(57)【要約】  本発明は、所望の染色体が欠失している再生可能な細胞、その生産方法、それに使用するための遺伝子カセットおよびキットを提供することを課題とする。より詳細には、本発明は、個人対応型の多能性幹細胞を簡便に入手することを課題とする。より特定すると、本発明は免疫的拒絶反応を惹起せず、ＥＳ細胞などの幹細胞を新たにその個人から取り出し樹立することをせずに、しかも卵細胞を材料とせずに、疾病を処置するためのドナーとなり得る細胞、組織および臓器を効率的に確立することを課題とする。本発明は、レコンビナーゼ認識部位をシス方向に２つ挿入するのではなく、１つまたは逆方向に挿入し、マーカー遺伝子を連結した遺伝子カセット、およびこのカセットを細胞融合技術に応用することによって解決した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
レコンビナーゼ認識配列を１つまたは逆方向に２つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセット。
【請求項２】
前記レコンビナーゼ認識配列は、ｌｏｘＰ配列、ＦＲＴ部位、ａｔｔＢ配列，ａｔｔＰ配列およびｒｅｓ部位配列からなる群より選択される配列を含む相同組み換え配列である、請求項１に記載の遺伝子カセット。
【請求項３】
前記マーカー遺伝子は、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、イエロー蛍光タンパク質（ＹＦＰ）遺伝子、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）遺伝子およびレッド蛍光タンパク質（ｄｓＲＥＤ）遺伝子からなる群より選択される遺伝子を含む、請求項１に記載の遺伝子カセット。
【請求項４】
さらに、選択配列を含む、請求項１に記載の遺伝子カセット。
【請求項５】
前記選択配列は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、ピューロマイシン抵抗性付与遺伝子、ネオマイシン抵抗性付与遺伝子、ハイグロマイシン抵抗性付与遺伝子、ブラストサイジン抵抗性付与遺伝子、ゼオシン抵抗性付与遺伝子、ＨＡＴ抵抗性付与遺伝子、ジフテリアトキシン抵抗性付与遺伝子およびフルオロウラシル抵抗性付与遺伝子からなる群より選択される遺伝子をコードする配列を含む、請求項４に記載の遺伝子カセット。
【請求項６】
前記レコンビナーゼ認識配列は、配列番号１に記載される配列ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴを含む、請求項１に記載の遺伝子カセット。
【請求項７】
さらに、配列番号２に記載されるＩＲＥＳ配列を含む、請求項１に記載の遺伝子カセット。
【請求項８】
さらに、配列番号３に記載されるＣＡＧ配列を含む、請求項１に記載の遺伝子カセット。
【請求項９】
前記レコンビナーゼ認識配列は、逆方向に２つ含まれる、請求項１に記載の遺伝子カセット。
【請求項１０】
前記レコンビナーゼ認識配列は、逆方向に２つ含まれ、該レコンビナーゼ認識配列の間に、ＣＡＧ、マーカー配列、ＩＲＥＳ配列、および選択配列を含む、請求項１に記載の遺伝子カセット。
【請求項１１】
レコンビナーゼ認識配列を１つまたは逆方向に２つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットを含む、所望の染色体を除去するための組成物。
【請求項１２】
前記染色体が、多能性関連遺伝子を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記除去は、前記染色体の両コピーの除去を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
Ａ）レコンビナーゼ認識配列を１つまたは逆方向に２つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットと、
Ｂ）該レコンビナーゼ認識配列に対応するレコンビナーゼまたはそれをコードする核酸配列を含む核酸分子と、
を備える、所望の染色体を除去するためのキット。
【請求項１５】
Ａ）レコンビナーゼ認識配列を１つまたは逆方向に２つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットと、
Ｂ）該レコンビナーゼ認識配列に対応するレコンビナーゼまたはそれをコードする核酸配列を含む核酸分子と、
Ｃ）幹細胞と、
を備える、幹細胞から所望の染色体を除去するためのキット。
【請求項１６】
Ａ）レコンビナーゼ認識配列を１つまたは逆方向に２つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットと、
Ｂ）該レコンビナーゼ認識配列に対応するレコンビナーゼまたはそれをコードする核酸配列を含む核酸分子と、
Ｃ）幹細胞と、
Ｄ）所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞と、
を備える、所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞から所望の染色体を除去し、該細胞に多分化能を付与するためのキット。
【請求項１７】
所望のゲノムを有する細胞から所望の染色体または染色体群を除去し、該細胞に多分化能を付与するための方法であって、
Ａ）レコンビナーゼ認識配列を１つまたは逆方向に２つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットを提供する工程と、
Ｂ）該遺伝子カセットを幹細胞に導入する工程と、
Ｃ）該幹細胞と所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞とを融合する工程と、
Ｄ）該融合された細胞に、該レコンビナーゼ認識配列を認識するレコンビナーゼまたはそれをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する工程と、
Ｅ）再構成が生じる条件に該融合された細胞を曝す工程と、
Ｆ）融合された細胞のマーカー遺伝子に由来するシグナルを観察して所望の染色体が除去された細胞を選択する工程と、
を包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法によって得られた細胞。
【請求項１９】
所望の染色体が除去された、細胞。
【請求項２０】
所望の染色体が除去された、幹細胞。
【請求項２１】
前記幹細胞は、ＥＳ細胞である、請求項２０に記載の幹細胞。
【請求項２２】
前記染色体がＭＨＣまたは対応する遺伝子をコードする配列を含む、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２３】
所望の染色体または染色体群が交換された、染色体交換細胞。
【請求項２４】
所望の染色体または染色体群が交換された、染色体交換された幹細胞。
【請求項２５】
前記幹細胞は、ＥＳ細胞である、請求項２４に記載の幹細胞。
【請求項２６】
ＥＳ細胞と、所望のゲノム、染色体または染色体群を有する微小核との融合細胞であって、該融合細胞からＥＳ細胞由来の所望の染色体が除去され、多分化能を有する、染色体交換細胞。
【請求項２７】
ＥＳ細胞と、所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞との融合細胞であって、該融合細胞から、所望の染色体が除去され、多分化能を有する、融合細胞。
【請求項２８】
ＥＳ細胞と、所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞との融合細胞であって、該融合細胞から、該ＥＳ細胞の染色体が除去され、多分化能を有する、融合細胞。
【請求項２９】
前記所望の染色体は、該ＥＳ細胞のＭＨＣ、拒絶反応関連遺伝子またはそれに対応する遺伝子をコードする配列を含む染色体である、融合細胞。
【請求項３０】
前記所望の染色体は、該ＥＳ細胞のマウスの第６染色体、第１１染色体、第１２染色体および第１７染色体、ヒトの第６染色体からなる群より選択される染色体または該染色体に対応する染色体の一方コピーまたは両コピーを含む染色体である、融合細胞。
【請求項３１】
前記所望の染色体は、該ＥＳ細胞の染色体のうち１つまたは２つ以上を含む染色体である、融合細胞。
【請求項３２】
前記所望の染色体は、該ＥＳ細胞の染色体全部である、融合細胞。
【請求項３３】
前記所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞は、疾患に罹患した個体由来のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞である、融合細胞。
【請求項３４】
前記所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞は、疾患に罹患した個体由来のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞であり、前記所望の染色体は、該ＥＳ細胞の染色体全部である、融合細胞。
【請求項３５】
所望の染色体が除去された細胞を複数種類含む、細胞ライブラリー。
【請求項３６】
レコンビナーゼ認識配列を１つまたは逆方向に２つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットの、所望の染色体を除去するための使用。
【請求項３７】
レコンビナーゼ認識配列を１つまたは逆方向に２つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットの、所望の染色体を除去するための組成物の製造のための使用。
【請求項３８】
所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞から所望の染色体を除去するための方法であって、
Ａ）レコンビナーゼ認識配列を１つまたは逆方向に２つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットを提供する工程と、
Ｂ）該遺伝子カセットを細胞に導入する工程と、
Ｃ）該細胞と所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞とを融合する工程と、
Ｄ）該融合された細胞に、該レコンビナーゼ認識配列を認識するレコンビナーゼまたはそれをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する工程と、
Ｅ）再構成が生じる条件に該融合された細胞を曝す工程と、
Ｆ）融合された細胞のマーカー遺伝子に由来するシグナルを観察して所望の染色体が除去された細胞を選択する工程と、
を包含する、方法。
【請求項３９】
染色体交換細胞を生産するための方法であって、
Ａ）レコンビナーゼ認識配列を１つまたは逆方向に２つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットを提供する工程と、
Ｂ）該遺伝子カセットを第１の細胞に導入する工程と、
Ｃ）所望の染色体を有する第２の細胞の細胞質と、第１の細胞とを融合させる工程；
Ｄ）該第２の細胞の所望の染色体に対応する該第１の細胞の染色体を、該第１の細胞の該染色体の除去を可能にするように、該レコンビナーゼ認識配列を認識するレコンビナーゼまたはそれをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する工程と、
Ｅ）再構成が生じる条件に該融合された細胞を曝す工程と、
Ｆ）融合された細胞のマーカー遺伝子に由来するシグナルを観察して所望の染色体が除去された細胞を選択する工程と、
を包含する、方法。
【請求項４０】
請求項３８または３９に記載の方法によって生産される細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して再生医療の分野に関する。所望の染色体が欠失している再生可能な細胞、その生産方法、それに使用するための遺伝子カセットおよびキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
再生医学（再生医療）による疾患治療が最近注目を浴びている。しかし、これを臓器ないし組織機能不全を呈する多くの患者に対して日常的に適応するまでには至っていない。現在まで、そのような患者の治療として、臓器移植のほか、医療機器での補助システムの利用がごく限られた患者に適応されているにすぎない。しかし、これらの治療法には、ドナー不足、拒絶、感染、耐用年数などの問題がある。特に、ドナー不足は深刻な問題であり、骨髄移植の場合、国内外で骨髄ないし臍帯血バンクが次第に充実してきたといっても、限られたサンプルを多くの患者に提供することが困難である。従って、これらの問題を克服するために胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などを利用した幹細胞治療とその応用を中心とした再生医学に対する期待がますます高まっている。【０００３】
ＥＳ細胞は、初期の胚から誘導される迅速に増殖する未分化の全能性細胞であり、胚性腫瘍細胞と類似の性質を示す。ＥＳ細胞は最初、マウス胚盤胞の内部細胞塊（Ｉｎｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ；ＩＣＭ）をマウス繊維芽細胞のフィーダー細胞層上で培養することにより確立された。ＥＳ細胞は、フィーダー細胞層および／または白血病阻害因子（ＬＩＦ）の存在下のその未分化の状態を維持するような条件下では無限の寿命を有する［非特許文献１＝Ｒ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：６８４−６８７（１９８８）］。また、高いインビトロ分化能を有し、集合塊として培養するだけで多種類の細胞に分化させることができることが知られている。ＥＳ細胞は、着床前の段階の胚より確立され、外胚葉、中胚葉および内胚葉の３胚葉由来の種々の細胞型へ分化する多分化能を有する細胞である［非特許文献２＝Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ  ａｎｄ  Ｍ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１５４−１５６（１９８１）；非特許文献３＝Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔａｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７８：７６３４−７６３８（１９８１）］。即ち、ＥＳ細胞は成体のあらゆる成熟細胞へと分化する能力を有し、例えば、正常な初期の胚中に導入しキメラ胚を形成させることによりキメラ動物の体細胞および生殖細胞の両方へ分化させることができる［非特許文献４＝Ｒ．Ｌ．Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４０：１９４９−１９５６（１９７４）；非特許文献５＝Ａ．Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：２５５−２５６（１９８４）］。精巣および卵巣等の生殖細胞にＥＳ細胞由来の細胞が導入されたキメラ動物を親として交配することにより、ＥＳ細胞由来の細胞のみで構成される子孫を得ることができる。これは即ち、遺伝学的に十分制御された人為的素質を有する動物を獲得できるということである。このような動物により、インビトロに限らず個体レベルにおいても発生および分化のメカニズムについての研究が可能となる。ＥＳ細胞は、胚性腫瘍細胞とは異なり、その多くが正常二倍体の核型を保持した正常細胞であり、キメラ形成率が高く、生殖系列の細胞へ分化する確率も高く［非特許文献５］、発生学分野以外でもＥＳ細胞の利用範囲は広がりつつある。【０００４】
ＥＳ細胞はまた、細胞研究および細胞分化を決定する遺伝子研究にとって重要な役割と果たしている。例えば、配列の知られた遺伝子の機能解析のため、マウスＥＳ細胞は遺伝的改変を導入し、遺伝子の破壊されたマウス株の産生に用いられてきた。未分化ＥＳ細胞の使用は、ヒトゲノム解読後の機能解析作業においてきわめて効率がよく有効である。また、ＥＳ細胞はインビトロにおいて、広い範囲にわたる種々の細胞型へ分化することができるため、胚発生の際の細胞分化機構を研究するために使用されてきた。ＥＳ細胞を成長因子の添加、または胚様体を形成することにより造血細胞、心筋、および、幾つかの型のニューロン等の臨床的に有用な細胞へと分化するよう促すことが可能となってきた［非特許文献６＝Ｍ．Ｗｉｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１１：２５９−２６７（１９９１）；非特許文献７＝Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ−Ｈａｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２５２４４−２５２５２（１９９３）；非特許文献８＝Ｖ．Ａ．Ｍａｌｔｓｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．４４：４１−５０（１９９３）；非特許文献９＝Ｇ．Ｂａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６８：３４２−３５７（１９９５）］。有用な細胞へと分化させるマウスＥＳ細胞についての誘導の試みは、造血細胞、心筋、特異的ニューロン、および、血管の製造について成功している［非特許文献１０＝Ｔ．Ｎａｋａｎｏ  ｅｔ  ａ１．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：１０９８−１１０１（１９９４）；非特許文献１１＝Ｒ．Ｐａｃａｃｉｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔａｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７５３０−７５３４（１９９５）；非特許文献８＝Ｖ．Ａ．Ｍａｌｔｓｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．４４：４１−５０（１９９３）；非特許文献１２＝Ｓ．Ｈ．Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：６７５−６７９（１９９９）；非特許文献１３＝Ｈ．Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ２８：３１−４０（２０００）；非特許文献１４＝Ｓ．−Ｉ．Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２５：１７４７−１７５７（１９９８）；非特許文献１５＝Ｍ．Ｈｉｒａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９３：１２５３−１２６３（１９９９）］。【０００５】
現在、ハムスター、マウスなどの種々の動物についてＥＳ細胞が確立されているほか、ヒトＥＳ細胞も確立されており、それらはマウスＥＳ細胞と類似した分化能を示した［非特許文献１６＝Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２：１１４５−１１４７（１９９８）；非特許文献１７＝Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３−１６５（１９９８）；非特許文献１８＝Ｂ．Ｅ．Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：３９９−４０４（２０００）］。主に、マウスＥＳ細胞を用いて得られた分化誘導調節について蓄積された膨大な知識を適用することにより、ヒトＥＳ細胞が心筋梗塞、パーキンソン病、糖尿病および白血病を含む多数の疾病における移植治療用の種々の細胞・組織の無限の材料となり、移植治療におけるドナー不足問題が解消されることが期待されている。２０００年の６月２３日には、豪・米・独による３つの研究チームが、国際幹細胞生物シンポジウムにおいて、ヒトＥＳ細胞から神経細胞および筋肉細胞などを初めて作り出すことに成功したことを報告した。また、最近、ヒトＥＳ細胞からの造血細胞を分化させる方法についても報告されている。しかしながら、移植治療においてＥＳ細胞を用いる場合にも、今日の臓器移植と同様に免疫的拒絶反応は生じるという問題は残されている。【０００６】
生きた組織の移植は種々の理由で行なわれている。臓器移植により欠損した機能を補い、例えば、腎臓のような重要臓器の致命的疾患を救うこともできる。同一個体で他の部位に移植する場合、これは自家移植と呼ばれ、自家移植片は拒絶されない。一卵性双生児間および近交系動物間での移植を同系移植といい、この場合も、移植片は宿主にいつまでも生着する。同種間の移植を同種（異系）移植といい、拒絶を防ぐ特別な処置を行なわない場合には移植片は拒絶される。また、異なる種属間の移植を異種移植といい、移植片は宿主により速やかに破壊される。【０００７】
移植片拒絶を招く因子は、移植抗原あるいは組織適合性抗原と呼ばれる。赤血球を除くすべての体細胞は移植抗原を有している。赤血球は独自の血液型（ＡＢＯ）抗原を持つ。主なヒト移植抗原は、主要組織適合抗原またはＨＬＡ（ヒト白血球グループＡ）と呼ばれ、第６染色体の遺伝子によって支配される。ＨＬＡ抗原は、拒絶反応の標的であるクラスＩ抗原、および拒絶反応の開始の役を果たすクラスＩＩ抗原の２群に分類される。クラスＩ抗原は全ての組織にみられるが、クラスＩＩ抗原はそうではなく、マクロファージ様の細胞である指状の突起を有する樹状細胞に多数発現している。拒絶反応が開始しないよう、このような細胞を臓器移植組織から除去する試みについては実験的な成功例はあるが、実用には向かず、現在のところ臨床的には応用されていない。【０００８】
移植後に発症する拒絶反応は、超急性拒絶反応、促進型急性拒絶反応、急性拒絶反応、慢性拒絶反応に分類することができる。超急性拒絶反応はレシピエントの血清中にドナーのＨＬＡ抗原に反応する既存抗体が存在しているときに起こる。血管結合が終了し、臓器への血流を再開した後、数時間以内に起こる激しい拒絶反応で移植臓器は直ちに廃絶される。現在、治療法はなく、移植前にリンパ球交差試験を行い、レシピエント血清中にドナーリンパ球に反応する抗体を持つことが認められた場合、その移植を断念することで予防することでしか防ぐことができない。促進型急性拒絶反応は、ドナーのＨＬＡ抗原に反応性のＴリンパ球が、移植前にレシピエントの体の中に存在するときに発現する。移植後７日以内に発症することが多く、超急性拒絶反応同様、激しい拒絶反応であるが、近年の治療薬の進歩により治癒させることも可能となってきている。急性拒絶反応は移植された臓器のドナーＨＬＡ抗原によって、主にＴリンパ球による細胞性の免疫反応が惹起された結果として起こるものである。移植後に最もよくみられる拒絶反応で、通常、移植後２週目から１か月位までに認められる。慢性拒絶反応は、臨床的には治療に抗して徐々に進行する臓器機能の低下を特徴とし、多くは移植後６か月から１年を経過してから発症する。基本的には、ドナーＨＬＡ抗原の侵入により活性化されたレシピエントの免疫反応が引き起こす移植臓器の組織障害と、それに対応した臓器組織の反応により、長期にわたって進行していく組織変性と考えられている。レシピエントと同じＭＨＣ分子構造の臓器を移植しない限り、必ず拒絶反応が起こる。現在のところ、どのように拒絶反応をコントロールするかは大きな課題である。【０００９】
上述のような拒絶反応を起こさないようにする免疫抑制法として、大きく分けて、免疫抑制剤によるもの、外科的手術、放射線照射等が挙げられる。まず、免疫抑制剤として主なものとして副腎皮質ステロイド薬、シクロスポリン、ＦＫ５０６等がある。副腎皮質ステロイド薬は循環性Ｔ細胞の数を減少させ、リンパ球の核酸代謝、サイトカイン産生を阻害してその機能を抑え、マクロファージの遊走および代謝を抑制して免疫反応を抑える。一方、シクロスポリンおよびＦＫ５０６の作用は類似しており、ヘルパーＴ細胞の表面にある受容体と結合して細胞内に入り込み、ＤＮＡに直接働いてインターロイキン２の生成を阻害する。最終的には、キラーＴ細胞が機能できなくなり免疫抑制作用が起こる。これらの免疫抑制剤の使用においては副作用が問題となる。ステロイドは特に副作用が多く、また、シクロスポリンは肝臓・腎臓に対する毒性がある。また、ＦＫ５０６は腎臓に対する毒性を有する。次に外科的手術としては、例えば、リンパ節摘出、脾臓摘出、胸腺摘除が挙げられるが、これらについてはその効果が十分に証明されてはいない。外科的手術の中でも胸菅ろうとは、循環しているリンパ球を体外に導くものであり効果も確認されているが、大量の血清タンパク質および脂肪の流出を引き起こし、栄養障害が起こりやすくなるという欠点がある。放射線照射には全身照射と移植片照射があるが、効果が不確実な面もあり、レシピエントに対する負担が大きいので、前述の免疫抑制剤との併用により利用されている。上述のいずれの方法も拒絶反応の防止に理想的ではないことは明らかである。【００１０】
現在、除核した卵細胞への体細胞核の導入により、体細胞核が全能性に再プログラム化されることが哺乳動物でも示され、クローンヒツジ、クローンウシ、クローンマウス、およびクローンブタ等が作成されている〔非特許文献１９＝Ｗｉｌｍｕｔ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０−８１３（１９９７）；非特許文献２０＝ＫａｔｏＹ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：２０９５−２０９８（１９９８）；非特許文献２１＝Ｗａｋａｙａｍａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９４：３６９−３７４（１９９８）；非特許文献２２＝Ｏｎｉｓｈｉ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：１１８８−１１９０（２０００）；非特許文献２３＝Ｐｏｌｅｊａｅｖａ  Ｉ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：８６−９０（２０００）］。この技術を利用し、移植を受ける宿主由来の体細胞の核を、卵細胞を用いて再プログラム化し、全能性の細胞を作製することにより免疫的拒絶反応を惹起しない移植片を作製することができると考えられる。また、このような細胞培養の方法によれば、ドナー不足をも解消することができると思われる。【００１１】
しかしながら、ヒトの治療用クローニングは、生物医学的倫理問題という社会問題に遭遇している（非特許文献２４＝Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｉ．Ｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４６，１５７６−１５７９．（２００２））。上述の方法では卵細胞を用いる必要があることが倫理的な観点で問題となっている。また、ヒトにおいては、ES細胞は初期胚の未分化な細胞に由来するということ、および成体の初期胚は存在しないという現実を考慮すると、初期胚より後の状態、特に成体である宿主からＥＳ細胞を樹立できないという原理的な問題がある。従って、個人に対応したＥＳ細胞のような多能性幹細胞を得るということは今までに達成されておらず、当該分野において解決されることが渇望されている課題である。【００１２】
本発明者らは、このような情況のもと、個人に対応したテイラーメイド治療を実現するために、以前に、胚性幹細胞（本明細書においてＥＳ細胞ともいう）由来の移植抗原の一部または全部を欠失させた、細胞融合による多能性幹細胞の製造方法、ならびにその融合細胞から体細胞由来の主要組織適合抗原のみを発現する細胞、組織または臓器を分化させることを含む、細胞、組織または臓器の製造方法を開発した（特許文献１＝国際公開ＷＯ０３／０２７２７８号）。しかし、所望の遺伝子または染色体（特にＨＬＡ遺伝子を含む６番染色体）の除去については、従来法を用いるのみでありその除去効率はそれほど優れたものではなかった。従って、このような多能性幹細胞の調製においても使用可能で、効率がよく、再生能および多分化能を保持させるような遺伝子除去方法の開発が求められていた。特許文献１は、細胞融合を用いて細胞を未分化状態にする方法を開示する。この文献は、特定の遺伝子を除くことを記載するが、染色体を除き、その結果、所望の染色体が除かれた融合細胞およびそれによって未分化状態にされ再生可能な細胞を生産することに関連する技術は記載されていない。【００１３】
非特許文献２５（Ｍａｒｋ  Ｌｅｗａｎｄｏｓｋ  ＆  Ｇ．Ｒ．  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｖｏｌ．  １７，  １９９７  ２２３−２５）は、ＸＹ染色体のうちＹ染色体を除く方法を開示する。この文献は、染色体を除き、その結果、所望の染色体が除かれた融合細胞およびそれによって未分化状態にされ再生可能な細胞を生産することに関連する技術は記載されていない。この文献の技術では、生成される細胞は奇形しか発生し得ず、再生治療に使用可能な細胞は提供できない。【００１４】
非特許文献２６および特許文献２では、同方向にｌｏｘＰ配列を入れた構築物を用いて胚性幹細胞の染色体を喪失させようと試みている。しかし、この方法は、従来方法と何ら変わることなく、従って、喪失の効率も悪い。従って、この文献の技術では、効率よく再生治療に使用可能な細胞を提供することはできない。
【特許文献１】国際公開ＷＯ０３／０２７２７８号
【特許文献２】特表２００３−５１２０５３
【非特許文献１】Ｒ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：６８４−６８７（１９８８）
【非特許文献２】Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ  ａｎｄ  Ｍ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１５４−１５６（１９８１）
【非特許文献３】Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔａｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７８：７６３４−７６３８（１９８１）
【非特許文献４】Ｒ．Ｌ．Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４０：１９４９−１９５６（１９７４）
【非特許文献５】Ａ．Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：２５５−２５６（１９８４）
【非特許文献６】Ｍ．Ｗｉｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１１：２５９−２６７（１９９１）
【非特許文献７】Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ−Ｈａｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２５２４４−２５２５２（１９９３）
【非特許文献８】Ｖ．Ａ．Ｍａｌｔｓｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．４４：４１−５０（１９９３）
【非特許文献９】Ｇ．Ｂａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６８：３４２−３５７（１９９５）
【非特許文献１０】Ｔ．Ｎａｋａｎｏ  ｅｔ  ａ１．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：１０９８−１１０１（１９９４）
【非特許文献１１】Ｒ．Ｐａｃａｃｉｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔａｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７５３０−７５３４（１９９５）
【非特許文献１２】Ｓ．Ｈ．Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：６７５−６７９（１９９９）
【非特許文献１３】Ｈ．Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ２８：３１−４０（２０００）
【非特許文献１４】Ｓ．−Ｉ．Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２５：１７４７−１７５７（１９９８）
【非特許文献１５】Ｍ．Ｈｉｒａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９３：１２５３−１２６３（１９９９）
【非特許文献１６】Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２：１１４５−１１４７（１９９８）
【非特許文献１７】Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３−１６５（１９９８）
【非特許文献１８】Ｂ．Ｅ．Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：３９９−４０４（２０００）
【非特許文献１９】Ｗｉｌｍｕｔ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０−８１３（１９９７）
【非特許文献２０】ＫａｔｏＹ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：２０９５−２０９８（１９９８）
【非特許文献２１】Ｗａｋａｙａｍａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９４：３６９−３７４（１９９８）
【非特許文献２２】Ｏｎｉｓｈｉ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：１１８８−１１９０（２０００）
【非特許文献２３】Ｐｏｌｅｊａｅｖａ  Ｉ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：８６−９０（２０００）
【非特許文献２４】Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｉ．Ｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４６，１５７６−１５７９．（２００２）
【非特許文献２５】Ｍａｒｋ  Ｌｅｗａｎｄｏｓｋ  ＆  Ｇ．Ｒ．  Ｍａｒｔｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｖｏｌ．  １７，１９９７  ２２３−２５
【非特許文献２６】Ｋｏｉｋｅ，Ｈ．，Ｈｏｒｉｅ，Ｋ．，Ｆｕｋｕｙａｍａ，Ｈ．，Ｋｏｎｄｏｈ，Ｇ．，Ｎａｇａｔａ，Ｓ．ａｎｄ  Ｔａｋｅｄａ，Ｊ．（２００２）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｂｉａｌｌｅｌｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈ  Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｔｅｒ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ  ３，４３３−７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、所望の染色体が欠失している再生可能な細胞、その生産方法、それに使用するための遺伝子カセットおよびキットを提供することを課題とする。【００１６】
より詳細には、本発明は、個人対応型の多能性幹細胞を簡便に入手することを課題とする。より特定すると、本発明は免疫的拒絶反応を惹起せず、ＥＳ細胞などの幹細胞を新たにその個人から取り出し樹立することをせずに、しかも卵細胞を材料とせずに、疾病を処置するためのドナーとなり得る細胞、組織および臓器を効率的に確立することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、レコンビナーゼ認識部位をシス方向に２つ挿入するのではなく、１つまたは逆方向に挿入し、マーカー遺伝子を連結した遺伝子カセット、およびこのカセットを細胞融合技術に応用することによって解決した。【００１８】
この結果、所望の染色体が除かれ、かつ、再生可能であり、好ましくは未分化状態を有する細胞が提供される。この技術を応用することにより、テイラーメイドの幹細胞（例えば、ＥＳ細胞）が提供される。【００１９】
さらに、本発明は、所望のゲノムを有し、多能性が付与された細胞から、不要な染色体を効率よく、多能性を失うことなく欠失させる技術を提供することによって、テイラーメイド多能性幹細胞を作製することに成功した。好ましくは、本発明では、所望のゲノム以外の遺伝子を有しない、拒絶反応の全くない「完全」個人対応型多能性幹細胞を得ることができる。【００２０】
本発明では、融合細胞、または再プログラム化された体細胞などの、所望のゲノムを有し、不要な染色体が効率よく除去された多能性幹細胞から、自在に分化された細胞、組織および臓器であって、レシピエントに導入された場合に、所望のテイラーメイド治療が可能になり、例えば、幹細胞（例えば、ＥＳ細胞）由来の移植抗原の全てを有する細胞由来のものと比べレシピエントにおいて受ける拒絶反応が減少または完全に除去されるなどの治療が効率よく実現される。即ち、本発明の多能性幹細胞は疾病を処置するためのドナーとなる細胞、組織および臓器を確立するための理想的な材料となり得る。これらの細胞、組織および臓器は、テイラーメイド型医療において多大な適用を有し、その産業上の有用性は高い。【００２１】
このように、ヒトおよびマウス胚性幹（ＥＳ）細胞は、ＥＳ−体細胞ハイブリッド細胞において成体の体細胞核に多能性を与え得る（Ｔａｄａ，Ｍ．，Ｔａｋａｈａｍａ，Ｙ．，Ａｂｅ，Ｋ．，Ｎａｋａｔｓｕｊｉ，Ｎ．およびＴａｄａ，Ｔ．Ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １１，１５５３−８，（２００１）；Ｃｏｗａｎ，Ｃ．Ａ．，Ａｔｉｅｎｚａ，Ｊ．，Ｍｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ａ．およびＥｇｇａｎ，Ｋ．Ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｆｔｅｒ  ｆｕｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９，１３６９−７３（２００５））。これは、体細胞から、胚性物質を使用することなく再プログラム化された多能性幹細胞を作製するための強力なアプローチであり、標的染色体がハイブリッド細胞から除去され得る場合、ヒト医療における進歩に対して非常に大きな意味を有する。この目的の実現化に向けて、本発明者らは、万能染色体除去カセット（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）（ＣＥＣ）を開発した。本明細書において、本発明者らは、いくつかの重要な多能性関連遺伝子（Ｎａｎｏｇが挙げられる）を有するハイブリッド細胞からの、ＥＳ起由来の第６番染色体の両コピーを標的として除去するための、ＣＥＣの使用を示す。その後のハイブリッド細胞の多能性の存続は、再プログラム化された体細胞核からのＮａｎｏｇの発現による。本発明者らの発明は、ハイブリッド細胞からのＥＳ由来ＭＨＣ染色体の除去を通じてか、またはＥＳ細胞中での、ＥＳ細胞由来ＭＨＣ染色体の体細胞由来のＭＨＣ染色体への置き換えを通じた、幹細胞治療における使用のための、個人化された多能性幹細胞の作製が実質的に実施可能であることが証明されたことになる。最終的に、全てのＥＳ由来染色体は、ハイブリッド細胞から除去され得る。ヒト疾患の原因および治療を調べるための、患者由来の、正常なＥＳ細胞染色体を標的として除去することによって種々の変異を有した多能性幹細胞の作製への展望も、同様に重要である。【００２２】
従って、本発明は、以下を提供する。
（１）  レコンビナーゼ認識配列を１つまたは逆方向に２つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセット。
（２）  上記レコンビナーゼ認識配列は、ｌｏｘＰ配列、ＦＲＴ部位、ａｔｔＢ配列，ａｔｔＰ配列およびｒｅｓ部位配列からなる群より選択される配列を含む相同組み換え配列である、項目１に記載の遺伝子カセット。
（３）  上記マーカー遺伝子は、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、イエロー蛍光タンパク質（ＹＦＰ）遺伝子、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）遺伝子およびレッド蛍光タンパク質（ｄｓＲＥＤ）遺伝子からなる群より選択される遺伝子を含む、項目１に記載の遺伝子カセット。
（４）  さらに、選択配列を含む、項目１に記載の遺伝子カセット。
（５）  上記選択配列は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、ピューロマイシン抵抗性付与遺伝子、ネオマイシン抵抗性付与遺伝子、ハイグロマイシン抵抗性付与遺伝子、ブラストサイジン抵抗性付与遺伝子、ゼオシン抵抗性付与遺伝子、ＨＡＴ抵抗性付与遺伝子、ジフテリアトキシン抵抗性付与遺伝子およびフルオロウラシル抵抗性付与遺伝子からなる群より選択される遺伝子をコードする配列を含む、項目４に記載の遺伝子カセット。
（６）  上記レコンビナーゼ認識配列は、配列番号１に記載される配列ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴを含む、項目１に記載の遺伝子カセット。
（７）  さらに、配列番号２に記載されるＩＲＥＳ配列を含む、項目１に記載の遺伝子カセット。
（８）  さらに、配列番号３に記載されるＣＡＧ配列を含む、項目１に記載の遺伝子カセット。
（９）  上記レコンビナーゼ認識配列は、逆方向に２つ含まれる、項目１に記載の遺伝子カセット。
（１０）  上記レコンビナーゼ認識配列は、逆方向に２つ含まれ、上記レコンビナーゼ認識配列の間に、ＣＡＧ、マーカー配列、ＩＲＥＳ配列、および選択配列を含む、項目１に記載の遺伝子カセット。
（１１）  レコンビナーゼ認識配列を１つまたは逆方向に２つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットを含む、所望の染色体を除去するための組成物。
（１２）  上記染色体が、多能性関連遺伝子を含む、項目１１に記載の組成物。
（１３）  上記除去は、上記染色体の両コピーの除去を含む、項目１１に記載の組成物。
（１４）  Ａ）レコンビナーゼ認識配列を１つまたは逆方向に２つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットと、
Ｂ）上記レコンビナーゼ認識配列に対応するレコンビナーゼまたはそれをコードする核酸配列を含む核酸分子と、
を備える、所望の染色体を除去するためのキット。
（１５）  Ａ）レコンビナーゼ認識配列を１つまたは逆方向に２つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットと、
Ｂ）上記レコンビナーゼ認識配列に対応するレコンビナーゼまたはそれをコードする核酸配列を含む核酸分子と、
Ｃ）幹細胞と、
を備える、幹細胞から所望の染色体を除去するためのキット。
（１６）  Ａ）レコンビナーゼ認識配列を１つまたは逆方向に２つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットと、
Ｂ）上記レコンビナーゼ認識配列に対応するレコンビナーゼまたはそれをコードする核酸配列を含む核酸分子と、
Ｃ）幹細胞と、
Ｄ）所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞と、
を備える、所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞から所望の染色体を除去し、上記細胞に多分化能を付与するためのキット。
（１７）  所望のゲノムを有する細胞から所望の染色体または染色体群を除去し、上記細胞に多分化能を付与するための方法であって、
Ａ）レコンビナーゼ認識配列を１つまたは逆方向に２つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットを提供する工程と、
Ｂ）上記遺伝子カセットを幹細胞に導入する工程と、
Ｃ）上記幹細胞と所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞とを融合する工程と、
Ｄ）上記融合された細胞に、上記レコンビナーゼ認識配列を認識するレコンビナーゼまたはそれをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する工程と、
Ｅ）再構成が生じる条件に上記融合された細胞を曝す工程と、
Ｆ）融合された細胞のマーカー遺伝子に由来するシグナルを観察して所望の染色体が除去された細胞を選択する工程と、
を包含する、方法。
（１８）項目１７に記載の方法によって得られた細胞。
（１９）所望の染色体が除去された、細胞。
（２０）所望の染色体が除去された、幹細胞。
（２１）上記幹細胞は、ＥＳ細胞である、項目２０に記載の幹細胞。
（２２）上記染色体がＭＨＣまたは対応する遺伝子をコードする配列を含む、項目１９に記載の細胞。
（２３）所望の染色体または染色体群が交換された、染色体交換細胞。
（２４）所望の染色体または染色体群が交換された、染色体交換された幹細胞。
（２５）上記幹細胞は、ＥＳ細胞である、項目２４に記載の幹細胞。
（２６）ＥＳ細胞と、所望のゲノム、染色体または染色体群を有する微小核との融合細胞であって、上記融合細胞からＥＳ細胞由来の所望の染色体が除去され、多分化能を有する、染色体交換細胞。
（２７）ＥＳ細胞と、所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞との融合細胞であって、上記融合細胞から、所望の染色体が除去され、多分化能を有する、融合細胞。
（２８）ＥＳ細胞と、所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞との融合細胞であって、上記融合細胞から、上記ＥＳ細胞の染色体が除去され、多分化能を有する、融合細胞。
（２９）上記所望の染色体は、上記ＥＳ細胞のＭＨＣ、拒絶反応関連遺伝子またはそれに対応する遺伝子をコードする配列を含む染色体である、融合細胞。
（３０）上記所望の染色体は、上記ＥＳ細胞のマウスの第６染色体、第１１染色体、第１２染色体および第１７染色体、ヒトの第６染色体からなる群より選択される染色体または上記染色体に対応する染色体の一方コピーまたは両コピーを含む染色体である、融合細胞。
（３１）上記所望の染色体は、上記ＥＳ細胞の染色体のうち１つまたは２つ以上を含む染色体である、融合細胞。
（３２）上記所望の染色体は、上記ＥＳ細胞の染色体全部である、融合細胞。
（３３）上記所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞は、疾患に罹患した個体由来のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞である、融合細胞。
（３４）上記所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞は、疾患に罹患した個体由来のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞であり、上記所望の染色体は、上記ＥＳ細胞の染色体全部である、融合細胞。
（３５）所望の染色体が除去された細胞を複数種類含む、細胞ライブラリー。
（３６）レコンビナーゼ認識配列を１つまたは逆方向に２つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットの、所望の染色体を除去するための使用。
（３７）レコンビナーゼ認識配列を１つまたは逆方向に２つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットの、所望の染色体を除去するための組成物の製造のための使用。
（３８）  所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞から所望の染色体を除去するための方法であって、
Ａ）レコンビナーゼ認識配列を１つまたは逆方向に２つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットを提供する工程と、
Ｂ）上記遺伝子カセットを細胞に導入する工程と、
Ｃ）上記細胞と所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞とを融合する工程と、
Ｄ）上記融合された細胞に、上記レコンビナーゼ認識配列を認識するレコンビナーゼまたはそれをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する工程と、
Ｅ）再構成が生じる条件に上記融合された細胞を曝す工程と、
Ｆ）融合された細胞のマーカー遺伝子に由来するシグナルを観察して所望の染色体が除去された細胞を選択する工程と、
を包含する、方法。
（３９）  染色体交換細胞を生産するための方法であって、
Ａ）レコンビナーゼ認識配列を１つまたは逆方向に２つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットを提供する工程と、
Ｂ）上記遺伝子カセットを第１の細胞に導入する工程と、
Ｃ）所望の染色体を有する第２の細胞の細胞質と、第１の細胞とを融合させる工程；
Ｄ）上記第２の細胞の所望の染色体に対応する上記第１の細胞の染色体を、上記第１の細胞の上記染色体の除去を可能にするように、上記レコンビナーゼ認識配列を認識するレコンビナーゼまたはそれをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する工程
Ｅ）再構成が生じる条件に上記融合された細胞を曝す工程と、
Ｆ）融合された細胞のマーカー遺伝子に由来するシグナルを観察して所望の染色体が除去された細胞を選択する工程と、
を包含する、方法。
（４０）項目３８または３９に記載の方法によって生産される細胞。【００２３】
従って、本発明のこれらおよび他の利点は、添付の図面を参照して、以下の詳細な説明を読みかつ理解すれば、当業者には明白になることが理解される。
【発明の効果】
【００２４】
本発明は、自在に目的の染色体を効率よく除去することができるという技術を提供する。従って、自在に染色体を欠如させることにより、例えば、免疫拒絶を低減または抑制した再生医療、テイラーメイド治療が容易になった。【００２５】
好ましい実施形態においては、本発明により、ＥＳ細胞由来染色体の除去により、特定の染色体由来の転写産物は体細胞由来のみとなる。このことを応用して、個人対応型の薬剤効果の検定等で創薬分野への応用が考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の１実施形態の実施スキームを示す。
【図１ＢＣ】図１Ｂは、染色体除去カセットがマウス１１番染色体の末端に導入されていることをＦＩＳＨ解析により確認した図である。図１Ｃは、染色体除去カセット導入ＥＳ細胞と体細胞の融合細胞の染色体解析である。白矢はマウス１１番染色体を示している。
【図１Ｄ】図１Ｄは、Ｃｒｅ酵素処理後の融合細胞のＦａｃｓ解析である。丸印がＧＦＰ陽性細胞集団、六角形印がＧＦＰ陰性細胞集団を示している。
【図１ＥＦ】図１Ｅは、染色体除去カセットが導入されたマウス１１番染色体が除去された細胞クローンの染色体解析である。白丸印により染色体が除去された事が示されている。図１Ｆは、図１Ｅとは独立した細胞クローンの染色体解析である。図１Ｅと同様にマウス１１番染色体が除去されている。
【図２】図２は、マウスにおける１実施形態の細胞の核型分析による欠失染色体の分布の実験結果を示す。ここで、１１番染色体が見事に除去されていることが理解される。
【図３】図３は、本発明の染色体除去のメカニズムを説明する模式図である。
【図４】図４は、染色体除去カセットのＥＳ細胞への導入および導入カセットのＦＩＳＨ解析である。
【図５】図５は、染色体除去カセットが導入されたＥＳ細胞（ＣＥＣ−ＥＳ）細胞と体細胞との融合実験。融合細胞は染色体数が８０本でＥＳ細胞と体細胞に由来するすべての染色体を保持している。マウス１１番染色体は、４本存在する。
【図６】図６は、染色体除去カセットが導入されたＥＳ細胞（ＣＥＣ−ＥＳ）細胞と体細胞との融合細胞をＣｒｅ酵素で処理し１１番染色体を選択的に除去した例を示す。１１番染色体が除去された細胞はＧＦＰ蛍光が消失し、Ｆａｃｓソーティングにより容易に分取可能である。分取した代表的な２細胞クローンの核型を示す。ともに、染色体除去カセットが挿入された１１番染色体が除去されている。
【図７】染色体除去カセットがマウスＥＳ細胞の５番染色体または１２番染色体に導入された例を示す。染色体上の除去カセット挿入部位をＦＩＳＨ法により解析した。
【図８】図８は、本発明の好ましい実施形態である、テイラーメイド治療のための融合細胞の作製模式図を示す。
【図９ａ】図９は、染色体除去カセット（ＣＥＣ）を有する胚性幹（ＥＳ）細胞、および体細胞との細胞融合を示す。ａ．ＥＳ細胞と体細胞との間の細胞融合、ならびにＣＥＣ−タグ化ＥＳ染色体を標的とした除去の模式図。白矢印は、緑色シグナルによって検出されるＣＥＣ組み込み部位を示す。
【図９ｂ】図９は、染色体除去カセット（ＣＥＣ）を有する胚性幹（ＥＳ）細胞、および体細胞との細胞融合を示す。ｂ．ＥＳ細胞の第１１番染色体上のＣＥＣの地図。
【図９ｃ】図９は、染色体除去カセット（ＣＥＣ）を有する胚性幹（ＥＳ）細胞、および体細胞との細胞融合を示す。ｃ．ＥＳ細胞の第１２番染色体上のＣＥＣの地図。
【図９ｄ】図９は、染色体除去カセット（ＣＥＣ）を有する胚性幹（ＥＳ）細胞、および体細胞との細胞融合を示す。ｄ．Ｃｒｅ処理前（Ｃｒｅ前）の、単一のＣＥＣタグ化第１１番染色体を有するハイブリッド細胞（ＣＥＣ１１ハイブリッド）のＧバンド形成核型。
【図９ｅ】図９は、染色体除去カセット（ＣＥＣ）を有する胚性幹（ＥＳ）細胞、および体細胞との細胞融合を示す。ｅ．単一のＣＥＣタグ化第１２番染色体を有するＣｒｅ前ハイブリッド細胞（ＣＥＣ１２ハイブリッド）のＧバンド形成核型。
【図９ｆ】図９は、染色体除去カセット（ＣＥＣ）を有する胚性幹（ＥＳ）細胞、および体細胞との細胞融合を示す。ｆ．Ｃｒｅ前およびＣｒｅ処理された（Ｃｒｅ後）ＣＥＣ１１ハイブリッド細胞およびＣＥＣ１２ハイブリッド細胞ＦＡＣＳ分析。ＧＦＰネガティブハイブリッド細胞は、囲みＲ２中にあり、一方ＧＦＰポジティブハイブリッド細胞は、囲みＲ３中にある。
【図９ｇ】図９は、染色体除去カセット（ＣＥＣ）を有する胚性幹（ＥＳ）細胞、および体細胞との細胞融合を示す。ｇ．Ｃｒｅ前およびＣｒｅ後ＣＥＣ１１ハイブリッドクローンにおけるＧＦＰ発現。
【図１０ａ】図１０は、第１１番染色体および第１２番染色体の除去後の、染色体ペインティングおよび分裂中期の核型を示す。ａ．Ｃｒｅ処理前の（Ｃｒｅ前）ＣＥＣ１１の染色体ペインティング。核内の４つの第１１番染色体は、赤色のペインティングシグナルとして認識される。
【図１０ｂ】図１０は、第１１番染色体および第１２番染色体の除去後の、染色体ペインティングおよび分裂中期の核型を示す。ｂ．Ｃｒｅ処理された（Ｃｒｅ後）ＣＦＣ１１ハイブリッド細胞の染色体ペインティング。赤色のペインティングシグナルとして認識されるように、染色体除去により、各核内に３つの第１１番染色体が生じた。
【図１０ｃ】図１０は、第１１番染色体および第１２番染色体の除去後の、染色体ペインティングおよび分裂中期の核型を示す。ｃ．Ｃｒｅ前ＣＥＣ１２ハイブリッド細胞の染色体ペインティング。核内における４つの第１２番染色体が、赤色のペインティングシグナルとして認識される。
【図１０ｄ】図１０は、第１１番染色体および第１２番染色体の除去後の、染色体ペインティングおよび分裂中期の核型を示す。ｄ．Ｃｒｅ後ＣＥＣ１２ハイブリッド細胞の染色体ペインティング。赤色のペインティングシグナルとして認識されるように、染色体除去により、各核内に３つの第１２番染色体が生じた。
【図１０ｅ】図１０は、第１１番染色体および第１２番染色体の除去後の、染色体ペインティングおよび分裂中期の核型を示す。ｅ．Ｃｒｅ後ＣＥＣ１１ハイブリッド細胞のＧバンド形成核型。白矢印は、核内の３つの第１１番染色体を示す。白丸は、１つの第１１番染色体の選択的除去を表す。
【図１０ｆ】図１０は、第１１番染色体および第１２番染色体の除去後の、染色体ペインティングおよび分裂中期の核型を示す。ｆ．Ｃｒｅ後ＣＥＣ１２ハイブリッド細胞のＧバンド形成核型。白矢印は、核内の３つの第１２番染色体を示す。白丸は、１つの第１２番染色体の選択的除去を表す。
【図１０ｇ】図１０は、第１１番染色体および第１２番染色体の除去後の、染色体ペインティングおよび分裂中期の核型を示す。ｇ．Ｃｒｅ後ＣＥＣ１２ハイブリッド細胞における微小染色体（Ｍ）。小型染色体（白矢印）は、大部分、ＦＩＳＨによって示されるように、動原体異質染色質からなる。
【図１１ａ】図１１は、ハイブリッド細胞核中のＥＳ由来第６番染色体対を標的とする除去を示す。ａ相同組み換えによるＧｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒ座へのＣＥＣ−ｎｅｏ／ｇｆｐカセットの組み込みの模式図（ＣＥＣ６ｔｇ／＋）。ＣＥＣに対するＥＳ  細胞ホモ接合体（ＣＥＣ６ｔｇ／ｔｇ）を、高用量０４１８処理によって選別した。
【図１１ｂ】図１１は、ハイブリッド細胞核中のＥＳ由来第６番染色体対を標的とする除去を示す。ｂ．ＣＥＣ６ｔｇ／＋ＥＳ細胞およびＣＥＣ６ｔｇ／ｔｇ  ＥＳ細胞における、ホモ接合体組み換えのサザンブロットハイブリダイゼーション分析。１１ｋｂバンドは、野生型対立遺伝子に特異的であり、一方２．３ｋｂバンドは、ノックイン対立遺伝子に特異的である。
【図１１ｃ】図１１は、ハイブリッド細胞核中のＥＳ由来第６番染色体対を標的とする除去を示す。ｃ．Ｃｒｅ処理の３日後における、核内に２つの第６番染色体を有するＣＥＣ６（ｔｇ／ｔｇ）ハイブリッド細胞の染色体ペインティング（赤色）。
【図１１ｄ】図１１は、ハイブリッド細胞核中のＥＳ由来第６番染色体対を標的とする除去を示す。ｄ．Ｃｒｅ処理の７日後における、核内に３つの第６番染色体（赤色）および４つの第１７番染色体（緑色）を有するＧＦＰネガティブＣＥＣ６（ｔｇ／ｔｇ）ハイブリッド細胞の染色体ペインティング。
【図１１ｅ】図１１は、ハイブリッド細胞核中のＥＳ由来第６番染色体対を標的とする除去を示す。ｅ．Ｃｒｅ処理の７日後における、核内の、２つの第６番染色体間のロバートソン転座によって形成された二腕染色体を有するＧＦＰネガティブＣＥＣ（ｔｇ／ｔｇ）ハイブリッド細胞、ならびに正常第６番染色体の、染色体ペインティング。
【図１１ｆｇ】図１１は、ハイブリッド細胞核中のＥＳ由来第６番染色体対を標的とする除去を示す。ｆ．第６番染色体上の、ＣＥＣ６（緑点）およびマーカー遺伝子座の位置。ｇ．第６番染色体上の３つのマーカー遺伝子座を用いたゲノムＰＣＲ分析による、第６番染色体の起源の決定。
【図１１ｈ】図１１は、ハイブリッド細胞核中のＥＳ由来第６番染色体対を標的とする除去を示す。ｈ．多型産物のＲＴ−ＰＣＲ分析による、Ｎａｎｏｇ  およびＳｔｅｌｌａ／ＰＧＣ７転写物の起源の決定。
【図１１ｉ】図１１は、ハイブリッド細胞核中のＥＳ由来第６番染色体対を標的とする除去を示す。ｉ．ＥＳ由来の第６番染色体を欠くハイブリッド細胞におけるＮＡＮＯＧおよびＯＣＴ４の発現（免疫組織化学染色）。
【図１１ｊ】図１１は、ハイブリッド細胞核中のＥＳ由来第６番染色体対を標的とする除去を示す。ｊ．ウェスタンブロットハイブリダイゼーションによるＣｒｅ後ハイブリッド細胞における、ＮＡＮＯＧの発現レベル。
【配列表の説明】
【００２７】
配列番号１は、ｌｏｘＰ配列である。
配列番号２は、ＩＲＥＳ配列である。
配列番号３は、ＣＡＧ配列である。
配列番号４は、ＦＲＴ部位である。
配列番号５は、ａｔｔＢ配列である。
配列番号６は、ａｔｔＰ配列である。
配列番号７は、グリーン蛍光タンパク質の配列である。
配列番号８は、グリーン蛍光タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号９は、ピューロマイシン抵抗性付与遺伝子のコード配列である。
配列番号１０は、ピューロマイシン抵抗性付与遺伝子のアミノ酸配列である。
配列番号１１は、ＣＥＣ全配列である。
配列番号１２は、Ｄ６Ｍｉｔ１８３、プライマー１：５’−ＴＴＣＴＣＡＡＴＧＡＡＣＡＣＴＡＧＡＡＣＡＴＴＣＧ−３’である。
配列番号１３は、Ｄ６Ｍｉｔ１８３、プライマー２：５’−ＡＡＡＡＣＡＣＡＧＧＴＡＧＡＡＡＡＣＡＴＡＣＡＴＡＣＡ−３’である。
配列番号１４は、Ｄ６Ｍｉｔ１０２、プライマー１：５’−ＣＣＡＴＧＴＧＧＡＴＡＴＣＴＴＣＣＣＴＴＧ−３’である。
配列番号１５は、Ｄ６Ｍｉｔ１０２、プライマー２：５’−ＧＴＡＴＡＣＣＣＡＧＴＴＧＴＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＴＧ−３’である。
配列番号１６は、Ｄ６Ｍｉｔ１４、プライマー１：５’−ＡＴＧＣＡＧＡＡＡＣＡＴＧＡＧＴＧＧＧＧ−３’である。
配列番号１７は、Ｄ６Ｍｉｔ１４、プライマー２：５’−ＣＡＣＡＡＧＧＣＣＴＧＡＴＧＡＣＣＴＣＴ−３’である。
配列番号１８は、ＧＦＰ  Ｆプライマー：５’−ＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡ−３’である。
配列番号１９は、ＧＦＰ  Ｒプライマー：５’−ＣＧＣＴＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴ−３’である。
配列番号２０は、Ｎａｎｏｇ  Ｆ１プライマー：５’−ＧＣＧＣＡＴＴＴＴＡＧＣＡＣＣＣＣＡＣＡ−３’である。
配列番号２１は、Ｎａｎｏｇ  Ｒ１プライマー：５’−ＧＴＴＣＴＡＡＧＴＣＣＴＡＧＧＴＴＴＧＣ−３’である。
配列番号２２は、Ｓｔｅｌｌａ／ＰＧＣ７  Ｆプライマー：５’−ＡＣＡＧＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＡＡＴＴＧＧ−３’である。
配列番号２３は、Ｓｔｅｌｌａ／ＰＧＣ７  Ｒプライマー：５’−ＧＧＡＡＡＴＴＡＧＡＡＣＧＴＡＣＡＴＡＣＴＣＣ−３’である。
配列番号２４は、Ｇ３ｐｄｈ  Ｆプライマー：５’−ＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＴＧＴＧＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＣ−３’である。
配列番号２５は、Ｇ３ｐｄｈ  Ｒプライマー：５’−ＣＡＴＧＴＡＧＧＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣ−３’である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。【００２９】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．ＡｓｓｏｃｉａｔＥＳａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。【００３０】
（用語の説明）
以下に本明細書において使用される用語を説明する。【００３１】
（細胞生物学）
本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞であっても、人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞）であってもよい。【００３２】
本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能を有し、多分化能（すなわち多能性）（「ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ」）を有する細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。本明細書では幹細胞は、ＥＳ細胞または組織幹細胞（組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）であり得るがそれらに限定されない。また、上述の能力を有している限り、人工的に作製した細胞（たとえば、本明細書において記載される融合細胞、再プログラム化された細胞など）もまた、幹細胞であり得る。ＥＳ細胞とは初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。ＥＳ細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒトＥＳ細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。組織幹細胞は、ＥＳ細胞とは異なり、分化の方向が限定されている細胞であり、組織中の特定の位置に存在し、未分化な細胞内構造をしている。従って、組織幹細胞は多能性のレベルが低い。組織幹細胞は、核／細胞質比が高く、細胞内小器官が乏しい。組織幹細胞は、概して、多分化能を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維持する。本明細書において使用される場合は、幹細胞は好ましくはＥＳ細胞であり得るが、状況に応じて組織幹細胞も使用され得る。【００３３】
由来する部位により分類すると、組織幹細胞は、例えば、皮膚系、消化器系、骨髄系、神経系などに分けられる。皮膚系の組織幹細胞としては、表皮幹細胞、毛嚢幹細胞などが挙げられる。消化器系の組織幹細胞としては、膵（共通）幹細胞、肝幹細胞などが挙げられる。骨髄系の組織幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。神経系の組織幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙げられる。【００３４】
本明細書において「体細胞」とは、卵子、精子などの生殖細胞以外の細胞であり、そのＤＮＡを次世代に直接引き渡さない全ての細胞をいう。体細胞は通常、多能性が限定されているかまたは消失している。本明細書において使用される体細胞は、天然に存在するものであってもよく、遺伝子改変されたものであってもよい。【００３５】
細胞は、由来により、外胚葉、中胚葉および内胚葉に由来する幹細胞に分類され得る。外胚葉由来の細胞は、主に脳に存在し、神経幹細胞などが含まれる。中胚葉由来の細胞は、主に骨髄に存在し、血管幹細胞、造血幹細胞および間葉系幹細胞などが含まれる。内胚葉由来の細胞は主に臓器に存在し、肝幹細胞、膵幹細胞などが含まれる。本明細書では、体細胞はどのような胚葉由来でもよい。好ましくは、体細胞は、リンパ球、脾臓細胞または精巣由来の細胞、骨髄細胞が使用され得る。【００３６】
本明細書において「単離された」とは、通常の環境において天然に付随する物質が少なくとも低減されていること、好ましくは実質的に含まないことをいう。従って、単離された細胞とは、天然の環境において付随する他の物質（たとえば、他の細胞、タンパク質、核酸など）を実質的に含まない細胞をいう。核酸またはポリペプチドについていう場合、「単離された」とは、たとえば、組換えＤＮＡ技術により作製された場合には細胞物質または培養培地を実質的に含まず、化学合成された場合には前駆体化学物質またはその他の化学物質を実質的に含まない、核酸またはポリペプチドを指す。単離された核酸は、好ましくは、該核酸が由来する生物において天然に該核酸に隣接している（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列（即ち、該核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。【００３７】
本明細書において、「樹立された」または「確立された」細胞とは、特定の性質（例えば、多分化能）を維持し、かつ、細胞が培養条件下で安定に増殖し続けるようになった状態をいう。したがって、樹立された幹細胞は、多分化能を維持する。本発明では、樹立された幹細胞を使用することは、宿主から新たに幹細胞を採取するという工程を回避することができるので好ましい。【００３８】
本明細書において、「非胚性」とは、初期胚に直接由来しないことをいう。従って、初期胚以外の身体部分に由来する細胞がこれに該当するが、ＥＳ細胞に改変（例えば、遺伝的改変、融合など）を加えて得られる細胞もまた、非胚性細胞の範囲内にある。【００３９】
本明細書において「分化（した）細胞」とは、機能および形態が特殊化した細胞（例えば、筋細胞、神経細胞など）をいい、幹細胞とは異なり、多能性はないか、またはほとんどない。分化した細胞としては、例えば、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられる。従って、本発明の１つの実施形態において、ある分化細胞を本発明の再プログラム化因子で処理することによって（例えば、ＷＯ０３／０２７２７７、ＷＯ０３／０２７２７８などを参照）、多能性を獲得することができる場合、そのような分化細胞もまた本発明における体細胞としてまたはその代わりに使用され得る。【００４０】
本明細書において、「分化」または「細胞分化」とは、１個の細胞の分裂によって由来した娘細胞集団の中で形態的および／または機能的に質的な差をもった二つ以上のタイプの細胞が生じてくる現象をいう。従って、元来特別な特徴を検出できない細胞に由来する細胞集団（細胞系譜）が、特定のタンパク質の産生などはっきりした特徴を示すに至る過程も分化に包含される。現在では細胞分化を，ゲノム中の特定の遺伝子群が発現した状態と考えることが一般的であり、このような遺伝子発現状態をもたらす細胞内あるいは細胞外の因子または条件を探索することにより細胞分化を同定することができる。細胞分化の結果は原則として安定であって、特に動物細胞では，別のタイプの細胞に分化することは例外的にしか起こらない。従って、本発明におけるような後天的に生じた多能性細胞の遺伝子改変を容易に行えるようになったことは非常に価値が高い。【００４１】
本明細書において「多能性」または「多分化能」とは、互換可能に用いられ、細胞の性質をいい、１以上、好ましくは２以上の種々の組織または臓器に分化し得る能力をいう。従って、「多能性」および「多分化能」は、本明細書においては特に言及しない限り「未分化」と互換可能に用いられる。通常、細胞の多能性は発生が進むにつれて制限され、成体では一つの組織または器官の構成細胞が別のものの細胞に変化することは少ない。従って多能性は通常失われている。とくに上皮性の細胞は他の上皮性細胞に変化しにくい。これが起きる場合通常病的な状態であり、化生（ｍｅｔａｐｌａｓｉａ）と呼ばれる。しかし間葉系細胞では比較的単純な刺激で他の間葉性細胞にかわり化生を起こしやすいので多能性の程度は高い。ＥＳ細胞は、多能性を有する。組織幹細胞は、多能性を有する。本明細書において、多能性のうち、受精卵のように生体を構成する全ての種類の細胞に分化する能力は全能性といい、多能性は全能性の概念を包含し得る。ある細胞が多能性を有するかどうかは、たとえば、体外培養系における、胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  Ｂｏｄｙ）の形成、分化誘導条件下での培養等が挙げられるがそれらに限定されない。また、生体を用いた多能性の有無についてのアッセイ法としては、免疫不全マウスへの移植による奇形種（テラトーマ）の形成、胚盤胞への注入によるキメラ胚の形成、生体組織への移植、腹水への注入による増殖等が挙げられるがそれらに限定されない。【００４２】
本発明で用いられる細胞は、どの生物由来の細胞（たとえば、任意の種類の多細胞生物（例えば、動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物）、植物（たとえば、単子葉植物、双子葉植物など）など））でもよい。好ましくは、脊椎動物（たとえば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）由来の細胞が用いられ、より好ましくは、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）由来の細胞が用いられる。さらに好ましくは、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞が用いられる。最も好ましくはヒト由来の細胞が用いられる。【００４３】
本発明が対象とする臓器はどのような臓器でもよく、また本発明が対象とする組織または細胞は、生物のどの臓器または器官に由来するものでもよい。本明細書において「臓器」または「器官」とは、互換可能に用いられ、生物個体のある機能が個体内の特定の部分に局在して営まれ，かつその部分が形態的に独立性をもっている構造体をいう。一般に多細胞生物（例えば、動物、植物）では器官は特定の空間的配置をもついくつかの組織からなり、組織は多数の細胞からなる。そのような臓器または器官としては、血管系に関連する臓器または器官が挙げられる。１つの実施形態では、本発明が対象とする臓器は、皮膚、血管、角膜、腎臓、心臓、肝臓、臍帯、腸、神経、肺、胎盤、膵臓、脳、四肢末梢、網膜などが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明の多能性細胞から分化した細胞としては、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられるがそれらに限定されない。【００４４】
本明細書において「組織」（ｔｉｓｓｕｅ）とは、多細胞生物において、実質的に同一の機能および／または形態をもつ細胞集団をいう。通常「組織」は、同じ起源を有するが、異なる起源を持つ細胞集団であっても、同一の機能および／-または形態を有するのであれば、組織と呼ばれ得る。従って、本発明の幹細胞を用いて組織を再生する場合、２以上の異なる起源を有する細胞集団が一つの組織を構成し得る。通常、組織は、臓器の一部を構成する。動物の組織は，形態的、機能的または発生的根拠に基づき、上皮組織、結合組織、筋肉組織、神経組織などに区別される。植物では、構成細胞の発達段階によって分裂組織と永久組織とに大別され、また構成細胞の種類によって単一組織と複合組織とに分けるなど、いろいろな分類が行われている。【００４５】
（分子生物学、遺伝子操作）
本発明の方法では、細胞に遺伝子構築物またはベクターが導入される。【００４６】
本明細書において、「遺伝子構築物」、「核酸構築物」または「遺伝子カセット」とは、交換可能に用いられ、遺伝子をコードする核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）と、これに必要に応じて作動可能に（すなわち、その核酸の発現を制御し得るように）連結された制御配列（例えば、プロモーター）とを含む核酸配列、ならびに、必要に応じて制御配列（例えば、プロモーター）と、これに作動可能に（すなわち、インフレームに）連結された異種遺伝子とを含む核酸分子をいう。このカセットまたは構築物は、必要に応じて他の調節エレメントと組み合わせて使用することもまた、本発明の範囲に含まれる。好ましい発現カセットは、特定の制限酵素で切断され、容易に回収され得る遺伝子カセットまたは核酸構築物である。【００４７】
そのような遺伝子構築物またはベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡなどの核酸分子を導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換などが挙げられる（例えば、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．およびその第三版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。【００４８】
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」または「組み換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。【００４９】
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡなどの核酸分子を導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）、リポフェクション法、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法が挙げられる。【００５０】
本明細書において「遺伝子導入試薬」とは、核酸（通常遺伝子をコードするが、それに限定されない）の導入方法において、導入効率を促進するために用いられる試薬をいう。そのような遺伝子導入試薬としては、例えば、カチオン性高分子、カチオン性脂質、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬、リン酸カルシウムなどが挙げられるがそれらに限定されない。トランスフェクションの際に利用される試薬の具体例としては、種々なソースから市販されている試薬が挙げられ、例えば、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ｃａｔ．ｎｏ．３０１４２５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＴｒａｎｓＦａｓｔＴＭ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２４３１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ），ＴｆｘＴＭ−２０  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２３９１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ），ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１３０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＰｏｌｙＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１１０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（１１６６８−０１９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＣＡ），ＪｅｔＰＥＩ（×４）ｃｏｎｃ．（１０１−３０，Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）およびＥｘＧｅｎ  ５００（Ｒ０５１１，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ．，ＭＤ）などが挙げられるがそれらに限定されない。本発明においては、本発明の核酸分子を細胞に導入する際にこのような遺伝子導入試薬が使用され得る。【００５１】
原核細胞に対する「組み換えベクター」としては、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓより市販）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＧＥＭＥＸ−１［Ｐｒｏｍｅｇａ］、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＴｒｓ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）、ｐＴｒｓ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）、ｐＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４００）、ｐＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  Ｂ−６７９８）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＥＧ４００［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）］、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＴｒｘＦｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＡＬ−ｃ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（宝酒造）、ｐＵＣ１１８（宝酒造）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）などが例示される。本明細書において原核生物細胞は、遺伝子を操作するときに主に用いられる。【００５２】
本明細書において動物細胞に対する「組み換えベクター」としては、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（いずれもフナコシより市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３）］、マウス幹細胞ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉｒｕｓ）（ＭＳＣＶ）に基づいたレトロウイルス型発現ベクターなどが例示される。【００５３】
本発明において使用される「レトロウイルスベクター」としては、例えば、Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ（ＭＭＬＶ）、  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉｒｕｓ（ＭＳＣＶ）にもとづいたレトロウイルス型発現ベクターなどが挙げられるがそれらに限定されない。【００５４】
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。【００５５】
本発明において遺伝子操作などにおいて原核生物細胞が使用される場合、原核生物細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属などに属する原核生物細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｄ−０１１０などが例示される。【００５６】
本明細書において使用される場合、動物細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト白血病細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ヒト結腸癌細胞株などを挙げることができる。マウス・ミエローマ細胞としては、ｐｓ２０、ＮＳＯなど、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０など、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）など、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１など、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ヒト結腸癌細胞株としてはＨＣＴ−１５などが例示される。【００５７】
本明細書において、レトロウイルスの感染方法は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  前出（特にＵｎｉｔｓ  ９．９−９．１４）などに記載されるように、当該分野において周知であり、例えば、トリプシナイズしてＥＳ細胞を単一細胞懸濁物（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）にした後、ウイルス産生細胞（ｖｉｒｕｓ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）（パッケージング細胞株＝ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ）の培養上清と一緒に１−２時間共培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）することにより、十分量の感染細胞を得ることができる。【００５８】
本明細書において遺伝子発現（たとえば、ｍＲＮＡ発現、ポリペプチド発現）の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００２  Ｄｅｃ；３２  Ｓｕｐｐｌ：５２６−３２に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔  羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。【００５９】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど遺伝子産物の「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一形態であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。【００６０】
本明細書において「発現量」とは、目的の細胞などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。【００６１】
従って、本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」または「発現量」の「減少」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に減少することをいう。好ましくは、発現の減少は、ポリペプチドの発現量の減少を含む。本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」または「発現量」の「増加」とは、細胞内に遺伝子発現に関連する因子（例えば、発現されるべき遺伝子またはそれを調節する因子）を導入したときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に増加することをいう。好ましくは、発現の増加は、ポリペプチドの発現量の増加を含む。本明細書において遺伝子の「発現」の「誘導」とは、ある細胞にある因子を作用させてその遺伝子の発現量を増加させることをいう。したがって、発現の誘導は、まったくその遺伝子の発現が見られなかった場合にその遺伝子が発現するようにすること、およびすでにその遺伝子の発現が見られていた場合にその遺伝子の発現が増大することを包含する。【００６２】
本明細書において、遺伝子が「特異的に発現する」とは、その遺伝子が、特定の部位または時期において他の部位または時期とは異なる（好ましくは高い）レベルで発現されることをいう。特異的に発現するとは、ある部位（特異的部位）にのみ発現してもよく、それ以外の部位においても発現していてもよい。好ましくは特異的に発現するとは、ある部位においてのみ発現することをいう。本発明によって生物または細胞に導入される遺伝子は、特異的に発現するように改変されていてもよい。【００６３】
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含される。例えば、コラーゲンがそのリガンドと相互作用する場合、その生物学的活性は、結合体の形成または他の生物学的変化を包含する。別の好ましい実施形態では、そのような生物学的活性は、遺伝子転位活性などであり得る。遺伝子転位活性は、その目的とする遺伝子をコードする配列の移動を任意の方法によって確認することによって判定され得る。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（本明細書において引用）などを参照）。【００６４】
（生化学・分子生物学）
本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子（たとえば、プロモーター）という。本明細書では、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含する。したがって、例えば、レコンビナーゼ遺伝子というときは、通常、レコンビナーゼの構造遺伝子およびレコンビナーゼのプロモーターの両方を包含するが、本発明の目的を達成することができる限り、構造遺伝子またはその改変体のみをさしてもよい。本明細書において通常、遺伝子とは、調節領域、コード領域、エキソン、イントロンを含む。【００６５】
本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／または「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を指すことがある。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現された「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／または「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を包含する。当業者であれば、遺伝子産物が何たるかはその状況に応じて理解することができる。したがって、通常、本明細書において、遺伝子は、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含し、またその長さに何ら制限されるものではない。従って、本発明の遺伝子には、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、およびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（センス鎖）、ならびにそのセンス鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖）、およびそれらのフラグメントのいずれもが含まれる。【００６６】
本明細書において配列（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、配列（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて同一性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、同一性と類似性とは同じ数値を示す。【００６７】
本明細書では、特に言及しない限り、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴにおいてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９  （２００４．５．１２  発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。【００６８】
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）を包含する。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。タンパク質の遺伝子産物は、通常ポリペプチド形態をとるが、同様の機能を有する限り、ポリペプチドの改変体であってもよい。特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、そのフラグメント、同族体、誘導体、改変体を含む。【００６９】
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸分子」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。タンパク質などをコードする遺伝子は、通常、このポリヌクレオチド形態をとる。【００７０】
本明細書において「ヌクレオチド」は、糖部分がリン酸エステルになっているヌクレオシドをいい、ＤＮＡ、ＲＮＡなどを含み、天然のものでも非天然のものでもよい。ここで、ヌクレオシドは、塩基と糖とがＮ−グリコシド結合をした化合物をいう。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡを含む。【００７１】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。このように、本発明において使用される細胞は、改変された核酸またはポリペプチドを含んでいてもよい。【００７２】
１つの実施形態において、改変体は、天然に存在する対立遺伝子変異体、天然に存在しない変異体、欠失、置換、付加、および／または挿入がなされた変異体；コードされるポリペプチドの機能を実質的に変更しないポリヌクレオチド配列を意味し得る。【００７３】
１つの実施形態において、これらアミノ酸配列の改変（変異等）は、天然において、例えば変異、翻訳後の修飾等により生じることもあるが、天然由来の遺伝子（例えば本発明の具体例遺伝子）を利用して人為的にこれを行なうこともできる。  【００７４】
１つの実施形態において、上記ポリペプチドは、対立遺伝子変異体、ホモログ、天然の変異体で少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９７％相同なものを含む。【００７５】
本明細書において、「対応する」アミノ酸または核酸とは、それぞれあるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸と同様の作用を有するか、あるいは有することが予測されるアミノ酸または核酸をいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、あるトランスポゾン配列であれば、そのトランスポゾン配列の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。【００７６】
本明細書において、「対応する」遺伝子（例えば、核酸分子、ポリペプチドなど）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子の対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログあるいは種相同体であり得る。したがって、マウスレコンビナーゼなどに対応する遺伝子は、他の動物においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、マウスレコンビナーゼなど）の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えばヒト、ラット、イヌ、ネコ）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。このような対応する遺伝子は、ゲノムデータベースを利用すれば、当業者は容易に得ることができる。そのようなゲノム配列の入手方法は、当該分野において周知であり、本明細書において他の場所に記載される。本発明では、このような検索によって得られた配列も利用可能である。【００７７】
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能（例えば、マウスレコンビナーゼなどの機能）を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。【００７８】
本明細書において使用される用語「生体分子」とは、生体に関連する分子をいう。【００７９】
本明細書において「生体」とは、生物学的な有機体をいい、動物、植物、菌類、ウイルスなどを含むがそれらに限定されない。従って、本明細書では生体分子は、生体から抽出される分子を包含するが、それに限定されず、生体に影響を与え得る分子であれば生体分子の定義に入る。したがって、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（たとえば、低分子リガンドなど）もまた生体への効果が意図され得るかぎり、生体分子の定義に入る。そのような生体分子には、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカライド、オリゴサッカライド、脂質、低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子など）、これらの複合分子（糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質など）などが包含されるがそれらに限定されない。生体分子にはまた、細胞への導入が企図される限り、細胞自体、組織の一部も包含され得る。通常、生体分子は、核酸、タンパク質、脂質、糖、プロテオリピッド、リポプロテイン、糖タンパク質およびプロテオグリカンなどであり得る。好ましくは、生体分子は、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）またはタンパク質を含む。別の好ましい実施形態では、生体分子は、核酸（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ、あるいはＰＣＲなどによって合成されたＤＮＡ）である。他の好ましい実施形態では、生体分子はタンパク質であり得る。好ましくは、そのような生体分子は、ホルモンまたはサイトカインであり得る。【００８０】
本明細書において、「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよび  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本発明では、このような検索によって同定されたレコンビナーゼ配列などもまた、使用され得る。【００８１】
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、および５０％  ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ），Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。【００８２】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。【００８３】
本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍ  ナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。【００８４】
本明細書において「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍ  ナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）での洗浄において、これは、約６％不一致を許容にする。より離れた関連する配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。【００８５】
約２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１Ｍ  ＮａＣｌにおける融解温度の適切な概算は、
Ｔｍ＝（１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃）＋（１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃）
によって提供される。なお、６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである（Ｓｕｇｇｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ、６８３頁、ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（編）（１９８１）を参照のこと）。【００８６】
レコンビナーゼもしくはレコンビナーゼ認識配列またはその改変体もしくはフラグメントなどのタンパク質をコードする天然の核酸および本発明で使用されるプロモーター配列などは、例えば、実施例において使用され、例示される核酸配列（例えば、配列番号１など）の全部もしくは部またはその改変体を含むＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを有するｃＤＮＡライブラリーから容易に分離される。好ましいレコンビナーゼもしくはレコンビナーゼ認識配列またはその改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸は、本質的に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；４２℃の温度で７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に２×ＳＳＣ（６００ｍＭ  ＮａＣｌ；６０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；５０℃の０．１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、さらに好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；  ７％  ＳＤＳ  を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に５０℃の１×ＳＳＣ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ；３０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、最も好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；２００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に６５℃の０．５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；０．１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下に、例えば、標的となる配列番号１などに示される核酸配列の１つまたはその一部とハイブリダイズし得る。【００８７】
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の対象となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチドなどが挙げられるがそれに限定されない。【００８８】
通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同なまたは相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。このようなプローブを用いて本発明において使用され得るトランスポゾンを得ることができる。【００８９】
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。【００９０】
遺伝子工学分野において通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、１６の連続するヌクレオチド長の、１７の連続するヌクレオチド長の、１８の連続するヌクレオチド長の、１９の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。このようなプライマーを用いて本発明に用いるトランスポゾンを作製することができる。【００９１】
本明細書においてある核酸分子またはポリペプチドに「特異的に結合する因子」とは、その核酸分子またはポリペプチドに対するその因子の結合レベルが、その核酸分子またはポリペプチド以外の核酸分子またはポリペプチドに対するその因子の結合レベルと同じかまたはそれよりも高い因子をいう。そのような因子としては、例えば、対象が核酸分子の場合、対象となる核酸分子に対して相補的な配列を有する核酸分子、対象となる核酸配列に対して結合するポリペプチド（例えば、転写因子など）などが挙げられ、対象がポリペプチドの場合、抗体、単鎖抗体、レセプター−リガンドの対のいずれか一方、酵素−基質のいずれか一方などが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、このような特異的に結合する因子（例えば、カルシウムに特異的に結合する因子、特定の遺伝子産物に対する抗体など）は、シグナル伝達を測定する際に利用され得る。【００９２】
本明細書において「因子」（ａｇｅｎｔ）としては、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。【００９３】
本明細書中で使用される「接触（させる）」とは、化合物を、直接的または間接的のいずれかで、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して物理的に近接させることを意味する。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、多くの緩衝液、塩、溶液などに存在し得る。接触とは、核酸分子またはそのフラグメントをコードするポリペプチドを含む、例えば、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマイクロアレイ（例えば、遺伝子チップ）などに化合物を置くことが挙げられる。【００９４】
あるタンパク質分子において、配列に含まれるあるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。【００９５】
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。【００９６】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。【００９７】
親水性指数もまたアミノ酸配列の改変の際に考慮することができる。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。【００９８】
（キット）
本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、試薬、粒子など）が提供されるユニットをいう。本発明では、例えば、遺伝子カセットなどがキット形態で製品として供給されるか、あるいは、細胞などがライブラリーとして提供される。細胞がキットとして提供される場合は、凍結などの保存方法により保存された状態で提供され得る。混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、試薬、粒子など）をどのように処理すべきかを記載する説明書を備えていることが有利である。このような説明書は、どのような媒体であってもよく、例えば、そのような媒体としては、紙媒体、伝送媒体、記録媒体などが挙げられるがそれらに限定されない。伝送媒体としては、例えば、インターネット、イントラネット、エクストラネット、ＬＡＮなどが挙げられるがそれらに限定されない。記録媒体としては、ＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−Ｒ、フレキシブルディスク、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ＭＤ、ミニディスク、ＭＯ、メモリースティックなどが挙げられるがそれらに限定されない。【００９９】
（トランスジェニック生物）
トランスジェニックマウスを作製するための一般的な技術は、例えば、国際公開ＷＯ０ｌ／１３１５０（Ｌｕｄｗｉｇ  Ｉｎｓｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）に記載されている。米国特許第４，８７３，１９ｌ号（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａ１．）は、哺乳動物接合体へのＤＮＡのマイクロインジェクションによって得られた、外因性ＤＮＡを有する哺乳動物を教示している。これらの技術において、レコンビナーゼを利用した本発明を応用することができる。【０１００】
このほかにもまた、トランスジェニック生物を作り出すための様々な方法は、例えば、Ｍ．Ｍａｒｋｋｕｌａら、Ｒｅｖ．Ｒｅｐｒｏｄ．，１，９７−１０６（１９９６）；Ｒ．Ｔ．ＷａｌｌらＪ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．，８０，２２１３−２２２４（１９９７）；Ｊ．Ｃ．Ｄａｌｔｏｎ、ら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，４１１，４１９−４２８（１９９７）；およびＨ．Ｌｕｂｏｎら、Ｔｒａｎｓｆｕｓ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．，１０，１３１−１４３（１９９６）などが挙げられるがそれらに限定されない。これらの文献の各々は、本明細書において参考として援用される。【０１０１】
そのような中、最近遺伝子機能の解析を目的として、胚性幹（ＥＳ）細胞の相同組換えを介したトランスジェニック（ノックアウト、ノックインを含む）動物の解析が重要な手段となってきている。【０１０２】
高等生物では、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を用いる陽性選択およびＨＳＶのチミジンキナーゼ遺伝子またはジフテリア毒素遺伝子を用いる陰性選択により組換え体の効率的な選別が行われている。ＰＣＲまたはサザンブロット法により相同組換え体の選択が行われる。すなわち、標的遺伝子の一部を陽性選択用のネオマイシン耐性遺伝子等で置換し、その末端に陰性選択用のＨＳＶＴＫ遺伝子等を連結したターゲティングベクターを作成し、エレクトロポレーションによりＥＳ細胞に導入し、Ｇ４１８およびガンシクロビルの存在下で選択して、生じたコロニーを単離し、さらにＰＣＲまたはサザンブロットにより相同組換え体を選択する。【０１０３】
このように、内在する標的遺伝子を置換または破壊して、機能が喪失したかまたは変更された変異を有するトランスジェニック（標的遺伝子組換え）マウスを作製する方法は、標的とした遺伝子だけに変異が導入されるので、その遺伝子機能の解析に有用である。【０１０４】
所望の相同組換え体を選択した後、得られた組換えＥＳ細胞を胚盤注入法または集合キメラ法により正常な胚と混合してＥＳ細胞と宿主胚とのキメラマウスを作製する。胚盤注入法では、ＥＳ細胞を胚盤胞にガラスピペットで注入する。集合キメラ法では、ＥＳ細胞の塊と透明帯を除去した８細胞期の胚とを接着させる。ＥＳ細胞を導入した胚盤胞を偽妊娠させた代理母の子宮に移植してキメラマウスを得る。ＥＳ細胞は、全能性を有するので、生体内では、生殖細胞を含め、あらゆる種類の細胞に分化することができる。ＥＳ細胞由来の生殖細胞を有するキメラマウスと正常マウスを交配させるとＥＳ細胞の染色体をヘテロに有するマウスが得られ、このマウス同士を交配するとＥＳ細胞の改変染色体をホモに有するトランスジェニックマウスが得られる。得られたキメラマウスから改変染色体をホモに有するトランスジェニックマウスを得るには、雄性キメラマウスと雌性野生型マウスとを交配して、Ｆ１世代のヘテロ接合体マウスを産出させ、生まれた雄性および雌性のヘテロ接合体マウスを交配して、Ｆ２世代のホモ接合体マウスを選択する。Ｆ１およびＦ２の各世代において所望の遺伝子変異が導入されているか否かは、組換えＥＳ細胞のアッセイと同様に、サザンブロッティング、ＰＣＲ、塩基配列の解読など当該分野において慣用される方法を用いて分析され得る。【０１０５】
本明細書において使用されるゲノムまたは遺伝子座などを除去する方法において用いられる、Ｃｒｅ酵素の一過的発現、染色体上でのＤＮＡマッピングなどは、細胞工学別冊実験プロトコールシリーズ「ＦＩＳＨ実験プロトコール  ヒト・ゲノム解析から染色体・遺伝子診断まで」松原謙一、吉川  寛  監修  秀潤社（東京）などに記載されるように、当該分野において周知である。【０１０６】
そのため、多様な遺伝子機能を選択的に解析することができないという問題を克服する次世代技術として、Ｃｒｅレコンビナーゼの細胞種特異的発現とＣｒｅ−ｌｏｘＰの部位特異的組み換えを併用する技術が注目されている。Ｃｒｅ−ｌｏｘＰを用いるトランスジェニックマウスは、標的遺伝子の発現を阻害しない位置にネオマイシン耐性遺伝子を導入し、後に削除するエキソンをはさむようにしてｌｏｘＰ配列を挿入したターゲティングベクターをＥＳ細胞に導入し、その後相同組換え体を単離する。この単離したクローンからキメラマウスを得、遺伝子改変マウスが作製される。次に、大腸菌のＰ１ファージ由来の部位特異的組換え酵素Ｃｒｅを組織特異的に発現するトランスジェニックマウスとこのマウスを交配させると、Ｃｒｅを発現する組織中でのみ遺伝子が破壊される（ここでは、Ｃｒｅは、ｌｏｘＰ配列（約３４ｂｐ）を特異的に認識して、２つのｌｏｘＰ配列にはさまれた配列で組換えを起こさせ、これが破壊される）。臓器特異的なプロモーターに連結したＣｒｅ遺伝子を有するトランスジェニックマウスと交配させるか、またはＣｒｅ遺伝子を有するウイルスベクターを使用して、成体でＣｒｅを発現させることができる。【０１０７】
本明細書において、「レコンビナーゼ」とは、組み換え酵素ともいい、ＤＮＡ上の特定配列（例えば、Ｃｒｅレコンビナーゼの場合、ｌｏｘＰという配列）を認識し、その部分の組み換えを促進させる酵素をいう。レコンビナーゼとしては、例えば、Ｃｒｅレコンビナーゼなどを挙げることができる。このほかに、使用され得るレコンビナーゼとしては、例えば、φＣ３１（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＣ＿００１９７８；ＧＩ：４０８０７２８５）を挙げることができるがこれらに限定されない。【０１０８】
本明細書において「レコンビナーゼ認識配列」とは、少なくとも１つのレコンビナーゼによって認識される配列をいい、そのような配列は、レコンビナーゼに通常特異的である。そのような認識配列は、以下のようにして決定することができる：サザンハイブリダイゼーション解析、ＰＣＲ産物のＤＮＡ塩基配列などが挙げられる。そのような認識配列としては、例えば、ｌｏｘＰ配列、ＦＲＴ部位、ａｔｔＢ配列，ａｔｔＰ配列およびｒｅｓ部位配列を挙げることができるがそれらに限定されない。そのような認識配列の具体的配列は以下の通りである：
ＬｏｘＰ配列
ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ（配列番号１）
ＦＲＴ部位
ＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＡＡＧＴＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＣ（配列番号４）
ａｔｔＢ配列
ＴＣＧＡＧＴＧＡＧＧＴＧＧＡＧＴＡＣＧＣＧＣＣＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＡＣＧＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＧＣＡ（配列番号５）
ａｔｔＰ配列
ＣＴＡＧＡＣＣＣＴＡＣＧＣＣＣＣＣＡＡＣＴＧＡＧＡＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＴＴＡＣＣＣＣＡＧＴＴＧＧＧＧＣＡＣＧ（配列番号６）。【０１０９】
このようなレコンビナーゼ認識配列は、上記配列のすべてを含んでいてもよく、レコンビナーゼに認識される限り、これらの配列に対して、１または複数の置換、付加および／または欠失を含んでいても良い。あるいは、レコンビナーゼと一定の条件下で任意の配列のライブラリーを用いてスクリーニングすることによって別のレコンビナーゼ認識配列を作製することも可能である。【０１１０】
本明細書において「逆方向」とは、レコンビナーゼ認識配列について用いられるとき、あるレコンビナーゼ認識配列が二本鎖ＤＮＡの一方に配置されているとき、他方の鎖にレコンビナーゼ認識配列が配置されていることをいう。好ましくは、実質的に相同な配列が、一方の鎖に５’から３’向きに、他方の鎖に５’から３’向きに配置されている。より好ましくは、同一の配列が一方の鎖に５’から３’向きに、他方の鎖に５’から３’向きに配置されている。【０１１１】
従来、レコンビナーゼ認識配列は、レコンビナーゼの活性を発揮させ、その結果、組み換えが起こるためには、同一方向に２つ以上必要であると考えられてきたが、本発明により、逆方向に複数または１つのみのレコンビナーゼ認識配列を使用することによって、所望の染色体の欠失を起こすことができることが見出された。特に、染色体の欠失が起こった後も、細胞が再生能力を有することは、予想外の発見であった。【０１１２】
特定の遺伝子を解析する方法としてジーントラップ（遺伝子トラップ）法が注目されている。ジーントラップ法では、プロモーターを有しないレポーター遺伝子が細胞に導入され、その遺伝子が偶発的にゲノム上に挿入されると、レポーター遺伝子が発現することを利用して、新規な遺伝子を単離（トラップ）される。ジーントラップ法は、マウス初期胚操作法，胚性幹細胞培養法，相同組換えによる遺伝子ターゲティング法に基づく、効率的な挿入変異と未知遺伝子同定のための方法である（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  ＷＬ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２：７５６−７６８（２００１））。ジーントラップ法では、遺伝子の導入ならびに挿入変異体の選択およびその表現型解析が比較的に容易である。【０１１３】
ジーントラップ法では、例えば、スプライシング／アクセプター配列とポリＡ付加シグナルとの間にｌａｃＺとｎｅｏとの融合遺伝子であるβ−ｇｅｏを連結したジーントラップベクターをＥＳ細胞に導入し、Ｇ４１８で選択すると、ＥＳ細胞で発現している遺伝子を偶然にトラップしたクローンだけが選択される。【０１１４】
このようにして得られたクローンからキメラ胚を作製すると、トラップした遺伝子の発現パターンにより、さまざまなＸ−ｇａｌの染色パターンを示す。このようにして、ジーントラップ法では、未知の遺伝子が単離され、その遺伝子発現パターンが解析され、またその遺伝子が破壊される。【０１１５】
本発明においては、所望のトランスジェニック生物をプレスクリーニングし得る。プレスクリーニングの方法としては、例えばジーントラップ法を用いることができる（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａ１．；Ｎａｔｕｒｅ，３９２：６０８・６１１（１９９８）；Ｇｏｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：４６３−４６５（１９８９）；Ｓｋａ１１ｎｅｓ，ＷＣ．ｅｔ  ａｌ．；Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．６：９０３・９１８（１９９２）；Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．；Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：１５１３−１５２３（１９９１））。このように、プレスクリーニングを行うことにより遺伝子機能の解明に有望な．トランスジェニック生物を予め選抜してその後２世代以上の交配あるいはその他適宜の手段により、１対の染色体の両遺伝子が変異したトランスジェニック生物を得ることができる。【０１１６】
本発明によれば、染色体レベルで除去導入することが可能である。本発明によれば、本発明の新規な生物またはその一部は、染色体レベルでの遺伝子機能解明のための便利なモデルシステムを提供する。本発明のこの実施態様は、生きた動物モデルにおいて遺伝性疾患の研究のための疾患モデルシステムを提供し得る。該システムにおいて、動物モデルにおいて対象となり得る疾患遺伝子としては、ヒト疾患原因遺伝子、または生物におけるその相同遺伝子がｃＤＮＡの遺伝子全長、ｃＤＮＡの遺伝子断片、ゲノムＤＮＡの遺伝子全長、あるいはゲノムＤＮＡの遺伝子断片であるものが挙げられる。疾患原因遺伝子は、生物に導入して、得られたトランスジェニック生物をヒト疾患モデル動物として研究に供し得るものであることが好ましく、特に限定されないが、ヒト疾患原因遺伝子であるのが好ましい。【０１１７】
本明細書において「マーカー遺伝子」とは、形質転換が行われたかどうかを視認などの明示的な方法によって確認させることができるような遺伝子産物をコードする任意の遺伝子をいう。そのようなマーカー遺伝子としては、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、イエロー蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）やレッド蛍光タンパク質（ｄｓＲＥＤ）等を挙げることができるがそれらに限定されない。グリーン蛍光タンパク質の配列は、例えば、配列番号７に示した配列が挙げられる。【０１１８】
本明細書において「選択配列」とは、その配列を含む核酸を細胞に導入したときに、導入していない細胞と導入した細胞との選別を可能にする配列をいい、例えば、抗生物質耐性付与遺伝子などを挙げることができる。そのような選択配列の例としては、例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、ピューロマイシン抵抗性付与遺伝子、ネオマイシン抵抗性付与遺伝子、ハイグロマイシン抵抗性付与遺伝子、ブラストサイジン抵抗性付与遺伝子、ゼオシン抵抗性付与遺伝子、ＨＡＴ抵抗性付与遺伝子、ジフテリアトキシン抵抗性付与遺伝子およびフルオロウラシル抵抗性付与遺伝子を挙げることができるがそれらに限定されない。ピューロマイシン抵抗性付与遺伝子をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号９を挙げることができる。【０１１９】
本明細書において「ＩＲＥＳ配列」または「内部リボソーム進入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）配列」とは、交換可能に用いられ、ポリシストロンとも呼ばれ、ＣＡＰ構造費依存的な翻訳機構に介在する配列をいう。そのようなＩＲＥＳ配列は、種々知られており、データベース化もされている。例えば、以下
http://www.rangueil.inserm.fr/IRESdatabase/
を参照のこと。【０１２０】
本明細書において「ＣＡＧ配列」とは、ＣＡＧが繰り返される配列をいい、通常１０〜３０に反復が見られる。好ましくは、コードする配列にグルタミンの反復があることが好ましい。ＣＡＧの繰り返し配列を持つｍＲＮＡを認識するタンパク質が存在し、このタンパク質は、ＣＡＧの繰り返しが多ければ多いほど、強くｍＲＮＡに結合し、他のタンパク質の発現を調節すると考えられている。【０１２１】
本発明では、本発明のトランスジェニック生物を臓器提供用ドナーとして使用することができる。例えば、ヒトヘの異種間臓器移植のドナーとして考えられる臓器として、具体的には神経細胞、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、角膜、皮膚などが挙げられる。この場合、導入される遺伝子は、例えば異種間での臓器移植に拒絶反応を低減する機能を有する遺伝子あるいは生着率の上昇を期待し得る機能を有する遺伝子が好ましい。【０１２２】
トランスジェニック生物の作製についてはまた、米国特許第５，４６４，７６４号公報；米国特許第５，４８７，９９２号公報；米国特許第５，６２７，０５９号公報；特開２００１−５４３３７号公報；Ｇｏｓｓｌｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４，４６３−４６５；Ｗｕｒｓｔ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３９，８８９−８９９；Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ、Ｂ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ  ３９２，６０８−６１１Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８６，８９３２−８９３５，１９８９；Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４２，４３５−４３８，１９８９；村松正實、山本雅編集、『実験医学別冊  新訂  遺伝子工学ハンドブック  改訂第３版』（１９９９年、羊土社発行）中特に２３９から２５６頁；相沢慎一（１９９５）実験医学別冊「ジーンターゲティング−ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製」などが挙げられるがそれらに限定されない。【０１２３】
本明細書において、「ノックアウト」とは、遺伝子について言及されるとき、その遺伝子を破壊（欠損）または機能不全にさせることをいう。従って、ノックアウトの概念は、トランスジェニックの中に含まれる。【０１２４】
本明細書において、「ノックアウト生物」とは、ある遺伝子がノックアウトされた生物（例えば、マウス）をいう。従って、ノックアウト生物の概念は、トランスジェニック生物の中に含まれる。【０１２５】
本明細書においてトランスジェニックの対象とされる「生物」は、トランスポゾンが作用し、そのような系が機能し得る任意の生物が含まれる。このような生物には、動物、植物、細菌などが含まれるがそれらに限定されない。【０１２６】
本明細書において、「動物」は、核酸配列（好ましくは遺伝子をコードする外来配列）の導入を目的とすることができるものであればどのような動物であってもよい。従って、動物には、脊椎動物および無脊椎動物が包含される。動物としては、哺乳動物（例えば、マウス、イヌ、ネコ、ラット、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、イルカ、クジラ、ヤギ、ウマなど）、鳥類（例えば、ニワトリ、ウズラなど）、両生類（例えば、カエルなど）、爬虫類、昆虫（例えば、ショウジョウバエなど）などが挙げられる。好ましくは、動物は、哺乳動物であり得、より好ましくは、ノックアウトを作製することが容易な動物（例えば、マウス）であり得る。別の好ましい形態では、動物は、ヒトのモデル動物として適切であることが判明している動物（例えば、サル）であり得る。ある実施形態では、動物は、非ヒト動物または非ヒト哺乳動物であり得るが、それに限定されない。例えば、ブタ、サル・ウシ・ウマ・ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、またはハムスター等であり、より好ましくは、マウスまたはラットである。ここで本発明の生物には、特に言及しない限り、哺乳動物個体だけでなく個体の一部および個体の有する臓器、器官も包含される。これらはヒト疾患モデルとして、また臓器移植用ドナーとして有用である。【０１２７】
上述の生物において、遺伝子の導入技術はマイクロインジェクション、核酸フラグメントと陽イオン脂質小胞体またはＤＮＡ凝縮試薬との組合せ；ならびに核酸フラグメントをウイルスベクターに導入し、そしてこのウイルスベクターを細胞と接触させること、ならびに粒子ボンバードメントおよびエレクトロポレーションから成る群より選ばれる方法を含む。【０１２８】
本明細書において使用され得るウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウィルスベクター、ヘルペスウィルスまたはアデノ関連ウイルスベクターからなる群より選ばれるものが挙げられるがそれらに限定されない。【０１２９】
本明細書において「レトロウイルス」とは、ＲＮＡの形で遺伝情報を有し、逆転写酵素によってＲＮＡの情報からＤＮＡを合成するウイルスをいう。したがって、「レトロウイルスベクター」とは、レトロウイルスを遺伝子の担い手（ベクター）として使用した形態をいう。本発明において使用される「レトロウイルスベクター」としては、例えば、Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ（ＭＭＬＶ）、Ｍｕｒｉｎｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉｒｕｓ（ＭＳＣＶ）にもとづいたレトロウイルス型発現ベクターなどが挙げられるがそれらに限定されない。【０１３０】
好ましくは、レトロウイルスベクターとしては、ｐＧｅｎ−、ｐＭＳＣＶなどが挙げられるがそれらに限定されない。【０１３１】
本明細書において使用される場合「ジーントラップ（法）」とは、目的の細胞に、例えば、プロモーターを欠いたレポーター遺伝子を導入し、染色体上で活性化されているプロモーターの下流に挿入された場合にのみレポーター活性が検出できること利用した遺伝子の同定方法をいう。このようなジーントラップは、「ジーントラップベクター」を、真核生物の宿主染色体中に導入して、宿主遺伝子を破壊することにより達成される。レポーター遺伝子が挿入された遺伝子は、レポーターとの複合タンパク質を発現するため、そのタンパク質をモニターすることによって遺伝子を同定することが可能である。したがって、相同組換えと同様に本来の遺伝子座にレポーター遺伝子が組み込まれるため、転写調節が完全なレポーター系を作ることができる。この手法を用いることによって、遺伝子破壊によって変異体を単離する手法では、得られなかった遺伝子の同定を行うことができる。したがって、本発明では、このようなジーントラップ法もまた利用することができる。【０１３２】
本明細書において「ジーントラップベクター」とは、真核生物遺伝子のｍＲＮＡが成熟ｍＲＮＡとなる過程においてスプライシングを受ける現象を利用して、遺伝子中へ挿入されたベクターを選択するためのベクターである。ジーントラップベクターとしては、（１）プロモーターを有さないレポーター遺伝子のコード領域、およびスプライスアクセプター部位を含むＤＮＡ配列を含むベクター、または（２）プロモーターを有するレポーター遺伝子のコード領域、およびスプライスドナー部位を含むＤＮＡ配列を含むベクター、ならびに（３）これら（１）および（２）の両方のＤＮＡ配列を含むベクターが挙げられるがこれらに限定されない。【０１３３】
上述のようなスプライスアクセプター配列を含むジーントラップベクターは、必要に応じて、ポリＡ付加シグナルを含んでもよい。スプライスドナー配列を含むジーントラップベクターは、必要に応じて、エンハンサー領域、および／またはｍＲＮＡ不安定化領域を含んでもよい。ポリＡ付加シグナルとしては、「ＡＡＴＡＡＡ」が挙げられるが、これに限定されない。【０１３４】
本発明において使用するプロモーターとしては、ＭＣ１プロモーター、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩプロモーターなどが挙げられるがそれらに限定されない。【０１３５】
本発明において使用されるエンハンサーとしては、ポリオーマウイルスエンハンサー（ＰＹＦ４４１）などが挙げられるがそれらに限定されない。【０１３６】
本発明において使用されるスプライスドナー配列としては、マウスｈｐｒｔ遺伝子エキソン８スプライスドナーが挙げられるがそれらに限定されない。【０１３７】
本発明において使用されるスプライスアクセプター配列としては、ヒトｂｃｌ−２遺伝子エキソン３スプライスアクセプターが挙げられるがそれらに限定されない。【０１３８】
本明細書において使用される「レポーター」分子または「レポーター」遺伝子とは、細胞内において遺伝子発現の指標として使用することのできる分子（例えば、ポリペプチド）または遺伝子をいう。そのような分子としては、公知のレポータータンパク質を用いることができ、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、またはエクオリンなどが挙げられる。ここで、遺伝子の導入方法自体は、当該分野において公知の技術をもちいて所望の材料を用いて行うことができる。そのような場合、例えば、目的とする胚性幹細胞に、例えば、プロモーターを欠いたレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、アルカリホスファターゼ遺伝子、Ｃｒｅレコンビナーゼ遺伝子など）を導入し、染色体上で活性化されているプロモーターの下流に挿入された場合にのみレポーター活性が検出する。使用されるベクターはこのレポーター遺伝子のほか、選択マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、レスキューマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子＋コリシンＥ１複製開始起点）などを含んでいてもよい。ここで、選択マーカー遺伝子は、ベクターが入った宿主を選択するために使用される。レスキューマーカー遺伝子は、ベクターをレスキューするために使用される  （Ｊｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．ｅｄ．”Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ”（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）を参照のこと）。上述のような技術を用いることによって、胚性幹細胞が生成される。この改変胚性幹細胞は、遺伝子がトラップされている。ここで、トラップされているとは、ゲノムへのトラップベクターの挿入により内在性遺伝子が破壊され、同時にそのベクターによって破壊された遺伝子がマーキングされた状態をいう。【０１３９】
特定の配列を有するオリゴヌクレオチドの調製は、当該分野において周知の技術を用いて行うことができ、例えば、Ｊｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．ｅｄ．”Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ”（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）に記載される方法で行うことができる。オリゴヌクレオチドは、必要に応じて、蛍光、放射能などで標識することができる。そのような標識方法は当該分野において周知であり、本明細書において引用される文献に記載されている。【０１４０】
（スクリーニング）
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作／評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の方法または生物を使用することができる。本発明では、種々のトランスジェニック生物が作製されることから、任意の核酸分子およびその機能調節因子をスクリーニングすることができる。【０１４１】
本発明では、任意の核酸分子を本発明の核酸分子、方法またはシステムを利用することによってスクリーニングすることができる。本発明はまた、そのようなスクリーニングによって同定された化学物質またはその組み合わせを包含することが企図される。【０１４２】
本発明のシステムは種々の分野に応用できる。例えば、生命体の成長、維持、調節および発育に関わる遺伝子の同定、単離および特性を決定することができる（例えば、Ｋａｉｓｅｒら、１９９５「Ｅｕｋｅｒｙｏｔｉｃ  ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ，ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ａｓ  ｔｏｏｌｓ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｇｅｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ」  Ｍｏｂｉｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．６９−１００）；生命体の成長、維持、調節および発育を調節する転写調節配列の同定、単離およびを同定することができる（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９６，Ｍｏｌ．Ｍａｒ．Ｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，５，１０５−１１３）。【０１４３】
（発明を実施するために好ましい形態）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。【０１４４】
（遺伝子カセット）
１つの局面において、本発明は、レコンビナーゼ認識配列を１つまたは逆方向に２つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットを提供する。この遺伝子カセットは、レコンビナーゼを用いた組み換え系において使用することができることが明らかになった。特に、レコンビナーゼを用いて、再生可能な（すなわち、次世代を生産することができる）細胞（特に、幹細胞）から、所望の染色体を除去したものを作製することができることは予想されていなかったことから、本願発明は、予想外に優れた効果を提供することになる。【０１４５】
本発明の遺伝子カセットでは、従来の方法とは異なり、レコンビナーゼ認識配列を２つ同じ向きに配置するのではなく、２つの逆向きまたは１つのみを配置することによって、予想外に、レコンビナーゼを用いて、再生可能な（すなわち、次世代を生産することができる）細胞（特に、幹細胞）から、所望の染色体を除去したものを作製することができることが見出された。従来の方法では、再生可能でない細胞が作製され、あるいは、所望の染色体除去の効率が良くなかったことから、本発明な顕著な効果を有するといえる。これまでの染色体除去は、Ｈｐｒｔ（−）細胞の染色体にＨｐｒｔ遺伝子等を導入し６ＴＧ（６−チオグアニン）で薬剤選択することで、Ｈｐｒｔ導入染色体が突然変異により欠損した細胞をスクリーニングする方法がとられていた。この方法では、染色体除去は１０−６以下の確率でしか観察されない。一方本法では、染色体除去カセットを導入することで突然変異の１００倍以上の高率で染色体除去を行うことができる。また、複数の染色体を除去することが容易に可能である点でも、本発明の方法は優れている。【０１４６】
本発明において使用されるレコンビナーゼ認識配列は、使用されるレコンビナーゼを認識することができる限り、任意の配列を使用することができ、レコンビナーゼ技術の当業者は、そのようなレコンビナーゼ認識配列を容易に設計することができる。本明細書においては、そのようなレコンビナーゼ認識配列が、レコンビナーゼ認識配列であるかどうかは、レコンビナーゼ酵素の処理により、２つのレコンビナーゼ配列間でＤＮＡの組み換えが起こり結果として、レコンビナーゼ配列が一つに統合され、レコンビナーゼ配列間のＤＮＡが欠損、または結合することによって容易に同定することが可能である。そのような配列としては、たとえば、ｌｏｘＰ配列、ＦＲＴ部位、ａｔｔＢ配列，ａｔｔＰ配列およびｒｅｓ部位配列などを挙げることができるがそれらに限定されない。このようなレコンビナーゼ認識配列は、配列番号１に記載される配列（ｌｏｘＰ配列）を含む。【０１４７】
本発明において使用されマーカー遺伝子は、細胞中に遺伝子導入された場合にその細胞の識別を可能にすることができる遺伝子であれば、どのようなものであっても使用することができる。このようなマーカー遺伝子としては、例えば、ＧＦＰ遺伝子、（ＥＧＦＰ遺伝子も含む）、ＣＦＰ遺伝子、ＹＦＰ遺伝子、ｄｓＲＥＤ遺伝子などを挙げることができる。【０１４８】
好ましい実施形態では、本発明の遺伝子カセットは、選択配列をさらに有していても良い。本発明において使用される選択配列としては、例えば、遺伝子導入した後に、特定の条件下で、導入された細胞を選別することができるような配列である限り、どのような配列を使用しても良いが、例えば、抗生物質耐性付与遺伝子（例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、ピューロマイシン抵抗性付与遺伝子、ネオマイシン抵抗性付与遺伝子、ネオマイシン抵抗性付与遺伝子、ハイグロマイシン抵抗性付与遺伝子、ブラストサイジン抵抗性付与遺伝子、ゼオシン抵抗性付与遺伝子、ジフテリアトキシン抵抗性付与遺伝子、フルオロウラシル抵抗性付与遺伝子など）、ＨＡＴ抵抗性付与遺伝子などを挙げることができるがそれらに限定されない。【０１４９】
好ましい実施形態では、本発明の遺伝子カセットは、ＩＲＥＳ配列（配列番号２）を含み得る。本発明において使用されるＩＲＥＳ配列は、ＩＲＥＳ活性を有する配列であれば、どのような配列を用いても良い。このようなＩＲＥＳ配列は、配列番号２に記載される配列またはその機能的等価物（例えば、１または数個の置換、付加または欠失を含む）を含む。【０１５０】
本発明の好ましい実施形態において、本発明の遺伝子カセットは、さらに、ＣＡＧ配列（配列番号３）を含み得る。本発明において使用されるＣＡＧ配列は、ＣＡＧ配列が通常を有する活性を有する配列であれば、どのような配列を用いても良い。このようなＣＡＧ配列には、配列番号３に記載される配列またはその機能的等価物（例えば、１または数個の置換、付加または欠失を含む）を含まれる。【０１５１】
従って、本発明の好ましい実施形態では、本発明の遺伝子カセットにおいて、レコンビナーゼ認識配列は、逆方向に２つ含まれ、該レコンビナーゼ認識配列の間に、ＣＡＧ、マーカー配列、ＩＲＥＳ配列、および選択配列を含む。別の好ましい実施形態では、Ｐｇｋ、選択配列、（ＩＲＥＳ配列）、マーカー配列を含む。前者はランダムに導入する際に、後者は相同組み換えで標的染色体に導入する際に用いた配列である。後者は、高濃度Ｇ４１８によるＣＥＣホモＥＳ細胞を選択する際に用いられ得る。【０１５２】
（所望の染色体を除去するための組成物）
別の局面において、本発明は、レコンビナーゼ認識配列を１つまたは逆方向に２つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットを含む、所望の染色体または染色体群を除去するための組成物を提供する。ここに含まれる遺伝子カセットは、上記（遺伝子カセット）に記載された任意の形態を採用することができることが理解される。【０１５３】
ここで、所望の染色体を除去する対象細胞としては、任意の細胞が挙げられる。そのような細胞としては、例えば、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞、組織幹細胞などの幹細胞、体細胞、または、体細胞と幹細胞との融合細胞（国際公開ＷＯ０３／０２７２７８号を参照）、再プログラム化された幹細胞（国際公開ＷＯ０３／０２７２７７号、国際公開ＷＯ０３／０２７２７８号などを参照）、などを挙げることができる。【０１５４】
除去され得る染色体としては、任意の染色体を挙げることができ、好ましくは、Ｘ染色体、Ｙ染色体以外の任意の常染色体が対象であり得る。そのような染色体例としては、例えば、４６本の染色体を有するヒトでは、１番染色体〜２２番染色体、特に５番染色体、９番染色体、１１番染色体、１３番染色体、１８番染色体、２１番染色体等を挙げることができる。マウスでは、１番染色体１９番染色体、特に２、７および１１番染色体等を挙げることができる。特に、ＭＨＣまたはＨＬＡを有する染色体（それぞれ、マウスの１７番染色体、およびヒトの６番染色体）を除去することが好ましい。除去された細胞において、免疫拒絶反応を取り除くことができるからである。【０１５５】
染色体は、染色体は二つの染色分体からなる。染色分体同士が接合する場所はセントロメアという。核分裂のときにはここに微小管が結合し、両極へ牽引する。セントロメアを挟んで長い側を長腕、短い側を短腕という。染色体の末端部はテロメアと呼ばれる特有の構造がある。有糸分裂の最初のステージでは、クロマチン鎖が次第に凝縮していく。この過程で染色体は遺伝物質として機能する形態から移動可能なコンパクトな形態に変化 する。やがて、２つの対応する染色分体（凝縮したクロマチン鎖）は、セントロメアで結合した染色体になる。細胞の両極から伸びた長い微小管（紡錘糸）はセントロメアに結合する。核分裂の間、紡錘糸は各染色分体を細胞の両極に向けて引き離し、最終的に各娘細胞は１セットの染色分体を受け継ぐ。染色体の本数は種ごとに一定である。無性生殖で増殖する種の細胞は染色体を１セットしか持たず、その生物の全細胞についてそれが言える。有性生殖を行う種は、二倍体［２ｘ］かまたは多倍体［Ｎｘ］の体細胞と、半数体の配偶子［ｎ＝ｘの整数倍］を持つ。二倍体は２セットの染色体で、１セットが父親など由来でもう１セットが母親などの別の個体由来である。多倍体は３セット以上の染色体を持ち、１倍体は１セットしか持たない。哺乳類では、受精において雄と雌の配偶子が融合すると、その時点ではまだ二倍体の卵細胞が減数分裂を起こし、受精卵の成熟化がおこる。減数分裂の過程で、母親と父親の対応する染色体同士は交叉を起こしてお互いの部分を交換する。融合により作製された幹細胞と体細胞との融合細胞は、４倍体をしている。この場合は、レコンビナーゼの働きにより、ＤＮＡ複製後の姉妹染色分体がＣＥＣ間で相同組み換えを起こすことで、セントロメアとテロメアで混乱し、染色体が除去されるようになる。一倍体は単相、二倍体は複相とも呼ばれる。本発明の染色体除去を行うための模式図は、図３にも例示される。【０１５６】
１．分化細胞で染色体除去を行った場合、遺伝子量補償機構のため染色体が除去された細胞を得ることが困難である。ところが、未分化細胞では遺伝子量補償に関して寛容性のあることがＸ染色体の不活性化やゲノムインプリングィングに関する本発明者らの発明から明らかになっている。これらの発見を元に、未分化細胞である胚性幹（ＥＳ）細胞で染色体除去を行うことで、遺伝子量補償の問題を解決した点に独創性がある。【０１５７】
２．これまでの染色体工学実験では、性染色体であるＹ染色体の除去は報告されているが、常染色体の丸ごと１本除去された２倍体細胞の例はない。常染色体では、相同染色体間での組み換えや、非相同染色体間での組み換えの報告があるが得られる頻度は著しく低い。我々は、ＤＮＡ  複製後である細胞分裂Ｇ２期における姉妹染色分体間での相同組み換えの機構を応用して、染色体異常を強制的に誘発することで相対的に高頻度での染色体除去をもたらした点が独創的である。【０１５８】
３．姉妹染色分体間での組み換え効率の向上、つまり染色体除去効率の向上を目的にＬｏｘＰ等の相同組み換え配列（レコンビナーゼ配列）を逆方向に２個１ペアーとして導入した染色体除去カセットを構築した点に独創性がある。【０１５９】
１つの実施形態では、本発明の組成物が目的とする細胞において、除去されるべき染色体は、多能性関連遺伝子を含み得る。ここで多能性関連遺伝子としては、例えば、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、他の特異的抗原などを挙げることができる。【０１６０】
別の実施形態では、本発明の組成物が目的とする細胞において、除去されるべき染色体は両方のコピーであり得る。【０１６１】
（キット）
本発明は、Ａ）レコンビナーゼ認識配列を１つまたは逆方向に２つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットと、Ｂ）該レコンビナーゼ認識配列に対応するレコンビナーゼまたはそれをコードする核酸配列を含む核酸分子と、を備える、所望の染色体を除去するためのキットを提供する。ここで、遺伝子カセットとしては、上記（遺伝子カセット）に記載された任意の形態を利用することができることが理解される。また、ここで使用されるレコンビナーゼまたは核酸分子としては、適切なレコンビナーゼまたはそれをコードする核酸配列であれば、どのようなものでもよい。そのような適切なレコンビナーゼは、含まれるレコンビナーゼ認識配列に応じて当業者が適宜選択することができる。この場合、以下の対応が例示される：
ｌｏｘＰ配列  Ｃｒｅレコンビナーゼ
ＦＲＴ（Ｆｌｐｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｔａｒｇｅｔ）部位：  Ｆｌｐ  インテグラーゼ
ａｔｔＢ配列：  φＣ３１インテグラーゼ
ａｔｔＰ配列：  φＣ３１インテグラーゼ
ｒｅｓ（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）部位配列：  ＩｎｔＩ１インテグラーゼ。【０１６２】
別の局面において、本発明は、Ａ）レコンビナーゼ認識配列を１つまたは逆方向に２つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットと、Ｂ）該レコンビナーゼ認識配列に対応するレコンビナーゼまたはそれをコードする核酸配列を含む核酸分子と、Ｃ）幹細胞と、を備える、幹細胞から所望の染色体を除去するためのキットを提供する。ここで、幹細胞としては、所望の染色体を除くことを目的とする任意の幹細胞を提供することができる。本発明は、幹細胞のような多分化能を有する細胞から、その多分化能を保持しながら染色体を除去することができる技術を提供したという点で、顕著な効果を奏する。使用される幹細胞は、生のままで提供されてもよく、保存状態で提供されても良い。そのような保存は、ＥＳ細胞などの幹細胞は、凍結保存されることが頻繁に行われているが、従来行われている緩慢冷却法（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  Ｒ．Ｉ．，  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ＷＩｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．２５５−２６５、１９９４）、より最近になって開発されたガラス化法という方法（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ＢＥ，  Ｐａｒａ  ＭＦ，  Ｖａｊｔａ  Ｇ，  Ｔｒｏｕｎｓｏｎ  ＡＯ．，Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ．  ２００１  Ｏｃｔ；１６（１０）：２１８７−９４）（この方法は、効率が緩慢冷却法よりも高く、しかも、簡便である）などを利用することができる。【０１６３】
別の局面において、本発明は、Ａ）レコンビナーゼ認識配列を１つまたは逆方向に２つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットと、Ｂ）該レコンビナーゼ認識配列に対応するレコンビナーゼまたはそれをコードする核酸配列を含む核酸分子と、Ｃ）幹細胞と、Ｄ）所望のゲノムを有する細胞と、を備える、所望のゲノムを有する細胞から所望の染色体を除去し、該細胞に多分化能を付与するためのキットを提供する。ここで、幹細胞と、所望のゲノムを有する細胞とを提供することにより、その後所望のテイラーメイド幹細胞を作製することができる。融合細胞の製造方法は、ＷＯ０３／０２７２７８号に記載されており、その記載は、本明細書においてその全体を参考として援用する。例えば、幹細胞（たとえば、ＥＳ細胞）と体細胞とを融合させる方法は、幹細胞と体細胞とが接触により融合し、融合細胞を形成するような方法であれば特に限定されない。例えば、実施例に記載されるようにＥＳ細胞と体細胞とを、一定の割合、例えばＥＳ細胞と胸腺細胞との融合細胞を作る場合には１：５の割合で混合し、洗浄する。細胞をマンニトール緩衝液等の適当な緩衝液中に懸濁し、電気融合させることにより作製することができる。このような電気刺激による細胞膜の構造変化を利用した高電圧パルス細胞融合法（エレクトポレーション）［例えば、ＥＭＢＯ  Ｊ．１：８４１−８４５（１９８２）］の他に、センダイウイルス、リゾレシチン、グリセロール、オレイン酸エステル、ポリエチレングリセロール等の化学的な細胞融合促進物質を用いた細胞融合法も使用され得る。いかなる融合方法であれ、幹細胞と体細胞の融合により形成された細胞が、融合細胞として安定に増殖させることができ、体細胞由来の核が多分化能を有する未分化細胞様に変化することができれば特に限定されない。【０１６４】
本明細書において細胞の「融合」または「細胞融合」とは、互換可能に用いられ、複数の細胞が融合して細胞の多核化がおこる現象をいう。生殖細胞の受精時など自然においてもおこるが、細胞工学上の手段の１つとしても用いられる。融合させるには、２種の相異なる細胞を化学的または物理的に融合させ、融合細胞だけを増殖させる選択培地を用いて培養する。たとえば、紫外線で感染力を失活させたウイルス（たとえば、ＨＶＪ（センダイウイルス）、パラインフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルスといったパラミクソウイルスなど）を用いると、細胞融合が誘導される。化学物質によっても細胞融合は可能で、たとえば、リゾレシチン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００、グリセロールオレイン酸エステルなどが用いられる。物理的手法としては，電気刺激を利用した細胞融合（電気融合）が行なわれている。化学物質による細胞融合は、ウイルスに対する特異性に非依存性であるので好ましい。【０１６５】
（方法）
別の局面において、本発明は、所望のゲノムを有する細胞から所望の染色体を除去し、該細胞に多分化能を付与するための方法であって、Ａ）レコンビナーゼ認識配列を１つまたは逆方向に２つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットを提供する工程と、Ｂ）該遺伝子カセットを幹細胞に導入する工程と、Ｃ）該幹細胞と所望のゲノムを有する細胞とを融合する工程と、Ｄ）該融合された細胞に、該レコンビナーゼ認識配列を認識するレコンビナーゼまたはそれをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する工程と、Ｅ）再構成が生じる条件に該融合された細胞を曝す工程と、Ｆ）融合された細胞のマーカー遺伝子に由来するシグナルを観察して所望の染色体が除去された細胞を選択する工程と、を包含する、方法を提供する。【０１６６】
別の局面において、本発明は、所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞から所望の染色体を除去するための方法であって、Ａ）レコンビナーゼ認識配列を１つまたは逆方向に２つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットを提供する工程と、Ｂ）該遺伝子カセットを細胞に導入する工程と、Ｃ）該細胞と所望のゲノム、染色体または染色体群を有する細胞とを融合する工程と、Ｄ）該融合された細胞に、該レコンビナーゼ認識配列を認識するレコンビナーゼまたはそれをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する工程と、Ｅ）再構成が生じる条件に該融合された細胞を曝す工程と、Ｆ）融合された細胞のマーカー遺伝子に由来するシグナルを観察して所望の染色体が除去された細胞を選択する工程と、を包含する、方法を提供する。【０１６７】
他の局面において、本発明は、染色体交換細胞を生産するための方法であって、
Ａ）レコンビナーゼ認識配列を１つまたは逆方向に２つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットを提供する工程と、Ｂ）該遺伝子カセットを第１の細胞に導入する工程と、Ｃ）所望の染色体を有する第２の細胞の細胞質と、第１の細胞とを融合させる工程；Ｄ）該第２の細胞の所望の染色体に対応する該第１の細胞の染色体を、該第１の細胞の該染色体の除去を可能にするように、該レコンビナーゼ認識配列を認識するレコンビナーゼまたはそれをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する工程と、Ｅ）再構成が生じる条件に該融合された細胞を曝す工程と、Ｆ）融合された細胞のマーカー遺伝子に由来するシグナルを観察して所望の染色体が除去された細胞を選択する工程と、を包含する、方法を提供する。【０１６８】
ここで、使用されるレコンビナーゼ認識配列、遺伝子カセット、マーカー遺伝子などは、本明細書において（遺伝子カセット）において説明されている任意の形態を用いることができることが理解される。【０１６９】
本発明の方法において用いられる幹細胞、および所望のゲノムを有する細胞としては、融合され得る限り、任意の細胞を用いることができることが理解される。【０１７０】
本発明において、使用される融合技術およびレコンビナーゼまたはそれをコードする核酸分子については、本明細書において（キット）中で説明されている任意の形態を用いることが理解される。【０１７１】
本発明において、「染色体の除去を可能にするよう」な条件は、本明細書において説明される任意の条件を用いることができる。ここでは、再構成が生じる条件を用いても良い。【０１７２】
本発明において、「再構成が生じる条件」は、組み換えが起きる任意の条件をいい、そのような条件は、当業者が容易に選択することができる。そのような再構成が生じる条件は、例えば、１．細胞が分裂を行っている；２．細胞が未分化状態を維持しているなどを挙げることができる。【０１７３】
本発明の方法において、マーカー遺伝子に由来するシグナルの観察は、そのマーカー遺伝子が発するシグナルに応じて当業者が適宜選択した手段によっておこなうことができる。例えば、グリーン蛍光タンパク質であれば、蛍光を観察する手段、例えば、蛍光顕微鏡などを用いることによって実施することができる。【０１７４】
別の局面において、本発明は、所望のゲノムを有する細胞から所望の染色体を除去するための方法であって、Ａ）レコンビナーゼ認識配列を１つまたは逆方向に２つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットを提供する工程と、Ｂ）該遺伝子カセットを細胞に導入する工程と、Ｃ）該細胞に、該レコンビナーゼ認識配列を認識するレコンビナーゼまたはそれをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する工程と、Ｄ）再構成が生じる条件に該細胞を曝す工程と、Ｅ）細胞のマーカー遺伝子に由来するシグナルを観察して所望の染色体が除去された細胞を選択する工程と、を包含する、方法を提供する。【０１７５】
（細胞など）
別の局面において、本発明はまた、所望の染色体が除去された細胞（例えば、ＥＳ細胞などの幹細胞）を提供する。このような細胞は、例えば、本発明の方法によって作製することができる。好ましい実施形態では、この細胞では、ＭＨＣを含む染色体が除去されている。このような染色体除去細胞は、従来効率よくは得ることには成功していなかった。【０１７６】
別の局面では、本発明は、本発明の方法によって得られた細胞を提供する。【０１７７】
１つの実施形態では、本発明は、ＥＳ細胞と、所望のゲノムを有する細胞との融合細胞であって、該融合細胞から、所望の染色体が除去され、多分化能を有する、融合細胞を提供する。【０１７８】
別の好ましい実施形態では、本発明は、ＥＳ細胞と、所望のゲノムを有する細胞との融合細胞であって、該融合細胞から、該ＥＳ細胞の主要組織適合(抗原遺伝子)複合体（ＭＨＣ）をコードする配列を含む染色体が除去されており、多分化能を有する、融合細胞を提供する。このようなＭＨＣまたはそれに対応する遺伝子としては、マウスのＨ−２抗原（第１７番染色体）、ヒトのＨＬＡ抗原（第６染色体）を挙げることができる。【０１７９】
１つの実施形態では、ＥＳ細胞と、所望のゲノムを有する細胞との融合細胞であって、上記所望の染色体は、該ＥＳ細胞のマウスの第６染色体、第１１染色体、第１２染色体および第１７番染色体、ヒトの第６番染色体（マウスの第１７番染色体に対応する）からなる群より選択される染色体または該染色体に対応する染色体の一方コピーまたは両コピーであり、これらの１つまたは複数の染色体が除去された、多能性を有する融合細胞が提供される。ここで、染色体間の対応（シンテニー）は、例えば、Nature 409, 860-921 (15 February 2001)、http://bioportal.ddbj.nig.ac.jp/synteny/index.html、http://www-btls.jst.go.jp/ComparativeGenomics/index_j.htmlなどを参酌して公知技術を用いて決定することができる。本明細書では、「シンテニー」とは、異なる種の染色体間で、遺伝子が同じ順番で配置されていること、もしくはその領域をさす。ゲノムの配列解読がなされる以前は、遺伝子地図や染色体マッピングなどによりシンテニーが確認されていたが、現在ではゲノムが詳細に解読されるに従って、配列レベルでの解析が進み今では、ヒトとフグなどの染色体どうしも比較できる。【０１８０】
１つの具体的な実施形態では、ＥＳ細胞と、所望のゲノムを有する細胞との融合細胞であって、上記所望の染色体は、ＥＳ細胞のＮａｎｏｇ遺伝子を含む染色体であり、これらの１つまたは両コピーの染色体が除去された、多能性を有する細胞が提供される。【０１８１】
１つの実施形態では、ＥＳ細胞と、所望のゲノムを有する細胞との融合細胞であって、ＥＳ細胞の染色体１または２以上の染色体（例えば、全部）が除去された、多能性を有する融合細胞が提供される。全部取り除かれることが好ましい。このような細胞は、そのＥＳ細胞由来の疾患に関連する染色体または染色体群が実質的にすべて取り除かれることからより好ましい。なぜなら、免疫拒絶を防ぐことができるからである。２以上の染色体の除去は、本発明において提供される１つの染色体除去の技術を複数回繰り返せばよい。そのような技術は当該分野において周知の技術を応用して、具体的な染色体の配列情報をもとに実施することができる。染色体の数だけ繰り返すと、全部所望の染色体が除くことができる。例えば、ＥＳ細胞と所望の細胞の融合細胞から、ＥＳ細胞由来の染色体をすべて抜くこともできる。【０１８２】
１つの実施形態では、ＥＳ細胞と、所望のゲノムを有する細胞との融合細胞において、所網のゲノムを有する細胞は、疾患に罹患した個体由来の細胞であり得る。このような細胞は、その疾患の原因を調査するために使用され得る。【０１８３】
別の実施形態では、ＥＳ細胞と、所望のゲノムを有する細胞との融合細胞において、所望のゲノムを有する細胞は、疾患に罹患した個体由来の細胞であり、ＥＳ細胞の染色体全部が除去された、多能性を有する融合細胞が提供される。このような細胞は、その疾患の原因を調査するためにより好ましい。【０１８４】
別の局面では、本発明は、所望の染色体または染色体群が交換された、染色体交換細胞を提供する。ここでは、染色体交換は、例えば、体細胞の染色体（２コピーまたは１コピー）をもつ細胞質をＥＳ細胞と融合させ、入れた染色体と同じＥＳ細胞由来染色体をカセットで抜くことができる。この細胞は、好ましくは、所望の染色体または染色体群が交換された、染色体交換された幹細胞であり得るがそれに限定されない。例えば、そのような幹細胞は、ＥＳ細胞であってもよい。【０１８５】
１つの具体的な実施形態では、本発明は、ＥＳ細胞と、所望のゲノム、染色体または染色体群を有する微小核との融合細胞であって、該融合細胞からＥＳ細胞由来の所望の染色体が除去され、多分化能を有する、染色体交換細胞を提供する。【０１８６】
本発明はまた、本発明の技術によって生産された任意の細胞を提供する。【０１８７】
（使用）
別の局面において、本発明は、レコンビナーゼ認識配列を１つまたは逆方向に２つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットの、所望の染色体を除去するための使用を提供する。【０１８８】
他の局面において、本発明は、レコンビナーゼ認識配列を１つまたは逆方向に２つ含む遺伝子カセットであって、マーカー遺伝子をコードする配列を含む、遺伝子カセットの、所望の染色体を除去するための組成物の製造のための使用を提供する。【０１８９】
ここで、染色体除去などについての技術は、本明細書において他の場所に記載される任意の技術を用いることができることが理解される。【０１９０】
（細胞ライブラリー）
別の局面において、本発明は、所望の染色体が除去された細胞を複数種類含む、細胞ライブラリーを提供する。このようなライブラリーは、目的とする染色体を除去するための遺伝子カセットを、上記（遺伝子カセット）に記載される本発明の遺伝子カセットを用いることによって作製し、種々の染色体が除去された細胞を作製することによって提供することができる。所望の染色体を除去するための遺伝子カセットの設計方法は以下の通りである：
１番染色体上のユニークなＤＮＡ配列、多くの場合は１番染色体上の特定の遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を同定する。同定されたＤＮＡ配列に上記遺伝子カセットを挿入する。この際、用いるＤＮＡ配列は５ｋｂ以上の長さを利用し、挿入遺伝子カセットの両側が均等な長さになる（片側２．５ｋｂ）なることが望ましい。【０１９１】
１番染色体上のＤＮＡ配列に挟まれた遺伝子カセットをＥＳ細胞に遺伝子導入すると、ＤＮＡ相同領域の組み換えが起こることで、遺伝子カセットが目的の１番染色体上に挿入される。ＦＩＳＨ法により遺伝子カセットの１番染色体上への挿入が確認できる。【０１９２】
本発明は、従来不可能または効率が悪かった、染色体ごとの欠失を、好ましくは再生能または多分化能を保持させながら簡便に行うことができるようになったという点で従来に比して予想外の効果を達成する。【０１９３】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。【０１９４】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１９５】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。以下の実施例において用いられる試薬などは、例外を除き、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）、和光純薬（大阪、日本）、などから市販されるものを用いた。動物の取り扱いは、京都大学において規定される規準を遵守して行った。以下において、本発明を、具体例を挙げて説明する。なお、このような例で用いられる出発プラスミド、プロモーター等の構成要素を同等のもので置き換えて実施することは当業者にとって容易である。【０１９６】
（実施例１  染色体除去カセット  （ＣＥＣ；  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）の有効性の検定）
１．ＣＥＣのコンストラクション
実験の第一段階としてデザインしたＣＥＣによって特定の染色体の除去が可能かを確認し、ＣＥＣの機能を確認し後、第二段階として相同組み換えにより特定の染色体へのＣＥＣの導入を試みた。【０１９７】
ＣＥＣは、ＬｏｘＰ→ＣＡＧ−ＧＦＰ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ←ＬｏｘＰからなり（配列番号１１）逆方向に導入されたＬｏｘＰ配列により相同染色分体間で組換えが起こった。相同組換えの組み合わせによりある頻度で、２動原体染色体や無動原体染色体が形成された。これらの以上染色体は細胞分裂を通じて細胞から除去された。この結果、ＣＥＣが導入された染色体のみを欠損した細胞が作製された。【０１９８】
その結果を、図１（特に、図１Ｅおよび図１Ｆ）および図２に示す。マウスにおける１実施形態の細胞の核型分析による欠失染色体の分布が示されている。ここで、１１番染色体が見事に除去されていることが理解される。【０１９９】
２．ＥＳ細胞への染色体除去カセットの導入
ＣＥＣを、Ｈｐｒｔ遺伝子を欠損した雄ＥＳ細胞株、ＨＭ−１（Ｓｅｌｆｒｉｄｇｅ，Ｊ．，Ｐｏｗ，Ａ．Ｍ．，ＭｃＷｈｉｒ，Ｊ．，Ｍａｇｉｎ，Ｔ．Ｍ．ａｎｄ  Ｍｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ｗ．（１９９２）Ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ＨＰＲＴ  ｍｉｎｉｇｅｎｅ／ＨＰＲＴ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｓｙｓｔｅｍ：  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ＥＲＣＣ−１  ｇｅｎｅ．Ｓｏｍａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １８，３２５−３６．に記載されている。本実施例では、Ｄｒ．Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ｅｖａｎｓ，ｉｎ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｒｄｉｆｆ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃａｒｄｉｆｆ，Ｗａｌｅｓ，ＵＫ．から使用許可を得て入手した（分与・使用許可取得済）。）に導入した。ＨＭ−１を実験に用いることにより、Ｈｐｒｔ（＋）の全ての正常体細胞との融合細胞をＨＡＴ培地により選択することが可能となった。ＨＭ−１への遺伝子導入はエレクトロポレーション法により行うことで、ＣＥＣのシングルコピーの導入を促した。２５０Ｖ／５００μＦの条件下で１×１０個の細胞に５０−１００μｇのｐＣＥＣ  ＤＮＡを導入した。ピューロマイシンで薬剤選択した後、顕微鏡下でＧＦＰ陽性細胞を選択クローニングした。得られたクローンからＤＮＡを抽出し、ＰＣＲにより導入遺伝子の再確認を、サザンハイプリダイゼーション法により導入ＣＥＣコピー数を確認した。シングルコピーが導入され、ＧＦＰ高発現のクローンを細胞融合実験に用いた。その結果を図４に示す。図４は、染色体除去カセットのＥＳ細胞への導入および導入カセットのＦＩＳＨ解析である。図３に示される本発明の染色体除去のメカニズムを説明する模式図で説明されるように、種々のメカニズムが起こっている可能性が考えられる。【０２００】
３．改変ＥＳ細胞と体細胞との細胞融合
ＣＥＣ  ＥＳ細胞と１２９Ｒｏｓａ２６由来の胸腺細胞を電気的に融合した。ＥＣＭ２００１（ＢＴＸ）装置（既存）を用いて、ＥＳ細胞と胸腺細胞（１：５）の細胞混合液を１０Ｖ（ＡＣ）／９０ｓ−２５０Ｖ（ＤＣ）／１０μｓの条件で処理し、細胞融合した。処理後の細胞は、ＨＡＴ選択培地での培養によりＥＳ−胸腺細胞融合細胞のみが生存が可能となった。融合細胞でのＧＦＰの発現、正常核型を確認した。その結果を図５に示す。模式図は、図８に例示する。【０２０１】
４．融合細胞からの染色体除去誘導
融合細胞にｐＣＭＶ−Ｃｒｅをリポフェクション導入し、一過的にＣｒｅ酵素を発現させ、４８−９６時間培養しＣＥＣ導入染色体での組換えを誘導させた。【０２０２】
５．染色体除去済み融合細胞の選別
Ｃｒｅ酵素で処理した融合細胞クローンをセルソーターで、ＧＦＰ陽性細胞とＧＦＰ
陰性細胞とに分け、ＧＦＰ陰性細胞を分取する。ＧＦＰ陰性細胞の染色体核型をＧ−バンド解析し、細胞間で共通に欠損した染色体を同定した。この操作を、クローンで繰り返した。【０２０３】
６．染色体除去の確認
細胞融合前のＣＥＣ−ＨＭ−１  ＥＳ細胞に対して、ｐＣＥＣをプローブに染色体ＦＩＳＨ  （Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｉｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）  解析を行い、ＣＥＣが導入された染色体を同定した。ＣＥＣ染色体が５．で同定された染色体と同じ染色体であれば、ＣＥＣにより染色体が選択的に除去されたことを意味する。染色体同定にはＧ−バンド解析の他に、染色体特異的繰り返し配列をもちいたＦＩＳＨ解析をも並行して用い、同定染色体を確認した。その結果を図４〜６に示す。【０２０４】
同様の実験を、染色体除去カセットがマウスＥＳ細胞の５番染色体または１２番染色体に導入する例を用いて行った。図７に示されるように、染色体上の除去カセット挿入部位をＦＩＳＨ法により解析したところ、効率よく染色体が除去されていた。【０２０５】
（実施例２  染色体除去ライブラリーの作製）
１．任意染色体の除去
ＣＥＣをＥＳ細胞の他の染色体上に導入し、ＥＳ−体細胞融合細胞から任意の染色体を除去できる事を、それぞれ異なった染色体を用いて証明した。方法は１−６の実験を、他の染色体で繰り返す形で行った。【０２０６】
２．ＣＥＣネオマイシン選択コンストラクトの作製
ＣＥＣの選択にピューロマイシンの代わりにネオマイシンを用いるコンストラクトｐＬｏｘＰ→Ｐｇｋ−Ｎｅｏ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ←ＬｏｘＰを作製し、任意の染色体除去に用いた。【０２０７】
３．ＣＥＣカセットホモ接合体の作製
ｐＬｏｘＰ→Ｐｇｋ−Ｎｅｏ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ←ＬｏｘＰ、ＣＥＣカセットを任意の染色体上に載せた。高濃度（８ｍｇ／ｍｌ）のネオマイシン処理により、ＣＥＣをホモ接合にもつＥＳ細胞を得た。【０２０８】
４．染色体除去ライブラリーの作製
ＣＥＣを特定の染色体にホモもつＥＳライブラリーと体細胞を融合し、融合細胞のＣｒｅ酵素処理によるＥＳ細胞由来の染色体除去により、特定の染色体セットが体細胞からのみ由来する融合細胞を自由に作製できるシステムを構築した。【０２０９】
体細胞に疾患マウスや特質な遺伝的多型等をもつマウスを用いることで、テイラーメイド創薬等への応用が可能になった。これにより、同様のシステムをヒトＥＳ細胞に導入することで、より効果的な解析が可能になる。【０２１０】
（実施例３  相同組み換えを応用した特定染色体の除去）
１．マウス１７番染色体の除去
テイラーメイド幹細胞作製の第一段階として、マウス第１７番染色体を除去することを目的に、コンストラクションを行う。マウス第１７番染色体上には免疫拒絶反応に関わるＭＨＣ（主要組織適合性抗原）遺伝子群が存在する。ＥＳ細胞由来の第１７番染色体を選択的に除去することにより、融合細胞からのＭＨＣ発現が、体細胞由来のもののみになる。結果として、融合細胞由来の分化細胞への拒絶反応の大幅な減少が観察されることになる。【０２１１】
２．相同組み換え配列
マウスゲノムライブラリーまたはゲノムからＰＣＲにより直接、第１７番染色体上のＨ２−ｂ遺伝子のゲノムＤＮＡをクローニングする。相同組換えに必要なゲノム断片（右側アーム（ＲＡ）と左側アーム（ＬＡ））をＣＥＣにつなぎ合わせｐＲＡ−ＬｏｘＰ→ＣＡＧ−ＧＦＰ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ←ＬｏｘＰ−ＬＡプラスミドおよびｐＲＡ−ＬｏｘＰ→ＣＡＧ−ｄｓＲｅｄ−ＩＲＥＳ−ｈｙｇｒｏ←ＬｏｘＰ−ＬＡを構築した。その模式図を図３左上に示す。【０２１２】
３．相同組み換え
ＨＭ−１  ＥＳ細胞を用いて相同組換えによりｐＲＡ−ＬｏｘＰ→ＣＡＧ−ＧＦＰ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ←ＬｏｘＰ−ＬＡを第１７番染色体上に載せる。続いて、ｐＲＡ−ＬｏｘＰ→ＣＡＧ−ｄｓＲｅｄ−ＩＲＥＳ−ｈｙｇｒｏ←ＬｏｘＰ−ＬＡを用いてセカンド遺伝子座上に載せる。Ｈ２−ｂ遺伝子の両遺伝座にＣＥＣが導入されたＥＳ細胞を得た。【０２１３】
４．ＦＩＳＨ解析
ＣＥＣをぞれぞれの染色体にもつＥＳ細胞を同定し、ライブラリーを作製した。【０２１４】
マウス１７番染色体のＨ２−ｂ遺伝子座にホモにＣＥＣが導入されたＥＳ細胞と体細胞を融合した。融合細胞をｐＣＭＶ−Ｃｒｅで処理し、ＥＳ細胞由来の１７番染色体が除去されたクローンを得た。この遺伝子操作ＥＳ細胞をｉｎ  ｖｉｖｏやｉｎ  ｖｉｔｒｏで様々な組織に分化誘導し、移植実験を行うことで拒絶反応の有無および程度を検定した。【０２１５】
（実施例４  相同組み換えを応用したＨＬＡ関連遺伝子が乗った染色体の除去）
実施例３と同様の手法を用いて、ＨＬＡ関連遺伝子が入っている染色体の除去を行う。ＨＬＡ関連遺伝子は、ヒト６番染色体に入っていることから、上記手順において、ヒト６番染色体に特異的な手順を用いた以外は、上記実施例に準じて実験を行う。すると、ヒト６番染色体もまた、同様に効率よく除去されることが分かる。【０２１６】
（実施例５  違うレコンビナーゼの例）
ＬｏｘＰ配列の代わりにＦＲＴ配列を用いて染色体除去を行う。ＦＲＴ部位としては、ＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＡＡＧＴＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＣ（配列番号４）を用い、インテグラーゼとしてＦｌｐインテグラーゼを用いて、上記実施例に基づいて、除去実験を行う。例えば、マウス１７番染色体を標的に染色体除去実験を行うと、同様に標的染色体が効率よく除去されることが分かる。【０２１７】
（実施例６  違う細胞の例）
ＥＳ細胞の代わりにＥＧ（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｇｅｒｍ）（生殖性幹）細胞を用いて融合細胞を作製し、染色除去を行うことが可能である。ここで、ＥＧ細胞は、Ｒｅｐｒｏｄ  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｄｅｖ．  ２００１；１３（７−８）：６６１−４などに基づいて作製することができる。【０２１８】
ＥＧ細胞でも、同様に、染色体除去が効率よく起こることが理解される。  【０２１９】
（実施例７  違う動物種細胞の例）
サルＥＳ細胞を用いて同様の実験を行う。実験手順は、上記実施例に従う。【０２２０】
その結果、サルＥＳ細胞でも、同様に、染色体除去が効率よく起こることが理解される。  【０２２１】
（実施例８：Ｎａｎｏｇ遺伝子の除去例）
（方法）
（染色体除去カセット）
ｌｏｘＰ２カセットベクター（ｐＢＳ２４６（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ））のインサートをＰＣＲ増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にサブクローニングした。ｌｏｘＰ部位を、逆方向に再クローニングした（ｐＧＥＭ−ＣＥＣ）。ＣＡＧ−ｇｆｐ／ＩＲＥＳ（内部リボゾーム侵入部位）．ｐｕｒｏ−ｐＡフラグメントをこのｐＧＥＭ−ＣＥＣ中に組み込み、ランダム挿入のため、ｐＣＥＣ−ＣＡＧ−ｇｆｐ／ＩＲＥＳ．ｐｕｒｏ−ｐＡを作製した（図９ａ）。第６番染色体除去のため、ｐＧＥＭ−ＣＥＣをｐＢＳ−ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングした（ｐＢＳ−ＣＥＣ）。Ｐｇｋ−ｎｅｏ／ＩＲＥＳ．ｇｆｐ−ｐＡフラグメントをｐＢＳ−ＣＥＣに組み込み、ｐＣＥＣ−Ｐｇｋ−ｎｅｏ／ＩＲＥＳ．ｇｆｐ  ｐＡを作製した。Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒ座における相同組み換えのため、ＣＥＣ−Ｐｇｋ−ｎｅｏ／ＩＲＥＳ．ｇｆｐ−ｐＡをｐＲＯＳＡ２６−ｐＡに組み込んだ（ｐＲＯＳＡ２６−ＣＥＣ）（Ｓｒｉｎｉｖａｓ，Ｓ．ら、Ｃｒｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ＥＹＦＰ  ａｎｄ  ＥＣＦＰ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ＲＯＳＡ２６  ｌｏｃｕｓ，ＢＭＣ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １，４（２００１））（図１１ａ）。【０２２２】
安定な形質転換体を得るため、ＳｃａＩで直鎖状にしたｐＣＥＣ−ＣＡＧ−ｇｆｐ／ＩＲＥＳ．ｐｕｒｏ−ｐＡ  ＤＮＡを、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ）を用いてＨＭ１  ＥＳ細胞にエレクトロポレーションした。Ｃｒｅ発現ベクター、ｐＢＳ１８５（ｐＣＭＶ−Ｃｒｅ）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を、一過性に発現させるため、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてハイブリッド細胞にトランスフェクトした。Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒ遺伝子座への相同組み換えのため、ＰｖｕＩで直鎖状にしたｐＲＯＳＡ−ＣＥＣプラスミドＤＮＡを、ＨＭ１  ＥＳ細胞にエレクトロポレーションした。【０２２３】
（細胞融合）
Ｈｐｒｔ遺伝子に関して欠損のあるＨＭ１  ＥＳ細胞（１２９／Ｏ１ａ：  Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）を、ＥＳ培地中で、初代胚性線維芽フィーダー細胞上で培養した（Ｔａｄａ，Ｍ．ら、Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｈｙｂｒｉｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｄｅｖ  Ｄｙｎ  ２２７，５０４−１０（２００３））。ＣＥＣ−トランスジェニックＨＭ１  ＥＳ細胞を、雌１２９ＲＯＳＡ２６（Ｍ  ｍ．ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）もしくはＪＦ１（Ｍ  ｍ．ｍｏｌｏｓｓｉｎｕｓ）マウスから集めた胸腺細胞と電気的に融合した（Ｔａｄａ，Ｍ．ら、Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｈｙｂｒｉｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｄｅｖ  Ｄｙｎ  ２２７，５０４−１０（２００３））。ハイブリッド細胞クローンを、ＨＡＴ培地で選別した。【０２２４】
（Ｇ４１８  高濃度薬剤耐性クローンの選択（ホモ細胞選択用プロトコール））
Ｐｇｋ−ｎｅｏカセットを導入したトランスジェニックＥＳ細胞を、２５０μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８で選択する。
２．  Ｇ４１８耐性ＥＳ細胞（５ｘ１０６個）を直径３ｃｍの培養ディシュ（６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）に播き、５−１０  ｍｇ／ｍｌ  の高濃度Ｇ４１８存在下で３日間培養する。この間、毎日選択培地の交換を行う。
選択培養後３日目に、３ｃｍ培養ディシュ３枚にサブカルチャーし、５−１０  ｍｇ／ｍｌ  の高濃度Ｇ４１８存在下で４−７日間培養する。この間、毎日選択培地の交換を行う。
４．  約４０個ほどの高濃度Ｇ４１８耐性ＥＳ細胞のコロニーが出現する。
５．  それぞれのコロニーからＤＮＡを抽出し、ゲノムＰＣＲ法またはサザンハイブリダイゼーション法によりＰｇｋ−ｎｅｏカセットをホモに持つクローンを選択する。【０２２５】
（ＦＡＣＳ分類）
ハイブリッド細胞を、２％ウシ胎仔血清および２μｇ／ｍｌ  ヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳ中に懸濁した。約１０，０００〜５００，０００細胞を定量分析に供し、１００〜１，０００個のＧＦＰネガティブハイブリッド細胞をＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で収集した。【０２２６】
（ＦＩＳＨ分析）
標準Ｇバンド形成手順（ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｇ−ｂａｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）に従って、染色体分析を行った（Ｔａｄａ，Ｍ．，Ｔａｄａ，Ｔ．，Ｌｅｆｅｂｖｒｅ，Ｌ．，Ｂａｔｏｎ，Ｓ．Ｃ．およびＳｕｒａｎｉ，Ｍ．Ａ．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｎｕｃｌｅｕｓ  ｉｎ  ｈｙｂｒｉｄ  ｃｅｌｌｓ．ＥＭＢＯ  Ｊ．１６，６５１０−２０（１９９７））。マッピングのため、染色体調製物を、ＣＥＣベクター特異的プローブもしくは動原体主要サテライト特異的プローブ（ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ  ｍａｊｏｒ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｂｅ）（Ｌｅｈｎｅｒｔｚ，Ｂ．ら、Ｓｕｖ３９ｈ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ３  ｌｙｓｉｎｅ  ９  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｄｉｒｅｃｔｓ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｍａｊｏｒ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｒｅｐｅａｔｓ  ａｔ  ｐｅｒｉｃｅｎｔｒｉｃ  ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ．Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １３，１１９２−２００（２００３））にハイブリダイズさせて、検出した（Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｊ．Ｂ．，Ｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｈ．およびＭａｒｓｅｌｌｅ，Ｌ．Ｍ．Ｈｉｇｈｌｙ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｔｒａｃｋｓ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ  ｎｕｃｌｅｉ  ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  ｂｙ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  ５７，４９３−５０２（１９８９）を参照）。染色体ペインティングのため、染色体調製物を、染色体ペインティングプロトコルに従って、第６番染色体、第１１番染色体、第１２番染色体および第１７番染色体に特異的なＳＴＡＲ  ＦＩＳＨプローブ（Ｃａｍｂｉｏ）にハイブリダイズさせて、検出した。【０２２７】
（ゲノムＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ）
ゲノムＰＣＲ産物を、３５サイクルの間、アニーリング温度６０℃で増幅した。Ｄ６Ｍｉｔ１８３、Ｄ６Ｍｉｔ１Ｏ２およびＤ６Ｍｉｔ１４を、１２９とＪＦ１との間のＤＮＡ配列多型を検出するための、マウス第６番染色体特異的マーカーとして使用した：Ｄ６Ｍｉｔ１８３（１２９；９４ｂｐ、およびＪＦ１；１９０ｂｐ）、プライマー１；５’−ＴＴＣＴＣＡＡＴＧＡＡＣＡＣＴＡＧＡＡＣＡＴＴＣＧ−３’（配列番号１２）、およびプライマー２；５’−ＡＡＡＡＣＡＣＡＧＧＴＡＧＡＡＡＡＣＡＴＡＣＡＴＡＣＡ−３’（配列番号１３）；Ｄ６Ｍｉｔ１０２（１２９；１７７ｂｐ、およびＪＦＩ；１２５ｂｐ）、プライマー１；５’−ＣＣＡＴＧＴＧＧＡＴＡＴＣＴＴＣＣＣＴＴＧ−３’（配列番号１４）およびプライマー２；５’−ＧＴＡＴＡＣＣＣＡＧＴＴＧＴＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＴＧ−３’（配列番号１５）；Ｄ６Ｍｉｔ１４（１２９；１５５ｂｐ、およびＪＦＩ；１４７ｂｐ）、プライマー１；５’−ＡＴＧＣＡＧＡＡＡＣＡＴＧＡＧＴＧＧＧＧ−３’（配列番号１６）およびプライマー２；５’−ＣＡＣＡＡＧＧＣＣＴＧＡＴＧＡＣＣＴＣＴ−３’（配列番号１７）。ＧＦＰ  ＤＮＡを、以下のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅した：ＧＦＰＦ；５’−ＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡ−３’（配列番号１８）およびＧＦＰＲ；５’−ＣＧＣＴＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴ−３’（配列番号１９）。ＮａｎｏｇおよびＳｔｅｌｌａ／ＰＧＣ７のＲＴ−ＰＣＲのため、ＥＳ細胞、Ｃｒｅハイブリッド細胞およびＣｒｅ処理ハイブリッド細胞から抽出されたＤＮａｓｅＩ処理ＲＮＡから、オリゴｄＴプライマーを用いて、ｃＤＮＡを合成した。ＲＴ−ＰＣＲ産物を、３０サイクルの間、アニーリング温度６０℃で、以下の特異的プライマーを用いて増幅した：Ｎａｎｏｇ  Ｆ１；５’−ＧＣＧＣＡＴＴＴＴＡＧＣＡＣＣＣＣＡＣＡ−３’（配列番号２０）およびＲ１；５’−ＧＴＴＣＴＡＡＧＴＣＣＴＡＧＧＴＴＴＧＣ−３’（配列番号２１）；Ｓｔｅｌｌａ／ＰＧＣ７  Ｆ；５’−ＡＣＡＧＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＡＡＴＴＧＧ−３’（配列番号２２）およびＲ；５’−ＧＧＡＡＡＴＴＡＧＡＡＣＧＴＡＣＡＴＡＣＴＣＣ−３’（配列番号２３）。Ｇ３ｐｄｈを、以下のプライマーを用いて増幅した；Ｆ；５’−ＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＴＧＴＧＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＣ−３’（配列番号２４）およびＲ；５’−ＣＡＴＧＴＡＧＧＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣ−３’（配列番号２５）。【０２２８】
（サザンブロットハイブリダイゼーション）
相同組み換え現象を検出するため、ゲノムＤＮＡをＧＦＰポジティブクローンから抽出し、ＥｃｏＲＶで消化し１．０％アガロースゲルで分離し、そしてアルカリブロッティングによってＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋膜へ移送した。この膜を予備ハイブリダイズし、次いでＭｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識したｐＲＯＳＡ２６−Ｓ’プラスミド（Ｓｒｉｎｉｖａｓ，Ｓ．ら、Ｃｒｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ＥＹＦＰ  ａｎｄ  ＥＣＦＰ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ＲＯＳＡ２６  ｌｏｃｕｓ，ＢＭＣ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １，４（２００１））（図１１ａ）と、４２℃で一晩ハイブリダイズさせ、続いて、６５℃で、２×ＳＳＰＥ／０，１％  ＳＤＳおよび０．１×ＳＳＰＥ／０．１％によって洗浄した。【０２２９】
（ウェスタンブロットハイブリダイゼーション）
全細胞抽出物を、１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によって分離した。これらのタンパク質を、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に移送した。この膜を、３％スキムミルク（Ｄｉｆｃｏ）と、ＰＢＳ中で室温で１時間、予備ハイブリダイズさせ、次いで、抗ＮＡＮＯＧ抗体（１：１０００希釈）（Ａｂｅａｍ）および抗ヒストンＨ３抗体（１：３０００希釈）（Ａｂｅａｍ）とともに、４℃で一晩インキュベートした。ＥＣＬウェスタンブロッティング検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてバンドを検出した。【０２３０】
（蛍光免疫組織化学）
Ｃｒｅ処理ハイブリッド細胞を、４％ホルムアルデヒドで１０分間固定した。ブロッキング溶液（２％スキムミルク）による１時間の前処理に続いて、細胞を抗ＮＡＮＯＧポリクローナル抗体（ウサギＩｇＧ）（１：５００）（Ａｂｅａｍ）および抗ＯＣＴ４モノクローナル抗体（マウスＩｇＧ）（１：１００）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）とともに、４℃で一晩インキュベートした。サンプルを、リンスした後、Ａｌｅｘａ  ５４６−結合抗ウサギＩｇＧ抗体（１：５００）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）およびＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ（１：１０００）（Ｚｙｍｅｄ）とともに、１時間インキュベートした。【０２３１】
（結果および検証）
この仮説を試験するため、ＧＦＰレポーターおよびｐｕｒｏ耐性遺伝子を含むＣＥＣ（ｐＣＥＣ−ＣＡＧ−ｇｆｐ／ＩＲＥＳ．ｐｕｒｏ−ｐＡ）を、Ｈｐｒｔ欠損ＨＭ−１  ＥＳ細胞にエレクトロポレーションした。５７個のｐｕｒｏ耐性、ＧＦＰポジティブクローンのうち、２つを無作為に取り出し、ＣＥＣ特異的プローブを用いた蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって分析した。両クローンとも、正常な核型（２Ｎ＝４０、ＸＹ）を保持していた。一方のクローンでは、ＣＥＣは、第１１番染色体の遠位領域に組み込まれていた（ＣＥＣ１１）（図９ｂ）。二番目のクローンでは、ＣＥＣは、第１２番染色体の近位上にあった（ＣＥＣ１２）（図９ｃ）。両クローンを、遍在性に発現するｎｅｏ／ｌａｃＺ遺伝子（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ，Ｇ．およびＳｏｒｉａｎｏ，Ｐ．Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｔｒａｐｓ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ａ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｃｒｅｅｎ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ａｎｄ  ｍｕｔａｔｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．５，１５１３−２３（１９９１））を有する雌ＲＯＳＡ２６マウス由来の胸腺細胞と細胞融合し、ＨＡＴ（ヒポキサチン、アミノプテリン、チミジン）で選別した。ＣＥＣ１１ハイブリッド細胞およびＣＥＣ１２ハイブリッド細胞の両方とも、染色体の完全なセット（４Ｎ＝８０、ＸＸＸＹ）を有した（図９ｄ、ｅ）。【０２３２】
ＣＥＣ１１ハイブリッド細胞およびＣＥＣ１２ハイブリッド細胞に、一過性Ｃｒｅ発現とその後のｐＣＭＶ−Ｃｒｅリポフェクションによって、ＣＥＣ媒介性姉妹染色分体内組み換えを誘導した。選別することなく３〜４回継代培養して１０日間さらに培養した後、約５．０×１０４〜２．５×１０５細胞をＦＡＣＳ分類した（図９ｆ）。Ｃｒｅ処理なしでは、ＧＦＰネガティブ集団は、ＣＥＣ１１ハイブリッド細胞およびＣＥＣ１２ハイブリッド細胞において、それぞれ０．８％および３．３％であった。しかしＣｒｅ処理後では、上記集団は、それぞれ２．２％および１０．１％に上昇した。このことと一致して、Ｃｒｅ処理なしでは、全ハイブリッド細胞はＧＦＰポジティブであり、一方Ｃｒｅ処理、ＦＡＣＳ分類されたＧＦＰネガティブハイブリッド細胞は、ＧＦＰネガティブコロニーを生じた（図９ｇ）。【０２３３】
ＣＥＣ１１ハイブリッド細胞（もしくはＣＥＣ１２ハイブリッド細胞）からの第１１番（第１２番）染色体の選択的除去を、特定のプローブによる染色体ペインティング分析によって確認した。Ｃｒｅ処理なしでは、核を分析された各ＣＥＣ１１ハイブリッド細胞は、４つの第１１番染色体および４つの第１７番染色体を含んでいた（図１０ａ）。Ｃｒｅ処理後、各場合において、１本の第１１番染色体が除去され得、一方４つの第１７番染色体は保持された（図１０ｂ、ｅ）。ＣＥＣハイブリッド細胞における第１２番染色体除去において、同様の状況が見出された（図１０ｃ、ｄ、ｆ）。Ｃｒｅ処理ＦＡＣＳ分類ハイブリッド細胞ＤＮＡ由来のｇｆｐ特異的産物を増幅する試みは、ネガティブであり、このことは、ＣＥＣの消失を明らかに示した。標的を絞った除去の特異性および非標的染色体の組み込みをさらに調べるため、Ｃｒｅ処理されたＣＥＣ１１ハイブリッド細胞およびＣＥＣ１２ハイブリッド細胞を核型決定した。２つの別個に単離したＣＥＣ１１ハイブリッドクローンは、７９、ＸＸＸＹ、−１１の核型を有し、他の染色体への有害な影響をほとんど有さないか、全く有さなかった（図１０ｅ）。一方、分析されたＣＥＣ１２ハイブリッドクローンは、７９、ＸＸＸＹ、−１２、＋マーカーの核型を有した（図１０ｆ）。このマーカーは、主要なサテライト特異的プローブを用いたＦＩＳＨ分析で示されるように、微小動原体反復を含む染色体であった（図１０ｇ）。まとめると、本発明者らの分析は、個別の常染色体がＥＳ×体細胞ハイブリッド核から有効に除去され得ることを、明らかに示す。興味深いことに、染色体除去頻度は、２つの組み込み部位の間で、第１１番染色体の消失を示すＣＥＣ１１ハイブリッド細胞では２６．１％、および第１２番染色体の消失を示すＣＥＣ１２ハイブリッド細胞では８８．４％と、大きく異なった（表１）。【０２３４】
【表１】
2006075671.tif 000002
【０２３５】
このことはおそらく、ＣＥＣがＣｒｅ分子へ接触する可能性に対する組み込み部位の影響を反映する。これに関係なく、本発明者らの分析は、任意の染色体もしくは所望の染色体群を標的とした除去に対するこの方法の広範な可能性、およびこの方法が全ＥＳゲノムに適用可能であり得ることを明らかに示した。【０２３６】
体細胞ゲノムの再プログラムが、ＥＳ細胞ゲノムの非存在下において安定した幹細胞特性を与えるのに十分であるか否かの解明を始めるため、本発明者らは、次に、第６番染色体の両ＥＳ細胞コピーを標的とした。このコピーは、多能性特異性遺伝子（Ｎａｎｏｇ遺伝子を含む）の集団（ｃｌｕｓｔｅｒ）およびＧｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒ座を含む（図１１ａ、ｆ）。このアプローチを通じて、本発明者らはまた、以下を調べることができた：（ｉ）標的を絞った相同組み換えによるＣＥＣタグ化染色体の有効性、および（ｉｉ）同じ核から一度に１つ以上の染色体を除去することの影響。Ｎａｎｏｇの発現は、ＥＳ細胞および初期胚性細胞において再生可能な多能性状態を維持するために必須であり（Ｈａｔａｎｏ，Ｓ．ら、Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｎａｎｏｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  １２２，６７−７９（２００５）；Ｍｉｔｓｕｉ，Ｋ．ら、Ｔｈｅ  Ｈｏｍｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｎａｎｏｇ  Ｉｓ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｐｉｂｌａｓｔ  ａｎｄ  ＥＳ  Ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  １１３，６３１−４２．（２００３））、そしてＮａｎｏｇの体細胞のサイレントコピーが核移植および細胞融合によって再活性化されることが以前に示されている（Ｈａｔａｎｏ，Ｓ．ら、Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｎａｎｏｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  １２２，６７−７９（２００５））。Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒ座は、Ｎａｎｏｇの上流のドメインであり、ここで、相同組み換えが効率的に生じることが知られている。ｐＲＯＳＡ２６−ｐＡにサブクローニングされたＰｇｋ−ｎｅｏ／ＩＲＥＳ．ｇｆｐ遺伝子を含むＣＥＣを有する標的ベクター（図１１ａ）を、ＨＭ１  ＥＳ細胞にエレクトロポレーションした。試験した１８個のＧ４１８耐性クローンのうち、２つが正確に標的とされて（ＣＥＣ６ｔｇ／＋）、２．３ｋｂのノックイン特異的ＥｃｏＲＶフラグメントを産生することを、サザンブロット分析によって見出し（図１１ｂ）、そしてＦＩＳＨ分析によって確認した（図１１ｆ）。これらのクローンを、Ｇ４１８濃度を上昇した状態（８ｍｇ／ｍｌ）で、さらに１０日間分裂増殖させた。これらの条件から試験した５つのクローンのうち全てが、サザンブロット分析における１１ｋｂの野生型特異的バンドの消失によって示されるように（図１１ｂ）、ＣＥＣに関するホモ接合（ＣＥＣ６ｔｇ／ｔｇ）であることを見出した。正常な核型を有するＣＥＣ６ｔｇ／ｔｇ  ＥＳ細胞を、雌ＪＦ１マウスから収集した成体胸腺細胞とハイブリッド形成させ、そしてＧＦＰポジティブハイブリッドクローンをＨＡＴ培地で選択した。Ｃｒｅ処理の３日後、全ハイブリッド細胞の染色体ペインティング分析は、２．２％（５／２２７）の細胞が、第６番染色体を２つのみ有したことを示した。このことは、ＥＳ細胞由来のＣＥＣタグ化第６番染色体の両方の除去を示す（図１１ｃ）。しかし、Ｃｒｅ処理の７日後、ＧＦＰネガティブ細胞をＦＡＣＳ分類して、��一細胞由来のクローンへと増幅した。染色体ペインティングによって分析された２０個のクローンのうち、１９個は、３つの第６番染色体を各々の核に有した（図１１ｄ）。明らかに一つのクローンは、中部動原体染色体を有し、このことは、第６番染色体の重複による同腕染色体ロバートソン転座の形成を示す（図１１ｅ）。実際、Ｃｒｅ処理後３日とは異なり、２つの第６番染色体を有するハイブリッドクローンは、この段階では検出されなかった。このことは、第６番染色体を２つのみ有する四倍体細胞の遺伝子量の遺伝的不均衡が細胞生存および細胞増殖を妨げたのであろうことを示唆する。３つの第６番染色体は、近位Ｄ６Ｍｉｔ１８３、中心Ｄ６Ｍｉｔ１０２、および遠位Ｄ６Ｍｉｔ１１４における、１２９個のＪＦ１非特異的ＤＮＡ配列多型のＰＣＲ分析によって決定されるように、体細胞（ＪＦ１）由来である（図１１ｆ、ｇ）。【０２３７】
このことを確認するため、ＥＳ由来の両第６番染色体を除去し、Ｎａｎｏｇ転写物をＲｔ−ＰＣＲで増幅した。エキソン特異的配列多型は、Ｆｏｋ１による消化に抵抗性のＥＳ由来産物を与える一方、ＪＦ１体細胞由来の産物は、感受性である（Ｈａｔａｎｏ，Ｓ．ら、Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｎａｎｏｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  １２２，６７−７９（２００５））。Ｃｒｅ処理前、ＥＳ由来の５７０ｂｐバンドと体細胞由来の３２６ｂｐおよび２４４ｂｐのバンドとの両方が検出され得、一方Ｃｒｅ処理後、体細胞由来のバンドのみが見られる（図１１ｈ）。同様の状況が、Ｓｔｅｌｌａ／ＰＧＣ７遺伝子（ＥＳ細胞および初代生殖細胞において発現され、やはり第６番染色体に位置する）について見られた。体細胞由来Ｓｔｅｌｌａ／ＰＧＣ７遺伝子  ＲＴ−ＰＣＲ産物のみを、１４１ｂｐ、１３６ｂｐ、および３３ｂｐのＨｉｎｆＩ消化フラグメントを生成する、Ｃｒｅ処理ハイブリッド細胞ＲＮＡから検出し得た（図１１ｈ）。したがって、ＥＳ由来の第６番染色体の両方とも、ハイブリッド細胞核から選択的に除去された。Ｃｒｅ処理ハイブリッド細胞において、第３の第６番染色体がＪＦ１体細胞性第６番染色体の重複、または動原体領域近くでの体細胞由来第６番染色体とＥＳ細胞由来第６番染色体との間の分裂組み換えから得られるか否かは明らかではない。【０２３８】
重要なことに、ＥＳ由来第６番染色体に関して欠損したＧＦＰネガティブハイブリッド細胞は、未分化の状態で生存する能力があり、抗ＮＡＮＯＧ抗体および抗ＯＣＴ４抗体による免疫組織化学染色がポジティブであることによって確認された（図１１ｉ）。実際、ウェスタンブロットハイブリダイゼーション分析は、３つの別個のＣｒｅ処理ハイブリッドクローンにおける相対的なＮＡＮＯＧ発現レベルが、ＥＳ細胞におけるレベルの約１．５倍であったことを示した（図１１ｊ）。さらに、ＥＳ融合誘導性の体細胞由来のＮａｎｏｇ遺伝子の後成的な再プログラム化は、ＥＳ由来Ｎａｎｏｇの寄与なしで、ハイブリッド細胞の未分化状態を維持するために十分であることが確認された。【０２３９】
このＣＥＣ法は、標的を絞った染色体の除去を通じて、ハイブリッド細胞ゲノム成分の大規模な変化を誘発するために、新規に開発されたアプローチである。再生医療において、ＭＨＣ適合、個人化した幹細胞は、免疫拒絶の可能性が低下した移植組織を生成するための供給源として、強く待望されている。ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ遺伝子のほとんどは、ヒト第６番染色体およびマウス第１７番染色体上に集団を形成している。第一の例においては、ＥＳ由来のＭＨＣ遺伝子を含む染色体の、ＥＳ×体細胞ハイブリッド細胞からの選択的な除去は、治療上のクローニングを必要とすることなく、個別化されたＭＨＣ適合ハイブリッド細胞の供給源を提供し得る。二倍体ＭＨＣ個人化多能性幹細胞を作製するため、ＥＳ由来ＭＨＣ染色体の両コピーは、本発明者らの標的を絞った染色体除去技術と微小核体媒介性染色体移送とを組み合わせて、ＥＳ核中の体細胞由来のＭＨＣ染色体を置き換えられ得る。最終的に、本発明者らは、本発明者らのＣＥＣ法が、全ＥＳ由来染色体の除去を通じて、個体自身の体細胞からの個体として同系の多能性幹細胞の作製を可能にすることを予測する。明らかに、標的を絞った染色体の除去は、種々の生物医学的研究に適用可能である。患者からの遺伝的変異を有するヒトＥＳ細胞の作製は、ヒト疾患の原因を理解し、そしてまた変異ＥＳ由来細胞を使用した薬学的評価に従って適切な薬物を開発する方法をもたらす。【０２４０】
（まとめ）
本発明によりヒトおよびマウスの胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、ＥＳ体細胞ハイブリッド細胞において成体体細胞核に対して多能性を付与することができる。これは、胚の材料を使用せずに、体細胞から再プログラム化多能性幹細胞を作出するための強力なツールである。これにより、ハイブリッド細胞から標的の染色体が除去され、医学の進歩に多大な寄与をすることになる。【０２４１】
この目的に向けて、本発明者らは、ユニバーサル染色体除去カセット（ＣＥＣ）を作製した。本実施例では、Ｎａｎｏｇを含む重要な多能性関連遺伝子を有するハイブリッド細胞から、ＥＳ起源の染色体６の両方のコピーの標的化除去のためのＣＥＣの使用を開示する。ハイブリッド細胞がその後も多能性を保持していたことから、再プログラム化された体細胞核からのＮａｎｏｇの発現が機能していることが証明された。本発明者らの発明によって、ＥＳに由来するＭＨＣ染色体がハイブリッド細胞から除去されるか、またはＥＳに由来するＭＨＣ染色体を体細胞に由来する染色体に置換することによって、幹細胞療法において使用するための個人特定の多能性幹細胞を生産することが可能となった。究極的には、すべてのＥＳ由来の染色体がハイブリッド細胞から除去され得る。また、正常なＥＳ染色体の標的化除去によって、種々の変異を有する患者由来の多能性幹細胞を生産してヒト疾患の原因および治癒を調査することができるという点においても重要である。【０２４２】
ＥＳ細胞は、核の再プログラム化能力を有する。再プログラム化能力とは、マウスおよびヒトの療法において、細胞融合技術により体細胞由来に対して多能性を付与する能力である。このアプローチは、ＥＳ細胞由来の染色体が、ハイブリッド細胞から除くことができ、非常に有用である。【０２４３】
テトラソミーが見出された染色体については、当該分野において公知の任意の方法を用いて正常体へと復旧させることができる。これには、Ｃｒｅ−ｌｏｘ系も含まれる。【０２４４】
（実施例９：染色体の複数および全部除去）
実施例１〜８に記載された例に準じて、他の染色体についても除去することができる。これを繰り返して、複数の染色体を除去することができる。【０２４５】
さらに、これらを繰り返すと、除くべき染色体を全部（例えば、ＥＳ細胞由来の染色体全部）を除くことができる。【０２４６】
これらの除去は、除くべきＥＳ細胞の染色体の情報が分かれば、当業者は周知技術に鑑み本願明細書に記載に基づいて具体的に設計することができる。具体的には以下のように行う。
１．  当該ＣＥＣまたは基本原理と基本設計は当該ＣＥＣを応用した改変型ＣＥＣを、融合前のＥＳ細胞の全ての染色体に導入する。導入はザザンブロット解析またはＦＩＳＨ解析により確認する。
２．  患者の体細胞には、ウイルスベクターによりＧＦＰまたは他のマーカー遺伝子（Ｍ）を導入する（Ｍ−体細胞）。  
３．  該ＣＥＣ  ＥＳ細胞とＭ−体細胞を細胞融合する。融合細胞を体細胞由来のマーカー遺伝子より選択する。  
４．  該融合細胞をＣｒｅ（または他の相同組み換え誘導酵素）により処理する。
５．  ＥＳ細胞に導入したＣＥＣが全て除去された、融合細胞を選択する。
６．  核型解析およびＥＳ細胞の各染色体に特異的なゲノム配列の多型を用いてゲノムＰＣＲ解析やサザンブロット解析により、ＥＳ細胞由来の全染色体の除去を確認する。
７．  作出された個人対応型幹細胞（２倍体）を、患者の必要な細胞に分化誘導し移植治療に用いる。【０２４７】
以上のようにして、所望の染色体全部が除去された細胞を生産することができ、これを医療応用することができる。【０２４８】
（実施例１０：ヒトでの染色体除去）
実施例８と同様の実験をヒト細胞において行うことができる。そのプロトコールを如何に記載する。【０２４９】
［試薬］
・Ｇ４１８（１０ｍｇ／ｍｌ）  溶液：Ｇ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ，  ８６０−１８１１ＩＪ，  ＧＩＢＣＯ）１ｇを１００μＭのＨＥＰＥＳを含む無血清培養液（ＤＭＥＭ）１００ｍｌに溶解させ、ｐＨ７．１に調整後、０．２２μｍフィルターで濾過滅菌後−２０℃に保存する。選択培養液を作製するときに希釈して用いる。
・ＰＥＧ（１：１．４）溶液（用事調整）：５ｇのポリエチレングリコール（ＰＥＧ−１０００，  Ｕ２１８−０７，  ＢＡＫＥＲ）を無血清培養液（ＤＭＥＭ）６ｍｌに溶解させ、最後にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を１ｍｌ加え、０．２２μｍフィルターで濾過滅菌する。
・ＰＥＧ（１：３）溶液（用事調整）：５ｇのポリエチレングリコール（ＰＥＧ−１０００）を無血清培養液（ＤＭＥＭ）１５ｍｌに溶解させ、０．２２μｍフィルターで濾過滅菌する。
・ウワバイン（１×１０−３Ｍ）溶液：３６．４ｍｇのウワバイン８水和物をあらかじめ温めておいた無血清培養液（ＤＭＥＭ）５０ｍｌに溶解させ、０．２２μｍフィルターで濾過滅菌後分注し、−２０℃に保存する。選択培養液を作製するときに希釈（最終濃度１×１０−５Ｍ）して用いる。
・コルセミド（１ｍｇ／ｍｌ）溶液：コルセミド（ＤＥＭＥＣＯＬＣＩＮＥ，  Ｄ−７３８５，  ＳＩＧＭＡ）１ｍｇを蒸留水１ｍｌに溶解させ、４℃で保存する。この溶液を希釈して、コルセミド（０．０５μｇ／ｍｌ）を含む培養液（２０％ＦＢＳ，  ＤＭＥＭ）を調整する。
・サイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ）溶液：サイトカラシンＢ（ｃ−６７６２，  ＳＩＧＭＡ）１０ｍｇをＤＭＳＯ  １ｍｌに溶解させ、無血清培養液（ＤＭＥＭ）１０００ｍｌに溶かし、０．２２μｍフィルターにより滅菌後、４℃で保存する。なお、この溶液は反復使用することができる。
・ＰＨＡ−Ｐ（１ｍｇ／ｍｌ）溶液：Ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−Ｐ（３１１０５６，ＤＩＦＣＯ）１０ｍｇを蒸留水１０ｍｌに溶解させ、０．２２μｍフィルターにより滅菌後−２０℃に保存する。この溶液を希釈して、ＰＨＡ−Ｐ（５０μｇ／ｍｌ）を含む無血清培養液（ＤＭＥＭ）を用意する。【０２５０】
（細胞）
・正常ヒト線維芽細胞（ＮＴＩ−４，  ＪＣＲＢ０２２０およびＭＲＣ−５，  ＡＴＣＣＣＣＬ１７１）：１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭにより培養する。
・疾患に罹患した個体由来のヒト細胞：同様に、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭにより培養するか、他の適切な培地にて培養する。【０２５１】
（ＥＳ細胞）
・ヒトＥＳ細胞：下記のように樹立した細胞を用いることができる。【０２５２】
ＥＳ細胞株の樹立は、フィーダー細胞を用いて行われる。通常、ＥＳ細胞は、胚盤胞から分離した内部細胞塊（ＩＣＭ）をフィーダー細胞上で培養することによって樹立される。通常フィーダー細胞としては、マウス胎仔繊維芽細胞あるいはそれ由来の細胞株STOが用いられている。【０２５３】
ヒトＥＳ細胞の調製は、提供者の合意を得た上で、情報が完全に守られる形で行う。具体的には、本明細書において別の場所において記載されるように、慎重に、かつ、認証された機関で行う。以下に示す実験は京都大学再生医科学研究所において、行われる。【０２５４】
まず、その一般的手順は以下のとおりである。ＥＳ細胞のソースとなる胚を取得し、凍結する。その後、凍結胚を解凍し、胚盤胞期まで培養する。次に、内部細胞塊を分離し、細胞株を樹立する。幹細胞マーカー発現の有無および染色体検定により、幹細胞であること、特にＥＳ細胞であることを確認する。ＥＳ細胞であることを確認するために、幹細胞マーカー（アルカリ性フォスファターゼ活性、特異的抗原、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇなど）の検出を行なう。また核型解析を行なって染色体数や形態が正常かどうかを検定する。その後、分化能を検定する。培養下での分化能を検定するために、培養条件の変更や細胞凝集塊作成による細胞分化の誘導と各種機能細胞への分化能の解析を行なう。また免疫不全動物などへの移植を行なってテラトーマ形成による組織分化能の解析を行なう。【０２５５】
具体的には以下のように行う。【０２５６】
（ＥＳ細胞用培養液）
培地組成：（本明細書においてＣＭＫ培地ともいう）
ＤＭＥＭ／Ｆ１２  （Ｓｉｇｍａ  Ｄ−６４２１）                  ８０ｍｌ
非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）                                  ０．８ｍｌ
２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン                                      １ｍｌ
ＫＳＲ（Ｇｉｂｃｏ）                                                ２０ｍｌ
２−メルカプトエタノール                                    ０．８μｌ
ヒト白血病阻害因子（ｈｕＬＩＦ）（１０μｇ／ｍｌ）            １００μｌ（１０ｎｇ／ｍｌ）
塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（１ｍｇ／ｍｌ）    ０．４μｌ（４ｎｇ／ｍｌ）。【０２５７】
（細胞解離液）
０．２５％  トリプシン（リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））
１ｍＭ  ＣａＣｌ２
２０％ＫＳＲ。【０２５８】
（ディッシュ）
フィーダーをつくる培養ディッシュは予めゼラチンコートしておく。０．１％ゼラチン溶液（ｓｗｉｎｅ  ｓｋｉｎ、Ｔｙｐｅ  Ａ：Ｓｉｇｍａ社製）で覆い、３７℃で１  時間以上インキュベートする。培養ディッシュのゼラチン溶液を除き、細胞の懸濁液を加える。数時間経てばフィーダー細胞として使用可能である。【０２５９】
フィーダー細胞を用いたＥＳ細胞の樹立は、以下のように行った。【０２６０】
１．フィーダー細胞の培養液をＥＳ細胞用の培養液に交換した。【０２６１】
２．免疫手術法もしくは機械的操作により胚盤胞から内部細胞塊を分離した。免疫手術法は、簡単に述べると、以下のとおりである。【０２６２】
酵素処理などにより透明帯を取り除き、表面抗原に反応する抗体溶液内でインキュベートした。次に補体溶液内でインキュベートすることによって最外層の細胞である栄養外胚葉が取り除かれ、内部細胞塊が分離された。【０２６３】
ヒトＥＳ細胞の場合、ヒトの細胞表面抗原に反応する抗体溶液を用いることに留意して上記手順を行う。【０２６４】
３．分離した内部細胞塊をフィーダー細胞上で培養した。【０２６５】
４．翌日内部細胞塊がフィーダー細胞に接着していることを確認して、培養液を交換した。以後毎日培地交換した。【０２６６】
５．５−１０日後に内部細胞塊から増殖してくるＥＳ細胞様の細胞が認められるようになった。細胞塊が１００から２００μｍになったら継代を行った。【０２６７】
６．培養液をのぞき細胞解離液を入れた。【０２６８】
７．５から１０分間処理するとＥＳ細胞様細胞が培養ディッシュよりはがれてくるので、これを細く引いたガラス管で拾い上げ数回出し入れすることで細胞塊を数個に分けた。【０２６９】
８．培養液中で細胞解離液を洗浄して除き、新しいフィーダー上に細胞塊を移した。【０２７０】
９．翌日、培養液を交換した。以後毎日培地交換した。【０２７１】
１０．フィーダー上で個々の細胞塊が１００−２００μｍ程度に増殖するのを確認した後、同様の操作で継代を行った。【０２７２】
１１．細胞が十分増殖するようになれば（３５mm培養ディッシュ１枚に増えるぐらい）サルＥＳ細胞の通常の継代操作と同様に継代ができるようになった。この段階に達すれば以後安定した培養が可能であることが確認される。【０２７３】
この実施例で樹立された細胞は、幹細胞であることが確認される。【０２７４】
本実施例では、基本培地にＤＭＥＭ／Ｆ１２を例示するが、ＤＭＥＭまたは他の基本培地でも問題なく使用できることが示される。【０２７５】
（マーカーによる染色）
次に、樹立した細胞の未分化状態を、特異的マーカーによる染色により調べた。ＥＳ細胞を、４％  ＰＦＡで固定し標準的な培養細胞の免疫染色法（Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，  １９８５．Ａｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｃｅｌｌ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｒｌａｎｄｏ，  ＦＬ，  ｐｐ．１−１３．）に従い免疫染色を行う。ブロッキングは０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ／ＰＢＳ／２％スキムミルクを用い室温で一時間、洗いは０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ／ＰＢＳを用い室温で５分を４回行う。一次抗体はＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０のモノクローナル抗体をそれぞれ２００μｇ／ｍｌ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を１／１００希釈したものを、二次抗体はＦＩＴＣ標識ｇｏａｔ  抗−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＺＹＭＥＤ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ）を１／２００希釈したものを使用した。二次抗体の反応後はローダミンファロイディン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）、ＤＡＰＩ（ＳＩＧＭＡ）の順に染色を行いシグナルを検出する。【０２７６】
ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）の組織化学的染色は、以下のように行った。培養ディッシュをダルベッコのＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、４℃の９５％冷エタノールで３０分以上固定し、次いで４℃の無水エタノールで３０分以脱水する。固定液を除き、ディッシュを室温で０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０〜９．５）にて５分間３回洗浄した後、１．５〜２ｍｌの染色液（ナフトールＡＳ−ＢＩホスフェート（シグマ社、カタログ番号Ｎ−２１２５）２．５ｍｇと、ファースト赤ＴＲ塩（Ｓｉｇｍａ）１５ｍｇ［またはファースト紫Ｂ塩６ｍｇ（Ｓｉｇｍａ）、ファースト青ＢＢ塩１２．５ｍｇ（Ｓｉｇｍａ）］とを０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液２５ｍｌに加え、遮光下で３〜５分間撹拌して溶解し、次いで濾過する）を各ディッシュに加え、遮光下で室温にてＡＬＰを１５〜３０分間染色する。ＰＢＳ（−）で２回洗浄した後グリセロールを加え位相差立体顕微鏡で赤褐色に染まったＥＳ細胞コロニーを検鏡する。【０２７７】
このようにして、樹立した幹細胞は通常どおり多分化能を保持していることが確認される。
［機器、器具］
・高速冷却遠心器（日立  ＳＣＲ２０Ｂ）
・ローター（日立  ＲＰＲ９−２）
・ゴム製アダプター（日立３００Ａ５００）
・遠心用フラスコ（コースター３０２５）
・アクリル製遠心用容器（特注品，池本理化）
・微小核細胞精製用フィルター：Ｓｗｉｎｎｅｘ  ２５ｍｍ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製のホルダーにフィルター（８μｍ，  ５μｍ，  ３μｍ；  ＳＮ１１０６１４，  ＳＮ−１１０６１３，  ＳＮ１１０６１２，  ＮＵＣＬＥＰＯＲＥ）をそれぞれセットし、オートクレーブ滅菌する。【０２７８】
３．  操作
１）正常ヒト線維芽細胞へのプラスミドＤＮＡトランスフェクションおよび、Ｇ４１８耐性クローンの分離
（１）トランスフェクション２日前にトリプシン処理により分散した正常ヒト線維芽細胞（２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｆｌａｓｋ）を４個の培養用フラスコ（２５ｃｍ２）に植え込む。
（２）トランスフェクションの４時間前に新しい培養液（１０％ＦＢＳ，  ＤＭＥＭ）に交換する。
（３）実施例１において調製されるような染色体除去カセットＮＡ（２５μｇＤＮＡ）を含むリン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿液（２．５ｍｌ）を作製し、ピペッティングにより均一にした沈殿液０．５ｍｌ（５μｇ  ＤＮＡ）を培養用フラスコに加え、緩やかに広げてＣＯ２インキュベーター内で４時間培養する。
（４）無血清培養液（ＤＭＥＭ）で細胞表面を洗い、１．５ｍｌの１５％グリセロール／ＨＢＳ溶液で１分間慮理する。
（５）無血清培養液（ＤＭＥＭ）で細胞表面を洗い、通常の培養液（１０％ＦＢＳ，  ＤＭＥＭ）で２日間培養する。
（６）トリプシン処理により細胞を分散し、Ｇ４１８（４００μｇ・ｍｌ）を含む選択培養液（１０％ＦＢＳ，  ＤＭＥＭ）に懸濁した細胞（１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｐｌａｔｅ）をプラスチックシャーレ（直径１００ｍｍ）６０枚に植え込み、約３週間選択培養する（２〜３日おきに培養液を交換する）。
（７）各シャーレに出現したＧ４１８耐性細胞からなるコロニーをクローニングする。
２）Ｇ４１８耐性ヒト細胞とマウスＡ９細胞との細胞融合および雑種細胞の分離
（１）トリプシン処理により細胞を分散し、培養液（１０％ＦＢＳ，  ＤＭＥＭ）懸濁したそれぞれの細胞（１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｅａｃｈ）を培養用フラスコ（２５ｃｍ２）に同時に植え込み、１日間培養する。
（２）ＰＢＳ溶液で細胞表面を２回洗った後、３ｍｌのＰＥＧ（１：１．４）溶液で１分間処理し、さらに、３ｍｌのＰＥＧ（１：３）溶液に換え１分間処理する。
（３）ＰＥＧ溶液を吸い取り、無血清培養液（ＤＭＥＭ）で３回洗った後、通常の培養液（１０％ＦＢＳ，  ＤＭＥＭ）で１日間培養する。
（４）トリプシン処理により細胞を分散し、ウワバイン（１×１０−５Ｍ）およびＧ４１８（８００μｇ／ｍｌ）を含む二重選択培養液（１０％ＦＢＳ，  ＤＭＥＭ）に懸濁した細胞（２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｐｌａｔｅ）をプラスチックシャーレ（直径１００ｍｍ）に植え込み、約３週間選択培養する（２〜３日おきに培養液を交換する）。
（５）各組み合わせ（ＮＴＩ−４細胞あるいはＭＲＣ−５細胞）より少なくとも１個の雑種細胞クローンを分離する。
３）雑種細胞からの微小核細胞分離
（１）微小核を分離する細胞を培養用フラスコ（７５ｃｍ２）で８０％〜９０％飽和の状態まで培養する。
（２）トリプシン処理により細胞を分散し、Ｇ４１８（８００μｇ／ｍｌ）を含む選択培養液（１０％ＦＢＳ，  ＤＭＥＭ）７ｍｌに懸濁させ、遠心用フラスコ（２５ｃｍ２）６個に細胞懸濁液１ｍｌずつを分配し、４ｍｌ選択培養液を加え、２日間培養する。なお、コルセミド処理をする前の細胞密度は７０〜８０％飽和程度が望ましい、従って２日間の培養を必ずしも必要としない場合もある。
（３）コルセミド（０．０５μｇ／ｍｌ）を含む培養液（２０％ＦＢＳ，  ＤＭＥＭ）に交換し、さらに２日間培養（微小核を形成させる）する。
（４）培養液を除去し、あらかじめ保温（３７℃）しておいたサイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ）溶液を遠心用フラスコに、ほぼいっぱいに満たす。
（５）アクリル製遠心用容器に遠心用フラスコを挿入し、温湯（３４℃）注入後（遠心用フラスコ中の水面を超えない程度）、ゴム製のアダプターを装着し、３４℃、８０００ｒｐｍ、１時間の遠心分離を行う。
（６）遠心分離後のサイトカラシンＢ溶液を除去し、遠心用フラスコの隅に位置する微小核細胞を１ｍｌの無血清培養液（ＤＭＥＭ）に懸濁した後回収し、さらに、１ｍｌの無血清培養液で洗い、最初の微小核細胞懸濁液に合わせる（合計約１２ｍｌ）。
（７）懸濁液を８μｍ，  ５μｍ，  ３μｍの順にフィルターを通し、微小核細胞を精製する。通常、８μｍのフィルターを１個、５μｍは２個、３μｍは１個を使用する。【０２７９】
４）微小核細胞と別種細胞との微小核雑種細胞形成
（１）別種細胞（例えば、ＥＳ細胞以外の細胞）を培養用フラスコ（２５ｃｍ２）で８０％飽和の状態まで培養する。
（２）精製した微小核細胞懸濁液を１，５００ｒｐｍ，  ５分間の遠心分離後、ＰＨＡ−Ｐ（５０μｇ／ｍｌ）を含む無血清培養液（ＤＭＥＭ）２ｍｌに再懸濁する。
（３）遠心分離の間に、細胞表面を無血清培養液（ＤＭＥＭ）で２回洗浄後、再懸濁した微小細胞を静かに播き、１５分間（３７℃）ＣＯ２インキュベーター内に静置する。
（４）微小核細胞懸濁液を吸い取り、ＰＥＧ（１：１．４）溶液３ｍｌを加え正確に１分間処理する。ＰＥＧは細胞に対して毒性が強いため、ここでの処理時間は正確に行う必要がある。
（５）ＰＥＧ溶液を除去し、無血清培養液（ＤＭＥＭ）で少なくとも３回洗い、通常培養液（１０％ＦＢＳ，  ＤＭＥＭ）で１日間培養する。
（６）トリプシン処理により細胞を分散し、Ｇ４１８（８００μｇ／ｍｌ）を含む選択培養液（ＤＭＥＭ）に懸濁した細胞をプラスチックシャーレ（直径１００ｍｍ）３枚に植え込み、約３週間選択培養する（２〜３日おきに培養液を交換する）。
（７）シャーレに出現したＧ４１８耐性別種細胞からなるコロニーをクローニングする。
５）微小核雑種細胞のヒト染色体同定：キナクリン・ヘキスト併用染色法により染色体解析を行い、選択したＧ４１８耐性別種細胞クローンに正常ヒト染色体が含まれていることを確認する。また、染色体ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を行い、存在するヒト染色体上の染色体除去カセットの標識部位を同定する。【０２８０】
（染色体除去）
染色体除去カセットを導入したＥＳ細胞を用いて相同組換えによりを所望の染色体上に載せる。続いて、染色体除去カセットを用いてセカンド遺伝子座上に載せる。所望の遺伝子の両遺伝座にＣＥＣが導入されたＥＳ細胞を得る。【０２８１】
４．ＦＩＳＨ解析
ＣＥＣをぞれぞれの染色体にもつＥＳ細胞を同定し、ライブラリーを作製する。【０２８２】
所望の染色体の所望の遺伝子座にホモにＣＥＣが導入されたＥＳ細胞と体細胞を融合する。融合細胞をｐＣＭＶ−Ｃｒｅで処理し、ＥＳ細胞由来の所望の染色体が除去されたクローンを得る。この遺伝子操作ＥＳ細胞をｉｎ  ｖｉｖｏやｉｎ  ｖｉｔｒｏで様々な組織に分化誘導し、移植実験を行うことで拒絶反応の有無および程度を検定する。【０２８３】
（Ｇ４１８  高濃度薬剤耐性クローンの選択（ホモ細胞選択用プロトコール））
Ｐｇｋ−ｎｅｏカセットを導入したトランスジェニックＥＳ細胞を、２５０μｇ／ｍｌ  Ｇ４で選択する。
２．  Ｇ４１８耐性ＥＳ細胞（５ｘ１０６個）を直径３ｃｍの培養ディシュ（６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）に播き、５−１０  ｍｇ／ｍｌ  の高濃度Ｇ４１８存在下で３日間培養する。この間、毎日選択培地の交換を行う。
選択培養後３日目に、３ｃｍ培養ディシュ３枚にサブカルチャーし、５−１０  ｍｇ／ｍｌ  の高濃度Ｇ４１８存在下で４−７日間培養する。この間、毎日選択培地の交換を行う。
４．  約４０個ほどの高濃度Ｇ４１８耐性ＥＳ細胞のコロニーが出現する。
５．  それぞれのコロニーからＤＮＡを抽出し、ゲノムＰＣＲ法またはサザンハイブリダイゼーション法によりＰｇｋ−ｎｅｏカセットをホモに持つクローンを選択する。【０２８４】
（４．結果および考察）
ヒト細胞における場合は、上記のようにかなり複雑な手順ではあるが、注意深く細胞の状態を観察しつつ行えば、融合細胞および染色体導入は比較的容易である。しかし、この実験方法にとって４つのポイントがある。（１）融合に用いるポリエチレングリコールは製造元あるいはロットによりその毒性が異なるため、ロットチェックを行い、毒性の少ないものを使用する。（２）細胞によりｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−Ｐ（ＰＨＡ−Ｐ）に対する感受性が異なることから、ＰＨＡ−Ｐ濃度を減少させるあるいは全く用いないなど、必要に応じて調節する。（３）微小核細胞の精製に用いるフィルターにもれが生じ、親細胞が混入することがある。従って、精製した微小核細胞の一部をプレートにまき親細胞の混入の有無を確かめる。（４）必ずしも染色体が完全な状態で導入されているとは限らないため、染色体解析が必須である。【０２８５】
実際には、前述した実験をくり返し行い、最終的に充分数の細胞を分離する。染色体解析によりヒト染色体の存在を検索することによって、クローンにおいて正常ヒト染色体がそれぞれ１本含まれていることが確認することができる。上述のように、選択培養にあたっては受容細胞が１００％死滅する最低濃度を用いる。さらに、得られたＧ４１８耐性細胞クローンについて染色体解析は必須であるが、ヒト染色体特異的ＤＮＡプローブを用いたＲＦＬＰ解析、あるいは染色体ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法などによっても、導入染色体の存在を確認することができる。【０２８６】
このようにして、所望の染色体が一方または両方のコピーで除去されたＥＳ細胞と、所望の細胞との融合細胞を得ることができる。【０２８７】
（実施例１１：染色体交換の例）
実施例１〜１０に記載された実験手順を応用して染色体交換細胞を作製することができる。その具体的手順を以下に示す。【０２８８】
その手順は、体細胞の染色体（２コピーまたは１コピー）をもつ細胞質をＥＳ細胞と融合させ、入れた染色体と同じＥＳ細胞由来染色体をカセットで抜くというものである。以下に具体的な手順を示す。
１．体細胞由来のＭＨＣ染色体２本（父性および母性）にそれぞれ異なる薬剤抵抗性遺伝子を導入する。  
２．  該体細胞とＡ９細胞を細胞融合する。融合細胞を上記微小核作製法を応用することで、ＭＨＣ染色体のみを含む微小核を作製する。  
３．  ＥＳ細胞は、ＭＨＣ染色体２本にＣＥＣ（ＧＦＰまたはＨＳＶ−ＴＫ遺伝子をマーカーに含  む）導入された、ＭＨＣ−ＣＥＣ  ＥＳ細胞を作製する。  
４．  ＭＨＣ−ＣＥＣ  ＥＳ細胞と体細胞由来のＭＨＣ微小核を細胞融合する。薬剤選択により、体細胞由来のＭＨＣ染色体が導入された微小核融合ＭＨＣ−ＣＥＣ  ＥＳ細胞を選択する。  
５．  体細胞由来のＭＨＣ染色体が導入された微小核融合ＭＨＣ−ＣＥＣ  ＥＳ細胞をＣｒｅ処理する。ＧＦＰ陰性細胞をＦＡＣＳソーティングまたはガンシクロビル抵抗性細胞を薬剤選択することで、ＥＳ細胞由来のＭＨＣ染色体が除去され、体細胞由来のＭＨＣ染色体をもつ、ＭＨＣ個人対応型２倍体ＥＳ細胞を選び出す（ＭＨＣ染色体交換幹細胞）。      【０２８９】
６．  作出されたＭＨＣ個人対応型幹細胞（２倍体）を、患者の必要な細胞に分化誘導し移植治療に用いる。  【０２９０】
このようにして、染色体交換細胞を生産し、医療応用することができる。【０２９１】
（実施例１２：再生治療の例）
上記実施例で得られる染色体除去後の融合細胞を神経細胞に分化誘導し、生体脳に移植することが可能である。神経細胞への分化には、以下の条件を使用する。この未分化細胞を、３回無血清培地にて洗浄し、血清を完全に取り除いた。ＥＳ細胞培地にウシ血清の代わりにノックアウト血清代替添加物ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ．Ｎｏ．１０８２８−０２８）を加えた培地を用いて、ＰＡ６フィーダー細胞上で未分化細胞を８−１１日間培養する（Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｎｅｕｒｏｎ  ２８；  ３１−４０、Ｔａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３；  Ｄｅｖ．  Ｄｙｎ．，  ２２７；  ５０４−５１０．参照）。これにより、神経細胞に分化させることができる。【０２９２】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０２９３】
所望の染色体を除去するためのＤＮＡキット、カセット（遺伝子工学ツールとして）、所望の染色体が除去された細胞、およびそのライブラリー、所望の染色体（特に、ＭＨＣ）を除去することにより、必要に応じて必要な遺伝子を導入することによりテイラーメイド医療が可能になる。
【図１Ａ】
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【図１ＢＣ】
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【図１Ｄ】
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【図１ＥＦ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図９ｅ】
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【図９ｆ】
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【図９ｇ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１０ｅ】
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【図１０ｆ】
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【図１０ｇ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１１ｅ】
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【図１１ｆｇ】
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【図１１ｈ】
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【図１１ｉ】
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【図１１ｊ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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