(57)【要約】インスリン依存型糖尿病の早期診断のために有用な、膵臓ランゲルハンス島β細胞特異的自己抗体に対する抗原性が維持され、かつ熱安定化したＧＡＤ６５変異体を提供する。  ＧＡＤ６５遺伝子を鋳型として、Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅＰＣＲを行い、得られたランダム遺伝子ライブラリーを用いて、宿主微生物を形質転換させ、その発現タンパク質が加熱処理後において、膵臓ランゲルハンス島β細胞特異的自己抗体に対する抗原性を有するか否かを指標にスクリーニングを行い、熱安定性及び抗原性を有するＧＡＤ６５変異体を得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタミン酸脱炭酸酵素６５変異体であって、配列表の配列番号２で示すアミノ酸配列中、３１０〜４７０の領域に変異を有し、膵臓ランゲルハンス島β細胞特異的自己抗体に対する抗原性を有し、かつ４５℃、１０分間加熱した場合において、相対抗原性が５０％以上残存することを特徴とする、上記酵素変異体。
【請求項２】
配列番号２に示されるアミノ酸配列において、以下ａ〜ｆのアミノ酸変異のうち、いずれかの変異をそれぞれ有することを特徴とする、グルタミン酸脱炭酸酵素６５変異体。
ａ；Ｅ４１２Ｇ
ｂ；Ｓ３１３Ｆ
ｃ；Ｍ３６１１及び／又はＦ４６７Ｓ
ｄ；Ｋ３５５Ｒ
ｅ；Ｄ３４５Ｖ
ｆ；Ｉ３５３Ｔ
【請求項３】
請求項２に記載のグルタミン酸脱炭酸酵素６５変異体のＮ末端側領域が欠失し、可溶化されていることを特徴とする、グルタミン酸脱炭酸酵素６５変異体。
【請求項４】
１〜１８７番目のアミノ酸残基が欠失していることを特徴とする、請求項３に記載のグルタミン酸脱炭酸酵素６５変異体。
【請求項５】
請求項１〜３いずれかに記載のグルタミン酸脱炭酸酵素６５変異体のＮ末端に、チオレドキシンが付加されていることを特徴とする、グルタミン酸脱炭酸酵素６５変異体。
【請求項６】
請求項１〜５いずれかに記載のグルタミン酸脱炭酸酵素６５変異体を含有することを特徴とする、膵臓ランゲルハンス島β細胞特異的自己抗体の検出又は定量試薬。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載のグルタミン酸脱炭酸酵素６５変異体を含有することを特徴とする、インスリン依存性糖尿病診断薬。
【請求項８】
請求項１〜５いずれかに記載のグルタミン酸脱炭酸酵素６５変異体をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項９】
配列番号１に示される塩基配列において、以下ａ〜ｆのいずれかの変異を有するＤＮＡ。
ａ；配列番号１に示される塩基配列１２３４〜１２３６番目のＧＡＧがＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ又はＧＧＴに置換された変異
ｂ；同塩基配列９３７〜９３９番目のＴＣＴがＴＴＣ又はＴＴＴに置換された変異
ｃ；同塩基配列１０８１〜１０８３番目のＡＴＧがＡＴＡ、ＡＴＣ又はＡＴＴに置換された変異、及び／または塩基配列１３９９〜１４０１番目のＴＴＴがＡＧＣ、ＡＧＴ、ＴＣＡ、ＴＣＣ、ＴＣＧ又はＴＣＴに置換された変異
ｄ；同塩基配列１０６３〜１０６５番目のＡＡＡがＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ又はＣＧＴに置換された変異
ｅ；同塩基配列１０３３〜１０３５番目のＧＡＣがＧＴＡ、ＧＴＣ、ＧＴＧ又はＧＴＴに置換された変異
ｆ；同塩基配列１０５７〜１０５９番目のＡＴＴがＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ又はＡＣＴに置換された変異
【請求項１０】
配列番号１に示される塩基配列において、１〜５６１番目の塩基配列が欠失していることを特徴とする請求項９に記載のＤＮＡ。
【請求項１１】
配列番号２７で示される塩基配列を５’末端側に有することを特徴とする、請求項９又は１０に記載のＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか記載のＤＮＡに対してアンチセンス鎖を構成していることを特徴とする、アンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡ。
【請求項１３】
請求項８〜１１いずれかに記載のＤＮＡが挿入された組換えベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項１５】
請求項１４に記載の形質転換体を培地で培養し、培養物から、請求項１〜５いずれかに記載のグルタミン酸脱炭酸酵素６５変異体を採取することを特徴とする、グルタミン酸脱炭酸酵素６５変異体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、熱安定化グルタミン酸脱炭酸酵素６５変異体ならびにインスリン依存性真性糖尿病（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ，ＩＤＤＭ：Ｉ型糖尿病）の診断に有用なヒト抗ＧＡＤ自己抗体の検出・定量手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルタミン酸脱炭酸酵素（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，ＧＡＤ）は、グルタミン酸を脱炭酸してＧＡＢＡ（γ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ）を生成する酵素であり、脳のＧＡＢＡ作動性ニューロン神経終末や膵臓ランゲルハンス島β細胞などに高濃度に存在する（Ｂｕ，Ｄ．Ｆ．，Ｅｒｌａｎｄｅｒ，Ｍ．Ｇ．．，Ｈｉｔｚ，Ｂ．Ｃ．，Ｔｉｌｌａｋａｒａｔｎｅ，Ｎ．Ｊ．Ｋ．，Ｋａｕｆｍａｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｗａｇｎｅｒ−ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．，Ｅｖａｎｓ，Ｇ．Ａ．＆  Ｔｏｂｉｎ，Ａ．Ｊ．（１９９２）．Ｔｗｏ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，６５−ｋＤａ  Ｇａｄ  ａｎｄ  ６７−ｋＤａ  ＧＡＤ，ａｒｅ  ｅａｃｈ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｇｅｎｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，２１１５−２１１９参照）。ＧＡＤは神経末端では神経終末のシナプス小胞（ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅ）内に、β細胞ではシナプス様微小胞（ｓｙｎａｐｔｉｃ−ｌｉｋｅ  ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）の細胞膜に結合するか、細胞質に存在し、ＧＡＢＡの局在と密接に関係している。β細胞におけるＧＡＢＡはインスリン合成あるいは隣接するα細胞、σ細胞の機能調節に働いていると考えられている（Ｃｈｒｉｓｔｇａｕ，Ｓ．，Ｓｃｈｉｅｒｂｅｃｋ，Ｈ．，Ａａｎｓｔｏｏｔ，Ｈ．−Ｊ．，Ａａｇａａｒｄ，Ｌ．，Ｂｅｇｌｅｙ，Ｋ．，Ｋｏｆｏｄ，Ｈ．，Ｈｅｊｎａｅｓ，Ｋ．＆  Ｂａｅｋｋｅｓｋｏｖ，Ｓ．（１９９１）．Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  β−ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｔｗｏ  ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，ａ  ６５  ｋＤａ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｆｏｒｍ  ａｎｄ  ａ  ６４  ｋＤａ  ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ  ｆｏｒｍ  ｗｉｃｈ  ｃａｎ  ｂｅ  ｂｏｔｈ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ  ａｎｄ  ｓｏｌｕｂｌｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，２１２５７−２１２６４；Ｃｈｒｉｓｇａｕ，Ｓ．，Ａａｎｓｔｏｏｔ，Ｈ．−Ｊ．，Ｓｃｈｉｅｒｂｅｃｋ，Ｈ．，Ｂｅｇｌｅｙ，Ｋ．，Ｔｕｌｌｉｎ，Ｓ．，Ｈａｊｎａｅｓ，Ｈ．，＆  Ｂａｅｋｋｅｓｋｏｖ，Ｓ．（１９９２）．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ  ＧＡＤ６５  ｔｏ  ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  β−ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｐａｌｍｉｔｏｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１８，３０９−３２０；Ｒｅｅｔｚ，Ａ．，Ｓｏｌｉｍｅｎａ，Ｍ．，Ｍａｔｔｅｏｌｉ，Ｍ．，Ｆｏｌｌｉ，Ｆ．，Ｔａｋｅｉ，Ｋ．＆  ＤｅＣａｍｉｌｌｉ，Ｐ．（１９９１）．ＧＡＢＡ  ａｎｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  β−ｃｅｌｌｓ：ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ＧＡＤ）ａｎｄ  ＧＡＢＡ  ｗｉｔｈ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｌｉｋｅ  ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｓｕｇｇｅｓｔｓ  ｔｈｅｉｒ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ＧＡＢＡ  ｓｔｏｒａｇｅ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．ＥＭＢＯＪ．１０，１２７５−１２８４参照）。
ヒトＧＡＤには分子量６５ｋＤａのＧＡＤ６５と分子量６７ｋＤａのＧＡＤ６７という２種類のアイソフォームが存在し、それぞれ５８５個および５９４個のアミノ酸からなり、６５％の相同性を持ち、第１０および第２染色体上の異なる遺伝子により支配されている。ヒト脳および膵臓ランゲルハンス島β細胞では両者が発現しているが、β細胞では圧倒的にＧＡＤ６５の発現が多い（Ｂｕ，Ｄ．Ｆ．，Ｅｒｌａｎｄｅｒ，Ｍ．Ｇ．．，Ｈｉｔｚ，Ｂ．Ｃ．，Ｔｉｌｌａｋａｒａｔｎｅ，Ｎ．Ｊ．Ｋ．，Ｋａｕｆｍａｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｗａｇｎｅｒ−ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．，Ｅｖａｎｓ，Ｇ．Ａ．＆  Ｔｏｂｉｎ，Ａ．Ｊ．（１９９２）．Ｔｗｏ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，６５−ｋＤａ  Ｇａｄ  ａｎｄ  ６７−ｋＤａ  ＧＡＤ，ａｒｅ  ｅａｃｈ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｇｅｎｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，２１１５−２１１９；Ｂｕ，Ｄ．Ｆ．＆  Ｔｏｂｉｎ，Ａ．Ｊ．（１９９４）．Ｔｈｅ  ｅｘｏｎ−ｉｎｔｒｏｎ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｓ（ＧＡＤ１  ａｎｄ  ＧＡＤ２）ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｗｏ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｓ（ＧＡＤ６７  ａｎｄ  ＧＡＤ６５）ｓｕｇｇｅｓｔｓ  ｔｈａｔ  ｔｈｅｙ  ｄｅｒｉｖｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ａｎｃｅｓｔｒａｌ  ＧＡＤ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２１，２２２−２２８；Ｌｅｒｎｍａｒｋ  Å．（１９９６）．Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ−−ｇｅｎｅ  ｔｏ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｔｏ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，２４０，２５９−２７７参照）。
近年、ＧＡＤは従来より糖尿病患者に検出されており、一般に「６４自己抗原」と呼称されていたものと同じものであることが見出され、インスリン依存性糖尿病に深く関連する自己抗原の一つとして同定された。
インスリン依存性糖尿病（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ，ＩＤＤＭ；Ｉ型糖尿病）は、自己免疫機序により膵臓ランゲルハンス島β細胞が選択的に破壊されることにより、インスリンの絶対的不足によって発症する。抗ＧＡＤ抗体は、糖尿病患者、特にＩＤＤＭ患者で検出されるが、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）患者血清中にも存在し、このような患者の一部はＩＤＤＭに移行する。また、進行性の遅いＩＤＤＭの場合にも、糖尿病の臨床的兆候の発現前に抗ＧＡＤ抗体が検出される。また、近年では、成人性潜在型糖尿病（Ｌａｔｅｎｔ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔｓ：ＬＡＤＡ）と呼ばれるＩＤＤＭとＮＩＤＤＭの中間型も報告されているが、このタイプの糖尿病の場合においても抗ＧＡＤ抗体が検出されることがある（生井ら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｆｒｏｎｔｉｅｒ，６，ｐ４０４，１９９５年）。ＩＤＤＭ患者血清中には発症の数年前から抗ＧＡＤ６５抗体が高頻度で確認されるため、抗ＧＡＤ抗体の検出により糖尿病、特に、ＩＤＤＭの診断または予知が可能である。抗ＧＡＤ抗体の検出をもとにした糖尿病の診断法は公知である（例えば、ＷＯ９２／０４６３２；ＷＯ９２／０３７３３参照）。これらの文献には、その具体的な方法として放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等があげられる。このようなアッセイにおいては、抗原の選択および検出手段の選択が感度および特異性の点から非常に重要である。糖尿病、特にインスリン依存性糖尿病患者血清中の抗ＧＡＤ抗体は、主としてＧＡＤ６５と反応することが知られている（Ｕｊｉｈａｒａら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４３，ｐ．９６８，１９９４年）。
さらに、このＧＡＤ６５タンパク質のアミノ酸配列およびその遺伝子の塩基配列はすでに知られている（ＷＯ９２／０４６３２；Ｄｉｎｇ−Ｆａｎｇ  Ｂｕ，Ｍ．Ｇ．Ｅｒｌａｎｄｅｒ，Ｂ．Ｃ．Ｈｉｔｚ，Ｎ．Ｊ．Ｋ．Ｔｉｌｌａｋａｒａｔｎｅ，Ｄ．Ｌ．Ｋａｕｆｍａｎ，Ｃ．Ｂ．ｗａｇｎｅｒ−Ｍｃｐｈｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ａ．Ｅｖａｎｓ，Ａ．Ｊ．Ｔｏｂｉｎ（１９９２）．Ｔｗｏ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｕｔａｍｉｃ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，６５−ｋＤａ  ＧＡＤ  ａｎｄ  ６７−ｋＤａ  ＧＡＤ，ａｒｅ  ｅａｃｈ  ｅｎｃｏｌｅｄ  ｂｙ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｇｅｎｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ，８９，２１１５−２１１９参照）。
ＧＡＤ６５はかってはブタ脳から抽出精製されていた。しかし、このような調製物にはＧＡＤ６７が混入するため、これを抗原として用いるとアッセイの特異性が低下し、正しい測定値が得られない。したがって、これらの天然抽出物よりも、近年は遺伝子工学的手法で調製された組換体ＧＡＤ６５を用いること（例えば特表平５−５０３２２０号公報（ＷＯ９２／０５４４６）；特表平９−５０３３８７号公報（ＷＯ９５／０７９９２）参照）によりアッセイの有用性が高まることが期待された。
しかし、ＧＡＤ６５は天然物、組換体のいずれであっても、疎水性が高いために立体構造の保持が難しく、不溶性になり易く精製収率が悪く、抗原性を維持することが極めて難しい。しかもＩ型糖尿病患者血清のＧＡＤ６５に対する反応性は、常温では短い時間で減衰してしまうことが知られている。これはＧＡＤ６５の立体構造が上述のように熱的に不安定であり、さらに患者血清中の抗ＧＡＤ６５抗体がＧＡＤ６５の未変性の立体構造のみを正確に認識していることが原因と考えられている（Ｂｕ，Ｄ．Ｆ．＆  Ｔｏｂｉｎ，Ａ．Ｊ．（１９９４）．Ｔｈｅ  ｅｘｏｎ−ｉｎｔｒｏｎ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｓ（ＧＡＤ１  ａｎｄ  ＧＡＤ２）ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｗｏ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｓ  （ＧＡＤ６７  ａｎｄ  ＧＡＤ６５）ｓｕｇｇｅｓｔｓ  ｔｈａｔ  ｔｈｅｙ  ｄｅｒｉｖｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ａｎｃｅｓｔｒａｌ  ＧＡＤ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２１，２２２−２２８；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｈ．Ｌ．，Ｃｈａｎｄｏｎｉａ，Ｊ．−Ｍ．，Ｋａｓｈ，Ｓ．Ｆ．，Ｋａｎａａｎｉ，Ｊ．Ｔｕｎｎｅｌｌ，Ｅ．，Ｄｏｍｉｎｇｏ，Ａ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｆ．Ｅ．，Ｂａｎｇａ，Ｊ．Ｐ．，Ｍａｄｅｃ，Ａ．−Ｍ．，Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｗ．＆  Ｂａｅｋｋｅｓｋｏｖ，Ｓ．（１９９９）．Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ６５  ｋＤａ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８７，９８３−９９９；Ｄｉｎｇ−Ｆａｎｇ  Ｂｕ，Ｍ．Ｇ．Ｅｒｌａｎｄｅｒ，Ｂ．Ｃ．Ｈｉｔｚ，Ｎ．Ｊ．Ｋ．Ｔｉｌｌａｋａｒａｔｎｅ，Ｄ．Ｌ．Ｋａｕｆｍａｎ，Ｃ．Ｂ．ｗａｇｎｅｒ−Ｍｃｐｈｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ａ．Ｅｖａｎｓ，Ａ．Ｊ．Ｔｏｂｉｎ（１９９２）．Ｔｗｏ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｕｔａｍｉｃ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，６５−ｋＤａ  ＧＡＤ  ａｎｄ  ６７−ｋＤａ  ＧＡＤ，ａｒｅ  ｅａｃｈ  ｅｎｃｏｌｅｄ  ｂｙ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｇｅｎｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ，８９，２１１５−２１１９参照）。
このようなＧＡＤ６５の立体構造の熱安定性の低さは、抗原性のあるＧＡＤ６５の製造自体を困難にするとともに、その使用時、上記患者の血清中の自己抗体の検出あるいは定量において、感度、正確性を欠くものとなり、ＧＡＤ６５を使用するＩＤＤＭ診断の信頼性を損ねる結果を招く。
一方、現在ＧＡＤ６５の組換体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）発現系として、酵母（Ｐｉｃｈｉａ，Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ）およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現が主に利用されている（Ｌａｗ，Ｒ．Ｈ．Ｐ．，Ｒｏｗｌｅｙ，Ｍ．Ｊ．，Ｍａｃｋａｙ，Ｉ．Ｒ．＆  Ｃｏｒｎｅｒ，Ｂ．（１９９８）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎｉａｌｌｙ  ａｎｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６１，５７−６８参照）。しかし、これらはいずれも操作の煩雑さや培養時間の長さ、経済性などの面で、細菌を使用する発現系に劣る。
また、ヒトＧＡＤ６５は、不溶性のタンパク質であり、不溶性のままでは分離、精製等が難しく、また、界面活性剤等の可溶化剤等を使用して可溶化すれば、タンパク質の変性等により、抗原性の喪失につながる。しかし、ＧＡＤ６５単体で大腸菌等の細菌において可溶性の状態で発現させた例はこれまで報告されていない。
【発明の開示】
【０００３】
そこで、本発明の課題は、患者血清中の膵臓ランゲルハンス島β細胞特異的自己抗体に対する抗原性が維持され、かつ熱安定化したＧＡＤ６５変異体を得ること、あるいは、さらに、該抗原性及び熱安定性を保持しつつ、上記ＧＡＤ６５変異体の可溶化を図ること、並びにこれらのＧＡＤ６５変異体を用いて、患者血清中の膵臓ランゲルハンス島β細胞特異的自己抗体を、正確かつ感度よく検出及び定量するための新たな手段を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために、分子進化工学的手法に基づき、ＧＡＤ６５の患者血清に対する抗原性を指標とした熱安定進化実験系を構築し、上記ＧＡＤ６５遺伝子にランダム変異を導入し、これら変異遺伝子を発現させて多数のＧＡＤ６５タンパク質変異体を得て、これらタンパク質変異体を熱安定性及び抗原性の観点からスクリーニングした結果、最終的に患者血清に対する抗原性が維持され、かつ熱安定化したＧＡＤ６５タンパク質変異体を得、さらに、熱安定性及び抗原性を保持し、かつ可溶化されたＧＡＤ６５タンパク質変異体を分離精製することにも成功した。また、これらのタンパク質変異体を用いたβ細胞特異的自己抗体の検出、定量系は、感度よくかつ正確であることも確認し、本発明を完成させたものである。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）  グルタミン酸脱炭酸酵素６５変異体であって、配列表の配列番号２で示すアミノ酸配列中、３１０〜４７０の領域に変異を有し、膵臓ランゲルハンス島β細胞特異的自己抗体に対する抗原性を有し、かつ４５℃、１０分間加熱した場合において、相対抗原性が５０％以上残存することを特徴とする、上記酵素変異体。
（２）  配列番号２に示されるアミノ酸配列において、以下ａ〜ｆのアミノ酸変異のうち、いずれかの変異をそれぞれ有することを特徴とする、グルタミン酸脱炭酸酵素６５変異体。
ａ；Ｅ４１２Ｇ
ｂ；Ｓ３１３Ｆ
ｃ；Ｍ３６１Ｉ及び／又はＦ４６７Ｓ
ｄ；Ｋ３５５Ｒ
ｅ；Ｄ３４５Ｖ
ｆ；Ｉ３５３Ｔ
（３）  上記（２）に記載のグルタミン酸脱炭酸酵素６５変異体のＮ末端側領域が欠失し、可溶化されていることを特徴とする、グルタミン酸脱炭酸酵素６５変異体。
（４）  １〜１８７番目のアミノ酸残基が欠失していることを特徴とする、上記（３）に記載のグルタミン酸脱炭酸酵素６５変異体。
（５）  上記（１）〜（３）のいずれかに記載のグルタミン酸脱炭酸酵素６５変異体のＮ末端に、チオレドキシンが付加されていることを特徴とする、グルタミン酸脱炭酸酵素６５変異体。
（６）  上記（１）〜（５）のいずれかに記載のグルタミン酸脱炭酸酵素６５変異体を含有することを特徴とする、膵臓ランゲルハンス島β細胞特異的自己抗体の検出又は定量試薬。
（７）  上記（１）〜（５）のいずれかに記載のグルタミン酸脱炭酸酵素６５変異体を含有することを特徴とする、インスリン依存性糖尿病診断薬。
（８）  上記（１）〜（５）のいずれかに記載のグルタミン酸脱炭酸酵素６５変異体をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
（９）  配列番号１に示される塩基配列において、以下ａ〜ｆのいずれかの変異を有するＤＮＡ。
ａ；配列番号１に示される塩基配列１２３４〜１２３６番目のＧＡＧがＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ又はＧＧＴに置換された変異
ｂ；同塩基配列９３７〜９３９番目のＴＣＴがＴＴＣ又はＴＴＴに置換された変異
ｃ；同塩基配列１０８１〜１０８３番目のＡＴＧがＡＴＡ、ＡＴＣ又はＡＴＴに置換された変異、及び／または塩基配列１３９９〜１４０１番目のＴＴＴがＡＧＣ、ＡＧＴ、ＴＣＡ、ＴＣＣ、ＴＣＧ又はＴＣＴに置換された変異
ｄ；同塩基配列１０６３〜１０６５番目のＡＡＡがＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ又はＣＧＴに置換された変異
ｅ；同塩基配列１０３３〜１０３５番目のＧＡＣがＧＴＡ、ＧＴＣ、ＧＴＧ又はＧＴＴに置換された変異
ｆ；同塩基配列１０５７〜１０５９番目のＡＴＴがＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ又はＡＣＴに置換された変異
（１０）  さらに、配列番号１に示される塩基配列において、１〜５６１番目の塩基配列が欠失していることを特徴とする上記（９）に記載のＤＮＡ。
（１１）  配列番号２７で示される塩基配列を５’末端側に有することを特徴とする、上記（９）又は（１０）に記載のＤＮＡ。
（１２）  上記（８）〜（１１）のいずれか記載のＤＮＡに対してアンチセンス鎖を構成していることを特徴とする、アンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡ。
（１３）  上記（８）〜（１１）のいずれかに記載のＤＮＡが挿入された組換えベクター。
（１４）  上記（１３）に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換体。
（１５）  上記（１４）に記載の形質転換体を培地で培養し、培養物から、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のグルタミン酸脱炭酸酵素６５変異体を採取することを特徴とする、グルタミン酸脱炭酸酵素６５変異体の製造方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００５−０７４０５６号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、本発明のＧＡＤ６５変異体及びその遺伝子のスクリーニング系の概略を示した図である。
図２は、本発明のスクリーニング系において、直接免疫染色によりクローンを選択する場合の観察結果を示す図である。
図３は、本発明のＧＡＤ６５変異体の変異の位置とＧＡＤ６５の立体構造との関係を示す模式図である。図３Ａは、ＧＡＤ６５の中央領域（２量体）を示し、図３Ｂは、ＧＡＤ６５のＣ−末端領域を示す。
図４は、変異プライマーを用いたＰＣＲ法の概略を示す図である。
図５は、熱安定化ＧＡＤ６５変異体抗原固相化プレートの作製手順の概略を示す図である。
図６は、抗ＧＡＤ抗体測定方法の手順の概略を示す図である。
図７は、ＧＡＤ６５−Δ９５抗原とＧＡＤ６５−Δ１８７変異株Ｆ８６抗原を各使用した場合における抗ＧＡＤ抗体陽性患者血清の検体希釈曲線を示す図である。
図８は、本発明のＧＡＤ６５−Δ１８７変異体の抗原性を測定した結果を示すグラフである。
図９は、本発明のＧＡＤ６５−Δ１８７変異体の熱安定性を測定した結果を示すグラフである。
図１０は、本発明のＧＡＤ６５−Δ１８７変異体の長時間加熱処理に伴う抗原性の変動を測定した結果を示すグラフである。
図１１は、本発明のＧＡＤ６５−Δ１８７変異体の高温（６０℃）加熱処理に伴う抗原性の変動を測定した結果を示すグラフである。
図１２は、本発明のＧＡＤ６５−Δ１８７変異体の１０％メタノール存在下における加熱処理に伴う抗原性の変動を測定した結果を示すグラフである。
図１３は、実施例８の可溶性試験において構築した各発現プラスミドの構造及びその構築手法の概略を示す図である。
図１４は、各種濃度のＧＡＤ陽性患者血清と本発明のＧＡＤ６５変異体との結合に基づく発光強度の変化の測定結果から導き出された、抗ＧＡＤ抗体標準検量線を示す図である。
図１５は、ｐＴｈｉｏＨｉｓＡのベクターのマルチプルクローニングサイトを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明のＧＡＤ６５変異体は、膵臓ランゲルハンス島β細胞特異的自己抗体に対する抗原性を有し、かつ４５℃、１０分間加熱した場合において、相対抗原性が５０％以上残存することを特徴とするものであり、この相対抗原性とは、非加熱時の上記酵素変異体の抗ＧＡＤ６５抗体との反応性に対する、上記加熱処理後の上記酵素変異体の同抗体との反応性の比を１００分率で表したものである。
本発明における熱安定性ＧＡＤ６５変異体及びその遺伝子は、ＧＡＤ６５遺伝子（配列番号１）を鋳型として、微量の塩化マンガン（ＭｇＣｌ２）を使用したエラー−プローン（Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ法を適用することにより、ＧＡＤ６５遺伝子毎に１〜数個のランダムな変異を導入し、多数の変異体遺伝子を含むランダムライブラリーを作成し、該ランダムライブラリーを大腸菌により発現させ、その中から、抗原性及び熱安定性を示すタンパク質を発現するクローンをスクリーニングして得られたものである。
本発明のＧＡＤ６５変異体及びその遺伝子のスクリーニング系について、図１を参照しつつ、さらに具体的に説明する。
上記Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ法において使用する塩化マンガンの濃度は、その濃度が増すにつれて突然変異の発生頻度も増すが、５０μＭの場合ｃＤＮＡ当たりの塩基置換数は１〜３で、その平均は１．５であり、７０μＭの場合ｃＤＮＡ当たりの塩基置換数は０〜４で、平均２．３であった。ＧＡＤ６５変異体の熱安定性とその原因の変異との関係を明らかにするためには、塩基置換数が平均１〜２程度が好ましく、塩化マンガン濃度を調節する。
鋳型となるＧＡＤ６５遺伝子は、完全長遺伝子あるいは後記するように、可溶化を高めるためＧＡＤ６５タンパク質のＮ末端側領域をコードする塩基配列が欠失した遺伝子でもよく、また、これら遺伝子がプラスミド等に組み込まれた形態であってもよく、これら遺伝子領域を含むＤＮＡであればよい。本発明のスクリーニングにおいては、このようなＧＡＤ６５遺伝子を鋳型としてＥｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ法により得られた変異体遺伝子ランダムライブラリーをベクターに組み込み、該組み換えベクターを用いて、例えば大腸菌等の宿主微生物を形質転換する。得られた該形質転換体は、例えば、ＩＰＴＧ溶液を塗布したＬＢプレートにニトロセルロース膜を敷き、その上に植菌して培養し、コロニーを形成させる。この後、ニトロセルロース膜にコロニーのレプリカを作成した。このレプリカ上の菌体を溶菌させ、固相化し、例えば４５℃、１５分間熱処理する。次いで、このニトロセルロース膜を直接免疫染色する。
この免疫染色においては、抗ＧＡＤ６５一次抗体溶液に該溶菌したニトロセルロース膜を浸して、例えば、２５℃で１時間反応させ、さらに該一次抗体に対する標識２次抗体溶液と反応させるが、標識抗ＧＡＤ６５一次抗体のみ使用して行ってもよい。抗体に結合させる標識としては、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）等が挙げられる。
これら操作の結果、ニトロセルロース膜上において強く染色されたコロニーは抗原性を示すクローンである（図２参照）。
ニトロセルロース膜上のコロニーは、元々のニトロセルロース膜のレプリカ由来であり、上記抗原性を示すクローンに対応する元々のコロニーは、目的とする熱安定性及び抗原性を示すＧＡＤ６５変異体を発現しているクローンである。これを培養し、菌体を含む培養物からＧＡＤ６５変異体を分離、精製できる。また、該変異体遺伝子は、例えば、菌体から、導入された組み換えベクターを採取し、制限酵素処理することにより容易に得ることができる。また上記組み換えベクターを鋳型として、そのＧＡＤ６５変異体遺伝子領域をＰＣＲ増幅することによっても容易に得ることができる。
本発明のＧＡＤ６５変異体は、そのＮ末端側領域に疎水性アミノ酸が多く含まれ、不溶性である。したがって、その精製等を容易に行うために可溶性にすることが望ましい。このためには、ＧＡＤ６５変異体のＮ末端側領域に、チオレドキシン（配列番号２８）を付加せしめた融合タンパク質とするか、あるいはＧＡＤ６５変異体のＮ末端側領域を欠失させる。また、これらの手段を併用してもよい。
さらに、本発明のＧＡＤ６５変異体のＣ末端側には、ポリヒスチジンタグを付加してもよい。ポリヒスチジンタグが付加されたタンパク質は、Ｎｉ＋＋あるいはＣｏ＋＋等のポリヒスチジンと錯体を形成する金属イオンを坦持した精製手段、例えばＮｉ＋＋セファロースカラム等を使用して、精製が極めて容易に行える。
このような融合タンパク質を得るには、例えば、ＧＡＤ６５変異体遺伝子、あるいはＧＡＤ６５変異体のＮ末端側領域のアミノ酸配列に対応する塩基配列を欠失した遺伝子の５’上流側に、チオレドキシン遺伝子（配列番号２７）、あるいはさらにＧＡＤ６５変異体遺伝子の３’下流側にポリヒスチジンタグ対応塩基配列が位置するように構成したベクターにより、大腸菌等の宿主微生物を形質転換させ、該大腸菌を培養する。この結果得られたＧＡＤ６５変異体は、従来技術にみられるＧＡＤ６５の１６５アミノ酸以後を誤転写して生成されるペプチド（４８ｋＤａ）の副生もなく（Ｍ．Ｌ．Ｐａｐｏｕｃｈａｄｏ，Ｓ．Ｎ．Ｖａｌｄｅｚ，Ｄ．Ｇｈｉｒｉｎｇｈｅｌｌｉ，Ｅ．Ｐｏｓｋｕｓ，Ｍ．Ｒ．Ｅｒｍａｃｏｒａ，（１９９７）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｐｅｒｌｙ  ｆｏｌｄｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ６５  ａｓ  ａ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４６，３５０〜３５９）、可溶性タンパク質発現量の増大が明らかに認められる。
本発明においてチオレドキシンあるいはその遺伝子というとき、チオレドキシンのＮ末端側部分ペプチド及びこれをコードするＤＮＡも包含する。
使用するベクターの具体例としては、例えば、ｐＴｈｉｏＨｉｓＡが挙げられる。
このベクターのマルチクローニングサイト（配列番号２９，３０）を図１５に示す。本発明のＧＡＤ６５変異体遺伝子、あるいはＧＡＤ６５変異体のＮ末端側領域のアミノ酸配列に対応する塩基配列を欠失した遺伝子は、図中矢印で示す位置ＥｃｏＲ１−ＮｏｔＩサイトに挿入される。
本発明においては、ＧＡＤ６５変異体として、ＧＡＤ６５の完全長タンパク質（配列番号２）のＮ末端側の１〜１８７番目のアミノ酸を欠失させ、そのＮ末端にチオレドキシン及びＣ末端にヒスチジンタグが付加された融合タンパク質について、上記手法でスクリーニングした結果、熱安定性に優れるとともに高い抗原性を有する以下のＧＡＤ６５変異体を得ている。
ａ（Ｆ５２）；Ｅ４１２Ｇ（配列番号６）
ｂ（Ｆ６８）；Ｓ３１３Ｆ（配列番号８）
ｃ（Ｆ１）；Ｍ３６１Ｉ，Ｆ４６７Ｓ（配列番号１０）
ｄ（Ｆ８６）；Ｋ３５５Ｒ（配列番号１２）
ｅ（Ｆ８７）；Ｄ３４５Ｖ（配列番号１４）
ｆ（Ｆ８４）；Ｉ３５３Ｔ（配列番号１６）
なお、上記ａ−ｆに続く括弧内は、各変異体の名称を示す。また、上記ａ−ｆの最初のアルファベット（大文字）と数字は配列番号１に示される野生型ＧＡＤ６５における変異前のアミノ酸残基とその位置を示し、末尾のアルファベット（大文字）は該位置における変異後のアミノ酸残基を示す。
上記変異体についての後記実施例に示す試験結果は、少なくともＮ末端側１〜１８７のアミノ酸配列を欠失しても、優れた熱安定性と１型糖尿病患者血清に対して有効な抗原性を有することを示している。
また、Ｎ末の末端側１〜１８７のアミノ酸配列を欠失した変異体が患者血清中のＧＡＤ６５抗体に対して抗原性を有するのであれば、欠失部分が１８７アミノ酸残基よりも少ないＧＡＤ６５変異体あるいは欠失しない変異体も、Ｎ末端側１〜１８７のアミノ酸欠失変異体のエピトープ部分を全て含み、抗原性を有する。
ＧＡＤ６５の推定立体構造と上記変異体のアミノ酸変異位置との関係を図３に示す。これによると、上記変異体におけるアミノ酸変異の位置は、α−ヘリックス構造のミドルドメイン（図中、Ｍで示す。）と、このα−ヘリックス構造の安定性に寄与すると考えられる、ミドルドメインに続く領域及び囲む領域にあり、この領域中のアミノ酸変異が、熱安定性に特に重要であることが分かる。この領域をＧＡＤ６５のアミノ酸配列における位置番号で示すと、３１０〜４７０、特に３１３〜４６７の領域であり、さらに具体的には３１９〜４１２の領域である。なお、Ｆ１においてはＲ領域にも変異を有するが、Ｆ１は、上記Ｍ領域近辺にも変異を有し、また、他の変異体の変異位置からみると、このＲ領域の変異（Ｆ４６７Ｓ）は、耐熱性に相加的に寄与する他領域の存在を示唆するものの、主たる原因ではないと考えられる。
したがって、本発明によれば、本発明のＧＡＤ６５変異体は、配列番号２で示すアミノ酸配列中、位置３１０〜４７０の領域に変異を有するものであって、（ｉ）膵臓ランゲルハンス島β細胞特異的自己に対する抗原性を有し、かつ（ｉｉ）４５℃、１０分間加熱した場合、相対抗原性が５０％以上残存する変異体である。
上記変異の例は、上記ａ〜ｆのいずれかの特定の変異、並びに／或いは、上記（ｉ）及び（ｉｉ）の特性を満足するような他の変異である。ここで、他の変異は、上記位置３１０〜４７０の領域中、例えば、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加、好ましくは置換である。数個とは、２〜約１０の整数を指す。特に、置換は、構造及び極性などの物理化学的性質が類似した又は相違したアミノ酸間の置換であるが、上記変異が上記他の変異のみからなる場合、好ましい置換は、物理化学的性質が相違したアミノ酸間の置換であり、一方、上記変異が上記ａ〜ｆのいずれかの特定の変異及び上記他の変異からなる場合、好ましい置換は、物理化学的性質が類似したアミノ酸間の置換である。物理化学的性質が類似したアミノ酸は、非極性アミノ酸の場合、例えばＧｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｐｒｏなど、極性の非電荷型アミノ酸の場合、例えばＳｅｒ，Ｔｈｒ，Ｍｅｔ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｃｙｓなど、芳香族アミノ酸の場合、例えばＰｈｅ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ、負電荷アミノ酸の場合、例えばＡｓｐ，Ｇｌｕ、或いは、正電荷アミノ酸の場合、例えばＬｙｓ，Ａｒｇ，Ｈｉｓである。物理化学的性質が相違したアミノ酸は、互いに性質の異なるアミノ酸、例えば極性の非電荷型アミノ酸と芳香族アミノ酸、非極性アミノ酸と電荷型アミノ酸、非極性アミノ酸と芳香族アミノ酸などである。置換されるアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸だけでなく、Ｄ−アミノ酸であってもよい。他の変異の例は、Ｆ３４４Ｓ、Ｉ３５８Ｖ、Ｓ４３６Ｐ、Ｍ４１５Ｌであるが、これらに限定されないものとする。
或いは、上記変異の別の例は、上記位置３１０〜４７０の領域中の変異（例えば上記ａ〜ｆのいずれかの特定の変異）、並びに、上記（ｉ）及び（ｉｉ）の特性を満足するような他の変異である。ここで、他の変異は、上記位置３１０〜４７０の領域以外の領域中、例えば、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加、好ましくは置換である。置換は、物理化学的性質が類似した又は相違したアミノ酸間の置換である。そのようなアミノ酸のタイプは、上で例示したようなものである。他の変異の例は、Ｖ２１９Ａ、Ｙ４８０Ｃ、Ｃ３０４Ｒ、Ｐ２６０Ｌ、Ｄ５５２Ｖ、Ｅ４８９Ｙ、Ｈ５６８Ｌ、Ｌ５１６Ｐ、Ｖ２１９Ａ、Ｆ２５９Ｉ、Ｅ５２０Ｇ、Ｍ４９３Ｖであるが、これらに限定されないものとする。
本発明において得られた上記ａ〜ｆのＧＡＤ６５変異体に対応する変異体遺伝子の塩基配列は、配列番号１に示される野生型ＧＡＤ６５遺伝子の塩基配列に対して、それぞれ以下に示される変異を有している。
ａ；塩基配列１２３４〜１２３６のＧＡＧ→ＧＧＧ（Ａ→Ｇ）
ｂ；塩基配列９３７〜９３９のＴＣＴ→ＴＴＴ（Ｃ→Ｔ）
ｃ；塩基配列１０８１〜１０８３のＡＴＧ→ＡＴＡ（Ｇ→Ａ）
塩基配列１３９９〜１４０１のＴＴＴ→ＴＣＴ（Ｔ→Ｃ）
ｄ；塩基配列１０６３〜１０６５のＡＡＡ→ＡＧＡ（Ａ→Ｇ）
ｅ；塩基配列１０３３〜１０３５のＧＡＣ→ＧＴＣ（Ａ→Ｔ）
ｆ；塩基配列１０５７〜１０５９のＡＴＴ→ＡＣＴ（Ｔ→Ｃ）
これら塩基配列の変異とアミノ酸変異の関係をまとめて表１に示す。
【表１】
2006098485.tif 000002
上記変異アミノ酸残基をコードするコドンは、表１に示したもののみではない。本件発明においては、表１に示した変異アミノ酸残基をコードするコドンを有する変異体遺伝子を包含する。すなわち、配列番号１に示される塩基配列において、以下の変異を生じるＤＮＡを包含する。
ａ；Ｅ４１２Ｇを生じる塩基配列１２３４〜１２３６がＧＧＡ，ＧＧＣ，ＧＧＧ，ＧＧＴ
ｂ；Ｓ３１３Ｆを生じる塩基配列９３７〜９３９がＴＴＣ，ＴＴＴ
ｃ；Ｍ３６１Ｉを生じる塩基配列１０８１〜１０８３がＡＴＡ，ＡＴＣ，ＡＴＴおよび
Ｆ４６７Ｓを生じる塩基配列１３９９〜１４０１がＡＧＣ，ＡＧＴ，ＴＣＡ，ＴＣＣ，ＴＣＧ，ＴＣＴ
ｄ；Ｋ３５５Ｒを生ずる塩基配列１０６３〜１０６５がＡＧＡ，ＡＧＧ，ＣＧＡ，ＣＧＣ，ＣＧＧ，ＣＧＴ
ｅ；Ｄ３４５Ｖを生ずる塩基配列１０３３〜１０３５がＧＴＡ，ＧＴＣ，ＧＴＧ，ＧＴＴ
ｆ；Ｉ３５３Ｔを生ずる塩基配列１０５７〜１０５９がＡＣＡ，ＡＣＣ，ＡＣＧ，ＡＣＴ
また、さらにこれらＤＮＡに対するアンチセンス鎖を構成する、アンチセンスＤＮＡ及びアンチセンスＲＮＡも包含する。
本発明において、上記アミノ酸変異を有する完全長のＧＡＤ６５およびＮ末端側領域が欠失したＧＡＤ６５変異体を発現する遺伝子は、変異プライマーを用いたＰＣＲ法、あるいは合成ＤＮＡも用いたカセット変換法などをもちいても容易に得られる。
具体的には例えば次の方法が挙げられるが、他に多くの方法があり以下に限定されるものではない。
（１）変異プライマーを用いたＰＣＲによる方法；
組み換え体ベクター中に挿入された変異のない完全長のＧＡＤ６５あるいはＮ末端側領域が欠失したＧＡＤ６５を発現する遺伝子を準備する。一方上記ベクターのマルチクローニングサイトにある制限酵素（制限酵素ｘ；例えば、ＥｃｏＲＩ）の切断部位の塩基配列をもつＰＣＲ順方向プライマー（プライマーＦ１）、およびそのプライマーがもつ制限酵素よりもマルチクローニングサイト上で３’側に存在する別の制限酵素（制限酵素ｙ；例えば、ＮｏｔＩ）の切断部位の塩基配列をもつＰＣＲ逆方向プライマー（プライマーＲ１）を準備する。さらに、変異挿入個所の中央部分に目的の変異塩基をもつ少なくとも２０塩基以上のＰＣＲ順方向プライマー（プライマーＦ２）とそれに相補的なＰＣＲ逆方向プライマー（プライマーＲ２）を準備する。これらのプライマーはＤＮＡ合成法により合成する。
塩基配列に変異のない完全長のＧＡＤ６５あるいはＮ末端側領域が欠失したＧＡＤ６５を発現するＤＮＡを鋳型としてプライマーＦ１とプライマーＲ２、およびプライマーＦ２とプライマーＲ１を用いて目的の変異遺伝子の５’断片と３’断片をＰＣＲ法により増幅する。この２種類の断片をそれぞれ単離した後混合し、ＰＣＲ法により変異遺伝子を増幅する。その概略を図４に示した。なお、この後、さらに変異遺伝子を鋳型とし、プライマーＦ１とプライマーＲ１とを用いてＰＣＲを行うことにより、より大量の変異遺伝子を獲得することも出来る。
次に、目的の変異が入った完全長のＧＡＤ６５変異体あるいはＮ末端側領域が欠失したＧＡＤ６５変異体遺伝子を制限酵素ｘおよび制限酵素ｙで消化する。一方で元のベクターも制限酵素ｘおよび制限酵素ｙで消化する。得られたベクターＤＮＡ断片と変異遺伝子断片をＤＮＡリガーゼで繋ぎ、目的の変異が導入された変異遺伝子をもつベクターが調製できる。
（２）合成ＤＮＡを用いたカセット変換法；
組み換え体ベクター中に挿入された変異のない完全長のＧＡＤ６５あるいはＮ末端側領域が欠失したＧＡＤ６５を発現する遺伝子を準備する。変異塩基挿入部位の上流および下流に存在する制限酵素サイトで制限酵素消化して、正常配列ヌクレオチド断片を除去した遺伝子（脱カセット遺伝子）を調製する。一方で、ＤＮＡ合成法により目的の変異を持ち両端に前述の制限酵素サイトをもつヌクレオチド断片（挿入カセット）を合成する。この変異ヌクレオチド断片（挿入カセット）と上記遺伝子（脱カセット遺伝子）とをＤＮＡリガーゼで繋ぎ、目的の変異が挿入された完全長のＧＡＤ６５およびＮ末端側領域が欠失したＧＡＤ６５を発現する変異遺伝子をもつベクターが調製できる。なお、この一連の操作においては、上述（１）の制限酵素ｘおよび制限酵素ｙで消化して、予め目的遺伝子を分別調製してから行うこともでき、その場合においては最終的に制限酵素サイトｘおよびｙを利用してベクターに挿入できる。
本発明のＧＡＤ６５変異体は、特に膵臓ランゲルハンス島のβ細胞破壊に伴い生じる自己抗体の検出あるいは定量に有効であり、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の診断および前臨床状態の検出に有用である。抗ＧＡＤ抗体の検出をもとにしたＩＤＤＭの診断法は広く知られており、その具体的な測定法としては放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などがあげられる。
本発明のＧＡＤ６５変異体を用いた、患者の上記自己抗体を検出あるいは定量測定法としては、ＥＬＩＳＡ法、特に性能的にＲＩＡ法に勝る感度および特異性を有する化学発光ＥＬＩＳＡ法が好ましい。以下に、化学発光ＥＬＩＳＡ法について説明する。
化学発光ＥＬＩＳＡ法は、熱安定化ＧＡＤ６５変異体抗原を固相化した担体に、試料を接触させ、前記抗原と当該試料中の抗体とを結合させて複合体を形成させ、この複合体を酵素で切断させ得る基を有する化学発光性ジオキシセタンおよびこの基を切断して化学発光を生じさせる酵素で標識された抗体により検出する抗ＧＡＤ抗体を検出または測定するＥＬＩＳＡである。
１）ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）は、例えば生体１内の物質等の検出、定量等に広く用いられている一般的な分析方法である。本発明においては、検出対象の抗体（ヒト抗ＧＡＤ抗体）に対する抗原（ＧＡＤ６５変異体抗原）を適切な担体に結合させておき、この担体に試料を反応させる。試料中に抗ＧＡＤ抗体が存在すれば、それらはＧＡＤ６５変異体抗原を介して担体に結合する。次いで、担体に結合した抗ＧＡＤ抗体に酵素標識抗ヒト免疫グロブリン抗体を結合させ、その標識を検出する。このようにしてヒト抗ＧＡＤ抗体を測定することができる。
本発明においては、ＧＡＤ６５変異体抗原を固相化したプレートを用いることが好ましい。当該プレートに抗ＧＡＤ抗体を含む分析試料（適当に希釈された、または希釈されない、血清、血漿、血液など）を加えて抗ＧＡＤ抗体をＧＡＤ６５変異体抗原に結合させる。その後、プレートを洗浄してＧＡＤ抗原と結合しなかった成分を分離除去する。次に、適当量の酵素標識抗ヒト免疫グロブリン抗体を加えて抗ＧＡＤ抗体と結合させる。その後、プレートを洗浄し、抗ＧＡＤ抗体に結合しなかった余分な酵素標識抗ヒト免疫グロブリン抗体を分離除去する。更に適当な酵素基質を加え、最終的に生成されてくる酵素反応生成物を測定することにより、分析検体中の抗ＧＡＤ抗体の濃度を測定することが出来る。ＧＡＤ固相化微粒子等を担体として用いる場合も、同様の方法で抗ＧＡＤ抗体の濃度を測定することができる。
別な方法として、競合法ＥＬＩＳＡも周知である。この場合、酵素標識された抗ＧＡＤ抗体を、試料中の抗ＧＡＤ抗体と共存させ、ＧＡＤ６５変異体抗原への結合について競合させる。その後、試料中の抗ＧＡＤ抗体の結合による標識抗ＧＡＤ抗体の結合の減少を測定する。
２）使用試薬等
ｉ．熱安定化ＧＡＤ６５変異体
本発明の熱安定化ＧＡＤ６５変異体抗原は担体に結合させて使用することができる。ＥＬＩＳＡに好適な担体は多くの種類が公知であり、例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストリン、ナイロン、アミロース、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアマイド、アガローズおよびマグネタイトがあげられる。担体の形状としては、例えばマイクロタイタープレート、微粒子やビーズがあげられる。これらの担体の市販品としてはＮｕｎｃ社製「フルオロＮｕｎｃモジュールプレート」、Ｃｏｓｔａｒ社製「オーバックストリップウェル」等、微粒子についてはＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社製「ポリビートポリスチレンマイクロフェア、磁気ポリスチレン微小球」、プロラボ社製「エスタポール（磁性粒子ならびに非磁性粒子）」等があげられる。またビーズについてはピアス社製「ヒドラジッドビーズ」等があげられる。
熱安定化ＧＡＤ６５変異体抗原を固定化した（結合させた）担体は、当該抗原を担体上に直接結合させるか、あるいは、他の物質を介して結合させることにより作製することができる。
直接結合させる方法としては、適当な濃度のＧＡＤ溶液をプレートのウエルに適当量加え、一晩静置する方法があげられる。
他の物質を介して結合させる方法としては、架橋剤や抗ＧＡＤ抗体を介して結合させる方法がある。例えば、適当な濃度の抗ＧＡＤ抗体溶液をプレートのウエルに適当量加えて一晩静置し、続いて適当濃度のＧＡＤ溶液をプレートのウエルに適当量加え、一晩静置することによりＧＡＤ抗原をプレートに結合させることができる。
担体に固定する、抗原としての当該ＧＡＤ６５変異体の量は、その検出に利用する化学発光物質の発光強度が頭打ちにならない程度でよい。具体的には当該変異体から得たＧＡＤ抗原０．１〜２．０μｇ（ＧＡＤ抗原としてのタンパク量；ブラッドフォード法による測定値）／ウエル程度とするのが好ましい。
本発明に用いられる直接結合によるＧＡＤ６５変異体抗原固相化担体の作製手順の一例を図５に示す。当該ＧＡＤを固相化した担体は使用時に作製してもよく、また、予め作製して適時保存しておいてもよい。保存条件等は、当事者に周知である。例えば、当該ＧＡＤ抗原を固相化した担体は乾燥させて、または乾燥させずに４℃から−２０℃等で安定に保存することが出来る。
ｉｉ．化学発光性ジオキシセタン
本発明に用いられる化学発光性ジオキシセタンとしては、ＷＯ８８／００６９５，特開平８−１３４０６およびこれらの関連特許出願に開示させたものを用いることが出来る。具体的には、２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキシセタン−３，２’−（５’−クロロ）−トリシクロ〔３．３．１．１３，７〕デカン｝−４−イル）−１−フェニルリン酸二ナトリウム（「ＣＤＰ−Ｓｔａｒ」（登録商標）という商品名）と３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキシセタン−３，２’−トリシクロ〔３．３．１．１３，７〕デカン｝−４−イル）フェニルリン酸二ナトリウム（「ＡＭＰＰＤ」（登録商標）という商品名）でいずれもＴｒｏｐｉｘ社から入手可能である。このＣＤＰ−ＳｔａｒまたはＡＭＰＰＤを抗ＧＡＤ抗体測定に用いると著しく早く発光強度のピークが得られ、かつ長時間にわたり安定した発光強度が保たれる。
さらに、ジオキシセタンの化学発光強度を上げるためにジオキシセタンが封鎖される疎水性環境を提供するエンハンサー、例えば第四級アンモニウムホモポリマー、特にポリ（ベンジルトリブチル）アンモニウムクロライドまたはこれを含有する組成物（ＳａｐｐｈｉｒｅＩＩまたはＥｍｅｒａｌｄＩＩ（いずれも商品名）としてＴｒｏｐｉｘ社から入手可能）を用いるのが好ましい。
ｉｉｉ．酵素標識抗体
本発明で用いられるジオキシセタンの特定の基を切断して化学発光を生じさせ得る酵素としては、アルカリまたは酸性ホスファターゼ、エステラーゼ、デカルボキシラーゼ、ホスホリパーゼＤ、β−キシロシダーゼ、β−Ｄ−フコシダーゼ、チオグルコシダーゼ、ＡＴＰアーゼ、ＡＤＰアーゼ、５’ヌクレオシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、α−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−フルクトフラノシダーゼ、β−Ｄ−グルコシドウロナーゼ、およびトリプシンがあげられる。  特に、ホスファターゼが好ましい。
このような酵素により標識された抗体は、市販のものを用いてもよいし、適切な酵素および抗体を用いて公知の方法により調製してもよい。酵素は、抗体に直接結合させてもよく、他の物質を介して結合させてもよい。他の物質としては、例えば、アビジンまたはストレプトアビジンおよびビオチンがあげられる。
ｉＶ．その他の試薬類
抗ＧＡＤ抗体の存在またはその濃度を測定するための試料としては生物学的試料、特に、適当に希釈された、または希釈しない、血清、血漿、血液またはリンパ液が用いられる。測定を行う際に用いられる抗ＧＡＤ抗体標準または陽性対照としては、抗ＧＡＤ抗体を含む任意の溶液を用いることができる。特に、試料が血清である場合、抗ＧＡＤ抗体陽性のインスリン依存性または非依存性糖尿病患者血清を用いることが好ましい。抗ＧＡＤ抗体陰性対照としては、抗ＧＡＤ抗体を含有しない、または実質的に含有しない、陽性対照と同じ溶液が用いられる。例えば、抗ＧＡＤ抗体陰性ヒト血清があげられる。
試料希釈液としては、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液、またはそれらを含む生理食塩水等を用いることができる。試料希釈液には、血清、保存剤などを添加してもよい。その他、ＥＬＩＳＡに用いられる洗浄液、ブロッキング液、緩衝液等の組成と調製方法は当事者に周知であり、本発明の実施に好適なものを任意に選択し使用することができる。
３）抗ＧＡＤ抗体測定の手順
本発明による抗ＧＡＤ抗体測定方法を説明する。具体的には、典型的な例として図６の手順にしたがって発光強度を測定し、測定値に基づき抗ＧＡＤ自己抗体濃度を算出する方法を説明する。
最初に、一次反応として、試料中の抗ＧＡＤ抗体と、担体上に固相化した熱安定化ＧＡＤ６５変異体抗原を結合させる。試料としては希釈しない、または適宜に希釈した検体（生物学的試料）を用いる。定量的に測定する場合は、必要な陰性対照試料と共に、既知の濃度の抗ＧＡＤ抗体を含む標準液（陽性対照試料）も同時に試験する。反応温度は、一般に、２０℃〜３７℃で行う。操作の便宜の点からは室温が好ましい。また、マイクロタイタープレートを使用して定量的に測定する場合には、一次反応、および以下に説明する二次反応と発光反応を含む酵素基質反応の全てを室温で行うことが好ましい。反応時間はできる限り短く、かつ反応速度が安定する時間が求められる。固相化抗原量、試料中の抗体量に応じて最適な反応時間を適宜設定することが求められるが、一般的には、５〜１２０分程度である。本発明の一例として、−次反応は抗ＧＡＤ抗体濃度約１００ｕｎｉｔ／ｍｌの検体では９０分後で充分に反応速度が緩やかになり、且つ各抗ＧＡＤ自己抗体濃度間で発光強度に充分な差が認められることから、６０〜１２０分、特に９０分程度に設定することが好ましい。
洗浄は、リン酸、ホウ酸、トリス塩酸等で緩衝化された生理食塩水、界面活性剤を含有する洗浄用緩衝液等を用いて行う。洗浄は、担体に結合しなかった成分を分離除去するためのものであり、その目的を達成するための洗浄液の組成、量、洗浄時間・回数等は必要に応じて適宜選択することができる。例えば、０．０５〜０．５％のＴｗｅｅｎ２０を含むトリス塩酸緩衝液またはリン酸緩衝整理食塩水（ｐＨ７．２〜８．０）を１〜６回、担体に適量添加し、次いで除去することにより、洗浄を行う。
次に、二次反応を行う。酵素標識抗体を洗浄後の担体に加えて、抗ＧＡＤ抗体と結合させる。反応温度については上述したとおりである。反応時間については、できる限り抗ＧＡＤ自己抗体濃度が０ｕｎｉｔ／ｍｌであるときの発光強度を低値に押さえ、且つ短時間で測定するという観点から一般的には、５〜９０分がのぞましく、特に約６０分が好ましい。
二次反応の洗浄は、一次反応の後の洗浄と同様に行う。すなわち、担体を洗浄して抗ＧＡＤ抗体に結合しなかった余分の酵素標識抗体を分離除去する。
酵素基質反応は、洗浄後の担体に適当量の酵素基質を加え、所定時間インキュベートすることにより行う。適切な反応時間と温度は用いる酵素、基質、緩衝液の種類、量、組成等によって変わり得るので適宜設定することができる。例えば、本発明での酵素基質反応では、化学発光性ジオキシセタン（Ｔｒｏｐｉｘ社製、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ  Ｓａｐｐｈｉｒｅ  ＩＩ）を０．４×１０−３ｍｏｌ／Ｌの濃度でマイクロタイターウエルに１００μｌ／ウエルの量を添加して、室温で３０分間静置することで行った。
測定は、酵素基質反応によって最終的に生成されてくる酵素反応生成物の発光強度をルミノメーター等で測定することにより行う。抗体量と発光強度とは正比例するので分析検体中の抗ＧＡＤ抗体の濃度を測定することができる。ルミノメーターによる分析検体の測定値（相対発光強度：ＲＬＵ）は、抗ＧＡＤ抗体標準液の測定値と当該標準液中の抗体濃度との関係を示す検量線グラフによって抗ＧＡＤ抗体濃度に換算することができる。
ＧＡＤ６５変異体抗原固相化微粒子等を担体として用いる場合も、同様の方法で抗ＧＡＤ抗体濃度を測定することができる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０００６】
（実施例１）
＜ＧＡＤ６５変異体の取得＞
（１）ＧＡＤ６５のＮ末端側１〜１８７番目のアミノ酸に対応する塩基配列を欠失したｃＤＮＡ（以下、この欠失した遺伝子をＧＡＤ６５−Δ１８７遺伝子（配列番号３１）という。）を含むプラスミドｐＴｈｉｏＨｉｓＡ−ＧＡＤ６５−△１８７を以下のようにして調製した。
ヒトＧＡＤ６５ｃＤＮＡはＷＯ９５／０７９９２およびＢｕら（Ｄｉｎｇ−Ｆａｎｇ  Ｂｕ，Ｍ．Ｇ．Ｅｒｌａｎｄｅｒ，Ｂ．Ｃ．Ｈｉｔｚ，Ｎ．Ｊ．Ｋ．Ｔｉｌｌａｋａｒａｔｎｅ，Ｄ．Ｌ．Ｋａｕｆｍａｎ，Ｃ．Ｂ．ｗａｇｎｅｒ−Ｍｃｐｈｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ａ．Ｅｖａｎｓ，Ａ．Ｊ．Ｔｏｂｉｎ（１９９２）．Ｔｗｏ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｕｔａｍｉｃ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，６５−ｋＤａ  ＧＡＤ  ａｎｄ  ６７−ｋＤａ  ＧＡＤ，ａｒｅ  ｅａｃｈ  ｅｎｃｏｌｅｄ  ｂｙ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｇｅｎｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ，８９，２１１５−２１１９）により調製し、プラスミドｐＰＩＣ３．５Ｋにサブクローニングした。このようにして得られたｐＰＩＣ３．５Ｋ−ＧＡＤ６５を鋳型として、ＧＡＤ６５−△１８７Ｆ（５’−ＴＴＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＴＴＧＧＡＴＴＡＧＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＧＣ−３’；配列番号１７）と３’ＡＯＸＲ（５’−ＧＧＣＡＡＡＴＧＧＣＡＴＴＣＴＧＡＣＡＴＣＣＴ−３’；配列番号１８）をプライマーとして使用し、ＰＣＲにより増幅した。得られた遺伝子断片をＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩで消化し、上記ｐＴｈｉｏＨｉｓＡのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩサイトに組み込み、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、クローニングした。
（２）この後、以下の材料・反応系を用いてＥｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲを行った。
鋳型プラスミドＤＮＡ；ｐＴｈｉｏＨｉｓＡ−ＧＡＤ６５−△１８７
プライマー；Ｔｒｘ−Ｆ（５’−ＴＴＣＣＴＣＧＡＣＧＣＴＡＡＣＣＴＧ−３’；配列番号１９）
Ｔｒｘ−Ｒ（５’−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣ−３’；配列番号２０）
反応系；｛１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍＭ  ＫＣｌ，１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．０１％ＢＳＡ，０．２ｍＭ  ｅａｃｈ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ，１０ｎｇ／ｍＬ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｔｅｍｐｌａｔｅ，０．３２μＭ  ｐｒｉｍｅｒｓ，２５Ｕ／ｍＬ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ），５０μＭ  ＭｎＣｌ２｝
反応サイクル；９４℃、１分
９４℃、３０秒→５０℃、３０秒→７２℃、４分（２５  ｃｙｃｌｅｓ）
上記ＰＣＲにより生成された断片を精製した後、ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩで消化し、同酵素で消化したｐＴｈｉｏＨｉｓＡベクターに組み込み、プラスミドＤＮＡライブラリーとした。
該プラスミドでＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、Ａｍｐ（アンピシリン）１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地で３７℃で１５時間培養した。
（３）次いで、大腸菌用発現誘導剤としてＩＰＴＧ溶液を塗ったＡｍｐ（アンピシリン）１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地プレートにニトロセルロース膜を敷き、上記形質転換体、ｐＴｈｉｏＨｉｓＡ−ＧＡＤ６５−△１８７／ＪＭ１０９のシングルコロニーを膜上に植菌し、３７℃、１６時間培養してコロニーを形成させた。また、このニトロセルロース膜上のコロニーを他のニトロセルロース膜にレプリカした。
コロニーを形成させたレプリカ膜をｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ｛９０％Ｂ−ＰＥＲ（ＰＩＥＲＣＥ），５００ｍＭ  ＮａＣｌ｝に浸し、２５℃、５０分溶菌した。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）で２回膜を洗い、１０％スキムミルク溶液でブロッキングし、さらに、このニトロセルロース膜を４５℃、１５分間熱処理した。
次いで、１次抗体である２５倍希釈陽性患者血清（ＰＳＩ）と２５℃、１時間反応させた。ＴＢＳ−Ｔで４回洗った後、標識２次抗体（ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ各１０，０００倍希釈）と２５℃、１時間反応させた。ＴＢＳ−Ｔで３回洗った後、ＥＣＬ  ｋｉｔで検出した。
これにより、染色され陽性を示したコロニーは、約７２０００のうち１２８であった。
次いで、この陽性を示した各コロニーに対応する位置にある、上記レプリカされたニトロセルロース膜上の各コロニーを、上記と同様な培地に植菌し、同様の条件で培養した。
得られた各培養物から遠心法により菌体を採取した後、菌体をリゾチーム処理と超音波処理により破砕し、Ｈｉｓ−ｔａｇを特異的に吸着するＮｉ＋＋キレートセファロースカラムで精製し、最終的に６種の精製された熱安定化ＧＡＤ６５−△１８７変異体（Ｆ５２、Ｆ６８、Ｆ１、Ｆ８６、Ｆ８７、Ｆ８４）を得た。これらの各変異体のアミノ酸配列の置換と各遺伝子の塩基配列の変化は上記表１に示すとおりである。
これら各変異体（Ｆ５２、Ｆ６８、Ｆ１、Ｆ８６、Ｆ８７、Ｆ８４）のアミノ酸配列はそれぞれ順に配列番号６、８、１０、１２、１４、１６に示され、その各遺伝子の塩基配列は配列番号５、７、９、１１、１３、１５に示される。
（実施例２）
以下の実施例は、本発明の変異体の１つであるＮ末端側領域が欠失したＧＡＤ６５変異体（ＧＡＤ６５−Δ１８７）のうち特に高い熱安定性を保持する変異体Ｆ５２を変異プライマーとして用いたＰＣＲ法により作成した例を示す。
鋳型として実施例１において得られたｐＴｈｉｏＨｉｓＡ−ＧＡＤ６５−△１８７を使用した。
一方、次の４種類のプライマーを設計し、委託合成した。プライマーＦ１とプライマーＲ１の下線部分は順にＥｃｏＲＩ認識配列とＮｏｔＩ認識配列を、またプライマーＦ２とプライマーＲ２の下線部分は導入する変異を示している。
プライマーＦ１；５’−ＴＴＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＴＴＧＧＡＴＴＡＧＣＡＧＡＣＴＧＧＣ−３’（配列番号２１）
プライマーＦ２；５’−ＴＣＣＴＧＧＴＴＡＧＡＧＡＡＧＣＧＧＧＡＴＴＧＡＴＧＣＡＧＡＡ−３’（配列番号２２）
プライマーＲ１；５’−ＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧ−３’（配列番号２３）
プライマーＲ２；５’−ＴＴＣＴＧＣＡＴＣＡＡＴＣＣＣＧＣＴＴＣＴＣＴＡＡＣＣＡＧＧＡ−３’（配列番号２４）
鋳型遺伝子にプライマーＦ１とプライマーＲ２、およびプライマーＦ２とプライマーＲ１を混合し、それぞれＰＣＲを次の条件で２５サイクル行った。
９５℃  ３０秒  →  ５５℃  ３０秒  →  ７２℃  ２分  （２５ｃｙｃｌｅｓ）
この操作により増幅される２種類のＤＮＡ断片（７００塩基対と５１８塩基対）を単離した。その後、両断片を混合して上述と同様の条件でＰＣＲを行った。この操作により増幅された１２１８塩基対のＤＮＡ断片を単離し、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化した。一方で、タンパク質発現用プラスミドｐＴｈｉｏＨｉｓＡのマルチクローニングサイトにあるＥｃｏＲＩとＮｏｔＩの認識配列をＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化し、上述の制限酵素処理済のＤＮＡ断片をＤＮＡリガーゼで繋いだ。この様にして作成した変異体プラスミドの塩基配列を確認した後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に形質転換し、実施例１と同様な方法で発現させたところ、目的の変異タンパク質が得られた。この変異体タンパク質の抗原性は高い熱安定性を保持していることが明らかとなった。
（実施例３）
＜ＧＡＤ６５変異体のＮ末端側領域欠失による可溶性向上＞
（各発現プラスミドの調製）
（１）ｐＴｈｉｏＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｅｒｏｇｅｎ）をＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ（ＴａＫａＲａ）で消化しＢＡＰ処理したものに、ｈＧＡＤ６５  ｃＤＮＡをｉｎ  ｆｒａｍｅで組み込んだ。また３’−末端に６ｘ  ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｔａｇをコードする遺伝子を付加し、ｐＴｈｉｏＨｉｓＡ−ＧＡＤ６５を構築し、この発現プラスミドでＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、クローニングした。
（２）ｐＰＩＣ３．５Ｋ−ＧＡＤ６５を鋳型として、以下のプライマーを使用してＰＣＲを行った。
Ｇ６５−Δ９５Ｆ；
５’−ＴＡＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＣＴＧＣＧＧＧＴＧＴＧＡＴＧＧＡＧＡＡＡＧＧＣＣＣ−３’（配列番号２５）
３’ＡＯＸＲ；
５’−ＧＧＣＡＡＡＴＧＧＣＡＴＴＣＴＧＡＣＡＴＣＣＴ−３’（配列番号２６）
次いで、得られた断片をＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩで消化し、ｐＴｈｉｏＨｉｓＡのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩサイトに組み込み、発現プラスミドｐＴｈｉｏＨｉｓＡ−ＧＡＤ６５−Δ９５を構築し、該発現プラスミドでＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、クローニングした。
また、実施例１（１）に記載した方法により、ｐＴｈｉｏＨｉｓＡ−ＧＡＤ６５−Δ１８７を構築し、該プラスミドによりＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、クローニングした。
これら各発現プラスミドの構築手法の概要は、図１３に示される。
（可溶性（不溶性）画分の調製）
次いで、目的の遺伝子が導入された菌体を１００ｍｌのＬＢ（１００μｇ／ｍｌ  Ａｍｐ．を含む）培地で３７℃、一晩前培養した。前培養液２０ｍｌを４００ｍｌのＬＢ（１００ｍｇ／ｍｌ  Ａｍｐ．を含む）培地に植え継ぎ、３７℃で振盪培養してＯＤ６００＝０．５に達した時点でＩＰＴＧ（終濃度０．５ｍＭ）を添加し誘導をかけた。発現誘導後２時間の菌体を回収した。菌体を８ｍｌのｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ｛５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０），１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ｝に懸濁し、Ｏｕｔｐｕｔ＝４０％，ｄｕｔｙ  ｃｙｃｌｅ＝３０％，１０分間超音波破砕した。次に、２０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を４０μｌ（ｆｉｎａｌ  ０．１％）加えて、氷上１０分静置した後、１２０００ｇ、４℃、１０分間遠心した。上清を可溶性画分とし、沈殿を８ｍｌの滅菌水に可能な限り再懸濁したものを不溶性画分とした。
これらを１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、抗ＧＡＤモノクローナル（ＭＡＢ３５１）抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ）を用いたウエスタンブロッティングにより発現を確認した。その後、フィルムをデンシトメーターで測定し、各バンドの濃度（相対値）によって可溶化率と不溶化率を計算した。
結果を以下の表２に示す。
【表２】
2006098485.tif 000003
この実験結果から明らかなように、ＧＡＤ６５のＮ末端側領域が欠失することにより、可溶化率が増加し、Ｎ末端より１９７アミノ酸残基まで削除することにより、およそ５割のタンパク質が可溶化出来ることが明らかとなった。
（実施例４）
（１）実施例１で得られた熱安定化ＧＡＤ６５−Δ１８７変異体の中からＦ８６を選び、化学発光ＥＬＩＳＡ法でのＧＡＤ抗原固相化量とＩＤＤＭ陽性患者血清との反応性を測定した。
変異体Ｆ８６は、０．１〜１．０μｇ／ウエル固相化膿度でＧＡＤ陽性患者血清と最大結合値を示した。
また、コントロールとしては、完全長ＧＡＤ６５抗原を用いるのが理想であるが、完全長ＧＡＤ６５は疎水性が高く、抗原性を保持することが難しいことから、ここでは上記ＧＡＤ６５−Δ９５抗原を代わりとして使用した。
ＧＡＤ６５−Δ９５抗原（配列番号４）は、ＧＡＤ６５−Δ９５遺伝子（配列番号３）のｃ−ＤＮＡ断片を発現ベクターｐＨＩＬ−Ｄ２に組み込み、宿主Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＳ１１５株に導入した。得られたコロニーからＧＡＤ６５−Δ９５発現株をスクリーニングし、目的とするＧＡＤ６５−Δ９５発現株を得た。
ＰｉｃｈｉａのＧＡＤ６５−Δ９５発現株はメタノール添加による目的タンパク質生成（ＧＡＤ抗原）を誘導後、培養した菌体を集菌し、得られた菌体をガラスビーズで破砕し、上清部（Ｐｉｃｈｉａ菌体抽出液）をＮｉ＋＋セルローズカラムに吸着させる。目的のＧＡＤ抗原はイミダゾールで溶出される。Ｎｉ＋＋セルローズカラムで精製されたＧＡＤ６５−Δ９５はさらに、抗ＧＡＤモノクローナル抗体カラムで精製した。得られたＧＡＤ６５−Δ９５抗原のＥＬＩＳＡ法での固相化濃度は０．５〜２．０ｍｇ／ウエルでＧＡＤ陽性患者血清と最大結合値を示した。
（２）さらに、ＧＡＤ陽性患者血清  １１４ｕｎｉｔ／ｍｌ（国際糖尿病学会；ＩＤＦによる患者血清の抗体価に基づく）の検体で倍倍希釈した希釈系列をつくり、ＧＡＤ６５−Δ９５抗原とＧＡＤ６５−Δ１８７変異株Ｆ８６抗原を各々固相化した化学発光ＥＬＩＳＡ法でヒト抗ＧＡＤ抗血清に対する反応性を検討した。その結果を表３に示す。また、この結果に基づき、ＧＡＤ６５−Δ９５抗原とＧＡＤ６５−Δ１８７変異株Ｆ８６抗原を各使用した場合における抗ＧＡＤ抗体陽性患者血清の検体希釈曲線を作成した（図７）。
両抗原の固相化条件を同等に調整していないことや変異株では精製法がＮｉ＋＋セルローズカラムのみであることから発光強度に差は認められるが、血清の希釈系列と発光強度との相関では同様の傾向があり、変異株はＧＡＤ６５−Δ９５と同等の抗原性があることが認められた。
【表３】
2006098485.tif 000004
（３）ＧＡＤ６５−Δ１８７変異株Ｆ８６抗原とＧＡＤ６５−Δ９５抗原とのヒト抗ＧＡＤ抗血清の反応性を健常人血清検体（ＧＡＤ陰性）２３名、ＧＡＤ患者検体（ＧＡＤ陽性）６名の臨床検体を用いて比較検討した。その結果を表４に示した。次に抗ＧＡＤ抗体価５．０ｕｎｉｔ／ｍｌを健常人のカット・オフ（ｃｕｔ  ｏｆｆ）値にして両者間の感度と特異性を算出した。以下の表５に示すようにＧＡＤ６５−Δ１８７変異株Ｆ８６のＧＡＤ抗原は対照のＧＡＤ６５−Δ９５に対して感度１００％、特異性９１％と共に９０％以上の結果が得られ、変異株の抗原性はＧＡＤ６５−Δ９５と同等と認められた。
【表４】
2006098485.tif 000005
2006098485.tif 000006
【表５】
2006098485.tif 000007
（４）ＧＡＤ６５−Δ１８７変異体Ｆ８６株から取得したＧＡＤ６５抗原に対する患者陽性血清との反応性は上記（２）で示したが、この結果をもとに抗原の固相化濃度を再検討した。固相化量０．２μｇ／ウエルで最大結合値を得た。抗ＧＡＤ抗体価測定では、カット・オフ値付近の低値領域の（測定値）安定性を重視する必要があることから４０ｕｎｉｔ／ｍｌからの５点希釈系列４０、２０、１０、５、２．５ｕｎｉｔ／ｍｌの濃度設定を行い測定した結果を表６に示す。また、この表６の結果に基づき、抗ＧＡＤ抗体標準検量線を作成した（図１４）。これによれば、２．５ｕｎｉｔ／ｍｌから４０ｕｎｉｔ／ｍｌまで濃度差に応じて十分な発光強度差が得られており、該検量線を用いることにより、測定された発光強度から、患者血清中の抗ＧＡＤ抗体の抗体価を直ちに知ることができる。
【表６】
2006098485.tif 000008
（実施例５）
＜Ｎ末端側領域が欠失したＧＡＤ６５変異体（ＧＡＤ６５−Δ１８７）の抗原性＞
実施例１で得られた、精製されＮ末端側領域が欠失した各ＧＡＤ６５変異体（ＧＡＤ６５−Δ１８７）を固相化緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１３．７ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，０．０５％  ＣＨＡＰＳ）で０．２５μｇ／１００μｌの濃度に希釈し、１００μｌ／ｗｅｌｌずつ９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに分注し、４℃で一晩固相化した。その後、ブロッキング液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，３％  ＢＳＡ）を３００μｌ／ｗｅｌｌずつ９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに分注し、４℃で２時間ブロッキングした。
一次抗体としてＰＳＩ患者血清（７０ｕｎｉｔ／ｍｌ）（国際糖尿病学会；ＩＤＦによる患者血清の抗体価の定義にもとづく）を１００μｌ／ｗｅｌｌずつ９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに分注し、２５℃で１．５時間反応させた。その後、ＴＢＳ−Ｔで３回ｗｅｌｌを洗浄した後、２次抗体としてＡＬＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（５０００倍希釈）を１００μｌ／ｗｅｌｌずつ９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに分注し、２５℃、１時間反応させた。次に、ＴＢＳ−Ｔでｗｅｌｌを５回洗浄したあと、基質としてＣＤＰ−ｓｔａｒ（Ｔｒｏｐｉｘ）を１００μｌ／ｗｅｌｌずつ９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに分注し、２５℃で３０分間反応させた。その後Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＤＩＡ−ＩＡＴＲＯＮ  Ｌｕｍｉｎｏｕｓ  ＣＴ−９０００Ｄ）を用いて発光強度を測定した。
結果を図８に示す。なお、コントロールとして同様の操作を行った、変異のないＧＡＤ６５−Δ１８７（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ；配列番号３２）の抗原性についても合わせて示す。
変異のないＧＡＤ６５−Δ１８７（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ；配列番号３２）と比較して変異体Ｆ６８及びＦ８６では抗原性が増加していた。一方で変異体Ｆ１，Ｆ５２，Ｆ８４およびＦ８７は相対的に抗原性の低下が見られたが、割合は最大でｗｉｌｄ  ｔｙｐｅの半分程度であり、抗原性として十分であることが明らかとなった。
（実施例６）
＜Ｎ末端側領域が欠失したＧＡＤ６５変異体（ＧＡＤ６５−Δ１８７）の熱安定性＞
実施例１で得られた各々の精製したＮ末端側領域が欠失したＧＡＤ６５変異体（ＧＡＤ６５−Δ１８７）を固相化緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１３．７ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，０．０５％  ＣＨＡＰＳ）で０．２５μｇ／１００μｌの濃度に希釈し、４５℃の温湯で０分、１０分、３０分インキュベーションした。その後、１００μｌ／ｗｅｌｌずつ９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに分注し、４℃で一晩固相化した。その後、ブロッキング液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，３％  ＢＳＡ）を３００μｌ／ｗｅｌｌずつ９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに分注し、４℃で２時間ブロッキングした。以下、実施例３と同様の操作を行い、発光強度を測定した。
ＧＡＤ６５変異体の４５℃の熱処理に伴う抗原性の変動を図９に示す。なお、コントロールとして、同様の操作を行った変異のないＧＡＤ６５−Δ１８７（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ；配列番号３２）の抗原性の変動についても合わせて示す。
これによれば、変異のないＧＡＤ６５−Δ１８７（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）の抗原性の半減期は約１分であり（データ未掲載）、１０分の加熱処理によりほぼ完全に抗原性が失われた。これに対して、全ての変異体は半減期が１０分以上であり、３０分の加熱でも変異体Ｆ１，Ｆ６８では約８割が、またＦ８６，Ｆ８７では約５割の抗原性を保持しており、ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅと比較すると３０倍以上熱安定化していた。特筆すべきことに、変異体Ｆ５２の抗原性は加熱に伴い高まり、３０分の加熱では加熱前に比べて１．３倍の抗原性を示した。以上のように、これらの変異体は高い熱安定性を獲得したことが明らかである。
（実施例７）
＜Ｎ末端側領域が欠失したＧＡＤ６５変異体（ＧＡＤ６５−Δ１８７）の４５℃、長時間加熱処理に伴う抗原性の変動＞
実施例１で得られた精製したＮ末端側領域が欠失したＧＡＤ６５変異体（ＧＡＤ６５−Δ１８７）のうち、特に高い熱安定性を示したＦ５２を固相化緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１３．７ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，０．０５％  ＣＨＡＰＳ）で０．２５μｇ／１００μｌの濃度に希釈し、４５℃の温湯で、１時間、３時間、６時間インキュベーションした。その後、１００μｌ／ｗｅｌｌずつ９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに分注し、４℃で一晩固相化した。その後、ブロッキング液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，３％  ＢＳＡ）を３００μｌ／ｗｅｌｌずつ９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに分注し、４℃で２時間ブロッキングした。以下、実施例３と同様の操作を行い、発光強度を測定した。
ＧＡＤ６５−Δ１８７（Ｆ５２）、４５℃の長時間熱処理に伴う抗原性の変動を図１０に示す。なお、コントロールとして同様の操作を行った変異のないＧＡＤ６５−Δ１８７（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ；配列番号３２）の抗原性の変動についても合わせて示す。
変異のないＧＡＤ６５−Δ１８７（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）は１時間の加熱で抗原性は２割前後に低下したが、Ｆ５２は３時間後では９割、６時間後でも７割の抗原性が保持されており、驚くべき高い熱安定性が確保されていることが明らかになった。このような高い熱安定性は当初の予想を遙かに上回るものであった。
（実施例８）
＜Ｎ末端側領域が欠失したＧＡＤ６５変異体（ＧＡＤ６５−Δ１８７）の高温（６０℃）加熱処理に伴う抗原性の変動＞
実施例１で得られた、精製したＮ末端側領域が欠失したＧＡＤ６５変異体（ＧＡＤ６５−Δ１８７）のうち、特に４５℃での加熱処理において高い熱安定性を示したＦ５２を固相化緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１３．７ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，０．０５％  ＣＨＡＰＳ）で０．２５μｇ／１００μｌの濃度に希釈し、６０℃の温湯で、３０分まで時間を変えて加熱処理した。その後、１００μｌ／ｗｅｌｌずつ９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに分注し、４℃で一晩固相化した。その後、ブロッキング液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，３％  ＢＳＡ）を３００μｌ／ｗｅｌｌずつ９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに分注し、４℃で２時間ブロッキングした。以下実験例３と同様の操作を行い、発光強度を測定した。
結果を図１１に示す。なお、コントロールとして同様の操作を行った変異のないＧＡＤ６５−Δ１８７（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ；配列番号３２）の抗原性の変動についても合わせて示す。
これによれば、変異のないＧＡＤ６５−Δ１８７（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）は急速に抗原性が低下したが、Ｆ５２は３０分の加熱処理でも約５割の抗原性が保持されており、驚くべきほど高温に対しても熱安定性が確保されていることが明らかになった。このような高温に対する熱安定性は当初の予想を遙かに上回るものであった。
（実施例９）
＜Ｎ末端側領域が欠失したＧＡＤ６５変異体（ＧＡＤ６５−Δ１８７）の１０％メタノール存在下での加熱処理に伴う抗原性＞
実施例３で得られた精製したＮ末端側領域が欠失したＧＡＤ６５変異体（ＧＡＤ６５−Δ１８７）のうち、特に６０℃での加熱処理において高い熱安定性を示したＦ５２を１０％メタノールを含む固相化緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１３．７ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，０．０５％  ＣＨＡＰＳ）で０．２５μｇ／１００μｌの濃度に希釈し、４５℃の温湯で、３０分まで時間を変えて加熱処理した。その後、１００μｌ／ｗｅｌｌずつ９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに分注し、４℃で一晩固相化した。その後、ブロッキング液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，３％  ＢＳＡ）を３００μｌ／ｗｅｌｌずつ９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに分注し、４℃で２時間ブロッキングした。以下実験例３と同様の操作を行い、発光強度を測定した。
ＧＡＤ６５変異体Ｆ５２の加熱処理に伴う抗原性の変動を図１２に示す。
なお、コントロールとして同様の操作を行った変異のないＧＡＤ６５−Δ１８７（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ；配列番号３２）の抗原性の変動についても合わせて示す。
変異のないＧＡＤ６５−Δ１８７（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）は急速に抗原性が低下したが、ＧＡＤ６５変異体Ｆ５２は３０分の１０％メタノール存在下の加熱処理でも元のままの抗原性が保持されており、熱安定性が保持されていることが明らかになった。このような有機溶媒存在下でも抗原性が保持されていることは、実用上において極めて好都合である。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明によれば、患者血清中の膵臓ランゲルハンス島β細胞特異的自己抗体に対する抗原性を維持し、かつ熱安定化したＧＡＤ６５変異体を提供することが可能となり、また、該抗原性及び熱安定性を保持しつつ、可溶化されたＧＡＤ６５変異体も提供することが可能となった。
これらのＧＡＤ６５変異体を用いることにより、患者血清中の膵臓ランゲルハンス島β細胞特異的自己抗体を、正確かつ感度よく検出及び定量することができ、このため、これらＧＡＤ６５変異体はインスリン依存性糖尿病の診断薬として極めて有用である。しかも上記可溶化されたＧＡＤ変異体は、分離、精製がし易く、そのため純度の高いものが得られる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
2006098485.tif 000009
2006098485.tif 000010
2006098485.tif 000011
2006098485.tif 000012
2006098485.tif 000013
2006098485.tif 000014
2006098485.tif 000015
2006098485.tif 000016
2006098485.tif 000017
2006098485.tif 000018
2006098485.tif 000019
2006098485.tif 000020
2006098485.tif 000021
2006098485.tif 000022
2006098485.tif 000023
2006098485.tif 000024
2006098485.tif 000025
2006098485.tif 000026
2006098485.tif 000027
2006098485.tif 000028
2006098485.tif 000029
2006098485.tif 000030
2006098485.tif 000031
2006098485.tif 000032
2006098485.tif 000033
2006098485.tif 000034
2006098485.tif 000035
2006098485.tif 000036
2006098485.tif 000037
2006098485.tif 000038
2006098485.tif 000039
2006098485.tif 000040
2006098485.tif 000041
2006098485.tif 000042
2006098485.tif 000043
2006098485.tif 000044
2006098485.tif 000045
2006098485.tif 000046
2006098485.tif 000047
2006098485.tif 000048
2006098485.tif 000049
2006098485.tif 000050
2006098485.tif 000051
2006098485.tif 000052
2006098485.tif 000053
2006098485.tif 000054
2006098485.tif 000055
2006098485.tif 000056
2006098485.tif 000057
2006098485.tif 000058
2006098485.tif 000059
2006098485.tif 000060
2006098485.tif 000061
2006098485.tif 000062
2006098485.tif 000063
2006098485.tif 000064
2006098485.tif 000065
2006098485.tif 000066
2006098485.tif 000067
2006098485.tif 000068
2006098485.tif 000069
2006098485.tif 000070
2006098485.tif 000071
2006098485.tif 000072
2006098485.tif 000073
2006098485.tif 000074
2006098485.tif 000075
2006098485.tif 000076
2006098485.tif 000077
2006098485.tif 000078
2006098485.tif 000079
2006098485.tif 000080
2006098485.tif 000081
2006098485.tif 000082
2006098485.tif 000083
2006098485.tif 000084
2006098485.tif 000085
2006098485.tif 000086
2006098485.tif 000087
2006098485.tif 000088
2006098485.tif 000089
2006098485.tif 000090
2006098485.tif 000091
2006098485.tif 000092
2006098485.tif 000093
2006098485.tif 000094
2006098485.tif 000095
【図１】
2006098485.tif 000096
【図２】
2006098485.tif 000097
【図３】
2006098485.tif 000098
【図４】
2006098485.tif 000099
【図５】
2006098485.tif 000100
【図６】
2006098485.tif 000101
【図７】
2006098485.tif 000102
【図８】
2006098485.tif 000103
【図９】
2006098485.tif 000104
【図１０】
2006098485.tif 000105
【図１１】
2006098485.tif 000106
【図１２】
2006098485.tif 000107
【図１３】
2006098485.tif 000108
【図１４】
2006098485.tif 000109
【図１５】
2006098485.tif 000110
【国際調査報告】
2006098485.tif 000111
2006098485.tif 000112
2006098485.tif 000113
2006098485.tif 000114