(57)【要約】  ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、システイン、アラニンまたはそれらの混合物から選択されるアミノ酸を含有するアディポネクチン誘導剤又はアディポネクチン分泌促進剤、及び該アディポネクチン誘導剤又はアディポネクチン分泌促進剤を含有する低アディポネクチン血症治療薬、高脂血症治療薬、高血圧治療薬、血管障害治療薬又は抗炎症薬などを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、システイン、アラニンまたはそれらの混合物から選択されるアミノ酸を含有することを特徴とするアディポネクチン誘導剤又はアディポネクチン分泌促進剤。
【請求項２】
アミノ酸が、ロイシン、イソロイシン、バリンまたはそれらの混合物から選択される請求項1記載のアディポネクチン誘導剤又はアディポネクチン分泌促進剤。
【請求項３】
アミノ酸が、ロイシン、イソロイシン及びバリンの混合物である請求項２記載のアディポネクチン誘導剤又はアディポネクチン分泌促進剤。
【請求項４】
アミノ酸として、ロイシン、イソロイシン、バリンの混合物のみを含有する請求項３記載のアディポネクチン誘導剤又はアディポネクチン分泌促進剤。
【請求項５】
アミノ酸として、ロイシンのみを含有する請求項１記載のアディポネクチン誘導剤又はアディポネクチン分泌促進剤。
【請求項６】
アミノ酸として、イソロイシンのみを含有する請求項１記載のアディポネクチン誘導剤又はアディポネクチン分泌促進剤。
【請求項７】
アミノ酸として、バリンのみを含有する請求項１記載のアディポネクチン誘導剤又はアディポネクチン分泌促進剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載のアディポネクチン誘導剤又はアディポネクチン分泌促進剤を含有することを特徴とする低アディポネクチン血症治療薬、高脂血症治療薬、高血圧治療薬、血管障害治療薬又は抗炎症薬。
【請求項９】
請求項３又は４記載のアディポネクチン誘導剤又はアディポネクチン分泌促進剤を含有することを特徴とする肝炎治療薬、脂肪肝治療薬、肝線維症治療薬又は肥満症治療薬。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項記載のアディポネクチン誘導剤又はアディポネクチン分泌促進剤を含有し、低アディポネクチン血症予防・治療効果、高脂血症予防・治療効果、高血圧予防・治療効果又は血管障害予防・治療効果を有する旨を表示することを特徴とする飲食品。
【請求項１１】
請求項３又は４記載のアディポネクチン誘導剤又はアディポネクチン分泌促進剤を含有し、脂肪肝予防・治療効果、肝線維症予防・治療効果又は肥満症予防・治療効果を有する旨を表示することを特徴とする飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアディポネクチン誘導剤又は分泌促進剤、アディポネクチンの分泌促進作用或いは誘導作用を利用した各種疾患の予防・治療剤に関する。【０００２】
（発明の背景）
成人病或いは生活習慣病と広く称される疾患群のうち、糖・脂質代謝異常とそれらに関連した耐糖能異常・糖尿病・高脂血症と高血圧、さらに腹部肥満症は疾患のクラスターを形成し、メタボリックシンドロームと呼ばれる症候群として認識されている。メタボリックシンドローム患者は多くの症状でクオリティオブライフが低下するだけでなく、健常者に比べ動脈硬化など致命的な血管障害発症・致死リスクが高い。耐糖能異常、糖尿病、高脂血症、高血圧などの疾患或いは症状はメタボリックシンドロームを全体とすると、その氷山の一角であり、個々の治療も重要であるが、メタボリックシンドロームの発症メカニズムに深く関係する異常の予防・治療により症候群全体を予防・治療することが致死リスクを最も軽減する有効な方法であると考えられる。それにも関わらず、これまでにそのような治療薬・治療方法は見出されていない。
近年の多施設における研究の成果から、メタボリックシンドロームの最も重要な原因として、脂肪組織で発現・産生され血中に分泌されるアディポネクチンに関する異常が注目されている。アディポネクチンは脂肪細胞で特異的に発現し、補体に類似した構造を有する分泌タンパク質として発見された（1, 2）。メタボリックシンドローム患者は低アディポネクチン血症であり、例えば低アディポネクチン血症は２型糖尿病の他因子とは独立したリスクファクターであるとされている（3）。メタボリックシンドロームや糖尿病性網膜症、妊娠糖尿病、多嚢胞性卵巣症などの糖代謝異常と関連する疾患以外にも、虚血性心疾患、心筋梗塞、狭心症、血管狭窄症、肥大性心筋症等を含む心血管疾患、冠動脈性心疾患、冠動脈疾患、脳血管障害、末梢動脈障害などの血管性の疾患、肝線維症、肝硬変、肝炎、非アルコール性・非ウイルス性脂肪肝炎及び脂肪肝（NASH及びNAFLD）、アルコール性脂肪肝及びアルコール性肝障害などの肝疾患、子宮内膜腫、子宮平滑筋腫、肺がんなどのがん・悪性新生物、クッシングシンドローム、HIV関連リポジストロフィー症候群、甲状腺機能障害、脂肪組織萎縮症などの内分泌・代謝性疾患、さらには神経性食欲不振、神経性大食症、腎症などでも低アディポネクチン血症や組織中アディポネクチンmRNA発現レベルの低下が報告され、基礎実験レベルも含めてアディポネクチン不足による発症の確認とアディポネクチンを補充することによる治療の可能性が報告されている。【０００３】
特に基礎実験レベルでは組み替えアディポネクチンの投与によってモデル動物における、血中脂質低下作用、血糖降下作用、体重増加予防作用などが確認され、メタボリックシンドロームの治療薬としての可能性が報告されている（4, 5）だけでなく、モノサイトの泡沫化や接着の抑制効果・平滑筋細胞の増殖抑制効果・血管内膜肥厚の抑制など血管への直接的な作用による抗動脈硬化作用が報告されている（6）。さらに化学物質によって惹起された疾患モデルにおける肝線維症の抑制、肝線維化に大きな役割を果たす星細胞の活性化抑制、エンドトキシンにより惹起された肝炎の抑制、などの肝疾患治療剤としての可能性も報告されている（7, 8）。またアディポネクチンには抗炎症作用も報告され、さらにアディポネクチンは運動時に活性化され、運動の効能をもたらす分子メカニズムに重要とされる5'AMP-activated kinase活性を組織中に誘導することから、運動効果を模倣する薬剤としても注目されている。このように、アディポネクチンは多くの致命的疾患の予防・治療薬として注目されているが、アディポネクチンそのものの患者への投与法としては、インスリンなどの生理活性物質と同様に注射が予想され、苦痛や手間がかかる治療法と考えられるため、脂肪細胞に直接働きかけてアディポネクチンの発現を誘導し、血中への分泌量を増やすことができるような治療剤が望まれているのが現状である。【０００４】
【非特許文献１】A novel serum protein similar to C1q, produced exclusively in adipocytes. J Biol Chem 1995 Nov 10;270(45):26746-9
【非特許文献２】AdipoQ is a novel adipose-specific gene dysregulated in obesity. J Biol Chem 1996 May 3;271(18):10697-703
【非特許文献３】Decreased serum levels of adiponectin are a risk factor for the progression to type 2 diabetes in the Japanese Population: the Funagata study. Diabetes Care 2003 Jul;26(7):2015-20.
【非特許文献４】The fat-derived hormone adiponectin reverses insulin resistance associated with both lipoatrophy and obesity. Nat Med. 2001 Aug;7(8):941-6.
【非特許文献５】The adipocyte-secreted protein Acrp30 enhances hepatic insulin action. Nat Med. 2001 Aug;7(8):947-53.
【非特許文献６】Adiponectin reduces atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. Circulation. 2002 Nov 26;106(22):2767-70.
【非特許文献７】Enhanced carbon tetrachloride-induced liver fibrosis in mice lacking adiponectin.Gastroenterology. 2003 Dec;125(6):1796-807.
【非特許文献８】Adiponectin protects LPS-induced liver injury through modulation of TNF-alpha in KK-Ay obese mice. Hepatology. 2004 Jul;40(1):177-84.
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、アディポネクチンの組織中発現の誘導作用、血中への分泌促進作用を有するアディポネクチン誘導剤又はアディポネクチン分泌促進剤を提供することを目的とする。
本発明は、又、低アディポネクチン血症治療薬、高脂血症治療薬、高血圧治療薬、血管障害治療薬又は抗炎症薬を提供することを目的とする。
本発明は、又、肝炎治療薬、脂肪肝治療薬、肝線維症治療薬又は肥満症治療薬を提供することを目的とする。
本発明は、又、アディポネクチン誘導剤又はアディポネクチン分泌促進剤を含有する飲食品を提供することを目的とする。
【０００６】
本発明者らは、脂肪の性質を良く保持している細胞でアディポネクチンの分泌を増大させ、培養液中のアディポネクチン濃度を増やす物質を探索したところ、アミノ酸であるロイシン、イソロイシン、バリン、システイン、メチオニン、アラニンがアディポネクチンの分泌を増大させる或いは分泌に必要であることを見出した。特にロイシン、イソロイシン、バリンについてはこれらの共存によりアディポネクチンの分泌が相乗的に増大した。これらの結果は、低アディポネクチン血症或いはアディポネクチンmRNAの発現が低い患者において、これらのアミノ酸が非常に有用であることを示しており、これらのアミノ酸を用いると上記課題を解決できるとの知見に基づいて本発明はなされたのである。
すなわち、本発明は、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、システイン、アラニンまたはそれらの混合物から選択されるアミノ酸を含有することを特徴とするアディポネクチン誘導剤又はアディポネクチン分泌促進剤を提供する。
本発明は、又、上記アディポネクチン誘導剤又はアディポネクチン分泌促進剤を含有することを特徴とする低アディポネクチン血症治療薬、高脂血症治療薬、高血圧治療薬、血管障害治療薬、抗炎症薬、肝炎治療薬、脂肪肝治療薬、肝線維症治療薬又は肥満症治療薬を提供する。
本発明は、又、上記アディポネクチン誘導剤又はアディポネクチン分泌促進剤を含有することを特徴とする低アディポネクチン血症予防・治療効果、高脂血症予防・治療効果、高血圧予防・治療効果、血管障害予防・治療効果、脂肪肝予防・治療効果、肝線維症予防・治療効果又は肥満症予防・治療効果を有する旨を表示することを特徴とする飲食品を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明のアディポネクチン誘導剤又はアディポネクチン分泌促進剤は、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、システイン、アラニンまたはそれらの混合物から選択されるアミノ酸を含有することを特徴とする。これらのうちロイシン、イソロイシン、バリンまたはそれらの混合物が好ましく、ロイシンが特に好ましい。ここで、これらのアミノ酸は、L-体、D-体、及びDL-体何れも使用可能であるが、L-体を用いるのが好ましい。またこれのアミノ酸は、１種又は２種以上の混合物として用いることができる。混合物としては、ロイシン、イソロイシン及びバリンの混合物であるのが好ましく、特に、ロイシン、イソロイシン、バリンの重量比が、０.５〜２.５：１：０.５〜１.５であるのが好ましく、例えば、０.７〜１.３：１：０.７〜１.３、０.９〜１.１：１：０.９〜１.１、１．９〜２．２：１：１．１〜１．３である混合物が好ましい。
アミノ酸が塩の形態を成し得る場合、その塩は医薬的に許容しうるものであればよく、例えば、アンモニウム塩、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、塩酸、硫酸、リン酸などの無機酸との塩、シュウ酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、コハク酸、グルタミン酸等の有機カルボン酸との塩、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸等の有機スルホン酸との塩などを挙げることができる。塩を形成する方法としては、アミノ酸と必要な酸または塩基とを適当な量比で溶媒、分散剤中で混合することや、他の塩の形より陽イオン交換または陰イオン交換を行うことによっても得られる。
上記アミノ酸にはその溶媒和物、例えば水和物、アルコール付加物等も含まれる。【０００８】
本発明では、さらに、上記アディポネクチン誘導剤又はアディポネクチン分泌促進剤を含有することを特徴とする低アディポネクチン血症治療薬、高脂血症治療薬、高血圧治療薬、血管障害治療薬又は抗炎症薬が提供される。
又、本発明では、ロイシン、イソロイシン及びバリンの混合物を含むアディポネクチン誘導剤又はアディポネクチン分泌促進剤を含有することを特徴とする肝炎治療薬、脂肪肝治療薬又は肥満症治療薬が提供される。
本発明では上記薬剤において、アミノ酸として、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、システイン、アラニンまたはそれらの混合物から選択されるアミノ酸のみを含有するのが好ましい。
本発明においては、上記予防・治療薬においては、該予防・治療に用いられている既存治療薬との併用が可能であり、併用の相手として例えば、高脂血症においては、例えば、ヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムA還元酵素阻害剤（例えばプラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチンなど）、フィブラート系薬剤（例えばクロフィブラート、ベザフィブラート、シンフィブラートなど）、リパーゼ阻害剤（オルリスタットなど）などの脂質吸収阻害剤、胆汁酸排泄促進薬などが挙げられる。高血圧、血管障害、炎症などにおいても、それぞれの疾患の予防・治療において使用される疾患治療薬との併用が可能である。併用時の割合については、多くの因子、例えば所望の投与量および使用される医薬的に許容される担体に依存しており、広範囲に変わり得るが、両者を合わせて単一製剤とする場合、別個の製剤とする場合のいずれにおいても、本発明のアミノ酸含量（重量）１に対して、血糖降下剤は0.00001〜1程度であることが好ましい。【０００９】
本発明の予防・治療薬の１製剤あたりでは、好ましくはアミノ酸を1〜100000 mg程度、より好ましくは10〜30000 mg程度を含有することができる。アミノ酸の混合物の場合、各アミノ酸は0.5〜50000 mg程度、より好ましくは5〜15000 mg程度を含有することができる。
本発明の予防・治療剤の投与形態は特に制限されず、静脈内、動脈内、皮下および筋肉内投与、輸液による投与により、安全かつ必要な量を、一気にまたは点滴等により投与できる。また、本発明の予防・治療剤の投与形態は非経口および経口投与のいずれも可能であるが、患者への苦痛等を考慮すると、経口投与が望ましい。投与量は投与する患者の症状、年齢、投与方法によって異なるが、通常0.1〜30g／kg／日である（通常の食生活から摂取される一日あたりの各アミノ酸の量を本発明における有効成分の一日あたりの投与量から控除して算定する必要はない。）。【００１０】
本発明の予防・治療剤は種々の剤型、例えば経口剤であれば、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、トローチ剤、液剤、細粒剤、その他、注射剤、クリーム剤、座剤等の製剤とすることができる。これらの製剤化は、それ自体公知の方法によって行い得る。本発明の有効成分、製剤のいずれにおいても医薬的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性向上剤、その他製剤として必要な物質を含有してよく、これらを適宜組み合わせて処方することにより製剤を製造することができる。製剤用担体としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、Ｄ-マンニトール、澱粉、結晶セルロース、炭酸カルシウム、カオリン、デンプン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、エタノール、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム塩、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アセチルセルロース、白糖、酸化チタン、安息香酸、パラオキシ安息香酸エステル、デヒドロ酢酸ナトリウム、アラビアゴム、トラガント、メチルセルロース、卵黄、界面活性剤、白糖、単シロップ、クエン酸、蒸留水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、ブドウ糖、塩化ナトリウム、フェノール、チメロサール、パラオキシ安息香酸エステル、亜硫酸水素ナトリウム等があり、製剤の形に応じて、本発明の化合物と混合して使用される。【００１１】
本発明の予防・治療薬は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒト等）に対して、低アディポネクチン血症やアディポネクチンの発現低下に起因する諸症状の予防・治療剤としても有用である。また、本発明には、使用すべきであることを記載した、該併用剤に関する記載物を含む、商業パッケージが含まれる。例えば、上記アディポネクチン誘導剤又はアディポネクチン分泌促進剤を含有し、低アディポネクチン血症予防・治療効果、高脂血症予防・治療効果、高血圧予防・治療効果又は血管障害予防・治療効果を有する旨を表示することを特徴とする飲食品があげられる。又、ロイシン、イソロイシン及びバリンの混合物を含むアディポネクチン誘導剤又はアディポネクチン分泌促進剤を含有し、脂肪肝予防・治療効果、肝線維症予防・治療効果又は肥満症予防・治療効果を有する旨を表示することを特徴とする飲食品があげられる。【００１２】
本発明のアディポネクチンの分泌促進又は誘導作用を有するアミノ酸によって、多くの致命的疾患の予防・治療薬として注目されるアディポネクチンを患者体内で増やすという、従来の治療剤にはない効果が期待され、本発明は低アディポネクチン血症或いは脂肪組織での低アディポネクチン発現を原因・指標として判断される疾患の予防または治療に極めて有用である。
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００１３】
（実施例１）
3T3-L1細胞を1.5x105 cells/mlになるように10%牛胎児血清を含むD-MEM培地に懸濁して播種し、37℃のCO2インキュベータで72時間培養した後、培地を吸引除去し、10ug/mlのインスリン、1uMのデキサメタゾン、0.5mMのIBMX（3-isobutyl-1-methlxanthin）、10%牛胎児血清を含むD-MEM培地に交換し、さらに37℃のCO2インキュベータで48時間培養した。さらに培地を除去した後、アミノ酸濃度を変化させた培地に10%の透析ウシ胎児血清（Sigma社、F-0392）を加えた培地に換えて72時間、37℃のCO2インキュベータで培養した。
D-MEM培地はアミノ酸としてグリシン（Gly）: 30mg/l、アラニン（Ala）: 35.6mg/l、セリン（Ser）: 42mg/l、スレオニン（Thr）: 95mg/l、システイン（Cys）・2HCl: 63mg/l、メチオニン（Met）: 30mg/l、グルタミン（Gln）: 1168mg/l、アスパラギン（Asn）: 52.8mg/l、グルタミン酸（Glu）: 58.8mg/l、アスパラギン酸（Asp）: 106.4mg/l、バリン（Val）: 94mg/l、ロイシン（Leu）: 105mg/l、イソロイシン（Ile）: 105mg/l、フェニルアラニン（Phe）: 66mg/l、Tyr（チロシン）・2Na・2H2O: 208mg/l、トリプトファン（Trp）: 16mg/l、リジン（Lys）・HCl: 146mg/l、アルギニン（Arg）: 84mg/l、ヒスチジン（His）・HCl・H2O: 42mg/l、プロリン（Pro）: 46mg/lを含んでいる。ビタミン、塩はD-MEM培地と同じ組成で、ある１種のアミノ酸、例えばメチオニン（Met）を除いた培地をΔMet（Metのみを除いたもの）等と標記、全アミノ酸を含むものをFull培地、全アミノ酸を除去したものをZero培地と標記した。
抗マウスアディポネクチン抗体（R&D Systems社、AF1119）のEu（ユーロピウム）キレート標識は、200μgの抗体に対して100ugのEuキレート標識試薬であるLANCE Eu-W1024-ITC chelate（Perkin Elmer社、AD0013）を用い、マニュアルに準じた方法を用いて行った。また抗マウスアディポネクチン抗体（R&D Systems社、AF1119）のビオチン標識は、100μgの抗体に対して26.8ugのビオチン標識試薬であるNHS-Biotin（Boehringer Mannheim社、1418165、Biotin Labeling Kit）を用い、マニュアルに準じた方法を用いて行った。【００１４】
細胞培養上清中のアディポネクチン量の測定は下記の通り行った。0.1%ウシ血清アルブミン（BSA）を含むTBS（Tris-buffered saline; 20mM Tris-HCl pH7.4、0.15M NaCl）で培養上清を10倍に希釈した後、その10μlを384穴プレート中で300ng/mlの上記Euキレート標識抗体、300ng/mlの上記ビオチン標識抗体、2.5μg/mlのStreptavidin-APC（Perkin Elmer社、AD0201）を含む溶液（0.1%BSAを含むTBS）10μlと混合し、室温で２日間保存した後、Perkin Elmer ARVO-SXマルチラベルカウンターを用いてLANCE法のプロトコールにしたがってLANCE countを測定した。同時にマウスアディポネクチン標品（LINCO社、8060-K）についても測定を行い、標品の検量線より培養上清中のアディポネクチン濃度を算出した。D-MEM培地組成で全アミノ酸を含むFull培地、および１種のアミノ酸をFull培地から除いた培地（例えばメチオニンを除いたものをΔMetと標記）中で72時間培養後の培養上清中のアディポネクチン濃度を表１に示した（データは平均値、N=2）。この結果、Met、Cys、Valを除いた培地中ではアディポネクチン濃度低下が大きく、これらのアミノ酸がアディポネクチンの分泌に必要なことが分かった。さらに全アミノ酸を除去したZero培地、および１種のアミノ酸をFull培地におけるそのアミノ酸濃度の４倍の濃度となるようにZero培地に加えた培地（例えばメチオニンを加えたものをMet x4と標記）中で72時間培養後の培養上清中のアディポネクチン濃度を表２に示した（データは平均値、N=2）。Ala、Cys、Val、Ileを加えた培地では培養上清中のアディポネクチン濃度が上昇しており、これらのアミノ酸がアディポネクチンの分泌を促進することが分かった。【００１５】
表１．Full培地から１種のアミノ酸を除いた場合のアディポネクチン濃度（ng/ml）
Full    ΔAla    ΔGln    ΔMet    ΔCys    ΔVal    ΔIle
109       90         96         53         44          32        90
表２．Zero培地に１種のアミノ酸を加えた場合のアディポネクチン濃度（ng/ml）
Zero  Ala x4  Gln x4  Met x4  Cys x4  Val x4  Ile x4
61        98         21        66         83        83     119【００１６】
（実施例２）
実施例１と同様の方法で、Val、Leu、Ile又はこれら３種のアミノ酸の混合による、3T3-L1細胞のアディポネクチン産生に対する影響を調べた。培養した3T3-L1細胞を、Zero培地、およびZero培地にそれぞれValのみ、Leuのみ、Ileのみの濃度を変化させた培地又はVal、Leu及びIleの３種のアミノ酸を等モル濃度となるように変化させた培地で10%の透析ウシ胎児血清存在下で72時間培養し、培養上清中アディポネクチン濃度を測定した。その結果、図１に示したように、Val、Leu、Ile全てのアミノ酸濃度に依存してZero培地に比べてアディポネクチン産生量の上昇が認められ、３種アミノ酸の混合培地ではより低濃度域で相乗的なアディポネクチン濃度上昇が認められた。【００１７】
（実施例３）
雄性5週齢ob/obマウス（日本チャールスリバー社より購入）を重量比25 %の脂肪を含有した基本食で1週間予備飼育し、体重及び飽食時血糖に群間で差がでないように群分けを行った。基本食は25%の脂質以外に、重量で17%のカゼイン、48%のスターチを含むものを使用した。その後BCAA（BCAAの組成は、Leu、Ile及びValの混合物であり、その重量比Leu: Ile: Val = 1:1:1）、LeuまたはIleを4 %含有した実験食（脂肪を25 %含有）を供与した。対照群にはアミノ酸のかわりにカゼインを4 %基本食組成から増やした実験食を供与した（対照群）。各実験食の組成については、単位重量あたりのカロリーが等しくなるようにスターチ含量を調節した。実験食供与17日目に採血及び血糖測定を行い、血漿中アディポネクチン濃度を測定した。また実験食供与開始23日目に剖検を行い、皮下脂肪を採取して凍結保存し、RNAを抽出後アディポネクチンmRNAの定量を行った。
マウスの血糖は尾静脈より血液を6 μL採取し、富士ドライケムシステム(富士フィルムメディカル社)を用いて測定した。血漿中アディポネクチン濃度は以下のような方法で測定した。
抗マウスアディポネクチン抗体（R&D Systems社、AF1119）のEu（ユーロピウム）キレート標識を、200 μgの抗体に対して100 μgのEuキレート標識試薬であるLANCE Eu-W1024-ITC chelate（Perkin Elmer社、AD0013）を用い、マニュアルに準じた方法で行った。また抗マウスアディポネクチン抗体（R&D Systems社、AF1119）のビオチン標識は、100 μgの抗体に対して26.8 μgのビオチン標識試薬であるNHS-Biotin（Boehringer Mannheim社、1418165、Biotin Labeling Kit）を用い、マニュアルに準じた方法を用いて行った。【００１８】
96穴ハーフプレート(costar、3693)に300 ng/mlの上記Euキレート標識抗体、300 ng/mlの上記ビオチン標識抗体、2.5 μg/mlのStreptavidin-APC（Perkin Elmer社、AD0201）、0.1 %ウシ血清アルブミン（BSA）を含むTBS（Tris-buffered saline;  20 mM Tris-HCl pH 7.4、0.15 M NaCl）溶液25 μlを添加し、0.1 %BSAを含むTBSで2000倍に希釈した血漿を25 μl加え、室温で２日間静置した後、ARVO-SXマルチラベルカウンター（Perkin Elmer社）を用いてLANCE法のプロトコールにしたがってLANCE countを測定した。同時にマウスアディポネクチン標品（LINCO社、8060-K）についても定量を行い、標品の検量線より培養上清中のアディポネクチン濃度を算出した。
凍結保存した皮下脂肪から、ISOGEN(日本ジーン)を用いてtotal RNAを抽出した。1 μgのtotal RNA, oligo d(T)(Invitrogen)および逆転写酵素SuperSctiptII(Invitrogen)を用い、cDNAを調製した。total RNAで5 ngに相当するcDNAに、以下のアディポネクチン遺伝子のprimerとSYBER GREEN Master Mix (ABI)を加え、ABI 7700 ditecterで増幅・定量解析を行った。データはβ-アクチンを用いて補正した。アディポネクチンprimerは5'側から塩基配列がAAAGGAGAGCCTGGAGAAGCとGTAGAGTCCCGGAATGTTGCである２種類のものを使用し、β-アクチンprimerは5'側から塩基配列がAGCCATGTACGTAGCCATCCとCTCTCAGCTGTGGTGGTGAAである２種類のものを使用した（シグマアルドリッチジャパン）。使用した合成primerについてはPCR反応後にアガロースゲル電気泳動を行い、目的の産物ができていることを確認した。【００１９】
図２に示したように、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）を4%含有した実験食を17日供与すると、供与開始前に比べ飽食時血糖が有意に低下した。BCAAを4%含有した実験食を供与した場合も飽食時血糖が低下する傾向が認められた。図３に示したように、BCAA、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）を4%含有した実験食を17日供与すると、血漿中アディポネクチン濃度は供与開始前に比べ上昇傾向であったが、対照群ではそのような傾向は認められなかった。さらに、図４に示したように飽食時血糖と血漿中アディポネクチン濃度には有意な負の相関が認められ、BCAA、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）を供与する事によって血漿中アディポネクチン濃度が増え、血糖が低下した可能性が考えられた。図5に示したように、脂肪組織におけるアディポネクチンmRNA量はロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）供与群で増加する傾向が認められた。これらの結果から、BCAA、ロイシン、イソロイシンは、生体に供与された場合にもアディポネクチン発現を誘導し、血中へのアディポネクチン分泌を促進し、血糖を低下させるポテンシャルを有すると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例２におけるロイシン（Leu）濃度を変化させた場合、イソロイシン（Ile）濃度を変化させた場合、バリン（Val）濃度を変化させた場合とこれら３種のアミノ酸濃度を等モルで共存させた場合、それぞれにおける脂肪細胞培養液中アディポネクチン濃度を示すグラフである（平均値±標準偏差、各点N=4）。図中、縦軸は明細書本文中に示した方法で測定されたLANCE countであり、アディポネクチン濃度を示す。横軸はアミノ酸濃度であり、３種アミノ酸共存の場合はそれぞれのアミノ酸の濃度を示す。
【図２】実施例3において、各実験食供与前後における飽食時血糖の変化を示すグラフである（平均値±標準誤差、各群N=6）。図中縦軸は明細書本文中に記載した方法で測定した飽食時血糖値である（*: p<0.05、paired-t testにて検定）。
【図３】実施例3において、各実験食供与前後における血漿中アディポネクチン濃度の変化を示すグラフである。図中縦軸は明細書本文中に記載した方法で測定した血漿中アディポネクチン濃度である（平均値±標準誤差、各群N=6）。
【図４】実施例3において、各実験食供与17日目の飽食時血糖値と血漿中アディポネクチン濃度の相関を示すグラフである。図中明細書本文中に記載した方法で測定した血漿中アディポネクチン濃度を縦軸に、飽食時血糖値を横軸にとり、個体別にプロットした（○：対照群、▲：4 %BCAA食群、●：4 %Leu食群、◆：4 %Ile食群）。回帰式の相関係数は0.591であった（p=0.0024）。
【図５】実施例3において、各実験食供与23日目に採取した皮下脂肪中のアディポネクチンmRNA定量の結果を示すグラフである。図中縦軸は明細書本文中に記載した方法で測定した皮下脂肪中のアディポネクチンmRNA量をβ-アクチンmRNA量で除した相対値である（平均値±標準誤差、各群N=6）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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