(57)【要約】  本発明は、単純反復配列(SSRs)を含むＤＮＡを単離するための方法を提供する。本発明は、(1)２本鎖ＤＮＡプラスミドライブラリーを、単離すべき単純反復配列を含むプローブと、相同組換え蛋白質の存在下でインキュベートする工程と、(2) プローブとハイブリダイズしたプラスミドを単離する工程を含む、SSRsを含む２本鎖ＤＮＡの単離方法である。あるいは本発明は、この方法に有用な、キット、プローブ、あるいはプローブの製造方法を提供する。本発明のプローブは、単純反復配列からなる領域と、その5'側および3'側のいずれか、または両方に連結された、単純反復配列以外の塩基配列で構成された領域によって構成される。本発明のプローブは、3'側に連結された領域をビオチン等の結合性リガンドで修飾することもできる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程を含む、単純反復配列を含む２本鎖DNAの単離方法。
(1) ２本鎖DNAプラスミドライブラリーを、単離すべき単純反復配列を含むプローブと、相同組換え蛋白質の存在下でインキュベートする工程、
(2) プローブとハイブリダイズしたプラスミドを単離する工程
【請求項２】
プラスミドライブラリーがゲノムの断片を含むプラスミドライブラリーである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プラスミドを単離する工程が、次の工程(2a)−(2c)を含む請求項２に記載の方法。
(2a) プローブとハイブリダイズしたプラスミドを回収する工程、
(2b) 回収されたプラスミドを、当該プラスミドを導入することができる宿主細胞に形質転換する工程、および
(2c) 増幅されたプラスミドを前記宿主細胞から回収する工程
【請求項４】
プローブが、次の領域(a)および(b)からなる請求項１に記載の方法。
(a) 単純反復配列からなる領域、および
(b) 領域(a)の3’側および5’側の両方、またはいずれかに位置し、単純反復配列以外の塩基配列で構成された領域
【請求項５】
領域(b)の塩基配列が、a、t、c、g、およびuからなる群から選択されるいずれかの塩基が連続した配列である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
プローブが領域(b)に結合性リガンドを有している請求項４に記載の方法。
【請求項７】
プラスミドとプローブをインキュベートする前、または後に、結合性リガンドに結合する固相にプラスミドを捕捉する工程を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
領域(a)の長さが２５−１００塩基である請求項４に記載の方法。
【請求項９】
領域(b)の長さが３０−６０塩基である請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
プローブが、領域(a)を構成する単純反復配列の反復の数が異なる複数種のプローブを含む請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
相同組換え蛋白質が、RecA蛋白質、Rad51蛋白質、およびRad52蛋白質からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
次の要素を含む、単純反復配列の単離用のキット。
i) 次の領域(a)および(b)からなり、かつ領域(b)に結合性リガンドを有するプローブ、
(a) 単純反復配列からなる領域、および
(b) 領域(a)の3’側および5’側の両方、またはいずれかに位置し、単純反復配列以外の塩基配列で構成された領域、
ii) 相同組換え蛋白質、および
iii) 前記結合性リガンドと結合する固相
【請求項１３】
次の工程を含む反復配列にハイブリダイズするプローブの製造方法。
A) 3’側に配置された反復配列と、5’側に配置された反復配列以外の任意の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを鋳型とし、少なくとも3'末端に前記鋳型の反復配列に相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして相補鎖を合成する工程、および
B) 工程A)で合成された相補鎖を回収する工程
【請求項１４】
次の領域(a)および(b)からなるプローブ。
(a) 単純反復配列からなる領域、および
(b) 領域(a)の3’側および5’側の両方、またはいずれかに位置し、単純反復配列以外の塩基配列で構成された領域、
【請求項１５】
プローブが、領域(a)を構成する単純反復配列の反復の数が異なる複数種のプローブを含む混合物である請求項１４に記載のプローブ。
【請求項１６】
プローブが、領域(b)に結合性リガンドおよびシグナル生成分子のいずれか、または両方を有する請求項１４に記載のプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、反復配列を含む２本鎖DNAの単離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
単純反復配列(Simple Sequence Repeats;SSRs)は、短い単純配列が２回以上繰り返し連続した塩基配列である。単純反復配列を構成する塩基配列は、たとえばgagagaga....のような、比較的短い塩基配列の繰り返しで構成されている。 この例のように２塩基単位の繰り返し配列は、特にタンデムリピート(tandem repeat)と呼ばれる。反復配列をゲノム中に有することは、真核生物の一般的な特徴である。単純反復配列を含むＤＮＡには、サテライトＤＮＡ、ミニサテライトＤＮＡ、およびマイクロサテライトＤＮＡ等と呼ばれるいつくかのファミリーの存在が明らかにされている。【０００３】
サテライトＤＮＡは、塩化セシウムの密度勾配中でゲノムＤＮＡを遠心分離したときに、ゲノムＤＮＡの平均的なＧ＋Ｃ含量に相当するバンドから離れた位置（サテライト）に分離されるＤＮＡとして同定された反復配列である。染色体の上では、主にセントロメアあるいはテロメア領域に存在することが明らかにされている。サテライトＤＮＡを構成する塩基配列はタンデムリピートである。サテライトＤＮＡの塩基配列は、生物種間のみならず、同じ種内でも高度な多様性が確認されている。サテライトＤＮＡは、品種間の遺伝学的な相違を確認するためのマーカーなどとして有用である。【０００４】
タンデムリピート配列は、セントロメアやテロメアなどの特定の領域だけでなく、ゲノム全体に散在している。ゲノム中に散在するSSRsの一つとして同定されたのが、ミニサテライトＤＮＡである。ミニサテライトＤＮＡは、種内で多型を示すため、ＤＮＡフィンガープリント法に利用されている。たとえば、法医学分野で、個人識別や親子関係の同定のための指標として用いられているのもミニサテライトＤＮＡである。動植物においては、ミニサテライトＤＮＡを品種の同定に利用することもできる。【０００５】
マイクロサテライトＤＮＡもミニサテライトＤＮＡと同様に、ゲノム全体に見られるSSRsで構成されるＤＮＡである。哺乳類では、(dA.dT)nの繰り返し配列が一般的である。ヒトでは、(dCA.dTG)n、あるいは(dCT.dAG)nの繰り返しが、それぞれゲノムの０．５%および０．２%の割合で存在する。３塩基以上の繰り返し単位からなるマイクロサテライトＤＮＡも存在するが、通常、その頻度は高くない。実際には２−５塩基程度の繰り返し配列で構成されるマイクロサテライト配列の存在が明らかにされている。【０００６】
マイクロサテライトＤＮＡは、ゲノム全体に広く分布することから、特に遺伝マーカーとしての有用性が高い。たとえば、特定の形質と遺伝学的な関連性を有するマイクロサテライトＤＮＡを明らかにすることができれば、そのマイクロサテライトＤＮＡの近くに、特定の形質と関連する遺伝子（あるいは転写調節領域）が存在する可能性が高い。このような遺伝解析を進めるためには、数多くのマイクロサテライトＤＮＡの情報を集積して、ゲノムの全体をできるだけ高密度にカバーすることが必要である。【０００７】
各種の反復配列は、基本的には次のような操作によって単離することができる。まず、ゲノムをランダムに切断したゲノムライブラリーを調製する。ライブラリーを構成する断片配列に、反復配列を含むプローブをハイブリダイズさせ、ポジティブクローンを単離する。単離されたポジティブクローンの塩基配列を決定すれば、反復配列の塩基配列を明らかにすることができる(Karagyozov et al, Nucleic Acid Research, 1993, Vol.21, No.16 3911-3912; Zane et al, Mol Ecol. 2002 Jan;11(1):1-16.)。しかし実際には、種々の制約のために、反復配列の効率的な取得が妨げられていた。【０００８】
制約の一つに、ＰＣＲ法の利用がある。たとえば、断片化したゲノムライブラリーを反復配列を含むプローブでスクリーニングした場合、ハイブリダイズしたゲノム断片はＰＣＲ法で増幅してクローニングされる（図２）。このとき、ゲノム断片の全てを均等に増幅することは、現在の技術では困難である。たとえば、比較的短い塩基配列が優先的に増幅される結果、クローニングされる反復配列も短いものに偏る可能性が高い。つまり、より長い反復配列の情報が失われる恐れがある。
【非特許文献１】Karagyozov et al, Nucleic Acid Research, 1993, Vol.21, No.16 3911-3912,Construction of random small-insert genomic libraries highly enriched  for simple sesquence repeats
【非特許文献２】Zane et al, Mol Ecol. 2002 Jan;11(1):1-16., Strategies for microsatellite isolation: a review.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、SSRsを含むＤＮＡを単離するための技術の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
SSRsを含むＤＮＡは、主に、プローブとのハイブリダイズと、ハイブリダイズしたゲノム断片のクローニングによって単離される。これらの工程において、反復配列を偏り無く単離することができれば、結果的に、効率的な反復配列の単離を実現できる。具体的には、まずプローブとのハイブリダイズの段階で、SSRsを含むＤＮＡが網羅的にスクリーニングされる必要がある。すなわち、スクリーニングに用いるプローブが、与えられたストリンジェンシーの元で、目的とするゲノム断片に十分にハイブリダイズしうる条件が与えられる必要がある。また先に述べたように、たとえばＰＣＲ法を応用すると、反応の過程で単離される反復配列に偏りが生じる可能性が予測された。したがって、たとえば、ＰＣＲ法に依存しないで目的とするＤＮＡを単離することができる方法を提供することができれば有用である。【００１１】
このような条件を満たすために、本発明者らは、ゲノム断片を保持したプラスミドベクターを直接スクリーニングすることで、ポジティブクローンを効率的に単離しうることを見出し本発明を完成した。更に本発明者らは、スクリーニング用のプローブのデザインについて検討を重ねた。その結果、特定の構造を有するプローブが、SSRsを含むＤＮＡの単離において有用であることを明らかにして本発明を完成した。すなわち本発明は、以下のSSRsを含むＤＮＡの単離方法、そのためのキット、並びにSSRsを含むＤＮＡの単離用のプローブとその製造方法に関する。
〔１〕次の工程を含む、単純反復配列を含む２本鎖DNAの単離方法。
(1) ２本鎖DNAプラスミドライブラリーを、単離すべき単純反復配列を含むプローブと、相同組換え蛋白質の存在下でインキュベートする工程、
(2) プローブとハイブリダイズしたプラスミドを単離する工程
〔２〕プラスミドライブラリーがゲノムの断片を含むプラスミドライブラリーである〔１〕に記載の方法。
〔３〕プラスミドを単離する工程が、次の工程(2a)−(2c)を含む〔２〕に記載の方法。
(2a) プローブとハイブリダイズしたプラスミドを回収する工程、
(2b) 回収されたプラスミドを、当該プラスミドを導入することができる宿主細胞に形質転換する工程、および
(2c) 増幅されたプラスミドを前記宿主細胞から回収する工程
〔４〕プローブが、次の領域(a)および(b)からなる〔１〕に記載の方法。
(a) 単純反復配列からなる領域、および
(b) 領域(a)の3’側および5’側の両方、またはいずれかに位置し、単純反復配列以外の塩基配列で構成された領域
〔５〕領域(b)の塩基配列が、a、t、c、g、およびuからなる群から選択されるいずれかの塩基が連続した配列である〔４〕に記載の方法。
〔６〕プローブが領域(b)に結合性リガンドを有している〔４〕に記載の方法。
〔７〕プラスミドとプローブをインキュベートする前、または後に、結合性リガンドに結合する固相にプラスミドを捕捉する工程を含む、〔６〕に記載の方法。
〔８〕領域(a)の長さが２５−１００塩基である〔４〕に記載の方法。
〔９〕領域(b)の長さが３０−６０塩基である〔４〕に記載の方法。
〔１０〕プローブが、領域(a)を構成する単純反復配列の反復の数が異なる複数種のプローブを含む〔４〕に記載の方法。
〔１１〕相同組換え蛋白質が、RecA蛋白質、Rad51蛋白質、およびRad52蛋白質からなる群から選択される〔１〕に記載の方法。
〔１２〕次の要素を含む、単純反復配列の単離用のキット。
i) 次の領域(a)および(b)からなり、かつ領域(b)に結合性リガンドを有するプローブ、
(a) 単純反復配列からなる領域、および
(b) 領域(a)の3’側および5’側の両方、またはいずれかに位置し、単純反復配列以外の塩基配列で構成された領域、
ii) 相同組換え蛋白質、および
iii) 前記結合性リガンドと結合する固相
〔１３〕次の工程を含む反復配列にハイブリダイズするプローブの製造方法。
A) 3’側に配置された反復配列と、5’側に配置された反復配列以外の任意の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを鋳型とし、少なくとも3'末端に前記鋳型の反復配列に相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして相補鎖を合成する工程、および
B) 工程A)で合成された相補鎖を回収する工程
〔１４〕次の領域(a)および(b)からなるプローブ。
(a) 単純反復配列からなる領域、および
(b) 領域(a)の3’側および5’側の両方、またはいずれかに位置し、単純反復配列以外の塩基配列で構成された領域、
〔１５〕プローブが、領域(a)を構成する単純反復配列の反復の数が異なる複数種のプローブを含む混合物である〔１４〕に記載のプローブ。
〔１６〕プローブが、領域(b)に結合性リガンドおよびシグナル生成分子のいずれか、または両方を有する〔１４〕に記載のプローブ。
あるいは本発明は、上記〔１３〕に記載の製造方法によって得ることができるプローブに関する。また本発明は、〔１４〕に記載した要素(a)および(b)からなるプローブの、単純反復配列を含む２本鎖DNAの単離における使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明に基づく単純反復配列の単離方法の、好ましい態様を示す図。(a)相補鎖合成によって得られた単純反復配列とそれ以外の配列からなるプローブ。相補鎖合成によって伸長した部分には、ビオチン(B)が導入されている。(b)１本鎖化されたプローブと円で示したプラスミドがハイブリダイズによって３本鎖を形成している。(c)ストレプトアビジンを有する磁性粒子によって、プローブが捕捉され、更にハイブリダイズしたプラスミドが回収される。
【図２】従来技術に基づく、ゲノム中のSSRsなどの単離方法を示す図。断片化されたゲノムＤＮＡは、まずアダプターが付加され、平滑末端化される(bluntended)。次いでビオチン化したプローブとハイブリダイズされる。(d)ハイブリダイズしたゲノム断片は、ストレプトアビジンを有する磁性粒子によって回収される。(e)回収されたゲノム断片がＰＣＲで増幅される。(f)増幅産物がプラスミドに組み込まれ、クローニングされる。
【図３】相補鎖合成による本発明のプローブの合成方法を示す図。
【図４】本発明によってイネのゲノムから単離された単純反復配列を含むＤＮＡの数と種類を示す。図中、左の縦軸は単離されたＤＮＡのクローン数またはその種類(cluster)の数を示す。左側のカラムが単離されたＤＮＡのクローン数を、右側のカラムがその種類(cluster)の数を示している。更に横軸は、単離に使用したプレートの数を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、次の工程を含む、単純反復配列(SSRs)を含む２本鎖DNAの単離方法に関する。
(1) ２本鎖ＤＮＡプラスミドライブラリーを、単離すべき単純反復配列を含むプローブと、相同組換え蛋白質の存在下でインキュベートする工程、および
(2) プローブとハイブリダイズしたプラスミドを単離する工程【００１４】
本発明において、プラスミドライブラリーとは、スクリーニングすべきＤＮＡを保持した複数種のプラスミドの集合体である。本発明におけるプラスミドは、SSRsを含む可能性のあるＤＮＡを保持した２本鎖のＤＮＡからなる。またライブラリーを構成するプラスミドは、好ましくは、適当な宿主細胞に形質転換することによって増幅することができるＤＮＡである。プラスミドの形状は限定されない。通常、プラスミドは環状２本鎖ＤＮＡである。あるいは直鎖状２本鎖ＤＮＡであっても、宿主細胞に形質転換することによって、増幅することができるプラスミドは、本発明におけるプラスミドとして好ましい。【００１５】
なおプラスミドの宿主細胞における増幅とは、たとえば、細胞内におけるコピー数の増加を含む。また、細胞当たりのコピー数とは無関係に、細胞の分裂に伴って分裂した細胞にプラスミドが伝達される場合にも、プラスミドは増幅される。たとえば細胞当たり１つのプラスミドのみを保持している場合でも、分裂によって細胞数が増加すれば、プラスミドの数は増える。細胞の分裂は、酵母における出芽を含む。【００１６】
本発明において、スクリーニングすべきＤＮＡは、SSRsを含む可能性のあるＤＮＡである。ＤＮＡの由来は限定されない。通常、細胞のゲノム由来のＤＮＡが用いられる。細胞のゲノム由来のＤＮＡを対象とすることによって、SSRsを含むＤＮＡをゲノム全体から単離することができる。あるいは、BACクローン、またはYACクローンなどに由来するＤＮＡを対象とすることもできる。特定のBACクローン、またはYACクローン由来の断片を対象とすることによって、ゲノムの特定の領域から、SSRsを含むＤＮＡを単離することができる。【００１７】
以下、特に断らない限り、「ゲノムＤＮＡ」と記載するときは、ＤＮＡの由来は限定されない。したがって、「ゲノムＤＮＡ」は、細胞由来のＤＮＡ、およびBAC、YAC、あるいはコスミドベクターなどの単離されたゲノム断片に由来するＤＮＡを含む。【００１８】
ゲノムＤＮＡは、必要に応じて断片化してプラスミドに挿入することができる。断片の大きさは、スクリーニングすべきSSRsの予想される長さに応じて適宜選択することができる。すなわち、単離すべき塩基配列よりも長いサイズの断片を選択することができる。一方、本発明の原理に基づけば、１００〜７０００程度のインサートサイズを有するプラスミドを単離することができる。したがって、たとえば、マイクロサテライトＤＮＡの単離を目的とする場合には、通常１００〜５０００bp、たとえば１００〜２０００bp、好ましくは８００〜１５００bpの範囲の断片を保持したプラスミドを用いることができる。実際には、約１０００bp前後の断片を保持したプラスミドを選択し、本発明の方法を適用することができる。【００１９】
本発明において、プラスミドライブラリーの調製に当たり、ゲノムＤＮＡを断片化するための方法は任意である。一般に、物理的な方法、あるいは生化学的な方法によって、ゲノムを断片化する方法が利用されている。物理的な方法としては、超音波によるＤＮＡの切断が挙げられる。生化学的な方法には、制限酵素による消化が含まれる。断片化されたゲノムＤＮＡを、プラスミドベクターにライゲーションすることによって、プラスミドライブラリーを得ることができる。断片化されたＤＮＡは、ライゲーションの前に、予め、目的のサイズを有するものを選択しておくことができる。あるいは、ライゲーションの後に、目的のサイズを有するＤＮＡが挿入されたプラスミドを選択しても良い。更に、適当なゲノムライブラリーが商業的に供給されていれば、市販のゲノムライブラリーを利用することもできる。【００２０】
ゲノム断片を挿入するためのプラスミドベクターは、限定されない。一般的には、SSRSの単離を目的とする場合には、pBluescriptベクターあるいはpUC ベクターなどが用いられる。これらのベクターは大腸菌に形質転換することによって、クローニング、あるいは増幅することができる。【００２１】
本発明の単離方法においては、プラスミドライブラリーは、単離すべき単純反復配列を含むプローブと、相同組換え蛋白質の存在下でインキュベートされる。単離すべき単純反復配列を含むプローブは、任意の方法によって調製することができる。目的とする塩基配列からなるＤＮＡを合成する方法は公知である。たとえば、化学的に塩基を連結することによって、任意の塩基配列を有するＤＮＡを合成することができる。また、鋳型となるＤＮＡにプライマーをアニールさせて、相補鎖合成反応を行えば、相補配列からなるＤＮＡを合成することができる。更に、ベクターに保持されたＤＮＡから、目的とする塩基配列を有する領域を制限酵素で切り出すこともできる。【００２２】
ＤＮＡの合成に用いられる塩基として、各種の誘導体を利用することもできる。たとえば、色素分子(chromophore)、蛍光分子(fluorophore)、あるいは発光分子(luminophore)等で標識されたヌクレオチド誘導体が公知である。これらのシグナル生成分子で修飾されたヌクレオチド誘導体を利用することによって、プローブを標識することができる。あるいは、結合性リガンドで修飾された塩基を利用することもできる。たとえば、ビオチンやジゴキシンなどの結合性リガンドで修飾されたヌクレオチド誘導体が公知である。結合性リガンドで修飾されたプローブは、ハイブリダイズしたプラスミドとハイブリダイズしなかったプラスミドの物理的な分離に有用である。【００２３】
プローブを構成する単純反復配列は、生物種ごとにある程度、頻度の高い配列が明らかにされている場合もある。このような既知の単純反復配列を利用することによって、出現頻度の高い単純反復配列を含むＤＮＡを単離することもできる。あるいは、未知の単純反復配列をプローブの塩基配列として利用することによって、新規な単純反復配列を同定することもできる。たとえば、ヒトにおける３塩基以上の単純反復配列の存在は稀とされている。したがって、３塩基以上の繰り返し単位を含む単純反復配列をプローブとして利用すれば、未知の単純反復配列を単離できる可能性がある。プローブは１種類でも良いし、複数種のプローブを混合して用いることもできる。以下にイネなどの高等植物のSSRSに利用することができる代表的なプローブの塩基配列を例示する。以下に例示する塩基配列において、ｎの数は、１〜１００、たとえば１０〜５０、通常２０〜４０である。
(CA)n
(TA)n
(GC)n
(GGA)n
(TTA)n【００２４】
本発明に用いられるプローブの塩基配列は、単純反復配列を構成する塩基配列そのもの、あるいはその相補配列を含む。本発明においては、２本鎖ＤＮＡプラスミドをハイブリダイズの対象とする。言うまでも無く、２本鎖ＤＮＡは、相補配列を有している。したがって、プローブの塩基配列は、単離すべき単純反復配列そのものであっても良い。【００２５】
相同組換え蛋白質は、相同組換え活性を有していれば、由来に関わらず本発明に利用することができる。本発明において、相同組換え活性とは、２本鎖ＤＮＡに含まれる１本鎖ＤＮＡに相同な塩基配列からなる部分を、当該１本鎖ＤＮＡによって組換える活性を言う。この活性は、１本鎖のＤＮＡを２本鎖中に存在する相補的な塩基配列に対してハイブリダイズさせる活性という言うこともできる。このような活性を有する多くの蛋白質が知られている。たとえばRecAは大腸菌に由来する相同組換え蛋白質である。遺伝子組み換えによって製造されたRecAの精製品が市販されている（"RecA"; New England Biolabs/NEB社の商品名, Product Code M0249S-200μg入り-）。また以下のとおり、大腸菌等のRecAのアミノ酸配列も決定されている。
E.coli; V00328, J01672
Shigella flexneri; X55553 
Salmonella; NP_457222【００２６】
RecAの真核細胞生物におけるホモログとして、Rad51並びにRad52が、ヒトや酵母(GenBank Accession Number: X64270, S38937)で同定されている(G Basile, M Aker, and R K Mortimer, Mol Cell Biol. 1992 July; 12(7): 3235-3246. "Nucleotide sequence and transcriptional regulation of the yeast recombinational repair gene RAD51.)。これらの相同組換え蛋白質を本発明に利用することができる。これらの相同組換え蛋白質は、天然由来のもののみならず、遺伝子組み換え体として得られた蛋白質であっても良い。更に、本発明に必要な相同組換え活性を有する限り、アミノ酸配列の変異を含む変異体を利用することもできる。たとえば、相同組み換え活性の維持に必要な領域を含む、Rad51の断片、あるいはその断片を部分構造として含む変異蛋白質は、本発明における相同組み換え蛋白質として有用である。Rad51の相同組み換え活性に必要なドメインは既に同定されている(Miller KA, Sawicka D, Barsky D, Albala JS., Nucleic Acids Res. 2004 Jan 02;32(1):169-78.  Domain mapping of the Rad51 paralog protein complexes.)。同様にRecAについても、本発明に必要な相同組換え活性を有する限り、アミノ酸配列の変異を含む変異体を利用することができる。【００２７】
本発明において、２本鎖ＤＮＡプラスミドライブラリーは、単離すべき単純反復配列を含むプローブとともに、相同組換え蛋白質の存在下でインキュベートされる。これらの要素は、利用する相同組換え蛋白質による、２本鎖ＤＮＡへのプローブの配列特異的なハイブリダイズが可能な条件下でインキュベートされる。通常、予めプローブと相同組換え蛋白質との複合体を形成させた後に、２本鎖プラスミドが混合される。したがって、本発明において、工程(1) ２本鎖ＤＮＡプラスミドライブラリーを、単離すべき単純反復配列を含むプローブと、相同組換え蛋白質の存在下でインキュベートする工程は、たとえば次のようにして実施することができる。【００２８】
(1a) 単離すべき単純反復配列を含むプローブと、相同組換え蛋白質をインキュベートする工程、および
(1b) 工程(1a)の後に２本鎖ＤＮＡプラスミドライブラリーを加えて更にインキュベートする工程
より具体的には、たとえば、相同組換え蛋白質としてRecAを用いた場合の反応条件としては、次のような条件を示すことができる。【００２９】
まずプローブ（１本鎖のＤＮＡ）とRecA蛋白質をATPとともにとインキュベートする。インキュベーションの条件は、たとえば２０−４０℃で５分〜３０分程度である。これらの要素は、通常、中性付近のｐＨでインキュベーションされる。具体的には、ｐＨ７−８が好適である。インキュベーションによって、RecA蛋白質はATPとともにプローブ（１本鎖ＤＮＡ）との複合体を形成する。インキュベーションには、たとえば以下の組成の緩衝液を利用することができる。
25mM トリス酢酸緩衝液(pH7.5)
8mM 酢酸マグネシウム
2mM CoCl2
1mg/mL ウシ血清アルブミン(BSA)
ATPは０．１〜１０mMが添加される。ATPに代えて、ATPの誘導体を利用することもできる。たとえば、デキシアデニントリフォスフェート(dATP)、あるいはアデノシン 5'-[γ-チオ]トリフォスフェート（γ-S-ATP）をATPに代えて用いることもできる。あるいはATPとγ-S-ATPを混合して用いることもできる。γ-S-ATP、あるいはATPとの混合物の利用によって、RecAの作用によって形成される３本鎖構造がより安定に維持される。したがって、γ-S-ATPの利用は本発明において好ましい条件である。ATPとγ-S-ATPとを混合する場合には、両者を合計した濃度が上記濃度範囲となるように調整することができる。ATPとγ-S-ATPの混合割合は、たとえば１：１０〜１０：１、通常１：２〜２：１、好ましくは１：１とすることができる。より具体的には、1mMのATPと1mMのγ-S-ATPを含むことができる。上記のような条件の場合、RecAはたとえば０．１〜１０g/mL、通常０．２〜１g/mL、より具体的には８μg/３０μL（約０．２７g/mL）添加される(Zhumabayava et al, BioTechniques 27:834-845 (October 1999), RecA-Mediated Affinity Capture: A Method for Full-Length cDNA Cloning)。【００３０】
続いてプラスミドを添加し、相同組換え蛋白質による２本鎖ＤＮＡに対するプローブのハイブリダイズが可能な条件下でインキュベートする。実際には、予め形成された複合体［RecA蛋白質−ATP−プローブ（１本鎖ＤＮＡ）］にプラスミド（２本鎖ＤＮＡ）を添加すればよい。たとえば２０−４０℃で５分〜３０分程度インキュベートすれば、プローブは２本鎖ＤＮＡの中の相補配列にハイブリダイズすることができる。プローブがハイブリダイズしたところは、２本鎖の間にプローブが入り込んだ３本鎖構造を取っている。【００３１】
あるいはヒト由来の相同組換え蛋白質であるRad51では、プローブ（１本鎖ＤＮＡ）はATPとともにインキュベートされる。ATPは０．１〜１０mMが添加される。Rad51においても、ATPに代えてその誘導体を用いることもできる。インキュベーションの条件は、たとえば１５−３０℃、１−２０分である。反応のための緩衝液としては、以下のような組成の緩衝液を用いることができる。
20mM トリス塩酸緩衝液(pH7.4)
1.5mM MgCl2
0.1mg/mL  ウシ血清アルブミン(BSA)【００３２】
インキュベート後、更にRad54を加えてインキュベートすることによって、プローブ（１本鎖ＤＮＡ）と組換え蛋白質からなる複合体が形成される。その後プラスミドライブラリー（２本鎖ＤＮＡ）を加えれば、相同組換えによってプラスミドにプローブをハイブリダイズさせることができる。複合体とプラスミドをインキュベートするための条件としては、たとえば２０−４０℃で５分−６０分を示すことができる。こうして、プローブ（１本鎖ＤＮＡ）とプラスミド（２本鎖ＤＮＡ）からなる３本鎖構造が形成される。【００３３】
工程(1)で２本鎖ＤＮＡプラスミドライブラリーが、単離すべき単純反復配列を含むプローブと、相同組換え蛋白質の存在下でインキュベートされると、単離すべき単純反復配列を含むプラスミドはプローブとハイブリダイズする。ハイブリダイズしたプラスミドを単離すれば、目的とする単純反復配列を含むクローンを得ることができる。たとえば予め結合性リガンド修飾したプローブを用いれば、結合性リガンドとの親和性を利用して、ハイブリダイズしたクローンを容易に回収することができる。【００３４】
具体的には、ビオチン化プローブを用いた場合には、アビジンを結合した固相との接触によって、プローブとハイブリダイズしたクローンを固相に捕捉することができる。捕捉されたクローンは、ハイブリダイズしなかったクローンと分離される。固相の洗浄によって、ハイブリダイズしなかったクローンは除去される。次いで、固相をハイブリダイズを解消する条件に置けば、ハイブリダイズしたクローンを回収することができる。一連の工程を図１に示した。【００３５】
本発明においては、回収されたクローンを更に増幅することもできる。クローンの増幅には、SSRsを偏り無く増幅できる方法を用いるのが望ましい。たとえばPCR法は、偏りを与える可能性を有する方法であることは既に述べたとおりである。SSRsの塩基配列の構成、あるいは長さによって、増幅の程度が異なると、最終的に単離されるＤＮＡに偏りを生じる可能性がある。したがって、本発明によって回収されたクローンを増幅するためには、たとえば、生物学的な方法を利用するのが好ましい。具体的には、プラスミドを適当な宿主細胞に導入し、細胞内において増幅することができる。すなわち本発明は、次の工程(2a)−(2c)によってプラスミドを単離する工程を含む、SSRsを含むＤＮＡを単離する方法を提供する。
(2a) プローブとハイブリダイズしたプラスミドを回収する工程、
(2b) 回収されたプラスミドを、当該プラスミドを導入することができる宿主細胞に形質転換する工程、および
(2c) 宿主細胞において増幅されたプラスミドを前記宿主細胞から回収する工程【００３６】
本発明のSSRsを含むＤＮＡの単離方法においては、プラスミドを単離の対象として利用する。プラスミドは、通常、適当な宿主細胞に形質転換することによって、増幅することができる。細胞内におけるプラスミドのコピーは、原則的には、プラスミドが保持しているインサートの種類などとは無関係である。つまり、インサートＤＮＡの塩基配列などに関わらず、形質転換されたプラスミドのコピーが分裂する細胞に伝達される。そして、好ましくは細胞内においてもコピーが生成される。こうして、回収されたプラスミドは増幅される。【００３７】
たとえば、プローブに導入された結合性リガンドを利用して、単離すべきSSRsを含むＤＮＡを有するプラスミドが固相に捕捉される。遠心分離やろ過によって固相を分離する。あるいは固相に磁性粒子を利用すれば、磁気的に固相を回収することもできる。次いで固相を洗浄して、ハイブリダイズしなかったプラスミドが除かれる。捕捉されたプラスミドは、変性条件に置くことによって、プローブとのハイブリダイズから解かれて回収される。こうして回収されたプラスミドを宿主細胞に形質転換する。たとえば大腸菌で増幅できるプラスミドであれば、大腸菌に形質転換する。そしてプラスミドを有する大腸菌を単離すれば、目的とするSSRsを含むＤＮＡを保持したプラスミドがクローニングされる。こうして、本発明によってSSRsを含む２本鎖ＤＮＡが単離される。クローニングされたプラスミドは、必要に応じて精製され、そのインサートの塩基配列を決定することもできる。【００３８】
一連の過程で各クローンの増幅効率は等しいと見なすことができる。たとえば、プラスミドの形質転換効率は、インサートの塩基配列の構成には影響されない。また形質転換されたプラスミドが、細胞内でコピーされたり、あるいは細胞の分裂に伴って伝達される過程においても、インサートの塩基配列によって偏りが生じる可能性は低いと考えられる。特に、ライブラリーを合成する段階で、インサートサイズを制限した場合には、インサートの長さは一定の範囲に留まる。そのため、インサートの長さに起因する増幅効率の偏りが抑制され、プラスミドの増幅効率は高度に均一に保たれる。その結果、プローブとハイブリダイズしたSSRsを含むＤＮＡを偏り無く単離することができる。すなわち、本発明によってSSRsを含むＤＮＡの単離効率の向上が期待できる。【００３９】
本発明に基づいてクローニングされたプラスミド間で、SSRsの塩基配列を照合することもできる。照合の結果、同じ塩基配列からなるSSRsを同種と判定し、クラスターにまとめることができる。クラスターの数は、同定されたSSRsの種類を意味している。クラスタリングされた塩基配列を既に報告されているSSRsと照合すれば、未知のSSRsを同定することができる。【００４０】
ところで、単離すべき単純反復配列（またはその相補配列）を含んでいれば、本発明に用いられるプローブの構造は制限されない。したがって、プローブは付加的な塩基配列を含むことができる。たとえば、プローブとなる塩基配列に対して、プラスミドとのハイブリダイズ以外の機能を有する塩基配列を付加することができる。このような付加的な塩基配列として、たとえば結合性リガンドを導入するための付加的な塩基配列を示すことができる。【００４１】
代表的な相同組換え蛋白質であるRecAは、２本鎖ＤＮＡをきわめて短時間で探索し、相同配列を見つけ出すことができる(Honigberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 9586-9590, 1986)。この作用を相同配列の探索に応用する試みが知られている。すなわち、プローブを相同組換え蛋白質の作用によって２本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせる方法が、ｃＤＮＡの単離などに応用されている(Teintze et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol.201, No.3, 804-811, 1995)。【００４２】
結合性リガンドを導入したプローブの応用も報告されている(Rigas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol.83, 9591-9595, 1986)。たとえば、これらの方法においては、プローブとハイブリダイズした２本鎖ＤＮＡは、結合性リガンドの結合パートナーを使って回収することができる。この原理を利用してｃＤＮＡから目的とする塩基配列を含むクローンを単離するための方法が実用化された(CloneCaptureTM cDNA Selection Kit; Clonetech)。しかし公知の方法においては、２本鎖ＤＮＡにハイブリダイズする領域に結合性リガンドが導入されていた。【００４３】
代表的な結合性リガンドであるビオチンの分子量は、約２４４である。これに対してヌクレオチド１分子の大きさは、平均３３０程度である。つまり結合性リガンドで修飾された部分は、通常の１本鎖オリゴヌクレオチドの部分に対して、大きく膨らんだ構造となっている。２本鎖−１本鎖間のハイブリダイズおいては、２本鎖の間に１本鎖ＤＮＡが割り込む構造が形成される。つまり１本鎖間のハイブリダイズに比較して、より構造的な変化に対してデリケートな状態にあると考えられる。そのため、２本鎖−１本鎖間のハイブリダイズは、修飾分子による立体障害を受けやすい。つまり相同組換え蛋白質を用いる公知の方法においては、相同組換え蛋白質による１本鎖ＤＮＡの２本鎖ＤＮＡとのハイブリダイズにあたっては、結合性リガンドが立体障害の原因となる可能性があった。【００４４】
このような結合性リガンドによる立体障害の可能性を回避するために、本発明におけるプローブにおいては、付加配列を利用することができる。具体的には、２本鎖ＤＮＡにハイブリダイズするための塩基配列ではなく、付加配列部分に結合性リガンドを有するプローブを利用することができる。すなわち本発明は、次の領域(a)および(b)を含むプローブ、並びにこのプローブによってSSRsを含む２本鎖ＤＮＡを単離する方法を提供する。
(a) 単純反復配列からなる領域、および
(b) 領域(a)の3’側および5’側の両方、またはいずれかに位置し、単純反復配列以外の塩基配列で構成された領域【００４５】
上記の構造を有するプローブの領域(a)が２本鎖ＤＮＡを構成するＤＮＡのいずれかの鎖にハイブリダイズする領域である。そして領域(b)が領域(a)に付加される領域である。領域(b)は、シグナル生成分子や結合性リガンドなどで修飾されていても良い。一方、領域(a)においては、ヌクレオチドの修飾が無いことが好ましい。領域(b)はハイブリダイズには関与しない領域である。したがって、領域(b)の修飾は、ハイブリダイズにおける立体障害の原因とならない。【００４６】
本発明におけるプローブの領域(b)は、ハイブリダイズに関与しないため、任意の塩基配列で構成することができる。たとえば、少数の塩基の連続で構成される塩基配列は、合成が容易である。更に同一分子内でハイブリダイズが起きない構成とすることは、プローブに求められる一般的な条件である。本発明においては、領域(a)が単純反復配列で構成されることから、領域(a)と領域(b)の間で、相補的な塩基配列、あるいは同じ塩基配列が存在しないようにデザインするのが好ましい。これらの条件を満たすために、たとえば、a、t、c、g、あるいはuの連続からなる塩基配列は、領域(b)を構成する塩基配列として好適である。中でも、a、t、あるいはuが連続した塩基配列は好ましい。これらの塩基は、c/g間の結合に比べると塩基対結合の親和性が低い。そのため同一鎖内のハイブリダイズによる影響をより小さくできると予測される。【００４７】
上記のような構造を有するプローブは、任意の方法によって調製することができる。たとえば、領域(a)と領域(b)を化学的に合成し、両者を連結することによってプローブを得ることができる。あるいは、予め合成された領域(a)に、ターミナルトランスフェラーゼなどの酵素によって、その末端に塩基を付加することができる。ターミナルトランスフェラーゼによって付加される塩基の数を人為的に制御することは難しい。したがって、この方法によって得られるプローブを構成する領域(b)は、長さが不均一となる可能性がある。領域(b)の長さを制御するためには、完全に化学的に合成するか、あるいは鋳型依存性の相補鎖合成反応の利用が好ましい。【００４８】
本発明に用いられる上記構造を有するプローブにおいて、領域(a)の長さは、単離すべきSSRsの長さに応じて任意の長さにデザインすることができる。一般的なSSRsの単離においては、領域(a)の長さは、通常２５−１００塩基程度である。一方、領域(b)の長さは制限されない。化学的に合成する場合には、３０−６０塩基とすることによって、容易に合成することができるので有利である。【００４９】
上記構造を有するプローブは、鋳型依存性の相補鎖合成反応を利用して合成することができる。すなわち本発明は、次の工程を含む反復配列にハイブリダイズするプローブの製造方法を提供する。
A) 3’側に配置された反復配列と、5’側に配置された反復配列以外の任意の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを鋳型とし、少なくとも3'末端に前記鋳型の反復配列に相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして相補鎖を合成する工程、および
B) 工程A)で合成された相補鎖を回収する工程
上記工程は、具体的には以下のように図示することができる。
2006059386.tif 000002
【００５０】
相補鎖合成反応によって生成された産物は、鋳型として用いたオリゴヌクレオチドの相補配列で構成される。相補鎖合成にあたり、基質としてヌクレオチド誘導体を与えた場合には、相補鎖合成産物にヌクレオチド誘導体を導入することもできる。たとえば、結合性リガンドで修飾されたヌクレオチド誘導体は、結合性リガンドで修飾された相補鎖合成産物を与える。相補鎖合成産物の単純反復配列に相当する部分はプライマーとして供給されているので、修飾されない。その結果、２本鎖ＤＮＡにハイブリダイズする単純反復配列部分は修飾されず、ハイブリダイズに関与しない領域が結合性リガンドによって修飾されたプローブを得ることができる。
なおこの態様において合成されたプローブを構成する[プライマー]に相当する領域が、プローブにおける領域(a)に、そして相補鎖合成反応によって伸長された部分が領域(b)に、それぞれ相当する。領域(b)は[反復配列以外の任意の塩基配列]の相補配列で構成される。【００５１】
本発明においては、上記プライマーとして、5'側に反復配列以外の任意の塩基配列を有する構造を利用することもできる。すなわち本発明は、次の工程を含む反復配列にハイブリダイズするプローブの製造方法を提供する。
A) 3’末端を含む領域において互いに相補的な塩基配列を有する少なくとも１組のプライマーセットの3’末端を含む領域をハイブリダイズさせる工程であって、当該プライマーが、3’側に配置された反復配列と、5’側に配置された反復配列以外の任意の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである工程、
B) 相補鎖合成反応によってプライマーの3’末端を伸長させる工程、および
C) 工程B)で得られた2本鎖DNAを回収する工程
上記工程は次のように図示することができる。
2006059386.tif 000003
【００５２】
この態様においては、互いに相補的な単純反復配列ＡおよびＢをそれぞれが有し、その5'側に反復配列以外の任意の塩基配列を連結した構造を有するオリゴヌクレオチドの組み合わせが用いられる。互いに相補的な単純反復配列ＡおよびＢがアニールし、互いを鋳型として矢印の方向に「反復配列以外の任意の塩基配列」を鋳型として相補鎖合成反応が進行する。その結果、中央に単純反復配列を有し、その5'側と3'側に単純反復配列以外の塩基配列（またはその相補配列）を有するＤＮＡが合成される。合成後に変性させれば、鋳型あるいはプライマーには、再び新たなプライマーあるいは鋳型がアニールし、同じ反応が繰り返される。すなわちPCR法の原理で、同じ構造のＤＮＡが指数的に増幅される。上記のように3'側に互いに相補的な塩基配列を有するＤＮＡがアニールして、両者の3'末端から相補鎖を合成する反応は、Overgo法とも呼ばれる公知の反応である。しかし、結合性リガンドで修飾された反復配列を含むプローブの合成に応用することは新規である。
なおこの態様において合成されたＤＮＡを構成する[単純反復配列Ａ]および[単純反復配列Ｂ]に相当する領域が、プローブにおける領域(a)に、そして相補鎖合成反応によって伸長された部分が領域(b)に、それぞれ相当する。領域(b)は[反復配列以外の任意の塩基配列]の相補配列で構成される。【００５３】
こうして合成されたＤＮＡの単純反復配列以外の塩基配列の相補配列（すなわち領域(b)）には、修飾ヌクレオチドを導入することができる。たとえば結合性リガンドで修飾されたＤＮＡは、本発明におけるプローブとして有用である。本発明においては、単純反復配列を含む２本鎖ＤＮＡの単離を目的とする。したがって上記のようにして合成されたＤＮＡは、単純反復配列ＡおよびＢを含むＤＮＡは、いずれもプローブとして利用することができる。【００５４】
本発明において、工程A)における相補鎖合成反応は、鋳型依存性の相補鎖合成反応を触媒するDNAポリメラーゼによって実施することができる。たとえば大腸菌由来のDNAポリメラーゼの活性断片であるKlenow断片は、上記の反応に基づくプローブの合成方法に有用である。その他、PCRなどに用いられているTaqポリメラーゼなどのDNAポリメラーゼも本発明の方法に利用することができる。【００５５】
本発明のプローブを得るための相補鎖合成反応において、反復配列以外の任意の塩基配列は制限されない。たとえば、先に述べたように、同じ塩基の連鎖を反復配列以外の任意の塩基配列として利用することができる。具体的には、aの連鎖(a stretch)などを反復配列以外の任意の塩基配列とすることができる。相補鎖合成反応のための基質として、修飾オリゴヌクレオチドを利用することができる。たとえばビオチン化されたウラシルを結合性リガンド修飾ヌクレオチドとして用いることができる。【００５６】
相補鎖合成反応によって本発明に用いるプローブを合成するとき、相補鎖合成反応のストリンジェンシーを高く保つことによって、より均一性の高いプローブを合成することができる。しかし上記の方法においては、cacacaca....といった単純反復配列がtgtgtgtg.....という塩基配列にアニールする。このような塩基配列の組み合わせにおいては、アニールする位置にズレが生じる可能性を否定できない。アニールする位置のズレは、単純反復配列の長さが異なる複数種のプローブを生成する原因となる。【００５７】
たとえば以下の例においては、caとgtとで構成される単純反復配列を含むプローブを合成している。なお(ca)25は5'-ca-3'の２５回の繰り返し配列を、(gt)25は5'-tg-3'の２５回の繰り返し配列をそれぞれ示している。
2006059386.tif 000004
【００５８】
(ca)25と(gt)25をアニールさせると、互いの5'側のaaaaa .....を鋳型として、それぞれの3'末端から相補鎖が合成される。相補鎖合成によって、理論的には以下のような構造のＤＮＡが生成される。
2006059386.tif 000005
【００５９】
ところが実際には、単純反復配列間のアニールにおいて、２５回の繰り返し配列が完全に一致せず、ｎ単位のズレが生じる可能性がある。ｎ単位のずれによって、ｎ回分の繰り返し配列が多いプローブが合成される。以下の例では２単位のズレ（+--+で示した部分）が生じている。繰り返し単位のずれによって、繰り返し単位が多いＤＮＡプローブが生成されることを図３にも示した。
2006059386.tif 000006
その結果生成されるＤＮＡは、以下のように４単位長い繰り返し配列を有することになる。
2006059386.tif 000007
【００６０】
本発明において、このように数単位のアニーリング位置のズレをともなって生成されたＤＮＡプローブは、単純反復配列を含むＤＮＡの単離において、むしろ有用である。未知の単純反復配列の単離においては、長さが特定できない単純反復配列も単離できることが望ましい。プローブの長さのバリエーションを増やすことは、そのための有効な手段の一つとなりうる。したがって単一の長さの出発材料から、長さの異なる単純反復配列を含むプローブの混合物を得ることができる上記の方法は、単純反復配列を単離するためのプローブの合成方法として好ましい。すなわち本発明は、次の領域(a)および(b)からなり、領域(a)を構成する単純反復配列の反復の数が異なる複数種のプローブの混合物を提供する。
(a) 単純反復配列からなる領域、および
(b) 領域(a)の3’側および5’側の両方、またはいずれかに位置し、単純反復配列以外の塩基配列で構成された領域、【００６１】
本発明のSSRsの単離方法を構成する各要素は、予め組み合わせてキットを構成することができる。すなわち本発明は、次の要素を含む、単純反復配列の単離用のキットを提供する。
i) 次の領域(a)および(b)からなり、かつ領域(b)に結合性リガンドを有するプローブ、
(a) 単純反復配列からなる領域、および
(b) 領域(a)の3’側および5’側の両方、またはいずれかに位置し、単純反復配列以外の塩基配列で構成された領域、
ii) 相同組換え蛋白質、および
iii) 前記結合性リガンドと結合する固相
【実施例】
【００６２】
１．ＤＮＡプローブの合成
以下の塩基配列からなる２種類のオリゴヌクレオチドを合成した。(A)30は30merからなるAの連鎖を、(CA)25と(TG)25は、それぞれcaとtgの２５回の繰り返しを示す。
CA-オリゴ：5'-(A)30(CA)25-3'（配列番号：１、80mer）
TG-オリゴ：5'-(A)30(TG)25-3'（配列番号：２、80mer）
ビオチン化にはAmersham社のMegaprime DNA labeling systemを利用した。具体的な操作は次のとおりである。まずCA-オリゴ200pmol とTG-オリゴ200pmol をアニーリングさせた。次いで、dATP,dGTP,dCTP,dTTPをそれぞれ20pmol加え、最後にビオチン21-dUTPを1000pmol加えた。更にDNAポリメラーゼ(Klenow断片)を２ユニット加えて室温で２時間反応させた。【００６３】
この反応によって、CA-オリゴとTG-オリゴの3'側に３０残基のビオチン化Uが連結され、それぞれ配列番号：３および配列番号：４に示すような構造のＤＮＡプローブが合成される。したがって得られたＤＮＡプローブは、プローブとして機能するＤＮＡ部分に、付加的にＵ（ＲＮＡ）が連結されたキメラ分子である。更に、この反応においては、CA-オリゴのCAの繰り返しと、TG-オリゴのTGの繰り返しがずれてアニーリングすることによって生成された、繰り返し単位の異なるＤＮＡプローブも合成されている可能性がある。以下に、繰り返し単位のずれについて、図３に基づいて説明する。【００６４】
たとえば繰り返し単位が５単位分ずれてアニーリングした場合には、配列番号：５および配列番号：６に記載された塩基配列を有するＤＮＡプローブが生成される。その他にも、ｎ個の繰り返し単位がずれてアニールすることによって、配列番号：７および配列番号：８に記載した一般式で示される塩基配列を有するＤＮＡプローブが生成される可能性がある。このように繰り返し単位がずれた場合には、ＤＮＡプローブのtに相当する位置には、実際にはuまたはtが導入されるため、プローブ部分にもＲＮＡを含む場合がある。更に図３においては、理解を助けるために、鋳型となるオリゴヌクレオチドのAに対していずれもUからなる相補鎖を記載した。しかし実際には、相補鎖合成に当たってはdTTPもdUTPと同じ可能性で導入される。その結果、合成された相補鎖においては、Tの場合とUがの場合がありえる。両者の割合は、基質dTTPとdUTPの濃度に依存する。
アニーリング条件は、通常、室温で１０分間程度である。アニーリングには一般的な緩衝液を利用することができる。具体的には、以下の組成を有する緩衝液を示すことができる。
Tris-HCl
MgCl2
β-mercaptoethanol
市販の緩衝液中でアニーリングさせることもできる。たとえば、Amersham Biosciences社のMegaprime DNA labelling system（キット）をアニーリングに使用することができる。更に、相補鎖合成に好適な緩衝液の組成も公知である。たとえばDNAポリメラーゼにKlenow断片を用いる場合には、次のような組成の緩衝液を利用することができる。
50mM Tris-HCl (pH 7.5)
10mM MgCl2
1mM DTT【００６５】
２．ビオチン化されたプローブの精製
合成されたプローブは、QIAGEN社QIAquick nucleotide removal kitによって回収した。操作は製品の指示書にしたがった。精製されたビオチン化プローブをアガロース電気泳動によって分離して、目的のサイズ(100-200bp)を有する２本鎖のバンドを切り出した。切り出したアガロースゲルから、フィルター（ultrafree-DA、アミコン社製）でＤＮＡを精製した。回収されたＤＮＡをさらにエタノール沈殿によって精製した。【００６６】
３．スクリーニング用プラスミドライブラリー
イネのゲノムＤＮＡを抽出し、超音波処理によって機械的に断片化した。1-13kbの大きさのゲノムＤＮＡ断片を選択し、SmaIで消化後に脱リン酸化したプラスミドベクターにライゲーションした。プラスミドベクターにはpUC18を用いた。ゲノムＤＮＡを挿入したベクターを大腸菌DH10B株に形質転換してプレーティングして、約1.000.000クローンからなるプラスミドライブラリーが得られた。形質転換された大腸菌から、アルカリ法によってＤＮＡをまとめて精製し、以降のハイブリダイゼーションによるスクリーニングに用いた。【００６７】
４．３重鎖形成
２で作成したビオチン化プローブを５分間煮沸後に氷上で急冷して１本鎖化した。１本鎖化したビオチン化プローブに緩衝液を加え、さらに2.5mM CoCl2、ATP(ATPとATP-gumma-Sの混合液)、およびRecAタンパク8microgramを加え、37℃で20分間インキュベートした。緩衝液の組成は次のとおりである。
25mM トリス酢酸緩衝液(pH7.5)
8mM 酢酸マグネシウム
2mM CoCl2
1mg/mL ウシ血清アルブミン(BSA)
次いで３で精製されたプラスミドライブラリー 10microgramを加えて37℃で１時間インキュベートして、３重鎖を形成させた。その後、0.1% SDS存在下でプロティナーゼＫ処理によってRecAを分解し、さらにPhenylmethylsulfonyl Fluoride(PMSF)を加えてプロティナーゼＫを不活化した。【００６８】
５．Streptavidin microbeadsによる捕捉
ビオチン化プローブとプラスミドベクターを含む４の液を緩衝液で平衡化したStreptavidin 磁気ビーズと混合した。平衡化用の緩衝液の組成は次のとおりである。
10mM Tris-HCl (pH7.5)
1mM EDTA
1M NaCl
室温で放置後、ストレプトアビジンと結合しなかったＤＮＡを洗浄した。洗浄液の組成は次のとおりである。
10mM Tris-HCl (pH7.5)
1mM EDTA
2M NaCl
洗浄後にアルカリ液(0.1N NaOH, 1mM EDTA )によって結合したDNAを溶出した。溶出されたプラスミドベクターは、エタノール沈殿で精製した。【００６９】
６．単離されたプラスミドの解析
５で回収されたプラスミドベクターで大腸菌を形質転換し、ライブラリーを構築した。更にこのライブラリーを希釈して９６ウエルのマイクロプレートに播いてクローニングした。各クローンからＤＮＡを精製してインサートの塩基配列を決定した。塩基配列に含まれる単純反復配列は、Repeat maskerなどの市販のソフトウエアによって検出した。検出された単純反復配列の数を単離されたSSRクローン数として集計した。更に、同一の塩基配列を有する複数のクローンは一つのクラスターとして集計した。すなわちクラスターの数は、単離された単純反復配列の種類を意味する。【００７０】
同様の操作によって、(TAA)n、(GGA)n、(GC)n、および(TA)nからなる単純反復配列について単離を試みた結果を以下にまとめた。表１には各単純反復配列のクローニング結果を示す。
【表１】
2006059386.tif 000008
ライブラリー／モチーフ：プローブの塩基配列を構成するモチーフと、当該プローブによって濃縮されたライブラリーの名称を示す。
ヒットしたクローン数：ポジティブクローンの数、すなわち９６ウエル中のポジティブクローンが検出されたウエルの数と、その割合(%)を示す。
SSRs：クローニングされた単純反復配列を含むプラスミドの数を示す。
SSRsの種類：同定された単純反復配列のうち、塩基配列が異なる単純反復配列の数（単純反復配列の種類）を示す。クラスターの数と同じ数である。
平均長(bp)：同定された単純反復配列の長さ(bp)の平均を示す。
最大長(bp)：同定された単純反復配列のうち、最長のものの長さ(bp)を示す。
これらのSSRSの単離に用いたプローブの塩基配列を以下に示す。なお塩基配列中T/Uと記載した部分には、プローブの合成において、Tとなる場合とUとなる場合があることを示している。更に*を付けたプローブにおいては、モチーフ部分のTもUとなる場合がある。
(TAA)n用プローブ：5' (A)30 (TAA)16-33(T/U)30*（配列番号：９）
(TTA)n用プローブ：5' (A)30 (TTA)16-33(T/U)30*（配列番号：１０）
(GGA)n用プローブ：5' (A)30 (GGA)16-33(T/U)30（配列番号：１１）
(CCT)n用プローブ：5' (A)30 (CCT)16-33(T/U)30*（配列番号：１２）
(GC)n 用プローブ：5' (A)30 (GC)25-50(T/U)30（配列番号：１３）
(TA)n 用プローブ：5' (A)30 (TA)25-50(T/U)30*（配列番号：１４）【００７１】
更に濃縮後の各ライブラリーから単離されたSSRsのモチーフの数を以下にまとめた。いずれのライブラリーにおいても、プローブに用いたモチーフ配列を含むクローンを選択的に単離できていることがわかる。
（表２）各ライブラリーから単離されたCA-モチーフを含むクローンが検出されたプレートのウエルの数(hit clone)と単離されたSSRsの数(CA-SSR)
hit clone   CA-SSR
[CA library      39         47]
GC library       1          1
GGA library      3          3
TAA library      6          6【００７２】
（表３）各ライブラリーから単離されたGC-モチーフを含むクローンが検出されたプレートのウエルの数(hit clone)と単離されたSSRsの数(GC-SSR)
hit clone   GC-SSR
CA library      1           1
[GC library      5           6]
GGA library     2           2
TAA library     0           0【００７３】
（表４）各ライブラリーから単離されたGGA-モチーフを含むクローンが検出されたプレートのウエルの数(hit clone)と単離されたSSRsの数(GGA-SSR)
hit clone  GGA-SSR
CA library     11          13
GC library      8          10
[GGA library    22          38]
TAA library    12          14【００７４】
（表５）各ライブラリーから単離されたTAA-モチーフを含むクローンが検出されたプレートのウエルの数(hit clone)と単離されたSSRsの数(TAA-SSR)
hit clone  TAA-SSR
CA library      5           5
GC library      9           9
GGA library     7           7
[TAA library    41          49]【００７５】
各プローブによって単離されたSSRsを含むＤＮＡのうち、プローブの塩基配列とは異なるが、その塩基配列に類似するモチーフを含むＤＮＡの割合を以下にまとめた。表６からわかるように、本発明においては、プローブの塩基配列に対する高い特異性が期待できる。
【表６】
2006059386.tif 000009
* ：２９個中２４個がTCリピート。
** ：１５個中１０個がTAリピート。
***：１６個中１個がTAリピート。
イネのゲノム中に多く含まれている(CA)n、(TAA)n、(GGA)nについては、得られたゲノムライブラリーから２０〜４０%に濃縮された。本発明によって、単純反復配列を含むプラスミドを効率的に濃縮できることが示された。【００７６】
更に、上記のようにして単離されたイネの(CA)nリピートを構成する塩基配列を、実際にイネのゲノム配列にマッピングした。各染色体上の分布をまとめたのが表７である。
【表７】
2006059386.tif 000010
*SSR：各染色体にマッピングされた9bp以上のCAまたはACまたはGTまたはTGリピートの数。
*クラスターの数：各染色体にマッピングされたSSR中で、塩基配列が重複しないSSRの数。重複は染色体上の位置によりclusteringした。すなわち、実際に単離されたＤＮＡにおけるリピートの数が異なっていても、同じ位置にマッピングされた場合には、クラスターの数は１とした。
位置不明のSSRは、現段階で決定されているゲノムの塩基配列上に見出せない塩基配列であると考えられる。このようなマッピングできなかった塩基配列は、各塩基配列間のアセンブル結果に基づいてクラスターの数を決定した。
*クローン：各染色体にマッピングされた塩基配列が由来する、単離されたSSRを含むクローンの数。【００７７】
表７の結果は (CA)nで濃縮した1056クローン（９６ウェルプレート１１枚分）から実際に(CA)nが503個(440クローン)得られ、染色体上の270カ所に位置付けられたことを示している。クローン化されたSSRは１２本の染色体へ分散した。つまり、染色体の広い範囲にわたって、効率よくSSR配列をマッピングできたと言える。【００７８】
更に、９６ウェルプレート１１枚分の解析結果を図４にまとめた。図４から明らかなように、プレートの枚数（すなわちクローンの数）の増加に伴って、単離されるSSRの数(カラム左：SSR)と種類（カラム右：クラスター）が順調に増加している。すなわち本発明によって構築されたSSR濃縮ライブラリーにおいては、多様なSSRが効率的に濃縮されていることを示している。【００７９】
本発明はPCRに依存しないため、長いインサートを持ったクローンも濃縮可能である。また、従来法では、配列毎にPCRでの増幅のレベルが異なり、得られるSSRに関して大きくバイアスがかかっていた。本法はきわめて配列の偏りの低いライブラリーの作成を可能とした。今回の実験結果に基づくと、理論的には、１つのモチーフに対して5000から１万クローンのシーケンスを行なうことで、１０００（たとえばGGAモチーフの場合）から２０００（たとえばCAモチーフ、あるいはTTAモチーフの場合）のSSRが得られると予測できる。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明は、単純反復配列(SSRs)を含むＤＮＡの単離に有用である。本発明によって、サテライトＤＮＡ、ミニサテライトＤＮＡ、あるいはマイクロサテライトＤＮＡなどの、SSRsを構成単位として含む各種のＤＮＡを単離することができる。本発明によって単離されるSSRsを含むＤＮＡの塩基配列の解析によって、遺伝マーカーとして有用な塩基配列を同定することができる。【００８１】
たとえばミニサテライト配列は、個人識別や親子鑑別などに有用である。あるいは、マイクロサテライトＤＮＡの塩基配列は、ゲノム配列上にマッピングすることによってゲノム上の物理的な位置を知るためのマーカーとして利用することができる。マイクロサテライトＤＮＡの塩基配列情報をマーカーとして利用するには、マーカーがゲノム全体に高い密度でマッピングされていることが前提である。高密度にマッピングされたマーカーを利用することで、具体的には次のような利点を期待できる。【００８２】
まず、BACあるいはYACなどの人口染色体にクローニングされたゲノムの断片を、マーカーを利用することによって、迅速に、かつ容易に整列化することができる。更に、遺伝マーカーとして利用する場合には、高密度にマッピングされたマーカーは特に重要である。たとえば表現形質との連鎖解析においては、マーカーのマッピング密度は、ポジショナルクローニングなどの、map based cloningの精度を大きく左右する。またマーカー選抜育種においても、高密度なマーカーの存在は重要な手がかりとなる。【００８３】
あるいは、量的形質に寄与する遺伝子座のマッピングにおいても、高密度なマーカーが、精度の向上に貢献すると考えられている。一般に、イネの種子重量のような量的に変化する形質には、複数の遺伝子座が関与している。したがって、通常の連鎖解析では、遺伝子座と形質との関連が、しばしば不連続となる。しかし多数のＤＮＡマーカーを使って遺伝子連鎖地図上のマーカーの密度を高めることで、形質に寄与する遺伝子座の特定が可能になる。【００８４】
ゲノムサイズは、イネでは４．３億塩基対、ヒトにおいては６０億塩基対に及ぶ。これらの種のゲノムの解析は、既にかなりの精度で完了したと言って良い。しかしゲノムの大きさに応じた多くの遺伝マーカーを同定することは、今後の大きな課題である。言い換えれば、巨大なゲノムの全体をカバーしうるマイクロサテライトＤＮＡマーカーを単離することの重要性が急激に高まっている。SSRsの効率的な単離を可能とする本発明の方法は、SSRsマーカーの単離を通じて、今後の遺伝子解析の進展に大きく貢献する。
【図１】
2006059386.tif 000011
【図２】
2006059386.tif 000012
【図３】
2006059386.tif 000013
【図４】
2006059386.tif 000014
【配列表】
2006059386000001.app
【国際調査報告】
2006059386.tif 000015
2006059386.tif 000016
2006059386.tif 000017
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