(57)【要約】  ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込むトランスポータータンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子を含むトランスジェニック植物を創製することを目的とする。係るトランスジェニック植物は、２価鉄不含の例えば３価鉄を含むアルカリ土壌において生育できる植物として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込むトランスポータータンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子。
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかであることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の遺伝子；
（ａ）配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるトランスポータータンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子；
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有するトランスポータータンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子；
（ｃ）前記（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有するトランスポータータンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子；
（ｄ）前記（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有するトランスポータータンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子。
【請求項３】
請求の範囲第１項又は第２項に記載の遺伝子を含むことを特徴とするベクター。
【請求項４】
請求の範囲第３項に記載のベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項５】
請求の範囲第１項又は第２項に記載の遺伝子が導入されていることを特徴とするトランスジェニック植物。
【請求項６】
請求の範囲第３項に記載のベクターが導入されていることを特徴とするトランスジェニック植物。
【請求項７】
請求の範囲第２項に記載の遺伝子が発現される条件下で、請求の範囲第４項に記載の宿主細胞を培養することを特徴とする、ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有するトランスポータータンパク質を製造する方法。
【請求項８】
請求の範囲第７項に記載の方法によって製造されるムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有するトランスポータータンパク質。
【請求項９】
ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有する、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかであるタンパク質；
（ａ）配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有するタンパク質；
（ｃ）前記（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有するタンパク質。
【請求項１０】
請求の範囲第１項に記載のＤＮＡのＲＮＡ転写物。
【請求項１１】
植物が、イネ科植物、クワ科植物、マメ科植物、バラ科植物、ツバキ科植物、アカネ科植物、ブナ科植物、ミカン科植物及びナス科植物からなる群から選択されるいずれかの科に属するものであることを特徴とする請求の範囲第６項に記載のトランスジェニック植物 。
【請求項１２】
請求の範囲第１項又は第２項に記載の遺伝子を植物体内で発現させることを特徴とする、植物体にムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を付与する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、土壌からのムギネ酸鉄錯体の取り込みを担うオオムギのトランスポータータンパク質、前記タンパク質をコードする遺伝子、前記遺伝子を含むベクター、ならびに前記ベクターを使ったトランスジェニック植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球の土壌面積のうち、主食である穀物やいも類を生産できる農地は約１０％にすぎず、残りの約９０％は植物の生育に必須元素を質的又は量的に欠いているために植物の生育が阻害される不良土壌であるといわれている。特に鉄は、植物の光合成の律速因子であり、鉄分を質的又は量的に欠いている土壌に生育した植物は鉄欠乏クロロシスが発現し枯死する。不良土壌のうち約３０％はアルカリ性土壌であり、この条件下では鉄が植物の根から吸収されにくい３価の水不溶体鉄となっていて、土壌に鉄が豊富にあっても植物の健全な生育に必要な鉄の量は満たされない。
イネ科植物は鉄欠乏に陥ると、ファイトシデロフォア（ｐｈｙｔｏｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ；鉄キレーター）であるムギネ酸を土壌に分泌する。ムギネ酸は、アルカリ性土壌における３価の鉄と錯体を形成し、イネ科植物のトランスポーターが根からムギネ酸鉄錯体として鉄分を吸収すると考えられている。イネ科植物の該機能を明らかにするために種々の研究がなされ、ファイトシデロフォアに関与する遺伝子の分離及び該遺伝子を導入したトランスジェニック植物が種々提案されている。例えばイネ科植物のムギネ酸を介した鉄獲得機構に深く関与しイネ科植物の鉄吸収を改善する３６ｋＤａタンパク質及びそのタンパク質をコードする遺伝子が明らかにされた（特許文献１参照）。該３６ｋＤａタンパク質は、ムギネ酸合成に関与する酵素群の遺伝子としての機能を持つことが明らかにされている。
また、イネにデオキシムギネ酸からムギネ酸に生合成する酵素の遺伝子ＩＤＳ３を導入して、ムギネ酸分泌を可能にしたり（非特許文献１参照）、同じくムギネ酸生合成経路中の酵素であるニコチアナミン・アミノ基転移酵素（ＮＡＡＴ）をコードする遺伝子を導入して、鉄欠乏耐性が改善されたイネを製造している（特許文献２参照）。
また、土からキレート鉄の取り込みを媒介する膜タンパク質をコードするトウモロコシのイエローストライプ１遺伝子（ｙｓ１遺伝子）がクローン化され、イエローストライプ１タンパク質（ＹＳ１タンパク質）が単離された。さらにＹＳ１タンパク質を発現する遺伝子で形質転換された酵母や卵母細胞は、金属を非選択的に、すなわち鉄以外に重金属を含む他の金属、例えば銅、亜鉛、鉛、コバルト又はニッケル等の取り込みも媒介できることが明かにされた(特許文献３、非特許文献２参照)。また、ＹＳ１タンパク質は、植物細胞内の鉄輸送に関与しているニコチアナミン鉄錯体を輸送することが報告されている（非特許文献３、４参照）。
上記ＹＳ１タンパク質をコードする遺伝子と約７０〜８０％の高いホモロジーを有する遺伝子が、イネから１４個、シロイヌナズナから８個見つかっている。このうち、イネのＯｓＹＳＬ２（非特許文献５参照）、シロイヌナズナのＡｔＹＳＬ２（例えば特許文献３、非特許文献６参照）は、ムギネ酸鉄錯体を輸送せず、ニコチアナミン鉄錯体のみを輸送し、植物内部の鉄の輸送に関与していることが報告されている。しかし、ニコチアナミン鉄錯体として鉄の吸収及び吸収後の茎葉部への鉄の移行は、ムギネ酸鉄錯体と比べて低いことが知られている（特許文献４参照）。
ムギネ酸鉄錯体は、固有のトランスポーターを介して植物体に取り込まれると考えられているが、ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込むトランスポータータンパク質やそれをコードする遺伝子については未だ知られていない。
【特許文献１】特開２００１−１７１８１号公報
【特許文献２】特開２００１−１７０１２号公報
【特許文献３】特表２００５−５０１５０２公報
【特許文献４】特開２００１−３１６１９２号公報
【非特許文献１】コバヤシ・ティー（Kobayashi，T．）他５名、プランタ（Plantａ）、２００１年、第２１２巻、ｐ．８６４−８７１
【非特許文献２】キュリー・シー（Curie，C）ら，ネイチャー（Nature）、２００１年、第４９巻、ｐ．３４６
【非特許文献３】シャーフ・ジー・ジェイ（Schaaf  GJ）ら，ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー（J．Biol．Chem）、２００４年、第２７９巻、ｐ．９０９１−９０９６
【非特許文献４】ロバーツ・エル・エー（Roberts  LA）ら，プラント・フィジオロジー（Plant  Physiolo．）、２００４年、第１３５巻、ｐ．１１２−１２０
【非特許文献５】コイケ・エス（Koike  S）ら，ザ・プラント・ジャーナル（Plant  J．）、２００４年、第３９巻、ｐ．４１５−４２４
【非特許文献６】ディ・ドナト・アール・ジェイ・ジェイ（DiDonato  R-J-J）ら，ザ・プラント・ジャーナル（Plant  J．）、２００４年、第３９巻、ｐ．４０３−４１４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、好ましくは鉄欠乏オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  Ｌ．）の根からムギネ酸鉄錯体を選択的に土壌から植物体内に取り込み、輸送する遺伝子をクローン化し、ムギネ酸存在下該遺伝子を導入した鉄欠乏状態（アルカリ土壌）で栽培が可能なトランスジェニック植物を創製することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
イネ科植物に見られる鉄獲得機構は、植物体内でムギネ酸類を合成し、これを土壌中に放出して生成するムギネ酸鉄錯体を植物体内に取り込むことによる。イネ科植物の中でも、特にオオムギはムギネ酸の分泌量が最も多く、アルカリ耐性がそれに対応して最も強いと考えられる。故に、オオムギ以外の植物に、土壌からムギネ酸鉄錯体を植物体内に取り込むトランスポーター遺伝子を導入すれば、オオムギと同様に、アルカリ土壌でも旺盛に生育するオオムギ以外の植物が開発できる。
本発明者らは、鉄欠乏状態で育てたオオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  Ｌ．）の根からＲＮＡを抽出して（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、トランスポーター遺伝子の単離を試みた。オオムギのデータベース（ＤＤＢＪ）でトウモロコシイエロー１（ＺｍＹＳ１）遺伝子との相同性を検索することによって行い、６０％以上相同性がある数種のＥＳＴを見いだし、これらＥＳＴの配列を利用してプライマーを作製し、前記オオムギから抽出したＲＮＡと共に５’−、３’−ＲＡＣＥ（Ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｒｏｃｈｅ社製）を行い、全長２４３０ｂｐのオオムギのトランスポーター遺伝子を単離した。本発明者らはさらに研究を進め、本発明を完成した。【０００５】
すなわち、本発明は、
［１］  ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込むトランスポータータンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子、
［２］  以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかであることを特徴とする上記［１］に記載の遺伝子；
（ａ）配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるトランスポータータンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子；
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有するトランスポータータンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子；
（ｃ）前記（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有するトランスポータータンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子；
（ｄ）前記（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有するトランスポータータンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子、
［３］  上記［１］又は［２］に記載の遺伝子を含むことを特徴とするベクター、
［４］  上記［３］に記載のベクターを含むことを特徴とする宿主細胞、
［５］  上記［１］又は［２］に記載の遺伝子が導入されていることを特徴とするトランスジェニック植物、
［６］  上記［３］に記載のベクターが導入されていることを特徴とするトランスジェニック植物
［７］  上記［２］に記載の遺伝子が発現される条件下で、上記［４］に記載の宿主細胞を培養することを特徴とする、ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有するトランスポータータンパク質を製造する方法、
［８］  上記［７］に記載の方法によって製造されるムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有するトランスポータータンパク質、
［９］  ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有する、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかであるタンパク質；
（ａ）配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有するタンパク質；
（ｃ）前記（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有するタンパク質、
［１０］  上記［１］に記載のＤＮＡのＲＮＡ転写物、
［１１］  植物が、イネ科植物、クワ科植物、マメ科植物、バラ科植物、ツバキ科植物、アカネ科植物、ブナ科植物、ミカン科植物及びナス科植物からなる群から選択されるいずれかの科に属するものであることを特徴とする上記［６］に記載のトランスジェニック植物 、及び
［１２］  上記［１］又は［２］の遺伝子を植物体内で発現させることを特徴とする、植物体にムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を付与する方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明はイネ科植物の中でも、好ましくは最も鉄欠乏耐性に強い、つまりアルカリ土壌下でも３価の鉄イオンを体内に摂取できるオオムギから同定したムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込むトランスポーター遺伝子ＨｖＹＳ１（Ｈｏｒｄｅｕｍ  Ｖｕｌｇａｒｅ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｔｒｉｐｅｌ）とそのトランスポータータンパク質を提供するものである。このトランスポーター遺伝子とムギネ酸鉄錯体摂取メカニズムを利用することにより、従来生育不能であったアルカリ土壌でも生育できるトランスジェニック植物（例えば、穀物等）が開発できる。係るトランスジェニック植物は、２価鉄不含の例えば３価鉄を含むアルカリ土壌において生育できるので、従来農地として不適切であった不良土壌、特にアルカリ土壌であっても農地として利用可能となる。このことは、穀物等の食糧野菜の作付け面積を拡大できることになり、人口増加による食糧不足を補足し得る。
また、発明の遺伝子を牧草等に導入することにより、牧草地を拡大することができ、酪農における放牧地拡大に利用できる。
また、本発明のトランスジェニック植物は、ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む機能を有するため、非選択的に金属を植物体内に取り込むトランスポーター遺伝子が導入された植物のように、鉄以外の金属、例えば人体等に有害な重金属等を取り込む危険性が少なく、食糧として安全な作物を生産できる。
さらに、本発明のトランスジェニック植物は、アルカリ土壌中で栽培しても光合成に必要な鉄が吸収されるため、生長が速いという特徴を持つ。このため、本発明のトランスポーター遺伝子をオオムギ以外の植物に導入することにより植物の生産能を高めることが可能となる。
本発明のトランスポーター遺伝子を導入し、形質転換した細菌、酵母、動物細胞又は植物細胞等は、トランスポーター機構を解明するための細胞として利用できる。さらに本発明のトランスポーター遺伝子又はその部分塩基配列は、他のトランスポーター遺伝子のプローブとして利用し得る。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、オオムギのＨｖＹＳ１のｃＤＮＡから決定されたアミノ酸配列を示す図である。ボックスは、トウモロコシのＺｍＹＳ１との相同性を表し、ローマ数字は、ＳＯＳＵＩプログラムから推定されるＺｍＹＳ１の膜貫通領域（１２個）を示す。
【図２】図２は、オオムギの組織におけるＨｖＹＳ１の発現を示す図である。
【図３】図３は、実施例３の結果を示す図である。ＨｖＹＳ１は、ＨｖＹＳ１発現ＤＤＹ４株を、ＺｍＹＳ１は、ＺｍＹＳ１発現ＤＤＹ４株を、ＶＥＣは、ベクターのみ導入したＤＤＹ４株を示す。Ｆｅ（ＩＩＩ）−ｃｉｔｒａｔｅは、クエン酸鉄（ＩＩＩ）錯体を、Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＭＡは、ムギネ酸鉄（ＩＩＩ）錯体を、Ｆｅ（ＩＩ）−ＮＡは、ニコチアナミン鉄（ＩＩ）錯体を示す。
【図４】図４は、アフリカツメガエルのＨｖＹＳ１発現卵母細胞における、種々のムギネ酸金属錯体、及びニコチアナミン鉄（ＩＩ）錯体に対する電気生理反応性を示す図である。縦軸はムギネ酸鉄錯体の電位変化を１００％としたときの、他の金属錯体の電位変化の％を示す。
【図５】図５は、鉄欠乏オオムギの根におけるＨｖＹＳ１の局在を示す図である。図中ａ及びｂは、根の縦断面を、ｃ及びｄは、根の横断面を示す。ａ及びｃはセンスプローブ（ネガティブコントロール）を、ｂ及びｄは、アンチセンスプローブを各々ハイブリダイゼーションした結果を示す。スケール；１００μｍ。
【図６】図６は、プラスミドＭａｃ−ＨｖＹＳ１−ｍａｓ−ｐＢｉｎＰｌｕｓの模式図を示す。
【図７】図７は、トランスジェニック植物におけるＲＴ−ＰＣＲでのＨｖＹＳ１の発現を示す図である。図中１、２、３は、ＨｖＹＳ１発現トランスジェニック植物を示し、４及び５は、ＨｖＹＳ１を導入していない通常の植物（ネガティブコントロール）を示し、Ｍは分子量マーカーを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
「ムギネ酸鉄錯体」とは、ムギネ酸類が鉄イオン、とりわけ３価の鉄イオンと配位結合して形成するキレート化合物をいう。ムギネ酸類としては、例えばムギネ酸、２’−デオキシムギネ酸、３−ヒドロキシムギネ酸、３−エピヒドロキシムギネ酸、アベニン酸、ディスティコン酸，エピヒドロキシデオキシムギネ酸又はアベニン酸等が挙げられる。
「ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む」とは、ムギネ酸鉄錯体のみを細胞外から細胞内に移送、輸送することをいい、ムギネ酸類と鉄以外の金属から形成される錯体化合物や、ムギネ酸アナログの例えばニコチアナミンが鉄イオンと配位して形成するキレート錯体化合物等を移送、輸送しないことをいう。【０００９】
「トランスポータータンパク質」とは、物質の細胞膜を介した輸送を担う細胞膜上に存在するタンパク質をいうが、本明細書においては、ムギネ酸鉄錯体の細胞膜輸送を担うタンパク質を意味する。特にムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有するタンパク質が好ましい。
ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有するタンパク質としては、例えば配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質等が挙げられる。配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、該タンパク質がムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有する機能を有する限り、本発明に係るタンパク質に含まれる。なお、前記数個とは好ましくは２０個以下、さらに好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下を意味する。ここで、アミノ酸配列について、「１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加」とは、遺伝子工学的手法、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により生じうる、又は天然に生じうる程度の数が、欠失、置換若しくは付加」等されていることを意味する。【００１０】
さらに、上記アミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するタンパク質、好ましくは７０％以上の相同性を有するタンパク質、より好ましくは８０％以上の相同性を有するタンパク質、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するタンパク質、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するタンパク質であって、かつムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有する機能を有する限り、本発明に係るタンパク質に含まれる。上記アミノ酸配列について「相同」とは、蛋白質の一次構造を比較し、配列間において各々の配列を構成するアミノ酸残基の一致の程度の意味である。【００１１】
「遺伝子」とは、ＤＮＡの機能単位を意味し、タンパク質の特定の情報を有する。本明細書におけるトランスポータータンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子（本明細書において、トランスポーター遺伝子と略記することもある。）は、ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有するトランスポータータンパク質の情報を有する。したがってトランスポーター遺伝子は、該トランスポータータンパク質をコードするＤＮＡ配列及び／又はそれらの発現に必要な調節配列を含むが、これらに限定されない。トランスポーター遺伝子は、例えば他のタンパク質のための認識配列等を形成する非発現ＤＮＡセグメントを含むこともできる。【００１２】
ＲＮＡ転写物としては、トランスポータータンパク質をコードするＤＮＡの一次転写物、並びに転写後プロセシングにより前駆体ＲＮＡ鎖切断、３’末端形成、ＲＮＡスプライシング又はＲＮＡエディティングなどの過程をへて機能を持つ成熟したｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｒＲＮＡが挙げられる。【００１３】
本発明のトランスポーター遺伝子は、例えば、まずトランスポータータンパク質をコードするｍＲＮＡの供給源からｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを調製する。次いで、例えば３’−ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）、５’−ＲＡＣＥ及び／又は５’／３’−ＲＡＣＥを行ない、目的のトランスポーター遺伝子を得る。３’−ＲＡＣＥ、５’−ＲＡＣＥ又は５’／３’−ＲＡＣＥで用いるプライマーは、公知のキレート鉄の取り込みを媒介する膜タンパク質をコードする遺伝子を基にオオムギのデータベースのホモロジー検索を行い、公知の前記遺伝子と約６０％以上の相同性を示すＥＳＴをオオムギの遺伝子配列から選択し、次いで、得られたＥＳＴを基に設計するのが好ましい。【００１４】
トランスポータータンパク質をコードするｍＲＮＡの供給源としては、例えば水耕栽培したイネ科の植物、例えばオオムギ、コムギ、ライムギ、エンバク、トウモロコシ、ソルガム又はイネ、好ましくはオオムギの根を用いることができる。さらに、本発明のトランスポーター遺伝子は鉄欠乏環境下に発現する遺伝子であるため、鉄イオンフリーあるいはアルカリ性条件下で鉄イオンを３価の水不溶性とした環境下に曝露させたイネ科（好ましくはオオムギ）の根を好適に用いることができる。また、イネ科（好ましくはオオムギ）の種子をＧＭ培地又はムラシゲ・スクーグ培地（以下、ＭＳ培地という。）等の固体培地に播種し、無菌条件下で生育させたイネ科（好ましくはオオムギ）の根を用いてもよい。またカルスや無菌条件下で育てたイネ科（好ましくはオオムギ）の培養細胞等でもよく、目的とする遺伝子のｍＲＮＡを含んでいる細胞であればその種類は問わない。【００１５】
ｍＲＮＡの供給源からｍＲＮＡの抽出は、公知の方法で行なうことができる。例えば水耕栽培で生育させたオオムギの植物体を鉄欠乏条件下に曝露後、根を採取する。採取した根を液体窒素で凍結する。凍結した根を乳鉢等で摩砕後、得られた摩砕物から、グリオキサール法、グアニジンチオシアネート−塩化セシウム法、塩化リチウム−尿素法、プロテイナーゼＫ−デオキシリボヌクレアーゼ法、ＡＧＰＣ法（Ａｃｉｄ  ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ法）等を用いてｍＲＮＡを抽出することができるが、市販のＲＮＡ抽出キットを用いて抽出することもできる。該市販のＲＮＡ抽出キットとしては、ＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、アイソジェン（株式会社ニッポンジーン製）、トライゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、コンサート植物用ＲＮＡ抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等が挙げられる。抽出方法はキットのマニュアルに準じて行うのがよい。ｍＲＮＡ抽出後にカラム［例えばＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）等）などによりｍＲＮＡの精製を行ってもよい。【００１６】
上記３’−ＲＡＣＥは、市販のキット、例えば３’−ＲＡＣＥ（Ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、３’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）又は３’−ｆｕｌｌ  ＲＡＣＥ  ｃｏｒｅ  ｓｅｔ（タカラバイオ株式会社製）等を用いることにより行なうことができる。
上記５’−ＲＡＣＥは、市販のキット、例えば５’−ＲＡＣＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＣａｐＦｉｓｈｉｎｇ  Ｆｕｌｌ−Ｌｅｎｇｔｈ  ｃＤＮＡ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｋｉｔ（フナコシ株式会社製）又は５’−ｆｕｌｌ  ＲＡＣＥ  ｃｏｒｅ  ｓｅｔ（タカラバイオ株式会社製）等を用いることにより行なうことができる。５’／３’−ＲＡＣＥとしては、５’／３’Ｒａｃｅ  ｋｉｔ，２ｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（Ｒｏｃｈｅ社製）等を用いることにより行なうことができる。【００１７】
上記３’−ＲＡＣＥ、５’−ＲＡＣＥ又は５’／３’−ＲＡＣＥで用いるプライマーとしては、公知のキレート鉄の取り込みを媒介する膜タンパク質をコードする遺伝子が有する部分塩基配列と相同性が約９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上である約１５〜２５ｂｐ程度の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが好ましい。３’−ＲＡＣＥのプライマーとしては、例えば配列番号４、５、６又は７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド等が挙げられる。５’−ＲＡＣＥのプライマーとしては、例えば配列番号８、９、１０、１１又は１２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド等が挙げられる。５’／３’−ＲＡＣＥのプライマーとしては、例えば配列番号１４又は１５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド等が挙げられる。【００１８】
上記公知のキレート鉄の取り込みを媒介する膜タンパク質をコードする公知の遺伝子は、例えばジーンバンクに登録ナンバー（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ）ＡＦ１８６２３４として登録されているトウモロコシのイエローストライプ１遺伝子（配列表の配列番号３）等を好ましく用いることができる。【００１９】
上記ＥＳＴとしては、オオムギについてのＤＤＢＪにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ４７２６２９、ＢＪ４７０８２１、ＢＪ４４８３５９又はＢＱ７６５６８９として登録されている配列等が挙げられる。なお、ＥＳＴは、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローンの３’末端又は５’末端から配列決定された、通例３００〜４００ヌクレオチド長の遺伝子断片である。【００２０】
上記ホモロジー検索は、例えばＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等の解析ソフトを用いて、ＧｅｎＢａｎｋやＤＤＢＪのデータベースに対して行うことができる。検出対象であるＥＳＴは保存性の高い領域や機能を有していると予想されている領域のアミノ酸配列において、特に高い相同性を有している遺伝子であり、タンパク質の機能に必須とされているアミノ酸を保存している配列であることが好ましい。【００２１】
ＰＣＲは、公知の方法により行なうことができる。ＰＣＲ産物は、ベクターに挿入し、宿主に導入して増幅することができる。【００２２】
得られる遺伝子は、公知の方法により全塩基配列の決定を行うことができる。塩基配列の決定法としては、マキサム−ギルバートの化学修飾法又はＭ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等を挙げることができるが、通常は自動塩基配列決定機（例えばパーキンエルマージャパン社製自動ＤＮＡシーケンサＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３１０  ｇｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ等）を用いて行われ得る。【００２３】
こうして、トランスポータータンパク質をコードするＤＮＡ（配列表の配列番号１の第１６９〜２２０２番目の塩基配列）を含む遺伝子として、例えば配列表の配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子を単離できる。
また、前記ＤＮＡには、前記トランスポータータンパク質をコードするＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有するトランスポータータンパク質をコードするＤＮＡも包含される。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるトランスポータータンパク質をコードするＤＮＡの部分配列をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。なお、ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、例えば、少なくとも配列番号１で示される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは、約０．１〜２倍程度の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる。）、温度約６５℃程度でのハイブリダイズする条件をいう。
なお、「ＤＮＡ」とは、デオキシリボ核酸のことをいう。ＤＮＡの単位はヌクレオチドと呼ばれ、塩基、糖（Ｄ−デオキシリボース）、リン酸でできている。塩基には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）の４種類があり、この４種類の並び方で、遺伝情報が規定されている。【００２４】
塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又は本遺伝子のｃＤＮＡないしゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明のトランスポーター遺伝子を得ることができる。【００２５】
また、本発明のトランスポーター遺伝子は配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子である。ただし、配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、該タンパク質がムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有する機能を有する限り、これをコードする遺伝子も本発明のトランスポーター遺伝子に含まれる。なお、前記「数個」及び「１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加」とは、上記タンパク質において記載した意味と同様である。なお、本発明のトランスポーター遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の方法又はこれに準ずる方法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット［例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（タカラバイオ株式会社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（タカラバイオ株式会社製）等］を用いて、あるいは、タカラバイオ株式会社のＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキット等を用いて行うことができる。【００２６】
さらに、上記アミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するタンパク質、好ましくは７０％以上の相同性を有するタンパク質、より好ましくは８０％以上の相同性を有するタンパク質、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するタンパク質、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するタンパク質であって、かつムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性を有する機能を有する限り、これをコードする遺伝子も本発明のトランスポーター遺伝子に含まれる。上記アミノ酸配列について「相同」とは、上記タンパク質において記載した意味と同様である。【００２７】
本発明に係るトランスポータータンパク質のムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性能は、例えば発芽酵母サッカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）二重変異体ｆｅｔ３ｆｅｔ４（ＤＤＹ４株）に、本発明のトランスポーター遺伝子を導入して形質転換し、形質転換された酵母を、ムギネ酸鉄（ＩＩＩ）錯体を添加した培地で培養することにより確かめることができる。ＤＤＹ４株は、２価鉄の取込み系に欠損を持ち、鉄制限培地では生育することができず（Ｅｉｄｅ，Ｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９６年，第９３巻，ｐ．５６２４−５６２８）、かつ、ムギネ酸（ＩＩＩ）鉄錯体を利用して生育することができない（Ｌｏｕｌｅｒｇｕｅ，Ｃ．Ｇｅｎｅ，１９９８年，第２２５巻，ｐ．４７−５７）酵母であるので、ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性能を有する酵母はムギネ酸鉄［ＩＩＩ］錯体を添加した培地で生育し、該活性能を有さない酵母は生育できない。【００２８】
また、ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む活性能は、アフリカツメガエル卵母細胞等で細胞膜電位変化等の観察を行うことにより、確かめることができる。細胞膜電位変化の測定は、ムギネ酸鉄錯体を含有する溶液を本発明のトランスポーター遺伝子を導入した卵母細胞に添加し、該卵母細胞膜に発現したトランスポータータンパク質を介して取り込まれるムギネ酸鉄錯体に伴っておこる卵母細胞の細胞膜電位変化を膜電位固定法等により、細胞膜内外の電位を電極で直接測定等することにより行うことが可能である。【００２９】
本発明に係るトランスポータータンパク質は、本発明のトランスポーター遺伝子をベクターに導入し、該ベクターにより形質転換した宿主を誘導条件下で培養し、この宿主から精製して得ることができる。【００３０】
「ベクター」とは、遺伝子を細胞内へ導入する働きを持つ物質を指し、プラスミド、ウイルスベクターや、人工的な非ウイルスベクター等が含まれる。非ウイルスベクターとしては、例えばリポソーム、ポリリジン化合物等が挙げられるが、これらに限定されない。【００３１】
本発明に係るベクターは、基礎となるベクター（以下の説明では、便宜上、基礎ベクターと称する）のマルチクローニングサイトに、本発明のトランスポーター遺伝子、プロモーター及びターミネーター等を組み込んで構築すればよい。ここで、上記基礎ベクターとしては、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８又はｐＵＣ１１９等の大腸菌宿主用プラスミド、例えばｐＵＢ１１０又はｐＴＰ５等の枯草菌宿主用プラスミド、例えばｐＦＬ６１（ＡＴＣＣ社製）、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４又はＹＣｐ５０等の酵母宿主用プラスミド、例えばｐＵＣ系［ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ＰＳＲ−０１，ＰＳＡ−０１、ＰＳＲ−０２，ＰＳＲ−０３（クミアイ化学工業株式会社製）等］プラスミド又はｐＢＩ２２１等の植物細胞宿主用プラスミド、或いは例えばｐＷＴＴ２３１３２（ＤＮＡＰ社製）等のバイナリーベクター等が挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ等が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
特に、本発明のトランスポーター遺伝子を導入したトランスジェニック植物を作製する場合には、植物に形質転換することが可能な植物細胞宿主用ベクターであれば特に限定されない。【００３２】
プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えば宿主が大腸菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の大腸菌由来のプロモーター、宿主が枯草菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等、宿主が酵母である場合は、ｐＦＬ６１（ＡＴＣＣ社製）、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が好ましい。また、宿主が植物である場合は、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター、ｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーター又はｒｂｃＳプロモーター等の植物由来のプロモーター、或いはカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターのエンハンサー配列をアグロバクテリウム由来のマンノピン合成酵素プロモーター配列の５’側に付加したｍａｃ−１プロモーター等のような構成的プロモーター等が好ましい。さらに、ｔａｃプロモーター等のように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。なかでもｍａｃ−１プロモーターが好ましい。前記ｍａｃ−１プロモーターを用い構築されたベクターが植物ゲノム中に挿入された場合、該プロモーターの下流に連結された遺伝子（ＨｖＹＳ１）が植物体のほとんど全ての器官で、いずれの成長段階においても高レベルで発現し得る。【００３３】
ターミネーターとしては、宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。特に、宿主が植物である場合は、例えばｒｒｎプロモーター、ｐｓｂＡターミネーター、３５Ｓターミネーター、ｒｐｓ１６ターミネーター、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、ＯＲＦ２５ｐｏｌｙＡ転写ターミネーター、ＰｓｂＡターミネーター等が挙げられる。【００３４】
また、本発明に係るベクターには、遺伝子組換え体を識別するための遺伝子を有することが好ましい。遺伝子組換え体を識別するための遺伝子としては、特に限定されず、自体公知のものを用いてよい。該遺伝子としては、例えば、各種の薬剤耐性遺伝子又は宿主の栄養要求性を相補する遺伝子等が挙げられる。より具体的には、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｇ４１８耐性）、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子又は除草剤クロルスルフロン耐性遺伝子等が挙げられる。また、該遺伝子の上流及び下流には、該遺伝子を認識するためのプロモーター及びターミネーターを有することが好ましい。【００３５】
本発明に係るベクターには、さらに他の遺伝子、例えばムギネ酸類の生合成酵素をコードする遺伝子等を導入し得る。本発明のトランスポーター遺伝子に加えムギネ酸類の生合成酵素をコードする遺伝子がベクターに導入され、該ベクターで形質転換される植物は、ムギネ酸鉄錯体を選択的に取り込む機能に加え、ムギネ酸類を植物体自身で生合成し土壌に分泌し得るので、ムギネ酸類を含まないアルカリ土壌においてもムギネ酸鉄錯体を取り込むことができ得る。ムギネ酸類の生合成酵素をコードする遺伝子としては、例えば特開２００１−１７１８１号公報に記載の３６ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子や、特開２００１−１７０１２号公報に記載のニコチアナミン・アミノ基転移酵素をコードする遺伝子等が挙げられるが、これらに限定されない。なお、前記他の遺伝子には、前記他の遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつムギネ酸類を生合成するタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子も包含される。ストリンジェントな条件は上記と同様である。【００３６】
本発明に係るベクターの作製方法については、特に限定されるものではなく、上記基礎ベクターに、上述した各ＤＮＡセグメント（プロモーター、ターミネーター、本発明のトランスポーター遺伝子、薬剤耐性遺伝子等）を所定の順序となるように導入すればよい。【００３７】
宿主へのベクターの導入方法は、特に限定されず、例えばカルシウムイオンを用いる方法［Cohen，S.N．et  al．：Proc．Natl．Acad．Sci．，USA，第６９巻、ｐ．２１１０−２１１４（１９７２年）］、エレクトロポレーション法［Becker，D.M．et  al．，Methods．Enzymol．，第１９４巻、ｐ．１８２−１８７（１９９０年）］、スフェロプラスト法［Hinnen，A．et  al．：Proc．Natl．Acad．Sci．，USA，第７５巻、ｐ．１９２９−１９３３（１９７８年）］、酢酸リチウム法［Itoh，H．，J．Bacteriol．，第１５３巻、ｐ．１６３−１６８（１９８３年）］等が挙げられる。これらの他にもマイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル・ボンバードメント（粒子加速法又はバイオリスティック・ボンバードメントとも呼ばれる）、ウイルスによる形質転換、及びアグロバクテリウムによる形質転換、パーティクルガン法（Svab，Z．，Hajdukiewicz，P．，and  Maliga，P．，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，１９９０年，第８７巻，ｐ．８５２６−８５３０）やＰＥＧ法（Golds，T．，Maliga，P．，and  Koop，H.-U．，Bio／Technol．，１９９３年，第１１巻，ｐ．９５−９７）等、様々な方法が挙げられるが、これらに限定されない。【００３８】
本発明に係るベクターが導入された宿主を増殖させる方法についても特に限定されるものではなく、宿主に応じた公知の方法を用いることが好ましい。【００３９】
宿主細胞から本発明に係るトランスポータータンパク質の分離、精製は、自体公知の分離、精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析法、限外濾過法、ゲル濾過法、及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー等の荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を利用する方法等が挙げられる。【００４０】
なお、上記の遺伝子工学又は生物工学の操作については、市販の実験書、例えば、１９８２年発行のモレキュラー・クローニング（Molecular  Cloning）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold  Spring  Harbor  Laboratory）、１９８９年発行のモレキュラー・クローニング第２版（Molecular  Cloning，  2nd  ed．）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold  Spring  Harbor  Laboratory）等に記載された方法に従って容易に行うことができる。【００４１】
本発明のトランスポーター遺伝子を発現又は過剰発現させるトランスジェニック植物は、上記遺伝子操作法を使って作出することができる。本発明にかかるトランスジェニック植物は、本発明のトランスポーター遺伝子の発現によりトランスポータータンパク質を生産するものであるが、このトランスポーター遺伝子は特に根の表皮細胞に発現することが好ましい。根の表面に本発明のトランスポーター遺伝子が発現することにより、土壌中のムギネ酸鉄錯体の取り込みが容易となる。トランスジェニック植物における該遺伝子の発現は、組織学的染色により確認できる。組織学的染色は、公知の方法により行なうことができる。【００４２】
本発明のトランスジェニック植物は、２価鉄不含の例えばアルカリ土壌において３価鉄やムギネ酸鉄錯体を含有する土壌において栽培できる。また、本発明のトランスジェニック植物は、光合成に必要な鉄が吸収されるため、生長が速いという特徴を持ち、植物の生産性を向上できる。【００４３】
本発明のトランスポーター遺伝子を使って形質転換される好ましい植物としては、単子葉植物又は双子葉植物が好ましい。より具体的には、例えばイネ科植物（例えば、コメ、オオムギ、コムギ、エンバク、ライムギ、トウモロコシ、アワ、ヒエ、コウリャン、牧草類）、クワ科植物（例えば、クワ、ホップ、コウゾ、ゴムノキ、アサ等）、マメ科植物（例えば、ダイズ、アズキ、ラッカセイ、インゲンマメ、ソラマメ等）、バラ科植物（例えば、イチゴ、ウメ、バラ等）、ツバキ科植物（例えば、チャノキ等）、アカネ科植物（例えば、コーヒーノキ、クチナシ等）、ブナ科植物（例えば、ナラ、ブナ、カシワ等）、ミカン科植物（例えば、ダイダイ、ユズ、ウンシュウミカン、サンショウ等）又はナス科植物（例えば、ナス、トマト、トウガラシ、ジャガイモ、タバコ、チョウセンアサガオ、ホオズキ、ペチュニア、カリブラコア、ニーレンベルギア等）などが挙げられるが、これらに限定されない。【００４４】
以下に、実施例をあげ本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、％は特に記載しない場合は容量％を示す。また、本明細書において、略語は以下を示す。
ａ：アデニン
ｃ：シトシン
ｇ：グアニン
ｔ：チアミン
ＰＢＳ：Phosphate  buffer  saline（リン酸緩衝食塩水）
ＰＣＲ：Polymerase  Chain  Reaction（ポリメラーゼ連鎖反応）
ＲＡＣＥ：Rapid  Amplification  of  cDNA  Ends
ＥＳＴ：Expressed  Sequence  Tag(発現配列タグ)
ＲＴ−ＰＣＲ：reverse  transcription-polymerase  chain  reaction
ＳＯＳＵＩ：膜タンパク質の二次構造推定システム
Ｆｅ（III）・クエン酸：クエン酸−鉄錯体（クエン酸鉄アンモニウム錯体）
Ｆｅ（III）・ＭＡ：ムギネ酸鉄錯体（ムギネ酸鉄（ＩＩＩ）錯体）
Ｆｅ（II）・ＮＡ：ニコチアナミン鉄錯体
Ｔｒｉｓ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＨＥＰＥＳ：２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸
ＭＡＳコート：Matsunami  Adhesive  Slideglass
ＤＩＧ：ジゴキシゲニン
【実施例１】
【００４５】
ＨｖＹＳ１  ｃＤＮＡのクローニング
（１）Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出
オオムギ（品種Ｍｏｒｅｘ）を播種後、１／５Ｈｏａｇｌａｎｄ培養液（以下、栽培用培養液という。）にて培養した。１６日目の苗に鉄欠乏処理（鉄イオンフリーの栽培用培養液で栽培）を４日間行った。その根を採取し、コンサート植物用ＲＮＡ抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。
（２）３’−ＲＡＣＥ
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １μｇを逆転写酵素でｃＤＮＡとした。次いで得られたｃＤＮＡを用いて３’−ＲＡＣＥ（Ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を行った。３’−ＲＡＣＥに用いたプライマーは、オオムギのデータベース（ＤＤＢＪ）でＺｍＹＳ１を検索配列として、６０％以上相同性がある４種類（ＡＦ４７２６２９，ＢＪ４７０８２１，ＢＪ４４８３５９，ＢＱ７６５６８９）のＥＳＴを検出し、このうちＢＪ４７０８２１の配列内から表１の塩基配列を選択し、合成したオリゴヌクレオチドを使用した。
【表１】
2006126294.tif 000002
【００４６】
３’−ＲＡＣＥで得られたｃＤＮＡを１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動にかけ、ゲルからの精製を、Ｑｉａｇｅｎ  ＧＩＡ  ｑｕｉｃｋ  ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて行った。精製されたｃＤＮＡをＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｒｓｉｏｎＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ  ｖｅｃｔｏｒ（４．０ｋｂ）に挿入し、大腸菌ＴＯＰ１０に形質転換した。Ｃｏｌｏｎｙ  ＰＣＲを行い、予想される長さの産物をパーキンエルマージャパン社製自動ＤＮＡシーケンサＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３１０  ｇｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒで塩基配列を決定した。シーケンサ用プライマーとしては、表２のプライマーを使用した。
【表２】
2006126294.tif 000003
【００４７】
（３）５’−ＲＡＣＥ
また、３’−ＲＡＣＥと同様に、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １μｇを逆転写酵素でｃＤＮＡとした。次いで得られたｃＤＮＡを用いて５’−ＲＡＣＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を行った。５’−ＲＡＣＥに用いたプライマーは、上記（２）で検出したＥＳＴのうち、ＡＦ４７２６２９の配列内から表３の塩基配列を選択し、合成したオリゴヌクレオチドを使用した。
【表３】
2006126294.tif 000004
【００４８】
５’−ＲＡＣＥで得られたｃＤＮＡを１．２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動にかけ、ゲルからの遺伝子の抽出、大腸菌への形質変換は上記（２）の３’−ＲＡＣＥで得られたｃＤＮＡと同様に行なった。シークエンスも同様に行い５’側の配列を途中まで決定した。
５’末端が高次構造をとっているために、さらにｍＲＮＡの逆転写酵素の温度が高い（５５℃），５’／３’Ｒａｃｅ  ｋｉｔ，２ｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（Ｒｏｃｈｅ社製）のキットを使って、５’−ＲＡＣＥと同様に操作し、５’末端までの配列を決定した。５’／３’−ＲＡＣＥに用いたプライマーは、ＡＦ４７２６２９の配列内から表４の塩基配列を選択し、合成したオリゴヌクレオチドを使用した。
【表４】
2006126294.tif 000005
【００４９】
（４）塩基配列の確定
５’／３’Ｒａｃｅで決定した配列の、５’ＲＡＣＥで決定した塩基配列とのつなぎ目部分を確定するため、上記（１）で得られたＴｏｔａｌ  ＲＮＡから逆転写酵素で得たｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。該ＰＣＲには、ＡＦ４７２６２９の配列内から表５の塩基配列を選択し、合成したフォワードプライマー（配列表の配列番号１４）及びＢＪ４７０８２１の配列内から表５の塩基配列を選択し、合成したリバースプライマー（配列表の配列番号１５）を用いた。
【表５】
2006126294.tif 000006
【００５０】
得られたＰＣＲ産物のｃＤＮＡを上記（２）と同様に、アガロースゲル電気泳動、ゲルからの遺伝子の抽出、大腸菌への形質変換を行ない、全塩基配列を決定した。
全塩基配列が決定したので、もう一度全長の塩基配列を、上記（１）で得たオオムギの根のＴｏｔａｌ  ＲＮＡから逆転写酵素で得たｃＤＮＡと表６及び表７のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
【表６】
2006126294.tif 000007
【表７】
2006126294.tif 000008
【００５１】
ＰＣＲで得られたｃＤＮＡを１．２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動にかけ、ゲルからの抽出、大腸菌への形質変換は上記（２）と同様に行なった。この形質変換した大腸菌をアンピシリン５０μｇ／ｍＬを添加したＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地で３７℃の下、終夜培養し、この培養液からＶＩＯＧＥＮＥ社製のＭｉｎｉ−Ｍ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍでＤＮＡを抽出した。この塩基配列を決定し、全配列を確定し（配列番号１）、ＨｖＹＳ１（Ｈｏｒｄｅｕｍ  Ｖｕｌｇａｒｅ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｔｒｉｐｅｌ，ＤＤＢＪ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ２１４１８３）と命名した。
塩基配列決定のためのシーケンスプライマーとして、表８のプライマーを用いた。
【表８】
2006126294.tif 000009
【００５２】
このｃＤＮＡの配列から、ＨｖＹＳ１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を決定した。タンパク質は６７８アミノ酸長で、トウモロコシのＺｍＹＳ１タンパク質と約７３％の相同性があり、特にＳＯＳＵＩプログラムから予想されるＺｍＹＳ１の１２個の膜貫通領域では高い相同性を示している（図１参照）。
【実施例２】
【００５３】
オオムギ組織における遺伝子の発現量の比較
オオムギ（Ｍｏｒｅｘ）を播種後、１週間２０μＭムギネ酸鉄錯体を添加した栽培用培養液にて前培養した。その後、鉄フリー栽培用培養液又は２０μＭムギネ酸鉄錯体添加栽培用培養液にて６日間培養したオオムギの根からＲＮＡをそれぞれ抽出した。そこから表９のプライマーを用いて、ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ（２６サイクル）（ＡＢＩ  ｐｒｉｓｍ  ７０００  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を行った。
【表９】
2006126294.tif 000010
コントロールとしてＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子を用いた。ＨｖＹＳ１はムギネ酸鉄錯体が豊富にあるときにはほとんど発現していないが、鉄欠乏状態では、根に選択的に発現量が増えることがわかった（図２参照）。
【実施例３】
【００５４】
形質転換酵母におけるＨｖＹＳ１の機能
発芽酵母サッカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）二重変異体ｆｅｔ３ｆｅｔ４（ＤＤＹ４株）は、２価鉄の取り込みを担う２種類の遺伝子［ｆｅｔ３（３価鉄を２価鉄に転換して取り込む遺伝子）及びｆｅｔ４（２価鉄をそのまま取り込む遺伝子）］を欠損するので、鉄制限培地では生育することができず（Eide，Dら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，１９９６年，第９３巻，ｐ．５６２４−５６２８）、ムギネ酸と錯化した鉄（Ｆｅ（III）・ＭＡ）を利用して生育することができない（Loulergue，C．Gene，１９９８年，第２２５巻，ｐ．４７−５７）。鉄輸送におけるＨｖＹＳ１の機能を調べるために、本発明者らは、ＨｖＹＳ１  ｃＤＮＡを導入したＤＤＹ４株を用いて該遺伝子の発現したＤＤＹ４株が、唯一の鉄源としてＦｅ（III）・ＭＡを含む培地で生育できるかどうかを調べた。【００５５】
ＤＤＹ４株とＤＹ１４５７（野生型）株に３つのプラスミド、すなわち（１）発現ベクターｐＦＬ６１（ＡＴＣＣ社製）のＮｏｔ１サイトにクローニングしたＨｖＹＳ１  ｃＤＮＡを挿入したプラスミド、（２）同じくｐＦＬ６１ベクターにクローニングしたＺｍＹＳ１  ｃＤＮＡ（Curie，Cら，Nature，２００１年，第４９巻，ｐ．３４６−３４９）を挿入したプラスミ、及び対照として（３）前記いずれの遺伝子をも挿入していないｐＦＬ６１ベクターを個別に導入した。
次に、本発明者らは、ＨｖＹＳ１に基質選択性があるとすれば、その基質選択性を決定するために、３つの異なる鉄源、すなわちＦｅ（III）・クエン酸又はＦｅ（III）・ＭＡ、Ｆｅ（II）・ＮＡを培地中に混入して、培養試験を行なった。酵母は、５０μＭ  Ｆｅ（III）・クエン酸、１０μＭ  Ｆｅ（III）・ＭＡ、又は１０μＭ  Ｆｅ（II）・ＮＡ及びブランクとして１０μＭ  ＦｅＣｌ２，ＦｅＣｌ３を添加した最少培地−Ｕｒａで培養した。また１０μＭ  Ｆｅ（III）・ＭＡ添加培地に２価鉄の強力なキレート剤であるＢＰＤＳも１０μＭ添加して、酵母の生育を阻害するかも調べた。Ｆｅ（III）・ＭＡはvon  Wiren，Nら，Biochem．Biophys．Acta，１９９８年，第１３７１巻，ｐ．１４３−１５５に従って調製した。ニコチアナミンは長谷川香料社から購入し、Schaaf  Gら、J．Biol．Chem．，２００４年，第２７９巻，ｐ．９０９１−９０９６に従ってＦｅ（II）・ニコチアナミンを調製した。培養は３０℃で４日間行なった。３つの酵母培養物希釈液（波長６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）が０．２、０．０２及び０．００２であるもの）をプレート上にスポットした。【００５６】
ＦｅＣｌ２，ＦｅＣｌ３、Ｆｅ（III）・クエン酸を唯一の鉄源として供給した場合、ＨｖＹＳ１発現ＤＤＹ４株は、生育しなかった。１０μＭ  Ｆｅ（III）・ＭＡが存在する場合、ＨｖＹＳ１発現ＤＤＹ４株はＺｍＹＳ１発現ＤＤＹ４株と同様に生育した。鉄をＦｅ（III）・ＭＡキレートとして供給した場合、ＨｖＹＳ１発現ＤＤＹ４株は生育できるが、鉄をＦｅ（III）・クエン酸として供給した場合は、該遺伝子発現ＤＤＹ４株は生育できないか、生育が強く抑制されることから、ＨｖＹＳ１タンパク質はＦｅ（III）・ＭＡに選択的な鉄トランスポーターをコードすることが示唆された。この点を明らかにするために、Ｆｅ（III）・ＭＡ添加培地から残留Ｆｅ（ＩＩ）が全て除去されるように、強力なＦｅ（ＩＩ）キレート剤であるＢＰＤＳを、Ｆｅ（III）・ＭＡ添加培地に添加した。ＢＰＤＳの存在下にＦｅ（III）・ＭＡ添加培地においてもＨｖＹＳ１発現ＤＤＹ４株は生育した。このことは、ＨｖＹＳ１タンパク質がファイトシデロフォア結合型Ｆｅ（ＩＩＩ）のトランスポータータンパク質であることを強く示唆している。また、トウモロコシのトランスポーターであるＺｍＹＳ１がＦｅ（III）・ＭＡの他に、植物全部に存在するＦｅ（II）・ＮＡを輸送するのに対し、ＨｖＹＳ１発現ＤＤＹ４株ではＦｅ（II）・ＮＡの取り込みが認められないか、生育が強く抑制された。このことは、ＨｖＹＳ１タンパク質が根に存在し、土壌からＦｅ（III）・ＭＡを取り込むことに選択的に働いていることを示すものである（図３参照）。
【実施例４】
【００５７】
アフリカツメガエルの形質転換卵母細胞における電気生理活性におけるＨｖＹＳ１の作用
ｐＳＰ６４Ｐｏｌｙ（Ａ）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のＸｂａＩとＢａｍＨＩのサイトにＨｖＹＳ１  ｃＤＮＡを挿入し、これを用いてＡｍｂｉｏｎ社のｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ  ＫｉｔでｃＲＮＡを作製した。
アフリカツメガエル（浜松生物教材から購入）の腹部を切開し、卵母細胞（Ｘｅｎｏｐｕｓ  Ｏｏｃｙｔｅｓ）を摘出した。そして、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｔｙｐｅＩＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を２ｍｇ／ｍＬとしたＯＲ−２溶液（８２．５ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）が入った遠沈管に卵母細胞を移し、室温で約２時間インキュベートした後、ＯＲ−２溶液で３回、さらにＮＤ−９６溶液（９６ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２，５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）で３回洗浄した。ｃＲＮＡ５０μｇ／ｍＬ，５０ｎＬをデジタル式マイクロディスペンサー（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）で、アフリカツメガエルの卵母細胞に注入した。卵母細胞はＮＤ−９６溶液中、１７℃で４８〜７２時間培養した。【００５８】
次に、本発明者らは、ＨｖＹＳ１タンパク質に基質選択性があるとすれば、その基質選択性を決定するために、Ｆｅ（III）・ＭＡ以外の基質として銅、亜鉛、ニッケル、マンガン、コバルトのムギネ酸錯体も鉄同様に作製した。ＨｖＹＳ１を発現させた卵母細胞をＮＤ−９６溶液で充たしたチャンバーにセットし、各々基質５ｍＭを１０μＬかけて（最終濃度５０μＭ）電気生理活性を測定した。卵母細胞に２本の３Ｍ  ＫＣｌを充たした微小電極（内部抵抗０．５−２ＭΩ）を差し込み、実験槽の電位を０ｍＶに固定したモードで、Ａｘｏｃｌａｍｐ−２型二電極電位固定アンプ（アクソン社製）を用いて電位固定した。電流は１ｋＨｚのローパスフィルター（−３ｄＢ，８ポールベッセル型フィルター／サイバー  アンプ、アクソン社製）を通し、デジデータ１２００型インターフェース（アクソン社製）を用いて１０ｋＨｚでサンプリングし、デジタル化して保存した。電位のプログラム、記録及び保存したデータの解析は、ＯＲＩＧＩＮ  ６．１  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｉｃｒｏｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いた。固定電位−６０ｍＶで測定した。
Ｆｅ（III）・ＭＡ以外の種々のムギネ酸金属錯体、及びニコチアナミン鉄（ＩＩ）錯体に比べて、ムギネ酸鉄（ＩＩＩ）錯体は圧倒的に強い電位の変化が認められた。ニコチアナミン鉄（ＩＩ）錯体の反応は実施例３の酵母の研究結果と一致した（図４）。
【実施例５】
【００５９】
オオムギの根におけるＨｖＹＳ１の発現部位
操作はすべてＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅで行った。実施例１で作製した鉄欠乏状態のオオムギの根を４％パラフォルムアルデヒド／ＰＢＳ中に入れ、根が沈むまで減圧、常圧を１５分おきに繰り返し、４℃で１昼夜インキュベートした。ＰＢＳで３０分２回洗浄後、３０％、４０％、５０％、６０％エタノール水溶液で、順次３０分２回インキュベートし、７０％エタノール水溶液にして、４℃で１昼夜インキュベートした。翌日、８５％、９５％、エタノール水溶液、１００％エタノールまで同様に脱水し、２５％、５０％、７５％キシレン／エタノール溶液、１００％キシレンまで移して、１００％キシレンにパラフィンチップ（Ｐａｒａｐｌａｓｔ  Ｐｌｕｓ，Ｔｙｃｏ社製）を入れて、４２℃で１昼夜インキュベートした。その後、パラフィンを１日２回交換して、３日間６０℃でインキュベートし、組織をパラフィン中に包埋した。回転式ミクロトーム（池本理化学工業社製）を用いて５μｍの連続切片を作製し、ＭＡＳコートのスライドグラス（マツナミ）に貼り付けて−２０℃で保存した。
ｃＲＮＡプローブはＨｖＹＳ１  ｃＤＮＡをプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（＋）のＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイトに導入し、Ｒｏｃｈｅ社製のＤＩＧ（ジゴキシゲニン）ＲＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔで作成した。センスはＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素でベクターを直線にしてＴ７ポリメラーゼで、アンチセンスのプローブはＸｂａＩ制限酵素でベクターを直線にしてＴ３ポリメラーゼで各々作成した。その後１５０ｂｐにアルカリ処理（４２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，６３ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３溶液中６０℃  ５６分）で断片化して、エタノール沈殿後ＤＥＰＣ処理水に溶解した。【００６０】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）はＣｉｎｄｙ  Ｌｉｎｃｏｌｎ  ＆  Ｄａｖｉｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ’  ｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌに基づいて行った。パラフィン切片を貼り付けたスライドを１０分乾燥し、キシレン１０分２回、１００％エタノール、９０％、８０％、７０％、５０％エタノール水溶液で２分、ＰＢＳ５分２回処理した。プロテイナーゼＫ処理（１μｇ／ｍＬ  プロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ社製）、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を３７℃で３０分行い、ＰＢＳ２分洗浄後、４％ＰＦＡ／ＰＢＳで２０分固定し、ＰＢＳ２分２回、０．２Ｎ  ＨＣｌで１０分、ＰＢＳ２分２回、グリシン２ｍｇ／ｍＬ  ＰＢＳ溶液  １５分２回、ＰＢＳ３分２回、そしてアセチル化を行った。２×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で２分２回洗浄後、再び上記と同様に脱水して、１００％エタノールまで脱水し、デシケーター内で１時間乾燥した。その後プローブを加えたハイブリダイゼーション溶液［５０％脱イオンホルムアミド、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１Ｘ  Ｄｅｎｈａｔ’ｓ溶液、１０％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸、２０μｇ／ｍＬ  酵母ｔＲＮＡ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ，０．３Ｍ  ＤＴＴ（ジチオスレイトール）］を切片にかけ、パラフィルムをかぶせて、５０℃、１６時間インキュベートした。０．２×ＳＳＣ  ５５℃で６０分２回洗浄し、ＲＮａｓｅ処理（ＲＮａｓｅＡ  ２０μｇ／ｍＬ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を３７℃、３０分行った。０．２×ＳＳＣ  ５５℃で３０分２回洗浄後、ＰＢＳ室温５分処理し、ＤＩＧの発色を行った。緩衝液１［０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）］１０分２回、緩衝液２［１５％（ｗ／ｖ）ブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ社製）／緩衝液１］４５分、緩衝液１  ５分処理後、ａｎｔｉ−ＤＩＧ抗体（Ｒｏｃｈｅ社製）７５０倍希釈を室温で１時間反応させた。緩衝液１、５分２回、緩衝液３［０．１Ｍ  ＮａＣｌ，１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、５０ｍＭ  ＭｇＳＯ４］１０分後、ナカライのアルカリフォスファターゼ用ＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液キットで一晩発色させた。緩衝液４［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ］１０分で発色を停止し、蒸留水で洗浄後、クリスタルマウント（コスモバイオ）で封入後、光学顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ４００，ニコン社製）で検鏡した。その結果を図５に示したが、鉄欠乏アンチセンスＨｖＹＳ１導入トランスジェニックオオムギの根の表皮細胞部分に発色が認められ、ＨｖＹＳ１が強く発現していることが分かった（図５）。
【実施例６】
【００６１】
ＨｖＹＳ１を導入したトランスジェニック植物の作成
本実施例において、分子生物学的手法は特に断らない限り、ＷＯ９６／２５５００あるいはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載されている方法に従った。【００６２】
（ＨｖＹＳ１発現ベクターの構築）
ｐＣＧＰ１３９４（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，３６：１０２３−１０３１に記載）をＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩＩで消化して得られる約１．３ｋｂのＤＮＡ断片と、ｐＣＧＰ１３９４をＰｓｔＩで消化後ブランティングキット（ＴａＫａＲａ社製）を用いて平滑末端化し、さらにＳａｃＩＩで消化して得られる約２ｋｂのＤＮＡ断片と、ｐＢｉｎＰＬＵＳ（ｖａｎ  Ｅｎｇｅｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｔｒａｎｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４，２８８−２９０）をＳａｃＩで消化後同様に平滑末端化しさらにＨｉｎｄＩＩＩで消化した約１２ｋｂのＤＮＡ断片の３種のＤＮＡ断片をライゲーションして得られるプラスミドをｐＳＰＢ１８５とした。【００６３】
ＨｖＹＳ１はＴＯＰＯ−ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、ＰＥＲＩＩ−ＴＯＰＯのベクターに表１０のプライマーで増幅したＰＣＲ産物をサブクローニングした。
【表１０】
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表１０のフォワードプライマーは、ＨｖＹＳ１翻訳領域５’末端に制限酵素サイトとしてＸｂａＩ配列（ＧＣＴＣＴＡＧＡ）を付加したものであり、リバースプライマーは、ＨｖＹＳ１翻訳領域３’末端に制限酵素サイトとしてＨｉｎｄＩＩＩ配列（ＣＣＣＡＡＧＣＴＴ）を付加したものである。【００６４】
このＨｖＹＳ１を含有するプラスミド（サブクローニングされたＰＥＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター）を、まずＨｉｎｄＩＩＩで消化し、突出する末端をブランティングキット（ＴａＫａＲａ社製）を用いて平滑末端化し、さらにＸｂａＩで消化して約２ｋｂのＨｖＹＳ１を含有するＤＮＡ断片を取り出した。別途、増幅したｐＳＰＢ１８５をＫｐｎＩで消化し、末端を同様に平滑末端化し、さらにＸｂａＩで消化して約１４ｋｂのＤＮＡ断片を得た。次いで、前記ＨｖＹＳ１を含有するＤＮＡ断片と約１４ｋｂのＤＮＡ断片をライゲーションして連結し、図６に示すプラスミドＭａｃ−ＨｖＹＳ１−ｍａｓ−ｐＢｉｎＰｌｕｓを作製した。このプラスミドは、植物において、ＨｖＹＳ１をＭａｃプロモーター（Comai  et  al．，１９９０，Plant  Mol  Biol，１５，３７３−３８１）により構成的に発現させることを目的としている。【００６５】
(ペチュニアの形質転換)
引き続いて、公知の方法（Plant  J.，5，81，1994）に基づいて、Ｍａｃ−ＨｖＹＳ１−ｍａｓ−ｐＢｉｎＰｌｕｓを用いてアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｔｒａｉｎ  Ａｇ１０）を形質転換した。次いで、該形質転換されたアグロバクテリウムをペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ品種サフィニアパープルミニ（サントリーフラワーズ社製）)に感染させ、ＨｖＹＳ１の翻訳領域遺伝子をペチュニアに導入した。
すべての植物を１６時間照射（６０μＥ．冷白色蛍光灯）のもとで２３±２℃に保持した。根が２〜３ｃｍの長さに達した時、トランスジェニックペチュニア植物を、１５ｃｍの培養ポット中のオートクレーブ殺菌されたＤｅｂｃｏ  ５１４１０／２ポットミックスに移植した。４週間後、植物を同じポットミックスを用いる１５ｃｍのポットに再移植し、そして１４時間照射（３００μＥ．ハロゲン化水銀灯）のもとで２３℃にて保持した。【００６６】
（導入されたＨｖＹＳ１のＲＴ−ＰＣＲ法による検出）
得られたトランスジェニックペチュニアの葉を磨砕し、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ社製）により、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡ  １μｇからＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＩＩ  ＲＴの酵素を用いたＦｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＫｉｔによりｃＤＮＡを作製した。ＨｖＹＳ１の有無を確認するため、トランスジェニックペチュニアから抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡから作成したｃＤＮＡを鋳型として、表１１のフォワードプライマー（配列表の配列番号２６）及びリバースプライマー（配列表の配列番号２７）を用いてＰＣＲを行った。前記フォワードプライマーはＨｖＹＳ１の塩基配列（配列表の配列番号１）から第８８９番目から第９１０番目の内部配列を合成した。リバースプライマーは、同塩基配列の第１６４４番目から第１６２１番目の内部配列を合成した。コントロール遺伝子としてＧＡＰＤＨ（グリセロアルデハイド３リン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子を用いた。ＧＡＰＤＨ遺伝子のプライマーは表１２のフォワードプライマーとリバースプライマーを使用した。【００６７】
【表１１】
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【００６８】
【表１２】
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【００６９】
ＰＣＲ産物を１．２（ｗ／ｖ）％アガロースゲル電気泳動で検出した。（図７）
ＨｖＹＳ１を導入したトランスジェニック植物（図７の１〜３）ではＰＣＲ産物の量の違いはあるが、ＨｖＹＳ１由来のＰＣＲ産物として予想される７５５ｂｐにバンドが検出され、ＨｖＹＳ１遺伝子がペチュニアに導入されていることを確認した。ＨｖＹＳ１遺伝子を導入していない通常のペチュニア（図７の４、５：コントロール）においてはＧＡＰＤＨのＰＣＲ産物（約１０００ｂｐ）は検出されたが、ＨｖＹＳ１由来のＰＣＲ産物は検出されなかった。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
発明の遺伝子を導入した植物は、従来不可能であった、アルカリ土壌での成育が可能となるので、アルカリ土壌における植物の生産が可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年11月23日(2007.11.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
イネ科植物に見られる鉄獲得機構は、植物体内でムギネ酸類を合成し、これを土壌中に放出して生成するムギネ酸鉄錯体を植物体内に取り込むことによる。イネ科植物の中でも、特にオオムギはムギネ酸の分泌量が最も多く、アルカリ耐性がそれに対応して最も強いと考えられる。故に、オオムギ以外の植物に、土壌からムギネ酸鉄錯体を植物体内に取り込むトランスポーター遺伝子を導入すれば、オオムギと同様に、アルカリ土壌でも旺盛に生育するオオムギ以外の植物が開発できる。
本発明者らは、鉄欠乏状態で育てたオオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  Ｌ．）の根からＲＮＡを抽出して（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、トランスポーター遺伝子の単離を試みた。オオムギのデータベース（ＤＤＢＪ）でトウモロコシイエローストライプ１（ＺｍＹＳ１）遺伝子との相同性を検索することによって行い、６０％以上相同性がある数種のＥＳＴを見いだし、これらＥＳＴの配列を利用してプライマーを作製し、前記オオムギから抽出したＲＮＡと共に５’−、３’−ＲＡＣＥ（Ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｒｏｃｈｅ社製）を行い、全長２４３０ｂｐのオオムギのトランスポーター遺伝子を単離した。本発明者らはさらに研究を進め、本発明を完成した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
ＰＣＲで得られたｃＤＮＡを１．２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動にかけ、ゲルからの抽出、大腸菌への形質変換は上記（２）と同様に行なった。この形質変換した大腸菌をアンピシリン５０μｇ／ｍＬを添加したＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地で３７℃の下、終夜培養し、この培養液からＶＩＯＧＥＮＥ社製のＭｉｎｉ−Ｍ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍでＤＮＡを抽出した。この塩基配列を決定し、全配列を確定し（配列番号１）、ＨｖＹＳ１（Ｈｏｒｄｅｕｍ  Ｖｕｌｇａｒｅ  Ｌ．  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｔｒｉｐｅｌ，ＤＤＢＪ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ２１４１８３）と命名した。
塩基配列決定のためのシーケンスプライマーとして、表８のプライマーを用いた。
【表８】
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【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）はＣｉｎｄｙ  Ｌｉｎｃｏｌｎ  ＆  Ｄａｖｉｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ’  ｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌに基づいて行った。パラフィン切片を貼り付けたスライドを１０分乾燥し、キシレン１０分２回、１００％エタノール、９０％、８０％、７０％、５０％エタノール水溶液で２分、ＰＢＳ５分２回処理した。プロテイナーゼＫ処理（１μｇ／ｍＬ  プロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ社製）、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を３７℃で３０分行い、ＰＢＳ２分洗浄後、４％ＰＦＡ／ＰＢＳで２０分固定し、ＰＢＳ２分２回、０．２Ｎ  ＨＣｌで１０分、ＰＢＳ２分２回、グリシン２ｍｇ／ｍＬ  ＰＢＳ溶液  １５分２回、ＰＢＳ３分２回、そしてアセチル化を行った。２×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で２分２回洗浄後、再び上記と同様に脱水して、１００％エタノールまで脱水し、デシケーター内で１時間乾燥した。その後プローブを加えたハイブリダイゼーション溶液［５０％脱イオンホルムアミド、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１Ｘ  Ｄｅｎｈａｔ’ｓ溶液、１０％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸、２０μｇ／ｍＬ  酵母ｔＲＮＡ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ，０．３Ｍ  ＤＴＴ（ジチオスレイトール）］を切片にかけ、パラフィルムをかぶせて、５０℃、１６時間インキュベートした。０．２×ＳＳＣ  ５５℃で６０分２回洗浄し、ＲＮａｓｅ処理（ＲＮａｓｅＡ  ２０μｇ／ｍＬ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を３７℃、３０分行った。０．２×ＳＳＣ  ５５℃で３０分２回洗浄後、ＰＢＳ室温５分処理し、ＤＩＧの発色を行った。緩衝液１［０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）］１０分２回、緩衝液２［１５％（ｗ／ｖ）ブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ社製）／緩衝液１］４５分、緩衝液１、５分処理後、ａｎｔｉ−ＤＩＧ抗体（Ｒｏｃｈｅ社製）７５０倍希釈を室温で１時間反応させた。緩衝液１、５分２回、緩衝液３［０．１Ｍ  ＮａＣｌ，１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、５０ｍＭ  ＭｇＳＯ４］１０分後、ナカライのアルカリフォスファターゼ用ＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液キットで一晩発色させた。緩衝液４［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ］１０分で発色を停止し、蒸留水で洗浄後、クリスタルマウント（コスモバイオ）で封入後、光学顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ４００，ニコン社製）で検鏡した。その結果を図５に示したが、ＨｖＹＳ１アンチセンスプローブにおいて鉄欠乏オオムギの根の表皮細胞部分に発色が認められ、ＨｖＹＳ１が強く発現していることが分かった（図５）。
【国際調査報告】
2006126294.tif 000022
2006126294.tif 000023
2006126294.tif 000024