(57)【要約】【課題】厚切り切片を再び樹脂に包埋してから再びスライスして薄切切片とし、これを電子顕微鏡によって観察する方法で、効率の向上を図り、短時間で生物の細胞の観察ができる顕微鏡観察用切片の再包埋方法を提供する。【解決手段】生物の細胞１３を樹脂に包埋した樹脂包埋試料１１を厚くスライスして厚切り切片１４を作製する第１の工程と、厚切り切片１４をスライドガラス１５に載置して乾燥する第２の工程と、樹脂１６を収容したカプセル１７を用意し、スライドガラス１５を裏返して厚切り切片１４を樹脂１６が収容されたカプセル１７の上部に位置合わせする第３の工程と、カプセル１７内の樹脂１６が硬化するまで加熱・待機し、厚切り切片１４を樹脂１６に再包埋させる第４の工程と、スライドガラス１５から樹脂とともにカプセル１７を剥離し、厚切り切片１４が再包埋された試料ブロックを電子顕微鏡観察可能にスライスして薄切りする第５の工程とからなる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物の細胞を樹脂に包埋した樹脂包埋試料を厚くスライスして厚切り切片を作製する第１の工程と、
前記厚切り切片をスライドガラスに載置して乾燥する第２の工程と、
樹脂を収容したカプセルを用意し、前記スライドガラスを裏返して前記厚切り切片を樹脂が収容されたカプセルの上部に位置合わせする第３の工程と、
前記カプセル内の樹脂が硬化するまで加熱・待機し、厚切り切片を樹脂に再包埋させる第４の工程と、
前記スライドガラスから樹脂とともにカプセルを剥離し、厚切り切片が再包埋された試料ブロックを電子顕微鏡観察可能にスライスして薄切りする第５の工程と、
からなる顕微鏡観察用切片の再包埋方法。
【請求項２】
前記厚切り切片は、厚さが、２／１０００ｍｍ〜５／１０００ｍｍであり、前記薄切り切片は、厚さが、約１／１００００ｍｍであることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡観察用切片の再包埋方法。
【請求項３】
生物の細胞を樹脂に包埋した樹脂包埋試料を厚くスライスした厚切り切片を載置するスライドガラスと、
樹脂を収容するカプセルと、
前記カプセルを載置する載置面を有する基台およびこの基台上に設けられ、前記スライドガラスを裏返して前記厚切り切片を前記カプセル内の樹脂に位置合わせ可能な一対のガイド片を有し、前記厚切り切片を前記樹脂に再包埋させる再包埋治具本体と、
を具備したことを特徴とする顕微鏡観察用切片の再包埋治具。
【請求項４】
前記カプセルは、ゼラチンカプセル等であり、底部に貫通穴を有するカプセルホルダーに収納されていることを特徴とする請求項３に記載の顕微鏡観察用切片の再包埋治具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、生物の内部組織を顕微鏡を用いて分子レベルで観察するための顕微鏡観察用切片の再包埋方法および再包埋治具に関する。
【背景技術】
【０００２】  生物の内部構造を分子レベルで観察するには電子顕微鏡が用いられている。生物は単細胞、多細胞と各種あるが、電子顕微鏡は内部が真空であるため、生物を生かせたまま観察することは殆んど不可能であり、細胞の生命現象を停止させてから観察している。【０００３】  生物の生命現象を停止させるには、物理的あるいは化学的な方法がある。一般的には化学的にホルマリンなどのアルデヒドを用いて生命現象をより早く停止させる方法が用いられているが、これを固定と呼んでいる。アルデヒドで固定された細胞は軽元素の炭素・水素・酸素などからなり、アルデヒド固定のみでの電子顕微鏡観察は不十分なので、前記細胞構成成分にさらに重金属を付加させている。【０００４】  前述の処理後の細胞を電子顕微鏡で観察しても、生物の内部構造を分子レベルで観察は不可能で、細胞の大きさを１／１００ｍｍとすれば、この細胞を１００枚にスライスして初めて分子レベルの観察が可能となる。細胞１個を１００枚にスライスするには、樹脂に埋め込み包埋する必要がある。そのために、前述のように固定してからアルコールで水分を取り除いて樹脂に埋め込む。【０００５】  従来、図４に示すように、樹脂包埋試料ａに埋め込まれた細胞ｂを観察する際、樹脂包埋試料ａの先端部側ｃから１００枚に薄切片ｄ…にスライスする。次に、薄切片ｄ…の全てを見る連続切片観察の方法が主流である。【０００６】  また、樹脂包埋した厚い切片の再包埋方法としては、包埋用カプセルに樹脂を満たしラベルを入れ、スライド上の切片の上に逆に立てる方法が知られている（例えば、非特許文献１参照。）。
【非特許文献１】  平成２年３月３０日に丸善株式会社から発行された書籍「透過電子顕微鏡生物試料作製ハンドブック」の第９９頁〜第１００頁。
【０００７】
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】  しかしながら、樹脂包埋試料ａに埋め込まれた細胞ｂが一部であるにも拘らず、樹脂包埋試料ａを１００枚に薄切片ｄ…にスライスするには、極めて効率が悪く、連続切片観察に多くの時間を費やしているのが実情である。【０００９】  非特許文献１は、樹脂包埋した厚い切片の再包埋方法であり、厚切り切片を再包埋して再びスライスして薄切切片を作製する技術については記載されていない。【００１０】  本発明は、前記事情に着目してなされたもので、その目的とするところは、目的観察部位が樹脂包埋試料の一部にしかない場合には、樹脂包埋試料を厚くスライスして厚切り切片を作り、この厚切り切片を光学顕微鏡で目的観察部位を探し、目的観察部位が入っている１枚の厚切り切片を再び樹脂に包埋してから再びスライスして薄切切片とし、これを電子顕微鏡によって観察する方法で、効率の向上を図り、短時間で生物の細胞の観察ができる顕微鏡観察用切片の再包埋方法と再包埋治具を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】  本発明は、前記目的を達成するために、請求項１は、生物の細胞を樹脂に包埋した樹脂包埋試料を厚くスライスして厚切り切片を作製する第１の工程と、前記厚切り切片をスライドガラスに載置して乾燥する第２の工程と、樹脂を収容したカプセルを用意し、前記スライドガラスを裏返して前記厚切り切片を樹脂が収容されたカプセルの上部に位置合わせする第３の工程と、前記カプセル内の樹脂が硬化するまで加熱・待機し、厚切り切片を樹脂に再包埋させる第４の工程と、前記スライドガラスから樹脂とともにカプセルを剥離し、厚切り切片が再包埋された試料ブロックを電子顕微鏡観察可能にスライスして薄切りする第５の工程とからなる顕微鏡観察用切片の再包埋方法にある。【００１２】  請求項２は、前記厚切り切片は、厚さが、２／１０００ｍｍ〜５／１０００ｍｍであり、前記薄切り切片は、厚さが、約１／１００００ｍｍであることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡観察用切片の再包埋方法にある。【００１３】  請求項３は、生物の細胞を樹脂に包埋した樹脂包埋試料を厚くスライスした厚切り切片を載置するスライドガラスと、樹脂を収容するカプセルと、前記カプセルを載置する載置面を有する基台およびこの基台上に設けられ、前記スライドガラスを裏返して前記厚切り切片を前記カプセル内の樹脂に位置合わせ可能な一対のガイド片を有し、前記厚切り切片を前記樹脂に再包埋させる再包埋治具本体とを具備したことを特徴とする顕微鏡観察用切片の再包埋治具にある。【００１４】  請求項４は、前記カプセルは、ゼラチンカプセル等であり、底部に貫通穴を有するカプセルホルダーに収納されていることを特徴とする請求項３に記載の顕微鏡観察用切片の再包埋治具にある。
【発明の効果】
【００１５】本発明によれば、生物の細胞を観察する際、その前処理が簡単で作業効率の向上を図ることができ、短時間で生物の細胞の観察ができ、また、治具によって熟練度を要することなく簡単に作業できる顕微鏡観察用切片の再包埋方法と再包埋治具を提供できるという効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】  以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。
図１〜図３は顕微鏡観察用切片の再包埋方法と再包埋治具の第１の実施形態を示し、図１は樹脂包埋試料の側面図、図２は再包埋治具と工程を示す図、図３は再包埋治具と工程を示す図である。【００１７】  図１に示すように、樹脂包埋試料１１はトリミングされた四角柱部１２を有し、四角柱部１２の内部には複数の細胞１３が包埋されている。この細胞１３はアルデヒドで固定された細胞に重金属を付加させて電子顕微鏡観察に可能にしたものである。樹脂包埋試料１１を公知のウルトラミクロトーム装置にセットし、四角柱部１２を例えば、２μ〜５μ（２／１０００ｍｍ〜５／１０００ｍｍ）にスライスして厚切りすると、目的観察部位としての細胞１３が入った厚切り切片１４…が得られる。【００１８】  次に、図２（ａ）に示すように、前記厚切り切片１４をナイフボート水面よりスライドガラス１５の上面１５ａに載置して乾燥する。同図（ｂ）はエポキシ樹脂等の熱硬化性の樹脂１６を８分収容したゼラチンカプセル１７であり、このゼラチンカプセル１７を例えばアルミニウム製のカプセルホルダー１８に収納する。カプセルホルダー１８は円筒状で、底部１８ａを有しており、底部１８ａの中央部には貫通穴１８ｂが穿設されている。【００１９】  同図（ｃ）は再包埋治具本体１９であり、再包埋治具本体１９は円板状の例えばステンレス製の基台２０を有し、この基台２０の上面には一対の例えばステンレス製のガイド片２１が互いに対向して垂直方向に立設されている。一対のガイド片２１の間隔ｇは前記スライドガラス１５の幅Ｗに略等しく、上端部にはスライドガラス１５を案内する傾斜したガイド面２１ａが設けられている。さらに、一対のガイド片２１の間で、基台２０の上面にはカプセルホルダー１８の載置面２０ａが設けられている。【００２０】  そこで、図３（ａ）に示すように、基台２０の載置面２０ａにゼラチンカプセル１７を収納したカプセルホルダー１８を載置し、スライドガラス１５を裏返しして、つまりスライドガラス１５の上面１５ａの厚切り切片１４を下向きにして、スライドガラス１５を水平状態のまま一対にガイド片２１の間に挿入する。そして、厚切り切片１４がゼラチンカプセル１７の上部に位置するようにスライドガラス１５を移動して位置合わせする。【００２１】  次に、同図（ｂ）に示すように、再包埋治具本体１９を反転してスライドガラス１５を基台２０の載置面２０ａから外してテーブル等に載置すると、ゼラチンカプセル１７もカプセルホルダー１８とともに反転する。同図（ｃ）に示すように、スライドガラス１５上で、ゼラチンカプセル１７もカプセルホルダー１８とともに反転し、この状態で加熱して樹脂１６が硬化するまで待機すると、厚切り切片１４が樹脂１６に包埋された状態で硬化する。【００２２】  さらに、スライドガラス１５と樹脂１６との接着部に熱と力を加えると、ゼラチンカプセル１７はスライドガラス１５から剥離される。また、カプセルホルダー１８の底部１８ａの貫通穴１８ｂからピン等を差し込むと、カプセルホルダー１８とゼラチンカプセル１７とが簡単に分離され、ゼラチンカプセル１７の上面に厚切り切片１４が重合した状態（再包埋）となる。次に、厚切り切片１４が再包埋された試料ブロックを��ルトラミクロトーム装置にセットし、例えば、０．１μ（１／１００００ｍｍ）にスライスして薄切りして、電子顕微鏡で観察する。【００２３】  このように、厚切り切片１４をゼラチンカプセル１７に重合して再包埋することにより、観察目的する細胞を電子顕微鏡で観察する前処理作業が簡単で、作業能率の向上が図れる。しかも、再包埋用治具を用いることにより、熟練度が要求されないという効果がある。【００２４】  なお、本発明は、前記実施形態そのままに限定されるものではなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で構成要素を変形して具体化できる。また、前記実施形態に開示されている複数の構成要素の適宜な組合せにより種々の発明を形成できる。例えば、実施形態に示される全構成要素から幾つかの構成要素を削除してもよい。さらに、異なる実施形態に亘る構成要素を適宜組み合わせてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の第１の実施形態を示し、樹脂包埋試料の側面図。
【図２】同実施形態を示し、（ａ）〜（ｃ）は再包埋治具と工程を示す図。
【図３】同実施形態を示し、（ａ）〜（ｃ）は再包埋治具と工程を示す図。
【図４】従来の樹脂包埋試料を先端部側から薄切片にスライスする状態を示す側面図。
【符号の説明】
１１…樹脂包埋試料、１３…細胞、１４…厚切り切片、１５…スライドガラス、１６…樹脂、１７…ゼラチンカプセル、１８…カプセルホルダー、１９…再包埋治具本体、２０…基台、２１…ガイド片
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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