェロン産生能
実施例２と同様に培養した骨髄細胞をSNK01培養上清および2次抗体で染色後、セルソーターにて陽性、陰性細胞を分離した。各々の分画の細胞、1x105個ずつを96 well 丸底プレートに分注し（100μl/well）、インフルエンザウイルスPR8を感染させ、24時間後の培養上清中のIFNαの濃度を以下のようなELISA法にて測定した。【０１０２】
まずラット抗マウスIFNα抗体（PBL Biomedical Laboratory社製）を96 wellプレートに4℃で一晩反応させ、プレートコートした。プレートを洗浄後、培養上清100μlを添加し、4℃で一晩反応させた。プレートを洗浄後、IFNαとIFNβを認識する標識化抗インターフェロン抗体を添加し、1時間反応させて、検出を行った。それぞれの反応は3連で行い、平均値を求めた。検量線を作成することにより、培養上清中のIFNα濃度を算出した。
SNK01陽性細胞では、陰性細胞に比べて、高いインターフェロンの産生が認められた。すなわち、モノクローナル抗体SNK01が認識する抗原はIPCに特異的な表面抗原であることが確認できた（図３）。
【実施例５】
【０１０３】
抗体のマウスインターフェロン産生能への影響
実施例２と同様に培養したマウス骨髄細胞を1x105個ずつ、96 well丸底プレートに分注した。これにSNK01抗体、またはコントロール抗体であるラットIgGを添加し、37℃にて30分間培養後、インフルエンザウイルスPR8を添加し、37℃にて24時間培養し、培養上清中のIFNαを上記実施例４に示したELISAにより測定した（図４）。その結果、SNK01は濃度依存的にIFNαの産生を抑制した。すなわち、この抗体のマウスIPCに与える作用は、特異的な作用であると考えられた。
【実施例６】
【０１０４】
抗体が認識する分子のクローニング
１） IPC-cDNAライブラリーの作製
実施例２と同様にFLT-3リガンドで骨髄細胞から誘導したIPCより全RNAをフェノール-グアニジン法により抽出し、oligo-dTカラムによりmRNAを精製した。精製したmRNAからGubler-Hoffman法によりcDNAを合成し、両端にEcoRI-NotIアダプター(インビトロジェン社製)を結合後、スパンカラム（クロマスピン400、クロンテック社製）により未反応のEcoRIアダプターおよび500塩基以下の短いcDNAを除去した。得られた両端にEcoRIサイトを有するcDNAを動物細胞用発現用ベクターpME18s (XhoI断片を除いたもの)のEcoRIサイトにT4リガーゼにより結合し、大腸菌DH10（インビトロジェン社製）にエレクトロポーレーション法により形質転換した。これを100μg/mlのカルベニシリンを含むLB培地（LB・カルベニシリン）500mlで30℃で一晩培養し、QIA filter plasmid maxi kit (Qiagen社製)により 同キットのプロトコールに従ってplasmidを抽出、精製し、IPC-cDNAライブラリーを得た。【０１０５】
２）COS7細胞による発現クローニング
COS7細胞を6cmディシュに5x105個ずつ10枚まき、37℃、5％CO2存在下で20時間培養後、Effectene trasfection Reagent(Qiagen社製)により同製品のプロトコールに従い、上記１）で取得したIPC cDNAライブラリーをtransfectionした。48時間、37℃、5％CO2下で培養後、PBS（Phosphate Buffered Saline）で洗浄、PBS/5mM EDTAで細胞をディシュから剥離し、さらにPBSで洗浄後、セルストレナー（70μm, ファルコン社製）を通した。遠心後（1300rpm, 5分）上清を除去し、PBS/ 0.5%BSA/2mM EDTAを１ml添加して懸濁し、Fc block (ファーミンジェン社製) 40μlを加え4℃で20分間置いた。これにビオチン化したSNK01抗体30〜50μgを加え、氷上で30分間保持した。PBSで洗浄後、100μlのＰＢＳに懸濁し、ストレプトアビジンマイクロビーズ（Miltenyi Biotec社製）10-20μlを加え10℃で15分静置した。PBS/ 0.5%BSA/2mM EDTAで洗浄することにより過剰なストレプトアビジンマイクロビーズを除去し、１mlのPBS/ 0.5%BSA/2mM EDTAに懸濁した。AutoMACS（Miltenyi Biotec社製）でposseldsの条件で細胞を分取した。改良Hirt法（BioTechniques Vol.24,760-762,1998）によりplasmidを抽出、精製した。得られたplasmidを大腸菌DH10にエレクトロポーレーション法により形質転換し、LB・カルベニシリン100mlで30℃で一晩培養し、QIA filter plasmid midi kit (Qiagen社製)により 同キットのプロトコールに従ってplasmidを抽出、精製した。【０１０６】
以上の操作を１クールとして、この後同じ操作を４回繰り返し、SNK01抗体に反応する抗原をコードするplasmidを濃縮した。最後に、AutoMACSのかわりにセルソーター（FACSVantage, Becton Dickinson社製）により陽性細胞を分取し、これらより抽出したplasmidを形質転換した大腸菌DH10を適量LB・カルベニシリンプレートに塗布した。30℃で一晩培養し、現れたコロニーを30個ピックアップし、それぞれよりplasmidを抽出、COS7細胞にtransfectionし、SNK01抗体を用いてFACS解析することにより陽性plasmidを選抜した。【０１０７】
得られたplasmid上にクローン化されているcDNAの塩基配列を決定し、マウス遺伝子データベースに登録されている塩基配列情報とblastサーチすることにより、その遺伝子を決定した。また、同時にヒト遺伝子データベースをサーチすることによりそのカウンターパートを同定した。
その結果モノクローナル抗体SNK01が結合したクローンは、配列番号：７および、配列番号：９に記載の塩基配列を有していた。これらの塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を、配列番号：８および配列番号：１０に示した。
配列番号：９に記載の塩基配列は、マウスBST2として既知の塩基配列であった(GenBank Acc#.BC027328)。一方、配列番号：７に記載の塩基配列は、配列番号：９の塩基配列と部分的に同一の塩基配列を有していたが、3’末端側に異なる塩基配列が見られ、異なるアミノ酸配列をコードしていた。すなわち、配列番号：８に記載のアミノ酸配列のうち、N末端から139位までのアミノ酸配列は、配列番号：１０に記載されたアミノ酸配列と一致した。そして配列番号：８に記載のアミノ酸配列において、N末端から140〜178番目のアミノ酸は、配列番号：８に記載のアミノ酸配列に固有の配列であった。両者はオータナティブスプライシングによって生じたバリアントであると考えられた。これらの知見に基づいて、配列番号：７に記載の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号：８）からなるタンパク質は、マウスBST2の新規なスプライシングバリアントであると考えられた。以下、配列番号：７に記載の塩基配列からなる遺伝子をmBST2H、配列番号：９に記載の塩基配列からなる遺伝子をmBST2Dとも称する。（図７(ａ)）     【０１０８】
３）FACSによる確認
上記発現クローニング法により得られたプラスミドをQIA filter plasmid midi kit (Qiagen社製)により再度大腸菌より高度に精製し、もう一度COS7細胞にtransfectionした。48時間後、定法に従って、SNK01抗体およびFITC標識抗ラットIg抗体で反応させ、FACS解析を行うことで、plasmid上にクローン化されているcDNAが、抗原をコードしているかどうかを確認した。
その結果、上記モノクローナル抗体SNK01は、プラスミドを導入したCOS7細胞に対する結合が観察された。したがって、プラスミド上にクローン化されているcDNAは、いずれもこのモノクローナル抗体によって認識された抗原をコードしていることが確認された。
【実施例７】
【０１０９】
ウエスタンブロティング法による抗体の反応性の確認
前記モノクローナル抗体が、配列番号：８または配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識し結合することを、ウエスタンブロッティング法によって確認した。配列番号：８または配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を遺伝子組み換え体として発現させ、本発明のモノクローナル抗体との反応性を確認した。具体的な操作は次のとおりである。【０１１０】
１）pcDNA3.1-mBST2DおよびpcDNA3.1-mBST2Hの構築
クローニングしたmBST2DおよびmBST2Hをコードするplasmid(1μg)を鋳型として、PCRにより配列番号：７または配列番号：９に記載の塩基配列を有するDNAを増幅した。PCRに用いたプライマーの塩基配列は次のとおりである。
forward primer（配列番号：１１）:
5'-tttttgctagcgacggatcacatggcgccctctttctatcactatctgcccgtgcccatggatgagatgggggggaagcaagga-3'
reverse primer（配列番号：１２）
5'-tttttttctcgagtcctcaaaagagcaggaacagtgac-3'
また反応液の組成は以下のとおりである。
1ＸGC bufferI,
dNTP mix (0.25 mM ),
LA Taq DNA polymerase 5U(以上タカラバイオ製)/100μL
forward primer (1 pmol):
reverse primer (1 pmol)【０１１１】
９５℃で１分インキュベート後、［９５℃３０秒／５５℃３０秒／７２℃１分３０秒］を１サイクルとして、２５回の条件でPCRを行った。アガロースゲル電気泳動にて目的の大きさのDNA断片が増幅されていることを確認後、フェノールクロロフォルム抽出、エタノール沈殿後、回収した増幅産物をTE buffer 10 μLに溶解した。これを制限酵素Nhe IおよびXho I (タカラバイオ製)で切断後、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製)を用いてアガロースゲル電気泳動により精製し、エタノール沈殿後、TE buffer ４μLに溶解した。
一方、哺乳動物細胞発現plasmid pcDNA3.1（インビトロジェン社製）5μgを制限酵素Nhe IおよびXho Iで消化、CIAP (タカラバイオ製)処理後、アガロースゲル電気泳動により精製し、エタノール沈殿後、TE buffer ４ μLに溶解した。前述のDNA断片それぞれ２μLと、このplasmid 0.5μLをligation kit ver.II (タカラバイオ製)を用いて連結し、大腸菌DH5に形質転換した。
LB培地（１００μg/mlアンピシリン）にて３７℃で一晩培養後、出現したコロニー数個を選び、QIAprep Spin miniprep kit(QIAGEN社製)を用いてplasmidを抽出した。抽出されたプラスミドに挿入されているDNA断片の塩基配列を定法に従って決定した。配列番号：８または配列番号：１０に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片が挿入されているプラスミドであることを確認し、目的の構築物pcDNA3.1-mBST2DおよびpcDNA3.1-mBST2Hを得た。【０１１２】
２）pcDNA3.1-mBST2D-HisおよびpcDNA3.1-mBST2H-Hisの構築
pcDNA3.1-mBST2D（pcDNA3.1-mBST2D-His構築の場合）あるいはpcDNA3.1-mBST2H（pcDNA3.1-mBST2H-His構築の場合）1μgを鋳型として、PCRによりHisタグをコードする塩基配列を付加した。PCRに用いたプライマーの塩基配列は次のとおりである。なおforward primer（配列番号：１３）は、pcDNA3.1-mBST2D-HisとpcDNA3.1-mBST2H-Hisに同じものを用いた。反応液の組成と温度サイクルの条件は１）と同様とした。
forward primer（配列番号：１３）:
5'-ccagctcacccgcacccaggacagtc-3'
reverse primer（pcDNA3.1-mBST2D-His用、配列番号：１４）:
5' -tttttttctcgagtcaatgatgatgatgatgatgaaagagcagaaacagtgacactttga-3'
reverse primer（pcDNA3.1-mBST2H-His用、配列番号：１５）:
5'-tttttttctcgagtcaatgatgatgatgatgatggaagtctccttttggatcctgagctg-3'【０１１３】
アガロースゲル電気泳動にて目的の大きさのDNA断片が増幅されていることを確認後、フェノールクロロフォルム抽出、エタノール沈殿後、TE buffer 10 μLに溶解した。これを制限酵素BamH IおよびXho I (タカラバイオ製)で切断後、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製)を用いてアガロースゲル電気泳動により精製し、エタノール沈殿後、TE buffer ４ μlに溶解した。
一方、pcDNA3.1-mBST2D およびpcDNA3.1-mBST2H 5μgを制限酵素BamH IおよびXho Iで消化、CIAP (タカラバイオ製)処理後、アガロースゲル電気泳動により精製し、エタノール沈殿後、TE buffer ４ μLに溶解した。PCRで増幅されたDNA断片それぞれ２μLとこれらのplasmid 0.5μLをligation kit ver.II (タカラバイオ製)を用いて連結し、大腸菌DH5に形質転換した。
LB培地（１００μg/mlアンピシリン）にて３７℃で一晩培養後、出現したコロニー数個を選び、QIAprep Spin miniprep kit(QIAGEN社製)を用いてこれらよりplasmidを抽出した。抽出されたプラスミドに挿入されているDNA断片の塩基配列を定法に従って決定した。Hisタグをコードする塩基配列が付加されたDNA断片が挿入されていることを確認し、目的の構築物pcDNA3.1-mBST2D-HisおよびpcDNA3.1-mBST2H-Hisを得た。【０１１４】
３）Western-blotting
６cmディシュにCOS7細胞を５ｘ１０５で１０枚まき、３７℃、５％CO2下で２０時間培養した。培養後のCOS7細胞に、Effectene trasfection Ｒeagent(Qiagen社製)により、pcDNA3.1-mBST2D-HisあるいはpcDNA3.1-mBST2H-Hisを形質転換した。操作は、同製品のプロトコールに従った。３７℃・５％CO2下で４８時間の培養後、PBSで洗浄、PBS/5mM EDTAで細胞をディシュから剥離し回収した。回収した細胞は、さらにPBSで洗浄後、1xHalt Protease Inhibitor Coctail (PIERCE 社製)を含む2mlのRIPA bufferを加えて氷上で１時間溶解した。RIPA bufferの組成を以下に示す。
50 mM Tris-HCl(pH7.4),
150 mM NaCl,
1% Triton x-100,
0.5% sodium deoxycholate,
0.1% SDS【０１１５】
溶解後の細胞は、４℃、15000 rpm、 5分間の遠心分離した。上清はMicrocon YM-10(MILLIPORE社製)にて50μL以下まで濃縮し、ウエスタンブロッテイングの試料とした。一方、沈殿物は、1xHalt Protease Inhibitor Coctail (PIERCE 社製)を含む１mLのRIPA bufferでもう一度洗浄後に、ウエスタンブロッティングの試料とした。
沈殿には２００μLの1x変性bufferを、濃縮した上清には等量の２ｘ変性bufferを加え１００℃にて１０分間煮沸した後、それぞれ５μLをNuPAGE4-12% Bis-Tris Gel (インビトロジェン社製)にて電気泳動した。泳動後のゲルから試料をセミドライ方式のブロッティング装置（BIO CRAFT社製、MODEL BE-330）にて、PVDF膜（MILLIPORE社製）にトランスファーした。
抗体による検出はイムノスターキット（和光純薬社製）を用いた。まず、１次抗体として、HRP標識抗His tag 抗体（インビトロジェン社製）を５０００倍希釈の濃度で用いて、イムノスターキットのプロトコールに従ってシグナルを検出した。シグナルの検出後、PVDF膜を変性溶液（７M  塩酸グアニジン、５０mM グリシン、0.05mM EDTA、0.1 M 塩化カリウム、20 mM 2-メルカプトエタノール）で室温で１時間振とう処理することにより、標識抗His tag 抗体を除去した。次に、ビオチン標識したSNK01抗体を用いて、同様に、シグナルを検出した。結果を図５に示す。【０１１６】
モノクローナル抗体SNK01において、アミノ酸配列から予想される分子量（約２０kD）の位置に明瞭なバンドが見られた。SNK01は、BST2D（配列番号：１０）とBST2H（配列番号：８）の両方に対して強く反応した。２０kD以上の位置にも強い反応が検出された。これらの分子量の大きい蛋白質は、糖鎖の修飾を有していると予想された。BST2D（配列番号：１０）は、上清よりも沈殿で強いシグナルが見られた。BST2H（配列番号：８）も沈殿でより強いシグナルが見られたが、上清に対しても抗体の強い反応が検出された。BST2D（配列番号：１０）に対するHisタグ抗体のシグナルが検出されていないのは、C末端に付加したHisタグがプロセシングによって除去されてしまったためと考えられた。
【実施例８】
【０１１７】
RT-PCR法によるマウスBST2の発現確認 
各細胞より抽出したRNAより合成したcDNAを鋳型として、定法に従ってPCRを行い、抗原遺伝子がIPCに特異的に発現していることを確認した。PCRに用いたプライマーの塩基配列は次の通りである。
配列番号：７用forward（配列番号：１６）：
5'-acatggcgccctctttctatcac-3'
reverse（配列番号：１７）：
5'-gagcccaggttttgaaggaagtg-3'
配列番号：９用forward（配列番号：１８）：
5'-agctcacccgcacccaggacagt-3'
reverse（配列番号：１９）：
5'-cactccccagtcctaaagttct-3'
βアクチン用センスプライマー（配列番号：２０）:
5'-gtgggccgctctaggcaccaa-3'
アンチセンスプライマー（配列番号：２１）:
5'-ctctttgatgtcacgcacgatttc-3'【０１１８】
発現レベルを比較したcDNAまたは細胞は次の通りである。DNAパネルは市販品（Clonetech社製）を利用した。細胞は、セルソーター（FACSVantage, Becton Dickinson社製）により高度に分離したものを用いた。結果は図６に示した。BST2D（配列番号：９）は、複数の細胞で発現が見られた。強い発現が見られたのはIPCであった。BST2H（配列番号：７）はマウスIPCで強い発現が観察された。
CD3陽性細胞（T細胞）、
CD8陽性細胞、
マウスIPC、
myeloid DC、および
マウス各臓器より抽出したRNAより合成したcDNAパネル
【実施例９】
【０１１９】
マウスBST2の新規スプライシングバリアントのクローニング
実施例８において、配列番号：７用プライマーの組み合わせにより、配列番号：７のcDNAに該当する増幅断片の他に、短い増幅断片が観察された。本増幅断片を定法によりクローニングして塩基配列を確認したところ、配列番号：７に示したmBST2Hの第2エクソン部分が欠失した塩基配列を有していた。すなわち、配列番号：２２に示した塩基配列を有する、マウスBST2の新規のスプライシングバリアントであると考えられた。この遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号：２３に示した。実施例８に示したように、本遺伝子もマウスIPCに発現していることを確認した。この配列番号：２２記載の遺伝子を、以下mBST2HSとも称する。
mBST2D、mBST2H、mBST2HSのアミノ酸配列のアライメントを図７(ａ)に、それぞれのゲノム構造を図７(ｂ)に示す。
【実施例１０】
【０１２０】
マウスBST2発現ベクターの作成
実施例６により得られたmBST2DおよびmBST2HのcDNAを鋳型とし、以下の塩基配列からなるプライマーを使って以下の条件でPCRを行った。
pmBST2-F ；tttttgctagcgacggatcacatggcgccctctttctatcactatctgcccgtgcccatggatgagatgggggggaagcaagga（配列番号：２４）および
pmBST2-R； tttttttctcgagtcctcaaaagagcaggaacagtgac（配列番号：２５）
DNAポリメラーゼ：LA Taq（タカラバイオ社）
［95℃を30秒、55℃を30秒、72℃を2分］を25サイクル
増幅されたそれぞれの断片を制限酵素NheI及びXhoI（いずれもタカラバイオ社製）で処理して切断した後、同様にNheIとXhoIで処理した動物細胞発現用ベクターpcDNA3.1-Zeo(+)（インビトロジェン社）とligation kit ver.II（タカラバイオ社製）を用いて連結し、それぞれの発現ベクターとした。mBST2HSの発現ベクターについてはmBST2Hの第2エクソン部分をPCR法を用いて定法に従って除去することによって作成した。
【実施例１１】
【０１２１】
ヒトオーソログcDNAのクローニングと発現ベクターの作成
本発明において同定されたマウスIPC特異抗原BST2のヒトオーソログを検索したところ、ヒトBST2として報告された既知の遺伝子であった（Ishikawa,J. et al. Genomics, 1995; 26, 527-；GenBank Acc#. D28137）。更にマウスで見出された新規スプライシングバリアントのヒトオーソログも含めて以下のようにしてPCR法によりクローニングし、3種類の発現ベクターを作成した。【０１２２】
下記の実施例に示した方法に従って、Herpes Simplex virus 刺激を行ったヒトIPCを調製し、RNAを抽出後、スーパースクリプトファーストストランドシステムキット（インビトロジェン社）を用いて、ファーストストランドcDNAを合成した。これを鋳型に、hBST2 primer F; aaaaaaagctagctggatggcatctacttcgtatg（配列番号：２６）およびhBST2 primer R ; aaaaaaactcgagacccataacaacaggcagcacat （配列番号：２７）で、LA Taq(タカラバイオ)を酵素にもちいてPCR(95℃を30 秒、55℃を30 秒、72℃を2分、25 cycle)を行った。増幅された断片を、制限酵素NheIおよびXhoIで切断後、pcDNA3.1-Zeo(+)（インビトロジェン社）のNheI-XhoIサイトに挿入し、ヒトBST2の発現プラスミドとした。【０１２３】
マウススプライシングバリアントのオーソログである遺伝子に関しては、IPCのcDNAライブラリーを鋳型として以下の塩基配列からなるプライマーで、LA Taq(タカラバイオ)を酵素にもちいてPCR(95℃を30 秒、55℃を30 秒、72℃を2分、25 cycle)を行った。cDNAは、GeneRacer kit （インビトロジェン社）によって合成した。増幅された断片を、制限酵素NheIおよびXhoIで切断後、pcDNA3.1-Zeo(+)（インビトロジェン社）のNheI-XhoIサイトに挿入し、発現プラスミドとした。
mBST2Hオーソログ用のプライマー
hBST2 primer F（配列番号：２６）および
primerhBHR；ttttttctcgagctagggatgtgggggtgagaggaatgtggcaggtggagggtagcgggggaaggctatctctgacctcagtcgctccacctctgcagac（配列番号：２８）
mBST2HSオーソログ用のプライマー
hBST2 primer F（配列番号：２６）および
primerhBST2HSR1； aaaaaaactcgagcttatggtttaatgtagtgatctctccacagtgtggttgcaggtggcggcct（配列番号：２９）【０１２４】
既知遺伝子であるヒトBST2の塩基配列を配列番号：１に、アミノ酸配列を配列番号：２に示した。以下、この配列を有する遺伝子をhBST2Dとも称する。また、上記により得られたmBST2Hのヒトオーソログ（以下、hBST2Hとも称する）の塩基配列を配列番号：３に、アミノ酸配列を配列番号：４に、また、mBST2HSのヒトオーソログ（以下、hBST2HSとも称する）の塩基配列を配列番号：５に、アミノ酸配列を配列番号：６に示した。
hBST2D、hBST2H、hBST2HSのアミノ酸配列のアライメントを図８(a)に、それぞれのゲノム構造を図８(b)に示した。hBST2HおよびhBST2HSは新規スプライシングバリアントであることが示唆された。
【実施例１２】
【０１２５】
RT-PCR法によるヒトBST2遺伝子の発現の確認
各細胞より抽出したRNAより合成したcDNAを鋳型として、定法に従ってPCRを行い、ヒトBST2の各バリアントの発現を検討した。PCR条件としては、95℃、1分間反応させた後、95℃を30秒、60℃を30秒、73℃を45秒を、1サイクルとして、Dタイプは30サイクル、Hタイプ及びHSタイプは35サイクル反応させた（図９）。
プライマーの配列は次の通りである。
Forward primer; gccttcgggcagtgatggagtgtc （配列番号：３０）
D用Reverse primer; tcaagcgaaaagccgagcaggac（配列番号：３１）
H、HS用Reverse primer; aatgtggcaggtggagggtag（配列番号：３２）
結果、ヒトBST2ｍRNAは複数の組織、細胞で発現していることがわかった。また、IPCにおいてはHSV刺激により、発現が増強されることがわかった。
【実施例１３】
【０１２６】
マウスBST2を認識する抗体の作製と評価
１）抗マウスBST2抗体の作製
マウスBST2の3種類のサブタイプD、H、HSのいずれか、あるいは複数を認識する抗体を以下のように作製した。
6cmディッシュ5枚に、1枚あたり4x105個のCOS7細胞を播種し、20時間培養後にEffectene trasfection Reagent(Qiagen社製)を用いて同製品のプロトコールに従い、上記実施例１０で作製したそれぞれのタイプのcDNAがクローニングされた3種類の発現ベクターを同量（ディッシュ1枚あたり1μg）ずつ混合してトランスフェクションした。24時間後、新鮮な培地に交換し、更に24時間後、PBS/5ｍM EDTAで細胞を回収し、PBSで洗浄した後に、Wister rat（5〜6週令）の両足のfoot padにアジュバンドCFAとともに注入した。このような操作を0、4、11日目に行って免疫したラットから、12日目にリンパ節を採取して、実施例１に示したのと同様の方法で、ハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの培養上清をCell ELISAによってスクリーニングし、3種類の発現ベクターをトランスフェクションしたCOS7細胞には反応し、宿主のCOS7細胞には反応しないクローンを選択した。更にFACS解析でも結合活性を確認して細胞のクローニングを行い、最終的には5つの陽性クローンを得た。【０１２７】
２）マウスIFN産生能への影響
得られたクローンの培養上清を用いて、実施例５に示した方法に従って、IFN産生に与える影響を検討したところ、いずれもコントロール抗体と比較してIPCのIFN産生を抑制する活性があった。更に、0.1μMのCpG ODN 1668（MWG Biotech社）を用いて刺激した際にも、IFN産生抑制活性を示した（図１０）。このことから、SNK01以外のmBST2に対する抗体もIPCからのIFN産生を抑制する活性を示すことが確認された。
【実施例１４】
【０１２８】
ヒトBST2（hBST2）を認識する抗体の作製と評価
１） ヒトBST2抗体の作製
ヒトBST2の3種類のサブタイプD、H、HSのいずれか、あるいは複数を認識する抗体を実施例１３と同様の方法に従って作製した。実施例１１で作製したそれぞれのタイプのヒトcDNAがクローニングされた3種類の発現ベクターを用い、培養上清をFACS解析することによってハイブリドーマをスクリーニングした。クローン3D3#7、3E2#8、5C11#7、および3G7#6などの、複数のクローンが得られた。得られた複数のクローンの精製抗体を取得し、更に解析を行った。【０１２９】
２）ヒトIFN産生能への影響
健常人より末梢血を採取し、PBL（末梢血リンパ球）を分離した。Lineage抗体(CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56抗体)にてMACSで種々の細胞を除去した後、CD4陽性、CD123陽性、Lineage陰性細胞群をIPCとしてセルソーターで分離した。このように取得したヒトIPCを2x104cells/wellで96 wellプレートに播種し、それぞれ3、10、30μg/mLの濃度で抗BST2抗体を添加して37℃で1時間培養した。1時間培養後にHerpes Simplex virus(20 pfu/cell)を添加し、37℃で24時間培養し、培養上清中のIFNαをELISA kit(Bender Med System社)により、測定した。その結果、抗ヒトBST2抗体は、既に報告のあるBDCA2抗体(Miltenyi社)と同様に、ヒトIFN産生抑制活性を示すことが明らかとなった。（図１１）すなわち、ヒトBST2を認識する抗体は、その分子を発現する細胞のIFN産生活性に影響を与えることが明らかとなった。
【実施例１５】
【０１３０】
BST2タンパク質の発現パターン
１） マウスBST2の発現パターン
モノクローナル抗体SNK01を用いて、マウスBST2タンパク質の発現をFACSにより解析した。Balb/cマウス、あるいはTypeI IFN receptorノックアウトマウスの脾臓細胞を、CpG（0.5μM）あるいはインフルエンザウイルスPR8で24時間刺激した後、各種抗体を用いて細胞染色を行った。刺激をしていない通常の状態では、図１に示したようにBST2はIPCに特異的に発現していたが、Balb/cマウスにおいては刺激によって、多くの細胞においてBST2の発現が誘導されることが明らかになった（図１２）。CD3陽性であるT細胞、CD19陽性であるB細胞、DX5陽性であるNK細胞、Gr-1陽性である顆粒球、いずれにおいても同様の傾向が検出された。更に、それらのCpG、ウイルスによるBST2の発現増強は、IFNRノックアウトマウスでは検出されなかったことから、IFNのシグナルを介してBST2の発現が誘導されることが推定された。【０１３１】
２） ヒトBST2の発現パターン
実施例１４の１）で作製した抗体5C11を用いて、ヒトBST2タンパク質の発現をFACSにより解析した。健常人の末梢血よりPBLを採取し、IFNαを1ng/mlの濃度で添加して37℃、24時間培養し、抗BDCA-2抗体、抗BDCA-4抗体と5C11との二重染色を行った（図１３）。この結果、ヒトIPCにおいて、通常はBST2の発現が検出されないが、IFN刺激によりBST2の発現が誘導されることが明らかになった。すなわち、BST2分子はマウスと同様ヒトにおいても、IFNにより発現が誘導され、更にIFNの産生自体に影響を与えることが明らかになった。また、CpGにより刺激した場合にも、IPC上で発現が誘導されることが明らかになった（図１４）。
【実施例１６】
【０１３２】
抗体のin vivoにおける評価
１） 抗体投与マウスより採取した細胞の解析
Balb/cマウスの腹腔内にSNK01、およびコントロールのラットIgGを1匹あたり300μgずつ、一日おきに3回投与し（0.9mg/マウス）、6日目に脾臓、骨髄をそれぞれ採取し、IPCの細胞数(cell population)をB220、CD11c、CD11bの染色によって解析した。更に、骨髄細胞を1x106/wellにて96wellプレートに播種し、CpG（0.5μM）あるいはインフルエンザウイルスPR8によって刺激し、24時間後の培養上清のサイトカイン値をELISAにより測定した（図１５）。
その結果、SNK01投与群において、IPCの各種刺激に対するIFNの産生能が低いことが明らかになった。なお、IL-12の産生への影響は認められなかった。このことより、BST2に対する抗体の投与により、BST2分子が発現している細胞の機能に変化を生じ、in vitroでの刺激によるIFN産生能が抑制されたことが示された。【０１３３】
２） ウイルス感染マウスを用いた解析
抗体を前投与（1.5日前と0.5日前にそれぞれ一匹あたり500μg）したマウス（n=3）に5x104pfu/mouseのMCMV（マウスサイトメガロウイルス）を腹腔内に投与し、感染を起した。この感染後、1.5日後のマウスの血清中のIFNαをELISAにより測定した。また、脾臓でのIPCの細胞数(cell population)をB220、CD11c、CD11bの染色によって解析した（図１６）。
その結果、SNK01投与群において、血清中のIFN産生量は抑制されていた。すなわち、本抗体投与により、in vivoにおけるIFN産生能が抑制されたことが示された。これらの結果から、抗体の細胞への結合が、細胞機能を調節したものと考えられた。
【実施例１７】
【０１３４】
関節リウマチ（RA）モデルマウスへの抗体の投与試験
関節炎惹起抗体カクテル(Chondrex社製)を用いて、添付の説明書に従って作成したマウスの関節リウマチモデルにBST2に対する抗体を投与し、関節炎抑制活性を評価した。Balb/cマウス（雌6週令）に関節炎惹起抗体カクテルを2mg/マウスで腹腔内投与する2日前、1日前に、SNK01、およびコントロールのラットIgGを1匹あたり300μgずつ腹腔内に投与した。抗体カクテル投与後は1日おきに300μg/マウスの抗体を腹腔内に投与していき、カクテル投与3日後にはLPSを50μg投与し、以後SNK01及びコントロール抗体の投与を続けた（図１７（a））。２回の試験をそれぞれブラインドで行い、継時変化を観察した。試験に用いたマウスの数は、１回目の試験は５匹(n=5)、２回目の試験が１０匹(n=10)の、合計１５匹(n=15)である。【０１３５】
関節炎発症率は、生き残っている動物数に対する発症した動物数の割合を計算して求めた(n=15)。また、関節炎スコアは以下のような基準で評価した。
0：健常
1：足首や手首に軽度の限局された赤変や腫脹が認められる。
あるいは個々の指に明らかな赤変や腫脹が認められる。
2：足首や手首に中程度の赤変と腫脹が認められる。
3：指を含めて足全体に重度の赤変と腫脹が認められる。
4：複数の関節に渡って肢全体に炎症が認められる。【０１３６】
図１７(b)(c)に示したように、SNK01投与群ではコントロール投与群に比べて、関節炎の発症が抑制された。
また、抗体カクテル投与16日後に採取したマウスの血清を用いて、ELISA法にてリウマチ因子の解析を行った。まず、56℃で30分熱変性させたRabbit IgG（R＆D Systems社製）（10μg/ｍl in PBS）をELISA plate（NUNC社製）に50μl/wellで添加して、4℃で一晩反応させ、プレートコートした。プレート洗浄、ブロッキングを行なった後、希釈したマウス血清を50μl/well添加して1時間反応させた。プレートを洗浄後、希釈したHRP標識Rabbit anti-Mouse IgG(H&L)（abcam社製）を50μl/wellで反応させ、Substrate Reagent（BD Pharmingen社製）を反応させた後、OD450（450nmにおける吸光度）を測定した。その結果を図１８に示した。SNK01投与群ではコントロール投与群に比べて、リウマチ因子が抑制されていた。【０１３７】
更に、抗体カクテル投与後のマウスの血清中のサイトカイン量を測定した。IFNαについては実施例４に示した方法にて測定し、抗体カクテル投与16日後の血清の結果を図１９に示した。SNK01投与群ではコントロール投与群に比べて、IFN産生が抑制されていた。また、血清中のTNFα濃度を、ELISA Development kit（Genzyme-Techne社製）を用いて添付の説明書に示された方法に従って測定した。抗体カクテル投与16日後の血清の結果を図２０に示した。SNK01投与群ではコントロール投与群に比べて、TNF産生も抑制されていた。【０１３８】
脾臓細胞及び末梢血中のIPCの割合をFACS解析によって測定した。その際には、実施例１に示した方法により作成されたIPC特異的抗体であるSNK02、及びCD11c抗体（Becton Dickinson社製）を用いて染色を行なった。その結果、SNK01投与群では脾臓細胞や末梢血中のIPCの割合が減少していた（図２１）。
以上のことより、SNK01抗体投与によってIPCの活性が抑制され、関節炎の発症が抑制されたことが示された。
【実施例１８】
【０１３９】
関節炎発症マウスへの抗体の投与試験
実施例１７と同様の方法によって、マウス（n=5）に関節炎惹起抗体カクテル及びLPSを投与して関節炎を引き起こした後、SNK01抗体を投与して、関節炎の治療効果を評価した。マウスの数は各群5匹とし、6日目より1日おきに5回、すなわち6、8、10、12、14日目に500μgずつSNK01およびコントロールのラットIgGをそれぞれ腹腔内に投与し、継時変化を観察した。関節炎スコアは実施例１７と同様の方法に従って求めた。発症したマウスについての結果を図２２に示した。SNK01は関節炎スコアの減少、すなわち、関節炎の治療効果を示した。なお、17日目の血清ではSNK01投与群においてIFN量が抑制されていた。
【産業上の利用可能性】
【０１４０】
本発明によってIPCを治療標的とするRAなどの自己免疫疾患を伴う関節炎の治療剤、並びに治療方法が提供された。IPCには他の細胞の数千倍ものIFNを産生する細胞が含まれる。したがって、そのIFN産生能、および細胞生存（あるいは細胞数）のいずれかあるいは両方を抑制すれば、IFNの産生が効果的に抑制され、RAなどの症状を緩和することができる。IPCに作用する本発明の治療剤は、関節炎症状の抑制のみではなく、RA患者の免疫バランスの改善を通じてより本質的な治療を実現する。【０１４１】
加えて本発明は、RAなどの自己免疫疾患を伴う関節炎の治療効果の検出方法と、その方法を利用した治療に有用な候補化合物のスクリーニング方法を提供した。本発明によって、IPCの活性の調節が、自己免疫疾患を伴う関節炎の治療において重要な課題であることが明らかにされた。したがって、IPCの活性を調節する化合物を選択することによって、RAなどの自己免疫疾患を伴う関節炎の治療に有用な化合物を選択することができる。すなわち本発明のスクリーニング方法に基づいて選択された化合物は、RAなどの自己免疫疾患を伴う関節炎の治療に有用である。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７ｃ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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