(57)【要約】  本発明は、ＵＬ５６遺伝子が不活化されている変異単純ヘルペスウイルスを用いてヒトの頭頚部癌を治療する方法、ならびにかかる方法に用いる医薬組成物が開示される。好ましくは、変異単純ヘルペスウイルスは単純ヘルペスウイルスタイプ１  ＨＦ１０株である。頭頚部癌を有する患者について、皮下腫瘍部位に弱毒化単純ヘルペスウイルスからなる本発明の医薬組成物を接種する研究的臨床試験を行い、ウイルスが患者に有害な影響を与えることなく腫瘍抑制効果を示すことが確認された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＵＬ５６遺伝子が不活化されている変異単純ヘルペスウイルスを有効成分とする、ヒトの頭頚部癌を治療するための医薬組成物。
【請求項２】
ＵＬ５６遺伝子が不活化されている変異単純ヘルペスウイルスを有効成分とする、ヒトの頭頚部癌の放射線療法の効果を増強するための医薬組成物。
【請求項３】
ＵＬ５６遺伝子が不活化されている変異単純ヘルペスウイルスを有効成分とする、ヒトの頭頚部癌の化学療法の効果を増強するための医薬組成物。
【請求項４】
変異単純ヘルペスウイルスが単純ヘルペスウイルスタイプ１  ＨＦ１０株である、請求項１−３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
ＵＬ５６遺伝子が不活化されている変異単純ヘルペスウイルスを癌部に投与することによりヒトの頭頚部癌を治療する方法。
【請求項６】
ＵＬ５６遺伝子が不活化されている変異単純ヘルペスウイルスを癌部に投与することによりヒトの頭頚部癌の放射線療法の効果を増強する方法。
【請求項７】
ＵＬ５６遺伝子が不活化されている変異単純ヘルペスウイルスを癌部に投与することによりヒトの頭頚部癌の化学療法の効果を増強する方法。
【請求項８】
変異単純ヘルペスウイルスが単純ヘルペスウイルスタイプ１  ＨＦ１０株である、請求項５−７のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、弱毒化ヘルペスウイルスを用いるヒトの頭頚部癌の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
頭頸部癌は、I-XII脳神経のすべてが関与しうること、呼吸、嚥下、発声などの生存に関わる機能を障害しやすいこと、顔面や頸部という露出部の変形を伴う可能性があることが特徴である。ゆえにその治療法選択においては臓器温存、機能温存が重視される一方で、局所制御が最大の課題でもある。頭頸部癌は化学療法のみでは治癒を達成することが困難である。また、外科手術による頭頸部癌の治療では機能障害や変形が問題となって、放射線療法では照射線量の限界や照射後の唾液分泌不全や嚥下障害などが問題となって、いずれもその適用が制限されたり、その効果が十分に得られない例が多い。また、アデノウイルス変異株を用いた頭頸部癌治療の臨床試験も行われているが、充分な治療成績を挙げているとはいえない。したがって、頭頸部癌を治療するための新たな治療法の開発が望まれている。【０００３】
近年、弱毒化ウイルスを利用して癌の退縮をはかるという方法が開発され、欧米でも臨床試験段階にある。この方法は癌細胞が正常細胞より増殖が激しいこと、インターフェロンに非感受性であること、特定の癌遺伝子に変異・活性化があることなどを利用したものである。これらの性質をもつ癌細胞は、多くの場合ウイルスの増殖に対して許容性が高く、ＨＳＶに対しても高い感受性を示す。したがって、弱毒化ウイルスを直接癌細胞に感染させると、ウイルスは癌細胞内で増殖し、その癌細胞を破壊して癌を退縮させることが可能であると考えられる。【０００４】
そのような治療法の１つとして、弱毒化単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を用いる方法が提案されている。このウイルスは、以下のような有用な特性を有する：１）ＨＳＶはほとんどすべての種類の細胞に感染することができる、２）ＨＳＶの感染能力は他のウイルス、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）等より高い、３）ＨＳＶゲノムのすべての基本的な配列が解明されている、４）ＨＳＶは低用量で感染細胞を死滅させることができる、５）ＨＳＶに対する抗ウイルス剤が利用可能である。【０００５】
外来性自殺遺伝子が組み込まれている単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）タイプ１の弱毒化変異体が癌の治療に有効であることが開示されている（特開２００２−２１８９７５）。また、ある種の遺伝子が不活化されている単純ヘルペスウイルス弱毒化変異体が、腫瘍細胞を接種したヌードマウスの生存期間を延長させることが報告されている（Teshigahara,  et  al.,  J.  Surg.  Oncol.,  85:  42-47,  2004、特表平２００４−５３５７９８）。しかし、このような変異単純ヘルペスウイルスが実際にヒトの頭頚部癌の治療において有効性を有するかについては、予測することができなかった。【０００６】
本明細書において引用される参考文献は以下のとおりである。これらの文献に記載される内容はすべて本明細書の一部としてここに引用する。
【特許文献１】特開２００２−２１８９７５
【特許文献２】特表平２００４−５３５７９８
【非特許文献１】J.  Surg.  Oncol.,  85:  42-47,  2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、頭頚部癌の新たな治療方法および治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、頭頚部癌を有する患者について、皮下腫瘍部位に弱毒化単純ヘルペスウイルスを接種する研究的臨床試験を行い、ウイルスが患者に有害な影響を与えることなく腫瘍抑制効果を示すことを見いだした。【０００９】
本発明は、ＵＬ５６遺伝子が不活化されている変異単純ヘルペスウイルスを有効成分とする、ヒトの頭頚部癌を治療するための医薬組成物を提供する。本発明はまた、ＵＬ５６遺伝子が不活化されている変異単純ヘルペスウイルスを有効成分とする、ヒトの頭頚部癌の放射線療法の効果を増強するための医薬組成物を提供する。本発明はさらに、ＵＬ５６遺伝子が不活化されている変異単純ヘルペスウイルスを有効成分とする、ヒトの頭頚部癌の化学療法の効果を増強するための医薬組成物を提供する。別の観点においては、本発明は、ＵＬ５６遺伝子が不活化されている変異単純ヘルペスウイルスを癌部に投与することにより、ヒトの頭頚部癌を治療する方法、ヒトの頭頚部癌の放射線療法の効果を増強する方法、およびヒトの頭頚部癌の化学療法の効果を増強する方法を提供する。本発明の方法および医薬組成物においては、変異単純ヘルペスウイルスは好ましくは単純ヘルペスウイルスタイプ１  ＨＦ１０株である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明において用いたＨＳＶ  ＨＦ１０の構造の図解を示す。
【図２】図２は、本発明の医薬組成物による治療の経過を示す。
【図３】図３は、本発明の医薬組成物を投与した組織のＨＥ染色および抗ＨＳＶ染色の結果を示す。
【図４】図４は、本発明の医薬組成物による治療の経過を示す。
【図５】図５は、本発明の医薬組成物を投与した組織のＨＥ染色の結果を示す。
【図６】図６は、本発明の医薬組成物を投与した組織の抗ＨＳＶ染色の結果を示す。
【図７】図７は、本発明の医薬組成物を投与した組織のＨＳＶ非感染部分の抗ＨＳＶ染色の結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
単純ヘルペスウイルスのＵＬ５６蛋白質は、ゴルジ装置およびエンドソームに局在するテールアンカータイプII膜蛋白質である。ＵＬ５６蛋白質の機能はまだよく解明されていないが、神経毒性に関連性があると考えられている。【００１２】
ＵＬ５６遺伝子が不活化されている変異単純ヘルペスウイルスは、既知の方法によりＵＬ５６遺伝子の一部を突然変異または欠失させるか、ＵＬ５６遺伝子中に別の遺伝子断片を挿入することにより作製することができる。このような方法の例としては、相同性を持たせた遺伝子部位で目的とする変異部位を挟んだ遺伝子鎖を作成して遺伝子導入する相同性遺伝子導入法などが挙げられる。また、ＵＬ５６遺伝子が不活化されている自然発生の変異体を用いてもよい。【００１３】
このような変異体の１つの好ましい例はＨＦ１０株である（例えば、Arch  Virol.,  148  (4):  813-825,  2003を参照)。ＨＦ１０株は遺伝子組み換えを行っていない自然発生型の弱毒化変異ウイルスとして見いだされたクローンであり、感染細胞において広範な細胞膜融合を引き起こす。ＨＦ１０のゲノム構造は図１に示される。ＨＦ１０は中枢神経侵襲性に関与する遺伝子ＵＬ５６の欠損を始め少なくとも４つのアクセサリー遺伝子が欠損しており、病原性が著しく低減しているが、腫瘍細胞における増殖能は極めて高い（野生株の１００倍以上）。ＨＦ１０は、結腸癌、乳癌、黒色腫および肉腫に由来する腫瘍細胞を接種したヌードマウスの生存期間を延長させることが報告されている（J.  Surg.  Oncol.,  85:  42-47,  2004）。また、ＨＦ１０はマウスに腹腔内接種したときに無毒性であった。【００１４】
本発明のＵＬ５６遺伝子が不活化されている変異単純ヘルペスウイルスは、既知の方法により増殖させることができる。例えば、アフリカミドリザル腎細胞由来であるＶｅｒｏ細胞が細胞変性効果（cytopathic  effect）を示していることを確認し、これを採集し、連続した３回の凍結融解の操作を加えた後、遠心分離にて細胞成分を沈殿させてウイルス含有上清液を採取する。増殖させた変異単純ヘルペスウイルスは、滅菌水、滅菌生理食塩水または適当なバッファー中に懸濁させて、注射液として製剤化することができる。製剤にはさらに、安定化剤、保存剤などを加えてもよい。【００１５】
本発明の変異単純ヘルペスウイルスを有効成分とする医薬組成物は、頭頚部癌の治療剤として有用である。本発明の医薬組成物は、腫瘍部位に直接接種することにより投与することができる。本発明により治療しうる頭頸部癌としては、例えば、舌癌、口腔底癌や歯肉癌を含む口腔癌、口唇癌、上咽頭癌、中咽頭癌、下咽頭癌、喉頭癌、鼻腔癌、甲状腺癌、耳下腺癌、顎下腺癌等が挙げられる。頭頸部癌は一般に、体表に近い部位あるいは開口すれば容易に到達できる部位に病変があることを特徴とするため、ウイルスの投与が容易であり、ウイルス療法の効果が有効に発揮されると期待される。開口のみでは到達できない上咽頭、下咽頭、喉頭に関しては、内視鏡下注入法が有用である。これは喉頭ファイバー下に腫瘍を明視下に局所注入針を用いてウイルスを注入する方法であり、患者への負担も侵襲も軽いため連日の繰り返し投与も可能である。また、本発明のウイルス療法と、放射線療法や化学療法を併用してもよい。ウイルス療法との併用によって相乗効果が得られ、局所制御率を向上させることにより、機能温存療法を発展させうる。併用療法の際には連日行われる放射線治療を中断することなく行うためにウイルス投与はできるだけ患者への侵襲がない方法で行う必要がある。その点でも開口のみで、あるいは喉頭ファイバー下に注入できる本治療法は手術室などの施設を必要とせず、患者負担の軽い治療法である。【００１６】
以下の実施例に示されるように、局所進行再発頭頸部扁平上皮癌に対してＨＳＶ−１  ＨＦ１０を局所投与したところ、ＨＦ１０の投与により軽度の発熱が起きた可能性があるが、他は明らかな副作用は認めなかった。癌細胞が壊死した部分に一致してＨＦ１０の感染が確認され、ＨＦ１０の抗腫瘍効果がヒトにおいても確認できた。【００１７】
本発明の変異単純ヘルペスウイルスを有効成分とする医薬組成物は、非常に弱毒化されており、その神経毒性は非常に低下しているので、患者における副作用はほとんど生じないであろうと考えられる。万一、若干の有害な事象が生じたとしても、弱毒化ヘルペスウイルスはアシクロビルやガンシクロビル等の抗ヘルペス剤に高度な感受性をもつため、安全のために患者にこのような薬剤を投与することが可能である。【００１８】
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００５−１２３７７６号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。【００１９】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００２０】
ＨＳＶ−１  ＨＦ１０の作成
ワクチン製造用のＳＰＦ鶏受精卵を用い、ニワトリ胎児初代培養細胞を宿主細胞としてウイルスを感染させ、迷入ウイルスの存在が否定されている牛血清、カナマイシンを加えた培養液で培養した。ウイルスはマスターウイルスバンクをMOI0.01pfu/cellで感染させ、無血清下に２４時間培養後、培養上清を回収した。培養されたウイルスに対し、日本薬局方一般試験法の無菌試験法、マイコプラズマ否定試験法に乗っ取った無菌検査を行った。また、外来性ウイルスを否定するためにHIV、EBV、CMV、HBVについてはPCR法にて否定試験を行い、さらに発熱性試験およびエンドトキシン試験も行った。1x106pfu/mlのウイルス溶液を調整し、-80℃に貯蔵した。投与時には、ウイルス溶液を1x104pfu/mlに希釈して使用した。【００２１】
投与方法
１回104-105/mlのHF10を数箇所にわけて原発病巣、またはリンパ節転移病巣内に注入した。３日間連続で３回同じ部位に注入を行った。被験者の定量的グロブリン、白血球分画、血小板、凝固能、生化学検査一般、抗HSV抗体価、腫瘍マーカー、クレアチニンクリアランス、免疫学的検査を週に２回、２ヶ月にわたり実施した。なお、効果判定は「固形癌化学療法直接効果判定基準」を参考にし、評価指標に基づいて判定した。摘出組織について、浸潤単核球細胞の同定と免疫組織化学的検討を行った。【００２２】
症例１
58歳男性、下咽頭癌再発rT4N2cM1
既往歴：特記すべきものなし。
現病歴：2003年2月頃より嚥下困難、疼痛、嗄声出現。前医にて化学療法・放射線治療を受けたのちの再発し、その後手術を６度にわたり受けるも治癒せず、咽頭皮膚瘻も形成。左鎖骨上皮膚にも転移増大してきた。2004年7月13日よりHSV  HF10による治療を開始した。【００２３】
1×104PFUのHF10を鎖骨上皮膚転移巣（40x33x28mm）に対して３日間連続局所投与した。投与後２日目より１０日間、３７度台の発熱が継続したが、その後沈静化した。そのほかには特記すべき有害事象はみとめなかった。治療の経過を図２に示す。【００２４】
腫瘍の大きさは７日後に45x40x38mm、15日後に55x44x34mm、21日後には55x50x33mmと増大傾向を認め、臨床的効果判定ではPD（進行）と評価された。病理学的検討を図３に示す。１：ＨＥ染色、２：ＨＳＶ−１免疫染色、３：ネガティブコントロール。ウイルス抗原は証明できなかったものの、病理学的には局注部分には腫瘍細胞壊死部分が認められ、非局注部と比べて目立っており、これはHF10による効果の可能性が高いと考えられる。【００２５】
症例２
79才女性。舌癌再発rT0N2bM0
2003年11月初旬から舌痛。2004年１月に舌癌T2N1M0と診断され、動注化学療法、放射線治療を受けたが、2004年8月に頸部再発を来たした。手術不能であったため動注化学療法併用放射線治療をうけたが腫瘍残存あり。【００２６】
2004年１１月にHSV  HF10による治療を開始した。この時点において、左上内深頸リンパ節転移は頸動脈、皮膚に浸潤し、頤下皮膚に19×10mmの皮膚転移を認めた。HF10を1×105PFUを一日一回、頤下皮膚転移巣にたいして３日連続で局所投与した（合計３×105PFU）。【００２７】
３日目より37.5度-38度の発熱を７日間認めたが、その後は解熱した。本症例は舌癌頸部転移による口腔底及び喉頭の浮腫が高度に認められたため、嚥下障害を生じており、試験１１日目に誤嚥性肺炎を併発した。そのため試験14日目に緊急気管切開施行し、同時に頤下皮膚転移巣を摘出した。治療の経過を図４に示す。【００２８】
摘出時の腫瘍径は20×12mmであった。臨床的効果判定はNC（不変）と評価された。病理標本中には壊死部分を多く認め、そこではエオジン好性で核が不明瞭になるか消失している所見を認めた。また、多核細胞の出現と炎症細胞の浸潤を認めた（図５）。さらに抗HSV-1抗体を用いた免疫染色を施行すると、壊死部に一致してHSVの存在が証明された（図６）。一方、HF10の感染していない部分では分裂細胞を多く認め、活発に増殖している癌組織が認められた（図７）。【００２９】
臨床試験中の同時期に他の転移巣は明らかな増大傾向を認めていたが、局所注射部位では増殖が抑えられていた。摘出標本の病理学的検討から、局注した部位に壊死部分に一致してHSV抗体が認められたことから、ヒト頭頸部扁平上皮癌において、HF10によって癌細胞が壊死することが確認された。すなわち、HF10の抗腫瘍効果がヒトにおいて確認できた。【００３０】
症例３
64才男性。下咽頭扁平上皮癌（rT0N2cM1）
頸部切開により喉頭下咽頭を部分摘出し、化学療法および放射線療法を行った。その後再発し、頚部リンパ節ならびに頚部，前胸部，および鎖骨上領域の皮膚への転移が認めあれた（rT0N3M1）。治療開始時における皮膚転移巣の大きさは0.9×0.9cmであった。HF10（1×105PFU/0.5ml）を皮膚転移巣に１日に１回、３日間注入した。注入後数日間、軽度の発熱があった。試験中、他の臨床知見の変化は認められなかった。注入部位の結節の寸法を測定し、接種から１５日目にこれを切除した。切除時の皮膚転移巣の大きさは0.８×0.9cmであった。一方、非注入部の結節は急速に増大していた。標本を10%バッファ加パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンブロックに包埋し、切片を作成した。HSV-1に対するポリクローナル抗体およびCD4またはCD8に対するモノクローナル抗体を用いて免疫染色を行った。抗HSV  IgGおよびIgMのタイターには変化がなかった。切除した皮膚転移巣の病理検査により、腫瘍細胞の壊死および線維組織の形成が認められた。興味深いことに、ほとんどのHF10感染腫瘍細胞は明確な核を有していなかった。HF10を注入した小結節では、CD4ポジティブまたはCD8ポジティブ細胞の浸潤は未処理の小結節よりはるかに多かった。さらに、抗HSV-1を用いた免疫組織化学染色により、扁平上皮癌にウイルスが感染していることが確認できた。すなわち、ヒト頭頸部扁平上皮癌において、HF10感染と一致して、癌細胞が壊死することが確認された。【００３１】
なお、症例１−３のいずれもHF10投与後１週間の微熱が持続した。HF10投与の影響であることは否定できないが、患者が苦痛を訴えることはなかった。そのほか、血液生化学的にあるいはウイルス抗体価の変動などの点では副作用は認めなかった。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明の弱毒化変異単純ヘルペスウイルスを有効成分とする医薬組成物は、ヒトの頭頚部癌の治療に有効である。
【図４】
2006115170.tif 000002
【図１】
2006115170.tif 000003
【図２】
2006115170.tif 000004
【図３】
2006115170.tif 000005
【図５】
2006115170.tif 000006
【図６】
2006115170.tif 000007
【図７】
2006115170.tif 000008
【国際調査報告】
2006115170.tif 000009
2006115170.tif 000010
2006115170.tif 000011
2006115170.tif 000012
2006115170.tif 000013
2006115170.tif 000014
2006115170.tif 000015
2006115170.tif 000016