(57)【要約】本発明は、２種以上の基質同士の付加反応を触媒して脂溶性の反応生成物を生じる酵素反応の活性測定法であって、いずれか一つの基質を標識する標識工程と、酵素、全ての基質及びアクセプターの存在下で酵素反応をさせる反応工程と、アクセプターを介して標識分子と被検出分子を近接させ、該標識分子により生じるエネルギーを被検出分子に転移させることにより反応生成物を検出する検出工程と、を含むことを特徴とする活性測定方法及び当該活性測定方法を利用した化合物の評価方法を提供する。本発明の方法により、酵素反応から酵素活性の測定までを単純な工程で処理することが可能であり、ＨＴＳの評価系に適応可能な酵素活性の測定方法を提供することが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２種以上の基質同士の付加反応を触媒して脂溶性の反応生成物を生じる酵素反応の活性測定法であって、
いずれか一つの基質を標識する標識工程と、
酵素、全ての基質及びアクセプターの存在下で酵素反応をさせる反応工程と、
アクセプターを介して標識分子と被検出分子を近接させ、該標識分子により生じるエネルギーを被検出分子に転移させることにより反応生成物を検出する検出工程と、
を含むことを特徴とする活性測定方法。
【請求項２】
２種以上の基質同士の付加反応を触媒して脂溶性の反応生成物を生じる酵素反応の活性測定法であって、
いずれか一つの基質を標識する標識工程と、
酵素及び全ての基質の存在下で酵素反応をさせる反応工程と、
該酵素反応溶液に、反応生成物に結合するアクセプターを混合する混合工程と、
アクセプターを介して標識分子と被検出分子を近接させ、該標識分子より生じるエネルギーを被検出分子に転移させることにより反応生成物を検出する検出工程と、
を含むことを特徴とする活性測定方法。
【請求項３】
前記酵素がＬＣＥ（Ｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｅｌｏｎｇａｓｅ）であることを特徴とする請求項１又は２に記載の活性測定方法。
【請求項４】
前記アクセプターが反応生成物に特異的に結合する物質であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の活性測定方法。
【請求項５】
前記検出工程における検出手段がＳＰＡであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の活性測定方法。
【請求項６】
２種以上の基質同士の付加反応を触媒する酵素に作用する化合物の評価方法であって、
いずれか一つの基質を標識する標識工程と、
酵素、全ての基質、アクセプター及び被検化合物の存在下で酵素反応をさせる反応工程と、
アクセプターを介して標識分子と被検出分子を近接させ、該標識分子より生じるエネルギーを被検出分子に転移させることにより反応生成物を検出する検出工程と、
を含むことを特徴とする化合物の評価方法。
【請求項７】
２種以上の基質同士の付加反応を触媒する酵素に作用する化合物の評価方法であって、
いずれか一つの基質を標識する標識工程と、
酵素、全ての基質及び被検化合物の存在下で酵素反応をさせる反応工程と、
該酵素反応溶液に、反応生成物に結合するアクセプターを混合する混合工程と、
アクセプターを介して標識分子と被検出分子を近接させ、該標識分子より生じるエネルギーを被検出分子に転移させることにより反応生成物を検出する検出工程と、
を含むことを特徴とする化合物の評価方法。
【請求項８】
前記酵素がＬＣＥ（Ｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｅｌｏｎｇａｓｅ）であることを特徴とする請求項６又は７に記載の化合物の評価方法。
【請求項９】
前記アクセプターが反応生成物に特異的に結合する物質であることを特徴とする請求項６〜８のいずれか一項に記載の化合物の評価方法。
【請求項１０】
前記検出工程における検出手段がＳＰＡであることを特徴とする請求項６〜９のいずれか一項に記載の化合物の評価方法。
【請求項１１】
脂溶性の反応生成物を触媒する酵素、該酵素の基質及びアクセプターを含むことを特徴とする酵素活性測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂溶性の反応生成物を生じる酵素反応の活性測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬は、創薬標的となる生体内分子の性質に基づいた生化学的、細胞生物学的な評価系（例えば、酵素アッセイ系、結合アッセイ系）を用いて候補となる多くの化合物を評価することによりスクリーニングされる。一つの開発候補化合物が選択される確率は、数万化合物に一つと言われており、スクリーニングのスピードを向上させることにより大量の開発候補化合物を検討することが効率的な医薬の開発には必須である。
このような状況の下、スクリーニングを極めて効率化したＨＴＳ（Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈ−ｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）と呼ばれる評価系を構築し、短期間で数万〜数十万種の化合物の評価を行い、開発候補化合物を選択することが行われている。
しかし、ＨＴＳに適用する生化学的、細胞生物学的な評価系の構築は評価者が行う必要があり、かかる評価系の完成度が効率的且つ有効なスクリーニングに大きな影響を及ぼすと言える。
一方、ある種の酵素を創薬標的とした場合に、酵素の反応生成物が脂溶性の物質である場合がある。反応生成物が脂溶性物質の場合、その定量や定性分析を行う際に、有機溶媒を用いて抽出した後、ＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、ＧＣ（ｇａｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＴＬＣ（ｔｈｉｎ  ｌａｙｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）等を組み合わせて分析する必要があった。
例えば、特開２００３−２１２７９０号公報には、神経変性疾患の予防及び治療に有効な成分としてヤマブシタケ由来の脂溶性成分を抽出する際に、アセトン及びクロロホルムで抽出した後、シリカゲルカラムにかけて画分を得る方法が記載されている。
【特許文献１】特開２００３−２１２７９０号公報
【０００３】
しかしながら、従来の方法では、脂溶性物質の抽出の際に有機溶媒による抽出工程を経る必要があり、酵素反応から酵素活性の測定まで多段階の工程が必要となることから、多大な労力や時間を費やすばかりでなく、マイクロプレート中で一連の反応、反応生成物の処理、測定を行うＨＴＳの評価系には使用できないという問題があった。
【発明の開示】
【０００４】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、酵素反応から酵素活性の測定までを単純な工程で処理することが可能であり、ＨＴＳの評価系に適応可能な酵素活性の測定方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、酵素反応によって生じた脂溶性物質に結合する物質（アクセプター）を酵素反応溶液に混合し、かかるアクセプターを介して反応生成物の検出を行うことにより、反応生成物の抽出を行うことなく酵素活性の測定が可能となる方法を見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明の活性測定方法は、２種以上の基質同士の付加反応を触媒して脂溶性の反応生成物を生じる酵素反応の活性測定法であって、いずれか一つの基質を標識する標識工程と、酵素、全ての基質及びアクセプターの存在下で酵素反応をさせる反応工程と、アクセプターを介して標識分子と被検出分子を近接させ、当該標識分子より生じるエネルギーを被検出分子に転移させることにより反応生成物を検出する検出工程と、を含むことを特徴とする。
また、本発明の活性測定方法は、２種以上の基質同士の付加反応を触媒して脂溶性の反応生成物を生じる酵素反応の活性測定法であって、いずれか一つの基質を標識する標識工程と、酵素及び全ての基質の存在下で酵素反応をさせる反応工程と、当該酵素反応溶液に、反応生成物に結合するアクセプターを混合する混合工程と、アクセプターを介して標識分子と被検出分子を近接させ、当該標識分子より生じるエネルギーを被検出分子に転移させることにより反応生成物を検出する検出工程と、を含むことを特徴とする。
ここで、本発明の活性測定方法において、前記アクセプターが反応生成物に特異的に結合する物質であることが好ましい。かかるアクセプターを使用することにより、より精度の高い酵素活性の測定が可能となる。
また、本発明の化合物の評価方法は、２種以上の基質同士の付加反応を触媒する酵素に作用する化合物の評価方法であって、いずれか一つの基質を標識する標識工程と、酵素、全ての基質、アクセプター及び被検化合物の存在下で酵素反応をさせる反応工程と、アクセプターを介して標識分子と被検出分子を近接させ、当該標識分子より生じるエネルギーを被検出分子に転移させることにより反応生成物を検出する検出工程と、を含むことを特徴とする。
さらに、本発明の化合物の評価方法は、２種以上の基質同士の付加反応を触媒する酵素に作用する化合物の評価方法であって、いずれか一つの基質を標識する標識工程と、酵素、全ての基質及び被検化合物の存在下で酵素反応をさせる反応工程と、当該酵素反応溶液に、反応生成物に結合するアクセプターを混合する混合工程と、アクセプターを介して標識分子と被検出分子を近接させ、当該標識分子より生じるエネルギーを被検出分子に転移させることにより反応生成物を検出する検出工程と、を含むことを特徴とする。
ここで、本発明の化合物の評価方法においては、前記アクセプターが反応生成物に特異的に結合する物質であることが好ましい。かかるアクセプターを使用することにより、より精度の高い酵素活性の測定が可能となり、結果的に、より精度の高い化合物の評価が可能となる。
また、本発明の酵素活性測定キットは、脂溶性の反応生成物を触媒する酵素、該酵素の基質及びアクセプターを含むことを特徴とする。かかるキットを使用することにより、脂溶性物質を生じる酵素反応の活性測定が簡便に実施できるようになり、また、このような酵素反応を標的とする化合物の評価、スクリーニング等が簡便に実施できることとなる。
酵素反応から酵素活性の測定までを単純な工程で処理でき、ＨＴＳの評価系に適応可能な酵素活性の測定方法を提供することが可能となる。また、本発明の活性測定方法を利用することにより、酵素に作用する化合物の評価（化合物の活性測定やスクリーニング等）が可能となる
【図面の簡単な説明】
【０００５】
図１は、本発明の方法によりＬＣＥの酵素活性を測定した結果を示す図である。
図２は、本発明の方法によりｈＥｌｏｖｌ３の酵素活性を測定した結果を示す図である。
図３は、本発明の方法によりｈＥｌｏｖｌ１の酵素活性を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
先ず、本発明において使用する語句について説明する。
本発明に係る「酵素」は、酵素反応の生成物として脂溶性物質を生じる反応を触媒する酵素であれば特に制限はないが、例えば、ＬＣＥ（アクセッションナンバー：ＡＫ０２７０３１）、ＦＡＳ（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）（同：ＢＣ０６３２４２）、Ｅｌｏｖｌ１（同：ＢＣ０００６１８、ＮＭ＿０２２８２１）、Ｅｌｏｖｌ２（同：ＢＣ０６０８０９）、Ｅｌｏｖｌ３（同：ＢＣ０３４３４４）、Ｅｌｏｖｌ４（同：ＡＹ０３７２９８）、Ｅｌｏｖｌ５（同：ＡＦ３３８２４１）等の脂肪酸伸長酵素（Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｅｌｏｎｇａｓｅ）、Ａｃｙｌ−ＣｏＡ合成酵素、ＧＰＡＴ（同：ＡＬ８３３０６１）、ＤＧＡＴ１（同：ＡＦ０５９２０２）又はＭＧＡＴ（同：ＡＦ３８４１６３）、ＡＣＡＴ（同：Ｌ２１９３４）、ＬＣＡＴ（同：ＮＭ＿０００２２９）を挙げることができる。
また、本発明に係る酵素としては、上記に挙げたもの以外にも、例えば、種々の膜タンパク質や各種リン脂質又は中性脂質合成・代謝酵素も本発明に係る酵素として挙げられる。このような酵素としては、具体的には、例えば、アシルトランスフェラーゼ、アセチルハイドロレース、リパーゼ、グリセロールキナーゼ（アクセッションナンバー：ＮＭ＿０３３２１４）、コリンホスホトランスフェラーゼ（同：ＮＭ＿２０２２４４）が挙げられる。また、各種コレステロール合成又は代謝酵素等の膜タンパク質も本発明に係る酵素に含まれる。
また、本発明に係る「基質」は、前記酵素の基質であれば特に制限はないが、当該酵素は２種の基質の付加反応を触媒するため、例えば、酵素がＬＣＥの場合では、長鎖脂肪酸（例えば、パルミトイルＣｏＡ）と、当該長鎖脂肪酸に付加してより長鎖の脂肪酸を生成する基質（例えば、マロニルＣｏＡ）の２種の基質が挙げられる。また、他の酵素の場合であれば、例えば、ＦＡＳの基質である短鎖又は中鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡ及びマロニルＣｏＡ、Ｅｌｏｖｌｓの基質である飽和超長鎖脂肪酸アシルＣｏＡ又は不飽和脂肪酸アシルＣｏＡ、アシルＣｏＡ合成酵素の基質である短鎖又は長鎖脂肪酸及び活性化ＣｏＡ、ＧＰＡＴの基質である中鎖又は長鎖脂肪酸アシルＣｏＡ及びグリセロール３リン酸及、リン脂質合成酵素の基質である中鎖又は長鎖脂肪酸アシルＣｏＡ及びグリセロール３リン酸、リゾリン脂質、ＤＧＡＴの基質である中鎖又は長鎖脂肪酸アシルＣｏＡ及びジアシルグリセロール、又はＭＧＡＴの基質である中鎖又は長鎖脂肪酸アシルＣｏＡ及びモノアシルグリセロールを挙げることができる。さらに、酵素がグリセロールキナーゼの場合には、グリセロール及びＡＴＰが基質となり、また、コリンホスホトランスフェラーゼの場合には、ジアシルグリセロール及びＣＤＰコリンが基質となる。
ここで、本発明に係る「基質」のいずれか一方は、検出工程で検出可能に修飾されている必要がある。かかる修飾の態様としては特に制限はなく、検出方法によって好適な態様に修飾すればよいが、例えば、ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）であれば蛍光色素標識、ＳＰＡ（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ）であればラジオアイソトープ標識を挙げることができる。
また、本発明に係る「脂溶性の反応生成物」は、前記の酵素の酵素反応により生じた脂溶性物質であれば特に制限はないが、例えば、ＬＣＥの酵素反応によって生じるアシルＣｏＡ（Ａｃｙｌ−ＣｏＡ）、ＦＡＳの酵素反応によって生じる中鎖又は長鎖脂肪酸及び中鎖又は長鎖脂肪酸及アシルＣｏＡ、Ｅｌｏｖｌｓの酵素反応によって生じる飽和超長鎖、長鎖脂肪酸又は不飽和脂肪酸及び飽和超長鎖、長鎖脂肪酸又は不飽和脂肪酸アシルＣｏＡ、Ａｃｙｌ−ＣｏＡ合成酵素の酵素反応によって生じるＡｃｙｌ−ＣｏＡ、ＧＰＡＴの酵素反応によって生じるＬｙｓｏ  ＰＡ、リン脂質合成酵素の酵素反応によって生じるリン脂質、ＤＧＡＴの酵素反応によって生じるトリアシルグリセロール、ＭＧＡＴの酵素反応によって生じるジアシルグリセロールを挙げることができる。さらに、酵素がグリセロールキナーゼの場合には、グリセロール３リン酸及びＡＤＰが反応生成物となり、また、コリンホスホトランスフェラーゼの場合には、ホスファチジルコリンが基質となる。
また、本発明に係る「アクセプター」は、前記の「酵素反応により生じた脂溶性物質」に結合する物質であれば特に制限はないが、例えば、当該脂溶性物質に対する抗体、当該脂溶性物質に対して親和性を有する膜存在型受容体、核内受容体、脂質輸送タンパク質などを挙げることができる。さらに、本発明に係るアクセプターは、脂溶性物質に特異的に結合する物質であることが好ましい。具体的には、例えば、ＬＣＥの酵素反応産物であるアシルＣｏＡに対するＡＣＢＰ（Ａｃｙｌ−ＣｏＡ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＰＡＴの酵素反応産物であるＬｙｓｏ−ＰＡに対するＬｙｓｏ  ＰＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＰＬ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅの酵素反応産物であるｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄに対するｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎが挙げられる。また、コリンホスホトランスフェラーゼの場合には、ホスファチジルコリン輸送タンパク質がアクセプターとなる。かかる特異的な結合をするアクセプターを使用することにより、非特異的結合によるノイズを検出することなく、正確な酵素活性の測定を行うことが可能となる。
（活性測定方法）
次に、本発明の活性測定方法について説明する。
本発明の活性測定方法は、２種以上の基質同士の付加反応を触媒して脂溶性の反応生成物を生じる酵素反応の活性測定法であって、いずれか一つの基質を標識する標識工程と、酵素、全ての基質及びアクセプターの存在下で酵素反応をさせる反応工程と、アクセプターを介して標識分子と被検出分子を近接させ、当該標識分子により生じるエネルギーを被検出分子に転移させることにより反応生成物を検出する検出工程と、を含むことを特徴とする。
以下、本発明の活性測定方法の手順について説明する。
本発明の活性測定方法においては、まず、基質を後の検出工程で検出できるよう標識する。標識の態様は、検出方法に応じて適宜選択すればよく、例えば、ラジオアイソトープ、蛍光色素による標識を挙げることができる。標識の方法としても特に制限はなく、公知の方法によって実施すればよい（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４３巻、２４８４頁、２００４年参照）。
また、標識する基質は、２種類以上基質がある場合でもそのうちいずれか一つのみでよい。
こうして標識した基質は、次の反応工程において酵素、標識されていない残りの基質を共存させることにより、酵素反応を進行させる。また、この反応溶液にアクセプターを共存させて反応させてもよい。酵素反応の条件は、使用する酵素の至適温度、至適ｐＨ等を考慮して適宜設定すればよく、例えば、生体と近似した条件である３５〜４０℃、ｐＨ６．５〜７．５が好適な条件として使用可能である。また、反応時の緩衝液も使用する酵素によって適宜好適なものを使用すればよく、例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液を使用することができる。また、これらの緩衝液は塩濃度等の種々の条件を適宜調整して使用してもよい。
反応工程を経た酵素反応溶液は、次に、混合工程へ進む。混合工程は、２種以上の基質及び酵素のみの存在下で酵素反応を行った場合に、酵素反応に次いでアクセプターを添加、混合する工程であり、反応工程において酵素反応溶液にアクセプターを共存させて酵素反応を行った場合には本工程は不要である。酵素反応により脂溶性の反応生成物が生じる。ここで、添加及び混合の方法は特に制限されず、例えば、アクセプターを含む溶液を準備し、酵素反応溶液に添加し、攪拌、混合すればよい。また、混合条件についても特に制限はなく、反応生成物と、それに結合する物質との結合に好適な条件を適宜選択することができる。これにより、反応生成物に結合し、反応生成物−アクセプター複合体が生じる。
また、上述したように、反応工程において、酵素及び当該酵素の基質を含む酵素反応溶液にアクセプターをも共存させた状態で反応を行ってもよい。この場合、溶液中で酵素反応が終了した反応生成物にアクセプターが順次結合する。従って、混合工程を経ることなく検出工程に進むことが可能となる。
混合工程で生じた複合体には検出可能なかたちで基質由来の標識が含まれる。従って、次の検出工程においては、かかる標識を検出することにより、反応生成物の存在を確認することとなる。反応生成物は、基質由来の蛍光色素、ラジオアイソトープ等で標識されているため、検出工程においては、標識の種類に応じて適宜好適な検出方法を採ることができる。具体的には、例えば、標識が蛍光色素の場合、蛍光を検出する媒体や装置（例えば、ＦＲＥＴシステ厶、トップカウント）により検出することができる。また、標識がラジオアイソトープの場合、ラジオアイソトープを検出する媒体や装置（例えば、ＳＰＡシステム、シンチレーションカウンタ、ＣＣＤカメラ）により検出することができる。
また、別途合成又は精製して準備した各種標準酵素生成物、具体的には、例えば、蛍光色素、ラジオアイソトープ等で標識された各種標準酵素生成物及び各種アクセプターを用いて検量線を作成することにより、上述のアッセイにおいて検出された値よりアッセイ系に含まれる酵素活性を定量することが可能である。
以上説明したような本発明の活性測定方法によれば、酵素反応によって生じた脂溶性の反応生成物を有機溶媒等で抽出する工程を経ることなく酵素活性を測定することができる。有機溶媒による抽出には、混合、攪拌、抽出の多工程が必要であることから、このような工程を経ることなく反応生成物の抽出を行うことにより、非常に簡易な工程で迅速な抽出が可能となり、結果として、短時間で多くの被検物質の活性測定や評価を行うことが可能となる。また、有機溶媒による抽出には環境や人体に有害な溶媒を使用することが多く、廃液の処理にも手間と費用がかかることから、有機溶媒を使用することなく活性測定を行うことができるメリットは非常に大きい。
（化合物の評価方法）
次に、本発明の化合物の評価方法について説明する。
本発明の化合物の評価方法は、２種以上の基質同士の付加反応を触媒する酵素に作用する化合物の評価方法であって、いずれか一つの基質を標識する標識工程と、酵素、全ての基質、アクセプター及び被検化合物の存在下で酵素反応をさせる反応工程と、アクセプターを介して標識分子と被検出分子を近接させ、該標識分子より生じるエネルギーを被検出分子に転移させることにより反応生成物を検出する検出工程と、を含むことを特徴とする。
ここで、本発明に係る「被検化合物」とは、本発明に係る「酵素」を標的とする化合物であればその種類は特に制限されない。ここで、酵素を標的とする化合物としては、例えば、酵素のアゴニスト、アンタゴニスト又はインバースアゴニストが挙げられる。また、酵素と被検化合物との結合態様も特に制限はなく、例えば、阻害反応の場合では競争阻害であってもよく、非競争阻害であってもよい。
本発明の化合物の評価方法は、前述した本発明の活性測定方法の反応工程においてさらに被検化合物を共存させ、その状態で酵素反応を進行させることにより実施する。こうすることにより、被検化合物が酵素になんらかの作用を及ぼしめ、その結果、酵素反応を阻害又は促進することによって生じる酵素反応の活性の変化を検出工程にて検出することにより、当該被検化合物の評価をすることができる。
以下、本発明の化合物の評価方法の手順について説明する。
本発明の化合物の評価方法においては、まず、基質を後の検出工程で検出できるよう標識する。標識の態様は、検出方法に応じて適宜選択すればよく、例えば、ラジオアイソトープ、蛍光色素による標識を挙げることができる。標識の方法としても特に制限はなく、公知の方法によって実施すればよい（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４３巻、２４８４頁、２００４年参照）。
また、標識する基質は、２種以上ある基質のうちいずれか一つのみでよい。
こうして標識した基質は、次の反応工程において酵素、標識されていない基質及び被検化合物と共存させることにより、酵素反応を進行させる。また、この反応溶液にアクセプターを共存させて反応させてもよい。当該酵素反応の条件は、使用する酵素の至適温度、至適ｐＨ等を考慮して適宜設定すればよく、例えば、生体と近似した条件である３５〜４０℃、ｐＨ６．５〜７．５が好適な条件として使用できる。また、反応時の緩衝液も使用する酵素によって適宜好適なものを使用すればよく、例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液を使用することができる。また、これらの緩衝液は塩濃度等を適宜調整して使用してもよい。
反応工程を経た酵素反応溶液は、次に、混合工程へ進む。混合工程は、２種類以上の基質及び酵素のみの存在下で酵素反応を行った場合に、酵素反応に次いでアクセプターを添加、混合する工程であり、反応工程において酵素反応溶液にアクセプターを共存させて酵素反応を行った場合には本工程は不要である。酵素反応により脂溶性の反応生成物が生じる。ここで、添加及び混合の方法は特に制限されず、例えば、アクセプターを含む溶液を準備し、酵素反応溶液に添加し、攪拌、混合すればよい。また、混合条件についても特に制限はなく、反応生成物と、それに結合する物質との結合に好適な条件を適宜選択することができる。これにより、反応生成物にアクセプターが結合し、複合体が生じる。
また、反応工程において、被検化合物、酵素及び当該酵素の基質を含む酵素反応溶液にアクセプターをも共存させた状態で反応を行ってもよい。この場合、溶液中で酵素反応が終了した反応生成物にアクセプターが順次結合する。従って、混合工程を経ることなく検出工程に進むことが可能となる。
混合工程で生じた複合体には検出可能なかたちで基質由来の標識が含まれる。従って、次の検出工程においては、かかる標識を検出することにより、反応生成物の存在を確認することとなる。反応生成物は、基質由来の蛍光色素、ラジオアイソトープ等で標識されているため、検出工程においては、標識の種類に応じて適宜好適な検出方法を採ることができる。具体的には、例えば、標識が蛍光色素の場合、蛍光を検出する媒体や装置（例えば、ＦＲＥＴシステム、トップカウント）により検出することができる。また、標識がラジオアイソトープの場合、ラジオアイソトープを検出する媒体や装置（例えば、ＳＰＡシステム、シンチレーションカウンタ、ＣＣＤカメラ）により検出することができる。
また、別途合成又は精製して準備した各種標準酵素生成物、具体的には、例えば、蛍光色素、ラジオアイソトープ等で標識された各種標準酵素生成物及び各種アクセプターを用いて検量線を作成することにより、上述のアッセイにおいて検出された値よりアッセイ系に含まれる酵素活性を定量することが可能である。
被検化合物の評価の具体例としては、例えば、酵素としてＬＣＥを用いて複数種の被検化合物の評価を行った際に、ある被検化合物の存在下ではＬＣＥの酵素活性が抑制され、結果的に酵素反応によって生じた脂溶性物質（例えばＡｃｙｌ−ＣｏＡ）の産生量が対照区（被検化合物を共存させていない状態）と比較して減少している場合には、当該被検化合物はＬＣＥの阻害剤として機能すると認められる。ＬＣＥは脂肪酸の炭素鎖を伸長して脂肪酸合成を促進する機能を有するため、これを阻害することにより脂肪酸の合成が抑制され、結果的に脂肪の合成を抑制することになる。すなわち、前記被検化合物は抗肥満の効果を呈する化合物と考えることができる。
以上説明したような本発明の化合物の評価方法によれば、酵素反応によって生じた脂溶性の反応生成物を有機溶媒等で抽出する工程を経ることなく酵素活性を測定することができることから、酵素に作用して反応の促進・阻害といった影響を及ぼす被検化合物の評価を行うことが可能となる。有機溶媒による抽出には、混合、攪拌、抽出の多工程が必要であることから、このような工程を経ることなく反応生成物の抽出を行うことにより、非常に簡易な工程で迅速な抽出が可能となり、結果として、短時間で多くの被検化合物の活性測定や評価を行うことが可能となる。
また、有機溶媒の抽出には環境や人体に有害な溶媒を使用することが多く、廃液の処理にも手間と費用がかかることから、有機溶媒を使用することなく活性測定を行うことができる本発明の化合物の評価方法のメリットは非常に大きい。
【実施例】
【０００７】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１
（Ｎ末端にＨｉｓ（ヒスチジン）タグが付加したヒト長鎖脂肪酸コエンザイムＡ結合タンパク質の調製）
ヒトＡＣＢＰタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  ａｃｔａ、１４４１巻、１５０頁、１９９９年）を、ヒト肝臓ｍＲＮＡ（クロンテック社製）を鋳型にしてＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。
次に、増幅産物をヒスチジンタグ付加発現ベクターｐＥＴ−１４ｂ（ノバジェン社製）にクローニングし、Ｎ末端にヒスチジンタグが付加したヒト長鎖脂肪酸コエンザイムＡ結合タンパク（以下、Ｎ−Ｔａｇ−ｈＡＣＢＰと呼ぶ）を発現する発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを塩化カルシウム法によって宿主大腸菌に導入し、形質転換体を得た。
得られたトランスフォーマントをイソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトシドを添加した培地で培養することによりＮ−Ｔａｇ−ｈＡＣＢＰの発現を誘導し、菌体の細胞質画分よりＨｉｓ−Ｂｉｎｄ  Ｋｉｔｓ（ノバジェン社製）を用いてＮ−Ｔａｇ−ｈＡＣＢＰの精製を行った。精製したＮ−Ｔａｇ−ｈＡＣＢＰを以下の実験に用いた。
（ｈＬＣＥ（ヒトＬｏｎｇ  ｃｈａｉｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｙｌ  ｅｌｏｎｇａｓｅ）の調製）
ｈＬＣＥをコードするｃＤＮＡ配列（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７６巻、４５３５８頁、２００１年：アクセッションナンバー  ＡＫ０２７０３１）をヒト肝臓ｍＲＮＡ（クロンテック社製）を用いたＲＴ−ＰＣＲにより増幅した後、発現ベクターｐＰＩＣＺα（インビトロジェン社製）にクローニングした。
得られた発現ベクターを宿主酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｒｉｓ（インビトロジェン社製）にエレクトロポレーション法によって形質転換し、形質転換酵母から定法によりマイクロソーム標品を得た。
（Ｎ−Ｔａｇ−ｈＡＣＢＰを用いたＬＣＥ活性測定法）
上記酵母マイクロソーム標品、１μＭ  ロテノン（シグマ社製）、１ｍＭ  ＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、シグマ社製）、２０μＭ  脂肪酸未含有ウシ血清アルブミン（シグマ社製）、４０μＭ  長鎖脂肪酸コエンザイ厶Ａ（シグマ社製）及び５０，０００ｄｐｍの６０μＭ  マロニルコエンザイムＡ（シグマ社製、室町薬品化学社）を含むアッセイ緩衝液（１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１００ｍＭ  トリス緩衝液、ｐＨ６．５）を、９６ウェルオプティプレート（パッカード社）中で３７℃、２時間インキュベーションした後、０．２５％  オクチル  β−グルコシドを加え反応を止めた。
次に、２μｇ  Ｎ末端にＨｉｓ  ｔａｇが付加したヒトアシルコエンザイムＡ結合タンパク及び５００μｇ  ＳＰＡ樹脂（ＰＶＴ  Ｃｏｐｐｅｒ  Ｈｉｓ−Ｔａｇ  ＳＰＡ  Ｂｅａｄｓ、アマシャム社製）を加え、３７℃、３０分間インキュベーションした。
インキュベーション後の溶液を３，０００ｒｐｍで遠心後、トップカウント（パッカード社）にて活性を求めた。ここで、特異的活性を評価する為にｈＬＣＥをクローニングしていない発現ベクターをエレクトロポレーション法により宿主酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｒｉｓに導入し形質転換酵母を得た。得られた形質転換酵母から定法に従ってマイクロソーム標品を得、Ｎ−Ｔａｇ−ｈＡＣＢＰが導入された形質転換酵母由来のマイクロソーム標品の活性と比較した。
図１に示すとおり、パルミトイルコエンザイムＡを基質とし、Ｎ−Ｔａｇ−ｈＡＣＢＰミクロソーム標品を反応に加えた場合にのみ特異的なシグナルの増強が観察され、非基質であるステアリルコエンザイムＡを基質とした場合、又は、ｈＬＣＥ非発現株より調製したミクロソーム標品を酵素として用いた場合はシグナルの増強は観察されなかった。図１中、ｒＨｕＬＣＥは組換えヒトＬＣＥを表し、Ｍｏｃｋはコントロールを表す。
以上より、本発明の方法により、ｈＬＣＥ特異的活性が測定できたことが確認できた。
実施例２及び３
（ｈＥｌｏｖｌ３（ヒトＥｌｏｎｇａｓｅ  ｏｆ  ｖｅｒｙ  ｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎ  Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ−ｌｉｋｅ３）の調製方法）
実施例１に記載のＬＣＥの活性測定法と同様に、ｈＥｌｏｖｌ３の活性測定を試みた。
先ず、ｈＥｌｏｖｌ３をコードするｃＤＮＡ配列（アクセッションナンバー：ＢＣ０３４３４４）をヒト肝臓ｍＲＮＡ（クロンテック社製）よりＲＴ−ＰＣＲにより増幅した後、発現ベクターｐＣＭＶ−Ｔａｇ２Ｂ（ストラタジーン社製）にクローニングした。得られた発現ベクターを宿主カチオン性脂質法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８４巻、７４１３頁、１９８７年）を用いて宿主細胞ＨＥＫ２９３にトランスフェクトし、発現細胞から定法によりマイクロソーム標品を得た。
（ｈＥｌｏｖｌ１（ヒトＥｌｏｎｇａｓｅ  ｏｆ  ｖｅｒｙ  ｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎ  Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ−ｌｉｋｅ  １）の調製方法）
ｈＥｌｏｖｌ３をコードするｃＤＮＡ配列（アクセッションナンバー  ＮＭ＿０２２８２１）をヒト肝臓ｍＲＮＡ（クロンテック社製）よりＲＴ−ＰＣＲにより増幅した後、発現ベクターｐＣＭＶ−Ｔａｇ２Ｂ（ストラタジーン社製）にクローニングした。得られた発現ベクターを宿主カチオン性脂質法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８４巻、７４１３頁、１９８７年）を用いて宿主細胞ＨＥＫ２９３にトランスフェクトし、発現細胞から定法によりマイクロソーム標品を得た。
（Ｎ−Ｔａｇ−ｈＡＣＢＰを用いたＥｌｏｖｌ３（実施例２）及びｈＥｌｏｖｌ１（実施例３）の活性測定）
上記調製方法によって得られたｈＥｌｏｖｌ３又はｈＥｌｏｖｌ１細胞マイクロソーム標品、１μＭ  ロテノン（シグマ社製）、１ｍＭ  ＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、シグマ社製）、２０μＭ  脂肪酸未含有ウシ血清アルブミン（シグマ社製）、４０μＭ  長鎖脂肪酸コエンザイムＡ（シグマ社製、アバンティ社製）、５０，０００ｄｐｍの６０μＭ  マロニルコエンザイムＡ（シグマ社製、室町薬品化学社）をアッセイ緩衝液（１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１００ｍＭ  トリス緩衝液、ｐＨ６．５）中で９６ウェルオプティプレート（パッカード社製）において、３７℃、２時間インキュベーションした後、０．２５％  オクチル  β−グルコシドを加え反応を止めた。
次に、反応液に２μｇ  Ｎ末端ヒスタグ付加ヒトアシルコエンザイムＡ結合タンパク、５００μｇ  ＳＰＡ樹脂（ＰＶＴ  Ｃｏｐｐｅｒ  Ｈｉｓ−Ｔａｇ  ＳＰＡ  Ｂｅａｄｓ、アマシャム社製）を加え、３７℃、３０分間インキュベーションし、３，０００ｒｐｍで遠心後、トップカウント（パッカード社）にて活性を求めた。
特異的活性を評価する為に各酵素をクローニングしていない発現ベクターを宿主細胞ＨＥＫ２９３に宿主カチオン性脂質法によってトランスフェクトし、発現細胞から定法により得たマイクロソーム標品と比較した。
その結果、ｈＥｌｏｖｌ３の場合、基質としてステアロイルコエンザイムＡを、アクセプターとしてＮ−Ｔａｇ−ｈＡＣＢＰ（ミクロソーム標品として反応液に添加）を用いた場合にのみ特異的なシグナルの増強が観察された（図２）。また、ｈＥｌｏｖｌ１の場合、基質としてアラキドイルコエンザイムＡを、アクセプターとしてＮ−Ｔａｇ−ｈＡＣＢＰ（ミクロソーム標品として反応液に添加）を用いた場合にのみ特異的なシグナルの増強が観察された（図３）。一方、ｈＥｌｏｖｌ３及びｈＥｌｏｖｌ１のいずれについても、非基質であるリグノセロイルコエンザイムＡを基質として用いた場合、又は、ｈＥｌｏｖｌ３又はｈＥｌｏｖｌ１非発現細胞より調製したミクロソームを酵素として用いた場合はシグナルの増強は観察されなかった。これらの結果より、本発明の酵素活性測定方法により、ｈＥｌｏｖｌ３及びｈＥｌｏｖｌ１特異的活性を測定できることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０００８】
酵素反応から酵素活性の測定までを単純な工程で処理でき、ＨＴＳの評価系に適応可能な酵素活性の測定方法を提供することが可能となる。その結果、被検化合物の評価を簡易・迅速に実施できることとなる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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