(57)【要約】  液体試料中の微生物の測定キットにおいて、遊離ＡＴＰの除去、捕捉した微生物からのＡＴＰの抽出及び抽出ＡＴＰの測定を容易かつ迅速に行うことができ、微生物の損失が少なく熟練を必要とせず、試料中の微生物を高感度に安定して測定しうること。  予め第１のシリンジ２に凝集剤３を吸引しておき、液体試料ＬＳを吸引して攪拌し、直ちに１次フィルターケース５及び２次フィルターケース６を先端に取付け、この混合液１５をろ過し、２次フィルターケース６のみを取外して、第２のシリンジ７で洗浄液８を吸引しておき２次フィルターケース６を洗浄する。次に、溶菌剤９で２次フィルターケース６内を満たして、約３０秒間反応させ、測定用チューブ１０に反応液１６を押出し、予め調製しておいた発光試薬（１１ａ＋１１ｂ）を加え、アダプタ１２を取付けて軽く攪拌し、直ちにルミノメータで発光量を測定する。
2006059359.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料を採取する第１のシリンジと、
前記第１のシリンジ中で前記液体試料中の蛋白質を凝集させる凝集剤と、
前記凝集した蛋白質と体細胞を捕捉し遊離ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）及び微生物を透過させる１次フィルターを収納して前記第１のシリンジに取付け可能とした１次フィルターケースと、
前記微生物を捕捉し前記遊離ＡＴＰを透過させる２次フィルターを収納して前記１次フィルターケースに取付け可能とした２次フィルターケースと、
前記２次フィルターケースを先端に取付け可能な第２のシリンジと、
前記２次フィルターを洗浄するための洗浄液と、
前記２次フィルターに捕捉された前記微生物を溶かしてＡＴＰを溶出させる溶菌剤と、
前記溶出したＡＴＰを溶菌剤とともに集める測定用チューブと、
前記溶出したＡＴＰを発光させる発光試薬と
を具備することを特徴とする液体試料中の微生物の測定キット。
【請求項２】
更に、発光量を測定するためのルミノメータと、
前記測定用チューブの先端を前記ルミノメータの発光測定部に届かせるために前記測定用チューブに取付けられるアダプタと
を具備することを特徴とする請求項１に記載の液体試料中の微生物の測定キット。
【請求項３】
更に、ろ過を短時間で行わせるためのろ過促進剤を具備するか、または前記凝集剤として予め前記ろ過促進剤を混入したものを使用することを特徴とする請求項１または請求項２に記載の液体試料中の微生物の測定キット。
【請求項４】
前記１次フィルター及び前記２次フィルターはそれぞれ前記１次フィルターケース及び前記２次フィルターケースに一体に組み込まれて使い捨てにされることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれか１つに記載の液体試料中の微生物の測定キット。
【請求項５】
液体試料を該液体試料中の蛋白質を凝集させる凝集剤と混合する工程と、
前記凝集した蛋白質と体細胞を捕捉し遊離ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）及び微生物を透過させる１次フィルターで加圧ろ過または減圧ろ過する工程と、
ろ液を前記１次フィルターより小さい孔径を有し前記微生物を捕捉し前記遊離ＡＴＰを透過させる２次フィルターで加圧ろ過または減圧ろ過して液体試料中の微生物を２次フィルターのろ過膜上に捕捉濃縮する工程と、
この微生物に溶菌剤を加え、抽出液に発光試薬を添加し、生じる発光量を測定する工程と
を具備することを特徴とする液体試料中の微生物の測定方法。
【請求項６】
前記液体試料を該液体試料中の蛋白質を凝集させる凝集剤と混合する工程の後に、または同工程と同時にろ過を短時間で行わせるためのろ過促進剤を加える工程を追加したことを特徴とする請求項５に記載の液体試料中の微生物の測定方法。
【請求項７】
液体試料を該液体試料中の蛋白質を凝集させる凝集剤と混合し、
前記凝集した蛋白質と体細胞を捕捉し遊離ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）及び微生物を透過させる１次フィルターで加圧ろ過または減圧ろ過し、
ろ液を前記１次フィルターより小さい孔径を有し前記微生物を捕捉し前記遊離ＡＴＰを透過させる２次フィルターで加圧ろ過または減圧ろ過して液体試料中の微生物を２次フィルターのろ過膜上に捕捉濃縮し、
この微生物に溶菌剤を加え、抽出液に発光試薬を添加し、生じる発光量を測定することを特徴とする液体試料中の微生物の測定装置。
【請求項８】
前記液体試料を該液体試料中の蛋白質を凝集させる凝集剤と混合した後に、または同時に、ろ過を短時間で行わせるためのろ過促進剤を加えることを特徴とする請求項７に記載の液体試料中の微生物の測定装置。
【請求項９】
前記凝集剤としてエチルアルコール等の脂肪族アルコール、安息香酸・サリチル酸等のカルボン酸、またはキトサン、キトサンオリゴ糖を用いることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか１つに記載の液体試料中の微生物の測定キット或いは請求項５または請求項６に記載の液体試料中の微生物の測定方法或いは請求項７または請求項８に記載の液体試料中の微生物の測定装置。
【請求項１０】
前記１次フィルターとして孔径約１μｍ〜約１０μｍのろ過材を用いることを特徴とする請求項１乃至請求項９のいずれか１つに記載の液体試料中の微生物の測定キット或いは測定方法或いは測定装置。
【請求項１１】
前記２次フィルターが孔径約０．１μｍ〜約０．５μｍの微細孔を有する多孔性高分子膜であることを特徴とする請求項１乃至請求項１０のいずれか１つに記載の液体試料中の微生物の測定キット或いは測定方法或いは測定装置。
【請求項１２】
前記多孔性高分子膜がポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンジフルオライド、ポリカーボネート、セルロースアセテート、親水性ポリプロピレン、ナイロン、親水性ポリエーテルスルホン、または親水性ホウケイ酸グラスファイバーのうちいずれかの高分子からなることを特徴とする請求項１１に記載の液体試料中の微生物の測定キット或いは測定方法或いは測定装置。
【請求項１３】
前記溶菌剤がジメチルスルホキシドを含む滅菌蒸留水であることを特徴とする請求項１乃至請求項１２のいずれか１つに記載の液体試料中の微生物の測定キット或いは測定方法或いは測定装置。
【請求項１４】
前記溶菌剤がジメチルスルホキシドを約１５容量％〜約２０容量％含む滅菌蒸留水であることを特徴とする請求項１３に記載の液体試料中の微生物の測定キット或いは測定方法或いは測定装置。
【請求項１５】
前記ろ過促進剤としてエチレンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩、トランス−１，２−シクロヘキサジアミン四酢酸のアルカリ金属塩、グリコールエーテルジアミン四酢酸のアルカリ金属塩、ジエチレントリアミン五酢酸のアルカリ金属塩、またはニトリロ三酢酸のアルカリ金属塩を用いることを特徴とする請求項３乃至請求項１４のいずれか１つに記載の液体試料中の微生物の測定キット或いは測定方法或いは測定装置。
【請求項１６】
固体試料または粘性の高い試料は前記凝集剤と混合する前に滅菌蒸留水を添加した後、ホモジナイズして前記液体試料とすることを特徴とする請求項５乃至請求項１５のいずれか１つに記載の液体試料中の微生物の測定方法或いは測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、通常のＡＴＰ法では微生物の測定が困難とされている固形食品、牛乳、乳製品等、遊離ＡＴＰ（体細胞ＡＴＰ）を多く含む食品・水・化粧品等の液体試料中の微生物を迅速かつ容易に高感度で測定することができる測定キット及び測定方法及び測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
食品等の微生物の測定には、標準寒天平板法が一般的に用いられているが、この方法では判定までに２４〜４８時間という長時間を要するので、微生物汚染が発生した場合に、迅速な対応を採ることができない。また、より簡便で迅速な微生物の検出方法として、微生物中のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の量をルミノメータを用いて発光量を測定し、これから微生物数を算出するバイオルミネッセンス法（ＡＴＰ法）が知られている。しかし、この方法では、微生物数が少ない検体液の場合、例えば、１０3 〜１０4 個／ｍｌ以下ではルミノメータの測定限界以下となり、検出できない。【０００３】
一方、ほとんどの食品の場合、微生物に由来しない遊離ＡＴＰを含んでおり、この遊離ＡＴＰ濃度は、微生物由来のＡＴＰ濃度に比べて桁違いに高い場合が多く、これらの妨害を予め除去しないと、微生物中のＡＴＰを正しく測定することはできないという問題点があった。これらの問題を解決するために、検体液のろ過やＡＴＰ分解酵素であるアピラーゼ等を用いて微生物に由来しない遊離ＡＴＰを予め分解してから、ＡＴＰ法を適用する方法が提案されている。【０００４】
しかしながら、遊離ＡＴＰを短時間で分解するためには、測定試料中のＡＴＰ分解酵素の濃度を十分に高くする必要があり、この分解酵素の濃度が高すぎると、次の工程で抽出した微生物由来のＡＴＰの発光を抑制し、測定濃度が著しく減少してしまうという問題が生じる。【０００５】
また、検体液をろ過して、その中に含まれている微生物をろ過材上に捕捉し、ろ過材とろ過材上の微生物に付着しているＡＴＰ分解試薬を洗い流し、微生物中のＡＴＰを抽出する方法も提案されている。しかし、この方法は、ろ過の容易な食品試料（アルコール飲料や調味料つゆ等）に限定され、市販の牛乳や乳製品のように、蛋白質や脂質、無脂肪固形分を多量に含む濁度の高い試料には、ろ過が困難で適用できない。【０００６】
このようなろ過の困難な乳製品試料を希釈処理し、その希釈液中の微生物ＡＴＰを測定する方法も提案されている。この方法では試料０．１ｍｌを採取し、これに処理液０．１ｍｌ、希釈液０．７ｍｌ、ＡＴＰ消去剤０．１ｍｌを加えて混合し、その混合物１．０ｍｌから０．１ｍｌを測定チューブに分取して３０分放置し、次に発光試薬０．１ｍｌを添加し、ルミノメータで発光量を測定する。これは、０．０１ｍｌという極めて微量の試料中の微生物ＡＴＰを測定しているので、発光量も極めて少ない。したがって、試薬ブランク値が常に発光量（ＲＬＵ）５０以下の低い値でないと、正しい測定結果が得られない。そのため、使用する処理液、希釈液、抽出剤、高感度発光試薬の汚染の有無調査等が要求される等、問題点が多い。【０００７】
そこで、本出願人は、特許文献１において、食品試料をリン酸系凝集剤及びエチレンジアミン四酢酸塩等のろ過促進剤と混合して重力による自然ろ過を行った後、ろ液をメンブランフィルターで減圧ろ過して試料中の微生物をろ過膜上に捕捉濃縮し、ろ過膜上の微生物に由来しない遊離ＡＴＰを洗浄液で洗浄除去した後、微生物にＡＴＰ抽出試薬（溶菌剤）を加え、抽出液に発光試薬を添加し、生じる発光量を測定することによって、食品中の微生物を測定する方法について開示している。この方法によれば、従来の方法に比べて著しく容易、迅速かつ高感度に微生物を測定することができる。
【特許文献１】特開２００３−２８４５８９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上記特許文献１に開示された方法においては、リン酸系凝集剤を用いているため、熟練者でないと凝集反応時に蛋白質も微生物も無差別に凝集させ、試料中の微生物を損失してしまうことがあり、また、ＡＴＰ抽出時には微生物をリン酸系凝集剤がコーティングしているため溶菌剤が効き難く、多量の洗浄液による洗浄が不可欠となり、これが検査結果の不安定化要因となる恐れがあった。【０００９】
そこで、本発明は、遊離ＡＴＰの除去、捕捉した微生物からのＡＴＰの抽出及び抽出ＡＴＰの測定を容易かつ迅速に行うことができ、洗浄液による洗浄を全く必要としないか、または多量の洗浄液による洗浄を必要とせず、試料中の微生物の損失が少なく、しかも熟練を必要とせず、食品の製造現場や、化粧品等の開発現場で検査可能な、試料中の微生物を高感度に安定して測定しうる液体試料中の微生物の測定キット及び測定方法及び測定装置を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
請求項１の発明にかかる液体試料中の微生物の測定キットは、液体試料を採取する第１のシリンジと、前記第１のシリンジ中で前記液体試料中の蛋白質を凝集させる凝集剤と、前記凝集した蛋白質と体細胞を捕捉し遊離ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）及び微生物を透過させる１次フィルターを収納して前記第１のシリンジに取付け可能とした１次フィルターケースと、前記微生物を捕捉し前記遊離ＡＴＰを透過させる２次フィルターを収納して前記１次フィルターケースに取付け可能とした２次フィルターケースと、前記２次フィルターケースを先端に取付け可能な第２のシリンジと、前記２次フィルターを洗浄するための洗浄液と、前記２次フィルターに捕捉された前記微生物を溶かしてＡＴＰを溶出させる溶菌剤と、前記溶出したＡＴＰを溶菌剤とともに集める測定用チューブと、前記溶出したＡＴＰを発光させる発光試薬とを具備するものである。【００１１】
請求項２の発明にかかる液体試料中の微生物の測定キットは、請求項１の構成において、更に、発光量を測定するためのルミノメータと、前記測定用チューブの先端を前記ルミノメータの発光測定部に届かせるために前記測定用チューブに取付けられるアダプタとを具備するものである。【００１２】
請求項３の発明にかかる液体試料中の微生物の測定キットは、請求項１または請求項２の構成において、更に、ろ過を短時間で行わせるためのろ過促進剤を具備するか、または前記凝集剤として予め前記ろ過促進剤を混入したものを使用するものである。【００１３】
請求項４の発明にかかる液体試料中の微生物の測定キットは、請求項１乃至請求項３のいずれか１つの構成において、前記１次フィルター及び前記２次フィルターはそれぞれ前記１次フィルターケース及び前記２次フィルターケースに一体に組み込まれて使い捨てにされるものである。【００１４】
請求項５の発明にかかる液体試料中の微生物の測定方法は、液体試料を該液体試料中の蛋白質を凝集させる凝集剤と混合する工程と、前記凝集した蛋白質と体細胞を捕捉し遊離ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）及び微生物を透過させる１次フィルターで加圧ろ過または減圧ろ過する工程と、ろ液を前記１次フィルターより小さい孔径を有し前記微生物を捕捉し前記遊離ＡＴＰを透過させる２次フィルターで加圧ろ過または減圧ろ過して液体試料中の微生物を２次フィルターのろ過膜上に捕捉濃縮する工程と、この微生物に溶菌剤を加え、抽出液に発光試薬を添加し、生じる発光量を測定する工程とを具備するものである。【００１５】
請求項６の発明にかかる液体試料中の微生物の測定方法は、請求項５の構成において、前記液体試料を該液体試料中の蛋白質を凝集させる凝集剤と混合する工程の後に、または同工程と同時にろ過を短時間で行わせるためのろ過促進剤を加える工程を追加したものである。【００１６】
請求項７の発明にかかる液体試料中の微生物の測定装置は、液体試料を該液体試料中の蛋白質を凝集させる凝集剤と混合し、前記凝集した蛋白質と体細胞を捕捉し遊離ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）及び微生物を透過させる１次フィルターで加圧ろ過または減圧ろ過し、ろ液を前記１次フィルターより小さい孔径を有し前記微生物を捕捉し前記遊離ＡＴＰを透過させる２次フィルターで加圧ろ過または減圧ろ過して液体試料中の微生物を２次フィルターのろ過膜上に捕捉濃縮し、この微生物に溶菌剤を加え、抽出液に発光試薬を添加し、生じる発光量を測定するものである。【００１７】
請求項８の発明にかかる液体試料中の微生物の測定装置は、請求項７の構成において、前記液体試料を該液体試料中の蛋白質を凝集させる凝集剤と混合した後に、または同時に、ろ過を短時間で行わせるためのろ過促進剤を加えるものである。【００１８】
請求項９の発明にかかる液体試料中の微生物の測定キット或いは液体試料中の微生物の測定方法或いは液体試料中の微生物の測定装置は、請求項１乃至請求項４のいずれか１つ或いは請求項５または請求項６或いは請求項７または請求項８の構成において、前記凝集剤としてエチルアルコール等の脂肪族アルコール、安息香酸・サリチル酸等のカルボン酸、またはキトサン、キトサンオリゴ糖を用いるものである。【００１９】
請求項１０の発明にかかる液体試料中の微生物の測定キット或いは測定方法或いは測定装置は、請求項１乃至請求項９のいずれか１つの構成において、前記１次フィルターとして孔径約１μｍ〜約１０μｍのろ過材を用いるものである。【００２０】
請求項１１の発明にかかる液体試料中の微生物の測定キット或いは測定方法或いは測定装置は、請求項１乃至請求項１０のいずれか１つの構成において、前記２次フィルターが孔径約０．１μｍ〜約０．５μｍの微細孔を有する多孔性高分子膜であるものである。【００２１】
請求項１２の発明にかかる液体試料中の微生物の測定キット或いは測定方法或いは測定装置は、請求項１１の構成において、前記多孔性高分子膜がポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンジフルオライド、ポリカーボネート、セルロースアセテート、親水性ポリプロピレン、ナイロン、親水性ポリエーテルスルホン、または親水性ホウケイ酸グラスファイバーのうちいずれかの高分子からなるものである。【００２２】
請求項１３の発明にかかる液体試料中の微生物の測定キット或いは測定方法或いは測定装置は、請求項１乃至請求項１２のいずれか１つの構成において、前記溶菌剤がジメチルスルホキシドを含む滅菌蒸留水であるものである。【００２３】
請求項１４の発明にかかる液体試料中の微生物の測定キット或いは測定方法或いは測定装置は、請求項１３の構成において、前記溶菌剤がジメチルスルホキシドを約１５容量％〜約２０容量％含む滅菌蒸留水であるものである。【００２４】
請求項１５の発明にかかる液体試料中の微生物の測定キット或いは測定方法或いは測定装置は、請求項３乃至請求項１４のいずれか１つの構成において、前記ろ過促進剤としてエチレンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩、トランス−１，２−シクロヘキサジアミン四酢酸のアルカリ金属塩、グリコールエーテルジアミン四酢酸のアルカリ金属塩、ジエチレントリアミン五酢酸のアルカリ金属塩、またはニトリロ三酢酸のアルカリ金属塩を用いるものである。【００２５】
請求項１６の発明にかかる液体試料中の微生物の測定方法或いは測定装置は、請求項５乃至請求項１５のいずれか１つの構成において、固体試料または粘性の高い試料は前記凝集剤と混合する前に滅菌蒸留水を添加した後、ホモジナイズして前記液体試料とするものである。
【発明の効果】
【００２６】
請求項１の発明にかかる液体試料中の微生物の測定キットは、液体試料を採取する第１のシリンジと、第１のシリンジ中で液体試料中の蛋白質を凝集させる凝集剤と、凝集した蛋白質と体細胞を捕捉し遊離ＡＴＰ及び微生物を透過させる１次フィルターを収納して第１のシリンジの先端に取付け可能とした１次フィルターケースと、微生物を捕捉し遊離ＡＴＰを透過させる２次フィルターを収納して１次フィルターケースの先端に取付け可能とした２次フィルターケースと、２次フィルターケースを先端に取付け可能な第２のシリンジと、２次フィルターを洗浄するための洗浄液と、２次フィルターに捕捉された微生物を溶かしてＡＴＰを溶出させる溶菌剤と、溶出したＡＴＰを溶菌剤とともに集める測定用チューブと、溶出したＡＴＰを発光させる発光試薬とを具備するものである。【００２７】
これによって、第１のシリンジの先端に１次フィルターケースを取付け、さらにその先端に２次フィルターケースを取付けた状態で、第１のシリンジ中で液体試料中の蛋白質を凝集剤で凝集させた後に第１のシリンジから液体試料を押し出すことによって、凝集した蛋白質と体細胞（内部にＡＴＰを含む）は１次フィルターに捕捉され、遊離ＡＴＰは１次フィルター・２次フィルターともに透過して２次フィルターケースの先端から排出され、微生物のみが２次フィルターに捕捉される。そこで、２次フィルターケースのみを外して新しい第１のシリンジまたは第２のシリンジの先端に取付け、洗浄液を押出して２次フィルターを充分洗浄した後、溶菌剤を第２のシリンジ内に吸引し、２次フィルターケースを先端に取付けて溶菌剤を注入して反応させ、２次フィルターに捕捉された微生物を溶かして内部のＡＴＰを溶出させる。【００２８】
こうして微生物由来のＡＴＰのみを抽出した試料液を、測定用チューブに集めて発光試薬を加え、発光量を測定する。これによって、液体試料中の微生物量を極めて短時間でかつ正確に測定することができる。しかも微生物の損失が少ないため、著しく信頼度の高い検査結果が得られる。そして、これらの必要な器具及び試薬がキットになっているので、専用ケースに入れて持ち運ぶことによって、牧場や工場・食品加工現場・化粧品開発現場等でも短時間で容易に微生物量の測定を行うことができる。【００２９】
このようにして、遊離ＡＴＰの除去、捕捉した微生物からのＡＴＰの抽出及び抽出ＡＴＰの測定を容易かつ迅速に行うことができ、洗浄液による洗浄を全く必要としないか、または多量の洗浄液による洗浄を必要とせず、試料中の微生物の損失が少なく、しかも熟練を必要とせず、食品の製造現場や、化粧品等の開発現場で検査可能な、試料中の微生物を高感度に安定して測定しうる液体試料中の微生物の測定キットとなる。【００３０】
請求項２の発明にかかる液体試料中の微生物の測定キットは、請求項１の構成において、更に、発光量を測定するためのルミノメータと、前記測定用チューブの先端を前記ルミノメータの発光測定部に届かせるために前記測定用チューブに取付けられるアダプタとを具備するものである。【００３１】
ルミノメータは、熟練を要せず誰でも何処でも容易かつ正確に発光量を測定できる測定機器であり、測定用チューブの先端をルミノメータの発光測定部に届かせるためには測定用チューブに取付けられるアダプタが必要となる。請求項１の構成に更にこれらを加えることによって、液体試料中の微生物量を極めて短時間でかつ正確に測定することができる。しかも微生物の損失が少ないため、著しく信頼度の高い検査結果が得られる。そして、これらの必要な器具及び試薬及び機器がキットになっているので、専用ケースに入れて持ち運ぶことによって、牧場や工場・食品加工現場・化粧品開発現場等でも短時間で容易に微生物量の測定を行うことができる。【００３２】
このようにして、遊離ＡＴＰの除去、捕捉した微生物からのＡＴＰの抽出及び抽出ＡＴＰの測定を容易かつ迅速に行うことができ、しかも熟練を必要とせず、食品の製造現場や、化粧品等の開発現場で検査可能な、試料中の微生物を高感度に安定して測定しうる液体試料中の微生物の測定キットとなる。【００３３】
請求項３の発明にかかる液体試料中の微生物の測定キットは、請求項１または請求項２の構成において、更に、ろ過を短時間で行わせるためのろ過促進剤を具備するか、または凝集剤として予めろ過促進剤を混入したものを使用するものである。ここで、ろ過促進剤としてはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のナトリウム塩等を用いることができる。第１のシリンジ中で液体試料中の蛋白質を凝集剤で凝集させた後に、または凝集剤と同時にろ過促進剤を加えることによって、１次フィルターケース及び２次フィルターケースによるろ過処理を初心者でもスムーズに短時間で行うことができ、液体試料中の微生物量を極めて短時間でかつ正確に測定することができる。しかも微生物の損失が少ないため、著しく信頼度の高い検査結果が得られる。そして、これらの必要な器具及び試薬及び機器がキットになっているので、専用ケースに入れて持ち運ぶことによって、牧場や工場・食品加工現場・化粧品開発現場等でも短時間で容易に微生物量の測定を行うことができる。【００３４】
このようにして、遊離ＡＴＰの除去、捕捉した微生物からのＡＴＰの抽出及び抽出ＡＴＰの測定を容易かつ迅速に行うことができ、しかも熟練を必要とせず、食品の製造現場や、化粧品等の開発現場で検査可能な、試料中の微生物を高感度に安定して測定しうる液体試料中の微生物の測定キットとなる。【００３５】
請求項４の発明にかかる液体試料中の微生物の測定キットは、１次フィルター及び２次フィルターはそれぞれ１次フィルターケース及び２次フィルターケースに一体に組み込まれて使い捨てにされるものである。これによって、フィルターをフィルターケースにセットしたり、フィルターケースから取出したりする手間が省けて、測定をより迅速に行うことができる。さらに、一度使用するだけの使い捨てとすることによって、測定精度も向上して信頼性の高い測定を行うことができる。【００３６】
このようにして、遊離ＡＴＰの除去、捕捉した微生物からのＡＴＰの抽出及び抽出ＡＴＰの測定を容易かつ迅速に行うことができ、洗浄液による洗浄を全く必要としないか、または多量の洗浄液による洗浄を必要とせず、試料中の微生物の損失が少なく、しかも熟練を必要とせず、食品の製造現場や、化粧品等の開発現場で検査可能な、試料中の微生物を高感度に安定して測定しうる液体試料中の微生物の測定キットとなる。【００３７】
請求項５の発明にかかる液体試料中の微生物の測定方法は、液体試料を液体試料中の蛋白質を凝集させる凝集剤と混合する工程と、凝集した蛋白質と体細胞を捕捉し遊離ＡＴＰ及び微生物を透過させる１次フィルターで加圧ろ過または減圧ろ過する工程と、ろ液を１次フィルターより小さい孔径を有し微生物を捕捉し遊離ＡＴＰを透過させる２次フィルターで加圧ろ過または減圧ろ過して液体試料中の微生物を２次フィルターのろ過膜上に捕捉濃縮する工程と、この微生物に溶菌剤を加え、抽出液に発光試薬を添加し、生じる発光量を測定する工程とを具備するものである。【００３８】
これによって、液体試料中の蛋白質を凝集剤で凝集させた後に１次フィルターで加圧ろ過または減圧ろ過し、ろ液を２次フィルターで加圧ろ過または減圧ろ過することによって、凝集した蛋白質と体細胞（内部にＡＴＰを含む）は１次フィルターに捕捉され、遊離ＡＴＰは１次フィルター・２次フィルターともに透過して排出され、微生物のみが２次フィルターに捕捉される。そこで溶菌剤を加えて２次フィルターに捕捉された微生物を溶かして内部のＡＴＰを溶出させ、発光試薬を添加し、生じる発光量を測定することによって、液体試料中の微生物量を極めて短時間でかつ正確に測定することができる。しかも微生物の損失が少ないため、著しく信頼度の高い検査結果が得られる。【００３９】
なお、２次フィルターに微生物に由来しない遊離ＡＴＰや他の発光物質が測定に影響する程度に付着していると考えられる場合等、必要に応じて加圧ろ過または減圧ろ過後に２次フィルターを少量の洗浄液で洗浄する工程を加えても良い。【００４０】
このようにして、遊離ＡＴＰの除去、捕捉した微生物からのＡＴＰの抽出及び抽出ＡＴＰの測定を容易かつ迅速に行うことができ、洗浄液による洗浄を全く必要としないか、または多量の洗浄液による洗浄を必要とせず、試料中の微生物の損失が少なく、しかも熟練を必要とせず、食品の製造現場や、化粧品等の開発現場で検査可能な、試料中の微生物を高感度に安定して測定しうる液体試料中の微生物の測定方法となる。【００４１】
請求項６の発明にかかる液体試料中の微生物の測定方法は、前記液体試料を該液体試料中の蛋白質を凝集させる凝集剤と混合する工程の後に、または同時にろ過を短時間で行わせるためのろ過促進剤を加える工程を追加したものである。即ち、凝集剤として予めろ過促進剤を添加したものを使用しても良い。このように、液体試料中の蛋白質を凝集剤で凝集させた後にまたは同時にろ過促進剤を加えることによって、１次フィルターでの加圧ろ過または減圧ろ過も、２次フィルターでの加圧ろ過または減圧ろ過も短持間でスムーズに進行するので、より短時間で試料中の微生物を高感度に安定して測定しうる液体試料中の微生物の測定方法となる。【００４２】
請求項７の発明にかかる液体試料中の微生物の測定装置は、液体試料を液体試料中の蛋白質を凝集させる凝集剤と混合し、凝集した蛋白質と体細胞を捕捉し遊離ＡＴＰ及び微生物を透過させる１次フィルターで加圧ろ過または減圧ろ過し、ろ液を１次フィルターより小さい孔径を有し微生物を捕捉し遊離ＡＴＰを透過させる２次フィルターで加圧ろ過または減圧ろ過して液体試料中の微生物を２次フィルターのろ過膜上に捕捉濃縮し、この微生物に溶菌剤を加え、抽出液に発光試薬を添加し、生じる発光量を測定するものである。【００４３】
これによって、液体試料中の蛋白質を凝集剤で凝集させた後に１次フィルターで加圧ろ過または減圧ろ過し、ろ液を２次フィルターで加圧ろ過または減圧ろ過することによって、凝集した蛋白質と体細胞（内部にＡＴＰを含む）は１次フィルターに捕捉され、遊離ＡＴＰは１次フィルター・２次フィルターともに透過して排出され、微生物のみが２次フィルターに捕捉される。そこで溶菌剤を加えて２次フィルターに捕捉された微生物を溶かして内部のＡＴＰを溶出させ、発光試薬を添加し、生じる発光量を測定することによって、液体試料中の微生物量を極めて短時間でかつ正確に測定することができる。しかも微生物の損失が少ないため、著しく信頼度の高い検査結果が得られる。【００４４】
なお、２次フィルターに微生物に由来しない遊離ＡＴＰや他の発光物質が測定に影響する程度に付着していると考えられる場合等、必要に応じて加圧ろ過または減圧ろ過後に２次フィルターを少量の洗浄液で洗浄しても良い。【００４５】
このようにして、遊離ＡＴＰの除去、捕捉した微生物からのＡＴＰの抽出及び抽出ＡＴＰの測定を容易かつ迅速に行うことができ、洗浄液による洗浄を全く必要としないか、または多量の洗浄液による洗浄を必要とせず、試料中の微生物の損失が少なく、しかも熟練を必要とせず、食品の製造現場や、化粧品等の開発現場で検査可能な、試料中の微生物を高感度に安定して測定しうる液体試料中の微生物の測定装置となる。【００４６】
請求項８の発明にかかる液体試料中の微生物の測定装置は、前記液体試料を該液体試料中の蛋白質を凝集させる凝集剤と混合した後に、または同時に、ろ過を短時間で行わせるためのろ過促進剤を加えるものである。即ち、凝集剤として予めろ過促進剤を添加したものを使用しても良い。このように、液体試料中の蛋白質を凝集剤で凝集させた後にまたは同時にろ過促進剤を加えることによって、１次フィルターでの加圧ろ過または減圧ろ過も、２次フィルターでの加圧ろ過または減圧ろ過も短持間でスムーズに進行するので、より短時間で試料中の微生物を高感度に安定して測定しうる液体試料中の微生物の測定装置となる。【００４７】
請求項９の発明にかかる液体試料中の微生物の測定キットまたは測定方法或いは測定装置は、凝集剤としてエチルアルコール等の脂肪族アルコール、安息香酸・サリチル酸等のカルボン酸、またはキトサン、キトサンオリゴ糖を用いるものである。これらの凝集剤は液体試料中の蛋白質のみを選択的に凝固させ、この際微生物をも取り込んでしまうことがないので、測定中における微生物の損失を少なく抑えることができ、液体試料中の微生物量を極めて短時間でかつ正確に測定することができる。【００４８】
このようにして、遊離ＡＴＰの除去、捕捉した微生物からのＡＴＰの抽出及び抽出ＡＴＰの測定を容易かつ迅速に行うことができ、洗浄液による洗浄を全く必要としないか、または多量の洗浄液による洗浄を必要とせず、試料中の微生物の損失が少なく、しかも熟練を必要とせず、食品の製造現場や、化粧品等の開発現場で検査可能な、試料中の微生物を高感度に安定して測定しうる液体試料中の微生物の測定キットまたは測定方法或いは測定装置となる。【００４９】
請求項１０の発明にかかる液体試料中の微生物の測定キットまたは測定方法或いは測定装置は、１次フィルターとして孔径約１μｍ〜約１０μｍのろ過材を用いるものである。これによって、凝固した蛋白質及び体細胞を確実に捕捉し、かつ微生物及び遊離ＡＴＰを確実に透過させることができて、高精度の微生物量の測定を行うことができる。【００５０】
請求項１１の発明にかかる液体試料中の微生物の測定キットまたは測定方法或いは測定装置は、２次フィルターが孔径約０．１μｍ〜約０．５μｍの微細孔を有する多孔性高分子膜であるものである。これによって、微生物のみを確実に捕捉することができ、かつ遊離ＡＴＰを確実に透過させることができて、高精度の微生物量の測定を行うことができる。【００５１】
請求項１２の発明にかかる液体試料中の微生物の測定キットまたは測定方法或いは測定装置は、多孔性高分子膜がポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンジフルオライド、ポリカーボネート、セルロースアセテート、親水性ポリプロピレン、ナイロン、親水性ポリエーテルスルホン、または親水性ホウケイ酸グラスファイバーのうちいずれかの高分子からなるものである。【００５２】
これらの高分子からなる多孔性高分子膜は、微生物のみを確実に捕捉することができ、かつ遊離ＡＴＰを確実に透過させることができて、高精度の微生物量の測定を行うことができる。【００５３】
請求項１３の発明にかかる液体試料中の微生物の測定キットまたは測定方法或いは測定装置は、溶菌剤がジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」ともいう。）を含む滅菌蒸留水であるものである。【００５４】
本発明者が鋭意実験研究した結果、溶菌剤として界面活性剤系の化合物を使用すると２次フィルターを通すときに泡立ってしまってうまく行かず、有機溶剤系の化合物、中でもＤＭＳＯの滅菌蒸留水溶液を用いた場合には、何らの支障なく溶菌剤として使用できることを見出し、この知見に基いて本発明を完成したものである。【００５５】
このようにして、捕捉した微生物からのＡＴＰの抽出及び抽出ＡＴＰの測定を容易かつ迅速に行うことができ、しかも熟練を必要とせず、食品の製造現場や、化粧品等の開発現場で検査可能な、試料中の微生物を高感度に安定して測定しうる液体試料中の微生物の測定キットまたは測定方法或いは測定装置となる。【００５６】
請求項１４の発明にかかる液体試料中の微生物の測定キットまたは測定方法或いは測定装置は、溶菌剤がジメチルスルホキシドを約１５容量％〜約２０容量％含む滅菌蒸留水であるものである。【００５７】
ＤＭＳＯは溶菌剤として優れているが、滅菌蒸留水中のＤＭＳＯの含有率が少な過ぎても溶菌作用（ＡＴＰ抽出作用）が急激に低下し、また含有率が多過ぎても発光量が低下して測定に支障をきたす。そこで、本発明者が鋭意実験研究した結果、溶菌剤としてＤＭＳＯを約１５容量％〜約２０容量％含む滅菌蒸留水を用いた場合に充分な溶菌作用が得られ、かつ発光量を低下させないことを見出し、この知見に基いて本発明を完成したものである。【００５８】
このようにして、捕捉した微生物からのＡＴＰの抽出及び抽出ＡＴＰの測定を容易かつ迅速に行うことができ、しかも熟練を必要とせず、食品の製造現場や、化粧品等の開発現場で検査可能な、試料中の微生物を高感度に安定して測定しうる液体試料中の微生物の測定キットまたは測定方法或いは測定装置となる。【００５９】
請求項１５の発明にかかる液体試料中の微生物の測定キットまたは測定方法或いは測定装置は、ろ過促進剤としてエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のアルカリ金属塩、トランス−１，２−シクロヘキサジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）のアルカリ金属塩、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）のアルカリ金属塩、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）のアルカリ金属塩、またはニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）のアルカリ金属塩を用いるものである。ここで、アルカリ金属としては、ナトリウムまたはカリウムが好ましい。【００６０】
これらのろ過促進剤は、一般にはキレート剤として用いられる化合物であるが、凝集剤と併用すると、牛乳等の液体試料中に含まれるミネラル、例えばカルシウムとキレート化合物（水溶性）を作り、ろ過を容易にする。上記のようなろ過促進剤の添加量は、使用するろ過促進剤や液体試料の種類によって変動し、一義的には決定できないが、一般に液体試料１ｍｌ当り１ｍｇ〜２０ｍｇで充分であり、ＥＤＴＡのナトリウム塩の場合、市販の牛乳１ｍｌ当り１ｍｇ〜２０ｍｇで充分である。【００６１】
請求項１６の発明にかかる液体試料中の微生物の測定方法或いは測定装置は、固体試料または粘性の高い試料は凝集剤と混合する前に滅菌蒸留水を添加した後、ホモジナイズして液体試料とするものである。【００６２】
本発明にかかる液体試料中の微生物の測定方法は、牛乳等のように最初から液体である試料のみでなく、食肉等の固体試料中の微生物量を測定するのにも応用することができる。その際には、滅菌蒸留水を添加した後、ホモジナイズして液体試料とする。【００６３】
このようにして、固体試料中の微生物量を測定するのにも応用することができる液体試料中の微生物の測定方法或いは測定装置となる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は本発明の実施の形態１にかかる液体試料中の微生物の測定キットを示す斜視図である。
【図２】図２（ａ），（ｂ）は本発明の実施の形態１及び実施の形態２にかかる液体試料中の微生物の測定方法の測定原理を示す模式図である。
【図３】図３（ａ），（ｂ），（ｃ），（ｄ），（ｅ），（ｆ）は本発明の実施の形態１及び実施の形態２にかかる液体試料中の微生物の測定方法の手順を示す説明図である。
【図４】図４は液体試料が市販の牛乳の場合における本発明の実施の形態１にかかる液体試料中の微生物の測定方法における実施例１の測定結果を比較例１と比較して示す図である。
【図５】図５は液体試料が市販の牛乳の場合における本発明の実施の形態１にかかる液体試料中の微生物の測定方法における実施例２の測定結果を示す図である。
【図６】図６は液体試料が搾りたての生乳の場合における本発明の実施の形態１にかかる液体試料中の微生物の測定方法における実施例２の測定結果を示す図である。
【符号の説明】
【００６５】
１  液体試料中の微生物の測定キット
２  第１のシリンジ
３  凝集剤
５  １次フィルターケース
５ａ  １次フィルター
６  ２次フィルターケース
６ａ  ２次フィルター
７  第２のシリンジ
８  洗浄液
９  溶菌剤
１０  測定用チューブ
１１  発光試薬
１２  アダプタ
１３  ルミノメータ
ＢＣ  体細胞
ＦＡ  遊離ＡＴＰ
ＧＰＲ  凝集した蛋白質
ＬＳ  液体試料
ＭＯ  微生物
ＰＲ  蛋白質
【発明を実施するための最良の形態】
【００６６】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しつつ説明する。【００６７】
実施の形態１
まず、本発明の実施の形態１にかかる液体試料中の微生物の測定キット・測定方法・測定装置について、図１乃至図６を参照しつつ説明する。図１は本発明の実施の形態１にかかる液体試料中の微生物の測定キットを示す斜視図である。図２（ａ），（ｂ）は本発明の実施の形態１にかかる液体試料中の微生物の測定方法或いは測定装置の測定原理を示す模式図である。図３（ａ），（ｂ），（ｃ），（ｄ），（ｅ），（ｆ）は本発明の実施の形態１にかかる液体試料中の微生物の測定方法の手順を示す説明図である。図４は液体試料が市販の牛乳の場合における本発明の実施の形態１にかかる液体試料中の微生物の測定方法における実施例１の測定結果を比較例１と比較して示す図である。図５は液体試料が市販の牛乳の場合における本発明の実施の形態１にかかる液体試料中の微生物の測定方法における実施例２の測定結果を示す図である。図６は液体試料が搾りたての生乳の場合における本発明の実施の形態１にかかる液体試料中の微生物の測定方法における実施例２の測定結果を示す図である。【００６８】
本発明においては、液体試料としては特に制限はなく、食品では牛乳や各種乳製品、蛋白質含有量の高い豆乳等が挙げられる他、化粧品や水そのものを試料とすることができる。また固形の試料或いは粘度の高い試料は、滅菌蒸留水を添加した後、ホモジナイズして液体試料とする。【００６９】
図１に示されるように、本実施の形態１にかかる液体試料中の微生物の測定キット１は、プラスティック製の第１のシリンジ２（３ｍｌ容）、ビン入りの凝集剤３、１次フィルターを収容したポリプロピレン製の１次フィルターケース５、２次フィルターを収容したポリプロピレン製の２次フィルターケース６、プラスティック製の第２のシリンジ７（１ｍｌ容）、ビン入りの洗浄液８、ビン入りの溶菌剤９、プラスティック製の測定用チューブ１０、容器入りの発光試薬溶解液１１ａ及びビン入りの発光試薬粉末１１ｂからなる発光試薬１１、測定時に測定用チューブ１０に取付けるアダプタ１２、そしてアダプタ１２を取付けた測定用チューブ１０を立設した円筒部に入れて発光量を測定するルミノメータ１３、を具備している。【００７０】
次に、かかる液体試料中の微生物の測定キット１を用いた本実施の形態１にかかる液体試料中の微生物の測定方法の測定原理について、図２を参照して説明する。図２（ａ）に示されるように、牛乳等の液体試料ＬＳ中には、微生物ＭＯ以外に遊離ＡＴＰ・ＦＡ、体細胞ＢＣ（内部にＡＴＰを含む）、蛋白質ＰＲ等が混在している。したがって、これらの物質を液体試料ＬＳ中から取り除かなければ、正確な微生物ＭＯの混入量を測定することができない。そこで、蛋白質ＰＲだけを凝集させる凝集剤を液体試料ＬＳと混合して反応させることによって、凝集した蛋白質ＧＰＲとする。【００７１】
ここで、蛋白質ＰＲだけを凝集させる凝集剤としては、エチルアルコール等の脂肪族アルコール、安息香酸・サリチル酸等のカルボン酸、さらにはキトサン、キトサンオリゴ糖等がある。これらの凝集剤は、蛋白質ＰＲを凝集させることができ、その際微生物ＭＯを一緒に凝集させないので、微生物ＭＯの損失が少ない。【００７２】
これによって、図２（ｂ）に示されるように、１次フィルターケース５及び２次フィルターケース６を接続したものに液体試料ＬＳを通すことによって、凝集した蛋白質ＧＰＲと体細胞ＢＣを捕捉し遊離ＡＴＰ・ＦＡ及び微生物ＭＯを透過させる１次フィルター５ａにおいて、凝集した蛋白質ＧＰＲと体細胞ＢＣが捕捉されて取り除かれ、さらに微生物ＭＯを捕捉し遊離ＡＴＰ・ＦＡを透過させる２次フィルター６ａにおいて微生物ＭＯが捕捉され、遊離ＡＴＰ・ＦＡは透過して排出されて取り除かれる。後は、２次フィルター６ａから微生物ＭＯ内のＡＴＰを取出して発光試薬を入れ、発光量を測定することによって最初の液体試料ＬＳ中に含まれていた微生物ＭＯの量が高精度で測定される。【００７３】
ここで、１次フィルター５ａとしては、孔径約１μｍ〜約１０μｍのメンブランフィルターを用いるのが好ましい。メンブランフィルターとしては、例えば、プレフィルターとしてホウケイ酸ガラスを用いた親水性ポリエーテルスルホン（２枚で１つのフィルター）、ポリエステル不織布にセルロースアセテートをコートしたメンブランフィルター、親水性ホウケイ酸グラスファイバー、ナイロン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリカーボネート、セルロースアセテート、セルロース混合エステル等を用いることができる。メンブランフィルターは、孔径が一定で圧力に強いので、１次フィルター５ａとしてメンブランフィルターを用いることによって、安定して検査を行うことができる。【００７４】
また、２次フィルター６ａとしてのメンブランフィルターは、孔径約０．１μｍ〜約０．５μｍ、好ましくは孔径約０．２μｍ〜約０．４５μｍの微細孔を有する多孔性高分子膜を用いるのが好ましい。多孔性高分子膜としては、ＰＴＦＥ、ポリビニリデンジフルオライド、ポリカーボネート、セルロースアセテート、親水性ポリプロピレン、ナイロン、親水性ポリエーテルスルホン、または親水性ホウケイ酸グラスファイバー等の高分子からなる分離膜を用いることができる。【００７５】
上記のようなメンブランフィルターでろ過すると、微生物ＭＯはろ過膜６ａ上に捕捉・濃縮される。このろ過膜６ａ及び微生物ＭＯには、微生物ＭＯに由来しない遊離ＡＴＰ・ＦＡや発光物質も付着していることがあるので、必要に応じて、これらを洗浄液で洗浄除去する。洗浄液としては、例えばエタノールの６０容量％〜１００容量％滅菌蒸留水溶液やＤＭＳＯの１容量％〜８容量％（より好ましくは４容量％〜５容量％）滅菌蒸留水溶液等を用いることができる。【００７６】
次に、この測定原理を応用した、本実施の形態１にかかる液体試料中の微生物の測定キット１による微生物の測定方法の具体的な手順について、図３を参照して説明する。まず、図３（ａ）に示されるように、予め第１のシリンジ２（３ｍｌ容）に凝集剤３を所定量（２．１ｍｌ）吸引しておき、試料カップ１４に液体試料ＬＳを入れて第１のシリンジ２で所定量（０．７ｍｌ）吸引して、さらに空気を入れて第１のシリンジ２の先端を指で押えて５秒間程度攪拌する。凝集剤３の種類と添加量は、液体試料ＬＳの種類によって変動するが、例えば、市販の牛乳の場合、牛乳０．７ｍｌに対して２．１ｍｌの割合でカルボン酸系の凝集剤（安息香酸等）を添加すると、凝集反応が迅速に進行する。【００７７】
続いて、図３（ｂ）に示されるように、攪拌後直ちに１次フィルターケース５及び２次フィルターケース６を連結したものを第１のシリンジ２の先端に取付けて、ゆっくりと第１のシリンジ２のピストンを押してこの混合液１５をろ過する。ろ過後、一旦第１のシリンジ２を取外して空気を吸い込み、再び１次フィルターケース５及び２次フィルターケース６を連結したものに取付けて空気を送り込むことによって、フィルター内の試料を全てろ過する。このとき、上述したように、図２（ｂ）に示される現象が起こっている。【００７８】
全量がろ過できたら、２次フィルターケース６のみを取外して、図３（ｃ）に示されるように、第２のシリンジ７で洗浄液８を吸引しておき、２次フィルターケース６を第２のシリンジ７の先端に取付けて第２のシリンジ７のピストンを押して、洗浄液８で２次フィルターケース６を洗浄する。ろ過後、一旦第２のシリンジ７を取外して空気を吸い込み、再び２次フィルターケース６に取付けて空気を送り込むことによって、２次フィルターケース６内の洗浄液８を完全に除去する。洗浄液８が残ると、次の溶菌処理が不完全になるので注意しなければならない。【００７９】
次に、図３（ｄ）に示されるように、第２のシリンジ７で溶菌剤９を所定量（０．２ｍｌ）吸引しておき、２次フィルターケース６を取付けて、第２のシリンジ７を上下逆にして下から２次フィルターケース６内に溶菌剤９を送り込み、溶菌剤９で２次フィルターケース６内を満たす。そして、２次フィルターケース６を回転させたり軽く振動を与えたりしながら溶菌剤９が満遍なく２次フィルター６ａに行き渡るようにして、約３０秒間反応させる。反応後、図３（ｅ）に示されるように、測定用チューブ１０に反応液１６を押出し、２次フィルター６ａに残った反応液１６も空気で押し出すことによって完全に測定用チューブ１０に集める。【００８０】
続いて、図３（ｆ）に示されるように、予め発光試薬溶解液１１ａを発光試薬粉末１１ｂに加えて調製しておいた発光試薬１１を所定量（０．１ｍｌ）加え、アダプタ１２を取付けて軽く攪拌した後、直ちにルミノメータ１３で発光量を測定する。発光試薬は、特に制限はなく、通常、ルシフェラーゼとルシフェリンが用いられる。【００８１】
(実施例１)
次に、本発明の実施の形態１にかかる液体試料中の微生物の測定方法の実施例１に基づいて本発明を具体的に説明する。【００８２】
本実施例１及び比較例に用いた標準培養液は、酵母エキス０．５％、ペプトン１．５％、塩化ナトリウム０．５％、リン酸水素カリウム０．５％を含むものであり、発光試薬は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び酢酸マグネシウムを主成分とし、Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液に溶解したものである。【００８３】
２０ｍｌの標準培養液に生乳を少量加えて培養したものを遠心分離し、培養液を捨て、沈殿した菌に、無菌であることが確認されている市販の牛乳を２０ｍｌ加えてよく攪拌した。これを同様の市販の牛乳で５段階に希釈し、これらを試料とした。【００８４】
フィルターとしては、直径４７ｍｍ、孔径１０μｍの１次フィルター（材質：ポリエステル不織布にセルロースアセテートをコートしたメンブランフィルター）と、直径２５ｍｍ、孔径０．５μｍの２次フィルターとしてのメンブランフィルター（材質：ポリテトラフルオロエチレン）を用い、それぞれのフィルターカバーをルアーフィッティングで接続したものを用いた。【００８５】
１０ｍｌ容のシリンジを用いて試料３ｍｌを吸引し、さらにそのまま凝集剤として７ｍｌの９９．５％のエタノールを加え、直ちに約１０秒間激しく混合し、上記フィルターでろ過した。この時、試料中の蛋白質等は１次フィルターに捕らえられ、２次フィルターには主に微生物がろ集されており、遊離ＡＴＰはろ液として排出される。次に、２次フィルターをフィルターカバーから取り出し、測定用チューブに移し、０．２ｍｌの２０％ＤＭＳＯ溶液を加えて１分間放置した後、発光試薬０．１ｍｌを加えてルミノメータで発光量（ＲＬＵ）を測定した。【００８６】
別に、段階希釈された前記の各試料を標準培養法により培養し、微生物数を測定した。測定された微生物数と発光量との関係を図４に示す。横軸は菌数（ｃｆｕ／ｍｌ）を、縦軸は発光量（ＲＬＵ）を示しており、いずれも対数軸である。このグラフから、本実施例１にかかる液体試料中の微生物の測定方法によれば、発光量（ＡＴＰ濃度）と菌数は、１０4 個／ｍｌ以上で良好な比例関係が成立することが分かった。【００８７】
［比較例］
比較例として、０．１ｍｌの各試料に０．２ｍｌの２０％ＤＭＳＯ溶液を加えて１分間放置し、次いで０．１ｍｌの発光試薬を添加し、ルミノメータで発光量を測定した。【００８８】
菌数と測定された発光量（ＡＴＰ濃度）との関係を図４に、白い四角でプロットして示した。この場合には、菌数と発光量との間に相関関係が認められない。【００８９】
このように、本実施例１によれば、遊離ＡＴＰの除去、捕捉した微生物からのＡＴＰの抽出及び抽出ＡＴＰの測定を簡単な操作で容易かつ迅速に行うことができ、その際、洗浄液による洗浄を全く必要としないか、又は多量の洗浄液による洗浄を必要とせず、しかも微生物の損失が少ないため、著しく信頼度の高い検査結果が得られる。また、本実施例１は、濁度の高い牛乳及び乳製品試料や固形食品でも適用でき、多量のたんぱく質やミネラルを含むろ過困難な豆乳等の食品中の微生物由来のＡＴＰを低濃度まで良好に測定することができる。さらに、本実施例１においては、１次フィルター及び２次フィルターの両方にメンブランフィルターを用いているので、安定した検査を行うことができ、ルミノメータ以外の特別の装置や技術を必要とせず、熟練しなくても生産現場で検査可能である。【００９０】
(実施例２)
次に、本発明の実施の形態１にかかる液体試料中の微生物の測定キット及び測定方法の実施例２に基づいて、図１乃至図３を参照しつつ、本発明を具体的に説明する。本実施例２においては、上述した本実施の形態１にかかる液体試料中の微生物の測定キット１を用いて、微生物の測定を行った。【００９１】
本実施例２に用いた標準培養液は、酵母エキス０．５％、ペプトン１．５％、塩化ナトリウム０．５％、リン酸水素カリウム０．５％を含むものであり、発光試薬１１は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び酢酸マグネシウムを主成分とした粉末１１ｂを、Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液１１ａに溶解したものである。【００９２】
２０ｍｌの標準培養液に生乳を少量加えて培養したものを遠心分離し、培養液を捨て、沈殿した菌に、無菌であることが確認されている市販の牛乳を２０ｍｌ加えてよく攪拌した。これを同様の市販の牛乳で５段階に希釈し、これらを液体試料ＬＳとした。また、同様に牧場で採取した搾り立ての生乳を２０ｍｌ加えてよく攪拌し、同様の生乳で数段階に希釈し、これらも液体試料ＬＳとした。【００９３】
まず、図３（ａ）に示されるように、予め第１のシリンジ２（３ｍｌ容）に凝集剤として安息香酸３を２．１ｍｌ吸引しておき、試料カップ１４に液体試料ＬＳを入れて第１のシリンジ２で０．７ｍｌ吸引して、さらに空気を入れて第１のシリンジ２の先端を指で押えて５秒間程度攪拌した。続いて、図３（ｂ）に示されるように、攪拌後直ちに１次フィルターケース５及び２次フィルターケース６を連結したものを第１のシリンジ２の先端に取付けて、ゆっくりと第１のシリンジ２のピストンを押してこの混合液１５をろ過した。ろ過後、一旦第１のシリンジ２を取外して空気を吸い込み、再び１次フィルターケース５及び２次フィルターケース６を連結したものに取付けて空気を送り込むことによって、フィルター内の試料を全てろ過した。【００９４】
全量がろ過できたら、２次フィルターケース６のみを取外して、図３（ｃ）に示されるように、第２のシリンジ７で洗浄液としてのエタノール６０容量％滅菌蒸留水溶液８を吸引しておき、２次フィルターケース６を第２のシリンジ７の先端に取付けて第２のシリンジ７のピストンを押して、洗浄液８で２次フィルターケース６を洗浄した。ろ過後、一旦第２のシリンジ７を取外して空気を吸い込み、再び２次フィルターケース６に取付けて空気を送り込むことによって、２次フィルターケース６内の洗浄液８を完全に除去した。【００９５】
なお、本実施例２においては、洗浄液８としてエタノール６０容量％溶液を用いた例について説明したが、他にもＤＭＳＯ１容量％〜８容量％滅菌蒸留水溶液、より好ましくはＤＭＳＯ４容量％〜５容量％滅菌蒸留水溶液等を洗浄液８として用いることができる。【００９６】
次に、図３（ｄ）に示されるように、第２のシリンジ７で溶菌剤としてのＤＭＳＯ２０容量％溶液９を０．２ｍｌ吸引しておき、２次フィルターケース６を取付けて、第２のシリンジ７を上下逆にして下から２次フィルターケース６内に溶菌剤９を送り込み、溶菌剤９で２次フィルターケース６内を満たした。そして、２次フィルターケース６を回転させたり軽く振動を与えたりしながら溶菌剤９が満遍なく２次フィルター６ａに行き渡るようにして、約３０秒間反応させ、図３（ｅ）に示されるように、測定用チューブ１０に反応液１６を押出し、２次フィルター６ａに残った反応液１６も空気で押し出すことによって完全に測定用チューブ１０に集めた。【００９７】
続いて、図３（ｆ）に示されるように、予め調製しておいた発光試薬１１を０．１ｍｌ加え、アダプタ１２を取付けて軽く攪拌した後、直ちにルミノメータ１３で発光量を測定した。別に、段階希釈された前記の各試料を標準培養法により培養し、微生物数を測定した。測定された微生物数と発光量との関係を、市販の牛乳について図５に、生乳について図６に示す。なお、生乳は市販の牛乳と異なり無菌ではないので、ブランクの状態ですでに発光する。図６においては、このブランクの発光量を差し引いた値を発光量として示している。横軸は菌数（ｃｆｕ／ｍｌ）を、縦軸は発光量（ＲＬＵ）を示しており、いずれも対数軸である。このグラフから、本実施例２にかかる液体試料中の微生物の測定方法によれば、発光量（ＡＴＰ濃度）と菌数は、１０4 個／ｍｌ以上で良好な比例関係が成立することが分かった。【００９８】
このように、本実施例２にかかる液体試料中の微生物の測定キット及び測定方法によれば、遊離ＡＴＰの除去、捕捉した微生物からのＡＴＰの抽出及び抽出ＡＴＰの測定を簡単な操作で容易かつ迅速に行うことができ、その際、洗浄液による洗浄を全く必要としないか、又は多量の洗浄液による洗浄を必要とせず、しかも微生物の損失が少ないため、著しく信頼度の高い検査結果が得られる。また、本実施例２にかかる液体試料中の微生物の測定キット及び測定方法は、濁度の高い牛乳及び乳製品試料や固形食品でも適用でき、多量のたんぱく質やミネラルを含むろ過困難な豆乳等の食品中の微生物由来のＡＴＰを低濃度まで良好に測定することができる。さらに、本実施例２においては、１次フィルター及び２次フィルターの両方をケースに収納して使い捨てにしているので、安定した検査を行うことができ、ルミノメータ以外の特別の装置や技術を必要とせず、熟練しなくても牧場や工場等の現場で検査可能である。【００９９】
実施の形態２
次に、本発明の実施の形態２にかかる液体試料中の微生物の測定キット・測定方法・測定装置について、図１乃至図３を参考にしながら説明する。本実施の形態２にかかる液体試料中の微生物の測定キットは、図１に示される実施の形態１にかかる液体試料中の微生物の測定キット１に、さらにろ過促進剤を追加したものである。本実施の形態２においては、ろ過促進剤としてエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のナトリウム塩を用いる。または、ＥＤＴＡのナトリウム塩を図１に示される測定キット１のビン入りの凝集剤３に所定割合で予め混合しておいても良い。ＥＤＴＡのナトリウム塩は、一般にはキレート剤として用いられる化合物であるが、凝集剤と併用すると、牛乳等の液体試料中に含まれるミネラル、例えばカルシウムとキレート化合物（水溶性）を作り、ろ過を容易にする。【０１００】
したがって、本実施の形態２にかかる微生物の測定方法の測定原理は、図２に示される通りになり、水溶性のキレート化合物は、遊離ＡＴＰ・ＦＡとともに２次フィルター６ａを透過して系外に排出される。これによって、液体試料のろ過が一層容易になり、測定時間も短縮できる。【０１０１】
次に、この測定原理を応用した、本実施の形態２にかかる液体試料中の微生物の測定キットによる微生物の測定方法の具体的な手順について、図３を参照して説明する。まず、図３（ａ）に示されるように、予め第１のシリンジ２（３ｍｌ容）に凝集剤３とろ過促進剤としてのＥＤＴＡのナトリウム塩の混合剤を所定量（２．１ｍｌ）吸引しておき、試料カップ１４に液体試料ＬＳを入れて第１のシリンジ２で所定量（０．７ｍｌ）吸引して、さらに空気を入れて第１のシリンジ２の先端を指で押えて５秒間程度攪拌する。凝集剤３の種類と添加量は、液体試料ＬＳの種類によって変動するが、例えば、市販の牛乳の場合、牛乳０．７ｍｌに対して２．１ｍｌの割合でカルボン酸系の凝集剤（安息香酸等）を添加すると、凝集反応が迅速に進行する。【０１０２】
あるいは、凝集剤３のみを所定量（２．１ｍｌ）吸引しておき、液体試料ＬＳを吸引して攪拌した後に、直ちにろ過促進剤としてＥＤＴＡのナトリウム塩を加えて、さらに第１のシリンジ２の先端を指で押えて５秒間程度攪拌する方法を採ることもできる。続いて、図３（ｂ）に示されるように、攪拌後直ちに１次フィルターケース５及び２次フィルターケース６を連結したものを第１のシリンジ２の先端に取付けて、ゆっくりと第１のシリンジ２のピストンを押してこの混合液１５をろ過する。ろ過後、一旦第１のシリンジ２を取外して空気を吸い込み、再び１次フィルターケース５及び２次フィルターケース６を連結したものに取付けて空気を送り込むことによって、フィルター内の試料を全てろ過する。このとき、上述したように、図２（ｂ）に示される現象が起こっている。【０１０３】
全量がろ過できたら、２次フィルターケース６のみを取外して、図３（ｃ）に示されるように、第２のシリンジ７で洗浄液８を吸引しておき、２次フィルターケース６を第２のシリンジ７の先端に取付けて第２のシリンジ７のピストンを押して、洗浄液８で２次フィルターケース６を洗浄する。ろ過後、一旦第２のシリンジ７を取外して空気を吸い込み、再び２次フィルターケース６に取付けて空気を送り込むことによって、２次フィルターケース６内の洗浄液８を完全に除去する。洗浄液８が残ると、次の溶菌処理が不完全になるので注意しなければならない。【０１０４】
次に、図３（ｄ）に示されるように、第２のシリンジ７で溶菌剤９を所定量（０．２ｍｌ）吸引しておき、２次フィルターケース６を取付けて、第２のシリンジ７を上下逆にして下から２次フィルターケース６内に溶菌剤９を送り込み、溶菌剤９で２次フィルターケース６内を満たす。そして、２次フィルターケース６を回転させたり軽く振動を与えたりしながら溶菌剤９が満遍なく２次フィルター６ａに行き渡るようにして、約３０秒間反応させる。反応後、図３（ｅ）に示されるように、測定用チューブ１０に反応液１６を押出し、２次フィルター６ａに残った反応液１６も空気で押し出すことによって完全に測定用チューブ１０に集める。【０１０５】
続いて、図３（ｆ）に示されるように、予め発光試薬溶解液１１ａを発光試薬粉末１１ｂに加えて調製しておいた発光試薬１１を所定量（０．１ｍｌ）加え、アダプタ１２を取付けて軽く攪拌した後、直ちにルミノメータ１３で発光量を測定する。発光試薬は、特に制限はなく、通常、ルシフェラーゼとルシフェリンが用いられる。【０１０６】
なお、上述したような液体試料中の微生物の測定方法に用いられる測定装置は、上記各実施の形態においては、測定キット１或いは測定キット１にろ過促進剤を追加した測定キットを用いて人の手によって測定する例について説明したが、これらを人の手を殆ど用いない自動測定装置とすることも可能である。【０１０７】
本発明にかかる液体試料中の微生物の測定キットまたは測定装置のその他の部分の構成、形状、材質、大きさ、数量、接続関係等についても、また本発明にかかる液体試料中の微生物の測定方法のその他の工程についても、上記各実施の形態に限定されるものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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