(57)【要約】ヒトヘパリン／ヘパラン硫酸結合タンパク質をコードする遺伝子のイントロンを含む配列に設定したプライマーを使用する増幅段階を含む多段階ポリメラーゼ連鎖反応を用いることを特徴とする、当該遺伝子の繰返し多型の検出方法；（１）（ａ）ヒトヘパリン／ヘパラン硫酸結合タンパク質をコードする遺伝子の第三イントロンを含む配列に設定したフォワードプライマーと、（ｂ）第四エクソンに設定したリバースプライマー、とから成る第一段階の増幅用プライマー；ならびに（２）（ｃ）第四エクソンに設定したフォワードプライマーと、（ｄ）第四エクソンに設定したリバースプライマーと、から成る第二段階の増幅用プライマー、を含んで成る上記検出方法のための試薬。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトヘパリン／ヘパラン硫酸結合タンパク質をコードする遺伝子のイントロンを含む配列に設定したプライマーを使用する増幅段階を含む多段階ポリメラーゼ連鎖反応を用いることを特徴とする、当該遺伝子の繰返し多型の検出方法。
【請求項２】
ヒトヘパリン／ヘパラン硫酸結合タンパク質をコードする遺伝子の第三イントロンを含む配列に設定したプライマーを使用する増幅段階を含む多段階ポリメラーゼ連鎖反応を用いることを特徴とする、当該遺伝子の繰返し多型の検出方法。
【請求項３】
ヒトヘパリン／ヘパラン硫酸結合タンパク質をコードする遺伝子の第三イントロンを含む配列に設定したフォワードプライマーと第四エクソンに設定したリバースプライマーを用いて第一段階の増幅を行い、第四エクソンに設定したフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて第二段階の増幅を行う二段階ポリメラーゼ連鎖反応を用いることを特徴とする、当該遺伝子の繰返し多型の検出方法。
【請求項４】
第一段階の増幅に用いるフォワードプライマーを配列番号１９の１〜４９１の配列範囲に設定し、第一段階の増幅に用いるリバースプライマーを配列番号９の７６４〜９０２の配列範囲に設定し、第二段階の増幅に用いるフォワードプライマーを配列番号１９の４８４〜７４６の配列範囲に設定し、第二段階の増幅に用いるリバースプライマーとして配列番号１９の配列範囲７６４〜９０２の範囲に、第一段階に用いたものと同じか、より５′−側に対応する部分に設定したものを用いることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
第一段階の増幅に用いるフォワードプライマーとして配列番号１〜６に記載の配列を持つＤＮＡの内いずれか一つを用い、第一段階の増幅に用いるリバースプライマーとして配列番号７〜１２に記載の配列を持つＤＮＡの内いずれか一つを用い、第二段階の増幅に用いるフォワードプライマーとして配列番号１３〜１８に記載の配列を持つＤＮＡの内いずれか一つを用い、第二段階の増幅に用いるリバースプライマーとして配列番号７〜１２に記載の配列を持つＤＮＡで、第一段階に用いたものと同じか、より５′−側に対応するものの内のいずれか一つを用いることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第一段階の増幅に用いるフォワードプライマーとして配列番号５に記載の配列を持つＤＮＡを用い、第一段階の増幅に用いるリバースプライマーとして配列番号１２に記載の配列を持つＤＮＡを用い、第二段階の増幅に用いるフォワードプライマーとして配列番号１７に記載のＤＮＡを用い、第二段階の増幅に用いるリバースプライマーとして配列番号７に記載のＤＮＡを用いることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ポリメラーゼ連鎖反応産物の分析方法が、アガロース電気泳動法である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ポリメラーゼ連鎖反応産物の分析方法が、キャピラリー電気泳動である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ポリメラーゼ連鎖反応産物の分析方法が、ポリアクリルアミドゲル電気泳動である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ヒトヘパリン／ヘパラン硫酸結合タンパク質をコードする遺伝子の繰り返し多型を検出するための試薬であって、
（１）（ａ）ヒトヘパリン／ヘパラン硫酸結合タンパク質をコードする遺伝子の第三イントロンを含む配列に設定したフォワードプライマーと、（ｂ）第四エクソンに設定したリバースプライマー、とから成る第一段階の増幅用プライマー；ならびに
（２）（ｃ）第四エクソンに設定したフォワードプライマーと、（ｄ）第四エクソンに設定したリバースプライマーと、から成る第二段階の増幅用プライマー；
を含んで成る試薬。
【請求項１１】
第一段階の増幅に用いるフォワードプライマー（ａ）が、配列番号１９の１〜４９１の配列範囲に設定されており、
第一段階の増幅に用いるリバースプライマー（ｂ）が、配列番号９の７６４〜９０２の配列範囲に設定されており、
第二段階の増幅に用いるフォワードプライマー（ｃ）が、配列番号１９の４８４〜７４６の配列範囲に設定されており、そして
第二段階の増幅に用いるリバースプライマー（ｄ）が、配列番号１９の配列範囲７６４〜９０２の範囲に設定されており、且つ前記第一段階の増幅に用いるリバースプライマーと同じであるか、またはそれより５′−側に対応する部分に設定されている、
ことを特徴とする請求項１０に記載の試薬。
【請求項１２】
第一段階の増幅に用いるフォワードプライマー（ａ）が、配列番号１〜６に記載の配列を持つＤＮＡの内いずれか一つであり、
第一段階の増幅に用いるリバースプライマー（ｂ）が、配列番号７〜１２に記載の配列を持つＤＮＡの内いずれか一つであり、
第二段階の増幅に用いるフォワードプライマー（ｃ）が、配列番号１３〜１８に記載の配列を持つＤＮＡの内いずれか一つであり、そして
第二段階の増幅に用いるリバースプライマー（ｄ）が、配列番号７〜１２に記載の配列を持つＤＮＡの内いずれか一つであり、且つ前記第一段階の増幅に用いるリバースプライマーと同じであるか、またはそれより５′−側に対応する部分に設定されている、
ことを特徴とする請求項１１に記載の試薬。
【請求項１３】
第一段階の増幅に用いるフォワードプライマー（ａ）が、配列番号５に記載の配列を持つＤＮＡであり、
第一段階の増幅に用いるリバースプライマー（ｂ）が、配列番号１２に記載の配列を持つＤＮＡであり、
第二段階の増幅に用いるフォワードプライマー（ｃ）が、配列番号１７に記載の配列を持つＤＮＡであり、そして
第二段階の増幅に用いるリバースプライマー（ｄ）が、配列番号７に記載の配列を持つＤＮＡである、
ことを特徴とする請求項１２に記載の試薬。
【請求項１４】
請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の試薬を含んで成る、ヘパリン／ヘパラン硫酸結合タンパク質の繰返し多型に基づく、糖尿病診断剤。
【請求項１５】
糖尿病が１型糖尿病である請求項１４に記載の糖尿病診断剤。
【請求項１６】
糖尿病が２型糖尿病である請求項１４に記載の糖尿病診断剤。
【請求項１７】
請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の試薬を含んで成る、ヘパリン／ヘパラン硫酸結合タンパク質の繰返し多型に基づく、動脈硬化症の診断剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、疑似遺伝子を多く有する特定の遺伝子の翻訳領域に存在する繰返し多型を測定する簡便な方法、及びその測定結果の疾病診断への応用に関する。より具体的には、ヒトヘパリン／ヘパラン硫酸結合タンパク質のＡＡＧＧＣＣ配列（タンパク質としてはＬｙｓ−Ａｌａに対応）の繰返し多型（３から６回）の簡便な測定方法、及びその糖尿病及び動脈硬化症の診断への応用に関する。
【背景技術】  糖尿病及び動脈硬化症は代表的な生活習慣病であり、それぞれ重篤な疾患の危険因子として知られている。例えば、糖尿病は網膜症や腎症のリスクが増え、動脈硬化は脳梗塞や心筋梗塞のリスクを高めることが知られる。従って、これらの疾患に罹る前にそのリスクを予想できれば、生活習慣の改善等適切な予防措置を取ることができると考えられる。すなわち、糖尿病及び動脈硬化症の罹患を予測できる方法の開発が強く望まれている。
ヒトヘパリン／ヘパラン硫酸結合タンパク質（以後ＨＩＰと略記）は１９９６年に二つのグループにより独立にｃＤＮＡがクローニングされた分子量約１８，０００の塩基性タンパク質である（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１，１１８１７，１９９６；Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １３０５，１０５，１９９６）。一方のグループは、ヒト心臓のｃＤＮＡライブラリーをランダムに配列解析することによりクローニングしており、この分子がマウスやラットのリボソームタンパク質Ｌ２９に配列が良く似ていることから、ｈｕｍａｎ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ２９（ｈＲＰＬ２９）と名付けた（Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １３０５，１０５，１９９６）。もう一方のグループは、細胞表面に存在するＨＩＰ分子の部分配列に対応する縮重プライマーによりＲＬ９５細胞の全ＲＮＡよりＲＴ−ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片配列によりＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによりこの分子をクローニングしている（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１，１１８１７，１９９６）。
ヒト、カニクイザル、ブタ、マウス、及びラットのＲＰＬ２９タンパク質の配列を図１に並べて示したが、マウス、ラット及びブタとの配列上の大きな違いは、ヒトのタンパク質中にはＬｙｓ−Ａｌａのジペプチド構造が繰り返した特徴的な配列がある点である。従って、ヒトにおけるこの分子の機能はマウスやラットとは異なっている可能性が高い。実際、分子の細胞内局在の点からも、マウスでは主に細胞質や核に存在する（Ｄｅｖ  Ｄｙｎ．２２３，７０，２００２）のに対して、ヒトでは主に細胞表面に存在することが知られる（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１，１１８２４，１９９６）。
Ｌｙｓ−Ａｌａの繰返し部分はヘパリンやヘパラン硫酸との結合部位であることが知られており（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３，９７１８，１９９８）、この部分の構造変化が、ＨＩＰ分子の機能に大きな影響をもたらす可能性ある。ＨＩＰ分子の生体内での本来の役割はまだ解明されていないが、例えば、ＨＩＰ分子あるいはその断片ペプチドによりヘパリンによる血液凝固の抑制が阻害されることが報告されている。また、細胞増殖や細胞接着など細胞機能に対する影響も報告されている。
従って、Ｌｙｓ−Ａｌａの繰返し部分の変異はこれらの機能に影響し、疾病発症に関わりある変化をもたらす可能性がある。つまり、血液凝固に対する影響は脳梗塞や心筋梗塞の原因となる可能性が考えられるし、例えばインスリン分泌細胞の細胞機能に対する影響は糖尿病の発症と関わる可能性がある。従って、ＨＩＰ遺伝子の繰り返し部分の多型と、疾患の発症の間に相関があることが見出されれば、それに基づく疾患の診断方法を提供することが可能となる。
実際、ＨＩＰ分子のＬｙｓ−Ａｌａ繰返しには多型があることが報告されている。これまでに報告されている多型は繰返し数で３回、４回、及び５回の３通りである。がん化におけるその意義が検討されたことはあったようであるが（理化学研究所年報平成１２年度、２１４−２１６頁、及び４８０−４８２頁）、解明されぬまま、他の疾病等の発症との相関に関しても全く研究されて来なかった。現在ＧＥＮＢＡＮＫのデータベースを検索するとｍＲＮＡレベルで４回（ｇｉ｜３３８７２４０３；ｇｉ｜９８４２８０；ｇｉ｜１７１０５３９５；ｇｉ｜１２１５７４１；ｇｉ｜７９３８４２）繰返しに対応するものと及び５回繰返しに対応するものの部分配列（ｇｉ｜３３８７３７７７）が収載されている。
一方ゲノムでは３回（ｇｉ｜２１６１７７１２）及び４回（ｇｉ｜２９７８８９１２）繰返しに対応する二種類が報告されている。その一方で、ゲノム上には複数の偽遺伝子が存在しており、最初にこの分子をクローニングした報告（Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １３０５，１０５，１９９６）にも１０コピー程度の偽遺伝子の存在が予測されている。実際、ＧＥＮＢＡＮＫ中にはＨＩＰ配列と９０％以上のホモロジーを示す偽遺伝子（２ないし３回の繰返し配列を持つ）が、１番、３番、５番、８番、１２番、１７番、及び１９番染色体上に登録されている。
遺伝子構造上の特徴として、ＨＩＰ遺伝子は３番染色体上に存在し、４つのエクソンと３つのイントロンを持つ（Ｌｏｃｕｓ  ＩＤ＝６１５９；Ｇｅｎｅ  ＩＤ＝６１５９；図２参照）のに対し、偽遺伝子はイントロン／エクソン構造を有さない。従って、偽遺伝子から真のＨＩＰ遺伝子を区別してこの領域の多型を解析するためには、何らかの仕方で特徴的なイントロンの配列を利用することが必要である。これまで、ＨＩＰ遺伝子の繰返し多型の系統的な解析はほとんど行われておらず、唯一報告されている理化学研究所のグループでもＰＣＲ産物を直接配列解析して区別する手法を用いている。従って、簡便な識別方法が開発されれば、種々の疾患とＨＩＰの繰返し多型との相関を調べる研究が、飛躍的に進展することが期待される。
【非特許文献１】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１，１１８１７，１９９６
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １３０５，１０５，１９９６
【非特許文献３】Ｄｅｖ  Ｄｙｎ．２２３，７０，２００２
【非特許文献４】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１，１１８２４，１９９６
【非特許文献５】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３，９７１８，１９９８
【非特許文献６】理化学研究所年報平成１２年度、２１４−２１６頁、及び４８０−４８２頁
【発明の開示】
以上の様な背景のもと、本発明は以下の課題を解決するものである。まず、第一に遺伝子配列決定を行わないでも可能な、ＨＩＰ遺伝子の繰返し多型の解析方法を提供することが課題となる。その際留意するべきは、ヒト遺伝子中に存在するＨＩＰの偽遺伝子と明確に区別できる手法を提供することである。第二に、開発されたＨＩＰ分子の多型識別方法を用いて、疾病と多型の相関を解明することである。第三に、解明された疾病とＨＩＰ分子多型の相関関係に基づいて疾病を診断する方法及び診断試薬を提供することが課題となる。
上記課題を解決するために鋭意努力を行った結果、本発明者らはＨＩＰタンパク質をコードする遺伝子のイントロンを含む配列に設定したプライマーを使用する増幅段階を含む多段階ポリメラーゼ連鎖反応を用いる方法により上記課題の内の第一を解決できることを見出した。また、本法を用いた解析により糖尿病の発症とＨＩＰ遺伝子の繰返し多型の間には相関があることを見出し、この遺伝子の繰返し多型の解明による疾病の診断が可能であることが明らかになった。すなわち、上記課題は以下の手段により解決できる。
（１）ヒトヘパリン／ヘパラン硫酸結合タンパク質をコードする遺伝子のイントロンを含む配列に設定したプライマーを使用する増幅段階を含む多段階ポリメラーゼ連鎖反応を用いることを特徴とする、当該遺伝子の繰返し多型の検出方法。
（２）ヒトヘパリン／ヘパラン硫酸結合タンパク質をコードする遺伝子の第三イントロンを含む配列に設定したプライマーを使用する増幅段階を含む多段階ポリメラーゼ連鎖反応を用いることを特徴とする、当該遺伝子の繰返し多型の検出方法。
（３）ヒトヘパリン／ヘパラン硫酸結合タンパク質をコードする遺伝子の第三イントロンを含む配列に設定したフォワードプライマーと第四エクソンに設定したリバースプライマーを用いて第一段階の増幅を行い、第四エクソンに設定したフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて第二段階の増幅を行う二段階ポリメラーゼ連鎖反応を用いることを特徴とする、当該遺伝子の繰返し多型の検出方法。
（４）第一段階の増幅に用いるフォワードプライマーを配列番号１９の１〜４９１の配列範囲に設定し、第一段階の増幅に用いるリバースプライマーを配列番号１９の７６４〜９０２の配列範囲に設定し、第二段階の増幅に用いるフォワードプライマーを配列番号１９の４８４〜７４６の配列範囲に設定し、第二段階の増幅に用いるリバースプライマーとして配列番号１９の配列範囲７６４〜９０２の範囲に、第一段階に用いたものと同じか、より５’−側に対応する部分に設定したものを用いることを特徴とする上記（３）に記載の方法。
（５）第一段階の増幅に用いるフォワードプライマーとして配列番号１〜６に記載の配列を持つＤＮＡの内いずれか一つを用い、第一段階の増幅に用いるリバースプライマーとして配列番号７〜１２に記載の配列を持つＤＮＡの内いずれか一つを用い、第二段階の増幅に用いるフォワードプライマーとして配列番号１３〜１８に記載の配列を持つＤＮＡの内いずれか一つを用い、第二段階の増幅に用いるリバースプライマーとして配列表番号７〜１２に記載の配列を持つＤＮＡで、第一段階に用いたものと同じか、より５’−側に対応するものの内のいずれか一つを用いることを特徴とする上記（４）に記載の方法。
（６）第一段階の増幅に用いるフォワードプライマーとして配列番号５に記載の配列を持つＤＮＡを用い、第一段階の増幅に用いるリバースプライマーとして配列番号１２に記載の配列を持つＤＮＡを用い、第二段階の増幅に用いるフォワードプライマーとして配列番号１７に記載のＤＮＡを用い、第二段階の増幅に用いるリバースプライマーとして配列番号７に記載のＤＮＡを用いることを特徴とする上記（５）に記載の方法。
（７）ポリメラーゼ連鎖反応産物の分析方法が、アガロース電気泳動法である上記（１）ないし（６）に記載の方法。
（８）ポリメラーゼ連鎖反応産物の分析方法が、キャピラリー電気泳動である上記（１）ないし（６）に記載の方法。
（９）ポリメラーゼ連鎖反応産物の分析方法が、ポリアクリルアミドゲル電気泳動である上記（１）ないし（６）に記載の方法。
（１０）ヒトヘパリン／ヘパラン硫酸結合タンパク質をコードする遺伝子の繰り返し多型を検出するための試薬であって、
（１）（ａ）ヒトヘパリン／ヘパラン硫酸結合タンパク質をコードする遺伝子の第三イントロンを含む配列に設定したフォワードプライマーと、（ｂ）第四エクソンに設定したリバースプライマー、とから成る第一段階の増幅用プライマー；ならびに
（２）（ｃ）第四エクソンに設定したフォワードプライマーと、（ｄ）第四エクソンに設定したリバースプライマーと、から成る第二段階の増幅用プライマー；
を含んで成る試薬。
（１１）第一段階の増幅に用いるフォワードプライマー（ａ）が、配列番号１９の１〜４９１の配列範囲に設定されており、
第一段階の増幅に用いるリバースプライマー（ｂ）が、配列番号９の７６４〜９０２の配列範囲に設定されており、
第二段階の増幅に用いるフォワードプライマー（ｃ）が、配列番号１９の４８４〜７４６の配列範囲に設定されており、そして
第二段階の増幅に用いるリバースプライマー（ｄ）が、配列番号１９の配列範囲７６４〜９０２の範囲に設定されており、且つ前記第一段階の増幅に用いるリバースプライマーと同じであるか、またはそれより５′−側に対応する部分に設定されている、
ことを特徴とする（１０）に記載の試薬。
（１２）第一段階の増幅に用いるフォワードプライマー（ａ）が、配列番号１〜６に記載の配列を持つＤＮＡの内いずれか一つであり、
第一段階の増幅に用いるリバースプライマー（ｂ）が、配列番号７〜１２に記載の配列を持つＤＮＡの内いずれか一つであり、
第二段階の増幅に用いるフォワードプライマー（ｃ）が、配列番号１３〜１８に記載の配列を持つＤＮＡの内いずれか一つであり、そして
第二段階の増幅に用いるリバースプライマー（ｄ）が、配列番号７〜１２に記載の配列を持つＤＮＡの内いずれか一つであり、且つ前記第一段階の増幅に用いるリバースプライマーと同じであるか、またはそれより５′−側に対応する部分に設定されている、
ことを特徴とする（１１）に記載の試薬。
（１３）第一段階の増幅に用いるフォワードプライマー（ａ）が、配列番号５に記載の配列を持つＤＮＡであり、
第一段階の増幅に用いるリバースプライマー（ｂ）が、配列番号１２に記載の配列を持つＤＮＡであり、
第二段階の増幅に用いるフォワードプライマー（ｃ）が、配列番号１７に記載の配列を持つＤＮＡであり、そして
第二段階の増幅に用いるリバースプライマー（ｄ）が、配列番号７に記載の配列を持つＤＮＡである、
ことを特徴とする（１２）に記載の試薬。
（１４）上記（１０）〜（１３）のいずれかに記載の試薬を含んで成る、ヘパリン／ヘパラン硫酸結合タンパク質の繰返し多型に基づく、糖尿病診断剤。
（１５）糖尿病が１型糖尿病である（１４）に記載の糖尿病診断剤。
（１６）糖尿病が２型糖尿病である（１４）に記載の糖尿病診断剤。
（１７）上記（１０）〜（１３）のいずれかに記載の試薬を含んで成る、ヘパリン／ヘパラン硫酸結合タンパク質の繰返し多型に基づく、動脈硬化症の診断剤。
上記方法においては、遺伝子増幅方法としてはポリメラーゼ連鎖反応を用いるとしているが、これに代わる他の方法、例えば、ＬＡＭＰ法その他の方法を用いて、イントロンを含む部分を増幅しても良い。また、上記方法においてはイントロンに設定するプライマーを第３イントロンを含む配列に設定するものを代表例として記載しているが（図２参照）、第１イントロンあるいは第２イントロンを含む配列に設定しても構わない。
診断方法としてＨＩＰ遺伝子の繰返し多型を測定する方法としては、本発明で開示された簡便法を用いず、従来の配列決定の手法を用いても構わないし、各人から採取した細胞からＨＩＰ分子をコードするｃＤＮＡをクローニングして、その配列を決定する手法を用いても構わない。また、１段階目の増幅産物のサイズをキャピラリー電気泳動や質量分析等の精密な測定方法により測定することにより繰返し数の違いを判定してもよい。更に、細胞や生体サンプルからＨＩＰタンパク質を精製して、配列決定や質量分析等の手段により繰り返し多型部分の構造を決定する手法を採用しても構わないことは言うまでもない。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＲＰＬ２９タンパク質配列の比較を示す。ヒト（Ｌｙｓ−Ａｌａ４回繰り返しのもの）、カニクイザル、ブタ、マウス、及びラットの配列をＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いてアラインして示した。
図２は、ヘパリン／ヘパラン硫酸結合タンパク質（ＨＩＰ）の遺伝子構造を示す図である。併せて、２段階のポリメラーゼ連鎖反応に用いる二組のプライマーペアの設定位置を模式的に示してある。
図３Ａは、使用したプライマーの位置をＨＩＰ遺伝子の第三イントロン及び第四エクソンのＤＮＡ配列上に示した図である。
図３Ｂは、使用したプライマーの位置をＨＩＰ遺伝子の第三イントロン及び第四エクソンのＤＮＡ配列上に示した図である。
図４は、２段階のポリメラーゼ連鎖反応を用いて、繰返し多型を判定した一例を示した図である。レーン左から、マーカー、３回／４回、４回／４回、４回／５回、３回／６回、標準品（３回／４回）、標準品（４回／５回）、マーカーである。
図５は、ゲノムＤＮＡを直接テンプレートとして用いて２段階目のポリメラーゼ連鎖反応を行って繰り返し部分を増幅した結果を示した図である。各レーンに乗っているサンプルは図３と同じである。
図６は、種々のプライマーペアを用いた１段階目の増幅結果を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、２段階のポリメラーゼ連鎖反応を用いた分析手段を用いたＨＩＰ遺伝子の多型解析方法とそれを用いた疾患診断方法に関して、詳しく述べるが、言うまでもなく本発明の実施の形態はこれに限定されるものではない。
ヒトＤＮＡはいかなる方法で採取してもよいが、例えば以下の手法を用いることで可能である。ヒト全血１ｍＬをＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  ｋｉｔを用いてマニュアルに従って処理し、約５０−１００μｇ／ｍｌのＤＮＡ溶液を２００μｌ取得することができる。
２段階のポリメラーゼ連鎖反応を用いたＨＩＰ遺伝子多型の判定は以下の手順で行うことができる。第一段階目の増幅は、例えばプライマーペアとしてＨＩＰ−ＥＸ４−Ｆ−２（配列番号５）及びＨＩＰ−Ｒ（配列番号１２）を用いて行うことができる。しかし、その他の可能なプライマーペアとして、例えばフォワードプライマーとしてＨＩＰ−ＥＸ４−Ｆ−３（配列番号１）、ＨＩＰ−ＥＸ４−Ｆ−４（配列番号２）、ＨＩＰ−ＥＸ４−Ｆ−５（配列番号３）、ＨＩＰ−ＥＸ４−Ｆ−６（配列番号４）、ＨＩＰ−ＥＸ４−Ｆ−２（配列番号５）、またはＨＩＰ−ＥＸ４−Ｆ（配列番号６）の中から一つを選択し、リバースプライマーとしてＨＩＰ−ＫＡ−Ｒ−ｌｏｎｇ（配列番号７）、ＨＩＰ−ＫＡ−Ｒ（配列番号８）、ＨＩＰ−ＫＡ−Ｒ−２（配列番号９）、ＨＩＰ−ＥＸ４−Ｒ（配列番号１０）、ＨＩＰ−ＥＸ４−Ｒ−２（配列番号１１）、またはＨＩＰ−Ｒ（配列番号１２）から一つを選択して用いうるし、それ以外であっても、繰返し部分を内側に含み、片方をイントロンに片方を第４エクソンに設定したプライマーペアであればどの様な組み合わせでも良い。プライマーの長さは、１０〜５０塩基、好ましくは２０〜３０塩基程度である。
ポリメラーゼ連鎖反応の反応条件は通常用いられるいずれの方法でも良いが、例えば、ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡを７０ｎｇ、ＴａＫａＲａのＥｘ  Ｔａｑ  １．２５ｕｎｉｔｓ、ｄＮＴＰ各１２．５ｎｍｏｌｅｓ、プライマー各１０ｐｍｏｌｅｓ、をＴａＫａＲａのＥｘ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ中で反応させることで増幅可能である（反応液量５０μｌ）。温度サイクルは例えば、９４℃×１分、５５℃×１分、７２℃×１分を３５サイクル繰り返す方法を用いることができる。２段階目の増幅は、プライマーペアとして例えばＨＩＰ−ＫＡ−Ｆ−ｌｏｎｇ（配列番号１７）及びＨＩＰ−ＫＡ−Ｒ−ｌｏｎｇ（配列番号７）を用いて行うことができる。
しかし、その他の可能なプライマーペアとして例えば、フォワードプライマーとしてＨＩＰ−ＫＡ−Ｆ−３（配列番号１３）、ＨＩＰ−ＫＡ−Ｆ−２（配列番号１４）、ＨＩＰ−ＫＡ−Ｆ−５（配列番号１５）、ＨＩＰ−ＫＡ−Ｆ−４（配列番号１６）、ＨＩＰ−ＫＡ−Ｆ−ｌｏｎｇ（配列番号１７）またはＨＩＰ−ＫＡ−Ｆ（配列番号１８）の中から一つを選択し、リバースプライマーとしてＨＩＰ−ＫＡ−Ｒ−ｌｏｎｇ（配列番号７）、ＨＩＰ−ＫＡ−Ｒ（配列番号８）、ＨＩＰ−ＫＡ−Ｒ−２（配列番号９）、ＨＩＰ−ＥＸ４−Ｒ（配列番号１０）、ＨＩＰ−ＥＸ４−Ｒ−２（配列番号１１）、またはＨＩＰ−Ｒ（配列番号１２）の内から一つを選択して使用する例を挙げることができるし、それ以外であっても、産物の長さが電気泳動で分離検出可能な組み合わせであればいずれの配列でも良い。ただし、２段階目の増幅に用いるプライマーペアは１段階目の増幅に用いるプライマリーペアの内側に設定しなければならない。
ポリメラーゼ連鎖反応の反応条件は、一段階目と同じく通常用いられるいずれの方法でも良いが、配列番号１７及び７に記載のプライマーペアを用いる際には、アニーリング温度は若干低めに設定した方が再現性良く産物を増幅できるようである。例えば、以下の条件で反応させることで増幅可能である。１段階目の増幅後の反応液の１／１００希釈液を１μｌ、プライマー各１００ｐｍｏｌｅｓ、その他の組成は１段階目と同じ（反応液量５０μｌ）、温度サイクルは例えば、９４℃×１分、５２℃×１分、７２℃×１分を３５サイクル繰り返す方法を用いることができる。この反応条件では、プライマーの涸渇にともなう産物同士の相互作用を防ぐためにプライマーを多めに設定し、更にプライマーの結合を確実にするために、アニーリング温度を１段階目より３℃低く設定してある。
増幅反応終了後、反応産物を１レーン当り２〜１０μｌとなる様に３〜４．５％アガロースゲル電気泳動で分離し、臭化エチジウムで処理後、紫外線照射を行うことでバンドを可視化できる。標準品として、２段階目のポリメラーゼ連鎖反応時に、３回、４回、及び５回の繰返しを有するＤＮＡをテンプレートにした増幅を行い、同じゲルに並べて泳動を行うことで、検体のＤＮＡの繰返し数を判定することができる。繰返し数、３回、４回、５回、及び６回のＤＮＡはゲル上明確に区別されるバンドとして検出されるので、容易に多型の判定が可能となる。例えば、４回繰り返し配列をホモに持つ個体であれば、４回繰り返しの位置に１本のバンドが検出され、３回と４回の繰返しをヘテロに持つ個体であれば、それぞれ３回及び４回繰り返しの位置に１本ずつのバンドが検出される。
上記手法を、各種疾患を持つ患者及び対照者のＤＮＡ分析に適用し、疾患の発症とＨＩＰ分子の多型の関係を調べることができる。実際１型糖尿病を有する患者及び健常人のＤＮＡを用いて多型の解析をしたところ、１型糖尿病患者の方が健常人に比して４回／５回のヘテロな組み合わせの遺伝子型の割合が、有意に低いことが明らかになった。あるいは少なくとも片方が４回、もう片方が５回以上の繰り返しを有する遺伝子型の割合が低い傾向があった。また、対立遺伝子自体の出現頻度でも、糖尿病においては５回またはそれ以上の繰返しを有するものの頻度が低い傾向であった。
このことは、ＨＩＰ分子の発症が１型糖尿病の発症に重要な役割を果たしていることを意味している。これが、膵臓β細胞からのインスリン分泌に対するＨＩＰ分子の作用の差に起因するものであるならば、１型糖尿病のみならず２型糖尿病の発症にも深く関与していることが予想され、２型糖尿病の診断にも使用できる可能性が高い。また、ＨＩＰ分子が抗凝固多糖であるヘパリンやヘパラン硫酸とＬｙａ−Ａｌａの繰返し部分で強く相互作用し、これらの作用に影響を与えることを考えると、糖尿病以外にも動脈硬化関連の疾患、例えば脳梗塞、脳血栓、心筋梗塞、深部静脈血栓、肺塞栓、等の疾患の診断にも、ＨＩＰ遺伝子の多型が使用できる可能性が考えられる。
以上の様に、ＨＩＰ遺伝子の多型と糖尿病を始めとした生活習慣病の発症の間には何らかの相関があることが明らかになった。従って、各人からサンプルリングしたＤＮＡを用いてＨＩＰ遺伝子の多型を解析することにより、これらの疾患の診断を行うことが可能である。
【実施例】  以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
実施例１． ヒト末梢血からのＤＮＡの調製
書面によるインフォームドコンセントを実施した被検者上腕静脈より抗凝固剤としてＥＤＴＡを用いた真空採血管により採血を行った。血液はＤＮＡ調製まで−８０℃で凍結保存した。血液細胞からのＤＮＡの採取は、ＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔを用いて実施した。１５ｍＬの遠沈管に１００μＬのプロテアーゼ溶液を入れ、そこに溶解した血液１ｍＬを加え軽く混和した。そこに、ｂｕｆｆｅｒ  ＡＬ  １．２ｍＬを加え、５秒３回ボルテックスし、７０℃で１０分インキュベートした。エタノール１ｍＬ加え、ボルテックス後、ＱＩＡａｍｐ  ｃｏｌｕｍｎ  ｔｕｂｅに全量３．２ｍＬを移した。遠心し、ｂｕｆｆｅｒ  ＡＷ１で２回洗浄後、７０℃で１０分インキュベートしてカラムを乾燥させた。最終的に、ｂｕｆｆｅｒ  ＡＥまたは水２００μＬで２回溶出することで、ＤＮＡ溶液２００μＬを得た。濃度的にはおよそ５〜１００μｇ／ｍＬ程度になる。
実施例２． ポリメラーゼ連鎖反応によるＨＩＰ遺伝子多型の検出
２段階のポリメラーゼ連鎖反応を用いたＨＩＰ遺伝子多型の判定は以下の手順で行った。第一段階目の増幅は、プライマーペアとしてＨＩＰ−ＥＸ４−Ｆ−２（配列番号５）及びＨＩＰ−Ｒ（配列番号１２）を用いた。ポリメラーゼ連鎖反応の反応条件以下の通りである、ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ溶液をを１μＬ、ＴａＫａＲａのＥｘ  Ｔａｑ  １．２５ｕｎｉｔｓ、ｄＮＴＰ各１２．５ｎｍｏｌｅｓ、プライマー各１０ｐｍｏｌｅｓ、をＴａＫａＲａのＥｘ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ中で反応させることで増幅した（反応液量５０μｌ）。温度サイクルは９４℃×１分、５５℃×１分、７２℃×１分を３５サイクル繰り返す方法を用いた。２段階目の増幅は、プライマーペアとしＨＩＰ−ＫＡ−Ｆ−ｌｏｎｇ（配列番号１７）及びＨＩＰ−ＫＡ−Ｒ−ｌｏｎｇ（配列番号７）を用いて行った。
ポリメラーゼ連鎖反応の反応条件としては、１段階目の増幅後の反応液の１／１００希釈液を１μｌ、プライマー各１００ｐｍｏｌｅｓ、その他の組成は１段階目と同じ（反応液量５０μｌ）、温度サイクルは、９４℃×１分、５２℃×１分、７２℃×１分を３５サイクル繰り返す方法を用いた。尚、各プライマーのＨＩＰ遺伝子配列上の位置は図３に模式的に示した。増幅反応終了後、反応産物を１レーン当り１０μｌとなる様に４．５％アガロースゲル電気泳動で分離し、臭化エチジウムで処理後、紫外線照射を行うことでバンドを可視化した。標準品として、２段階目のポリメラーゼ連鎖反応時に、３回、４回、及び５回の繰返しを有するＤＮＡをテンプレートにした増幅を行い、同じゲルに並べて泳動を行うことで、検体のＤＮＡの繰返し数を判定の標準品として用いた。
図４にこの方法で増幅した結果の一例を示した。この図に示される様に、遺伝子型が３回／４回、４回／４回、４回／５回、４回／６回、及び３回／５回の組み合わせを持つ被検者を明確に区別できることが分かる。これらの断片が確かに、３回、４回、５回、及び６回の繰返しを有することは、ゲルからバンドを切り出し、クローニングベクターに組み込み、大腸菌を用いて増やした後に、ＤＮＡ配列を調べることにより確認した。
図５には、１段階目の増幅を行わず、直接ゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて２段階目の増幅を行った結果を示したが、図４における結果と異なり、ＨＩＰ遺伝子の多型を区別するＤＮＡ断片を増幅することはできず、薄くはあるが、主として２回繰り返しと思われる位置のバンドが共通に検出された。これは、遺伝子内に多数存在するＨＩＰの偽遺伝子が増幅されてしまったためであると考えられる。この様に、一段階目にイントロンに設定したプライマーを用いた増幅段階を設定した２段階のポリメラーゼ増幅反応を用いることにより、配列解析を行わなくても明確にＨＩＰ遺伝子の多型を区別する方法が提供されることが分かる。
実施例３． 種々のプライマーペアによる１段階目の増幅
実施例２における第一段階の増幅が、他のプライマーペアでも可能であることを示すために、ＨＩＰ−ＥＸ４−Ｆ−２（配列表５）及びＨＩＰ−Ｒ（配列番号１２）以外の様々な組み合わせで第一段階増幅を行い、産物１０μｌを３％アガロースゲルで分離した。ここで用いたプライマーは、フォワードプライマーとして、ＨＩＰ−ＥＸ４−Ｆ−２（配列番号５）、ＨＩＰ−ＥＸ４−Ｆ−３（配列番号１）、ＨＩＰ−ＥＸ４−Ｆ−４（配列番号２）、ＨＩＰ−ＥＸ４−Ｆ−５（配列番号３）、及びＨＩＰ−ＥＸ４−Ｆ−６（配列番号４）、リバースプライマーとして、ＨＩＰ−Ｒ（配列番号１２）及びＨＩＰ−ＥＸ４−Ｒ−２（配列番号１１）であり、これらの全ての組み合わせを試した。尚、使用した各プライマーの遺伝子配列上の位置は図３に模式的に示した。結果を図６に示す。図に示される様に、今回試みたいずれのプライマーペアを用いても産物の明確な増幅が観察され、これらのいずれの組み合わせも１段階目の増幅に用いることができることが分かった。
実施例４． １型糖尿病と健常人におけるＨＩＰ遺伝子多型頻度の比較
実施例２に記載の方法を用いて、１型糖尿病５８名、健常人３０名を用いてＨＩＰ遺伝子多型の比較を行った。結果を表１に示す。１型糖尿病においては繰返し数３、４、５、及び６回が、健常人からは３、４、及び５回が検出された。繰返し数６回のＨＩＰ遺伝子は今回の検討により初めて見出されたものである。対立遺伝子の出現頻度を比較すると、１型糖尿病において５回繰り返しの頻度が低い傾向であった（有意差は無し）。
【表１】
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また、遺伝子型に関しては、１糖尿病において４回／５回のヘテロ体の頻度が２９．３％であったのに対して、健常人では４６．７％と、１型糖尿病において有意に頻度が低かった（ｐ＜０．０１；χ２検定）。これを、少なくとも一方が４回以上、他方が５回以上の頻度とすると、１型糖尿病で３４．５％、健常人で４６．７％となり、やはり１型糖尿病において頻度が低い傾向が認められた（有意差は無し）。すなわち、ＨＩＰ分子中のＬｙｓ−Ａｌａ（遺伝子ではＡＡＧＧＣＣ）の繰返し数が多い方が、特に４回と５回のヘテロの組み合わせである場合に、１型糖尿病に罹患し難いという傾向が認められた。この結果は、ＨＩＰ多型の測定により１型糖尿病への罹患の危険度を予測できることを示唆している。
【産業上の利用可能性】  本発明により提示された測定方法は、ＨＩＰ遺伝子のＡＡＧＧＣＣ（タンパク質ではＬｙｓ−Ａｌａ）繰返し多型を、配列解析を行わずに簡便に判定するのに有用である。この方法または他の方法によりヒトＤＮＡを解析し、ＨＩＰ遺伝子の繰返し多型を判定することにより、糖尿病等の疾患の罹患リスクを予測することができる。罹患前にこれらの疾病の罹患のリスクを予測できれば、生活習慣の改善や早期治療等の手立てを講じることができるので、疾病対策の上で大きな有用性を発揮しうる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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