(57)【要約】本発明は、非荷電性セグメントと荷電性セグメントとのブロック共重合体に遺伝子ノックダウン用２本鎖オリゴ核酸が担持された、静電結合型ポリイオンコンプレックス及び当該ポリイオンコンプレックスを含む医薬組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非荷電性セグメントと荷電性セグメントからなるブロック共重合体と、２本鎖オリゴ核酸とを含んでなるポリイオンコンプレックス。
【請求項２】
コア部に２本鎖オリゴ核酸を担持したポリマーミセルの形態にある請求項１記載のポリイオンコンプレックス。
【請求項３】
非荷電性セグメントがポリエチレングリコールまたはその誘導体である請求項１または２記載のポリイオンコンプレックス。
【請求項４】
荷電性セグメントがポリアミノ酸もしくはその誘導体またはそれらの塩である請求項１〜３のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
【請求項５】
ブロック共重合体の構造が一般式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）またはそれらの塩である請求項１または２記載のポリイオンコンプレックス。
2005078084.tif 000012
（式中、Ｒ１ａ及びＲ１ｂはそれぞれ独立して水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ１−１２アルキル基を表し、Ｌ１およびＬ２は連結基を表し、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ及びＲ２ｄはそれぞれ独立してメチレン基またはエチレン基を表し、Ｒ３は水素原子、保護基、疎水性基または重合性基を表し、Ｒ４はＲ５ｃ又はＲ５ｄと同一であるかまたは開始剤残基であり、Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ５ｃ及びＲ５ｄはそれぞれ独立して水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基を表し、ここでＸはそれぞれ独立して一級、二級、三級アミンまたは四級アンモニウム塩の内一種類または二種類以上を含むアミン化合物残基であるか、あるいはアミンでない化合物残基であり、ａは１〜５の整数であり、Ｒ６ａ及びＲ６ｂはそれぞれ独立して水素原子または保護基であり、ここで保護基とは通常アミノ基の保護基として用いられているＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基、トリフルオロアセチル基等であり、ｍは５〜２０，０００の整数であり、ｎは２〜５，０００の整数であり、ｙは０〜５，０００の整数であり、２は０〜５，０００の整数であるが、ｙ＋ｚはｎより大きくないものとする。）
【請求項６】
Ｒ１ａ又はＲ１ｂがメチル基である請求項５記載のポリイオンコンプレックス。
【請求項７】
Ｒ１ａ又はＲ１ｂが置換された直鎖もしくは分枝Ｃ１−１２アルキル基を表し、ここで置換基がアセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ２−７アシルアミド基、同一もしくは異なるトリ−Ｃ１−６アルキルシロキシ基、シロキシ基またはシリルアミノ基である請求項５記載のポリイオンコンプレックス。
【請求項８】
Ｌ１が−（ＣＨ２）ｂ−ＮＨ−であり、ここでｂは１〜５の整数である請求項５〜７のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
【請求項９】
Ｌ２が−（ＣＨ２）ｃ−ＣＯ−であり、ここでｃは１〜５の整数である請求項５〜７のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
【請求項１０】
Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ及びＲ２ｄがメチレン基である請求項５〜９のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
【請求項１１】
Ｘが下記に示す式で表される基からなる群から選ばれるいずれかのものである請求項５〜１０のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
2005078084.tif 000013
2005078084.tif 000014
（式中、Ｘ２は水素原子またはＣ１−６アルキル基もしくはアミノＣ１−６アルキル基を表し、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ及びＲ７ｃはそれぞれ独立して水素原子またはメチル基を表し、ｄ１、ｄ２及びｄ３はそれぞれ独立して１〜５の整数を表し、ｅ１、ｅ２及びｅ３はそれぞれ独立して１〜５の整数を表し、ｆは０〜１５の整数を表し、Ｒ８ａ及びＲ８ｂはそれぞれ独立して水素原子または保護基を表し、ここで保護基とは通常アミノ基の保護基として用いられているＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基、トリフルオロアセチル基等を表し、ｇは０〜１５の整数を表す。）
【請求項１２】
Ｒ５ａ及びＲ５ｂの合計の８５％以上が−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−（ＮＲ７ａ（ＣＨ２）ｄ１）ｅ１−ＮＨＲ８ａである請求項５、６、７、８、１０及び１１のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
【請求項１３】
Ｒ５ｃ及びＲ５ｄの合計の８５％以上が−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−（ＮＲ７ａ（ＣＨ２）ｄ１）ｅ１−ＮＨＲ８ａである請求項項５、６、７、９、１０及び１１のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
【請求項１４】
Ｒ５ａ及びＲ５ｂの合計の８５％以上が−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２である請求項５、６、７、８、１０及び１１のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
【請求項１５】
Ｒ５ｃ及びＲ５ｄの合計の８５％以上が−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２である請求項５、６、７、９、１０及び１１のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
【請求項１６】
ｚ＝０である請求項５〜１５のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
【請求項１７】
Ｒ３がアセチル基、アクリロイル基またはメタクリロイル基である請求項５、６、７、８、１０、１１、１２、１４及び１６のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
【請求項１８】
Ｒ４が−ＮＨ−Ｒ９であり、ここでＲ９は未置換または置換された直鎖または分枝のＣ１−２０アルキル基を表す請求項５、６、７、９、１０、１１、１３、１５及び１６のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
【請求項１９】
２本鎖オリゴ核酸が、遺伝子ノックダウン能を有する核酸分子である請求項１〜１８のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
【請求項２０】
遺伝子ノックダウン用核酸を、非荷電性セグメントと荷電性セグメントからなるブロック共重合体に静電結合させることを特徴とする、ポリイオンコンプレックスの製造方法。
【請求項２１】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のポリイオンコンプレックスを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、遺伝子ノックダウンを目的とする２本鎖オリゴ核酸のデリバリーシステムに関する。
【背景技術】  近年、生体内での遺伝子発現やその機能コントロールにおいて、小さな核酸分子が非常に大きな役割を果たしていることが明らかとなり、そのメカニズムが活発に探求されている。その端緒となったのが、小さな２本鎖ＲＮＡによって、配列特異的に遺伝子発現が抑制（ノックダウン）される現象、即ちＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（以下、ＲＮＡｉと略称する））である。これは従来植物の細胞などでは観察されていた現象であるが、最近になって哺乳動物細胞においても、２１〜２３塩基程度の小さな２本鎖ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）を利用すると、ＲＮＡｉを生じさせることが明らかとなった。即ち、ｓｉＲＮＡが細胞内に入ると、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）と呼ばれるｓｉＲＮＡ−タンパク複合体が形成され、配列特異的にｍＲＮＡが分解される。ＲＩＳＣは一度形成されると非常に安定で、繰り返しｍＲＮＡに働きかけることが出来るため、従来より行われていた遺伝子ノックダウン法であるアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）ＤＮＡ法と比べて、非常に効率よく遺伝子発現を抑制させることができる。そのため、このＲＮＡｉを用いて細胞や組織の生物学的機能を遺伝子レベルでコントロールすることによる、新規治療法開発への展望が開け、従来治療が困難であった難治性疾患等への有効な治療法として、期待は非常に高い。
ＲＮＡｉを起こす核酸分子として、ｓｉＲＮＡのほか、ヘアピン構造を持つＲＮＡ分子であるｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）も同様の効果を持ち、また従来のアンチセンスＤＮＡのように、遺伝子ノックダウンはＲＮＡ分子に限らず、２本鎖オリゴＤＮＡ（ｄｓＯＤＮ）、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドオリゴ核酸も有効である可能性が検討されている。また、ＲＮＡｉと類似した現象として、種々の細胞で内在性の数百種類の小さなＲＮＡファミリーが発見され、時期、部位特異的な遺伝子発現コントロールを通じて、広範な生命現象に関与していることが明らかとなってきた。このｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる小さなＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡによるノックダウンと異なり、標的遺伝子と完全に配列が一致しない場合でも、ｍＲＮＡの翻訳を抑制することによって、遺伝子発現をコントロールする。このように、小さな２本鎖核酸を用いることによって、遺伝子の発現やその機能を自在にコントロールできる可能性があり、その応用範囲は非常に広範にわたると考えられる。
しかしながら、２本鎖オリゴ核酸をそのまま細胞、組織へ投与しても、（ｉ）生体内、細胞内における核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）のため、安定に存在できない、（ｉｉ）核酸自体が陰性荷電を持つため、細胞の取り込みが起こりにくい、などの理由により、本来その２本鎖オリゴ核酸が有する機能を充分に発揮することが出来ない。
現在、この問題点を解決するため、例えば２本鎖オリゴ核酸のひとつであるｓｉＲＮＡにおいては、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）やＲＮＡｉＦｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）などのカチオン性脂質をベースにしたｓｉＲＮＡ導入試薬を用いる手法が一般的となっている。しかし、これら脂質をベースにしたｓｉＲＮＡデリバリーは、血清成分やタンパクの影響を受けやすく、ＲＮＡｉを実際の臨床へ応用することを考えた場合、このようなシステムは現実的ではない。従って、ｓｉＲＮＡなどの２本鎖オリゴ核酸の機能を損なわずに、安定に標的とする細胞、組織へ送達するデリバリーシステムの開発が急務となっている。
本発明者らは、荷電性タンパク質やＤＮＡのデリバリーシステムとして、ブロック共重合体とのポリイオンコンプレックスが有用であることをすでに報告している（特許第２６９０２７６号公報、Ｋ．Ｋａｋｉｚａｗａ，Ｋ．Ｋａｔａｏｋａ，Ｂｌｏｃｋ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｍｉｃｅｌｌｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５４（２００２）２０３−２２２．）。しかしながら２本鎖オリゴ核酸については、デリバリーに適したブロック共重合体の構造やポリイオンコンプレックスの作製法についての検討はされていなかった。
【発明の開示】
本発明は、遺伝子ノックダウンに機能する２本鎖オリゴ核酸の細胞又は組織への送達に有用なデリバリーシステムを提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、２本鎖オリゴ核酸の細胞、組織への送達にポリイオンコンプレックスを採用することにより、効率的にデリバリーしうることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は以下の通りである。
（１）非荷電性セグメントと荷電性セグメントからなるブロック共重合体と、２本鎖オリゴ核酸とを含んでなるポリイオンコンプレックス。
（２）コア部に２本鎖オリゴ核酸を担持したポリマーミセルの形態にある（１）記載のポリイオンコンプレックス。
（３）非荷電性セグメントがポリエチレングリコールまたはその誘導体である（１）または（２）記載のポリイオンコンプレックス。
（４）荷電性セグメントがポリアミノ酸もしくはその誘導体またはそれらの塩である（１）〜（３）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
（５）ブロック共重合体の構造が一般式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）またはそれらの塩である（１）または（２）記載のポリイオンコンプレックス。
2005078084.tif 000002
（式中、Ｒ１ａ及びＲ１ｂはそれぞれ独立して水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ１−１２アルキル基を表し、Ｌ１およびＬ２は連結基を表し、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ及びＲ２ｄはそれぞれ独立してメチレン基またはエチレン基を表し、Ｒ３は水素原子、保護基、疎水性基または重合性基を表し、Ｒ４はＲ５ｃ又はＲ５ｄと同一であるかまたは開始剤残基であり、Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ５ｃ及びＲ５ｄはそれぞれ独立して水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基を表し、ここでＸはそれぞれ独立して一級、二級、三級アミンまたは四級アンモニウム塩の内一種類または二種類以上を含むアミン化合物残基であるか、あるいはアミンでない化合物残基であり、ａは１〜５の整数であり、Ｒ６ａ及びＲ６ｂはそれぞれ独立して水素原子または保護基であり、ここで保護基とは通常アミノ基の保護基として用いられているＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基、トリフルオロアセチル基等であり、ｍは５〜２０，０００の整数であり、ｎは２〜５，０００の整数であり、ｙは０〜５，０００の整数であり、ｚは０〜５，０００の整数であるが、ｙ＋ｚはｎより大きくないものとする。）
（６）Ｒ１ａ又はＲ１ｂがメチル基である（５）記載のポリイオンコンプレックス。
（７）Ｒ１ａ又はＲ１ｂが置換された直鎖もしくは分枝Ｃ１−１２アルキル基を表し、ここで置換基がアセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ２−７アシルアミド基、同一もしくは異なるトリ−Ｃ１−６アルキルシロキシ基、シロキシ基またはシリルアミノ基である（５）記載のポリイオンコンプレックス。
（８）Ｌ１が−（ＣＨ２）ｂ−ＮＨ−であり、ここでｂは１〜５の整数である（５）〜（７）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
（９）Ｌ２が−（ＣＨ２）ｃ−ＣＯ−であり、ここでｃは１〜５の整数である（５）〜（７）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
（１０）Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ及びＲ２ｄがメチレン基である（５）〜（９）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
（１１）Ｘが下記に示す式で表される基からなる群から選ばれるいずれかのものである（５）〜（１０）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
2005078084.tif 000003
（式中、Ｘ２は水素原子またはＣ１−６アルキル基もしくはアミノＣ１−６アルキル基を表し、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ及びＲ７ｃはそれぞれ独立して水素原子またはメチル基を表し、ｄ１、ｄ２及びｄ３はそれぞれ独立して１〜５の整数を表し、ｅ１、ｅ２及びｅ３はそれぞれ独立して１〜５の整数を表し、ｆは０〜１５の整数を表し、Ｒ８ａ及びＲ８ｂはそれぞれ独立して水素原子または保護基を表し、ここで保護基とは通常アミノ基の保護基として用いられているＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基、トリフルオロアセチル基等を表し、ｇは０〜１５の整数を表す。）
（１２）Ｒ５ａ及びＲ５ｂの合計の８５％以上が−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−（ＮＲ７ａ（ＣＨ２）ｄ１）ｅ１−ＮＨＲ８ａである（５）、（６）、（７）、（８）、（１０）及び（１１）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
（１３）Ｒ５ｃ及びＲ５ｄの合計の８５％以上が−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−（ＮＲ７ａ（ＣＨ２）ｄ１）ｅ１−ＮＨＲ８ａである（５）、（６）、（７）、（９）、（１０）及び（１１）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
（１４）Ｒ５ａ及びＲ５ｂの合計の８５％以上が−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２である（５）、（６）、（７）、（８）、（１０）及び（１１）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
（１５）Ｒ５ｃ及びＲ５ｄの合計の８５％以上が−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２である（５）、（６）、（７）、（９）、（１０）及び（１１）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
（１６）ｚ＝０である（５）〜（１５）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
（１７）Ｒ３がアセチル基、アクリロイル基またはメタクリロイル基である（５）、（６）、（７）、（８）、（１０）、（１１）、（１２）、（１４）及び（１６）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
（１８）Ｒ４が−ＮＨ−Ｒ９であり、ここでＲ９は未置換または置換された直鎖または分枝のＣ１−２０アルキル基を表す（５）、（６）、（７）、（９）、（１０）、（１１）、（１３）、（１５）及び（１６）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
（１９）２本鎖オリゴ核酸が、遺伝子ノックダウン能を有する核酸分子である（１）〜（１８）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
（２０）遺伝子ノックダウン用核酸を、非荷電性セグメントと荷電性セグメントからなるブロック共重合体に静電結合させることを特徴とする、ポリイオンコンプレックスの製造方法。
（２１）（１）〜（１９）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックスを含む医薬組成物。
【図面の簡単な説明】    図１は、ＰＥＧ−ＰＬＬ／ｄｓＯＤＮ、ＰＥＧ−ＤＰＴ／ｄｓＯＤＮ、ＰＥＧ−ＤＰＴ／ｓｉＲＮＡの各コンプレックス形成を電気泳動により示す図である。
図２は、ＰＥＧ−ＰＬＬ／ｄｓＯＤＮコンプレックス、ＰＥＧ−ＤＰＴ／ｄｓＯＤＮコンプレックスの動的光散乱測定による粒径を測定した結果を示す図である。
図３は、ＰＥＧ−ＰＬＬ／ｓｉＲＮＡコンプレックスを用いたルシフェラーゼ遺伝子発現抑制効果を示す図である。
図４は、ＰＥＧ−ＤＥＴ／ｓｉＲＮＡコンプレックス、ＰＥＧ−ＤＰＴ／ｓｉＲＮＡコンプレックス、ＰＥＧ−ＡＰＭ−ＰＬＬ／ｓｉＲＮＡコンプレックス及びＰＥＧ−ＰＬＬ／ｓｉＲＮＡコンプレックスを用いたルシフェラーゼ遺伝子発現抑制効果を示す図である。
図５は、ｓｉＲＮＡ担持ポリイオンコンプレックスの血清中でのインキュベーション後の、ルシフェラーゼ遺伝子発現抑制効果を示す図である。
図６は、ｓｉＲＮＡ担持ポリイオンコンプレックスによる内在性遺伝子ＬａｍｉｎＡ／Ｃのノックダウン効果を示す図である。
図７は、ｓｉＲＮＡ担持ポリイオンコンプレックスによる内在性遺伝子ＡＴＸのノックダウン効果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、遺伝子ノックダウンを起こさせる核酸を、ブロック共重合体とポリイオンコンプレックスを形成させることにより、標的の組織又は細胞内の遺伝子発現を抑制できる静電結合型の高分子（ポリマー）ミセル医薬組成物に関する。
１．ブロック共重合体
本発明に用いられるブロック共重合体は、非荷電性セグメントと荷電性セグメントから構成され、荷電性セグメントが遺伝子ノックダウン用核酸とポリイオンコンプレックスを形成することが可能なものである。
非荷電性セグメントとしては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリサッカライド、ポリアクリルアミド、ポリ置換アクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリ置換メタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、もしくはそれらの誘導体由来の各種セグメント等が例示される。非荷電性セグメントの好ましい分子量は、２００〜１，０００，０００、より好ましくは５００〜２００，０００、特に好ましくは１，０００〜５０，０００である。
荷電性セグメントとしては、例えばポリアミノ酸もしくはその誘導体またはそれらの塩が挙げられ、より具体的には、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン、ポリヒスチジン等のポリアミノ酸や、ポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸のエステルまたは酸アミドの側鎖に荷電性基を有するもの等が挙げられる。またポリアクリル酸、ポリメタクリル酸等のエステルまたは酸アミドの側鎖に荷電性基を有するものも挙げることができる。荷電性セグメントの好ましい分子量は、２００〜１，０００，０００、より好ましくは５００〜２００，０００、特に好ましくは１，０００〜５０，０００である。
本発明で用いられるブロック共重合体の一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）を下記に示す。
2005078084.tif 000004
上記の一般式（Ｉ）または（ＩＩ）において、Ｒ１ａ及びＲ１ｂはそれぞれ独立して水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ１−１２アルキル基を表すが、Ｃ１−１２アルキルとしては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、デシル、ウンデシル等が挙げられる。また置換された場合の置換基としてはアセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ２−７アシルアミド基、同一もしくは異なるトリ−Ｃ１−６アルキルシロキシ基、シロキシ基またはシリルアミノ基が挙げられる。置換基がアセタール化ホルミル基であるときは、酸性の温和な条件下で加水分解して他の置換基であるホルミル基（−ＣＨＯ：またはアルデヒド基）に転化できる。かようなホルミル基、またはカルボキシル基もしくはアミノ基は、例えば、本発明に従う共重合体と核酸または陰イオン性タンパク質とのポリイオンコンプレックスミセルのシェル部に存在することができ、これらの基を介して、抗体もしくはその特異結合性を有する断片（Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）、等）およびその他の機能性もしくは標的指向性を該ミセルに付与し得るタンパク質等を該ミセルに共有結合するのに利用できる。このような官能基を片末端に有するＰＥＧセグメントは、例えば、ＷＯ  ９６／３２４３４、ＷＯ  ９６／３３２３３、ＷＯ  ９７／０６２０２に記載のブロック共重合体のＰＥＧセグメント部の製造法によって、都合よく形成できる。
こうして形成されるＰＥＧセグメント部分とポリ（アミノ酸またはその誘導体）セグメント部分とは、上記一般式（Ｉ）または（ＩＩ）の共重合体の製造方法に応じて、どのような連結様式をもとり得、そして本発明の目的に沿う限り、どのような連結基で結合されていてもよい。
上記共重合体の製造方法は特に限定されるものではないが、一つの方法として、例えば、末端にアミノ基を有するＰＥＧ誘導体を用いて、そのアミノ末端に、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート、Ｎε−Ｚ−Ｌ−リシン等の保護アミノ酸のＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）を重合させてブロック共重合体を合成し、その後側鎖を変換することにより、本発明の共重合体を得る方法が挙げられる。この場合、共重合体の構造は一般式（Ｉ）となり、連結基Ｌ１は、用いたＰＥＧ誘導体等の末端構造に由来する構造となるが、好ましくは−（ＣＨ２）ｂ−ＮＨ−であり、かつｂは１〜５の整数である。
また、ポリ（アミノ酸またはその誘導体）セグメント部分を合成してから、ＰＥＧセグメント部分と結合させる方法でも、本発明の共重合体は製造可能であり、この場合結果的に上記の方法で製造したものと同一の構造となることもあるが、一般式（ＩＩ）の構造となることもある。連結基Ｌ２は特に限定されるものではないが、好ましくは−（ＣＨ２）ｃ−ＣＯ−であり、かつｃは１〜５の整数である。
一般式（Ｉ）または（ＩＩ）中のＲ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ５ｃ及びＲ５ｄはそれぞれ独立して水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基であることができるが、大部分（一般的にはＲ５ａ及びＲ５ｂの合計の８５％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、特に好ましくは１００％、Ｒ５ｃ及びＲ５ｄの合計の８５％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、特に好ましくは１００％）が−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基であること、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−（ＮＲ７ａ（ＣＨ２）ｄ１）ｅ１−ＮＨＲ８ａであること、あるいは、−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２であることが好ましい（Ｒ７ａ、ｄ１、ｅ１、Ｒ８ａに関しては後述）。なお、ａは１〜５の整数である。
また一般式（Ｉ）または（ＩＩ）中のＲ６ａ及びＲ６ｂはそれぞれ独立して水素原子または保護基であることができるが、大部分が水素原子であることが好ましい。ここで保護基とは通常アミノ基の保護基として用いられているＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基、トリフルオロアセチル基等のことである。
Ｘは共重合体が本発明の条件を満たす限り特に制限されないが、それぞれ独立して一級、二級、三級アミンまたは四級アンモニウム塩の内一種類または二種類以上を含むアミン化合物残基であるか、あるいはアミンでない化合物残基であり、例として下記式のような残基が挙げられる。下記式中、Ｘ２は、水素原子またはＣ１−６アルキル基もしくはアミノＣ１−６アルキル基であり、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ及びＲ７ｃはそれぞれ独立して水素原子またはメチル基であり、ｄ１、ｄ２及びｄ３はそれぞれ独立して１〜５の整数であり、ｅ１、ｅ２及びｅ３はそれぞれ独立して１〜５の整数であり、ｆは０から１５の整数であり、Ｒ８ａ及びＲ８ｂはそれぞれ独立して水素原子またはアミノ基の保護基として通常用いられているＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基、トリフルオロアセチル基等の保護基であり、ｇは０〜１５の整数であることができる。
2005078084.tif 000005
ポリアミノ酸構造の側鎖にこれらの残基を導入する方法は、特にポリアスパラギン酸構造の場合には、例えば、特許第２７７７５３０号公報に記載されているようなポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）部分のアミノリシスによるエステルからアミドへの交換反応によって都合よく製造することができる。別法としてはベンジルエステルを接触還元、酸、アルカリ等により加水分解しポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸に変換した後、縮合剤等を用いてこれらの残基を有する化合物を結合させるという方法でも製造できる。
一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるブロック共重合体は、その塩を形成していてもよい。この場合塩を形成する対イオンとしてはＣｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、（１／２ＳＯ４）−、ＮＯ３−、（１／２ＣＯ３）−、（１／３ＰＯ４）−、ＣＨ３ＣＯＯ−、ＣＦ３ＣＯＯ−、ＣＨ３ＳＯ３−、ＣＦ３ＳＯ３−等が挙げられる。
一般式（Ｉ）または（ＩＩ）におけるＲ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ及びＲ２ｄは、それぞれ独立してメチレン基またはエチレン基を表すが、Ｒ２ａ及びＲ２ｂのいずれもがメチレン基の場合はポリ（アスパラギン酸誘導体）、エチレン基の場合はポリ（グルタミン酸誘導体）に、Ｒ２ｃ及びＲ２ｄのいずれもがメチレン基の場合はポリ（アスパラギン酸誘導体）、エチレン基の場合はポリ（グルタミン酸誘導体）に相当する。これらの一般式中、Ｒ２ａ及びＲ２ｂ（Ｒ２ｂ及びＲ２ａ）がメチレン基およびエチレン基の両者を表す場合、及びＲ２ｃ及びＲ２ｄ（Ｒ２ｄ及びＲ２ｃ）がメチレン基およびエチレン基の両者を表す場合、アスパラギン酸誘導体およびグルタミン酸誘導体の反復単位は、それぞれブロックを形成して存在するか、あるいはランダムに存在できる。
ポリエチレングリコール−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）ブロック共重合体にジプロピレントリアミンを反応させてアミノリシスを行った下記式（ＩＩＩ）に示す構造のブロック共重合体（ＰＥＧ−ＤＰＴと略記する）は、本発明において特に好ましいブロック共重合体のひとつである。
2005078084.tif 000006
また、上記のポリエチレングリコール−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）ブロック共重合体にスペルミンを反応させて得ることのできる下記式（ＩＶ）に示す構造のブロック共重合体（ＰＥＧ−ＳＰＭと略記する）も、本発明において特に好ましいブロック共重合体のひとつである。ＰＥＧ−ＳＰＭは、２本鎖オリゴ核酸（下記２．参照）のほか、ｓｓＤＮＡやアンチセンスＲＮＡなどの１本鎖オリゴ核酸、プラスミドＤＮＡなどの環状核酸、例えば環状核酸を切断して得られる線状核酸とポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）ミセルを形成することもできる。
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一般式（Ｉ）におけるＲ３は水素原子、保護基、疎水性基または重合性基を表すが、保護基としてはＣ１−６アルキルカルボニル基が挙げられ、好ましくはアセチル基である。疎水性基としてはベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ピレン等の誘導体が挙げられる。重合性基としてはメタクリロイル基、アクリロイル基が挙げられ、かような重合性基を一般式（Ｉ）の共重合体が有する場合には、これらの共重合体は、所謂、マクロマーとして使用でき、例えば、ＰＩＣミセルを形成した後、必要により他のコモノマーを用い、これらの重合性基を介して架橋させることもできる。
これらの保護基、疎水性基、重合性基を共重合体の末端に導入する方法としては、酸ハロゲン化物を用いる方法、酸無水物を用いる方法、活性エステルを用いる方法等、通常の合成で用いられている手法が挙げられる。
一般式（ＩＩ）におけるＲ４はＲ５ｃ又はＲ５ｄと同じくそれぞれ独立して水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基であることができる。またはＲ４は開始剤残基である。つまり、低分子の開始剤を用いて保護アミノ酸のＮＣＡを重合させてポリ（アミノ酸またはその誘導体）セグメントを合成してからＰＥＧセグメントと結合させる方法でブロック共重合体を製造する場合には、使用した開始剤に由来する構造、すなわち−ＮＨ−Ｒ９であってＲ９が未置換または置換された直鎖または分枝のＣ１−２０アルキル基をとることもできる。
ＰＥＧセグメントの鎖長およびポリ（アミノ酸またはその誘導体）セグメントの鎖長を規定する、ｍおよびｎは、ｍについては５〜２０，０００の整数、好ましくは１０〜５，０００、特に好ましくは４０〜５００であり、ｎについては２〜５，０００の整数、より好ましくは５〜１，０００、特に好ましくは１０〜２００であるが、一般式（Ｉ）または（ＩＩ）の共重合体が、核酸または陰イオン性タンパク質とＰＩＣミセルを形成するものであれば、限定されるものではない。したがって、本明細書では便宜上、ポリエチレングリコール、ポリアミノ酸等と称しているが、「ポリ」の語には、所謂、「オリゴ」に分類されるものも包合される概念として用いている。
またポリ（アミノ酸またはその誘導体）セグメントの構成割合を規定する、ｙ、ｚは、いずれも０〜５，０００の整数（ただしｙ＋ｚはｎより大きくない。）である（例えばｚ＝０またはｚ＝ｎとすることができる。また、ｚ＝１〜（ｎ−１）のトリブロック共重合体も、本発明のブロック共重合体に含まれる。）。また各構成成分はランダムに分布していることもブロック状に分布していることもどちらも可能であり、表記上順番に書いているがこれに限定されるものではない。
例えば、ｚ＝１のトリブロック共重合体も、本発明のブロック共重合体に含まれる。
本発明のポリイオンコンプレックスがポリマーミセルの形態にある場合、ミセルのコア部には２本鎖オリゴ核酸が担持されており、シェル部には非荷電性セグメントが存在すると考えられる。
本発明において、好ましいブロック共重合体としては、上記のＰＥＧ−ＤＰＴ、ＰＥＧ−ＳＰＭの他、片末端一級アミノ基のポリエチレングリコールとＮε−Ｚ−Ｌ−リシンＮカルボン酸無水物を反応させた後、Ｚ基を脱保護して得られるポリエチレングリコール−ポリリシンブロック共重合体（ＰＥＧ−ＰＬＬと略記する）、ポリエチレングリコール−ｂｌｏｃｋ−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）ブロック共重合体（ＰＥＧ−ＰＢＬＡと略記する）にジエチレントリアミンを反応させて得られるブロック共重合体（ＰＥＧ−ＤＥＴと略記する）、ポリエチレングリコール−ｂｌｏｃｋ−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）−ｂｌｏｃｋ−ポリ（Ｎε−Ｚ−Ｌ−リシン）トリブロック共重合体（ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−ＰＬＬ（Ｚ））に４−（３−アミノプロピル）モルホリンを反応させた後、Ｚ基を脱保護して得られるトリブロック共重合体（ＰＥＧ−ＡＰＭ−ＰＬＬと略記する）等を例示することができる。特に、ＰＥＧ−ＤＥＴを含むＰＩＣミセルは細胞毒性が少ないという特徴を有する。
２．遺伝子ノックダウン用核酸
本発明において、上記ブロック共重合体からなる高分子ミセル中に静電的に担持させる核酸は、遺伝子ノックダウンを目的とした２本鎖オリゴ核酸である限り、その種類に限定されるものではない。ここで、「遺伝子ノックダウン」とは、遺伝子の発現をオリゴ核酸を用いて抑制することの総称であり、そのノックダウン用核酸としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドオリゴ核酸を含めた２本鎖オリゴ核酸の少なくとも１つである。
（１）ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ
近年、二本鎖ＲＮＡが遺伝子ノックダウンを起こす現象が発見され、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と名付けられた。ハエ、線虫だけではなく、哺乳動物細胞でもｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡがｍＲＮＡを破壊することが明らかとなっている。
ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ，ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）は、ターゲットとする遺伝子に相補的な配列を有する短い二本鎖ＲＮＡであり、ターゲットとなる遺伝子の発現を強力に抑制する作用を有する。ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）は、センス鎖とアンチセンス鎖がループを介して繋がり、ノックダウン効果の発現にはさらに細胞内でのプロセシングを経て、ｓｉＲＮＡとなる。また、近年内在性の遺伝子発現調節機構として発見されたｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ）では、ｓｉＲＮＡと同様の機構が推測されながら、標的ｍＲＮＡと完全な相補性を持たないことが多いことも明らかとなっている。従って、ｓｉＲＮＡのターゲット配列との完全な相補性は必ずしも絶対の条件ではない。ｓｉＲＮＡの長さは、１０〜１００ヌクレオチド（ｎｔ）、好ましくは１０〜５０ｎｔ、より好ましくは１８〜２５ｎｔである。
（２）ｄｓＯＤＮ，ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドオリゴ核酸
従来遺伝子ノックダウンの得るための手段として、１本鎖オリゴＤＮＡである、アンチセンスＤＮＡが用いられてきた。これは種々の評価系で一定のノックダウン効果を示したが、オリゴＤＮＡの不安定性、細胞への取り込みの悪さのため、臨床応用等には不十分な効果しか得られなかった。
一方、ＲＮＡｉにおいては、２本鎖オリゴＲＮＡがＲＩＳＣ複合体に取り込まれ、ｓｉＲＮＡの解離、活性化を経て、その高いノックダウン効率が発揮されると考えられる。しかし、そのメカニズムの詳細はまだ不明の点も多く、細胞内へ有効にデリバリーされれば、オリゴＤＮＡでも同様のノックダウン効果が得られる、との報告もある。従って、２本鎖オリゴ核酸として、ｄｓＯＤＮ、およびＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドオリゴ核酸も細胞内での遺伝子ノックダウン機能を有する可能性が想定される。これらのオリゴ核酸も同様に高分子ミセルに担持させることが出来る。
これらの核酸とブロック共重合体とのポリイオンコンプレックスを製造する方法としては、それぞれの溶液を適切な混合比で混合することにより、核酸をブロック共重合体に静電結合させることを基本とする。つまり、核酸とブロック共重合体とを混合すると、核酸の負電荷とブロック共重合体の正電荷によって、ミセルの形態のポリイオンコンプレックスが形成する。
ここで、核酸とブロック共重合体との混合比は、２本鎖オリゴ核酸分子内のリン酸基とブロック共重合体中のカチオンとの比率（Ｎ／Ｐ比）で表すことができる。Ｎ／Ｐ比とは、次式によって定義される量であり、以後断りの無い限り、Ｎ／Ｐ比とはこの量のことを指す。
Ｎ／Ｐ比＝〔溶液中の２本鎖オリゴ核酸中のヌクレオチドの総数〕
／〔溶液中のブロック共重合体中のカチオンの総数〕
本発明において、Ｎ／Ｐ比は、ポリイオンコンプレックスを形成できる限り限定されず、ブロック共重合体に含まれる非荷電性セグメント又は荷電性セグメントの性質によって異なる。本発明における適当なＮ／Ｐ比は、当業者であれば、適宜選択することができる。
さらに、透析、攪拌、希釈、濃縮、超音波処理、温度制御、ｐＨ制御、イオン強度制御、有機溶媒の添加等の操作を適宜付加することができる。
３．医薬組成物
本発明においては、上記のように得られる高分子ブロック共重合体に２本鎖オリゴ核酸を担持させることにより、遺伝子治療を目的とした医薬組成物として使用することができる。
本発明において、高分子ブロック共重合体に担持させる２本鎖オリゴ核酸として、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ，ｄｓＯＤＮ，ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドオリゴ核酸等、前述の２本鎖オリゴ核酸を用いることができ、単独で、又は適宜組み合わせて使用することができる。
本発明の医薬組成物の投与形態としては注射が挙げられ、通常の静脈内、動脈内等の全身投与のほか、筋肉、関節内、皮下、皮内等に局所投与することができる。さらに、カテーテルを用いた投与形態を採用することも可能である。この場合、通常は単位投与量アンプル又は多投与量容器の形態で提供され、使用する際に適当な担体、例えばパイロジェンフリーの滅菌した水で再溶解させる粉体であってもよい。また、これらの剤形に対し、製剤上一般に使用される添加剤を含有させることもできる。その投与量は、治療目的、ミセルの形態、投与対象の年齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変えることができ、本発明の医薬組成物に含まれる２本鎖オリゴ核酸の量は、当業者であれば適宜設定することができる。例えば、本発明の医薬組成物の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体との組合せとして投与される有効量は、一回につき体重１ｋｇあたり１０μｇ〜１００００μｇであり、３日間から４週間間隔で投与される。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は実施例に限定されるものではない。本実施例では、２本鎖オリゴ核酸であるｓｉＲＮＡ，ｄｓＯＤＮを用いて、ポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）を調製し、その形成の確認、物性および遺伝子ノックダウン能の評価を行った。
【実施例１】      ２本鎖オリゴ核酸を担持させたＰＩＣの調製
（１）材料及び方法
ＧＬ３、ＧＦＰ、ＬａｍｉｎＡ／ＣをターゲットとするｓｉＲＮＡサンプル（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｉＲＮＡ）はＱＩＡＧＥＮより購入した。Ａｕｔｏｔａｘｉｎ（ＡＴＸ）をターゲットとする下記のｓｉＲＮＡ、
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は、ＱＩＡＧＥＮよりカスタム合成されたものを購入した。配列番号１で示される配列中、かっこ内の塩基は、オーバーハングである。ｄｓＯＤＮは、ＧＬ３  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｉＲＮＡと同一の塩基配列をもつオリゴ（Ｏｌｉｇｏ）ＤＮＡ（２１ｂｐｓ）（Ｓｉｇｍａ）のセンス（ｓｅｎｓｅ）及びアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）鎖をそれぞれ購入し、両者をアニール（ａｎｎｅａｌ）させることによって調製した。２本鎖が形成されていることを電気泳動（ＰＡＧＥ）で確認した後、実験に用いた。ｓｉＲＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬であるＲＮＡｉＦｅｃｔは、ＱＩＡＧＥＮより購入した。
ｄｓＯＤＮおよびｓｉＲＮＡを担持させたＰＩＣは、各オリゴ核酸溶液に対して、各ブロック共重合体（ｂｌｏｃｋ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）溶液を体積比２：１で添加、混合することによって調製した。
ＰＥＧ−ＰＬＬ、ＰＥＧ−ＰＢＬＡ、ＰＥＧ−ＤＰＴ、ＰＥＧ−ＳＰＭ、ＰＥＧ−ＤＥＴ、ＰＥＧ−ＡＰＭ−ＰＬＬの各ブロック共重合体は、以下の通り合成した。
（例１）ＰＥＧ−ＰＬＬブロック共重合体の合成
Ｎε−Ｚ−Ｌ−リシンＮカルボン酸無水物を、片末端一級アミノ基のポリエチレングリコールを開始剤として重合した。反応溶液を、冷エーテル中に滴下し生じたポリエチレングリコール−ポリ（Ｎε−Ｚ−Ｌ−リシン）ブロック共重合体（ＰＥＧ−ＰＬＬ（Ｚ））を濾過で回収した。ＰＥＧ−ＰＬＬ（Ｚ）をトリフルオロ酢酸に溶解させ、ＨＢｒ酢酸を用いて脱保護反応を行い、エーテル再沈、透析、凍結乾燥によりポリエチレングリコール−ポリリシンブロック共重合体（ＰＥＧ−ＰＬＬ）を得た。
（例２）ＰＥＧ−ＰＢＬＡブロック共重合体の合成
片末端メトキシ、片末端アミノプロピルで平均分子量が１２，０００のポリエチレングリコールを塩化メチレンに溶解し、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート−Ｎ−カルボン酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）と塩化メチレンの混合溶媒に溶解して加え、４０℃で２日間反応させ、さらに無水酢酸によりＮ末端のアセチル化を行い、ポリエチレングリコール−ｂｌｏｃｋ−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）（ＰＥＧ−ＰＢＬＡ）を得た。ＮＭＲによる解析からＰＢＬＡ部分の重合度は６８であった。以下、ＰＥＧの分子量が１２，０００、ＰＢＬＡ部分の重合度６８のブロック共重合体をＰＥＧ−ＰＢＬＡ（１２−６８）のように表記することがある（かっこ内の数字１２が分子量１２，０００を表し、６８が重合度を表している）。
（例３）ＰＥＧ−ＤＰＴブロック共重合体の合成
ＰＥＧ−ｂｌｏｃｋ−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）（ＰＥＧ−ＰＢＬＡ）をベンゼンに溶解させ凍結乾燥を行った後、アルゴン雰囲気下で乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させた。この溶液に、蒸留により乾燥・精製したジプロピレントリアミンを５０倍当量添加し、アルゴン雰囲気下４０℃で２４時間攪拌した。反応溶液を１０％酢酸に滴下し、分画分子量３５００の透析膜を用い０．１Ｎ−ＨＣｌに対して透析を行い、透析膜内液を回収・濃縮・凍結乾燥することでＰＥＧ−ＤＰＴブロック共重合体を白色固体として得た。
（例４）ＰＥＧ−ＳＰＭブロック共重合体の合成
ＰＥＧ−ＰＢＬＡ（１２−６８）をベンゼンに溶解させ凍結乾燥を行った後、アルゴン雰囲気下で乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させた。この溶液に、ベンゼンに溶解させ凍結乾燥を行い脱水したスペルミンを乾燥ＤＭＦに溶解させた溶液を添加し、アルゴン雰囲気下４０℃で２４時間攪拌した。スペルミンの量はベンジルエステルに対して５０倍当量用いた。反応溶液を１０％酢酸に滴下し、分画分子量６−８０００の透析膜を用い０．１Ｎ−ＨＣｌに対して透析を行い、透析膜内液を回収し、凍結乾燥することで下記式（ＩＶ）に示すＰＥＧ−ＳＰＭブロック共重合体を白色固体として得た。
2005078084.tif 000009
（例５）ＰＥＧ−ＤＥＴブロック共重合体の合成
ＰＥＧ−ＰＢＬＡ（１２−６８）をベンゼンに溶解させ凍結乾燥を行った後、アルゴン雰囲気下で乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させた。この溶液に、蒸留により乾燥・精製したジエチレントリアミンをベンジルエステルに対して５０倍当量添加し、アルゴン雰囲気下４０℃で２４時間攪拌した。反応溶液を１０％酢酸に滴下し、分画分子量３５００の透析膜を用いて０．１Ｎ−ＨＣｌに対して透析を行い、透析膜内液を回収、凍結乾燥することで下記式（Ｖ）に示すＰＥＧ−ＤＥＴブロック共重合体を白色固体として得た。
2005078084.tif 000010
（例６）ＰＥＧ−ＡＰＭ−ＰＬＬブロック共重合体の合成
ポリエチレングリコール−ｂｌｏｃｋ−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）−ｂｌｏｃｋ−ポリ（Ｎε−Ｚ−Ｌ−リシン）トリブロック共重合体（ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−ＰＬＬ（Ｚ））を合成し、Ｎ末端を無水酢酸を用いてアセチル化した。ＰＥＧの分子量は１２０００であり、ＰＢＬＡ、ＰＬＬ（Ｚ）の重合度はそれぞれ３６、５０であった（１２−３６−５０と表記）。このポリマーをベンゼンに溶解させ凍結乾燥を行った後、アルゴン雰囲気下で乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させた。この溶液に蒸留により乾燥・精製した４−（３−アミノプロピル）モルホリンをベンジルエステルに対し５０倍当量添加し、アルゴン雰囲気下４０℃で２４時間攪拌した。反応溶液をエーテル再沈し、ろ過、乾燥して回収したポリマーをトリフルオロ酢酸に溶解し、３０％ＨＢｒ／酢酸を用いて脱保護反応を行った。反応後エーテル再沈、濾過、乾燥して回収したポリマーを水に溶解し、分画分子量６−８０００の透析膜を用いて０．１Ｎ−ＨＣｌに対して透析を行い、透析膜内液を回収、凍結乾燥することで下記に示すＰＥＧ−ＡＰＭ−ＰＬＬトリブロック共重合体を白色固体として得た。
2005078084.tif 000011
（２）ｄｓＯＤＮおよびｓｉＲＮＡとブロック共重合体のｃｏｍｐｌｅｘ調製とその物性評価
（ｉ）電気泳動
まず、Ｃｏｍｐｌｅｘ形成を確認する目的で、２本鎖オリゴ核酸分子内のリン酸基とブロック共重合体中のカチオンとの比率（Ｎ／Ｐ比）を変化させた各サンプルを、２０％ポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ  ＴＢＥ  Ｇｅｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で電気泳動をおこなった。
結果を図１に示す。図１において、左パネルはＰＥＧ−ＰＬＬにｄｓＯＤＮを担持させたときのｃｏｍｐｌｅｘ（ＰＥＧ−ＰＬＬ（１２−４８）／ｄｓＯＤＮ）の電気泳動結果、中央パネルはＰＥＧ−ＤＰＴにｄｓＯＤＮを担持させたときのｃｏｍｐｌｅｘ（ＰＥＧ−ＤＰＴ（１２−６８）／ｄｓＯＤＮ）の電気泳動結果、右パネルはＰＥＧ−ＤＰＴにｓｉＲＮＡを担持させたときのｃｏｍｐｌｅｘ（ＰＥＧ−ＤＰＴ（１２−６８）／ｓｉＲＮＡ）の電気泳動結果である。
各レーンは以下の通りである。
ＰＥＧ−ＰＬＬ（１２−４８）／ｄｓＯＤＮ：左側から順にマーカー（レーン１）、ｆｒｅｅ  ＯＤＮ（レーン２）、Ｎ／Ｐ比＝０．２５，０．５，０．７５，１，１．５，２，３，５，１０（レーン３〜１１）
ＰＥＧ−ＤＰＴ（１２−６８）／ｄｓＯＤＮ：左側から順にマーカー（レーン１）、ｆｒｅｅ  ＯＤＮ（レーン２）、Ｎ／Ｐ比＝０．５，１，１．５，２，３，４，６，１０，２０（レーン３〜１１）
ＰＥＧ−ＤＰＴ（１２−６８）／ｓｉＲＮＡ：左側から順にマーカー（レーン１）、ｆｒｅｅ  ＯＤＮ（レーン２）、Ｎ／Ｐ比＝０．５，１，１．５，２，４，１０，２０（レーン３〜９）
図１に示すように、ブロック共重合体としてＰＥＧ−ＰＬＬ（左パネル）、ＰＥＧ−ＤＰＴ（中央および右パネル）を用いた場合、いずれもＮ／Ｐ比＝２前後までにフリーのｄｓＯＤＮのバンドは消失し、ｄｓＯＤＮとブロック共重合体とのｃｏｍｐｌｅｘ形成が確認された。また、ＰＥＧ−ＤＰＴに対してｓｉＲＮＡをコンプレックス化させた場合、ｄｓＯＤＮとほぼ同一の結果が得られ、ｃｏｍｐｌｅｘ形成に際して、ｓｉＲＮＡとｄｓＯＤＮは同等の挙動を示すことが示された。
（ｉｉ）動的光散乱測定
電気泳動によって形成が確認された、ブロック共重合体とｄｓＯＤＮからなるコンプレックスの動的光散乱測定を行った。測定結果を図２に示す。
ＰＥＧ−ＰＬＬとｄｓＯＤＮをＮ／Ｐ比を２として混和したとき、粒径が７２ナノメータの単峰性の会合体の存在が確認された。同様にＰＥＧ−ＤＰＴとｄｓＯＤＮをＮ／Ｐ比を４として混和したものについても、粒径が６４ナノメータの単峰性の会合体の存在が確認された。また、これらの会合体のζ−ポテンシャルを測定したところ、それぞれ１．５ｍＶ、３．５ｍＶであり、静電的にほぼ中性であることがわかった。さらに、このコンプレックス溶液は調整後、長期間に渡り目立った凝集体（沈殿）を示さず水溶性の高い会合体であることが確認された。
以上の結果を総合的に解釈すると、形成される会合体は外殻にＰＥＧ層を有し、内核部にポリカチオンブロックと２本鎖オリゴ核酸のポリイオンコンプレックスを有するいわゆるコア−シェル構造のミセル様の形態の会合体であることが示された。なお、ｄｓＯＤＮと同一の配列を持つｓｉＲＮＡを用いた場合も、ほぼ同様の会合体が形成されることは容易に推察できる。
【実施例２】      遺伝子ノックダウン機能の評価（ルシフェラーゼ遺伝子ノックダウン）
（１）材料と方法
細胞に対して、ウミホタル（ＧＬ３）及びウミシイタケ（ＲＬ）の異なった２種のルシフェラーゼ遺伝子をトランスフェクションし、次いでＧＬ３をターゲットとしたｓｉＲＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘを投与することによって、選択的にＧＬ３の発現を阻害し、ＲＬ発現をコントロールとして、そのノックダウン効果を評価した。
方法は、以下の通りである。まず、ＨｕＨ−７細胞を２４ｗｅｌｌ  ｄｉｓｈに２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように蒔き、１０％血清入りＤＭＥＭ中で２４時間インキュベーションした後、実験を行った。培地をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に交換し、ｐＧＬ３及びｐＲＬの２種のルシフェラーゼ遺伝子をそれぞれコードしたｐＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、同時にＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクションした。４時間後、細胞を洗浄し、培地を１０％血清入りＤＭＥＭに交換し、先に調製したｓｉＲＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘを、ｓｉＲＮＡ量として１μｇ／ｗｅｌｌ添加した。４８時間後、Ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、２種のルシフェラーゼ（ＧＬ３及びＲＬ）発現を定量した。
遺伝子ノックダウンは、ＧＬ３  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｉＲＮＡによるＧＬ３の選択的な発現抑制を、ＲＬの発現量を標準としたＧＬ３の相対的発現量によって評価し、ｓｉＲＮＡを投与していないｍｏｃｋ細胞のＧＬ３とＲＬの発現量比（ＧＬ３／ＲＬ）を基準に表示した。
（２）結果
（ｉ）ＰＥＧ−ＰＬＬ／ｓｉＲＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘを用いたルシフェラーゼ遺伝子ノックダウン
図３に示すように、ＰＥＧ−ＰＬＬ／ｓｉＲＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘによって、市販のｓｉＲＮＡ導入試薬であるＲＮＡｉＦｅｃｔによるノックダウン効果にはやや及ばないものの、ＧＬ３の発現は６０−７０％も抑制された。Ｃｏｍｐｌｅｘを形成せず、核酸そのものの状態であるｎａｋｅｄ  ｓｉＲＮＡでは全くノックダウンが見られず、陰性対照の配列であるＧＦＰ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｉＲＮＡによるノックダウンも見られなかった。従って、ＰＥＧ−ＰＬＬ／ｓｉＲＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘによって、有効なｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ及び遺伝子ノックダウンが得られたことが示された。
（ｉｉ）ＰＥＧ−ＤＰＴ／ｓｉＲＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘを用いたルシフェラーゼ遺伝子発現抑制
次に、ＰＥＧ−ＤＥＴ，ＰＥＧ−ＤＰＴ，ＰＥＧ−ＡＰＭ−ＰＬＬの各ブロック共重合体を用いた。
図４に示すように、各ブロック共重合体によって，良好なルシフェラーゼ遺伝子発現抑制が見られた。特に、ＰＥＧ−ＤＰＴではＰＥＧ−ＰＬＬをさらに上回る遺伝子発現の抑制が得られ、特にＮ／Ｐ比＝２０では８０％近い抑制が得られ、ＲＮＡｉ  Ｆｅｃｔを上回る抑制効果となった。
【実施例３】  ｃｏｍｐｌｅｘの血清中でのインキュベーション後の遺伝子ノックダウン
（１）材料と方法
臨床において２本鎖オリゴ核酸のｄｅｌｉｖｅｒｙを有効に達成するためには、ｃｏｍｐｌｅｘの生理的環境下での安定性が非常に重要となる。しかし、従来これらのｄｅｌｉｖｅｒｙに用いられてきたのは、ほとんどが脂質をベースとして調製された試薬であったが、生理的環境下では血清等の影響を非常に受けやすいため、期待される性能を発揮できないことが多く、実際の臨床応用に対して問題があった。
本実施例では、２本鎖オリゴ核酸のひとつであるｓｉＲＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘの血清中での安定性評価を目的とし、前述のように調製されたｃｏｍｐｌｅｘを５０％血清中でインキュベーションした後に、遺伝子ノックダウン実験に用いた。
方法は、実施例２と同様に、ＨｕＨ−７細胞に対し、ｐＧＬ３及びｐＲＬの２種のルシフェラーゼ遺伝子をコードしたｐＤＮＡをトランスフェクションした後、ＧＬ３の選択的なノックダウンによって行った。ｓｉＲＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘとして、ＰＥＧ−ＤＰＴ／ｓｉＲＮＡ、ＰＥＧ−ＰＬＬ／ｓｉＲＮＡの２種を用いた。投与前の血清中でのインキュベーションとして、ｃｏｍｐｌｅｘ溶液に等量の血清を添加し、３７℃で３０分インキュベーションを行った後、実験に使用した。遺伝子ノックダウンの評価は実施例２と同様に、ＲＬの発現量を標準としたＧＬ３の相対的発現量によって評価した。
（２）結果
図５に示すように、ブロック共重合体を用いた系では、ＰＥＧ−ＰＬＬ及びＰＥＧ−ＤＰＴともに、血清中でのインキュベーション後もその遺伝子ノックダウン効果は比較的変化が少なく保たれるのに対し、脂質をベースとしたＲＮＡｉ  Ｆｅｃｔではそのノックダウン効果は約１／２に減少した。
従って、ブロック共重合体とｓｉＲＮＡとのｃｏｍｐｌｅｘ化によって得られる、外殻がＰＥＧによって覆われ内核にｓｉＲＮＡを内包するというミセル構造は、生理的環境下にても非常に安定したノックダウン機能を発揮するのに有効であることが示された。
【実施例４】  内在性遺伝子（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｇｅｎｅ）のノックダウン（ＬａｍｉｎＡ／Ｃ）
本実施例では、ブロック共重合体によるｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙが、ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｇｅｎｅのノックダウンに対しても同様に機能しうることを確認するため、核タンパクの一種であるＬａｍｉｎＡ／ＣをターゲットとしたｓｉＲＮＡを用い、ＬａｍｉｎＡ／Ｃ  ｍＲＮＡのノックダウンを定量ＰＣＲ法にて評価した。
（１）材料と方法
ＨｕＨ−７細胞および２９３Ｔ細胞をそれぞれ６ｗｅｌｌ  ｄｉｓｈに蒔き、１０％血清入りＤＭＥＭ中で２４時間インキュベーションをした後、実験を行った。Ｍｅｄｉｕｍを交換し、各ｗｅｌｌに１０％血清入りＤＭＥＭを１ｍｌ加え、先に調製したｓｉＲＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘ（ＰＥＧ−ＤＰＴ／ｓｉＲＮＡ，ＰＥＧ−ＰＬＬ／ｓｉＲＮＡ）を、ｓｉＲＮＡ量として４μｇ／ｗｅｌｌずつ添加した。４８時間のインキュベーション後、ＲＮＡｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、各ＷｅｌｌよりＲＮＡを抽出、精製した。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Ｐｒｉｓｍ７０００，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＬａｍｉｎＡ／Ｃおよび内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量を定量した。ＬａｍｉｎＡ／Ｃのノックダウンの評価は、ＧＡＰＤＨ発現量を標準としたＬａｍｉｎＡ／Ｃの相対的発現定量として行い、ｓｉＲＮＡを投与していないｍｏｃｋ細胞の発現量比（ＬａｍｉｎＡ／Ｃ／ＧＡＰＤＨ）を基準として表示した。
（２）結果
図６に示すように、ＨｕＨ−７細胞（上パネル）、２９３Ｔ細胞（下パネル）のいずれにおいても、各ｓｉＲＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘによるＬａｍｉｎＡ／Ｃ  ｍＲＮＡの発現抑制が見られた。陰性対照として、ＧＬ３  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｉＲＮＡの評価もＲＮＡｉ  Ｆｅｃｔ及びＰＥＧ−ＤＰＴを用いて行ったが、いずれも全くＬａｍｉｎＡ／Ｃ  ｍＲＮＡの発現抑制は見られず、上記発現抑制は、Ｌａｍｉｎ  Ａ／Ｃ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｉＲＮＡによる配列特異的なＲＮＡｉによるものであることが確認された。
実施例２と同様にｃｏｍｐｌｅｘの血清中でのインキュベーションの影響を調べたところ、ＰＥＧ−ＤＰＴではインキュベーション後もほぼ同等の発現抑制が得られたのに対し、ＲＮＡｉ  Ｆｅｃｔではその抑制効率は大きく低下し、その生理的環境下での安定性が確認された。
【実施例５】    内在性遺伝子（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｇｅｎｅ）のノックダウン（Ａｕｔｏｔａｘｉｎ）
本実施例では、さらに他の内在性遺伝子に対しても遺伝子ノックダウンが可能であることを確認する目的で、細胞走化因子であるＡｕｔｏｔａｘｉｎ（ＡＴＸ）をターゲットとした遺伝子ノックダウンを行った。実施例４と同様に、ＡＴＸ  ｍＲＮＡのノックダウンを定量ＰＣＲ法にて評価した。
（１）材料と方法
実施例４と同様に、ＨｕＨ−７細胞を６ｗｅｌｌ  ｄｉｓｈに蒔き、１０％血清入りＤＭＥＭ中で２４時間インキュベーションをした後、実験を行った。Ｍｅｄｉｕｍを交換し、各ｗｅｌｌに１０％血清入りＤＭＥＭを１ｍｌ加え、先に調製したｓｉＲＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘ（ＰＥＧ−ＤＰＴ／ｓｉＲＮＡ，ＰＥＧ−ＳＰＭ／ｓｉＲＮＡ）を、ｓｉＲＮＡ量として４μｇ／ｗｅｌｌずつ添加した。４８時間のインキュベーション後、ＲＮＡｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、各ｗｅｌｌよりＲＮＡを抽出、精製した。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Ｐｒｉｓｍ７０００，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＡＴＸおよび内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量を定量した。ＡＴＸのノックダウンの評価は、ＧＡＰＤＨ発現量を標準としたＡＴＸの相対的発現定量として行い、ｓｉＲＮＡを投与していないｍｏｃｋ細胞の発現量比（ＡＴＸ／ＧＡＰＤＨ）を基準として表示した。
（２）結果
図７に示すように、いずれのｃｏｍｐｌｅｘにおいても、９０％を超えるＡＴＸ  ｍＲＮＡの発現抑制が見られた。ＰＥＧ−ＳＰＭ／ｓｉＲＮＡはＰＥＧ−ＤＰＴ／ｓｉＲＮＡと同程度のＡＴＸ  ｍＲＮＡの発現抑制を示した。陰性対照として、ＧＬ３  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｉＲＮＡを用いたｃｏｍｐｌｅｘでは、全くＡＴＸ  ｍＲＮＡの発現抑制は見られず、ＡＴＸ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｉＲＮＡによる配列特異的な遺伝子ノックダウンであることが確認された。実施例５におけるＬａｍｉｎ  Ａ／Ｃノックダウンとくらべ、さらに効率の高い遺伝子ノックダウンが得られたことは、遺伝子の細胞内での恒常的な発現パターンの違い、ｓｉＲＮＡ配列の有効性の違いが影響しているものと考えられる。以上から、ブロック共重合体によるｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙが、内在性遺伝子のノックダウンに対して、普遍的に機能しうることが確認された。
＜まとめ＞
非荷電性セグメントと荷電性セグメントからなるブロック共重合体と２本鎖オリゴ核酸を混和することで、ポリイオンコンプレックスが形成されることが確認された。２本鎖オリゴ核酸のひとつであるｓｉＲＮＡと、非荷電性セグメントと荷電性セグメントからなるブロック共重合体とをコンプレックス化することにより、内在性遺伝子のノックダウンを含めて、効率のよい遺伝子ノックダウンが可能であった。そのノックダウン効果は、塩基配列特異的であり、有効にｓｉＲＮＡが細胞内にデリバリーされたことによるＲＮＡｉであることが確認された。ノックダウンの効率は、脂質をベースとした市販ｓｉＲＮＡ導入試薬と異なり、血清中でのインキュベーション後でも、非常に良好に保持された。以上より、本発明は、ｓｉＲＮＡをはじめとする２本鎖オリゴ核酸を、生理的環境下においてもその機能を損なわずに安定に担持することが出来る、非常に実用性に優れたシステムであることが明らかとなった。従って、本発明のＰＩＣは、２本鎖オリゴ核酸を用いた疾患治療に必要となる、臨床応用可能なデリバリーシステムとして、非常に有用である。
産業上の利用の可能性
本発明により、ｓｉＲＮＡ等の２本鎖オリゴ核酸の、組織又は細胞への優れた送達システム（ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）が提供される。本発明の２本鎖オリゴ核酸担持ポリイオンコンプレックスは、生理環境下における安定性が高く、臨床応用可能な薬物送達システムとして機能する。また、本発明のポリイオンコンプレックスを医薬組成物として使用すると、組織又は細胞内の標的遺伝子を特異的にノックダウンすることが可能である。
【配列表フリーテキスト】配列番号１：ｓｉＲＮＡ配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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