(57)【要約】  本発明の課題は、組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患の重症化の可能性を予測する新規な方法を提供することである。  上記課題を解決するため、本発明では、免疫機能の制御に関与するサイトカイン及びサイトカイン受容体の遺伝子の一塩基多型を検出し、該一塩基多型のアレル又はゲノタイプに基づき、組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患の重症化の可能性を予測する方法、及び、組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患の重症化の可能性を予測するためのキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫機能の制御に関与するサイトカイン又はサイトカイン受容体の遺伝子における一塩基多型を検出し、該一塩基多型のアレル又はゲノタイプに基づき、組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患の重症化の可能性を予測する方法。
【請求項２】
前記一塩基多型が、免疫機能の制御に関与するサイトカインの遺伝子における一塩基多型である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サイトカイン又はサイトカイン受容体が、インターフェロン−γ(IFN-γ)、インターロイキン−２(IL-2)、インターロイキン−１０(IL-10)、インターロイキン−４(IL-4)、インターロイキン−６(IL-6)、インターロイキン−１２(IL-12)、インターロイキン−１３（IL-13）、インターロイキン−１８（IL-18）、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）β１、インターフェロン−γレセプター１からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記一塩基多型が、
ＩＦＮ−γの第一イントロンに存在する＋８７４番目（配列番号１に示す塩基配列の１３４８番目）の一塩基多型、
ＩＬ−２のpromoterに存在する−３３０番目の一塩基多型（配列番号２に示す塩基配列の７４番目）、
ＩＬ−１０の5'flanking region (promoter region)に存在する−１１１７、−８５４、−６２７番目（それぞれ、配列番号３に示す塩基配列の２９４０、３２０３、３４３０番目）の一塩基多型、
ＩＬ−１０のpromoter regionに存在する−２８４９番目の一塩基多型、（配列番号３に示す塩基配列の１２０８番目）
ＩＬ−４のopen reading frameに存在する−５９０番目の一塩基多型、
ＩＬ−６のpromoterに存在する−１７４番目の一塩基多型、
ＩＬ−１２ｐ４０（ＩＬ−１２Ｂ）の３’非転写領域に存在するACCESSION AY008847の１６９７４番目の一塩基多型、
ＩＬ−１３のpromoterに存在する−１０５５番目の一塩基多型、
ＩＬ−１８のpromoterに存在する−１３７番目および−６０７番目の一塩基多型、
ＴＧＦβ１のpromoterに存在する−５０９番目の一塩基多型、
ＩＦＮ−γレセプター１のminimal promoter regionに存在する−６１１番目の一塩基多型
（ここで、アミノ酸転写領域(coding region)の開始点となる塩基を＋１番目として、開始点より３’末端方向に位置する場合には＋、開始点より５’末端方向に位置する場合には−と定義する。但し、ＩＬ−１２ｐ４０（ＩＬ−１２Ｂ）については、ACCESSION AY008847 の最初の塩基を＋１番目とする。）からなる群より選択される少なくとも１種の一塩基多型である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記一塩基多型が、ＩＦＮ−γの第一イントロンに存在する＋８７４番目の一塩基多型である（ここで、＋８７４番目の塩基とは、アミノ酸転写領域(coding region)の開始点となる塩基を＋１番目として３’末端方向へ８７４番目に位置する塩基であり、配列番号１に示す塩基配列の１３４８番目の塩基に相当する）、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患が、橋本病、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、１型糖尿病である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＡＲＭＳ  ＰＣＲ法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、シークエンス法、サザンハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法、ＬＡＭＰ法、及びオリゴチップ法からなる群より選択される少なくとも１つの方法により前記一塩基多型を検出する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ＩＦＮ−γの第一イントロンに存在する＋８７４番目の一塩基多型のゲノタイプに基づき、橋本病の重症化の可能性を予測する方法であって、ここで、
該ゲノタイプがTTである場合、重症化の可能性が非常に高く、
該ゲノタイプがATである場合、重症化の可能性が高く、
該ゲノタイプがAAである場合、重症化と軽症化の可能性が同程度である、
と予測する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ＩＦＮ−γの第一イントロンに存在する＋８７４番目の一塩基多型のTアレルの有無に基づき、橋本病の重症化の可能性を予測する方法であって、ここで、
Tアレルが存在する場合、重症化の可能性が高く、
Tアレルが存在しない場合、重症化と軽症化の可能性が同程度である、
と予測する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患の重症化の可能性を予測するための、配列番号４に示す塩基配列を有するプライマー及び配列番号６に示す塩基配列を有するプライマーのペア、並びに、配列番号５に示す塩基配列を有するプライマー及び配列番号６に示す塩基配列を有するプライマーからなるプライマーのペア、から成る群より選択される少なくとも１種のプライマーペア。
【請求項１１】
免疫機能の制御に関与するサイトカイン又はサイトカイン受容体の一塩基多型を検出するためのプライマーペア、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅを備える、組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患の重症化の可能性を予測するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主に、組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患の重症化の可能性を予測するための方法、及び、組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患の重症化の可能性を予測するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
自己抗原に対する免疫学的自己寛容が破綻して生じる様々な自己免疫疾患が存在する。自己免疫疾患を、組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患と、組織破壊によらずに機能障害を来たす自己免疫疾患とに大別すると、前者としては、例えば、橋本病、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、1型糖尿病、リンパ球性下垂体炎、特発性アジソン病、シェーグレン症候群、全身性強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性水疱症等が挙げられ、一方、後者としては、バセドウ病、重症筋無力症等が挙げられる。【０００３】
ところで、近年、ゲノムにおける一塩基多型の一部には、免疫に関与するサイトカインやサイトカイン受容体の産生能・発現量・構造（活性）に影響を与えて、遺伝子の機能に影響を与える一塩基多型が存在することが示唆された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患の重症化の可能性を予測する手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患の重症化の可能性を予測するための手段を提供すべく鋭意研究を行った。その結果、本発明者らは、免疫機能の制御に関与するサイトカイン又はサイトカイン受容体の遺伝子における一塩基多型のアレル又はゲノタイプが、組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患の重症患者と機能障害を来たさない軽症患者との間で異なる傾向を示すことを見出した。そして、本発明者らは、かかる免疫機能の制御に関与するサイトカイン又はサイトカイン受容体の遺伝子における一塩基多型のアレル又はゲノタイプに基づき、組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患の重症化の可能性を予測することができることを見出した。本発明者らは、さらに、組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患であり、重症化した場合に甲状腺機能低下症を発症する橋本病の患者においてこれを確認した。本発明は、かかる知見に基づいて完成するに至ったものである。【０００６】
即ち、本発明は、以下の事項に関する。
［項１］免疫機能の制御に関与するサイトカイン又はサイトカイン受容体の遺伝子における一塩基多型を検出し、該一塩基多型のアレル又はゲノタイプに基づき、組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患の重症化の可能性を予測する方法。
［項２］前記一塩基多型が、免疫機能の制御に関与するサイトカインの遺伝子における一塩基多型である、項１に記載の方法。
［項３］前記サイトカイン又はサイトカイン受容体が、インターフェロン−γ(IFN-γ)、インターロイキン−２(IL-2)、インターロイキン−１０(IL-10)、インターロイキン−４(IL-4)、インターロイキン−６(IL-6)、インターロイキン−１２(IL-12)、インターロイキン−１３（IL-13）、インターロイキン−１８（IL-18）、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）β１、インターフェロン−γレセプター１からなる群より選択される少なくとも一種である、項１又は２に記載の方法。
［項４］前記一塩基多型が、
ＩＦＮ−γの第一イントロンに存在する＋８７４番目（配列番号１に示す塩基配列の１３４８番目）の一塩基多型、
ＩＬ−２のpromoterに存在する−３３０番目の一塩基多型（配列番号２に示す塩基配列の７４番目）、
ＩＬ−１０の5'flanking region (promoter region)に存在する−１１１７、−８５４、−６２７番目（それぞれ、配列番号３に示す塩基配列の２９４０、３２０３、３４３０番目）の一塩基多型、
ＩＬ−１０のpromoter regionに存在する−２８４９番目の一塩基多型、（配列番号３に示す塩基配列の１２０８番目）
ＩＬ−４のopen reading frameに存在する−５９０番目の一塩基多型、
ＩＬ−６のpromoterに存在する−１７４番目の一塩基多型、
ＩＬ−１２ｐ４０（ＩＬ−１２Ｂ）の３’非転写領域に存在するACCESSION AY008847の１６９７４番目の一塩基多型、
ＩＬ−１３のpromoterに存在する−１０５５番目の一塩基多型、
ＩＬ−１８のpromoterに存在する−１３７番目および−６０７番目の一塩基多型、
ＴＧＦβ１のpromoterに存在する−５０９番目の一塩基多型、
ＩＦＮ−γレセプター１のminimal promoter regionに存在する−６１１番目の一塩基多型
（ここで、アミノ酸転写領域(coding region)の開始点となる塩基を＋１番目として、開始点より３’末端方向に位置する場合には＋、開始点より５’末端方向に位置する場合には−と定義する。但し、ＩＬ−１２ｐ４０（ＩＬ−１２Ｂ）については、ACCESSION AY008847 の最初の塩基を＋１番目とする。）からなる群より選択される少なくとも１種の一塩基多型である、項１〜３のいずれかに記載の方法。
［項５］前記一塩基多型が、ＩＦＮ−γの第一イントロンに存在する＋８７４番目の一塩基多型である（ここで、＋８７４番目の塩基とは、アミノ酸転写領域(coding region)の開始点となる塩基を＋１番目として３’末端方向へ８７４番目に位置する塩基であり、配列番号１に示す塩基配列の１３４８番目の塩基に相当する）、項４に記載の方法。
［項６］前記組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患が、橋本病、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、１型糖尿病である、項１〜５のいずれかに記載の方法。
［項７］ＡＲＭＳ  ＰＣＲ法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、シークエンス法、サザンハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法、ＬＡＭＰ法、及びオリゴチップ法からなる群より選択される少なくとも１つの方法により前記一塩基多型を検出する、項１〜６のいずれかに記載の方法。
［項８］ＩＦＮ−γの第一イントロンに存在する＋８７４番目の一塩基多型のゲノタイプに基づき、橋本病の重症化の可能性を予測する方法であって、ここで、
該ゲノタイプがTTである場合、重症化の可能性が非常に高く、
該ゲノタイプがATである場合、重症化の可能性が高く、
該ゲノタイプがAAである場合、重症化と軽症化の可能性が同程度である、
と予測する、項１〜７のいずれかに記載の方法。
［項９］ＩＦＮ−γの第一イントロンに存在する＋８７４番目の一塩基多型のTアレルの有無に基づき、橋本病の重症化の可能性を予測する方法であって、ここで、
Tアレルが存在する場合、重症化の可能性が高く、
Tアレルが存在しない場合、重症化と軽症化の可能性が同程度である、
と予測する、項１〜７のいずれかに記載の方法。
［項１０］組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患の重症化の可能性を予測するための、配列番号４に示す塩基配列を有するプライマー及び配列番号６に示す塩基配列を有するプライマーのペア、並びに、配列番号５に示す塩基配列を有するプライマー及び配列番号６に示す塩基配列を有するプライマーからなるプライマーのペア、から成る群より選択される少なくとも１種のプライマーペア。
［項１１］免疫機能の制御に関与するサイトカイン又はサイトカイン受容体の一塩基多型を検出するためのプライマーペア、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅを備える、組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患の重症化の可能性を予測するためのキット。【０００７】
以下、本発明をより詳細に説明する。【０００８】
本発明では、基本的に、免疫機能の制御に関与するサイトカイン又はサイトカイン受容体の遺伝子における一塩基多型を検出し、その一塩基多型のアレル又はゲノタイプに基づき、組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患の重症化の可能性を予測する。【０００９】
組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患
自己免疫疾患を、組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患と組織破壊によらずに機能障害を来たす自己免疫疾患とに大別すると、本発明では、組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患を対象とする。【００１０】
本発明において、組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患としては、組織の少なくとも一部が破壊され且つそれにより何らかの機能障害を来たす自己免疫疾患であれば特に限定されない。【００１１】
破壊が起こる組織は、疾患によって異なるので特に限定しないが、例えば、神経組織、内分泌組織（例えば、甲状腺、下垂体、副甲状腺、副腎皮質、卵巣、精巣、膵臓ランゲルハンス島など）、外分泌組織（唾液腺、涙腺など）、肝臓、腎臓、皮膚、筋肉、骨、軟骨、血管、などである。【００１２】
組織破壊は、サイトカインなどの免疫調節因子によって制御される免疫学的組織障害機序によって生じる。多くの場合、炎症性細胞浸潤、組織細胞破壊、線維化、などを伴って起こる。【００１３】
本発明における「組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患」の具体例としては、例えば、橋本病、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、１型糖尿病、リンパ球性下垂体炎、特発性アジソン病、シェーグレン症候群、全身性強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性水疱症等、好ましくは、橋本病、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、1型糖尿病、さらに好ましくは、橋本病が挙げられるが、これらに限定されない。【００１４】
組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患の代表例について、以下に簡単に説明する。詳細については、今日の診療プレミアム Vol.13 DVD-ROM版 (C)2003 医学書院（東京）を参照のこと。
橋本病
橋本病（Hashimoto's disease）は、甲状腺に炎症性細胞浸潤が生じて甲状腺組織が徐々に破壊されていく甲状腺特異的な慢性疾患である。橋本病の初期症状は軽く、自覚症状は殆ど無いか又は甲状腺に僅かな腫れを生じる程度であるが、病態が進行するにつれて、甲状腺組織の破壊が進行して甲状腺ホルモンレベルの低下や甲状腺刺激ホルモンレベルの上昇が起こり、甲状腺機能低下症を発症する場合がある。甲状腺機能低下症による諸症状としては、感覚機能の低下、精神感情の鈍麻、筋力低下、脈拍低下、新陳代謝の低下、脱毛、皮膚乾燥、嗄声、月経不順、便秘、コレステロールの上昇等が挙げられる。甲状腺機能低下症を発症した患者は、感覚機能低下や精神感情鈍麻を生じるため、早期発見が遅れる傾向にある。甲状腺機能低下症が重症になると致死的な粘液水腫昏睡に陥る。また、甲状腺機能低下症が軽度であっても、その低下症が長期間にわたると、心筋梗塞や狭心症等の重大な二次的疾患を招きやすくなるので、甲状腺機能低下症を早期に発見し、甲状腺機能回復の為の適切な治療（通常、サイロキシン等の甲状腺ホルモン剤の補充療法）を行うことが重要である。【００１５】
橋本病は、軽症例を含めると約12人に1人の割合でみられる非常に症例数の多い疾患であるが、橋本病患者のうち約60％〜約70％は、生涯に渡り軽症のままであり、前記のような甲状腺機能低下症を発症しない。それにも拘らず、従来の診断方法では甲状腺機能低下症を発症するか否かを予測することができないため、橋本病と診断された患者は、半年〜1年に一回程度の定期検査による経過観察を続けているのが現状である。また、1回の定期検診の費用は高額であり、約1000万人の医療費は、患者にとっては勿論、国にとっても大きな負担となっている。【００１６】
橋本病の従来の診断は、通常、橋本病診断のガイドラインに従って行われる（網野信行，ほか：甲状腺疾患診断ガイドライン．ホルモンと臨床50:643-563,2002）。基本的には、血清中の抗甲状腺ミクロソーム抗体又は抗甲状腺ペルオキシダーゼ(TPO)抗体の測定、抗サイログロブリン(Tg)抗体の測定、細胞診によるリンパ球浸潤の観察による検査所見と、びまん性甲状腺腫大の観察による臨床所見とに基づいて行われる。橋本病であると診断された患者は、更に、通常、血清サイロキシン(T4)濃度の測定、血清3，5，3’−トリヨードサイロニン(T3)濃度の測定、血清甲状腺刺激ホルモン(TSH)濃度の測定等の甲状腺機能検査を受ける。【００１７】
甲状腺機能検査の結果、甲状腺機能低下症を発症している場合、すぐに治療が開始される。一方、甲状腺機能低下症を発症していない場合、上記甲状腺機能検査を定期的に行い、経過観察を続ける（網野信行，ほか：甲状腺疾患診断ガイドライン．ホルモンと臨床50:643-563,2002、及び、内科学［第八版］IV  内分泌・代謝・血液・神経(朝倉書店),2003を参照）。【００１８】
慢性関節リウマチ
慢性関節リウマチ（RA）とは、骨の破壊を特徴とする慢性の多関節炎である。病態は、関節滑膜組織の炎症と増殖を特徴とし、マクロファージ、リンパ球、形質細胞の浸潤が著しい。滑膜下基質結合組織は、増殖性及び侵襲性が高く、肉芽組織となって骨を破壊する。【００１９】
多発性硬化症
多発性硬化症（MS）は、中枢神経組織（主に、白質）の炎症性脱髄性疾患である。原因の１つとして自己免疫反応が検討され、髄鞘抗原に対する免疫反応の亢進が重要であると考えられている。最近は、急性期や再発期における腫瘍壊死因子-α（TNF-α）、インターフェロン-γ（IFN-γ）、インターロイキン2（IL-2）の増加の報告がなされている。【００２０】
1型糖尿病
1型糖尿病は、インスリン作用が不足し、血中グルコース濃度の慢性的な上昇をきたす症候群である。原因としては、飲酒やウイルス感染等による膵β細胞の障害、遺伝素因等の複合的因子によるインスリン分泌障害やインスリン感受性低下が考えられる。【００２１】
リンパ球性下垂体炎
リンパ球性下垂体炎は、下垂体にリンパ球浸潤を伴う炎症が生じ、下垂体前葉ホルモンの分泌障害を引き起こす疾患である。ACTH、甲状腺刺激ホルモン（TSH）、ゴナドトロピンの分泌低下により、それぞれ、続発性の副腎皮質機能低下症、甲状腺機能低下症、性腺機能低下症が生じる。障害されるホルモンの組合せにより、種々の病態を生じる。【００２２】
特発性アジソン病
特発性アジソン病は、副腎皮質の旧上層・束状層・網状層の90％以上が破壊された、慢性の副腎皮質機能低下症である。抗副腎抗体が陽性である症例があることなどから、自己免疫機序の関与が考えられている。【００２３】
シェーグレン症候群
シェーグレン（Sjoegren）症候群とは、唾液腺及び涙腺の慢性炎症、口腔及び眼の乾燥症状を特徴とする自己免疫疾患である。病理学的には、唾液腺・涙腺におけるリンパ球浸潤を特徴とし、腺房の破壊や線維化をきたす。腺組織以外でも全身的にBリンパ球の活性化、γ-グロブリンの上昇、自己抗体の産生がみられる。【００２４】
全身性硬化症（強皮症）
全身性硬化症（SSc）は、免疫異常を背景に、全身の結合組織の炎症と増生を基盤として、皮膚の硬化と小血管の障害を主徴とする慢性疾患である。各種自己抗体がみられ、皮膚硬化初期には病変部位にT細胞の浸潤がみられる。また、サイトカイン、特に、形質転換増殖因子（TGF-β）が線維化に関与していると考えられている。【００２５】
多発性筋炎・皮膚筋炎
多発性、対称性に横紋筋の炎症を起こす疾患を多発性筋炎（PM）といい、これに皮膚の炎症が加わった疾患を皮膚筋炎（DM）と呼ぶ。PMでは、筋線維間に炎症細胞の浸潤があるが、これは主にCD8陽性の細胞傷害性T細胞である。DMでは、筋線維の病変はPMよりも軽度で、血管周囲にB細胞、CD4陽性のT細胞主体の細胞浸潤がみられ、補体の沈着も認められる。血管炎の色彩がPMよりも濃く、これが皮膚の紅斑や皮膚潰瘍にも反映されると思われる。【００２６】
自己免疫性肝炎
自己免疫性肝炎（AIH）は、女性に好発し、早期に肝硬変への進展傾向を示す慢性活動性肝炎で、その病因として自己免疫機序の関与が考えられる。血清トランスアミナーゼの上昇、抗核抗体（ANA）、抗平滑筋抗体などの自己抗体陽性、γ-グロブリン高値などの特徴を有する。病態として、自己免疫機序により肝細胞がリンパ球に破壊されると考えられている。一方、遺伝的素因も認められ，欧米ではHLA-DR3、わが国ではDR4をもつ症例が多い。慢性関節リウマチ（RA）、Sjoegren（シェーグレン）症候群、慢性甲状腺炎など、他の自己免疫性疾患を伴うこともある。【００２７】
自己免疫性水疱症
自己免疫性水疱症の患者は、表皮基底膜に存在する係留線維（anchoring fibril）の主成分であるVII型コラーゲンに対する自己抗体を有する。皮膚、粘膜に水疱を形成し、稗粒腫や瘢痕を残す傾向がある。また、in vivoでのIgGの線状沈着が表皮基底膜にみられる。免疫ブロットや免疫電顕により、診断の確実性が上がる。【００２８】
免疫機能の制御に関与するサイトカイン又はサイトカイン受容体
サイトカインは、細胞から放出される因子で、免疫機能（免疫応答）の制御、抗腫瘍作用、抗ウイルス作用、細胞増殖・分化の調節などの働きをもつ物質の総称である。本発明では、これらの中でも特に、免疫機能の制御に関与するサイトカイン又はその受容体の遺伝子の一塩基多型を検出する。【００２９】
免疫機能の制御に関与するサイトカインとしては、例えば、インターフェロン-γ(IFN-γ)、インターロイキン-2(IL-2)、インターロイキン-10(IL-10)、インターロイキン-4(IL-4)、インターロイキン-12(IL-12)、インターロイキン-6(IL-6)、インターロイキン-13（IL-13）、インターロイキン-18（IL-18）、腫瘍増殖因子β1（形質転換成長因子β1、TGFβ1）、特に好ましくは、IFN−γ、IL-２、IL-10が挙げられるが、これら以外の免疫機能の制御に関与するサイトカインも同様に本発明において用いることができる。【００３０】
また、免疫機能の制御に関与するこれらのサイトカインの受容体としては、前記サイトカインの受容体、例えば、IFN-γレセプター１、IL-2レセプター、IL-12レセプターなどが挙げられる。【００３１】
一塩基多型
本発明における一塩基多型としては、上記サイトカイン又はサイトカイン受容体の遺伝子に存在し、且つ、組織破壊による機能障害を来たす自己免疫疾患の重症化において、一方のアレルと他方のアレルとの間で有意に異なる傾向を示すものであれば特に限定されない。また、本発明において複数の一塩基多型を組み合わせて検出する場合には、個々の一塩基多型が有意に異なる傾向を示さなくても、複数の一塩基多型の組み合わせが有意に異なる傾向を示せば足りる。つまり、個別には有意差を示さないが、組み合わせたときに有意差を示す一塩基多型についても、本発明における一塩基多型に含まれる。【００３２】
近年、ヒトIFN-γの第一イントロンに存在する874番目の一塩基多型(Single Nucleotide Polymorphism: SNP)がチミジン（T）である場合、リンパ球のIFN-γの産生能が高いことが示された（Human Immunology 61: 863-866, 2000）。【００３３】
なお、健常者におけるIFN-γの第一イントロンの874番目の一塩基多型のアレルは、人種により異なる傾向を示すことが示唆されている。例えば、南アフリカ人では平均A:T=約7:3であり、イタリア系白人では平均A:T=約5:4であること（Govan VA et. al. J Carcinog. 2003 May 16;2(1):3-7）、あるいはシチリア人では平均A:T=約1:1であるとの報告がなされている（Lio D et.al. Eur J Immunogenet. 2002 Oct;29(5):371-4.を参照のこと）。【００３４】
IL-2については、ヒトIL-2のプロモーターに存在する-330番目の一塩基多型がグアニン（G）である場合、リンパ球のIL-2の産生能がチミジン（T）の場合より高いことが示された。（Hoffmann SC, et.al, Transplantation 72巻8号、p.1444-1450, 2001年、及び、Matesanz F, et.al, Journal of Neuroimmunology 148巻、p.212-217, 2004年）。【００３５】
IL-10については、ヒトIL-10の5' flanking region (promoter region)に存在する-1117, -854, -627番目の一塩基多型がそれぞれグアニン（G）、シトシン(C)、シトシン（C）である場合、リンパ球のIL-10の産生能がそのほかの多型の場合より高いことが示された（Turner, DM, et.al, Eur J Immunogenet, 24巻1号、p.1-8, 1997年、及び、Edward-Smith, CJ et al, Hepatology 30巻2号、p.526-530, 1999年）。【００３６】
そこで、本発明者らは、これらのサイトカインの一塩基多型に着目して、これらの一塩基多型と組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患の重症化との関係を調べたところ、驚くべきことに、一塩基多型が特定のアレルである場合に重症化が起こりやすいことを見出した。【００３７】
本発明における一塩基多型の例として、以下のものが挙げられる：
IFN-γの第一イントロンに存在する＋874番目（配列番号１に示す塩基配列の1348番目、ACCESSION J00219の1348番目）の一塩基多型、
IL-2のpromoterに存在する-330番目（配列番号２に示す塩基配列の74番目、ACCESSION AJ006884の74番目）の一塩基多型、
IL-10の5' flanking region (promoter region)に存在する-1117, -854, -627番目（それぞれ、配列番号３に示す塩基配列の2940、3203、3430番目、ACCESSION U16720の2940、3203、3430番目）の一塩基多型、
IL-10のpromoter regionに存在する-2849番目（配列番号３に示す塩基配列の1208番目、ACCESSION U16720の1208番目）の一塩基多型、
IL-4のopen reading frameに存在する-590番目（ACCESSION AF395008の11903番目）の一塩基多型、
IL-6のpromoterに存在する-174番目（ACCESSION AF372214の1510番目）の一塩基多型、
IL-12p40(IL-12B)の3'非転写領域に存在するACCESSION AY008847の16974番目の一塩基多型、
IL-13のpromoterに存在する-1055番目（ACCESSION AF377331の693番目）の一塩基多型、
IL-18のpromoterに存在する-137番目および-607番目の一塩基多型（IL-18のpromoter の遺伝子配列については、 Giedraitis V, He B, Huang WX, Hillert J. Cloning and mutation analysis of the human IL-18 promoter: a possible role of polymorphisms in expression regulation. J Neuroimmunol. 2001 Jan 1;112(1-2):146-52を参照のこと）、
TGFβ1のpromoterに存在する-509番目（ACCESSION J04431の854番目）の一塩基多型（TGFβ1のpromoter の遺伝子配列については、Silverman ES, Palmer LJ, Subramaniam V, Hallock A, Mathew S, Vallone J, Faffe DS, Shikanai T, Raby BA, Weiss ST, Shore SA. ransforming growth factor-beta1 promoter polymorphism C-509T is associated with asthma.  Am J Respir Crit Care Med. 2004 Jan 15;169(2):214-9. Epub 2003 Nov 03.を参照のこと）、
IFN-γレセプター１のminimal promoter regionに存在する-611番目（ACCESSION AY594694の1433番目）の一塩基多型、である。
ここで、アミノ酸転写領域（coding region）の開始点となる塩基を＋１番目として、開始点より３’末端方向に位置する場合には＋、開始点より５’末端方向に位置する場合には−と定義する。但し、IL-12p40(IL-12B)については、ACCESSION AY008847 の最初の塩基を＋１番目とする。また、本明細書において、「ACCESSION」の後ろのアルファベット及び数字は、GenBank 、DDBJ及びEMBLから配列データを入手するためのアクセッションナンバーである。また、個体によって一塩基多型の位置が若干異なっている場合があるが、このように個体差により異なる位置に存在する一塩基多型についても、上記の一塩基多型に相当する一塩基多型であれば、本発明の一塩基多型に含まれる。【００３８】
特に好ましくは、IFN-γの第一イントロンに存在する＋874番目の一塩基多型、IL-2のpromoterに存在する-330番目の一塩基多型、又は、IL-10の5'flanking region (promoter region)に存在する-1117番目の一塩基多型が挙げられるが、これら以外の一塩基多型についても、本発明において同様に用いることができる。【００３９】
本発明では、一塩基多型を下記の方法で検出する。【００４０】
一塩基多型の検出方法
一塩基多型を検出するための方法としては、特に制限されないが、例えば、ARMSPCR(Amplification Refractory Mutation System Polymerase Chain Reaction)（Vera Pravica et al. Human Immunology 61: 863-866, 2000を参照のこと）、PCR-RFLP（PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism）（PCR Tips、真木寿治監修、秀潤社、1997年12月1日発行、pp.80−85を参照のこと）、TaqMan PCR(TaqMan Polymerase Chain Reaction)(SNP遺伝子多型の戦略、松原謙一監修、中山書店、2000年6月30日発行、pp.94-105を参照のこと)、Invader法(SNP遺伝子多型の戦略、松原謙一監修、中山書店、2000年6月30日発行、pp.94-105を参照のこと)、MALDI-TOF/MS（matrix assisted laser desorption-time of flight/ mass spectrometry）(SNP遺伝子多型の戦略、松原謙一監修、中山書店、2000年6月30日発行、pp.106-117を参照のこと) 、シークエンス法（PCR Tips、真木寿治監修、秀潤社、1997年12月1日発行、pp.63−65を参照のこと）、サザンハイブリダイゼーション法（バイオ実験イラストレイテッド第2巻  遺伝子解析の基礎、中山広樹・西方敬人著、秀潤社、1998年3月25日発行pp.137-152を参照のこと）、PCR-SSCP法（PCR Tips、真木寿治監修、秀潤社、1997年12月1日発行、pp.74−79を参照のこと）、PCR-CFLP法（PCR Tips、真木寿治監修、秀潤社、1997年12月1日発行、pp.86−94を参照のこと）、LAMP法（BIO INDUSTRY, Vol.18, No.2, 15-23, 2001を参照のこと、或いは、栄研化学（株）から入手可能なキットを使用のこと）、又はオリゴチップ法（SNP遺伝子多型の戦略、松原謙一監修、中山書店、2000年6月30日発行、pp.128-135を参照のこと）等の慣例的な手法が用いられる。【００４１】
自己免疫疾患の重症化
本発明において、「軽症」とは、自己免疫疾患に罹患しているが組織の機能障害を発症していない状態を意味する。【００４２】
本発明において、「重症」とは、自己免疫疾患に罹患し且つ組織の機能障害を発症している状態を意味する。【００４３】
自己免疫疾患の「重症化」とは、自己免疫疾患に罹患しているが組織の機能障害を発症していない状態から、自己免疫疾患に罹患し且つ組織の機能障害を発症している状態への変化をいう。【００４４】
自己免疫疾患に罹患しているか否かは、疾患によって異なる慣例的な検査により判定することができる。被験者が自己免疫疾患に罹患している場合、通常、自己免疫疾患の標的臓器に特異的な自己抗体が血清中で検出されるようになり、また自己免疫疾患の標的臓器の組織中に炎症性細胞浸潤が確認される。詳細については、例えば、本書においてその全体が援用される「今日の診療プレミアムVol.13 DVD-ROM版 (C)2003 医学書院（東京）」を参照のこと。
【００４５】
組織の機能障害を発症しているか否かについては、疾患によって異なる慣例的な検査により判定することができる。例えば、橋本病の場合には甲状腺機能の低下、慢性関節リウマチの場合には関節の変形や疼痛等の病態観察により判定することができる。病態観察の結果、これらの病態がみられた場合、組織の機能障害を発症していると判断する。詳細については、例えば、本書においてその全体が援用される「今日の診療プレミアムVol.13 DVD-ROM版 (C)2003 医学書院（東京）」を参照のこと。【００４６】
重症化の可能性の予測
重症化の可能性は、被験者のサイトカイン又はサイトカイン受容体の遺伝子の一塩基多型のアレル又はゲノタイプに基づき、予測することができる。【００４７】
ゲノタイプに基づいて予測する場合、先ず、被験者の一塩基多型のゲノタイプが次の（I）〜（III）のいずれの場合に該当するかを判断する：
（I）重症化の可能性が高いアレルがホモで存在するゲノタイプの場合
（II）重症化の可能性が高いアレルがヘテロで存在するゲノタイプの場合
（III）重症化の可能性が高いアレルが存在しないゲノタイプの場合。【００４８】
そして、ゲノタイプと重症化との関係について調べたデータに基づき定められた判定基準に従って、被験者のゲノタイプから重症化の可能性を予測する。【００４９】
例えば、ゲノタイプと重症化との関係について調べたデータに基づき定められた判定基準に基づき、
（I）重症化の可能性が高いアレルがホモで存在するゲノタイプの場合、重症化の可能性が「高い」
（II）重症化の可能性が高いアレルがヘテロで存在するゲノタイプの場合、重症化の可能性が「中程度」
（III）重症化の可能性が高いアレルが存在しないゲノタイプの場合、重症化の可能性が「低い」
などと、予測することができる。【００５０】
以下、橋本病を例に挙げて説明する。後述する実施例１及び第２表の統計学的データに示すとおり、IFN-γの＋874番目に存在する一塩基多型においてTアレルがヘテロで存在するゲノタイプ（AT）である橋本病患者１３人中、軽症患者は３人であるのに対し、重症患者は１０人であった。Tアレルがホモで存在するゲノタイプ（TT）である橋本病患者２人中、２人とも重症患者であった。Tアレルが存在しないゲノタイプ（AA）である橋本病患者４１人中、軽症患者は１９人、重症患者は２２人であった。【００５１】
この結果から、IFN-γの＋874番目に存在する一塩基多型のゲノタイプに基づき、例えば以下のような判定基準を作成することができる：
（I）ゲノタイプがTTである場合、重症化の可能性が非常に高い
（II）ゲノタイプがATである場合、重症化の可能性が高い
（III）ゲノタイプがAAである場合、重症化と軽症化の可能性が同程度である。【００５２】
医療従事者は、このような判定基準に基づき、被験者の一塩基多型のゲノタイプから、重症化の可能性を予測することができる。【００５３】
また、アレルに基づいて、重症化の可能性を予測することもできる。【００５４】
この場合、重症化の可能性が高いアレルがホモで存在するかヘテロで存在するかに関係なく、重症化の可能性が高いアレルの有無のみに基づいて、重症化する可能性が高いか低いかを判断する。【００５５】
先ず、被験者の一塩基多型のアレルが次のいずれの場合に該当するかを判断する：
（i）重症化の可能性が高いアレルが存在する場合、
（ii）重症化の可能性が高いアレルが存在しない場合。【００５６】
そして、アレルと重症化との関係について調べたデータに基づき定められた判定基準に従って、被験者のアレル（重症化の可能性が高いアレルの有無）から重症化の可能性を予測する。【００５７】
例えば、アレルと重症化との関係について調べたデータに基づき定められた判定基準に従って、（i）重症化の可能性が高いアレルが存在する場合、重症化の可能性が高い、（ii）重症化の可能性が高いアレルが存在しない場合、重症化の可能性が低い、と予測することができる。【００５８】
「重症化の可能性が高いアレル」については、アレルと重症化の関係を調べることにより知ることができる。「重症化の可能性が高いアレル」の具体例を、後述の第１表に示す。【００５９】
以下、橋本病を例に挙げて説明する。後述する実施例１及び第２表の統計学的データに示すとおり、IFN-γの＋874番目の一塩基多型においてTアレルが１つでも存在する（すなわち、ゲノタイプAT及びTTに相当する）橋本病患者１５人中、軽症患者が３人であるのに対し、重症患者は１２人であった。またTアレルが存在しない（すなわち、ゲノタイプAAに相当する）橋本病患者４１人中、軽症患者は１９人、重症患者は２２人であった。この結果から、重症化の可能性が高いアレルの有無に基づき、例えば、以下のような判定基準を作成することができる：
（i）Tアレルが存在する場合、重症化の可能性が高い、
(ii)Tアレルが存在しない場合、重症化と軽症化の可能性が同程度である。【００６０】
医療従事者は、このような判定基準に基づき、被験者の一塩基多型のアレルから、重症化の可能性を予測することができる。【００６１】
アレルに基づく予測は、アレルがホモで存在する場合とヘテロで存在する場合との間に重症度における有意差がない場合に、好適に用いることができる。【００６２】
以上、橋本病を例に挙げて、ゲノタイプに基づく予測方法、並びに、アレルに基づく（重症化の可能性が高いアレルの有無に基づく）予測方法を説明したが、この説明は、本発明を何ら限定するものではない。また、当業者であれば、橋本病の場合の説明に基づき、他の疾患についても、適宜に改変を行い、重症化の可能性を予測することができる。【００６３】
また、評価基準は、症例数の多い統計学的データや信憑性の高い実験データに基づき、複数の医療従事者（医師を含む）によって定められることが望ましい。評価基準における可能性の格付けは、１〜３段階評価、ABC評価、％等で表示してもよい。【００６４】
また、当業者であれば、統計学的データに基づき作成される判断基準を用いる場合、症例数が増えるに従って評価基準が多少変動する可能性があることを容易に理解することができる。【００６５】
下記の第１表に、サイトカイン又はサイトカイン受容体、一塩基多型が存在する領域、一塩基多型の位置、一塩基多型、及び、重症化の可能性が高い一塩基多型のアレルをまとめた。【００６６】
【表１】
2006051886.tif 000002
【００６７】
本発明の１つの好ましい実施形態において、２以上の異なる一塩基多型を検出し、自己免疫疾患の重症化の可能性を予測する。２以上の異なる一塩基多型を検出することによって、予測の確実性を高めることができる。このとき、複数の一塩基多型の検出結果から個別に予測を行い、それらの予測結果を総合的に判断して最終的な予測をおこなってもよい。あるいは、複数の一塩基多型の検出結果から包括的に予測を行ってもよい。つまり、複数の一塩基多型のアレルの組み合わせを検出し、組み合わせごとに定められた判定基準に従って、予測してもよい。【００６８】
２以上の異なる一塩基多型としては、例えば、IFN-γの第一イントロンに存在する＋874番目の一塩基多型、IL-2のpromoterに存在する-330番目の一塩基多型、及びIL-10の5'flanking region (promoter region)に存在する-1117番目の一塩基多型からなる群より選択される少なくとも２種が挙げられるが、他の２以上の異なる一塩基多型を用いることもできる。【００６９】
組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患の重症化の可能性を予測するためのキット
本発明は、また、組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患の重症化の可能性を予測するための各種ＰＣＲ法に用いるキットに関する。各種ＰＣＲ法は、基本的に、(I)変性、(II)アニーリング、及び(III)伸長のステップを繰り返し実施する工程を含む方法であり、例えば、前述のARMS PCR、PCR-RFLP、TaqMan PCR等が挙げられる。【００７０】
本発明のキットは、免疫機能の制御に関与するサイトカイン又はサイトカイン受容体の遺伝子における一塩基多型を検出するためのプライマーペア、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅを備える。【００７１】
本発明のキットが備えるプライマーペアは、検出対象となる一塩基多型の一方のアレルを含む配列を特異的に増幅する（すなわち、一方のアレルを含む配列を非常に高い効率で増幅させる一方、他方のアレルを含む配列における増幅効率はきわめて低い）オリゴヌクレオチドペアであることが望ましい。増幅の特異性は、高いほど好ましい。【００７２】
また、本発明のキットは、好ましくは、検出対象となる一塩基多型の一方のアレルを含む配列を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドペアと、逆に、他方のアレルを含む配列を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドペアとの両方を備える。【００７３】
例えば、IFN-γの第一イントロンに存在する＋874番目の一塩基多型（T/A）を検出する場合、Tアレルを含む配列を特異的に増幅するプライマーペアと、Aアレルを含む配列を特異的に増幅するプライマーペアとの両方を、本発明のキットに備えることが好ましい。【００７４】
IFN-γの第一イントロンに存在する＋874番目の一塩基多型（T/A）のTアレルを含む配列を特異的に増幅するプライマーペアとして、例えば、配列番号４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとのペア、Aアレルを含む配列を特異的に増幅するプライマーペアとして、例えば、配列番号５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとのペアが挙げられる。本発明のキットは、これらのペアのいずれか一方を備えてもよいし、両方を備えてもよいが、両方を備える方が好ましい。【００７５】
IL-2のpromoterに存在する-330番目の一塩基多型（G/T）を検出する場合、Tアレルを含む配列を増幅するのに好ましいプライマーペアとして、例えば、配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとのペア、Gアレルを含む配列を増幅するのに好ましいプライマーペアとして、例えば、配列番号１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとのペアが挙げられる。本発明のキットは、これらのペアのいずれか一方を備えてもよいし、両方を備えてもよいが、両方を備える方が好ましい。【００７６】
IL-10の-1117番目の一塩基多型（G/A）を検出する場合、Gアレルを含む配列を増幅するのに好ましいプライマーペアとして、例えば、配列番号１４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとのペア、Aアレルを含む配列を増幅するのに好ましいプライマーペアとして、例えば、配列番号１５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとのペア、が挙げられる。本発明のキットは、これらのペアのいずれか一方を備えてもよいし、両方を備えてもよいが、両方を備える方が好ましい。【００７７】
プライマーは、常法、例えば、ホルムアミド法（Beaucage and Carruthers, Tetra. Letts. 22:1859-1862, 1981）又はトリエステル法（Matteucci and Caruthers,J. Amer. Chem. Soc., 103, 3185, 1981）により合成することができる。簡便には、自動合成装置を用いて合成するか、又は、受託合成をおこなう業者から合成品を入手することもできる。【００７８】
本発明のキットが備えるＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡの増幅が可能なポリメラーゼであれば特に限定されないが、例えば、市販の耐熱性ポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ＫＯＤ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、Ｐｆｕ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、Ｖｅｎｔ（ＮＥＢ社製）等が好適である。【００７９】
本発明のキットが備えるｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの混合物）は、当業者が通常用いる方法により製造され得る。簡便のために、市販品を用いてもよい。ｄＮＴＰは、必要に応じて、放射性同位体（RI）、化学発光剤、または蛍光色素などの任意の標識剤で標識されていてもよい。【００８０】
本発明のキットは、更に、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ2、２−メルカプトエタノール等の各種ＰＣＲに必要な任意の試薬を備えてもよい。かかる各種ＰＣＲに必要な試薬は、それぞれ、常法により製造され得、適当な濃度でキットに備えられ得る。【００８１】
本発明のキットは、必要に応じて、重症化の予測のための判定基準を記載した指示書を備える。
【発明の効果】
【００８２】
本発明は、組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患の重症化の可能性を予測する手段を提供する。【００８３】
即ち、本発明は、免疫機能の制御に関与するサイトカイン又はサイトカイン受容体の一塩基多型のアレル又はゲノタイプに基づき、組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患の重症化の可能性を予測する新規な方法、並びに、組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患の重症化の可能性を予測するための新規なキットを提供する。【００８４】
本発明の方法は、遺伝子の一塩基多型に基づく方法であるため、従来のホルモン測定、自己抗体測定、その他の免疫血清学的検査、画像診断、理学的所見、自覚症状等に基づく診断と異なり、種々の生理的な外的因子の影響を受けないという利点を有する。外的因子の影響を受けないことから、被験者の性別、年齢、人種、性格等に左右されずに安定した結果を得ることが可能である。【００８５】
さらに、本発明の方法は、遺伝子の一塩基多型に基づく方法であるため、機能障害の兆候が現れる前や、従来の機能検査では偽判定になりやすい時期であっても、重症化の可能性を予測することが可能である。このことは、早期発見及び早期治療が必要な疾患において、或いは、感覚機能の低下、精神感情の鈍麻等を伴うため早期発見が遅れる傾向にある疾患において、特に有益である。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１−１】図１−１は、IFN-γの配列を示す。図中、各プライマーの結合配列、一塩基多型の位置を表示している。
【図１−２】図１−２は図１−１の続きである。
【図１−３】図１−３は図１−２の続きである。
【図２】図２は、IL-2の配列を示す。図中、各プライマーの結合配列、一塩基多型の位置を表示している。
【図３−１】図３−１は、IL-10の配列を示す。図中、各プライマーの結合配列、一塩基多型の位置を表示している。
【図３−２】図３−２は図３−１の続きである。
【図３−３】図３−３は図３−２の続きである。
【図３−４】図３−４は図３−３の続きである。
【図３−５】図３−５は図３−４の続きである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８７】
以下に本発明の実施例を示すが、かかる実施例は本発明をより容易に理解するための単なる例示であって、本発明を限定することを意図しない。なお、以下の実施例及び比較例で使用する被験試料は、倫理委員会の承認のもと、被験者の承諾を得て採取されたものである。
【実施例１】
【００８８】
１．被験者からのゲノム溶液の調製
重症橋本病患者（50歳以下で甲状腺機能低下症を発症した橋本病）34人及び軽症橋本病患者（50歳を越えても甲状腺機能が正常である橋本病）22人から、末梢血を採取した。末梢血は2mgのEDTAを添加した無菌容器に2ml採取した。このサンプルから、ゲノム抽出キット〔Genとるくん（血液用）、タカラバイオ株式会社〕を用いて、当該キットに付属の説明書に従ってゲノムを抽出し、ゲノム溶液(50 ng/μl)を作製した。【００８９】
２．ARMS PCR
一塩基多型（single mononucleotide polymorphism: SNP）の検出は、Vera Pravica らの報告した論文（Human Immunology 61: 863-866, 2000に記載のAmplification Refractory Mutational System PCR (ARMS PCR)）に記載の方法を一部改変して、下記の通り実施した。【００９０】
なお、ARMS PCRに用いたプライマーの配列は、下記の通りである。
IFN-γ Tアレル特異的プライマー 5'-TTCTTACAACACAAAATCAAATCT-3' （配列番号４）
IFN-γAアレル特異的プライマー 5'-TTCTTACAACACAAAATCAAATCA-3' （配列番号５）
IFN-γ共通プライマー 5'-TCAACAAAGCTGATACTCCA-3'   （配列番号６）
内部コントロールプライマー1 5'-GCCTTCCCAACCATTCCCTTA-3' （配列番号７）
内部コントロールプライマー2 5'-TCACGGATTTCTGTTGTGTTTC-3'   （配列番号８）
（下線部は、一塩基多型である）
先ず、一塩基多型における塩基がTであるDNA（Tアレル型DNA）を特異的に増幅のためのPCR反応液、及び、一塩基多型における塩基がAであるDNA（Aアレル型DNA）を特異的に増幅のためのPCR反応液を、それぞれ、下記の反応組成１及び２になるように調製した。
2006051886.tif 000003
2006051886.tif 000004
【００９１】
次いで、各PCR反応液を用いてPCRを行った。PCRの反応条件は、以下に示す通りである。
【数１】
2006051886.tif 000005
【００９２】
PCR反応後、PCR産物を1.5％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色を行って、目的のDNA断片が増幅していることを確認した。【００９３】
IFN-γプライマー Aアレル及びIFN-γ共通プライマーのプライマーセットのみで増幅産物が確認できたものをゲノタイプAA、IFN-γプライマー Tアレル及びIFN-γ共通プライマーのプライマーセットのみで増幅産物が確認できたものをゲノタイプTT、これらの両方のプライマーセットで増幅産物が確認できたものをゲノタイプATと分類した。さらに、ゲノタイプAAの個体をAアレルを2つ持つ個体、ゲノタイプATの個体をAアレルを1つとTアレルを1つ持つ個体、ゲノタイプTTの個体をTアレルを2つ持つ個体として、AアレルとTアレル
の比率（％）を計算した。
【比較例１】
【００９４】
重症バセドウ病患者（抗甲状腺剤で5年以上治療しても寛解しなかったバセドウ病患者）49人及び軽症バセドウ病患者（抗甲状腺剤の5年以上の治療で寛解したバセドウ病患者）16人から採取した末梢血を用いて、実施例1と同様の手順でゲノムを抽出し、該ゲノムを鋳型としてARMS PCRを行った。その後、各ゲノタイプ及び各アレルについて、比率（％）を求めた。
【比較例２】
【００９５】
健常者39人から採取した末梢血を用いて、実施例1と同様の手順でゲノムを抽出し、該ゲノムを鋳型としてARMS PCRを行った。その後、各ゲノタイプ及び各アレルについて、比率（％）を求めた。
【００９６】
結果
実施例1、比較例1及び比較例2で得られた結果を下記の第２表に示す。
【００９７】
【表２】
2006051886.tif 000006
【００９８】
上記第２表に示すように、軽症橋本病群では、ATゲノタイプが約14％であり、TTゲノタイプは存在していなかったのに対し、重症橋本病群では、ATゲノタイプが約29％であり、TTゲノタイプが約6％であり、有意に高い数値を示した。Tアレルの比率についても、軽症橋本病群では約7％であったのに対し、重症橋本病群では約21％と有意に高い数値を示した。
【００９９】
一方、比較例１のバセドウ病においては、重症バセドウ病群と軽症バセドウ病群との間に有意な差異はみられず、また両バセドウ病群と軽症橋本病群との間にもほとんど差異はなかった。
【０１００】
また、比較例２の健常者においても、Ｔアレルの存在比が９％であり、重症橋本病群との間に有意な差異(p<0.05)が確認されたが、軽症橋本病群、軽症及び重症バセドウ病群との間に有意な差異はなかった。
【０１０１】
考察
橋本病の患者の中で、IFN-γの第一イントロンの＋874番目の一塩基多型がTアレルである患者は、50歳まで甲状腺機能低下症を発症しなかった軽症の橋本病患者に比べ、50歳以前に甲状腺機能低下症を発症して治療（甲状腺ホルモン補充療法）を受けている重症の橋本病患者に有意に多かった。このことは、若年で診断された甲状腺機能正常の橋本病患者が、将来、甲状腺機能低下を発症して治療が必要になるか否かを推測する上において、このIFN-γの第一イントロンの＋874番目の一塩基多型の検査が有用であり、また、患者がTアレルを持つ場合には、橋本病が重症化しやすいことを意味する。Tアレルが検出された患者は、意識的に経過観察を行い、重症化を早期に発見し、適切な治療を早期に開始することが可能になる。
【０１０２】
また、TTゲノタイプの橋本病患者は、症例数が少ないものの、100％の確率で重症化していた。このことから、TTゲノタイプの患者は、かなり高い確率で重症化すると推測される。本発明により、TTゲノタイプであることが判明した患者は、特に注意を払いながら経過観察を行い、重症化を早期に発見し、適切な治療を早期に開始することが可能となる。
【実施例２】
【０１０３】
IL-2のpromoterに存在する-330番目の一塩基多型（T／G）について、橋本病の重症化の可能性を予測する。【０１０４】
１．被験者からのゲノム溶液の調製
実施例１と同様の手順に従い、被験者から、ゲノム溶液を調製した。【０１０５】
２．ARMS PCR
実施例１と同様の手順に従い、ARMS PCRを行った。なお、ARMS PCRに用いたプライマーの配列は、下記の通りである。
IL-2 -330 Tアレル特異的プライマー 5'-TCACATGTTCAGTGTAGTTTTAT-3'（配列番号９）
IL-2 -330 Gアレル特異的プライマー 5'-TCACATGTTCAGTGTAGTTTTAG-3'（配列番号１０）
IL-2 -330共通プライマー 5'-ACGCCTTCTGTATGAAAC-3' （配列番号１１）
内部コントロールプライマー１   5'-TGCCAAGTGGAGCACCCAA-3' （配列番号１２）
内部コントロールプライマー２   5'-GCATCTTGCTCTGTGCAGAT-3' （配列番号１３）
（下線部は、一塩基多型である）
先ず、一塩基多型における塩基がTであるDNA（Tアレル型DNA）を特異的に増幅するためのPCR反応液、及び、一塩基多型における塩基がGであるDNA（Gアレル型DNA）を特異的に増幅するためのPCR反応液を、それぞれ下記の反応組成３及び４になるように調製した。
2006051886.tif 000007
2006051886.tif 000008
次いで、各PCR反応液を用いてPCRを行った。PCRの反応条件は、以下に示す通りである。【０１０６】
【数２】
2006051886.tif 000009
【０１０７】
PCR反応後、PCR産物を1.5％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色を行って、目的のDNA断片が増幅していることを確認した。【０１０８】
IL-2-330 T特異的及びIL-2-330共通プライマーのプライマーセットのみで増幅産物が確認できたものをゲノタイプTT、IL-2 -330 G特異的及びIL-2 -330共通プライマーのプライマーセットのみで増幅産物が確認できたものをゲノタイプGG、これらの両方のプライマーセットで増幅産物が確認できたものをゲノタイプGTと分類した。さらに、ゲノタイプGGの個体をGアレルを2つ持つ個体、ゲノタイプGTの個体をGアレルを1つとTアレルを1つ持つ個体、ゲノタイプTTの個体をTアレルを2つ持つ個体として、GアレルとTアレルの比率（％）を計算する。
【実施例３】
【０１０９】
IL-10の5' flanking region (promoter region)に存在する-1117番目の一塩基多型（G/A）について、橋本病の重症化の可能性を予測する。【０１１０】
１．被験者からのゲノム溶液の調製
実施例１と同様の手順に従い、被験者から、ゲノム溶液を調製した。【０１１１】
２．ARMS PCR
実施例１と同様の手順に従い、ARMS PCRを行った。なお、ARMS PCRに用いたプライマーの配列は、下記の通りである。
IL-10 -1117G/A SNPのプライマーは次の４つを用いる。
afor3(-1258/-1234) 5'-TTTCCAGATATCTGAAGAAGTCCTG-3'（配列番号１４）
fpena(-1106/-1117) 5'-AACACTACTAAGGCTTCTTTGGGTA-3' （配列番号１５）
revpl(-990/-996) 5'-TCTAAAGTTTAAAAGATGGGGTGGA-3' （配列番号１６）
rpeng(-1117/-1059) 5'-CTCTTACCTATCCCTACTTCCCGC-3'（配列番号１７）
（下線部は、一塩基多型である）
先ず、一塩基多型における塩基がGであるDNA（Gアレル型DNA）が存在した場合にGに特異的な増幅がおこるＰＣＲ反応液と、一塩基多型における塩基がAであるDNA（Aアレル型DNA）が存在した場合には、Aに特異的な増幅がおこるPCR反応液を、それぞれ、下記の反応組成５及び６のように調製した。
2006051886.tif 000010
2006051886.tif 000011
次いで、おのおののPCR反応液を用いてPCRを行った。PCRの反応条件は、以下に示す通りである。【０１１２】
【数３】
2006051886.tif 000012
【０１１３】
PCR反応後、PCR産物を1.5％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色を行って、目的のDNA断片が増幅していることを確認した。【０１１４】
増幅されたDNA断片のうち、afof3プライマーとrevplプライマーによって増幅された293bpの増幅産物はPCR反応が確実に行われたことを示すコントロールであり、すべての個体において認められるべきものである。また、反応組成５においてfpenaプライマーとrevplプライマーによって増幅された141bpの増幅産物はAアレル特異的であり、この産物が増幅された場合はAアレルをもつ個体である。反応組成６においてrpengプライマーとafor3プライマーによって増幅された200bpの増幅産物はGアレル特異的であり、この産物が増幅された場合はGアレルをもつ個体である。したがって、コントロールの増幅産物に加え、双方のアレル特異的増幅産物を認めた個体はゲノタイプAGであり、どちからの一方のアレル特異的増幅産物とコントロールの増幅産物を認めた場合はゲノタイプAAもしくはゲノタイプGGと判別する。【０１１５】
さらに、ゲノタイプAAの個体をAアレルを2つ持つ個体、ゲノタイプAGの個体をAアレルを1つとGアレルを1つ持つ個体、ゲノタイプGGの個体をGアレルを2つ持つ個体として、AアレルとGアレルの比率（％）を計算する。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明は、組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患の重症化の可能性を予測する手段を提供した。従来法では将来的な重症化を予測することができなかったため、本発明の方法が、従来の診断ガイドラインに基づく診断システムに取り入れられる可能性がある。これにより、組織破壊によって機能障害を来たす自己免疫疾患の検査を受けた被験者は、現在の病状と将来的な病状の両方を知ることができる。将来的な重症化の可能性を考慮した上で、その後の治療方針や定期検診のプランを決めることができるため、本発明の方法を取り入れた診断システムは非常に有益であると考えられる。
【配列表フリーテキスト】
【０１１７】
配列番号４〜１７は、プライマーである。
【図１−１】
2006051886.tif 000013
【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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