(57)【要約】  本発明は、不可逆的に部位特異的に遺伝子組換えを起こすリコンビナーゼとして新規な酵素を提供し、さらに当該酵素を利用した新たな不可逆的部位特異的遺伝子組換え方法を提供する。  当該方法は下記により行うことができる：(i) 第１組換え部位（attP1）及び第２組換え部位（attP2）がコア配列を介して接続してなる認識配列（attP1/P2）を有するポリヌクレオチド、(ii) 第３組換え部位（attB1）及び第４組換え部位（attB2）がコア配列を介して接続してなる認識配列（attB1/B2）を有するポリヌクレオチド、及び(iii)黄色ブドウ球菌ΦMR11ファージに由来するインテグラーゼを組み合わせて、(iv) 第１組換え部位（attP1）及び第４の組換え部位（attB2）がコア配列を介して接続してなる組換え配列（attP1/B2）を有するポリヌクレオチド、及び(v) 第３組換え部位（attB1）及び第２の組換え部位（attP2）がコア配列を介して接続してなる組換え配列（attB1/P2）を有するポリヌクレオチドを生成する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i) 第１組換え部位（attP1）及び第２組換え部位（attP2）がコア配列を介して接続してなる認識配列（attP1/P2）を有するポリヌクレオチド、
(ii) 第３組換え部位（attB1）及び第４組換え部位（attB2）がコア配列を介して接続してなる認識配列（attB1/B2）を有するポリヌクレオチド、及び
(iii)黄色ブドウ球菌ΦMR11ファージに由来するインテグラーゼ
を組み合わせて、
(iv) 第１組換え部位（attP1）及び第４の組換え部位（attB2）がコア配列を介して接続してなる組換え配列（attP1/B2）を有するポリヌクレオチド、及び
(v) 第３組換え部位（attB1）及び第２の組換え部位（attP2）がコア配列を介して接続してなる組換え配列（attB1/P2）を有するポリヌクレオチドを生成する、
不可逆的部位特異的遺伝子組換え方法。
【請求項２】
(i)認識配列（attP1/P2）を有するオリゴヌクレオチド、及び(ii)認識配列（attB1/B2）を有するオリゴヌクレオチドの一方が環状であって他方が端部を有する直鎖状であり、組換えによって生じる(iv)組換え配列（attP1/B2）を有するオリゴヌクレオチド、及び(v)組換え配列（attB1/P2）を有するオリゴヌクレオチドが、組換え配列（attP1/B2）と組換え配列（attB1/P2）を単一の塩基配列上に有する同一の直鎖状DNA分子である、請求項１に記載する不可逆的部位特異的遺伝子組換え方法。
【請求項３】
(i)認識配列（attP1/P2）を有するオリゴヌクレオチド、及び(ii)認識配列（attB1/B2）を有するオリゴヌクレオチドがそれぞれ異なる環状DNA分子であって、組換えによって生じる(iv)組換え配列（attP1/B2）を有するオリゴヌクレオチド、及び(v)組換え配列（attB1/P2）を有するオリゴヌクレオチドが、組換え配列（attP1/B2）と組換え配列（attB1/P2）を単一の塩基配列上に有する同一の環状DNA分子である、請求項１に記載する不可逆的部位特異的遺伝子組換え方法。
【請求項４】
(i)認識配列（attP1/P2）を有するオリゴヌクレオチド、及び(ii)認識配列（attB1/B2）を有するオリゴヌクレオチド が、単一の塩基配列上に、認識配列（attP1/P2）と認識配列（attB1/B2）を任意の塩基配列を挟んで同一方向に有する同一の直鎖状DNA分子であって、組換えによって生じる(iv)組換え配列（attP1/B2）を有するオリゴヌクレオチド、及び(v)組換え配列（attB1/P2）を有するオリゴヌクレオチドの一方が、上記任意の塩基配列を有する環状DNA分子であり、他方が直鎖状のDNA分子である、請求項１に記載する不可逆的部位特異的遺伝子組換え方法。
【請求項５】
(i)認識配列（attP1/P2）を有するオリゴヌクレオチド、及び(ii)認識配列（attB1/B2）を有するオリゴヌクレオチドが、単一の塩基配列上に、認識配列（attP1/P2）と認識配列（attB1/B2）を任意の塩基配列を挟んで逆方向に有する同一の直鎖状DNA分子であって、組換えによって生じる(iv)組換え配列（attP1/B2）を有するオリゴヌクレオチド、及び(v)組換え配列（attB1/P2）を有するオリゴヌクレオチドが、単一の塩基配列上に、組換え配列（attP1/B2）と組換え配列（attB1/P2）を任意の塩基配列を組換え前とは逆位に挟んで、逆方向に有する同一の直鎖状DNA分子である、請求項１に記載する不可逆的部位特異的遺伝子組換え方法。
【請求項６】
(i)認識配列（attP1/P2）を有するオリゴヌクレオチド、及び(ii)認識配列（attB1/B2）を有するオリゴヌクレオチド が、単一の塩基配列上に、認識配列（attP1/P2）と認識配列（attB1/B2）を任意の塩基配列を挟んで同方向に有する同一の直鎖状DNA分子であって、当該直鎖状DNA分子として認識配列（attP1/P2）と認識配列（attB1/B2）の順番を異にする2つの直鎖状DNA分子１及び２、並びに(iii)黄色ブドウ球菌ΦMR11に由来するインテグラーゼを組み合わせて行う組換え方法であって、
部位特異的組換えによって2つのDNA分子を生じ、これらのDNA分子が、単一の塩基配列上に、任意の塩基配列を挟んで組換え配列〔（attP1/B2）または（attB1/P2）〕を同方向に有する直鎖状DNA分子である、請求項１に記載する不可逆的部位特異的遺伝子組換え方法。
【請求項７】
標的細胞における不可逆的部位特異的遺伝子組換え方法であって、
ａ）認識配列（attP1/P2）を標的細胞に導入する工程、及び／又は
ｂ）認識配列（attB1/B2）を標的細胞に導入する工程、及び
ｃ）認識配列（attP1/P2）及び認識配列（attB1/B2）に黄色ブドウ球菌ΦMR11ファージに由来するインテグラーゼを作用させて、組換えによって組換え配列（attP1/B2）及び組換え配列（attB1/P2）を生成する工程
を有する方法。
【請求項８】
天然的に、またはDNA組換えによって認識配列（attB1/B2）を有する標的細胞における不可逆的部位特異的遺伝子組換え方法であって、
ａ）認識配列（attP1/P2）を標的細胞に導入する工程、及び
ｃ）認識配列（attP1/P2）及び認識配列（attB1/B2）に黄色ブドウ球菌ΦMR11ファージに由来するインテグラーゼを作用させて、組換えによって組換え配列（attP1/B2）及び組換え配列（attB1/ P2）を生成する工程
を有する方法。
【請求項９】
認識配列（attP1/P2）が配列番号４に記載する塩基配列、認識配列（attB1/B2）が配列番号８に記載する塩基配列、組換え配列（attP1/B2）が配列番号１１に記載する塩基配列、及び組換え配列（attB1/P2）が配列番号１２に記載する塩基配列である、請求項１乃至８のいずれかに記載する不可逆的部位特異的遺伝子組換え方法。
【請求項１０】
黄色ブドウ球菌ΦMR11ファージに由来するインテグラーゼが、下記（ａ）または（ｂ）に記載するDNAによってコードされるタンパク質である、請求項１乃至８のいずれかに記載する不可逆的部位特異的遺伝子組換え方法：
（ａ）配列番号１３に示す塩基配列を有するDNA、
（ｂ）配列番号１３に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、認識配列（attP1/P2）及び認識配列（attB1/B2）を認識して組換え配列（attP1/B2）及び組換え配列（attB1/P2）を生じるリコンビナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項１１】
黄色ブドウ球菌ΦMR11ファージに由来するインテグラーゼが、下記（ｃ）または（ｄ）に記載するタンパク質である、請求項１乃至８のいずれかに記載する不可逆的部位特異的遺伝子組換え方法：
（ｃ）配列番号１４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｄ）配列番号１４に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸配列が欠失、置換、または付加してなるアミノ酸配列を有し、認識配列（attP1/P2）及び認識配列（attB1/B2）を認識して組換え配列（attP1/B2）及び組換え配列（attB1/P2）を生じるリコンビナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１２】
下記（ａ）または（ｂ）に記載するDNAによってコードされるタンパク質からなる、黄色ブドウ球菌ΦMR11ファージに由来するインテグラーゼ：
（ａ）配列番号１３に示す塩基配列を有するDNA、
（ｂ）配列番号１３に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、認識配列（attP1/P2）及び認識配列（attB1/B2）を認識して組換え配列（attP1/B2）及び組換え配列（attB1/P2）を生じるリコンビナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項１３】
下記（ｃ）または（ｄ）に記載するタンパク質からなる、請求項１２に記載の黄色ブドウ球菌ΦMR11ファージに由来するインテグラーゼ：
（ｃ）配列番号１４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｄ）配列番号１４に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸配列が欠失、置換、または付加してなるアミノ酸配列を有し、認識配列（attP1/P2）及び認識配列（attB1/B2）を認識して組換え配列（attP1/B2）及び組換え配列（attB1/P2）を生じるリコンビナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１４】
下記（ｃ）または（ｄ）に記載するタンパク質をコードする黄色ブドウ球菌ΦMR11ファージに由来するインテグラーゼの遺伝子：
（ｃ）配列番号１４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｄ）配列番号１４に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸配列が欠失、置換、または付加してなるアミノ酸配列を有し、認識配列（attP1/P2）及び認識配列（attB1/B2）を認識して組換え配列（attP1/B2）及び組換え配列（attB1/P2）を生じるリコンビナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１５】
下記（ａ）または（ｂ）に記載するDNAからなる、請求項１４記載の黄色ブドウ球菌ΦMR11ファージに由来するインテグラーゼの遺伝子：
（ａ）配列番号１３に示す塩基配列を有するDNA、
（ｂ）配列番号１３に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、認識配列（attP1/P2）及び認識配列（attB1/B2）を認識して組換え配列（attP1/B2）及び組換え配列（attB1/P2）を生じるリコンビナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項１６】
請求項１４に記載する黄色ブドウ球菌ΦMR11ファージに由来するインテグラーゼの遺伝子を含有するベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載するベクターを用いて宿主細胞を形質転換してなる形質転換体。
【請求項１８】
１つ以上の容器に、同一または異なった成分として、
1)  認識配列（attP1/P2）を有するポリヌクレオチド(i)、及び／又は
2)  認識配列（attB1/B2）を有するポリヌクレオチド(ii)、及び
3)  黄色ブドウ球菌ΦMR11ファージに由来するインテグラーゼ、当該インテグラーゼをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、当該インテグラーゼをコードする遺伝子を発現可能な状態で有する組換えベクター、及び当該インテグラーゼを発現し得る細胞よりなる群から選択される少なくとも１つ
を含有する標的DNA分子のクローニングに有用なキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換え技術に関する。より詳細には、部位特異的リコンビナーゼを用いた遺伝子組換え技術に関する。この技術は、インビトロまたはインビボにおいて、所望の核酸分子の構築または選択、並びに所望の組換えタンパク質の構築に有効に利用することができる。
【背景技術】
【０００２】
部位特異的遺伝子組換えは、λファージが宿主の染色体に自己のDNAを組み込む過程として見出された現象であり、相対的に短い配列を特異的に認識して組換えを触媒する組換え酵素（以下、「リコンビナーゼ」と称する）によって行われる点で、長い相同的な核酸の対合を介して進行する相同的組換えとは根本的に異なるものである。部位特異的遺伝子組換え技術を用いれば、所望の遺伝子の任意の部位に特定の塩基配列を挿入するか、または所望の遺伝子から特定の塩基配列を欠失させることができ、所望の核酸分子の構築（クローニング、サブクローニングを含む）、並びに遺伝子発現のスイッチング（ON-OFF）を簡単に実施することが可能となる。このため、部位特異的遺伝子組換えは、とりわけ所望の核酸分子の構築及びタンパク質の産生だけでなく、発生工学の分野において、時期特異的、部位特異的に、特定の遺伝子をノックアウト又はノックインする技術として用いられており、医療分野での応用も期待されている。【０００３】
世界的に汎用されている部位特異的遺伝子組換え技術は、大腸菌ファージP1由来のリコンビナーゼCreとその認識部位loxPを用いた「Cre-loxP」の系である（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、Cre-loxP系は遺伝子組換えが２箇所の認識部位loxP間で起こり、それによってloxPと全く同一の塩基配列が新たに２箇所生じてしまうため、組換え後に残ったloxP間で再度組換えが起こり、結果的に無視できない頻度で組換えが元に戻ってしまう。すなわちCre-loxP系は組換えが可逆的であるため、逆反応が生じるという問題がある。【０００４】
一方、不可逆的な部位特異的遺伝子組換え技術として、酵母プラスミド由来のリコンビナーゼFLPとその認識部位frtを用いた組換えシステム「FLP」（例えば、非特許文献２参照）；λファージ由来のリコンビナーゼ(BPクロナーゼ、LRクロナーゼ）とその認識部位attB及びattP（BPクロナーゼ）並びにattL及びattR（LRクロナーゼ）を用いた組換えシステム「GATEWAY」（例えば、特許文献１〜６等参照のこと）；放射線ΦC31ファージ由来のインテグラーゼとその認識部位attB及びattPを用いた組換えシステム（例えば、非特許文献３参照）；乳酸菌（Lactococcus lactis subsp. cremoris）のTP901-1ファージ由来のインテグラーゼとその認識部位attB及びattPを用いた組換えシステム（例えば、非特許文献４参照）；及びStreptomyces parvulusｍのR4ファージ由来のインテグラーゼとその認識部位attB及びattPを用いた組換えシステム（例えば、非特許文献５参照）が知られている。
【特許文献１】米国特許第5888732号公報
【特許文献２】特表平11-507236号公報
【特許文献３】特開2003-159063号公報
【特許文献４】特表2002-510502号公報
【特許文献５】特表2003-512075号公報
【特許文献６】特表2004-500061号公報
【非特許文献１】Sauer（1994）Curr．Opin．Biotechnol.５, 521-527
【非特許文献２】Ow（1996）Curr.Opin．Biotechnol.７：181−186
【非特許文献３】Amy C. Groth, et al., PNAS 97(11) 5995-6000, 2000
【非特許文献４】Stephanie M. Stoll, et al., J. Bacteriol, 184(13) 3657-3667,2002
【非特許文献５】Eric C. Olivares, et al., Gene 278, 167-176, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、従来のCre-loxP系が有する欠点を克服した、新規な不可逆的部位特異的遺伝子組換えシステムを提供することである。より詳細には、本発明の目的は、不可逆的に部位特異的に遺伝子組換えを起こすリコンビナーゼとして新規な酵素を提供し、さらに当該酵素を利用した新たな不可逆的部位特異的遺伝子組換えシステムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、不可逆的に部位特異的に遺伝子組換えを起こすリコンビナーゼ活性を有する酵素を求めて検討していたところ、黄色ブドウ球菌のファージΦMR11（J. Infect. Dis., 187: 613-624, 2003）が保有する新規インテグラーゼ酵素（以下、「ΦMR11由来インテグラーゼ」ともいう）がこの目的に適うものであることを見いだした。すなわち、このΦMR11由来インテグラーゼが認識する２つの塩基配列（認識配列）attP 及び attBは、配列が相互に全く異なるものであるだけでなく、従来公知の部位特異的遺伝子組換え系で使用されるリコンビナーゼの認識配列とも相同性が低いことが判明し、このことから当該ΦMR11由来インテグラーゼとその認識部位attPおよびattB（ΦMR11由来インテグラーゼ／attP-attB系）を用いることにより、従来とは異なる不可逆的な部位特異的遺伝子組換え系が構築できることがわかった。本発明はかかる知見に基づくものである。【０００７】
すなわち、本発明は下記の態様を含むものである：
項１．  (i) 第１組換え部位（attP1）及び第２組換え部位（attP2）がコア配列を介して接続してなる認識配列（attP1/P2）を有するポリヌクレオチド、
(ii) 第３組換え部位（attB1）及び第４組換え部位（attB2）がコア配列を介して接続してなる認識配列（attB1/B2）を有するポリヌクレオチド、及び
(iii)黄色ブドウ球菌ΦMR11ファージに由来するインテグラーゼ
を組み合わせて、
(iv) 第１組換え部位（attP1）及び第４の組換え部位（attB2）がコア配列を介して接続してなる組換え配列（attP1/B2）を有するポリヌクレオチド、及び
(v) 第３組換え部位（attB1）及び第２の組換え部位（attP2）がコア配列を介して接続してなる組換え配列（attB1/P2）を有するポリヌクレオチドを生成する、
不可逆的部位特異的遺伝子組換え方法。【０００８】
項２．  認識配列（attP1/P2）を有するオリゴヌクレオチド(i)及び認識配列（attB1/B2）を有するオリゴヌクレオチド(ii)の一方が環状であって他方が端部を有する直鎖状であり、組換えによって生じる組換え配列（attP1/B2）を有するオリゴヌクレオチド(iv)及び組換え配列（attB1/P2）を有するオリゴヌクレオチド(v)が、組換え配列（attP1/B2）と組換え配列（attB1/P2）を単一の塩基配列上に有する同一の直鎖状DNA分子である、項１に記載する不可逆的部位特異的遺伝子組換え方法。【０００９】
項３．  認識配列（attP1/P2）を有するオリゴヌクレオチド(i)及び認識配列（attB1/B2）を有するオリゴヌクレオチド(ii) がそれぞれ異なる環状DNA分子であって、組換えによって生じる組換え配列（attP1/B2）を有するオリゴヌクレオチド(iv)及び組換え配列（attB1/P2）を有するオリゴヌクレオチド(v)が、組換え配列（attP1/B2）と組換え配列（attB1/P2）を単一の塩基配列上に有する同一の環状DNA分子である、項１に記載する不可逆的部位特異的遺伝子組換え方法。【００１０】
項４．  認識配列（attP1/P2）を有するオリゴヌクレオチド(i)及び認識配列（attB1/B2）を有するオリゴヌクレオチド(ii) が、単一の塩基配列上に、認識配列（attP1/P2）と認識配列（attB1/B2）を任意の塩基配列を挟んで同一方向に有する同一の直鎖状DNA分子であって、組換えによって生じる組換え配列（attP1/B2）を有するオリゴヌクレオチド(iv)及び組換え配列（attB1/P2）を有するオリゴヌクレオチド(v)の一方が、上記任意の塩基配列を有する環状DNA分子であり、他方が直鎖状のDNA分子である、項１に記載する不可逆的部位特異的遺伝子組換え方法。【００１１】
項５．  認識配列（attP1/P2）を有するオリゴヌクレオチド(i)及び認識配列（attB1/B2）を有するオリゴヌクレオチド(ii) が、単一の塩基配列上に、認識配列（attP1/P2）と認識配列（attB1/B2）を任意の塩基配列を挟んで逆方向に有する同一の直鎖状DNA分子であって、組換えによって生じる組換え配列（attP1/B2）を有するオリゴヌクレオチド(iv)及び組換え配列（attB1/P2）を有するオリゴヌクレオチド(v)が、単一の塩基配列上に、組換え配列（attP1/B2）と組換え配列（attB1/P2）を任意の塩基配列を組換え前とは逆位に挟んで、逆方向に有する同一の直鎖状DNA分子である、項１に記載する不可逆的部位特異的遺伝子組換え方法。【００１２】
項６．  認識配列（attP1/P2）を有するオリゴヌクレオチド(i)及び認識配列（attB1/B2）を有するオリゴヌクレオチド(ii) が、単一の塩基配列上に、認識配列（attP1/P2）と認識配列（attB1/B2）を任意の塩基配列を挟んで同方向に有する同一の直鎖状DNA分子であって、当該直鎖状DNA分子として認識配列（attP1/P2）と認識配列（attB1/B2）の順番を異にする2つの直鎖状DNA分子１及び２、並びに黄色ブドウ球菌ΦMR11に由来するインテグラーゼ(iii)を組み合わせて行う組換え方法であって、
部位特異的組換えによって2つのDNA分子を生じ、これらのDNA分子が、単一の塩基配列上に、任意の塩基配列を挟んで同一の組換え配列〔（attP1/B2）または（attB1/P2）〕を同方向に有する直鎖状DNA分子である、項１に記載する不可逆的部位特異的遺伝子組換え方法。【００１３】
項７．  標的細胞における不可逆的部位特異的遺伝子組換え方法であって、
ａ）認識配列（attP1/P2）を標的細胞に導入する工程、及び／又は
ｂ）認識配列（attB1/B2）を標的細胞に導入する工程、及び
ｃ）認識配列（attP1/P2）及び認識配列（attB1/B2）に黄色ブドウ球菌ΦMR11ファージに由来するインテグラーゼを作用させて、組換えによって組換え配列（attP1/B2）及び組換え配列（attB1/P2）を生成する工程
を有する方法。【００１４】
項８．  天然的に、またはDNA組換えによって認識配列（attB1/B2）を有する標的細胞における不可逆的部位特異的遺伝子組換え方法であって、
ａ）認識配列（attP1/P2）を標的細胞に導入する工程、及び
ｃ）認識配列（attP1/P2）及び認識配列（attB1/B2）に黄色ブドウ球菌ΦMR11ファージに由来するインテグラーゼを作用させて、組換えによって組換え配列（attP1/B2）及び組換え配列（attB1/ P2）を生成する工程
を有する方法。【００１５】
項９．  認識配列（attP1/P2）が配列番号４に記載する塩基配列、認識配列（attB1/B2）が配列番号８に記載する塩基配列、組換え配列（attP1/B2）が配列番号１１に記載する塩基配列、及び組換え配列（attB1/P2）が配列番号１２に記載する塩基配列である、項１乃至８のいずれかに記載する不可逆的部位特異的遺伝子組換え方法。【００１６】
項１０．  黄色ブドウ球菌ΦMR11ファージに由来するインテグラーゼが、下記（ａ）または（ｂ）に記載するDNAによってコードされるタンパク質である、項１乃至９のいずれかに記載する不可逆的部位特異的遺伝子組換え方法：
（ａ）配列番号１３に示す塩基配列を有するDNA、
（ｂ）配列番号１３に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、認識配列（attP1/P2）及び認識配列（attB1/B2）を認識して組換え配列（attP1/B2）及び組換え配列（attB1/P2）を生じるリコンビナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。【００１７】
項１１．  黄色ブドウ球菌ΦMR11ファージに由来するインテグラーゼが、下記（ｃ）または（ｄ）に記載するタンパク質である、項１乃至９のいずれかに記載する不可逆的部位特異的遺伝子組換え方法：
（ｃ）配列番号１４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｄ）配列番号１４に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸配列が欠失、置換、または付加してなるアミノ酸配列を有し、認識配列（attP1/P2）及び認識配列（attB1/B2）を認識して組換え配列（attP1/B2）及び組換え配列（attB1/P2）を生じるリコンビナーゼ活性を有するタンパク質。【００１８】
項１２．  下記（ａ）または（ｂ）に記載するDNAによってコードされるタンパク質からなる、黄色ブドウ球菌ΦMR11ファージに由来するインテグラーゼ：
（ａ）配列番号１３に示す塩基配列を有するDNA、
（ｂ）配列番号１３に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、認識配列（attP1/P2）及び認識配列（attB1/B2）を認識して組換え配列（attP1/B2）及び組換え配列（attB1/P2）を生じるリコンビナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。【００１９】
項１３．  下記（ｃ）または（ｄ）に記載するタンパク質からなる、黄色ブドウ球菌ΦMR11ファージに由来するインテグラーゼ：
（ｃ）配列番号１４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｄ）配列番号１４に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸配列が欠失、置換、または付加してなるアミノ酸配列を有し、認識配列（attP1/P2）及び認識配列（attB1/B2）を認識して組換え配列（attP1/B2）及び組換え配列（attB1/P2）を生じるリコンビナーゼ活性を有するタンパク質。【００２０】
項１４．  下記（ｃ）または（ｄ）に記載するタンパク質をコードする黄色ブドウ球菌ΦMR11ファージに由来するインテグラーゼの遺伝子：
（ｃ）配列番号１４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｄ）配列番号１４に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸配列が欠失、置換、または付加してなるアミノ酸配列を有し、認識配列（attP1/P2）及び認識配列（attB1/B2）を認識して組換え配列（attP1/B2）及び組換え配列（attB1/P2）を生じるリコンビナーゼ活性を有するタンパク質。【００２１】
項１５．  下記（ａ）または（ｂ）に記載するDNAからなる黄色ブドウ球菌ΦMR11ファージに由来するインテグラーゼの遺伝子：
（ａ）配列番号１３に示す塩基配列を有するDNA、
（ｂ）配列番号１３に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、認識配列（attP1/P2）及び認識配列（attB1/B2）を認識して組換え配列（attP1/B2）及び組換え配列（attB1/P2）を生じるリコンビナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。【００２２】
項１６．  項１４または１５に記載する黄色ブドウ球菌ΦMR11ファージに由来するインテグラーゼの遺伝子を含有するベクター。【００２３】
項１７．  項１６に記載するベクターを用いて宿主細胞を形質転換してなる形質転換体。【００２４】
項１８．  １つ以上の容器に、同一または異なった成分として、
1)  認識配列（attP1/P2）を有するポリヌクレオチド(i)、及び／又は
2)  認識配列（attB1/B2）を有するポリヌクレオチド(ii)、及び
3)  黄色ブドウ球菌ΦMR11ファージに由来するインテグラーゼ、当該インテグラーゼをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、当該インテグラーゼをコードする遺伝子を発現可能な状態で有する組換えベクター、及び当該インテグラーゼを発現し得る細胞からなる群から選択される少なくとも１つ
を含有する標的DNA分子のクローニングに有用なキット。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、不可逆的部位特異的な遺伝子組換え技術に好適に利用できるリコンビナーゼとして、新規なΦMR11由来インテグラーゼを提供することができる。当該新規リコンビナーゼ（ΦMR11由来インテグラーゼ）を用いた本発明の部位特異的な組み換え技術は、過去に知られたシステムとは異なり、可逆的に組換えが戻るといった逆反応が生じず、組み換えの産物を安定して作成することができる。このため、本発明の方法は、例えば、真核細胞の染色体へトランスジーンを導入するために利用することができ、これによって、既に知られた部位特異的な組み換えシステムを用いる場合にしばしば起こるトランスジーンの切除（脱離）を回避することができる。また、本発明の技術によれば、挿入だけでなく、種々の組換え態様〔逆位（inversion）、トランスロケーション（translocation）、欠失（deletoin）、及び他の転位（rearrangement）〕も行うことができ、例えば遺伝子の発現や生体の発生をスイッチング（ON-OFF）によって制御することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の部位特異的遺伝子組換え（挿入組換え）の態様を示す模式図を示す。直鎖状遺伝子（直鎖状ポリヌクレオチド）(ii)と環状遺伝子（環状ポリヌクレオチド）(i)との間での組換えである。なお、図中実線および各種の破線はいずれもヌクレオチド鎖を意味する（下記図面においても同様）。
【図２】本発明の部位特異的遺伝子組換え（挿入組換え）の態様を示す模式図を示す。環状遺伝子（環状ポリヌクレオチド）(i)と環状遺伝子（環状ポリヌクレオチド）(ii)との間での組換えである。
【図３】本発明の部位特異的遺伝子組換え（欠失組換え）の態様を示す模式図を示す。
【図４】本発明の部位特異的遺伝子組換え（逆位組換え）の態様を示す模式図を示す。
【図５】本発明の部位特異的遺伝子組換え（置換組換え）の態様を示す模式図を示す。直鎖状遺伝子（直鎖状ポリヌクレオチド）と直鎖状遺伝子（直鎖状ポリヌクレオチド）との二本鎖間での置換組換えである。
【図６】図１〜５に示す図柄の意味を示す図である。但し、図１〜５において、認識配列（attP1/P2）の組換え部位attP1とattP2の間にある縦棒、認識配列（attB1/B2）の組換え部位attB1とattB2の間にある縦棒は省略して記載する。図１〜５において、  →  は、実線や破線で示すヌクレオチド鎖と同様、任意の塩基配列からなるが、本発明の組換え方法による挿入、欠失、逆位および置換の結果をよりわかりやすくするための標記である。
【図７】ファージΦMR11ゲノムにおける、インテグラーゼ遺伝子、及び認識部位（attP）の位置関係を示す図である。
【図８（ａ）】「ΦMR11-Gp1」（ΦMR11由来インテグラーゼ）遺伝子の塩基配列を示す。
【図８（ｂ）】「ΦMR11-Gp1」（ΦMR11由来インテグラーゼ）のアミノ酸配列を示す。
【図９】「ΦMR11-Gp1」（ΦMR11由来インテグラーゼ）とΦ105由来インテグラーゼのアミノ酸配列を対比した図（アライメント）である。上段がΦMR11由来インテグラーゼのアミノ酸配列、下段が105由来インテグラーゼのアミノ酸配列である。
【図１０】ヒト細胞（HeLa）内での部位特異的DNA組換えの模式図である（実施例１）。
【図１１】ΦMR11由来インテグラーゼ／attP-attB系について、遺伝子組換えの遺伝子治療における応用例を模式的に示した図である（実施例２）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
（１）用語の定義
なお、本発明において「遺伝子」または「ＤＮＡ」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨で用いられる。またその長さは特に制限されるものではない。従って、本明細書でいう「遺伝子」または「ＤＮＡ」とは、特に言及しない限り、ゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）及び該正鎖に対して相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖、逆鎖）、並びに合成ＤＮＡが含まれ、さらに「遺伝子」にはＲＮＡも含まれる。また「遺伝子」または「ＤＮＡ」は、本発明の効果を保有する限りにおいて、コード領域以外に、例えば発現制御領域、シグナル領域、エキソン、イントロンを含むことができる。【００２８】
また、特に言及しない限り、本発明でいう「遺伝子」または「ＤＮＡ」には、特定の塩基配列で示される「遺伝子」または「ＤＮＡ」だけでなく、これらによりコードされるタンパク質と生理学的機能が同等であるタンパク質（例えば、同族体、変異体または誘導体など、本明細書では「機能的同等物」ともいう）をコードする「遺伝子」または「ＤＮＡ」が含まれる。本明細書では、かかる「遺伝子」または「ＤＮＡ」を、特定の塩基配列で示される「遺伝子」または「ＤＮＡ」の「ホモログ」ともいう。かかる「ホモログ」としては、特定の塩基配列で示される「遺伝子」または「ＤＮＡ」の相補鎖に対して、ストリンジェントな条件で、ハイブリダイズする塩基配列を有する「遺伝子」または「ＤＮＡ」を挙げることができる。例えば、同族体をコードする遺伝子（ホモログ）としては、本発明の遺伝子の由来生物である黄色ブドウ球菌ファージΦMR11以外の他の微生物に由来する対応の遺伝子を例示することができる。【００２９】
本発明でいう「酵素（インテグラーゼ）」または「タンパク質」には、特定のアミノ酸配列で示される「酵素（インテグラーゼ）」または「タンパク質」だけでなく、これらと同等な生理学的機能を有する「酵素（インテグラーゼ）」または「タンパク質」（例えば、同族体、変異体または誘導体などの「機能的同等物」）が含まれる。例えば、同族体（機能的同等物）としては、本発明の「酵素（インテグラーゼ）」または「タンパク質」の由来生物である黄色ブドウ球菌ファージΦMR11以外の他の微生物に由来する対応の「酵素（インテグラーゼ）」または「タンパク質」を例示することができる。また、変異体（機能的同等物）には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、及び人為的に欠失、置換、付加または挿入等されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が含まれる。なお、かかる同族体や変異体等の「機能的同等物」としては、特定のアミノ酸配列（配列番号６）で特定される酵素（インテグラーゼ）またはタンパク質と、アミノ酸配列において少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましく８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上が同一であるものを挙げることができる。【００３０】
「サブクローニングベクター」とは、レプリコンを含む環状または直鎖状DNA分子を含むクローニングベクターである。最終産物に組み込まれてクローン化されたDNAインサートに対して作用するか、またはそれとともに作用することが望まれる機能性及び／又は調節エレメントを含むことができる。また、サブクローニングベクターはまた、選択マーカーを含みうる。【００３１】
「ベクター」は、核酸（又は複数の核酸）を宿主細胞へ運搬するためのDNA分子を言う。例えば、インビトロまたは宿主細胞において複製し得るかまたは複製され得る、あるいは所望のDNAセグメントを宿主細胞内の所望の位置に運搬し得る、プラスミド、ファージ、及びその他のDNA分子を挙げることができる。ベクターは、運搬すべき物質をコード化する核酸を含み、核酸の宿主細胞内への加入及び／又はベクターの宿主細胞での複製を容易にするために、ウイルスキャプシド又は他の物質（例えば、キャプシド内、又はキャプシドの一部としてパッケージされた逆転写酵素又は他の酵素）を選択的に含むことができる。【００３２】
「トランスジェニック」の語は、細胞の中へか、細胞の原型の中へ導入された特異的修飾を含む細胞をいう。そのような修飾は、一又はそれ以上の点突然変異、欠失、挿入、又はその組み合わせを含むことができる。動物または植物に関して「トランスジェニック」の語は、トランスジェニックである細胞を含む動物または植物（トランスジェニック動物またはトランスジェニック植物）を意味する。トランスジェニック及び非トランスジェニック細胞の両方からなる動物は、ここでは「キメラ」動物という。【００３３】
「リコンビナーゼ」は、一般には、2つ又はそれ以上の認識配列間での組み換えを触媒する酵素をいう。本発明で用いられるリコンビナーゼは、下記に説明する特定の認識配列を特異的に認識し、その組換え部位での組み換えを触媒する作用を有する。「インテグラーゼ」は、リコンビナーゼのタイプをいう。なお、リコンビナーゼ（インテグラーゼ）は、2つのグループ、λインテグラーゼ（Argos et al.（1986）EMBO J．5：433-44；Voziyanov et al（1999）Nucl. Acids Res.27:930-941）と、リゾルバーゼ/転化酵素属（Hatfull ＆ Grindley （1988）"Resolvases and DNA−invertase：a family of enzymes active in site-specific recombination" In Genetic Recombination, eds. Kucherlipati, R., & Smith, G.R. (Am. Soc. Microbiol., Wachington DC), pp. 357-396）に分類される。本発明のリコンビナーゼ（インテグラーゼ）は、後者のリゾルバーゼ/転化酵素属に属する。【００３４】
「認識配列」とは、本発明で用いるリコンビナーゼ、すなわち黄色ブドウ球菌ファージΦMR11に由来するインテグラーゼ（ΦMR11由来インテグラーゼ）によって認識され、そして該酵素が結合する特異的ポリヌクレオチド配列である。２つの認識配列があり、一つは本来的にファージ・ドナーに由来する認識配列であり「attP」と称される。もう一つはバクテリア・ターゲットに由来する認識配列であり「attB」と称される。各認識部位は、４塩基対からなるコア配列（AATAまたはAACT）を介して分離された左アーム（5'領域）及び右アーム（3'領域）を含む。具体的には、認識配列「attP」は、コア配列（AATA）（「core」という）を中心として、左アーム（5'領域）に約19塩基対の塩基配列(「attP1」という)と右アーム（3'領域）に約17塩基対の塩基配列(「attP2」という)を有する約40塩基対からなる。認識配列「attB」は、コア配列（AATAまたはAACT：：以下、これを総括して「AAYA」ともいう）（core）を中心として、左アーム（5'領域）に約10塩基対の塩基配列(「attB1」という)と右アーム（3'領域）に約11塩基対の塩基配列(「attB2」という)を有する約25塩基対からなる。それゆえ、認識配列「attP」は“attP1-core-attP2”からなり、またattBは“attB1-core-attB2”からなる。本明細書ではいくつかの記載において、「core」の表示を省略し、“attP1-core-attP2”からなる「attP」及び“attB1-core-attB2”からなる「attB」を、それぞれ「attP1/P2」及び「attB1/B2」と記載する。４塩基対からなるコア配列（AAYA）は、切断及び再結合が生じる部位であり、組換えによっても保存される塩基配列（AAYA）である。一方、認識配列「attP」中の「attP1」及び「attP2」、及び認識配列「attB」中の「attB1」及び「attB2」の各部位は、上記コア配列（AAYA）の切断及び再結合によって組み換えられる部位である。それゆえ、本明細書において、認識配列「attP」中の各組換え部位のうち、「attP1」を第１組換え部位、及び「attP2」を第２組換え部位と称し、また認識配列「attB」中の各組換え部位のうち、「attB1」を第３組換え部位、及び「attB2」を第４組換え部位と称する。【００３５】
前記認識配列の間での組み換えによって新たに生じた配列を「組換え配列」と称する。認識配列「attP」〔認識配列（attP1/ P2）〕及び「attB」〔認識配列（attB1/B2）〕との組み換えによって生じた組換え配列（attP1/B2）（正確には“attP1-core-attB2”）、および組換え配列（attB1/ P2）（正確には“attB1-core-attP2”）をそれぞれ組換え配列「attR」及び組換え配列「attL」ともいう。なお、認識配列（attB1/B2）がコア配列として「AACT」を有する場合、コア配列（AATA）を有する認識配列（attP1/ P2）との組み換えによって生じる組換え配列（attP1/B2）のコア配列は「AACA」となり、組換え配列（attB1/ P2）のコア配列は「AATA」となる。【００３６】
（２）部位特異的遺伝子組換え方法
特異的遺伝子組換え方法として、本発明は下記の態様を包含する。
(i) 第１組換え部位（attP1）及び第２組換え部位（attP2）がコア配列を介して接続してなる認識配列（attP1/P2）を有するポリヌクレオチド、
(ii) 第３組換え部位（attB1）及び第４組換え部位（attB2）がコア配列を介して接続してなる認識配列（attB1/B2）を有するポリヌクレオチド、及び
(iii)黄色ブドウ球菌ΦMR11ファージに由来するインテグラーゼ
を組み合わせて、
(iv) 第１組換え部位（attP1）及び第４の組換え部位（attB2）がコア配列を介して接続してなる組換え配列（attP1/B2）を有するポリヌクレオチド、及び
(v) 第３組換え部位（attB1）及び第２の組換え部位（attP2）がコア配列を介して接続してなる組換え配列（attB1/P2）を有するポリヌクレオチドを生成する、
不可逆的部位特異的遺伝子組換え方法。【００３７】
なお、上記認識配列（attP1/P2）を有するポリヌクレオチド(i)（以下、「認識配列(attP1/P2)含有ポリヌクレオチド」ともいう）と認識配列（attB1/B2）を有するポリヌクレオチド(ii)（以下、「認識配列(attB1/B2)含有ポリヌクレオチド」ともいう）とは、認識配列（attP1/P2）及び認識配列（attB1/B2）を単一の塩基配列上に有する同一のDNA分子であってもよいし、またこれらの認識配列をそれぞれ異なる塩基配列上に有する別個のDNA分子であってもよい。【００３８】
また、組換え配列（attP1/B2）を有するポリヌクレオチド(iv)（以下、「組換え配列(attP1/ B2)含有ポリヌクレオチド」ともいう）と組換え配列（attB1/P2）を有するポリヌクレオチド(v)（以下、「組換え配列(attB1/ P2)含有ポリヌクレオチド」ともいう）もまた、組換え配列（attP1/B2）及び組換え配列（attB1/P2）を単一の塩基配列上に有する同一のDNA分子であってもよいし、またこれらの認識配列をそれぞれ異なる塩基配列上に有する別個のDNA分子であってもよい。【００３９】
なお、認識配列(attP1/P2)含有ポリヌクレオチド(i)と認識配列(attB1/B2)含有ポリヌクレオチド(ii)が同一のDNA分子である場合（すなわち、認識配列（attP1/P2）と認識配列（attB1/B2）が単一の塩基配列上に存在する場合）、当該認識配列（attP1/P2）と認識配列（attB1/B2）と間には任意の塩基配列が介在する。また組換え配列(attP1/B2)含有ポリヌクレオチド(iv)と組換え配列(attB1/P2)含有ポリヌクレオチド(v)が同一のDNA分子である場合（すなわち、組換え配列（attP1/B2）と組換え配列（attB1/P2）が単一の塩基配列上に存在する場合）も同様に、当該組換配列（attB1/P2）と認識配列（attB1/P2）と間には任意の塩基配列が介在する。【００４０】
これらのオリゴヌクレオチド〔認識配列(attP1/P2)含有ポリヌクレオチド(i)、認識配列(attB1/B2)含有ポリヌクレオチド(ii)、組換え配列(attP1/B2)含有ポリヌクレオチド(iv)、組換え配列(attB1/P2)含有ポリヌクレオチド(v)〕は、端部を有する直鎖状であってもよいし、また環状であってもよい。これらのオリゴヌクレオチドの形態は任意であって特に制限されない。ゆえに上記オリゴヌクレオチドには、染色体、プラスミド、ベクター、ウイルスゲノム、ミトコンドリアゲノム、葉緑体ゲノムが含まれる。【００４１】
ここで認識配列（attP1/P2）の一例として、例えば配列番号１に記載する40塩基対からなる塩基配列を挙げることができる。当該配列番号１において、1〜19番目の領域が第１組換え部位「attP1」、20〜23番めの領域「AATA」がコア配列、24〜40番目の領域が第２組換え部位「attP2」に該当する。なお、認識配列（attP1/P2）は、配列番号１の塩基配列に限定されず、その配列において１乃至数個の塩基が置換、欠失または付加されてなる塩基配列を有するものであってもよい。一例として、配列番号１の塩基配列において、5'末端から17番目のａ（アデニン）がｃ（シトシン）に置換してなる塩基配列、5'末端から18番目のｔ（チミン）がｇ（グアニン）に置換してなる塩基配列、またはこれら両方が置換してなる塩基配列を挙げることができ、これらはいずれも認識配列（attP1/P2）として機能し得る。なお、これら種々の態様を含めて、後述する配列表の配列番号２に第１組換え部位「attP1」の塩基配列、配列番号３には第２組換え部位「attP2」の塩基配列、および配列番号４にはこれらの組換え部位を含む認識配列（attP1/P2）の塩基配列をそれぞれ示す。なお、配列表中、ｍはアデニンまたはシトシンを、ｋはチミンまたはグアニンを意味する。本発明で単に「第１組換え部位『attP1』」、「第２組換え部位『attP2』」、および「認識配列（attP1/P2）」という場合、これらはそれぞれ上記の配列番号２、３および４に記載する包括的な塩基配列を意味する。【００４２】
また認識配列（attB1/B2）の一例としては配列番号５に記載する25塩基対からなる塩基配列を挙げることができる。当該配列番号５において、1〜10番目の領域が第３組換え部位「attB1」、11〜14番めの領域「AATA」がコア配列、15〜25番目の領域が第４組換え部位「attB2」に該当する。認識配列（attB1/B2）も、配列番号５の塩基配列に限定されず、その配列において１乃至数個の塩基が置換、欠失または付加されてなる塩基配列を有するものであってもよい。その一例として、配列番号５の塩基配列において、5'末端から10番目のａ（アデニン）がｃ（シトシン）に置換してなる塩基配列、5'末端から13番目のｔ（チミン）がｃ（シトシン）に置換してなる塩基配列、5'末端から19番目のａ（アデニン）が t（チミン）に置換してなる塩基配列、5'末端から20番目のt（チミン）がａ（アデニン）に置換してなる塩基配列、またはこれらの２以上が置換してなる塩基配列を挙げることができ、これらはいずれも認識配列（attB1/B2）として機能し得る。なお、これら種々の態様を含めて、後述する配列表の配列番号６には第３組換え部位「attB1」の塩基配列、配列番号７には第４組換え部位「attB2」の塩基配列、および配列番号８にはこれらの組換え部位を含む認識配列（attB1/B2）の塩基配列をそれぞれ示す。なお、配列表中、ｍはアデニンまたはシトシンを、ｙはチミンまたはシトシンを、ｗはチミンまたはアデニンを意味する。本発明で、単に「第３組換え部位『attB1』」、「第４組換え部位『attB2』」、および「認識配列（attB1/B2）」という場合、これらはそれぞれ上記の配列番号６、７および８に記載する包括的な塩基配列を意味する。【００４３】
さらに組換え配列（attP1/B2）としては、例えば認識配列として上記の配列番号１（attP1/P2）及び配列番号５（attB1/B2）に対応するものとして、配列番号９に記載する34塩基対からなる塩基配列を挙げることができる。配列番号９において、1〜19番目の領域が第１組換え部位「attP1」、20〜23番めの領域「AATA」がコア配列、24〜34番目の領域が第４組換え部位「attB2」に該当する。またさらに組換え配列（attB1/P2）としては、例えば認識配列として上記の配列番号１（attP1/P2）及び配列番号５（attB1/B2）に対応するものとして、配列番号１０に記載する31塩基対からなる塩基配列を挙げることができる。配列番号１０において、1〜10番目の領域が第３組換え部位「attB1」、11〜14番めの領域「AATA」がコア配列、15〜31番目の領域が第２組換え部位「attP2」に該当する。なお、組換え配列（attP1/B2）および（attB1/P2）についても、上記配列番号９及び１０に記載される塩基配列に限定されず、前述の認識配列（配列番号１及び５）の欠失、置換または付加体のように、認識配列が有する塩基配列に応じて、各種の塩基配列を有する。なお、これら種々の態様を含めて、後述する配列表の配列番号１１には組換え配列（attP1/B2）の塩基配列を、配列番号１２には組換え配列（attB1/P2）の塩基配列をそれぞれ示す。配列番号１１において、1〜19番目の領域が第１組換え部位「attP1」、20〜23番めの領域「AAYA」がコア配列、24〜34番目の領域が第４組換え部位「attB2」に該当する。配列番号１２において、1〜10番目の領域が第３組換え部位「attB1」、11〜14番めの領域「AATA」がコア配列、15〜31番目の領域が第２組換え部位「attP2」に該当する。本発明で、単に「組換え配列（attP1/B2）」および「組換え配列（attB1/P2）」という場合、これらはそれぞれ上記の配列番号１１および１２に記載する包括的な塩基配列を意味する。【００４４】
部位特異的遺伝子組換えは、一対のDNAの対合から開始される相同的組換えとは異なり、認識配列にリコンビナーゼが結合し、DNA−タンパク質複合体を形成することによって開始される。そこでリコンビナーゼは認識部位に含まれる各組換え部位（認識部位(attP1/P2)には組換え部位「attP1」及び「attP2」が、認識部位(attB1/B2)には組換え部位「attB1」及び「attB2」が含まれる）の間の組み換えを仲介する。二つの認識配列の相対的な位置に応じて、種々の態様の組換えを生じさせることができる。例えば、二つの認識配列が異なるDNA分子（第１DNA分子、第2DNA分子）上に存在している場合は、組換えによって、一つのDNA分子（第1DNA分子）が他方のDNA分子（第2DNA分子）内に組み込まれる。こうすることで、例えば、一方の認識配列を含んでいる標的細胞中の遺伝子（例えば染色体など）に、他方の認識配列を含むポリヌクレオチド（プラスミド等を含む）を組み込むことができる。本発明の方法において用いられるリコンビナーゼ（ΦMR11由来インテグラーゼ）は逆反応を触媒することができないから、その組込みは安定である。従って、本発明のこうした方法は、例えば、プラスミド上に存在している外来DNAを、標的細胞の染色体へ安定に組み込むために有効に用いることができる。【００４５】
また二つの認識配列は、同一のDNA分子上に存在することもできる。この場合に得られる組換え物は、通常、認識配列の相対的な方向性に依存する。例えば、同一方向を向いた2つの認識配列間の組換えは、その2つの認識配列の間にある任意の塩基配列を切り出す結果を生じる。一方、互いに逆方向をむいた2つの認識配列間の組換えは、その2つの認識配列の間にある任意の塩基配列にインバージョン（逆位）が起こるという結果を生じる。上記するように、本発明の方法による組換えは不可逆的であるため、得られた欠失DNA分子または逆位を含むDNA分子は安定である。この方法は、例えば、2つの認識配列の間に位置するプロモーターの交換に使用できる。もしプロモーターが、そのプロモーターによって発現されるべきコード配列に関して最初に反対向きであって、そしてそのプロモーターをフランク（flank）する2つの認識配列がお互いに逆方法に存在する場合、リコンビナーゼの存在下で、2つの認識配列を接触させるとプロモーターの逆位（inversion）が生じ、その結果プロモーターが正しい方向に配位されてコード配列の発現にスイッチが入ることになる。一方、プロモーターが最初に発現のために正しい方向性にあり、2つの認識配列が互いに同じ方向性にある場合は、リコンビナーゼの存在下、2つの認識配列が接触するとこれらの認識配列がプロモーターと接触することにより、プロモーターが切断除去されて、その結果、コード配列の発現が停止されることになる。【００４６】
本発明の方法は、例えば、染色体のトランスロケーションを得るためにも有用である。これは、一つの認識配列が一つの染色体上にあり、そしてその認識配列と共に組み換えの認識配列となるもう一つの認識配列が、別の染色体上に置かれている場合に生じる。その二つの認識配列をリコンビナーゼと接触させると組換えが起こって、2つの染色体アームが交換される結果となる。かかる方法によって、例えば生物の２つの系統を構築することが可能である。そのうちの一つの系統は第一の認識配列を含み、第二の系統は第二の認識配列を含んでいる。これら2つの系統を掛け合わせると、第一と第二の両者の認識配列を含む子孫の系統が得られる。その認識配列をリコンビナーゼと接触させると、染色体アームの交換が起こる。【００４７】
以下に、図面（図１〜５）を参照しながら、本発明の部位特異的遺伝子組換え方法のメカニズムとその応用をより具体的に説明する。なお、図６に図１〜５に示す図柄の意味を示す。図１及び２は、異なるDNA分子上に、認識配列（attP1/P2）と認識配列（attB1/B2）が存在しており〔認識配列（attP1/P2）を有するオリゴヌクレオチド(i)と認識配列（attB1/B2）を有するオリゴヌクレオチド(ii)とが互いに異なるDNA分子である〕、いずれか少なくとも一方が環状のDNA分子であるケースである。図１は、一方だけが環状のDNA分子である場合、図２は両方とも環状のDNA分子である場合である。また図３〜４は、端部を有する同一の直鎖状のDNA分子上に、任意の塩基配列を挟んで認識配列（attP1/P2）と認識配列（attB1/ B2）が存在するケース〔認識配列（attP1/P2）を有するオリゴヌクレオチドと、認識配列（attB1/B2）を有するオリゴヌクレオチドとが、互いに同一のDNA分子であるケース）を示すものである。なかでも図３は、同一の直鎖状DNA分子上に、任意の塩基配列を挟んで認識配列（attP1/P2）と認識配列（attB1/B2）が同方向を向いて存在するケースである。また図４は、同一の直鎖状DNA分子上に、任意の塩基配列を挟んで認識配列（attP1/P2）と認識配列（attB1/B2）が逆方向に向いて存在するケースである。図５は、一つのDNA上に任意の塩基配列を挟んで認識配列（attP1/P2）と認識配列（attB1/B2）とを有する直鎖状のDNA分子が２つあるケースであり、DNA分子に存在する認識配列（attP1/P2）と認識配列（attB1/B2）の順番が、一方のDNA分子ともう一方のDNA分子とで互いに逆になっているケースである。【００４８】
(1) 挿入組換え  （図１及び２）
図１は、異なるDNA分子上に、認識配列（attP1/P2）と認識配列（attB1/B2）が存在するケースのうち、一方が環状のDNA分子であるケースである。なお、図１には認識配列（attP1/P2）を有するオリゴヌクレオチド(i)が環状のDNA分子である場合を示しているが、それに代えて認識配列（attB1/B2）を有するオリゴヌクレオチド(ii)が環状であってもよい。図１において、異なるDNA分子上に位置する認識配列（attP1/P2）及び認識配列（attB1/B2）に結合したリコンビナーゼは、認識配列（attP1/P2）及び認識配列（attB1/B2）が有する各コア配列（AATA）を切断した後、切断により生じた認識配列（attP1/P2）に由来する第１組換え部位（attP1）と第２組換え部位（attP2）を、同様に切断によって生じた認識配列（attB1/B2）に由来する第４組換え部位（attB2）と第３組換え部位（attB1）にそれぞれ結合させる反応、すなわち2つの一本鎖DNA切断再結合反応を触媒する。【００４９】
図１のように、認識配列が異なるDNA分子上にあって、一方が直鎖状のDNA分子（便宜上「第１DNA分子」という）であって、他方が環状のDNA分子（便宜上「第2DNA分子」という）である場合、部位特異的な組換えが起こると、2つの分子は融合して1つの分子となり、その結果、直鎖状のDNA分子（第１DNA分子）内に、当初環状のDNA分子（第2DNA分子）上に存在していた塩基配列が挿入されることになる。【００５０】
図２は、異なるDNA分子上に、認識配列（attP1/P2）と認識配列（attB1/B2）が存在するケースのうち、両方ともが環状のDNA分子であるケースである。図２において、異なるDNA分子上に位置する認識配列（attP1/P2）と認識配列（attB1/B2）に結合したリコンビナーゼは、認識配列（attP1/P2）及び認識配列（attB1/B2）が有する各コア配列（AATA）を切断した後、切断によって生じた認識配列（attP1/P2）に由来する第１組換え部位（attP1）と第２組換え部位（attP2）を、同様に切断によって生じた認識配列（attB1/B2）に由来する第４組換え部位（attB2）と第３組換え部位（attB1）にそれぞれ結合させる反応、すなわち2つの一本鎖DNA切断再結合反応を触媒する。その結果、2つの環状DNA分子は融合して1つの環状DNA分子となる。【００５１】
こうした挿入組換え方法の応用例として、制限されないが、例えば、一方の環状DNA分子に認識配列と所望の遺伝子を組み込んだ遺伝子構築物（例えば、ベクター等）、及びリコンビナーゼ遺伝子とを、予め上記の認識配列と対になる認識領域を導入しておいた染色体（細菌、酵母、植物ゲノムを含む）中に導入し、時期特異的に、及び/又は細胞・部位・組織・臓器特異的にリコンビナーゼを発現させると、所望の遺伝子だけを時期特異的に、及び/又は細胞・部位・組織・臓器特異的に挿入（ノックイン）させることができる。また、一方の環状DNA分子に認識配列、所望の遺伝子及びリコンビナーゼ遺伝子を組み込んだ遺伝子構築物（例えば、ベクター等）を、上記の認識配列と対になる認識領域を導入した細菌、酵母または植物のゲノム中に導入することにより、当該ゲノムの特定部位に上記所望の遺伝子を挿入することができる。【００５２】
(2) 欠失組換え  （図３）
図３は、同一の直鎖状DNA分子上に、任意の塩基配列を挟んで認識配列（attP1/P2）と認識配列（attB1/B2）が同方向を向いて存在するケースである。図３において、同一のDNA分子上に位置する認識配列（attP1/P2）及び認識配列（attB1/B2）に結合したリコンビナーゼは、認識配列（attP1/P2）及び認識配列（attB1/B2）が有する各コア配列（AATA）を切断した後、切断によって生じた認識配列（attP1/P2）に由来する第１組換え部位（attP1）と第２組換え部位（attP2）を、同様に切断によって生じた認識配列（attB1/B2）に由来する第４組換え部位（attB2）と第３組換え部位（attB1）にそれぞれ結合させる反応、すなわち2つの一本鎖DNA切断再結合反応を触媒する。このように2つの認識配列〔認識配列（attP1/P2）及び認識配列（attB1/B2）〕が同一のDNA分子中に同じ方向を向いて存在するときには、部位特異的組換えが起きるとDNAが二つに切断され、直鎖状DNA分子と環状DNA分子がそれぞれ1個ずつ生じ、環状DNA分子に相当するヌクレオチド領域は元のDNA分子から脱落することになる。【００５３】
こうした欠失組換え方法の応用例として、制限されないが、欠失させたい所望の遺伝子（塩基配列）を挟んで認識配列（attP1/P2）及び認識配列（attB1/B2）を本来有するか、または人為的に導入した、例えば細菌、酵母または植物ゲノムなどに、リコンビナーゼ遺伝子を発現し得る遺伝子構築物（例えば、ベクターなど）を導入し、時期特異的に、及び/又は細胞・部位・組織・臓器特異的にリコンビナーゼを発現させることによって、上記所望の遺伝子（塩基配列）だけを時期特異的に、及び/又は細胞・部位・組織・臓器特異的に欠失（ノックアウト）させる方法を例示することができる。【００５４】
(3) 逆位組換え  （図４）
図４は、同一の直鎖状DNA分子上に、任意の塩基配列を挟んで認識配列（attP1/P2）と認識配列（attB1/B2）が逆方向に向いて存在するケースである。図４において、同一のDNA分子上に位置する認識配列（attP1/P2）及び認識配列（attB1/B2）に結合したリコンビナーゼは、認識配列（attP1/P2）と認識配列（attB1/B2）のコア配列（AATA）を切断した後、切断によって生じた認識配列（attP1/P2）に由来する第１組換え部位（attP1）と第２組換え部位（attP2）を、同様に切断によって生じた認識配列（attB1/B2）に由来する第４組換え部位（attB2）と第３組換え部位（attB1）にそれぞれ結合させる反応、すなわち2つの一本鎖DNA切断再結合反応を触媒する。このように任意の塩基配列を挟んで、2つの認識配列が同一のDNA中に互いに逆方向を向いて存在するときには、部位特異的組換えが起きると上記任意の塩基配列の方向が逆転し、一つの直鎖状DNA分子上に、組換え前とは逆向きに任意の塩基配列が組み込まれたDNA分子が生じる。【００５５】
こうした逆位組換え方法は、次に説明するように癌細胞の死滅させる等、臨床に応用することができる。具体的には、例えば、細胞毒性遺伝子の上流部分に2つの認識配列で挟んだ癌特異的プロモーターを逆方向に配置し、これをアデノウイルスベクターにクローニングし、ウイルス産生用細胞（例えば、293細胞）で増殖させ、産生された組換えウイルスを癌細胞に感染させる。これと同時にリコンビナーゼを他のベクターにより同じ癌細胞に導入すると、2つの認識配列で挟まれた癌特異的プロモーターが正方向に逆位されて正常に機能し、結果的に癌細胞を死滅させることができる。【００５６】
(4) 置換（転移）組換え  （図５）
図５は、同一の直鎖状DNA分子上に、任意の塩基配列を挟んで認識配列（attP1/P2）と認識配列（attB1/B2）を同方向に有するDNA分子を2つ用いたケースである。図５に示すように使用する一方のDNA分子（第１DNA分子）は他方のDNA分子（第2DNA分子）と、認識配列（attP1/P2）と認識配列（attB1/B2）の配位順序が逆になっている。そして互いに異なるDNA分子上に位置する認識配列（attP1/P2）及び認識配列（attB1/B2）に結合したリコンビナーゼ（２箇所）は、認識配列（attP1/P2）及び認識配列（attB1/B2）が有するそれぞれのコア配列（AATA）を切断した後、切断によって生じた認識配列（attP1/P2）に由来する第１組換え部位（attP1）と第２組換え部位（attP2）を、同様に切断によって生じた認識配列（attB1/B2）に由来する第４組換え部位（attB2）と第３組換え部位（attB1）にそれぞれ結合させるDNA切断再結合反応を、二本のDNA分子間で触媒する。このケースの場合、二本のDNA分子間で2箇所の部位特異的組換えが起こると、各DNA分子間で、2つの認識配列で挟まれていた任意の塩基配列が入れ替わることになる。【００５７】
こうした置換（転移）組換え方法の応用例として、ベクター上の特定部位に種々の任意遺伝子を、他の煩雑な切断／再結合操作を行うことなく、簡便にクローニングする方法を例示することができる。【００５８】
（３）リコンビナーゼ（ΦMR11由来インテグラーゼ）
上記組換え反応は、リコンビナーゼによって触媒される。【００５９】
上記の方法において好ましくは、リコンビナーゼをコードする遺伝子が、上記いずれかのDNA分子上に位置し、共トランスフェクションされることである。【００６０】
ここでリコンビナーゼは、いくつかのウイルスや細菌に存在する酵素であり、エンンドヌクレアーゼ特性及びリガーゼ特性の両方を有する酵素として特徴付けられている。より具体的には、少なくとの下記４つの活性を有する部位特異的リコンビナーゼである（Sauer, B., Current Oponions in Biotechnology 5:521-527 (1994)）：
(i) １つ又は２つの特異的DNA配列を認識する
(ii) 前記DNA配列（１又は複数）の切断
(iii)鎖交換に関与するDNAトポイソメラーゼ活性
(iv)切断されたDNA鎖の再封鎖を行うリガーゼ活性。【００６１】
なお、ここで鎖交換機構は、特異的DNA配列の切断と再結合の両方の機構を含む（Landy，a．，(1989) Ann. Rev. Biochem. 58, 913-949）。【００６２】
かかる特性を有するリコンビナーゼは、DNA中の特異的な塩基配列を認識し、そしてそれらのセグメントに隣接するDNAセグメントを交換することが知られている（例えば、Landy, A., Current Opinion in Biotechnology 3; 699-707 (1993)等）。種々の生物に由来する多数の部位特異的リコンビナーゼが知られているが、その多くはインテグラーゼファミリーに属するものである（Argo et al., EMBO J. 5: 433-440 (1960)）。これらの中で最も良く研究されているものは、バクテリオファージλ由来のインテグラーゼ／att系（例えば、Landy, A., Current Opinion in Biotechnology 3; 699-707 (1993)等）、バクテリオファージP1由来のCre/loxP系（Hoess 及びAbremski (1990) Nucreic Acids and Molecular Biology, No.4, Eckstein and Lilley 編, Berlin-Heidelberg: Springer-Verlag; 90-109）及びSaccharomyces serevisiae 2μ環状プラスミド由来のFLP/frt系（Broachら、Cell 29; 227-234 (1982)）である。【００６３】
本発明の方法で用いられるリコンビナーゼは、本来的な機能としてファージゲノムを黄色ブドウ球菌の染色体への組み込みを媒介する作用を有する、黄色ブドウ球菌ファージΦMR11に由来するインテグラーゼ（以下、「ΦMR11由来インテグラーゼ」という）であり、これはインテグラーゼファミリーの中のリゾルバーゼ/転化酵素属に属する。本発明のΦMR11由来インテグラーゼは、ファージΦMR11上のattP部位（attP1/P2部位）（約40bp）を黄色ブドウ球菌のゲノム上のattB部位（attB1/B2部位）（約25bp）と組み換えて、attL部位（attB1/P2）（約31bp）及びattR部位（attP1/B2）（約34bp）によって隣接された、組み込まれたファージゲノムを生成するように作用する。この反応は本質的に不可逆的である。ΦMR11由来インテグラーゼによって媒介されるこの組換え反応は、インビトロでは単純な緩衝液中で生じる。かかる緩衝液条件としては特に制限されないが、一例を挙げると20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、100 mM NaCl、１％  glycerolおよび0.1 mM EDTA・2Naを含む水溶液を挙げることができる。【００６４】
しかるに本発明は、上記本発明の部位特異的遺伝子組換えを触媒するリコンビナーゼとして、上記ΦMR11由来インテグラーゼを提供する。さらにその遺伝子として当該ΦMR11由来インテグラーゼをコードするポリヌクレオチド（ΦMR11由来インテグラーゼ遺伝子）を提供する。【００６５】
ΦMR11由来インテグラーゼとして、特に好適には配列表：配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。しかし、本発明のΦMR11由来インテグラーゼは、かかる特定のアミノ酸配列を有するものに制限されず、その機能的同等物であってもよい。ここで機能的同等物としては、配列番号１４に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸配列が欠失、置換または付加してなるアミノ酸配列を有し、認識配列（attP1/P2）（配列番号４）及び認識配列（attB1/B2）（配列番号８）を認識して組換え配列（attP1/B2）（配列番号１１）及び組換え配列（attB1/P2）（配列番号１２）を生じるリコンビナーゼ活性を有するものである。機能的同等物としてより好ましくは、配列番号１４に示すアミノ酸配列とアミノ酸配列において５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、更により好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有し、上記特性を有するタンパク質を挙げることができる。なお、２つの配列における配列同一性は、配列間での同一である部位数の全部位（全アミノ酸）数に対する百分率で示される。【００６６】
上記の原理に従い、２つのアミノ酸配列における配列同一性は、Karlin および Altschul のアルゴリズム(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990およびProc. Natl.Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)により、決定することができる。このようなアルゴリズムを用いたプログラムとしては、BLASTプログラム (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)、及び当該BLASTより感度良く配列同一性を決定することのできるGapped BLASTプログラム (Nucleic Acids Res.25:3389-3402, 1997)を挙げることができる。これらのプログラムは、例えば米国National Center for Biotechnology Informationのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。【００６７】
表１に、本発明のΦMR11由来インテグラーゼと他のファージに由来する公知のインテグラーゼのアミノ酸配列を比較した結果を示す（BLAST database search、analysis with Genetyx-Mac v.11）。【００６８】
【表１】
2006041096.tif 000002
【００６９】
尚、表中「相同性/アミノ酸残基数」は、コンピューターによる相同性検索において、対象のインテグラーゼのアミノ酸配列とΦMR11ファージ由来のインテグラーゼのアミノ酸配列との間で、最も相同性が高くなるアミノ酸領域〔この領域のアミノ酸数が上記「相同性/アミノ酸残基数」でいう「アミノ酸残基数」にあたる〕における相同性（％）（同一性）を意味する。【００７０】
これらのインテグラーゼはいずれも部位特異的リコンビナーゼ活性を有するものであるが、表１に示すように本発明で用いるΦMR11由来インテグラーゼは、これら公知のインテグラーゼとアミノ酸配列において35％以下の同一性しかなく、新規な酵素である。【００７１】
また、本発明のΦMR11由来インテグラーゼには、配列表：配列番号１３で示される塩基配列からなるDNAによってコードされるタンパク質、並びにその機能的同等物が含まれる。ここで機能的同等物としては、配列番号１３で示される塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ（ホモログ）によってコードされるタンパク質であって、且つ前述する認識配列（attP1/P2）及び認識配列（attB1/B2）を認識して組換え配列（attP1/B2）及び組換え配列（attB1/P2）を生じるリコンビナーゼ活性を有するものである。。【００７２】
なお、ここで配列番号１３に示される塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズする「ストリンジェントな条件」は、Berger and Kimmel (1987, Guide  to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol.152, Academic Press,San Diego CA)に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えば、ハイブリダイズ後の洗浄条件（いわゆるこれが「ストリンジェントな条件」）として、通常「5×SSC、0.1％SDS、30℃」程度の条件を挙げることができる。かかる条件で洗浄しても、上記配列番号１３に示される塩基配列の相補鎖とハイブリダイズ状態を維持するものは、上記本発明でいうホモログに含まれる。特に制限されないが、厳しいハイブリダイズ条件（ストリンジェントな条件）として「5×SSC、0.1％SDS、45℃」程度、より厳しいハイブリダイズ条件（ストリンジェントな条件）として「1×SSC、0.1％SDS、45℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。斯くして得られるホモログは、配列番号１３に示される塩基配列と少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは８５％以上、さらに一層好ましくは９０％以上、とりわけ９５％以上の同一性を有するものである。【００７３】
例えば、配列番号１３で示される塩基配列からなるDNAのホモログとして、配列番号１４のアミノ酸配列を有するΦMR11由来インテグラーゼと同一のタンパク質をコードするコドンであって、ヒトのcDNAで最も利用頻度の高いコドンに改変されたものを例示することができる。こうすることによって、本発明のΦMR11由来インテグラーゼの哺乳類での発現効率を上げることができる。具体的には、使用されるコドンとしては以下のものが例示できる（括弧内は、バクテリオフージP1で最も使用頻度が高いコドンを示している）。
Ala:GCC(GCT),Arg:CGC(CGC),Asn:AAC(AAT),Asp:GAC(GAT),Cys:TGC(TGT),Gln:CAG(CAG),Glu:GAG(GAA),Gly:GGC(GGT),His:CAC(CAT),Ile:ATC(ATT),Leu:CTG(CTG),Lys:AAG(AAA),Pro:CCC(CCT),Phe:TTC(TTT),Ser:AGC(TCA),Thr:ACC(ACA),Tyr:TAC(TAT),Val:GTG(GTT)
なお、MetとTrpは、1種類のコドンのみによってコードされているので改変されていない。【００７４】
このように、本発明のΦMR11由来インテグラーゼ遺伝子には、配列番号１３の塩基配列からなるポリヌクレオチドのみならず、各種哺乳類への使用に適するように若干の改変を加えたポリヌクレオチドも含まれる。【００７５】
本発明のΦMR11由来インテグラーゼは、本発明で開示するアミノ酸配列に基づいて化学的または遺伝子工学的手法によって製造することができる。遺伝子工学的手法による製造方法の詳細については、後述する。また、アミノ酸配列における改変は、当業界において既に公知な方法、例えば部位特異的変異導入法（Current Protocols I molecular Biology edit. Ausubel et al.,(1987) Publish, John Wily & Sons Section 8.1-8.5)等を用いて、改変しようとするアミノ酸配列に、適宜、置換、欠失、挿入、付加などの変異を導入することによって行うことができる。【００７６】
いくつかの態様において、認識配列に加えて、リコンビナーゼとしてΦMR11由来インテグラーゼをコードするポリヌクレオチド・コンストラクトが標的細胞に導入される。ΦMR11由来インテグラーゼをコードしているポリペプチドは、一つ又は複数の認識配列として同一の核酸上に含まれることが可能であり、また別個の核酸として細胞内へ導入されることも可能である。ゆえに本発明は認識配列を含む核酸のみならず、その核酸内においてΦMR11由来インテグラーゼをコードしているポリヌクレオチド配列が標的細胞内において機能しているプロモーターに作用可能に結合しているポリヌクレオチドもまた提供する。【００７７】
さらに本発明は、ΦMR11由来インテグラーゼ遺伝子を含有する組み換えベクターを提供する。当該組み換えベクターは、ΦMR11由来インテグラーゼ遺伝子を、所望の宿主細胞内で発現可能な状態で含んでおり、当該宿主細胞を形質転換するために使用される。ゆえに、本発明の組み換えベクターは、かかる宿主細胞の形質転換が達成できる形態を有するものであればよく、例えばプラスミド、バクテリオファージ、レトロトランスポゾンの形態を有するものであってもよい。【００７８】
本発明の組み換えベクター（発現ベクター）は、宿主として大腸菌（E. coli）や枯草菌（B. subtilis）などの細菌を使用する場合、一般に、少なくともプロモーター−オペレーター領域（プロモーター、オペレーター及びリボゾーム結合領域（SD領域）を含む）、開始コドン、本発明のΦMR11インテグラーゼをコードするＤＮＡ、終止コドン、ターミネーター領域、及び複製可能単位を有する。また、酵母等の真菌細胞または動物細胞を宿主細胞として用いる場合は、一般に、少なくともプロモーター、開始コドン、シグナルペプチド及び本発明のΦMR11由来インテグラーゼをコードするＤＮＡ、及び終止コドンを有する。また、本発明の組み換えベクター（発現ベクター）は、必要に応じて、エンハンサーなどのシスエレメント、本発明のΦMR11由来インテグラーゼをコードするＤＮＡの5'側または3'側の非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、複製可能単位、相同領域、選択マーカーを含むことができる。これらのエレメントは、本発明のΦMR11由来インテグラーゼをコードする遺伝子の発現に用いられる宿主に対応したものであれば、特に制限されず、当業界の技術常識に基づいて選択することができる。【００７９】
なお、選択マーカーとしては、特に制限されず、例えば遺伝子発現に使用される宿主が細菌の場合は、薬剤抵抗性遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、シクロヘキシミド耐性遺伝子、テトラマイシン耐性遺伝子など）、宿主が細菌以外の例えば酵母などの場合は、栄養要求性遺伝子（例えば、ＨＩＳ４、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＡＲＧ４など）などを始めとする公知の各種選択マーカーを利用することができる。【００８０】
プロモーターとしては、好適には誘導性プロモーターを挙げることができる。誘導性プロモーターは、栄養素、ホルモン、基質、温度、電磁波、酸化的ストレス等の種々の物質ないし刺激によって遺伝子の発現を誘導するものが多数知られている。よって、当業者であれば、目的に応じて、容易に適切な誘導性プロモーターを選択することができる。なお、誘導性プロモーターを連結させる場合には、ΦMR11インテグラーゼ遺伝子を発現させたい部位及び/又は時期に特異的に存在する物質によって誘導されるプロモーターを用いることが好ましい。【００８１】
本発明の組み換えベクター（発現ベクター）は、簡便には、上記本発明のΦMR11インテグラーゼをコードするＤＮＡを、公知の発現用ベクターに、目的のΦMR11インテグラーゼが発現可能な状態で導入することによって、具体的にはプロモーターの下流に導入することによって作成することができる。かかる導入は、ＤＮＡ組み換えの一般的な方法、例えばMolecular Cloning. (1989). (Cold Spring Harbor Lab.)に記載される方法に従って行うことができる。【００８２】
発現用ベクターとしては、プラスミドベクターとして、例えばpRS413、pRS415、pRS416、YCp50、pAUR112またはpAUR123などのYCp型大腸菌（E.coli）-酵母シャトルベクター；pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pAUR101またはpAUR135などのYIp型大腸菌（E.coli）-酵母シャトルベクター；大腸菌（E. coli）由来のプラスミド（例えばpBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC119、pTV118N、pTV119N、pBluescript、pHSG298、pHSG396またはpTrc99AなどのColE系プラスミド；pACYC177またはpACYC184などのp1A系プラスミド；pMW118、pMW119、pMW218またはpMW219などのpSC101系プラスミドなど）；枯草菌（B.subtilis）由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5など）；pHSP64などの大腸菌（E. coli）-枯草菌（B. subtilis）シャトルベクターを挙げることができる。またファージベクターとして、λファージ（Charon 4A, Charon21A, EMBL4, λgt100, gt11, zap）、ψX174、M13mp18、M13mp19などを挙げることができる。レトロトランスポゾンとしてはTy因子などを挙げることができる。また、融合タンパク質として発現する発現ベクター、例えばpGEXシリーズ（ファルマシア製）、pMALシリーズ（Biolabs社製）を使用することもできる。【００８３】
上記ベクターは、本発明のΦMR11由来インテグラーゼ遺伝子を含むポリヌクレオチドを、臓器、組織、又は細胞に導入するために使用される。さらに本発明には、本発明のΦMR11インテグラーゼ遺伝子を含むポリヌクレオチドを導入した形質転換体（例えば細胞、臓器、組織）も含まれる。細胞、臓器、組織の中にポリヌクレオチドを導入する方法としては、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、リピッド法、マイクロインジェクション法、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、コンピテント細胞法など、導入する宿主細胞の種類や組み換えベクターの形態に応じて、適宜選択することができる。【００８４】
ポリヌクレオチドを導入する宿主細胞としては、大腸菌（E. coli）や枯草菌(B. subtilis)などの細菌、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomycescerevisiae）、サッカロマイセス・ポンベ（Saccharomyces pombe）、ピヒア・パストリス（Pichiapastoris）などの酵母、sf9やsf21などの昆虫細胞、COS細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、肝細胞、膵細胞、卵細胞、受精卵、及び胚性幹細胞などの動物細胞、タバコなどの植物細胞を挙げることができる。好ましくは、大腸菌や枯草菌などの細菌、酵母、及び動植物などの樹立細胞である。【００８５】
なお、発現ベクターの宿主細胞内での存在様式は、特に制限されず、染色体中に挿入されて、あるいは置換されて組み込まれてもよいし、またプラスミド状態で存在していてもよい。【００８６】
前述する本発明の組換え法を実施するために、上記ΦMR11由来インテグラーゼは、そのままタンパク質の状態で用いることもできるが、好ましくは、組換え反応を望む場所（例えば細胞内）で発現するように（場合によっては所望の時間的または場所的なコントロール下で）用いられる。組換え反応を望む場所でΦMR11由来インテグラーゼを発現させるためには、ΦMR11由来インテグラーゼ遺伝子を含む、例えば上記のベクターを組換え反応を望む場所に導入することによって行うことができる。【００８７】
また、本発明の方法は、任意の型の真核細胞において、DNA の安定した組み込み及び／又は転位（rearrangement）を得るために有効に利用することができる。例えば、本発明の方法は動物、植物、カビ、細菌、及び他の微生物の細胞において有用である。これらの細胞は多細胞生物、例えば形質転換植物又は動物等の一部分であることができる。本発明の方法は、コムギやトウモロコシ等の植物、及び動物の様な、形質転換した材料を得ることが困難である場合に特に有用である。かかる場合、まれにしかない単一コピー挿入物を見出すには、独立して得られた多数の形質転換したクローンを前もって得ることが必要となるが、それは非常に多くの労力がかかるからである。【００８８】
本発明の方法は、標的細胞内に外来DNAを導入するためにも有用である。当該外来DNAは、ポリヌクレオチド・コンストラクト（またはベクター）として標的細胞内に導入できるが、当該ポリヌクレオチド・コンストラクトは、一つ又は複数の認識配列に加えて、望まれる形質型を当該標的細胞に与え得る遺伝子又は機能的な配列を含むことができる。典型的には、これらの細胞に導入されるコンストラクトは、組換え発現技術を用いて調製される。標的細胞中へ取り込まれるために使用されるポリヌクレオチド・コンストラクト及び／又はベクターは、好ましくは選択可能なマーカーを含むことができる。かかるマーカーによって、目的のポリヌクレオチドを含んでいる細胞のコロニーを選択することができる。これらのマーカーとしては当業界で選択マーカーとして汎用されているマーカーを同様に使用することができる。【００８９】
認識配列を含むポリヌクレオチド・コンストラクトは、標的細胞及び／又は標的生物に、当業者に知られている任意の手段を用いて導入することができる。なお、外来DNA が正確に細胞内に組み込まれたかどうかは、当業者に良く知られている方法で分析することができる。例えば形質転換した細胞からDNAを抽出し、一つ又はそれ以上の制限酵素によってそのDNAを消化し、そしてポリヌクレオチド・コンストラクトのラベル化された断片をハイブリダイズさせる方法を挙げることができる。また挿入された配列をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて同定することもまた可能である。【００９０】
また、本発明の方法は、形質転換したキメラ型の多細胞生物（植物、動物）を得るために有効に利用することができるる。形質転換したキメラ型の生物を得るための方法は、植物と動物の両者について当業者に良く知られている。【００９１】
本発明の組換え方法によって得られた植物細胞は培養され、形質転換した遺伝子型及びそのために望みの表現型を有している完全な植物が再生される。その様な再生技術は、特定の植物ホルモンを配合した組織培養成長培地を用いることによって行うことができる。典型的には所望の塩基配列と共に植物細胞に導入された殺生剤及び／又は除草剤マーカーに依る。培養されたプロトプラストからの植物再生は、Evans et al.,Protoplast Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture （プロトプラストの単離及び培養、植物細胞培養のハンドブック）,pp.124-176, Macmillian Publishing Company, New York (1983);及びその結びつきで、Regeneration of Plants, Plant Protoplast（植物、植物プロトプラストの再生）,pp.21-73,CRC Press, Boca Raton,(1985)において述べられている。植物カルス、外植片、体細胞胚（Dandekar et al.,J.Tissue Cult.Meth.,12:145 (1989); MacGranahan et al.,Plant Cell Rep.,8:512 (1990)）、器官、又はその一部分からもまた再生することができる。その様な再生技術は一般的にKlee et al.,Ann.Rev.of Plant Phys., 38: 467-486 (1987)において述べられている。【００９２】
またこの方法は、キメラ型の脊椎動物を作製するのにも有効に利用できる。かかる動物には、限定されるものではないが、マウス及びラットの様なゲッシ類、ウサギ、ヒツジやヤギの様なヒツジ類（ovines）、ブタの様なブタ類（porcines）、ウシ（cattle）やバッファローの様なウシ類（bovine）を含む、非ヒト哺乳類が含まれる。形質転換動物を得る方法は、例えば、Puhler,A.,Ed.,Genetic Engineering of Animals（動物の遺伝工学）VCH Publ.,1993; Murphy and Carter, Eds.,Transgenesis Techniques:Principles and Protocols（形質転換技術：原理とプロトコール）（Methods in Molecular Biology, Vol.18）,1993;及びPinkert,CA,Ed.,Transgenic Animal Technology:A Laboratory Handbook （形質転換動物の技術工学：実験室ハンドブック）,Academic Press,1994において述べられている。【００９３】
そのゲノム中に特異的な修飾を有する、形質転換した又はキメラ型の動物を得る一つの方法は、受精した卵母細胞を目的のポリヌクレオチドを認識配列に隣接して含んでいるベクターと接触させることである。マウスの様ないくつかの動物についてインビボで受精が行われ、受精した卵子は手術により体内に移すことができる。他の動物、特にウシにおいては、生きた又は屠殺された動物から卵子を移して来て、そしてその卵子をインビトロで受精させることができる。インビトロで受精させることにより、実質的に同調した細胞に導入すべき修飾を行うことができる。そして、着床前の胚が約16-150個の細胞を含むようになるまで受精した卵母細胞をインビトロで培養する。【００９４】
受精した卵母細胞を着床前の段階まで培養するための方法は、Gordon et al.(1984) Methods Enzymol.101:414; Hogan et al. Manipulation of the Mouse Embryo:A Laboartory Manual（マウス胚の操作：実験室マニュアル）C.S.H.L. N.Y.(1986) （マウス胚）; Hammer et al.(1985) Nature 315:680（ウサギ及びブタ胚）;Gandolfi et al.(1987) J.Reprod.Fert.81:23-28;Rexroad et al.(1988) J.Anim.Sci.66:947-953（ヒツジ胚）及びEyestone et al.(1989) J.Reprod.Fert.85:715-720; Camous et al.(1984) J.Reprod.Fert.72:779-785及びHeyman et al.(1987) Theriogenology 27:5968（ウシ胚）において述べられている。【００９５】
また本方法を用いて、所望の外来性ポリヌクレオチドの単一コピーを有する胚幹細胞（ES）を得ることができる。これらの細胞は、インビトロで培養された着床前の胚から得ることができる（例えば、Hooper,ML,Embryonal Stem Cells:Introducing Planned Changes into the Animal Germline （胚性幹細胞；計画された変化の動物生殖系列への導入）(Modern Genetics,v.1) Int'1.Pub.Distrib.,Inc.,1993; Bradley et al.(1984) Nature 309,255-258 など）。形質転換したES細胞を非ヒト動物由来の胞胚と結合させる。ES細胞は胚をコロナイズし、いくつかの胚においてキメラ動物の生殖系列が形成される（Jaenisch,Science,240:1468-1474 (1988)）。代わりに、生物を再構成することができるES細胞又は体細胞（"体細胞再集団細胞：somatic repopulating cells"）を、形質転換した哺乳動物を生み出す、除核された受精卵母細胞へ着床させるための核の起源として使用することもできる（例えば、Wilmut et al.(1997) Nature 385:810-813）。【００９６】
本発明の方法は、またクローニングにおいても有効に利用することができる。【００９７】
DNAクローニングは、遺伝子組換え技術において汎用されている技術であり、例えば大きなDNAやRNA中の所望の断片を、公知のベクター（例えばpUC、pGem、pBlueScriptなど）に組み込んだり、これらのDNA断片の機能等を確認・分析するために特殊なベクターに組み込んむためなどの使用される（サブクローニング）。クローニングの代表的なプロトコルとしては次のものを挙げることができる。【００９８】
(1) 目的のDNAを１または２の制限酵素で消化し、
(2) 目的のDNA断片をゲル精製し、
(3) 適当な制限酵素を用いて切断、アルカリファスファターゼ処理、及びゲル精製などの処理によってベクターを調製し、
(4) 上記目的のDNA断片をベクターに連結し、
(5) 得られた組換えベクターを宿主細胞中に導入して形質転換体を作成し、
(6) 得られた形質転換体を培養して、
(7) 所望の物（例えばプラスミド、DNA、DNA発現産物等）を採取する。【００９９】
上記クローニング技術における本発明方法の利用例として下記の態様を例示することができる
(i) PCRのための新たなプライマー部位の作成
(ii)制限酵素または他のDNA修飾酵素、化学物質、またはリボザイム等によって作用される塩基配列の作成
(iii) DNA結合タンパク質、RNA、DNA、化学物質などによって認識される塩基配列の作成
(iv)ランダム化され、そしてcDNA由来のRNAライブラリーを用いることによる、エプスタインバールウイルスに発現されるRNAに会合するリボゾームL22タンパク質についてのRNAリガンドのインビトロ選択
(v) 塩基配列の方向または配置が活性に影響する機能性エレメントにおける、塩基配列の方向または配置の調整
(vi)  分子のサイズまたは他の物理的性質を有する所望の産物の選択
(vii) 特異的修飾など、同定を可能にするために必要な塩基配列の生成。【０１００】
この他の実施態様は、当該分野において公知の事実を組み合わせて、本明細書による教示から当業者であれば容易に理解することができる。【０１０１】
（４）クローニングキット
さらに本発明は、本明細書に記載する本発明の方法を利用したクローニングを容易に実施するために好適に使用することできるキットを提供する。【０１０２】
一態様として、１つ以上の容器に、同一または異なった成分として、下記の成分を含むキットを挙げることができる：
1)  認識配列（attP1/P2）を有するポリヌクレオチド(i)、及び／又は
2)  認識配列（attB1/B2）を有するポリヌクレオチド(ii)、及び
3)  黄色ブドウ球菌ΦMR11ファージに由来するインテグラーゼ（ΦMR11由来インテグラーゼ）、ΦMR11由来インテグラーゼをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、ΦMR11由来インテグラーゼをコードする遺伝子を発現可能な状態で有する組換えベクター、及びΦMR11由来インテグラーゼを発現し得る細胞の中から選択される少なくとも１つ。【０１０３】
なお、ここでいう細胞は、本来的にΦMR11由来インテグラーゼを発現することのできる細胞（すなわち黄色ブドウ球菌ΦMR11ファージ）であっても、遺伝子組換えによってΦMR11由来インテグラーゼ遺伝子を発現可能に含む細胞（形質転換体）であってもよい。【０１０４】
また、認識配列（attP1/P2）を有するポリヌクレオチド(i)、及び認識配列（attB1/B2）を有するポリヌクレオチド(ii)は、プラスミド、ファージ、ベクター、染色体、ウイルスゲノム、ミトコンドリアゲノム等の形態を有するDNA分子であることができる。また、認識配列（attP1/P2）を有するポリヌクレオチド(i)、及び認識配列（attB1/B2）を有するポリヌクレオチド(ii)は、別個異なるDNA分子であってもよいし、また単一の塩基配列上に、認識配列（attP1/P2）と認識配列（attB1/B2）の両方を有する同一のDNA分子であることもできる。さらに、認識配列（attP1/P2）を有するポリヌクレオチド(i)、または認識配列（attB1/B2）を有するポリヌクレオチド(ii)の少なくとも１方は、認識配列と共に、ΦMR11由来インテグラーゼをコードする塩基配列を含んでいてもよい。
【実施例】
【０１０５】
実施例１    黄色ブドウ球菌ΦMR11ファージ由来インテグラーゼ, attP, およびattBシステムによるヒト細胞内での部位特異的ＤＮＡ組換え
（１）本発明者らは、先に、ファージ療法を目的として、黄色ブドウ球菌MR11株をマイトマイシンC（1μg/ml）で誘発することによって、新規の黄色ブドウ球菌ΦMR11ファージ（以下、単に「ファージΦMR11」ともいう）を分離し取得することに成功している（The Journal of Infectious Deseases, 2003, 187, 613-24）。このファージΦMR11（Siphoviriae, morphotype B1）の詳細な性状とともにゲノム全塩基配列（43,011bp、二本鎖環状DNA）を解読したところ、少なくとも67個のopen reading frame（ORF）が予想された。各ORFについて、各々アミノ酸配列をデータベース上で相同性検索したところ、ORF1にコードされる遺伝子産物（蛋白質）（以下、「ΦMR11-Gp1」ともいう）がインテグラーゼの機能ドメインを有する「インテグラーゼ遺伝子」と推定された（図７）。このORF1（ΦMR11由来インテグラーゼ遺伝子）の塩基配列及びそこから演繹されるアミノ酸配列をそれぞれ図８（ａ）及び図８（ｂ）にそれぞれ示す。この蛋白質「ΦMR11-Gp1」（ΦMR11由来インテグラーゼ）のアミノ酸配列を、他のファージに由来する公知のインテグラーゼのアミノ酸配列と比べたところ、いずれの配列ともかなり異なっていた（表１、及び図９参照）。最も相同性の高い枯草菌ファージΦ105のインテグラーゼのアミノ酸配列とも約35％の同一性（BLAST database search, analysis with Genetyx-Mac v.11）しか認められず、「ΦMR11-Gp1」（ΦMR11由来インテグラーゼ）は新規でユニークな酵素であると考えられた。また、Protein-protein BLAST Searchの結果、「ΦMR11-Gp1」（ΦMR11由来インテグラーゼ）は、resolvase／invertase（serine recombinase）ファミリーに属することがわかった。【０１０６】
（２）インテグラーゼ（リコンビナーゼ）は、２つまたはそれ以上の認識配列間での組換えを触媒する酵素である。そこで、「ΦMR11-Gp1」（ΦMR11由来インテグラーゼ）が、組換えの際に認識する塩基配列（attP、attB）を特定するため、ファージΦMR11の本来の溶原化黄色ブドウ球菌MR11株及び人為的にΦMR11ファージを溶原化させた黄色ブドウ球菌株SA37/ΦMR11株のゲノムの各々について、ΦMR11ゲノムの挿入部位における塩基配列を解析した。その結果、「ΦMR11-Gp1」（ΦMR11由来インテグラーゼ）遺伝子の約30塩基下流部分に、認識部位（attP）「gaactacgaacagttcattaatacgaagtgtacaaacttc」（配列番号１）（コア配列「aata」を介して左アーム（5'領域）「attP1」と右アーム（3'領域）「attB2」からなる：認識部位「attP1/P2」）を含む塩基配列が、また黄色ブドウ球菌染色体の水銀還元酵素遺伝子内（遺伝子開始塩基から約250塩基の付近）に、認識部位（attB）「cacttgtataaatataggatgtata」（配列番号５）（コア配列「aata」を介して左アーム（5'領域）「attB1」と右アーム（3'領域）「attB2」からなる：認識部位「attB1/B2」）を含む塩基配列が存在することが明らかになった（図７参照）。【０１０７】
（３）プラスミドDNAの調製
「ΦMR11-Gp1」（ΦMR11由来インテグラーゼ）の遺伝子（配列番号１３）を、ベクターpSG5（4.1-kb eukaryotic expression vector：STRATAGENE）のSV40プロモーターの下流にクローニングしてブラスミドを作成し〔Integrase発現プラスミド：plasmid A（pSG5-SVneoRES1）〕、これを大腸菌STBL2株に導入した。組換え認識部位「attP」を含む種々の長さ（32bp〜68bp）の塩基配列をPCR増幅によって調製し、ベクターpUC18の「EcoRI/BamHI」部位に挿入し〔attPプラスミド: plasmid B（pUC18/attP68〜32）〕、大腸菌DH5a株に導入した。また、組換え認識部位「attB」についても、その部位を含む塩基配列（40bp）をPCR増幅によって調製し、ベクターpACYC184の「BamHI」部位に挿入し〔attBプラスミド: plasmid C（pACYC184/attB40）〕、大腸菌DH5a株に導入した。【０１０８】
これらの大腸菌を培地に播いて（Integrase発現プラスミドまたはattPプラスミドを保有する大腸菌については100μg/mlアンピシリン含有TB培地使用。attBプラスミドを保有する大腸菌については50μg/mlクロラムフェニコール含有TB培地使用）、培養増殖させた（大腸菌STBL2は30℃、大腸菌DH5aは37℃使用）。増殖後、培地からプラスミドDNA（以下、plasmid A 由来のDNAを「pSG5-Int」、plasmid B 由来のDNAを「pUC18-attP」、plasmid C 由来のDNAを「pACYC184-attB」と称する）を抽出し、CsCl密度勾配超遠心法（300,000×g、室温、16時間）で精製した。【０１０９】
（４）HeLa細胞へのトランスフェクション
予めDULBECCO(modified)培地において、37℃で増殖させておいたHeLa細胞に、上記の精製プラスミドDNA（pSG5-Int、pUC18-attP、及びpACYC184-attBの少なくとも１つ）とLipofectamineを混合し、３時間反応させた。その後、細胞をリン酸緩衝液で洗浄して、新鮮なDULBECCO(modified)培地と置換して２日間培養を継続した（トランスフェクタント）。次いで、トリプシン処理を行い細胞を浮遊させ、リン酸緩衝液で洗浄した後、ProteinaseKを作用させて、細胞を破壊してDNAを遊離させた。【０１１０】
（５）ウエスタンブロット法によるインテグラーゼの検出
上記で調製したトランスフェクタント（細胞）について、各細胞内で発現産生しているタンパク質をSDS-sample bufferで可溶化し、それらをSDS-ポリアクリルアミド(12.5%) 電気泳動により分離後、PVDF膜に電気的に転写した。そのPVDF膜を１次抗体として抗インテグラーゼ−ウサギ抗血清で処理し、2次抗体として抗ウサギIgGヤギIgG-Peroxidaseを使用し、発色法によりインテグラーゼを検出した（ウェスタンブロット法）。その結果、pSG5-Intのトランスフェクタントに インテグラーゼが発現していることが確認された。【０１１１】
（６）組換えDNAの検出
attPプラスミドのpUC18ベクターのattP1上流域（正方向）とattBプラスミドのpACYC184ベクターのattB2下流域（逆方向）の塩基配列を基に、プライマーを作成した〔184-P1プライマー：5'-GTCCTGCTCGCTTCGCTACTTG-3'（配列番号１５）、M4プライマー：5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'（配列番号１６）〕。これらのプライマーの組み合わせでは、attPとattB間で組み合わせが起こった時のみ増幅が起こる。このため、増幅の有無、PCR産物のサイズ、及びその塩基配列から、組換えを検出することができる。【０１１２】
このPCR法を用いて組換えの有無を調べたところ、HeLa細胞に、プラスミドDNAとしてpUC18-attP、及びpACYC184-attBのみを使用してトランスフェクションしても組換えは生じず、これらに加えて（５）でインテグラーゼの発現が確認されたpSG5-Intを共存させることによって初めて組換えが生じることがわかった。このことから、「ΦMR11-Gp1」（ΦMR11由来インテグラーゼ）は実際にヒトの細胞（HeLa細胞）において部位特異的DNA組換え機能を有することが確認された。【０１１３】
なお、上記の実験では、「attP」として配列番号１に記載する40bpの塩基配列を含む42〜68bp、及び「attB」として配列番号５に記載する25bpの塩基配列を含む40bpを使用したが、「attP」及び「attB」を含む配列の塩基数を順次絞り込むことによって、認識配列「attP」として機能する最小単位が、「gaactacgaacagttcattaatacgaagtgtacaaacttc」（配列番号１）（コア配列「aata」を介して左アーム（5'領域）「attP1」と右アーム（3'領域）「attB2」からなる：認識配列「attP1/P2」）であること、また認識配列「attB」として機能する最小単位が、「cacttgtataaatataggatgtata」（配列番号５）（コア配列「aata」を介して左アーム（5'領域）「attB1」と右アーム（3'領域）「attB2」からなる：認識配列「attB1/B2」）であることが明らかになった。【０１１４】
また、「attP」として配列番号１に記載する40bpの塩基配列において、5'末端から17番目をａ（アデニン）からｃ（シトシン）に変更したもの、5'末端から18番目をt（チミン）からｇ（グアニン）に変更したもの（配列番号４参照）；「attB」として配列番号５に記載する25bpの塩基配列において、5'末端から10番目をａ（アデニン）からｃ（シトシン）に変更したもの、5'末端から10番目をａ（アデニン）からｃ（シトシン）に変更したもの、5'末端から13番目をｔ（チミン）からｃ（シトシン）に変更したもの、5'末端から20番目をt（チミン）からａ（アデニン）に変更したものを使用した場合（配列番号８参照）、これらはいずれも部位特異的DNA組換え機能を有することが確認された。【０１１５】
（７）考察
以上の結果から、本発明の部位特異的DNA組換え系（「ΦMR11-Gp1/attP-attB」）の特徴として、次のことを挙げることができる。
(i) 本発明の「ΦMR11-Gp1」（ΦMR11ファージ由来インテグラーゼ）は、従来公知のインテグラーゼ（表１参照）とはアミノ酸配列がかなり異なっているとともに、認識配列〔認識配列（attP1/P2）、認識配列（attB1/B2）〕も相違している。また、ΦC31ファージ系と比べてそのサイズも小さい（約3/4）。
(ii) 「ΦMR11-Gp1」（ΦMR11ファージ由来インテグラーゼ）が認識する配列「attP」（認識配列（attP1/ P2）と「attB」（認識配列（attB1/B2））は相互に全く塩基配列が異なるだけでなく、既知の組換え酵素認識部位とも異なる。【０１１６】
以上のことから、本発明の「ΦMR11-Gp1/attP-attB」系を使用することにより、従来とは異なる組換え系を構築することができる。【０１１７】
(iii) 本発明の「ΦMR11-Gp1/attP-attB」系は、P1ファージCre/LoxPや酵母のFLP/FRT系と異なり、部位特異的DNA組換えが不可逆的である。
(iv)  本発明の「ΦMR11-Gp1/attp-attB」系は、ファージΦMR11が由来する黄色ブドウ球菌（原核生物）のみならず、ヒト細胞を含む真核細胞でも機能するため、遺伝子治療、発生学、及び細胞（組織）再生医療の医学的研究にも応用できる。
(v) 本発明の「ΦMR11-Gp1/attp-attB」系は、組換えに宿主由来の因子を必要としないので、宿主に依存せず、種々の細胞で利用することができ、広い範囲で応用が可能である。【０１１８】
実施例２    応用例
１）遺伝子治療における応用例（図１１）
p53やFasL（アポトーシス誘導）、HSV-tk（チミジンキナーゼ：ガンシクロビル共存により細胞障害）などの所謂「自殺遺伝子」を組み込んだ癌細胞治療用アデノウイルスベクターを、293細胞（パッケージング細胞）で産生させる。その際、「自殺遺伝子」のプロモーターの直下流にattP（認識配列（attP1/ P2））とattB（認識配列（attB1/B2））で挟んだストップコドン配列を挿入しておくか、あるいは、逆位にしたプロモーターをattPとattBで挟むことによって、293細胞内でベクターが増殖した場合には「自殺遺伝子」が発現しないようにしておく。得られた組換えウイルスベクターを腫瘍組織に接種した後、「ΦMR11-Gp1」（ΦMR11ファージ由来インテグラーゼ）を別ベクターにより導入（同一のウイルスベクター上に搭載も可能）すると、attP-attB間での組換えが生じてプロモーターが作動し、腫瘍細胞を死滅に導くことができる。【０１１９】
２）発生学、細胞（組織）再生医学的研究における応用例
(i) 機能検索対象遺伝子発現ユニットをattPとattBとで挟んだコンストラクトのトランスジェニック動物を作成し、発生過程の任意の時期、任意の臓器にΦMR11ファージ由来インテグラーゼを導入することで、その機能検索対象遺伝子を欠失させることができ、その遺伝子の機能や重要性を知ることができる。【０１２０】
(ii)  attP（認識配列（attP1/P2））（あるいはattB（認識配列（attB1/B2）））を染色体の目的部位に挿入したトランスジェニック動物を作成し、これにattB（あるいはattP）、目的遺伝子、「ΦMR11-Gp1」（ΦMR11ファージ由来インテグラーゼ）遺伝子を有するベクターあるいはプラスミドを移入することにより、任意の時期、任意の臓器で目的の遺伝子発現が可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８（ａ）】
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【図８（ｂ）】
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【図９】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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