(57)【要約】本発明は、補助人工心臓（ＶＡＤ）併用下に投与される、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、特発性心筋症（ＩＣＭ）、拡張型心筋症（ＤＣＭ）または心不全治療のための、血管新生サイトカインをコードする遺伝子からなる医薬である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
補助人工心臓（ＶＡＤ）併用下に投与される、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、特発性心筋症（ＩＣＭ）、拡張型心筋症（ＤＣＭ）または心不全治療のための、血管新生サイトカインをコードする遺伝子からなる医薬。
【請求項２】
血管新生サイトカインが、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）およびインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）からなる群より選ばれた一種である、請求項１記載の医薬。
【請求項３】
血管新生サイトカインがＨＧＦである、請求項１または２記載の医薬。
【請求項４】
遺伝子がプラスミドの形にある、請求項１ないし３いずれか記載の医薬。
【請求項５】
血管新生サイトカインが心筋に直接投与される、請求項１ないし４いずれか記載の医薬。
【請求項６】
血管新生サイトカインが心筋の複数箇所に投与される、請求項１ないし５いずれか記載の医薬。
【請求項７】
心筋が左心室壁の虚血部位である、請求項１ないし６いずれか記載の医薬。
【請求項８】
ＶＡＤが、左室補助人工心臓（ＬＶＡＤ）である、請求項１ないし７いずれか記載の医薬。
【請求項９】
請求項１に記載の医薬を補助人工心臓（ＶＡＤ）併用下の患者に投与することにより、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、特発性心筋症（ＩＣＭ）、拡張型心筋症（ＤＣＭ）または心不全を治療する方法。
【請求項１０】
補助人工心臓（ＶＡＤ）併用下の患者の急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、特発性心筋症（ＩＣＭ）、拡張型心筋症（ＤＣＭ）または心不全を治療する医薬を製造するための血管新生サイトカインをコードする遺伝子の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は心不全治療のための遺伝子治療またはその医薬である。
【背景技術】  以下の説明における［番号］は後に記載した文献を示す。
重症慢性心不全（ＣＨＦ）患者においては、依然として心移植が究極的な治療方法である。
しかしながら心移植の全般的な適用可能性は、ドナーの極端な不足により限定的である［１］。
重症ＣＨＦ患者の多くに対する薬物治療は十分ではなく、血管再開通術や他の外科的手法も通常は一時的なものに過ぎず、全体的に最終死亡率を大幅に減じるものではない。
左室補助人工心臓（ＬＶＡＤ）は、心移植が実施できるまで、血液循環補助のために多頻度に用いられている。
しかし不幸なことに多くの患者は、この装置装着下に数ヶ月ないし数年を過ごしている。
ＬＶＡＤの改良は臨床的に有意な生存利益を与え、重症ＣＨＦ患者のＱＯＬ（ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ）を改善したが、一層の改善が求められている［２］。
最近、装着に成功したＬＶＡＤによる心機能の回復が十分だった末期ＣＨＦ患者に関し、数件の報告がなされている。［３−５］
しかしながらこのような患者は、ＬＶＡＤを使用している患者のうちわずかな割合を占めるに過ぎない。
また長期回復成果、回復の機序、どの患者に対し適用可能かなど、依然不明であった。
重症ＣＨＦ患者数は増加しているため、再生医療のような他の選択肢を探す努力も続けられている。
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、筋肉細胞を含む種々の細胞において、その特異的レセプターであるｃ−Ｍｅｔを介し細胞分裂、遊走／移動（ｍｏｔｏｇｅｎｉｃ）、形態変化（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ）を起こさせることによる血管再生作用を有している［６，７］。
我々発明者は以前、ＨＧＦが心筋において繊維化抑制作用およびアポトーシス抑制作用を示すことを示した［８−１０］。
繊維化の進行、内皮機能障害の進行、機能する毛細血管の喪失、およびアポトーシスに関連した収縮容量喪失のような、重症心不全の発症上の特徴を考慮すると［１１，１２］、ＨＧＦは、心障害におけるリモデリング過程を減じる有用な効果を有するかもしれない［１３，１４］。
従ってＨＧＦ遺伝子導入は、ＬＶＡＤ補助下における心障害に、“自己心機能回復への橋渡し（Ｂｒｉｄｇｅ  ｔｏ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ）“を可能とするかもしれない。
この可能性を検証するため、我々はＬＶＡＤを埋設した心障害ヤギに対し、ＨＧＦ遺伝子治療を実施した。
ＷＯ０１／０２６６９４公報は、心機能修復のため、センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソームに封入したＨＧＦ遺伝子を、心筋病変部位に非侵襲的に投与する方法を開示している。
しかしながらこの先行技術は、裸の（ｎａｋｅｄ）プラスミドの投与や補助人工心臓（ＶＡＤ）との組み合わせに関しては、何ら開示していなかった。
【発明の開示】
本発明は以下それぞれに関する。
（１）助人工心臓（ＶＡＤ）併用下に投与される、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、特発性心筋症（ＩＣＭ）、拡張型心筋症（ＤＣＭ）または心不全治療のための、血管新生サイトカインをコードする遺伝子からなる医薬、
（９）上記医薬を補助人工心臓（ＶＡＤ）併用下の患者に投与することにより、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、特発性心筋症（ＩＣＭ）、拡張型心筋症（ＤＣＭ）または心不全を治療する方法、または
（１０）補助人工心臓（ＶＡＤ）併用下の患者の急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、特発性心筋症（ＩＣＭ）、拡張型心筋症（ＤＣＭ）または心不全を治療する医薬を製造するための血管新生サイトカインをコードする遺伝子の用途。
【図面の簡単な説明】  図１は、心臓障害の動物モデルおよび実験デザインを示した写真である。
Ａ，成体ヤギ心臓の左前下行枝（ＬＡＤ）を結紮して心筋梗塞を作製し、心筋中に直接、ｈＨＧＦ  ｃＤＮＡまたはβ−ガラクシダーゼをコードするプラスミドを投与した。
Ｂ，心障害ヤギに両心室補助装置［Ｂｉ−ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ａｓｓｉｓｔ  ｄｅｖｉｃｅｓ（ＢＶＡＤ）］を装着した状況である。
Ｃ，超音波振動子の装着部位を示した写真である。
手術時、２個の超音波振動子を図示のように、心内膜中乳頭筋レベルで左室短軸と平行に埋設した。
図２は、本実験における、ＶＡＤ補助率を比較したグラフ（Ａ）、およびＨＧＦ群（□）と対照群（○）の原（ｎａｔｉｖｅ）心拍出量を比較したグラフ（Ｂ）である。
データは平均±標準偏差で示した。
＊対照群に対しＰ＜０．０１を示す。
図３は、音波測微法（ｓｏｎｏｍｉｃｒｏｍｅｔｒｙ）により算出した、％左室内径短縮率（％ＦＳ）で壁収縮能を比較した図である。
ＨＧＦ群は□で、対照群は○で示した。
データは平均±標準偏差で示した。
＊対照群に対しＰ＜０．０１を示す。
図４は、ＶＡＤを取り除いた後の血行動態変化を示した図である。
心拍数（Ａ，ＨＲ）、全身血圧（Ｂ，平均ＡｏＰ）、混合静脈血酸素飽和度（Ｃ，ＳｖＯ２）、肺動脈圧（Ｄ，ｍｅａｎ  ＰＡＰ）、原（ｎａｔｉｖｅ）心拍出量（Ｅ，ＣＯ）および左室拡張末期径（Ｆ，ＬＶＤｄ）を測定した。
データは平均±標準偏差で示した。
＊対照群に対しＰ＜０．０５を示す。
図５は、遺伝子導入４週後の心組織学的所見を示した写真である。
Ａ，Ｂ，左室短軸面断層部の顕微鏡所見
Ｃ，Ｄ，梗塞領域に隣接する心筋（梗塞部位、正常部位）をアザン−トリクローム染色した結果。（直線＝１００μｍ、原拡大率×１００）
Ｅ，Ｆ，境界領域心筋をヘマトキシリン・エオジン染色した結果。（直線＝１００μｍ、原拡大率×２００）
Ｇ，Ｈ，フォンヴィレブランド抗体による免疫組織染色した結果。（直線＝１００μｍ、原拡大率×２００）
矢印は、フォンヴィレブランド抗体に対し陽性の内皮細胞の例を示す。
Ａ，Ｃ，ＥおよびＧはＨＧＦ群である。
Ｂ，Ｄ，ＦおよびＨは対照群である。
図６は、組織学的所見の評価結果を示したグラフである。
Ａ，線維化率
Ｂ，境界領域における筋細胞直径
データは平均±標準偏差で示した。
Ｃ，血管密度
細動脈密度
発明の詳細な説明
本発明は、詳細には以下も含む。
（２）血管新生サイトカインが、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）およびインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）からなる群より選ばれた一種である、（１）記載の医薬、
（３）血管新生サイトカインがＨＧＦである、（１）または（２）記載の医薬、
（４）遺伝子がプラスミドの形にある、（１）ないし（３）いずれか記載の医薬、
（５）血管新生サイトカインが心筋に直接投与される、（１）ないし（４）いずれか記載の医薬、
（６）血管新生サイトカインが心筋の複数箇所に投与される、（１）ないし（５）いずれか記載の医薬、
（７）心筋が左心室壁の虚血部位である、（１）ないし（６）いずれか記載の医薬、
（８）ＶＡＤが、左室補助人工心臓（ＬＶＡＤ）である、（１）ないし（７）いずれか記載の医薬、
重症心不全においては、心移植までの血液循環補助に左室補助人工心臓（ＬＶＡＤ）がしばしば用いられているが、長期ＬＶＡＤ使用における死亡率は依然として高い。我々は肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）が血管新生作用、繊維化抑制作用およびアポトーシス抑制作用を有することを明らかにした。従ってＨＧＦ−ｃＤＮＡプラスミドを用いる遺伝子治療は、“自己心機能回復への橋渡し（Ｂｒｉｄｇｅ  ｔｏ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ）“の可能性を高めるかもしれない。本研究では、我々は心障害ヤギにおいて、ＬＶＡＤ使用下にＨＧＦ遺伝子治療を行った。詳しくは、６匹の成体ヤギ（５６−６５ｋｇ）に対し、冠動脈結紮により心障害を作製しＶＡＤを装着した。ＨＧＦ群（ｎ＝３）には、ヒトＨＧＦ−ｃＤＮＡプラスミド（２．０ｍｇ）を心筋内投与した。対照群（ｎ＝３）には、β−カラクトシダーゼ・プラスミドを同様に投与した。遺伝子導入４週後、すべてのヤギからＶＡＤを取り外した。ｈＨＧＦ−ｃＤＮＡを遺伝子導入した心筋においては、導入３日後に１．０±０．３ｎｇ／組織（ｇ）レベルでヒトＨＧＦタンパクを含有した。ＶＡＤを取り除いた後、ＨＧＦ群は良好な血行動態を示したのに対し、対照群では悪化が認められた。％左室内径短縮率は、ＨＧＦ群は対照群と比較し有意に高かった（ＨＧＦ  ｖｓ．ｃｏｎｔｒｏｌ，３７．９±１．７％  ｖｓ．２６．４±０．３％，ｐ＜０．０１）。対照群においては心筋細胞肥大および繊維化を伴う左室拡張が認められたが、ＨＧＦ群では認められなかった。ＨＧＦ群においては血管密度が著増していた。これらの結果は、心障害に対するＶＡＤ使用下にヒトＨＧＦを用いた遺伝子治療は、“自己心機能回復への橋渡し（Ｂｒｉｄｇｅ  ｔｏ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ）“の可能性を高めるかもしれないことを示唆している。
【実施例】  以下の実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、これらには限定されない。
（１）方法
１）ヒトＨＧＦｃＤＮＡをコードしたプラスミドの調製
配列番号１で示されるヒトＨＧＦ（ｈＨＧＦ）を、［１５］に記載されているように、ｐＵＣ−ＳＲα発現ベクタープラスミドのＮｏｔＩ部位に挿入した。
このプラスミドにおいて、ｈＨＧＦｃＤＮＡの発現は、シミアンウィルス４０ポリアデニル化配列で構成されるＳＲαプロモータの制御下で調節される。
２０００μｇのｈＨＧＦ−ｃＤＮＡを含む精製プラスミドを無菌生理食塩水２．０ｍＬ中で再構成し、２．５ｍＬシリンジおよび３０ゲージ針を用いて、心筋の１０箇所に直接注射した。
心臓内でのｈＨＧＦ濃度は、抗ヒトＨＧＦ抗体（免疫学会、東京、日本）を用いた酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定した。
ｈＨＧＦに対する抗体は、ｈＨＧＦだけと反応し、ヤギＨＧＦとは反応しない。
血清ｈＨＧＦレベルについても、ｃＤＮＡ注射後、１、３、５、７、１４、２８日目に、同じＥＬＩＳＡ装置を用いて評価した。
（２）心臓機能障害の動物モデル
この研究のために、５６〜６５ｋｇの１０匹のヤギ成体を用いた。
すべての動物は、国立医学研究協会作成の「実験動物取扱方針（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）」および実験動物資源協会によって作成され、国立衛生研究所（ＮＩＨ出版番号８６〜２３、１９８５年改訂）によって出版されている「実験動物の取扱および使用の手引き（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）」に準拠するように、人道的に取り扱った。
イソフルランおよび亜酸化窒素による全身麻酔下において、左第５肋間開胸術を行った。
ポリエチレンカテーテルは、全身血圧（ＢＰ）測定のためには、左頸動脈を介して胸部大動脈に挿入し、静脈内注射のためには左頸静脈に挿入した。
光ファイバー肺動脈カテーテル（Ｏｘｉｍｅｔｒｉｘ；Ａｂｂｏｔｔ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ、イリノイ州ノースシカゴ）は、肺動脈内に配置して、混合静脈酸素消費量（ＳｖＯ２）と肺動脈圧（ＰＡＰ）を混合させるようにした。
心拍数（ＨＲ）は心電図によって連続的にモニタした。
大動脈血流およびバイパス流量を測定するために、電磁流量計（ＭＦ−２１００；日本光電、東京、日本）を上行大動脈内に、ＬＶＡＤを流出カニューレ内に配置した。
大動脈血流は、原（ｎａｔｉｖｅ）心拍質量の指標として用い、ＶＡＤ補助率は以下のようにして算出した。
ＶＡＤ補助率（％）＝バイパス流量（Ｌ／分）／［大動脈流量（Ｌ／分）＋バイパス流量（Ｌ／分）］
機能障害心臓は、左冠動脈前下行枝（ＬＡＤ）をその第１斜行分枝の遠位側に結紮することにより作成した（図１、Ａ）。
結紮後、すべてのヤギは心原性ショックを経験し、心室細動や心室頻脈などの重篤な不整脈を発症した。
全身循環を維持し、左室への負荷を除くために、体外において、左心房と下行大動脈の間にＬＶＡＤ（東洋紡、大阪、日本）を導入した。
血液の排出のためには、複数の側孔を有する１／２インチの塩化ビニル流入カニューレを用い、血液の回収のためには１２ｍｍの織グラフト（Ｍｅａｄｏｘ、米国オークランド）を有する１／２インチの塩化ビニル流出カニューレを用いた。
全身ヘパリン化後（３００ｕ／ｋｇ、静脈内注射）に、流出カニューレは下行大動脈に縫合し、流入カニューレは心肺バイパスを有しない左心房内に挿入した（図１、Ｂ）。
ＲＶＡＤ（東洋紡、大阪、日本）は、同様の手順により、体外にて、右心房と肺動脈幹の間に導入した（図１、Ｂ）。
ヤギをランダムに２つの群に分けた。
ＨＧＦ群においては、全量２．０ｍｇのｈＨＧＦ−ｃＤＮＡを含む２．０ｍＬのプラスミド溶液を、３０Ｇ針を用いて、左心室壁の虚血領域の１０カ所から心筋に注射した（図１、Ａ）。
ｈＨＧＦ−ｃＤＮＡプラスミドの注射に伴う血行動態の変化は見られず、この実験全体を通してヤギ達にアナフィラキシー反応などの明らかな悪影響は観察されなかった。
対照群において、等体積のβ−ガラクトシダーゼ・プラスミドを同様の手順で注射した。
その後、閉胸して麻酔から回復させた。
処理した心筋内のｈＨＧＦタンパク質を検出するために、ｃＤＮＡ注射の３日後に各群より２匹のヤギを屠殺した。
各群からの別の３匹において、ＢＶＡＤ下で４週間のあいだ、全身循環を引き続き維持した。
外科手術の２日後に、抗凝固法を行った。
ワルファリン・ナトリウムを、２．５〜３．５の範囲の国際標準比で標的に投与した。
血小板抗凝集剤は一切投与しなかった。
（３）心機能の評価
心機能の変化について、三次元デジタル音波測微計（ｓｏｎｏｍｉｃｒｏｍｅｔｒｙ）（ソノメトリック社（Ｓｏｎｏｍｅｔｒｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．）、オンタリオ、カナダ）を用いて評価した［１６］。
２つの超音波発振子を、手術時に、乳頭筋の高さにおいて短軸に平行な心内膜内に移植した（図１、Ｃ）。
これらの発振子を前壁内とその対向部位に配置して、ＬＡＤ冠動脈の分布における心筋収縮能を評価した。
心筋拡張期の最後（ＬＶＤｄ）および心筋収縮期の最後（ＬＶＤｓ）におけるＬＶ寸法を、同時に測定されたＬＶＰによって判定した。
ＬＶ短縮百分率（％ＦＳ）は以下のようにして算出した。
％ＦＳ（％）＝（ＬＶＤｄ−ＬＶＤｓ）／ＬＶＤｄ×１００
ＬＡＤ冠動脈の結紮の前後、遺伝子トランスフェクションの１、２、３および４日目に、ＢＶＡＤを短期間の間停止した状態で、％ＦＳと心拍出量を測定した。
（４）ＶＡＤ停止試験
遺伝子トランスフェクションの４週間後、すべてのヤギをＢＶＡＤから引き離す試みを行った。
全身ヘパリン化（３００ｕ／ｋｇ、静脈内注射）の後、ＢＶＡＤを停止した。
ＢＶＡＤ停止から５、１５、および３０分後、ＨＲ、ＢＰ、ＳｖＯ２、ＰＡＰ、心拍出量、およびＬＶＤｄを測定した。
（５）組織学的分析
プラスミド投与から４週間後、およびＶＡＤ停止試験の後、すべてのヤギをペントバルビタールナトリウムの過剰投与により安楽死させ、心臓を摘出した。
心臓を短軸において５つの小片に裁断し、ＬＶ心筋標本を１０％緩衝ホルマリン中に固定し、パラフィン中に包埋した。
各標本からのいくつかの連続した切片を５μｍの厚みにスライスし、組織学的観察および心筋細胞径の測定のためにヘマトキシリンおよびエオシンで、あるいはＡＺＡＮ−トリクロムで染色し、コラーゲン含量を評価した。
梗塞に隣接する境界領域における線維症が占める面積の割合を、１０のランダムに選択された視野上で測定し、結果を線維症の百分率として表した。
血管壁を、梗塞に隣接する境界領域において計数できるように血管内皮細胞を標識するために、フォンヴィレブランド因子に関連した抗原の免疫組織学的染色を、修正プロトコールに従って実施した。
ＨＲＰと連結されたフォンヴィレブランド因子に関連した抗原に対するＥＰＯＳ共役抗体（ＤＡＫＯ  ＥＰＯＳ抗−ヒト／ＨＲＰ、ＤＡＫＯ）を、一次抗体として使用した。
染色された血管内皮細胞を、１切片につき少なくとも１０のランダムに選択された視野を用いて、２００倍の光学顕微鏡下で、血管密度として計数した。
結果は、１ｍｍ２あたりの血管の数として表した。
病理学（細胞径、線維症の百分率、および血管密度）のコンピュータによる鑑定は、米国国立衛生研究所で開発された公開ドメイン画像プログラムを用いてマッキントッシュコンピュータによって実施した。
（６）統計学的分析
すべてのデータは、平均±標準偏差として表した。
ＡＮＯＶＡおよび対応のない検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）を用いて群同士の比較を行った。
すべての分析は、プログラムＳｔａｔＶｉｅｗ（バージョン５．０；Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ、Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バークレー）を用いて行った。
ｐ＜０．０５となる値が統計学的有意性を示すと考えた。
結果
（１）Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＨＧＦ遺伝子トランスフェクション
心臓にｈＨＧＦ−ｃＤＮＡプラスミドをトランスフェクトして３日後、ｃＤＮＡを注射した領域から得た心筋試料内のｈＨＧＦタンパク質含量を、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。
ｈＨＧＦ−ｃＤＮＡでトランスフェクトした心筋は、トランスフェクションの３日目に、組織１ｇあたりに１．０±０．３ｎｇという高い濃度ｈＨＧＦタンパク質を含んでいた。
対照的に、対象群の動物の心筋においては、ｈＨＧＦは検出されなかった。
血清ｈＨＧＦレベルは、この実験全体を通して２群のいずれにおいても検出されなかった。
（２）動物状態と全身血液状態データ
梗塞直後、すべてのヤギは、重篤な低拍出症候群および心性ショックを発症した。
原（ｎａｔｉｖｅ）心拍出量は、約２０または３０ｍＬ／ｋｇ／分低下した。
ＢＶＡＤの補助下において、すべての動物を良好な状態に維持し、ＶＡＤ補助による無負荷状態におけるＨＲおよびＢＰは、本実験を通じて２つの群間で違わなかった（表１）。
【表１】
2006046766.tif 000002
2006046766.tif 000003
ＶＡＤ補助率は、本実験を通じて約７０％に維持し、この比は２つの群の間で顕著には違わなかった（図２、Ａ）。
しかしながら、遺伝子トランスフェクションから４週間目には、ＨＧＦ群における心拍出力が対象群のものよりも著しく高くなっていた（ＨＧＦ群における８５．０±１．４ｍＬ／ｋｇ／分に対し、対照群における６４．６±６．０ｍＬ／ｋｇ／分、ｐ＜０．０１；図２、Ｂ）。
（３）心機能の評価
梗塞後、％ＦＳは、いずれの群においてもベースラインと比較して著しく減少し、劣化の程度は２つの群の間で違いはなかった。
％ＦＳは、遺伝子トランスフェクション後の２つの群において徐々に回復した。
しかしながら、ＨＧＦ群における％ＦＳの改善は、対照群よりもはるかに大きかった。
遺伝子トランスフェクション４日後のＨＧＦ群における％ＦＳは、対照群よりもはるかに回復していた。（ＨＧＦ群における３７．９±１．７％に対し、対照群における２６．４±０．３％、ｐ＜０．０１；図３）
（４）ＶＡＤ停止試験
遺伝子トランスフェクションの４週後、ＶＡＤ「停止試験」（図４）を行った。
ＢＶＡＤをオフにした後の負荷状態において、対照群においては、ＨＲが定常的に増加し、ＢＰが定常的に減少したが、ＨＧＦ群においては、これらのパラメータは安定なままであり劣化することはなかった。
対照群ではＳｖＯ２およびＰＡＰも、ＨＧＦ群のものとくらべて劣化していた。
ＶＡＤから引き離して３０分後の心拍出量は、対照群に比べてＨＧＦ群においてはるかに増加していた（ＨＧＦ群における８０．１±６．２ｍＬ／ｋｇ／分に対し、対照群における６１．２±４．３ｍＬ／ｋｇ／分、ｐ＜０．０５；図４）。
また対照群において、ＶＡＤから引き離した３０分後のＬＶＤｄは、ＨＧＦ群のものと比べてはるかに増加していた。（ＨＧＦ群における３５．８±１．６ｍｍに対し、対照群における４６．９±０．１ｍｍ、ｐ＜０．０５；図４）。
（５）組織学的評価
実験終了後の心臓の巨視的な所見では、動脈壁の壊死変化と瘢痕形成はいずれの群においても認められたものの、ＬＶ拡張は、対照群の場合と比べてＨＧＦ群において顕著に抑制されていることが分かった（図５、ＡおよびＢ）。
梗塞領域に隣接する心筋をアザン染色したところ、ＨＧＦ群においては、対照群の場合と比べて、線維変化も抑制されていることが分かった（図５、ＣおよびＤ）。
線維症の百分率は、対照群に比べて、ＨＧＦ群において著しく減少していた（ＨＧＦ群における１３．９±１．７％に対し、対照群における２２．３±１．３％、ｐ＜０．０１；図６、Ａ）。
境界域のＨＥ染色から、対照群においては心筋細胞が肥大変化しているが、ＨＧＦ群においてはこの変化が見られないことが分かった（図５、ＥおよびＦ）。
細胞径は、対照群に比べてＨＧＦ群の方がはるかに小さい（ＨＧＦ群における３９．６±０．５μｍに対し、対照群における５４．４±０．６μｍ、ｐ＜０．０１；図６、Ｂ）。
血管密度は、梗塞領域の境界域において調べた（図５、ＧおよびＨ）。
血管密度は、対照群に比べてＨＧＦ群においてはるかに高かった（ＨＧＦ群においては１視野あたりに血管３５．２±２．１本に対し、対照群においては１四やあたり血管２４．５±２．７本、ｐ＜０．０５；図６、Ｃ）。
考察
（１）ＶＡＤ単独による左心室の除負荷作用では、心筋梗塞後の心リモデリングを十分に抑制することができなかった。
（２）ＨＧＦ−ｃＤＮＡプラスミドによる遺伝子トランスフェクションは、ＶＡＤによる機械的除負荷作用下で損傷した心臓における心リモデリングを減衰させるとともに、ＶＡＤ単独による場合よりも、著しく良好に心機能を改善したことから、その「自己心機能回復への橋渡し」としての潜在的用途が示唆される。
最近になって、遺伝子治療または細胞移植を用いた再生治療のいくつかの研究において、心筋細胞の保護および損傷心臓における心機能の改善への効果を報告している［１７〜２０］。
しかしながら、そのような治療は実施に時間がかかり、処置後直ちに心不全を制御することができない。
ＶＡＤは全身循環を補助するだけでなく、心室の除負荷作用とともに心筋回復のための最適環境を与える［２〜５、２１〜２３］。
したがって、我々は、遺伝子治療とＶＡＤとを併用した治療を、重篤な心不全の治療のための新しい戦略として提案する。
ＶＡＤは心筋の再生のために十分な時間と適切な状況を提供し、再生的治療は損傷心臓における心筋の回復を促進して、「回復への橋渡し」を増大させる。
ＨＧＦは強力な脈管形成因子であり、我々は大阪大学医学部付属病院にて閉塞性動脈硬化の患者に対しその臨床応用を開始している［２４］。
さらに、ＨＧＦは脈管形成因子であるだけでなく、抗線維化および心回帰（ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｃ）活性を含む様々な生理学的活性を示す［６〜９、２５、２６］。
したがって、ＨＧＦは、心筋の再生を促進するのに有利であるに違いない。
心筋梗塞の慢性期における心機能の低下を伴う心リモデリングの進行は、心筋細胞のアポトーシスだけでなく、間質性線維症にも関与している。
特に、梗塞領域から遠く離れた線維症は、虚血性心筋症における心室再造形の主たる要因であると考えられる。
本研究においては、梗塞周辺領域において、ＨＧＦ遺伝子トランスフェクションにより、血管新生が誘引され、線維化が抑制される。
心リモデリングの間に線維化に寄与する分子のいくつかが同定されている［２７］。
トランスフォーミング成長因子βおよびアンジオテンシンＩＩが、線維症の病理学に重要な役割を果たすと信じられている［２８〜３０］。
これらの分子は様々な細胞型において局所的ＨＧＦ生産の負の調節剤である［７〜９］。
本研究においては、局所的なＨＧＦ発現の増加が、おそらくは以前に報告されているような分子の生産を阻害することにより［６〜１０］、心筋の線維化を防止しているのかもしれない。
ＨＧＦの送達に関して、本研究においては遺伝子治療用のベクターを使用しなかった。
これは、我々がすでに報告しているように、ＨＧＦ−ｃＤＮＡプラスミドは、直接投与でも、梗塞心筋における血管形成および心機能を高めるのに十分なＨＧＦを局所的かつ持続的に壁内に送達できるからである［６〜８、２４、２５］。
天然のＨＧＦも心臓保護因子として重要な役割を果たしていると考えられるが天然のＨＧＦは本実験において心リモデリングを減衰するには不十分である。
プラスミドの遺伝子トランスフェクションが、天然のＨＧＦの心臓保護機能も支援するので、連続的に発現されるタンパク質はより少ない量でも、血管形成を誘導し、これに続く局所的心機能の回復を支持するのに十分である［１３、１４］。
さらに、ＨＧＦは、パラクリン成長因子として機能し、心筋中へのＨＧＦ−ｃＤＮＡプラスミドの投与によるＨＧＦの生産は約１４日間持続する。
したがって、ウィルスベクターを用いないＨＧＦの局所合成副作用に対して安全であり、遺伝子治療中に血清ＨＧＦレベルは検出されない。
したがって、我々の結果は臨床応用を約束するものであろう。
本発明は、ＬＶＡＤ下での損傷心臓における再生治療の効力を実証した最初の報告であり、本研究のプロトコールは重篤な心不全に対する新しい治療戦略の１つとして用いることができる。
しかしながら、臨床に応用する際には、本研究のいくつかの制限を考慮しなければならない。
まず最初に、実験プロトコールの制限から、慢性期における損傷心筋の瘢痕の菲簿化（ｓｃａｒ  ｔｈｉｎｎｉｎｇ）や拡大に関して、本方法の効力を明確にすることができない。
拡張型心筋症患者においてなど、収縮量の損失が著しく増加する場合には、ＨＧＦ遺伝子トランスフェクションをもってしても、心筋の再生が収縮機能を増加させるのには不十分である。
したがって、治療効果を高めるために細胞心筋形成術などの収縮量を補う方法が必要かもしれない。
第２に、ヤギＨＧＦを測定するための技術が無いため、本実験における内在性ＨＧＦの変化および役割が明確でない。
第３に、ＨＧＦ効果の長期の成果についても明確でない。
本実験の設定において、冠状動脈結紮後、心室頻拍症や細動などの重篤な不整脈が頻繁に起こった。
したがって、我々はＶＡＤ流と全身循環を維持するために、ＲＶＡＤＳを移植した。
結論として、我々はＬＶＡＤ下において損傷した心臓中にｈＨＧＦ遺伝子をトランスフェクションすることにより心リモデリングを抑制する潜在的治療価値を実証したのである。
我々の結果は、心原性ショックを引き起こす急性心筋梗塞の設定において、ＨＧＦ遺伝子治療とＬＶＡＤとを併用した治療が、ＬＶＡＤ下において、重篤な損傷を受けた心臓における「自己心機能回復への橋渡し」の可能性を高め得る。
【非特許文献１】Ｈｏｓｅｎｐｕｄ  ＪＤ，Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＬＥ，Ｋｅｃｈ  ＢＨ，Ｆｉｏｌ  Ｂ，Ｂｏｕｃｅｋ  ＭＭ，Ｎｏｖｉｃｋ  ＲＪ．Ｔｈｅ  ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：Ｓｅｖｅｎｔｅｅｎｔｈ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｒｅｐｏｒｔｓ−２０００．Ｊ  Ｈｅａｒｔ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０００；１９：９０９−９３１．
【非特許文献２】Ｒｏｓｅ  ＥＡ，Ｇｅｌｉｊｎｓ  ＡＣ，Ｍｏｓｋｏｗｉｔｚ  ＡＪ，Ｈｅｉｔｊａｎ  ＤＦ，Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ＬＷ，Ｄｅｍｂｉｔｓｋｙ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ａｓｓｉｓｔａｎｃｅ  ｆｏｒ  ｅｎｄ−ｓｔａｇｅ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００１；３４５（２０）：１４３５−４３．
【非特許文献３】Ｆｒａｚｉｅｒ  ＯＨ，Ｍｙｅｒｓ  Ｔ．Ｌｅｆｔ  Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  Ａｓｓｉｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  ａｓ  ａ  Ｂｒｉｄｇｅ  ｔｏ  Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ．Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．１９９９；６８：７３４−７４１
【非特許文献４】Ｌｅｖｉｎ  ＨＲ，Ｏｚ  ＭＣ，Ｃｈｅｎ  ＪＭ，Ｐａｃｋｅｒ  Ｍ，Ｒｏｓｅ  ＥＡ，Ｂｕｒｋｈｏｆｆ  Ｄ．Ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｄｉｌａｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｄ−ｓｔａｇｅ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ  ｂｙ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｕｎｌｏａｄｉｎｇ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９９５；９１：２７１７−２０．
【非特許文献５】Ｈｅｔｚｅｒ  Ｒ，Ｍｕｌｌｅｒ  Ｊ，Ｗｅｎｇ  Ｙ，Ｗａｌｌｕｋａｔ  Ｇ，Ｓｐｉｅｇｅｌｓｂｅｒｇｅｒ  Ｓ，Ｌｏｅｂｅ  Ｍ．Ｃａｒｄｉａｃ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｉｎ  ｄｉｌａｔｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ  ｂｙ  ｕｎｌｏａｄｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ａｓｓｉｓｔ  ｄｅｖｉｃｅ．Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．１９９９；６８：７４２−７４９．
【非特許文献６】Ａｏｋｉ  Ｍ，Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ，Ｔａｎｉｙａｍａ  Ｙ，Ｋｉｄａ  Ｉ，Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ  Ａ，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｉｎｆａｒｃｔｅｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ａｎｄ  ｉｎｆａｒｃｔｅｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ：ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｅｔｓ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０００；７：４１７−４２７．
【非特許文献７】Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｋ，Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９６；１１９：５９１−６００．
【非特許文献８】Ｔａｎｉｙａｍａ  Ｙ，Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｔ，Ｎａｋａｇａｍｉ  Ｈ，Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ  Ａ，Ｓａｋｏｎｊｏ  Ｈ，Ｋｉｍ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉｆｉｂｒｏｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ，ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ｔｏ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｂｙ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｉｎ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｉｃ  ｈａｍｓｔｅｒｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０００；１０２：２４６−２５２．
【非特許文献９】Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ，Ｍｉｚｕｎｏ  Ｓ，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｋ，Ｓａｗａ  Ｙ，Ｍａｔｓｕｄａ  Ｈ，Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ．Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｂｙ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ａｎｄ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ＨＧＦ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０００；１０６：１５１１−１５１９．
【非特許文献１０】Ｕｅｄａ  Ｈ，Ｓａｗａ  Ｙ，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｋ，Ｋｉｔａｇａｗａ−Ｓａｋａｋｉｄａ  Ｓ，Ｋａｗａｈｉｒａ  Ｙ，Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｅａｒｔ．Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．１９９９；６７：１７２６−３１．
【非特許文献１１】Ｔｒｅａｓｕｒｅ  ＣＢ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＲＷ．Ｔｈｅ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．１９９３；２２：Ａ１２９−１３４．
【非特許文献１２】Ｐｆｅｆｆｅｒ  ＭＡ，Ｂｒａｕｎｗａｌｄ  Ｅ．Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９９０；８１：１１６１−１１７２．
【非特許文献１３】Ｏｎｏ  ｋ，Ｍａｔｓｕｍｏｒｉ  Ａ，Ｓｈｉｏｉ  Ｔ，Ｆｕｒｕｋａｗａ  Ｙ，Ｓａｓａｙａｍａ  Ｓ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ／ｃ−Ｍｅｔ  ｂｙ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ  ａｎｄ  ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９９７；９５：２５５２−２５５８．
【非特許文献１４】Ｕｅｄａ  Ｈ，Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｋ，Ｓａｗａ  Ｙ，Ｍａｔｓｕｄａ  Ｈ，Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ．Ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔｓ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｃｈ．２００１；５１：４１−５０．
【非特許文献１５】Ｓｅｋｉ  Ｔ，Ｈａｇｉｙａ  Ｍ，Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｉ  Ｍ，Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ，Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｓ．Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｇｅｎｅ．Ｇｅｎｅ．１９９１；１０２：２１３−２１９．
【非特許文献１６】Ｓｍｉｔｈ  Ｗ，Ｖｅｓｅｌｙ  Ｉ．Ｔｈｒｅｅ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １３ｔｈ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＥＥＥ−ＥＭＢＳ，１９９１．
【非特許文献１７】Ｔａｙｌｏｒ  ＤＡ，Ａｔｋｉｎｓ  ＢＺ，Ｈｕｎｇｓｐｒｅｕｇｅｓ  Ｐ，Ｊｏｎｅｓ  ＴＲ，Ｒｅｅｄｙ  ＭＣ，Ｈｕｔｃｈｅｎｓｏｎ  ＫＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ：ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｆｔｅｒ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９８；４：９２９−９３３．
【非特許文献１８】Ｋｏｃｈｅｒ  ＡＡ，Ｓｃｈｕｓｔｅｒ  ＭＪ，Ｓｚａｂｏｌｋｓ  ＭＪ，Ｔａｋｕｍａ  Ｄ，Ｂｕｒｋｈｏｆｆ  Ｄ，Ｗａｎｇ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ−ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｎｇｉｏｂｌａｓｔｓ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｒｅｄｕｃｅｓ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００１；７：４３０−４３６．
【非特許文献１９】Ｊａｃｋｓｏｎ  ＫＡ，Ｍａｊｋａ  ＳＭ，Ｗａｎｇ  Ｈ，Ｐｏｃｉｕｓ  Ｊ，Ｈａｒｔｌｅｙ  ＣＪ，Ｇｏｏｄｅｌｌ  ＭＡ．Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ｂｙ  ａｄｕｌｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００１；１０７：１３９５−１４０２．
【非特許文献２０】Ｓｕｚｕｋｉ  Ｋ，Ｍｕｒｔｕｚａ  Ｂ，Ｓｍｏｌｅｎｓｋｉ  ＲＴ，Ｓａｍｍｕｔ  ＩＡ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｎ，Ｋａｎｅｄａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００１；１０４［ｓｕｐｐｌ  Ｉ］：Ｉ−２０７−Ｉ−２１２．
【非特許文献２１】Ｌｅｖｉｎ  ＨＲ，Ｏｚ  ＭＣ，Ｃａｔａｎｅｓｅ  ＫＡ，Ｒｏｓｅ  ＥＡ，Ｂｕｒｋｈｏｆｆ  Ｄ．Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｎｏｒｍａｌｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｓｔｏｌｉｃ  ａｎｄ  ｄｉａｓｔｏｌｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｗｉｔｈ  ａ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ａｓｓｉｓｔ  ｄｅｖｉｃｅ  ｉｎ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｄｉｌａｔｅｄ  ｃａｒｄｉ  ｏｍｙｏｐａｔｈｙ．Ｊ  Ｈｅａｒｔ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１９９６；１５：８４０−８４２．
【非特許文献２２】Ｆｒａｚｉｅｒ  ＯＨ，Ｂｅｎｅｄｅｃｔ  ＣＲ，Ｒａｄｏｖａｎｃｅｖｉｃ  Ｂ，Ｂｉｃｋ  ＲＪ，Ｃａｐｅｋ  Ｐ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ＷＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｕｎｌｏａｄｉｎｇ．Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．１９９６；６２：６７５−６８２．
【非特許文献２３】ＭｃＣａｒｔｈｙ  ＰＭ，Ｎａｋａｔａｎｉ  Ｓ，Ｖａｒｇｏ  Ｒ，Ｋｏｔｔｋｅ−Ｍａｒｃｈａｎｔ  Ｋ，Ｈａｒａｓａｋｉ  Ｈ，Ｊａｍｅｓ  ＫＢ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ  ｃｈａｎｇｅｓ  ａｆｔｅｒ  ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ  ＬＶＡＤ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ．Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．１９９５；５９：６０９−６１３．
【非特許文献２４】Ｔａｎｉｙａｍａ  Ｙ，Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ，Ａｏｋｉ  Ｍ，Ｎａｋａｇａｍｉ  Ｈ，Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｋ，Ｙａｍａｚａｋｉ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｒａｔ  ａｎｄ  ｒａｂｂｉｔ  ｈｉｎｄｌｉｍｂ  ｉｓｃｈｅｍｉａ  ｍｏｄｅｌｓ：ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００１；８：ｅ１８１−ｅ１８９．
【非特許文献２５】Ｆｕｎａｔｓｕ  Ｔ，Ｓａｗａ  Ｙ，Ｏｈｔａｋｅ  Ｓ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｔ，Ｍａｔｓｕｍｉｙａ  Ｇ，Ｍａｔｓｕｕｒａ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｃａｎｉｎｅ  ｈｅａｒｔ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｋｅｄ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ．Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ．２００２；１２４：１０９９−１１０５．
【非特許文献２６】Ｏｎｏ  Ｍ，Ｓａｗａ  Ｙ，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｋ，Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ，Ｋａｎｅｄａ  Ｙ，Ｍａｔｓｕｄａ  Ｈ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｌｕｎｇ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００２；１０６［ｓｕｐｐｌ  Ｉ］：Ｉ−２６４−２６９．
【非特許文献２７】Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  Ｓ，Ａｌｉ  ＡＳ，Ｓａｂｂａｈ  Ｈ．Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．Ｃａｒ  ｄｉｏｌ  Ｃｌｉｎ．１９９８；１６：６２３−６３１．
【非特許文献２８】Ｋａｐａｄｉａ  Ｓ，Ｄｉｂｂｓ  Ｚ，Ｋｕｒｒｅｌｍｅｙｅｒ  Ｋ，Ｋａｌｒａ  Ｄ，Ｓｅｔａ  Ｙ，Ｗａｎｇ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆａｉｌｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｒｔ．Ｃａｒｄｉｏｌ  Ｃｌｉｎ．１９９８；１６：６４５−６５６．
【非特許文献２９】Ｂｒｉｓｔｏｗ  ＭＲ，Ｇｉｎｓｂｕｒｇ  Ｒ，Ｕｍａｎｓ  Ｖ，Ｆｏｗｌｅｒ  Ｍ，Ｍｉｎｏｂｅ  Ｗ，Ｒａｓｒｍｕｓｓｅｎ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．β１−  ａｎｄ  β２−  ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｎｏｎｆａｉｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｆａｉｌｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ：ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  β１−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ．Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．１９８６；５９：２９７−３０９．
【非特許文献３０】Ｇｗａｔｈｍｅｙ  ＪＫ，Ｃｏｐｅｌａｓ  Ｌ，ＭａｃＫｉｎｎｏｎ  Ｒ，Ｓｃｈｏｅｎ  ＦＪ，Ｆｅｌｄｍａｎ  ＭＤ，Ｇｒｏｓｓｍａｎ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ  Ａｂｎｏｒｍａｌ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｈａｎｄｌｉｎｇ  ｉｎ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｄ−ｓｔａｇｅ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ．Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．１９８７；６１：７０−７６．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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