(57)【要約】生体内でのエネルギー代謝に関与する、配列番号２、４もしくは６に記載のアミノ酸配列からなる新規タンパク質：ＰＧＣ１αｂ、配列番号３３、３４もしくは３５に記載の塩基配列等からなる当該ＰＧＣ１αｂのプロモーター、及びこれらを用いる糖代謝異常を伴う疾患の治療剤の探索方法等を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質；
（ａ）配列番号２、４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２、４又は６に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、Ｎ末端に配列番号８に記載のアミノ酸配列を含有し、かつミトコンドリア活性化能力を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｎ末端に配列番号８に記載のアミノ酸配列を含有し、かつミトコンドリア活性化能力を有するタンパク質、
（ｄ）配列番号１、３又は５に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、Ｎ末端に配列番号８に記載のアミノ酸配列を含有し、かつミトコンドリア活性化能力を有するタンパク質、
（ｅ）配列番号１、３又は５に記載の塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、Ｎ末端に配列番号８に記載のアミノ酸配列を含有し、かつミトコンドリア活性化能力を有するタンパク質、
（ｆ）配列番号１、３又は５に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、Ｎ末端に配列番号８に記載のアミノ酸配列を含有し、かつミトコンドリア活性化能力を有する蛋白質のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む遺伝子。
【請求項３】
請求項２に記載の遺伝子を特異的に認識するポリヌクレオチド、またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなるプライマー又はプローブ。
【請求項４】
請求項１に記載のタンパク質を特異的に認識する抗体。
【請求項５】
以下の（ｇ）〜（ｉ）のいずれかに記載される遺伝子を含むことを特徴とする請求項１に記載のタンパク質の発現を制御し得るプロモーター；
（ｇ）配列番号３３、３４または３５で示される塩基配列からなる遺伝子、
（ｈ）配列番号３３、３４または３５で示される塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ転写制御能力を有する遺伝子、
（ｉ）配列番号３３、３４または３５で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつ転写制御能力を有する遺伝子。
【請求項６】
請求項２に記載の遺伝子を含有することを特徴とする発現ベクター。
【請求項７】
請求項５に記載のプロモーターを含有することを特徴とする発現ベクター。
【請求項８】
更に、プロモーターの下流（３’側）に当該プロモーターによって転写が制御される遺伝子をコードする塩基配列を含有することを特徴とする請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項９】
遺伝子が、請求項２に記載の遺伝子である、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれかに記載の発現ベクターが導入されてなる形質転換細胞。
【請求項１１】
下記の工程（１）、（２）及び（３）を含むＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現制御能力の評価方法：
（１）被験物質とＰＧＣ１αｂ遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（２）被験物質を接触させた細胞のＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現量を測定し、該発現量を、被験物質を接触させない対照細胞の上記遺伝子の発現量と比較する工程、
（３）（２）の比較結果に基づいて、ＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現量を変動させるか否かを指標として被験物質のＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現制御能力を評価する工程。
【請求項１２】
下記の工程（１）、（２）及び（３）を含むＰＧＣ１αｂの発現制御能力の評価方法：
（１）被験物質とＰＧＣ１αｂを発現可能な細胞とを接触させる工程、
（２）被験物質を接触させた細胞のＰＧＣ１αｂの発現量を測定し、該発現量を、被験物質を接触させない対照細胞のＰＧＣ１αｂの発現量と比較する工程、
（３）（２）の比較結果に基づいて、ＰＧＣ１αｂの発現量を変動させるか否かを指標として被験物質のＰＧＣ１αｂの発現制御能力を評価する工程。
【請求項１３】
下記の工程（１）〜（３）を含む、ＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現制御能力の評価方法：
（１）被験物質と、請求項５に記載のプロモーターを結合されてなるレポーター遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（２）被験物質を接触させた細胞の前記レポーター遺伝子の発現量を測定し、該発現量を、被験物質を接触させない対照細胞の前記レポーター遺伝子の発現量と比較する工程、及び
（３）（２）の比較結果に基づいて、前記レポーター遺伝子の発現量を変動させるか否かを指標として被験物質のＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現制御能力を評価する工程。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれかに記載の評価方法で評価された被験物質のＰＧＣ１αｂ遺伝子もしくはＰＧＣ１αｂの発現制御能力を指標として、ＰＧＣ１αｂ遺伝子もしくはＰＧＣ１αｂの発現誘導活性を有する物質又はＰＧＣ１αｂの発現抑制活性を有する物質を選別することを特徴とする、ＰＧＣ１αｂの発現制御物質の探索方法。
【請求項１５】
請求項１１〜１３のいずれかに記載の評価方法で評価された被験物質のＰＧＣ１αｂ遺伝子もしくはＰＧＣ１αｂの発現制御能力を指標として、ＰＧＣ１αｂ遺伝子もしくはＰＧＣ１αｂの発現誘導活性を有する候補物質を選別することを特徴とする、糖代謝改善剤の探索方法。
【請求項１６】
糖代謝異常を伴う疾患の予防、改善又は治療剤の、候補物質の探索のために行われることを特徴とする、請求項１５に記載の探索方法。
【請求項１７】
インスリン抵抗性疾患の予防、改善または治療剤の、候補物質の探索のために行われることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の探索方法。
【請求項１８】
更に、被験物質がＰＧＣ１αａ遺伝子もしくはＰＧＣ１αａの発現を変動させないことを指標として化合物を選別することを特徴とする、請求項１５〜１７のいずれかに記載の探索方法。
【請求項１９】
請求項１５〜１８のいずれかに記載の探索方法により選別される化合物を有効成分として含有する、糖代謝改善剤。
【請求項２０】
請求項１５〜１８のいずれかに記載の探索方法により選別される化合物を有効成分として含有する、インスリン抵抗性疾患の予防、改善又は治療剤。
【請求項２１】
ＰＧＣ１αｂもしくはＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現誘導物質を有効成分として含有する、糖代謝改善剤。
【請求項２２】
ＰＧＣ１αｂもしくはＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現誘導物質を有効成分として含有する、インスリン抵抗性改善剤。
【請求項２３】
ＰＧＣ１αａもしくはＰＧＣ１αａ遺伝子の発現を変動させないことを特徴とする、請求項２１又は請求項２２に記載の改善剤。
【請求項２４】
生体において筋肉細胞に特異的に作用することを特徴とする、請求項２３に記載の改善剤。
【請求項２５】
以下の（１）及び（２）の工程を有することを特徴とする、請求項５に記載のプロモーターと結合する物質の探索方法；
（１）請求項５に記載のプロモーターと被験物質とを接触させる工程、及び
（２）前記（１）の工程後に、当該プロモーターと被験物質との複合体生成の有無を調べる工程。
【請求項２６】
請求項５に記載のプロモーターと結合する物質の精製方法であって、
（１）請求項５記載のプロモーターと試料とを接触させて、当該プロモーターと当該試料中に含有される当該プロモーターと結合する物質との複合体を生成させる工程、及び、
（２）前記（１）の工程後、生成させた複合体から当該結合物質を単離する工程、を有することを特徴とする精製方法。
【請求項２７】
配列番号８に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド。
【請求項２８】
配列番号５３〜５５のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有する請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
請求項２７又は２８に記載のポリペプチドを特異的に認識することを特徴とする、請求項４に記載の抗体。
【請求項３０】
請求項２７又は２８に記載のポリペプチドをコードする遺伝子。
【請求項３１】
配列番号：７に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
【請求項３２】
配列番号５０〜５２のいずれかに記載の塩基配列を含有する請求項３１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３３】
請求項３１もしくは請求項３２に記載のポリヌクレオチド、又はそれに相補的なポリヌクレオチドのうち、少なくとも５以上の連続する塩基配列を含むことを特徴とする、請求項３に記載のプライマー又はプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、生体内でのエネルギー代謝に関与する新規遺伝子：ＰＧＣ１αｂ、そのプロモーター、及びこれらを用いる糖代謝異常を伴う疾患の治療剤の探索方法等に関する。
【背景技術】  ホメオスタシス（恒常性）の維持は、生体にとって基本となる制御機能であり、特にエネルギーの摂取と消費のバランスの維持は生体機能を維持するために必須である。このエネルギーバランスの調節が崩れると、生体は代謝異常を伴う疾患、例えば、肥満症、糖尿病又は高脂血症などを引き起こす。すなわち、エネルギー代謝異常は、高血圧症、動脈硬化症、糖尿病などのいわゆる生活習慣病の原因となっていると考えられている。
糖・脂質代謝の調節で、最も重要な役割を果たしているのはインスリンである。インスリンは糖、脂質、蛋白質の代謝作用の他、細胞増殖、細胞骨格の制御、筋肉もしくは肝臓細胞の分化、転写調節、アポトーシスの抑制と多岐にわたる生理作用を有するホルモンである。生体内でのエネルギー代謝において、エネルギー代謝がインスリンによって制御されており、肝臓、筋肉もしくは脂肪といった組織の果たす役割は大きい。
インスリン作用不全はインスリン抵抗性と呼ばれ、インスリンの分泌不全と共に代謝異常を引き起こす大きな要因と考えられている。すなわち、インスリン抵抗性とは、「細胞、臓器、個体レベルでインスリンの各種の作用のために、通常量以上のインスリンを必要とする状態」と定義される。インスリン抵抗性を伴う疾患として２型糖尿病が挙げられるが、近年、糖尿病や耐糖能障害だけではなく、高血圧、高脂血症、肥満など多くの病態でインスリン抵抗性が認められることが明らかとなってきている。従って、インスリン抵抗性は各々の病態に密接に関連しているだけでなく、相互の合併症を引き起し易く、その結果、相乗的に動脈硬化症等を発症・進展させることとなる。
ところで、２型糖尿病において、空腹時と糖摂取時ではインスリン抵抗性の責任臓器、組織が異なっていると考えられている。すなわち、空腹時には血中インスリン濃度や血糖値が正常人よりも高値にもかかわらず、肝臓での糖新生が増加することから肝臓におけるインスリン抵抗性を改善することが重要となる。一方、糖摂取時、すなわち血中インスリン濃度上昇時のインスリン抵抗性においては骨格筋での糖取り込みの低下及び肝臓での糖産生抑制の障害を改善することが重要である。
従って、骨格筋におけるインスリンの機能、すなわち糖取り込み、グリコーゲン合成等の同化作用、運動に伴う解糖によるエネルギー供給、体温維持のための熱産生作用を改善することがインスリン抵抗性に伴う症状の改善に重要である。事実Ｄｅ  Ｆｒｏｎｚｏらは、２型糖尿病においては末梢組織（骨格筋）でのインスリンを介した糖取り込みの低下が問題であると指摘している（非特許文献１を参照）。しかしながら、骨格筋におけるインスリンの機能を選択的に改善する薬剤は見出されていない。
最近になって、熱産生作用の制御に関与する新たな因子として、マウス由来のＰＰＡＲγの転写コアクチベーター：ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ−１α（ＰＧＣ１α）が見出された（非特許文献２を参照）。ＰＧＣ１αは核内受容体ＰＰＡＲγと相互作用し、その転写活性を補助する因子としてクローニングされた因子で、白色脂肪細胞を褐色脂肪細胞に形質転換することが知られている（特許文献１を参照）。また、熱産生作用に関わる一連のタンパク質（ＵＣＰ１、ミトコンドリア酵素など）の合成やミトコンドリアの増殖にＰＧＣ１αが重要な調節作用を営んでいることが明らかにされた（非特許文献３を参照）。
例えば、筋肉細胞においてＰＧＣ１αは、ミトコンドリアにおいてエネルギー消費を起こすと考えられているＵＣＰ２の発現を誘導する。また、ＰＧＣ１αを強制発現させることによって、ミトコンドリアのゲノム複製や転写反応に重要な役割を示す転写因子：ｍｔＴＦＡ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ａ）の発現が誘導され、細胞内の酸素消費量や細胞内のミトコンドリア数が増加することも明らかとなった（非特許文献４を参照）。また、ＰＧＣ１αは筋肉細胞において、糖輸送蛋白質であるＧＬＵＴ４の発現を誘導し、糖輸送を増大させることも報告されている（非特許文献５を参照）。更に、骨格筋ミトコンドリア機能不全とインスリン抵抗性との関係についての報告が相次ぎ、骨格筋におけるＰＧＣ１αとの関係が示唆されている（非特許文献６〜８を参照）。
また、ＰＧＣ１αの発現促進活性を指標として、ミトコンドリア活性化を作用機序とする抗肥満・抗糖尿病薬をスクリーニングする方法が知られている（特許文献２を参照）。
しかしながら、ＰＧＣ１αは、肝臓においては糖新生系遺伝子の誘導機構に関与している。すなわち、ＰＧＣ１αは糖新生系遺伝子を誘導するグルココルチコイドやグルカゴンの細胞内セカンドメッセンジャーであるｃＡＭＰによって発現が誘導され、グルココルチコイド受容体やＨＮＦ４αの転写活性を刺激することにより、糖新生系遺伝子の発現を誘導することが報告されている（非特許文献９及び１０を参照）。従って、ＰＧＣ１αの機能亢進は肝臓においては糖新生作用を促進し、インスリン抵抗性を伴う疾患等においては好ましくない。
これまでに、骨格筋における熱産生作用等のインスリンの機能を選択的に改善する方法は知られていなかった。
【特許文献１】特表２００２−５３１０７９号公報
【特許文献２】国際公開パンフレット第０１／０９０３５６号
【非特許文献１】ＤｅＦｒｏｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７６，１４９−１５５（１９８５）．
【非特許文献２】Ｃｅｌｌ，９２，８２９−８３８（１９９８）．
【非特許文献３】Ｌｏｗｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０４，６５２−６６０（２０００）．
【非特許文献４】Ｃｅｌｌ，９８，１１５−１２４（１９９９）．
【非特許文献５】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｍ．Ｓｏｃ．，９８，３８２０−３８２５（２００１）．
【非特許文献６】Ｍｏｏｔｈａ，Ｖ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３４：２６７−２７３．（２００３）．
【非特許文献７】Ｐａｔｔｉ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１００：８４６６−８４７１．（２００３）．
【非特許文献８】Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｋ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３００：１１４０−１１４２．（２００３）．
【非特許文献９】Ｙｏｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１３，１３１−１３８（２００１）．
【非特許文献１０】Ｈｅｒｚｉｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１３，１７９−１８３（２００１）．
【発明の開示】
本発明が解決しようとする課題は、糖代謝改善剤、すなわち、生体内でのエネルギー代謝に重要な役割を果たしているＰＧＣ１αの新規バリアント：ＰＧＣ１αｂ、そのプロモーター、これらを利用した、骨格筋における熱産生作用等の改善により、インスリン抵抗性時の骨格筋の機能を改善する糖代謝改善剤の探索方法、及びＰＧＣ１αｂの発現を促進する物質を有効成分とする医薬（特にミトコンドリア活性化を作用機序とする抗肥満・抗糖尿病薬）等を提供することにある。
発明者らは、鋭意検討を行った結果、ＰＧＣ１αの新規なバリアントである、ＰＧＣ１αｂを見出した。次いで、ＰＧＣ１αｂの組織分布を調べたところ、驚くべきことに当該ＰＧＣ１αｂは肝臓等の組織ではほとんど発現せず、骨格筋で特異的に発現していることがわかった。更に、ＰＧＣ１αｂは、骨格筋において運動によるエネルギー消費、熱産生の条件下で誘導された。上記のことから、ＰＧＣ１αｂは骨格筋特異的に熱産生などのエネルギー代謝を促進することがわかった。インスリン抵抗性の患者においては、運動によってエネルギー代謝を促進する運動療法が有効であることが知られていることから、ＰＧＣ１αｂは、インスリン抵抗性患者における骨格筋の熱産生亢進によるインスリン抵抗性治療のターゲット因子となり得る。すなわち、ＰＧＣ１αｂの発現もしくは活性を促進する物質は、インスリン抵抗性など疾患の予防、改善又は治療剤となり得る。また、骨格筋におけるエネルギー代謝を促進することにより、糖代謝などのエネルギー代謝異常を伴う疾患、例えば、肥満症、糖尿病、高脂血症、又は動脈硬化症などのいわゆる生活習慣病の改善剤ともなり得る。
次いで発明者らは、ヒトゲノムＤＮＡより約３ｋｂからなるプロモーター活性を有する領域を単離することに成功した。本プロモーター領域中に約１．３ｋｂからなるプロモーター活性を示すために必須となる領域を同定した。また、マウスゲノムＤＮＡより約３ｋｂからなるプロモーター活性を有する領域を単離することに成功した。さらに単離したプロモーターＤＮＡを用いることにより、ＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現制御能力の評価方法、該評価方法にて該プロモーター活性を促進する物質を選別することを特徴とする、糖代謝改善剤等の探索方法を見出した。
本発明は上記の知見をもとに完成するに至ったものである。
尚、以下、本明細書、要約書及び特許請求の範囲においては、前述の、本発明以前に知られていたＰＧＣ１αを本発明遺伝子と区別するために、ＰＧＣ１αａと呼ぶこととする。
即ち本発明は、
〔１〕  以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質；
（ａ）配列番号２、４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２、４又は６に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、Ｎ末端に配列番号８に記載のアミノ酸配列を含有し、かつミトコンドリア活性化能力を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｎ末端に配列番号８に記載のアミノ酸配列を含有し、かつミトコンドリア活性化能力を有するタンパク質、
（ｄ）配列番号１、３又は５に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、Ｎ末端に配列番号８に記載のアミノ酸配列を含有し、かつミトコンドリア活性化能力を有するタンパク質、
（ｅ）配列番号１、３又は５に記載の塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、Ｎ末端に配列番号８に記載のアミノ酸配列を含有し、かつミトコンドリア活性化能力を有するタンパク質、
（ｆ）配列番号１、３又は５に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、Ｎ末端に配列番号８に記載のアミノ酸配列を含有し、かつミトコンドリア活性化能力を有する蛋白質のアミノ酸配列からなるタンパク質；
〔２〕  〔１〕に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む遺伝子；
〔３〕  〔２〕に記載の遺伝子を特異的に認識するポリヌクレオチド、またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなるプライマー又はプローブ；
〔４］  〔１〕に記載のタンパク質を特異的に認識する抗体。
〔５〕  以下の（ｇ）〜（ｉ）のいずれかに記載される遺伝子を含むことを特徴とする〔１〕に記載のタンパク質の発現を制御し得るプロモーター；
（ｇ）配列番号３３、３４または３５で示される塩基配列からなる遺伝子、
（ｈ）配列番号３３、３４または３５で示される塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ転写制御能力を有する遺伝子、
（ｉ）配列番号３３、３４または３５で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつ転写制御能力を有する遺伝子；
〔６〕  〔２〕に記載の遺伝子を含有することを特徴とする発現ベクター；
〔７〕  〔５〕に記載のプロモーターを含有することを特徴とする発現ベクター；
〔８〕  更に、プロモーターの下流（３’側）に当該プロモーターによって転写が制御される遺伝子をコードする塩基配列を含有することを特徴とする〔７〕に記載の発現ベクター；
〔９〕  遺伝子が、〔２〕に記載の遺伝子である、〔８〕に記載の発現ベクター；
〔１０〕  〔６〕〜〔９〕のいずれかに記載の発現ベクターが導入されてなる形質転換細胞；
〔１１〕  下記の工程（１）、（２）及び（３）を含むＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現制御能力の評価方法：
（１）被験物質とＰＧＣ１αｂ遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（２）被験物質を接触させた細胞のＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現量を測定し、該発現量を、被験物質を接触させない対照細胞の上記遺伝子の発現量と比較する工程、
（３）（２）の比較結果に基づいて、ＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現量を変動させるか否かを指標として被験物質のＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現制御能力を評価する工程；
〔１２〕  下記の工程（１）、（２）及び（３）を含むＰＧＣ１αｂの発現制御能力の評価方法：
（１）被験物質とＰＧＣ１αｂを発現可能な細胞とを接触させる工程、
（２）被験物質を接触させた細胞のＰＧＣ１αｂの発現量を測定し、該発現量を、被験物質を接触させない対照細胞のＰＧＣ１αｂの発現量と比較する工程、
（３）（２）の比較結果に基づいて、ＰＧＣ１αｂの発現量を変動させるか否かを指標として被験物質のＰＧＣ１αｂの発現制御能力を評価する工程；
〔１３〕  下記の工程（１）〜（３）を含む、ＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現制御能力の評価方法：
（１）被験物質と、〔５〕に記載のプロモーターを結合されてなるレポーター遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（２）被験物質を接触させた細胞の前記レポーター遺伝子の発現量を測定し、該発現量を、被験物質を接触させない対照細胞の前記レポーター遺伝子の発現量と比較する工程、及び
（３）（２）の比較結果に基づいて、前記レポーター遺伝子の発現量を変動させるか否かを指標として被験物質のＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現制御能力を評価する工程；
〔１４〕  〔１１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の評価方法で評価された被験物質のＰＧＣ１αｂ遺伝子もしくはＰＧＣ１αｂの発現制御能力を指標として、ＰＧＣ１αｂ遺伝子もしくはＰＧＣ１αｂの発現誘導活性を有する物質又はＰＧＣ１αｂの発現抑制活性を有する物質を選別することを特徴とする、ＰＧＣ１αｂの発現制御物質の探索方法；
〔１５〕  〔１１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の評価方法で評価された被験物質のＰＧＣ１αｂ遺伝子もしくはＰＧＣ１αｂの発現制御能力を指標として、ＰＧＣ１αｂ遺伝子もしくはＰＧＣ１αｂの発現誘導活性を有する候補物質を選別することを特徴とする、糖代謝改善剤の探索方法；
〔１６〕  糖代謝異常を伴う疾患の予防、改善又は治療剤の、候補物質の探索のために行われることを特徴とする、〔１５〕に記載の探索方法；
〔１７〕  インスリン抵抗性疾患の予防、改善または治療剤の、候補物質の探索のために行われることを特徴とする、〔１５〕又は〔１６〕に記載の探索方法；
〔１８〕  更に、被験物質がＰＧＣ１αａ遺伝子もしくはＰＧＣ１αａの発現を変動させないことを指標として化合物を選別することを特徴とする、〔１５〕〜〔１７〕のいずれかに記載の探索方法；
〔１９〕  〔１５〕〜〔１８〕のいずれかに記載の探索方法により選別される化合物を有効成分として含有する、糖代謝改善剤；
〔２０〕  〔１５〕〜〔１８〕のいずれかに記載の探索方法により選別される化合物を有効成分として含有する、インスリン抵抗性疾患の予防、改善又は治療剤；
〔２１〕  ＰＧＣ１αｂもしくはＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現誘導物質を有効成分として含有する、糖代謝改善剤；
〔２２〕  ＰＧＣ１αｂもしくはＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現誘導物質を有効成分として含有する、インスリン抵抗性改善剤；
〔２３〕  ＰＧＣ１αａもしくはＰＧＣ１αａ遺伝子の発現を変動させないことを特徴とする、〔２１〕又は〔２２〕に記載の改善剤；
〔２４〕  生体において筋肉細胞に特異的に作用することを特徴とする、〔２３〕に記載の改善剤；
〔２５〕  以下の（１）及び（２）の工程を有することを特徴とする、〔５〕に記載のプロモーターと結合する物質の探索方法：
（１）〔５〕に記載のプロモーターと被験物質とを接触させる工程、及び
（２）前記（１）の工程後に、当該プロモーターと被験物質との複合体生成の有無を調べる工程；
〔２６〕  〔５〕に記載のプロモーターと結合する物質の精製方法であって、
（１）〔５〕記載のプロモーターと試料とを接触させて、当該プロモーターと当該試料中に含有される当該プロモーターと結合する物質との複合体を生成させる工程、及び、
（２）前記（１）の工程後、生成させた複合体から当該結合物質を単離する工程、を有することを特徴とする精製方法；
〔２７〕  配列番号８に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド；
〔２８〕  配列番号５３〜５５のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有する〔２７〕に記載のポリペプチド；
〔２９〕  〔２７〕又は〔２８〕に記載のペプチドを特異的に認識することを特徴とする、〔４〕に記載の抗体；
〔３０〕  〔２７〕又は〔２８〕に記載のポリペプチドをコードする遺伝子；
〔３１〕  配列番号：７に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
〔３２〕  配列番号５０〜５２のいずれかに記載の塩基配列を含有する〔３１〕に記載のポリヌクレオチド；
〔３３〕  〔３１〕もしくは〔３２〕に記載のポリヌクレオチド、又はそれに相補的なポリヌクレオチドのうち、少なくとも５以上の連続する塩基配列を含むことを特徴とする、〔３〕に記載のプライマー又はプローブ；
に関する。
【図面の簡単な説明】  図１は、マウス各組織におけるＰＧＣ１αｂ及びＰＧＣ１αａの発現を示す図である。発現量をＲＴ−ＰＣＲで定量し、コントロールの３６Ｂ４の値を１として相対値で示した。
図２は、骨格筋におけるＰＧＣ１αｂの運動依存的発現誘導を示す図である。発現量をＲＴ−ＰＣＲで定量し、コントロールの３６Ｂ４の値を１として相対値で示した。
図３は、培養筋細胞におけるＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現誘導を示す図である。発現量をＲＴ−ＰＣＲで定量し、コントロールの３６Ｂ４の値を１として相対値で示した。ＡｘはアデノウイルスＡｘＣＡｗｔ−ｍＰＧＣ１αｂを示し、括弧内は添加したウイルス量を示す。
図４は、培養筋細胞におけるＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現誘導を示す図である。発現量をＲＴ−ＰＣＲで定量し、コントロールの３６Ｂ４の値を１として相対値で示した。ＡｘはアデノウイルスＡｘＣＡｗｔ−ｍＰＧＣ１αｂを示し、括弧内は添加したウイルス量を示す。
図５は、マウス横紋筋由来培養細胞におけるＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現誘導（実施例１１の結果）を示す図である。発現量をＲＴ−ＰＣＲで定量し、コントロールの３６Ｂ４の値を１として相対値で示した。
図６は、本発明ヒトＰＧＣ−１αｂプロモーターが有する転写開始能力の測定結果（実施例１８の結果）を示した。発現量をＲＴ−ＰＣＲで定量し、コントロールの３６Ｂ４の値を１として相対値で示した。ＢａｓｉｃはｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ、Ｐ１はｐｈＰＧＣ１αｂ−Ｐ１（３．０）−ｐＧＬ３ｂａｓｉｃ、Ｐ２はｐｈＰＧＣ１αｂ−Ｐ２（１．８）−ｐＧＬ３ｂａｓｉｃ、Ｐ３はｐｈＰＧＣ１αｂ−Ｐ３（１．３）−ｐＧＬ３ｂａｓｉｃを示し、ＤＭＳＯはコントロールとしてのＤＭＳＯ添加、ＦＳＫはＦｏｒｓｋｏｌｉｎ添加を示す。
図７は、本発明マウスＰＧＣ−１αｂプロモーターが有する転写開始能力の測定結果（実施例１９の結果）を示した。発現量をＲＴ−ＰＣＲで定量し、コントロールの３６Ｂ４の値を１として相対値で示した。ＢａｓｉｃはｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ、ｍＰＧＣ−１αｂ（１ｋｂ）はｍＰＧＣ１αｂ−Ｐ２（１．０）−ｐＧＬ３ｂａｓｉｃを示す。ＤＭＳＯはコントロールとしてのＤＭＳＯ添加、ＦｏｒｓｋｏｌｉｎはＦｏｒｓｋｏｌｉｎ添加を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に本発明を詳細に説明する。
本発明で用いられる遺伝子工学的技術は、たとえば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ及び  Ｄ．，Ｍ．，Ｇｌｏｖｅｒ著、ＤＮＡ  クローニング（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）、ＩＲＬ発行、１９８５年などに記載されている通常の方法に準じて行うことができる。
本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８：９（１９８４）〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における慣用記号に従う。
本明細書において「遺伝子」または「ＤＮＡ」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨で用いられる。また、「遺伝子」または「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡおよびＤＮＡのいずれをも包含する趣旨で用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。従って、本明細書において遺伝子（ＤＮＡ）とは、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）並びに該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、およびこれらの断片のいずれもが含まれる。また、ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及び合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。
（Ｉ）ＰＧＣ１αｂ及びＰＧＣ１αｂ遺伝子
本発明は、新規なＰＧＣ１αのバリアントである、ＰＧＣ１αｂに関する。
本明細書において、「ＰＧＣ１αｂ」とは、ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ−１αのバリアントの一種を表し、具体的には配列番号２で表されるタンパク質（ヒトＰＧＣ１αｂ）を例示することができる。本発明のＰＧＣ１αｂは、既に報告されているＰＧＣ１αａ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿０１３２６１）のＮ末端の約５０残基に配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる部分ペプチドを含むことを特徴とする。好ましくは、ＰＧＣ１αｂはＰＧＣ１αａの１残基目のメチオニンを除くＮ末端の１７アミノ酸残基に相当する部分が、配列番号８で表されるアミノ酸配列で置換されたポリペプチドである。例えば、ヒトＰＧＣ１αｂは、ＰＧＣ１αａの１残基目のメチオニンをのぞくＮ末端の１７アミノ酸残基に相当する部分が、ＬＧＬＳＳＭＤＳＩＬＫ（配列番号５３）からなるアミノ酸配列で置換された、配列番号２で表されるポリペプチドである。
また、本発明のＰＧＣ１αｂには、同族体（ホモログ）および変異体等が包含される。例えば、同族体（ホモログ）としては、ヒトのタンパク質に対応するマウスやラットなど他生物種のタンパク質が例示でき、これらはＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ／）により同定された遺伝子の塩基配列から演繹的に同定することができる。具体的には、マウスＰＧＣ１αｂは、ＰＧＣ１αａの１残基目のメチオニンをのぞくＮ末端の１７アミノ酸残基に相当する部分が、ＬＧＬＳＳＭＤＳＩＬＫ（配列番号５４）からなるアミノ酸配列で置換された、配列番号４で表されるタンパク質（マウスＰＧＣ１αｂ）である。また、ラットＰＧＣ１αｂは、ＰＧＣ１αａの１残基目のメチオニンをのぞくＮ末端の１７アミノ酸残基に相当する部分が、ＳＧＬＳＳＭＤＳＴＬＫ（配列番号５５）からなるアミノ酸配列で置換された、配列番号６で表されるタンパク質（ラットＰＧＣ１αｂ）である。
また変異体としては、天然に存在するアレル変異体及び天然に存在しない変異体が挙げられ、具体的には下記の（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）及び（ｆ）に示されるタンパク質が挙げられる。
すなわち、本発明においてＰＧＣ１αｂとは、前記配列番号２、４又は６で表されるタンパク質に限定されず、以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質を表す：
（ａ）配列番号２、４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２、４又は６に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、Ｎ末端に配列番号８に記載のアミノ酸配列を含有し、かつミトコンドリア活性化能力を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｎ末端に配列番号８に記載のアミノ酸配列を含有し、かつミトコンドリア活性化能力を有するタンパク質、
（ｄ）配列番号１、３又は５に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、Ｎ末端に配列番号８に記載のアミノ酸配列を含有し、かつミトコンドリア活性化能力を有するタンパク質、
（ｅ）配列番号１、３又は５に記載の塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、Ｎ末端に配列番号８に記載のアミノ酸配列を含有し、かつミトコンドリア活性化能力を有するタンパク質、
（ｆ）配列番号１、３又は５に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、Ｎ末端に配列番号８に記載のアミノ酸配列を含有し、かつミトコンドリア活性化能力を有する蛋白質のアミノ酸配列からなるタンパク質。
前記（ｂ）〜（ｆ）における「ミトコンドリア活性化能力」とは、本発明のタンパク質が細胞内で発現する条件下において細胞内でのミトコンドリア活性化作用の確認をすることにより評価できる。ミトコンドリア活性化作用の確認は、ミトコンドリアに存在する酵素の活性の測定あるいはミトコンドリア機能に関わる遺伝子の発現を測定し、その活性あるいは発現が上昇することにより判定することが可能となる。
具体的には、例えばミトコンドリア酵素活性の検討には生細胞のミトコンドリア内脱水素酵素活性を比色法により測定できる試薬ＷＳＴ−１（ＤＯＪＩＮＤＯ，３４２−０６４５１）を使用することができる。具体的には例えば本発明のタンパク質の発現ベクターをトランスフェクトしたＬ６細胞を直径１０ｃｍの組織培養皿で培養し、コンフルエントに達したところで細胞を９６ｗｅｌｌの組織培養皿へ移す。この際、培地を、フェノールレッドを含まないダルベッコ改変イーグル培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，ＵＳＡ，２１０６３−０２９）に変更する。６時間培養後、培地を、ウシ胎児血清を含まないものに変更し、適当な時間培養を続ける。培養後、一旦培地を吸引廃棄し、ここにフェノールレッド及びウシ胎児血清を含まないダルベッコ改変イーグル培地１００μｌ、５ｍＭ  ＷＳＴ−１及び０．２ｍＭ  １−Ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳ（ＤＯＪＩＮＤＯ，３４５−０４００１）を含むＰＢＳ  １０μｌを加える。３７℃で４時間反応させた後に、４５０ｎｍの測定波長で吸光度を測定することによりミトコンドリア酵素活性を測定できる。
あるいは、具体的には例えばミトコンドリア機能に関わる遺伝子の発現を測定する方法としては以下のようなＲＴ−ＰＣＲ法が挙げられる。
ＲＴ−ＰＣＲ法を利用する場合は、本発明のタンパク質の発現ベクターをトランスフェクトした細胞を培養した後、当該細胞から調製したＲＮＡを、あるいは得られたＲＮＡを鋳型として調製したｃＤＮＡを鋳型としてミトコンドリア機能に関わる遺伝子をコードする塩基配列領域が特異的に増幅できるように、一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）を設計し、通常の方法で合成する。例えば、具体的にはマウス由来の細胞を用いて検討する場合、ミトコンドリアにおいてエネルギー消費を起こすと考えられているＵＣＰ２（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＦ１１１９９８）、ミトコンドリアのゲノム複製や転写反応に重要な役割を示す転写因子：ｍｔＴＦＡ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ａ；Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００９３６０）、多くのミトコンドリア遺伝子のプロモーターに結合する転写因子ＮＲＦ１（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＦ０９８０７７）、ミトコンドリアでの酸化的リン酸化経路に関わる遺伝子群であるβ  ＡＴＰｓｙｎｔｈａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＦ０３０５５９）、及び／又はｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ＩＩ（ＣＯＸＩＩ；Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＦ３７８８３０）の配列に従い、合成したプライマーを用いることができる。ＲＴ−ＰＣＲ法に用いる鋳型としては、具体的は例えば、マウス筋肉組織、あるいはマウス横紋筋由来培養細胞Ｃ２Ｃ１２から調製したＲＮＡを、あるいは得られたＲＮＡを鋳型としてＴａｑＭａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＡＢＩ社製）を用いて調製したｃＤＮＡを用いることができる。ＲＴ−ＰＣＲの反応は具体的には、例えばＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ法を用いる場合にはＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてプロトコールに従ってＲＴ−ＰＣＲ反応液を調製し、ＡＢＩ  ＰＲＩＭＥ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で反応させることで、該反応物を検出、定量することができる。
前記（ｂ）における、アミノ酸の「欠失、付加もしくは置換」や前記（ｄ）における「８０％以上の配列同一性」には、例えば、配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質が細胞内で受けるプロセシング、該蛋白質が由来する生物の種差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や、人為的なアミノ酸の変異等が含まれる。
前記（ｂ）におけるアミノ酸の「欠失、付加もしくは置換」（以下、総じてアミノ酸の改変と記すこともある。）を人為的に行う場合の手法としては、例えば、配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このＤＮＡを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２，９４４１−９４５６（１９８４））、変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法等が挙げられる。
前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも１残基、具体的には１若しくは数個、又はそれ以上である。かかる改変の数は、ミトコンドリア活性化能力、及び／または免疫学的活性を見出すことのできる範囲であれば良い。
前記（ｃ）及び（ｅ）における「配列同一性」とは、２つのＤＮＡ又は２つの蛋白質間における配列の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡ又は蛋白質は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩを用いて、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２２（２２）：４６７３−４６８０（１９９４）を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐにおいて一般的に利用可能である。
本発明における配列同一性は、８０％以上であればよいが、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％である。
また、前記（ｆ）における「ストリンジェントな条件」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，Ｆｒｉｓｃｈ  Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ）等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６ｘＳＳＣ（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１５Ｍ  クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０ｘＳＳＣとする）、５０％フォルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、２ｘＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、２ｘＳＳＣで５０℃の条件（低ストリンジェンシーな条件）から０．２ｘＳＳＣで５０℃までの条件（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）までの温度から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。
前記（ｆ）における「相補的な塩基配列」とは、ＰＧＣ１αｂ遺伝子の塩基配列に対して、Ａ：ＴおよびＧ：Ｃといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味するものである。
なお、タンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、その生物学的機能、すなわちミトコンドリア活性化能力、及び／または免疫学的活性が保持される限り制限はない。生物学的機能や免疫学的活性を喪失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個置換、挿入あるいは欠失されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばＤＮＡ  Ｓｔａｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内である。また置換されるアミノ酸は、置換後に得られるタンパク質がＰＧＣ１αｂの生物学的機能及び／または免疫学的活性を保持している限り、特に制限されないが、タンパク質の構造保持の観点から、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ及びＴｒｐは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Ａｓｐ及びＧｌｕは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またＬｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。
また、本発明は、前記ＰＧＣ１αｂをコードする塩基配列を含む遺伝子に関する。当該「遺伝子」または「ＤＮＡ」には、特定の塩基配列（配列番号：１）で示される「遺伝子」または「ＤＮＡ」だけでなく、これらによりコードされるタンパク質と生物学的機能が同等であるタンパク質（例えば、同族体（ホモログ）等）をコードする「遺伝子」または「ＤＮＡ」が包含される。具体的には、「ＰＧＣ１αｂ遺伝子」は配列番号１で表されるヒトＰＧＣ１αｂ遺伝子のみならず、その同族体（ホモログ）や、前記（ｄ）に記載の「８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ」や、前記（ｆ）に記載の「配列番号１で表されるヒトＰＧＣ１αｂ遺伝子の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」を包含している。すなわち、これらの遺伝子（ＤＮＡ）によりコードされるアミノ酸配列からなり、かつＮ末端に配列番号８に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質がミトコンドリア活性化能力を有している限り、本発明のＰＧＣ１αｂ遺伝子の範疇である。
例えばヒト由来のタンパク質の同族体をコードする遺伝子（ホモログ）としては、当該タンパク質をコードするヒト遺伝子に対応するマウスやラットなど他生物種の遺伝子が例示できる。これらの遺伝子（ホモログ）は、ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．Ｇｏｖ／ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ／）により同定することができる。当該遺伝子（ホモログ）は、具体的には、例えば下記のようにして取得することができる：特定のヒト遺伝子の塩基配列をＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，１９９３、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）にかけて一致する（Ｓｃｏｒｅが最も高く、Ｅ−ｖａｌｕｅが０でかつＩｄｅｎｔｉｔｙが１００％を示す）配列のアクセッション番号を取得する。そのアクセッション番号をＵｎｉＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＵｎｉＧｅｎｅ／）に入力して得られたＵｎｉＧｅｎｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＤ（Ｈｓ．で示す番号）をＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅに入力する。結果として得られた他生物種遺伝子とヒト遺伝子との遺伝子ホモログの相関を示したリストから、特定の塩基配列で示されるヒト遺伝子に対応する遺伝子（ホモログ）としてマウスやラットなど他生物種の遺伝子を選抜する。具体的には、配列番号３で表されるマウスＰＧＣ１αｂ遺伝子や、配列番号５で表されるラットＰＧＣ１αｂ遺伝子を挙げることができる。
なお、遺伝子またはＤＮＡは、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン、またはイントロンを含むことができる。
本発明のＰＧＣ１αｂ遺伝子は、前述のとおり公知遺伝子であるＰＧＣ１αａのバリアントである。従って、ＰＧＣ１αｂ遺伝子は、配列番号１に示す配列のうち、４０番目の塩基以降の配列についてはＰＧＣ１αａ遺伝子と同様の方法で取得することができる。ＰＧＣ１αａ遺伝子は、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０１３２６１として公知であり、その取得方法についてもＣｅｌｌ  ９２（６），８２９−８３９（１９９８）に記載されるように公知である。その同族体（ホモログ）としては、配列番号３に記載のマウスＰＧＣ１αｂ遺伝子の４９番目の塩基以降の配列についてはマウスＰＧＣ１αａ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００８９０４）や配列番号５に記載のラットＰＧＣ１αｂ遺伝子の６４番目の塩基以降の配列についてはラットＰＧＣ１αａ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０３１３４７）が挙げられ、これらの取得方法についてもＣｅｌｌ  ９２（６），８２９−８３９（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７．（１９），１６７５０−１６７５７（２００２）に記載されるように公知である。
また、ＰＧＣ１αｂ遺伝子は、通常の遺伝子工学的方法〔例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，Ｆｒｉｓｃｈ  Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ）等に記載されている方法〕に準じて取得することができる。
具体的には、まず、ヒト、マウス又はラット等の組織、細胞やこれらに由来する培養細胞などからＲＮＡを調製する。例えば、ラット筋肉を塩酸グアニジンやグアニジンチオシアネート等の強力な蛋白質変性剤を含む溶液中で粉砕し、さらに該粉砕物にフェノール、クロロホルム等を加えることにより蛋白質を変性させる。変性蛋白質を遠心分離等により除去した後、回収された上清画分から塩酸グアニジン／フェノール法、ＳＤＳ−フェノール法、グアニジンチオシアネート／ＣｓＣｌ法等の方法により全ＲＮＡを抽出する。なお、これらの方法に基づいた市販の試薬としては、例えばＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン製）、トリゾル試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）等がある。
得られた全ＲＮＡを鋳型としてオリゴｄＴプライマーをＲＮＡのポリＡ配列にアニールさせ、逆転写酵素を作用させることにより一本鎖ｃＤＮＡを合成する。次いで、該一本鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、かつＰＧＣ１αｂ遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号１、３又は５に記載の塩基配列）に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼチェイン反応（以下、ＰＣＲと記す。）を行うことにより、ＰＧＣ１αｂ遺伝子を増幅し、取得することができる。
また、上記の一本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてＤＮＡポリメラーゼを作用させることにより二本鎖のｃＤＮＡを合成する。得られた二本鎖ｃＤＮＡを、例えばプラスミドｐＵＣ１１８やファージλｇｔ１０などのベクターに挿入することによりｃＤＮＡライブラリーを作製する。このようにして得られるｃＤＮＡライブラリーや市販のｃＤＮＡライブラリーから、ＰＧＣ１αｂ遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号１、３又は５で示される塩基配列）の部分塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして用いるハイブリダイゼーション法や、ＰＧＣ１αｂ遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号１、３又は５で示される塩基配列）に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲにより、ＰＧＣ１αｂ遺伝子を取得することもできる。
ＰＣＲに用いるプライマーとしては、例えば、約１５ｂｐから約５０ｂｐ程度の長さでかつＧまたはＣ塩基の割合が約４０％から約６０％程度の塩基配列を、上記のような本発明のタンパク質をコードする既知の塩基配列から選択し、該塩基配列に基いてオリゴヌクレオチドを設計し、合成するとよい。
得られたＰＧＣ１αｂ遺伝子の塩基配列は、Ｍａｘａｍ  Ｇｉｌｂｅｒｔ法（例えば、Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ  ＆  Ｗ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５６０，１９７７等に記載の方法）やＳａｎｇｅｒ法（例えばＳａｎｇｅｒ，Ｆ．＆  Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９４，４４１，１９７５、Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ，＆  Ｎｉｃｋｌｅｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３，１９７７等に記載の方法）により確認することができる。
上記のようにして得られたＰＧＣ１αｂ遺伝子は、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；モレキュラー  クローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールドスプリング  ハーバー  ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）発行、１９８９年等記載の遺伝子工学的方法に準じてベクターにクローニングすることができる。
ベクターとしては、ＰＧＣ１αｂ遺伝子を挿入可能な限り特に限定は無く、公知のベクターや市販されているベクターを適宜用いることができる。ＰＧＣ１αｂ遺伝子を挿入したベクターも又本発明の範疇である。
具体的には、大腸菌を宿主細胞とする場合には、例えばプラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造（株）製）や、ファージミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ストラタジーン社製）等をあげることができる。出芽酵母を宿主細胞とする場合には、プラスミドｐＡＣＴ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）などをあげることができる。また、哺乳類動物細胞を宿主細胞とする場合には、ｐＲＣ／ＲＳＶ、ｐＲＣ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等のプラスミド、ウシパピローマウイルスプラスミドｐＢＰＶ（アマシャムファルマシア社製）、ＥＢウイルスプラスミドｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等のウイルス由来の自律複製起点を含むベクター、ワクシニアウイルス等のウイルスなどをあげることができる。昆虫類動物細胞（以下、昆虫細胞と記す。）を宿主細胞とする場合には、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスをあげることができる。
ＰＧＣ１αｂ遺伝子の上流に、宿主細胞で機能可能なプロモーターを機能可能な形で結合させ、これを上述のようなベクターに組み込むことにより、ＰＧＣ１αｂ遺伝子を宿主細胞で発現させることの可能な発現ベクターを構築することができる。
ここで、「機能可能な形で結合させる」とは、ＰＧＣ１αｂ遺伝子が宿主細胞に導入された際に、宿主細胞においてプロモーターの制御下に発現されるように、当該プロモーターとＰＧＣ１αｂ遺伝子とを結合させることを意味する。宿主細胞で機能可能なプロモーターとしては、前記〔５〕に記載の本発明のプロモーターを挙げるこあとができる。また、例えば、宿主細胞が大腸菌である場合には、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター（ｌａｃＰ）、トリプトファンオペロンのプロモーター（ｔｒｐＰ）、アルギニンオペロンのプロモーター（ａｒｇＰ）、ガラクトースオペロンのプロモーター（ｇａｌＰ）、ｔａｃプロモーターもしくはｔｒｃプロモーター等の大腸菌内で機能可能な合成プロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、λファージのプロモーター（λ−ｐＬ、λ−ｐＲ）等をあげることができる。また、宿主細胞が動物細胞や分裂酵母である場合には、例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス（ＳＶ４０）の初期もしくは後期プロモーター、マウス乳頭腫ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター等をあげることができる。宿主細胞が出芽酵母である場合には、ＡＤＨ１プロモーター（尚、ＡＤＨ１プロモーターは、例えばＡＤＨ１プロモーター及び同ターミネーターを保持する酵母発現ベクターｐＡＡＨ５〔Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｕｎｄａｔｉｏｎから入手可能、Ａｍｍｅｒｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１  ｐａｒｔ（ｐ．１９２−２０１）〕から通常の遺伝子工学的方法により調製することができる。）などをあげることができる。
一般的には、宿主細胞で機能可能なプロモーターとＰＧＣ１αｂ遺伝子とが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡを、宿主細胞で利用可能なベクターに組込んで、これを宿主細胞に導入する。宿主細胞において機能可能なプロモーターをあらかじめ保有するベクターを使用する場合には、ベクター保有のプロモーターとＰＧＣ１αｂ遺伝子とが機能可能な形で結合するように、該プロモーターの下流にＰＧＣ１αｂ遺伝子を挿入すればよい。例えば、前述のプラスミドｐＲＣ／ＲＳＶ，ｐＲＣ／ＣＭＶ等は、動物細胞で機能可能なプロモーターの下流にクローニング部位が設けられており、該クローニング部位にＰＧＣ１αｂ遺伝子を挿入し動物細胞へ導入することにより、ＰＧＣ１αｂ遺伝子を発現させることができる。また、前述の酵母用プラスミドｐＡＣＴ２はＡＤＨ１プロモーターを有しており、該プラスミドまたはその誘導体のＡＤＨ１プロモーターの下流にＰＧＣ１αｂ遺伝子を挿入すれば、ＰＧＣ１αｂ遺伝子を例えばＣＧ１９４５（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等の出芽酵母内で発現させることが可能な発現ベクターが構築できる。マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子など）を含むベクターを用いると、ＰＧＣ１αｂ遺伝子が導入された形質転換細胞を当該マーカー遺伝子の表現型等を指標にして選択する際に便利である。
さらなる高発現を導くことが必要な場合には、ＰＧＣ１αｂ遺伝子の上流にリボゾーム結合領域を連結してもよい。用いられるリボゾーム結合領域としては、Ｇｕａｒｅｎｔｅ  Ｌ．ら（Ｃｅｌｌ  ２０，ｐ５４３）や谷口ら（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，ｐ２０２，講談社）による報告に記載されたものを挙げることができる。
上記のようにして得られる本ベクターを宿主細胞へ導入することにより、形質転換細胞（以下、本形質転換細胞と記すこともある。）を得ることができる。本形質転換細胞も又本発明の範疇である。宿主細胞としては、大腸菌などの原核生物細胞、酵母、動物細胞もしくは昆虫細胞などの真核生物細胞のいずれでもよく、用いる発現ベクターに応じて選択することができる。
ＰＧＣ１αｂ遺伝子が組み込まれたベクター（以下、本ベクターと記すこともある。）を宿主細胞へ導入する方法としては、宿主細胞に応じた通常の導入方法を適用することができる。
例えば、大腸菌を宿主細胞とする場合には、「モレキュラー・クローニング」（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、コールド・スプリング・ハーバー、１９８９年）等に記載される塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法等の通常の方法を用いることにより本ベクターを宿主細胞へ導入することができる。また、哺乳類動物細胞または昆虫細胞を宿主細胞とする場合には、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法またはリポフェクション法等の一般的な遺伝子導入法により前記細胞に本ベクターを導入することができる。酵母菌を宿主細胞とする場合には、例えば、リチウム法を基にしたＹｅａｓｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）などを用いて導入することができる。
本ベクターが導入された形質転換細胞を選抜するには、例えば、本ベクターと同時に下記のようなマーカー遺伝子を宿主細胞に導入し、導入されたマーカー遺伝子の性質に応じた方法で本ベクターが導入された宿主細胞を培養すればよい。例えば、当該マーカー遺伝子が、宿主細胞に致死活性を示す選抜薬剤に対する薬剤耐性を付与する遺伝子（薬剤耐性付与遺伝子）である場合には、該薬剤を添加した培地を用いて、本ベクターが導入された宿主細胞を培養すれば良い。薬剤耐性付与遺伝子と選抜薬剤との組み合わせとしては、例えば、ネオマイシン耐性付与遺伝子とネオマイシンとの組み合わせ、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子とハイグロマイシンとの組み合わせ、ブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子とブラストサイジンＳとの組み合わせ等を挙げることができる。また、当該マーカー遺伝子が宿主細胞の栄養要求性を相補する遺伝子である場合には、該栄養素を含まない最少培地を用いて、本ベクターが導入された細胞を培養すればよい。
上述のようにして得られた本ベクターが導入された形質転換細胞を培養することによりＰＧＣ１αｂ遺伝子を発現させることができる。
形質転換細胞の培養は、微生物培養、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞の培養に使用される通常の方法によって行うことができる。例えば大腸菌の場合、適当な炭素源、窒素源およびビタミン等の微量栄養物を適宜含む培地中で培養を行う。培養方法としては、固体培養、液体培養のいずれの方法でもよく、好ましくは、通気撹拌培養法等の液体培養を挙げることができる。
ＰＧＣ１αｂ遺伝子は、前述の如く調製すればよいが、例えば、ＰＧＣ１αｂ遺伝子の塩基配列からなる核酸を含有する組換えベクター又は組換えウイルス等の形態で使用されることもある。このような形態では、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連性ベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター、ポリオーマウイルスベクター、乳頭腫ウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター及びワクシニアウイルスベクター等のウイルスベクターをあげることができる。さらに、アデノウイルスベクターを使用する場合には、例えばＱＵＡＮＴＵＭ社製のＡｄＥａｓｙ  Ｋｉｔを用い、ＰＧＣ１αｂ遺伝子をＴｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒのマルチクローニングサイトに組み込み、得られた組換えベクターを直線化した後に、ｐＡｄＥａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒと共に大腸菌にトランスフォームし、相同組換え体ＤＮＡをヒト２９３Ａ細胞に組み込むことにより、ＰＧＣ１αｂ遺伝子を含有する組換えウイルスを産生させ、これを回収し、使用することもできる。
また、ヒトサイトメガウイルスのプロモーター領域を有するプラスミドＤＮＡ等のような非ウイルス系のベクターを用いることもできる。ＰＧＣ１αｂ遺伝子を線維化組織部位に直接注入する場合のように、非ウイルスベクターを用いてＰＧＣ１αｂ遺伝子を局所的に送達するシステムにおいては、プラスミドＤＮＡの使用は極めて有益である。体外に取り出された細胞に発現ベクターを導入して体内に戻す方法、すなわち、ｅｘ  ｖｉｖｏ法を使えば、あらゆる既知の導入方法が利用可能である。例えば、ａ）直接注入、ｂ）リポソームを介する形質導入、ｃ）リン酸カルシウム法・エレクトロポレーション法・ＤＥＡＥ−デキストラン法による細胞トランスフェクション、ｄ）ポリブレンを介した送達、ｅ）プロトプラスト融合、ｆ）マイクロインジェクション、ｇ）ポリリシンを使った形質導入などによって、非ウイルスベクターを導入することができる。
ＰＧＣ１αｂの取得は、一般の蛋白質の単離・精製に通常使用される方法を組み合わせて実施することができる。例えば、前記の培養により得られた形質転換細胞を遠心分離等で集め、該形質転換細胞を破砕または溶解させればよい。必要であれば蛋白質の可溶化を行い、イオン交換、疎水、ゲルろ過等の各種クロマトグラフィーを用いた工程を単独で、もしくは組み合わせることにより精製すればよい。必要であれば、精製された蛋白質の高次構造を復元する操作をさらに行ってもよい。
また、ＰＧＣ１αｂは、前述のとおりＰＧＣ１αａのバリアントであり、ＰＧＣ１αａと同様の方法で取得することができる。具体的には、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ．Ｖｏｌ３６７  ｐ４１３−２２（２００２）に記載された方法が挙げられる。
（ＩＩ）プライマー又はプローブ
また、本発明は、ＰＧＣ１αｂ遺伝子の塩基配列を特異的に認識するポリヌクレオチド、またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなるプライマー又はプローブに関する。
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡおよびＤＮＡのいずれをも包含する趣旨で用いられ、前記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また前記ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及び合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。
ここで「特異的に認識する」とは、例えばノーザンブロット法を用いた場合は、ＰＧＣ１αｂ遺伝子またはこれらに由来するポリヌクレオチドが特異的に検出できること、またＲＴ−ＰＣＲ法を用いた場合は、ＰＧＣ１αｂ遺伝子またはこれらに由来するポリヌクレオチドが特異的に生成されることを意味するが、それに限定されることなく、当業者が上記検出物または生成物がこれらの遺伝子に由来するものであると判断できるものであればよい。本発明のプライマー又はプローブは、ＰＧＣ１αｂをＰＧＣ１αａと区別して認識できることが好ましい。
ＰＧＣ１αｂは、ＰＧＣ１αａのスプライシングバリアントの一種であり、コード領域（ＯＲＦ）のＮ末端付近の塩基配列が異なっている。従って、２つのプライマーのうち少なくとも１つ、又は両方のプライマーを、配列番号７に記載の塩基配列を特異的に認識するポリヌクレオチドとすることによって、ＰＧＣ１αｂを選択的に認識することができる。
ここで、「配列番号７に記載の塩基配列を特異的に認識するポリヌクレオチド」は、配列番号７に記載の塩基配列の内、少なくとも連続する５塩基以上、好ましくは１０塩基以上の塩基配列を有するポリヌクレオチドであれば特に限定は無いが、ＰＧＣ１αｂ遺伝子の部分配列からなるポリヌクレオチドであることが好ましい。すなわち、配列番号１、３又は５で表される塩基配列のうち連続する１５以上の塩基配列を含有するポリヌクレオチドであって、かつＮ末端の部分配列に相当する配列番号７に記載の塩基配列の内、少なくとも連続する５塩基以上、好ましくは１０塩基以上の塩基配列を有するポリヌクレオチドである。
「配列番号７に記載の塩基配列」として更に具体的には、配列番号５０で表されるヒトＰＧＣ１αｂ由来の部分配列、配列番号５１で表されるマウスＰＧＣ１αｂ由来の部分配列、配列番号５２で表される、ラットＰＧＣ１αｂ由来の部分配列を挙げることができる。
一方、「配列番号７に記載の塩基配列を特異的に認識するポリヌクレオチド」とともに用いられるもう１つのプライマーは、「配列番号７に記載の塩基配列を特異的に認識するポリヌクレオチド」とともに用いることによって、ＰＧＣ１αｂを特異的に認識できるものであれば特に限定は無く、ＰＧＣ１αｂにおいて連続する少なくとも１５塩基の長さを有するものであればよく、長さについては適宜選択し設定することができる。通常１５ｂｐ〜１００ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ〜５０ｂｐ、より好ましくは１５ｂｐ〜３５ｂｐの塩基長を有するものが例示できる。また検出プローブとして用いる場合には、通常１５ｂｐ〜全配列の塩基数、好ましくは１５ｂｐ〜１ｋｂ、より好ましくは１００ｂｐ〜１ｋｂの塩基長を有するものが例示できる。
そのようなプライマーもしくはプローブは、配列番号１、配列番号３、又は配列番号５で示される塩基配列等のＰＧＣ１αｂ遺伝子の塩基配列をもとに、例えばｐｒｉｍｅｒ３（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ／ｐｒｉｍｅｒ３．ｃｇｉ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ／ｐｒｉｍｅｒ３．ｃｇｉ）あるいはベクターＮＴＩ（Ｉｎｆｏｍａｘ社製）を利用して設計することができる。
具体的にはＰＧＣ１αｂ遺伝子をｐｒｉｍｅｒ  ３またはベクターＮＴＩのソフトウエアにかけて得られる、プライマーまたはプローブの候補配列、若しくは少なくとも該配列を一部に含む配列をプライマーまたはプローブとして使用することができる。
ここで相補的なポリヌクレオチド（相補鎖、逆鎖）とは、ＰＧＣ１αｂ遺伝子の全長配列、または該塩基配列において少なくとも連続した１５塩基長の塩基配列を有するその部分配列（ここでは便宜上、これらを「正鎖」ともいう）に対して、Ａ：ＴおよびＧ：Ｃといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味するものである。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係を有するものであってもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度（Ｔｍ）に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。ストリンジェントな条件としては、特に制限されないが、前述のものが挙げられる。
具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも９０％、好ましくは９５％の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
また、正鎖側のポリヌクレオチドには、ＰＧＣ１αｂ遺伝子の塩基配列またはその部分配列を有するものだけでなく、上記相補鎖の塩基配列に対してさらに相補的な関係にある塩基配列からなる鎖を含めることができる。
さらに上記正鎖のポリヌクレオチド及び相補鎖（逆鎖）のポリヌクレオチドは、各々一本鎖の形態で使用されても、また二本鎖の形態で使用されてもよい。
本発明のプライマー又はプローブは、ヒト等の哺乳動物の細胞や生体由来物（例えば尿、血液、組織片等）におけるＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現の有無またはその程度（発現量）の検出に使用することもできる。すなわち本発明のプライマーは、ヒト等の哺乳動物の筋肉において、運動負荷の結果生じるミトコンドリア遺伝子群の活性化を正確に判断することができる。すなわち、本発明のプライマー又はプローブは運動応答的ミトコンドリア活性化の応答性を評価するためのツール（糖代謝マーカー）として有用である。
また本発明のプライマー又はプローブは、後述する、被験物質の、ミトコンドリア活性促進能力等の糖代謝改善能力、もしくはＧｌｕｔ４発現誘導能力の評価方法において、ＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現の有無や発現レベルを検出するために用いることができる。
（ＩＩＩ）抗体
また本発明は、前記（Ｉ）における本発明のタンパク質、すなわちＰＧＣ１αｂを特異的に認識する抗体に関する。
本明細書でいう「抗体」は、その形態に特に制限はなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはＦａｂフラグメントやＦａｂ発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。また、「ＰＧＣ１αｂを特異的に認識する」は、ＰＧＣ１αｂをＰＧＣ１αａと区別して認識できることが好ましい。
本発明の抗体は、ＰＧＣ１αｂの部分ペプチドである配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む配列を免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよい。さらに、ＰＧＣ１αｂを構成するアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常８アミノ酸、好ましくは１５アミノ酸、より好ましくは２０アミノ酸からなり、かつ配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体である。
「配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド」として、具体的には、配列番号５３で表されるヒトＰＧＣ１αｂ特異的な部分配列を含むポリペプチド、配列番号５４で表されるマウスＰＧＣ１αｂ特異的な部分配列を含むポリペプチド、又は配列番号５５で表されるラットＰＧＣ１αｂ特異的な部分配列を含むポリペプチドを挙げることができる。
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．１２〜１１．１３）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したＰＧＣ１αｂを用いて、あるいは常法に従って当該いずれかの本発明タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。例えば（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，１１：２０５２−２０６５，１９９７）記載の方法で取得することもできる。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したＰＧＣ１αｂ、あるいはこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．４〜１１．１１）。
また、抗体の作製に使用されるタンパク質は、後述する配列表に記載する遺伝子の配列情報（配列番号１、３、５）等に基づいて、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換細胞の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作等、通常の遺伝子工学的方法により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，Ｆｒｉｓｃｈ  Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ；ＤＭ．Ｇｌｏｖｅｒら著、ＤＮＡクローニング（ＩＲＬプレス発行、１９８５）等に記載されている方法］などに準じて行うことができる。具体的にはＰＧＣ１αｂをコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換えＤＮＡ（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換細胞を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって実施することができる。また、これらＰＧＣ１αｂは、後記配列表に記載するアミノ酸配列の情報（配列番号２、４、６）等に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。
また本発明の抗体は、ＰＧＣ１αｂの部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを用いて調製されるものであってよい。かかる抗体誘導のために用いられるオリゴペプチドは、機能的な生物活性を有することは要しないが、ＰＧＣ１αｂと同様な免疫原特性を有するものであることが望ましい。好ましくはかかる特性を有しＰＧＣ１αｂのアミノ酸配列において少なくとも連続する、通常８アミノ酸、好ましくは１５アミノ酸、より好ましくは２０アミノ酸からなるポリペプチドであって、かつ配列番号８に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを例示することができる。
なお、ここで「ＰＧＣ１αｂと同様な免疫原特性を有するオリゴペプチド」とは、免疫学的活性においてＰＧＣ１αｂと同等の活性を有するオリゴペプチドを表し、適当な動物あるいはその細胞において特定の免疫反応を誘発し、かつＰＧＣ１αｂに対する抗体と特異的に結合する能力を有するタンパク質を挙げることができる。当該抗体は、ＰＧＣ１αｂとＰＧＣ１αａと区別して認識できることが好ましい。
かかるポリペプチドに対する抗体の生成は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。限定はされないが、そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのような表面活性物質、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム−パルヴムなどのヒトアジュバントなどがある。
本発明の抗体はＰＧＣ１αｂに特異的に結合する性質を有することから、該抗体を利用することによって、ヒト等の哺乳動物の細胞や生体由来物（例えば尿、血液、組織片等）中の上記本発明タンパク質を特異的に検出することができる。すなわち、当該抗体はヒト等の哺乳動物の組織内、具体的には筋肉におけるＰＧＣ１αｂのタンパク発現の有無を検出するために有用である。例えばヒト等の哺乳動物の筋肉において、運動負荷の結果生じるミトコンドリア遺伝子群の活性化を正確に判断することができる。従って、本発明の抗体は、運動応答的ミトコンドリア活性化の応答性を評価するためのツール（糖代謝マーカー）として有用である。
また、本発明の抗体は、後述する、被験物質の、ミトコンドリア活性促進能力などの糖代謝改善能力、もしくはＧｌｕｔ４発現誘導能力の評価方法において、ＰＧＣ１αｂの発現の有無や発現レベルを検出するために用いることができる。
ここで、該抗体をヒト等の哺乳動物における糖代謝の評価や糖代謝異常に関する診断に用いる場合、該マーカーは、配列番号２に記載されたヒトＰＧＣ１αｂのアミノ酸配列を認識する抗体であることが好ましい。
（ＩＶ）ＰＧＣ１αｂプロモーター、発現ベクター及び形質転換細胞
本発明はまた、新規な、ＰＧＣ１α（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ−１α）のバリアントであるＰＧＣ１αｂのプロモーターを包含する。
本発明プロモーターは、（ｇ）配列番号３３、３４または３５で示される塩基配列からなるＤＮＡ、（ｈ）配列番号３３、３４または３５で示される塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ転写を制御する能力を有するＤＮＡ、（ｉ）配列番号３３、３４または３５で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつ転写を制御する能力を有するＤＮＡを含むプロモーターである。ここで、配列番号３３で示される塩基配列からなるＤＮＡは、ヒト由来の約３ｋｂのＰＧＣ１αｂプロモーター領域を表し、配列番号３４で示される塩基配列からなるＤＮＡは、ヒト由来の約１．３ｋｂのＰＧＣ１αｂプロモーター領域を表し、配列番号３５で示される塩基配列からなるＤＮＡは、マウス由来の約１．３ｋｂのＰＧＣ１αｂプロモーター領域を表す。
本明細書において「プロモーター」とは、調節遺伝子の一種で、ＲＮＡポリメラーゼが結合し、オペロンの転写を開始する部位であり、転写を促すために必要な配列を含むＤＮＡを意味し、さらに、例えば、細胞型特異的もしくは組織特異的な制御を受けるプロモーター要素、又は外来性のシグナルもしくは因子（例えば、転写活性化蛋白質）によって誘導されるプロモーター依存的遺伝子発現を引き起こすために十分なプロモーター要素を含んでいてもよい。
前記（ｈ）における「欠失、付加もしくは置換」（以下、総じて塩基の改変と記すこともある。）には、例えば、配列番号３３、３４または３５で表される塩基配列を有するＤＮＡの由来する生物の種差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や、人為的な塩基配列の変異等が含まれる。ここで、塩基配列の「欠失、付加もしくは置換」を人為的に行う場合の手法としては、例えば、配列番号３３、３４または３５で表される塩基配列からなるＤＮＡに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このＤＮＡを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、ギャップド・デュープレックス法（、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２，９４４１−９４５６（１９８４））、変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法等が挙げられる。
前記で改変される塩基の数については、少なくとも１残基、具体的には１若しくは数個、又はそれ以上である。かかる改変の数は、転写を制御する能力を保持している限り特に限定はない。
前記（ｉ）における「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６ｘＳＳＣ（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１５Ｍ  クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０ｘＳＳＣとする）、５０％フォルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、２ｘＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、２ｘＳＳＣで５０℃の条件（低ストリンジェンシーな条件）から０．２ｘＳＳＣで５０℃までの条件（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）までの温度から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。
本発明プロモーターの調製方法としては、例えば、化学合成法、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション法等が挙げられる。
化学合成法を用いて調製する場合、ＤＮＡ自動合成機、例えばＤＮＡ合成機モデル３８０Ａ（ＡＢＩ社製）等を用いることができる。
次に、ＰＣＲを用いて本発明プロモーターを調製する方法について説明する。鋳型とするゲノムライブラリーは、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ等に記載されている方法に準じてヒト、マウス等の哺乳動物の組織から調製することができる。また、ヒトゲノムＤＮＡ（クローンテック製）等の市販のゲノムＤＮＡや、ヒトゲノムウォーカーキット（クローンテック製）等の市販ゲノムライブラリーを用いることができる。次いで、増幅させるプロモーターに対応したプライマー、例えば配列番号３３で示される塩基配列からなるＤＮＡを含む本発明プロモーターを調製する場合であれば、例えば配列番号３６で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３７で示される塩基配列からなるプライマーとを用いてＰＣＲを行う。尚、前記プライマーは、配列番号３３で示される塩基配列に基づいて適宜設計することができ、また、その５’末端側に、制限酵素認識配列等を付加してもよい。前記のようにして増幅されたＤＮＡは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ＩＳＢＮ０−４７１−５０３３８−Ｘ等に記載される通常の方法に準じてベクターにクローニングすることができる。具体的には例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＴＡクローニングキットに含まれるプラスミドベクターやＳｔｒａｔａｇｅｎｅ製のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩなどのプラスミドベクターを用いてクローニングすることができる。クローニングされたＤＮＡの塩基配列は、Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ，Ｓ．Ｎｉｃｋｌｅｎ，Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ著、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９７７），７４，５４６３−５４６７等に記載されるダイデオキシターミネーティング法などにより分析することができる。
次に、ハイブリダイゼーション法を用いて本発明プロモーターを調製する方法について説明する。
まず、プローブに用いるＤＮＡを標識する。プローブに用いるＤＮＡとしては、調製しようとするプロモーターの塩基配列の少なくとも一部を有するＤＮＡ、例えば、配列番号３３又は３５で示される塩基配列もしくはその連続した一部の塩基配列からなるＤＮＡであってその鎖長が２０塩基以上１６０塩基以下であるＤＮＡ、前記ＤＮＡの塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ、前記ＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズするＤＮＡ等を挙げることができる。
具体的には、配列番号３３の塩基番号１番から６００番で示される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号３３の塩基番号４００番から１１００番で示される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号３３の塩基番号９００番から１６００番で示される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号３３の塩基番号１４００番から２１００番で示される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号３３の塩基番号１９００番から２６００番で示される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号３３の塩基番号２４００番から３０００番で示される塩基配列からなるＤＮＡ等を挙げることができる。
また、配列番号３５の塩基番号１番から６００番で示される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号３５の塩基番号４００番から１１００番で示される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号３５の塩基番号９００番から１６００番で示される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号３５の塩基番号１４００番から２１００番で示される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号３５の塩基番号１９００番から２６００番で示される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号３５の塩基番号２４００番から３０００番で示される塩基配列からなるＤＮＡ等を挙げることができる。
プローブに用いる前記ＤＮＡは、例えば、化学合成法、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション法等、「本発明プロモーターの調製方法」として前述した通常のＤＮＡの調製方法によって得ることができる。なお、プローブに用いる前記ＤＮＡは、それ自身が例えば配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するＰＧＣ１αｂをコードする遺伝子の転写を制御する能力を有していても良い。
プローブに用いる前記ＤＮＡを放射性同位元素により標識するには、例えば、ベーリンガー製、宝酒造製のＲａｎｄｏｍ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｋｉｔ等を用いることができ、通常のＰＣＲ反応組成中のｄＣＴＰを［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰに替えて、プローブに用いる前記ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ反応を行うことにより、標識を行うこともできる。また、プローブに用いるＤＮＡを蛍光色素で標識する場合には例えば、ＥＣＬ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｉｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）等を用いることができる。プローブをハイブリダイズさせるＤＮＡライブラリーとしては、例えば、ラットなどのげっ歯類等の動物由来のゲノムＤＮＡライブラリー等を使用することができる。当該ＤＮＡライブラリーには、市販のゲノムＤＮＡライブラリーを用いることもできるし、また「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓや「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ＩＳＢＮ０−４７１−５０３３８−Ｘ等に記載される通常のライブラリー作製法に従い、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製のλ  ＦＩＸ  ＩＩ、λ  ＥＭＢＬ３、λ  ＥＭＢＬ４、λ  ＤＡＳＨ  ＩＩ等のλベクターを用い、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）等をｉｎ  ｖｉｔｒｏパッケージングに用いてゲノムＤＮＡライブラリーを作製し、これを用いることもできる。
ハイブリダイゼーション方法としては、コロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションをあげることができ、ライブラリーの作製に用いられたベクターの種類に応じて方法を選択するとよい。例えば、使用されるライブラリーがプラスミドベクターで構築されたライブラリーである場合には、コロニーハイブリダイゼーションを行うことができる。具体的にはまず、ライブラリーのＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換細胞を取得し、得られた形質転換細胞を希釈して寒天培地にまき、コロニーが現れるまで３７℃で培養を行う。また、使用されるライブラリーがファージベクターで構築されたライブラリーである場合には、プラークハイブリダイゼーションを行うことができる。具体的にはまず、宿主微生物とライブラリーのファージを感染可能な条件下で混合した後さらに軟寒天培地と混合し、これを寒天培地上にまく。その後プラークが現れるまで３７℃で培養を行う。より具体的には、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９年）２．６０から２．６５等に記載されている方法に準じて、ＮＺＹ寒天培地に寒天培地１ｍｍ２当り０．１〜１．０ｐｆｕの密度で、約９．０×１０５ｐｆｕのファージライブラリーを広げ、３７℃で６〜１０時間培養する。
次いで、前記のいずれのハイブリダイゼーション法を用いた場合も、前述の培養を行った寒天培地の表面にメンブレンフィルターをのせ、プラスミドを保有する形質転換細胞やファージを当該メンブレンフィルターに転写する。このメンブレンフィルターをアルカリ処理した後、中和処理し、次いで、ＤＮＡを当該フィルターに固定する処理を行う。より具体的には例えば、プラークハイブリダイゼーションの場合には、クローニングとシークエンス：植物バイオテクノロジー実験マニュアル（渡辺、杉浦編集、農村文化社１９８９年）等に記載の通常の方法に準じて、前記寒天培地の上にニトロセルロースフィルター又はナイロンフィルター等、例えば、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）を置き、約１分間静置してファージ粒子をメンブレンフィルターに吸着させる。次に、当該フィルターをアルカリ溶液（１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｎ水酸化ナトリウム）に約３分間浸してファージ粒子を溶解させてファージＤＮＡをフィルター上に溶出させた後、中和溶液（１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍトリス塩酸、ｐＨ７．５）に約５分間浸す処理を行う。当該フィルターを洗浄溶液（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、２００ｍＭトリス塩酸）で約５分間洗った後、例えば、約８０℃で約９０分間ベーキングすることによりファージＤＮＡをフィルターに固定する。このように調製されたフィルターと、前記プローブとを用いてハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションを行う際の試薬及び温度条件は、例えば、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編「ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ」ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ（１９８５）ＩＳＢＮ  ０−９４７９４６−１８−７、クローニングとシークエンス：植物バイオテクノロジー実験マニュアル（渡辺、杉浦編集、農村文化社１９８９年）、または、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）等の記載の方法に準じて行うことができる。例えば、４５０〜９００ｍＭの塩化ナトリウム、４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を０．１〜１．０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｇ／ｍＬの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２％（Ｗ／Ｖ）の濃度で含んでいてもよいプレハイブリダイゼーション溶液、好ましくは、９００ｍＭの塩化ナトリウム、９０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１％（Ｗ／Ｖ）のＳＤＳおよび１００μｇ／ｍＬの変性Ｃａｌｆ−ｔｈｙｍｕｓ  ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液を、前記のようにして作製したフィルター１ｃｍ２当り５０〜２００μＬの割合で準備し、当該溶液に前記フィルターを浸して４２〜６８℃で１〜４時間、好ましくは、４５℃で２時間保温する。次いで、例えば、４５０〜９００ｍＭの塩化ナトリウム、４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、ＳＤＳを０．１〜１．０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｇ／ｍＬの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２％（Ｗ／Ｖ）の濃度で含んでいてもよいハイブリダイゼーション溶液、好ましくは、９００ｍＭの塩化ナトリウム、９０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１％（Ｗ／Ｖ）のＳＤＳおよび１００μｇ／ｍＬの変性Ｃａｌｆ−ｔｈｙｍｕｓ  ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液と、前述の方法で調製して得られたプローブ（フィルター１ｃｍ２当り１．０×１０４〜２．０×１０６ｃｐｍ相当量）とを混合した溶液をフィルター１ｃｍ２当り５０〜２００μＬの割合で準備し、当該溶液にフィルターを浸し４２〜６８℃で４〜２０時間、好ましくは、４５℃で１６時間保温しハイブリダイゼーション反応を行う。当該ハイブリダイゼーション反応後、フィルターを取り出し、１５〜３００ｍＭの塩化ナトリウム、１．５〜３０ｍＭのクエン酸ナトリウム、および０．１〜１．０％（Ｗ／Ｖ）のＳＤＳ等を含む４２〜６８℃の洗浄溶液等、好ましくは、３００ｍＭの塩化ナトリウム、３０ｍＭのクエン酸ナトリウム、および１％（Ｗ／Ｖ）のＳＤＳを含む５５℃の洗浄溶液で、１０〜６０分間のフィルター洗浄を１〜４回、好ましくは１５分間の洗浄を２回行う。さらに、フィルターを２×ＳＳＣ溶液（３００ｍＭ塩化ナトリウム、および３０ｍＭクエン酸ナトリウムを含む。）で軽くすすいだのち乾燥させる。このフィルターを、例えば、オートラジオグラフィーなどに供してフィルター上のプローブの位置を検出することにより、用いたプローブとハイブリダイズするＤＮＡのフィルター上の位置を検出する。検出されたＤＮＡのフィルター上の位置に相当するクローンをもとの寒天培地上で特定しこれを釣菌することにより、当該ＤＮＡを有するクローンを単離することができる。具体的には例えば、フィルターをイメージングプレート（富士フィルム）に４時間露光させ、次いで当該プレートを、ＢＡＳ２０００（富士フィルム）を用いて解析し、シグナルを検出する。フィルターの作製に用いた寒天培地のうち、シグナルが検出された位置に相当する部分を約５ｍｍ角にくり抜き、これを約５００μＬのＳＭバッファー（５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．５、０．１Ｍ塩化ナトリウム、７ｍＭ硫酸マグネシウム、および０．０１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチンを含む。）に２〜１６時間、好ましくは３時間浸してファージ粒子を溶出させる。得られたファージ粒子溶出液をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）２．６０から２．６５に記載の方法に準じて寒天培地に広げ、３７℃で６〜１０時間培養する。この寒天培地を用いて前述の方法と同様の方法でファージＤＮＡをフィルターに固定し、このフィルターと前述のプローブを用いてハイブリダイゼーションを行う。フィルターの作製に用いた寒天培地のうちの、シグナルが検出された位置に相当する部分からファージ粒子を溶出し、これを寒天培地に広げ、前述の方法と同様にフィルターを作製し、ハイブリダイゼーションを行う。このようなファージクローンの特定と純化を繰り返すことにより、用いたプローブとハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡを含むファージクローンが得られる。前述のようなハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行うことにより得られたクローンの保有するＤＮＡは、ＤＮＡ調製や解析が容易なプラスミドベクター、例えば市販のｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ  ＫＳ＋、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ  ＫＳ−  等にサブクローニングして、プラスミドＤＮＡを調製し、Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ，Ｓ．Ｎｉｃｋｌｅｎ，Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ著、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９７７），７４，５４６３−５４６７等に記載されるダイデオキシターミネーティング法を用いてその塩基配列を決定することができる。塩基配列分析に用いる試料の調製は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）１３．１５等に記載されているプライマーエクステンション法に準じて行うことができる。また、ファージクローンをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）２．６０から２．６５等に記載の方法に準じてＮＺＹＭ液体培地で増幅し、ファージ液を調製して、これから例えば、Ｌａｍｂｄａ−ＴＲＡＰＰＬＵＳ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）等を用いてファージクローンＤＮＡを抽出し、当該ＤＮＡを鋳型として、例えば前述のプライマーエクステンション法により塩基配列分析用の試料を調製し、塩基配列を分析することもできる。このようにして得られるＤＮＡの転写を制御する能力は、後述のようにして確認することもできる。尚、本願において「転写を制御する能力」とは、例えば、プロモーターの下流に位置する遺伝子の転写を開始させる活性等を意味する（以下、プロモーター活性と記すこともある。）。
本発明プロモーターは、配列番号３３の塩基番号１番から３０００番又は配列番号３５の塩基番号１番から３０２２番で示される塩基配列からなるＤＮＡを含むプロモーター等に変異を導入することによって作製しても良い。具体的には、例えば、Ａ．Ｇｒｅｅｎｅｒ，Ｍ．Ｃａｌｌａｈａｎ、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（１９９４）７，３２−３４等に記載される方法を用いてランダムに変異を導入することによって取得することができ、Ｗ．Ｋｒａｍｅｒ，ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８４）１２，９４４１もしくはＷ．Ｋｒａｍｅｒ，Ｈ．Ｊ．Ｆｒｉｔｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８７）１５４，３５０等に記載のギャップド・デュープレックス（ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ）法、またはＴ．Ａ．Ｋｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ．ｏｆ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８５）８２，４８８もしくはＴ．Ａ．Ｋｕｎｋｅｌ，ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８７）１５４，３６７等に記載のクンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）法を用いて部位特異的に変異を導入することによって取得することができる。あるいは、配列番号３３で示される塩基配列からなるＤＮＡを含むプロモーター等のうち１ヶ所ないし数カ所の部分塩基配列を、他のプロモーターの、ＤＮＡの一部と入れ換えたキメラＤＮＡを作製することによって取得することができ、例えば、Ｓ．Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ（１９８４）２８，３５１、Ｃ．Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ（１９８５）３３，１０３等に記載された方法を用いることができる。
本明細書において、「プロモーターの下流（３’側）に当該プロモーターによって転写が制御される遺伝子」とは、前記プロモーターによって、転写が開始する遺伝子であれば特に限定は無いが、具体的には、ＰＧＣ１αｂ遺伝子又は後述するレポータージーンアッセイに用いられるレポーター遺伝子等を挙げることができる。
ここで、ＰＧＣ１αｂ遺伝子には、配列番号２で示されるヒトＰＧＣ１αｂをコードする、配列番号１で示される塩基配列からなるヒトＰＧＣ１αｂ遺伝子のみならず、その同族体（ホモログ）および変異体等が包含される。例えば、同族体（ホモログ）としては、ヒトのタンパク質に対応するマウスやラットなど他生物種のタンパク質が例示でき、これらはＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ／）により同定された遺伝子の塩基配列から演繹的に同定することができる。具体的には、配列番号４で示されるマウスＰＧＣ１αｂをコードする、配列番号３で示される塩基配列からなるマウスＰＧＣ１αｂ遺伝子、又は配列番号６で示されるラットＰＧＣ１αｂをコードする、配列番号５で示される塩基配列からなるラットＰＧＣ１αｂ遺伝子を挙げることができる。
前記の種々の方法で調製される本発明プロモーターを、通常の方法、例えば、「田村隆明著（羊土社刊）、新転写制御のメカニズム（２０００年）」３３〜４０頁、「野村慎太郎、渡辺俊樹監修著（秀潤社刊）、脱アイソトープ実験プロトコール（１９９８年）」等に記載された方法に準じて、プロモーター活性を維持したまま、その一部分の塩基を欠失させて得られる（即ち、適当な制限酵素を用いて切り出すことにより調製される）ＤＮＡも本発明プロモーターとして使用することができる。得られたＤＮＡの、ＰＧＣ１αｂ遺伝子の転写を制御する能力は後述する方法により確認することができる。
本発明プロモーターを機能可能な形で含有する発現ベクターも又、本発明の範疇である。当該発現ベクターとしては、後述するプラスミド等を挙げることができる。すなわち、本発明プロモーターを挿入するためのプラスミドとしては、所望の細胞内で機能可能なプラスミドであれば良く、当該プラスミドが導入された細胞を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子又はネオマイシン耐性遺伝子等）を含んでいてもよい。また、前記プラスミドにおいて、本発明プロモーターおよび所望の遺伝子がプラスミド上で機能可能な形で連結されるような位置、例えば当該プロモーターを挿入する部位の下流に遺伝子挿入部位がさらに有ると、所望の遺伝子を細胞内で発現させるためのプラスミドの構築等に好ましく利用できる。ここで遺伝子挿入部位とは、例えば、遺伝子工学的手法で通常用いられる制限酵素が特異的に認識切断可能な塩基配列であり、本発明プロモーターを有するプラスミド上に唯一存在する種類の制限酵素認識配列が好ましい。当該プラスミドとして具体的には、例えば、ｐＵＣ系プラスミド［ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９（宝酒造製）など］、ｐＳＣ１０１系プラスミド、Ｔｉ−プラスミド［ｐＢＩ１０１，ｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）など］、ｐＢＲ３２２プラスミド（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ製）、ｐｃＤＮＡ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）等が挙げられる。
本発明プロモーターの前記プラスミドへの挿入は、通常の方法、例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ＩＳＢＮ０−４７１−５０３３８−Ｘ等に記載される方法に準じて行うことができる。
また、例えば前記プラスミドのうち本発明プロモーターの制御下にルシフェラーゼ遺伝子等のレポーター遺伝子を含むプラスミドは、当該プラスミド中の本発明プロモーターのプロモーター活性を測定する場合に好ましく利用することができる。具体的には、ルシフェラーゼ遺伝子を含む市販のプラスミド、例えば、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）、ＰｉｃａＧｅｎｅ  Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒ（東洋インキ製）等のプラスミドを使って作製することができる。具体的には、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃの遺伝子挿入部位に通常の方法により本発明プロモーターを機能可能な形で挿入することにより、本発明プロモーターの制御下にルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドを作製することができる。
前記の本発明プロモーターを含有する本発明の発現ベクターが導入されてなる本発明形質転換細胞の調製方法について以下に説明する。
本発明プロモーター又は本発明発現ベクターを導入する宿主細胞としては、大腸菌、酵母、植物細胞、動物細胞等の細胞を挙げることができ、本発明プロモーター又は本発明発現ベクターが細胞内で増幅可能な形態を保てる細胞であればよい。好ましくは動物細胞、特に好ましくは骨格筋由来細胞を挙げることができる。本発明プロモーター又は本発明発現ベクターの宿主細胞への導入法としては、細胞に応じた導入方法を適用することができ、例えば動物細胞にはりん酸カルシウム法、電気導入法、ＤＥＡＥデキストラン法、ミセル形成法などを適用することができる。具体的には例えば、りん酸カルシウム法としては、Ｇｒｉｍｍ，Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，１０９２３−１０９２７等に記載の方法を挙げることができ、電気導入法およびＤＥＡＥデキストラン法としては、Ｔｉｎｇ，Ａ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１５，６１８９−６１９６等に記載の方法を挙げることができ、ミセル形成法としては、Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，１３７８６−１３７９０等に記載の方法を挙げることができる。ミセル形成法としては例えば、リポフェクトアミン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ製）やフュージーン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ製）等の市販の試薬を使用することが可能である。
（Ｖ）発現制御能力の評価方法
（Ｖ−１）プライマー又はプローブを用いる方法
また本発明は、下記の工程（１）、（２）及び（３）の工程を含むＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現制御能力の評価方法を包含する。
（１）被験物質とＰＧＣ１αｂ遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（２）被験物質を接触させた細胞のＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現量を測定し、該発現量を、被験物質を接触させない対照細胞の上記遺伝子の発現量と比較する工程、
（３）（２）の比較結果に基づいて、ＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現量を変動させるか否かを指標として被験物質のＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現制御能力を評価する工程。
ここで用いられるＰＧＣ１αｂ遺伝子としては、使用する細胞の内在性のＰＧＣ１αｂ遺伝子、外来遺伝子として細胞に導入されたＰＧＣ１αｂ遺伝子のいずれでも良いが、使用する細胞の内在性のＰＧＣ１αｂ遺伝子が好ましい。外来遺伝子として導入する場合、ＰＧＣ１αｂ遺伝子は用いられる細胞の由来動物種のＰＧＣ１αｂ遺伝子であることが好ましい。
かかるスクリーニングに用いられる細胞としては、ＰＧＣ１αｂ遺伝子を発現している細胞であれば特に限定は無いが、例えば筋肉組織由来細胞、前述のＰＧＣ１αｂ遺伝子発現ベクターを導入されてなる形質転換細胞等が挙げられる。由来動物種としては、ラット、マウス、モルモット等のげっ歯類哺乳動物、イヌ、サル、ヒト等が挙げられる。
以上に挙げたような細胞の他、細胞の集合体である組織（例えば筋肉組織片）も、本発明のスクリーニングに用いられる「細胞」の範疇に含まれる。
被験物質となりえるものとしては、制限されないが、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物などであり、スクリーニングは、具体的には被験物質を含む試料（被験試料）を上記組織／または細胞と接触させて行うことができる。かかる被験試料としては特に限定は無く、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物、土壌抽出液などが挙げられるが、これに制限されない。
前記の工程（２）における「対照細胞」とは前記工程（１）で用いられるＰＧＣ１αｂ遺伝子を発現可能な細胞において、被験物質を接触させない場合の当該細胞を表す。「被験物質を接触させない場合」には、被験物質の代わりに被験物質と同量の溶媒（ブランク）を添加する場合や、ＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現に影響を与えないネガティブコントロール物質を添加する場合も含まれる。
また、被験物質と細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、該細胞が死なないように、その培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を大きく変化させない条件を採用することが好ましい。
このような遺伝子の発現レベルの検出及び定量は、前記細胞から調製したＲＮＡ又はそれから転写された相補的なポリヌクレオチドを用いて、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法など公知の方法で実施できる。
ノーザンブロット法を利用する場合は、具体的には、ＰＧＣ１αｂ遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチド及び／又はその相補的なポリヌクレオチドをプライマーまたはプローブとして用いることによって、ＲＮＡ中のＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。
ここで相補的なポリヌクレオチド（相補鎖、逆鎖）とは、ＰＧＣ１αｂ遺伝子の全長配列、または該塩基配列において少なくとも連続した１５塩基長の塩基配列を有するその部分配列（ここでは便宜上、これらを「正鎖」ともいう）に対して、Ａ：ＴおよびＧ：Ｃといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味するものである。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係を有するものであってもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、前述のとおりである。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも９０％、好ましくは９５％の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
また、正鎖側のポリヌクレオチドには、ＰＧＣ１αｂ遺伝子の塩基配列またはその部分配列を有するものだけでなく、上記相補鎖の塩基配列に対してさらに相補的な関係にある塩基配列からなる鎖を含めることができる。
さらに上記正鎖のポリヌクレオチド及び相補鎖（逆鎖）のポリヌクレオチドは、各々一本鎖の形態でプライマーもしくはプローブとして使用されても、また二本鎖の形態で使用されてもよい。
前記プライマーもしくはプローブは、具体的にはヒトＰＧＣ１αｂ遺伝子の塩基配列に関する配列番号１に記載される塩基配列（全長配列）からなるポリヌクレオチドであってもよいし、その相補配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。また、マウスＰＧＣ１αｂ遺伝子の塩基配列に関する配列番号３に記載される塩基配列（全長配列）もしくはラットＰＧＣ１αｂ遺伝子の塩基配列に関する配列番号５に記載される塩基配列（全長配列）からなるポリヌクレオチドであってもよいし、その相補配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。更に、前記各配列番号で示されるＰＧＣ１αｂ遺伝子もしくは該遺伝子に由来するポリヌクレオチドを選択的に（特異的に）認識するものであれば、上記全長配列若しくはその相補配列の部分配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。この場合、前記（ＩＩ）に記載のプライマーもしくはプローブを用いればよい。
なお、ここで「選択的に（特異的に）認識する」とは、例えばノーザンブロット法を用いた場合は、ＰＧＣ１αｂ遺伝子またはこれらに由来するポリヌクレオチドが特異的に検出できること、またＲＴ−ＰＣＲ法を用いた場合は、ＰＧＣ１αｂ遺伝子またはこれらに由来するポリヌクレオチドが特異的に生成されることを意味するが、それに限定されることなく、当業者が上記検出物または生成物がこれらの遺伝子に由来するものであると判断できるものであればよい。
上記のプローブもしくはプライマーは、ＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現によって生じたＲＮＡまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に認識し増幅するためのプライマーとして、または該ＲＮＡまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に検出するためのプローブとして利用することができる。
具体的には、前記プライマーもしくはプローブを放射性同位元素（３２Ｐ、３３Ｐなど：ＲＩ）や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした細胞由来のＲＮＡとハイブリダイズさせた後、形成された前記プライマーもしくはプローブ（ＤＮＡまたはＲＮＡ）とＲＮＡとの二重鎖を、前記プライマーもしくはプローブの標識物（ＲＩ若しくは蛍光物質）に由来するシグナルを放射線検出器（ＢＡＳ−１８００ＩＩ、富士フィルム社製）または蛍光検出器で検出、測定する方法を例示することができる。また、ＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＰｈａｒａｍｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、プロトコールに従って前記プローブを標識し、被験者の生体組織由来のＲＮＡとハイブリダイズさせた後、前記プローブの標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージャーＳＴＯＲＭ８６０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で検出、測定する方法を使用することもできる。
ＲＴ−ＰＣＲ法を利用する場合は、ＰＧＣ１αｂ遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチド及び／又はその相補的なポリヌクレオチドをプライマーとして用いることによって、ＲＮＡ中のＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現の有無や発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、被験者の生体組織由来のＲＮＡから常法に従ってｃＤＮＡを調製して、これを鋳型として標的のＰＧＣ１αｂ遺伝子の領域が増幅できるように、ＰＧＣ１αｂ遺伝子の配列に基づき調製した一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせて、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する方法を例示することができる。なお、増幅された二本鎖ＤＮＡの検出は、上記ＰＣＲを予めＲＩや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法、産生された二本鎖ＤＮＡを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識した前記プライマーをプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。なお、生成された標識二本鎖ＤＮＡ産物はアジレント２１００バイオアナライザ（横河アナリティカルシステムズ社製）などで測定することができる。また、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で該プロトコールに従ってＲＴ−ＰＣＲ反応液を調製し、ＡＢＩ  ＰＲＩＭＥ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で反応させて、該反応物を検出することもできる。
また、ＰＧＣ１αｂ遺伝子の遺伝子発現レベルは、ＤＮＡチップを利用して検出あるいは定量することもできる。この場合、前記のＰＧＣ１αｂ遺伝子を特異的に認識するポリヌクレオチドをチップのプローブとして使用することができる（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅ  Ｃｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ９５  Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅの場合、２５ｂｐの長さのポリヌクレオチドプローブとして用いられる）。かかるＤＮＡチップを、本評価方法で用いる細胞から調製される標識ＤＮＡまたは標識ＲＮＡとハイブリダイズさせて、ハイブリダイズによって形成されたチップ上の前記プローブと標識ＤＮＡまたは標識ＲＮＡとの複合体を、該標識ＤＮＡまたは標識ＲＮＡの標識を指標として検出することにより、細胞でのＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現の有無または発現レベル（発現量）が評価できる。
被験物質を添加した細胞におけるＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現量が被験物質を添加しない対照細胞での発現量と比較して１．５倍以上、好ましくは２倍以上、更に好ましくは３倍以上であれば、該被験物質はＰＧＣ１αｂの発現誘導物質として選択することができる。一方、被験物質（候補物質）を添加した細胞におけるＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現が被験物質（候補物質）を添加しない対照細胞での発現量と比較して３／４倍以下、好ましくは１／２倍以下、更に好ましくは１／３倍以下であれば、該被験物質はＰＧＣ１αｂの発現抑制物質として選択することができる。
あるいは、被験物質存在下における、ＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現量（以下、測定値１と記す。）を、被験物質非存在下における当該遺伝子の発現量（以下、測定値２と記す。）と比較することによって、被験物質のＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現誘導活性もしくは発現抑制活性を評価することができる。この場合、前記測定値を用いて、下記の式に従って発現誘導率として求めるとよい。
発現誘導率（％）＝｛（測定値１−測定値２）／測定値２｝×１００
被験物質のＰＧＣ１αｂ遺伝子発現誘導率が、統計学的に有意な値を示す物質、具体的に好ましくは、例えば、３０％以上を示す物質、より好ましくは５０％以上を示す物質を、ＰＧＣ１αｂ発現誘導能力を有する物質として選抜する。尚、測定値が負の値を示す場合、当該被験物質は発現抑制物質である。
実施例に示すように、筋肉細胞では、運動刺激により特異的かつ迅速にＰＧＣ１αｂ遺伝子が発現上昇している。この知見は、ＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現は糖代謝応答性であることを示している。
よって、本発明の評価方法で得られるＰＧＣ１αｂ遺伝子発現促進剤は、後述する糖代謝改善剤等として利用される。
（Ｖ−２）抗体を用いる方法
また、本発明は下記の工程（１）、（２）及び（３）の工程を含む、ＰＧＣ１αｂの発現制御能力の評価方法に関する：
（１）被験物質とＰＧＣ１αｂを発現可能な細胞とを接触させる工程、
（２）被験物質を接触させた細胞のＰＧＣ１αｂの発現量を測定し、該発現量を、被験物質を接触させない対照細胞のＰＧＣ１αｂの発現量と比較する工程、
（３）（２）の比較結果に基づいて、ＰＧＣ１αｂの発現量を変動させるか否かを指標として被験物質のＰＧＣ１αｂの発現制御能力を評価する工程。
本発明スクリーニング方法に用いられる細胞は、内在性および外来性を問わず、ＰＧＣ１αｂを有する培養細胞全般を挙げることができる。具体的には上記（Ｖ−１）項に記載された細胞を挙げることができる。
ＰＧＣ１αｂの発現はＰＧＣ１αｂ遺伝子発現産物であるタンパク質を検出することにより、容易に確認することができる。
本発明の評価方法にかかるＰＧＣ１αｂの発現量は、前記（ＩＩＩ）に記載の抗体（例えば配列番号２で表されるヒトＰＧＣ１αｂ、または配列番号４もしくは６で表されるそのホモログを認識する抗体）を用いたウェスタンブロット法等の公知方法に従って定量できる。ウェスタンブロット法は、一次抗体として本発明の抗体を用いた後、二次抗体として１２５Ｉなどの放射性同位元素、蛍光物質、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等の酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器（ＢＡＩ−１８００ＩＩ：富士フィルム社製など）、蛍光検出器などで測定することによって実施できる。また、一次抗体として本発明の抗体を用いた後、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャム  ファルマシアバイオテク社製）を利用して該プロトコールに従って検出し、マルチバイオメージャーＳＴＯＲＭ８６０（アマシャム  ファルマシアバイオテク社製）で測定することもできる。
被験物質となりえるもの、または対照細胞としては、前記（Ｖ−１）と同じものが挙げられる。
被験物質を添加した細胞におけるＰＧＣ１αｂの発現量が被験物質を添加しない対照細胞での発現量と比較して１．５倍以上、好ましくは２倍以上、更に好ましくは３倍以上であれば、該被験物質はＰＧＣ１αｂの発現誘導物質として選択することができる。一方、被験物質（候補物質）を添加した細胞におけるＰＧＣ１αｂの発現が被験物質（候補物質）を添加しない対照細胞での発現量と比較して３／４倍以下、好ましくは１／２倍以下、更に好ましくは１／３倍以下であれば、該被験物質はＰＧＣ１αｂの発現抑制物質として選択することができる。
あるいは、被験物質存在下における、ＰＧＣ１αｂの発現量（以下、測定値１と記す。）を、被験物質非存在下におけるＰＧＣ１αｂの発現量（以下、測定値２と記す。）と比較することによって、当該被験物質のＰＧＣ１αｂの発現誘導活性もしくは発現抑制活性を評価することができる。この場合、前記測定値を用いて、下記の式に従って発現誘導率として求めるとよい。
発現誘導率（％）＝｛（測定値１−測定値２）／測定値２｝×１００
被験物質のＰＧＣ１αｂ発現誘導率が、統計学的に有意な値を示す物質、具体的に好ましくは、例えば、３０％以上を示す物質、より好ましくは５０％以上を示す物質を、ＰＧＣ１αｂ発現誘導能力を有する物質として選抜する。尚、測定値が負の値を示す場合、当該被験物質は発現抑制物質である。
（Ｖ−３）プロモーター活性を指標とする方法
また本発明は、下記の工程（１）、（２）及び（３）を含む、ＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現制御能力の評価方法を包含する：
（１）被験物質と、本発明のプロモーターを結合されてなるレポーター遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（２）被験物質を接触させた細胞の前記レポーター遺伝子の発現量を測定し、該発現量を、被験物質を接触させない対照細胞の前記レポーター遺伝子の発現量と比較する工程、及び
（３）（２）の比較結果に基づいて、前記レポーター遺伝子の発現量を変動させるか否かを指標として被験物質のＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現制御能力を評価する工程。
使用される細胞としては、哺乳動物細胞を宿主とする本発明形質転換細胞が好ましく、哺乳動物の骨格筋由来細胞を宿主とする本発明形質転換細胞が特に好ましい。由来動物種としては、ラット、マウス、モルモット等のげっ歯類哺乳動物、イヌ、サル、ヒト等が挙げられる。以上に挙げたような細胞の他、細胞の集合体である組織（例えば筋肉組織片）も、本発明のスクリーニングに用いられる「細胞」の範疇に含まれる。
前記形質転換細胞は、以下のようにして調製することができる。
まず本発明プロモーターを、グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールトランスアセチラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ及びグリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）等のレポーター遺伝子（その発現を解析することができる遺伝子）に機能可能な形で連結することにより、本発明プロモーターを機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を調製する。ここで「機能可能な形で連結する」とは、ある遺伝子と一つまたはそれ以上の調節配列とが、適した外来性のシグナル又は因子が調節配列に結合した時に遺伝子発現が可能となるような様式で連結することを意味する。次に、本発明プロモーターを機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を通常の遺伝子工学的手法を用いて、当該レポーター遺伝子を導入する細胞において使用可能なベクターに挿入することにより、プラスミドを作製する。次いで、前記プラスミドを細胞へ導入する。細胞への導入法としては、例えば、リン酸カルシウム法、電気導入法、ＤＥＡＥデキストラン法、ミセル形成法等を挙げることができる。リン酸カルシウム法としてはＧｒｉｍｍ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，１０９２３−１０９２７等に記載される方法、電気導入法及びＤＥＡＥデキストラン法としてはＴｉｎｇ，Ａ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１５，６１８９−６１９６等に記載される方法、ミセル形成法としてはＨａｗｋｉｎｓ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，１３７８６−１３７９０等に記載される方法を挙げることができる。ミセル形成法を用いる場合には、リポフェクトアミン（ギブコ製）やフュージーン（ベーリンガー製）等の市販の試薬を利用するとよい。
前記プラスミドの導入処理を施した細胞を、例えば、当該ベクターに予め含まれる選抜マーカー遺伝子を利用し、当該選択マーカー遺伝子に応じた選抜条件の培地で培養することにより、形質転換細胞を選抜することができる。
また、前記形質転換細胞は、後述する形質転換非ヒト動物の組織から通常の方法により調製してもよい。
被験物質となりえるものとしては、制限されないが、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物などであり、スクリーニングは、具体的には被験物質を含む試料（被験試料）を上記組織／または細胞と接触させて行うことができる。かかる被験試料としては特に限定は無く、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物、土壌抽出液などが挙げられるが、これに制限されない。
上記の工程（１）において、本発明プロモーターを機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を含有する細胞と接触させる被験物質の濃度は、通常約０．１μＭ〜約１００μＭであればよく、約１μＭ〜約５０μＭが好ましく、約１μＭ〜約１０μＭがより好ましい。当該細胞と被験物質とを接触させる時間は、通常、約１時間以上５日程度であり、数時間から４日程度が好ましい。好ましくは、１８時間以上６０時間程度であり、より好ましくは２４時間から４０時間程度が挙げられる。
当該細胞と被験物質との接触は、当該細胞が成育可能な条件で培養しながら行えばよい。例えば、哺乳動物細胞を宿主とする本発明形質転換細胞の場合、適宜ウシ胎児血清等の哺乳動物由来の血清を添加したＤ−ＭＥＭ、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ製）等の市販の培地中で培養できる。培養は、通常約３０℃〜約４０℃、約２％（Ｖ／Ｖ）〜１０％（Ｖ／Ｖ）二酸化炭素存在下で実施すればよく、約３５℃〜約３７℃、約４％（Ｖ／Ｖ）〜約６％（Ｖ／Ｖ）二酸化炭素存在下で実施するのがより好ましい。
被験物質と接触させる際の当該細胞の細胞数は、例えば２４ウェルプレートを用いる場合、通常約１×１０５個／ウェル〜約１×１０６個／ウェルであればよく、約５×１０５個／ウェル〜約８×１０５個／ウェルが好ましい。
前記の工程（２）における「対照細胞」とは、前記工程（１）で用いられるレポーター遺伝子を発現可能な細胞において、被験物質を接触させない場合の当該細胞を表す。「被験物質を接触させない場合」には、被験物質の代わりに被験物質と同量の溶媒（ブランク）を添加する場合や、レポーター遺伝子の発現に影響を与えないネガティブコントロール物質を添加する場合も含まれる。
また、被験物質と細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、該細胞が死なないように、その培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を大きく変化させない条件を採用することが好ましい。
上記の探索方法において、「レポーター遺伝子の発現量をモニターする」方法としては、前記形質転換細胞中におけるレポーター遺伝子の発現量を時間経過に沿って連続的に又は不連続に測定できる方法であればどのような方法であってもよい。例えば、レポーター遺伝子として酵素遺伝子を用いる場合には当該酵素の活性測定を利用し、またレポーター遺伝子の発現産物、即ち当該遺伝子に対応するｍＲＮＡもしくは当該遺伝子に対応する蛋白質を検出する方法（具体的にはノザンブロッティング、ウェスタンブロッティング等）等を利用すればよい。
レポーター遺伝子として酵素遺伝子を用いる場合における当該酵素の活性測定を利用する方法において、使用され得るレポーター遺伝子としては、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、βガラクトシダーゼ等、発現生成した蛋白質の活性の測定が容易であるものを好ましく挙げることができる。レポーター遺伝子としてはルシフェラーゼ遺伝子を用いる場合には次のようにすればよい。（１）例えば本発明プロモーターの制御下にルシフェラーゼ遺伝子を含む本発明プラスミドを導入された本発明形質転換細胞を数日間培養後、当該細胞の抽出物を得る。（２）当該抽出物をルシフェリンおよびＡＴＰと反応させて化学発光させ、その発光強度を測定することによりプロモーター活性を検出できる。この際、ピッカジーンデュアルキット（東洋インキ製）等の市販のルシフェラーゼ反応検出キットを用いることができる。
前記のようにして、前記細胞と被験物質との接触および前記細胞における本発明プロモーターのプロモーター活性の測定を行い、当該プロモーター活性の上昇または低下が検出された場合、当該被験物質を、当該プロモーターに作用し当該プロモーター活性を制御する物質として選抜することができる。
すなわち、被験物質存在下におけるレポーター遺伝子の発現量が、被験物質非存在下におけうるレポーター遺伝子の発現量よりも大きければ、当該被験物質は、本発明プロモーターの機能を亢進するＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現誘導剤であるとして評価することができる。一方、被験物質存在下におけるレポーター遺伝子の発現量が、被験物質非存在下におけるレポーター遺伝子の発現量よりも小さければ、当該被験物質は、本発明プロモーターの機能を抑制するＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現抑制剤であるとして評価することができる。
具体的には、被験物質を添加した細胞におけるレポーター遺伝子の発現が被験物質を添加しない対照細胞での発現量と比較して１．５倍以上、好ましくは２倍以上、更に好ましくは３倍以上であれば、該被験物質はＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現誘導物質として選択することができる。一方、被験物質（候補物質）を添加した細胞におけるレポーター遺伝子の発現が被験物質（候補物質）を添加しない対照細胞での発現量と比較して３／４倍以下、好ましくは１／２倍以下、更に好ましくは１／３倍以下であれば、該被験物質はＰＧＣ１αｂの発現抑制物質として選択することができる。
あるいは、被験物質存在下における、本発明プロモーターを機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子の発現量（以下、測定値１と記す。）を、被験物質非存在下における当該レポーター遺伝子の発現量（以下、測定値２と記す。）と比較することによって、当該被験物質のＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現誘導活性もしくは発現抑制活性を評価することができる。この場合、前記測定値を用いて、下記の式に従って発現誘導率として求めるとよい。
発現誘導率（％）＝｛（測定値１−測定値２）／測定値２｝×１００
被験物質のＰＧＣ１αｂ遺伝子発現誘導率が、統計学的に有意な値を示す物質、具体的に好ましくは、例えば、３０％以上を示す物質、より好ましくは５０％以上を示す物質を、ＰＧＣ１αｂ発現誘導能力を有する物質として選抜する。尚、測定値が負の値を示す場合、当該被験物質は発現抑制物質である。
（ＶＩ）糖代謝改善剤等の探索方法
本発明実施例に示されるように、ＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現が亢進することにより、ミトコンドリア活性化作用が生ずる。
従って、前記（Ｖ−１）〜（Ｖ−３）に記載の評価方法で評価された被験物質のＰＧＣ１αｂ遺伝子もしくはＰＧＣ１αｂの発現促進能力を指標として、ミトコンドリア活性化能力を有する物質、すなわち糖代謝改善剤を選別する方法も又、本発明の範疇である。
すなわち、本発明は前記（Ｖ−１）〜（Ｖ−３）に記載の評価方法で評価された被験物質のＰＧＣ１αｂ遺伝子もしくはＰＧＣ１αｂの発現誘導活性を指標として、ＰＧＣ１αｂ遺伝子又はＰＧＣ１αｂの発現誘導物質（発現量を増大させる物質）を、ミトコンドリア活性化能力を有する物質、すなわち糖代謝改善剤として選択する工程を含む探索方法を提供する。
ここでミトコンドリア活性化能力とは前記と同義である。
また、前記（Ｖ−１）〜（Ｖ−３）に記載の評価方法で評価された被験物質のＰＧＣ１αｂ遺伝子もしくはＰＧＣ１αｂの発現誘導活性を指標として、ＰＧＣ１αｂ遺伝子又はＰＧＣ１αｂの発現誘導物質（発現量を増大させる物質）を、Ｇｌｕｔ４発現誘導活性を有する物質、すなわちＧｌｕｔ４発現誘導剤として選択する工程を含む、Ｇｌｕｔ４発現誘導剤の探索方法を提供する。
Ｇｌｕｔ４は、細胞における糖（すなわちグルコース）の取り込みを制御するタンパク質であり、Ｇｌｕｔ４の発現量が上昇することにより、細胞外から細胞内へ、トランスポーターを介して糖が取り込まれ、細胞へのエネルギーの補充が行われる。
運動によりエネルギーが消費される場合、細胞内のＡＭＰレベルが上昇し、ＡＴＰレベルは低下する。キナーゼの一種であるＡＭＰＫはこのような環境下で活性が上昇する。発明者らは、ＰＧＣ１αｂの発現が運動により誘導され、誘導されたＰＧＣ１αｂはＧｌｕｔ４の発現を誘導することを見出した。更にＡＭＰＫを活性化することが知られている化合物：５−ａｍｉｎｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ−４−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ  ｒｅｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ（ＡＩＣＡＲ）によってもＰＧＣ１αｂ遺伝子が発現誘導されることを見出した（実施例９を参照）。
上記のように、ＰＧＣ１αｂ遺伝子もしくはＰＧＣ１αｂの発現誘導物質は、Ｇｌｕｔ４の発現を誘導することによって、細胞内への糖取り込みを促進する活性を有する。ＰＧＣ１αｂは筋肉細胞特異的に発現しており、ＰＧＣ１αｂ遺伝子もしくはＰＧＣ１αｂの発現誘導物質は、筋肉細胞における糖取り込みを選択的に促進することを特徴とする。
上記のことから、ＰＧＣ１αｂ遺伝子もしくはＰＧＣ１αｂの発現誘導物質は、糖代謝改善能力を有する。すなわち、本発明はＰＧＣ１αｂ遺伝子もしくはＰＧＣ１αｂの発現誘導物質（発現量を増大させる物質）を、糖代謝改善能力を有する物質、すなわち糖代謝改善剤として選択する工程を含む、糖代謝改善剤の探索方法を提供する。
本発明実施例に示されるようにＰＧＣ１αｂは、筋肉細胞等に特異的に発現している。一方、従来知られているＰＧＣ１αａは筋肉細胞のみならず肝臓、腎臓、脳などの他の組織細胞でも発現している。従って、ＰＧＣ１αｂ遺伝子もしくはＰＧＣ１αｂの発現を選択的に誘導させる物質は、筋肉細胞特異的に作用する糖代謝改善剤として非常に有用である。また、ＰＧＣ１αｂ遺伝子もしくはＰＧＣ１αｂの発現を選択的に誘導または抑制する物質は、例えば当該遺伝子の翻訳産物の発現過少もしくは発現過多に起因する疾患のための医薬として有用である。
従って、糖代謝改善剤の候補物質のうち、被験物質を添加した細胞におけるＰＧＣ１αａ遺伝子の発現量が被験物質を添加しない対照細胞における当該遺伝子の発現量と比較して、有意な発現誘導もしくは発現抑制を示さない物質、すなわちＰＧＣ１αａ遺伝子もしくはＰＧＣ１αａの発現量を変動させない物質であるものを選別することが望ましい。尚、被験物質がＰＧＣ１αａの発現を誘導もしくは制御するかどうかは、前記（Ｖ−１）〜（Ｖ−３）に記載の評価方法と同様の方法で、被験物質の存在下及び非存在下にＰＧＣ１αａの発現レベルを定量することで判断することができる。
また、前記（Ｖ−３）に記載の方法で評価することによって選別される、本発明プロモーターを活性化する物質は、本発明プロモーターの制御下に連結した所望のＤＮＡ、例えば前記ＰＧＣ１αｂ等の筋肉細胞における作用等を検討する際の転写調節剤として利用することもできる。
（ＶＩＩ）予防剤、改善剤及び治療剤
本発明の探索方法で得られる糖代謝改善剤は、糖代謝の異常な低下の改善作用を示す。
すなわち、本発明の探索方法は、インスリン抵抗性糖尿病、及び／又は肥満等の代謝性疾患の予防／改善／治療薬の有効成分となる候補物質を提供するものである。
当該有効成分となるＰＧＣ１αｂ遺伝子もしくはＰＧＣ１αｂの発現誘導物質もしくは発現抑制物質（これらをまとめて発現制御物質と称する。）は、上記のスクリーニング方法を利用して選別されたもののみならず、選別された物質に関する情報に基づいて常法に従って工業的に製造されたものであってもよい。
上記探索方法によって選別されるＰＧＣ１αｂ遺伝子もしくはＰＧＣ１αｂの発現誘導剤の候補物質の中から、さらにインスリン抵抗性糖尿病及び／又は肥満等の代謝性糖代謝疾患の改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質を選別する方法としては、従来公知である如何なる選別方法をも用いることができるが、代表的な方法として、例えばインスリン負荷試験、ブドウ糖負荷試験を挙げることができる。
本発明遺伝子・タンパク質の発現制御物質は、そのままもしくは自体公知の薬学的に許容される担体（賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤などが含まれる）や慣用の添加剤などと混合して医薬組成物として調製することができる。当該医薬組成物は、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤などの非経口投与剤）等に応じて経口投与または非経口投与することができる。また投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象または患者の年齢、体重、症状などによって異なり一概に規定できないが、１日投与用量として、数ｍｇ〜２ｇ、好ましくは数十ｍｇ程度を、１日１〜数回にわけて投与することができる。
また、上記の物質がＤＮＡによりコードされるものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組み込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。これらの場合も、投与量、投与方法は患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
上記遺伝子治療につき詳述すれば、該遺伝子治療は、通常のこの種の遺伝子治療と同様にして、例えばＰＧＣ１αｂ遺伝子またはそれらの化学的修飾体（以下本遺伝子と称することがある。）を直接患者の体内に投与することにより目的遺伝子の発現を制御する方法、もしくはこれらの遺伝子を患者の標的細胞に導入することにより該細胞による目的遺伝子の発現を制御する方法により実施できる。
ここで前記化学修飾体としては、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホトリエステル、アルキルホスホナート、アルキルホスホアミデートなどの、細胞内への移行性または細胞内での安定性を高め得る誘導体（″Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ＤＮＡ″ＷＩＬＥＹ−ＬＩＳＳ刊、１９９２年、ｐｐ．１−５０、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６，：１９２３−１９３７（，１９９３））が含まれる。これらは常法に従い合成することができる。
本遺伝子は、その投与に当たり、通常慣用される安定化剤、緩衝液、溶媒などを用いて製剤化され得る。
本遺伝子を患者の標的細胞に導入する方法において、用いられるポリヌクレオチドは、好ましくは１００塩基以上、より好ましくは３００塩基以上、さらに好ましくは５００塩基以上の長さを有するものでミトコンドリア活性化能力を有する蛋白質を発現するものとすればよい。また、この方法は、生体内の細胞に遺伝子を導入するｉｎ  ｖｉｖｏ法および一旦体外に取り出した細胞に遺伝子を導入し、該細胞を体内に戻すｅｘ  ｖｉｖｏ法を包含する（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，１２（１５），全頁（１９９４）など参照）。この内ではｉｎ  ｖｉｖｏ法が好ましく、これには、ウイルス的導入法（組換えウイルスを用いる方法）と非ウイルス的導入法がある（前記各文献参照）。
上記組換えウイルスを用いる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルスなどのウイルスゲノムにＰＧＣ１αｂ遺伝子のポリヌクレオチドを組込んで生体内に導入する方法が挙げられる。この中では、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスなどを用いる方法が特に好ましい。非ウイルス的導入法としては、リポソーム法、リポフェクチン法などが挙げられ、特にリポソーム法が好ましい。他の非ウイルス的導入法としては、例えばマイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法なども挙げられる。
遺伝子治療用製剤組成物は、本遺伝子又はこれらを含む組換えウイルスおよびこれらウイルスが導入された感染細胞などを有効成分とするものである。該組成物の患者への投与形態、投与経路などは、治療目的とする疾患、症状などに応じて適宜決定できる。例えば注射剤などの適当な投与形態で、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することができ、また患者の疾患対象部位に直接投与、導入することもできる。ｉｎ  ｖｉｖｏ法を採用する場合、遺伝子治療用組成物は、本遺伝子を含む注射剤などの投与形態の他に、例えば本遺伝子を含有するウイルスベクターをリポソームまたは膜融合リポソームに包埋した形態（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソームなど）とすることができる。これらのリポソーム製剤形態には、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤などが含まれる。また、遺伝子治療用組成物は、本遺伝子を含有するベクターを導入されたウイルスで感染された細胞培養液の形態とすることもできる。これら各種形態の製剤中の有効成分の投与量は、治療目的である疾患の程度、患者の年齢、体重などにより適宜調節することができる。通常、患者成人１人当たり約０．０００１−１００ｍｇ、好ましくは約０．００１−１０ｍｇが数日ないし数カ月に１回投与される量とすればよい。本遺伝子を含むレトロウイルスベクターの場合は、レトロウイルス力価として、１日患者体重１ｋｇ当たり約１ｘ１０３ｐｆｕ−１ｘ１０１５ｐｆｕとなる量範囲から選ぶことができる。本遺伝子を導入した細胞の場合は、１ｘ１０４細胞／ｂｏｄｙ−１ｘ１０１５細胞／ｂｏｄｙ程度を投与すればよい。
（ＶＩＩＩ）本発明プロモーターと結合する物質の探索方法
本発明は、以下の（１）及び（２）の工程を有することを特徴とする、本発明プロモーターと結合する物質の探索方法を包含する：
（１）〔５〕記載のプロモーターと被験物質とを接触させる工程、
（２）前記（１）の工程後に、当該プロモーターと被験物質との複合体生成の有無を調べる工程。
本発明プロモーターと被験物質とを接触させる工程（１）に使用されるプロモーターは、例えば市販のＤＮＡ標識キットを用い、ラジオアイソトープ若しくは蛍光色素化合物で標識したものを用いることができ、当該プロモーターと被験物質との複合体の検出が容易になる点で好ましい。当該プロモーターを放射性同位元素により標識するには、例えば、市販のＲａｎｄｏｍ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｋｉｔ等を用いることができ、通常のＰＣＲ反応組成中のｄＣＴＰを［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰに替えて、当該ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ反応を行うことにより、標識を行うこともできる。また、当該ＤＮＡを蛍光色素で標識する場合には例えば、ＥＣＬ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ等を用いることができる。
当該プロモーターと被験物質とを、約４℃〜約３７℃、好ましくは約２０℃〜約３０℃で、約５分間〜約６０分間、好ましくは約１０分間〜約３０分間適当なバッファー中、例えばトリス、Ｈｅｐｅｓ、ＭＥＳ等のバッファー中、好ましくはＨｅｐｅｓバッファー中で接触させる。被験物質の濃度は通常約０．１μＭ〜約１，０００μＭであればよく、１μＭ〜１００μＭが好ましい。当該ＤＮＡの量は通常約１ｆｍｏｌ〜約１０ｆｍｏｌであればよく、２ｆｍｏｌ〜７ｆｍｏｌが好ましい。
当該プロモーターと被験物質との複合体生成の有無を調べる方法としては、ゲルシフト法、フットプリント法、ＢＩＡＣＯＲＥ法等を挙げることができる。被験物質が比較的高分子量の化合物（例えばタンパク質、ＤＮＡ等）の場合、ゲルシフト法、フットプリント法等を用いるとよい。被験物質が比較的低分子量の化合物の場合、ＢＩＡＣＯＲＥ法、例えば「永田和宏・半田宏共著  生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法−ＢＩＡＣＯＲＥを中心に−  シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社」記載の方法を用いるとよい。例えば、ゲルシフト法の場合、先ず当該ＤＮＡと被験物質混合液を、通常の方法でポリアクリルアミドゲル電気泳動に供する。電気泳動後のポリアクリルアミドゲルを乾燥した後、例えば、オートラジオグラフィーなどに供してゲル上の当該ＤＮＡの位置を検出することにより、当該ＤＮＡと被験物質が結合しているかどうか調べることが出来る。具体的には例えば、乾燥したゲルをイメージングプレートに約１時間〜約１晩、より好ましくは６〜８時間感光し、ＢＡＳ２０００で画像イメージを取得する。被験物質が当該プロモーターと結合した場合、プロモーター−被験物質複合体の移動度が遊離のプロモーターより小さくなり、画像イメージ上のバンドのシフトが起こる。バンドのシフトが検出された場合の被験物質を、本発明プロモーターと結合する物質として選抜することが出来る。当該結合物質は、本発明プロモーターに結合できることから、本発明プロモーターのプロモーター活性を制御し得る。さらに、本発明プロモーターの制御下にある遺伝子の細胞内での発現を制御し得る。具体的には、本発明プロモーターに結合する転写因子等が挙げられる。よって、当該物質は、当該遺伝子の翻訳産物の発現過多もしくは発現過少に起因する疾患のための医薬として有用である。また、本発明プロモーターの制御下に連結した所望のＤＮＡ、例えば骨格筋との関連が推定されるＤＮＡ等の骨格筋における作用やミトコンドリア活性化への影響を検討する際の転写調節剤として利用することもできる。
前記被験物質としては、特に限定は無く、例えば上記（Ｖ−１）に記載の物質を用いることができる。
（ＩＸ）本発明のプロモーターと結合する物質の精製方法
また、本発明は、以下の（１）及び（２）の工程を含む、本発明のプロモーターと結合する物質の精製方法に関する：
（１）〔５〕記載のプロモーターと試料とを接触させて、当該プロモーターと当該試料中に含有される当該プロモーターと結合する物質との複合体を生成させる工程、及び、
（２）前記（１）の工程後、生成させた複合体から当該結合物質を単離する工程、を有することを特徴とする精製方法。
本発明精製方法について以下に説明する。
本発明精製方法は、本発明プロモーターと試料とを接触させて、当該プロモーターと当該試料中に含有される当該プロモーターと結合する物質との複合体を生成させる第一工程、及び、前記第一工程後、生成させた複合体から当該結合物質を単離する第二工程を含む。
本発明プロモーターと試料とを接触させる際には、通常、当該プロモーターを担体に結合させた形態で試料との接触を行うと、当該プロモーターもしくは当該プロモーターと結合物質との複合体を容易に回収できる点で好ましい。当該プロモーターを結合させる担体の種類は特に限定されないが、例えば、市販のアフィニティークロマトグラフィー用担体、好ましくは臭化シアン活性化セファロース４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）等を使用することができる。当該プロモーターを担体に結合させる場合には、当該プロモーターを直接担体に結合させる方法と、スペーサーを介して結合させる方法がある。結合させる際の条件は、例えば、当該プロモーターと臭化シアン活性化セファロース４Ｂを混合し、約４℃〜約１０℃で１晩１０００ｒｐｍで撹拌し、当該プロモーターをセファロース上に固定する。ついで、未反応の臭化シアンの活性基を無くすために、アミノ基を持つ化合物を含んだバッファー、例えば、１Ｍグリシンを含む炭酸水素ナトリウム溶液中で、例えば約４℃〜約１０℃で１晩放置する。得られたゲルは、通常のバッチ法により試料と接触させてもよく、また、そのゲルを市販のクロマトグラフ管に充填することで、本発明プロモーターと結合する物質用アフィニティーカラムを作製し、通常のカラムクロマトグラフィー法により試料と接触させてもよい。
例えば、カラムクロマトグラフィー法で接触・単離を行う場合、前記した試料をアフィニティーカラムに供し当該プロモーターとプロモーター結合物質の複合体を形成せしめた後、担体の洗浄、結合物質の溶出を通常の方法で行うことで、結合物質を単離することができる。具体的には、まず試料をロードし、次いで、ロードするときと同組成のバッファーで洗浄し、複合体形成しなかった試料中成分を除去する。その後、バッファーに含まれる塩濃度を上昇させるグラジエントを行い本発明プロモーターと結合する物質を溶出することによって、本発明プロモーターと結合する物質を単離することができる。溶出に使われる前記の塩は、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫安等を挙げることができる。
ここで「試料」として用いられるものには特に限定は無く、上述の（Ｖ−１）等に挙げられる被験物質、合成化合物ライブラリー、生体由来試料等が挙げられる。生体由来試料としては、任意の培養細胞由来の縣濁液もしくは抽出物、動物組織由来の縣濁液もしくは抽出物等が挙げられる。試料としてヒト由来の組織・細胞の抽出物を用いることによって、ＰＧＣ１αｂプロモーターと結合する内因性の物質を探索することができる。
本発明精製方法によって、本発明プロモーターのプロモーター活性を制御する物質の選抜方法によって選抜される物質又は本発明プロモーターと結合する物質の選抜方法によって選抜される物質を精製することができる。
【実施例】  以下の実施例で本発明を具体的に詳細に説明するが、もとより本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１
（ｃＤＮＡの調製）
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、組織からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １０μｇ、Ｔ７−（ｄＴ）２４プライマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）１００ｐｍｏｌを含む１１μｌの混合液を、７０℃、１０分間加熱後、氷上で冷却した。冷却後、当該混合液に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）に含まれる５ｘＦｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４μｌ、該キットに含まれる０．１Ｍ  ＤＴＴ  ２μｌ及び当該キットに含まれる１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ  １μｌを添加し、この混合液を４２℃、２分間加熱した。更に、当該混合液に、当該キットに含まれるＳｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＩＩ  ＲＴ  ２μｌ（４００Ｕ）を添加し、この混合液を４２℃、１時間加熱後、氷上で冷却した。冷却後、当該混合液にＤＥＰＣ処理滅菌蒸留水９１μｌ、当該キットに含まれる５ｘＳｅｃｏｎｄ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ３０μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ  ３μｌ、当該キットに含まれるＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ  １μｌ（１０Ｕ）、当該キットに含まれるＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ  ４μｌ（４０Ｕ）及び当該キットに含まれるＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  １μｌ（２Ｕ）を添加し、この混合液を１６℃、２時間反応させた。次いで、当該混合液に当該キットに含まれるＴ４  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ２μｌ（１０Ｕ）を加え、この混合液を１６℃、５分間反応させた後、当該混合液に０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  １０μｌを添加した。次いで、この混合液にフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール溶液（ニッポンジーン社製）１６２μｌを添加し、混合した。当該混合液を、予め室温、１４，０００ｒｐｍ、３０秒間遠心分離しておいたＰｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  Ｇｅｌ  Ｌｉｇｈｔ（エッペンドルフ社製）に移し、これを室温、１４，０００ｒｐｍ、２分間遠心分離した。遠心分離後、１４５μｌの水層をエッペンドルフチューブに回収した。回収された水層に、７．５Ｍ酢酸アンモニウム溶液７２．５μｌ及びエタノール３６２．５μｌを加え混合した後、この混合液を４℃、１４，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した。遠心分離後、上清を捨て、ＤＮＡペレットを得た。その後、ＤＮＡペレットに８０％エタノール０．５ｍＬを添加した。この混合液を４℃、１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、上清を捨て、ＤＮＡペレットを再び得た。得られたＤＮＡペレットに再度８０％エタノール０．５ｍＬを添加した。この混合液を４℃、１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、上清を捨て、ＤＮＡペレットを得た。得られたＤＮＡペレットを乾燥させた後、ＤＥＰＣ処理滅菌蒸留水１２μｌに溶解することにより、ｃＤＮＡ溶液を得た。
実施例２
（ヒトＰＧＣ−１αｂ遺伝子のクローニング）
ヒトｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）１μＬ、配列番号９で示される塩基配列からなるプライマー２０ｐｍｏｌ、配列番号１０で示される塩基配列からなるプライマー  ２０ｐｍｏｌ、Ｅｘ−ｔａｑ（宝酒造社）１μＬ、Ｅｘ−ｔａｑ添付のバッファー  ５μＬ及びｄＮＴＰ  ４μＬを含む５０μＬの反応液を調製し、ＰＣＲを行った。当該ＰＣＲでは、まず９４℃で１分間、次いで６０℃で１分間、更に７２℃で２分間からなる保温サイクルが４０回繰り返された。ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動することにより、約２．４ｋｂｐの大きさのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。精製されたＤＮＡを水２０μＬに溶解し、そのうち１μＬとｐＴ７−Ｂｌｕｅ（宝酒造社）とを混合し当該混合物をライゲーションキットｖｅｒ．１（宝酒造社）を用いて１６℃で１時間のライゲーション反応に供した。このようにして得られたライゲーション反応液２０μＬとＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡社）とを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９形質転換細胞を得た。当該形質転換細胞を５０μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培地１００ｍＬで培養して得られた培養菌体からＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて配列番号１に示す本発明ヒトＰＧＣ１αｂ遺伝子の塩基配列を含む組換えベクターを精製・単離した。
実施例３
（マウスＰＧＣ−１αｂ遺伝子のクローニング）
マウス骨格筋ｃＤＮＡライブラリー（宝酒造製）１μＬ、配列番号１１で示される塩基配列からなるプライマー２０ｐｍｏｌ、配列番号１２で示される塩基配列からなるプライマー  ２０ｐｍｏｌ、Ｅｘ−ｔａｑ（宝酒造社）１μＬ、Ｅｘ−ｔａｑ添付のバッファー  ５μＬ及びｄＮＴＰ  ４μＬを含む５０μＬの反応液を調製し、ＰＣＲを行った。当該ＰＣＲでは、まず９４℃で１分間、次いで６５℃で１分間、更に７２℃で２分間からなる保温サイクルが４０回繰り返された。ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動することにより、約２．４ｋｂｐの大きさのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。精製されたＤＮＡを水２０μＬに溶解し、そのうち１μＬとｐＴ７−Ｂｌｕｅ（宝酒造社）とを混合し当該混合物をライゲーションキットｖｅｒ．１（宝酒造社）を用いて１６℃で１時間のライゲーション反応に供した。このようにして得られたライゲーション反応液２０μＬとＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡社）とを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９形質転換細胞を得た。当該形質転換細胞を５０μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培地１００ｍＬで培養して得られた培養菌体からＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて配列番号３に示す本発明マウスＰＧＣ１αｂ遺伝子の塩基配列を含む組換えベクターを精製・単離した。
実施例４
（ラットＰＧＣ−１αｂ遺伝子のクローニング）
ラットｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）１μＬ、配列番号１３で示される塩基配列からなるプライマー２０ｐｍｏｌ、配列番号１４で示される塩基配列からなるプライマー  ２０ｐｍｏｌ、Ｅｘ−ｔａｑ（宝酒造社）１μＬ、Ｅｘ−ｔａｑ添付のバッファー  ５μＬ及びｄＮＴＰ  ４μＬを含む５０μＬの反応液を調製し、ＰＣＲを行った。当該ＰＣＲでは、まず９４℃で１分間、次いで６５℃で１分間、更に７２℃で２分間からなる保温サイクルが４０回繰り返された。ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動することにより、約２．４ｋｂｐの大きさのＤＮＡを回収する。回収されたＤＮＡをＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製する。精製されたＤＮＡを水２０μＬに溶解し、そのうち１μＬとｐＴ７−Ｂｌｕｅ（宝酒造社）とを混合し当該混合物をライゲーションキットｖｅｒ．１（宝酒造社）を用いて１６℃で１時間のライゲーション反応に供する。このようにして得られたライゲーション反応液２０μＬとＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡社）とを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９形質転換細胞を得る。当該形質転換細胞を５０μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培地１００ｍＬで培養して得られた培養菌体からＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて配列番号５に示す本発明ラットＰＧＣ１αｂ遺伝子の塩基配列を含む組換えベクターを精製・単離できる。
実施例５
（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＲＴ−ＰＣＲ法を利用する場合は、マウス筋肉組織、あるいはマウス横紋筋由来培養細胞Ｃ２Ｃ１２から調製したＲＮＡを、あるいは得られたＲＮＡを鋳型としてＴａｑＭａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＡＢＩ社製）を用いて調製したｃＤＮＡを鋳型として定量しようとする遺伝子をコードする塩基配列領域が特異的に増幅できるように、一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）を設計し、通常の方法で合成した。マウスＰＧＣ１αｂを定量する際には配列番号１５で示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号１６で示される塩基配列からなるプライマーを用いた。合成したプライマーを用いてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてプロトコールに従ってＲＴ−ＰＣＲ反応液を調製し、ＡＢＩ  ＰＲＩＭＥ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で反応させて、該反応物を検出、定量した。以下実施例６及び７においては本実施例の方法でＲＴ−ＰＣＲを行った。
実施例６
（マウス各組織におけるＰＧＣ１αｂの発現）
マウス各組織から調製したＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲによりマウスＰＧＣ１αｂの発現の解析を行った。発現の内部標準としては３６Ｂ４遺伝子の発現定量を用い、配列番号１７で示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号１８で示される塩基配列からなるプライマーを用いた。それぞれのサンプルにおける解析対象遺伝子の発現定量値を３６Ｂ４遺伝子発現定量値で除することで相対発現量を求めた。比較のため、配列番号１９で示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２０で示される塩基配列からなるマウスＰＧＣ１αａ遺伝子を特異的に定量するプライマーを用いて比較した。結果を図１に示す。ＰＧＣ１αｂは筋肉、心臓でのみ明らかな発現が検出され、褐色脂肪組織でわずかに発現が認められた。他の肝臓を含む臓器ではこの条件においては全く発現は認められなかった。一方、これまで知られているＰＧＣ１αａにおいては褐色脂肪組織、筋肉、腎臓、脳、心臓で明らかな発現が見られ、肝臓でも発現が認められた。
実施例７
（骨格筋におけるＰＧＣ１αｂの運動依存的発現誘導）
４７〜５５週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ６ｊマウス（日本クレア）を用いた。飼育室の照明時間は、６時〜１８時までを明期、１８時〜６時までを暗期とした。飼育飼料としてＣＥ−２型固形飼料（日本クレア）、飲料水として水道水を与え飼育した。
運動負荷試験にはトレッドミル機種：ＭＫ−６８０Ｓ（ラット・マウス兼用型トレッドミル／室町機械株式会社製）を使用し、運動条件は１４ｍ／ｍｉｎ  ｘ  ４５ｍｉｎ  ｘ  ２（１０ｍｉｎ  ｉｎｔｅｒｖａｌ）で実施した。運動終了から３時間後に下肢よりヒラメ筋、長指伸筋をすばやく摘出し、液体窒素にて急速凍結することによりＲＮＡのＲＮａｓｅによる分解を防いだ。摘出したヒラメ筋、長指伸筋よりＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行なった。
５−ａｍｉｎｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ−４−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ（ＡＩＣＡＲ）処理試験にはＡＩＣＡＲ（Ｔｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）を１ｍｇ／ｇ  ｏｆ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ（５０ｍｇ／ｍｌ  ｉｎ  ｓｔｅｒｉｌｅ  ０．９％ＮａＣｌ）皮下より投与した。投与１２時間後にヒラメ筋、長指伸筋を摘出し、液体窒素にて早急に凍結し、ＲＮＡのＲＮａｓｅによる分解を防いだ。摘出したヒラメ筋、長指伸筋よりＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行なった。
発現の内部標準としては３６Ｂ４遺伝子の発現定量を用い、配列番号１７で示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号１８で示される塩基配列からなるプライマーを用いた。それぞれのサンプルにおける解析対象遺伝子の発現定量値を３６Ｂ４遺伝子発現定量値で除することで相対発現量を求めた。ＲＴ−ＰＣＲは３連で実施し、平均値、及び標準誤差を算出した。
結果を図２に示す。ＰＧＣ１αｂは運動、及びＡＩＣＡＲ処理でヒラメ筋、長指伸筋のいずれにおいても明らかな発現誘導が共通して認められた。一方、これまで知られているＰＧＣ１αａにおいては長指伸筋のＡＩＣＡＲ処理で誘導される傾向が見られたものの、ヒラメ筋、長指伸筋のいずれにおいても運動、及びＡＩＣＡＲ処理で共通した誘導は見られなかった。
実施例８
（マウスＰＧＣ１αｂアデノウイルスベクターの構築）
実施例３で調製されたマウスＰＧＣ１αｂ遺伝子のセンス鎖をコスミドベクターｐＡｘＣＡｗｔ（宝酒造社）のＳｗａＩ部位に挿入し、ｐＡｘＣＡｗｔ−ｍＰＧＣ１αｂを得た。得られたｐＡｘＣＡｗｔ−ｍＰＧＣ１αｂをλパッケージングキットＧｉｇａｐａｃｋＸＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いてインビトロパッケージングを行い大腸菌ＤＨ５αに感染させた。感染させた大腸菌を、５０ｍｌ  ５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地で培養し、Ｌａｍｂｄａ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（東洋紡社）によりコスミドＤＮＡを大量調製した。
２９３細胞（宝酒造社）を１０％ＦＣＳ添加Ｄ−ＭＥＭ培地（宝酒造社）で３７℃、５％二酸化炭素下で培養する。前述のようにして調製されたｐＡｘＣＡｗｔ−ｍＰＧＣ１αｂ  ８μｇと制限酵素処理済みＤＮＡ−ＴＰＣ（宝酒造）５μｌとを混合し、当該混合物を用いてリン酸カルシウム法にて２９３細胞にコトランスフェクションを行った。当該細胞をそのまま１８時間培養後、培地を１０％ＦＣＳ添加Ｄ−ＭＥＭ培地（宝酒造社）と交換し、さらに１２時間培養する。培養終了後、後細胞をディッシュから剥がすことにより、回収された細胞懸濁液と２９３細胞を混ぜてさらに１０％ＦＣＳ添加Ｄ−ＭＥＭ培地（宝酒造社）にて培養をつづけ、２９３細胞が完全に死滅した時点で培養液をドライアイスにて急凍した。凍結融解６回後、５０００ｒｐｍ  ５分間遠心することにより得られた上清を１次組換えアデノウイルス液（ＡｘＣＡｗｔ−ｍＰＧＣ１αｂ）として保存した。
２９３細胞（宝酒造社）に前述方法で調製された１次組換えウイルス液を１０μｌ加え、これに５％ＦＣＳ添加Ｄ−ＭＥＭ培地（宝酒造社）を加えた後、当該混合物を３７℃、５％二酸化炭素下で１時間培養した。さらに当該混合物に５％ＦＣＳ添加Ｄ−ＭＥＭ培地（宝酒造社）を加えた後、これを３７℃、５％二酸化炭素下で培養した。３日間培養後、感染させた２９３細胞を回収し、細胞から蛋白画分を抽出し、ＰＧＣ１α抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いたイムノブロットに供した。ＰＧＣ１α蛋白の発現の有無を確認することにより、組換えアデノウイルスの作成を確認した。また、ウイルス感染させた２９３細胞（宝酒造社）の培養液を回収し、これをドライアイスにて急凍した。凍結融解６回後、５０００ｒｐｍ  ５分間遠心することにより得られた上清を２次組換えアデノウイルス液として保存した。続いてこの組換えアデノウイルスＤＮＡを前記操作を繰り返すことにより継代培養した。このようにして、高力価組換えウイルスを作製した。力価の測定は既存の方法（特開平７−２９８８７７）により測定した。
実施例９
（培養筋細胞におけるＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現誘導）
マウス横紋筋由来培養細胞Ｃ２Ｃ１２へのアデノウイルスＡｘＣＡｗｔ−ｍＰＧＣ１αｂの感染実験は以下のように行った。
Ｃ２Ｃ１２細胞を１０％ＦＣＳ添加Ｄ−ＭＥＭ培地（宝酒造社）にてコンフルエントになるまで培養した後に、２％ＦＣＳ添加Ｄ−ＭＥＭ培地（宝酒造社）にて５日間培養することにより筋筒細胞への分化を誘導した。筋筒細胞への分化後、ＡｘＣＡｗｔ−ｍＰＧＣ１αｂで感染させ、４８時間後に細胞を回収し、ＲＮＡを抽出した。実施例５に記載の方法で、ＲＴ−ＰＣＲを行い、マウスＰＧＣ１αｂの発現定量を行った。
発現の内部標準としては３６Ｂ４遺伝子の発現定量を用い、配列番号１７で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号１８の塩基配列からなるプライマーを用いた。それぞれのサンプルにおける解析対象遺伝子の発現定量値を３６Ｂ４遺伝子発現定量値で除することで相対発現量を求めた。ｍｔＴＦＡ遺伝子の定量には、配列番号２１で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号２２で示される塩基配列からなるプライマー、ＵＣＰ−２遺伝子の定量には、配列番号２３で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号２４で示される塩基配列からなるプライマー、ＣＯＸＩＩ遺伝子の定量には、配列番号２５で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号２６で示される塩基配列からなるプライマー、ＮＲＦ遺伝子の定量には、配列番号２７で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号２８で示される塩基配列からなるプライマー、βＡＴＰｓｙｎｔｈａｓｅ遺伝子の定量には、配列番号２９で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号３０で示される塩基配列からなるプライマー、Ｇｌｕｔ４遺伝子の定量には、配列番号３１で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号３２で示される塩基配列からなるプライマーを用いて定量、比較した。結果を図３及び図４に示す。
アデノウイルスＡｘＣＡｗｔ−ｍＰＧＣ１αｂの感染により、ＰＧＣ１αｂの発現が見られ、その発現はウイルス量の増加により上昇した。ミトコンドリア機能に関わる遺伝子であり、ミトコンドリアにおいてエネルギー消費を起こすと考えられているＵＣＰ２、ミトコンドリアのゲノム複製や転写反応に重要な役割を示す転写因子：ｍｔＴＦＡ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ａ、多くのミトコンドリア遺伝子のプロモーターに結合する転写因子ＮＲＦ１、ミトコンドリアでの酸化的リン酸化経路に関わる遺伝子群であるβＡＴＰｓｙｎｔｈａｓｅ、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ＩＩ（ＣＯＸＩＩ）のいずれにおいてもＰＧＣ１αｂの発現の上昇に呼応した発現上昇が見られた。
実施例１０
（探索方法）
ＰＧＣ１αｂ遺伝子を発現する筋肉組織、あるいは培養細胞を用いて化合物がその発現を促進するか否かを判定することにより、ＰＧＣ１αｂ遺伝子発現誘導物質を探索することができる。マウス横紋筋由来培養細胞Ｃ２Ｃ１２を１０ｃｍ  Ｄｉｓｈ（コーニング社）に１Ｄｉｓｈ当たり５×１０５細胞ずつ巻き込む。この細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ社。以下、ＦＣＳと記す。）、及び１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）が添加されたＤ−ＭＥＭ培地（高グルコース、ＳＩＧＭＡ社）を用い、３７℃、５％二酸化炭素下で培養する。培養開始後、３日目に２％  ＨＳ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）入りの培地に交換して分化誘導を行なう。分化開始７日目のマウス横紋筋由来培養細胞Ｃ２Ｃ１２に例えば、被験物質もしくは培養溶媒（対照の場合）、および必要に応じて０．５％ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯと記す。）を添加した培地に交換することができる。１５時間後に培養されたＣ２Ｃ１２培養細胞を回収し、それぞれ培養混合物よりｔｏｔａｌＲＮＡを調製、さらにｃＤＮＡを調製する。調製したサンプルをノーザンブロット法で分析し、ＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現レベルを定量する。被験物質を添加した細胞におけるＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現が被験物質を添加しない対照細胞での発現量と比較して１．５倍以上であれば、該被験物質はＰＧＣ１αｂの発現誘導物質であり、糖代謝改善物質の候補物質として選択することができる。このとき、同様の方法で対照としてＰＧＣ１αａ遺伝子の発現レベルを定量する。糖代謝改善物質の候補物質のうち、被験物質を添加した細胞におけるＰＧＣ１αａ遺伝子の発現が被験物質を添加しない対照細胞と比較して、有意な発現誘導を示さない物質であるものを選別する。
実施例１１
（培養筋細胞におけるＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現誘導）
マウス横紋筋由来培養細胞Ｃ２Ｃ１２を１０ｃｍ  Ｄｉｓｈ（コーニング社）に１Ｄｉｓｈ当たり５×１０５細胞ずつまき込んだ。この細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ社。以下、ＦＣＳと記す。）、及び１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）が添加されたＤ−ＭＥＭ培地（高グルコース、ＳＩＧＭＡ社）を用い、３７℃、５％二酸化炭素下で培養した。培養開始後、３日目に２％  ＨＳ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）入りの培地に交換して分化誘導を行い、分化開始７日目に５−ａｍｉｎｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ−４−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ（ＡＩＣＡＲ；Ｔｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）５００μＭ、Ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ（ＳＩＧＭＡ社）１０μＭ、Ｆｏｒｋｏｌｉｎ（ＤＭＳＯ溶液ＳＩＧＭＡ社）５０μＭ、Ｃａｆｆｅｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ社）５７ｍＭ、ＣｏＣｌ２（ＳＩＧＭＡ社）１００μＭ、Ａ２３１８７（ＳＩＧＭＡ社）５００ｎＭを含む培地に交換した。１５時間後に培養されたＣ２Ｃ１２培養細胞を回収し、ＲＮＡの抽出を行なった。発現の内部標準としては３６Ｂ４遺伝子の発現定量を用い、配列番号４０と４１の配列を有するプライマーを用いた。それぞれのサンプルにおける解析対象遺伝子の発現定量値を３６Ｂ４遺伝子発現定量値で除することで相対発現量を求めた。結果を図５に示す。Ｆｏｒｋｏｌｉｎ、Ｃａｆｆｅｉｎｅ、ＡＩＣＡＲ処理条件で明らかなＰＧＣ１αｂ遺伝子の発現誘導が認められた。
実施例１２
（本発明ヒトＰＧＣ−１αｂプロモーターのクローニング）
Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）１μＬ、配列番号３６で示される塩基配列からなるプライマー２０ｐｍｏｌ、配列番号３７で示される塩基配列からなるプライマー  ２０ｐｍｏｌ、Ｅｘ−ｔａｑ（宝酒造社）１μＬ、Ｅｘ−ｔａｑ添付のバッファー  ５μＬ及びｄＮＴＰ  ４μＬを含む５０μＬの反応液を調製し、ＰＣＲを行った。当該ＰＣＲでは、まず９４℃で３０秒間、次いで６０℃で３０秒間、更に７２℃で３分間からなる保温サイクルが４０回繰り返された。ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動することにより、約３ｋｂｐの大きさのＤＮＡを回収した。
同様に配列番号４４で示される塩基配列からなるプライマー２０ｐｍｏｌ、配列番号４５で示される塩基配列からなるプライマー  ２０ｐｍｏｌを用いて約１．８ｋｂの大きさのＤＮＡ、配列番号４６で示される塩基配列からなるプライマー２０ｐｍｏｌ、配列番号４７で示される塩基配列からなるプライマー  ２０ｐｍｏｌを用いて約１．３ｋｂの大きさのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。精製されたＤＮＡを水２０μＬに溶解し、そのうち１μＬとｐＴ７−Ｂｌｕｅ（宝酒造社）とを混合し当該混合物をライゲーションキットｖｅｒ．１（宝酒造社）を用いて１６℃で１時間のライゲーション反応に供した。このようにして得られたライゲーション反応液２０μＬとＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡社）とを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９形質転換細胞を得た。当該形質転換細胞を５０μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培地１００ｍＬで培養して得られた培養菌体からＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて本発明ヒトＰＧＣ−１αｂプロモーターの塩基配列を含む組換えベクターｈＰＧＣ１αｂ−Ｐ１（３．０）−ｐＴ７Ｂｌｕｅ、ｈＰＧＣ１αｂ−Ｐ２（１．８）−ｐＴ７Ｂｌｕｅ、ｈＰＧＣ１αｂ−Ｐ３（１．３）−ｐＴ７Ｂｌｕｅを精製・単離した。
実施例１３
（本発明ヒトＰＧＣ−１αｂプロモーターの塩基配列の決定）
実施例５で精製・単離された、本発明ヒトＰＧＣ−１αｂプロモーターの塩基配列を含む組換えベクターを鋳型として、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ＩＩダイ・ターミネーターキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）及びＡＢＩ３７３ＤＮＡ配列読み取り装置（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、サンガーの方法〔Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ，Ｓ．Ｎｉｃｋｌｅｎ，Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ著、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９７７），７４，５４６３−５４６７〕により、本発明ヒトＰＧＣ−１αｂプロモーターの塩基配列を決定した。決定された約３ｋｂｐの断片の塩基配列を配列番号３３に、約１．８ｋｂｐの断片の塩基配列を配列番号３３で示される塩基配列における塩基番号１１５７から塩基番号３０００までの塩基配列、約１．３ｋｂｐの断片の塩基配列を配列番号３４に示す。尚、配列番号３４に示される塩基配列は、配列番号３３で示される塩基配列における塩基番号１６４８〜塩基番号３０００までの塩基配列に対応している。
実施例１４
（本発明ヒトＰＧＣ−１αｂプロモーター及びルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有するプラスミドの構築）
実施例１３で精製・単離された、本発明ヒトＰＧＣ−１αｂプロモーターの塩基配列を含む組換えベクターｈＰＧＣ１αｂ−Ｐ１（３．０）−ｐＴ７Ｂｌｕｅ、ｈＰＧＣ１αｂ−Ｐ２（１．８）−ｐＴ７Ｂｌｕｅ、ｈＰＧＣ１αｂ−Ｐ３（１．３）−ｐＴ７Ｂｌｕｅ５μｇを、ＫｐｎＩ及びＳａｌＩ各５Ｕを用いて７０μＬの反応液中で３７℃で１時間消化した。一方、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）５μｇをＫｐｎＩ及びＸｈｏＩ各５Ｕを用いて７０μＬの反応液中で３７℃で１時間消化した。両者の消化反応液をそれぞれ別々にアガロースゲル電気泳動に供することにより、ＤＮＡ断片を回収した。回収されたＤＮＡ断片をＱＩＡＥＸＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。精製されたＤＮＡ断片をそれぞれ水２０μＬに溶解し、この溶解液各１μＬとライゲーションキットｖｅｒ．１に含まれるＡ液１６μＬとＢ液２μＬとを混合した。当該混合物を１６℃で１時間のライゲーション反応に供した。このようにして得られたライゲーション反応液２０μＬとＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９株コンピテントセルとを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９形質転換細胞を得た。当該形質転換細胞を５０μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培地１００ｍＬで培養して得られた培養菌体からＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔを用いて本発明ヒトＰＧＣ−１αｂプロモーターの下流（３’側）にルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む組換え発現ベクター（以下、ｐｈＰＧＣ１αｂ−Ｐ１（３．０）−ｐＧＬ３ｂａｓｉｃ、ｐｈＰＧＣ１αｂ−Ｐ２（１．８）−ｐＧＬ３ｂａｓｉｃ、ｐｈＰＧＣ１αｂ−Ｐ３（１．３）−ｐＧＬ３ｂａｓｉｃと記す。）を精製・単離した。
実施例１５
（本発明マウスＰＧＣ−１αｂプロモーターのクローニング）
Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）１μＬ、配列番号４８で示される塩基配列からなるプライマー２０ｐｍｏｌ、配列番号４９で示される塩基配列からなるプライマー  ２０ｐｍｏｌ、Ｅｘ−ｔａｑ  １μＬ、Ｅｘ−ｔａｑ添付のバッファー  ５μＬ及びｄＮＴＰ  ４μＬを含む５０μＬの反応液を調製し、ＰＣＲを行った。当該ＰＣＲでは、まず９４℃で３０秒間、次いで６５℃で３０秒間、更に７２℃で３分間からなる保温サイクルが４０回繰り返された。ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動することにより、約３ｋｂｐの大きさのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。精製されたＤＮＡを水２０μＬに溶解し、そのうち１μＬとｐＴ７−Ｂｌｕｅとを混合し当該混合物をライゲーションキットｖｅｒ．１を用いて１６℃で１時間のライゲーション反応に供した。このようにして得られたライゲーション反応液２０μＬとＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９株コンピテントセルとを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９形質転換細胞を得た。当該形質転換細胞を５０μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培地１００ｍＬで培養して得られた培養菌体からＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔを用いて本発明マウスＰＧＣ−１αｂプロモーターの塩基配列を含む組換えベクターを精製・単離した。
実施例１６
（本発明マウスＰＧＣ−１αｂプロモーターの塩基配列の決定）
実施例１５で精製・単離された、本発明マウスＰＧＣ−１αｂプロモーターの塩基配列を含む組換えベクターを鋳型として、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ＩＩダイ・ターミネーターキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）及びＡＢＩ３７３ＤＮＡ配列読み取り装置（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、サンガーの方法〔Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ，Ｓ．Ｎｉｃｋｌｅｎ，Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ著、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９７７），７４，５４６３−５４６７〕により、本発明マウスＰＧＣ−１αｂプロモーターの塩基配列を決定した。決定された塩基配列を配列番号３５に示す。
実施例１７
（本発明マウスＰＧＣ−１αｂプロモーター及びルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有するプラスミドの構築）
実施例１５で精製・単離された、本発明マウスＰＧＣ−１αｂプロモーターの塩基配列を含む組換えベクター５μｇを、ＭｌｕＩ及びＳｍａＩ各５Ｕを用いて７０μＬの反応液中で３７℃で１時間消化した。一方、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）５μｇをＭｌｕＩ及びＳｍａＩを用いて７０μＬの反応液中で３７℃で１時間消化した。両者の消化反応液をそれぞれ別々にアガロースゲル電気泳動に供することにより、ＤＮＡ断片を回収した。回収されたＤＮＡ断片をＱＩＡＥＸＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。精製されたＤＮＡ断片をそれぞれ水２０μＬに溶解し、この溶解液各１μＬとライゲーションキットｖｅｒ．１に含まれるＡ液１６μＬとＢ液２μＬとを混合した。当該混合物を１６℃で１時間のライゲーション反応に供した。このようにして得られたライゲーション反応液２０μＬとＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９株コンピテントセルとを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９形質転換細胞を得た。当該形質転換細胞を５０μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培地１００ｍＬで培養して得られた培養菌体からＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔを用いて配列番号３５で示される塩基配列における塩基番号１から塩基番号３０２２までの塩基配列からなる本発明マウスＰＧＣ−１αｂプロモーターの下流（３’側）にルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む組換え発現ベクター（以下、ｍＰＧＣ１αｂ−Ｐ１（３．０）−ｐＧＬ３ｂａｓｉｃと記す。）を精製・単離した。
また、実施例１５で精製・単離された、本発明マウスＰＧＣ−１αｂプロモーターの塩基配列を含む組換えベクターがＫｐｎＩ及びＳｍａＩで切断されることにより得られたＤＮＡ断片をｐＧＬ３−ＢａｓｉｃのＫｐｎＩ及びＳｍａＩサイトに導入すること以外は上記と同様な方法に準じて、配列番号３５で示される塩基配列における塩基番号１６３１から塩基番号３０２２までの塩基配列からなる本発明マウスＰＧＣ−１αｂプロモーターの下流（３’側）にルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む組換え発現ベクター（以下、ｍＰＧＣ１αｂ−Ｐ２（１．０）−ｐＧＬ３ｂａｓｉｃと記す。）を取得した。
実施例１８
（本発明ヒトＰＧＣ−１αｂプロモーターが有する転写開始能力の測定）
マウス横紋筋由来培養細胞Ｃ２Ｃ１２を２４ウエルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）に１ウエル当たり５．０×１０４細胞ずつまき込んだ。このＣ２Ｃ１２培養細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ社。以下、ＦＣＳと記す。）及び、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）が添加されたＤ−ＭＥＭ培地（高グルコース、ＳＩＧＭＡ社）を用い、３７℃、５％二酸化炭素下で一晩培養した。次いで、ｐｈＰＧＣ１αｂ−Ｐ１（３．０）−ｐＧＬ３ｂａｓｉｃ、あるいはｐｈＰＧＣ１αｂ−Ｐ２（１．８）−ｐＧＬ３ｂａｓｉｃ、ｐｈＰＧＣ１αｂ−Ｐ３（１．３）−ｐＧＬ３ｂａｓｉｃ  １００ｎｇと、ＬａｃＺ遺伝子を含むプラスミドｐＭＥ１８ｓ−ＬａｃＺ  １００ｎｇとを混合し、これにＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２μＬ及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）０．５μＬを添加、混合し、これを２４ウエルプレート１ウエル当たりのトランスフェクション用ＤＮＡ液とした。このトランスフェクション用ＤＮＡ液を前記のＣ２Ｃ１２培養細胞に添加し、これをさらに一晩培養した。翌日、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（５０μＭ）またはＡＩＣＡＲ（５００μＭ）を含む培地に交換し、１０から１４時間後に培養されたＣ２Ｃ１２培養細胞を回収した。細胞をＤ−ＰＢＳで１回洗浄した後、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含むＤ−ＰＢＳで希釈したピッカジーンキット（東洋インキ）専用の細胞溶解剤を、１ウエル当たり１００μＬずつ添加した。これを室温で１５分間放置することにより細胞溶解液を得た。ピペットを用いて当該細胞溶解液を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移し、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２分間、４℃）することにより上澄み液を得た。得られる上澄み液のうち２０μＬを、上記キット付属のホタルルシフェラーゼ用発光基質液１００μＬに添加し、１０秒間の発光量をルミノメーター（Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ＦＬ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社）で定量した。測定された値をホタルルシフェラーゼ活性測定値（測定値Ａ）とした。次いで、前記の上澄み液にＬａｃＺ用基質液（２５ｍＭのｏ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ；ＳＩＧＭＡ社）１０μＬを添加し、マイクロプレートリーダー（ｍｏｄｅｌ  ３５５０；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で定量した。測定された値をβ−ガラクトシダーゼ活性測定値（測定値Ｂ）とした。上記の測定値Ａを上記の測定値Ｂで割った値（Ａ／Ｂ値）を算出した後、各Ｃ２Ｃ１２培養細胞細胞におけるＡ／Ｂ値を対照におけるＡ／Ｂ値で割って、各Ｃ２Ｃ１２培養細胞における相対ルシフェラーゼ活性（相対値）を算出した。尚、ここで「対照」とは、組換えプラスミドｐｈＰＧＣ１αｂ−Ｐ１（３．０）−ｐＧＬ３ｂａｓｉｃ、ｐｈＰＧＣ１αｂ−Ｐ２（１．８）−ｐＧＬ３ｂａｓｉｃ、ｐｈＰＧＣ１αｂ−Ｐ３（１．３）−ｐＧＬ３ｂａｓｉｃの代わりにｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃのみを同様な方法によりトランスフェクションして得られた対照横紋筋由来細胞を意味する。
Ｃ２Ｃ１２培養細胞を分化誘導して測定する場合には、上記と同様にトランスフェクションを行なった後、翌日に２％  ＨＳ入りの培地に交換して分化誘導を行い、さらにその翌日にＦｏｒｓｋｏｌｉｎ（５０μＭ）またはＡＩＣＡＲ（５００μＭ）による刺激を行なった。１０から１４時間後に培養されたＣ２Ｃ１２培養細胞を回収し、活性の測定を行なった。
結果を図６に示す。分化誘導を行なわなかったマウス横紋筋由来培養細胞Ｃ２Ｃ１２（未分化）と分化誘導を行なったマウス横紋筋由来培養細胞Ｃ２Ｃ１２のいずれにおいてもｐｈＰＧＣ１αｂ−Ｐ１（３．０）−ｐＧＬ３ｂａｓｉｃ、ｐｈＰＧＣ１αｂ−Ｐ２（１．８）−ｐＧＬ３ｂａｓｉｃ、ｐｈＰＧＣ１αｂ−Ｐ３（１．３）−ｐＧＬ３ｂａｓｉｃの全てにおいて対照と比較して有意なプロモーター活性が検出され、その活性はＦｏｒｓｋｏｌｉｎで約５．５から８．５倍に増強された。
実施例１９
（本発明マウスＰＧＣ−１αｂプロモーターが有する転写開始能力の測定）
マウス横紋筋由来培養細胞Ｃ２Ｃ１２を２４ウエルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）に１ウエル当たり５．０×１０４細胞ずつまき込んだ。この細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ社。以下、ＦＣＳと記す。）及び１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）が添加されたＤ−ＭＥＭ培地（高グルコース、ＳＩＧＭＡ社）を用い、３７℃、５％二酸化炭素下で一晩培養した。次いで、ｍＰＧＣ１αｂ−Ｐ２（１．０）−ｐＧＬ３ｂａｓｉｃ  １００ｎｇと、ＬａｃＺ遺伝子を含むプラスミドｐＭＥ１８ｓ−ＬａｃＺ  １００ｎｇとを混合し、これにＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２μＬ及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）０．５μＬを添加、混合し、これを２４ウエルプレート１ウエル当たりのトランスフェクション用ＤＮＡ液とした。このトランスフェクション用ＤＮＡ液を前記のＣ２Ｃ１２培養細胞に添加し、これをさらに一晩培養した。翌日、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（５０μＭ）を含む培地に交換し、１０から１４時間後に培養されたＣ２Ｃ１２培養細胞を回収し、これをＤ−ＰＢＳで１回洗浄した後、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含むＤ−ＰＢＳで希釈したピッカジーンキット（東洋インキ）専用の細胞溶解剤を、１ウエル当たり１００μＬずつ添加した。これを室温で１５分間放置することにより細胞溶解液を得た。ピペットを用いて当該細胞溶解液を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移し、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２分間、４℃）することにより上澄み液を得た。得られる上澄み液のうち２０μＬを、上記キット付属のホタルルシフェラーゼ用発光基質液１００μＬに添加し、１０秒間の発光量をルミノメーター（Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ＦＬ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社）で定量した。測定された値をホタルルシフェラーゼ活性測定値（測定値Ａ）とした。次いで、前記の上澄み液にＬａｃＺ用基質液（２５ｍＭのｏ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ；ＳＩＧＭＡ社）１０μＬを添加し、マイクロプレートリーダー（ｍｏｄｅｌ  ３５５０；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で定量した。測定された値をβ−ガラクトシダーゼ活性測定値（測定値Ｂ）とした。上記の測定値Ａを上記の測定値Ｂで割った値（Ａ／Ｂ値）を算出した後、各Ｃ２Ｃ１２培養細胞細胞におけるＡ／Ｂ値を対照におけるＡ／Ｂ値で割って、各Ｃ２Ｃ１２培養細胞における相対ルシフェラーゼ活性（相対値）を算出した。尚、ここで「対照」とは、組換えプラスミドｍＰＧＣ１αｂ−Ｐ２（１．０）−ｐＧＬ３ｂａｓｉｃの代わりにｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃのみを同様な方法によりトランスフェクションして得られた対照横紋筋由来細胞を意味する。
結果を図７に示す。ｍＰＧＣ１αｂ−Ｐ２（１．０）−ｐＧＬ３ｂａｓｉｃにおいて対照と比較して有意なプロモーター活性が検出され、その活性はＦｏｒｓｋｏｌｉｎで約１．８倍に増強された。
実施例２０
（本発明ヒトＰＧＣ−１αｂプロモーターのプロモーター活性を制御する物質の選抜）
実施例１８に記載される方法を用いて、ｐｈＰＧＣ１αｂ−Ｐ１（３．０）−ｐＧＬ３ｂａｓｉｃ、あるいはｐｈＰＧＣ１αｂ−Ｐ２（１．８）−ｐＧＬ３ｂａｓｉｃ、ｐｈＰＧＣ１αｂ−Ｐ３（１．３）−ｐＧＬ３ｂａｓｉｃがトランスフェクションされたマウス横紋筋由来培養細胞Ｃ２Ｃ１２を９６ウエルプレートに１ウエル当たり１×１０４細胞ずつまき込む。次いで、被験物質の１μＭ  ＤＭＳＯ溶液をウエルプレートに１ウエル当たり０．５μＬずつ添加し、これを一晩培養する。同時に、対照として、被験物質の１μＭ  ＤＭＳＯ溶液の代わりにＤＭＳＯ０．５μＬを添加し、これを同様に培養する。実施例１５に記載される方法を用いてホタルルシフェラーゼ活性測定値（測定値Ａ）とＬａｃＺ活性測定値（測定値Ｂ）との測定を行う。次いで、測定値Ａを測定値Ｂで割った値（Ａ／Ｂ値）を算出した後、各培養細胞におけるＡ／Ｂ値を対照におけるＡ／Ｂ値で割って、各細胞の相対ルシフェラーゼ活性（相対値）を算出する。この相対ルシフェラーゼ活性（相対値）が１より大きい場合の被験物質を、正の転写調節能力を有する物質として選抜する。逆に、この相対ルシフェラーゼ活性（相対値）が１より小さい場合の被験物質を、負の転写調節能力を有する物質として選抜する。
実施例２１
（本発明ヒトＰＧＣ−１αｂプロモーターに結合する物質の選抜）
実施例１２に記載されるｈＰＧＣ１αｂ−Ｐ１（３．０）−ｐＴ７Ｂｌｕｅ、ｈＰＧＣ１αｂ−Ｐ２（１．８）−ｐＴ７Ｂｌｕｅ、ｈＰＧＣ１αｂ−Ｐ３（１．３）−ｐＴ７Ｂｌｕｅ  ５μｇを、ＫｐｎＩ及びＳａｌＩ各１０Ｕを用いて２０μＬの反応液中で３７℃で１時間消化する。この消化反応液をアガロースゲル電気泳動に供することにより、ＤＮＡ断片を回収する。回収されたＤＮＡ断片をＱＩＡＥＸＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製する。精製されたＤＮＡ断片１μｇ、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）５μＬ、非標識ヌクレオチド（ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ）（宝酒造社）各１μＬ、１０×ｋｌｅｎｏｗ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社）２μＬ及びｋｌｅｎｏｗ酵素（宝酒造社）１μＬを混合する。これを蒸留水で合計２０μＬとする混合液を、３７℃で１時間放置することにより、標識ＤＮＡ断片を反応系内に形成させる。このように調製された反応液を、反応系内に存在する未反応［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ  と標識ＤＮＡ断片とを分離するために、１０ｍＭトリス塩酸及び１ｍＭＥＤＴＡ（以後ＴＥ溶液と表記する。）で平衡化されたＰｒｏｂｅＱｕａｎｔ  Ｇ−５０  Ｍｉｃｒｏ  Ｃｏｌｕｍｎｓに供した後、遠心分離（室温、１，２００ｒｐｍ、１分）により、標識ＤＮＡ断片を溶出させる。得られた溶出液の放射活性をシンチレーターで測定し、１０４ｃｐｍ／μＬになるようＴＥ溶液で希釈して標識ＤＮＡ断片溶液を調製する。次いで、５×バインディングバッファー（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−水酸化カリウム（ｐＨ７．８）、２５０ｍＭ  塩化カリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、２５ｍＭ  塩化マグネシウム、５０％グリセロール、２５ｍＭ  ジチオスレイトール、３．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍＬ  Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１０μｇ／ｍＬ  Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ、１０μｇ／ｍＬ  Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ及び５ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅを含有する。）５μＬ、２μｇ／μＬ  ｐｏｌｙｄＩｄＣ  １．５μＬ、１０μＭ被験物質  ５μＬ及び標識ＤＮＡ断片溶液  ２μＬを混合し、これを蒸留水で合計２５μＬにする。混合液を室温で３０分間放置した後、これをポリアクリルアミドゲル電気泳動に供する。電気泳動後、ゲルをゲル板よりはがして、ワットマン３ＭＭろ紙上にて８０℃、１時間真空ポンプにより減圧乾燥した。これをイメージングプレートに２時間感光させた後、ＢＡＳ２０００で画像イメージを取得する。被験物質が標識ＤＮＡ断片と結合し、ＤＮＡと被験物質とからなる複合体が形成された結果、ゲル上での移動度が遊離のＤＮＡ断片より小さくなり、画像イメージ上のバンドのシフトが検出された場合の被験物質を本発明プロモーターに結合する物質（即ち、結合物質）として選抜する。
実施例２２
（本発明ヒトＰＧＣ−１αｂプロモーターに結合する物質の取得方法）
（１）本発明ヒトＰＧＣ−１αｂプロモーターに結合する物質を精製するためのアフィニティーカラム（結合物質用アフィニティーカラム）の作製
実施例１２に記載されるｈＰＧＣ１αｂ−Ｐ１（３．０）−ｐＴ７Ｂｌｕｅ、ｈＰＧＣ１αｂ−Ｐ２（１．８）−ｐＴ７Ｂｌｕｅ、ｈＰＧＣ１αｂ−Ｐ３（１．３）−ｐＴ７Ｂｌｕｅ  ２００μｇを、ＫｐｎＩ及びＳａｌＩ各５０Ｕを用いて２００μＬの反応液中で３７℃で１時間消化する。この消化反応液をアガロースゲル電気泳動に供することにより、約１８０ｂｐ付近に存在するＤＮＡ断片を回収した。回収されたＤＮＡ断片をＱＩＡＥＸＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製する。精製されたＤＮＡ断片４４ｍｇと、２ｍＬの臭化シアン活性化セファロース４Ｂとを混合し、４℃で一晩１，０００ｒｐｍで撹拌しながら、当該ＤＮＡ断片をセファロース上に固定する。次いで、未反応の臭化シアンの活性基を無くすために、前記混合物に１Ｍグリシンを含む炭酸水素ナトリウム溶液（ｐＨ９．５）２０ｍＬを添加し、これを４℃で一晩放置する。このようにして得られたゲルを、１０×３００ｍｍクロマトグラフ管（イワキガラス社）に充填することにより、結合物質用アフィニティーカラムを作製する。
（２）被験物質の調製
マウス横紋筋由来培養細胞Ｃ２Ｃ１２を５０ｃｍ２フラスコ（イワキガラス社）４０枚に１フラスコ当たり４．５×１０６個の細胞ずつをまき込む。このマウス横紋筋由来培養細胞Ｃ２Ｃ１２を、１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ社。以下、ＦＣＳと記す。）及び１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）が添加されたＤ−ＭＥＭ培地（高グルコース、ＳＩＧＭＡ社）を用い、３７℃、５％二酸化炭素下で二晩培養する。培養後、上記フラスコから培地を除去した後、１５ｍＬのリン酸緩衝液でフラスコの器壁を１回洗浄する。洗浄後のフラスコにトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．０５％トリプシン、０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡを含む。Ｇｉｂｃｏ社）１ｍＬ〜２ｍＬを細胞が浸るように添加し、３７℃で５分放置する。これに、ＦＢＳ含有培地を上記のトリプシン−ＥＤＴＡ溶液の約１０倍量添加することにより、細胞懸濁液を得る。得られる細胞懸濁液を遠心分離（室温、１，３００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を除去する。残った細胞沈殿を１５ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁して得られる懸濁液を遠心分離（室温、１，３００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を除去する。残った細胞沈殿を氷冷した１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−水酸化カリウム（ｐＨ７．８）、１０ｍＭ  塩化カリウム及び０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液（以下、バッファーＡと記す。）１０ｍＬに懸濁する。得られる懸濁液を１０分間氷上で冷却した後、遠心分離（４℃、１，３００ｒｐｍ、５分間）する。上清を除去した後、残った細胞沈殿を３０ｍｌのバッファーＡで懸濁する。得られる懸濁液をダウンスホモジナイザーペッスルＢ（Ｗｈｅａｔｏｎ社）を用いて氷上で冷却しながら細胞を完全に破砕する。得られた細胞破砕液を遠心分離（４℃、１，３００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を除去する。残った沈殿を５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）、４２０ｍＭ  塩化カリウム、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  塩化マグネシウム及び２％グリセロール溶液（以下、バッファーＢと記す。）２ｍＬに懸濁する。得られる懸濁液を、４℃で３０分間ローテーターにて穏やかに回転させた後、遠心分離（４℃、２４，０００ｇ、３０分間）する。上清を回収し、回収される上清に蒸留水を加えることにより５倍に希釈された液を被験物質として調製することが出来る。
（３）単離・回収の工程
上記の被験物質を、上記（１）で作製される結合物質用アフィニティーカラムに供する。さらに、当該カラムを洗浄するために、５倍に希釈されたバッファーＢ１０ｍＬを供する。その後、バッファーＢ中の塩化カリウムの濃度を１Ｍまで上昇させるグラジエント溶出を行うことにより、当該カラムから結合物質を溶出させる。溶出液を回収した後、当該溶出液から結合物質を回収する。
【産業上の利用可能性】  本発明により、生体内でのエネルギー代謝に重要な役割を果たしているＰＧＣ１αの新規バリアント：ＰＧＣ１αｂ、そのプロモーター、これらを用いる骨格筋における熱産生作用等のインスリンの機能を選択的に改善する薬剤の探索方法、及びＰＧＣ１αｂの発現を促進する物質を有効成分とする糖代謝異常を伴う糖尿病等の疾患の治療薬を提供することが可能になった。
【配列表フリーテキスト】配列番号７：ＰＧＣ１αｂの部分配列
配列番号８：ＰＧＣ１αｂの部分配列
配列番号９：ＰＣＲ用プライマー
配列番号１０：ＰＣＲ用プライマー
配列番号１１：ＰＣＲ用プライマー
配列番号１２：ＰＣＲ用プライマー
配列番号１３：ＰＣＲ用プライマー
配列番号１４：ＰＣＲ用プライマー
配列番号１５：ＰＣＲ用プライマー
配列番号１６：ＰＣＲ用プライマー
配列番号１７：ＰＣＲ用プライマー
配列番号１８：ＰＣＲ用プライマー
配列番号１９：ＰＣＲ用プライマー
配列番号２０：ＰＣＲ用プライマー
配列番号２１：ＰＣＲ用プライマー
配列番号２２：ＰＣＲ用プライマー
配列番号２３：ＰＣＲ用プライマー
配列番号２４：ＰＣＲ用プライマー
配列番号２５：ＰＣＲ用プライマー
配列番号２６：ＰＣＲ用プライマー
配列番号２７：ＰＣＲ用プライマー
配列番号２８：ＰＣＲ用プライマー
配列番号２９：ＰＣＲ用プライマー
配列番号３０：ＰＣＲ用プライマー
配列番号３１：ＰＣＲ用プライマー
配列番号３２：ＰＣＲ用プライマー
配列番号３６：ＰＣＲ用プライマー
配列番号３７：ＰＣＲ用プライマー
配列番号３８：ＰＣＲ用プライマー
配列番号３９：ＰＣＲ用プライマー
配列番号４０：ＰＣＲ用プライマー
配列番号４１：ＰＣＲ用プライマー
配列番号４２：ＰＣＲ用プライマー
配列番号４３：ＰＣＲ用プライマー
配列番号４４：ＰＣＲ用プライマー
配列番号４５：ＰＣＲ用プライマー
配列番号４６：ＰＣＲ用プライマー
配列番号４７：ＰＣＲ用プライマー
配列番号４８：ＰＣＲ用プライマー
配列番号４９：ＰＣＲ用プライマー
配列番号５０：ＰＧＣ１αｂの部分配列
配列番号５１：ＰＧＣ１αｂの部分配列
配列番号５２：ＰＧＣ１αｂの部分配列
配列番号５３：ＰＧＣ１αｂの部分配列
配列番号５４：ＰＧＣ１αｂの部分配列
配列番号５５：ＰＧＣ１αｂの部分配列
【図１】
2005093068.tif 000002
【図２】
2005093068.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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