(57)【要約】  有効成分としてアルギニンを含有する低酸素応答亢進剤、及び該低酸素応答亢進剤を含有する虚血あるいは低酸素状態を伴って生じる疾患の治療薬を提供する。この低酸素応答亢進剤は、低酸素誘導因子であるHIF-1の作用を亢進させ、低酸素応答を亢進させることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分としてアルギニンを含有することを特徴とする低酸素応答亢進剤。
【請求項２】
エリスロポエチンの分泌を亢進する請求項1記載の低酸素応答亢進剤。
【請求項３】
HIF-1の作用を亢進する請求項１又は２記載の低酸素応答亢進剤。
【請求項４】
HIF-1αの作用を亢進する請求項１又は２記載の低酸素応答亢進剤。
【請求項５】
通常酸素下で亢進する請求項２〜４にいずれか１項記載の低酸素応答亢進剤。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項記載の低酸素応答亢進剤を含有することを特徴とする虚血あるいは低酸素状態を伴って生じる疾患の治療薬。
【請求項７】
虚血あるいは低酸素状態を伴って生じる疾患が、腎不全、心筋梗塞、心不全、脳梗塞、糖尿病性血管障害、閉塞性動脈硬化症大腸炎、潰瘍、脊髄障害、視神経障害又は神経障害である請求項６記載の治療薬。
【請求項８】
アルギニンを含有し、低酸素応答亢進作用を有する旨の表示をしたパッケージに包装されてなることを特徴とする食品。
【請求項９】
有効成分としてアルギニンを含有することを特徴とするHIF-1作用亢進剤。
【請求項１０】
HIF-1αの作用を亢進する請求項９記載のHIF-1作用亢進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低酸素応答亢進剤、及びこれを含有する医薬組成物に関し、特に医薬品および食品の形態で、或は食品に含まれた形態でこの薬剤を好適に使用することが出来る。【０００２】
（発明の背景）
HIF-1（hypoxia inducible factor-1）は120KDaのサブユニットHIF-1αと、91〜94KDaのサブユニットHIF-1βよりなる蛋白質であり（非特許文献１）、低酸素で発現が誘導されるDNAエレメント、HRE（hypoxia-response element）に結合し、低酸素下での遺伝子発現を誘導する。
このうちHIF-1αは低酸素に応答し、酸素存在下においてはユビキチン化、さらにはプロテオソームにおいて分解されることにより、その活性を失う。すなわち、低酸素下ではHIF-1を転写制御因子とする蛋白質の生合成は活発に行われる、酸素濃度が上昇した状況において、HIF-1αは分解を受け、HIF-1を転写促進因子とする蛋白質の生合成は低下する。HIF-1を転写促進因子とする蛋白質としては、エリスロポエチン、VEGF（vascular endothelial cell growth factor）をはじめ、ドーパミン生合成を制御するチロシンヒドロキシラーゼ、解糖系に関わるホスホフルクトキナーゼ、ホスホグリセロリン酸キナーゼI、乳酸脱水素酵素A、アルドラーゼA、エノラーゼI、あるいはグルコース輸送担体（Glut-1）、ヘムオキシゲナーゼ１、トランスフェリン、誘導型一酸化窒素合成酵素などが知られている（非特許文献２及び３）。
HIF-1の活性を亢進する薬剤は、HIF-1を転写制御因子とする蛋白質の生合成を亢進するが、例えばIvanらはHIF-1αの安定化を特徴とする化合物を見出し（非特許文献４）、その化合物がエリスロポエチンの生合成を亢進することを報告し、貧血治療に効果があること示唆している（非特許文献５）。
アルギニンは、エリスロポエチンの産生メカニズムに関与することが報告されている（非特許文献６及び７）が、低酸素誘導因子であるHIF-1との関係はこれまで知られておらず、さらにアルギニンが虚血あるいは低酸素状態を伴って生じる疾患、例えば腎不全、心筋梗塞、心不全、脳梗塞、糖尿病性血管障害、閉塞性動脈硬化症大腸炎、潰瘍、脊髄障害、視神経障害、神経障害等に対して有効であるかは全く明らかにされておらず、このような病態の治療を考えた場合その解明が必要とされていた。【０００３】
【非特許文献１】G. L. Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 5510-5514 (1995)
【非特許文献２】永尾ら、蛋白質核酸酵素、Vol.41、No.16、p2522-2531 (1996)
【非特許文献３】十川（Sogawa）ら、蛋白質核酸酵素、Vol.44、No.15、p2472-2477 (1999)
【非特許文献４】M. Ivan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 13459-13464 (2002)
【非特許文献５】Q. Wang et al., J Am Soc Nephrol. 2004; Oct 15: 773A
【非特許文献６】S. Imagawa et. Al., blood, 96, 1716-1722 (2000)
【非特許文献７】S. Imagawa et al., Kidney Int., 61, 396-404 (2002)
【発明の開示】
【０００４】
本発明は、低酸素誘導因子であるHIF-1に対して作用を亢進させ、低酸素応答を亢進させる低酸素応答亢進剤を提供することを目的とする。
本発明は、又、虚血あるいは低酸素状態を伴って生じる疾患の治療薬を提供することを目的とする。
さらに本発明は、上記亢進剤を含有する食品及びHIF-1作用亢進剤を提供することを目的とする。
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、アルギニンの低下がHIF-1αの不安定化を引き起こし、アルギニンの添加によってHIF-1αの安定性が回復する現象を見出し、本発明の完成に至った。
すなわち、本発明は、有効成分としてアルギニンを含有することを特徴とする低酸素応答亢進剤を提供する。
本発明は、又、低酸素応答亢進剤を含有することを特徴とする虚血あるいは低酸素状態を伴って生じる疾患の治療薬を提供する。
本発明は、又、アルギニンを含有し、低酸素応答亢進作用を有する旨の表示をしたパッケージに包装されてなることを特徴とする食品を提供する。
本発明は、又、有効成分としてアルギニンを含有することを特徴とするHIF-1作用亢進剤を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明のアルギニンを有効成分とする薬剤は、その薬剤に含有されるアルギニンの実質の効果が発現されれば良く、アルギニンの含量率は100%〜0.1質量%（以下、％と略称する）であるのが良く、好ましくは100%〜5%である。また、薬剤中のアルギニンの含量は0.001〜20gであるのがよく、好ましくは0.1〜10gである。
本発明の薬剤に有効成分として含まれるアルギニンは、そのままの形でも良いが様々な塩でも良い。又、生体反応でアルギニンに変換される化合物を用いても良い。塩の例としては蟻酸、酢酸、プロピオン酸、クエン酸、マロン酸、リンゴ酸のような有機酸、塩酸、硫酸、硝酸のような無機酸、あるいは種々のアミン、金属塩等が挙げられる。またL-体、D-体、DL-体いずれの形でも良いが、好ましくはL-体、DL-体がある。
生体内の反応でアルギニンに変換される化合物としては、例えば、シトルリン、オルニチン、アルギノコハク酸あるいはアルギニンを含むペプチド等が挙げられるが、これら以外でも想定される代謝酵素による１〜５段階の反応でアルギニンへと変換される化合物、プロテアーゼ、エステラーゼ、トランスフェラーゼ等でアルギニンを生じる化合物等も含まれる。【０００７】
本発明の薬剤の特徴である低酸素応答の亢進とは、生体内で虚血あるいは低酸素状態（例えば、酸素濃度20vol%以下、好ましくは10%以下）において行われる反応の亢進を指し、具体的にはVEGF（vascular endothelial cell growth factor）をはじめ、ドーパミン生合成を制御するチロシンヒドロキシラーゼ、解糖系に関わるホスホフルクトキナーゼ、ホスホグリセロリン酸キナーゼI、乳酸脱水素酵素A、アルドラーゼA、エノラーゼI、あるいはグルコース輸送担体（Glut-1）、ヘムオキシゲナーゼ１、トランスフェリン、誘導型一酸化窒素合成酵素等、低酸素で誘導される蛋白質の発現亢進等が挙げられる。
本発明の薬剤を用いた治療対象とする虚血あるいは低酸素状態を伴って生じる疾患とは、疾患部位に何らかの虚血あるいは低酸素状態が生じる疾患を指し、例えば、腎不全、心筋梗塞、心不全、脳梗塞、糖尿病性血管障害、閉塞性動脈硬化症大腸炎、潰瘍、脊髄障害、視神経障害、神経障害などが挙げられるが、その他の疾患でも良い。
本発明のHIF-1の作用を亢進することを特徴とする薬剤とは、生体内においてHIF-1、より具体的にはHIF-1のその病態が関与する蛋白質をコードする遺伝子の発現を実質的に亢進する薬剤を指す。【０００８】
さらに、アルギニンによるHIF-1作用の亢進を介したエリスロポエチンの産生の上昇作用を見出したことから、アルギニンを含む、上記疾患に対する治療薬として、同じメカニズムであるHIF-1の作用を亢進しない薬剤と併用することができる。又は、同じHIF-1作用の亢進であっても、作用が相加的に発現する可能性があることから、アルギニンを含む、上記疾患に対する治療薬として、同じメカニズムであるHIF-1の作用を亢進する薬剤と併用することができる。
このような他の薬剤と共に用いる方法としては、腎不全、心筋梗塞、心不全、脳梗塞、糖尿病性血管障害、閉塞性動脈硬化症大腸炎、潰瘍、脊髄障害、視神経障害、神経障害等の虚血を伴って生じる疾患に対する単一あるいは複数の薬剤と同時に使用する方法が挙げられ、その薬剤がHIF-1の作用を亢進しない薬剤であることがより好ましいが、その薬剤がHIF-1の作用を亢進する薬剤であっても良い。
本発明の薬剤を医薬品として使用する場合、その製剤の形は注射剤、液剤、シロップ剤錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤、クリーム剤、軟膏剤、座剤などいかなる形態でも良く、乳糖、ブドウ糖、澱粉、炭酸カルシウム、ゼラチン、セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、等の可能なあらゆる担体、水、エタノール、オリーブ油等の可能なあらゆる溶剤、界面活性剤、安定化剤等の薬学的に可能ないかなる成分、甘味料等の調味料、香料、着色剤等を含んでいても良い。
また本発明の食品は溶液、粉末、固体のいかなる形態でも良く、食品として使用可能ないかなる担体、溶剤、界面活性剤、安定化剤、甘味料、調味料、香料、着色剤等を含んでいても良い。また他の食品、飲料品と混合していても良い。
以下実施例により本発明をさらに詳細に説明する。なお、以下の実施例は、本発明を説明するものであって、本発明をこれに限定するものではない。
【実施例】
【０００９】
実施例１  Hep3B細胞を用いたアルギニンのエリスロポエチン（EPO）分泌亢進作用
ヒト胎児肝細胞株Hep3Bを用い、培地中のアルギニン（Arg）濃度の変化によるエリスロポエチン産生量の変化を測定した。実験時に用いた培地は、D-MEM培地組成を元に、アミノ酸を一切含まない培地（Zero培地）、20種類の全アミノ酸を表１に示される量で含有する培地（Full培地）、及びFull培地からアルギニンのみを除いたアルギニン欠乏培地（ΔArg培地）を用いた。【００１０】
表１  Full培地中のアミノ酸組成
2006075642.tif 000002
【００１１】
Hep3B細胞を96ウエル培養シャーレに５×104cells/wellで藩種し、24時間培養後Zero培地で1回洗浄した後、アルギニンを最終濃度0〜400uM添加したΔArg培地で、通常酸素下（normoxia、21%O2）及び低酸素下（hypoxia、3%O2）で24時間培養を行なった。培養終了後、培地中に含まれているエリスロポエチン量をEPO ELISA kit (Roch社、1693417)にて定量を行なった。実験はN=2で行なった。
エリスロポエチンの分泌量は、通常酸素下（酸素濃度21vol%）ではアルギニン欠乏では全く分泌されないが、アルギニン添加により濃度依存的に分泌量が増加することが認められ、200uMの添加でほぼ最大値を示した（図１）。また、低酸素下でのエリスロポエチン分泌量はアルギニン欠乏でも通常酸素下に比べ高い値であったが、アルギニン50uMの添加で更に増加し、50uMの添加で最大値を示すことが確認された（図１）。【００１２】
実施例２  Hep3B細胞を用いたアルギニンのエリスロポエチンプロモーター活性に対する作用（野生型HIF結合領域：WT、変異型HIF結合領域：ΔHIFに対する作用）
実施例１において示されたように、アルギニンは通常酸素下ではエリスロポエチン（EPO）産生に必要な成分であるが、EPO遺伝子の発現制御に関与する酸素感受性転写因子であるHIF-1の関与が示唆された。HIF-1は、EPO遺伝子下流に位置するエンハンサー領域に結合サイトが存在することが知られており、HIF-1の関与を検討するために、EPOプロモーター領域及びエンハンサー領域をもつレポーターアッセイ系を構築し、EPOプロモーター活性でアルギニンの効果とHIF-1の関与を検討した。
野生型（WT）EPOレポーターベクターの構築は、下記のように行った。Human Genomic DNA（Roche、1691112）より、制限酵素SalI及びHindIIIサイトを導入したEPO遺伝子のプロモーター領域（転写開始点の-118〜＋26）と、制限酵素BamHI及びSalIサイトを導入したエンハンサー領域（ポリA付加シグナルの下流120〜245bp）をそれぞれ配列表１と２、３と４に示したプライマーを用い、PCR法でクローニングを行った。【００１３】
得られた２つのプロモーター領域及びエンハンサー領域を増幅したPCR断片を、ルシフェラーゼレポーターベクターｐGL3-Enhancer (Promega、E1771)のBglII-HindIIIサイトに３者ライゲーションで導入し、EPO遺伝子のプロモーター領域とその上流にエンハンサー領域をもつ野生型（WT）EPOレポーターベクターを構築した。
また、HIF-1が結合できない変異型（ΔHIF）EPOレポーターベクターの構築は、下記のように行った。野生型（WT）EPOレポーターベクターを元に配列表５および６に示したプライマーを用いて、エンハンサー領域に存在するHIF-1結合領域（TACGTGCT）にQuikChange Site-Directed Mutagenesis kit (:STRATAGENE 200517-5)を用いて２箇所変異（TACTTGCG）を導入し、HIF-1が結合できない変異型（ΔHIF）EPOレポーターベクターを構築した。
さらにコントロールとして用いるための、野生型（WT/Enh）SV40レポーターベクター及び変異型（ΔHIF/Enh）SV40レポーターべクターの構築は下記のように行った。細胞内で恒常的に発現するSV40プロモーター下流にルシフェラーゼ遺伝子が導入されているレポーターベクターpGL3-Cont.( Promega、E1741)のSalI-BamHIサイトに、クローニングした野生型EPOエンハンサー領域及び変異型（ΔHIF）エンハンサー領域を導入し、野生型（WT/Enh）SV40レポーターベクター及び変異型（ΔHIF/Enh）SV40レポーターベクターを構築した。【００１４】
Hep3B細胞を96ウエル培養シャーレに５×104cells/wellで藩種し、６時間培養後、各レポーターベクター（プラスミド溶液1mg/ml）を含むトランスフェクション溶液に置換（100ul/well）し、遺伝子導入する。トランスフェクションにはFugene6（Roche）を用い、培地１ｍｌに対し、OPTI-MEM 50ulにFugene6  1.8ulを加え、混合し、室温で5分静置する。その後プラスミド溶液を1.2ug（1mg/ml）を加え混合し、室温で20分静置した溶液に、培地を１ｍｌ加えた溶液をトランスフェクション溶液として用いた。
遺伝子導入18時間後に１×Zero培地で1回洗浄を行い、アルギニンを最終濃度0uM〜３００ｕM添加したΔArg培地で、通常酸素下（normoxia、21%O2）及び低酸素下（hypoxia、3%O2）で２４時間培養を行なった。培養終了後、Dual-GloLuciferase Assay kit(Promega、E2920)でルシフェラーゼ活性を測定した。実験はN=3で行なった。
その結果、レポーターアッセイにおいても、EPO蛋白発現量と同様に通常酸素下ではアルギニンの添加により濃度依存的にEPOプロモーター活性が増加すること、また低酸素下ではアルギニン50uMで最大値を示した（図２）。しかし、HIF-1が結合できない変異型レポーターベクターを用いた評価では、アルギニン濃度依存的なEPOプロモーター活性の増加は見られなかった（図３）。更に、恒常的に発現するSV40プロモーターにHIF-1結合領域を含むEPOのエンハンサー領域を導入すると、アルギニン濃度依存的にプロモーター活性が上昇すること、及び変異型（ΔHIF）エンハンサー領域を導入するとアルギニン存在下でもプロモーター活性が上昇しないことが確認され、アルギニンはHIF-1結合領域を含むエンハンサー領域に作用し、遺伝子発現を増加することが確認された（図４）。【００１５】
実施例３  Hep3B細胞を用いたアルギニンのHIF-1αに対する作用
低酸素感受性因子であるHIF-1は、HIF-1αとHIF-1β（Arnt）のヘテロダイマーから成り、HIF-1αが通常酸素下ではユビキチン／プロテアソーム系で分解されること、及び低酸素下ではその分解が抑制され安定化したHIF-1αが核内へ移行し転写促進に働くことが知られている。よってアルギニン添加によるHIF-1を介したエリスロポエチン増加は、HIF-1αの安定化に関与している可能性があり、アルギニン添加とHIF-1α蛋白量について検討を行った。
Hep3B細胞を６ウエル培養シャーレに9×105cells/wellで藩種し、24時間培養後、Zero培地で1回洗浄を行い、20種類のアミノ酸を含むFull培地及びΔArg培地で通常酸素下（normoxia、21%O2）及び低酸素下（hypoxia、3%O2）で24時間培養を行なった。培養終了後、cold PBSで１回洗浄後、氷上に５分静置した後、RIPA Buffer（150mM NaCl、1%  NP-40、0.5% deoxycholate、50mM Tris.HCl pH 7.4、0.1% SDS、50mM   β-glycerophosphate、25mM NaF、20mM EGTA、1mM DTT、1mM Na2VO3、Protease Inhibitor cocktail (ナカライテスク、25955-11)）で細胞粗抽出液を回収した。回収した細胞粗抽出液を15000 rpm 10分遠心した上清の蛋白定量を行ない、各サンプルの総蛋白量20ugを6〜13%のSDS-PAGEで分画し、PVDFメンブレンにトランスファーした後、抗HIF-1α抗体（BectonDickinson社、610958）を用いたWestern法によりHIF-1α蛋白の検出を行った。【００１６】
その結果、通常酸素下のFull培地ではHIF-1α蛋白が検出されたが、アルギニン欠乏培地であるΔArg培地ではHIF-1α蛋白は消失し、アルギニン100uM添加でHIF-1α蛋白が検出された。一方、低酸素下では、Full培地及びΔArg培地共に安定化したHIF-1α蛋白が同等に検出された。よって通常酸素下では、アルギニンはHIF-1α蛋白の安定化に必須で、アルギニンの欠乏でHIF-1α蛋白が不安定化し、消失することが確認された。
すなわち、本発明では、通常酸素下においてはアルギニン単独添加で、その濃度依存的にエリスロポエチンの分泌上昇を誘導する作用が見られた。また、この作用は低酸素感受性因子であるHIF-1を介していることが示され、アルギニンの低下がHIF-1α蛋白の不安定化を引き起こすこと、及びアルギニンの添加によってHIF-1α蛋白の安定性が回復することが示された。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＥＰＯ発現におけるアルギニンの影響を示す。
【図２】ＥＰＯプロモーター活性におけるアルギニンの影響を示す。
【図３】HIF-1結合部位におけるアルギニンの影響を示す（ＥＰＯプロモーター活性）(3-1:21% O2下（normoxia）; 3-2:3% O2下（hypoxia）)。
【図４】HIF-1結合部位におけるアルギニンの影響を示す（ＳＶ４０プロモーター活性）(4-1:21% O2下（normoxia）; 4-2:3% O2下（hypoxia）)。
【図５】HIF-1α蛋白質に対するアルギニンの影響を示す。
【図１】
2006075642.tif 000003
【図２】
2006075642.tif 000004
【図３】
2006075642.tif 000005
【図４】
2006075642.tif 000006
【図５】
2006075642.tif 000007
【配列表】
2006075642000001.app
【国際調査報告】
2006075642.tif 000008
2006075642.tif 000009
2006075642.tif 000010
2006075642.tif 000011