(57)【要約】本発明は、１６位水酸化マクロライド系化合物を直接生産する遺伝子組換え微生物、およびそれらの遺伝子組換え微生物を用いた１６位水酸化マクロライド系化合物の製造方法を提供する。詳しくは、マクロライド系化合物プラジエノライドの生合成に関与するポリペプチドをコードするＤＮＡおよびプラジエノライドの１６位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを有する遺伝子組換え微生物、およびそれらの遺伝子組換え微生物を培地で培養し、その培養液から１６位水酸化マクロライド系化合物を採取することを特徴とする、１６位水酸化マクロライド系化合物の製造方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
2006126723.tif 000059
（但し、Ｒは水素原子または水酸基を示す）で表わされる１６位水酸化マクロライド系化合物を生産する能力を有する微生物であって、
（ａ）  式（ＩＩ）
2006126723.tif 000060
（但し、Ｒは水素原子または水酸基を示す）で表わされるマクロライド系化合物の生合成に関与するポリペプチドを一部にまたは全体としてコードするＤＮＡ、および
（ｂ）前記式（ＩＩ）で表わされるマクロライド系化合物の１６位水酸化酵素活性を有するポリペプチドを一部にまたは全体としてコードするＤＮＡ、
を有する遺伝子組換え微生物。
【請求項２】
前記（ａ）で表わされるＤＮＡが、ポリケチド合成酵素活性を有するポリペプチド、７位アセチル化酵素活性を有するポリペプチド、１８，１９位エポキシ化酵素活性を有するポリペプチドおよび転写調節因子活性を有するポリペプチドを一部にまたは全体としてコードするＤＮＡである請求項１記載の遺伝子組換え微生物。
【請求項３】
前記（ａ）で表わされるＤＮＡが、
（ａ−１）配列番号１の塩基８３４０から塩基２７９３５までの連続した塩基配列
（ａ−２）配列番号１の塩基２８０２１から塩基４９０９８までの連続した塩基配列
（ａ−３）配列番号１の塩基４９１３４から塩基６０２６９までの連続した塩基配列
（ａ−４）配列番号１の塩基６０２６９から塩基６５６９２までの連続した塩基配列
（ａ−５）配列番号１の塩基６８１６０から塩基６６９７０までの連続した塩基配列
（ａ−６）配列番号１の塩基６９５６８から塩基６８２７０までの連続した塩基配列、および
（ａ−７）配列番号１の塩基７２７２５から塩基７００２０までの連続した塩基配列
を含んでなるＤＮＡまたはその改変体である請求項１または２記載の遺伝子組換え微生物。
【請求項４】
前記（ａ）で表わされるＤＮＡが、さらに６位水酸化酵素活性を有するポリペプチドを一部にまたは全体としてコードするＤＮＡを含む請求項２または３記載の遺伝子組換え微生物。
【請求項５】
６位水酸化酵素活性を有するポリペプチドを一部にまたは全体としてコードするＤＮＡが、配列番号１の塩基６５７０７から塩基６６９０３までの連続した塩基配列を含むＤＮＡまたはその改変体である請求項４記載の遺伝子組換え微生物。
【請求項６】
前記（ｂ）で表わされるＤＮＡが、
（ｂ−１）配列番号２の塩基１３２２から塩基２５４８までの連続した塩基配列、
（ｂ−２）配列番号３の塩基４２０から塩基１６０４までの連続した塩基配列、および
（ｂ−３）配列番号４の塩基１７２から塩基１３８３までの連続した塩基配列
からなる群より選択されるＤＮＡまたはその改変体である請求項１から５までのいずれかの請求項に記載の遺伝子組換え微生物。
【請求項７】
前記（ｂ）で表わされるＤＮＡが、配列番号２の塩基１３２２から塩基２５４８までの連続した塩基配列を含んでなるＤＮＡの改変体であって、以下の１）〜６）からなる群より選択される改変部位を１または２以上有する、請求項１から６までのいずれかの請求項に記載の遺伝子組換え微生物。
１）塩基１５９２から塩基１５９４にかけての配列ｃｇｃを、アルギニン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
２）塩基１６５５から塩基１６５７にかけての配列ａｔｇを、メチオニン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
３）塩基１９０４から塩基１９０６にかけての配列ｃｇｃを、アルギニン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
４）塩基２０２７から塩基２０２９にかけての配列ｃｇｃを、アルギニン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
５）塩基２０５４から塩基２０５６にかけての配列ａｔｃを、イソロイシン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
６）塩基２５２８から塩基２５３０にかけての配列ｃｔｇを、ロイシン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
【請求項８】
前記（ｂ）で表わされるＤＮＡが、配列番号２の塩基１３２２から塩基２５４８までの連続した塩基配列を含んでなるＤＮＡの改変体であって、以下の１）〜６）からなる群より選択される改変部位を１または２以上有する、請求項１から６までのいずれかの請求項に記載の遺伝子組換え微生物。
１）塩基１５９２から塩基１５９４にかけての配列ｃｇｃを、システイン、メチオニンまたはプロリンをコードするコドンに改変した改変部位
２）塩基１６５５から塩基１６５７にかけての配列ａｔｇを、スレオニンまたはセリンをコードするコドンに改変した改変部位
３）塩基１９０４から塩基１９０６にかけての配列ｃｇｃを、ロイシン、イソロイシン、プロリン、チロシンまたはフェニルアラニンをコードするコドンに改変した改変部位
４）塩基２０２７から塩基２０２９にかけての配列ｃｇｃを、ロイシン、イソロイシンまたはプロリンをコードするコドンに改変した改変部位
５）塩基２０５４から塩基２０５６にかけての配列ａｔｃを、フェニルアラニンまたはバリンをコードするコドンに改変した改変部位
６）塩基２５２８から塩基２５３０にかけての配列ｃｔｇを、メチオニン、システィンまたはイソロイシンをコードするコドンに改変した改変部位
【請求項９】
前記（ｂ）で表わされるＤＮＡが、配列番号２の塩基１３２２から塩基２５４８までの連続した塩基配列を含んでなるＤＮＡの改変体であって、以下の１）〜６）からなる群より選択される改変部位を１または２以上有する、請求項１から６までのいずれかの請求項に記載の遺伝子組換え微生物。
１）塩基１５９２から塩基１５９４にかけての配列ｃｇｃを、システインをコードするコドンに改変した改変部位
２）塩基１６５５から塩基１６５７にかけての配列ａｔｇを、スレオニンをコードするコドンに改変した改変部位
３）塩基１９０４から塩基１９０６にかけての配列ｃｇｃを、ロイシンまたはチロシンをコードするコドンに改変した改変部位
４）塩基２０２７から塩基２０２９にかけての配列ｃｇｃを、ロイシンをコードするコドンに改変した改変部位
５）塩基２０５４から塩基２０５６にかけての配列ａｔｃを、フェニルアラニンをコードするコドンに改変した改変部位
６）塩基２５２８から塩基２５３０にかけての配列ｃｔｇを、メチオニンをコードするコドンに改変した改変部位
【請求項１０】
前記（ａ）で表わされるＤＮＡを有する宿主に、異種微生物由来の前記（ｂ）で表わされるＤＮＡを組み込んだ請求項１記載の遺伝子組換え微生物。
【請求項１１】
前記（ｂ）で表わされるＤＮＡを有する宿主に、異種微生物由来の前記（ａ）で表わされるＤＮＡを組み込んだ請求項１記載の遺伝子組換え微生物。
【請求項１２】
前記（ａ）および（ｂ）で表わされるいずれのＤＮＡも有しない宿主に、異種微生物由来の前記（ａ）および（ｂ）で表わされるＤＮＡを両方とも組み込んだ請求項１記載の遺伝子組換え微生物。
【請求項１３】
式（Ｉ）で表わされる１６位水酸化マクロライド系化合物を生産する能力を有する遺伝子組換え微生物が、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌株である請求項１から１２までのいずれかの請求項に記載の遺伝子組換え微生物。
【請求項１４】
下記の培地３０ｍＬを入れた２５０ｍＬ容の三角フラスコに遺伝子組換え微生物を植菌し、２５℃で４日間回転振とう培養（２２０ｒｐｍ）した後、アセトニトリル２７０ｍＬを加えて抽出し、得られた抽出液を下記の測定条件でＨＰＬＣ分析し、式（Ｉ）で表わされる１６位水酸化マクロライド系化合物を定量したときに、式（Ｉ）で表わされる１６位水酸化マクロライド系化合物を培養液１Ｌ当り５０ｍｇ以上生産する能力を有する請求項１から１３までのいずれかの請求項に記載の遺伝子組換え微生物。
（培地）
溶性デンプン５％、グルコース１％、ファルマメディア３％、ＣａＣＯ３  ０．１％、ｐＨ７．５
（ＨＰＬＣ測定条件）
分析装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣ  １０Ａｖｐ
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ  ＵＧ−３（φ４．６ｍｍ×５０ｍｍ  ３μｍ）
移動相：４５％〜５５％メタノール（０〜５分）、５５％メタノール（５〜１３分）、５５％〜７０％メタノール（１３〜２１分）、７０％メタノール（２１〜２５分）
流速：１．２ｍＬ／分
検出：ＵＶ２４０ｎｍ
インジェクション容量：５μＬ
カラム温度：４０℃
【請求項１５】
請求項１から１４までのいずれかの請求項に記載された遺伝子組換え微生物を、栄養培地中で培養し、その培養液から式（Ｉ）で表わされる１６位水酸化マクロライド系化合物を採取することを特徴とする、式（Ｉ）で表わされる１６位水酸化マクロライド系化合物もしくはその薬理学上許容される塩またはそれらの水和物の製造方法。
【請求項１６】
培養液中にシクロデキストリン類を存在させることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
シクロデキストリン類が、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、部分メチル化β−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、グリコシル−β−シクロデキストリンおよびヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンからなる群から選択されるシクロデキストリン類である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
配列番号２の塩基１３２２から塩基２５４８までの連続した塩基配列を含んでなるＤＮＡの改変体であって、以下の１）〜６）からなる群より選択される改変部位を１または２以上含んでなるＤＮＡ改変体。
１）塩基１５９２から塩基１５９４にかけての配列ｃｇｃを、アルギニン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
２）塩基１６５５から塩基１６５７にかけての配列ａｔｇを、メチオニン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
３）塩基１９０４から塩基１９０６にかけての配列ｃｇｃを、アルギニン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
４）塩基２０２７から塩基２０２９にかけての配列ｃｇｃを、アルギニン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
５）塩基２０５４から塩基２０５６にかけての配列ａｔｃを、イソロイシン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
６）塩基２５２８から塩基２５３０にかけての配列ｃｔｇを、ロイシン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
【請求項１９】
配列番号２の塩基１３２２から塩基２５４８までの連続した塩基配列を含んでなるＤＮＡの改変体であって、以下の１）〜６）からなる群より選択される改変部位を１または２以上含んでなるＤＮＡ改変体。
１）塩基１５９２から塩基１５９４にかけての配列ｃｇｃを、システイン、メチオニンまたはプロリンをコードするコドンに改変した改変部位
２）塩基１６５５から塩基１６５７にかけての配列ａｔｇを、スレオニンまたはセリンをコードするコドンに改変した改変部位
３）塩基１９０４から塩基１９０６にかけての配列ｃｇｃを、ロイシン、イソロイシン、プロリン、チロシンまたはフェニルアラニンをコードするコドンに改変した改変部位
４）塩基２０２７から塩基２０２９にかけての配列ｃｇｃを、ロイシン、イソロイシンまたはプロリンをコードするコドンに改変した改変部位
５）塩基２０５４から塩基２０５６にかけての配列ａｔｃを、フェニルアラニンまたはバリンをコードするコドンに改変した改変部位
６）塩基２５２８から塩基２５３０にかけての配列ｃｔｇを、メチオニン、システインまたはイソロイシンをコードするコドンに改変した改変部位
【請求項２０】
配列番号２の塩基１３２２から塩基２５４８までの連続した塩基配列を含んでなるＤＮＡの改変体であって、以下の１）〜６）からなる群より選択される改変部位を１または２以上含んでなるＤＮＡ改変体。
１）塩基１５９２から塩基１５９４にかけての配列ｃｇｃを、システインをコードするコドンに改変した改変部位
２）塩基１６５５から塩基１６５７にかけての配列ａｔｇを、スレオニンをコードするコドンに改変した改変部位
３）塩基１９０４から塩基１９０６にかけての配列ｃｇｃを、ロイシンまたはチロシンをコードするコドンに改変した改変部位
４）塩基２０２７から塩基２０２９にかけての配列ｃｇｃを、ロイシンをコードするコドンに改変した改変部位
５）塩基２０５４から塩基２０５６にかけての配列ａｔｃを、フェニルアラニンをコードするコドンに改変した改変部位
６）塩基２５２８から塩基２５３０にかけての配列ｃｔｇを、メチオニンをコードするコドンに改変した改変部位
【請求項２１】
請求項１８から２０までのいずれかの請求項に記載されたＤＮＡ改変体によりコードされるポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１６位水酸化マクロライド系化合物を生産する能力を有する遺伝子組換え微生物、およびそれらの微生物を用いた１６位水酸化マクロライド系化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
放線菌の生産する様々な代謝産物のなかには生理活性物質として重要な物質が見出されている。とりわけ構造上ポリケチドを母核にもつ化合物（以下、ポリケチド化合物という）が多く見出されている。例えば、抗菌性物質として知られるエリスロマイシン、ジョサマイシン、タイロシン、ミデカマイシン、マイシナマイシン、抗真菌性物質として知られるナイスタチン、アンフォテリシン、殺虫性物質として知られるミルベマイシン、エバーメクチン、免疫抑制物質として知られるタクロリムス、ラパマイシンおよび抗腫瘍性物質として知られるダウノマイシン、アドリアマイシン、アクラシノマイシン等、種々の生物活性を有する化合物が知られている。
そのようなポリケチド化合物の１つとしてプラジエノライドと命名された優れた抗腫瘍活性を示す一群のマクロライド系化合物がある。プラジエノライドは、放線菌ストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）Ｍｅｒ−１１１０７株の培養物から見出された化合物群の総称であり、下記式（Ａ）で示される１１１０７Ｂ（プラジエノライドＢというときがある）をはじめとして５０種以上の類縁体が知られている（ＷＯ２００２／０６０８９０参照）。
2006126723.tif 000002
このようなプラジエノライドのうち、下記式（Ｉ）で示される１６位水酸化体は、強い抗腫瘍活性等の優れた性質を有しているが、その生産性は１１１０７Ｂの生産性よりも少なく、効率的な製造は難しかった。
2006126723.tif 000003
（但し、Ｒは水素原子または水酸基を示す）
なお、式（Ｉ）において、Ｒが水素原子である化合物をＭＥ−２８２、Ｒが水酸基である化合物を１１１０７ＤまたはプラジエノライドＤというときがある。
その後、本出願人らの研究グループは、１１１０７Ｂの１６位水酸化反応を行う、プラジエノライド生産菌とは別の放線菌を見出し（ＷＯ２００３／０９９８１３およびＷＯ２００４／０５０８９０参照）、それらの放線菌から１１１０７Ｂの１６位水酸化反応に関与するＤＮＡ（１６位水酸化酵素およびそのフェレドキシンをコードするＤＮＡ）を取得、同定した（２００５年６月９日頒布のＷＯ−Ａ  ２００５／０５２１５２参照）。
また、プラジエノライド生産菌であるストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）Ｍｅｒ−１１１０７株から１１１０７Ｂの生合成に関与するポリペプチドおよびそれらのポリペプチドをコードするＤＮＡについても取得、同定した（２００６年１月２６日頒布のＷＯ−Ａ  ２００６／００９２７６参照）。
こうしてストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）Ｍｅｒ−１１１０７株またはその改変体を用いて１１１０７Ｂ等を生産し、得られた１１１０７Ｂ等をそれらの１６位水酸化反応を行う他の放線菌により１６位水酸化体へと変換することで、これまでより１６位水酸化体を効率的に製造できるようになった。しかし、２段階の反応を行うため作業上の手間も２倍となり、より効率的な製造方法の確立が望まれていた。
一方、ポリケチド化合物を生産する菌株に、そのポリケチド化合物を修飾する酵素をコードする遺伝子を発現できる形で導入することにより、導入した酵素により修飾されたポリケチド化合物を直接生産した例は知られている。例えば、テトラセノマイシンＣを生産するストレプトミセス・グラウセスセンス（Ｓｔｒｏｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｌａｕｃｅｓｃｅｎｓ）ＧＬＡ．０株に、ストレプトミセス・フラジエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ）Ｔｕ２７１７株の水酸化遺伝子を導入することにより、６−ヒドロキシ−テトラセノマイシンＣが直接生産できることが報告されている（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９５，ｖｏｌ．１７７，６１２６−６１３６参照）。
また、ポリケチド化合物を修飾する酵素をもつ菌株にそのポリケチド化合物の生合成遺伝子を発現できる形で導入することにより、宿主となる菌株が本来持つ酵素により修飾されたポリケチド化合物が直接生産された例も知られている。例えば、テトラセノマイシンＣの６位を水酸化する酵素をもつストレプトミセス・フラジエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ）Ｔｕ２７１７株に、ストレプトミセス・グラウセスセンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｌａｕｃｅｓｃｅｎｓ）ＧＬＡ．０株のテトラセノマイシンＣの生合成遺伝子を導入することにより、６−ヒドロキシ−テトラセノマイシンＣを直接生産できることが報告されている（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９５，ｖｏｌ．１７７，６１２６−６１３６参照）。
さらに、ポリケチド化合物の生合成遺伝子と、そのポリケチド化合物を修飾する酵素をコードする遺伝子の両方を異種菌株に導入することにより、異種菌株による修飾ポリケチド化合物の生産ができる場合がある。例えば、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）Ｋ４−１１４株を宿主に、サッカロポリスポラ・エリスレア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ）株由来の６−エリスロノライドＢ合成酵素をコードする遺伝子とストレプトミセス・アンチビオテカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ１１８９１株由来のＰ−４５０遺伝子の両方を導入することにより、８，８ａ−ジハイドロキシ−６−エリスロノライドＢが直接生産されたことが報告されている（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，２０００，ｖｏｌ．５３，５０２−５０８参照）。
【発明の開示】
【０００３】
本発明の課題は、前記式（Ｉ）で表わされる１６位水酸化マクロライド系化合物を生産する能力を有する遺伝子組換え微生物を提供することである。さらには、それら遺伝子組換え微生物を用いた１６位水酸化マクロライド系化合物の製造方法を提供することである。
本発明者らは、前記課題を解決するため、先に分離同定された１１１０７Ｂの生合成に関与するＤＮＡと１１１０７Ｂの１６位水酸化反応に関与するＤＮＡを両方とも持つ微生物を遺伝子工学の手法により作製（育種）したところ、その培養液に多量の１６位水酸化マクロライド系化合物が蓄積されていることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［２１］に関する。
［１］  式（Ｉ）
2006126723.tif 000004
（但し、Ｒは水素原子または水酸基を示す）で表わされる１６位水酸化マクロライド系化合物を生産する能力を有する微生物であって、
（ａ）  式（ＩＩ）
2006126723.tif 000005
（但し、Ｒは水素原子または水酸基を示す）で表わされるマクロライド系化合物の生合成に関与するポリペプチドを一部にまたは全体としてコードするＤＮＡ、および
（ｂ）  前記式（ＩＩ）で表わされるマクロライド系化合物の１６位水酸化酵素活性を有するポリペプチドを一部にまたは全体としてコードするＤＮＡ、
を有する遺伝子組換え微生物。
［２］  前記（ａ）で表わされるＤＮＡが、ポリケチド合成酵素活性を有するポリペプチド、７位アセチル化酵素活性を有するポリペプチド、１８，１９位エポキシ化酵素活性を有するポリペプチドおよび転写調節因子活性を有するポリペプチドを一部にまたは全体としてコードするＤＮＡである［１］記載の遺伝子組換え微生物。
［３］  前記（ａ）で表わされるＤＮＡが、
（ａ−１）配列番号１の塩基８３４０から塩基２７９３５までの連続した塩基配列
（ａ−２）配列番号１の塩基２８０２１から塩基４９０９８までの連続した塩基配列
（ａ−３）配列番号１の塩基４９１３４から塩基６０２６９までの連続した塩基配列
（ａ−４）配列番号１の塩基６０２６９から塩基６５６９２までの連続した塩基配列
（ａ−５）配列番号１の塩基６８１６０から塩基６６９７０までの連続した塩基配列
（ａ−６）配列番号１の塩基６９５６８から塩基６８２７０までの連続した塩基配列、および
（ａ−７）配列番号１の塩基７２７２５から塩基７００２０までの連続した塩基配列
を含んでなるＤＮＡまたはその改変体である［１］または［２］記載の遺伝子組換え微生物。
［４］  前記（ａ）で表わされるＤＮＡが、さらに６位水酸化酵素活性を有するポリペプチドを一部にまたは全体としてコードするＤＮＡを含む［２］または［３］記載の遺伝子組換え微生物。
［５］  ６位水酸化酵素活性を有するポリペプチドを一部にまたは全体としてコードするＤＮＡが、配列番号１の塩基６５７０７から塩基６６９０３までの連続した塩基配列を含むＤＮＡまたはその改変体である［４］記載の遺伝子組換え微生物。
［６］  前記（ｂ）で表わされるＤＮＡが、
（ｂ−１）配列番号２の塩基１３２２から塩基２５４８までの連続した塩基配列、
（ｂ−２）配列番号３の塩基４２０から塩基１６０４までの連続した塩基配列、および
（ｂ−３）配列番号４の塩基１７２から塩基１３８３までの連続した塩基配列
からなる群より選択されるＤＮＡまたはその改変体である［１］から［５］までのいずれかに記載の遺伝子組換え微生物。
［７］  前記（ｂ）で表わされるＤＮＡが、配列番号２の塩基１３２２から塩基２５４８までの連続した塩基配列を含んでなるＤＮＡの改変体であって、以下の１）〜６）からなる群より選択される改変部位を１または２以上有する、［１］から［６］までのいずれかに記載の遺伝子組換え微生物。
１）塩基１５９２から塩基１５９４にかけての配列ｃｇｃを、アルギニン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
２）塩基１６５５から塩基１６５７にかけての配列ａｔｇを、メチオニン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
３）塩基１９０４から塩基１９０６にかけての配列ｃｇｃを、アルギニン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
４）塩基２０２７から塩基２０２９にかけての配列ｃｇｃを、アルギニン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
５）塩基２０５４から塩基２０５６にかけての配列ａｔｃを、イソロイシン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
６）塩基２５２８から塩基２５３０にかけての配列ｃｔｇを、ロイシン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
［８］  前記（ｂ）で表わされるＤＮＡが、配列番号２の塩基１３２２から塩基２５４８までの連続した塩基配列を含んでなるＤＮＡの改変体であって、以下の１）〜６）からなる群より選択される改変部位を１または２以上有する、［１］から［６］までのいずれかに記載の遺伝子組換え微生物。
１）塩基１５９２から塩基１５９４にかけての配列ｃｇｃを、システイン、メチオニンまたはプロリンをコードするコドンに改変した改変部位
２）塩基１６５５から塩基１６５７にかけての配列ａｔｇを、スレオニンまたはセリンをコードするコドンに改変した改変部位
３）塩基１９０４から塩基１９０６にかけての配列ｃｇｃを、ロイシン、イソロイシン、プロリン、チロシンまたはフェニルアラニンをコードするコドンに改変した改変部位
４）塩基２０２７から塩基２０２９にかけての配列ｃｇｃを、ロイシン、イソロイシンまたはプロリンをコードするコドンに改変した改変部位
５）塩基２０５４から塩基２０５６にかけての配列ａｔｃを、フェニルアラニンまたはバリンをコードするコドンに改変した改変部位
６）塩基２５２８から塩基２５３０にかけての配列ｃｔｇを、メチオニン、システインまたはイソロイシンをコードするコドンに改変した改変部位
［９］  前記（ｂ）で表わされるＤＮＡが、配列番号２の塩基１３２２から塩基２５４８までの連続した塩基配列を含んでなるＤＮＡの改変体であって、以下の１）〜６）からなる群より選択される改変部位を１または２以上有する、［１］から［６］までのいずれかに記載の遺伝子組換え微生物。
１）塩基１５９２から塩基１５９４にかけての配列ｃｇｃを、システインをコードするコドンに改変した改変部位
２）塩基１６５５から塩基１６５７にかけての配列ａｔｇを、スレオニンをコードするコドンに改変した改変部位
３）塩基１９０４から塩基１９０６にかけての配列ｃｇｃを、ロイシンまたはチロシンをコードするコドンに改変した改変部位
４）塩基２０２７から塩基２０２９にかけての配列ｃｇｃを、ロイシンをコードするコドンに改変した改変部位
５）塩基２０５４から塩基２０５６にかけての配列ａｔｃを、フェニルアラニンをコードするコドンに改変した改変部位
６）塩基２５２８から塩基２５３０にかけての配列ｃｔｇを、メチオニンをコードするコドンに改変した改変部位
［１０］  前記（ａ）で表わされるＤＮＡを有する宿主に、異種微生物由来の前記（ｂ）で表わされるＤＮＡを組み込んだ［１］記載の遺伝子組換え微生物。
［１１］  前記（ｂ）で表わされるＤＮＡを有する宿主に、異種微生物由来の前記（ａ）で表わされるＤＮＡを組み込んだ［１］記載の遺伝子組換え微生物。
［１２］  前記（ａ）および（ｂ）で表わされるいずれのＤＮＡも有しない宿主に、異種微生物由来の前記（ａ）および（ｂ）で表わされるＤＮＡを両方とも組み込んだ［１］記載の遺伝子組換え微生物。
［１３］  式（Ｉ）で表わされる１６位水酸化マクロライド系化合物を生産する能力を有する遺伝子組換え微生物が、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌株である［１］から［１２］までのいずれかに記載の遺伝子組換え微生物。
［１４］  下記の培地３０ｍＬを入れた２５０ｍＬ容の三角フラスコに遺伝子組換え微生物を植菌し、２５℃で４日間回転振とう培養（２２０ｒｐｍ）した後、アセトニトリル２７０ｍＬを加えて抽出し、得られた抽出液を下記の測定条件でＨＰＬＣ分析し、式（Ｉ）で表わされる１６位水酸化マクロライド系化合物を定量したときに、式（Ｉ）で表わされる１６位水酸化マクロライド系化合物を培養液１Ｌ当り５０ｍｇ以上生産する能力を有する［１］から［１３］までのいずれかに記載の遺伝子組換え微生物。
（培地）
溶性デンプン５％、グルコース１％、ファルマメディア３％、ＣａＣＯ３  ０．１％、ｐＨ７．５
（ＨＰＬＣ測定条件）
分析装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣ  １０Ａｖｐ
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ  ＵＧ−３（φ４．６ｍｍ×５０ｍｍ  ３μｍ）
移動相：４５％〜５５％メタノール（０〜５分）、５５％メタノール（５〜１３分）、５５％〜７０％メタノール（１３〜２１分）、７０％メタノール（２１〜２５分）
流速：１．２ｍＬ／分
検出：ＵＶ２４０ｎｍ
インジェクション容量：５μＬ
カラム温度：４０℃
［１５］  ［１］から［１４］までのいずれかに記載された遺伝子組換え微生物を、栄養培地中で培養し、その培養液から式（Ｉ）で表わされる１６位水酸化マクロライド系化合物を採取することを特徴とする、式（Ｉ）で表わされる１６位水酸化マクロライド系化合物もしくはその薬理学上許容される塩またはそれらの水和物の製造方法。
［１６］  培養液中にシクロデキストリン類を存在させることを特徴とする［１５］に記載の方法。
［１７］  シクロデキストリン類が、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、部分メチル化β−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、グリコシル−β−シクロデキストリンおよびヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンからなる群から選択されるシクロデキストリン類である［１６］に記載の方法。
［１８］  配列番号２の塩基１３２２から塩基２５４８までの連続した塩基配列を含んでなるＤＮＡの改変体であって、以下の１）〜６）からなる群より選択される改変部位を１または２以上含んでなるＤＮＡ改変体。
１）塩基１５９２から塩基１５９４にかけての配列ｃｇｃを、アルギニン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
２）塩基１６５５から塩基１６５７にかけての配列ａｔｇを、メチオニン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
３）塩基１９０４から塩基１９０６にかけての配列ｃｇｃを、アルギニン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
４）塩基２０２７から塩基２０２９にかけての配列ｃｇｃを、アルギニン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
５）塩基２０５４から塩基２０５６にかけての配列ａｔｃを、イソロイシン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
６）塩基２５２８から塩基２５３０にかけての配列ｃｔｇを、ロイシン以外のアミノ酸をコードするコドンに改変した改変部位
［１９］  配列番号２の塩基１３２２から塩基２５４８までの連続した塩基配列を含んでなるＤＮＡの改変体であって、以下の１）〜６）からなる群より選択される改変部位を１または２以上含んでなるＤＮＡ改変体。
１）塩基１５９２から塩基１５９４にかけての配列ｃｇｃを、システイン、メチオニンまたはプロリンをコードするコドンに改変した改変部位
２）塩基１６５５から塩基１６５７にかけての配列ａｔｇを、スレオニンまたはセリンをコードするコドンに改変した改変部位
３）塩基１９０４から塩基１９０６にかけての配列ｃｇｃを、ロイシン、イソロイシン、プロリン、チロシンまたはフェニルアラニンをコードするコドンに改変した改変部位
４）塩基２０２７から塩基２０２９にかけての配列ｃｇｃを、ロイシン、イソロイシンまたはプロリンをコードするコドンに改変した改変部位
５）塩基２０５４から塩基２０５６にかけての配列ａｔｃを、フェニルアラニンまたはバリンをコードするコドンに改変した改変部位
６）塩基２５２８から塩基２５３０にかけての配列ｃｔｇを、メチオニン、システインまたはイソロイシンをコードするコドンに改変した改変部位
［２０］  配列番号２の塩基１３２２から塩基２５４８までの連続した塩基配列を含んでなるＤＮＡの改変体であって、以下の１）〜６）からなる群より選択される改変部位を１または２以上含んでなるＤＮＡ改変体。
１）塩基１５９２から塩基１５９４にかけての配列ｃｇｃを、システインをコードするコドンに改変した改変部位
２）塩基１６５５から塩基１６５７にかけての配列ａｔｇを、スレオニンをコードするコドンに改変した改変部位
３）塩基１９０４から塩基１９０６にかけての配列ｃｇｃを、ロイシンまたはチロシンをコードするコドンに改変した改変部位
４）塩基２０２７から塩基２０２９にかけての配列ｃｇｃを、ロイシンをコードするコドンに改変した改変部位
５）塩基２０５４から塩基２０５６にかけての配列ａｔｃを、フェニルアラニンをコードするコドンに改変した改変部位
６）塩基２５２８から塩基２５３０にかけての配列ｃｔｇを、メチオニンをコードするコドンに改変した改変部位
［２１］  ［１８］から［２０］までのいずれかに記載されたＤＮＡ改変体によりコードされるポリペプチド。
なお、本明細書における各用語の定義は以下のとおりである。
「遺伝子組換え微生物」とは、遺伝子組換え技術を用いて特定の微生物に別の生物由来の遺伝子を導入した微生物（細菌、放線菌、酵母、糸状菌等）を意味し、それに用いる遺伝子導入の手法は、プラスミド等のベクターを用いた遺伝子組換えだけでなく、相同組換え等の手法も包含する。
「ＤＮＡの改変体」とは、
（１）元のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
（２）元のＤＮＡの塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列を有するＤＮＡ、
（３）元のＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡ、または
（４）遺伝暗号の縮重のため、元のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしないが、（１）項から（３）項までのいずれかの項で定義されたＤＮＡがコードするアミノ酸配列と同じ配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
を意味する。
なお、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、例えば、元のＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。
「類縁体」とは、化学構造を特徴づける主骨格が同じで、修飾の様式や側鎖の形状などが異なる化合物を意味する。
「１６位水酸化酵素活性」とは、マクロライド系化合物（ＩＩ）の１６位水素原子を水酸基に変換する活性を意味する。
「６位水酸化酵素活性」とは、下記式（Ｂ）で表わされるマクロライド系化合物（ＭＥ−２６５というときがある）の６位水素原子を水酸基に変換する活性を意味する。
2006126723.tif 000006
「ポリケチド合成酵素活性」とは、下記式（Ｅ）で表わされるマクロライド系化合物を合成する活性を意味する。
2006126723.tif 000007
「７位アセチル化酵素活性」とは、下記式（Ｃ）で表わされるマクロライド系化合物の７位水酸基をアセチル基に変換する活性を意味する。
2006126723.tif 000008
（但し、Ｒは水素原子または水酸基を示す）
「１８，１９位エポキシ化酵素活性」とは、式（Ｄ）で表わされるマクロライド系化合物の１８，１９位二重結合をエポキシ基に変換する活性を意味する。
2006126723.tif 000009
（但し、Ｒは水素原子または水酸基を示す）
「転写調節因子活性」とは、マクロライド系化合物（ＩＩ）の生合成に関与するポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を調節する活性を意味する。
本発明により、マクロライド系化合物（ＩＩ）の生合成に関与するポリペプチドをコードするＤＮＡおよびマクロライド系化合物（ＩＩ）の１６位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡをもつ、１６位水酸化マクロライド系化合物（Ｉ）を直接発酵生産することが可能な遺伝子組換え微生物を得ることができる。またその遺伝子組換え微生物を培養し培養液中から採取することにより１６位水酸化マクロライド系化合物（Ｉ）を効率よく生産することができる。
特に１６位水酸化酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列を一部改変したポリペプチドをコードするＤＮＡを上述の方法に適用することにより、１６位水酸化マクロライド系化合物（Ｉ）をさらに効率よく選択的に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、Ｍｅｒ−１１１０７株におけるプラジエノライドの生合成経路を示した図である。
図２は、Ｍｅｒ−１１１０７株におけるプラジエノライドの生合成に関与するＤＮＡの各ＯＲＦとコスミドの対応関係を示した図である。
図３は、プラスミドｐＫＵ２５３の構造を示す図である。
図４は、プラスミドｐＵＣ１９ａｐｈ：：ｏｒｉＴ：：ｉｎｔｐｈｉＣ３１の構造を示す図である。
［発明の詳細な説明］
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明における、マクロライド系化合物（ＩＩ）の生合成に関与するポリペプチドをコードするＤＮＡは、当該技術分野で周知の方法（例えば、モレキュラ・クローニング第２版に記載されたコロニーハイブリダイゼーション法）に従って、当該マクロライド系化合物を生産する能力を有する微生物の培養菌体から得ることができる。このような微生物としては、当該マクロライド系化合物を生産する能力を有するものであれば種および株の種類を問うことなく使用できるが、好ましい微生物としてストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属放線菌に属する菌株を挙げることができる。その一例として、土壌から分離されたストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）Ｍｅｒ−１１１０７株を挙げることができる。Ｍｅｒ−１１１０７株は、ＦＥＲＭ  Ｐ−１８１４４として平成１２年１２月１９日付で日本国３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番３号在の工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、さらに平成１３年１１月２７日付で日本国３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６在の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）において、国際寄託ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８１２に移管された。
以下、Ｍｅｒ−１１１０７株の場合を例に挙げ、目的のＤＮＡを取得する操作の概要を説明する。まずＭｅｒ−１１１０７株のゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で部分分解したものを、大腸菌内で複製可能なコスミドベクターを適当な制限酵素で分解したものと連結して得た組換えＤＮＡを大腸菌に組込み、形質導入株を得る。次に公知の水酸化酵素（シトクロムＰ４５０酵素）遺伝子の断片をプローブとして、先に得られた多数の形質導入株をスクリーニングし、プローブと結合する形質導入株を選択する。そして選択されたコスミド中に存在する水酸化酵素遺伝子と結合するＤＮＡを取得し、配列を決定する。さらにこれを大腸菌に導入し、形質転換された大腸菌が６位水酸化酵素活性をもつことを確認した上で、この６位水酸化酵素をコードするＤＮＡをプローブに用いてサザンハイブリダイゼーションを行い、先に取得した多数の陽性クローン（コスミド）から６位水酸化酵素をコードするＤＮＡに隣接するマクロライド系化合物の生合成遺伝子クラスターを含むコスミドを選択し整列化することにより取得することができる。これらの操作全体についての詳細は、参考例１に記載されており、また本出願人らによるＷＯ−Ａ  ２００６／００９２７６明細書にも記載されており、これらの記載を参照することができる。
こうして取得されるマクロライド系化合物（ＩＩ）の生合成に関与するポリペプチドをコードするＤＮＡの周辺領域を含むヌクレオチド配列（コード配列におけるアミノ酸配列）を配列表の配列番号１に示す。
この配列番号１で示されるＤＮＡには、ｐｌｄＡ  Ｉ（塩基８３４０〜２７９３５）、ｐｌｄＡ  ＩＩ（塩基２８０２１〜４９０９８）、ｐｌｄＡ  ＩＩＩ（塩基４９１３４〜６０２６９）、ｐｌｄＡ  ＩＶ（塩基６０２６９〜６５６９２）、ｐｌｄＢ（塩基６５７０７〜６６９０３）、ｐｌｄＣ（塩基６８１６０〜６６９７０）、ｐｌｄＤ（塩基６９５６８〜６８２７０）およびｐｌｄＲ（塩基７２７２５〜７００２０）の８つのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）が含まれている。
これらのＤＮＡのうち、ｐｌｄＡ  Ｉ、ｐｌｄＡ  ＩＩ、ｐｌｄＡ  ＩＩＩおよびｐｌｄＡ  ＩＶには、既に明らかにされている他のポリケチド生合成遺伝子と同様にモジュールと呼ばれる１またはそれ以上の反復単位をそれぞれ含むいくつかの転写解読枠がある。そして各モジュールは後述するとおりポリケチド合成の縮合反応に関与するアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）、β−ケトアシルＡＣＰ合成酵素（ＫＳ）、アシル転移酵素（ＡＴ）と、β位カルボニル基修飾反応に関与するケトアシル還元酵素（ＫＲ）、脱水酵素（ＤＨ）およびエノイル還元酵素（ＥＲ）から選択されるドメインの全てあるいはいくつかをコードしており最後のモジュールにはポリケチド鎖をポリケチド合成酵素から切り離すチオエステラーゼ（ＴＥ）ドメインが存在している。
図１に、Ｍｅｒ−１１１０７株におけるマクロライド系化合物の生合成経路を示した。開始モジュール（ｌｏａｄｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ）は他のモジュールと違って活性中心のシステインがグルタミンに置換されていることより、ｐｌｄＡ  Ｉは初発反応に関与していることがわかる。またモジュール１０にはチオエステラーゼ（ＴＥ）ドメインがあることより、ｐｌｄＡ  ＩＶはポリケチド基本骨格の合成の最後の反応に関与していることがわかる。こうしてポリケチドの基本骨格が形成された後、さらに、ｐｌｄＤがコードしている１８，１９位エポキシ化酵素、ｐｌｄＣがコードしている７位アセチル化酵素およびｐｌｄＢがコードしている６位水酸化酵素により修飾を受け、マクロライド系化合物（ＩＩ）が生合成される。なお、マクロライド系化合物（ＩＩ）のうち、Ｒが水素原子である化合物は、ｐｌｄＢを欠失させるか、機能を発現しないように改変することにより製造することができる。またｐｌｄＲはエバーメクチン生合成における転写調節因子をコードする遺伝子ａｖｅＲとの相同性が高く、マクロライド系化合物の生合成に関与するＤＮＡの転写調節因子をコードしている。
本発明における、マクロライド系化合物（ＩＩ）の１６位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも、当該技術分野で周知の方法（例えば、モレキュラ・クローニング第２版に記載されたコロニーハイブリダイゼーション法）に従って、当該マクロライド系化合物の１６位水酸化能を有する微生物の培養菌体から得ることができる。このような微生物としては、当該マクロライド系化合物の１６位水素原子を水酸基に変換する能力を有するものであれば種および株の種類を問うことなく使用できるが、好ましい微生物として放線菌に属する菌株を挙げることができる。その例として、土壌から分離された、ストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）Ａ−１５４４株、ストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）Ｍｅｒ−１１１０７株あるいはストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）Ａ−１５６０株を挙げることができる。Ａ−１５４４株は、ＦＥＲＭ  Ｐ−１８９４３として平成１４年７月２３日付で日本国３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６在の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託され、さらに平成１５年７月３０日付で日本国３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６在の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）において、国際寄託ＦＥＲＭ  ＢＰ−８４４６に移管された。Ａ−１５６０株は、ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５８５として平成１５年１１月１３日付で日本国３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６在の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託され、さらに平成１６年８月１９日付で日本国３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６在の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）において、国際寄託ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０２に移管された。
以下、Ａ−１５４４株の場合を例に挙げ、目的のＤＮＡを取得する操作の概要を説明する。まずＡ−１５４４株のゲノムＤＮＡを調製し、次に公知の水酸化酵素（シトクロム  Ｐ４５０酵素）遺伝子の配列情報を基にプライマーを調製してＰＣＲ反応を行い、特異的に増幅されたＤＮＡ断片を取得し、その配列を決定する。さらに得られた配列情報を基にインバースＰＣＲ法（細胞工学１４巻、ｐ．５９１−５９３，１９９５年）によって、クローニングされたＤＮＡ断片の上流、下流域に広がる周辺領域の塩基配列を増幅、クローニング、配列解析することにより取得することができる。これらの操作全体についての詳細は、参考例２（Ａ−１５４４株）、参考例３（Ｍｅｒ−１１１０７株）および参考例４（Ａ−１５６０株）に記載されており、また２００５年６月９日頒布のＷＯ−Ａ  ２００５／０５２１５２にも記載されており、これらの記載を参照することができる。
こうしてＡ−１５４４株から取得されるマクロライド系化合物（ＩＩ）の１６位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ（周辺領域を含む）は配列表の配列番号２に示すとおりである。この配列番号２で示されるＤＮＡには、ｐｓｍＡ（塩基１３２２〜塩基２５４８）およびｐｓｍＢ（塩基２５６４〜塩基２７６１）の２つのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）が含まれており、それぞれ、１６位水酸化酵素およびフェレドキシンをコードしている。
同様にＭｅｒ−１１１０７株から取得されるマクロライド系化合物（ＩＩ）の１６位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ（周辺領域を含む）は配列表の配列番号３に示すとおりである。この配列番号３で示されるＤＮＡには、ｂｐｍＡ（塩基４２０〜塩基１６０４）およびｂｐｍＢ（塩基１６４３〜塩基１８３４）の２つのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）が含まれており、それぞれ、１６位水酸化酵素およびフェレドキシンをコードしている。
Ａ−１５６０株から取得されるマクロライド系化合物（ＩＩ）の１６位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ（周辺領域を含む）は配列表の配列番号４に示すとおりである。この配列番号４で示されるＤＮＡには、ｔｐｍＡ（塩基１７２〜塩基１３８３）およびｔｐｍＢ（塩基１３９９〜塩基１５９３）の２つのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）が含まれており、それぞれ、１６位水酸化酵素およびフェレドキシンをコードしている。
また上述した１６位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードする各種ＤＮＡの改変体は、次のようにして取得することができる。まず元のＤＮＡの配列情報を基に部位特異的な改変処理を行い、次いで得られた部位特異的ＤＮＡ改変体を宿主に組み込み、その遺伝子組換え微生物の１６位水酸化酵素活性の強さおよび選択性の高さを指標として選択し、取得することができる。部位特異的な改変処理は、例えば元のＤＮＡがクローニングされているプラスミドを鋳型とし、その配列情報を基に設計したプライマーを用いて、市販のキット、例えば、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏ．）など用いて行うことができる。
このような改変体のうち１６位水酸化酵素活性が強くしかも選択性が高いものとして、例えばＡ−１５４４株から得られる１６位水酸化酵素をコードするｐｓｍＡの場合、配列番号２の塩基１３２２から塩基２５４８までの連続した塩基配列を含み、以下の１）〜６）からなる群より選択される改変部位を１または２以上含んでなるＤＮＡ改変体を挙げることができる。
１）塩基１５９２から塩基１５９４にかけての配列ｃｇｃを、アルギニン以外のアミノ酸、好ましくはシステインをコードするコドンに改変した改変部位
２）塩基１６５５から塩基１６５７にかけての配列ａｔｇを、メチオニン以外のアミノ酸、好ましくはスレオニンをコードするコドンに改変した改変部位
３）塩基１９０４から塩基１９０６にかけての配列ｃｇｃを、アルギニン以外のアミノ酸、好ましくはロイシンまたはチロシンをコードするコドンに改変した改変部位
４）塩基２０２７から塩基２０２９にかけての配列ｃｇｃを、アルギニン以外のアミノ酸、好ましくはロイシンをコードするコドンに改変した改変部位
５）塩基２０５４から塩基２０５６にかけての配列ａｔｃを、イソロイシン以外のアミノ酸、好ましくはフェニルアラニンをコードするコドンに改変した改変部位
６）塩基２５２８から塩基２５３０にかけての配列ｃｔｇを、ロイシン以外のアミノ酸、好ましくはメチオニンをコードするコドンに改変した改変部位
本発明の組換え体は、前記「マクロライド系化合物（ＩＩ）の生合成に関与するポリペプチドをコードするＤＮＡ」および「マクロライド系化合物（ＩＩ）の１６位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ」を保有する遺伝子組換え微生物であり、以下のＡ）〜Ｃ）に示す方法により作製することができる。
Ａ）  「マクロライド系化合物（ＩＩ）の生合成に関与するポリペプチドをコードするＤＮＡ」を元々もっている宿主に「マクロライド系化合物（ＩＩ）の１６位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ」を組み込む。
Ｂ）  「マクロライド系化合物（ＩＩ）の１６位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ」を元々もっている宿主に「マクロライド系化合物（ＩＩ）の生合成に関与するポリペプチドをコードするＤＮＡ」を組み込む。
Ｃ）  「マクロライド系化合物（ＩＩ）の生合成に関与するポリペプチドをコードするＤＮＡ」および「マクロライド系化合物（ＩＩ）の１６位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ」の両方とももっていない宿主に、これらのＤＮＡの両方を組み込む。
本発明の組換え体における宿主は、目的のＤＮＡを組み込むことができ、目的の１６位水酸化マクロライド化合物を生産できる微生物であれば特に制限はなく使用できるが、好ましい微生物としてストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属放線菌に属する菌株を挙げることができる。例えば前記Ａ）の場合は、ストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）Ｍｅｒ−１１１０７株等、前記Ｂ）の場合は、ストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）Ａ−１５４４株、ストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）Ｍｅｒ−１１１０７株あるいはストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）Ａ−１５６０株等を挙げることができる。また前記Ｃ）の場合は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に属する菌株等を挙げることができる。
このような宿主に目的のＤＮＡを組み込み発現させるためには、特に制限はないが、例えばモレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法を用いて行うことができる。宿主、プラスミド−ベクター系は、目的のＤＮＡが宿主中で安定に保持、発現できる系であれば特に制限はない。またプラスミドは、目的のＤＮＡ以外に、自律複製配列、プロモーター配列、ターミネーター配列、薬剤耐性遺伝子等を含んでいてもよく、プラスミドの種類としては、自律複製性プラスミドだけでなく、使用が予定される宿主のゲノムの一定領域と相同の配列をもつ組込み型プラスミドであってもよい。目的のＤＮＡを組み込む部位は、プラスミド上または宿主微生物のゲノム上のいずれでもあってもよい。
宿主として放線菌あるいはその類縁株を宿主とするならば、自律複製型ベクターｐＩＪ６０２１（Ｇｅｎｅ，１６６，１３３−１３７（１９９５））やゲノム組み込み型ベクターＫＣ５１５〔Ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ，ｖｏｌ．９，Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（ｅｄ：Ｑｕｅｅｎｅｒ，Ｓ．Ｅ．ａｎｄ  Ｄａｙ，Ｌ．Ｅ．），ｐ．１１９−１５８，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｆｇｌａ．〕などが利用できる。
自律複製配列としては、ｒｅｐ  ｐＩＪ１０１（１９８８，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０，４６３４−４６５１）、ｒｅｐ  ＳＣＰ２（１９８１，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１２６，４２７−４４２）、ｐＵＣ１９（Ｇｅｎｅ，３３（１），１０３−１１９（１９８５））等を、プロモーター配列としては、ｅｒｍＥｐ（Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９４，Ｎｏｖ；１４（３）：５３３−４５．）、ＳｎｐＡｐ（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９２，Ｍａｙ；１７４（９）：２７９７−２８０８）等を、ターミネーター配列としては、ｔｅｒ（ｍｍｒ）（Ｇｅｎｅ，１９８７；５８（２−３）：２２９−４１）、ｆｄ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，５（１２），４４９５−４５０３（１９７８））等を、薬剤耐性遺伝子としては、ｈｙｇ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，４（１４），１５６５−１５８１（１９８６））、ｔｓｒ（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９（１），２６−３６（１９８５））等を、それぞれ挙げることができる。なお、本発明の遺伝子組換え微生物は当業者であれば本明細書の記載に従って容易に作製することができる。
このようにして調製した遺伝子組換え微生物を培養し、１６位水酸化マクロライド系化合物（Ｉ）の生産性を、以下の方法により評価、選択することにより、当該マクロライド系化合物の高生産株を得ることができる。すなわち、当該マクロライド系化合物を培養液１Ｌ当り５０ｍｇ以上生産する能力を有する遺伝子組換え微生物は、約４０％の確率で、培養液１Ｌ当り１００ｍｇ以上生産する能力を有するものは、約３０％の確率で得ることができ、いずれも高い確率で得ることができる。
（生産性評価方法）
培地（溶性デンプン５％、グルコース１％、ファルマメディア３％、ＣａＣＯ３  ０．１％、ｐＨ７．５）３０ｍＬを入れた２５０ｍＬ容の三角フラスコに遺伝子組換え微生物を植菌し、２５℃で４日間回転振とう培養（２２０ｒｐｍ）した後、アセトニトリル２７０ｍＬを加えて抽出し、得られた抽出液を下記の測定条件でＨＰＬＣ分析し、１６位水酸化マクロライド系化合物（Ｉ）の蓄積濃度を定量する。
（ＨＰＬＣ測定条件）
分析装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣ  １０Ａｖｐ
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ  ＵＧ−３（φ４．６ｍｍ×５０ｍｍ  ３μｍ）
移動相：４５％〜５５％メタノール（０〜５分）、５５％メタノール（５〜１３分）、５５％〜７０％メタノール（１３〜２１分）、７０％メタノール（２１〜２５分）
流速：１．２ｍＬ／分
検出：ＵＶ２４０ｎｍ
インジェクション容量：５μＬ
カラム温度：４０℃
本発明の遺伝子組換え微生物を栄養源培地に接種し、好気的に培養することにより、その培養液から１６位水酸化マクロライド系化合物（Ｉ）もしくはその薬理学上許容される塩またはそれらの水和物を採取することができる。
これら遺伝子組換え微生物の培養方法は、原則的には一般微生物の培養方法に準ずるが、通常は液体培養による振とう培養、通気撹拌培養等の好気的条件下で実施するのが好ましい。培養に用いられる培地としては、これらの微生物が利用できる栄養源を含有する培地であればよく、各種の合成、半合成培地、天然培地などいずれも利用可能である。培地組成としては炭素源としてのグルコース、シュークロース、フルクトース、グリセリン、デキストリン、デンプン、糖蜜、大豆油等を単独または組み合わせて用いることができる。窒素源としてはファルマメディア、ペプトン、肉エキス、大豆粉、カゼイン、アミノ酸、酵母エキス、尿素等の有機窒素源、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなどの無機窒素源を単独または組み合わせて用いうる。その他例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化コバルト等の塩類、重金属類塩、ビタミンＢおよびビオチン等のビタミン類も必要に応じ添加使用することができる。なお、培養中発泡が著しい場合には、各種消泡剤を適宜培地中に添加することもできる。また、必要に応じて薬剤耐性遺伝子を維持するのに必要な薬剤を添加しても良い。消泡剤の添加にあたっては、目的物質の生産に大きな影響を与えない濃度とするのが望ましい。
また本発明の遺伝子組換え微生物を培養し、１６位水酸化マクロライド系化合物（Ｉ）を製造するに際して、培養液中にシクロデキストリン類を存在させることにより、１６位水酸化マクロライド系化合物の蓄積濃度を増大することができる。本発明において使用できるシクロデキストリン類としては、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、部分メチル化β−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、グリコシル−β−シクロデキストリンおよびヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを挙げることができ、これらを単独または組み合わせて用いることができる。
培養液へのシクロデキストリン類の添加量は、０．５％〜５％が好ましい。添加時期は培養初期、または培養途中で添加しても良い。
培養条件は、当該菌株が良好に生育して１６位水酸化マクロライド系化合物（Ｉ）を生産し得る範囲内で適宜選択し得る。例えば培地のｐＨは５〜９程度、通常中性付近とするのが望ましい。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは２３〜３５℃に保つのがよい。培養日数は２〜１２日程度で、通常３〜１０日程度である。上述した各種の培養条件は、使用微生物の種類や特性、外部条件等に応じて適宜変更でき、最適条件を選択できるのはいうまでもない。培養液中に蓄積された１６位水酸化マクロライド系化合物（Ｉ）を分離精製するためには、一般に微生物代謝産物をその培養液から単離するために用いられる分離、精製の方法が利用できる。例えば、メタノール、エタノール、ブタノール、酢酸エチル、クロロホルム、アセトン、トルエン等を用いた有機溶媒抽出、各種のイオン交換クロマトグラフィー、セファデックスＬＨ−２０等を用いたゲル濾過クロマトグラフィー、活性炭、シリカゲル、吸着樹脂（ダイヤイオンＨＰ２０）等による吸着クロマトグラフィー、もしくは薄層クロマトグラフィーによる吸脱着処理、あるいは逆相カラム等を用いた高速液体クロマトグラフィー等の公知のあらゆる方法がこれにあたるが、ここに示した方法に限定されるものではない。これらの方法を単独あるいは任意の順序に組み合わせ、また反復して用いることにより、１６位水酸化マクロライド系化合物（Ｉ）を単離・精製することができる。
【実施例】
【０００５】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。また下記の説明中、培地成分については、特に記載がない限り表示濃度は重量％である。
参考例１：マクロライド系化合物（ＩＩ）の生合成に関与するポリペプチドをコードするＤＮＡの取得
（１）Ｍｅｒ−１１１０７株の培養およびゲノムＤＮＡの取得
ストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）Ｍｅｒ−１１１０７株の菌糸を２５ｍＬのＴｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈに接種し、２８℃、３日間振とう培養した。この結果得られた培養液から、Ｄ．Ａ．Ｈｏｐｗｏｏｄらの放線菌遺伝子実験書Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，Ｅｎｇｌａｎｄ，２０００）のＩｓｏｌａｔｉｏｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（Ｐ１６２〜１７０）記載の方法に従ってゲノムＤＮＡを調製した。
（２）Ｍｅｒ−１１１０７株のゲノムライブラリーの調製
滅菌精製水１６０μＬと、Ｍｅｒ−１１１０７株のゲノムＤＮＡ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）２００μＬと、１０倍濃度のＭ緩衝液［１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  ジチオスレイトール，５００ｍＭ  ＮａＣｌ］４０μＬと制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（１ｕｎｉｔ／μＬ）１μＬとを混合し、３７℃で３分インキュベートした。その後、５０μＬを取り出し、５０μＬのフェノール−クロロホルム混液（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１，容量比）で抽出し、水相を回収し、さらに５０μＬのクロロホルムで抽出し、再び水相を回収した。この液に５μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）と１５０μＬのエタノールを加えて、−８０℃に３０分置き、遠心することで沈殿してくるＤＮＡを回収した。このＤＮＡを７０％エタノールで洗浄した後、９０μＬの滅菌精製水に溶解し、１０μＬの１０倍濃度ＢＡＰ緩衝液［５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２］および５μＬ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（０．５ｕｎｉｔ／μＬ、タカラバイオ社）を加えて３７℃で３時間インキュベートした。この反応液を１００μＬのフェノール−クロロホルム混液（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１，容量比）で抽出し、水相を回収し、さらに１００μＬのクロロホルムで抽出し、再び水相を回収した。この液に１０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）と３００μＬのエタノールを加えて、−８０℃に３０分置き、遠心することで沈殿してくるＤＮＡを回収した。このＤＮＡを７０％エタノールで洗浄した後、２０μＬのＴＥ緩衝液［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ］に溶解した。
一方でＳｕｐｅｒＣｏｓ  コスミドベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）１０μｇをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のマニュアルに従い制限酵素ＸｂａＩで消化後、ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｏｎａｌ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（タカラバイオ社）によりＤＮＡ末端の脱リン酸化を行い、さらに制限酵素ＢａｍＨＩで消化、精製後、１０μＬのＴＥ緩衝液に溶解した。このコスミドＤＮＡ溶液１μＬに、前述のＭｅｒ−１１１０７株ＤＮＡのＳａｕ３Ａ１部分分解物の溶液２．５μＬを加え、さらに滅菌精製水１．５μＬ、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）のＳｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩを５μＬ、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを１０μＬ順次加えた後、２３℃で１０分インキュベートした。この反応液４μＬをＧｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  ＸＬ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いてラムダファージにパッケージングした。得られたパッケージング液（全量５００μＬ）について形質導入試験を実施して、コロニー形成能を検定した結果、３８０ｃｆｕ（Ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）／μＬであった。
（３）各種プローブの調製
（３−１）ケト合成酵素コード領域を含むプローブの調製
一般にポリケチド合成酵素のケト合成酵素領域（ｋｅｔｏ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ）において保存されている配列に基づいて以下に示すような配列からなる２種のプライマー、ＫＳ−３ＦおよびＫＳ−４Ｒを合成した（配列番号５および６参照）。
ＫＳ−３Ｆ：５’−ＧＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＧＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＧ−３’
ＫＳ−４Ｒ：５’−ＧＴＧＣＣＣＧＡＴＧＴＴＧＧＡＣＴＴＣＡＡＣＧＡ−３’
これらのプライマーを用いてＰＣＲを以下の条件にて行った。
（ＰＣＲ反応液組成）
滅菌精製水                                                            ３１μＬ
２倍濃縮ＧＣ  ｂｕｆｆｅｒ                                            ５０μＬ
ｄＮＴＰ混合溶液（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ各２．５ｍＭ）１６μＬ
ＫＳ−３Ｆ（１００ｐｍｏｌ／μＬ）                                  ０．５μＬ
ＫＳ−４Ｒ（１００ｐｍｏｌ／μＬ）                                  ０．５μＬ
Ｍｅｒ−１１１０７株  ｔｏｔａｌ  ＤＮＡ（１００ｎｇ／μＬ）            １μＬ
ＬＡ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ｕ／μＬ，タカラバイオ社）        １μＬ
（反応温度条件）
９５℃  ３分
（９８℃  ２０秒，６３℃  ３０秒，６８℃  ２分）      ３０サイクル
７２℃  ５分
この反応の結果増幅された９３０ｂｐ  ＤＮＡ断片を０．８％アガロースゲル上で電気泳動し、分離した９３０ｂｐ  ＤＮＡ断片を切り出し、ＳＵＰＲＥＣ−０１（タカラバイオ社）を用いてＤＮＡを回収精製した。さらに得られたＤＮＡ断片１０ｎｇを鋳型として反応サイクル数を２０サイクルとする以外は前述のＰＣＲと同じ反応条件でケト合成酵素コード領域を含む９３０ｂｐ  ＤＮＡ断片を再増幅した。このＤＮＡ断片をＳＵＰＲＥＣ−０２（タカラバイオ社）を用いて濃縮精製して得られた５０μＬのＴＥ溶液をプローブ溶液とした。
（３−２）シトクロムＰ４５０遺伝子領域を含むプローブの調製
シトクロムＰ４５０遺伝子プローブを調製するために公知の２種のシトクロムＰ４５０遺伝子を放線菌から増幅した。すなわちストレプトミセス・サーモトレランス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）ＡＴＣＣ１１４１６由来ＯＲＦ−Ａ遺伝子（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：５８２−５８８，１９９５）を増幅するために以下に示すような配列からなる２種のプライマー、ＣＢ−１ＦおよびＣＢ−２Ｒを合成した（配列番号７および８参照）。
ＣＢ−１Ｆ：５’−ＡＴＧＡＣＡＧＣＴＴＴＧＡＡＴＣＴＧＡＴＧＧＡＴＣＣＣ−３’
ＣＢ−２Ｒ：５’−ＴＣＡＧＡＧＡＣＧＧＡＣＣＧＧＣＡＧＡＣＴＣＴＴＣＡＧＡＣＧ−３’
一方でストレプトミセス・ベネズエラエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）ＡＴＣＣ１５４３９由来ｐｉｋＣ遺伝子（Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：６６１−６６７，１９９８）を増幅するために以下に示すような配列からなる２種のプライマー、ＰＫＣ−１ＦおよびＰＫＣ−２Ｒを合成した（配列番号９および１０参照）。
ＰＫＣ−１Ｆ：５’−ＧＴＧＣＧＣＣＧＴＡＣＣＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＣＧＡＣＣ−３’
ＰＫＣ−２Ｒ：５’−ＴＣＡＣＧＣＧＣＴＣＴＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＣＴＧＣＣ−３’
これらのプライマーを用いてＰＣＲを以下の条件にて行った。
（ＰＣＲ反応液組成）
滅菌精製水                                                            ３１μＬ
２倍濃縮ＧＣ  ｂｕｆｆｅｒ                                            ５０μＬ
ｄＮＴＰ混合溶液（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ各２．５ｍＭ）１６μＬ
ｐｒｉｍｅｒ−Ｆ（１００ｐｍｏｌ／μＬ）                            ０．５μＬ
ｐｒｉｍｅｒ−Ｒ（１００ｐｍｏｌ／μＬ）                            ０．５μＬ
ＡＴＣＣ１１４１６株またはＡＴＣＣ１５４３９株のゲノムＤＮＡ（１００ｎｇ／μＬ）１μＬ
ＬＡ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ｕ／μＬ，タカラバイオ社）        １μＬ
（反応温度条件）
９５℃３分
（９８℃  ２０秒，６３℃  ３０秒，６８℃  ２分）      ３０サイクル
７２℃  ５分
この反応の結果増幅された２種の１．２ｋｂ  ＤＮＡ断片をＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）で精製した後、各ＤＮＡ断片１０ｎｇ／μＬずつを含む等量混合溶液を調製してプローブ溶液とした。
（４）ケト合成酵素コード領域を含むプローブを用いたスクリーニング
前項（２）で調製したＭｅｒ−１１１０７株のゲノムＤＮＡライブラリーのパッケージング液を使って大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅ  ＭＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を宿主とし、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のマニュアルに従って形質導入した。形質導入操作後の菌液を１０枚のＬＢ−５０μｇ／ｍＬアンピシリン−１．５％寒天培地シャーレ（内径９０ｍｍ、高さ１５ｍｍ）に分注して広げ、３７℃で１８時間培養した。各シャーレに生育したコロニーをＨｙｂｏｎｄｏＮ＋フィルター（ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に転写し、ＨｙｂｏｎｄｏＮ＋フィルターに添付のマニュアルに記載された条件でアルカリ処理、中和処理を行い、８０℃で２時間乾燥することでフィルター上にコロニー由来のＤＮＡを固定化した。
前項（３−１）にて調製したケト合成酵素領域を含む９３０ｂｐ  ＤＮＡ断片１００ｎｇをプローブにしてＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いてゲノムＤＮＡライブラリーをコロニーハイブリダイゼーション法でスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは塩濃度０．５Ｍ  ＮａＣｌで６５℃で２時間行った。プローブＤＮＡの標識、ハイブリダイゼーションおよび検出の条件についてはＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍに添付されたマニュアルに記載された条件に従った。試験した約７，６００コロニーのうち、アルカリホスファターゼで標識したプローブと強くハイブリダイズした５９コロニーを分離した。このコロニーから派生した大腸菌クローンからコスミドを抽出精製した。
（５）シトクロムＰ４５０遺伝子領域を含むプローブを用いたプラジエノライド生合成遺伝子領域を有するコスミドクローンの選択確認
前項（４）で得られた各コスミドのＤＮＡ溶液２μＬをＨｙｂｏｎｄｏＮ＋フィルター上にスポットし、添付のマニュアルに記載された条件でアルカリ処理、中和処理を行い、さらに８０℃で２時間乾燥することでフィルター上にＤＮＡを固定化した。このフィルターを用いて、前項（３）にて記述したシトクロムＰ４５０遺伝子断片をプローブとして、前項（４）と同じ条件でハイブリダイゼーションを行った。この結果プローブと強くハイブリダイズしたコスミド１つを選択し、ｐＫＳ５８と命名した。
ｐＫＳ５８  ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分分解した後、ファージベクターＺａｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＢａｍＨＩ−ＣＩＡＰ処理済（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にライゲーションし、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  ＸＬ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いてラムダファージにパッケージングした。このファージ液を大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’に感染させて、プラークを形成させた。前項（３−２）で調製したシトクロムＰ４５０遺伝子プローブを用いてプラークハイブリダイゼーションを行うことで、約２ｋｂのシトクロムＰ４５０遺伝子を含むＤＮＡ断片をサブクローニングした。
このシトクロムＰ４５０遺伝子ＤＮＡ断片の配列を決定し、シトクロムＰ４５０コード領域とされるＮ−末端およびＣ−末端から以下に示すような配列からなる２種のプライマー、ＰＤＬ５８−１ＦおよびＰＤＬ５８−２Ｒを合成した（配列番号１１および１２参照）。
ＰＤＬ５８−１Ｆ：５’−ＧＣＣＣＣＧＣＡＴＡＴＧＧＡＴＣＴＧＧＡＡＡＣＣＣＡＡＣＴＴＣＴＣ−３’
ＰＤＬ５８−２Ｒ：５’−ＧＣＡＣＴＡＧＴＣＡＧＣＣＧＣＧＣＴＣＧＡＣＧＡＧＧＡＧＧＴＧ−３’
これらのプライマーを用いてＰＣＲを以下の条件にて行った。
（ＰＣＲ反応液組成）
滅菌精製水                                                            ３１μＬ
２倍濃縮ＧＣ  ｂｕｆｆｅｒ                                            ５０μＬ
ｄＮＴＰ混合溶液（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ各２．５ｍＭ）１６μＬ
ＰＤＬ５８−１Ｆ（１００ｐｍｏｌ／μＬ）                            ０．５μＬ
ＰＤＬ５８−２Ｒ（１００ｐｍｏｌ／μＬ）                            ０．５μＬ
ｐＫＳ５８ＤＮＡ（１０ｎｇ／μＬ）                                      １μＬ
ＬＡ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ｕ／μＬ，タカラバイオ社）        １μＬ
（反応温度条件）
９５℃  ３分
（９８℃  ２０秒，６３℃  ３０秒，６８℃  ２分）２０サイクル
７２℃  ５分
この反応の結果増幅された１．２ｋｂ  ＤＮＡ断片をＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）で精製した後、制限酵素ＮｄｅＩとＳｐｅＩで分解した。反応後ＤＮＡを０．８％アガロースゲル上で電気泳動し、分離した１．２ｋｂ  ＤＮＡ断片を切り出し、ＱＩＡＧＥＮ  ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＤＮＡを回収精製した。このＤＮＡ断片をシトクロムＰ４５０遺伝子発現用プラスミドｐＴ７ＮＳ−ｃａｍＡＢ（参考例５およびＷＯ０３／０８７３８１参照）のＮｄｅＩおよびＳｐｅＩ部位へ挿入することでｐＰＤＬ９６を構築した。
このプラスミドで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、Ｍ９ＣＧ培地（１．２８％  Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．３％  ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％  ＮａＣｌ、０．１％  ＮＨ４Ｃｌ、１％カザミノ酸、０．４％グルコース、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００μＭ  ＣａＣｌ２、５０μｇ／ｍＬアンピシリン）にて菌密度としてＯＤ６００（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｔ  ６００ｎｍ）が０．８に達するまで培養した。５−アミノレブリン酸およびＩＰＴＧをそれぞれ８０μｇ／ｍＬ、０．１ｍＭになるよう添加した後、２２℃で２５時間培養を継続し、シトクロムＰ４５０タンパク質を誘導させた。誘導後、菌体を集めてＣＶ緩衝液［５０ｍＭ  ＮａＰＯ４（ｐＨ７．３）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１ｍＭグルコース］５ｍＬに懸濁した。この液１ｍＬを試験管に取り、プラジエノライドＢの６位デオキシ体であるＭＥ−２６５のＤＭＳＯ溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）を５μＬ添加して２８℃で１５時間インキュベートした。この反応液に１ｍＬのアセトニトリルを加えて混合した後、遠心分離して上清を以下の条件にてＨＰＬＣで分析することでプラジエノライドＢへの変換を認めた。このことからｐＫＳ５８にプラジエノライド生合成遺伝子領域が含まれていることを確認した。
（ＨＰＬＣの分析条件）
分析装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣ  １０Ａｖｐ
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ  ＵＧ−３（φ４．６ｍｍ×５０ｍｍ  ３μｍ）
移動相：４５％〜５５％  メタノール（０〜５分）
５５％  メタノール（５〜１３分）
５５％〜７０％  メタノール（１３〜２１分）
４５％  メタノール（２１〜２５分）
流速：１．２ｍＬ／分
検出：ＵＶ２４０ｎｍ
インジェクション容量：５μＬ
カラム温度：４０℃
分析時間：２５分
保持時間：ＭＥ−２６５；２０分、プラジエノライドＢ；１３分
（６）シトクロムＰ４５０遺伝子に隣接する生合成遺伝子クラスターを含むコスミドの選定
前項（４）で得られた、５９個のコスミドＤＮＡの中で、前項（５）で得られたシトクロムＰ４５０遺伝子に隣接する生合成遺伝子クラスターを含むコスミドを選定した。
５９個のコスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩで消化し、得られた各々のＤＮＡをアガロースゲル電気泳動し、エバーメクチンアグリコン合成酵素遺伝子（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６（１９９９）９５０９−９５１４、特開平２０００−２４５４５７号公報またはＷＯ  ００／５０６０５パンフレット参照）のＫＳドメインのＤＮＡ（ａｖｅＡ２のＫＳ６  ｄｏｍａｉｎ）、ＡＴドメインのＤＮＡ（ａｖｅＡ１のＡＴ２  ｄｏｍａｉｎ）、および前項（５）で得られたシトクロムＰ４５０遺伝子をプローブに用いたサザンハイブリダイゼーションを行った。
制限酵素ＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩで消化したＤＮＡの電気泳動パターンと、各プローブでのハイブリダイズしたバンドパターンの結果から、まず、同じ長さでハイブリダイズしたＤＮＡ断片を持つコスミドをグループ化した。そのうち、ほぼ同等のパターンを示したコスミドについては１つを残して削除し、残ったものでバンドパターンが部分一致するものについて整列化した。そして、（５）で得られたシトクロムＰ４５０遺伝子を含むコスミドｐＫＳ５８を中心とし、シトクロムＰ４５０遺伝子側からポリケチド合成酵素遺伝子を含む側に隣接するコスミドとしてｐＫＳ５４を選出し、さらにｐＫＳ５４に隣接するコスミドとしてｐＫＳ３５を選出した。また、コスミドｐＫＳ５８とシトクロムＰ４５０遺伝子側からポリケチド合成酵素遺伝子を含まない側に隣接するコスミドとしてｐＫＳ２３を選出した。その結果、図２に示すようにプラジエノライド生合成遺伝子クラスターを包括するコスミドクローンとしてｐＫＳ２３，ｐＫＳ５８，ｐＫＳ５４，ｐＫＳ３５が選定された。
（７）プラジエノライド生合成遺伝子クラスターの塩基配列の決定
プラジエノライド生合成遺伝子をコードする一群のＤＮＡの塩基配列を決定した。前項（６）で選出した各コスミドを、塩化セシウム法を用いて単離後、ＨｙｄｒｏＳｈｅａｒ（Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）を用いて約１ｋｂに剪断し、ＢＫＬ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて、サブクローン化した。
得られたサブクローンに対し、蛍光標識プライマーを用いたサイクルシークエンス反応（ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を行い、それぞれの断片の塩基配列を決定（ＭｅｇａＢＡＣＥ  １０００：ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）することにより、プラジエノライドの生合成に関連するＤＮＡを含む約７５ｋｂの塩基配列を決定した（配列番号１参照）。
（８）プラジエノライドの６位水酸化酵素遺伝子（ｐｌｄＢ）破壊株の作製
前項（７）で決定されたプラジエノライドの生合成に関連するＤＮＡを含む約７５ｋｂの塩基配列（配列番号１参照）より、図１に示された生合成経路でプラジエノライドが生合成されることが明らかとなった。そこで、そのうちのシトクロムＰ４５０遺伝子ｐｌｄＢのみを破壊することで、プラジエノライドＢの６位デオキシ体であるＭＥ−２６５のみを生産する株を取得可能と考え、以下の方法でｐｌｄＢ破壊株を作製した。
配列番号１記載の塩基配列に基づいて、以下に示す配列からなる４種のプライマー、ｐｌｄＢ−Ｌ−Ｂｇｌ２Ｆ、ｐｌｄＢ−Ｌ−Ｈｉｎｄ３Ｒ、ｐｌｄＢ−Ｒ−Ｈｉｎｄ３ＦおよびｐｌｄＢ−Ｒ−Ｂｇｌ２Ｒ（配列番号１３、１４、１５および１６参照）を合成した。
ｐｌｄＢ−Ｌ−Ｂｇｌ２Ｆ：５’−ＧＧＧＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＧＴＴＡＣＣＴＣＴＡＣＧＡＧＴＡ−３’
ｐｌｄＢ−Ｌ−Ｈｉｎｄ３Ｒ：５’−ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＧＡＴＧＡＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＡＴＡＧ−３’
ｐｌｄＢ−Ｒ−Ｈｉｎｄ３Ｆ：５’−ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＡＡＣＴＧＧＣＧＣＧＡＣＡＧＴＧＴＣＴＴ−３’
ｐｌｄＢ−Ｒ−Ｂｇｌ２Ｒ：５’−ＧＧＧＡＧＡＴＣＴＧＣＡＧＣＧＧＡＴＣＧＴＣＴＴＣＧＡＧＡＣＣＣＴＴ−３’
これらのプライマーを用いてＰＣＲを以下の条件にて行った。
（ＰＣＲ反応液組成）
滅菌精製水                                                            ３０μＬ
２倍濃縮ＧＣ  ｂｕｆｆｅｒ                                            ５０μＬ
ｄＮＴＰ混合溶液（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ各２．５ｍＭ）１６μＬ
ｐｌｄＢ−Ｌ−Ｂｇｌ２ＦまたはｐｌｄＢ−Ｒ−Ｈｉｎｄ３Ｆ（５０ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ
ｐｌｄＢ−Ｌ−Ｈｉｎｄ３ＲまたはｐｌｄＢ−Ｒ−Ｂｇｌ２Ｒ（５０ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ
Ｍｅｒ−１１１０７株ｔｏｔａｌ  ＤＮＡ（１００ｎｇ／μＬ）              １μＬ
ＬＡ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ｕ／μＬ，タカラバイオ社）        １μＬ
（反応温度条件）
９５℃  ３分
（９８℃  ２０秒，６３℃  ３０秒，６８℃  ２分）      ３０サイクル
７２℃  ５分
この反応の結果、ｐｌｄＢ−Ｌ−Ｂｇｌ２ＦとｐｌｄＢ−Ｌ−Ｈｉｎｄ３Ｒを用いた反応から、配列番号１の塩基６４７５６から塩基６６３０２を含む１．５７ｋｂのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ｌ１）が増幅され、ｐｌｄＢ−Ｒ−Ｈｉｎｄ３ＦとｐｌｄＢ−Ｒ−Ｂｇｌ２Ｒを用いた反応から、配列番号１の塩基６６８４９から塩基６８３６８を含む１．５４ｋｂのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ｒ１）が増幅された。ＤＮＡ断片Ｌ１およびＲ１をＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）で精製した後、制限酵素ＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した。
制限酵素ＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したＤＮＡ断片Ｌ１およびＲ１と、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した２．３ｋｂのハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（ｐＨＰ４５ｏｍｅｇａｈｙｇ：Ｇｅｎｅ１９０，３１５−３１７，１９９７由来。以下ｈｙｇと略記することがある）、および制限酵素ＢａｍＨＩで消化したシャトルベクターｐＫＵ２５３（図３参照）、の計４者をＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社）で連結した。こうしてＤＮＡ断片Ｌ１とＲ１の間にハイグロマイシンＢ耐性遺伝子が挿入された形の約５．４ｋｂのＤＮＡ断片が、ｐＫＵ２５３に挿入された約２１．４ｋｂのプラスミドｐＫＵ２５３−Ｌ１−ｈｙｇ−Ｒ１が構築された。
得られたｐＫＵ２５３−Ｌ１−ｈｙｇ−Ｒ１を、接合大腸菌Ｓ１７−１へエレクトロポレーション法を用いて形質転換し、Ｓ１７−１／ｐＫＵ２５３−Ｌ１−ｈｙｇ−Ｒ１株を得た。得られたＳ１７−１／ｐＫＵ２５３−Ｌ１−ｈｙｇ−Ｒ１株を、２５μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび１００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢを含むＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）１０ｍＬに植菌し、３０℃で２時間振盪培養後、集菌し、ＬＢ培地１０ｍＬで２回洗浄後、ＬＢ培地５ｍＬに懸濁した。これを供与菌懸濁液とした。
供与菌懸濁液を調製するのと同時進行で、Ｍｅｒ−１１１０７株をＴＳＢ培地（Ｔｒｙｐｔｏ−Ｓｏｙａｂｒｏｔｈ：日水製薬社）１０ｍＬに植菌し、３０℃で５時間振盪培養後、集菌し、滅菌水１０ｍＬで２回洗浄後、滅菌水１ｍＬに懸濁した。これを受容菌懸濁液とした。得られたＳ１７−１／ｐＫＵ２５３−Ｌ１−ｈｙｇ−Ｒ１株供与菌懸濁液５００μＬを、Ｍｅｒ−１１１０７株受容菌懸濁液１０μＬと混ぜ、Ａｃｔｉｎｏ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｎｏ．４寒天培地（日本製薬社）に塗布した。３０℃で１８時間培養後、２ｍｇ／ｍＬのリボスタマイシンを含む２．５ｍＬのＳＮＡ（０．８％栄養培地：Ｄｉｆｃｏ社、０．４％寒天）を重層した。３０℃で７日間培養し、リボスタマイシンに耐性なｐＫＵ２５３−Ｌ１−ｈｙｇ−Ｒ１形質転換株を得た。
得られたｐＫＵ２５３−Ｌ１−ｈｙｇ−Ｒ１形質転換株を、リボスタマイシンを含まないＴＳＢ培地１０ｍＬに植菌し、３０℃で２４時間振盪培養した。ｐＫＵ２５３−Ｌ１−ｈｙｇ−Ｒ１形質転換株培養液を集菌し、滅菌水１０ｍＬで２回洗浄後、滅菌水１０ｍＬに懸濁した。適当に希釈した懸濁液を、２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢを含むＹＭＳ寒天培地（０．４％酵母エキス、１％麦芽エキス、０．４％溶性デンプン、２％寒天、１０ｍＭ塩化カルシウム）に塗布し、３０℃で４日間培養した。ハイグロマイシンＢを含むＹＭＳ寒天培地で生育したシングルコロニーを２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢを含むＹＭＳ寒天培地および２００μｇ／ｍＬのリボスタマイシンを含むＹＭＳ寒天培地に植えかえ、３０℃で２日間培養した。培養後、ハイグロマイシンＢ耐性で、リボスタマイシン感受性の株を選択した。得られた菌株は、ゲノム中のｐｌｄＢ遺伝子内の５４６ｂｐ（配列番号１の塩基６６３０３から塩基６６８４８）を欠失し、その間にハイグロマイシンＢ耐性遺伝子が挿入されたｐｌｄＢ破壊株であり、Ｍｅｒ−１１１０７ｐｌｄＢ：：ｈｙｇ株とした。
（９）プラジエノライドの６位水酸化酵素遺伝子（ｐｌｄＢ）破壊株のプラジエノライド生産性試験
前項（８）で得られたＭｅｒ−１１１０７  ｐｌｄＢ：：ｈｙｇ株の凍結種母２００μＬを、種母培地（溶性デンプン２％、大豆粉（味の素社：エスサンミート）２％、酵母エキス０．５％、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２５％、ＣａＣＯ３  ０．３％ｐＨ無調整）２０ｍＬに植菌し、２５℃で２日間培養した。得られた種母培養液の３００μＬを、本培養培地（溶性デンプン５％、グルコース１％、ファルマメディア３％、β−シクロデキストリン２％、ＣａＣＯ３  ０．１％  ｐＨ７．５）３０ｍＬに植菌し、２５℃で４日間および５日間培養した。培養終了後、得られた培養液２０ｍＬに同量のアセトニトリルを加えて抽出した。その抽出液の一部を分取しアセトニトリルで５倍量に希釈し、以下の条件にてＨＰＬＣでプラジエノライドＢおよびＭＥ−２６５の量を測定した。測定結果を表１に示す。
（ＨＰＬＣ分析条件）
分析装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣ  １０Ａｖｐ
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ  ＵＧ−３（φ４．６ｍｍ×５０ｍｍ  ３μｍ）
移動相：４５％〜５５％メタノール（０〜５分）
５５％メタノール（５〜１３分）
５５％〜７０％メタノール（１３〜１７分）
７０％メタノール（１７〜３５分）
４５％メタノール（３５〜４０分）
流速：１．２ｍＬ／分
検出：ＵＶ２４０ｎｍ
インジェクション容量：１０μＬ
カラム温度：４０℃
分析時間：３５分
保持時間：ＭＥ−２６５；２２分、プラジエノライドＢ；１６分
【表１】
2006126723.tif 000010
参考例２：マクロライド系化合物（ＩＩ）の１６位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ−１
（１）ストレプトミセス・エスピーＡ−１５４４株のゲノムＤＮＡの調製
グルコース１％、麦芽エキス０．４％、酵母エキス１％からなる培地にＡ−１５４４株を接種し、２８℃、３日間培養した。得られた培養液を３０００ｒｐｍ、１０分間遠心して菌体を集めた。その菌体からＢｌｏｏｄ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。
（２）マクロライド系化合物１１１０７Ｂの１６位水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの部分的配列のクローニング
ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）のチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１０５Ｄ５）と推定されるアミノ酸配列を参考にして以下のようなミックス・プライマー（５Ｄｍ−３Ｆおよび５Ｄｍ−３Ｒ）を設計し作成した（配列番号１７および１８参照）。
５Ｄｍ−３Ｆ：５’−ＴＴＣＧＣＳＣＴＳＣＣＳＧＴＣＣＣＳＴＣＳＡＴＧＧＴＳＡＴ−３’
５Ｄｍ−３Ｒ：５’−ＧＴＴＧＡＴＳＡＹＳＧＡＳＧＴＳＧＡＧＡＡ−３’
コドンの揺らぎを考慮して反応性を高めるために、混合塩基Ｓ（＝Ｃ＋Ｇ）、Ｙ（＝Ｃ＋Ｔ）を使用した。
次に、この２種のプライマー（５Ｄｍ−３Ｆおよび５Ｄｍ−３Ｒ）と前項（１）で得たＡ−１５４４株ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ社）とＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社  Ｔ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、変性を９８℃、２０秒間、アニーリングを５０℃、２分間、伸長を６８℃、３０秒間行う３段階の反応を３５回繰り返した。その結果、約５００ｂｐの大きさのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片−Ａ１という）が増幅された。このＤＮＡ断片−Ａ１は水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分である可能性が高い。ＰＣＲ反応にて増幅したＤＮＡ断片−Ａ１を、反応液からＳＵＰＲＥＣ  ＰＣＲ（タカラバイオ社）によって回収した。
次に得られたＤＮＡ断片−Ａ１の塩基配列を解析するに足る量のＤＮＡ断片−Ａ１を得るために、プラスミドベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ社）を用いてＤＮＡ断片−Ａ１を連結し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。その後、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）、Ｘ−ｇａｌ（５−ｂｒｏｍｏ−４−Ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ；４０μｇ／ｍＬ）、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ；１００μＭ）を含むＬ−Ｂｒｏｔｈ寒天培地（１．０％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天）を用いて、形質転換された大腸菌を選択した。こうして分離した形質転換大腸菌のコロニーをアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）で培養した。増殖した形質転換大腸菌の菌体からプラスミド精製キット（ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドＤＮＡの分離精製を行い、一定量のＤＮＡ断片−Ａ１を得た。
（３）クローニングされたＤＮＡ断片−Ａ１の塩基配列の解析
前項（２）で得られたＤＮＡ断片−Ａ１の塩基配列をＤＮＡ塩基配列解析装置（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７７ＸＬ）を用い、ダイターミネーター・サイクル・シークエンス法で解析した。塩基配列解析の結果、ＰＣＲ反応で増幅されたＤＮＡ断片−Ａ１は電気泳動で約５００ｂｐと測定されたが、塩基配列分析の結果、正確には５２８ｂｐであることが明らかとなった（配列番号２の塩基１７７５〜塩基２３０２参照）。クローニングされた前記の５２８ｂｐのＤＮＡ配列の両端には前記のＰＣＲ反応の時に使用した２種類のプライマーに対応するＤＮＡ配列が見出されたので、前記のＰＣＲ反応ではＤＮＡ断片−Ａ１がこの２種類のプライマー（５Ｄｍ−３Ｆおよび５Ｄｍ−３Ｒ）により特異的に増幅されたことが明らかとなった。
（４）ＤＮＡ断片−Ａ１の周辺領域の解析
前記のとおり、Ａ−１５４４株由来の水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの部分的配列が決定されたのでインバースＰＣＲ法（細胞工学１４巻、ｐ．５９１−５９３，１９９５年）によって、クローニング断片の上流、下流域に広がる周辺領域の塩基配列を増幅、クローニング、配列解析した。すなわち、Ａ−１５４４株ゲノムＤＮＡ（前項（１）参照）をＨ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  ジチオスレイトール，１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中において制限酵素ＰｓｔＩとＳａｌＩでそれぞれ消化した。得られた各制限酵素切断ＤＮＡ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ社）を用いて自己環状化させた。
他方、ＤＮＡ断片−Ａ１の塩基配列から、以下のようなプライマー（６ＰＩＮ−２Ｆおよび６ＰＩＮ−２Ｒ）を設計し作成した（配列番号１９および２０参照）。
６ＰＩＮ−２Ｆ：５’−ＧＣＴＧＣＧＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＡＴＣＧＡＧＡＴ−３’
６ＰＩＮ−２Ｒ：５’−ＣＴＧＴＴＣＣＴＣＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＧＧＴＣＧＧＣＧＴＡ−３’
次にこの２種のプライマー（６ＰＩＮ−２Ｆおよび６ＰＩＮ−２Ｒ）と前記の自己環状化させたＡ−１５４４株ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ社）とＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社  Ｔ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、変性を９８℃、２０秒間、アニーリングと伸長を６８℃、５分間行う２段階の反応を３５回繰り返した。
この結果、約３．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｂ１）と約２．８ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｃ１）が増幅したが、これらは、水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡおよびその上流と下流領域を含むＤＮＡ配列を有するＤＮＡである可能性が高い。
このＰＣＲ増幅反応液からＤＮＡ断片−Ｂ１およびＤＮＡ断片−Ｃ１をＳＵＰＲＥＣ  ＰＣＲ（タカラバイオ社）によって回収した。次に得られたＤＮＡ断片−Ｂ１およびＤＮＡ断片−Ｃ１について、塩基配列を解析するに足る量の各ＤＮＡ断片を得るために、前項（２）と同様にプラスミドベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ社）、大腸菌ＪＭ１０９株およびプラスミド精製キット（ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、一定量の各ＤＮＡ断片を得た。
（５）ＤＮＡ断片−Ｂ１（約３．５ｋｂｐのサイズ）およびＤＮＡ断片−Ｃ１（約２．８ｋｂｐのサイズ）の塩基配列の解析
前項（４）で得られたＤＮＡ断片−Ｂ１およびＤＮＡ断片−Ｃ１の塩基配列をＤＮＡ塩基配列解析装置（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７７ＸＬ）を用い、ダイターミネーター・サイクル・シークエンス法で解析した。このように塩基配列の解析を行い、ＤＮＡ断片−Ｂ１およびＤＮＡ断片−Ｃ１配列から、配列番号２に示された３７９３ｂｐの塩基配列の情報を得た。
この３７９３ｂｐ中のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を検索したところ、２種類のタンパク質がコードされていることが判明した。これらのタンパク質のアミノ酸配列をＢＬＡＳＴ  ｓｅａｒｃｈにて検索した結果、配列番号２の塩基１３２２〜塩基２５４８にチトクロムＰ４５０と高い相同性を有する４０９個のアミノ酸からなるタンパク質をコードするＯＲＦ（以下、ｐｓｍＡという）が存在した。そしてｐｓｍＡは、ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）のチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１０５Ｄ５）と推定されるアミノ酸配列と、ストレプトミセス・リビダンスのチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１０５Ｄ４）と推定されるアミノ酸配列に最も高い相同性を有し（相同性７２．６％）、さらにストレプトミセス・グリセウスのチトクロムＰ４５０ｓｏｙ（ＳｏｙＣ）にも比較的高い相同性を有した（相同性６９．４％）。このことからｐｓｍＡはチトクロムＰ４５０タイプの水酸化酵素をコードする遺伝子である可能性が高いと考えられた。
またｐｓｍＡのすぐ下流（配列番号２の塩基２５６４〜塩基２７６１）には２Ｆｅ−２Ｓタイプのフェレドキシンに高い相同性を有するタンパク質をコードするＯＲＦ（以下、ｐｓｍＢという）が存在した。ｐｓｍＢがコードするタンパク質は６６個のアミノ酸からなり、ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）のチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１０５Ｄ５）と推定されるアミノ酸配列のすぐ下流のフェレドキシンと推定されるアミノ酸配列に最も高い相同性を有し（８３．３％）、さらにストレプトミセス・グリセウスのフェレドキシンｓｏｙ（ｓｏｙＢ）にも比較的高い相同性を有した（相同性５７．６％）。そのため、ｐｓｍＢは電子伝達を担い、ｐｓｍＡと共に水酸化を行うフェレドキシンをコードしていると考えられた。
（６）プラスミドｐＴＣ−ＤＭの構築
ｐＴ７ＮＳ−ｃａＡＢ（参考例５およびＷＯ０３／０８７３８１参照）をＨ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  ジチオスレイトール，１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中で制限酵素ＮｄｅＩとＳｐｅＩにより消化してプラスミド消化物を得た。一方、配列番号２の塩基配列を参考にして、５’末端にＮｄｅＩサイトを付加したプライマーＤＭ−ＮｄｅＦ（５’−ＧＣＣＣＣＣＡＴＡＴＧＡＣＧＧＡＡＣＴＧＡＣＧＧＡＣＡＴＣＡ−３’：配列番号３３参照）および５’末端にＳｐｅＩサイトを付加したプライマーＤＭ−ＳｐｅＲ（５’−ＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＣＡＧＣＣＧＧＣＣＧＧＴＴＣＧＧＴＣＡ−３’：配列番号３４参照）を設計し作成した。次に、この２種のプライマー（ＤＭ−ＮｄｅＦおよびＤＭ−ＳｐｅＲ）と前項（１）で得たＡ−１５４４株ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ  ＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造社）とＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社  Ｔ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、変性を９８℃、２０秒間、アニーリングと伸長を６８℃、２分間行う２段階の反応を３０回繰り返した。このＰＣＲ増幅反応液からｐｓｍＡおよびｐｓｍＢを含む約１．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片をＳＵＰＲＥＣ  ＰＣＲ（宝酒造社）によって回収した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＳｐｅＩで消化し、その消化物と前記ｐＴ７ＮＳ−ｃａＡＢプラスミド消化物とを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて連結した。これによって、ｐｓｍＡおよびｐｓｍＢの両方を内部に含有するＤＮＡ断片と、プラスミドｐＴ７ＮＳ−ｃａｍＡＢとが連結された約９．５ｋｂｐのサイズのプラスミド（プラスミドｐＴＣ−ＤＭというときがある）が構築された。
参考例３：マクロライド系化合物（ＩＩ）の１６位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ−２
（１）ストレプトミセス・エスピーＭｅｒ−１１１０７株ゲノムのＤＮＡの調製
グルコース１％、麦芽エキス０．４％、酵母エキス１％からなる培地にＭｅｒ−１１１０７株を接種し、２８℃、３日間培養した。得られた培養液を３０００ｒｐｍ、１０分間遠心して菌体を集めた。その菌体からＢｌｏｏｄ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。
（２）マクロライド系化合物１１１０７Ｂの１６位水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの部分的配列のクローニング
ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）のチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１０５Ｄ５）と推定されるアミノ酸配列を参考にして以下のようなミックス・プライマー（５Ｄｍ−３Ｆおよび５Ｄ−１Ｒ）を設計し作成した（配列番号１７および２１参照）。
５Ｄｍ−３Ｆ：５’−ＴＴＣＧＣＳＣＴＳＣＣＳＧＴＣＣＣＳＴＣＳＡＴＧＧＴＳＡＴ−３’
５Ｄ−１Ｒ：５’−ＡＧＧＴＧＣＣＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＡＴＧＴＴ−３’
コドンの揺らぎを考慮して反応性を高めるために、混合塩基Ｓ（＝Ｃ＋Ｇ）、Ｙ（＝Ｃ＋Ｔ）を使用した。
次に、この２種のプライマー（５Ｄｍ−３Ｆおよび５Ｄ−１Ｒ）と前項（１）で得たＭｅｒ−１１１０７株ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ社）とＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社  Ｔ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、変性を９８℃、２０秒間、アニーリングを５０℃、２分間、伸長を６８℃、３０秒間行う３段階の反応を３５回繰り返した。その結果、約３００ｂｐの大きさのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片−Ａ２という）が増幅された。このＤＮＡ断片−Ａ２は水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分である可能性が高い。ＰＣＲ反応にて増幅したＤＮＡ断片−Ａ２を、反応液からＳＵＰＲＥＣ  ＰＣＲ（タカラバイオ社）によって回収した。
次に得られたＤＮＡ断片−Ａ２の塩基配列を解析するに足る量のＤＮＡ断片−Ａ２を得るために、プラスミドベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ社）を用いてＤＮＡ断片−Ａ２を連結し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。その後、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）、Ｘ−ｇａｌ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ；４０μｇ／ｍＬ）、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ；１００μＭ）を含むＬ−Ｂｒｏｔｈ寒天培地（１．０％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天）を用いて、形質転換された大腸菌を選択した。こうして分離した形質転換大腸菌のコロニーをアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）で培養した。増殖した形質転換大腸菌の菌体からプラスミド精製キット（ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドＤＮＡの分離精製を行い、一定量のＤＮＡ断片−Ａ２を得た。
（３）クローニングされたＤＮＡ断片−Ａ２の塩基配列の解析
前項（２）で得られたＤＮＡ断片−Ａ２の塩基配列をＤＮＡ塩基配列解析装置（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７７ＸＬ）を用い、ダイターミネーター・サイクル・シークエンス法で解析した。塩基配列解析の結果、ＰＣＲ反応で増幅されたＤＮＡ断片−Ａ２は電気泳動で約３００ｂｐと測定されたが、塩基配列分析の結果、正確には３２５ｂｐであることが明らかとなった（配列番号３の塩基８３７〜塩基１１６１参照）。クローニングされた前記の３２５ｂｐのＤＮＡ配列の両端には前記のＰＣＲ反応の時に使用した２種類のプライマーに対応するＤＮＡ配列が見出されたので、前記のＰＣＲ反応ではＤＮＡ断片−Ａ２がこの２種類のプライマー（５Ｄｍ−３Ｆおよび５Ｄ−１Ｒ）により特異的に増幅されたことが明らかとなった。
（４）ＤＮＡ断片−Ａ２の周辺領域の解析
前記のとおり、Ｍｅｒ−１１１０７株由来の水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの部分的配列が決定されたのでインバースＰＣＲ法（細胞工学１４巻、ｐ．５９１−５９３，１９９５年）によって、クローニング断片の上流、下流域に広がる周辺領域の塩基配列を増幅、クローニング、配列解析した。すなわち、Ｍｅｒ−１１１０７株ゲノムＤＮＡ（前項（１）参照）を、Ｋ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭジチオスレイトール，１００ｍＭ  ＫＣｌ）中で制限酵素ＢａｍＨＩで、Ｈ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭジチオスレイトール，１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中で制限酵素ＳａｌＩでそれぞれ消化した。得られた各制限酵素切断ＤＮＡ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ社）を用いて自己環状化させた。
他方、ＤＮＡ断片−Ａ２の塩基配列から、以下のようなプライマー（７ＰＩＮ−２Ｆおよび６ＰＩＮ−２Ｒ）を設計し作成した（配列番号２２および２０参照）。
７ＰＩＮ−２Ｆ：５’−ＣＣＡＴＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＡＧＡ−３’
６ＰＩＮ−２Ｒ：５’−ＣＴＧＴＴＣＣＴＣＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＧＧＴＣＧＧＣＧＴＡ−３’
次にこの２種のプライマー（７ＰＩＮ−２Ｆおよび６ＰＩＮ−２Ｒ）と前記の自己環状化させたＭｅｒ−１１１０７株ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ社）とＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社  Ｔ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、変性を９８℃、２０秒間、アニーリングと伸長を６８℃、５分間行う２段階の反応を３５回繰り返した。
この結果、約１．３ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｂ２）と約１．４ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｃ２）が増幅したが、これらは、水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡおよびその上流と下流領域を含むＤＮＡ配列を有するＤＮＡである可能性が高い。
このＰＣＲ増幅反応液からＤＮＡ断片−Ｂ２およびＤＮＡ断片−Ｃ２をＳＵＰＲＥＣ  ＰＣＲ（タカラバイオ社）によって回収した。次に得られたＤＮＡ断片−Ｂ２およびＤＮＡ断片−Ｃ２について、塩基配列を解析するに足る量の各ＤＮＡ断片を得るために、前項（２）と同様にプラスミドベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ社）、大腸菌ＪＭ１０９株およびプラスミド精製キット（ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、一定量の各ＤＮＡ断片を得た。
（５）ＤＮＡ断片−Ｂ２（約１．３ｋｂｐのサイズ）およびＤＮＡ断片−Ｃ２（約１．４ｋｂｐのサイズ）の塩基配列の解析
前項（４）で得られたＤＮＡ断片−Ｂ２およびＤＮＡ断片−Ｃ２の塩基配列をＤＮＡ塩基配列解析装置（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７７ＸＬ）を用い、ダイターミネーター・サイクル・シークエンス法で解析した。このように塩基配列の解析を行い、ＤＮＡ断片−Ｂ２およびＤＮＡ断片−Ｃ２配列から、配列番号３に示された２３２９ｂｐの塩基配列の情報を得た。
この２３２９ｂｐ中のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を検索したところ、２種類のタンパク質がコードされていることが判明した。これらのタンパク質のアミノ酸配列をＢＬＡＳＴ  ｓｅａｒｃｈにて検索した結果、配列番号３の塩基４２０〜塩基１６０４にチトクロムＰ４５０と高い相同性を有する３９５個のアミノ酸からなるタンパク質をコードするＯＲＦ（以下、ｂｐｍＡという）が存在した。そしてｂｐｍＡは、Ａ−１５４４株から単離したｐｓｍＡのアミノ酸配列に最も高い相同性を有し（相同性６７．４％）、さらにストレプトミセス・グリセウスのチトクロムＰ４５０ｓｏｙ（ＳｏｙＣ）にも比較的高い相同性を有した（相同性６４．８％）。このことからｂｐｍＡがチトクロムＰ４５０タイプの水酸化酵素をコードする可能性が高いと考えられた。
またｂｐｍＡのすぐ下流（配列番号３の塩基１６４３〜塩基１８３４）には２Ｆｅ−２Ｓタイプのフェレドキシンに高い相同性を有するタンパク質をコードするＯＲＦ（以下、ｂｐｍＢという）が存在した。ｂｐｍがコードするタンパク質は６４個のアミノ酸からなり、Ａ−１５４４株から単離したｐｓｍＢのアミノ酸配列に最も高い相同性を有し（相同性８１．０％）、さらにストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）のチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１０５Ｄ５）と推定されるアミノ酸配列のすぐ下流のフェレドキシンと推定されるアミノ酸配列にも比較的高い相同性を有した（７６．２％）。そのため、ｂｐｍＢは電子伝達を担い、ｂｐｍＡと共に水酸化を行うものと考えられた。
参考例４：マクロライド系化合物（ＩＩ）の１６位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ−３
（１）Ａ−１５６０株ゲノムのＤＮＡの調製
グルコース１％、麦芽エキス０．４％、酵母エキス１％からなる培地にＡ−１５６０株を接種し、２８℃、３日間培養した。得られた培養液を３０００ｒｐｍ、１０分間遠心して菌体を集めた。その菌体からＢｌｏｏｄ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＡ−１５６０株ゲノムＤＮＡを調製した。
（２）マクロライド系化合物１１１０７Ｂの１６位水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの部分的配列のクローニング
ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）のチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１０５Ｄ５）と推定されるアミノ酸配列を参考にして以下のようなミックス・プライマー（５Ｄｍ−３Ｆおよび５Ｄｍ−２Ｒ）を設計し作成した（配列番号１７および２３参照）。
５Ｄｍ−３Ｆ：５’−ＴＴＣＧＣＳＣＴＳＣＣＳＧＴＣＣＣＳＴＣＳＡＴＧＧＴＳＡＴ−３’
５Ｄｍ−２Ｒ：５’−ＣＴＧＧＡＴＳＧＴＧＴＣＳＣＣＳＧＧＹＴＴ−３’
コドンの揺らぎを考慮して反応性を高めるために、混合塩基Ｓ（＝Ｃ＋Ｇ）、Ｙ（＝Ｃ＋Ｔ）を使用した。
次に、この２種のプライマー（５Ｄｍ−３Ｆおよび５Ｄｍ−２Ｒ）と前項（１）で得たＡ−１５６０株ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ社）とＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社  Ｔ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、変性を９８℃、２０秒間、アニーリングを５０℃、２分間、伸長を６８℃、３０秒間行う３段階の反応を３５回繰り返した。その結果、約７５０ｂｐの大きさのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片−Ａ３という）が増幅された。このＤＮＡ断片−Ａ３は水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分である可能性が高い。ＰＣＲ反応にて増幅したＤＮＡ断片−Ａ３を、反応液からＳＵＰＲＥＣ  ＰＣＲ（タカラバイオ社）によって回収した。
次に得られたＤＮＡ断片−Ａ３の塩基配列を解析するに足る量のＤＮＡ断片−Ａ３を得るために、プラスミドベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ社）を用いてＤＮＡ断片−Ａ３を連結し、大腸菌ＪＭ１０９株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を形質転換した。その後、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）、Ｘ−ｇａｌ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ；４０μｇ／ｍＬ）、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ；１００μＭ）を含むＬ−Ｂｒｏｔｈ寒天培地（１．０％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天）を用いて、形質転換された大腸菌を選択した。こうして分離した形質転換大腸菌のコロニーをアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）で培養した。増殖した形質転換大腸菌の菌体からプラスミド精製キット（ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドＤＮＡの分離精製を行い、一定量のＤＮＡ断片−Ａ３を得た。
（３）クローニングされたＤＮＡ断片−Ａ３の塩基配列の解析
前項（２）で得られたＤＮＡ断片−Ａ３の塩基配列をＤＮＡ塩基配列解析装置（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７７ＸＬ）を用い、ダイターミネーター・サイクル・シークエンス法で解析した。塩基配列解析の結果、ＰＣＲ反応で増幅されたＤＮＡ断片−Ａ３は電気泳動で約７５０ｂｐと測定されたが、塩基配列分析の結果、正確には７４１ｂｐであることが明らかとなった（配列番号４の塩基６１６〜塩基１３５６参照）。クローニングされた前記の７４１ｂｐのＤＮＡ配列の両端には前記のＰＣＲ反応の時に使用した２種類のプライマーに対応するＤＮＡ配列が見出されたので、前記のＰＣＲ反応ではＤＮＡ断片−Ａ３がこの２種類のプライマー（５Ｄｍ−３Ｆおよび５Ｄｍ−２Ｒ）により特異的に増幅されたことが明らかとなった。
（４）ＤＮＡ断片−Ａ３の周辺領域の解析
前記のとおり、Ａ−１５６０株由来の水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの部分的配列が決定されたのでインバースＰＣＲ法（細胞工学１４巻、ｐ．５９１−５９３，１９９５年）によって、クローニング断片の上流、下流域に広がる周辺領域の塩基配列を増幅、クローニング、配列解析した。すなわち、Ａ−１５６０株ゲノムＤＮＡ（前項（１）参照）を、Ｋ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭジチオスレイトール，１００ｍＭ  ＫＣｌ）中において制限酵素ＢａｍＨＩで、Ｌ緩衝掖（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭジチオスレイトール）中において制限酵素ＫｐｎＩで、Ｈ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭジチオスレイトール，１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中において制限酵素ＳａｌＩでそれぞれ消化した。得られた各制限酵素切断ＤＮＡ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ社）を用いて自己環状化させた。
他方、ＤＮＡ断片−Ａ３の塩基配列から、以下のようなプライマー（５ＰＩＮ−２Ｆおよび６ＰＩＮ−２Ｒ）を設計し作成した（配列番号２４および２０参照）。
５ＰＩＮ−２Ｆ：５’−ＣＧＧＡＡＴＣＣＡＣＣＡＧＴＧＣＣＴＣＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＴ−３’
６ＰＩＮ−２Ｒ：５’−ＣＴＧＴＴＣＣＴＣＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＧＧＴＣＧＧＣＧＴＡ−３’
次にこの２種のプライマー（５ＰＩＮ−２Ｆおよび６ＰＩＮ−２Ｒ）と前記の自己環状化させたＡ−１５６０株ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ社）とＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社  Ｔ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、変性を９８℃、２０秒間、アニーリングと伸長を６８℃、５分間行う２段階の反応を３５回繰り返した。
この結果、約４．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｂ３）と約３．０ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｃ３）と約１．７ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｄ３）が増幅したが、これらは、水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡおよびその上流と下流領域を含むＤＮＡ配列を有するＤＮＡである可能性が高い。
このＰＣＲ増幅反応液からＤＮＡ断片−Ｂ３およびＤＮＡ断片−Ｃ３およびＤＮＡ断片−Ｄ３をＳＵＰＲＥＣ  ＰＣＲ（タカラバイオ社）によって回収した。次に得られたＤＮＡ断片−Ｂ３およびＤＮＡ断片−Ｃ３およびＤＮＡ断片−Ｄ３について、塩基配列を解析するに足る量の各ＤＮＡ断片を得るために、前項（２）と同様にプラスミドベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ社）、大腸菌ＪＭ１０９株およびプラスミド精製キット（ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、一定量の各ＤＮＡ断片を得た。
（５）ＤＮＡ断片−Ｂ３（約４．５ｋｂｐのサイズ）、ＤＮＡ断片−Ｃ３（約３．０ｋｂｐのサイズ）およびＤＮＡ断片−Ｄ３（約１．７ｋｂｐのサイズ）の塩基配列の解析
前項（４）で得られたＤＮＡ断片−Ｂ３、ＤＮＡ断片−Ｃ３およびＤＮＡ断片−Ｄ３の塩基配列をＤＮＡ塩基配列解析装置（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７７ＸＬ）を用い、ダイターミネーター・サイクル・シークエンス法で解析した。このように塩基配列の解析を行い、ＤＮＡ断片−Ｂ３、ＤＮＡ断片−Ｃ３およびＤＮＡ断片−Ｄ３の配列の中から、配列番号４に示された１８６０ｂｐの塩基配列の情報を得た。
この１８６０ｂｐ中のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を検索したところ、２種類のタンパク質がコードされていることが判明した。これらのタンパク質のアミノ酸配列をＢＬＡＳＴ  ｓｅａｒｃｈにて検索した結果、配列番号４の塩基１７２〜塩基１３８３にチトクロムＰ４５０と高い相同性を有する４０４個のアミノ酸からなるタンパク質をコードするＯＲＦ（以下、ｔｐｍＡという）が存在した。そしてｔｐｍＡは、ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）のチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１０５Ｄ５）と推定されるアミノ酸配列に最も高い相同性を有し（相同性７７．４％）、Ａ−１５４４株から単離したｐｓｍＡのアミノ酸配列にも高い相同性を有した（相同性７６．６％）。このことからｔｐｍＡはチトクロムＰ４５０タイプの水酸化酵素をコードする遺伝子である可能性が高いと考えられた。
またｔｐｍＡのすぐ下流（配列番号４の塩基１３９９〜塩基１５９３）には２Ｆｅ−２Ｓタイプのフェレドキシンに高い相同性を有するタンパク質をコードするＯＲＦ（以下、ｔｐｍＢという）が存在した。ｔｐｍＢがコードするタンパク質は６５個のアミノ酸からなり、Ａ−１５４４株から単離したｐｓｍＢのアミノ酸配列に最も高い相同性を有し（相同性８７．３％）、ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）のチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１０５Ｄ５）と推定されるアミノ酸配列のすぐ下流のフェレドキシンと推定されるアミノ酸配列にも高い相同性を有した（８２．５％）。そのため、ｔｐｍＢは電子伝達を担い、ｔｐｍＡと共に水酸化を行うフェレドキシンをコードしていると考えられた。
参考例５：プラスミドｐＴ７ＮＳ−ｃａｍＡＢの構築
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＡＴＣＣ  １７４５３のゲノムＤＮＡを鋳型にして、以下に示す配列からなるプライマーＰＲＲ−１Ｆ（配列番号２９参照）とＰＲＲ−２Ｒ（配列番号３０参照）を用いて下記の条件でＰＣＲを行った。
ＰＲＲ−１Ｆ：５’−ＧＣＣＣＣＣＣＡＴＡＴＧＡＡＣＧＣＡＡＡＣＧＡＣＡＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＣ−３’
ＰＲＲ−２Ｒ：５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＧＣＡＣＴＡＣＴＣＡＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＧＧＣ−３’
（反応液組成）
滅菌精製水                                                            １５μｌ
２倍濃縮ＧＣ緩衝液Ｉ（宝酒造）                                        ２５μｌ
ｄＮＴＰ混合溶液（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ各２．５ｍＭ）  ８μｌ
ＰＲＲ−１Ｆプライマー（１００ｐｍｏｌ／μｌ）                      ０．５μｌ
ＰＲＲ−２Ｒプライマー（１００ｐｍｏｌ／μｌ）                      ０．５μｌ
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＡＴＣＣ  １７４５３ゲノムＤＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）０．５μｌ
ＬＡ  Ｔａｑ（５ｕｎｉｔｓ／μｌ，宝酒造）                          ０．５μｌ
（温度条件）
９５℃  ３分
（９８℃  ２０秒、６３℃  ３０秒、６８℃  ２分）  ３０サイクル
７２℃  ５分
得られたｐｕｔｉｄａｒｅｄｏｘｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子（ｃａｍＡ）およびその遺伝子すぐ下流のｐｕｔｉｄａｒｅｄｏｘｉｎ遺伝子（ｃａｍＢ）を含む１．５ｋｂの増幅された断片（ｃａｍＡＢ断片）を制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで処理したのち、０．８％アガロースゲルにて電気泳動した。泳動後、このゲルから切り出したｃａｍＡＢ断片を含むゲル切片から同断片をＳＵＰＲＥＣ−０１（宝酒造）を用いて回収・精製した。この断片を大腸菌プラスミドベクターｐＥＴ１１ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＮｄｅＩ部位およびＢａｍＨＩ部位にＴ４  ＤＮＡリガーゼにより連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換して、プラスミドｐＴ７−ｃａｍＡＢを構築した。次に以下に示す配列からなる２種の合成オリゴＤＮＡ  ＳＰ−１（配列番号３１参照）およびＳＰ−２（配列番号３２参照）をアニールして得られるリンカー１分子をこのプラスミドのＮｄｅＩ部位にＴ４  ＤＮＡリガーゼにより連結し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換して、プラスミドｐＴ７ＮＳ−ｃａｍＡＢを構築した。
ＳＰ−１：５’−ＴＡＴＧＣＧＴＣＡＣＴＡＧＴＣＧＧＧＡＧＴＧＣＧＴＴＡ−３’
ＳＰ−２：５’−ＴＡＴＡＡＣＧＣＡＣＴＣＣＣＧＡＣＴＡＧＴＧＡＣＧＣＡ−３’
［実施例１］ｐｌｄＡプロモーターとｐｓｍＡＢを連結させたプラスミドｐＰａｐｓｍＡＢの作製
ｐｓｍＡＢをプラジエノライドＢ生合成遺伝子と連動して発現させるため、プラジエノライドＢ生合成遺伝子のｐｌｄＡのプロモーター領域をｐｓｍＡＢと連結させた。配列番号１の塩基配列情報をもとに、ｐｌｄＡのプロモーター領域を増幅するために以下に示すような配列からなる２種のプライマー、ｐｌｄＡｐｒｏ−ＳｐｅＮｄｅＦ（５’末端にＳｐｅＩおよびＮｄｅＩサイトを付加：配列番号２５参照）およびｐｌｄＡｐｒｏ−ＮｄｅＲ（５’末端にＮｄｅＩサイトを付加：配列番号２６参照）を合成した。
ｐｌｄＡｐｒｏ−ＳｐｅＮｄｅＦ：５’−ＧＧＧＣＡＴＡＴＧＡＣＴＡＧＴＡＧＣＣＧＴＧＴＣＣＴＧＣＣＣＧＣＣ−３’
ｐｌｄＡｐｒｏ−ＮｄｅＲ：５’−ＧＧＧＣＡＴＡＴＧＴＴＣＧＧＡＣＧＴＧＡＡＴＴＣＡＴＴＣＧ−３’
これらのプライマーを用いてＰＣＲを以下の条件にて行った。
（ＰＣＲ反応液組成：東洋紡績社ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を使用）
滅菌精製水                                                            ７１μＬ
１０倍濃縮ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ                                        １０μＬ
ｄＮＴＰ混合溶液（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ  各２ｍＭ）  １０μＬ
ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）                                                  ４μＬ
ＫＯＤ＋                                                                ２μＬ
ｐｌｄＡｐｒｏ−ＳｐｅＮｄｅＦ（５０ｐｍｏｌ／μＬ）                    １μＬ
ｐｌｄＡｐｒｏ−ＮｄｅＲ（５０ｐｍｏｌ／μＬ）                          １μＬ
ｐＫＳ３５（参考例１（６）１０ｎｇ／μＬ）                              １μＬ
（反応条件：Ｂｉｏｍｅｔｒａ社  Ｔ  ＧＲＡＤＩＥＮＴを使用）
９５℃  ５分
（９８℃  ２０秒、６３℃  １分、６８℃  １分）２５サイクル
７２℃  ５分
この反応の結果、増幅された３６０ｂｐのＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて回収した。得られた３６０ｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩで消化した。同様にプラスミドｐＴＣ−ＤＭ（参考例２（６））を制限酵素ＮｄｅＩで消化した。得られた３６０ｂｐのＤＮＡ断片の消化物とプラスミド消化物とを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社）を用いて連結した。これにより、ｐｌｄＡプロモーターとｐｓｍＡＢを連結させた、約９．９ｋｂｐのサイズのプラスミドｐＰａｐｓｍＡＢを構築した。
［実施例２］組み換え導入用プラスミドの作製
実施例１で調製したプラスミドｐＰａｐｓｍＡＢを制限酵素ＳｐｅＩで消化した後、ＢＫＬ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて末端を平滑化した。得られたＤＮＡを０．８％のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｇａｒｏｓｅ（登録商標、ＢＩＯ−ＲＡＤ社）上で電気泳動（Ｍｕｐｉｄ−ｅｘ：アドバンス社）し、分離した１．８ｋｂｐのｐｌｄＡプロモーターとｐｓｍＡＢを含むＤＮＡ断片（以後、ＰａｐｓｍＡＢというときがある）を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて回収精製した。また、図４に示す組み換え導入用ベクターｐＵＣ１９ａｐｈ：：ｏｒｉＴ：：ｉｎｔｐｈｉＣ３１を制限酵素ＢａｍＨＩで消化した後、ＢＫＬ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて末端を平滑化した。こうして得られたベクターとＰａｐｓｍＡＢとをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社）を用いて連結した。これにより、ＰａｐｓｍＡＢを組み換え導入用ベクターｐＵＣ１９ａｐｈ：：ｏｒｉＴ：：ｉｎｔｐｈｉＣ３１に挿入した、組み換え導入用プラスミドｐＡＯＣ：：ＰａｐｓｍＡＢを構築した。
［実施例３］組み換え導入用プラスミドｐＡＯＣ：：ＰａｐｓｍＡＢのＭｅｒ−１１１０７株への導入
得られたｐＡＯＣ：：ＰａｐｓｍＡＢを、接合大腸菌Ｓ１７−１（ＡＴＣＣ４７０５５）へエレクトロポレーション法を用いて形質転換し、Ｓ１７−１／ｐＡＯＣ：：ＰａｐｓｍＡＢ株を得た。得られたＳ１７−１／ｐＡＯＣ：：ＰａｐｓｍＡＢ株を、２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）１０ｍＬに植菌し、３０℃で２時間振盪培養後、集菌し、ＬＢ培地１０ｍＬで２回洗浄後、ＬＢ培地５ｍＬに懸濁した。これを供与菌懸濁液とした。供与菌懸濁液を調製するのと同時進行で、Ｍｅｒ−１１１０７株をＴＳＢ培地（Ｔｒｙｐｔｏ−Ｓｏｙａ  ｂｒｏｔｈ：日水製薬社）１０ｍＬに植菌し、３０℃で５時間振盪培養後、集菌し、滅菌水１０ｍＬで２回洗浄後、滅菌水１ｍＬに懸濁した。これを受容菌懸濁液とした。得られたＳ１７−１／ｐＡＯＣ：：ＰａｐｓｍＡＢ株供与菌懸濁液５００μＬを、Ｍｅｒ−１１１０７株受容菌懸濁液１０μＬと混ぜ、Ａｃｔｉｎｏ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｎｏ．４寒天培地（日本製薬社）に塗布した。３０℃で１８時間培養後、２ｍｇ／ｍＬのリボスタマイシンを含む２．５ｍＬのＳＮＡ（０．８％栄養培地：Ｄｉｆｃｏ社、０．４％寒天）を重層した。３０℃で７日間培養し、リボスタマイシンに耐性なｐＡＯＣ：：ＰａｐｓｍＡＢ形質転換株Ｍｅｒ−１１１０７：：ｐＡＯＣ：：ＰａｐｓｍＡＢ株を得た。
［実施例４］Ｍｅｒ−１１１０７：：ｐＡＯＣ：：ＰａｐｓｍＡＢ株のプラジエノライド生産試験
実施例３で得られたＭｅｒ−１１１０７：：ｐＡＯＣ：：ＰａｐｓｍＡＢ株とコントロールとして親株のＭｅｒ−１１１０７株について、プラジエノライドＢおよびその１６位水酸化体であるプラジエノライドＤの生産性を試験した。
Ｍｅｒ−１１１０７：：ｐＡＯＣ：：ＰａｐｓｍＡＢ株と、Ｍｅｒ−１１１０７株の各々の凍結種母３００μＬを、種母培地（溶性デンプン２％、大豆粉（味の素社：エスサンミート）２％、酵母エキス０．３％、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１％、ＭｇＳＯ・７Ｈ２Ｏ  ０．２５％、ＣａＣＯ３  ０．３％  ｐＨ無調整）６０ｍＬに植菌し、２５℃で３日間培養した。得られた種母培養液の６００μＬを、本培養培地（溶性デンプン５％、グルコース１％、ファルマメディア３％、アデカノールＬＧ−１２６  ０．０５％、ＣａＣＯ３  ０．１％、ｐＨ７．５）６０ｍＬに植菌し、２５℃で３日間、４日間、５日間および６日間培養した。培養終了後、得られた培養液に対して４倍量のアセトニトリルを加えて抽出した。得られた抽出液についてＨＰＬＣにてプラジエノライドＢおよびその１６位水酸化体であるプラジエノライドＤの量を測定した。測定結果を表２に示す。また、ＨＰＬＣの測定条件を以下に示す。
分析装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣ  １０Ａｖｐ
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ  ＵＧ−３（φ４．６ｍｍ×５０ｍｍ  ３μｍ）
移動相：４５％〜５５％メタノール（０〜５分）
５５％メタノール（５〜１３分）
５５％〜７０％メタノール（１３〜２１分）
７０％メタノール（２１〜２５分）
流速：１．２ｍＬ／分
検出：ＵＶ２４０ｎｍ
インジェクション容量：５μＬ
カラム温度：４０℃
分析時間：２５分
保持時間：プラジエノライドＢ  １２．４分
プラジエノライドＤ    ４．３分
【表２】
2006126723.tif 000011
2006126723.tif 000012
この結果、親株であるＭｅｒ−１１１０７株ではプラジエノライドＤの生産がほとんどみられなかったのに対して、ｐＡＯＣ：：ＰａｐｓｍＡＢを導入したＭｅｒ−１１１０７：：ｐＡＯＣ：：ＰａｐｓｍＡＢ株ではプラジエノライドＤを生産していた。このことより、プラジエノライドＢ生産株であるＭｅｒ−１１１０７株に、プラジエノライドＢの１６位水酸化酵素遺伝子であるｐｓｍＡＢを導入することにより、プラジエノライドＤを直接生産できることが示された。
［実施例５］Ｍｅｒ−１１１０７：：ｐＡＯＣ：：ＰａｐｓｍＡＢ株のプラジエノライドＤ生産におけるβ−ＣＤ添加効果
実施例３で得られたＭｅｒ−１１１０７：：ｐＡＯＣ：：ＰａｐｓｍＡＢ株におけるプラジエノライドＢおよびその１６位水酸化体であるプラジエノライドＤの生産性について、β−シクロデキストリン（β−ＣＤ）の添加効果を調べた。Ｍｅｒ−１１１０７：：ｐＡＯＣ：：ＰａｐｓｍＡＢ株の凍結種母３００μＬを、種母培地（溶性デンプン２％、大豆粉（味の素社：エスサンミート）２％、酵母エキス０．３％、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２５％、ＣａＣＯ３  ０．３％  ｐＨ無調整）３０ｍＬに植菌し、２５℃で３日間培養した。得られた種母培養液の３００μＬを、β−ＣＤを２％加えた本培養培地（溶性デンプン５％、グルコース１％、ファルマメディア３％、アデカノールＬＧ−１２６  ０．０５％、β−ＣＤ  ２．０％、ＣａＣＯ３  ０．１％、ｐＨ７．５）３０ｍＬ、またはβ−ＣＤを加えない本培養培地（溶性デンプン５％、グルコース１％、ファルマメディア３％、アデカノールＬＧ−１２６  ０．０５％、ＣａＣＯ３  ０．１％、ｐＨ７．５）３０ｍＬに植菌し、２５℃で３日間、４日間、５日間および６日間培養した。培養終了後、得られた培養液に対して４倍量のアセトニトリルを加えて抽出した。得られた抽出液についてＨＰＬＣにてプラジエノライドＢおよびその１６位水酸化体であるプラジエノライドＤの量を測定した。測定結果を表３に示す。また、ＨＰＬＣの測定条件を以下に示す。
分析装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣ  １０Ａｖｐ
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ  ＵＧ−３（φ４．６ｍｍ×５０ｍｍ  ３μｍ）
移動相：４５％〜５５％メタノール（０〜５分）
５５％メタノール（５〜１３分）
５５％〜７０％メタノール（１３〜２１分）
７０％メタノール（２１〜２５分）
流速：１．２ｍＬ／分
検出：ＵＶ２４０ｎｍ
インジェクション容量：５μＬ
カラム温度：４０℃
分析時間：２５分
保持時間：プラジエノライドＢ  １２．４分
プラジエノライドＤ    ４．３分
【表３】
2006126723.tif 000013
この結果、β−ＣＤ  ２％添加によりプラジエノライドＤの蓄積量が約１．４倍に増大したことより、β−ＣＤの添加がプラジエノライドＤの直接生産に効果があることが示された。
［実施例６］Ｍｅｒ−１１１０７：：ｐＡＯＣ：：ＰａｐｓｍＡＢ株のプラジエノライド生産（２）
実施例３で得られたＭｅｒ−１１１０７：：ｐＡＯＣ：：ＰａｐｓｍＡＢ株の凍結種母３００μＬを種母培地（溶性デンプン２％、大豆粉（味の素社：エスサンミート）２％、酵母エキス０．３％、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２５％、ＣａＣＯ３  ０．３％  ｐＨ無調整）３０ｍＬに植菌し、２５℃で３日間培養した。得られた種母培養液の３００μＬを、本培養培地（溶性デンプン５％、グルコース１％、ファルマメディア３％、大豆粉（Ｊ−オイルミルズ社：豊年ソイプロ）１％、アデカノールＬＧ−１２６  ０．０５％、β−ＣＤ  ２．０％、ＣａＣＯ３  ０．１％、ｐＨ７．５）３０ｍＬに植菌し、２５℃で３日間、４日間、５日間、６日間および７日間培養した。
培養終了後、得られた培養液に対して４倍量のアセトニトリルを加えて抽出した。得られた抽出液についてＨＰＬＣにてプラジエノライドＢおよびその１６位水酸化体であるプラジエノライドＤの量を測定した。測定結果を表４に示す。また、ＨＰＬＣの測定条件を以下に示す。
分析装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣ  １０Ａｖｐ
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ  ＵＧ−３（φ４．６ｍｍ×５０ｍｍ  ３μｍ）
移動相：４５％〜５５％メタノール（０〜５分）
５５％メタノール（５〜１３分）
５５％〜７０％メタノール（１３〜２１分）
７０％メタノール（２１〜２５分）
流速：１．２ｍＬ／分
検出：ＵＶ２４０ｎｍ
インジェクション容量：５μＬ
カラム温度：４０℃
分析時間：２５分
保持時間：プラジエノライドＢ  １２．４分
プラジエノライドＤ    ４．３分
【表４】
2006126723.tif 000014
2006126723.tif 000015
前記の培養液に等量のアセトニトリルを添加して得た抽出液５０ｍＬをろ過した後、菌体を水３０ｍＬにて洗浄した。ろ液に水７０ｍＬを加え酢酸エチル１００ｍＬで１回、５０ｍＬで２回抽出した。酢酸エチル層を合わせ、飽和食塩水５０ｍＬで２回洗浄後、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。溶媒を除去した後、得られた残渣を薄層クロマトグラフィー（ＭＥＲＣＫ  Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４  ０．５ｍｍ  展開液；トルエン：アセトン＝１：１）により精製することによりプラジエノライドＢが１２．８ｍｇ、プラジエノライドＤが２３．１ｍｇ得られた。プラジエノライドＢ及びプラジエノライドＤの１Ｈ−ＮＭＲ分析結果を以下に示す。
プラジエノライドＢ；
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）：δｐｐｍ（積分、多重度、結合定数Ｊ（Ｈｚ））：０．９３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），０．９８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），１．１２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．２３（３Ｈ，ｓ），１．２５（１Ｈ，ｍ），１．４２（２Ｈ，ｍ），１．５３−１．７０（６Ｈ，ｍ），１．７９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ），２．１０（３Ｈ，ｓ），２．５２（１Ｈ，ｍ），２．５６（２Ｈ，ｍ），２．６０（１Ｈ，ｍ），２．７０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．４，８．３Ｈｚ），２．７６（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝２．４，５．７Ｈｚ），３．５６（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝８．３，４．４Ｈｚ），３．８２（１Ｈ，ｍ），５．０８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ），５．６０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．８，１５．２Ｈｚ），５．７０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．３，１５．２Ｈｚ），５．７４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．８，１５．２Ｈｚ），６．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ），６．３６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．８，１５．２Ｈｚ）
プラジエノライドＤ；
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）：δｐｐｍ（積分、多重度、結合定数Ｊ（Ｈｚ））：０．９３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），０．９８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），１．２３（３Ｈ，ｓ），１．３０（１Ｈ，ｍ），１．３６−１．６６（９Ｈ，ｍ），１．７０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．４，１４．２Ｈｚ），１．８２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ），１．９０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．４，１４．２Ｈｚ），２．１０（３Ｈ，ｓ），２．５２（２Ｈ，ｍ），２．６２（１Ｈ，ｍ），２．７２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．４，８．３Ｈｚ），２．９４（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝２．４，５．７Ｈｚ），３．５５（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝８．３，４．４Ｈｚ），３．８２（１Ｈ，ｍ），５．１０（（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ），５．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ），５．６０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．８，１５．２Ｈｚ），５．７４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．３，１５．２Ｈｚ），５．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ），６．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ），６．５７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．８，１５．２Ｈｚ）
［実施例７］組み換え導入用プラスミドｐＡＯＣ：：ＰａｐｓｍＡＢのＭｅｒ−１１１０７  ｐｌｄＢ：：ｈｙｇ株への導入
実施例３で得られたＳ１７−１／ｐＡＯＣ：：ＰａｐｓｍＡＢ株を、２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）１０ｍＬに植菌し、３０℃で２時間振盪培養後、集菌し、ＬＢ培地１０ｍＬで２回洗浄後、ＬＢ培地５ｍＬに懸濁した。これを供与菌懸濁液とした。
供与菌懸濁液を調製するのと同時進行で、参考例１（８）で作製したＭｅｒ−１１１０７  ｐｌｄＢ：：ｈｙｇ株をＴＳＢ培地（Ｔｒｙｐｔｏ−Ｓｏｙａ  ｂｒｏｔｈ：日水製薬社）１０ｍＬに植菌し、３０℃で５時間振盪培養後、集菌し、滅菌水１０ｍＬで２回洗浄後、滅菌水１ｍＬに懸濁した。これを受容菌懸濁液とした。得られたＳ１７−１／ｐＡＯＣ：：ＰａｐｓｍＡＢ株供与菌懸濁液５００μＬを、Ｍｅｒ−１１１０７  ｐｌｄＢ：：ｈｙｇ株受容菌懸濁液１０μＬと混ぜ、Ａｃｔｉｎｏ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｎｏ．４寒天培地（日本製薬社）に塗布した。３０℃で１８時間培養後、２ｍｇ／ｍＬのリボスタマイシンを含む２．５ｍＬのＳＮＡ（０．８％栄養培地：Ｄｉｆｃｏ社、０．４％寒天）を重層した。３０℃で７日間培養し、リボスタマイシンに耐性なｐＡＯＣ：：ＰａｐｓｍＡＢ形質転換株Ｍｅｒ−１１１０７  ｐｌｄＢ：：ｈｙｇ：：ｐＡＯＣ：：ＰａｐｓｍＡＢ株を得た。
［実施例８］Ｍｅｒ−１１１０７  ｐｌｄＢ：：ｈｙｇ：：ｐＡＯＣ：：ＰａｐｓｍＡＢ株のプラジエノライド生産試験
実施例７で得られたＭｅｒ−１１１０７  ｐｌｄＢ：：ｈｙｇ：：ｐＡＯＣ：：ＰａｐｓｍＡＢ株とコントロールとして親株のＭｅｒ−１１１０７  ｐｌｄＢ：：ｈｙｇ株について、ＭＥ−２６５およびその１６位水酸化体であるＭＥ−２８２の生産性を試験した。Ｍｅｒ−１１１０７  ｐｌｄＢ：：ｈｙｇ：：ｐＡＯＣ：：ＰａｐｓｍＡＢ株と、Ｍｅｒ−１１１０７  ｐｌｄＢ：：ｈｙｇ株の各々の凍結種母３００μＬを、種母培地（溶性デンプン２％、大豆粉（味の素社：エスサンミート）２％、酵母エキス０．３％、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２５％、ＣａＣＯ３  ０．３％  ｐＨ無調整）３０ｍＬに植菌し、２５℃で３日間培養した。得られた種母培養液の３００μＬを、β−ＣＤを２％加えた本培養培地（溶性デンプン５％、グルコース１％、ファルマメディア３％、アデカノールＬＧ−１２６  ０．０５％、β−ＣＤ  ２．０％、ＣａＣＯ３  ０．１％、ｐＨ７．５）３０ｍＬに植菌し、２５℃で３日間、４日間、５日間および６日間培養した。培養終了後、得られた培養液に対して４倍量のアセトニトリルを加えて抽出した。得られた抽出液についてＨＰＬＣにてＭＥ−２６５およびその１６位水酸化体であるＭＥ−２８２の量を測定した。測定結果を表５に示す。また、ＨＰＬＣの測定条件を以下に示す。
分析装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣ  １０Ａｖｐ
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ  ＵＧ−３（φ４．６ｍｍ×５０ｍｍ  ３μｍ）
移動相：４５％〜５５％メタノール（０〜５分）
５５％メタノール（５〜１３分）
５５％〜７０％メタノール（１３〜１７分）
７０％メタノール（１７〜３５分）
流速：１．２ｍＬ／分
検出：ＵＶ２４０ｎｍ
インジェクション容量：５μＬ
カラム温度：４０℃
分析時間：３５分
保持時間：ＭＥ−２６５  ２１．０分
ＭＥ−２８２  １５．６分
【表５】
2006126723.tif 000016
2006126723.tif 000017
この結果、親株であるＭｅｒ−１１１０７  ｐｌｄＢ：：ｈｙｇ株ではＭＥ−２８２の生産がほとんどみられなかったのに対して、ｐＡＯＣ：：ＰａｐｓｍＡＢを導入したＭｅｒ−１１１０７  ｐｌｄＢ：：ｈｙｇ：：ｐＡＯＣ：：ＰａｐｓｍＡＢ株ではＭＥ−２８２を生産していた。このことより、ＭＥ−２６５生産株であるＭｅｒ−１１１０７  ｐｌｄＢ：：ｈｙｇ株に、ＭＥ−２６５の１６位水酸化酵素遺伝子であるｐｓｍＡＢを導入することにより、ＭＥ−２８２を直接生産できることが示された。
前記のＭｅｒ−１１１０７  ｐｌｄＢ：：ｈｙｇ：：ｐＡＯＣ：：ＰａｐｓｍＡＢ株の培養液に等量のアセトニトリルを添加して得た抽出液約９０ｍＬに濾過助剤を加えて混合後、桐山ロート６０φ（桐山濾紙Ｎｏ．４）で濾過して菌体を分離した。菌体を水５０ｍＬで洗浄して、菌体分離濾液を得た。菌体分離濾液を、酢酸エチル１００ｍＬで２回抽出した。無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、溶媒を除去して残渣を得た。薄層クロマトグラフィー（ＭＥＲＣＫ  Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４  ０．５ｍｍ  展開液；トルエン：アセトン＝１：１）により精製し、ＭＥ−２６５を０．５ｍｇ、ＭＥ−２８２を１２．５ｍｇ得た。ＭＥ−２６５及びＭＥ−２８２の１Ｈ−ＮＭＲ分析結果を以下に示す。
ＭＥ−２６５；
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）：δｐｐｍ（積分，多重度，結合定数Ｊ（Ｈｚ））：０．８７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．９７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），１．０８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），１．１７−１．２１（１Ｈ，ｍ），１．２４−１．３６（２Ｈ，ｍ），１．４２−１．５２（３Ｈ，ｍ），１．６１−１．６６（３Ｈ，ｍ），１．７４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ），１．８９−１．９６（１Ｈ，ｍ），２．００（３Ｈ，ｓ），２．４１−２．４７（１Ｈ，ｍ），２．４３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．５，１３．９Ｈｚ），２．５１−２．５８（１Ｈ，ｍ），２．５６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．７，１３．９Ｈｚ），２．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．２，８．１Ｈｚ），２．７２（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝２．２，５．９Ｈｚ），３．５１（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝４．４，８．４Ｈｚ），３．７５−３．８０（１Ｈ，ｍ），４．９１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８，１０．６Ｈｚ），５．００（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ），５．４２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．２，１５．０Ｈｚ），５．４９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．２，１５．０Ｈｚ），５．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．４，１５．０Ｈｚ），６．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ），６．３２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．６，１５．０Ｈｚ）
ＭＥ−２８２；
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）：δｐｐｍ（積分，多重度，結合定数Ｊ（Ｈｚ））：０．８７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９４（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．９７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．２１−１．２６（１Ｈ，ｍ），１．２９−１．３７（３Ｈ，ｍ），１．３４（３Ｈ，ｓ），１．４４−１．５２（２Ｈ，ｍ），１．６０−１．６４（１Ｈ，ｍ），１．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．２，１３．９Ｈｚ），１．７７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ），１．８６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．４，１３．９Ｈｚ），１．８９−１．９４（１Ｈ，ｍ），２．００（３Ｈ，ｓ），２．４３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．５，１３．９Ｈｚ），２．５０−２．６０（１Ｈ，ｍ），２．５６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．３，１３．９Ｈｚ），２．６６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．２，７．７Ｈｚ），２．８９（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝２．２，６．２Ｈｚ），３．５２（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝４．８，８．４Ｈｚ），３．７５−３．８０（１Ｈ，ｍ），４．９０（１Ｈ，ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｄ２Ｏ），５．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ），５．４２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．２，１５．０Ｈｚ），６．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ），６．５２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．０，１５．０Ｈｚ）
［実施例９］ｅｒｍＥプロモーターとｐｓｍＡＢを連結させたプラスミドｐＰｅｐｓｍＡＢの作製
ｐｓｍＡＢをｅｒｍＥプロモーターを用いて発現させるため、ｅｒｍＥプロモーター領域をｐｓｍＡＢと連結させた。配列番号２の塩基配列情報をもとに、ｐｓｍＡＢを増幅するために以下に示すような配列からなる２種のプライマー、ｅＤＭ−ＳｐｈＦ（５’末端にＳｐｈＩサイトを付加：配列番号２７参照）およびｅＤＭ−ＳｐｈＲ（５’末端にＳｐｈＩサイトを付加：配列番号２８参照）を合成した。
ｅＤＭ−ＳｐｈＦ：５’−ＴＣＣＣＣＧＣＡＴＧＣＣＧＧＡＡＣＴＧＡＣＧＧＡＣＡＴＣＡＣ−３’
ｅＤＭ−ＳｐｈＲ：５’−ＣＣＣＧＧＧＣＡＴＧＣＡＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＴＡＧＡＧＧＡＡ−３’
これらのプライマーを用いてＰＣＲを以下の条件にて行った。
（ＰＣＲ反応液組成：タカラバイオ社ＬＡ  Ｔａｑを使用）
滅菌精製水                                                          １７μＬ
２倍濃縮ＧＣ  ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ                                    ２５μＬ
ｄＮＴＰ混合溶液（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ  各２ｍＭ）  ５μＬ
ＬＡ  Ｔａｑ                                                      ０．５μＬ
ｅＤＭ−ＳｐｈＦ（５０ｐｍｏｌ／μＬ）                            ０．５μＬ
ｅＤＭ−ＳｐｈＲ（５０ｐｍｏｌ／μＬ）                            ０．５μＬ
ストレプトミセス・エスピーＡ−１５４４株ゲノムＤＮＡ
（参考例２（１）１０ｎｇ／μＬ）                                      １μＬ
（反応条件：Ｂｉｏｍｅｔｒａ社  Ｔ  ＧＲＡＤＩＥＮＴを使用）
９５℃  ３分
（９８℃  ２０秒、６８℃  ４分）３０サイクル
６８℃  ５分
この反応の結果、増幅された１５７０ｂｐのｐｓｍＡＢを含むＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて回収した。得られた１５７０ｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＳｐｈＩで消化した。同様にプラスミドｐＳＫ１１７（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．ｖｏｌ．２００２  １８４，６４１７−６４２３参照）を制限酵素ＳｐｈＩで消化した。得られた１５７０ｂｐのｐｓｍＡＢを含むＤＮＡ断片の消化物とプラスミド消化物とを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社）を用いて連結した。これにより、ｅｒｍＥプロモーターとｐｓｍＡＢを連結させたプラスミドｐＰｅｐｓｍＡＢを構築した。
［実施例１０］ｅｒｍＥプロモーターと連結させたｐｓｍＡＢの入った組み換え導入用プラスミドの作製
実施例９で調製したプラスミドｐＰｅｐｓｍＡＢを制限酵素ＫｐｎＩおよびＢｇｌＩＩで消化した後、ＢＫＬ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて末端を平滑化した。得られたＤＮＡを０．８％のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｇａｒｏｓｅ（登録商標、ＢＩＯ−ＲＡＤ社）上で電気泳動（Ｍｕｐｉｄ−ｅｘ：アドバンス社）し、分離した２０６０ｂｐのｅｒｍＥプロモーターとｐｓｍＡＢを含むＤＮＡ断片（以後、ＰｅｐｓｍＡＢという）を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて回収精製した。また、図４に示す組み換え導入用ベクターｐＵＣ１９ａｐｈ：：ｏｒｉＴ：：ｉｎｔｐｈｉＣ３１を制限酵素ＢａｍＨＩで消化した後、ＢＫＬ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて末端を平滑化した。こうして得られたベクターとＰｅｐｓｍＡＢとをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社）を用いて連結した。これにより、ＰｅｐｓｍＡＢを組み換え導入用ベクターｐＵＣ１９ａｐｈ：：ｏｒｉＴ：：ｉｎｔｐｈｉＣ３１に挿入した、組み換え導入用プラスミドｐＡＯＣ：：ＰｅｐｓｍＡＢを構築した。
［実施例１１］天然型ｐｓｍＡＢの入った組み換え導入用プラスミドの作製
配列番号２の塩基配列を参考にして、５’末端にＢｇｌＩＩサイトを付加したプライマーＤＭ−ＢｇｌＦ（５’−ＣＧＣＡＴＡＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＣＧＡＧＣＧＧＧＴＧＡＴＣＡ−３’：配列番号３５参照）および５’末端にＢｇｌＩＩサイトを付加したプライマーＤＭ−ＢｇｌＲ（５’−ＴＣＣＣＧＡＧＡＴＣＴＴＧＡＡＧＧＴＣＣＧＣＧＴＣＡＣＣＧＴ−３’：配列番号３６参照）を設計し作成した。次に、この２種のプライマー（ＤＭ−ＢｇｌＦおよびＤＭ−ＢｇｌＲ）と参考例２（１）で得たＡ−１５４４株ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ社）とＰＣＲ増幅装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社  Ｔ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用い、変性を９８℃、２０秒間、アニーリングを６３℃、３０秒間、伸長を６８℃、４分間行う３段階の反応を３０回繰り返した。このＰＣＲ増幅反応液から天然型のｐｓｍＡおよびｐｓｍＢを含む約３．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片（以後、ＰｏｐｓｍＡＢという）をアガロースゲル電気泳動とＳＵＰＲＥＣ  ０１（タカラバイオ社）によって回収した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＢｇｌＩＩで消化した。また、図４に示す組み換え導入用ベクターｐＵＣ１９ａｐｈ：：ｏｒｉＴ：：ｉｎｔｐｈｉＣ３１を制限酵素ＢａｍＨＩで消化した。こうして得られたベクターとＰｏｐｓｍＡＢとをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社）を用いて連結した。これにより、ＰｏｐｓｍＡＢを組み換え導入用ベクターｐＵＣ１９ａｐｈ：：ｏｒｉＴ：：ｉｎｔｐｈｉＣ３１に挿入した、組み換え導入用プラスミドｐＡＯＣ：：ＰｏｐｓｍＡＢを構築した。
［実施例１２］組み換え導入用プラスミドｐＵＣ１９ａｐｈ：：ｏｒｉＴ：：ｉｎｔｐｈｉＣ３１、ｐＡＯＣ：：ＰｅｐｓｍＡＢおよびｐＡＯＣ：：ＰｏｐｓｍＡＢのＭｅｒ−１１１０７株への導入
組み換え導入用ベクターｐＵＣ１９ａｐｈ：：ｏｒｉＴ：：ｉｎｔｐｈｉＣ３１および実施例１０および１１で得られたｐＡＯＣ：：ＰｅｐｓｍＡＢおよびｐＡＯＣ：：ＰｏｐｓｍＡＢを、接合大腸菌Ｓ１７−１（ＡＴＣＣ４７０５５）へエレクトロポレーション法を用いて各々形質転換し、それぞれＳ１７−１／ｐＵＣ１９ａｐｈ：：ｏｒｉＴ：：ｉｎｔｐｈｉＣ３１株、Ｓ１７−１／ｐＡＯＣ：：ＰｅｐｓｍＡＢ株およびＳ１７−１／ｐＡＯＣ：：ＰｏｅｐｓｍＡＢ株を得た。得られた３株を、２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）１０ｍＬに植菌し、３０℃で２時間振盪培養後、集菌し、ＬＢ培地１０ｍＬで２回洗浄後、ＬＢ培地５ｍＬに懸濁した。これを供与菌懸濁液とした。
供与菌懸濁液を調製するのと同時進行で、Ｍｅｒ−１１１０７株をＴＳＢ培地（Ｔｒｙｐｔｏ−Ｓｏｙａ  ｂｒｏｔｈ：日水製薬社）１０ｍＬに植菌し、３０℃で５時間振盪培養後、集菌し、滅菌水１０ｍＬで２回洗浄後、滅菌水１ｍＬに懸濁した。これを受容菌懸濁液とした。得られた３株の供与菌懸濁液５００μＬの各々を、Ｍｅｒ−１１１０７株受容菌懸濁液１０μＬと混ぜ、Ａｃｔｉｎｏ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｎｏ．４寒天培地（日本製薬社）に塗布した。３０℃で１８時間培養後、２ｍｇ／ｍＬのリボスタマイシンを含む２．５ｍＬのＳＮＡ（０．８％栄養培地：Ｄｉｆｃｏ社、０．４％寒天）を重層した。３０℃で７日間培養し、リボスタマイシンに耐性なｐＵＣ１９ａｐｈ：：ｏｒｉＴ：：ｉｎｔｐｈｉＣ３１形質転換株Ｍｅｒ−１１１０７：：ｐＡＯＣ株、ｐＡＯＣ：：ＰｅｐｓｍＡＢ形質転換株Ｍｅｒ−１１１０７：：ｐＡＯＣ：：ＰｅｐｓｍＡＢ株およびｐＡＯＣ：：ＰｏｐｓｍＡＢ形質転換株Ｍｅｒ−１１１０７：：ｐＡＯＣ：：ＰｏｐｓｍＡＢ株を得た。
［実施例１３］Ｍｅｒ−１１１０７：：ｐＡＯＣ株、Ｍｅｒ−１１１０７：：ｐＡＯＣ：：ＰｅｐｓｍＡＢ株およびＭｅｒ−１１１０７：：ｐＡＯＣ：：ＰｏｐｓｍＡＢ株のプラジエノライド生産試験
実施例１２で得られたＭｅｒ−１１１０７：：ｐＡＯＣ株、Ｍｅｒ−１１１０７：：ｐＡＯＣ：：ＰｅｐｓｍＡＢ株およびＭｅｒ−１１１０７：：ｐＡＯＣ：：ＰｏｐｓｍＡＢ株について、プラジエノライドＢおよびその１６位水酸化体であるプラジエノライドＤの生産性を試験した。Ｍｅｒ−１１１０７：：ｐＡＯＣ株、Ｍｅｒ−１１１０７：：ｐＡＯＣ：：ＰｅｐｓｍＡＢ株およびＭｅｒ−１１１０７：：ｐＡＯＣ：：ＰｏｐｓｍＡＢ株の各々の凍結種母３００μＬを、種母培地（溶性でんぷん２％、大豆粉（味の素社：エスサンミート）２％、酵母エキス０．３％、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２５％、ＣａＣＯ３  ０．３％  ｐＨ無調整）２０ｍＬに植菌し、２５℃で２日間培養した。得られた種母培養液の３００μＬを、本培養培地（溶性デンプン５％、グルコース１％、ファルマメディア３％、ＣａＣＯ３  ０．１％、ｐＨ７．５）３０ｍＬに植菌し、２５℃で４日間培養した。培養終了後、得られた培養液に対して９倍量のアセトニトリルを加えて抽出した。得られた抽出液についてＨＰＬＣにてプラジエノライドＢおよびその１６位水酸化体であるプラジエノライドＤの量を測定した。測定結果を表６に示す。また、ＨＰＬＣの測定条件を以下に示す。
分析装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣ  １０Ａｖｐ
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ  ＵＧ−３（φ４．６ｍｍ×５０ｍｍ  ３μｍ）
移動相：４５％〜５５％メタノール（０〜５分）
５５％メタノール（５〜１３分）
５５％〜７０％メタノール（１３〜２１分）
７０％メタノール（２１〜２５分）
流速：１．２ｍＬ／分
検出：ＵＶ２４０ｎｍ
インジェクション容量：５μＬ
カラム温度：４０℃
分析時間：２５分
保持時間：プラジエノライドＢ  １２．４分
プラジエノライドＤ    ４．３分
【表６】
2006126723.tif 000018
この結果、ベクターのみを導入したＭｅｒ−１１１０７：：ｐＡＯＣ株ではプラジエノライドＤの生産がほとんどみられなかったのに対して、ｐＡＯＣ：：ＰｅｐｓｍＡＢまたはｐＡＯＣ：：ＰｏｐｓｍＡＢを導入したＭｅｒ−１１１０７：：ｐＡＯＣ：：ＰｅｐｓｍＡＢ株およびＭｅｒ−１１１０７：：ｐＡＯＣ：：ＰｏｐｓｍＡＢ株ではプラジエノライドＤを生産していた。このことより、プラジエノライドＢ生産株であるＭｅｒ−１１１０７株に、プラジエノライドＢの１６位水酸化酵素遺伝子であるｐｓｍＡＢを導入することにより、プラジエノライドＤを直接生産できることが示された。
［実施例１４］改変型ｐｓｍＡをふくむｐＰａｍｐｓｍＡＢの作製
ｐｓｍＡに位置特異的変異を加えるため、実施例１で作製したｐＰａｐｓｍＡＢを鋳型にＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いて変異を導入したｐＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＭ，ｐＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＬＭ，ｐＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＦＭ，ｐＰａｍｐｓｍＡＢ−ＴＹを作製した。
まず、以下に示すような配列からなるプライマーＲ９１Ｃ−ＦおよびＲ９１Ｃ−Ｒ（配列番号３７および３８参照）を合成し、
Ｒ９１Ｃ−Ｆ：５’−ＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＴＣＴＧＣＧＡＣＣＧＧＣＧＧＧＴＧ−３’
Ｒ９１Ｃ−Ｒ：５’−ＣＡＣＣＣＧＣＣＧＧＴＣＧＣＡＧＡＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡ−３’
ｐＰａｐｓｍＡＢを鋳型にＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いてＰｓｍＡの９１番目のアルギニンをシステインに置換するように変異を導入したｐＰａｍｐｓｍＡＢ−Ｃを作製した。次に、以下に示すような配列からなるプライマーＲ１９５Ｌ−ＦおよびＲ１９５Ｌ−Ｒ（配列番号３９および４０参照）を合成し、
Ｒ１９５Ｌ−Ｆ：５’−ＴＣＧＣＡＡＧＧＧＧＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＴＣＧＡＧ−３’
Ｒ１９５Ｌ−Ｒ：５’−ＣＴＣＧＡＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＣＣＣＣＴＴＣＣＧＡ−３’
ｐＰａｍｐｓｍＡＢ−Ｃを鋳型にＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いてＰｓｍＡの１９５番目のアルギニンをロイシンに置換するように変異を導入したｐＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬを作製した。次に、以下に示すような配列からなるプライマーＬ４０３Ｍ−ＦおよびＬ４０３Ｍ−Ｒ（配列番号４１および４２参照）を合成し、
Ｌ４０３Ｍ−Ｆ：５’−ＡＣＧＡＴＣＣＡＧＧＧＧＡＴＧＡＴＧＧＡＡＣＴＣＣＣＣＧＴＧＡ−３’
Ｌ４０３Ｍ−Ｒ：５’−ＴＣＡＣＧＧＧＧＡＧＴＴＣＣＡＴＣＡＴＣＣＣＣＴＧＧＡＴＣＧ−３’
ｐＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬを鋳型にＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いてＰｓｍＡの４０３番目のロイシンをメチオニンに置換するように変異を導入したｐＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＭを作製した。次に、以下に示すような配列からなるプライマーＲ２３６Ｌ−ＦおよびＲ２３６Ｌ−Ｒ（配列番号４３および４４参照）を合成し、
Ｒ２３６Ｌ−Ｆ：５’−ＡＧＣＴＧＧＡＣＣＧＡＣＴＣＧＡＣＧＴＧＧＴＧＧＣＧＣＴＧＧ−３’
Ｒ２３６Ｌ−Ｒ：５’−ＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＣＧＴＣＧＡＧＴＣＧＧＴＣＣＡＧＣＴＣ−３’
ｐＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＭを鋳型にＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いてＰｓｍＡの２３６番目のアルギニンをロイシンに置換するように変異を導入したｐＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＬＭを作製した。次に、以下に示すような配列からなるプライマーＩ２４４Ｆ−ＦおよびＩ２４４Ｆ−Ｒ（配列番号４５および４６参照）を合成し、
Ｉ２４４Ｆ−Ｆ：５’−ＴＧＧＣＧＣＴＧＧＣＣＧＴＣＴＴＣＣＴＧＣＴＣＧＴＧＧ−３’
Ｉ２４４Ｆ−Ｒ：５’−ＣＣＡＣＧＡＧＣＡＧＧＡＡＧＡＣＧＧＣＣＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡ−３’
ｐＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＭを鋳型にＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いてＰｓｍＡの２４４番目のイソロイシンをフェニルアラニンに置換するように変異を導入したｐＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＦＭを作製した。また、以下に示すような配列からなるプライマーＭ１１２Ｔ−ＦおよびＭ１１２Ｔ−Ｒ（配列番号４７および４８参照）を合成し、
Ｍ１１２Ｔ−Ｆ：５’−ＣＡＧＣＧＧＣＧＧＡＴＧＡＣＧＡＴＣＣＣＧＴＣＧＴＴＣ−３’
Ｍ１１２Ｔ−Ｒ：５’−ＧＡＡＣＧＡＣＧＧＧＡＴＣＧＴＣＡＴＣＣＧＣＣＧＣＴＧ−３’
ｐＰａｐｓｍＡＢを鋳型にＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いてＰｓｍＡの１１２番目のメチオニンをトレオニンに置換するように変異を導入したｐＰａｍｐｓｍＡＢ−Ｔを作製した。そして、以下に示すような配列からなるプライマーＲ１９５Ｙ−ＦおよびＲ１９５Ｙ−Ｒ（配列番号４９および５０参照）を合成し、
Ｒ１９５Ｙ−Ｆ：５’−ＡＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＡＧＴＡＣＣＴＣＧＡＧＧＡＧＴＡＣＣＴ−３’
Ｒ１９５Ｙ−Ｒ：５’−ＧＧＴＡＣＴＣＣＴＣＧＡＧＧＴＡＣＴＣＧＣＧＣＧＣＣＣＣＴＴ−３’
ｐＰａｍｐｓｍＡＢ−Ｔを鋳型にＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いてＰｓｍＡの１９５番目のアルギニンをチロシンに置換するように変異を導入したｐＰａｍｐｓｍＡＢ−ＴＹを作製した。
［実施例１５］２重相同組換えによる導入プラスミドの作製
参考例１（７）プラジエノライド生合成遺伝子クラスターの塩基配列の決定により、決定されたプラジエノライドの生合成に関与するＤＮＡとその周辺のＤＮＡを含む塩基配列を用いて、２重相同組換えによりｐｓｍＡＢまたはその改変体を導入することが可能と考え、以下の方法で、導入用のプラスミドを作製した。
２重相同組換えのための相同配列を増幅させるため、プラジエノライドの生合成に関与するＤＮＡの下流の塩基配列に基づいて、以下に示す配列からなる４種のプライマー、ｐｌｄｏｕｔ−Ｌ−Ｂｇｌ２Ｆ、ｐｌｄｏｕｔ−Ｌ−ＳｐｈｌＲ、ｐｌｄｏｕｔ−Ｒ−ＳｐｈｌＦおよびｐｌｄｏｕｔ−Ｒ−Ｂｇｌ２Ｒ（配列番号５１、５２、５３および５４参照）を合成した。
ｐｌｄｏｕｔ−Ｌ−Ｂｇｌ２Ｆ：５’−ＧＧＧＡＧＡＴＣＴＧＣＡＧＧＴＣＡＴＣＧＧＧＧＧＧＡＡＧＡＡＣＣＡＣＡ−３’
ｐｌｄｏｕｔ−Ｌ−ＳｐｈｌＲ：５’−ＴＣＴＣＣＡＧＣＣＧＣＡＴＧＣＧＧＴＣＣＣＧＧＧＴＣＡＣＣＧＴ−３’
ｐｌｄｏｕｔ−Ｒ−ＳｐｈｌＦ：５’−ＣＣＣＧＣＡＴＧＣＧＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＴＣＣＡＧＡＧＣＧＣＡ−３’
ｐｌｄｏｕｔ−Ｒ−Ｂｇｌ２Ｒ：５’−ＧＧＧＡＧＡＴＣＴＡＧＡＡＣＡＴＧＣＣＧＧＧＣＣＡＧＡＧＧＣＴＧＡＣ−３’
これらのプライマーを用いてＰＣＲを以下の条件にて行った。
（ＰＣＲ反応液組成）
滅菌精製水                                                              ３０μＬ
２倍濃縮ＧＣ  ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ                                        ５０μＬ
ｄＮＴＰ混合溶液（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ  各２．５ｍＭ）１６μＬ
ｐｌｄｏｕｔ−Ｌ−Ｂｇｌ２Ｆまたはｐｌｄｏｕｔ−Ｒ−ＳｐｈｌＦ（５０ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ
ｐｌｄｏｕｔ−Ｌ−ＳｐｈｌＲまたはｐｌｄｏｕｔ−Ｒ−Ｂｇｌ２Ｒ（５０ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ
Ｍｅｒ−１１１０７株ｔｏｔａｌ  ＤＮＡ（１００ｎｇ／μＬ）                １μＬ
ＬＡ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ｕ／μＬ，宝酒造社）                １μＬ
（反応温度条件）
９５℃  ３分（９８℃  ２０秒，６５℃  ３０秒，６８℃  ３分）    ３０サイクル
７２℃  ５分
この反応の結果、ｐｌｄｏｕｔ−Ｌ−Ｂｇｌ２Ｆとｐｌｄｏｕｔ−Ｌ−ＳｐｈｌＲを用いた反応から、２．０８ｋｂのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片  ＬＺ）が増幅され、ｐｌｄｏｕｔ−Ｒ−ＳｐｈｌＦとｐｌｄｏｕｔ−Ｒ−Ｂｇｌ２Ｒを用いた反応から、２．７３ｋｂのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片  ＲＸ）が増幅された。ＤＮＡ断片ＬＺ及びＲＸをＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）で精製した後、制限酵素ＢｇｌＩＩとＳｐｈＩで消化した。
次に、ハイグロマイシン耐性遺伝子を増幅させるため、塩基配列に基づき、以下に示すような配列からなる２種のプライマーｈｙｇ−ＳｐｅＳｐｈＦおよびｈｙｇ２−ＳｐｈＲ（配列番号５５および５６参照）を合成した。
ｈｙｇ−ＳｐｅＳｐｈＦ：５’−ＧＧＧＧＣＡＴＧＣＧＧＡＣＴＡＧＴＡＣＡＣＣＧＴＣＧＣＣＴＣＧＧＴ−３’
ｈｙｇ２−ＳｐｈＲ：５’−ＧＣＣＧＣＡＴＧＣＧＴＣＡＧＧＣＧＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＴＧＴ−３’
これらのプライマーを用いてＰＣＲを以下の条件にて行った。
（ＰＣＲ反応液組成）
滅菌精製水                                                              ３０μＬ
２倍濃縮ＧＣ  ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ                                        ５０μＬ
ｄＮＴＰ混合溶液（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ  各２，５ｍＭ）１６μＬ
ｈｙｇ−ＳｐｅＳｐｈＦ（５０ｐｍｏｌ／μＬ）                              １μＬ
ｈｙｇ２−ＳｐｈＲ（５０ｐｍｏｌ／μＬ）                                  １μＬ
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ  ＪＣＭ  ４７７２株  ｔｏｔａｌ  ＤＮＡ（１００ｎｇ／μＬ）１μＬ
ＬＡ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ｕ／μＬ，宝酒造社）                １μＬ
（反応温度条件）
９５℃  ６分（９８℃  ２０秒，６３℃  ３０秒，６８℃  ２分）    ３０サイクル
７２℃  ５分
この反応の結果増幅された１．２１ｋｂのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片ｈｙｇ２）をＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）で精製した後、制限酵素ＳｐｈＩで消化した。
制限酵素ＢｇｌＩＩとＳｐｈＩで消化したＤＮＡ断片ＬＺ及びＲＸと、制限酵素ＳｐｈＩで消化したＤＮＡ断片ｈｙｇ２、および制限酵素ＢａｍＨＩで消化したシャトルベクターｐＫＵ２５３（図３参照）、の計４者をＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社）で連結した。こうしてＤＮＡ断片ＬＺとＲＸの間にＤＮＡ断片ｈｙｇ２が挿入された形の約６．０ｋｂのＤＮＡ断片が、ｐＫＵ２５３に挿入された約２２ｋｂの２重相同組換えによる導入用プラスミドｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＲＸが構築された。
［実施例１６］２重相同組換えによる導入用プラスミドｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＲＸへのｐｓｍＡＢまたはその改変体の挿入
実施例１で構築したｐＰａｐｓｍＡＢおよび実施例１４で構築したｐＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＭ，ｐＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＬＭ，ｐＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＦＭ，ｐＰａｍｐｓｍＡＢ−ＴＹを制限酵素ＳｐｅＩで消化した。制限酵素ＳｐｅＩで消化した各ＤＮＡを０．８％のＣｅｒｔｉｆｉｅｄＴＭ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｇａｒｏｓｅ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）上で電気泳動（Ｍｕｐｉｄ−ｅｘ：アドバンス社）し、分離した１．８ｋｂｐのｐｌｄＡプロモーターとｐｓｍＡＢまたはその改変体を含むＤＮＡ断片（以後、ＰａｐｓｍＡＢ，ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＭ，ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＬＭ，ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＦＭ，ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＴＹというときがある）を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて回収精製した。そうして得られた各ＤＮＡ断片（ＰａｐｓｍＡＢ，ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＭ，ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＬＭ，ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＦＭ，ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＴＹ）を、実施例１５で作製したｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＲＸを制限酵素ＳｐｅＩで消化したものとＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社）で連結した。こうして各ＤＮＡ断片（ＰａｐｓｍＡＢ，ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＭ，ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＬＭ，ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＦＭ，ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＴＹ）がｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＲＸのｈｙｇ２の上流に挿入された、約２４ｋｂの２重相同組換えによるｐｓｍＡＢまたはその改変体導入プラスミドｐＫＵ２５３−Ｌｚ−ｈｙｇ２−ＰａｐｓｍＡＢ−ＲＸ，ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＭ−ＲＸ，ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＬＭ−ＲＸ，ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＦＭ−ＲＸ，ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＴＹ−ＲＸが構築された。
［実施例１７］２重相同組換えによるＭｅｒ−１１１０７株へのｐｓｍＡＢまたはその改変体の挿入
得られたｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｐｓｍＡＢ−ＲＸ，ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＭ−ＲＸ，ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＬＭ−ＲＸ，ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＦＭ−ＲＸ，ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＴＹ−ＲＸを、それぞれ接合大腸菌Ｓ１７−１へエレクトロポレーション法を用いて形質転換し、Ｓ１７−１／ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｐｓｍＡＢ−ＲＸ株，Ｓ１７−１／ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＭ−ＲＸ株，Ｓ１７−１／ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＬＭ−ＲＸ株，Ｓ１７−１／ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＦＭ−ＲＸ株，Ｓ１７−１／ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＴＹ−ＲＸ株を得た。得られたＳ１７−１／ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｐｓｍＡＢ−ＲＸ株，Ｓ１７−１／ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＭ−ＲＸ株，Ｓ１７−１／ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＬＭ−ＲＸ株，Ｓ１７−１／ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＦＭ−ＲＸ株，Ｓ１７−１／ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＴＹ−ＲＸ株を、それぞれ２５μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび１００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢを含むＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）１０ｍＬに植菌し、３０℃で２時間振盪培養後、集菌し、ＬＢ培地１０ｍＬで２回洗浄後、ＬＢ培地５ｍＬに懸濁した。これを供与菌懸濁液とした。
供与菌懸濁液を調製するのと同時進行で、Ｍｅｒ−１１１０７株をＴＳＢ培地（Ｔｒｙｐｔｏ−Ｓｏｙａ  ｂｒｏｔｈ：日水製薬社）１０ｍＬに植菌し、３０℃で５時間振盪培養後、集菌し、滅菌水１０ｍＬで２回洗浄後、滅菌水１ｍＬに懸濁した。これを受容菌懸濁液とした。Ｓ１７−１／ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｐｓｍＡＢ−ＲＸ株，Ｓ１７−１／ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＭ−ＲＸ株，Ｓ１７−１／ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＬＭ−ＲＸ株，Ｓ１７−１／ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＦＭ−ＲＸ株，Ｓ１７−１／ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＴＹ−ＲＸ株供与菌懸濁液５００μＬを、Ｍｅｒ−１１１０７株受容菌懸濁液１０μＬと混ぜ、Ａｃｔｉｎｏ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｎｏ．４寒天培地（日本製薬社）に塗布した。３０℃で１８時間培養後、２ｍｇ／ｍＬのリボスタマイシンを含む２．５ｍＬのＳＮＡ（０．８％栄養培地：Ｄｉｆｃｏ社、０．４％寒天）を重層した。３０℃で７日間培養し、リボスタマイシンに耐性なｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｐｓｍＡＢ−ＲＸ，ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＭ−ＲＸ，ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＬＭ−ＲＸ，ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＦＭ−ＲＸ，ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＴＹ−ＲＸ形質転換株を得た。得られたｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｐｓｍＡＢ−ＲＸ，ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＭ−ＲＸ，ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＬＭ−ＲＸ，ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＦＭ−ＲＸ，ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＴＹ−ＲＸ形質転換株を、リボスタマイシンを含まないＴＳＢ培地１０ｍＬにそれぞれ植菌し、３０℃で２４時間振盪培養した。ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｐｓｍＡＢ−ＲＸ，ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＭ−ＲＸ，ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＬＭ−ＲＸ，ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＦＭ−ＲＸ，ｐＫＵ２５３−ＬＺ−ｈｙｇ２−ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＴＹ−ＲＸ形質転換株培養液を集菌し、滅菌水１０ｍＬで２回洗浄後、滅菌水１０ｍＬに懸濁した。適当に希釈した懸濁液を、２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢを含むＹＭＳ寒天培地（０．４％酵母エキス、１％麦芽エキス、０．４％溶性デンプン、２％寒天、１０ｍＭ塩化カルシウム）に塗布し、３０℃で４日間培養した。ハイグロマイシンＢを含むＹＭＳ寒天培地で生育したシングルコロニーを２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢを含むＹＭＳ寒天培地および２００μｇ／ｍＬのリボスタマイシンを含むＹＭＳ寒天培地に植えかえ、３０℃で２日間培養した。培養後、ハイグロマイシンＢ耐性で、リボスタマイシン感受性の株を選択した。得られた菌株は、ゲノム中のプラジエノライドの生合成に関与するＤＮＡの下流（配列番号１の塩基７３３６２と塩基７３３６９の間）にハイグロマイシンＢ耐性遺伝子ｈｙｇ２およびｐｓｍＡＢ��たはその改変体が挿入された株であり、各々Ｍｅｒ−１１１０７−ＺＸ：：ｈｙｇ２：：ＰａｐｓｍＡＢ株，Ｍｅｒ−１１１０７−ＺＸ：：ｈｙｇ２：：ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＭ株，Ｍｅｒ−１１１０７−ＺＸ：：ｈｙｇ２：：ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＬＭ株，Ｍｅｒ−１１１０７−ＺＸ：：ｈｙｇ２：：ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＦＭ株，Ｍｅｒ−１１１０７−ＺＸ：：ｈｙｇ２：：ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＴＹ株とした。
［実施例１８］Ｍｅｒ−１１１０７−ＺＸ：：ｈｙｇ２：：ＰａｐｓｍＡＢ株，Ｍｅｒ−１１１０７−ＺＸ：：ｈｙｇ２：：ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＭ株，Ｍｅｒ−１１１０７−ＺＸ：：ｈｙｇ２：：ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＬＭ株，Ｍｅｒ−１１１０７−ＺＸ：：ｈｙｇ２：：ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＦＭ株，Ｍｅｒ−１１１０７−ＺＸ：：ｈｙｇ２：：ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＴＹ株のプラジエノライド生産
実施例１７で得られたＭｅｒ−１１１０７−ＺＸ：：ｈｙｇ２：：ＰａｐｓｍＡＢ株，Ｍｅｒ−１１１０７−ＺＸ：：ｈｙｇ２：：ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＭ株，Ｍｅｒ−１１１０７−ＺＸ：：ｈｙｇ２：：ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＬＭ株，Ｍｅｒ−１１１０７−ＺＸ：：ｈｙｇ２：：ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＦＭ株，Ｍｅｒ−１１１０７−ＺＸ：：ｈｙｇ２：：ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＴＹ株の凍結種母、各５００μＬを種母培地（溶性デンプン２％、大豆粉（味の素社：エスサンミート）２％、酵母エキス０．３％、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２５％、ＣａＣＯ３  ０．３％  ｐＨ無調整）２５ｍＬに植菌し、２５℃で３日間培養した。得られた種母培養液の３００μＬを、本培養培地（溶性デンプン５％、グルコース１％、ファルマメディア３％、ソイプロ１％、アデカノールＬＧ−１２６  ０．０５％、β−ＣＤ  ２．０％、ＣａＣＯ３  ０．１％、ｐＨ７．５）３０ｍＬに植菌し、２５℃で６日間培養した。
培養終了後、得られた培養液に対して４倍量のアセトニトリルを加えて抽出した。得られた抽出液についてＨＰＬＣにてプラジエノライドＤ、およびプラジエノライドＤの２０位水酸化体であるプラジエノライドＨ１３、およびプラジエノライドＤの２１位ケト体であるプラジエノライドＣ２、そしてプラジエノライドＤの２０位水酸化、２１位ケト体であるプラジエノライドＣ３の量を測定した。測定結果を表７に示す。また、ＨＰＬＣの測定条件を以下に示す。
（ＨＰＬＣの分析条件）
分析装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣ  １０Ａｖｐ
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ  ＵＧ−３（４．６×５０ｍｍ  ３μｍ）
移動相：２０％〜３５％    アセトニトリル（０〜１３分）
３５％〜１００％  アセトニトリル（１３〜１７分）
２０％            アセトニトリル（１７〜２２分）
流速：１．０ｍＬ／分
検出：ＵＶ２４０ｎｍ
インジェクション容量：５μＬ
カラム温度：４０℃
分析時間：２２分
保持時間：  プラジエノライドＨ１３；  ５．５分、
プラジエノライドＣ３；  ８．３分、
プラジエノライドＤ；  ９．０分、
プラジエノライドＣ２；  １１．１分
【表７】
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この結果、ＰａｐｓｍＡＢを導入したＭｅｒ−１１１０７−ＺＸ：：ｈｙｇ２：：ＰａｐｓｍＡＢ株ではプラジエノライドＤの生産とともプラジエノライドＤの分解物であるプラジエノライドＨ１３、プラジエノライドＣ２、プラジエノライドＣ３が大量に生産されていたのに対して、ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＭ，ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＬＭ，ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＦＭ，ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＴＹを導入したＭｅｒ−１１１０７−ＺＸ：：ｈｙｇ２：：ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＭ株，Ｍｅｒ−１１１０７−ＺＸ：：ｈｙｇ２：：ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＬＭ株，Ｍｅｒ−１１１０７−ＺＸ：：ｈｙｇ２：：ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＣＬＦＭ株，Ｍｅｒ−１１１０７−ＺＸ：：ｈｙｇ２：：ＰａｍｐｓｍＡＢ−ＴＹ株ではプラジエノライドＤを生産しながらプラジエノライドＤの分解物であるプラジエノライドＨ１３、プラジエノライドＣ２、プラジエノライドＣ３の生産が約４分の１以下に減少した。このことより、プラジエノライドＢ生産株であるＭｅｒ−１１１０７株に、プラジエノライドＢの１６位水酸化酵素遺伝子であるｐｓｍＡＢの改変体を導入することにより、プラジエノライドＤを直接生産できるとともにプラジエノライドＤの分解物の生産を低減できることが示された。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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