(57)【要約】  低分子量ＧＴＰ結合蛋白質の１グループであるＲｈｏファミリー蛋白質に対するグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）活性を有する新規な蛋白質をコードする遺伝子、すなわち配列番号１、３若しくは５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、該ポリヌクレオチドの相同物、前記ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターを含む形質転換体、前記ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質に対する抗体、前記ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の機能および／または発現を阻害する化合物の同定方法、疾患の判定方法、医薬組成物および試薬キットを提供した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、または配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチド若しくは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列表の配列番号３若しくは５に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、または配列表の配列番号４若しくは６に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列表の配列番号３に記載の塩基配列若しくはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、または配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチド若しくは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドであって、Ｃｄｃ４２に対するグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
下記の群から選ばれるポリヌクレオチドであって、Ｃｄｃ４２に対するグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド：
ｉ）請求項１または２に記載のポリヌクレオチドの塩基配列と少なくとも７０％の相同性を有する塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、
ｉｉ）請求項１または２に記載のポリヌクレオチドの塩基配列において、１乃至数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有するポリヌクレオチド、および
ｉｉｉ）請求項１または２に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体。
【請求項７】
請求項５に記載の組換えベクターおよびＣｄｃ４２をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクターにより形質転換されてなる請求項６に記載の形質転換体。
【請求項８】
配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質。
【請求項９】
配列表の配列番号４または６に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質。
【請求項１０】
請求項３または４に記載のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質。
【請求項１１】
請求項６または７に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項８から１０のいずれか１項に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項１２】
請求項８から１０のいずれか１項に記載の蛋白質を認識する抗体。
【請求項１３】
請求項８から１０のいずれか１項に記載の蛋白質の機能および／または請求項１から４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法であって、該化合物と該蛋白質および／または該ポリヌクレオチドとの相互作用を可能にする条件下で、該機能および／または該発現の存在、不存在または変化を検出することにより、該化合物が該蛋白質の機能および／または該ポリヌクレオチドの発現を阻害するか否かを判定することを特徴とする同定方法。
【請求項１４】
蛋白質の機能が、Ｃｄｃ４２に対するグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）活性である請求項１３に記載の同定方法。
【請求項１５】
ヒト食道組織由来の被検組織が、ヒト食道癌由来組織であるか否かを判定する方法であって、該被検組織における請求項１から４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする判定方法。
【請求項１６】
被検組織における請求項１から４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの発現量が、対照であるヒト正常食道由来組織における該ポリヌクレオチドの発現量の少なくとも２．５倍以上である場合に、被検組織がヒト食道癌由来組織であると判定することを特徴とする、請求項１５に記載の判定方法。
【請求項１７】
請求項８から１０のいずれか１項に記載の蛋白質の機能を阻害する化合物および／または請求項１から４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物を有効成分として含んでなる食道癌の防止剤および／または治療剤。
【請求項１８】
請求項８から１０のいずれか１項に記載の蛋白質の機能を阻害する化合物および／または請求項１から４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物を用いることを特徴とする食道癌の防止方法および／または治療方法。
【請求項１９】
請求項８から１０のいずれか１項に記載の蛋白質、請求項１から４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項５に記載の組換えベクター、請求項６または７に記載の形質転換体および請求項１２に記載の抗体のうち少なくともいずれか１つを含んでなる試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低分子量ＧＴＰ結合蛋白質の１グループであるＲｈｏファミリー蛋白質に対するグアニンヌクレオチド交換因子活性を有する蛋白質および該蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する。より詳しくは、Ｒｈｏファミリー低分子量ＧＴＰ結合蛋白質であるＣｄｃ４２に対するグアニンヌクレオチド交換因子活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体に関する。また、前記蛋白質の製造方法、前記蛋白質に対する抗体に関する。さらに、前記蛋白質の機能および／または前記ポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法に関する。また、前記ポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする腫瘍疾患、例えば食道癌の診断方法に関する。さらに、前記蛋白質の機能阻害剤および／または前記ポリヌクレオチドの発現阻害剤を有効成分として含んでなる腫瘍疾患、例えば食道癌の防止剤および／または治療剤、前記蛋白質の機能阻害剤および／または前記ポリヌクレオチドの発現阻害剤を用いることを特徴とする、腫瘍疾患、例えば食道癌の防止方法および／または治療方法に関する。また、前記蛋白質、前記ポリヌクレオチド、前記組換えベクター、前記形質転換体および前記抗体のうち、少なくともいずれか１つを含んでなる試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｒｈｏファミリー低分子量ＧＴＰ結合蛋白質（以下、単にＲｈｏファミリー蛋白質と称することがある）は低分子量ＧＴＰ結合蛋白質（以下、単に低分子量Ｇ蛋白質と称する）の１グループに属する蛋白質である。低分子量Ｇ蛋白質は、細胞膜受容体と細胞内情報伝達経路に関与する効果器（エフェクター）との間で、シグナルの増幅因子として作用する。また、低分子量Ｇ蛋白質は、グアノシン５´−三リン酸（ＧＴＰ）またはグアノシン５´−二リン酸（ＧＤＰ）と特異的に結合し、結合したＧＴＰをＧＤＰに加水分解する酵素活性をもつ。細胞膜受容体に細胞外情報物質が結合すると、そのシグナルが低分子量Ｇ蛋白質に伝達され、低分子量Ｇ蛋白質に結合しているＧＤＰと細胞内に存在するＧＴＰとの交換反応（以下、ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応と略称する）が起きる。その結果、活性型のＧＴＰ結合型低分子量Ｇ蛋白質が生じる。活性型低分子量Ｇ蛋白質は、エフェクターに作用してシグナルを増幅する。その後、ＧＴＰ結合型低分子量Ｇ蛋白質は、その酵素活性により、結合しているＧＴＰをＧＤＰに加水分解し、それにより不活性化する。このように、低分子量Ｇ蛋白質は、グアニンヌクレオチドの交換により、細胞内情報伝達経路において分子スイッチとして働く。【０００３】
Ｒｈｏファミリー蛋白質として、Ｃｄｃ４２、Ｒａｃ１およびＲｈｏＡ等が知られている。Ｃｄｃ４２は線維芽細胞でフィロポディアの形成を制御している。Ｒａｃ１は、白血球やマクロファージではスーパーオキシドの産生を、線維芽細胞では細胞膜のラッフリングやラメリポディアの形成を制御している。また、Ｃｄｃ４２とＲａｃ１はｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼシグナル伝達経路を活性化し得る。このように、Ｒｈｏファミリー蛋白質は、細胞内情報伝達の制御を介して様々な細胞機能に関与している。Ｒｈｏファミリー蛋白質が関与する細胞機能として、例えば細胞骨格の再構成、細胞接着、遺伝子発現等が知られている。Ｒｈｏファミリー蛋白質を介するこのような作用は、発生時の形態形成、白血球等の遊走、神経突起退縮、および癌細胞の転移や浸潤に働くと考えられる。【０００４】
Ｒｈｏファミリー蛋白質の分子スイッチとしての作用に関与している分子の１つがＲｈｏグアニンヌクレオチド交換因子（Ｒｈｏ  Ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｆａｃｔｏｒ、以下Ｒｈｏ−ＧＥＦと略称する）である。Ｒｈｏ−ＧＥＦは、Ｒｈｏファミリー蛋白質のＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応を促進して、Ｒｈｏファミリー蛋白質をＧＤＰが結合した不活性型からＧＴＰが結合した活性型に変換する機能を有する。この機能により、Ｒｈｏ−ＧＥＦは、Ｒｈｏファミリー蛋白質が関与する細胞内情報伝達の制御に重要な役割を担う。以下、ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応を促進して、Ｒｈｏファミリー蛋白質をＧＤＰが結合した不活性型からＧＴＰが結合した活性型に変換することをＧＥＦ活性またはＲｈｏファミリー蛋白質の活性化と称することがある。【０００５】
Ｒｈｏ−ＧＥＦには、特徴的ドメイン構造、例えばＤｂｌ相同ドメイン（Ｄｂｌ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  Ｄｏｍａｉｎ、以下ＤＨドメインと略称する）およびプレックストリン相同ドメイン（Ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  Ｄｏｍａｉｎ、以下ＰＨドメインと略称する）が存在する。ＤＨ／ＰＨのタンデム構造は、Ｒｈｏ−ＧＥＦに典型的なドメイン構造である。以下、ＤＨドメインおよびＰＨドメインのタンデム構造を、ＤＨ／ＰＨドメインと呼称する。【０００６】
ＤＨ／ＰＨドメインは、Ｒｈｏ−ＧＥＦの活性化に寄与する重要なドメインであり、Ｒｈｏ−ＧＥＦの活性ドメインであると考えられている。例えば、Ｒｈｏ−ＧＥＦのプロトタイプであるｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌのアミノ酸配列のうち、ＤＨ／ＰＨドメインを含むＣ末端側領域からなる蛋白質が、Ｒｈｏファミリー蛋白質を活性化することが報告されている（非特許文献１）。この報告において、ｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌの全長９２５アミノ酸残基からなるアミノ酸配列のうちＮ末端側第１番目から第４９７番目のアミノ酸残基の欠失により生じたＣ末端側領域からなる蛋白質は、Ｒｈｏファミリー蛋白質を活性化し、その結果、細胞形質転換に関与した。このことから、ｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌの活性化は腫瘍原性活性化（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）と考えられている。以下、ｐｒｏｔｏ−ＤｂｌのＣ末端側領域からなるこのような蛋白質をｏｎｃｏｇｅｎｉｃ−Ｄｂｌと呼称する。ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ−Ｄｂｌが、ＲｈｏＡ、Ｃｄｃ４２およびＲａｃ１と結合すること、並びにＣｄｃ４２およびＲｈｏＡに対してＧＥＦ活性を有する一方、Ｒａｃ１にはＧＥＦ活性を示さないことが報告されている（非特許文献２）。【０００７】
ｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌのファミリー蛋白質をコードする遺伝子として、例えばｖａｖ（非特許文献３および４）、ｏｓｔ（非特許文献５）、ｌｂｃ（非特許文献６）等が知られている。これら遺伝子は癌に関与する遺伝子である。その他、Ｒｈｏ−ＧＥＦとして作用する蛋白質をコードする遺伝子として、Ｔｒｉｏ（非特許文献７）やｋａｌｉｒｉｎ（非特許文献８）等が報告されている。Ｔｒｉｏは、そのノックアウトマウスにおいて胎仔発生時の骨格筋の異常および脳の構成異常を引き起こす。ｋａｌｉｒｉｎは、神経細胞における神経突起形成に関与する。このように、Ｒｈｏ−ＧＥＦとして作用する蛋白質が関与する細胞機能は蛋白質ごとに固有であり、また、該蛋白質により活性化されるＲｈｏファミリー蛋白質もそれぞれ異なる。【０００８】
【非特許文献１】ビ（Ｂｉ，Ｆ．）ら、「モレキュラー  アンド  セルラー  バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、２００１年、第２１巻、ｐ．１４６３−１４７４。
【非特許文献２】ハート（Ｈａｒｔ，Ｍ．Ｊ．）ら、「ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９４年、第２６９巻、ｐ．６２−６５。
【非特許文献３】カツァブ（Ｋａｔｚａｖ，Ｓ．）ら、「エンボ  ジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ）」、１９８９年、第８巻、ｐ．２２８３−２２９０。
【非特許文献４】コステロ（Ｃｏｓｔｅｌｌｏ，Ｐ．Ｓ．）ら、「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９９９年、第９６巻、ｐ．３０３５−３０４０。
【非特許文献５】ホリイ（Ｈｏｒｉｉ，Ｙ．）ら「エンボ  ジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ）」、１９９４年、第１３巻、ｐ．４７７６−４７８６。
【非特許文献６】トクソズ（Ｔｏｋｓｏｚ，Ｄ．）ら、「オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）」、１９９４年、第９巻、ｐ．６２１−６２８。
【非特許文献７】オブリエン（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｓ．Ｐ．）ら、「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、２０００年、第９７巻、ｐ．１２０７４−１２０７８。
【非特許文献８】ペンゼス（Ｐｅｎｚｅｓ，Ｐ．）ら、「ジャーナル  オブ  ニューロサイエンス（Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）」、２００１年、第２１巻、ｐ．８４２６−８４３４。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、新規なＲｈｏ−ＧＥＦおよび該Ｒｈｏ−ＧＥＦをコードする遺伝子を提供することである。また本発明の課題には、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体を提供することも含まれる。さらに本発明の課題には、該Ｒｈｏ−ＧＥＦの製造方法および該Ｒｈｏ−ＧＥＦを認識する抗体を提供することも含まれる。また本発明の課題には、該Ｒｈｏ−ＧＥＦの機能および／または該遺伝子の発現を阻害する化合物の同定方法を提供することも含まれる。さらに本発明の課題には、該Ｒｈｏ−ＧＥＦの機能の異常および／または該遺伝子の発現の異常に基づく疾患の防止方法および／または治療方法、並びに該疾患の診断方法、試薬キットを提供することも含まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題解決のために鋭意努力し、Ｒｈｏ−ＧＥＦに特徴的なＤＨ／ＰＨドメインをコードする領域を有する新規遺伝子を見出し、さらに該遺伝子を取得することに成功した。そして、該遺伝子の部分配列であってＤＨ／ＰＨドメインコード領域を含む塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が、Ｒｈｏファミリー蛋白質であるＣｄｃ４２に対するＧＥＦ活性を有することを実証した。さらに該Ｒｈｏ−ＧＥＦ遺伝子の組織発現が、食道癌例において正常な食道組織の少なくとも２．５倍以上であることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて達成した。【００１１】
すなわち本発明は、配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、または配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチド若しくは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドに関する。【００１２】
本発明はまた、配列番号３若しくは５に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、または配列番号４若しくは６に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドに関する。【００１３】
本発明はさらに、配列番号３に記載の塩基配列若しくはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、または配列番号４に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチド若しくは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドであって、Ｃｄｃ４２に対するＧＥＦ活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する。【００１４】
本発明はさらにまた、下記の群から選ばれるポリヌクレオチドであって、Ｃｄｃ４２に対するグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する：
ｉ）前記ポリヌクレオチドの塩基配列と少なくとも７０％の相同性を有する塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、
ｉｉ）前記ポリヌクレオチドの塩基配列において、１乃至数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有するポリヌクレオチド、および
ｉｉｉ）前記ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。【００１５】
本発明はまた、前記いずれかのポリヌクレオチドを含有する組換えベクターに関する。【００１６】
本発明はさらに、前記組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体に関する。【００１７】
本発明はさらにまた、前記組換えベクターおよびＣｄｃ４２をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体に関する。【００１８】
本発明はまた、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質に関する。【００１９】
本発明はさらに、配列番号４または６に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質に関する。【００２０】
本発明はさらにまた、前記いずれかのポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質に関する。【００２１】
本発明はまた、前記形質転換体を培養する工程を含む、前記いずれかの蛋白質の製造方法に関する。【００２２】
本発明はさらに、前記いずれかの蛋白質を認識する抗体に関する。【００２３】
本発明はさらにまた、前記いずれかの蛋白質の機能および／または前記いずれかのポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法であって、該化合物と該蛋白質および／または該ポリヌクレオチドとの相互作用を可能にする条件下で、該機能および／または該発現の存在、不存在または変化を検出することにより、該化合物が該蛋白質の機能および／または該ポリヌクレオチドの発現を阻害するか否かを判定することを特徴とする同定方法に関する。【００２４】
本発明はまた、蛋白質の機能がＣｄｃ４２に対するＧＥＦ活性である前記同定方法に関する。【００２５】
本発明はさらに、ヒト食道組織由来の被検組織が、ヒト食道癌由来組織であるか否かを判定する方法であって、該被検組織における前記いずれかのポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする判定方法に関する。【００２６】
本発明はさらにまた、被検組織における前記いずれかのポリヌクレオチドの発現量が、対照であるヒト正常食道由来組織における該ポリヌクレオチドの発現量の少なくとも２．５倍以上である場合に、被検組織がヒト食道癌由来組織であると判定することを特徴とする、前記判定方法に関する。【００２７】
本発明はまた、前記いずれかの蛋白質の機能を阻害する化合物および／または前記いずれかのポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物を有効成分として含んでなる食道癌の防止剤および／または治療剤に関する。【００２８】
本発明はさらに、前記いずれかの蛋白質の機能を阻害する化合物および／または前記いずれかのポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物を用いることを特徴とする食道癌の防止方法および／または治療方法に関する。【００２９】
本発明はさらにまた、前記いずれかの蛋白質、前記いずれかのポリヌクレオチド、前記組換えベクター、前記形質転換体および前記抗体のうち少なくともいずれか１つを含んでなる試薬キットに関する。
【発明の効果】
【００３０】
本発明により、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有する新規蛋白質をコードするポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質を提供できる。また、前記ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体を提供できる。さらに、前記蛋白質の製造方法、前記蛋白質に対する抗体を提供できる。また、前記蛋白質の機能および／または前記ポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法を提供できる。さらに、前記ポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする腫瘍疾患、例えば食道癌の診断方法を提供できる。また、前記蛋白質の機能阻害剤および／または前記ポリヌクレオチドの発現阻害剤を有効成分として含んでなる腫瘍疾患、例えば食道癌の防止剤および／または治療剤、前記蛋白質の機能阻害剤および／または前記ポリヌクレオチドの発現阻害剤を用いることを特徴とする、腫瘍疾患、例えば食道癌の防止方法および／または治療方法を提供できる。さらに、前記蛋白質、前記ポリヌクレオチド、前記組換えベクター、前記形質転換体および前記抗体のうち、少なくともいずれか１つを含んでなる試薬キットを提供できる。【００３１】
本蛋白質は、Ｒｈｏファミリー蛋白質であるＣｄｃ４２を活性化した。本発明により、Ｒｈｏファミリー蛋白質、例えばＣｄｃ４２が関与する情報伝達経路および細胞機能の解明とその調節が実施できる。さらに、本蛋白質の機能の異常および／または本ポリヌクレオチドの発現の異常に基づく疾患、例えば腫瘍疾患、より具体的には食道癌の診断、防止および／または治療が実施できる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ｓｈ０４００９全長遺伝子（配列番号１）、または該遺伝子の部分配列からなりＤＨ／ＰＨドメインコード領域を含むＤＮＡ（ｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ）の５´末端にコザックシークエンスとメチオニンをコードするコドンとが付加されたＤＮＡ（配列番号５）を用いて構築した発現ベクターをトランスフェクションした細胞の細胞溶解液において、これら遺伝子によりコードされる蛋白質を示すバンドが、ウエスタンブロッティング法により検出されたこと（それぞれレーン２および３）を説明する図である。各ベクターを導入せずＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００のみを添加した細胞から同様の処理により得た細胞溶解液では、このようなバンドは検出されなかった（レーン１）。（実施例２）
【００３３】
【図２】ｓｈ０４００９全長遺伝子の部分配列からなりＤＨ／ＰＨドメインコード領域を含むＤＮＡ（ｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ）の５´末端にコザックシークエンスとメチオニンをコードするコドンとが付加されたＤＮＡ（配列番号５）を用いて構築した発現ベクターと、Ｃｄｃ４２遺伝子発現ベクターとをコトランスフェクションした細胞の細胞溶解液（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ；レーン４）において、Ｃｄｃ４２遺伝子発現ベクターのみをトランスフェクションした細胞の細胞溶解液（レーン２）と比較して、ＰＡＫ−１に結合する活性型Ｃｄｃ４２（ＧＴＰ結合型Ｃｄｃ４２；ＧＴＰ  ｂｏｕｎｄ  Ｃｄｃ４２）が増加したことを、ＰＡＫ−１を用いたプルダウン法（ＰＡＫ−１  ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ）により明らかにした図である（上段のパネル）。ｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ発現ベクターとＣｄｃ４２遺伝子発現ベクターとをコトランスフェクションした細胞の細胞溶解液（レーン４）、およびＣｄｃ４２遺伝子発現ベクターのみをコトランスフェクションした細胞の細胞溶解液（レーン２）のいずれにおいても、総Ｃｄｃ４２量はほぼ同じであった（中段のパネル）。ｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ発現ベクターとＣｄｃ４２遺伝子発現ベクターとをコトランスフェクションした細胞の細胞溶解液（レーン４）、およびｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ発現ベクターのみをトランスフェクションした細胞の細胞溶解液（レーン３）のいずれにおいても、ｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ蛋白質量はほぼ同じであった（下段のパネル）。ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）のみをトランスフェクションした細胞の細胞溶解液（レーン１）では、活性型Ｃｄｃ４２、Ｃｄｃ４２およびｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ蛋白質のいずれも検出されなかった（それぞれ上段、中段および下段のパネル）。（実施例３）
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下、本発明について発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。【００３５】
本発明において、単離された完全長ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ；合成完全長ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ；単離されたＤＮＡオリゴヌクレオチド類および／またはＲＮＡオリゴヌクレオチド類；あるいは合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド類および／またはＲＮＡオリゴヌクレオチド類を意味する総称的用語として「ポリヌクレオチド」という用語を使用し、ここでそのようなＤＮＡおよび／またはＲＮＡは最小サイズが２ヌクレオチドである。【００３６】
本発明において、単離された若しくは合成の完全長蛋白質；単離された若しくは合成の完全長ポリペプチド；または単離された若しくは合成の完全長オリゴペプチドを意味する総称的用語として「蛋白質」という用語を使用し、ここで蛋白質、ポリペプチド若しくはオリゴペプチドは最小サイズが２アミノ酸である。以降、アミノ酸を表記する場合、１文字または３文字にて表記することがある。【００３７】
（ポリヌクレオチド）
本発明の一態様は新規ポリヌクレオチドに関する。本ポリヌクレオチドは、ヒト脾臓由来ｃＤＮＡライブラリーから、Ｒｈｏ−ＧＥＦに特徴的なドメインであるＤＨ／ＰＨドメインをコードする領域を有する遺伝子として同定し単離した。【００３８】
本発明に係るポリヌクレオチドは、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドであり得る。配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドは、６０１８ｂｐのポリヌクレオチドであり、５７４アミノ酸残基（配列番号２）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。また、配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドはＲｈｏ−ＧＥＦの活性ドメインであるＤＨ／ＰＨドメインをコードする領域を含む。配列番号１に記載の塩基配列において第４９６番目から第１０３２番目までのヌクレオチドからなる領域は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第１６６番目のバリン（Ｖａｌ）から第３４４番目のアスパラギン（Ａｓｎ）までの１７９アミノ酸残基からなるＤＨドメインをコードする。配列番号１に記載の塩基配列において第１１３２番目から第１４４９番目までのヌクレオチドからなる領域は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第３７８番目のロイシン（Ｌｅｕ）から第４８３番目のアルギニン（Ａｒｇ）までの１０６アミノ酸残基からなるＰＨドメインをコードする。配列番号１に記載の塩基配列において第４９６番目から第１４４９番目までのヌクレオチドからなる領域は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第１６６番目のバリン（Ｖａｌ）から第４８３番目のアルギニン（Ａｒｇ）までの３１８アミノ酸残基からなるＤＨ／ＰＨドメインをコードする。【００３９】
本発明の範囲には、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドも包含される。【００４０】
本発明に係るポリヌクレオチドとしてまた、配列番号３若しくは５に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドが例示できる。配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドは、配列番号１に記載の塩基配列の第３８８番目から第１７２２番目までの塩基配列で表わされるポリヌクレオチドである。また、配列番号５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドは、配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドの５´末端にコザックコンセンサス配列（以下、コザックシークエンスと称する）とメチオニンに対応するコドンとからなるオリゴヌクレオチド（配列番号１０）が付加されたポリヌクレオチドである。配列番号３または５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドは、Ｒｈｏ−ＧＥＦの活性ドメインであるＤＨ／ＰＨドメインをコードする領域を含む。【００４１】
配列番号５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドは、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有する蛋白質をコードする。実際、配列番号５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドとＣｄｃ４２をコードする遺伝子とを共に発現させた動物細胞において、Ｃｄｃ４２をコードする遺伝子のみを発現させた動物細胞と比較して、活性型Ｃｄｃ４２（ＧＴＰ結合型）が増加した（実施例３参照）。配列番号５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドは、配列番号１に記載の塩基配列の第３８８番目から第１７２２番目までの塩基配列で表わされるポリヌクレオチド（配列番号３）の５´末端にコザックシークエンスとメチオニンに対応するコドンとからなるオリゴヌクレオチド（配列番号１０）が付加されたポリヌクレオチドである。配列番号５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質（配列番号６）は、配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質（配列番号４）のＮ末端にメチオニンがペプチド結合により付加された蛋白質である。コザックシークエンスとメチオニンに対応するコドンとからなるオリゴヌクレオチド（配列番号１０）は、配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドの発現を目的として付加したオリゴヌクレオチドであり、発現された蛋白質の機能に大きな影響を与えない。したがって、配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドは、コザックシークエンスとメチオニンに対応するコドンとからなるオリゴヌクレオチド（配列番号１０）が付加されていないが、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有する蛋白質をコードすると考える。【００４２】
本発明に係るポリヌクレオチドは、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有する蛋白質またはＲｈｏファミリー蛋白質を活性化する蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドである。【００４３】
「Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性」または「Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化」とは、Ｒｈｏファミリー蛋白質に結合したグアノシン５´−二リン酸（ＧＤＰ）をグアノシン５´−三リン酸（ＧＴＰ）に交換することによって、Ｒｈｏファミリー蛋白質をＧＤＰが結合した不活性型からＧＴＰが結合した活性型に変換することを意味する。本交換反応は、Ｒｈｏファミリー蛋白質からのＧＤＰの解離反応と、その結果生成したヌクレオチドに結合していないＲｈｏファミリー蛋白質へのＧＴＰの結合反応からなる。具体的には、Ｃｄｃ４２の活性化またはＣｄｃ４２に対するＧＥＦ活性とは、Ｃｄｃ４２に結合しているＧＤＰと細胞内に存在するＧＴＰとの交換反応により、Ｃｄｃ４２を不活性型から活性型に変換することを意味する。【００４４】
本明細書において「Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性」という用語と「Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化」という用語は交換可能に使用される。【００４５】
本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、Ｒｈｏ−ＧＥＦの活性ドメインであるＤＨ／ＰＨドメインを含み、Ｒｈｏファミリー蛋白質を活性化した。一般的に、Ｒｈｏファミリー蛋白質を活性化する蛋白質、すなわちＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有する蛋白質は、Ｒｈｏファミリー蛋白質に結合してその機能を示す。したがって、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、Ｒｈｏファミリー蛋白質に結合して、Ｒｈｏファミリー蛋白質を活性化すると考える。【００４６】
配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質および配列番号５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質はいずれも、上記のように、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有する。配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質として配列番号４に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質が例示できる。配列番号５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質として配列番号６に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質が例示できる。配列番号４若しくは６に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドも本発明の範囲に包含される。【００４７】
配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドがＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有する蛋白質をコードすることから、配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有する蛋白質をコードすると考える。また、配列番号４に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有する蛋白質をコードすると考える。配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドとして、配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドが例示できる。配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドも、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有する蛋白質をコードすると考える。【００４８】
本発明の範囲には、配列番号３に記載の塩基配列若しくはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドまたは配列番号４に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチド若しくは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも包含される。好ましくは、このようなポリヌクレオチドであって、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドである。さらに好ましくは、該ポリヌクレオチドであって、ＤＨ／ＰＨドメインコード領域を有するポリヌクレオチドである。【００４９】
本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質により活性化されるＲｈｏファミリー蛋白質として、Ｃｄｃ４２が好ましく例示できる。本発明においてＲｈｏファミリー蛋白質というときは、好ましくはＣｄｃ４２を指す。Ｒｈｏファミリー蛋白質はこれに限定されず、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質により活性化される限りにおいていずれのＲｈｏファミリー蛋白質であってもよい。本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質による、Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化は、例えばエフェクタープルダウン法により測定できる（実施例３参照）。【００５０】
Ｃｄｃ４２のアミノ酸配列およびＣｄｃ４２遺伝子の塩基配列を、それぞれ配列番号１２および１１に記載する。Ｃｄｃ４２およびその遺伝子は、上記各配列で表わされるものに限らず、一般的に知られているＣｄｃ４２の機能を有する限りにおいて、上記各配列において１乃至数個の変異を有する蛋白質および遺伝子であることができる。また、これらの機能を促進するあるいは欠失させるといった所望の目的のために上記各配列に１乃至数個の変異を導入した変異体を用いることもできる。Ｃｄｃ４２は、例えば、その遺伝子を含有する組換えベクターを自体公知の遺伝子工学的方法により適当な宿主にトランスフェクションして形質転換体を作製し、該形質転換体を培養することにより取得できる。【００５１】
本発明に係るポリヌクレオチドの取得は、本発明により開示されたその具体例、例えば配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドについての配列情報に基づいて、公知の遺伝子工学的手法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；および村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社等を参照）により容易に実施できる。【００５２】
具体的には、本発明に係るポリヌクレオチドの発現が確認されている適当な起源から、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ｃＤＮＡライブラリーから所望のクローンを選択することにより本ポリヌクレオチドを取得できる。ｃＤＮＡの起源として、本ポリヌクレオチドの発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞、例えばヒトの脾臓由来の細胞等が例示できる。これら起源からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等はいずれも常法に従って実施できる。また、ヒト脾臓由来の市販されているｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを構築して用いることもできる。ｃＤＮＡライブラリーから所望のクローンを選択する方法は特に制限されず、慣用の方法を利用できる。例えば、本ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイゼーションするプローブやプライマー等を用いて所望のクローンの選択を実施できる。具体的には、本ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイゼーションするプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法等やこれらを組合せた方法等を例示できる。ここで用いるプローブとして、本ポリヌクレオチドの配列情報に基づいて化学合成したポリヌクレオチド等が一般的に使用できる。また、本ポリヌクレオチドやその部分塩基配列で表わされるポリヌクレオチドも好ましく使用できる。さらに、本ポリヌクレオチドの配列情報に基づき設計したセンスプライマー、アンチセンスプライマーをこのようなプローブとして使用できる。【００５３】
ｃＤＮＡライブラリーからの所望のクローンの選択は、例えば公知の蛋白質発現系を利用して各クローンについて発現蛋白質の確認を行い、さらに該蛋白質の機能を指標にして実施できる。本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の機能として、Ｃｄｃ４２等のＲｈｏファミリー蛋白質を活性化する機能、言い換えればＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性が例示できる。蛋白質発現系は、自体公知の発現系がいずれも利用できる。例えば、無細胞蛋白質発現系の利用が簡便である（マディン（Ｍａｄｉｎ，Ｋ．）ら、「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、２０００年、第９７巻、ｐ．５５９−５６４）。【００５４】
本発明に係るポリヌクレオチドの取得にはその他、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略称する）によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる（ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１；エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．）編、「ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用」、１９８９年、ストックトンプレス；およびサイキ（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８５年、第２３０巻、ｐ．１３５０−１３５４）。ｃＤＮＡライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法（「実験医学」、１９９４年、第１２巻、第６号、ｐ．６１５−６１８）、特に５´−ＲＡＣＥ法（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．）ら、「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９８８年、第８５巻、第２３号、ｐ．８９９８−９００２）等の採用が好適である。ＰＣＲに使用するプライマーは、ポリヌクレオチドの塩基配列情報に基づいて適宜設計でき、常法に従って合成により取得できる。増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離精製は、常法、例えばゲル電気泳動法等により実施できる。【００５５】
ポリヌクレオチドの塩基配列の決定は、常法、例えばジデオキシ法（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ）ら、「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９７７年、第７４巻、ｐ．５４６３−５４６７）やマキサム−ギルバート法（マキサム（Ｍａｘａｍ  Ａ．Ｍ．）ら、「メソッズ  イン  エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、１９８０年、第６５巻、ｐ．４９９−５６０）等により、また簡便には市販のシーケンスキット等を用いて実施できる。【００５６】
本発明に係るポリヌクレオチドは上記ポリヌクレオチドに限定されず、上記ポリヌクレオチドと配列相同性を有し、かつＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを包含する。配列相同性は、通常、塩基配列の全体で５０％以上、好ましくは少なくとも７０％であることが適当である。より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上であることが適当である。また、好ましくは、ＤＨ／ＰＨドメインコード領域を有するポリヌクレオチドが望ましい。ＤＨ／ＰＨドメインコード領域における配列相同性は少なくとも７０％であることが好ましい。より好ましくは、７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上であることが適当である。また、ＤＨ／ＰＨドメインがその機能、例えばＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を保持していることがさらに好ましい。【００５７】
本発明に係るポリヌクレオチドには、上記ポリヌクレオチドの塩基配列において１個以上、例えば１乃至１００個、好ましくは１乃至３０個、より好ましくは１乃至２０個、さらに好ましくは１乃至１０個、特に好ましくは１個乃至数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入といった変異が存する塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドが包含される。変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有するポリヌクレオチドがＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有する蛋白質、より好ましくはＤＨ／ＰＨドメインを有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドである限り特に制限されない。変異を有するポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチドであることができ、誘発変異を有するポリヌクレオチドであることができる。また、天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たポリヌクレオチドであることもできる。このようなポリヌクレオチドとして、配列番号１に記載の塩基配列の第１５６６番目のチミン（Ｔ）がシトシン（Ｃ）に置換したポリヌクレオチドが例示できる。変異を導入する方法は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはＰＣＲ等を、単独でまたは適宜組合せて使用できる。例えば成書に記載の方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；および村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社）に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施でき、ウルマーの技術（ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１）を利用して実施することもできる。【００５８】
本発明に係るポリヌクレオチドとしてはまた、上記ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドを例示できる。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば成書に記載の方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー）等に従うことができる。具体的には、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳおよび５０％  ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件をいう。これらポリヌクレオチドは本ポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドであれば相補的配列を有するポリヌクレオチドでなくてもよい。好ましくは、コードする蛋白質がＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有する蛋白質であり、より好ましくはＤＨ／ＰＨドメインを有する蛋白質であることが望ましい。【００５９】
本発明に係るポリヌクレオチドには、上記ポリヌクレオチドの指定された領域に存在する部分塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドが包含される。このようなオリゴヌクレオチドは、その最小単位として好ましくは該領域において連続する５個以上のヌクレオチド、より好ましくは１０個以上、より好ましくは２０個以上のヌクレオチドからなる。これらオリゴヌクレオチドは、本ポリヌクレオチドの塩基配列情報に従って、所望の配列を設計し、自体公知の化学合成法により製造できる。簡便には、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置を用いてオリゴヌクレオチドを製造できる。これらオリゴヌクレオチドは、本遺伝子または本遺伝子断片を増幅するためのプライマー、本遺伝子またはその転写産物を検出するためのプローブ等として使用できる。【００６０】
本発明に係るポリヌクレオチドの指定された領域に存在する部分塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドとして、配列番号７、８または９に記載の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドを好ましく例示できる。【００６１】
本発明に係るポリヌクレオチドは、好ましくはヒト由来のポリヌクレオチドである。しかし、本ポリヌクレオチドと配列相同性を有し、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドである限りにおいて、哺乳動物由来のポリヌクレオチド、例えばマウス、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ラットまたはウサギ等由来のポリヌクレオチドも本発明に包含される。配列相同性は、通常、塩基配列の全体で５０％以上、好ましくは少なくとも７０％であることが適当である。より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上であることが適当である。また、好ましくは、ＤＨ／ＰＨドメインコード領域を有するポリヌクレオチドが望ましい。ＤＨ／ＰＨドメインコード領域における配列相同性は少なくとも７０％であることが好ましい。より好ましくは、７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上であることが適当である。【００６２】
本発明に係るポリヌクレオチドは、その発現あるいはそれによりコードされる蛋白質の機能、例えばＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性が阻害されない限りにおいて、５´末端側や３´末端側に所望の遺伝子が付加されたポリヌクレオチドであることができる。本ポリヌクレオチドに付加し得る遺伝子として、具体的にはグルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、ホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）等の酵素類、あるいはＨｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類等の遺伝子が例示できる。これら遺伝子から選択された１種類または複数種類の遺伝子を組合せて本ポリヌクレオチドに付加できる。これら遺伝子の付加は、慣用の遺伝子工学的手法により行うことができ、遺伝子やｍＲＮＡの検出を容易にするために有用である。【００６３】
（ベクター）
本発明の一態様は、本発明に係るポリヌクレオチドを含有する組換えベクターに関する。本組換えベクターは、本ポリヌクレオチドを適当なベクターＤＮＡに挿入することにより取得できる。【００６４】
ベクターＤＮＡは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターＤＮＡは、天然に存在するＤＮＡを抽出して得られたベクターＤＮＡの他、複製に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているベクターＤＮＡであることができる。代表的なベクターＤＮＡとして例えば、プラスミド、バクテリオファージおよびウイルス由来のベクターＤＮＡを挙げられる。プラスミドＤＮＡとして、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド等を例示できる。バクテリオファージＤＮＡとして、λファージ等が挙げられる。ウイルス由来のベクターＤＮＡとして、例えばレトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルス等の動物ウイルス由来のベクター、あるいはバキュロウイルス等の昆虫ウイルス由来のベクターが挙げられる。その他、トランスポゾン由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来のベクターＤＮＡ等を例示できる。あるいは、これらを組合せて作成したベクターＤＮＡ、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメントを組合せて作成したベクターＤＮＡ（コスミドやファージミド等）を例示できる。【００６５】
ベクターＤＮＡは、発現ベクターやクローニングベクター等、目的に応じていずれを用いることもできる。本発明に係るポリヌクレオチドを含有する組換え発現ベクターは、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の製造に有用である。【００６６】
ベクターＤＮＡには、本発明に係るポリヌクレオチドの機能が発揮されるように該ポリヌクレオチドを組込むことが必要であり、少なくとも本ポリヌクレオチドとプロモーターとをその構成要素とする。これら要素に加えて、所望によりさらに、複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列を組合せて自体公知の方法によりベクターＤＮＡに組込むことができる。このような遺伝子配列として、リボソーム結合配列、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、および選択マーカー（ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等）等を例示できる。これらから選択された１種類または複数種類の遺伝子配列をベクターＤＮＡに組込むことができる。【００６７】
ベクターＤＮＡに本発明に係るポリヌクレオチドを組込む方法は、自体公知の方法を適用できる。例えば、本ポリヌクレオチドを含む遺伝子を適当な制限酵素により処理して特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターＤＮＡと混合し、リガーゼにより再結合する方法が用いられる。あるいは、本ポリヌクレオチドに適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組換えベクターが取得できる。【００６８】
（形質転換体）
本発明の一態様は、本発明に係る組換えベクターにより、宿主を形質転換して得られる形質転換体に関する。本発明に係るポリヌクレオチドを含有する組換え発現ベクターを導入した形質転換体は、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の製造に有用である。本形質転換体には、本ポリヌクレオチド以外の所望の遺伝子を含有するベクターＤＮＡの１種類または複数種類をさらに導入できる。本ポリヌクレオチド以外の所望の遺伝子を含有するベクターＤＮＡとして、例えば、Ｃｄｃ４２等のＲｈｏファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含有するベクターＤＮＡが挙げられる。本ポリヌクレオチドを含有する発現ベクターとＲｈｏファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターとにより形質転換して得られる形質転換体は、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質のＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性、言い換えればＲｈｏファミリー蛋白質の活性化を阻害または増強する化合物の同定方法に使用できる。このような形質転換体として好ましくは、本ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターとＣｄｃ４２をコードする遺伝子を含有する組換えベクターとにより形質転換して得られる形質転換体が挙げられる。【００６９】
宿主として、原核生物および真核生物のいずれも用いることができる。原核生物として、例えば大腸菌（エシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））等のエシェリヒア属、枯草菌等のバシラス属、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウムメリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられる。真核生物として、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞等の動物細胞を例示できる。酵母は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等が挙げられる。昆虫細胞は、Ｓｆ９細胞やＳｆ２１細胞等を例示できる。哺乳動物細胞は、サル腎由来細胞（ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞等）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒトＦＬ細胞や２９３ＥＢＮＡ細胞等が例示できる。好ましくは哺乳動物細胞を用いる。最も好ましくは、２９３ＥＢＮＡ細胞を用いる。【００７０】
組換えベクターによる宿主細胞の形質転換は、自体公知の手段を応用して実施できる。例えば成書に記載されている標準的な方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー）により実施できる。より好ましい方法として、遺伝子の安定性を考慮するならば染色体内へのインテグレート法が挙げられる。簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系を使用できる。具体的には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、バリスティック導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）および感染等が例示できる。【００７１】
原核生物を宿主とする場合、組換えベクターが該原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明に係るポリヌクレオチド、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。細菌を宿主とする場合、プロモーターとして、大腸菌等の細菌中で発現できるプロモーターであればいずれも利用できる。例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。ｔａｃプロモーター等の人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、いずれも利用できる。好ましくは例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が利用される。【００７２】
哺乳動物細胞を宿主とする場合、組換えベクターが該細胞中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、ＲＮＡスプライス部位、本発明に係るポリヌクレオチド、ポリアデニル化部位、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、所望により複製起点が含まれていてもよい。プロモーターとして、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、サイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。哺乳動物細胞への組換えベクターの導入方法は、好ましくは例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が利用される。最も好ましくは、リポフェクション法が利用される。【００７３】
酵母を宿主とする場合、プロモーターは、酵母中で発現できるプロモーターであれば特に限定されず、例えば、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、好ましくは例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が利用される。【００７４】
昆虫細胞を宿主とする場合、組換えベクターの導入方法は、好ましくは例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が利用される。【００７５】
（蛋白質）
本発明の一態様は、本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質に関する。【００７６】
本発明に係る蛋白質として、配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質を例示できる。より具体的には、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質を例示できる。配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質において、その第１６６番目バリン（Ｖａｌ）から第３４４番目アスパラギン（Ａｓｎ）までのアミノ酸残基がＤＨドメインを構成する。第３７８番目ロイシン（Ｌｅｕ）から第４８３番目アルギニン（Ａｒｇ）までのアミノ酸残基がＰＨドメインを構成する。第１６６番目バリン（Ｖａｌ）から第４８３番目アルギニン（Ａｒｇ）までのアミノ酸残基がＤＨ／ＰＨドメインを構成する。【００７７】
本発明に係る蛋白質としてまた、配列番号３または５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質を例示できる。より具体的には、配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質として配列番号４に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質を例示できる。また、配列番号５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質として配列番号６に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質を例示できる。配列番号４に記載のアミノ酸配列は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第１３０番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）から第５７４番目のリジン（Ｌｙｓ）までのアミノ酸配列に相当する。また、配列番号６に記載のアミノ酸配列は、配列番号４に記載のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニンがペプチド結合により付加されたアミノ酸配列である。すなわち、これら各アミノ酸配列で表わされる蛋白質は、ＤＨ／ＰＨドメインを含んでいる。【００７８】
配列番号５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有する。実際、配列番号５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドとＣｄｃ４２をコードする遺伝子とを共に発現させた動物細胞において、Ｃｄｃ４２をコードする遺伝子のみを発現させた動物細胞と比較して、活性型Ｃｄｃ４２（ＧＴＰ結合型）が増加した（実施例３参照）。配列番号５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質のＮ末端にメチオニンがペプチド結合により付加された蛋白質である。配列番号５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドの発現を目的として該ポリヌクレオチドの５´末端にコザックシークエンスとメチオニンに対応するコドンとからなるオリゴヌクレオチド（配列番号１０）を付加した結果、得られた蛋白質である。付加されたメチオニンは、発現された蛋白質の機能に大きな影響を与えない。したがって、配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、Ｎ末端のメチオニンが付加されていないが、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有すると考える。【００７９】
本発明に係る蛋白質は、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有する蛋白質またはＲｈｏファミリー蛋白質を活性化する蛋白質である。【００８０】
本発明に係る蛋白質は、Ｒｈｏ−ＧＥＦの活性ドメインであるＤＨ／ＰＨドメインを含み、Ｒｈｏファミリー蛋白質を活性化した。一般的に、Ｒｈｏファミリー蛋白質を活性化する蛋白質、すなわちＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有する蛋白質は、Ｒｈｏファミリー蛋白質に結合してその機能を示す。したがって、本蛋白質は、Ｒｈｏファミリー蛋白質に結合して、Ｒｈｏファミリー蛋白質を活性化すると考える。【００８１】
配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、上記のように、配列番号５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質と同様、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有すると考える。また、これら蛋白質に含まれるＤＨ／ＰＨドメインは、Ｒｈｏファミリー蛋白質のＧＥＦ活性に寄与する重要なドメインであることが知られている。これらから、配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質を含有する蛋白質もＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有すると考える。このような蛋白質として、配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が挙げられる。また、配列番号４に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が挙げられる。具体的には、配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質として、配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が例示できる。配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質として、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質が例示できる。これら例示した蛋白質はいずれも、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有すると考える。【００８２】
本発明の範囲には、配列番号３に記載の塩基配列若しくはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドまたは配列番号４に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチド若しくは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドであって、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質も包含される。【００８３】
本発明に係る蛋白質は上記蛋白質に限定されず、本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質であればいずれも本発明の範囲に包含される。好ましくは、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質であって、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有する蛋白質が望ましい。このような蛋白質として、配列番号１に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、配列番号３若しくは５に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、および配列番号４若しくは６に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドからなる群より選ばれるいずれか１のポリヌクレオチドの塩基配列と少なくとも７０％の相同性を有する塩基配列で表わされるポリヌクレオチドであって、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が例示できる。また、上記ポリヌクレオチド群より選ばれるいずれか１のポリヌクレオチドの塩基配列において１乃至数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加等の変異あるいは誘発変異を有する塩基配列で表わされるポリヌクレオチドであって、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が例示できる。さらに、上記ポリヌクレオチド群より選ばれるいずれか１のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドであって、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が例示できる。【００８４】
本発明に係るこのような蛋白質として、より具体的には、配列番号２、４または６に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質と配列相同性を有し、かつＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有する蛋白質が例示できる。配列相同性は、通常、アミノ酸配列の全体で５０％以上、好ましくは少なくとも７０％であることが適当である。より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上であることが適当である。また、好ましくは、ＤＨ／ＰＨドメインを有するポリペプチドが望ましい。ＤＨ／ＰＨドメインにおける配列相同性は少なくとも７０％であることが好ましい。より好ましくは、７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上であることが適当である。また、ＤＨ／ＰＨドメインがその機能、例えばＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を保持していることがさらに好ましい。また、本蛋白質として、配列番号２、４または６に記載のアミノ酸配列において１個以上、例えば１乃至１００個、好ましくは１乃至３０個、より好ましくは１乃至２０個、さらに好ましくは１乃至１０個、特に好ましくは１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入といった変異を有するアミノ酸配列で表わされ、かつＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有する蛋白質が例示できる。アミノ酸の変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有する蛋白質が、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有する蛋白質、より好ましくはＤＨ／ＰＨドメインを有する蛋白質である限り特に制限されない。このような変異を有する蛋白質は、天然において例えば突然変異や翻訳後の修飾等により生じたものであることができ、また天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たものであることができる。変異を導入する方法は自体公知であり、例えば、公知の遺伝子工学的技術を利用して実施できる。変異の導入において、当該蛋白質の基本的な性質（物性、機能、生理活性または免疫学的活性等）を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。【００８５】
本発明に係る蛋白質にはさらに、上記蛋白質の部分配列で表わされる蛋白質が包含される。例えば、配列番号２、４または６に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質の部分配列で表わされる蛋白質も本発明の範囲に包含される。このような蛋白質は、その最小単位として好ましくは５個以上、より好ましくは８個以上、さらに好ましくは１２個以上、特に好ましくは１５個以上の連続するアミノ酸で表わされる。【００８６】
本発明に係る蛋白質は、好ましくはヒト由来の蛋白質である。しかし、本蛋白質と配列相同性を有し、かつＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有する蛋白質である限りにおいて、哺乳動物由来の蛋白質、例えばマウス、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ラットまたはウサギ等由来の蛋白質も本発明に包含される。好ましくはＤＨ／ＰＨドメインを有する蛋白質が望ましい。配列相同性は、通常、アミノ酸配列の全体で５０％以上、好ましくは少なくとも７０％であることが適当である。より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上であることが適当である。ＤＨ／ＰＨドメインにおける配列相同性は少なくとも７０％であることが好ましい。より好ましくは、７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上であることが適当である。【００８７】
本発明に係る蛋白質は、本蛋白質をコードする遺伝子を遺伝子工学的手法で発現させた細胞や生体試料から調製したもの、無細胞系合成産物または化学合成産物であることができ、あるいはこれらからさらに精製されたものであることができる。また、本蛋白質は、本蛋白質をコードする遺伝子を含む細胞において発現しているものであることができる。該細胞は、本蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターをトランスフェクションして得られた形質転換体であることができる。【００８８】
本発明に係る蛋白質はさらに、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない限りにおいて改変できる。また、Ｎ末端側やＣ末端側に別の蛋白質等を、直接的に、またはリンカーペプチド等を介して間接的に、遺伝子工学的手法等を用いて付加することにより標識化できる。好ましくは、本蛋白質の基本的な性質が阻害されないような標識化が望ましい。さらに好ましくは、本蛋白質のＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性が阻害されないような標識化が推奨される。標識化に用いる物質（標識物質）として、例えばＧＳＴ、β−Ｇａｌ、ＨＲＰまたはＡＬＰ等の酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）またはフィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）等の蛍光物質類、マルトース結合蛋白質、免疫グロブリンのＦｃ断片あるいはビオチン等が例示できるが、これらに限定されない。また、放射性同位元素による標識化もできる。標識物質は、１種類または複数種類を組合せて本蛋白質に付加できる。これら標識物質自体またはその機能の測定により、本蛋白質の検出または精製を容易に実施でき、また、例えば本蛋白質と他の蛋白質との結合の検出や本蛋白質の機能の測定が実施できる。【００８９】
（蛋白質の製造方法）
本発明の一態様は、本発明に係る蛋白質の製造方法に関する。本蛋白質は、例えば本蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列情報に基づいて一般的遺伝子工学的手法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社；ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１；およびエールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．）編、「ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用」、１９８９年、ストックトンプレス等を参照）により取得できる。例えば、本発明に係るポリヌクレオチドの発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞から常法に従ってｃＤＮＡライブラリーをまず調製する。次いで、本蛋白質をコードする遺伝子に選択的にハイブリダイゼーションするプライマーを用いて、該ｃＤＮＡライブラリーから本ポリヌクレオチドを増幅する。得られたポリヌクレオチドの発現誘導を公知の遺伝子工学的手法を利用して行うことにより、本蛋白質を取得できる。【００９０】
具体的には例えば、本発明に係る形質転換体を培養し、次いで得られた培養物から本蛋白質を回収することにより、本蛋白質を製造できる。本形質転換体の培養は、形質転換体の作製に用いた宿主に最適な自体公知の培養条件および培養方法で行うことができる。培養は、形質転換体により発現される本蛋白質自体または本蛋白質の機能、例えばＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を指標にして実施できる。あるいは、宿主中または宿主外に産生された本蛋白質自体またはその蛋白質量を指標にして培養してもよく、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養またはバッチ培養を行ってもよい。【００９１】
本発明に係る蛋白質が形質転換体の細胞内あるいは細胞膜上に発現する場合には、形質転換体を破砕して本蛋白質を抽出する。また、本蛋白質が形質転換体外に分泌される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離処理等により形質転換体を除去した培養液を用いる。本蛋白質は、所望により、形質転換体を培養した培養液または形質転換体から、分離および／または精製することができる。【００９２】
本蛋白質の精製および／または分離は、本蛋白質の物理的性質や化学的性質等を利用した各種分離操作方法により実施できる。分離操作方法として、具体的には、硫酸アンモニウム沈殿、限外ろ過、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、透析法等を例示できる。また、これら方法は適宜組合せて実施できる。好ましくは、本蛋白質に対する特異抗体を結合させたカラムを利用するアフィニティクロマトグラフィーが用いられる。本蛋白質に対する特異抗体は、本蛋白質のアミノ酸配列情報に基づき、自体公知の抗体作成法により取得できる。分離および／または精製を行なうとき、本蛋白質を得るための指標として、本蛋白質の機能、例えばＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性が利用できる。【００９３】
本発明に係る蛋白質はまた、一般的な化学合成法により製造できる。蛋白質の化学合成法として、成書（「ペプチド合成」、丸善株式会社、１９７５年；および「ペプチド  シンテシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、インターサイエンス（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９９６年）に記載の方法が例示されるが、これらに限らず公知の方法が広く利用できる。具体的には、固相合成方法や液相合成方法等が知られているが、いずれも利用できる。かかる蛋白質合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていくいわゆるステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメントコンデンセーション法とを包含する。本蛋白質の合成は、そのいずれによっても行うことができる。上記蛋白質合成法において利用される縮合法も常法に従って実施できる。縮合法として、例えば、アジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等）法、ウッドワード法等が例示できる。化学合成により得られる本蛋白質はさらに、上記のような慣用の各種精製方法により適宜精製できる。【００９４】
本発明に係る蛋白質の部分配列で表わされる蛋白質は、本蛋白質を適当なペプチダーゼにより切断することによっても取得できる。【００９５】
（抗体）
本発明の一態様は、本発明に係る蛋白質を認識する抗体に関する。本抗体は、本蛋白質を抗原として用いて作製できる。抗原は、本蛋白質またはその断片でもよく、少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１２個、さらに好ましくは１５個以上のアミノ酸で構成される。本蛋白質に特異的な抗体を作成するためには、本蛋白質に固有なアミノ酸配列からなる領域を抗原として用いることが好ましい。この領域のアミノ酸配列は、必ずしも本蛋白質またはその断片のアミノ酸配列と同一である必要はない。このようなアミノ酸配列として、蛋白質の立体構造上の外部への露出部位のアミノ酸配列が好ましい。露出部位のアミノ酸配列が一次構造上で不連続であっても、該露出部位について連続的なアミノ酸配列であればよい。本抗体は本蛋白質を特異的に認識する抗体であればいずれであってもよく、特に限定されない。本蛋白質を特異的に認識するとは、例えば本蛋白質に結合するが、本蛋白質以外の蛋白質には結合しないか、弱く結合することを意味する。認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応により決定できる。【００９６】
抗体の生産は、自体公知の抗体作製法により実施できる。例えば、抗原をアジュバントの存在下または非存在下で、単独でまたは担体に結合して動物に投与し、体液性応答および／または細胞性応答等の免疫誘導を行うことにより抗体を取得できる。担体は、それ自体が宿主に対して有害作用を示さずかつ抗原性を増強せしめる限りにおいて、公知の担体をいずれも使用できる。具体的には、セルロース、重合アミノ酸、アルブミンおよびキーホールリンペットヘモシアニン等を例示できる。アジュバントとして、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ）、Ｒｉｂｉ（ＴＤＭ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ）、百日咳ワクチン（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｖａｃｃｉｎｅ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）、およびこれらの組合わせが例示できる。免疫される動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等が好適に用いられる。【００９７】
ポリクローナル抗体は、免疫手段を施された動物の血清から自体公知の抗体回収法により取得できる。好ましい抗体回収法として免疫アフィニティクロマトグラフィー法が例示できる。【００９８】
モノクローナル抗体は、免疫手段が施された動物から採取した抗体産生細胞（例えば、脾臓またはリンパ節由来のリンパ球）と、自体公知の永久増殖性細胞（例えば、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株等のミエローマ株）とを融合させて作製したハイブリドーマを用いて生産できる。例えば、抗体産生細胞と永久増殖性細胞とを自体公知の方法で融合させてハイブリドーマを作成し、次いでクローン化する。クローン化した数々のハイブリドーマから、本発明に係る蛋白質を特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマを選別し、該ハイブリドーマの培養液から抗体を回収する。【００９９】
本発明に係る蛋白質を認識または結合し得るポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、該蛋白質の精製用抗体、試薬または標識マーカー等として利用できる。特に本蛋白質の機能を阻害する抗体は、本蛋白質の機能調節に使用でき、本蛋白質の機能異常や量的異常に起因する各種疾患の解明、防止、改善および／または治療のために有用である。【０１００】
（化合物の同定方法）
本発明の一態様は、本発明に係る蛋白質の機能を阻害または促進する化合物、あるいは本発明に係るポリヌクレオチドの発現を阻害または促進する化合物の同定方法に関する。本ポリヌクレオチドは食道腺癌等の食道癌において発現が高いことが判明したので、本発明者らは、本蛋白質の機能を阻害および／または本ポリヌクレオチドの発現を阻害することにより、これらの疾患を防止および／または治療できると考える。したがって、本発明に係る同定方法として、好ましくは、本蛋白質の機能を阻害する化合物および／または本ポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法が挙げられる。【０１０１】
本発明に係る同定方法は、本蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体または抗体のうち少なくともいずれか１種類を用いて、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して実施できる。本同定方法は、インビトロまたはインビボで実施されるいずれの方法も包含する。本同定方法により、本蛋白質の立体構造に基づくドラッグデザインによる拮抗剤の選別、蛋白質合成系を利用した遺伝子レベルでの発現の阻害剤の選別、または抗体を利用した抗体認識物質の選別等が実施できる。【０１０２】
本発明に係る蛋白質の機能を阻害または促進する化合物の同定方法は、本蛋白質の機能を測定し得る実験系において、本蛋白質と調べようとする化合物（被検化合物）の相互作用を可能にする条件下で、本蛋白質と被検化合物とを共存させてその機能を測定し、次いで、被検化合物の存在下における本蛋白質の機能と、被検化合物の非存在下における本蛋白質の機能とを比較し、本蛋白質の機能の存在、不存在または変化、例えば低減、増加、消失、出現を検出することにより実施できる。被検化合物の非存在下における本蛋白質の機能と比較して、被検化合物の存在下における本蛋白質の機能が低減または消失する場合、該被検化合物は本蛋白質の機能を阻害すると判定できる。逆に、被検化合物の存在下における本蛋白質の機能が増加する場合、該被検化合物は本蛋白質の機能を促進すると判定できる。機能の測定は、該機能の直接的な検出により、または機能の指標となるシグナルを実験系に導入して該シグナルを検出することにより実施できる。シグナルとして、ＧＳＴ等の酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類、または蛍光蛋白質等が例示できるが、一般的に化合物の同定方法に用いられている標識物質であればいずれも利用できる。【０１０３】
本発明に係る蛋白質の機能として、好ましくはＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性、より好ましくはＲｈｏファミリー蛋白質に結合してＧＥＦ活性を示す機能が例示される。言い換えれば、Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化、より好ましくはＲｈｏファミリー蛋白質と結合してＲｈｏファミリー蛋白質を活性化する機能が例示される。【０１０４】
本発明に係る蛋白質がＲｈｏファミリー蛋白質と結合してＧＥＦ活性を示すと考えられることから、本蛋白質とＲｈｏファミリー蛋白質との結合を阻害することにより本蛋白質のＧＥＦ活性を阻害できると考える。また、本蛋白質とＲｈｏファミリー蛋白質との結合を増強することにより本蛋白質のＧＥＦ活性を促進できると考える。本同定方法の範囲には、本蛋白質とＲｈｏ蛋白質、例えばＣｄｃ４２との結合を阻害または増強する化合物の同定方法も包含される。【０１０５】
本発明に係る蛋白質が有するＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を阻害または促進する化合物の同定方法は、例えば、本蛋白質と本蛋白質により活性化されるＲｈｏファミリー蛋白質とを共存させ、活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質の量を、被検化合物の存在下または非存在下において測定することにより実施できる。活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質の量が被検化合物の非存在下と比較して被検化合物の存在下において減少する場合、該化合物は、本蛋白質が有するＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を阻害すると判定できる。逆に、活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質の量が被検化合物の存在下において増加する場合、該被検化合物は本蛋白質が有するＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を促進すると判定できる。活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質の測定は、該蛋白質に対する抗体等を用いて実施できる。例えば、活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質の測定は、活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質には結合するが、活性化されていないＲｈｏファミリー蛋白質には結合しないか弱く結合するエフェクター分子を用いて実施できる。具体的には、活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質との結合部位を含むエフェクター分子断片にＧＳＴ−ｔａｇを付加した蛋白質と、活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質との結合の検出を、実施例３に示すように、プルダウン法により実施する。このような方法において、活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質の量は、電気泳動法およびウエスタンブロット法により測定できる。Ｒｈｏファミリー蛋白質の種類によって、活性化された該蛋白質と結合するエフェクター分子は異なる。したがって、用いるＲｈｏファミリー蛋白質の種類により適当なエフェクター分子を選択して用いる。例えば、活性化されたＣｄｃ４２が結合するエフェクターとしてＰＡＫ−１（ｐ２１  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ）が知られている。したがって、本蛋白質が有するＣｄｃ４２に対するＧＥＦ活性を阻害または促進する化合物を同定する場合は、エフェクター分子としてＰＡＫ−１を用いることが推奨される。【０１０６】
本発明に係る蛋白質が有するＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を阻害または促進する化合物の同定方法はまた、本蛋白質、本蛋白質により活性化されるＲｈｏファミリー蛋白質であって放射性同位元素で標識したＧＤＰと結合しているＲｈｏファミリー蛋白質およびＧＴＰを共存させ、活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質の量を被検化合物の存在下または非存在下において測定することにより実施できる。活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質は、放射性同位元素で標識したＧＤＰと結合しているＲｈｏファミリー蛋白質の量の減少により定量され得る。このような方法は、公知文献（グラベン（Ｇｌａｖｅｎ  Ｊ．Ａ．）ら、「ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９６年、第２７１巻、第４４号、ｐ．２７３７４−２７３８１）記載の方法等を参照して実施できる。【０１０７】
「Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を阻害する」とは、ＧＤＰが結合した不活性型のＲｈｏファミリー蛋白質からＧＴＰが結合した活性型のＲｈｏファミリー蛋白質への変換を阻害することを意味する。より具体的には、ＧＴＰが結合した活性型のＲｈｏファミリー蛋白質の量を低減させるまたは消失させることを意味する。「Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を促進する」とは、ＧＤＰが結合した不活性型のＲｈｏファミリー蛋白質からＧＴＰが結合した活性型のＲｈｏファミリー蛋白質への変換を促進することを意味する。より具体的には、ＧＴＰが結合した活性型のＲｈｏファミリー蛋白質の量を増加させることを意味する。【０１０８】
本発明に係る同定方法において用いるＲｈｏファミリー蛋白質は、本発明に係る蛋白質による活性化に影響がない限りにおいて、一部を欠損した蛋白質であってよく、あるいは標識物質が付加された蛋白質であってよい。標識物質として、上記標識物質が例示できる。【０１０９】
本発明に係る蛋白質のＲｈｏファミリー蛋白質との結合を阻害または増強する化合物の同定方法は、例えば、本蛋白質を遺伝子工学的手法により発現させて取得し、被検化合物の存在下または非存在下におけるＲｈｏファミリー蛋白質との結合の検出を行うことにより実施できる。具体的には、例えばＲｈｏファミリー蛋白質を遺伝子工学的手法によりＧＳＴ−ｔａｇ融合蛋白質として発現させ、その後グルタチオンセファロースに結合させ、被検化合物の存在下または非存在下で、本蛋白質と反応させる。グルタチオンセファロースに結合させたＲｈｏファミリー蛋白質に結合する本蛋白質を定量することにより、本蛋白質のＲｈｏファミリー蛋白質との結合を阻害または増強する化合物の同定を実施できる。被検化合物の非存在下における両蛋白質の結合と比較して、被検化合物の存在下における両蛋白質の結合が低減または消失する場合、該被検化合物は本蛋白質のＲｈｏファミリー蛋白質との結合を阻害すると判定できる。逆に、被検化合物の存在下における両蛋白質の結合が増加する場合、該被検化合物は本蛋白質のＲｈｏファミリー蛋白質との結合を増強すると判定できる。本蛋白質の定量は、例えば、本発明に係る抗体を用いて実施できる。抗体は、ＨＲＰやＡＬＰ等の酵素、放射性同位元素、蛍光物質またはビオチン等の標識物質で標識した抗体であることができる。あるいは、標識した二次抗体を用いてもよい。本蛋白質として、タグペプチドを融合した蛋白質を用いれば、抗タグ抗体を用いて定量を実施できる。または、本蛋白質を上記酵素、放射性同位元素、蛍光物質、ビオチン等の標識物質で直接標識して用いてもよい。このような場合、標識物質を測定することにより、本蛋白質の定量を実施できる。【０１１０】
本発明に係る蛋白質のＲｈｏファミリー蛋白質との結合を阻害または増強する化合物の同定方法は、より具体的には、本蛋白質をコードするポリヌクレオチドとＲｈｏファミリー蛋白質をコードするポリヌクレオチドとを共発現させた適当な細胞を用い、両蛋白質の結合をプルダウン法により検出する実験系を用いて実施できる。【０１１１】
本発明に係る蛋白質とＲｈｏファミリー蛋白質との結合を阻害または増強する化合物の同定方法はまた、公知のツーハイブリッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）法を用いて実施できる。例えば、本蛋白質とＤＮＡ結合蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、Ｒｈｏファミリー蛋白質と転写活性化蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、および適切なプロモーター遺伝子に連結したレポーター遺伝子を含有するプラスミドを、酵母または真核細胞等に導入する。次いで、被検化合物の存在下におけるレポーター遺伝子の発現量と、被検化合物の非存在下におけるレポーター遺伝子の発現量との比較により、本蛋白質とＲｈｏファミリー蛋白質との結合を阻害または増強する化合物の同定を達成できる。被検化合物の非存在下におけるレポーター遺伝子の発現量と比較して、被検化合物の存在下におけるレポーター遺伝子の発現量が減少または消失する場合、該被検化合物は本蛋白質のＲｈｏファミリー蛋白質との結合を阻害すると判定できる。逆に、被検化合物の存在下におけるレポーター遺伝子の発現量が増加する場合、該被検化合物は本蛋白質のＲｈｏファミリー蛋白質との結合を増強すると判定できる。レポーター遺伝子は、レポーターアッセイで一般的に用いられている遺伝子をいずれも使用できる。具体的には、ルシフェラーゼ、β−Ｇａｌまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ等の酵素活性を有する遺伝子が例示できる。レポーター遺伝子の発現の検出は、その遺伝子産物の活性、例えば、上記例示したレポーター遺伝子の場合は酵素活性を検出することにより実施できる。【０１１２】
本発明に係る蛋白質とＲｈｏファミリー蛋白質との結合を阻害または増強する化合物の同定方法はまた、ビアコアシステム（ＢＩＡＣＯＲＥ  ｓｙｓｔｅｍ）等の表面プラズモン共鳴センサーを用いて実施できる。あるいは、シンチレーションプロキシミティアッセイ法（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ、ＳＰＡ）や蛍光共鳴エネルギー転移（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）を応用した方法を用いて、本同定方法を実施できる。【０１１３】
本発明に係るポリヌクレオチドの発現を阻害または促進する化合物の同定方法は、本ポリヌクレオチドの発現を測定し得る実験系において、本ポリヌクレオチドと被検化合物を可能にする条件下で、本ポリヌクレオチドと被検化合物とを共存させてその発現を測定し、次いで、被検化合物の存在下における本ポリヌクレオチドの発現と、被検化合物の非存在下における本ポリヌクレオチドの発現とを比較し、本ポリヌクレオチドの発現の存在、不存在または変化、例えば低減、増加、消失、出現を検出することにより実施できる。被検化合物の非存在下における本ポリヌクレオチドの発現と比較して、被検化合物の存在下における本ポリヌクレオチドの発現が減少または消失する場合、該被検化合物は本ポリヌクレオチドの発現を阻害すると判定できる。逆に、被検化合物の存在下における本ポリヌクレオチドの発現が増加する場合、該被検化合物は本ポリヌクレオチドの発現を促進すると判定できる。【０１１４】
具体的には、本発明に係るポリヌクレオチドの発現を阻害または促進する化合物の同定方法は、例えば、本発明に係る形質転換体を用いて本ポリヌクレオチドを発現させる実験系において、該形質転換体と被検化合物とを接触させた後に、本ポリヌクレオチドの発現を測定することにより実施できる。発現の測定は、簡便には発現される蛋白質の量、あるいは該蛋白質の機能、例えばＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を指標にして実施できる。また、例えば発現の指標となるシグナルを実験系に導入して該シグナルを検出することにより、発現の測定を実施できる。シグナルとして、ＧＳＴ等の酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類、または蛍光物質等が使用できる。これらシグナルの検出方法は当業者には周知である。【０１１５】
本発明に係るポリヌクレオチドの発現を阻害または促進する化合物の同定方法はまた、例えば、本ポリヌクレオチドを含む遺伝子のプロモーター領域の下流に、該ポリヌクレオチドの代わりにレポーター遺伝子を連結したベクターを作成し、該ベクターを導入した細胞、例えば真核細胞等と被検化合物とを接触させ、レポーター遺伝子の発現の存在、不存在または変化を測定することにより実施できる。レポーター遺伝子として、レポーターアッセイで一般的に用いられている遺伝子をいずれも使用できる。具体的には、ルシフェラーゼ、β−Ｇａｌまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ等の酵素活性を有する遺伝子が例示できる。レポーター遺伝子の発現の検出は、その遺伝子産物の活性、例えば、上記に例示したレポーター遺伝子の場合は酵素活性を検出することにより実施できる。【０１１６】
（化合物）
本発明に係る同定方法により得られた化合物は、本発明に係るポリヌクレオチドの発現阻害剤、本発明に係る蛋白質の機能の阻害剤や拮抗剤等の候補化合物として利用できる。該化合物は、例えば、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性、言い換えればＲｈｏファミリー蛋白質の活性化の阻害剤の候補化合物として利用できる。本同定方法により得られた化合物は、本発明に係るポリヌクレオチドの発現促進剤、または本発明に係る蛋白質の機能の促進剤の候補化合物として利用できる。本ポリヌクレオチドは食道腺癌等の食道癌において発現が高いことが判明したので、本発明者らは、本蛋白質の機能を阻害および／または本ポリヌクレオチドの発現を阻害することにより、これらの疾患を防止および／または治療できると考える。したがって、本発明に係る同定方法により得られる化合物として、好ましくは、本蛋白質の機能を阻害する化合物および／または本ポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物が挙げられる。これら候補化合物は、その有用性と毒性のバランスを考慮して選別することにより医薬として調製できる。このような医薬は、本蛋白質の機能の異常および／または本ポリヌクレオチドの発現の異常に起因する各種病的症状の防止および／または治療に有効である。本発明に係る化合物には、本同定方法以外の方法により得られた化合物であって、本蛋白質の機能を阻害するおよび／または本ポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物、あるいは本蛋白質の機能を促進するおよび／または本ポリヌクレオチドの発現を促進する化合物も含まれる。【０１１７】
（医薬組成物）
本発明の一態様は、本発明に係る蛋白質、ポリペプチド、組換えベクター、形質転換体、抗体、または化合物を有効成分として含み、本蛋白質の機能および／または本ポリペプチドの発現を阻害するまたは拮抗すること、あるいは本蛋白質の機能および／または本ポリペプチドの発現を促進することに基づく医薬または医薬組成物に関する。【０１１８】
本発明に係る医薬は、本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、抗体、または化合物のうち少なくともいずれか１つを有効成分としてその有効量含む医薬となしてもよい。通常は、１種類または２種類以上の医薬用に許容される担体（医薬用担体）を用いて医薬組成物を製造することが好ましい。【０１１９】
本発明に係る医薬組成物中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択される。通常約０．００００１乃至７０重量％、好ましくは０．０００１乃至５重量％程度の範囲とするのが適当である。【０１２０】
医薬用担体は、医薬組成物の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤等の希釈剤や賦形剤等が例示できる。これらは得られる医薬組成物の使用形態に応じて適宜選択して使用される。【０１２１】
例えば水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等が挙げられる。これらは、本発明に係る医薬組成物の使用形態に応じて適宜１種類または２種類以上を組合せて使用される。【０１２２】
所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤等を適宜使用して医薬組成物を調製することもできる。【０１２３】
安定化剤は、ヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体等が例示でき、これらは単独でまたは界面活性剤等と組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。上記Ｌ−アミノ酸は、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸等のいずれでもよい。糖類も特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等およびそれらの誘導体等のいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のいずれでもよい。【０１２４】
界面活性剤も特に限定はなく、イオン性および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。これには、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が包含される。【０１２５】
緩衝剤は、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）等が例示できる。【０１２６】
等張化剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン等が例示できる。【０１２７】
キレート剤は、エデト酸ナトリウム、クエン酸等が例示できる。【０１２８】
本発明に係る医薬および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる。その他、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生埋的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することもできる。【０１２９】
本発明に係る医薬および医薬組成物は、本発明に係る蛋白質の機能の異常および／または本ポリヌクレオチドの発現の異常に基づく疾患の防止剤および／または治療剤として使用できる。また、当該疾患の防止方法および／または治療方法に使用できる。【０１３０】
本発明に係る蛋白質の機能および／または本発明に係るポリヌクレオチドの発現の過剰に関連する異常な症状に対しては、例えば本蛋白質の機能および／または本ポリヌクレオチドの発現を阻害する有効量の阻害剤を医薬用担体とともに対象に投与することにより、異常な症状を防止、改善または治療するといった効果が得られる。あるいは、内在性の本ポリヌクレオチドの発現をブロックする方法を用いて阻害することにより同様の効果が得られる。本ポリヌクレオチドの発現の阻害は、例えば本ポリヌクレオチドの部分配列からなるオリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いることにより実施できる。アンチセンスオリゴヌクレオチオドとして用いるオリゴヌクレオチオドは、本ポリヌクレオチドの翻訳領域のみでなく、非翻訳領域に対応するものであっても有用である。本ポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害するためには、該ポリヌクレオチドに固有な領域の塩基配列を用いることが好ましい。【０１３１】
本発明に係る蛋白質の機能の異常および／または本発明に係るポリヌクレオチドの発現の異常に基づく疾患として、癌疾患、好ましくは食道癌が例示できる。本ポリヌクレオチドである配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドの組織発現は、疾患データベース情報ＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓ（ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ社）を用いて調べたところ、食道癌の１つである食道腺癌（ｅｓｏｐｈａｇｕｓ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）で正常食道組織と比較して２．７８倍高いことが判明した。上記のように、配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質はＧＥＦ活性を有することから、Ｒｈｏ−ＧＥＦとして作用すると考えられる。Ｒｈｏ−ＧＥＦとして単離された遺伝子には、癌に関与する次のような遺伝子が知られている：ｖａｖ（非特許文献３および４）；ｏｓｔ（非特許文献５）；およびｉｂｃ（非特許文献６）。これらから、本ポリヌクレオチドの高発現は癌疾患、例えば食道腺癌等の食道癌に関連すると考える。本蛋白質の機能および／または本ポリヌクレオチドの発現を阻害することにより、これら疾患を防止および／または治療できると考える。本発明に係る医薬および医薬組成物は、食道癌の防止剤および／または治療剤として有用であり、食道癌の防止方法および／または治療方法に使用できる。【０１３２】
本発明に係る医薬および医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等に応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ乃至１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ乃至１ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。上記投与量は１日１回乃至数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。【０１３３】
本発明に係る医薬または医薬組成物を投与するときは、該医薬または医薬組成物を単独で使用してよく、あるいは治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。【０１３４】
投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択できる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与のほか、皮下、皮内、筋肉内等への投与が挙げられる。あるいは経口経路で投与できる。さらに、経粘膜投与または経皮投与も実施できる。癌疾患に用いる場合は、腫瘍に注射等により直接投与することもできる。【０１３５】
投与形態は、各種の形態が治療目的に応じて適宜選択できる。その代表的な例として、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リポソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。【０１３６】
（診断方法）
本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、抗体または化合物は、それ自体を、診断マーカーや診断試薬等の疾患診断手段として使用できる。【０１３７】
本発明によれば、例えば本発明に係るポリヌクレオチドの一部または全部のポリヌクレオチドを利用することにより、個体または各種組織における該ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む遺伝子の異常の有無あるいは発現の有無を特異的に検出できる。本ポリヌクレオチドの検出により、該ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む遺伝子の量的異常および／または機能異常等に基づく疾患の易罹患性、発症、および／または予後の診断が実施できる。【０１３８】
疾患の診断は、例えば調べようとする試料（被検試料）について、本発明に係るポリヌクレオチドの存在を検出すること、その存在量を決定すること、および／またはその変異を同定することにより実施できる。正常な対照試料との比較において、本ポリヌクレオチドの存在の変化およびその量的変化を検出できる。あるいは、正常遺伝子型との比較において本ポリヌクレオチドを公知の手法により増幅した増幅生成物について、例えばサイズ変化を測定することにより、欠失や挿入といった変異を検出できる。また、被検試料から増幅したポリヌクレオチドを、例えば標識した本ポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせることにより点突然変異を同定できる。このような変化および変異の検出により、上記診断を実施できる。【０１３９】
本発明には、被検試料中の本発明に係るポリヌクレオチドの定性的または定量的な測定方法、または該ポリヌクレオチドの特定領域における変異の定性的または定量的な測定方法も包含される。【０１４０】
配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドの組織発現は、食道癌の１つである食道腺癌で正常食道組織と比較して２．７８倍高いことが判明した。上述したように、本ポリヌクレオチドの高発現は食道癌に関連すると考えられる。したがって、被検試料中の該ポリヌクレオチドの発現量の増加を検出することにより、該被検試料が食道癌由来の被検試料であるか否かを判定する方法を実施できる。このような判定方法も本発明の範囲に包含される。本判定方法において該ポリヌクレオチドの発現量の増加は、被検試料と正常な対照試料とを比較することにより検出できる。被検試料として、好ましくはヒト食道組織由来の被検組織が挙げられる。対照試料として、好ましくはヒト正常食道由来組織が挙げられる。該ポリヌクレオチドの発現量が対照試料と比較して増加している場合、好ましくは少なくとも２．５倍以上、より好ましくは少なくとも３倍以上に増加している場合、被検試料がヒト食道癌由来試料であると判定できる。本判定方法はまた、配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドの代わりに、本ポリヌクレオチドを除く本発明に係るポリヌクレオチドを用いて実施できる。このようなポリヌクレオチドとして、配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドが例示できる。本発明に係るポリヌクレオチドの発現量とは、該ポリヌクレオチドの転写産物の量を意味する。【０１４１】
被検試料は、食道由来組織に制限されず、生体由来のあらゆる組織や細胞を使用できる。具体的には、細胞、血液、尿、唾液、髄液、組織生検または剖検材料等の生体由来の試料を例示できる。所望により被検試料から核酸を抽出して核酸試料を調製して使用することもできる。核酸は、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡのいずれであることもできる。核酸は、ＰＣＲまたはその他の増幅法により酵素的に増幅してもよい。核酸試料は、また、標的配列の検出を容易にする各種方法、例えば変性、制限消化、電気泳動またはドットブロッティング等により調製してもよい。【０１４２】
本発明に係るポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む遺伝子の検出には、自体公知の遺伝子検出法がいずれも使用できる。具体的には、プラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、サザンブロット法、ノザンブロット法、ＮＡＳＢＡ法、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）等が例示できる。また、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲやｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション等を利用した細胞レベルでの遺伝子検出方法も使できる。このような遺伝子検出法においては、本ポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む遺伝子またはその変異遺伝子の同定および／またはその増幅の実施に、本ポリヌクレオチドの部分配列からなるオリゴヌクレオチドであってプローブとしての性質を有するものまたはプライマーとしての性質を有するものが有用である。プローブとしての性質を有するオリゴヌクレオチドとは、本ポリヌクレオチドのみに特異的にハイブリダイゼーションできる該ポリヌクレオチド特有の配列からなるものを意味する。プライマーとしての性質を有するものとは本ポリヌクレオチドのみを特異的に増幅できる該ポリヌクレオチド特有の配列からなるものを意味する。また、増幅できる変異遺伝子を検出する場合には、遺伝子内の変異を有する箇所を含む所定の長さの配列を持つプライマーあるいはプローブを作成して用いる。プローブまたはプライマーとしては、塩基配列長が一般的に５乃至５０ヌクレオチド程度であるものが好ましく、１０乃至３５ヌクレオチド程度であるものがより好ましく、１５乃至３０ヌクレオチド程度であるものがさらに好ましい。本ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅するためのプライマー、あるいは本ポリヌクレオチドを検出するためのプローブとして、具体的には、配列番号７、８または９に記載の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドを好ましく例示できる。プローブは、通常は標識したプローブを用いるが、非標識のものであってもよい。また、直接的または間接的に標識したリガンドとの特異的結合により検出することができる。プローブおよびリガンドを標識する方法は、様々な方法が知られており、例えばニックトランスレーション、ランダムプライミングまたはキナーゼ処理を利用する方法等が例示できる。適当な標識として、放射性同位体、ビオチン、蛍光物質、化学発光物質、酵素、抗体等が挙げられる。【０１４３】
遺伝子検出法は、ＰＣＲが感度の点から好ましい。ＰＣＲは、本発明に係るポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む遺伝子またはその変異遺伝子を特異的に増幅できるプライマーを用いる方法である限り、従来公知の方法のいずれも使用できる。例えばＲＴ−ＰＣＲが例示できる。その他、当該分野で用いられる様々なＰＣＲの変法が適用できる。【０１４４】
ＰＣＲにより、遺伝子の検出の他に、本発明に係るポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む遺伝子またはその変異遺伝子のＤＮＡの定量も実施できる。このような分析方法として、ＭＳＳＡ法等の競合的定量法、または一本鎖ＤＮＡの高次構造の変化に伴う移動度の変化を利用した突然変異検出法として知られるＰＣＲ−ＳＳＣＰ法を例示できる。【０１４５】
本発明によればまた、例えば本発明に係る蛋白質を利用することにより、個体若しくは各種組織における該蛋白質およびその機能の異常の有無を特異的に検出できる。本蛋白質およびその機能の異常の検出により、該蛋白質の量的異常および／または機能の異常に基づく疾患の易罹患性、発症、および／または予後の診断が実施できる。【０１４６】
蛋白質の検出による疾患の診断は、例えば被検試料について、該蛋白質の存在を検出すること、その存在量を決定すること、および／またはその変異を検出することにより実施できる。すなわち、本発明に係る蛋白質および／またはその変異体を定量的あるいは定性的に測定する。正常な対照試料との比較において、本蛋白質の存在の変化、その量的変化が検出できる。正常蛋白質との比較において、例えばアミノ酸配列を決定することによりその変異を検出できる。このような変化および変異の検出により、上記診断を実施できる。被検試料は、本蛋白質および／またはその変異体を含むものである限り特に制限されず、例えば、細胞、血液、血清、尿、生検組織等の生体生物由来の生物学的試料を例示できる。【０１４７】
本発明に係る蛋白質および変異を有する該蛋白質の測定は、本蛋白質、例えば配列番号２、４または６に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質、または該蛋白質のアミノ酸配列において１若しくは数個乃至複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列で表わされる蛋白質、これらの断片、または該蛋白質やその断片に対する抗体を用いることにより実施できる。【０１４８】
蛋白質の定量的あるいは定性的な測定は、この分野における慣用技術による蛋白質検出法あるいは定量法を用いて実施できる。例えば、本蛋白質のアミノ酸配列分析により変異蛋白質を検出できる。さらに好ましくは、抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル抗体）を用いることにより、蛋白質の配列の相違、または蛋白質の有無が検出できる。【０１４９】
本発明には、被検試料中の本蛋白質の定性的または定量的な測定方法、または該蛋白質の特定領域の変異の定性的または定量的な測定方法が包含される。【０１５０】
具体的には、被検試料について、本蛋白質に対する特異抗体を用いて免疫沈降を行い、ウェスタンブロット法またはイムノブロット法で本蛋白質の解析を行うことにより、上記検出が実施できる。また、本蛋白質に対する抗体を用いて、免疫組織化学的技術によりパラフィン切片または凍結組織切片中の本蛋白質を検出できる。【０１５１】
本蛋白質またはその変異体を検出する方法の好ましい具体例として、モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を用いるサンドイッチ法を含む、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）、免疫放射線検定法（ＩＲＭＡ）、および免疫酵素法（ＩＥＭＡ）等が例示できる。その他、ラジオイムノアッセイや競争結合アッセイ等が利用できる。【０１５２】
本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、および抗体はいずれも、それ自体を単独であるいは組合わせて、試薬等として使用できる。試薬は、本蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、および抗体のうちの少なくとも１種類の他に、緩衝液、塩、安定化剤、および／または防腐剤等の物質を含むことができる。なお、製剤化にあたっては、各性質に応じた自体公知の製剤化手段を導入すればよい。該試薬は、例えば、本発明に係る判定方法、化合物の同定方法、あるいは本蛋白質または本ポリヌクレオチドの測定方法に使用できる。該試薬はその他、本蛋白質またはポリヌクレオチドが関与する細胞内情報伝達経路の解明、および該蛋白質またはポリヌクレオチドの異常に基づく疾患等に関する基礎的研究等に有用である。【０１５３】
本発明はまた、本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、および抗体のうちの少なくともいずれか１つを含んでなる試薬キットを提供する。試薬キットにはその他、本蛋白質やポリヌクレオチドを検出するための標識物質、標識の検出剤、反応希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤および反応停止液等、測定の実施に必要とされる物質を含むことができる。標識物質として、上述の蛋白質や放射性同位元素等が例示できる。標識物質は、予め本蛋白質あるいはポリヌクレオチドに付加されていてもよい。本試薬キットは、本発明に係る判定方法、化合物の同定方法、あるいは本蛋白質または本ポリヌクレオチドの測定方法に使用できる。さらに、本試薬キットは、前記測定方法を用いる検査方法に、検査剤並びに検査用キットとして使用できる。また、前記測定方法を用いる診断方法にも、診断剤並びに診断用キットとして使用できる。【０１５４】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定して解釈されない。
【実施例１】
【０１５５】
（遺伝子のクローニング）
ヒト脾臓由来ｃＤＮＡライブラリーは、小原らの方法（オハラ（Ｏｈａｒａ，Ｏ．）ら、「ディーエヌエー  リサーチ（ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９７年、第４巻、ｐ．５３−５９）に従って構築した。具体的には、ＮｏｔＩ部位を有するオリゴヌクレオチド（ＧＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＣＧＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣ（Ｔ）１５）（配列番号１５：ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）をプライマーとして用い、ヒト脾臓ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製：カタログ番号６５４２−１）をテンプレートにしてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素キット（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）で２本鎖ｃＤＮＡを合成した。ＳａｌＩ部位を有するアダプター（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）をｃＤＮＡとライゲーションした後、ＮｏｔＩ消化し、１％濃度の低融点アガロース電気泳動により、３ｋｂ以上のＤＮＡ断片を精製した。精製ｃＤＮＡ断片を、ＳａｌＩ−ＮｏｔＩ制限酵素処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋プラスミドとライゲーションした。エレクトロポーレーション法により、大腸菌ＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ  ＤＨ１０Ｂ株（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）に組換えプラスミドを導入した。構築したｃＤＮＡライブラリーから、約１０，０００個の組換え体を選択し、これらクローンの両末端ＤＮＡ配列を決定した。この中から、新規遺伝子を含む約４２０個のクローンを選択し、そのｃＤＮＡについて全塩基配列の決定を行なった。配列決定には、株式会社島津製作所製のＤＮＡシーケンサー（ＲＩＳＡ）とＰＥアプライドバイオシステム社製の反応キットを使用した。大部分の配列は、ショットガンクローンをダイターミネーター法（ターミネーター標識法）を用いて決定した。【０１５６】
全塩基配列が決定されたｃＤＮＡクローンについて、コンピュータプログラムを用いた汎用解析方法によりＯＲＦを予想した。次いで、ＯＲＦ領域についてモチーフドメイン検索を行い、Ｒｈｏ−ＧＥＦの活性ドメインであるＤＨ／ＰＨドメインをコードする領域を含むｃＤＮＡを同定した。【０１５７】
その結果、新規な塩基配列を有し、ＤＨ／ＰＨドメインをコードする領域を含むｃＤＮＡ（以下、ｓｈ０４００９と称する）が同定された。【０１５８】
同定したｃＤＮＡクローンｓｈ０４００９の塩基配列が全長蛋白質をコードする塩基配列か否かを検討するために、ＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇ）データベースを用いてインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）で解析を行なった。その結果、ｓｈ０４００９の５´末端配列と部分的に重複するＢＵ５９９４０７を見出した。ＢＵ５９９４０７がｓｈ０４００９において欠失している５´側配列であると予測し、この５´側配列を含むｓｈ０４００９のコード領域（ＣＤＳ）がｍＲＮＡに存在するかをＲＴ−ＰＣＲクローニングにより確認した。具体的には、ＢＵ５９９４０７の１００番目から１２２番目までの塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（配列番号７）とｓｈ０４００９の１５８２番目から１５５４番目までの塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド（配列番号８）とをプライマーとして用い、ヒト脾臓由来ｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）をテンプレートとして逆転写反応によりｃＤＮＡを作製した。ＤＮＡポリメラーゼとしてｐｆｕ  ｔｕｒｂｏ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、ＰＣＲによりＢＵ５９９４０７の配列を５´上流に有するｓｈ０４００９のＣＤＳを取得した。該ＣＤＳは、ＴＯＰＯ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍを用いた反応によりｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入し、エントリーベクターを作製した。以下、ＢＵ５９９４０７の配列を５´上流に有するｓｈ０４００９をｓｈ０４００９全長遺伝子と称する。インシリコで予測した、ｓｈ０４００９全長遺伝子のＣＤＳの塩基配列が正しいこと、そしてＣＤＳの塩基配列がエントリーベクターに正しく挿入されていることを、シーケンス解析により確認した。シーケンス反応はＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、泳動および解析はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７を用いて、それぞれ実施した。【０１５９】
シーケンス解析の結果、ｓｈ０４００９全長遺伝子は、配列番号１に示す塩基配列（６０１８ｂｐ）からなり、配列番号２に示すアミノ酸配列（５７４アミノ酸）をコードすることが判明した。ｓｈ０４００９全長遺伝子とｓｈ０４００９を比較すると、ｓｈ０４００９の５´上流側に１４０ヌクレオチドの欠失が認められた他、１塩基が異なることが判明した。しかし、この１塩基の差異によるアミノ酸置換は認められなかった。具体的には、ｓｈ０４００９全長遺伝子の塩基配列（配列番号１）において第１５６６番目の塩基はチミン（Ｔ）である。一方、ｓｈ０４００９において該塩基に相当する位置の塩基はシトシン（Ｃ）である。ｓｈ０４００９全長遺伝子の第１５６４番目から第１５６６番目までの塩基はＣＣＴであり、プロリンをコードしている。一方、ｓｈ０４００９において、該位置に相当する塩基はＣＣＣであり、同様にプロリンをコードしている。すなわち、１塩基の差異によるアミノ酸置換は認められなかった。一塩基の違いがある配列の前後についてゲノム配列（ＮＴ＿００９７９９．１１  Ｈｓ１３＿９９５６）と比較したところ、配列番号１に記載の塩基配列の第１５６６番目に相当する塩基はチミン（Ｔ）であった。【０１６０】
ｓｈ０４００９全長遺伝子において、ＤＨドメインは、配列番号１に示す塩基配列の第４９６番目から第１０３２番目のヌクレオチドからなる領域にコードされている。ＰＨドメインは、配列番号１に示す塩基配列の第１１３２番目から第１４４９番目のヌクレオチドからなる領域にコードされている。また、ｓｈ０４００９全長遺伝子によりコードされる蛋白質において、ＤＨドメインは、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第１６６番目のバリン（Ｖａｌ）から第３４４番目のアスパラギン（Ａｓｎ）までの１７９アミノ酸残基からなる。ＰＨドメインは、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第３７８番目のロイシン（Ｌｅｕ）から第４８３番目のアルギニン（Ａｒｇ）までの１０６アミノ酸残基からなる。
【実施例２】
【０１６１】
（ＤＮＡの発現と精製）
実施例１で得られたｓｈ０４００９全長遺伝子の発現ベクターを、ゲートウェイＴＭクローニングテクノロジー（ＧＡＴＥＷＡＹＴＭ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて作製した。次いで、該発現ベクターを用いて、該遺伝子によりコードされる蛋白質（以下、ｓｈ０４００９全長蛋白質と称する）をＦＬＡＧ−ｔａｇ融合蛋白質として２９３ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で発現させた。また、該遺伝子の、ＤＨ／ＰＨドメインコード領域を含む部分塩基配列からなるＤＮＡ（以下、ｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨと称する）を含む発現ベクターを同様に作製した。そして、該発現ベクターを用いて、該遺伝子によりコードされる蛋白質のＤＨ／ＰＨドメインを含む部分アミノ酸配列からなる蛋白質（以下、ｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ蛋白質と称する）を、同様にＦＬＡＧ−ｔａｇ融合蛋白質として２９３ＥＢＮＡ細胞で発現させた。発現の確認はウエスタンブロット法により行った。【０１６２】
具体的には、ｓｈ０４００９全長遺伝子の発現ベクターの作製および該遺伝子の発現のために、ヒト脾臓由来ｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）から逆転写反応によりｃＤＮＡライブラリーを作製した。このｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとし、ｐｆｕ  ｔｕｒｂｏ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）により、該遺伝子のＯＲＦ領域（終止コドンを除く）を増幅した。増幅用プライマーには、配列番号７および８に記載の各塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドを用いた。その後、増幅産物をＴＯＰＯ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍを用いた反応にて、ｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯに挿入してエントリーベクターを作製した。作製したエントリーベクターとＢｓｐＥＩで切断したＣ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇ（３×）融合蛋白質発現ベクターとを用いて、ＬＲクロナーゼ酵素による組換え反応により、ｓｈ０４００９全長遺伝子発現プラスミドを作製した。この発現プラスミドを用いることにより、Ｃ末端にＦＬＡＧ−ｔａｇ（３×）が付加されたｓｈ０４００９全長蛋白質が得られる。ｓｈ０４００９全長遺伝子のコード領域の塩基配列が発現プラスミドに正しく挿入されていることは、シーケンス解析により確認した。シーケンス反応はＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、泳動および解析はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７を用いて、それぞれ実施した。【０１６３】
次に、ｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨの発現ベクターを、ゲートウェイＴＭクローニングテクノロジー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて構築した。具体的には、まず、上記作製した、ｓｈ０４００９全長遺伝子のエントリーベクターをテンプレートとし、ｓｈ０４００９全長遺伝子のＤＨ／ＰＨコード領域を含む部分配列（配列番号１の第３８８番目から第１７２２番目までのヌクレオチド：配列番号３）の５´末端にコザックシークエンスとメチオニンに対応するコドンとからなるオリゴヌクレオチド（配列番号１０）が付加されたポリヌクレオチド（配列番号５）を増幅した。増幅は、プライマーとして配列番号９および８に記載の各塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドを用い、ｐｆｕ  ｔｕｒｂｏ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）により行なった。その後、増幅産物をＴＯＰＯ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍを用いた反応にて、ｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯに挿入してエントリーベクターを作製した。作製したエントリーベクターとＢｓｐＥＩで切断したＣ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇ（３×）融合蛋白質発現ベクターとを用いて、ＬＲクロナーゼ酵素による組換え反応により、ｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ発現プラスミドを作製した。この発現プラスミドを用いることにより、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第１３０番目から第５７４番目のアミノ酸残基からなる配列（配列番号４）のＮ末端にメチオニン（Ｍｅｔ）が付加され（配列番号６）、さらにそのＣ末端にＦＬＡＧ−ｔａｇ（３×）が付加された蛋白質が得られる。ｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨの塩基配列が正しく挿入されていることは、シーケンス解析により確認した。シーケンス反応はＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、泳動および解析はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７を用いて、それぞれ実施した。【０１６４】
ｓｈ０４００９全長遺伝子発現ベクターおよびｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ発現ベクターは、それぞれ２９３ＥＢＮＡ細胞にリポフェクション法によりトランスフェクションした。２９３ＥＢＮＡ細胞は、遺伝子導入の前日にＴ２５フラスコに細胞数６×１０５で播種し、培養培地（ＩＭＤＭ培地、ＳＩＧＭＡ社製；１０％牛胎児血清；４ｍＭ  グルタミン；および１０μｇ／ｍＬ  ゲンタマイシン）５ｍＬ中で培養した。翌日、培養した細胞から培地を３ｍＬ除去した後、リポフェクトアミン２０００（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた手法で遺伝子導入を実施した。具体的には、まず、各発現ベクターを添加した無血清のＤＭＥＭとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００を添加したＤＭＥＭとを混合し、室温で２０分間インキュベーションした。得られた混合液を、前日播種して３７℃にて５％  ＣＯ２存在下で培養した２９３ＥＢＮＡ細胞に添加した。遺伝子導入処理した細胞は３７℃にて５％  ＣＯ２存在下で８時間以上培養後、培養培地を３ｍＬ添加してさらに培養を行なった。遺伝子導入２日後、培地を除去してリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）にて細胞を洗浄し、プロテアーゼインヒビターカクテル（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ、ＳＩＧＭＡ社製）１％を含む溶解バッファーＡ（Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ  Ａ）にて細胞を溶解して細胞溶解液を調製した。溶解バッファーＡは、次の組成からなる：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１ｍＭ  ＣａＣｌ２；および１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００。【０１６５】
各細胞溶解液は、等量のＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーと混合し、１００℃で５分間加熱処理して電気泳動用サンプルを調製した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行い、泳動ゲルをブロッティングバッファーに５分間以上浸して平衡化した後、ＰＶＤＦ膜上に蛋白質をトランスファーした。ブロッティング終了後のＰＶＤＦ膜は、ＴＢＳ−Ｔにブロックエース（大日本製薬株式会社製）を３：１の割合で混合した溶液（ＴＢＳ−Ｔ＋ＢＡ）に４℃で一晩浸してブロッキングした。ブロッキング終了後に、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔにて１０分以上振とうしながら１回洗浄した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーは、トリスＳＤＳβＭＥサンプル処理液（第一化学薬品社製）を用いた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いた泳動バッファーは次の組成からなる：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ；１９２ｍＭ  グリシン；０．１％  ＳＤＳ、ｐＨ８．３（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）。上記ブロッティングバッファーは、次の組成からなる：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ；４０ｍＭ  ε−アミノ−ｎ−カプロン酸；２０％メタノール；および０．０５％  ＳＤＳ。ＴＢＳ−Ｔは、次の組成からなる：１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；および０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０。【０１６６】
ＰＶＤＦ膜に、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ社製）をＴＢＳ−Ｔ＋ＢＡで１０００倍希釈して添加し、３７℃で１時間以上保温した。その後、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔにて３回洗浄し（１回の洗浄に付き２０分以上の振とう）、ＴＢＳ−Ｔ＋ＢＡで１０００倍に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加して、３７℃で１時間以上保温した。最終的に、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔにて３回洗浄した後（１回の洗浄に付き２０分以上の振とう）、ＥＣＬプラスウエスタンブロッティングディテクションシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）により、抗ＦＬＡＧ抗体に反応する発現蛋白質の検出を行った。化学発光シグナルは検出装置（Ｌｕｍｉｎｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、東洋紡績株式会社製）にて可視化した。【０１６７】
結果を図１に示す。ｓｈ０４００９全長遺伝子発現ベクターおよびｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ発現ベクターをそれぞれトランスフェクションした細胞から調製した細胞溶解液のいずれにおいても、５０ＫＤａから１００ＫＤａの間に主要バンドが検出された（それぞれ図１内レーン２およびレーン３）。これらベクターによりＦＬＡＧ−ｔａｇ融合蛋白質として発現されるｓｈ０４００９全長蛋白質およびｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ蛋白質の予想分子量は、それぞれ約７２ＫＤａおよび約５８ＫＤａである。一方、各ベクターを導入せずＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００のみを添加した細胞から同様の処理により得た細胞溶解液では、このようなバンドは検出されなかった（図１内レーン１）。このことから、図１のレーン２およびレーン３で認められた主要バンドは、それぞれｓｈ０４００９全長蛋白質およびｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ蛋白質であると考える。かくして、ｓｈ０４００９全長蛋白質およびｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ蛋白質を取得できた。
【実施例３】
【０１６８】
（ｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ蛋白質のＣｄｃ４２に対するＧＥＦ活性）
ｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ蛋白質のＧＥＦ活性を、実施例２で構築したｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ発現ベクターを用いて、エフェクタープルダウン法により検討した。この発現ベクターによれば、ｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ蛋白質は、Ｃ末端３×ＦＬＡＧ−ｔａｇ融合蛋白質として発現される。Ｒｈｏファミリー蛋白質として、Ｃｄｃ４２を用いた。Ｃｄｃ４２を発現させるために、Ｃｄｃ４２遺伝子発現ベクターを、ゲートウェイＴＭクローニングテクノロジー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて作製した。具体的には、まず、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃＤＮＡ  Ｐａｎｅｌｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）のスプリーンファーストストランドＤＮＡ（ｓｐｌｅｅｎ  ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ）をテンプレートとして、ｐｆｕ  ｔｕｒｂｏを用いてＣｄｃ４２遺伝子（配列番号１１）を増幅した。増幅産物を、ＴＯＰＯ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍを用いた反応にてｐＥＮＴＲ／Ｄに挿入してエントリーベクターを作製した。Ｃｄｃ４２遺伝子の増幅用プライマーとして、配列番号１３および１４に記載の各塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドを使用した。次に、構築したエントリーベクターについて、ＢｓｐＥＩで切断したＮ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇ（３×）融合蛋白質発現ベクターを用いて、ＬＲクロナーゼ酵素による組換え反応により、Ｃｄｃ４２遺伝子発現プラスミドを作製した。この発現プラスミドにより、Ｃｄｃ４２（配列番号１２）のＮ末端にＦＬＡＧ−ｔａｇ（３×）が付加された蛋白質が発現される。Ｃｄｃ４２遺伝子のコード領域の塩基配列が正しく挿入されていることは、シーケンス解析により確認した。シーケンス反応はＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、泳動および解析はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７を用いて、それぞれ実施した。【０１６９】
ｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ発現ベクターとＣｄｃ４２遺伝子発現ベクターとを、２４ウエルプレートに播種した２９３ＥＢＮＡ細胞（細胞数５．０×１０４／ｗｅｌｌ）に導入した。ベクターの細胞への導入は、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００を用いて行った。陰性コントロールとして、各ベクターのＣＤＳが挿入されていない空ベクター（ｅｍｐｔｙ  ｖｅｃｔｏｒ）を導入した細胞を用いた。遺伝子導入２日後、培地を除去してＰＢＳにて細胞を洗浄し、プロテアーゼインヒビターカクテル（ＳＩＧＭＡ社製）１％を含む溶解バッファーＢで細胞を溶解して細胞溶解液を調製した。次いで、細胞溶解液をエフェクタービーズ（ＵＰＳＴＡＴＥ社製）と４℃で１時間反応させた。エフェクタービーズとして、ＰＡＫ−１の、活性型Ｒｈｏファミリー蛋白質に結合するドメインにＧＳＴ−ｔａｇを付加した蛋白質が結合しているグルタチオンアガロースを用いた。ＰＡＫ−１は活性型Ｃｄｃ４２および活性型Ｒａｃ１と結合することが知られている。反応させたエフェクタービーズは、溶解バッファーＢで洗浄し、溶解バッファーＢとＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーの等量混合溶液を４０μＬ添加した後、１００℃で５分間の加熱処理を行い、サンプルを調製した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに８μＬのサンプルをアプライして電気泳動を行なった。タンク式ブロッティングバッファーに５分間以上浸して平衡化した泳動ゲルから、ＰＶＤＦ膜上に蛋白質をトランスファーした。ＴＢＳ−Ｔ＋ＢＡに４℃で一晩浸してブロッキングした。ブロッキング終了後に、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔにて１０分以上振とうしながら１回洗浄した。溶解バッファーＢは、次の組成からなる：１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；２％  グリセロール；１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２。タンク式ブロッティングバッファーは、以下の組成からなる：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ；１９２ｍＭ  グリシン；および２０％  メタノール。ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー、泳動バッファー、ＴＢＳ−ＴおよびＴＢＳ−Ｔ＋ＢＡはいずれも、実施例２で使用した各バッファーと同一組成のバッファーを用いた。【０１７０】
ＦＬＡＧ−ｔａｇ付加蛋白質の検出は、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて実施した。具体的には、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ社製）をＴＢＳ−Ｔ＋ＢＡで１０００倍希釈して添加し、室温で１時間以上保温した。その後、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔにて３回洗浄し（１回の洗浄に付き２０分以上の振とう）、ＴＢＳ−Ｔ＋ＢＡで１０００倍に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加して、室温で１時間以上保温した。最終的に、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔにて３回洗浄した後（１回の洗浄に付き２０分以上の振とう）、ＥＣＬウエスタンブロッティングディテクションシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）により、抗ＦＬＡＧ抗体に反応する発現蛋白質の検出を行った。化学発光シグナルは検出装置（Ｌｕｍｉｎｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、東洋紡績株式会社製）にて可視化した。【０１７１】
ｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ蛋白質がＣｄｃ４２に対するＧＥＦ活性を有するならば、ｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ蛋白質によりＣｄｃ４２は不活性型（ＧＤＰ結合型）から活性型（ＧＴＰ結合型）に移行する。エフェクタービーズとして使用したＰＡＫ−１は活性型Ｃｄｃ４２および活性型Ｒａｃ１と結合することが知られている。したがって、ｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ蛋白質がＣｄｃ４２に対するＧＥＦ活性を有しＣｄｃ４２を活性化するならば、エフェクタービーズに結合するＣｄｃ４２量が増加する。ｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ蛋白質およびＣｄｃ４２を共発現させた細胞から得た細胞溶解液を用いたときに、Ｃｄｃ４２のみを発現させた細胞から得た細胞溶解液を用いたときよりも、Ｃｄｃ４２のバンドが濃く検出される場合、ｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨはＧＥＦ活性を有しＣｄｃ４２を活性化すると判定した。【０１７２】
結果を図２に示す。図２の上段のパネルは、上記各細胞溶解液を用いてエフェクタープルダウン法を実施した結果を示す。ｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ蛋白質とＣｄｃ４２とを共発現させた細胞から得た細胞溶解液（図２のレーン４）を用いたときに、Ｃｄｃ４２のみを発現させた細胞から得た細胞溶解液（図２のレーン２）を用いたときと比較して、バンドが濃く検出された。すなわち、Ｃｄｃ４２とｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ蛋白質を共発現させた細胞では、ＰＡＫ−１に結合する活性型Ｃｄｃ４２が増加した。図２の中段のパネルは、各細胞溶解液に含まれるＣｄｃ４２を、抗ＦＬＡＧ抗体により検出した結果を示す。Ｃｄｃ４２は、Ｃｄｃ４２のみを発現させた細胞およびＣｄｃ４２とｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ蛋白質とを共発現させた細胞のいずれにおいても、ほぼ同量であった（図２のレーン２および４）。図２の下段のパネルは、各細胞溶解液に含まれるｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ蛋白質を、抗ＦＬＡＧ抗体により検出した結果を示す。ｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ蛋白質は、ｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ蛋白質のみを発現させた細胞およびｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ蛋白質とＣｄｃ４２とを共発現させた細胞のいずれにおいても、ほぼ同量であった（図２のレーン３および４）。【０１７３】
これら結果から、ｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ蛋白質により、Ｃｄｃ４２が不活性型から活性型に変換されることが明らかになった。すなわち、ｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ蛋白質はＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応を促進して、Ｃｄｃ４２を不活性型から活性型に変換すると考える。言い換えれば、ｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ蛋白質はＧＥＦ活性を有すると考える。【０１７４】
ｓｈ０４００９全長蛋白質は、ｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ蛋白質を含むことから、ｓｈ０４００９ＤＨ／ＰＨ蛋白質と同様に、Ｃｄｃ４２に対して同様にＧＥＦ活性を有すると考える。
【産業上の利用可能性】
【０１７５】
本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質はＲｈｏファミリー蛋白質、例えばＣｄｃ４２に対するＧＥＦ活性を示した。本蛋白質およびポリヌクレオチドの利用により、Ｒｈｏファミリー蛋白質が関与する情報伝達経路および細胞機能の解明とその調節、並びに本蛋白質またはポリヌクレオチドの異常に基づく疾患、例えば食道癌の診断、防止および／または治療が実施できる。したがって、本発明は基礎科学分野から医薬開発分野まで広く寄与する有用な発明である。
【配列表フリーテキスト】
【０１７６】
配列番号１：グアニンヌクレオチド交換因子としての機能を有する蛋白質（配列番号２）をコードするポリヌクレオチド。
配列番号１：（４９６）：（１０３２）Ｄｂｌ相同ドメインをコードする領域。
配列番号１：（１１３２）：（１４４９）プレックストリン相同ドメインをコードする領域。
配列番号３：配列番号１の第３８８番目から第１７２２番目までのヌクレオチドからなる部分配列であり、Ｄｂｌ相同ドメインおよびプレックストリン相同ドメインをコードする領域を含む配列からなるポリヌクレオチド。
配列番号３：配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
配列番号５：５´末端にコザックコンセンサス配列とメチオニンをコードする配列を有し、それに続いて、配列番号１の第３８８番目から第１７２２番目までのヌクレオチドからなる部分配列であり、Ｄｂｌ相同ドメインおよびプレックストリン相同ドメインをコードする領域を含む配列を有するポリヌクレオチド。
配列番号５：配列番号６に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
配列番号５：（１）：（４）コザックコンセンサス配列。
配列番号５：（５）：（７）メチオニンに対応するコドン。
配列番号７：プライマー用に配列番号１の配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号８：プライマー用に配列番号１の配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号９：プライマー用に配列番号１の配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１０：コザックコンセンサス配列とそれに続くメチオニンに対応するコドンを含む設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１１：Ｃｄｃ４２をコードするポリヌクレオチド。
配列番号１２：Ｃｄｃ４２。
配列番号１３：プライマー用に配列番号１１の配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１４：プライマー用に配列番号１１の配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１５：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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