(57)【要約】本願発明は、農薬候補又は医薬候補の効率的なスクリーニング方法を提供することを課題としている。具体的には、農薬については、植物体を用いることなく、しかも、植物など他の生物に弊害を及ぼすことのない農薬候補化合物を、効率的にスクリーニングすることを課題としている。  本願発明者等は、糸状菌特異的酵素をコードする遺伝子発現ベクターで糸状菌と生物学的に近縁であるが当該酵素を有しない酵母を形質転換し、農薬候補試料をコントロール酵母（糸状菌特異的酵素を発現しない酵母）及び糸状菌特異的酵素発現形質転換体に適用し、コントロール酵母に副作用などの影響を与えず、糸状菌特異的酵素発現形質転換体のみに特異的に成長阻害又は殺菌作用を示す農薬候補試料を、農薬候補として選択するスクリーニング方法を開発することに成功し、本願発明を完成させた。  なお、本スクリーニング方法は、医薬候補のスクリーニングにも同様に用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸状菌のＯｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子で形質転換した酵母。
【請求項２】
糸状菌のＯｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子が、ＨＩＫ１遺伝子である請求項１記載の形質転換酵母。
【請求項３】
酵母が出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である請求項１又は２項記載の形質転換酵母。
【請求項４】
（１）糸状菌由来のＯｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子発現ベクターで形質転換した酵母及び（２）コントロール酵母（糸状菌特異的酵素を発現しない酵母）を含む糸状菌特異的農薬候補又は医薬候補スクリーニングキット。
【請求項５】
糸状菌由来のＯｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子がＨＩＫ１遺伝子である請求項４記載の糸状菌特異的農薬候補又は医薬候補スクリーニングキット。
【請求項６】
酵母が出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である請求項４又は５記載の糸状菌特異的農薬候補又は医薬候補スクリーニングキット。
【請求項７】
以下の（１）から（３）の工程を含む糸状菌特異的農薬候補又は糸状菌特異的医薬候補のスクリーニング方法。
（１）糸状菌由来Ｏｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子組み換え発現ベクターにより酵母を形質転換した形質転換体及びコントロール酵母（Ｏｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼを発現しない酵母）に農薬候補試料又は医薬候補試料を投与する工程
（２）農薬候補試料又は医薬候補試料を投与された上記Ｏｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼ発現形質転換体及びコントロール酵母を一定時間培養する工程、及び
（３）一定時間培養後、Ｏｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼ発現形質転換体及びコントロール酵母の増殖率又は生存細胞数を計測する工程。
【請求項８】
形質転換体及びコントロール酵母の増殖率又は生存細胞数の計測を、Ｏｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼ発現形質転換体及びコントロール酵母の培養液のＯＤを計測することにより行う請求項７記載の方法。
【請求項９】
Ｏｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼ発現形質転換体及びコントロール酵母の増殖率又は生存細胞数の計測を酵母特異的抗体を用いて行う請求項７記載の方法。
【請求項１０】
糸状菌由来Ｏｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子がＨＩＫ１遺伝子である請求項７から９いずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
酵母が出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である請求項７から１０いずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本願発明は、糸状菌特異的抗菌剤、例えば、糸状菌特異的農薬又は抗糸状菌医薬の新たなスクリーニング法に関する。より具体的には、本願発明は、糸状菌特異的酵素をターゲットとした薬剤をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】  従来からの、農薬として有用な物質の探索を目的として行われる試験としては、実験室内での培地上で一次試験とすることが通常である。培地上での標的病害菌に対するこのような試験では、標的病害菌に対して効果がある様々な薬剤が全て引っかかってくる。そのため、非ターゲット生物に対しても殺菌性を示してしまう薬剤を拾ってしまう可能性が高い。
他方、作物体の一部又は温室内での植木鉢を用いた病害防除試験は、作物の育成、調製が欠かせず、費用及び労力を要するところ、現在新機能薬となる化合物は、供試化合物の１万分の１程度といわれており（非特許文献１；）、非常に多数の供試化合物の検査には、不適切であった。
さらに、このような方法では、植物体、人体への副作用などについては、十分検討できないものであった。
たとえば、有機水銀剤は、イネいもち病の重要な防除剤として使用されてきたが、動物への毒性に鑑み、使用が中断されている。
また、農薬の植物毒性を簡便に調査する方法としては、植物培養細胞を用いる方法が提案されている（特許文献１：特開平５−２９４９９５）。さらに、特許文献２（特開平９−１２４４１１）では、いもち病害防除剤のためのファイアトレキシンのスクリーニングを、試験試料をイネの葉先端に滴下施用後、１週間後に、葉を裁断し抽出してファイアトレキシンの生成の有無をＨＰＬＣで確認する方法が記載されている。
一方、各種糸状菌病に有効な農薬として知られているフェニルピロールｐｈｅｎｙｌｐｙｒｒｏｌｅｓ、ジカルボキシイミドｄｉｃａｒｂｏｘｉｍｉｄｅｓ、芳香族炭化水素ａｒｏｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓの薬剤の作用点の解析から（非特許文献２−７：Ｐｉｌｌｏｎｅｌ  ａｎｄ  Ｍｅｙｅｒ，１９９７；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｆｕｊｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｏｃｈｉａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｏｃｈｉａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｏｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、多くの糸状菌特異的農薬のターゲットが糸状菌特異的ヒスチジンキナーゼ（ここではＯｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼと呼ぶ）であることが解明されつつある。本願明細書中ではＯｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼ（Ｏｓ−１ファミリーとも表記する。Ｏｓ−１サブファミリーとも表記された。）は、菌糸型生長を行う菌類（糸状菌）由来の、ヒスチジンキナーゼドメインとレスポンスレギュレータードメインを持つハイブリッド型ヒスチジンキナーゼであって、アカパンカビのハイブリッド型ヒスチジンキナーゼＯｓ−１（配列番号１７；Ｎｉｋ−１とも言う；非特許文献８：Ａｌｅｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ  ９３：３４１６−３４２１）に存在するお互いに相同性を示す６つのアミノ酸リピート（アミノ酸リピート１（１７１−２６０，９０  ａａ）、アミノ酸リピート２（２６１−３５２，９２  ａａ）、アミノ酸リピート３（３５３−４４４，９２  ａａ）、アミノ酸リピート４（４４５−５３６，９２  ａａ）、アミノ酸リピート５（５３７−６２８，９２  ａａ）、アミノ酸リピート６（６２９−７００，７２  ａａ））を含む領域の全長と５０％以上の相同性を示す領域を有するものを意味する。
医薬のスクリーニングについても同様の問題が存在している。
【特許文献１】  特開平５−２９４９９５
【特許文献２】  特開平９−１２４４１１
【非特許文献１】  植物病理学事典  養賢堂  １９９５年３月３０日、Ｐ．７８３−７８４
【非特許文献２】  Ｐｉｌｌｏｎｅｌ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｍｅｙｅｒ，Ｔ．１９９７．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｒｏｌｅｓ  ｏｎ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ．Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ．４９：２２９−２３６
【非特許文献３】  Ｏｃｈｉａｉ，Ｎ．，Ｆｕｊｉｍｕｒａ，Ｍ．，Ｏｓｈｉｍａ，Ｍ．，Ｍｏｔｏｙａｍａ，Ｔ．，Ｉｃｈｉｉｓｈｉ，Ａ．，Ｙａｍａｄａ−Ｏｋａｂｅ，Ｈ．ａｎｄ  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｉ．２００２．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｉｐｒｏｄｉｏｎｅ  ａｎｄ  ｆｌｕｄｉｏｘｏｎｉｌ  ｏｎ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｈｙｐｈａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６：２２０９−２２１５．
【非特許文献４】  Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｌａｍｍ，Ｒ．，Ｐｉｌｌｏｎｅｌ，Ｃ．，Ｘｕ，Ｊ．−Ｒ．，ａｎｄ  Ｌａｍ，Ｓ．１９９９．Ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒ−ｏｓｍｏｔｉｃ  ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａｉｓ  ｔｈｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｒｏｌｅ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ．Ｐｒｏｃ．２０ｔｈ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ａｓｉｌｏｍａｒ，ＵＳＡ，ｐ．７２
【非特許文献５】  Ｆｕｊｉｍｕｒａ，Ｍ．，Ｏｃｈｉａｉ，Ｎ．，Ｉｃｈｉｉｓｈｉ，Ａ．，Ｕｓａｍｉ，Ｒ．，Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｉ．２０００．Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｒｏｌｅ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ  ａｎｄ  ａｂｎｏｒｍａｌ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｏｓ  ａｎｄ  ｃｕｔ  ｍｕｔａｎｔ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ．Ｊ．Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ．２５：３１−３６
【非特許文献６】  Ｏｃｈｉａｉ，Ｎ．，Ｆｕｊｉｍｕｒａ，Ｍ．，Ｍｏｔｏｙａｍａ，Ｔ．，Ｉｃｈｉｉｓｈｉ，Ａ．，Ｕｓａｍｉ，Ｒ．，Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｉ．２００１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｗｏ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｆｅｒ  ｆｌｕｄｉｏｘｏｎｉｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｏｓｍｏｔｉｃ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｓ−１  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ．Ｐｅｓｔ  Ｍａｎａｇ．Ｓｃｉ．５７：４３７−４４２．
【非特許文献７】  Ｏｓｈｉｍａ，Ｍ．，Ｆｕｊｉｍｕｒａ，Ｍ．，Ｂａｎｎｏ，Ｓ．，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｃ．，Ｍｏｔｏｙａｍａ，Ｔ．，Ｉｃｈｉｉｓｈｉ，Ａ．，ａｎｄ  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｉ．２００２．Ａ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｗｏ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ＢｃＯＳ−１  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｄｉｃａｒｂｏｘｉｍｉｄｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｆｉｅｌｄ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｏｆ  Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，９２，７５−８０．
【非特許文献８】  Ａｌｅｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ  ９３：３４１６−３４２１
【発明の開示】
本願発明は、農薬候補又は医薬候補の効率的なスクリーニング方法を提供することを課題としている。具体的には、農薬については、植物体を用いることなく、しかも、植物など他の生物に弊害を及ぼすことのない農薬候補化合物を、効率的にスクリーニングすることを課題としている。
本願発明者等は、植物病害を起こす病害菌に特異的に作用する農薬をスクリーニングする方法を鋭意研究した結果、植物病害菌にのみ存在する酵素又は該酵素が関与する情報伝達経路を標的とする農薬候補をスクリーニングすることで、植物病害菌を特異的に抑え、他の生物に影響をしない、農薬を探査できると考えた。
そこで、糸状菌防除を例とし、糸状菌にのみ存在する酵素又は酵素を介する情報伝達系を利用できないか検討した。上述したように、糸状菌を防除するための農薬である三種のグループ（フェニルピロールｐｈｅｎｙｌｐｙｒｒｏｌｅｓ、ジカルボキシイミドｄｉｃａｒｂｏｘｉｍｉｄｅｓ、芳香族炭化水素ａｒｏｍａｔｉｃ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ）（図１）の薬剤の作用点の解析から、フェニルピロールに属するフルジオキソニルをはじめとする多くの糸状菌特異的農薬のターゲットが糸状菌特異的ヒスチジンキナーゼ（Ｏｓ−１ファミリー）を介した情報伝達系であることが明らかになりつつある。本発明者らは、まず、この情報伝達系を利用し、農薬候補スクリーニング方法及びキットを開発した。
具体的には、本願発明者等は、これら糸状菌特異的酵素をコードする遺伝子発現ベクターで糸状菌と生物学的に近縁であるが当該酵素を有しない酵母を形質転換し、農薬候補試料をコントロール酵母（糸状菌特異的酵素を発現しない酵母）及び糸状菌特異的酵素発現形質転換体に適用し、コントロール酵母に副作用などの影響を与えず、糸状菌特異的酵素発現形質転換体のみに特異的に成長阻害又は殺菌作用を示す農薬候補試料を、農薬候補として選択するスクリーニング方法を開発することに成功し、本願発明を完成させたものである。
なお、本スクリーニング方法は、医薬候補のスクリーニングにも同様に用いることができる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００４−０６１２７３号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１は、糸状菌を標的とした三種のグループの薬剤：薬剤の構造と、その薬剤が病原糸状菌防除に用いられる生物を示す。
図２は、バクテリア及び真核生物のヒスチジンキナーゼの概念図。
図３は、Ｏｓ−１ファミリーのヒスチジンキナーゼ及び出芽酵母のヒスチジンキナーゼの概念図。
図４は、糸状菌と出芽酵母の情報伝達系の比較    出芽酵母とアカパンカビで共通と推定される部分を網掛けした。アカパンカビのタンパク質で括弧に入っているのは酵母のタンパク質と相同性はあるが相補性が確認されていないものである。
図５は、イネいもち病菌のＨＩＫ１を導入した出芽酵母の薬剤感受性試験結果：Ａ．  ＨＩＫ１をＧＡＬ１プロモーターの制御下で発現させることができるプラスミドを酵母に導入して、発現誘導条件で各種薬剤への感受性をみた。：Ｂ．  各種薬剤を含む９０ｍｍ径プレート上に、プレートの上段にはｐＹＥＳ２−ＨＩＫ１を導入した酵母細胞懸濁液、下段にはｐＹＥＳ２を導入した酵母細胞（コントロール）、それぞれを９ｍｍ間隔で（左から１０７、１０６、１０５、１０４／ｍｌ）５μｌずつ滴下後３０°Ｃで６０時間培養した。左プレートより、プレートごとに、ＳＧ培地のみ、Ｆｌｕｄｉｏｘｏｎｉｌ，Ｉｐｒｏｄｉｎｅ，Ｃｈｌｏｒｏｎｅｂ，又はＣｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅが添加されている。薬剤濃度は、Ｆｌｕｄｉｏｘｏｎｉｌ，Ｉｐｒｏｄｉｎｅ，及びＣｈｌｏｒｏｎｅｂについては、最上段のプレートが５ｐｐｍ、２段目のプレートが２５ｐｐｍ，更に、Ｉｐｒｏｄｉｎｅ及びＣｈｌｏｒｏｎｅｂについては、３段目が５０ｐｐｍ、４段目が１００ｐｐｍである。Ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅについては、０．２５ｐｐｍで、２４０時間培養した。
図６は、ＨＩＫ１による薬剤感受性とヒスチジンキナーゼドメインとレスポンスレギュレータードメインの有無：Ａ．  ヒスチジンキナーゼドメインが機能しないＨｉｋ１−Ｈ７３６Ｖあるいはレスポンスレギュレータードメインが機能しないＨｉｋ１−Ｄ１１５３Ｅを発現する酵母を作成した。：Ｂ．  各種薬剤を含む９０ｍｍ径プレート上に、最上段にはｐＹＥＳ２を導入した酵母細胞懸濁液、上から２段目にはｐＹＥＳ２−ＨＩＫ１を導入した酵母細胞懸濁液、上から３段目にはｐＹＥＳ２−ｈｉｋ１−Ｈ７３６Ｖを導入した酵母細胞懸濁液、最下段にはｐＹＥＳ２−ｈｉｋ１−Ｄ１１５３Ｅを導入した酵母細胞懸濁液それぞれを９ｍｍ間隔で（左から１０７、１０６、１０５、１０４／ｍｌ）５μｌずつ滴下後３０°Ｃで７２時間培養した。なお、各プレートには、左のプレートから順に、ＳＧ培地のみ、２５ｐｐｍ  Ｆｌｕｄｉｏｘｏｎｉｌ、２５ｐｐｍ  Ｉｐｒｏｄｉｏｎｅ、５０ｐｐｍ  Ｃｈｌｏｒｏｎｅｂ、又は０．５Ｍ  ＮａＣｌとなるように薬剤が含有されている。
図７は、ＨＩＫ１による薬剤感受性とＳＳＫ１とＨＯＧ１の有無：Ａ．  ｓｓｋ１変異株とｈｏｇ１変異株ではＨＩＫ１を導入しても薬剤感受性を示さない。各種薬剤を含む９０ｍｍ径プレート上に、上段から、順に、（最上段）コントロール酵母にｐＹＥＳ２−ＨＩＫ１を導入した細胞懸濁液、（２段目）ｈｏｇ１変異株にｐＹＥＳ２−ＨＩＫ１を導入した細胞懸濁液、（３段目）ｓｓｋ１変異株にｐＹＥＳ２−ＨＩＫ１を導入した細胞懸濁液、（４段目）ｓｔｅ１１変異株にｐＹＥＳ２−ＨＩＫ１を導入した細胞懸濁液、（５段目）コントロール酵母にｐＹＥＳ２を導入した細胞懸濁液、（６段目）ｈｏｇ１変異株にｐＹＥＳ２−ＨＩＫ１を導入した細胞懸濁液、（７段目）ｓｓｋ１変異株にｐＹＥＳ２−ＨＩＫ１を導入した細胞懸濁液、又は（最下段）ｓｔｅ１１変異株にｐＹＥＳ２−ＨＩＫ１を導入した細胞懸濁液それぞれを９ｍｍ間隔で（左から１０７、１０６、１０５、１０４／ｍｌ）５μｌずつ滴下後３０°Ｃで６０時間（ＮａＣｌのみ９６時間）培養した。なお、左のプレートから順に、各プレートには、ＳＧ培地のみ、２５ｐｐｍ  Ｆｌｕｄｉｏｘｏｎｉｌ、２５ｐｐｍ  Ｉｐｒｏｄｉｏｎｅ、５０ｐｐｍ  Ｃｈｌｏｒｏｎｅｂ、又は０．５Ｍ  ＮａＣｌとなるように薬剤が含有されている。：Ｂ．  ｓｓｋ１変異株とｈｏｇ１変異株にそれぞれＳＳＫ１とＨＯＧ１を導入するとＨＩＫ１存在下で薬剤感受性を示すようになった。各種薬剤を含む９０ｍｍ径プレート上に、上段から順に、（最上段）ｈｏｇ１変異株にｐＣＬΔ−ＨＯＧ１及びｐＹＥＳ２−ＨＩＫ１を導入した細胞懸濁液、（２段目）ｈｏｇ１変異株にｐＣＬΔ及びｐＹＥＳ２−ＨＩＫ１を導入した細胞懸濁液、（３段目）ｓｓｋ１変異株にｐＣＬΔ−ＳＳＫ１及びｐＹＥＳ２−ＨＩＫ１を導入した細胞懸濁液、又は（最下段）ｓｓｋ１変異株にｐＣＬΔ及びｐＹＥＳ２−ＨＩＫ１を導入した細胞懸濁液それぞれを９ｍｍ間隔で（左から１０７、１０６、１０５、１０４／ｍｌ）５μｌ滴下後３０°Ｃで６０時間（ＮａＣｌのみ９６時間）培養した。なお、左のプレートから順に、各プレートには、ＳＧ培地のみ、２５ｐｐｍ  Ｆｌｕｄｉｏｘｏｎｉｌ、２５ｐｐｍ  Ｉｐｒｏｄｉｏｎｅ、５０ｐｐｍ  Ｃｈｌｏｒｏｎｅｂ、又は０．５Ｍ  ＮａＣｌとなるように薬剤が含有されている。
図８は、イネいもち病菌のＨｉｋ１と出芽酵母のＹｐｄ１との相互作用  Ａ．  ＣｙｔｏＴｒａｐ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍの概要。ターゲットと餌（ｂａｉｔ）の間で相互作用があるとｈＳｏｓが細胞膜に移行しＲａｓを活性化して、ｃｄｃ２５Ｈ株が３７°Ｃでも生育できるようになる。ここでは、餌のＹｐｄ１あるいはＳｓｋ１にターゲットのＨｉｋ１が「食いつくかどうか」をみた。  Ｂ．  Ｈｉｋ１とＹｐｄ１の相互作用。細胞懸濁液（左から１０７、１０６、１０５、１０４／ｍｌ）を５μｌ滴下後それぞれの温度で５日間培養した。
【発明を実施するための最良の形態】  本願発明は、植物又は動物に病害を起こす病原糸状菌に特異的な酵素をコードする遺伝子発現ベクターで当該病害菌と生物学的に近縁であるが当該酵素を有しない他の微生物等の生物を形質転換し、農薬又は医薬の候補試料をコントロール微生物（同じ宿主由来で糸状菌特異的酵素を発現しないものなど）及び糸状菌特異的酵素発現形質転換体に適用し、コントロール微生物に副作用等の影響を与えず、糸状菌特異的酵素発現形質転換体のみに特異的に成長阻害又は殺菌作用を示す農薬候補又は医薬候補を選択するスクリーニング方法及びそのための形質転換体並びにそのためのキットを包含する。
本願発明が対象とする病害菌には、糸状菌、例えば、植物病について言えばイネいもち病菌が、ヒトなどの動物病について言えば、カンジダ、アスペルギルス、水虫菌（白癬菌）等が包含される。糸状菌病害菌特異的酵素としては、糸状菌特異的ヒスチジンキナーゼ（Ｏｓ−１ファミリー）が包含される。又、糸状菌を対象とする農薬又は医薬をスクリーニングする場合に置いては、糸状菌特異的酵素遺伝子を導入する宿主微生物としては、酵母、好適には出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を挙げることができる。
さらに具体的には、本願発明には、糸状菌由来の糸状菌特異的ヒスチジンキナーゼ遺伝子を発現する酵母（発現酵母）と発現しない酵母（非発現酵母）の組み合わせからなるキット、及び当該キットを用いる農薬侯補スクリーニング方法が包含される。
［病害菌特異的薬剤とその標的酵素、植物病害を例として］
現在までに、植物病害菌特異的農薬として、糸状菌特異的農薬が知られている。糸状菌特異的農薬としては、フェニルピロール（ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｒｏｌｅｓ）としてフルジオキソニル（Ｆｌｕｄｉｏｘｏｎｉｌ）及びフェンピクロニル（Ｆｅｎｐｉｃｌｏｎｉｌ）が、ジカルボキシイミド（ｄｉｃａｒｂｏｘｉｍｉｄｅｓ）としてイプロジオン（ｉｐｒｏｄｉｏｎｅ）及びビンクロゾリン（ｖｉｎｃｌｏｚｏｌｉｎ）が、並びに芳香族炭化水素（ａｒｏｍａｔｉｃ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ）としてはクロロネブ（Ｃｈｌｏｒｏｎｅｂ）及びＰＣＮＢが知られている。
最近の研究により、上記した多くの糸状菌特異的農薬のターゲットが糸状菌特異的ヒスチジンキナーゼであることが、例えば、上記非特許文献２〜７により解明されてきている。
［ヒスチジンキナーゼ及びその情報伝達系］
細胞内情報伝達には、シグナル蛋白質のセリン、スレオニン、アスパラギン酸、ヒスチジン及びチロシンの修飾を含む可逆的なリン酸化が関与している。ヒスチジンキナーゼは、バクテリアから酵母、糸状菌、植物に存在する情報伝達因子の１つである。
原核生物では、基本的な情報伝達因子として自己リン酸化ヒスチジンキナーゼ及びそこからリン酸を受け取り下流に情報を伝えるレスポンスレギュレーターの二つの成分からなり２成分情報伝達システムである。
真核生物のヒスチジンキナーゼは、ほとんどヒスチジンキナーゼドメインとレスポンスレギュレータードメインをともに持つハイブリッド型ヒスチジンキナーゼである（図２）（Ｏｔａ，Ｉ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ，Ａ．１９９３．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：５６６−５６９．；Ｕｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １１：１７４３−１７５４．，；Ｐｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．３１：５５−６７．；Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．３７：３６４−３７２．；Ｗｅｓｔ  ａｎｄ  Ｓｔｏｃｋ，２００１  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６：３６９−３７６．）。
真核生物型のヒスチジンキナーゼを介する情報伝達系は、ハイブリッド型ヒスチジンキナーゼ、含ヒスチジンリン酸転移タンパク質及びレスポンスレギュレーターの三成分からなる。
ところでハイブリッド型ヒスチジンキナーゼの一つでアパカンカビから見出されたＯｓ−１はＮ−末端側に９２アミノ酸から７２アミノ酸のお互いに相同性を持つ繰り返し配列を６つ持つという特徴を持つ（図３）（Ａｌｅｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。このような特徴を持つハイブリッド型ヒスチジンキナーゼ（Ｏｓ−１ファミリー）はイネいもち病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｏｒｙｚａｅ：完全世代名Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）やＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ等の菌糸型生長を示す菌類（糸状菌）からしか見つかっていない（Ａｌｅｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ  ９３：３４１６−３４２１．；Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７  Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３４：３４０−３４７．；Ａｌｅｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：７０６９−７０７３．；Ｎａｇａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４４：４２５−４３２．）。
［糸状菌特異的薬剤感受性酵母の調製］
Ｏｓ−１ファミリーは、糸状菌でしか見つかっておらず、しかも、Ｏｓ−１ファミリーが糸状菌特異的薬剤の対象酵素であると考えられている。他方、糸状菌と同じく真核微生物である酵母においては、生物学的に近縁であるにもかかわらず、Ｏｓ−１ファミリーは存在しない。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいては全ゲノム配列が決定されているが、ヒスチジンキナーゼは一つしか存在せず、Ｏｓ−１ファミリーのものとは異なる特徴を持つもの（Ｓｌｎ１，図３参照）である（Ｓｌｎ１は、Ｎ末端側の６つのアミノ酸リピートを持たず、２つの膜貫通領域を持つ）。しかしながら、興味深いことに、糸状菌のＯｓ−１ファミリーの情報伝達系の下流因子は、出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでも多くが共通している（図４）（Ｍａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：５５４−５５８；Ｐｏｓａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｃｅｌｌ  ８６：８６５−８７５．：Ｆｕｊｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３  Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：１８６−１９１（２００３）．）。
そこで、Ｏｓ−１ファミリーに属するタンパク質の遺伝子をＯｓ−１ファミリータンパク質の遺伝子を有しない酵母に導入して、糸状菌特異的薬剤感受性酵母を調製した。
Ｏｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼとしては、菌糸型生長をする菌類（糸状菌）由来の、ヒスチジンキナーゼドメインと、レスポンスレギュレータードメインを持つハイブリッド型ヒスチジンキナーゼであって、アカパンカビのハイブリッド型ヒスチジンキナーゼＯｓ−１（配列番号１７）に存在するお互いに相同性を示す６つのアミノ酸リピート（アミノ酸リピート１（１７１−２６０，９０  ａａ）、アミノ酸リピート２（２６１−３５２，９２  ａａ）、アミノ酸リピート３（３５３−４４４，９２  ａａ）、アミノ酸リピート４（４４５−５３６，９２  ａａ）、アミノ酸リピート５（５３７−６２８，９２  ａａ）、アミノ酸リピート６（６２９−７００，７２ａａ））を含む領域の全長と５０％以上の相同性を示す領域を有するものがあげられる。
具体的には、Ｏｓ−１ファミリーに属するタンパク質としては、例えば、イネいもち病菌のＯｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼＨｉｋ１（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０４１６４７−１）、アカパンカビのＯｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼＮｉｋ−１／Ｏｓ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ｖｏｌ．９３，ｐｐ．３４１６−３４２１、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ５０２６３−１）、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓのＮｉｋ１（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＹ４５６０３８−１）、Ｂｏｔｒｙｏｔｉｎｉａ  ｆｕｃｋｅｌｉａｎａ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）のＢｏｓ１（Ｐｈｙｔｐａｔｈｏｌｏｇｙ，９２，７５−８０、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＦ４３５９６４−１）、Ｎｅｃｔｒｉａ  ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａのＦｉｋ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ６１８３８−１）、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）のＨｋ４（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＹ２８２７５０−１）、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓのＢｍｈｋ１（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０９５７４８−１）、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａのＡｂＮＩＫ１ｐ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＹ７０００９２−１）、カンジダ酵母Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓのＣａＮＩＫ１（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ００６３６３−１）、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのＣａＮＩＫ１類似タンパク質（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＣＲ３８２１３１−１２９）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓの推定ヒスチジンキナーゼ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＥ０１７３４３−３３８）を挙げることができる。
さらに、これらＯｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子のコードするアミノ酸配列で表されるペプチド又は該アミノ酸配列に対して、いくつかのアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表されるペプチドであってヒスチジンキナーゼ活性（ヒスチジンキナーゼドメインとレスポンスレギュレータードメインが機能している）を有するポリペプチドをコードする遺伝子も含めることができる。ここで、いくつかのアミノ酸とは、１から２００アミノ酸、好適には、１から１００アミノ酸、さらに好適には、１から５０アミノ酸、より好適には、１から２０アミノ酸、さらに好適には１から９アミノ酸を意味する。
また、これらＯｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子は、上記したｏｓ−１ファミリー遺伝子に対して、通常のデフォルト条件で比較し、８０％以上の相同性、好適には、８５％以上の相同性、さらに好適には、９０％の相同性、より好適には、９５％以上の相同性を有するヒスチジンキナーゼ活性（ヒスチジンキナーゼドメインとレスポンスレギュレータードメインが機能している）を有するポリペプチドをコードする遺伝子も含めることができる。
好適には、イネいもち病菌由来のＨＩＫ１及び配列番号１６で示されるアミノ酸配列で表されるペプチド又は配列番号１６で示されるアミノ酸配列に対して、１乃至数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列で表されるペプチドであってヒスチジンキナーゼ活性（ヒスチジンキナーゼドメインとレスポンスレギュレータードメインが機能している）を有するポリペプチドをコードする遺伝子を挙げることができる。
これらＯｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子を導入する生物体としては、微生物、植物培養細胞が挙げられ、好適には、Ｏｓ−１の下流の情報伝達系（含ヒスチジンリン酸転移タンパク質、レスポンスレギュレーター、ＭＡＰＫＫＫ，ＭＡＰＫＫ，ＭＡＰｋｉｎａｓｅからなる情報伝達系）を備えた生物体が望ましい。具体的には、含ヒスチジンリン酸転移タンパク質としてＹｐｄ１、レスポンスレギュレーターとしてＳｓｋ１、ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅとしてＨｏｇ１を内生的に有する微生物、好適には酵母、特に好適には出芽酵母、サッカロミセス属に属する微生物を挙げることができる。
Ｏｓ−１ファミリーに属する遺伝子、例えばＨＩＫ１は、該遺伝子を導入する対象生物における、周知の発現ベクターに組み換えて、当該対象生物に導入することができる。例えば、酵母に導入するのであれば、ｐＹＥＳ２、ｐＹＥｐ５１、ＹＥｐ６２、ｐＢＭ１５０、ｐＬＧＤＳＤ５、ｐＡＭ８２、ｐＹＥ４、ｐＡＡｈ５、ｐＭＡ５６、ｐＡＨ９／１０／２１、ｐＭＡ２３０、ｐＭＡ９１、ｐＧ−１／２等を用いることができる。
組み換えベクターの宿主生物（対象生物）への導入方法としては周知の手段を用いることができるが、例えば、酵母の形質転換は酢酸リチウム法（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３−１６８．）を用いることができる。
［スクリーニング方法及びそのためのキット］
［Ｉ］  本発明の農薬候補又は医薬候補化合物スクリーング用キットとしては、
（１）Ｏｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子などの糸状菌特異的遺伝子発現ベクターで酵母などの宿主生物を形質転換して調製された形質転換体および同じ宿主で糸状菌特異的遺伝子を発現しないコントロール生物を含むキット、
好適には、
（２）（１）Ｏｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子発現ベクターで酵母を形質転換して調製された形質転換体および宿主酵母をベクターのみで形質転換して作成したコントロール酵母を含むキットが挙げられる。
上記キットには、更に、以下で説明するスクリーニングに用いる計測用試薬などを含めることができる。
［ＩＩ］  本発明の農薬候補又は医薬候補化合物スクリーング方法は、
（１）Ｏｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子などの糸状菌特異的遺伝子発現ベクターで酵母などの宿主生物を形質転換して調製された形質転換体および同じ宿主で糸状菌特異的遺伝子を発現しないコントロール生物に農薬候補試料又は医薬候補試料を投与する工程
（２）農薬候補試料又は医薬候補試料を投与された上記糸状菌特異的遺伝子発現形質転換体及びコントロール生物を一定時間培養する工程、及び
（３）一定時間培養後、糸状菌特異的遺伝子発現形質転換体及びコントロール生物の生存量（又は生存細胞数）を計測する工程を含んでいる。
好適には、
（１）Ｏｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子発現ベクターで酵母を形質転換して調製された形質転換体および宿主生物をベクターのみで形質転換して作成したコントロール酵母に農薬候補試料を投与する工程
（２）農薬候補試料を投与された上記Ｏｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子発現形質転換体及びコントロール酵母を一定時間培養する工程、及び
（３）一定時間培養後、Ｏｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子発現形質転換体及びコントロール酵母の増殖（又は生存細胞数）を計測する工程を含んでいる。
以下具体的には、酵母を形質転換して用いる場合を例示して説明するが、他の微生物又は生物体であっても同様にスクリーニングなし得る。
Ｏｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子発現形質転換酵母とコントロール酵母の増殖又は生存細胞数は、例えば、目視や、ＯＤ６００を測定することにより計測することもできるが、これ以外にも、酵母の酸素消費量を計測、培地中の糖濃度減少を計測する、蛍光又は発色酵素などの標識により酵母特異的標識抗体、又はビオチン等ラベルされた酵母特異的抗体を用いて計測する等、周知の適宜の方法で計測することができる。
（ｉ）プレート法
Ｏｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子発現ベクターで形質転換した形質転換体とコントロール酵母を適当な細胞数、例えば、１０７細胞／ｍｌ、１０６細胞／ｍｌ、１０５細胞／ｍｌ、及び１０４細胞／ｍｌとなるように希釈し、１定量の農薬候補試料を含むプレート（例えば、９０ｍｍプレート）に、同じ量の細胞含有溶液（例えば、５μリットル）を滴下し、適宜な時間、例えば、５時間以上、３００時間以下、好適には、４８から７２時間、培養温度は２５°Ｃ−３７°Ｃ、好適には、３０℃で培養し、プレートにおけるＯｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子発現形質転換酵母とコントロール酵母の増殖状況を目視により確認し、コントロール酵母とＯｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子発現形質転換体で増殖状況（生存数）が異なった農薬候補試料又は医薬候補試料を、農薬候補又は医薬候補として選抜する。
（ｉｉ）液体培養法
Ｏｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子発現ベクターで形質転換した形質転換体とコントロール酵母をそれぞれ、８時間から１０時間培養した後に、ＯＤ６００を測定する。次に、１定量の農薬候補試料又は医薬候補試料を含む培地に例えば、ＯＤ６００＝０．０１になるように加える。適温、例えば、２７°Ｃで培養、好適には、振とう培養し、１６０ｒｐｍで旋回振とうし、適宜の時間後から、一定時間間隔、好適にはコントロール酵母の倍加時間の＋−５０％時間の範囲内の一定時間間隔でＯＤ６００を計測する。コントロール酵母としてＡＴＣＣ２０１３８８にベクターｐＹＥＳ２を形質転換したものを用いた場合には、例えば、３時間間隔でＯＤ６００を計測する。この計測から、増殖曲線を作り、倍化時間を計算する。コントロール酵母に対し、Ｏｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子発現形質転換体で倍加時間に２０％以上、好適には５０％以上、更に好適には１００以上の倍加時間の増加した農薬候補試料又は医薬候補試料を、農薬候補又は医薬候補として選抜する。
更に、次のような方法を採用することもできる。
（ｉｉｉ）それぞれの酵母をプレーティングしたプレート上でペーパーディスクにしみこませて薬剤を投与し、３０°Ｃ程度で静置培養し、目視等により生育阻止部分を評価する。
なお、従来よりｆｌｕｄｉｏｘｏｎｉｌとｉｐｒｏｄｉｏｎｅについては、アカパンカビ（Ｏｃｈｉａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｐｅｓｔ  Ｍａｎａｇ  Ｓｃｉ．５７：４３７−４４２．）とイネいもち病菌以外にも、カンジダ症の病原菌Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｏｃｈｉａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６：２２０９−２２１５．）、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ（Ｄｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４．Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｂｉｏｌ．４１：１０２−１０８．）においてはＯｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼがターゲットであることが示唆されている。同様に、ある糸状菌由来のＯｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼを標的として上記方法でスクリーニングされた農薬候補又は医薬候補は、通常、Ｏｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼを有する他の糸状菌に対しても、農薬又は医薬候補として検討対象とすることができる。
材料
使用した酵母菌株とプラスミドを以下の表１に示す。
【表１】
2005085416.tif 000002
2005085416.tif 000003
薬剤は和光純薬から入手した。培地成分は特に断らない限りＤｉｆｃｏから購入したものを用いた。なお、遺伝子操作は一般的方法を用いた（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．）。酵母の培養は特に断らない限り３０°Ｃで行った。完全培地はＹＰＤ（１％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、２％  ｐｅｐｔｏｎｅ、２％  ｇｌｕｃｏｓｅ）を用い、最小培地は選択に必要な栄養源を抜いたＳＤ（０．６７％  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、２％  ｇｌｕｃｏｓｅ、１Ｘ  ｄｒｏｐｏｕｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））あるいはＳＧ（０．６７％  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、２％  ｇａｌａｃｔｏｓｅ、１％  ｒａｆｆｉｎｏｓｅ、１Ｘ  ｄｒｏｐｏｕｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用いた。プレートを作る場合は２％になるように寒天を加えた。イネいもち病菌Ｐ−２株のｃＤＮＡは以前報告した（Ｍｏｔｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８  Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：５６４−５６６．）のと同様にして作成した。
【実施例】［実施例１］酵母での糸状菌のヒスチジンキナーゼの発現と解析
（１）  イネいもち病菌のＯｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子ＨＩＫ１（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０４１６４７；配列番号１）のｃＤＮＡを酵母用発現ベクターｐＹＥＳ２のＢａｍＨＩ部位に挿入し、ｐＹＥＳ２−ＨＩＫ１を得た。ｐＹＥＳ２−ＨＩＫ１はＧＡＬ１  ｐｒｏｍｏｔｅｒの制御下でＨｉｋ１の全長をタグなしで発現できる。ＧＡＬ１  ｐｒｏｍｏｔｅｒの発現抑制条件での培養はウラシルを抜いたグルコースを炭素源とした合成培地（ＳＤ／−Ｕｒａ）、発現誘導条件での培養はウラシルを抜いたガラクトースを炭素源とした合成培地（ＳＧ／−Ｕｒａ）で行った。酵母の形質転換は酢酸リチウム法（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３  ｉｂｉｄ）を用いた。
薬剤感受性は、プレート上での培養と液体培養により解析した。プレートでの培養の場合、５ｍｌ  ＳＤ／−Ｕｒａで一晩前培養し、集菌し、１０ｍｌ  ＳＧ／−Ｕｒａで洗浄し、１０ｍｌ  ＳＧ／−Ｕｒａで８時間から１０時間培養した後に、ＯＤ６００を測定し、１０７細胞／ｍｌ、１０６細胞／ｍｌ、１０５細胞／ｍｌ、１０４細胞／ｍｌに希釈し、各種薬剤を加えたＳＧ／−Ｕｒａプレート上に５μｌずつ滴下し、６０時間から２４０時間培養した。液体培養の場合、５ｍｌ  ＳＤ／−Ｕｒａで一晩前培養し、集菌し、１０ｍｌ  ＳＧ／−Ｕｒａで洗浄し、１０ｍｌ  ＳＧ／−Ｕｒａで８時間から１０時間培養した後に、ＯＤ６００を測定し、各種薬剤を含むＳＧ／−Ｕｒａが５０ｍｌ入った３００ｍｌ三角フラスコにＯＤ６００＝０．０１になるように加えた。２７°Ｃ  １６０ｒｐｍで旋回振とうし、１２、１５、１８、２１、２４、３３、３６、３９時間後にサンプリングし、ＯＤ６００を測定し、増殖曲線を作り、倍化時間を計算した。
（結果）
Ｏｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼ遺伝子ＨＩＫ１の酵母での発現による薬剤感受性の付与
ゲノム中にＯｓ−１ファミリーのヒスチジンキナーゼを持たない出芽酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに、イネいもち病菌由来のＯｓ−１ファミリーのヒスチジンキナーゼＨｉｋ１をｐＹＥＳ２−ＨＩＫ１を導入することによりＧＡＬ１  ｐｒｏｍｏｔｅｒの制御下で発現させた（図５Ａ）。ＧＡＬ１  ｐｒｏｍｏｔｅｒの発現誘導条件で、薬剤非存在下ではｐＹＥＳ２−ＨＩＫ１形質転換体はｐＹＥＳ２形質転換体と同様の生育を示したが、本来感受性を示さない糸状菌特異的農薬（フルジオキソニル、イプロジオン、クロロネブ、図１参照）の存在下では、ｐＹＥＳ２−ＨＩＫ１形質転換体のみが生育阻害を示した（図５Ｂ）。フルジオキソニルに対する効果は５ｐｐｍで飽和し、イプロジオンに対する効果は２５ｐｐｍで飽和し、クロロネブに対する効果は５０ｐｐｍで飽和した。また、ｐＹＥＳ２−ＨＩＫ１形質転換体でもＧＡＬ１  ｐｒｏｍｏｔｅｒの発現抑制条件下では生育阻害を示さなかった（データ示さず）。なお、このような三種のグループの薬剤とは構造の違うシクロヘキシミドに対してはｐＹＥＳ２−ＨＩＫ１形質転換体とｐＹＥＳ２形質転換体の間で発現誘導条件でも感受性の差は認められなかった。以上のように、ｐＹＥＳ２−ＨＩＫ１形質転換体でＧＡＬ１  ｐｒｏｍｏｔｅｒの発現誘導条件でのみ特異的に、３種の薬剤に対する感受性が付与されることから、この感受性は導入したＨＩＫ１によって特異的に引き起こされていると考えられる。
同様の実験を液体培養で行った場合（表２）、ｐＹＥＳ２形質転換体のＧＡＬ１  ｐｒｏｍｏｔｅｒ発現誘導条件では薬剤の有無（０、２５ｐｐｍフルジオキソニル、２５ｐｐｍイプロジオン、２５ｐｐｍクロロネブ）にかかわらず同様の生育速度を示し、倍化時間は２．２時間前後になった。ｐＹＥＳ２−ＨＩＫ１形質転換体では、薬剤の影響を受け、薬剤非存在下では倍化時間が２．１９時間でｐＹＥＳ２形質転換体の場合とほとんど変わらなかったが、２５ｐｐｍフルジオキソニル存在下では４．２５時間、２５ｐｐｍイプロジオン存在下では３．１２時間、２５ｐｐｍクロロネブ存在下では２．９０時間、と明らかに生育速度の低下が認められた。
【表２】
2005085416.tif 000004
2005085416.tif 000005
（２）  変異導入したＨＩＫ１は変異導入用合成ＤＮＡ（ＨＫ−Ｈ７３６Ｖ：５’−ＣＣＴＣＧＣＴＡＡＣＡＴＧＴＣＣＧＴＣＧＡＡＡＴＣＣＧＣＡＣＡＣＣ−３’（配列番号２），ＨＫ−Ｄ１１５３Ｅ：５’−ＧＡＴＧＴＧＡＴＣＣＴＧＡＴＧＧＡＧＧＴＴＣＡＡＡＴＧＣＣＴＧＴＣＡＴＧ−３’（配列番号３））を使用し、Ｍｕｔａｎ−Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ  ｋｉｔ（宝酒造）により作成した。それぞれの変異導入ＨＩＫ１をｐＹＥＳ２のＢａｍＨＩ部位にクローニングすることにより、ｐＹＥＳ２−ｈｉｋ１−Ｈ７３６ＶとｐＹＥＳ２−ｈｉｋ１−Ｄ１１５３Ｅを作成した。
（結果）  Ｈｉｋ１による薬剤感受性の付与にヒスチジンキナーゼの機能に必要とされるドメインが関わっているかどうかをみるため、ヒスチジンキナーゼドメインの機能に必要な自己リン酸化されるＨ７３６に変異を入れてこのドメインが機能しなくなるようにしたもの（Ｈｉｋ１−Ｈ７３６Ｖ）を発現させるためのプラスミドｐＹＥＳ２−ｈｉｋ１−Ｈ７３６Ｖと、レスポンスレギュレータードメインのリン酸リレーにおいてリン酸を受け取るＤ１１５３に変異を入れてこのドメインが機能しなくなるようにしたもの（Ｈｉｋ１−Ｄ１１５３Ｅ）を発現させるためのプラスミドｐＹＥＳ２−ｈｉｋ１−Ｄ１１５３Ｅを作成して同様にＡＴＣＣ２０１３８８株に導入した（図６Ａ）。ｐＹＥＳ２−ＨＩＫ１を導入した株と異なり、ｐＹＥＳ２−ｈｉｋ１−Ｈ７３６Ｖ導入株とｐＹＥＳ２−ｈｉｋ１−Ｄ１１５３Ｅ導入株はいずれも、３種の薬剤（２５ｐｐｍ  ｆｌｕｄｉｏｘｏｎｉｌ、２５ｐｐｍ  ｉｐｒｏｄｉｏｎｅ、５０ｐｐｍ  ｃｈｌｏｒｏｎｅｂ）にほとんど感受性を示さなくなり（図６Ｂ）、ヒスチジンキナーゼドメインとレスポンスレギュレータードメインの両方が薬剤感受性の付与に必要とされることが示唆された。なお、ｐＹＥＳ２−ｈｉｋ１−Ｈ７３６Ｖ導入株では薬剤の有無にかかわらずやや生育阻害効果が認められた。また、浸透圧（０．５Ｍ  ＮａＣｌ）感受性には特に変化は認められなかった。
［参考例１］  Ｈｉｋ１による薬剤感受性の付与には酵母のＨｏｇ１  ＭＡＰＫを介する経路が必要である。
（１）  糸状菌において、Ｏｓ−１ファミリーヒスチジンキナーゼの下流には、出芽酵母のＨｏｇ１  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅのホモログ（アカパンカビの場合Ｏｓ−２（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：５３２−５３８．）で、イネいもち病菌の場合Ｏｓｍ１（Ｄｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １１：２０４５−２０５８．））を介した情報伝達系が働いている（図４）。
Ｈｉｋ１を出芽酵母で発現させて薬剤感受性が付与された結果の解釈として最も可能性が高いのが、Ｈｉｋ１に薬剤が作用して、出芽酵母のＨｏｇ１  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅに至る情報伝達系を攪乱して生育阻害を引き起こすというものである。この可能性を明らかにするため、この情報伝達系の因子の変異株であるｈｏｇ１変異株とｓｓｋ１変異株とｓｔｅ１１変異株を用いて、それぞれの変異株にｐＹＥＳ２−ＨＩＫ１を導入して、発現を誘導した場合に薬剤感受性を示すかどうかをみた（図７Ａ）。ｈｏｇ１変異株とｓｓｋ１変異株では、ｐＹＥＳ２−ＨＩＫ１を導入して発現を誘導しても、薬剤（２５ｐｐｍ  ｆｌｕｄｉｏｘｏｎｉｌ、２５ｐｐｍ  ｉｐｒｏｄｉｏｎｅ、５０ｐｐｍ  ｃｈｌｏｒｏｎｅｂ）に対する感受性を示さなかった。一方、ｓｔｅ１１変異株の場合は野生型株と同様に、ｐＹＥＳ２−ＨＩＫ１を導入して発現を誘導すると、薬剤（２５ｐｐｍ  ｆｌｕｄｉｏｘｏｎｉｌ、２５ｐｐｍ  ｉｐｒｏｄｉｏｎｅ、５０ｐｐｍ  ｃｈｌｏｒｏｎｅｂ）に対する感受性を示した。なお、ｐＹＥＳ２導入株ではいずれの株も薬剤に対する感受性を示さなかったことから、ここでの薬剤感受性はＨＩＫ１特異的であることが示唆される。また、Ｈｉｋ１の発現は浸透圧（０．５Ｍ  ＮａＣｌ）感受性には影響を与えなかった。以上の結果から、Ｓｓｋ１とＨｏｇ１が薬剤感受性の付与に必要で、Ｓｔｅ１１は必要でないことが示唆される。
（２）  この段階では、ｈｏｇ１変異株とｓｓｋ１変異株でｐＹＥＳ２−ＨＩＫ１を導入して発現を誘導しても、薬剤に対する感受性を示さなかったのは、ｈｏｇ１変異やｓｓｋ１変異とは関係がない変異のためである可能性が否定できない。そこで、ｈｏｇ１変異株とｓｓｋ１変異株にそれぞれ、無傷のＨＯＧ１遺伝子及びＳＳＫ１遺伝子を導入した場合に薬剤感受性が回復するかどうか、言い換えると、ｈｏｇ１変異やｓｓｋ１変異が薬剤感受性を示さなくなった原因であるかどうかを明らかにするための実験を行った（図７Ｂ）。
酵母の変異相補用のプラスミドｐＣＬΔ−ＨＯＧ１とｐＣＬΔ−ＳＳＫ１は、ｐＣＬ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＨｉｎｄＩＩＩ消化し自己連結して作成したｐＣＬΔのＨｉｎｄＩＩＩ部位にＡＴＣＣ２０１３８８株由来のＨＯＧ１あるいはＳＳＫ１をクローニングすることにより作成した。ＨＯＧ１は５’−ＴＴＴＡＡＧＣＴＴＡＴＣＧＡＴＴＧＡＡＧＧＡＡＡＴＡＡＧＡＧＧＡＡＴＡＧＣ−３’（配列番号８）と５’−ＴＴＴＡＡＧＣＴＴＧＧＧＴＧＡＧＡＣＡＧＣＴＡＴＴＴＡＧＣＡＡＧＴＴＣ−３’（配列番号９）で増幅し、ＳＳＫ１は５’−ＴＴＴＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＣＧＡＣＣＡＴＴＣ−３’（配列番号１０）と５’−ＴＴＴＡＡＧＣＴＴＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＴＣＡＡＧＡＴＴＴＣＣＣ−３’（配列番号１１）で増幅した。なお、増幅した遺伝子に変異が入っていないことをＤＮＡ塩基配列決定により確認した。
ｈｏｇ１変異株にｐＣＬΔ−ＨＯＧ１を導入しＨＯＧ１遺伝子を発現させた場合、薬剤に対する感受性が回復した。同様に、ｓｓｋ１変異株にｐＣＬΔ−ＳＳＫ１を導入しＨＯＧ１遺伝子を発現させた場合も、薬剤に対する感受性が回復した。なお、ベクターのみ（ｐＣＬΔ）を導入したコントロールでは両変異株とも薬剤感受性の回復は認められなかった。
以上の結果から、Ｈｏｇ１  ＭＡＰＫを介した情報伝達系の因子の中で、Ｓｓｋ１とＨｏｇ１がＨｉｋ１による薬剤感受性の付与に必要で、Ｓｔｅ１１は必要でないことが示された。
［参考例２］Ｈｉｋ１とＹｐｄ１の相互作用の解析
ＣｙｔｏＴｒａｐ  ＸＲ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、ＣｙｔｏＴｒａｐ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍによるタンパク質間相互作用を解析した。このシステムは、一方のタンパク質をヒトＳｏｓとの融合蛋白として発現させるためのベクターｐＳｏｓと、もう一方のタンパク質をミリスチン酸化シグナルとの融合タンパク質として発現させるためのベクターｐＭｙｒと、酵母におけるＳｏｓホモログＣｄｃ２５の遺伝子に温度感受性変異が入った酵母株ｃｄｃ２５Ｈとからなる。二つのタンパク質の間で相互作用があるとヒトＳｏｓがミリスチン酸修飾部位により膜に移行し、酵母のｃｄｃ２５変異を相補し、高温（３７度）でも生育できるようになる（図８Ａ）。ｐＭｙｒ−ＨＩＫ１はｐＭｙｒのＳｍａＩ部位にＨＩＫ１  ｃＤＮＡをクローニングすることにより構築した。ｐＳｏｓ−ＹＰＤ１はＳｒｆＩとＳａｌＩで消化したｐＳｏｓにＳｍａＩとＸｈｏＩで消化したＡＴＣＣ２０１３８８株由来のＹＰＤ１を連結することにより構築した。ｐＳｏｓ−Ｓｓｋ１はＳｒｆＩとＳａｌＩで消化したｐＳｏｓにＳｍａＩとＸｈｏＩで消化したＡＴＣＣ２０１３８８株由来のＳＳＫ１を連結することにより構築した。ＹＰＤ１は５’−ＴＴＴＣＣＣＧＧＧＡＴＡＴＧＴＣＴＡＣＴＡＴＴＣＣＣＴＣＡＧＡＡＡＴＣ−３’（配列番号１２）と５’−ＴＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＡＧＧＴＴＴＧＴＧＴＴＧＴＡＡＴＡＴＴＴＡＧＡＴ−３’（配列番号１３）で増幅し、ＳＳＫ１は５’−ＴＴＴＣＣＣＧＧＧＡＴＡＴＧＣＴＣＡＡＴＴＣＴＧＣＧＴＴＡＣＴＧＴＧＧ−３’（配列番号１４）と５’−ＴＴＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＡＡＴＴＣＴＡＴＴＴＧＡＧＴＧＧＧＣＧ−３’（配列番号１５）で増幅した。なお、増幅した遺伝子に変異が入っていないことをＤＮＡ塩基配列決定により確認した。酵母の形質転換から、形質転換酵母の滴下までは、前述の薬剤感受性の解析の場合と同様に行った。ただし、滴下までの培養は全て２５°Ｃで行い、滴下後は２５°Ｃと３７°Ｃで培養した。
（結果）
Ｈｉｋ１は酵母のＨｏｇ１の上流の情報伝達因子Ｙｐｄ１と相互作用する
さらに、Ｈｉｋ１の酵母における作用点を明らかにするために、Ｈｉｋ１と酵母側の相互作用因子の候補Ｙｐｄ１やＳｓｋ１との間の相互作用をｙｅａｓｔ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ（図８Ａ、材料と方法参照）で解析した。本システムで用いるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｃｄｃ２５Ｈ株はＣＤＣ２５遺伝子の温度感受性変異により高温（３７°Ｃ）ではＲａｓ経路を活性化できないために生育できず、許容温度の２５°Ｃでは生育できる。ターゲットをミリスリン酸化シグナルとの融合タンパク質、獲物（ｂａｉｔ）をヒトＳｏｓ（酵母のＣｄｃ２５のホモログ）との融合タンパク質として発現させる。ターゲットと獲物との間に相互作用があるとミリスリン酸化シグナルによりヒトＳｏｓが細胞膜に移行し、Ｒａｓ経路を活性化して３７°Ｃでもｃｄｃ２５Ｈ株が生育でできるようになることにより、相互作用が検出できる。
ここでは獲物をＹｐｄ１（ｐＳｏｓ−ＹＰＤ１で発現）とＳｓｋ１（ｐＳｏｓ−ＳＳＫ１で発現）にして、ターゲットのイネいもち病菌のＨｉｋ１（ｐＭｙｒ−ＨＩＫ１で発現）が結合するかどうかを解析した（図８Ｂ）。許容温度の２５°Ｃでは全ての組み合わせで生育が認められた。ただし、相互作用を示すｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌの組み合わせ（ｐＳｏｓ−ＭＡＦＢ＋ｐＭｙｒ−ＭＡＦＢ）と相互作用を示さないｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌの組み合わせ（ｐＳｏｓ−Ｃｏｌ１＋ｐＭｙｒ−ＭＡＦＢ）ではやや生育阻害が認められた。３７°Ｃでは、ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌの組み合わせでは生育が認められ、ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌの組み合わせでは生育が認められず、実験系に問題がないことが示された。Ｈｉｋ１が相互作用を示したのはＹｐｄ１であり（ｐＳｏｓ−ＹＰＤ１＋ｐＭｙｒ−ＨＩＫ１）、Ｓｓｋ１とは相互作用を示さなかった（ｐＳｏｓ−ＳＳＫ１＋ｐＭｙｒ−ＨＩＫ１）。なお、Ｙｐｄ１のみでもわずかに３７°Ｃでの生育が認められたが（ｐＳｏｓ−ＹＰＤ１＋ｐＭｙｒ）、これはＹｐｄ１の通常の酵母内での相互作用の相手である膜結合領域を持つＳｌｎ１（図３、４）との相互作用によるものと考えられる。以上の結果から、出芽酵母内において、イネいもち病菌のＨｉｋ１は出芽酵母のＹｐｄ１を介して薬剤感受性を付与している可能性が高いことが示された。
【産業上の利用可能性】  本願発明により、従来の方法では不可能であった、糸状菌特異的酵素をターゲットとして糸状菌に特異的に作用する薬剤の候補を選択的に得ることが出来る。更に本願発明のスクーニング方法及びキットでは、同じ菌類に属し、糸状菌に近縁である酵母をスクリーニングに用いているため、酵母にも作用する（副作用を起こす）薬剤を薬剤候補の選択と同時に除外することも可能であり、農薬及び医薬の開発を大幅に短縮できるという優れた効果を奏するものである。
本願発明は、農薬開発及び医薬開発の技術分野で利用することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま引用により本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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