(57)【要約】  アルギニンを有効成分として含有する骨髄赤血球前駆細胞の分化促進剤、及び該分化促進剤を含有する貧血治療剤を提供する。この分化促進剤は、安全性が高く、経口投与可能で、かつ、汎用性のある優れたものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギニンを有効成分として含有する骨髄赤血球前駆細胞の分化促進剤。
【請求項２】
請求項１記載の分化促進剤を含有する貧血治療剤。
【請求項３】
血液・腹膜透析時の投与用である請求項２記載の貧血治療剤。
【請求項４】
経口投与用である請求項２記載の貧血治療剤。
【請求項５】
経腸投与用である請求項２記載の貧血治療剤。
【請求項６】
腎性貧血の治療用である請求項２〜５のいずれか1項記載の貧血治療剤。
【請求項７】
エリスロポエチン不応答性患者用である請求項２〜５のいずれか1項記載の貧血治療剤。
【請求項８】
更にエリスロポエチン様物質を組み合わせてなる請求項２〜７のいずれか１項記載の貧血治療剤。
【請求項９】
エリスロポエチン様物質が、エリスロポエチンである請求項８記載の貧血治療剤。
【請求項１０】
エリスロポエチン様物質が、エリスロポエチンミミックペプチドである請求項８記載の貧血治療剤。
【請求項１１】
エリスロポエチン様物質が、エリスロポエチン産生促進剤である請求項８記載の貧血治療剤。
【請求項１２】
配合剤であることを特徴とする請求項８〜１１のいずれか１項記載の貧血治療剤。
【請求項１３】
アルギニンを含有してなる薬剤とエリスロポエチン様物質を含有してなる薬剤とからなるキットであることを特徴とする請求項８記載の貧血治療剤。
【請求項１４】
エリスロポエチン様物質が、エリスロポエチンである請求項１３記載の貧血治療剤。
【請求項１５】
エリスロポエチン様物質が、エリスロポエチンミミックペプチドである請求項１３記載の貧血治療剤。
【請求項１６】
エリスロポエチン様物質が、エリスロポエチン産生促進剤である請求項１３記載の貧血治療剤。
【請求項１７】
アルギニンを有効成分として含有するエリスロポエチン様物質効果増強剤。
【請求項１８】
エリスロポエチン様物質が、エリスロポエチンである請求項１７記載の効果増強剤。
【請求項１９】
エリスロポエチン様物質が、エリスロポエチンミミックペプチドである請求項１７記載の効果増強剤。
【請求項２０】
エリスロポエチン様物質が、エリスロポエチン産生促進剤である請求項１７記載の効果増強剤。
【請求項２１】
アルギニンを有効成分として含有するエリスロポエチン様物質投与量減量剤。
【請求項２２】
エリスロポエチン様物質が、エリスロポエチンである請求項２１記載の投与量減量剤。
【請求項２３】
エリスロポエチン様物質が、エリスロポエチンミミックペプチドである請求項２１記載の投与量減量剤。
【請求項２４】
エリスロポエチン様物質が、エリスロポエチン産生促進剤である請求項２１記載の投与量減量剤。
【請求項２５】
アルギニンを有効成分として含有する、自己血液貯蔵者用造血促進剤。
【請求項２６】
アルギニンを有効成分として含有する造血因子産生促進剤。
【請求項２７】
造血因子が、アクチビン、SCF及びIGF-1からなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項２６記載の造血因子産生促進剤。
【請求項２８】
骨髄内造血因子の産生を促進する請求項２６記載の造血因子産生促進剤。
【請求項２９】
請求項２６に記載の造血因子産生促進剤の増強物質をスクリーニングする方法であって、
造血因子産生促進活性を測定するための造血因子産生促進活性測定系に、アルギニン、又はアルギニン及び被検物質を添加したときの造血因子産生促進活性を比較するステップと、
被検物質を添加したときに高い造血因子産生促進活性を示す被検物質を選択するステップと、
を含む上記方法。
【請求項３０】
請求項２６に記載の造血因子産生促進剤の阻害物質をスクリーニングする方法であって、
造血因子産生促進活性を測定するための造血因子産生促進活性測定系に、アルギニン、又はアルギニン及び被検物質を添加したときの造血因子産生促進活性を比較するステップと、
被検物質を添加したときに低い造血因子産生促進活性を示す被検物質を選択するステップと、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄赤血球前駆細胞の分化促進剤、これを用いた貧血治療剤に関するものである。本発明は、又、造血因子産生促進剤及び造血因子産生促進剤の増強物質や阻害物質をスクリーニングする方法に関するものである。【０００２】
（発明の背景）
赤血球造血は赤血球数の恒常性維持のために必須のプロセスである。赤血球の平均寿命はヒトでは約120日であり、老化赤血球は循環系から継続的に除かれるため、毎日、約千億個の赤血球が成人体内で新たに産生されている。赤血球の発生についてはよく研究されており、数多くの解説書に記載されているが、代表例として「血液学  中外医学社」より概要を抜粋すると以下のようになる。
骨髄中には様々な血球系に分化が可能な多能性幹細胞が存在し、多能性幹細胞の一部は赤血球系への分化の方向が決定された赤血球前駆細胞に分化する。赤血球前駆細胞として同定される最も幼若なものは、BFU-E（burst forming unit-erythroid）と、やや分化の進んだCFU-E（colony forming unit-erythroid）である。CFU-E以降は、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、正染性赤芽球へと分裂しながら分化し、脱核して網状赤血球から赤血球に成熟する。BFU-E、CFU-Eの段階になると、赤血球系への分化の方向が完全に決定されており、赤血球以外の血球系に分化することはない。このため、BFU-E、CFU-E数が増加すると、赤血球造血が促進する。【０００３】
赤血球造血は、主に造血因子のエリスロポエチン（Erythropoetin；EPO）によって恒常性維持されている。EPOは主に腎臓で産生され、血液中を循環し、骨髄中のCFU-Eに作用して増殖、分化を刺激することで赤血球造血を促進する。EPOが正常レベルに産生されず不足すると、CFU-Eが減少し、赤血球造血が低下、貧血になる。貧血はヘモグロビン濃度が不十分で身体の酸素輸送要求を満足できない病的状態であり、労作意欲の低下、易疲労感、息切れ、立ちくらみ、動悸等の臨床症状を呈するため、症状を改善することが望まれる。各種の疾患がEPO不足による貧血をもたらすことが知られるが、最も古典的な例は腎臓病である。慢性腎不全患者は腎臓が損傷することによりEPO産生が低下するため、貧血を呈する。慢性腎不全患者のうちの多くは、腎機能代替のため頻繁な透析を必要とする透析患者であるが、透析患者の９割は貧血である。現在、貧血の治療法として、組換えヒトEPO(rHuEPO)の投与が広く用いられている。透析患者の９割はrHuEPO投与されており、それらのうち多くは貧血改善効果が認められている。【０００４】
rHuEPOの貧血改善効果は高いが、臨床使用の拡大に伴い、いくつかの問題点が挙げられている。1つは長期治療のコストである。典型的rHuEPO投与量は最大で９０００国際単位／週、薬価で約１２,０００円であるが、貧血の原疾患が治療されない限り投与は長期にわたり、コスト面における患者、保険制度の負担は大きい。また、EPOは静脈内投与を必要とするために、投与の度の通院など、患者の負担が大きいことも問題である。さらに、rHuEPOの投与によって血液中EPO濃度が上昇するにもかかわらず、EPOに対する反応が弱く、貧血改善に高投与量rHuEPOが必要、または、ほとんど貧血改善のみられない患者（これらの患者はEPO不応答性患者と呼ばれる）も１〜２割程度存在することが知られている。EPO不応答性患者の貧血改善には、EPOと異なる作用機序でCFU-Eを増加する骨髄赤血球前駆細胞の分化促進剤が有効であると考えられる。また骨髄赤血球前駆細胞の分化促進剤を併用することでrHuEPO投与必要量を減少させる効果も期待される。
又、自己の血液を採取し、将来の使用のために貯蔵している人（自己血液貯蔵者）に対して、血液採取後に迅速に造血作用を促進させる手段にも利用できる。【０００５】
一方、赤血球前駆細胞はEPO以外にも複数の造血因子によって増殖、分化が促進されることが知られている。造血因子のアクチビン、IGF-1は、EPOと協調的にCFU-Eに作用し、増殖、分化を促進することが知られている。（Blood,1992,Nov 15;80(10):2503-12.）また、造血因子のSCFは、CFU-E より未分化な赤血球前駆細胞であるBFU-Eに作用し、増殖、分化を促進することが知られている。（Blood,1991,Oct 15;78(8):1975-80.）
これらアクチビン、IGF-1、SCFは、EPOと異なる受容体に作用しCFU-Eを増加することから、EPO不応答性患者への投与で貧血改善することが期待される。しかし、造血因子の組換えタンパク質投与はEPOと同様に非経口投与となるため、投与の度の通院など、患者の負担が大きい。また、一般的に複数の造血因子を同時に作用させた場合に相乗作用を示すことが知られているが、複数の造血因子の併用はコスト面で患者の負担が大きい。
以上から、アクチビン、IGF-1、SCFの産生を同時に促進する作用をもつ薬剤を見出せれば、現在の臨床上の問題点を改善する貧血治療剤となることが期待される。【０００６】
非特許文献１は、正常ラットにアルギニンを反復投与した結果、ヘモグロビン及び赤血球数が増加したことを示しているが、赤血球新生（造血）を亢進する効果か、赤血球寿命を亢進する効果か、作用機構が不明であるので、どのような貧血症に有効であるかといった臨床有用性が不明瞭である。非特許文献２は、腎性貧血患者にアルギニンを投与した結果、貧血状態が改善された（赤血球数が正常レベルに近づいた）ことが示されており、その作用機構がアルギニンによる腎臓EPOの産生促進にあることが論述されている。従って、非特許文献１の正常ラットで観察された赤血球数の増加現象は、アルギニンがラット腎臓のEPO産生を促進することによるものと当然かつ容易に類推することができる。すなわち、当該領域の研究者にとって、アルギニンが骨髄に直接作用して赤血球前駆細胞の増殖を促進する造血作用を有することは予想困難といえる。また、アルギニンが有効である貧血症とは、EPOの産生促進が治療効果に結びつくものに限られること、と考えることも当然の帰結となる。以上より、アルギニンが骨髄造血作用を有すること、EPOに対する不応答性患者の貧血治療にも適応できること、EPOとの相乗効果によりEPO投与量を低減できることなど到底考えの及ばないことである。【０００７】
非特許文献３には、ブタ初代肝細胞培養の培地に、アルギニン、プロリン、スレオニン、トリプトファンを高濃度で添加すると、IGF-1の遺伝子発現が増加することが報告されている。これは肝臓細胞に対するアミノ酸の作用に限定して行われた研究であり、肝臓以外の細胞に対する作用あるいは赤血球造血に対する作用に関して何らの示唆も示されていない。
非特許文献４は骨芽細胞様細胞株であるMC3T3-E1細胞にアルギニンを添加すると、IGF-1の分泌量が増加し、更に高濃度添加すると遺伝子発現が増加することを報告している。骨芽細胞は骨形成に関わることから、アルギニンがIGF-1産生の亢進を介して、骨形成を促進する可能性が示唆されると論じている。すなわち、この研究は骨代謝調節に対する作用に注目して行われたものであり、論文中には赤血球造血に対する作用に関して何らの示唆も示されていない。【０００８】
【非特許文献１】Int.J.Toxicol.,2004,23:101-105
【非特許文献２】医学のあゆみ  2004, 211,No.8
【非特許文献３】J.Nutr., 1999,129;1298-1306
【非特許文献４】Bone, 1998, 23; 103-109
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、骨髄赤血球前駆細胞の分化促進剤を提供することを目的とする。
本発明は、又、貧血治療剤を提供することを目的とする。
本発明は、又、造血因子産生促進剤を提供することを目的とする。
本発明は、又、造血因子産生促進剤の増強物質や阻害物質をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決できる薬剤を探索、検討した結果、アミノ酸であるアルギニンに、CFU-E増加作用があることを新たに見出し、本発明を完成するに至った。
本発明者らは、又、アミノ酸であるアルギニンに、骨髄細胞のアクチビン、IGF-1、SCF産生促進を介したCFU-E増加作用があることを新たに見出し、本発明を完成するに至った。
より詳細には、CFU-Eを測定する方法には、メチルセルロース半固形培地を用いたインビトロコロニーアッセイ法が一般的に用いられており、CFU-E増加作用を発見するには最も適した実験系である。本発明者はこの方法を用い、単離したマウス骨髄細胞にアルギニン６００μM添加時のCFU-Eコロニー数を測定した結果、血液中平均アルギニン濃度の１７０μMと比べ、CFU-E数が有意に増加することを見出した。ラット経口投与では１．２g/kgのアルギニン単回投与で血液中濃度が６００μM程度に達することから、経口投与では、投与量依存的なCFU-E数増加が期待される。ヒトにおいても、経口投与により、血液中アルギニン濃度依存的なCFU-E数増加が期待される。
【００１１】
よって、以下に示す発明を提供する。
(1)アルギニンを有効成分として含有する骨髄赤血球前駆細胞の分化促進剤。
(2)上記(1)記載の分化促進剤を含有する貧血治療剤。
(3)血液・腹膜透析時の投与用である(2)記載の貧血治療剤。
(4)経口投与用である(2)記載の貧血治療剤。
(5)経腸投与用である(2)記載の貧血治療剤。
(6)腎性貧血の治療用である(2)〜(5)のいずれかに記載の貧血治療剤。
(7)エリスロポエチン不応答性患者用である(2)〜(5)のいずれかに記載の貧血治療剤。
(8)更にエリスロポエチン様物質を組み合わせてなる請求項２〜７のいずれか１項記載の貧血治療剤。
(9)エリスロポエチン様物質が、エリスロポエチンである(8)記載の貧血治療剤。
(10)エリスロポエチン様物質が、エリスロポエチンミミックペプチドである(8)記載の貧血治療剤。
【００１２】
(11)エリスロポエチン様物質が、エリスロポエチン産生促進剤である(8)記載の貧血治療剤。
(12)配合剤であることを特徴とする請求項(8)〜(11)のいずれかに記載の貧血治療剤。
(13)アルギニンを含有してなる薬剤とエリスロポエチン様物質を含有してなる薬剤とからなるキットであることを特徴とする(8)記載の貧血治療剤。
(14)エリスロポエチン様物質が、エリスロポエチンである(13)記載の貧血治療剤。
(15)エリスロポエチン様物質が、エリスロポエチンミミックペプチドである(13)記載の貧血治療剤。
(16)エリスロポエチン様物質が、エリスロポエチン産生促進剤である(13)記載の貧血治療剤。
(17)アルギニンを有効成分として含有するエリスロポエチン様物質効果増強剤。
(18)エリスロポエチン様物質が、エリスロポエチンである(17)記載の効果増強剤。
(19)エリスロポエチン様物質が、エリスロポエチンミミックペプチドである(17)記載の効果増強剤。
(20)エリスロポエチン様物質が、エリスロポエチン産生促進剤である(17)記載の効果増強剤。
【００１３】
(21)アルギニンを有効成分として含有するエリスロポエチン様物質投与量減量剤。
(22)エリスロポエチン様物質が、エリスロポエチンである(21)記載の投与量減量剤。
(23)エリスロポエチン様物質が、エリスロポエチンミミックペプチドである(21)記載の投与量減量剤。
(24)エリスロポエチン様物質が、エリスロポエチン産生促進剤である(21)記載の投与量減量剤。
(25)アルギニンを有効成分として含有する、自己血液貯蔵者用造血促進剤。
(26)アルギニンを有効成分として含有する造血因子産生促進剤。
(27)造血因子が、アクチビン、SCF及びIGF-1からなる群から選ばれる少なくとも１つである(26)記載の造血因子産生促進剤。
(28)骨髄内造血因子の産生を促進する(26)記載の造血因子産生促進剤。
【００１４】
(29)上記(26)に記載の造血因子産生促進剤の増強物質をスクリーニングする方法であって、
造血因子産生促進活性を測定するための造血因子産生促進活性測定系に、アルギニン、又はアルギニン及び被検物質を添加したときの造血因子産生促進活性を比較するステップと、
被検物質を添加したときに高い造血因子産生促進活性を示す被検物質を選択するステップと、
を含む上記方法。
(30)上記(26)に記載の造血因子産生促進剤の阻害物質をスクリーニングする方法であって、
造血因子産生促進活性を測定するための造血因子産生促進活性測定系に、アルギニン、又はアルギニン及び被検物質を添加したときの造血因子産生促進活性を比較するステップと、
被検物質を添加したときに低い造血因子産生促進活性を示す被検物質を選択するステップと、を含む方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明による赤血球前駆細胞の分化促進剤及び造血因子産生促進剤は、アルギニンを有効成分とする。アルギニンとしては、アルギニンおよび／または生理学的に許容可能なその塩でもよい。塩としては、塩酸塩、クエン酸塩、グルタミン酸塩などがあるがこれらに限定されない。有効成分の異性体に関しては、L-体、D-体、およびDL体いずれも使用可能であるが、天然に存在するという観点からL-体が好ましい。例えば、アルギニンとして遊離体のL−アルギニンとL−アルギニン一塩酸塩を併含するものでもよい。
本発明の赤血球前駆細胞の分化促進剤及び造血因子産生促進剤は、公知のまたは将来開発されるような様々な医薬製剤の形態、例えば、経口投与、腹腔内投与、経皮的投与、皮下投与、経静脈投与、吸入投与等、各種の投与形態に調製することができる。本発明の赤血球前駆細胞の分化促進剤及び造血因子産生促進剤はアルギニン単独で用いることができるが、アルギニンを有効成分とする医薬製剤として、公知の又は将来開発される方法を適宜採用して、様々の形態とすることができる。
本発明による赤血球前駆細胞の分化促進剤及び造血因子産生促進剤の投与法としては、それぞれ特に制限はないが、好ましくは経口投与がのぞましい。この場合、投与量は投与する患者の貧血指標となるヘモグロビン濃度、年齢等によって異なるが、一般成人の場合、1日あたり0.1〜12ｇ程度、より好ましくは0.5〜6ｇ程度である。【００１６】
本発明の赤血球前駆細胞の分化促進剤及び造血因子産生促進剤は、赤血球造血の低下に起因する各種疾患の治療または予防に用いる医薬品の有効成分や食品、メディカルフードの構成成分として使用することができる。本発明の赤血球前駆細胞の分化促進剤が有効であることが期待される疾患は、腎性貧血、鉄欠乏性貧血、溶血性貧血、再生不良性貧血、悪性貧血、失血性貧血、及び抗がん剤治療にともなう貧血である。これらのうち、腎性貧血特に、EPO不応答性の腎性貧血の治療に有用である。
本発明におけるEPO不応答性とは、効果が期待される量のEPOを投与しても十分な効果が発現しない状態をいい、特にEPOの投与量に限定されるものではない。好ましくは、EPO投与量が9000以上国際単位/週でも、十分な効果が発現しない状態をいう。十分な効果が発現しない状態とは、好ましくは、４〜８週間でHt値の上昇が3%未満である状態をいう。一般に、EPO不応答性患者の定義は人種、生活習慣等によって異なるが、本発明は特にこれらの定義にも限定されるものではない。例えば、米国ではガイドライン上、EPOを300-450国際単位/kg/週で4〜6ヶ月投与してもHbが10〜12g/dlに到達しないものと定められているが（Am J Kidney Dis 30 Suppl.3 1997）、一般的な用法用量では、150-300国際単位/kg/週で2ヶ月投与してもHbが2g/dl上昇せず、Hbが10〜12g/dlに到達しない者をEPO不応答性患者と扱っている（EPOGEN添付文書）。また欧州ではガイドライン上、300国際単位/kg/週以上皮下投与しても目標とするHt値に到達しない患者と定められている（Nephrol Dial Transplant (1999) 14 Suppl5 : 25-27）。また日本では、EPO必要投与量が9000以上国際単位/週であり、４〜８週間でHt値の上昇が3%未満である場合においてEPO不応答性と考えられている。上記以外の国においても、推奨される最大用法用量でも貧血改善効果が期待できない場合についてEPO不応答性患者と定められる。このようなEPO不応答性患者においては、本発明の赤血球前駆細胞の分化促進剤の投与が必須である。【００１７】
EPO不応答性以外のEPO投与患者のうちEPO必要投与量が、最大用法用量未満、好ましくは、1500〜9000国際単位/週の患者においては、本発明の赤血球前駆細胞の分化促進剤による貧血改善の増強が期待される。従って、EPO単独貧血改善治療時のEPOの必要投与量を減少することが期待される。本発明の赤血球前駆細胞の分化促進剤の投与によるEPO増強及びEPO減量は、EPO投与開始時の通常EPO投与量では、通常期間では充分な貧血改善（４〜８週間でHt値の上昇が約3%未満）が認められない場合から有効であることが期待され、その後EPOの投与量を通常投与される最高投与量においても通常期間では充分な貧血改善が認められない場合まで、有効であることが期待される。以上の、EPO増強及びEPO減量投与法としては、経口投与および、非経口投与を用いることができる。また、本発明の赤血球前駆細胞の分化促進剤の投与により、腎性貧血患者のうち、透析導入されていない患者及び透析導入されている患者について、貧血改善が期待されるが、投与法としては、経口投与および、非経口投与を用いることができる。【００１８】
エリスロポエチン様物質とは、生体内に投与・摂取等された場合に、生体内でエリスロポエチン様作用を発揮・誘導する物質をいう。
例えば、エリスロポエチン、エリスロポエチンミミックペプチド、エリスロポエチン産生促進剤などを含むが、特にそれらに限定されるものではない。【００１９】
エリスロポエチンとは、天然型、遺伝子組み換え型、修飾型のいずれでもよい。例えば遺伝子組み換え型であれば、ヒト肝細胞のｍRNAに由来するヒトエリスロポエチンｃDNAの発現により、チャイニーズハムスター卵巣細胞で産生される165個のアミノ酸残基（C809H1301N2290240S5；分子量：18,235.96）からなる糖タンパク（分子量：約30,000）である、エポエチンアルファ（遺伝子組み換え）（Epoetin Alfa(genetical recombination)）やエポエチンベータ（遺伝子組み換え）（Epoetin Beta(genetical recombination)）などでも良い。
エリスロポエチンミミックペプチドとは、EPO受容体に結合し、そして活性化し、またはEPOアゴニストとして働くペプチドをいう。例えば、WO96/40749に開示されている、アミノ酸配列Ｘ３Ｘ４ＧＰＸ６ＴＷＸ７Ｘ８を含み、ここに各々のアミノ酸は標準的な一文字省略で示され；Ｘ３はＣ；Ｘ４はＲ、Ｈ、ＬまたはＷ；Ｘ５はＭ、Ｆ、またはＩ；Ｘ６は２０の遺伝的にコードされたＬ−アミノ酸から独立して選択され；Ｘ７はＤ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶ；およびＸ８はＣである長さ１０〜４０アミノ酸残基のペプチドを含む。【００２０】
更に詳細には、EPOミミックペプチドは、下記の要件を満たすペプチドを成分として有するものをいう。
１．エリトロポエチン受容体に結合し、アミノ酸配列X3X4GPX6TWX7X8を含み、ここに、各々のアミノ酸は標準的な一文字省略で示され、Ｘ6は20の遺伝的にコードされたＬ−アミノ酸のいずれかから独立して選択され；Ｘ3はＣ；Ｘ4はＲ，Ｈ，ＬまたはＷ；Ｘ5はＭ，ＦまたはＩ；Ｘ7はＤ，Ｅ，Ｉ，ＬまたはＶ；およびＸ8はＣである長さ10〜40アミノ酸残基のペプチド。
２．各々のアミノ酸が標準的な一文字省略によって示されるアミノ酸配列 YX2X3X4X5GPX6TWX7X8からなり、Ｘ2およびＸ6の各々は20の遺伝的にコードされたＬ−アミノ酸のいずれかから独立して選択され；Ｘ3はＣ；Ｘ4はＲ，Ｈ，ＬまたはＷ；Ｘ5はＭ，ＦまたはＩ，Ｘ7はＤ，Ｅ，Ｉ，ＬまたはＶ；およびＸ8はＣである１記載のペプチド。
３．アミノ酸配列 X1YX2X3X4X5GPX6TWX7X8X9X10X11よりなり、ここに、各々のアミノ酸は標準的な一文字省略によって示され、Ｘ1，Ｘ2，Ｘ6，Ｘ9，Ｘ10およびＸ11の各々は20の遺伝的にコードされたＬ−アミノ酸のいずれかから独立して選択され；Ｘ3はＣ；Ｘ4はＲ，Ｈ，ＬまたはＷ；Ｘ5はＭ，ＦまたはＩ；Ｘ7はＤ，Ｅ，Ｉ，ＬまたはＶ；およびＸ8はＣである２記載のペプチド。
４．Ｘ4がＲまたはＨ；Ｘ5がＦまたはＭ；Ｘ6がＩ，Ｌ，Ｔ，Ｍ，ＥまたはＶ；Ｘ7がＤまたはＶ；Ｘ9がＧ，Ｋ，Ｌ，Ｑ，Ｒ，ＳまたはＴ；およびＸ10がＡ，Ｇ，Ｐ，ＲまたはＹである３記載のペプチド。【００２１】
５．Ｘ1がＤ，Ｅ，Ｌ，Ｎ，Ｓ，ＴまたはＶ；Ｘ2がＡ，Ｈ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，ＳまたはＴ；Ｘ4がＲまたはＨ；Ｘ9がＫ，Ｒ，ＳまたはＴ；およびＸ10がＰである４記載のペプチド。
６．下記よりなる群から選択される１記載のペプチド。
2006115274.tif 000002
2006115274.tif 000003
【００２２】
７．下記よりなる群から選択される１記載のペプチド。
2006115274.tif 000004
８．該アミノ酸配列が環化される１のペプチド。【００２３】
９．下記よりなる群から選択される８記載のペプチド。
2006115274.tif 000005
10．該アミノ酸配列がダイマー化された１記載のペプチド。
11．該ペプチドが下記のアミノ酸配列からなる10記載のペプチド。
2006115274.tif 000006
更にEPOミミックペプチドには、AFFYMAX社が開発したHEMATIDETMや、実施例２記載されているEMP1も含まれる。【００２４】
また、EPO産生促進剤とは、生体内に投与することによって、生体内因性のEPOの産生を誘導する薬剤をいい、例えばHＩＦ（Hypoxia-Inducible Factor）安定化剤などであり、HIF安定化作用を有するものであればどのような構造のものでもよい。例えば、具体的に、ＦｉｂｒｏＧｅｎ社が開発したＦＧ２２１６（日本名ＹＭ３１１）などをいう。また、低酸素誘発因子プロリン水酸化酵素阻害剤以外の作用機構を有するEPO産生促進薬剤であってもよい。
一方、本発明の造血因子産生促進剤は、赤血球造血の低下に起因する各種疾患の治療または予防に用いる医薬品の有効成分や食品、メディカルフードの構成成分として使用することができる。本発明の造血因子産生促進剤が有効であることが期待される疾患は、腎性貧血、鉄欠乏性貧血、溶血性貧血、再生不良性貧血、悪性貧血、失血性貧血、及び抗がん剤治療にともなう貧血である。【００２５】
本発明の有効成分の医薬への適用方法としては、経口投与あるいは非経口投与を採用することができるが、投与に際しては、有効成分を、経口投与、注射などの投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬製剤の形態で投与することができる。このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤、凍結乾燥製剤などが挙げられ、これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングルコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水などが挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤などの慣用の添加剤を適宜添加することもできる。【００２６】
本発明により、安全性が高く、経口投与可能で、かつ、汎用性のある赤血球前駆細胞の分化促進剤が提供される。
本発明の赤血球前駆細胞の分化促進剤は、貧血患者の貧血の予防または治療を可能とし、貧血に伴う労作意欲の低下、易疲労感、息切れ、立ちくらみ、動悸等の臨床症状を改善することが期待される。さらに、経口投与とすれば、皮下または静脈注射の痛みを伴うことなく、また通院せずに在宅で毎日簡単に服用できることから、確実な貧血改善を奏することができると期待される。また、生体に存在するアミノ酸であることから服用に伴う副作用発現がなく、腎機能の悪化を懸念することなく治療できることが期待される。
例えば既にrHuEPOによる治療を受けている患者については、必要投与量が最大用法用量未満、好ましくは、1500〜9000国際単位/週の患者に、本発明の有効成分を加えて投与することにより、EPO必要投与量が減少し、コスト面や、皮下または静脈注射による痛みなどの患者の負担を減らすことが期待される。また、EPO必要投与量が最大用法用量以上、好ましくは９０００国際単位/週以上のEPO不応答性患者に対する貧血改善も期待される。また、今後、EPOミミックペプチドあるいはEPO産生促進剤による治療が普及した場合にも、本発明の有効成分を加えて投与することにより、必要投与量が減少するなど期待される。【００２７】
本発明の造血因子産生促進剤を用いて、これに対するアゴニスト、すなわち本発明の造血因子産生促進剤の持つ造血因子産生促進活性を促進する物質（以下、「造血因子産生促進活性促進剤」ともいう。）をスクリーニングすることができる。このような造血因子産生促進活性促進剤は、生体内に存在するアルギニンによって造血因子産生促進されことによる造血促進が不足するなどに起因する疾患に関係する場合に、その疾患に対する治療薬として開発することが期待できる。ここで、造血因子産生促進活性とは、ある分子が造血因子遺伝子発現を介して産生上昇する作用をいう。【００２８】
造血因子産生促進活性促進剤は、例えば以下のステップによりスクリーニングすることができるが、これらの工程に限定されるものではない。
ｉ）造血因子産生促進活性を測定するための造血因子産生促進活性測定系に、アルギニン、又はアルギニン及び被検物質を添加して、造血因子産生促進活性を測定する。
ii）前記測定系にアルギニンのみ添加したときの造血因子産生促進活性と、アルギニン及び被検物質を添加したときの造血因子産生促進活性を比較する。
iii）被検物質を添加したときに高い造血因子産生促進活性を示す被検物質を選択する。【００２９】
本発明の造血因子産生促進剤を用いて、これに対するアンタゴニスト、すなわち本発明の造血因子産生促進剤の持つ造血因子産生促進活性を抑制する物質（以下、「造血因子産生促進活性抑制剤」ともいう。）をスクリーニングすることができる。このような造血因子産生促進活性抑制剤は、生体内に存在するアルギニンによって造血因子産生促進される造血促進が疾患に関係する場合に、その疾患に対する治療薬として開発することが期待できる。
造血因子産生促進活性抑制剤は、例えば以下のステップによりスクリーニングすることができるが、これらの工程に限定されるものではない。
ｉ）造血因子産生促進活性を測定するための造血因子産生促進活性測定系に、アルギニン、又はアルギニン及び被検物質を添加して、造血因子産生促進活性を測定する。
ii）前記測定系にアルギニンのみ添加したときの造血因子産生促進活性と、アルギニン及び被検物質を添加したときの造血因子産生促進活性を比較する。
iii）被検物質を添加したときに低い造血因子産生促進活性を示す被検物質を選択する。【００３０】
造血因子産生促進活性の測定は、例えば、動物から単離した細胞を用いて行われ、前記細胞は、造血因子産生促進活性測定系は、被検物質添加後の遺伝子発現、タンパク質産生を検出することができるものであれば、特に制限なく使用することができる。造血因子産生促進活性測定系としては、実施例に記載された定量PCR法などの他にも、ジーンチップ法、マイクロアレイ法、in situ ハイブリダイゼーション法、RNase プロテクションアッセイ法、ノザンブロッティング法、ディファレンシャルディスプレイ法、SDSアクリルアミドゲル電気泳動法、ウエスタンブロッティング法、カラムクロマトグラフィー法などの方法を用いることができる。【００３１】
造血因子産生促進剤は、アルギニンおよび生理学的に許容可能なその塩を含有する等いずれであってもよく、これらの任意の混合物であってもよい。また、被検物質の濃度は、造血因子産生促進活性測定系に影響を与えない限り、任意であってよい。さらに、被検物質は単一の化合物であってもよく、複数の化合物を含む混合物又は組成物であってもよい。尚、アルギニン及び被検物質の造血因子産生促進活性測定系への添加は、通常同時に行われるが、アルギニンの造血因子産生促進活性を検出し得る限り、同時でなくてもよい。
上記の操作により、又は上記の操作を繰返すことによって、本発明の造血因子産生促進剤の持つ造血因子産生促進活性を抑制する物質又は促進する物質及びそれを含む組成物等をスクリーニングすることができる。
上記のようにして選ばれた造血因子産生促進活性抑制剤及び造血因子産生促進活性促進剤は、アルギニンの造血因子産生促進活性の新たな調節物質として、造血因子産生促進活性が関連する各種疾患の治療薬又はその候補として期待される。【００３２】
本発明により、安全性が高く、経口投与可能で、かつ、汎用性のある造血因子産生促進剤が提供される。
本発明の造血因子産生促進剤は、貧血患者の貧血の予防または治療を可能とし、貧血に伴う労作意欲の低下、易疲労感、息切れ、立ちくらみ、動悸等の臨床症状を改善することが期待される。さらに、経口投与とすれば、皮下または静脈注射の痛みを伴うことなく、また通院せずに在宅で毎日簡単に服用できることから、確実な貧血改善を奏することができると期待される。また、生体に存在するアミノ酸であることから服用に伴う副作用発現がなく、腎機能の悪化を懸念することなく治療できることが期待される。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない
【実施例】
【００３３】
〔実施例１〕アルギニンのCFU-E増加作用
インビトロマウスCFU-Eコロニーアッセイ法は以下の方法で行った。BDF-1マウス雌10週齢（日本チャールズリバー株式会社）を頚椎脱臼法で致死後、大腿骨から骨髄細胞を単離し、10％FCS（JRHバイオサイエンス）を含有するIMDM培地（インビトロジェン株式会社）に懸濁した。骨髄細胞を１５００rpｍ、４℃、１０分間遠心し、沈殿した骨髄細胞をアミノ酸を含有しないIMDM培地に置換し、細胞数を測定した。直径３．５ｃｍのディッシュ（ナルジェヌンクインターナショナル）に、骨髄細胞を懸濁したアルギニン濃度１７０μMのメチルセルロース半固形培地｛１国際単位/ml  ｒHuEPO（中外製薬株式会社）、１００μM  ２−メルカプトエタノール（和光純薬工業株式会社）、２４％FCS（JRHバイオサイエンス）、０．８％メチルセルロース（ステムセルテクノロジー社  メチルセルロース含有IMDM溶液M3134）、２％BSA（シグマアルドリッチジャパン株式会社）、骨髄細胞２．２×１０5個/ml｝を１ｍｌ加えた。（２４％FCSを含有するアミノ酸組成が１／３濃度のIMDM培地と同等。）上記の組成に加え、アルギニンを最終濃度６００μMとなるように追添加したものを調製し、３７℃、５％CO2条件で４８時間培養後、倒立顕微鏡を用いて、CFU-Eコロニー数を測定した。各条件についてN=4で行った。統計学的検定はUnpaired t-testで行った。
CFU-Eコロニーアッセイの結果を図１(A)に示す。図中、＊  P<０．０５。データは平均値±SEMで示した。縦軸は２．２×１０5個の骨髄細胞あたりのCFU-Eコロニー数である。【００３４】
図１には、アルギニンを最終濃度６００μMになるように添加した場合、CFU-E数が増加したことが示されている。このことから、アルギニンは骨髄細胞に直接作用し、CFU-E数を増加させることが明らかとなった。
EPOが十分量存在する条件でアルギニンがCFU-E数を増加したことから、EPO効果増強作用およびEPO投与量減量効果が期待できる。１U/mlのEPOが十分量であることは、図１(A)と同一条件で実施した図１(B)の結果で示したとおり、０．５U/ml以上で最大作用量であることから明らかである。EPOミミックペプチド、EPO産生促進剤との組み合わせも同様である。以下に詳しく述べる。
EPOは赤血球幹細胞膜上に存在するEPO受容体と結合することによって赤血球造血に作用すると考えられている。図１(B)に示されるように、EPOは濃度依存的に赤血球幹細胞ＣＦＵ−Ｅを増加させ、それぞれ一定濃度に達すると最大活性となり、それ以上に濃度を高くしても最大活性のままである。本件発明で見出したアルギニンは、このような十分量のEPOが存在するにもかかわらず、同時に作用させるとＣＦＵ−Ｅを更に増加させる。このことから、EPOとアルギニンとは、作用点が異なること、両者が相乗効果を発揮することがわかる。
先に述べたように、EPO不応答性とは、効果が期待される量のEPOを投与しても十分な効果が発現しない状態をいうが、このようなEPO単独で効果が十分でない場合でも、アルギニンを投与することにより、EPOの最大活性を越えた高い効果を得ることができる。また、EPO不応答性以外の患者でも、EPO必要投与量が多い場合には、アルギニンを併用することでEPO効果を増強し、その結果EPO投与量を低減することができる。すなわち、「EPO効果増強剤」あるいは「EPO投与量減量剤」として利用できる。【００３５】
EPOとEPOミミックペプチドの作用点は、共通のEPO受容体であることから、以上述べたEPOとアルギニンとの関係は、EPOミミックペプチドでも全く同じといえる。すなわち、「EPOミミックペプチド効果増強剤」あるいは「EPOミミックペプチド投与量減量剤」として利用できる。
生体内ではEPOは腎臓で産生されているが、腎性貧血症などの疾患に伴い、赤血球造血に必要なEPOが不足した場合、医薬品としてのEPOが投与されている。しかし、腎性貧血症であっても、腎臓がEPOを産生できなくなったわけではなく、腎臓EPO産生促進剤を用いてEPO産生を増加させれば、EPO投与と同じ治療効果が期待できる。本件発明のアルギニンは、EPOが医薬品として投与されたEPOであっても、腎臓から産生促進された内因性EPOであっても同等であるので、前述したＦＧ２２１６などのEPO産生促進剤との併用も可能である。その場合、図１で示される効果が期待され、単独投与よりも効果を増強すること、あるいは投与量を軽減することが可能となる。すなわち、「EPO産生促進剤効果増強剤」あるいは「EPO産生促進剤投与量減量剤」として利用できる。【００３６】
〔実施例２〕アルギニンのCFU-E増加作用（EPOミミックペプチド）
EPOミミックペプチドの代表例として引用文献（Science Vol.273, 458-463, 1996の表１他）に記載されているEMP1（GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG-NH2, C6-C15ジスルフィド結合）を、引用文献（Biochemistry Vol.37(11), 3699-3710の3700-3701頁）に記載されている方法を用いて調製した。
BDF-1マウス雌10週齢（日本チャールズリバー株式会社）を頚椎脱臼法で致死後、大腿骨から骨髄細胞を単離し、10％FCS（JRHバイオサイエンス）を含有するIMDM培地（インビトロジェン株式会社）に懸濁した。骨髄細胞を１５００rpｍ、４℃、１０分間遠心し、沈殿した骨髄細胞をアミノ酸を含有しないIMDM培地に置換し、細胞数を測定した。直径３．５ｃｍのディッシュ（ナルジェヌンクインターナショナル）に、骨髄細胞を懸濁したアルギニン濃度１７０μMのメチルセルロース半固形培地｛３０μMのEMP1、１００μMの２−メルカプトエタノール（和光純薬工業株式会社）、２４％FCS（JRHバイオサイエンス）、０．８％メチルセルロース（ステムセルテクノロジー社  メチルセルロース含有IMDM溶液M3134）、２％BSA（シグマアルドリッチジャパン株式会社）、骨髄細胞２．２×１０5個/ml｝を１ｍｌ加えた。（２４％FCSを含有するアミノ酸組成が１／３濃度のIMDM培地と同等。）上記の組成に加え、３０μMのEMP1存在下でアルギニンを最終濃度７７０μMとなるように追添加したものを調製し、３７℃、５％CO2条件で４８時間培養後、倒立顕微鏡を用いて、CFU-Eコロニー数を測定した。各条件についてN=4で行った。統計学的検定はUnpaired t-testで行った。
CFU-Eコロニーアッセイの結果より、最大作用濃度のEMP1存在下においてアルギニンが増加効果を示すことが明らかとなった。
EPOミミックペプチドが十分量存在する条件でアルギニンがCFU-E数を増加したことから、EPOミミックペプチド効果増強作用およびEPOミミックペプチド投与量減量効果が期待できる。３０μMのEPOミミックペプチドが十分量であることは、図2（A）と同一条件で実施した図2（B）の結果で示したとおり、１０μM以上で最大作用量であることから明らかである。【００３７】
〔実施例３〕アルギニンによる腎不全ラット単離骨髄細胞の、アクチビン、SCF、IGF-1産生促進作用
腎不全ラット（5/6部分腎臓摘出ラット）の作製は以下のように行った。Wistarラット雄8週齢（日本チャールズリバー株式会社）を、ネンブタール麻酔下で、右側腎臓全摘出、左側腎臓皮質2/3部分摘出し、縫合した。手術後、通常飼育条件下で飼育（CRF-１食  日本チャールズリバー株式会社）し、手術後６週目に、ジエチルエーテルにより腎不全ラットを致死後、両足大腿骨を摘出、骨髄細胞を単離した。単離した骨髄細胞を１０％ＦＣＳ含有血中アミノ酸濃度ＩＭＤＭ培地に懸濁した。血中アミノ酸濃度IMDM培地は、IMDM培地のアミノ酸組成のみを表１に示す組成にしたものを調製し、使用した。
２×１０6個/ｍｌに調製した骨髄細胞溶液１０ｍｌを、直径１０ｃｍディッシュ（ナルジェヌンク社）で、３7℃、５％CO2条件で２４時間培養した。培養２４時間後、アルギニンＨＣｌを添加し、２時間後にディッシュ内の骨髄細胞を回収し、Total  RNAの精製、ｃDNA合成に用いた。【００３８】
表−１
2006115274.tif 000007
【００３９】
TotalRNA調製およびｃDNA合成は以下の方法で行った。大腿骨1本あたりの骨髄細胞を、Isogen (株式会社日本ジーン)１．５mlに懸濁し、ホモジェナイズ（バイオ１０１FastPrep）した。ホモジェネートのうち1mlを用い、Isogenに記載の方法に従って、Total RNAを精製した。Total RNA の品質をバイオアナライザー（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）により確認した。Total RNA5μgをテンプレートとし、オリゴDT２０merプライマー（インビトロジェン社）、SuperScriptIII（インビトロジェン社）を用いてｃDNA合成を行った。ｃDNA合成法はSuperScriptIIIに記載の方法に従った。【００４０】
造血因子ｍＲＮＡの定量は以下の定量ＰＣＲ法で行った。ＮＣＢＩに登録されているアクチビン（rat Inhibin betaA）、 SCF、 IGF-1、配列（各々順にGenBank accession M37482、NM021843、NM178886 ）を元に、定量ＰＣＲ法に用いるオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。アクチビン遺伝子には表２の配列番号１及び２に記載のプライマーを、ＳＣＦには表２の配列番号３及び４に記載のプライマーを、IGF-1には表２の配列番号５及び６に記載のプライマーを使用した。定量ＰＣＲ法はSybrGreenPCR  kit (TOYOBO株式会社)記載の方法に従った。すなわち、ｃDNA溶液１μlをテンプレートとし、500nＭの上記プライマー、SybrGreenPCR  kitを用いて、ＡＢＩ７７００（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）でＰＣＲ反応（９４℃で１分の後、９４℃で３０秒、６０℃で１分を４０回）、および増幅産物の検出を行い、mRNAの相対濃度を算出した。定量ＰＣＲ後、増幅産物の有無及び大きさを、アガロース電気泳動法により確認した。【００４１】
表２
配列番号  オリゴヌクレオチドプライマー
１       gaaaacgggtatgtggaga
２       tgaaacagacggatggtga
３       tggtggacgctcttcagtt
４       catctccagcctcctcaga
５       ctacaatggacagcaat
６       gaaactctctctctttctgttgc      【００４２】
腎不全ラットから骨髄細胞を単離し、アルギニンを添加２時間後の骨髄細胞を回収し、アクチビン、SCF、IGF-1ｍRNAを定量PCR法により定量した結果を図３に示す。データは平均値±SEMで示した。縦軸は、Total  RNAあたりの相対mRNA量である。
Pre：アルギニン添加前  アルギニン濃度１００μM
Ctrl：アルギニン非添加２時間 アルギニン濃度１００μM
A400μM：アルギニン添加２時間 アルギニン濃度４００μM
A600μM：アルギニン添加２時間 アルギニン濃度６００μM
この結果から、アルギニンが、骨髄細胞に直接作用し、アクチビン、ＳＣＦ、ＩＧＦ−１の産生を促進することが明らかとなった。【００４３】
〔実施例４〕アクチビン、ＳＣＦ、ＩＧＦ−１阻害剤によるアルギニンのCFU-E増加作用阻害
実施例１に記載の方法に従って、BDF-1マウス雌10週齢（日本チャールズリバー社）インビトロマウスCFU-Eコロニーアッセイ法を行った。アルギニンHCｌ１７０μM存在下に、最終濃度６００μMのアルギニンHCｌを追添加し、さらに、フォリスタチン（FSN  抗アクチビン  R&D社  １００ng/ml）、抗SCF抗体（ぺプロテック社  1μg/ml）、抗IGF-1抗体（ぺプロテック社  ２μg/ml）を添加した。３7℃、５％CO2条件で２８時間培養後、倒立顕微鏡を用いて、CFU-Eコロニー数を測定した。各条件についてN=4で行った。統計学的検定はUnpaired t-testで行った。＊  P<０．０５、＊＊  P<０．００５。データは平均値±SEMで示した。
CFU-Eコロニーアッセイの結果を図４に示す。縦軸は２．２×１０5個の骨髄細胞あたりのCFU-Eコロニー数である。
図４からアルギニンのCFU-E増加作用は、フォリスタチン、抗SCF抗体、抗IGF-1抗体によって阻害されることがわかる。以上から、アルギニンは骨髄細胞に作用し、造血因子のアクチビン、SCF、IGF-1の産生促進を介して、CFU-Eを増加させることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】アルギニンのCFU-E増加作用を示す。図１（A）は最大作用濃度である１U/mlのEPO存在下におけるアルギニンのCFU-E増加作用を示す。図１（B）は、EPOの濃度存在性において０．５U/ml以上でEPOが最大作用量であることを示す。
【図２】EPOミミックペプチド存在下のアルギニンのCFU-E増加作用を示す。図２（A）は最大作用濃度である３０μMのEPOミミックペプチド存在下におけるアルギニンのCFU-E増加作用を示す。図２（B）は、EPOミミックペプチドの濃度存在性において１０μM以上でEPOミミックペプチドが最大作用量であることを示す。
【図３】アルギニンによる腎不全ラット単離骨髄細胞の、アクチビン、SCF、IGF-1産生促進作用を示す。
【図４】造血因子阻害剤によるアルギニンのCFU-E増加作用阻害を示す。
【図１】
2006115274.tif 000008
【図２】
2006115274.tif 000009
【図３】
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【図４】
2006115274.tif 000011
【配列表】
2006115274000001.app
【国際調査報告】
2006115274.tif 000012
2006115274.tif 000013
2006115274.tif 000014
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