(57)【要約】  下記一般式（１）で表されるロイシン誘導体又は下記一般式（２）で表されるメチオニン誘導体を含むDpp4阻害剤。2006118196.tif 000008（式中、R1及びR3はそれぞれ水素原子（H）、Ｌ-アミノ酸残基、R2は水酸基（ＯＨ）、炭素数１から６のアルコキシキ基、アミノ基（ＮＨ２）、炭素数1から６のアルキルアミノ基、グリシン残基、β-アラニン残基、Ｌ-アミノ酸（プロリン、アラニン及びフェニルアラニンを除く）残基、Ｌ-アミノ酸アミド（プロリンアミド、アラニンアミド及びフェニルアラニンアミドを除く）残基、R4は水酸基（ＯＨ）、炭素数１から６のアルコキシキ基、アミノ基（ＮＨ２）、炭素数1から６のアルキルアミノ基、グリシン残基、β-アラニン残基、Ｌ-アミノ酸（プロリン及びアラニンを除く）残基、Ｌ-アミノ酸アミド（プロリンアミド及びアラニンアミドを除く）残基を表す。）。これらの誘導体はオートファジー調節剤としても作用する。
2006118196.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表されるロイシン誘導体又は下記一般式（２）で表されるメチオニン誘導体を含むことを特徴とするDpp4阻害剤。
2006118196.tif 000007
（式中、R1及びR3はそれぞれ水素原子（H）、Ｌ-アミノ酸残基、R2は水酸基（ＯＨ）、炭素数１から６のアルコキシキ基、アミノ基（ＮＨ２）、炭素数1から６のアルキルアミノ基、グリシン残基、β-アラニン残基、Ｌ-アミノ酸（プロリン、アラニン及びフェニルアラニンを除く）残基、Ｌ-アミノ酸アミド（プロリンアミド、アラニンアミド及びフェニルアラニンアミドを除く）残基、R4は水酸基（ＯＨ）、炭素数１から６のアルコキシキ基、アミノ基（ＮＨ２）、炭素数1から６のアルキルアミノ基、グリシン残基、β-アラニン残基、Ｌ-アミノ酸（プロリン及びアラニンを除く）残基、Ｌ-アミノ酸アミド（プロリンアミド及びアラニンアミドを除く）残基を表す。）
【請求項２】
一般式（１）中、R2のアミノ酸残基が、それぞれL-Val、L-Orn、L-Ile、L-Gln、L-Asp、L-Asn、L-Met、L-Lys、L-Thr及びL-Serからなる群から選ばれるアミノ酸の残基である請求項１記載のDpp4阻害剤。
【請求項３】
L-ロイシン及び/又はL-メチオニンを含むことを特徴とするDpp4阻害剤。
【請求項４】
請求項１〜４のいずれか１項記載のDpp4阻害剤を含有する糖尿病治療薬、抗肥満薬、飲水行動異常の改善薬、抗不安薬又は痛感鈍麻治療薬。
【請求項５】
Dpp4への結合することを特徴とするオートファジー調節剤。
【請求項６】
Dpp4抗体を含む請求項５記載のオートファジー調節剤。
【請求項７】
Dpp4抗体が、モノクローナル抗体クローン２３６.３である請求項６記載のオートファジー調節剤。
【請求項８】
Dpp4抗体が、モノクローナル抗体OX-61である請求項６記載のオートファジー調節剤。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか１項記載のオートファジー調節剤を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１０】
栄養不良、老化、手術後の腸管萎縮、慢性炎症や癌悪疫質に伴う症状の治療剤、または予防剤である請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
代謝・内分泌疾患、または神経変性疾患の治療剤、または予防剤である請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１２】
請求項５〜８のいずれか１項記載のオートファジー調節剤を含むことを特徴とする移植用臓器保存剤。
【請求項１３】
膜型Dpp4または遊離型Dpp4への結合を指標とすることを特徴とする薬物スクリーニング法。
【請求項１４】
オートファジーを促進するモノクローナル抗体OX61及び／又はオートファジーを抑制するモノクローナル抗体クローン２３６.３を用いて、膜型及び／又は遊離型Dpp4との結合を指標とする請求項１３記載の薬物スクリーニング法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Dpp4（ジペプチジルペプチダーゼー４）阻害剤、その医薬用途、オートファジー調節剤及びこれを含む医薬組成物に関する。【０００２】
（発明の背景）
オートファジーとは栄養源の枯渇により、細胞が自己成分（オルガネラ、細胞質蛋白質）を分解・再利用する生態システムであり、細胞内における非特異的でバルクな蛋白質分解である。オートファジーは細胞が栄養飢餓ストレスを受けたときに起こる緊急の生体応答のみならず、恒常性の維持に必要とされる。さらに最近の研究により、オートファジーは、癌化、細胞死、免疫細胞の抗原提示、神経変性疾患及び心筋症などとのと関わりを持つことが明らかとされている。とりわけ、老化や消耗性疾患あるいは外科手術後に問題とされる筋肉や消化管などの臓器萎縮にはオートファジーによる蛋白質分解やミトコンドリア機能低下などが深く関与すると考えられている（非特許文献１）。
オートファジーの際にはオートファゴソームと呼ばれる新たなオルガネラが形成され、ミトコンドリア・小胞体といったオルガネラをも包み込むようにして細胞質成分を取り囲み、最終的に内容物をリソソームにて分解する。栄養素の中でもアミノ酸が最大のオートファジー調節因子であり、とりわけ、ロイシンには最も強いオートファジー抑制作用がある（非特許文献２）。これまでの研究の多くは形態学、細胞生理が主体であり、オートファジー調節のメカニズムの多くが不明である。出芽酵母のオートファジー欠損株を用いた遺伝学解析によってオートファジーに必須な遺伝子群の同定が進み、それらの多くが哺乳動物でも保存されていることが明らかとされている。培養肝細胞を用いた研究では、オートファジーは、アミノ酸飢餓やグルカゴンによって誘導され、アミノ酸やインスリンによって抑制される（非特許文献３）。しかし、生体内では実際にどのようなメカニズムでアミノ酸が細胞に認識され、オートファジーを抑制しているかについては、ほとんど明らかにはされていない。アミノ酸によるオートファジー調節機構については、本発明の発明者の一人であるGiovanni Miottoらにより、ロイシンによる肝細胞でのオートファジー抑制には肝細胞膜上に発現する蛋白質（ロイシン受容体）が重要な役割を果たすことが知られていた（非特許文献４）。しかしながら、その分子実態は明らかではなかった。【０００３】
一方、アミノ酸の中でもロイシンには、前述のオートファジー抑制に加えて、種々の生理作用や薬理作用が知られており、こうした作用の中には、蛋白質の合成促進や内分泌ホルモンの分泌促進、糖代謝改善作用、食欲亢進作用などの多彩な作用が知られている（非特許文献５）。こうした作用が、生体内のどのような機構により発揮されるかの詳細なメカニズムは明らかにされてはいない。Miottoらが、肝細胞膜上に想定したオートファジー抑制を担う膜蛋白質（ロイシン受容体）はこうしたさまざまなロイシンの生理機能に対しても重要な役割を果たすことが考えられるため、分子の単離同定が期待されていた。
Dpp4は、各種のペプチドのN末端から二残基を切断する膜結合型ペプチド分解酵素であり、血中の種々のペプチドホルモンを基質として、その活性化や不活性化に関与することが知られる。Dpp4は血中に遊離の状態でも存在するが、その意義と遊離のメカニズムは不明である。肝炎、炎症性腸疾患などの炎症性疾患やある種の精神疾患では、血中の遊離Dpp4の酵素活性の上昇や低下が報告されているが、病態との関連は必ずしも明らかにはされていない。Dpp4は多くのニューロペプチド、免疫ペプチド、消化管ペプチドなどのホルモンを基質とし、そのN末端の2番目の配列がプロリンあるいはアラニンであることが多い。Dpp4の基質として最も有名なものがGLP-１（glucagon-like peptide 1）であり、Dpp4はGLP-１を分解、不活性化することが知られる。そのため、Dpp4阻害剤はGLP-1の血中濃度を維持し、β細胞からの生理的なインスリン分泌を促す薬理作用が期待され、糖尿病薬の創薬標的としての研究が進んでいる。GLP-1はその他の多くの基質とは異なり二番目の配列がセリンである。Dpp4は全身に分布して発現することが知られているが、腎臓や消化管、皮膚などの上皮細胞や肝細胞にとりわけ多く分布する。細胞膜結合型のDpp4は、上皮細胞における細胞極性の決定に重要な役割を有し、接着因子としての働きも想定されている。また、Tリンパ球では副刺激シグナルの伝達分子としての役割ももち、CD4陽性T細胞の活性化に重要である（非特許文献６）。ヒトDpp4遺伝子の機能及び構造については下記のURLに多くの情報がある。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=102720【０００４】
【非特許文献１】Science, 2004, 306: 990-995、Biochem. Biophys. Res. Com., 2004, 313: 453-458
【非特許文献２】Ann. Rev. Nutr. 1987, 7: 539-564
【非特許文献３】Science, 2004; 306: 990-995、Biochem. Biophys. Res. Com., 2004; 313: 453-458
【非特許文献４】J. Biol. Chem., 1994; 269: 25348-25353
【非特許文献５】Biochem. Biophys. Res. Com., 2004; 313: 387-458、Neurosci Lett. 2004; 354: 166-168
【非特許文献６】Clinical Science, 2000; 99: 93-104
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、新規なDpp4阻害剤を提供することを目的とする。
本発明は、又、上記Dpp4阻害剤を含有する医薬組成物を提供することを目的とする。
本発明は、又、新規なオートファジー調節剤を提供することを目的とする。
本発明は、又、上記オートファジー調節剤を含有する医薬組成物を提供することを目的とする。
本発明は、又、上記オートファジー調節剤を含有する移植用臓器保存剤を提供することを目的とする。
本発明は、又、薬物スクリーニング法を提供することを目的とする。
【０００６】
上記の課題を解決するために発明者らは、まず、膜不透過性のロイシン誘導体（Leu8-MAP）を用いて、ラット肝細胞の膜上に存在するロイシン結合蛋白質の同定を試みた。鋭意努力の結果、肝細胞膜上に分子量103キロダルトンの特異的なロイシン結合蛋白質（p103）を認めた。Leu8-MAPのp103への結合は過剰の遊離ロイシンにより阻害されたが、イソロイシンやバリンでは阻害されず、ロイシンに選択的に結合する蛋白質であった。さらに、肝細胞膜からのp103の精製条件を種々に検討した結果、本蛋白質の単離精製に成功し、SDS-PAGE電気泳動にて単一のバンドの蛋白質として検出した。このバンドをゲルから切り出し、ゲル内還元アルキル化および酵素消化によりペプチド断片化し、ナノHPLCシステム（Ultimate：日本ダイオネクス社製）をイオントラップ型質量分析計（LCQ：サーモエレクトロン社製）に連結させた装置に供して、質量分析を行った。得られたデータは、データベース検索システム（Mascot：マトリックスサイエンス社製）を用いて同定した。MSDB（マトリックスサイエンス社製、2004年1月6日版）を検索用の配列データベースとして用いた。その結果、高いスコアでラット・ジペプチジルペプチダーゼ IV（DPP4：EC 3.4.14.5）が同定できた。これらの結果から、p103がラットDpp4蛋白質であることを突き止めた。
さらに、発明者らはロイシンによるDpp4酵素活性への影響を無細胞系の酵素アッセイにより検討し、またラット肝細胞を用いたオートファジー評価系により、肝細胞膜上のDpp4と肝細胞オートファジーの関係を調べることにより本発明を完成した。
すなわち、本発明は、下記一般式（１）で表されるロイシン誘導体又は下記一般式（２）で表されるメチオニン誘導体を含むことを特徴とするDpp4阻害剤を提供する。
【０００７】
2006118196.tif 000003
（式中、R1及びR3はそれぞれ水素原子（H）、Ｌ-アミノ酸残基、R2は水酸基（ＯＨ）、炭素数１から６のアルコキシキ基、アミノ基（ＮＨ２）、炭素数1から６のアルキルアミノ基、グリシン残基、β-アラニン残基、Ｌ-アミノ酸（プロリン、アラニン及びフェニルアラニンを除く）残基、Ｌ-アミノ酸アミド（プロリンアミド、アラニンアミド及びフェニルアラニンアミドを除く）残基、R4は水酸基（ＯＨ）、炭素数１から６のアルコキシキ基、アミノ基（ＮＨ２）、炭素数1から６のアルキルアミノ基、グリシン残基、β-アラニン残基、Ｌ-アミノ酸（プロリン及びアラニンを除く）残基、Ｌ-アミノ酸アミド（プロリンアミド及びアラニンアミドを除く）残基を表す。）
【０００８】
本発明は、又、L-ロイシン及び/又はL-メチオニンを含むことを特徴とするDpp4阻害剤を提供する。
本発明は、又、上記Dpp4阻害剤を含有する糖尿病治療薬、抗肥満薬、飲水行動異常の改善薬、抗不安薬又は痛感鈍麻治療薬を提供する。
本発明は、又、オートファジー調節剤を提供する。
本発明は、又、オートファジー調節剤を含むことを特徴とする医薬組成物を提供する。
本発明は、又、オートファジー調節剤を含むことを特徴とする移植用臓器保存剤を提供する。
本発明は、又、膜型Dpp4または遊離型Dpp4への結合を指標とすることを特徴とする薬物スクリーニング法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
これまでにDpp４阻害剤としてある種のジペプチド型化合物がよく知られているが、たとえば、Biochem. J., 371, 525-532 (2003)によれば、Xaa-Yaa-Aminomethyl Coumarineを実験基質として用いてDPP4の基質特異性を検討した結果、Xaaは幅広いアミノ酸で基質として認識されるが、YaaはPro, Alaに特異的であると示されている。つまりAA-Pro-, AA-Ala-の配列を持つペプチドはDPP4の特異的でよい基質になることが公知である。
プロテアーゼ、ペプチダーゼ阻害剤をデザインする上で、基質切断部位の部分構造を持つペプチドに着目することは広く行われることであり、そのような配列のペプチドが競合阻害活性を持ちうることは、当業者には容易に類推できる範囲にある。実際、ジペプチドのプロリン部分を構造変換したDPP4阻害剤は世間でよく知られている。
また、Adv.Exp.Med.Biol., 421, 171-178 (1997)には、AA-Pro, Ala-Ala, Ile-Ala, Leu-Pheなどの化合物について、それぞれDPP4に対する阻害pKi値が記載されている。一方、Leuおよびエステル、Leuアミド、またはLeuを部分構造に含むジペプチドや誘導体が広くDPP4阻害活性を持つことは、Leu-Pro, Leu-Ala以外には、Ki値が示されているLeu-Pheを除くと、DPP4の基質選択性から類推することはきわめて困難であり、本発明で示された化合物のDpp4阻害活性は新規な活性である。【００１０】
本発明の一般式（１）及び（２）において、R1及びR3はそれぞれ水素原子（H）、Ｌ-アミノ酸残基を表す。ここで、Ｌ-アミノ酸残基としては、Ｌ-アミノ酸のカルボキシル基から水酸基が脱離してなるものがあげられる。これらのうち、L-Asp、L-Trp、L-Met、L-Asn、L-Tyr、L-Val、L-Arg、L-Orn、L-Leu、L-Phe、L-Gln及びL-Ileからなる群から選ばれるアミノ酸の残基であるのが好ましい。
又、本発明の一般式（１）及び（２）において、R2は水酸基（ＯＨ）、炭素数１から６のアルコキシキ基、アミノ基（ＮＨ２）、炭素数1から６のアルキルアミノ基、グリシン残基、β-アラニン残基、Ｌ-アミノ酸（プロリン、アラニン及びフェニルアラニンを除く）残基、Ｌ-アミノ酸アミド（プロリンアミド、アラニンアミド及びフェニルアラニンアミドを除く）残基、R4は水酸基（ＯＨ）、炭素数１から６のアルコキシキ基、アミノ基（ＮＨ２）、炭素数1から６のアルキルアミノ基、グリシン残基、β-アラニン残基、Ｌ-アミノ酸（プロリン及びアラニンを除く）残基、Ｌ-アミノ酸アミド（プロリンアミド及びアラニンアミドを除く）残基を表す。）。Ｌ-アミノ酸残基及びＬ-アミノ酸アミド残基としては、これらの分子中のアミノ基から水素原子が脱離してなるものがあげられる。これらのうち、R2のアミノ酸残基が、それぞれL-Val、L-Orn、L-Ile、L-Gln、L-Asp、L-Asn、L-Met、L-Lys、L-Thr及びL-Serからなる群から選ばれるアミノ酸の残基であるのが好ましく、L-Val、L-Orn、L-Ile及びL-Glnからなる群から選ばれるアミノ酸の残基であるのがより好ましい。R2としては、水酸基（ＯＨ）であるのも好ましい。尚、R4のアミノ酸残基としては、L-Pro及びL-Ala以外のアミノ酸の残基が好ましく、さらにR2について述べたのと同様の基も好ましい。【００１１】
一般式（１）及び（２）において、R1とR2のいずれか一方がアミノ酸残基であるのが好ましく、R3とR4のいずれか一方がアミノ酸残基であるのが好ましい。この場合、R1とR3がアミノ酸残基で、R2とR4が水酸基（ＯＨ）であるのが好ましく、又R1とR3が水素原子で、R2とR4がアミノ酸残基であるのも好ましい。
上記一般式（１）及び（２）で表されるジペプチド誘導体やアミド誘導体は、例えば、以下の反応スキームに示すように、アミノ基またはカルボキシル基を保護したロイシンやメチオニンと、適切な保護アミノ酸誘導体またはアミン類を縮合することで得ることが出来る。ペプチド合成法として液相合成、固相合成とも数多くの優れた方法が報告されており、いずれの方法を用いて合成しても良く、特定の合成法に限定されるものではない。【００１２】
反応スキーム
2006118196.tif 000004
なお、（般式（１）及び（２）で示される化合物には、すでに試薬として入手可能なものも多数有り、その場合、購入して用いることも可能である。【００１３】
本発明では、又、L-ロイシン及び/又はL-メチオニンを含むことを特徴とするDpp4阻害剤を提供する。
本発明では、上記Dpp4阻害剤を糖尿病治療薬、抗肥満薬、飲水行動異常の改善薬、抗不安薬又は痛感鈍麻治療薬の有効成分として使用することができる。
すなわち、本発明のDpp4阻害剤のうち、L-ロイシンには既に糖代謝改善効果が知られており（特開2003-171271など）、糖尿病の治療や予防への用途については公知であるが、一方で、多くのDpp4阻害剤がGLP-1の分解阻害活性により抗糖尿病作用を有することから（Diabetes 53:2181-2189, 2004、Diabetes Care 26:2929-2940, 2003）も、本発明の式（１）で表される化合物に抗糖尿病作用があることは明らかである。
また、Dpp4を遺伝的に欠損した動物においては、飲水行動の低下や、社会活動性の上昇、痛覚の感受性上昇などの行動学的な特性が知られている（Physiology & Behavior 80 (2003) 123-134）、こうした既知の知見は、本発明のDpp4阻害剤が飲水行動異常の改善薬、抗不安薬、痛感鈍麻治療薬として有用であることを示している。【００１４】
本発明では、又、Dpp4への結合することを特徴とするオートファジー調節剤を提供する。すなわち、Dpp4への結合する物質自体をオートファジー調節剤として使用することができ、又はDpp4への結合する物質自体を有効成分とするオートファジー調節剤を提供する。このようなDpp4への結合する物質としては、Dpp4抗体が好ましいものとしてあげられ、具体的には、モノクローナル抗体クローン２３６.３やモノクローナル抗体OX-61をあげることができる。ここで、モノクローナル抗体クローン２３６.３はオートファジーを抑制する作用を有し、一方、モノクローナル抗体OX-61はオートファジーを促進する作用を有する。これらの抗体は市販品として容易に入手することができる。
上記オートファジー調節剤は、医薬組成物の有効成分として使用することができる。このような医薬組成物としては、手術後の腸管萎縮、慢性炎症や癌悪疫質に伴う筋肉などの臓器萎縮症などの症状の治療剤、または予防剤である医薬組成物があげられる。又、異常蛋白質の蓄積が病因と考えられる糖尿病に代表される種々の代謝・内分泌疾患、またはパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病などの神経変性疾患の治療剤、または予防剤である医薬組成物があげられる。【００１５】
本発明の医薬組成物の投与形態は特に制限されず、非経口又は経口投与、具体的には静脈内、動脈内、皮下および筋肉内投与、輸液による投与により、安全かつ必要な量を、一気にまたは点滴等により投与できる。このうち、経口投与が望ましい。
本発明の医薬組成物は、種々の剤型、例えば経口剤であれば、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、トローチ剤、液剤、細粒剤、その他、注射剤、クリーム剤、座剤等の投与製剤とすることができる。これらの製剤化は、それ自体公知の方法によって行い得る。本発明の有効成分、製剤のいずれにおいても医薬的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性向上剤、その他製剤として必要な物質を含有してよく、これらを適宜組み合わせて処方することにより製剤を製造することができる。製剤用担体としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、Ｄ-マンニトール、澱粉、結晶セルロース、炭酸カルシウム、カオリン、デンプン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、エタノール、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム塩、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アセチルセルロース、白糖、酸化チタン、安息香酸、パラオキシ安息香酸エステル、デヒドロ酢酸ナトリウム、アラビアゴム、トラガント、メチルセルロース、卵黄、界面活性剤、白糖、単シロップ、クエン酸、蒸留水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、ブドウ糖、塩化ナトリウム、フェノール、チメロサール、パラオキシ安息香酸エステル、亜硫酸水素ナトリウム等があり、製剤の形に応じて、本発明の化合物と混合して使用される。【００１６】
本発明では、さらに、膜型Dpp4または遊離型Dpp4への結合を指標とすることを特徴とする薬物スクリーニング法を提供する。このうち、オートファジーを促進するモノクローナル抗体OX61及び／又はオートファジーを抑制するモノクローナル抗体クローン２３６.３を用いて、膜型及び／又は遊離型Dpp4との結合を指標とする薬物スクリーニング法が好ましい。
薬物スクリーニング法については、例えば、何らかの物理化学的な手法によりアイソトープや蛍光色素などを標識したモノクローナル抗体OX61やモノクローナル抗体クローン２３６.３を用いて、膜型Dpp4を発現する細胞とモノクローナル抗体との結合能を変化させる活性を指標として、低分子化合物ライブラリーやペプチドライブラリーなどから、その結合能を修飾する物質のスクリーニングを行うことにより、簡便にオートファジーを調節する物質のスクリーニングを行うことができる。このときに、モノクローナル抗体OX61を用いたときには、オートファジーを促進する物質が、また、モノクローナル抗体クローン２３６.３を用いたときには、オートファジーを抑制する物質がスクリーニング可能である。さらに、膜型Dpp4を発現する細胞の代りに、ヒトもしくは動物の血漿より単離精製するか、もしくは組み換えDNA手法により作製したリコンビナントDpp4を用いても構わない。
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００１７】
参考例１：Lys-Leuの合成
１）  Leu-Wang Resinの合成
Fmoc-L-ロイシン2.12g (6.01mmol)、ジイソプロピルカルボジイミド756mg (6.00mmol)、ジメチルアミノピリジン30mg (0.246mmol)をDMF20mlに溶解して、固相合成用の50mlシリンジ中でWang Resin (1.20mmol/g)と3時間室温で震盪した。溶液を捨て、ジメチルホルムアミド、メタノール、ジクロロメタンで樹脂を6回繰り返し洗浄した。ピリジン2ml、無水酢酸2mlをN-メチルピロリドン20mlに溶解してシリンジに吸い、2時間室温で震盪した。溶液を捨て、ジメチルホルムアミド、メタノール、ジクロロメタンで樹脂を6回繰り返し洗浄して、真空ポンプで乾燥した。20%ピペリジン／ジメチルホルムアミド溶液をシリンジに20ml吸い、室温で10分震盪後、溶液を捨て、もう一度同じ操作を繰り返した。ジメチルホルムアミド、メタノール、ジクロロメタンで樹脂を6回繰り返し洗浄して真空ポンプで乾燥した。【００１８】
２）  ω-Boc-Lys-Leu- Wang Resinの合成
Fmoc-(ω- Boc)-L-リジン2.814g (6.00mmol)、ジイソプロピルカルボジイミド940mg、ジメチルアミノピリジン30mgをDMF20mlに溶解して、固相合成用の50mlシリンジ中で前記のLeu-Wang Resin全量と一晩室温で震盪した。溶液を捨て、ジメチルホルムアミド、メタノール、ジクロロメタンで樹脂を6回繰り返し洗浄した。20%ピペリジン／ジメチルホルムアミド溶液をシリンジに20ml吸い、室温で10分震盪後、溶液を捨てる操作を2回行った。ジメチルホルムアミド、メタノール、ジクロロメタンで樹脂を6回繰り返し洗浄して真空ポンプで乾燥した。【００１９】
３）  Lys-Leuの合成
固相合成用の5mlシリンジ中で、前記のω-Boc-Lys-Leu- Wang Resin 100mgと95%トリフルオロ酢酸水溶液2mlを1時間室温で放置（時々震盪）して、溶液を回収した。95%トリフルオロ酢酸水溶液2ml、アセトニトリル2mlの順で樹脂を洗い、洗液と反応溶液と合わせて減圧濃縮した。主生成物を逆相HPLC分取後、凍結乾燥して、Lys-Leu 4.5mgを得た。
ESI-MS (m/z) [M+H]+ 260
他のジペプチドは、参考例１と同様にして合成した。【００２０】
実施例１：rhDpp4に対する阻害活性
Recombinant human Dipeptidyl Peptidase IV (rhDPP4, R&D systems, #1180-SE) の合成基質GLY-PRO-p-nitroanilide (G-P-pNA, sigma, #G−0513) 切断活性に対する各被検物の阻害能を測定した。rhDPP4によってG-P-pNAはPROとpNAの間で切断された。pNAは405nmに吸収を示すので、それを測定し切断量を求めた。
反応溶液（25mM Tris (pH8.0), 100uM G-P-pNA, 0.25ng/ul rhDPP4）を調整し、被検物は最終濃度2mM（DMSO濃度1%）になるように添加した。反応溶液を37度中に30分保温し、終了後直ちに分光光度計を用いて405nmの吸光度を測定した。反応は200ulスケールで行い、96ウェルマイクロプレートを使用した。
同時に100,33,11,3.7,1.2,0.41,0.14uMのpNA溶液の405nmにおける吸光度を測定し、pNA濃度と吸光度の関係式を得、各反応液中のpNA量（基質切断量）を算出した。
阻害率は同一プレート上に被検物なしのウェルを３−４ウェル作成し、その基質切断量の平均値(A)に対する各被検物添加ウェルの基質切断量(B)の割合から以下の式を用いて求め、100分率で表記した。
阻害率(%)＝100×（1-（B）/(A)）【００２１】
図１に、蛋白質を構成する20種類のアミノ酸のうち、ロイシン、イソロイシン、バリン、及び4-ヒドロキシ-イソロイシンと既存のDpp4阻害剤であるDiprotin Aについて濃度依存的なDpp4阻害活性をプロットして示した。この結果から、ロイシンがDpp4を阻害することが明らかである。図２に、蛋白質を構成する20種類のアミノ酸が、Dpp4酵素活性に及ぼす影響を検討した結果を、縦軸には反応後の基質切断率で表記して示した。図２から20種類のアミノ酸の中では、Leuと同様にMetにDpp4阻害活性があることがわかる。
一方、表１に、一般式（１）であらわされる代表的な化合物のDpp4阻害活性を上記の方法によって求めた結果をまとめて示した。【００２２】
表１
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【００２３】
実施例２：ラット肝細胞を用いたオートファジーの測定
自由摂食で飼育した140-180ｇ雄のWistar ratを用いて、collagenase perfusion法によりラット肝細胞を調整した（Seglen, P.O. Preparation of isolated liver cells. (1976) In Methods in Cell Biology eds. D.M. Prescott, 13, 29-83. Academic: new York / London）。この方法で、1個体の肝臓あたり2-2.5 x 108 cellsの肝細胞が調整できた。
調整した肝細胞の蛋白質分解（オートファジー）の測定は、Venerandoらの方法で行った。すなわち、肝細胞を10mlのフラスコ中にKRBバッファー（24 mM bicarbonate, 6 mM glucose）3.5mlの細胞懸濁液(1-1.2 x 106 cells/ml)として、炭酸ガスインキュベータ中で37℃に保温し45分放置した。その後、蛋白質合成を止める目的で20uMシクロへキシミドの存在下に各種の薬剤処理を行い、さらに30分間に保温した。31分及び42分に0.35mlの肝細胞懸濁液を取り出し、後者に氷冷perchloric acid (最終濃度6%)を添加しー20℃にて保存した。酸可溶性画分の上清中のバリンを測定し、11分間のバリン放出を測定した。【００２４】
実験は独立して三回行った（Venerando, R., Miotto, G., Kadowaki, M., Siliprandi, N., and Mortimore, G.E. (1994) Multiphasic control of proteolysis by leucine and alanine in the isolated rat hepatocytes. Am. J. Physiol. 266, C455-C461）。アミノ酸測定はTapuhiらの方法で行った（Tapuhi, Y., Schmidt, D., Lindner, W., and Karger, B.L. (1981) Dansylation of amino acids for high-performance liquid chromatography, Anal. Biochem. 115, 123-129）。
実験材料は下記のとおりである。Dpp4に対するモノクローナル抗体、MRC OX61 isotype IgG2a (Oxford Biotechnology)、clone 236.3 isotype IgG2bk (Pierce Endogen)。
表２に、アミノ酸飢餓によりラット肝細胞に誘導されるオートファジーに対して、ロイシン、及びDpp4抗体によるオートファジーの効果を示した。【００２５】
表２
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【００２６】
ロイシンはこれまでによく知られるように、アミノ酸飢餓によるオートファジーを強く抑制することが明らかである（Ann. Rev. Nutr. 1987, 7: 539-564）。一方、Dpp4抗体はクローンにより、オートファジーに対する効果に差があり、単独で処理した場合には、OX-61はオートファジーを促進し、一方で、２３６．３はオートファジーを抑制する。また
、OX-61はロイシンとともに添加するとロイシンによるオートファジー抑制効果をさらに高めることがわかる。こうした結果は、Dpp4に結合する物質によりアミノ酸飢餓によるオートファジー活性を調節できることを示している。したがって、Dpp4に結合する物質、たとえば、Dpp4に対する抗体や、既存のDpp4阻害剤などにより、オートファジー活性を調節することができることを示すものである。
アミノ酸以外にオートファジー活性を調節する物質としては、インスリンによるオートファジーの抑制、グルカゴンによるオートファジーの促進が知られている。一方で、低分子化合物としては、ビタミンCがグリア細胞のオートファジーを抑制する効果が報告されているが（J.ournal of Neurochemistry,2002,82, 538-549）、それ以外にはほとんど知られていない。また、Dpp4は各種のペプチドホルモンの活性制御を介して生体内で栄養代謝を調節すると考えられている（Clinical Science, 2000; 99: 93-104）が、これまでに栄養飢餓に伴うオートファジーなどの臓器萎縮や細胞死などに関与することは知られていない。【００２７】
オートファジーは栄養飢餓による生体の正常な応答であり、細胞の生育や正常な細胞機能に必要なアミノ酸を、生体が自ら再利用する恒常性維持の重要な仕組みである。しかしながら、過度の栄養飢餓による臓器萎縮や、その仕組みの破綻は各種の臓器に様々な異常をきたし、疾患の原因となることも知られてきた。こうした、状況の中で、栄養飢餓によるオートファジーをアミノ酸以外の物質によって調節することは、栄養不良や炎症に伴う臓器萎縮や、オートファジー異常が原因となる、種々の疾患の予防・治療のために有効な手段である。臓器萎縮としては、手術後の不摂食の持続に伴う消化管萎縮や慢性炎症、癌悪疫質に伴う筋肉などの臓器萎縮症などがあげられ、また、オートファジー異常が原因となる疾患としては、異常蛋白質の蓄積が病因と考えられる糖尿病に代表される種々の代謝・内分泌疾患、またはパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病などの神経変性疾患があげられる（Science, 2004; 306: 990-995、Biochem. Biophys. Res. Com., 2004; 313: 453-458）。さらに、移植用臓器の保存中および、移植後の再かん流時の臓器で、オートファジーが起こることが知られている（Arch Histol Cytol, 68(1):71-80(2005)）。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ロイシン、イソロイシン、バリン、及び4-ヒドロキシ-イソロイシンと既存のDpp4阻害剤であるDiprotin Aについて濃度依存的なDpp4阻害活性をプロットして示した図である。
【図２】蛋白質を構成する20種類のアミノ酸が、Dpp4酵素活性に及ぼす影響を検討した結果を、縦軸には反応後の基質切断率で表記して示した図である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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