(57)【要約】この発明は、検体をトリス緩衝剤および必要に応じて添加される界面活性剤で希釈し、この希釈検体に抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を反応させてアポＢ−４８を測定することからなるアポＢ−４８測定方法およびそれに使用するアポＢ−４８測定用キットを提供する。これによって、特に血液中のアポＢ−４８を正確に、迅速にかつ簡便に測定することができる。  また、この発明のアポＢ−４８測定方法および／またはそれに使用するアポＢ−４８測定用キットはアポＢ−４８関連疾患を診断するとともに、血液中のアポＢ−４８を増減させる高脂血症治療薬成分並びに機能性食品成分の効能評価にも応用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体をトリス緩衝剤で希釈し、この希釈検体に抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を反応させてアポＢ−４８を測定することを特徴とするアポＢ−４８測定方法。
【請求項２】
請求の範囲第１項に記載のアポＢ−４８測定方法において、前記希釈検体に抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を反応させて前記検体中のアポＢ−４８を結合させ、抗アポＢ−４８／アポＢ−１００−ビオチン標識抗体を添加して前記アポＢ−４８に結合させた後、アビジン結合パーオキシダーゼとを反応させ、更に発色基質と反応させることによってアポＢ−４８を測定することを特徴とするアポＢ−４８測定方法。
【請求項３】
請求の範囲第１項または第２項に記載のアポＢ−４８測定方法において、前記トリス緩衝剤がトリス、トリス塩酸緩衝液、トリスマレイン酸緩衝液またはグッドバッファーであることを特徴とするアポＢ−４８測定方法。
【請求項４】
請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか１項に記載のアポＢ−４８測定方法において、前記希釈検体に界面活性剤が更に添加されていることを特徴とするアポＢ−４８測定方法。
【請求項５】
請求の範囲第１項ないし第４項のいずれか１項に記載のアポＢ−４８測定方法において、前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤であることを特徴とするアポＢ−４８測定方法。
【請求項６】
アポＢ−４８測定用キットであって、トリス緩衝剤と抗アポＢ−４８モノクローナル抗体とを含んでいることを特徴とするアポＢ−４８測定用キット。
【請求項７】
請求の範囲第６項に記載のアポＢ−４８測定用キットにおいて、抗アポＢ−４８／アポＢ−１００−ビオチン標識抗体と、アビジン結合パーオキシダーゼと、発色基質とを更に含んでいることを特徴とするアポＢ−４８測定用キット。
【請求項８】
請求の範囲第６項または第７項に記載のアポＢ−４８測定用キットにおいて、前記トリス緩衝剤がトリス、トリス塩酸緩衝液、トリスマレイン酸緩衝液またはグッドバッファーであることを特徴とするアポＢ−４８測定用キット。
【請求項９】
請求の範囲第６項ないし第８項のいずれか１項に記載のアポＢ−４８測定用キットにおいて、界面活性剤が更に含まれていることを特徴とするアポＢ−４８測定用キット。
【請求項１０】
請求の範囲第６項ないし第９項のいずれか１項に記載のアポＢ−４８測定用キットにおいて、前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤であることを特徴とするアポＢ−４８測定用キット。
【請求項１１】
請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項に記載のアポＢ−４８測定方法および／または請求の範囲第６項ないし第１０項のいずれか１項に記載のアポＢ−４８測定用キットを用いて、検体中のアポＢ−４８を測定することを特徴とするアポＢ−４８測定方法。
【請求項１２】
請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項もしくは請求の範囲第１１項に記載のアポＢ−４８測定方法および／または請求の範囲第６項ないし第１０項のいずれか１項に記載のアポＢ−４８測定用キットを用いて、検体中のアポＢ−４８を測定することによってアポＢ−４８関連疾患を診断することを特徴とする疾患診断方法。
【請求項１３】
請求の範囲第１２項に記載の疾患診断方法において、前記アポＢ−４８関連疾患が高脂血症、動脈硬化性疾患、心機能不全症またはポックリ病であることを特徴とする疾患診断方法。
【請求項１４】
請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項もしくは請求の範囲第１１項に記載のアポＢ−４８測定方法および／または請求の範囲第６項ないし第１０項のいずれか１項に記載のアポＢ−４８測定用キットを用いて、高脂血症治療薬成分並びに機能性食品成分の効能評価法。
【請求項１５】
請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項に記載のアポＢ−４８測定方法とアポＢ−４８以外の他の測定項目を組みあせて同一検体で同一測定器により同時多項目に測定することを特徴とする疾患分析法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  この発明は、アポリポタンパク質Ｂ−４８の測定方法およびその用途に関するものである。更に詳細には、この発明は、アポリポタンパク質Ｂ−４８の測定方法ならびにアポリポタンパク質Ｂ−４８測定用キットまたはそれらを用いたアポリポタンパク質Ｂ−４８関連疾患の診断方法ならびに血液中のアポリポタンパク質Ｂ−４８を増減させる高脂血症治療薬成分並びに機能性食品成分の効能評価法に関するものである。
【背景技術】  現在、日本人の死因は、心疾患と脳血管疾患、いわゆる動脈硬化性疾患が、悪性新生物（がん）に次いで多く、動脈硬化の予防ならびに治療により、この動脈硬化性疾患による死亡率を低下させることは、高齢化社会における国民健康の上からも急務である。
ところが、動脈硬化性疾患は、必ずしも確実で効果的な診断法も治療法も確立されていないのが現状であるところから、確実でかつ有効な診断法ならびに治療法の開発が待望されている。しかしながら、この動脈硬化性疾患の発症の原因は、一様ではなく、高脂血症、高血圧症、糖尿病、肥満、喫煙、遺伝、加齢など実に多くの要因が関係していることが明らかになっている。その中でも、最大の危険因子といわれているのが、高脂血症である。
高脂血症は、全身の血管に動脈硬化を発症させ、動脈硬化が進展すると、血液の流れが悪くなり、各種臓器に障害が発生する。この動脈硬化が心臓血管（冠動脈）に発症すると、虚血性心疾患（狭心症や心筋梗塞）の原因となり、脳血管に発症すると、脳血管疾患（脳梗塞）の原因となる。
高脂血症とは、血液中の脂肪、特にコレステロールと中性脂肪（トリグリセリド）などの脂質が過剰に存在している状態である。コレステロールとトリグリセリド（中性脂肪）は、そのままでは水分が大半を占める血液中には溶け込むことができない。そこで、コレステロールと中性脂肪は、球状のリポタンパク質という粒子に形を変えて血液中に溶け込んでいる。このリポタンパク質は、その表層が親水性のリン脂質、遊離コレステロール、アポタンパク質から構成され、その内部の核層には、疎水性のコレステロール（多くはエステル型コレステロール）とトリグリセリド（中性脂肪）とが存在している。これらの脂肪は、体内の細胞膜を構成するとともに、ステロイドホルモンなどの材料として元来重要な役割を担っている。しかしながら、血液中の脂肪、特にコレステロールとトリグリセリドとが過剰に存在すると、高脂血症の原因となる。
高脂血症などにより動脈硬化が起こると、体内を循環する血液中に存在するコレステロールやトリグリセリド（中性脂肪）を構成しているリポタンパク質のうち、血管内壁へのコレステロールの沈着促進または沈着防止に関与する種々のリポタンパク質が増減する。これらのリポタンパク質の血中量を正確に測定することができれば、高脂血症や動脈硬化症の診断および治療に役立てることができることになる。
ところで、血液中のリポタンパク質は、血清脂質とアポリポタンパク質とが結合してできていて、血清脂質の運搬体としての役割を果たしている。
また、リポタンパク質は、その脂質構成などによって比重や粒子サイズが異なり、一般的には、カイロミクロン（ＣＭ）、超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、中間比重リポタンパク質（ＩＤＬ）、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）の５種類に分けられる。このリポタンパク質は、この順に比重が重くなり、粒子の大きさはこの順に小さくなっている。また、これらのリポタンパク質は、コレステロールと中性脂肪（トリグリセリドＴＧ）との割合がそれぞれ異なっており、大きい粒子では中性脂肪の割合が多くなり、小さい粒子ではコレステロールの割合が多くなっている。
これらリポタンパク質のうち、カイロミクロン（ＣＭ）は、トリグリセリド（中性脂肪）が主成分であり、食物由来のトリグリセリドやコレステロールから合成され、小腸から産生分泌される。また、ＣＭは、胸管リンパ管を経て血液中に分泌され、リポタンパクリパーゼ（ＬＰＬ）により、トリグリセリドが分解されてその粒子が小さくなり、コレステロールに富んだカイロミクロンレムナント（ＣＭ−Ｒ）になる。このカイロミクロンレムナントは、アポリポタンパク質Ｅを介して肝臓に取り込まれる。このように、カイロミクロン（ＣＭ）は、外因性（食事由来）トリグリセリドを脂肪組織や筋肉に運搬するとともに、コレステロールを肝臓に運搬する役目を果たしている。
超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）も、トリグリセリド（中性脂肪）が主成分であり、肝臓と小腸で生成され分泌された後、主に内因性の脂質、つまり、肝細胞で合成された内因性トリグリセリドと内因性コレステロールとを肝臓から血液中に運搬する。ＶＬＤＬは、その１部は直接組織に取り込まれるが、そのほとんどはリボタンパクリパーゼ（ＬＰＬ）によってそのトリグリセリドが分解されて中間比重リポタンパク質（ＩＤＬ＝ＶＬＤＬレムナント）になる。
この中間比重リポタンパク質（ＩＤＬ）は、アポリポタンパク質Ｅを介して肝臓に取り込まれ、リパーゼによって分解されて低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）になる。
この低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）は、上記したように、超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）から中間比重リポタンパク質（ＩＤＬ）を介して代謝されて生成される。ＬＤＬは、コレステロールが最も多く含まれていて、約４０％がコレステロールで構成されていて、主としてコレステロールを肝臓を始めほとんど全ての組織に供給している。このＬＤＬは、粒子が小さいことから、動脈壁を透過しやすいという性質を持っている。動脈壁中に透過したＬＤＬは、血液中とは異なって、非常に酸化されやすくなって、酸化ＬＤＬになる。この酸化ＬＤＬが動脈硬化発症の引き金として作用している。したがって、動脈硬化の予防・治療には、コレステロールの量を減らすとともに、この酸化から守ることが重要と考えられるようになった。
他方、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）は、主に小腸と肝臓で生成されるほか、カイロミクロン（ＣＭ）や超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）がリポタンパクリパーゼの作用を受けて異化される過程でも生成される。このＨＤＬは、末梢組織の細胞での余剰なコレステロールや動脈壁に蓄積したコレステロールを回収して肝臓に運搬して異化する役目を果たしている。したがって、このＨＤＬの量を増やすことは、高脂血症を改善することになり、動脈硬化の予防・治療に繋がることになる。
ところが、最近では、空腹時の脂質レベルのみでは、動脈硬化のリスクを評価するには不十分であることが明らかとなってきている。この食後の脂質レベルによって動脈硬化のリスク、つまり食後高脂血症の評価が必要であると考えられている。
食後に増加する脂質としては、トリグリセリド（ＴＧ）がある。高トリグリセリド血症は、ＴＧを豊富に含むリポタンパク質、つまり、ＴＧリッチリポタンパク質であるカイロミクロン（ＣＭ）、超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）および代謝物であるレムナントリポタンパク質の増加による。この高トリグリセリド血症の原因となる３つのリポタンパク質の内、レムナントリポタンパク質が動脈硬化の危険性評価をする場合には最も重要と考えられている。
つまり、小腸で産生され食事由来の外因性ＴＧを豊富に含んでいるカイロミクロン（ＣＭ）は、リポタンパクリパーゼ（ＬＰＬ）により分解されＣＭレムナントになり、肝臓でアポリポタンパク質Ｅを認識するレムナントレセプターに取り込まれ処理される。
今のところ、食物由来の循環中の外因性脂質の結合体、つまりカイロミクロンならびにカイロミクロンレムナントと、肝臓から分泌された内因性脂質の結合体、つまり超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）ならびに低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）とを識別する簡単で、再現性ある迅速なアッセイ法は存在していない（Ｌｏｖｅｇｒｏｖｅ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｉｍ．ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙ．Ａｃｔａ，１３０１（１９９６）２２１−２２９）。
しかし、カイロミクロン（ＣＭ）と超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）は食事の前後では大きな変動は認められない。これに対して、このレムナントリポタンパク質は、カイロミクロン（ＣＭ）と超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）が、リボタンパクリパーゼ（ＬＰＬ）によって、そのトリグリセリドが分解代謝されて生成する代謝産物（ＣＭレムナントとＶＬＤＬレムナント）であり、健常人では肝細胞などによって速やかに吸収分解される。したがって、このレムナントリポタンパク質は、食後には増加するものの空腹時血中には存在していない。しかし、このレムナントリポタンパク質は、代謝異常や、過食・運動不足などにより代謝が遅くなり、食後の血液中に停滞すると、動脈壁のマクロファージに容易に取り込まれ、動脈硬化の初期病変の原因となると考えられている。このレムナントリポタンパク質は、レムナント様リポタンパク質（ｒｅｍｎａｎｔ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ：ＲＬＰ）と呼ばれていて、食後高脂血症を構成する重要な因子であると考えられている。
一方、このレムナント様リポタンパク質を構成するタンパク質成分としてアポリポタンパク質（アポタンパク質）が存在する。このアポタンパク質は、水に不溶性の脂質（エステル型コレステロール、中性脂肪など）に結合して脂質を血液中に溶解しやすくして運搬する役目を持っているとともに、アポタンパク質自体も各種の脂質代謝に深く関与している。かかるアポタンパク質として、アポタンパク質Ａ−Ｉ、アポタンパク質Ａ−ＩＩ，アポタンパク質Ｂ、アポタンパク質Ｃ−Ｉ、アポタンパク質Ｃ−ＩＩ、アポタンパク質Ｅなど現在１０数種類が存在していることが確認されている。
このうち、アポタンパク質Ｂにはアポタンパク質Ｂ−１００（アポＢ−１００）とアポタンパク質Ｂ−４８（アポＢ−４８）の２種類がある。前者は肝臓で合成される。ヒト血漿ＶＬＤＬの主要なタンパク質成分であり、その合成ならびに分泌に重要な役割を果たしている。後者は小腸で産生され、カイロミクロン（ＣＭ）の合成に関与しているアポＢ−４８とがある。アポＢ−１００は、超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）中に存在するタンパク質の約４０〜６０％を、また低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）の約９８％を占めている（Ｍａｈｌｅｙ，Ｒ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ：Ｊ．（１９８４）Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．２５，１２７７−１２９４）。また、アポＢ−４８は、ヒト血中にあって高脂血症と密接に関連しているリポタンパク質の構成タンパク質であり、その測定が正確に可能であれば、高脂血症や動脈硬化症の診断及び治療に有用である。
ところが、アポＢ−４８は、肝臓によって分泌されたアポＢ−１００のＮ末端アミノ酸配列と４８％が同一のアミノ酸配列を有していて相同性が非常に高いので、アポＢ−４８と、アポＢ−１００とは正確に区別することが非常に困難である（Ｌｏｖｅｇｒｏｖｅ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．：ｉｂｉｄ）。
このように、このレムナントリポタンパク質は、動脈硬化の危険因子であることは知られていたが、その測定が容易でなかったために、実際の臨床検査には長年利用されてこなかった。これまでの測定法としては、密度で分ける超遠心分離法や、荷電で分けるアガロース電気泳動法、またサイズで分ける電気泳動法や、アポタンパク質に対する抗体を使用したリポタンパク質を測定する方法などがあるが、これらはいずれも測定が困難であったり、定量性に欠けたり、または特異性がないなどの理由により、実用的ではなかった。
しかしながら、レムナント様リポタンパク質（ＲＬＰ）自体を正確に測定することは非常に難しい。そこで、レムナント様リポタンパク質（ＲＬＰ）の血中濃度を、そのレムナントタンパク質中に存在するコレステロール、つまり、レムナント様リポタンパク質コレステロール（ｒｅｍｎａｎｔ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ：ＲＬＰ−Ｃ）として測定する方法が開発された。
このＲＬＰ−Ｃ測定法は、抗アポＡ−Ｉモノクローナル抗体と抗アポＢ−１００モノクローナル抗体とを用いて、アポＡ−ＩとアポＢ−１００とを上記モノクローナル抗体に結合させて除去して、上清中に残存する未結合リポタンパク質の量をコレステロールの量として測定するものである。つまり、アポＡ−ＩはＣＭ、ＨＤＬの主要なアポタンパク質として存在し、またアポＢ−１００はＶＬＤＬ、ＶＬＤＬレムナント、ＬＤＬの主要なアポタンパク質として存在するところから、抗アポＡ−Ｉモノクローナル抗体には、ＣＭとＨＤＬとが結合し、抗アポＢ−１００モノクローナル抗体には、ｎａｓｃｅｎｔ（原始型）ＶＬＤＬ（又はＶＬＤＬ−２）とＬＤＬとが結合することになる。しかし、この抗アポＢ−１００モノクローナル抗体は、アポＢ−１００の特定アミノ酸領域を特異的に認識するものであり、アポＢ−１００のアミノ酸配列の１部からなるアポＢ−４８を認識しない。したがって、ＲＬＰ−Ｃ測定法では、アポＢ−４８含有カイロミクロンとＡＰＯ−Ｅ  ｒｉｃｈ  ＶＬＤＬが測定される。
しかしながら、このＲＬＰ−Ｃ測定法は、吸着除去操作が必須であり、作業が煩雑であるとともに、完全な吸着が必要であるところから測定操作に熟練が要求される。
上記したように、アポＢ−４８は、ＣＭとＣＭレムナントにアポタンパク質として含有されている。ＣＭは、食後速やかにリポタンパク質リパーゼによりＣＭレムナントに変換されるので、空腹時等においては、血中にＣＭは存在しない。したがって、ＣＭレムナントに含まれるアポＢ−４８のみの量を正確に測定することができれば、より確実な高脂血症の診断が可能となり、動脈硬化症の診断および治療に大いに役立つものと考えられる。
アポＢ−４８だけを特異的に認識できる抗アポＢ−４８モノクローナル抗体が開発できれば、血中に含まれるＣＭレムナントのみの量を直接測定することができると考えられる。
かかる測定方法の１つとして、食後高脂血症を定量的に診断するために抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ測定方法が報告されている（木下誠ら、「アポＢ−４８含有リポ蛋白の測定法の開発」、第３０回日本動脈硬化学会総会抄録集（１９９９年６月１１−１２日）、１３３頁）。この方法は、アポＢ−４８を特異的に認識するモノクローナル抗体（４Ｃ８）を作成し、それを用いたプレートに２％ＳＤＳを含むＰＢＳで希釈した血清を添加して、アポＢ−４８含有リポ蛋白を測定することからなっている。しかしながら、２％ＳＤＳ中では血清中のアポＢ−４８を測定できず、ＳＤＳは、逆に免疫反応を阻害するため、アポＢ−４８のエピトープを露出させるための界面活性剤として好ましくないとの記載がある（日本国特許ｐ３４４０８５２、第８欄、７−９頁）。
また、抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を用いた別の測定方法として、検体を、非イオン性界面活性剤および陰イオン性界面活性剤としてのデオキシコール酸ナトリウムから選択される界面活性剤による処理または凍結融解処理してエピトープを露出させるための処理後、該検体と、実質的なアポＢ−１００には反応せず、アポＢ−４８を特異的に認識するモノクローナル抗体とを反応させることを特徴とするアポＢ−４８および・またはアポＢ−４８含有リポ蛋白の免疫測定方法からなっている（日本国特開Ｐ２００３−２７０２４７Ａ）。
また、この特許記載の方法では、各種界面活性剤を含むＰＢＳで血清を希釈し、この希釈血清にアポＢ−４８を特異的に認識するモノクローナル抗体Ｂ４８−１５１（同特許、第１２欄、第３０−３８行）を添加して、アポＢ−４８Ｃ末エピトープが露出されているかどうかを判断している。その結果、界面活性剤が含まれていない場合には、上記エピトープは露出しておらず、全く発色していないのに対し、トライトンＴＭＸ−１００、トライトンＴＭＸ−１１４、ツィーンＴＭ−２０、ＮＰＴＭ−４０などの非イオン性界面活性剤を使用した場合には、強い発色が認められ、アポＢ−４８Ｃ末エピトープが露出されていると判断している（同特許、第１４欄、第１２−２６行）。
そこで、本発明者らは、アポＢ−４８をより正確に測定することができる更に別のアポＢ−４８の測定方法を開発すべく種々検討した結果、アポＢ−４８をより正確に測定することができるアポＢ−４８測定方法を見出して、この発明を完成した。
【発明の開示】
したがって、この発明は各種界面活性剤を必ずしも使用しない測定方法である。トリス緩衝液で希釈した検体を、抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を用いてアポＢ−４８を測定することからなるアポＢ−４８測定方法を提供することを目的としている。
また、この発明は、上記アポＢ−４８測定方法に利用することができるアポＢ−４８測定用キットを提供することを目的としている。
この発明の好ましい態様としては、更に界面活性剤を使用することからなるアポＢ−４８測定方法およびアポＢ−４８測定用キットを提供することを目的としている。
更に、この発明は、上記アポＢ−４８測定方法またはアポＢ−４８測定用キットを使用して、アポＢ−４８を正確にかつ迅速簡単に測定することにより、アポＢ−４８が関連している各種疾患を診断もしくは治療する方法を提供することを目的としている。
また、アポＢ−４８測定用キットを用いて、高脂血症治療薬成分並びに機能性食品成分の効能評価方法を提供することを目的としている。
【発明を実施するための最良の形態】  この発明に係るアポＢ−４８測定方法は、トリス緩衝剤で希釈した検体を、抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を用いてアポＢ−４８を測定することからなる方法である。
この発明に使用することができるモノクローナル抗体は、アポＢ−４８のＣ末端からのアミノ酸配列の１部を特異的に認識することができる抗アポＢ−４８モノクローナル抗体であればいずれも使用することができ、例えば、上記抗アポＢ−４８モノクローナル抗体（４Ｃ８）を使用することができる。これらのモノクローナル抗体は、いずれも当業者に周知の慣用方法によって製造することができる。
一方、この発明に使用することができるトリス緩衝剤としては、この発明の目的を適うものであればいずれも使用することができ、例えば、トリス（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール・トリス）、トリス−塩酸緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンヒドロクロリド）（ｐＨ７．２−９．０）、トリス−マレイン酸緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンマレエート）（ｐＨ５．２−８．６）などが挙げられる。また、この発明に使用できるトリス緩衝剤は、Ｇｏｏｄ′ｓ  ｂｕｆｆｅｒ（グッドバッファー）に分類されるものであって、例えば、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、コラミンクロリド、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＨＥＰＰＳ（ＥＰＰＳ）、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、グリシンアミドなどが挙げられる。
かかるトリス緩衝剤の使用濃度は、その種類などによって適宜変することができるが、例えば、トリス−塩酸緩衝液を使用する場合は、１０ｍＭ〜０．５Ｍの範囲であるのが好ましい。
この発明に係るアポＢ−４８測定方法においては、界面活性剤を用いる必要はないが、所望により、界面活性剤を使用することもできる。かかる界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤が好ましく、トライトンＸ−１００ＴＭ、トライトンＸ−１１４ＴＭ、ツィーン−２０ＴＭ、ＮＰ−４０ＴＭなどが例示される。これらの界面活性剤は、単独でも、または混合しても用いることができる。
かかる界面活性剤は、エピトープを露出させ易くするために用いるものであるが、一般に界面活性剤は免疫反応を阻害するので、エピトープの露出効果と免疫反応の阻害作用とのバランスによって使用濃度を適宜選択することができる。上記界面活性剤は、検体とモノクローナル抗体との免疫反応を行う際の溶液に共存させることもでき、通常０．０１％〜２％、好ましくは０．０２％〜０．５％の濃度で使用するのがよい。上記界面活性剤の処理温度および処理時間は、特に限定されるものではなく、例えば、通常４℃〜４０℃の温度で約５分〜４８時間の範囲であるのがよい。
なお、この発明においては、リポタンパク質のエピトープを露出させるために、検体を凍結融解を繰り返すことも可能であり、この凍結融解処理を行なう場合には、１回以上行うのがよい。
ここで、この発明に係るアポＢ−４８測定方法について更に詳細に説明する。ただし、下記の説明は、この発明を限定するために記載するものでは一切なく、この発明を具体的に説明するための単なる例示であるものと理解すべきである。したがって、この発明は、下記説明に一切限定されるものではないと理解すべきである。
この発明のアポＢ−４８測定方法は、例えば、検体をトリス緩衝剤で希釈し、この希釈検体を抗アポＢ−４８モノクローナル抗体（４Ｃ８）ＩｇＧ精製品を固相化したプレートに添加して、その検体に含まれているアポＢ−４８を結合させ、抗アポＢ−４８／アポＢ−１００−ビオチン標識抗体を結合させ、更にアビジン結合西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合させた後、ＥＬＩＳＡ法によってアポＢ−４８を測定することから構成されている。
このアポＢ−４８測定方法では、まず、検体としての血清に、例えば、０．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．８）を添加して血清サンプルを調製する。この血清サンプルを、抗アポＢ−４８モノクローナル抗体（４Ｃ８）ＩｇＧ固相化９６穴プレートに添加して、所定時間反応させて、血清サンプル中のアポＢ−４８と抗アポＢ−４８モノクローナル抗体（４Ｃ８）とを結合させる。その後、抗アポ−４８／Ｂ−１００−ビオチン標識抗体を添加して、所定時間反応させて、上記標識抗体を結合させる。更に、アビジン結合ＨＲＰなどのアビジン結合パーオキシダーゼを反応させて、上記標識抗体に結合させる。その後、テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）などの発色基質と反応させ、硫酸などの反応停止剤で反応停止させて、４５０ｎｍでの発色吸光を測定する。
この発明に係るアポＢ−４８測定方法は、ＥＬＩＳＡによるイムノアッセイ法（抗原抗体反応を原理とした測定法）に基づいて実施するのが好ましいが、その他のイムノアッセイ法にも使用することができる。例えば、無標識沈降法（比濁法、比ろう法等）、固相法（ラテックス法、Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ法、水晶発振子法等）、標識測定法（ラジオイムノアッセイ法、エンザイムイムノアッセイ法、発光イムノアッセイ法、蛍光イムノアッセイ法、金属標識イムノアッセイ法等）に応用できる。
この発明の別の態様であるアポＢ−４８測定用キットは、上記抗アポＢ−４８モノクローナル抗体（４Ｃ８）などの抗アポＢ−４８モノクローナル抗体と、トリス塩酸緩衝液などのトリス緩衝剤と、抗アポＢ−４８／アポＢ−１００−ビオチン標識抗体と、アビジン結合西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）などのアビジン結合パーオキシダーゼと、テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）などの発色基質と、硫酸などの反応停止剤と、から構成されている。また、抗アポＢ−４８モノクローナル抗体としては、抗アポＢ−４８モノクローナル抗体（４Ｃ８）ＩｇＧ固相化９６穴プレートなどが使用することができる。
以下、この発明を実施例によって更に説明するが、この発明は、下記実施例に一切限定されるものではなく、下記実施例は、この発明を更に具体的に例示して説明をする目的だけに記載するものと理解すべきである。
【実施例】実施例１：
検体としての血清に、０．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．８）を添加して測定用検体とした。一方、抗アポＢ−４８モノクローナル抗体（４Ｃ８）ＩｇＧ固相化９６穴プレートを洗浄用緩衝液で３回洗浄した。このプレートに、各ウエル当たりアポＢ−４８標準品（１６０ｎｇ／ｍｌ−２．５ｎｇ／ｍｌ）５０μｌ並びに上記測定用検体５０μｌを添加した。このプレートを室温で１時間反応させ、検体中のアポＢ−４８と抗アポＢ−４８モノクローナル抗体（４Ｃ８）とを結合させた。その後、洗浄用緩衝液で３回洗浄した。次に、この反応生成物に、抗アポＢ−４８／Ｂ−１００−ビオチン標識抗体（各ウエル当たり５０μｌづつ）を添加して、室温で１時間反応させ上記標識抗体を結合させた。その後、洗浄用緩衝液で３回洗浄した。更に、アビジン結合ＨＲＰ（各ウエル当たり５０μｌづつ）を室温で３０分間反応させて、上記標識抗体に結合させた。その後、テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）（各ウエル当たり５０μｌづつ）を添加して、室温で３０分間反応させて、１Ｍ硫酸（各ウエル当たり５０μｌづつ）を添加して反応停止させて、４５０ｎｍでの発色吸光を測定した。その結果は下表１に示す。
実施例２
検体としての血清に、０．１％トリトンＴＭＸ−１００含有０．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．８）を添加して測定用検体とした。一方、抗アポＢ−４８モノクローナル抗体（４Ｃ８）ＩｇＧ固相化９６穴プレートを洗浄用緩衝液で３回洗浄した。このプレートに、各ウエル当たりアポＢ−４８標準品（１６０ｎｇ／ｍｌ−２．５ｎｇ／ｍｌ）５０μｌ並びに上記測定用検体５０μｌを添加した。このプレートを室温で１時間反応させ、検体中のアポＢ−４８と抗アポＢ−４８モノクローナル抗体（４Ｃ８）とを結合させた。その後、洗浄用緩衝液で３回洗浄した。次に、この反応生成物に、抗アポＢ−４８／Ｂ−１００−ビオチン標識抗体（各ウエル当たり５０μｌづつ）を添加して、室温で１時間反応させ上記標識抗体を結合させた。その後、洗浄用緩衝液で３回洗浄した。更に、アビジン結合ＨＲＰ（各ウエル当たり５０μｌづつ）を室温で３０分間反応させて、上記標識抗体に結合させた。その後、テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）（各ウエル当たり５０μｌづつ）を添加して、室温で３０分間反応させて、１Ｍ硫酸（各ウエル当たり５０μｌづつ）を添加して反応停止させて、４５０ｎｍでの発色吸光を測定した。その結果は下表１に示す。
【表１】
2005093415.tif 000002
実施例３：キット
この発明の別の態様であるアポＢ−４８測定用キットは、次の構成を有している。
抗アポＢ−４８モノクローナル抗体（４Ｃ８）ＩｇＧ固相化９６穴プレート
アポＢ−４８標準品（検量線作製用抗原）
トリス塩酸緩衝液
抗アポＢ−４８／アポＢ−１００−ビオチン標識抗体
アビジン結合西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）
テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）
硫酸
濃縮洗浄液
実施例４：
実施例１と同様にして、健常者の空腹時アポＢ−４８の量を測定した結果を下表２に示す。
【表２】
2005093415.tif 000003
実施例５：
実施例１と同様にして、ポックリ病患者からの検体中のアポＢ−４８の量を測定した結果を下表３に示す。
【表３】
2005093415.tif 000004
実施例６：
実施例１と同様にして、急性心筋梗塞患者からの検体中のアポＢ−４８の量を測定した結果を下表４に示す。
【表４】
2005093415.tif 000005
発明の工業利用性
この発明のアポＢ−４８測定方法は、検体中のアポＢ−４８を正確に、迅速にかつ簡単に測定することができることから、高脂血症や動脈硬化症などの疾患の予防や治療に有用である。また、血液中のアポＢ−４８を正確にかつ確実に測定することができることから、心冠動脈疾患の検査方法としても有効であり、また突然死（ポックリ病）の予防に役立てることが可能である。
更に、この発明は、血液中のアポＢ−４８を増減させる高脂血症治療薬成分並びに機能性食品成分の効能評価法に応用できる。
【手続補正書】
【提出日】平成19年1月10日(2007.1.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体をトリス緩衝剤で希釈し、この希釈検体に抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を反応させてアポＢ−４８を測定することを特徴とするアポＢ−４８測定方法。
【請求項２】
請求項１に記載のアポＢ−４８測定方法において、前記希釈検体に抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を反応させて前記検体中のアポＢ−４８を結合させ、抗アポＢ−４８／アポＢ−１００一ビオチン標識抗体を添加して前記アポＢ−４８に結合させた後、アビジン結合パーオキシダーゼとを反応させ、更に発色基質と反応させることによってアポＢ−４８を測定することを特徴とするアポＢ−４８測定方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載のアポＢ−４８測定方法において、前記トリス緩衝剤がトリス、トリス塩酸緩衝液、トリスマレイン酸緩衝液またはグッドバッファーであることを特徴とするアポＢ−４８測定方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアポＢ−４８測定方法において、前記希釈検体に界面活性剤が更に添加されていることを特徴とするアポＢ−４８測定方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のアポＢ−４８測定方法において、前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤であることを特徴とするアポＢ−４８測定方法。
【請求項６】
アポＢ−４８測定用キットであって、トリス緩衝剤と抗アポＢ−４８モノクローナル抗体とを含んでいることを特徴とするアポＢ−４８測定用キット。
【請求項７】
請求項６に記載のアポＢ−４８測定用キットにおいて、抗アポＢ−４８/アポＢ−１００一ビオチン標識抗体と、アビジン結合パーオキシダーゼと、発色基質とを更に含んでいることを特徴とするアポＢ−４８測定用キット。
【請求項８】
請求項６または７に記載のアポＢ−４８測定用キットにおいて、前記トリス緩衝剤がトリス、トリス塩酸緩衝液、トリスマレイン酸緩衝液またはグッドバッファーであることを特徴とするアポＢ−４８測定用キット。
【請求項９】
請求項６ないし８のいずれか１項に記載のアポＢ−４８測定用キットにおいて、界面活性剤が更に含まれていることを特徴とするアポＢ−４８測定用キット。
【請求項１０】
請求項６ないし９のいずれか１項に記載のアポＢ−４８測定用キットにおいて、前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤であることを特徴とするアポＢ−４８測定用キット。
【請求項１１】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のアポＢ−４８測定方法および/または請求項６ないし１０のいずれか1項に記載のアポＢ−４８測定用キットを用いて、検体中のアポＢ−４８を測定することを特徴とするアポＢ−４８測定方法。
【請求項１２】
請求項１ないし５のいずれか１項もしくは請求項１１に記載のアポＢ−４８測定方法および/または請求項６ないし１０のいずれか１項に記載のアポＢ−４８測定用キットを用いて、高脂血症治療薬成分並びに機能性食品成分の効能評価法。
【請求項１３】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のアポＢ−４８測定方法とアポＢ−４８以外の他の測定項目を組みあせて同一検体で同一測定器により同時に多項目を測定することを特徴とする疾患分析法。
【国際調査報告】
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