(57)【要約】  本発明は、シグナル性プローブに適したハイブリダイズ方法を提供する。このため、本発明では、アレイであって、基板と、該基板に固定され、被験試料とハイブリダイズすることによりシグナル変化を生じる核酸プローブと、前記被験試料を含み前記被験試料と前記核酸プローブとのハイブリダイズ反応のための液体を充填可能な１又は２以上の空間と、を備える、アレイを提供する。こうした形態でのハイブリダイゼーションがシグナル性プローブを用いたハイブリダイゼーションの再現性や効率の向上に有効である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アレイであって、
基板と、
該基板に固定され、被験試料とハイブリダイズすることによりシグナル変化を生じる核酸プローブと、
前記被験試料を含み前記被験試料と前記核酸プローブとのハイブリダイズ反応のための液体を充填可能な１又は２以上の空間と、
を備える、アレイ。
【請求項２】
前記空間は、前記基板に形成され前記核酸プローブの固定領域を含む凹部内に備えられる、請求項１に記載のアレイ。
【請求項３】
カバー部材を備えている、請求項１に記載のアレイ。
【請求項４】
前記空間は、前記核酸プローブの固定領域に対して所定高さを持って覆うカバー部材の中空部内に備えられる、請求項１又は２に記載のアレイ。
【請求項５】
前記カバー部材は、前記アレイを収納可能な容器の一部を構成する、請求項４に記載のアレイ。
【請求項６】
前記カバー部材は、前記基板に対して脱着可能に備えられる、請求項３〜５のいずれかに記載のアレイ。
【請求項７】
前記カバー部材は、前記アレイに対して接着剤又は粘着剤によって固定される、請求項３〜６のいずれかに記載のアレイ。
【請求項８】
前記カバー部材は前記核酸プローブと前記被験試料とのハイブリダイズにより発生するシグナル変化を検出可能な透過性を備えている、請求項３〜７のいずれかに記載のアレイ。
【請求項９】
前記カバー部材には、前記ハイブリダイズ反応のための液体を前記空間に充填するための注入口を備える、請求項３〜８のいずれかに記載のアレイ。
【請求項１０】
前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域の厚みは３００μｍ以上である、請求項３〜９のいずれかに記載のアレイ。
【請求項１１】
前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域を形成する材料は、ガラス、ポリカーボネート、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリイミド、アクリル樹脂ならびにこれらのフッ化物およびポリハロゲン化ビニルからなる群から選択される１種あるいは２種以上からなる、請求項３〜１０のいずれかに記載の装置。
【請求項１２】
前記空間の内部に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域を有している、請求項１〜１１のいずれかに記載のアレイ。
【請求項１３】
前記カバー部材の少なくとも一部に疎水性領域を有している、請求項３〜１２のいずれかに記載のアレイ。
【請求項１４】
前記疎水性領域は、前記核酸プローブの固定領域に対向する領域に備えられる、請求項１２又は１３に記載のアレイ。
【請求項１５】
前記疎水性領域は、水の接触角が３０°以上である、請求項１２〜１４のいずれかに記載のアレイ。
【請求項１６】
前記空間の高さ（前記固定領域とこれに対向する対向領域との距離）の変動係数が５０％以下及び／又は前記空間の高さの平均値が１５μｍ以上である、請求項１〜１５のいずれかに記載のアレイ。
【請求項１７】
前記核酸プローブは、ハイブリダイズにより、蛍光波長のシフト、蛍光強度の増大及び蛍光強度の減少のいずれかあるいは組み合わせからなる蛍光シグナルが変化するプローブである、請求項１〜１６のいずれかに記載のアレイ。
【請求項１８】
前記核酸プローブは、塩基識別型蛍光性核酸塩基を含む、請求項１７に記載のアレイ。
【請求項１９】
前記被験試料は標識されていない核酸である、請求項１〜１８いずれかに記載のアレイ。
【請求項２０】
前記核酸プローブは２０ｍｅｒ以上１００ｍｅｒ以下であり、前記シグナルの検出精度がＣＶ１０％以下、好ましくは５％以下である、請求項１〜１９いずれかに記載のアレイ。
【請求項２１】
体質（１塩基多型など）診断用、疾患遺伝子（遺伝子キメラなどの各種遺伝子変異）診断用、治療予後診断用、薬剤反応性診断用及び薬剤耐性診断用のいずれかあるいは２種以上の用途を有する、請求項１〜２０記載のアレイ。
【請求項２２】
核酸のハイブリダイズ方法であって、
請求項１〜２１いずれかに記載のアレイの前記空間に被験試料を含む液体を充填してハイブリダイズを実施するハイブリダイズ工程を備える、方法。
【請求項２３】
前記ハイブリダイズ工程は、前記アレイを静置して又は一時的若しくは間欠的若しくは連続的に前記空間内の液体を強制攪拌してハイブリダイズを実施する工程である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
標識されていない核酸を被験試料とする、請求項２２又は２３記載の方法。
【請求項２５】
前記ハイブリダイズ工程後、前記核酸プローブに基づくシグナル変化を検出する検出工程を備える、請求項２２〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記検出工程は、前記ハイブリダイズ工程後の前記被験試料を含む液体が前記空間に充填されたままの状態で前記シグナル変化を検出する工程である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記検出工程は、前記ハイブリダイズ工程後に洗浄工程を経ることなく実施する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
核酸ハイブリダイズ用のプローブ保持体であって、
固相担体と、
該固相担体に識別可能に固定され、被験試料とハイブリダイズすることによりシグナル変化を生じるプローブと、
を備える、プローブ保持体。
【請求項２９】
前記固相担体は、平板状あるいは粒子状である、請求項２８に記載のプローブ保持体。
【請求項３０】
前記固相担体は、液体透過性又は多孔質である、請求項２８又は２９に記載のプローブ保持体。
【請求項３１】
前記固相担体に対して単一の種類のプローブが固定され、前記固相担体は色、蛍光、記号、数字、文字及び柄等から選択されるプローブ識別情報を有している、請求項２８〜３０のいずれかに記載のプローブ保持体。
【請求項３２】
前記プローブは、ハイブリダイズにより、蛍光波長のシフト、蛍光強度の増大及び蛍光強度の減少のいずれかあるいは組み合わせからなる蛍光シグナルが変化するプローブである、請求項２８〜３１のいずれかに記載のプローブ保持体。
【請求項３３】
前記プローブは、塩基識別型蛍光性核酸塩基を含む、請求項３２に記載のプローブ保持体。
【請求項３４】
前記被験試料は標識されていない核酸である、請求項２８〜３３のいずれかに記載のプローブ保持体。
【請求項３５】
前記被験試料を含む液体に浸漬又は懸濁された状態で使用するための、請求項２８〜３４のいずれかに記載のプローブ保持体。
【請求項３６】
核酸のハイブリダイズ方法であって、
請求項２８〜３５のいずれかに記載のプローブ保持体を含む空間に被験試料を含有する液体を充填してハイブリダイズを実施するハイブリダイズ工程を備える、方法。
【請求項３７】
前記ハイブリダイズ工程後、前記被験試料を含む液体の存在下で前記シグナル変化を検出する工程である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
核酸ハイブリダイズ用のプローブであって、
以下の（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）被験試料について検出しようとする塩基配列上の特徴を検出可能な領域
（ｂ）前記（ａ）領域における塩基配列上の特徴の近傍に存在する被験試料について定常的な塩基配列（（１）変異が未だ検出されていない領域、（２）変異がないか若しくは高い確率で存在しないことが推測される領域、（３）変異がないか若しくは高い確率で存在しないことが確認された領域などが挙げられる。）を検出可能な領域
を備えており、
前記（ａ）の領域及び前記（ｂ）の領域におけるハイブリダイズによりそれぞれ異なるシグナル変化を生じる、プローブ。
【請求項３９】
前記（ａ）の領域及び前記（ｂ）の領域におけるハイブリダイズによって生じる前記シグナル変化は、蛍光波長のシフト、蛍光強度の増大及び蛍光強度の減少のいずれかあるいは組み合わせからなる蛍光シグナルが変化するプローブである、請求項３８に記載のプローブ。
【請求項４０】
前記プローブは、塩基識別型蛍光性核酸塩基を含む、請求項３８又は３９に記載のプローブ。
【請求項４１】
前記被験試料は標識されていない核酸である、請求項３８〜４０のいずれかに記載のプローブ。
【請求項４２】
核酸ハイブリダイズ用のプローブ保持体であって、
固相担体と、
請求項３８〜４１のいずれかに記載のプローブと、
を備える、プローブ保持体。
【請求項４３】
前記固相担体は、平板状あるいは粒子状である、請求項４２に記載のプローブ保持体。
【請求項４４】
前記固相担体は、液体透過性又は多孔質である、請求項４２又は４３に記載のプローブ保持体。
【請求項４５】
前記固相担体に対して単一の種類のプローブが固定され、前記固相担体は色、蛍光、記号、数字、文字及び柄等から選択されるプローブ識別情報を有している、請求項４２〜４４のいずれかに記載のプローブ保持体。
【請求項４６】
前記被験試料を含む液体に浸漬又は懸濁された状態で使用するための、請求項４２〜４５のいずれかに記載のプローブ保持体。
【請求項４７】
前記プローブは２０ｍｅｒ以上１００ｍｅｒ以下である、請求項４２〜４６のいずれかに記載のプローブ保持体。
【請求項４８】
前記シグナルの検出精度がＣＶ１０％以下である、請求項４２〜４７のいずれかに記載のプローブ保持体。
【請求項４９】
体質（１塩基多型など）診断用、疾患遺伝子（遺伝子キメラなどの各種遺伝子変異）診断用、治療予後診断用、薬剤反応性診断用及び薬剤耐性診断用のいずれかあるいは２種以上の用途を有する、請求項４２〜４８のいずれかに記載のプローブ保持体。
【請求項５０】
核酸ハイブリダイズ装置であって、
請求項４２〜４９のいずれかに記載のプローブ保持体と、
前記プローブ保持体における前記プローブとのハイブリダイズ反応のための液体を充填可能な１又は２以上の空間と、
を備える、核酸ハイブリダイズ装置。
【請求項５１】
前記空間の内部に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域を有する、請求項５０に記載の核酸ハイブリダイズ装置。
【請求項５２】
前記疎水性領域は、水の接触角が３０°以上である、請求項５１に記載の核酸ハイブリダイズ装置。
【請求項５３】
前記疎水性領域は、ガラス、ポリカーボネート、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリイミド、アクリル樹脂ならびにこれらのフッ化物およびポリハロゲン化ビニルからなる群から選択される１種あるいは２種以上で構成される、請求項５１又は５２に記載の核酸ハイブリダイズ装置。
【請求項５４】
前記空間の開口を覆うカバー部材を備えている、請求項５１〜５３のいずれかに記載の核酸ハイブリダイズ装置。
【請求項５５】
前記固相担体は基板であり、前記カバー部材を、前記基板に対して脱着可能に備える、請求項５４に記載の核酸ハイブリダイズ装置。
【請求項５６】
前記カバー部材は前記プローブと前記被験試料とのハイブリダイズにより発生するシグナル変化を検出可能な透過性を備える、請求項５４又は５５に記載の核酸ハイブリダイズ装置。
【請求項５７】
前記カバー部材の前記プローブの固定領域に対向する領域の厚みは３００μｍ以上である、５４〜５６のいずれかに記載の核酸ハイブリダイズ装置。
【請求項５８】
前記カバー部材の少なくとも一部に疎水性領域を有する、請求項５４〜５７のいずれかに記載の核酸ハイブリダイズ装置。
【請求項５９】
前記疎水性領域は、プローブが固定化された基板上の領域に対向する領域に備えられる、請求項５８に記載の核酸ハイブリダイズ装置。
【請求項６０】
前記空間の高さ（前記基板上のプローブ固定領域とこれに対向する対向領域との距離）の変動係数が５０％以下及び／又は前記空間の高さの平均値が１５μｍ以上である、請求項５４〜５９のいずれかに記載の核酸ハイブリダイズ装置。
【請求項６１】
核酸のハイブリダイズ方法であって、
請求項４２〜４９のいずれかに記載のプローブ保持体を含む空間に被験試料を含有する液体を充填してハイブリダイズを実施するハイブリダイズ工程を備える、方法。
【請求項６２】
前記ハイブリダイズ工程は、前記ハイブリダイズ装置を静置して又は一時的若しくは間欠的若しくは連続的に前記空間内の液体を強制攪拌してハイブリダイズを実施する工程である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ハイブリダイズ工程後、前記プローブに基づくシグナル変化を検出する検出工程を備える、請求項６１又は６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記検出工程は、前記ハイブリダイズ工程後の前記被験試料を含む液体の存在下で前記シグナル変化を検出する工程である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記検出工程は、前記ハイブリダイズ工程後に洗浄工程を経ることなく実施する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
核酸ハイブリダイズ用のプローブであって、
被験個体又は被験個体を含む群（家系、民族、人種等）において、定常的な塩基配列（（１）変異が未だ検出されていない領域、（２）変異がないか若しくは高い確率で存在しないことが推測される領域、（３）変異がないか若しくは高い確率で存在しないことが確認された領域などが挙げられる。）を検出可能な領域を備えており、
当該領域におけるハイブリダイズによりシグナル変化を生じる、プローブ。
【請求項６７】
前記定常的塩基配列を検出可能な領域におけるハイブリダイズによって生じる前記シグナル変化は、蛍光波長のシフト、蛍光強度の増大及び蛍光強度の減少のいずれかあるいは組み合わせからなる蛍光シグナルが変化するプローブである、請求項６６に記載のプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定塩基とのハイブリダイズをシグナル変化として検出できるプローブを保持するアレイ、改良されたプローブ及びこれらの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｃＤＮＡプローブやオリゴヌクレオチドプローブはガラス基板の表面に固定化されたＤＮＡマイクロアレイなどの形態でヒトなどの遺伝子解析に用いられている。例えばヒトを対象とする遺伝子解析では、遺伝子多型、遺伝子変異、遺伝子発現量等などの各種の遺伝子に関連したシグナルを検出して遺伝子診断することを目的としている。【０００３】
遺伝子関連シグナルを検出するには、いずれもプローブとサンプルＤＮＡ等の間のハイブリダイゼーションを用いている。すなわち、通常、予め蛍光物質等により標識してサンプルＤＮＡを固相担体に固定化したプローブに供給し、ハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイズしなかったサンプルＤＮＡを洗浄除去し、その後、プローブとハイブリダイズしたサンプルＤＮＡの標識物質に基づく標識量（通常は蛍光強度）を検出することにより多型等の遺伝子関連シグナルを検出している。したがって、最終的に得られる標識量の変動要因は、標識ステップ、ハイブリダイゼーションステップ及び洗浄ステップに存在しうるといえる。【０００４】
例えば、プローブに対して供給される標識されたサンプルＤＮＡ量は必ずしも一定ではないため、ハイブリダイズ産物の標識量は大きく変動してしまう。また、ハイブリダイゼーションは多種多様な要因に影響されるため、再現性よく実施することは困難であるとともに、プローブとサンプルＤＮＡ間のミスハイブリダイゼーションが生じ得ることから、ハイブリダイゼーションステップは標識量変動の要因となりうる。さらに、洗浄が不十分であれば、標識されたサンプルＤＮＡが残留するため、ノイズや標識量の変動要因となっている。このため、従来、遺伝子解析には、通常、コントロールなどを用いたシグナル補正がなされるほかミスハイブリダイゼーションの影響を回避するためのプローブデザインや配置並びに解析処理も行われている。さらに、ハイブリダイゼーションステップの安定化のための種々の試みもなされている。【０００５】
一方、特開２００４−３５７５７０号公報に記載されるインターカレーターによる電気化学的手法や特開２００４−１６８６７２号、特開２００４−１６６５２２号等に記載の特定塩基とハイブリダイズすると蛍光を発する塩基識別型蛍光性核酸塩基（ＢＤＦ）の開発が試みられている。塩基識別型蛍光性核酸塩基を用いたプローブは、検出しようとする配列中の特定塩基との対合により特異的なシグナル変化を自ら発することができる。
【発明の開示】
【０００６】
特定塩基とのハイブリダイズによりシグナルが変化するシグナル性プローブによれば、サンプルＤＮＡの標識操作が不要となるため標識ステップに由来する誤差や特異性の向上からミスハイブリダイゼーションによる誤差を回避又は抑制できることが期待される。また、従来、ミスハイブリダイゼーションによる測定誤差を低減させるための多種類のプローブが必要であったが、こうしたプローブの作製や配置も不要となることが期待される。しかしながら、シグナル性プローブを用いることによる各種のメリットを享受するには、より安定的でかつ高いハイブリダイゼーション効率を確保することが求められる。また、アレイに供されるサンプル量が測定毎にまた遺伝子毎に変動することによるシグナル補正の手法もより確実なものにすることが必要である。
【０００７】
そこで、本発明は、この種のシグナル性プローブを用いた遺伝子解析に適した技術を提供することを目的とする。具体的には、この種のシグナル性プローブに適したハイブリダイズ方法を提供することを一つの目的とする。また、本発明は、改良されたシグナル性プローブ、該プローブを固定化した固相担体を提供することを他の一つの目的とする。
【０００８】
本発明者らは、上記した課題を解決するために検討したところ、特定形態でのハイブリダイゼーションがシグナル性プローブを用いたハイブリダイゼーションの再現性や効率の向上に有効であることを見出した。また、本発明者らは、シグナル補正を同時に可能とする新たなデザインのシグナル性プローブを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて本発明を完成した。すなわち、本発明によれば以下の手段が提供される。
【０００９】
本発明によれば、アレイであって、基板と、該基板に固定され、被験試料とハイブリダイズすることによりシグナル変化を生じる核酸プローブと、前記被験試料を含み前記被験試料と前記核酸プローブとのハイブリダイズ反応のための液体を充填可能な１又は２以上の空間と、を備える、アレイが提供される。
【００１０】
前記アレイはカバー部材を備えていることが好ましく、前記空間は、前記基板に形成され前記核酸プローブの固定領域を含む凹部内に備えられることが好ましく、より好ましくは、凹部の底部が核酸プローブの固定領域である。さらに、前記空間は、前記核酸プローブの固定領域に対して所定高さを持って覆うカバー部材の中空部内に備えられることが好ましく、より好ましくは、カバー部材の中空部と前記固定領域とによって規定される空間として備えられる。前記カバー部材は、前記アレイを収納可能な容器の一部を構成していてもよい。さらに、前記カバー部材は、前記基板に対して脱着可能に備えられることが好ましい。さらにまた、前記カバー部材は、前記アレイに対して接着剤又は粘着剤によって固定されていてもよく、前記カバー部材は前記核酸プローブと前記被験試料とのハイブリダイズにより発生するシグナル変化を検出可能な透過性を備えていることが好ましい。また、前記カバー部材には、前記ハイブリダイズ反応のための液体を前記空間に充填するための注入口を備えることもできる。さらに、前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域の厚みは３００μｍ以上とすることができる。さらにまた、前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域を形成する材料は、ガラス、ポリカーボネート、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリイミド、アクリル樹脂ならびにこれらのフッ化物およびポリハロゲン化ビニルからなる群から選択される１種あるいは２種以上を含んでいてもよい。
【００１１】
また、前記空間の内部に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域を有していることができる。前記カバー部材の少なくとも一部に疎水性領域を有していてもよく、前記疎水性領域は、前記核酸プローブの固定領域に対向する領域に備えられていてもよい。また、前記疎水性領域は、水の接触角が３０°以上、好ましくは６０°以上である、より好ましくは７０°以上である。
【００１２】
さらに、前記空間の高さ（前記固定領域とこれに対向する対向領域との距離）の変動係数が５０％以下及び／又は前記空間の高さの平均値が１５μｍ以上であることが好ましい。
【００１３】
また、前記核酸プローブは、ハイブリダイズにより、蛍光波長のシフト、蛍光強度の増大及び蛍光強度の減少のいずれかあるいは組み合わせからなる蛍光シグナルが変化するプローブとすることができ、好ましくは、前記核酸プローブは、塩基識別型蛍光性核酸塩基を含んでいる。また、被験試料は標識されていない核酸であることが好ましい。前記核酸プローブは２０ｍｅｒ以上１００ｍｅｒ以下であり、前記シグナルの検出精度がＣＶ１０％以下、好ましくは５％以下であることが好ましい。
【００１４】
本発明のアレイは、体質（１塩基多型など）診断用、疾患遺伝子（遺伝子キメラなどの各種遺伝子変異）診断用、治療予後診断用、薬剤反応性診断用及び薬剤耐性診断用のいずれかあるいは２種以上の用途を有することができる。
【００１５】
本発明によれば、核酸のハイブリダイズ方法であって、上記いずれかに記載のアレイの前記空間に被験試料を含む液体を充填してハイブリダイズを実施するハイブリダイズ工程を備える、方法が提供される。
【００１６】
前記ハイブリダイズ工程は、前記アレイを静置して又は一時的若しくは間欠的若しくは連続的に前記空間内の液体を強制攪拌してハイブリダイズを実施する工程とすることができる。また、標識されていない核酸を被験試料とすることが好ましい。
【００１７】
本ハイブリダイズ方法は、前記ハイブリダイズ工程後、前記核酸プローブに基づくシグナル変化を検出する検出工程を備えることができ、検出工程は、前記ハイブリダイズ工程後の前記被験試料を含む液体が前記空間に充填されたままの状態で前記シグナル変化を検出する工程とすることができ、検出工程は、前記ハイブリダイズ工程後に洗浄工程を経ることなく実施することもできる。
【００１８】
本発明によれば、核酸ハイブリダイズ用のプローブ保持体であって、固相担体と、該固相担体に識別可能に固定され、被験試料とハイブリダイズすることによりシグナル変化を生じるプローブと、を備える、プローブ保持体が提供される。
【００１９】
前記固相担体は、平板状あるいは粒子状とすることができ、前記固相担体は、液体透過性又は多孔質とすることもできる。さらに、例えば、粒子状等の前記固相担体に対して単一の種類のプローブが固定され、前記固相担体は色、蛍光、記号、数字、文字及び柄等から選択されるプローブ識別情報を有するようにしてもよい。
【００２０】
また、前記プローブは、ハイブリダイズにより、蛍光波長のシフト、蛍光強度の増大及び蛍光強度の減少のいずれかあるいは組み合わせからなる蛍光シグナルが変化するプローブとすることができ、好ましくは、塩基識別型蛍光性核酸塩基を含んでいる。さらに、前記被験試料は標識されていない核酸であってもよい。さらにまた、本発明のプローブ保持体は、前記被験試料を含む液体に浸漬又は懸濁された状態で使用するためのものであってもよい。
【００２１】
本発明によれば、核酸のハイブリダイズ方法であって、上記プローブ保持体を含む空間に被験試料を含有する液体を充填してハイブリダイズを実施するハイブリダイズ工程を備える方法が提供される。
【００２２】
このハイブリダイズ方法は、被験試料を含む液体の存在下で前記シグナル変化を検出する工程を有することができる。
【００２３】
本発明によれば、核酸ハイブリダイズ用のプローブであって、
以下の（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）被験試料について検出しようとする塩基配列上の特徴を検出可能な領域
（ｂ）前記（ａ）領域における塩基配列上の特徴の近傍に存在する被験試料について定常的な塩基配列（（１）変異が未だ検出されていない領域、（２）変異がないか若しくは高い確率で存在しないことが推測される領域、（３）変異がないか若しくは高い確率で存在しないことが確認された領域などが挙げられる。）を検出可能な領域
を備えており、
前記（ａ）の領域及び前記（ｂ）の領域におけるハイブリダイズによりそれぞれ異なるシグナル変化を生じる、プローブが提供される。
【００２４】
前記（ａ）の領域及び前記（ｂ）の領域におけるハイブリダイズによって生じる前記シグナル変化は、蛍光波長のシフト、蛍光強度の増大及び蛍光強度の減少のいずれかあるいは組み合わせからなる蛍光シグナルが変化するプローブであることが好ましく、より好ましくは前記プローブは、塩基識別型蛍光性核酸塩基を含んでいる。また、使用する被験試料は標識されていない核酸であることが好ましい。
【００２５】
本発明によれば、核酸ハイブリダイズ用のプローブ保持体であって、固相担体と、上記記載のいずれかのプローブと、を備える、プローブ保持体が提供される。
【００２６】
前記固相担体は、平板状あるいは粒子状とすることができ、また、前記固相担体は、液体透過性又は多孔質とすることもできる。さらに、例えば粒子状等の前記固相担体に対して単一の種類のプローブが固定され、前記固相担体は色、蛍光、記号、数字、文字及び柄等から選択されるプローブ識別情報を有していてもよい。さらにまた、前記プローブ保持体は、前記被験試料を含む液体に浸漬又は懸濁された状態で使用するためのものであってもよい。
【００２７】
前記プローブは２０ｍｅｒ以上１００ｍｅｒ以下とすることができるし、また、前記シグナルの検出精度がＣＶ１０％以下、好ましくは５％以下とすることができる。
【００２８】
本プローブ保持体は、体質（１塩基多型など）診断用、疾患遺伝子（遺伝子キメラなどの各種遺伝子変異）診断用、治療予後診断用、薬剤反応性診断用及び薬剤耐性診断用のいずれかあるいは２種以上の用途を有することができる。
【００２９】
本発明によれば、核酸ハイブリダイズ装置であって、前記（ａ）領域及び前記（ｂ）領域を備えるプローブを備える上記いずれかに記載のプローブ保持体と、前記プローブ保持体における前記プローブとのハイブリダイズ反応のための液体を充填可能な１又は２以上の空間と、を備える、核酸ハイブリダイズ装置が提供される。
【００３０】
前記空間の内部に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域を有することができ、前記疎水性領域は、水の接触角が３０°以上、好ましくは６０°以上である、より好ましくは７０°以上とすることができる。また、前記疎水性領域は、ガラス、ポリカーボネート、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリイミド、アクリル樹脂ならびにこれらのフッ化物およびポリハロゲン化ビニルからなる群から選択される１種あるいは２種以上で構成されることが好ましい。また、本ハイブリダイズ装置は、前記空間の開口を覆うカバー部材を備えていることが好ましい。また、前記固相担体は基板であり、前記カバー部材を、前記基板に対して脱着可能に備えることが好ましい。また、前記カバー部材は前記プローブと前記被験試料とのハイブリダイズにより発生するシグナル変化を検出可能な透過性を備えることが好ましく、また、前記カバー部材の前記プローブの固定領域に対向する領域の厚みは３００μｍ以上であることも好ましい。
【００３１】
さらに、前記カバー部材の少なくとも一部に疎水性領域を有することができ、前記疎水性領域は、プローブが固定化された基板上の領域に対向する領域に備えられることが好ましい。また、前記空間の高さ（前記基板上のプローブ固定領域とこれに対向する対向領域との距離）の変動係数が５０％以下及び／又は前記空間の高さの平均値が１５μｍ以上であることも好ましい。
【００３２】
本発明によれば、核酸のハイブリダイズ方法であって、前記（ａ）領域及び前記（ｂ）領域を備えるプローブを備える上記いずれかに記載のプローブ保持体を含む空間に被験試料を含有する液体を充填してハイブリダイズを実施するハイブリダイズ工程を備える、方法が提供される。
【００３３】
前記ハイブリダイズ工程は、前記ハイブリダイズ装置を静置して又は一時的若しくは間欠的若しくは連続的に前記空間内の液体を強制攪拌してハイブリダイズを実施する工程とすることが好ましい。また、前記ハイブリダイズ工程後、前記プローブに基づくシグナル変化を検出する検出工程を備えることができ、前記検出工程は、前記ハイブリダイズ工程後の前記被験試料を含む液体の存在下で前記シグナル変化を検出する工程とすることが好ましく、前記検出工程は、前記ハイブリダイズ工程後に洗浄工程を経ることなく実施してもよい。
【００３４】
本発明によれば、核酸ハイブリダイズ用のプローブであって、
被験個体又は被験個体を含む群（家系、民族、人種等）において、定常的な塩基配列（（１）変異が未だ検出されていない領域、（２）変異がないか若しくは高い確率で存在しないことが推測される領域、（３）変異がないか若しくは高い確率で存在しないことが確認された領域などが挙げられる。）を検出可能な領域を備えており、
当該領域におけるハイブリダイズによりシグナル変化を生じる、プローブが提供される。
【００３５】
前記定常的塩基配列を検出可能な領域におけるハイブリダイズによって生じる前記シグナル変化は、蛍光波長のシフト、蛍光強度の増大及び蛍光強度の減少のいずれかあるいは組み合わせからなる蛍光シグナルが変化するプローブであることが好ましく、より好ましくは、塩基識別型蛍光性核酸塩基を備える。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＡＬＤＨ２遺伝子における多型部位と該多型を検出するのに好ましいプローブの一例を示す図である。
【図２】図１のプローブによる多型の検出を示す図である。
【図３】ハイブリダイズ装置の一例を示す図である。
【図４】図３に示すハイブリダイズ装置の平面図と断面図とを示す図である。
【図５】空間高さを測定するための測定部位を例示する図である。
【図６】実施例４で作製したハイブリダイズ装置を示す図である。
【図７】実施例４で作製したハイブリダイズ装置を用いたハイブリダイゼーションの評価方法及び結果を示す図である。
【図８】塩基識別型蛍光性核酸塩基プローブを用いた場合の同一プローブ間での蛍光シグナルのバラツキを表すグラフ図である。
【図９】従来のプローブを用いた場合の同一プローブ間での蛍光シグナルのバラツキを表すグラフ図である。
【図１０】ハイブリダイズ装置のキャビティの撹拌による効果を表すグラフ図である。
【図１１】変異部位検出用の塩基識別型蛍光性核酸塩基と内部標準用の塩基識別型蛍光性核酸塩基とを備えるプローブを用いた場合のそれぞれの核酸塩基に由来するシグナルの関係を表すグラフ図である。
【図１２】bcr/abl遺伝子のキメラ部分（ブレークポイント）と正常bｃｒ遺伝子のb3とをそれぞれ検出可能に塩基識別型蛍光性核酸塩基を備えるプローブと未標識サンプルとのハイブリダイゼーション結果を示す図である。
【図１３】bcr/abl遺伝子のキメラ部分（ブレークポイント）と正常bcr遺伝子のb3とをそれぞれ検出可能に塩基識別型蛍光性核酸塩基を備えるプローブと標識サンプルとのハイブリダイゼーション結果を示す図である。
【図１４】多孔質粒子状の固相担体に固定化された変異部位検出用の塩基識別型蛍光性核酸塩基を備えるプローブの評価結果を示す図である。
【図１５】は、液体透過性平板状の固相担体に固定化された変異部位検出用の塩基識別型蛍光性核酸塩基を備えるプローブの評価結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本発明のアレイは、基板と、該基板に固定され、被験試料とハイブリダイズすることによりシグナル変化を生じる核酸プローブと、前記被験試料を含み前記被験試料と前記核酸プローブとのハイブリダイズ反応のための液体を充填可能な１又は２以上の空間と、を備えることを特徴としている。このアレイによれば、前記空間内で前記核酸プローブと前記被験試料とをハイブリダイズ反応させることができる。前記空間内のハイブリダイズ反応では、ハイブリダイゼーションが促進され、前記核酸プローブのシグナル変化量を高めることができるとともに、そのバラツキを低減することができる。また、前記核酸プローブはハイブリダイズによりシグナル変化を生じるためミスハイブリダイゼーションによってはシグナル変化を生じない。このためハイブリダイゼーションに由来するシグナル変化量のバラツキを抑制して、検出感度及び精度の高い遺伝子解析が可能となる。また、前記核酸プローブは被験試料とのハイブリダイズによりシグナル変化を生じるため、アレイに供給した被験試料を含む液体が維持された状態でシグナル変化量を検出することができる。本発明のアレイは、前記液体を充填可能な空間を有しているため、この空間に前記液体を容易に維持できる。このため、ハイブリダイゼーション後の状態に何ら変化させることなくそのままシグナルが検出されるため、洗浄等に起因するシグナル変化量のバラツキも回避又は抑制される。核酸プローブの固定領域全体で効率的なハイブリダイズ反応を実現でき、結果的にハイブリダイズ反応の再現性を向上させることができる。【００３８】
また、本発明のプローブ保持体は、核酸ハイブリダイズ用のプローブ保持体であって、固相担体と、該固相担体に識別可能に固定され、被験試料とハイブリダイズすることによりシグナル変化を生じるプローブと、を備えることを特徴としている。このプローブ保持体によれば、被験試料とハイブリダイズすることによりシグナル変化を生じるプローブを備えているため、ミスハイブリダイゼーションによってはシグナル変化を生じない。したがって、厳密なハイブリダイゼーション条件によらないでも安定的に被験試料中の特定配列を検出できる。また、前記核酸プローブは被験試料とのハイブリダイズによりシグナル変化を生じるため、アレイに供給した被験試料を含む液体が維持された状態でシグナル変化量を検出することができる。【００３９】
さらに、本発明のプローブは、核酸ハイブリダイズ用のプローブであって、
以下の（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）被験試料について検出しようとする塩基配列上の特徴を検出可能な領域
（ｂ）前記（ａ）領域における塩基配列上の特徴の近傍に存在する被験試料について定常的な塩基配列（（１）変異が未だ検出されていない領域、（２）変異がないか若しくは高い確率で存在しないことが推測される領域、（３）変異がないか若しくは高い確率で存在しないこと又は確認された領域などが挙げられる。）を検出可能な領域
を備えており、
前記（ａ）の領域及び前記（ｂ）の領域におけるハイブリダイズによりそれぞれ異なるシグナル変化を生じることを特徴としている。【００４０】
本発明のプローブによれば、被験試料の前記（ａ）領域におけるハイブリダイズによるシグナル変化と同時に前記（ｂ）領域におけるハイブリダイズによるシグナル変化を生じるため、前記（ｂ）領域において得られるシグナル変化をシグナル補正のために用いることができる。同一プローブにおいてこれら２種のシグナル変化を生じるため、余分なプローブ等シグナル補正のためのコントロールを要しない。また、このプローブによれば、多型、変異、キメラを相対的にも絶対的にも定量することが容易となる。【００４１】
以下、本発明を実施するための最良の形態について、ハイブリダイズ方法、プローブ保持体、プローブ等について図面を適宜参照しながら説明する【００４２】
（ハイブリダイズによりシグナル変化を生じる核酸プローブ）
本発明における核酸プローブは、ハイブリダイズによりシグナル変化を生じる。ここで、核酸とは、少なくとも一部に核酸の塩基対合によって他の核酸とハイブリダイズするものであればよい。したがって、核酸とは、天然あるいは合成のヌクレオチドのオリゴマーおよびポリマーの双方を含み、さらにゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡなどのＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ、ペプチド核酸を含む概念である。また、ハイブリダイズとは、核酸分子間における塩基の対合による相補鎖間の結合反応を意味している。【００４３】
シグナル変化とは、特に限定しないが、電気化学的信号であっても、色や光などの信号、放射性信号であってもよい。シグナル変化を生じるプローブとしては、例えば、特開２００４−３５７５７０等のような電気化学的手法によりミスマッチを検出可能な酸化還元性ユニット、フラビン、ポルフィリン、キノン、メタロセン、フラビン等の公知の化合物から選択される核酸へのインターカレート性基を備えるインターカレート性蛍光ユニット、特開２００４−１６６５２２号公報及び特開２００４−１６８６７２号公報に記載されるヌクレオチド誘導体等からなるインターカレート性の特定塩基認識型蛍光性ユニット（塩基識別型蛍光性核酸塩基）や特開２００２−２８１９７８号公報等に記載される相互に会合可能であって会合により消光する自己クエンチング性基を備える蛍光ユニットなどを備えるプローブが挙げられる。【００４４】
プローブにおいてこうしたシグナル変化を生じるユニットとしては、蛍光に関する信号の変化を生じるプローブが好ましい。蛍光に関する信号変化としては、蛍光波長のシフト、蛍光強度の増大及び蛍光強度の減少のいずれかあるいはこれらのうち２種類以上の組み合わせが挙げられる。【００４５】
蛍光シグナル変化を生じるユニットとしては、上記したインターカレート性蛍光ユニット及び特定塩基認識性蛍光ユニットが挙げられる。こうしたユニットは、ハイブリダイズする塩基により蛍光シグナルが変化する蛍光色素インターカレーターを含んでいる。例えば、蛍光色素インターカレーターとしては、ピレン、アントラセン、ナフタレン等を使用することができる。あるいは公知のインターカレーターに公知の蛍光物質を結合させたものであってもよい。この場合、インターカレーターとしては、アクリジンオレンジ、プロフラビン、臭化エチジウム、アクチノマイシンＤ等の芳香族色素分子を使用することができる。また、蛍光物質としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン誘導体等を使用することができる。【００４６】
ピリミジン塩基又はプリン塩基にインターカレーターを結合させるためのリンカーとしては、炭素鎖やポリマー鎖を利用することができる。さらに、インターカレーターが連結されるピリミジン塩基又はプリン塩基の位置は、それぞれの非置換炭素位置から任意に選択される。すなわち、ピリミジン塩基の場合には、第４位又は第５位であり、プリン塩基の場合には、第７位又は第８位である。【００４７】
こうしたインターカレート性蛍光ユニット及び塩基識別型蛍光性ユニットは、前記核酸プローブにおける１又は２以上１０以下の予め決められた塩基に対応するヌクレオチドを置換することができる。なお、特開２００４−１６６５２２号公報、特開２００４−１６８６７２号公報、特開２００２−２８１９７８号公報、国際出願明細書ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００４７０３及びＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１６６０２は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。【００４８】
上記したうち、蛍光ユニットを備えるプローブは、いずれもこうした蛍光に関する信号変化を生じるが、なかでも、本発明においては、以下の式（１）〜（２０）に示す塩基識別型蛍光性核酸塩基ユニット（ヌクレオチド誘導体及びヌクレオシド誘導体として表す。）を用いることが好ましい。こうした塩基識別型蛍光性核酸塩基ユニットを用いることで、標識誤差やバックグラウンドを低下させて測定誤差を低減し、マッチとミスマッチとを厳密に判別できるため、体質、薬剤反応性、薬剤感受性等に影響するＳＮＰｓなどの多型、疾患の診断、予後診断、発症予測などに影響する遺伝子変異（染色体転座等によるキメラ遺伝子を含む）を検出するのに有効である。なお、式（１）〜（４）は、アデニン識別型蛍光性核酸塩基ユニットであり、式（５）〜（８）は、チミン／ウラシル識別型蛍光性核酸塩基ユニットであり、式（９）〜（１２）は、グアニン識別型蛍光性核酸塩基ユニットであり、式（１３）〜（１６）は、シトシン識別型蛍光性核酸塩基ユニットであり、式（１７）〜（２０）は、チミン／ウラシル又はシトシン識別型蛍光性核酸塩基ユニットである。【００４９】
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【００５０】
以上の式（１）〜（２０）において、Ｒ１〜Ｒ９は、水素原子又は置換基を表し、Ｒ１０は、水素原子又は水酸基であり、Ｘはイミノ（ＮＨ）、オキシ（Ｏ）、チオ（Ｓ）、メチレン（ＣＨ２）及びアルキルアミノ基から選択される連結基であり、アルキレン鎖長を表す整数ｎは、Ｘがメチレン又はアルキルアミノ基の場合には０〜５であり、Ｘがイミノ、オキシ又はチオの場合には１〜５である。このうち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８及びＲ９の置換基は、ハロゲン原子、含酸素基、含窒素基、含硫黄基、及びこれらの原子や置換基を有していてもよい炭化水素基若しくは複素環基などである。さらに詳しくは、置換基は、ハロゲン原子、アルコキシ基、エステル基、アミノ基、置換アミノ基、ニトロ基、アミド基、シアノ基、カルバメール基、ウレイド基、チオール基、チオエーテル基、チオエステル基などである。また、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８及びＲ９が同時に水素原子であることはなく、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８及びＲ９の隣接するもの同士が結合して置換基を有していてもよいフェニル基を形成してもよい。【００５１】
さらに、前記式（３）〜（８）、（１１）、（１２）、（１５）、（１６）、（１９）及び（２０）におけるＸについては、以下の式（２１）〜（２７）の連結基を例示することができる。また、このＸで表される連結基が存在せず、ピリミジン塩基又はプリン塩基と蛍光色素インタカレーターとがリンカーを介して直接に結合されていてもよい。
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【００５２】
また、本発明において、プローブは、以下の（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）被験試料について検出しようとする塩基配列上の特徴を検出可能な領域
（ｂ）前記（ａ）領域における塩基配列上の特徴の近傍に存在する被験試料について定常的な塩基配列（（１）変異が未だ検出されていない領域、（２）変異がないか若しくは高い確率で存在しないことが推測される領域、（３）変異がないか若しくは高い確率で存在しないことが確認された領域などが挙げられる。）を検出可能な領域
を備え、前記（ａ）の領域及び前記（ｂ）の領域におけるハイブリダイズによりそれぞれ異なるシグナル変化を生じるものであってもよい。【００５３】
こうしたプローブによれば、一つのプローブにより、検査対象となる被験試料中の配列に対応したシグナルとともに、シグナル補正や定量に用いることができるコントロールとしてのシグナルを得ることができる。すなわち、前記（ｂ）領域におけるハイブリダイズによるシグナル変化を、前記（ａ）領域におけるマッチ／ミスマッチに関わらず生じるようにすることで（例えば、ハイブリダイゼーション条件の設定により）、換言すれば、前記プローブに対するミスハイブリダイゼーションを利用することで、前記（ｂ）領域に基づくシグナル変化は、前記プローブ又は前記プローブを固定化したアレイに供給される被験試料中のターゲット核酸の量を代表することができる。同一プローブにおいてこうしたコントロール（内部標準）等として用いるシグナルが得られるため、精度の高い測定が可能となる。【００５４】
ここで、前記（ａ）領域が検出する被験試料の塩基配列上の特徴としては、変異、一塩基多型、染色体転座等によって生じるキメラ遺伝子のブレークポイントなどの特徴的キメラ部分などが挙げられ、前記（ａ）領域は、こうした特徴に含まれる１又は２以上の塩基を識別する塩基識別型蛍光性核酸塩基を備えることができる。また、前記（ｂ）領域が検出する定常的な塩基配列としては、上記のとおり特に限定するものではないが、前記特徴近傍の定常的な１又は２以上の塩基とすることができ、前記（ｂ）領域は、こうした定常的な１又は２以上の塩基に対応する塩基を識別する塩基識別型蛍光性核酸塩基を備えることができる。なお、定常的な塩基配列は、被験個体又は被験個体を含む群（家系、民族、人種等）を考慮して決定されることが好ましい。【００５５】
なお、コントロールとするための定常的な塩基は、特徴的塩基のマッチ／ミスマッチに関わらず検出できればよいが、好ましくは特徴的塩基との間に少なくとも１塩基が介在されていることが好ましい。【００５６】
例えば、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）２遺伝子においては、図１に示す配列中の第１１位において一塩基多型（Ａ／Ｇ）を有している。この場合多型を検出するために第１１位のメジャー型塩基に対応して第１の塩基識別型蛍光性核酸塩基を有し、多型等が報告されていない第６位の塩基に対応して別の第２の塩基識別型蛍光性核酸塩基を有するプローブを設計することができる。【００５７】
図２に示すように、それぞれ塩基識別型蛍光性核酸塩基を有する多型検出領域と定常的塩基検出領域を備えるプローブに対して、多型検出領域では不完全な対合状態であっても定常的塩基検出領域にハイブリダイズして蛍光を生じる条件で被験試料と接触させて最終的に得られる前記第２の塩基識別型蛍光性核酸塩基に由来する蛍光シグナルは、供給された被験試料（ＡＬＤＨ２遺伝子サンプル）の量を代表することができる。なお、このとき、多型検出領域では、第１の塩基識別型蛍光性核酸塩基が不対合であれば当該塩基に由来する蛍光は生じないし、当該塩基が検出すべき塩基と対合していれば当該塩基に由来する蛍光が生じる。このため、第２の塩基識別型蛍光性核酸塩基に由来する蛍光シグナルに対する第１の塩基識別型蛍光性塩基核酸に由来する蛍光シグナルの比を利用すれば、供給した被験試料量に関わらず被験試料中におけるメジャー配列量の比率を検出できるため、マイナー配列量を測定することなく多型の型を容易に特定できる。さらに、こうしたプローブを用いて、変異配列等を一定濃度で含む標準溶液について第２の塩基識別型蛍光性核酸塩基由来の蛍光シグナルに対する第１の塩基識別型蛍光性核酸塩基由来の蛍光シグナルの比を利用することで、容易に変異配列量を定量できる。標準溶液における蛍光シグナル比は、予め求めておいてもよいし、被験試料のアッセイ毎に行ってもよい。【００５８】
なお、前記（ａ）領域を検出するためのシグナル変化と前記（ｂ）領域を検出するためのシグナル変化は、互いに区別できるものであればよい。例えば、異なる蛍光波長を有することができる。【００５９】
このように、本発明においては、塩基配列中の特定塩基とのハイブリダイズによりシグナル変化を生じるユニットを１又は２以上備えることができる。こうしたユニットは、全てが被験試料中の測定対象となる塩基配列の特定塩基とのハイブリダイズによりシグナル変化を生じるものであってもよい。例えば、染色体転座等によって生じるキメラ遺伝子のそれぞれの部位を検出するように蛍光ユニットを備えていてもよい。【００６０】
また、本発明によれば、こうした被験試料の量を補正することができるように前記（ｂ）領域のみを有するプローブも提供される。こうしたプローブと前記（ａ）領域のみを有するプローブとを、例えば、一つの固相担体に固定化することにより同時に用いることで、これらのシグナル変化量を測定し、比率を算出することで、先と同様の補正、解析等が可能となる。【００６１】
（プローブ保持体）
プローブ保持体は、プローブを保持した固相担体である。固相担体が基板状の場合には、プローブ保持体はアレイを構成する。固相担体が後述するように粒子状の場合もある。予め合成されたプローブの固相担体への固定化は、特に限定されないで、各種の共有結合、静電的結合など結合手法を用いることができる。また、プローブは、固相担体表面においてその場でフォトリソグラフィ等の手法を利用して合成されるものであってもよい。【００６２】
（アレイ）
プローブ保持体の一形態であるアレイの一例を図３に示す。アレイ２はプローブを備えた、核酸のハイブリダイズ反応のための装置（ハイブリダイズ装置）でもある。【００６３】
（基板）
本ハイブリダイズ装置２における基板４は、少なくとも核酸プローブが固定される核酸固定領域６を備えている。核酸固定領域６は、それぞれ核酸プローブが固定された微小な1以上の領域（スポットともいう。）が形成された、あるいは該微小領域が形成されるために準備された領域である。なお、本発明においては、基板４に対する核酸プローブの固定方法や固定形態については特に限定することなく本出願時における公知の全ての形態を包含するものである。基板４における核酸固定領域６は、微小な三次元形状を有している場合も含め実質的に平坦であることが好ましい。また、基板４は、基板４上に直接あるいは必要に応じて多孔質体などの介在物を介して核酸固定領域６を単数あるいは２以上有することができる。基板４に２以上の核酸固定領域６を有する場合には、これらは疎水性の離隔部によって互いに隔てられていてもよい。【００６４】
また、基板４の形状は特に限定しない。例えば、平板のほか、基板４として機能する平坦な底部を有する凹状体が挙げられる。基板４を構成する材料は、従来この種の基板に用いられている各種の材料の他各種の材料を使用できる。例えば、ガラス、二酸化ケイ素、窒化ケイ素などのシリコン系セラミックスを含むセラミックス、シリコーン、ポリメチルメタクリレート、ポリ(メタ)アクリレートなどの樹脂、金、銀、銅等の金属などを用いることができる。所望の表面特性を付与するために適当なコートが施されていてもよい。なかでも、ガラス基板、シリコーン、アクリル樹脂を使用することができる。こうした基板４の最も典型例は、ｃＤＮＡプローブ等が固定されたＤＮＡチップ若しくはＤＮＡマイクロアレイまたはｃＤＮＡ等が固定されていない（固定されるべき）ＤＮＡマイクロアレイ用等の基板である。【００６５】
（カバー部材）
本ハイブリダイズ装置２は、基板４に対して使用されるカバー部材１０を備えている。カバー部材１０は、基板４の核酸固定領域６を含んだハイブリダイズ反応のためのキャビティ１２を構成する。カバー部材１０は、基板４に対して装着されるものとすることもできるが、基板４を収容あるいは保持する基板保持体に対して装着された結果として、基板４との間でキャビティ１２を構成するものであってもよい。前者の例としては、平板状あるいは平坦な底部を有する凹状の基板に対して装着される形態を挙げることができ、後者の例としては、平板状の基板を載置する平坦部あるいは凹状部を備える基板保持体に対して装着される形態を挙げることができる。【００６６】
キャビティ１２は、核酸固定領域６を含んだ空間であって、前記ハイブリダイズ反応のための液体（以下、単にハイブリダイズ液という。）を貯留可能に形成される空間である。キャビティ１２は、核酸固定領域６上において所定の空間高さ（あるいは空間の厚み）を有する空間を有していることが好ましい。すなわち、カバー部材１０は、ハイブリダイズ液が貯留されない状態であっても基板４の核酸固定領域６に対向する領域（以下、単に対向領域という。）１４を基板４からいくらかの距離離れて保持できる構成を有していることが好ましい。カバー部材１０がこうした形態を有することで、基板４に対して特別な操作を施すことなく、カバー部材１０を基板４等に対して装着するだけで、核酸固定領域６に所定の空間高さを有するキャビティ１２を形成できる。【００６７】
キャビティ１２内には、少なくとも基板４の核酸固定領域６とカバー部材１０の対向領域１４とが露出されている他、これらの領域以外にキャビティ１２を外部と遮断するために必要な追加の面が露出されている。追加の面は、基板４あるいはカバー部材１０の一部であってもよいし、さらに別個の部材で構成されていてもよい。キャビティ１２の平面形態は特に限定しないが、突状部や角部を有しないことが好ましい。このような個所には、ハイブリダイズ液が滞留しやすいからである。なお、後述するように外側に膨出する個所であっても、該個所が、十分に小さく全体として液体の滞留が抑制されるような曲線形態などを有する側壁部分近傍に形成されていれば、滞留が抑制される。好ましい平面形態としては、図３および図４に示すような長円や円などが挙げられる。また、キャビティ１２の対向領域１４は基板４から離れる方向に対して凸状としても凹状としてもよいが、平坦であることが好ましい。平坦であると、核酸固定領域６に対しておおよそ一定の空間高さを備えるキャビティ１２を容易に構成できるからである。【００６８】
このようなカバー部材１０は、図４に示すように、基板４が平板である場合には、対向領域１４を含む平板状体１０ａの周囲に所定高さのスペーサ８を有する形態とすることもできる。図３においては、カバー部材１０は、基板４とほぼ同じ大きさで少なくとも基板４に対向する側にはほぼ平坦な表面を有する板状体１０ａと、その周縁に基板４との間に介在されるスペーサ８とを有している。他の形態としては、それ自体が核酸固定領域６を覆う所定形状のドームを有する形態とすることもできる。このような形態のカバー部材１０は、高分子材料の成形体とすることができる。一方、基板４が凹状部の底部を核酸固定領域６とする凹状体であるとか核酸固定領域６の外周に所定高さの周縁部を有する場合、さらには基板４が基板保持体などの底部に収容される場合など、カバー部材１０を装着するのにあたり核酸固定領域６が凹状部の底部に位置されるときには、これら凹状部の周縁の縦壁部分に装着される平板状体とすることもできる。【００６９】
スペーサ８の材料としては、例えば、アクリル樹脂、熱可塑性エラストマー、天然あるいは合成ゴム、シリコーン、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリイミド、ハロゲン化ビニル、ポリカーボネートを用いることができる。【００７０】
（疎水性領域）
本ハイブリダイズ装置２は、キャビティ１２内に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域１６を有していることが好ましい。疎水性とは、少なくとも撥水性を示す表面特性を意味し、好ましくは、親水処理など施されていない一般的なケイ酸ソーダガラスよりも高い撥水性を有していることを意味する。撥水性は、一般に平坦な表面における水の接触角で表現することができる。本発明における疎水性領域の水の接触角は、３０°以上であることが好ましく、より好ましくは６０°以上であり、さらに好ましくは７０°以上である。最も好ましくは、９０°以上である。なお、接触角とは、液滴を水平な固体板状に置いたときに液滴が固体と接している部分の角度をいうものとする。接触角は、静的接触角や臨界値としての前進接触角あるいは後退接触角、さらには動的接触角などをも用いることができるが、液滴法によって測定した静的接触角を用いることが好ましい。【００７１】
なお、静的接触角を測定する液滴法は、（１）接線法、（２）θ／２法および（３）３点クリック法がある。（１）の接線法は、読み取り顕微鏡等を利用してカーソルを液滴の接線に合わせて接触角を直接求める方法であり、（２）のθ／２法は、液滴の片端と頂点とを結ぶ直線と固体面との角度を２倍して接触角として求める方法であり、（３）の３点クリック法は、液滴と固体面との接点2ヶ所と頂点をコンピュータ画像上等でクリックして画像処理により求める方法である。これらの液滴法においては、上記（２）および（３）の方法にて接触角を求めることが好ましい。【００７２】
疎水性領域１６は、キャビティ１２内に露出される領域の少なくとも一部に備えられていればよいが、好ましくは、カバー部材１０に備えられる。カバー部材１０に疎水性領域１６を備えることで、シグナル強度を効果的に向上させることができる。カバー部材１０においては、対向領域１４に疎水性領域１６を有していることが好ましく、さらに好ましくは、核酸固定領域６のおおよそ全体に対応する対向領域１４の全体に均一に疎水性領域１６を備えることが好ましい。疎水性領域１６は、対向領域１４において複数個分散して備えられていてもよいが、好ましくは、対向領域１４のおおよそ全体を被覆するような連続状に備えられている。さらに、カバー部材１０のキャビティ１２に露出される全領域が疎水性領域１６であってもよい。【００７３】
疎水性領域１６は、例えば、カバー部材１０自体の材質を疎水性材料を用いることで形成することもできるし、疎水性領域１６を形成しようとする領域に対して疎水性材料および／または疎水性(撥水性)を呈する表面形態を付与することによっても形成することができる。疎水性領域１６を構成する疎水性材料としては、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレンなどのポリオレフィン、ハロゲン化ビニル、ポリアミド、ポリイミド、アクリル樹脂およびこれらの樹脂のフッ化又は塩化物を挙げることができる。また、撥水性を呈する表面形態としては、例えば、各種材料表面に化学的な修飾や機械的処理により接触角が９０°以上になるように粗面化された形態を挙げることができる。【００７４】
キャビティ１２における核酸固定領域６とこれに対向する対向領域１４との距離、すなわち、核酸固定領域６におけるキャビティ１２の空間高さの変動係数（標準偏差／平均値×１００（％））が５０％以下であることが好ましい。核酸固定領域６において空間高さの変動係数が５０％以下であると、ハイブリダイズ産物のシグナル強度のバラツキを抑制することができる。シグナル強度のバラツキが抑制されることは、精度の高い検出が可能となるとともに、再現性の高いハイブリダイズ反応が実現できることを意味する。例えば、空間高さの変動係数が５０％以下であるとシグナル強度の変動係数を２０％以下程度に容易に抑制することができる。空間高さの変動係数はより好ましくは４０％以下であり、さらに好ましくは３０％以下であり、最も好ましくは２０％以下である。本発明者らの今回得られた知見によれば、キャビティ１２内の核酸固定領域６の空間高さの変動係数が一定以下であることは、核酸固定領域６の単位面積あたりのハイブリダイズ液量（液厚）の均一性に大きく寄与していることがわかっている。【００７５】
また、キャビティ１２の空間の高さの平均値は、１５μｍ以上であることが好ましい。１５μｍ以上であると、ハイブリダイズ産物のシグナル強度のバラツキがよく抑制されるからである。より好ましくは、２０μｍ以上である。キャビティ１２の空間高さを２０μｍ以上とすることで、それによって確保される核酸固定領域６における液厚により、キャビティ１２内に露出される領域の影響を抑制してハイブリダイズ液の対流ないし被験核酸の拡散を確保できる。また、空間高さの平均値の上限は、好ましくは１０００μｍ以下である。さらに、こうしたキャビティ１２が区画する基板４上の面積は、１ｍｍ2以上２０００ｍｍ2以下であることが好ましい。【００７６】
キャビティ１２における上記空間高さの平均値および空間高さの変動係数は、例えば、以下の方法（以下、高さ−表面うねり量法という。）により測定することができる。
（１）計測部位
カバー部材１０によって形成されるキャビティ１２を分割する分割線、好ましくは、キャビティ１２の中心線あるいは等分割線の分割線上を計測部位とする。計測部位は、例えば、図５（ａ）に示すように、キャビティ１２の長手方向および短手方向のそれぞれ２等分する２本の分割線の組み合わせとすることもできる（分割線は計２本）。また、図５（ｂ）に示すように、長手方向および短手方向にそれぞれ４等分する分割線の組み合わせとすることもできる（分割線は計６本）。さらに、図５（ｃ）に示すように、長手方向に８等分する分割線と短手方向に４分割する分割線との組み合わせとすることもできる（分割線は計１０本）。
（２）周縁高さの測定と基準高さの算出
まず基準高さ（Ｈ）を求める。基準高さ（Ｈ）とは、カバー部材１０を基板４の核酸固定領域６に対向するように装着したとき形成されるキャビティ１２の外縁に対応するカバー部材１０の周縁部の核酸固定領域６を含む表面からの高さ（以下、周縁部高さという。）の平均値である。周縁部高さは、図５に示すとおり、分割線上の周縁部において計測する。分割線は、キャビティ１２を分割しているため、一つの分割線について周縁部の高さは対向する周縁部の２点を計測することになる。したがって、周縁高さの測定箇所数は、分割線の数×２となる。すべての分割線上における周縁部高さを測定し、これらから平均値を求め、これを基準高さ（Ｈ）とする。なお、空間高さの平均値および変動係数を得るのに好ましい周縁高さの測定個所は、４箇所以上であり、より好ましくは、２０箇所以上である。
（３）カバー部材の表面のうねり量の測定
カバー部材１０の表面のうねり量は、分割線上のカバー部材１０の対向領域１４に対応する領域の外表面（基板４と対向しない側の表面）の周縁部を基準とした表面の凹凸の変動量として測定する。うねり量としては、一つの分割線をその測定軌跡として測定し、最高値と最低値とのみを用いればよい。したがって、うねり量の測定箇所は、結果として各分割線に対して２箇所ということになり、分割線の数×２がうねり量の測定箇所数となる。なお、空間高さの平均値および変動係数を得るのに好ましいうねり量の測定個所は、４箇所以上であり、より好ましくは、２０箇所以上である。
（４）膜厚の測定
カバー部材１０の膜厚は、対向領域１４の膜厚を意味しており、対向領域１４の膜厚の平均値（Ｔave）を用いてもよいし、あるいは上記うねり量の最高値と最低値とをそれぞれ測定した部位の膜厚（Ｔmax、Ｔmin））を用いてもよいが、好ましくは平均値を用いる。なお、膜厚は、ノギスなどの計測装置など公知の計測装置により測定できる。
（５）空間高さの算出
これらのデータから一つの分割線上において複数の空間高さを求めることができる。一つの分割線上においては、うねり量の最高値と最低値（それぞれＭＡＸおよびＭＩＮとする）から最大の空間高さと最小の空間高さとを求めることができる。
最大空間高さ＝基準高さ（Ｈ）＋うねり量の最高値（ＭＡＸ）−膜厚（ＴaveあるいはＴmax）
最小空間高さ＝基準高さ（Ｈ）＋うねり量の最低値（ＭＩＮ）−膜厚（ＴaveあるいはＴmin）
として得ることができる。
こうして、一つの分割線から最大空間高さと最小空間高さを得て、他の分割線からも同様に最大空間高さと最小空間高さとを得て、これらの平均値を、空間高さの平均値とし、標準偏差／空間高さの平均値×１００を変動係数（％）とする。【００７７】
なお、カバー部材１０の所定位置における周縁高さは、例えば、デジタル測長機（デジマイクロ、株式会社Nikon製）によって測定することができ、カバー部材１０の表面のうねり量は、表面粗さ形状測定機（サーフコム、株式会社東京精密製）にて測定することができる。【００７８】
さらに、キャビティ１２の容積は、０．１μＬ以上２０００μＬ以下であることが好ましい。より好ましくは１μＬ以上１０００μＬ以下である。【００７９】
さらに、カバー部材１０の対向領域１４を含む部分は、外部からキャビティ１２内を視認可能な光透過性を有することが好ましいが、対向領域１４を含む部分の厚みの平均値が３００μｍ以上であることが好ましい。厚みの平均値が３００μｍ以上であると、ハイブリダイズ産物のシグナル強度の変動係数がよく抑制されるからである。該厚みはより好ましくは３５０μｍ以上である。なお、上限は特に限定しないが、厚いため熱容量が大きくなり過ぎて加熱時にキャビティの温度分布の不均一性が生起してしまうことを考慮すれば３０００μｍ以下であることが好ましい。【００８０】
（その他の構造）
カバー部材１０にはハイブリダイズ液を注入するための開口２０を備えることができる。開口２０は２以上備えることが好ましく、少なくとも一つの開口２０は、カバー部材１０においてキャビティ１２を区画する輪郭近傍に開口していることが好ましい。かかる部位に開口されていることで、キャビティ１２に注入したハイブリダイズ液がキャビティ１２の内壁に留まりにくくキャビティ１２全体にハイブリダイズ液が容易に拡散される。より好ましくは、開口２０は、前記輪郭に沿って形成されおり、さらに好ましくは、前記開口２０によってキャビティ１２の内壁が外側に膨出した膨出部を構成するように形成されている。すなわち、図３に示すように、円形上にカバー部材１０に開口された開口２０は、平面形態が長円状のキャビティ１２の長径方向の両端に形成されるとともに、該両端部において開口２０の開口端縁の一部がキャビティ１２の両端を外側に膨出させるように形成されている。かかる開口２０からハイブリダイズ液が注入されると、開口２０の両側および反対側のいずれにもハイブリダイズ液が容易に拡散されることになる。なお、開口２０は、適当なシール材によって密閉される。【００８１】
こうした本ハイブリダイズ装置２に用いるカバー部材１０は、実質的にカバー部材１０を構成する平板状体１０ａにシール層５を介してスペーサ８を積層することにより得ることができる。シール層５としては、平板状体１０ａとスペーサ８とを接着する接着剤層あるいは粘着剤層とすることができる。また、一つのカバー部材１０に対して、隣合う区画を遮断するような形態のスペーサ８を用いることで基板４上に複数個のキャビティ１２を形成するカバー部材１０も容易に得ることができる。【００８２】
また、カバー部材１０は、複合体としてではなく一体の樹脂の成形体として得ることもできる。さらに、こうしたカバー部材１０の基板４あるいは基板保持体に対して装着するための部位には、接着剤や粘着剤の層を形成しておくことが好ましく、さらに、このような接着層は剥離可能なシートによって保護されていることが好ましい。したがって、本発明の別の形態として、このハイブリダイズ装置２と基板４とを備えるハイブリダイズ反応用キットも提供されることになる。このようなキットに備えられる基板４に核酸プローブなどを固定すれば有効な好ましい核酸アレイを得ることができる。なお、カバー部材１０は、基板４あるいは基板保持体に対して別個に備えられて適時に装着可能に備えられなくてもよい。カバー部材１０は、基板４あるいは基板保持体に対して接着により予め一体化されていてもよく、また、基板４等と一体の成形体として一体化されていてもよい。また、カバー部材１０は洗浄やシグナル検出のために基板４等に対し、該基板４等から分離可能に装着可能に形成されていてもよく、あるいは一体化されていてもよい。【００８３】
カバー部材１０の対向領域１４を含む部分を弾性変形可能に形成してもよい。この部分あるいはカバー部材１０の全体を弾性変形可能な材料で形成することにより、対向領域１４にガス圧又は機械的外力を付加して変形させることでキャビティ１２内の液体を攪拌することができる。【００８４】
また、カバー部材１０の対向領域１４のキャビティ１２に露出される側（基板４と対向される側の表面）には、凹部及び／又は凸部を備えることができる。この凹凸は、キャビティ１２内の液体を撹拌する場合に、液体の流れを複雑化して撹拌効率を向上させ、ひいてはハイブリダイズ効率を向上させることができる。こうした凹部及び／又は凸部は、カバー部材１０の対向領域１４を構成する材料で一体に備えていてもよいし、カバー部材１０の基板４に対向される側の表面にこうした凹部及び／又は凸部を備えるフィルムやシート状体を付着させることによっても形成できる。こうした凹部及び凸部の大きさは、特に限定しないで、キャビティの空間高さに応じて設定される。なお、こうした凹部及び／又は凸部に疎水性領域を備えていてもよい。【００８５】
（他のプローブ保持体）
他の形態のプローブ保持体としては、固相担体を基板などの平板状体に替えて粒子状のものを用いる形態が挙げられる。粒子状体は、一般的なビーズなどの球形状のほか、針状、不定形状等各種の形態であってもよい。こうした粒子状の固相担体を用いる場合には、粒子毎に一つのプローブを固定化するとともに、色、蛍光、記号、数字、文字及び柄等から選択されるプローブ識別情報を有するようにする。こうした粒子識別情報とプローブの種類とを予め関連付けておくことにより、粒子上でのハイブリダイズ産物のシグナル変化と識別情報とを検出することで、その粒子に固定化されていたプローブとサンプルＤＮＡ等との関係を関連付けることができる。なお、固相担体が平板状である場合には、プローブの識別情報は、プローブの固相担体における位置として把握されている。なお、粒子状体の材料としては、基板と同様、例えば、ガラス、二酸化ケイ素、窒化ケイ素などのシリコン系セラミックスを含むセラミックス、シリコーン、ポリメチルメタクリレート、ポリ(メタ)アクリレートなどの樹脂、金、銀、銅等の金属などを用いることができ、所望の表面特性を付与するために適当なコートが施されたものであってもよい。【００８６】
また、他の形態のプローブ保持体としては、平板状又は粒子状の固相担体が液体透過性で又は多孔質である場合が挙げられる。固相担体が液体透過性又は多孔質である場合には、プローブＤＮＡの固定化領域、サンプルＤＮＡとの接触領域も拡大するため、高感度な検出が可能となる。なお、液体透過性とは、固相担体の構造に寄らず液体が反対側まで通過するものであればよく、フィルター状、多孔質体等とすることができる。【００８７】
（核酸のハイブリダイズ方法）
こうしたプローブ保持体２を用いたハイブリダイズ反応は常法に準じて行うことができる。例えば、本ハイブリダイズ装置２あるいはカバー部材１０を用いるハイブリダイズ工程は次のようにして行うことができる。基板４としてのＤＮＡマイクロアレイに、基板４への装着側にシール層を有するカバー部材１０を該シール層を介して貼着し、開口２０から所定の方法で調製したハイブリダイズ液を注入し、２つの開口２０の双方をシール材でシールして、２５℃以上８０℃以下の温度で所定時間静置する。【００８８】
本ハイブリダイズ装置２によれば、キャビティ１２内でハイブリダイズ反応を行うため、効率的なハイブリダイゼーションが可能である。また、キャビティ１２内に露出される少なくとも一部に疎水性領域１６を有する場合には、攪拌、振動、摩擦、噴流等を基板４に対して付与するなど、外力を加えなくても、キャビティ１２内におけるハイブリダイズ液の対流あるいは被験核酸の拡散を促進してハイブリダイズ反応を促進し一層その効率を向上させることができる。したがって、本ハイブリダイズ装置２あるいはカバー部材１０は、静置状態でハイブリダイズ反応を行うハイブリダイズ方法およびかかるハイブリダイズ工程を含む各種の検査方法に好ましく用いることができる。さらに、静置によっても十分なハイブリダイズ反応の促進効果を有するため、作業者の基板４やカバー部材１０の取り扱い操作の違いなどの作業者によるバラツキ要因およびハイブリダイズ時のハイブリダイズ装置２の静置場所の水平性や外力の大小などの外部環境によるバラツキ要因による影響を抑制して再現性の高いハイブリダイズ結果を得ることができる。【００８９】
さらに、本発明のプローブを用いることで、プローブがハイブリダイズによってシグナル変化を生じるため、ハイブリダイゼーション後の状態で（ハイブリダイズしていないＤＮＡ等がプローブと混在した状態のまま）、換言すれば洗浄工程を実施しないで、そのままシグナル検出工程を実施することができる。このため、洗浄工程に由来する誤差を排除することができ、より精度の良好な検出が可能となっている。【００９０】
また、本ハイブリダイズ装置２およびカバー部材１０が形成するキャビティ１２においてキャビティ１２の空間高さおよびその変動係数の制御ならびに対向領域１４部分の厚みの制御をすることで、ハイブリダイズ産物のシグナル強度のバラツキを抑制して精度の高いシグナル検出が可能となる。このようなキャビティ１２の構造あるいは寸法制御によって、ハイブリダイズ産物のシグナル強度のバラツキ抑制のために従来採用されていた各種の上記した手法を採用することなく簡易な構成でハイブリダイズ産物のシグナル強度のバラツキ抑制という効果が得ることができる。なお、このようなキャビティ１２の構造あるいは寸法制御は、核酸固定領域６の単位面積当たりのハイブリダイズ液量の均一化あるいは熱緩衝効果によって得られた効果であるということもできる。【００９１】
また、カバー部材１０の対向領域１４の基板４に対向される側に凹部及び／又は凸部を有している場合には、静置によっても、好ましい液体の対流が得られ、ハイブリダイズ反応の効率を向上させることができる。【００９２】
ハイブリダイズ工程においては、キャビティ１２内の液体を攪拌する撹拌工程を実施してもよい。撹拌によりハイブリダイズ抑制が向上する。特にキャビティ１２内の少なくとも一部に疎水領域１６を有するときには、キャビティ１２内の水性の液体が撹拌された際に、疎水性領域１６において液体が撥液されることにより、キャビティ１２内のハイブリダイズ液の移動が促進され、この結果、より一層ハイブリダイズ効率が向上される。【００９３】
攪拌工程では、一時的、間欠的又は連続的にキャビティ１２内の液体を強制的に攪拌してもよい。キャビティ１２内の液体の攪拌のためには、例えば、キャビティ１２を形成した基板４やハイブリダイズ装置２を動かすことが有効である。具体的な動作としては、基板４を含んでキャビティ１２を構成する部材を、回転運動、旋回運動、シーソー運動、往復運動、転倒運動又はこれらの２種類以上の組み合わせなどの各種動作が挙げられる。他には、カバー部材１０の対向領域１４が弾性変形可能である場合には、この対向領域１４を外力により変形させることによってもキャビティ１２内の液体の攪拌が可能である。具体的には、ローラーなどの回転体を回転させつつ対向領域１４上を移動させたり、その他の押圧部材を対向領域１４上を押圧しながら移動させることが挙げられる。こうした撹拌工程は、ハイブリダイズ工程の全体を通じて実施してもよいし、断続的に又はその一部においてのみ実施してもよい。【００９４】
こうしたキャビティ１２内の液体の攪拌にあたっては、キャビティ１２内にキャビティ１２内の液体と分離して存在する程度に該液体に不溶解性のガス（例えば、空気のほか、窒素などの不活性ガスなど）を存在させた状態とすることが好ましい。通常、ガスがキャビティ１２内に存在する場合、キャビティ１２が静置状態であると、ガスが定位置で保持されるため、ガスの保持部分（ガス溜り）においてはハイブリダイゼーションが進行しにくいが、ガスを存在させた上でキャビティ１２内の液体を移動させるような外力が付加されることで、キャビティ１２内の液体の移動を促進することができ、これにより、ハイブリダイズ反応を促進することができる。【００９５】
なお、キャビティ１２を備えてないプローブ保持体を用いたハイブリダイゼーションは、固相担体の形態（基板状かあるいは粒子状か、多孔質状体、液体透過性か）に応じて適宜実施することができる。ガラス製基板など液体透過性を有しない基板状の固相担体の場合には、従来とおり、固相担体表面にサンプル溶液を供給してハイブリダイゼーションを行う。また、例えば、粒子状固相担体の場合には、固相担体をサンプル液に浸漬又は懸濁させた状態でハイブリダイゼーションを行う。さらに、平板状で液体透過性の固相担体の場合には、固相担体をサンプル溶液に浸漬したり、サンプル溶液を固相担体に浸透させた状態で行うことができる。なお、こうしたプローブ保持体を用いる場合であっても、ハイブリダイゼーション後の被験試料を洗浄等により除く必要はなく、ハイブリダイゼーション後の状態でシグナルを検出することができる。【００９６】
以上のことから、本発明の別の形態として、予め１あるいは２以上の核酸プローブが固定された核酸固定領域を有する基板４と、前記核酸固定領域を含んで核酸ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成するカバー部材１０と、を備えるアレイキット、好ましくは、カバー部材の核酸固定化領域に対向する部位など前記キャビティ内部に露出される少なくとも一部に疎水性領域を有する、アレイキットも提供される。こうしたアレイキットによれば、カバー部材１０によって効率的なハイブリダイズ反応が可能なチャンバーを形成できるため、容易かつ効率的に核酸のハイブリダイズ反応を行うことができる。カバー部材１０は、基板４あるいは基板保持体に対して接着剤や粘着剤等により一体化可能にしておくことができる。さらに、基板４や基板保持体に対して一体化後のカバー部材１０は、その後において基板４等から分離可能とされていてもよい。
【実施例】
【００９７】
以下、本発明を実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００９８】
実施例１
[塩基識別型蛍光核酸塩基（ヌクレオチド誘導体N1、N2、N3)を用いたオリゴデオキシリボヌクレオチドプローブの合成]【００９９】
以下、表１に示すプローブのうち、プローブ２及び７以外のプローブ（１、３〜５及び６）について塩基識別型蛍光核酸塩基を用いて所定配列のプローブを合成した。【０１００】
（プローブ１，４、５）
WO2004/058793特許記載のアデニン識別型蛍光性核酸塩基N1（AMPｙUとする）を用いて、蛍光塩基含有のオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成した。３種のオリゴデオキシリボヌクレオチドはアプライドバイオシステムズ社のDNA 自動合成機（3400 DNA/RNA シンセサイザー）で通常のホスホロアミダイト法に従って合成した。合成した配列は以下の通りであった。なお、５’末端はアミノ修飾されるとともにSpacerC12（１２−（４−モノメトキシトリチルアミノ）ドデシル−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）］ホスホアミダイトが導入された。【０１０１】
（蛍光塩基Ｎ１の構造式）
2006075735.tif 000023
【０１０２】
（プローブ３）
WO2004/058793特許記載のアデニン識別型蛍光性核酸塩基N1（AMPｙUとする）及びN2（PｙUとする）を用いて、蛍光塩基含有のオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成した。オリゴデオキシリボヌクレオチドはアプライドバイオシステムズ社のDNA 自動合成機（3400  DNA/RNA シンセサイザー）で通常のホスホロアミダイト法に従って合成した。合成した配列は以下の通りであった。なお、５’末端はアミノ修飾されるとともにSpacerC12（１２−（４−モノメトキシトリチルアミノ）ドデシル−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）］ホスホアミダイトが導入された。【０１０３】
（蛍光塩基Ｎ２の構造式）
2006075735.tif 000024
【０１０４】
（プローブ６）
WO2004/058793特許記載のシトシン認識型蛍光性核酸塩基N3（PｙCとする）を用いて、蛍光塩基含有のオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成した。オリゴデオキシリボヌクレオチドはアプライドバイオシステムズ社のDNA 自動合成機（3400 DNA/RNA シンセサイザー）で通常のホスホロアミダイト法に従って合成した。合成した配列は以下の通りであった。なお、５’末端はアミノ修飾されるとともにSpacerC12（１２−（４−モノメトキシトリチルアミノ）ドデシル−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）］ホスホアミダイトが導入された。【０１０５】
（蛍光塩基Ｎ３の構造式）
2006075735.tif 000025
【０１０６】
表１
2006075735.tif 000026
【０１０７】
なお、プローブ１、2、3はALDH（アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ）2の多型のメジャー型検出用として、プローブ6、7はALDH2マイナー型検出用として用いた。また、プローブ4は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）のフィラデルフィア染色体のbcr/abl遺伝子におけるb3a2型ブレークポイント検出用として、プローブ5はヒト９番染色体正常ｂｃｒ遺伝子のｂ３（ｂ３ａ２型ｂｃｒ／ａｂｌ遺伝子を生成する際のブレークポイント近傍配列）検出用として用いた（表1）。【０１０８】
これらのオリゴヌクレオチド合成後、固相担体からオリゴヌクレオチドをアンモニア水を用いて切り出し、エッペンドルフチューブに移し替え、55℃で8 時間加熱して脱保護を行った。得られたオリゴヌクレオチドの水溶液を高速液体クロマトグラフィー（600, Waters）で精製した。精製後、凍結乾燥機で溶媒を減圧留去することで目的物を得た。【０１０９】
実施例２
[オリゴデオキシリボヌクレオチドをプローブとして固定したＤＮＡマイクロアレイの作製]
Amersham Bioscience社製Codelink基板にプローブ１，３，４及び５と５’末端をアミノ基で修飾したプローブ２及び７（株式会社日本遺伝子研究所製）をスポットした。なお、スポット溶液におけるプローブ濃度は50pmol/μl、スポット量は150plとし、上記７種のプローブを5スポットずつスポットした基板を作製した。【０１１０】
スポット後、20℃、相対湿度７５％の条件下で一晩インキュベートした。次に、以下の組成のブロッキング溶液に0.1％ SDSとなるように 10％SDS を添加した溶液に15分浸漬した。次に、滅菌水で2回洗浄を行った。次に、4×SSC 0.1％SDS(50℃)で30分洗浄を行った後、滅菌水で1回洗浄を行った。次に、沸騰水(98℃)に2分浸漬した後、滅菌水で2回洗浄を行った。その後、遠心機で5分間、800rpm遠心し、乾燥し、アレイを作製した。
2006075735.tif 000027
【０１１１】
実施例３
[サンプルDNAの調製]
ハイブリダイゼーションサンプルとして、表２に示す各種のサンプル１〜１３を調製した。サンプル１〜６は、ＡＬＤＨ２遺伝子メジャー型、マイナー型及びへテロ型に対応する20ｍｅｒ合成DNAであり、サンプル７〜９は、ＡＬＤＨ２遺伝子メジャー型、マイナー型及びへテロ型に対応する１８９ｍｅｒPCR増幅サンプル（1本鎖化したもの）であり、サンプル１０〜１３は、ｂ３ａ２型bcr/abl遺伝子及びｂ３遺伝子（ｂ３におけルブレークポイント近傍配列）の所定領域に対応する129mer合成ＤＮＡであった。【０１１２】
表２
2006075735.tif 000028
【０１１３】
なお、20merおよび129mer合成DNAは株式会社日本遺伝子研究所製およびシグマジェノシス製のものを用いた。また、189merPCR増幅サンプルであるサンプル７及び８は表３記載のプライマーを用いて、以下の手順で合成した。サーマルサイクラーはGeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems社)を使用し、PCR産物の確認は、電気泳動装置（BIO-RAD社）で行った。【０１１４】
表３
2006075735.tif 000029
*PrimerにおいてForward方向をF、Reverse方向をRと表記
**メジャーサンプル増幅のゲノム試料としてInvitrogen社CS0DM006YI23を使用
***マイナーサンプル増幅のゲノム試料としてOpenBiosystems社4849418を使用【０１１５】
PCR増幅条件
PCRではTAKARA Ex Taq(タカラバイオ社)を用いて、それぞれ単独に増幅した。反応の詳細は以下の通りである。
2006075735.tif 000030
【０１１６】
増幅したメジャー及びマイナーのPCR増幅サンプルの配列分析を行った。その結果、得られたメジャー増幅産物及びマイナー増幅産物は、それぞれ目的の配列を含む189bpの二本鎖DNAであることを確認した。これら二本鎖サンプルはStreptavidinセファロース中NaOH存在下で一本鎖への変性を行った。【０１１７】
こうして取得した上記各種サンプル（１０ｐｍｏｌ／５０μｌ）をそれぞれサンプルチューブに加え、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた溶液（５０μｌ）を添加した。９５℃ヒートブロックで２分間加熱した後、室温で５分間放置し、遠心してサンプル液を調製し（最終濃度：１００ｎＭ）、ハイブリダイゼーションサンプルとした。【０１１８】
実施例４
[キャビティを有するハイブリダイズ装置（チャンバー）の作製]
本実施例で使用したハイブリダイズ装置（チャンバー）は以下の通りである。このチャンバーは、実施例２で作製したDNAマイクロアレイと、ポリカーボネート製スペーサーと、小孔つきガラス（ホウ珪酸ガラス）製カバーとで形成されている。図６に示すように、スペーサーは、プローブが固定化された領域表面上を長円状に区画して所定深さのキャビティを形成可能な孔部を有するシート状形態を有しており、カバーは、アレイ上に形成されたキャビティの開口を閉鎖するとともに、キャビティの長径の両端に位置されるハイブリダイズ液の供給用の小孔を有している。プローブを固定化した基板にスペーサーを一体化し、さらに、小孔付きカバーをキャビティの開口を覆うように一体化することで、キャビティの長径方向に沿った両端部にハイブリダイズ液供給用の開口をそれぞれ有するハイブリダイズ用チャンバーを有したハイブリダイズ装置が構成されるようになっている。なお、このハイブリダイズ装置におけるキャビティは、長径が約４５ｍｍ、短径が約１５ｍｍ、内部高さが５００μｍ、及びガラス製カバーの厚みが１５０μｍ、容積が約４００μｌであった。またハイブリダイズ装置は、サンプルDNAとのハイブリダイズにより発生するシグナル変化（ここでは蛍光の発生）を検出可能な透過性を備えるとともに、シグナル変化の検出を妨げない程度の自家蛍光しか生じないように構成されている。こうして構成されたチャンバーを用いて、次の方法でハイブリダイズを実施し、次いで、蛍光測定の後、数値解析した。【０１１９】
実施例５
[実施例４に記載のハイブリダイズ装置を用いたハイブリダイゼーションの評価]
本実施例は、実施例４で作製したハイブリダイズ装置を用いてハイブリダイズしたときの蛍光シグナルの向上を評価した例である。すなわち、本実施例では、実施例４のハイブリダイズ装置を用いて、実施例３で調製したサンプル１（未標識ＡＬＤＨ２遺伝子メジャー配列サンプル）溶液を前記ハイブリダイズ装置のキャビティを満たした状態で１６時間、４２℃で静置してハイブリダイズし、プローブ１におけるハイブリダイズ産物の蛍光シグナルを測定し、評価した。対照として、実施例３で作製したDNAマイクロアレイ上に同じサンプルDNA溶液をスポット（２００μｌ、スポット形状：直径約１００μｍの円状）し、カバーガラスをかぶせ、16hr、42℃で静置ハイブリダイズを行った後、洗浄および乾燥工程を経て、同様に蛍光を測定し、数値解析ソフト（GenePix pro Axon社製）で蛍光シグナルの数値化を行った（対照例５）。本実施例と対照のデバイス、工程およびその特徴を図７に示し、ハイブリダイズ評価及び蛍光シグナル評価の組み合わせを表４に示す。蛍光測定はバイオチップリーダー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ 社製）を用いて行った。結果を図７に併せて示す。
表４
2006075735.tif 000031
【０１２０】
図７に示すように実施例５の蛍光シグナルは対照例５の１．８倍であり、サンプルDNAの検出能が向上していることがわかった。この結果によれば、実施例４で作製したハイブリダイズ装置を用いることにより、ハイブリダイズ効率を向上させることができることが明らかであった。また対照例５と比べ、実施例５では、ハイブリダイズから蛍光測定までの間の工程は不要なため、洗浄および乾燥に要する時間（およそ２時間）を短縮できた。【０１２１】
実施例６
本実施例は、Cy3蛍光試薬等で標識されていないＡＬＤＨ２遺伝子サンプルの検出を評価した例である。本実施例では、実施例５と同様、実施例４のハイブリダイズ装置を用いて、実施例３で調製した未標識のサンプルDNA溶液（サンプル１〜３）でハイブリダイズし、ハイブリダイズ産物の蛍光シグナルと同一プローブのスポット間の蛍光シグナルのバラツキ（CV）を評価した。対照としてCy3蛍光試薬で標識されたサンプルDNA溶液（サンプル４〜６）でハイブリダイズし、洗浄、乾燥後に蛍光を測定した。ハイブリダイズおよび蛍光シグナルの評価の組み合わせを表５に示す。蛍光測定はバイオチップリーダー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ 社製）を用いて行った。結果を図８及び図９に示す。【０１２２】
表５
2006075735.tif 000032
【０１２３】
図８と図９とを比較すると、図９の対照例６ではCVが高く、Cy3蛍光試薬で標識された各サンプルDNA（サンプル４〜６）の検出は困難であった。一方、図８の実施例６ではCVが低く、標識されていない各サンプルDNA（サンプル１〜３）をそれぞれ検出することができた。本実施例により、実施例４で作製した塩基認識型蛍光性核酸塩基含有のオリゴデオキシリボヌクレオチドプローブが固定されたDNAマイクロアレイに対してチャンバーを備えるハイブリダイズ装置を用いることで、標識されていないサンプルDNAであってもALDH2遺伝子の一塩基多型を精度よく確実に検出できることがわかった。【０１２４】
実施例７
本実施例は、実施例４で作製したハイブリダイズ装置が形成するキャビティ内の液体を攪拌することと、DNAマイクロアレイ内の同一プローブのスポット間の蛍光シグナルのばらつき（CV）との関係を評価した例である。本実施例では、実施例５と同様、実施例４のハイブリダイズ装置（蛍光塩基含有のオリゴデオキシリボヌクレオチドが固定）に、実施例３で調製したサンプルDNAの調製に記載の未標識の長鎖DNAサンプル溶液3種（サンプル７〜９）を加え、ハイブリダイズ装置のチャンバーに供給したサンプル溶液を攪拌しながらハイブリダイズ(42℃、16ｈｒ)し、ハイブリダイズ産物の蛍光シグナルと同一プローブのスポット間の蛍光シグナルのCVを評価した。なお、キャビティ内のサンプル溶液の撹拌は、ハイブリダイズ装置を回転させることによって行った。対照として、サンプル溶液を加えたDNAマイクロアレイを静置(42℃、16hr)してハイブリダイズする以外は、実施例７と同様に操作して、ハイブリダイズ産物の蛍光シグナルと同一プローブのスポット間の蛍光シグナルのCVを評価した。ハイブリダイズ評価及び蛍光シグナルの評価の組み合わせを表６に示す。また、蛍光測定はバイオチップリーダー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ 社製）を用いて行った。結果を図１０に示す。【０１２５】
表６
2006075735.tif 000033
図１０に示すように、実施例４で作製したハイブリダイズ装置においてハイブリダイズ溶液を撹拌することで、サンプル間の蛍光シグナルの差は広がる結果を得た。一方、同一プローブのスポット間の蛍光シグナルのCVは6〜8％から5％未満に低減し、サンプル検出の信頼性が向上する結果を得た。以上のことから、キャビティ内のハイブリダイズ溶液を撹拌することにより、ハイブリダイゼーション効率が向上するとともに、検出精度が向上することがわかった。【０１２６】
実施例８
本実施例は、ＡＬＤＨ２遺伝子の変異部位検出用の蛍光塩基を含有するオリゴデオキシリボヌクレオチドの定常領域配列中に内部標準検出用の異なる蛍光塩基をもつプローブによるＡＬＤＨ２遺伝子サンプルの検出を評価した例である。本実施例では、実施例５と同様、実施例４のハイブリダイズ装置に、実施例３で調製したサンプルDNAの調製に記載の未標識の長鎖ＤＮＡサンプル溶液種（サンプル７：ＡＬＤＨ２遺伝子メジャーホモサンプル、サンプル８：ＡＬＤＨ２遺伝子マイナーホモサンプル、サンプル９：ＡＬＤＨ２遺伝子へテロサンプル）を加え、ハイブリダイズ装置のキャビティに供給したハイブリダイズ溶液を、ハイブリダイズ装置を回転させることにより攪拌しながらハイブリダイズ(42℃、16ｈｒ)し、ハイブリダイズ産物の変異部位検出用の蛍光塩基由来の蛍光シグナルと内部標準検出用の蛍光塩基由来の蛍光シグナルとを測定し、評価した。ハイブリダイズ評価及び蛍光シグナルの評価の組み合わせを表７に示す。また、蛍光測定はバイオチップリーダー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ 社製）を用いて行った。結果を図１１に示す。
表７
2006075735.tif 000034
【０１２７】
図１１に示すように、内部標準検出用蛍光塩基シグナル強度を横軸に変異部位検出用蛍光塩基シグナルを縦軸に取ったとき、内部標準用蛍光塩基シグナルの強度はおおよそ一定であったのに対して、変異部位検出用蛍光塩基シグナルは、サンプル７〜９における変異の有無にほぼ対応して変化していた。内部標準検出用蛍光塩基シグナル強度に対する変異部位検出用蛍光塩基シグナルの比率は、サンプル７〜９（メジャーホモ、マイナーホモ、ヘテロ）における変異部位の比率に対応していることがわかった。以上のことから、プローブ３において用いた定常領域に導入した塩基識別型蛍光性核酸塩基は、内部標準シグナルとして使用できることがわかった。すなわち、こうした内部標準検出用塩基識別型蛍光性核酸塩基を有するプローブによれば、アレイに供給されるサンプル量の変動、標識量の変動及び遺伝子ごとのＤＮＡ量の変動に関わらず、サンプル中のターゲット部位の相対量を検出することができる。したがって、通常、変異遺伝子を検出するためには、メジャー型（例えば、プローブ１）のプローブとマイナー型（例えば、プローブ６）のプローブの2種類のプローブを用いて評価を行っていたが、本実施例によれば、１種類のプローブでしかもミスハイブリダイゼーションの影響もなく容易に変異遺伝子を検出できることが分かった。【０１２８】
実施例９
本実施例は、実施例塩基識別型蛍光性核酸塩基含有のオリゴデオキシリボヌクレオチドプローブを用いて、慢性骨髄性白血病の原因遺伝子とされるbcr/abl遺伝子のサンプルの検出を評価した例である。すなわち、本実施例では、実施例５と同様、実施例４のハイブリダイズ装置を用いて、実施例３で調製した未標識のサンプルDNA溶液（サンプル１０：ｂｃｒ遺伝子のｂ３近傍の正常配列サンプル、サンプル１１：ｂｃｒ／ａｂｌ遺伝子のｂ３ａ２型のブレークポイント近傍配列サンプル）でハイブリダイズし、ハイブリダイズ産物の蛍光シグナルを測定し、評価した。対照として、プローブ４及び５を用い、Cy3蛍光試薬で標識されたサンプルDNA溶液（サンプル１２：ｂｃｒ遺伝子のｂ３近傍の正常配列サンプル、サンプル１３：ｂｃｒ／ａｂｌ遺伝子のｂ３ａ２型のブレークポイント近傍配列サンプル）でハイブリダイズし、洗浄、乾燥後にＣｙ３の蛍光を測定した。ハイブリダイズ評価及び蛍光シグナルの評価の組み合わせを表８に示す。蛍光測定はバイオチップリーダー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ 社製）を用いて行った。結果を図１２及び図１３に示す。
表８
2006075735.tif 000035
【０１２９】
図１２及び図１３を比較すると、図１２の実施例９では、ｂｃｒ／ａｂｌ遺伝子のｂ３ａ２型ブレークポイント特異的プローブ４と２種類のＤＮＡサンプルのハイブリダイズ結果は、明らかにキメラ遺伝子のブレークポイント近傍配列サンプル（サンプル１１）に有意に高いシグナルを示した。また、ｂｃｒ正常配列を検出するプローブ５と２種類のＤＮＡサンプルのハイブリダイズ結果は、反対に、ｂｃｒ正常配列サンプル（サンプル１０）に有意に高いシグナルを示した。これに対して、図１３の対照例９では、プローブ４及びプローブ５に対するそれぞれのハイブリダイズ産物の蛍光シグナルの強度は、いずれのサンプル(サンプル１２：ｂｃｒ遺伝子正常配列サンプル、サンプル１３：ｂｃｒ／ａｂｌキメラ遺伝子ブレークポイント配列サンプル)の間に有意なシグナル強度の差が認められなかった。【０１３０】
以上のことから、本実施例によれば、共通配列を有しサンプルのミスハイブリダイゼーションを生じうるプローブであっても、両者プローブ間で配列の特異性の高い領域（例えば、ブレークポイント近傍あるいは両プローブ間で共通しない部分）に塩基識別型蛍光核酸塩基を含め、該塩基の蛍光シグナルを検出することで、容易に２種類のサンプルを区別することができることがわかった。なお、これらの２種類のプローブの配列はｂｃｒ遺伝子のｂ３遺伝子の部分配列を識別する配列を共通して有するとともに、２種類のサンプルにも同様にｂ３遺伝子の部分配列を共通していて有している。このため、ｂ３正常配列サンプル（サンプル１２）は、ｂ３ａ２プローブ（プローブ４）に対してミスハイブリダイゼーションし、ｂ３ａ２キメラ配列サンプル（サンプル１３）は、ｂ３近傍正常配列プローブ（プローブ５）にミスハイブリダイゼーションする。プローブ４及びプローブ５に対する同様のミスハイブリダイゼーションは、サンプル１０及び１１においても生じるが、プローブ４及び５に含まれる塩基識別型蛍光性塩基は、ミスハイブリダイゼーションの場合には、蛍光を発しない。このため、実施例９のようにプローブ４及び５における蛍光性塩基のシグナルを検出することで、共通部分を有するプローブであっても完全に一致するＤＮＡサンプルのみを検出することができたと考えられる。【０１３１】
実施例１０
[粒子状で多孔質の固相担体に固定されたBDFプローブによる評価]
本実施例は、塩基識別型蛍光性塩基含有ＡＬＤＨ２遺伝子メジャー配列プローブ（プローブ１）と塩基識別型蛍光性塩基含有ＡＬＤＨ２遺伝子マイナー配列プローブ（プローブ６）を別々に固定した粒子状で多孔質の固相担体を用い、ALDH2遺伝子サンプルの検出を評価した例である。固相担体材料としては、無機化合物、合成高分子化合物、天然高分子化合物、ガラスなどが挙げられるが、本実施例では、まず初めに、表面をプラズマ照射により活性化し、脱気した多孔質ガラス粒子（平均粒子径3.1μm、ポアサイズ30nm）を、エポキシを官能基にもつシラン剤（信越シリコーン、LS-2940）１wt%水溶液に浸漬（1hr、常温）してカップリングさせ、余剰分を水で洗浄したものを用いた。【０１３２】
プローブ１及び６の水溶液に上記多孔質ガラス粒子を加え、表面のシラン剤のエポキシ基と共有結合させた（16hrインキュベート）後、余剰分をPBS溶液で洗浄した。次に、これらのプローブをそれぞれ固定化したガラス粒子の等量混合物に対して、実施例３で調製した未標識の長鎖DNAサンプル溶液3種（サンプル７〜９、ＡＬＤＨ２遺伝子メジャーホモサンプル、同マイナーホモサンプル及び同へテロサンプル）をそれぞれ供給し、ハイブリダイズ(42℃、15min)を行った。最後に、フローサイトメーターで測定を行い、各プローブの蛍光性塩基のシグナル（プローブ１については、励起波長360±20ｎｍ、蛍光波長460±25ｎｍ、プローブ６については励起波長360±20ｎｍ、蛍光波長400ｎｍ）を測定した。フローサイトメーターによる測定はCyto ACE-300（日本分光製）を用いて行った。結果を図１４に示す。【０１３３】
図１４に示すように、それぞれのサンプルにおけるメジャー配列、マイナー配列の比率に応じた蛍光シグナル比が得られた。すなわち、本実施例によれば、粒子状の固相担体を用いた場合であっても、効率的なハイブリダイゼーションと特異的なハイブリダイゼーションが可能であることがわかった。【０１３４】
実施例１１
[平板状で液体透過性の固相担体に固定されたBDFプローブによる評価]
本実施例は、塩基識別型蛍光性塩基含有ＡＬＤＨ２遺伝子メジャー配列プローブ（プローブ１）と塩基識別型蛍光性塩基含有ＡＬＤＨ２遺伝子マイナー配列プローブ（プローブ６）を固定した平板状で液体透過性の固相担体を用い、ＡＬＤＨ２遺伝子サンプルの検出を評価した例である。固相担体材料としては、無機化合物、合成高分子化合物、天然高分子化合物、ガラスなどが挙げられるが、本実施例では、まず初めに、表面をプラズマ照射により活性化し、脱気した多孔質ガラス板（ポアサイズ１０ｎｍ）を、エポキシを官能基にもつシラン剤（信越シリコーン、LS-2940）１wt%水溶液に浸漬（1hr、常温）してカップリングさせ、余剰分を水で洗浄したものを用いた。【０１３５】
次に、プローブ１及び６を予め定めたガラス板上の位置にインクジェット方式でスポットし、表面のシラン剤のエポキシ基と共有結合させた（16hrインキュベート）後、余剰分をPBS溶液で洗浄した。このガラス板内に、実施例３で調製したサンプルDNAの調製に記載の、未標識の長鎖DNAサンプル溶液3種（サンプル７〜９、ＡＬＤＨ２遺伝子メジャーホモサンプル、同マイナーホモサンプル及び同へテロサンプル）をそれぞれ供給し、含侵させて満たした状態でハイブリダイズ反応(42℃、15min)を行った。サンプル溶液は洗浄することなく、ガラス板内に満たされた状態で、蛍光顕微鏡（オリンパスBX50）およびCCDカメラ（オリンパスM3204-C）でスポット画像を取得した後、各プローブの蛍光塩基シグナル（プローブ１については、励起波長360±20ｎｍ、蛍光波長460±25ｎｍ、プローブ６については励起波長360±20ｎｍ、蛍光波長400ｎｍ）を測定し、評価した。結果を、図１５に示す。【０１３６】
図１５に示すように、それぞれのサンプルにおけるメジャー配列、マイナー配列の比率に応じた蛍光シグナル比が得られた。すなわち、本実施例によれば、粒子状の固相担体を用いた場合であっても、効率的なハイブリダイゼーションと特異的なハイブリダイゼーションが可能であることがわかった。【０１３７】
本明細書の一部には、２００２年１２月２６日に出願された米国仮出願番号６０／４３５，９９５、２００３年９月５日に出願された日本国特許出願番号２００３−３１４５５６、２００３年１１月２０日に出願された米国仮出願番号６０／５２３，３１８、２００３年１２月２４日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１６６０２、２００４年３月９日に出願された米国出願番号１０／７９５，４３６、および２００５年３月９日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００４７０３の全内容が引用により組み込まれる。【０１３８】
本発明は２００５年１月１４日に出願された米国仮出願番号６０／６４３，６０３、および２００５年３月１１日に出願された米国仮出願番号６０／６６０，３３４を優先権主張の基礎としており、引用によりその内容のすべてが編入される。
【産業上の利用可能性】
【０１３９】
本発明は、生物由来の試料中の核酸の検出装置の製造及びその検出結果を利用する産業に利用できる。
【配列の説明】
【０１４０】
配列番号１〜７：合成ヌクレオチド
配列番号１４〜１７：合成ヌクレオチド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2006075735.tif 000048
【図１４】
2006075735.tif 000049
【図１５】
2006075735.tif 000050
【配列表】
2006075735000001.app
【国際調査報告】
2006075735.tif 000051
2006075735.tif 000052