(57)【要約】  システイン、メチオニン、及びオルニチン並びにこれらのアミノ酸の骨格を含む誘導体から選ばれる１種又は２種以上を、セロトニン受容体、ヒスタミン受容体、及びムスカリン受容体等のＧＰＣＲの阻害剤とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
システイン、メチオニン、及びオルニチン並びにこれらのアミノ酸の骨格を含む誘導体から選ばれる１種又は２種以上からなるＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）阻害剤。
【請求項２】
ＧＰＣＲがセロトニン受容体、ヒスタミン受容体、及びムスカリン受容体から選ばれる受容体である請求項１に記載のＧＰＣＲ阻害剤。
【請求項３】
請求項１に記載のＧＰＣＲ阻害剤を有効成分として含有する医薬品であって、内科系疾患、神経内科系疾患、循環器科系疾患、外科系疾患、脳神経外科系疾患、胸部外科系疾患、整形外科系疾患、産婦人科系疾患、泌尿器科系疾患、小児科系疾患、眼科系疾患、耳鼻咽喉科系疾患、皮膚科系疾患、若しくは歯科系疾患の治療又は予防に用いられる医薬品。
【請求項４】
請求項１に記載のＧＰＣＲ阻害剤を含有し、ＧＰＣＲ阻害作用を有する旨の表示を付した食品。
【請求項５】
請求項１に記載のＧＰＣＲ阻害剤のＧＰＣＲ阻害活性を抑制する物質をスクリーニングする方法であって、
ＧＰＣＲ活性を測定するためのＧＰＣＲ活性測定系に、前記ＧＰＣＲ阻害剤、又は前記ＧＰＣＲ阻害剤及び被検物質を添加して、ＧＰＣＲ活性を測定するステップと、
前記測定系に前記ＧＰＣＲ阻害剤のみ添加したときのＧＰＣＲ活性と、前記ＧＰＣＲ阻害剤及び被検物質を添加したときのＧＰＣＲ活性を比較するステップと、
被検物質を添加したときに高いＧＰＣＲ活性を示す被検物質を選択するステップと、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＧＰＣＲ阻害剤に関するものである。ＧＰＣＲ阻害剤は、各種疾患に対する医薬品として有用である。
【背景技術】
【０００２】
Ｇタンパク質共役型受容体（以下、「ＧＰＣＲ」とも呼ぶ）は、７つの膜貫通ヘリックスドメインである共通の構造モチーフを典型的に共有し、約８００種の受容体スーパーファミリーを成す。ＧＰＣＲは広範囲の組織の細胞に発現し、各々のＧＰＣＲは、アミン、タンパク質、ペプチド、脂質、核酸など多種類にわたる特異的な生体内リガンドに応答し、グアニンヌクレオチド結合タンパク質を活性化することで細胞内にシグナルを増幅して伝達し、それによって様々な生理学的機能が調節されている。【０００３】
一方で、既に上市されている治療薬の約３分の１はＧＰＣＲの阻害剤もしくは促進剤である。例えば、イミトレックス(Imitrex、セロトニン受容体阻害、頭痛薬)、アレガ(Allega、ヒスタミン受容体阻害、アレルギー疾患薬)、ジプレキサ(Zyprexa、ドーパミン受容体阻害、精神疾患薬)、ミアカルシック(Miacalcic、カルシトニン受容体促進剤、骨粗鬆症薬)など、医薬品売り上げの上位に入るＧＰＣＲ阻害剤もしくは促進剤は数多い。【０００４】
ＧＰＣＲが関与することが知られている疾患は、内科系疾患、神経内科系疾患、循環器科系疾患、外科系疾患、脳神経外科系疾患、胸部外科系疾患、整形外科系疾患、産婦人科系疾患、泌尿器科系疾患、小児科系疾患、眼科系疾患、耳鼻咽喉科系疾患、皮膚科系疾患、歯科系疾患にわたる。例えば、ＧＰＣＲリガンドであるセロトニンは、学習および記憶、睡眠、体温調節、気分、運動活動、痛み、性的および攻撃的行動、食欲、神経変性性調節、ならびに生体リズムに関連するプロセスにおいて役割をもつと考えられている。セロトニン受容体阻害剤は、性的機能障害、鬱病、欲求障害、不安、精神分裂病、胃腸障害、頭痛、および心臓血管障害などの病態を改善することが期待される。【０００５】
ゲノム研究の発展と相まって、ＧＰＣＲの新しい調節機能が今後も更に明らかになっていくと考えられている。従って、ＧＰＣＲは、内科系疾患、神経内科系疾患、循環器科系疾患、外科系疾患、脳神経外科系疾患、胸部外科系疾患、整形外科系疾患、産婦人科系疾患、泌尿器科系疾患、小児科系疾患、眼科系疾患、耳鼻咽喉科系疾患、皮膚科系疾患、歯科系疾患における治療薬の開発のための重要な薬剤標的であり、安全かつ薬理学的に優れたＧＰＣＲ阻害剤の開発が大いに必要とされている。【０００６】
現在まで、多くのＧＰＣＲ阻害剤が開発されてきたが、いずれも、薬効、吸収性、あるいは安定性等の面で、十分満足できるものではない。これらのうち、特に重要であるのが生体への安全性であるが、従来のほとんどのＧＰＣＲ阻害剤は生体に存在しない化合物であるため、疾患の治療効果以外に予期しない毒性を併せ持つことが多く、投与量を厳密に制御しなければ重篤な副作用が起きる可能性があった。【０００７】
一方、生体に存在するアミノ酸などの成分は安全性が高いことが期待されるが、ＧＰＣＲ阻害剤として報告されているものはない。アミノ酸に近いものとして、アミノ酸の誘導体によるGPCR阻害剤として以下のような例が報告されている。フェニルグリシン誘導体が代謝型グルタミン酸受容体阻害剤として（非特許文献１）、フェニルアラニン誘導体がコレストキニン受容体阻害剤として（非特許文献２）機能する。
【非特許文献１】J. Neurosci., 1994, 14(5 Pt 2), 3370-7
【非特許文献２】Eur. J. Med. Chem., 2002, 37(5), 379-89
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、安全性が高く、経口投与可能で、汎用性のあるＧＰＣＲ阻害剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上述した課題を解決するため、生体に存在し、高い安全性があることが確認されている生体成分に着目し、それらの生体成分にＧＰＣＲ阻害活性があるかについて研究を行った。【００１０】
具体的には、ＧＰＣＲの代表例としてセロトニン受容体、ヒスタミン受容体、ムスカリン受容体を用い、アフリカツメガエル卵母細胞タンパク質発現系を用いた電気生理学的手法により、生体成分の阻害活性の有無を評価した結果、システイン、メチオニン、及びオルニチンに、セロトニン受容体、ヒスタミン受容体、及びムスカリン受容体に対する阻害活性が有ることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）システイン、メチオニン、及びオルニチン並びにこれらのアミノ酸の骨格を含む誘導体から選ばれる１種又は２種以上からなるＧＰＣＲ阻害剤。
（２）ＧＰＣＲがセロトニン受容体、ヒスタミン受容体、及びムスカリン受容体から選ばれる受容体である前記ＧＰＣＲ阻害剤。
（３）前記ＧＰＣＲ阻害剤を有効成分として含有する医薬品であって、内科系疾患、神経内科系疾患、循環器科系疾患、外科系疾患、脳神経外科系疾患、胸部外科系疾患、整形外科系疾患、産婦人科系疾患、泌尿器科系疾患、小児科系疾患、眼科系疾患、耳鼻咽喉科系疾患、皮膚科系疾患、若しくは歯科系疾患の治療又は予防に用いられる医薬。
（４）前記ＧＰＣＲ阻害剤を含有し、ＧＰＣＲ阻害作用を有する旨の表示を付した食品。
（５）前記ＧＰＣＲ阻害剤のＧＰＣＲ阻害活性を抑制する物質をスクリーニングする方法であって、
ＧＰＣＲ活性を測定するためのＧＰＣＲ活性測定系に、前記ＧＰＣＲ阻害剤、又は前記ＧＰＣＲ阻害剤及び被検物質を添加して、ＧＰＣＲ活性を測定するステップと、
前記測定系に前記ＧＰＣＲ阻害剤のみ添加したときのＧＰＣＲ活性と、前記ＧＰＣＲ阻害剤及び被検物質を添加したときのＧＰＣＲ活性を比較するステップと、
被検物質を添加したときに高いＧＰＣＲ活性を示す被検物質を選択するステップと、
を含む方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】セロトニン受容体に対するセロトニンの応答電流を示す図。
【図２】ヒスタミン受容体に対するヒスタミンの応答電流を示す図。
【図３】ムスカリン受容体に対するカルバミルコリンの応答電流を示す図。
【図４】セロトニン受容体に対するシステインによる阻害を示す図。システイン非存在下の応答電流に対する、システインが共存下の応答電流の比を縦軸に示した。
【図５】セロトニン受容体に対するメチオニンによる阻害を示す図。メチオニン非存在下の応答電流に対する、メチオニンが共存下の応答電流の比を縦軸に示した。
【図６】セロトニン受容体に対するオルニチンによる阻害を示す図。オルニチン非存在下の応答電流に対する、オルニチンが共存下の応答電流の比を縦軸に示した。
【図７】ヒスタミン受容体に対するシステインによる阻害を示す図。システイン非存在下の応答電流に対する、システインが共存下の応答電流の比を縦軸に示した。
【図８】ムスカリン受容体に対するシステインによる阻害を示す図。システイン非存在下の応答電流に対する、システインが共存下の応答電流の比を縦軸に示した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のＧＰＣＲ阻害剤は、システイン、メチオニン、及びオルニチン並びにこれらのアミノ酸の骨格を含む誘導体から選ばれる１種又は２種以上からなる。尚、本明細書において、アミノ酸及びそれらの誘導体はいずれもＬ−体である。
前記アミノ酸の骨格とは、それらのアミノ酸を構成する炭素原子、αアミノ基の窒素原子、並びにシステイン及びメチオニンについてはこれらの原子に加えて硫黄原子からなる骨格を意味する。前記アミノ酸の骨格を含む誘導体とは、前記骨格を維持しながら、１又は２以上の水素原子が他の置換基で置換された化合物をいう。このような誘導体として具体的には、シスチン、ホモシスチンチオラクトン、硫黄原子が、炭素数１から６の、分岐していてもよいアルキル基で置換されているシステイン、硫黄原子が、炭素数１から６の、分岐していてもよいアルキル基で置換されているホモシステインを含まれる。また、これらの誘導体に含まれる硫黄原子または窒素原子は任意に酸化されていてもよい。【００１４】
本発明において、前記アミノ酸又はその誘導体は単独で用いてもよく、また任意の２種又は３種以上を混合して用いることもできる。【００１５】
システイン、メチオニン、オルニチンは、該評価で行った複数のＧＰＣＲを阻害する作用を有しており、ＧＰＣＲ阻害剤として使用することができる。尚、「ＧＰＣＲを阻害する」とは、ＧＰＣＲにリガンドが結合し、グアニンヌクレオチド結合タンパク質を活性化してシグナルを伝達すること、その結果として引き続き生じる一連のシグナル伝達を介して起こりうる細胞の機能変化を阻害することを意味する。【００１６】
本発明のＧＰＣＲ阻害剤は、ＧＰＣＲが関与する各種疾患の治療又は予防に用いる医薬品の有効成分して使用することができる。本発明の医薬品には、医薬及び医薬部外品が含まれる。【００１７】
前記ＧＰＣＲが関与する疾患としては、内科系疾患、神経内科系疾患、循環器科系疾患、外科系疾患、脳神経外科系疾患、胸部外科系疾患、整形外科系疾患、産婦人科系疾患、泌尿器科系疾患、小児科系疾患、眼科系疾患、耳鼻咽喉科系疾患、皮膚科系疾患、及び歯科系疾患等が挙げられる。【００１８】
前記ＧＰＣＲ阻害剤を含有する本発明の医薬品の適用方法としては、特に制限されず、経口投与又は非経口投与を採用することができる。非経口投与としては、注射、又は経皮投与等が挙げられる。【００１９】
本発明の医薬品の剤型は、特に制限されず、投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬製剤の形態で投与することができる。このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤、凍結乾燥製剤などが挙げられる。これらの製剤は、製剤上の常套手段により調製することができる。【００２０】
上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングルコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水などが挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤などの慣用の添加剤を適宜添加することもできる。【００２１】
本発明の医薬品の有効投与量は、患者の年齢、体重、症状、患者の程度、投与経路、投与スケジュール、製剤形態、阻害活性の強さなどにより、適宜選択、決定されるが、例えば、経口投与の場合、システイン、メチオニン及びオルニチン並びにこれらの誘導体の合計量として、一般に１日当たり０．１ｇ／人〜１００ｇ／人程度、好ましくは、１日当たり２０ｇ／人程度である。これらの投与量を、１日に一度投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。アミノ酸であるシステイン、メチオニン、オルニチンは生体成分であることから、人体に対する毒性が低く、毎日、長期間に亘って服用しても安全性の点で優れていると考えられる。【００２２】
また、本発明のＧＰＣＲ阻害剤は、食品に含有させることもできる。本発明の食品は、ＧＰＣＲ阻害作用を有する旨の表示を付し、前記のＧＰＣＲが関与する各種疾患の治療又は予防に用いることができる。本発明の食品は、ＧＰＣＲ阻害剤を含有させること以外は、通常の食品原料を用いて、通常の方法により製造することができる。食品の形態は特に問わず、固形であっても液状であってもよい。また、食品には、特定保健用食品、栄養剤、サプリメント等も含まれる。【００２３】
また、本発明のＧＰＣＲ阻害剤は、ＧＰＣＲが関与する各種疾患の予防又は治療効果を有する食品の成分として使用することができる。食品としては、システイン、メチオニンもしくはオルニチン又はこれらの誘導体を安定に保持できるものであれば特に制限されない。本発明の食品は、通常の食品の製造に用いられる食品原料に、システイン、メチオニンもしくはオルニチン又はこれらの誘導体を配合すること以外は、通常の食品の製造法にしたがって製造することができる。食品の形態としては特に制限されず、液状、粉条、固体状等のいずれであってもよい。【００２４】
本発明のＧＰＣＲ阻害剤は、本発明のＧＰＣＲ阻害剤に対するアンタゴニスト、すなわち本発明のＧＰＣＲ阻害剤の持つＧＰＣＲ阻害活性を抑制する物質（以下、「ＧＰＣＲ阻害活性抑制剤」ともいう。）をスクリーニングすることができる。このようなＧＰＣＲ阻害活性抑制剤は、生体内に存在するシステイン、メチオニン、オルニチンによって阻害を受けるＧＰＣＲが疾患に関係する場合に、その疾患に対する治療薬として開発することが期待できる。【００２５】
スクリーニングに用いるＧＰＣＲは、セロトニン受容体、ヒスタミン受容体、ムスカリン受容体のいずれであってもよいが、システイン、メチオニン、オルニチンによって阻害を受けるものであれば、他のＧＰＣＲであってもよい。ＧＰＣＲは、天然物であっても組換え体であってもよい。また、ＧＰＣＲの由来は特に制限されず、哺乳動物であるヒト型やマウス型、下等動物である魚類、両生類、昆虫などの種由来のＧＰＣＲが挙げられるが、これらの中ではヒト型又はマウス型が好ましい。【００２６】
ＧＰＣＲ阻害活性抑制剤は、例えば以下のステップによりスクリーニングすることができるが、これらの工程に限定されるものではない。【００２７】
ｉ）ＧＰＣＲ活性を測定するためのＧＰＣＲ活性測定系に、本発明のＧＰＣＲ阻害剤、又は本発明のＧＰＣＲ阻害剤及び被検物質を添加して、ＧＰＣＲ活性を測定する。
ii）前記測定系に本発明のＧＰＣＲ阻害剤のみ添加したときのＧＰＣＲ活性と、本発明のＧＰＣＲ阻害剤及び被検物質を添加したときのＧＰＣＲ活性を比較する。
iii）被検物質を添加したときに高いＧＰＣＲ活性を示す被検物質を選択する。【００２８】
「ＧＰＣＲ活性」とは、ＧＰＣＲにリガンドが結合し、グアニンヌクレオチド結合タンパク質を活性化してシグナルを伝達すること、その結果として引き続き生じる一連のシグナル伝達を介して起こりうる細胞の機能変化に至る過程である。【００２９】
ＧＰＣＲ活性の測定は、例えば、ＧＰＣＲを発現する細胞を用いた測定系を用いて行われる。前記細胞は、ＧＰＣＲを内在的に発現している細胞であっても、外来のＧＰＣＲ遺伝子が導入された組換え細胞であってもよい。ＧＰＣＲの種類としては、実施例に挙げたセロトニン受容体、ヒスタミン受容体、ムスカリン受容体の中の１つを選んでもよいし、他のＧＰＣＲでもよい。また、これらの受容体のサブタイプも特に制限されない。【００３０】
ＧＰＣＲ活性測定系は、前記ＧＰＣＲを発現する細胞に各々のＧＰＣＲに特異的な細胞外リガンドを加えたときに、リガンドとＧＰＣＲとの結合を検出することができるか、又は、リガンドとＧＰＣＲとの結合に応答して細胞内に検出可能なシグナルを伝達するものであれば、特に制限なく使用することができる。【００３１】
ＧＰＣＲ活性の測定方法としては、実施例に記載されたアフリカツメガエル卵母細胞を用いた電気生理学的方法の他にも、細胞内シグナル伝達を利用した方法（Brandish, P.E.,et. al (2003).Anal. Biochem., 313, 311-318.）、又はリガンドとＧＰＣＲの結合を測定する方法などを用いることができる（Roth BL et.al(1998) Adv Pharmacol 42:482-485.）。このとき、ＧＰＣＲの種類に応じて、種々のＧタンパク質、もしくはＣＦＴＲ（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator）又はＧＩＲＫ（G protein-activated inwardly rectifying K+ channel）のような補助因子を共発現させたり、GqタイプＧタンパク質とGiタイプもしくはGsタイプＧタンパク質とのキメラタンパク質を利用したりすることによって、測定をより効率的にすることが可能である。【００３２】
また、ＧＰＣＲ活性化および細胞内シグナル伝達を利用する場合には、測定方法として、ＧＰＣＲ活性化に伴う細胞代謝の変化を利用したり、細胞内伝達物質の局在又は量の変化を利用して測定することもできるが、これら以外にもＧＰＣＲ評価方法ならどのようなものでも利用可能である。測定の形態は、方法に適したものが選択され、電気生理学的測定や細胞用マルチウェルプレートを用いた同時多検体測定が一例としてあげられる。【００３３】
次に、ＧＰＣＲ活性を測定するためのＧＰＣＲ活性測定系に、ＧＰＣＲ阻害剤、又はＧＰＣＲ阻害剤及び被検物質を添加して、ＧＰＣＲ活性を測定する。その際、ＧＰＣＲ活性測定系にＧＰＣＲに対応するリガンドを添加する。ＧＰＣＲ活性測定系に添加するリガンドの量は、予めＧＰＣＲ阻害剤を添加せずにＧＰＣＲ活性を測定することにより、作用濃度を調べておき、その濃度に応じて決定することができる。また、ＧＰＣＲ阻害剤も、作用濃度を予め調べておき、ＧＰＣＲ阻害作用を示す限り低濃度でＧＰＣＲ活性測定系に添加することが好ましい。【００３４】
ＧＰＣＲ阻害剤は、システイン、メチオニン、オルニチンのいずれであってもよく、これらの任意の混合物であってもよい。また、被検物質の濃度は、ＧＰＣＲ活性測定系自体に影響を与えない限り、任意であってよい。さらに、被検物質は単一の化合物であってもよく、複数の化合物を含む混合物又は組成物であってもよい。尚、リガンド、ＧＰＣＲ阻害剤及び被検物質のＧＰＣＲ活性測定系への添加は、通常同時に行われるが、ＧＰＣＲ阻害剤のＧＰＣＲ活性抑制活性を検出し得る限り、同時でなくてもよい。【００３５】
続いて、ＧＰＣＲ測定系にＧＰＣＲ阻害剤のみ添加したときのＧＰＣＲ活性と、ＧＰＣＲ阻害剤及び被検物質を添加したときのＧＰＣＲ活性を比較する。そして、被検物質を添加したときに高いＧＰＣＲ活性を示す被検物質を選択する。【００３６】
上記の操作により、又は上記の操作を繰返すことによって、本発明のＧＰＣＲ阻害剤の持つＧＰＣＲ阻害活性を抑制する物質又は複数の化合物を含む混合物又は組成物等をスクリーニングすることができる。【００３７】
上記のようにして選ばれたＧＰＣＲ阻害活性抑制剤は、該ＧＰＣＲの新たな調節物質として、該ＧＰＣＲが関連する各種疾患の治療薬又はその候補として期待される。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。【００３９】
〔実施例１〕ＧＰＣＲ遺伝子の調製
セロトニン受容体サブタイプ２Ａ遺伝子、ヒスタミン受容体サブタイプ１遺伝子、ムスカリン受容体サブタイプ３遺伝子は、以下に示すＰＣＲ法で取得した。ＮＣＢＩに登録されている各受容体のＤＮＡ配列（各々順に  GenBank accession NM_000621、NM_000861、NM_000740）を元に、ＰＣＲ法に用いるオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。セロトニン受容体遺伝子には配列番号１及び２に記載のプライマーを、ムスカリン受容体遺伝子には配列番号３及び４に記載のプライマーを、ヒスタミン受容体遺伝子には配列番号５及び６に記載のプライマーを使用した。【００４０】
ヒト脳由来のｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を材料として、Ｐｆｕ  ｕｌｔｒａ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用い、以下の条件でＰＣＲを実施した。９４℃で３分の後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分を３５回繰り返した後、７２℃で７分の反応を行った。増幅産物の有無及び大きさは、アガロース電気泳動法により確認した。【００４１】
プラスミドベクターpBR322を制限酵素EcoRV(Takara社製)によって切断した。その切断部位にPCRによって増幅された各遺伝子断片をＬｉｇａtｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて連結した。この反応溶液でエシェリヒア・コリDH5α株を形質転換し、ＰＣＲ増幅産物がクローニングされたプラスミドを保持する形質転換体を選抜した。各々のＰＣＲ増幅産物がセロトニン受容体遺伝子、ヒスタミン受容体遺伝子、又はムスカリン受容体遺伝子であることを、ＤＮＡ塩基配列解析によって確認した。これらの組換えプラスミドを鋳型とし、ｃＲＮＡ作製キット（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて各受容体遺伝子のｃＲＮＡを作製した。【００４２】
〔実施例２〕各種試料の調製
アミノ酸試料として、各々特級グレードのアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、オルニチン、タウリンの２２種類を用いた。各アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸、トリプトファンは25mM、その他は100mMに以下の組成の緩衝液に溶解させた。ＮａＣｌ  ９６ｍＭ，ＫＣｌ  ２ｍＭ，ＭｇＣｌ２  １ｍＭ，ＣａＣｌ２  １．８ｍＭ，Ｈｅｐｅｓ  ５ｍＭ，ｐＨ＝７．２。尚、グルタミン、システインは用事調製し、他の試薬は調製後、−２０℃に保存した。ｐＨは使用前に７．２となるよう調製した。【００４３】
アフリカツメガエル卵母細胞の調製用の溶液、及びリガンド溶液にも、前記緩衝液を使用した。また、卵母細胞の培養用の培地には、同緩衝液に２ｍＭピルビン酸と10U/mlペニシリンと10μg/mlストレプトマイシンを加えたものを使用した。【００４４】
〔実施例３〕アフリカツメガエル卵母細胞を用いた電気生理学的測定によるＧＰＣＲ評価
ＧＰＣＲ活性及びＧＰＣＲ阻害の測定方法は、アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いた。任意のＧＰＣＲを発現させたアフリカツメガエル卵母細胞に、各リガンドを添加すると、細胞内のＣａイオンが増加する。次にＣａ濃度イオン依存性Ｃｌチャネルが開き、イオン電流として細胞内電流値が変化する。この細胞内電流値の変化を測定することで、ＧＰＣＲ活性及びＧＰＣＲ阻害の有無を知り得ることが出来る。【００４５】
アフリカツメガエル腹部を切開し、卵塊を取り出した後、１％コラゲナーゼ溶液により２０℃で２時間処理して卵母細胞を分散させることにより、卵母細胞を得た。１個あたりの卵母細胞に、マイクロガラスキャピラリーを用いて５０ｎｌの受容体ｃＲＮＡ溶液（１μｇ／μｌ）又は５０ｎｌの滅菌水を導入した。卵母細胞は、直径5cmのシャーレに１０ｍｌの前記培地で１８℃にて２〜３日培養した。【００４６】
電気生理学的測定は、増幅器Ｇｅｎｅｃｌａｍｐ５００（Ａｘｏｎ社製）および記録用ソフトAxoScope9.0（Ａｘｏｎ社製）を用いて行った。培養後、卵母細胞を２電極膜電位固定法により−７０ｍＶに膜電位固定し、Ｃａ濃度イオン依存性Ｃｌイオンを介した細胞内電流を測定した。細胞内電流の最大値を応答電流値とした。【００４７】
膜電位固定した各々の卵母細胞に対し、終濃度が下記の括弧内に示されたリガンド溶液を添加した。各リガンドは、ナカライテスク社から入手した。セロトニン受容体ｃＲＮＡを導入した卵母細胞にはセロトニン（１０ｎＭ）、ヒスタミン受容体を導入した卵母細胞にはヒスタミン（１０ｎＭ）、ムスカリン受容体を導入した卵母細胞にはカルバミルコリン（３０ｎＭ）を添加した。【００４８】
リガンドを添加した後、各々の細胞のＣａ濃度イオン依存性Ｃｌイオン電気応答を測定した。リガンド濃度と電流応答の関係を図１〜３に示す。この結果より、卵母細胞に導入したセロトニン受容体、ヒスタミン受容体、ムスカリン受容体のｃＲＮＡが機能的に発現していること、ＧＰＣＲ評価法が完成されたことが確認された。【００４９】
〔実施例４〕セロトニン受容体に対するアミノ酸の阻害活性の評価
セロトニン受容体に対する種々のアミノ酸の阻害活性の有無を以下のように評価した。  実施例３に記載した方法を用いて、セロトニン受容体遺伝子を導入した卵母細胞を調製し、２電極膜電位固定法により−７０ｍＶに膜電位固定した。膜電位固定された卵母細胞にアミノ酸を１種類ずつ添加した後、セロトニン（１０ｎＭ）を添加し、Ｃａイオン濃度依存性Ｃｌ電流応答を測定した。試験したアミノ酸及びその最終濃度は、以下のとおりである。アラニン（１０ｍＭ）、アルギニン（１０ｍＭ）、アスパラギン（１０ｍＭ）、アスパラギン酸（１０ｍＭ）、システイン（１０ｍＭ）、グルタミン（１０ｍＭ）、グルタミン酸（１０ｍＭ）、グリシン（１０ｍＭ）、ヒスチジン（１０ｍＭ）、イソロイシン（１０ｍＭ）、ロイシン（１０ｍＭ）、リジン（１０ｍＭ）、メチオニン（１０ｍＭ）、フェニルアラニン（１０ｍＭ）、プロリン（１０ｍＭ）、セリン（１０ｍＭ）、トレオニン（１０ｍＭ）、トリプトファン（１０ｍＭ）、チロシン（１０ｍＭ）、バリン（１０ｍＭ）、オルニチン（１０ｍＭ）、タウリン（１０ｍＭ）。【００５０】
阻害活性の有無は、アミノ酸溶液存在下におけるリガンド溶液の応答電流値をリガンド溶液単独添加時の応答電流値で割った比で表した。すなわちアミノ酸非存在下の応答電流比は１となり、アミノ酸に阻害活性が見られる場合は応答電流比が１より小さい値を示す。セロトニンに対する電流応答比が、０．６以下に減少させる場合を阻害活性有りとして判定した。結果、システイン、メチオニン、オルニチンを添加した場合にのみ、セロトニン受容体の阻害活性が見られた。システイン、メチオニン、オルニチン以外のアミノ酸に関しては、阻害活性は認められなかった(表１)。
【表１】
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【００５１】
〔実施例６〕３種類のアミノ酸のセロトニン受容体阻害活性の濃度依存性評価
阻害活性の認められた３種類のアミノ酸について、セロトニン受容体に対する阻害活性の濃度依存性評価を以下の方法で行った。実施例３に記載した方法を用いて、セロトニン受容体遺伝子を導入した卵母細胞を調製し、２電極膜電位固定法により−７０ｍＶに膜電位固定した。膜電位固定された卵母細胞に阻害活性を評価する３種類のアミノ酸を１種類ずつ添加した後、セロトニン（１０ｎＭ）を添加し、Ｃａイオン濃度依存性Ｃｌ電流応答を測定した。各アミノ酸濃度は以下の３点で行った。システイン（１ｍＭ、３ｍＭ、５ｍＭ）、メチオニン（１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ）、オルニチン（１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ）。結果を図４〜６に示す。【００５２】
〔実施例７〕ＧＰＣＲに対するシステインの阻害活性の濃度依存性評価
セロトニン受容体以外のＧＰＣＲとして、ヒスタミン受容体、ムスカリン受容体に対するシステインの阻害活性の評価を、以下の方法で行った。実施例３に記載した方法を用いて、ヒスタミン受容体遺伝子又はムスカリン受容体遺伝子を導入した卵母細胞を調製し、２電極膜電位固定法により−７０ｍＶに膜電位固定した。膜電位固定した卵母細胞にシステイン（１ｍＭ、３ｍＭ、５ｍＭ）を添加した後、ヒスタミン（１０ｎＭ）又はカルバミルコリン（３０ｎＭ）を添加し、Ｃａイオン濃度依存性Ｃｌ電流応答を測定した。結果を図７〜８に示す。その結果、システインを添加した場合に、セロトニン受容体と同様に、ヒスタミン受容体とムスカリン受容体に対する濃度依存的な阻害活性が認められた。
【産業上の利用の可能性】
【００５３】
本発明により、安全性が高く、かつ汎用性のあるＧＰＣＲ阻害剤が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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