(57)【要約】本発明によれば、早期に、安全性の高い重症急性呼吸器症候群の予防または治療用組成物を提供することができる。すなわち本発明は、カテキン類を含有してなる重症急性呼吸器症候群の予防または治療用組成物であって、該組成物中の総カテキン類の重量に対するエピガロカテキンガレートの重量の比率が０．３〜０．８であることを特徴とする組成物を提供するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カテキン類を含有してなる重症急性呼吸器症候群の予防または治療用組成物であって、該組成物中の総カテキン類の重量に対するエピガロカテキンガレートの重量の比率が０．３〜０．８であることを特徴とする、組成物。
【請求項２】
更に、上記組成物中の総カテキン類の重量に対する総エステル型カテキン類の重量の比率が０．５〜０．９５であることを特徴とする、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
食品または医薬品である、請求項１または２記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、カテキン類を特定の比率範囲で含有することを特徴とする、重症急性呼吸器症候群の予防または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】  重症急性呼吸器症候群（Ｓｅｖｅｒｅ  Ａｃｕｔｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＳＡＲＳ）は、２００２年１１月に中国大陸南部で初めて発見され、２００３年３月に香港で爆発的、大規模に流行した。２００２年１１月１日から２００３年６月１８日までの間に、各国から世界保健機関（ＷＨＯ）にＳＡＲＳに疑わしい８，４６５例が報告され、そのうち８０１人の死亡が確認された。【０００３】  この致命的な呼吸器疾病であるＳＡＲＳは、コロナウイルスの一種であるＳＡＲＳウイルス（Ｓｅｖｅｒｅ  Ａｃｕｔｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｃｏｒｏｎａ  Ｖｉｒｕｓ（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ））によって引き起こされることが分かっている。現在、ＳＡＲＳの治療には、ＳＡＲＳウイルスに対して抗複製作用を有する、リバビリン、６−アザウリジン、ピラゾフリン（Ｐｙｒａｚｏｆｕｒｉｎ）、マイコフェノール酸、グリシルリジンなどといった薬品が使用されている（例えば、非特許文献１参照）。また、これまでの研究の中では、漢方薬品の甘草根から抽出される活性物質であるグリシルリジン（例えば、非特許文献２参照）が、最も強い抗コロナウイルス複製作用を有していると考えられている。
【非特許文献１】Ｌａｎｃｅｔ．２００３  Ｊｕｎ  １４；３６１（９３７４）：２０４５−６
【非特許文献２】Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ．２００４  Ａｐｒ  ９；１０３３（１）：１８３−６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】  しかしながら現在使用されている薬品には、例えば高血圧症や糖尿病といった合併症を引き起こす可能性がある等の問題点があることから、ＳＡＲＳを有効に治療できる、更なる新薬の開発が望まれている。【０００５】  また各国の科学者たちにより、薬物スクリーニング技術等を用いて、ＳＡＲＳを有効に治療できる化合物の探索が積極的に行われている。しかし、化合物の安全性確認等に要する時間を考慮すると、ＳＡＲＳを有効に治療できる新薬の完成にいたるまでの道のりは、依然として遠いものと考えられる。【０００６】  従って、本発明の目的は、出来る限り早期に、安全性の高いＳＡＲＳの予防または治療用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  本発明者らは、天然物から抗ＳＡＲＳウイルス複製作用を有する物質を探索し、食品抽出物の選別を行ったところ、緑茶抽出物から得られた、カテキン類を特定の比率範囲で含有する組成物が、抗ＳＡＲＳウイルス複製作用を有することを見出した。【０００８】  すなわち本発明は、
〔１〕カテキン類を含有してなる重症急性呼吸器症候群の予防または治療用組成物であって、該組成物中の総カテキン類の重量に対するエピガロカテキンガレートの重量の比率が０．３〜０．８であることを特徴とする、組成物；
〔２〕更に、上記組成物中の総カテキン類の重量に対する総エステル型カテキン類の重量の比率が０．５〜０．９５であることを特徴とする、請求項１記載の組成物；ならびに
〔３〕食品または医薬品である、請求項１または２記載の組成物
に関する。
【発明の効果】
【０００９】  本発明の組成物は、ＳＡＲＳウイルスの増殖を抑制する効果を有しているため、本発明によりＳＡＲＳの予防および治療用組成物を提供することができる。また、本発明の組成物に含有されるカテキン類は既に食用としての安全性が確認されており、また、茶葉などの既にある天然物からの調製が可能であるため、早期に、安全性の高いＳＡＲＳの予防および治療用組成物を提供することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染Ｖｅｒｏ  Ｅ６細胞の病理学的変化の観察結果を示す。
【図２】図２は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染Ｖｅｒｏ  Ｅ６細胞の免疫蛍光染色の結果を示す。
【図３】図３は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染Ｖｅｒｏ  Ｅ６細胞培養液中のＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来ＲＮＡの発現を示した、ＲＴ−ＰＣＲ産物の電気泳動像である。
【図４】図４は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染Ｖｅｒｏ  Ｅ６細胞抽出液中のＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来タンパク質の発現を示した、ウエスタンブロット像である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】  本発明の組成物は、カテキン類を特定の比率範囲で含有することを特徴とする。具体的には、本発明の組成物は、組成物中の総カテキン類の重量に対するエピガロカテキンガレートの重量の比率が０．３〜０．８であることを特徴とする。この特徴のために、本発明の組成物はＳＡＲＳウイルスに対する増殖抑制効果を有し、ＳＡＲＳに対する有効な予防または治療用組成物として使用することが可能である。【００１２】  本発明において「カテキン類」とは、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、およびエピガロカテキンガレートからなる群より選択される少なくとも１種類以上の化合物のことをいう。【００１３】  また、本発明において「エステル型カテキン類」とは、カテキンガレート、エピカテキンガレート、およびエピガロカテキンガレートからなる群より選択される少なくとも１種類以上の化合物のことをいう。【００１４】  更に、本発明において「総カテキン類」とは、組成物中に含まれる全てのカテキン類を指す。また、「総エステル型カテキン類」とは、組成物中に含まれる全てのエステル型カテキン類を指す。【００１５】  本発明において、組成物中の各カテキン類の含有比率は、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００系液体クロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ｓｅｒｉｏｕｓ）を用いて分析する。【００１６】  本発明の組成物は、ＳＡＲＳウイルスに対する増殖抑制効果の観点から、組成物中の総カテキン類の重量に対するエピガロカテキンガレートの重量の比率が０．３〜０．８であることが必要であり、０．５〜０．７であることが好ましい。また、組成物中の総カテキン類の重量に対する総エステル型カテキン類の重量の比率は０．５〜０．９５であることが好ましく、０．６〜０．８であることがより好ましい。【００１７】  また、上記と同様の観点から、本発明の組成物は、総カテキン類の含有量が３０重量％以上であることが好ましく、５０重量％以上であることがより好ましい。【００１８】  本発明の組成物は、以下に記載するようにカテキン類を含有する天然物から抽出することによって得ることも出来るが、これに限定されるものではなく、得られた組成物が本発明の特定の比率範囲内でカテキン類を含有していれば良い。例えば、既に製品として市販されている各カテキン類製品を用いて、本発明の特定の比率範囲となるように各カテキン類を配合することによって本発明の組成物を得ることも出来る。【００１９】  本発明に使用されるカテキン類を含有する天然物としては、カテキン類を含有するものであれば特に限定されないが、例えば、茶葉などが挙げられる。【００２０】  茶葉としては、例えば、緑茶葉、烏龍茶葉、紅茶葉などが挙げられる。茶葉を用いる場合、茶葉そのままを用いてもよいし、粉砕して用いてもよい。【００２１】  天然物からのカテキン類の抽出は、当該分野の従来技術に従って行うことが出来る。抽出方法としては、例えば、茶葉または粉砕した茶葉などを、水、熱水、メタノール、エタノール、プロパノールなどの一価アルコールまたはグリセリンなどの多価アルコールを用いて抽出する方法、茶葉または粉砕した茶葉などを、水、熱水、メタノール、エタ��ール、プロパノールなどの一価アルコールまたはグリセリンなどの多価アルコールを用いて抽出した画分に酢酸エチル、アセトンなどの溶媒を加えて分画する方法などが挙げられる。【００２２】  また、上記のように得られたカテキン類について、例えば極性樹脂カラムを使用して、各カテキン類を分離、精製することが出来る。更に、各カテキン類の上記精製品をブレンドすることによってエピガロカテキンガレートやこれを含むエステル型カテキン類の組成物中の含有比率を所望の通りに調整することができ、本発明の特定の比率範囲でカテキン類を有する組成物を得ることが出来る。【００２３】  上記のようにして得られた本発明の組成物は、ＳＡＲＳの予防または治療目的のためにそのまま単独で使用することも出来るが、食品または医薬品の形態で使用することもできる。本発明における食品には、食品添加物なども含まれる。【００２４】  食品としての本発明の組成物は、例えば、以下に列挙されるような種類の食品に対して、製造後の食品が本発明における特定の比率範囲でカテキン類を含有するように、各カテキン類を配合して製造することができる。【００２５】  本発明に使用される食品としては、乾燥食品、サプリメントなどの固形食品、また、清涼飲料、ミネラルウォーター、嗜好飲料、アルコール飲料などの液状食品が挙げられる。固形食品としては、例えば、タブレット、ムース、ゼリー、冷菓、飴、チョコレート、クラッカー、ケーキ、パン、麺、ガム、スナックなどの菓子、ハム、ソーセージなどの畜産加工品、蒲鉾などの水産加工品などが挙げられる。また、液状食品としては、例えば、緑茶、ウーロン茶、紅茶、ハーブティーなどの茶類、濃縮果汁、濃縮還元ジュース、ストレートジュース、果実ミックスジュース、果肉入り果実ジュース、果汁入り飲料、果実・野菜ミックスジュース、野菜ジュース、炭酸飲料、清涼飲料、乳飲料、乳酸菌飲料、コーヒー飲料、日本酒、ビール、ワイン、カクテル、焼酎、ウイスキーなどが挙げられる。【００２６】  医薬品としての本発明の組成物は、例えば、経口投与に適した公知の有機または無機の担体、賦形剤、結合剤、安定剤などに対して、製造後の医薬品が本発明における特定の比率範囲でカテキン類を含有するように各カテキン類を配合して製造することができる。【００２７】  医薬品の形態としては、溶液、懸濁物、粉末、固体成型物などのいずれでもよく、その剤型としては、錠剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、ドリンク剤、注射剤、貼付剤、坐剤、吸入剤などが挙げられる。【００２８】  上記のように、本発明の組成物は、そのまま単独で、あるいは食品または医薬品の形態で、ＳＡＲＳの予防または治療目的のためにヒトを含む哺乳動物に投与することができる。【００２９】  本発明の所望の効果を得るための本発明の組成物の投与量は、通常、好ましくは１日あたり１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは、１日あたり５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重である。ただし、本発明における投与量は、かかる範囲にのみ限定されるものではなく、本発明の所望の効果が得られるように、種差、性別、年齢、または個体差、ＳＡＲＳ感染の有無、症状、所望する効果の程度等を考慮して、個別具体的に投与量を適宜設定すれば良い。���発明の組成物の投与時期、投与期間などについても同様に、個別具体的に適宜設定することができる。【００３０】  本発明の組成物の投与方法としては、特に限定されないが、好ましくは経口投与である。【００３１】  本発明の組成物に含有されるカテキン類は既に高い安全性が示されており、既にヒトが摂取する食品の食品添加物としても広範囲に使用されている。そのため、本発明の組成物は、安全かつ効果的に、ＳＡＲＳの予防または治療目的のために使用することができる。【００３２】  以下に実施例を示して本発明を説明するが、本発明の範囲はこれらにより限定されるものではない。
【実施例】
【００３３】実施例１：カテキン類含有組成物の調製および該組成物の各カテキン類含有比率の測定
緑茶葉を熱水で抽出した緑茶抽出物から、当該分野で公知であるカフェインの除去技術（特開平６−１４２４０５、特開平７−１６０５７）を用いてカフェインを除去し、カテキン類を主成分とする緑茶抽出物を得た。更に、極性樹脂カラムを使用して各カテキン類を分離、精製し、その精製品を、本発明の特定の比率範囲になるようにブレンドすることにより、本発明のカテキン類含有組成物（組成物Ａ〜Ｆ）を得た。【００３４】  得られた組成物Ａ〜Ｆ各１ｍｇを、１ｍｌの溶離液（２５％メタノール、７４．９％脱イオン水（ＭｉｌｌｉＱ，１８．２ＭΩ）、０．１％ギ酸（ｖ／ｖ））に溶解させ（１ｍｇ／ｍｌ）、０．４５μｍのフィルターで濾過し、成分比率分析用試料とした。得られた試料１μｌを、カラム（Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ８  ５μｍ、４．６×１５０ｍｍ）を備え付けたＡｌｉｌｅｎｔ  １１００系液体クロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ｓｅｒｉｏｕｓ）に添加し、０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で上記溶離液を用いて４０℃で３０分間、溶出した。得られた分析チャートを、各カテキン類の標準品のものと比較することにより、各組成物中の各カテキン類含有比率を測定した。【００３５】  その結果を、以下表１および表２に示す。表１は、組成物Ａ〜Ｆ中の、各カテキン類含有量（重量％、組成物乾燥重量あたり）を示す。また、表２は、組成物Ａ〜Ｆ中の、総カテキン量に対する各エステル型カテキン類含有量の比率（各エステル型カテキン重量／総カテキン重量）を示す。【００３６】
【表１】
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【００３７】
【表２】
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【００３８】試験例１：体内でのＳＡＲＳ−ＣｏＶ増殖抑制作用試験
本発明の組成物をあらかじめ投与したカニクイザルにＳＡＲＳ−ＣｏＶを感染させることにより、本発明の組成物の、体内でのＳＡＲＳ−ＣｏＶ増殖抑制作用について調べた。【００３９】  ６匹のカニクイザルを準備した。３匹に対しては、実施例１に記載の方法により調製した本発明のカテキン類含有組成物を体重１ｋｇあたり５０ｍｇの用量で２週間毎日経口投与し、試験群とした。他の３匹には組成物を投与せず、対照群とした。経口投与開始後２週間目に、ＳＡＲＳ患者から単離し、ミドリザル腎臓由来のＶｅｒｏ  Ｅ６細胞で培養、分離、濃縮したＳＡＲＳ−ＣｏＶウイルスを試験群および対照群両方のカニクイザルに経鼻・経気管投与した。カニクイザルは１匹ずつ陰圧のキャビネット内で飼育し、症状の変化を毎日観察した。定期的に検体を採取し、死亡後は解剖して病理所見を検討した。【００４０】  その結果、対照群については、３匹とも感染２日後から鼻、咽頭でＳＡＲＳウイルスが検出された。また、対照群の３匹中２匹は肺胞にびまん性の障害を生じ、感染３日後に死亡した。残りの１匹は感染４日後より肺胞にびまん性の障害を生じ、５日後に死亡した。一方、試験群については、３匹中１匹に鼻、咽頭でＳＡＲＳ−ＣｏＶが検出され、感染１０日後に死亡したが、試験群の他の２匹にはＳＡＲＳ−ＣｏＶは検出されず、死亡もなかった。【００４１】  以上の結果から、本発明の組成物を経口投与することによってＳＡＲＳ−ＣｏＶの感染を抑制できることが明らかとなり、本発明の組成物の、抗ＳＡＲＳウイルス増殖における有効性が確認された。【００４２】試験例２：インビトロにおけるＳＡＲＳ−ＣｏＶ増殖抑制作用試験【００４３】  本発明の組成物をあらかじめ添加した培養細胞にＳＡＲＳ−ＣｏＶを感染させることにより、本発明の組成物の、インビトロでのＳＡＲＳ−ＣｏＶ増殖抑制作用について調べた。【００４４】ｉ）細胞病理学的変化の観察
４×１０４個のミドリザル腎臓細胞（Ｖｅｒｏ  Ｅ６：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＡＴＣＣより提供）を４８ウェルの細胞培養皿に播種し、ＣＯ２気相下でインキュベートした。次いで、実施例１に記載の方法により調製した本発明のカテキン類含有組成物を７８０μｇ／ｍｌ、３９０μｇｍｌ、１９５μｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ培地に添加し、これらをそれぞれ試験区１〜３とした。また、カテキン類含有組成物を添加しないものを対照区とした。組成物の添加から１時間後に、Ｖｅｒｏ  Ｅ６細胞にＳＡＲＳ−ＣｏＶ（香港株。台湾台北疾病管制局より提供）を０．１ウイルス重複感染度（Ｍ．Ｏ．Ｉ）で感染させた。【００４５】  感染から４８時間後に、位相差顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｒ）を利用してＶｅｒｏ  Ｅ６細胞の病理学的変化（ＣＰＥ）を観察した。図１に示される通り、試験区１〜３においては、Ｖｅｒｏ  Ｅ６細胞は生存したままで通常通り培養皿の底に付着固定されており、形態学的な変化も伴っていなかった。これに対して、対照区においては、Ｖｅｒｏ  Ｅ６細胞は培養液に浮遊し、全て死滅していることが観察された。【００４６】ｉｉ）免疫蛍光分析によるＳＡＲＳウイルスタンパク質の発現解析
上記と同様に、試験区１〜３、対照区のＶｅｒｏ  Ｅ６細胞を準備し、組成物の添加から１時間後に、ＳＡＲＳ−ＣｏＶを０．１Ｍ．Ｏ．Ｉで感染させた。【００４７】  感染から４８時間後に細胞を収集し、１０％ホルムアルデヒド、およびメチル・アルコールとアセトンを半分ずつ混合した溶液を用いて細胞を固定した後、回復期のＳＡＲＳ患者から得た抗血清を用いて、細胞内のＳＡＲＳウイルス抗原に対する免疫蛍光染色を行った。【００４８】  細胞内のＳＡＲＳウイルス抗原が発する蛍光を、倒立型蛍光レーザー顕微鏡（ＺｅｉｓｓＲ）を用いて観察した。図２に示されるように、対照区のＶｅｒｏ  Ｅ６細胞は全てＳＡＲＳウイルス抗原の蛍光を示したのに対し、本発明のカテキン類含有組成物で処理した試験区１〜３の細胞は蛍光を示さなかった。【００４９】ｉｉｉ）ＲＴ−ＰＣＲによるＳＡＲＳウイルスｍＲＮＡの発現解析
上記と同様に、試験区１〜３、対照区のＶｅｒｏ  Ｅ６細胞を準備し、組成物の添加から１時間後に、ＳＡＲＳ−ＣｏＶを０．１Ｍ．Ｏ．Ｉで感染させた。【００５０】  感染から４８時間後に細胞培養液を収集し、この細胞培養液からＱＩＡａｍｐＲＶＩＲＡＬＲＮＡ  ＭＩＮＩ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてウイルスＲＮＡを単離した。１μｌのウイルスＲＮＡを用いて、ＱｉａｇｅｎＲ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔを使用してＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲの際のＳＡＲＳウイルス特異的プライマーとしては、５’プライマー：
ＣＴＡＡＣＡＴＧＣＴＴＡＧＧＡＴＡＡＴＧＧ、および３’プライマー：
ＣＡＧＧＴＡＡＧＣＧＴＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣを使用した。ＲＴ−ＰＣＲの反応条件は以下の通りである：まず、逆転写反応として、５０℃で３０分反応させた。次に９５℃で１５分の反応を１サイクル、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で１５分の反応を２５サイクル、７２℃で１０分の反応を１サイクル行った。【００５１】  ＲＴ−ＰＣＲ反応後の産物を２％アガロースゲル電気泳動により解析した結果、図３に示されるように、対照区では３６８ｂｐの位置にバンドが確認された。これに対して、試験区１〜３ではバンドは確認できなかった。【００５２】ｉｖ）ウエスタンブロット法によるＳＡＲＳウイルスタンパク質の発現解析
上記と同様に、試験区１〜３、対照区のＶｅｒｏ  Ｅ６細胞を準備し、組成物の添加から１時間後に、ＳＡＲＳ−ＣｏＶを０．１Ｍ．Ｏ．Ｉで感染させた。【００５３】  感染から４８時間後に細胞抽出液を採取した。この細胞抽出液から得られた１０μｇのタンパク質を、電気泳動した後にナイロンメンブレン上に転写させ、回復期のＳＡＲＳ患者由来抗血清を用いてウエスタンブロットを行い、Ｘ線によりシグナルを観察した。【００５４】  その結果、図４に示されるように、対照区ではＳＡＲＳウイルスのスパイクタンパク質（Ｓ）およびヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）の存在を示すシグナルが確認されたのに対して、試験区１〜３ではシグナルは確認されなかった。【００５５】  ｉ）の結果により、本発明のカテキン類含有組成物がＳＡＲＳウイルス感染により生じる細胞病理変化を有効に抑制する効果を有することが明らかとなった。また、ｉｉ）〜ｉｖ）の結果により、その効果が分子生物学的にも確認された。以上のように、本発明の組成物は細胞へのＳＡＲＳ感染を有効に抑制できることが、インビトロ実験においても明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５６】  本発明によれば、ＳＡＲＳウイルスの増殖を抑制する効果のある、安全性の高いＳＡＲＳの予防および治療用組成物を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００５７】  配列番号：１は、ＳＡＲＳウイルスＲＮＡに対する５’プライマーの配列である。【００５８】  配列番号：２は、ＳＡＲＳウイルスＲＮＡに対する３’プライマーの配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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