(57)【要約】  Gpbar1欠損マウスを作製し、Gpbar1が胆汁酸恒常性及び脂質代謝の制御に関与するか否かについて検討した結果、Gpbar1欠損マウスでは糞便中胆汁酸排泄レベルが変化することなく全胆汁酸プール量が減少した。また、高脂肪餌で飼育したGpbar1欠損雌性マウスの体重は、野性型マウスと比較して顕著に増加し、これは脂肪の増加によるものであった。これより、Gpbar1が胆汁酸恒常性及び脂質代謝の制御に寄与することが示唆された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、全胆汁酸プール量の減少に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）Gpbar1に被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該Gpbar1と被検化合物との結合を検出する工程
（ｃ）該Gpbar1と結合する被検化合物を選択する工程。
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、全胆汁酸プール量の減少に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）Gpbar1を発現する細胞に被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該Gpbar1の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、該Gpbar1の発現レベルを増加させた被検化合物を選択する工程。
【請求項３】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、全胆汁酸プール量の減少に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）Gpbar1をコードするDNAのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞又は細胞抽出液を提供する工程
（ｂ）該細胞又は該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程
（ｃ）該細胞又は該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｄ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを増加させた被検化合物を選択する工程。
【請求項４】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、全胆汁酸プール量の減少に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）Gpbar1に対するリガンドの存在下で、Gpbar1を細胞表面に発現させた細胞に被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該細胞におけるGpbar1の活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、上記活性を上昇させた被検化合物を選択する工程。
【請求項５】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、全胆汁酸プール量の減少に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）被検化合物をGpbar1遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする遺伝子改変非ヒト哺乳動物に投与する工程
（ｂ）該遺伝子改変非ヒト哺乳動物における全胆汁酸プール量を測定する工程
（ｃ）被検化合物を投与していない場合と比較して、該遺伝子改変非ヒト哺乳動物における全胆汁酸プール量を増加させる化合物を、選択する工程
【請求項６】
Gpbar1遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
【請求項７】
Gpbar1遺伝子の遺伝子対の一方又は双方に外来遺伝子が挿入されていることを特徴とする遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
【請求項８】
全胆汁酸プール量の減少に伴う疾患又は脂質代謝性疾患のモデル動物である、請求項６又は７に記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
【請求項９】
Gpbar1遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする遺伝子改変哺乳動物細胞。
【請求項１０】
Gpbar1遺伝子の遺伝子対の一方又は双方に外来遺伝子が挿入されていることを特徴とする遺伝子改変哺乳動物細胞。
【請求項１１】
Gpbar1タンパク質をコードするＤＮＡを有効成分とする、全胆汁酸プール量の減少に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれかに記載のスクリーニング方法により選択された、全胆汁酸プール量の減少に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤。
【請求項１３】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、全胆汁酸プール量の増加に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）Gpbar1に被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該Gpbar1と被検化合物との結合を検出する工程
（ｃ）該Gpbar1と結合する被検化合物を選択する工程。
【請求項１４】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、全胆汁酸プール量の増加に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）Gpbar1を発現する細胞に被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該Gpbar1の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、該Gpbar1の発現レベルを減少させた被検化合物を選択する工程。
【請求項１５】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、全胆汁酸プール量の増加に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）Gpbar1をコードするDNAのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞又は細胞抽出液を提供する工程
（ｂ）該細胞又は該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程
（ｃ）該細胞又は該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｄ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを減少させた被検化合物を選択する工程。
【請求項１６】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、全胆汁酸プール量の増加に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）Gpbar1を細胞表面に発現させた細胞に被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該細胞におけるGpbar1の活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、上記活性を低下させた被検化合物を選択する工程。
【請求項１７】
Gpbar1の発現又は活性を低下させる化合物を有効成分とする、全胆汁酸プール量の増加に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤。
【請求項１８】
請求項１３〜１６のいずれかに記載のスクリーニング方法により選択された、全胆汁酸プール量の増加に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤。
【請求項１９】
Gpbar1遺伝子の発現量を測定する工程を含む、全胆汁酸プール量の減少又は増加に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の検査方法。
【請求項２０】
Gpbar1遺伝子領域における変異を検出する工程を含む、全胆汁酸プール量の減少又は増加に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の検査方法。
【請求項２１】
Gpbar1遺伝子領域にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、全胆汁酸プール量の減少又は増加に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の検査薬。
【請求項２２】
Gpbar1に結合する抗体を含む、全胆汁酸プール量の減少又は増加に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の検査薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は全胆汁酸プール量の増減に伴う疾患又は脂質代謝性疾患に対する薬剤及び、それら薬剤のスクリーニング方法に関する。また、全胆汁酸プール量の増減に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の検査方法及び検査薬に関する。さらに、Gpbar1遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする遺伝子改変非ヒト哺乳動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
胆汁酸は肝臓においてコレステロールから合成され、食物中の脂肪の可溶化においてばかりでなく胆汁酸及びコレステロールの恒常性の維持においても、極めて重要な役割を担っている（非特許文献1, 2）。胆汁酸は、ファルネソイドX受容体（FXR）の活性化を介して多くの生合成酵素及び輸送体を制御することがよく知られている（非特許文献3, 4）。例えば、胆汁酸合成の律速酵素であるコレステロール7α-水酸化酵素（CYP7A）、Na+-タウロコール酸共輸送ポリペプチド（NTCP）、及び胆汁酸排出ポンプ（BSEP）。これらの酵素及び輸送体は、胆汁酸の恒常性にとって非常に重要である（非特許文献5〜9）。【０００３】
ステロイドホルモンが、その核内受容体の刺激を介して古典的なゲノム応答により様々な遺伝子を調節することは、よく研究されている（非特許文献10, 11）。しかし、いくつかのステロイドホルモンは、迅速な非ゲノム応答により二次メッセンジャーを刺激するこという実質的な証拠が存在する（非特許文献12）。Zhuらは膜プロゲスチン受容体（mPR）を同定し、これがG-タンパク共役型受容体（GPCR）の典型的な構造である7回膜貫通ドメインを有することを明らかにした（非特許文献13, 14）。mPRを発現している細胞では、プロゲスチンがcAMP形成を阻害し、その反応が百日咳毒素に感受性であったことから、mPRがGi/oタンパク質と共役していることが示唆された。同様に、胆汁酸はFXR等の核内受容体を活性化し、またいくつかのデータからは、迅速にcAMP形成を刺激する胆汁酸の特異的受容体の存在が示唆されていた（非特許文献15, 16）。【０００４】
【非特許文献１】Russell, D. W., and Setchell, K. D. 1992. Bile acid biosynthesis. Biochemistry 31:  4737-4749
【非特許文献２】Dietschy, J. M. 1968. Mechanisms for the intestinal absorption of bile acids. J. Lipid Res. 9: 297-309
【非特許文献３】Russell, D. W. 2003. The enzymes, regulation, and genetics of bile acid synthesis. Annu. Rev. Biochem. 72: 137-174
【非特許文献４】Redinger, R. N. 2003. Nuclear receptors in cholesterol catabolism: molecular biology of the enterohepatic circulation of bile salts and its role in cholesterol homeostasis. J. Lab. Clin. Med. 142: 7-20.
【非特許文献５】Sinal, C. J., Tohkin, M., Miyata, M., Ward, J. M., Lambert, G., and Gonzalez, F. J. 2000. Targeted disruptinon of the nuclear receptor FXR/BAR impairs bile acid and lipid homeostasis. Cell 102: 731-744
【非特許文献６】Tu, H., Okamoto, A. Y., and Shan, B. 2000. FXR, a bile acid receptor and biological sensor. Trends. Cardiovasc. Med. 10: 30-35
【非特許文献７】Chiang, J. Y. L., kimmel, R., Weinberger, C., and Stroup, D. 2000. Farnesoid X receptor responds to bile acids and represses cholesterol 7alpha-hydroxylase gene (CYP7A1) transcription. J. Biol. Chem. 275: 10918-10924
【非特許文献８】Ananthanarayanan, M., Balasubramanian, N., Makishima, M., Mangelsdorf, D. J., and Suchy, F., J. 2001. Human bile salt export pump promoter is transactivated by the farnesoid X receptor/bile acid receptor. J. Biol. Chem. 276: 28857-28865
【非特許文献９】Grober, J., Zaghini, I., Fujii, H., Jones, S. A., Kliewer, S. A., Willson, T. M., Ono, T., and Besnard, P. 1999. Identification of a bile acid-responsive element in the human ileal bile acid-binding protein gene. J. Biol. Chem. 274: 29749-29754
【非特許文献１０】Beato, M. 1989. Gene regulation by steroid hormones. Cell 56: 335-344
【非特許文献１１】Aranda, A., and Pascual, A. 2001. Nuclear hormone receptors and gene expression. Physiol. Rev. 81: 1269-1304
【非特許文献１２】Norman, A. W., Mizwicki, M. T., and Norman, D. P. 2004. Steroid-hormone rapid actions, membrane receptors and a conformational ensemble model. Nat. Rev. Drug Discov. 3: 27-41
【非特許文献１３】Zhu, Y., Rice, C. D., Pang, Y., Pace, M., and Thomas, P. 2003. Cloning, expression, and characterization of a membrane progestin receptor and evidence it is an intermediary in meiotic maturation of fish oocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100: 2231-2236
【非特許文献１４】Zhu, Y., Bond, J., and Thomas, P. 2003. Identification, classification, and partial characterization of genes in humans and other vertebrates homologous to a fish membrane progestin receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100: 2237-2242
【非特許文献１５】Conley, D. R., Coyne, M. J., Bonorris, G. G., Chung, A., and Schoenfield, L. J. 1976. Bile acid stimulation of colonic adenylate cyclase and secretion in the rabbit. Am. J. Dig. Dis. 21: 453-458
【非特許文献１６】Potter, G. D., Sellin, J. H., and Burlingame, S. M. 1991. Bile acid stimulation of cyclic AMP and ion transport in developing rabbit colon. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 13: 335-341
【非特許文献１７】Maruyama, T., Miyamoto, Y., Nakamura, T., Tamai, Y., Okada, H., Sugiyama, E., Nakamura, T., Itadani, H., and Tanaka, K. 2002. Identification of membrane-type receptor for bile acids (M-BAR). Biochem. Biophys. Res. Commun. 298: 714-719
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
最近になって本発明者らは、新規Gタンパク質共役胆汁酸受容体１（Gpbar1）を同定した（非特許文献17）。Gpbar1は、NCI-H716、STC-1、及びGLUTag等の腸内分泌細胞株において、内因的に発現されていた。胆汁酸は、Gpbar1を発現している細胞において、胆汁酸の核内受容体であるFXRを活性化することなく、cAMP応答を刺激することがわかっていた。さらに、Gpbar1が同定されたことにより、胆汁酸の二重のシグナル系、GPCRを介した系と核内受容体を介した系の存在が明らかにされた。【０００６】
しかしながら、Gpbar1の腸内における正確な役割及び、Gpbar1の欠損により引き起こされる疾患は未だ解明されていない。【０００７】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、Gpbar1の腸内における生理的役割を明らかにし、その知見を医療に応用することを目的とする。【０００８】
より具体的には、本発明は全胆汁酸プール量の増減に伴う疾患又は脂質代謝性疾患に対する薬剤及び、それら薬剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。また、全胆汁酸プール量の増減に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の検査方法及び検査薬を提供する。さらに、Gpbar1遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする遺伝子改変非ヒト哺乳動物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、まず本願発明者らはインビボでのGpbar1の生理的役割を明らかにすることを目的として、相同的組換えによりマウスのGpbar1遺伝子を破壊し、Gpbar1欠損マウスを作製した。そして、該Gpbar1欠損マウスにおける全胆汁酸プール量及び糞便中胆汁酸排泄レベルを測定し、Gpbar1が胆汁酸恒常性の制御に関与しているか否かを検討した。【００１０】
その結果、ホモ接合性マウスでは、糞便中胆汁酸排泄レベルは変化することなく、全胆汁酸プール量が野生型マウスと比較して有意に21〜25%減少することがわかった。このことからGpbar1が胆汁酸恒常性の制御に寄与することが示唆され、Gpbar1欠損マウスの解析は、胆汁酸の新たな生理的役割を明らかにする上で有用であることがわかった。【００１１】
次に、該Gpbar1欠損マウスに高脂肪餌を与えて飼育し、Gpbar1が脂質代謝の制御に関与しているか否かを検討した。その結果、ホモ接合性マウスの体重は、同じ高脂肪餌を与えて飼育した野性型マウスと比較して顕著に増加することがわかった。この体重増加は、脂肪量の増加を示していることが判明し、Gpbar1の欠損が脂質代謝の異常を引き起こすことが示唆された。【００１２】
Gpbar1が全胆汁酸プール量の増減及び脂質代謝異常に関係することから、Gpbar1への結合性、Gpbar1の発現量、Gpbar1の活性を標的としてスクリーニングを行えば、全胆汁酸プール量の増減に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤を、特定することが可能であることがわかった。【００１３】
すなわち、本発明者らは、全胆汁酸プール量の増減に伴う疾患又は脂質代謝性疾患に対する薬剤及びそれら薬剤のスクリーニング方法を開発することに成功した。さらに、全胆汁酸プール量の増減に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の検査方法、該検査薬、及びGpbar1遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする遺伝子改変非ヒト哺乳動物についても開発することに成功し、これらにより本発明を完成するに至った。【００１４】
すなわち、本発明における、全胆汁酸プール量の減少に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法は、（ａ）Gpbar1に被検化合物を接触させる工程と、（ｂ）該Gpbar1と被検化合物との結合を検出する工程と、（ｃ）該Gpbar1と結合する被検化合物を選択する工程とを含むことを特徴とする。この方法を用いれば、Gpbar1に結合し、胆汁酸と同様の生理作用を発揮し得る化合物（例えば、Gpbar1アゴニスト）を選別することができる。このスクリーニング方法で活性が認められた化合物は、全胆汁酸プール量の減少に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療薬又は予防薬の候補とすることができる。【００１５】
上記のスクリーニング方法の各工程は、（ａ）Gpbar1を発現する細胞に被検化合物を接触させる工程と、（ｂ）該Gpbar1の発現レベルを測定する工程と、（ｃ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、該Gpbar1の発現レベルを増加させた被検化合物を選択する工程とすることができる。この方法を用いれば、Gpbar1に直接作用しない化合物であっても、細胞内のいずれかの分子に作用してGpbar1の発現を亢進する作用を有する化合物を選別することができる。【００１６】
上記のスクリーニング方法の各工程は、（ａ）Gpbar1をコードするDNAのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞又は細胞抽出液を提供する工程と、（ｂ）該細胞又は該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程と、（ｃ）該細胞又は該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程と、（ｄ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを増加させた被検化合物を選択する工程とすることができる。この方法を用いれば、Gpbar1に直接作用しない化合物であっても、Gpbar1のプロモーターに作用して、Gpbar1の発現を亢進する作用を有する化合物を選別することができる。【００１７】
上記のスクリーニング方法の各工程は、（ａ）Gpbar1に対するリガンドの存在下で、Gpbar1を細胞表面に発現させた細胞に被検化合物を接触させる工程と、（ｂ）該細胞におけるGpbar1の活性を測定する工程と、（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、上記活性を上昇させた被検化合物を選択する工程とすることができる。この方法を用いれば、Gpbar1に対するリガンドの存在下で、Gpbar1の活性をさらに亢進する作用を有する化合物を選別することができる。【００１８】
上記のスクリーニング方法の各工程は、（ａ）被検化合物を、Gpbar1遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする遺伝子改変非ヒト哺乳動物に投与する工程と、（ｂ）該遺伝子改変非ヒト哺乳動物における全胆汁酸プール量を測定する工程と、（ｃ）被検化合物を投与していない場合と比較して、該遺伝子改変非ヒト哺乳動物における全胆汁酸プール量を増加させる化合物を選択する工程とすることができる。この方法を用いれば、in vivoでGpbar1の発現を亢進する作用を有する化合物又はGpbar1を介さずに全胆汁酸プール量を増加させる化合物を選別し、薬効の有無について評価することができる。【００１９】
また、本発明は、Gpbar1遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする遺伝子改変非ヒト哺乳動物を提供する。この非ヒト哺乳動物は、in vivoでGpbar1の発現を亢進する作用を有する化合物又はGpbar1を介さずに全胆汁酸プール量を増加させる化合物のスクリーニングに使用することができる。【００２０】
上記遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、Gpbar1遺伝子の遺伝子対の一方又は双方に外来遺伝子を挿入して作成することができる。【００２１】
また、本発明は、Gpbar1遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする遺伝子改変哺乳動物細胞を提供する。遺伝子改変哺乳動物細胞は、全胆汁酸プール量の減少に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニングに使用することができる。【００２２】
上記遺伝子改変哺乳動物細胞は、Gpbar1遺伝子の遺伝子対の一方又は双方に外来遺伝子が挿入されていることを特徴とする遺伝子改変哺乳動物由来の細胞であってもよい。【００２３】
また、本発明は、Gpbar1タンパク質をコードするＤＮＡを有効成分とする、全胆汁酸プール量の減少に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤を提供する。この薬剤を患者に投与し、該ＤＮＡからGpbar1タンパク質が作られれば、全胆汁酸プール量の減少に伴う疾患又は脂質代謝性疾患を治療し又は予防することができる。【００２４】
さらに、本発明における、全胆汁酸プール量の増加に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法は、（ａ）Gpbar1に被検化合物を接触させる工程と、（ｂ）該Gpbar1と被検化合物との結合を検出する工程と、（ｃ）該Gpbar1と結合する被検化合物を選択する工程とを含むことを特徴とする。この方法を用いれば、Gpbar1に結合し、胆汁酸の生理作用を阻害し得る化合物（例えば、Gpbar1アンタゴニスト）を選別することができる。このスクリーニングで活性が認められた化合物は、全胆汁酸プール量の増加に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療薬又は予防薬の候補とすることができる。【００２５】
上記のスクリーニング方法の各工程は、（ａ）Gpbar1を発現する細胞に被検化合物を接触させる工程と、（ｂ）該Gpbar1の発現レベルを測定する工程と、（ｃ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、該Gpbar1の発現レベルを減少させた被検化合物を選択する工程とすることができる。この方法を用いれば、Gpbar1に直接作用しない化合物であっても、細胞内のいずれかの分子に作用してGpbar1の発現を抑制する作用を有する化合物を選別することができる。【００２６】
上記のスクリーニング方法の各工程は、（ａ）Gpbar1をコードするDNAのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する、細胞又は細胞抽出液を提供する工程と、（ｂ）該細胞又は該細胞抽出液に、被検化合物を接触させる工程と、（ｃ）該細胞又は該細胞抽出液における、該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程と、（ｄ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを減少させた被検化合物を選択する工程とすることができる。この方法を用いれば、Gpbar1に直接作用しない化合物であっても、Gpbar1のプロモーターに作用して、Gpbar1の発現を抑制する作用を有する化合物を選別することができる。【００２７】
上記のスクリーニング方法の各工程は、（ａ）Gpbar1を細胞表面に発現させた細胞に、被検化合物を接触させる工程と、（ｂ）該細胞におけるGpbar1の活性を測定する工程と、（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、上記活性を低下させた被検化合物を選択する工程とすることができる。この方法を用いれば、Gpbar1の活性を抑制する作用を有する化合物を選別することができる。【００２８】
また、本発明は、Gpbar1の発現又は活性を低下させる化合物を有効成分とする、全胆汁酸プール量の増加に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤を提供する。この薬剤を患者に投与することにより、全胆汁酸プール量の増加に伴う疾患又は脂質代謝性疾患を治療し又は予防することができる。【００２９】
また、本発明は、上記の各スクリーニング方法により選択された、全胆汁酸プール量の増減又は脂質代謝性疾患に伴う疾患の治療又は予防のための薬剤を提供する。これらの薬剤は、これまで知られていなかった新たなメカニズムで、Gpbar1の下流のシグナル伝達を亢進又は抑止することが可能であり、全胆汁酸プール量の増減又は脂質代謝性疾患に伴う疾患の治療し又は予防することができる。【００３０】
また、本発明は、Gpbar1遺伝子の発現量を測定する工程を含む、全胆汁酸プール量の増減に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の検査方法を提供する。この検査方法により、少量の生体材料（血液等）から、全胆汁酸プール量の増減又は脂質代謝性疾患に伴う疾患を検査することができる。【００３１】
上記検査方法は、Gpbar1遺伝子領域における変異を検出する工程を含むことが好ましい。【００３２】
また、上記検査には、Gpbar1遺伝子領域にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、全胆汁酸プール量の減少又は増加に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の検査薬を使用することができる。【００３３】
尚、上記検査方法は、Gpbar1に結合する抗体を含むものであってもよい。Gpbar1に結合する抗体を含む検査薬であっても、少量の生体材料（血液等）から、全胆汁酸プール量の減少又は増加、に伴う疾患又は脂質代謝性疾患を検査することができる。
【発明の効果】
【００３４】
本発明において、マウスでのGpbar1の標的破壊により全胆汁酸プール量の減少が示され、Gpbar1がインビボでの胆汁酸恒常性の制御に寄与することが示唆された。さらに、Gpbar1欠損マウスに高脂肪餌を与えて飼育することにより、該マウスの体重は同じ高脂肪餌を与えて飼育した野性型マウスと比較して顕著に増加し、Gpbar1の欠損が脂質代謝の異常を引き起こすことが示唆された。【００３５】
このことより、Gpbar1への結合性、Gpbar1の発現量、Gpbar1の活性を標的として、全胆汁酸プール量の増減に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤のスクリーニングが可能になる。また、Gpbar1の発現量やGpbar1遺伝子の変異を指標として、全胆汁酸プール量の増減に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の検査が可能となる。【００３６】
本発明のGpbar1欠損マウスの解析は、Gpbar1の生理的役割を解明する研究において有用なものとなり得る。また、該Gpbar1欠損マウスは、本発明のスクリーニング方法により特定された薬剤や、抗Gpbar1抗体又はGpbar1アンタゴニスト低分子等のGpbar1阻害剤の副作用を推測するために使用することができる。遺伝子改変動物の組織から樹立した細胞株を用いることで、各組織でスクリーニング方法により特定された薬剤の副作用を詳細に検討することが可能である。【００３７】
また、本発明の遺伝子改変動物は、生まれながらにしてGpbar1遺伝子が不活性化されているため、Gpbar1と結合するタンパク質に対する抗体を効率よく作製することができる。【００３８】
さらに、本発明の遺伝子改変動物の症状を観察し、これまで原因の明らかでなかった疾患の症状と比較することで、疾患の原因がGpbar1の機能不全であることを明らかにすることも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】マウスGpbar1 mRNAの組織分布を示す図である。
【図２】マウスGpbar1遺伝子の標的破壊を示す図及び写真である。
【図３】Gpbar1欠損マウスにおける、全胆汁酸プール量及び糞便中胆汁酸排泄を示す図である。
【図４】通常餌を与えたGpbar1欠損マウスの体重変動を示す図である。
【図５】高脂肪餌を与えたGpbar1欠損マウスの体重変動を示す図である。
【図６】高脂肪餌を与えたGpbar1欠損マウスの脂肪量及び除脂肪体重を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
本発明は、全胆汁酸プール量の増減に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法に関する。【００４１】
胆汁酸は、胆汁の一成分であり、コレステロールを原料として肝臓で合成される。脂肪を乳化し、小腸での消化吸収を助けるほか、各種ビタミンの吸収にも関係している。胆管を経て腸に排出されるが、回腸末端部を中心とした腸管よりほとんど再吸収され、門脈を経て肝臓にいく極めて閉鎖的な腸肝循環を行っている。【００４２】
本発明において、全胆汁酸プール量の増減に伴う疾患とは、全胆汁酸プール量の減少に伴う疾患及び全胆汁酸プール量の増加に伴う疾患のいずれでもよい。全胆汁酸プール量の減少に伴う疾患としては、消化不全、コレステロールの低下によるホルモンの減少、赤血球や血管の細胞膜の障害等を挙げることが出来る。また、全胆汁酸プール量の増加に伴う疾患としては、血中のコレステロールの増加による動脈硬化等を上げることが出来る。【００４３】
本発明において、脂質代謝性疾患とは、脂質の代謝に異常をきたすことを原因とする疾患のいずれでもよい。脂質の代謝異常により引き起こされる脂肪蓄積を基盤とする疾患としては、例えば、肥満、糖尿病、高脂血症、高血圧等のメタボリックシンドロームを挙げることができる。【００４４】
本発明のスクリーニング方法の第一の態様においては、まず、Gpbar1に複数の被験化合物を接触させる。【００４５】
本発明において、ヒト由来のGpbar1 cDNAの塩基配列を配列番号：１に、該DNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。また、マウス由来のGpbar1 cDNAの塩基配列を配列番号：３に、該cDNAによりコードされるGpbar1のアミノ酸配列を配列番号：４に示す。さらに、ラット由来のGpbar1のcDNAの塩基配列を配列番号：５に、該cDNAによりコードされるGpbar1のアミノ酸配列を配列番号：６に示す。尚、本明細書においてGpbar1とは、特に断りがない限り、ヒトGpbar1、マウスGpbar1及びラットGpbar1の全てを指す。【００４６】
また、本発明の方法に使用されるGpbar1には、上記の公知のGpbar1タンパク質と機能的に同等なタンパク質を包含する。このようなタンパク質には、例えば、Gpbar1タンパク質の変異体、アレル、バリアント、ホモログ、Gpbar1の部分ペプチド又は他のタンパク質との融合タンパク質等が挙げられるが、これらに限定されない。【００４７】
本発明におけるGpbar1の変異体としては、配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなる天然由来のタンパク質であって、配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を挙げることが出来る。また、配列番号：１、３又は５に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする天然由来のDNAよりコードされるタンパク質であって、配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質も、Gpbar1の変異体として挙げることができる。【００４８】
本発明において、変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、30アミノ酸以内であり、好ましくは15アミノ酸以内であり、さらに好ましくは5アミノ酸以内（例えば、3アミノ酸以内）であると考えられる。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（R、K、H）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。あるアミノ酸配列に対する1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている。【００４９】
本発明において「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が、該タンパク質と同等の生物学的機能や生化学的機能を有することを指す。本発明において、該タンパク質の生物学的機能や生化学的機能としては、胆汁酸との結合等が挙げられる。生物学的な性質には発現する部位の特異性や、発現量等も含まれる。【００５０】
目的のタンパク質と「機能的に同等なタンパク質」をコードするDNAを調製するために、当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を利用する方法が挙げられる。すなわち、当業者にとっては、Gpbar1の塩基配列（配列番号：１、３又は５）若しくはその一部をプローブとして、またGpbar1（配列番号：１、３又は５）に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、Gpbar1と高い相同性を有するDNAを単離することは通常行い得ることである。このようにハイブリダイズ技術やPCR技術により単離し得るGpbar1と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAもまた本発明のDNAに含まれる。【００５１】
このようなDNAを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、6M尿素、0.4%SDS、0.5xSSCの条件又はこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M尿素、0.4%SDS、0.1xSSCの条件を用いることにより、より相同性の高いDNAの単離を期待することができる。これにより単離されたDNAは、アミノ酸レベルにおいて、目的タンパク質のアミノ酸配列と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で、少なくとも50％以上、さらに好ましくは70％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95%,96%,97%,98%,99%以上）の配列の同一性を指す。アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。【００５２】
本発明の方法に使用されるGpbar1が由来する生物種としては、特定の生物種に限定されるものではない。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、酵母、昆虫等が挙げられる。【００５３】
第一の態様に用いられるGpbar1の状態としては、特に制限はなく、例えば、精製された状態、細胞内に発現した状態、細胞抽出液内に発現した状態等であってもよい。【００５４】
Gpbar1の精製は周知の方法で行うことができる。また、Gpbar1が発現している細胞としては、内在性のGpbar1を発現している細胞又は外来性のGpbar1を発現している細胞が挙げられる。上記内在性のGpbar1を発現している細胞としては、培養細胞等を挙げることができるが、これに限定されるものではない。上記培養細胞としては、特に制限はなく、例えば、市販のものを用いることが可能である。内在性のGpbar1を発現している細胞が由来する生物種としては、特に制限はなく、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、酵母、昆虫等が挙げられる。また、上記外来性のGpbar1を発現している細胞は、例えば、Gpbar1をコードするDNAを含むベクターを細胞に導入することで作製できる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェタミン法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。また、上記外来性のGpbar1を有する細胞は、例えば、Gpbar1をコードするDNAを、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により、染色体へ挿入することで作製することができる。このような外来性のGpbar1が導入される細胞が由来する生物種としては、哺乳類に限定されず、外来タンパク質を細胞内に発現させる技術が確立されている生物種であればよい。【００５５】
また、Gpbar1が発現している細胞抽出液は、例えば、試験管内転写翻訳系に含まれる細胞抽出液に、Gpbar1をコードするDNAを含むベクターを添加したものを挙げることができる。該試験管内転写翻訳系としては、特に制限はなく、市販の試験管内転写翻訳キット等を使用することが可能である。【００５６】
本発明の方法における「被検化合物」としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物若しくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被験試料は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。また、上記被験試料に加えて、これらの被験試料を複数種混合した混合物も含まれる。【００５７】
また、本発明において「接触」は、Gpbar1の状態に応じて行う。例えば、Gpbar1が精製された状態であれば、精製標品に被験試料を添加することにより行うことができる。また、細胞内に発現した状態又は細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液又は該細胞抽出液に被験試料を添加することにより行うことができる。被験試料がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするDNAを含むベクターを、Gpbar1が発現している細胞へ導入する、又は該ベクターをGpbar1が発現している細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。また、例えば、酵母又は動物細胞等を用いたツーハイブリッド法を利用することも可能である。【００５８】
第一の態様では、次いで、Gpbar1と被験化合物との結合を検出する。検出方法としては、特に制限はない。Gpbar1と被験化合物との結合は、例えば、Gpbar1タンパク質に結合した被験化合物に付された標識（例えば、放射標識や蛍光標識等定量的測定が可能な標識）によって検出することができる。また、Gpbar1への被験化合物の結合により生じるGpbar1の活性変化を指標に検出することもできる。【００５９】
本態様では、次いで、Gpbar1と結合する被験化合物を選択する。選択された化合物には、Gpbar1の活性を促進又は抑制する化合物若しくは、Gpbar1の発現を増加又は減少させる化合物が含まれ、それらの化合物は結果として全胆汁酸プール量の増加又は減少を引き起こすものである。【００６０】
本発明のスクリーニング方法の第二の態様としては、まずGpbar1を発現する細胞に被検化合物を接触させる。【００６１】
第二の態様では、次いでGpbar1の発現レベルを測定する。Gpbar1の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、該遺伝子のmRNAを定法に従って抽出し、このmRNAを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法又はRT-PCR法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。さらに、DNAアレイ技術を用いて、該遺伝子の発現レベルを測定することも可能である。【００６２】
また、該遺伝子からコードされるGpbar1を含む画分を定法に従って回収し、該Gpbar1の発現をSDS-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。また、Gpbar1に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実施し、該Gpbar1の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。【００６３】
Gpbar1の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の両方を利用することができる。該抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして取得することができる。Gpbar1、あるいはGSTとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させたリコンビナントタンパク質又はその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、Gpbar1や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、Gpbar1又はその部分ペプチドをマウス等の小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、Gpbar1に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、Gpbar1や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。【００６４】
第二の態様では、次いで、被検化合物を接触させていない場合と比較して、該Gpbar1の発現レベルを減少又は増加させた被検化合物を選択する。選択された化合物には、Gpbar1の発現を増加又は減少させる化合物が含まれ、それらの化合物は結果として全胆汁酸プール量の増加又は減少を引き起こすものである。【００６５】
本発明のスクリーニング方法の第三の態様としては、まず、Gpbar1をコードするDNAのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞又は細胞抽出液を提供する。【００６６】
第三の態様において、「機能的に結合した」とは、Gpbar1遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、Gpbar1遺伝子のプロモーター領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、Gpbar1遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。【００６７】
上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるCAT遺伝子、lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β-グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）及びGFP遺伝子等を挙げることができる。また、上記レポーター遺伝子には、Gpbar1タンパク質をコードするDNAもまた含まれる。【００６８】
Gpbar1をコードするDNAのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞又は細胞抽出液は、第一の態様において述べた方法で調製することが可能である。【００６９】
第三の態様では、次いで、上記細胞又は上記細胞抽出液に被験試料を接触させる。次いで、該細胞又は該細胞抽出液における上記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。【００７０】
レポーター遺伝子の発現レベルは、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がCAT遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポーター遺伝子がlacZ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、β-グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるGlucuron（ICN社）の発光や5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-グルクロニド（X-Gluc）の発色を検出することにより、さらに、GFP遺伝子である場合には、GFPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。【００７１】
また、Gpbar1遺伝子をレポーターとする場合、該遺伝子の発現レベルの測定は、第二の態様に記載された方法で行うことが出来る。【００７２】
第三の態様においては、次いで、被検化合物を接触させていない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを減少又は増加させた被検化合物を選択する。選択された化合物には、該レポーター遺伝子の発現レベルを増加又は減少させる化合物が含まれ、それらの化合物は結果として全胆汁酸プール量の増加又は減少を引き起こすものである。【００７３】
本発明のスクリーニング方法の第四の態様としては、まず、Gpbar1に対するリガンドの存在下で、Gpbar1を細胞表面に発現させた細胞に被検化合物を接触させる。【００７４】
本明細書で使用される「リガンド」とは、特定の受容体によって認識されるランダムペプチド又は可変セグメント配列のような分子を示す。当業者が認識しているような分子（又は高分子複合体）は、受容体とリガンドの両方であることができる。一般的には、より小さい分子量を持つ結合パートナーは、リガンドと呼ばれ、より大きい分子量を持つ結合パートナーは受容体と呼ばれる。【００７５】
第四の態様では、次いで、上記Gpbar1の活性を測定する。Gpbar1の活性としては、胆汁酸との結合活性、cＡＭＰの合成活性、[35S]GTPγSの結合活性等を挙げることが出来る。次いで、被検化合物を接触させない場合と比較して、上記活性を低下若しくは増加させた被検化合物を選択する。選択された化合物には、Gpbar1の活性を上昇又は低下させる化合物が含まれ、それらの化合物は結果として全胆汁酸プール量の増加又は減少を引き起こすものである。【００７６】
本発明は、Gpbar1遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする遺伝子改変非ヒト哺乳動物に関する。【００７７】
本発明において「Gpbar1遺伝子の発現が人為的に抑制されている」とは、通常、Gpbar1遺伝子の遺伝子対の一方又は双方に、ヌクレオチドの挿入、欠失、置換等の遺伝子変異を有することにより該遺伝子の発現が抑制されている状態を指す。正常なGpbar1タンパク質としての機能が減少又は喪失している変異Gpbar1タンパク質が発現している場合も、この「Gpbar1遺伝子の発現の抑制」に含まれる。上記「抑制」には、Gpbar1遺伝子の発現が完全に抑制されている場合のほか、該遺伝子の遺伝子対の一方の遺伝子の発現のみが抑制されている場合も含まれる。本発明においては、Gpbar1遺伝子の発現が特異的に抑制されていることが好ましい。また、遺伝子変異の存在する部位は、該遺伝子の発現が抑制されるような部位であれば特に制限されず、例えばエクソン部位、プロモーター部位等を挙げることができる。【００７８】
本発明においてGpbar1遺伝子の改変の対象となる動物は、通常、ヒト以外の動物であり、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、ウサギ等のげっ歯類であり、その中でも特にマウスが好ましい。本発明においてGpbar1遺伝子の改変の対象となるES細胞もまた、げっ歯類に由来するものが好ましく、特にマウス由来が好ましい。尚、一般的に称される「ノックアウト動物」も本発明の遺伝子改変動物に含まれる。【００７９】
本発明の遺伝子改変非ヒト動物（単に、「遺伝子改変動物」と記載する場合あり）及び遺伝子改変ES細胞において、Gpbar1遺伝子の発現を人為的に抑制する手段としては、Gpbar1遺伝子全体又はその一部を欠損させる方法や、Gpbar1遺伝子の発現制御領域の全部又はその一部を欠損させる方法等を例示することができるが、好ましくはGpbar1遺伝子の遺伝子対の一方又は双方に外来遺伝子を挿入することによりGpbar1遺伝子を不活性化する方法である。すなわち、本発明の好ましい態様において、遺伝子改変動物及び遺伝子改変ES細胞は、Gpbar1遺伝子の遺伝子対の一方又は双方に外来遺伝子が挿入されていることを特徴とする。【００８０】
本発明の遺伝子改変動物は、当業者においては一般的に公知の遺伝子工学技術により作製することができる。例えば、以下のようにして遺伝子改変マウスを作製することができる。まず、マウスからGpbar1遺伝子のエクソン部分を含むDNAを単離し、このDNA断片に適当なマーカー遺伝子を挿入し、ターゲッティングベクターを構築する。このターゲッティングベクターをエレクトロポレーション法等によりマウスのES細胞株に導入し、相同組み換えを生じた細胞株を選抜する。挿入するマーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子が好ましい。抗生物質耐性遺伝子を挿入した場合には、抗生物質を含む培地で培養するだけで相同組み換えを生じた細胞株を選抜することができる。また、より効率的な選抜を行うためには、ターゲッティングベクターにチミジンキナーゼ遺伝子等を結合させておくことも可能である。これにより、非相同組み換えを起こした細胞株を排除することができる。また、PCR及びサザンブロットにより相同組み換え体の検定を行い、Gpbar1遺伝子の遺伝子対の一方が不活性化された細胞株を効率よく得ることもできる。【００８１】
相同組み換えを生じた細胞株を選抜する場合、相同組み換え箇所以外にも、遺伝子挿入による未知の遺伝子破壊の恐れがあることから、複数のクローンを用いてキメラ作製を行うことが好ましい。得られたES細胞株をマウス胚盤葉にインジェクションしキメラマウスを得ることができる。このキメラマウスを交配させることで、Gpbar1遺伝子の遺伝子対の一方を不活性化したマウスを得ることができる。さらに、このマウスを交配させることで、Gpbar1遺伝子の遺伝子対の双方を不活性化したマウスを取得することができる。より具体的には、後述の実施例に記載の方法に従って、本発明の遺伝子改変マウスを作製することが可能である。マウス以外のES細胞が樹立された動物においても、同様の手法により、遺伝子改変を行うことができる。【００８２】
また、Gpbar1遺伝子の遺伝子対の双方を不活性化したES細胞株は、以下の方法により取得することも可能である。すなわち、遺伝子対の一方を不活性化したES細胞株を高濃度の抗生物質を含む培地で培養することにより、遺伝子対のもう一方も不活性化された細胞株、すなわち、Gpbar1遺伝子の遺伝子対の双方を不活性化したES細胞株を得ることができる。また、遺伝子対の一方を不活性化したES細胞株を選抜し、この細胞株に再度ターゲッティングベクターを導入し、相同組換えを生じた細胞株を選択することでも作製することができる。ターゲッティングベクターに挿入するマーカー遺伝子は、前出のマーカー遺伝子とは異なるものを使用することが好ましい。【００８３】
また本発明は、本発明の遺伝子改変非ヒト動物から得られる遺伝子改変哺乳動物細胞を提供する。遺伝子改変哺乳動物細胞は、初代培養細胞としてだけでなく、そこから樹立された細胞株としても提供される。本発明の遺伝子改変動物由来の細胞株を樹立する方法としては、公知の方法を利用することができる。例えば、げっ歯類においては、胎仔細胞の初代培養の方法を用いることが可能である。さらに、本発明における遺伝子改変哺乳動物細胞は、ES細胞であってもよい。【００８４】
本発明の遺伝子改変動物、遺伝子改変哺乳動物細胞、そこから樹立した細胞株、及びES細胞は、Gpbar1遺伝子の詳細な機能の解析に利用することができる。例えば抗Gpbar1抗体又はGpbar1アンタゴニスト低分子等のGpbar1阻害剤の副作用を推測するために使用することができる。本発明で取得される遺伝子改変マウスは正常に生育し、少なくとも胎生期に死亡することはなかったことから、Gpbar1阻害剤（アンタゴニスト）は致死性の副作用はないものと考えられる。本発明の遺伝子改変動物を詳細に検討することにより、Gpbar1阻害剤の副作用を推測することができる。また、遺伝子改変哺乳動物細胞及びそこから樹立した細胞株を用いることで、各組織でのGpbar1阻害剤の副作用を詳細に検討することが可能である。さらに、本発明の遺伝子改変哺乳動物のES細胞から分化誘導して得られる体の様々な組織を構成する細胞（血液、神経、肝臓、膵臓等）は、全胆汁酸プール量の減少に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニングに好適である。【００８５】
本発明の遺伝子改変動物は、生まれながらにしてGpbar1遺伝子が不活性化されているため、Gpbar1と結合するタンパク質に対する抗体を効率よく作製することができる。例えば、完全フロインドアジュバンドとともに、Gpbar1を本発明の遺伝子改変マウスに免疫することによって、Gpbar1に対するモノクローナル抗体、あるいはポリクローナル抗体を効率よく作製することができる。この際、免疫するGpbar1はマウス由来のもの以外に、ラットやヒト由来であってもよい。【００８６】
また、本発明の遺伝子改変動物の症状を観察し、これまで原因の明らかでなかった疾患の症状と比較することで、疾患の原因がGpbar1の機能不全であることを明らかにすることも可能である。例えば、遺伝子改変マウスあるいは当該マウス由来細胞に特徴的に現れる表現系を観察し、ヒトの疾患の諸症状と比較する。当該ヒト疾患の諸症状のうち半分以上が本発明の遺伝子改変マウスで観察されれば、当該疾患の原因がGpbar1の機能不全であると推定することができる。本発明の遺伝子改変動物は、全胆汁酸プール量の減少に伴う疾患又は脂質代謝性疾患のモデル動物としても用いることが可能である。【００８７】
また、該遺伝子改変非ヒト哺乳動物を利用して、全胆汁酸プール量の減少に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニングを行うことも可能である。【００８８】
本方法においては、まず、被検化合物をGpbar1遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする遺伝子改変非ヒト哺乳動物に投与する。遺伝子改変動物への被験化合物の投与は、経口的又は非経口的に行うことができる。【００８９】
次いで、該遺伝子改変非ヒト哺乳動物における全胆汁酸プール量を測定する。全胆汁酸プール量を測定するには、まず測定したい組織をホモジナイズし、それらの組織を灌流しながら、一定分量をエタノールで抽出する。次いで、これらの抽出物における全胆汁酸含有量を、Kitadaらの記載通り酵素的方法により測定することができる（Kitada, H., Miyata, M., Nakamura, T., Tozawa, A., Honma, W., Shimada, M., Nagata, K., Sinal, C. J., Guo, G. L., Gonzalez, F. J., and Yamazoe, Y. 2003. Protective role of hydroxysteroid sulfotransferase in lithocholic acid-induced liver toxicity. J Biol Chem. 278: 17838-17844）。本測定は、実施例に具体的に記載された方法でも行うことが出来る。【００９０】
本方法は次いで、被検化合物を投与していない場合と比較して、該遺伝子改変非ヒト哺乳動物における全胆汁酸プール量を増加させる化合物を選択する。選択された化合物には、全胆汁酸プール量の増加する化合物が含まれ、全胆汁酸プール量の減少に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤として有用であると考えられる。【００９１】
本発明は、上記のスクリーニング方法により選択された、全胆汁酸プール量の増減に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤に関する。【００９２】
全胆汁酸プール量の減少に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤としては、Gpbar1タンパク質をコードするＤＮＡを有効成分とする薬剤を挙げることが出来る。Gpbar1タンパク質をコードするＤＮＡは上記に記載の通りである。【００９３】
また、全胆汁酸プール量の増加に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤としては、Gpbar1の発現又は活性を低下させる化合物を有効成分とする薬剤を挙げることが出来る。Gpbar1の発現又は活性を低下させる化合物としては、結果としてGpbar1の発現又は活性を低下させるものであれば如何なるものでもよい。【００９４】
本発明の、Gpbar1の発現を抑制する化合物としては、Gpbar1をコードするDNAの転写産物と相補的なRNA又は該転写産物を特異的に開裂するリボザイムを挙げることができる。Gpbar1をコードするDNAとしては配列番号：１、３又は５に記載の塩基配列からなるDNA、配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、及び配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする天然由来のDNA等も含まれる。【００９５】
本発明の「Gpbar1の発現を抑制」という記載には、遺伝子の転写の抑制及びタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、DNAの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。【００９６】
本発明の「Gpbar1をコードするDNAの転写産物と相補的なRNA」の一つの態様は、Gpbar1をコードするDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAである。【００９７】
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ(Ａ)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、及び核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制等である。これらは、転写、スプライシング又は翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する。【００９８】
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域若しくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むDNAも、本発明で利用されるアンチセンスDNAに含まれる。使用されるアンチセンスDNAは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製されたDNAは、公知の方法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスDNAの配列は、形質転換する植物が持つ内在性遺伝子又はその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスDNAの長さは、少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスDNAの長さは5kbよりも短く、好ましくは2.5kbよりも短い。【００９９】
「Gpbar1をコードするDNAの転写産物と相補的なRNA」の他の一つの態様は、Gpbar1をコードするDNAの転写産物と相補的なdsRNAである。RNAiは、標的遺伝子配列と同一若しくは類似した配列を有する二重鎖RNA（以下dsRNA）を細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子及び標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象である。細胞に約40〜数百塩基対のdsRNAが導入されると、ヘリカーゼドメインを持つダイサー(Dicer)と呼ばれるRNaseIII様のヌクレアーゼがATP存在下で、dsRNAを3’末端から約21〜23塩基対ずつ切り出し、siRNA（short interference RNA）を生じる。このsiRNAに特異的なタンパク質が結合して、ヌクレアーゼ複合体（RISC：RNA-induced silencing complex）が形成される。この複合体はsiRNAと同じ配列を認識して結合し、RNaseIII様の酵素活性によってsiRNAの中央部で標的遺伝子のmRNAを切断する。また、この経路とは別にsiRNAのアンチセンス鎖がmRNAに結合してRNA依存性RNAポリメラーゼ(RsRP)のプライマーとして作用し、dsRNAが合成される。このdsRNAが再びダイサーの基質となって、新たなsiRNAを生じて作用を増幅する経路も考えられている。【０１００】
本発明のRNAは、標的遺伝子mRNAのいずれかの領域に対するアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、標的遺伝子mRNAのいずれかの領域のセンスRNAをコードしたセンスコードDNAより発現させることができる。また、これらのアンチセンスRNA及びセンスRNAよりdsRNAを作成することもできる。【０１０１】
本発明のdsRNAの発現システムを、ベクター等に保持させる場合の構成としては、同一のベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる場合と、異なるベクターからそれぞれアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる場合がある。例えば、同一のベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる構成としては、アンチセンスコードDNA及びセンスコードDNAの上流にそれぞれpolIII系のような短いRNAを発現し得るプロモータを連結させたアンチセンスRNA発現カセット、センスRNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに挿入することにより構成することができる。また、異なる鎖上に対向するようにアンチセンスコードDNAとセンスコードDNAと逆向きに配置した発現システムを構成することもできる。この構成では、アンチセンスRNAコード鎖とセンスRNAコード鎖とが対となった一つの二本鎖DNA（siRNAコードDNA）が備えられ、その両側にそれぞれの鎖からアンチセンスRNA、センスRNAとを発現し得るようにプロモータを対向して備えられる。この場合には、センスRNA、アンチセンスRNAの下流に余分な配列が付加されることを避けるために、それぞれの鎖（アンチセンスRNAコード鎖、センスRNAコード鎖）の３'末端にターミネーターをそれぞれ備えることが好ましい。このターミネーターは、A（アデニン）塩基を４つ以上連続させた配列等を用いることができる。また、このパリンドロームスタイルの発現システムでは、二つのプロモータの種類を異ならせることが好ましい。【０１０２】
また、異なるベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスコードDNA及びセンスコードDNAの上流にそれぞれpolIII系のような短いRNAを発現し得るプロモータを連結させたアンチセンスRNA発現カセット、センスRNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを異なるベクターに保持させることにより構成することができる。【０１０３】
本発明のRNAiにおいては、dsRNAとしてsiRNAが使用されたものであってもよい。「siRNA」は、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖RNAを意味し、例えば、15〜49塩基対と、好適には15〜35塩基対と、さらに好適には21〜30塩基対とすることができる。あるいは、発現されるsiRNAが転写され最終的な二重鎖RNA部分の長さが、例えば、15〜49塩基対、好適には15〜35塩基対、さらに好適には21〜30塩基対とすることができる。【０１０４】
RNAiに用いるDNAは、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の配列の相同性を有する。【０１０５】
dsRNAにおけるRNA同士が対合した二重鎖RNAの部分は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）等により不対合部分が含まれていてもよい。本発明においては、dsRNAにおけるRNA同士が対合する二重鎖RNA領域中に、バルジ及びミスマッチの両方が含まれていてもよい。【０１０６】
本発明の「Gpbar1の発現の抑制」は、また、リボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことをいう。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型や、RNasePに含まれるM1RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある。【０１０７】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15のC15の3'側を切断するが、活性にはU14が９位のAと塩基対を形成することが重要とされ、15位の塩基はCの他にA又はUでも切断されることが示されている。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のRNA配列と相補的になるように設計すれば、標的RNA中のUC、UU又はUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することが可能である。例えば、阻害標的となる本発明のGpbar1のコード領域中には標的となり得る部位が複数存在する。【０１０８】
また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される(J.M.Buzayan Nature 323:349,1986)。このリボザイムも、標的特異的なRNA切断を起こすように設計できることが示されている。【０１０９】
標的を切断できるよう設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター等のプロモーター及び転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写されたRNAの5'末端や3'末端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われてしまうことがある。このようなとき、転写されたリボザイムを含むRNAからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の5'側や3'側に、トリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である(K.Taira et al. (1990) Protein Eng. 3:733、A.M.Dzianottand J.J.Bujarski (1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 86:4823、 C.A.Grosshansand R.T.Cech (1991) Nucleic Acids Res. 19:3875、 K.Taira et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:5125)。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる(N.Yuyama et al. Biochem.Biophys.Res.Commun.186:1271,1992)。このようなリボザイムを用いて本発明で標的となる遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。【０１１０】
本発明のスクリーニングにより単離しうる化合物、Gpbar1タンパク質をコードするＤＮＡ又はGpbar1の発現又は活性を低下させる化合物をヒトや他の動物の医薬として使用する場合には、これらの化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体若しくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。【０１１１】
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。【０１１２】
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート80（TM）、HCO-50と併用してもよい。【０１１３】
油性液としてはゴマ油、大豆油が挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。【０１１４】
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等のほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的又は経口的に当業者に公知の方法により行い得る。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がDNAによりコードされ得るものであれば、該DNAを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状等により変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。【０１１５】
化合物の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重60kgとして）においては、1日あたり約0.1から100mg、好ましくは約1.0から50mg、より好ましくは約1.0から20mgであると考えられる。【０１１６】
非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重60kgとして）においては、通常、1日当り約0.01から30mg、好ましくは約0.1から20mg、より好ましくは約0.1から10mg程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。他の動物の場合も、体重60kg当たりに換算した量、あるいは体表面積あたりに換算した量を投与することができる。【０１１７】
本発明は、全胆汁酸プール量の増減に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の検査方法に関する。【０１１８】
該方法としては、Gpbar1遺伝子の発現量を測定する工程を含む、全胆汁酸プール量の減少又は増加に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の検査方法を挙げることが出来る。Gpbar1遺伝子の発現量の測定は上記に記載の方法で行うことが可能である。【０１１９】
Gpbar1遺伝子の発現量が増減した場合には、併せて全胆汁酸プール量も増減するものと考えられ、全胆汁酸プール量の増減に基づく疾患であるかどうかを検査することが可能である。【０１２０】
さらに該方法には、Gpbar1遺伝子領域における変異を検出する工程を含む、全胆汁酸プール量の減少又は増加に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の検査方法を挙げることが出来る。【０１２１】
本発明において、Gpbar1遺伝子領域とは、Gpbar1の遺伝子及び該遺伝子の発現に影響する領域を意味する。該遺伝子の発現に影響する領域としては、特に制限はないが、例えば、プロモーター領域等が例示できる。【０１２２】
また、本発明における変異は、全胆汁酸プール量の減少又は増加に伴う疾患又は脂質代謝性疾患に関与する変異であれば、その種類、その数等に制限はない。上記遺伝子の発現量を変化させる、mRNAの安定性等の性質を変化させる、あるいは上記遺伝子によってコードされるタンパク質の有する活性を変化させるような変異であることが多いが、特に制限されない。上記変異の種類としては、例えば、欠失、置換又は挿入変異等が挙げられる。上記の変異には、該タンパク質のアミノ酸配列においてアミノ酸の置換が起こる変異、及びアミノ酸の置換は起こらないが、塩基配列における塩基の置換が起こる変異が含まれる。【０１２３】
以下、Gpbar1遺伝子領域に生じた変異を検出する工程を含む検査方法の好ましい態様を記載するが、本発明の方法はそれらの方法に限定されるものではない。【０１２４】
上記検査方法の好ましい態様においては、まず、被検者からDNA試料を調製する。DNA試料は、例えば被検者の血液、皮膚、口腔粘膜、毛髪、手術やバイオプシー等により採取あるいは切除した組織又は細胞から抽出した。染色体DNA、あるいはRNAを基に調製することができる。【０１２５】
本方法においては、次いで、Gpbar1の遺伝子領域を含むDNAを単離する。該DNAの単離は、例えば、Gpbar1の遺伝子領域を含むDNAにハイブリダイズするプライマーを用いて、染色体DNA、あるいはRNA由来cDNAを鋳型としたPCR等によって行うことができる。【０１２６】
本方法においては、次いで、単離したDNAの塩基配列を決定する。【０１２７】
本方法においては、次いで、決定したDNAの塩基配列を対照と比較する。本発明において、対照とは、正常な（より高頻度な、あるいは、野生型の）Gpbar1の遺伝子領域を含むDNAを言う。一般に健常人のGpbar1の遺伝子領域を含むDNAの配列は正常であるものと考えられることから、上記「対照と比較する」とは、通常、健常人のGpbar1の遺伝子領域を含むDNAの配列と比較することを意味する。【０１２８】
本発明における変異の検出は、以下のような方法によっても行うことができる。まず、被検者からDNA試料を調製する。次いで、調製したDNA試料を制限酵素により切断する。次いで、DNA断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたDNA断片の大きさを、対照と比較する。また、他の一つの態様においては、まず、被検者からDNA試料を調製する。次いで、Gpbar1の遺伝子領域を含むDNAを増幅する。さらに、増幅したDNAを制限酵素により切断する。次いで、DNA断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたDNA断片の大きさを、対照と比較する。【０１２９】
このような方法としては、例えば、制限酵素断片長変異（Restriction Fragment Length Polymorphism／RFLP）を利用した方法やPCR-RFLP法等が挙げられる。具体的には、制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、あるいは制限酵素処理によって生じるDNA断片内に塩基挿入又は欠失がある場合、制限酵素処理後に生じる断片の大きさが対照と比較して変化する。この変異を含む部分をPCR法によって増幅し、それぞれの制限酵素で処理することによって、これらの変異を電気泳動後のバンドの移動度の差として検出することができる。あるいは、染色体DNAをこれらの制限酵素によって処理し、電気泳動した後、本発明のプローブDNAを用いてサザンブロッティングを行うことにより、変異の有無を検出することができる。用いられる制限酵素は、それぞれの変異に応じて適宜選択することができる。この方法では、ゲノムDNA以外にも被検者から調製したRNAを逆転写酵素でcDNAにし、これをそのまま制限酵素で切断した後、サザンブロッティングを行うことも可能である。また、このcDNAを鋳型としてPCRでGpbar1の遺伝子領域を含むDNAを増幅し、それを制限酵素で切断した後、移動度の差を調べることも可能である。【０１３０】
さらに別の方法においては、まず、被検者からDNA試料を調製する。次いで、Gpbar1遺伝子領域を含むDNAを増幅する。さらに、増幅したDNAを一本鎖DNAに解離させる。次いで、解離させた一本鎖DNAを非変性ゲル上で分離する。分離した一本鎖DNAのゲル上での移動度を対照と比較する。【０１３１】
該方法としては、例えばPCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism、一本鎖高次構造変異)法(Cloning and polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism analysis of anonymous Alu repeats on chromosome 11. Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.、Detection of p53 gene mutations in human brain tumors by single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products. Oncogene. 1991 Aug 1; 6(8): 1313-1318.、Multiple fluorescence-based PCR-SSCP analysis with postlabeling. 、PCR Methods Appl. 1995 Apr 1; 4(5): 275-282.)が挙げられる。この方法は操作が比較的簡便であり、また被検試料の量も少なくて済む等の利点を有するため、特に多数のDNA試料をスクリーニングするのに好適である。その原理は次の通りである。二本鎖DNA断片を一本鎖に解離すると、各鎖はその塩基配列に依存した独自の高次構造を形成する。この解離したDNA鎖を、変性剤を含まないポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、それぞれの高次構造の差に応じて、相補的な同じ鎖長の一本鎖DNAが異なる位置に移動する。一塩基の置換によってもこの一本鎖DNAの高次構造は変化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において異なる移動度を示す。従って、この移動度の変化を検出することによりDNA断片に点突然変異や欠失、あるいは挿入等による変異の存在を検出することができる。【０１３２】
具体的には、まず、Gpbar1の遺伝子領域を含むDNAをPCR法等によって増幅する。増幅される範囲としては、通常200〜400bp程度の長さが好ましい。PCRは、当業者においては反応条件等を適宜選択して行うことができる。PCRの際に、32P等のアイソトープ、蛍光色素、又はビオチン等によって標識したプライマーを用いることにより、増幅DNA産物を標識することができる。あるいはPCR反応液に32P等のアイソトープ、蛍光色素、又はビオチン等によって標識された基質塩基を加えてPCRを行うことにより、増幅DNA産物を標識することも可能である。さらに、PCR反応後にクレノウ酵素等を用いて、32P等のアイソトープ、蛍光色素、又はビオチン等によって標識された基質塩基を、増幅DNA断片に付加することによっても標識を行うことができる。こうして得られた標識DNA断片を、熱を加えること等により変性させ、尿素等の変性剤を含まないポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行う。この際、ポリアクリルアミドゲルに適量（5から10％程度）のグリセロールを添加することにより、DNA断片の分離の条件を改善することができる。また、泳動条件は各DNA断片の性質により変動するが、通常、室温（20から25℃）で行い、好ましい分離が得られないときには4から30℃までの温度で最適の移動度を与える温度の検討を行う。電気泳動後、DNA断片の移動度を、Ｘ線フィルムを用いたオートラジオグラフィーや、蛍光を検出するスキャナー等で検出し、解析を行う。移動度に差があるバンドが検出された場合、このバンドを直接ゲルから切り出し、PCRによって再度増幅し、それを直接シークエンシングすることにより、変異の存在を確認することができる。また、標識したDNAを使わない場合においても、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドや銀染色法等によって染色することによって、バンドを検出することができる。【０１３３】
さらに別の方法においては、まず、被検者からDNA試料を調製する。次いで、Gpbar1の遺伝子領域を含むDNAを増幅する。さらに、増幅したDNAを、DNA変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する。次いで、分離したDNAのゲル上での移動度を対照と比較する。【０１３４】
このような方法としては、例えば、変性剤濃度勾配ゲル（denaturant gradient gel electrophoresis： DGGE法）等を例示することができる。DGGE法は、変性剤の濃度勾配のあるポリアクリルアミドゲル中で、DNA断片の混合物を泳動し、それぞれの不安定性の違いによってDNA断片を分離する方法である。ミスマッチのある不安定なDNA断片が、ゲル中のある変性剤濃度の部分まで移動すると、ミスマッチ周辺のDNA配列はその不安定さのために、部分的に1本鎖へと解離する。この部分的に解離したDNA断片の移動度は、非常に遅くなり、解離部分のない完全な二本鎖DNAの移動度と差がつくことから、両者を分離することができる。具体的には、Gpbar1の遺伝子領域を含むDNAを本発明のプライマー等を用いたPCR法等によって増幅し、これを尿素等の変性剤の濃度が移動するに従って徐々に高くなっているポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、対照と比較する。変異が存在するDNA断片の場合、より低い変性剤濃度位置でDNA断片が一本鎖になり、極端に移動速度が遅くなるため、この移動度の差を検出することにより変異の有無を検出することができる。【０１３５】
さらに別の方法においては、まず、被検者から調製したGpbar1の遺伝子領域を含むDNA、及び、該DNAにハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する。【０１３６】
本発明において「基板」とは、ヌクレオチドプローブを固定することが可能な板状の材料を意味する。本発明においてヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドが含まれる。本発明の基板は、ヌクレオチドプローブを固定することができれば特に制限はないが、一般にDNAアレイ技術で使用される基板を好適に用いることができる。一般にDNAアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのDNAは非透過性(non- porous)の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性(porous)の膜、例えばニトロセルロースメンブレムを使用することができる。【０１３７】
本発明において、ヌクレオチドの固定（アレイ）方法として、Affymetrix社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常インサイチュ(in situ)で合成される。例えば、photolithographicの技術（Affymetrix社）、及び化学物質を固定させるためのインクジェット(Rosetta Inpharmatics社)技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。【０１３８】
基板に固定するヌクレオチドプローブは、Gpbar1の遺伝子領域の変異を検出することができるものであれば、特に制限されない。すなわち該プローブは、例えば、Gpbar1の遺伝子領域を含むDNAにハイブリダイズするようなプローブである。特異的なハイブリダイズが可能であれば、ヌクレオチドプローブは、Gpbar1の遺伝子領域を含むDNAに対し、完全に相補的である必要はない。本発明において基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常10〜100ベースであり、好ましくは10〜50ベースであり、さらに好ましくは15〜25ベースである。【０１３９】
本方法においては、次いで、該DNAと該基板を接触させる。この過程により、上記ヌクレオチドプローブに対し、DNAをハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの反応液及び反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さ等の諸要因により変動しうるが、一般的に当業者に周知の方法により行うことができる。【０１４０】
本方法においては、次いで、該DNAと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出する。この検出は、例えば、蛍光シグナルをスキャナー等によって読み取ることによって行うことができる。尚、DNAアレイにおいては、一般的にスライドガラスに固定したDNAをプローブといい、一方溶液中のラベルしたDNAをターゲットという。従って、基板に固定された上記ヌクレオチドを、本明細書においてヌクレオチドプローブと記載する。本方法においては、さらに、検出したハイブリダイズの強度を対照と比較する。【０１４１】
このような方法としては、例えば、DNAアレイ法等が挙げられる。【０１４２】
上記の方法以外にも、特定位置の変異のみを検出する目的にはアレル特異的オリゴヌクレオチド（Allele Specific Oligonucleotide／ASO）ハイブリダイゼーション法が利用できる。変異が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを作製し、これとDNAでハイブリダイゼーションを行わせると、変異が存在する場合、ハイブリッド形成の効率が低下する。それをサザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法等により検出することができる。【０１４３】
また、本発明においては、TaqMan PCR法、Acyclo Prime法、及びMALDI-TOF/MS法等も使用することができる。またPCRに依存しない塩基種の決定法としてInvader法やRCA法も使用することができる。以下にこれらの方法について簡単に述べる。ここに述べた方法は、いずれも本発明における変異部位の塩基種の決定に応用できる。
［TaqMan PCR法］【０１４４】
TaqMan PCR法の原理は次のとおりである。TaqMan PCR法は、アレルを含む領域を増幅することができるプライマーセットと、TaqManプローブを利用した解析方法である。TaqManプローブは、このプライマーセットによって増幅されるアレルを含む領域にハイブリダイズするように設計される。【０１４５】
TaqManプローブのTmに近い条件で標的塩基配列にハイブリダイズさせれば、１塩基の相違によってTaqManプローブのハイブリダイズ効率は著しく低下する。TaqManプローブの存在下でPCR法を行うと、プライマーからの伸長反応は、いずれハイブリダイズしたTaqManプローブに到達する。このときDNAポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性によって、TaqManプローブはその5'末端から分解される。TaqManプローブをレポーター色素とクエンチャーで標識しておけば、TaqManプローブの分解を、蛍光シグナルの変化として追跡することができる。つまり、TaqManプローブの分解が起きれば、レポーター色素が遊離してクエンチャーとの距離が離れることによって蛍光シグナルが生成する。１塩基の相違のためにTaqManプローブのハイブリダイズが低下すればTaqManプローブの分解が進まず蛍光シグナルは生成されない。【０１４６】
変異に対応するTaqManプローブをデザインし、更に各プローブの分解によって異なるシグナルが生成されるようにすれば、同時に塩基種の判定を行うこともできる。例えば、レポーター色素として、あるアレルのアレルＡのTaqManプローブに6-carboxy-fluorescein(FAM)を、アレルＢのプローブにVICを用いる。プローブが分解されない状態では、クエンチャーによってレポーター色素の蛍光シグナル生成は抑制されている。各プローブが対応するアレルにハイブリダイズすれば、ハイブリダイズに応じた蛍光シグナルが観察される。すなわち、FAM又はVICのいずれかのシグナルが他方よりも強い場合には、アレルＡ又はアレルＢのホモであることが判明する。他方、アレルをヘテロで有する場合には、両者のシグナルがほぼ同じレベルで検出されることになる。TaqMan PCR法の利用によって、ゲル上での分離のような時間のかかる工程無しで、ゲノムを解析対象としてPCRと塩基種の決定を同時に行うことができる。そのため、TaqMan PCR法は、多くの被検者についての塩基種を決定できる方法として有用である。【０１４７】
［Acyclo Prime法］
PCR法を利用した塩基種を決定する方法として、Acyclo Prime法も実用化されている。Acyclo Prime法では、ゲノム増幅用のプライマー１組と、SNPs検出用の１つのプライマーを用いる。まず、ゲノムの変異部位を含む領域をPCRで増幅する。この工程は、通常のゲノムPCRと同じである。次に、得られたPCR産物に対して、SNPs検出用のプライマーをアニールさせ、伸長反応を行う。SNPs検出用のプライマーは、検出対象となっている変異部位に隣接する領域にアニールするようにデザインされている。【０１４８】
このとき、伸長反応のためのヌクレオチド基質として、蛍光偏光色素でラベルし、かつ3'-OHをブロックしたヌクレオチド誘導体（ターミネーター）を用いる。その結果、変異部位に相当する位置の塩基に相補的な塩基が１塩基だけ取りこまれて伸長反応が停止する。ヌクレオチド誘導体のプライマーへの取りこみは、分子量の増大による蛍光偏光(Fluorescence polarization;FP)の増加によって検出することができる。蛍光偏光色素に波長の異なる２種類のラベルを用いれば、特定のSNPsが２種類の塩基のうちのいずれであるのかを特定することができる。蛍光偏光のレベルは定量することができるので、１度の解析でアレルがホモかヘテロかを判定することもできる。【０１４９】
［MALDI-TOF/MS法］
PCR産物をMALDI-TOF/MSで解析することによって塩基種の決定を行うこともできる。MALDI-TOF/MSは、分子量をきわめて正確に知ることができるため、タンパク質のアミノ酸配列や、DNAの塩基配列のわずかな相違を明瞭に識別することができる解析手法として様々な分野で利用されている。MALDI-TOF/MSによる塩基種の決定のためには、まず解析対象であるアレルを含む領域をPCRで増幅する。次いで増幅産物を単離してMALDI-TOF/MSによってその分子量を測定する。アレルの塩基配列は予めわかっているので、分子量に基づいて増幅産物の塩基配列は一義的に決定される。【０１５０】
MALDI-TOF/MSを利用した塩基種の決定には、PCR産物の分離工程等が必要となる。しかし標識プライマーや標識プローブを使わないで、正確な塩基種の決定が期待できる。また複数の場所の変異の同時検出にも応用することができる。【０１５１】
［IIs型制限酵素を利用したSNPs特異的な標識方法］
PCR法を利用した更に高速な塩基種の決定が可能な方法も報告されている。例えば、IIs型制限酵素を利用して変異部位の塩基種の決定が行われている。この方法においては、PCRにあたり、IIs型制限酵素の認識配列を有するプライマーが用いられる。遺伝子組み換えに利用される一般的な制限酵素（II型）は、特定の塩基配列を認識して、その塩基配列中の特定部位を切断する。これに対してIIs型の制限酵素は、特定の塩基配列を認識して、認識塩基配列から離れた部位を切断する。酵素によって、認識配列と切断個所の間の塩基数は決まっている。従って、この塩基数の分だけ離れた位置にIIs型制限酵素の認識配列を含むプライマーがアニールするようにすれば、IIs型制限酵素によってちょうど変異部位で増幅産物を切断することができる。【０１５２】
IIs型制限酵素で切断された増幅産物の末端には、SNPsの塩基を含む付着末端(conhesive end)が形成される。ここで、増幅産物の付着末端に対応する塩基配列からなるアダプターをライゲーションする。アダプターは、変異に対応する塩基を含む異なる塩基配列からなり、それぞれ異なる蛍光色素で標識しておくことができる。最終的に、増幅産物は変異部位の塩基に対応する蛍光色素で標識される。【０１５３】
前記IIs型制限酵素認識配列を含むプライマーに、捕捉プライマー(capture primer)を組み合せてPCR法を行えば、増幅産物は蛍光標識されるとともに、捕捉プライマーを利用して固相化することができる。例えばビオチン標識プライマーを捕捉プライマーとして用いれば、増幅産物はアビジン結合ビーズに捕捉することができる。こうして捕捉された増幅産物の蛍光色素を追跡することにより、塩基種を決定することができる。【０１５４】
［磁気蛍光ビーズを使った変異部位における塩基種の決定］
複数のアレルを単一の反応系で並行して解析することができる技術も公知である。複数のアレルを並行して解析することは、多重化と呼ばれている。一般に蛍光シグナルを利用したタイピング方法では、多重化のために異なる蛍光波長を有する蛍光成分が必要である。しかし実際の解析に利用することができる蛍光成分は、それほど多くない。これに対して、樹脂等に複数種の蛍光成分を混合した場合には、限られた種類の蛍光成分であっても、相互に識別可能な多様な蛍光シグナルを得ることができる。更に、樹脂中に磁気で吸着される成分を加えれば蛍光を発するとともに、磁気によって分離可能なビーズとすることができる。このような磁気蛍光ビーズを利用した、多重化変異タイピングが考え出された(バイオサイエンスとバイオインダストリー, Vol.60 No.12, 821-824)。【０１５５】
磁気蛍光ビーズを利用した多重化変異タイピングにおいては、各アレルの変異部位に相補的な塩基を末端に有するプローブが磁気蛍光ビーズに固定化される。各アレルにそれぞれ固有の蛍光シグナルを有する磁気蛍光ビーズが対応するように、両者は組み合せられる。一方、磁気蛍光ビーズに固定されたプローブが相補配列にハイブリダイズしたときに、当該アレル上で隣接する領域に相補的な塩基配列を有する蛍光標識オリゴDNAを調製する。【０１５６】
アレルを含む領域を非対称PCRによって増幅し、上記の磁気蛍光ビーズ固定化プローブと蛍光標識オリゴDNAをハイブリダイズさせ、更に両者をライゲーションする。磁気蛍光ビーズ固定化プローブの末端が、変異部位の塩基に相補的な塩基配列であった場合には効率的にライゲーションされる。逆にもしも変異のために末端の塩基が異なれば、両者のライゲーション効率は低下する。その結果、各磁気蛍光ビーズには、試料が当該磁気蛍光ビーズに相補的な塩基種であった場合に限り、蛍光標識オリゴDNAが結合する。【０１５７】
磁気によって磁気蛍光ビーズを回収し、更に各磁気蛍光ビーズ上の蛍光標識オリゴDNAの存在を検出することにより、塩基種が決定される。磁気蛍光ビーズは、フローサイトメーターでビーズ毎に蛍光シグナルを解析できるので、多種類の磁気蛍光ビーズが混合されていてもシグナルの分離は容易である。つまり、多種類の変異部位について、単一の反応容器で並行して解析する「多重化」が達成される。【０１５８】
［Invader法］
PCR法に依存しないジェノタイピングのための方法も実用化されている。例えば、Invader法では、アレルプローブ、インベーダープローブ、及びFRETプローブの３種類のオリゴヌクレオチドと、cleavaseと呼ばれる特殊なヌクレアーゼのみで、塩基種の決定を実現している。これらのプローブのうち標識が必要なのはFRETプローブのみである。【０１５９】
アレルプローブは、検出すべきアレルに隣接する領域にハイブリダイズするようにデザインされる。アレルプローブの5'側には、ハイブリダイズに無関係な塩基配列からなるフラップが連結されている。アレルプローブは変異部位の3'側にハイブリダイズし、変異部位の上でフラップに連結する構造を有する。【０１６０】
一方インベーダープローブは、変異部位の5'側にハイブリダイズする塩基配列からなっている。インベーダープローブの塩基配列は、ハイブリダイズによって3'末端が変異部位に相当するようにデザインされている。インベーダープローブにおける変異部位に相当する位置の塩基は任意で良い。つまり、変異部位を挟んでインベーダープローブとアレルプローブとが隣接してハイブリダイズするように両者の塩基配列はデザインされている。【０１６１】
変異部位がアレルプローブの塩基配列に相補的な塩基であった場合には、インベーダープローブとアレルプローブの両者がアレルにハイブリダイズすると、アレルプローブの変異部位に相当する塩基にインベーダープローブが侵入(invasion)した構造が形成される。cleavaseは、このようにして形成された侵入構造を形成したオリゴヌクレオチドのうち、侵入された側の鎖を切断する。切断は侵入構造の上で起きるので、結果としてアレルプローブのフラップが切り離されることになる。一方、もしも変異部位の塩基がアレルプローブの塩基に相補的でなかった場合には、変異部位におけるインベーダープローブとアレルプローブの競合は無く、侵入構造は形成されない。したがってcleavaseによるフラップの切断が起こらない。【０１６２】
FRETプローブは、こうして切り離されたフラップを検出するためのプローブである。FRETプローブは5'末端側に自己相補配列を有し、3'末端側に１本鎖部分が配置されたヘアピンループを構成している。FRETプローブの3'末端側に配置された１本鎖部分は、フラップに相補的な塩基配列からなっていて、ここにフラップがハイブリダイズすることができる。フラップがFRETプローブにハイブリダイズすると、FRETプローブの自己相補配列の5'末端部分にフラップの3'末端が侵入した構造が形成されるように両者の塩基配列がデザインされている。cleavaseは侵入構造を認識して切断する。FRETプローブのcleavaseによって切断される部分を挟んで、TaqMan PCRと同様のレポーター色素とクエンチャーで標識しておけば、FRETプローブの切断を蛍光シグナルの変化として検知することができる。【０１６３】
尚、理論的には、フラップは切断されない状態でもFRETプローブにハイブリダイズするはずである。しかし実際には、切断されたフラップとアレルプローブの状態で存在しているフラップとでは、FRETに対する結合効率に大きな差が有る。そのため、FRETプローブを利用して、切断されたフラップを特異的に検出することは可能である。【０１６４】
Invader法に基づいて塩基種を決定するためには、アレルＡとアレルＢのそれぞれに相補的な塩基配列を含む、２種類のアレルプローブを用意すれば良い。このとき両者のフラップの塩基配列は異なる塩基配列とする。フラップを検出するためのFRETプローブも２種類を用意し、それぞれのレポーター色素を識別可能なものとしておけば、TacMan PCR法と同様の考え方によって、塩基種を決定することができる。【０１６５】
Invader法の利点は、標識の必要尚リゴヌクレオチドがFRETプローブのみであることである。FRETプローブは検出対象の塩基配列とは無関係に、同一のオリゴヌクレオチドを利用することができる。従って、大量生産が可能である。一方アレルプローブとインベーダープローブは標識する必要が無いので、結局、ジェノタイピングのための試薬を安価に製造することができる。【０１６６】
［RCA法］
PCR法に依存しない塩基種の決定方法として、RCA法を挙げることができる。鎖置換作用を有するDNAポリメラーゼが、環状の１本鎖DNAを鋳型として、長い相補鎖を合成する反応に基づくDNAの増幅方法が、Rolling Circle Amplification(RCA)法である(Lizardri PM et al.,Nature Genetics 19, 225, 1998)。RCA法においては、環状DNAにアニールして相補鎖合成を開始するプライマーと、このプライマーによって生成する長い相補鎖にアニールする第２のプライマーを利用して、増幅反応を構成している。【０１６７】
RCA法には、鎖置換作用を有するDNAポリメラーゼが利用されている。そのため、相補鎖合成によって２本鎖となった部分は、より5'側にアニールした別のプライマーから開始した相補鎖合成反応によって置換される。例えば、環状DNAを鋳型とする相補鎖合成反応は、１周分では終了しない。先に合成した相補鎖を置換しながら相補鎖合成は継続し、長い１本鎖DNAが生成される。一方、環状DNAを鋳型として生成した長い１本鎖DNAには、第２のプライマーがアニールして相補鎖合成が開始する。RCA法において生成される１本鎖DNAは、環状のDNAを鋳型としていることから、その塩基配列は同じ塩基配列の繰り返しである。従って、長い１本鎖の連続的な生成は、第２のプライマーの連続的なアニールをもたらす。その結果、変性工程を経ることなく、プライマーがアニールすることができる１本鎖部分が連続的に生成される。こうして、DNAの増幅が達成される。【０１６８】
RCA法に必要な環状１本鎖DNAが変異部位の塩基種に応じて生成されれば、RCA法を利用して塩基種の決定をすることができる。そのために、直鎖状で１本鎖のパドロックプローブが利用される。パドロックプローブは、5'末端と3'末端に検出すべき変異部位の両側に相補的な塩基配列を有している。これらの塩基配列は、バックボーンと呼ばれる特殊な塩基配列からなる部分で連結されている。変異部位がパドロックプローブの末端に相補的な塩基配列であれば、アレルにハイブリダイズしたパドロックプローブの末端をDNAリガーゼによってライゲーションすることができる。その結果、直鎖状のパドロックプローブが環状化され、RCA法の反応がトリガーされる。DNAリガーゼの反応は、ライゲーションすべき末端部分が完全に相補的でない場合には反応効率が著しく低下する。従って、ライゲーションの有無をRCA法で確認することによって、変異部位の塩基種の決定が可能である。【０１６９】
RCA法は、DNAを増幅することはできるが、そのままではシグナルを生成しない。また増幅の有無のみを指標とするのでは、アレル毎に反応を行わなければ、通常、塩基種を決定することができない。これらの点を塩基種の決定のために改良した方法が公知である。例えば、モレキュラービーコンを利用して、RCA法に基づいて１チューブで延期種の決定を行うことができる。モレキュラービーコンは、TaqMan法と同様に、蛍光色素とクエンチャーを利用したシグナル生成用プローブである。モレキュラービーコンの5'末端と3'末端は相補的な塩基配列で構成されており、単独ではヘアピン構造を形成する。両端付近を蛍光色素とクエンチャーで標識しておけば、ヘアピン構造を形成している状態では蛍光シグナルが検出できない。モレキュラービーコンの一部を、RCA法の増幅産物に相補的な塩基配列としておけば、モレキュラービーコンはRCA法の増幅産物にハイブリダイズする。ハイブリダイズによってヘアピン構造が解消されるため、蛍光シグナルが生成される。【０１７０】
モレキュラービーコンの利点は、パドロックプローブのバックボーン部分の塩基配列を利用することによって、検出対象とは無関係にモレキュラービーコンの塩基配列を共通にできる点である。アレル毎にバックボーンの塩基配列を変え、蛍光波長が異なる２種類のモレキュラービーコンを組み合せれば、１チューブで塩基種の決定が可能である。蛍光標識プローブの合成コストは高いので、測定対象に関わらず共通のプローブを利用できることは、経済的なメリットである。【０１７１】
これらの方法はいずれも多量のサンプルを高速にジェノタイピングするために開発された方法である。MALDI-TOF/MSを除けば、通常、いずれの方法にも何らかの形で標識プローブ等を用意する必要がある。これに対して、標識プローブ等に頼らない塩基種決定法も古くから行われている。このような方法の一つとして、例えば、制限酵素断片長変異（Restriction Fragment Length Polymorphism／RFLP）を利用した方法やPCR-RFLP法等が挙げられる。【０１７２】
本方法によってGpbar1遺伝子の変異が確認された場合には、併せて全胆汁酸プール量も減少するものと考えられ、全胆汁酸プール量の減少に基づく疾患であると判定することが可能である。また、変異の位置によっては、全胆汁酸プール量が増加する場合があるものと考えられ、その場合には全胆汁酸プール量の増加に基づく疾患であると判定することが可能である。【０１７３】
本発明は、全胆汁酸プール量の減少又は増加に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の検査薬に関する。【０１７４】
該検査薬としては、Gpbar1遺伝子領域にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、全胆汁酸プール量の減少又は増加に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の検査薬を挙げることが出来る。【０１７５】
本発明のオリゴヌクレオチドには、ポリヌクレオチドが含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明のタンパク質をコードするDNAの検出や増幅に用いるプローブやプライマー、該DNAの発現を検出するためのプローブやプライマー、本発明のタンパク質の発現を制御するためのヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザイム又はこれらをコードするDNA等）として使用することができる。また、本発明のオリゴヌクレオチドは、DNAアレイの基板の形態で使用することができる。【０１７６】
該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常15bp〜100bp であり、好ましくは15bp〜30bpである。プライマーは、本発明のDNA又はその相補鎖の少なくとも一部を増幅し得るものであれば、特に制限されない。また、プライマーとして用いる場合、3'側の領域は相補的とし、5'側には制限酵素認識配列やタグ等を付加することができる。【０１７７】
また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、本発明のDNA又はその相補鎖の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも15bp以上の鎖長を有する。【０１７８】
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの5'端を32P等でリン酸化することにより標識する方法及びクレノウ酵素等のDNAポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして32P等のアイソトープ、蛍光色素又はビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。【０１７９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖DNA断片として作製することもできる。【０１８０】
また、該検査薬としては、Gpbar1に結合する抗体を含む、全胆汁酸プール量の減少又は増加に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の検査薬を挙げることが出来る。【０１８１】
本発明の抗体は上記のGpbar1を認識する限り特に限定されないが、特異的にGpbar1を認識する抗体であることが好ましい。【０１８２】
該タンパク質の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の両方を利用することができる。本発明の該タンパク質を認識する抗体は、既に公知の抗体を用いることが可能であり、また、該タンパク質を抗原とし、当業者に公知の方法により抗体を作製して用いることも可能である。【０１８３】
具体的には、例えば、以下のようにして作製することができる。【０１８４】
該タンパク質あるいはGSTとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させたリコンビナントタンパク質又はその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、該該タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、該該タンパク質又はその部分ペプチドをマウス等の小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、該タンパク質に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、該該タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。【０１８５】
また、ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして取得することができる。該タンパク質若しくはその断片を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングする。抗原の調製は公知の方法、例えばバキュロウイルスを用いた方法（WO98/46777等）等に準じて行うことができる。ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46）等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。その後、ハイブリドーマのmRNAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（V領域）のcDNAを合成し、得られたcDNAの配列を公知の方法により解読すればよい。【０１８６】
該タンパク質を認識する抗体は、該タンパク質と結合する限り特に制限はなく、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ヒト抗体等を適宜用いることができる。又、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト化（Humanized）抗体等も使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体等であり、マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。【０１８７】
ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region；FR）を連結するように設計したDNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR法により合成する。得られたDNAをヒト抗体定常領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 239400、国際特許出願公開番号WO 96/02576参照）。CDRを介して連結されるヒト抗体のFRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856）。【０１８８】
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原又は所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号WO 93/12227, WO 92/03918，WO 94/02602, WO 94/25585，WO 96/34096, WO 96/33735参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列を有する適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる【０１８９】
本発明に使用する抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）、放射性物質、トキシン等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。このようなコンジュゲート抗体は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。尚、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明における「抗体」にはこれらのコンジュゲート抗体も包含される。【０１９０】
上記の検査薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチド又は抗体以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定剤（BSAやゼラチン等）、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
【実施例】
【０１９１】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。【０１９２】
以下の実施例における全ての値は、平均値±標準誤差（SE）として表す。これらの値は、ポストホックBonferroniテストと連関したANOVA（StatView Windows(登録商標)版、ver5.0）により解析されたものである。【０１９３】
〔実施例１〕マウスGpbar1 mRNAの組織分布の解明
マウスGpbar1 mRNAの組織分布を明らかにするため、様々なマウス組織について、定量的RT-PCR解析を行った。【０１９４】
6〜10週齢のC57BL/6Nマウスから各組織（脳、肺、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、胃、空腸、回腸、結腸、骨格筋、褐色脂肪組織及び白色脂肪組織）を摘出し、そこから全RNAをISOGEN（ニッポンジーン社、東京）で抽出した。各組織由来の全RNAは、分光光度計で定量後、その一定量を逆転写酵素と反応させ、得られたcDNAを定量的RT-PCRによる解析に供した。定量的RT-PCRによる解析は、PRISM 7900HT配列検出装置（Applied Biosystems社、米国）を用い、TaqMan PCR法により行った。マウスGpbar1発現の検出のためのプライマー及びプローブは、Assay on demandセット（アッセイID：Mm00558112_s1）をApplied Biosystems社から購入して用いた。【０１９５】
定量的RT-PCRの結果、マウスGpbar1 mRNAは、雄マウスの回腸及び結腸、並びに雌マウスの結腸で強く検出され、肺、脾臓、腎、胃、空腸及び白色脂肪組織においても、性別を問わず中程度に検出された（図1A、1B）。尚、雌性マウスの回腸でも、中程度に検出された。このことより、Gpbar1 mRNAは、小腸及び大腸で強く発現することが判明し、Gpbar1が胆汁酸と共に腸で主要な役割を担っていることが示唆された。尚、ヒトGPBAR1 mRNAについても小腸及び大腸で発現していることがわかっているため、ヒトとマウスの両者において共通の役割を担っているものと思われる（Maruyama, T., Miyamoto, Y., Nakamura, T., Tamai, Y., Okada, H., Sugiyama, E., Nakamura, T., Itadani, H., and Tanaka, K. 2002. Identification of membrane-type receptor for bile acids (M-BAR). Biochem. Biophys. Res. Commun. 298: 714-719）。但し、ヒトGPBAR1 mRNAは肝臓で検出されるのに対し、マウスGpbar1 mRNAの発現量は他の組織と比べて肝臓で少量であった。【０１９６】
〔実施例２〕Gpbar1欠損マウスの作製
インビボでのGpbar1の生理的役割を調べるため、Gpbar1欠損マウスを作製した。【０１９７】
Gpbar1遺伝子を標的破壊したマウスは、以下に記載の方法ならびに図2Aに記載したターゲティング戦略により作製した。図2A中の黒四角部分はエキソンを表し（E1及びE2）、英記号はそれぞれ制限酵素部位を示した（HがHindIII、SがSph I、AがApa I、NがNsi I、EがEcoRIを表す。）。【０１９８】
まず、マウスGpbar1/M-Barの1.2 kb全長cDNA（GenBankアクセッション番号AB086170）を用いて129/Svマウスゲノムλファージライブラリー（Stratagene）をスクリーニングすることにより、エキソン1及び2を含むマウスゲノムGpbar1クローンを取得した。Gpbar1遺伝子のATGコドンを含むエキソン2領域のほとんどを、PGK-neoカセットで置換した（図2A）。ターゲティングベクターを唯一のSalI部位で線状化し、エレクトロポレーション法によりマウス胚幹（ES）細胞、RW4に導入した。【０１９９】
次に、相同的組換え体（HR）を同定するため、PCR法によりネオマイシン耐性によりトランスフェクションされたES細胞をスクリーニングし、672個のコロニーを拾った。プライマーBGEX2（5'-CAGAGGAGCAGAGGGCAGAATC-3'  配列番号：７）及びPGKR（5'-CTAAAGCGCATGCTCCAGACT-3'  配列番号：８）を用いて94℃で30秒間、68℃で1.5分間、及び72℃で2分間の40サイクルのPCRを行うことによりこれらのクローンをスクリーニングし、7個の陽性クローンを取得した。さらに、HindIII消化後にプローブA及びBそれぞれを用いてゲノムサザンブロット解析することにより、これらの陽性クローンを解析した。【０２００】
相同的組換え体クローンをC57BL/6胚盤胞に注入し、偽妊娠マウスに移植した。キメラの雄マウスをC57BL/6N雌マウスと交配させた所、生殖系列への伝達を示した2匹の雄マウスが作製された。Gpbar座の遺伝子型は、HindIII消化したゲノムDNAを用いてサザンブロット解析により決定した（図2B）。野生型のバンドは11.7 kb長であり、組換え体のバンドは3.5 kb長であった。【０２０１】
Gpbar1 mRNA発現の破壊は、ホモ接合性マウスの小腸から調製したポリ(A)RNAを用いてノーザンブロット解析により解析した（図2C）。解析前に、4世代間、これらのマウスをC57BL/6Nマウスと戻し交配した。マウスは12時間明/12時間暗のサイクルで維持し、標準的なげっ歯類固形飼料、CA-1（Clea）を適宜与えた。3匹の野生型マウス（+/+）及び3匹のホモ接合性マウス（-/-）の小腸から調製した一定分量（10μg）のポリ(A)RNAをブロットし、マウスGpbar1 cDNAの[32P]標識プローブでハイブリダイズした（図2C）。Gpbar1は1.5 kb長であり、β-アクチンを泳動コントロールとして用いた。【０２０２】
その結果、ホモ接合性マウスでは、Gpbar1のバンドが観察されず、Gpbar1 mRNA発現が破壊されていることが確認された。【０２０３】
ヘテロ接合性及びホモ接合性マウスは生存可能でありかつ生殖可能であり、標準的なげっ歯類固形飼料での標準的な実験室条件下で正常と思われた。ヘテロ接合性マウスの交雑により、野生型、ヘテロ接合性、及びホモ接合性マウスが期待されるメンデル比で誕生した。【０２０４】
〔実施例３〕Gpbar1欠損マウスの全胆汁酸プール量及び糞便中胆汁酸排泄レベルの解析
Gpbar1が胆汁酸恒常性の維持において役割を果たしているか否かを調べるため、酵素的方法により、Gpbar1欠損マウスの全胆汁酸プール量及び糞便中胆汁酸排泄レベルを測定した。いずれの値も、それぞれ野生型（+/+）、ヘテロ接合性（+/-）及びホモ接合性（-/-）マウスのデータの平均値± 標準誤差（SE）として表した（n=7〜16）。【０２０５】
全胆汁酸プール量及び糞便中胆汁酸排泄レベルの測定では、マウスをケージ内で個々に飼育し、適宜個々に食餌を与えた。全胆汁酸は、Sinalらによる記載通りに抽出した（Sinal, C. J., Tohkin, M., Miyata, M., Ward, J. M., Lambert, G., and Gonzalez, F. J. 2000. Targeted disruptinon of the nuclear receptor FXR/BAR impairs bile acid and lipid homeostasis. Cell 102: 731-744）。【０２０６】
全胆汁酸プール量の測定においては、まず、肝臓、胆嚢、及び全小腸をホモジナイズした。そして、これらの組織を灌流しながら、一定分量をエタノールで2回抽出した。続いて窒素流下で抽出物を完全に乾燥させ、50%エタノールに懸濁した。【０２０７】
糞便中胆汁酸排泄レベルの測定においては、屠殺直前の72時間にわたって各マウスから糞便を回収して乾燥させ、重さを量りホモジナイズした。全胆汁酸プール量測定と同様に、一定分量を抽出した。【０２０８】
これらの抽出物における全胆汁酸含有量は、Kitadaらの記載通り酵素的方法により測定した（Kitada, H., Miyata, M., Nakamura, T., Tozawa, A., Honma, W., Shimada, M., Nagata, K., Sinal, C. J., Guo, G. L., Gonzalez, F. J., and Yamazoe, Y. 2003. Protective role of hydroxysteroid sulfotransferase in lithocholic acid-induced liver toxicity. J Biol Chem. 278: 17838-17844）。【０２０９】
上記の測定の結果、図3A及び図3Bに示すように、全胆汁酸プール量は野生型マウスと比較して、雄及び雌のホモ接合性マウスにおいてそれぞれ有意に25%及び21%減少していることがわかった。核内胆汁酸受容体FXRがこの表現型に影響を及ぼしているか否かを評価するため、Gpbar1欠損マウスの肝臓及び小腸から調製した全RNAを用いてノーザンブロット解析を行った。FXR mRNAの発現レベルは、3つの遺伝子型間で同程度であった（データは示さず）。これらのデータから、Gpbar1はFXR遺伝子発現に影響を及ぼさずに胆汁酸恒常性の制御に寄与することが示唆される。全胆汁酸プール量が減少するにもかかわらず、糞便中胆汁酸排泄レベルは3つの遺伝子型間で同程度であった（図3C、3D）。胆汁酸合成は、ホモ接合性マウスにおいて胆汁酸プールの減少（21〜25%）を補償するために誘導されるものではないことが示唆された。【０２１０】
〔実施例４〕血漿トリグリセリド（TG）及び全コレステロールの測定
ホモ接合性マウス及び野生型マウスの、血漿トリグリセリド（TG）及び全コレステロールを測定した。血漿トリグリセリド（TG）及び全コレステロールは、市販のキット［Determiner L-TG II及びL TC II（Kyowa medex）］を用いて測定した。【０２１１】
ホモ接合性マウスの血漿トリグリセリドレベルは野生型マウスと同程度であったが、血漿全コレステロールレベルは雄のホモ接合性マウスでは有意に16%増加し（p＜0.05）、雌では増加は見られなかった（データは示さず）。この結果より、Gpbar1は性的二型性様式で血漿コレステロール濃度の制御に寄与する可能性があることが示唆された。【０２１２】
〔実施例５〕通常餌を与えたGpbar1欠損マウスの体重変動
Gpbar1遺伝子欠損の影響を検討するため、通常餌を与えたGpbar1ホモ接合性マウス及びヘテロ接合性マウスの体重変動を経時的に調べた（n=10）。その結果、雄性及び雌性のホモ接合性マウスの体重は野性型マウスと異ならなかった（図4）。【０２１３】
そこで、これらのマウスの血漿中の総胆汁酸及び脂質の濃度についても測定した。その結果、総胆汁酸及びトリグリセリドの血漿濃度は野性型マウスとホモ接合性マウスで異ならなかったが、血漿総コレステロール濃度については雄性マウスで有意に増加した（16%、p < 0.05）（データは示されず）。【０２１４】
〔実施例６〕高脂肪餌を与えたGpbar1欠損マウスの体重変動及び体組成分析
Gpbar1の脂肪蓄積に及ぼす影響を検討するため、雄性又は雌性のホモ接合性マウス群、ヘテロ接合性マウス群及び野生型マウス群に高脂肪餌を与えて飼育し、各群（n=10）の体重変動を経時的に調べた。実験を通じ、各群のマウスは12時間明/12時間暗の明暗周期下で管理し、9週齢から18週齢まで高脂肪餌（カロリーの60％がラード；RESEARCH DIETS社、ニュージャージー、米国）を自由に摂取させた。体重は、週に1回、13時に測定した。【０２１５】
その結果を図5に示した。図5A及び5Cは雄性又は雌性の各群のマウスの体重を、図5B及び5Dはその体重変化量を示し、ホモ接合性マウス群、ヘテロ接合性マウス群及び野性型マウス群についてはそれぞれ白四角、黒三角、黒丸で表した。【０２１６】
その結果、12週齢からの雌性ホモ接合性マウス群の体重は野性型マウス群の変化と比較して増加し、体重変化量については有意差が認められた（図5C、5D）。雌性ヘテロ接合性マウス群については、体重及び体重増加量のいずれにおいても野性型マウス群に対して有意差は認められないものの、顕著な増加が認められた（図5C、5D）。一方、雄性ホモ接合性マウス群及び雄性ヘテロ接合性マウス群の体重及び体重増加量は、野性型マウス群と比較して増加する傾向が認められるものの、顕著なものではなかった（図5A、5B）。【０２１７】
次に、高脂肪餌を与えたGpbar1欠損マウスの体重増加に脂肪の蓄積が寄与するか否かを検討するために、各群のマウスの体組成を核磁気共鳴により測定した。その結果を図6に示した。図6A及び6Cは雄性又は雌性の各群の18週齢マウスの脂肪量を、図6B及び6Dはその脂肪量を除いた除脂肪体重を示した。ホモ接合性マウス群、ヘテロ接合性マウス群及び野性型マウス群については、それぞれ-/-、+/-、+/+で表した。【０２１８】
その結果、雌性ホモ接合性マウス群及び雌性ヘテロ接合性マウス群の除脂肪体重は雌性野性型マウス群とほぼ同じであるものの（図6D）、脂肪量は雌性野性型マウス群と比較して顕著に多いものであった（図6C）。雌雌性ホモ接合性マウス群の脂肪量については、雌性野性型マウス群に対して、統計的有意差が認められた（図6C）。一方、雄性ホモ接合性マウス群及び雄性ヘテロ接合性マウス群の脂肪量は、野性型マウス群と比較して増加する傾向が認められるものの、顕著なものではなかった（図6A）。尚、雄性マウスの各群の除脂肪体重はほぼ同じであった（図6B）。
【産業上の利用可能性】
【０２１９】
Gpbar1の発現量若しくは活性又はGpbar1に対する結合性は、全胆汁酸プール量の増減に伴う疾患又は脂質代謝性疾患の治療又は予防のための薬剤のスクリーニング又は当該疾患の検査の指標として利用できる。
本発明のGpbar1欠損マウスは、Gpbar1の生理的役割を解明する研究の病態モデルマウスとして使用でき、本発明のスクリーニング方法により特定された薬剤、抗Gpbar1抗体又はGpbar1アンタゴニスト低分子等のGpbar1阻害剤の副作用を推測するために利用できる。
さらに、遺伝子改変動物の組織から樹立した細胞株は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの系で上記薬剤等の副作用を検討するために利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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