(57)【要約】  幅広い用途に適用でき、且つ簡便な移植術で移植可能なシート状組成物を提供する。羊膜の表面にフィブリノーゲンと及びトロンビンとを付着させたシート状組成物とする。一態様では、接着成分の付着側と反対側の羊膜上に細胞層が形成されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリノーゲンと及びトロンビンとが表面に付着した羊膜、を備えてなるシート状組成物。
【請求項２】
前記羊膜において、前記フィブリノーゲン及び前記トロンビンの付着面が乾燥状態である、請求項１に記載のシート状組成物。
【請求項３】
前記羊膜が乾燥状態である、請求項２に記載のシート状組成物。
【請求項４】
前記羊膜の表面にさらにアプロチニンが付着している、請求項１〜３のいずれかに記載のシート状組成物。
【請求項５】
前記羊膜が、上皮が除去された羊膜である、請求項１〜４のいずれかに記載のシート状組成物。
【請求項６】
生体由来細胞からなる細胞層が前記羊膜上に形成されており、該細胞層の形成面と反対側の羊膜表面に前記フィブリノーゲン及び前記トロンビンが付着している、請求項５に記載のシート状組成物。
【請求項７】
前記生体由来細胞が角膜上皮、結膜上皮、皮膚表皮、毛包上皮、口腔粘膜上皮、虹彩色素上皮、網膜色素上皮、気道粘膜上皮又は腸管粘膜上皮由来の細胞である、請求項６に記載のシート状組成物。
【請求項８】
前記フィブリノーゲンの付着量が、前記羊膜1cm2あたり0.5 mg〜20 mgである、請求項１〜７のいずれかに記載のシート状組成物。
【請求項９】
前記トロンビンの付着量が、前記羊膜1cm2あたり1 μg〜1 mgである、請求項１〜８のいずれかに記載のシート状組成物。
【請求項１０】
厚さが10μm〜200μmである、請求項１〜９のいずれかに記載のシート状組成物。
【請求項１１】
ヒト組織に対して接着性を有し、移植の際に縫合不要である、請求項１〜１０のいずれかに記載のシート状組成物。
【請求項１２】
以下のステップを含んでなる、シート状組成物の作製方法：
(a)羊膜を調製するステップ；
(b)前記羊膜の表面にフィブリノーゲン及びトロンビンを付着させるステップ。
【請求項１３】
以下のステップを更に含む、請求項１２に記載の作製方法：
(c)ステップbの後、乾燥処理するステップ。
【請求項１４】
以下のステップを更に含む、請求項１２又は１３に記載の作製方法：
(b-1)前記羊膜の表面にアプロチニンを付着させるステップ。
【請求項１５】
前記ステップaが以下のステップを含む、請求項１２〜１４のいずれかに記載の作製方法：
(a-1)羊膜から上皮を除去するステップ。
【請求項１６】
前記ステップaが以下のステップを含む、請求項１２〜１５のいずれかに記載の作製方法：
(a-2)羊膜を乾燥させるステップ。
【請求項１７】
前記ステップaと前記ステップbの間に、以下のステップが実施される、請求項１２〜１６のいずれかに記載の作製方法：
(A)生体由来細胞からなる細胞層を前記羊膜上に形成するステップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、羊膜を用いたシート状組成物及びその作製方法に関する。本発明のシート状組成物は例えば、眼表面や皮膚の再建用の移植材料として利用され得る。
【背景技術】
【０００２】
昨今、角膜上皮幹細胞を利用した、角膜上皮疾患に対する再生医療の技術が実用化されつつある。角膜上皮疾患以外にも、眼科領域では内皮疾患、網膜疾患について、皮膚科領域では表皮疾患について等、様々な疾患を治療する目的での細胞培養の新しい試みが積極的に行われてきている。今後もこうした再生医療に対する需要はますます大きくなると考えられる。再生医療に用いるための培養細胞の支持体として用いられている物質の一つが羊膜である。羊膜は哺乳動物の子宮内に存在する胎盤の最も内側に存在する組織であり、胎児を包む一層の膜である。羊膜は各種細胞の培養基質として非常に優れていることが知られており、これまでに羊膜を担体とする培養角膜上皮細胞シート、培養口腔粘膜上皮シート、培養表皮細胞シートといった培養細胞シートが作成されている（例えば特許文献１〜３を参照）。【０００３】
【特許文献１】国際公開第０３／０４３５４２  Ａ１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０３／０９２７６２  Ａ１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００４／０７８２２５  Ａ１号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
培養細胞シートや羊膜シートなどが高い治療効果を奏するためには、それが迅速に移植部に接着し、そして接着状態を維持することが必要である。即ち、このような移植用のシートには高い接着性及び生着性が要求される。ところが現状では、十分な接着力が得られないがために、培養細胞シートや羊膜シートを生体に移植する際にはほとんどすべての場合でシートを縫合する必要が生じる。一般的に縫合を行った際には、１．組織が機械的に破壊され細胞の壊死が起きる、２．細菌による感染が誘発される、３．毛細血管が破壊され出血が生じる、という不都合が生じる。壊死細胞や細菌が生じると生体はそれらを除去しようと試み、ランゲルハンス細胞、樹状細胞、マクロファージ、白血球等の免疫系の細胞が活性化され炎症が惹起される。またマクロファージから成長因子が放出されて血管新生が引き起こされる。炎症が起こると充血、涙目、目やに、発熱、発赤、痒みなどの原因となる。網膜部位で血管新生が起こると視力低下に繋がる可能性がある。こうした生理的な作用が生じることは本来の治療効果を減少させるばかりか場合によっては追加的な処置が必要になる等、臨床の現場において大変不都合であり、細胞培養シートや羊膜シートを生体へと移植する際の大きな課題であった。その一方で、縫合という作業は操作が煩雑であり経験と熟練を要する術者が必要不可欠である。このためシート移植を実施可能な術者、機関が限られているのが現状であり、再生医療のさらなる普及を考える上での潜在的な足枷になってきた。また縫合の手間が余分にかかり移植に要する時間も増加するため、それに伴って患者にかかる負担も増し容態が悪化する可能性もあった。こういった問題点を解決するため細胞培養シートあるいは羊膜シートを生体に移植する際には縫合不要であることが望まれる。
一方、生体に物質を無縫合にて接着する際に用いられる物質としては、これまで組織接着剤のフィブリンのり（ティシール；バクスター、ボルヒール；化血研、ベリプラスト；アベンティスファーマ）が主に使われてきた。フィブリンのりは生体内での血液凝固の最終段階を模倣して組織の接着、閉鎖を行う薬剤である。フィブリンのりを用いて細胞培養シートや羊膜シートを生体に接着させることを考えた場合、術者が薬剤としてフィブリンのりを別途購入し、術中に調製をすることとなる。しかしフィブリンのりの調製には時間と手間がかかり、比較的容易に固化する性質を持つため扱いづらく、シートを組織に接着する際の接着剤として用いることは容易なことではない。
無縫合にて物質を生体に接着させる製品にはフィブリンのり以外にもタココンブ（ニコメドファルマ）が存在する。本製品は損傷補填剤として用いられており、コラーゲンシートを担体としてのりが片面に固着化されている医薬品である。製品には既にのりが塗布済みであるため調製の時間と手間の必要がなく、タココンブを患部に接触させるだけで組織への接着が完了する。但しタココンブの担体として用いられているのはコラーゲンを再構成して作った化学物質であるため、羊膜シートや培養細胞シートといった生体由来の生組織をそのまま接着するものではない。また、このシート状構築物は厚さが数mmであって透明性に乏しい。従って、移植後に十分な透明性が要求される用途（例えば眼表面の再建）には当然として適用できない。また、眼表面の再建に代表されるように上皮組織の再建術などにおいては、被移植部は物理的なスペースに乏しく、従って移植材料には薄さが要求される。この点においても上記の製品は適切でない。
以上のように、これまでには機能を有する生体由来の組織を縫合不要でそのまま生体に接着する技術は提供されていなかった。
本発明は以上の背景の下、眼表面の再建、皮膚又は表皮の再建、熱傷時の被覆等、幅広い用途に適用でき、且つ簡便な移植術で移植可能なシート状組成物を提供することを目的とする。特に、眼表面の再建など、それ自体に高い透明性が要求される用途に対して好適に適用できるシート状の組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために本発明者らは、シート状組成物を構築する上で使用する支持体として羊膜を用いることにした。そして移植後の接着性及び生着性を高めるべく羊膜の表面にフィブリン及びトロンビンを付着させた。その結果得られたシート状組成物は非常に薄く、高い透明性を確保することができた。また、十分な強度を備えるものであった。一方、シート状組成物の接着性及び生着性を確認するために、シート状組成物を眼表面に適用したところ迅速な接着が認められ、また長期間に亘って良好な接着状態が維持された。以上のように、羊膜の表面にフィブリン及びトロンビンを付着して構成されるシート状組成物は透明性、強度、並びに接着性及び生着性に優れるものであった。即ち、当該シート状組成物は、幅広い用途への適用に必要な条件を満たすことが判明した。また、高い接着性及び生着性を有することから、これによって縫合などを併用しない、簡便な移植術を実現できると考えられた。縫合が不要となれば、縫合した場合に問題となっていた炎症の惹起と血管新生が起こるという問題が解消される。また、生体へ移植する際に必要となる手間と時間を省くことができ、シート移植の作業のできる術者の裾野が広がり、再生医療の発展に大きく寄与することが期待される。一方、得られたシート状組成物は高い透明性を有することから、特に眼表面の再建など、それ自体に高い透明性が要求される用途へ好適に使用できることが判明した。
以上の知見を得た後、上記シート状組成物の接着性に関してさらに検討したところ、接着成分であるフィブリノーゲン及びトロンビンの添加量（付着量）と接着性との間に関連性を見出すに至った。この知見によって、必要とされる接着性を維持しつつ、フィブリノーゲン等の添加量を低減できることから、フィブリノーゲン等の作用による移植後の炎症及び血管新生を最小限の範囲に抑えることが可能となる。従って、移植後の炎症及び血管新生を抑制することが必要な用途、即ち例えば眼表面の再建などにおいて極めて好適な移植材料を提供できる。【０００６】
本発明は以上の成果に基づくものであって、以下の構成からなる。
フィブリノーゲンと及びトロンビンとが表面に付着した羊膜、を備えてなるシート状組成物である。本発明の一態様では、羊膜においてフィブリノーゲン及びトロンビンの付着面が乾燥状態である。本発明の他の態様では、羊膜の実質的に全体が乾燥状態である。
また本発明の一態様は、羊膜の表面にさらにアプロチニンが付着していることを特徴とする。アプロチニンを併用することでフィブリン塊の分解を抑え、接着力の維持ないし増強を図れる。
羊膜として、上皮が除去された羊膜を使用することができる。上皮成分が含まれないことによって免疫原性がさらに低下したシート状組成物となる。
本発明の更なる一態様では、生体由来細胞からなる細胞層が羊膜上に形成されており、該細胞層の形成面と反対側の羊膜表面がフィブリノーゲン等の付着面となる。この態様の培養細胞シートは、含有する細胞の作用によって治療効果の高い移植用シートとなる。細胞層を形成する細胞は例えば、角膜上皮、結膜上皮、皮膚表皮、毛包上皮、口腔粘膜上皮、虹彩色素上皮、網膜色素上皮、気道粘膜上皮又は腸管粘膜上皮由来の細胞である。
羊膜へのフィブリノーゲンの付着量を羊膜1cm2あたり0.5 mg〜20 mgとすることが好ましい。同様に、羊膜へのトロンビンの付着量を羊膜1cm2あたり1 μg〜1 mgとすることが好ましい。高い接着性を維持しつつ、移植後の炎症及び血管新生の惹起を低減することが可能となるからである。
本発明のシート状組成物は、羊膜を用いることによって、厚さが10μm〜200μmに調製することができる。
本発明のシート状組成物は、予めトロンビン等を付着させておくことによってヒト組織に対して接着性を有し、移植の際に縫合をしなくとも良好な接着力が得られる。【０００７】
一方、本発明は上記シート状組成物の作製方法をも提供する。具体的には以下の構成を提供する。
即ち、(a)羊膜を調製するステップ、(b)前記羊膜の表面にフィブリノーゲン及びトロンビンを付着させるステップを含んでなるシート状組成物の作製方法である。
本発明の一態様では更に、ステップbの後、乾燥処理するステップ（ステップc）が実施される。乾燥処理は、使用用途に合わせて、組成物全体又はフィブリノーゲン等の付着面のみなどに対して実施される。
本発明の一態様では、羊膜の表面にアプロチニンを付着させるステップ（ステップb-1）が実施される。尚、フィブリノーゲン及びトロンビンの付着ステップと同時に当該ステップを実施することが好ましい。
ステップaの一部として、羊膜から上皮を除去するステップ（ステップa-1）を実施することが好ましい。この態様では、上皮が除去された羊膜を用いてシート状組成物が作製されることになる。
また、ステップaの一部として、羊膜を乾燥させるステップ（ステップa-2）を実施することができる。即ち、この態様ではシート状組成物の作製過程において一旦羊膜が乾燥され、その後の工程に供される。
本発明の更なる一態様では、ステップaとステップbの間に、生体由来細胞からなる細胞層を羊膜上に形成するステップ（ステップA）が実施される。このステップによって羊膜上に細胞層が形成され、最終的に培養細胞シートが作製されることになる。
以下、本発明の構成を更に詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、羊膜上に口腔粘膜上皮細胞及び角膜上皮細胞を培養する際の器具等の状態を模式的に示した断面図である。培養皿１内にカルチャーインサート２が静置され、培養皿１底面には3T3細胞層５が形成される。また、カルチャーインサート２の底面上に羊膜３が静置され、その上に口腔粘膜上皮細胞及び角膜上皮細胞４が培養される状態が示される。符号６は培地である。
【図２】接着成分の付着量と接着性の関係についての実験結果をまとめた表である。接着の可否は＋（シートがずれることも剥がれることもない）及び−（シートがずれる）で表される。
【符号の説明】
【０００９】
１  培養皿（第１の容器）
２  カルチャーインサート（第２の容器）
３  羊膜
４  角膜上皮細胞
５  3T3細胞層
６  培地
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の第１の局面はシート状組成物に関する。本発明のシート状組成物ではその主要構成成分の一つとして羊膜が使用される。羊膜が有する高い透明性及び強靱性によって、透明性及び強度に優れたシート状組成物を構成できる。また、羊膜の高い生体親和性及び低免疫原性によって、生体親和性に一層優れ且つ免疫原性の低いシート状組成物を構成できる。羊膜を使用することによってさらに、抗炎症作用、痕跡形成の抑制、血管新生の阻害といった作用を期待できる。羊膜を使用することは、本発明のシート状組成物が細胞層を含む場合において、当該細胞層を良好に形成させる点でも好ましい。即ち、後述のように、細胞層を備えるシート状組成物は、羊膜を基質（支持体）としてその上に所定の細胞を播種、培養することによって形成されるところ、羊膜はその上に細胞が良好に接着及び増殖するという特性を備えることから、羊膜を使用すれば良好な細胞の接着、増殖、そして細胞層の形成が可能となる。
羊膜が、掻爬処理などにより上皮を除去したものであることが更に好ましい。上皮成分が含まれないことによって免疫原性がさらに低下したシート状組成物となるからである。また、上皮が除去された羊膜ではその上に細胞が一層良好に接着及び増殖することから、より短時間で高い品質の角膜上皮様シートを構築することができるという、作製上の利点も得られる。
上皮を除去した羊膜であることは、シート状組成物に羊膜上皮層の細胞が含まれていないことを調べることによって確認できる。尚、羊膜としてヒト羊膜を用いることが特に好ましい。【００１１】
本発明のシート状組成物において羊膜の表面にはフィブリノーゲン及びトロンビン（以下、これらをまとめて「接着成分」ともいう）が付着している。これによって、本発明のシート状組成物を移植した際、まずトロンビンによってフィブリノーゲンが特異的に加水分解されてフィブリンが生成し、続いてフィブリンが重合して安定なフィブリン塊となり接着作用を発揮する。
フィブリノーゲン及びトロンビンは、本発明のシート状組成物の用途に合わせて、羊膜の片面又は両面に付着している。片面付着の場合には、羊膜における上皮の有無に拘わらず、羊膜の絨毛膜側表面（即ち、上皮側と反対側の表面）が付着面となる。従って、このような構成のシート状組成物を使用する場合には、羊膜の上皮が存在していた側を上にして適用部位に移植されることになる。生体接着剤を目的として生体内に移植される場合は、羊膜の両面に接着成分を付着させることが適当である。【００１２】
尚、後述のように本発明のシート状組成物は、使用目的などを考慮して適切な状態（例えば乾燥状態又は湿潤状態）へと、羊膜表面にフィブリノーゲン及びトロンビンを付着させる工程を経て調製される。従って、その作製過程において及び／又はその最終状態の如何によっては、使用されるまでの間に一部のフィブリノーゲンからフィブリンが生成することが予想される。従って、本発明のシート状組成物には、このような原因によって生じたフィブリン又はフィブリン塊が付着しているものも含まれる。【００１３】
フィブリノーゲン及びトロンビンの由来は特に限定されない。例えば、ヒト、サル、チンパンジー、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ等の血液を材料としてフィブリノーゲン及びトロンビンを調製することができる。また、フィブリノーゲン及びトロンビンとして、培養細胞（例えばＣＨＯ細胞やＣＯＳ細胞）を利用して得られた組み換え体（リコンビナント）を使用してもよい。ヒト由来（特にヒト由来の組換え体）のフィブリノーゲン及びトロンビンを使用することが好ましい。免疫原性を含め、安全性の面で有利だからである。また、安定した品質のものを使用できる点及び感染の問題を考慮すれば、組み換え体を用いることが特に好ましい。
本発明のシート状組成物の移植を受ける患者（レシピエント）の血液に由来するフィブリノーゲン及びトロンビンを使用することが特に好ましい。これら接着成分に起因する免疫拒絶反応を惹起するおそれがなくなるからである。
尚、フィブリノーゲン及びトロンビンの由来は必ずしも同一でなくて良い。一例を挙げれば、ヒト血液由来のフィブリノーゲンと、ウシ血液由来のトロンビンを組み合わせて使用することができる。【００１４】
フィブリノーゲン及びトロンビンの付着量は特に限定されない。例えば、フィブリノーゲンの付着量を、羊膜1cm2あたり0.1mg〜50mgの範囲で設定することができる。同様に、トロンビンの付着量を、羊膜1cm2あたり0.5μmg〜10mgの範囲で設定することができる。
フィブリノーゲン及びトロンビンの付着量の設定にあたっては第一に接着力が考慮される。即ち、期待される接着量が得られるように、これらの成分の付着量を設定する必要がある。一方、フィブリノーゲンやトロンビンの付着量が多すぎる場合には、使用するフィブリノーゲンの由来にもよるが、免疫反応や血管新生を惹起し易くなる点が問題となる。
ここで、例えば眼表面の再建に適用されるシート状組成物とする場合など、移植後にこれらの成分による血管新生が問題となる場合には、血管新生の惹起をできるだけ抑えるために、これらの成分の付着量を少なくすることが好ましい。これらの成分の付着量を可能な範囲で少なく設定することによって、移植後の血管新生が抑えされ、高い治療効果が期待できる。後述の実施例に示すように、本発明者らの検討の結果、フィブリノーゲンの付着量が羊膜1cm2あたり約0.5mg以上の場合に、眼表面に対する良好な接着力が得られた。トロンビンについてはその付着量を羊膜1cm2あたり約1μgとした場合であっても眼表面に対する良好な接着力が得られた。これらの知見に基づいて、フィブリノーゲンの付着量の好ましい範囲として羊膜1cm2あたり0.5〜20mg、さらに好ましい範囲として羊膜1cm2あたり0.5mg〜10mg、より一層好ましい範囲として羊膜1cm2あたり0.5mg〜6mg（具体的には例えば約0.5mg、約1mg、約2mg）を挙げることができる。同様にトロンビンの付着量の好ましい範囲として羊膜1cm2あたり1μg〜1mg、さらに好ましい範囲として羊膜1cm2あたり5μg〜200μg、より一層好ましい範囲として羊膜1cm2あたり10μg〜100μg（具体的には例えば約10μg、約20μg、約30μg）を挙げることができる。【００１５】
本発明の一形態では、フィブリノーゲン及びトロンビンに加えてアプロチニンが羊膜表面に付着している。アプロチニンは、トロンビンの作用によって形成されたフィブリン塊がプラスミンにより溶解されるのを阻害する。従って、アプロチニンを併用することでフィブリン塊の分解を抑え、接着力の維持ないし増強を図れる。
アプロチニンの由来は特に限定されない。例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、サル、チンパンジー等の膵臓由来のアプロチニンを使用することができる。また、培養細胞（例えばＣＨＯ細胞やＣＯＳ細胞）を利用して得られた組み換え体（リコンビナント）のアプロチニンを使用してもよい。安定した品質のものを使用できる点及び感染の問題を考慮すれば、組み換え体を用いることが好ましい。
アプロチニンを使用する場合、その付着量は特に限定されない。例えば、アプロチニンの付着量を、羊膜1cm2あたり0.1 KIU〜200 KIUの範囲で設定することができる。上述したフィブリノーゲンの付着量の検討に合わせて、アプロチニンについての付着量も変化させて接着力への影響を調べたところ、アプロチニン量を1 KIU〜2 KIUの範囲で設定した場合であっても眼表面に対する十分な接着力が得られた。この知見に基づいて、アプロチニンの付着量の好ましい範囲として羊膜1cm2あたり1 KIU〜100 KIU、さらに好ましい範囲として羊膜1cm2あたり1 KIU〜20 KIU、より一層好ましい範囲として羊膜1cm2あたり1 KIU〜10 KIU（具体的には例えば約1 KIU、約2 KIU、約3 KIU）を挙げることができる。アプロチニン量が多すぎると、製造コストの上昇を引き起こすことは勿論のこと、アプロチニン自体の免疫原性などに起因する副作用のおそれが大きくなる。一方でアプロチニン量が少なすぎる場合には、フィブリン塊の分解抑制という、アプロチニンの作用が十分に発揮されないおそれがある。
尚、様々な用途においてフィブリン塊が接着剤として利用されているが、そのような用途ではアプロチニンを併用することが一般的である。本発明者らの検討の結果、本発明のシート状組成物においては、アプロチニンを使用しなくとも生体に対する十分な接着力が得られることが判明した。アプロチニンを使用しなくても良いことは、構成が簡略化されて作製上及びコスト面で有利となるばかりか、アプロチニン自体の免疫原性などに起因する副作用を考慮する必要がなくなることを意味する。【００１６】
本発明のシート状組成物の一態様は、羊膜上に細胞層を備える。この態様では、細胞層が形成されない側の羊膜表面に接着成分（フィブリノーゲン等）が付着されることになる。
この態様では上皮が除去された羊膜が使用される。そして、上皮が存在していた側に細胞層が形成される。ここでの細胞層は生体由来細胞から構成される。細胞層を構成する細胞の由来は特に限定されない。例えば、角膜上皮、結膜上皮、皮膚表皮、毛包上皮、口腔粘膜上皮、虹彩色素上皮、網膜色素上皮、気道粘膜上皮又は腸管粘膜上皮由来の細胞によって細胞層が構成される。互いに異なる二種以上の細胞によって細胞層が構成されていてもよい。このように由来の異なる二種以上の細胞を含んで構成されていることを、本明細書では「ハイブリッド化」ともいう。ハイブリッド化された細胞層における細胞の含有形態（ハイブリッド化の状態）は特に限定されず例えば、各細胞が散在していてもよいし、いずれかの細胞（又は複数種類の細胞）が一定のまとまりをもって存在していてもよい。また、各細胞の含有率が細胞層全体に亘って均一でなくてもよい。細胞層は単層であっても多層（重層化した状態）であってもよい。【００１７】
ハイブリッド化された細胞層が備えられる場合における、細胞層を構成する細胞の種類を、角膜上皮の再建用として本発明のシート状組成物が構築される場合を例にとり、以下に詳述する。
ハイブリッド化された細胞層には二種類以上の細胞が含有される。そこで、説明の便宜上、細胞層に含まれる細胞種の一つを第１細胞とし、これと種類が異なる細胞種を第２細胞とする。まず、第１細胞として自己細胞を用いる。本明細書において「自己」とは、本発明のシート状組成物を適用する対象、即ち移植を受ける者（レシピエント）をいう。一方、このような「自己」以外の者を「他人」という。後述の第２細胞とハイブリッド化させた場合に角膜上皮様の粘膜上皮層を形成可能である限り、第１細胞の種類は特に限定されない。第１細胞の例としては、口腔粘膜上皮、結膜上皮、鼻腔粘膜上皮等の粘膜上皮に由来する細胞、或いはこのような粘膜上皮を構築可能な未分化細胞（即ち粘膜上皮の幹細胞）に由来する細胞を挙げることができる。ここで「由来する又は由来の」とは、出発材料を特定する目的で使用される。従って例えば、口腔粘膜上皮に由来する（又は由来の）細胞といえば、口腔粘膜上皮細胞を出発材料として得られた細胞を意味する。また、本発明において「粘膜上皮を構築可能な未分化細胞」とは、当該粘膜上皮を構成する細胞への分化能を有する細胞をいう。例えば、口腔粘膜上皮を構築可能な未分化細胞といえば、口腔粘膜上皮細胞へと分化し得る細胞をいう。未分化細胞の具体例としては、口腔粘膜上皮や結膜上皮など、特定の組織を構成する細胞の前駆又は幹細胞、或いはさらに分化度の低い上皮系幹細胞などが挙げられる。【００１８】
ハイブリッド化された細胞層が、異なる二種以上の第１細胞を含んでいてもよい。例えば、口腔粘膜上皮に由来する細胞と、結膜上皮に由来する細胞とを含んだ状態で細胞層が構築されていてもよい。【００１９】
本発明における「口腔粘膜上皮」には、口腔内縁粘膜上皮部、口唇部、口蓋部、頬部などが含まれる。それが口腔粘膜上皮に由来する細胞であることは、口腔粘膜上皮特異的なケラチン４、又はケラチン１３が発現していることを指標として確認することができる。又は、ケラチン３を発現していることを指標とすることもできる。このケラチン３は、角膜特異的ケラチンの一つと知られているが、口腔粘膜上皮においても発現していることが確認されている。尚、この角膜特異的ケラチンであるケラチン３を発現している点において、口腔粘膜上皮細胞を角膜上皮移植用の組成物を作製する材料として用いることは好ましいといえる。
一方、口腔粘膜上皮細胞特異的な遺伝子の発現を調べることによっても、それが口腔粘膜上皮由来であることを確認することができる。
尚、口腔粘膜上皮以外の組織に由来する細胞の場合も同様に、当該組織に特異的なマーカー或いは遺伝子の発現を調べることによってその由来を確認することができる。【００２０】
第２細胞の具体例としては、角膜上皮、結膜上皮、又は羊膜上皮に由来する細胞を挙げることができる。中でも、第２細胞が角膜上皮又は結膜上皮に由来する細胞であることが好ましい。眼表面組織に由来する細胞によって構築された細胞層では、角膜上皮により近い特性を備えることができるからである。第２細胞が角膜上皮に由来する細胞であることが特に好ましい。角膜上皮に一層近似した特性の細胞層となるからである。
第２細胞は自己細胞又は他人の細胞のいずれであってもよい。自己細胞によって構築された細胞層であれば、免疫拒絶の問題のない又は少ない細胞層となる。他人の細胞によって構築された細胞層であれば、原材料となる細胞の入手が容易となることから、その作製の観点から有利な細胞層となる。本発明の細胞層が、異なる二種以上の第２細胞を含んでいてもよい。例えば、角膜上皮に由来する細胞と、結膜上皮に由来する細胞とを含んだ状態で細胞層が構築されていてもよい。【００２１】
本発明のシート状組成物における細胞層が角膜上皮に由来する細胞を含むことは例えば、角膜上皮特異的なケラチン３又はケラチン１２が発現していることを指標として確認することができる。または、ケラチン４を発現していることを指標とすることもできる。
尚、角膜上皮以外の組織に由来する細胞の場合も同様に、当該組織に特異的なマーカー或いは遺伝子の発現を調べることによってその由来を確認することができる。【００２２】
本発明のシート状組成物は、支持体として羊膜を使用することから、非常に薄い状態に構築できる。本発明のシート状組成物を、細胞層を含まない場合には例えば10μm〜100μmの厚さ、細胞層を含む場合には例えば20μm〜200μmの厚さに調製することができる。このように非常に薄いことも本発明の大きな特徴の一つである。この特徴を備えることによって、様々な用途への適用が可能となる。特に、高い透明性を利用して眼表面の再建などへの適用が図れる。【００２３】
本発明のシート状組成物の状態は特に限定されず、乾燥状態（例えば凍結乾燥状態）、半乾燥状態、湿潤状態（例えば溶液に浸析された状態）のいずれであってもよい。例えば、羊膜において接着成分の付着面のみが乾燥状態であってもよく、或いは羊膜全体が乾燥状態であってもよい。細胞層を含む場合には、細胞層部分は湿潤状態であることが好ましく、その他の部分は例えば半乾燥状態又は乾燥状態とする。具体的には例えば細胞層を湿潤状態とし、羊膜においてフィブリノーゲン等の付着面（フィブリノーゲン等も含む）を乾燥状態又は半乾燥状態とし、羊膜のその他の部分を湿潤状態にすることができる。
本発明のシート状組成物を、ガラスやプラスチックなどのケースに収納された状態、或いは透明フィルムや遮光シートなどを用いて包装された状態で提供することもできる。好ましくは、本発明のシート状組成物は密封状態で提供される。また、通常は事前に滅菌処理が施された上で提供される。【００２４】
羊膜に代えて、羊膜と同等の性状（薄さ、透明性など）を備えるコラーゲンシートを用いてシート状組成物を構築することもできる。羊膜はIV型コラーゲンを豊富に含有するから、このようなコラーゲンシートの例としてIV型コラーゲンの含有率が高いものを挙げることができる。例えばウシ、ブタ、又はウマコラーゲンを用いて当該シートを構成することができる。【００２５】
本発明のシート状組成物は、組織の再建用の移植材料等として使用される。本発明のシート状組成物の適用領域として眼科領域、消化器外科領域、婦人科領域、皮膚科領域を挙げることができる。これら各領域での適用部位、対象疾患、及び用途の例を以下に示す。
１．眼科領域
細胞層を備えないシート状組成物は、強膜や角膜の再建（翼状片や角膜上皮欠損などに対する治療）、瞼球癒着防止に適用され得る。他方、細胞層を備えるシート状組成物は、角膜や網膜の再建（スティーブンジョンソン症候群、熱化学外傷、眼類天疱瘡、網膜剥離、加齢性黄斑変性症、緑内障、網膜色素変性症などに対する治療）に適用され得る。【００２６】
２．皮膚科領域
細胞層を備えないシート状組成物は、皮膚（表皮）潰瘍、熱傷時の被覆に適用され得る。他方、細胞層を備えるシート状組成物は、表皮−糖尿病性潰瘍（表皮）、表皮水疱症、又は熱傷の治療に適用され得る。【００２７】
本発明の他の局面はシート状組成物の作製方法に関する。本発明の作製方法は次のステップを含む。即ち、(a)羊膜を調製するステップと(b)前記羊膜の表面にフィブリノーゲン及びトロンビンを付着させるステップである。
「羊膜」とは、哺乳動物において子宮と胎盤の最表層を覆う膜であって、コラーゲンに富む実質組織上に基底膜、上皮層が形成されて構成される。羊膜としてヒト羊膜を使用することが好ましい。ヒト羊膜は、例えば分娩時に後産として得られるヒト胎仔膜、胎盤などから採取することができる。具体的には、分娩直後に得られるヒト胎仔膜、胎盤及び臍帯からなる一体物を処理、精製することによりヒト羊膜を調製することができる。処理、精製方法は、特開平５−５６９８号に記載される方法などの公知の方法を採用できる。すなわち、分娩時に得られる胎仔膜より羊膜を剥離し、超音波洗浄等の物理的処理及び酵素処理などにより残存組織を除去し、適宜洗浄工程を経てヒト羊膜を調製することができる。
このように調製したヒト羊膜は、使用時まで凍結して保存しておくことができる。ヒト羊膜の凍結は、例えば-80℃、DMEM（Dulbecco's modified Eagle's medium）とグリセロールとを体積比で等量混合した液中で行うことができる。凍結保存することにより操作性が向上することは勿論のこと、抗原性が低下することも期待できる。【００２８】
羊膜をそのまま利用することもできるが、羊膜から掻爬処理などによって上皮を除去したものを利用することが好ましい。上皮の除去によって、抗原性が低下する。例えば、上記のように凍結保存したヒト羊膜を解凍した後、EDTAやタンパク分解酵素で処理して細胞間の接着を緩め、そしてセルスクレイパーなどを用いて上皮を掻爬することにより、上皮が除去されたヒト羊膜を調製することができる。【００２９】
羊膜を予め乾燥処理しておくことが好ましい。乾燥状態の羊膜を使用することにより、フィブリノーゲン等の接着成分をより良好に付着させることができる。ここでの乾燥処理としては例えば、凍結乾燥、風乾、真空乾燥、減圧乾燥を挙げることができる。中でも凍結乾燥を採用することが好ましい。凍結乾燥処理の場合は羊膜の柔軟性が低下しにくいからである。【００３０】
羊膜の表面へのフィブリノーゲン及びトロンビンの付着は、それぞれ単独に又は同時に行われる。付着方法は特に限定しない。付着方法の例として、付着させる成分の溶解液を羊膜表面に塗布、滴下、又は噴霧する方法、或いは付着させる成分の溶解液に羊膜を浸漬する方法を挙げることができる。また、フィブリノーゲン自体（又はトロンビン自体）を、又はフィブリノーゲン（又はトロンビン）を適当な溶媒に溶解した後析出させた成分を羊膜表面に添加する（まぶす）ことによってフィブリノーゲン（又はトロンビン）を羊膜表面に付着させることもできる。
好ましくはこれら２成分の混合液を調製し、当該混合液を用いた塗布、滴下などによってフィブリノーゲン及びトロンビンを同時に羊膜表面に付着させる。このような２成分を同時に付着させる方法の具体例を以下に説明する。
まず、フィブリノーゲン溶解液を調製する。具体的にはフィブリノーゲンを、所望の濃度となるようにエタノール（例えば94%エタノール）などの溶剤（溶媒）に溶解する。エタノールの他、無水エタノール、イソプロパノール、メタノールなどのアルコール類やアセトンなどを溶剤として用いることができる。一方、同様の手順でトロンビン溶解液を別途調製する。この場合の溶剤としては例えばエタノール（例えば99.5%エタノール）、無水エタノール、イソプロパノール、メタノール等のアルコール類やアセトンなどを用いることができる。
次に、以上の手順で用意したフィブリノーゲン溶解液及びトロンビン溶解液を混合する。このようにして得られた混合液を用いて、上記の通り、羊膜上への塗布、滴下などを実施する。以上のようにフィブリノーゲン溶解液とトロンビン溶解液を混合し、混合液を用いて付着操作を実施する場合には、混合液中の水分量が多くならないよう留意することが好ましい。仮に混合液中の水分量が多くなれば、付着操作前にフィブリノーゲン、トロンビン間の反応が起こり、付着操作に支障を来す。また、移植後に良好な接着力を得るためには、フィブリノーゲンとトロンビンが事前に作用しない状態で羊膜上に付着していることが好ましい。以上の点を考慮すれば、フィブリノーゲンの溶剤及びトロンビンの溶剤としてそれぞれ、水溶性で且つ水分量が少なく揮発性であるものを採用することが好ましい。【００３１】
フィブリノーゲン溶解液及びトロンビン溶解液、又はフィブリノーゲンとトロンビンの混合液の塗布、滴下などは、典型的には羊膜表面の全領域に対して均一に実施されるが、例えば一部領域にのみ実施したり（例えば、スポット的に間隔をおいて複数領域に実施したり、周辺部のみに実施する）、付着量に濃淡をつけて実施したりすることもできる。【００３２】
上記方法では、フィブリノーゲン及びトロンビンの付着が同時に行われるが、それぞれの成分を別個の工程で付着させてもよい。即ち、フィブリノーゲンの付着と、トロンビンの付着を２段階のステップとして実施してもよい。但し、操作を簡略化できる点、及びフィブリノーゲンとトロンビンをより均一な分散状態で付着できる点において、フィブリノーゲンとトロンビンの混合液を用いて１ステップで付着操作を行うことが好ましい。
尚、フィブリノーゲン及びトロンビンは、常法に従って血液より調製することができる。リコンビナント体のフィブリノーゲン等を使用することもでき、この場合には適当な培養細胞の培養液又は細胞破砕液より常法で調製することができる。また、市販のフィブリノーゲン等を使用することにしても良い。例えば、ヒト由来のフィブリノーゲンはバクスター社より購入することができる。同様にヒト由来のトロンビンはバクスター社より購入することができる。【００３３】
フィブリノーゲン及びトロンビンに加えて、アプロチニンを羊膜表面に付着させることにしてもよい。即ち、当該態様では、アプロチニンを付着させるステップ（ステップb-1）を更に実施する。アプロチニンの付着は、フィブリノーゲン等と同様の手段及び手順で実施できる。即ち、アプロチニン溶解液を用いた塗布、滴下、噴霧、浸漬などによって羊膜表面にアプロチニンを付着させることができる。アプロチニン溶解液は、塩化ナトリウム溶液（例えば0.85%溶液）、塩化カリウム溶液、塩化カルシウム溶液、塩化マグネシウム溶液などにアプロチニンを溶解することによって調製することができる。
尚、アプロチニンは、常法に従ってウシの膵臓より調製することができる。リコンビナント体のアプロチニンを使用することもでき、この場合には適当な培養細胞の培養液又は細胞破砕液より常法で調製することができる。また、市販のアプロチニンを使用することにしても良い。例えば、ウシ由来のアプロチニンはバイエル薬品より購入することができる。
アプロチニンを付着させるステップを単独で実施することも可能であるが、フィブリノーゲン及びトロンビンを付着させるステップと同時に実施することが好ましい。接着成分の付着操作が全体として簡略化されるからである。また、フィブリノーゲン、トロンビン、及びアプロチニンをより均一に分散した状態で羊膜表面に付着できるからである。例えば、フィブリノーゲン、トロンビン、及びアプロチニンの混合液を調製し、これを塗布することなどによって、これら３成分の羊膜への同時付着を実施できる。これら３成分の混合順序は特に限定されない。【００３４】
フィブリノーゲン等の付着は、羊膜の片面又は両面に対して実施される。前者の場合には原則として、羊膜における上皮の有無に拘わらず、上皮側（上皮が存在していた側）と反対側の表面（即ち絨毛膜側）にフィブリノーゲン等の付着が行われる。【００３５】
フィブリノーゲン及びトロンビン（場合によっては更にアプロチニン）を付着させた後、必要に応じて乾燥処理を施す。これによって、保存安定性に優れたシート状組成物となる。また、取り扱い（輸送、移植操作など）の面でも好ましい形態となる。
乾燥処理として、風乾、真空乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥など、一般的な乾燥処理方法を採用できる。【００３６】
本発明の一態様では、羊膜上に生体由来細胞を用いた細胞層が形成される。この細胞層は、羊膜表面へのトロンビン等の付着操作に先行して形成される。即ち、この態様では、羊膜上に細胞層を形成した後、トロンビン等の接着成分を羊膜表面（細胞層が形成されない側の表面）に付着させる。
細胞層を形成するステップは次の手順で実施することができる。まず、適切な生体由来細胞を用意する（生体由来細胞を調製するステップ）。生体由来細胞としては、最終的に得られるシート状組成物の用途に適合した細胞を使用する。例えば皮膚表皮組織の再生用のシートを作製する場合には、皮膚表皮細胞（その幹細胞、前駆細胞を含む）や毛包上皮細胞（その幹細胞、前駆細胞を含む）などが好適に使用される。同様に、角膜上皮組織の再生を目的とする場合には角膜上皮細胞（その幹細胞、前駆細胞を含む）が好適に使用され、粘膜上皮組織の再生を目的とする場合には粘膜上皮細胞（その幹細胞、前駆細胞を含む）が好適に使用される。粘膜上皮細胞の例としては口腔粘膜上皮細胞、腸管粘膜上皮細胞、気道粘膜上皮細胞などを挙げることができる。
生体由来細胞の調製方法について、皮膚表皮細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、腸管粘膜上皮細胞及び気道粘膜上皮細胞を例に採り説明する。【００３７】
（皮膚表皮細胞）
まず、皮膚の採取にあたっては、あらかじめ採取部位を予防的にポビドンヨードなどの消毒薬にて消毒し、抗真菌剤の外用塗布を行った後、小皮膚片を皮膚生検に準じて採取する。表皮角化細胞の培養にあたってはハサミで皮膚片から脂肪組織と真皮をできる限り取り除き、ダルベッコリン酸緩衝液（PBS）にて数回洗浄する。70％エタノールに１分間浸し滅菌する。短冊状に切り、ディスパーゼ液に浸し、4℃で一晩静置する。ついで表皮を真皮から剥離する。剥離した表皮を、洗浄後、表皮片をほぐし、表皮角化細胞浮遊液を調整する。細胞を無血清培地に懸濁し、コラーゲンコートシャーレに播種し、継代培養を行う。【００３８】
（角膜上皮細胞）
角膜上皮細胞は角膜輪部組織から得ることができる。例えば角膜輪部組織から内皮細胞を剥離除去し、結膜を切除し単一細胞懸濁液を作製する。そしてこれを窒素タンクで保存し、その後急速に37℃で融解して角膜上皮細胞浮遊液を調整する。必要に応じて継代培養する。継代培養には、例えば無血清培地であるEpiLifeTM（カスケード社）、MCDB153培地（日水製薬株式会社）やこれらの培地のアミノ酸組成等を改変して作製される培地などを使用することができる。【００３９】
（口腔粘膜上皮細胞）
口腔粘膜上皮細胞としては歯根部に存在する細胞（口腔内縁粘膜上皮細胞）、口唇部の細胞、口蓋部の細胞、頬部の細胞などが用いられる。中でも口腔内縁粘膜上皮細胞はその増殖能が高く、また抗原性が低いことから、これを用いることが特に好ましい。口腔粘膜上皮細胞は、目的とする細胞が存在する場所をメスなどで切除したり、掻爬したりすることにより採取することができる。口腔内縁粘膜上皮細胞にあっては、抜歯に付着している口腔粘膜上皮をエナメルセメント移行部より分離し、これより採取することができる。尚、結合組織などの不純物を除去するために、ディスパーゼやトリプシンなどの酵素による処理や、フィルター処理を施すことが好ましい。【００４０】
（腸管粘膜上皮細胞）
腸管粘膜上皮細胞は大腸内視鏡下腸管上皮生検組織より採取、または開腹手術時に通常の手法で採取される。また、組織よりlazer capture microdissectionにより上皮細胞を切除することもできる。食道、胃、十二指腸、小腸、大腸のヒトの全ての消化管上皮細胞を用いて作製される生体組織シートについても本発明の技術は適用される。潰瘍や炎症などでヒトの消化管上皮が傷害を受けた時、骨髄由来細胞が緊急事態に対応するレスキュー的な役割を果たし、上皮が修復される。消化管上皮細胞も一部とはいえ骨髄から作られる。この意味で本発明の意義は角膜上皮細胞を用いるものと同等とみなすことができる。通常はわずか1000個に数個程度しかない骨髄からできる上皮細胞が、胃潰瘍、大腸炎などでできた消化管内面の潰瘍(傷口)が治っていく過程では50倍から100倍にも増え、概ね10個に1個の消化管上皮細胞が骨髄由来であることが判明している。ここで作製される消化管粘膜上皮細胞由来生体組織シートは難病に指定されている重症腸管感染症、潰瘍性大腸炎、クローン病、ベーチェット病などの腸疾患の治りにくい潰瘍、炎症に対して、腸管上皮の再生を促す意味でもすこぶる有意義と考えられる。腸管アレルギーに対しての有用性も期待される。【００４１】
（気道粘膜上皮細胞）
気道粘膜上皮細胞は気道粘膜の生検組織より容易に得られ、前述の組織同様に結合組織などの不純物を除去するために、ディスパーゼやトリプシンなどの酵素による処理や、フィルター処理を施すことが好ましい。気道粘膜上皮細胞はβデフェンシンの生合成、放出などを介し、各種感染症の病態進展に重要な働きを担う。また、喘息やアレルギー疾患においても気道粘膜上皮の果たす役割は高い。組織障害を受けた気道粘膜に本発明になる気道粘膜上皮細胞から作製される生体組織シートを提供することは、緊急時対応を超え、人口気道の提供にも繋がるものである。特に羊膜上に作製されたシートの持つ免疫抑制作用は有益である。【００４２】
口腔粘膜上皮細胞や腸管粘膜上皮細胞などは特に、組織の採取後、結合組織などの不純物を除去するために、ディスパーゼやトリプシンなどの酵素による処理や、フィルター処理を施すことが好ましい。【００４３】
生体由来細胞は、生体組織シートの移植を受ける者（レシピエント）から調製することが好ましい。即ち、生体由来細胞のドナーと、生体移植シートのレシピエントが同一人であることが好ましい。このような自家細胞を用いることにより、免疫拒絶の問題が解消される。【００４４】
調製された生体由来細胞は、羊膜上に播種され（生体由来細胞を羊膜上に播種するステップ）、その後培養に供される（播種した生体由来細胞を培養して増殖させるステップ）。
この態様においては特に、上皮が除去された羊膜を用いることが好ましい。上皮の除去によって抗原性の低下を期待でき、また不要な細胞を事前に除くことで良好に目的の細胞層を形成することが可能となる。上皮が除去された羊膜を用いる場合、上皮を除去して表出した面側（即ち、基底膜側）に生体由来細胞を播種することが好ましい。この面側には、IV型コラーゲンがリッチに含まれており、播種された生体由来細胞の増殖、重層化が良好に進行すると考えられるからである。【００４５】
ここで、二種以上の細胞を用いることでハイブリッド化された細胞層を形成することにしてもよい。このような場合の細胞層の具体的な形成方法を、角膜上皮の再建用のシート状組成物を作製する場合を例にとり、以下に詳述する。
まず、細胞層の形成に使用する細胞種の一つ（第１細胞）として口腔粘膜上皮細胞、結膜上皮細胞、鼻腔粘膜上皮細胞、又はその他の粘膜上皮細胞、或いはこれらいずれかの粘膜上皮を構築可能な未分化細胞が好適に用いられる。他方、第１細胞とともに細胞層の形成に使用される細胞種（第２細胞）としては、角膜上皮細胞、結膜上皮細胞、又は羊膜上皮細胞が好適に用いられる。これらの細胞は、それが存在する生体組織より採取される。具体的には例えば、目的の細胞が存在する組織の一部をメスなどで採取した後、結合組織の除去、細胞の分離等の処理を経て細胞浮遊液（懸濁液）の形態に調製する。尚、第１細胞として異なる二種以上の細胞を用いてもよい。第２細胞についても同様に、異なる二種以上の細胞を用いてもよい。【００４６】
第１細胞の採取源として好適な口腔粘膜上皮には幹細胞の存在が示唆されており、上皮様細胞層を形成する細胞へと分化誘導を行い易いと考えられる。また、口腔粘膜上皮細胞を用いることは、採取が容易なこと、多量の細胞を採取可能なこと、更には両眼性の患者を処置する場合においても自己の細胞を用いて移植材料を調製できること等の利点を有する。特に、角膜上皮細胞を採取不可能な患者に対して、自己の細胞由来の移植材料を適用できるという利点は、臨床上極めて重要な拒絶反応の問題を大幅に解消するものと期待される。
口腔粘膜上皮細胞としては歯根部に存在する細胞（口腔内縁粘膜上皮細胞）、口唇部の細胞、口蓋部の細胞、頬部の細胞などが用いられる。中でも口腔内縁粘膜上皮細胞はその増殖能が高く、また抗原性が低いことから、これを用いることが特に好ましい。口腔粘膜上皮細胞は、目的とする細胞が存在する場所をメスなどで切除したり、掻爬したりすることにより採取することができる。口腔内縁粘膜上皮細胞にあっては、抜歯に付着している口腔粘膜上皮をエナメルセメント移行部より分離し、これより採取することができる。尚、結合組織などの不純物を除去するために、ディスパーゼやトリプシンなどの酵素による処理や、フィルター処理を施すことが好ましい。
本発明によって作製されるシート状組成物を移植する予定の患者以外の口腔より採取した口腔粘膜上皮細胞を用いることもできるが、免疫拒絶反応を考慮すれば、患者自身の口腔より口腔粘膜上皮細胞を採取し、培養に供することが好ましい。
口腔粘膜は増殖能が高く、通常、術後数日間の抗生剤内服、イソジン消毒等で創傷治癒するため、粘膜採取による患者自身の侵襲は軽度であると思われる。【００４７】
一方、第２細胞としては、他人（アロ）の角膜上皮細胞を好適に利用できる。このような角膜上皮細胞は例えば、感染症フリーのドナー眼球をアイバンク（Northwest eye bank等）より入手することができる。第２細胞として使用可能な細胞は角膜上皮細胞に限られず、結膜上皮細胞、羊膜上皮細胞等を用いてもよい。但し、生体における角膜上皮を構成する細胞である角膜上皮細胞、又はその近隣に存在する結膜上皮細胞を採用すれば、角膜上皮の特性をより良好に再現するシート状組成物を構築できると考えられる。本発明者らの検討の結果、第２細胞として角膜上皮細胞を使用した場合には、角膜上皮に近似した細胞層を構築できることが確認された。この事実は、上記の予想を支持するものであるとともに、第２細胞として角膜上皮細胞が特に好適であることを裏付けるものである。一方、第２細胞として羊膜上皮細胞を用いた場合にも、角膜として求められる特性を良好に再現した細胞層を形成できることが確認された。この事実は、第２細胞として羊膜上皮細胞も好適に使用できることを示すものである。【００４８】
第２細胞として自己の細胞を用いることもできるが、他人の細胞を用いることにすれば細胞をより容易に入手することができる。例えば、両眼性の患者の治療用にシート状組成物を作製する場合においても、第２細胞としての角膜上皮細胞を入手可能となる。【００４９】
それぞれ調製された第１細胞と第２細胞（以下、これらをまとめて「第１細胞等」ともいう）は羊膜上に播種され、培養に供される。通常、細胞浮遊液の形態に調製された第１細胞と第２細胞とをそれぞれ羊膜上に滴下し、培養を実施する。
典型的には、第１細胞の播種と第２細胞の播種とを同時（ここでの「同時」は、文字通りの同時は勿論のこと、片方の播種の後に実質的な時間的間隔を置かずに他方を播種する場合を含む）に実施するが、例えば、第１細胞の播種後、数分〜数時間経過した時点で第２細胞を播種する等、両者を異なるタイミングで播種してもよい。このように播種の時期をずらすことによって例えば、第１細胞に由来する細胞に富む領域が局在している細胞層を構築するなど、細胞層の構成及びそれに伴う特性を変化ないし調整することが可能となる。【００５０】
播種される第１細胞等の比率は特に限定されないが、典型的には、およそ同数の第１細胞と第２細胞が播種されるようにする。尚、第１細胞として口腔粘膜上皮細胞を、第２細胞として角膜上皮細胞を用いた実験において、第１細胞の数：第２細胞の数が３：７の場合、５：５の場合、及び７：３の場合を比較したところ、細胞の増殖の点及び重層化の点についてこれらの間に明確な差異は認められなかった（データ示さず）。【００５１】
羊膜上で第１細胞及び第２細胞を培養することによって、これらの細胞が増殖して細胞層を形成する（この過程において少なくとも一部の細胞が分化すると考えられる）。細胞層が形成された後、当該細胞層の表層を空気に接触させるステップを実施する。尚、このステップを本明細書においてエアーリフティング（Air-lifting）とも呼ぶ。このステップは、細胞層を形成する細胞の分化、及びバリア機能の誘導のために行われる。
このステップは、培養液の一部をスポイト、ピペットなどを用いて一時的に除去することにより培養液表面を低下させ、これにより細胞層の最表層を一時的に培養液外に露出させることによって行うことができる。又は、細胞層を羊膜ごと持ち上げて、最表層を培養液表面から一時的に露出させることにより行うこともできる。更には、チューブなどを用いて空気を培養液中に送り込み、細胞層の最上層に空気を接触させてもよい。操作の容易さの観点から、培養液表面を低下させて細胞層の最表層を露出させる方法により行うことが好ましい。
このステップを行う時間、即ち重層化した細胞層の最表層を空気に接触させる時間は、細胞の状態や培養条件などによって変動するが、例えば３日〜２週間程度であり、好ましくは１週間以内、更に好ましくは３日以内である。
以上の本発明の方法により、羊膜上において、第１細胞等が重層化した角膜上皮様の細胞層が形成される。このようにして得られたシート状組成物は、第１細胞等の培養基質として用いられる羊膜とともに、角膜を損傷、欠損等した患者に対する移植材料（角膜上皮の代替）として用いることができる。この場合、羊膜が眼球側となるように角膜上皮欠損部に移植される。【００５２】
本発明の一態様では、生体由来細胞の培養を支持細胞の存在下で行う。支持細胞とは、feeder細胞とも呼ばれ培養液中に成長因子等などを供給する。支持細胞との共存下で培養することにより、細胞の増殖効率が向上する。支持細胞には、例えば3T3細胞（スイスマウス3T3細胞、マウスNIH3T3細胞、3T3J2細胞など）などを用いることができる。中でも、増殖効率、取り扱いの容易さなどの観点からマウスNIH3T3細胞を支持細胞として用いることが好ましい。
支持細胞を予めマイトマイシンCなどを用いて不活性化しておくことが好ましい。支持細胞自体が増殖することによって生体由来細胞の増殖が阻害されることを防止し、生体由来細胞の増殖効率を上昇させるためである。このような不活性化は、放射線処理などによっても行うことができる。【００５３】
支持細胞の細胞密度は、例えば約1×102個／cm2以上、好ましくは約1×102個／cm2〜約1×107個／cm2、更に好ましくは約1×103個／cm2〜約1×105個／cm2とすることができる。第１細胞等との対比でいえば、使用する支持細胞数を、例えば生体由来細胞の総数に対して1／103倍〜1×102倍、好ましくは1／102〜１倍となるような条件で培養を行うことができる。支持細胞数が少ないと生体由来細胞の増殖率が低下し、少なすぎる場合には良好な生体由来細胞の増殖及び重層化が得られない。一方、支持細胞数が多すぎる場合には、かえって生体由来細胞の増殖率を低下させることとなり好ましくない。【００５４】
生体由来細胞の培養を支持細胞の共存下で行う場合には、支持細胞と羊膜との間に支持細胞が通過できないポアサイズの隔離膜を存在させることが好ましい。この隔離膜の利用によって、培養時に羊膜側（即ち、生体細胞側）に支持細胞が侵入することを防止できる。その結果、最終的に得られるシート状組成物内に支持細胞が混在するおそれが無くなる。このことは、支持細胞による免疫拒絶の問題のないシート状組成物の作製が可能になることを意味し、臨床上極めて有意義である。
隔離膜としては、支持細胞が通過できないポアサイズを有する公知のものを適宜選択して使用することができる。例えば、ポリカーボネート製、ポアサイズが約0.4μｍ〜3.0μｍの膜を用いることができる。隔離膜の材質は特に限定されず、ポリカーボネートの他、ポリエステルなどであってもよい。このような隔離膜は市販されており、容易に入手することができる。
隔離膜を用いた場合の培養方法の例として以下の方法を挙げることができる。まず、シャーレ等の容器（第１の容器）に不活性化した支持細胞を播種して培養することにより、容器表面に支持細胞層を形成させる。次に、隔離膜で底面を形成した第２の容器を、第１の容器内に設置する。この際、第２の容器の底面が培養液中となるように第２の容器の位置を調整する。続いて、第２の容器の底面、即ち隔離膜上に羊膜を載置又は付着させる。そして、羊膜上に生体由来細胞を播種し、培養する。
第２の容器の底面に予め羊膜を載置又は付着させておき（例えば、第２の容器の底面に上皮を除去した羊膜を載せ、この状態で一旦乾燥処理を行う）、この第２の容器を、支持細胞を播種した第１の容器内に設置し、そして羊膜上に生体由来細胞を播種し、培養を行ってもよい。【００５５】
生体由来細胞を培養する際に用いられる培養液は、当該細胞を増殖させ、重層化できるものであれば特に限定されない。例えば、上皮細胞の成長に通常用いられるDMEM（Dulbecco's modified Eagle's medium）とハムF12培地（Ham's F12 medium）とを所定割合で混ぜ、FBS、成長因子、抗生物質等を添加した培地を使用することができる。具体例としては、FBS（10%）、インシュリン（5 mg/ml）、コレラトキシン（0.1 nM）、上皮細胞増殖因子（EGF）（10 ng/ml）、及びペニシリン−ストレプトマイシン（50 IU/ml）を添加した、DMEMとハムF12培地の混合培地（混合体積比１：１）が挙げられる。また、トリヨードサイロニン（例えば、2 nM）、グルタミン（例えば、4 mM）、トランスフェリン（例えば、5 mg/ml）、アデニン（例えば、0.18 mM）、及び／又はハイドロコルチゾン（例えば、0.4 mg/ml）を更に添加したDMEM／ハムF12混合培地を用いることもできる。【００５６】
生体由来細胞の培養を、異種動物細胞非存在下で行うことにしてもよい。本発明において「異種動物細胞非存在下」とは、生体由来細胞を培養する際の条件として、当該生体由来細胞に対して異種である動物の細胞が使用されないことをいう。具体的には生体由来細胞としてヒト細胞（例えばヒト皮膚表皮細胞やヒト角膜上皮細胞）を使用する場合に、マウスやラット等、ヒト以外の動物種の細胞が培養液中に存在（併存）しない条件のことをいう。このような条件で培養を実施することによって、最終的に得られる移植材料（即ちシート状組成物）に異種由来の成分（異種細胞自体を含む）が混入するおそれがなくなる。
生体由来細胞を培養する際に用いられる培地は、当該細胞を増殖させるものであれば特に限定されない。例えば、MCDB153培地（日水製薬株式会社）や、EpiLifeTM（カスケード社）、これらの培地のアミノ酸組成等を改変して作製される培地、上皮細胞の成長に通常用いられるDMEM（Dulbecco's modified Eagle's medium）とハムF12培地（Ham's F12 medium）とを所定割合で混ぜた培地などを使用することができる。特に、本発明では無血清で且つ異種動物由来のタンパク質を含まない培地を用いることが好ましい。一方、成長因子や抗生物質等が添加された培地を使用してもよい。但し、血清を含まない培地を使用することが好ましい。即ち、本発明における培養方法として無血清培養法を採用することが好ましい。血清由来の成分の混入による免疫拒絶等の問題を回避することができるからである。尚、血清を含む培地中で培養することにしてもよいが、その場合には同種由来の血清（ヒトの生体由来細胞を培養する際にはヒト由来の血清）を使用するか、自家血清を使用することが好ましい。勿論、可能であれば、免疫拒絶反応の惹起のおそれがなくなる自家血清を使用することが好ましい。
生体由来細胞の良好な増殖を目的として培養ステップの途中で培養条件を変更することもできる。【００５７】
培養ステップの結果、羊膜上で生体由来細胞が増殖する。このようにして得られた細胞層の表層を角化する必要がある場合（例えば皮膚表皮細胞を用いて皮膚表皮シートを作製する場合や、角膜上皮細胞を用いて角膜上皮シートを作製する場合）には、上述したエアーリフティング（Air-lifting）を実施することができる。【００５８】
生体由来細胞は、例えば細胞密度が約1×103個／cm2以上、好ましくは約1×103個／cm2〜約1×107個／cm2、更に好ましくは約1×104個／cm2〜約1×106個／cm2となるように羊膜上に播種される。【００５９】
好適な一態様では、予め調製したヒト線維芽細胞含有コラーゲンマトリクス上に羊膜を載置し、その後、羊膜上に生体由来細胞を播種し、培養する。即ち、この態様では、コラーゲンゲル内でヒト線維芽細胞を培養するステップ（ステップB）、及び前記コラーゲンゲル上に羊膜を載置した後、前記生体由来細胞を該羊膜上に播種ないし載置するステップ（ステップC）が実施される。このような手順で作製されたシート状組成物は、ヒト線維芽細胞を含有するコラーゲンゲル上に載置した羊膜上で増殖させた生体由来細胞を含有することとなる。この態様のシート状組成物は、コラーゲンマトリクスを除去した後に移植材料として用いることもできる。また、コラーゲンマトリクスごと移植材料として用いることもできる。
「コラーゲンゲル」はヒト線維芽細胞の培養基質として機能する。コラーゲンゲルの原材料となるコラーゲンの種類は特に限定されず、Ｉ型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲンなどを用いることができる。複数の種類のコラーゲンが混在するものを用いることもできる。これらのコラーゲンは、ブタ、ウシ、ヒツジなどの動物の皮膚、軟骨などの結合組織から、酸可溶化法、アルカリ可溶化法、酵素可溶化法などにより抽出、精製することができる。尚、抗原性を低下させる目的から、ペプシンやトリプシンなどの分解酵素で処理することによりテロペプチドを除去した、いわゆるアテロコラーゲンとしたものを用いることが好ましい。コラーゲンゲルの材料として羊膜由来、特にヒト羊膜由来のコラーゲンを用いてもよい。ここで、羊膜由来とは、広く羊膜を出発原料として得られたものであることを意味する。【００６０】
コラーゲンゲルが含有するヒト線維芽細胞の由来は特に限定されず、コラーゲンを産生するものであればいずれの組織由来のものでもよく、例えば、皮膚組織、口腔粘膜組織などから調製したヒト線維芽細胞を使用することができる。【００６１】
コラーゲンマトリクスの作製方法の具体例を示す。まず、以下の手順でヒト線維芽細胞を調製する。皮膚を採取し、続いて皮膚から真皮を剥離する。真皮を細切し、I型コラーゲンコートディッシュに密着させる。静置培養し、真皮片から遊走するヒト線維芽細胞を継代する。細胞がディッシュ底面から剥離させ、細胞浮遊液を調整し、細胞培養用ディッシュに播種する。適宜細胞を凍結保存（例えば液体窒素中で保存）する。
一方、Ｉ型コラーゲンを用いて中和コラーゲン液を調製する（後述の実施例を参照）。これを培養容器（例えばカルチャーインサート）に添加し、室温で10分間程度静置させてゲル化させる。次に、上述の方法によって予め培養しておいた対数増殖期のヒト線維芽細胞をこのゲルに混和し、再度ゲル化させる。その後、静置培養する。以上の手順によってヒト線維芽細胞を含有するコラーゲンマトリクスが得られる。この創意工夫により、必要な強度を有し、羊膜層や生体由来細胞を載置できるコラーゲンマトリクスとなったもので、本発明の根幹をなす。コラーゲンマトリクスの上には、別途用意した羊膜が載置（密着）される。その後、上述の手順で細胞の播種、培養が実施される。【００６２】
以下、本発明の実施例（実験例を含む）を説明する。
【実施例】
【００６３】
１．接着剤付着シートの作製
１―１．接着成分混合液の調製
まず、フィブリノーゲン（バクスター社製）84mgと94%エタノール700μlを混和し、ホモジナイズによって攪拌した後、4℃で20時間、静置させた（A液）。一方、トロンビン（バクスター社製）2mgと100%エタノール35μlを混和し、ピペッティングによって攪拌した後、-30℃で16時間、静置させた（B液）。
A液及びB液を混和し、続いて3000 KIU/mlに調整したアプロチニン（バクスター社製）を7μl添加した。このようにして得られた３成分混合液を後述の付着処理に使用した。【００６４】
１−２．接着成分付着−上皮つき羊膜シートの作製
羊膜（上皮を有する）に接着成分が付着したシート（以下、「接着成分付着−上皮つき羊膜シート」ともいう）を、以下の手順で調製した。
１−２−１．羊膜の採取
羊膜は、全身的合併症のない帝王切開予定の妊婦に対して事前に産婦人科医とともに十分なインフォームドコンセントを行った後、手術室で帝王切開時に採取した。操作は清潔に気をつけ、手術操作に準じて手洗いの後に専用ガウンを装用した。分娩前に清潔な羊膜採取用のバットと洗浄用の生理食塩水を準備した。分娩後に胎盤組織をバットに移し、用手的に羊膜組織を胎盤より剥離した。羊膜と胎盤との癒着が強い部分はハサミで切除した。【００６５】
１−２−２．羊膜の処理
羊膜処理の過程は（１）洗浄、（２）トリミング、（３）保存の順で行った。すべての過程において、操作は清潔なドラフト内で行うのが望ましく、使用する容器や器具もすべて滅菌されたものを使用し、シャーレ等は滅菌された使い捨て（ディスポーザブル）タイプのものを使用した。採取した羊膜に付着した血液成分を生理食塩水にて洗浄しながら除去し、さらに十分量の生理食塩水（0.005% ofloxacin添加）にて洗浄した。次に羊膜をシャーレ内のリン酸緩衝液（PBS）に移し、ハサミを用いて約4×3cm程度のサイズに分割した。分割後さらに数個のシャーレに保存液を浸し、その中で状態のよい羊膜を選別した。【００６６】
１−２−３．羊膜の保存
2ccの滅菌クライオチューブに1ccずつ保存液を入れ、そこに採取、洗浄して選別された羊膜を１枚ずついれラベルした後、-80℃の冷蔵庫に保存した。保存液には50％滅菌済みグリセロール in DMEM (Dulbecco’S Modofied Eagle Medium: GIBCOBRL社)を使用した。保存された羊膜の使用期限は３ヶ月とし、期限が過ぎれば焼却処分した。【００６７】
１−２−４．乾燥処理
一組の滅菌済みプラスチックフレームで挟持した後、クリップで固定した。フレームごと−80℃のディープフリーザー内に移し、羊膜が凍結したのを確認した後、真空凍結乾燥機（Yamato, NEOCOOL）を用いて凍結乾燥処理（-110℃、約1時間）を行った。使用説明書に従い、十分な乾燥体が得られるように条件設定した。【００６８】
１−２−５．乾燥羊膜シートへの接着成分の塗布
１―１．で調製したA液、B液、及びアプロチニン液を混和し、十分にピペッティングした（混和液）。次に、１−２−４．で作製した乾燥羊膜の表面（絨毛膜側）のほぼ全体に広がるように、この混和液を滴下した後（フィブリノーゲンの付着量：5.5mg/cm2、トロンビンの付着量：0.13mg(1.4 U)/cm2、アプロチニンの付着量：1.4 KIU/cm2）、常温で2時間、減圧乾燥させた。続いて、乾燥羊膜をフレームから外し、外側がポリアミドナイロン、内側がポリエチレンからなる二層構造の袋に移し、家庭用真空パック器（フレームノバ、マジックパック）を用いて真空包装した。このようにして得られた真空パック状態の羊膜にγ線を照射して（約25kGy）滅菌した。滅菌処理後の羊膜を真空パック状態のまま使用直前まで常温保存した（接着成分付着−上皮つき羊膜シート）。【００６９】
１−３．接着成分付着−上皮なし羊膜シートの作製
上皮が除去された羊膜に接着成分が付着したシート（以下、「接着成分付着−上皮なし羊膜シート」ともいう）を、以下の手順で調製した。
１−３−１．羊膜上皮の除去
上記の手順（１−２−１．〜１−２−３．）で採取、保存した羊膜を室温で解凍した後、シャーレ内の滅菌済みリン酸緩衝液（PBS）で十分に洗浄した。洗浄後0.02％EDTA溶液 (Nacalai tesque社)に2時間37℃で保存した後、セルスクレイパー（cell scraper、Nunc社 USA)を用いて機械的に上皮を掻爬した。このようにして得られた、上皮を含まない羊膜に対して、上記の手順（１−２−４．及び１−２−５．）で乾燥処理、接着成分の塗布を実施し（フィブリノーゲンの付着量：0.5mg/cm2、トロンビンの付着量：12μg/cm2、アプロチニンの付着量：0.12KIU/cm2）、真空パック状態の、接着成分付着−上皮なし羊膜シートを得た。【００７０】
１−４．接着成分付着−細胞層形成羊膜シート（１）（接着剤付着−培養角膜シート）の作製
角膜上皮細胞に由来する細胞層が羊膜（上皮なし）上に形成され、さらに羊膜の表面に接着成分が付着したシート（以下、「接着成分付着−培養角膜シート」ともいう）を、以下の手順で調製した。
１−４−１．羊膜上皮の除去
上記の手順（１−２−１．〜１−２−３．）で採取、保存した羊膜を室温で解凍した後、シャーレ内の滅菌済みリン酸緩衝液（PBS）で十分に洗浄した。洗浄後0.02％EDTA溶液 (Nacalai tesque社)に2時間37℃で保存した後、セルスクレイパー(Nunc社 USA)を用いて機械的に上皮を掻爬した。このようにして得られた、上皮を含まない羊膜を以下の細胞培養の基質として使用した。【００７１】
１−４−２．角膜上皮細胞の回収
６週令の日本白色家兎の角膜輪部より手術用メスを用いて約5×10mmの角膜輪部組織片を採取した。採取した組織片を50 IU/mlのペニシリンストレプトマイシン、ゲンタシンを含有するリン酸緩衝液（PBS）に30分、室温の条件で2回浸漬した。その後、組織を1.2 Uディスパーゼ(Nacalai tesque社)を含有するリン酸緩衝液（PBS）に1時間、37℃の条件で浸漬し、続いて0.05％トリプシン−EDTA溶液 (GIBCOBRL社)で１５分間、浸漬処理して細胞を分離した。酵素活性は10％ウシ胎児血清(FBS)を含有するDMEMに浸漬させることにより停止させた。その後、60μmのセル・フィルターで余分な組織を除去し、角膜上皮細胞を単離した（角膜上皮細胞浮遊液）。【００７２】
１−４−３．共培養細胞の調製
共培養の細胞（支持細胞）として、NIH-3T3細胞（以下、「3T3細胞」と略称する）を使用した。事前に培養して75Fフラスコ(BD Falcon社)でコンフレントになった3T3細胞を0.05％マイトマイシンＣ溶液に2時間浸漬させ、3T3の増殖活性を抑えた。続いてリン酸緩衝液（PBS）で数回洗浄してマイトマイシンＣを除去した後、0.05％トリプシン−EDTA溶液で処理することにより、3T3細胞浮遊液を調製した。【００７３】
１−４−４．細胞培養及び粘膜上皮の誘導
１−４−１．で得られた、上皮を掻爬したヒト羊膜を基質として、角膜上皮細胞を、上記処理を施した3T3細胞と以下の手順で共培養した。培養器具としては6ウェルの培養皿（culture dish）（Corning社, NY）とカルチャーインサート（培養挿入容器）（ポリカーボネート製、平均ポアサイズ3.0μm、Corning社, NY）を用いた。
まず、培養皿上に約1×104個／cm2の細胞密度となるように3T3細胞浮遊液を播種し、37℃、5％CO2の条件下で培養した。また、カルチャーインサート上に掻爬した上皮側を上にして羊膜基質を静置して貼り付け、室温で10分乾燥させた。その後、羊膜を貼り付けたカルチャーインサート上にそれぞれ約1×10４個／cm2の細胞密度となるように角膜上皮細胞浮遊液を播種した。
以上の操作後、図１に示すように、カルチャーインサートを培養皿内に設置し、3T3細胞及び角膜上皮細胞を同じ培地中で培養した。尚、図１は培養中の状態を示した模式断面図である。培養皿１内にカルチャーインサート２が静置され、培養皿１底面には3T3細胞層５が形成される。また、カルチャーインサート２の底面上に羊膜３が静置され、その上に角膜上皮細胞４が培養される状態が示される。符号６は培地である。
培地には、DMEM/ハムF12混合培地（混合体積比１：１）に、10％FBS、インシュリン(5 mg/ml)、コレラトキシン(0.1nM)、ペニシリンストレプトマイシン(50 IU/ml)、ヒトリコンビナント上皮細胞増殖因子(EGF)(10 ng/ml)を添加したものを使用した。
上記の培地中で約７日間培養した(Submerge)。その後、粘膜上皮を分化誘導すべく、いわゆるエアーリフティング（Air-lifting）法を用いて約３日間培養した。エアーリフティング法とは、培地の液面を、羊膜上に形成された細胞層面までにし、当該細胞層の表面を空気中に暴露する方法である。Submerge中は隔日で培地を交換し、エアーリフティング後は毎日培地交換して培養を行った。
以上の方法で培養することによって、約１０日間（エアーリフティング法による３日間の培養を含む）で５〜６層の重層化した細胞層を形成した（培養角膜シート）。【００７４】
１−４−５．接着成分の付着
以上の結果得られた培養角膜シートを培養液中から取り出した後、その細胞層形成側と反対側の表面（絨毛膜側）を、送風による風乾によって半乾燥状態にした。次に、半乾燥状態の羊膜表面を、フィブリノーゲン、トロンビン、及びアプロチニンの混和液（１−２−５．と同様の手順で調製される）に浸漬し、続いて風乾し半乾燥状態とした。この一連の作業中、細胞培養面を湿潤状態に維持した。以上の操作の結果、細胞層が形成された側と反対側の羊膜表面に接着成分が付着したシート状組成物（接着剤付着−培養角膜シート）を得た。【００７５】
１−５．接着成分付着−細胞層形成羊膜シート（２）（接着成分付着−培養表皮シート）の作製
表皮角化細胞に由来する細胞層が羊膜（上皮なし）上に形成され、さらに羊膜の表面に接着成分が付着したシート（以下、「接着成分付着−培養角膜シート」ともいう）を、以下の手順で調製した。
１−５−１．羊膜上皮の除去
上記の手順（１−２−１．〜１−２−３．）で採取、保存した羊膜を室温で解凍した後、シャーレ内の滅菌済みリン酸緩衝液（PBS）で十分に洗浄した。洗浄後0.02％EDTA溶液 (Nacalai tesque社)に2時間37℃で保存した後、cell scraper (Nunc社 USA)を用いて機械的に上皮を掻爬した。このようにして得られた、上皮を含まない羊膜を以下の細胞培養の基質として使用した。【００７６】
１−５−２．表皮角化細胞の調製
１−５−２−１．皮膚の採取
あらかじめ採取部位を3日間程度予防的にポビドンヨードにて消毒・抗真菌剤の外用塗布を行った後、小皮膚片を皮膚生検に準じて採取する。【００７７】
１−５−２−２．表皮角化細胞の無血清培養法
ハサミで皮膚片から脂肪組織と真皮をできる限り取り除き、ダルベッコリン酸緩衝液（PBS）にて数回洗浄する。70％エタノールに１分間浸し滅菌する。PBSにて洗浄後、幅3mm長さ10mm程度の短冊状に切り、ディスパーゼ液（ディスパーゼII、 合同酒精社、250単位/mlダルベッコ変法MEM培地；DMEM）に浸し、4℃で一晩（18〜24時間）静置する。翌日、ピンセットを用いて表皮を真皮から剥離する。剥離した真皮は線維芽細胞培養に供する。剥離した表皮を、DMEMにて洗浄、続いて、PBSにて洗浄後、0.25%トリプシン溶液中にひたし、37℃、10分間の処理を行う。表皮をトリプシン中和液を入れたプラスチックシャーレに移しピンセットにて表皮片をほぐし、50mlの滅菌チューブに移す。PBSを添加し、表皮角化細胞浮遊液を調整する。細胞数を数え、1000rpm、5分間遠心し細胞を沈殿させる。上清を吸引し、細胞を無血清培地であるMCDB153培地で懸濁し、100mmコラーゲンコートシャーレ（旭テクノグラス、I型コラーゲンコートディッシュ；4010-010）当たり2〜3×106細胞/10ml 培養液の割合で播種する。翌日培養液を交換し、以後１日おきに培養液を交換する。細胞密度が70〜80%程度になった時点で継代培養を行う。【００７８】
１−５−３．線維芽細胞の調製
剥離した真皮をDMEMにて洗浄後、一辺が1〜2mmにメスを用いて細切する。細切した真皮片をI型コラーゲンコートディッシュに約1cmの間隔で密着させる。CO2インキュベーターに30分間静置し、完全に密着させる。その後、牛胎児血清を10％含むDMEM培地を約5ml添加し、7日間静置する。7日目に初回の培養液交換を行う。真皮片から線維芽細胞が遊走してくるのを確認する。細胞が増殖し、真皮片の周囲5mmまで遊走してきた段階で、継代を行う。PBSで洗浄後、0.125%トリプシン、0.05%EDTAを含む溶液を3ml添加し、37℃、3分間処理する。細胞がディッシュ底面から剥離したことを顕微鏡で確認した後、3mlのトリプシンインヒビターを添加し細胞を回収し50mlのチューブに移す。PBSを用いて残りの細胞を回収し、1000rpm、5分間の遠心処理にて細胞を沈殿させ、上清を吸引後、牛胎児血清を10％含むDMEM培地を添加し、細胞浮遊液を調整し、細胞培養用ディッシュに播種する。継代の細胞密度はおおむね1：3程度とする。適宜細胞を凍結保存する。凍結保存液は10％グリセロール、20%FCS、70%DMEMを用い、液体窒素中で保存する。【００７９】
１−５−４．中和コラーゲンゲルの作製
I型コラーゲン溶液（セルマトリクスタイプ1A：3mg/ml：新田ゼラチン）：6容量に対して0.1N NaOH：１容量、8倍濃度DMEM：１容量、20％FCS/DMEM：10容量の割合で中和コラーゲン液（コラーゲンの最終濃度：1mg/ml）を4℃にて作製し、直径24mmのカルチャーインサート（Corning-Costar社）に１mlずつ添加し、室温で10分間静置しゲル化させる。あらかじめ培養しておいた対数増殖期の線維芽細胞（ディスパーゼ処理し表皮を剥離した残りの真皮からoutgrowth法で培養し5-10代継代した細胞を用いる。）を5x105細胞/ml、10%FCS/DMEMの濃度に調整し、この細胞懸濁液：2容量に対して中和コラーゲン液：8容量の割合で混和し、細胞を含む中和コラーゲン溶液を調製する（コラーゲンの最終濃度：0.8mg/ml）。この溶液を各カルチャーインサートに3.5mlずつ添加し、CO2インキュベーター内(37℃、5%CO2)に静置する。約30分でゲル化したことを確認する。その後10％FCS/DMEMをゲルが浸る程度（カルチャーインサイト内側に3ml、カルチャーインサート外側に3ml）加え5日間静置培養する。培養2日目よりゲルは収縮を開始しはじめ、線維芽細胞の増殖を位相差顕微鏡下に観察できる。【００８０】
１−５−５．羊膜の接着
培養開始後5日後にはコラーゲンゲルの底面はメンブレンに密着しているがコラーゲンゲル上部は収縮し厚さが2〜3mmになっている。保存していた羊膜（１−３−１．と同様の手順で調製した、上皮を除去した羊膜）をPBSにて２回洗浄、さらに角化細胞用培養液で１回洗浄する。羊膜の実質細胞側を下にしてカルチャーインサートに移し、ピンセットを用いてコラーゲンゲルと密着させる。ピンセットにて皺ができないようにのばし、カルチャーインサートの側壁に羊膜の周辺を密着させる。CO2インキュベーター内に移し、37℃で30分間静置する。【００８１】
１−５−６．角化細胞の播種
１−５−２．で調製した角化細胞をトリプシン・EDTAを用いてディッシュから剥離し、回収する。1000rpm、5分間遠心し、上清を除去し、200万個/0.25mlの濃度になるように細胞を懸濁する。カルチャーインサート内側の羊膜上に0.25mlの細胞懸濁液を播種し、CO2インキュベーター内に移し、角化細胞が羊膜に密着するように1.5〜2.0時間インキュベーター内で静置し、その後1mlの表皮細胞増殖用培地をカルチャーインサート内側に緩やかに添加し、さらにカルチャーインサート外側に1ml添加する。翌日表皮細胞増殖用培地をカルチャーインサート内側に緩やかに追加し、さらにカルチャーインサート外側にも1ml追加する。【００８２】
１−５−７．気相下培養
表皮細胞を羊膜に播種後3日目に空気曝露（エアーリフティング）を行う。空気曝露用の維持容器に滅菌したフィルターペーパーを設置し、重層化用培地をフィルターペーパーが浸る程度（約9ml）添加する。カルチャーインサート内側の培養液を注意深く除去し、カルチャーインサートをフィルターペーパー上に移し、CO2インキュベーター内で培養する。培養液は一日おきに交換する。7〜14日の空気曝露により三次元培養皮膚が完成する。重層化用培地は以下のごとく調整する。ダルベッコ変法MEM培地：F-12培地＝1:1、カルシウム濃度；1.95mM、monoethanolamine;0.1mM、0-phosphoethanolamine;0.1mM、insulin;5ug/ml、hydrocortisone;0.4ug/ml、L-glutamine;4mM、Adenin;0.18mM、transfferin;5ug/ml、selenious acid;53nM、triiodothyronine;20pM、serine;1mM、choline chloride;0.64mM、linoleic acid;2ug/ml、FCS;2%
以上の操作の結果得られる培養表皮シートは、ディッシュ底面から若しくはコラーゲンマトリクスから容易に剥離する。従前の技術ではシートの収縮が起こるため、キチン膜（ベスキチンW）を支持体として用いることが必要であり、また破損することも多いが、以上の方法によれば強固なシートが作製され、シートの収縮も認められないことから、支持体の使用が不要となる。
以上の方法で培養表皮シートを作製したところ空気曝露後7日目では表皮は5〜8層となり、角層の形成が認められ、正常ヒト皮膚とほぼ同様の構造を呈していた。重層化した角化細胞の組織所見は一層の基底細胞様の細胞とその上に5〜8層の重層化し、分化した細胞構築が認められる。3代継代した細胞で培養表皮シートを作製した場合、皮膚採取後約4週間で培養表皮シートが使用可能となり、培養面表面積は計算上、数千倍に増加する。
作製した培養表皮シートはキャリアーと共に若しくはキャリアーなしに少量の保存液を用いることで凍結可能である。具体的にはまず、−80℃のフリーザーで凍結保存し、翌日、−150℃の超低温フリーザーで保存する。−150℃での保存では長期間シートの形で保存可能であり、実際に十分な治療効果が得られている。その他、生体組織の保存に用いられる保存液を使用して4℃で保存することも可能であり、この場合には抗酸化物質を添加しておくことが望ましい。【００８３】
１−５−８．接着成分の付着
コラーゲンマトリクスから剥離させた培養表皮シートを取り出した後、その細胞層形成側と反対側の表面を、送風による風乾によって半乾燥状態にした。次に、半乾燥状態の羊膜表面を、フィブリノーゲン、トロンビン、及びアプロチニンの混和液（１−２−５．と同様の手順で調製される）に浸漬し、続いて風乾し半乾燥状態とした。この一連の作業中、細胞培養面を湿潤状態に維持した。以上の操作の結果、細胞層が形成された側と反対側の羊膜表面に接着成分が付着したシート状組成物（接着成分付着−培養表皮シート）を得た。【００８４】
２．接着成分付着シートを用いた移植実験
２−１．ブタ眼強膜への適用
接着成分付着−上皮つき羊膜シート（１−２−５．）の接着性について、ブタ強膜を適用部位として検討した。
食用に屠殺されたブタの眼（死後約6-10時間経過）の組織を用いた。このブタ眼からはさみを用いて結膜を切除し、強膜を露出させた（ベアの状態）。尚、翼状片の治療の際には通常、異常結膜を剥離し、結膜除去部位が正常結膜で被覆されるものであり、上記の如き処理を施したブタ眼は翼状片の臨床モデルとして広く利用されている。
移植用シートとして、接着成分付着−上皮つき羊膜シート（１−２−５．）を用いた。移植用シートの適用方法は以下の通りとした。まず、上記処理を施したブタ眼の強膜表面の水分を綿棒で拭い、組織を半乾燥状態とした。尚、目視で判断して細かい水滴が認められない程度を基準にした。この強膜上に、１−２−５．で調製した接着成分付着−上皮つき羊膜シートをその接着成分付着面側を下にして乾燥状態のまま載せた。次に、セシを用いてシートを軽く押さえ、気泡が入らないように注意しながら全領域を強膜に接触させた。以上の操作によって、シートに付着した接着成分が、強膜上に残存するわずかな水分によって湿潤し、シートと組織を接着させる。
シートを載せてから一週間後に以下の二つの試験を行い、接着性を評価した。
（１）ずらし試験：綿棒で押さえ水平方向に力をかけ、シートが組織からずれないかを検討した。
（２）ひっぱり試験：セシでシートを持ち垂直方向に力をかけ、シートが組織から剥がれないかを検討した。
検討の結果、シートがずれたり、剥がれたりすることはなく、良好な接着性が認められた。【００８５】
続いて、接着成分の量と接着性との関係を調べるために、付着接着成分量の異なるシートを複数枚用意し、上記と同様の手順で移植、及び接着性の評価を実施した。評価結果を図２の表に示す。表中のフィブリノーゲン量は、シート1cm2あたりの付着量である。また、表中の＋はシートがずれることも剥がれることもなかったことを表し、−はシートがずれたことを表す（少しのずれであっても−とした）。尚、全ての試験群の付着成分比率（フィブリノーゲン付着量：トロンビン付着量：アプロチニン付着量）が同一となるように、トロンビン付着量及びアプロチニン付着量を調整した。
図２の表に示されるように、フィブリノーゲン付着量が0.5mg/cm2（トロンビン付着量：12μg/cm2、アプロチニン付着量：0.12KIU/cm2）以上であれば、シートが組織からずれたり剥がれたりすることがなく、非常に良好な接着性が認められる。即ち、フィブリノーゲン付着量として0.5 mg/cm2あれば十分な接着性の得られることが明らかとなった。【００８６】
２−２．ウサギ強膜への適用
接着成分付着−上皮なし羊膜シート（１−３−１．）の接着性及び作用について、ウサギ強膜を適用部位として検討した。
まず、ウサギに麻酔をかけ眼の結膜をはさみで約1×1cm切除し、強膜を露出させ（ベアの状態）、翼状片モデルを作成した。次に強膜表面の水分や血液を綿棒で拭い、強膜表面を半乾燥にした。出血が収まり、目視で水分が判別できないことを目安とし、シート適用の直前まで乾燥作業を行った。
この強膜上に、１−３−１．で調製した接着成分付着−上皮なし羊膜シートをその接着成分付着面側を下にして乾燥状態のまま載せた。次に、セシを用いてシートを軽く押さえ、気泡が入らないように注意しながら全領域を強膜に接触させた。試験期間中、ウサギには一日一回の抗菌剤（タリビット軟膏）、ステロイド剤（リンデロン軟膏）の投与を実施した。
施術後、シートの接着性及び生理的作用について検討するために、カメラ撮影による表面観察を実施した（シート移植日から1、2、4週目）。カメラ撮影は以下の手順で実施した。ウサギに麻酔をかけた後、シート被覆部位をメディカルニコル（ニコン社製）もしくはスリットランプ（オリンパス社製）で撮影した。この際の観察項目はシートの残存、血管新生の有無、炎症の有無の3点とした。次にフルオレセインを一滴滴下し、シート上における上皮の被覆の有無を観察した。移植4週後にはシート適用部位の組織を採取し、免疫染色によってシート（羊膜）の接着、残存、フィブリノーゲンの残存を調べた。
検討結果、本シートは移植後直ちに強膜に接着し、移植1週目ではシート（羊膜）移植部の全領域で上皮化が起こっていた。一方、血管新生及び炎症の惹起は認められなかった。2、4週目においてもシートは接着状態を維持し、上皮化の状態も維持された。2、4週目においても血管新生及び炎症は認められなかった。また、免疫染色の結果から、4週目にはフィブリノーゲンが生分解されていることが分かった。一方、羊膜は強膜上に残存していた。また、羊膜上では正常な上皮化が確認され、結膜の被覆も正常であった。以上の結果をまとめると、本シートの適用によって、１．十分な接着性が得られること、２．上皮化が正常に生ずること、３．血管新生及び炎症は誘発されない、４．シートに付着したフィブリノーゲンは少なくとも4週間以内に生分解されること、５．結膜の被覆が正常に生ずることが判明した。このように本シートは、眼表面の再建用の移植材料として好ましい作用を発揮できることが分かった。【００８７】
２−３．ウサギ角膜への適用
接着成分付着−培養角膜シート（１−４―６．）の接着性及び作用について、ウサギ角膜を適用部位として検討した。
家兎に対し、輪部より4mm外側からクレセントナイフを用いて角膜および結膜上皮を100μmの厚さですべて除去した。この操作により角膜上皮幹細胞を含む上皮細胞が存在しなくなるため、人為的な眼表面幹細胞疲弊症が再現されると考えることができる。次に、接着成分付着−培養角膜シートを輪部よりやや内側の領域に移植した。術後、抗菌剤（タリビット軟膏）およびステロイド剤（リンデロン軟膏）を１回／日塗布した。
シートは移植後直ちに眼表面に接着した。また、移植後4週目においても接着性を維持していた。一方、血管新生及び炎症の惹起は軽度であった。【００８８】
２−４．皮膚への適用
接着成分付着−培養表皮シート（１−５−８．）の接着性及び作用について、ウサギ皮膚を適用部位として以下の手順で検討することができる。
まず、ウサギの背中の一部を剃毛後、その部分の表皮を剥離する。次に、接着成分付着−培養表皮シート（１−５−８．）を移植する。移植後、シートを軽く押さえ全領域を接触させる。術後、一日一回の抗菌剤の外用塗布を行う。移植後の接着状態、及び経時的な接着状態の変化を観察することによって、本シートの接着性及び作用を評価できる。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明が提供するシート状組成物は、組織の再建用の移植材料等として使用され得る。本発明のシート状組成物の適用領域として眼科領域、消化器外科領域、婦人科領域、皮膚科領域が挙げられる。
本発明のシート状組成物は接着性に優れる。従って、適用後短時間で周囲組織に接着し、且つ長期に亘って良好な接着状態を維持することが期待できる。そのため、縫合等を併用しなくとも高い治療効果を望める。適用対象によっては一層高い接着力が要求され、縫合等を併用することが適切と考えられる場合であっても、比較的簡便な手段で対処することができ、医師及び患者の負担を軽減できる。【００９０】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。【００９１】
（１）前記ステップAが以下のステップを含む、請求項１７に記載の作製方法：
(A-1)生体由来細胞を調製するステップ；
(A-2)前記生体由来細胞を前記羊膜上に播種するステップ；
(A-3)播種した前記生体由来細胞を培養して増殖させるステップ。
（２）前記ステップAが以下のステップを含む、請求項１７に記載の作製方法：
(A-1)生体由来細胞を調製するステップ；
(B)コラーゲンゲル内でヒト線維芽細胞を培養するステップ；
(C)前記コラーゲンゲル上に前記羊膜を載置した後、該羊膜上に前記生体由来細胞を播種するステップ；
(A-3)播種した前記生体由来細胞を培養して増殖させるステップ。
（３）前記ステップA-3が、異種動物細胞非存在下で実施される、上記（１）又は上記（２）に記載の作製方法。
（４）以下のステップを更に含む、上記（１）〜上記（３）のいずれかに記載の作製方法：
(A-4)前記生体由来細胞が増殖した後、最表層を空気に接触させるステップ。
（５）前記ステップA-3が、無血清培地を使用して実施される、上記（１）〜上記（４）のいずれかに記載の作製方法。
（６）前記ステップA-3が、血清成分として、レシピエントに由来する血清のみを含む培地を使用して実施される、上記（１）〜上記（４）のいずれかに記載の作製方法。
（７）前記生体由来細胞が角膜上皮、結膜上皮、皮膚表皮、毛包上皮、口腔粘膜上皮、虹彩色素上皮、網膜色素上皮、気道粘膜上皮又は腸管粘膜上皮由来の細胞である、請求項１７及び上記（１）〜（６）のいずれかに記載の作製方法。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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