(57)【要約】  配列表の配列番号１から６のアミノ酸配列を含む抗体が、これまで知られている胃癌、大腸癌または乳癌等の癌種以外に、卵巣癌にも反応性がある抗体であり、卵巣癌組織特異的な診断薬および／または治療薬として有用であることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む抗体を含有する卵巣癌の診断および／または治療薬。
【請求項２】
抗体が、重鎖の超可変領域に、配列表の配列番号１、２および３のアミノ酸配列を含有し、軽鎖の超可変領域に、配列表の配列番号４、５および６のアミノ酸配列を含有するものである請求項１に記載の卵巣癌の診断および／または治療薬。
【請求項３】
抗体が、重鎖可変領域に配列表の配列番号７のアミノ酸配列を含有し、軽鎖可変領域に配列表の配列番号８のアミノ酸配列を含有するものである請求項１または２に記載の卵巣癌の診断および／または治療薬。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の抗体と薬剤を内包するリポソームを含有する卵巣癌の診断および／または治療薬。
【請求項５】
抗体が、チオエーテル基を介して、リポソームに結合している請求項４に記載の卵巣癌の診断および／または治療薬。
【請求項６】
抗体が、チオエーテル基を介して、脂質末端の一部がマレイミド化されたリポソームに結合している請求項４または５に記載の卵巣癌の診断および／または治療薬。
【請求項７】
抗体が、マレイミド化脂質１モルに対して０．１〜２モル％結合している請求項６に記載の卵巣癌の診断および／または治療薬。
【請求項８】
抗体が、F(ab’)2フラグメントである請求項４から７のいずれかに記載の卵巣癌の診断および／または治療薬。  
【請求項９】
リポソームが、ポリアルキレングリコール部分を含む化合物を結合している請求項４に記載の卵巣癌の診断および／または治療薬。
【請求項１０】
ポリアルキレングリコール部分を含む化合物が、リポソームに含まれるマレイミド化脂質１モルに対して１５〜５０モル％結合している請求項９に記載の卵巣癌の診断および／または治療薬。
【請求項１１】
ポリアルキレングリコール部分を含む化合物が２つのポリアルキレングリコールを有する化合物である請求項９または１０に記載の卵巣癌の診断および／または治療薬。
【請求項１２】
ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコールである請求項９から１１のいずれかに記載の卵巣癌の診断および／または治療薬。
【請求項１３】
ポリエチレングリコールが、分子量２０００〜７０００ダルトンである請求項１２に記載の卵巣癌の診断および／または治療薬。
【請求項１４】
薬剤が、抗腫瘍性物質である請求項4に記載の卵巣癌の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵巣癌の診断および／または治療薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌の診断および治療分野においては、十分な治療効果を得るとともに、治療薬による副作用を低減することを目的として、特定の癌細胞を標的としたターゲッティング療法の研究が行われている。具体的には、癌化した細胞の表面に特異的に発現する抗原を同定し、その抗原に対するモノクローナル抗体を取得し、当該モノクローナル抗体を癌治療薬として用いる方法が挙げられる（非特許文献１または非特許文献２）。【０００３】
ターゲッティング療法に用いられるモノクローナル抗体としてはこれまでに多数報告があるが、胃癌および大腸癌との反応性からスクリーニングされたヒトモノクローナル抗体であるGAH抗体もその一例として挙げられる（特許文献１）。  【０００４】
GAH抗体は、スクリーニングの際に用いられた胃癌および大腸癌の他に、乳癌に対しても反応性を示すことが知られているが(特許文献２)、肺癌に対しては反応性を示さない。すなわち、種類の異なる癌との反応性を予測することは当業者でも困難であり、これは、抗原に対する特異性が極めて高いモノクローナル抗体の性質に由来するものであると考えられる。【０００５】
一方、GAH抗体の抗原としては、ヒト非筋肉型ミオシン重鎖タイプA（nmMHCA）が同定されているが、当該抗原が卵巣癌組織に強く発現していることを示唆する報告は、発明者の知る限りこれまでにない。
【特許文献１】特開平5-304987号公報
【特許文献２】国際公開パンフレットWO03/009870号
【非特許文献１】Vogel C, Cobleigh MA, Eur J Cancer. 2001 Jan;37 Suppl 1:25-29
【非特許文献２】J. Baselga, Clinical trials of Herceptin, Eur. J. Cancer 37 Suppl 1 (2001) S18-24.
【非特許文献３】HOSOKAWA  S, Hybridoma And Hybridomics. vol 23, no 2 (2004):109-120
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、卵巣癌に対して有用な診断および／または治療薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、配列表の配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む抗体が、これまで知られている胃癌、大腸癌または乳癌等の癌種以外に、卵巣癌にも反応性がある抗体であり、卵巣癌組織特異的な診断および／または治療薬として有用であることを見出し、本発明を完成した。【０００８】
すなわち本発明の要旨は以下の通りである。
１．配列表の配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む抗体を含有する卵巣癌の診断および／または治療薬。
２．抗体が、重鎖の超可変領域に、配列表の配列番号１、２および３のアミノ酸配列を含有し、軽鎖の超可変領域に、配列表の配列番号４、５および６のアミノ酸配列を含有するものである上記１に記載の卵巣癌の診断および／または治療薬。
３．抗体が、重鎖可変領域に配列表の配列番号７のアミノ酸配列を含有し、軽鎖可変領域に配列表の配列番号８のアミノ酸配列を含有するものである上記１または２に記載の卵巣癌の診断および／または治療薬。
４．上記１から３のいずれかに記載の抗体と薬剤を内包するリポソームを含有する卵巣癌の診断および／または治療薬。
５．抗体が、チオエーテル基を介して、リポソームに結合している上記４に記載の卵巣癌の診断および／または治療薬。
６．抗体が、チオエーテル基を介して、脂質末端の一部がマレイミド化されたリポソームに結合している上記４または５に記載の卵巣癌の診断および／または治療薬。
７．抗体が、マレイミド化脂質１モルに対して０．１〜２モル％結合している上記６に記載の卵巣癌の診断および／または治療薬。
８．抗体が、F(ab’)2フラグメントである上記４から７のいずれかに記載の卵巣癌の診断および／または治療薬。  
９．リポソームが、ポリアルキレングリコール部分を含む化合物を結合している上記４に記載の卵巣癌の診断および／または治療薬。
１０．ポリアルキレングリコール部分を含む化合物が、リポソームに含まれるマレイミド化脂質１モルに対して１５〜５０モル％結合している上記９に記載の卵巣癌の診断および／または治療薬。
１１．ポリアルキレングリコール部分を含む化合物が２つのポリアルキレングリコールを有する化合物である上記９または１０に記載の卵巣癌の診断および／または治療薬。
１２．ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコールである上記９から１１のいずれかに記載の卵巣癌の診断および／または治療薬。
１３．ポリエチレングリコールが、分子量２０００〜７０００ダルトンである上記１２に記載の卵巣癌の診断および／または治療薬。
１４．薬剤が、抗腫瘍性物質である上記4に記載の卵巣癌の治療薬。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、卵巣癌に対して有用な診断および／または治療薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ヒト卵巣癌患者組織（Ａ，Ｃ）およびヒト卵巣非癌部組織（Ｂ，Ｄ）に対するGAH抗体を用いた免疫組織染色像を示す。
【図２】ヒト卵巣癌組織に対するGAH抗体（Ａ）及びヒトIgG抗体（Ｂ）を用いた免疫組織染色像を示す。
【図３】漿液性腺癌(Ａ)、類内膜癌(Ｂ)、淡明細胞癌(Ｃ)およびムチン性腺癌(Ｄ)の組織型の卵巣癌に対するGAH抗体の染色像の代表例を示す。
【図４】GAH抗体結合DXR封入リポソームのヒト卵巣癌細胞に対するｉｎ  vitroにおける抗腫瘍効果を示す。縦軸はコントロール（薬剤濃度０）に対する各処理濃度時の細胞数の比(％)を示す。横軸は抗体結合リポソームの濃度（DXR濃度(μg/ml)として）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明において抗体とは、配列表の配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むものをいい、好ましくは、重鎖の超可変領域に配列表の配列番号１、２および３のアミノ酸配列を含み、軽鎖の超可変領域に配列表の配列番号４、５および６のアミノ酸配列を含むものが挙げられ、特に好ましくは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域が配列表の配列番号７および８のアミノ酸配列で表されるものが挙げられる。【００１２】
ここで、超可変領域とは、免疫グロブリンの抗体としての特異性、抗原決定基と抗体の結合親和性を決定するものであり、相補性決定部とも呼ばれる。従って、本発明において、かかる超可変領域以外の領域は他の抗体由来であっても構わない。すなわち、これらの超可変領域を有する抗体は本発明の抗体に含まれると考えられる。【００１３】
また、卵巣癌組織との反応性を損なわない範囲で一部のアミノ酸を置換、挿入、削除あるいは追加する等の改変を行ったものも、本発明における抗体に含まれる。【００１４】
抗体としては、好ましくはモノクローナル抗体が挙げられ、特に好ましくはヒトモノクローナル抗体が挙げられるが、これは本発明の卵巣癌の診断および／または治療薬をヒトに投与する場合、異種動物の蛋白質ではない点で有利である。【００１５】
ヒトモノクローナル抗体は、癌患者由来リンパ球とマウスミエローマ細胞とのハイブリドーマを作製し、上記の特定のアミノ酸配列を有するものを選択すること等によって得ることができる。【００１６】
ハイブリドーマは、Ａ．Ｉｍａｍらの方法〔Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓａｒｃｈ ４５，２６３（１９８５）〕に準じて、まず、癌患者から摘出された癌所属のリンパ節から、リンパ球を単離し、ポリエチレングリコールを用いてマウスミエローマ細胞と融合して得られる。得られたハイブリドーマの上清を用いて、パラフォルムアルデヒド固定した各種癌細胞株に対し、エンザイムイムノアッセイにより陽性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択し、クローニングを行う。次に、ハイブリドーマの上清から、常法〔Ｒ．Ｃ．Ｄｕｈａｍｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３１，２１１（１９７９）〕によりモノクローナル抗体を精製し、蛍光物質でラベルし、生癌細胞株、各種の赤血球、白血球等に対する反応性をフローサイトメトリーで検出することにより、生癌細胞株に対しては反応性を示す抗体を、赤血球、白血球に対しては、反応性を示さない抗体を選別する。また、癌患者から摘出される癌組織から単離される癌細胞、および同一患者の同一組織の非癌部から単離される正常細胞に対する反応性を比較して、癌細胞に、より多量の抗体が結合し、正常細胞には反応がないか、もしくは健常人由来の抗体と同程度の反応性しかない抗体を選別する。【００１７】
かくして選別されたハイブリドーマが産生する抗体をコードするＤＮＡの塩基配列は、たとえば、以下の方法によって得られる。抗体産生ハイブリドーマから、チオシアン酸グアニジン−塩化リチウム法〔Casaraら, DNA, 2, 329 (1983)〕でｍＲＮＡを調製して、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いてそのｃＤＮＡライブラリーを作製する。次いで、ｃＤＮＡに（ｄＧ）テーリングを行い、このｄＧテールにハイブリダイズするポリＣと、既に遺伝子が取得されているヒト抗体重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子の各々共通な配列部分をプローブとしてＰＣＲ法によって、抗体をコードするｃＤＮＡを増幅させる。その後、ＤＮＡの末端平滑化を行い、電気泳動法によってゲルから切りだしたＤＮＡをｐＵＣ１１９等のクローニングベクターに挿入し、Ｓａｎｇｅｒらのジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 5463 (1977)〕によってその塩基配列が決定される。この塩基配列に基づいて、上記特定のアミノ酸配列を有するものを選別できる。【００１８】
抗体は、遺伝子工学的な手法により作製することもできる。この場合の手法としては、特に限定されるものではないが、以下の手法が挙げられる。本抗体を産生するハイブリドーマを牛胎児血清含有ｅＲＤＦ、ＲＰＭＩ １６４０培養液等を用いて培養するか、または、上記の特定の超可変領域を含む可変領域をコードするＤＮＡにさらに重鎖および軽鎖の定常領域をコードするＤＮＡが夫々連結された遺伝子を化学合成し、その遺伝子の発現を可能とする公知の種々の発現ベクター、例えば、動物細胞における発現ベクターとして、ｐＫＣＲＨ２〔三品ら、Nature, 307, 605 (1984)〕から特開平5-304987号公報の図１または図２に示した手順で構築することができるｐＫＣＲ（ΔＥ）／ＨとｐＫＣＲＤに挿入し、ＣＨＯ細胞（チャイニーズ ハイスター 卵巣細胞）等の宿主中で発現させることにより得ることができる。例えば、重鎖遺伝子の両端にＨｉｎｄIII部位を付加したものをｐＫＣＲ（ΔＥ）／ＨのＨｉｎｄIII部位に挿入し、またこのプラスミドのＳａｌＩ部位にＤＨＦＲ遺伝子等の選択マーカー遺伝子を挿入する。一方、軽鎖遺伝子の両端にはＥｃｏＲＩ部位を付加したものをｐＫＣＲＤのＥｃｏＲＩ部位に挿入し、さらにこのプラスミドのＳａｌＩ部位にもＤＨＦＲ遺伝子を挿入する。両プラスミドをＣＨＯｄｈｆｒ-〔Urlaub G. & Chasin L.A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, 4216 (1980)〕等の細胞にリン酸カルシウム法で導入し、ヌクレオチドを含まないαＭＥＭ培養液等で増殖する細胞から、さらに抗体を産生する細胞を選別することによって得ることができる。抗体は、これらの細胞を培養した培養液から、プロテインＡをセルロファイン、アガロース等の支持体に結合させたカラム等に吸着し、溶出させること等によって精製される。【００１９】
抗体の重鎖および軽鎖の定常領域の塩基配列は、例えばＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４，１７７９（１９８６）、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５７，１５１６（１９８２）およびＣｅｌｌ ２２，１９７（１９８０）に記載のものと同じ配列を有するものでよい。【００２０】
抗体は、全長抗体（抗体全体）、抗体断片（抗体フラグメント、例えば、Fab'、F(ab')2、scFv（一本鎖抗体）等）、誘導体化抗体または修飾化抗体等を包含しており、最も広義に解釈しなければならないが、もっとも好ましくはF(ab')2フラグメントが挙げられる。【００２１】
抗体は、単独で用いても良く、薬剤等と複合化して用いても良い。薬剤と抗体を複合化する場合は、抗体と直接結合する方法、スペーサーを介して薬剤と結合する方法、薬剤を封入したリポソームと抗体を結合する方法等が挙げられるが、好ましくは薬剤を封入したリポソームと抗体を結合する方法が挙げられる。【００２２】
本発明においてリポソームとは、例えば、天然レシチン（例えば、卵黄レシチン、大豆レシチン）やジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリストイルフォスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルフォスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルフォスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジパルミトイルフォスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジパルミトイルフォファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジミリストイルフォスファチジン酸（ＤＭＰＡ）等のリン脂質、スフィンゴ糖脂質、グリセロ糖脂質等の糖脂質、脂肪酸、両親媒性ジアルキルジメチルアンモニウム(dialkyl dimethylammnonium amphiphiles)、ポリグリセロールアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル等（Liposome Technology, 2nd edition, vol.1, 141, 1993）、アルキルグリコシド、アルキルメチルグルカミド、アルキルシュークロースエステル、ジアルキルポリオキシエチレンエーテル、ジアルキルポリグリセロールエーテル等（Liposome Technology, 2nd edition, vol.1, 141, 1993）、ポリオキシエチレン−ポリ乳酸等の両親媒性ブロック共重合体等（特表平6-508831号公報）等の脂質によって構成されるが、これらに限定されることはない。これらの脂質は単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができ、さらにコレステロール等の非極性物質、ＤＣ−ｃｈｏｌ（3β-[N-(N',N'-dimethylaminoethyl)carbamoyl]cholesterol）等のコレステロール誘導体と組み合わせ用いてもよい。【００２３】
リポソームの製造方法は、特に限定されず、当業者に利用可能な方法はいずれも適用可能である。また、リポソームの形態も特に限定されず、いかなる形態であってもよい。例えば、ガラス壁に付着させた脂質薄膜に水溶液を加え、機械的振盪を加えて形成するマルチラメラリポソーム（ＭＬＶ）；超音波処理法、エタノール注入法、フレンチプレス法により得られるスモールユニラメラリポソーム（ＳＵＶ）；界面活性剤除去法、逆相蒸発法（リポソーム、砂本順三ら、南江堂、1998）、ＭＬＶを均一孔径を有するメンブランから加圧により押し出すイクストゥルージョン法等によって得られるラージユニラメラリポソーム（ＬＵＶ）のいずれであってもよい（Liposome Technology, 2nd edition, vol.1, 141, 1993）。リポソームの粒径は、例えば、３００ｎｍ以下、好ましくは３０から２００ｎｍ程度である。【００２４】
本発明において薬剤をリポソームに導入する方法は、特に限定されず、当業者に利用可能な方法はいずれも適用可能である。例えば、リポソーム形成時に水溶液として添加してリポソーム内部に封入してもよい。また、リポソーム形成後、ベジクル内外にｐＨ勾配等の濃度勾配を形成し、このポテンシャルを駆動力としてイオン化可能な抗腫瘍性物質をリポソーム内部に取り込ませる方法（Cancer Res., 49, 5922, 1989; BBA, 455, 269, 1976）等を用いることができる。【００２５】
本発明において抗体をリポソームに結合させる方法は、特に限定されるものではないが、抗体をリポソームの表面に結合させることが好ましく、精製抗体に疎水性の物質を結合させ、リポソームに挿入する方法、ホスファチジルエタノールアミンと抗体とをグルタールで架橋させる方法等があるが、好適には、抗体にチオール基を付与した後、リポソームのマレイミド基と該チオール化抗体とを反応させることによって、リポソームを抗体で修飾する方法が挙げられる。抗体へのチオール基の付与は、抗体のアミノ基に対して、蛋白質のチオール化に通常用いるN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ）プロピネート（ＳＰＤＰ）（Carlsson, J., et al., Biochem. J., 173, 723, 1978）やイミノチオラン、メルカプトアルキルイミデート（Traut, R.R., et al., Biochemistry, 12, 3266, 1973）等の化合物を反応させる方法により行なうことができる。【００２６】
また、抗体由来のイオウ含有基、すなわち、抗体の内在性ジオール基を反応させることもでき、抗体活性の維持の点から内在性ジチオール基を用いる方法は好適である。抗体の内在性ジチオール基は、それを還元してチオール基とすることによりマレイミド基と反応させることができる。例えば、ＩｇＧを用いる場合はペプシン等の酵素でF(ab’)2化し、さらにジチオスレイトール等で還元して得られるＦab’に生じるチオール基をリポソームとの結合反応に利用することができる（Martin, F.J., et al., Biochemistry, 20, 4229, 1981）。ＩｇＭの場合には、ミラーらの方法（J. Biol. Chem., 257, 286, 1965）に準じ、緩和な条件でＪ鎖を還元して得られるＩｇＭｓのＦｃ部分のチオール基をリポソームとの結合に利用すればよい。特開平5-304987号公報に記載されたＧＡＨ抗体を用いる場合には、F(ab’)2を用いることが好適である。チオール基が付与された抗体等の蛋白質とマレイミド基を含むリポソームとの結合は、通常には、中性の緩衝液（ｐＨ６．５〜７．５）中で２〜１６時間反応させることにより達成される。【００２７】
本発明においてリポソームに対する抗体の結合量は、マレイミド化脂質１モルに対して、０．１モル％から約２モル％程度が挙げられるが、好ましくは０．１〜１．６モル％、より好ましくは０．４〜０．７モル％が挙げられる。【００２８】
本発明においてリポソームは、特に限定されるものではないが、上記ポリアルキレングリコール部分を含む化合物がリポソーム表面のマレイミド化脂質にチオエーテル結合を介して結合した形態を有していることが好ましい。ポリアルキレングリコール部分を含む化合物としては、ポリエチレングリコール基を有し、末端にチオール化可能な化合物または末端にメルカプト基を有する化合物を挙げることができる。具体的には、例えば、ポリアルキレングリコール基をトリアジンに結合した化合物、さらに該トリアジンがアミノ酸等により置換された化合物を挙げることができる。この際、ポリアルキレングリコール基を２つ有する化合物（２本鎖）であってもよい。【００２９】
本発明においてリポソームに対するポリアルキレングリコール部分を含む化合物の結合量は、特に限定されず、残存マレイミド化脂質に対して過剰に反応させてもよいが、ポリアルキレングリコールの好ましい結合量としては、全脂質に対して０．２８〜０．９０モル％程度、より好ましくは０．２８〜０．５６モル％程度、マレイミド化脂質に対しては１５〜５０モル％程度、より好ましくは１５〜３０モル％程度であり、ＤＰＰＣに対して０．４４〜１．４５モル％程度、より好ましくは０．４４〜０．８９モル％程度である。【００３０】
本発明においてポリアルキレングリコールとは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール等が挙げられるが、好ましくはポリエチレングリコールが挙げられる。ポリエチレングリコールを用いる場合には、分子量が２，０００〜７，０００ダルトン程度のものが好ましく、約５，０００ダルトン程度のものが最も好ましい。【００３１】
上記ポリアルキレングリコール部分を含む化合物がリポソーム表面のマレイミド化脂質にチオエーテル結合を介して結合した形態を有している場合には、通常、ポリアルキレングリコール部分を含む化合物にチオール基を導入した後、この化合物をリポソームのマレイミド基と反応させることにより、ポリアルキレングリコールを結合させたリポソームを製造することができる。【００３２】
チオール基が導入されたポリアルキレングリコール部分を含む化合物の製造には、ポリアルキレングリコールとしてポリエチレングリコールを用いる場合には、例えば、モノメトキシポリオキシエチレンアミンと各種チオールカルボン酸とを脱水縮合する方法；モノメトキシポリオキシエチレンアミンにＳＰＤＰでピリジルジチオプロピオニル基を導入し、さらに還元する方法；モノメトキシポリオキシエチレンアミンにイミノチオランによりチオール基を導入する方法；モノメトキシポリオキシエチレンカルボン酸の活性エステルと各種チオールアミンを結合させる方法；ポリエチレングリコールトリアジン誘導体をチオールアミンと縮合する方法等を利用することができる。さらに具体的には、2,4-ビス（ポチエチレングリコール）-6-クロロ-s-トリアジン（活性化ＰＥＧ２（生化学工業株式会社製））をシスチンと反応させ、さらに還元してシステイン結合活性化ＰＥＧ２を得ることができる。【００３３】
本発明の好ましい実施態様では、抗体およびポリアルキレングリコール部分を含む化合物とが結合されたリポソームが使用され、これを製造するためには、まず、マレイミド基を有するリポソームに対して中性の緩衝液中でチオール化抗体を反応させる。例えば、リポソームを構成する全脂質１００ｍｇあたり０．５〜５．３ｍｇ、好ましくは０．５〜４．５ｍｇ、より好ましくは１．２〜２ｍｇの抗体が結合するように、すなわちチオール化抗体をマレイミド基（マレイミド化脂質）１モルに対して、０．１モル％から約２モル％程度、好ましくは０．１〜１．６モル％、より好ましくは０．４〜０．７モル％反応させればよい。ついで、残存しているマレイミド基に対してチオール化ポリアルキレングリコール部分を含む化合物を反応させ、抗体とポリアルキレングリコール部分を含む化合物とが結合したリポソームを製造することができ、具体的には、マレイミド化脂質基１モルに対して、１５モル％から５０モル％、好ましくは１５〜３０モル％（全脂質に対して０．２８〜０．９０モル％、好ましくは０．２８〜０．５６モル％、ＤＰＰＣを用いる場合には、ＤＰＰＣに対して０．４４〜１．４５モル％、好ましくは０．４４〜０．８９モル％）のチオール化ポリアルキレングリコール部分を含む化合物を加え、抗体とポリアルキレングリコール部分を含む化合物が結合したリポソームを製造することができる。【００３４】
本発明において薬剤とは、診断薬または抗腫瘍性物質が挙げられる。【００３５】
本発明において診断薬とは、インジュームやテクネシュウムなどの放射性元素；ガドリニュームやヨードなどの造影剤などが挙げられる。【００３６】
本発明において抗腫瘍性物質とは、種類は特に限定されないが、例えば、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノマイシン、ビンブラスチン、シスプラチン、ネダプラチン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）等の抗腫瘍剤（抗癌剤）；ヨード１３１などの放射性物質；リシンＡ、ジフテリアトキシン等の毒素；アンチセンスＲＮＡ；並びにそれらの薬学的に許容し得る塩および誘導体等を用いることができる。これらの物質は、市販品を購入するか、または、それぞれ公知の方法により適宜製造することにより得ることができる。【００３７】
上記の薬学的に許容し得る塩としては、薬学的に許容し得る多価陰イオン性物質との塩、例えば、クエン酸塩、酒石酸塩、グルタミン酸塩、およびそれらの誘導体との塩が好ましい。【００３８】
抗体が結合した薬剤含有リポソームは、公知の方法、例えば脱水法（WO8806441号公報）、安定化剤を加え液剤として用いる方法（特開昭64-9931号公報）、凍結乾燥法（特開昭64-9931号公報）等により製剤化することができ、卵巣癌の診断および／または治療のために、血管内投与、局所投与等の方法で患者に投与することができる。投与量は有効成分の抗腫瘍性物質の種類に応じて適宜選択することができるが、例えばドキソルビシンを封入したリポソームを卵巣癌の治療のために投与する場合には、有効成分量として５０ｍｇ／ｋｇ以下、好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ以下、より好ましくは５ｍｇ／ｋｇ以下で用いることができる。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限定されるものではない。【００４０】
実施例１
特開平5-304987号公報（実施例1、2、3）に記載の配列表の配列番号１から６のアミノ酸配列を含む抗体（以下、GAH抗体と略すこともある）にビオチン化試薬（アマシャム社製）を用いてビオチン化標識を行った。ヒト卵巣癌組織（国立がんセンター中央病院病理部より入手）及び周辺の非癌部組織（国立がんセンター中央病院病理部より入手）のパラフィン切片を脱パラフィン処理し、5％-BSA/PBS溶液に室温で１時間浸してブロッキングを行った後、100μg/ｍlのビオチン化GAH抗体溶液と３７℃で２時間反応させた。切片をPBSで洗浄し、4μg/ml のPerCP（ペリジニン クロロフィル プロテイン）標識ストレプトアビジン溶液（Becton/Dickinsin社製）と遮光下、氷冷中で30分間反応させた。GAH抗体の卵巣癌組織切片に対する反応性は、蛍光顕微鏡を用い、励起波長490nmにおける680nmのPerCPの赤色蛍光として検出した。【００４１】
その結果を図１に示す。A及びCに示すように卵巣癌組織切片ではGAH陽性である明確な赤色染色像が見られたが、B及びDの非癌部組織ではGAH抗体の反応は認められず、赤色染色像は見られなかった。【００４２】
実施例２
対照用抗体として、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）を用いて実施例１と同様にビオチン化抗体を作製し、ＧＡＨ抗体及び対照抗体を用いてヒト卵巣癌組織切片を染色した（図２）。【００４３】
その結果、ＧＡＨ抗体で認められた赤色染色像に示されるような、強い陽性反応（赤色染色）は対照抗体では検出されなかった。【００４４】
実施例３
ヒト卵巣癌組織切片に対して、実施例１と同様にＧＡＨ抗体を反応させ赤色蛍光の強度、ならびに分布から陽性、陰性を判断した。【００４５】
その結果、GAH抗体は６２例のヒト卵巣癌組織切片中５７例を陽性の赤色に染色した。代表例を図３（Ａ：漿液性腺癌、Ｂ：類内膜癌、Ｃ：淡明細胞癌、Ｄ：ムチン性腺癌）に示す。【００４６】
以上より、GAH抗体はヒト卵巣癌組織に対して特異的に反応することが明らかとなった。【００４７】
実施例４  
WO00/64413号公報（実施例１）に記載の方法に準じて、ドキソルビシン（DXR）（協和発酵社）封入リポソームを作製した。得られたＤＸＲ封入リポソームにチオール化したGAH抗体を結合させ、さらにチオール化したポリエチレングリコール（PEG）を結合さることで、GAH抗体結合リポソームを作製した。【００４８】
ヒト卵巣癌細胞ＥＳ−２（ATCC  NO.CRL-1978）を用い上記抗体結合イムノリポソームのin  vitroにおける抗腫瘍効果を検討した。細胞培養プレートに播種した細胞株に、抗体結合リポソームを図４に示す濃度（DXR濃度(μg/ml)として表示）で添加した。４８時間培養した後、薬剤を除去し、MTT法(Green, L. M., et al. J. Immunol. Methods 70:257-268, 1984)により細胞数を測定した。【００４９】
その結果、抗体結合リポソームの添加濃度が増加するに従って細胞数が減少した。【００５０】
以上より、GAH抗体結合リポソームには、卵巣癌細胞増殖の抑制効果があることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明によれば、抗体の特異的反応性により、胃癌、大腸癌、乳癌に加え、卵巣癌に対しても有効な卵巣癌の予防および／または治療薬が提供可能である。【００５２】
なお、本出願は、日本特許出願  特願２００４−２６９７５７号を優先権主張して出願されたものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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