(57)【要約】糖尿病性神経障害をより効果的に治療し得る、塩基性線維芽細胞成長因子をゼラチンゲルに担持させてなる糖尿病性神経障害治療剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基性線維芽細胞成長因子をゼラチンゲルに担持させてなる、糖尿病性神経障害治療剤。
【請求項２】
ゼラチンゲルが架橋ゼラチンゲルである、請求項１記載の治療剤。
【請求項３】
ゼラチンゲルに担持させた塩基性線維芽細胞成長因子の治療上有効量を哺乳動物に投与することを含む、糖尿病性神経障害の治療方法。
【請求項４】
ゼラチンゲルが架橋ゼラチンゲルである、請求項３記載の治療方法。
【請求項５】
糖尿病性神経障害の治療剤を製造するための塩基性線維芽細胞成長因子及びゼラチンゲルの使用。
【請求項６】
ゼラチンゲルが架橋ゼラチンゲルである、請求項５記載の使用。
【請求項７】
請求項１又は２記載の治療剤、および当該治療剤を糖尿病性神経障害に使用することができることまたは使用すべきであることを記載した当該治療剤に関する記載物を含む商業パッケージ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む糖尿病性神経障害治療剤に関する。より詳細には、本発明は糖尿病性神経障害治療用のｂＦＧＦ担持ゼラチンゲル製剤に関する。
【背景技術】  我が国における糖尿病患者数は増加の一途をたどっており、糖尿病が強く疑われる患者は７４０万人、可能性を否定できない患者も含めれば１６２０万人にも上ると言われている。糖尿病患者の診療においては、糖尿病性合併症（網膜症、腎症、神経障害など）の発症や進展を如何に阻止するかが最も重大なテーマであり、合併症のなかでも神経障害が最も高頻度かつ早期から出現すると考えられている。
糖尿病性神経障害は、多彩な臨床症状を呈することにより糖尿病患者のＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ）を著しく低下させるだけでなく、心血管系自律神経障害の生命予後に及ぼす影響には計り知れないものがあり、その予防と早期治療が重要である。これまでに報告されている糖尿病患者における糖尿病性神経障害の発症頻度は、用いた診断方法と基凖、糖尿病罹病期間、年齢、診察者あるいは検査技師の知識と経験度の違いにより様々であるが、一般的には３０〜４０％といわれている。神経障害分類として様々な分類が提唱されているが、臨床的には多発性神経障害（感覚運動神経障害および自律神経障害）と単一性神経障害（混合性脊髄神経障害および脳神経障害）に大別される。
糖尿病性神経障害が高血糖を基盤として発症および進展することは言うまでもないが、高血糖に起因するさまざまな異常を介して神経機能異常が引き起こされる。この高血糖由来の異常として代表的なものが、代謝因子、血管因子および神経栄養因子の異常である。なかでも代謝因子と血管因子の重要性と相互関連性についての検討がこれまでなされており、高血糖に起因する代謝障害による神経細胞の機能異常と代謝障害に基づく血流異常が、神経機能異常の発現に複雑に絡み合っていると考えられている。代表的代謝異常と神経栄養因子異常については以下のようなことが知られている。
１）ポリオール代謝活性の亢進：神経組織におけるポリオール代謝活性の亢進によるソルビトール蓄積とミオイノシトール欠乏を介してプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性の低下およびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ活性の低下を来たし、神経伝導速度の遅延すなわち神経障害を引き起こすと考えられている。
２）ＰＫＣ活性異常：血管系細胞においてはＰＫＣ（特にＰＫＣ−ｂｅｔａ）活性の亢進が血流異常に関与し、神経系細胞においてはＰＫＣ（特にＰＫＣ−ａｌｐｈａ）活性の低下が細胞機能異常を惹起すると考えられており、両者が神経障害の発症に関連していると推察されている。
３）非酵素的糖化反応の亢進：非酵素的糖化反応の亢進による後期反応生成物（ＡＧＥｓ）が、神経内血管内皮細胞に作用することにより神経内血管の血流異常を引き起こす一方で神経系細胞に直接作用することで細胞機能障害を引き起こすと考えられている。
４）酸化ストレスの亢進：高血糖による活性酸素の産生亢進と消去能の低下が酸化ストレスの亢進を引き起こし、血流障害とともに細胞機能障害を引き起こすと考えられている。
５）神経栄養因子異常：神経栄養因子はニューロンの生存・分化・機能を維持する内因性物質であり、糖尿病性神経障害に関しては主に神経成長因子（ＮＧＦ）とニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）について報告されている。これらは、糖尿病状態で発現が低下したサブスタンスＰおよびカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）などの神経伝導物質の発現増加を介して神経機能を改善すると考えられている。
糖尿病性神経障害に限られたものではないが、糖尿病性合併症の管理・治療の基本は長期に亘り良好な血糖コントロールを維持することである。しかしながら、日常診療において血糖コントロールを完璧に行うことは不可能であり、上述の発症機序にのっとった治療法の確立が必要である。
ポリオール経路の律速酵素であるアルドース還元酵素（ＡＲ）の活性を抑制するＡＲ阻害薬は日常診療に用いられているが、その臨床的有用性に関する国際的コンセンサスは得られていない。しかし、ＡＲ阻害薬はポリオール代謝以外の代謝異常および血流異常をも改善し得る治療薬として、最も期待される薬剤である。また血流改善作用を有する様々な薬剤（プロスタグランジンＥ１、プロスタグランジンＩ２、ニセリトロール、シロスタゾール、塩酸サルポグレラート）が、多くの患者に使用されている。今後治療薬として期待される薬剤として、ＰＫＣ−ｂｅｔａ阻害薬、非酵素的糖化反応阻害薬、抗酸化薬、神経成長因子（ＮＧＦ）などが挙げられるがこれらの薬剤による治療は未だ確立されていない。
一方、非可逆性の組織変化を伴った重症の神経障害に対しては、血糖コントロールの改善あるいは成因に基づく薬剤による治療はもはや効果が期待できず、痛みなどの自覚症状に対する対症療法が必要となる。痛みに対しては鎮痛薬としてサリチル酸や非ステロイド系消炎薬が治療の基本となり、夜間の激しい痛みに対してはインドメタシン坐薬やカルバマゼピン、フェニトインといった抗痙攣薬の投与がなされている。また三環系および四環系の抗うつ薬の併用も不眠を伴った症候性抑うつの解消に効果的といわれている。また、経口抗不整脈薬であるメキシレチンの有効性が明らかとなってきている。
近年新たな経口血糖降下薬およびインスリン製剤が次々に出現し、よりよい血糖コントロールの維持が可能となったことが、神経障害を含めた糖尿病性合併症の発症や進展の抑制に繋がることが予想される。しかしながら、それだけでは十分とはいえず、より効果的な糖尿病性合併症の予防および治療法の確立が切望されている。
塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）は、血管新生作用を有するサイトカインであり、虚血モデルを用いた研究によりその有効性が報告されている（国際公開第９４／２７６３０号パンフレット）。加えて、ｂＦＧＦは、線維芽細胞および神経系細胞を始めとする様々な細胞の増殖および分化誘導因子として作用することが明らかにされている。また、ｂＦＧＦが糖尿病性神経障害の治療に有効であるとする報告もなされている（中村ら，「糖尿病性神経障害に対するｂＦＧＦの効果」，第４６回日本糖尿病学会要旨集，ＩＩ−Ｊ３−２８，平成１５年５月）。
【発明の開示】
本発明が解決しようとする課題は、糖尿病性合併症をより効果的に治療し得る薬剤を提供することにある。
本発明者らは、ｂＦＧＦの糖尿病性神経障害の治療効果に着目し、その作用効果をさらに効率的に発現させるべく、鋭意検討の結果、ｂＦＧＦをゼラチンゲルに担持させることによって、所期の目的が達成されることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
［１］  ｂＦＧＦをゼラチンゲルに担持させてなる、糖尿病性神経障害治療剤。
［２］  ゼラチンゲルが架橋ゼラチンゲルである、［１］に記載の治療剤。
［３］  ゼラチンゲルに担持させたｂＦＧＦの治療上有効量を哺乳動物に投与することを含む、糖尿病性神経障害の治療方法。
［４］  ゼラチンゲルが架橋ゼラチンゲルである、［３］記載の治療方法。
［５］  糖尿病性神経障害の治療剤を製造するためのｂＦＧＦ及びゼラチンゲルの使用。
［６］  ゼラチンゲルが架橋ゼラチンゲルである、［５］記載の使用。
［７］  ［１］又は［２］記載の治療剤、および当該治療剤を糖尿病性神経障害に使用することができることまたは使用すべきであることを記載した当該治療剤に関する記載物を含む商業パッケージ。
以下、ｂＦＧＦをゼラチンゲルに担持させてなる糖尿病性神経障害治療剤を単に「本発明の製剤」とも称する。
本発明は、ｂＦＧＦをゼラチンに担持させた結果、糖尿病性神経障害の治療の指標となる神経伝達速度および神経内血流量を顕著に改善させることを可能とし、ｂＦＧＦの糖尿病性神経障害の治療剤としての利用性を向上させた点で有用である。本発明の製剤によれば、糖尿病性神経障害を有効に治療することができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、正常ラットおよびＳＴＺ誘導糖尿病ラットに架橋ゼラチンゲル（コントロール）またはｂＦＧＦ担持架橋ゼラチンゲルを筋肉内注射した場合の処置１０日後の坐骨神経における神経伝導速度を表すグラフである。
図２は、正常ラットおよびＳＴＺ誘導糖尿病ラットに架橋ゼラチンゲル（コントロール）またはｂＦＧＦ担持架橋ゼラチンゲルを筋肉内注射した場合の処置１０日後の坐骨神経における神経内血流量を表すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明におけるｂＦＧＦとしてはその同族体を用いてもよい。本発明におけるｂＦＧＦおよび／またはその同族体は、天然あるいは遺伝子組換え技術により微生物または培養細胞に産生させたものから単離精製することにより、あるいはそれらを化学的修飾または生物的修飾することにより得られる。本発明で用いるｂＦＧＦとしては特にヒトｂＦＧＦまたはその同族体が好ましい。
ｂＦＧＦの同族体とは、下記〔Ｉ〕または〔ＩＩ〕のポリペプチドを意味する。
〔Ｉ〕哺乳動物で産生されるｂＦＧＦと実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチド。実質的に同一のアミノ酸配列とは、アミノ酸配列中の１〜６個のアミノ酸が別種のアミノ酸により置換されたものでｂＦＧＦの生物活性を有するものを意味する。
〔ＩＩ〕哺乳動物で産生されるｂＦＧＦのＮ末端および／またはＣ末端、あるいは上記〔Ｉ〕のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に、追加のアミノ酸セグメントが追加されたポリペプチド。追加のアミノ酸セグメントとは、１〜１２個のアミノ酸からなり、ｂＦＧＦの生物活性または上記〔Ｉ〕のポリペプチドの生物活性を損なわないものを意味する。
ヒトｂＦＧＦはアミノ酸１４６個のポリペプチドであるが、本発明の製剤においては、ヒトｂＦＧＦの同族体（前記〔Ｉ〕の同族体）として、例えば特表平２−５０４４６８号公報に記載のアミノ酸１４６個のポリペプチドを用いてもよい。このポリペプチドは、ヒトｂＦＧＦのアミノ酸配列を構成する６９位のシステイン（Ｃｙｓ）および８７位のシステイン（Ｃｙｓ）がそれぞれセリン（Ｓｅｒ）により置換されたものである。
また、前記〔ＩＩ〕の同族体として、例えば特表昭６３−５００８４３号公報に記載のアミノ酸１５５個のポリペプチドを用いてもよい。このポリペプチドは、ヒトｂＦＧＦのＮ末端にアミノ酸９個のセグメントが付加されたものである。
また、Ｎ末端にＭｅｔ−が付加されたアミノ酸１４７個のポリペプチドや、特表昭６３−５０１９５３号公報に記載のＮ末端にアミノ酸１１個からなるセグメントが付加されたアミノ酸１５７個のポリペプチドを用いてもよい。
特に好ましいｂＦＧＦとしては、トラフェルミン（遺伝子組換え）が挙げられる。
本発明の製剤においては、一種類のｂＦＧＦを単独で使用してもよいし、複数種を併用してもよい。さらに、前述したように、ｂＦＧＦの同族体は複数種あるが、これらの同族体についても、それぞれを単独で使用してもよいし、併用してもよい。
なお、生体内におけるｂＦＧＦの存在量は極微量であるため、本発明の製剤を商業的に安定して供給する上からは、遺伝子組換え技術により大腸菌等の微生物または培養細胞に産生させたｂＦＧＦまたはその同族体を使用することが特に好ましい。ｂＦＧＦまたはその同族体（この場合は一般に前記〔Ｉ〕のポリペプチド）を産生させるための遺伝子を微生物または培養細胞に組み込んだ場合、この微生物または培養細胞から産生されるものは、一般に、ｂＦＧＦのＮ末端および／またはＣ末端、または上記〔Ｉ〕のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に、追加のアミノ酸セグメントが付加したもの、すなわち前述した〔ＩＩ〕のポリペプチドである。
本発明におけるゼラチンゲルの原料となるゼラチンの種類には特に制限はなく、通常入手できるものでよい。そのようなゼラチンとしては、例えば、等電点５付近のアルカリ処理ゼラチン（酸性ゼラチン）、等電点９付近の酸処理ゼラチン（アルカリゼラチン）などが挙げられるが、ｂＦＧＦとの親和性の点で、等電点５付近の酸性ゼラチンが好ましい。ゼラチンは、一種類のみではなく、原料や、溶解性、分子量、等電点等の物性の異なるものを適宜混合して用いてもよい。
本発明で用い得るゼラチンを架橋するための架橋剤としては、生体に対する毒性がないものであれば特に限定されないが、例えば、グルタルアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩や１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド−メト−ｐ−トルエンスルホナート等の水溶性カルボジイミド、ビスエポキシ化合物、ホルマリンなどが好ましく、グルタルアルデヒドおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩が特に好ましい。
ゼラチンはまた、熱処理または紫外線照射もしくは電子線照射によって架橋してもよい。
本発明で用いる架橋ゼラチンゲルの形状は特に制限はなく、例えば、円柱状、角柱状、シート状、ディスク状、球状、粒子状、粒状、ペースト状などが挙げられる。インプラントとして用いる場合には、円柱状、角柱状、シート状、ディスク状のものが好ましく、注入可能な製剤として用いる場合には、球状、粒子状、粒状、ペースト状のものが好ましい。
円柱状、角柱状、シート状、ディスク状の架橋ゼラチンゲルは、ゼラチン水溶液に架橋剤水溶液を添加するか、あるいは架橋剤水溶液にゼラチンを添加し、所望の形状の鋳型に流し込み、架橋反応させて調製することができる。また、成形したゼラチンゲルをそのまま、あるいは乾燥後に架橋剤水溶液を添加してもよい。架橋反応を停止させるには、エタノールアミン、グリシン等のアミノ基を持つ低分子物質に接触させるか、またはｐＨ２．５以下の水溶液を添加する。得られた架橋ゼラチンゲルは、蒸留水、エタノール、２−プロパノール（以下、ＩＰＡと称する）、アセトン等により洗浄し、製剤調製に供される。
得られる架橋ゼラチンゲルの含水率は、５０〜９９ｗ／ｗ％である。ここで、ゲルの含水率とは、湿潤時のゲル全重量に対するゲル中の水分重量の割合を示す。
ペースト状の架橋ゼラチンゲルは、上述の円柱状、角柱状、シート状、ディスク状の架橋ゼラチンゲルの調製方法と類似の方法で調製することができる。
球状、粒子状、粒状の架橋ゼラチンゲルは、例えば、撹拌用モーター（例えば、新東科学社製、スリーワンモーター、ＥＹＥＬＡ  ｍｉｎｉ  Ｄ．Ｃ．  Ｓｔｉｒｒｅｒ等）とテフロン（登録商標）製撹拌用プロペラを三つ口丸底フラスコに取り付け、これらを固定した装置に、ゼラチン水溶液を入れ、ここにオリーブ油等の油を加えて２００〜６００ｒｐｍ程度の速度で撹拌し、Ｗ／Ｏ型エマルジョンとし、これに架橋剤水溶液を添加するか、ゼラチン水溶液を予めオリーブ油中にて前乳化（例えば、ｖｏｒｔｅｘ  ｍｉｘｅｒ  Ａｄｖａｎｔｅｃ  ＴＭＥ−２１、ホモジナイザー  ｐｏｌｙｔｒｏｎ  ＰＴ１０−３５等）しておいたものをオリーブ油中に滴下し、微粒子化したＷ／Ｏ型エマルジョンを調製し、これに架橋剤水溶液を添加し、架橋反応させ、遠心分離により架橋ゼラチンゲルを回収し、アセトン、酢酸エチル等で洗浄し、さらにＩＰＡ、エタノール等で洗浄して乾燥させる。次に、Ｔｗｅｅｎ８０を含む水溶液に１００ｍＭグリシンを加え、その中に粒子を懸濁させることで架橋反応を停止させることにより調製することができる。得られた架橋ゼラチンゲル粒子は、ＩＰＡ、Ｔｗｅｅｎ８０を含む蒸留水、蒸留水等で順次洗浄し、製剤調製に供される。
得られる架橋ゼラチンゲル粒子の平均粒子径は、１〜１０００μｍであり、目的に応じて適宜必要なサイズの粒子をふるい分けして使用する。筋肉内注射により投与する場合には平均粒子径１０〜１５０μｍの粒子を用いるのが好ましい。ここでいう平均粒子径とは篩過により類推される粒子の平均径を意味する。また、得られる架橋ゼラチンゲル粒子の含水率は５０〜９９ｗ／ｗ％程度であり、適宜好ましい含水率のものを調製できる。ここで、ゲルの含水率とは、湿潤時のゲル全重量に対するゲル中の水分重量の割合を示す。
架橋ゼラチンゲル粒子が凝集する場合には、例えば、超音波照射（冷却下、１分以内程度が好ましい）等を行ってもよい。
なお、前乳化することによって、平均粒子径２０μｍ以下の微粒子状の架橋ゼラチンゲルを得ることもできる。
球状、粒子状の架橋ゼラチンゲルを調製する別法として次のような方法もある。
上記の方法と同様の装置にオリーブ油を入れ、２００〜６００ｒｐｍ程度の速度で撹拌し、ここにゼラチン水溶液を滴下し、Ｗ／Ｏ型エマルジョンを調製し、これを冷却後アセトン、酢酸エチル等を加えて撹拌し、遠心分離によりゼラチン粒子を回収する。回収したゼラチン粒子をさらにアセトン、酢酸エチル等、次いでＩＰＡ、エタノール等で洗浄後、乾燥させる。乾燥ゼラチン粒子を０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む架橋剤水溶液に懸濁し、緩やかに撹拌しながら架橋反応させ、使用した架橋剤に応じて０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１００ｍＭグリシン水溶液または０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む０．００４Ｎ  ＨＣｌなどにて洗浄して架橋反応を停止することにより架橋ゼラチンゲル粒子を得ることができる。
本別法で得られる架橋ゼラチンゲル粒子の平均粒子径および含水率は、上記の方法で得られるものと同様である。
架橋反応条件は適宜選択すべきものであるが、反応温度は０〜４０℃、反応時間は１〜４８時間が好ましい。
上記のようにして得られた架橋ゼラチンゲルは減圧乾燥または凍結乾燥させることもできる。
凍結乾燥は、例えば架橋ゼラチンゲルを蒸留水に入れ、液体窒素中で３０分以上または−８０℃で１時間以上凍結させた後に凍結乾燥機で１〜３日間乾燥させることにより行う。
架橋ゼラチンゲルを調製する際のゼラチンと架橋剤の濃度は、所望の含水率により適宜選択すべきであるが、ゼラチン濃度１〜１００ｗ／ｖ％、架橋剤濃度０．０１〜１００ｗ／ｖ％（１〜５４００ｍＭに相当）が好ましい。
架橋ゼラチンゲルは、原料であるゼラチンと架橋剤の濃度を変化させることにより所望の含水率とすることができる。含水率を高くするには、ゼラチン濃度、架橋剤濃度共に低くし、逆に含水率を低くするにはゼラチン濃度、架橋剤濃度共に高くすればよい。
上記のようにして調製した架橋ゼラチンゲルにｂＦＧＦを担持させるには、ｂＦＧＦ水溶液を架橋ゼラチンゲルに滴下して含浸させるか、架橋ゼラチンゲルをｂＦＧＦ水溶液中に懸濁して再膨潤させる。
架橋ゼラチンゲルに担持させることができるｂＦＧＦの量は、架橋ゼラチンゲルの含水率等により異なるが、架橋ゼラチンゲル１ｍｇ当たり０．１〜５００μｇである。
なお、ゼラチンゲルからのｂＦＧＦの放出時間および放出量は、ゼラチンゲルの含水率、用いたゼラチンの等電点等の物性、製剤に担持されるｂＦＧＦの量、投与される部位などの種々の条件により異なる。
上記のようにして得られたｂＦＧＦ担持架橋ゼラチンゲル製剤は、凍結乾燥することもできる。凍結乾燥する場合には、例えば、液体窒素中で３０分以上または−８０℃で１時間以上凍結させた後に、凍結乾燥機で１〜３日間乾燥させることにより行う。
本発明の製剤を注入可能な製剤とする場合には、注射用精製水、生理食塩水、緩衝液などの媒体に適宜懸濁する。緩衝液としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液などが挙げられる。さらに必要に応じ、注射可能な製剤の製造に通常使用される、分散剤、界面活性剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、安定化剤、保存剤、着色剤などを適宜配合することができる。
本発明の製剤は、優れた糖尿病性神経障害治癒作用を有しており、糖尿病性神経障害の治療に用いることができる。また本発明の製剤は、ヒトのみならずその他の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サルなど）における糖尿病性神経障害の処置にも適用可能である。
本発明における糖尿病性神経障害とは、高血糖に起因する末梢神経の働きの低下を意味する。糖尿病性神経障害は、多発性神経障害（例えば、しびれ、冷感、神経痛、感覚麻痺、こむらがえりなど）、自律神経障害（例えば、発汗異常、立ちくらみ、便秘、下痢、胆のう収縮能低下など）、単一性神経障害（例えば、顔面神経、外眼筋、聴神経の麻痺、四肢の神経障害など）などに分類されるが、本発明の製剤はこれらいずれの症状にも適用され得る。好ましくは、多発性神経障害に適用され得る。
本発明の製剤は、静脈内投与、筋肉内投与など任意の投与経路で投与され得るが、筋肉内投与が好ましい。例えば、ｂＦＧＦを担持させた粒子状のゲルを注射剤の製造において慣用されている適当な媒体に懸濁し注射可能な製剤としこれを筋肉内に注射する。また、ｂＦＧＦ担持ゼラチンゲルを円柱状、角柱状、シート状、ディスク状などに成形して、神経障害部位に埋設してもよい。
本発明の治療剤の投与量は、対象や適応症の種類、症状の程度、対象の年齢や病態により異なるので特定することは困難であるが、例えば、ヒトにおける糖尿病性神経障害の処置の場合には、ｂＦＧＦ量で、１箇所の処置部位に対して１回の処置あたり、およそ０．００１μｇ〜１０ｍｇ、好ましくは１〜１０００μｇの範囲である。投与回数は症例、１回の処置あたりの投与量にもよるが、通常１〜１０回程度とする。さらに症状の種類や程度によって、２〜６回投与してもよい。
【実施例】  以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
架橋ゼラチンゲルの作製（含水率９９％）
ゼラチン水溶液（等電点５付近のアルカリ処理ゼラチン（タイプＢ、（株）ニッピ製））に、グルタルアルデヒド水溶液を添加し、円柱状の鋳型に流し込み、架橋反応させて架橋ゼラチンゲルを調製した。この架橋ゼラチンゲルをグリシン水溶液に浸しながら架橋停止反応を行った後、さらに注射用水に浸して洗浄し、凍結乾燥させて架橋ゼラチンゲルを作製した。
注射剤の作製
上記の凍結乾燥させた架橋ゼラチンゲルに、５０μｇ／８００μＬ濃度のｂＦＧＦ水溶液を添加し、ｂＦＧＦを含浸させ、注射剤（ｂＦＧＦ担持架橋ゼラチンゲル）を作製した。
実験方法
ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を０．９％の終濃度になるように滅菌生理食塩水に溶解し、この溶液を８週齢のＷｉｓｔａｒ系雄性ラットに体重１ｋｇ当たり６０ｍｇ腹腔内投与することにより糖尿病ラットを作製した。未処置の正常ラットおよびＳＴＺ投与８週後の糖尿病ラットの右側大腿筋およびヒラメ筋に、ｂＦＧＦ（５０μｇ）担持架橋ゼラチンゲル（８００μＬ）を４等分し、２ヶ所ずつ計４ヵ所（１２．５μｇ／０．２ｍＬ  ×４）に筋肉内投与した。コントロールとして左側大腿筋およびヒラメ筋にｂＦＧＦを担持させていない架橋ゼラチンゲルを筋肉内投与した。処置１０日後に眼底撮影、網膜血流測定を行った。神経伝導速度は、ｓｃｉａｔｉｃ  ｎｏｔｃｈとアキレス腱部より電流刺激を行い、その刺激を足底部で受け取りそれぞれの伝導時間をＮｅｕｒｏ  ｐａｃｋ  ＥＲＥＣＴＲＯＭＹＯＧＲＡＰＨ  ＭＥＭ−３２０２を用いて測定し、その後刺激部位の距離を測定し、距離（２点の刺激部位の距離）／伝導時間（ｓｃｉａｔｉｃ  ｎｏｔｃｈ−アキレス腱部）より神経伝導速度を算出した。神経内血流量の測定は、坐骨神経に電極の針を刺し、そこで電気分解を起こし発生させた水素のクリアランスより血流量を半導体レーザー組織血流計ＭＯＤＥＬ  ＬＢＦ−２２１Ｒ  ＳＥＲＩＡＬ  ９１０５２を用いて測定した。
結果
眼底検査では全群において網膜症の発症は認められなかった。また網膜血流量は、糖尿病ラットにおいて低下が認められたがｂＦＧＦ投与による変化は認められなかった。
神経伝導速度の測定結果を図１に、神経内血流量の測定結果を図２に、それぞれ示す。
図１および図２の結果から、ｂＦＧＦ担持ゼラチン製剤の投与は、正常ラットの神経伝導速度および神経内血流量には影響を与えず、糖尿病ラットにおいてのみ、糖尿病に起因する神経伝導速度の低下および神経内血流量の低下を有意に改善したことがわかる。
以上の結果から、本発明の製剤は糖尿病性神経障害を効果的に治療し得ることが判明した。
【産業上の利用可能性】  本発明は、ｂＦＧＦをゼラチンに担持させた結果、糖尿病性神経障害の治療の指標となる神経伝導速度および神経内血流量を顕著に改善させることを可能とし、ｂＦＧＦの糖尿病性神経障害の治療剤としての利用性を向上させた点で有用である。本発明の製剤によれば、糖尿病性神経障害を有効に治療することができる。
以上、本発明の具体的な態様のいくつかを詳細に説明したが、当業者であれば示された特定の態様には、本発明の教示と利点から実質的に逸脱しない範囲で様々な修正と変更をなすことは可能である。従って、そのような修正及び変更も、すべて後記の請求の範囲で請求される本発明の精神と範囲内に含まれるものである。
本出願は、日本で出願された特願２００４−１１６１０９（出願日：２００４年４月９日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含される。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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