(57)【要約】  赤色デイジー（Bellis  perennis）由来のＵＤＰ−グルクロニル基転移酵素（ＢｐＵＧＴ），その遺伝子，および該遺伝子を保持する形質転換体を提供することにより，フラボノイド化合物のグルクロニル化を可能とし，フラボノイド化合物の安定化，吸収性の向上，生理活性の制御，活性体の徐放化など，これらの化合物の機能改善を実現する．また，赤色デイジー（Bellis  perennis）由来のＵＤＰ−グルクロニル基転移酵素（ＢｐＵＧＴ），その遺伝子，および該遺伝子を保持する形質転換体を提供することにより，遺伝子工学的手法による花色発現の安定化や色彩，色調の調節，代謝工学的制御に用いることができる有効な修飾手段を提供する．配列番号１のアミノ酸配列を有する酵素，あるいは配列番号２で規定される遺伝子にコードされる酵素を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アントシアニンに作用して対応するグルクロニル化アントシアニンを生成する反応を触媒する作用を有するＵＤＰ−グルクロニル基転移酵素であって、（Ａ） 配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列または（Ｂ）該アミノ酸配列に対して前記触媒活性を維持し得る範囲内で１以上のアミノ酸残基の挿入、欠失または置換を行って得られる変異アミノ酸配列を有することを特徴とする請求項２記載のＵＤＰ−グルクロニル基転移酵素。
【請求項２】
アントシアニンに作用して対応するグルクロニル化アントシアニンを生成する反応を触媒する作用を有するＵＤＰ−グルクロニル基転移酵素をコードする塩基配列であって、（a） 配列表の配列番号：1記載の塩基配列または（ｂ）配列番号：１の塩基配列に対して該塩基配列がコードするＵＤＰ−グルクロニル基転移酵素の作用が維持される範囲内で１以上の塩基の挿入、欠失または置換を行って得られる変異塩基配列からなることを特徴とするＵＤＰ−グルクロニル基転移酵素をコードする塩基配列。
【請求項３】
前記変異塩基配列が、前記配列番号：１の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものである請求項２に記載の塩基配列。
【請求項４】
赤色デイジー（Bellis  perennis）由来の遺伝子であることを特徴とする請求項2に記載の遺伝子。
【請求項５】
赤色デイジー（Bellis  perennis）由来であることを特徴とする請求項1に記載のＵＤＰ−グルクロニル基転移酵素。
【請求項６】
請求項2または請求項３または請求項４に記載の遺伝子が導入されてなることを特徴とする形質転換体。
【請求項７】
請求項１または請求項５記載のＵＤＰ−グルクロニル基転移酵素を用いたグルクロニル化アントシアニンの製造方法
【請求項８】
請求項６に記載の形質転換体を用いることを特徴とするグルクロニル化アントシアニンの製造方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なＵＤＰ−グルクロニル基転移酵素およびその遺伝子に関わる。
【背景技術】
【０００２】
ＵＤＰ−グルクロニル基転移酵素（ＵＧＴ）は哺乳動物の生体内において糖鎖合成や種々の化合物の解毒を担っており、特に解毒作用についてはその薬学的重要性から幅広い研究がなされている。グルクロニル基転移酵素はグルクロン酸抱合という解毒機構において中心的な役割を果たす酵素で、ステロイド，ビリルビンなどの疎水性内在性物質やフェノール，ドラッグなど，種々の毒性化合物をグルクロニル化することによりこれらの化合物の水溶性を高め，尿や胆汁などへの排出を促進する。これらグルクロニル化はＵＤＰ（ウリジン二リン酸）グルクロン酸を糖残基供与体としてグルクロニル基転移酵素により触媒される。このような解毒機構に関与する脊椎動物由来グルクロニル基転移酵素に関しては現在までに多くの知見が得られており、本酵素群は多量体であること，小胞体に局在する膜タンパク質であること，その触媒活性に二価金属イオン(Ｍｇ2+, Ｍｎ2+)を要求すること、および糖残基受容体に対する特異性が幅広く、様々な疎水性化合物のグルクロニル化を触媒することなどが知られている（例えば非特許文献１〜５参照）。【０００３】
植物においてもこのような配糖化の機構が存在し、疎水性化合物を水溶化する役割を担っている。しかし、これまでに植物から見つかっている二次代謝産物の配糖体は、多くはグルコシル化されたものであり、グルクロニル化合物はあまり見つかっておらず、また、植物におけるグルクロニル化に関する分子レベルでの知見はほとんど得られていない．
これまでの研究では、ライ麦子葉由来ルテオリン-7-O-ジグルクロニル4’-O-グルクロニドとシソ科コガネバナ由来バイカレイン 7-O-グルクロニドおよび大豆由来サポニンの合成に関与すると思われるグルクロニル基転移酵素の精製が行われた（非特許文献６参照)。これらの研究において、大豆由来グルクロニル基転移酵素は、膜タンパク質で活性の発現に金属イオンを必要とするなど，脊椎動物由来グルクロニル基転移酵素とよく似た性質を持つと考えられている。しかし、その一方でライ麦およびコガネバナ由来グルクロニル基転移酵素は既知の動物由来グルクロニル基転移酵素とは異なり、水溶性タンパク質であり、また、活性の発現に金属補因子を必要としないことを示唆する結果が出ている（非特許文献７，８参照)。このことから、これらの酵素が既知の哺乳動物由来グルクロニル基転移酵素とは異なる機能を持っている可能性がある。しかし、植物において、このような二次代謝産物の合成に関わるグルクロニル基転移酵素の遺伝子クローニングに成功した例は報告されておらず、これら植物由来グルクロニル基転移酵素の生体内での機能や進化上の位置付けは未解明のままである。
これまでにも植物からのグルクロニル基転移酵素遺伝子のクローニングは試みられており、グルクロニル基転移酵素と推測される遺伝子が２つ得られている。一つはエンドウ(Pisum sativum)由来グルクロニル基転移酵素（PsUGT1）（非特許文献９参照）で、もう一つはニコチアナ  プルムバギニフォリア（Nicotiana plumbaginifolia）由来のグルクロニル基転移酵素(NpGUT1)（非特許文献１０参照）がある。しかし、PsUGT1の発現産物については、ＵＤＰ−グルクロン酸を基質に用いることができ，根の成長点の有糸分裂期において発現するという事実以外は、その糖残基受容体の正体も含め，ほとんど何も明らかになっていない．また、NpGUT1も、配列相同性からグルクロニル基転移酵素と推測されるだけであり、これらの発現産物の酵素学的知見は全く得られていない． 【０００４】
一方、アントシアニンはフラボノイド化合物の一種で、アントシアニジンおよびそれらが糖，メチル基，アシル基，硫酸、およびグルタチオンなどにより修飾された化合物群の総称であり、赤，青，紫，黒紫色などの花や果実の色ばかりでなく、紫シソや赤キャベツ，紅葉した葉などにも見いだされる色素である。【０００５】
アントシアニンの種類は非常に豊富であり、これまでの研究で数百種類のアントシアニンが植物から単離され，その構造が決定されている。これらアントシアニンは生体内においては配糖化された形で存在している。そのほとんどはグルコースによる修飾を受けており、ガラクトースやラムノースの修飾を受けたものも少数存在するが、グルクロニル基を有するものは見つかっていなかった。しかし、１９９４年に赤色デイジー(Bellis perennis)花弁より単離されたシアニジン3-O-(6”-O-マロニル-2”-O-グルクロニルグルコシド) はアントシアニンとしては唯一，グルクロニル基をその構造中に持つ珍しい色素である（非特許文献１１，１２参照）。【０００６】
アントシアニンをはじめとする植物フラボノイド化合物には，抗酸化能，抗菌作用，発ガン抑制作用，動脈硬化抑制作用，抗う蝕作用，口臭抑制作用，肝機能向上作用，視力増強作用など，人体に対して好ましい数々の作用を有している．一般にこれらの作用はアグリコンの形で発現するとされているが，フラボノイド化合物のアグリコンは一般に水溶性が低く，また特にアントシアニンのアグリコン（アントシアニジン）は水溶液中で不安定であるなどの問題点がある．またこれらの化合物の腸管吸収は配糖体やその修飾体（アシル化体など）の形でも行われ，また生体内で半減期も配糖体やその修飾体の方が長いことが明らかにされている．したがって，フラボノイド化合物の配糖体化やその修飾は，それらの化合物の安定化，吸収性の向上，生理活性の制御，活性体の徐放化など，これらの化合物の機能改善に有効な役割を果たすことができる．グルクロニル化はそのような目的に用いることができる有効なフラボノイド修飾手段であるが，これを達成できる酵素触媒やその遺伝子はまだ得られていない．【０００７】
また近年，遺伝子工学的手法による花色の改変技術が現実的なものとなってきた．上述のように花弁細胞内では，アントシアニンは修飾を受けた形で存在するが，その理由は，修飾体の方が物理化学的にも生化学的にも安定であり，また微妙な色彩，色調をもたらすことができるからである（非特許文献１１，１２参照）．またそのような修飾を行うことにより，細胞内の別の修飾反応の基質となったり逆にブロックしたりすることができ，生体内での代謝制御に役割を果たしうると考えられる．グルクロニル化はそのような遺伝子工学的手法による花色発現の安定化や色彩，色調の調節，代謝工学的制御に用いることができる有効な修飾手段であるが，これを達成できる酵素触媒やその遺伝子はまだ得られていない．【０００８】
【非特許文献１】C. D. King, G. R. Rios, M. D. Green, and T. R. Tephly. UDP-Glucuronosyltransferases. Current Drug Metabolism，1, 143-161 (2000)
【非特許文献２】Karl Walter Bock Vertebrate UDP-glucuronosyltransferases: functional and evolutionary aspects. Biochemical  Pharmacology, 66, 691-696 (2003)
【非特許文献３】井柳  堯  生化学  第７５巻  第３号, ２３４-２４１,（２００３）
【非特許文献４】Christopher D. King, Mitchell D. Green, Gladys R. Rios, Birgit L. Coffman, Ida S. Owens, Warren P. Bishop, and Thomas R. Tephly. The glucuronidation of exogenous and endogenous compounds by stably expressed rat and human udp-glucuronosyltransferase 1.1. Archives of Biochemistry and Biophysics, 332, 92-100 (1996)
【非特許文献５】Sahidan B. Senafi, Douglas J. Clarke, and Brian Burchell. Investigation of the substrate specificity of a cloned expressed human bilirubin UDP-glucuronosyltransferase:UDP-suger specificity and involvement in steroid and xenobiotic glucuronidation. Biochem. J., 303, 233-240 (1994)
【非特許文献６】Yasunori Kurosawa, Hidenari Takahara, and Masakazu Shiraiwa. UDP-glucuronicacid:soyasapogenol glucuronosyltransferase involved in saponin biosynthesis in germinating soybean seeds. Planta, 215, 620-629 (2002)
【非特許文献７】Margot Schulz and Gotttfried Weissenbock. Three specific UDP-glucuronate:flavone-glcuronosyltransferases from primary leaves of Secale cereale. Phytochemistry, 27, 1261-1267(1988)
【非特許文献８】Shigeyuki Nagashima, Masao Hiratani, and Takafumi Yoshikawa. Purification and characterization of UDP-glucuronate:baicalein 7-O-glucuronosyltransferase from Scutellaria baicalensis Georgi. cell suspension cultures. Phytochemistry, 53, 533-538 (2000)
【非特許文献９】Ho-Hyung Woo, Marc J. Orbach, Ann M. Hirsch, and Martha C. Hawes. Meristem-localized inducible expression of a UDP-glycosyltransferase gene is essential for growth and development in pea and alfalfa. Plant Cell, 11,2303-2315 (1999)
【非特許文献１０】Hiroaki Iwai, Nobutaka. Masaoka, Tadashi Ishii, and Shinobu Satoh. A pectin glucuronyltransferase gene is essentinal for intercellular attachment in the plantmeristem. PNAS, 99, 16319-16324  (2002)
【非特許文献１１】Kenjiro Toki, Norio Saito, and Toshio Honda. Three cyanidin 3-glucuronylglucosides from red flower of Bellis perennis. Phytochemistry, 30, 3769-3771 (1991)
【非特許文献１２】Norio Saito, Kenjiro Toki, Toshio Honda, and Koshiro Kawase. Cyanidin 3-malonylglucuronylglucoside in Bellis and Cyanidin 3-malonylglucoside in Dendranthema. Phytochemistry, 27, 2963-2996 (1988)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで本発明は以上のような従来の事情に鑑み、アントシアニンのグルクロニル化を可能たらしめる酵素ならびにその遺伝子を取得することを目的とし、赤色デイジー花弁に蓄積されるグルクロニル化アントシアニンであるシアニジン3-O-(6”-O-マロニル-2”-O-グルクロニルグルコシド)のグルクロニル化の原因となっていると予想されるグルクロニル基転移酵素（BpUGT）を取得してその遺伝子クローニングも行った。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち本発明は、請求項1記載の配列番号１（図１）、配列番号２（図２）および配列番号３（図３）から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸配列を有することを特徴とする遺伝子である。
また本発明によれば、請求項2記載配列番号４（図４）で表される塩基配列であって、1〜1317番目の塩基配列をアミノ酸翻訳領域として有する赤色デイジー由来の遺伝子が提供される。
これらの遺伝子は、好適にはＵＤＰ−グルクロニル基転移酵素をコードする遺伝子である。
さらに本発明によれば、上記に記載の遺伝子が導入されてなることを特徴とする形質転換体が提供される。【００１１】
また本発明は、請求項1記載の配列番号１（図１）、配列番号２（図２）および配列番号３（図３）から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸配列を含むことを特徴とするＵＤＰ−グルクロニル基転移酵素である。
また本発明によれば、請求項2記載の配列番号４（図４）で表される塩基配列であって、塩基配列をアミノ酸翻訳領域として有する配列からなる赤色デイジー由来のＵＤＰ−グルクロニル基転移酵素（ＢｐＵＧＴ）が提供される。【００１２】
本発明において、ＢｐＵＧＴが触媒する反応は具体的には次式（１）で表される。【００１３】
【化１】
2006016395.tif 000002
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、赤色デイジー由来のＵＤＰ−グルクロニル基転移酵素（ＢｐＵＧＴ）およびその遺伝子が提供される。これによりフラボノイド化合物のグルクロニル化が可能となり，それらの化合物の安定化，吸収性の向上，生理活性の制御，活性体の徐放化など，これらの化合物の機能改善が実現する．また，遺伝子工学的手法による花色発現の安定化や色彩，色調の調節，代謝工学的制御に用いることができる有効な修飾手段を提供する．
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の具体的な実施の形態について説明する。
実施例1  グルクロニル基転移活性の測定方法
ＵＤＰ−グルクロン酸, トリフルオロ酢酸 (ＴＦＡ), アセトニトリル は ナカライテスク より購入した。リン酸二水素カリウムおよびリン酸水素二カリウムは大信化学より購入した。使用したアントシアニン基質は南九州大学園芸学部において単離、精製されたものを使用した。【００１６】
エッペンドルフチューブに反応液（0.5 mg/mLシアニジン3-O-6”-O-マロニルグルコシド） / 0.01%トリフルオロ酢酸・メタノール 5 μL, 0.5 mg/mL UDP-グルクロン酸水溶液 3 μL, 20mM リン酸カリウム緩衝液 pH 7.0, 最終液量 100μL）を調製した。反応液を ドライサーモユニットDTU-2B (TAITEC) にて30℃, 5 min 分間プレインキュベートした後、酵素標品を添加することで反応を開始した。同温度で 10 min 分間インキュベートした後、氷冷した0.5% トリフルオロ酢酸 水溶液 200μL を添加することにより反応を停止した。生成した反応生成物は逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC) を用いて分析した。なお酵素反応に使用する酵素標品量は、反応生成物量が基質の初期量の10%以下になるように調節した。【００１７】
反応生成物は逆相HPLC (DYNAMAX HPLC システム; UV-VIS 検出器，SHIMADZU SPD-10A VP; カラム，流量 0.7 mL/min; 検出波長，520 nm)を用いて定量した。分離条件は表１に示す通りである。3Gおよび3G5G 法 における溶媒は A液，0.5% トリフルオロ酢酸水溶液; B液, 0.5% トリフルオロ酢酸を含有する 50% アセトニトリル水溶液であり、Qu およびIsoF法の溶媒は A液，0.1% トリフルオロ酢酸水溶液; B液, 0.1% トリフルオロ酢酸を含有する90%アセトニトリル水溶液である。【００１８】
【表１】
2006016395.tif 000003
【００１９】
実施例2  デイジー花弁由来ＵＤＰ−グルクロニル基転移酵素の完全精製
ポリビニルポリピロリドン (PVPP), フェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF), 2-メルカプトエタノール (2-ME), 硫安, エチレンジアミン四酢酸 (EDTA), エチレングリコール, グリセロール, 2-[(3-コールアミドプロピル)-ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホン酸(CHAPS)、および塩化ナトリウムはナカライテスク からそれぞれ特級品を購入した。酵素精製用カラム発売元はその都度記載した。出発原料であるデイジー花弁は、市場に出回った期間（晩冬〜春）中に収集（開花直前〜開花後）、保存（−80℃）しておいたものを使用した。操作は全行程４℃にて行った。BpUGT 活性は シアニジン 3-O-6”-O-マロニルグルコシド とUDP-グルクロン酸を基質としたグルクロニル基転移活性により評価した。【００２０】
デイジー花弁500 g とPVPP 180 g および緩衝液 EX (100 mM リン酸カリウム緩衝液 pH 7.5, 10% グリセロール, 0.2% 2-ME, 5 mM EDTA, 0.5 mM PMSF) 2,000 mLを混合し、ワーリングブレンダー にて花弁を破砕ホモジェナイズし、ホオジェネート破砕液を遠心分離 (8000×g, 20分間) した。得られた上清を吸引ろ過（ワットマン 114 ろ紙）で清澄化し、粗酵素液として回収した。2000 g のデイジー花弁に対して同操作を繰り返し行い7000 mL の酵素標品を得た。【００２１】
粗酵素液7000 mL について硫安分画を行い30〜70% 画分の沈殿を回収した。得られた沈殿を緩衝液 EX 2,500 mL に溶解した。この溶液に終濃度0.3%となるようにポリエチレンイミンを添加し、10分間攪拌した後、遠心分離(8000×g, 20分間)した。 得られた上清を透析緩衝液 (40 mM リン酸カリウム緩衝液 pH 7.5, 0.2% 2-ME) で透析した。【００２２】
透析後の酵素標品全量を緩衝液QS1.A (40 mM リン酸カリウム緩衝液 pH 7.5, 0.2% 2-ME) で平衡化した Q Sepharose Fast Flow (300 mL, Amasham Amersham Bioscience, 5 cm×20 cm) に負荷(5 mL/min)して、緩衝液QS1.A でカラムを洗浄した。つづいて緩衝液 B (100 mM リン酸カリウム緩衝液 pH 7.5, 10% グリセロール, 0.2% 2-ME) によりカラムに結合したタンパク質を溶出し、1900 mL の酵素標品を得た。得られた標品を 20 mM リン酸カリウム緩衝液 pH 7.5, 0.2% 2-ME で透析した。【００２３】
透析した酵素標品全量を緩衝液QS2.A (20 mM リン酸カリウム緩衝液 pH 7.5, 0.2% 2-ME, 10%グリセロール) で平衡化したQ Sepharose Fast Flow 充填カラム(100 mL,φ2 cm×20 cm) に負荷(4 mL/min)して、緩衝液QS2.A でカラムを洗浄した。つづいて緩衝液QS2.B (200 mM リン酸カリウム緩衝液 pH 7.5, 10%グリセロール, 0.2% 2-ME) の0〜100%直線濃度勾配によりカラムに結合したタンパク質を溶出した。 活性画分を集め，135 mL の酵素標品を得た。これを限外ろ過法により25 mL まで濃縮した。【００２４】
得られた酵素標品全量に終濃度20%飽和の硫安を添加し、緩衝液PS.A (100 mM リン酸カリウム緩衝液 pH7.5, 20%飽和硫安, 0.2% 2-ME)で平衡化したPhenyl Sepharose low sub 充填カラム(15 mL Amersham Bioscience, HR16/10) に負荷(1 mL/min)した。緩衝液PS.Aでさらに100 mL 洗浄し、素通りした活性画分を回収した。【００２５】
緩衝液CHT.A (5 mM リン酸カリウム緩衝液 pH 7.5, 0.2% 2-ME)で平衡化したヒドロキシアパタイト(BioRad CHT-typeI)充填カラム(AmashamHR10/10，Amersham Bioscience)に酵素標品全量を負荷(1 mL/min)し、緩衝液CHT.A 100 mLでカラムを洗浄した。溶出は緩衝液CHT.A と 緩衝液CHT.B (300 mM リン酸カリウム緩衝液 pH 7.5, 0.2% 2-ME) の混合率を変化させ、10 mM から 100 mM まで10 mM 刻みの段階的溶出により行った。各段階では、それぞれ50 mLの緩衝液を用いた。40 mM および50 mM のリン酸カリウム緩衝液で溶出された活性画分を回収し、限外ろ過法により23 mLまで濃縮した。【００２６】
緩衝液MQ.A (20 mM リン酸カリウム緩衝液 pH 7.5, 10% glycerolグリセロール, 0.1%(w/v) CHAPS, 0.2% 2-ME) で平衡化したMono Q HR 10/10 (Amasham Amersham Bioscience) に得られた酵素標品全量を負荷（1 mL/min）し、緩衝液MQ.A でカラムを洗浄（50 mL）した。つづいて緩衝液MQ.B（300 mM リン酸カリウム緩衝液 pH 7.5, 10%グリセロール, 0.1%(w/v) CHAPS, 0.2% 2-ME）の 0〜100% 直線濃度勾配（350 min分間）によりカラムに結合したタンパク質を溶出した。【００２７】
Superdex 200 pg 26/60 (Amersham Bioscience) を 緩衝液SPD(20 mM KPB pH7.5, 0.15 M NaCl, 0.2% 2-ME, 0.1% CHAPS) で平衡化した後、 酵素標品全量を負荷(0.9 mL/min) し、引き続き 500 mL の 緩衝液SPD により分離を行った。活性画分を集め，セントリコン(YM10)を用いて 3 mL まで濃縮した。【００２８】
緩衝液RP.A (100 mM リン酸カリウム緩衝液 pH7.5, 20%飽和硫安, 0.2% 2-ME, 0.1%(w/v) CHAPS) で平衡化した RESOURCE PHE (Amasham Amersham Bioscience, 6 mL)に酵素標品全量を負荷(1 mL/min)し、緩衝液RP.A でカラムを洗浄（6 mL）した。素通りした活性画分を集め，セントリコンにより2 mLに濃縮した。【００２９】
SDS-PAGE は Laemmli の方法に準じて行い、分離用ゲルはアクリルアミド濃度10％のものを用いた。泳動は20 mA の定電流にて行った。【００３０】
Protein Assay Kit (BioRad) を用いてタンパク質を定量した。標準タンパク質として ウシ血清アルブミン (シグマ社) を使用した。【００３１】
得られた精製酵素標品のSDS-PAGEは54 kDaに相当する均一のタンパク質バンドを示し、本タンパク質バンドは各クロマトグラフィー後の画分におけるSDS-PAGEにおいて、その出現と消失がBpUGT活性のものと一致していたことから、赤色デイジーにおけるアントシアニンのグルクロニル化を担うBpUGT活性の本体であると考察した。
一般に哺乳動物由来グルクロニル基転移酵素は、小胞体に局在する膜タンパク質で、多量体を形成することが、これまでの研究で明らかになっており、植物由来グルクロニル基転移酵素についてもコガネバナ由来バイカレイン 7-O-グルクロニルトランスフェラーゼ などは二量体を形成する。しかし、本酵素については、その抽出の際に界面活性剤などのタンパク質可溶化試薬を必要とせず、水系溶媒で簡単に抽出できたことから、水溶性タンパク質であると考えられた。また、本タンパク質のゲル濾過カラムクロマトグラフィーにおいてはBpUGT活性が49 kDaに相当する位置に観測されたことから、本酵素は分子質量54 kDa の単量体タンパク質であることが示唆された。【００３２】
実施例3  ＢｐＵＧＴの遺伝子クローニング
液体窒素中で破砕したデイジー花弁からStraight A’s mRNA Isolation System (Novagen) を用いてpoly(A)+-RNA を得た。得られたpoly(A)+ RNAを鋳型とし、ZAP-cDNA Synthesis Kit（STRATAGENE）を用いて二本鎖cDNAライブラリーを作製した。得られた二本鎖cDNAをSizeSep 400 Spin Columns (Amersham Pharmacia Biotech) を用いて精製した後、ZAP-cDNA Synthesis Kitの処方に従ってUni-ZAP XR insertion vectorへクローニングした。これをGigapack III Gold Cloning Kit (STRATAGENE) を用いてλファージにパッケージングし、デイジー花弁のcDNAファージライブラリーを構築した。【００３３】
得られた精製酵素標品のうち20 pmolの酵素をSDS-PAGEに供し、クマシーブルー染色後、目的のバンドを切り出した。これをリシルエンドペプチダーゼ で35℃，終夜 処理し、得られたBpUGT消化産物を逆相HPLCで分離しペプチドマッピングを行った。各ピークを分取し、アミノ酸シークエンサー(Procise 494 HT Protein Sequencing System) によるアミノ酸配列解析に供したところ、以下の表２に示すような３つの内部アミノ酸配列が判読できた。これらの配列のうち#1と#2を元に以下の表３に示すような３種類(F1, R1, R2)の縮重プライマーを作製した。 【００３４】
【表２】
2006016395.tif 000004
【００３５】
【表３】
2006016395.tif 000005
【００３６】
デイジー花弁から得られたpoly(A)+RNA を鋳型としてプライマーF1およびR1を用いたRT-PCRを行った。本実験はQIAGEN OneStep RT-PCR Kitを用いて行い、反応液組成はキットの処方に従った。反応条件は50℃, 30 分間; 94℃, 15分間; [94℃, 15 秒間;50℃, 15 秒間;72℃, 30秒間]×35 サイクル, 72℃, 10分間で行った。得られたPCR産物についてnested PCR（反応液組成：1st PCR product,100ng; ExTaq 緩衝液, 1×; dNTPs, 200 mM; プライマー F1, 1 μM; プライマー R2, 1 μM;ExTaq polymerase (TaKaRa), 2.5 U;反応条件94℃, 2分間; [94℃, 15 秒間;55℃, 15 秒間;72℃, 30秒間]×30 サイクル, 72℃, 7 分間）を行った。
増幅されたDNA断片を pCR2.1-TOPO ベクター (TOPO TA cloning Kit, Invitrogen) にTAクローニングし、DNAシークエンサー（BECKMAN COULTER CEQ 2000XL DNA Analysis System）によって塩基配列解析を行った。得られた塩基配列から推定されるアミノ酸配列を用いて相同性検索を行った結果、 得られた965 bp のPCR産物は既知のフラボノイド グリコシルトランスフェラーゼの遺伝子と最も高い相同性を示した。このことから、本部分cDNA断片がBpUGT遺伝子の一部である可能性が高いと判断した。この部分cDNA配列を鋳型にしてPCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Biochemicals) によりDIG(digoxigenin) 標識プローブを作製した。【００３７】
作製したDIG標識BpUGT 特異的プローブを用いたプラークハイブリダイゼーションによってcDNAライブラリーをスクリーニングした。デイジー花弁のcDNAファージライブラリーを 大腸菌 XL1-Blue MRF’ に感染させ、8枚のNZY 寒天培地 にそれぞれ約5万個のプラークを形成させた。得られたプラークのファージDNAを Hybond N (Amersham Pharmacia Biotech) に吸着させ、製造者の推奨する方法で処理した。ハイブリダイゼーションは上記DIG標識プローブ(100 ng/mL) を含むハイブリダイゼーションバッファー (30% ホルムアミド, 5xSSC, 0.02% SDS, 2% blocking reagent (Roche Diagnostics), 0.1% N-ラウロイルザルコシン) によって37℃において16 時間行った。洗浄液  (0.1×SSC, 0.1% SDS) でメンブレンを洗浄 (65℃, 15 分間×2) した後、DIG Labeling and Detection KIT (Roche Diagnostics) を用いて、製造者が推奨する方法にてポジティブプラークの検出を行ったところ、最終的に16個の陽性クローンが得られた。得られたポジティブクローンは STRATAGENE 社の推奨する方法 (in vivo excision) により、pBluescript SK(-) phagemid ベクターにサブクローニングした。これらについて塩基配列解析を行った結果、精製BpUGTから得られた部分アミノ酸配列をすべてコードする, 1317 bp のORF を持ったBpUGT cDNA を得た（配列番号１：図１）。【００３８】
本BpUGT遺伝子の推定アミノ酸配列（配列番号２：図２）には、グリコシルトランスフェラーゼスーパーファミリー(GT) に共通の保存配列が存在した。図２中、黒線は糖転移酵素の保存配列であり、糖ヌクレオチド認識部位と推定される。この保存配列は糖ヌクレオチドの結合部位であると考えられている。GT family に属する酵素はその立体構造などから大きくGT-AとGT-Bに分けられている。GT-AとGT-Bの最も大きな違いは糖ヌクレオチド結合部位と思われる保存配列の位置であり、GT-AではN末端側に、GT-BではC末端側に存在することが知られている。本酵素の保存配列は脊椎動物由来グルクロニル基転移酵素と同じくC末端側に存在し、また、本酵素の推定アミノ酸配列にはGT-Aに特徴的なN末端側のDXDモチーフも存在しなかったことから、GT-Bに属するものと推定した。【００３９】
これまでの研究でグリコシルトランスフェラーゼスーパーファミリーは73のファミリーに分類されている（James A. Campbell, Gideon J. Davies, Vincent Bulone and Bernard Henrissat.A classification of nucleotide-diphospho-sugar glycosyltransferases based on amino acid Sequence similarities. Biochem.J.326,929-942(1997)参照）(http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/index.html)。これらのファミリーは各酵素遺伝子の推定アミノ酸配列に基づいて分類されたものであり、同じファミリーに属する酵素は類似の立体構造を保持すると推定されている。本研究で単離されたBpUGT遺伝子と各familyに属する酵素遺伝子の推定アミノ酸配列を用いてそれらの系統樹を作製した結果、本酵素遺伝子はファミリー1 の酵素と同じ集団に属しており、このことから、BpUGTはファミリー1に分類されるものと考察した。これまでに植物から見つかっている、二次代謝産物の合成に関与する糖転移酵素、およびグルクロン酸抱合に関与する脊椎動物由来グルクロニル基転移酵素はすべてファミリー1に属している。しかし、本酵素と動物由来グルクロニル基転移酵素との相同性は低く、糖ヌクレオチド結合部位以外には有意な相同性が見られなかった。また、植物由来のアントシアニングリコシルトランスフェラーゼに対する類似性も15%〜40%程度であり、本酵素と最も類似性が高いザボン（文旦）由来フラボノイド1,2ラムノシルトランスフェラーゼとの間でも、類似性は40%程度であった。【００４０】
つぎに、ファミリー1に属する酵素遺伝子の推定アミノ酸配列をもとに進化系統樹を作製した結果、本酵素は哺乳動物由来グルクロニル基転移酵素と離れた位置に存在し、植物由来GTの集団に属していた（図３)。このことから本酵素が、既知の哺乳動物由来グルクロニル基転移酵素とは異なる進化によりグルクロニル基転移活性を獲得したものと考察した。
これまでの研究（Thomas Vogt and Patrik Jones. Glycosyltransferases in plant natural product Synthesis: characterization of a supergene family. Trends in Plant Science, 5, 380-386 (2000) 参照）で植物由来グリコシルトランスフェラーゼは大きく３つのクラスターが見いだされており、それぞれ次のような特徴を有している。クラスターIはフラボノールまたはアントシアニンの３位にグルコシル基を転移する酵素を多く含む。クラスターIIはアントシアニンの５位にグルコシル基を転移する酵素とその他の機能未知の酵素よりなる。クラスターIIIについてはその共通性は明らかとなっていないが、広い基質特異性を有し、部位特異的にグルコシル基を転移する酵素であると考えられている。各々のクラスター内での相同性は40〜50%程度で、クラスター間の相同性は20%程度である。BpUGT遺伝子はこれら３つのクラスターのいずれにも属さず、フラボノイド-ラムノシルトランスフェラーゼと近縁に位置していた。これら、BpUGTとラムノシルトランスフェラーゼが触媒する糖転移反応は、いずれもすでにフラボノイドのアグリコンに結合している糖残基に対し、新たな糖残基を付加するという性質を持っており、このタイプの酵素がさらに発見されれば新規なクラスターを形成する可能性がある。【００４１】
実施例4  ＢｐＵＧＴの酵母における異種発現系の構築
寒天，ガラクトース, グルコース, ポリエチレンイミン(PEI), グリセロール, アデニンサルフェート， ウラシル, 酢酸リチウム, EDTA, ポリエチレングリコール 3000および各種アミノ酸はナカライテスク からそれぞれ特級品を購入した。Yeast Nitrogen Base without amino acids，Bacto ペプトン、 および酵母エキスはDIFCOより購入した。制限酵素はTaKaRa もしくはNew England Biolabs より購入した。【００４２】
BpUGT cDNAの5’末端側にXhoI サイト，3’末端側にKpnI サイトを導入するプライマーXhoI-F，KpnI-Rをそれぞれ合成した。実施例３で得られたBpUGTのORFを持つpBluescript-BpUGT を鋳型にPCRを行った(反応液組成：pBluescript-BpUGT, 400 ng; pfu 緩衝液, 1×; dNTPs, 200 mM; プライマー XhoI-F, 1 μM;プライマー KpnI-R, 1 μM; pfu Turbo polymerase (TOYOBO), 2.5 U; 反応条件:96℃, 2分間ののち、[96℃, 45 秒間; 55℃, 45秒間; 72℃, 2分間]×30サイクル, 次いで72℃ 10分間)を行い、PCR産物を前述の方法で精製した。得られたDNAをZero Blunt TOPO PCR Cloning Kit for Sequencing (Invitrogen)をもちいて製造者の推奨する方法に従い、pCR4Blunt-TOPO vector へサブクローニングした。その結果、完全長BpUGTを挿入するプラスミド(pCR4-BpUGTxk)を得た。塩基配列解析により、BpUGT遺伝子に変異が生じていないことを確認した。
pCR4-BpUGTxkをXhoI および KpnI で完全消化し、生成した約1400 bpの断片を回収し、得られたDNA断片をサッカロマイセス  セレビジエ発現用ベクター pESC-TRP(STRATAGENE) のXhoI および KpnI サイトにサブクローニングした(pESC-TRP-BpUGT)。pESC-TRP-BpUGTを用いて大腸菌XL1-Blueを形質転換した。【００４３】
培養したpESC-TRP-BpUGT XL1-Blue より抽出したpESC-TRP-BpUGTを2 μg用いてpESC Yeast Epitope Tagging Vectors (STRATAGENE) の推奨する方法に従い、サッカロマイセス  セレビジエ YPH499株を形質転換した。【００４４】
得られた形質転換体をpESC Yeast Epitope Tagging Vectors (STRATAGENE) の推奨する方法で作製したSD Trp dropout 培地 50 mL で３日間振とう培養(30℃, 160 rpm) した。菌体濁度(OD600)が0.5になった時点で遠心分離(6,000×g, 15 分間)により集菌し、キットが推奨する方法で作製したSG dropout 培地0.1 mL で２回洗浄した。菌体をSG Trp dropout 培地50 mL で再懸濁し、懸濁液4 mLをSG Trp dropout 培地4 L に植菌し、本培養を行った(30℃, 160 rpm)。この条件で7日〜10日間培養し、OD600が1.4〜1.5になった時点で遠心分離(6,000×g, 15 分間) を用いて集菌した。菌体は-30℃で凍結保存した。
以下の操作は全行程4℃にて行った。菌体12.6 gに対し26 mLの破砕緩衝液 (100 mM リン酸カリウム緩衝液 pH 7.5, 10% グリセロール, 0.5% 2-ME, 5 mM EDTA, 0.5 mM PMSF, 0.1%(w/v) CHAPS) を加え、よく懸濁した。懸濁液にφ0.5 mmのガラスビーズを、ビーズが液面よりも上に来るところまで加えた。これをマルチビーズショッカー(安井器械)にセットし、菌体を破砕した(破砕条件：[2500 rpm, 1分間; 0 rpm, 1分間]×5回)。遠心分離(>1000×g, 1分間)によってビーズと抽出液を分離し、抽出液を再度遠心分離(10,000×g, 20分間)した。上清に対し、終濃度0.3% となるようにPEI を添加して、10分間ほど攪拌した後、遠心分離(10,000×g, 20分間)を行った。得られた上清を粗酵素液として回収した。すでに述べた方法により、粗酵素液にBpUGT活性が存在することを確認した。【００４５】
得られた粗酵素液全量を緩衝液QS3.A (20 mM リン酸カリウム緩衝液 pH 7.5, 0.2% 2-ME)で透析した後、緩衝液QS3.A で平衡化したQ Sepharose Fast Flow 充填カラム(30 mL,φ1 cm×30 cm) に負荷(1 mL/min)して、緩衝液QS3.A でカラムを洗浄した。つづいて緩衝液QS3.B (300 mM リン酸カリウム緩衝液 pH 7.5, 0.2% 2-ME) の0〜100%直線濃度勾配によりカラムに結合したタンパク質を溶出した。 活性画分を集め，140 mL の酵素標品を得た。これをAmicon Ultra-15 10,000 MWCO (MILLIPORE)を用いて12 mL まで濃縮した。【００４６】
実施例5  ＢｐＵＧＴ組み換え体反応生成物の特定
実施例1で述べた方法で酵素反応を行い、生成物をHPLC にて精製回収後、アスピレーターを用いてアセトニトリルを除去し、再度HPLCに負荷してメタノールで溶出した。得られたサンプルをエバポレーターで1 mLにまで濃縮し、得られたサンプルの一部をHPLC分析やFAB-MS解析に供して、BpUGT 組み換え体反応生成物の特定を行った。HPLC分析において、反応生成物と思われるピークの保持時間はデイジー花弁中の主色素と一致した。このことから、本酵素はシアニジン 3-O-6”-O-マロニルグルコシド の2”位にグルクロニル基を付加する反応を触媒するものと推定した。反応生成物と思われるピークを分取し、FAB-MSスペクトルによる構造解析を行った結果、シアニジン 3-O-(6”-O-マロニル-2”-O-グルクロニルグルコシド)の分子量である711 m/z にピークが見られたことから、今回単離した遺伝子の発現産物がBpUGT活性を有することが確認された。【００４７】
実施例6  ＢｐＵＧＴ遺伝子の発現解析
デイジーの各組織（花弁、筒状花、がく、くき、葉）を液体窒素中で摩砕し、RNeasy Miniprep Kit (QIAGEN)を用いてトータルRNA を得た。吸光度を測定し、トータルRNA の濃度と純度を決定した。【００４８】
増幅断片が150 bp以下になるように、BpUGT cDNA配列に特異的なプライマーを設計した。本プライマーは、QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit(QIAGEN)のマニュアルに記載された条件に沿うように設計した。 RT-PCR反応はQuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit(QIAGEN)を使用し、Light Cycler クイックシステム330(Roche)によりPCR産物の増幅をモニタした。検量線はpET32a-BpUGTを鋳型として使用し、各デイジー組織由来のトータルRNA をおのおの0.2μg を鋳型として使用した。PCR反応条件は(50℃, 20 分間; 95℃, 15 分間ののち，[94℃, 15 秒間; 55℃, 20秒間; 72℃, 10秒間]×35サイクル; 次いで95℃ 0秒間; 65℃, 15秒間)で行い、検量線はその都度作製した。
サイクル数を横軸，蛍光強度を縦軸して検量線を作製し、これを用いて各デイジー組織におけるBpUGT遺伝子転写産物のコピー数を求めた。【００４９】
各デイジー組織におけるBpUGT遺伝子の転写量(A)と比活性(B)を図４に示した。その結果、各デイジー組織における本酵素遺伝子の転写分布はBpUGT活性の分布とよく一致していた。このことは、本研究において得られたBpUGT遺伝子の発現産物が赤色デイジーにおけるBpUGT活性の本体であることを強く示唆する。また、本酵素遺伝子は着色の見られる花弁に特異的に発現していたことから、その生理的意義はアントシアニンのグルクロニル化に特化しているものと考えられる。【００５０】
実施例7  ＢｐＵＧＴのキャラクタリゼーションのための実験材料
酢酸, グリシン, 塩酸（HCl）,トリス (ヒドロキシメチル) アミノメタン (Tris), 水酸化カリウム (KOH), N-エチルマレイミド (NEM), ジエチルピロカーボネート (DEPC), 30%アンモニア水および各金属塩は ナカライテスク より特級品を購入した。UDP-グルコース，UDP-ガラクトース, ウリジン, UMP, UDP, UTP, β-エストラジオール, 17α-エストラジオール, 1-ナフトール, 2-ナフトール, 4-メチルウンベリフェロン, p-ニトロフェノール, およびヒトUDP-グルクロニルトランスフェラーゼ 1A1 (UGT1A1)は シグマ社 より購入した。TLCプレートはシリカゲル 60F254 (MERCK)を使用した。UDP-[U-14C]グルクロン酸は日本アイソトープ協会を通じて和光純薬工業より購入した。シアニジン 3-O-6”-O-マロニルグルコシドおよびUDP-グルクロン酸を基質としたグルクロニル基転移活性について、精製した酵素標品のキャラクタリゼーションを行った。【００５１】
実施例8  ＢｐＵＧＴの反応pH依存性とpH安定性
すでに述べた反応液中の緩衝液を変え、BpUGT 組み換え体の pH依存性を評価した。pH 4.0〜6.0 においては20mM 酢酸-NaOH 緩衝液を、pH 6.0〜7.5 においては20mM リン酸-KOH 緩衝液を用いた。pH 7.5〜9.0 においては20mM Tris-HCl 緩衝液，pH 9.0〜11.0 においては20mM グリシン-KOH 緩衝液を用いた。
酵素標品を上述した各pHの緩衝液で希釈し（10倍）し、20℃にて17 h インキュベートした。処理後の酵素標品の残存活性を実施例１で述べた方法によって測定し、BpUGT組み換え体のpH安定性を評価した。
図５に示すように、本酵素の反応至適pH は8.0であり（図５A）、pH 7において安定であった（図５B）。【００５２】
実施例９  基質特異性の解析（その1）
。本酵素の反応初速度を求め，両逆数プロット（1/v vs. 1/[S1]）から、シアニジン 3-O-6”-O-マロニルグルコシドやUDP-グルクロン酸に対するKmおよびVmax を算出した。またUDP-グルクロン酸に変えて、UDP-グルコース，UDP-ガラクトースを用いて酵素反応を行った。また、シアニジン 3-O-6”-O-マロニルグルコシドに代えてペラルゴニジン 3-O-6”-O-マロニルグルコシド,シアニジン3-O-グルコシド, デルフィニジン 3-O-グルコシド,シアニジン3-O-3”,6”-O-ジマロニルグルコシド, ペラルゴニジン 3,5-O-ジグルコシド，ペラルゴニジン3-O-6”-O-マロニルグルコシド-5-O-グルコシド,シアニジン, ゲニステイン 7-O-グルコシド, ダイゼイン 7-O-グルコシド, ゲニステイン 7-O-6”-O-マロニルグルコシド, ダイゼイン 7-O-6”-O-マロニルグルコシド，ゲニステイン,ダイゼイン, ケルセチン 3-O-グルコシド,ケルセチン3-O-6”-O-マロニルグルコシドを用いて酵素反応を行った。【００５３】
（1）糖残基供与体特異性
既知のグルクロニル基転移酵素の中には糖残基供与体としてUDP-グルクロン酸以外にUDP-グルコースなどの糖を基質にできるものも見つかっているが、多くはUDP-グルクロン酸を唯一の糖残基供与体とすることが知られている。本酵素の糖残基供与体の認識は既知の多くのグルクロニル基転移酵素と同様に UDP-グルクロン酸に非常に特異的であった。【００５４】
(2) 糖残基受容体特異性
シアニジン 3-O-6”-O-マロニルグルコシド に対するkcat は32.4 s-1であり、シアニジン3-O-6”-O-マロニルグルコシドに対するKmは19.4 μM, UDP-グルクロン酸に対するKmは455 μM であった。また、本酵素のVmaxは1,300 nmol/mg/s であり、これは既知の脊椎動物由来グルクロニル基転移酵素のVmaxよりも1,000倍以上大きい値である。本酵素はシアニジン3-O-6”-O-マロニルグルコシドに対してもっとも高い活性を示し（相対活性100％），次のアントシアニンにも有効な活性を示した: ペラルゴニジン 3-O-6”-O-マロニルグルコシド （相対活性86%）, シアニジン 3-O-グルコシド (31%)，デルフィニジン 3-O-グルコシド (14%).しかしながら,次のフラボノイド化合物はグルクロニル基受容体とはなりえなかった (相対活性, 0.1%未満): シアニジン 3-O-3”,6”-Oジマロニルグルコシド,ペラルゴニジン 3,5-O-ジグルコシド， ペラルゴニジン 3-O-6’’-O-マロニルグルコシド-5-O-グルコシド, ケルセチン 3-O-グルコシド, ケルセチン 3-O-6’’-O-マロニルグルコシド,ダイジン,ゲニスチン,ダイゼインやゲニステインの7-O-6’’-O-マロニルグルコシド,シアニジン，ケルセチン，ダイゼイン，ゲニステイン.  p-ニトロフェニル β-D-グルコシド も基質にはなりえなかった。【００５５】
実施例１０  基質特異性の解析（その2）
BpUGTと既知の脊椎動物由来グルクロニル基転移酵素の基質特異性を比較するため，ヒト肝臓由来UGT1A1の良好な基質である次式の化合物に対するBpUGTのグルクロニル基転移活性の有無を調べた．以下に記述する放射性同位体を用いたグルクロニル基転移酵素活性の検出は、主にBansal らの手法（Surendra K. Bansal and T. Gessner. A unified method for the assay of uridine diphosphoglucuronyltransferase activities toward various aglycondes using uridine diphospho[u-14c]glucuronic acid. Analytical Biochemistry, 109, 321-329(1980)）に基づくものである。【００５６】
糖残基受容体としてβ-エストラジオール, 17α-エストラジオール, 1-ナフトール, 2-ナフトール, 4-メチルウンベリフェロン, p-ニトロフェノールを用いた。なお１Uの定義は37℃，1 分間の反応で1 nmol のグルクロニル基転移を触媒できる量とする。
UDP-[U-14C]グルクロン酸(0.02 μCi/μL, 225 mCi/mmol) 5 μLと終濃度3 mMの各糖残基受容体を20 mM Tris-maleate 緩衝液 pH7.4 に添加した(全体積 20 μL)。UGT1A1( 5 mg タンパク質 / mL) 10 μL，(0.034U当量)を各チューブに添加し、反応を開始した。反応は30℃, 30 分間 行い、100%エタノール100 μLを添加することで反応を停止した。
同様の組成の反応液にUGT1A1 10 μL に変えて、天然型BpUGT (0.12 mg/mL) 2 μL (0.093 U当量)を添加し、20 mM Tris-マレイン酸 緩衝液 pH7.4 で全体積が30 μL となるよう調節した。この反応液を(1)と同様に30℃, 30 分間 反応させ、100% エタノール100 μLを添加することで反応を停止した。【００５７】
得られた反応液のうち各々50 μL をTLCにスポットした。分離はn-ブタノール:アセトン:酢酸:30%アンモニア水:水(70:50:18:1.5:60) を展開溶媒として用いて行った。展開した反応生成物のスポットは14Cの放射線をモレキュラーイメージャー(BioRad, GS525)により検出することで観察した。【００５８】
その結果、ヒトUGT1A1についてはこれらのすべての基質に対するグルクロニル基転移活性が確認できたが、BpUGTについては活性が検出されなかった（図６）。このことから本酵素の生理的役割は、既知の脊椎動物由来グルクロニル基転移酵素のような解毒に関与するものではないと考察した。なお、脊椎動物由来のグルクロニル基転移酵素の中にはアントシアニンなどのフラボノイドに対し、グルクロニル基転移活性を示すものが存在し、UGT1A1もフラボノイドのアグリコンに対し活性を示すことが知られている（C. D. King, G.R. Rios,M. D. Green, and T. R. Tephly. UDP-Glucuronosyltransferases. Current Drug Metabolism, 1,143-161 (2000)、およびE. J. Oliveira, D. G. Watson. In vitro glucuronidation of kaempferol and quercetin by human UGT-1A9 microsomes. FEBS Letters, 471, 1-6 (2000) 参照）。そこで、UGT1A1のシアニジン 3-O-グルコシド, およびシアニジン 3-O-6”-O-マロニルグルコシド に対する活性を調べたがこれらに対する活性は検出されなかった。【００５９】
実施例１１  阻害剤の検討
酵素標品を、終濃度 5 mM NEMおよび1 mM DEPCを含む緩衝液で希釈（20倍）し、20℃で20 分間 インキュベートした。また、コントロールとして、酵素標品をNEMを含まない緩衝液で同様に処理した。処理後の各酵素標品の残存活性を測定し、コントロールと比較することで、SH基に特異的なアルキル化試薬であるNEMの影響を調べた。また0.1 mM の各種2価金属イオンを含むアッセイ系で酵素活性を測定し、金属イオンを含まない同条件のアッセイ系での酵素活性と比較することにより、マロニル基転移活性に対する各金属イオンの影響を調べた。さらに1 mM の ウリジン, UMP, UDP, UTP を含むアッセイ系でも酵素活性を測定し、これらを含まない同条件のアッセイ系での酵素活性と比較することにより、BpUGTの生成物阻害を調べた。なおこれらの阻害剤の影響を評価するアッセイ系では、反応液の緩衝液として 20 mM リン酸カリウム緩衝液 pH 7.0 を用いた。【００６０】
その結果，ウリジンでは全く阻害が見られなかったが、リン酸基の増加に伴い阻害の程度が大きくなり、本酵素活性はUDPに最も強く阻害された。このことからリン酸基が糖残基供与体の認識に関与している可能性が示唆された。【００６１】
また、本酵素はシアニジン 3-O-6”-O-マロニルグルコシドの一部であるマロン酸やグルコースによる阻害を受けなかった。【００６２】
また、ファミリー1に属する酵素の配列比較からヒスチジン残基が重要高度に保存されていることが見いだされており、触媒活性に重要な役割を果たしていると推測されているが、本酵素においてはヒスチジン残基の修飾試薬であるDEPCによる触媒活性の阻害は見られなかった。また、本酵素はシステイン残基に特異的なアルキル化剤であるNEMによって完全に失活した。【００６３】
本酵素に対する各種金属イオンによる影響を調べた。既知の脊椎動物由来グルクロニル基転移酵素は触媒活性に二価金属イオン(Mg2+, Mn2+)を要求する（井柳  堯  生化学  第７５巻  第３号, ２３４-２４１,２００３、およびChristopher D. King, Mitchell D. Green, Gladys R. Rios, Birgit L. Coffman, Ida S. Owens, Warren P. Bishop, and Thomas R. Tephly.  The glucuronidation of exogenous and endogenous compounds by stably expressed rat and human UDP-glucuronosyltransferase 1.1. Archives of Biochemistry and Biophysics, 332, 92-100 (1996)）。しかしながら本酵素はその触媒活性にこれらの補因子を必要とせず、金属イオンによる活性の阻害は観察されたものの，活性化は観察されなかった。また、本酵素を5 mM EDTA で20分間処理した場合にも本酵素の活性に影響が見られなかったことから、本酵素はその触媒活性に金属イオンを必要としないことが示唆された。また、Hg2+,および Cu2+  の存在下では活性が検出されなくなったが、近年の報告にアントシアニンがHg2+ もしくは Cu2+  と金属錯体を形成して沈殿し、 無色化するという報告もあることから、これらの金属イオンは酵素に作用したものではなくアントシアニン基質に作用した可能性もある。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】本発明に係る酵素遺伝子の塩基配列（配列番号１）である。配列の最初の下線は翻訳開始コドン，最後の下線は翻訳終止コドンを示す。
【図２】本発明に係る酵素のアミノ酸配列（配列番号２）である。下線はグリコシルトランスフェラーゼファミリー１に保存されている配列を示す。
【図３】グリコシルトランスフェラーゼファミリー１の系統樹である。図のI, II, IIIは植物のグリコシルトランスフェラーゼファミリー１のクラスター（群）を示す。なお、図３における各酵素のGeneBank accession numberは次の通りである。  Tobacco Is10a, U32643; Tobacco Is5a, U32644; tomato Twi1, X85138; Dorotheanthus 5GT, Y18871;Scutellaria 7GT, BAA83484; petunia RhamT, Z25802;Perilla 5GT1 , AB013596; Perilla 5GT2, AB013597; Verbena 5GT ,BAA36423; Petunia 5GT, 027455; Barley 3GT,X15694; Maize 3GT, X13501; Grape 3GT, AF000371; Perilla 3GT, AB002818; Gentiana 3GT, D85186; Petunia 3GT, AB027454; Ipomea 3GT, AF028237; citrus RhamT, AY048882.1; Eggplant 3GT, X77369; Gentiana 3’GT, BAC54092; Nierembergia RhamT, AB078511.1; UGT1A1, P22309; UGT1A3, P33503; UGT1A6, P19224; UGT2A1, CAB41974.1; UGT2B7, P16662; UGT2B10, P36537; UGT2B15, A48633
【図４】ＢｐＵＧＴ遺伝子の転写量と活性の比較を示す図である。
【図５】ＢｐＵＧＴのｐＨ依存性とｐＨ安定性を示す図である。図５(A)はBpUGTのpH依存性(30℃, 20 分間)を示し、図５(B)はpH安定性(20℃, 12 時間処理)を示している。また、各プロットは、◆:20 mM 酢酸-NaOH; ■: 20 mM リン酸-KOH; ▲: 20 mM Tris-HCl; ×: 20 mM glycine-KOHである。
【図６】糖残基供与体に対する特異性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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