(57)【要約】  分子中に官能基を有するフラーレンに水溶性高分子を該官能基を介して結合させることにより、水溶性高分子の結合数を制御した水溶性フラーレンを得ることができる。この水溶性フラーレンを活性酸素発生剤として使用することにより、癌の光線力学的治療あるいは超音波治療に適用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子中に官能基を有するフラーレンに水溶性高分子を該官能基を介して結合させた水溶性フラーレン。
【請求項２】
官能基が１〜５個である請求項１の水溶性フラーレン。
【請求項３】
官能基が１個である請求項１または２の水溶性フラーレン。
【請求項４】
官能基がカルボキシル基である請求項１から３のいずれかの水溶性フラーレン。
【請求項５】
フラーレンがＣ６０フラーレンである請求項１から４のいずれかの水溶性フラーレン。
【請求項６】
水溶性高分子の分子量が１，０００〜１，０００，０００である請求項１から５のいずれかの水溶性フラーレン。
【請求項７】
水溶性高分子が、非イオン性水溶性合成高分子、非イオン性もしくはイオン性多糖類、これらの修飾物、これらの水溶性高分子の２成分もしくは３成分の共重合体または複合体、ヒアルロン酸、キトサンおよびキチン誘導体から選択される水溶性高分子である請求項１から６のいずれかの水溶性フラーレン。
【請求項８】
水溶性高分子が、片末端に不活性基を有し他端にフラーレンの官能基と反応する反応基を有する水溶性高分子である請求項１から７のいずれかの水溶性フラーレン。
【請求項９】
水溶性高分子が、片末端に不活性基を有し他端にフラーレンの官能基と反応する反応基を有する分子量４０００〜１５０００のポリエチレングリコールである請求項８の水溶性フラーレン。
【請求項１０】
水溶性高分子が、片末端にＣ１〜Ｃ６アルキル基を有し他端にアミノ基で置換されたＣ１−６アルキル基を有する分子量４０００〜１５０００のポリエチレングリコールである請求項９の水溶性フラーレン。
【請求項１１】
水溶性高分子が、片末端に不活性基を有する分子量４０００〜１５０００のポリエチレングリコールと、フラーレンの官能基と反応する反応基を有する化合物との複合体である請求項８の水溶性フラーレン。
【請求項１２】
水溶性高分子が、片末端にＣ１〜Ｃ６アルキル基を有し他端にアミノ基で置換されたＣ１−６アルキル基を有する分子量４０００〜１５０００のポリエチレングリコールと、アミノ酸との反応物である請求項１１の水溶性フラーレン。
【請求項１３】
水溶性フラーレンが凝集した凝集体の形態にある請求項１から１２のいずれかの水溶性フラーレン。
【請求項１４】
凝集体の大きさが２０〜４００ｎｍである請求項１３の水溶性フラーレン。
【請求項１５】
水溶性フラーレンもしくはその凝集体が水溶液の形態にある請求項１から１４のいずれかの水溶性フラーレン。
【請求項１６】
分子中に官能基を有するフラーレンの官能基に水溶性高分子を反応させることを特徴とする水溶性フラーレンの製造方法。
【請求項１７】
水溶性高分子が、請求項６から１２のいずれかの水溶性高分子である請求項１６の水溶性フラーレンの製造方法。
【請求項１８】
フラーレンの官能基が１個のカルボキシル基である請求項１６または１７の水溶性フラーレンの製造方法。
【請求項１９】
請求項１から１５のいずれかの水溶性フラーレンまたは請求項１６から１８のいずれかの製造方法により製造される水溶性フラーレンを含有する活性酸素発生剤。
【請求項２０】
光線力学的治療または超音波治療に用いるための請求項１９の活性酸素発生剤。
【請求項２１】
細胞の増殖を阻害するための請求項１９の活性酸素発生剤。
【請求項２２】
細胞が癌細胞である請求項２１の活性酸素発生剤。
【請求項２３】
癌の治療に用いるための請求項１９から２２のいずれかの活性酸素発生剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規水溶性フラーレン、その製造方法およびそれを含む活性酸素発生剤に関する。更に詳細には、分子中に官能基を有するフラーレンに水溶性高分子を該官能基を介して結合させて得られる新規水溶性フラーレン、その製造方法およびそれを含む活性酸素発生剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
一重項酸素やスーパーオキシドアニオンなどの活性酸素は、フラーレン、ポルフィリン誘導体などの各種活性酸素発生剤に可視光等を照射することにより発生させることができる。この活性酸素は、反応性に富み、細胞のＤＮＡを切断し、細胞増殖を抑制し、タンパク質分解酵素の活性を阻害するなどの細胞毒性を示すことから、例えば、癌、ウイルス感染症、細胞内寄生性感染症、肺線維症、肝硬変、慢性腎炎、動脈硬化、糖尿病性網膜症、老人性黄斑変性症及び血管狭窄病変などの各種疾患に対する効果が期待されている。【０００３】
活性酸素発生剤の一つであるフラーレンには、ｎの数に応じてＣ６０、Ｃ７０などの純炭素物質や金属もしくは金属酸化物を内包した炭素クラスターなどの化合物があることが知られている（非特許文献１）。フラーレン自体は、水不溶性であるため、生体内への投与が困難である。一方、癌組織には、正常組織と比べてその組織構造の違いから、高分子物質が移行しやすく、また癌組織に長く滞留する傾向がある（非特許文献２）。これらの理由により、水溶性を付与するとともに、癌組織に特異的に移行し、滞留する特性を付与し、正常組織が活性酸素による細胞毒性を被ることに起因する副作用を軽減するために、各種水溶性高分子をフラーレンと結合させることが検討されている。このような水溶性高分子としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、デキストラン、プルラン、デンプン、及びこれらの高分子の誘導体を用いることが提案されている（非特許文献３、特許文献１）。
また、フラーレンに結合する置換基の結合数が、活性酸素の生成量に大きく影響することも知られている（非特許文献４）。【０００４】
癌組織に集積した光増感剤は光照射によって反応性に富んだ一重項酸素等を生成し、その周辺の癌組織のみを選択的に破壊する。このように、光増感剤と光照射とを組み合わせた癌治療を光線力学的治療という。この光線力学的治療用光増感剤として、片末端にメチル基を有し他端にアミノ基を有する複数のポリエチレングリコールを直接結合させたフラーレンが知られている（特許文献１）。【０００５】
さらに、液体に超音波を照射すると、液体内部に泡が生成（cavitation）し、この生成した泡が壊れる際に、局所的に熱や圧力などが発生する。これによりラジカル（・ＯＨなど）が発生し、このラジカルが励起状態から基底状態に遷移したり、再結合する際に、主として３００〜６００ｎｍの波長範囲を有する光を出す。この現象はソノルミネッセンスとして知られている（非特許文献５）。これを利用し、片末端にメチル基を有し他端にアミノ基を有する複数のポリエチレングリコールを直接結合させたフラーレンを含有する超音波治療用活性酸素発生剤が知られている（特許文献２）。
【特許文献１】特開平９−２３５２３５号公報
【特許文献２】特開２００２−２４１３０７号公報
【非特許文献１】化学、50(6), 1995
【非特許文献２】松村ら，癌と化学療法，Vol.14, No.3, p821-829, 1987
【非特許文献３】BIO INDUSTRY, Vol.14, No.7, p30-37, 1997
【非特許文献４】Toxicology in vitro, Vol.16, p41-46, 2002
【非特許文献５】Science, Vol.247, p1439-1445, 1990
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ポリエチレングリコール等の水溶性高分子を複数結合した上記のようなフラーレンが得られているが、その結合ポリエチレングリコールの数は一定ではない。即ち、水溶性高分子の結合数を制御することができず、従って、この結合数に依存する活性酸素の生成量にバラつきが生じ、医療用としての使用を考えた場合、製品の規格化が難しい。
本発明は、水溶性高分子の結合数を制御した水溶性フラーレン、即ち、修飾分子数が制御された高分子結合水溶性フラーレンの提供を目的とする。更には、そのような水溶性フラーレンの製造方法、それを含む活性酸素発生剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、分子中に官能基を有するフラーレンに水溶性高分子を該官能基を介して結合させた水溶性フラーレンに関する。
更に本発明は、分子中に官能基を有するフラーレンの官能基に水溶性高分子を反応させることを特徴とする水溶性フラーレンの製造方法に関する。
更に本発明は、上記水溶性フラーレンまたは上記製造方法により製造される水溶性フラーレンを含有する活性酸素発生剤に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、水溶性高分子の結合数を制御した水溶性フラーレンを得ることができる。本発明の水溶性フラーレンに光を照射すると、２２０ｎｍ〜可視光領域（３８０〜７８０ｎｍ）の広い波長範囲でＯ２−（スーパーオキシドアニオン）等が発生する。特に、２６０〜４５０ｎｍの波長範囲で高いＯ２−発生能を発揮することにより癌の光線力学的治療に適用できる。また、超音波照射により惹起されるソノルミネッセンスによって発生する光は、主として３００〜６００ｎｍの波長範囲を有するので、これにより本発明の水溶性フラーレンはＯ２−を発生する。本発明の水溶性フラーレンは超音波治療にも好適である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１で得られたＰＥＧ１分子結合フラーレンを高速液体クロマトグラフィーに付して分子量を測定した結果を示す。
【図２】特開平９−２３５２３５号公報の実施例１に記載された方法に従って合成したフラーレン−水溶性高分子結合体を高速液体クロマトグラフィーに付して分子量を測定した結果を示す。
【図３】実施例１および２で得られた本発明の水溶性フラーレンの粒子径を光散乱法により測定した結果を示す。
【図４】実施例２で得られた本発明の水溶性フラーレンの光照射による活性酸素発生量を測定した結果を示す。
【図５】実施例２で得られた本発明の水溶性フラーレンの光照射によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ癌細胞増殖阻害活性を測定した結果を示す。
【図６】実施例１で得られた本発明の水溶性フラーレンの光照射によるｉｎ  ｖｉｖｏ抗癌活性を測定した結果を示す。
【図７】実施例２で得られた本発明の水溶性フラーレンの超音波照射による活性酸素発生量を測定した結果を示す。
【図８】実施例１で得られた本発明の水溶性フラーレンの超音波照射によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ癌細胞増殖阻害活性を測定した結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の水溶性フラーレンは、分子中に官能基を有するフラーレンに水溶性高分子を該官能基を介して結合させたことを特徴とする。
本発明で使用するフラーレンは、その種類が特に限定されるものではなく、活性酸素を発生するものであればいかなる種類のものも使用し得る。具体的には、炭素原子数が６０の純炭素物質Ｃ６０フラーレン、Ｃ７０フラーレン、純炭素物質であるナノチューブフラーレン、各種高次フラーレンなどを用いることができる。これらの各種フラーレンは、市販されており、例えば本荘ケミカル（株）、三菱商事（株）、東京化成工業（株）などから入手することができる（商品名：Ｃ６０フラーレン、Ｃ７０フラーレン、マルチウオールナノチューブ、シングルウオールナノチューブなど）。なかでも供給および取り扱いの容易さの点から、Ｃ６０フラーレンを用いるのが好ましい。【００１１】
フラーレンに結合している官能基としては、例えばカルボキシル基、アミノ基、水酸基、シアノ基、チオール基等が挙げられる。その結合数は、１−５個が好ましく、１個がより好ましい。特に好ましくは、分子中に１つのカルボキシル基を有するフラーレンである。この分子中に１つのカルボキシル基を有するフラーレンは、市販されており、例えば（株）サイエンスラボラトリーズ等の試薬会社から入手することができる。また、文献「テトラヘドロン  レターズ  １９９５年３６巻３８号６８４３頁」記載の方法にて合成することができる。【００１２】
本発明で使用する水溶性高分子は、特に限定されるものではないが、分子量が１，０００〜１，０００，０００のもの、好ましくは４，０００〜５０，０００のものを用いることができる。【００１３】
本発明で使用する水溶性高分子としては特に限定されるものではなく、市販されている各種水溶性高分子を使用することができる。なかでも、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンのような非イオン性水溶性合成高分子；デキストラン；プルラン；デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプンのようなイオン性もしくは非イオン性多糖類；これらの修飾物；これらの水溶性高分子の２成分もしくは３成分の共重合体もしくは複合体；ヒアルロン酸；キトサン；キチン誘導体などを用いることができる。なかでもフラーレンと共通の溶媒を持ち、フラーレンとの結合反応に関与する官能基が分子末端のみにあり、化学結合様式が単純であるなどの理由から、ポリエチレングリコールを好ましく用いることができる。特に４，０００〜１５，０００のポリエチレングリコールを用いるのが好ましい。【００１４】
本発明で使用する水溶性高分子は、通常、フラーレンの官能基と反応する反応性基を有するものが用いられる。反応性基としては、例えばカルボキシル基、アミノ基、水酸基、シアノ基、チオール基等が挙げられる。なかでもアミノ基、水酸基などの脱水縮合反応性を有する反応性基が好ましく、より好ましくはアミノ基である。なお、反応性基がＣ１−Ｃ６アルキル基を介して水溶性高分子と結合していてもよい。このような反応性基は、フラーレンとの結合に適した位置であれば水溶性高分子の分子内のいかなる位置に存在してもよいが、結合のしやすさを考慮して、水溶性高分子の末端に位置するのが好ましい。このような反応性基を有しない水溶性高分子を用いる場合には、フラーレンとの結合の前にまず反応性基を導入しておくことが必要である。【００１５】
本発明で使用する水溶性高分子は、片末端に不活性基を有し他端に反応性基を有するものが好ましい。不活性基としては、例えばＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、ベンジル基、その他通常保護基として使用されるものが挙げられる。水溶性高分子としてポリエチレングリコールを用いる場合、Ｃ１−Ｃ６アルキル基が好ましい。Ｃ１−Ｃ６アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒt−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基等が挙げられ、入手の容易性からメチル基が好ましい。【００１６】
本発明で使用する水溶性高分子としては、片末端に不活性基を有し他端に反応性基を有する分子量４０００〜１５０００のポリエチレングリコールが好ましく、特に片末端にＣ１〜Ｃ６アルキル基を有し他端にアミノ基を有する分子量４０００〜１５０００のポリエチレングリコールが好ましい。また、片末端に不活性基を有する分子量４０００〜１５０００のポリエチレングリコールと、フラーレンの官能基と反応する反応基を有する化合物との複合体も好ましく、特に片末端にＣ１〜Ｃ６アルキル基を有し他端にアミノ基を有する分子量４０００〜１５０００のポリエチレングリコールと、アスパラギン酸などのアミノ酸との反応物が好ましい。【００１７】
本発明の水溶性フラーレンは、生体への投与が可能な程度の水溶性を有していればよい。水溶性高分子と結合したフラーレンは、凝集体を形成するものが好ましく、その凝集体の粒径は、癌などの組織への移行と集積のし易さおよび正常細胞への移行を考慮すると、光散乱法による測定において２０〜４００ｎｍ程度が好ましく、より好ましくは３０〜２００ｎｍ程度である。このような凝集体を形成するために必要な水溶性高分子の分子量は、用いる水溶性高分子の種類およびフラーレンに結合する数によっても異なる。例えば１分子当たり１個のアミノ基を有するポリエチレングリコールの場合には分子量が２，０００〜３０，０００、好ましくは４，０００〜１５，０００の範囲であるのが好ましい。【００１８】
本発明の水溶性フラーレンの製造方法は、分子中に官能基を有するフラーレンの官能基に水溶性高分子を反応させることを特徴とする。分子中に官能基を有するフラーレンを使用することにより、水溶性高分子の結合数を制御することが可能となる。例えば、分子中に１つの官能基を有するフラーレンを使用すると水溶性高分子を１つ有するフラーレンが得られ、分子中に２つの官能基を有するフラーレンを使用すると水溶性高分子を２つ有するフラーレンが得られる。例えば、分子中に１つのカルボキシル基を有するフラーレンと片末端にＣ１−Ｃ６アルキル基を有し他端に反応性基を有する水溶性高分子を縮合反応させる場合、分子中に１つのカルボキシル基を有するフラーレンと片末端にＣ１−Ｃ６アルキル基を有し他端に反応性基を有する水溶性高分子の使用割合は前者１モルに対して後者０．１〜１０モル程度、好ましくは前者０．５モルに対して後者２モル程度であり、より好ましくは前者１モルに対して後者１〜１．１モル程度である。【００１９】
反応は、例えば縮合反応、付加反応、置換反応等の公知の化学結合を生成させる反応が挙げられる。縮合反応の場合は、例えば、水溶性高分子の反応性基がアミノ基の場合、通常のペプチド縮合反応によって行われる。ペプチド縮合反応の場合、フラーレンに結合する官能基はカルボキシル基であり、脱水縮合剤の存在下に行われる。当該脱水縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、１−ジメチルアミノプロピル−３−エチルカルボジイミドなどのカルボジイミド、ベンゾトリアゾール−１−イル−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロフォスフェートなどのホスホニウム塩、ジフェニルホスホリルアジドなどが挙げられ、好ましくは、ジイソプロピルカルボジイミドである。脱水縮合剤の使用量は、フラーレンのカルボキシル基に対して０．５〜１０モル当量であり、好ましくは、１〜２モル当量である。反応は、添加剤存在下または非存在下で行われ、添加剤としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、４−ニトロフェノール、ペンタフルオロフェノールなどが挙げられ、好ましくは、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールである。添加剤の使用量は、フラーレンのカルボキシル基に対して０．５〜１０モル当量であり、好ましくは、１〜２モル当量である。【００２０】
この反応では有機溶媒を使用する。有機溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素類、塩化メチレン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、クロロベンゼン、ブロモベンゼン、１，２−ジクロロベンゼンなどのハロゲン化炭化水素類；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン、ジエチレングリコールジメチルエーテルなどのエーテル類；アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ヘキサメチルリン酸トリアミドなどのアミド類；Ｎ，Ｎ−ジメチルイミダゾリジノンなどのウレア類；これら溶媒の混合溶媒などが挙げられ、好ましくは、トルエン、クロロベンゼン、ブロモベンゼン、１，２−ジクロロベンゼン及びジオキサンとジクロロメタンの１：１混合溶媒であり、より好ましくは、ブロモベンゼンである。反応温度は、−２０〜１００℃、好ましくは０〜５０℃、より好ましくは室温〜３７℃であり、反応時間は、１〜７２時間、好ましくは３〜２４時間である。本反応は遮光下で行うのが好ましい。得られた反応生成物は、自体公知の分離手段、例えば、減圧濃縮、溶媒抽出、結晶化、クロマトグラフィー、透析、凍結乾燥などにより単離、精製することができる。【００２１】
水溶性高分子としては特に限定されるものではなく、上述したような市販されている各種水溶性高分子を使用することができる。なお上述したように、水溶性高分子は、フラーレンとの結合を可能とするように、通常アミノ基などの反応性基を有しているものを用いる。反応性基を有しない水溶性高分子を用いる場合には、フラーレンとの結合の前にまず反応性基を導入することが必要である。例えばカルボキシル基を有する水溶性高分子においては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドとカルボジイミド、カルボジイミドまたはクロロ炭酸エチルなどを用いるカルボキシル基とアミノ化合物との結合反応によりアミノ基を高分子鎖に導入する。例えば、ポリエチレングリコールにアミノ基を導入するには、片末端カルボキシル基を有するポリエチレングリコールをｐＨ５．０のリン酸緩衝液（１０重量％）に溶解し、そこへ水溶性カルボジイミドをカルボキシル基に対して３倍モル量投入し、室温で１時間撹拌することによりカルボキシル基を活性化する。その後、エチレンジアミンをカルボキシル基に対して１０倍モル量加え、更に室温で６時間反応させる。得られた反応液を水に対して透析することにより片末端にアミノ基が導入されたポリエチレングリコールを得ることができる。また、片末端がアミノプロピル基で、他端がメチル基であるポリエチレングリコール、即ち、ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯ（ＣＨ２）３ＮＨ２（ｎは９０〜３００程度の整数を示す）は、日本油脂株式会社から入手可能である。【００２２】
また、前述のように、水溶性高分子が片末端に不活性基を有するポリエチレングリコールとフラーレンの官能基と反応する反応基を有する化合物との複合体であってもよく、フラーレンの官能基と反応する反応基を有する化合物としてはアミノ酸が挙げられ、好ましくはアスパラギン酸やグルタミン酸等の酸性アミノ酸が挙げられる。該複合体は、例えば以下のようにして製造される。アミノ基を保護した酸性アミノ酸と片末端がＣ１−Ｃ６アルキル基で他端がアミノ基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル基のポリエチレングリコールとを有機溶媒中、脱水縮合剤存在下で反応させる。反応条件は前述の水溶性高分子の反応基がアミノ基であり、フラーレンの官能基がカルボキシル基である場合のペプチド縮合反応の際と同様の条件でよい。得られた反応物を保護基に応じた脱保護反応に付すことにより片末端Ｃ１−Ｃ６アルキル基のポリエチレングリコールが結合したアミノ酸誘導体である水溶性高分子を得ることができる。具体的には、後述の実施例３に示す。【００２３】
本発明の活性酸素発生剤は、上記のようにして得られた水溶性高分子と結合した水溶性フラーレンを含有し、水溶液や含水溶媒の溶液として使用される。この水溶性フラーレンに光を照射すると、２２０〜可視光領域（３８０〜７８０ｎｍ）の広い波長範囲でＯ２−が発生する。特に、２６０〜４５０ｎｍの波長範囲で高いＯ２−発生能を発揮する。従って、光照射による癌の光線力学的治療に適用できる。また、超音波照射により惹起されたソノルミネッセンスによって発生する光は、主として３００〜６００ｎｍの波長範囲を有するので、本発明の活性酸素発生剤は超音波治療にも好適である。
本発明の活性酸素発生剤により発生する活性酸素には、一重項酸素（１Ｏ２）、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２−）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）等が含まれる。【００２４】
本発明の水溶性フラーレンは、水系溶媒中では、一定の大きさの凝集体を形成する。水系溶媒としては、例えば水、水−アセトニトリル等が挙げられる。本発明の活性酸素発生剤は、フラーレンが水溶性高分子と結合しているため、生体に投与するのに十分な水溶性を有すると共に、一定の大きさの凝集体を形成するので、癌組織や炎症組織への高い移行性、滞留性を有すると考えられる。この凝集体は、結合する水溶性高分子の数がそろったフラーレンの凝集体で、高分子ミセル構造をとると考えられる。【００２５】
本発明の活性酸素発生剤に含まれるフラーレンは、超音波照射により惹起されたソノルミネッセンスによって発生する光により、水性媒体中で一重項酸素やスーパーオキシドアニオンなどの活性酸素を発生させることにより細胞毒性を示すため、後述するような癌を含む各種疾患の治療に使用することができる。照射する超音波としては、周波数約１００ＫＨｚ〜２０ＭＨｚ、特に約１〜３ＭＨｚのものを好ましく使用することができる。照射は、約０．１〜５Ｗａｔｔ／ｃｍ２、なかでも約２Ｗａｔｔ／ｃｍ２の出力で行うのが好ましい。照射時間は、用いる周波数、照射出力によっても異なるが、約５〜３００秒、好ましくは約３０〜１２０秒であり、パルス照射の場合、その Duty cycle は、約１〜１００％、好ましくは約１０％である。【００２６】
本発明の活性酸素発生剤は、活性酸素が細胞毒性を示すあらゆる種類の癌、ウイルス感染症、細胞内寄生性感染症、肺線維症、肝硬変、慢性腎炎、動脈硬化、糖尿病性網膜症、老人性黄斑変性症及び血管狭窄病変などの治療に有効である。例えば癌としては、肺癌、肝癌、膵癌、胃腸癌、膀胱癌、腎癌、脳腫瘍のような臓器の表層およびその内部に発生するあらゆる固形癌を挙げることができる。なかでも、本発明の活性酸素発生剤を超音波治療に使用する場合には、光照射が不可能であり従来は光線力学的治療が不可能であった身体深部の癌の治療に有効に用いることができる。その他の疾病については、その病巣または感染細胞もしくは罹患細胞が臓器内部に位置しているので、活性酸素発生剤をその部位に適当な方法によって集積させた後、そこに外部より光もしくは超音波照射することによって治療を行うことができる。【００２７】
本発明の活性酸素発生剤は、注射剤、分散剤、流動性剤、固形粉末剤などのあらゆる剤型とすることができる。例えば注射剤とする場合には、本発明の活性酸素発生剤を、注射剤に一般に用いられる緩衝剤、生理食塩水、保存剤、注射用蒸留水などの各種添加剤を配合して注射剤とすることができる。本発明の活性酸素発生剤は静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、皮内などに投与することができ、その投与量は、投与経路、患者の年齢、性別、疾患の種類及び状態によっても異なるが、成人１日当たり、本発明の水溶性フラーレンとして約１〜１０ｍｇ／ｋｇを１〜数回に分けて投与することができる。【００２８】
上述したように、癌組織や炎症組織には、正常組織と比較して高分子物質が移行しやすく、かつ蓄積しやすい。したがって、水溶性高分子と結合したフラーレンを含有する本発明の活性酸素発生剤は、生体に投与されると、正常組織に比べて癌組織や炎症組織に集積され、正常組織におけるよりも高濃度で長く癌組織や炎症組織に滞留する。一方、正常組織においては癌組織や炎症組織におけるよりも速やかに本発明の活性酸素発生剤が排泄されるため、本活性酸素発生剤を生体に投与後、ある程度の時間をおけば、癌組織や炎症組織における本活性酸素発生剤の濃度は、正常組織における濃度よりも有意に高いものとなり、本活性酸素発生剤が癌組織や炎症組織に特異的に高濃度で分布することになる。したがって、本活性酸素発生剤を生体に投与後、ある程度の時間をおいた後に生体に光もしくは超音波を照射すれば、光もしくは超音波照射により惹起されたソノルミネッセンスによって発生する光により活性酸素発生剤が一重項酸素などの活性酸素を発生することにより癌組織や炎症組織において特異的に抗癌活性や抗炎症活性が示す。一方、正常組織においては、本活性酸素発生剤の濃度は低くなっているため、正常組織に対する細胞毒性は癌組織や炎症組織におけるほど高くなく、正常組織における副作用が軽減されることが期待される。【００２９】
ヒトにおいて本発明の活性酸素発生剤の投与後、癌組織や炎症組織での活性酸素発生剤の濃度が正常組織での濃度よりも有意に高くなり、光もしくは超音波照射が可能になるまでの時間は、個々の患者の治療部位における代謝の状態、活性酸素発生剤の分布の時間変化などによって異なるが、一般的には投与の約０．１〜４８時間後、特に約２４時間後に光もしくは超音波照射を行うのが好ましい。超音波をヒトに照射する場合には、前述したような周波数を、前述したような出力、時間で照射する。したがって、本発明の活性酸素発生剤を用いて治療を行なうには、本発明の活性酸素発生剤を、例えば注射剤の剤型で患者に投与し、約０．１〜４８時間後に、光照射装置もしくは超音波発生装置を用いて照射を行なう。投与量、及び投与／照射の頻度、回数などは、患者の年齢、体重、性別、疾患の種類及び状態などに応じて決定することができる。【００３０】
本発明の活性酸素発生剤は、癌組織や炎症組織に特異的に移行、蓄積されるわけではないが、目標とする組織や細胞へ本発明の活性酸素発生剤を送達する任意の方法、例えばドラッグデリバリーシステムにより特異的に送達する方法を用いることにより、目標とする組織や細胞でその細胞毒性作用を示させることが可能である。このような方法としては、目標とする組織や細胞に本発明の活性酸素発生剤を直接注入する方法（例えば内視鏡を用いることで体内のほとんどの部位への送達が可能である）、目標とする組織や細胞に対する抗体、レクチン、細胞接着因子、糖鎖などの細胞認識因子を活性酸素発生剤に結合させた本発明の活性酸素発生剤を投与する方法などを挙げることができる。また、本発明の活性酸素発生剤を生体に投与後、活性酸素発生剤に活性酸素を発生させたい部位のみに光もしくは超音波照射をすることにより、所望の箇所でのみ活性酸素を発生させて細胞毒性を示させることもできる。また、光もしくは超音波をフォーカシングすることによって、細胞毒性発現部位の選択性を向上させることも可能である。【００３１】
以下に、実施例、参考例および試験例を示し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
参考例１
（１、２−メタノ［６０］フラーレン）−６１−カルボン酸の合成
テトラヘドロン  レターズ、１９９５年、３６巻、３８号、６８４３頁に記載の方法により得られる（１，２−メタノ［６０］フラーレン）−６１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（５４０ｍｇ，０．６５ｍｍｏｌ）をトルエン（３８０ｍＬ）に溶解し、４−トルエンスルホン酸１水和物（２２２ｍｇ，１．１７ｍｍｏｌ）を加えて、１０時間加熱還流した。析出した褐色沈殿物をろ取し、トルエン、蒸留水およびエタノールにて順次洗浄後、減圧下乾燥して、（１，２−メタノ［６０］フラーレン）−６１−カルボン酸（３３８ｍｇ，収率６７％）を褐色結晶として得た。【００３２】
ＦＡＢ−ＭＳ（positive mode）：ｍ/ｚ７７９（Ｍ＋Ｈ）＋；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３/ＤＭＳＯ-ｄ６（１:１）,ｐｐｍ）：５．１５（１Ｈ，ｓ）．【００３３】
実施例１
ＰＥＧ（分子量５０００）１分子結合フラーレンの合成
０．３３ｍＭ（１，２−メタノ［６０］フラーレン）−６１−カルボン酸のブロモベンゼン溶液１４．７ｍＬに等モル量の片末端メチル基で他端アミノプロピル基のポリエチレングリコール（ＰＥＧ，分子量５０００，日本油脂製）を含むブロモベンゼン溶液２ｍＬを加え、２倍モル量の１-ヒドロキシベンゾトリアゾール及びＮ，Ｎ’-ジイソプロピルカルボジイミドを添加し、室温、２４時間、遮光条件下で攪拌した。反応液を等量の蒸留水にて抽出した。水層を陽イオン交換樹脂カラム（ＳＰ−トヨパール６５０Ｍ，Ｈ＋型）に通塔後、溶出液を凍結乾燥し、ＰＥＧ（分子量５０００）１分子結合フラーレン（２４．４ｍｇ）を得た。
薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：２０％メタノール−ジクロロメタン）相対移動度（Ｒｆ）：０．７５．【００３４】
実施例２
ＰＥＧ（分子量１２０００）１分子結合フラーレンの合成
分子量５０００の代わりに分子量１２０００の片末端メチル基で他端アミノプロピル基のＰＥＧ（日本油脂製）を用い、実施例１と同様の操作をすることにより、ＰＥＧ（分子量１２０００）１分子結合フラーレン（４７．４ｍｇ）を得た。
薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：２０％メタノール−ジクロロメタン）相対移動度（Ｒｆ）：０．７３．【００３５】
試験例１
実施例１で合成したＰＥＧ（分子量５０００）１分子結合フラーレンの分子量の分析
実施例１において反応液を等量の蒸留水にて抽出した画分と、水層を陽イオン交換樹脂カラムに通塔後の画分を用いて分子量の測定をＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＰＷＸＬ（東ソー株式会社）を接続した高速液体クロマトグラフィーシステム８０２０（東ソー株式会社）を用いて実施した。移動相として２０％アセトニトリル及び０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ６．９を用い、移動相の流速を０．５ｍＬ／ｍｉｎとし、検出はフラーレンの紫外部吸収で行った。その結果を図１に示す。分子量マーカーとしては、分子量が既知のポリエチレングリコール（分子量９４，０００及び５，０００）を用い、その保持時間を図１中に示した。【００３６】
比較対照として、特開平９−２３５２３５号公報の実施例１に記載された方法に従って、分子量５０００の片末端メチル基で他端アミノプロピル基のＰＥＧを用い、フラーレンとＰＥＧのモル比が１：１０の比率で合成したフラーレン−水溶性高分子結合体の分子量の測定を実施した。移動相として０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ６．９を用い、移動相の流速を１ｍＬ／ｍｉｎとし、検出はフラーレンの紫外部吸収で行った。その結果を図２に示す。分子量マーカーとしては、分子量が既知のポリエチレングリコール（分子量９４，０００、４６，０００及び５，０００）を用い、その保持時間を図２中に示した。【００３７】
これらの結果から、分子量約５，８００の実施例１の化合物は自己組織化によって分子量約１００，０００の凝集体を形成し、そのサイズが大きくなっていることが示された。またその凝集体は、溶液組成が異なる状態においても再現良く形成され、結合する水溶性高分子の数が一定でそろっているために分子量分布の狭い、単一なピークを示した。一方、特開平９−２３５２３５号公報の実施例１に従って合成したフラーレン−水溶性高分子結合体は、主に分子量４６，０００以下に主要成分を有するが、その分子量分布が幅広く、複数のピークが見られたことから、水溶性高分子の結合数の制御により均一な凝集体が得られることが示された。【００３８】
フラーレンに結合する置換基の結合数が、活性酸素の生成量に大きく影響することが知られており（文献：Toxicology in vitro, Vol.16, p41-46, 2002）、実施例１の化合物のように１置換の誘導体であることはドラッグデリバリーシステムのターゲッティング及び活性酸素の生成量の点からも、従来のフラーレン−水溶性高分子結合体と比較して有用である。【００３９】
試験例２
実施例１で合成したＰＥＧ（分子量５０００）１分子結合フラーレンの粒径の測定
本発明の水溶性フラーレンについて、光散乱法による粒径測定を行った。実施例１で合成した水溶性フラーレンを蒸留水に最終濃度１ｍｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬになるように溶解した。この溶液を光散乱測定装置ＤＬＳ−７０００(大塚電子株式会社)で測定した。その測定結果を図３に示す。
測定結果より、実施例１の化合物は比較的粒径がそろった約５０ｎｍの粒子径を、実施例２の化合物は若干粒径分布が広い約１００ｎｍの粒子径を、それぞれ有する凝集体であることが示された。これらの粒子径は、高分子物質が、正常組織に比べてがん組織に移行しやすく、またがん組織に長く滞留する傾向があるというＥＰＲ効果（Enhanced Permeation and Retention effect）を示すのに充分な大きさであると考えられる。【００４０】
試験例３
実施例２で合成したＰＥＧ（分子量１２０００）１分子結合フラーレンの活性酸素発生量の測定
チトクローム法により、活性酸素（スーパーオキシドアニオン，Ｏ２−）発生量を測定した。最終濃度５０μＭになるようにチトクロムｃ（ナカライテスク社）をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ，ｐＨ  ７．４、ライフテックオリエンタル社）に溶解した溶液２００μＬと、実施例２で調製したＰＥＧ（分子量１２０００）１分子結合フラーレンを最終濃度２００μＭになるようにＨＢＳＳに溶解した溶液２００μＬを混合した。この混合溶液に種々の波長の光(２２０〜８００ｎｍ)を分光蛍光光度計Ｆ−２０００（日立製作所）を用いて、３０℃で２０分間照射した。照射後、溶液の５５０ｎｍの吸光度を分光光度計ＤＵ−６５０（ベックマン社）で測定した。３０℃で２０分間遮光条件下の溶液をコントロールとし、１分間当りのＯ２−発生量を図４に示した。【００４１】
実施例２の水溶性フラーレンは光の照射を行った場合、紫外〜可視光領域の広い波長範囲でＯ２−が発生が観察され、特に２６０〜４５０ｎｍの広い波長範囲で有意な発生が認められた。従って、光照射による癌の光線力学的治療に適用できる事が示された。また、超音波照射により惹起されたソノルミネッセンスによって発生する光は、主として３００〜６００ｎｍの波長範囲を有するので、本化合物は超音波治療にも好適である事が示された。【００４２】
実施例３
ＰＥＧ（分子量５０００）２分子がＬ−アスパラギン酸のカルボキシル基にアミド結合した水溶性高分子がフラーレンに結合した水溶性フラーレンの合成
実施例１と同様の操作をすることにより片末端メチル基で他端アミノプロピル基のＰＥＧ（分子量５０００）２分子がＬ−アスパラギン酸の２つのカルボキシル基にアミド結合した水溶性高分子がフラーレンのカルボキシル基に結合した水溶性フラーレンを得た。
５０ｍＭ  Ｂｏｃ−Ｌ−アスパラギン酸（和光純薬製）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液５ｍＬに３倍モル量の片末端メチル基、他端アミノプロピル基のポリエチレングリコール（ＰＥＧ，分子量５０００，日本油脂製）を含むＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液１０ｍＬを加え、３倍モル量の１-ヒドロキシベンゾトリアゾール及びＮ，Ｎ’-ジイソプロピルカルボジイミドを添加し、室温、２４時間、遮光条件下で攪拌した。反応液にジイソプロピルエーテルを添加し、沈殿物を得た。沈殿物を蒸留水に溶解後、陰イオン交換樹脂カラム（ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ，Ｃｌ−型）および陽イオン交換樹脂カラム（ＳＰ−トヨパール６５０Ｍ，Ｈ＋型）に通塔後、溶出液を凍結乾燥し、カルボキシル基にＰＥＧ（分子量５０００）２分子がアミド結合したＢｏｃ−Ｌ−アスパラギン酸を得た。得られた化合物１ｇを５ｍＬのトリフルオロ酢酸に溶解し、室温、１時間で脱保護を行った。反応液にジイソプロピルエーテルを添加し、沈殿物を減圧乾固することで、カルボキシル基にＰＥＧ（分子量５０００）２分子がアミド結合したＬ−アスパラギン酸を得た。
実施例１における分子量５０００の片末端メチル基、他端アミノプロピル基のポリエチレングリコールの代わりに、カルボキシル基にＰＥＧ（分子量５０００）２分子がアミド結合したＬ−アスパラギン酸を用い、実施例１と同様の操作をすることによりＰＥＧ（分子量５０００）２分子結合フラーレンを得た。【００４３】
試験例４
実施例２の水溶性フラーレンに光照射した場合の癌細胞増殖阻害活性の測定
光照射によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの癌細胞増殖阻害活性を測定した。癌細胞としてＲＬmale１細胞（京都パスツール研究所より供与）を用い、この細胞を１００ｍｍディッシュにてＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ社、ウシ胎児血清１０％含有）中、５％ＣＯ２、９５％大気、３７℃の培養条件下で、８０％コンフルエントになるまで培養した。実施例２の水溶性フラーレンを遮光条件下で、癌細胞の培養に用いたものと同じ組成の培地に溶解し、２５０μＭの濃度に調整後、滅菌濾過を行った。滅菌調整した２５０μＭの溶液を培地にて順次希釈し、１２５μＭ、および６２．５μＭの溶液を調製した。９６ウエルプレートの各ウエルに調製した種々の溶液を１０μＬずつ分注し、コントロールのウエルには実施例２の化合物を含まない培地のみを１０μＬ分注した。上記の８０％コンフルエントになった細胞を５×１０４細胞／ｍＬに調製して細胞懸濁液を得、上記の各ウエルに細胞懸濁液を１００μＬずつ分注した。９６ウエルプレートをシェーカーにて軽く攪拌した後、８Ｗライトボックス（富士カラー販売）上に２０分、または４０分間放置し、光照射を行った。光照射後、プレートをアルミホイルで遮光し、インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）内で３日間培養した。光未照射のコントロールは攪拌後、直ちにプレートをアルミホイルで遮光し、３日間培養した。３日間培養後各ウエルに生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク社）を１０μＬずつ添加し、インキュベータで８０分間保温した後、４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーＶＥＲＳＡｍａｘ（日本モレキュラーデバイス社）で測定した。各光照射時間について、実施例２の化合物未添加における４５０ｎｍの吸光度を生存率１００％として癌細胞の生存率を求め、結果を図５に示した。
実施例２の水溶性フラーレンは４０分間の光照射において、その添加量の増加に従って癌細胞の生存率が顕著に低下することが示された。【００４４】
試験例５
実施例１の水溶性フラーレンに光照射した場合の抗癌活性の測定
光照射におけるｉｎ  ｖｉｖｏの抗癌活性を投与経路を変えて比較した。担癌マウスは、マウス結腸癌Ｃｏｌｏｎ２６細胞（癌研究会  癌化学療法センターより供与）をＢＡＬＢ／ｃ−ｎｎ（雌、日本チャールズ・リバー社）皮下移植にて継代した腫瘍隗を摘出し、細切片をＣＤＦ１マウス（雌、日本チャールズ・リバー社）の背部皮下に移植することによって作製した。移植５日後に皮下に直径５ｍｍ程度の腫瘤を形成したマウスを担癌マウスとして実験に用いた。実施例１の化合物を６ｍｇ／ｍＬになるようにリン酸緩衝生理食塩液に溶解し、腫瘍部皮下または腫瘍内に１００μＬ投与した群には、投与５分後にｂｌｕｅｐｈａｓｅ（ビバデント社）を用いて腫瘍部位に光照射を行った。照射条件は直径８ｍｍのプローブを用いて６５０Ｗ／ｃｍ２の出力で４分間照射した。この操作を３日間連続して行った。静脈内投与群は、実施例１の水溶性フラーレンを６０ｍｇ／ｍＬになるようにリン酸緩衝生理食塩液に溶解し、マウス尾静脈内に１００μＬ投与し、投与２４時間後にｂｌｕｅｐｈａｓｅを用いて腫瘍部位に光照射を行った。照射条件は皮下および腫瘍内投与群と同一条件であり、この操作を３日間連続して行った。
水溶性フラーレン未投与で光照射を行わない担癌マウスを対照群とし、経時的に各マウス皮下の腫瘤サイズを計測した。腫瘤サイズは腫瘤の長軸と短軸をノギスにて実測し、Ｗｉｎｎにより報告されている計算式（Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  Ｍｏｎｏｇｒ．，Ｖｏｌ．２，ｐ１１３−１３８（１９６０））を用いて算出した。その結果を図６に示した。【００４５】
実施例１の水溶性フラーレンの投与と光照射を併用すると腫瘍体積の増加は抑制され、その抑制効果は皮下投与＜腫瘍内投与＜静脈内投与の順で増加した。静脈内投与群は２４時間後の光照射にもかかわらず最も効果的であったことから、本発明の水溶性フラーレンは、経血管的に投与することが至適投与方法であり、ＥＰＲ効果が寄与している可能性が示された。【００４６】
試験例６
実施例２の水溶性フラーレンに超音波照射した場合の癌細胞増殖阻害活性の測定
受田の報告（ＤＯＪＩＮ  ＮＥＷＳ，Ｎｏ．９６，ｐ１−６，２０００）を参考に生細胞数測定試薬ＳＦを用いて、超音波照射による活性酸素（スーパーオキサイドアニオン，Ｏ２−）の発生量を測定した。実施例２の水溶性フラーレンを２００μＭになるようにハンクス平衡塩溶液に溶解した溶液を３５ｍｍディッシュに７５０μＬずつ分注した。これに６００μＬのハンクス平衡塩溶液と１５０μＬの生細胞数測定試薬ＳＦを混合し、攪拌しながら、液面より種々の出力の超音波(１．５、２．０、２．５、および３．０Ｗ／ｃｍ２)を超音波治療器ＵＳ−７００（伊藤超短波社）を用いて、周波数１ＭＨｚ、出力モード（Ｄｕｔｙ  ｃｙｃｌｅ）３０％で５分間照射した。照射後、溶液の４５０ｎｍの吸光度を分光光度計ＤＵ−６５０で測定した。化合物を添加せずに超音波照射を行った溶液の４５０ｎｍの吸光度をコントロールとし、１分間当りのＯ２−発生量を求め図７に示した。
実施例２の水溶性フラーレンは超音波照射を行った場合、その出力増加に従って活性酸素の発生量が増加することが示された。【００４７】
試験例７
実施例１の水溶性フラーレンに超音波照射した場合の癌細胞増殖阻害活性の測定
超音波照射におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏの抗癌活性を測定した。試験例４と同様にＲＬmale１細胞を用いた。実施例１の水溶性フラーレンを遮光条件下で、癌細胞の培養に用いたものと同じ組成の培地に溶解し、５００μＭの濃度に調整後、滅菌濾過を行った。滅菌調整した５００μＭの溶液から、２５０μＭの溶液を調製した。６ウエルプレートに調製した溶液を２００μＬずつ分注し、コントロールのウエルには実施例１の水溶性フラーレンを含まない培地のみを２００μＬ分注した。ＲＬmale１細胞を１×１０５細胞／ｍＬに調製して細胞懸濁液を得、上記の各ウエルに細胞懸濁液を２ｍＬずつ分注した。ウエルの細胞をピペットで軽く混合した後、伝導ジェルを介してプレートの底部より、周波数１ＭＨｚ、または３ＭＨｚの超音波を超音波治療器ＵＳ−７００を用いて、出力２．０Ｗ／ｃｍ２、出力モード２０％で２分間照射した。超音波照射後、プレートをアルミホイルで遮光し、インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）内で３日間培養した。超音波未照射のコントロールは混合後、直ちにプレートをアルミホイルで遮光し、同様に３日間培養した。３日間培養後各ウエルから細胞懸濁液１００μＬを９６ウエルプレートに分注し、各ウエルに生細胞数測定試薬ＳＦを１０μＬずつ添加し、インキュベータで４５分間保温した後、４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーＶＥＲＳＡｍａｘで測定した。各周波数において実施例１の水溶性フラーレン未添加における４５０ｎｍの吸光度を生存率１００％として癌細胞の生存率を求め、結果を図８に示した。【００４８】
超音波照射においても試験例４と同様に本発明化合物の添加量の増加に伴い癌細胞の生存率が低下することが示された。この効果は周波数３ＭＨｚよりも１ＭＨｚのほうが顕著であった。従って本発明の水溶性フラーレンは、光照射による癌の光線力学的治療だけではなく、超音波照射による超音波治療にも使用できる事が示された。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
以上に詳細に説明したように、本発明によれば、水溶性高分子の結合数を制御した水溶性フラーレンを得ることができる。本発明の水溶性フラーレンに光を照射すると、２２０ｎｍ〜可視光領域（３８０〜７８０ｎｍ）の広い波長範囲でＯ２−が発生する。特に、２６０〜４５０ｎｍの波長範囲で高いＯ２−発生能を発揮する。また、超音波照射により惹起されたソノルミネッセンスによって発生する光は、主として３００〜６００ｎｍの波長範囲を有し、本発明の水溶性フラーレンに超音波を照射してもＯ２−が発生する。更には、本発明の水溶性フラーレンは、癌組織や炎症組織に対して高い集積性を有する。従って、本発明の水溶性フラーレンを活性酸素発生剤として使用して、癌の光線力学的治療あるいは超音波治療に適用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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