(57)【要約】本発明は、ヒトＢＭＰ−２遺伝子を組み込んだプラスミドベクターを含む骨または軟骨形成剤、および遺伝子導入効率を高めるために繰り返しエレクトロポレーションを行っても、極めて低侵襲で、安価かつ簡易に自己骨再生が可能な、前記骨または軟骨形成剤を用いた、骨または軟骨形成方法を提供する。  本発明は、骨形成因子であるＢＭＰ−２をプラスミドベクターに組み込み、エレクトロポレーションを繰り返し行うことで、標的細胞へのＢＭＰ−２の導入効率を高め、骨欠損部位における自己骨再生を誘導する骨または軟骨形成方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＢＭＰ−２遺伝子を発現可能に組み込んだプラスミドベクターからなる、骨または軟骨形成剤。
【請求項２】
ヒトＢＭＰ−２遺伝子を発現可能に組み込んだプラスミドベクター、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項３】
骨または軟骨形成用の請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記担体が、注射剤または経血管投与に適したものである請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
一対の電極、電気パルスの供給手段、骨または軟骨を形成すべき部位に電極を固定することが可能な手段を備え、請求項１に記載の骨または軟骨形成剤を前記部位の細胞に導入するための装置。
【請求項６】
さらに抗炎症剤および成長因子からなる群より選ばれる２以上の補助成分を含む、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ヒトＢＭＰ−２遺伝子を発現可能に組み込んだプラスミドベクターにより、形質転換された細胞からなる、骨または軟骨形成剤。
【請求項８】
ヒトＢＭＰ−２遺伝子を組み込んだプラスミドベクターをｉｎ  ｖｉｖｏの標的部位に投与する工程、エレクトロポレーション法により、ｉｎ  ｖｉｖｏの標的部位の細胞に前記遺伝子を導入する工程、をこの順に含む骨形成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ヒトＢＭＰ−２を用いた骨および軟骨形成に関する。
【背景技術】  ＢＭＰ−２（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−２）タンパク質は、骨誘導作用を有することが知られている（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７，２２２０−２２２４）。ヒトＢＭＰ−２タンパク質をコードする遺伝子が単離されてから、ｒｈＢＭＰ−２（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＢＭＰ−２）タンパク質の精製が行われ、動物を用いた実験で、異所性の骨形成、および骨欠損の治療の成果をあげてきた（Ｙａｓｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２），Ｊ．ＢｏｎｅＪｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．Ａｍ．７４，６５９−６７０；Ｆｕｊｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０８，３１６−３２２）。これにより、該タンパク質の歯科、顎顔面および整形外科領域における様々な臨床適用が期待されている。
しかし、ＢＭＰ−２タンパク質は、その精製物の製造に費用がかかり高価である。また、可溶性であることから、移植後直ちに拡散するため、標的部位にこのタンパク質を留めておくことが困難であった。そこで、ＢＭＰ−２タンパク質を用いた骨形成誘導方法の代替手段として、ＢＭＰ−２タンパク質をコードする遺伝子を利用した、遺伝子治療が行われるようになった。その代表的な方法として、ウイルスベクターを用いる方法、および非ウイルスベクターを用いるエレクトロポレーション法があげられる。
ウイルスベクターを用いた場合、宿主の免疫反応惹起等の危険性がある。一方、非ウイルスベクターを用いるエレクトロポレーション法では、ウイルスを用いた場合よりも迅速な遺伝子発現が可能であり、宿主の免疫系に影響することもない。さらに、エレクトロポレーション法は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても適用することが可能であることから、生体内における骨欠損を修復することが可能である。しかし、エレクトロポレーション法を用いると、高電圧パルスを細胞に加えるため細胞へのダメージは避けられない。そのため、エレクトロポレーションを繰り返し行うという、侵襲を増やすような方法で遺伝子導入効率を高めることは知られていなかった。
本発明は、ヒトＢＭＰ−２遺伝子を組み込んだプラスミドベクターを含む骨または軟骨形成剤、および遺伝子導入効率を高めるために繰り返しエレクトロポレーションを行っても、極めて低侵襲で、安価かつ簡易に自己骨再生が可能な、前記骨または軟骨形成剤を用いた、骨または軟骨形成方法を提供することを主な目的とする。
【発明の開示】
本発明者らは、ヒトＢＭＰ−２遺伝子を組み込んだプラスミドベクターを標的部位に注入後、経皮的エレクトロポレーションを繰り返し行うことで、遺伝子導入効率を高めることができ、骨形成が誘導されること、および繰り返しエレクトロポレーションを行っても、標的部位の細胞へのダメージが極めて軽度であることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下の骨または軟骨形成剤、およびエレクトロポレーション法を用いた骨形成因子遺伝子導入による骨または軟骨形成方法を提供する。
項１．ヒトＢＭＰ−２遺伝子を発現可能に組み込んだプラスミドベクターからなる、骨または軟骨形成剤。
項２．ヒトＢＭＰ−２遺伝子を発現可能に組み込んだプラスミドベクター、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
項３．骨または軟骨形成用の項２に記載の医薬組成物。
項４．前記担体が、注射剤または経血管投与に適したものである項２に記載の医薬組成物。
項５．一対の電極、電気パルスの供給手段、骨または軟骨を形成すべき部位に電極を固定することが可能な手段を備え、項１に記載の骨または軟骨形成剤を前記部位の細胞に導入するための装置。
項６．さらに抗炎症剤および成長因子からなる群より選ばれる２以上の補助成分を含む、項２に記載の医薬組成物。
項７．ヒトＢＭＰ−２遺伝子を発現可能に組み込んだプラスミドベクターにより、形質転換された細胞からなる、骨または軟骨形成剤。
項８．ヒトＢＭＰ−２遺伝子を組み込んだプラスミドベクターをｉｎ  ｖｉｖｏの標的部位に投与する工程、エレクトロポレーション法により、ｉｎ  ｖｉｖｏの標的部位の細胞に前記遺伝子を導入する工程、をこの順に含む骨形成方法。
本発明の限定的解釈を望むものではないが、本発明の作用機序について、本発明者らは以下のように考える。
ヒトＢＭＰ−２遺伝子を組み込んだプラスミドベクターを標的部位に注射した後、エレクトロポレーションでヒトＢＭＰ−２遺伝子を標的部位の細胞に導入すると、ヒトＢＭＰ−２遺伝子を導入された細胞は、ＢＭＰ−２蛋白質を細胞内で作成し、分泌する。分泌されたＢＭＰ−２蛋白質が、その周囲に存在する間葉系細胞に作用し、骨芽細胞を誘導、骨組織を形成する。
異所性に骨組成の形成を誘導するヒトＢＭＰ−２（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−２）遺伝子を組み込んだプラスミドベクターを標的部位に注射した後、エレクトロポレーションでヒトＢＭＰ−２遺伝子を標的部位の細胞に導入することによって、標的部位にて骨形成が誘導される。このとき、エレクトロポレーションを数回行うことで、効率の良い遺伝子導入が可能である。また、ヒトＢＭＰ−２は異所性に骨形成を誘導することから、手術等により骨を欠損した患者に対しても、自己骨での骨再生が可能である。
本発明において、『異所性に骨形成を誘導する』とは、近傍に骨組織がない場合であっても骨形成が可能なことを指す。すなわち、本発明の骨または軟骨形成剤を用いれば、例えば下顎骨の大部分を欠損した場合等でも修復が可能である。また、『標的部位』とは哺乳動物のｉｎ  ｖｉｖｏでの骨または軟骨形成を目的とする部分を指し、『標的部位の細胞』とは、哺乳動物のｉｎ  ｖｉｖｏでの骨または軟骨形成を目的とする部分の任意の細胞を指す。
本発明に使用されるＢＭＰ遺伝子は、ＴＧＦ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）−βスーパージーンファミリーに属するサイトカインであり、骨誘導能を有する骨形成因子等の遺伝子が広く含まれる。また、ＢＭＰ遺伝子は、ヒトＢＭＰであることが好ましい。
以下、ヒトＢＭＰ−２を用いた場合について説明するが、他のＢＭＰ遺伝子を用いた場合の変更点は、当業者であれば容易に想到し得るものである。
本発明のヒトＢＭＰ−２を組み込んだプラスミドベクターは、スクリーニングおよびサブクローニング等の常法によって得ることができる。
本発明のヒトＢＭＰ−２−プラスミドベクターの作製には、プライマーとして配列番号１及び２のプライマーセットを用いてスクリーニングを行うことが好ましい。配列番号１において、５’側から第９〜１４位のＧＡＡＴＴＣはＥｃｏＲＩ認識サイトを表し、５’側から第２２〜２４位のＡＴＧは、開始コドンを表す。配列番号２において、５’側から第９〜１４位のＧＡＡＴＴＣはＥｃｏＲＩ認識サイトを表し、５’側から第１５〜１７位のＣＴＡは、終止コドンを表す。
本発明のヒトＢＭＰ−２−プラスミドベクターの作製に使用されるプラスミドベクターとしては、ｐＣＡＧＧＳ、ｐＵＣ  ＢＮＰ−２、ｐＧＬ３Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒ、ｐＤＳＲｅｄ  ２−１等、動物細胞発現用に通常用いられているプラスミドベクターを適宜に使用することができるが、ｐＣＡＧＧＳが好ましい。
本発明に使用されるプラスミドベクターには、プロモーターが含まれる。プロモーターとしては、当業者によって通常使用されるものであれば特に制限されず、ウイルス由来のもの、例えば、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０由来のもの等、あるいは非ウイルス由来のもの（例えば、ＥＦ１−α）等、バクテリオファージλ由来のもの、ＣＡＧ、ｔｒｐ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｔａｃプロモーター等があげられるが、ＣＡＧプロモーターが好ましい。
本発明のヒトＢＭＰ−２−プラスミドベクターは、室温であっても安定であるが、４℃の冷蔵庫内で保存することが好ましい。
本発明のヒトＢＭＰ−２−プラスミドベクターを、骨または軟骨形成剤として使用することができ、前記骨または軟骨形成剤に、当業者によって通常使用される、薬学的に許容される担体を含むこともできる。担体としては、滅菌水、生理食塩水、および各種緩衝溶液等があげられる。また、同様に、賦形剤および添加剤等を含むこともできる。
賦形剤としては、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム等があげられ、添加剤としては、粘稠剤、緩衝剤、保存剤または防腐剤等があげられる。
粘稠剤としては、メチルセルロース（ＭＣ）、カルメロースナトリウム（ＣＭＣ−Ｎａ）、コンドロイチン硫酸等があげられる。
緩衝剤としては、ホウ酸、ポリリン酸ナトリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸二カリウム、マレイン酸、無水クエン酸、乾燥炭酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム等があげられる。
保存剤または防腐剤としては、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、ベンジルアルコール、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム等があげられる。
本発明の骨または軟骨形成剤は、局所投与用の製剤として調製されることが好ましい。
本発明に係るエレクトロポレーションを用いた骨形成方法は、以下のプロセスを含む。
プロセス１．前処置
プロセス１では、エレクトロポレーションを行いやすくするため、必要であれば標的部位の体毛を除去し、通電性を高めるため、例えばケラチンクリーム等を適量塗布しておくことが好ましい。
プロセス２．標的部位への投与
本発明のヒトＢＭＰ−２−プラスミドベクターを含む骨または軟骨形成剤の投与形態としては、標的部位に該プラスミドベクターを投与できるものであれば特に限定されず、カテーテルまたはバルーン付きカテーテル等を用いることもできるが、注射が好ましい。
ヒトＢＭＰ−２−プラスミドベクターを注射は、エレクトロポレーションに用いる電極間の通電される部位に行うことが好ましい。また、例えばおよそ１ｍｌ容量の骨を形成させる場合、ヒトＢＭＰ−２−プラスミドベクターの投与量は、およそ１ｍｌであり、このプラスミドベクターの濃度は、約０．１〜１００．０μｇ／μｌ、好ましくは約０．３〜５０．０μｇ／μｌ、より好ましくは約０．５〜８．０μｇ／μｌである。該プラスミドベクターの投与量および濃度は、対象となる患者および標的部位によって適宜調節することができる。
本発明の骨形成方法を行う場合、骨形成促進物質をヒトＢＭＰ−２−プラスミドベクターの注射の際に、注射液に混合することにより、骨形成速度を速めることが可能である。骨形成促進物質としては、ＰＧＥ１（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ１）、ＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、ＴＧＦ−β、ビタミンＤ３、ビタミンＫ２等があげられる。この骨形成促進物質は、エレクトロポレーションを行った後に投与することも可能である。
プロセス３．エレクトロポレーション
本発明に係る骨形成方法において使用される電極は、カーボン、白金、金、チタン、銀、塩化銀、ステンレス、ステンレス鋼、タングステン、銅、鉛または塩化銅等を材料とし、中でもステンレス鋼製であることが好ましい。また、これに白金、金、銀、銅等の通常使用されるメッキ材でメッキしたものであってもよい。
電極の形状は、針電極でも良いが、侵襲性の観点から経皮的に通電が可能なプレート電極であることが好ましい。標的部位によっては、電極の形状をピンセット型、またはグリップ型等に適宜変更することが可能である。電極を固定する手段としては、ピンセット型電極による挟み込み、または針型電極の刺入等があげられる。この電極を２本用意し、標的部位を挟むようにして２本一組で使用する。
上記の電極を使用し、２つの電極間の中心部分にヒトＢＭＰ−２−プラスミドベクターを注射し、エレクトロポレーション、すなわち電気パルスを与えることで、標的部位の細胞にトランスフェクションを行うことができる。電気パルスを供給する装置としては、当業者によって通常使用されるエレクトロポレーションシステムを用いることができる。
電気パルスの方法としては、電圧２５〜５００Ｖ程度、好ましくは、５０〜２００Ｖ程度、通電時間５〜１０００ミリ秒程度、好ましくは、１０〜２００ミリ秒程度であり、合計１〜１００回、好ましくは６〜１２回を、約０．２５〜３０秒、好ましくは、約０．５〜５秒間隔で通電する。
このとき、後半（合計８回行うのであれば後半の４回）の通電は異極性（逆向き）の電気パルスで行うことが好ましく、可能であれば、交互に異極性の電気パルスを通電することが、より好ましい。このヒトＢＭＰ−２−プラスミドベクターの注射およびエレクトロポレーションの一連の処置を、１セッションとする。
生体内でヒトＢＭＰ−２遺伝子を発現による骨形成を誘導するには、上記の処置を１セッション行うだけでも可能であるが、骨形成を確実に誘導するには、２〜６セッション程度、好ましくは３〜５セッション程度、最も好ましくは５セッションエレクトロポレーションを行う。
ヒトＢＭＰ−２−プラスミドベクターは、体内で拡散しやすいため、注射後直ちにエレクトロポレーションを行い、エレクトロポレーションは、１セッションにつき６回を上限とすることが好ましい。エレクトロポレーションを７回以上行うと、標的部位の細胞への負担が大きくなり、また細胞の感受性も低下するため好ましくない。また、連続して骨形成の誘導を行う場合は、１セッションごとに、２４時間程度あけることが好ましい。
通電の際、電極間の抵抗を測定することで、電流の精度を確認することが好ましい。このとき、電極間の抵抗は、通常８００Ω以下であることが好ましい。また、電極間の距離は、可能な限り短くすることが好ましい。
例えば、本発明の骨形成方法を上腕骨を一部欠損した患者に適用する場合、ヒトＢＭＰ−２プラスミドベクター溶液（８．０μｇ／μｌ）を欠損した骨部分と同じ容量（上腕骨の断面積が４平方ｃｍとすると、４０ｃｃ）注入し、骨の断端に設置した端子もしくは経皮的エレクトロポレーションで１００Ｖ、通電時間は５０ミリ秒で８回（４回は通電方向を逆にする）を、１秒間隔で通電する。これを２４時間おきに５セッション行う。他の部位の骨欠損に適用する場合、当業者は上記の上腕骨の例を参考に、容易に実施条件を決定することができる。
比較的大きな骨を形成する場合、形成させたい骨の形（もしくは断面形状）の端子を作製し、経皮的に通電させるか、または吸収性材料などで作製した端子を埋入して通電する方法があげられる。このとき吸収性材料としては、生分解性および導電性を有するプラスチック等を使用することができる。また、ＢＭＰ−２−プラスミドベクターの投与およびエレクトロポレーションを何度も繰り返し、適当な形状になったところで止める方法もあげられる。この場合には、ピンセット型電極を用いても良い。
本発明に係る骨形成方法を実施する場合、患者を臨床医によって通常用いられる麻酔薬で麻酔してもよい。
プロセス４．後処置
エレクトロポレーション後、Ｘ−線撮影によって骨形成の有無を確認することが可能である。また、エレクトロポレーション後は、当業者によって通常用いられる方法（ギブス、包帯等）で患部を固定しておくことが好ましい。
本発明に係る骨形成方法によって、軽度ではあるが筋肉が損傷され、患部に炎症を引き起こす場合があるため、エレクトロポレーション後に、通常用いられる消炎剤を投与することが好ましい。消炎剤としては、例えばアスピリン、フェルビナク、インドメタシン、ジクロフェナクナトリウム等があげられる。これらの消炎剤は、エレクトロポレーションの前にヒトＢＭＰ−２−プラスミドベクターと共に、または別々に投与しておくこともできる。
本発明に係る骨形成方法が、大腿骨欠損、深部の骨欠損に対して適用される場合、本発明の電極を、針状または端子状にして用いることができる。深部の骨欠損の場合には、通電性の膜等を外科的に体内に埋め込み、針状電極を用いてエレクトロポレーションを行った後、この通電性の膜を除去する方法を適用することができる。
本発明の他の好ましい実施態様として、ヒトＢＭＰ−２遺伝子を組み込んだプラスミドベクターによって、形質転換された細胞を用いた骨または軟骨形成があげられる。
ヒトＢＭＰ−２−プラスミドベクターによる細胞の形質転換は、当業者によって通常使用される形質転換方法によって行うことができる。
本発明に係るヒトＢＭＰ−２−プラスミドベクターによって形質転換される細胞としては、当業者によって通常使用されるものであれば特に限定されないが、Ｈｅｌａ細胞等のヒト由来の細胞であることが好ましい。
形質転換細胞を作製する場合、ヒトＢＭＰ−２−プラスミドベクターに、薬剤耐性マーカー等の選択マーカーを組み込んでおくことが好ましい。
上記のようにして得られた形質転換細胞を、例えば、骨粗鬆症患者の骨の標的部位に注入することで骨量を増加し、症状を改善させることができる。また、膝軟骨等の軟骨損傷部位に注入することによって、軟骨形成を促進することができる。
また、標的部位に吸収性の材料からなる、円筒形またはシート状等のガイド、すなわち最終的な骨の形状を規定する材料を外科的に埋め込み、そこへ該形質転換細胞を注入することによって骨および軟骨形成を誘導することも可能である。このとき、吸収性の材料は、コラーゲン、セルロース、キチン・キトサン等の宿主側からの血液供給が可能なものであることが好ましい。
上記の形質転換細胞を使用した骨および軟骨形成は、形質転換細胞のかわりに、ヒトＢＭＰ−２−プラスミドベクターを用いた本発明のエレクトロポレーション法によっても同様に行うことができる。
本発明による骨形成方法の適用対象としては、例えば、腫瘍手術または事故等によって骨欠損を生じた患者があげられる。また、骨欠損を生じていなくても、例えば、粉砕骨折、変形性関節症、先天性骨疾患（骨形成不全症等）等、整形外科領域の疾患；口蓋裂；顎提形成および上顎洞底挙上等のインプラント前処置等、歯科領域の疾患；ならびに骨粗鬆症等にも適用することができる。また、本発明の骨形成方法は、獣医外科領域についても適用が可能である。
インプラントの前処置としては、主に２通りの適用方法があり、骨量が不足している部位へ投与する方法、およびインプラント埋入時に投与し、インプラントと骨が結合する速度、すなわち治癒速度を促進することで治癒期間を短縮させる方法がある。後者の場合、ヒトＢＭＰ−２−プラスミドベクターまたはこれによって形質転換された細胞が、インプラント表面にごく微量存在するだけでも治癒速度を促進することが可能である。
また、本発明の骨または軟骨形成剤を、歯の再生、特に象牙質形成に用いることができ、歯胚細胞および幹細胞等を応用すれば、セメント質およびエナメル質の再生も可能である。
さらに、本発明の骨または軟骨形成剤は、ＢＭＰ遺伝子の骨形成能以外の性質、例えばＢＭＰ遺伝子の腎細胞分化活性を利用し、腎疾患の予防および治療剤等としても使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、経皮的エレクトロポレーションを行った、または経皮的エレクトロポレーション行わなかった、ｐＣＡＧＧＳ−ｌａｃＺの遺伝子導入後の、筋肉におけるβ−ガラクトシダーゼに対するＸ−ｇａｌ染色の写真を示す。筋肉に、経皮的エレクトロポレーションを１回（Ａ）、またはエレクトロポレーションなしに２５μｇのｐＣＡＧＧＳ−ｌａｃＺの注射を５回（Ｂ）行った後、１日後に染色した。コントロールとして、未処置の筋肉（Ｃ）を、同様の方法で染色した。全ての切片をエオシンで染色した。スケールバー：１ｍｍ
【図２】図２は、ｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２またはｐＣＡＧＧＳの経皮的エレクトロポレーションした後の筋肉における、ヒトＢＭＰ−２ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによる検出を写真で示す。２５、１００、４００μｇのｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２をエレクトロポレーションした後、５日後（５ｄ）または１０日後（１０ｄ）に、ヒトＢＭＰ−２ｍＲＮＡが検出された。
【図３】図３は、ｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２（図中：ＢＭＰ−２）またはｐＣＡＧＧＳ（図中：Ｃ）の経皮的エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を１、３、５セッション（それぞれ、×１、×３、×５）行った後の、筋肉におけるヒトＢＭＰ−２ｍＲＮＡ検出のためのＲＴ−ＰＣＴの結果を、写真で示す。
【図４】図４は、ｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２の単回エレクトロポレーション後のＢＭＰ−２産生を観察した。２５μｇ、１００μｇ、または４００μｇのｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２の注射及びエレクトロポレーションを行った後、５日後（５ｄ）または１０日後（１０ｄ）のウェスタンブロッティングの結果を写真で示す。
【図５】図５は、２５μｇのｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２のエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、１、３、または５セッション（それぞれ、×１、×３、×５）後の、ＢＭＰ−２産生を写真で示す。
【図６】図６は、ｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２のエレクトロポレーション、１（Ａ，Ｅ）、３（Ｂ，Ｆ）、または５（Ｃ，Ｇ）セッションの後の筋肉の病理学的変化、およびＢＭＰ−２の局在を写真で示す。Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を示す。エレクトロポレーションの７日後のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色で、病理学的変化が検出された。同一の切片を、免疫生化学によるＢＭＰ−２局在について解析した（Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ）。未処置の筋肉を、同様の方法で染色した（Ｄ，Ｈ）。  スケールバー：５００μｍ
【図７】図７は、ｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２またはｐＣＡＧＧＳの遺伝子導入の後、２１日後の標的筋肉の軟Ｘ−線写真を示す。ｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２のエレクトロポレーション後（ｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２  ｗｉｔｈ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、不透明部分が見られた（矢印）。  スケールバー：１０ｍｍ
【図８】図８は、ｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２またはｐＣＡＧＧＳの遺伝子導入の後、２１日後の組織学的試験の結果を写真で示す。ｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２の投与後、Ｈ＆Ｅ染色（Ａ，Ｄ）は、骨芽細胞様細胞（赤矢印：図中左の矢印）、および破骨細胞様細胞（黒矢印：図中右の矢印）を有する異所性骨形成の存在を示した。連続切片を、組織非特異的アルカリホスファターゼの免疫組織化学的検出のために染色した（ＴＮＡＬＰ；Ｂ，Ｅ）。酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）陽性破骨細胞を、ＴＲＡＰ染色によって検出した（Ｃ，Ｆ）。陽性破骨細胞は、赤く染色される（Ｃ，Ｆ）。ｐＣＡＧＧＳのエレクトロポレーションの後、２１日後のＴＮＡＬＰ発現、またはＴＲＡＰ陽性破骨細胞には、骨形成は認められなかった（Ｇ，Ｈ，Ｉ）。  スケールバー：１００μｍ
【図９】図９は、ｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２のマップを表す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、実施例をあげて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、これらの実施例によって限定されないことは言うまでもない。
【実施例】実施例１．プラスミドベクター
ヒトＢＭＰ−２ｃＤＮＡを得るため、プラスミドｐＵＣ  ＢＮＰ−２（Ｏｋｕｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６２，７３９−７４３）、ならびに配列番号１及び配列番号２に示されるプライマーセットを用いたＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った。配列番号１において、５’側から第９〜１４位のＧＡＡＴＴＣはＥｃｏＲＩ認識サイトを表し、５’側から数えて第２２位からのＡＴＧは、開始コドンを表す。配列番号２において、５’側から第９〜１４位のＧＡＡＴＴＣはＥｃｏＲＩ認識サイトを表し、５’側から第１５〜１７位のＣＴＡは、終止コドンを表す。
ＰＣＲは、９８℃にて１５秒を２５サイクル、６５℃にて２秒、そして７４℃にて３０秒のプロトコールを、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメレース（Ｔｏｙｏｂｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を使用して行った。このＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩを用いて消化を行い、ｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２を得るために、ＣＡＧ（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｉｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｒ／ｃｈｉｋｅｎ  β−ａｃｔｉｎ  ｈｙｂｒｉｄ）プロモーター（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１），Ｇｅｎｅ  １０８，１９３−１９９）を含む、ｐＣＡＧＧＳ発現ベクターのＥｃｏＲＩ−消化クローニングサイトにライゲーションを行った。
この１１９７−ｂｐのインサート配列を、ＤＮＡシーケンシングによって確認した。その後、プラスミドを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α中で増殖させた。プラスミドベクターは、Ｑｉａｇｅｎ  ＥｎｄｏＦｒｅｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  Ｇｉｇａ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて調製した（Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。注射の直前、このＤＮＡを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に、０．５、２、または８μｇ／μｌに希釈した。
ラット
９週齢の雄ウイスターラットを、Ｋｕｒｅａ（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）から購入し、特定の発光体の無い条件の下で飼育した。
筋肉内ＤＮＡ注射および経皮的エレクトロポレーション
ラットを、ペントバルビタールナトリウム（体重１００ｇにつき０．５ｍｇ）を腹腔内投与することで麻酔し、足の標的領域の毛を、クリッパーで除去した。標的部位をケラチンクリーム（Ｆｕｋｕｄａ  Ｄｅｎｓｈｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で覆った後、一組の５ｍｍ固定長のステンレス鋼からなるプレート電極を取り付けた。電流の精度を、皮膚切開をしていない腓腹筋の中央を囲む、電極間の抵抗（通常、８００Ω以下）を測定することによって確認した。
次に、５０μｌのプラスミドＤＮＡ（２５μｇ、１００μｇ、または４００μｇ）を、２７ゲージの注射針を使用して、電極間の中央に注射した。注射の直後に、電気パルスを８回（１００Ｖ，５０ｍｓｅｃ）加えることによってエレクトロポレーションを開始した。４回通電した後、異極性の電気パルスを４回行い、これらの電気パルスは、四辺形のエレクトロポレーター（ＣＵＹ２１ＥＤＩＴ；Ｎｅｐａ  Ｇｅｎｅ）を使用して、１秒間隔で注射部位に処理した。本実施例において、２４時間間隔で１〜５セッション、エレクトロポレーションを行った。
統計学的解析
平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）で結果を表す。ＡＬＰ活性およびＣａ含有量の群間での相違の統計学的解析を、分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続き、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｅｓｔによって行った。
Ｘ−ｇａｌ染色
経皮的エレクトロポレーションによる、骨格筋内へのｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子導入を明らかにするため、Ｅ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼの細胞質発現を引き起こす（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１），Ｇｅｎｅ  １０８，１９３−１９９）２５μｇのｐＣＡＧＧＳ−ｌａｃＺの供与後に、筋組織に組織学的染色を行った。ラットを、エレクトロポレーションの１日後に解剖し、標的の筋肉をＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  Ｏ．Ｃ．Ｔ．ｃｏｕｍｐｏｕｎｄ（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に包埋し、この組織を、ドライアイスおよびアセトンの混合液の中で凍結した。そして、クライオスタットにて連続切片（５−μｍの厚さ）を作製し、３−アミノ−プロピルトリエトキシシランでコーティングしたスライドガラス上に置いた。
この切片を、室温で１０分間、１．５％グルタルアルデヒド中にて固定し、冷やしたＰＢＳで３回洗浄（１回の洗浄につき５分間）した後、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に、１ｍｇ／ｍｌ  Ｘ−ｇａｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６、５ｍＭ  Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、および０．５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０を含む、Ｘ−ｇａｌ染色溶液中で、３７℃にて３時間、インキュベーションを行った。この切片に、エオシンで対比染色を行った（Ａｉｈａｒａ  ａｎｄ  Ｍｉｙａｚａｋｉ，（１９９８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６，８６７−８７０）。
１回の２５μｇのｐＣＡＧＧＳ−ｌａｃＺとのエレクトロポレーションの後（図１Ａ）では、エレクトロポレーションをせずに５回のｐＣＡＧＧＳ−ｌａｃＺ注射（２５μｇ）を行った後（図１Ｂ）よりも、はるかに広範囲にわたってＸ−ｇａｌ染色された筋線維が観察された。
結果より、経皮的エレクトロポレーションを行うことで、プラスミドＤＮＡによってトランスフェクションされる筋線維の数が増加することがわかった。
実施例２．ＲＴ−ＰＣＲ
遺伝子導入の１日、５日、または１０日後、ｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２（ｎ＝１）またはｐＣＡＧＧＳのみ（ｎ＝１）を注射したラットを、一般的な麻酔の下で解剖し、そして標的筋（０．１５ｇ）を切除した。全ＲＮＡを、Ｉｓｏｇｅｎ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して筋組織から単離した。配列番号３〜６に示されるプライマーを用い、ＲＴ−ＰＣＲによって、ヒトＢＭＰ−２ｍＲＮＡおよびグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデハイドロゲネース（Ｇ３ＰＤＨ）ｍＲＮＡを検出した。
配列番号４に示されるヒトＢＭＰ−２フォワードプライマーを、ＰＣＲ産物がプラスミドＤＮＡまたはゲノムＤＮＡによって汚染されないようにするため、ＣＡＧプロモーターの転写開始サイトのすぐ下流の配列にハイブリダイズするように設計した。ＲＮＡ（１μｇ）を、全容量２０μｌ中にて４２℃で１時間、インキュベーションし、その後、９４℃で３分間に続いて、９４℃にて１分、５５℃にて１分、そして７２℃にて１分を４０サイクル行った。このＰＣＲ産物を、２８５−ｂｐヒトＢＭＰ−２ｍＲＮＡおよび６８２−ｂｐＧ３ＰＤＨｍＲＮＡを検出するため、２％アガロースゲル電気泳動によって解析した。
ｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２（２５μｇ、１００μｇまたは４００μｇ）またはｐＣＡＧＧＳとの１セッションのエレクトロポレーションの後、５日または１０日後、筋肉の一部を切除し、ＲＴ−ＰＣＲによって、ｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２より転写されたヒトＢＭＰ−２ｍＲＮＡの存在を検出した（図２）。加えて、ｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２の１、３、または５セッションのエレクトロポレーションを行った（各２５μｇ）１日後に取り出した筋肉においても、同様の解析を行った（図３）。
ヒトＢＭＰ−２ｍＲＮＡは、経皮的エレクトロポレーションによってｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２をトランスフェクションした１日、５日および１０日後のすべての筋肉で検出されたが、ｐＣＡＧＧＳをトランスフェクションした筋肉では観察されなかった。コントロールＧ３ＰＤＨｍＲＮＡは、すべての群で観察された（図２および３）。したがって、ＲＴ−ＰＣＲの結果は、ｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２のエレクトロポレーション後、標的筋肉内のトランスフェクションされた細胞において、ヒトＢＭＰ−２が発現したことを示した。
実施例３．ＢＭＰ−２のウェスタンブロット解析
前記プラスミドの注射およびエレクトロポレーションの後、腓腹筋を解剖した。組織試料（０．２ｇ）を、Ｂｉｏ  Ｍｉｘｅｒ  Ｐｏｌｙｔｒｏｎ  ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（ｔｙｐｅ  ＡＢＭ，Ｎｉｓｓｅｉ  Ｉｎｃ．Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）の中の０．２５Ｍスクロース中でホモジェナイズし、４℃で１０分間、５０００ｇにて遠心分離した。この上清をヘパリン−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）に混合し、ヘパリンセファロースにタンパク質が吸着するように、暗闇で攪拌した。このヘパリンセファロース混合物をＰＢＳで洗浄し、４℃で１分間、８０００ｇにて遠心分離した。上清を除去した後、ヘパリンセファロース混合物は等量のドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動ローディングバッファーと混合し、７０℃で１０分間加熱し、そして１２％アクリルアミドゲル上で分離した。
このタンパク質を、ナイロンメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏ．，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）上にエレクトロブロッティングを行った後、このメンブレンをＢｌｏｃｋ  Ａｃｅ（Ｄａｉｎｉｐｐｏｎ  Ｓｅｉｙａｋｕ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で４℃にて一晩、ブロッキングし、その後、ブロッキングバッファー中にて抗ヒトＢＭＰ−２モノクローナル抗体（１：２００希釈、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）と共に室温にて２時間、インキュベートした。その後、このメンブレンを洗浄し、室温にて１時間、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウス抗体（１：３０００希釈）と共にインキュベートし、そして電気化学発光（ＥＬＣ）検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて可視化した。
ウェスタンブロッティングによって測定されるように、ｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２のエレクトロポレーションを行った標的筋肉の細胞は、ＢＭＰ−２を分泌できることを示した。ｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２（２５μｇ、１００μｇまたは４００μｇ）で処理された標的筋肉におけるウェスタンブロッティング解析により、１セッションのエレクトロポレーションから５日または１０日後に、ＢＭＰ−２が観察された（図４）。これに対し、ｐＣＡＧＧＳで処置された群では、ＢＭＰ−２産生は観察されなかった。また、１セッション、３セッションまたは５セッションのｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２（２５μｇ）とのエレクトロポレーションの後、１日後のラットの筋肉において、全ての群でＢＭＰ−２の産生が観察された（図５）。これらの結果は、経皮的エレクトロポレーションによる骨格筋へのＢＭＰ−２遺伝子導入が、ＢＭＰ−２を産生することを示す。
実施例４．Ｘ−線撮影による評価
エレクトロポレーションと共にプラスミド注射を行った、またはプラスミド注射を単独で行った後２１日目に、ラットを、過剰量のペントバルビタールで薬殺した。その後、注射を行った腓腹筋を切り取り、軟Ｘ−線撮影を行った（ＳＲＯ−Ｍ５０，Ｓｏｆｒｏｎ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）。
レントゲン写真は、ｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２のエレクトロポレーション（ｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２  ｗｉｔｈ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を受けた全ての群の標的筋肉において、明確な縁のある不透明部を示した。これに対し、ｐＣＡＧＧＳのエレクトロポレーション（ｐＣＡＧＧＳ  ｗｉｔｈ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）またはエレクトロポレーションをせずに５回のｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２の注射を受けた群（ｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）においては、軟Ｘ−線撮影では、明確な縁のある不透明部が検出されなかった（図７）。
明確な縁のある不透明部は、２５μｇのｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２を１セッションのエレクトロポレーションでトランスフェクションされた６匹のラットのうち２匹（３３％）、２５μｇのｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２を３セッションのエレクトロポレーションで処理された６匹のラットのうち２匹（３３％）、および２５μｇのｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２を５セッションのエレクトロポレーションで処理された６匹全てのラット（１００％）で見られた。
１００μｇまたは４００μｇのｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２をトランスフェクションした後では、軟Ｘ−線撮影において明確な縁のある不透明部には、２５−μｇ処理群で検出されたものと同様の傾向が見られた。すなわち、ｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２の経皮的エレクトロポレーションの繰り返しに伴い、不透明部が検出される確率が増加した。
実施例５．組織学的および免疫組織化学的解析
標的筋において、ｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２とのエレクトロポレーションによるＢＭＰ−２の分泌および分布を調査するため、この筋肉を、エレクトロポレーションの７日後に免疫組織化学的解析用に採取し、１０％緩衝ホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋した。その後、この試料の４μｍ厚切片を作成した。モノクローナル抗ヒトＢＭＰ−２抗体を、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から購入し、標識ストレプトビジン−ビオチン染色キット（ＬＳＡＢ  ｋｉｔ，ＤＡＫＯ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を用いて、免疫組織化学を行った。切片の脱パラフィン化を行い、再水和し、内因性のペルオキシダーゼの活性を阻害するために、３％Ｈ２Ｏ２で１５分間処理した。その後、この切片を、抗ＢＭＰ−２抗体（１：１００希釈）と共に、４℃にて一晩インキュベートした。そして、標識反応を、ジアミノベンジジン（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）で可視化し、Ｍａｙｅｒ’ｓヘマトキシリンで対比染色を行った。
ｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２の１セッション、３セッションまたは５セッションのエレクトロポレーションの７日後、免疫組織化学的解析により、血管をとりまく筋肉にＢＭＰ−２が高発現していることが示された（図６Ｅ、６Ｆおよび６Ｇ）。一方、処理されなかった筋肉においては、ＢＭＰ−２の発現は見られなかった（図６Ｈ）。これらの結果は、ｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２のエレクトロポレーションによる遺伝子導入が、標的筋肉においてＢＭＰ−２の産生および分泌を引き起こしたことを示している。
軟Ｘ−線写真における不透明部分がｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２のエレクトロポレーション後の骨形成であることを検証するため、エレクトロポレーションから２１日後の試料を１０％緩衝ホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋した。その後、４μｍ厚切片を作製し、Ｈ＆Ｅで染色した。
新生骨様のマトリックスが、筋線維において観察され（図８Ａ）、血球を含む骨髄様の空間が、新生骨様マトリックスの一部において見られた。新生骨様マトリックスは、楕円形で、ヘマトキシリン陽性の、マトリックスの周囲にラインを形成する、多数の骨が細胞を含有していた（図８Ｄ、赤矢印：図中左の矢印）。そこには、骨様マトリックスを取り囲む、多核破骨細胞様細胞も見られた（図８Ｄ、黒矢印：図中右の矢印）。一方、ｐＣＡＧＧＳのエレクトロポレーションを受けた群においては、異所性の骨形成は見られなかった（図８Ｇ）。
連続切片を、破骨細胞のマーカーである酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）で染色するため、また正常な骨形成過程を検出するため、骨芽細胞の活性による石灰化のマーカーである組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＬＰ）の免疫組織化学的検出のために使用した。０．１Ｍアセテート緩衝溶液（ｐＨ５．０）中の０．１ｍｇ／ｍｌナフトールＡＳＭＸリン酸（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、０．５％Ｎ，Ｎ−ジ−メチルホルムアミド、および０．６ｍｇ／ｍｌｆａｓｔ  ｒｅｄ  ＡＬ  ｓａｌｔ（Ｓｉｇｍａ）の混合液と共に、３７℃にて３０分間インキュベーションすることによって、ＴＲＡＰ活性を検出した。ＴＮＡＬＰ免疫組織化学用の切片を、脱パラフィンし、再水和し、そして内因性のペルオキシダーゼを阻害するために、３％Ｈ２Ｏ２で１５分間処理した。それから、この切片を抗ＴＮＡＬＰ抗体（１：２００希釈）と共に、４℃にて一晩インキュベートした（Ｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９），Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２６，６９４−６９９）。その後、ジアミノベンジジンで標識反応を可視化し、切片をＭａｙｅｒ’ｓヘマトキシリンで比較染色した。
異所性骨様マトリックスが、骨芽細胞が寄与する石灰化の活性を有しているかどうか、について試験した結果、多くの骨芽細胞が存在する、異所性骨様マトリックスの周辺組織、および骨髄様空間に、ＴＮＡＬＰ発現が検出された（図８Ｂおよび８Ｅ）。
この破骨細胞様細胞が成熟した破骨細胞かどうかを明らかにするため、切片にＴＲＡＰ染色を行った。ＴＲＡＰ陽性細胞は、骨様マトリックスの表面に散乱していた。多くのこれらの細胞は、破骨細胞様細胞と一致していた（図８Ｃおよび８Ｆ）。
実施例６．生化学的試験
ｉｎ  ｖｉｖｏ経皮的エレクトロポレーションを使用したｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２との遺伝子導後骨形成の定量的解析のため、ＡＬＰ活性（１ミリグラムのタンパク質につき１国際単位［ＩＵ／ｍｇ］）および組織のカルシウム（Ｃａ）含有量（μｇ／ｍｇ組織）を計測した。試料（ｎ＝５）を計量し、その後、Ｂｉｏ  Ｍｉｘｅｒ  Ｐｏｌｙｔｒｏｎホモゲナイザーにおいて０．２５Ｍのスクロース中でホモゲナイズした。結果として得られた上清のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性、および総タンパク質含有量を、４−ニトロフェニルフォスファターゼ法（Ｏｋｕｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６２，７３９−７４３）によって測定した。この沈殿物を０．５Ｎ塩酸で脱塩し、可溶性画分のカルシウム（Ｃａ）含有量をｏｒｔｈｏｃｒｅｓｏｌｐｈｔｈａｌｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ法（Ｃｏｎｎｅｒｙ  ａｎｄ  Ｂｒｉｇｇｓ，（１９６６），Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．４５，２９０−２９６）で測定した。
ＡＬＰ活性（３．６６８０±０．０５５ＩＵ／ｍｇタンパク質）およびＣａ含有量（９０４６００±１．８４５２μｇ／ｍｇ組織）は、いずれも、ｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２（２５μｇ）を２４時間おきに５セッションのエレクトロポレーションした後の方が、ｐＣＡＧＧＳを用いて同様の処置を行ったものに比べ、有意（ｐ＜０．００１）に高い値を示した（０．０００２±０．０００１ＩＵ／ｍｇタンパク質、０．００１７±０．０００８μｇ／ｍｇ組織）。
これらのデータから、軟Ｘ−線写真で観察された不透明部分は、異所性骨化を表すことがわかった。この異所性の骨は、分化し、骨マトリックス産生に重要な役割を果たす骨芽細胞、および成熟した破骨細胞を含有していた。
実施例７．エレクトロポレーションによる筋肉損傷
ｐＣＡＧＧＳ−ＢＮＰ−２のエレクトロポレーションによって生じた損傷を解析するため、実施例５で作製した連続切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
ｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２の経皮的エレクトロポレーションによる筋肉の損傷を、顕微鏡的および組織学的試験によって解析した。本実施例の条件下においては、試験期間の３週間のあいだ、どのラットにもその兆候は見られなかった。さらに、火傷および浮腫といった微少な筋肉損傷は、エレクトロポレーションの１日、５日、７日または１０日後にも観察されなかった。ｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２のエレクトロポレーションを５回繰り返してから７日後、顕微鏡的試験により、単核細胞の標的筋肉への顕著な侵入およびネクローシスが明らかになったが、いずれも重篤なものではなかった（図６Ｃ）。
一方、１回のエレクトロポレーションを受けた筋肉は、ごく軽い単核細胞の侵入を示し、ネクローシスは観察されなかった（図６Ａ）。さらに、エレクトロポレーションによって引き起こされる損傷の程度は、ｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２の量に依存しないことがわかっている。上記の炎症反応は、２１日目までに消滅し（図８Ａ）、エレクトロポレーションによる損傷は、５回の経皮的エレクトロポレーションの後でさえも、骨形成に悪影響を与えるものではなかった。
本実施例で使用したｐＣＡＧＧＳ−ＢＭＰ−２を、図９に示す。
【産業上の利用可能性】  本発明によれば、ヒトＢＭＰ−２遺伝子を発現可能に組み込んだプラスミドベクターからなる骨または軟骨形成剤、および遺伝子導入効率を高めるために繰り返しエレクトロポレーションを行っても、極めて低侵襲で、安価かつ簡易に自己骨再生が可能な、前記骨または軟骨形成剤を用いた、骨または軟骨形成方法を提供することができる。
したがって、本発明によれば、低侵襲的、安価、かつ簡易に骨または軟骨形成を誘導することが可能である。
さらに、本発明の骨または軟骨形成剤は、ＢＭＰ−２遺伝子を組み込んだプラスミドベクターを含むことから、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて骨組織の近傍に自己骨を再生することができ、骨欠損部位が広範囲にわたる場合にも適用することが可能である。
本発明の骨形成方法は、整形外科、歯科、獣医外科等の幅広い分野において適用され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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