(57)【要約】  本発明は、動物の悪性リンパ腫の治療に有用な抗CD20抗体の作成において、必須であるCD20アミノ酸配列および遺伝子配列を明らかにすることを課題とする。さらに、CD20遺伝子配列を用いて、イヌの悪性リンパ腫を診断する方法を提供することを課題とする。  イヌの血液中の単核球を試料としてmRNAを得て、イヌCD20遺伝子全塩基配列（配列番号2）を決定した。その配列に基づき、アミノ酸配列（配列番号1）を決定した。ヒト、マウスのCD20遺伝子およびアミノ酸配列と相同性を比較し、イヌCD20遺伝子として同定した。さらに、イヌのCD20遺伝子に特異的なプライマーを作成し、試料におけるCD20遺伝子の発現を調べることで、イヌのBリンパ球由来の悪性リンパ腫を診断する方法を得た。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表配列番号1記載のアミノ酸配列を有するイヌCD20蛋白質。
【請求項２】
配列表配列番号1に記載のアミノ酸配列に70%以上の相同性を有する蛋白質。
【請求項３】
配列表配列番号1に記載のアミノ酸配列に80%以上の相同性を有する蛋白質 。
【請求項４】
配列表配列番号2記載のイヌCD20をコードするDNA 。
【請求項５】
配列表配列番号2に記載のDNA配列に70%以上の相同性を有するヌクレオチド。
【請求項６】
配列表配列番号2に記載のDNA配列に80%以上の相同性を有するヌクレオチド。
【請求項７】
配列表配列番号3記載のイヌCD20をコードするRNA 。
【請求項８】
配列表配列番号3に記載のRNA配列に70%以上の相同性を有するヌクレオチド。
【請求項９】
配列表配列番号3に記載のRNA配列に80%以上の相同性を有するヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項4に記載のイヌCD20遺伝子断片を組み込んだプラスミド。
【請求項１１】
請求項5または6に記載のヌクレオチドを組み込んだプラスミド。
【請求項１２】
請求項7に記載のイヌCD20遺伝子断片を組み込んだプラスミド。
【請求項１３】
請求項8または9に記載のヌクレオチドを組み込んだプラスミド。
【請求項１４】
請求項10または11に記載のプラスミドを組み込んだ形質転換体。
【請求項１５】
請求項12または13に記載のプラスミドを組み込んだ形質転換体。
【請求項１６】
イヌCD20遺伝子またはその断片を増幅するための、配列表配列番号19に記載のプライマー。
【請求項１７】
イヌCD20遺伝子またはその断片を増幅するための、配列表配列番号20に記載のプライマー。
【請求項１８】
請求項16または17に記載のプライマーを用い、イヌCD20遺伝子またはその断片を増幅することで、イヌのCD20遺伝子の発現を調べ、イヌの悪性リンパ腫を診断する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性リンパ腫の抗体治療や診断等の開発に用いうるイヌのCD20遺伝子に関する。
さらに、イヌのCD20遺伝子を増幅することで、イヌのCD20の発現を調べ、イヌのBリンパ球由来の悪性リンパ腫を診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性リンパ腫とは、生体内のリンパ組織が腫瘍化したものを言う。人間の悪性リンパ腫は、ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫に分けられ、非ホジキンリンパ腫はその由来によって、Ｔリンパ球由来、ＮＫ細胞由来やＢリンパ球由来のリンパ腫がある。これらは、悪性化の進行の度合いに応じて、低悪性度リンパ腫、中悪性度リンパ腫、高悪性度リンパ腫に分けられる。
日本人では、悪性リンパ腫患者の大半が非ホジキンリンパ腫である。これはリンパ節に発生することが多いが、皮膚、脳、眼、鼻腔、副鼻腔、扁桃、咽頭、唾液腺、甲状腺、乳腺、肺、縦隔、胸膜、胃、小腸、大腸、肝臓、脾臓、精巣、卵巣、骨など、リンパ組織が存在する全身に発生し、組織ごとに症状が異なる。【０００３】
悪性リンパ腫は、イヌ等に多く認められる腫瘍の一つで、イヌにおいては体中のリンパ節が腫れる多中心型リンパ腫が多い。多中心型リンパ腫が悪性化すると、リンパ組織を介して肺や肝臓、脾臓、骨髄に転移し、黄疸や貧血などの症状を示す。
また、胸腺のリンパ節が腫れて胸腔内に水が溜まる胸腺型リンパ腫や、消化器のリンパ組織が腫瘍化する消化器型リンパ腫などもある。これらの悪性リンパ腫は進行が早く、イヌ等の罹患動物において、無治療の場合であると、発見後平均して100日前後で死に至る。従って、早期の発見とともに、発見後の適切な治療が望まれている。【０００４】
悪性リンパ腫の治療法として、放射線療法、化学療法、外科療法などの複数の治療法があるが、従来は、放射線療法と化学療法が主体的に行われている。
放射線療法は悪性リンパ腫の病変部位が数箇所である場合に多く用いられる。腫瘍細胞に対し放射線を照射して、病変部位をピンポイントに死滅させる治療法であり、早期の腫瘍除去には最適な治療法であるが、皮膚障害や粘膜障害、肺障害の副作用がある。【０００５】
化学療法はリンパ組織や臓器、骨髄や血液などの全身に腫瘍細胞が広がっている場合に多く用いられる。腫瘍細胞に対し細胞毒性を有する抗がん剤を投与して、全身の病変部位を死滅させる治療法であり、悪性リンパ腫における唯一の全身療法である。
人間の悪性リンパ腫において、シクロホスファミド、アドリアマイシン、ビンクリスチン、プレドニゾロンの抗がん剤を組み合わせて用いたCHOP（チョップ）療法が標準的になされる。また、イヌの悪性リンパ腫において、シクロホスファミド、ビンクリスチン、シトシンアラビノシド、プレドニゾロンの抗がん剤を組み合わせて用いたCOAP計画等がなされる(非特許文献１)。【０００６】
これらの抗がん剤は、すべての細胞を破壊する細胞毒であり、正常細胞にも影響を及ぼすが、腫瘍細胞が正常細胞より成長が早い為、腫瘍細胞の方が障害を受けやすいという性質を利用して用いられている。
しかし、これらの抗がん剤は、細胞分裂が早い正常細胞、例えば血液細胞、毛根細胞、消化管の細胞、生殖細胞などに対して、腫瘍細胞と同様に傷害してしまうため、白血球の減少、脱毛、吐き気などの副作用が起こる。【０００７】
放射線療法、化学療法等は現在、主として行われている治療法であるにもかかわらず、生体内に及ぼす副作用が強く、また治療によっていったん寛解しても再発することが多々あるため、必ずしも完治できる治療法とはいえない。
また、治療法の実施には多額の費用が必要となる。人間のみならず、イヌ（30〜32ｋｇ）の治療においても米国の統計では、約1,500〜1,800ドルの費用がかかり、必ずしも安価とはいえない。そこで、このような問題を解決するために、安全性が高く、完治につながり、かつ安価に実施できる悪性リンパ腫の治療法が求められている。【０００８】
化学療法は、使用する抗がん剤がすべての細胞を攻撃する細胞毒である点に問題があるといえる。そこで、標的となる腫瘍細胞のみを特異的に攻撃できる、モノクローナル抗体療法が近年注目されている（非特許文献２）。
これは、標的となる腫瘍細胞に特異的に発現する抗原を利用し、その抗原に特異的な抗体を用いて腫瘍細胞を特定することで、腫瘍細胞に集中的に薬剤が集まるようにする治療法である。
人間の悪性リンパ腫におけるこの治療法の対象として、Ｂリンパ球の細胞表面に特異的に発現し、悪性リンパ腫に高レベルで発現するCD20抗原を利用し、これを特異的に認識する抗CD20抗体を用いる方法があげられた。【０００９】
抗CD20抗体は、腫瘍細胞のCD20抗原と結合すると、抗体や補体を介する免疫反応が起こり、腫瘍細胞を傷害する。従来の抗がん剤とは作用機序が異なり、標的となる腫瘍細胞のみに働くため、細胞表面にCD20抗原が発現しない造血幹細胞等に影響を与えない。実際、副作用は過敏症、アレルギー症状と類似した病状のみで、抗がん剤のような、脱毛、吐き気などはほとんど起こらないことがわかっている。
抗CD20抗体は、ヒト由来のマウス／ヒトキメラ型抗体として、調整され、CD20陽性の低悪性度、または濾胞型Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫に対し、2001年に日本において保険適応となった。商品名リツキサン（rituxan）、一般名リツキシマブ（rituximab）という薬で全薬工業が販売している。
このように治療効果が優れ、副作用の少ない抗体療法は、悪性リンパ腫の治療法を大きく変えるものとして期待されている。【００１０】
人間において、このように有用な治療法が確立されたにもかかわらず、イヌ等の罹患動物において、抗体療法はいまだ行われていない。一方で、悪性リンパ腫の罹患動物は多く、抗体療法の確立が強く望まれている。そこで、本発明者らは抗体療法の確立において必須とされるイヌのCD20遺伝子配列を本発明にて明らかした。本発明で明らかにしたイヌのCD20遺伝子配列はイヌの抗CD20抗体の作成に必須であり、イヌの悪性リンパ腫の抗体治療や診断等の開発に用いうる。
さらに、本発明において明らかにしたイヌのCD20遺伝子配列を用い、イヌのCD20遺伝子を特異的に増幅できるプライマーを作成し、イヌのCD20の発現を調べることでイヌの悪性リンパ腫の診断に用いうる。
【非特許文献１】猫と犬のリンパ腫  長谷川篤彦  辻本元  総監訳  スモールアニマルインターナルメディスン、1127-1137
【非特許文献２】造血幹細胞移植の適応ガイドライン  日本造血細胞移植学会2002.4
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、イヌの抗CD20抗体の作成に必須であるイヌのCD20遺伝子配列を明らかにすることを課題とする。さらに、本発明は、明らかにしたイヌのCD20遺伝子配列より、イヌのCD20遺伝子を特異的に増幅できるプライマーを作成し、イヌのCD20遺伝子の発現を調べることで、イヌの悪性リンパ腫を診断する方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を鋭意検討した結果、イヌの血液中の単核球を試料として遺伝子を単離し、イヌのCD20遺伝子を精製し、この配列を明らかにすることができた。当該イヌのCD20遺伝子はヒトのCD20遺伝子と81.0％の高い相同性を有し、またマウスのCD20遺伝子とも71.8％の相同性を有することが明らかにされた。また、これらの遺伝子配列によってコードされるCD20のアミノ酸配列は、ヒトのCD20のアミノ酸配列と72.8％の高い相同性を有し、マウスのCD20のアミノ酸配列とも68.2％の相同性を有することが明らかにされた。
また、CD20は細胞の膜外に発現し、抗原として認識されることから、本発明にて解明されたCD20の膜外領域のアミノ酸配列とヒトCD20の膜外領域のアミノ酸配列の相同性を調べたところ、66.6％であった。これらから当該イヌのCD20遺伝子は抗CD20抗体作成に有用であることが示唆された。
従って、本発明によって明らかにされたアミノ酸配列、DNA配列、RNA配列と70％以上または80％以上の相同性をもつ配列も有効と考えられ、この範囲内であれば、1またはそれ以上のアミノ酸または塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入されているものも含まれる。
さらに、本発明で明らかとされたイヌのCD20遺伝子配列より、イヌのCD20遺伝子を特異的に増幅できるプライマーを作成し、試料におけるイヌのCD20遺伝子を増幅することで、イヌのCD20遺伝子の発現を調べられることを見出し、イヌの悪性リンパ腫を診断する方法を完成するに至った。【００１３】
すなわち、本発明は、
（１）配列表配列番号１記載のアミノ酸配列を有するイヌCD20蛋白質、
（２）配列表配列番号１に記載のアミノ酸配列に70%以上の相同性を有する蛋白質、
（３）配列表配列番号１に記載のアミノ酸配列に80%以上の相同性を有する蛋白質、
（４）配列表配列番号２記載のイヌCD20をコードするDNA、
（５）配列表配列番号２に記載のDNA配列に70%以上の相同性を有するヌクレオチド、
（６）配列表配列番号２に記載のDNA配列に80%以上の相同性を有するヌクレオチド、
（７）配列表配列番号３記載のイヌCD20をコードするRNA、
（８）配列表配列番号３に記載のRNA配列に70%以上の相同性を有するヌクレオチド、
（９）配列表配列番号３に記載のRNA配列に80%以上の相同性を有するヌクレオチド、
（１０）（４）に記載のイヌCD20遺伝子断片を組み込んだプラスミド、
（１１）（５）または（６）に記載のヌクレオチドを組み込んだプラスミド、
（１２）（７）に記載のイヌCD20遺伝子断片を組み込んだプラスミド、
（１３）（８）または（９）に記載のヌクレオチドを組み込んだプラスミド、
（１４）（１０）または（１１）に記載のプラスミドを組み込んだ形質転換体、
（１５）（１２）または（１３）に記載のプラスミドを組み込んだ形質転換体、
（１６）イヌCD20遺伝子またはその断片を増幅するための、配列表配列番号19に記載のプライマー、
（１７）イヌCD20遺伝子またはその断片を増幅するための、配列表配列番号20に記載のプライマー、
（１８）（１６）または（１７）に記載のプライマーを用い、イヌCD20遺伝子またはその断片を増幅することで、イヌのCD20遺伝子の発現を調べ、イヌの悪性リンパ腫を診断する方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により明らかにされたイヌのCD20遺伝子配列は、イヌの抗CD20抗体作成に必須である。本発明のイヌのCD20遺伝子配列は、イヌの悪性リンパ腫の抗体治療や診断等の開発に用いうる。さらに、本発明で明らかとされたイヌのCD20遺伝子配列より、イヌのCD20遺伝子を特異的に増幅できるプライマーを作成し、試料におけるイヌのCD20遺伝子を増幅し、イヌのCD20遺伝子の発現を調べることで、イヌの悪性リンパ腫を診断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】各試料におけるイヌCD20遺伝子の発現を示した図である。（実施例8）   図中のMはマーカーを示し、１〜１０は表１の試料１〜１０に対応する。１１、１２は正常イヌリンパ節由来の試料である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の目的であるCD20遺伝子配列の決定において、PCR法を用いるにあたり、試料の精度と使用するプライマーの設計が重要となる。mRNAの抽出などには市販のキットを用いることもできる。【００１７】
さらに、本発明で明らかとされたイヌのCD20遺伝子配列より、イヌのCD20遺伝子またはその断片を特異的に増幅できるプライマーを作成する場合、作成するプライマーはイヌのCD20遺伝子またはその断片の発現を調べることができる遺伝子であれば、DNAでもRNAでもいずれでもよく、特にｍRNAから合成したｃDNAが扱いやすく好ましい。発現を調べるイヌのCD20遺伝子の断片としては、イヌのCD20の膜外領域の遺伝子を含む配列であることが好ましい。
以下に、本発明を具現化した実施例を示すが、本発明はいかなる場合でもこのような実施例に限定して解釈されるものではない。
【実施例１】
【００１８】
＜試料の調製＞
（１）  単核球の分離 
正常イヌ１頭より採取した血液（5ml）をヘパリンで抗凝固処理し、それにヘパリン加生理食塩水（５ml）を加え、転倒混和した（総量10ml）。遠心沈殿管に５mlのLymphoprepを入れ、その上に試料を重層し、遠心分離機にて室温で800×ｇで遠心することで単核球を分離した。単核球の分離にはLymphoprep（Axis-Shield  Pos  AS）を用いた。
（２）  RNA抽出
得られた単核球に、グアニジン塩を含んだBuffer  RLT（β-メルカプトエタノール加）を加え細胞溶解させた。QIAshredderスピンカラムに添加した後、1000×ｇで２分間遠心し、ホモジナイズした（QIAshredder、QIAGEN）。70％エタノールを添加しピペッティングした後、RNeasyミニスピンカラムにアプライし、8000×ｇで15秒遠心した後、フロースルーを捨てた。RNAはRNeasyミニスピンカラムのシリカゲルメンブレンに吸着した。
次にBuffer  RW１をRNeasyカラムに添加し、5分間室温でインキュベートした後8000×ｇで15秒遠心し、フロースルーを捨てた。RNeasyカラムへBuffer  RPEをアプライした後、8000×ｇで15秒遠心した。これを2回繰り返すことで不純物を取り除いた。
最後にRNase  free  waterを適量加え、8000×ｇで１分遠心することでRNAを溶出させた。RNAの抽出にはキット（RNeasy  Mini  Kit、QIAGEN）を用いた。【００１９】
（３）  DNase処理
得られたRNAに微量のゲノムDNAが混入することを避けるため、次のDNase処理によりゲノムDNAを取り除いた。
キットに付属のBufferとDNaseIをRNA溶液に加え、37℃で30分間インキュベートした。DNase  Inactivation  Reagentをさらに混ぜあわせ、室温で２分間インキュベートした。8000×ｇで１分遠心し、上清を新しいチューブに移し、DNA-FreeのRNA溶液とした。DNase処理にはキット（DNA-free,Ambion）を用いた。
（４）  cDNA合成
DNase処理したRNA溶液に、10×Buffer  RT、dNTP  Mix、RT（逆転写酵素）、Ribonuclease  Inhibitor  cloned（Invitrogen）、配列表配列番号6に示した配列を有するoligo  dT  primer（プロリゴ・ジャパン）を加え37℃で１時間インキュベートすることでcDNAを合成した。cDNAの合成にはキット(Omniscript,QIAGEN)を用いた。
【実施例２】
【００２０】
＜イヌCD20遺伝子断片のクローニング＞
（１）PCR
ヒト・マウスのCD20遺伝子の塩基配列を基に相同性の高い領域から配列表配列番号7に示した配列を有するSense  primer及び配列表配列番号８に示した配列を有するReverse  primerを設計し、合成したｃDNAを鋳型としてPCRを行った（TaKaRa  Taq、TaKaRa）。
キット中の耐熱性DNA  polymerase  （rTaq）を添加した反応液を94℃で５分heat  denateした後、94℃・１分、53〜60℃・１分、72℃・２分を35cycleの条件でPCRを行い、CD20遺伝子断片を増幅した。その後PCR産物をアガロースゲル電気泳動にて確認した。
（２）  TA  cloning・Transformation
このCD20遺伝子断片をプラスミドベクター（pCR  vector）に組み込み、大腸菌に形質転換した後（TA  Cloning  Kit、Invitrogen）、アンピシリン・X-gal添加LB培地にて大腸菌を増殖させた。
増殖した大腸菌が目的の遺伝子断片を含むプラスミドDNAを持っているか、ボイル法を用いて確認した。大腸菌からのプラスミド抽出にはキット（BioRad  plasmid  kit,  BioRad）を用いた。
【実施例３】
【００２１】
＜イヌCD20遺伝子断片の塩基配列の決定＞
シークエンス
得られたプラスミドを鋳型とし、使用したpCR  vectorに特異的な配列配列番号9に示した配列を有するM13  Forward（-21）primer  primer及び配列表配列番号10に示した配列を有するM13  Reverse  primerを用いてサイクルシークエンス反応を行った。反応にはサーマルサイクラーを用い、96℃・10秒、50℃・5秒、60℃・４分を25cycle繰り返した。反応液の調製にはキット（Big  Dye  Terminator  v3.1  Cycle  Sequencing  Kit,  Applied  Biosystems）を用いた。キット中のTerminator  Ready  Reaction  MixにはDNA  polymeraseの他、蛍光色素で標識されたジデオキシリボヌクレオシド3リン酸（ddNTP）があらかじめ混合されているものを用いた。
反応終了後のシークエンス産物をEthanol/EDTA沈殿法にて精製し、未反応の蛍光物質を除去した。これをTemplete  Suppression  Reagent  (TSR)に溶解し、シークエンサー（ABI  PRISM  310  Genetic  Analyzer,Applied  Biosystems）にて塩基配列を解析した。
【実施例４】
【００２２】
＜全イヌCD20遺伝子塩基配列の決定＞
CD20遺伝子cDNAの全長を解析するため、一部解析した塩基配列より新たなprimerを設計し、５’-および３’-RACE  PCR（５’RACE  System  of  Rapid  Amplification  of  cDNA  Ends  version  2.0／３’RACE  System  of  Rapid  Amplification  of  cDNA  Ends、Invitrogen）を行った。
(1)  ３’RACE法
１）ｃDNA合成
RNA溶液に配列表配列番号１１に示した配列を有するAdaptor  Primerを混合し、70℃で10分インキュベートした。氷上に3分付けた後、Buffer  ・0.1M  DTT  ・10mM  dNTPを加えて混合し、37℃で2分加温した。次に逆転写酵素（SuperScript  II  Reverse  Transcriptase）を加えて混合し、42℃で１時間反応させ、cDNAを合成した。
２）PCR
配列表配列番号12に示した配列を有するSense  primer（GSP１）および配列表配列番号13に示した配列を有するReverse  primer（Universal  Amplification  Primer：キット中）を用い、耐熱性DNA  polymerase  （rTaq）を添加した反応液を94℃で５分heat  denateした後、94℃・１分、54℃・１分、72℃・２分を35cycleの条件でFirst  PCRを行った。次にFirst  PCR産物をtempleteにした反応液を調製し、配列表配列番号14に示した配列を有するSense  primer（GSP２）および配列表配列番号13に示した配列を有するReverse  primer（Universal  Amplification  Primer  ：キット中）を用い、94℃で5分heat  denateした後、94℃・１分、55℃・１分、72℃・２分を35cycleの条件でnested  PCR（Second  PCR）を行うことで、CD20遺伝子断片を増幅した。
rTaq（TaKaRa  Taq、TaKaRa）以外の試薬は３’RACE法のキット中のものを使用した。その後PCR産物をアガロースゲル電気泳動にて確認した。【００２３】
（２）５’RACE法
１）ｃDNA合成
RNA溶液に配列表配列番号15に示した配列を有するSense  primer（GSP１）を加え、70℃で10分インキュベートした。氷上に1分置いた後、Buffer、MgCl２、DTT、dNTP、逆転写酵素（SuperScript  II  Reverse  Transcriptase）を加え、42℃で１時間インキュベートした。70℃で15分加温しReverse  Transcriptaseを失活させた。RNase  Mixを加えまぜ、37℃で30分加温することでRNAを分解した。
２）DNA精製
cDNA反応液にbinding  solutionを加え混合し、spin  cartridgeに移す。1000×ｇで2分間遠心し、フロースルーを捨てた。Wash  Bufferを加え、1000×ｇ２分間遠心しフロースルーを捨てた。spin  cartridgeを新しいチューブに移し、65℃の滅菌水を加え１分間室温でインキュベートした後、14000rpmで１分間遠心し、液を回収した。【００２４】
３）TdTによるホモポリマーの付加
滅菌水  7.5、Buffer、MgCl2、dCTP、cDNAを混ぜ、  94℃で1〜2分加温し、氷上で1分おき、TdTを加えまぜ、37℃で10分、65℃で10分インキュベートした。
４）PCR
配列表配列番号16に示した配列を有するSense  primer（GSP２）および配列表配列番号1７に示した配列を有するReverse  primer（Anchor  Primer  ：キット中）を用い、耐熱性DNA  polymerase（rTaq）  を添加した反応液を94℃で５分heat  denateした後、94℃・１分、50℃・１分、72℃・2分を35cycleの条件でFirst  PCRを行った。次にFirst  PCR産物をtempleteにした反応液を調整し、配列表配列番号18に示した配列を有するSense  primer（GSP３）および配列表配列番号13に示した配列を有するReverse  primer  （Universal  Amplification  Primer：キット中）を用い、94℃で５分heat  denateした後、94℃・１分、58℃・１分、72℃・２分を35cycleの条件でnested  PCR（Second  PCR）を行うことで、CD20遺伝子断片を増幅した。rTaq  （TaKaRa  Taq、TaKaRa）以外の試薬の調整は３’RACE法のキット中のものを使用した。その後PCR産物をアガロースゲル電気泳動にて確認した。
【実施例５】
【００２５】
＜イヌCD20遺伝子の同定法について＞
解析した遺伝子の塩基配列と、ヒト・マウスの遺伝子との相同性を確認した。Genbankに登録されているヒトCD20ゲノム（エキソン）との相同性が81.0％、マウスCD20mRNAとは71.8％と高い相同性を示したため、今回解析した遺伝子はイヌのCD20であると判断できた。イヌのCD20のDNA配列は配列表配列番号3に示し、イヌのCD20のRNA配列は配列表配列番号４に示した。
【実施例６】
【００２６】
＜アミノ酸配列の同定方法について＞
解析した遺伝子の塩基配列より、CD20のアミノ酸配列を同定した。同定したイヌのCD20アミノ酸配列は配列表配列番号１に示した。
このアミノ酸配列とヒト・マウスの遺伝子との相同性を確認した。Genbankに登録されているヒトCD20のアミノ酸配列との相同性が72.8％、マウスでは68.2％と高い相同性を示したため、今回解析した遺伝子はイヌのCD20であると判断できた。
またヒトCD20の膜外領域のアミノ酸配列とそれに相当すると考えられるイヌCD20のアミノ酸配列の相同性は66.6％であった。CD20の膜外領域の配列は配列表配列番号2に示し、DNA配列は配列表配列番号5に示した。
【実施例７】
【００２７】
＜イヌCD20遺伝子を増幅するためのプライマーの作製＞
上記において決定した全イヌCD20遺伝子塩基配列より、配列表配列番号5に記載のイヌCD20の膜外領域の遺伝子を含む506ｂｐの配列を増幅するためのプライマーとして適した配列を選択し、配列表配列番号19に示した配列を有するSense  primerおよび配列表配列番号20に示した配列を有するReverse  primerを設計した。
【実施例８】
【００２８】
＜イヌの悪性リンパ腫を診断する方法＞
（１）試料の調製
正常イヌリンパ節（２例）およびリンパ腫（Stage  III  １例、IV １例、V ８例）のリンパ節から採取した腫瘍細胞から、キット（Rneasy  Mini  kit、QIAGEN）を用いて、total  RNAを抽出した。次に混入しているDNAをキット（DNA  free  kit、Ambion）で取り除いた後、total  RNA（2μg）からキット（Omniscript  RT  kit、QIAGEN）を用いて、PCR反応に使用する鋳型cDNAを合成した。なお、リンパ腫（１０例）における各試料の由来は表面抗原解析によって調べ、各試料の由来および特徴を表１に示した。
各試料の鋳型cDNA量をそろえるために、遺伝子発現の対照遺伝子としてイヌのGAPDH遺伝子量の発現量を調べ、これに基づき各試料中のcDNA量を均一化した。各試料におけるイヌのGAPDH遺伝子について、GAPDH遺伝子特異的プライマー（Sense  primer５´-  CTCTTTGCTGCCATTTCTGGAAT  -３、Reverse  primer５´-  TCTATTGGTGAAGATTCCTG  -３´）と、耐熱性DNA  polymerase  （rTaq）を添加した反応液を94℃で５分heat  denateした後、94℃・30秒、55℃・30秒、72℃・1分（伸長反応7分）を26cycleの条件でPCRを行った（TaKaRa  Taq、TaKaRa）。PCR反応によって増幅した遺伝子を2％のアガロースゲル上で電気泳動し、臭化エチジウムで染色後、紫外線照射下で観察した。【００２９】
【表１】
2005075640.tif 000002
【００３０】
（２）試料の増幅
各試料のcDNA量を均一化し、それらを鋳型として、配列表配列番号19に示した配列を有するCD20遺伝子またはその断片を増幅するためのSense  primerおよび配列表配列番号20に示した配列を有するCD20遺伝子またはその断片を増幅するためのReverse  primerと、耐熱性DNA  polymerase  （rTaq）を添加した反応液を94℃で５分heat  denateした後、94℃・30秒、55℃・30秒、72℃・1分（伸長反応7分）を37cycleの条件でPCRを行った（TaKaRa  Taq、TaKaRa）。PCR反応によって増幅された各試料のｃDNAについてアガロースゲル上で電気泳動し、臭化エチジウムで染色後、紫外線照射下で観察した。これに基づき各試料におけるイヌCD20の膜外領域の遺伝子を含む断片の増幅の有無により、イヌCD20遺伝子の発現を調べ、イヌのBリンパ球由来の悪性リンパ腫の診断に用いた。各試料におけるイヌCD20遺伝子の発現を図１に示した。【００３１】
（３）結果
図１に示したように、正常イヌリンパ節２例（図１、１１、１２）およびBリンパ球由来7例（図１、１２の１〜３、６、８〜１０）においては、CD20遺伝子の発現が認められたが、Tリンパ球由来1例（図１、４）、未分化リンパ腫細胞1例（図１、７）、不明1例（図１、５）においてはCD20遺伝子の発現が認められなかった。このことより、本発明の配列表配列番号19及び20に記載のCD20遺伝子を増幅するためのプライマーを用い、CD20遺伝子の発現を調べることで、イヌのBリンパ球由来の悪性リンパ腫を診断できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明により明らかにされたイヌのCD20遺伝子配列は、イヌの悪性リンパ腫の抗体治療や診断等の開発において有用である。さらに詳しくは該遺伝子配列よりイヌの抗CD20抗体作成し、新規なイヌの悪性リンパ腫の治療薬や診断薬、またはそれらを用いる器具等の開発に役立つ。
【図１】
2005075640.tif 000003
【配列表】
2005075640000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年8月11日(2005.8.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】請求の範囲
【請求項１】配列表配列番号１記載のアミノ酸配列を有するイヌＣＤ２０蛋白質。
【請求項２】配列表配列番号１に記載のアミノ酸配列に７０％以上の相同性を有し、イヌＣＤ２０と同じ機能を有する蛋白質。
【請求項３】配列表配列番号１に記載のアミノ酸配列に８０％以上の相同性を有し、イヌＣＤ２０と同じ機能を有する蛋白質。
【請求項４】配列表配列番号３記載のイヌＣＤ２０をコードするＤＮＡ。
【請求項５】配列表配列番号３に記載のＤＮＡ配列に７０％以上の相同性を有するヌクレオチド。
【請求項６】配列表配列番号３に記載のＤＮＡ配列に８０％以上の相同性を有するヌクレオチド。
【請求項７】配列表配列番号４記載のイヌＣＤ２０をコードするＲＮＡ。
【請求項８】配列表配列番号４に記載のＲＮＡ配列に７０％以上の相同性を有するヌクレオチド。
【請求項９】配列表配列番号４に記載のＲＮＡ配列に８０％以上の相同性を有するヌクレオチド。
【請求項１０】請求項４に記載のイヌＣＤ２０遺伝子断片を組み込んだプラスミド。
【請求項１１】請求項５または６に記載のヌクレオチドを組み込んだプラスミド。
【請求項１２】請求項７に記載のイヌＣＤ２０遺伝子断片を組み込んだプラスミド。
【請求項１３】請求項８または９に記載のヌクレオチドを組み込んだプラスミド。
【請求項１４】請求項１０または１１に記載のプラスミドを組み込んだ形質転換体。
【請求項１５】請求項１２または１３に記載のプラスミドを組み込んだ形質転換体。
【請求項１６】イヌＣＤ２０遺伝子またはその断片を増幅するための、イヌ悪性リンパ腫診断用の配列表配列番号１９に記載のプライマー。
【請求項１７】イヌＣＤ２０遺伝子またはその断片を増幅するための、イヌ悪性リンパ腫診断用の配列表配列番号２０に記載のプライマー。
【請求項１８】請求項１６または１７に記載のプライマーを用い、イヌＣＤ遺伝子またはその断片を増幅することで、イヌのＣＤ２０遺伝子の発現を調べ、イヌの悪性リンパ腫を診断する方法。
【国際調査報告】
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