(57)【要約】本発明は、複数の転写調節因子の阻害作用に基づく血管再狭窄、虚血性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ガンの転移または浸潤（ガンの転移・浸潤）あるいは悪液質の予防、改善、治療薬を提供する。本発明のキメラ（ダブル）デコイ（おとり分子）は、一分子内に複数の転写調節因子の結合配列を持つ。従って、一分子で複数の転写調節因子活性を阻害することが出来る。例えば人工血管吻合部の狭窄は、血管内膜が肥厚することによっておこるが、この主な原因は、吻合部に起こる炎症反応により細胞増殖が活発化するためである。従って、本発明のキメラデコイを用いて、炎症と細胞増殖に関わる二つの転写因子を同時に阻害することにより、血管壁の肥厚を抑制することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一分子中に複数の転写調節因子結合配列を含むキメラ（ダブル）デコイ。
【請求項２】
キメラデコイがＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドからなる請求項１記載のデコイ。
【請求項３】
キメラデコイがＤＮＡオリゴヌクレオチドからなる請求項１または２記載のデコイ。
【請求項４】
キメラデコイが転写因子阻害作用を有する、請求項１ないし３のいずれかに記載のデコイ。
【請求項５】
キメラデコイの少なくとも一つの転写調節因子結合配列が、ＮＦ−κＢ、Ｅ２Ｆ、ＧＡＴＡ−３、ＳＴＡＴ−１、ＳＴＡＴ−６、Ｅｔｓ、ＡＰ−１の結合配列である請求項１ないし４のいずれかに記載のデコイ。
【請求項６】
前記キメラデコイ中のＮＦ−κＢ結合配列がＧＧＧＲＨＴＹＹＨＣ（式中、ＲはＡまたはＧを、ＹはＣまたはＴを、ＨはＡ、ＣまたはＴをそれぞれ意味する。）である請求項１ないし５のいずれかに記載のデコイ。
【請求項７】
前記キメラデコイ中のＮＦ−κＢ結合配列がＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣまたはＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣである請求項６に記載のデコイ。
【請求項８】
前記キメラデコイ中のＥ２Ｆ結合配列がＴＴＴＳＳＣＧＳ（式中、ＳはＧまたはＣを意味する。）である請求項１ないし５のいずれかに記載のデコイ。
【請求項９】
前記キメラデコイ中のＥ２Ｆ結合配列がＴＴＴＣＣＣＧＣである請求項８に記載のデコイ。
【請求項１０】
前記キメラデコイ中のＧＡＴＡ−３結合配列がＷＧＡＴＡＲ（式中ＷはＡまたはＴを、ＲはＡまたはＧをそれぞれ意味する）である請求項１ないし５のいずれかに記載のデコイ。
【請求項１１】
前記キメラデコイ中のＧＡＴＡ−３結合配列がＡＧＡＴＡＧである請求項１０に記載のデコイ。
【請求項１２】
前記キメラデコイ中のＳＴＡＴ−１結合配列がＴＴＣＮＮＮＧＡＡ（式中ＮはＡ，Ｇ，ＴまたはＣを意味する）である請求項１ないし５のいずれかに記載のデコイ。
【請求項１３】
前記キメラデコイ中のＳＴＡＴ−１結合配列がＴＴＣＣＧＧＧＡＡである請求項１２に記載のデコイ。
【請求項１４】
前記キメラデコイ中のＳＴＡＴ−６結合配列がＴＴＣＮＮＮＮＧＡＡ（式中ＮはＡ，Ｇ，ＴまたはＣを意味する）である請求項１ないし５のいずれかに記載のデコイ。
【請求項１５】
前記キメラデコイ中のＳＴＡＴ−６結合配列がＴＴＣＣＣＡＡＧＡＡである請求項１４に記載のデコイ。
【請求項１６】
前記キメラデコイ中のＥｔｓ結合配列がＭＧＧＡＷ（式中ＭはＡまたはＣを、ＷはＡまたはＴをそれぞれ意味する）である請求項１ないし５のいずれかに記載のデコイ。
【請求項１７】
前記キメラデコイ中のＥｔｓ結合配列がＣＧＧＡＡである請求項１６に記載のデコイ。
【請求項１８】
前記キメラデコイ中のＡＰ−１結合配列がＴＧＡＳＴＭＡ（式中ＳはＧまたはＣを、ＭはＡまたはＣをそれぞれ意味する）である請求項１ないし５のいずれかに記載のデコイ。
【請求項１９】
前記キメラデコイ中のＡＰ−１結合配列がＴＧＡＧＴＣＡである請求項１８に記載のデコイ。
【請求項２０】
キメラデコイが一分子中に二つの転写調節因子結合配列を含むデコイである請求項１ないし１９のいずれかに記載のデコイ。
【請求項２１】
キメラデコイが次式に示されるオリゴヌクレオチドから成る請求項１ないし２０のいずれかに記載のデコイ。
５’−Ｎ（ｍ）−コンセンサス１−Ｎ（ｓ）−コンセンサス２−Ｎ（ｎ）−３’
（式中、Ｎ（ｍ）は５’端の付加配列、Ｎ（ｓ）はスペーサー、Ｎ（ｎ）は３’端の付加配列を表す。コンセンサス１、２は同一または相異なる転写調節因子結合配列を示す。ｍ，ｓ，ｎはそれぞれ独立して０または１〜２０の整数を意味する。ＮはヌクレオチドＡ，Ｇ，ＴまたはＣを意味する。）
【請求項２２】
コンセンサス１および／またはコンセンサス２がＧＧＧＲＨＴＹＹＨＣ（式中、ＲはＡまたはＧを、ＹはＣまたはＴを、ＨはＡ、ＣまたはＴをそれぞれ意味する）、ＴＴＴＳＳＣＧＳ（式中、ＳはＧまたはＣを意味する）、ＷＧＡＴＡＲ（式中ＷはＡまたはＴを、ＲはＡまたはＧをそれぞれ意味する）、ＴＴＣＮＮＮＧＡＡ（式中ＮはＡ，Ｇ，ＴまたはＣを意味する）、ＴＴＣＮＮＮＮＧＡＡ（式中ＮはＡ，Ｇ，ＴまたはＣを意味する）、ＭＧＧＡＷ（式中ＭはＡまたはＣを、ＷはＡまたはＴをそれぞれ意味する）、ＴＧＡＳＴＭＡ（式中ＳはＧまたはＣを、ＭはＡまたはＣをそれぞれ意味する）から選ばれた配列である請求項１ないし２１のいずれかに記載のデコイ。
【請求項２３】
コンセンサス１および／またはコンセンサス２がＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣ、ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ、ＴＴＴＣＣＣＧＣ、ＡＧＡＴＡＧ、ＴＴＣＣＧＧＧＡＡ、ＴＴＣＣＣＡＡＧＡＡ、ＣＧＧＡＡ、ＴＧＡＧＴＣＡから選ばれた配列である請求項１ないし２２のいずれかに記載のデコイ。
【請求項２４】
請求項２１の式中、（ｍ）＝０または１〜２０の整数である請求項２１ないし２３に記載のデコイ。
【請求項２５】
請求項２１の式中、（ｍ）＝０または１〜１０の整数である請求項２１ないし２４のいずれかに記載のデコイ。
【請求項２６】
請求項２１の式中、（ｍ）＝０または１〜５の整数である請求項２１ないし２５のいずれかに記載のデコイ。
【請求項２７】
請求項２１の式中、（ｓ）＝０または１〜２０の整数である請求項２１ないし２６のいずれかに記載のデコイ。
【請求項２８】
請求項２１の式中、（ｓ）＝０または１〜１０の整数である請求項２１ないし２７のいずれかに記載のデコイ。
【請求項２９】
請求項２１の式中、（ｓ）＝０または１〜５の整数である請求項２１ないし２８のいずれかに記載のデコイ。
【請求項３０】
請求項２１の式中、（ｎ）＝０または１〜２０の整数である請求項２１ないし２９のいずれかに記載のデコイ。
【請求項３１】
請求項２１の式中、（ｎ）＝０または１〜１０の整数である請求項２１ないし３０のいずれかに記載のデコイ。
【請求項３２】
請求項２１の式中、（ｎ）＝０または１〜５の整数である請求項２１ないし３１のいずれかに記載のデコイ。
【請求項３３】
キメラデコイが、ＮＦ−κＢとその他の転写因子のキメラデコイである、請求項１ないし３２のいずれかに記載のデコイ。
【請求項３４】
キメラデコイが、ＮＦ−κＢとＥ２Ｆのキメラデコイである、請求項１ないし３３のいずれかに記載のデコイ。
【請求項３５】
キメラデコイが、配列番号１で示されるキメラデコイである、請求項１ないし３４のいずれかに記載のデコイ。
【請求項３６】
キメラデコイが、二本鎖ＤＮＡからなる請求項１ないし３５のいずれかに記載のデコイ。
【請求項３７】
請求項１ないし３６のいずれかに記載のデコイを含む医薬組成物。
【請求項３８】
請求項１ないし３７のいずれかに記載のデコイからなる虚血性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ガンの転移または浸潤（ガンの転移・浸潤）あるいは悪液質の予防、改善、治療剤。
【請求項３９】
請求項１ないし３７のいずれかに記載のデコイからなる血管再狭窄、急性冠症候群、脳虚血、心筋梗塞、虚血性疾患の再潅流障害、アトピー性皮膚炎、尋常性乾癬、接触性皮膚炎、ケロイド、褥創、潰瘍性大腸炎、クローン病、腎症、糸球体硬化症、アルブミン尿症、腎炎、腎不全、慢性関節リウマチ、変形性関節症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の予防、改善、治療剤。
【請求項４０】
請求項１ないし３７のいずれかに記載のデコイからなるＰＴＣＡ（経皮的冠動脈形成術）、ＰＴＡ（経皮的血管形成術）、バイパス手術、臓器移植または臓器の手術後におこる血管の再狭窄の予防、改善、治療剤。
【請求項４１】
前記血管の再狭窄が、人工血管、カテーテル、ステントの使用または静脈移植に起因する再狭窄である請求項１ないし３７のいずれかに記載のデコイからなる予防、改善、治療剤。
【請求項４２】
前記血管の再狭窄が、閉塞性動脈硬化症、動脈瘤、大動脈乖離、急性冠症候群、脳虚血、マルファン症候群、プラークラプチャーに対する外科的治療に起因する請求項１ないし３７のいずれかに記載のデコイからなる予防、改善、治療剤。
【請求項４３】
請求項１ないし３７のいずれかに記載のデコイを、虚血性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ガンの転移または浸潤（ガンの転移・浸潤）あるいは悪液質の予防、改善または治療剤の製造のために用いる用途。
【請求項４４】
請求項１ないし３７のいずれかに記載のデコイを用いて、虚血性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ガンの転移または浸潤（ガンの転移・浸潤）あるいは悪液質を予防、改善または治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、転写調節因子が結合する配列を複数有するオリゴヌクレオチドからなるデコイおよびその使用方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、キメラ（ダブル）デコイオリゴヌクレオチドおよびその使用方法に関する。
【背景技術】  閉塞性動脈硬化症や、大動脈瘤、大動脈乖離などの治療に対して行われる外科的血行再建術には人工血管がよく用いられる。また、閉塞した血管を拡張するためには、バルーンカテーテルやステントなどが用いられることも多い。しかし、これらの器具を用いた術後にはしばしば血管の再閉塞が起こり、再度同様の施術を必要とすることもあり、これが問題となっている。
例えば、閉塞性動脈硬化症の患者に対しては、下肢切断を回避するために外科的血行再建術を用いるが、膝上部の病変については人工血管を用いたバイパス手術が第一選択肢となっている。しかし、術後一ヶ月以降に人工血管閉塞が起こることがある。この閉塞は吻合部の血管内膜の肥厚が主な原因である。肥厚を抑制することで、グラフトの長期保存、さらには膝下部の血行再建に人工血管を使用することが可能となる。
人工血管吻合部の血管内膜の肥厚の主な原因は、吻合部に起こる炎症反応により細胞増殖が活発化するためである。従って、この細胞増殖を阻害することで肥厚を抑制することができると考えられる。
近年、炎症反応を阻害することを目的とした遺伝子治療法が開発されている。
炎症反応に関わる転写調節因子であるＮＦ−κＢの働きをデコイ核酸で抑えることによって消炎効果を期待する研究がなされている。
特再表（ＷＯ−Ａ１）９６／０３５４３０号公報は、ＮＦ−κＢデコイ核酸が炎症性疾患に対する治療剤となりうることを開示している。
また、細胞増殖をコントロールする遺伝子治療法も開発されている。例えば、細胞増殖に重要な役割を果たす転写調節因子であるＥ２Ｆの働きをデコイ核酸で抑えることで血管中膜の増殖を抑制することができる。
ＪＰ−Ｂ  ３３９２１４３は、Ｅ２Ｆデコイ核酸を用いた制ガン剤を開示している。
ＷＯ９５／１１６８７はＥ２Ｆデコイ核酸を用いて細胞増殖を抑えられることを開示している。
今までに、一分子内に二つの異なった機能を持つオリゴヌクレオチドには、以下のようなものが開示されている。
ＪＰ−Ａ（Ｗ）２００２−５１５５１４は、ＩＣＡＭ−１のアンチセンスを皮膚外用剤として用いる方法を開示しており、それはＤＮＡ：ＲＮＡやＲＮＡ：ＲＮＡキメラ構造であってもよいとしているが、引用例を含め、キメラデコイの具体例を挙げていない。またこれは、アンチセンスの経皮送達に関わる発明を開示している。
ＵＳ−Ａ  ２００３−１７６３７６は、ｂｃ１−２のアンチセンスとＣＲＥデコイのハイブリッド分子が、ガンなどの異常な細胞増殖に起因する疾患を治療できる可能性を示している。
ＪＰ−Ａ  ２００２−１９３８１３はＮＦ−κＢとＥｔｓのキメラデコイが大動脈瘤モデルにおいて大動脈面積の増大を抑制することを示している。
【発明の開示】
血管再狭窄をより有効に防止するためには、炎症と細胞増殖を同時に抑える必要がある。従って、両者をバランスよく抑制し、かつより薬効・安全性に優れた薬剤の開発が望まれている。
ＪＰ−Ａ（Ｗ）２００２−５１５５１４は、具体的な治療効果は全く記載されておらず、各種疾患への応用可能性は全く不明であった。
ＵＳ−Ａ  ２００３−１７６３７６は上記以外の疾患への有用性については言及していない。
ＪＰ−Ａ  ２００２−１９３８１３は上記以外の疾患への有用性については不明であった。
本発明が解決しようとする課題は、デコイ核酸を有効成分とし、炎症と細胞増殖を同時に抑える薬剤を提供することである。
本発明者らは、吻合部内膜の肥厚は、血管壁の炎症による炎症細胞浸潤、平滑筋細胞の増殖、遊走に起因しているため、一分子でこれらを同時にコントロールする薬剤を開発することが有効であると考えた。
本発明者らは、鋭意検討の結果、例えばＮＦ−κＢに制御される炎症作用、そしてＥ２Ｆに制御される細胞増殖作用を同時に抑えることができる分子を設計した。すなわち、一分子内にＮＦ−κＢ、Ｅ２ＦのＤＮＡ結合配列を両方有するデコイ［キメラ（ダブル）デコイ］が、両転写因子をより効果的に抑制することを見いだしたものである。デコイとは、転写調節因子が結合する核酸配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチドであり、該転写調節因子が結合する他の核酸配列と競合し、おとり（デコイ）作用をするものである。デコイはＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、ＤＮＡがより好ましい。また本明細書において、デコイ、デコイオリゴヌクレオチド、デコイＯＤＮは同義に用いられる。
その要旨は、
（１）一分子中に複数の転写調節因子結合配列を含むキメラ（ダブル）デコイ、
（２）キメラデコイがＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドからなる（１）記載のデコイ、
（３）キメラデコイがＤＮＡオリゴヌクレオチドからなる（１）または（２）記載のデコイ、
（４）キメラデコイが転写因子阻害作用を有する、（１）〜（３）記載のデコイ、
（５）キメラデコイの少なくとも一つの転写調節因子結合配列が、ＮＦ−κＢ、Ｅ２Ｆ、ＧＡＴＡ−３、ＳＴＡＴ−１、ＳＴＡＴ−６、Ｅｔｓ、ＡＰ−１の結合配列である（１）〜（４）記載のデコイ、
（６）前記キメラデコイ中のＮＦ−κＢ結合配列がＧＧＧＲＨＴＹＹＨＣ（式中、ＲはＡまたはＧを、ＹはＣまたはＴを、ＨはＡ、ＣまたはＴをそれぞれ意味する）である（１）〜（５）のいずれかに記載のデコイ、
（７）前記キメラデコイ中のＮＦ−κＢ結合配列がＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣまたはＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣである（６）に記載のデコイ、
（８）前記キメラデコイ中のＥ２Ｆ結合配列がＴＴＴＳＳＣＧＳ（式中、ＳはＧまたはＣを意味する）である（１）〜（５）のいずれかに記載のデコイ、
（９）前記キメラデコイ中のＥ２Ｆ結合配列がＴＴＴＣＣＣＧＣである（８）に記載のデコイ、
（１０）前記キメラデコイ中のＧＡＴＡ−３結合配列がＷＧＡＴＡＲ（式中ＷはＡまたはＴを、ＲはＡまたはＧをそれぞれ意味する）である（１）〜（５）のいずれかに記載のデコイ、
（１１）前記キメラデコイ中のＧＡＴＡ−３結合配列がＡＧＡＴＡＧである（１０）に記載のデコイ、
（１２）前記キメラデコイ中のＳＴＡＴ−１結合配列がＴＴＣＮＮＮＧＡＡ（式中ＮはＡ，Ｇ，ＴまたはＣを意味する）である（１）〜（５）のいずれかに記載のデコイ、
（１３）前記キメラデコイ中のＳＴＡＴ−１結合配列がＴＴＣＣＧＧＧＡＡである（１２）に記載のデコイ、
（１４）前記キメラデコイ中のＳＴＡＴ−６結合配列がＴＴＣＮＮＮＮＧＡＡ（式中ＮはＡ，Ｇ，ＴまたはＣを意味する）である（１）〜（５）のいずれかに記載のデコイ、
（１５）前記キメラデコイ中のＳＴＡＴ−６結合配列がＴＴＣＣＣＡＡＧＡＡである（１４）に記載のデコイ、
（１６）前記キメラデコイ中のＥｔｓ結合配列がＭＧＧＡＷ（式中ＭはＡまたはＣを、ＷはＡまたはＴをそれぞれ意味する）である（１）〜（５）のいずれかに記載のデコイ、
（１７）前記キメラデコイ中のＥｔｓ結合配列がＣＧＧＡＡである（１６）に記載のデコイ、
（１８）前記キメラデコイ中のＡＰ−１結合配列がＴＧＡＳＴＭＡ（式中ＳはＧまたはＣを、ＭはＡまたはＣをそれぞれ意味する）である（１）〜（５）のいずれかに記載のデコイ、
（１９）前記キメラデコイ中のＡＰ−１結合配列がＴＧＡＧＴＣＡである（１８）に記載のデコイ、
（２０）キメラデコイが一分子中に二つの転写調節因子結合配列を含むデコイである（１）〜（１９）のいずれかに記載のデコイ、
（２１）キメラデコイが次式に示されるオリゴヌクレオチドから成る（１）〜（２０）のいずれかに記載のデコイ、
５’−Ｎ（ｍ）−コンセンサス１−Ｎ（ｓ）−コンセンサス２−Ｎ（ｎ）−３’
（式中、Ｎ（ｍ）は５’端の付加配列、Ｎ（ｓ）はスペーサー、Ｎ（ｎ）は３’端の付加配列を表す、コンセンサス１、２は転写調節因子結合配列を示す。ｍ，ｓ，ｎはそれぞれ独立して０または１〜２０の整数を意味する。ＮはヌクレオチドＡ，Ｇ，ＴまたはＣを意味する。）
（２２）コンセンサス１および／またはコンセンサス２がＧＧＧＲＨＴＹＹＨＣ（式中、ＲはＡまたはＧを、ＹはＣまたはＴを、ＨはＡ、ＣまたはＴをそれぞれ意味する）、ＴＴＴＳＳＣＧＳ（式中、ＳはＧまたはＣを意味する）、ＷＧＡＴＡＲ（式中ＷはＡまたはＴを、ＲはＡまたはＧをそれぞれ意味する）、ＴＴＣＮＮＮＧＡＡ（式中ＮはＡ，Ｇ，ＴまたはＣを意味する）、ＴＴＣＮＮＮＮＧＡＡ（式中ＮはＡ，Ｇ，ＴまたはＣを意味する）、ＭＧＧＡＷ（式中ＭはＡまたはＣを、ＷはＡまたはＴをそれぞれ意味する）、ＴＧＡＳＴＭＡ（式中ＳはＧまたはＣを、ＭはＡまたはＣをそれぞれ意味する）から選ばれた配列である（１）〜（２１）のいずれかに記載のデコイ、
（２３）コンセンサス１および／またはコンセンサス２がＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣ、ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ、ＴＴＴＣＣＣＧＣ、ＡＧＡＴＡＧ、ＴＴＣＣＧＧＧＡＡ、ＴＴＣＣＣＡＡＧＡＡ、ＣＧＧＡＡ、ＴＧＡＧＴＣＡから選ばれた配列である（１）〜（２２）のいずれかに記載のデコイ、
（２４）（２１）の式中、（ｍ）＝０または１〜２０の整数である（２１）〜（２３）のいずれかに記載のデコイ、
（２５）（２１）の式中、（ｍ）＝０または１〜１０の整数である（２１）〜（２４）のいずれかに記載のデコイ、
（２６）（２１）の式中、（ｍ）＝０または１〜５の整数である（２１）〜（２５）のいずれかに記載のデコイ、
（２７）（２１）の式中、（ｓ）＝０または１〜２０の整数である（２１）〜（２６）のいずれかに記載のデコイ、
（２８）（２１）の式中、（ｓ）＝０または１〜１０の整数である（２１）〜（２７）のいずれかに記載のデコイ、
（２９）（２１）の式中、（ｓ）＝０または１〜５の整数である（２１）〜（２８）のいずれかに記載のデコイ、
（３０）（２１）の式中、（ｎ）＝０または１〜２０の整数である（２１）〜（２９）のいずれかに記載のデコイ、
（３１）（２１）の式中、（ｎ）＝０または１〜１０の整数である（２１）〜（３０）のいずれかに記載のデコイ、
（３２）（２１）の式中、（ｎ）＝０または１〜５の整数である（２１）〜（３１）のいずれかに記載のデコイ、
（３３）キメラデコイが、ＮＦ−κＢとその他の転写因子のキメラデコイである、（１）〜（３２）のいずれかに記載のデコイ、
（３４）キメラデコイが、ＮＦ−κＢとＥ２Ｆのキメラデコイである、（１）〜（３３）のいずれかに記載のデコイ、
（３５）キメラデコイが、配列番号１で示されるキメラデコイである、（１）〜（３４）のいずれかに記載のデコイ、
（３６）キメラデコイが、二本鎖ＤＮＡからなる（１）〜（３５）のいずれかに記載のデコイ、
（３７）（１）〜（３６）のいずれかに記載のデコイを含む医薬組成物、
（３８）（１）〜（３７）のいずれかに記載のデコイからなる虚血性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ガンの転移または浸潤（ガンの転移・浸潤）あるいは悪液質の予防、改善、治療剤、
（３９）（１）〜（３７）のいずれかに記載のデコイからなる血管再狭窄、急性冠症候群、脳虚血、心筋梗塞、虚血性疾患の再潅流障害、アトピー性皮膚炎、尋常性乾癬、接触性皮膚炎、ケロイド、褥創、潰瘍性大腸炎、クローン病、腎症、糸球体硬化症、アルブミン尿症、腎炎、腎不全、慢性関節リウマチ、変形性関節症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の予防、改善、治療剤、
（４０）（１）〜（３７）のいずれかに記載のデコイからなるＰＴＣＡ（経皮的冠動脈形成術）、ＰＴＡ（経皮的血管形成術）、バイパス手術、臓器移植または臓器の手術後におこる血管の再狭窄の予防、改善、治療剤、
（４１）前記血管の再狭窄が、人工血管、カテーテル、ステントの使用または静脈移植に起因する再狭窄である（１）〜（３７）のいずれかに記載のデコイからなる予防、改善、治療剤、
（４２）前記血管の再狭窄が、閉塞性動脈硬化症、動脈瘤、大動脈乖離、急性冠症候群、脳虚血、マルファン症候群、プラークラプチャーに対する外科的治療に起因する（１）〜（３７）のいずれかに記載のデコイからなる予防、改善、治療剤、
（４３）前記（１）ないし（３７）のいずれかに記載のデコイを、虚血性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ガンの転移または浸潤（ガンの転移・浸潤）あるいは悪液質の予防、改善または治療剤の製造のために用いる用途、
（４４）前記（１）ないし（３７）のいずれかに記載のデコイを用いて、虚血性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ガンの転移または浸潤（ガンの転移・浸潤）あるいは悪液質を予防、改善または治療する方法、に関する。
本発明のキメラデコイは、一分子で複数の転写調節因子を同時に阻害することを特徴とする核酸系薬剤である。このキメラデコイは、例えば虚血性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ガンの転移または浸潤（ガンの転移・浸潤）あるいは悪液質に用いることができる。より好ましくは、閉塞性動脈硬化症、動脈瘤、大動脈乖離、マルファン症候群、プラークラプチャーに対する外科的治療に用いられるＰＴＣＡ（経皮的冠動脈形成術）、ＰＴＡ（経皮的血管形成術）、バイパス手術後の再狭窄に用いることができる。
発明の詳細な説明
本発明は一分子内に複数の転写調節因子結合配列をもつデコイ核酸［キメラ（ダブル）デコイ］およびそれを有効成分とする医薬組成物を提供するものである。
本明細書において、キメラデコイとは二つ以上の転写調節因子結合配列を有するデコイであり、ダブルデコイは二つの転写調節因子結合配列を有するデコイを指す。従って、ダブルデコイはキメラデコイの概念に含まれる。
本発明のデコイには、ＮＦ−κＢ、ＳＴＡＴ−１、ＧＡＴＡ−３、ＳＴＡＴ−６、ＡＰ−１、Ｅｔｓ、Ｅ２Ｆ等のデコイを挙げることができるが、例えばＮＦ−κＢとＥ２Ｆを組み合わせたキメラデコイが好適対象である。ＮＦ−κＢ結合配列をコンセンサス配列ＧＧＧＲＨＴＹＹＨＣ（Ｒ（Ａ，Ｇ）；Ｙ（Ｃ，Ｔ）；Ｈ（Ａ，Ｃ，Ｔ））（配列番号２）から選択し、Ｅ２Ｆ結合配列をコンセンサス配列ＴＴＴＳＳＣＧＳ（Ｓ（Ｇ，Ｃ））（配列番号３）から選択し、組み合わせたキメラデコイを作成することができる。例えば、好ましいキメラデコイの例としては、ＮＦ−κＢのＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣ（配列番号９）、Ｅ２ＦのＴＴＴＣＣＣＧＣ（配列番号１１）をコアシーケンスとしたＧＡＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＣＣＡＴＴＴＣＣＣＧＣＧＧＡ（配列番号１）（ＮＦ−κＢ，Ｅ２Ｆキメラデコイ）が挙げられるが、これに限定されない。
他に、ＧＡＴＡ−３コンセンサス配列ＷＧＡＴＡＲ（Ｗ（Ａ，Ｔ）；Ｒ（Ａ，Ｇ））（配列番号４）、ＳＴＡＴ−１コンセンサス配列ＴＴＣＮＮＮＧＡＡ（Ｎ（Ａ，Ｇ，Ｔ，Ｃ））（配列番号５）、ＳＴＡＴ−６コンセンサス配列ＴＴＣＮＮＮＮＧＡＡ（Ｎ（Ａ，Ｇ，Ｔ，Ｃ））（配列番号６）、Ｅｔｓコンセンサス配列ＭＧＧＡＷ（（Ｍ（Ａ，Ｃ）；Ｗ（Ａ，Ｔ））（配列番号７）、ＡＰ−１  コンセンサス配列ＴＧＡＳＴＭＡ（Ｓ（Ｇ，Ｃ）；Ｍ（Ａ，Ｃ））（配列番号８）から選択した配列を適宜組み合わせて用いることもできる。例えば、ＮＦ−κＢ結合配列ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号１０）、ＧＡＴＡ−３結合配列ＡＧＡＴＡＧ（配列番号１２）、ＳＴＡＴ−１結合配列ＴＴＣＣＧＧＧＡＡ（配列番号１３）、ＳＴＡＴ−６結合配列ＴＴＣＣＣＡＡＧＡＡ（配列番号１４）、Ｅｔｓ結合配列ＣＧＧＡＡ（配列番号１５）、ＡＰ−１結合配列ＴＧＡＧＴＣＡ（配列番号１６）を適宜組み合わせて用いることができるが、これに限定されない。
本発明にかかるキメラデコイは次式により定義することもできる。
５’−Ｎ（ｍ）−コンセンサス１−Ｎ（ｓ）−コンセンサス２−Ｎ（ｎ）−３’（式中、Ｎ（ｍ）は５’端の付加配列、Ｎ（ｓ）はスペーサー、Ｎ（ｎ）は３’端の付加配列を表す。コンセンサス１、２は転写調節因子結合配列を示す。ｍ，ｓ，ｎはそれぞれ独立して０または１〜２０の整数を意味する。ＮはヌクレオチドＡ，Ｇ，ＴまたはＣを意味する。）
式中の５’付加配列については、通常（ｍ）＝０または１〜２０の整数であるが、好ましくは（ｍ）＝０または１〜１０の整数、より好ましくは、（ｍ）＝０または１〜５の整数のものを用いる。また、式中のスペーサー部分は通常（ｓ）＝０または１〜２０の整数であるが、好ましくは（ｓ）＝０または１〜１０の整数、より好ましくは（ｓ）＝０または１〜５の整数のものを用いる。式中の３’付加配列については、通常（ｎ）＝０または１〜２０の整数であるが、好ましくは（ｎ）＝０または１〜１０の整数、より好ましくは、（ｎ）＝０または１〜５の整数のものを用いる。
本発明のキメラデコイは、通常ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いることができるが、二本鎖ＤＮＡがより好ましい。加えて、これらの相補体を含むオリゴヌクレオチド、これらの変異体、またはこれらを分子内に含む化合物も用いることができる。また、これらのオリゴヌクレオチド内に核酸修飾体および／または擬核酸を含むものであってもよい。これらの核酸系薬剤は上記核酸配列を二つ以上含む二本鎖オリゴヌクレオチドまたはその変異体が挙げられる。
なお、本発明に係るキメラデコイは、ＤＮＡ合成機（ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）等の常法により製造することができる。
また、本発明に係るキメラデコイの投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法等によって異なるが、通常０．１〜１０００μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１〜１００μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１０〜８０μｍｏｌ／Ｌのデコイ溶液を例えばカニュレーション等により治療部位に導入する。これらの溶液を用い、成人一日当たり、通常０．１〜１０，０００ｎｍｏｌ、好ましくは１〜１，０００ｎｍｏｌ、より好ましくは１０〜１００ｎｍｏｌを投与することができる。デコイ核酸溶液は、通常２５〜２５０ｍｍＨｇの加圧で導入する。好ましくは５０〜２００ｍｍＨｇ、より好ましくは１００〜１７５ｍｍＨｇの加圧で導入する。
【産業上の利用可能性】  複数の転写調節因子の阻害作用に基づく血管再狭窄、虚血性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ガンの転移または浸潤（ガンの転移・浸潤）あるいは悪液質の予防、改善、治療薬を提供する。
【図面の簡単な説明】  図１は、血管平滑筋細胞増殖アッセイの結果を表したグラフである。（図中、−ＰＤＧＦは、ノーマル（ＰＤＧＦ刺激なし）を意味する。以下同じ。）
図２は、血管内皮細胞増殖アッセイの結果を表したグラフである。
図３は、血管平滑筋細胞遊走アッセイ後の細胞の顕微鏡写真である。（倍率×４００）
図４は、血管平滑筋細胞遊走アッセイの結果を表したグラフである。
図５は、ウサギ血管壁へのデコイＯＤＮの導入効率を比較したグラフである。
図６は、バイパス手術を施したウサギ血管の遠位吻合部の顕微鏡写真である（倍率×１００）。図の上部が血管内腔側である。矢印先部に人工血管吻合部を示す。コントロール、スクランブルデコイに比べて、キメラデコイが吻合部の肥厚を抑制していることが分かる。
図７は、バイパス手術を施したウサギ血管の遠位吻合部の内膜、中膜の厚さを表したグラフである。
図８は、バイパス手術を施したウサギ血管の遠位吻合部の内膜、中膜の厚さの比を表したグラフである。
図９は、バイパス手術を施したウサギ血管の近位吻合部の顕微鏡写真である（倍率×１００）。図の上部が血管内腔側である。矢印先部に人工血管吻合部を示す。コントロール、スクランブルデコイに比べて、キメラデコイが吻合部の肥厚を抑制していることが分かる。
図１０は、バイパス手術を施したウサギ血管の近位吻合部の内膜、中膜の厚さを表したグラフである。
図１１は、バイパス手術を施したウサギ血管の近位吻合部の内膜、中膜の厚さの比を表したグラフである。
図１２は、ウサギバイパスモデルから摘出したグラフト吻合部のマクロファージに対する免疫組織化学染色の顕微鏡写真（倍率×４００）および全細胞中におけるマクロファージの割合を表したグラフである。
図１３は、ウサギバイパスモデルから摘出したグラフト吻合部のＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）陽性細胞に対する免疫組織化学染色の顕微鏡写真（倍率×４００）および全細胞中におけるＰＣＮＡ陽性細胞の割合を表したグラフである。
【実施例】  続いて本発明を具体的に説明するため、以下に実施例を掲げるが、本発明はこれらに限定されない。
１．血管平滑筋細胞増殖アッセイ
継代数５〜６の血管平滑筋細胞（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｅｌｌ；ＶＳＭＣ）（三光純薬ｃｒｙｏ  ＡＯＳＭＣ，Ｃａｔ＃ＣＣ−２５７１）を９６ウェルプレートに５×１０３細胞／ウェル播種し、４８時間、無血清培地で培養した。オリゴフェクタミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ＃１２２５２−０１１）を用いてデコイＯＤＮ（２０ｎＭまたは６００ｎＭ）を細胞に導入後、さらに２４時間、無血清培地で培養した。デコイＯＤＮの配列を以下に示す。
2006043722.tif 000002
血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＰＤＧＦ）―ＢＢ（１０ｎｇ／ｍｌ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＥＣ  Ｌｔｄ，Ｃａｔ＃１００−１４Ｂ）で２４時間刺激後、無血清培地に交換し、２４時間後ＷＳＴ−１細胞数カウントキット（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ、同仁化学研究所）を用いて細胞数を計測した。
結果）キメラデコイはスクランブルデコイに比べて、有意に血管平滑筋細胞増殖を抑制した。（表１、図１参照）
【表１】
2006043722.tif 000003
2006043722.tif 000004
２．血管内皮細胞増殖アッセイ
継代数５〜６の血管内皮細胞（Ｅｎｄｏｔｈｅｒｉａｌ  Ｃｅｌｌ；ＥＣ）（三光純薬ｃｒｙｏ  ＨＡＥＣ，Ｃａｔ＃ＣＣ−２５３５）を９６穴ウェルプレートに１×１０４細胞／ウェル播種し、４８時間、０．５％血清培地で培養した。オリゴフェクタミンを用いてデコイＯＤＮ（６００ｎＭ）を細胞に導入後、さらに２４時間、０．５％血清培地で培養した。５％血清培地で２４時間刺激後、０．５％血清培地に交換し、２４時間後ＷＳＴ−１細胞数カウントキットで細胞数を計測した。
結果）キメラデコイを含めた全てのＯＤＮは、血管内皮細胞の増殖を抑制しなかった。（表２、図２参照）
【表２】
2006043722.tif 000005
2006043722.tif 000006
３．血管平滑筋細胞遊走アッセイ
継代数５〜６のＶＳＭＣを６穴ウェルプレートに５０％コンフルエントになるよう播種し、４８時間、無血清培地で培養した。オリゴフェクタミンを用いてデコイＯＤＮ（６００ｎＭ）を細胞に導入後、さらに２４時間、無血清培地で培養した。２４ウェルマトリゲルインベイジョンチャンバー（Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｃｈａｍｂｅｒ）の上部チャンバーにＶＳＭＣを２．５×１０４細胞播種し、下部チャンバーにＰＤＧＦ−ＢＥ（５０ｎｇ／ｍｌ）を入れ、４８時間細胞を刺激した後、ディフクイック（Ｄｉｆｆ  Ｑｕｉｋ）染色を行い、遊走細胞数を計測した。
結果）キメラデコイ、ＮＦ−κＢデコイ、Ｅ２Ｆデコイはスクランブルデコイに比べて、有意に細胞遊走を抑制した。その中でもキメラデコイは、最も活性が強かった。（表３、図３，４参照）
【表３】
2006043722.tif 000007
４．ウサギバイパスモデル実験
デコイＯＤＮを動脈壁に導入するのに最も適切な圧力を求めた。ＦＩＴＣ−ＯＤＮ（４０μｍｏｌ／Ｌ）を動脈吻合部へ任意の圧力で導入し、その導入効率を測定したところ、１５０ｍｍＨｇが最も適切であることが明らかとなった。（表４、図５）
【表４】
2006043722.tif 000008
2006043722.tif 000009
高脂血症家兎の総頚動脈を剥離し、動脈内にカニュレーション後、１５０ｍｍＨｇの加圧でデコイＯＤＮ（４０μｍｏｌ／Ｌ）を動脈壁に導入した。導入部に２ｍｍｅｘｐａｎｄｅｄ  ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ（ｅＰＴＦＥ）グラフト（２ｃｍ）を置換し、バイパスモデルとした。４週間後にエラスチカ・ワンギーソン（Ｅｌａｓｔｉｃａ  Ｖａｎ  Ｇｉｅｓｏｎ；ＥＶＧ）染色を行い、吻合部内膜肥厚を計測、評価した。
結果）キメラデコイはスクランブルデコイに比較して、優位に吻合部の内膜、中膜の肥厚を抑制した。キメラデコイは、吻合部が遠位（体の中心から遠い位置）にあっても、近位（体の中心に近い位置）にあっても、同様の抑制活性を示した。（表５、６、図６〜１１参照）
【表５】
2006043722.tif 000010
【表６】
2006043722.tif 000011
2006043722.tif 000012
５．マクロファージおよびＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）の染色
４で用いたウサギバイパスモデルから摘出したグラフト吻合部の細胞中におけるマクロファージとＰＣＮＡ陽性細胞の割合を調べた。ペルオキシダーゼ、アビジン−ビオチン複合体システムを用いて、免疫組織化学染色を行った。
５μｍ厚のパラフィン切片を脱パラフィンした後、再水和（ｒｅｈｙｄｒａｔｅ）した。３％過酸化水素を用いて内因性ペルオキシダーゼをブロックした。５％ウマ血清添加リン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）を用いて３０分間ブロッキングを行った。１：５０に希釈した一次抗体を切片に加え、４℃で一晩インキュベートした。マクロファージの検出にはＲＡＭ１１抗体（ＤＡＫＯ，ＵＳＡ）、ＰＣＮＡには抗ＰＣＮＡ抗体（Ｃｌｏｎｅ：ＰＣ１０）（ＤＡＫＯ，ＵＳＡ）を用いた。切片をＰＢＳで適宜洗浄しながら、ビオチン化抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）添加ＰＢＳを加えて３０分間インキュベートした後、アビジン−ビオチン化西洋わさびペルオキシダーゼ添加ＰＢＳを加えてさらに３０分間インキュベートした。これはＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｓ  ＡＢＣ  ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用い、キットに添付の方法に従った。免疫複合体は０．０５％  ３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＤＡＢ，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて検出し、その後切片をヘマトキシリンでカウンター染色した。
結果）キメラデコイはスクランブルデコイに比べて、有意にマクロファージの浸潤を抑制した（表７、図１２参照）。また、キメラデコイは、スクランブルデコイに比べて、ＰＣＮＡ陽性細胞を減少させたことから、細胞増殖を抑制することも示された（表８、図１３参照）。
【表７】
2006043722.tif 000013
【表８】
2006043722.tif 000014
６．統計解析データは全て平均値±標準誤差（ＳＥＭ）で表した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
2006043722000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年4月5日(2007.4.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一分子中に複数の転写調節因子結合配列を含むキメラ（ダブル）デコイ。
【請求項２】
キメラデコイがDNAまたはRNAオリゴヌクレオチドからなる請求項１記載のデコイ。
【請求項３】
キメラデコイがDNAオリゴヌクレオチドからなる請求項１または２記載のデコイ。
【請求項４】
キメラデコイが転写調節因子阻害作用を有する、請求項１ないし３のいずれかに記載のデコイ。
【請求項５】
キメラデコイの少なくとも一つの転写調節因子結合配列が、NF-κB、E2F、GATA-3、STAT-1、STAT-6、Ets、AP-1の結合配列である請求項１ないし４のいずれかに記載のデコイ。
【請求項６】
前記キメラデコイ中のNF-κB結合配列がGGGRHTYYHC（式中、RはAまたはGを、YはCまたはTを、HはA、CまたはTをそれぞれ意味する。）である請求項１ないし５のいずれかに記載のデコイ。
【請求項７】
前記キメラデコイ中のNF-κB結合配列がGGGATTTCCCまたはGGGACTTTCCである請求項６に記載のデコイ。
【請求項８】
前記キメラデコイ中のE2F結合配列がTTTSSCGS（式中、SはGまたはCを意味する。）である請求項１ないし５のいずれかに記載のデコイ。
【請求項９】
前記キメラデコイ中のE2F結合配列がTTTCCCGCである請求項８に記載のデコイ。
【請求項１０】
前記キメラデコイ中のGATA-3結合配列がWGATAR(式中WはAまたはTを、RはAまたはGをそれぞれ意味する)である請求項１ないし５のいずれかに記載のデコイ。
【請求項１１】
前記キメラデコイ中のGATA-3結合配列がAGATAGである請求項１０に記載のデコイ。
【請求項１２】
前記キメラデコイ中のSTAT-1結合配列がTTCNNNGAA(式中NはA,G,TまたはCを意味する)である請求項１ないし５のいずれかに記載のデコイ。
【請求項１３】
前記キメラデコイ中のSTAT-1結合配列がTTCCGGGAAである請求項１２に記載のデコイ。
【請求項１４】
前記キメラデコイ中のSTAT-6結合配列がTTCNNNNGAA(式中NはA,G,TまたはCを意味する)である請求項１ないし５のいずれかに記載のデコイ。
【請求項１５】
前記キメラデコイ中のSTAT-6結合配列がTTCCCAAGAAである請求項１４に記載のデコイ。
【請求項１６】
前記キメラデコイ中のEts結合配列がMGGAW（式中MはAまたはCを、WはAまたはTをそれぞれ意味する）である請求項１ないし５のいずれかに記載のデコイ。
【請求項１７】
前記キメラデコイ中のEts結合配列がCGGAAである請求項１６に記載のデコイ。
【請求項１８】
前記キメラデコイ中のAP-1結合配列がTGASTMA(式中SはGまたはCを、MはAまたはCをそれぞれ意味する)である請求項１ないし５のいずれかに記載のデコイ。
【請求項１９】
前記キメラデコイ中のAP-1結合配列がTGAGTCAである請求項１８に記載のデコイ。
【請求項２０】
キメラデコイが一分子中に二つの転写調節因子結合配列を含むデコイである請求項１ないし１９のいずれかに記載のデコイ。
【請求項２１】
キメラデコイが次式に示されるオリゴヌクレオチドから成る請求項１ないし２０のいずれかに記載のデコイ。
５’−N（m）−コンセンサス1−N(s)−コンセンサス2−N(n)−３’
（式中、N（m）は５’端の付加配列、N(s)はスペーサー、N(n)は３’端の付加配列を表す。コンセンサス１、２は同一または相異なる転写調節因子結合配列を示す。ｍ, s, nはそれぞれ独立して０または１〜２０の整数を意味する。NはヌクレオチドA,G,TまたはCを意味する。）
【請求項２２】
コンセンサス１および／またはコンセンサス２がGGGRHTYYHC（式中、RはAまたはGを、YはCまたはTを、HはA、CまたはTをそれぞれ意味する）、TTTSSCGS（式中、SはGまたはCを意味する）、WGATAR(式中WはAまたはTを、RはAまたはGをそれぞれ意味する)、TTCNNNGAA(式中NはA,G,TまたはCを意味する)、TTCNNNNGAA(式中NはA,G,TまたはCを意味する)、MGGAW（式中MはAまたはCを、WはAまたはTをそれぞれ意味する）、TGASTMA(式中SはGまたはCを、MはAまたはCをそれぞれ意味する)から選ばれた配列である請求項１ないし２１のいずれかに記載のデコイ。
【請求項２３】
コンセンサス１および／またはコンセンサス２がGGGATTTCCC、GGGACTTTCC、TTTCCCGC、AGATAG、TTCCGGGAA、TTCCCAAGAA、CGGAA、TGAGTCAから選ばれた配列である請求項１ないし２２のいずれかに記載のデコイ。
【請求項２４】
請求項２１の式中、(m)=０または１〜２０の整数である請求項２１ないし２３に記載のデコイ。
【請求項２５】
請求項２１の式中、(m)=０または１〜１０の整数である請求項２１ないし２４のいずれかに記載のデコイ。
【請求項２６】
請求項２１の式中、(m)=０または１〜５の整数である請求項２１ないし２５のいずれかに記載のデコイ。
【請求項２７】
請求項２１の式中、(s)=０または１〜２０の整数である請求項２１ないし２６のいずれかに記載のデコイ。
【請求項２８】
請求項２１の式中、(s)=０または１〜１０の整数である請求項２１ないし２７のいずれかに記載のデコイ。
【請求項２９】
請求項２１の式中、(s)=０または１〜５の整数である請求項２１ないし２８のいずれかに記載のデコイ。
【請求項３０】
請求項２１の式中、(n)=０または１〜２０の整数である請求項２１ないし２９のいずれかに記載のデコイ。
【請求項３１】
請求項２１の式中、(n)=０または１〜１０の整数である請求項２１ないし３０のいずれかに記載のデコイ。
【請求項３２】
請求項２１の式中、(n)=０または１〜５の整数である請求項２１ないし３１のいずれかに記載のデコイ。
【請求項３３】
キメラデコイが、NF-κBとその他の転写調節因子のキメラデコイである、請求項１ないし３２のいずれかに記載のデコイ。
【請求項３４】
キメラデコイが、NF-κBとE2Fのキメラデコイである、請求項１ないし３３のいずれかに記載のデコイ。
【請求項３５】
キメラデコイが、配列番号１で示されるキメラデコイである、請求項１ないし３４のいずれかに記載のデコイ。
【請求項３６】
キメラデコイが、二本鎖DNAからなる請求項１ないし３５のいずれかに記載のデコイ。
【請求項３７】
請求項１ないし３６のいずれかに記載のデコイを含む医薬組成物。
【請求項３８】
請求項１ないし３７のいずれかに記載のデコイからなる虚血性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ガンの転移または浸潤（ガンの転移・浸潤）あるいは悪液質の予防、改善、治療剤。
【請求項３９】
請求項１ないし３７のいずれかに記載のデコイからなる血管再狭窄、急性冠症候群、脳虚血、心筋梗塞、虚血性疾患の再潅流障害、アトピー性皮膚炎、尋常性乾癬、接触性皮膚炎、ケロイド、褥創、潰瘍性大腸炎、クローン病、腎症、糸球体硬化症、アルブミン尿症、腎炎、腎不全、慢性関節リウマチ、変形性関節症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）の予防、改善、治療剤。
【請求項４０】
請求項１ないし３７のいずれかに記載のデコイからなるPTCA（経皮的冠動脈形成術）、PTA（経皮的血管形成術）、バイパス手術、臓器移植または臓器の手術後におこる血管の再狭窄の予防、改善、治療剤。
【請求項４１】
前記血管の再狭窄が、人工血管、カテーテル、ステントの使用または静脈移植に起因する再狭窄である請求項１ないし３７のいずれかに記載のデコイからなる予防、改善、治療剤。
【請求項４２】
前記血管の再狭窄が、閉塞性動脈硬化症、動脈瘤、大動脈乖離、急性冠症候群、脳虚血、マルファン症候群、プラークラプチャーに対する外科的治療に起因する請求項１ないし３７のいずれかに記載のデコイからなる予防、改善、治療剤。
【請求項４３】
請求項１ないし３７のいずれかに記載のデコイを、虚血性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ガンの転移または浸潤（ガンの転移・浸潤）あるいは悪液質の予防、改善または治療剤の製造のために用いる用途。
【請求項４４】
４４．請求項１ないし３７のいずれかに記載のデコイを用いて、虚血性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ガンの転移または浸潤（ガンの転移・浸潤）あるいは悪液質を予防、改善または治療する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】  キメラ（ダブル）デコイ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転写調節因子が結合する配列を複数有するオリゴヌクレオチドからなるデコイおよびその使用方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、キメラ（ダブル）デコイオリゴヌクレオチドおよびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
閉塞性動脈硬化症や、大動脈瘤、大動脈乖離などの治療に対して行われる外科的血行再建術には人工血管がよく用いられる。また、閉塞した血管を拡張するためには、バルーンカテーテルやステントなどが用いられることも多い。しかし、これらの器具を用いた術後にはしばしば血管の再閉塞が起こり、再度同様の施術を必要とすることもあり、これが問題となっている。
【０００３】
例えば、閉塞性動脈硬化症の患者に対しては、下肢切断を回避するために外科的血行再建術を用いるが、膝上部の病変については人工血管を用いたバイパス手術が第一選択肢となっている。しかし、術後一ヶ月以降に人工血管閉塞が起こることがある。この閉塞は吻合部の血管内膜の肥厚が主な原因である。肥厚を抑制することで、グラフトの長期保存、さらには膝下部の血行再建に人工血管を使用することが可能となる。
人工血管吻合部の血管内膜の肥厚の主な原因は、吻合部に起こる炎症反応により細胞増殖が活発化するためである。従って、この細胞増殖を阻害することで肥厚を抑制することができると考えられる。
【０００４】
近年、炎症反応を阻害することを目的とした遺伝子治療法が開発されている。
炎症反応に関わる転写調節因子であるNF-κBの働きをデコイ核酸で抑えることによって消炎効果を期待する研究がなされている。
特再表(WO-A1)96/035430号公報は、NF-κBデコイ核酸が炎症性疾患に対する治療剤となりうることを開示している。
また、細胞増殖をコントロールする遺伝子治療法も開発されている。例えば、細胞増殖に重要な役割を果たす転写調節因子であるE2Fの働きをデコイ核酸で抑えることで血管中膜の増殖を抑制することができる。
【０００５】
JP-B 3392143は、E2Fデコイ核酸を用いた制ガン剤を開示している。
WO95/11687はE2Fデコイ核酸を用いて細胞増殖を抑えられることを開示している。
今までに、一分子内に二つの異なった機能を持つオリゴヌクレオチドには、以下のようなものが開示されている。
JP-A(W) 2002-515514は、ICAM-1のアンチセンスを皮膚外用剤として用いる方法を開示しており、それはDNA:RNAやRNA:RNAキメラ構造であってもよいとしているが、引用例を含め、キメラデコイの具体例を挙げていない。またこれは、アンチセンスの経皮送達に関わる発明を開示している。
US-A 2003-176376は、bcl-2のアンチセンスとCREデコイのハイブリッド分子が、ガンなどの異常な細胞増殖に起因する疾患を治療できる可能性を示している。
JP-A 2002-193813はNF-κBとEtsのキメラデコイが大動脈瘤モデルにおいて大動脈面積の増大を抑制することを示している。
【特許文献１】  特再表(WO-A1)96/035430号公報
【特許文献２】  JP-B 3392143
【特許文献３】  WO95/11687
【特許文献４】  JP-A(W) 2002-515514
【特許文献５】  US-A 2003-176376
【特許文献６】  JP-A 2002-193813
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
血管再狭窄をより有効に防止するためには、炎症と細胞増殖を同時に抑える必要がある。従って、両者をバランスよく抑制し、かつより薬効・安全性に優れた薬剤の開発が望まれている。
JP-A(W) 2002-515514は、具体的な治療効果は全く記載されておらず、各種疾患への応用可能性は全く不明であった。
US-A 2003-176376は上記以外の疾患への有用性については言及していない。
JP-A 2002-193813は上記以外の疾患への有用性については不明であった。
本発明が解決しようとする課題は、デコイ核酸を有効成分とし、炎症と細胞増殖を同時に抑える薬剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、吻合部内膜の肥厚は、血管壁の炎症による炎症細胞浸潤、平滑筋細胞の増殖、遊走に起因しているため、一分子でこれらを同時にコントロールする薬剤を開発することが有効であると考えた。
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討の結果、例えばNF-κB に制御される炎症作用、そしてE2Fに制御される細胞増殖作用を同時に抑えることができる分子を設計した。すなわち、一分子内にNF-κB、E2FのDNA結合配列を両方有するデコイ[キメラ（ダブル）デコイ]が、両転写因子をより効果的に抑制することを見いだしたものである。デコイとは、転写調節因子が結合する核酸配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチドであり、該転写調節因子が結合する他の核酸配列と競合し、おとり（デコイ）作用をするものである。デコイはDNAでもRNAでもよいが、DNAがより好ましい。また本明細書において、デコイ、デコイオリゴヌクレオチド、デコイODNは同義に用いられる。
【０００９】
その要旨は、
（１）一分子中に複数の転写調節因子結合配列を含むキメラ（ダブル）デコイ、
（２）キメラデコイがDNAまたはRNAオリゴヌクレオチドからなる（１）記載のデコイ、
（３）キメラデコイがDNAオリゴヌクレオチドからなる（１）または（２）記載のデコイ、
（４）キメラデコイが転写調節因子阻害作用を有する、（１）〜（３）記載のデコイ、
（５）キメラデコイの少なくとも一つの転写調節因子結合配列が、NF-κB、E2F、GATA-3、STAT-1、STAT-6、Ets、AP-1の結合配列である（１）〜（４）記載のデコイ、
（６）前記キメラデコイ中のNF-κB結合配列がGGGRHTYYHC（式中、RはAまたはGを、YはCまたはTを、HはA、CまたはTをそれぞれ意味する）である（１）〜（５）のいずれかに記載のデコイ、
（７）前記キメラデコイ中のNF-κB結合配列がGGGATTTCCCまたはGGGACTTTCCである（６）に記載のデコイ、
（８）前記キメラデコイ中のE2F結合配列がTTTSSCGS（式中、SはGまたはCを意味する）である（１）〜（５）のいずれかに記載のデコイ、
（９）前記キメラデコイ中のE2F結合配列がTTTCCCGCである（８）に記載のデコイ、
（１０）前記キメラデコイ中のGATA-3結合配列がWGATAR(式中WはAまたはTを、RはAまたはGをそれぞれ意味する)である（１）〜（５）のいずれかに記載のデコイ、
（１１）前記キメラデコイ中のGATA-3結合配列がAGATAGである（１０）に記載のデコイ、
（１２）前記キメラデコイ中のSTAT-1結合配列がTTCNNNGAA(式中NはA,G,TまたはCを意味する)である（１）〜（５）のいずれかに記載のデコイ、
（１３）前記キメラデコイ中のSTAT-1結合配列がTTCCGGGAAである（１２）に記載のデコイ、
（１４）前記キメラデコイ中のSTAT-6結合配列がTTCNNNNGAA（式中NはA,G,TまたはCを意味する）である（１）〜（５）のいずれかに記載のデコイ、
（１５）前記キメラデコイ中のSTAT-6結合配列がTTCCCAAGAAである（１４）に記載のデコイ、
（１６）前記キメラデコイ中のEts結合配列がMGGAW（式中MはAまたはCを、WはAまたはTをそれぞれ意味する）である（１）〜（５）のいずれかに記載のデコイ、
（１７）前記キメラデコイ中のEts結合配列がCGGAAである（１６）に記載のデコイ、
（１８）前記キメラデコイ中のAP-1結合配列がTGASTMA（式中SはGまたはCを、MはAまたはCをそれぞれ意味する）である（１）〜（５）のいずれかに記載のデコイ、
（１９）前記キメラデコイ中のAP-1結合配列がTGAGTCAである（１８）に記載のデコイ、
（２０）キメラデコイが一分子中に二つの転写調節因子結合配列を含むデコイである（１）〜（１９）のいずれかに記載のデコイ、
（２１）キメラデコイが次式に示されるオリゴヌクレオチドから成る（1）〜（２０）のいずれかに記載のデコイ、
５’−N（m）−コンセンサス1−N(s)−コンセンサス 2−N(n)−３’
（式中、N（m）は５’端の付加配列、N(s)はスペーサー、N(n)は３’端の付加配列を表す、コンセンサス1、２は転写調節因子結合配列を示す。ｍ, s, nはそれぞれ独立して０または１〜２０の整数を意味する。NはヌクレオチドA,G,TまたはCを意味する。）
（２２）コンセンサス１および／またはコンセンサス２がGGGRHTYYHC（式中、RはAまたはGを、YはCまたはTを、HはA、CまたはTをそれぞれ意味する）、TTTSSCGS（式中、SはGまたはCを意味する）、WGATAR（式中WはAまたはTを、RはAまたはGをそれぞれ意味する）、TTCNNNGAA（式中NはA,G,TまたはCを意味する）、TTCNNNNGAA（式中NはA,G,TまたはCを意味する）、MGGAW（式中MはAまたはCを、WはAまたはTをそれぞれ意味する）、TGASTMA（式中SはGまたはCを、MはAまたはCをそれぞれ意味する）から選ばれた配列である（１）〜（２１）のいずれかに記載のデコイ、
（２３）コンセンサス１および／またはコンセンサス２がGGGATTTCCC、GGGACTTTCC、TTTCCCGC、AGATAG、TTCCGGGAA、TTCCCAAGAA、CGGAA、TGAGTCAから選ばれた配列である（１）〜（２２）のいずれかに記載のデコイ、
（２４）（２１）の式中、(m)=０または１〜２０の整数である（２１）〜（２３）のいずれかに記載のデコイ、
（２５）（２１）の式中、(m)=０または１〜１０の整数である（２１）〜（２４）のいずれかに記載のデコイ、
（２６）（２１）の式中、(m)=０または１〜５の整数である（２１）〜（２５）のいずれかに記載のデコイ、
（２７）（２１）の式中、(s)=０または１〜２０の整数である（２１）〜（２６）のいずれかに記載のデコイ、
（２８）（２１）の式中、(s)=０または１〜１０の整数である（２１）〜（２７）のいずれかに記載のデコイ、
（２９）（２１）の式中、(s)=０または１〜５の整数である（２１）〜（２８）のいずれかに記載のデコイ、
（３０）（２１）の式中、(n)=０または１〜２０の整数である（２１）〜（２９）のいずれかに記載のデコイ、
（３１）（２１）の式中、(n)=０または１〜１０の整数である（２１）〜（３０）のいずれかに記載のデコイ、
（３２）（２１）の式中、(n)=０または１〜５の整数である（２１）〜（３１）のいずれかに記載のデコイ、
（３３）キメラデコイが、NF-κBとその他の転写調節因子のキメラデコイである、（１）〜（３２）のいずれかに記載のデコイ、
（３４）キメラデコイが、NF-κBとE2Fのキメラデコイである、（１）〜（３３）のいずれかに記載のデコイ、
（３５）キメラデコイが、配列番号１で示されるキメラデコイである、（１）〜（３４）のいずれかに記載のデコイ、
（３６）キメラデコイが、二本鎖DNAからなる（１）〜（３５）のいずれかに記載のデコイ、
（３７）（１）〜（３６）のいずれかに記載のデコイを含む医薬組成物、
（３８）（１）〜（３７）のいずれかに記載のデコイからなる虚血性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ガンの転移または浸潤（ガンの転移・浸潤）あるいは悪液質の予防、改善、治療剤、
（３９）（１）〜（３７）のいずれかに記載のデコイからなる血管再狭窄、急性冠症候群、脳虚血、心筋梗塞、虚血性疾患の再潅流障害、アトピー性皮膚炎、尋常性乾癬、接触性皮膚炎、ケロイド、褥創、潰瘍性大腸炎、クローン病、腎症、糸球体硬化症、アルブミン尿症、腎炎、腎不全、慢性関節リウマチ、変形性関節症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）の予防、改善、治療剤、
（４０）（１）〜（３７）のいずれかに記載のデコイからなるPTCA（経皮的冠動脈形成術）、PTA（経皮的血管形成術）、バイパス手術、臓器移植または臓器の手術後におこる血管の再狭窄の予防、改善、治療剤、
（４１）前記血管の再狭窄が、人工血管、カテーテル、ステントの使用または静脈移植に起因する再狭窄である（１）〜（３７）のいずれかに記載のデコイからなる予防、改善、治療剤、
（４２）前記血管の再狭窄が、閉塞性動脈硬化症、動脈瘤、大動脈乖離、急性冠症候群、脳虚血、マルファン症候群、プラークラプチャーに対する外科的治療に起因する（１）〜（３７）のいずれかに記載のデコイからなる予防、改善、治療剤、
（４３）前記（１）ないし（３７）のいずれかに記載のデコイを、虚血性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ガンの転移または浸潤（ガンの転移・浸潤）あるいは悪液質の予防、改善または治療剤の製造のために用いる用途、
（４４）前記（１）ないし（３７）のいずれかに記載のデコイを用いて、虚血性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ガンの転移または浸潤（ガンの転移・浸潤）あるいは悪液質を予防、改善または治療する方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のキメラデコイは、一分子で複数の転写調節因子を同時に阻害することを特徴とする核酸系薬剤である。このキメラデコイは、例えば虚血性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ガンの転移または浸潤（ガンの転移・浸潤）あるいは悪液質に用いることができる。より好ましくは、閉塞性動脈硬化症、動脈瘤、大動脈乖離、マルファン症候群、プラークラプチャーに対する外科的治療に用いられるPTCA（経皮的冠動脈形成術）、PTA（経皮的血管形成術）、バイパス手術後の再狭窄に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は一分子内に複数の転写調節因子結合配列をもつデコイ核酸[キメラ（ダブル）デコイ]およびそれを有効成分とする医薬組成物を提供するものである。
本明細書において、キメラデコイとは二つ以上の転写調節因子結合配列を有するデコイであり、ダブルデコイは二つの転写調節因子結合配列を有するデコイを指す。従って、ダブルデコイはキメラデコイの概念に含まれる。
【００１２】
本発明のデコイには、NF-κB、STAT-1、GATA-3、STAT-6、AP-1、Ets、E2F等のデコイを挙げることができるが、例えばNF-κBとE2Fを組み合わせたキメラデコイが好適対象である。NF-κB結合配列をコンセンサス配列GGGRHTYYHC（R(A,G); Y(C,T); H(A,C,T)）（配列番号２）から選択し、E2F結合配列をコンセンサス配列TTTSSCGS（S(G,C)）（配列番号３）から選択し、組み合わせたキメラデコイを作成することができる。例えば、好ましいキメラデコイの例としては、NF-κBのGGGATTTCCC（配列番号９）、E2FのTTTCCCGC（配列番号１１）をコアシーケンスとしたGAAGGGATTTCCCTCCATTTCCCGCGGA（配列番号１）（NF-κB, E2Fキメラデコイ）が挙げられるが、これに限定されない。
【００１３】
他に、GATA-3コンセンサス配列WGATAR（W(A,T);R(A,G)）（配列番号４）、STAT-1コンセンサス配列TTCNNNGAA（N(A,G,T,C)）（配列番号５）、STAT-6コンセンサス配列TTCNNNNGAA（N(A,G,T,C)）（配列番号６）、Etsコンセンサス配列MGGAW（(M(A,C); W(A,T))（配列番号７）、AP-1コンセンサス配列TGASTMA（S(G,C); M(A,C)）（配列番号８）から選択した配列を適宜組み合わせて用いることもできる。例えば、NF-κB結合配列GGGACTTTCC（配列番号１０）、GATA-3結合配列AGATAG（配列番号１２）、STAT-1結合配列TTCCGGGAA（配列番号１３）、STAT-6結合配列TTCCCAAGAA（配列番号１４）、Ets結合配列CGGAA（配列番号１５）、AP-1結合配列TGAGTCA（配列番号１６）を適宜組み合わせて用いることができるが、これに限定されない。
【００１４】
本発明にかかるキメラデコイは次式により定義することもできる。
５’−N（m）−コンセンサス1−N(s)−コンセンサス 2−N(n)−３’
（式中、N（m）は５’端の付加配列、N(s)はスペーサー、N(n)は３’端の付加配列を表す。コンセンサス1、２は転写調節因子結合配列を示す。ｍ, s, nはそれぞれ独立して０または1〜２０の整数を意味する。NはヌクレオチドA,G,TまたはCを意味する。）
式中の５’付加配列については、通常(m)=０または１〜２０の整数であるが、好ましくは(m)=０または１〜１０の整数、より好ましくは、(m)=０または１〜５の整数のものを用いる。また、式中のスペーサー部分は通常(s)=０または１〜２０の整数であるが、好ましくは(s)=０または１〜１０の整数、より好ましくは(s)=０または１〜５の整数のものを用いる。式中の３’付加配列については、通常(n)=０または１〜２０の整数であるが、好ましくは(n)=０または１〜１０の整数、より好ましくは、(n)=０または１〜５の整数のものを用いる。
【００１５】
本発明のキメラデコイは、通常DNAまたはRNAオリゴヌクレオチドを用いることができるが、二本鎖DNAがより好ましい。加えて、これらの相補体を含むオリゴヌクレオチド、これらの変異体、またはこれらを分子内に含む化合物も用いることができる。また、これらのオリゴヌクレオチド内に核酸修飾体および/または擬核酸を含むものであってもよい。これらの核酸系薬剤は上記核酸配列を二つ以上含む二本鎖オリゴヌクレオチドまたはその変異体が挙げられる。
なお、本発明に係るキメラデコイは、DNA合成機（DNA Synthesizer）等の常法により製造することができる。
【００１６】
また、本発明に係るキメラデコイの投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法等によって異なるが、通常0.1〜1000μmol/L、好ましくは1〜100μmol/L、より好ましくは10〜80μmol/Lのデコイ溶液を例えばカニュレーション等により治療部位に導入する。これらの溶液を用い、成人一日当たり、通常0.1〜10,000nmol、好ましくは1〜1,000nmol、より好ましくは10〜100nmolを投与することができる。デコイ核酸溶液は、通常25〜250mmHgの加圧で導入する。好ましくは50〜200mmHg、より好ましくは100〜175ｍｍHgの加圧で導入する。
【実施例】
【００１７】
続いて本発明を具体的に説明するため、以下に実施例を掲げるが、本発明はこれらに限定されない。
【００１８】
1. 血管平滑筋細胞増殖アッセイ
継代数５〜６の血管平滑筋細胞（Vascular Smooth Muscle Cell; VSMC）（三光純薬cryo AOSMC, Cat#CC-2571）を９６ウェルプレートに５×１０３細胞／ウェル播種し、４８時間、無血清培地で培養した。オリゴフェクタミン（Oligofectamine Reagent, Invitrogen, Cat#12252-011）を用いてデコイODN（20nM または600ｎＭ）を細胞に導入後、さらに２４時間、無血清培地で培養した。デコイODNの配列を以下に示す。
キメラデコイ  5’-GAAGGGATTTCCCTCCATTTCCCGCGGA-3’（配列番号１）
3’-CTTCCCTAAAGGGAGGTAAAGGGCGCCT-5’
スクランブルデコイ  5’-CGTACCTGACTTAGCCATTTCGAGCGGA-3’（配列番号１７）
3’-GCATGGACTGAATCGGTAAAGCTCGCCT-5’
NF-κBデコイ  5’-CCTTGAAGGGATTTCCCTCC-3’（配列番号１８）
3’-GGAACTTCCCTAAAGGGAGG-5’
E2Fデコイ  5’-CTAGATTTCCCGCG-3’（配列番号１９）
3’-TAAAGGGCGCCTAG-5’（配列番号２０）
【００１９】
血小板由来成長因子（Platelet-derived growth factor；PDGF）−BB（１０ｎｇ／ｍｌ）（PeproTech EC Ltd, Cat#100-14B）で２４時間刺激後、無血清培地に交換し、２４時間後ＷＳＴ−１細胞数カウントキット（Cell Counting Kit、同仁化学研究所）を用いて細胞数を計測した。
結果）キメラデコイはスクランブルデコイに比べて、有意に血管平滑筋細胞増殖を抑制した。（表１、図１参照）
【００２０】
【表１】
2006043722.tif 000032
【００２１】
2. 血管内皮細胞増殖アッセイ
継代数５〜６の血管内皮細胞（Endotherial Cell; EC）（三光純薬cryo HAEC, Cat#CC-2535）を９６穴ウェルプレートに１×１０４細胞／ウェル播種し、４８時間、０．５％血清培地で培養した。オリゴフェクタミンを用いてデコイODN（６００ｎＭ）を細胞に導入後、さらに２４時間、０．５％血清培地で培養した。５％血清培地で２４時間刺激後、０．５％血清培地に交換し、２４時間後ＷＳＴ−１細胞数カウントキットで細胞数を計測した。
結果）キメラデコイを含めた全てのODNは、血管内皮細胞の増殖を抑制しなかった。（表２、図２参照）
【００２２】
【表２】
2006043722.tif 000033
【００２３】
3. 血管平滑筋細胞遊走アッセイ
継代数５〜６のVSMCを６穴ウェルプレートに５０％コンフルエントになるよう播種し、４８時間、無血清培地で培養した。オリゴフェクタミンを用いてデコイODN（６００ｎＭ）を細胞に導入後、さらに２４時間、無血清培地で培養した。２４ウェルマトリゲルインベイジョンチャンバー（Matrigel Invasion Chamber）の上部チャンバーにVSMCを２．５×１０４細胞播種し、下部チャンバーにＰＤＧＦ−ＢＢ（５０ｎｇ／ｍｌ）を入れ、４８時間細胞を刺激した後、ディフクイック（Diff Quik）染色を行い、遊走細胞数を計測した。
結果）キメラデコイ、NF-κBデコイ、E2Fデコイはスクランブルデコイに比べて、有意に細胞遊走を抑制した。その中でもキメラデコイは、最も活性が強かった。（表３、図３，４参照）
【００２４】
【表３】
2006043722.tif 000034
【００２５】
4. ウサギバイパスモデル実験
デコイODNを動脈壁に導入するのに最も適切な圧力を求めた。FITC-ODN（40μmol/L）を動脈吻合部へ任意の圧力で導入し、その導入効率を測定したところ、１５０ｍｍＨｇが最も適切であることが明らかとなった。（表４、図５）
【００２６】
【表４】
2006043722.tif 000035
【００２７】
高脂血症家兎の総頚動脈を剥離し、動脈内にカニュレーション後、１５０ｍｍＨｇの加圧でデコイＯＤＮ（40μmol/L）を動脈壁に導入した。導入部に２mm expanded polytetrafluoroethylene (ePTFE)グラフト（２cm）を置換し、バイパスモデルとした。４週間後にエラスチカ・ワンギーソン（Elastica Van Gieson; EVG）染色を行い、吻合部内膜肥厚を計測、評価した。
結果）キメラデコイはスクランブルデコイに比較して、優位に吻合部の内膜、中膜の肥厚を抑制した。キメラデコイは、吻合部が遠位（体の中心から遠い位置）にあっても、近位（体の中心に近い位置）にあっても、同様の抑制活性を示した。（表５、６、図６〜１１参照）
【００２８】
【表５】
2006043722.tif 000036
【００２９】
【表６】
2006043722.tif 000037
【００３０】
5. マクロファージおよびProliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA)の染色
4で用いたウサギバイパスモデルから摘出したグラフト吻合部の細胞中におけるマクロファージとPCNA陽性細胞の割合を調べた。ペルオキシダーゼ、アビジン―ビオチン複合体システムを用いて、免疫組織化学染色を行った。
5μm厚のパラフィン切片を脱パラフィンした後、再水和（rehydrate）した。３％過酸化水素を用いて内因性ペルオキシダーゼをブロックした。５％ウマ血清添加リン酸緩衝液（Phospate-buffered Saline, PBS）を用いて３０分間ブロッキングを行った。１：５０に希釈した一次抗体を切片に加え、４℃で一晩インキュベートした。マクロファージの検出にはRAM11抗体(DAKO, USA)、PCNAには抗PCNA抗体（Clone:PC10）(DAKO, USA)を用いた。切片をPBSで適宜洗浄しながら、ビオチン化抗マウスIgG (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)添加PBSを加えて３０分間インキュベートした後、アビジン―ビオチン化西洋わさびペルオキシダーゼ添加PBSを加えてさらに３０分間インキュベートした。これはVectastain Elits ABC kit（Vector Laboratories）を用い、キットに添付の方法に従った。免疫複合体は0.05% 3,3’-diaminobenzidine（DAB, Vector Laboratories）を用いて検出し、その後切片をヘマトキシリンでカウンター染色した。
結果）キメラデコイはスクランブルデコイに比べて、有意にマクロファージの浸潤を抑制した（表７、図１２参照）。また、キメラデコイは、スクランブルデコイに比べて、PCNA陽性細胞を減少させたことから、細胞増殖を抑制することも示された（表８、図１３参照）。
【００３１】
【表７】
2006043722.tif 000038
【００３２】
【表８】
2006043722.tif 000039
6. 統計解析データは全て平均値±標準誤差（SEM）で表した。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
複数の転写調節因子の阻害作用に基づく血管再狭窄、虚血性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ガンの転移または浸潤（ガンの転移・浸潤）あるいは悪液質の予防、改善、治療薬を提供する。
【００３４】
【図面の簡単な説明】
図１は、血管平滑筋細胞増殖アッセイの結果を表したグラフである。（図中、―PDGFは、ノーマル（PDGF刺激なし）を意味する。以下同じ。）
図２は、血管内皮細胞増殖アッセイの結果を表したグラフである。
図３は、血管平滑筋細胞遊走アッセイ後の細胞の顕微鏡写真である。（倍率×４００）
図４は、血管平滑筋細胞遊走アッセイの結果を表したグラフである。
図５は、ウサギ血管壁へのデコイODNの導入効率を比較したグラフである。
図６は、バイパス手術を施したウサギ血管の遠位吻合部の顕微鏡写真である（倍率×１００）。図の上部が血管内腔側である。矢印先部に人工血管吻合部を示す。コントロール、スクランブルデコイに比べて、キメラデコイが吻合部の肥厚を抑制していることが分かる。
図７は、バイパス手術を施したウサギ血管の遠位吻合部の内膜、中膜の厚さを表したグラフである。
図８は、バイパス手術を施したウサギ血管の遠位吻合部の内膜、中膜の厚さの比を表したグラフである。
図９は、バイパス手術を施したウサギ血管の近位吻合部の顕微鏡写真である（倍率×１００）。図の上部が血管内腔側である。矢印先部に人工血管吻合部を示す。コントロール、スクランブルデコイに比べて、キメラデコイが吻合部の肥厚を抑制していることが分かる。
図１０は、バイパス手術を施したウサギ血管の近位吻合部の内膜、中膜の厚さを表したグラフである。
図１１は、バイパス手術を施したウサギ血管の近位吻合部の内膜、中膜の厚さの比を表したグラフである。
図１２は、ウサギバイパスモデルから摘出したグラフト吻合部のマクロファージに対する免疫組織化学染色の顕微鏡写真（倍率×４００）および全細胞中におけるマクロファージの割合を表したグラフである。
図１３は、ウサギバイパスモデルから摘出したグラフト吻合部のProliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA)陽性細胞に対する免疫組織化学染色の顕微鏡写真（倍率×４００）および全細胞中におけるPCNA陽性細胞の割合を表したグラフである。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Anges MG, Inc
<120> Chimera (double) decoy
<130> 05093PCT
<160> 7
<210> 1                                         
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NF-κB, E2F Chimera decoy
<400> 1 
gaagggattt ccctccattt cccgcgga                     28
<210> 2
<211> 10                                     
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NF-κB consensus
<400> 2
gggrhtyyhc                                         10
<210> 3  
<211> 8                                     
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E2F consensus
<400> 3
tttsscgs                                            8
<210> 4  
<211> 6                                     
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GATA-3 consensus
<400> 4
wgatar                                              6
<210> 5  
<211> 8                                      
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: STAT-1 consensus
<400> 5
ttcnnnga                                            8
<210> 6  
<211> 10                                      
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> STAT-6 consensus
<400> 6
ttcnnnngaa                                         10
<210> 7  
<211> 5                                     
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ets consensus
<400> 7
mggaw                                               5
<210> 8  
<211> 7                                      
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AP-1 consensus
<400> 8
tgastma                                             7
<210> 9 
<211> 10                                     
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NF-κB binding sequence
<400> 9
gggatttccc                                         10
<210> 10
<211> 10                                     
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NF-κB binding sequence
<400> 10
gggactttcc                                         10
<210> 11 
<212> DNA
<211> 8                                     
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E2F binding sequence
<400> 11
tttcccgc                                            8
<210> 12 
<211> 6                                      
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GATA-3 binding sequence
<400> 12
agatag                                              6
<210> 13 
<211> 9                                     
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> STAT-1 binding sequence
<400> 13
ttccgggaa                                           9  
<210> 14  
<211> 10                                      
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> STAT-6 binding sequence
<400> 14
ttcccaagaa                                         10
<210> 15  
<211> 5                                      
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ets binding sequence
<400> 15
cggaa                                               5
<210> 16
<211> 7                                      
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AP-1binding sequence
<400> 16
tgagtca                                             7
<210> 17  
<211> 28                                      
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scrambled decoy
<400> 17
cgtacctgac ttagccattt cgagcgga                     28
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NF-κB decoy
<400> 18
ccttgaaggg atttccctcc                              20
<210> 19
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E2F decoy
<400> 19
ctagatttcc cgcg                                    14
<210> 20
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E2F decoy  (complementary strand of SEQ#19)
<400> 20
gatccgcggg aaat                                    14
【国際調査報告】
2006043722.tif 000040
2006043722.tif 000041
2006043722.tif 000042
2006043722.tif 000043
2006043722.tif 000044