(57)【要約】細胞内のミトコンドリア由来の活性酸素発生量を正確に測定することができる方法を提供することを目的とする。  生体試料に対して細胞内の活性酸素と特異的に反応する性質を有する蛍光試薬を適用する第１のステップと、第１のステップで得られた生体試料に含まれる蛍光試薬を励起させた状態において、当該生体試料を顕微鏡撮影並びに光電変換処理することにより、１もしくは２以上の細胞を視野に含む蛍光画像を取得する第２のステップと、第２のステップで取得された蛍光画像の所定領域内の構成画素の輝度総和を求める第３のステップと、第３のステップで求められた構成画素の輝度総和に基づいて細胞内のミトコンドリアから発生する活性酸素の量を同定する第４のステップと、を具備することを特徴とするミトコンドリアから発生する活性酸素の測定方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料に対して細胞内の活性酸素と特異的に反応する性質を有する蛍光試薬を適用する第１のステップと、
第１のステップで得られた生体試料に含まれる蛍光試薬を励起させた状態において、当該生体試料を顕微鏡撮影並びに光電変換処理することにより、１もしくは２以上の細胞を視野に含む蛍光画像を取得する第２のステップと、
第２のステップで取得された蛍光画像の所定領域内の構成画素の輝度総和を求める第３のステップと、
第３のステップで求められた構成画素の輝度総和に基づいて細胞内のミトコンドリアから発生する活性酸素の量を同定する第４のステップと、
を具備する、ことを特徴とするミトコンドリアから発生する活性酸素の測定方法。
【請求項２】
細胞内の活性酸素が、ヒドロキシラジカル、一重項酸素、もしくは、スーパーオキサイドである、ことを特徴とする請求の範囲第１項に記載のミトコンドリアから発生する活性酸素の測定方法。
【請求項３】
蛍光試薬がＨＰＦである、ことを特徴とする請求の範囲第２項に記載のミトコンドリアから発生する活性酸素の測定方法。
【請求項４】
蛍光試薬がＤＭＡＸである、ことを特徴とする請求の範囲第２項に記載のミトコンドリアから発生する活性酸素の測定方法。
【請求項５】
蛍光試薬がＡＰＦである、ことを特徴とする請求の範囲第２項に記載のミトコンドリアから発生する活性酸素の測定方法。
【請求項６】
同一の活性酸素発生特性を有する生体試料を２組用意する第１のステップと、
第１のステップで用意された２組の生体試料のうちの一方の組の生体試料には、抗酸化能定量化の対象となる抗酸化材を適用する一方、他方の組の生体試料には抗酸化能定量化の基準となる抗酸化材を適用する第２のステップと、
第２のステップにて抗酸化材が適用された２組の生体試料に対して、同一の活性酸素誘因刺激を与える第３のステップと、
第３のステップにて活性酸素誘因刺激が与えられた２組の生体試料のそれぞれに対して、細胞内の活性酸素と特異的に反応する性質を有する蛍光試薬を適用する第４のステップと、
第４のステップで蛍光試薬が適用された２組の生体試料のそれぞれを、その蛍光試薬が励起された状態において、顕微鏡撮影並びに光電変換処理することにより、それぞれ１もしくは２以上の細胞を視野に含む２組の蛍光画像を取得する第５のステップと、
第５のステップで取得された２組の蛍光画像のそれぞれについて、所定領域内の構成画素の輝度総和を求める第６のステップと、
第６のステップにて求められた２組の輝度総和について、抗酸化能定量化の基準となる抗酸化材が適用された側の輝度総和に対する、抗酸化能定量化の対象となる抗酸化材が適用された側の輝度総和の比を求める第７のステップと、
を具備する、ことを特徴とする抗酸化材の抗酸化能を定量化する方法。
【請求項７】
同一の活性酸素発生特性を有する生体試料を２組用意する第１のステップと、
第１のステップにて用意された２組の生体試料に対して、同一の活性酸素誘因刺激を与える第２のステップと、
第２のステップにて同一の活性酸素誘因刺激が与えられた２組の生体試料のうちの一方の組の生体試料には、抗酸化能定量化の対象となる抗酸化材を適用する一方、他方の組の生体試料には抗酸化能定量化の基準となる抗酸化材を適用する第３のステップと、
第３のステップにて抗酸化材が適用された２組の生体試料のそれぞれに対して、細胞内の活性酸素と特異的に反応する性質を有する蛍光試薬を適用する第４のステップと、
第４のステップにて蛍光試薬が適用された２組の生体試料のそれぞれを、その蛍光試薬が励起された状態において、顕微鏡撮影並びに光電変換処理することにより、それぞれ１もしくは２以上の細胞を視野に含む２組の蛍光画像を取得する第５のステップと、
第５のステップで取得された２組の蛍光画像のそれぞれについて、所定領域内の構成画素の輝度総和を求める第６のステップと、
第６のステップにて求められた２組の輝度総和について、抗酸化能定量化の基準となる抗酸化材が適用された側の輝度総和に対する、抗酸化能定量化の対象となる抗酸化材が適用された側の輝度総和の比を求める第７のステップと、
を具備する、ことを特徴とする抗酸化材の抗酸化能を定量化する方法。
【請求項８】
活性酸素誘因刺激がＸ線照射である、ことを特徴とする請求の範囲第５項又は第６項に記載の抗酸化材の抗酸化能を定量化する方法。
【請求項９】
活性酸素誘因刺激がサイトカインの適用である、ことを特徴とする請求の範囲第５項又は第６項に記載の抗酸化材の抗酸化能を定量化する方法。
【請求項１０】
細胞内の活性酸素と特異的に反応する性質を有する蛍光試薬がＨＰＦである、ことを特徴とする請求の範囲第５項又は第６項に記載の抗酸化材の抗酸化能を定量化する方法。
【請求項１１】
細胞内の活性酸素と特異的に反応する性質を有する蛍光試薬がＤＭＡＸである、ことを特徴とする請求の範囲第５項又は第６項に記載の抗酸化材の抗酸化能を定量化する方法。
【請求項１２】
抗酸化能定量化の基準となる抗酸化材がビタミンＥである、ことを特徴とする請求の範囲第５項又は第６項に記載の抗酸化材の抗酸化能を定量化する方法。
【請求項１３】
同一の活性酸素発生特性を有する生体試料が、予め用意された標準個体から取得された生体試料である、ことを特徴とする請求の範囲第５項又は第６項に記載の抗酸化材の抗酸化能を定量化する方法。
【請求項１４】
同一の活性酸素発生特性を有する生体試料が、当該抗酸化材を服用すべき特定個体から取得された生体試料である、ことを特徴とする請求の範囲第５項又は第６項に記載の抗酸化材の抗酸化能を定量化する方法。
【請求項１５】
抗酸化能を定量化したい抗酸化材を、当該抗酸化材を服用すべき特定個体に経口服用させたのち、当該特定個体から生体試料を採取して細胞内への抗酸化材摂取量を測定し、この測定された摂取量の値に合わせて抗酸化能定量化の際の抗酸化材適用量を調整する、ことを特徴とする請求の範囲第１３項に記載の抗酸化材の抗酸化能を定量化する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ミトコンドリアから発生する活性酸素の測定方法、並びに、同方法を応用した抗酸化材の抗酸化能を定量化する方法に関するものである。
【背景技術】  老化に関しては、テロメアの重要性やクロト（ｋｌｏｔｈｏ）遺伝子の重要性が指摘されてきた。しかしながら、テロメアやクロト（ｋｌｏｔｈｏ）遺伝子だけでは、健康や老化を充分に説明することは困難であった。最近、老化及びアルツハイマー、パーキンソン、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）等、多くの神経疾患や原因不明の難病等の原因が、実は、活性酸素の病気であると言うことが明らかにされつつある。これらの病気は、急性ではなくて慢性の症状を伴うことが多い。これらの疾患では、アポトーシス（細胞死）が関連することが言われており、アポトーシスにはミトコンドリアが重要な役割を果たしていることが報告されている。ミトコンドリアには１６５６９塩基対のＤＮＡが存在し、酸化ストレスによりこのミトコンドリアＤＮＡに突然変異を多く発生させ、老化、及びアルツハイマー、パーキンソン、ＡＬＳ等、多くの神経疾患の原因となっていると言われており、酸化ストレスとミトコンドリア障害との関連が浮き彫りにされている。
ミトコンドリア内膜には電子伝達系が存在し酸素下でＡＴＰ（アデノシン３リン酸）合成が行われている。この電子伝達系は複合体（Ｃｏｍｐｌｅｘ）Ｉ〜ＩＶ、ＡＴＰシンターゼ（ｓｙｎｔｈａｓｅ）、及びＡＴＰ／ＡＤＰ（アデノシン２リン酸）トランスロケータ（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ）から構成されている。この複雑なバイオマシンは細胞中の最も大きなエネルギー製造器官となっているが、一方完璧なマシンではなく、電子の漏れが生ずることが知られている。この電子の漏れは、複合体（Ｃｏｍｐｌｅｘ）ＩとＩＩＩから最も多く生ずる。通常、正常な状態でも２〜３％の電子の漏れが生じ、これからスーパーオキサイドが発生すると考えられている。即ち、この漏れ電子は酸素により捕獲され、酸素はスーパーオキサイドとなる。ミトコンドリアには、特有のマンガンスーパーオキサイドが存在するが、この酵素の役割はこのスーパーオキサイドを捕獲する役割上において重要であることが容易に示唆される。
最近、この電子伝達系の異常による病気が多数報告されつつある。例えば、パーキンソン病では、電子伝達系の複合体（Ｃｏｍｐｌｅｘ）Ｉにその異常が集中している。前述のように、この部分は最も大きな電子の漏れを生じさせており、この電子の漏れによりスーパーオキサイドが生ずることが原因として考えられる。パーキンソン病のほか、多くの神経系疾患ではもミトコンドリアＤＮＡの突変異が報告されている。これらの疾患でも同様にミトコンドリアからの大量のスーパーオキサイドの発生が容易に予想され、これが病因となっている可能性が大きい。老化に関する研究では、細胞の加齢に伴いミトコンドリアＤＮＡの欠損が生ずる、いわゆるコモンディレーション（ｃｏｍｍｏｎ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ）が起こることが知られている。また、神経障害疾患では、特に、このコモンディレーションが早期に起こり始めることが知られている。ミトコンドリアＤＮＡコモンディレーションでは、この部分が特に電子伝達系のＡＴＰａｓｅ蛋白質を部分的にコードしているため、前述のように、より大量のスーパーオキサイドが放出されている可能性が大きい。
活性酸素の生体内における反応の一部が図１に示されている。同図に示されるように、酸素ラジカル（Ｏ２−・）と過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）が反応することにより、ヒドロキシラジカル（ＯＨ・）が発生する。また、酸素ラジカル（Ｏ２−・）と一酸化窒素ラジカル（ＮＯ・）とが反応することによりＮＯ３ラジカル（ＮＯ３・）が発生する。ヒドロキシラジカルとＮＯ３ラジカルはいずれも反応性の高い物質である。
酸素ラジカル（Ｏ２−・）がスーパー・オキサイド・ディムスターゼ（ＳＯＤ）と反応することにより過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）となり、この過酸化水素とカタラーゼ（ＣＡＴ）とが反応することにより水（Ｈ２Ｏ）と酸素（Ｏ２）になる。また、過酸化水素とグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰＸ）とが反応することにより、水（Ｈ２Ｏ）と酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）とが発生する。グルタチオン還元酵素（ＧＲ）は、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）よりの電子を酸化型グルタチオンに転移し、これにより酸化型グルタチオンは還元型グルタチオン（ＧＳＨ）となり、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）となる。グルコース６リン酸脱水酵素（Ｇ６ＰＤ）は、ペントースリン酸回路にてプロスタグランジン（ＰＧ）をグルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）に変換する過程にて、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸に戻す。
前述のスーパーオキサイドについて、活性酸素のうちスーパーオキサイド（Ｏ２・−）こそが、活性酸素群系列の最初を担う重要な物質であると言う説がある。１９６９年にフリードビッチ（Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ）博士がスーパーオキサイドを駆除するスーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）を発見している。スーパーオキサイドと一酸化炭素は容易に反応し、ペロキシナイトライト（ｐｅｒｏｘｉｎｉｔｒｉｔｅ）と言う反応活性の著しく高い物質に変わることがわかった。出願人らは、１９９８年にマンガンスーパーオキサイドディスムターゼの遺伝子をトランスフェクトした細胞では、活性酸素刺激により生ずるアポトーシスに対し抵抗性を示すことを明らかにした（Ｍａｊｉｍａ等、ＪＢＣ，１９９８）。すなわち、ミトコンドリア内スーパーオキサイドの量を少なくするようにコントロールすることこそ、一連の後に続く生体内反応を制御することが可能であると言うことを意味している。
ミトコンドリアから発生する活性酸素こそが、老化や神経障害等の原因となっている可能性が大きい。従って、抗酸化能を有する薬剤、食品等（以下、抗酸化材とする）がミトコンドリア由来の活性酸素をどれだけ抑えるかを調べることによりこれらの抗酸化材の抗酸化能を調べることが可能である。
現在、細胞内活性酸素の検出には２，７ｄｉｃｈｌｏｒｏ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ（ＤＣＦ）、ｄｉｈｙｄｒｏｒｈｉｄａｍｉｎｅ  １２３（ＤＨＲ）、ｈｙｄｒｏｅｔｈｉｄｉｎｅ（ＨＥ）等の試薬を用いた方法が存在する。
活性酸素抑制の効果がある抗酸化材の抗酸化能の測定方法としては、試験管内において化学反応により測定する方法が主流である。このような測定法の一つとして、特開平０８−１８９９２９号公報（以下、特許文献１とする）には、生体中で酸化されたＤＮＡである８−ＯｈｄＧ量の測定法が開示されている。また、「Ｆｒｅｅ  Ｒａｄ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｓ．，１４巻、３号、１７３−１７８頁、１９９１」（以下、非特許文献１とする）には、細胞や動物・ヒトに対する活性酸素もしくは抗酸化物の影響、活性酸素や過酸化水素に対する細胞毒性の評価法が開示されている。
［特許文献１］特開平０８−１８９９２９号公報
［非特許文献１］Ｆｒｅｅ  Ｒａｄ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｓ．，１４巻、３号、１７３−１７８頁、１９９１
しかしながら、ＤＣＦ、ＤＨＲ、ＨＥ等の従前の試薬を用いた活性酸素検出方法では、細胞内の活性酸素の測定は行えても、いずれの小器官から発生するかの検証を行うことはできなかった。また、活性酸素を染色する際にプラスまたはマイナスの電荷を生じてしまう試薬もあり、このような試薬で染色された活性酸素はマイナスの電荷を持つ細胞膜やプラスの電荷を持つミトコンドリア外膜に引き寄せられてしまい元々の発生箇所がわからなくなるため、ミトコンドリア由来の活性酸素のみを特定してその活性酸素発生量を測定することは極めて困難であった。
また抗酸化能の測定方法に関しては、従前の測定方法は抗酸化材の投与後に生体内から細胞を取り出し抗酸化材の抗酸化能を測定する方法、試験管内において化学反応により測定する方法、等が用いられており、前者によれば投与の瞬間よりのタイムラグで正確に測定できない可能性があり、後者によっても定量的には表現できないという問題点があった。
この発明は、上述した技術的背景に基づいてなされたものであり、その目的とするところは、細胞内のミトコンドリア由来の活性酸素発生量を正確に測定することができる方法を提供することにある。
この発明の他の目的とするところは、各種抗酸化材の有する抗酸化能を正確に定量化することができる方法を提供することにある。
この発明の他の目的とするところは、各種抗酸化材の有する抗酸化能を正確に定量化することにより、老化阻止や健康増進の観点から、抗酸化材に関して、科学的に根拠のある評価方法を提供することにある。
この発明のさらに他の目的並びに作用効果については、以下の記述を参照することにより、当業者であれば容易に理解されるであろう。
【発明の開示】
上記の目的を達成するために、本発明のミトコンドリアから発生する活性酸素の測定方法は、生体試料に対して細胞内の活性酸素と特異的に反応する性質を有する蛍光試薬を適用する第１のステップと、第１のステップで得られた生体試料に含まれる蛍光試薬を励起させた状態において、当該生体試料を顕微鏡撮影並びに光電変換処理することにより、１もしくは２以上の細胞を視野に含む蛍光画像を取得する第２のステップと、第２のステップで取得された蛍光画像の所定領域内の構成画素の輝度総和を求める第３のステップと、第３のステップで求められた構成画素の輝度総和に基づいて細胞内のミトコンドリアから発生する活性酸素の量を同定する第４のステップと、を具備するものである。ここで、生体試料としては、ヒト細胞、動物細胞、植物細胞のいずれでもよく、また、いずれの部位の細胞でもよい。
そしてこのような構成によれば、ミトコンドリア由来の活性酸素の発生量を特定することが可能である。
ここで、蛍光試薬としては、ヒドロキシラジカル、一重項酸素、もしくは、スーパーオキサイドを測定可能な試薬を用いてもよい。このような構成によれば、活性酸素の中でも特にヒドロキシラジカル、一重項酸素、スーパーオキサイドと特異的に作用する蛍光試薬を用いて細胞中の活性酸素を染色するため、細胞内の活性酸素のうちミトコンドリア由来の活性酸素を捕捉可能である。
また、ヒドロキシラジカル、一重項酸素、もしくは、スーパーオキサイドを測定可能な試薬な蛍光試薬の中で特にＨＰＦ、ＡＰＦを用いれば、活性酸素の中でも特にヒドロキシラジカルを選択的に蛍光染色することが可能であり、蛍光試薬としてＤＭＡＸを用いれば一重項酸素を選択的に蛍光染色することが可能である。ＨＰＦ、ＡＰＦ、ＤＭＡＸのいずれの蛍光試薬もプラス・マイナスのいずれにも電荷が偏らないため、従前の蛍光試薬のように逆の電荷をもつ箇所に引き寄せられて元々の活性酸素発生器官がわからない、という問題が生じることもない。
次に、本発明にかかる抗酸化材の抗酸化能を定量化する方法は、同一の活性酸素発生特性を有する生体試料を２組用意する第１のステップと、第１のステップで用意された２組の生体試料のうちの一方の組の生体試料には、抗酸化能定量化の対象となる抗酸化材を適用する一方、他方の組の生体試料には抗酸化能定量化の基準となる抗酸化材を適用する第２のステップと、第２のステップにて抗酸化材が適用された２組の生体試料に対して、同一の活性酸素誘因刺激を与える第３のステップと、第３のステップにて活性酸素誘因刺激が与えられた２組の生体試料のそれぞれに対して、細胞内の活性酸素と特異的に反応する性質を有する蛍光試薬を適用する第４のステップと、第４のステップで蛍光試薬が適用された２組の生体試料のそれぞれを、その蛍光試薬が励起された状態において、顕微鏡撮影並びに光電変換処理することにより、それぞれ１もしくは２以上の細胞を視野に含む２組の蛍光画像を取得する第５のステップと、第５のステップで取得された２組の蛍光画像のそれぞれについて、所定領域内の構成画素の輝度総和を求める第６のステップと、第６のステップにて求められた２組の輝度総和について、抗酸化能定量化の基準となる抗酸化材が適用された側の輝度総和に対する、抗酸化能定量化の対象となる抗酸化材が適用された側の輝度総和の比を求める第７のステップとを具備するものである。
ここで、「抗酸化材」とは、抗酸化能を有する（もしくは有する可能性のある）薬品や食材等のことである。
そして、このような構成によれば、顕微鏡撮影画像の輝度総和より抗酸化能の定量が容易に行える。また、生体試料に活性酸素誘因刺激を与えることにより活性酸素の発生量が著しく増加し、測定基準となる抗酸化材と測定対象となる抗酸化材の抗酸化能との差異がより明確になる。
測定基準となる抗酸化材と測定対象となる抗酸化材とを同条件の生体試料に投与して比較することにより、測定対象となる抗酸化材の抗酸化能を相対的に表すことが可能である。加えて、抗酸化材を投与した後に細胞を生体内から取り出す方法よりも精度高く活性酸素発生量を測定することが可能である。
また、活性酸素誘因刺激を与えるのは抗酸化材投与前、投与後のいずれでもよい。
本発明の好ましい実施の形態においては、活性酸素誘因刺激がＸ線照射であってもよい。また、活性酸素誘因刺激がサイトカインの適用であってもよい。
ここで、細胞内の活性酸素と特異的に反応する性質を有する蛍光試薬としてＨＰＦ、ＡＰＦ、ＤＭＡＸを用いてもよい。蛍光試薬としてＨＰＦ、ＡＰＦを用いれば活性酸素の中でも特にヒドロキシラジカルを選択的に蛍光染色することが可能であり、ＤＭＡＸを用いれば一重項酸素を選択的に蛍光染色することが可能である。
抗酸化能定量化の基準となる抗酸化材としては、ビタミンＥを用いてもよい。このような構成によれば、入手が比較的容易であるビタミンＥを抗酸化能測定基準とすることにより、「ビタミンＥの２倍の抗酸化力」「ビタミンＥの５倍の抗酸化力」のようにわかりやすい表現で様々な抗酸化材の抗酸化力を示すことが可能となる。
同一の活性酸素発生特性を有する生体試料が、予め用意された標準個体から取得された生体試料であってもよい。
ここで「標準個体」とは、細胞株、系統動植物、被検体等のとあるサンプル群に含まれる１サンプルのことである。
そして、このような構成によれば、ある集合の中の一個体を標準個体として用いることにより、そのサンプル群に対する当該抗酸化材のおおよその効果を予測することが可能である。
同一の活性酸素発生特性を有する生体試料が、当該抗酸化材を服用すべき特定個体から取得された生体試料であってもよい。
ここで、「特定個体」とは１個体、１個人、突然変異株、薬剤等で処置された動植物ないしはヒト、遺伝子ないしはタンパク質を導入された細胞、トランスジェニック動植物、クローン動植物等のサンプル群の中の特定の１個体のことである。
そして、このような構成によれば、特定個体に対する抗酸化能を定量化することにより、たとえば個人個人に対する効果を測定することが可能となり、より個体差を考慮した試験を行うことができる。
本願の抗酸化材の抗酸化能を定量化する方法においては、抗酸化能を定量化したい抗酸化材を、当該抗酸化材を服用すべき特定個体に経口服用させたのち、当該特定個体から生体試料を採取して細胞内への抗酸化材摂取量を測定し、この測定された摂取量の値に合わせて抗酸化能定量化の際の抗酸化材適用量を調整するようにしてもよい。
このような構成によれば、特定個体が抗酸化材を経口服用で摂取した場合に、抗酸化材が体内にどれだけ摂取されるかがわかる。抗酸化能の定量化を行う際にこの摂取量を参照して生体試料に抗酸化材を投与することにより、経口服用で摂取した場合と同じ摂取量で実験が行えるため、より特定個体への影響を判断しやすくなる。
本願にかかるミトコンドリアから発生する活性酸素の測定方法によれば、細胞内の活性酸素のうちミトコンドリアから発生した活性酸素を特定し、ミトコンドリアから発生した活性酸素の量を測定し視覚的に確認することが可能である。
また、本願にかかる抗酸化材の抗酸化能を定量化する方法によれば、様々な食品・薬剤等の抗酸化能を測定し、視覚的に認識することが可能である。また、顕微鏡撮影を行い得られた画像について画像処理を行うことにより食品・薬剤等の抗酸化能を数値化して比較することが可能である。
【図面の簡単な説明】  図１は、抗酸化酵素の反応式を示す図である。
図２は、活性酸素抑制の経過を示す図である。
図３は、  ミトコンドリアの膜表面を模式的に示す図である。
図４は、ＨＰＦの構造を示す図である。
図５は、ＤＭＡＸの構造を示す図である。
図６は、ＨＰＦによる蛍光活性を示す図である。
図７は、ＤＭＡＸによる蛍光活性を示す図である。
図８は、蛍光感度を示すグラフ（その１）である。
図９は、蛍光感度を示すグラフ（その２）である。
図１０は、蛍光感度を示すグラフ（その３）である。
図１１は、蛍光感度を示すグラフ（その４）である。
図１２は、抗酸化材の抗酸化能を示すグラフ（その１）である。
図１３は、抗酸化材の抗酸化能を示すグラフ（その２）である。
図１４は、抗酸化材の抗酸化能を示すグラフ（その３）である。
図１５は、本願の第一実施形態を説明する図である。
図１６は、本願の第二実施形態を説明する図である。
図１７は、本願の第三実施形態（その１）を説明する図である。
図１８は、本願の第三実施形態（その２）を説明する図である。
図１９は、１４３Ｂ細胞の顕微鏡写真である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に、本発明の好適な実施の一形態を添付図面を参照しながら詳細に説明する。
先に述べたように、本発明に係る活性酸素測定方法は、生体試料に対して細胞内の活性酸素と特異的に反応する性質を有する蛍光試薬を適用する第１のステップと、第１のステップで得られた生体試料に含まれる蛍光試薬を励起させた状態において、当該生体試料を共焦点顕微鏡撮影並びに光電変換処理することにより、１もしくは２以上の細胞を視野に含む蛍光画像を取得する第２のステップと、第２のステップで取得された蛍光画像の所定領域内の構成画素の輝度総和を求める第３のステップと、第３のステップで求められた構成画素の輝度総和に基づいて細胞内のミトコンドリアから発生する活性酸素の量を同定する第４のステップと、を具備することを特徴とするものである。
生体細胞内における活性酸素の発生源としては、従前よりミトコンドリアが疑われていたが、従来の手法では細胞内に活性酸素が存在することは証明出来ても、それらの活性酸素がいずれの小器官より発生したものかを特定することは出来なかった。本発明者らは以下の手法にてミトコンドリアから発生する活性酸素についての検証を行い、細胞内の活性酸素の多くがミトコンドリアから発生していることを検証した。
１４３Ｂ細胞に蛍光試薬を適用し顕微鏡撮影したものが図１９に示されている。同図において１ａはＨＥで細胞内の活性酸素を蛍光染色した状態、１ｂはミトコンドリアグリーンにて細胞内のミトコンドリアを染色した状態、１ｃは１ａと１ｂを重ね合わせたものである。また、２ａはＨＰＦで細胞内の活性酸素を蛍光染色した状態、２ｂはミトコンドリアレッドにて細胞内のミトコンドリアを染色した状態、２ｃは２ａと２ｂを重ね合わせた状態である。ＨＥの染色領域はミトコンドリア画像と完全には重ならないが（１ｃ）、ＨＰＦの染色領域はミトコンドリアと完全に一致することが同図より明らかである。
蛍光試薬であるＨＰＦ及びＡＰＦの構造が図４に示されている。ＨＰＦはＨｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＡＰＦはＡｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎであり、いずれもヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）、パーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ−）を特異的に検出する蛍光試薬である。ヒドロキシラジカル、パーオキシナイトライト等の活性酸素を生産する細胞にＨＰＦもしくはＡＰＦを添加し、レーザ光で励起させることにより活性酸素を発生している箇所のみが染色される。活性酸素と反応する前の（ａ）の状態ではＨＰＦ、ＡＰＦ共にほとんど蛍光が見られないが、活性酸素と反応した後の（ｂ）の状態では高い蛍光が見られる。
また、他の蛍光試薬であるＤＭＡＸの構造が図５に示されている。ＤＭＡＸは９−［２−（３−ｃａｒｂｏｘｙ−９，１０−ｄｉｍｅｔｈｙｌ）ａｎｔｈｒｙｌ］−６−ｈｙｄｒｏｘｙ−３Ｈ−ｘａｎｔｈｅｎ−３のことであり、一重項酸素との反応性が高い蛍光試薬である。一重項酸素を生産する細胞にＤＭＡＸを投与した後レーザ光で励起させることにより一重項酸素を生産する部位が蛍光発色する。ＤＭＡＸ−ＤＡ（ａ）を加水分解する、もしくはｅｓｔｅｒａｓｅと反応させることによりＤＭＡＸ（ｂ）が得られ、ＤＭＡＸ（ｂ）が一重項酸素と反応することによりＤＭＡＸ−ＥＰ（ｃ）となる。ＤＭＡＸ−ＤＡ（ａ）の状態では蛍光が見られないが、ＤＭＡＸ（ｂ）となると低い傾向が見られ、一重項酸素と反応しＤＭＡＸ−ＥＰ（ｃ）となると高い蛍光が見られる。
本願発明者は、ＨＰＦ、ＤＭＡＸ等の蛍光試薬を用いて生体試料を蛍光染色することにより、ミトコンドリアから発生する活性酸素を蛍光着色できることを発見した。この知見に基づき、抗酸化材の投与前後における活性酸素量の変化を測定可能とし、抗酸化材の抗酸化能を定量的に測定できるようになった。
本願の第一実施形態が図１５に示されている。標準個体１００より生体試料（Ａ）を採取し２つに分け、一方の生体試料には測定対象となる抗酸化材（Ｂｘ）を、もう一方には測定基準となる抗酸化材（Ｂｒｅｆ）を加える。抗酸化材を投与した生体試料に活性酸素誘因刺激（Ｃ）と、活性酸素を染色する蛍光試薬（Ｅ）とを与え所定時間（たとえば２時間程度）静置し、その後投与した蛍光試薬を励起させ共焦点顕微鏡にて撮影を行う。得られた顕微鏡画像を画像処理しそれぞれの画像ごとに輝度総和を求め、測定対象となる抗酸化材の輝度総和（Ｄｘ）と測定基準となる抗酸化材の輝度総和（Ｄｒｅｆ）より活性酸素の残量を算出し、測定対象となる抗酸化材の抗酸化能を求める。
測定対象となる抗酸化材の抗酸化能＝（Ｄｘ）／（Ｄｒｅｆ）
本願の第二実施形態が図１６に示されている。標準個体１００より生体試料（Ａ）を採取し２つに分け、生体試料のそれぞれに活性酸素誘因刺激（Ｃ）と活性酸素を染色する蛍光試薬（Ｅ）とを加える。活性酸素誘因刺激（Ｃ）を加えた生体試料（Ａ）に、一方の生体試料には測定対象となる抗酸化材（Ｂｘ）を、もう一方には測定基準となる抗酸化材（Ｂｒｅｆ）を加え所定時間静置し、その後投与した蛍光試薬を励起させ共焦点顕微鏡にて撮影を行う。得られた顕微鏡画像を画像処理しそれぞれの画像ごとに輝度総和を求め、測定対象となる抗酸化材の輝度総和（Ｄｘ）と測定基準となる抗酸化材の輝度総和（Ｄｒｅｆ）より活性酸素の残量を算出し、測定対象となる抗酸化材の抗酸化能を求める。
本願の第三実施形態（その１）が図１７に示されている。まず特定個体２００に測定対象となる抗酸化材を経口投与し、その後血液・細胞等を取り抗酸化材の体内摂取量を測定する。測定された体内摂取量に応じて、生体試料（Ａ）への抗酸化材（Ｂｘ，Ｂｒｅｆ）投与量を決定する。これにより、この後の抗酸化能テストを抗酸化材を実際に経口投与した場合と同様の条件で行える為、実際に抗酸化材を摂取した場合とほぼ同条件で試験が行える。
特定個体２００より生体試料（Ａ）を生体試料Ａを採取し２つに分け、一方の生体試料には測定対象となる抗酸化材（Ｂｘ）を、もう一方には測定基準となる抗酸化材（Ｂｒｅｆ）を加える。抗酸化材を加えた生体試料に活性酸素誘因刺激（Ｃ）と活性酸素を染色する蛍光試薬（Ｅ）とを与え所定時間静置し、その後投与した蛍光試薬を励起させ共焦点顕微鏡にて撮影を行う。得られた顕微鏡画像を画像処理しそれぞれの画像ごとに輝度総和を求め、測定対象となる抗酸化材の輝度総和（Ｄｘ）と測定基準となる抗酸化材の輝度総和（Ｄｒｅｆ）より活性酸素の残量を算出し、測定対象となる抗酸化材の抗酸化能を求める。
本願の第三実施形態（その２）が図１８に示されている。先の例と同様に、まず特定個体２００に測定対象となる抗酸化材を経口投与し、その後血液・細胞等を取り抗酸化材の体内摂取量を測定し、体内摂取量に応じて生体試料（Ａ）への抗酸化材（Ｂｘ，Ｂｒｅｆ）投与量を決定する。特定個体２００より生体試料（Ａ）を採取し２つに分け、分けた生体試料のそれぞれに活性酸素誘因刺激（Ｃ）と活性酸素を染色する蛍光試薬（Ｅ）とを与える。活性酸素誘因刺激（Ｃ）を与えた生体試料（Ａ）に、一方の生体試料には測定対象となる抗酸化材（Ｂｘ）を、もう一方には測定基準となる抗酸化材（Ｂｒｅｆ）を加え所定時間（たとえば２時間程度）静置し、その後投与した蛍光試薬を励起させ共焦点顕微鏡にて撮影を行う。得られた顕微鏡画像を画像処理しそれぞれの画像ごとに輝度総和を求め、測定対象となる抗酸化材の輝度総和（Ｄｘ）と測定基準となる抗酸化材の輝度総和（Ｄｒｅｆ）より活性酸素の残量を算出し、測定対象となる抗酸化材の抗酸化能を求める。
なお、図１５〜１８の例においては、測定対象となる抗酸化材と基準となる抗酸化材の２つで比較したが、生体試料を３つ以上にわけて複数の抗酸化材の抗酸化能を同時に測定するようにしてもよいし、まったく抗酸化材を用いないブランクサンプルを用いるようにしてもよい。また、蛍光試薬（Ｅ）の投与タイミングと、抗酸化材（Ｂｘ、Ｂｒｅｆ）や活性酸素誘因刺激（Ｃ）を与えるタイミングとの前後関係は特定しないが、蛍光試薬（Ｅ）が変質しやすい種類のものである場合には投与タイミングを検討する必要がある。
本願に係る抗酸化能測定方法においては、抗酸化能を有する物質の投与前、もしくは投与後に生体試料にストレスを与え活性酸素をより多く発生させることが望ましい。より多く活性酸素を発生させることにより、基準となる抗酸化材と、測定対象となる抗酸化材との抗酸化能の差異がより顕著に現れる。ここで生体試料にストレスを与える方法としては、Ｘ線照射、サイトカイン投与、抗ガン剤投与などが考えられる。
抗酸化能を有する物質により活性酸素が抑制される状態が図２に示されている。図２（ａ）は、細胞にＸ線照射を行い、その２時間後に細胞を観察したものである。同図において、着色されているのはミトコンドリア由来の活性酸素が発生している箇所である。この図より、Ｘ線照射によりミトコンドリアから多量の活性酸素が発生している様子がわかる。次に図２（ｂ）は、細胞にＸ線照射を行い、その直後にビタミンＥを投与し、２時間後に細胞を観察したものである。図２（ａ）と比較して明らかに活性酸素の発生量が抑制されていることがわかる。
この測定は、以下の手順で行われている。
１．細胞培養
２．Ｘ線照射
３．培養液置換
４．蛍光染色（ＨＰＦ）
５．レーザ光による励起、蛍光発色観察（図２）
図２（ａ）に示されているのは、細胞にＸ線照射を行いその２時間後にヒドロキシラジカルを観察したものである。ミトコンドリアのみを染色した写真との比較により、ミトコンドリアより多量の活性酸素が発生したことがわかった。対して、図２（ｂ）に示されているのはＸ線照射直後にビタミンＥを投与した場合の２時間後のヒドロキシラジカルの状態である。図２（ａ）の場合と比べて明らかに発光の度合いが小さく活性酸素の発生が少ないことが分かった。この結果より、ビタミンＥを投与することにより活性酸素の発生が抑制されるということが証明された。
図２に示された細胞の蛍光発色の度合いを比べたグラフが図１２に示されている。同図において、（ａ）は生体試料にＸ線（１８．８Ｇｙ）照射のみを行った場合の蛍光感度、（ｂ）はＸ線照射の３時間前にビタミンＥを投与した場合の蛍光感度、（ｃ）はＸ線を照射した直後にビタミンＥを投与した場合の蛍光感度である。なお、活性酸素の蛍光染色にはＨＰＦを用いた。同図より、Ｘ線照射の２時間前に抗酸化材であるビタミンＥを投与した（ｂ）と、Ｘ線照射直後に抗酸化材であるビタミンＥを投与した（ｃ）とでは、蛍光感度はほぼ同等の値であるのに対して、Ｘ線照射のみで抗酸化材を一切投与していない（ａ）では、（ｂ），（ｃ）と比べて、活性酸素の発生量が１割以上多いことがわかる。このことより、ビタミンＥは活性酸素の発生を抑制することと、ビタミンＥはＸ線照射によってほとんど影響を受けていないことがわかった。即ち図１２からは、Ｘ線照射の前後にかかわらずビタミンＥを投与することにより活性酸素の発生が抑制されるということがわかる。活性酸素誘因刺激を与えるタイミングは抗酸化材の種類等により適宜決定可能である。
次に、図１２の場合において、蛍光染色剤としてＤＭＡＸを用いた例が図１３に示されている。ヒドロキシラジカルを選択的に染色するＨＰＦに対して、ＤＭＡＸは一重項酸素を選択的に染色する蛍光染色剤である。同図において、（ａ）はＸ線（１８．８Ｇｙ）照射のみを行った場合の蛍光感度、（ｂ）はＸ線照射の３時間前にビタミンＥを投与した場合の蛍光感度、（ｃ）はＸ線を照射した直後にビタミンＥを投与した場合の蛍光感度を示している。ＤＭＡＸで染色を行った場合でもＨＰＦのときと同様に、ビタミンＥの投与タイミングによる蛍光感度の差は見られなかった（（ｂ）、（ｃ）参照）。これに対して、Ｘ線照射のみを行った（ａ）では、活性酸素の発生量が（ｂ）、（ｃ）と比べて１割以上多く、活性酸素発生量が多いことがわかる。
生体試料にＸ線（１８．８Ｇｙ）を照射した後の、アポトーシス発生率を比較するグラフが図１４に示されている。図１２、図１３の場合と同様にそれぞれ（ａ）Ｘ線（１８．８Ｇｙ）照射のみを行った場合、（ｂ）Ｘ線照射の３時間前にビタミンＥを投与した場合、（ｃ）Ｘ線照射直後にビタミンＥを投与した場合である。なお、蛍光染色剤としてはＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いた。Ｘ線照射のみを行った（ａ）のアポトーシス発生率と、ビタミンＥを投与した（ｂ）、（ｃ）のアポトーシス発生率とでは明らかに異なり、ビタミンＥを投与した（ｂ）、（ｃ）では、ビタミンＥを投与していない（ａ）の１／５程度までアポトーシス発生率が落ちている。このことより、活性酸素の抑制によりアポトーシス発生率が下がることが予測される。
様々な細胞をＨＰＦで蛍光染色した状態が図６に、様々な細胞をＤＭＡＸで染色した状態が図７に、それぞれ示されている。図６，７において、（ａ）はヒト細胞（１４３Ｂ）、（ｂ）はｍｔＤＮＡ欠損細胞（ρ０）、（ｃ）はρ０細胞に正常ミトコンドリアを戻し入れた細胞（８７ＷＴ）、（ｄ）は不死化したヒト子宮ガン細胞（Ｈｅｌａ）、（ｅ）は（ＢＨ５）、（ｆ）は（ＢＨ５０）、（ｇ）は（ＢＨ３＃１２）をそれぞれＨＰＦにて蛍光染色したものである。蛍光染色の手順は、先に示した方法と同じである。同図より、１４３Ｂ細胞や８７ＷＴ細胞等では活性酸素が多量に発生しているが、ｍｔＤＮＡが欠損したρ０細胞では活性酸素の発生量が少ないことがわかる。
図６、図７に示された写真の蛍光強度をグラフ化したものが図８〜１１に示されている。図８及び図９はＨＰＦを用いて蛍光染色した細胞の蛍光感度を表したものであり、図６中の（ａ）〜（ｆ）の蛍光感度を数値化したものである。同様に、図１０及び図１１はＤＭＡＸを用いて蛍光染色した細胞の蛍光感度を表したものであり、図７中の（ａ）〜（ｆ）の蛍光感度を数値化したものである。
ミトコンドリアの細胞内における働き等はよく知られたことであるが、念のため以下において簡単に説明する。
ミトコンドリアの膜表面における内外物質の移動を示す模式図が図３に示されている。同図において、１は外膜、２は複合体（Ｃｏｍｐｌｅｘ、以下同じ）Ｉ、３は複合体ＩＩ、４は複合体ＩＩＩ、５は複合体ＩＶ、６はＡＴＰ合成酵素、７はＡＴＰ／ＡＤＰ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ、８は内膜、９はチトクロムＣ、１０は補酵素Ｑ、を示しており、外膜１の設けられた側（即ち、図の下部）がミトコンドリアの外側であり、内膜８の設けられた側（即ち図の上部）がミトコンドリアの内側である。
ミトコンドリアの膜表面の反応の模式図が図３に示されている。先に説明したように、１は外膜、２は複合体Ｉ、３は複合体ＩＩ、４は複合体ＩＩＩ、５は複合体ＩＶ、６はＡＴＰシンターゼ、７はＡＴＰ／ＡＤＰトランスロケータ、８は内膜、９はチトクロムＣ、１０は補酵素Ｑであり、複合体Ｉ〜ＩＶまでの過程が電子伝達系である。
ＮＡＤＨ２＋として運ばれた水素は複合体Ｉから膜間スペースへ移動し、同時に補酵素Ｑへ２個の電子が渡される。一方、ＦＡＤＨ２として運ばれた電子も複合体ＩＩから補酵素Ｑへ渡される。還元型ユビキノンの水素は複合体ＩＩＩとの連鎖で２Ｈ＋として外れて膜間スペースへ移動する。同時に、電子は複合体ＩＩＩに渡される。複合体ＩＩＩに渡された電子はミトコンドリア膜表在性のシトクロムＣを経て複合体ＩＶに送られる。複合体ＩＶは、還元型シトクロムＣを酸化し、生じた電子がＯ２分子に渡される。１／２分子のＯ２がマトリックス内の２個のＨ＋と結合すると１分子の水がつくられる。
本願において、活性酸素を染色するために用いる蛍光試薬としてはＨＰＦもしくはＤＭＡＸが好ましい。ＤＣＦ、ＤＨＲ、ＨＥのような従前の蛍光試薬は、活性酸素と作用した後にプラスもしくはマイナスに帯電し、逆の電荷を有する箇所に偏ってしまうことがあった。つまりこれらの蛍光試薬では、活性酸素の染色を行った後にその箇所に止まらないため染色された活性酸素が元々どこで発生したものであるかを特定するのは非常に困難であった。これに対して、本願で用いたＨＰＦ、ＤＭＡＸによれば、従前の蛍光試薬のように特定の側に電荷が偏るということが起こらず、活性酸素の発生箇所が確実に特定可能である。
【実施例１】  ＜細胞培養及び活性酸素測定法＞
本実施例では、ヒト細胞（１４３Ｂ）を用いた（他の細胞でもよい）。ヒト細胞は、１０％牛胎児血清を含むダルベッコＭＥＭ培養液を用い、３７℃にて５％炭酸ガスを含む空気中で培養した。細胞を上記の培養液を含むグラスボトムディッシュ（ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐ．，Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）に播種し、およそ１日上記の条件にて培養する。このの培養液をハンクス液（ＨＢＳＳ）（１０．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１．０ｍＭ  ＭｇＣ１２，２ｍＭ  ＣａＣ１２，ａｎｄ  ２．７ｍＭ  ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ０．０５）に置換する。活性酸素の観察には、活性酸素種のうちヒドロキシラジカルを比較的特異的に反応し蛍光を発するＨＰＦを用いた。（一重項酸素観察用のＤＭＡＸでも同様な結果が得られている。）共焦点レーザ顕微鏡にて、５００μＷの４８８ｎｍの励起光を０．４秒間照射し、５１５ｎｍバリアフリーフィルターを用い、観察する。画像はコンピューターに保存し、後、コンピューター上で蛍光強度を、作成したプログラムを用いて求める。
＜抗酸化能測定試験＞
細胞をグラスボトムディッシュに播種し上記のごとく培養する。培養開始１日後、Ｘ線照射装置（ＭＢＲ−１５０５Ｒ（日立社製））を用い、１５Ｇｙ照射を行う。その後、ただちに５％炭酸ガスインキュベーターに細胞を戻し、２時間後、１ｍｌのＨＢＳＳに培養液を入れ替えし、１μｌのＨＰＦを最終濃度１０μｇ／ｍｌになるように加え、共焦点レーザ顕微鏡にて蛍光を観察、コンピューターに保存し、後、コンピューター上で蛍光強度を作成したプログラムを用い強度を求める。この照射に伴い、照射の直後に最終濃度１０μｇ／ｍｌになるようにＤＭＳＯに溶解したビタミンＥ１μｌを培養液に加え２時間インキュベーターに同様にもどす。その後、前述のように蛍光を測定する。ビタミンＥ投与、非投与の蛍光強度から比を求める。
食品等から抽出した抗酸化剤について、ビタミンＥと同様に培養液に加え、ＨＰＦ蛍光強度を調べ、ビタミンＥ投与の場合と比較することにより、抗酸化能を調べる。ＨＰＦを用いた活性酸素検出は、ミトコンドリア付近に認められ、ミトコンドリア特定検出試薬（Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ）の分布と一致したことにより、ＨＰＦを用いるとミトコンドリアから発生する活性酸素を検出していることが検証された。
【産業上の利用可能性】  以上より明らかなように、本願によれば細胞内の活性酸素のうちミトコンドリアから発生した活性酸素を特定することが可能である。また、本発明によれば画像の所定領域画像を一様に輝度積算するだけでミトコンドリアから発生する活性酸素量を測定することが可能であり、ミトコンドリアの内外判定不要で処理が簡易で処理時間が短縮する。
さらに、本願にかかる抗酸化材の抗酸化能を定量化する方法によれば、様々な食品・薬剤等の抗酸化能を測定し、視覚的に認識することが可能である。また、顕微鏡撮影を行い得られた画像について画像処理を行うことにより食品・薬剤等の抗酸化能を数値化して比較することが可能である。
【図１】
2005103282.tif 000002
【図２】
2005103282.tif 000003
【図３】
2005103282.tif 000004
【図４】
2005103282.tif 000005
【図５】
2005103282.tif 000006
【図６】
2005103282.tif 000007
【図７】
2005103282.tif 000008
【図８】
2005103282.tif 000009
【図９】
2005103282.tif 000010
【図１０】
2005103282.tif 000011
【図１１】
2005103282.tif 000012
【図１２】
2005103282.tif 000013
【図１３】
2005103282.tif 000014
【図１４】
2005103282.tif 000015
【図１５】
2005103282.tif 000016
【図１６】
2005103282.tif 000017
【図１７】
2005103282.tif 000018
【図１８】
2005103282.tif 000019
【図１９】
2005103282.tif 000020
【国際調査報告】
2005103282.tif 000021
2005103282.tif 000022
2005103282.tif 000023
2005103282.tif 000024
2005103282.tif 000025
2005103282.tif 000026