(57)【要約】がんに対する新しい診断および治療を提供する。がん遺伝子ｍｙｃタンパク質の標的タンパク質Ｍｉｍｉｔｉｎ、その変異体およびそれらの断片、ならびにそれらをコードするポリヌクレオチド分子を提供する。本発明のＭｉｍｉｔｉｎタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子とＭｙｃとの結合による生物作用に対する阻害物質は、がんの診断、予防または治療に有用な手段を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、または配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸配列に１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加の中から選ばれる少なくとも１つを含む配列を有しかつ該タンパク質における細胞増殖活性と実質的に同じ程度の活性を有する該タンパク質の変異体、またはそれらの断片。
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質またはその変異体に対する抗体。
【請求項３】
請求項１記載のタンパク質またはその変異体をコードするポリヌクレオチド分子。
【請求項４】
ＤＮＡ分子である請求項３記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項５】
ヒトクロモソーム５ｑ１２付近に存在し、ｃ−Ｍｙｃタンパク質が結合することにより転写上昇する遺伝子に相当する、請求項３記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項６】
配列番号２における１２８位から６３４位、または配列番号４に示す塩基配列を有する請求項３から５までのいずれか記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項７】
配列番号２に示す塩基配列を有し、細胞増殖活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子。
【請求項８】
配列番号４に示す塩基配列を有するポリヌクレオチド分子。
【請求項９】
請求項３から８までのいずれか記載のポリヌクレオチド分子を含有するベクター。
【請求項１０】
請求項９記載のベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
【請求項１１】
請求項１０記載の形質転換体を培養し、産生されたタンパク質を培養物から回収することを特徴とする、請求項１記載のタンパク質を製造する方法。
【請求項１２】
配列番号２または配列番号４に示す塩基配列の全長または一部と相補的な配列を有するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド分子、またはその変異体であって請求項１記載のタンパク質の細胞増殖活性を阻害する分子。
【請求項１３】
アンチセンスオリゴヌクレオチド分子である、請求項１２記載の分子。
【請求項１４】
配列番号２または配列番号４に示す塩基配列の一部、およびその相補鎖を含む、遺伝子発現を特異的に抑制するスモール・インターフェアリングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子である、請求項１２記載の分子。
【請求項１５】
請求項１２から１４のいずれか記載の分子を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項１６】
がんを予防または処置するための、請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項１７】
請求項２に記載の抗体を含有する癌の診断薬。
【請求項１８】
がんが疑われる患者から採取した組織を請求項２記載の抗体を用いて標識し、その標識の程度を判定する、請求項１記載のタンパク質の該患者における検出方法。
【請求項１９】
請求項３から８までのいずれか記載のポリヌクレオチド分子の細胞増殖活性に対する阻害物質をスクリーニングする方法であって、該阻害物質の候補物質を含む試料を、該ポリヌクレオチド分子とｃ−Ｍｙｃタンパク質とを含む反応系に加え、該ポリヌクレオチド分子とｃ−Ｍｙｃタンパク質との結合を阻害する該候補物質における活性を測定する工程を包含する方法。
【請求項２０】
請求項１５または１６のいずれか記載の医薬組成物を動物に投与することを特徴とするがんの予防または治療方法。
【請求項２１】
請求項１５または１６のいずれか記載の医薬組成物、当該組成物をがんの予防または治療のために使用し得るか、または使用すべきであることを記載した書類を含む商業的パッケージ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、Ｍｙｃ標的遺伝子ｍｉｍｉｔｉｎ、該遺伝子がコードするタンパク質またはその変異体、該タンパク質の製造方法、該タンパク質の活性を阻害する分子、該分子を含有する医薬組成物、該遺伝子の阻害物質をスクリーニングする方法、該タンパク質の発現を利用するがんの診断に関する。
【背景技術】  前がん遺伝子ｍｙｃファミリーは、特にがんとの関連が古くから知られており、がんや個体発生などにおいて重要な役割を果たしている細胞増殖関連の遺伝子である。この遺伝子の異常がヒトがんにおいて非常に高い割合で見つかっている。ｍｙｃファミリーは主に、３つの遺伝子、ｃ−ｍｙｃ、Ｎ−ｍｙｃおよびＬ−ｍｙｃから構成されている。これら３つの遺伝子は、発現する場所とタイミングが異なっているが、基本的には同じ生物学的活性を持つと考えられている。
がん遺伝子ｃ−ｍｙｃはｍｙｃ遺伝子ファミリーの中でも広く研究されている前がん遺伝子である。その発現は、転写レベルと転写後レベルなどのレベルで高度に調節されている。一般的には、ｃ−ｍｙｃの発現は細胞増殖に関連しており、静止期にある細胞あるいは分化細胞中においてその発現が低下する。遺伝子増殖、ウイルスプロモーター挿入、染色体の転座もしくはプロモーター突然変異などによって、ｍｙｃファミリー遺伝子が異常に発現することは、ヒトなどの広い範囲の脊椎動物における新形成疾患（いわゆる腫瘍形成等）に関連している（ＤｅＰｉｎｈｏ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．：（１９９１）Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７，１−４６、Ｍａｒｃｕ，Ｋ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．：（１９９２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１，８０９−８６０、Ｍｏｒｇｅｎｂｅｓｓｅｒ，Ｓ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．：（１９９４）Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．５，２１−３６、Ｈｅｎｒｉｋｓｓｏｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．：（１９９６）Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８，１０９−１８２、Ｇｒａｎｄｏｒｉ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．：（２０００）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６，６５３−９９）。ｃ−ｍｙｃもしくはＮ−ｍｙｃをノックアウトしたマウス胎児は、胚発生中期の間に多臓器発育不全を誘発し死亡する（Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｂ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．：（１９９２）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ６，２２３５−２２４７、Ｓａｗａｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１７，１４４５−１４５５、Ｄａｖｉｓ，Ａ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．：（１９９３）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．７，６７１−６８２）。これらの結果は、ｍｙｃが細胞発育の中心的調節因子であることを示している（Ｈｅｎｒｉｋｓｓｏｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．：（１９９６）Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８，１０９−１８２、Ｇｒａｎｄｏｒｉ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．：（２０００）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６，６５３−９９、Ｌｕｓｃｈｅｒ，Ｂ．：（２００１）Ｇｅｎｅ  ２７７，１−１４）。
このがん遺伝子ｍｙｃファミリーの遺伝子は、種々の遺伝子の発現を調節する転写因子（Ｍｙｃタンパク質）をコードしている（Ｇｒａｎｄｏｒｉ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．：（２０００）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６，６５３−９９、Ｌｕｓｃｈｅｒ，Ｂ．：（２００１）Ｇｅｎｅ２７７（Ｏｃｔ  １７；（１−２）），１−１４）。ｍｙｃファミリー遺伝子がコードしているタンパク質は、転写因子のベーシック−ヘリックス−ループ−ヘリックス−ロイシンジッパー（ＢＨＬＨＬＺ）クラスの転写因子の１員である。Ｍｙｃタンパク質はＭａｘとヘテロ２量体を形成し、Ｅ−ボックス部位（主にＣＡＣＧＴＧエレメント）に結合し、遺伝子の転写を活性化する。例えば、ＯＤＣ（Ｂｅｌｌｏ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．：（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，７８０４−７８０８）、ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ２（Ｂｏｕｃｈａｒｄ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．：（２０００）Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ  １５，２０４２−２０４７）、ｍｉｎａ５３（Ｔｓｕｎｅｏｋａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．：（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，３５４５０−３５４５９）などの数々のＭｙｃ標的遺伝子が同定されている（Ｄａｎｇ，Ｃ．Ｖ．：（１９９９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１−１１）。しかし、がん遺伝子ｍｙｃの機能を解明するのに十分なＭｙｃ標的遺伝子が未だ同定されておらず、遺伝子ｍｙｃの機能発揮のメカニズムは未だ十分には明らかにされていない。
【発明の開示】
がんはヒトの死亡原因の大きな割合を占めており、その割合は増加する傾向がある。
がん細胞は元来は正常細胞であるが、例えば化学物質や放射線またはウイルスの感染などの何らかの原因によって、その遺伝子のＤＮＡが傷つき、修復されずにその傷が蓄積されると、正常細胞ががん化すると考えられている。今までにがんに関連する遺伝子が数多く見つかっており、その中には、がんを促進するがん遺伝子と、がんを抑制するがん抑制遺伝子とがある。
がん遺伝子の１つである前がん遺伝子ｍｙｃファミリーは、特にがんとの関連が古くから知られ、がんや個体発生などにおいて重要な役割を果たしている細胞増殖と関連する遺伝子であり、この遺伝子の異常がヒトがんにおいて非常に高い割合で見つかっている。従って、この遺伝子によりコードされているＭｙｃタンパク質の機能をあきらかにすること、例えばＭｙｃタンパク質によって発現調節される新規な遺伝子を同定することは、がん遺伝子ｍｙｃの機能を解明するのに役立つ。
我が国では食道癌にかかる患者が増えており、その患者数も加齢と共に急激に増加している。現在では、食道癌で亡くなる患者数はがんで亡くなる総患者数の約３％にも達している。食道癌は予後不良の侵攻性疾患である。これから迎えつつある高齢化社会において食道癌が更に増えることが危惧され、食道癌も国民の健康を考える上で重要な病気になってきている。食道癌に関連した遺伝子を解明する研究によって、がん抑制遺伝子の機能損失ならびにがん遺伝子の活性化や発現異常が発癌に関与していることが示されており、ｃ−ｍｙｃもその発現異常が報告されている（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ＡＲ：Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９４，５４（７  Ｓｕｐｐｌ）：１９９９ｓ−２００５ｓ）。
そこで、本発明者らは新たながんマーカーとなり得るがん関連遺伝子の検索を試み、ｃ−Ｍｙｃタンパク質の新しい標的である遺伝子ｍｉｍｉｔｉｎ、およびそれによってコードされるタンパク質Ｍｉｍｉｔｉｎを見出した。
即ち、本発明は
（１）  配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、または配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸配列に１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加の中から選ばれる少なくとも１つを含む配列を有しかつ該タンパク質における細胞増殖活性と実質的に同じ程度の活性を有する該タンパク質の変異体、またはそれらの断片；
（２）  上記（１）記載のタンパク質またはその変異体に対する抗体；
（３）  上記（１）記載のタンパク質またはその変異体をコードするポリヌクレオチド分子、具体的にはＤＮＡ分子であるポリヌクレオチド分子、またはヒトクロモソーム５ｑ１２付近に存在し、ｃ−Ｍｙｃタンパク質が結合することにより転写上昇する遺伝子に相当するポリヌクレオチド分子、より具体的には配列番号２における１２８位から６３４位、または配列番号４に示す塩基配列を有するポリヌクレオチド分子、好ましくは、配列番号２に示す塩基配列を有し、細胞増殖活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子、または配列番号４に示す塩基配列を有するポリヌクレオチド分子；
（４）  上記（３）記載のポリヌクレオチド分子を含有するベクター；
（５）  上記（４）記載のベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体；
（６）  上記（５）記載の形質転換体を培養し、産生されたタンパク質を培養物から回収することを特徴とする、上記（１）記載のタンパク質を製造する方法；
（７）  配列番号２または配列番号４に示す塩基配列の全長または一部と相補的な配列を有するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド分子、またはその変異体であって上記（１）記載のタンパク質の細胞増殖活性を阻害する分子、具体的にはアンチセンスオリゴヌクレオチド分子である阻害分子、または配列番号２または配列番号４に示す塩基配列の一部、およびその相補鎖を含む、遺伝子発現を特異的に抑制するスモール・インターフェアリングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子である、阻害分子；
（８）  上記（７）記載の分子を有効成分として含有する医薬組成物、好ましくはがんを予防または処置するための医薬組成物；
（９）  上記（２）に記載の抗体を含有する癌の診断薬；
（１０）  がんが疑われる患者から採取した組織を上記（２）記載の抗体を用いて標識し、その標識の程度を判定する、上記（１）記載のタンパク質の該患者における検出方法；
（１１）  上記（３）記載のポリヌクレオチド分子の細胞増殖活性に対する阻害物質をスクリーニングする方法であって、該阻害物質の候補物質を含む試料を、該ポリヌクレオチド分子とｃ−Ｍｙｃタンパク質とを含む反応系に加え、該ポリヌクレオチド分子とｃ−Ｍｙｃタンパク質との結合を阻害する該候補物質における活性を測定する工程を包含する方法；
（１２）  上記（８）記載の医薬組成物を動物に投与することを特徴とするがんの予防または治療方法；および
（１３）  上記（８）記載の医薬組成物、当該組成物をがんの予防または治療のために使用し得るか、または使用すべきであることを記載した書類を含む商業的パッケージ、に関する。
本発明は主としてミトコンドリアに発現産物が認められる、ｃ−Ｍｙｃタンパク質によって直接発現上昇するＭｙｃ標的遺伝子ｍｉｍｉｔｉｎを基本とする。
ｍｉｍｉｔｉｎは新しいｃ−Ｍｙｃ標的遺伝子であり、食道癌細胞において細胞増殖に必要であることが判明した。このことからｍｉｍｉｔｉｎ遺伝子は食道癌などのがんの診断、治療に応用できると考えられる。ｍｉｍｉｔｉｎ遺伝子の作用を阻害するインヒビター（阻害物質）は新しい抗がん剤となる可能性がある。
【図面の簡単な説明】  図１は、Ｍｉｍｉｔｉｎタンパク質の細胞内局在を示す、図面に代わる写真である。
図１Ａはウエスタンブロッティング解析を示す。左のパネルは抗Ｍｉｍｉｔｉｎ抗体がＴ９８Ｇ細胞において特異的にＭｉｍｉｔｉｎを認識すること、およびＴ９８Ｇｍｙｃｅｒ細胞中のＭｙｃＥＲ蛋白質をＯＨＴにより活性化することによりＭｉｍｉｔｉｎタンパク質が増加することを示しており、右のパネルはＭｉｍｉｔｉｎ発現ベクター（ｍｉｍｉｔｉｎまたはｍｉｍｉｔｉｎ−ｍｙｃｈｉｓ）を導入したＴ９８Ｇ細胞でのＭｉｍｉｔｉｎの検出を示す。
図１ＢはＭｉｍｉｔｉｎがミトコンドリアに存在することを示している。
図１ＣはＭｉｍｉｔｉｎがミトコンドリア画分に分画されることを示している。
図２は、ｍｉｍｉｔｉｎ  ｍＲＮＡの発現レベルを示す図面に代わる写真である。
図２Ａはｍｉｍｉｔｉｎ  ｍＲＮＡの発現レベルがＴ９８Ｇ細胞中のｃ−ｍｙｃ発現レベルと関連していることを示す。
図２Ｂはヒト前骨髄性白血病ＨＬ６０細胞におけるｍｉｍｉｔｉｎ  ｍＲＮＡの発現レベルの低下とｃ−ｍｙｃｍＲＮＡの消滅との関係を示す。
図２Ｃは４−ヒドロキシタモキシフェン（ＯＨＴ）によりＭｙｃＥＲタンパク質を活性化したＴ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞（図中、ｍｙｃｅｒと表記）におけるｍｉｍｉｔｉｎ  ｍＲＮＡの発現誘導および当該発現誘導がシクロヘキシミド（ＣＨＸ）により影響されないことを示している。
図３は、ｃ−Ｍｙｃがｍｉｍｉｔｉｎゲノム遺伝子に直接結合しその発現を上昇させていることを示す、図面に代わる写真である。
図３ＡはＴ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞を使用したｍｉｍｉｔｉｎプロモーター活性を測定するレポータープラスミドのトランジエント発現アッセイの結果を示す。
図３ＢはＨＬ６０細胞を使用したクロマチン免疫沈降実験結果を示している。
図４は、食道癌におけるＭｉｍｉｔｉｎの存在を示す、細胞の形態を表す写真である。各写真中のバーは、５０μｍのスケールを示す。
図４ＡはＨＥ染色であり、図４Ｂは抗Ｍｉｍｉｔｉｎ抗体、図４Ｃは一次抗体なし、図４Ｄは抗ｃ−Ｍｙｃ抗体、図４Ｅは抗Ｋｉ−６７抗体を用いた免疫染色である。
図５は、Ｍｉｍｉｔｉｎが細胞増殖に関与することを示す図である。
図５Ａは、ｍｉｍｉｔｉｎ特異的ｓｉＲＮＡがＭｉｍｉｔｉｎの発現を抑制することを示す、図面に代わる写真である。
図５Ｂは、ｍｉｍｉｔｉｎ特異的ｓｉＲＮＡを導入した種々の細胞における細胞数の変化を示す図面である。図中、●はｓｉ−ｍｉｍｉｔｉｎ−２ＲＮＡを、○は対照のｓｉＲＮＡを導入した細胞を表わし、↓は血清を添加した日を示す。
図５Ｃは、ｃ−Ｍｙｃの発現を示す、図面に代わる写真である。
図６は、ｍｉｍｉｔｉｎ特異的ｓｉＲＮＡが細胞増殖を抑制することを示す。
図６Ａは図面に代わる写真である。
図６Ｂは細胞数をグラフ化したものであり、グラフ中、◆はｓｉ−ｍｉｍｉｔｉｎ−１  ＲＮＡを、▲はｓｉ−ｍｉｍｉｔｉｎ−２  ＲＮＡを、●はｃ−ｍｙｃ  ＲＮＡをおよび○は対照のｓｉＲＮＡを導入した細胞を表わし、↓は血清を添加した日を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の遺伝子ｍｉｍｉｔｉｎ（Ｍｙｃ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）はミトコンドリアに局在する分子量約２０ｋＤａのタンパク質Ｍｉｍｉｔｉｎをコードしている。ｍｉｍｉｔｉｎ遺伝子の転写はＭｙｃにより直接的に刺激される。本発明におけるＭｙｃとは、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−ＭｙｃおよびＬ−Ｍｙｃを包含するものであり、特に限定されるものではないが、種々の癌において遺伝子増幅、過剰発現や転座が報告されているｃ−Ｍｙｃを中心に説明する。一般的に予後が悪いといわれている食道癌におけるＭｉｍｉｔｉｎタンパク質の発現を調べた結果、Ｍｉｍｉｔｉｎタンパク質は殆どの食道癌検体において強く発現されていることが判明した。このことは、Ｍｉｍｉｔｉｎタンパク質の発現が食道癌を検出する指標となり得ることを示している。細胞増殖の程度、癌の分化度、癌進行度の程度と、Ｍｉｍｉｔｉｎの染色程度とを比較したところ、癌の分化度、癌進行度の程度とＭｉｍｉｔｉｎの染色程度とには関係が認められなかった。しかしＭｉｍｉｔｉｎの染色程度と細胞増殖との間に明瞭な相関関係を認めた。さらに、ＲＮＡ干渉法によってｍｉｍｉｔｉｎ発現を特異的に阻害すると、培養癌細胞の細胞増殖が抑制されることが判明した。これらは、新規なＭｙｃ標的遺伝子ｍｉｍｉｔｉｎが食道癌を始めとする癌細胞の増殖に関与するミトコンドリア局在タンパク質をコードしていることを示している。
より詳細には本発明は、配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質（以下、Ｍｉｍｉｔｉｎタンパク質と呼称する）、または配列番号１のアミノ酸配列に１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加の中から選ばれる少なくとも１つを含む配列を有しかつ該タンパク質における細胞増殖活性と実質的に同じ程度の活性を有する該タンパク質の変異体、またはそれらの断片に関する。
本発明タンパク質は遺伝子工学的手法、タンパク質合成手法等、常法により調製できる。以下、概略説明する。
（１）ｃ−Ｍｙｃ標的遺伝子ｍｉｍｉｔｉｎのクローニング
本発明のＭｉｍｉｔｉｎタンパク質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片は以下の実施例に詳細に説明している手法により、単離される。
簡単に説明すれば、本発明に係るがん関連遺伝子ｍｉｍｉｔｉｎは、その発現ががん遺伝子ｃ−ｍｙｃによって直接誘発される。このことを利用し、ｍｉｍｉｔｉｎ遺伝子を単離するため、まず人為的に誘導できるｃ−Ｍｙｃ活性を有する細胞株を調製する。これには例えば、エストロゲン誘発性Ｍｙｃシステム（Ｅｉｌｅｒｓ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．：（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０，６６−６８）が挙げられる。キメラタンパク質ｃ−ＭｙｃＥＲはヒトｃ−Ｍｙｃとヒトエストロゲンレセプターのエストロゲン結合ドメインとから構成され、このキメラタンパク質は、エストロゲンの非存在下では細胞骨格成分に結合しているが、エストロゲンまたはその類似体４−ヒドロキシタモキシフェン（ＯＨＴ）が結合すると、細胞骨格成分から遊離し、ｃ−Ｍｙｃとして機能する。
キメラタンパク質ｃ−ＭｙｃＥＲ作製に使用するｃ−Ｍｙｃをコードするプラスミドは、当該分野において慣用されている手法によって作製することができる。使用するプラスミドも種々のプラスミドが市販されており、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ヒトｃ−ＭｙｃをＣＭＶプロモーターによって発現誘導するＰｃ−ｍｙｃ／ＣＤＭ８（Ｔｓｕｎｅｏｋａ  Ｍ．，Ｎａｋａｎｏ  Ｆ．，Ｏｈｇｕｓｕ  Ｈ．，ａｎｄ  Ｍｅｋａｄａ  Ｅ．，ｃ−ｍｙｃ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ＲＣＣ１  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｅ−ｂｏｘ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  １４：２３０１−２３１１，１９９７）、とエストロゲン結合ドメインをコードするプラスミド、例えばｐＢＳＫＳＲ−ＥＲ（Ｔｓｕｎｅｏｋａ  Ｍ．，Ｎａｋａｎｏ  Ｆ．，Ｏｈｇｕｓｕ  Ｈ．，ａｎｄ  Ｍｅｋａｄａ  Ｅ．，ｃ−ｍｙｃ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ＲＣＣ１  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｅ−ｂｏｘ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１４：２３０１−２３１１，１９９７）より作製したｃ−ｍｙｃｅｒをチキン−アクチンプロモーターとＣＭＶプロモーターとから構成されたキメラプロモーター下に挿入して作製されたｐｃ−ｍｙｃｅｒ／ＣＡＧＧＳなどを使用することができる（Ｔｓｕｎｅｏｋａ  Ｍ．，Ｋｏｄａ  Ｙ．，Ｓｏｅｊｉｍａ  Ｍ．，Ｔｅｙｅ  Ｋ．Ｋｉｍｕｒａ  Ｈ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  Ｍｙｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ，ｍｉｎａ５３，ｔｈａｔ  ｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（３８）：３５４５０−３５４５９，２００２）。これらを常法に従い、ヒト膠芽腫細胞株Ｔ９８Ｇ細胞（ｈｕｍａｎ，Ｃａｕｃａｓｉａｎ，ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ、ＥＣＡＣＣ  ９２０９０２１３、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６９０）等の細胞に遺伝子導入する。
次に、示差ディスプレイにより、ｃ−Ｍｙｃ活性によって発現上昇する遺伝子を検索する。得られた細胞について、未処理の細胞とｃ−Ｍｙｃ活性を誘導させた細胞のそれぞれからＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡマイクロアレイ手法等により、ＲＮＡの発現状態を調べ、ｃ−ＭｙｃＥＲ活性化によって刺激され発現上昇する遺伝子を同定する。
同定した遺伝子の配列情報に基づき、ＲＡＣＥシステム、ＲＴ−ＰＣＲ等によって全長ｃＤＮＡを調製し、配列決定する。このようにして得られた本発明に係るがん関連遺伝子ｍｉｍｉｔｉｎは、ヒトについては配列表の配列番号２（１２８位から６３４位）、およびマウスについては配列番号４に示される塩基配列を有する。その他のオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）についても上記と同様にして得ることができる。あるいは、ヒト塩基配列（配列番号２）に基づいて設計したプローブを用いて、各種動物由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによってもオルソログを得ることができる。ヒトおよびマウス以外の動物としては、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、トリ、サル等があげられる。
好ましくは、ヒトまたはマウスｍｉｍｉｔｉｎ遺伝子であり、ヒトｍｉｍｉｔｉｎ遺伝子は４個のエクソンから構成され、ＵＣＳＣＧｅｎｏｍｅＢｒｏｗｓｅｒのマッピングデータからヒトｍｉｍｉｔｉｎ遺伝子が第５番染色体（５ｑ１２．１）にマップされている。
（２）組換えタンパク質の発現
つぎに得られたｃＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込み、Ｍｉｍｉｔｉｎタンパク質を発現するための発現ベクターとする。適切な発現ベクターとしては、例えば、細菌についてはｐＥＴ２８（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，Ｃａｔ＃  ６９８６５−３）、ｐＧＥＸ−３Ｘ（ＧｅｎＢａｎｋ  ｄａｔａ  ｂａｓｅ，ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ１３８５２）、動物細胞についてはｐＣＡＧＧＳ（Ｎｉｗａ  Ｈ．，Ｙａｍａｍｕｒａ  Ｋ．，ａｎｄ  Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｊ．，（１９９１），Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１０８，１９３−１９９））、ｐＲＣ／ＣＭＶ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ（−）Ｂ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ＃  Ｖ８５５−２０）が挙げられる。この他、酵母についてのベクター、昆虫細胞にて用いられるベクターも当然可能である。この発現ベクターを適当な宿主細胞、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞、または動物細胞に導入して、形質転換体を作製する。
あるいは、Ｍｉｍｉｔｉｎタンパク質は、例えば固相法を用いて、既報の方法（Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：３１２８−３１３５，１９９１）を用いて全合成できる。
得られたタンパク質の精製は当業者に周知の方法、例えばアフィニティーカラム、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、などを組み合わせて行うことができる。
得られたＭｉｍｉｔｉｎタンパク質は次の性質を有している：
Ａ）その発現をｃ−Ｍｙｃが直接上昇する；
Ｂ）主にミトコンドリアに存在している；
Ｃ）抗Ｍｉｍｉｔｉｎ抗体で食道癌組織を染色すると癌部分が良く染色される。これはＭｉｍｉｔｉｎタンパク質が癌マーカーであることを示している；
Ｄ）その染色パターンは抗Ｋｉ−６７抗体のそれと良く似ている。Ｋｉ−６７は細胞増殖している細胞のみで発現され、組織中で細胞増殖している細胞を探し出すために一般的に使われている。抗Ｍｉｍｉｔｉｎ抗体で染色される細胞が抗Ｋｉ−６７抗体でも染色されたと言うことはＭｉｍｉｔｉｎが発現している細胞は増殖していることを示している；
Ｅ）食道癌の培養細胞においてＭｉｍｉｔｉｎの発現を抑制すると細胞増殖が抑制された。同じ細胞でｃ−Ｍｙｃの発現を抑制するとやはり細胞増殖が抑制され、かつＭｉｍｉｔｉｎの発現が抑制された。これらのことから、この細胞でｃ−Ｍｙｃは細胞増殖を正にコントロールしており、そのコントロールにＭｉｍｉｔｉｎ発現上昇が関係していることが考えられる。
本発明のタンパク質の変異体の発現は、当業者に周知の遺伝子組換え技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｒｏｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｎ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）によって変異を導入したＤＮＡを用いて行う。
本発明の変異体が有するＭｉｍｉｔｉｎタンパク質における細胞増殖活性と実質的に同じ程度の活性は次のようにして測定する。
食道癌細胞にｍｉｍｉｔｉｎ発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ／ｍｉｍｉｔｉｎ）を導入するとＭｉｍｉｔｉｎタンパク質が細胞中で強く発現した。この時、細胞増殖マーカータンパク質（細胞増殖が盛んな時に増えるタンパク質、例えばリン酸化Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ３、Ａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏ−Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ３（ｕｐｓｔａｔｅ社Ｃａｔ＃  ０６−５７０）で検出する）の量が増えることが観察された。このことは、Ｍｉｍｉｔｉｎタンパク質が細胞増殖に関係するタンパク質であることを示している。よって、本発明の変異体が有するＭｉｍｉｔｉｎタンパク質における細胞増殖活性と実質的に同じ程度の活性は、これら細胞増殖マーカータンパク質の増大レベルを指標に判定することができる。
本発明の変異体はＭｉｍｉｔｉｎタンパク質と同様に次の生物活性を示すことが好ましい：
Ａ）ｃ−Ｍｙｃにより発現が直接上昇する；
Ｂ）主にミトコンドリアに存在している；
Ｃ）抗変異体抗体で食道癌組織を染色すると癌部分が良く染色される；
Ｄ）その染色パターンは抗Ｋｉ−６７抗体のそれと良く似ている。
Ｍｉｍｉｔｉｎタンパク質またはその変異体の断片は、本発明の変異体と同じように、Ｍｉｍｉｔｉｎタンパク質と同様の生物活性を示すことが好ましい。
別の態様として、本発明は、本発明のタンパク質またはその変異体に対する抗体、特にモノクローナル抗体、および該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に関する。抗体は当該技術分野に慣用されている常法に従って作製することができる。本発明に係るモノクローナル抗体は、ポリエチレングリコールを用いた細胞融合法や電気的融合法などの融合方法、センダイウイルスやエプシュタイン−バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス等を用いた方法、遺伝子組換えによる組換え体や発がんプロモーター等による形質転換体を用いた方法などによってハイブリドーマを作製し、調製できる（Ｋｏｅｈｌｅｒ，Ｇ．，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．：Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５（１９７５））。特に、ポリエチレングリコールを用いた細胞融合法によるハイブリドーマの樹立が好適である。
本発明の抗体は、Ｍｉｍｉｔｉｎが関与する疾患、具体的にはがんの診断に好適に用いることができる。
別の態様として、本発明は、本発明のＭｉｍｉｔｉｎタンパク質および該タンパク質の変異体をコードするポリヌクレオチド分子に関する。
本明細書中、「ポリヌクレオチド分子」はＤＮＡ、ＲＮＡも包含し得る。ＤＮＡの場合、ｃＤＮＡ、ゲノミックＤＮＡあるいは合成ＤＮＡであり得る。またＤＮＡおよびＲＮＡいずれも２本鎖でも１本鎖でもあり得る。１本鎖の場合、コード鎖あるいは非コード鎖であり得る。ＲＮＡにはｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）も包含される。
詳細には、配列番号２における１２８位から６３４位、または配列番号４に示す塩基配列を含むポリヌクレオチド分子またはその変異体に関する。ここに、変異体とは上記ポリヌクレオチド分子の塩基置換、塩基付加またはアレル変異による変異体を意味する。「アレル変異による変異体」とは自然に存在する個人差や人種差に基づく塩基変異を意味し、コードするアミノ酸配列が変化する場合もある。
好ましい態様としては、配列番号２に示す塩基配列からなり、細胞増殖活性を有するヒトＭｉｍｉｔｉｎをコードするポリヌクレオチド分子、または配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド分子である。
本発明はさらに、配列番号２または配列番号４に示す塩基配列の全長または一部と相補的な配列を有するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド分子、またはその変異体であって本発明タンパク質の細胞増殖活性を阻害する分子に関する。
典型的には、配列番号２における１２８位から６３４位、または配列番号４の塩基配列に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドが包含される。
配列番号２において、阻害する分子は５’または３’非コーディング部分における相補鎖を含むものであってもよい。特に５’非コーディング部分に相補的な配列が挙げられ、それには転写開始部位、翻訳開始部位、５’非翻訳領域等に相補的な配列を有する分子が含まれる。阻害分子の好ましい長さは、約１５塩基対（ｂｐ）から約１００ｂｐである。
配列番号２に示す塩基配列に関する阻害分子が好ましい。
阻害分子には特にスモール・インターフェアリング（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｒｉｎｇ）ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が含まれる。２１個のヌクレオチドからなるｓｉＲＮＡ二本鎖が、哺乳動物の細胞株中で遺伝子発現を特異的に抑制するとの報告が最近なされている（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．：（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１１，４９４−４９８）。特に好ましい本発明のｓｉＲＮＡは、実施例５に記載しているようにして作製されるｓｉ−ｍｉｍｉｔｉｎ−１（ｍｉｍｉｔｉｎの７２−９０に相当するｓｉＲＮＡ）およびｓｉ−ｍｉｍｉｔｉｎ−２（ｍｉｍｉｔｉｎの３３０−３４８に相当するｓｉＲＮＡ）を用いる手法である。
よって、本発明は、配列番号２または配列番号４の一部、およびその相補鎖を含むｓｉＲＮＡ分子である、本発明タンパク質の細胞増殖活性を阻害する分子を包含する。本発明のｓｉＲＮＡは１８−２５ｍｅｒ長、好ましくは２１ｍｅｒ長である。配列番号２に示す塩基配列に関するｓｉＲＮＡ分子が好ましい。
これらｓｉＲＮＡの細胞への導入方法は、例えばＥｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．：（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１１，４９４−４９８に記載のようにして行うことができる。或はｓｉＲＮＡを細胞内で合成するように設計されたプラスミド、ウイルスベクター等を利用することができる（Ｗａｌｌ  ＮＲ，Ｓｈｉ  Ｙ．，Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ：ｃａｎ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｅｅｘｐｌｏｉｔｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ？（２００３）Ｌａｎｃｅｔ，３６２（９３９３）：１４０１−１４０３．；Ｔｕｓｃｈｌ  Ｔ，ａｎｄ  Ｂｏｒｋｈａｒｄｔ  Ａ．，Ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ：ａ  ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．（２００２）Ｍｏｌ  Ｉｎｔｅｒｖ．２（３）：１５８−６７；Ｄａｖｅ  ＲＳ，ａｎｄ  Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ  ＲＪ，ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｏａｄ  ｔｏ  ａｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｙ！，（２００３）Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ．１３（６）：３７３−３８５；Ｓｉｏｕｄ  Ｍ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｉＲＮＡｓ．（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ．２５（１）：２２−２８）。
簡単に説明すれば、ｓｉＲＮＡ導入の２４時間前に、指数関数的生育期の細胞をトリプシン処理し、ｓｉＲＮＡの適量をオリゴフェクタミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）法を含むリポフェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポーレイション法等により細胞に導入する。無血清培地では４−２０時間以上培養し、ｓｉＲＮＡを導入する。また、当該ｓｉＲＮＡはｐＳｉｌｅｎｃｅｒＴＭａｄｅｎｏ  １．０−ＣＭＶ（アンビオン社、Ｃａｔ＃  ５７９６）等のｓｉＲＮＡ発現ベクターにより細胞内にて発現できる。その際発現ベクターはリポフェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポーレイション法等により細胞内に導入することができる。
これらの阻害分子はｍｉｍｉｔｉｎの活性、即ち癌細胞増殖活性を阻害する。よって、本発明は別の態様として、本発明の阻害分子を有効成分として含有する医薬組成物、好ましくはがんを予防または処置するための医薬組成物、さらに好ましくは食道癌を予防または処置するための医薬組成物に関する。
当該阻害分子は、化学的に合成されたｓｉＲＮＡ分子、或はｓｉＲＮＡを細胞内で合成するように設計されたプラスミド、ウイルスベクター等を利用する（Ｗａｌｌ  ＮＲ，Ｓｈｉ  Ｙ．，Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ：ｃａｎ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｅ  ｅｘｐｌｏｉｔｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ？（２００３）Ｌａｎｃｅｔ，３６２（９３９３）：１４０１−１４０３．；Ｔｕｓｃｈｌ  Ｔ，ａｎｄ  Ｂｏｒｋｈａｒｄｔ  Ａ．，Ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ：ａ  ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．（２００２）Ｍｏｌ  Ｉｎｔｅｒｖ．２（３）：１５８−６７；Ｄａｖｅ  ＲＳ，ａｎｄ  Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ  ＲＪ，ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｏａｄ  ｔｏ  ａｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｙ！，（２００３）Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ．１３（６）：３７３−３８５；Ｓｉｏｕｄ  Ｍ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｉＲＮＡｓ．（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ．２５（１）：２２−２８）。
本発明の医薬組成物は周知の賦形剤を含有してもよい。当該医薬組成物の投与方法としては、皮内投与、皮下投与または静脈注射が挙げられ、各投与方法に適した剤型とすることができる。製剤中の本発明の有効成分の含有量は、例えば処置目的の疾患状態、個々の患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常０．００１〜１００重量％であり、これを１〜数日ごとに投与する。
別の態様として、本発明は、本発明のポリヌクレオチド分子、特にＭｉｍｉｔｉｎタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子とｃ−Ｍｙｃタンパク質との関係を提供することによって、本発明ポリヌクレオチド分子とｃ−Ｍｙｃタンパク質との結合により誘発される生物作用に対する阻害物質として働く物質を探索し、評価する工程を包含する方法に関する。すなわち、本発明のポリヌクレオチド分子の細胞増殖活性に対する阻害物質をスクリーニングする方法であって、該阻害物質の候補物質を含む試料を、該ポリヌクレオチド分子とｃ−Ｍｙｃタンパク質とを含む反応系に加え、該ポリヌクレオチド分子とｃ−Ｍｙｃタンパク質との結合を阻害する該候補物質における活性を測定する工程を包含する方法に関する。
該阻害物質の候補物質としては、前記本発明の阻害分子を始めとするいかなる公知物質および新規物質であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分などがあげられる。
前記該ポリヌクレオチド分子とｃ−Ｍｙｃタンパク質との結合を阻害する活性は、公知の方法により測定することができ、特に限定されるものではないが、例えば、ｃ−Ｍｙｃタンパク質の転写活性を指標とする方法があげられる。該転写活性は、例えば、本発明のポリヌクレオチド分子（好ましくはプロモーター領域を含むＤＮＡ）とルシフェラーゼ、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、β−ガラクトシダーゼ、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）等のレポーター遺伝子とを含むレポータープラスミドをＭｙｃが発現する細胞に導入し、前記候補物質を含む試料と前記細胞とを接触させ、常法によりレポーターの活性を測定することにより行うことができる。得られた活性を、候補物質を接触させない細胞における活性と比較し、活性が低下している場合、候補物質を阻害物質として選択することができる。
このようにして得られた阻害物質は、がん、特に食道癌を予防、処置するために使用できると考えられる。ここで、がんとしては、ｃ−ＭｙｃとＭｉｍｉｔｉｎが共に発現している細胞または組織から構成されているものであれば特に限定されるものではなく、例えば、膀胱癌、乳癌、大腸癌、胃癌、食道癌、肝臓癌、メラノーマ、骨髄腫、神経芽細胞腫、神経膠芽腫、卵巣癌、前立腺癌、肺癌等があげられ、好ましくは食道癌、神経膠芽腫または乳癌であり、最も好ましくは食道癌である。
本発明はさらなる態様として、がんが疑われる患者からがん組織を採取し、得られた切片を、本発明のタンパク質Ｍｉｍｉｔｉｎまたはその変異体に対する抗体を用いて標識し、その標識の程度を判定する、がん、特に食道癌の診断、具体的には本発明タンパク質、その変異体またはその断片の該患者における検出方法に関する。
がんが疑われる患者から採取したがん組織を例えば１０％ホルマリン固定・パラフィン包埋により固定化し、ストレプトアビジン−ビオチン・コンプレックス・イムノパーオキシダーゼ法などにより免疫染色する。
次いで、常法に従い、顕微鏡観察により免疫組織化学的染色の評価を行う。
さらに、本発明は、本発明の医薬組成物を動物に投与することを特徴とするがんの予防または治療方法に関する。投与対象の動物としては、ヒトおよびヒト以外の動物があげられ、ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、トリ、サル等があげられる。
投与量および投与回数は、処置目的の疾患状態、個々の患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常、一日当たりの投与量として０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇであり、投与回数は、通常１〜数日ごとである。投与方法としては、皮内投与、皮下投与または静脈注射があげられる。
【実施例】  以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はいかなる意味においてもこれら実施例により制限されるものではない。
実施例１
ｃ−Ｍｙｃ標的遺伝子ｍｉｍｉｔｉｎのクローニング
ｍｙｃ標的遺伝子ｍｉｍｉｔｉｎを参考文献１（Ｔｓｕｎｅｏｋａ  Ｍ．，Ｋｏｄａ  Ｙ．，Ｓｏｅｊｉｍａ  Ｍ．，Ｔｅｙｅ  Ｋ．，Ｋｉｍｕｒａ  Ｈ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  Ｍｙｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ，ｍｉｎａ５３，ｔｈａｔ  ｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（３８）：３５４５０−３５４５９，２００２）に記載の５’−ＲＡＣＥおよびＲＴ−ＰＣＲプロトコルと同様の手法でクローニングした。
（１）条件付に活性化するｃ−Ｍｙｃ活性を持つ細胞株の確立
ｃ−Ｍｙｃ活性を条件付に活性化するため、エストロゲン誘発性Ｍｙｃシステムを使用した（Ｅｉｌｅｒｓ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．：（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０，６６−６８）。
ヒト膠芽腫細胞株Ｔ９８Ｇ細胞（ｈｕｍａｎ，Ｃａｕｃａｓｉａｎ，ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ、ＥＣＡＣＣ９２０９０２１３、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６９０）を非必須アミノ酸と１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有イーグル培地中で培養した。ｃ−ＭｙｃＥＲキメラタンパク質をコードするｐｃ−ｍｙｃｅｒ／ＣＡＧＧＳ（Ｔｓｕｎｅｏｋａ  Ｍ．，Ｋｏｄａ  Ｙ．，Ｓｏｅｊｉｍａ  Ｍ．，Ｔｅｙｅ  Ｋ．，Ｋｉｍｕｒａ  Ｈ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  Ｍｙｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ，ｍｉｎａ５３，ｔｈａｔ  ｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（３８）：３５４５０−３５４５９，２００２）（２０μｇ）と、ハイグロマイシン耐性遺伝子をコードするｐＡｃｔＨｙｇ（Ｔｓｕｎｅｏｋａ  Ｍ．，Ｎａｋａｎｏ  Ｆ．，Ｏｈｇｕｓｕ  Ｈ．，ａｎｄ  Ｍｅｋａｄａ  Ｅ．，ｃ−ｍｙｃ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ＲＣＣ１  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｅ−ｂｏｘ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１４：２３０１−２３１１，１９９７）（０．４μｇ）とをリン酸−カルシウム方法によって、Ｔ９８Ｇ細胞に遺伝子導入した（Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．：（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６，６３２−６３８）。得られた細胞を２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含有する培地中で２週間培養した。個々のクローンを単離し、ｃ−ＭｙｃＥＲタンパク質の発現を、抗ｃ−Ｍｙｃ抗体を使用してウェスタンブロット分析法によって検出し、ｃ−ｍｙｃｅｒを発現するＴ９８Ｇ細胞（以下、Ｔ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞と称する）を確立した。
既に報告されているＭｙｃ標的遺伝子であるＯＤＣ（Ｐｅｎａ  Ａ，Ｒｅｄｄｙ  ＣＤ，Ｗｕ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｃ−Ｍｙｃ．Ｍａｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ１９９３；２６８：２７２７７−８５）およびヌクレオリン（Ｇｒｅａｓｌｅｙ  ＰＪ，Ｂｏｎｎａｒｄ  Ｃ，Ａｍａｔｉ  Ｂ．Ｍｙｃ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ  ａｎｄ  ＢＮ５１  ｇｅｎｅｓ：ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０００；２８：４４６−５３）に対する特異的シグナルは、次項にのべるＤＮＡチップ（ｃＤＮＡマイクロアレイ）を用いた示差ディスプレイ解析により、Ｔ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞におけるｃ−ＭｙｃＥＲの活性に伴ってそれぞれ２．６倍と１．６倍増加した。この結果は、作製したＴ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞がＭｙｃ標的遺伝子を検出できることを示している。
（２）ＤＮＡチップ（ｃＤＮＡマイクロアレイ）を用いた示差ディスプレイ
未処理のＴ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞と４−ヒドロキシタモキシフェン（ＯＨＴ）で２０時間処理したＴ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞のそれぞれから全ＲＮＡを単離した。ポリ（Ａ＋）ＲＮＡを回収し、市販のＤＮＡチップ（インサイト社製）を用いて示差ディスプレイに適用した。発現配列タグ（ＥＳＴ）クローンを含む約９千種類のｃＤＮＡをチップにプレートし（ＵｎｉＧＥＭ  Ｈｕｍａｎ  Ｖ  Ｖｅｒ．２）、ｃ−ＭｙｃＥＲ活性化によって発現上昇する遺伝子の検索を行った。その結果、ＥＳＴクローンＡＩ８０３２３０に対するシグナルがｃ−Ｍｙｃ活性によって２．２倍上昇することが分かった。この上昇率は、ｃ−Ｍｙｃ標的遺伝子であるＯＤＣとヌクレオリンについて上記のように測定した値と類似していた。
（３）５’−ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ５’ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）および３’−ＲＡＣＥ分析
次に、ＡＩ８０３２３０の５’−上流部をコードするｃＤＮＡ分子を、ヒト赤血球腫瘍白血病細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＨＥＬ）ライブラリーから５’−ＲＡＣＥプロトコールを用いて単離した。また、３’−下流部をコードするｃＤＮＡ分子を、ヒト赤血球腫瘍白血病細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＨＥＬ）ライブラリーから３’−ＲＡＣＥプロトコールを用いて単離した。
なお、増幅は、各プライマー１０ｐｍｏｌｅと、ＥＸ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）１．２Ｕと、ｄＮＴＰ  ２００μＭとを含むＥｘ  Ｔａｑ  バッファ５０μｌを用いてポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）により行った。
５’−ＲＡＣＥについて、ＨＥＬ細胞のポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（１μｇ）（Ｋｏｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．：（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，７５０１−７５０５）から、逆転写反応、２重鎖ｃＤＮＡ合成およびアダプターライゲーションを、マラソン（Ｍａｒａｔｈｏｎ）ｃＤＮＡ増幅キット（クロンテック社製）を用いて行った（Ｋｏｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．：（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，７５０１−７５０５）。
第１ＰＣＲは、プライマーとして、
ｍｉｍｉｔｉｎ−ＲＡＣＥ−１（５’−ＧＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＣＣＡＣＴＧＡＧＧＧＴＴＣＴ−３’：配列番号５）とＡＰ１プライマー（クロンテック社製、５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’：配列番号６）とを使用して行った。温度プロファイルは、９４℃で１分間の初期熱変性後、９６℃での１５秒間の熱変性工程、６８℃での３分間のアニーリング工程と伸張工程とを１サイクルとして２５サイクルの処理をした。上記第１ＲＡＣＥ−ＰＣＲ生産物を１０００倍希釈した液１μｌをネストＲＡＣＥ−ＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。ネストＲＡＣＥ−ＰＣＲは、ｍｉｍｉｔｉｎ−ＲＡＣＥ−２（５’−ＧＣＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＡＴＴＴＧＡＧＴＴＴＧＡＡＣ−３’：配列番号７）と、ＡＰ２プライマー（クロンテック社製、５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ−３’：配列番号８）とを使用して行った。温度プロファイルは、９４℃で１分間の初期熱変性後、９６℃での１５秒間の熱変性工程、６８℃での４分間のアニーリング工程と伸張工程とを１サイクルとして２５サイクルの処理をした。増幅したＤＮＡ断片をｐＧＥＭＴベクターにクローニングし、シークエンスした。このシークエンス情報を元にして３’−ＲＡＣＥのためのプライマーを設計した。
３’−ＲＡＣＥについて、ＨＥＬ細胞のポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（１μｇ）（Ｋｏｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．：（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，７５０１−７５０５）から、逆転写反応、２重鎖ｃＤＮＡ合成およびアダプターライゲーションを、マラソン（Ｍａｒａｔｈｏｎ）ｃＤＮＡ増幅キット（クロンテック社製）を用いて行った（Ｋｏｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．：（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，７５０１−７５０５）。第１ＰＣＲは、プライマーとして、ｍｉｍｉｔｉｎ−３’ＲＡＣＥ−１（５’−ＧＣＧＧＣＴＧＧＡＧＣＡＴＴＡＣＣＣＣＴＡＣＴＧＣ−３’：配列番号９）と、ＡＰ１プライマーとを使用して行った。温度プロファイルは、９４℃で１分間の初期熱変性後、９６℃での１５秒間の熱変性工程、６８℃での３分間のアニーリング工程と伸張工程とを１サイクルとして２５サイクルの処理をした。上記第１ＲＡＣＥ−ＰＣＲ生産物を１０００倍希釈した液１μｌをネストＲＡＣＥ−ＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。ネストＲＡＣＥ−ＰＣＲは、ｍｉｍｉｔｉｎ−３’ＲＡＣＥ−２（５’−ＡＡＡＣＴＧＧＧＴＧＧＡＣＧＧＣＡＴＧＧＧＴＴＧＧ−３’：配列番号１０）と、ＡＰ２プライマーとを使用して行った。温度プロファイルは、９４℃で１分間の初期熱変性後、９６℃での１５秒間の熱変性工程、６８℃での４分間のアニーリング工程と伸張工程とを１サイクルとして２５サイクルの処理をした。０．６ｋｂの増幅ＤＮＡ断片をｐＧＥＭＴベクターにクローニングし、ｐＴ／ｍｉｍｉｔｉｎと名づけた。
（４）ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ＰＣＲ）
ＲＡＣＥ実験からのヌクレオチドの配列から、ｍＲＮＡ分子の全配列を予測した。その結果タンパク質をコードするヌクレオチドが全て前述のｐＴ／ｍｉｍｉｔｉｎに存在することが分かった。解読されたｃＤＮＡの配列をヒトについては配列番号１に示す。ヒトでは、１９８５６．３３Ｄａの予測分子量を有する１６９個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしていることがわかった。予測分子の５’−末端の配列と３’−末端の配列とに一致するプライマーを使用し、０．５ｋｂ長ｃＤＮＡをＰＣＲプロトコールによってｐＴ／ｍｉｍｉｔｉｎより増幅した。増幅用のＰＣＲ用プライマーとしては、ヒトに対しては、
ｍｉｍｉｔｉｎ−ＲＴ−Ｆ（５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＧＣＣＡＴＧＧＧＴＴＧＧＴＣＴＣＡＧＧＡＴＴＴＧＴＴＣＣ−３’：配列番号１１、５’端にＥｃｏＲＩ  ｓｉｔｅを付加）と、
ｍｉｍｉｔｉｎ−ＲＴ−Ｒ（５’−ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＡＴＴＧＡＴＴＧＴＧＧＣＴＣＴＴＧＣＣＡＴＣＴＣＧ−３’：配列番号１２、３’端にＥｃｏＲＩ  ｓｉｔｅを付加）とを使用した。温度プロファイルは、９８℃での１５秒間の熱変性工程と、６５℃での１分間のアニーリング工程と、７２℃での２分３０秒間の伸張工程を１サイクルとして３５サイクルの処理をした。
次いで、増幅したｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ処理した後、あらかじめＥｃｏＲＩで切断し末端を脱リン酸化したｐＣＡＧＧＳベクターにクローン化しｐＣＡＧＧＳ／ｍｉｍｉｔｉｎを作製した。
マウスに関してはマウスの胃の細胞の一本鎖ｃＤＮＡを、市販のスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）一本鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡ（１μｇ）に対して合成した。得られた１本鎖ｃＤＮＡ１μｌ（全量２０μｌ）をＰＣＲの鋳型として使用した。ヒト配列と相同の配列をもつマウスｃＤＮＡ断片をＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａ  ｂａｓｅより検索し、マウスｍｉｍｉｔｉｎをコードするポリヌクレオチドをＲＴ−ＰＣＲ用プライマーとしてｍｏｕｓｅ  ｍｉｍｉｔｉｎ  ＲＴ−Ｆ（５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＧＧＣＡＧＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＣＣＧＧＴＧＴＧＴＧＧＣＧＣ−３’：配列番号１３）と、ｍｏｕｓｅ  ｍｉｍｉｔｉｎＲＴ−Ｒ（５’−ＧＧＴＣＧＡＡＴＴＣＡＴＴＧＡＣＴＴＴＧＴＣＴＴＴＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣ−３’：配列番号１４）とを使用して増幅した。温度プロファイルは、９８℃での１５秒間の熱変性工程と、６５℃での１分間のアニーリング工程と、７２℃での２分３０秒間の伸張工程を１サイクルとして３５サイクルの処理をした。
次いで、増幅したｃＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ社製）にクローン化し、その配列を決定した。得られたマウスｃＤＮＡの配列を配列番号３に示す。マウスｍｉｍｉｔｉｎでは１９６２７．８５の予測分子量を有する１６８個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしている。
実施例２
Ｍｉｍｉｔｉｎタンパク質の調製
増幅用のＰＣＲ用プライマーとして、ｍｉｍｉｔｉｎ−ＲＴ−Ｆ（配列番号１１、５’端にＥｃｏＲＩサイトを付加）とｍｉｍｉｔｉｎ−ＲＴ−Ｒ（配列番号１２、３’端にＥｃｏＲＩサイトを付加）とを使用し、０．５ｋｂ長ｃＤＮＡをＰＣＲプロトコールによってｐＴ／ｍｉｍｉｔｉｎを鋳型として増幅し、その０．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＥＴ２８（Ｎｏｖａｇｅｎ）（ＥｃｏＲＩで切断し、Ｅ．ｃｏｌｉアルカリホスファターゼで脱リン酸化した）に挿入し、ｐＥＴ／ｍｉｍｉｔｉｎ（Ｈｉｓタグ化Ｍｉｍｉｔｉｎタンパク質をコードしている）を作製した。上記０．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、ｐＧＥＸ−３Ｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（ＥｃｏＲＩで消化してＥ．ｃｏｌｉアルカリホスファターゼで脱リン酸化した）中に挿入し、ｐＧＥＸ／ｍｉｍｉｔｉｎ（ＧＳＴ融合Ｍｉｍｉｔｉｎタンパク質をコードしている）を作製した。Ｍｉｍｉｔｉｎタンパク質は上記プラスミドを用いて、常法により大腸菌にて産生し、さらにＨｉｓタグ化Ｍｉｍｉｔｉｎタンパク質はニッケルカラムをもちいて、あるいはＧＳＴ融合Ｍｉｍｉｔｉｎタンパク質はグルタチオンカラムを用いてアフィニティー精製した。
実施例３
ｍｉｍｉｔｉｎの発現
実施例２にて調製した抗原を用い、常法に従い抗Ｍｉｍｉｔｉｎウサギ抗体を作製した。この抗体を用い、ヒト膠芽腫細胞株Ｔ９８Ｇ細胞を基本的に既に記載された方法（Ｔｓｕｎｅｏｋａ  Ｍ．，ａｎｄ  Ｍｅｋａｄａ  Ｅ．，１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：９１０７−９１１１）に従って間接免疫蛍光法により染色すると、細胞質が染色された。
（１）Ｍｉｍｉｔｉｎタンパク質の誘導発現
Ｔ９８Ｇ細胞およびＴ９８Ｇｍｙｃｅｒ細胞を、既報（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：３５４５０−３５４５９（２００２））に従ってＯＨＴ（４−ヒドロキシタモキシフェン）で処理し、さらに４０時間培養を続けた。次いで、前記細胞を回収し、抗Ｍｉｍｉｔｉｎウサギ抗体を用いてウエスタンブロッティングによりＭｉｍｉｔｉｎタンパク質の発現を調べた（図１Ａ、左パネル）。次に、Ｔ９８Ｇ細胞を、Ｍｉｍｉｔｉｎを発現するベクターおよびｃ−ｍｙｃで標識したＭｉｍｉｔｉｎを発現するベクターをそれぞれ導入して、上記と同様にＭｉｍｉｔｉｎタンパク質の発現を調べた（図１Ａ、右パネル）。
その結果、Ｍｉｍｉｔｉｎタンパク質はアミノ酸配列から予想される２０ｋｄのバンドとして検出されること、Ｍｉｍｉｔｉｎタンパク質の発現はＯＨＴによるｃ−ＭｙｃＥＲの活性化により上昇すること、その発現誘導は細胞増殖の刺激を伴わないこと、ならびに外来性のＭｉｍｉｔｉｎを発現させた場合も同様に２０ｋｄのバンドとして検出されること、ｃ−ｍｙｃで標識したＭｉｍｉｔｉｎを発現させた場合は移動度が遅くなることがわかった。
（２）Ｍｉｍｉｔｉｎタンパク質の細胞内局在
６ウエルプレートのガラスカバースリップ上で生育したＨｅＬａ細胞を室温で３０分間４％パラホルムアルデヒドで固定し、さらに１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳ中で１０分間放置した。抗Ｍｉｍｉｔｉｎウサギ抗体を添加し、３７℃で１２０分間反応した。０．１％スキムミルクＰＢＳ懸濁液で３回洗浄した後、Ａｌｅｘａ４８８結合抗ウサギＩｇＧを添加し、３７℃で１２０分間反応し、０．１％スキムミルクＰＢＳ懸濁液で３回洗浄した。最後に、細胞をイムノン（Ｉｍｍｕｎｏｎ）（テルモ・シャンドン社製）中に埋設し、蛍光顕微鏡で観察し、撮影した。同様にして、ミトコンドリアの外膜に局在するＴｏｍ２０に対する抗体を用いて間接免疫蛍光法により染色し、蛍光顕微鏡で観察し、撮影した。得られた蛍光染色像および当該２種の染色像を重ね合わせた像（ｍｅｒｇｅ）を図１Ｂに示す。図１Ｂより、Ｍｉｍｉｔｉｎタンパク質はＴｏｍ２０と同様の染色像を示すことが判明し、Ｍｉｍｉｔｉｎはミトコンドリアに局在するタンパク質であることが示唆された。
ヒト膠芽腫細胞株Ｔ９８Ｇ細胞を、ミトコンドリア／サイトゾル分画キット（Ｂｉｏ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃａｔ＃  Ｋ２５６−１００）を用いて、濃縮されたミトコンドリア画分およびサイトゾル画分に分画し、それぞれの画分由来の抽出液をウエスタンブロッティングに供した。用いた抗体は、上記抗Ｍｉｍｉｔｉｎウサギ抗体、ミトコンドリアタンパク質Ｔｏｍ２２に対する抗体（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，３１９９６−３２００２）、抗ＭＡＰＫ／ＥＲＫ−１抗体（Ｋ−２３，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）である。結果を図１Ｃに示す。図１Ｃより、Ｍｉｍｉｔｉｎは、Ｔｏｍ２２と同様に、ミトコンドリア画分に局在することがわかった。
（３）ｍｉｍｉｔｉｎの発現解析
ｍｉｍｉｔｉｎ発現の様子をノーザンブロットにより調べた。
まず、ｃ−ｍｙｃ、ｍｉｍｉｔｉｎおよびＧＡＰＤＨの各ＤＮＡプローブを調製した。
ｃ−ｍｙｃプローブの調製：
ヒトｃ−ｍｙｃｃＤＮＡを含有するｐｃ−ｍｙｃ／ＣＤＭ８（Ｔｓｕｎｅｏｋａ  Ｍ．，Ｎａｋａｎｏ  Ｆ．，Ｏｈｇｕｓｕ  Ｈ．，ａｎｄ  Ｍｅｋａｄａ  Ｅ．，ｃ−ｍｙｃ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ＲＣＣ１  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｅ−ｂｏｘ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１４：２３０１−２３１１，１９９７）からの１．６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ断片を調製した（Ｔｓｕｎｅｏｋａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．：（１９９７）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４，２３０１−２３１１）。
ｍｉｍｉｔｉｎプロープの調製：
実施例２で作製した０．５ｋｂｐの断片を使用した。
ＧＡＰＤＨプローブの調製：
ＴＰＡ１０ｎＭ中で２４時間培養したＨＬ６０細胞から単離した全ＲＮＡから、５’−ＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴ−３’（配列番号１５）と、
５’−ＣＡＴＧＴＧＧＧＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣ−３’（配列番号１６）とをプライマーとして使用し、ＲＴ−ＰＣＲ法にて増幅して得られた１．８ｋｂの断片。ＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡの配列は直接シーケンス法によって確認した。
ヒト膠芽腫細胞株Ｔ９８Ｇ細胞（ｈｕｍａｎ，Ｃａｕｃａｓｉａｎ，ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ、ＥＣＡＣＣ  ９２０９０２１３、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６９０）、ヒト前骨髄性白血病細胞ＨＬ６０（ＥＣＡＣＣ  ８５０１１４３１、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２４０）から全ＲＮＡを市販のＲＮＡ調製液セット（ナカライテスク社製）を用いて、酸グアニジウム−チオシアネートフェノール−クロロホルム抽出法によって単離した。抽出したＲＮＡは、ホルムアルデヒド含有アガロースゲルを用いて電気泳動し、ハイボンドＮ（アマシャム社製）に転写し、先に調製した３２Ｐ標識した各ｃＤＮＡプローブで検出した。各プローブは、市販のＭｕｌｔｉｐｒｉｍｅラベリングキット（アマシャム社製）を用いて［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識した。結果はＢＡＳ２００イメージ分析（富士フィルム社製）を用いて定量した。
ヒト膠芽腫細胞株Ｔ９８Ｇ細胞を非必須アミノ酸と０．２５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有イーグル培地中で２日間培養し血清飢餓状態にした後、ウシ胎児血清を最終濃度１０％になるように加え血清刺激すると、ｃ−ｍｙｃ発現上昇に引き続き、ｍｉｍｉｔｉｎ発現の上昇が観察された（図２Ａ）。ヒト前骨髄性白血病細胞ＨＬ６０の培養液中に最終濃度が１０ｎＭになるようにＴＰＡ（ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌ  ｐｈｏｒｂｏｌ  ａｃｅｔａｔｅ）を加えると、ｍｙｃ発現減少に引き続き、ｍｉｍｉｔｉｎ発現の減少が観察された（図２Ｂ）。これらのことはｃ−ｍｙｃ発現とｍｉｍｉｔｉｎ発現が相関していることを示している。
実施例１（１）にて作製したＭｙｃＥＲを発現するＴ９８Ｇｍｙｃｅｒ細胞をＯＨＴ処理するとｍｉｍｉｔｉｎ発現が上昇し、その上昇はタンパク質合成阻害剤（ＣＨＸ、シクロヘキシミド）の存在下でも観察された（図２Ｃ）。このことから、ｃ−Ｍｙｃが新たなタンパク質合成を必要とせず、ｍｉｍｉｔｉｎの発現を直接的に上昇することが分かった。
（４）ｃ−Ｍｙｃによるｍｉｍｉｔｉｎ発現上昇機構の解析
ｍｉｍｉｔｉｎプロモーター領域からイントロン１に伸長しているヒトｍｉｍｉｔｉｎ遺伝子のゲノミックＤＮＡ断片を、プライマーとして
５’−ＧＴＧＧＡＧＧＧＣＡＧＴＴＡＴＴＣＴＴＴＧＧＡＧ−３’（配列番号１７）と、
５’−ＧＧＧＣＴＣＴＣＡＣＴＴＴＴＣＣＴＴＣＣＴＴＴＡ−３’（配列番号１８）とを用い、ヒト末梢血由来のＤＮＡを鋳型としＰＣＲで増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にクローニングした。そのプラスミドを鋳型として、
５’−ＧＴＧＧＡＧＡＣＧＣＧＴＴＡＴＴＣＴＴＴＧＧＡＧＴＡＡＣＴＴＡＡ−３’（配列番号１９、ＭｌｕＩサイトを付加）と
５’−ＧＧＧＧＣＴＣＣＣＡＴＧＧＴＴＣＣＴＴＣＣＴＴＴＡＣＴＧＡＣＣＴＣ−３’（配列番号２０、ＮｃｏＩサイトを付加）をプライマーとしてＤＮＡ断片を増幅した。得られた０．９ｋｂの断片を、ＭｌｕＩとＮｃｏＩとで切断した後、ＭｌｕＩとＮｃｏＩとで切断したｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（プロメガ社製）の４．８ｋｂ断片中に挿入し、ｐｍｉｍｉｔｉｎ（Ｗ）ｌｕｃｉを作製した。ｐｍｉｍｉｔｉｎ（Ｗ）ｌｕｃｉをＧｅｎｅ  Ｅｄｉｔｏｒインビトロ部位指向突然変異システム（プロメガ社製）を用いて、ｐｍｉｍｉｔｉｎ（Ｗ）ｌｕｃｉのＥ−ボックス部位（ＣＡＣＧＴＧエレメント）に突然変異を導入し、ＣＡＣＣＣＧに変異したｐｍｉｍｉｔｉｎ（ｍ）ｌｕｃｉを作製した。
Ｔ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞を、０．２５％ＦＣＳを追加した培地中で生育した。３ｘ１０４個の細胞をデイッシュ（１２ウエルプレート；ウエルの直径：２２ｍｍ）中にプレートし、２０〜２４時間培養した。１μｇのレポータープラスミドとインターナルマーカーとして２０ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶ（プロメガ社、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅをＣＭＶプロモーターにより発現する）をＦｕＧＥＮＥ６試薬（ロッシュ・ダイアグノステイックス社製）を用いて細胞に導入した。レポーター遺伝子導入１０時間後、最終濃度が０．２μＭになるようにＯＨＴを添加してＭｙｃＥＲキメラタンパク質を活性化し、更に９−１２時間培養した。次いで、細胞を回収して、ファイアフライ・ルシフェラーゼ（ｆｉｒｅｆｌｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）ならびにレニラ・レニホルミス・ルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）の活性をデュアル−ルシフェラーゼレポーターアッセイ系（ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ）（プロメガ社製）を用いて定量した。レニラ・レニホルミス・ルシフェラーゼ活性値を用いて試料間の遺伝子導入程度を標準化した後、活性化ＭｙｃＥＲを有する細胞からのファイアフライ  ルシフェラーゼ活性を、ＭｙｃＥＲ活性化していない細胞からの活性に対する比率として表した。ＭｙｃＥＲの活性化によらないＯＨＴの効果を標準化するために、Ｔ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞からの値を、上記Ｔ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞と同一方法で処理したＴ９８Ｇ親細胞からの値で割った値を求め、ＭｙｃＥＲキメラタンパク質の活性化に対するレポーター遺伝子の反応性とした。得られた結果を図３Ａに示す。図中、ｐＢａｓｉｃはベクターのみ、ｗｉｌｄはＣＡＣＧＴＧエレメントを、ｍｕｔａｎｔは変異したエレメントを導入した細胞を表わす。値は４回実験をしてその平均値で表している。
上記のようにしてｍｉｍｉｔｉｎ遺伝子のプロモーター部分を取り出し、ルシフェラーゼｃＤＮＡと繋ぎ、ｍｉｍｉｔｉｎプロモーター活性を測定するためのレポーター遺伝子を構築した。このレポーター遺伝子からのルシフェラーゼ発現はｃ−Ｍｙｃ（ＭｙｃＥＲ）を活性化することにより上昇した。ｃ−ＭｙｃはＣＡＣＧＴＧという配列に結合し、その遺伝子の転写を上昇することが知られている。ｍｉｍｉｔｉｎ遺伝子由来のプロモーター中のＣＡＣＧＴＧ配列に変異を導入すると、ｃ−Ｍｙｃ（ＭｙｃＥＲ）による発現上昇が見られなくなった（図３Ａ）。このことは、ｃ−ＭｙｃがＣＡＣＧＴＧ配列を介してｍｉｍｉｔｉｎ発現を上昇させることを示している。
（５）クロマチン免疫沈降実験
細胞内のｍｉｍｉｔｉｎゲノム遺伝子にｃ−Ｍｙｃタンパク質が直接結合しているかを調べるため、ＴＰＡ処理した白血病細胞ＨＬ６０を使って、クロマチン免疫沈降実験（Ｃｈｉｐ）を行った。
クロマチン免疫沈降実験は、ｃ−Ｍｙｃに対する抗体ならびに対照抗体を使用して行うとともに、抗体を使用しない対照実験も行った。この実験では、ｃ−Ｍｙｃに対する抗体は２種類使用した。１つはｃ−ＭｙｃのＮ−末端側半分と反応する抗体−１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ  Ｃａｔ＃  Ｎ２６２）、もう１つはＣ−末端側半分に主に結合する抗体−２（Ｔｓｕｎｅｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１４：２３０１−２３１１）である。アッセイは基本的にはすでに発表された方法に従って行った（Ｂｏｙｄ，Ｋ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．：（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ  １７，２５２９−２５３７）。免疫複合体は、非特異的な結合を妨げるように処理をしたプロテインＡビーズ（５０％容量／容量）２０μｌを添加することによって回収した。上記文献記載のようにして、ビーズを洗浄し、ＤＮＡ断片を溶出し、溶出した溶液をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈降させた。免疫沈降したＤＮＡ断片はＰＣＲによって検出した。使用したＰＣＲプライマーは、
５’−ＧＴＧＧＡＧＧＧＣＡＧＴＴＡＴＴＣＴＴＴＧＧＡＧ−３’（配列番号１７）と、
５’−ＧＧＧＣＴＣＴＣＡＣＴＴＴＴＣＣＴＴＣＣＴＴＴＡ−３’（配列番号１８）であり、これらのプライマーを使用してヒトｍｉｍｉｔｉｎ遺伝子のエクソン１にあるＥ−ボックスを含む０．９ｋｂｐの断片を増幅した。別のプライマーとしては、
５’−ＴＴＡＣＡＧＧＴＡＡＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＧＡＣＣ−３’（配列番号２１）と、
５’−ＧＣＡＡＡＧＣＴＡＣＣＡＴＴＴＡＧＧＡＡＣＣＣ−３’（配列番号２２）とを使用し、第２２番染色体中の検出可能な遺伝子を有しない領域に位置している（Ｂｏｕｃｈａｒｄ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．：（２００１）Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ  １５，２０４２−２０４７）Ｅ−ボックスにおけるゲノミック配列を増幅した。このＥ−ボックスは検出可能な遺伝子を有しないクロモソーム中に位置している（Ｂｏｕｃｈａｒｄ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．：（２００１）Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ  １５，２０４２−２０４７）。
上記のようにして２種類の抗ｃ−Ｍｙｃ抗体によりｍｉｍｉｔｉｎゲノム断片が回収されたが、対照抗体では回収されなかった（図３Ｂ）。またＴＰＡ処理することによりＭｙｃ発現をあらかじめ抑制しておくと、抗ｃ−Ｍｙｃ抗体によるｍｉｍｉｔｉｎゲノム断片回収はみられなくなった。遺伝子がないがＣＡＣＧＴＧ配列を含むゲノム断片はいずれの場合も抗ｃ−Ｍｙｃ抗体では回収されなかった。これらのことは、Ｍｙｃがｍｉｍｉｔｉｎゲノムに直接結合していることを示している。
以上よりｃ−Ｍｙｃがｍｉｍｉｔｉｎゲノム遺伝子に直接結合しその発現を上昇することが証明された。
実施例４
食道癌細胞におけるｍｉｍｉｔｉｎ発現解析
久留米大学にて採取していた食道癌組織を抗Ｍｉｍｉｔｉｎ抗体を用いて検出し、Ｍｉｍｉｔｉｎタンパク質の存在を調べた。検出は参考文献（Ｔｅｙｅ  Ｋ．，Ｔｓｕｎｅｏｋａ  Ｍ，Ａｒｉｍａ  Ｎ．，Ｋｏｄａ  Ｙ．，Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｙ．，Ｕｅｔａ  Ｙ，Ｓｈｉｒｏｕｚｕ  Ｋ．，ａｎｄ  Ｋｉｍｕｒａ  Ｈ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｍｙｃ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｇｅｎｅ  ｍｉｎａ５３  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １６４（１）：２０５−２１６．，２００４）に記載したものと同様の方法で行った。
実施例２に従って調製し、グルタチオンカラムを用いてアフィニティー精製したＧＳＴ融合Ｍｉｍｉｔｉｎタンパク質をさらに調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけることにより他のタンパク質と完全に分離し、Ｍｉｍｉｔｉｎタンパク質に対する抗体を作製するための抗原とした。この抗原を使用して常法により抗Ｍｉｍｉｔｉｎ血清を調製した。抗Ｍｉｍｉｔｉｎ血清をニッケルカラムをもちいて精製したＨｉｓタグ化Ｍｉｍｉｔｉｎタンパク質によりアフィニティー精製し、抗Ｍｉｍｉｔｉｎ抗体として使用した。この抗体を用いて食道癌組織内のタンパク質Ｍｉｍｉｔｉｎを検出するとともに、ＨＥ染色法を使って癌領域を識別した。１０％ホルマリン固定・パラフィン包埋食道癌組織を、脱パラフィン化し、ストレプトアビジン−ビオチン・コンプレックス・イムノパーオキシダーゼ法によって免疫染色した（Ｆｕｊｉｔａｎｉ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ２０００，４８：１６４９−１６５６）。抗原性を回復させるため、切片をマウントしたスライドを、１０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）中で２０分間オートクレーブした。３％過酸化水素のＰＢＳ溶液、次いで１％スキムミルクと５％ラビット血清を含むＰＢＳ溶液で前処理した後、最終濃度３．５μｇ／ｍｌの抗Ｍｉｍｉｔｉｎ抗体を含む１％スキムミルク溶液または抗Ｋｉ−６７抗体を、湿ったチェンバー中において４℃で一昼夜反応させた。０．０５％ツイーンのＰＢＳ溶液で３回洗浄した後、切片を、ビオチン化抗ウサギＩｇＧヤギ抗体またはビオチン化抗マウスＩｇＧウサギ抗体、続いてＨＲＰ−ストレプトアビジン・コンジュゲートとインキュベーションした。次いで、３、３−ジアミノベンジジンと過酸化水素を用いて、２分間発色させた後、水で洗浄して反応を停止させた。ヘマトキシリンで対比染色した後、スライドを脱水し、カバーガラスをかけた後、顕微鏡で観察した。
各切片を目視観察することによって０から４までの点数で記録した。点数は、最高の染色強度を有する切片を４点とし、染色しなかった切片を０点とした。染色された細胞の割合を推定するために、表示視界内の陽性細胞の数を数えて、染色細胞の割合（％）で表した。また、染色インデックスは、染色強度に染色細胞の平均割合％を乗じた値として計算した。図４に示す切片には中程度に分化した食道癌細胞が含まれていた（図４Ａ）。図４Ｂに示すように、癌領域内が抗Ｍｉｍｉｔｉｎ抗体により顕著に染色されていた。染色は、主に細胞質に見出された（図４Ｂ）。該抗体を使用せずに切片を処理したとき（図４Ｃ）、この染色は認められなかった。染色されている細胞は抗ｃ−Ｍｙｃ抗体で染色される領域と良く重なった（図４Ｄ）。これは、ｍｉｍｉｔｉｎがＭｙｃ標的遺伝子であることと矛盾しない。増殖中の細胞を検出するために広く使用されている抗Ｋｉ−６７抗体で染色すると、癌領域内が強く染色され、この領域は抗Ｍｉｍｉｔｉｎ抗体で染色される領域と重なった（図４Ｅ）。これらの結果より、Ｍｉｍｉｔｉｎは食道癌細胞における細胞増殖に関連していることが示唆される。
次に、３５人の食道癌患者からの癌切片を染色しそれぞれについて染色強度、染色細胞の割合（％）、染色程度を決定した（表１）。また２３例の食道正常上皮での発現を癌部と同様の方法で測定したところ染色程度の平均が０．８０５と算出された。正常上皮でのＭｉｍｉｔｉｎの染色程度よりも大きい値を示す癌をＭｉｍｉｔｉｎ高発現癌と判定した。その結果、８０％（３５例中２８例）でＭｉｍｉｔｉｎの高発現が見られた。このことからＭｉｍｉｔｉｎ発現は食道癌に特徴的であることが判明した。
Ｍｉｍｉｔｉｎの染色程度と癌の生物学的特徴（分化度、進行度、増殖程度（図４Ｅ））とを比較した。抗Ｋｉ−６７抗体はマウスモノクローナル抗体（ＭＩＢ−１）（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用した。Ｋｉ−６７に関しても３５人の食道癌患者からの癌切片について染色強度、染色細胞の割合（％）、染色程度をＭｉｍｉｔｉｎと同様の方法で決定した。ｃ−Ｍｙｃに関しても３５人の食道癌患者からの癌切片について染色強度、染色細胞の割合（％）、染色程度をＭｉｍｉｔｉｎと同様の方法で決定した。得られた結果を表１と表２に示す。表２中、ｒは相関を示す。この値が＋で大きい程正の相関がある。Ｐはｐ値を示す。ｐ値は０．０５以下だとその相関は有意であると考える。
【表１】
2005111213.tif 000002
2005111213.tif 000003
【表２】
2005111213.tif 000004
抗Ｍｉｍｉｔｉｎ抗体による染色パターンは抗Ｋｉ−６７抗体のそれと良く似ている。Ｋｉ−６７は細胞増殖している細胞のみで発現され、抗Ｋｉ−６７抗体は組織中で細胞増殖している細胞を探し出すために一般的に使われている。抗Ｍｉｍｉｔｉｎ抗体で染色されるところが抗Ｋｉ−６７抗体でも染色されたということはＭｉｍｉｔｉｎが発現している細胞は増殖していることを示している。以上より、Ｍｉｍｉｔｉｎ発現と細胞増殖に関係があることが分かった。
実施例５
種々の培養細胞の増殖におけるＭｉｍｉｔｉｎの関与
Ｍｉｍｉｔｉｎの生物学的機能を調べるために、大腸癌細胞株ＳＷ６２０、子宮頸部癌細胞株ＨｅＬａ、食道扁平上皮癌細胞ＴＥ−１１、Ｔ９８Ｇ、胎児肺細胞ＨＥＬおよび肝細胞癌株Ｋｙｎ２を用いて、ＲＮＡ干渉によるＭｉｍｉｔｉｎの発現抑制と細胞増殖との関係を調べた。
ｍｉｍｉｔｉｎ特異的なｓｉＲＮＡ（下記実施例６に記載のｓｉ−ｍｉｍｉｔｉｎ−２）を実質的に文献記載の方法と同じ方法で細胞に導入した（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．：（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１１，４９４−４９８）。ｓｉＲＮＡ導入の２４時間前に、指数関数的生育期の細胞をトリプシン処理し、１２ウエルプレートにプレートした。ｓｉＲＮＡは１ウエルあたり２００ｐｍｏｌｅを、市販のオリゴフェクタミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（ライフテクノロジー社）を用いて細胞に導入した。無血清培地では２０時間以上培養し、ｓｉＲＮＡを導入した。この方法によりｍｉｍｉｔｉｎ特異的なｓｉＲＮＡを培養細胞に導入すると、調べたすべての細胞においてｍｉｍｉｔｉｎ発現が減少した（図５Ａ）。
次に、ｓｉＲＮＡ導入した培養細胞および導入しない培養細胞をさらに培養を続け、その増殖の程度を細胞数を計数することにより調べた。結果を図５Ｂに示す。図５Ｂより、ＴＥ−１１、Ｔ９８ＧおよびＨＥＬ細胞は細胞の増殖が抑制されたが、ＳＷ６２０、ＨｅＬａおよびＫｙｎ２細胞は抑制されなかった。
上記６種の細胞について、ｃ−Ｍｙｃのレベルをウエスタンブロッティングにより比較した（図５Ｃ）。図５Ｃより、ｍｉｍｉｔｉｎのノックダウンにより増殖が影響されなかったＳＷ６２０およびＨｅＬａ細胞は、ｃ−Ｍｙｃが高レベルに発現していた。ＴＥ−１１、Ｔ９８ＧおよびＫｙｎ２細胞は、ｃ−Ｍｙｃの発現が相対的に低く、同等のレベルであった。この群においては、ＴＥ−１１およびＴ９８Ｇ細胞でｍｉｍｉｔｉｎのノックダウンにより細胞増殖が抑制されたが、Ｋｙｎ２細胞では抑制されなかった。ＨＥＬ細胞においては、ｃ−Ｍｙｃの発現レベルが非常に低く、ｍｉｍｉｔｉｎのノックダウンによる細胞増殖の抑制は弱かった。最も抑制効果の高かったＴＥ−１１細胞を用いて、さらに解析を進めた。
実施例６
ｓｉＲＮＡを用いたＭｉｍｉｔｉｎ機能解析
次に食道癌細胞の増殖にＭｉｍｉｔｉｎタンパク質が関係していることを直接観察するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養食道癌細胞を用いて実験した。
まずｃ−ｍｙｃ  ｓｉＲＮＡ（Ｃａｔ＃  ４６０４；Ａｍｂｉｏｎ  Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）によって培養食道癌細胞ＴＥ−１１（東北大学加齢医学研究所  医用細胞資源センターより分与される。食道癌、扁平上皮癌、ＴＫＧ  ０２６２：：ＴＥ−１１）を処理し、抗ｃ−Ｍｙｃ抗体、抗Ｍｉｍｉｔｉｎ抗体を用いてウエスタンブロット解析によりｃ−Ｍｙｃ、Ｍｉｍｉｔｉｎタンパク質を検出した。その結果、ｃ−Ｍｙｃ発現を減少させるとＭｉｍｉｔｉｎタンパク質発現が減少することがわかった（図６Ａ）。このことは培養食道癌細胞中でもＭｉｍｉｔｉｎ発現がｃ−Ｍｙｃによってコントロールされていることを示している。
次に、２１個のヌクレオチドからなるヒトｍｉｍｉｔｉｎに対して特異的なｓｉＲＮＡ二本鎖ｓｉ−ｍｉｍｉｔｉｎ−１およびｓｉ−ｍｉｍｉｔｉｎ−２を常法にしたがって化学的に合成した：
ｓｉ−ｍｉｍｉｔｉｎ−１；ｍｉｍｉｔｉｎ  ｃＤＮＡの開始コドンの第１ヌクレオチドに対して位置７２−９０に相当する部分をリボヌクレオチドにより合成し、その３’末端に２つのｄＴ（デオキシリボヌクレオチド）を付加した。
５’−ＣＡＣＧＧＡＣＣＡＡＵＵＣＧＧＧＡＡＣｄＴｄＴ（配列番号２３）と５’−ＧＵＵＣＣＣＧＡＡＵＵＧＧＵＣＣＧＵＧｄＴｄＴ（配列番号２４）（ここに、ｄＴはデオキシリボヌクレオチド、それ以外はリボヌクレオチド）とをアニーリングして作製；および
ｓｉ−ｍｉｍｉｔｉｎ−２；ｍｉｍｉｔｉｎ  ｃＤＮＡの開始コドンの第１ヌクレオチドに対して位置３３０−３４８に相当する部分をリボヌクレオチドにより合成し、その３’末端に２つのｄＴ（デオキシリボヌクレオチド）を付加した。
５’−ＡＣＵＣＣＵＵＡＧＵＡＡＡＧＡＧＡＣＣｄＴｄＴ（配列番号２５）と５’−ＧＧＵＣＵＣＵＵＵＡＣＵＡＡＧＧＡＧＵｄＴｄＴ（配列番号２６）（ここに、ｄＴはデオキシリボヌクレオチド、それ以外はリボヌクレオチド）とをアニーリングして作製。
非特異的コントロールとして、市販の対照ｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ  Ｃａｔ＃  ４６１１）を用いた。
次いで、実質的には文献記載の方法と同じ方法で細胞に導入した（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．：（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１１，４９４−４９８）。ｓｉＲＮＡ導入の２４時間前に、指数関数的生育期の細胞をトリプシン処理し、１２ウエルプレートにプレートした。ｓｉＲＮＡは１ウエルあたりｓｉＲＮＡ２００ｐｍｏｌｅと、市販のオリゴフェクタミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（ライフテクノロジー社）とを用いて細胞に導入した。無血清培地では２０時間以上培養し、ｓｉＲＮＡを導入した。
ｓｉ−ｍｉｍｉｔｉｎ−１およびｓｉ−ｍｉｍｉｔｉｎ−２を、ｍｉｍｉｔｉｎの発現を特異的に阻止するために適用したところ、食道癌細胞ＴＥ−１１中でＭｉｍｉｔｉｎタンパク質の発現が特異的に減少した。他方、Ｍｉｍｉｔｉｎタンパク質の発現は、対照ｓｉＲＮＡによっでは減少しなかった。Ｍｉｍｉｔｉｎタンパク質の発現が減少したとき、細胞増殖が著しく阻害されることが観察された。これらの結果は食道癌細胞の増殖におけるｍｉｍｉｔｉｎの重要性を示している。
ｓｉ−ｍｉｍｉｔｉｎ−１  ｓｉＲＮＡおよびｓｉ−ｍｉｍｉｔｉｎ−２  ｓｉＲＮＡのいずれによってもＭｉｍｉｔｉｎ発現を抑制することができた。ｓｉ−ｍｉｍｉｔｉｎ−１  ｓｉＲＮＡよりもｓｉ−ｍｉｍｉｔｉｎ−２  ｓｉＲＮＡの方が強く発現抑制をした（図６Ａ）。この時の細胞増殖を観察したところ、ｍｉｍｉｔｉｎ発現抑制により細胞増殖が強く抑制されることが分かった（図６Ｂ）。増殖抑制の程度はｓｉ−ｍｉｍｉｔｉｎ−１  ｓｉＲＮＡよりもｓｉ−ｍｉｍｉｔｉｎ−２  ｓｉＲＮＡの方が強く、これは発現抑制の程度と相関していた。即ち、ｍｉｍｉｔｉｎ発現を強く抑える方が細胞増殖を強く抑えており、このことからｍｉｍｉｔｉｎの発現を抑えることと細胞増殖抑制が相関していることが分かる。
この細胞ではｃ−ｍｙｃ  ｓｉＲＮＡによってｃ−Ｍｙｃ発現を抑えた時に細胞増殖抑制が観察された。このことはｃ−ｍｙｃ発現がこの細胞の増殖に必要なことを示している。ｃ−Ｍｙｃはｍｉｍｉｔｉｎ発現を上昇する機能をもっている。ｍｉｍｉｔｉｎはこの細胞の増殖に必要なので、ｃ−Ｍｙｃによる細胞増殖促進作用にｍｉｍｉｔｉｎ遺伝子が関係していると考えられる。
以上より、ｍｉｍｉｔｉｎは新しいＭｙｃ標的遺伝子であり、食道癌細胞において細胞増殖に必要であることが判明した。このことからｍｉｍｉｔｉｎが食道癌の診断、治療に応用できる可能性があると考えられる。
【配列表フリーテキスト】配列番号２３；ｎは、デオキシチミン（存在位置２０−２１）である。
配列番号２４；ｎは、デオキシチミン（存在位置２０−２１）である。
配列番号２５；ｎは、デオキシチミン（存在位置２０−２１）である。
配列番号２６；ｎは、デオキシチミン（存在位置２０−２１）である。
【産業上の利用可能性】  ｍｉｍｉｔｉｎ遺伝子は食道癌などのがんの診断、治療に応用できると考えられる。ｍｉｍｉｔｉｎ遺伝子の作用を阻害するインヒビター（阻害物質）は新しい抗がん剤となる可能性がある。
以上、本発明の具体的な態様のいくつかを詳細に説明したが、当業者であれば示された特定の態様には、本発明の教示と利点から実質的に逸脱しない範囲で様々な修正と変更をなすことは可能である。従って、そのような修正及び変更も、すべて後記の請求の範囲で請求される本発明の精神と範囲内に含まれるものである。
本出願は、日本で出願された特願２００４−１４７９６４（出願日：２００４年５月１８日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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