(57)【要約】細胞電位測定プローブは、底面を有する第１のキャビティが表面に形成されたプレートと、第１のキャビティ内に配置されたセンサ素子とを備える。第１のキャビティの底面に第２のキャビティが形成される。第２のキャビティに開口する第１の開口部とプレートの外部に開口する第２の開口部とを有する第１の流路がプレート内に形成される。センサ素子は、薄板と、薄板の周囲に設けられてプレートの第１のキャビティに配置された支持基板とを有する。薄板には第１の開口部と、プレートの第２のキャビティに連結する第２の開口部とを貫通する貫通孔が形成される。第１の流路は流体を流すことができ、吸引手段が流路の第２の開口部に接続されて第１の流路内を流れる流体を吸引できる。この細胞電位測定プローブは、溶液内に浮遊する細胞の電位をそのままの環境で測定できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
吸引手段と共に用いられる細胞電位測定プローブであって、
表面を有するプレートであり、底面を有する第１のキャビティが前記表面に形成され、前記第１のキャビティの前記底面に第２のキャビティが形成され、前記第２のキャビティに開口する第１の開口部と前記プレートの外部に開口する第２の開口部とを有する第１の流路が内部に形成された前記プレートと、
前記第１のキャビティ内に配置されたセンサ素子と、
を備え、
前記センサ素子は
第１面と前記第１面の反対側の第２面とを有し、前記第１面に開口する第１の開口部と、前記第２面に開口して前記プレートの前記第２のキャビティに連結する第２の開口部とを有する貫通孔が形成された薄板と、
前記薄板の周囲に設けられて前記プレートの前記第１のキャビティに配置された支持基板と、
を有し、
前記第１の流路は流体を流すことができ、前記吸引手段は前記第１の流路の前記第２の開口部に接続されて前記第１の流路内を流れる流体を吸引できる細胞電位測定プローブ。
【請求項２】
前記第１のキャビティの前記底面と前記センサ素子の前記薄板の前記第２面は同一面内にある、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項３】
前記センサ素子の前記支持基板は前記プレートの前記表面と同じ向きの第１面と前記プレートの前記第１のキャビティの前記底面上に配置された第２面とを有し、前記薄板の前記第１面上に第３のキャビティが形成される、請求項２に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項４】
前記センサ素子の前記支持基板と前記プレートとは接合されている、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項５】
前記プレート内に、前記第２のキャビティに開口する第１の開口部と前記プレートの外部に開口する第２の開口部とを有する第２の流路がさらに形成された、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項６】
前記プレートの前記第２の流路の前記第２の開口部には前記第２の流路の前記第２の開口部から流体を注入する注入手段が接続される、請求項５に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項７】
前記注入手段と前記第２の流路との間に弁が設けられる、請求項６に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項８】
前記第２の流路の断面積は０．０１ｍｍ２以上である、請求項５に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項９】
前記第２の流路の、少なくとも一部が曲がっている、請求項５に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項１０】
前記プレートは、前記第１の流路と前記第２の流路との間に設けられて前記第２のキャビティに向かって突出する段差を有する、請求項５に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項１１】
前記第１の流路の断面積は０．０１ｍｍ２以上である、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項１２】
前記第１の流路の少なくとも一部が曲がっている、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項１３】
前記センサ素子の前記貫通孔の前記第１の開口部と前記第２の開口部の両側の領域にそれぞれ電極を設けた請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項１４】
前記センサ素子の前記薄板には、前記薄板の前記貫通孔の前記第１の開口部と前記第２の開口部のうちの少なくとも１つに前記薄板の前記貫通孔の径より大きな径を有する窪みが形成された、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項１５】
前記プレートは可視光を透過する材料で形成された、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項１６】
前記センサ素子の前記薄板は可視光を透過する材料で形成された、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項１７】
前記プレートは前記第２のキャビティに向かって突出する段差を有する、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項１８】
前記プレートの前記表面と前記センサ素子の前記薄板の前記第１面は同一面内にある、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項１９】
前記センサ素子の前記支持基板は前記プレートの前記表面と同じ向きの第１面と前記プレートの前記第１のキャビティの前記底面上に配置された第２面とを有し、前記薄板の前記第２面上に第３のキャビティが形成される、請求項１８に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項２０】
開口部と底面とをそれぞれ有する第１のウエルと第２のウエルと第３のウエルが形成されたウエルアレイをさらに備え、
前記第１のウェルの前記底面には前記第１の流路の前記第２の開口部に連結した貫通孔が形成され、
前記第２のウェルの前記底面には前記センサ素子の前記薄板の前記貫通孔に連結した貫通孔が形成され、
前記第３のウェルの前記底面には前記第２の流路の前記第２の開口部に連結した貫通孔が形成された、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項２１】
前記第２のウエルの前記貫通孔は前記センサ素子の前記薄板の前記貫通孔に向かって狭まる形状を有する、請求項２０に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項２２】
前記第２のウエル内に配置された第１の電極と、
前記第３のウエル内と前記第１の流路内のうちの一方に配置された第２の電極と、
をさらに備えた、請求項２０に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項２３】
前記第２のウエルに被験体細胞を含む流体が投入され、
前記第３のウェルには前記被験体細胞との反応を検査する流体が投入され、
前記第１のウェルには前記吸引手段が接続される、請求項２０に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項２４】
前記第２のウエルは前記センサ素子の前記薄板の前記第１面上に配置された、請求項２０に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項２５】
前記第２のウエルの前記貫通孔は前記薄板の外形より大きい、請求項２４に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項２６】
前記第１のウエルの前記貫通孔は前記第１の流路の前記第２の開口部より大きい、請求項２０に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項２７】
前記第３のウエルの前記貫通孔は前記第２の流路の前記第２の開口部より大きい、請求項２０に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項２８】
前記ウェルアレイは、前記第１のウェルの前記貫通孔と前記第２のウェルの前記貫通孔と前記第３のウェルの前記貫通孔とが開口し、前記プレートの前記表面と同一面内にある底面を有する、請求項２０に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項２９】
前記ウエルアレイは前記プレートと同じ材質で形成された、請求項２０に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項３０】
前記プレートと前記ウエルアレイはガラスまたは石英で形成された、請求項２０に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項３１】
前記プレートと前記ウエルアレイはポリスチレン、シクロオレフィンポリマー、またはシクロオレフィンコポリマーで形成された、請求項２０に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項３２】
前記プレートと前記ウエルアレイは熱可塑性樹脂で形成された、請求項２０に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項３３】
複数の開口部が形成された別のプレートと、
前記別のプレートの前記複数の開口部と同じ方向に開口する貫通孔が形成された別の薄板を有する別のセンサ素子と、
をさらに備え、
前記ウエルアレイには、前記別のプレートの前記複数の開口部と前記センサ素子の前記貫通孔とにそれぞれ連結する貫通孔が形成された底面をそれぞれ有する複数の別のウェルアレイがさらに形成された、請求項２０に記載の細胞電位測定プローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、細胞の活動によって発生する物理化学的変化を測定するために用いられる、細胞内電位あるいは細胞外電位等の細胞電位を測定するための細胞電位測定プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】  細胞の電気的活動を指標にしながら薬理効果のある薬剤を候補薬剤からスクリーニングする従来の方法としてパッチクランプ法が知られている。パッチクランプ法は、微細な先端を持つ中空ガラス管を直接、細胞に搾入して細胞内外の電位差を測定する方法で（たとえば、Ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｃｕｒｒｅｎｔｓ  ｒｅｃｏｒｄｅｄ  ｆｒｏｍ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｏｆ  ｄｅｎｅｒｖａｔｅｄ  ｆｒｏｇ  ｍｕｓｃｌｅ  ｆｉｂｅｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ２６０：７９９−８０２、Ｎｅｈｃｒ  Ｅ  ＆  Ｓａｋｍａｎｎ  Ｂ、１９７６）、これによって、細胞膜に存在するイオンチャネルの活動状態を精度よく測定できる。【０００３】  また、国際公開第０２／０５５６５３号公報には、細胞の保持手段を有した基板およびこれに設けられた電極によって細胞外電位を測定する細胞外電位測定デバイスと方法が開示されている。この方法では、パッチクランプ法で得られるデータと同等の高品質なデータが得られ、簡易に高速で大量の試料を測定できる。【０００４】  図２４は上記の細胞外電位測定デバイスの断面図である。容器５０内に培養液５１が入れられ、被験体細胞５２は基板５３に設けられた保持手段によって捕捉されて保持されている。この保持手段は基板５３に形成された窪み５４、開口部５５、および窪み５４に連絡する貫通孔５６により構成されている。容器５０の中には参照電極５８が配置されている。貫通孔５６の周辺にはセンシング手段である測定電極５７が配置されており、測定電極５７は配線を経て外部の信号検出部に連結されている。【０００５】  被験体細胞５２は貫通孔５６を通して外部から吸引ポンプなどの手段により吸引されて窪み５４に密着して保持される。被験体細胞５２の活動により発生する電気信号は容器５０中の培養液５１側に漏れることなく、貫通孔５６に設けられた測定電極５７と参照電極５８との電位差として検出される。【０００６】  上述の従来のデバイスは、窪み５４および貫通孔５６が形成された基板５３と、この上部に設けられた、培養液および薬液を投入・蓄積するための容器５０を有している。よって、十分容量の大きい空間内に存在する溶液内の浮遊細胞をそのままの環境で測定することはできない。【０００７】  また、従来のデバイスでは、基板５３によって隔てられた２つの領域、つまり被験体細胞５２側の領域と、測定電極５７側の領域とに互いに異なる種類の培養液や薬液をそれぞれ導入できない。
【発明の開示】
【０００８】  細胞電位測定プローブは、底面を有する第１のキャビティが表面に形成されたプレートと、第１のキャビティ内に配置されたセンサ素子とを備える。第１のキャビティの底面に第２のキャビティが形成される。第２のキャビティに開口する第１の開口部とプレートの外部に開口する第２の開口部とを有する第１の流路がプレート内に形成される。センサ素子は、薄板と、薄板の周囲に設けられてプレートの第１のキャビティに配置された支持基板とを有する。薄板には第１の開口部と、プレートの第２のキャビティに連結する第２の開口部とを貫通する貫通孔が形成される。第１の流路は流体を流すことができ、吸引手段が流路の第２の開口部に接続されて第１の流路内を流れる流体を吸引できる。
【０００９】  この細胞電位測定プローブは、溶液内に浮遊する細胞の電位をそのままの環境で測定できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は本発明の実施の形態１における細胞電位測定プローブの斜視図である。
【図２】図２は実施の形態１における細胞電位測定プローブの分解斜視図である。
【図３】図３は実施の形態１における細胞電位測定プローブの断面斜視図である。
【図４】図４は実施の形態１における細胞電位測定プローブの拡大断面斜視図である。
【図５】図５は実施の形態１における細胞電位測定プローブの断面図である。
【図６】図６は実施の形態１における細胞電位測定プローブの拡大断面図である。
【図７】図７は実施の形態１における細胞電位測定プローブの斜視図である。
【図８】図８は実施の形態１における細胞電位測定プローブの使用方法を説明するための斜視図である。
【図９】図９は実施の形態１における細胞電位測定プローブの概念図である。
【図１０】図１０は実施の形態１における細胞電位測定プローブの断面図である。
【図１１】図１１は実施の形態１における細胞電位測定プローブの断面図である。
【図１２】図１２は実施の形態１における細胞電位測定プローブの断面図である。
【図１３】図１３は実施の形態１における細胞電位測定プローブの断面図である。
【図１４】図１４は実施の形態１における細胞電位測定プローブの断面図である。
【図１５】図１５は実施の形態１における他の細胞電位測定プローブの平面図である。
【図１６Ａ】図１６Ａは図１５に示す細胞電位測定プローブの拡大断面図である。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは実施の形態１によるさらに他の細胞電位測定プローブの拡大断面図である。
【図１７】図１７は本発明の実施の形態２における細胞電位測定プローブの断面図である。
【図１８】図１８は実施の形態２における細胞電位測定プローブの拡大断面図である。
【図１９Ａ】図１９Ａは実施の形態２における細胞電位測定プローブの使用方法を説明するための断面図である。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは図１９Ａに示す細胞電位測定プローブの拡大断面図である。
【図２０】図２０は本発明の実施の形態３による細胞電位測定プローブの分解斜視図である。
【図２１】図２１は実施の形態３による細胞電位測定プローブの断面斜視図である。
【図２２】図２２は実施の形態３による細胞電位測定プローブの拡大断面図である。
【図２３】図２３は実施の形態３による細胞電位測定プローブアレイの斜視図である。
【図２４】図２４は従来の細胞外電位測定プローブの断面図である。
【符号の説明】
【００１１】１  細胞電位測定プローブ
２  プレート
２Ａ  成型プレート
２Ｂ  成型プレート
３  キャビティ（第１のキャビティ）
４  センサ素子
５  キャビティ（第３のキャビティ）
６  キャビティ（第２のキャビティ）
７  支持基板
８  薄板
９  貫通孔
１０  流路（第２の流路）
１０Ａ  開口部（第１の開口部）
１１  流路（第１の流路）
１１Ａ  開口部（第１の開口部）
１２  開口部（第２の開口部）
１３  吸引手段
１５  容器（注入手段）
１６  測定溶液
１７  段差
１８  参照電極（第１の電極）
１９  測定電極（第２の電極）
２０  被験体細胞
２１  培養液
２２  開口部（第２の開口部）
２３  弁
２６  支持基板
２７  細胞電位測定プローブ
２８  プレート
２９  センサ素子
３０  薄板
３１  貫通孔
３２  キャビティ
３３  顕微鏡
３４  パッチプローブ
３５  被験体細胞
３６  培養液
３７Ａ，３７Ｂ  窪み
１１７  段差
５０１  細胞電位測定プローブ
５０２  プレート
５０３  キャビティ（第１のキャビティ）
５０４  センサ素子
５０５  キャビティ（第３のキャビティ）
５０６  キャビティ（第２のキャビティ）
５０７  薄板
５０８  貫通孔
５０９  流路（第２の流路）
５１０  流路（第１の流路）
５１１  開口部（第２の開口部）
５１２  支持基板
５１４  参照電極（第１の電極）
５１５  測定電極（第２の電極）
５１８  開口部（第２の開口部）
５１９  細胞電位測定プローブアレイ
５２０  ウエルアレイ
５２１Ａ  貫通孔
５２１Ｂ  貫通孔
５２１Ｃ  貫通孔
５２２  ウエル
５２３  ウエル
５２４  ウエル
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】  （実施の形態１）
図１は本発明の実施の形態１における細胞電位測定プローブ１の斜視図である。図２は細胞電位測定プローブ１の分解斜視図である。図３は細胞電位測定プローブ１の断面斜視図である。図４は細胞電位測定プローブ１の拡大断面斜視図である。図５は細胞電位測定プローブ１の断面図である。図６は細胞電位測定プローブ１の要部拡大断面図である。細胞電位測定プローブ１は樹脂あるいはガラスなどの絶縁体よりなるプレート２とセンサ素子４から構成されている。プレート２の上面２Ｃにはキャビティ３が形成されており、キャビティ３の内部にはセンサ素子４がはめ込まれている。キャビティ３の底面３Ａにはキャビティ６が形成されている。センサ素子４の下部にはキャビティ６が位置する。【００１３】  プレート２は成型プレート２Ａと成型プレート２Ａに貼り合わされた成型プレート２Ｂよりなり、容易に複雑な形状に形成できる。成型プレート２Ｂには溝の形状で流路１０、１１が形成される。成型プレート２Ａには貫通孔の形状で開口部１２、２２が形成され、貫通孔の形状で互いに連結したキャビティ３、６が形成されている。【００１４】  キャビティ６にはプレート２の外部に通じる流路１０、１１のそれぞれの一方の開口部１０Ａ、１１Ａが連通している。流路１０、１１のそれぞれの他方の開口部１２、２２はプレート２の上面２Ｃに開口する。流路１０、１１の断面積は０．０１ｍｍ２以上であり、この寸法により流路１０、１１は詰まりにくく、容易に清掃できる。【００１５】  キャビティ６の下面６Ａには、センサ素子４に向かってすなわちキャビティ６に向かって上方に突出する段差１７が設けられ、これにより流路１０、１１の断面積とキャビティ６での開口部１０Ａ、１１Ａ近傍の断面積を調整することができ、測定溶液を流路１０、キャビティ６、流路１１でスムースに移動させることができる。【００１６】  センサ素子４はシリコンあるいはシリコンとシリコン酸化膜との積層体からなる支持基板７を備える。プレート２の上面２Ｃと同じ向きの支持基板７の上面７Ａにはキャビティ５が設けられている。キャビティ５の底面５Ａは薄板８で構成されている。薄板８には薄板８の上面８Ａ（キャビティ５の底面５Ａ）と上面８Ａの反対側の薄板８の下面８Ｂとを連通する微小な孔径を有する貫通孔９が形成されている。貫通孔９の一方の開口部９Ａはキャビティ５に開口し、他方の開口部９Ｂはプレート２内のキャビティ６に連通している。【００１７】  センサ素子４の支持基板７の下面７Ｂ、すなわち薄板８の下面８Ｂ上には白金、金、銀、塩化銀などからなる測定電極１９が設けられている。測定電極１９はワイヤ配線、薄膜電極などの引き出し電極を接続することにより、プローブ１の外部の測定器へ接続されて信号を検出することができる。【００１８】  キャビティ３にセンサ素子４を接着剤による接合することにより確実に固定でき、流路１０、１１、キャビティ６を満たす測定溶液の漏れを完全に防止できる。なお、センサ素子４は融着、超音波接合などの方法によってキャビティ３内に接合しても良い。【００１９】  図７は細胞電位測定プローブ１の斜視図である。流路１０の開口部１２にはチューブ２４Ａが接続され、流路１１の開口部２２にはチューブ２４���が接続されている。チューブ２４Ｂは吸引手段１３に接続され、チューブ２４Ａは容器１５に接続されている。容器１５と開口部１２の間には必要に応じて測定溶液等の流体の流動を止めることができる弁２３が設けられている。吸引手段１３によってキャビティ６はキャビティ５より圧力を低く減圧雰囲気にできる。吸引手段１３はダイヤフラムポンプ、シリンジポンプなど通常のポンプの他に人の口による吸引などにより実現できるが、特にこれらに限定されない。【００２０】  次に、細胞電位測定プローブ１を用いて細胞電位を測定する方法について説明する。【００２１】  図８は細胞電位測定プローブ１の使用方法を説明するための斜視図であり、細胞電位測定プローブ１が測定棒２５に設置されている。測定棒２５の一端２５Ａには細胞電位測定プローブ１が固定されている。測定棒２５の内部には、流路１０に接続されたチューブ２４Ａと流路１１に接続されたチューブ２４Ｂと、測定電極１９と電気的に接続されている引き出し電極１９Ａが通り、測定棒２５の他端２５Ｂから外部に引き出されている。引き出し電極１９Ａは外部に設けられた測定器に接続され、測定信号を測定器に供給する。【００２２】  図９は細胞電位測定プローブ１の使用中の概念図であり、容器１４に充填されている培養液２１中に細胞電位測定プローブ１を設置された測定棒２５が入れられている。培養液２１中には被験体細胞２０が浮遊している。容器１４内では参照電極１８が培養液２１に接しており、容器１４内の培養液２１の電位を検出できる。細胞電位測定プローブ１は容器１４内の培養液２１内にセンサ素子４が位置するように設置されている。【００２３】  図１０〜図１４は細胞電位測定プローブ１を用いて細胞電位を測定する方法を説明するための断面図である。【００２４】  図１０では、培養液２１内のセンサ素子４の上部で被験体細胞２０が浮遊している。【００２５】  次に、図１１に示すように、弁２３が閉じられて流路１０、１１およびキャビティ６は容器１５と遮断されている。そして吸引手段１３によってキャビティ６を減圧して、キャビティ５より圧力を低くする。これにより、キャビティ５に充填されている培養液２１および被験体細胞２０が貫通孔９へ引き込まれ、培養液２１はキャビティ６へ流れ出す。被験体細胞２０はその大きさが貫通孔９の断面積より大きいので貫通孔９を通り抜けることができず、貫通孔９の開口部９Ａで保持される。培養液２１はキャビティ６へ流れることにより測定電極１９と接触し、キャビティ６内の電位を検出できる。この状態で、参照電極１８と測定電極１９との電位差および抵抗値・容量値などの電気的な測定を行うことができる。【００２６】  被験体細胞２０が貫通孔９の開口部９Ａに保持されると、培養液２１はセンサ素子４により遮断されてキャビティ５内の部分２１Ａとキャビティ６内の部分２１Ｂに分離し、参照電極１８と測定電極１９との間の抵抗値は上昇する。【００２７】  その後、さらに吸引手段１３によりキャビティ６を減圧すると図１２に示すように被験体細胞２０の表面は貫通孔９の開口部９Ａにさらに強く押しつけられ、単に保持されるより参照電極１８と測定電極１９との間の抵抗値は高くなる。このときの抵抗値は１００ＭΩ以上、時には１ＧΩ以上となり、ギガシール（Ｇｉｇａ−Ｓｅａｌ）と呼ばれる状態となる。ギガシール状態において、被験体細胞２０のイオンチャネル活動によって培養液２１と被験体細胞２０内との間でイオンの交換が行われると被験体細胞２０の内部電位が変化する。内部電位の変位は参照電極１８と測定電極１９との電位差として検出できる。【００２８】  細胞２０のイオンチャネル活動は培養液２１に含まれる薬剤によって変化し、このイオンチャネル活動を参照電極１８と測定電極１９との電位差によって検出することによって薬剤が被験体細胞２０に与える影響を知る、つまり、被験体細胞２０に対する薬剤の薬理効果を判定できる。【００２９】  なお、参照電極１８、測定電極１９をそれぞれ貫通孔９の開口部９Ａ、９Ｂ付近に設けることにより被験体細胞２０の近傍で電位差を高精度に測定できる。【００３０】  細胞電位測定プローブ１は、培養液２１に浮遊している細胞２０を容易に捕捉しギガシール状態を形成できる。【００３１】  プレート２の上面２Ｃとセンサ素子４の支持基板７の上面７Ａとを同一面とすることにより、図１３に示すように、被験体細胞２０を含む培養液２１をセンサ素子４の支持基板７の上面７Ａ上やキャビティ５内にプレートピペット等で直接供給できる。これにより、プレート２の上面２Ｃの上部より顕微鏡により細胞２０を容易に観測できる。さらに、細胞２０の周辺で発生する気泡を容易に除去でき、薬剤を確実に細胞２０に投与できる。【００３２】  図１２に示したギガシール状態で弁２３を開くと、図１４に示すように、容器１５内にある測定溶液１６が流路１０およびキャビティ６へ引き込まれ、容器１５は測定溶液１６を流路１０に注入する注入手段として機能する。流路１１を吸引手段１３により減圧することでキャビティ６の内部の培養液２１の部分２１Ｂは測定溶液１６に置換えられる。測定溶液１６として高いＫ＋濃度の溶液を用いることで、被験体細胞２０の電位変化をより正確に検出できる。【００３３】  貫通孔９の開口部９Ａ、９Ｂの近傍に参照電極１８および測定電極１９を薄膜技術などによってそれぞれ形成することにより、被験体細胞２０の電位変化を検出できる。【００３４】  図１５は実施の形態１による他の細胞電位測定プローブ１Ａの平面図である。流路１１０、１１１の少なくとも一部が曲がっている。これにより、流路１１０、１１１を流体が流れる際の抵抗が大きくなるので、一度キャビティ６内に進入した培養液２１や測定溶液１６が外部に漏れ出したり、外部より気泡が混入したりすることを防止できる。【００３５】  図１６Ａは細胞電位測定プローブ１Ａの線１６−１６における拡大断面図である。貫通孔９のキャビティ５に開口する開口部９Ａには貫通孔９の孔径より大きい径の窪み３７Ａが設けられており、被験体細胞２０をより確実に捕捉できる。【００３６】  図１６Ｂは実施の形態１によるさらに他の細胞電位測定プローブ１Ｂの拡大断面図である。細胞電位測定プローブ１Ｂでは、貫通孔９のキャビティ６に開口する開口部９Ｂに貫通孔９の孔径より大きな径の窪み３７Ｂが設けられている。これにより、キャビティ６内の培養液２１や測定溶液１６の貫通孔９の開口部９Ｂ付近での流動性を安��させることができる。【００３７】  図１６Ａ、図１６Ｂに示すように、段差１１７およびキャビティ６のエッジ部１１７Ａ、６Ｂを曲面状に面取りすることにより測定溶液１６をスムースに流すことができる。【００３８】  プレート２の材料である樹脂やガラスなどの絶縁性材料は可視光を透過させる透明性を有してもよい。これによりキャビティ６から貫通孔９の開口部９Ｂを顕微鏡で容易に観測でき、培養液２１や測定溶液１６のキャビティ６への進入状態や気泡の有無などを観察しながら細胞電位を測定できる。【００３９】  さらに、センサ素子４の薄板８も樹脂やガラスなどの可視光を透過させる透明な材料で形成してもよい、これにより、プレート２の下面から顕微鏡で被験体細胞２０を観察できる。【００４０】  （実施の形態２）
図１７は本発明の実施の形態２における細胞電位測定プローブ２７の断面図である。図１８は細胞電位測定プローブ２７のセンサ素子２９の拡大断面図である。実施の形態１と同じ部分は同じ参照符号を付して説明を省略する。【００４１】  細胞電位測定プローブ２７はプレート２８とセンサ素子２９により構成されている。プレート２８の上面２８Ｃにはキャビティ８３が形成され、キャビティ８３の底面８３Ａにはキャビティ６が形成されている。キャビティ８３にはセンサ素子２９がはめ込まれている。センサ素子２９は支持基板２６を備える。支持基板２６の下面２６Ｂにキャビティ３２が形成され、キャビティ３２の底面３２Ａには薄板３０が形成されている。薄板３０には薄板３０の上面３０Ａと下面３０Ｂ（キャビティ３２の底面３２Ａ）とを連通する貫通孔３１が形成されている。貫通孔３１の開口部３１Ａは薄板３０の上面３０Ａ（支持基板２６の上面２６Ａ）で開口して外方に通じている。貫通孔３１の開口部３１Ｂは薄板３０の下面３０Ｂで開口してキャビティ３２およびキャビティ６に通じている。これにより貫通孔３１はプレート２８内に設けられたキャビティ６を介して流路１０、１１に通じている。必要に応じて薄板３０の下面３０Ｂ上に測定電極１９が形成される。【００４２】  図１９Ａは細胞電位測定プローブ２７の使用方法を説明するための断面図である。図１９Ｂは図１９Ａに示す細胞電位測定プローブ２７の拡大断面図である。図１に示す実施の形態１による細胞電位測定プローブ１と同様に、センサ素子２９の支持基板２６の上面２６Ａはプレート２８の上面２８Ｃと同一平面であり、凸凹がない。これにより、顕微鏡３３で被験体細胞３５をより接近して観察できる。顕微鏡３３により観測しながらパッチプローブ３４を被験体細胞３５にアタッチさせることができる。これにより、一つの被験体細胞３５から複数の部分におけるイオンチャネル活動を測定できる。例えば、薬剤を培養液３６の中に投与したとき、細胞３５の投与位置に近い部分３５Ａにアタッチさせたパッチプローブ３４の電位と、細胞３５の部分３５Ａより投与位置から遠い貫通孔３１に捕捉された細胞３５の部分３５Ｂに近い測定電極１９の電位が同時に得られ、細胞３５でのイオンチャネル活動の部分３５Ａから部分３５Ｂへの伝達状態を検出できる。【００４３】  なお、実施の形態１による細胞電位測定プローブ１のプレート２や支持基板７と同様に、細胞電位測定プローブ２７のプレート２８や薄板３０を、可視光を透過させる透明性を有する材料で形成することで同様の効果が得られる。【００４４】  （実施の形態３）
図２０は本発明の実施の形態３における細胞電位測定プローブ５０１の分解斜視図である。図２１は細胞電位測定プローブ５０１の断面斜視図である。図２２は細胞電位測定プローブ５０１の要部拡大断面図である。細胞電位測定プローブ５０１は樹脂あるいはガラスなどの絶縁体よりなるプレート５０２とセンサ素子５０４とウエルアレイ５２０から構成している。プレート５０２の上面５０２Ｃにはキャビティ５０３が形成され、キャビティ５０３の底面５０３Ａにはキャビティ５０６が形成されている。キャビティ５０３にはセンサ素子５０４がはめ込まれている。キャビティ５０６はセンサ素子５０４の下部に位置している。【００４５】  キャビティ５０６には外方へ通じる流路５０９、５１０が設けられている。流路５０９はプレート５０２の上面５０２Ｃに設けた開口部５１１を有し、流路５１０はプレート５０２の上面５０２Ｃに設けた開口部５１８を有する。流路５０９、５１０はプレート５０２の外部と接続されている。予め成形された成型プレート５０２Ａに、予め成型された成型プレート５０２Ｂを貼り合わせることで複雑な形状を有するプレート５０２が得られる。成型プレート５０２Ｂには溝の形状で流路５０９、５１０が形成される。成型プレート５０２Ａには貫通孔の形状で開口部５１１、５１８が形成され、貫通孔の形状で互いに連結したキャビティ５０３、５０６が形成されている。【００４６】  センサ素子５０４は支持基板５１２と薄板５０７よりなり、図２２に示すように、薄板５０７の下方（プレート５０２の上面５０２Ｃと反対側の下面５１２Ｂ側）にキャビティ５０５が設けられている。つまり、キャビティ５０５の底面５０５Ａは薄板５０７で形成される。薄板５０７には上面５０７Ａ（支持基板５１２の上面５１２Ａ）と下面５０７Ｂを貫通する微小貫通孔５０８が設けられている。貫通孔５０８の、薄板５０７の上面５０７Ａ（支持基板５１２の上面５１２Ａ）に開口する開口部５０８Ａに被験体細胞が保持される。貫通孔５０８の孔径は被験体細胞の大きさよりも小さいことが必要である。図１６Ａと同様に、貫通孔５０８の開口部５０８Ａに貫通孔５０８の孔径より大きな径の窪みを設けることにより被験体細胞を安定して確実に保持できる。貫通孔５０８は薄板５０７の下面５０７Ｂ（キャビティ５０５の底面５０５Ａ）でキャビティ５０５に開口する開口部５０８Ｂを有する。貫通孔５０８の開口部５０８Ａはセンサ素子５０４の支持基板５１２の上面５１２Ａに通じ、開口部５０８Ｂはキャビティ５０５を介してキャビティ５０６と連結している。この構造により、貫通孔５０８、キャビティ５０５、５０６を通って培養液、薬液などの液体が流動できる。【００４７】  センサ素子５０４では、薄板５０７が上部に位置する、すなわち支持基板５１２の上面５１２Ａがプレート５０２の上面５０２Ｃと同一平面内に位置する。これに対し、図６に示す実施の形態１による細胞電位測定プローブと同様に、キャビティ５０５が支持基板５１２の上面５１２Ａに形成されてもよい。【００４８】  プレート５０２の上面５０２Ａ上には所定の容量を有し、培養液、薬液などの液体を投入したり、蓄えたり、循環させることができるウエルアレイ５２０が配置されている���ウェルアレイ５２０はウェル５２２、５２３、５２４が形成されている。ウェル５２２の下面５２２Ａには流路５０９の開口部５１１に連結した貫通孔５２１Ａが形成されている。ウエル５２３の下面５２３Ａには、センサ素子５０４の薄板５０７に形成された貫通孔５０８に連結した貫通孔５２１Ｂが形成されている。ウエル５２４の下面５２４Ａには、流路５１０の開口部５１８に連結した貫通孔５２１Ｃが形成されている。ウエル５２２、５２３、５２４の上面には培養液、薬液などの液体を投入する開口部５２２Ｂ、５２３Ｂ、５２４Ｂが設けられている。ウェル５２３には参照電極５１４が設けられている。流路５１０内にはプレート５０２の外部に繋がる測定電極５１５が設けられている。【００４９】  被験体細胞を有した培養液をウエル５２３の開口部５２３Ｂから投入し、ウエル５２４の開口部５２４Ｂから吸引ポンプなどの吸引手段によって吸引する。これによって培養液は貫通孔５０８を通過し、その後キャビティ５０５、５０６、流路５１０および開口部５１８を通過することによりウエル５２４へ吸引される。または、ウエル５２２へ測定液または培養液を投入後、ウエル５２４から吸引することによって、流路５０９、５１０およびキャビティ５０５、５０６には十分な測定液または培養液が行き渡り、気泡が混入することが少なくなるため、測定をより正確に行いやすい。なお、この場合は、ウエル５２３に被験体細胞を投入する前に測定液を投入し、流路５０９，５１０内に測定液を十分行き渡らせたのちにウエル５２２の開口部５２２Ｂを閉じ、この後、被検体細胞をウエル５２３に投入してウエル５２４から測定液の吸引を行うことが望ましい。【００５０】  センサ素子５０４の貫通孔５０８が被験体細胞を通過させない孔径を有することで、被験体細胞は貫通孔５０８の開口部５０８Ａで保持され、貫通孔５０８で保持された被験体細胞の電位を測定できる。実施の形態３では、薄板５０７には複数の貫通孔５０８が形成されており、これにより一度に複数の被験体細胞の電位を一括して測定できる。被験体細胞が全ての貫通孔５０８を塞ぐと、それ以外の被験体細胞はウエル５２３中にとどまる。これにより、培養液がキャビティ５０５に流入する量が少なくなり、貫通孔５０８の開口部５０８Ａに被験体細胞が保持されたことを検知できる。この作業は培養液の流量を測定しながらウエル５２４での吸引力を制御することによって行うことができる。なお、この吸引動作はウエル５２２から行っても同じである。【００５１】  ウエル５２３の開口部５２３Ｂを閉じた後、ウエル５２２から薬液を投入してウエル５２４から吸引手段により吸引することによって薬液が貫通孔５２１Ａを通過し、開口部５１１、流路５０９、キャビティ５０６、キャビティ５０５、流路５１０および開口部５１８を通過して、ウエル５２４へ吸引される。このとき、貫通孔５０８の開口部５０８Ａでトラップされている被験体細胞に貫通孔５０８の開口部５０８Ｂから薬液が接触して、被験体細胞が薬液に反応する。反応したとき被験体細胞の電位を、ウェル５２３内の培養液に接触している参照電極５１４と、流路５１０内の薬液に接触している測定電極５１５とを介して測定できる。【００５２】  ��胞電位測定プローブ５０１では、被験体細胞が存在する領域すなわちウェル５２３と測定電極５１５が存在する領域すなわち流路５１０にそれぞれ、培養液や薬液などの別の液体を導入できる。また、ウエル５２２とウエル５２４間で溶液を吸引させれば、キャビティ５０５，５０６内の溶液の種類を置換することが容易にできる。【００５３】  なお、ウエル５２０は三個のウエル５２２、５２３、５２４よりなり、これらを用いる方法を説明してきたが、被験体細胞を微小貫通孔５０８に保持した後、培養液の代わりにウエル５２３より薬液を投入して、細胞電位の測定を行うだけでよい場合は、２個のウエル（例えばウエル５２３とウエル５２４）だけで測定することができる。【００５４】  プレート５０２の上面５０２Ｃとウエルアレイ５２０の底面５２０Ａに密着させることでプレート５０２をウェルアレイ５２０で確実に封止できるので、液漏れなどを確実に防止できる。【００５５】  ウエイアレイ５２０をプレート５０２と同じ材質で形成することでウエイアレイ５２０とプレート５０２の膨張係数の違いによる変形を防止でき、プレート５０２をウェルアレイ５２０でより確実に封止できる。【００５６】  ウエルアレイ５２０とプレート５０２をポリスチレン、シクロオレフィンポリマー、シクロオレフィンコポリマーなどの熱可塑性樹脂で形成することにより、超音波融着やレーザ溶着によって確実な封止と高い生産性で細胞電位測定プローブ５０１を製造できる。【００５７】  ウエルアレイ５２０とプレート５０２をガラス、石英の材料で形成してもよい。これらの材料は鏡面研磨した表面同士であれば、接着剤を使わずに直接接合できる。あるいは、これら材料は耐熱性が高いため、ガラス接着剤やセラミック接着剤などの無機系接着材料で接合することができる。このように構成されたウエルアレイ５２０とプレート５０２は耐熱性に優れているため加熱洗浄による再利用が可能な細胞電位測定プローブ５０１が得られる。【００５８】  図２１に示すように、ウエル５２２、５２３、５２４の下面５２２Ａ、５２３Ａ、５２４Ａにそれぞれ形成された貫通孔５２１Ａ、５２１Ｂ、５２１Ｃのうちの少なくとも貫通孔５２１Ｂを、ウェル５２３の開口部５２３Ｂに向かって広がる形状、すなわちセンサ素子５０４の貫通孔５０８に向かって狭まる形状に形成しても良い。これにより、ウエル５２３に投入する培養液や薬液などを速やかにセンサ素子５０４の貫通孔５０８へ浸透させることができる。【００５９】  図２１に示すように、貫通孔５２１Ｂの大きさを、貫通孔５０８を形成した薄板５０７よりも大きくすることにより、貫通孔５０８へ被験体細胞を効率よく引き込むことができる。【００６０】  また、ウエルアレイ５２０には、被験体細胞を含む培養液を投入するウエル５２３と、薬液を投入するウエル５２２と、吸引手段に接続されたウエル５２４とが形成されている。これにより、プレート５０２の上面５０２Ｃに被験体細胞を容易に保持でき、薬液などを投入することが全てウエルアレイ５２０の上部より独立して行うことができるので測定の際に容易にプローブ５０１を操作できる。【００６１】  ウエル５２２の貫通孔５２１Ａの大きさを流路５０９の開口部５１１より大きく��、ウエル５２４の貫通孔５２１Ｃの大きさを流路５１０の開口部５１８よりも大きくする。これにより、薬液などの液体を速やかに流路に導入することができ、高精度でばらつきの少ない細胞電位を測定できる細胞電位測定プローブ５０１が得られる。【００６２】  参照電極５１４がウエル５２３内の培養液に接する所定の位置に配置される。測定電極５１５が流路５１０内に設けられて流路５１０内の培養液あるいは薬液などの液体に接触する。これにより、培養液中における被験体細胞の細胞電位と薬液などの液体をウエル５２２またはウエル５２３より投入した後の被験体細胞の細胞電位の変化を測定できる。測定電極５１５はキャビティ５０５またはキャビティ５０６の近傍に設けても良い。【００６３】  参照電極５１４と測定電極５１５はワイヤ配線や薄膜電極などで形成でき、プローブ５０１の外部の測定器に接続されて電極からの信号を検出できる。【００６４】  次に、細胞電位測定プローブ５０１を用いて、細胞電位を測定する方法を説明する。【００６５】  まず、ウエル５２３には被験体細胞を含む培養液を投入し、次にウエル５２２またはウエル５２４から吸引手段により吸引することで被験体細胞はセンサ素子５０４の貫通孔５０８に保持される。ウエル５２３内に設けられて培養液に接触する参照電極５１４と、流路５１０内に設けられた測定電極５１５との間の抵抗値を測定する。電極５１４、５１５間の抵抗値は、吸引手段の吸引圧力を制御することにより、ウエル５２３に貯留された培養液と流路５１０内に貯留された培養液の間の抵抗値が１００ＭΩ以上となる。参照電極５１４および測定電極５１５はＡｕ、Ａｇ、ＡｇＣｌなどの導電材料で構成することができ、培養液に接触させることで電気的接続が得られる。したがって、電極５１４、５１５が配置される位置は上記の位置に限定されない。【００６６】  次に、ウエル５２２内に薬液等の測定溶液を貯留してウエル５２４から吸引すると、流路５０９、キャビティ５０５、キャビティ５０６、流路５１０内の培養液を測定溶液で置換させることができる。これにより、細胞が存在するウエル５２３の領域と測定電極５１５が存在するキャビティ５０６の領域に、それぞれ別種類の培養液や測定溶液を容易に導入でき、より速く細胞電位を測定できる。【００６７】  ウエル５２２とウエル５２４の機能を逆にしても同様に細胞の電位が測定できる。【００６８】  ウエル５２２、５２３、５２４にバルブあるいは蓋を設けることにより、プローブ５０１での測定をより容易に制御できる。【００６９】  実施の形態３による他の細胞電位測定プローブ５１９である、複数の細胞電位測定プローブ５０１を用いた細胞電位測定プローブアレイ５１９について説明する。図２３は実施の形態３による他の細胞電位測定プローブ５１９（細胞電位測定プローブアレイ５１９）の分解斜視図である。細胞電位測定プローブ５０１が４列×８列のマトリックス状に配置されている。ウェル５２２、５２３、５２４が複数のプレート５２０に対応する位置でそれぞれ形成された複数のウエルアレイ５２０は一括してウェルアレイユニット５２０Ａとして作製できる。【００７０】  このように複数の細胞電位測定プローブ５０１が所定のフォーマット���並べられた細胞電位測定プローブアレイ５１９は、薬液注入・細胞投入・吸引などにロボットなどを利用することができるので、短時間で多数の被験体細胞の電位を測定でき、薬理効果を判断して候補薬剤を迅速にスクリーニングできる。
【産業上の利用可能性】
【００７１】  本発明による細胞電位測定プローブは、溶液内に浮遊する細胞の電位をそのままの環境で測定でき、細胞への薬理効果を判定して薬剤のスクリーニングに用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2006022092.tif 000012
【図１２】
2006022092.tif 000013
【図１３】
2006022092.tif 000014
【図１４】
2006022092.tif 000015
【図１５】
2006022092.tif 000016
【図１６Ａ】
2006022092.tif 000017
【図１６Ｂ】
2006022092.tif 000018
【図１７】
2006022092.tif 000019
【図１８】
2006022092.tif 000020
【図１９Ａ】
2006022092.tif 000021
【図１９Ｂ】
2006022092.tif 000022
【図２０】
2006022092.tif 000023
【図２１】
2006022092.tif 000024
【図２２】
2006022092.tif 000025
【図２３】
2006022092.tif 000026
【図２４】
2006022092.tif 000027
【手続補正書】
【提出日】平成17年11月28日(2005.11.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】請求の範囲
【請求項１】（補正後）吸引手段と共に用いられる細胞電位測定プローブであって、
表面を有するプレートであり、底面を有する第１のキャビティが前記表面に形成され、
前記第１のキャビティの前記底面に第２のキャビティが形成され前記第２のキャビティに開口する第１の開口部と前記プレートの外部に開口する第２の開口部とを有する第１の流路が内部に形成された前記プレートと、
前記第１のキャビティ内に配置されたセンサ素子と、
を備え、
前記センサ素子は
第１面と前記第１面の反対側の第２面とを有し、前記第１面に開口する第１の開口部と、
前記第２面に開口して前記プレートの前記第２のキャビティに連結する第２の開口部とを有する貫通孔が形成された薄板と、
前記薄板の周囲に設けられて前記プレートの前記第１のキャビティに配置された支持基板と、
を有し、
前記第１の流路は流体を流すことができ、前記吸引手段は前記第１の流路の前記第２の開口部に接続されて前記第１の流路内を流れる流体を吸引でき、
前記プレートの前記第２の流路の前記第２の開口部には前記第２の流路の前記第２の開口部から流体を注入する注入手段が接続される、細胞電位測定プローブ。
【請求項２】前記第１のキャビティの前記底面と前記センサ素子の前記薄板の前記第２面は同一面内にある、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項３】前記センサ素子の前記支持基板は前記プレートの前記表面と同じ向きの第１面と前記プレートの前記第１のキャビティの前記底面上に配置された第２面とを有し、前記薄板の前記第１面上に第３のキャビティが形成される、請求項２に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項４】前記センサ素子の前記支持基板と前記プレートとは接合されている、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項５】前記プレート内に、前記第２のキャビティに開口する第１の開口部と前記プレートの外部に開口する第２の開口部とを有する第２の流路がさらに形成された、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項６】（削除）
【請求項７】（補正後）前記注入手段と前記第２の流路との間に弁が設けられる、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項８】前記第２の流路の断面積は０．０１ｍｍ２以上である、請求項５に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項９】前記第２の流路の、少なくとも一部が曲がっている、請求項５に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項１０】前記プレートは、前記第１の流路と前記第２の流路との間に設けられて前記第２のキャビティに向かって突出する段差を有する、請求項５に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項１１】前記第１の流路の断面積は０．０１ｍｍ２以上である、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項１２】前記第１の流路の少なくとも一部が曲がっている、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項１３】前記センサ素子の前記貫通孔の前記第１の開口部と前記第２の開口部の両側の領域にそれぞれ電極を設けた請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項１４】前記センサ素子の前記薄板には、前記薄板の前記貫通孔の前記第１の開口部と前記第２の開口部のうちの少なくとも１つに前記薄板の前記貫通孔の径より大きな径を有する窪みが形成された、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項１５】前記プレートは可視光を透過する材料で形成された、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項１６】前記センサ素子の前記薄板は可視光を透過する材料で形成された、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項１７】前記プレートは前記第２のキャビティに向かって突出する段差を有する、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
２４
【手続補正書】
【提出日】平成17年12月8日(2005.12.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
吸引手段と共に用いられる細胞電位測定プローブであって、
表面を有するプレートであり、底面を有する第１のキャビティが前記表面に形成され、前記第１のキャビティの前記底面に第２のキャビティが形成され、前記第２のキャビティに開口する第１の開口部と前記プレートの外部に開口する第２の開口部とを有する第１の流路が内部に形成された前記プレートと、
前記第１のキャビティ内に配置されたセンサ素子と、
を備え、
前記センサ素子は
第１面と前記第１面の反対側の第２面とを有し、前記第１面に開口する第１の開口部と、前記第２面に開口して前記プレートの前記第２のキャビティに連結する第２の開口部とを有する貫通孔が形成された薄板と、
前記薄板の周囲に設けられて前記プレートの前記第１のキャビティに配置された支持基板と、
を有し、
前記第１の流路は流体を流すことができ、前記吸引手段は前記第１の流路の前記第２の開口部に接続されて前記第１の流路内を流れる流体を吸引でき、
前記プレートの前記第２の流路の前記第２の開口部には前記第２の流路の前記第２の開口部から流体を注入する注入手段が接続される、細胞電位測定プローブ。
【請求項２】
前記第１のキャビティの前記底面と前記センサ素子の前記薄板の前記第２面は同一面内にある、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項３】
前記センサ素子の前記支持基板は前記プレートの前記表面と同じ向きの第１面と前記プレートの前記第１のキャビティの前記底面上に配置された第２面とを有し、前記薄板の前記第１面上に第３のキャビティが形成される、請求項２に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項４】
前記センサ素子の前記支持基板と前記プレートとは接合されている、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項５】
前記プレート内に、前記第２のキャビティに開口する第１の開口部と前記プレートの外部に開口する第２の開口部とを有する第２の流路がさらに形成された、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項６】
前記注入手段と前記第２の流路との間に弁が設けられる、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項７】
前記第２の流路の断面積は０．０１ｍｍ２以上である、請求項５に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項８】
前記第２の流路の、少なくとも一部が曲がっている、請求項５に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項９】
前記プレートは、前記第１の流路と前記第２の流路との間に設けられて前記第２のキャビティに向かって突出する段差を有する、請求項５に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項１０】
前記第１の流路の断面積は０．０１ｍｍ２以上である、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項１１】
前記第１の流路の少なくとも一部が曲がっている、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項１２】
前記センサ素子の前記貫通孔の前記第１の開口部と前記第２の開口部の両側の領域にそれぞれ電極を設けた請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項１３】
前記センサ素子の前記薄板には、前記薄板の前記貫通孔の前記第１の開口部と前記第２の開口部のうちの少なくとも１つに前記薄板の前記貫通孔の径より大きな径を有する窪みが形成された、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項１４】
前記プレートは可視光を透過する材料で形成された、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項１５】
前記センサ素子の前記薄板は可視光を透過する材料で形成された、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項１６】
前記プレートは前記第２のキャビティに向かって突出する段差を有する、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項１７】
前記プレートの前記表面と前記センサ素子の前記薄板の前記第１面は同一面内にある、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項１８】
前記センサ素子の前記支持基板は前記プレートの前記表面と同じ向きの第１面と前記プレートの前記第１のキャビティの前記底面上に配置された第２面とを有し、前記薄板の前記第２面上に第３のキャビティが形成される、請求項１７に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項１９】
開口部と底面とをそれぞれ有する第１のウエルと第２のウエルと第３のウエルが形成されたウエルアレイをさらに備え、
前記第１のウェルの前記底面には前記第１の流路の前記第２の開口部に連結した貫通孔が形成され、
前記第２のウェルの前記底面には前記センサ素子の前記薄板の前記貫通孔に連結した貫通孔が形成され、
前記第３のウェルの前記底面には前記第２の流路の前記第２の開口部に連結した貫通孔が形成された、請求項１に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項２０】
前記第２のウエルの前記貫通孔は前記センサ素子の前記薄板の前記貫通孔に向かって狭まる形状を有する、請求項１９に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項２１】
前記第２のウエル内に配置された第１の電極と、
前記第３のウエル内と前記第１の流路内のうちの一方に配置された第２の電極と、
をさらに備えた、請求項１９に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項２２】
前記第２のウエルに被験体細胞を含む流体が投入され、
前記第３のウェルには前記被験体細胞との反応を検査する流体が投入され、
前記第１のウェルには前記吸引手段が接続される、請求項１９に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項２３】
前記第２のウエルは前記センサ素子の前記薄板の前記第１面上に配置された、請求項１９に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項２４】
前記第２のウエルの前記貫通孔は前記薄板の外形より大きい、請求項２３に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項２５】
前記第１のウエルの前記貫通孔は前記第１の流路の前記第２の開口部より大きい、請求項１９に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項２６】
前記第３のウエルの前記貫通孔は前記第２の流路の前記第２の開口部より大きい、請求項１９に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項２７】
前記ウェルアレイは、前記第１のウェルの前記貫通孔と前記第２のウェルの前記貫通孔と前記第３のウェルの前記貫通孔とが開口し、前記プレートの前記表面と同一面内にある底面を有する、請求項１９に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項２８】
前記ウエルアレイは前記プレートと同じ材質で形成された、請求項１９に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項２９】
前記プレートと前記ウエルアレイはガラスまたは石英で形成された、請求項１９に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項３０】
前記プレートと前記ウエルアレイはポリスチレン、シクロオレフィンポリマー、またはシクロオレフィンコポリマーで形成された、請求項１９に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項３１】
前記プレートと前記ウエルアレイは熱可塑性樹脂で形成された、請求項１９に記載の細胞電位測定プローブ。
【請求項３２】
複数の開口部が形成された別のプレートと、
前記別のプレートの前記複数の開口部と同じ方向に開口する貫通孔が形成された別の薄板を有する別のセンサ素子と、
をさらに備え、
前記ウエルアレイには、前記別のプレートの前記複数の開口部と前記センサ素子の前記貫通孔とにそれぞれ連結する貫通孔が形成された底面をそれぞれ有する複数の別のウェルアレイがさらに形成された、請求項１９に記載の細胞電位測定プローブ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】細胞電位測定プローブ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の活動によって発生する物理化学的変化を測定するために用いられる、細胞内電位あるいは細胞外電位等の細胞電位を測定するための細胞電位測定プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の電気的活動を指標にしながら薬理効果のある薬剤を候補薬剤からスクリーニングする従来の方法としてパッチクランプ法が知られている。パッチクランプ法は、微細な先端を持つ中空ガラス管を直接、細胞に搾入して細胞内外の電位差を測定する方法で（たとえば、Ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｃｕｒｒｅｎｔｓ  ｒｅｃｏｒｄｅｄ  ｆｒｏｍ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｏｆ  ｄｅｎｅｒｖａｔｅｄ  ｆｒｏｇ  ｍｕｓｃｌｅ  ｆｉｂｅｒｓ．    Ｎａｔｕｒｅ  ２６０  ：  ７９９−８０２、Ｎｅｈｅｒ  Ｅ  ＆  Ｓａｋｍａｎｎ  Ｂ、１９７６）、これによって、細胞膜に存在するイオンチャネルの活動状態を精度よく測定できる。
【０００３】
また、国際公開第０２／０５５６５３号公報には、細胞の保持手段を有した基板およびこれに設けられた電極によって細胞外電位を測定する細胞外電位測定デバイスと方法が開示されている。この方法では、パッチクランプ法で得られるデータと同等の高品質なデータが得られ、簡易に高速で大量の試料を測定できる。
【０００４】
図２４は上記の細胞外電位測定デバイスの断面図である。容器５０内に培養液５１が入れられ、被験体細胞５２は基板５３に設けられた保持手段によって捕捉されて保持されている。この保持手段は基板５３に形成された窪み５４、開口部５５、および窪み５４に連絡する貫通孔５６により構成されている。容器５０の中には参照電極５８が配置されている。貫通孔５６の周辺にはセンシング手段である測定電極５７が配置されており、測定電極５７は配線を経て外部の信号検出部に連結されている。
【０００５】
被験体細胞５２は貫通孔５６を通して外部から吸引ポンプなどの手段により吸引されて窪み５４に密着して保持される。被験体細胞５２の活動により発生する電気信号は容器５０中の培養液５１側に漏れることなく、貫通孔５６に設けられた測定電極５７と参照電極５８との電位差として検出される。
【０００６】
上述の従来のデバイスは、窪み５４および貫通孔５６が形成された基板５３と、この上部に設けられた、培養液および薬液を投入・蓄積するための容器５０を有している。よって、十分容量の大きい空間内に存在する溶液内の浮遊細胞をそのままの環境で測定することはできない。
【０００７】
また、従来のデバイスでは、基板５３によって隔てられた２つの領域、つまり被験体細胞５２側の領域と、測定電極５７側の領域とに互いに異なる種類の培養液や薬液をそれぞれ導入できない。
【発明の開示】
【０００８】
細胞電位測定プローブは、底面を有する第１のキャビティが表面に形成されたプレートと、第１のキャビティ内に配置されたセンサ素子とを備える。第１のキャビティの底面に第２のキャビティが形成される。第２のキャビティに開口する第１の開口部とプレートの外部に開口する第２の開口部とを有する第１の流路がプレート内に形成される。センサ素子は、薄板と、薄板の周囲に設けられてプレートの第１のキャビティに配置された支持基板とを有する。薄板には第１の開口部と、プレートの第２のキャビティに連結する第２の開口部とを貫通する貫通孔が形成される。第１の流路は流体を流すことができ、吸引手段が流路の第２の開口部に接続されて第１の流路内を流れる流体を吸引できる。
【０００９】
この細胞電位測定プローブは、溶液内に浮遊する細胞の電位をそのままの環境で測定できる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明による細胞電位測定プローブは、溶液内に浮遊する細胞の電位をそのままの環境で測定でき、細胞への薬理効果を判定して薬剤のスクリーニングに用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（実施の形態１）
図１は本発明の実施の形態１における細胞電位測定プローブ１の斜視図である。図２は細胞電位測定プローブ１の分解斜視図である。図３は細胞電位測定プローブ１の断面斜視図である。図４は細胞電位測定プローブ１の拡大断面斜視図である。図５は細胞電位測定プローブ１の断面図である。図６は細胞電位測定プローブ１の要部拡大断面図である。細胞電位測定プローブ１は樹脂あるいはガラスなどの絶縁体よりなるプレート２とセンサ素子４から構成されている。プレート２の上面２Ｃにはキャビティ３が形成されており、キャビティ３の内部にはセンサ素子４がはめ込まれている。キャビティ３の底面３Ａにはキャビティ６が形成されている。センサ素子４の下部にはキャビティ６が位置する。
【００１２】
プレート２は成型プレート２Ａと成型プレート２Ａに貼り合わされた成型プレート２Ｂよりなり、容易に複雑な形状に形成できる。成型プレート２Ｂには溝の形状で流路１０、１１が形成される。成型プレート２Ａには貫通孔の形状で開口部１２、２２が形成され、貫通孔の形状で互いに連結したキャビティ３、６が形成されている。
【００１３】
キャビティ６にはプレート２の外部に通じる流路１０、１１のそれぞれの一方の開口部１０Ａ、１１Ａが連通している。流路１０、１１のそれぞれの他方の開口部１２、２２はプレート２の上面２Ｃに開口する。流路１０、１１の断面積は０．０１ｍｍ２以上であり、この寸法により流路１０、１１は詰まりにくく、容易に清掃できる。
【００１４】
キャビティ６の下面６Ａには、センサ素子４に向かってすなわちキャビティ６に向かって上方に突出する段差１７が設けられ、これにより流路１０、１１の断面積とキャビティ６での開口部１０Ａ、１１Ａ近傍の断面積を調整することができ、測定溶液を流路１０、キャビティ６、流路１１でスムースに移動させることができる。
【００１５】
センサ素子４はシリコンあるいはシリコンとシリコン酸化膜との積層体からなる支持基板７を備える。プレート２の上面２Ｃと同じ向きの支持基板７の上面７Ａにはキャビティ５が設けられている。キャビティ５の底面５Ａは薄板８で構成されている。薄板８には薄板８の上面８Ａ（キャビティ５の底面５Ａ）と上面８Ａの反対側の薄板８の下面８Ｂとを連通する微小な孔径を有する貫通孔９が形成されている。貫通孔９の一方の開口部９Ａはキャビティ５に開口し、他方の開口部９Ｂはプレート２内のキャビティ６に連通している。
【００１６】
センサ素子４の支持基板７の下面７Ｂ、すなわち薄板８の下面８Ｂ上には白金、金、銀、塩化銀などからなる測定電極１９が設けられている。測定電極１９はワイヤ配線、薄膜電極などの引き出し電極を接続することにより、プローブ１の外部の測定器へ接続されて信号を検出することができる。
【００１７】
キャビティ３にセンサ素子４を接着剤による接合することにより確実に固定でき、流路１０、１１、キャビティ６を満たす測定溶液の漏れを完全に防止できる。なお、センサ素子４は融着、超音波接合などの方法によってキャビティ３内に接合しても良い。
【００１８】
図７は細胞電位測定プローブ１の斜視図である。流路１０の開口部１２にはチューブ２４Ａが接続され、流路１１の開口部２２にはチューブ２４Ｂが接続されている。チューブ２４Ｂは吸引手段１３に接続され、チューブ２４Ａは容器１５に接続されている。容器１５と開口部１２の間には必要に応じて測定溶液等の流体の流動を止めることができる弁２３が設けられている。吸引手段１３によってキャビティ６はキャビティ５より圧力を低く減圧雰囲気にできる。吸引手段１３はダイヤフラムポンプ、シリンジポンプなど通常のポンプの他に人の口による吸引などにより実現できるが、特にこれらに限定されない。
【００１９】
次に、細胞電位測定プローブ１を用いて細胞電位を測定する方法について説明する。
【００２０】
図８は細胞電位測定プローブ１の使用方法を説明するための斜視図であり、細胞電位測定プローブ１が測定棒２５に設置されている。測定棒２５の一端２５Ａには細胞電位測定プローブ１が固定されている。測定棒２５の内部には、流路１０に接続されたチューブ２４Ａと流路１１に接続されたチューブ２４Ｂと、測定電極１９と電気的に接続されている引き出し電極１９Ａが通り、測定棒２５の他端２５Ｂから外部に引き出されている。引き出し電極１９Ａは外部に設けられた測定器に接続され、測定信号を測定器に供給する。
【００２１】
図９は細胞電位測定プローブ１の使用中の概念図であり、容器１４に充填されている培養液２１中に細胞電位測定プローブ１を設置された測定棒２５が入れられている。培養液２１中には被験体細胞２０が浮遊している。容器１４内では参照電極１８が培養液２１に接しており、容器１４内の培養液２１の電位を検出できる。細胞電位測定プローブ１は容器１４内の培養液２１内にセンサ素子４が位置するように設置されている。
【００２２】
図１０〜図１４は細胞電位測定プローブ１を用いて細胞電位を測定する方法を説明するための断面図である。
【００２３】
図１０では、培養液２１内のセンサ素子４の上部で被験体細胞２０が浮遊している。
【００２４】
次に、図１１に示すように、弁２３が閉じられて流路１０、１１およびキャビティ６は容器１５と遮断されている。そして吸引手段１３によってキャビティ６を減圧して、キャビティ５より圧力を低くする。これにより、キャビティ５に充填されている培養液２１および被験体細胞２０が貫通孔９へ引き込まれ、培養液２１はキャビティ６へ流れ出す。被験体細胞２０はその大きさが貫通孔９の断面積より大きいので貫通孔９を通り抜けることができず、貫通孔９の開口部９Ａで保持される。培養液２１はキャビティ６へ流れることにより測定電極１９と接触し、キャビティ６内の電位を検出できる。この状態で、参照電極１８と測定電極１９との電位差および抵抗値・容量値などの電気的な測定を行うことができる。
【００２５】
被験体細胞２０が貫通孔９の開口部９Ａに保持されると、培養液２１はセンサ素子４により遮断されてキャビティ５内の部分２１Ａとキャビティ６内の部分２１Ｂに分離し、参照電極１８と測定電極１９との間の抵抗値は上昇する。
【００２６】
その後、さらに吸引手段１３によりキャビティ６を減圧すると図１２に示すように被験体細胞２０の表面は貫通孔９の開口部９Ａにさらに強く押しつけられ、単に保持されるより参照電極１８と測定電極１９との間の抵抗値は高くなる。このときの抵抗値は１００ＭΩ以上、時には１ＧΩ以上となり、ギガシール（Ｇｉｇａ−Ｓｅａｌ）と呼ばれる状態となる。ギガシール状態において、被験体細胞２０のイオンチャネル活動によって培養液２１と被験体細胞２０内との間でイオンの交換が行われると被験体細胞２０の内部電位が変化する。内部電位の変位は参照電極１８と測定電極１９との電位差として検出できる。
【００２７】
細胞２０のイオンチャネル活動は培養液２１に含まれる薬剤によって変化し、このイオンチャネル活動を参照電極１８と測定電極１９との電位差によって検出することによって薬剤が被験体細胞２０に与える影響を知る、つまり、被験体細胞２０に対する薬剤の薬理効果を判定できる。
【００２８】
なお、参照電極１８、測定電極１９をそれぞれ貫通孔９の開口部９Ａ、９Ｂ付近に設けることにより被験体細胞２０の近傍で電位差を高精度に測定できる。
【００２９】
細胞電位測定プローブ１は、培養液２１に浮遊している細胞２０を容易に捕捉しギガシール状態を形成できる。
【００３０】
プレート２の上面２Ｃとセンサ素子４の支持基板７の上面７Ａとを同一面とすることにより、図１３に示すように、被験体細胞２０を含む培養液２１をセンサ素子４の支持基板７の上面７Ａ上やキャビティ５内にプレートピペット等で直接供給できる。これにより、プレート２の上面２Ｃの上部より顕微鏡により細胞２０を容易に観測できる。さらに、細胞２０の周辺で発生する気泡を容易に除去でき、薬剤を確実に細胞２０に投与できる。
【００３１】
図１２に示したギガシール状態で弁２３を開くと、図１４に示すように、容器１５内にある測定溶液１６が流路１０およびキャビティ６へ引き込まれ、容器１５は測定溶液１６を流路１０に注入する注入手段として機能する。流路１１を吸引手段１３により減圧することでキャビティ６の内部の培養液２１の部分２１Ｂは測定溶液１６に置換えられる。測定溶液１６として高いＫ＋濃度の溶液を用いることで、被験体細胞２０の電位変化をより正確に検出できる。
【００３２】
貫通孔９の開口部９Ａ、９Ｂの近傍に参照電極１８および測定電極１９を薄膜技術などによってそれぞれ形成することにより、被験体細胞２０の電位変化を検出できる。
【００３３】
図１５は実施の形態１による他の細胞電位測定プローブ１Ａの平面図である。流路１１０、１１１の少なくとも一部が曲がっている。これにより、流路１１０、１１１を流体が流れる際の抵抗が大きくなるので、一度キャビティ６内に進入した培養液２１や測定溶液１６が外部に漏れ出したり、外部より気泡が混入したりすることを防止できる。
【００３４】
図１６Ａは細胞電位測定プローブ１Ａの線１６−１６における拡大断面図である。貫通孔９のキャビティ５に開口する開口部９Ａには貫通孔９の孔径より大きい径の窪み３７Ａが設けられており、被験体細胞２０をより確実に捕捉できる。
【００３５】
図１６Ｂは実施の形態１によるさらに他の細胞電位測定プローブ１Ｂの拡大断面図である。細胞電位測定プローブ１Ｂでは、貫通孔９のキャビティ６に開口する開口部９Ｂに貫通孔９の孔径より大きな径の窪み３７Ｂが設けられている。これにより、キャビティ６内の培養液２１や測定溶液１６の貫通孔９の開口部９Ｂ付近での流動性を安定させることができる。
【００３６】
図１６Ａ、図１６Ｂに示すように、段差１１７およびキャビティ６のエッジ部１１７Ａ、６Ｂを曲面状に面取りすることにより測定溶液１６をスムースに流すことができる。
【００３７】
プレート２の材料である樹脂やガラスなどの絶縁性材料は可視光を透過させる透明性を有してもよい。これによりキャビティ６から貫通孔９の開口部９Ｂを顕微鏡で容易に観測でき、培養液２１や測定溶液１６のキャビティ６への進入状態や気泡の有無などを観察しながら細胞電位を測定できる。
【００３８】
さらに、センサ素子４の薄板８も樹脂やガラスなどの可視光を透過させる透明な材料で形成してもよい、これにより、プレート２の下面から顕微鏡で被験体細胞２０を観察できる。
【００３９】
（実施の形態２）
図１７は本発明の実施の形態２における細胞電位測定プローブ２７の断面図である。図１８は細胞電位測定プローブ２７のセンサ素子２９の拡大断面図である。実施の形態１と同じ部分は同じ参照符号を付して説明を省略する。
【００４０】
細胞電位測定プローブ２７はプレート２８とセンサ素子２９により構成されている。プレート２８の上面２８Ｃにはキャビティ８３が形成され、キャビティ８３の底面８３Ａにはキャビティ６が形成されている。キャビティ８３にはセンサ素子２９がはめ込まれている。センサ素子２９は支持基板２６を備える。支持基板２６の下面２６Ｂにキャビティ３２が形成され、キャビティ３２の底面３２Ａには薄板３０が形成されている。薄板３０には薄板３０の上面３０Ａと下面３０Ｂ（キャビティ３２の底面３２Ａ）とを連通する貫通孔３１が形成されている。貫通孔３１の開口部３１Ａは薄板３０の上面３０Ａ（支持基板２６の上面２６Ａ）で開口して外方に通じている。貫通孔３１の開口部３１Ｂは薄板３０の下面３０Ｂで開口してキャビティ３２およびキャビティ６に通じている。これにより貫通孔３１はプレート２８内に設けられたキャビティ６を介して流路１０、１１に通じている。必要に応じて薄板３０の下面３０Ｂ上に測定電極１９が形成される。
【００４１】
図１９Ａは細胞電位測定プローブ２７の使用方法を説明するための断面図である。図１９Ｂは図１９Ａに示す細胞電位測定プローブ２７の拡大断面図である。図１に示す実施の形態１による細胞電位測定プローブ１と同様に、センサ素子２９の支持基板２６の上面２６Ａはプレート２８の上面２８Ｃと同一平面であり、凸凹がない。これにより、顕微鏡３３で被験体細胞３５をより接近して観察できる。顕微鏡３３により観測しながらパッチプローブ３４を被験体細胞３５にアタッチさせることができる。これにより、一つの被験体細胞３５から複数の部分におけるイオンチャネル活動を測定できる。例えば、薬剤を培養液３６の中に投与したとき、細胞３５の投与位置に近い部分３５Ａにアタッチさせたパッチプローブ３４の電位と、細胞３５の部分３５Ａより投与位置から遠い貫通孔３１に捕捉された細胞３５の部分３５Ｂに近い測定電極１９の電位が同時に得られ、細胞３５でのイオンチャネル活動の部分３５Ａから部分３５Ｂへの伝達状態を検出できる。
【００４２】
なお、実施の形態１による細胞電位測定プローブ１のプレート２や支持基板７と同様に、細胞電位測定プローブ２７のプレート２８や薄板３０を、可視光を透過させる透明性を有する材料で形成することで同様の効果が得られる。
【００４３】
（実施の形態３）
図２０は本発明の実施の形態３における細胞電位測定プローブ５０１の分解斜視図である。図２１は細胞電位測定プローブ５０１の断面斜視図である。図２２は細胞電位測定プローブ５０１の要部拡大断面図である。細胞電位測定プローブ５０１は樹脂あるいはガラスなどの絶縁体よりなるプレート５０２とセンサ素子５０４とウエルアレイ５２０から構成している。プレート５０２の上面５０２Ｃにはキャビティ５０３が形成され、キャビティ５０３の底面５０３Ａにはキャビティ５０６が形成されている。キャビティ５０３にはセンサ素子５０４がはめ込まれている。キャビティ５０６はセンサ素子５０４の下部に位置している。
【００４４】
キャビティ５０６には外方へ通じる流路５０９、５１０が設けられている。流路５０９はプレート５０２の上面５０２Ｃに設けた開口部５１１を有し、流路５１０はプレート５０２の上面５０２Ｃに設けた開口部５１８を有する。流路５０９、５１０はプレート５０２の外部と接続されている。予め成形された成型プレート５０２Ａに、予め成型された成型プレート５０２Ｂを貼り合わせることで複雑な形状を有するプレート５０２が得られる。成型プレート５０２Ｂには溝の形状で流路５０９、５１０が形成される。成型プレート５０２Ａには貫通孔の形状で開口部５１１、５１８が形成され、貫通孔の形状で互いに連結したキャビティ５０３、５０６が形成されている。
【００４５】
センサ素子５０４は支持基板５１２と薄板５０７よりなり、図２２に示すように、薄板５０７の下方（プレート５０２の上面５０２Ｃと反対側の下面５１２Ｂ側）にキャビティ５０５が設けられている。つまり、キャビティ５０５の底面５０５Ａは薄板５０７で形成される。薄板５０７には上面５０７Ａ（支持基板５１２の上面５１２Ａ）と下面５０７Ｂを貫通する微小貫通孔５０８が設けられている。貫通孔５０８の、薄板５０７の上面５０７Ａ（支持基板５１２の上面５１２Ａ）に開口する開口部５０８Ａに被験体細胞が保持される。貫通孔５０８の孔径は被験体細胞の大きさよりも小さいことが必要である。図１６Ａと同様に、貫通孔５０８の開口部５０８Ａに貫通孔５０８の孔径より大きな径の窪みを設けることにより被験体細胞を安定して確実に保持できる。貫通孔５０８は薄板５０７の下面５０７Ｂ（キャビティ５０５の底面５０５Ａ）でキャビティ５０５に開口する開口部５０８Ｂを有する。貫通孔５０８の開口部５０８Ａはセンサ素子５０４の支持基板５１２の上面５１２Ａに通じ、開口部５０８Ｂはキャビティ５０５を介してキャビティ５０６と連結している。この構造により、貫通孔５０８、キャビティ５０５、５０６を通って培養液、薬液などの液体が流動できる。
【００４６】
センサ素子５０４では、薄板５０７が上部に位置する、すなわち支持基板５１２の上面５１２Ａがプレート５０２の上面５０２Ｃと同一平面内に位置する。これに対し、図６に示す実施の形態１による細胞電位測定プローブと同様に、キャビティ５０５が支持基板５１２の上面５１２Ａに形成されてもよい。
【００４７】
プレート５０２の上面５０２Ａ上には所定の容量を有し、培養液、薬液などの液体を投入したり、蓄えたり、循環させることができるウエルアレイ５２０が配置されている。ウェルアレイ５２０はウェル５２２、５２３、５２４が形成されている。ウェル５２２の下面５２２Ａには流路５０９の開口部５１１に連結した貫通孔５２１Ａが形成されている。ウエル５２３の下面５２３Ａには、センサ素子５０４の薄板５０７に形成された貫通孔５０８に連結した貫通孔５２１Ｂが形成されている。ウエル５２４の下面５２４Ａには、流路５１０の開口部５１８に連結した貫通孔５２１Ｃが形成されている。ウエル５２２、５２３、５２４の上面には培養液、薬液などの液体を投入する開口部５２２Ｂ、５２３Ｂ、５２４Ｂが設けられている。ウェル５２３には参照電極５１４が設けられている。流路５１０内にはプレート５０２の外部に繋がる測定電極５１５が設けられている。
【００４８】
被験体細胞を含有した培養液をウエル５２３の開口部５２３Ｂから投入し、ウエル５２４の開口部５２４Ｂから吸引ポンプなどの吸引手段によって吸引する。これによって培養液は貫通孔５０８を通過し、その後キャビティ５０５、５０６、流路５１０および開口部５１８を通過することによりウエル５２４へ吸引される。または、ウエル５２２へ測定液または培養液を投入後、ウエル５２４から吸引することによって、流路５０９、５１０およびキャビティ５０５、５０６には十分な測定液または培養液が行き渡り、気泡が混入することが少なくなるため、測定をより正確に行いやすい。なお、この場合は、ウエル５２３に被験体細胞を投入する前に測定液を投入し、流路５０９，５１０内に測定液を十分行き渡らせたのちにウエル５２２の開口部５２２Ｂを閉じ、この後、被検体細胞をウエル５２３に投入してウエル５２４から測定液の吸引を行うことが望ましい。
【００４９】
センサ素子５０４の貫通孔５０８が被験体細胞を通過させない孔径を有することで、被験体細胞は貫通孔５０８の開口部５０８Ａで保持され、貫通孔５０８で保持された被験体細胞の電位を測定できる。実施の形態３では、薄板５０７には複数の貫通孔５０８が形成されており、これにより一度に複数の被験体細胞の電位を一括して測定できる。被験体細胞が全ての貫通孔５０８を塞ぐと、それ以外の被験体細胞はウエル５２３中にとどまる。これにより、培養液がキャビティ５０５に流入する量が少なくなり、貫通孔５０８の開口部５０８Ａに被験体細胞が保持されたことを検知できる。この作業は培養液の流量を測定しながらウエル５２４での吸引力を制御することによって行うことができる。なお、この吸引動作はウエル５２２から行っても同じである。
【００５０】
ウエル５２３の開口部５２３Ｂを閉じた後、ウエル５２２から薬液を投入してウエル５２４から吸引手段により吸引することによって薬液が貫通孔５２１Ａを通過し、開口部５１１、流路５０９、キャビティ５０６、キャビティ５０５、流路５１０および開口部５１８を通過して、ウエル５２４へ吸引される。このとき、貫通孔５０８の開口部５０８Ａでトラップされている被験体細胞に貫通孔５０８の開口部５０８Ｂから薬液が接触して、被験体細胞が薬液に反応する。反応したとき被験体細胞の電位を、ウェル５２３内の培養液に接触している参照電極５１４と、流路５１０内の薬液に接触している測定電極５１５とを介して測定できる。
【００５１】
細胞電位測定プローブ５０１では、被験体細胞が存在する領域すなわちウェル５２３と測定電極５１５が存在する領域すなわち流路５１０にそれぞれ、培養液や薬液などの別の液体を導入できる。また、ウエル５２２とウエル５２４間で溶液を吸引させれば、キャビティ５０５，５０６内の溶液の種類を置換することが容易にできる。
【００５２】
なお、ウエル５２０は三個のウエル５２２、５２３、５２４よりなり、これらを用いる方法を説明してきたが、被験体細胞を微小貫通孔５０８に保持した後、培養液の代わりにウエル５２３より薬液を投入して、細胞電位の測定を行うだけでよい場合は、２個のウエル（例えばウエル５２３とウエル５２４）だけで測定することができる。
【００５３】
プレート５０２の上面５０２Ｃとウエルアレイ５２０の底面５２０Ａに密着させることでプレート５０２をウェルアレイ５２０で確実に封止できるので、液漏れなどを確実に防止できる。
【００５４】
ウエイアレイ５２０をプレート５０２と同じ材質で形成することでウエイアレイ５２０とプレート５０２の膨張係数の違いによる変形を防止でき、プレート５０２をウェルアレイ５２０でより確実に封止できる。
【００５５】
ウエルアレイ５２０とプレート５０２をポリスチレン、シクロオレフィンポリマー、シクロオレフィンコポリマーなどの熱可塑性樹脂で形成することにより、超音波融着やレーザ溶着によって確実な封止と高い生産性で細胞電位測定プローブ５０１を製造できる。
【００５６】
ウエルアレイ５２０とプレート５０２をガラス、石英の材料で形成してもよい。これらの材料は鏡面研磨した表面同士であれば、接着剤を使わずに直接接合できる。あるいは、これら材料は耐熱性が高いため、ガラス接着剤やセラミック接着剤などの無機系接着材料で接合することができる。このように構成されたウエルアレイ５２０とプレート５０２は耐熱性に優れているため加熱洗浄による再利用が可能な細胞電位測定プローブ５０１が得られる。
【００５７】
図２１に示すように、ウエル５２２、５２３、５２４の下面５２２Ａ、５２３Ａ、５２４Ａにそれぞれ形成された貫通孔５２１Ａ、５２１Ｂ、５２１Ｃのうちの少なくとも貫通孔５２１Ｂを、ウェル５２３の開口部５２３Ｂに向かって広がる形状、すなわちセンサ素子５０４の貫通孔５０８に向かって狭まる形状に形成しても良い。これにより、ウエル５２３に投入する培養液や薬液などを速やかにセンサ素子５０４の貫通孔５０８へ浸透させることができる。
【００５８】
図２１に示すように、貫通孔５２１Ｂの大きさを、貫通孔５０８を形成した薄板５０７よりも大きくすることにより、貫通孔５０８へ被験体細胞を効率よく引き込むことができる。
【００５９】
また、ウエルアレイ５２０には、被験体細胞を含む培養液を投入するウエル５２３と、薬液を投入するウエル５２２と、吸引手段に接続されたウエル５２４とが形成されている。これにより、プレート５０２の上面５０２Ｃに被験体細胞を容易に保持でき、薬液などを投入することが全てウエルアレイ５２０の上部より独立して行うことができるので測定の際に容易にプローブ５０１を操作できる。
【００６０】
ウエル５２２の貫通孔５２１Ａの大きさを流路５０９の開口部５１１より大きくし、ウエル５２４の貫通孔５２１Ｃの大きさを流路５１０の開口部５１８よりも大きくする。これにより、薬液などの液体を速やかに流路に導入することができ、高精度でばらつきの少ない細胞電位を測定できる細胞電位測定プローブ５０１が得られる。
【００６１】
参照電極５１４がウエル５２３内の培養液に接する所定の位置に配置される。測定電極５１５が流路５１０内に設けられて流路５１０内の培養液あるいは薬液などの液体に接触する。これにより、培養液中における被験体細胞の細胞電位と薬液などの液体をウエル５２２またはウエル５２３より投入した後の被験体細胞の細胞電位の変化を測定できる。測定電極５１５はキャビティ５０５またはキャビティ５０６の近傍に設けても良い。 
【００６２】
参照電極５１４と測定電極５１５はワイヤ配線や薄膜電極などで形成でき、プローブ５０１の外部の測定器に接続されて電極からの信号を検出できる。
【００６３】
次に、細胞電位測定プローブ５０１を用いて、細胞電位を測定する方法を説明する。
【００６４】
まず、ウエル５２３には被験体細胞を含む培養液を投入し、次にウエル５２２またはウエル５２４から吸引手段により吸引することで被験体細胞はセンサ素子５０４の貫通孔５０８に保持される。ウエル５２３内に設けられて培養液に接触する参照電極５１４と、流路５１０内に設けられた測定電極５１５との間の抵抗値を測定する。電極５１４、５１５間の抵抗値は、吸引手段の吸引圧力を制御することにより、ウエル５２３に貯留された培養液と流路５１０内に貯留された培養液の間の抵抗値が１００ＭΩ以上となる。参照電極５１４および測定電極５１５はＡｕ、Ａｇ、ＡｇＣｌなどの導電材料で構成することができ、培養液に接触させることで電気的接続が得られる。したがって、電極５１４、５１５が配置される位置は上記の位置に限定されない。
【００６５】
次に、ウエル５２２内に薬液等の測定溶液を貯留してウエル５２４から吸引すると、流路５０９、キャビティ５０５、キャビティ５０６、流路５１０内の培養液を測定溶液で置換させることができる。これにより、細胞が存在するウエル５２３の領域と測定電極５１５が存在するキャビティ５０６の領域に、それぞれ別種類の培養液や測定溶液を容易に導入でき、より速く細胞電位を測定できる。
【００６６】
ウエル５２２とウエル５２４の機能を逆にしても同様に細胞の電位が測定できる。
【００６７】
ウエル５２２、５２３、５２４にバルブあるいは蓋を設けることにより、プローブ５０１での測定をより容易に制御できる。
【００６８】
実施の形態３による他の細胞電位測定プローブ５１９である、複数の細胞電位測定プローブ５０１を用いた細胞電位測定プローブアレイ５１９について説明する。図２３は実施の形態３による他の細胞電位測定プローブ５１９（細胞電位測定プローブアレイ５１９）の分解斜視図である。細胞電位測定プローブ５０１が４列×８列のマトリックス状に配置されている。ウェル５２２、５２３、５２４が複数のプレート５２０に対応する位置でそれぞれ形成された複数のウエルアレイ５２０は一括してウェルアレイユニット５２０Ａとして作製できる。
【００６９】
このように複数の細胞電位測定プローブ５０１が所定のフォーマットで並べられた細胞電位測定プローブアレイ５１９は、薬液注入・細胞投入・吸引などにロボットなどを利用することができるので、短時間で多数の被験体細胞の電位を測定でき、薬理効果を判断して候補薬剤を迅速にスクリーニングできる。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明による細胞電位測定プローブは、溶液内に浮遊する細胞の電位をそのままの環境で測定でき、細胞への薬理効果を判定して薬剤のスクリーニングに用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】本発明の実施の形態１における細胞電位測定プローブの斜視図
【図２】実施の形態１における細胞電位測定プローブの分解斜視図
【図３】実施の形態１における細胞電位測定プローブの断面斜視図
【図４】実施の形態１における細胞電位測定プローブの拡大断面斜視図
【図５】実施の形態１における細胞電位測定プローブの断面図
【図６】実施の形態１における細胞電位測定プローブの拡大断面図
【図７】実施の形態１における細胞電位測定プローブの斜視図
【図８】実施の形態１における細胞電位測定プローブの使用方法を説明するための斜視図
【図９】実施の形態１における細胞電位測定プローブの概念図
【図１０】実施の形態１における細胞電位測定プローブの断面図
【図１１】実施の形態１における細胞電位測定プローブの断面図
【図１２】実施の形態１における細胞電位測定プローブの断面図
【図１３】実施の形態１における細胞電位測定プローブの断面図
【図１４】実施の形態１における細胞電位測定プローブの断面図
【図１５】実施の形態１における他の細胞電位測定プローブの平面図
【図１６Ａ】図１５に示す細胞電位測定プローブの拡大断面図
【図１６Ｂ】実施の形態１によるさらに他の細胞電位測定プローブの拡大断面図
【図１７】本発明の実施の形態２における細胞電位測定プローブの断面図
【図１８】実施の形態２における細胞電位測定プローブの拡大断面図
【図１９Ａ】実施の形態２における細胞電位測定プローブの使用方法を説明するための断面図
【図１９Ｂ】図１９Ａに示す細胞電位測定プローブの拡大断面図
【図２０】本発明の実施の形態３による細胞電位測定プローブの分解斜視図
【図２１】実施の形態３による細胞電位測定プローブの断面斜視図
【図２２】実施の形態３による細胞電位測定プローブの拡大断面図
【図２３】実施の形態３による細胞電位測定プローブアレイの斜視図
【図２４】従来の細胞外電位測定プローブの断面図
【符号の説明】
【００７２】
１    細胞電位測定プローブ
２    プレート
２Ａ    成型プレート
２Ｂ    成型プレート
３    キャビティ（第１のキャビティ）
４    センサ素子
５    キャビティ（第３のキャビティ）
６    キャビティ（第２のキャビティ）
７    支持基板
８    薄板
９    貫通孔
１０    流路（第２の流路）
１０Ａ    開口部（第１の開口部）
１１    流路（第１の流路）
１１Ａ    開口部（第１の開口部）
１２    開口部（第２の開口部）
１３    吸引手段
１５    容器（注入手段）
１６    測定溶液
１７    段差
１８    参照電極（第１の電極）
１９    測定電極（第２の電極）
２０    被験体細胞
２１    培養液
２２    開口部（第２の開口部）
２３    弁
２６    支持基板
２７    細胞電位測定プローブ
２８    プレート
２９    センサ素子
３０    薄板
３１    貫通孔
３２    キャビティ
３３    顕微鏡
３４    パッチプローブ
３５    被験体細胞
３６    培養液
３７Ａ，３７Ｂ    窪み
１１７    段差
５０１    細胞電位測定プローブ
５０２    プレート
５０３    キャビティ（第１のキャビティ）
５０４    センサ素子
５０５    キャビティ（第３のキャビティ）
５０６    キャビティ（第２のキャビティ）
５０７    薄板
５０８    貫通孔
５０９    流路（第２の流路）
５１０    流路（第１の流路）
５１１    開口部（第２の開口部）
５１２    支持基板
５１４    参照電極（第１の電極）
５１５    測定電極（第２の電極）
５１８    開口部（第２の開口部）
５１９    細胞電位測定プローブアレイ
５２０    ウエルアレイ
５２１Ａ    貫通孔
５２１Ｂ    貫通孔
５２１Ｃ    貫通孔
５２２    ウエル
５２３    ウエル
５２４    ウエル
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2006022092.tif 000028
【図２】
2006022092.tif 000029
【図３】
2006022092.tif 000030
【図４】
2006022092.tif 000031
【図５】
2006022092.tif 000032
【図６】
2006022092.tif 000033
【図７】
2006022092.tif 000034
【図８】
2006022092.tif 000035
【図９】
2006022092.tif 000036
【図１０】
2006022092.tif 000037
【図１１】
2006022092.tif 000038
【図１２】
2006022092.tif 000039
【図１３】
2006022092.tif 000040
【図１４】
2006022092.tif 000041
【図１５】
2006022092.tif 000042
【図１６Ａ】
2006022092.tif 000043
【図１６Ｂ】
2006022092.tif 000044
【図１７】
2006022092.tif 000045
【図１８】
2006022092.tif 000046
【図１９Ａ】
2006022092.tif 000047
【図１９Ｂ】
2006022092.tif 000048
【図２０】
2006022092.tif 000049
【図２１】
2006022092.tif 000050
【図２２】
2006022092.tif 000051
【図２３】
2006022092.tif 000052
【図２４】
2006022092.tif 000053
【国際調査報告】
2006022092.tif 000054
2006022092.tif 000055
2006022092.tif 000056