(57)【要約】  ＥＣＡＴ１５−１遺伝子、ＥＣＡＴ１５−２遺伝子、ＥＣＡＴ１６遺伝子、Ｒｎｆ１７遺伝子またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）遺伝子のいずれかに由来するポリヌクレオチドを含有する、ＥＳ細胞検出用マーカー等に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＣＡＴ１５−１遺伝子、ＥＣＡＴ１５−２遺伝子、ＥＣＡＴ１６遺伝子、Ｒｎｆ１７遺伝子またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）遺伝子のいずれかに由来するポリヌクレオチドを含有する、ＥＳ細胞検出用マーカー。
【請求項２】
ＥＣＡＴ１５−１遺伝子が配列番号：１または３に記載の塩基配列を含有する遺伝子である、請求項１記載のマーカー。
【請求項３】
ＥＣＡＴ１５−２遺伝子が配列番号：５または７に記載の塩基配列を含有する遺伝子である、請求項１記載のマーカー。
【請求項４】
ＥＣＡＴ１６遺伝子が配列番号：１７または３３に記載の塩基配列を含有する遺伝子である、請求項１記載のマーカー。
【請求項５】
Ｒｎｆ１７遺伝子が配列番号：９または１１に記載の塩基配列を含有する遺伝子である、請求項１記載のマーカー。
【請求項６】
ＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）遺伝子が配列番号：１３または１５に記載の塩基配列を含有する遺伝子である、請求項１記載のマーカー。
【請求項７】
連続する少なくとも１５塩基を含有するポリヌクレオチド及び／又は該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有する、請求項１〜６いずれか記載のマーカー。
【請求項８】
配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７または３３のいずれかに記載の塩基配列において、連続する少なくとも１５塩基を含有するポリヌクレオチド及び／又は該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有する、ＥＳ細胞検出用マーカー。
【請求項９】
ＥＳ細胞の検出においてプローブまたはプライマーとして使用される、請求項１〜８いずれか記載のマーカー。
【請求項１０】
ＥＣＡＴ１５−１、ＥＣＡＴ１５−２、ＥＣＡＴ１６、Ｒｎｆ１７またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）のいずれかを認識する抗体を含有する、ＥＳ細胞検出用マーカー。
【請求項１１】
ＥＣＡＴ１５−１が配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、請求項１０記載のマーカー。
【請求項１２】
ＥＣＡＴ１５−２が配列番号：６または８に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、請求項１０記載のマーカー。
【請求項１３】
ＥＣＡＴ１６が配列番号：１８または３４に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、請求項１０記載のマーカー。
【請求項１４】
Ｒｎｆ１７が配列番号：１０または１２に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、請求項１０記載のマーカー。
【請求項１５】
ＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）が配列番号：１４または１６に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、請求項１０記載のマーカー。
【請求項１６】
下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、ＥＳ細胞の検出方法：
（ａ）被験細胞に由来するＲＮＡまたはそれから転写された相補的ポリヌクレオチドと、請求項１〜９いずれか記載のマーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該マーカーに結合した被験細胞由来のＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを、上記マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の測定結果に基づいて、被験細胞がＥＳ細胞であるか否かを判断する工程。
【請求項１７】
下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、ＥＳ細胞の検出方法：
（ａ）被験細胞に由来するタンパク質と、請求項１０〜１５いずれか記載のマーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該マーカーに結合した被験細胞由来のタンパク質を、上記マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の測定結果に基づいて、被験細胞がＥＳ細胞であるか否かを判断する工程。
【請求項１８】
以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、体細胞の核初期化物質のスクリーニング方法：
（ａ）ＥＣＡＴ１５−１遺伝子、ＥＣＡＴ１５−２遺伝子、ＥＣＡＴ１６遺伝子、Ｒｎｆ１７遺伝子またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞と、被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）前記（ａ）の工程の後、マーカー遺伝子発現細胞の出現の有無を調べ、該細胞を出現させた被験物質を体細胞の核初期化候補物質として選択する工程。
【請求項１９】
マーカー遺伝子が、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、発光酵素遺伝子、発色酵素遺伝子またはこれらの組み合わせに係る遺伝子である、請求項１８記載のスクリーニング方法。
【請求項２０】
以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、請求項１８または１９記載のスクリーニング方法：
（ａ）ＥＣＡＴ１５−１遺伝子、ＥＣＡＴ１５−２遺伝子、ＥＣＡＴ１６遺伝子、Ｒｎｆ１７遺伝子またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）遺伝子に薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子をノックインした遺伝子を含有する体細胞と、被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）前記（ａ）の工程の後、選択培地中での生存細胞の有無を調べ、該生存細胞を生じさせた被験物質を体細胞の核初期化候補物質として選択する工程。
【請求項２１】
ＥＣＡＴ１５−１遺伝子、ＥＣＡＴ１５−２遺伝子、ＥＣＡＴ１６遺伝子、Ｒｎｆ１７遺伝子またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）遺伝子にマーカー遺伝子をノックインした遺伝子を含有するノックインマウス。
【請求項２２】
請求項２１記載のノックインマウスの、請求項１８〜２０いずれか記載のスクリーニング方法において用いる体細胞の供給源としての使用。
【請求項２３】
ＥＣＡＴ１５−１遺伝子、ＥＣＡＴ１５−２遺伝子、ＥＣＡＴ１６遺伝子、Ｒｎｆ１７遺伝子またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞。
【請求項２４】
ＥＣＡＴ１５−１遺伝子、ＥＣＡＴ１５−２遺伝子、ＥＣＡＴ１６遺伝子、Ｒｎｆ１７遺伝子またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）遺伝子にマーカー遺伝子をノックインした遺伝子を含有する、請求項２３記載の体細胞。
【請求項２５】
以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、ＥＳ様細胞の選択方法：
（ａ）ＥＣＡＴ１５−１遺伝子、ＥＣＡＴ１５−２遺伝子、ＥＣＡＴ１６遺伝子、Ｒｎｆ１７遺伝子またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞と、体細胞の核初期化物質とを接触させる工程、
（ｂ）前記（ａ）の工程の後、マーカー遺伝子発現細胞をＥＳ様細胞として選択する工程。
【請求項２６】
以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、請求項２５記載の選択方法：
（ａ）ＥＣＡＴ１５−１遺伝子、ＥＣＡＴ１５−２遺伝子、ＥＣＡＴ１６遺伝子、Ｒｎｆ１７遺伝子またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置に薬剤耐性遺伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞と、体細胞の核初期化物質とを接触させる工程、
（ｂ）前記（ａ）の工程の後、選択培地中での生存細胞をＥＳ様細胞として選択する工程。
【請求項２７】
請求項２３または２４記載の体細胞の、請求項１８〜２０いずれか記載のスクリーニング方法または請求項２５〜２６いずれか記載の選択方法における使用。
【請求項２８】
以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、ＥＳ細胞の未分化・多能性維持物質のスクリーニング方法：
（ａ）ＥＣＡＴ１５−１遺伝子、ＥＣＡＴ１５−２遺伝子、ＥＣＡＴ１６遺伝子、Ｒｎｆ１７遺伝子またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有するＥＳ細胞を、ＥＳ細胞の未分化・多能性を維持できない培地中で被験物質と接触させる工程、
（ｂ）前記（ａ）の工程の後、マーカー遺伝子発現細胞の存在の有無を調べ、該細胞を存在させた被験物質をＥＳ細胞未分化・多能性維持の候補物質として選択する工程。
【請求項２９】
以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、請求項２８記載のスクリーニング方法：
（ａ）ＥＣＡＴ１５−１遺伝子、ＥＣＡＴ１５−２遺伝子、ＥＣＡＴ１６遺伝子、Ｒｎｆ１７遺伝子またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）遺伝子に薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子をノックインした遺伝子を含有するＥＳ細胞を、ＥＳ細胞の未分化・多能性を維持できない培地中で被験物質と接触させる工程、
（ｂ）前記（ａ）の工程の後、選択培地中での生存細胞の有無を調べ、該生存細胞を存在させた被験物質をＥＳ細胞未分化・多能性維持の候補物質として選択する工程。
【請求項３０】
ＥＣＡＴ１５−１遺伝子、ＥＣＡＴ１５−２遺伝子、ＥＣＡＴ１６遺伝子、Ｒｎｆ１７遺伝子またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有するＥＳ細胞。
【請求項３１】
ＥＣＡＴ１５−１遺伝子、ＥＣＡＴ１５−２遺伝子、ＥＣＡＴ１６遺伝子、Ｒｎｆ１７遺伝子またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）遺伝子にマーカー遺伝子をノックインした遺伝子を含有する、請求項３０記載のＥＳ細胞。
【請求項３２】
請求項３０または３１記載のＥＳ細胞の、請求項２８または２９記載のスクリーニング方法における使用。
【請求項３３】
ＥＣＡＴ１５−１、ＥＣＡＴ１５−２、ＥＣＡＴ１６、Ｒｎｆ１７またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）のいずれかを含有するタンパク質と、当該タンパク質の細胞内への取り込みを促進する物質との結合体。
【請求項３４】
ＥＣＡＴ１５−１、ＥＣＡＴ１５−２、ＥＣＡＴ１６、Ｒｎｆ１７またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）のいずれかを含有するタンパク質と、当該タンパク質の細胞内への取り込みを促進するタンパク質との融合タンパク質である、請求項３３記載の結合体。
【請求項３５】
請求項３４記載の融合タンパク質をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
【請求項３６】
請求項３５記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
【請求項３７】
請求項３６記載の発現ベクターを導入した細胞。
【請求項３８】
ＥＣＡＴ１５−１、ＥＣＡＴ１５−２、ＥＣＡＴ１６、Ｒｎｆ１７またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）のいずれかを含有するタンパク質、若しくは請求項３３または３４記載の結合体を有効成分として含有するＥＳ細胞の機能維持剤。
【請求項３９】
ＥＣＡＴ１５−１遺伝子、ＥＣＡＴ１５−２遺伝子、ＥＣＡＴ１６遺伝子、Ｒｎｆ１７遺伝子またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）遺伝子のいずれかを含有するポリヌクレオチド、またはこれらを含有する発現ベクターを有効成分として含有するＥＳ細胞の機能維持剤。
【請求項４０】
以下の(ａ）〜（ｄ）のいずれかよりなるＥＣＡＴ１６遺伝子のポリヌクレチド：
（ａ）配列番号：１７または３３に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：１８または３４に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチド、
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと７０％以上の相同性を有し、且つＥＣＡＴ１６の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）前記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチド（相補鎖）に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＥＣＡＴ１６の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかよりなるＥＣＡＴ１６タンパク質：
（ａ）配列番号：１８または３４に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質、
（ｂ）前記（ａ）のタンパク質と７０％以上の相同性を有し、且つＥＣＡＴ１６の機能を有するタンパク質、
（ｃ）前記（ａ）のタンパク質において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を含有し、且つＥＣＡＴ１６の機能を有するタンパク質。
【請求項４２】
配列番号：１または５に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
【請求項４３】
配列番号：２または６に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質。
【請求項４４】
請求項４０または４２記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
【請求項４５】
請求項４４記載の発現ベクターを導入した細胞。
【請求項４６】
請求項４５記載の細胞を、請求項４４記載の発現ベクターの発現可能な条件下で培養することを特徴とする、組換えタンパク質の製造方法。
【請求項４７】
請求項４１または４３記載のタンパク質に特異的に結合する抗体。
【請求項４８】
請求項４０または４２記載のポリヌクレオチドのいずれかに特異的な、連続する少なくとも１５塩基を含有するポリヌクレオチド及び／又は該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド。
【請求項４９】
請求項４１または４３記載のタンパク質のいずれかに特異的な、連続する少なくとも６アミノ酸を含有するポリペプチド。
【請求項５０】
請求項４０または４２記載のポリヌクレオチドのいずれかを人為的に染色体中に挿入したか、あるいはいずれかをノックアウトさせた遺伝子改変動物。
【請求項５１】
請求項４０または４２記載のポリヌクレオチドのいずれかに相補的なアンチセンス核酸または短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）。
【請求項５２】
ＥＣＡＴ１５−１およびＥＣＡＴ１５−２の複合体。
【請求項５３】
請求項５２記載の複合体、または当該複合体の細胞内への取り込みを促進する物質との結合体を有効成分として含有する、請求項３８記載のＥＳ細胞の機能維持剤。
【請求項５４】
以下の（ａ）および（ｂ）：
（ａ）ＥＣＡＴ１５−１遺伝子を含有するポリヌクレオチドまたはこれを含有する発現ベクター、
（ｂ）ＥＣＡＴ１５−２遺伝子を含有するポリヌクレオチドまたはこれを含有する発現ベクター、
を有効成分として含有する、請求項３９記載のＥＳ細胞の機能維持剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＳ細胞（embryonic stem cells）に特異的に発現している遺伝子及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は哺乳動物胚盤胞の内部細胞塊より樹立した幹細胞であり、すべての細胞へと分化する能力（分化多能性）を維持したまま、無限に増殖させることができる。ＥＳ細胞は1981年にまずマウスで樹立され、ノックアウトマウスによる遺伝子機能解析という画期的な技術をもたらした。さらに、1998年にヒトＥＳ細胞の樹立が報告されてからは、再生医学への応用が大きく期待されるようになった。ＥＳ細胞から分化させた心筋や神経細胞を心筋梗塞や神経変性疾患の患者へ移植して機能回復を計ろうというものである。【０００３】
白血病に対する骨髄移植に代表されるように細胞移植療法は既に実施されているが、十分な移植細胞の確保と拒絶反応の抑制という２つの課題を抱えている。半永久的に分裂するＥＳ細胞を用いると、十分な細胞の確保という問題を一気に解決できる。さらに体細胞クローン技術と組み合わせると、拒絶反応も克服することが可能である。患者の体細胞から作製したクローン胚からＥＳ細胞を樹立し移植に用いれば、患者と同じ遺伝子を持つため拒絶は起こり得ない。したがって、ＥＳ細胞は細胞移植療法における２つの課題をともに克服する可能性を持つ。【０００４】
このように大きな可能性を秘めたＥＳ細胞であるが、ヒトＥＳ細胞はマウスのＥＳ細胞に比べて樹立と維持が困難であり、確実な樹立技術および培養技術の開発が必要である。さらにヒトＥＳ細胞を樹立するためには胚を犠牲にする必要がある。さらに体細胞クローン技術と組み合わせた場合は、クローン人間の作製に容易につながる。このような倫理的問題点を解決するために、分化多能性を持ったＥＳ様細胞を体細胞から胚を経ずに直接作り出す技術の開発が望まれている。【０００５】
これらの技術開発において重要な役割を果たすのがＥＳ細胞等分化多能性細胞で特異的に発現する遺伝子（ES cell associated transcript gene、以下ECAT遺伝子）である。ECAT遺伝子は、細胞がＥＳ細胞であるかどうかのマーカーとなる。またECAT遺伝子のＥＳ細胞特異的発現を引き起こす調節領域と薬剤耐性遺伝子を組み合わせることにより、多種類の細胞の混合培養からＥＳ細胞を効率よく選択することができる（特許文献１を参照）。さらに体細胞においてECAT遺伝子を発現誘導することにより、ＥＳ様細胞への変換を促進させる可能性もある。
これまでにECAT遺伝子として報告されているものとしては、転写因子Oct3(Oct4、POU5f1とも呼ばれる。以下Oct3/4という）遺伝子が知られている。また、同様な遺伝子がヒトでも報告されているが（hOct3/4遺伝子；非特許文献１を参照）、hOct-3/4遺伝子についてはＥＳ細胞特異的な発現を証明したという報告はない。【０００６】
近年我々のグループは、ES細胞と内部細胞塊の両方で分化多能性を積極的に維持する未知因子の探索をめざし、ESTデータベースを Digital Differential Display で解析し、ES細胞で特異的に発現する９個の遺伝子を見出し、これをECAT1遺伝子〜ECAT9遺伝子と命名した（特許文献２を参照）。このうちECAT4はNanogとも呼ばれる因子であり、ＥＳ細胞が有する全能性（分化多能性）の維持に必須の因子であることが明らかとなった（非特許文献２を参照）。またECAT5はERasとも呼ばれる因子であり、ＥＳ細胞の増殖を促進する因子であることが明らかになっている（非特許文献３を参照）。
前記の解析においては、他にも実験的に多能性細胞特異的な発現が報告されているOct3/4、UTF1、REX1なども同定されており、スクリーニング法として極めて有効であることが証明されている。【０００７】
【特許文献１】米国特許第6146888号公報
【特許文献２】WO 02/097090 号公報
【非特許文献１】Takeda et al., Nucleic Acids Research, 20:4613-4620(1992)
【非特許文献２】Mitsui, K., et al., Cell, 113: 631-642(2003)
【非特許文献３】Takahashi, K., et al., Nature, 423: 541-545(2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、新規なECAT遺伝子を提供することを目的とする。さらに詳しくは、本発明は、新たなECAT遺伝子であるECAT15-1遺伝子、ECAT15-2遺伝子、ECAT16遺伝子、Rnf17遺伝子およびLOC380905(TDRD4)遺伝子を利用したＥＳ細胞の検出法、体細胞核初期化物質のスクリーニング法またはＥＳ細胞維持物質のスクリーニング法などを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、ＥＳ細胞の基礎研究や再生医学、ＥＳ細胞の細胞移植への応用といった観点から、新たなECAT遺伝子の探索を進めている。【００１０】
本発明者は新たなECAT遺伝子を同定するために、ESTデータベースを Digital Differential Display で解析し、候補遺伝子の探索を行った。候補遺伝子のうち、DNA結合ドメインであるSAPモチーフを含有するECAT15-1遺伝子、および癌遺伝子mycへの結合が示唆されているRnf17遺伝子にまず着目し、鋭意検討を進めた結果、以下の（1）〜（5）：
（1）ECAT15-1遺伝子（配列番号：1〜4）、
（2）ECAT15-2遺伝子（配列番号：5〜8）、
（3）ECAT16遺伝子（配列番号：17〜18および配列番号：33〜34）、
（4）Rnf17遺伝子（配列番号：9〜12）、
（5）LOC380905遺伝子（配列番号：13〜16）、
の5種類の遺伝子(上記配列番号は対応のアミノ酸配列も含む)、中でもECAT15-1遺伝子、ECAT15-2遺伝子およびECAT16遺伝子は、いずれもＥＳ細胞特異的に発現するECAT遺伝子であり、ＥＳ細胞を特徴付けるマーカー遺伝子であることが明らかとなった。
本発明の新規ECAT遺伝子は、いずれもES細胞特異的に発現する遺伝子であるため、これら遺伝子または当該遺伝子よりコードされるタンパク質は、ＥＳ細胞の検出、体細胞核初期化物質のスクリーニング、またはＥＳ細胞維持物質のスクリーニング等において有効に用いられる。
本発明はこのような知見に基づき完成するに至ったものである。【００１１】
すなわち本発明は、下記に掲げるものである：
（１）  ＥＣＡＴ１５−１遺伝子、ＥＣＡＴ１５−２遺伝子、ＥＣＡＴ１６遺伝子、Ｒｎｆ１７遺伝子またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）遺伝子のいずれかに由来するポリヌクレオチドを含有する、ＥＳ細胞検出用マーカー、
（２）  ＥＣＡＴ１５−１遺伝子が配列番号：１または３に記載の塩基配列を含有する遺伝子である、前記（１）記載のマーカー、
（３）  ＥＣＡＴ１５−２遺伝子が配列番号：５または７に記載の塩基配列を含有する遺伝子である、前記（１）記載のマーカー、
（４）  ＥＣＡＴ１６遺伝子が配列番号：１７または３３に記載の塩基配列を含有する遺伝子である、前記（１）記載のマーカー、
（５）  Ｒｎｆ１７遺伝子が配列番号：９または１１に記載の塩基配列を含有する遺伝子である、前記（１）記載のマーカー、
（６）  ＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）遺伝子が配列番号：１３または１５に記載の塩基配列を含有する遺伝子である、前記（１）記載のマーカー、
（７）  連続する少なくとも１５塩基を含有するポリヌクレオチド及び／又は該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有する、前記（１）〜（６）いずれか記載のマーカー、
（８）  配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７または３３のいずれかに記載の塩基配列において、連続する少なくとも１５塩基を含有するポリヌクレオチド及び／又は該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有する、ＥＳ細胞検出用マーカー、
（９）  ＥＳ細胞の検出においてプローブまたはプライマーとして使用される、前記（１）〜（８）いずれか記載のマーカー、【００１２】
（１０）  ＥＣＡＴ１５−１、ＥＣＡＴ１５−２、ＥＣＡＴ１６、Ｒｎｆ１７またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）のいずれかを認識する抗体を含有する、ＥＳ細胞検出用マーカー、
（１１）  ＥＣＡＴ１５−１が配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、前記（１０）記載のマーカー、
（１２）  ＥＣＡＴ１５−２が配列番号：６または８に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、前記（１０）記載のマーカー、
（１３）  ＥＣＡＴ１６が配列番号：１８または３４に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、前記（１０）記載のマーカー、
（１４）  Ｒｎｆ１７が配列番号：１０または１２に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、前記（１０）記載のマーカー、
（１５）  ＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）が配列番号：１４または１６に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、前記（１０）記載のマーカー、【００１３】
（１６）  下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、ＥＳ細胞の検出方法：
（ａ）被験細胞に由来するＲＮＡまたはそれから転写された相補的ポリヌクレオチドと、前記（１）〜（９）いずれか記載のマーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該マーカーに結合した被験細胞由来のＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを、上記マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の測定結果に基づいて、被験細胞がＥＳ細胞であるか否かを判断する工程、
（１７）  下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、ＥＳ細胞の検出方法：
（ａ）被験細胞に由来するタンパク質と、前記（１０）〜（１５）いずれか記載のマーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該マーカーに結合した被験細胞由来のタンパク質を、上記マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の測定結果に基づいて、被験細胞がＥＳ細胞であるか否かを判断する工程、【００１４】
（１８）  以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、体細胞の核初期化物質のスクリーニング方法：
（ａ）ＥＣＡＴ１５−１遺伝子、ＥＣＡＴ１５−２遺伝子、ＥＣＡＴ１６遺伝子、Ｒｎｆ１７遺伝子またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞と、被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）前記（ａ）の工程の後、マーカー遺伝子発現細胞の出現の有無を調べ、該細胞を出現させた被験物質を体細胞の核初期化候補物質として選択する工程、
（１９）  マーカー遺伝子が、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、発光酵素遺伝子、発色酵素遺伝子またはこれらの組み合わせに係る遺伝子である、前記（１８）記載のスクリーニング方法、
（２０）  以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、前記（１８）または（１９）記載のスクリーニング方法：
（ａ）ＥＣＡＴ１５−１遺伝子、ＥＣＡＴ１５−２遺伝子、ＥＣＡＴ１６遺伝子、Ｒｎｆ１７遺伝子またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）遺伝子に薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子をノックインした遺伝子を含有する体細胞と、被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）前記（ａ）の工程の後、選択培地中での生存細胞の有無を調べ、該生存細胞を生じさせた被験物質を体細胞の核初期化候補物質として選択する工程、【００１５】
（２１）  ＥＣＡＴ１５−１遺伝子、ＥＣＡＴ１５−２遺伝子、ＥＣＡＴ１６遺伝子、Ｒｎｆ１７遺伝子またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）遺伝子にマーカー遺伝子をノックインした遺伝子を含有するノックインマウス、
（２２）  前記（２１）記載のノックインマウスの、前記（１８）〜（２０）いずれか記載のスクリーニング方法において用いる体細胞の供給源としての使用、【００１６】
（２３）  ＥＣＡＴ１５−１遺伝子、ＥＣＡＴ１５−２遺伝子、ＥＣＡＴ１６遺伝子、Ｒｎｆ１７遺伝子またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞、
（２４）  ＥＣＡＴ１５−１遺伝子、ＥＣＡＴ１５−２遺伝子、ＥＣＡＴ１６遺伝子、Ｒｎｆ１７遺伝子またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）遺伝子にマーカー遺伝子をノックインした遺伝子を含有する、前記（２３）記載の体細胞、【００１７】
（２５）  以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、ＥＳ様細胞の選択方法：
（ａ）ＥＣＡＴ１５−１遺伝子、ＥＣＡＴ１５−２遺伝子、ＥＣＡＴ１６遺伝子、Ｒｎｆ１７遺伝子またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞と、体細胞の核初期化物質とを接触させる工程、
（ｂ）前記（ａ）の工程の後、マーカー遺伝子発現細胞をＥＳ様細胞として選択する工程、
（２６）  以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、前記（２５）記載の選択方法：
（ａ）ＥＣＡＴ１５−１遺伝子、ＥＣＡＴ１５−２遺伝子、ＥＣＡＴ１６遺伝子、Ｒｎｆ１７遺伝子またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置に薬剤耐性遺伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞と、体細胞の核初期化物質とを接触させる工程、
（ｂ）前記（ａ）の工程の後、選択培地中での生存細胞をＥＳ様細胞として選択する工程、
（２７）  前記（２３）または（２４）記載の体細胞の、前記（１８）〜（２０）いずれか記載のスクリーニング方法または前記（２５）〜（２６）いずれか記載の選択方法における使用、【００１８】
（２８）  以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、ＥＳ細胞の未分化・多能性維持物質のスクリーニング方法：
（ａ）ＥＣＡＴ１５−１遺伝子、ＥＣＡＴ１５−２遺伝子、ＥＣＡＴ１６遺伝子、Ｒｎｆ１７遺伝子またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有するＥＳ細胞を、ＥＳ細胞の未分化・多能性を維持できない培地中で被験物質と接触させる工程、
（ｂ）前記（ａ）の工程の後、マーカー遺伝子発現細胞の存在の有無を調べ、該細胞を存在させた被験物質をＥＳ細胞未分化・多能性維持の候補物質として選択する工程、
（２９）  以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、前記（２８）記載のスクリーニング方法：
（ａ）ＥＣＡＴ１５−１遺伝子、ＥＣＡＴ１５−２遺伝子、ＥＣＡＴ１６遺伝子、Ｒｎｆ１７遺伝子またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）遺伝子に薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子をノックインした遺伝子を含有するＥＳ細胞を、ＥＳ細胞の未分化・多能性を維持できない培地中で被験物質と接触させる工程、
（ｂ）前記（ａ）の工程の後、選択培地中での生存細胞の有無を調べ、該生存細胞を存在させた被験物質をＥＳ細胞未分化・多能性維持の候補物質として選択する工程、【００１９】
（３０）  ＥＣＡＴ１５−１遺伝子、ＥＣＡＴ１５−２遺伝子、ＥＣＡＴ１６遺伝子、Ｒｎｆ１７遺伝子またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有するＥＳ細胞、
（３１）  ＥＣＡＴ１５−１遺伝子、ＥＣＡＴ１５−２遺伝子、ＥＣＡＴ１６遺伝子、Ｒｎｆ１７遺伝子またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）遺伝子にマーカー遺伝子をノックインした遺伝子を含有する、前記（３０）記載のＥＳ細胞、
（３２）  前記（３０）または（３１）記載のＥＳ細胞の、前記（２８）または（２９）記載のスクリーニング方法における使用、【００２０】
（３３）  ＥＣＡＴ１５−１、ＥＣＡＴ１５−２、ＥＣＡＴ１６、Ｒｎｆ１７またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）のいずれかを含有するタンパク質と、当該タンパク質の細胞内への取り込みを促進する物質との結合体、
（３４）  ＥＣＡＴ１５−１、ＥＣＡＴ１５−２、ＥＣＡＴ１６、Ｒｎｆ１７またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）のいずれかを含有するタンパク質と、当該タンパク質の細胞内への取り込みを促進するタンパク質との融合タンパク質である、前記（３３）記載の結合体、
（３５）  前記（３４）記載の融合タンパク質をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチド、
（３６）  前記（３５）記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター、
（３７）  前記（３６）記載の発現ベクターを導入した細胞、【００２１】
（３８）  ＥＣＡＴ１５−１、ＥＣＡＴ１５−２、ＥＣＡＴ１６、Ｒｎｆ１７またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）のいずれかを含有するタンパク質、若しくは前記（３３）または（３４）記載の結合体を有効成分として含有するＥＳ細胞の機能維持剤、
（３９）  ＥＣＡＴ１５−１遺伝子、ＥＣＡＴ１５−２遺伝子、ＥＣＡＴ１６遺伝子、Ｒｎｆ１７遺伝子またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）遺伝子のいずれかを含有するポリヌクレオチド、またはこれを含有する発現ベクターを有効成分として含有するＥＳ細胞の機能維持剤、【００２２】
（４０）  以下の(ａ）〜（ｄ）のいずれかよりなるＥＣＡＴ１６遺伝子のポリヌクレチド：
（ａ）配列番号：１７または３３に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：１８または３４に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチド、
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと７０％以上の相同性を有し、且つＥＣＡＴ１６の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）前記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチド（相補鎖）に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＥＣＡＴ１６の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（４１）  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかよりなるＥＣＡＴ１６タンパク質：
（ａ）配列番号：１８または３４に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質、
（ｂ）前記（ａ）のタンパク質と７０％以上の相同性を有し、且つＥＣＡＴ１６の機能を有するタンパク質、
（ｃ）前記（ａ）のタンパク質において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を含有し、且つＥＣＡＴ１６の機能を有するタンパク質、【００２３】
（４２）  配列番号：１または５に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、
（４３）  配列番号：２または６に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質、
（４４）  前記（４０）または（４２）記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター、
（４５）  前記（４４）記載の発現ベクターを導入した細胞、
（４６）  前記（４５）記載の細胞を、前記（４４）記載の発現ベクターの発現可能な条件下で培養することを特徴とする、組換えタンパク質の製造方法、
（４７）  前記（４１）または（４３）記載のタンパク質に特異的に結合する抗体、
（４８）  前記（４０）または（４２）記載のポリヌクレオチドのいずれかに特異的な、連続する少なくとも１５塩基を含有するポリヌクレオチド及び／又は該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、
（４９）  前記（４１）または（４３）記載のタンパク質のいずれかに特異的な、連続する少なくとも６アミノ酸を含有するポリペプチド、
（５０）  前記（４０）または（４２）記載のポリヌクレオチドのいずれかを人為的に染色体中に挿入したか、あるいはいずれかをノックアウトさせた遺伝子改変動物、
（５１）  前記（４０）または（４２）記載のポリヌクレオチドのいずれかに相補的なアンチセンス核酸または短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、
（５２）  ＥＣＡＴ１５−１およびＥＣＡＴ１５−２の複合体、
（５３）  前記（５２）記載の複合体、または当該複合体の細胞内への取り込みを促進する物質との結合体を有効成分として含有する、前記（３８）記載のＥＳ細胞の機能維持剤、ならびに
（５４）  以下の（ａ）および（ｂ）：
（ａ）ＥＣＡＴ１５−１遺伝子を含有するポリヌクレオチドまたはこれを含有する発現ベクター、
（ｂ）ＥＣＡＴ１５−２遺伝子を含有するポリヌクレオチドまたはこれを含有する発現ベクター、
を有効成分として含有する、前記（３９）記載のＥＳ細胞の機能維持剤。
【発明の効果】
【００２４】
本発明のECAT15-1遺伝子、ECAT15-2遺伝子、ECAT16遺伝子、Rnf17遺伝子及びLOC380905(TDRD4)遺伝子は、ＥＳ細胞で特異的に発現する遺伝子であることから、これら遺伝子または当該遺伝子よりコードされるタンパク質は、ＥＳ細胞の検出、体細胞核初期化物質のスクリーニング、またはＥＳ細胞維持物質のスクリーニング等において有効に用いられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における慣用記号に従う。【００２６】
本明細書において「遺伝子（ECAT15-1遺伝子、ECAT15-2遺伝子、ECAT16遺伝子、Rnf17遺伝子、LOC380905(TDRD4)遺伝子）」という用語を用いる場合、技術内容に応じて、cDNA(mRNA)のみならずゲノムDNAを指す場合もある。
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、RNAおよびDNAのいずれをも包含する趣旨で用いられる。
本明細書において「抗体」とは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはＦａｂフラグメントやＦａｂ発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。【００２７】
本明細書において「ECAT15-1遺伝子」とは、配列番号：１に記載の塩基配列を含有するマウスECAT15-1遺伝子、配列番号：３に記載の塩基配列を含有するヒトECAT15-1遺伝子、またはこれら塩基配列に類似の塩基配列を含有する遺伝子が挙げられる。
本明細書において「ECAT15-2遺伝子」とは、配列番号：５に記載の塩基配列を含有するマウスECAT15-2遺伝子、配列番号：７に記載の塩基配列を含有するヒトECAT15-2遺伝子、またはこれら塩基配列に類似の塩基配列を含有する遺伝子が挙げられる。【００２８】
本明細書において「ECAT16遺伝子」とは、配列番号：１７に記載の塩基配列を含有するマウスECAT16遺伝子、配列番号：３３に記載の塩基配列を含有するヒトECAT16遺伝子、またはこれら塩基配列に類似の塩基配列を含有する遺伝子が挙げられる。【００２９】
本明細書において「Rnf17遺伝子」とは、配列番号：９に記載の塩基配列を含有するマウスRnf17遺伝子、配列番号：１１に記載の塩基配列を含有するヒトRnf17遺伝子、またはこれら塩基配列に類似の塩基配列を含有する遺伝子が挙げられる。
本明細書において「LOC380905(TDRD4)遺伝子」とは、LOC380905遺伝子またはTDRD4遺伝子と呼ばれる遺伝子であり、具体的には配列番号：１３に記載の塩基配列を含有するマウスLOC380905遺伝子、配列番号：１５に記載の塩基配列を含有するヒトTDRD4遺伝子（マウスLOC380905のヒト相同遺伝子）、またはこれら塩基配列に類似の塩基配列を含有する遺伝子が挙げられる。【００３０】
前記において「類似の塩基配列を含有する遺伝子」とは、前記配列番号に示される塩基配列中、１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含有する遺伝子や、前記配列番号で示される塩基配列と高い相同性を有する塩基配列を含有する遺伝子が挙げられる。
ここで「高い相同性を有する塩基配列を含有する遺伝子」とは、具体的には前記配列番号で示された塩基配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上の相同性を有する塩基配列を含有する遺伝子が挙げられる。また別の態様としては、前記配列番号で示された塩基配列（相補鎖）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子が挙げられる。ここでストリンジェントな条件とは、ハイブリダイズ反応や洗浄の際の温度、塩濃度等を適宜変化させることにより調節することができ、所望の相同性に応じて設定されるが、例えば塩濃度：6×SSC、温度：65℃のハイブリダイズ条件が挙げられる。【００３１】
これら「（本発明の各ECAT遺伝子と）類似の塩基配列を含有する遺伝子」は、マーカーとして使用する場合は、各ECAT遺伝子のES細胞特異的な発現を検出できるという特徴を有すればよい。また後述のES細胞の機能維持剤として使用する場合は、各ECAT遺伝子と同様のES細胞の機能維持活性を有すれば良い。【００３２】
本明細書において「ECAT15-1」とは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含有するマウスECAT15-1タンパク質、配列番号：４に記載のアミノ酸配列を含有するヒトECAT15-1タンパク質、またはこれらアミノ酸配列に類似のアミノ酸配列を含有するタンパク質が挙げられる。
本明細書において「ECAT15-2」とは、配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含有するマウスECAT15-2タンパク質、配列番号：８に記載のアミノ酸配列を含有するヒトECAT15-2タンパク質、またはこれらアミノ酸配列に類似のアミノ酸配列を含有するタンパク質が挙げられる。【００３３】
本明細書において「ECAT16」とは、配列番号：１８に記載のアミノ酸配列を含有するマウスECAT16タンパク質、配列番号：３４に記載のアミノ酸配列を含有するヒトECAT16タンパク質、またはこれらアミノ酸配列に類似のアミノ酸配列を含有するタンパク質が挙げられる。【００３４】
本明細書において「Rnf17」とは、配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を含有するマウスRnf17タンパク質、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含有するヒトRnf17タンパク質、またはこれらアミノ酸配列に類似のアミノ酸配列を含有するタンパク質が挙げられる。
本明細書において「LOC380905(TDRD4)」とは、配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を含有するマウスLOC380905タンパク質、配列番号：１６に記載のアミノ酸配列を含有するヒトTDRD4タンパク質（マウスLOC380905のヒト相同タンパク）、またはこれらアミノ酸配列に類似のアミノ酸配列を含有するタンパク質が挙げられる。【００３５】
前記において「（本発明の各ECATと）類似のアミノ酸配列を含有するタンパク質」とは、前記「（本発明の各ECAT遺伝子と）類似の塩基配列を含有する遺伝子」によりコードされるタンパク質が挙げられる。具体的には前記配列番号で示されたアミノ酸配列と70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含有するタンパク質が挙げられる。【００３６】
これら「（本発明の各ECATと）類似のアミノ酸配列を含有するタンパク質」は、マーカー（抗体）を作製するための抗原として使用する場合は、各ECATと同様の抗原性を有するという特徴を有すればよい。また後述のES細胞の機能維持剤として使用する場合は、各ECATと同様のES細胞の機能維持活性を有すれば良い。【００３７】
(1)ＥＳ細胞検出用マーカー
(1-1)ポリヌクレオチド
本発明は前述するように、ＥＳ細胞において、ECAT15-1遺伝子、ECAT15-2遺伝子、ECAT16遺伝子、Rnf17遺伝子及びLOC380905(TDRD4)遺伝子（以下、本発明遺伝子と称する場合がある）がES細胞で特異的に発現しているという知見を発端に、これらの遺伝子発現の有無や発現の程度を検出することによって、被験細胞がＥＳ細胞であるか否かを検出できるという知見に基づくものである。具体的には本発明は、これらECAT15-1遺伝子、ECAT15-2遺伝子、ECAT16遺伝子、Rnf17遺伝子またはLOC380905(TDRD4)遺伝子のいずれかに特異的なポリヌクレオチドからなる、ＥＳ細胞検出用マーカーを提供する。
ここで「ES細胞」とはいわゆるES細胞の他、ES様細胞も含まれる。当該「ES様細胞」とは、ES細胞としての性質を有する細胞、すなわち未分化・多能性を有する細胞を意味する。【００３８】
ここで「特異的なポリヌクレオチド」とは、前記各遺伝子を他の遺伝子と区別して特定することのできる長さを有するポリヌクレオチドを指す。なお本発明遺伝子の中には、ECAT16遺伝子、Rnf17遺伝子およびLOC380905(TDRD4)遺伝子という、遺伝子配列上オーバーラップする遺伝子が存在している。これらの遺伝子はいずれもES細胞特異的発現遺伝子であるため、ECAT16遺伝子、Rnf17遺伝子およびLOC380905(TDRD4)遺伝子の2種以上に結合するポリヌクレオチドをマーカーとして使用しても何ら支障はない。よってECAT16遺伝子、Rnf17遺伝子およびLOC380905(TDRD4)遺伝子はお互いに「他の遺伝子」の範疇から除外するものとする。具体的には、ECAT16遺伝子、Rnf17遺伝子およびLOC380905(TDRD4)遺伝子のうちの2種以上を認識するポリヌクレオチドであっても、これらと無関係な他の遺伝子を認識しない限り、前記「特異的なポリヌクレオチド」の範疇に含まれる。
また、同一因子に関してヒトとマウスといった種間の相違は「他の遺伝子」の範疇から除外するものとする。具体的には、ECAT15-1遺伝子の2種以上の種（例えばマウスとヒト）、ECAT15-2遺伝子の2種以上の種（例えばマウスとヒト）、ECAT16遺伝子の2種以上の種（例えばマウスとヒト）、Rnf17遺伝子の2種以上の種（例えばマウスとヒト）、またはLOC380905(TDRD4)遺伝子の2種以上の種（例えばマウスとヒト）を認識するポリヌクレオチドであっても、これと無関係な他の遺伝子を認識しない限り、前記「特異的なポリヌクレオチド」の範疇に含まれる。【００３９】
本発明のＥＳ細胞検出用マーカーは、具体的には、通常15塩基もあれば、１つの遺伝子を他の遺伝子から区別して特定することが可能である。従って本発明のマーカーの具体例として、前記ECAT15-1遺伝子、ECAT15-2遺伝子、ECAT16遺伝子、Rnf17遺伝子又はLOC380905(TDRD4)遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を含有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなるＥＳ細胞検出用マーカーが挙げられる。
より具体的には、本発明のマーカーは、配列番号：1、3、5、7、9、11、13、15、17または33のいずれかに記載の塩基配列において、連続する少なくとも１５塩基を含有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドを含有するＥＳ細胞検出用マーカーが挙げられる。【００４０】
ここで相補的なポリヌクレオチド（相補鎖、逆鎖）とは、前記本発明遺伝子の塩基配列からなるポリヌクレチドの全長配列、または該塩基配列において少なくとも連続した１５塩基長の塩基配列を有するその部分配列に対して、A:TおよびG:Cといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味する。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイスすることができる程度の相補関係を有するものであってもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「１×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも90％、好ましくは95％の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。【００４１】
ここで、正鎖側のポリヌクレオチドには、本発明遺伝子の塩基配列、またはその部分配列を有するものだけでなく、上記相補鎖の塩基配列に対してさらに相補的な関係にある塩基配列からなる鎖を含めることができる。【００４２】
さらに上記正鎖のポリヌクレオチド及び相補鎖（逆鎖）のポリヌクレオチドは、各々一本鎖の形態でマーカーとして使用されても、また二本鎖の形態でマーカーとして使用されてもよい。また前記ポリヌクレオチドが検出用に標識されたものも、本発明のポリヌクレオチドの範疇に含まれる。【００４３】
本発明のＥＳ細胞検出用マーカーは、具体的には、本発明遺伝子の塩基配列（全長配列）からなるポリヌクレオチドであってもよいし、その相補配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。また本発明遺伝子もしくは該遺伝子に由来するポリヌクレオチドを選択的に（特異的に）認識するものであれば、上記全長配列またはその相補配列の部分配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。この場合、部分配列としては、上記全長配列またはその相補配列の塩基配列から任意に選択される少なくとも15個の連続した塩基長を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。【００４４】
なお、ここで「選択的に（特異的に）認識する」とは、例えばノーザンブロット法においては、本発明遺伝子またはこれらに由来するポリヌクレオチドが特異的に検出できること、またRT-PCR法においては本発明遺伝子またはこれらに由来するポリヌクレオチドが特異的に生成されることを意味するが、それに限定されることなく、当業者が上記検出物または生成物が本発明遺伝子に由来するものであると判断できるものであればよい。【００４５】
本発明のマーカーは、例えば配列番号：１で示されるマウスECAT15-1遺伝子、配列番号：３で示されるヒトECAT15-1遺伝子、配列番号：５で示されるマウスECAT15-2遺伝子、配列番号：７で示されるヒトECAT15-2遺伝子、配列番号：９で示されるマウスRnf17遺伝子、配列番号：11で示されるヒトRnf17遺伝子、配列番号：13で示されるマウスLOC380905遺伝子、配列番号：15で示されるヒトTDRD4遺伝子、配列番号：17で示されるマウスECAT16遺伝子、配列番号：33で示されるヒトECAT16遺伝子の塩基配列をもとに、例えばprimer 3（ HYPERLINK http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi）あるいはベクターNTI（Infomax社製）を利用して設計することができる。具体的には前記本発明遺伝子の塩基配列をprimer 3またはベクターNTIのソフトウエアにかけて得られる、プライマーまたはプローブの候補配列、若しくは少なくとも該配列を一部に含む配列をプライマーまたはプローブとして使用することができる。具体例としては、配列番号：19〜32に記載の塩基配列からなるプライマーが例示される。【００４６】
本発明のマーカーは、上述するように連続する少なくとも15塩基の長さを有するものであればよいが、具体的にはマーカーの用途に応じて、長さを適宜選択し設定することができる。【００４７】
(1-2)プローブまたはプライマーとしてのポリヌクレオチド
被験細胞がＥＳ細胞であるか否かの検出は、被験細胞における本発明遺伝子のいずれかの発現の有無または発現レベル（発現量）を評価することによって行われる。この場合、上記本発明のマーカーは、本発明遺伝子の発現によって生じたＲＮＡまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に認識し増幅するためのプライマーとして、または該ＲＮＡまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に検出するためのプローブとして利用することができる。【００４８】
本発明のマーカーをＥＳ細胞の検出においてプライマーとして用いる場合には、通常15bp〜100bp、好ましくは15bp〜50bp、より好ましくは15bp〜35bpの塩基長を有するものが例示できる。さらに好ましくは20bp〜35bpの塩基長を有するものが例示される。また検出プローブとして用いる場合には、通常15bp〜全配列の塩基数、好ましくは15bp〜1kb、より好ましくは100bp〜1kbの塩基長を有するものが例示できる。【００４９】
本発明のマーカーは、ノーザンブロット法、RT-PCR法、in situハイブリダーゼーション法、DNAチップなどといった、特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法において、常法に従ってプライマーまたはプローブとして利用することができる。該利用によって被験細胞における本発明遺伝子の発現の有無または発現レベル（発現量）を評価することができる。
測定対象試料としては、被験細胞から常法に従って調製したtotal RNAを用いてもよいし、さらに該RNAをもとにして調製される各種のポリヌクレオチドを用いてもよい。また細胞そのものを測定対象試料として用いてもよい。【００５０】
（1-3）抗体
本発明は、ＥＳ細胞検出用マーカーとして、ECAT15-1、ECAT15-2、ECAT16、Rnf17またはLOC380905(TDRD4)（以下、本発明タンパク質と称する場合がある）のいずれかを特異的に認識することのできる抗体を提供する。
当該抗体として、具体的には、配列番号：2に記載のアミノ酸配列を含有するマウスECAT15-1、配列番号：4に記載のアミノ酸配列を含有するヒトECAT15-1、配列番号：6に記載のアミノ酸配列を含有するマウスECAT15-2、配列番号：8に記載のアミノ酸配列を含有するヒトECAT15-2、配列番号：10に記載のアミノ酸配列を含有するマウスRnf17、配列番号：12に記載のアミノ酸配列を含有するヒトRnf17、配列番号：14に記載のアミノ酸配列を含有するマウスLOC380905、配列番号：16に記載のアミノ酸配列を含有するヒトTDRD4、配列番号：18に記載のアミノ酸配列を含有するマウスECAT16または配列番号：34に記載のアミノ酸配列を含有するヒトECAT16を特異的に認識することのできる抗体を挙げることができる。これらの抗体は、被験細胞における本発明タンパク質の発現の有無またはその程度を検出することによって、被験細胞がES細胞であるか否かを検出することのできるツールとして有用である。【００５１】
ここで「（本発明タンパク質を）特異的に認識する抗体」とは、前記「特異的なポリヌクレオチド」と同様の特異性を意味する。すなわち、ECAT16、Rnf17およびLOC380905(TDRD4)のうちの2種以上を認識する抗体であっても、これらと無関係な他のタンパクを認識しない抗体である限り、前記「特異的な抗体」の範疇に含まれる。
またECAT15-1の2種以上の種（例えばマウスとヒト）、ECAT15-2の2種以上の種（例えばマウスとヒト）、ECAT16の2種以上の種（例えばマウスとヒト）、Rnf17の2種以上の種（例えばマウスとヒト）、またはLOC380905(TDRD4)の2種以上の種（例えばマウスとヒト）を認識する抗体であっても、これと無関係な他のタンパクを認識しない抗体である限り、前記「特異的な抗体」の範疇に含まれる。【００５２】
本発明の抗体は、その形態に特に制限はなく、本発明タンパク質を免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよい。さらに本発明タンパク質のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常８アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も、本発明の抗体に含まれる。【００５３】
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current Protocol in Molecular Biology, Chapter 11.12〜11.13(2000)）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した本発明タンパク質を用いて、あるいは常法に従って本発明タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した本発明タンパク質、あるいはこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11）。【００５４】
抗体の作製に免疫抗原として使用される本発明タンパク質は、本発明により提供される遺伝子の配列情報（配列番号1,3,5,7,9,11,13,15,17,33）に基づいて、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)）などに準じて行うことができる。【００５５】
具体的には、本発明タンパク質をコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換えDNA（発現ベクター）を作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって、本発明抗体の製造のための免疫抗原としてのタンパク質を得ることができる。また、これら本発明タンパク質の部分ペプチドは、本発明により提供されるアミノ酸配列の情報（配列番号2,4,6,8,10,12,14,16,18,34）に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。【００５６】
本発明抗体はまた、本発明タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを用いて調製されるものであってよい。かかる抗体の製造のために用いられるオリゴ（ポリ）ペプチドは、本発明タンパク質と同様な免疫原特性を有するものであることが望ましい。好ましくはこの免疫原特性を有し、且つ本発明タンパク質のアミノ酸配列において少なくとも連続する８アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるオリゴ（ポリ）ペプチドを例示することができる。【００５７】
かかるオリゴ（ポリ）ペプチドに対する抗体の製造は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。限定はされないが、そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのような表面活性物質、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム-パルヴムなどのヒトアジュバントが含まれる。【００５８】
本発明の抗体は本発明タンパク質に特異的に結合する性質を有することから、該抗体を利用することによって、本発明タンパク質（ECAT15-1、ECAT15-2、ECAT16、Rnf17またはLOC380905(TDRD4)）を特異的に検出することができる。すなわち、当該抗体は被験細胞・組織における本発明タンパク質の発現の有無を検出するためのプローブとして有用である。【００５９】
(2)ES細胞の検出方法
本発明は、前述した本発明のマーカーを利用したＥＳ細胞の検出方法を提供するものである。
具体的には、本発明のＥＳ細胞検出方法は、被験細胞に含まれる本発明遺伝子（ECAT15-1遺伝子、ECAT15-2遺伝子、ECAT16遺伝子、Rnf17遺伝子またはLOC380905(TDRD4)遺伝子）の遺伝子発現レベル、およびこれらの遺伝子に由来するタンパク質レベル（ECAT15-1、ECAT15-2、ECAT16、Rnf17またはLOC380905(TDRD4)）を測定し、被験細胞がＥＳ細胞であるか否かを判断するというものである。
本発明の検出方法は、具体的には下記のようにして実施される。【００６０】
(2-1) 測定対象としてRNAを利用する場合
測定対象物としてRNAを利用する場合、ＥＳ細胞の検出は、具体的に下記の工程(a)、(b)及び(c)を含む方法によって実施することができる：
(a) 被験細胞に由来するＲＮＡまたはそれから転写された相補的ポリヌクレオチドと、本発明のマーカー（ECAT15-1遺伝子、ECAT15-2遺伝子、ECAT16遺伝子、Rnf17遺伝子またはLOC380905(TDRD4)遺伝子のいずれかに由来するポリヌクレオチド）とを結合させる工程、
(b) 該マーカーに結合した被験細胞由来のＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを、上記マーカーを指標として測定する工程、
(c) 上記(b)の測定結果に基づいて、被験細胞がＥＳ細胞であるか否かを判断する工程。【００６１】
測定対象物としてRNAを利用する場合は、本発明の検出方法は該RNA中の本発明遺伝子の発現レベルを検出し、測定することによって実施される。具体的には、前述のポリヌクレオチドからなる本発明のマーカーをプライマーまたはプローブとして用いて、ノーザンブロット法、RT-PCR法、DNAチップ解析法、in situハイブリダイゼーション解析法などの公知の方法を行うことにより実施できる。【００６２】
ノーザンブロット法を利用する場合は、本発明のマーカーをプローブとして用いることによって、RNA中の本発明遺伝子の発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、本発明のマーカー（相補鎖）を放射性同位元素（32P、33Pなど：RI）や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした被験細胞由来のRNAとハイブリダイズさせた後、形成されたマーカーとRNAとの二重鎖を、マーカーの標識物（RI若しくは蛍光物質）に由来するシグナルをX線フィルム等で検出するか、放射線検出器（BAS-1800II、富士フィルム社製）または蛍光検出器等で検出、測定する方法を例示することができる。また、AlkPhos Direct Labelling and Detection System (アマシャム ファルマシアバイオテク社製)を用いて、該プロトコールに従ってマーカー（プローブDNA）を標識し、被験細胞由来のRNAとハイブリダイズさせた後、マーカーの標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージャーSTORM860（アマシャム ファルマシアバイオテク社製）で検出、測定する方法を使用することもできる。【００６３】
RT-PCR法を利用する場合は、本発明のマーカーをプライマーとして用いることによって、RNA中の本発明遺伝子の発現の有無や発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、被験細胞由来のRNAから常法に従ってcDNAを調製して、これを鋳型として標的遺伝子(本発明遺伝子）の領域が増幅できるように、本発明のマーカー（一対のプライマー）をこれとハイブリダイズさせて、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する方法を例示することができる。なお、増幅された二本鎖ＤＮＡの検出は、アガロースゲル電気泳動後エチジウムブロマイド染色により検出する方法、上記ＰＣＲを予めRIや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法、産生された二本鎖ＤＮＡを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識した本発明のマーカーをプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。なお、生成された標識二本鎖ＤＮＡ産物はアジレント2100バイオアナライザ（横河アナリティカルシステムズ社製）などで測定することができる。また、SYBR Green RT-PCR Reagents (アプライド バイオシステム社製)で該プロトコールに従ってRT-PCR反応液を調製し、ABI PRIME 7700 Sequence Detection System (アプライド バイオシステム社製)で反応させて、該反応物を検出することもできる。【００６４】
ＤＮＡチップ解析を利用する場合は、本発明のマーカーをＤＮＡプローブ（１本鎖または２本鎖）として貼り付けたＤＮＡチップを用意し、これに被験細胞由来のRNAから常法によって調製されたcRNAとハイブリダイズさせて、形成されたDNAとcRNAとの二本鎖を、本発明のマーカーから調製される標識プローブと結合させて検出する方法を挙げることができる。【００６５】
(2-2) 測定対象としてタンパク質を用いる場合
測定対象物としてタンパク質を用いる場合、本発明のＥＳ細胞の検出方法は、被験細胞中の本発明タンパク質（ECAT15-1、ECAT15-2、ECAT16、Rnf17またはLOC380905(TDRD4)）を検出することによって実施される。具体的には下記の工程(a)、(b)及び(c)を含む方法によって実施することができる：
(a) 被験細胞に由来するタンパク質と、本発明のマーカー（ECAT15-1、ECAT15-2、ECAT16、Rnf17またはLOC380905(TDRD4)のいずれかを認識する抗体）とを結合させる工程、
(b) 該マーカーに結合した被験細胞由来のタンパク質を、上記マーカーを指標として測定する工程、
(c) 上記(b)の測定結果に基づいて、被験細胞がＥＳ細胞であるか否かを判断する工程。【００６６】
より具体的には、抗体に関する本発明のマーカーを用いて、被験細胞、または被験細胞抽出液などを試料として用い、ウエスタンブロット法や組織免疫学的染色法などの公知方法で、本発明タンパク質を検出、定量する方法を挙げることができる。【００６７】
ウエスタンブロット法は、一次抗体として本発明のマーカーを用いた後、二次抗体として125Ｉなどの放射性同位元素、蛍光物質、ホースラディッシュペルオキシターゼ（HRP）などの酵素等で標識した標識抗体（一次抗体に結合する抗体）を用い、得られる標識化合物の放射性同位元素、蛍光物質などに由来するシグナルを X線フィルム等で検出するか、放射線測定器（BAS-1800II：富士フィルム社製など）、蛍光検出器などで検出し、測定することによって実施できる。また、一次抗体として本発明のマーカーを用いた後、ECL Plus Western Blotting Detction System (アマシャム ファルマシアバイオテク社製)を用いて、該プロトコールに従って検出し、マルチバイオイメージャーSTORM860(アマシャム ファルマシアバイオテク社製)で測定することもできる。【００６８】
(2-3)ＥＳ細胞の検出
ＥＳ細胞（ES様細胞）であるか否かの判断は、被験細胞において本発明遺伝子のいずれかの発現量（レベル）、若しくは本発明タンパク質のいずれかの発現量（レベル）を測定することで実施できる。本発明遺伝子またはタンパク質のいずれかが発現していること、または体細胞での発現と比較して発現レベルが高いことをもって、被験細胞がＥＳ細胞であると判断することができる。その際、Oct3/4やNanog(ECAT4)といった他のＥＳ細胞特異的発現遺伝子が発現していることも、併せて確認することが望ましい。【００６９】
(3)体細胞核初期化物質またはES細胞未分化・多能性維持物質等のスクリーニング
参考例１に記載したように、本発明者らは、本発明遺伝子と同じくES細胞特異的発現遺伝子であるECAT3遺伝子にマーカー遺伝子であるβgeo遺伝子をノックインしたノックインマウスから体細胞（リンパ球）を調製した。この体細胞をES細胞の培養条件で培養し、G418で選択したところ、全て死滅し、薬剤耐性コロニーは一つも得られなかった。一方、前記体細胞を正常ES細胞と融合し、ES細胞の培養条件で培養し、G418で選択したところ、生存細胞が出現した。この生存細胞を解析した結果、ECAT4やOct3/4を発現し、ES細胞としての性質を有するES様細胞であることが分かった。以上の実験結果より、体細胞とES細胞との融合により体細胞の核が初期化（リプログラミング）されたためにES様細胞が出現し、そしてECAT3遺伝子に置き換えられたβgeoが発現して薬剤耐性となったことが明らかとなった。【００７０】
このようにES細胞特異的発現遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞は、ES様細胞に変換された時にのみ、マーカー遺伝子を発現する。すなわちES様細胞への変換を薬剤耐性等のマーカー遺伝子の発現で容易にモニターすることができる。この性質を利用すれば、体細胞からES様細胞への変換を誘導する核初期化因子を、薬剤耐性等のマーカー遺伝子の発現を指標として効率的にスクリーニングすることができる。また同様に、前記マーカー遺伝子の発現を指標として、ES様細胞を効率的に選択することができる。【００７１】
さらに「ES様細胞への変換を薬剤耐性等のマーカー遺伝子の発現で容易にモニターする」という前記システムは、ES細胞の未分化・多能性維持物質のスクリーニングにも応用することができる。すなわち本発明の前記システムによれば、ES細胞状態を薬剤耐性等のマーカー遺伝子の発現で容易にモニターすることができるため、例えばES細胞状態を維持できない培養条件下に被験物質を添加し、マーカー遺伝子発現細胞の存在の有無を調べることにより、ES細胞の未分化・多能性維持（候補）物質を容易にスクリーニングすることができる。【００７２】
以上のスクリーニング方法等については既に特許出願がなされている（特願2004-276572、出願日：2004年9月24日（優先日：2004年2月19日）、出願人：山中伸弥、住友製薬株式会社）（その後2005年2月16日国際出願。国際出願番号：PCT/JP2005/002842、国際公開番号：WO2005/080598）。【００７３】
なお、前記で体細胞から核初期化物質により変換されて生じた「ES様細胞」とは、ES細胞としての性質を有する細胞、すなわち未分化・多能性を有する細胞を意味する。
以下において「本発明遺伝子」とは、技術常識に応じてゲノム遺伝子を指す場合もある。【００７４】
(3-1)本発明の体細胞核初期化物質のスクリーニング方法
本発明は、以下の(a)および(b)の工程：
(a)ECAT15-1遺伝子、ECAT15-2遺伝子、ECAT16遺伝子、Rnf17遺伝子またはLOC380905(TDRD4)遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞と、被験物質とを接触させる工程、
(b)前記(a)の工程の後、マーカー遺伝子発現細胞の出現の有無を調べ、該細胞を出現させた被験物質を体細胞の核初期化候補物質として選択する工程、
を含む、体細胞の核初期化物質のスクリーニング方法を提供する。【００７５】
前記で「マーカー遺伝子」とは、当該マーカー遺伝子を細胞に導入することにより、細胞の選別や選択を可能とするような遺伝子全般を指す。具体的には薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、発光酵素遺伝子、発色酵素遺伝子またはこれらの組み合わせに係る遺伝子が挙げられる。【００７６】
薬剤耐性遺伝子としては、具体的にはネオマイシン耐性遺伝子（neo）、テトラサイクリン耐性遺伝子(tet) 、カナマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子（zeo)、ハイグロマイシン耐性遺伝子（hygro)等が挙げられる。各薬剤を含有する培地（選択培地という）で細胞を培養することにより、薬剤耐性遺伝子が導入・発現した細胞のみが生き残る。従って、選択培地で細胞を培養することにより、薬剤耐性遺伝子を含有する細胞を容易に選択することができる。【００７７】
蛍光タンパク質遺伝子としては、具体的にはGFP（緑色蛍光タンパク質）遺伝子、YFP（黄色蛍光タンパク質）遺伝子、RFP（赤色蛍光タンパク質）遺伝子、エクオリン遺伝子等が挙げられる。これら蛍光タンパク質遺伝子が発現した細胞は、蛍光顕微鏡で検出することができる。また蛍光強度の違いを利用することによりセルソーター等で分離・選択することや、細胞を限界希釈して１ウエルあたり1細胞以下とした後に培養・増殖させ、蛍光を発する細胞（ウエル）を蛍光顕微鏡下で検出することにより当該細胞を選択することができる。さらに、軟寒天培地などの上でコロニーを形成させ、蛍光顕微鏡下などでコロニーを選択することもできる。【００７８】
発光酵素遺伝子としては、具体的にはルシフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。これら発光酵素遺伝子を発現した細胞は、発光基質を加えて発光光度計で発光量を測定することにより検出することができる。また細胞を限界希釈して１ウエルあたり1細胞以下とした後に培養・増殖させ、各ウエルから一部の細胞を採取し、発光基質を加えて発光光度計で発光の如何を測定することにより当該細胞を選択することができる。【００７９】
発色酵素遺伝子としては、具体的にはβガラクトシダーゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子、又は分泌型アルカリフォスファターゼであるSEAP遺伝子等が挙げられる。これら発色酵素遺伝子が発現した細胞は、発色基質を加えて発色の有無を観察することにより検出することができる。また細胞を限界希釈して１ウエルあたり1細胞以下とした後に培養・増殖させ、各ウエルから一部の細胞を採取し、発色基質を加えて発色の如何を観察することにより当該細胞を選択することができる。【００８０】
これらマーカー遺伝子の組み合わせに係る遺伝子としては、具体的にはネオマイシン耐性遺伝子（neo）とβガラクトシダーゼ遺伝子（β-gal)との融合遺伝子であるβgeo遺伝子が挙げられる。【００８１】
以上のようなマーカー遺伝子はいずれも当業者に周知であり、このようなマーカー遺伝子を含有するベクターはインビトロジェン社、アマシャムバイオサイエンス社、プロメガ社、MBL(医学生物学研究所)等から市販されている。【００８２】
前記マーカー遺伝子のうち、細胞の選択が容易であるという観点から、特に好ましいのは薬剤耐性遺伝子、または当該薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子である。【００８３】
前記において「体細胞」とは、正常ES細胞等の未分化・多能性維持細胞を除く全ての細胞を意味する。具体的には、例えば（1）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、精子幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、（3）リンパ球、上皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞等の分化した細胞、(4)ES細胞から何らかの手法で未分化・多能性を消失させた細胞、(5)体細胞とES細胞との融合細胞であって未分化・多能性を有さない細胞、などが挙げられる。【００８４】
本発明のスクリーニング方法においては、本発明遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞を、スクリーニング用細胞として用いる。
ここで「発現調節領域」とは、遺伝子の発現（転写）を調節する領域のことであり、「プロモーター領域」、若しくは「プロモーター及びエンハンサー領域」を含む領域を意味する。
本発明遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させる方法は、いろいろ知られており、当業者に周知の如何なる方法を用いてマーカー遺伝子を存在させても良い。大別すると、(3-1-1) 個体（マウス）を利用してマーカー遺伝子を存在させる場合と、(3-1-2）個体を利用せずに細胞レベルでマーカー遺伝子を存在させる場合がある。【００８５】
(3-1-1）個体（マウス）を利用してマーカー遺伝子を存在させる方法
個体（マウス）を利用してマーカー遺伝子を存在させる場合は、本発明遺伝子の発現調節領域により発現調節を受けるゲノム上の位置にマーカー遺伝子を存在させる。この場合、個体が有する本発明遺伝子自身は、発現可能な形で存在していても良く、また本発明遺伝子が破壊された形で存在していても良い。
遺伝子の発現調節領域は、通常エクソン１より上流域に存在する。従って、本発明遺伝子の発現調節領域によりマーカー遺伝子が発現調節を受けるためには、当該マーカー遺伝子は、本発明遺伝子のエクソン1開始部位より下流域に存在させることが望ましい。この場合、エクソン１開始部位より下流であれば、どのような位置に存在していても良い。【００８６】
（3-1-1-a）本発明遺伝子を破壊する場合
本発明遺伝子を破壊する方法は、当業者に周知の如何なる方法を用いても良いが、最も良く使われる手法としては、マーカー遺伝子を含有し、かつ本発明遺伝子の任意の位置で相同組換えを起こすベクター（以下ターゲッティングベクターと称する）を用いて、相同組換えにより当該本発明遺伝子を標的破壊し、代わりにマーカー遺伝子をこの位置に存在させる方法が挙げられる。このように本発明遺伝子を破壊し、その位置にマーカー遺伝子を存在させることを、「本発明遺伝子にマーカー遺伝子をノックインする」と言う。【００８７】
すなわち本発明の体細胞核初期化物質のスクリーニング法の具体例として、本発明は以下の(a)および(b)：
(a) ECAT15-1遺伝子、ECAT15-2遺伝子、ECAT16遺伝子、Rnf17遺伝子またはLOC380905(TDRD4)遺伝子に薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子をノックインした遺伝子を含有する体細胞と、被験物質とを接触させる工程、
(b) 前記(a)の工程の後、選択培地中での生存細胞の有無を調べ、該生存細胞を生じさせた被験物質を体細胞の核初期化候補物質として選択する工程、
の工程を含む、体細胞核初期化物質のスクリーニング方法を提供する。【００８８】
マーカー遺伝子をノックインする方法は種々知られているが、中でもプロモータートラップ法が好適に用いられる。当該プロモータートラップ法は、プロモーターを持たないターゲッティングベクターを相同組換えによりゲノム中に挿入し、相同組換えが正しく起こった場合に内在性プロモーター（本発明遺伝子のプロモーター）によりマーカー遺伝子が発現するというものである。以下、当該プロモータートラップ法により本発明遺伝子発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させる方法につき具体例を示す。【００８９】
まず、ターゲッティングに必要な本発明遺伝子のゲノム配列を決定する。当該ゲノム配列は、例えば公的データベースであるMouse Genome Resources (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/mouse/)等において既に公知である場合はこの配列情報を利用して配列決定することができる。また未知の場合は、配列番号：１、3、5、7、9、11、13、15、17、33に記載の本発明遺伝子の一部をプライマーとして用い、当業者に入手可能なゲノムライブラリーをPCR法等でスクリーニングすることなどにより、所望の本発明遺伝子のゲノム領域を含有するゲノミッククローンを単離することや、ゲノム塩基配列を決定することができる。ここで用いるゲノムライブラリーとしては、例えばマウスBAC(bacterial artificial chromosome)ライブラリー（Invitrogen）やPAC(P1-derived artificial chromosome)ライブラリー（Invitrogen）等が挙げられる。【００９０】
次に、前記で同定した本発明遺伝子のゲノムDNA配列に基づき、マーカー遺伝子と置き換える本発明遺伝子のゲノム領域を決定する(以下、本発明遺伝子ゲノム領域Aと称する）。この本発明遺伝子ゲノム領域Aを挟む5'側領域（5'アーム）と3'側領域（3'アーム）を、ゲノムDNAを鋳型としてPCRを行うことなどにより増幅する。ここで鋳型となるゲノムDNAとしては、本発明遺伝子を含有するマウスBACクローンのゲノムDNA等が挙げられる。PCRのプライマーは前記本発明遺伝子ゲノムDNAの配列に基づき設計することができる。増幅した5'アームおよび3'アームを、プロモータートラップ用ターゲッティングベクターのマーカー遺伝子カセットを挟む両側に挿入する。ここで用いるプロモータートラップ用ターゲッティングベクターとしては、例えばIRES（internal ribosome entry site)-βgeo(βガラクトシダーゼとネオマイシン耐性遺伝子の融合遺伝子）カセット（Mountford P.et al., Proc.Natl.Sci.USA,91:4303-4307(1994)）を含有するpBSSK(-)-IRES-βgeoや、IRES-Hygro（ハイグロマイシン耐性遺伝子）カセットを含有する同様のベクターなどを挙げることができる。ここでIRES-Hygroカセットは、前記IRES-βgeoカセットのβgeo部分をHygro（Invitrogen)に置き換えることなどにより作製することができる。
次に作製されたターゲッティングベクターを制限酵素で消化して直鎖化し、これをエレクトロポレーション等によりES細胞に導入する。【００９１】
導入に用いるES細胞としては、たとえば RF8細胞（Meiner,V. et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93: 14041-14046(1996)）、JI細胞（Li,E. et al.,Cell,69:915-926(1992)）、CGR8細胞(Nichols,J. et al., Development,110:1341-1348(1990))、MG1.19細胞（Gassmann,M. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,92:1292-1296(1995)）や、市販されているマウスES細胞 129SV（No.R-CMTI-1-15, R-CMTI-1A）、マウスES細胞 C57/BL6（No.R-CMTI-2A）、マウスES細胞DBA-1（No.R-CMTI-3A）（以上大日本製薬）等のES細胞が挙げられる。【００９２】
ターゲッティングベクターのES細胞への導入は、エレクトロポレーション（Meiner,V. et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93: 14041-14046(1996)等参照）、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子導入用リピッド（Lipofectamine、Lipofectin; Invitrogen）を用いる方法などにより行われる。その後当該ターゲッティングベクターが導入されたES細胞を、用いたマーカー遺伝子（例えば薬剤耐性遺伝子）の特性に基づき選択する。選択されたES細胞において正しく相同組み換えが起こっていることは本発明遺伝子の一部をプローブとして用いたサザンブロット等により確認することができる。以上のようにして本発明遺伝子（ゲノム遺伝子）にマーカー遺伝子をノックインした遺伝子をヘテロで含有するES細胞を作製することができる。【００９３】
ES細胞の培養には、当業者に知られた如何なる培地を用いても良い。例えばRF8細胞の場合、以下の組成：15％FBS、0.1mM Non Essential Amino Acids (GIBCO BRL)、2mM L-glutamine、50U/mlペニシリン-ストレプトマイシン、0.11mM 2-ME(GIBCO BRL)/Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)の培地等が挙げられる。また市販の調製済み培地（例えば大日本製薬No.R-ES-101等）を用いることもできる。【００９４】
ES細胞の培養においてフィーダー細胞を用いる場合、当該フィーダー細胞は、マウス胚から常法により調製した繊維芽細胞や繊維芽細胞由来のSTO細胞株（Meiner,V. et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93: 14041-14046(1996)）を用いても良く、また市販品を用いても良い。市販品としては、例えば PMEF-N、PMEF-NL、PMEF-H、PMEF-HL（以上大日本製薬）などのフィーダー細胞が挙げられる。フィーダー細胞は、マイトマイシンC処理することにより増殖を停止させた後にES細胞の培養に用いることが望ましい。
また、ES細胞の培養において前記フィーダー細胞を用いない場合は、LIF（Leukemia Inhibitory Factor）を添加して培養を行うことができる。LIFとしてはマウス組み換えLIF、ラット組み換えLIF（ケミコン社等）などが用いられる。【００９５】
次に、前記ターゲッティングベクターを含有するES細胞をマウスに導入してノックアウトマウス（マーカー遺伝子ノックインマウス）を作製する。当該マーカー遺伝子ノックインマウスの作製方法は当業者に周知である。具体的には、前記ES細胞をマウス（例えばC57BL/6等）の胚盤胞（blastocyst)にインジェクトし、偽妊娠させたメスのマウス（ICR等)の子宮内に移植することによりキメラマウスを作製する。その後キメラマウスと通常のマウス（C57BL/6等)とを交配させ、マーカー遺伝子がヘテロでノックインされたヘテロ変異マウスを作製する。ヘテロ変異マウス同士を交配させることにより、マーカー遺伝子がホモでノックインされたホモ変異マウスが得られる。
以上のノックインマウスの作製については、ECAT3ノックインマウス（Tokuzawa, Y., et al., Molecular and Cellular Biology, 23(8): 2699-2708(2003)）、ECAT4ノックインマウス（Mitsui, K., et al., Cell, 113: 631-642(2003)）、ECAT5ノックインマウス（Takahashi, K., K. Mitsui, and S. Yamanaka, Nature,423(6939): p541-545(2003)、特開2003-265166号公報)等を参考にされたい。【００９６】
本発明の体細胞核初期化物質のスクリーニングで用いる体細胞は、前記へテロノックインマウスから単離された体細胞、ホモノックインマウスから単離された体細胞が挙げられる。【００９７】
（3-1-1-b）本発明遺伝子を破壊しない場合
本発明遺伝子を破壊することなく、本発明遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させる手法としては、当該本発明遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させたBACベクターまたはPACベクター等を、マウスやラット等の個体に導入して作製したトランスジェニック非ヒト動物を利用する手法が挙げられる。以下BACベクターを例にとり説明する。
ここで用いる本発明遺伝子の発現調節領域を含有するBACクローンは、前記(3-1-1-a)に記述したように、本発明遺伝子の配列情報に基づき単離・同定することができる。本発明遺伝子含有BACクローンにおいて、本発明遺伝子の一部をマーカー遺伝子に置き換えるには、例えば Red/ET Recombination(Gene Bridges)を用いて容易に行うことができる。各本発明遺伝子の発現調節領域は、通常、本発明遺伝子のエクソン１より上流域に存在する。従って、本発明遺伝子の発現調節領域によりマーカー遺伝子が発現調節を受けるためには、当該マーカー遺伝子は、本発明遺伝子のエクソン1より下流域に存在させることが望ましい。この場合、エクソン１より下流であれば、本発明遺伝子上のどのような位置にマーカー遺伝子を存在させても良い。【００９８】
以上のようにして作製された本発明遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させたBACベクター（以下、マーカー遺伝子含有BACベクターと称することがある）を導入したトランスジェニック動物を作製する方法は周知であり、例えば実験医学別冊「新遺伝子工学ハンドブック改訂第３版」（羊土社,1999年）等に基づき作製することができる。以下、マウスを例にとりトランスジェニック動物の作製につき説明する。
マウス受精卵への遺伝子の導入方法は特に限定されるものではなく、マイクロインジェクション法やエレクトロポレーション法等により導入することができる。導入後、得られた卵細胞を培養し、仮親マウスの輸卵管に移植し、その後被移植マウスを飼育し、産まれた仔マウスから所望の仔マウスを選択する。当該選択は、例えば仔マウス由来のDNAをドットブロットハイブリダイゼーション法やPCR法で導入遺伝子の可否を調べることにより行うことができる。
前記仔マウスと野生型マウスとを交配させ、ヘテロトランスジェニックマウス（導入遺伝子をヘテロで含有するマウス）を作製する。ヘテロマウス同士を交配させることにより、マーカー遺伝子含有BACベクターをホモで含有するトランスジェニックマウスを得ることができる。【００９９】
本発明の体細胞核初期化物質のスクリーニングにおいては、前記へテロトランスジェニックマウスから単離された体細胞、ホモトランスジェニックマウスから単離された体細胞のいずれも用いることができる。トランスジェニックマウスの場合、マウスが本来有している本発明遺伝子は破壊されていないため、ホモトランスジェニックマウス由来の体細胞を利用することが好ましい。
さらに異なるECAT遺伝子のトランスジェニックマウス同士を交配させることにより、ダブルトランスジェニックマウスを作製することができる。その際、交配させる各トランスジェニックマウスは、それぞれ異なるマーカー遺伝子を含有していることが好ましい。【０１００】
以上のノックインマウスまたはトランスジェニックマウスから単離する体細胞は、マーカー遺伝子の発現していない（若しくは発現量の少ない）如何なる細胞であっても良い。具体的にはES細胞等の分化全能性細胞以外の細胞が挙げられ、例えば（1）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、精子幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、または（3）リンパ球、上皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞等の分化した細胞が挙げられる。【０１０１】
(3-1-2）個体を利用せずに細胞レベルでマーカー遺伝子を存在させる方法
個体を利用せずに、細胞内において、本発明遺伝子発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させる方法はいろいろ知られており、当業者に周知の如何なる方法を用いてマーカー遺伝子を存在させても良い。一般的には、マーカー遺伝子を含有するベクターを細胞に導入する方法が挙げられる。【０１０２】
遺伝子導入に用いられる細胞は、体細胞であってもES細胞であっても良い。ここで用いる体細胞としては、マウス、ヒト、サル等の如何なる種に由来する体細胞であっても良い。当該体細胞は初代培養細胞であっても株化細胞であっても良く、具体的には、胎児繊維芽細胞（MEF）、骨髄由来間葉系幹細胞、または精子幹細胞等の初代培養細胞や、NIH3T3のような株化細胞などが挙げられる。またES細胞としては、前記に挙げたマウスES細胞の他、ヒトやサルのES細胞も用いることができる。ここでヒトES細胞としては、KhES-1、KhES-2あるいは KhES-3（以上、京大再生研付属幹細胞医学研究センター）などが挙げられ、またサルES細胞としてはカニクイザルES細胞（旭テクノグラス）を挙げることができる。これらES細胞を本発明のスクリーニングに用いる場合は、何らかの手法でES細胞の未分化・多能性を消失させてから用いる。【０１０３】
細胞へのベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の導入方法を用いれば良い。具体的にはリン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子導入用リピッド（Lipofectamine、Lipofectin; Invitrogen）を用いる方法などが挙げられる。【０１０４】
導入に用いるベクターとしては、約300kbのDNAまでクローニング可能なベクターであるBACベクターやPACベクター、プラスミドベクター、さらには前記(3-1-1)に記載したターゲッティングベクターなどが挙げられる。以下これら各ベクターを用いて本発明遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させた体細胞を作製する方法について記載する。【０１０５】
(3-1-2-a)BACベクター、PACベクターを用いる場合
本発明遺伝子の発現調節領域を含有するBACベクターやPACベクターを利用することにより、本発明遺伝子発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させることができる。以下BACベクターを例にとり説明する。
ここで用いる本発明遺伝子の発現調節領域を含有するBACクローン（以下本発明遺伝子含有BACクローンと称する）は、前記(3-1-1)に記述したように、本発明遺伝子の配列情報に基づき単離・同定することができる。本発明遺伝子含有BACクローンにおいて、本発明遺伝子の一部をマーカー遺伝子に置き換えるには、例えば Red/ET Recombination(Gene Bridges)を用いて容易に行うことができる。各本発明遺伝子の発現調節領域は、通常、本発明遺伝子のエクソン１より上流域に存在する。従って、本発明遺伝子の発現調節領域によりマーカー遺伝子が発現調節を受けるためには、当該マーカー遺伝子は、本発明遺伝子のエクソン1開始部位より下流域に存在させることが望ましい。この場合、エクソン１開始部位より下流であれば、本発明遺伝子上のどのような位置にマーカー遺伝子を存在させても良い。【０１０６】
以上のようにして作製された本発明遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させたBACベクターを体細胞に導入することにより、本発明のスクリーニング用の体細胞とすることができる。ここで導入するBACベクターは1種類であっても、異なる本発明遺伝子を含有する2種類以上のBACベクターであっても良い。なお、当該BACベクター導入細胞を選択培地中で容易に選択できるように、BACベクター中に薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子（以下第2の薬剤耐性遺伝子と称する）が挿入されていることが好ましい。この場合、体細胞での発現を可能とするために、当該第2の薬剤耐性遺伝子の5'側または3'側に体細胞で発現するプロモーターが付加されている必要がある。また当該第2の薬剤耐性遺伝子は、本発明遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置に存在するマーカー遺伝子と同じ種類の薬剤耐性遺伝子であっても良く、異なる種類の薬剤耐性遺伝子であっても良いが、異なる種類の薬剤耐性遺伝子であることが望ましい。前記で同じ種類の薬剤耐性遺伝子を用いた場合は、第2の薬剤耐性遺伝子の両側にloxP配列またはFRT配列を付加しておき、BACベクター導入細胞を選択培地中で選択した後に、リコンビナーゼCreまたはFLPにより第2の薬剤耐性遺伝子を切り出すことができる。
前記と異なり、BACベクター中に第2の薬剤耐性遺伝子を挿入しない場合は、当該第2の薬剤耐性遺伝子を含有する第2の発現ベクターを、前記BACベクターと共に共導入（co-transfection）し、選択培地で選択しても良い。その場合、第2の発現ベクターよりもBACベクターを大過剰に用いて導入を行うことが望ましい。【０１０７】
前記本発明遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させたBACベクターをES細胞に導入した場合は、用いたマーカー遺伝子の性質に基づき、マーカー遺伝子が導入・発現しているES細胞を選択することができる。その後、当該ES細胞を体細胞に分化させることにより、本発明のスクリーニングに用いる体細胞とすることができる。ES細胞はフィーダー細胞の存在しない培養条件下で分化するため、このような条件下で分化させて得られた体細胞や、レチノイン酸等の当業者に知られた分化誘導剤で分化させて得られた体細胞を、本発明のスクリーニングに用いることができる。ここでES細胞から分化させた体細胞としては、例えば組織幹細胞、組織前駆細胞、または体細胞（神経細胞、皮膚角質細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、血液細胞、膵島細胞または色素細胞など）が挙げられる。【０１０８】
(3-1-2-b)プロモーターを有さないプラスミドベクターを用いる場合
本発明遺伝子の発現調節領域とマーカー遺伝子との融合遺伝子を、プロモーターを有さないプラスミドベクターに挿入し、細胞を形質転換することにより、本発明のスクリーニング用の細胞を作製することができる。
ここで用いるベクターとしては、例えば pBluescript(Stratagene)、pCR2.1(Invitrogen)といったプロモーターを有さないプラスミドベクターが挙げられる。
ここで用いる本発明遺伝子の発現調節領域は、例えば該遺伝子の転写開始部位上流約１kb、好ましくは約2kbが挙げられる。【０１０９】
各本発明遺伝子の発現調節領域は、例えば(i)5'-RACE法（例えば、5'full Race Core Kit(宝酒造社製)等を用いて実施される）、オリゴキャップ法、S1プライマーマッピング等の通常の方法により5'末端を決定するステップ；(ii)Genome Walker Kit(クローンテック社製)等を用いて5'-上流領域を取得し、得られた上流領域について、プロモーター活性を測定するステップ；を含む手法等により同定することができる。このようにして同定した本発明遺伝子発現調節領域の3'側にマーカー遺伝子を融合し、これを前記プラスミドベクターに挿入することにより、本発明遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させたプラスミドベクターを作製することができる。
以上のようにして作製したベクターを、前記(3-1-2-a)と同様にして体細胞やES細胞に導入することにより、本発明のスクリーニング用体細胞を作製することができる。【０１１０】
(3-1-2-c)ターゲッティングベクターを用いる場合
前記(3-1-1)に記載したターゲッティングベクターを体細胞若しくはES細胞に導入することによっても、本発明のスクリーニング用体細胞を作製することができる。
前記ターゲッティングベクターを体細胞に導入する場合は、ベクター導入細胞を選択培地中で容易に選択できるように、前記(3-1-2-a)と同様に薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子（第2の薬剤耐性遺伝子）をターゲッティングベクター上に存在させるか、またはターゲッティングベクターと共に第2の薬剤耐性遺伝子を含有する第2の発現ベクターを共導入（co-transfection）し、選択培地で選択して得られた体細胞を本発明のスクリーニングに用いることがより好ましい。その場合、第2の発現ベクターよりも前記ターゲッティングベクターを大過剰に用いて導入を行うことが望ましい。【０１１１】
前記ターゲッティングベクターをES細胞に導入する場合は、ターゲッティングベクター上のマーカー遺伝子の性質に基づいて、マーカー遺伝子導入・発現細胞を選択することができる（作製法についてはTokuzawa, Y., et al., Molecular and Cellular Biology, 23(8): 2699-2708(2003)等を参照）。ES細胞から体細胞への誘導方法は、前記(3-1-2-a)と同様である。【０１１２】
本発明のスクリーニング工程(a）においては、以上のようにして作製した体細胞と、被験物質とを接触させる。
ここで用いられる被験物質（被験試料）は制限されないが、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物あるいはこれらの混合物などであり、本発明のスクリーニングは、具体的にはこれらの被験物質を前記体細胞と接触させることにより行われる。かかる被験物質としてより具体的には、細胞抽出液、遺伝子（ゲノム、cDNA）ライブラリー、RNAiライブラリー、アンチセンス核酸、遺伝子（ゲノム、cDNA、mRNA)、タンパク質、ペプチド、低分子化合物、高分子化合物、天然化合物などが挙げられる。より具体的には、後述の参考例に示したようなES細胞、卵、ES細胞や卵の細胞抽出物（抽出画分）、ES細胞や卵由来のcDNAライブラリー、ゲノムライブラリーまたはタンパク質ライブラリー、あるいは増殖因子などが挙げられる。【０１１３】
cDNAライブラリー、タンパク質ライブラリーまたは細胞抽出物（有機化合物や無機化合物等）の由来としては、前述のようにES細胞や卵のような未分化細胞が好ましい。
ここでcDNAライブラリーは、市販のcDNAライブラリー作製キット（例えばクローンマイナーcDNAライブラリー作製キット(Invitrogen）や Creator SMART cDNAライブラリー作製キット(BD Biosciences)等）を用いて作製することができる。またタンパク質ライブラリーはWO 00/71580 等を参考にして作製することができる。【０１１４】
これら被験物質は、体細胞への取り込み可能な形態で体細胞と接触させる。例えば被験試料が核酸（cDNAライブラリー等）の場合は、リン酸カルシウム、DEAE-デキストラン、遺伝子導入用リピッドまたは電気パルス等を用いて体細胞に導入する。【０１１５】
体細胞と被験物質とを接触させる条件は、該細胞が死滅せず且つ被験物質が取り込まれるのに適した培養条件（温度、pH、培地組成など）であれば特に制限はない。
前記体細胞と被験物質との接触の前に、接触の際に、若しくは接触後に、ES細胞の培養条件で細胞培養を行う。ES細胞の培養は、当業者に知られた如何なる方法を用いても良い。例えばRF8細胞の場合、以下の組成：15％FBS、0.1mM Non Essential Amino Acids (GIBCO BRL)、2mM L-glutamine、50U/mlペニシリン-ストレプトマイシン、0.11mM 2-ME(GIBCO BRL)/Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)の培地等が挙げられる。また市販の調製済み培地（例えば大日本製薬No.R-ES-101等）を用いることもできる。【０１１６】
ES細胞の培養においてフィーダー細胞を用いる場合、当該フィーダー細胞は、マウス胚から常法により調製した繊維芽細胞や繊維芽細胞由来のSTO細胞株（Meiner,V. et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93: 14041-14046(1996)）を用いても良く、また市販品を用いても良い。市販品としては、例えば PMEF-N、PMEF-NL、PMEF-H、PMEF-HL（以上大日本製薬）などのフィーダー細胞が挙げられる。フィーダー細胞は、マイトマイシンC処理することにより増殖を停止させた後にES細胞の培養に用いることが望ましい。
また、ES細胞の培養において前記フィーダー細胞を用いない場合は、LIF（Leukemia Inhibitory Factor）を添加して培養を行うことができる。LIFとしてはマウス組み換えLIF、ラット組み換えLIF（ケミコン社等）などが挙げられる。
前記ES細胞の培養条件における培養日数は、細胞の状態等により適宜変更できるが、1日〜3日程度が好ましい。【０１１７】
マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子を用いた場合は、対応する薬剤を含む培地（選択培地）で選択を行う。当該薬剤は、体細胞と被験物質との接触の際に培地に含まれていても良く、また接触後に含ませても良い。さらに、ES細胞の培養条件で培養した後に前記薬剤を培地に含ませても良い。【０１１８】
前記工程の後、マーカー遺伝子発現細胞の出現の有無を調べ、該細胞を出現させた被験物質を体細胞の核初期化物質の候補物質として選択する（工程(b))。以下当該工程(b)について記述する。【０１１９】
マーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子の場合は、前記のように選択培地で培養することによりマーカー遺伝子発現細胞を選択することができる。またマーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、マーカー遺伝子発現細胞を検出することができる。
被験物質非添加の場合に比してマーカー遺伝子発現細胞が検出された場合（発現量が増加した場合も含む）、ここで用いた被験試料（被験物質）を、体細胞核初期化物質の候補物質として選択する。
前記スクリーニングは、必要に応じて何度でも繰り返し行うことができる。例えば1回目のスクリーニングでcDNAライブラリーや細胞抽出物といった混合物を用いた場合、2回目以降は、さらに当該混合物を細分化（分画）して同様のスクリーニングを繰り返し行うことにより、最終的に、体細胞核初期化因子の候補物質を選択することができる。【０１２０】
なお、スクリーニングの効率を上げるための１つの例として、前記体細胞をそのままスクリーニングに用いるのではなく、体細胞とES細胞とを融合させた融合細胞に対して、被験物質を添加するスクリーニング系が有効である。即ち本発明のスクリーニング方法には、
以下の(a)および(b)：
(a) ECAT15-1遺伝子、ECAT15-2遺伝子、ECAT16遺伝子、Rnf17遺伝子またはLOC380905(TDRD4)遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞とES細胞とを融合させた融合細胞（体細胞)と、被験物質とを接触させる工程、
(b)前記(a)の工程の後、マーカー遺伝子発現細胞の出現の有無を調べ、該細胞を出現させた被験物質を体細胞の核初期化候補物質として選択する工程、
を含む、体細胞の核初期化物質のスクリーニング方法も含まれる。
ここで「融合細胞」とは、体細胞とES細胞との融合細胞であって前記マーカー遺伝子が発現していない（若しくは発現量が少ない）細胞を意味する。体細胞とES細胞とを融合させて生じるES様細胞のコロニー数に比して、さらに被験物質を添加した際にコロニー数が増加した場合、当該被験物質は体細胞核初期化候補物質として選択することができる。【０１２１】
本発明のスクリーニングで選択された体細胞核初期化(候補)物質が体細胞の核を初期化するか否かは、（1）当該核初期化（候補）因子により体細胞から変換されたES様細胞が Oct3/4やEcat4(Nanog）といったES細胞のマーカー遺伝子を発現しているか否か、（2）前記ES細胞が in vitroにおいてレチノイン酸刺激等で分化するか否か、（3）前記ES細胞をマウスブラストシストにインジェクションしてキメラマウスが誕生するか等を調べることにより、確認することができる。【０１２２】
(3-2)本発明のノックインマウス及び当該ノックインマウスの新規用途（本発明スクリーニング用体細胞の供給源としての使用）
本発明は、ECAT15-1遺伝子、ECAT15-2遺伝子、ECAT16遺伝子、Rnf17遺伝子またはLOC380905(TDRD4)遺伝子にマーカー遺伝子をノックインした遺伝子を含有するノックインマウス、および当該マウスの本発明のスクリーニングにおいて用いる体細胞の供給源としての用途を提供するものである。当該ノックインマウスの作製法等については、前記(3-1)本発明の体細胞核初期化物質のスクリーニング方法において述べた通りである。【０１２３】
(3-3)本発明の体細胞
本発明は、本発明遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞を提供する。すなわち本発明は、ECAT15-1遺伝子、ECAT15-2遺伝子、ECAT16遺伝子、Rnf17遺伝子またはLOC380905(TDRD4)遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞を提供する。具体的にはECAT15-1遺伝子、ECAT15-2遺伝子、ECAT16遺伝子、Rnf17遺伝子またはLOC380905(TDRD4)遺伝子にマーカー遺伝子をノックインした遺伝子を含有する体細胞が例示される。
当該体細胞の作製法等については、前記(3-1)本発明の体細胞核初期化物質のスクリーニング方法において述べた通りである。本発明の体細胞は、前記本発明のスクリーニング方法、または後述の本発明のES様細胞の選択方法において、有効に使用される。【０１２４】
(3-4)本発明のES様細胞の選択方法
本発明はまた、以下の(a)および(b)の工程：
(a) ECAT15-1遺伝子、ECAT15-2遺伝子、ECAT16遺伝子、Rnf17遺伝子またはLOC380905(TDRD4)遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞と、体細胞の核初期化物質とを接触させる工程、
(b) 前記(a)の工程の後、マーカー遺伝子発現細胞をＥＳ様細胞として選択する工程、
を含むES様細胞の選択方法を提供する。【０１２５】
前記本発明のスクリーニング方法において述べたような本発明遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させた体細胞は、ES様細胞の選択のためにも有効に用いられる。例えば幹細胞療法を念頭においた場合、ヒトの体細胞を核初期化物質で刺激することにより出現したES様細胞を、他の細胞（体細胞）から分離（純化）し、後の治療に用いることが望ましい。前述のように、本発明のシステムは、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子の発現を指標として、ES様細胞を容易に選択できるシステムであるため、ES様細胞を選択・分離する際に有効に用いることができる。
本発明のES様細胞の選択方法は、前記ヒトの治療のみならず、イン・ビトロおよびイン・ビボでのES細胞関連の様々な研究において、ES細胞を選択（分離）する如何なる目的においても使用することができる。【０１２６】
前記において、1)本発明遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞の作製方法、2)当該体細胞と体細胞核初期化物質との接触方法、および3)マーカー遺伝子発現細胞の選択方法については、全て「(3-1)本発明の体細胞核初期化物質のスクリーニング方法」に記述したものと同様である。なお、マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子を用いた場合は選択培地で培養することにより、マーカー遺伝子発現細胞を容易に選択（分離）することができる。またマーカー遺伝子として蛍光タンパク質遺伝子、発光酵素遺伝子、または発色酵素遺伝子を用いた場合は、セルソーター、限界希釈法または軟寒天コロニー法などを利用することにより、当該細胞を選択（分離）することができる。
前記で「核初期化物質」とは前記体細胞核初期化物質のスクリーニングで得られるような、体細胞の核初期化に関与する物質を指す。なお、後述の参考例においては、体細胞の核初期化物質としてES細胞自身を用いることにより、マーカー遺伝子発現細胞をES様細胞として選択している。【０１２７】
ES様細胞の選択方法において用いる体細胞は、ヒトの治療を念頭においた場合は、本発明遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を挿入したベクターを含有するヒト体細胞であることが望ましい。具体的には以下のようにして作製された体細胞が用いられる。【０１２８】
すなわちまず、患者の体細胞をヒトから単離することなどにより調製する。体細胞としては、疾患に関与する体細胞、疾患治療に関与する体細胞などが挙げられる。このヒト体細胞に対し、前記(3-1-2)の項に記載のいずれかのベクターを導入する。具体的にはBACベクター（本発明遺伝子の発現調節領域の下流にマーカー遺伝子を存在させたBACベクター）またはPACベクターを導入することが望ましい。ここで導入するBACベクター（PACベクター）は1種類であっても、異なる本発明遺伝子を含有する2種類以上のBACベクターであっても良い。このBACベクター導入細胞に対して核初期化物質を添加することにより、ES様細胞を出現させる。このES様細胞を、用いたマーカー遺伝子の性質に応じて選択する。例えばマーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を用いた場合は、核初期化物質添加後に選択培地で選択することにより、薬剤耐性を指標として、ES様細胞を容易に選択することができる。【０１２９】
（3-5）本発明のES細胞未分化・多能性維持物質のスクリーニング方法
本発明は、以下の(a)および(b)の工程：
(a) ECAT15-1遺伝子、ECAT15-2遺伝子、ECAT16遺伝子、Rnf17遺伝子またはLOC380905(TDRD4)遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有するＥＳ細胞を、ＥＳ細胞の未分化・多能性を維持できない培地中で被験物質と接触させる工程、
(b) 前記(a)の工程の後、マーカー遺伝子発現細胞の存在の有無を調べ、該細胞を存在させた被験物質をＥＳ細胞未分化・多能性維持の候補物質として選択する工程、
を含むES細胞の未分化・多能性維持物質のスクリーニング方法を提供する。【０１３０】
本発明遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させたES細胞を、ES細胞としての状態（未分化・多能性）を維持できない培地中で培養した場合、マーカー遺伝子の発現は消失若しくは低下する。一方、前記培地中にES細胞の未分化・多能性維持物質が存在していれば、マーカー遺伝子の発現は存続する。この性質を利用することにより、ES細胞の未分化・多能性維持(候補)物質を容易にスクリーニングすることができる。【０１３１】
前記スクリーニング工程(a)において用いられるES細胞としては、本発明遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有するES細胞であればどのようなものであっても良い。具体的には、例えば、前記(3-1-1-a)に記載されたノックインマウス由来のES細胞、前記(3-1-1-b)に記載されたトランスジェニックマウス由来のES細胞、前記(3-1-2-a)に記載されたBACベクター若しくはPACベクターを含有するES細胞、前記(3-1-2-b)に記載されたプラスミドベクターを含有するES細胞、若しくは前記(3-1-2-c)に記載されたターゲッティングベクターを含有するES細胞を挙げることができる。【０１３２】
前記スクリーニング工程(a)において用いられる「ES細胞の未分化・多能性を維持できない培地」とは、ES細胞としての状態を維持できない培地、未分化状態を維持できない培地であれば、どのような培地であっても良い。例えばマウスES細胞は、低密度では、その維持（未分化・多能性維持）に血清またはフィーダー細胞が必須であることが知られているため、当該ES細胞の培養条件から血清、フィーダー細胞又はその両者を除去した条件が挙げられる。またヒトES細胞の維持（未分化・多能性維持）にはフィーダー細胞が必須であるため、ヒトES細胞の培養条件からフィーダー細胞を除去した条件が挙げられる。さらにヒトES細胞の場合はフィーダー細胞存在下でも分化する細胞が出現するため、フィーダー細胞存在下の培養条件でも良い。
具体的には、文献（Meiner, V.L., et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 93(24): p14041-14046(1996)）に記載のES細胞の培養条件から血清、フィーダー細胞又はその両者を除去した条件などが例示される。【０１３３】
前記工程(a)は、前記ES細胞を、ES細胞の未分化・多能性を維持できない培地中で被験物質と接触させることにより行われる。被験物質は、ES細胞を未分化・多能性非維持培地に移す前に、また移す際に、若しくは移した後に、当該ES細胞と接触させる。
本スクリーニングで用いられる被験物質（被験試料）は制限されないが、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物またはこれらの混合物などであり、本発明のスクリーニングは、具体的にはこれらの被験物質を前記ES細胞と接触させることにより行われる。かかる被験物質としては、細胞分泌産物、血清、細胞抽出液、遺伝子（ゲノム、cDNA）ライブラリー、RNAiライブラリー、核酸（ゲノム、cDNA、mRNA)、アンチセンス核酸、低分子化合物、高分子化合物、タンパク質、ペプチド、天然化合物などが挙げられる。具体的には、動物血清またはその画分、フィーダー細胞の分泌産物またはその画分などが挙げられる。
これら被験物質（被験試料）は、体細胞への取り込み可能な形態で体細胞と接触させる。例えば被験物質が核酸（cDNAライブラリー等）の場合は、リン酸カルシウム、DEAE-デキストランや遺伝子導入用リピッドを用いて体細胞に導入する。【０１３４】
マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子を用いた場合は、対応する薬剤を含む培地（選択培地）で選択を行う。当該薬剤は、ES細胞と被験物質との接触の際に培地に含まれていても良く、また接触後に含ませても良い。さらに被験物質存在下、ES細胞の未分化・多能性非維持培地中で培養した後に前記薬剤を培地に含ませても良い。【０１３５】
前記工程(a)の後、マーカー遺伝子発現細胞の存在の有無を調べ、該細胞を存在させた被験物質をＥＳ細胞の未分化・多能性維持の候補物質として選択する（工程(b))。当該工程(b)については、前記「(3-1)本発明の体細胞核初期化物質のスクリーニング方法」に記載した通りである。マーカー遺伝子発現細胞が認められた場合、ここで用いた被験試料（被験物質）を、ES細胞の未分化・多能性維持の候補物質として選択する。
前記スクリーニングは、必要に応じて何度でも繰り返し行うことができる。例えば１回目のスクリーニングでフィーダー細胞分泌産物や血清といった混合物を用いた場合、2回目以降は、さらに当該混合物を細分化（分画）して同様のスクリーニングを繰り返し行うことにより、最終的に、ES細胞の未分化・多能性維持の候補物質を選択することができる。
なお、前記のように被験試料として混合物を用いてスクリーニングを行った場合、ES細胞の未分化・多能性維持物質と共にES細胞の増殖促進物質も選択される可能性がある。すなわち、ある混合物（画分A）を前記本発明のスクリーニング方法に供し、生存細胞が確認され且つ当該生存細胞の細胞数が増加した場合には、当該画分中には、ES細胞の未分化・多能性維持物質と共に、ES細胞の増殖促進物質も含まれていると考えられる（もちろん１つの物質が両方の性質を兼ね備えている場合もある）。その場合、当該画分Aをさらに分画し、片方の画分（画分B）を本発明のスクリーニングに供した場合には生存細胞が確認されるが細胞数の増加は認めらず、もう片方の画分（画分C）を本発明のスクリーニングに供した場合は生存細胞が認められなかった場合、画分BにはES細胞の未分化・多能性維持物質が含まれ、画分CにはES細胞の増殖促進物質が含まれることが考えられる。本発明のスクリーニングは、そのようなES細胞の増殖促進（候補）物質の選択にも有用である。
また、生存細胞が確認され且つ当該生存細胞が不死化状態を保った場合には、前記ES細胞の増殖促進（候補）物質と同様にして、ES細胞の不死化維持物質を選択することもできる。【０１３６】
前記本発明のスクリーニングにより選択されたES細胞の未分化・多能性維持(候補)物質がES細胞の未分化・多能性を維持するか否かは、ES細胞の未分化・多能性を維持できない培地中に当該候補物質を添加した培養条件下でES細胞を培養し、ES細胞としての種々の能力を調べることにより、確認することができる。具体的には、例えば前記培養条件下で培養したES細胞が、（1）Oct3/4やEcat4(Nanog）といったES細胞のマーカー遺伝子を発現しているか否か、（2）前記ES細胞が in vitroにおいてレチノイン酸刺激等で分化するか否か、（3）前記ES細胞をマウスブラストシストにインジェクションしてキメラマウスが誕生するか等を調べることにより、確認することができる。【０１３７】
（3-6）本発明のES細胞
本発明は、ECAT遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有するES細胞を提供する。すなわち本発明は、ECAT15-1遺伝子、ECAT15-2遺伝子、ECAT16遺伝子、Rnf17遺伝子またはLOC380905(TDRD4)遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有するES細胞を提供する。当該ES細胞の作製法等については、前記(3-1)において詳しく述べたとおりである。本発明のES細胞は、ES細胞の未分化・多能性維持物質のスクリーニング方法において有効に使用される。【０１３８】
(4)タンパク質の細胞内取り込み促進物質との結合体
本発明は、ECAT15-1、ECAT15-2、ECAT16、Rnf17またはLOC380905(TDRD4)のいずれかを含有するタンパク質と、当該タンパク質の細胞内への取り込みを促進する物質との結合体を提供する。
本発明のタンパク質は、ECAT4（Nanog)やECAT5(ERas)と同様の解析手法により見出されたES細胞で特異的に発現するタンパク質であり、ES細胞の機能維持に関与している。このようなES細胞の機能維持に関わる作用を発揮するために、本発明のタンパク質と各種細胞への取り込みを促進する物質との結合体が有効に用いられる。
ここで「細胞内への取り込みを促進する物質」とは、タンパク質、化学物質のいずれであっても良い。【０１３９】
細胞内への取り込み促進物質がタンパク質（ペプチド）の場合、当該タンパク質と本発明タンパク質との融合タンパク質の形態とすることができる。当該細胞内への取り込み促進タンパク（ペプチド）としては、例えば以下の(i)〜(iii)が例示される：
(i)HIV由来のTAT（Green and Loewnstein, Cell, 56(6), 1179-88 (1988)、Frankel and Pabo, Cell, 55(6), 1189-93 (1988)）、ショウジョウバエ由来のアンテナペディア・ホメオドメイン（Vives et al., J. Biol. Chem, 272(25), 16010-7 (1997)）、HSV由来のVP22（Elliott and O'Hare, Cell, 88(2), 223-33 (1997)）、またはこれらのフラグメント。
(ii)HIV Revのフラグメント、flock house virus Coat (FHV Coat)のフラグメント、brome mosaic virus Gag (BMV Gag)のフラグメント、human T cell leukemia-II Rex(HTLV -II Rex)のフラグメント、cowpea chlorotic mottle virus Gag (CCMV Gag)のフラグメント、P22 Nのフラグメント、λNのフラグメント、φ21Nのフラグメントまたは酵母PRP6のフラグメント（J.Biol.Chem., 276, 5836-5840(2001)）。
(iii)オリゴアルギニンを有するペプチド（J.Biol.Chem., 276, 5836-5840(2001)、J.Biol.Chem., 277(4), 2437-2743 (2002)）。【０１４０】
前記(i)におけるフラグメントとしては、細胞膜を貫通する能力を有する蛋白トランスダクションドメイン（以下「PTD」）が同定されているため、タンパク質導入ドメインであるHIV TATのフラグメント、アンテナペデイア・ホメオドメインのフラグメントおよびHSV VP22のフラグメントとしては、これらのPTDからなるフラグメントが例示される。異種蛋白とPTDを融合することにより、培養細胞中に導入することができることは公知であり、その作製方法も知られている（Fawell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(2), 664-8 (1994)、Elliott and O'Hare (1997), Phelan et al., Nature Biotech. 16, 440-443 (1998)およびDilber et al., Gene Ther., 6(1), 12-21 (1999)、特許番号第2702285号）。HIV TATのPTDについては、HIV TAT蛋白由来の11アミノ酸よりなるPTDに融合したβ−ガラクトシダーゼ蛋白が、生きたマウスの組織に浸潤し、すべての単一細胞に到達できることが報告されている（Schwarze et al., Science, 285(5433), 1569-72 (1999)）。【０１４１】
HIV TATのフラグメントとしては、具体的には、前記の公知文献等に記載されているものを挙げることができるが、好ましくは特許番号第2702285号に記載のHIV TATフラグメントが挙げられる。
アルギニンに富む塩基性ペプチドは細胞膜透過能を有しており、HIV TATのフラグメントは分子中央部を全てアルギニンに置換しても、該フラグメント（ペプチド）は細胞膜透過能を有することが知られているため（J.Biol.Chem., 276, 5836-5840(2001)）、HIV TATのフラグメント、アンテナペデイア・ホメオドメインのフラグメントおよびHSV VP22のフラグメントは、複数個のアミノ酸がアルギニンに置換されていても良い。【０１４２】
前記(ii)におけるHIV RevのフラグメントとしてはHIV Rev-(34-50)ペプチドが、FHV CoatのフラグメントとしてはFHV Coat-(35-49)ペプチドが、BMV GagのフラグメントとしてはBMV Gag-(7-25)ペプチドが、HTLV-II RexのフラグメントとしてはHTLV-II Rex-(4-16)ペプチドが、それぞれ挙げられる。またCCMV GagのフラグメントとしてはCCMV Gag-(7-25)ペプチドが、P22 NのフラグメントとしてはP22 N-(14-30)ペプチドが、λNのフラグメントとしてはλN-(1-22)ペプチドが、φ21Nのフラグメントとしてはφ21N-(12-29)ペプチドが、酵母PRP6のフラグメントとしては酵母PRP6-(129-144)ペプチドが、それぞれ挙げられる。また、これらのフラグメントの配列において複数個のアミノ酸がアルギニンに置換されても良い。【０１４３】
前記(iii)のオリゴアルギニンを有するペプチドとしては、オリゴアルギニン（n=5〜9）を有するペプチドが好ましく、オリゴアルギニン（n=6〜8）を有するペプチドが更に好ましい。【０１４４】
前記細胞内への取り込み促進タンパク質（ペプチド）は、本発明タンパク質のN末端側、C末端側のいずれに融合しても良いが、好ましくは本発明タンパク質のN末端側に融合する。その際、細胞内への取り込み促進タンパクと本発明タンパク質との間にリンカー配列を挿入しても良い。当該融合タンパク質は、常法により融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを作製し、適当な宿主細胞に導入することにより製造することができる（発現ベクターや細胞の具体例については後述の(5)及び(6)を参照）。また、例えばPureGeneシステム等を用いてin vitroで合成、精製することもできる。【０１４５】
細胞内への取り込み促進物質が化学物質の場合、当該化学物質としては、例えばP糖タンパク質に結合活性を持つ化合物や、アルギニンを有する分岐型ペプチド等が例示される。
ここで「P糖タンパク質に結合活性を持つ化合物」とは、例えばBCRPインヒビターを挙げることができる。具体的には、例えば、BCRPインヒビターであるGF120918などを挙げることができる。P糖タンパク質に結合活性を持つ化合物と本発明タンパク質と化学的に結合させることにより、化学的結合体はSP細胞と呼ばれる各種体性幹細胞特異的に取り込まれる。
前記で「アルギニンを有する分岐型ペプチド」とは、例えば、文献(Biochemistry, 41, 7925-7930, (2002))に記載されているような細胞膜透過能をもつ8個程度のアルギニンを有する分岐型ペプチドのことであり、具体的には、該文献の(R2)4ペプチドや(RG3R)4ペプチドなどが挙げられる。【０１４６】
本発明のタンパク質と当該タンパク質の細胞内への取り込み促進物質との結合様式としては、共有結合やイオン結合が挙げられる。例えばイオン結合の場合には、コラーゲンとの静電複合体やN-アセチル-キトサンとの静電複合体等が挙げられる。【０１４７】
(5)ＥＳ細胞の機能維持剤
本発明は、本発明タンパク質（ECAT15-1、ECAT15-2、ECAT16、Rnf17またはLOC380905(TDRD4))のいずれかを含有するタンパク質を有効成分として含有する、ES細胞の機能維持剤を提供する。
本発明のタンパク質は、ECAT4（Nanog)やECAT5(ERas)と同様の解析手法により見出されたES細胞で特異的に発現するタンパク質であり、ES細胞の機能維持に関与している。ここで「ES細胞の機能維持」とは、ES細胞の未分化能維持、ES細胞の多能性維持、ES細胞の増殖能維持、ES細胞の不死化状態維持、またはES細胞以外の細胞に導入した際のES細胞の機能維持（ES様細胞化、体細胞核初期化）に関与することを意味する。特にES細胞の未分化能維持、およびES細胞の増殖能維持に関与することを意味する。【０１４８】
有効成分となる本発明タンパク質（ECAT15-1、ECAT15-2、ECAT16、Rnf17またはLOC380905(TDRD4))のいずれかを含有するタンパク質としては、本発明タンパク質そのものを用いることもできれば、前記細胞内への取り込み促進物質との結合体を用いることもできる。これらタンパク質または結合体は、当業者に周知の細胞内への取り込み可能な形態で、細胞に導入することができる。
なおタンパク質の形態での細胞導入は、不可逆的な遺伝子導入（染色体への組み込み）と異なり可逆的であり、必要な時だけ培地に添加し、不必要であれば培地から除去すれば良いというメリットを有する。【０１４９】
また、これら本発明のタンパク質や結合体（融合タンパク質）をコードする遺伝子を含有するポリヌクレオチドも、ES細胞の機能維持剤の有効成分とすることができる。この場合、前記ポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入し、組換え発現ベクターの形態で細胞に導入することが好ましい。【０１５０】
ここで発現ベクターとしては、用いる宿主や目的等に応じて適宜選択することができ、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。具体的には、例えば pCEP4、pKCR、pCDM8、pGL2、pcDNA3.1、pRc/RSV、pRc/CMVなどのプラスミドベクターや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。
前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子、選択用マーカー遺伝子、ターミネーターなどの因子を含有していても良い。また、マーカータンパク質をコードする遺伝子（マーカー遺伝子）を含有していても良い。【０１５１】
ここで「マーカー遺伝子」とは、目的遺伝子導入細胞と非導入細胞とを区別することの可能な遺伝子のことであり、例えば、ＧＦＰやＧＦＰの変異体であるＣＦＰやＹＦＰなどの蛍光タンパク質遺伝子、薬剤耐性遺伝子、発光酵素遺伝子、発色酵素遺伝子等を挙げることができる。詳しくは前記(3-1)項を参照されたい。このようなマーカー遺伝子を付加したベクターを細胞内に導入することにより、本発明遺伝子を発現する細胞を簡便に検出、選別することができる。
更に、本発明の遺伝子を含む発現ベクターをコンディショナルな遺伝子発現制御システムを利用して作製することもできる。例えばテトラサイクリンの共存下では導入した目的遺伝子が発現し、非共存下では発現しない強制発現システムを挙げることができる（Niwa et al．，(2000). Nat Genet 24, 372-6.）。また目的遺伝子の発現をオン/オフするシステムとしてリコンビナーゼCre-loxPシステムや、リコンビナーゼFLP-FRTシステムなども用いることができる。
さらに前記ベクターは、一定条件下で消失する性質を有するベクターであってもよい。具体的には、例えば、pCAG-IPベクターを挙げることができる。【０１５２】
細胞への導入法としては、例えばリン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子導入用リピッド（Lipofectamine、Lipofectin; Gibco-BRL社）を用いる方法、マイクロインジェクション法、電気パルス法等の公知の方法が挙げられる。【０１５３】
本発明のES細胞の機能維持剤は、種々の哺乳動物細胞に導入される。ここで哺乳動物細胞とは、ヒト、サル、マウスやラット等の哺乳動物の組織・臓器等由来の細胞を意味し、個体から取り出した初代細胞であっても、また培養細胞であっても良い。細胞の種類としては、ES細胞等の未分化・多能性維持細胞であっても良く、また体細胞（(a）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、精子幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（b）組織前駆細胞、（c）リンパ球、上皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞等の分化した細胞）であっても良い。これら細胞の詳細については前記(3)体細胞核初期化物質またはES細胞未分化・多能性維持物質等のスクリーニングの項に記載した通りである。【０１５４】
本発明のES細胞機能維持剤の細胞への添加量は、細胞の種類、細胞数等により適宜調整することができるが、通常培地に0.0001μM〜1000μM、好ましくは0.0001μM〜10μM、より好ましくは0.0001μM〜1μMであり、これを必要に応じて細胞に添加する。
本発明のES細胞の機能維持剤は、再生医療における治療薬または試薬として、また再生医療に関連する研究用試薬として、有効に用いられる。【０１５５】
(6)ＥＣＡＴ１６
（6-1）ECAT16遺伝子
本発明は、以下の(a)〜(d)：
(a) 配列番号：１７または３３に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、
(b) 配列番号：１８または３４に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチド、
(c) 前記(a)または(b)のポリヌクレオチドと70％以上の相同性を有し、且つECAT16の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
(d) 前記(a)または(b)のポリヌクレオチド（相補鎖）に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つECAT16の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
のいずれかよりなるECAT16遺伝子のポリヌクレオチドを提供する。【０１５６】
本発明のECAT16遺伝子は、公知の遺伝子であるRnf17遺伝子とLOC380905遺伝子とが一部オーバーラップして連結した長い転写産物であり、本発明者により見出された新規な遺伝子である。
ここで「ECAT16遺伝子」とは、具体的には配列番号：17に記載の塩基配列を含有するマウスECAT16遺伝子が例示されるが、これに限定されず、前述のように、配列番号：17に記載の塩基配列を含有するマウスECAT16遺伝子と70％以上の相同性を有し、且つECAT16の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子や、配列番号：17に記載の塩基配列を含有するマウスECAT16遺伝子の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つECAT16の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子も、本発明のECAT16遺伝子の範疇に含まれる。このような遺伝子として具体的には、ヒトECAT16遺伝子(配列番号：33)が例示される。【０１５７】
また、配列番号：33に記載の塩基配列を含有するヒトECAT16遺伝子のみならず、配列番号：33に記載の塩基配列を含有するヒトECAT16遺伝子と70％以上の相同性を有し、且つECAT16の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子や、配列番号：33に記載の塩基配列を含有するヒトECAT16遺伝子の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つECAT16の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子も、本発明のECAT16遺伝子の範疇に含まれる。
なおRnf17遺伝子、およびLOC380905遺伝子は前記「ECAT16遺伝子」の範疇には含まれない。【０１５８】
前記（c）において「70％以上の相同性を有するポリヌクレオチド」とは、具体的には前記配列番号で示された塩基配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上の相同性を有する塩基配列を含有するポリヌクレオチドを指す。また前記（d）において「ストリンジェントな条件」とは、前記配列番号で特定された遺伝子の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子が挙げられる。
ここで「ストリンジェントな条件」とは、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA)や前記Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。【０１５９】
ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、6×SSC(20×SSCは、333mM Sodium citrate、333mM NaClを示す)、0.5%SDSおよび50% ホルムアミドを含む溶液中で42℃にてハイブリダイズさせる条件、または6×SSCを含む(50%ホルムアミドは含まない)溶液中で65℃にてハイブリダイズさせる条件などが挙げられる。
またハイブリダイゼーション後の洗浄の条件としては、「１×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。【０１６０】
前記において「ECAT16の機能を有する」とは、具体的には、ECAT16の特徴であるES細胞で特異的に発現するという性質を有すること、あるいはECAT16の作用であるES細胞の機能維持作用を有することを意味する。【０１６１】
ECAT16遺伝子のポリヌクレオチドが２本鎖の場合、発現ベクターに挿入することにより、ECAT16タンパク質を発現するための組換え発現ベクターを作製することができる。【０１６２】
ここで用いる発現ベクターとしては、用いる宿主や目的等に応じて適宜選択することができ、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。【０１６３】
例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、pUC118、pUC119、pBR322、pCR3等のプラスミドベクター、λZAPII、λgt11などのファージベクターが挙げられる。宿主が酵母の場合、ベクターとしては、pYES2、pYEUra3などが挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合には、pAcSGHisNT-Aなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合には、pCEP4、pKCR、pCDM8、pGL2、pcDNA3.1、pRc/RSV、pRc/CMVなどのプラスミドベクターや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。【０１６４】
前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子、選択用マーカー遺伝子、ターミネーターなどの因子を含有していても良い。また、マーカータンパク質をコードする遺伝子（マーカー遺伝子）を含有していても良い。マーカー遺伝子については前記(3-1)項を参照されたい。【０１６５】
また前記発現ベクターは、前述のようなコンディショナルな遺伝子発現制御システム（Niwa et al．，(2000). Nat Genet 24, 372-6.）や、リコンビナーゼCre-loxPシステム、リコンビナーゼFLP-FRTシステムなどに対応した配列を含有しても良い。さらに前記ベクターは、一定条件下で消失する性質を有するベクター（例えばpCAG-IPベクター）であっても良い。【０１６６】
また、単離精製が容易になるように、チオレドキシン、Hisタグ、あるいはGST（グルタチオンS-トランスフェラーゼ）等との融合タンパク質として発現する配列が付加されていても良い。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター（lac、tac、trc、trp、CMV、SV40初期プロモーターなど）を有するGST融合タンパクベクター（pGEX4Tなど）や、Myc、Hisなどのタグ配列を有するベクター（pcDNA3.1/Myc-Hisなど）、さらにはチオレドキシンおよびHisタグとの融合タンパク質を発現するベクター（pET32a）などを用いることができる。【０１６７】
前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、当該発現ベクターを含有する形質転換細胞を作製することができる。
ここで用いられる宿主としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。大腸菌としては、E.coli K-12系統のHB101株、C600株、JM109株、DH5α株、AD494(DE3)株などが挙げられる。また酵母としては、サッカロミセス・セルビジエなどが挙げられる。動物細胞としては、L929細胞、BALB/c3T3細胞、C127細胞、CHO細胞、COS細胞、Vero細胞、Hela細胞、293-EBNA細胞などが挙げられる。昆虫細胞としてはsf9などが挙げられる。また前記（5）項に記載の各種細胞（ES細胞、体細胞）も用いることができる。【０１６８】
宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の導入方法を用いれば良い。具体的にはリン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子導入用リピッド（Lipofectamine、Lipofectin; Gibco-BRL社）を用いる方法、電気パルス法などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む通常の培地にて培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換細胞を選択することができる。【０１６９】
以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な条件下で培養し続けることにより、ECAT16を製造することができる。得られたタンパク質は、一般的な生化学的精製手段により、さらに単離・精製することができる。ここで精製手段としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。また本発明のタンパク質を、前述のチオレドキシンやHisタグ、GST等との融合タンパク質として発現させた場合は、これら融合タンパク質やタグの性質を利用した精製法により単離・精製することができる。【０１７０】
（6-2）ＥＣＡＴ１６タンパク質
また本発明は、以下の(a)〜(c)：
(a)配列番号：１８または３４に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質、
(b)前記(a)のタンパク質と70％以上の相同性を有し、且つECAT16の機能を有するタンパク質、
(c)前記(a)のタンパク質において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を含有し、且つECAT16の機能を有するタンパク質、
のいずれかよりなるECAT16タンパク質を提供する。【０１７１】
ここで「ECAT16」とは、具体的には配列番号：18に記載のアミノ酸配列を含有するマウスECAT16タンパク質が例示されるが、これに限定されず、前述のように、配列番号：18に記載のアミノ酸配列を含有するマウスECAT16タンパク質と70％以上の相同性を有し、且つECAT16の機能を有するタンパク質や、配列番号：18に記載のアミノ酸配列を含有するマウスECAT16タンパク質において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を含有し、且つECAT16の機能を有するタンパク質も、本発明のECAT16の範疇に含まれる。このようなタンパク質として具体的には、ヒトECAT16（ヒトECAT16タンパク質、配列番号：34）が例示される。【０１７２】
また、配列番号：34に記載のアミノ酸配列を含有するヒトECAT16タンパク質と70％以上の相同性を有し、且つECAT16の機能を有するタンパク質や、配列番号：34に記載のアミノ酸配列を含有するヒトECAT16タンパク質において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を含有し、且つECAT16の機能を有するタンパク質も、本発明のECAT16の範疇に含まれる。
なおRnf17およびLOC380905は、前記「ECAT16」の範疇には含まれない。【０１７３】
前記（b）において「70％以上の相同性を有するタンパク質」とは、具体的には前記配列番号で示されたアミノ酸配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含有するポリヌクレオチドを指す。【０１７４】
前記(c）において「１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を含有するタンパク質」とは、人為的に作製したいわゆる改変タンパク質や、生体内に存在するアレル変異対等のタンパク質を意味する。
ここでタンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、ECAT16の活性が保持される限り制限はない。このように活性を喪失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個欠失、置換及び／又は付加されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばDNA Star softwareを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内である。また置換されるアミノ酸は、タンパク質の構造保持の観点から、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe及びTrpは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn及びGlnは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Asp及びGluは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またLys、Arg及びHisは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。【０１７５】
前記において「ECAT16の機能を有する」とは、具体的には、ECAT16の特徴であるES細胞で特異的に発現するという性質を有すること、あるいはECAT16の作用であるES細胞の機能維持作用を有することを意味する。
以上のECAT16タンパク質は、前記形質転換体を培養することにより得ることができる。また例えばPureGeneシステム等を用いてin vitro合成することもできる。【０１７６】
（6-3）ECAT16タンパクに特異的に結合する抗体
本発明は、ECAT16に特異的に結合する抗体を提供する。当該抗体については、前記（1-3）に記載した方法により作製することができる。【０１７７】
（6-4）ECAT16遺伝子の部分ポリヌクレオチド
本発明は、ECAT16のポリヌクレオチドに特異的な、連続する少なくとも15塩基を含有するポリヌクレオチド及び／又は該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを提供する（ただしRnf17遺伝子、およびLOC380905遺伝子は含まれない）。当該ポリヌクレオチドの詳細については、前記（1-1）及び（1-2）に記載した通りである。【０１７８】
（6-5）ECAT16の部分ポリペプチド
本発明は、ECAT16に特異的な、連続する少なくとも６アミノ酸を含有するポリペプチドを提供する（ただしRnf17およびLOC380905は含まれない）。ここで「少なくとも6アミノ酸」との定義は、一般に6アミノ酸あれば１つのタンパク質を他のタンパク質と区別して定義するのに充分であるという理由による。好ましくは8アミノ酸、更に好ましくは10アミノ酸以上のアミノ酸を含有するポリペプチドが提供される。【０１７９】
（6-6）ECAT16遺伝子の遺伝子改変動物
本発明は、ECAT16遺伝子を人為的に染色体中に挿入したか、あるいはいずれかをノックアウトさせた遺伝子改変動物を提供する。ここで「ECAT16遺伝子を人為的に染色体中に挿入した遺伝子改変動物」とはECAT16遺伝子のトランスジェニック動物を指し、また「ECAT16遺伝子をノックアウトさせた遺伝子改変動物」とはECAT16遺伝子ノックアウト動物、ノックイン動物を指す。
当該遺伝子改変動物の作製法は当業者に周知であり、例えば前記（3-1）項に記載の方法にて作製することができる。【０１８０】
（6-7）ECAT16遺伝子のアンチセンス核酸またはsiRNA
本発明は、ECAT16遺伝子のアンチセンス核酸またはsiRNAを提供する。ここで「アンチセンス核酸」とはアンチセンスポリヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドを指し、具体的には配列番号：17または配列番号：33に記載の塩基配列またはその一部分に相補的なアンチセンス核酸が例示される。【０１８１】
アンチセンス核酸は通常、10〜1000個程度、好ましくは15〜500個程度、更に好ましくは16〜30個程度の塩基から構成される。ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスDNAを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換されていてもよい。これらのアンチセンス核酸は、公知のDNA合成装置などを用いて製造することができる。【０１８２】
前記アンチセンス核酸は、ECAT16遺伝子のRNA若しくは転写後プロセッシングにより該RNAを生じる初期転写産物とハイブリダイズすることができ、ECAT16遺伝子のRNAの合成または機能を阻害することができるか、あるいは該RNAとの相互作用を介してECAT16遺伝子の発現を調節・制御することができる。【０１８３】
本発明のアンチセンス核酸は、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で用いることもできる。このような形態としては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例、ホスホリピド、コレステロールなど）などの疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の3’端または5’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の3’端または5’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、RNaseなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。【０１８４】
前記において「siRNA」とは短い干渉RNAのことであり、具体的にはECAT16遺伝子のmRNAまたはその初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的な二本鎖オリゴRNAを指す。短い二本鎖RNAを細胞内に導入するとそのRNAに相補的なmRNAが分解される、いわゆるRNA干渉（RNAi）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、最近、この現象が動物細胞でも起こることが確認されている（Nature,411(6836):p494-498(2001)）。当該RNAi活性を有する二本鎖オリゴRNAは、センス鎖及びアンチセンス鎖をDNA/RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中でアニーリングさせることにより調製することができる。【０１８５】
以上の(6-1)〜(6-7)に記載した各物質は、ES細胞に関連するメカニズム解析や再生医療に関連する研究用試薬として、有効に用いられる。【０１８６】
（7）129マウスES細胞由来のECAT15
本発明は、配列番号：１に記載の塩基配列を含有するマウスECAT15-1遺伝子（ポリヌクレチド）、および配列番号：５に記載の塩基配列を含有するマウスECAT15-2遺伝子（ポリヌクレチド）を提供する。また本発明は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含有するマウスECAT15-1、および６に記載のアミノ酸配列を含有するマウスECAT15-2を提供する。これら129マウスES細胞由来のECAT15の塩基配列およびアミノ酸配列は、公共ジーンバンク（GenBak等）に登録されている遺伝子と、アミノ酸残基で数アミノ酸異なる新規な遺伝子である。
当該ECAT15-1遺伝子およびECAT15-2遺伝子についても、前記（6-1）〜（6-7）に基づき、遺伝子、タンパク質、発現ベクター、形質転換細胞、抗体、部分ポリヌクオチド、部分ペプチド、および遺伝子改変動物を作製することができる。【０１８７】
（8）ECAT15-1及びECAT15-2の複合体
本発明は、ECAT15-1およびECAT15-2の複合体を提供する。当該ECAT15-1およびECAT15-2の複合体を形成している限り、さらなるECAT15-1が結合して複合体を形成していても良く、また、さらなるECAT15-2が結合して複合体を形成していても良い。また当該複合体は、細胞内への取り込みを促進する物質との結合体の形にすることもできる（前記(4)項参照）。
これらECAT15-1およびECAT15-2の複合体、または当該複合体の細胞内への取り込みを促進する物質との結合体は、前記(5)項に示したES細胞の機能維持剤の有効成分とすることができる。より具体的には、ES細胞の未分化能維持剤、およびES細胞の増殖能維持剤の有効成分とすることができる。ECAT15-1およびECAT15-2は複合体を形成するため、ES細胞の機能維持剤において同時に用いることが好ましい。【０１８８】
さらに本発明は、以下の(a)および(b)：
(a)ECAT15-1遺伝子を含有するポリヌクレオチドまたはこれを含有する発現ベクター、
(b)ECAT15-2遺伝子を含有するポリヌクレオチドまたはこれを含有する発現ベクター、
を有効成分として含有するES細胞の機能維持剤も提供する。両者は発現して複合体を形成するため、ES細胞の機能維持剤において同時に用いることが好ましい。
なお、前記において「ECAT15-1」、「ECAT15-2」、「ECAT15-1遺伝子」および「ECAT15-2遺伝子」は、前述のように特定の配列に限定されるものではなく、特定配列に類似のアミノ酸配列または塩基配列を含有するものも含まれる。【０１８９】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【実施例１】
【０１９０】
ＥＳ細胞特異的発現遺伝子の同定
ES細胞特異的発現遺伝子を同定するために、Expressed Sequence Tag(EST)データベースをDigital Differential Display法で解析した。すなわち、Digital differential display法により次に示す５つの細胞や臓器由来のライブラリー群における遺伝子発現頻度解析を行った。各群の括弧内の数字は解析したクローン数を示している。1群から5群までは該当するライブラリーをすべて解析した。6群はデーター数が膨大であるため、全身の臓器、細胞を可及的に含むように抽出した23ライブラリーを解析した。【０１９１】
1群  1細胞期よりブラストシストまでの受精卵（49050クローン）
2群  ES細胞またはEmbryonic carcinoma細胞（32277クローン）
3群  受精後8.5日までの胎児（46728クローン）
4群  受精後9日以降の胎児（128882クローン）
5群  精巣（65685クローン）
6群  その他の細胞、組織（272460クローン）
Digital differential display法により受精卵とES細胞等の多能性細胞で特異的に発現することが予想されたセットについては、マウス由来のESTデータベースをBlastNにて検索し、多能性細胞由来のライブラリーでのみESTが存在するかどうかを検討した。【０１９２】
使用したデータベースおよび解析プログラムのURLは以下の通りである。
Unigene Mouse Sequence Collection
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/Mm.Home.html
Digital differential display
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/info_ddd.html
Blast search
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/【０１９３】
Digital differential display法による解析とBlastNによるESTデータベース検索により選択されたECATの候補遺伝子のうち、DNA結合ドメインであるSAP (SAF-A/B, Acinus, and PIAS) motifを含有するECAT15-1、および癌遺伝子mycへの結合が示唆されているRnf17に着目した。これら2つの遺伝子のES細胞および13種類の臓器における発現を、RT-PCRにより解析した。即ちES細胞（未分化／分化）と成体マウスの13種類の臓器におけるECAT15-1遺伝子およびRNF17（RNF17,long form)遺伝子の発現を、RT-PCRにより解析した。用いたプライマーの配列は以下のとおりである。【０１９４】
〔ECAT15-1〕
ECAT15-1-gw-s: CACCATGGAGACTGCTGGAGACAAGAAG（配列番号：19）
ECAT15-1-gw-as2: GGACCTATTCCAGAGGAACTGTCAC（配列番号：20）
〔RNF17〕
Rnf17-RT-S：  GACCGGGCTGGCTTCCTGTCACCTAGT（配列番号：27）
Rnf17-RT-AS：  TTTACCATTTTCGGTGGCAAGGCTTCC（配列番号：28）
ECAT15-1遺伝子の解析結果を図１に、またRnf17遺伝子の解析結果を図２に示す。【０１９５】
ECAT15-1遺伝子は未分化ES細胞（MG1.19 ES細胞およびRF8 ES細胞）で発現しており、その発現はES細胞をレチノイン酸で分化誘導すると著しく低下した。成体マウスの13種類の臓器においては発現が認められなかった。またRnf17遺伝子（図中Rnf17L）は未分化ES細胞（MG1.19 ES細胞およびRF8 ES細胞）及び精巣でのみ発現が認められた。精巣での発現はOct3/4遺伝子と同様に始原生殖細胞や精母細胞に由来する可能性が高い。これらの結果から、ECAT15-1遺伝子およびRnf17遺伝子は、いずれもES細胞特異的発現遺伝子であることが明らかとなった。【０１９６】
ECAT15-1遺伝子と配列上及び構造上類似の遺伝子としてECAT15-2遺伝子が存在しており、このECAT15-2についても同様のRT-PCR解析を行った（図１）。用いたプライマーの配列は以下の通りである。
〔ECAT15-2〕
ECAT15-2-gw-s: CACCATGTCATACTTCGGCCTGGAGACT（配列番号：21）
ECAT15-2-gw-as2: ACTCTACTCTTTTCTCCTTTGGCACCC（配列番号：22）
その結果、ECAT15-1と同様の発現パターンを示し、ES細胞特異的発現遺伝子であることが示された。【０１９７】
またRnf17についてはゲノム上重複するもう１つの遺伝子LOC380905が存在している。このLOC380905についても同様のRT-PCR解析を行った（図２）。用いたプライマーの配列は以下の通りである。
〔LOC380905〕
LOC380905-RT-S：  AAGCTGGCATATGTTGAACCAAGTAAA（配列番号：29）
LOC380905-RT-AS：  TTCATAAGATGCTAGGCCCTCTTTCAC（配列番号：30）
その結果、Rnf17と同様の発現パターンを示し、ES細胞特異的発現遺伝子であることが示された。
以上のようにECAT15-1遺伝子、ECAT15-2遺伝子、Rnf17遺伝子およびLOC380905遺伝子は、いずれもES細胞特異的に発現するECAT遺伝子であり、ES細胞を特徴付けるマーカー遺伝子であることが明らかとなった。
【実施例２】
【０１９８】
各遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列の同定
次に、前記ECAT15-1遺伝子、ECAT15-2遺伝子、Rnf17遺伝子およびLOC380905遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を同定した。【０１９９】
ECAT15-1遺伝子およびECAT15-2遺伝子について、RF8 ES細胞のmRNAよりRT-PCR法によりcDNAを増幅し、その塩基配列を決定した。決定したマウスECAT15-1(mECAT15-1)の塩基配列を配列番号：１に、アミノ酸配列を配列番号：２に示す。またマウスECAT15-2(mECAT15-2)の塩基配列を配列番号：５に、アミノ酸配列を配列番号：６に示す。これら塩基配列およびアミノ酸配列は、公共ジーンバンク（GenBak等）に登録されている遺伝子のそれと、アミノ酸残基で数アミノ酸異なる新規な遺伝子であった。
マウスECAT15のヒト相同遺伝子として、hECAT15-1（配列番号：3、4）およびhECAT15-2（配列番号：7、8）を、それぞれ遺伝子データベースより同定した。【０２００】
マウスRnf17(mRnf17)として配列番号：9及び10を、そのヒト相同遺伝子としてhRnf17（配列番号：11、12）を同定した。またマウスLOC380905 (mLOC380905)として配列番号：13及び14を、そのヒト相同遺伝子としてhTDRD4（配列番号：15、16）を、それぞれ遺伝子データベースより同定した。
【実施例３】
【０２０１】
ECAT16遺伝子の同定
RF8 ES細胞におけるRnf17遺伝子および LOC380905遺伝子の発現を、ノーザンブロット解析により調べた。その結果Rnf17特異的プローブ、LOC380905特異的プローブのどちらを用いた場合も、Rnf17やLOC380905に相当する約2kbのバンドは確認されず、変わりに約4kbの新規なバンドのみが確認された。この新規なバンドに相当する遺伝子をECAT16遺伝子と命名した。
次にこれらの遺伝子発現をRT-PCRにより解析した。用いたプライマーの配列は以下の通りである。【０２０２】
〔Rnf17LのORF増幅用プライマー〕
Rnf17-S：  CACCATGGCGGCAGAGGCTTCGTCGACCGG（配列番号：23）
Rnf17L-AS：  CTAAAACTCCACAGCCTTTGAGGGAGAATC（配列番号：24）
〔LOC380905のORF増幅用プライマー〕
LOC380905-ORF-S：  CACCATGAAGTCTGAACCATACAGTGA（配列番号：25）
LOC380905-ORF-AS：  TTAGGAGGAGGAGGCCCTTCTCTCTCT（配列番号：26）
〔ECAT16のORF増幅用プライマー〕
Rnf17-S：  CACCATGGCGGCAGAGGCTTCGTCGACCGG（配列番号：23）
LOC380905-ORF-AS：TTAGGAGGAGGAGGCCCTTCTCTCTCT（配列番号：26）【０２０３】
その結果、いずれの遺伝子（ECAT16遺伝子、Rnf17遺伝子およびLOC380905遺伝子）についても発現が認められたが、ECAT16遺伝子の発現量が格段に多かった。従って図２におけるRnf17(Rnf17L)遺伝子およびLOC380905遺伝子の発現は、その殆どがECAT16遺伝子の発現であったこと、すなわちECAT16遺伝子がES細胞特異的発現遺伝子の主体であることが明らかとなった。【０２０４】
ECAT16遺伝子について、RF8 ES細胞のmRNAよりRT-PCR法によりcDNAを増幅し、その塩基配列を決定した。決定されたマウスECAT16遺伝子の塩基配列を配列番号：17に、またアミノ酸配列を配列番号：18に示す。ECAT16遺伝子はRnf17遺伝子とLOC380905遺伝子とが一部オーバーラップして連結した長い転写産物であり、新規な遺伝子であることが明らかとなった。【０２０５】
次に、ヒトECAT16遺伝子の同定を行った。ヒト由来testisのmRNAより、RT-PCR法によりヒトECAT16遺伝子のcDNAを増幅し、その塩基配列を決定した。増幅に用いたプライマーの配列は以下の通りである。
〔hECAT16〕
hRnf17-S：CACCATGGCGGCAGAGGCTTCGAAGAC（配列番号：31）
hLOC380905-AS：TTATTCATCTTTATCTGCAAGCCCCATTT（配列番号：32）【０２０６】
決定されたヒトECAT16遺伝子の塩基配列を配列番号：33に、またアミノ酸配列を配列番号：34に示す。blastp 、blastn、BLAT、blast(genome)検索の結果、マウスECAT16遺伝子同様、ヒトECAT16遺伝子についても塩基配列、アミノ酸配列共に公開されていない新規な遺伝子であった。マウスECAT16とヒトECAT16の遺伝子レベルでの相同性は71％、タンパクレベルでの相同性は72.5％であった。
【実施例４】
【０２０７】
（参考例１）ECAT3遺伝子を利用した体細胞核初期化物質の選択システム
ECAT3遺伝子のコーディング領域をβガラクトシダーゼとネオマイシン耐性遺伝子の融合遺伝子（βgeo）に置き換え、ECAT3遺伝子をノックアウトするとともに、ECAT3遺伝子の発現をX-Gal染色や薬剤耐性でモニターできるようにしたホモ変異ノックインマウス（以下、ECAT3βgeo/βgeoマウス）を作製した。このECAT3βgeo/βgeoマウスの作製は文献（Tokuzawa, Y., et al., Molecular and Cellular Biology, 23(8): 2699-2708(2003)）の記載に基づき行った。【０２０８】
次に、ECAT3βgeo/βgeoマウスの胸腺から常法によりリンパ球を採取した。この細胞を文献（Meiner, V.L., et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 93(24): p14041-14046(1996)）に記載のES細胞の培養条件で２日間培養し、G418（0.25mg/ml）で選択した。その結果、これらリンパ球はすべて死滅し、薬剤耐性コロニーは一つも得られなかった。またこのG418濃度では正常ES細胞はすべて死滅することも確認された。【０２０９】
次に、ECAT3βgeo/βgeoマウス由来のリンパ球とRF8細胞とを、多田らの方法（Tada, M., et al., Curr. Biol., 11(19): p1553-1558(2001))に従って電気的に融合し、前記ES細胞の培養条件でフィーダー細胞（STO細胞）上で２日間培養し、G418（0.25mg/ml）で選択したところ、多数のES細胞様コロニーが得られた。これらのコロニーを単離、培養し、RNAを回収した。ノザンブロットによりこれらの細胞は全クローンにおいてOct3/4やECAT4（Nanog）を発現しており、またこのクローンをマウスブラストシストに移植したところキメラマウスが形成されたことから、G418で選択された細胞は確かにES細胞としての性質を有するES様細胞であることが明らかとなった。これらの細胞をフローサイトメトリー（FACS）で解析したところ、大きさ（Forward scatter）は約２倍となり、DNA量も４倍体となっていた。以上のことから、これらのコロニーはECAT3βgeo/βgeoマウス由来のリンパ球と正常ES細胞との融合により、リンパ球核の初期化（ES細胞化）が起こったためにG418耐性になったことが分かった。このようにECAT3βgeo/βgeoマウス由来の体細胞は、ES様細胞に変換された時のみ薬剤耐性となる。従ってこの性質を利用すれば、ES様細胞の選択や、ES様細胞への変換を誘導する核初期化因子を容易にスクリーニングできることが明らかとなった。
【実施例５】
【０２１０】
ECAT15-1およびECAT15-2のターゲティングと機能解析
1.実験方法
1)BAC のスクリーニング
ECAT15 のBACクローンを得るためにマウスBAC ライブラリー(Research Genetics Co., Catalog No.96021)のDNAプールを、マニュアルに従ってPCRによりスクリーニングを行った。プライマーは ECAT15-1 の第 1 エクソンより約2 kbp上流に設計したプライマー(5’:ECAT15-BAC-S2:AGATTCATTTACTTCACCGCTCCATCATAC/3’:ECAT15-BAC -AS2:TCCTGGTAATAAAATTCCGTCGCTGTTG)（それぞれ配列番号：35、36）を用いた。反応条件は以下に記した。【０２１１】
反応溶液 (25 μL):dNTP 2 mM, 5’及び 3’primer 5 pmol, rTaq polymerase 1unit, template DNA 100 ng。温度条件: 94℃ , 5 sec. (94℃ , 2 sec. 55℃ , 2 sec. 72℃ , 5min.)×55 cycle, 68 ℃ , 5 min. 4℃。PCR 反応後、 EtBrを含む2.0 % アガロースゲルで電気泳動し、約560 bp のバンド増幅したクローンをスクリーニングした。その結果、同定できた #290 プレートを新たに入手した。# 290プレートは 384穴プレートであったため、まず 4穴分を1穴にまとめたDNA プールを作成した。このプールを鋳型にし、同様の条件でPCR を行って、目的のクローンを含むプールを決定した。最後に、このプールに含まれた各 DNA を鋳型にPCR を行って、最終的に ECAT15 遺伝子の15-1、15-2 の両方を含むクローンを得た。得られた BAC クローンは500 mL の LB 培地 (12.5 μg/mL クロラムフェニコール)で 37℃で一晩振とう培養し、集菌した後に nucleobond kit (MACHEREY-NAGEL Co.)を用いてBAC クローンの精製を行った。精製の際、ボルテックス等での激しい攪拌は避け、シェーカーでゆっくり振とうすることによって懸濁した。また、S 1 溶液 23 mLを加えて振とうし、細胞の沈殿が完全に懸濁された後に塩化リゾチーム(50 mg/mL) を 1mL加え、さらに室温で5 分間振とうすることで細胞を溶菌しやすくした。その後、S2、S3 溶液をピペットで均一に懸濁するまで混ぜた後、氷上で 5 分間振とうした。カラム精製後、DNAをイソプロ沈殿し、70 % エタノールで洗浄した後、3-5 分風乾し、10mM Tris-HCl (PH8.0)に溶かして、4℃で保存した。【０２１２】
2)BAC ターゲティングベクターの作成
ECAT15-1及び15-2を含み、全長約 140 kbp の BAC クローンを大腸菌の組み換え酵素である Rec/ET を用いて BAC ターゲティングベクターの作成を以下の様に行った。【０２１３】
(1)Rec/ET による相同組み換えのためのオリゴ設計
15-1 部位をネオマイシン耐性遺伝子カセットに、15-2 部位にハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを導入したターゲティングベクターを作成する。このためのセレクションマーカー (ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子) を鋳型にしてPCR により BACに導入する部位を作成した。この PCR のプライマーとして鋳型に相同な部位 24 bp、BAC に相同な部位 50 bp を含む、計 74 bp のオリゴを用いた。BAC に相同な部位に関しては繰り返し配列がないことを確認して設計した(RepeatMasker2: http://ftp.genome.washington.edu/)。【０２１４】
15-1 部位に用いたプライマー
15-1recomb5'-s
(5'-CCGCTCGAAGTGGCCTTGCGCGAGACCCTGGGGCCCGGGTGTAGATGTGTTGGCAGAACATATCCATCGC -3')(配列番号：37)
15-1recomb 3'-as
(5'-GTGGAATATATGACATCAAATACAACCAGCAGTCGTCCATCAGGGGATGACTATCAACAGGTTGAACTGATGGC -3')(配列番号：38)
15-2 部位に用いたプライマー
15-2-5'Recomb-s
(5'- CTGGGAGTAAAATGAAACTGTTTCCTTGCTAAAGGAGTAAATCGTCTCAGCCCTATGCTACTCCGTCGAAGTTC -3')(配列番号：39)
15-2recomb3'-as
(5'- ACTACTGCCAGTTGATGACTGCTGGAGCACGGAGAGCCATCAGCAGTCAGCTGGCAGTTT ATGGCGGGCGTCCT -3') (配列番号：40)【０２１５】
(2)PCR の条件
下記の条件でKOD +により反応を行った。
94℃ 1 分
20 サイクル; 1’ 94℃ 2 秒; 1’ 68℃ 2 分
68℃ 5 分後, 4℃で維持【０２１６】
(3)Rec/ET 発現プラスミドのトランスフォーメーション
ECAT15 BAC を含有する DH10B を12.5μg/mL のクロラムフェニコールを含む1.0 mL LB 培地で 37 ℃ オーバーナイトで培養する。そして、そこから 30μLを先程と同様の新しい培地 1.4 mLに加え、37℃ 2時間培養する。11000 rpm、30 秒遠心し、上清を捨てる。ペレットをミリQ 水で再懸濁し再度遠心し、上清を捨てる。40μ L のミリQ 水に懸濁し、pSC-101-BAD-gbaA ベクターを 200 ng 加え、1 mm キュベットに移し、エレクトロポレーション (BioRad Electroporator: 1350 V, 10μF, 600 Ohms) を行った。1 mL LB 培地でエッペンに移し、30℃、70分培養した。導入した Rec/ET 発現プラスミドは 37 ℃ で培養すると消失する。12.5μg/mL のクロラムフェニコール、10μg/mL のテトラサイクリンを含むLB プレートで30 ℃ オーバーナイト、遮光下で培養した。【０２１７】
(4)Rec/ET による組み換え反応
生えてきたコロニーを12.5μg/mL のクロラムフェニコール、10μg/mL のテトラサイクリンを含む 1 mL LB 培地で30 ℃ オーバーナイト、遮光下で培養した。そして、そこから 30 μL を先程と同様の新しい培地 1.4 mL に加え、30 ℃ 2 時間培養する。最終濃度が 0.2% となるように L-アラビノースを加え、30 ℃ 1 時間培養する。11000 rpm、30 秒遠心し、上清を捨てる。ペレットをミリQ 水で再懸濁し再度遠心し、上清を捨てる。40μL のミリQ 水に懸濁し、上で作成したオリゴ (PCR 産物)を0.3μg 加え、1 mm キュベットに移し、エレクトロポレーション (BioRad Electroporator: 1350 V、10μF、600 Ohms)を行った。1mL LB 培地でエッペンに移し、37℃ 、70分培養した。12.5 μg/mL のクロラムフェニコール、及びセレクションマーカーによる抗生物質 (15-1 部位: 50 μg/mL のカナマイシン、15-2 部位: 50 μg/mL のハイグロマイシン) を含む LB プレートで 30 ℃ オーバーナイト、培養した。生えてきたコロニーよりBACターゲティングベクターを得た。【０２１８】
(5)BAC ジーンターゲティング
作製した BAC ターゲティングベクターを SalI (NEB) で一晩処理して直線化し、フェノールクロロホルム抽出後にエタノール沈殿を行いPBS に溶かした。前日に10 cm の細胞培養用プレートにコンフルエントな状態のRF8 細胞を1:2 で継代し、当日PBS で洗浄した後、トリプシン処理を行い15ml チューブに回収した。これを 800 rpm で5分間遠心分離して上清を除去し、800μL のPBS に再懸濁した。この細胞懸濁液に直線化したターゲティングベクター20μg を加え、エレクトロポレーション用キュベット (BM Equipment.Co.)に移した。Gene pullser II (BIO-RAD. Co.) を0.25kV、500μ F、抵抗無限に設定してエレクトロポレーションを行った。室温で15 分放置し、これを100mm細胞培養用プレートで培養しているMSTO に1:2 で播種し、インキュベーターで培養した。エレクトロポレーションの翌日はES mediumで培地交換を行い、2 日後からは250μg/mL のG418(SIGMA. Co.)、及び100 μg/mLのハイグロマイシン (SIGMA. Co.)を加えて選択を行った。10日後にマイクロピペットでコロニーを拾い、トリプシン20μL が入った96well プレートに移してトリプシン処理を行い、ES medium 180μLを加えて中和してから24wellプレートのMSTO 上に継代した。コンフルエントになった細胞はトリプシン処理して、一部は0.1%ゼラチンコートした24well プレートにゲノム抽出用に継代し、残りは細胞凍結用培地を加えてプレートごと凍結した。ゲノム抽出用に継代した細胞がコンフルエントになったら、PBS で2 回洗浄してゲノムを抽出した。【０２１９】
(6)サザンブロット
抽出したゲノムDNA 10μg をBcl I(NEB)で一晩処理したものを0.7 %アガロースゲルで電気泳動した。泳動後のゲルをdenaturingbuffer (0.5M NaOH, 1.5MNaCl) に浸し、50rpm で30 分間、室温で振とうした。ゲルを蒸留水ですすぎ、neutralizing buffer (0.5M Tris-HCl pH7.0、1.5M NaCl) に浸して50rpm で30 分間、室温で振とうした。ゲルを蒸留水ですすぎ、20×SSC (3M NaCl、0.3M Na citratepH7.0)に浸して50rpm で30 分間、室温で振とうした後、TURBOBLOTTER Rapid Downward Transfer System/Stack Tray (Schleicher &Schuell) のマニュアルに従ってナイロンメンブレン (Hybond N,Amersham Biosciences) に一晩かけてブロットした。翌日、ナイロンメンブレンにDNA が移っていることを確認した。ナイロンメンブレンを2 ×SSC で洗浄し、UV 照射を行いナイロンメンブレンにDNA を固定した。このメンブレンをハイブリダイゼーションボトルに移し,PerfectHyb Plus HYBRIDIZATION Buffer (SIGMA. Co.) を7ml 加えて68℃ で1時間プレハイブリダイゼーションした。ECAT 15 の遺伝子型を確認する際のプローブは、ECAT15 BAC を鋳型にして ECAT15- 3' probe-s (5’-GCTCCAAATGACCACAAGACTAACAGGC -3')(配列番号：41) とECAT15- 3 ’probe-as (5’-GTGCACATTCCTCCAAGTAGGTAT GAA A -3')(配列番号：42)を用いてPCR を行って得られた断片を、Rediprime II Random Prime Labelling System (AmershamBiosciences. Co.)を用いて[32P]-dCTP でラベリングしたものを用いた。ラベリングしたプローブを液体シンチレーションにより放射線強度を測定した。1.2 ×107 dpm のプローブを100℃ で5分間処理したものを、プレハイブリダイゼーションを行なったメンブレンの入ったボトルに加え、68℃ で3 時間ハイブリダイゼーションを行なった。3 時間後、first wash buffer(2×SSC,10%SDS)を適量加えて室温で5 分間洗浄した。次にsecond wash buffer (0.2 ×SSC,10%SDS)を適量加え、68℃ で20分間の洗浄を2 回行なった。洗浄後のメンブレンをラップで包み、イメージングプレート (Fuji. Co.)で一晩露光し、翌日BAS 5000 (Fuji. Co.)を用いて解析を行った。【０２２０】
(7)定量 PCR
定量 PCR 用プライマー、taq man プローブの設計
Taq man プローブは長さが 20〜 30 塩基で 5’末端のGは避けた。4つ以上の Gの連続はさけた。このプローブを挟む形でプライマーを設計した。以上の部位は繰り返し配列がないことを確認して設計した(RepeatMasker2)。15-1、15-2、及びコントロールとして Nanog 遺伝子をターゲティングした部位(Cell,113,p631-642(2003))で設計した。これらを用いて以下の様に定量PCRを行った。【０２２１】
定量 PCR 反応条件：
2×buffer 6.25；primer 1.25, 1.25；taq man probe 1.25；template 0.5；DDW 2；Total 12.5 μl
94℃ 3 分；94℃ 2 秒 50 ℃ 15 秒 72℃ 1 分 (40 cycle)；72℃で維持【０２２２】
用いたプライマー：
Q15-1-s2 (5’-AGAAGAGAAGAATGAGCGTTACAA T -3')(配列番号：43),
Q15-1-as2 (5' -GGATTCTAAATTCCTTCCTAACAA A-3') (配列番号：44),
Q15-2-s (5'-ATG AATACAGTGTATTTACCAGTGT -3') (配列番号：45),
Q15-2-as (5’-GAGCTACTACTGCCAGTTGATGACT -3') (配列番号：46),
Qnanog-s (5’-GTCCTTAGAAGTTGCTGTAATGTA A -3') (配列番号：47),
Qnanog-as (5’-TCACATAATTATGATTTTAACAGGC -3') (配列番号：48)
バッファー: QuickGoldSt ar Mastermix Plus (NIPPON GENE Co.)【０２２３】
Taq man Probe (NIPPON EGT Co.)
15-1Taq (5’-CGGGTGTAGATGTGTTAGGAGAGGA -3 ’) (配列番号：49),
15-2Taq (5’-CCTGCAGCTGAACTGACTGCTG -3 ’) (配列番号：50),
nanogTaq (5’-TGAATCGAACTAACGTCTGGACGTC -3 ’) (配列番号：51)
ABI PRISM 7300 (Applied Biosystems Co.)【０２２４】
2.結果
BAC（Bacterial artificial chromosome） のスクリーニングの結果、ECAT15-1、15-2 の全長を含み、全長が約 140 kbp の ECAT15 BAC クローンが得られた。このBAC を Rec/ET の組み換え酵素を用いて、ECAT15 BAC ターゲティングベクターを作成した。このベクターは 15-1 の第2エキソンから第7エキソンまでをネオマイシン耐性遺伝子で置換し、15-2 の第2エキソンから第7エキソンまでをハイグロマイシン耐性遺伝子で置換している(図3)。【０２２５】
このターゲティングベクターを ES 細胞(RF8) に導入し、PCR により耐性マーカーが導入されているか調べた結果、15-1 部位でその導入が確認できた (18/18 クローン)。さらに、15-2 部位でも同様に確認できた。このクローンを用いてサザンブロットによる相同組み換えの確認を行ったところ、相同組み換え体にのみ存在する19.5 kb のバンドを検出するクローンを得た(3/18 クローン) (図4)。
サザンブロットでは 5’側で相同組み換えが起こる部位が 40 kb 以上あり、確認が困難だったので、定量 PCR による確認を行った。相同組み換え体のゲノムは、通常のゲノムに比べ、組み変わった部位のPCR 増幅量が半減していると考えた。15-1 部位でスクリーニングを行った結果 3 クローン値が半減しているクローンが得られた。この際、コントロールとして、すでに相同組み換えの確認がなされているNanog (+ /-) クローン(Cell,113,p631-642(2003))のゲノムを用いた結果、予想通り値が半減していた。また、これら3 クローンは 15-2 部位でも同様の結果が得られた。【０２２６】
上記で定量 PCR 及びサザンブロットでともに確認できたクローンを ECAT15-1、2 ダブルへテロ変異細胞とした。15-1および15-2ヘテロ変異ES細胞はコントロール細胞（相同組換えを起こさなかった細胞）に比べて増殖が遅く、分化しやすい傾向にあった。以上の結果より、ECAT15がES細胞の増殖と未分化維持において重要な役割を果たしていることが確認された。
【実施例６】
【０２２７】
ECAT15-1及びECAT15-2のタンパク複合体解析
1.実験方法
1)ベクターの構築
本研究でのベクター構築の多くは GATEWAY Cloning Technology(Invitrogen. Co.)を利用した。この手法は目的遺伝子をもつエントリーベクターと、大腸菌や動物細胞での発現をもたらすデスティネーションベクターとの間で組み換え反応を起こし、目的の遺伝子をもつ発現ベクターを迅速に作成できる。RF8 cDNA 産物より、以下のプライマー：
ECAT15-gw-s (5’-CACCATGGAGACTGCTGGAGACAAGAAG-3’)(配列番号：52),
ECAT15-1-gw-as (5’- TTATCCTTCGAGGCTCTTAGTCAA-3 ’)(配列番号：53),
ECAT15-2-gw-s (5’-CACCATGTCATACTTCGGCCTGGAGACT -3 ’)(配列番号：54),
ECAT15-2-gw-as (5’- TGTCTACGGCGGCATATTTGGGGG-3 ’)(配列番号：55),
を用いて PCR反応を行い、pENTR - D-TOPO にTOPO クローニング(Invitrogen. Co.) により導入し、pENTR-ECAT15 -1, 2を得た。これらと pCAG-Myc-gw-IPおよびpCAG-Flag-gw-IPベクターを用いて、GETEWAY Cloning Technology (Invitrogen Co.) によりpCAG -Myc-ECAT15-1、pCAG -Myc-ECAT15-2、 pCAG -Flag-ECAT15-1、pCAG -Flag-ECAT15-2を作成した。また抗体作製のために、大腸菌での発現ベクターであるpDEST17と、pENTR-ECAT15 -1, 2を反応させ、pDEST17-ECAT15-1, 2を作製した。【０２２８】
2)組み換えタンパク質精製及び抗体作成
pDEST17-ECAT15-1, 2 を組み換えタンパク質発現用大腸菌 BL21-AI に導入し、カルベニシリン含有 (100 μg/mL) LBプレートに撒いた。翌日、シングルコロニーを拾い5 mL のカルベニシリン含有(100 μg/mL) LB 液体培地において 37℃ において O.D. = 0.6 まで培養した。これに L-アラビノースを最終濃度が 0.2 % となるように加え、4 時間培養した。菌体を回収し、菌体重量1g に対して3 ml のBuffer A ( 0.01 M Tris - HCl pH8.0、6M Guanidine Hydrochloride、0.1 M NaH2PO4 /Na2HPO4)を加え、室温で1 時間攪拌した。これを10000G で30 分間遠心し、上清を回収した。これにBuffer A で洗浄した1 ml のNi-NTA agarose ( QIAGEN )を加え、1 時間以上室温で撹拌した。2 ml 容量のポリスチレン製カラム (PIERCE) にこの混合溶液を入れ、余分なBuffer を自然落下させた。4 ml のBuffer C( 0.01 M Tris- HCl pH6.3、8 MUrea、0.1 M NaH2PO4)で2 回洗浄後、0.5 ml のBuffer E( 0.01 M Tris-HCl pH4.5、8 M Urea、0.1 M NaH2PO4)で組換えタンパク質を溶出させた。溶出は4 回行い、回収した組み換えタンパク質をSlide-A-Lyzer Cassette(PIERCE) を用いて6 M Urea/PBS に一晩透析した。【０２２９】
その後、一部に等容量の2 ×sample buffer(100 mM Tris- HCl pH6.8、4% SDS、10% 2-ME,14% glycerol、0.0 2% BPB) を加え、100 ℃ で5 分間熱処理した。SDS- ゲル電気泳動およびCBB 染色により組み換えタンパク質の存在および量を確認した。 抗体作製用動物として、ニュージーランドホワイト種 ( 10週齢、雌) を用いた。初回免疫は、約200 μgの抗原タンパク質 (0.5 ml)と等容量のADJUVANT COMPLETE FREUND (DIFCO Co.) を混合しエマルジョンを形成したものを5 カ所程度背中に皮下注射した。 初回免疫から4 週間後、2回目の免疫からは約200 μgの抗原タンパク質と等容量のADJUVANT INCOMPLETE FREUND を混合しエマルジョンを形成したものを同様に5カ所程度皮下注射した。2 回目の免疫以降は2 週間に1 回、5 回目まで免疫注射を行った。2 回目の免疫注射から1 週間後、2 週間おきにラビットの耳の動脈より約20 ml の血液を採取した。採取した血液は37℃で1 時間温め、4 ℃ で一晩静置後、3000 rpm で10 分間遠心し、上清を回収した。これをさらに15000 rpm で10 分間遠心し、上清を回収した。この血清を用いて、作成した抗体の力価をwestern blotting によって確認した。 5 回目免疫の翌週に耳動脈より可能な限り採血した後、心窄刺による全採血を行った。これを上記と同様に処理し、抗ECAT15-1および15-2 血清とした。【０２３０】
3)一過性過剰発現細胞を用いた免疫沈降法
Myc-tagged ECAT15-2（以下Myc15-2）とFlag-tagged ECAT15 -1（以下Flag15-1）、Myc-tagged ECAT15-1(以下Myc15-1)とFlag15-1、またはMyc15 -2とFlag-tagged ECAT15 -2(以下Flag15-2)の組み合わせで、上記のpCAG -Myc-ECAT15-1、pCAG -Myc-ECAT15-2、 pCAG -Flag-ECAT15-1、pCAG -Flag-ECAT15-2を MG1.19 ES細胞へリポフェクタミン 2000でトランスフェクションした。まずDMEM 250 μl へ ベクターを 4μg 加える。また、別に DMEM 250 μL にリポフェクタミン2000 を 8μl 加える。 両者を混ぜ、20 分後静置。6 well プレート上の細胞をPBS で洗った後に上記混合液を加える。 4 時間後、培養液を2ml 加える。24h 後にタンパクを回収した。コントロールとして Flag15-1、2,pCAG-IP (Mock)を発現させたものも同時に用意した。Buffer に NP40 0.05 % になるよう加えソニケーションを行い、上清を回収した。ここに Normal mouse IgG Ac を5μL 加え、4℃ 30分ローテートした。上清にcMyc (9E10)Acを15μl 加え、4℃ 2時間ローテートした。12000 rpm 10 秒遠心し、buffer にNacl(final 150 mM)、NP40 (final 0.05 %)を加えたもので 4 回洗った。ビーズにSDS サンプルバッファーを加え 100℃ 5 分間処理し、ウエスタンブロットを行った。【０２３１】
4)内在性タンパク質での免疫沈降法
MG1.19  ES細胞よりタンパクを回収し、上記buffer で洗った。 Bufferに NP40を0.05 % になるよう加えソニケーションを行い、上清を回収した。ここにNormal mouse IgG Ac を 5μl加え 4℃で30 分ローテートした。上清に抗15-1, 2、ノーマル血清を 7.5 μl 加え、4℃ ２時間ローテートした。ProteinA-Sepharose を10μl 加え、1 時間ローテートした。12000 rpm 10秒遠心し、 buffer に Nacl (final 150 mM)、 NP40 (final 0.05 %)を加えたもので 4 回洗った。 ビーズに SDS サンプルバッファーを加え100℃ 5 分処理し、ウエスタンブロットにより解析した。【０２３２】
2.結果
Flag15-1及びMyc15-2を強制発現させ、抗Myc抗体により免疫沈降をおこなった結果、Flag15-1の共沈降が検出された（図５左）。さらに、Myc15 -1及びFlag15 -1を強制発現させ、Myc により免疫沈降をおこなった結果、Flag15-1 の共沈降が検出された（図５中央）。また、Myc15-2 及び Flag15-2 を強制発現させ、 Myc により免疫沈降をおこなった結果、 Flag15-2の共沈降が検出された（図５右）。以上の結果から、ECAT15-1同士、ECAT15-2同士、およびECAT15-1とECAT15-2が細胞内で結合していると考えられた。【０２３３】
前記の結果が内在性タンパク質ではどうかを調べるため、抗血清を用いて免疫沈降を行った。その結果、抗15-1 抗血清で免疫沈降したものでは 15-1, 15-2 が検出された。また抗 15-2 抗血清で免疫沈降したものでも同様に 15-1, 15 -2が検出できた(図６)。以上によりECAT15-1とECAT15-2が細胞内で結合していることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０２３４】
本発明により、ES細胞において特異的に発現しているECAT遺伝子5種（ECAT15-1遺伝子、ECAT15-2遺伝子、ECAT16遺伝子、Rnf17遺伝子、LOC380905遺伝子）を、新たに提供する。本発明のES細胞特異的発現遺伝子およびそれがコードするタンパク質は、ES細胞の検出、体細胞核初期化物質のスクリーニング、またはES細胞維持物質のスクリーニング等において有効に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【０２３５】
【図１】ＥＳ細胞と成体マウスの13種類の臓器におけるmECAT15-1及びmECAT15-2の発現をRT-PCTにより解析した結果を示す図である。陽性コントロールとしてmNAT1の発現も解析した。レーン1：未分化MG1.19 ES細胞、レーン2：分化MG1.19 ES細胞、レーン3：未分化RF8 ES細胞（RTマイナスコントロール）、レーン4：未分化RF8 ES細胞、レーン5：分化RF8 ES細胞、レーン6：脳、レーン7：心臓、レーン8：腎臓、レーン9：精巣、レーン10：脾臓、レーン11：筋肉、レーン12：肺、レーン13：胃、レーン14：卵巣、レーン15：胸腺、レーン16：肝臓、レーン17：皮膚、レーン18：腸。
【図２】ES細胞と成体マウスの13種類の臓器におけるECAT16（mRnf17、LOC380905）の発現をRT-PCTにより解析した結果を示す図である。陽性コントロールとしてmNAT1の発現も解析した。レーン1：未分化MG1.19 ES細胞、レーン2：分化MG1.19 ES細胞、レーン3：未分化RF8 ES細胞（RTマイナスコントロール）、レーン4：未分化RF8 ES細胞、レーン5：分化RF8 ES細胞、レーン6：脳、レーン7：心臓、レーン8：腎臓、レーン9：精巣、レーン10：脾臓、レーン11：筋肉、レーン12：肺、レーン13：胃、レーン14：卵巣、レーン15：胸腺、レーン16：肝臓、レーン17：皮膚、レーン18：腸、レーン１９：水（陰性コントロール）。
【図３】ECAT15遺伝子のターゲッティングベクターと、それを用いたECAT15遺伝子破壊の概念を示した図である。図中、上段は野生型ゲノム上のECAT15-1及びECAT15-2遺伝子の位置を、中断はBACターゲッティングベクターの概念図を、下段は相同組換え後のゲノムの概念図を、それぞれ示す。また図中、白抜き四角はネオマイシン耐性遺伝子を、また黒四角はハイグロマイシン耐性遺伝子を示す。
【図４】ECAT15遺伝子の相同組換えが行われたことをサザンブロットで確認した結果を示す図である。図中 +/+ は正常ES細胞の結果を、また+/-はECAT15遺伝子ヘテロ変異 ES細胞の結果を示す。
【図５】ECAT15 蛋白質の複合体形成を示した図である。図中、左段はECAT15-1とECAT15-2の結合を、中段はECAT15-1同士の結合を、右段はECAT15-2同士の結合を示す。また図中、IPは免疫沈降(Immunoprecipitation)を、WBはウエスタンブロット(Western blot)を示す。
【図６】ECAT15 蛋白質（内在性）の複合体形成を示した図である。図中 、左段は抗ECAT15-1抗体で免疫沈降を行った結果を、右段は抗ECAT15-2抗体で免疫沈降を行った結果を示す。また図中、Inputは免疫沈降前の細胞抽出液の結果を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０２３６】
配列番号：１９〜配列番号：３２に記載の塩基配列はプライマーである。
配列番号：３５〜配列番号：４８に記載の塩基配列はプライマーである。
配列番号：４９〜配列番号：５１に記載の塩基配列はプローブである。
配列番号：５２〜配列番号：５５に記載の塩基配列はプライマーである。
【図１】
2006035741.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
2006035741000001.app
【国際調査報告】
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