(57)【要約】  たもぎ茸抽出物を有効成分とする抗腫瘍性免疫賦活剤が開示される。たもぎ茸抽出物は、腫瘍細胞細胞の増殖を抑制し、免疫賦活性サイトカインの産生を増強し、免疫抑制性Ｔ細胞増加を抑制することが示された。本発明はまた、たもぎ茸抽出物からなる免疫賦活用健康食品ならびに腫瘍細胞増殖抑制用健康食品を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
たもぎ茸抽出物を有効成分とする抗腫瘍性免疫賦活剤。
【請求項２】
たもぎ茸抽出物を有効成分とする腫瘍細胞増殖抑制剤。
【請求項３】
たもぎ茸抽出物を有効成分とする免疫賦活性サイトカインの産生増強剤。
【請求項４】
たもぎ茸抽出物を有効成分とする免疫抑制性Ｔ細胞増加の抑制剤。
【請求項５】
たもぎ茸抽出物からなる免疫賦活用健康食品。
【請求項６】
たもぎ茸抽出物からなる腫瘍細胞増殖抑制用健康食品。
【請求項７】
たもぎ茸抽出物を被験者に投与することにより、被験者において抗腫瘍性免疫を賦活させる方法。
【請求項８】
たもぎ茸抽出物を被験者に投与することにより、被験者において腫瘍細胞の増殖を抑制する方法。
【請求項９】
たもぎ茸抽出物を被験者に投与することにより、免疫賦活性サイトカインの産生を増強する方法。
【請求項１０】
たもぎ茸抽出物を被験者に投与することにより、免疫抑制性Ｔ細胞増加を抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、たもぎ茸抽出物を有効成分とする抗腫瘍性免疫賦活剤および免疫賦活用健康食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
キノコ類の生体免疫賦活作用についてはさまざまな報告がされており、免疫賦活の機作やキノコ種の違いによる生理活性の差などが徐々に明らかにされている。これまでにある種のキノコ類に含有される多糖体が抗癌の目的で製品化され使用されているが、その効果は必ずしも充分なものとはいえず、より有用な免疫賦活剤が望まれていた。【０００３】
近年、各種感染症、癌などに対する薬剤による治療法が開発され、その有用性が見いだされているが、癌化学療法や癌免疫療法も満足すべき結果は得られていない。これら疾患の発症は免疫担当細胞類の活性低下に起因するところが大きい。このため、免疫担当細胞に対して免疫賦活効果を有する組成物は、これらの疾患の予防や治療に極めて有用であり、健康維持の観点からも重要である。【０００４】
免疫系による生体防御機構には自然免疫と獲得免疫がある。自然免疫はマクロファージ、白血球が主体となり病原性細菌等のパターンを認識し捕食することにより生体内から排除する機構であるのに対して、獲得免疫はＴ細胞とＢ細胞を主体とした多様な異物抗原にそれぞれ対応できる免疫応答である。その免疫応答は抗原に生体が暴露されるほど強力かつ効率的に反応し、ウイルスなどの再感染を防御している。しかしながら免疫応答が生体内で常に活発に行われていると、逆に炎症性組織障害や自己免疫性疾患が多発することが示されており、生体内にはその免疫応答を“負”に制御できる細胞、つまり抑制性Ｔ細胞が正常個体中に自然状態で自己免疫寛容の維持に関与している。【０００５】
最近の研究で自然状態に存在する抑制性Ｔ細胞の異常がヒトの自己免疫性疾患、炎症性腸炎、アレルギーの直接原因となることが示されている。この抑制性Ｔ細胞の機能を強化できれば自己免疫病やアレルギー、さらには移植臓器に対する免疫拒絶反応の制御も期待できる。【０００６】
一方、抑制性Ｔ細胞は正常個体中で自己から発生した腫瘍細胞（癌細胞）に対する有効な免疫反応を阻害していることが示されている。すなわち自己免疫寛容に関与する細胞が腫瘍細胞に対しても寛容であることが考えられる。実際に正常個体から抑制性Ｔ細胞を実験的に除去すると腫瘍に対する免疫応答が惹起あるいは強化され抗腫瘍効果が発揮できる。【０００７】
正常個体に存在する抑制性Ｔ細胞はＣＤ４陽性Ｔ細胞群に含まれるＣＤ２５またはＧＩＴＲ(Glucocorticoid-induced TNFR family gene)およびＦｏｘＰ３遺伝子陽性細胞として分類されている。そのため正常個体中のリンパ組織（脾臓、リンパ節、末梢血、骨髄）に存在する抑制性Ｔ細胞はＣＤ４とＣＤ２５、ＧＩＴＲまたはＦｏｘＰ３分子の発現陽性細胞で解析することが可能である。抑制性Ｔ細胞の割合が生体内で増加しているときは個体が免疫寛容もしくは免疫抑制状態に陥りやすく、腫瘍、ウイルス、病原性細菌等に対する免疫応答も低下する。【０００８】
したがって、免疫抑制性Ｔ細胞の増加を抑制しうる免疫調整物質は免疫賦活剤の有効成分として有用であると考えられる。【０００９】
本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある：特開平１１−３０２１９１、および三崎旭ら、「キシメジ科食用茸（ヒラタケ、タモギタケ）の多糖の化学的性質及び抗腫瘍作用」、大阪市立大学生活科学部紀要、第３９巻（１９９１）、ｐ．１−８。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、安全性が極めて高い、免疫賦活作用を有する薬剤ならびに機能性食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、北海道産の食用キノコから免疫賦活作用を有するキノコを検索した結果、たもぎ茸の抽出物に高い免疫賦活作用があることを見いだした。【００１２】
すなわち、本発明は、たもぎ茸抽出物を有効成分とする抗腫瘍性免疫賦活剤を提供する。別の態様においては、本発明は、たもぎ茸抽出物を有効成分とする腫瘍細胞増殖抑制剤を提供する。腫瘍細胞としては、ヒトの体内の腫瘍、例えば、子宮頚部癌、白血病、リンパ腫、骨髄腫、黒色種、膵臓癌、前立腺癌、頭頚部癌、乳癌、肺癌、大腸癌、胃癌、食道癌、卵巣癌、扁平上皮癌、肝細胞癌、胆管癌、中皮腫および類表皮癌由来細胞、マウス等の実験動物に移植された腫瘍細胞、ならびにヒト腫瘍に由来する細胞株の細胞、例えば、ＨeLa、MeWo, Hs695T, A137, KATO-III, MKN45, MKN28, HuH28, Daudi, Ramos, Raji, U937, HS-Sultan, SKM-1, THP-1, IM-9, MM1S, K562, HL60, HSC-3, HSC-4, TTn, TE-10, IMR-32, U251, PC-3, LNCaP, DU145, DLD-1, WiDr, SW837, Lu135, IMR-90, A549, SK-OV-3, SK-Br-3, A431, RMG-1, MCF-7, MIAPaCa-2, AsPC1, KP-4が含まれる。また別の態様においては、本発明は、たもぎ茸抽出物を有効成分とする免疫賦活性サイトカインの産生の増強剤を提供する。免疫賦活性サイトカインとしては、例えば、インターロイキン(IL)１、２、３、４、５、６、７、１２、１５、１８、２１、２３、インターフェロン(IFN)α、β、γ、腫瘍壊死因子(TNF)α、β、が挙げられる。また別の態様においては、本発明は、たもぎ茸抽出物を有効成分とする免疫抑制性Ｔ細胞増加の抑制剤を提供する。さらに別の態様においては、本発明は、たもぎ茸抽出物からなる免疫賦活用健康食品ならびに腫瘍細胞増殖抑制用健康食品を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
図１は、たもぎ茸熱水抽出物によるＨｅＬａ細胞増殖の抑制を示す。
図２は、たもぎ茸熱水抽出物による腫瘍細胞Ｓａｒｃｏｍａ１８０の増殖の抑制を示す。
図３は、たもぎ茸熱水抽出物によるヒト樹状細胞の活性化抗原発現の増加を示す。
図４は、たもぎ茸熱水抽出物によるヒト樹状細胞からのＩＬ−１２産生の増強を示す。
図５は、マウス脾細胞中の抑制性Ｔ細胞のＦＡＣＳ解析の結果を示す。
図６は、Ｓａｒｃｏｍａ１８０担癌マウス脾臓中におけるＧＩＴＲ陽性抑制性Ｔ細胞の割合を示す。
図７は、たもぎ茸熱水抽出物および他のキノコ抽出物を与えたＳａｒｃｏｍａ１８０移植マウスの腫瘍体積の変化を示す。
図８は、たもぎ茸熱水抽出物および他のキノコ抽出物を与えたＳａｒｃｏｍａ１８０移植マウスの腫瘍重量の平均値を示す。
図９は、たもぎ茸熱水抽出物および他のキノコ抽出物を与えたＳａｒｃｏｍａ１８０移植マウスの生存率を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
たもぎ茸はヒラタケ属に属するキノコであり、北海道を中心として広く食用に供されている。たもぎ茸抽出物は以下の方法によって製造することができる。本発明において使用するたもぎ茸は、天然に産するものを収穫してもよく、工場で人工栽培してもよい。たもぎ茸は、好ましくは、収穫後２時間以内に使用する。【００１５】
収穫したたもぎ茸から有効成分を抽出する。抽出は好ましくは熱水抽出により行う。例えば、収穫したたもぎ茸を、たもぎ茸の重量の２−３０倍、好ましくは５−２０倍量の沸騰水の中に投入し、蒸気を加えながら撹拌する。沸騰してから１０分間撹拌しながらたもぎ茸エキスを抽出する。得られたエキスはそのまま使用してもよく、濾過して固形分を除いてもよい。また、減圧濃縮機、凍結濃縮機等を用いて適宜濃縮してもよい。また、エキスを長期間保存するためには、レトルトパックに封入した後、例えば、１２０℃、１５分間で殺菌処理をしてもよく、凍結乾燥または噴霧乾燥により粉末としてもよい。【００１６】
このようにして得られたたもぎ茸抽出物は、後述の実施例で示されるように、ＨｅＬａ細胞などのヒト癌に由来する細胞株の増殖を抑制し、マウスに移植した肉腫の成長を阻害することができた。さらに、たもぎ茸抽出物が、ＩＬ−１２などの免疫賦活性サイトカインの産生を増強し、樹状細胞を活性化させ、免疫抑制性Ｔ細胞の出現を阻害しうることが示された。これらの結果は、本発明にしたがうたもぎ茸抽出物が、免疫賦活活性および腫瘍細胞増殖抑制活性を有することを裏付ける。【００１７】
本発明にしたがって得られたたもぎ茸抽出物は、そのまま免疫賦活用健康食品あるいは腫瘍細胞増殖抑制用健康食品として用いることができるが、他の食品に添加して用いてもよい。摂取量は、固形分２．５％のエキスとして０．１−１０ｍｌ／ｋｇ／日、特に１．８−２．７ｍｌ／ｋｇ／日が適当である。【００１８】
本発明にしたがう免疫賦活剤は、毒性を有しないこと、多量に摂取しても生体に悪影響を与えないことなどの利点を有するため、健康食品に添加するのに非常に適している。【００１９】
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００４−２９０５２８号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。【００２０】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
キノコ熱水抽出物の調製
各種キノコの熱水抽出物を調製した。たもぎ茸、マイタケ、シメジ、およびシイタケ各１ｋｇをそれぞれ沸騰水５ｋｇ中に入れ、さらに加熱し、沸騰してから１０分間撹拌した。得られた抽出液を減圧濃縮して、固形分２．５％の濃縮物２４０ｍｌを得た。得られた濃縮物を１２０℃、１５分間のレトルト殺菌処理をして、キノコ熱水抽出物を得た。
【実施例２】
【００２２】
ＨｅＬａ細胞増殖抑制活性
実施例１で製造したたもぎ茸熱水抽出物をさらに減圧濃縮して、３倍濃度のたもぎ茸エキスを調製し、これを用いて、ＨｅＬａ細胞増殖抑制活性を測定した。ＨｅＬａ細胞を９６穴マイクロプレートでＭＥＭ培地中に３．７ｘ１０３細胞／ウエルで播種し、たもぎ茸エキスを最終固形分濃度がそれぞれ１．２５％、２．５％、２．７５％および３．７５％となるようにウエルに加え、３７℃で培養した。１２、２４、および４８時間後に、ＭＴＴ法により４５０ｎｍで細胞数を係数した。【００２３】
結果を図１に示す。たもぎ茸エキス添加後１２時間および２４時間では、すべての濃度で細胞数が減少した。４８時間では２．５％濃度以上で細胞数の減少が見られた。すなわち、たもぎ茸エキスを添加することによりＨｅＬａ細胞の増殖が抑制されることが明らかとなった。なお、対照としてマウス脾臓由来の正常細胞についても同様の実験を行ったが、たもぎ茸エキスは正常細胞の増殖には影響を及ぼさなかった。
【実施例３】
【００２４】
肉腫に対する抗腫瘍効果
実施例１で製造したたもぎ茸熱水抽出物のＳａｒｃｏｍａ１８０に対する抗腫瘍効果を測定した。Ｓａｒｃｏｍａ１８０の凍結細胞（東北大学加齢医学研究所より入手）を、３７℃の温水で急速解凍し、約１０倍量の生理食塩水を加え、遠心分離（１０００回転／分、５分間）し、上清を除去した。この操作を４回繰り返した後、ペレットに約３倍量の生理食塩水を加えて撹拌し、細胞液とした。【００２５】
細胞液０．１ｍｌ（約５×１０６個の細胞）を雌マウス（Ｓｌｃ：ＩＣＲ）５匹の腹腔内に移植し、７日後に頸椎脱臼により犠牲死させた。腹部をエタノール消毒し、滅菌した注射筒を用いて腹水を回収した。各動物から回収した腹水を混合し、約５×１０６個の細胞を雌マウス（Ｓｌｃ：ＩＣＲ、５週齢、約１８ｇ）の鼡径部皮下に移植した。【００２６】
予防効果の評価実験（群１−３）においては腫瘍移植前１０日間および移植後２１日間、治療効果の評価実験（群４）においては移植後２１日間、それぞれ１日１回試験溶液を経口投与した。投与は、所定量のたもぎ茸熱水抽出物と精製水からなる試験溶液１２ｍｌ／ｋｇをマウス用金属ゾンデを用いて移植動物の胃内に強制的に投与することにより行った。投与量は以下の表に示すとおりである。【００２７】
【表１】
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【００２８】
移植後５、７、１０、１４、１７、２１および２２日目に腫瘍体積を測定した。腫瘍体積は、ノギスを用いて腫瘍の短径（ａ）および長径（ｂ）を測定し、以下の式により算出し、平均±標準偏差で示した。
腫瘍体積（ｃｍ３）＝４／３πａ２ｂ／２【００２９】
結果を図２に示す。たもぎ茸熱水抽出物を投与することにより、腫瘍体積の増加が有意に抑制されることが示された。また、たもぎ茸熱水抽出物を予防的に投与することにより、さらに高い効果が得られることがわかった。
【実施例４】
【００３０】
樹状細胞の細胞表面抗原の発現変化
ヒト末梢血単核球由来樹状細胞の誘導は、加藤ら（K. Kato, et al., J Leukoc Biol, 70: 941-949, 2001）に記載されている手法に従い調製した。まず、ヘパリンを加えたシリンジを用いて健常人左腕静脈部より血液１５−２０ｍｌを採取し、無菌下で等量のＰＢＳで希釈した。等倍希釈血液を予め無菌プラスチックチューブに準備したリンフォセパール１５ｍｌ（ＩＢＬ社製）上に重層し、１５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。遠心後、リンフォセパール上の単核球層を回収し、ＰＢＳにて細胞を２回遠心洗浄した。単核球は最終的にＲＰＭＩ１６４０培地、１０％ウシ胎児血清含（Ｓｉｇｍａ社製）に希釈し、１０ｃｍのプラスチックシャーレに細胞を添加し培養した。３７℃で３０分後に非付着性の細胞（リンパ球）を除去し、付着細胞（単核球）に対して樹状細胞誘導培地（ＲＰＭＩ１６４０培地、１０％ウシ胎児血清、５０ｎｇ／ｍｌヒトＧＭ−ＣＳＦ（オステオジェネティクス社製）および５０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−４（オステオジェネティクス社製））にて３７℃で７日間培養し、ヒト単核球由来樹状細胞を誘導した。【００３１】
誘導した樹状細胞をプラスチックチューブに回収し、ＲＰＭＩ１６４０培地を加えて遠心洗浄を行い、細胞数を測定した。細胞濃度を最終的に２ｘ１０５個／ｍｌにＲＰＭＩ１６４０培地で調整し、０．５ｍｌずつ２４穴プレートに添加し、実施例１で調製した各種キノコ熱水抽出液（たもぎ茸、マイタケ、シメジ、シイタケ）をそれぞれ最終濃度２％で添加し３７℃で２４時間培養した。【００３２】
キノコ熱水抽出液で刺激した樹状細胞をプラスチックチューブに回収し、ＲＰＭＩ１６４０培地で遠心洗浄後、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ４５抗体、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ８６抗体（いずれもｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を各５μｌ添加し、４℃で１時間反応後、ＦＡＣＳ（ＢＤ社製）にて細胞表面抗原の発現変化を解析した。樹状細胞におけるＣＤ５４およびＣＤ８６は、免疫応答の惹起に不可欠な分子であり、抗原発現の増加は樹状細胞の活性化状態を示すものであることが知られている。その結果、図３に示すようにたもぎ茸熱水抽出液を添加した樹状細胞において非添加細胞と比較してＣＤ８６抗原の発現増加（ヒストグラムの右側へのシフト）が確認された。またこの発現増強は他のキノコ抽出液（マイタケ、シメジ）ではほとんど認められなかった。下記の表に樹状細胞上のＣＤ５４抗原とＣＤ８６抗原の発現変化量を示す（ＦｌｏｗＪｏソフトによる解析；ＴｒｅｅＳｔａｒ社製）。【００３３】
【表２】
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たもぎ茸熱水抽出液を添加することにより樹状細胞のＣＤ５４、ＣＤ８６抗原の発現が増加していることが確認され、この効果は他のキノコよりも有意に高いものであった。
【実施例５】
【００３４】
樹状細胞からのＩＬ−１２産生
実施例１で製造した各種キノコ熱水抽出物を用いて、ヒト樹状細胞からのＩＬ−１２産生の増強効果を調べた。インターロイキン１２（ＩＬ−１２）は、主として樹状細胞から産生されるサイトカインの１種であり、ＮＫ細胞、Ｔｈ１細胞の活性化に最も重要な因子であることが知られている。活性化樹状細胞から産生されるインターロイキン１２（ＩＬ−１２）の産生増強効果は以下の方法にて解析した。実施例４と同様に誘導した樹状細胞を細胞濃度を最終的に２ｘ１０５個／ｍｌにＲＰＭＩ１６４０培地で調整し、０．５ｍｌずつ２４穴プレートに添加した。成熟化刺激としては、アデノウイルスによるＣＤ４０リガンド遺伝子導入（ＡｘＣＡＣＤ４０Ｌ−Ｆ／ＲＧＤ、３００粒子／細胞）を行い、さらに各種キノコ熱水抽出物（たもぎ茸、マイタケ、シメジ、シイタケ）をそれぞれ最終濃度２％で添加し３７℃で４８時間培養した。【００３５】
キノコ熱水抽出液で４８時間活性化刺激した樹状細胞の培養液をプラスチックチューブに回収し、１００００ｒｐｍ、５分間遠心して上清を回収した。培養上清をＰＢＳにて１０倍に希釈後、ＩＬ−１２含有量をＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ社製）を用いて測定した。その結果、キノコ熱水抽出液を添加していない樹状細胞では１３．０±０．１ｎｇ／ｍｌの産生に対して、たもぎ茸熱水抽出液添加樹状細胞では１４．４±０．１ｎｇ／ｍｌと有意な差をもってＩＬ−１２の産生が亢進していた。またこの効果は他のキノコ（シイタケ：１３．８±０．１ｎｇ／ｍｌよりも高いものであった。
【実施例６】
【００３６】
脾細胞中の抑制性Ｔ細胞の解析
実験動物はＳlc:ICR系のＳＰＦ雄性マウス（日本エスエルシー株式会社）より購入した生後５週齢の動物を飼育室で１週間飼育を行った後に実験を開始した。飼育室の平均温度は２２℃、湿度５０％の空調施設にて、無菌ケージ内で固形飼料を自由摂取で飼育した。ICRマウスの大腿部皮下に実施例３で示したSarcoma180細胞を１匹あたり５００万個の細胞数を１ｍｌ注射筒と注射針２６Ｇ（テルモ）を用いて投与した。【００３７】
移植同日に実施例１で製造した被験物質たもぎ茸抽出物をマウス用金属ゾンデにて胃内に強制的に４ｍｌ／ｋｇを連日２１日目まで投与した。対照群として生理食塩水（大塚製薬（株））を等量投与した。１群あたりマウスは７匹使用した。移植後より週２回継続的に腫瘍系を測定し、２１日後まで腫瘍体積を測定したところ、たもぎ茸熱水抽出物投与群で有為な腫瘍増殖抑制効果が認められた。この結果は実施例３で示した増殖抑制と同様であり、抗腫瘍効果が再確認された。【００３８】
腫瘍移植後２２日目に全ての腫瘍移植マウスを深麻酔下にて安楽死後、脾臓を腹腔内から摘出した。摘出脾臓を培養液の満たされたシャーレ内でほぐしてリンパ球を主体とした脾細胞液を得た。得られた脾臓細胞中の赤血球を溶血後、細胞数を測定しプラスチックチューブに１０万個の細胞を入れた。【００３９】
脾臓は腫瘍系が大きいほど巨大化しており、繊維芽質でやや赤みが薄く、骨髄系の細胞の混入も多く認められた。たもぎ茸熱水抽出物投与マウスでは生理食塩水投与マウスに比べて脾臓の巨大化、繊維芽質の程度も軽度であった。【００４０】
脾細胞中の抑制性Ｔ細胞の蛍光染色は以下に示すとおりに行った。各投与群７匹で実施したが、抑制性Ｔ細胞の解析はうち６匹を用いて施行した。各マウスの実験番号は以下の通りである。
グループ１：生理食塩水投与群
１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５７
グループ２：タモギタケ熱水抽出液投与群
２５１、２５２、２５４、２５５、２５６、２５７【００４１】
各細胞入りのプラスチックチューブにFITC-CD4 (RM4-5; 0.5μl/reaction, eBioscience), Biotin-GITR (DTA-1; 0.5μl/reaction, eBioscience), Avidine-PE (0.2μl/reaction, BDpharmingen)を添加し、４℃で１時間反応させた。ＰＢＳで細胞を洗浄後PI染色にて死細胞を除去し、FACScalibur（ＢＤバイオサイエンス社製）を用いて蛍光標識細胞を測定した。抑制性Ｔ細胞数の解析はFlowJoソフトウェア（トリースター社製）を用いて解析した。【００４２】
抑制性Ｔ細胞はＣＤ４陽性Ｔ細胞(FITC陽性細胞)中のGITR陽性細胞を割合で算出した。その結果を図５および６に示す。GITR陽性抑制性Ｔ細胞は、たもぎ茸熱水抽出物投与担癌マウス群 (13.2%±3.1%) では生理食塩水投与担癌マウス(33.4%±10.6%) にくらべて有為に減少していることが判明した。【００４３】
以上の結果から、たもぎ茸熱水抽出物には、担癌状態により誘導される免疫抑制性Ｔ細胞の出現を阻害できる活性物質が含まれることが示された。このことは、たもぎ茸抽出物が免疫賦活剤として有用であることを示す。
【実施例７】
【００４４】
肉腫に対する予防的抗腫瘍効果の比較
たもぎ茸熱水抽出物および市販のキノコ抽出物のＳａｒｃｏｍａ１８０に対する予防的抗腫瘍効果を測定した。被検物質としては、実施例１で製造したたもぎ茸熱水抽出物（ロット１および２）、アガリクス仙生露ロイヤルおよびメシマ（登録商標）ピュアＰＬ２．５を使用した。【００４５】
Ｓａｒｃｏｍａ１８０の凍結細胞（ＴＫＧ０１７３、東北大学加齢医学研究所より入手）を、３７℃の温水で急速解凍し、約１０倍量の生理食塩水を加え、遠心分離（１０００回転／分、５分間）し、上清を除去した。この操作を４回繰り返した後、ペレットに約３倍量の生理食塩水を加えて撹拌し、細胞液とした。細胞液０．１ｍｌ（約５×１０６個の細胞）をマウスの腹腔内に移植し、７日後に頸椎脱臼により犠牲死させた。腹部をエタノール消毒し、滅菌した注射筒を用いて腹水を回収した。各動物から回収した腹水を混合し、約５×１０６個の細胞を試験動物の鼡径部皮下に移植した。【００４６】
試験動物としては６週齢の雌マウス（Ｓｌｃ：ＩＣＲ）を各群１０匹ずつ用い、飼料および水を自由に摂取させた。腫瘍移植前１０日間および移植後３５日間、１日１回試験溶液を経口投与した。投与は、所定量のたもぎ茸熱水抽出物または対照キノコ抽出物と精製水からなる試験溶液１２ｍｌ／ｋｇをマウス用金属ゾンデを用いて移植動物の胃内に強制的に投与することにより行った。投与量は以下の表に示すとおりである。【００４７】
【表３】
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【００４８】
腫瘍体積は、実験開始日、移植後５、７、１０、１４、１７、２１、２４、２８、３２および３６日目（観察終了日）に、生存している個体について測定した。腫瘍体積は、ノギスを用いて腫瘍の短径（ａ）および長径（ｂ）を測定し、以下の式により算出した。
腫瘍体積（ｃｍ３）＝４／３πａ２ｂ／２【００４９】
腫瘍重量は、死亡例は発見後速やかに、生存例は最終投与（移植後３５日目）の翌日に測定した。試験動物をエーテル麻酔下で放血により安楽死させ、左鼠径部の腫瘍を摘出し、その重量を測定した。各試験群の腫瘍重量の平均値より、それぞれの腫瘍増殖阻止率を以下の式により算出した。
腫瘍増殖阻止率(%)＝（１−投与群の平均腫瘍重量／対照群の平均腫瘍重量）×１００【００５０】
延命率は、腫瘍移植後の試験動物の生存日数を調べ、以下の式により算出した。
延命率（％）＝（投与群の平均生存日数／対照群の平均生存日数−１）×１００【００５１】
各パラメータについて一元配置分散分析を実施し（有意水準１０％）、群間に有意差がみられた場合は、平均値についてDunnettの多重比較検定を実施した（有意水準５％および１％）。【００５２】
結果を図７−９に示す。たもぎ茸熱水抽出物投与群では、腫瘍体積の平均値は経日的に増加したが対照群より低値で推移し、移植後５日目以降では、対照群と比較して統計学的に有意に低い値を示した。腫瘍重量の平均値は対照群と比べて２３．４−２９．３％の腫瘍増殖抑制が認められたが、統計学的有意差はみられなかった。延命率は１５．５−２１．０％であった。また、生存日数において対照群と比べ統計学的に有意な延命効果がみられた。【００５３】
アガリクス投与群では、腫瘍体積の平均値は経日的に増加したが対照群より低値で推移し、移植後５日目以降断続的に、対照群と比較して統計学的に有意に低い値を示した。腫瘍重量の平均値は対照群と比べて５．７％の腫瘍増殖抑制が認められたが、統計学的有意差はみられなかった。延命率は２０．６％であった。また、生存日数において対照群と比べ統計学的に有意な延命効果がみられた。メシマ（登録商標）投与群では、腫瘍体積の平均値は経日的に増加したが対照群より低値で推移し、移植後５日目以降断続的に、対照群と比較して統計学的に有意に低い値を示した。腫瘍重量の平均値は対照群と比べて２４．６％の腫瘍増殖抑制が認められたが、統計学的有意差はみられなかった。延命率は８．９％であった。また、生存日数は対照群と比べ統計学的有意差はみられなかった。【００５４】
以上のことから、たもぎ茸熱水抽出物を予防的に投与することにより、腫瘍増殖抑制効果および延命効果が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の抗腫瘍性免疫賦活剤は腫瘍細胞の増殖の抑制に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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