(57)【要約】スフィンゴシン−１−リン酸やリゾホスファチジン酸を少量の試料で迅速かつ精度良く測定する分析方法を提供する。  試料中に存在するスフィンゴシン−１−リン酸とリン酸捕獲性亜鉛錯体との複合体を形成し、この複合体をマトリックス支援レーザー脱離イオン化・飛行時間型質量分析計を用いて分析することを特徴とする、スフィンゴシン−１−リン酸の分析方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に存在するスフィンゴシン−１−リン酸とリン酸捕獲性亜鉛錯体との複合体を形成し、この複合体をマトリックス支援レーザー脱離イオン化・飛行時間型質量分析計を用いて分析することを特徴とする、スフィンゴシン−１−リン酸の分析方法。
【請求項２】
試料中に標準物質として非天然型スフィンゴシンー１−リン酸を添加する請求の範囲第１項記載の分析方法。
【請求項３】
試料中のスフィンゴシン−１−リン酸及びリゾホスファチジン酸とリン酸捕獲性亜鉛錯体との複合体を形成し、この複合体をマトリックス支援レーザー脱離イオン化・飛行時間型質量分析計を用いて分析することを特徴とする、スフィンゴシン−１−リン酸及びリゾホスファチジン酸の同時分析方法。
【請求項４】
試料中に標準物質として非天然型スフィンゴシン−１−リン酸及び非天然型リゾホスファチジン酸を添加する請求の範囲第３項記載の分析方法。
【請求項５】
リン酸捕獲性亜鉛錯体が１，３−ビス［ビス（ピリジン−２−イルメチル）アミノ］プロパン−２−オラート二亜鉛（ＩＩ）錯体である請求の範囲第１〜４項のいずれか１項記載の分析方法。
【請求項６】
リン酸捕獲性亜鉛錯体及び非天然型スフィンゴシン−１−リン酸を含む、マトリックス支援レーザー脱離イオン化・飛行時間型質量分析によるスフィンゴシン−１−リン酸の分析用試薬キット。
【請求項７】
リン酸捕獲性亜鉛錯体、非天然型スフィンゴシン−１−リン酸及び非天然型リゾホスファチジン酸を含む、マトリックス支援レーザー脱離イオン化・飛行時間型質量分析によるスフィンゴシン−１−リン酸及びリゾホスファチジン酸の同時分析用試薬キット。
【請求項８】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化・飛行時間型質量分析によるスフィンゴシン−１−リン酸の分析におけるリン酸捕獲性亜鉛錯体の使用。
【請求項９】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化・飛行時間型質量分析によるスフィンゴシン−１−リン酸及びリゾホスファチジン酸の同時分析におけるリン酸捕獲性亜鉛錯体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、生理活性リゾリン脂質の分析方法、特に、スフィンゴシン−１−リン酸とリゾホスファチジン酸の同時分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  脂質は単純脂質、複合脂質及び不ケン化物に分類され、エネルギー源としてのトリグリセリド、細胞膜を構成するリン脂質、ステロイドホルモンの原料であるコレステロールがそれぞれの代表的な脂質である。【０００３】  これらの脂質の中で、リン脂質に対する認識は、従来の構造脂質から機能脂質へと大きく変わってきている。例えば、ホスファチジン酸は脂質生合成の中間体として知られてきたが、ホルモン受容の際、活性化されたホスホリパーゼＤが細胞膜のホスファチジルコリンに働いて生じるホスファチジン酸は、そのセカンドメッセンジャーとして機能する。また、血清は古典的な増殖因子として細胞培養に必須であるが、この作用はホスファチジン酸から脂肪酸が１分子はずれたリゾホスファチジン酸（本明細書以降「ＬＰＡ」と略す）や、セラミドを疎水基に持つリン脂質であるスフィンゴミエリンより生じるスフィンゴシン−１−リン酸（本明細書以降「Ｓ１Ｐ」と略す）によるところが大きいと考えられる。単純な化学構造を有する、Ｓ１ＰやＬＰＡが意外にも重要な生理活性を示し、またそれらの受容体が存在することから注目をされている。【０００４】  Ｓ１ＰやＬＰＡは上記のような重要な生体機能を有すると考えられることから、その分析は重要であるが、これらの脂質の生体内での存在が一過性で非常に微量であり、かつ、誘導体化しにくいため、従来から用いられてきた分析法では分析を行い難い（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌｕｍｅ１４６，Ｎｕｍｂｅｒ１，６２−６６（２００３））。そのため、そのままでイオン化できるエレクトロスプレーイオン化法による質量分析がよく使われている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９０，３０２−３１３（２００１）及びＣａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ．，１３（７），Ｊｕｌｙ，２００４）。しかし、この分析法では、共存する不純物によって検出感度が影響を受けやすいこと、また、共存する不純物によってイオン源が汚れやすく、多検体分析に耐えないなどの欠点があった（Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，１７，８７−９６（２００３））。
【発明の開示】
【０００５】  したがって、多検体のＳ１ＰやＬＰＡを少量の試料で迅速かつ精度良く測定する方法が求められている。
【０００６】  本発明者は、上記の課題を解決するため鋭意検討した結果、リン酸捕獲性亜鉛錯体で複合体化したＳ１ＰやＬＰＡをカチオンとして検出する、マトリックス支援レーザー脱離イオン化・飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ）による分析法を完成した。
【０００７】  すなわち、本発明は、
（１）試料中に存在するＳ１Ｐとリン酸捕獲性亜鉛錯体との複合体を形成し、この複合体をマトリックス支援レーザー脱離イオン化・飛行時間型質量分析計を用いて分析することを特徴とする、Ｓ１Ｐの分析方法；
（２）試料中に標準物質として非天然型Ｓ１Ｐを添加する前記発明（１）記載の分析方法；
（３）試料中のＳ１Ｐ及びＬＰＡとリン酸捕獲性亜鉛錯体との複合体を形成し、この複合体をマトリックス支援レーザー脱離イオン化・飛行時間型質量分析計を用いて分析することを特徴とする、Ｓ１Ｐ及びＬＰＡの同時分析方法；
（４）試料中に標準物質として非天然型Ｓ１Ｐ及び非天然型ＬＰＡを添加する前記発明（３）記載の分析方法；
（５）リン酸捕獲性亜鉛錯体が１，３−ビス［ビス（ピリジン−２−イルメチル）アミノ］プロパン−２−オラート二亜鉛（ＩＩ）錯体（本明細書以降「Ｚｎ２Ｌ３＋」と略す）である前記発明（１）〜（４）のいずれか一つに記載の分析方法；
（６）リン酸捕獲性亜鉛錯体及び非天然型Ｓ１Ｐを含む、マトリックス支援レーザー脱離イオン化・飛行時間型質量分析によるＳ１Ｐの分析用試薬キット；
（７）リン酸捕獲性亜鉛錯体、非天然型Ｓ１Ｐ及び非天然型ＬＰＡを含む、マトリックス支援レーザー脱離イオン化・飛行時間型質量分析によるＳ１Ｐ及びＬＰＡの同時分析用試薬キット；
（８）マトリックス支援レーザー脱離イオン化・飛行時間型質量分析によるＳ１Ｐの分析におけるリン酸捕獲性亜鉛錯体の使用；及び
（９）マトリックス支援レーザー脱離イオン化・飛行時間型質量分析によるＳ１Ｐ及びＬＰＡの同時分析におけるリン酸捕獲性亜鉛錯体の使用
である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、ＬＰＡ及びＳ１Ｐの構造式及び分子量、複合体ＬＰＡ／Ｚｎ２Ｌ３＋及びＳ１Ｐ／Ｚｎ２Ｌ３＋の構造式及びｍ／ｚを示す。
【図２】図２は、内部標準Ｓ１Ｐ（Ｃ２０）とＳ１Ｐ（Ｃ１８）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによる質量分析結果を示す。
【図３】図３は、Ｓ１Ｐ（Ｃ１８）とＳ１Ｐ（Ｃ２０）の感度比、すなわち検量線を示す。
【図４】図４は、内部標準Ｓ１Ｐ（Ｃ２０）とＬＰＡ（Ｃ１７：０）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによる質量分析結果を示す。
【図５】図５は、ヒト血漿中のＳ１Ｐ及びＬＰＡのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによる質量分析結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】  本発明における分析対象化合物は、Ｓ１Ｐである。あるいは、本発明における分析対象化合物は、Ｓ１Ｐ及びＬＰＡの両方である。本発明により、Ｓ１Ｐ及びＬＰＡが分子種レベルで分析できる。【００１０】  本発明における分析試料は、Ｓ１ＰやＬＰＡを含むものであれば特に限定されず、例えば、生体からの試料（器官、臓器、血液、血清、血漿、唾液、尿、腹水、リンパ液など）、動植物細胞の培養物、細胞画分、食品、飲料、医薬、化粧品等が挙げられる。さらに、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリンなどのリン脂質は、ホスホリパーゼＤおよびホスホリパーゼＡ１又はＡ２などの酵素で処理して選択的に加水分解しＳ１ＰやＬＰＡに変換した後に、本発明の分析方法を適用できる。【００１１】  本発明におけるリン酸捕獲性亜鉛錯体は、二価のリン酸（−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）−（Ｏ−）２）を捕獲できる亜鉛錯体化合物をいい、例えば、ＷＯ０３／０５３９３２Ａ１及びＷＯ２００４／０７８８２８Ａ１に記載の亜鉛錯体、すなわち、
一般式（１）：
2006090711.tif 000002
｛式中、Ｒは、相互に同一又は異なっていてもよく、水素原子；炭素数が１〜１６であるアルキル基；アシル基、アルコキシカルボニル基、アシルアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、カルボキシアルキル基、カルバモイルアルキル基、シアノアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基又はハロアルキル基（ここで、これらの基のアルキル部分の炭素数は、１〜１６である）；カルボキシル基；カルバモイル基；シアノ基；ヒドロキシル基；アミノ基；或いはハロゲノ基である｝で示される亜鉛錯体、
一般式（２）：
2006090711.tif 000003
で示される亜鉛錯体
が挙げられる。【００１２】  リン酸捕獲性亜鉛錯体としては、一般式（１）で表される錯体が好ましく、特に下式（３）：
2006090711.tif 000004
で示されるＺｎ２Ｌ３＋が好ましい。【００１３】  本発明においては、Ｓ１Ｐとリン酸捕獲性亜鉛錯体との複合体、又はＳ１Ｐ及びＬＰＡとリン酸捕獲性亜鉛錯体との複合体は、試料から分離したリン脂質中のＳ１ＰやＬＰＡをリン酸捕獲性亜鉛錯体と水性媒体（例えば水、水・メタノール混合媒体など）中で混合、撹拌することによって調製できる。Ｓ１Ｐ及びＬＰＡとリン酸捕獲性亜鉛錯体の量比は、モル比で、１：１０〜１：０．５、好ましくは、１：２〜１：１である。Ｓ１Ｐ及びＬＰＡとリン酸捕獲性亜鉛錯体との複合体は１：１複合体であり、例えば、リン酸捕獲性亜鉛錯体が３価であれば、Ｓ１ＰやＬＰＡが−２価であるから、１価の陽イオン型複合体が形成される。本発明の分析方法は、Ｓ１ＰやＬＰＡの総電荷が−２価から１価に変化することによる質量変化に基づく（図１）。【００１４】  本発明におけるマトリックス支援レーザー脱離イオン化・飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ）は、サンプル分子を取り込みながら結晶化したマトリックス分子にレーザー光を照射することによりサンプル分子をイオン化し、加速電圧によってイオンに運動エネルギーを与えた後、各イオンの飛行速度の違いにより質量分離を行う装置であり、例えば、市販の商品名「Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥＳＴＲ」（製造元：アプライドバイオシステムズ）や商品名「Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ  ＴＯＦ／ＴＯＦ」（製造元：ブルカーダルトニクス）を例示できる。【００１５】  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳは、１価陽イオン型のリン酸捕獲性亜鉛錯体／Ｓ１Ｐ又はＬＰＡ複合体の場合、２′，４′，６′−トリヒドロキシ−アセトフェノン（ＴＨＡＰ）をマトリックスとし、陽イオン検出モードで実施できる。【００１６】  本発明の分析方法によれば、Ｓ１ＰやＬＰＡの分子種別、例えば、結合している脂肪酸の種類別に分析できる。さらに、本発明の分析方法は、ホスホリパーゼなどの各種酵素による選択的加水分解と組み合わせれば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリンなどのリン脂質の分子種（結合脂肪酸やグリセリンへの結合位置別）を分析できる。【００１７】  本発明の分析方法においては、内部標準としてのＳ１ＰやＬＰＡ（測定すべきＳ１Ｐ又はＬＰＡとは結合脂肪酸の炭素数、二重結合の数又は結合の位置が異なるもの、例えばＳ１ＰはＣ２０あるいはＣ１７等、ＬＰＡはＣ１７：０あるいはＣ１９：０等）に対する測定すべきＳ１ＰやＬＰＡの検出効率を測定して、予めそれぞれの測定すべきＳ１ＰやＬＰＡ分子種の検量線を作成しておき、試料に既知量の内部標準としてのＳ１Ｐ又はＬＰＡを添加後、内部標準のピークカウントと測定すべきＳ１ＰやＬＰＡ分子種のピークカウントをそれぞれ測定し、検量線に基づいて測定すべきＳ１ＰやＬＰＡ分子種を定量することができる。内部標準としては、Ｓ１Ｐに対してはＳ１Ｐ（Ｃ２０又はＣ１７）、ＬＰＡに対してはＬＰＡ（Ｃ１７：０又はＣ１９：０）が好ましい。【００１８】  また、本発明は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化・飛行時間型質量分析によるＳ１Ｐの分析用試薬キットに関し、このキットは、リン酸捕獲性亜鉛錯体及び非天���型Ｓ１Ｐ（Ｃ２０あるいはＣ１７等）を含む。非天然型Ｓ１ＰとしてはＳ１Ｐ（Ｃ２０又はＣ１７）が好ましい。【００１９】  さらに、本発明は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化・飛行時間型質量分析によるＳ１Ｐ及びＬＰＡの同時分析用試薬キットに関し、このキットは、リン酸捕獲性亜鉛錯体、非天然型Ｓ１Ｐ（Ｃ２０あるいはＣ１７等）及び非天然型ＬＰＡ（Ｃ１７：０あるいはＣ１９：０等）を含む。非天然型Ｓ１ＰとしてはＳ１Ｐ（Ｃ２０又はＣ１７）、非天然型ＬＰＡとしてはＬＰＡ（Ｃ１７：０又はＣ１９：０）が好ましい。【００２０】  加えて、本発明は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化・飛行時間型質量分析によるＳ１Ｐの分析又はマトリックス支援レーザー脱離イオン化・飛行時間型質量分析によるＳ１Ｐ及びＬＰＡの同時分析におけるリン酸捕獲性亜鉛錯体の使用に関する。【００２１】  本発明の分析方法は、多検体のＳ１ＰやＬＰＡの分子種を少量の試料で迅速かつ精度良く測定できるので、Ｓ１ＰやＬＰＡが関係する種々の疾患や病態の診断や、Ｓ１ＰやＬＰＡの細胞レベルもしくは個体レベルでの機能の解明ができる。上記の疾患や病態又は機能としては、例えば、卵巣ガン、卵管ガン、乳ガン、子宮ガン、心環状動脈疾患、心不全、免疫疾患、喘息、アレルギー性疾患、血管新生、炎症、糖尿病、動脈硬化症、筋繊維芽細胞症、発作、ストレス性疾患、脳機能の異常、血栓、骨代謝異常、血液の凝固異常、創傷、遺伝子の発現、アポトーシス、アラキドン酸代謝、細胞増殖、細胞分化、血小板の活性化、ＮＯ合成などがある。
【実施例】
【００２２】実施例１
Ｓ１Ｐ（Ｃ２０）及びＬＰＡ（Ｃ１７：０）の調製
内部標準としてのＳ１Ｐ（Ｃ２０）及びＬＰＡ（Ｃ１７：０）を以下のようにして調製した。
１．Ｓ１Ｐ（Ｃ２０）
Ｓ１Ｐ（Ｃ２０）は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．より購入した。
２．ＬＰＡ（Ｃ１７：０）
市販の１，２−ジヘプタデカノイル−ホスホコリン（Ｃ１７：０／Ｃ１７：０−ＰＣ）を市販の蛇毒由来ホスホリパーゼＡ２で処理し、１−ヘプタデカノイル−２−リゾ−ホスホコリンを得た。この１−ヘプタデカノイル−２−リゾ−ホスホコリンをキャベツより調製したホスホリパーゼＤで処理してＬＰＡ（Ｃ１７：０）を得た。【００２３】実施例２
検量線の作成
内部標準物質であるＳ１Ｐ（Ｃ２０）の一定量（３．２ｎｍｏｌ）と種々の量（０．３２ｎｍｏｌ、１．６ｎｍｏｌ、３．２ｎｍｏｌ、６．４ｎｍｏｌあるいは１２．８ｎｍｏｌ）のＳ１Ｐ（Ｃ１８）とを混合し、０．１％アンモニア／メタノール液１００μｌに溶解した。それぞれの溶液の１０μｌに１ｍＭのＺｎ２Ｌ３＋溶液５μｌを加えて混合した。この混合液０．５μｌをプレートにスポットし、直ちにＴＨＡＰ溶液（ＴＨＡＰ１０ｍｇ／ｍｌアセトニトリル溶液）０．５μｌを重層し、プレート上で混合した。乾燥後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳを用いて測定を行い、検量線を作成した。図２にＳ１Ｐ（Ｃ２０）及びＳ１Ｐ（Ｃ１８）を共に３．２ｎｍｏｌ混合したサンプルについて測定した結果を示した。なお、図２の測定条件は以下の通りである。
測定モード  ：リフレクター（Ｒｅｆｌｅｃｔｏｒ）  加速電圧    ：２００００Ｖ
グリッド電圧  ：７２．５００％            遅延          ：２００ｎｓ  ｐｕｌｓｅ
レーザー強度  ：２５００                    測定回数          ：２５６
真空度      ：４．７０×１０−７Ｔｏｒｒ
また、これらの測定結果から得られた検量線を図３に示した。【００２４】  さらに、図４には、本測定法で内部標準物質に用いるＳ１Ｐ（Ｃ２０）及びＬＰＡ（Ｃ１７：０）を共に３．２ｎｍｏｌ混合したサンプルについて測定した結果を示した。なお、図４の測定条件は以下の通りである。
測定モード  ：リフレクター（Ｒｅｆｌｅｃｔｏｒ）    加速電圧    ：２００００Ｖ
グリッド電圧  ：７２．５００％              遅延        ：２００ｎｓ  ｐｕｌｓｅ
レーザー強度  ：２４５０                  測定回数        ：２５６
真空度      ：４．８５×１０−７Ｔｏｒｒ【００２５】実施例３
ヒト血漿からのＳ１Ｐ及びＬＰＡの分離
ヒト血漿３ｍｌ（×４）に６Ｎ塩酸０．６ｍｌ、クロロホルム４ｍｌ及びメタノール８ｍｌを加え撹拌し、さらに内部標準として３．２ｎｍｏｌのＳ１Ｐ（Ｃ２０）と１６．１ｎｍｏｌのＬＰＡ（Ｃ１７：０）とを加え撹拌した。これにクロロホルム３ｍｌと水３．７５ｍｌを加え抽出し、上層を得た。さらに上層をクロロホルム６．９ｍｌで２回抽出し、クロロホルム層を集め濃縮した。残渣にクロロホルム２．５ｍｌと０．１％アンモニア／メタノール溶液５ｍｌと水２ｍｌを加えてこれを溶解した。さらに、クロロホルム２．５ｍｌと水２．５ｍｌを加え攪拌した。下層を廃棄し、上層をクロロホルム５ｍｌで洗浄、分液し下層を廃棄した。上層にクロロホルム５ｍｌと４Ｎ塩酸１００μｌとを加え抽出した。上層をさらにクロロホルム５ｍｌで２回抽出し、下層を集めて、濃縮した。残渣をシリカゲル薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム／メタノール／２８％アンモニア水＝６０／３５／８（Ｖ／Ｖ／Ｖ））で展開した後、Ｓ１Ｐ及びＬＰＡに相当するバンドのシリカゲルを掻き取り、これを抽出し、濃縮した。【００２６】実施例４
Ｓ１Ｐ及びＬＰＡの分析
実施例３で濃縮したリン脂質を０．１％アンモニア／メタノール溶液０．１ｍｌに溶解し、その１０μｌを１ｍＭのＺｎ２Ｌ３＋溶液５μｌと混合した。この溶液０．５μｌをプレートにスポットして、直ちに０．５μｌのＴＨＡＰ溶液（ＴＨＡＰ１０ｍｇ／ｍｌアセトニトリル溶液）を重層し、プレート上で混合した。数分間乾燥し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳを用いて測定を行った。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによる測定結果を図５及び表１に示した。なお、図５の測定条件は以下の通りである。
測定モード    ：リフレクター（Ｒｅｆｌｅｃｔｏｒ）    加速電圧  ：２００００Ｖ
グリッド電圧  ：７２．５００％              遅延      ：２００ｎｓ  ｐｕｌｓｅ
レーザー強度  ：２５００                    測定回数    ：２５６
真空度      ：５．７２×１０−７Ｔｏｒｒ【００２７】
【表１】
2006090711.tif 000005
表１における「ｂａｓｅ」、「Ｃｏｕｎｔ−ｂａｓｅ」、「１５％同位体補正」及び「検出効率補正」は次の意味である。
マススペクトル上で検出されたそれぞれのピークの強度（Ｃｏｕｎｔ）からベースラインの値（ｂａｓｅ）を差し引いた値をそのイオンの真の強度とした（Ｃｏｕｎｔ−ｂａｓｅ）。【００２８】  天然に存在する炭素は１２Ｃと１３Ｃとが１００：１程度の割合で存在する。このため、図４に示すように、たとえ単一分子種であっても、その分子が１２Ｃからのみ構成される〔Ｍ〕＋だけでなく、分子中に１３Ｃを１個含む〔Ｍ＋１〕＋、あるいはこれを２個含む〔Ｍ＋２〕＋が検出される。このことは天然に存在するＬＰＡの分子種別定量をやや複雑にしている。例えば、ＬＰＡ（Ｃ１８：２）のリン酸捕獲性亜鉛錯体との複合体の〔Ｍ〕＋はｍ／ｚ１０２１として検出されるが、その〔Ｍ＋２〕＋はｍ／ｚ１０２３として検出される。これはＬＰＡ（Ｃ１８：１）のリン酸捕獲性亜鉛錯体との複合体の〔Ｍ〕＋と同じになってしまう。従って、このような場合には検出されたｍ／ｚ１０２３のイオン強度の内、ＬＰＡ（Ｃ１８：２）の〔Ｍ＋２〕＋に由来する部分を差し引き、その残りがＬＰＡ（Ｃ１８：１）のリン酸捕獲性亜鉛錯体との複合体の〔Ｍ〕＋と解釈すべきである。ＬＰＡのリン酸捕獲性亜鉛錯体との複合体では〔Ｍ＋２〕＋は〔Ｍ〕＋の約１５％で出現することがわかっているので、この値を用いて補正した（１５％同位体補正）。【００２９】  また、ＬＰＡはパルミチン酸などの飽和脂肪酸の結合した飽和型ＬＰＡ分子種とリノール酸などの不飽和脂肪酸の結合した不飽和型ＬＰＡ分子種が存在する。検出効率を比較した結果、いずれの不飽和型ＬＰＡ分子種の検出効率も飽和型ＬＰＡ分子種のそれに比べて２倍であった。今回、内部標準に用いた非天然型ＬＰＡは飽和型である。そこで、検出効率の違いを補正するために、不飽和型ＬＰＡ分子種の場合には、観察されたイオン強度を２分の１に補正した（検出効率補正）。
【産業上の利用可能性】
【００３０】  本発明により、Ｓ１ＰやＬＰＡを少量の試料量で迅速かつ精度良く測定することができ、Ｓ１ＰやＬＰＡが関係する種々の疾患や病態の診断や、Ｓ１ＰやＬＰＡの細胞レベルもしくは個体レベルでの機能の解明ができる。
【図１】
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【図２】
2006090711.tif 000007
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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