(57)【要約】テロメレースの触媒サブユニットであるＴＥＲＴとＭＡＰＫＡＰＫ３の結合を阻害することまたは活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化阻害することを特徴とする、テロメレース活性化阻害方法およびテロメレース活性化阻害剤、テロメレース活性阻害方法およびテロメレース活性阻害剤、癌疾患の防止方法および／または治療方法、癌疾患の防止剤および／または治療剤、ＴＥＲＴとＭＡＰＫＡＰＫ３の結合を阻害する化合物または活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害する化合物の同定方法、並びに試薬キットを提供した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の群より選ばれるテロメレース活性化阻害方法：
（ｉ）ＭＡＰＫＡＰＫ３（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−３）とＴＥＲＴ（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）の結合を阻害することを特徴とするテロメレース活性化阻害方法
および
（ｉｉ）活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害することを特徴とするテロメレース活性化阻害方法。
【請求項２】
ＭＡＰＫＡＰＫ３（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−３）とＴＥＲＴ（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）の結合を阻害することを特徴とするテロメレース活性化阻害方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載のテロメレース活性化阻害方法を用いることを特徴とするテロメレース活性阻害方法。
【請求項４】
ＭＡＰＫＡＰＫ３（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−３）の不活性化型変異体によるテロメレース活性阻害方法であって、該変異体がＴＥＲＴ（ｔｅｌｏｍｅｌａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）と結合する変異体である、テロメレース活性阻害方法。
【請求項５】
ＭＡＰＫＡＰＫ３（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−３）の不活性化型変異体が配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質である、請求項４に記載のテロメレース活性阻害方法。
【請求項６】
請求項１若しくは２に記載のテロメレース活性化阻害方法、および／または請求項３から５のいずれか１項に記載のテロメレース活性阻害方法を用いることを特徴とするテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項７】
テロメレース活性の亢進に起因する疾患が、癌疾患である請求項６に記載のテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項８】
癌疾患が、乳癌、腎細胞癌、急性白血病、グリア性腫瘍、前立腺癌、神経上皮腫、扁平上皮癌、肝細胞癌、前立腺癌および非小細胞肺癌のいずれかである請求項７に記載のテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項９】
癌疾患が乳癌疾患である請求項７に記載のテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項１０】
ＭＡＰＫＡＰＫ３（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−３）とＴＥＲＴ（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）の結合を阻害する化合物の同定方法であって、ある化合物とＭＡＰＫＡＰＫ３および／またはＴＥＲＴとの相互作用を可能にする条件下、該化合物とＭＡＰＫＡＰＫ３および／またはＴＥＲＴとを接触させ、次いで、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合により生じるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、該シグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、該化合物がＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害するか否かを決定する方法。
【請求項１１】
活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−３）によるＴＥＲＴ（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）のリン酸化を阻害する化合物の同定方法であって、ある化合物と活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３および／またはＴＥＲＴとの相互作用を可能にする条件下、該化合物と活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３および／またはＴＥＲＴとを接触させ、次いで、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３よるＴＥＲＴのリン酸化により生じるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、該シグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、該化合物が活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害するか否かを決定する方法。
【請求項１２】
以下の群より選ばれるテロメレース活性化阻害剤：
（ｉ）ＭＡＰＫＡＰＫ３（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−３）とＴＥＲＴ（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）の結合を阻害することを特徴とするテロメレース活性化阻害剤
および
（ｉｉ）活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害することを特徴とするテロメレース活性化阻害剤。
【請求項１３】
以下の群より選ばれるテロメレース活性化阻害剤：
（ｉ）ＭＡＰＫＡＰＫ３（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−３）とＴＥＲＴ（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）の結合を阻害する化合物を少なくとも１つ含んでなるテロメレース活性化阻害剤
および
（ｉｉ）活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害する化合物を少なくとも１つ含んでなるテロメレース活性化阻害剤。
【請求項１４】
以下の群より選ばれるテロメレース活性阻害剤：
（ｉ）ＭＡＰＫＡＰＫ３（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−３）とＴＥＲＴ（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）の結合を阻害することを特徴とするテロメレース活性阻害剤
および
（ｉｉ）活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害することを特徴とするテロメレース活性阻害剤。
【請求項１５】
以下の群より選ばれるテロメレース活性阻害剤：
（ｉ）ＭＡＰＫＡＰＫ３（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−３）とＴＥＲＴ（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）の結合を阻害する化合物を少なくとも１つ含んでなるテロメレース活性阻害剤
および
（ｉｉ）活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害する化合物を少なくとも１つ含んでなるテロメレース活性阻害剤。
【請求項１６】
ＭＡＰＫＡＰＫ３（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−３）の不活性化型変異体を含んでなるテロメレース活性阻害剤であって、該変異体がＴＥＲＴ（ｔｅｌｏｍｅｌａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）と結合する変異体である、テロメレース活性阻害剤。
【請求項１７】
ＭＡＰＫＡＰＫ３（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−３）の不活性化型変異体が配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質である、請求項１６に記載のテロメレース活性阻害剤。
【請求項１８】
請求項１若しくは２に記載のテロメレース活性化阻害方法を用いるテロメレース活性化阻害、および／または請求項３から５のいずれか１項に記載のテロメレース活性阻害方法を用いるテロメレース活性阻害を特徴とするテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止剤および／または治療剤。
【請求項１９】
請求項１２および１３に記載のテロメレース活性化阻害剤並びに請求項１４から１７に記載のテロメレース活性阻害剤のうち少なくともいずれか１つを含んでなるテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止剤および／または治療剤。
【請求項２０】
テロメレース活性の亢進に起因する疾患が、癌疾患である請求項１８または１９に記載のテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止剤および／または治療剤。
【請求項２１】
癌疾患が、乳癌、腎細胞癌、急性白血病、グリア性腫瘍、前立腺癌、神経上皮腫、扁平上皮癌、肝細胞癌、前立腺癌および非小細胞肺癌のいずれかである請求項２０に記載のテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止剤および／または治療剤。
【請求項２２】
癌疾患が乳癌疾患である請求項２０に記載のテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止剤および／または治療剤。
【請求項２３】
ＭＡＰＫＡＰＫ３（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−３）、ＭＡＰＫＡＰＫ３をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれか１つと、ＴＥＲＴ（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）、ＴＥＲＴをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれか１つとを含んでなる試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ＭＡＰＫＡＰＫ３（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−３）とテロメレース逆転写酵素（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＴＥＲＴ）の結合を阻害すること、または活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害することを特徴とするテロメレース活性化阻害方法、テロメレース活性阻害方法、テロメレース活性化阻害剤およびテロメレース活性阻害剤に関する。
また、ＭＡＰＫＡＰＫ３不活性化型変異体によるテロメレース活性阻害方法および該変異体を含んでなるテロメレース活性阻害剤に関する。
さらに、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害する化合物または活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害する化合物の同定方法に関する。
また、前記テロメレース活性化阻害方法および／または前記テロメレース活性阻害方法を用いることを特徴とするテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止方法および／または治療方法に関する。
さらに、前記テロメレース活性化阻害方法を用いるテロメレース活性化阻害、および／または前記テロメレース活性阻害方法を用いるテロメレース活性阻害を特徴とするテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止剤および／または治療剤に関する。
また、ＭＡＰＫＡＰＫ３、ＭＡＰＫＡＰＫ３をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれか１つと、ＴＥＲＴ、ＴＥＲＴをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれか１つとを含んでなる試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】  テロメレースは、真核細胞の染色体末端のテロメア配列の伸張反応を触媒する酵素であり、鋳型となるＲＮＡ分子であるテロメレースＲＮＡ（ＴＲ）と触媒サブユニットであるＴＥＲＴからなるリボ核蛋白質である（非特許文献１）。【０００３】  テロメレースは、テロメア長を維持することにより、細胞に不死化能（無限寿命）を与える。テロメアは真核細胞の染色体ＤＮＡの末端部分に存在する単純な繰り返し配列であり、染色体の安定性維持に寄与している。細胞分裂においてＤＮＡの複製を司る通常のＤＮＡポリメラーゼではＤＮＡの最末端まで完全に複製が行われないため、細胞分裂に伴いテロメアは短縮される。正常な体細胞では一定回数分裂後に増殖が停止し、細胞の老化あるいは細胞死が生じる。【０００４】  テロメレース活性は生殖細胞、各種幹細胞および末梢血リンパ球を除く正常細胞では検出されない。したがって、大多数の正常細胞は分裂毎にテロメア長が短縮するためテロメア長を維持することができず、その寿命は有限である。【０００５】  一方、癌細胞等不死化した細胞の大多数においては、テロメレース活性が検出される。すなわち、細胞分裂に伴い短縮されたテロメアがテロメレースにより伸張され、その結果、テロメア長が維持されることが、癌細胞の無限増殖性獲得機序の１つであると考えられている。テロメレースによるテロメア長の維持が癌細胞の不死化に寄与することは、アンチセンスＲＮＡを用いて癌細胞のテロメレース活性を消失させると、１０数回の細胞分裂の後に細胞増殖が停止し、細胞死が誘導されるという報告により明らかである。また、癌細胞内でドミナントネガティブ型テロメレースを発現させることにより、テロメレース活性の消失と細胞分裂に伴ったテロメア長の短小化、染色体末端融合の出現および細胞死が誘導されることが報告されている。【０００６】  テロメレースの活性化に関しては、ＴＥＲＴ遺伝子の発現活性化による活性化やＴＥＲＴのリン酸化を介した活性化等が報告されている。前者については、多くの正常細胞においてＴＲ遺伝子の発現は検出されるもののＴＥＲＴ遺伝子の発現は検出されないのに対し、多くの癌細胞ではＴＲおよびＴＥＲＴ両遺伝子の発現が認められることから、癌細胞等テロメレース活性が検出される細胞では何らかの機構によりＴＥＲＴ遺伝子の発現が活性化されていると考えられている。後者については、癌細胞の核抽出液を脱リン酸化処理すると抽出液中のテロメレース活性が低減することが報告されており、テロメレースの活性化にリン酸化が関与している可能性が示唆されている（非特許文献２）。また、癌細胞由来の核抽出液をＡｋｔやプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）と反応させることにより抽出液中のテロメレース活性が上昇することが報告されており、これらキナーゼがテロメレース活性化に関与する可能性があると考えられている（非特許文献３および４）。さらに、ヒト臍帯静脈内皮細胞に活性型Ａｋｔを過剰に発現させると該細胞内テロメレース活性が上昇することが報告されている（非特許文献５および６）。また、ヒト臍帯静脈内皮細胞にドミナントネガティブ型Ａｋｔを過剰に発現させると該細胞内テロメラーゼ活性が低減することが報告されている（非特許文献５��よび６）。さらに、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤によるヒト臍帯静脈内皮細胞内テロメラーゼ活性の低減も報告されている（非特許文献５および６）。しかし、Ａｋｔについては、乳癌組織におけるＡｋｔ活性とその正常組織におけるＡｋｔ活性とに差が見られないことが報告されている（非特許文献７）。また、ＰＫＣについては、癌細胞内においてＰＫＣがテロメレース活性を上昇させるか否かは不明である。なお、ＰＫＣのアイソザイムの１つであるＰＫＣａｌｐｈａおよびＡｋｔとＭＡＰＫＡＰＫ３とは一次構造上の相同性が低く、それぞれおよそ１４．８９％、２３．７６％の相同性を示す。ＰＫＣの他のアイソザイムとＭＡＰＫＡＰＫ３との一次構造上の相同性も同様に低い。【０００７】  ＭＡＰＫＡＰＫ３はセリン／スレオニンキナーゼの一つであり、ＭＡＰキナーゼファミリー（ＥＲＫ、ｐ３８およびＪＮＫ等）によりリン酸化されて活性化することが報告されている。ＭＡＰＫＡＰＫ３の機能については黄体成熟機構への関与が報告されているのみである。また、基質としてＨＳＰ２７（ｓｍａｌｌ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２７）、転写因子ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）および転写因子Ｅ４７をリン酸化することが報告されている。しかし、これら基質とテロメレースとの関連についての報告はない。【０００８】  以下に本明細書において引用した文献を列記する。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ０１／６７２９９号パンフレット。
【非特許文献１】ケラー（Ｋｅｌｌｅｈｅｒ  Ｃ．）ら、「トレンズ  イン  バイオケミカル  サイエンシズ（ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、２００２年、第２７巻、ｐ．５７２−５７９。
【非特許文献２】「ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９７年、第２７２巻、ｐ．１６７２９−１６７３２。
【非特許文献３】「ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９９年、第２７４巻、ｐ．１３０８５−１３０９０。
【非特許文献４】「ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９８年、第２７３巻、ｐ．３３４３６−３３４４２。
【非特許文献５】「フェブス  レターズ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）」、２００１年、第４９３巻、ｐ．２１−２５。
【非特許文献６】「フェブス  レターズ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）」、２００３年、第５３６巻、ｐ．１８０−１８６。
【非特許文献７】「インターナショナル  ジャーナル  オブ  キャンサー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ）」、２００２年、第９８巻、ｐ．１４８−１５４。
【非特許文献８】「アメリカン  ジャーナル  オブ  レスピレイトリー  セル  アンド  モレキュラー  バイオロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、２００２年、第２６巻、ｐ．５５８−５６４。
【非特許文献９】「キャンサー  レターズ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）」、２００３年、第１９１巻、ｐ．２２９−２３７。
【非特許文献１０】「ジャーナル  オブ  クリニカルインベスティゲーション（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」、１９９７年、第９９巻、ｐ．１４７８−１４８３。
【非特許文献１１】「キャンサー  リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９５年、第５５巻、ｐ．４１８２−４１８７。
【非特許文献１２】「ジャーナル  オブ  クリニカルインベスティゲーション（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」、１９９７年、第９９巻、ｐ．１４６３−１４６４。
【非特許文献１３】「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」、１９９９年、第９３巻、ｐ．３８９３−３８９９。
【非特許文献１４】「アメリカン  ジャーナル  オブ  パソロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）」、１９９８年、第１５３巻、ｐ．１４１１−１４２３。
【非特許文献１５】「ジャーナル  オブ  ステロイド  バイオケミストリー  アンド  モレキュラーバイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、２００２年、第８０巻、ｐ．２３９−２５６。
【非特許文献１６】「パソロジー、リサーチ  アンド  プラクティス（Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」、２０００年、第１９６巻、ｐ．８１７−８２６。
【非特許文献１７】「パソロジー、オンコロジー  リサーチ（Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２００１年、第７巻、ｐ．１７１−１７７。
【非特許文献１８】「キャンサー  リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９９年、第５９巻、ｐ．２７９−２８４。
【非特許文献１９】「アンチキャンサー  リサーチ（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２００１年、第２１巻、ｐ．２７３３−２７３８。
【非特許文献２０】「キャンサー  リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２００１年、第６１巻、ｐ．６５００−６５１０。
【非特許文献２１】「ヘパトロジー（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）」、１９９８年、第２７巻、ｐ．９５１−９５８。
【非特許文献２２】「ジャーナル  オブ  ウロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ）」、１９９９、第１６２巻、ｐ．１５３７−１５４２。
【非特許文献２３】ウルマー（Ｋ．Ｍ．Ｕｌｍｅｒ）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１。
【非特許文献２４】「ペプチド合成」、丸善株式会社、１９７５年。
【非特許文献２５】「ペプチド  シンテシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、インターサイエンス（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９９６年。
【非特許文献２６】「モレキュラー  アンド  セルラー  バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９９６年、第１６巻、ｐ．６６８７−６６９７。
【非特許文献２７】キム（Ｋｉｍ  Ｎ．Ｗ．）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９４年、第２６６巻、第５１９３号、ｐ．２０１１−２０１５。
【非特許文献２８】ウェン（Ｗｅｎｚ  Ｃ．）ら、「ザ  エンボ  ジャーナル（Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ）」、２００１年、第２０巻、第１３号、ｐ．３５２６−３５３４。
【非特許文献２９】タテマツ（Ｔａｔｅｍａｔｓｕ  Ｋ．）ら、「オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）」、１９９６年、第１３巻、第１０号、ｐ．２２６５−２２７４。
【非特許文献３０】ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｙ．）ら、「クリニカル  ケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９９年、第４５巻、第１０号、ｐ．１７１８−１７２４。
【非特許文献３１】マエサワ（Ｍａｅｓａｗａ  Ｃ．）ら、「ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００３年、第３１巻、第２号、ｐ．Ｅ４−４。
【非特許文献３２】「バイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、２００２年、第３２巻、第５号、ｐ．１１５４−１１５６、１１５８、１１６０。
【非特許文献３３】パディソン（Ｐａｄｄｉｓｏｎ  Ｐ．Ｊ．）ら、「ジーンズ  アンド  ディベロプメント（Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、２００２年、第１６巻、ｐ．９４８−９５８。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】  本発明の課題は、テロメレースの活性化に関与する蛋白質を見出して提供することである。また、本発明の課題には、テロメレースの活性化を阻害する手段およびテロメレースの活性を阻害する手段を提供することが含まれる。さらに、本発明の課題には、テロメレース活性の亢進に起因する疾患、例えば癌疾患の防止および／または治療に有用な手段を提供することが含まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】  上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意努力し、テロメレースの触媒サブユニットであるＴＥＲＴがＭＡＰＫＡＰＫ３（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−３）と相互作用することをインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）で予測した。そして、ＭＡＰＫＡＰＫ３がテロメレースの活性化に関与することを実証した。具体的には、ＭＡＰＫＡＰＫ３がＴＥＲＴと結合すること、およびテロメレース活性が活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３の用量依存的に上昇することを実証した。これらから、ＴＥＲＴとＭＡＰＫＡＰＫ３が結合した後、該ＭＡＰＫＡＰＫ３がＥＲＫ、ＪＮＫおよび／またはｐ３８等によりリン酸化されることにより活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３が生成され、該活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３により該ＴＥＲＴがリン酸化され、その結果、テロメレース活性が上昇すると考える。【００１１】  本発明においてはまた、ＴＥＲＴと結合する不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によりテロメレース活性を阻害できることを見出した。具体的には、ＴＥＲＴと不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３が結合すること、およびＴＥＲＴと結合する不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によりテロメレース活性が低減し、その結果、ゲノムＤＮＡのテロメア長が短縮されることを実証した。これらから、ＴＥＲＴと結合する不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３は、テロメレースの活性化および／またはテロメレースを阻害することにより、テロメレースの活性を阻害すると考える。ＴＥＲＴと結合する不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３のキナーゼ活性は、ＭＡＰＫＡＰＫ３および活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３と比較し、低減または消失している。しかし、ＴＥＲＴと結合する不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３は、ＭＡＰＫＡＰＫ３の基質であるＴＥＲＴへの結合能を有する。したがって、ＴＥＲＴと結合する不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３は、ＭＡＰＫＡＰＫ３へのＴＥＲＴの結合を拮抗的に阻害することによりテロメレースの活性化を阻害し、その結果、テロメレース活性を阻害すると考える。このように、ＴＥＲＴと結合する不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によりテロメレース活性を阻害できる。【００１２】  上述のように、ＴＥＲＴとＭＡＰＫＡＰＫ３との結合を阻害すること、または活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるテロメレースのリン酸化を阻害することにより、テロメレースの活性化を阻害することができ、その結果、テロメレースの活性を阻害できる。【００１３】  また、不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３を用いてテロメレース活性を低減させることができ、その結果、テロメア長の短縮を引き起こすことができた。したがって、ＴＥＲＴとＭＡＰＫＡＰＫ３との結合を阻害すること、または活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるテロメレースのリン酸化を阻害することにより、テロメレース活性を低減させることができ、テロメア長の短縮を引き起こして、癌細胞の有限寿命化と染色体の不安定化による細胞死を誘導できる。その結果、癌疾患、例えば乳癌等を防止および／または治療することができる。【００１４】  本発明は、これら知見により完成した。【００１５】  すなわち本発明は、以下の群より選ばれるテロメレース活性化阻害方法に関する：
（ｉ）ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害することを特徴とするテロメレース活性化阻害方法、および
（ｉｉ）活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害することを特徴とするテロメレース活性化阻害方法。【００１６】  本発明はまた、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害することを特徴とするテロメレース活性化阻害方法に関する。【００１７】  本発明はさらに、前記いずれかのテロメレース活性化阻害方法を用いることを特徴とするテロメレース活性阻害方法に関する。【００１８】  本発明はさらにまた、ＭＡＰＫＡＰＫ３の不活性化型変異体によるテロメレース活性阻害方法であって、該変異体がＴＥＲＴと結合する変異体である、テロメレース活性阻害方法に関する。【００１９】  本発明はまた、ＭＡＰＫＡＰＫ３の不活性化型変異体が配列表の配列番号６のアミノ酸配列で表される蛋白質である、前記テロメレース活性阻害方法に関する。【００２０】  本発明はさらに、前記いずれかのテロメレース活性化阻害方法、および／または前記いずれかのテロメレース活性阻害方法を用いることを特徴とするテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止方法および／または治療方法に関する。【００２１】  本発明はさらにまた、テロメレース活性の亢進に起因する疾患が癌疾患である前記テロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止方法および／または治療方法に関する。【００２２】  本発明はまた、癌疾患が、乳癌、腎細胞癌、急性白血病、グリア性腫瘍、前立腺癌、神経上皮腫、扁平上皮癌、肝細胞癌、前立腺癌および非小細胞肺癌のいずれかである前記テロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止方法および／または治療方法に関する。【００２３】  本発明はさらに、癌疾患が乳癌疾患である前記テロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止方法および／または治療方法に関する。【００２４】  本発明はさらにまた、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害する化合物の同定方法であって、ある化合物とＭＡＰＫＡＰＫ３および／またはＴＥＲＴとの相互作用を可能にする条件下、該化合物とＭＡＰＫＡＰＫ３および／またはＴＥＲＴとを接触させ、次いで、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合により生じるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、該シグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、該化合物がＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害するか否かを決定する方法に関する。【００２５】  本発明はまた、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害する化合物の同定方法であって、ある化合物と活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３および／またはＴＥＲＴとの相互作用を可能にする条件下、該化合物と活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３および／またはＴＥＲＴとを接触させ、次いで、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化により生じるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、該シグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、該化合物が活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害するか否かを決定する方法に関する。【００２６】  本発明はさらに、以下の群より選ばれるテロメレース活性化阻害剤に関する：
（ｉ）ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害することを特徴とするテロメレース活性化阻害剤、および
（ｉｉ）活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害することを特徴とするテロメレース活性化阻害剤。【００２７】  本発明はさらにまた、以下の群より選ばれるテロメレース活性化阻害剤に関する：
（ｉ）ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害する化合物を少なくとも１つ含んでなるテロメレース活性化阻害剤、および
（ｉｉ）活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害する化合物を少なくとも１つ含んでなるテロメレース活性化阻害剤。【００２８】  本発明はまた、以下の群より選ばれるテロメレース活性阻害剤に関する：
（ｉ）ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害することを特徴とするテロメレース活性阻害剤、および
（ｉｉ）活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害することを特徴とするテロメレース活性阻害剤。【００２９】  本発明はさらに、以下の群より選ばれるテロメレース活性阻害剤に関する：
（ｉ）ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害する化合物を少なくとも１つ含んでなるテロメレース活性阻害剤、および
（ｉｉ）活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害する化合物を少なくとも１つ含んでなるテロメレース活性阻害剤。【００３０】  本発明はさらにまた、ＭＡＰＫＡＰＫ３の不活性化型変異体を含んでなるテロメレース活性阻害剤であって、該変異体がＴＥＲＴと結合する変異体である、テロメレース活性阻害剤に関する。【００３１】  本発明はまた、ＭＡＰＫＡＰＫ３の不活性化型変異体が配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質である、前記テロメレース活性阻害剤に関する。【００３２】  本発明はさらに、前記いずれかのテロメレース活性化阻害方法を用いるテロメレース活性化阻害、および／または前記いずれかのテロメレース活性阻害方法を用いるテロメレース活性阻害を特徴とするテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止剤および／または治療剤に関する。【００３３】  本発明はさらにまた、前記テロメレース活性化阻害剤並びに前記テロメレース活性阻害剤のうち少なくともいずれか１つを含んでなるテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止剤および／または治療剤に関する。【００３４】  本発明はまた、テロメレース活性の亢進に起因する疾患が、癌疾患である前記いずれかのテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止剤および／または治療剤に関する。【００３５】  本発明はさらに、癌疾患が、乳癌、腎細胞癌、急性白血病、グリア性腫瘍、前立腺癌、神経上皮腫、扁平上皮癌、肝細胞癌、前立腺癌および非小細胞肺癌のいずれかである前記テロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止剤および／または治療剤に関する。【００３６】  本発明はさらにまた、癌疾患が乳癌疾患である前記テロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止剤および／または治療剤に関する。【００３７】  本発明はまた、ＭＡＰＫＡＰＫ３、ＭＡＰＫＡＰＫ３をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれか１つと、ＴＥＲＴ、ＴＥＲＴをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれか１つとを含んでなる試薬キットに関する。
【発明の効果】
【００３８】  本発明により、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害すること、または活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害することを特徴とするテロメレース活性化阻害方法、テロメレース活性阻害方法、テロメレース活性化阻害剤およびテロメレース活性阻害剤を提供できる。また、ＭＡＰＫＡＰＫ３不活性化型変異体によるテロメレース活性阻害方法および該変異体を含んでなるテロメレース活性阻害剤を提供できる。さらに、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害する化合物または活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害する化合物の同定方法を提供できる。また、前記テロメレース活性化阻害方法および／または前記テロメレース活性阻害方法を用いることを特徴とするテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止方法および／または治療方法を提供できる。さらに、前記テロメレース活性化阻害方法を用いるテロメレース活性化阻害、および／または前記テロメレース活性阻害方法を用いるテロメレース活性阻害を特徴とするテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止剤および／または治療剤を提供できる。また、ＭＡＰＫＡＰＫ３、ＭＡＰＫＡＰＫ３をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれか１つと、ＴＥＲＴ、ＴＥＲＴをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれか１つとを含んでなる試薬キットを提供できる。【００３９】  本発明により、テロメレースの活性化およびテロメレース活性を阻害することができる。そのため本発明により、テロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止および／または治療が可能になる。テロメレースは、細胞に不死化能（無限寿命）を与える機能を有し、癌細胞等不死化細胞においてその活性が検出されている。本発明によるテロメレース活性化阻害およびテロメレース活性阻害により、癌細胞の有限寿命化と染色体の不安定化による細胞死が誘導できる。したがって本発明により、例えば、乳癌等の癌疾患の防止および／または治療が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】［図１］テロメレースの触媒サブユニットであるＴＥＲＴとＭＡＰＫＡＰＫ３の相互作用をインシリコで予測した結果を示す図である。ＴＥＲＴとＭＡＰＫＡＰＫ３の間でローカルアライメントを行い、高いスコア（ｓｃｏｒｅ）を示した領域を図示した。アミノ酸配列は１文字表記した。図中の数字は、ＴＥＲＴまたはＭＡＰＫＡＰＫ３の各アミノ酸配列における、図示した各領域のＮ末端アミノ酸の位置を意味する。（実施例１）
［図２］ＭＡＰＫＡＰＫ３または活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３と３５Ｓ−メチオニン標識蛋白質として合成したＴＥＲＴとが結合することを、グルタチオンセファロースを用いたプルダウン法により検出した結果を示す図である。また、不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３も、ＭＡＰＫＡＰＫ３または活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３と比較して弱い結合であるが、ＴＥＲＴと結合した。ＧＳＴはＴＥＲＴと結合しなかった。矢頭は、ＴＥＲＴの位置を示す。（実施例２）
［図３］ＴＥＲＴとＨＡ−ＭＡＰＫＡＰＫ３を共発現させた細胞の細胞溶解液（レーン２）について、抗ＨＡ抗体で免疫沈降（ＩＰ）後に抗ＴＥＲＴ抗体を用いたウエスタンブロッティング（ＷＢ）で蛋白質の検出を行なったところ、ＨＡ−ＭＡＰＫＡＰＫ３の共沈降が認められた（最下段のパネル）ことを示す図である。レーン１は、ＨＡ−ＭＡＰＫＡＰＫ３をコードするポリヌクレオチドを含むベクターの代わりに空ベクターをトランスフェクションした細胞の細胞溶解液についての結果を示す。（実施例３）
［図４］活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３を一過性発現させた細胞では、細胞内テロメレース活性が上昇したことを示す図である。一方、不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３を一過性発現させた細胞では、細胞内テロメレース活性は低減した。用いた細胞は、テロメレース活性を有する細胞である。図中、「＊＊」はスチューデント  ｔ−テストで有意差（ｐ＜０．０１）が認められたことを示す。（実施例４）
［図５］脱リン酸化処理により、脱リン酸化酵素の用量依存的にテロメレース活性が低減したことを示す図である。（実施例５）
［図６］脱リン酸化処理によりテロメレース活性が低減した核抽出液に活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３を添加してリン酸化反応を行なったところ、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３用量依存的にテロメレース活性が上昇したことを示す図である。ＧＳＴを添加して同様にリン酸化反応を行なったときは、テロメレース活性の上昇は認められなかった。図中、「ＣＩＰ」とは、脱リン酸化酵素を意味する。（実施例５）
［図７］脱リン酸化処理によりテロメレース活性が低減した核抽出液に活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３を添加してリン酸化反応を行なったところテロメレース活性が上昇したが、ＭＡＰＫＡＰＫ３または不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によってはテロメレース活性の上昇が認められなかったことを示す図である。（実施例５）
［図８−Ａ］不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３発現レトロウイルス感染細胞（ｉｎａｃｔｉｖｅ  ３ｐＫ、図中では黒カラムで示す）において、親株（ｐａｒｅｎｔ、図中では白カラムで示す）または空ウイルス感染細胞（ｅｍｐｔｙ、図中では斜線カラムで示す）と比較して、テロメレース活性が顕著に低減したことを示す図である。（実施例６）
［図８−Ｂ］不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３発現レトロウイルスを癌細胞株（ＰＣ−３およびＵ−８７ＭＧ）に感染させたときに、感染細胞（ｉｎａｃｔｉｖｅ  ３ｐＫ）において不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３が過剰発現されたことを示す図である。コントロールであるβ−チューブリンの発現量は、感染細胞（ｉｎａｃｔｉｖｅ  ３ｐＫ）、親株（ｐａｒｅｎｔ）および空ウイルス感染細胞（ｅｍｐｔｙ）のいずれにおいても同程度であった。不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３（Ｎ末端ＨＡ−ｔａｇ付加）の検出は抗ＨＡ抗体、β−チューブリンの検出は抗β−チューブリン抗体を用いたウェスタンブロット（ＷＢ）により実施した。（実施例６）
［図９］不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３発現レトロウイルスを癌細胞株Ｕ−８７ＭＧに感染させたときに、感染細胞（ｉｎａｃｔｉｖｅ  ３ｐＫ）において経時的なテロメア長の短縮が認められたことを示す図である。一方、親株（ｐａｒｅｎｔ）および空ウイルス感染細胞（ｅｍｐｔｙ）においてはテロメア長の変化は認められなかった。（実施例６）
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】  以下、本発明について発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。
本明細書においては単離された若しくは合成の完全長蛋白質；単離された若しくは合成の完全長ポリペプチド；または単離された若しくは合成の完全長オリゴペプチドを意味する総称的用語として「蛋白質」という用語を使用することがある。ここで蛋白質、ポリペプチド若しくはオリゴペプチドはペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合している２個以上のアミノ酸を含むものである。以降、アミノ酸を表記する場合、１文字または３文字にて表記することがある。【００４２】  本発明においては、テロメレースの触媒サブユニットであるＴＥＲＴがＭＡＰＫＡＰＫ３と相互作用することを、特許文献１に記載の方法に従ってインシリコで予測した。そして、ＴＥＲＴがＭＡＰＫＡＰＫ３と結合することを実証した。さらに、テロメレース活性が活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３の用量依存的に上昇することを明らかにした。また、ＴＥＲＴと不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３が結合すること、およびＴＥＲＴと結合する不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によりテロメレース活性が低減し、その結果、ゲノムＤＮＡのテロメア長が短縮されることを実証した。【００４３】  ＭＡＰＫＡＰＫ３はセリン／スレオニンキナーゼの一つであり、ＭＡＰキナーゼファミリー（ＥＲＫ、ｐ３８およびＪＮＫ等）によりリン酸化されて活性化することが報告されている。ＭＡＰＫＡＰＫ３の機能については黄体成熟機構への関与が報告されているのみである。また、基質としてＨＳＰ２７、転写因子ＣＲＥＢおよび転写因子Ｅ４７をリン酸化することが報告されている。しかし、これら基質とテロメレースとの関連についての報告はない。【００４４】  ＭＡＰＫＡＰＫ３を活性化することが知られているｐ３８は乳癌組織および非小細胞肺癌組織において活性化しているという報告がある（非特許文献７−９）。また、ＭＡＰＫＡＰＫ３を活性化することが知られているＥＲＫは、乳癌、腎細胞癌、急性白血病、グリア性腫瘍、前立腺癌、神経上皮腫、扁平上皮癌、肝細胞癌、前立腺癌等の癌組織において活性化しているという報告がある（非特許文献１０−２２）。したがって、これらの癌組織においてＭＡＰＫＡＰＫ３の活性化によりテロメレースが活性化するというシグナルが存在している可能性があると考える。【００４５】  本発明において、ＭＡＰＫＡＰＫ３がＴＥＲＴと結合すること、および活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によりテロメレース活性が上昇することを明らかにした。これらから、ＴＥＲＴとＭＡＰＫＡＰＫ３が結合した後、該ＭＡＰＫＡＰＫ３がｐ３８等によりリン酸化されることにより活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３が生成され、該活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３により該ＴＥＲＴがリン酸化され、その結果、テロメレース活性が上昇すると考える。【００４６】  したがって、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害すること、または活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害することにより、テロメレースの活性化を阻害でき、その結果、テロメレース活性を阻害できると考える。【００４７】  さらに本発明において、ＴＥＲＴと不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３が結合すること、およびＴＥＲＴと結合する不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によりテロメレース活性が低減し、その結果、テロメア長が短縮されることを明らかにした。ＴＥＲＴと結合する不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３は、テロメレースの活性化および／またはテロメレースを阻害することにより、テロメレースの活性を阻害すると考える。ＴＥＲＴと結合する不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３のキナーゼ活性は、ＭＡＰＫＡＰＫ３および活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３と比較し、低減または消失している。しかし、ＴＥＲＴと結合する不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３は、ＭＡＰＫＡＰＫ３の基質であるＴＥＲＴへの結合能を有する。したがって、ＴＥＲＴと結合する不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３は、ＭＡＰＫＡＰＫ３へのＴＥＲＴの結合を拮抗的に阻害することによりテロメレースの活性化を阻害し、その結果、テロメレース活性を阻害する可能性が高い。ＴＥＲＴと結合する不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によりテロメレース活性を阻害できる。【００４８】  テロメアは真核細胞の染色体ＤＮＡの末端部分に存在する単純な繰り返し配列であり、染色体の安定性維持に寄与している。したがって、テロメア長が短縮されることにより、癌細胞の有限寿命化と染色体の不安定化による細胞死が誘導される。【００４９】  ＴＥＲＴと結合する不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３を発現させた癌細胞において実際に、テロメレース活性が低減し、テロメア長の短縮が引き起こされたことから、ＴＥＲＴと結合する不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によりテロメレース活性を低減させることによって細胞死を誘導できると考える。【００５０】  テロメレースが癌の種類を問わずほとんどの癌細胞で発現していることから、ＴＥＲＴと結合する不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３を用いること、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害すること、または活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害することにより、テロメレース活性を阻害し、それにより癌細胞の細胞死を誘導して、癌疾患等、例えば乳癌疾患等を防止および／または治療できる。【００５１】  本発明の一態様は、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害すること、または活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害することを特徴とするテロメレース活性化阻害方法および該テロメレース活性化阻害方法を用いるテロメレース活性阻害方法に関する。さらに、本発明の一態様は、ＭＡＰＫＡＰＫ３の不活性化型変異体によるテロメレース活性阻害方法であって、該変異体がＴＥＲＴと結合する変異体である、テロメレース活性阻害方法に関する。好ましくは、乳癌、腎細胞癌、急性白血病、グリア性腫瘍、前立腺癌、神経上皮腫、扁平上皮癌、肝細胞癌、前立腺癌並びに非小細胞肺癌等のヒト癌組織におけるテロメレース活性化阻害方法およびテロメレース活性阻害方法、さらに好ましくは、ヒト乳癌組織におけるテロメレース活性化阻害方法およびテロメレース活性阻害方法に関する。【００５２】  「活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３」とは、キナーゼ活性を示すように活性化されたＭＡＰＫＡＰＫ３を意味する。活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３は、ＭＡＰＫＡＰＫ３がＭＡＰキナーゼファミリー（ＥＲＫ、ｐ３８およびＪＮＫ等）等によりリン酸化されて活性化したＭＡＰＫＡＰＫ３であることができる。好ましくは、ＭＡＰキナーゼファミリー等により、ＭＡＰＫＡＰＫ３のアミノ酸配列第２０１��目と第３１３番目のスレオニンがリン酸化された結果、リン酸化を受ける前のＭＡＰＫＡＰＫ３と比較し、高いキナーゼ活性を示すように活性化されたＭＡＰＫＡＰＫ３であることができる。また、ＭＡＰＫＡＰＫ３にキナーゼ活性を示すような変異が天然においてあるいは遺伝子工学的手法を用いて導入されたＭＡＰＫＡＰＫ３変異体であってもよい。かかるＭＡＰＫＡＰＫ３変異体として、ＭＡＰＫＡＰＫ３のアミノ酸配列第２０１番目と第３１３番目のスレオニンをグルタミン酸に置換した変異体（配列番号８）が例示できる。【００５３】  「ＭＡＰＫＡＰＫ３」とは、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列（配列番号２）からなる蛋白質であり、リン酸化等により活性化されておらず、キナーゼ活性を示さないあるいはキナーゼ活性が低いものを意味する。【００５４】  ＴＥＲＴ遺伝子および該遺伝子がコードする蛋白質は、それぞれ配列表の配列番号３および配列番号４に記載の各配列で表される遺伝子および蛋白質である。【００５５】  「ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合」とは、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴが複合体を形成するように、水素結合、疎水結合または静電的相互作用等の非共有結合により、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴが相互作用することを意味する。ここでの結合とは、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴがそれら分子の一部分において結合すれば足りる。例えば、ＭＡＰＫＡＰＫ３またはＴＥＲＴを構成するアミノ酸の中に、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合に関与しないアミノ酸が含まれていてもよい。【００５６】  ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合は、免疫沈降法による共沈物の確認、ツーハイブリッド法、ウエスタンブロット法および蛍光共鳴エネルギー転移法等の自体公知の方法またはこれらの方法を組合わせることにより検出され得る。【００５７】  例えば、まず、Ｎ末端にグルタチオンＳ  トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を融合させたＭＡＰＫＡＰＫ３（ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰＫ３）と３５Ｓ−メチオニン標識蛋白質として合成したＴＥＲＴとを反応させる。次いで、グルタチオンセファロースによりＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰＫ３を回収し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により展開する。オートラジオグラフィーでＴＥＲＴを検出することにより、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を検出できる（実施例２を参照）。【００５８】  また、Ｎ末端にＨＡ−ｔａｇが付加されたＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴとを反応させた後に、抗ＨＡ抗体を用いて該ＭＡＰＫＡＰＫ３を免疫沈降する。次いで、共沈物を抗ＴＥＲＴ抗体を用いてウエスタンブロッティングすることにより、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を検出できる（実施例３を参照）。【００５９】  「テロメレースの活性化」とは、テロメレースを構成するＴＥＲＴが活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によりリン酸化を受けた結果、リン酸化を受ける前と比較しテロメレース活性が上昇することを意味する。【００６０】  ＭＡＰＫＡＰＫ３、ＴＥＲＴおよびこれらの遺伝子は上記各配列で表されるものに限らず、一般に知られているＭＡＰＫＡＰＫ３およびＴＥＲＴの機能を有する限りにおいて、上記各配列において１乃��数個の変異を有する蛋白質およびポリヌクレオチドであることができる。また、これらの機能を促進するあるいは欠失させるといった所望の目的のために、上記各配列に１乃至数個の変異を導入した変異体を用いることもできる。【００６１】  ＭＡＰＫＡＰＫ３遺伝子およびＴＥＲＴ遺伝子は、例えば、それぞれの遺伝子の発現が認められる適当な起源（例えば、ヒト乳癌由来の細胞）から、自体公知のクローニング方法等を用いて容易に取得され得る。活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３遺伝子は、例えば、ＭＡＰＫＡＰＫ３遺伝子の変異体として、ＭＡＰＫＡＰＫ３遺伝子に部位特異的突然変異法等自体公知の変異導入手段を用いて変異を導入することにより取得され得る。これら遺伝子がコードする蛋白質は、例えば、それぞれの遺伝子を用いた自体公知の遺伝子工学的手法により取得され得る。【００６２】  ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合阻害は、例えば、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害する化合物を用いることにより実施できる。ここでは、このような阻害効果を有する化合物（後述する例として競合阻害効果を有するポリペプチド類、抗体および低分子化合物等が挙げられる）を阻害剤と称する。【００６３】  ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害する化合物として、好ましくは当該結合を特異的に阻害する化合物、より好ましくは当該結合を特異的に阻害する低分子量化合物が挙げられる。ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を特異的に阻害するとは、当該結合を強く阻害するが、他の蛋白質間結合は阻害しないか、弱く阻害することを意味する。【００６４】  ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害する化合物としてその他に、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴが結合する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドが例示できる。かかるポリペプチドは、蛋白質間の結合を競合的に阻害し得る。かかるポリペプチドは、ＭＡＰＫＡＰＫ３またはＴＥＲＴのアミノ酸配列から設計し、自体公知のペプチド合成法により合成したものから、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害するものを選択することにより取得できる。このように特定されたポリペプチドに、１乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入したものも本発明の範囲に包含される。このような変異を導入したポリペプチドは、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害するものが好ましい。変異を有するポリペプチドは天然に存在するものであってよく、また変異を導入したものであってもよい。欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマーの技術（非特許文献２３）を利用できる。このような変異の導入において、当該ポリペプチドの基本的な性質（物性、機能または免疫学的活性等）を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。さらに、これら利用できるポリペプチドは、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度に改変できる。【００６５】  上記ポリペプチドは、ペプチド化学において知られる一般的な���法で製造できる。具体的には、成書（非特許文献２４および２５）に記載の方法が例示されるが、これらに限らず公知の方法が広く利用できる。具体的には、通常の液相法および固相法によるペプチド合成法、例えばＦｍｏｃ法等が挙げられる。または市販のアミノ酸合成装置を用いて製造できる。あるいは遺伝子工学的手法により取得することもできる。例えば目的とするポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞中で発現できる組換え発現ベクターを作成し、これを適当な宿主細胞、例えば大腸菌にトランスフェクションして形質転換した後に該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から目的とするポリペプチドを回収することにより製造できる。【００６６】  ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合の阻害は、ＭＡＰＫＡＰＫ３またはＴＥＲＴを認識する抗体であって、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害する抗体を用いることによっても実施できる。かかる抗体は、ＭＡＰＫＡＰＫ３またはＴＥＲＴ自体、またはこれら蛋白質の断片、好ましくはＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴが結合する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原として自体公知の抗体作製法により取得できる。【００６７】  「活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化」とは、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３により、ＴＥＲＴを構成するアミノ酸のうちセリン、スレオニン残基のヒドロキシル基にアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）のγ−リン酸基が転移されることを意味する。一般的に酵素活性を有する蛋白質は、リン酸化によりその酵素活性が調節されることが多い。したがって、リン酸化によりＴＥＲＴの逆転写酵素活性が促進され、その結果テロメレース活性が上昇すると考える。【００６８】  活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化、およびリン酸化されたＴＥＲＴの検出は、自体公知の方法により実施できる。生体内においては、ＴＥＲＴとＭＡＰＫＡＰＫ３が結合した後に、該ＭＡＰＫＡＰＫ３がＥＲＫ、ＪＮＫおよびｐ３８等のＭＡＰキナーゼファミリー等により活性化されると考える。しかし、実施例に示したように、変異体である活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３はＴＥＲＴと結合し、かつ活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３の用量依存的にテロメレース活性を上昇させる。したがって、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴとを共存させることにより、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を実施できる。活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３として、ＭＡＰＫＡＰＫ３のアミノ酸配列第２０１番目と第３１３番目のスレオニンをグルタミン酸に置換したＭＡＰＫＡＰＫ３変異体が好ましく例示できる。【００６９】  活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化、およびリン酸化されたＴＥＲＴを検出する方法として、具体的には、次の方法が例示できる。【００７０】  放射性同位体で標識されたＡＴＰ（例えば［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ）を含むキナーゼバッファー中で活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴとを接触させ、反応後にＳＤＳ−ＰＡＧＥで反応産物を展開し、オートラジオグラフィーにより放射活性を測定することにより、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によりリン酸化されたＴＥＲＴを検出できる。【００７１】  また、ＴＥＲＴ自体を自体公知の方法によりマイクロタイタープレートのウエル上に固定した後、該ウエル内にＡＴＰおよび活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３を添加し、ＴＥＲＴと活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３を接触させ、反応後に、予めユーロピウム（Ｅｕ）標識されかつリン酸化されたＴＥＲＴを認識する抗体を用いて、リン酸化されたＴＥＲＴと該抗体との抗原抗体反応を行い、時間分解蛍光を検出することにより、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によりリン酸化されたＴＥＲＴを検出できる。【００７２】  ＴＥＲＴを結合させたドナービーズと活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３とを接触させ、反応後に抗リン酸化ＴＥＲＴ抗体を結合させたアクセプタービーズを反応溶液に添加し、両ビーズが近接したときのみ発生するシグナル（例えば、ドナービーズをレーザ照射した際に発生する一重項状態の酸素が、アクセプタービーズに含まれる蛍光物質を活性化させた結果、発生する一定波長の光）を検出することにより、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によりリン酸化されたＴＥＲＴを検出できる。【００７３】  また、自体公知のシンチレーションプロキシミティアッセイ法（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ、ＳＰＡ）を用いて、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によりリン酸化されたＴＥＲＴを検出できる。【００７４】  上記例示した方法は、ＴＥＲＴの代わりに、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によりリン酸化を受けるＴＥＲＴの部分ポリペプチドを基質として用いて実施することもできる。ＭＡＰＫＡＰＫ３の基質であるＨＳＰ２７およびｅＥＦ２キナーゼがＭＡＰＫＡＰＫ３によりリン酸化を受ける部位についての報告から、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によりリン酸化を受けるＴＥＲＴの部位はＲＸＸＳの４つのアミノ酸（ここで、Ｘはいずれのアミノ酸でもあり得る）からなる部分ポリペプチドに相当する部位と予測される。かかる部位を含むＴＥＲＴの部分ポリペプチドのうち、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるリン酸化を受けることが実証されたＴＥＲＴの部分ポリペプチドをＴＥＲＴの代わりに基質として用いることができる。ＴＥＲＴの部分ポリペプチドは自体公知の方法により合成できる。【００７５】  活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化の阻害は、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害する化合物を用いることにより実施できる。活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害する化合物として、例えば、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害する化合物が挙げられる。活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害する化合物は、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの相互作用を阻害できるため、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害すると考える。また、ＴＥＲＴがＭＡＰＫＡＰＫ３と結合し、その後、該ＭＡＰＫＡＰＫ３がＥＲＫ、ＪＮＫおよび／またはｐ３８等によりリン酸化されることにより活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３が生成され、該活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３により該ＴＥＲＴがリン酸化されると考えられることから、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害する化合物は、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの相互作用を阻害し、その結果、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３の生成とそれに引き続いて起きる活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害すると考える。したがって、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害する化合物が、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害する化合物として好ましく例示できる。その他、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害する化合物として、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３のキナーゼ活性を阻害する化合物が挙げられる。【００７６】  あるいは、細胞内、例えば癌細胞内のＭＡＰＫＡＰＫ３の発現をＲＮＡ干渉の手法により低減させることにより、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３の生成を低減させ、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害できる。その結果、テロメレース活性を低減または消失させることができる。したがって、かかるＲＮＡ干渉の手法によりテロメレース活性を低減または消失させるｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）もテロメレース活性を阻害する化合物として例示できる。癌細胞にｓｉＲＮＡを導入することにより、該細胞内の該細胞内のテロメレース活性は低減し、それにより細胞分裂に伴う染色体末端のテロメア長の短縮化が起こり、細胞死を誘導することができる。【００７７】  「ＭＡＰＫＡＰＫ３の不活性化型変異体」とは、ＭＡＰＫＡＰＫ３に、アミノ酸の欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入したＭＡＰＫＡＰＫ３であって、ＭＡＰＫＡＰＫ３および活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３と比較しキナーゼ活性が減弱し、または消失したＭＡＰＫＡＰＫ３を意味する。ＭＡＰＫＡＰＫ３の不活性化型変異体は、天然に存在するものであることができ、人工的に変異を導入したものであることもできる。かかる変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマーの技術（非特許文献２３）を利用して実施できる。好ましくは、例えば、ＭＡＰＫＡＰＫ３の、ＥＲＫ、ＪＮＫおよび／またはｐ３８等のＭＡＰＫＡＰＫ３をリン酸化および活性化するキナーゼによりリン酸化される部位、ＭＡＰＫＡＰＫ３のＴＥＲＴとの結合部位およびＭＡＰＫＡＰＫ３のＡＴＰとの結合部位のうち少なくともいずれか１つの部位に変異を導入したＭＡＰＫＡＰＫ３であることができる。ＭＡＰＫＡＰＫ３をリン酸化および活性化するキナーゼによりリン酸化されるＭＡＰＫＡＰＫ３の部位として、ＭＡＰＫＡＰＫ３のアミノ酸配列第２０１番目および第３１３番目、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＡＴＰとの結合部位として該アミノ酸配列第７３番目が報告されている（非特許文献２６）。したがって、ＭＡＰＫＡＰＫ３の不活性化型変異体として、ＭＡＰＫＡＰＫ３のアミノ酸配列の第７３番目、第２０１番目および第３１３番目のうちの少なくともいずれか１つの部位のアミノ酸に変異を導入したＭＡＰＫＡＰＫ３の不活性化型変異体が挙げられる。【００７８】  より好ましくは、ＭＡＰＫＡＰＫ３の不活性化型変異体であって、かつＴＥＲＴと結合する不活性化型変異体が適当である。かかる変異体として、配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質を例示できる。該変異体は、ＭＡＰＫＡＰＫ３のアミノ酸配列第２０１番目および第３１３番目のスレオニンがアラニンに置換されたＭＡＰＫＡＰＫ３の不活性化型変異体である。該変異体は、ＴＥＲＴと結合し（実施例２および図２を参照）、またテロメレース活性を有する細胞で発��させたときに、細胞内テロメレース活性を低減させた（実施例４および図４を参照）。また、該変異体は、癌細胞で発現させたときに、細胞内テロメレース活性を低減させ、その結果、テロメア長の短縮を引き起こした（実施例６、図８−Ａ、図８−Ｂおよび図９を参照）。これらから、細胞内において、該変異体は、テロメレースの活性化および／またはテロメレースを阻害することにより、テロメレースの活性を阻害すると考える。【００７９】  さらに好ましくは、ＴＥＲＴと結合するＭＡＰＫＡＰＫ３の不活性化型変異体であって、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を拮抗的に阻害するＭＡＰＫＡＰＫ３の不活性化型変異体が適当である。かかる不活性化型変異体は、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害することによりテロメレースの活性化を阻害し、結果としてテロメレース活性を阻害できる。配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質は、ＴＥＲＴと結合し、テロメレース活性を有する細胞や癌細胞で発現させたときに、細胞内テロメレース活性を低減させた。すなわち、該蛋白質は、ＭＡＰＫＡＰＫ３に対してドミナントネガティブ効果を有すると考える。したがって、該蛋白質は、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を拮抗的に阻害するＭＡＰＫＡＰＫ３の不活性化型変異体であると発明者らは考えている。【００８０】  ＭＡＰＫＡＰＫ３の不活性化型変異体とＴＥＲＴの結合は、前記ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合の検出方法と同様の方法により検出され得る。【００８１】  本発明の別の一態様は、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害する化合物の同定方法に関する。本化合物の同定方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して実施できる。例えば、上述のようなＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を検出する方法を用いて実施できる。【００８２】  ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害する化合物の同定方法は、具体的には、調べようとする化合物（被検化合物）とＭＡＰＫＡＰＫ３および／またはＴＥＲＴとの相互作用を可能にする条件を選択し、当該条件下で、被検化合物とＭＡＰＫＡＰＫ３および／またはＴＥＲＴとを接触させ、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を検出し得るシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより実施できる。例えばＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合により生じるシグナルまたは該結合のマーカーが、被検化合物をＭＡＰＫＡＰＫ３またはＴＥＲＴと接触させたときに消失あるいは低減する等の変化を示した場合、当該被検化合物はＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害すると判定できる。かかる同定方法において、被検化合物をＭＡＰＫＡＰＫ３および／またはＴＥＲＴと予め接触させ、その後にＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合反応を行なうことができ、または被検化合物をこれらの結合反応に共存させることもできる。被検化合物とＭＡＰＫＡＰＫ３および／またはＴＥＲＴとの相互作用を可能にする条件は、インビトロのものであってよく、インビボのものであってもよい。例えば、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴとを共発現させた細胞を用いることができる。かかる細胞は、ＭＡＰＫＡＰＫ３をコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターとＴＥＲＴをコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターとを用いて慣用の遺伝子工学的方法でこれらを細胞にトランスフェクションすることにより取得できる。あるいはかかる細胞は、テロメレース活性が認められた細胞にＭＡＰＫＡＰＫ３をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクションすることによっても取得できる。さらに、実施例２に示したように、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３がＴＥＲＴと結合したことから、ＭＡＰＫＡＰＫ３の代わりに、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３を用いて同様の同定方法を構築することができる。この場合、ＥＲＫ、ＪＮＫおよび／またはｐ３８をコードするポリヌクレオチドを共発現させて、細胞内でＭＡＰＫＡＰＫ３をリン酸化して活性化させることもできる。ここでシグナルとは、そのもの自体がその物理的または化学的性質により直接検出され得るものを指し、マーカーとはそのものの物理的または生物学的性質を指標として間接的に検出され得るものを指す。シグナルとして、ルシフェラーゼ、および放射性同位体等、マーカーとして、レポーター遺伝子、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等、または検出用のエピトープタグ、例えば６×Ｈｉｓ−ｔａｇ等、公知のものが利用できる。これらシグナルまたはマーカーの検出方法は当業者には周知である。ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合は、簡便には、これら蛋白質の結合の存在若しくは不存在の検出および／またはその量の変化の測定により判定できる。これら蛋白質の結合の検出は、自体公知の蛋白質またはペプチドの検出方法、例えばウェスタンブロッティング法等を用いて実施できる。【００８３】  ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害する化合物の同定方法は、具体的には例えば、ＭＡＰＫＡＰＫ３またはＴＥＲＴの一方を固相化し、他方をシグナルで標識化して用いて結合反応を行い、標識シグナルを定量的に測定するといった当業者に知られた一般的なインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）における結合試験系を用いて実施できる。このような試験系に被検化合物を共存させたときの標識シグナルが、被検化合物の非共存下における標識シグナルと比較して低減するまたは消失する場合、該被検化合物はＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害すると判定できる。【００８４】  ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害する化合物の同定方法はまた、ＧＳＴ融合ＭＡＰＫＡＰＫ３またはＧＳＴ融合活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴとをインビトロで反応させて、ＧＳＴを用いたプルダウン法により両蛋白質の結合を検出する試験系（実施例２を参照）を用いて実施できる。このような試験系におけるＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴとの結合の検出は、ＴＥＲＴを予め標識物質で標識しておき、その標識物質を検出することにより実施できる。標識物質は、一般に蛋白質の検出に使用されている標識物質であればいずれも使用できる。具体的には、３５Ｓ等の放射性同位体等が好ましく例示できる。このような試験系に被検化合物を共存させたときに検出される標識物質の量が、被検化合物の非共存下において検出される標識物質の量と比較して低減するまたは消失する場合、該被検化合物はＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥ���Ｔの結合を阻害すると判定できる。【００８５】  あるいは、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害する化合物の同定方法は、動物細胞にＴＥＲＴをコードするポリヌクレオチドおよびＭＡＰＫＡＰＫ３をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクションして得られた細胞を用いて細胞内における結合反応を検出する試験系（実施例３を参照）を用いて実施できる。このような試験系におけるＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴとの結合の検出は、免疫沈降法やウェスタンブロッティング等の公知方法で実施できる。このような試験系に被検化合物を共存させたとき、被検化合物の非共存下における結果と比較して、結合する蛋白質量が減少するあるいは結合が検出されなくなる場合、該被検化合物はＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害すると判定できる。【００８６】  また、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害する化合物の同定方法の実施に、公知のツーハイブリッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）法を利用することもできる。例えば、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＤＮＡ結合蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、ＴＥＲＴと転写活性化蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、および適切なプロモーター遺伝子に接続したｌａｃＺ等レポーター遺伝子を含有するプラスミドを酵母、真核細胞等に導入し、被検化合物を共存させた場合のレポーター遺伝子の発現量を被検化合物非存在下でのレポーター遺伝子の発現量とを比較することにより達成できる。被検化合物を共存させた場合のレポーター遺伝子の発現量が被検化合物非存在下でのレポーター遺伝子の発現量と比較して減少した場合、該被検化合物はＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴとの結合を阻害する作用を有すると判定できる。【００８７】  ビアコアシステム（ＢＩＡＣＯＲＥ  ｓｙｓｔｅｍ）等の表面プラズモン共鳴センサー、ＳＰＡ法、あるいは蛍光共鳴エネルギー転移（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）を応用した方法を用いて、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害する化合物の同定方法を実施することもできる。【００８８】  本発明の別の一態様は、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害する化合物の同定方法に関する。本化合物の同定方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して実施できる。例えば、上述のような活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を検出する方法を用いて実施できる。【００８９】  活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害する化合物の同定方法は、具体的には、被検化合物と活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３および／またはＴＥＲＴとの相互作用を可能にする条件を選択し、当該条件下で、被検化合物と活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３および／またはＴＥＲＴとを接触させ、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を検出し得るシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより実施できる。例えば活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化により生じるシグナルまたは該結合のマーカーが、被検化合物を活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３および／またはＴＥＲＴ���接触させたときに消失あるいは低減する等の変化を示した場合、当該被検化合物は活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害すると判定できる。被検化合物と活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３および／またはＴＥＲＴとの相互作用を可能にする条件は、インビトロのものであってよく、インビボのものであってもよい。例えば、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴとを共発現させた細胞を用いることができる。【００９０】  活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害する化合物の同定方法は、具体的には例えば、テロメレース活性が確認されている細胞から調製した核抽出液を用い、脱リン酸化処理を行なった後、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３を添加してテロメレース活性の上昇を測定する試験系（実施例５を参照）を用いて実施できる。かかる試験系に被検化合物を共存させたときにテロメレース活性の上昇が阻害された場合、該被検化合物はＴＥＲＴのリン酸化を阻害する化合物であると判定できる。または、かかる試験系において、テロメレース活性の上昇を測定する代わりに、ＴＥＲＴのリン酸化を検出することにより、ＴＥＲＴのリン酸化を阻害する化合物の同定を実施できる。【００９１】  活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害する化合物の同定方法はまた、上述した活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化、およびリン酸化されたＴＥＲＴの検出を実施する方法を用いた試験系を用いて実施できる。かかる試験系に被検化合物を共存させ、該被検化合物によるＴＥＲＴのリン酸化が被検化合物の非共存下におけるリン酸化と比較して低減されるまたは消失する場合に、該被検化合物は活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害すると判定できる。【００９２】  ＭＡＰＫＡＰＫ３、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３、不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３およびＴＥＲＴ等の蛋白質はいずれも、遺伝子工学的手法で発現させた細胞や生体試料から調製したもの、無細胞系合成産物または化学合成産物であることができ、あるいはさらに精製されたものであることができる。これらはまた、それぞれの蛋白質をコードする遺伝子のうち少なくとも１を含む細胞において発現しているものであることができる。該細胞は、本蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターをトランスフェクションして得られた形質転換体であることができる。これらはまた、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合、および活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化等の機能に影響がなければ、Ｎ末端側やＣ末端側に別の蛋白質やポリペプチド、例えばＧＳＴ、β−ガラクトシダーゼ、ＩｇＧ等の免疫グロブリンＦｃ断片、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、またはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のｔａｇペプチド類を、直接的にまたはリンカーペプチド等を介して間接的に、遺伝子工学的手法等を用いて付加したものであることができる。【００９３】  被検化合物は、例えば化学ライブラリーや天然物由来の化合物、または活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３またはＴＥＲＴの一次構造や立体構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等が挙げられる。あるいは、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドの構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等も被検化合物として好適である。【００９４】  本発明の別の一態様は、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害することを特徴とするテロメレース活性化阻害剤およびテロメレース活性阻害剤に関する。本テロメレース活性化阻害剤およびテロメレース活性阻害剤として、好ましくは、ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴの結合を阻害する化合物、例えば上記化合物を少なくとも１つ含んでなるテロメレース活性化阻害剤およびテロメレース活性阻害剤が挙げられる。【００９５】  本発明の別の一態様は、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害することを特徴とするテロメレース活性化阻害剤およびテロメレース活性阻害剤に関する。本テロメレース活性化阻害剤およびテロメレース活性阻害剤として、好ましくは、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害する化合物、例えば上記化合物を少なくとも１つ含んでなるテロメレース活性化阻害剤およびテロメレース活性阻害剤が挙げられる。より好ましくは、上記ＭＡＰＫＡＰＫ３の不活性化型変異体を含んでなるテロメレース活性阻害剤、または該不活性化型変異体を含んでなるテロメレース活性化阻害剤が挙げられる。【００９６】  テロメレース活性化阻害作用およびテロメレース活性阻害作用の確認は、例えばトラップ法（ＴＲＡＰ法：非特許文献２７）、ダイレクトテロメレースアッセイ（Ｄｉｒｅｃｔ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ：非特許文献２８）、ストレッチＰＣＲアッセイ（Ｓｔｒｅｔｃｈ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ：非特許文献２９）、ハイブリダイゼーションプロテクションアッセイ（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ：非特許文献３０）、ＴＲＥアッセイ（非特許文献３１）、ラピッドダイレクトテロメレースアッセイ（ｒａｐｉｄ  ｄｉｒｅｃｔ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ：非特許文献３２）等の方法により実施できる。あるいは、これらの確認をパディソンらの方法（非特許文献３３）や本明細書の実施例に具体的に記載した方法等に従って実施できる。【００９７】  本発明の別の一態様は、上記化合物および上記阻害剤を含む医薬組成物に関する。上記化合物および上記阻害剤は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することにより、医薬組成物として調製できる。医薬組成物の調製において、これら化合物や阻害剤は、単独で使用することができ、また、複数を組み合わせて使用することができる。本発明に係る医薬組成物は、テロメレースの作用やその活性の亢進に起因する疾患の防止剤および／または治療剤、並びに当該疾患の防止方法および／または治療方法に利用できる。テロメレース活性の亢進に起因する疾患として、例えば癌疾患が挙げられる。【００９８】  テロメレースは腫瘍の種類に関わらず大多数の腫瘍においてその活性が確認されていることから、本発明に係る医薬組成物は多様な癌細胞の増殖阻害に有効であると考える。したがって、本医薬組成物を癌疾患に使用する場合、対象となる腫瘍の種類は特に限定されず、固形腫瘍または非固形腫瘍のいずれにも適用できる。固形腫瘍または非固形腫瘍の種類も特に限定されず、テロメレース活性を有するあらゆる種��の腫瘍において適用できる。癌疾患として、胃癌、食道癌、大腸癌、小腸癌、十二指腸癌、肺癌、肝臓癌、胆嚢癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、口腔癌、骨癌、皮膚癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、脳腫瘍、神経芽腫等の固形腫瘍、あるいは白血病や悪性リンパ腫等の非固形腫瘍等を例示できるが、本医薬組成物の適用対象はこれら疾患に限定されない。より好ましくは、さらにＭＡＰＫＡＰＫ３の活性化やその遺伝子発現の亢進が認められる癌疾患、あるいはＭＡＰＫＡＰＫ３の活性化に関与する蛋白質の活性化が認められる癌疾患に適用できる。ＭＡＰＫＡＰＫ３を活性化することが知られているｐ３８が乳癌組織および非小細胞肺癌組織において活性化されていることが報告されている。さらに、ＭＡＰＫＡＰＫ３を活性化することが知られているＥＲＫが、乳癌、腎細胞癌、急性白血病、グリア性腫瘍、前立腺癌、神経上皮腫、扁平上皮癌、肝細胞癌、前立腺癌等の癌組織において活性化されていることが報告されている。したがって、好ましくは、乳癌、腎細胞癌、急性白血病、グリア性腫瘍、前立腺癌、神経上皮腫、扁平上皮癌、肝細胞癌、前立腺癌および非小細胞肺癌への適用が望ましく、さらに好ましくは乳癌への適用が望ましい。【００９９】  本発明に係る疾患の防止剤および／または治療剤は、上記化合物および上記阻害剤のうち少なくともいずれか１つを有効成分としてその有効量含む医薬となしてもよいが、通常は、１種または２種以上の医薬用担体を用いて医薬組成物として製造することが好ましい。【０１００】  本発明に係る医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択される。通常約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲とするのが適当である。【０１０１】  医薬用担体は、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤や賦形剤等を例示できる。これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択使用される。【０１０２】  例えば水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等が挙げられる。これらは、本発明に係る剤形に応じて適宜１種類または２種類以上を組合せて使用される。【０１０３】  所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤等を適宜使用して調製することもできる。【０１０４】  安定化剤は、例えばヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体等を例示できる。これらは単独でまたは界面活性剤等と組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。上記Ｌ−アミノ酸は、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸等の��ずれでもよい。糖類も特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等およびそれらの誘導体等のいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のいずれでもよい。界面活性剤も特に限定はなく、イオン性および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。これには、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が包含される。【０１０５】  緩衝剤は、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）等を例示できる。【０１０６】  等張化剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン等を例示できる。【０１０７】  キレート剤は、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸等を例示できる。【０１０８】  本発明に係る医薬および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる。その他、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生埋的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することもできる。【０１０９】  医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ乃至１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量を変更できる。上記投与量は１日１〜数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。【０１１０】  本発明の医薬組成物を投与するときは、該医薬組成物を単独で使用してもよく、あるいは目的の疾患の防止および／または治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。例えば、他のテロメレース阻害剤または抗腫瘍用医薬の有効成分等を配合してもよい。【０１１１】  投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択できる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内等への投与が挙げられる。あるいは経口経路で投与できる。さらに、経粘膜投与または経皮投与も実施できる。癌疾患に用いる場合は、腫瘍に直接投与することが好ましい。【０１１２】  投与形態は、各種の形態が目的に応じて選択できる。その代表的な例として、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒���、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リポソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらはさらに投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。【０１１３】  本発明の一態様は、ＭＡＰＫＡＰＫ３、ＭＡＰＫＡＰＫ３をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、および該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれか１つと、ＴＥＲＴ、ＴＥＲＴをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、および該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれか１つとを含んでなるキットに関する。当該キットは、例えば本発明に係る同定方法に使用できる。好ましくは、ＭＡＰＫＡＰＫ３として活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３を使用できる。【０１１４】  ポリヌクレオチドは、例えばヒトｃＤＮＡライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により調製できる。ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体は、当該ポリヌクレオチドを適当な発現ベクター、例えば細菌プラスミド由来のベクターに自体公知の遺伝子工学的手法で導入することにより、また得られたベクターを周知の方法で適当な細胞にトランスフェクションすることにより取得できる。【０１１５】  上記キットは、ＭＡＰＫＡＰＫ３または活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴとの結合、または活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を検出するためのシグナルおよび／またはマーカー、緩衝液、並びに塩等、必要とされる物質を含むことができる。さらに、安定化剤および／または防腐剤等の物質を含んでいてもよい。製剤化にあたっては、使用する各物質それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。【０１１６】  以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
【実施例１】
【０１１７】（ＴＥＲＴと相互作用する機能を有する蛋白質のインシリコでの探索）
テロメレースの触媒サブユニットであるＴＥＲＴと相互作用する機能を有する蛋白質の予測を、特許文献１に記載のインシリコでの予測方法に従って次のように予測した：ｉ）ＴＥＲＴのアミノ酸配列をある長さのオリゴペプチドに分解し、ｉｉ）各オリゴペプチドのアミノ酸配列あるいはそのアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を持った蛋白質をデータベース中で検索し、ｉｉｉ）得られた蛋白質とＴＥＲＴとの間でローカルアライメントを行い、ｉｖ）ローカルアライメントのスコアの高いものをＴＥＲＴと相互作用すると予測する。【０１１８】  解析の結果（図１）、ＴＥＲＴと相互作用する機能を有すると予測される蛋白質として、ＭＡＰＫＡＰＫ３を見出した。
【実施例２】
【０１１９】（ＴＥＲＴとＭＡＰＫＡＰＫ３のインビトロにおける結合解析）
ＴＥＲＴとＭＡＰＫＡＰＫ３が結合するか否かを、ＧＳＴ−ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ法によるインビトロ結合試験により検討した。ＭＡＰＫＡＰＫ３として、ＭＡＰＫＡＰＫ３、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３および不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３をそれぞれ使用した。【０１２０】  ＜材料およびその調製＞
ＴＥＲＴ発現プラスミドの構築
ヒトＴＥＲＴ  ｃＤＮＡはヒト胸腺ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）からＰＣＲにより獲得した。ヒトＴＥＲＴ  ｃＤＮＡを動物細胞用発現ベクターｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）へ組込むことにより、動物細胞用ＴＥＲＴ発現プラスミドを構築した。【０１２１】ＭＡＰＫＡＰＫ３発現プラスミドの構築
ヒトＭＡＰＫＡＰＫ３  ｃＤＮＡはヒト骨格筋ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）からＰＣＲにより獲得した。ヒトＭＡＰＫＡＰＫ３  ｃＤＮＡを、大腸菌でのＧＳＴ融合蛋白質発現用ベクターであるｐＧＥＸ−４Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）へ組込むことにより、大腸菌用Ｎ末端ＧＳＴ融合ＭＡＰＫＡＰＫ３発現プラスミドを構築した。【０１２２】活性化型および不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３発現プラスミドの構築
Ｎ末端にＧＳＴを融合させた活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３発現プラスミドを構築するために、上記ＭＡＰＫＡＰＫ３  ｃＤＮＡに、ＭＡＰＫＡＰＫ３のアミノ酸配列第２０１番目と第３１３番目のスレオニンが共にグルタミン酸に置換されるように変異を導入した。変異が導入されたＭＡＰＫＡＰＫ３  ｃＤＮＡを大腸菌でのＧＳＴ融合蛋白質発現用ベクターであるｐＧＥＸ−４Ｔへ組込むことにより、Ｎ末端にＧＳＴを融合させた活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３発現プラスミドを構築した。また、Ｎ末端にＧＳＴを融合させた不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３発現プラスミドを構築するために、上記ＭＡＰＫＡＰＫ３  ｃＤＮＡに、ＭＡＰＫＡＰＫ３のアミノ酸配列第２０１番目と第３１３番目のスレオニンが共にアラニンに置換されるように変異を導入した。変異が導入されたＭＡＰＫＡＰＫ３  ｃＤＮＡを大腸菌でのＧＳＴ融合蛋白質発現用ベクターであるｐＧＥＸ−４Ｔへ組込むことにより、Ｎ末端にＧＳＴを融合させた不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３発現プラスミドを構築した。【０１２３】各プラスミドを用いた蛋白質の調製
ＴＥＲＴは、ＴＮＴ  ｑｕｉｃｋ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使用してインビトロにて３５Ｓ−メチオニン標識した蛋白質として合成した。
ＧＳＴ融合ＭＡＰＫＡＰＫ３（ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰＫ３）、ＧＳＴ融合活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３（活性化型ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰＫ３）およびＧＳＴ融合不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３（不活性化型ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰＫ３）は、上記構築した各プラスミドを用いて大腸菌にトランスフェクションして発現誘導後、グルタチオンセファロースで精製して使用した。【０１２４】各ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰＫ３の活性確認
それぞれ５μｇのＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰＫ３、活性化型ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰＫ３、不活性化型ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰＫ３またはＧＳＴと、基質として２μｇのＨＳＰ２７（Ｕｐｓｔａｔｅ社製）とを５μＣｉの［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を含む２０μｌのリン酸化バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５／５ｍＭ  β−グリセロホスフェート（β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）／２ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）／０．１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４／１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２／１０μＭ  ＡＴＰ）中にて、３０℃で１５分間インキュベーションすることによりリン酸化反応を行った。反応後、２０μｌの２×ＳＤＳ  サンプルバッファー（４％  ＳＤＳ／１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ６．８／２０％  グリセロール／０．０１％ＢＰＢ／１０％  β−メルカプトエタノール）を反応液に加え、１００℃で５分間処理した。次いで、５−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより蛋白質を分離し、ＢＡＳ２０００（Ｆｕｊｉ  ｆｉｌｍ社製）を用いたオートラジオグラフィーによりリン酸化されたＨＳＰ２７を検出した。【０１２５】＜方法＞
ＧＳＴ−ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ法による結合試験
ＴＥＲＴ合成反応液の２０μｌとＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰＫ３、活性化型ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰＫ３または不活性化型ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰＫ３の５μｇとを、５００μｌのバインディングバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０／１４０ｍＭ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  エチレングリコールビス四酢酸（ＥＧＴＡ）／１ｍＭ  ＤＴＴ／１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／１０％  グリセロール）中にて、氷上、１時間静置した。その後、２０μｌのグルタチオンセファロース４Ｂ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ）を添加し、４℃にて一晩、転倒混和した後、遠心処理によりセファロースビーズを回収した。セファロースビーズを５００μｌのバインディングバッファーで４回洗浄した後、２０μｌの２×ＳＤＳ  サンプルバッファー（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８／４％  ＳＤＳ／２０％  グリセロール／０．０１％  ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ））を加え、３分間煮沸後、上清を５−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。その後、ＦＬＡ３０００（Ｆｕｊｉ  ｆｉｌｍ社製）によりＴＥＲＴを検出した。陰性コントロールとして、各ＭＡＰＫＡＰＫ３の代わりにＧＳＴを用い、上記同様の処理を行なった。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＴＥＲＴ検出のコントロールとして、３５Ｓ−メチオニン標識したＴＥＲＴを用いた。【０１２６】＜結果＞
ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰＫ３、活性化型ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰＫ３および不活性化型ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰＫ３はいずれも、インビトロでＴＥＲＴと結合した（図２）。一方、ＧＳＴとＴＥＲＴとの結合は認められなかった。この結果から、各ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰＫ３とＴＥＲＴとの結合は特異的であると言える（図２）。【０１２７】  ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰＫ３、活性化型ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰＫ３および不活性化型ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰＫ３はいずれも、ＴＥＲＴと直接結合することが明らかになった。
【実施例３】
【０１２８】（ＴＥＲＴとＭＡＰＫＡＰＫ３の細胞内における結合解析）
ＴＥＲＴとＭＡＰＫＡＰＫ３が細胞内において結合するか否かを、細胞内共発現／免疫共沈降法による結合試験により検討した。【０１２９】＜材料＞
ＭＡＰＫＡＰＫ３発現プラスミドの構築
ヒトＭＡＰＫＡＰＫ３  ｃＤＮＡはＲＴ−ＰＣＲにより獲得し、動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）へ組込んだ。その際、５´側にＨＡ−ｔａｇコード配列を挿入し、動物細胞用Ｎ末端ＨＡ−ｔａｇ付加型ＭＡＰＫＡＰＫ３発現プラスミドを構築した。【０１３０】  ＴＥＲＴ発現プラスミドは、実施例２で作製したプラスミドを用いた。【０１３１】＜方法＞
トランスフェクションおよび免疫共沈降法による結合試験
細胞数４×１０５のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を５％ＣＯ２存在下にて３７℃で一晩培養した後（直径６０ｍｍシャーレ）、２μｇのＨＡ−ｔａｇ付加型ＭＡＰＫＡＰＫ３発現プラスミドまたは陰性コントロールとしてｐｃＤＮＡ３．１（＋）を２μｇのＴＥＲＴ発現プラスミドと共に、ＦｕＧＥＮＥ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてトランスフェクションした。２日間培養後、細胞を氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））で洗浄して回収後、５００μｌの細胞溶解バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）／１ｍＭ  ＥＧＴＡ／１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／２．５ｍＭ  ピロホスフェートナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）／１ｍＭ  β−グリセロホスフェート／１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４／プロテアーゼ阻害剤カクテル（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ））に懸濁し、氷上で１０分間放置した。その後、４℃、１４，０００ｒｐｍで１０分間の遠心処理により上清を回収し、細胞溶解液として用いた。次に、５００μｌの細胞溶解液に１０μｌのアガロース結合正常ウサギＩｇＧ（Ａｇａｒｏｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ、Ｓｉｇｍａ社製）を加え、４℃にて３０分間転倒混和した後、遠心処理により上清を回収した。回収した上清に１０μｌのアガロース結合抗ＨＡ抗体（Ｙ−１１、ＳａｎｔａＣｒｕｚ社製）を加え、４℃にて一晩転倒混和した後、遠心処理によりアガロースビーズを回収した。アガロースビーズを５００μｌの細胞溶解バッファーで４回洗浄した後、２５μｌの２×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、５分間加熱後、上清を５−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。その後、抗ＴＥＲＴ抗体（Ｌ−２０、ＳａｎｔａＣｒｕｚ社製）を用いたウェスタンブロッティングにより結合蛋白質を検出した。なお、検出はＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用して行なった。【０１３２】＜結果＞
ＴＥＲＴとＨＡ−ｔａｇ付加型ＭＡＰＫＡＰＫ３（ＨＡ−ＭＡＰＫＡＰＫ３）を共発現させた細胞の細胞溶解液について、抗ＨＡ抗体で免疫沈降した後に抗ＴＥＲＴ抗体でウェスタンブロッティングを行なった結果、バンドが検出された（図３におけるレーン２の下段パネル）。一方、ＴＥＲＴのみを発現させた細胞の細胞溶解液について、同様に免疫沈降およびウエスタンブロッティングを行った結果、バンドは検出されなかった（図３におけるレーン１の下段パネル）。細胞におけるＨＡ−ＭＡＰＫＡＰＫ３およびＴＥＲＴの発現は、それぞれ抗ＨＡ抗体および抗ＴＥＲＴ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより確認した（図３におけるレーン１および２の上段パネルおよび中段パネル）。【０１３３】  この結果から、ＴＥＲＴがＨＡ−ＭＡＰＫＡＰＫ３と共沈降することが明らかになった。すなわち、ＴＥＲＴとＭＡＰＫＡＰＫ３が細胞内で結合することが明らかになった。
【実施例４】
【０１３４】（ＭＡＰＫＡＰＫ３一過性発現による細胞内テロメレース活性の上昇）
テロメレース陽性細胞であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのＭＡＰＫＡＰＫ３の一過性発現により細胞内テロメレース活性が変動するか否かについて検討した。【０１３５】＜材料＞
ＭＡＰＫＡＰＫ３発現プラスミドは、実施例３で構築した動物細胞用Ｎ末端ＨＡ−ｔａｇ付加型ＭＡＰＫＡＰＫ３発現プラスミドを用いた。このＨＡ−ｔａｇ付加型ＭＡＰＫＡＰＫ３発現プラスミドを基に、ＭＡＰＫＡＰＫ３のアミノ酸配列第２０１番目と第３１３番目のスレオニンが共にグルタミン酸に置換されるように変異を導入することにより、Ｎ末端にＨＡ−ｔａｇが付加された活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３発現プラスミドを構築した。また、Ｎ末端にＨＡ−ｔａｇが付加された不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３発現プラスミドを、上記ＨＡ−ｔａｇ付加型ＭＡＰＫＡＰＫ３発現プラスミドを基に、ＭＡＰＫＡＰＫ３のアミノ酸配列第２０１番目と第３１３番目のスレオニンが共にアラニンに置換されるように変異を導入することにより構築した。また、陰性コントロールとしてｐｃＤＮＡ３．１（＋）を使用した。【０１３６】＜方法＞
トランスフェクションおよびＴＲＡＰ法による細胞内テロメレース活性の測定
細胞数２×１０４のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を５％ＣＯ２存在下にて３７℃で一晩培養した後（２４ｗｅｌｌプレート）、各０．２μｇの発現プラスミドをそれぞれＦｕＧＥＮＥ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてトランスフェクションした。４８時間培養後、細胞を回収し、ＴＲＡＰＥＺＥ  ＸＬ  Ｋｉｔ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社製）を用いたＴＲＡＰ法により細胞内テロメレース活性を測定した。【０１３７】  具体的には、細胞を１００μｌの１×  ＣＨＡＰＳ  細胞溶解バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５／１ｍＭ  ＭｇＣｌ２／１ｍＭ  ＥＧＴＡ／０．１ｍＭ  ベンズアミジン（Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ）／５ｍＭ  β−メルカプトエタノール／０．５％  ＣＨＡＰＳ／１０％  グリセロール）に懸濁し、３０分間氷上で静置した後、遠心処理して上清を回収し、細胞溶解液として用いた。細胞溶解液中の蛋白質濃度をＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ−２００  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）で測定後、蛋白質量５ｎｇの細胞溶解液を用いてＴＲＡＰ反応を行った。【０１３８】  ＴＲＡＰ反応は、まず３０℃で３０分間のテロメレース反応を行った後、生成したテロメアリピート配列の増幅をＰＣＲ反応により行った。ＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒間、５９℃で３０秒間、７２℃で１分間を３６サイクル行なった後、５５℃で２５分間反応させることにより実施した。その後、ＰＣＲ反応液の蛍光強度を測定することによりテロメレース活性の強度を測定した。蛍光強度の測定は、ＰＣＲに用いたプライマーに標識されたフルオレセイン（テロメレース反応産物の指標）およびスルホローダミン（内部標準の指標）の各蛍光強度を、蛍光分光光度計Ｆ−２０００（Ｈｉｔａｃｈｉ）を使用し、測定波長（λＥｘ／λＥｍ）４８５ｎｍ／５３５ｎｍおよび５８５ｎｍ／６２０ｎｍで計測することにより行なった。その際、反応液２３μｌを６００μｌの測定用希釈液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で希釈して測定した。テロメレース活性は、内部標準との比（ΔＦＬ／ΔＲＬ）により表した。【０１３９】免疫複合体キナーゼ試験によるＭＡＰＫＡＰＫ３活性の確認
細胞数２×１０５のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を５％ＣＯ２存在下にて３７℃で一晩培養した後（６ｃｍシャーレ）、各２μｇの発現プラスミドをそれぞれＦｕＧＥＮＥ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてトランスフェクションした。４８時間培養後、細胞を回収し、５００μｌの細胞溶解バッファー（実施例３で用いた細胞溶解バッファーと同組成）に懸濁し、氷上で２０分間放置した。その後、４℃で、１４，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心処理により上清を回収し、細胞溶解液として用いた。次に、５００μｌの細胞溶解液に１０μｌのアガロース結合正常マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社製）を加え、４℃にて３０分間転倒混和した後、遠心処理により上清を回収した。回収した上清に１０μｌのＡｎｔｉ−ＨＡ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｒｉｘ（Ｒｏｃｈｅ社製）を加え、４℃にて２時間転倒混和した後、遠心処理によりアガロースビーズを回収し、さらにアガロースビーズを５００μｌの細胞溶解バッファーで２回、５００μｌのキナーゼバッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５／５ｍＭ  β−グリセロホスフェート／２ｍＭ  ＤＴＴ／０．１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４／１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で２回洗浄した。次に、ビーズに２μｇのＨＳＰ２７（Ｕｐｓｔａｔｅ社製）と１０μＭ  ＡＴＰおよび５μＣｉの［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を含む２０μｌのキナーゼバッファーを加え、３０℃にて３０分間リン酸化反応を行った。反応後、２０μｌの２×ＳＤＳ  サンプルバッファーを加え、５分間煮沸後、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＦＬＡ３０００（Ｆｕｊｉ  ｆｉｌｍ社製）を用いたオートラジオグラフィーによりリン酸化されたＨＳＰ２７を検出した。【０１４０】＜結果＞
テロメレース活性を有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３を一過性発現させたときに、陰性コントロールであるベクターをトランスフェクションしたときと比較して、細胞内テロメレース活性の上昇が認められた（約１．４倍、図４）。活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３の一過性発現によるテロメレース活性の上昇は、スチューデントｔ−テストで有意差（ｐ＜０．０１）が認められた。それに対し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＭＡＰＫＡＰＫ３を一過性発現させたときには細胞内テロメレース活性の変化は殆ど認められなかった。【０１４１】  一方、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３を一過性発現させたときは、細胞内テロメレース活性の低減が認められた（約０．７倍）。【０１４２】  一過性発現させた各ＭＡＰＫＡＰＫ３のキナーゼ活性をＨＳＰ２７を基質として用いたリン酸化試験で測定した結果、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３においてのみキナーゼ活性が認められた。【０１４３】  上記結果から、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のテロメレース活性が活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３の一過性発現により促進されること、およびＭＡＰＫＡＰＫ３によるテロメレース活性の促進効果はＭＡＰＫＡＰＫ３のキナーゼ活性に依存することが明らかになった。【０１４４】  また、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のテロメレース活性が不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３の一過性発現により低減されることが明らかになった。不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３はＴＥＲＴと結合する（実施例２を参照）が、そのキナーゼ活性は低減または消失している。このことから、不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３は、内因性のＭＡＰＫＡＰＫ３のＴＥＲＴへの結合を拮抗的に阻害することによりテロメレースの活性化を阻害し、その結果、テロメレース活性を低減させたと考える。
【実施例５】
【０１４５】（ＭＡＰＫＡＰＫ３によるテロメレース活性の上昇／ＨＥＫ２９３細胞核抽出液を用いたインビトロ系での検討）
細胞抽出液を脱リン酸化処理することにより抽出液中のテロメレース活性が低減することが報告されている。このことから、テロメレースの活性化におけるリン酸化の必要性が示唆されている。そこで、ＨＥＫ２９３細胞核抽出液を用いて核抽出液中のテロメレース活性に対する脱リン酸化処理の影響について検討した。さらに、ＨＥＫ２９３細胞核抽出液中のテロメレース活性が、精製したＭＡＰＫＡＰＫ３との反応により変化するか否かについて検討した。【０１４６】＜材料＞
ＭＡＰＫＡＰＫ３の調製と活性確認
ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰＫ３、活性化型ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰＫ３および不活性化型ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰＫ３は、実施例２に記載の方法と同様の方法で調製した。また、各ＭＡＰＫＡＰＫ３の活性は、実施例２に記載の方法で確認した。【０１４７】ＨＥＫ２９３細胞核抽出液の調製
ＨＥＫ２９３細胞を４００μＬのバッファーＡ（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐＨ８．０／１０ｍＭ  ＫＣｌ／０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ／０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ／１ｍＭ  ＤＴＴ／プロテアーゼ阻害剤カクテル）に懸濁し、氷上で１５分間放置後、２５μＬの１０％  ノニデットＰ−４０を加えてさらに氷上で１０分間放置した。その後、４℃で１４，０００ｒｐｍ，５分間の遠心処理により沈降した核を回収した。沈殿した核に１００μＬのバッファーＣ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐＨ８．０／４００ｍＭ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／１ｍＭ  ＥＧＴＡ／１ｍＭ  ＤＴＴ／プロテアーゼ阻害剤カクテル）を加えてよく攪拌し、氷上で１５分放置後、４℃で１４，０００ｒｐｍ，５分間の遠心処理により上清を回収し、核抽出液として用いた。その後、回収した核抽出液にバッファーＤ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐＨ８．０／０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、核抽出液中のＮａＣｌの最終濃度を１５０ｍＭにした。核抽出液は使用時まで−８０℃で保存した。【０１４８】＜方法＞
ＨＥＫ２９３細胞核抽出液の脱リン酸化処理および核抽出液内テロメレース活性の測定
蛋白質量２０００ｎｇのＨＥＫ２９３細胞核抽出液に５００、１００、２０、４、０．８、０、ｍｕｎｉｔのホスファターゼ、アルカリ−アガロース（ＣＩＰ−Ａｇａｒｏｓｅ、Ｓｉｇｍａ社製）を加え、２０μｌの反応バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０／１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で３０℃で３０分間脱リン酸化反応を行った。その後、遠心処理上清１μｌを上記反応バッファーで２０μｌに希釈し、そのうち１μｌを用いてＴＲＡＰ反応を行い、テロメレース活性を測定した。【０１４９】ＨＥＫ２９３細胞核抽出液中のテロメレース活性に対するＭＡＰＫＡＰＫ３の影響についての検討
上記と同様の方法でＨＥＫ２９３細胞核抽出液を脱リン酸化処理後、遠心処理上清１μｌに１００、５０、２５、１２．５、６．２５ｐｍｏｌの活性化型ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰＫ３またはＧＳＴを加え、２０μｌの反応系（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５／５ｍＭ  β−グリセロホスフェート／２ｍＭ  ＤＴＴ／０．１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４／１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２／０．１ｍＭ  ＡＴＰ）にて３０℃で３０分間リン酸化反応を行った。その後、反応液１μｌを用いてＴＲＡＰ反応を行い、テロメレース活性を測定した。活性化型ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰＫ３の代わりにＭＡＰＫＡＰＫ３または不活性化型ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰＫ３をリン酸化反応に用いるときは、それぞれ１００ｐｍｏｌを使用した。【０１５０】＜結果＞
脱リン酸化処理により、脱リン酸化酵素であるホスファターゼ、アルカリ−アガロースの用量依存的に、テロメレース活性の低減が認められた（図５）。この結果から、ＨＥＫ２９３細胞核抽出液中のテロメレースがリン酸化依存的に活性化されていることが判明した。【０１５１】  脱リン酸化処理によりテロメレース活性が低減した核抽出液に活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３を添加してリン酸化反応を行なった。その結果、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３用量依存的にテロメレース活性が上昇した（最大約１．５倍、図６）。それに対し、ＧＳＴを添加して同様にリン酸化反応を行なったときは、テロメレース活性の上昇は認められなかった。また、ＭＡＰＫＡＰＫ３または不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３を添加して同様にリン酸化反応を行なったときには、テロメレース活性の変化は認められなかった（図７）。【０１５２】  精製した各ＭＡＰＫＡＰＫ３のキナーゼ活性をＨＳＰ２７を基質として用いたリン酸化試験で測定した結果、活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３においてのみキナーゼ活性が認められた。【０１５３】  これら結果から、インビトロにおいてもＭＡＰＫＡＰＫ３がそのキナーゼ活性依存的にテロメレース活性を上昇させることが明らかになった。
【実施例６】
【０１５４】（不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３過剰発現によるテロメレース活性の阻害およびテロメア長短縮の検討）
癌細胞株において不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３過剰発現によりテロメレース活性が阻害されるか否かおよびテロメア長が短出されるか否かを検討した。【０１５５】  不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３は、ドミナントネガティブ効果を有し、内因性のＭＡＰＫＡＰＫ３の作用を阻害すると考える。実際、不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３は、ＴＥＲＴと結合し（実施例２および図２を参照）、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一過性発現させたときに細胞内テロメレース活性を低減させた（実施例４および図４を参照）。【０１５６】  不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３は、組換えレトロウイルスを利用し、癌細胞株において安定的に過剰発現させた。【０１５７】  テロメレース活性の測定はＴＲＡＰ法により実施した。また、テロメレース活性の阻害はテロメア長の短縮を誘導すると考えられることから、不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３を安定に過剰発現させた癌細胞株のテロメア長の測定を行った。【０１５８】＜材料と方法＞
不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３発現用組換えレトロウイルスベクターの構築
ｐ３８によるリン酸化部位である２０１番目と３１３番目のスレオニンのコドンをそれぞれアラニンのコドンに置換したＭＡＰＫＡＰＫ３  ｃＤＮＡ（５´側にＨＡ−ｔａｇコード配列を挿入）をレトロウイルスベクターであるｐＱＣＸＩＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に組込むことにより、不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３発現用組換えレトロウイルスベクターを構築した。本ベクターにより発現されるＭＡＰＫＡＰＫ３は、ｐ３８によるリン酸化を受けないために活性化されず、そのためキナーゼ活性を示さない。また、本ベクターにより発現されるＭＡＰＫＡＰＫ３は、そのＮ末端にＨＡ−ｔａｇが付加されている。【０１５９】組換えレトロウイルスの作製
細胞数２×１０６のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を５％ＣＯ２存在下にて３７℃で一晩培養した後（６０ｍｍシャーレ）、２μｇの不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３発現用組換えレトロウイルスベクターを各２μｇのｐＶＰａｃｋ−ＧＰおよびｐＶＰａｃｋ−ＶＳＶ−Ｇ（共にＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）と共に、ＦｕＧＥＮＥ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてトランスフェクションした。２日間培養後、培養上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過した後、ウイルス液として用いた。陰性コントロールとして不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３  ｃＤＮＡを組込んでいないｐＱＣＸＩＰを用い、同様に処理してウイルス液（以下空ウイルスと称する）を得た。【０１６０】培養細胞への組換えレトロウイルスの感染
癌細胞株として、ヒト前立腺癌由来細胞株ＰＣ−３およびヒト神経膠芽腫由来細胞株Ｕ−８７ＭＧを用いた。ＰＣ−３およびＵ−８７ＭＧをそれぞれ１２ウエルプレートにて一晩培養した後（約１０％コンフリュエンシー（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ））、培地を８μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ社製）を含むウイルス液（３５０μｌ／ｗｅｌｌ）に置換した。２４〜３６時間培養後、２．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含む培地に交換し、ウイルス感染細胞の選択培養を開始した。一週間以上選択培養後、ウェスタンブロッティングによる発現蛋白質の検出およびＴＲＡＰ法によるテロメレース活性の測定を実施した。なお、ウイルス感染細胞は、その後も選択培地にて継代維持した。【０１６１】ウェスタンブロッティング
細胞をＳＤＳサンプルバッファー（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８／４％  ＳＤＳ／２０％  グリセロール／０．０１％  ＢＰＢ）に懸濁し、超音波処理後、５分間煮沸したものを細胞抽出液として用いた。細胞抽出液を５−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、抗ＨＡポリクローナル抗体（Ｙ−１１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）を用いたウェスタンブロッティングにより、不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３の検出を行った。また、コントロールとして、抗β−チューブリンポリクローナル抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚｅ社製）を用いてβ−ｔｕｂｕｌｉｎの検出を行った。【０１６２】ＴＲＡＰ法によるテロメレース活性の定量
細胞内テロメレース活性は、ＴＲＡＰＥＺＥ  ＸＬ  Ｋｉｔ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社製）を用い、実施例４に記載した方法と同様の方法（ＴＲＡＰ法）で測定した。ただし、細胞溶解バッファーは、次に示す組成のものを用いた：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ  ７．５／１ｍＭ  ＭｇＣｌ２／１ｍＭ  ＥＧＴＡ／０．１ｍＭ  Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ／５ｍＭ  β−メルカプトエタノール／０．５％  ＣＨＡＰＳ／１０％  グリセロール／５ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム／１ｍＭ  β−グリセロホスフェート／１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４／１ｍＭ  ＮａＦ。また、蛋白質量４０ｎｇの細胞溶解液を用いてＴＲＡＰ反応を行った。【０１６３】培養細胞からのゲノムＤＮＡの抽出
ヒト神経膠芽腫由来細胞株Ｕ−８７ＭＧからゲノムＤＮＡを抽出し、テロメア長の測定に用いた。ゲノムＤＮＡの抽出は、Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、添付の説明書に従い実施した。【０１６４】テロメア長の測定
テロメア長の測定は、Ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（ＴＲＦ）解析法により実施した。具体的には、テロメア長の測定は、ＴｅｌｏＴＡＧＧＧ  Ｔｅｌｏｍｅｒｅ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用い、添付の説明書に従い実施した。即ち、ＨｉｎｆＩおよびＲｓａＩで消化した２μｇのゲノムＤＮＡを０．８％アガロースゲル電気泳動により分離後、ナイロンメンブレン（ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ−ｃｈａｒｇｅｄ、Ｒｏｃｈｅ社製）に２０×ＳＳＣ存在下にてキャピラリートランスファーした。トランスファー後のメンブレンを１２０℃で３０分間ベイクし、ＤＮＡを固定した。次に、メンブレンをキットに付属のＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ液中にてプレハイブリダイゼーションした後、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識されたテロメアプローブ（キットに付属）を加え、４２℃にて３時間以上ハイブリダイゼーションを行った。メンブレンを洗浄後、アルカリホスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体およびＣＤＰ−Ｓｔａｒ（共にキットに付属）を用いた化学発光法によりＴＲＦのシグナルを検出した。【０１６５】＜結果＞
不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３発現レトロウイルス感染細胞（ｉｎａｃｔｉｖｅ  ３ｐＫ）において、親株（ｐａｒｅｎｔ）または空ウイルス感染細胞（ｅｍｐｔｙ）と比較して、テロメレース活性が顕著に低減した（図８−Ａ）。不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３発現レトロウイルス感染細胞（ｉｎａｃｔｉｖｅ  ３ｐＫ）において不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３が過剰発現されていることはウェスタンブロットにより確認された。（図８−Ｂ）。すなわち、不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３発現レトロウイルス感染細胞は、不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３を安定的に過剰発現している。【０１６６】  不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３発現レトロウイルス感染細胞において経時的なテロメア長の短縮が認められた（図９）。特に、感染３８日後では、親株（ｐａｒｅｎｔ）および空ウイルス感染細胞（ｅｍｐｔｙ）と比較して明らかなテロメア長短縮が認められた（図９）。一方、親株（ｐａｒｅｎｔ）および空ウイルス感染細胞（ｅｍｐｔｙ）においてはテロメア長の変化は認められなかった（図９）。【０１６７】  これら結果から、不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３過剰発現によりテロメレース活性が阻害され、それによりテロメア長の短縮が引き起こされることが明らかになった。【０１６８】  不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３はＴＥＲＴと結合する（実施例２を参照）が、そのキナーゼ活性は低減または消失している。このことから、不活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３は、内因性のＭＡＰＫＡＰＫ３のＴＥＲＴへの結合を拮抗的に阻害することによりテロメレースの活性化を阻害し、それによりテロメレース活性の低減とテロメア長の短縮を引き起こしたと考える。
【産業上の利用可能性】
【０１６９】  本発明によれば、テロメレースの活性化またはテロメレースの活性を阻害する化合物の同定方法を提供できる。また、本発明によれば、テロメレースの活性化またはテロメレースの活性を阻害できる。さらに、テロメレースの作用やその活性の亢進に起因する疾患の防止および／または治療を期待できる。テロメレースが癌の種類を問わずほとんどの癌細胞で発現しており、生殖細胞以外の正常体細胞ではほとんど発現していないことから、本発明は例えば、多様な癌疾患の防止および／または治療に有効であると考える。【０１７０】  このように本発明は、テロメレースが関与する細胞増殖や細胞老化のメカニズムおよびテロメレースの作用やその活性の亢進に起因する疾患等に関する基礎的研究等に有用である。さらにテロメレースの作用やその活性の亢進に起因する疾患、例えば癌疾患の防止および／または治療に非常に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１７１】配列番号１：ＭＡＰＫＡＰＫ３（配列番号２）をコードするポリヌクレオチド。
配列番号３：ＴＥＲＴ（配列番号４）をコードするポリヌクレオチド。
配列番号５：ＭＡＰＫＡＰＫ３（配列番号２）の第２０１番目および第３１３番目のアミノ酸残基が共にスレオニンからアラニンに置換した不活性化型変異体をコードするポリヌクレオチド。
配列番号６：ＭＡＰＫＡＰＫ３（配列番号２）の第２０１番目および第３１３番目のアミノ酸残基が共にスレオニンからアラニンに置換した不活性化型変異体。
配列番号７：ＭＡＰＫＡＰＫ３（配列番号２）の第２０１番目および第３１３番目のアミノ酸残基が共にスレオニンからグルタミン酸に置換した活性化型変異体をコードするポリヌクレオチド。
配列番号８：ＭＡＰＫＡＰＫ３（配列番号２）の第２０１番目および第３１３番目のアミノ酸残基が共にスレオニンからグルタミン酸に置換した活性化型変異体。
配列番号９：ＭＡＰＫＡＰＫ３（配列番号２）の部分配列と高い相同性を有する、ＴＥＲＴ（配列番号４）の部分配列。
配列番号１０：ＴＥＲＴ（配列番号４）の部分配列と高い相同性を有する、ＭＡＰＫＡＰＫ３（配列番号２）の部分配列。
配列番号１１：ＭＡＰＫＡＰＫ３（配列番号２）の部分配列と高い相同性を有する、ＴＥＲＴ（配列番号４）の部分配列。
配列番号１２：ＴＥＲＴ（配列番号４）の部分配列と高い相同性を有する、ＭＡＰＫＡＰＫ３（配列番号２）の部分配列。
配列番号１３：ＴＥＲＴ（配列番号４）およびＭＡＰＫＡＰＫ３（配列番号２）の配列において、同一の部分配列。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【国際調査報告】
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