(57)【要約】【課題】微生物の種類によらず微生物が有する物質生産能を改善できる手段を提供すること、糖代謝活性を改善した変異型大腸菌を用いたピルビン酸の製造方法および酢酸の製造方法を提供すること。【解決手段】微生物の糖代謝活性または酢酸生産能を改善する方法。微生物のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１及びシトクロムｂｏオキシダーゼを欠失させる。微生物のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１遺伝子及びシトクロムｂｏオキシダーゼ遺伝子の一部をそれぞれ外来遺伝子と相同組み換えすることで、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１及びシトクロムｂｏオキシダーゼを欠失させる。ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１及びシトクロムｂｏオキシダーゼを欠失した変異型大腸菌。変異型大腸菌を培地中で培養し、培地中に酢酸を生成させ、生成した酢酸を採取する酢酸の製造方法。変異型大腸菌を培地中で培養し、培地中にピルビン酸を生成させ、生成したピルビン酸を採取するピルビン酸の製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物の糖代謝活性を改善する方法であって、前記微生物のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１及びシトクロムｂｏオキシダーゼを欠失させることを特徴とする方法。
【請求項２】
微生物の酢酸生産能を改善する方法であって、前記微生物のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１及びシトクロムｂｏオキシダーゼを欠失させることを特徴とする方法。
【請求項３】
微生物のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１遺伝子及びシトクロムｂｏオキシダーゼ遺伝子の一部をそれぞれ外来遺伝子と相同組み換えすることで、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１及びシトクロムｂｏオキシダーゼを欠失させる請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
微生物が大腸菌である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１及びシトクロムｂｏオキシダーゼを欠失した変異型大腸菌。
【請求項６】
請求項５に記載の変異型大腸菌を培地中で培養し、培地中に酢酸を生成させ、生成した酢酸を採取することを特徴とする酢酸の製造方法。
【請求項７】
請求項５に記載の変異型大腸菌を培地中で培養し、培地中にピルビン酸を生成させ、生成したピルビン酸を採取することを特徴とするピルビン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、微生物の糖代謝活性を改善する方法およびこの方法で糖代謝活性を改善した変異型大腸菌に関する。さらに本発明は、本発明の変異型大腸菌を用いたピルビン酸の製造方法および酢酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  微生物の有する物質生産能を改善して、有用物質を効率よく生産させる試みがなされている。例えば、特開平５−１３７５６８号公報（特許文献１）には、ピルビン酸生産能を改善した変異型大腸菌およびこの大腸菌を利用したピルビン酸の製造方法が記載されている。
【特許文献１】特開平５−１３７５６８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】  特許文献１に記載の発明においては、リポ酸を要求する大腸菌にＨ＋−ＡＴＰａｓｅの欠失を導入することで、ピルビン酸生産能を改善した大腸菌を得ている。
微生物を利用した有用物質の生産（発酵法）は、化学合成法と並んで有効な方法であっが、生産性を向上させる手段として、微生物自体の生産能を、微生物の種類によらず、改善できる方法は知られていない。【０００４】  そこで、本発明は、微生物の種類によらず微生物が有する物質生産能を改善できる手段を提供することを目的とする。
さらに本発明は、糖代謝活性を改善した変異型大腸菌を用いたピルビン酸の製造方法および酢酸の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】  本発明者らは、発酵法による有用物質生産の効率化をはかるため、種々の検討を行い、その結果、微生物の有する糖代謝活性に注目し、微生物の糖代謝を改変すること、特に、大腸菌においてＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１およびシトクロムｂｏオキシダーゼを欠失させることで、物質生産能を改善できることを見いだして本発明を完成させた。【０００６】  本発明は、以下の通りである。
［１］微生物の糖代謝活性を改善する方法であって、前記微生物のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１及びシトクロムｂｏオキシダーゼを欠失させることを特徴とする方法。
［２］微生物の酢酸生産能を改善する方法であって、前記微生物のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１及びシトクロムｂｏオキシダーゼを欠失させることを特徴とする方法。
［３］微生物のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１遺伝子及びシトクロムｂｏオキシダーゼ遺伝子の一部をそれぞれ外来遺伝子と相同組み換えすることで、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１及びシトクロムｂｏオキシダーゼを欠失させる［１］または［２］に記載の方法。
［４］微生物が大腸菌である［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１及びシトクロムｂｏオキシダーゼを欠失した変異型大腸菌。
［６］［５］に記載の変異型大腸菌を培地中で培養し、培地中に酢酸を生成させ、生成した酢酸を採取することを特徴とする酢酸の製造方法。
［７］［５］に記載の変異型大腸菌を培地中で培養し、培地中にピルビン酸を生成させ、生成したピルビン酸を採取することを特徴とするピルビン酸の製造方法。
【発明の効果】
【０００７】  本発明によれば、微生物の糖代謝を改変すること、特に、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１およびシトクロムｂｏオキシダーゼを欠失させることで、微生物の物質生産能を改善することができる。本発明の方法を用いて物質生産能を改善した微生物を用いることで、発酵法による有用物質生産の効率化をはかることができる。さらに本発明によれば、糖代謝活性を改善した変異型大腸菌を用いることで、ピルビン酸の生産効率を向上したピルビン酸の製造方法および酢酸の生産効率を向上した酢酸の製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】  本発明は、微生物の糖代謝活性を改善する方法であって、前記微生物のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１及びシトクロムｂｏオキシダーゼを欠失させることを特徴とする方法に関する。
本発明において糖代謝活性を改善する対象となる微生物は、好気性の微生物に限定されるが、好気性の微生物であれば、特に制限はない。好気性の微生物としては、例えば、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、コリネ型グルタミン酸生産菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、放線菌（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓなど）などを挙げることができる。【０００９】  本発明において改善される微生物の糖代謝活性とは、例えば、グルコース代謝活性であるが、グルコース代謝活性以外に、一般的な糖質すなわち、ガラクトース、フラクトース、シュクロースなどを代謝する能力も含めることができる。さらに、実用的な面からは、廃糖蜜やコーンスティープリカー、デンプン分解物糖蜜など、一般的な発酵生産に用いられる天然の糖源の代謝活性も含む。【００１０】  さらに、本発明は微生物の酢酸生産能を改善する方法を包含する。糖代謝の結果生産される、酢酸の生産能を改善する方法である。ここでの微生物は、上記好気性の微生物であることができる。【００１１】  本発明の微生物の糖代謝活性を改善する方法および微生物の酢酸生産能を改善する方法においては、微生物のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１及びシトクロムｂｏオキシダーゼを欠失させる。好気性の微生物は、好気呼吸鎖に図１に示すように、ＮＡＤＨを酸化して膜外にプロトンを排出する経路を有し、この経路には、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼとシトクロムオキシダーゼが関与する。尚、図１中、ＡはＦ１−ＡＴＰａｓｅ欠損変異株であり、ＢはＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１及びシトクロムｂｏオキシダーゼ欠損変異株である。ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼには、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１とＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ２というアイソザイムが存在し、シトクロムオキシダーゼには、シトクロムｂｏオキシダーゼとシトクロムｂｄオキシダーゼというアイソザイムが存在する。本発明者らは、これらアイソザイムのうち、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１及びシトクロムｂｏオキシダーゼの組み合わせが膜外へのプロトン排出能が高いことを見いだし、さらに、これら２つの酵素活性を阻害することで、微生物の糖代謝活性および酢酸生産能が改善されることを見いだした。【００１２】  微生物におけるＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１及びシトクロムｂｏオキシダーゼを欠失させるには、公知の遺伝子組み換え技術を利用して適宜行うことができる。例えば、微生物のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１遺伝子及びシトクロムｂｏオキシダーゼ遺伝子の一部をそれぞれ外来遺伝子と相同組み換えすることで、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１及びシトクロムｂｏオキシダーゼを欠失させることができる。具体的には、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１遺伝子の一部を外来遺伝子と相同組み換えして、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１活性を欠失させることができるプラスミド、およびシトクロムｂｏオキシダーゼ遺伝子の一部を外来遺伝子と相同組み換えして、シトクロムｂｏオキシダーゼ活性を欠失させることができるプラスミドを用い、これらプラスミドで、目的とする微生物を形質転換することで、微生物におけるＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１及びシトクロムｂｏオキシダーゼを欠失させることができる。【００１３】  ���り具体的には、後述の実施例で記載したよう、シトクロムｂｏオキシダーゼ活性を欠失させることができるプラスミドｐＭｃｙｏ３を、例えば、ヒートショック法あるいはエレクトロポレーション等を用いて、目的微生物に導入し、プラスミドｐＭｃｙｏ３が導入され、目的微生物のシトクロムｂｏオキシダーゼ遺伝子と相同組み換えを起こした微生物を選択することで、シトクロムｂｏオキシダーゼ活性を欠失させた微生物を得る。プラスミドｐＭｃｙｏ３は、温度感受性プラスミドベクターｐＭＡＮ９９７にカナマイシン耐性遺伝子を導入したものである。プラスミドｐＭｃｙｏ３が導入された微生物の選択は、カナマイシン耐性遺伝子をシトクロムｂｏオキシダーゼ遺伝子の一部に置き換えてあるため、カナマイシンを用いて行うことができる。プラスミドｐＭｃｙｏ３には、シトクロムｂｏオキシダーゼ遺伝子の一部にカナマイシン耐性遺伝子が導入されているが、カナマイシン耐性遺伝子以外の薬剤遺伝子を用いることも可能である。【００１４】  次いで、シトクロムｂｏオキシダーゼ活性を欠失させた微生物に、後述の実施例で記載したよう、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１を欠失させることができるプラスミドｐＭｎｕｏ３を、例えば、ヒートショック法あるいはエレクトロポレーション等を用いて導入し、プラスミドｐＭｎｕｏ３がさらに導入され、目的微生物のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１遺伝子と相同組み換えを起こした微生物を選択する。これにより、シトクロムｂｏオキシダーゼ活性およびＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１活性を欠失させた微生物を得ることができる。プラスミドｐＭｎｕｏ３は、温度感受性プラスミドベクターｐＭＡＮ９９７にアンピシリン耐性遺伝子を導入したものである。プラスミドｐＭｎｕｏ３が導入された微生物の選択は、アンピシリン耐性遺伝子をＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１遺伝子の一部に置き換えてあるため、アンピシリンを用いて行うことができる。プラスミドｐＭｎｕｏ３には、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１遺伝子の一部にアンピシリン耐性遺伝子が導入されているが、アンピシリン耐性遺伝子以外の薬剤遺伝子を用いることも可能である。ただし、この場合、プラスミドｐＭｃｙｏ３に含まれている薬剤遺伝子以外の遺伝子を用いる。【００１５】  目的微生物のシトクロムｂｏオキシダーゼ遺伝子またはＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１遺伝子との相同組み換えは、より詳細には、以下のように行う。以下の方法では、プラスミドとして温度感受性プラスミドベクターｐＭＡＮ９９７にカナマイシン耐性遺伝子を導入したプラスミドｐＭｃｙｏ３を用いた例である。組み換えの手順は図２に示した。
１．変異型遺伝子を有するプラスミド（ここではｐＭｃｙｏ３）を宿主株（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５株）へ導入する。
２．一部のプラスミドが相同組み換えを起こして、染色体上の対応する遺伝子部位に導入される（１回組み換え株）。この際、相同組み換えを生ずる部位は、変異の前方にある場合と後方にある場合と２種類あり得る。
３．高温にてプラスミドをキュアリングした条件でプラスミド上の薬剤耐性マーカー株を選択することによって、１回組み換え株を効率よく取得する。
４．得られた２回組み換え株から、再度組み換えを生じて染色体よりプラスミドが除去された株（２回組み換え株）を、非許容温度にてプラスミド上のマーカーの脱落を指標として選択する。２回組み換え株の中には、１回組み換えと逆の相同部位にて２回組み換えを生じた遺伝子置き換え株と、同じ相同部位にて２回組み換えを生じて宿主株と同じ遺伝子型に戻った株の２種類がある。
５．２回組み換え株のなかから、変異型遺伝子に置き換えられた株を選択する。【００１６】  上記説明では、温度感受性プラスミドベクターとして、ｐＭＡＮ９９７を用いたが、ｐＭＡＮ９９７以外に例えば、ｐＥＬ３など公知の温度感受性プラスミドを用いることができる。（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ  ＫＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７５，３３１−３４７（１９８４）参照）。【００１７】  本発明においては、糖代謝活性または酢酸生産能が改善する対象となる微生物は、大腸菌であることができ、本発明は、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１及びシトクロムｂｏオキシダーゼを欠失した大腸菌を包含する。ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１及びシトクロムｂｏオキシダーゼを欠失した大腸菌としては、後述する実施例に記載した、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５ΔｎｕｏΔｃｙｏ  ｍｕｔａｎｔ（ΔｃｙｏＡＢＣＤＥ：：ｋｍ，ΔｎｕｏＡ−Ｎ：：ｃｍ）を挙げることができる。大腸菌はもとより、大腸菌以外の微生物でも、上記に示した手法を用いてＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１及びシトクロムｂｏオキシダーゼを欠失させることで、微生物の糖代謝活性または酢酸生産能を改善することができる。【００１８】［変異型大腸菌を用いたピルビン酸の製造方法］
本発明でピルビン酸を生産するために使用する培地は炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン、核酸などの有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地が使用される。炭素源としては使用する変異株の利用可能なものであればよく、例えばグルコース、フラクトース、澱粉分解物糖蜜などの糖類が使用され、その他菌株によっては、シュークロース、マルトースや、エタノール、プロパノール等のアルコール類、酢酸、クエン酸等の有機酸類、ノルマルパラフィン等も単独あるいは他の炭素源と併用して使用される。【００１９】  窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、尿素、アンモニア、肉エキス等無機あるいは有機の窒素源が使用される。有機微量栄養素としてはアミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、蛋自分解物等が使用され、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが必要である。【００２０】  培養は好気的条件で行うことが望ましく、培養期間中培地のｐＨを５乃至９、温度を２０℃乃至４０℃に制御しつつ１日乃至４日間振とう培養または通気撹拌培養することによりピルビン酸が蓄量培養液中に蓄積される。【００２１】  培養液からピルビン酸を採取する方法は公知の方法に従って行えばよく、培養液から菌体を分離除去した後、ピルビン酸塩として濃縮晶析する方法あるいはイオン交換樹脂を用いる方法などにより採取される。【００２２】［変異型大腸菌を用いた酢酸の製造方法］
酢酸の製造方法は、上記ピルビン酸の製造方法とほぼ同様に実施することができる。培地は、上記で例示したものをそのまま使用できる。培養は好気的条件で行うことが望ましく、培養期間中培地のｐＨを５乃至９、温度を２０℃乃至４０℃に制御しつつ１日乃至４日間振とう培養または通気撹拌培養することにより酢酸が蓄量培養液中に蓄積される。【００２３】  培養液から酢酸を採取する方法は公知の方法に従って行えばよく、培養液から菌体を分離除去した後、酢酸塩として濃縮晶析する方法あるいはイオン交換樹脂を用いる方法などにより採取される。【００２４】  下記実施例に記載したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５ΔｎｕｏΔｃｙｏ  ｍｕｔａｎｔ（ΔｃｙｏＡＢＣＤＥ：：ｋｍ，ΔｎｕｏＡ−Ｎ：：ｃｍ）は、変異を導入することで、酢酸産生能が最善された大腸菌である。この大腸菌を用い、上記条件で培養することで、酢酸を効率よく生産することができる。【００２５】  一方、ピルビン酸の生産については、ピルビン酸の生産能を改善した大腸菌等の微生物を用いることが好ましい。例えば、特開平５−１３７５６８号公報（特許文献１）に記載のよう、ＡＴＰａｓｅの活性低下、あるいはそれに加えてリポ酸要求性、すなわちピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性低下を利用して、ピルビン酸を蓄積せしめる（ピルビン酸の生産能を改善する）ことができる。この方法は、ピルビン酸からアセチルＣｏＡへの代謝を止めることで、微生物内にピルビン酸を蓄積させる方法である。【００２６】  本発明では、微生物の呼吸鎖に改変を加えているが、呼吸鎖以外に改変は行っておらず、本発明の改変に加えて、さらにピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性低下、あるいはピルビン酸から酢酸への代謝を触媒するピルビン酸オキシダーゼ遺伝子の破壊などを行って、代謝をピルビン酸で止めることは、可能である。【００２７】  同様に、ピルビン酸産生以外の生産能を改善する場合、野生型の微生物に、所望の性能を改善する改変を、本発明による呼吸鎖への改変に加えることで、所望の生産物をより効率よく生産させることが可能になる。
【実施例】
【００２８】  以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例１
ＮＤＨ−１およびｃｙｔ  ｂｏ二重欠損変異株の構築方法
［目的］
大腸菌の野性株にチトクロームｂｏオキシダーゼ（以下ｃｙｔ  ｂｏ）をコードする遺伝子ｃｙｏＡＢＣＤＥ欠損させ、得られた大腸菌のｃｙｔ  ｂｏ欠損変異株に、呼吸鎖第一酵素であるＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ１（ＮＤＨ−１）の欠損変異を導入し、二重変異株を構築した。【００２９】［供試菌株］
（１）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５株（ＡＴＣＣ１２４３５）
本株は、Ｋ−１２株系統の栄養要求性のない野生株である。
（２）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５Ｄｃｙｏ  ｍｕｔａｎｔ（ΔｃｙｏＡＢＣＤＥ：：ｋｍ）
本株は、遺伝子工学的手法を用いてＷ１４８５にｃｙｔ  ｂｏ欠損変異を導入した株である。
（３）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５ＤｎｕｏＤｃｙｏ  ｍｕｔａｎｔ（ΔｃｙｏＡＢＣＤＥ：：ｋｍ，ΔｎｕｏＡ−Ｎ：：ｃｍ）
本株は、遺伝子工学的手法を用いてＷ１４８５Δｃｙｏ  ｍｕｔａｎｔにＮＤＨ−１欠損変異を導入した株である。【００３０】  チトクロームｂｏオキシダーゼ（ｃｙｔ  ｂｏ）欠損変異株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５Δｃｙｏ  ｍｕｔａｎｔ（ΔｃｙｏＡＢＣＤＥ：：ｋｍ）の構築
［ｃｙｔ  ｂｏ欠損変異株の構築方法］【００３１】Ｉ  組み換え用プラスミドｐＭｃｙｏ３の構築
相同組み換えを行うにあたってまず、組み換え用プラスミドｐＭｃｙｏ３を構築しなければならない。ｐＭｃｙｏ３の構築には、欠失させるｃｙｔ  ｂｏをコードする領域の上流部分、下流部分、そして耐性遺伝子を温度感受性プラスミドベクターｐＭＡＮ９９７に挿入する必要がある。ｃｙｔ  ｂｏ領域上流部分と下流部分が、組み換えが起こる際の相同部位となり、ｃｙｔ  ｂｏ領域を含む約５．８ｋｂｐの断片が欠失して代わりにカナマイシン耐性遺伝子がその部分に挿入される。このようにしてｃｙｔ  ｂｏ欠損株を構築する。全体の手順は図４に示した。【００３２】（１）ｐＭｃｙｏ１の構築
［方法］
まず塩基配列のデータベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ  ｄａｔａｂａｓｅ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＣ＃０００９１３）からｃｙｔ  ｂｏ（ｃｙｏＡＢＣＤＥ）の配列を調べ、組み換えの際に相同配列とするｃｙｔ  ｂｏ領域上流の約１．２ｋｂｐの断片を表１に示したようにプライマーＡＺＰｃｙｏ１、ＡＺＰｃｙｏ２を設計しＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＰＣＲを行った。鋳型はＷ１４８５株のゲノムを用いた。なお、プライマーＡＺＰｃｙｏ１の５’末端にはＨｉｎｄ  ＩＩＩサイトをライゲーションのために付加している（ＡＡＧＣＴＴがＨｉｎｄＩＩＩサイト）。ＰＣＲの反応組成と反応条件はそれぞれ表２および図３に示した。以下、ＡｍｐｌｉＴａｑを用いたＰＣＲは同じ条件で行った。【００３３】
【表１】
2006085589.tif 000002
【００３４】
【表２】
2006085589.tif 000003
Ｓ．Ｄ．Ｗ．５０μｌでｆｉｌｌ  ｕｐした。【００３５】  ＰＣＲで増幅した約１．２ｋｂｐの断片をＨｉｎｄ  ＩＩＩ、Ｓａｌ  Ｉ消化し、得られた０．９ｋｂｐの断片をインサートとした。ベクターは温度感受性プラスミドベクターｐＭＡＮ９９７をＨｉｎｄ  ＩＩＩ、Ｓａｌ  Ｉ消化したものを用い、インサートとをＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｐａｃｋ、ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ）で、１６℃で一晩ライゲーションを行った。以下、ライゲーションは同じ条件で行った。
このライゲーション産物を用いてエレクトロポレーション法でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株を形質転換し、ＬＢ＋アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）プレートに出現したコロニーからピックアップしたもののプラスミド抽出を行い、インサートが挿入されていることを電気泳動にて確認した。【００３６】（２）ｐＭｃｙｏ２の構築
［方法］
ｐＭｃｙｏ１を構築したので、次にｃｙｔ  ｂｏ領域下流の約１．３ｋｂｐの領域をｐＭｃｙｏ１に繋げ、ｐＭｃｙｏ２の構築を試みた。（１）と同様にまずインサートとなる約１．３ｋｂｐの断片を作成した。表３に示すプライマーＡＺＰｃｙｏ３とＡＺＰｃｙｏ４を用いＰＣＲにより増幅した断片をＳａｌ  Ｉ、Ｅｃｏ  ＲＩで消化したものをインサートとした。なおプライマーＡＺＰｃｙｏ４にはＥｃｏ  ＲＩサイトを付加している（ＧＡＡＴＴＣがＥｃｏＲＩサイト）。ベクターはｐＭｃｙｏ１をＳａｌ  Ｉ、Ｅｃｏ  ＲＩで消化したものを用い、ライゲーションを行うことによりｐＭｃｙｏ２を得ることを試みた。
（１）と同様に、エレクトロポレーション法でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株を形質転換し、ＬＢアンピシリンプレートに出現したコロニーからピックアップしたもののプラスミド抽出を行いインサートが挿入されていることを電気泳動にて確認した。【００３７】
【表３】
2006085589.tif 000004
【００３８】［結果］
ｐＭｃｙｏ１とｐＭｃｙｏ２の電気泳動結果を図５に示し、各レーンの概要は図６に示す。（３）レーンのｐＭＡＮ９９７をＥｃｏＲ  Ｉ消化したサンプルは約４．１ｋｂｐのところにバンドが出現した。そして（４）レーンのｐＭｃｙｏ１をＥｃｏＲ  Ｉ消化したサンプルは４．９、（５）レーンのｐＭｃｙｏ２においてをＥｃｏＲ  Ｉ消化したサンプルは５．７ｋｂｐ付近にバンドが出現し、バンドの長さは計算上の値と一致しており、構築が成功していることが伺える。また、（７）レーンのｐＭｃｙｏ１をＨｉｎｄ  ＩＩＩとＳａｌ  Ｉで消化したサンプルは４．１と０．８ｋｂｐに、（８）レーンのｐＭｃｙｏ２をＨｉｎｄ  ＩＩＩとＥｃｏＲ  Ｉで消化したサンプルは４．１と１．６ｋｂｐに、そして（９）レーンのｐＭｃｙｏ２をＨｉｎｄ  ＩＩＩ、ＥｃｏＲ  ＩとＳａｌ  Ｉで消化したサンプルは４．１と０．８ｋｂｐのところにバンドが出現しており、それらは全てｐＭＡＮ９９７の長さのバンドと挿入したインサートの長さのバンドに一致することから、ｐＭｃｙｏ１とｐＭｃｙｏ２は両方とも意図した通りに構築が成功していると示唆された。【００３９】（３）ｐＭｃｙｏ３の構築
［方法］
カナマイシン耐性遺伝子（Ｋｍｒ）とｐＭｃｙｏ２とのライゲーションを行うことによりｐＭｃｙｏ３を得ることを試みた。表４に示したようにプライマーＡＺＰｋａｎ４、ＡＺＰｋａｎ６を設計し、ｐＨＳＧ２９９（ＴａＫａＲａ）を鋳型としてＰＣＲにより増幅した断片をＳａｌ  Ｉで消化し、得られた約１．４ｋｂｐの断片をカナマイシン耐性インサートとして用いた。なおプライマーＡＺＰｋａｎ４にはＳａｌ  Ｉサイトを付加している（ＧＴＣＧＡＣがＳａｌＩサイト）。ベクターはｐＭｃｙｏ２をＳａｌ  Ｉ消化したものを用いた。
形質転換後はＬＢ＋アンピシリン（最終濃度１００ｇ／ｍｌ）＋カナマイシン（最終濃度５０ｇ／ｍｌ）のプレートに菌液１００μｌを塗りつけ、出現したコロニーからピックアップしたもののプラスミド抽出を行いインサートが挿入されていることを電気泳動にて確認した。このプレートに出現するコロニーは理論上アンピシリン耐性のｐＭｃｙｏ２にカナマイシン耐性遺伝子が挿入されたプラスミドｐＭｃｙｏ３であると考えられる。【００４０】
【表４】
2006085589.tif 000005
【００４１】［結果］
ｐＭｃｙｏ３の電気泳動結果を図７に示す。未消化サンプルであるので分子量マーカーとの比較はでいないが、（１）、（２）、（３）および（４）は他のバンドより上にシフトしているのがはっきりと分かる。これらがｐＭｃｙｏ３である可能性が非常に高く、以後の確認作業に用いた。【００４２】（４）ｐＭｃｙｏ３の塩基配列決定
［方法］
得られたｐＭｃｙｏ３が意図した塩基配列を有しているかを確認するために、シークエンス反応を行った。シークエンスに供するサンプルは、ｐＭｃｙｏ３を鋳型にしてプライマーＭ１３  ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ１とＭ１３  ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ（ＴａＫａＲａ，表５）でＰＣＲ反応を行い、（ｐＭＡＮ９９７はｐＵＣ１９由来のマルチクローニングサイトを持っているため、市販のマルチクローニングサイト増幅用プライマーであるＭ１３  ｐｒｉｍｅｒが使用できる）そこで得られた約４．２ｋｂｐの断片を、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて調製した。反応組成、および反応条件をそれぞれ表６、図８に示す。また反応はホットスタートで開始した。反応後のサンプルはＣｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐスピンカラム（ＰＲＩＮＳＥＴＯＮ  ＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ）を用いて精製した。まずカラムを滅菌水８００μｌで２時間以上水和し、カラム内の滅菌水をゲル表面まで自然落下させ廃棄した。ウォッシャーチューブをセットし７３０ｘｇで２分間遠心し、サンプルチューブをセットし反応液２０μｌを加え７３０ｘｇで２分間遠心後３０分間遠心濃縮した。シークエンサーはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。得られた塩基配列の解析はＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ  ｖｅｒ．４．０（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ａｕｔｏ−ＡｓｓｅｍｂｌｅｒＴＭ  ｖｅｒ．２．１（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ）を用いて行った。【００４３】
【表５】
2006085589.tif 000006
【００４４】
【表６】
2006085589.tif 000007
Ｓ．Ｄ．Ｗ．２０μｌでｆｉｌｌ  ｕｐした。【００４５】［結果］
シークエンスの結果、設計した配列と得られたｐＭｃｙｏ３の配列は９９％以上の相同性を示した。ｐＭＡＮ９９７にｃｙｔ  ｂｏの上流および下流領域が組み込まれており、その間にカナマイシン耐性遺伝子が挿入されていることが確認できた。今後、野性株との組み換え実験にこのプラスミドｐＭｃｙｏ３を用いることにした。【００４６】ＩＩ  ｐＭｃｙｏ３を用いたゲノムとの相同組み換え
上記Ｉで記載したように組み換え用プラスミドｐＭｃｙｏ３を構築したのでこれを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５株（ＡＴＣＣ１２４３５）を形質転換し、ゲノムＤＮＡとの二回の相同組み換えによりｃｙｔ  ｂｏ欠損株の構築を行う。【００４７】（１）ヒートショック法による大腸菌の形質転換
ヒートショック法は塩化カルシウムによって膜の透過性を変化させる方法で、エレクトロポレーションよりも転換効率は劣ると言われているが、安価で作成にかかる時間も長くないという理由から、この方法によってｐＭｃｙｏ３を用いてＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５株を形質転換する。【００４８】［方法］
ヒートショック法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ（３ｒｄ  ｅｄ．）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓなど参照）により、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５株をプラスミドｐＭｃｙｏ３で形質転換した。形質転換体をＬＢ＋アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）＋カナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）プレートに菌液１００μｌを塗りつけ、３０℃にて一晩培養した。【００４９】［結果］
ｐＭｃｙｏ３の形質であるアンピシリン耐性およびカナマイシン耐性を持ったＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５株を取得し、プラスミド抽出によりｐＭｃｙｏ３の存在を確認した。ｐＭｃｙｏ３を用いた形質転換体が得られた。【００５０】（２）Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５株ゲノムとの相同組み換え
［方法］
ｐＭｃｙｏ３を用いて形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５株をＬＢ＋アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）＋カナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）プレートで３０℃、２４ｈｒ培養した。培養後、プレート上に出現したコロニーからいくつかを選択し５ｍｌのＬＢ＋アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）＋カナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）の液体培地（中試験官）で３０℃、２４ｈｒ培養を行った。培養後、培養液を１０−４、１０−５、１０−６倍希釈しＬＢ＋アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）＋カナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）プレートで４２℃、２４ｈｒの培養を２回繰り返した。ここで生き残った株が１回組み換え株と推定される。取得した１回組み換え株を５ｍｌのＬＢ（薬剤なし）液体培地で３０℃、２４ｈｒ培養し、培養液５００μｌを５ｍｌのＬＢ＋カナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）の液体培地に４２℃でフルグロースまで振盪培養を行った。この培養液を１０−４、１０−５、１０−６倍希釈しＬＢ＋カナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）プレートで４２℃、２４ｈｒ培養した。プレートに出現したコロニーをさらにＬＢ＋カナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）プレートとＬＢ＋アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）プレートにレプリカし、カナマイシン耐性でかつ、アンピシリン感受性であるものを選択し、推定上２回組み換え株とした。【００５１】［結果］
推定上の２回組換え株がいくつか取得された。これらの株について、組み換え体が目的通りｃｙｔ  ｂｏをコードする遺伝子ｃｙｏＡＢＣＤＥが欠失しており、ｃｙｔ  ｂｏ活性が無くなっているかを、ＰＣＲ、シークエンス、酵素活性測定を行って確認した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５Δｃｙｏ  ｍｕｔａｎｔ（ΔｃｙｏＡＢＣＤＥ：：ｋｍ）が得られたことを確認した。【００５２】［ＮＤＨ−１およびｃｙｔ  ｂｏ二重欠損変異株の構築方法］
構築方法は、上記で述べたｃｙｔ  ｂｏ欠損変異株の構築方法と同様の手法を採用した。ただし宿主株には上記で得られたＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５Δｃｙｏ  ｍｕｔａｎｔを用い、かつ変異導入のプラスミドとしてｐＭｎｕｏ３を用いた。ＮＤＨ−１欠損変異導入の際は、ＮＤＨ−１オペロンではなくプロモーターを欠損させている他は、同様に実施した。【００５３】組み換え用プラスミドｐＭｎｕｏ３の構築
組み換え用プラスミドｐＭｎｕｏ３の構築は、上記の組み換え用プラスミドｐＭｃｙｏ３の構築と同様の手順で行った。即ち、ｐＭｃｙｏ３の構築において、ｐＭｃｙｏ１の代りにｐＭｎｕｏ１を構築し、ｐＭｃｙｏ２の代りにｐＭｎｕｏ２を構築し、ｐＭｃｙｏ３の代りにｐＭｎｕｏ３を構築した。
ｐＭｎｕｏ１は、以下の２つのプライマーを用いてＮＤＨ−１プロモーター領域の下流の７００ｂｐをクローニングした。なおライゲーションするにあたって用いた制限酵素はＳｍａ  ＩとＸｂａ  Ｉである。配列番号９ではＴＣＴＡＧＡがＸｂａＩサイトであり、配列番号１０ではＣＣＣＧＧＧがＳｍａＩサイトである。【００５４】
【表７】
2006085589.tif 000008
【００５５】  ＰＭｎｕｏ２は、以下の２つのプライマーを用いてＮＤＨ−１プロモーター領域の上流の７００ｂｐをクローニングした。なおライゲーションするにあたって用いた制限酵素はＥｃｏ  ＲＩとＳｍａ  Ｉである。配列番号１１ではＣＣＣＧＧＧがＳｍａＩサイトであり、り配列番号１２ではＧＡＡＴＴＣがＥｃｏＲＩサイトである。【００５６】
【表８】
2006085589.tif 000009
【００５７】  ｐＭｎｕｏ３は、クロラムフェニコール耐性遺伝子はＴａｋａＲａより購入したｐＨＳＧ３９６をＡｃｃ  ＩＩ消化し約１０００ｂｐの断片として得た。ベクターはｐＭｎｕｏ２をＳｍａ  Ｉ消化したものを用いた（Ａｃｃ  ＩＩ、Ｓｍａ  Ｉはともに平滑末端である）。【００５８】組み替え用プラスミドｐＭｎｕｏ３を用いたゲノムとの相同組み換え
［方法］
上記で構築したｐＭｎｕｏ３を用いてＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５Δｃｙｏ  ｍｕｔａｎｔをヒートショック法で形質転換し、形質転換後、ＬＢ＋アンピシリン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）＋クロラムフェニコール（最終濃度２５ｇ／ｍｌ）＋カナマイシン（最終濃度２０μｇ／ｍｌ）プレートで３０℃、２４ｈｒ培養した。培養後、プレート上に出現したコロニーからいくつかを選択し５ｍｌのＬＢ＋アンピシリン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）＋クロラムフェニコール（最終濃度２５μｇ／ｍｌ）＋カナマイシン（最終濃度２０μｇ／ｍｌ）の液体培地（中試験官）で３０℃、２４ｈｒ培養を行った。培養後、培養液を１０−４、１０−５、１０−６倍希釈しＬＢ＋アンピシリン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）＋クロラムフェニコール（最終濃度２５μｇ／ｍｌ）＋カナマイシン（最終濃度２０μｇ／ｍｌ）プレートで４２℃、２４ｈｒの培養を２回繰り返した。ここで生き残った株が１回組み換え株と推定される。取得した１回組み換え株を５ｍｌのＬＢ（薬剤なし）液体培地で３０℃、２４ｈｒ培養し、培養液５００μｌを５ｍｌのＬＢ＋クロラムフェニコール（最終濃度４０μｇ／ｍｌ）＋カナマイシン（最終濃度４０μｇ／ｍｌ）の液体培地に４２℃でフルグロースまで振盪培養を行った。この培養液を１０−４、１０−５、１０−６倍希釈しＬＢ＋クロラムフェニコール（最終濃度４０μｇ／ｍｌ）＋カナマイシン（最終濃度４０μｇ／ｍｌ）プレートで４２℃、２４ｈｒ培養した。プレートに出現したコロニーをさらにＬＢ＋クロラムフェニコール（最終濃度４０μｇ／ｍｌ）＋カナマイシン（最終濃度４０μｇ／ｍｌ）プレートとＬＢ＋アンピシリン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）プレートにレプリカし、クロラムフェニコール耐性およびカナマイシン耐性でかつ、アンピシリン感受性であるものを選択し、推定上２回組み換え株とした。【００５９】［結果］
推定上の２回組換え株がいくつか取得された。これらの株を次節に述べる、組み替え体の確認に用いた。【００６０】組み替え体の確認
上記で得た組み換え体が、目的通りｎｕｏＡ−Ｎ遺伝子のプロモーター領域が欠失しており、ＮＤＨ−１活性が無くなっているかを確認した上で今後の実験に、意図した欠損株として用いるために組み換え体の候補株を用いＰＣＲ、シークエンスを行った。【００６１】（１）ＰＣＲによる組み換え体の確認
［方法］
組み換え体の候補株と、ネガティブコントロールである野性株Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５株をサンプルとして用いてｎｕｏＡ−Ｎ遺伝子のプロモーター領域が欠損しているかどうかを確認した。用いたプライマーは表９に、ＰＣＲ反応の概要は図９に示した。なお、ＰＣＲの反応組成と反応条件は前述の表２および図３を参照のこと。【００６２】
【表９】
2006085589.tif 000010
【００６３】［結果］
ＰＣＲの結果の電気泳動写真を図１０に示した。ＹＨＰｎ１７とＹＨＰｎ１８とでＰＣＲすると、野性株Ｗ１４８５（図１０、サンプル（２）、（３））では約２．０ｋｂｐ、組み換え体の候補株（図１０、サンプル（４）、（５）、（６）、（７））では約２．７ｋｂｐの断片が増幅した。この結果から組み換え体の候補株のゲノム上において、ＮＤＨ−１が欠損していることが推定された。【００６４】（２）シークエンスによる組み換え体の確認
［方法］
組み換え体の候補株についてｎｕｏＡ−Ｎ遺伝子のプロモーター領域が欠損しているかどうかをゲノムを鋳型にしてプライマーＹＨＰｎ１７とＹＨＰｎ１８で増幅したＰＣＲ産物約２．７ｋｂｐの断片のシークエンスを行った。シークエンスは前述の方法に従い、反応組成と反応条件は前述の表４および図３を参照のこと。【００６５】［結果］
シークエンスの結果からｎｕｏＡ−Ｎのプロモーター領域が欠失しており、代わりにクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入されていることがわかった。すなわちこの組み替え体候補株にはＮＤＨ−１欠損変異が導入されたことが示唆され、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５ΔｎｕｏΔｃｙｏ  ｍｕｔａｎｔと命名した。【００６６】実施例２
ＮＤＨ−１とｃｙｔ  ｂｏの二重欠損変異株の発酵解析
［供試菌株］
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５（ＡＴＣＣ１２４３５）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５ＤｎｕｏΔｃｙｏ  ｍｕｔａｎｔ（ΔｃｙｏＡＢＣＤＥ：：ｋｍ，ΔｎｕｏＡ−Ｎ：：ｃｍ）
［方法］
（ａ）保存および培養培地
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５ΔｎｕｏΔｃｙｏ  ｍｕｔａｎｔの保存培地にはＬＢ＋クロラムフェニコール（最終濃度２５μｇ／ｍｌ）＋カナマイシン（最終濃度２５ｇ／ｍｌ）を用い、本培養培地はＭ９最少液体培地を２Ｌ容ジャーファーメンターに分注したものを用いた。【００６７】（ｂ）ケモスタット培養
リフレッシュはグルコース４ｇ／ｌのＭ９寒天培地で一晩培養を二回行い、この菌体をグルコース４ｇ／ｌのＭ９培地５０ｍｌに接種し、坂口フラスコで振盪培養した。これを前培養としてＯＤ６６０が０．８〜１．０ぐらいになるまで培養した。これは対数増殖期にあり、十分高い生育能を保持している菌体を本培養に供給するためである。本培養であるケモスタット培養ではＯＤ６６０が０．０１５となるように前培養液を接種した。培養を開始してグルコースが消費され尽くされてから、Ｍ９培地をペリスタポンプで連続的に供給し、その同等量の培養液を排出することで連続培養とした。そして、Ｍ９培地供給開始から３ｖｏｌｕｍｅ以上を流したあと、菌体濃度が一定であること、グルコースが培養液中に検出されないことをもって定常状態とし、培養菌体を回収した。なお、ケモスタット培養の培養条件を表１０に示す。【００６８】
【表１０】
2006085589.tif 000011
【００６９】（ｃ）生育量の測定と残糖量の測定
［方法］
培養開始後から以後２〜３時間毎に培養液を無菌的に回収した。生育量測定はサンプリングした培養液をイオン交換水で適当に希釈しで６６０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６６０）を測定した。
残糖量の測定に用いるサンプルは２〜３時間毎にサンプリングした培養液を３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃で遠心した培養上清を用いた。残糖量（培養上清に含まれるグルコース量）は体外診断用医薬品であるグルコースＣＩＩ−テストワコー（和光純薬工業）を使い、ムタロターゼ・ＧＯＤ法により行った。このグルコースＣＩＩ発色液２ｍｌと適当に希釈した培養上清サンプル１３ｌを混合して室温で５分反応させた後に５０５ｎｍの吸光度を測定した。検量線は４ｇ／ｌ以下の濃度のグルコース水溶液を用いて作成し、サンプルの希釈もこの範囲に収まるように行った。【００７０】（ｄ）有機酸排出量の測定
［方法］
有機酸は特にα−ケトグルタル酸、ピルビン酸、乳酸、フマル酸、酢酸をスタンダードとして解析を行った。解析にはＡＭＩＮＥＸ  ＨＰＸ−８７Ｈカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって行い、移動相には０．０１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４（ミリＱ水調製）を使用し、流速は０．６００ｍｌ／ｍｉｎ、検出は２１０ｎｍの吸収を見ることで行った。スタンダードとして１ｇ／ｌ−ケトグルタル酸、１ｇ／ｌピルビン酸、１０ｇ／ｌ乳酸、０．５ｇ／ｌフマル酸、１０ｇ／ｌ酢酸を解析し、チャート上のエリア面積と濃度の関係からサンプルの濃度を計算して求めた。サンプルはスタンダードの範囲に収まるように０．０５Ｎ  ＨＣｌ（ミリＱ水調製）で２倍に希釈し、不溶性の不純物を除くために孔径０．２μｍのフィルター、クロマトディスク  タイプ−４Ａ（十慈フィールド）で濾過を行い、ＨＰＬＣに供した。【００７１】［結果］
供試菌株２株についての生育量と糖消費、そして培地中酢酸排出量の測定結果を図１１に示した。生育量においてＷ１４８５ΔｎｕｏΔｃｙｏ  ｍｕｔａｎｔは野生株であるＷ１４８５株と比較して２５％程度の低下が確認された（図１１Ａ）。さらに糖の消費が始まり、切れるまでに要した時間はＷ１４８５ΔｎｕｏΔｃｙｏ  ｍｕｔａｎｔとＷ１４８５株では差は見られなかった（図１１Ｂ）。これらより対数増殖期での菌体（ＯＤ６６０）当たりの糖消費量を算出した結果を表１１に示した。その結果Ｗ１４８５で利他ｎｕｏΔｃｙｏ  ｍｕｔａｎｔがＷ１４８５株の１．６倍の菌体当たりの糖消費量を示しており、優れた発酵能を有していることが示唆された。【００７２】  また有機酸排出量においては、α−ケトグルタル酸、ピルビン酸、乳酸およびフマル酸は特に顕著な差は見られなかったが、酢酸の排出量に大きな差が見られた（図１１Ｃ）。具体的には、培養を開始してグルコースが消費され尽くすまでの間（＝バッチ培養条件）においてＷ１４８５ΔｎｕｏΔｃｙｏ  ｍｕｔａｎｔはＷ１４８５株の１．５倍量の酢酸を排出していた。そしてグルコースが消費され尽くされてから開始する連続培養条件下においてはＷ１４８５株の方からは酢酸が検出されなくなるのに対しＷ１４８５ΔｎｕｏΔｃｙｏ  ｍｕｔａｎｔの方からは常に一定量の酢酸が検出された。【００７３】
【表１１】
2006085589.tif 000012
【００７４】実施例３
バッチ培養による酢酸発酵
本実施例では実際に発酵培地を用いて本変異株を酢酸酸生産条件下にてバッチ培養し、野生株との比較解析に供した。【００７５】［供試菌株］
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５（ＡＴＣＣ１２４３５）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５ΔｎｕｏΔｃｙｏ（ΔｃｙｏＡＢＣＤＥ：：Ｋｍｒ，ΔｎｕｏＡ−Ｎ：：Ｃｍｒ）【００７６】［方法］
（ａ）保存および培養培地
Ｗ１４８５株はＬＢ寒天培地、Ｗ１４８５ΔｎｕｏΔｃｙｏはＬＢ＋クロラムフェニコール（最終濃度２５μｇ／ｍｌ）＋カナマイシン（最終濃度２５μｇ／ｍｌ）を保存用培地としており、リフレッシュもそれに倣った。前培養にはグルコース２ｇ／ｌを含むＬＢ液体培地５０ｍｌを５００ｍｌ坂口フラスコに分注したものを用いた。なお、リフレッシュと前培養には抗生物質を上述の濃度で添加した。本培養培地はグルコース５０ｇ／ｌを含む発酵用液体培地（表１２）を１Ｌ容ジャーファーメンターに分注したものを用いた。【００７７】
【表１２】
2006085589.tif 000013
ｐＨは、ＮａＯＨにより７．０に調整した。１２０℃、１０分間オートクレーブ殺菌した。【００７８】（ｂ）バッチ培養
ＬＢ寒天培地で２回リフレッシュを行い、２白金耳の菌体をグルコース２ｇ／ｌを含む５０ｍｌのＬＢ液体培地（５００ｍｌ坂口フラスコ）に接種し３７℃で１晩振盪培養した。これを前培養とし、全量を６００ｍｌの発酵用液体培地に接種し培養を開始した。培養条件は表１３に示した。【００７９】
【表１３】
2006085589.tif 000014
【００８０】（ｃ）生育量の測定と残糖量の測定
生育量の測定と残糖量の測定は、実施例２と同様に行った。
（ｄ）有機酸排出量の測定
有機酸排出量の測定は、実施例２と同様に行った。【００８１】［結果］
結果を図１２および表１４に示す。酢酸の排出量は、Ｗ１４８５については１０ｇ／ｌの排出が見られたがＷ１４８５ΔｎｕｏΔｃｙｏについては２０ｇ／ｌもの酢酸を排出していた。Ｗ１４８５ΔｎｕｏΔｃｙｏはＭ９最少培地を用いたニュートラルな条件下（実施例２）でも、本実施例の酢酸酸生産条件のようなニュートラルではない条件下においても酢酸生成方にフラックスが傾いていることが示された。【００８２】
【表１４】
2006085589.tif 000015
【産業上の利用可能性】
【００８３】  本発明の方法は、物質生産に利用されている種々の微生物の糖代謝活性または酢酸生産能の改善に供することができる。本発明の方法は、酢酸のみならす、一般的に好気性微生物を用いて生産されるアミノ酸（グルタミン酸、リジン、スレオニンなど）や有機酸（コハク酸やリンゴ酸など）の生産に応用可能である。また、さらに複雑な化合物である抗生物質などの生産性向上に利用できる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】大腸菌好気呼吸鎖の概要図。
【図２】実施例におけるｃｙｔ  ｂｏ欠損変異株の構築方法の説明図。
【図３】ＰＣＲの反応条件を示す。
【図４】組み換え用プラスミドｐＭｃｙｏ３の構築方法の説明図。
【図５】ｐＭｃｙｏ１とｐＭｃｙｏ２の電気泳動結果。
【図６】図５に示す各レーンの概要。
【図７】ｐＭｃｙｏ３の電気泳動結果。
【図８】シーケンス用のＰＣＲの反応条件を示す。
【図９】ＰＣＲ反応の概要。
【図１０】ＰＣＲの結果の電気泳動写真。
【図１１】供試菌株２株についての生育量と糖消費、そして培地中酢酸排出量の測定結果。
【図１２】実施例３において得られた酢酸産生の結果。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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