(57)【要約】以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列を含有し、かつタンナーゼ活性を有するタンパク質（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上のホモロジーを示すアミノ酸配列を含有し、かつタンナーゼ活性を有するタンパク質【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含有するタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列を含有し、かつタンナーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上のホモロジーを示すアミノ酸配列を含有し、かつタンナーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列を含有するＤＮＡを含むポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列を含有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつタンナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項３】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含有するタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列を含有し、かつ、タンナーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上のホモロジーを示すアミノ酸配列を含有し、かつタンナーゼ活性を有するタンパク質
【請求項４】
請求項１又は２記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項５】
請求項１もしくは２記載のポリヌクレオチド、または請求項４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞またはその培養上清から、産生させたタンパク質を回収する工程を含む、請求項３に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項７】
スタフィロコッカス・ルグダネンシスを検出するための、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項３に記載のタンパク質に結合する抗体又はその断片。
【請求項９】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項８記載の抗体又はその断片。
【請求項１０】
請求項３記載のタンパク質又はその一部を抗原として免疫された動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合によって得られるハイブリドーマにより産生される、タンナーゼに結合するモノクローナル抗体又はその断片。
【請求項１１】
請求項３記載のタンパク質又はその一部を抗原として免疫された動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合によって得られるハイブリドーマであって、タンナーゼに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１２】
請求項１１記載のハイブリドーマを培養し、得られる培養物からタンナーゼに結合するモノクローナル抗体を採取することを特徴とする、前記モノクローナル抗体の製造方法。
【請求項１３】
請求項７に記載のポリヌクレオチドと被験試料とを接触させることにより、スタフィロコッカス・ルグダネンシスを検出する方法。
【請求項１４】
請求項７に記載のポリヌクレオチドと被験試料とを接触させることにより、スタフィロコッカス・ルグダネンシスを検出することを特徴とする、大腸癌を検出又は診断する方法。
【請求項１５】
請求項８〜１０のいずれか１項記載の抗体又はその断片と被験試料とを反応させてタンナーゼ産生スタフィロコッカス・ルグダネンシスを検出する方法。
【請求項１６】
請求項８〜１０のいずれか１項記載の抗体又はその断片と被験試料とを反応させてタンナーゼ産生スタフィロコッカス・ルグダネンシスを検出することを特徴とする、大腸癌を検出又は診断する方法。
【請求項１７】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、大腸癌診断薬。
【請求項１８】
請求項８〜１０のいずれか１項に記載の抗体又はその断片を含んでなる、大腸癌診断薬。
【請求項１９】
請求項７記載のポリヌクレオチド、及び請求項８〜１０のいずれか１項に記載の抗体又はその断片からなる群から選ばれる少なくとも１つを含む、スタフィロコッカス・ルグダネンシス検出用又は大腸癌検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、糞便中のタンナーゼ陽性細菌が有するタンナーゼ遺伝子、該遺伝子がコードするタンナーゼタンパク質、該遺伝子あるいは該タンパク質を検出することにより大腸癌を診断する方法並びに診断薬に関する。
【背景技術】  ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（Ｓｔ．）ｂｏｖｉｓ）は感染性心内膜炎の原因菌として知られているが、欧米では本菌による感染性心内膜炎と大腸癌との併存率が高いことが注目されている（Ｈｏｎｂｅｒｇ  Ｐ．Ｚ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，ｉ；１６３−１６４，１９８７）。一方、大澤らによって、タンニン酸のエステル結合を加水分解し没食子酸を放出するタンナーゼ活性を有する細菌がタンニンを高濃度に含有するユーカリを喫食するコアラの糞便から分離され、Ｓｔ．ｂｏｖｉｓ  ｂｉｏｔｙｐｅ  Ｉと同定された（Ｏｓａｗａ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｏｒｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５６；８２９−８３１，１９９９）。本菌はタンニンを分解し没食子酸を放出するタンナーゼ活性と、さらに没食子酸を脱炭酸しピロガロールに変化させる脱炭酸酵素を有する細菌であり、ストレプトコッカス・ガロリティカス（Ｓｔ．ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）と新たに命名することが提案されている。大澤は、このＳｔ．ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓが感染性心内膜炎を併発している大腸癌患者から分離されるＳｔ．ｂｏｖｉｓと同一の細菌である可能性を推論している（大澤朗、理研シンポジウム「乳酸菌の分類と生態」抄録３６−４５，１９９６）。
一般にタンニンと称される物質は、ポリフェノールに属し、フェノール性化合物の重要な部分を占めている天然物質であり、微生物に対して毒性および発育阻害作用を有し収斂性の渋みを有している。タンニンの分類は種々提案されているが、便宜的に加水分解型タンニンと縮合型タンニンに大別される。前者は、構造的にはピロガロールタンニンであり、五倍子や没食子中に多く含まれているため病理的タンニンともいわれている。一方、後者は、カテコールタンニンであり、植物の常成分であるので生理的タンニンともいわれている。加水分解型タンニンは中核に糖類を有し、それにフェノール酸（没食子酸，エラグ酸等）がエステル結合した化学構造を有する。この加水分解型タンニンは、主に土壌に生息するアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属等に属する真菌類や、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等に属する真菌類が産生するタンニン分解酵素、タンナーゼによって加水分解されることが知られている。しかしながら、動物の腸管内に生息する細菌類によるタンナーゼの産生は、大澤の発表以前には報告されていなかった。
その後タンナーゼ陽性細菌として、コアラの糞便からＳｔ．ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ以外にもロネピネラ・カラルム（Ｌｏｎｅｐｉｎｅｌｌａ  ｋｏａｌａｒｕｍ）が分離され、また他に主に草食動物から分離されたことが報告されている（Ｏｓａｗａ  Ｒ．，Ｓｙｓｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１５；１４４−１４７，１９９２）。さらに、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ（Ｌ．）ｐｌａｎｔａｒｕｍ）がヒト糞便より分離されたことが報告された。Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍは主にサイロから分離される乳酸桿菌で、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍによる感染性心内膜炎も報告されている（Ｏａｋｅｙ  Ｈ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，７８；１４２−１４８，１９９５）。
ヒトの大腸癌におけるタンナーゼ産生菌の関与については、糞便中のタンナーゼ産生菌が大腸癌患者で多く見出されること（ＷＯ  ０２／３４９３８）、下部消化管内視鏡検査を施行した患者糞便中からのタンナーゼ産生菌分離率が大腸癌患者で高いこと（萩原恭史ら、第９０回日本消化器病学会抄録Ａ２２５、２００４）が報告されている。上記萩原らの文献では、タンニン処理した寒天培地を用いてタンナーゼ産生菌の分離を行い、タンナーゼ陽性細菌は正常者の１０．６％、良性ポリープの３３．３％、早期大腸癌の２５．０％、進行大腸癌の５４．５％で認められることが報告されており、大腸癌とタンナーゼ産生菌の関係が示唆されている。
またＷＯ  ０２／３４９３８号公報には、タンナーゼ産生菌の中でも特にスタフィロコッカス・ルグダネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（Ｓ．）ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）のタンナーゼ活性が強く、大腸癌患者で分離されるタンナーゼ産生菌の多くがＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓであることが報告されている。
タンナーゼ産生菌の分離は、タンニン酸処理寒天培地中、嫌気条件下３７℃で７日間培養し、周辺のタンニンが分解して透明体を形成したコロニーを選び出して、当該コロニーの菌が産生するタンナーゼの活性を、大澤らの方法（Ｏｓａｗａ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５９，１２５１−１２５２，１９９３）に基づいて測定することにより行われる。この方法は操作が煩雑であるとともに結果が得られるまでに１週間以上の時間を要するため、一般的な臨床検査に用いることが可能な、簡便かつ迅速なタンナーゼ産生菌の検出方法が求められている。
【発明の開示】
本発明が解決しようとする課題は、大腸癌診断の指標となりうるタンナーゼ産生菌を検出するための、簡便な遺伝子検出法あるいは免疫化学的な検出方法を開発することである。
このような背景の下に本発明者らは、大腸癌患者の糞便より比較的強いタンナーゼ活性を有する細菌であるＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓを分離し、その菌よりタンナーゼ遺伝子のクローニングと塩基配列の決定を行った。クローニングしたタンナーゼ遺伝子は、すでに報告されているＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来のタンナーゼ遺伝子（Ｈａｔａｍｏｔｏ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１７５，２１５−２２１，１９９６）とは全く異なる新規なものであった。
そして、ヒト糞便から培養した菌からＰＣＲによりタンナーゼ遺伝子の検出を試み、タンナーゼ遺伝子が検出される検体からは、タンナーゼ産生菌が分離されることを見出して、簡便なタンナーゼ産生菌の検出法を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下に関する。
（１）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含有するタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列を含有し、かつタンナーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上のホモロジーを示すアミノ酸配列を含有し、かつタンナーゼ活性を有するタンパク質
（２）以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列を含有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつタンナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（３）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含有するタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列を含有し、かつ、タンナーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上のホモロジーを示すアミノ酸配列を含有し、かつタンナーゼ活性を有するタンパク質
（４）（１）又は（２）記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
（５）（１）もしくは（２）記載のポリヌクレオチド、または（４）に記載のベクターを含む宿主細胞。
（６）（５）に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞またはその培養上清から、産生させたタンパク質を回収する工程を含む、（３）に記載のタンパク質の製造方法。
（７）スタフィロコッカス・ルグダネンシスを検出するための、（１）又は（２）に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するポリヌクレオチド。
（８）（３）に記載のタンパク質に結合する抗体又はその断片。
（９）抗体が、モノクローナル抗体である、（８）記載の抗体又はその断片。
（１０）（３）記載のタンパク質又はその一部を抗原として免疫された動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合によって得られるハイブリドーマにより産生される、タンナーゼに結合するモノクローナル抗体又はその断片。
（１１）（３）記載のタンパク質又はその一部を抗原として免疫された動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合によって得られるハイブリドーマであって、タンナーゼに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
（１２）（１１）記載のハイブリドーマを培養し、得られる培養物からタンナーゼに結合するモノクローナル抗体を採取することを特徴とする、前記モノクローナル抗体の製造方法。
（１３）（７）に記載のポリヌクレオチドと被験試料とを接触させることにより、スタフィロコッカス・ルグダネンシスを検出する方法。
（１４）（７）に記載のポリヌクレオチドと被験試料とを接触させることにより、スタフィロコッカス・ルグダネンシスを検出することを特徴とする、大腸癌を検出又は診断する方法。
（１５）（８）〜（１０）のいずれか１項記載の抗体又はその断片と被験試料とを反応させてタンナーゼ産生スタフィロコッカス・ルグダネンシスを検出する方法。
（１６）（８）〜（１０）のいずれか１項記載の抗体又はその断片と被験試料とを反応させてタンナーゼ陽性細菌を検出することを特徴とする、大腸癌を検出又は診断する方法。
（１７）（７）に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、大腸癌診断薬。
（１８）（８）〜（１０）のいずれか１項に記載の抗体又はその断片を含んでなる大腸癌診断薬。
（１９）（７）に記載のポリヌクレオチド、及び（８）〜（１０）のいずれか１項に記載の抗体又はその断片からなる群から選ばれる少なくとも１つを含む、スタフィロコッカス・ルグダネンシス検出用又は大腸癌検出用キット。
【図面の簡単な説明】  図１は、タンナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の物理的地図である。
図２は、ＧＳＴ融合タンナーゼタンパク質のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動結果を示す図である。
図３は、ウエスタンブロット法による抗体の特異性を確認した結果を示す図である。
図４は、ＥＩＡによるＧＳＴ−ｔａｎｎａｓｅの測定結果を示す図である。
図５は、ＥＩＡによるＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ  ｔａｎｎａｓｅの測定結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に本発明の実施の形態について、タンナーゼ遺伝子のクローニングと同定法、タンナーゼタンパク質の発現ベクターの作製法、タンナーゼタンパク質に対する抗体の作製法及びタンナーゼ検出法に関し詳細に説明する。
以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
＜本発明の概要＞
本発明は、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ由来のタンナーゼ遺伝子、タンナーゼタンパク質、タンナーゼタンパク質に対する抗体であり、この遺伝子及び抗体を用いてタンナーゼ産生菌を検出することによる大腸癌診断に関する。
タンナーゼとは、ポリフェノールと称される化合物の重要な部分を占めている天然物質であるタンニンを分解して、没食子酸を放出する反応を触媒する酵素である。タンニンは、病理的タンニンといわれる加水分解型と、植物の常成分である生理的タンニンといわれるカテコールタンニンである縮合型に分類されるが、タンナーゼが分解するのは、加水分解型タンニンである。
このタンナーゼを産生するタンナーゼ産生菌は、主として草食動物から分離されるほか、ヒト糞便中からも検出されるが、特に大腸癌患者の糞便からタンナーゼ産生菌分離率が高いことが知られている。そこで、タンナーゼ遺伝子又はタンナーゼに対する抗体等を指標として、簡便な大腸癌診断に供しうることが考えられる。
＜タンナーゼ＞
本発明におけるタンナーゼ（以下、「本発明のタンパク質」とも称する）は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、好ましくは配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、およびこれらと実質的に同一なアミノ酸配列からなるタンパク質を含むものである。
以下、本発明のタンパク質について詳細に説明する。
配列番号２に示されるアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列と約９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつタンナーゼ活性を有するアミノ酸配列などがあげられる。ホモロジーは、インターネットを利用したホモロジー検索サイトを利用して行うことができる［例えば日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）において、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、およびＳＳＥＡＲＣＨ等の相同性検索が利用できる［例えば日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）のウェブサイトの相同性検索（Ｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）のページ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｅ−ｍａｉｌ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｊ．ｈｔｍｌ］。また、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）において、ＢＬＡＳＴを用いた検索を行うことができる（例えばＮＣＢＩのホームページのウェブサイトのＢＬＡＳＴのページ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５（３）：４０３−１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．＆  Ｇｉｓｈ，Ｗ．，Ｍｅｔｈ，Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９９６，２６６：４６０−４８０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９７，２５：３３８９−３４０２）］
特に、配列番号２に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、上記のアミノ酸配列の他、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個（例えば１個又は数個）のアミノ酸に欠失、挿入、置換若しくは付加等の変異、又はこれらの組み合わせ変異が生じたアミノ酸配列であって、タンナーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列である。タンナーゼ活性を有するとは、配列番号２に示されるアミノ酸配列のタンパク質のタンナーゼ活性と比較して、１０％以上、３０％以上、好ましくは９０％以上の活性を有することである。またタンナーゼ活性は、加水分解型タンニンを分解して没食子酸を放出するように機能する活性を意味し、ＷＯ  ０２／３４９３８号公報に記載の方法により測定することができる。
例えば、（ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号２に示されるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、（ｖ）上記（ｉ）〜（ｉｖ）を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
（Ｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：５６６２−６；Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７−５００；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：１４３１−３；Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６４０９−１３）。
ここで、アミノ酸の置換とは、配列中のアミノ酸残基の１っ以上が、異なる種類のアミノ酸残基に変えられた変異を意味する。このような置換により本発明のアミノ酸配列を改変する場合、タンパク質の機能を保持することが必要な場合には、保存的な置換を行うことが好ましい。保存的な置換とは、置換前のアミノ酸と似た性質のアミノ酸をコードするように配列を変化させることである。アミノ酸の性質は、例えば、非極性アミノ酸（Ａｌａ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，Ｔｒｐ，Ｖａｌ）、非荷電性アミノ酸（Ａｓｎ，Ｃｙｓ，Ｇｌｎ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｙｒ）、酸性アミノ酸（Ａｓｐ，Ｇｌｕ）、塩基性アミノ酸（Ａｒｇ，Ｈｉｓ，Ｌｙｓ）、中性アミノ酸（Ａｌａ，Ａｓｎ，Ｃｙｓ，Ｇｌｎ，Ｇｌｙ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｖａｌ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ，Ｇｌｙ）、分枝アミノ酸（Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｖａｌ）、ヒドロキシアミノ酸（Ｓｅｒ，Ｔｈｒ）、アミド型アミノ酸（Ｇｌｎ，Ａｓｎ）、含硫アミノ酸（Ｃｙｓ，Ｍｅｔ）、芳香族アミノ酸（Ｈｉｓ，Ｐｈｅ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ）、複素環式アミノ酸（Ｈｉｓ，Ｔｒｐ）、イミノ酸（Ｐｒｏ，４Ｈｙｐ）等に分類することができる。
従って、非極性アミノ酸同士、あるいは非荷電性アミノ酸同士で置換させることが好ましい。中でも、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅの間、Ｓｅｒ及びＴｈｒの間、Ａｓｐ及びＧｌｕの間、Ａｓｎ及びＧｌｎの間、Ｌｙｓ及びＡｒｇの間、Ｐｈｅ及びＴｙｒの間の置換は、タンパク質の性質を保持する置換として好ましい。変異されるアミノ酸の数及び部位は特に制限ない。
本発明のタンパク質を構成するアミノ酸残基は天然に存在するものでも、また修飾されたものであっても良い。アミノ酸残基の修飾としては、アシル化、アセチル化、アミド化、アルギニル化、ＧＰＩアンカー形成、架橋、γ・カルボキシル化、環化、共有架橋の形成、グリコシル化、酸化、脂質または脂肪誘導体の共有結合化、ジスルフィド結合の形成、セレノイル化、脱メチル化、タンパク質の分解処理、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合化、ヒドロキシル化、ピログルタメートの形成、フラビンの共有結合化、プレニル化、ヘム部分の共有結合化、ホスファチジルイノシトールの共有結合化、ホルミル化、ミリストイル化、メチル化、ユビキチン化、ヨウ素化、ラセミ化、ＡＤ−リボシル化、硫酸化、リン酸化等が例示される。さらに、本発明のタンパク質には他のペプチド配列により付加された融合タンパク質を含む。本発明のタンパク質に付加するペプチド配列としては、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、サブスタンスＰ、多重ヒスチジンタグ（６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ等）、プロテインＣ断片、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、免疫グロブリン定常領域断片、α−チューブリン断片、β−ガラクトシダーゼ、Ｂ−タグ、ｃ−ｍｙｃ断片、Ｅ−タグ（モノクローナルファージ上のエピトープ）、ＦＬＡＧ（Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｈｃｎｏｌ．６：１２０４−１０）、ｌｃｋタグ、ｐ１８  ＨＩＶ断片、ＨＳＶ−タグ（ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質）、ＳＶ４０Ｔ抗原断片、Ｔ７−タグ（Ｔ７  ｇｅｎｅ１０タンパク質）、ＶＳＶ−ＧＰ断片（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓウイルス糖タンパク質）等のタンパク質の識別を容易にする配列、組換え技術によりタンパク質を発現させる際に安定性を付与する配列等を選択することができる。
＜タンナーゼ遺伝子＞
タンナーゼ遺伝子とは、一般には、タンナーゼをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを意味するが、本発明のタンナーゼ遺伝子（以下、「本発明のポリヌクレオチド」とも称する）は、配列番号１に示される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含むものである。実質的に同一の塩基配列を有するポリヌクレオチドとしては、前記本発明のタンパク質をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドであれば、特に制限はされず、例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドのほか、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる変異タンパク質であって、タンナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド等も挙げることができる。
ここで、本発明における「ポリヌクレオチド」とは、複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）等の塩基または塩基対からなる重合体を意味し、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。また、天然以外の塩基を必要に応じて含むポリヌクレオチドも包含する。天然以外の塩基としては、例えば、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、２’−Ｏ−メチルシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、２’−Ｏ−メチルプソイドウリジン、β−Ｄ−ガラクトシルキュェオシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、１−メチルアデノシン、１−メチルプソイドウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、β−Ｄ−マンノシルキュェオシン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシル−２−メチルリオプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）Ｎ−メチルカルバモイル）トレオニン、ウリジン−５−オキシ酢酸−メチルエステル、ウリジン−５オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウリジン、キュェオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−メチルウリジン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、ワイブトシン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン等が挙げられる。
本発明のタンナーゼ遺伝子は、図１においてＯＲＦ３の領域のもの（配列番号１）であるが、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。このようなアミノ酸配列をコードする塩基配列は、配列番号１に示される塩基配列に加えて、遺伝子暗号の縮重により配列番号１に示される塩基配列とは異なる塩基配列を含むものである。配列番号１に示される塩基配列のほか、非コード領域を除いた領域のみであってもよい。本発明のポリヌクレオチドを遺伝子工学的な手法によりタンパク質を発現させるために用いる場合、使用する細胞のコドン使用頻度を考慮して、発現効率の高いヌクレオチド配列を選択し、設計することができる（Ｇｒａｎｔｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：４３−７４）。
さらに、本発明のタンナーゼ遺伝子は、配列番号１に示される塩基配列または該塩基配列に相補的な配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。このようなポリヌクレオチドとしては、アイソフォーム、アルタナティブアイソフォーム、及びアレリック変異体があげられ、これらは、本発明のタンナーゼ遺伝子に含まれる。このようなタンナーゼ遺伝子は、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により得ることができる。これらの方法については、『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．』（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））を参照することができる。
より具体的には、本発明のタンナーゼ遺伝子の取得は、以下の方法を用いることができる。まず、タンナーゼ遺伝子を有するタンナーゼ産生菌を適当な培地を用いて培養する。培地には、嫌気培養用の培地を用いることができるが、例えば、Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ：Ｄｉｆｃｏ）培地を使用できる。培養条件は必要なＤＮＡ量に応じて適当に選択できるが、例えば、３７℃、一晩振とう培養とすることもできる。なお、タンニン酸処理寒天培地で透明斑が観察されるコロニーから分離したタンナーゼ産生菌を用いて、上記培養を行うこともできる。
ＤＮＡの抽出には、上記培地にて培養した培養液を、遠心分離機を用いて集菌して、沈殿菌体を溶菌処理し、菌体外にＤＮＡを溶出させて回収することができる。溶菌処理としては、公知の方法を用いて行うことができるが、例えば、沈澱菌体をＣｅｌｌ  Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ２Ｎａ，１００μｇ／ｍＬ  ＲＮａｓｅ  Ａ］に懸濁した後に、アクロモペプチダーゼ含有Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えて、５０℃、３０分間処理し、Ｓｏｄｉｕｍ  ｌａｕｒｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ）を加えることにより溶菌することができる。その後、Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ溶液［平衡化Ｐｈｅｎｏｌ  ５０ｍＬ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ  ４８ｍＬ，ｉｓｏ−Ａｍｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ２ｍＬ，０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１０ｍＬ］を加え、よく混合し、適当な条件で遠心後、上清の水相を回収し、その上清にＥｔｈａｎｏｌを加え、さらに遠心することにより染色体ＤＮＡを沈殿として回収することができる。上述のようにして得られたＤＮＡは、適当なベクター中に組み込むことができる。
本発明におけるハイブリダイゼーション条件において、ストリンジェントな条件としては、例えば、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃」、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」等の条件を挙げることができる。より詳細には、Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ  ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた方法として、６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して１時間以上６８℃に保ってハイブリッド形成させ、その後、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で２０分の洗浄を３回、最後に、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で２０分の洗浄を２回行うことも考えられる。その他、例えばＥｘｐｒｅｓｓｈｙｂ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）中、５５℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行い、標識プローブを添加し、３７〜５５℃で１時間以上インキュベートし、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で２０分の洗浄を１回行うこともできる。ここで、例えば、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションや２度目及びそれ以降の洗浄の際の温度を上げることにより、よりストリンジェントな条件とすることができる。例えば、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの温度を６０℃、さらにストリンジェントな条件としては６８℃とすることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、本発明のタンナーゼ遺伝子をコードするポリヌクレオチドを得るための条件を適宜設定することができる。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．』（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；特にＳｅｃｔｉｏｎ９．４７−９．５８）、『Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ』（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）；特にＳｅｃｔｉｏｎ６．３−６．４）、『ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ２ｎｄ  ｅｄ．』（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）；条件については特にＳｅｃｔｉｏｎ２．１０）等を参照することができる。ハイブリダイズするポリヌクレオチドとしては、配列番号１に示される塩基配列あるいはそれに相補的な塩基配列に対して少なくとも５０％以上、好ましくは７０％、さらに好ましくは８０％、より一層好ましくは９０％（例えば、９５％以上、さらには９９％）の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。このような同一性は、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−８；Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−７）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいたプログラムのうち、配列の同一性を決定するプログラムとして、アミノ酸配列についてはＢＬＡＳＴＸ、ヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０）等が開発されており、本発明の配列に対して使用することができる。具体的な解析方法については、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．等を参照することができる。
本発明のタンナーゼ遺伝子に含まれるタンナーゼのアイソフォーム、アルタナティブアイソフォームやアレリック変異体等、タンナーゼと類似した構造及び機能を有する遺伝子は、例えば配列番号１に示される塩基配列を基にプライマーを設計し、遺伝子増幅技術（ＰＣＲ）（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７）Ｓｅｃｔｉｏｎ６．１−６．４）により得ることができる。この場合、プライマーは、上記の配列番号１に示される塩基配列のいずれの部分も用いることができるが、たとえば、上流側用プライマーとしてＴａｎ−Ｆ−Ｆ６：５’−ｃｇｔｇｇｔｇｃｃｃｔａｔｔａｃａａｇｔ−３’（配列番号１４）を用い、下流側プライマーとしてＴａｎ−Ｆ−Ｒ７：５’−ｔｇａｇｃｃｔｔｃａｇｔａｔａｔｔｇａｃｃａ−３’（配列番号１５）を用いることができる。そして、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓゲノムＤＮＡに、上記プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼ等を作用させてＰＣＲ反応を行う。得られたＰＣＲ産物の精製には公知の方法を用いることができる。たとえば、エチジウムブロマイドを用いる方法、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ社）を用いる方法、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ（フナコシ）、ＱＩＡＧＥＮ（ＱＩＡＧＥＮ社）等によるアガロースゲルを用いる方法、ＤＥＡＥ−セルロース濾紙を用いる方法、フリーズ＆スクイーズ法、透析チューブを用いる方法等がある。アガロースゲルを用いる場合には、アガロースゲル電気泳動し、ＤＮＡ断片をアガロースゲルより切り出して精製する。
本発明のポリヌクレオチドには、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチド配列に相補的な配列が含まれる。これら本発明のポリヌクレオチドは、『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．』（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））、『Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ』（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）；特にＳｅｃｔｉｏｎ８．１−８．５）、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ  １５２：２７１−５、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−９２、Ｋｒａｍｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３５０−６７、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５：２７６３−６等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。
また、ポリヌクレオチドに変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。
本発明のポリヌクレオチドの塩基配列の確認は、慣用の方法により配列決定することにより行うことができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３）等により行うことができる。また、適当なＤＮＡシーケンサを利用して配列を解析することも可能である。
＜タンナーゼタンパク質発現ベクターの作製、及びこれを用いた形質転換＞
決定したタンナーゼタンパク質をコードする塩基配列領域の開始コドンの５’側と終止コドンの３’側にそれぞれ異なる制限酵素配列を有するプライマーを設定し、本領域を遺伝子増幅する。増幅した領域を制限酵素で切り出して発現ベクターに組み込み、宿主（大腸菌等）に導入して形質転換体を得ることができる。
具体的には、ＰＣＲ産物からクローニングされた本発明のタンパク質をコードするポリペプチドを含有するプラスミドを、制限酵素を用いて消化する。タンナーゼ遺伝子配列中に適当な制限酵素切断部位があれば、それに対応した制限酵素を用いればよい。また、別法としては、ＰＣＲプライマー中に挿入された制限酵素認識配列に対応した制限酵素を用いることができる。例えば、プライマーがＯＲＦ３−Ｆ（ＢａｍＨＩ）（配列番号１０）及びＯＲＦ３−Ｒ（ＸｈｏＩ）（配列番号１１）であれば、用いる制限酵素は、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩである。消化後のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により精製する。このＤＮＡ断片を、発現用ベクターに公知の方法を用いて組み込み、タンナーゼ発現用ベクターを得ることができる。この発現ベクターを宿主に導入し形質転換体を作製し、目的遺伝子の発現に供する。このとき、発現ベクター及び宿主は、目的とする遺伝子を発現できるものであれば特に限定されず、例えば、宿主として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等の細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の酵母、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の哺乳類細胞などが挙げられる。大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合は、本発明の遺伝子が宿主中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、転写終結配列を含む構成であることが好ましい。発現ベクターとしては、例えばｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、等が挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが用いられる。細菌への組み換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法や塩化カルシウム法を用いることができる。酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして、例えばＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等が挙げられる。プロモーターとしては、例えばｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。哺乳類細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えばｐｃＤＮＡ３（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）等が挙げられる。ＴＩＧＡ１発現ベクタープラスミドを、例えばＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）を用いたリポソーム法にて細胞株に導入する。
このようにタンナーゼ遺伝子が導入された宿主細胞をタンニン酸処理寒天培地で培養すると、得られたコロニーに透明斑が観察されればタンナーゼ遺伝子がクローニングされたコロニーであると判断できる。例えば、形質転換した大腸菌をタンニン酸処理寒天培地で培養し、コロニー周辺に透明斑を形成するものを選択する。選択したクローンが保有するベクターより、タンナーゼ遺伝子の塩基配列を決定することができる。すなわち、上記の方法により精製ＤＮＡ断片をクローニングした後に、ＤＮＡシーケンサを用いて塩基配列の決定を行い、クローニングしたＰＣＲ産物が目的とするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であるか否かを確認する。
＜タンナーゼの精製＞
タンナーゼは、タンナーゼタンパク質発現ベクターを宿主（大腸菌等）に組み込んだ形質転換体を大量に培養し、培養物を例えば界面活性剤と超音波で破砕し遠心した後の上清より精製することができる。精製は、タンナーゼ活性を指標として、種々のクロマトグラフィー（アフィニティークロマト・イオン交換クロマト・ゲルろ過等）を適宜組み合わせて行うことができる。
具体的には、前述のタンナーゼ遺伝子がクローニングされたコロニーを、例えばアンピシリン（Ａｍｐ）を含むルーリエ培地（ＬＢ）（ＬＢ−Ａｍｐ培地）等を用いて培養したものを集菌し、酵素が安定に保たれるのに適当なｐＨに調製されたＰＢＳ（−）等の緩衝液に懸濁させ、さらにＰＭＳＦ（フェニルメタンスルホニルフルオライド）等のプロテアーゼ阻害剤および溶菌作用を有するリゾチームを添加し、インキュベートして溶菌し、得られた上清を粗酵素溶液とする。プロテアーゼ阻害剤を用いるのは、本発明の酵素を抽出する過程において共存するプロテアーゼの作用によりこの酵素が分解されることを防ぐためである。粗酵素溶液を熱処理し、遠心分離した後に上清を回収して、大腸菌由来のタンパク質を除去する。この上清を透析したのち、陽イオン又は陰イオン交換カラムにアプライし、塩化ナトリウム等を用いた直線濃度勾配により目的タンパク質を溶出させる。溶出画分の中で最も比活性の高かった画分を限外ろ過により濃縮し、この濃縮画分を、高速液体クロマトグラフィーを用いて精製し、本発明のタンナーゼを得る。
また、本発明においては、タンナーゼ遺伝子又は上記ベクターからタンナーゼを採取することも可能である。すなわち、本発明においては、生細胞を全く使用することなく無細胞タンパク質合成系を採用して、タンナーゼを製造することが可能である。
無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液を用いて試験管などの人工容器内でタンパク質を合成する系であり、例えばｍＲＮＡの情報を読み取って、リボソーム上でタンパク質を合成するというものである。なお、本発明において使用される無細胞タンパク質合成系には、ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系も含まれる。
上記細胞抽出液は、真核細胞由来又は原核細胞由来の抽出液、例えば、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、マウスＬ−細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、出芽酵母、大腸菌などの抽出液を使用することができる。なお、これらの細胞抽出液は濃縮されたものであっても濃縮されないものであってもよい。
ここで、ＤＮＡ上に暗号化された遺伝情報は、転写によりｍＲＮＡとなり、さらに翻訳されてタンパク質に変換される。人工容器内でこの翻訳過程を再現してタンパク質を合成するためには、リボソーム、ｔＲＮＡ、各種タンパク質因子など、翻訳因子群を安定化し、目的に応じてｍＲＮＡを生産するシステムを構築することが必要である。このシステムを構築するため、本発明においては小麦胚芽を選択することができる。小麦胚芽には、種子が発芽してタンパク質合成を行うための翻訳因子群が保存されている点で好ましい。
細胞抽出液は、例えば限外濾過、透析、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿等によって得ることができる。ＰＥＧ沈殿による方法では、細胞抽出液にＰＥＧ溶液を混合することによりタンパク質、核酸を沈殿させて回収し、これを少量の緩衝液に溶かすことにより濃縮細胞抽出液を得る。透析による濃縮は、例えば、振とう又は攪拌可能な閉鎖系で細胞抽出液を透析内液とし、透析膜（例えば分子量限界１０００〜１００００）を介して透析外液に対して透析を行う。ここで透析外液は、緩衝液（酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、ジチオスレイトール等を含有する）及び高分子吸収剤（ＰＥＧ、Ｆｉｃｏｌｌ等）を含めることができる。
本発明において、無細胞タンパク質合成は、市販のキットを用いて行うこともできる。そのようなキットとしては、例えば試薬キットＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（東洋紡）、合成装置のＰＧ−ＭａｔｅＴＭ（東洋紡）などが挙げられる。
無細胞タンパク質合成によって得られるタンナーゼは、前述のように適宜クロマトグラフィーを選択して、精製することができる。
また、タンナーゼが単離精製されたことの確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５，１９７０）により、活性の測定はＨＰＬＣにより行うことが可能である。具体的には、タンナーゼの活性測定は、例えばＷＯ  ０２／３４９３８号公報に記載に準じて、没食子酸メチルを基質としてその分解産物の没食子酸を、ＨＰＬＣを用いて定量することにより、あるいは没食子酸メチルと被験検体を混合し４４０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、あるいは没食子酸メチルと被験検体を混合し溶液が緑色を経て褐色に変化するか否かを観察することにより行う。好ましくは吸光度により定量する。
＜タンナーゼに対する抗体の作製＞
精製したタンナーゼを、非ヒト動物、例えば家兎等に免疫することにより、タンナーゼに対するポリクローナル抗体を得ることができる。またマウス等に免疫し、その脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させて、モノクローナル抗体を得ることもできる。以下に具体的に説明する。
なお、本発明において「抗体」とは、抗原とするタンナーゼ又はその部分断片に結合し得る抗体分子全体（ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい）のほか、さらに、当該抗体分子の断片、すなわち抗原抗体反応活性を有する活性フラグメント（具体的には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、組換えＦｖ体、１本鎖Ｆｖ等）をも意味する。
（１）抗原の調製
上記抗体を作製するための抗原としては、前述した本発明のタンパク質、又はこれと実質的に同一なタンパク質を用いることができる。ここでいう実質的に同一なタンパク質とは、例えば、糖鎖等の生理的または人為的な修飾、蛍光や放射性物質のような標識の有無や種類・程度の異なるものを含む。つまり、例えば、本発明のタンパク質を発現させる宿主によっては、糖鎖による修飾に差異が生じる可能性があるが、糖鎖の修飾に違いを持っていても、タンナーゼと同様の性状を示すものであれば、いずれもタンナーゼまたはそれと実質的に同一なタンパク質であるとして、抗原に用いることができる。
また、抗体の検出においては、抗原分子そのもの（すなわち、タンナーゼ又はそれと実質的に同一なタンパク質）のみならず、それらのタンパク質のフラグメント、断片ペプチド、化学的に合成したオリゴペプチドを適切な担体とともに含む複合体を抗原として用いる方法が採用されることも多い。その理由は、とくに優勢なエピトープ、あるいは臨床的になんらかの意味を持つエピトープに特異的である分析系としたほうが非特異的な反応の影響を受けにくくなるためである。すなわち、後述するハイブリドーマのクローニングおよびクローン選別が効率的に実施でき、しかも抗体価の高い抗タンナーゼ・モノクローナル抗体を得ることができるためである。エピトープ部位として抗原タンパク質の高次構造における多数の領域を認識させるよりは、それより低次でも特定のしかも少数の特定構造を認識させるようにするのが好ましい。
タンナーゼに対して、特異性および親和性が高いモノクローナル抗体を得る場合においても、このようなアプローチは有効である。具体的には、後述する免疫学的に活性なドメインペプチドを得る方法に基づいて、エピトープとして機能するドメインを決定することができる。
エピトープは少なくとも３アミノ酸残基で構成できる場合のあることが知られている。また他のタンパク質との免疫学的な識別は、少なくとも６アミノ酸残基で可能となるといわれている。したがって、タンナーゼ又はそれと実質的に同一なタンパク質のアミノ酸配列から選択された少なくとも連続した６アミノ酸残基、通常８アミノ酸残基、好ましくは１０アミノ酸残基、より好ましくは１１〜１５アミノ酸残基からなる。
さらに、エピトープを構成するオリゴペプチドに対して、様々な修飾を加えて免疫学的な反応性を向上させる方法も当業者には公知である。たとえば、ヒト血清アルブミンのような不活性タンパク質、あるいは無意味なアミノ酸配列の付加といった修飾が免疫学的な反応性の向上に寄与する。
タンナーゼの断片は、トリプシン、キモトリプシン、ペプシンなどのプロテアーゼを使った酵素消化又はブロモシアンなどを用いる化学的切断、あるいはそれらを組み合わせることにより得ることができる。生成したペプチド混合物から、目的のペプチドを分離精製するには、クロマトグラフィー、電気泳動法などの公知の分離技術を利用すればよい。
別の方法として、タンナーゼをコードするＤＮＡをランダムに切断し、それをファージベクターに挿入してドメインペプチドを提示したファージライブラリーを作成することによっても得ることができる。これらのライブラリーを、タンナーゼを認識する抗体でイムノスクリーニングすれば、免疫学的に活性なドメインを決定することができる。別法としては、タンナーゼの親水性プロファイルとその他の抗原性指標を検索する解析法によって、まずアミノ酸残基数１４個以上の好適と想定されるペプチド部分が決定される。免疫原候補としてのこれらのペプチドは、公知技術である液相法または固相法によるペプチド合成技術により合成することができる。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法に代表される固相合成法が、簡便で短時間に行うことができる。
α−アミノ保護基として、標準的には第三ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）が用いられるが、Ｓｈｅｐｐａｒｄらが開発した９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基（Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅ．ａｎｄ  Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．（１９８５）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．１６５）も利用可能である（泉屋信夫、他著「ペプチド合成の基礎と実験」１９４〜２３３ページ、丸善、１９８５年を参照）。
本発明においては、固相合成法に基づく自動化ペプチド合成機を利用してもよい。合成されたペプチドは、トリフルオロ酢酸などの存在下で樹脂から切り離し、次いで逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製する。精製ペプチドは８５％以上の純度を有することが望ましい。
上記候補ペプチドのうち、免疫感作動物から採取されるポリクローナル抗体とタンナーゼと反応させ、酵素標識抗ＩｇＧ抗体による検出反応で陽性を示すペプチドを、本発明の抗体作出用の免疫抗原とすることができる。
このようなペプチドを担体タンパク質と結合させて調製された免疫原は、タンナーゼに対して特異的で、かつ十分な結合親和性を有する抗体を与える。これにより、例えば、免疫原として有用なタンナーゼの上記ペプチドを、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）を担体タンパク質として結合させてから、非ヒト動物に感作させることができる。
免疫原を得るために使用できるその他の担体物質として、ツベルクリン精製タンパク質誘導体、破傷風変性毒素、コレラ毒素およびそのＢサブユニット、ジフテリア毒素、オボアルブミン、ウシ血清アルブミン、大豆トリプシンインヒビター、ムラミルジペプチド、ブラウンのリポタンパク質などが挙げられる。ペプチドを担体タンパク質に結合させるための反応、試薬などは公知の文献に記載されているものを用いてもよい。
（２）タンナーゼに対するポリクローナル抗体の作製
上記の通り作製した抗原を哺乳動物に投与する。哺乳動物は特に限定されるものではなく、例えば、マウス、モルモット、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤギ、サル、イヌなどが挙げられるが、一般に扱いやすさなどから、とくにマウスまたはウサギが好ましく用いられる。
抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは、例えば、ウサギで１〜１０ｍｇであり、アジュバントを用いるときは例えば、０．０１〜１ｍｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、静脈内、皮下、腹腔内等に注入することにより行うことができる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間、適当な間隔にて免疫を行うことができる。その後、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）又はＥＩＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ））、放射性免疫測定法（ＲＩＡ；ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ）等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得ることができる。
（３）タンナーゼに対するモノクローナル抗体の作製
（ｉ）抗体産生細胞の採取
モノクローナル抗体の調製のためには、免疫用抗原となるタンナーゼもしくは免疫学的に同等のタンパク質、またはそのフラグメントもしくは断片ペプチドを免疫原として哺乳動物の抗体産生が可能な部位に、単独で、または担体および希釈剤とともに投与することによって行うことができる。その際、抗体産生能力を高めるため、アジュバントなどを混ぜて投与してもよい（Ａｄｖ．Ｔｕｂｅｒｃｌ．Ｒｅｓ．，１：１３０−１４８，１９５６）。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。
モノクローナル抗体は、免疫担当細胞（具体的には抗体産生細胞）と骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）との間に融合細胞を形成させ、当該細胞をクローニングし、タンナーゼに特異的な抗体を産生するクローンを選択することにより得ることができる（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−７，１９７５）。
免疫には、免疫原として上記ペプチドを含む複合体（またはタンナーゼもしくはそれと免疫学的に同等なタンパク質、またはそのフラグメントもしくは断片ペプチド）を用い、１回当たり、たとえば２０μｇ〜１ｍｇ、適当なアジュバントと溶解もしくは混和して免疫動物に免疫感作してもよい。
免疫動物として用いる哺乳動物は、マウス、モルモット、ラット、サルなどが挙げられるが、一般に扱いやすさなどから、とくにマウスまたはラットが好ましく用いられる。抗体産生細胞と骨髄腫細胞とは同種動物由来である方が望ましい。投与は、通常３〜６ヶ月間の期間において、２〜６週ごとに１回ずつ２〜１０回程度行われるがこれらに限定されない。
抗体産生細胞の採取は、抗原感作された上記動物から抗体価が認められた個体を選択し、最終免疫から適当な期間後に脾臓細胞、リンパ節細胞またはＢ−リンパ球を採取することによって得ることができる。
（ｉｉ）細胞融合
上記のようにして得られた抗体産生細胞と自立増殖能を有する骨髄腫細胞との融合操作は公知の技術を使用することができ、その手順は、基本的には、ケーラーの方法に準じて行えばよい（”Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，３９１，１９７９）。骨髄腫細胞（ミエローマ）として、Ｐ３Ｕ１、ＮＳ−１、ＳＰ２／０といったマウス骨髄腫由来の細胞株またはその変異株などが挙げられるが、これらに限定されない。融合促進剤としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルスなどが挙げられるがこれらに限定されない。融合は、例えば、血清を含有しない液体培地などに骨髄腫細胞を浮遊させ、この浮遊液に上記で調製した脾細胞などの抗体産生細胞を含む液を加えてしばらく静置した後、軽く遠心分離して細胞を回収し、ＰＥＧを含む培地を加えて、数分間インキュベートすることにより行うことができ、このような操作により細胞融合は完了する。
反応物を遠心分離して回収したハイブリドーマは、適当な選択培地、たとえばＨＡＴ培地に移し、たとえば９６ウェルマイクロプレートに分注したのち、所定期間培養する。培養条件として特に限定されないが、例えば、５％の炭酸ガス下、インキュベータ中で、２０〜４０℃、好ましくは３４から３８℃である。通常１週間後には、ハイブリドーマが生育してコロニー形成が観察される。
（ｉｉｉ）抗体スクリーニングおよびクローニング
モノクローナル抗体の選別は、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞培養液などで行うことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものであれば特に制限はない。たとえばハイブリドーマ培養用無血清培地、牛胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ；ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ培地、ＧＩＴ培地などを用いることができる。
増殖の見られたウェルの培養上清中のペプチドに対する抗体価を酵素抗体法などによって測定し、たとえば限界希釈法によってハイブリドーマのクローニングを行って本発明のハイブリドーマのクローンを得る。
形成された本発明のハイブリドーマをスクリーニングする操作は、一般に次のとおりであるがこれに限定されない。免疫原として用いたペプチドを直接にまたは担体とともに吸着させたマイクロプレートなどの固相へ、ハイブリドーマ培養上清を添加し、次いで放射性物質、酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法が便利である。あるいは抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、次いで標識抗原を加えて、固相に結合したモノクローナル抗体を検出してもよい。
上記操作により陽性ウェルを選択し、数日してから、一株につき９６ウェルプレート１枚に、たとえば１００細胞／プレートとなるように撒き、数日間培養し、コロニーを判定し、培養上清を上記スクリーニング用抗原固相化プレートに適用して、検定を同様に行うことができる。選択したコロニーは、培養後、リクローニングし、数日間培養してコロニー判定および培養上清の検定を上記と同様に実施することができる。親株別にウェルを選択して培養し、上清を回収してクローンのチェックを行い、抗体のサブクラスおよび抗体産生を検定することができる。
（ｉｖ）モノクローナル抗体の産生およびその分離
上記のようにして選別されたクローンを生体内外で培養すると、本発明のモノクローナル抗体が産生される。その培養には、当該技術分野において慣用されている方法を使用することができる。
ハイブリドーマを生体外の培養培地で培養した場合、その培養物からモノクローナル抗体を分離すればよい。増殖速度、抗体産生効率の向上には、培地の種類の選択と維持、培養条件の管理（たとえば培地内酸素濃度、撹拌速度）が求められる。
ヒトを除く温血動物を利用してクローンを培養した場合、その腹水および／または血液からモノクローナル抗体を採取することができる。たとえば所定の細胞密度になるようにクローンを、ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地などに接種したのち、インキュベータ中、５％炭酸ガスの存在下で培養する。次いでその培養物を、予めプリスタンを投与しておいたマウスの腹腔内に接種し、所期の期間、通常の方法で飼育する。数週間後、腹水を採取し、これに硫酸アンモニウムを添加して塩析沈殿を得て、その分画からクロマトグラフィーなどを利用してモノクローナル抗体を分離精製することができる。
培養物または腹水および／または血液からモノクローナル抗体を単離する方法は、公知のポリクローナル抗体の精製方法と同じであり、免疫グロブリンの分離精製法を用いることができる。すなわち、塩析法、透析法、濾過法、濃縮、アルコール沈殿法，等電点沈殿法、各種電気泳動法、イオン交換体（ＤＥＡＥ樹脂など）による吸脱着法、超遠心法、ゲル濾過法、特異的アフィニティ精製法などを適宜組み合わせて利用することができる。生成したモノクローナル抗体は、その後適宜濃縮し、液状として、また用途に応じて凍結乾燥により固体状として用いてもよい。
＜タンナーゼ検出法の大腸癌診断への利用＞
タンナーゼ産生菌については、糞便中のタンナーゼ産生菌が大腸癌患者で多く見出され、下部消化管内視鏡検査を施行した患者糞便中からのタンナーゼ産生菌分離率が大腸癌患者で高いことより、ヒトの大腸癌には、タンナーゼ産生菌が関与していることが報告されている。したがって、ヒト糞便中のタンナーゼ産生菌から単離されたタンナーゼ遺伝子を遺伝子工学的手法に供することにより、または、抗タンナーゼ抗体の免疫学的な特性を用いることにより、大腸癌の検出方法及び診断方法が提供される。
（１）免疫学的大腸癌検出方法
（１−１）抗体を用いた大腸癌検出方法
大腸癌の検出方法は、被験者の生体試料と本発明の抗体又はその断片とを反応させて、試料中に存在する疾患のマーカーを検出する工程、および前記工程の検出結果を、疾患と関連付ける工程を含む。また、本発明においては、抗体又はその断片と被験試料とを反応させてタンナーゼ産生スタフィロコッカス・ルグダネンシスを検出する方法も含む。
上記マーカーとして、以下に示すいずれかを用いることができる。これらのマーカーの測定方法は、後述する。
（ａ）タンナーゼまたはタンナーゼと実質的に同一なタンパク質、または
（ｂ）タンナーゼまたはタンナーゼと実質的に同一なペプチド。
作製したタンナーゼに対する抗体（抗タンナーゼ抗体）を用いた免疫化学的手法により、被験試料、例えばヒト糞便中のタンナーゼ産生細菌、特にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ（スタフィロコッカス・ルグダネンシス）が産生するタンナーゼを測定することが可能である。たとえば、被験者から採取された糞便試料中に、タンナーゼまたはタンナーゼと実質的に同一なタンパク質もしくはペプチドが見出されれば、被験者の腸内細菌中にはタンナーゼ産生細菌、特にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓが存在すると考えられ、その被験者は大腸癌に罹患している可能性が高い。
あるいは、患者から採取された糞便におけるタンナーゼまたはタンナーゼと実質的に同一なタンパク質の発現は、大腸癌の罹患を示している。タンパク質の発現は、一般にタンパク質自体またはその情報を担うｍＲＮＡの存在を指標として検出することができる。タンナーゼの検出のためには、本発明の抗タンナーゼ抗体が、好ましく利用される。糞便中においてタンナーゼが検出される場合には、大腸癌に罹患している可能性が高い。
本発明の抗体は、タンナーゼを精製するための抗体カラムの作成、精製時の各分画中に存在する該タンパク質の検出に利用してもよい。もっとも、本発明に係る特異的な抗タンナーゼ抗体の利用は、これらの用途のみに限定されるものではない。
（１−２）抗体を用いた大腸癌診断薬としての利用
次に、抗タンナーゼ抗体を含む免疫学的な大腸癌診断薬は、上記の用途のためにどのような態様で使用されるかについて具体的に述べる。
被験試料中の抗原もしくは抗体に対する免疫学的手法としては、公知の方法が適用でき、検体中の抗原量、すなわちタンナーゼタンパク質の量に対応した抗体又は抗原・抗体複合体の量を化学的又は物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準溶液を用いて作成した検量線から算出する測定方法でもよい。例えば酵素免疫測定法、放射免疫測定法、化学発光免疫測定法、電気化学発光免疫測定法、イムノクロマトグラフィー法、ウエスタンブロット法、受け身粒子凝集法、受け身血球凝集法、ラテックス粒子凝集法などが挙げられる。特に、感度および特異性の見地から、酵素免疫測定法である次のサンドイッチ法が特に好ましい。サンドイッチ法（例えばＥＬＩＳＡ法）では、本発明の抗タンナーゼ抗体を固相化したマイクロタイタープレートと検体試料とを反応させ（１次反応）、洗浄後第二抗体として酵素標識抗タンナーゼ抗体を反応させる（２次反応）。洗浄後酵素基質を加え、基質の発色量を分光光度計によって測定することにより、検体中のタンナーゼなどの量を定量できる。この場合、１次反応と２次反応は逆順序に行ってもよく、同時に行ってもよいし、時間をずらして行ってもよい。２次反応に用いられる抗体は、タンナーゼの結合する部位が本発明の１次反応に用いられる抗体と相異なる抗体が好ましく用いられる。
抗タンナーゼ抗体の固相化担体としては、マイクロタイタープレートの他に、磁気感応性ビーズ、プラスチックビーズ、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、赤血球、ゼラチン粒子、ポリアミノ酸粒子、ラテックス粒子などいずれの担体も使用することができる。
本発明のモノクローナル抗体を使用するイムノクロマトグラフィー法では、検体中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化モノクローナル抗体に対して競合反応をさせた後に、固相と液相とを分離する。あるいは検体中の抗原と過剰量の標識化モノクローナル抗体とを反応させ、次いで固相化抗原を加えて未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相とを分離する。次に何れかの相の標識量を測定し検体中の抗原量を定量する。
競合法では、検体中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原（Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ、Ｆのいずれかの標識量を測定し検体中の抗原量を定量する。別の方法として、抗体には可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、上記抗体に対する第２抗体などを使用する液相法、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは第１抗体は可溶性のものを用い、第２抗体として固相化抗体を用いてもよい。たとえば、担体上に不溶化した本発明の抗タンナーゼ・モノクローナル抗体および標識化された抗体と検体とを同時又は連続的に競合反応させた後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することも可能である。
本発明の抗タンナーゼ抗体を細胞の分離又は検出用試薬として用いる場合には、抗タンナーゼ抗体を他の溶媒や溶質と組み合わせて組成物とすることができる。たとえば、蒸留水、ｐＨ緩衝試薬、塩、タンパク質、界面活性剤などを組み合わせることができる。
反応試薬は適当な化学的または物理的検出手段により検出可能な標識を有する。そのような標識物質を用いる測定法に使用される標識剤として、たとえば蛍光物質、酵素、放射性同位元素、発光物質などが用いられる。標識に特に酵素を用いた場合は、上記のようにＥＬＩＳＡ法と呼ばれ、広く利用されている。この場合、第二抗体の標識物質としては、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ベータガラクトシダーゼなどの酵素の他に、蛍光物質、放射性物質、生物または化学発光物質、電気化学発光物質、色素、金属など定量可能な物質であればいずれも使用できる。
蛍光物質として、フルオレスカミン、フルオレッセインイソチオシアネートなど、酵素として、パーオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、リンゴ酸脱水酵素、α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼなど、放射性同位元素として、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃなど、発光物質として、ルシフェリン、ルシゲニン、ルミノール、ルミノール誘導体などが例示される。標識物質は、通常の条件、操作に準じた方法により、抗体に結合させることができる。
さらに本発明の抗タンナーゼモノクローナル抗体または抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いてもよい。抗原またはモノクローナル抗体の不溶化には、物理的吸着を用いてもよく、あるいは通常タンパク質または酵素などを不溶化、固定化するために用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体として、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコンなどの合成樹脂、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、あるいはガラスなどが用いられる。
反応媒体として、反応の至適条件を与えるか、反応生成物質の安定化などに有用な緩衝液、反応物質の安定化剤などが含まれる。
検出手段としては、分光器、放射線検出器、光散乱検出器といった上記標識を検出可能なものである。
（２）タンナーゼ遺伝子の検出法
本発明においては、本発明のタンナーゼ遺伝子のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するポリヌクレオチドも提供する。このポリヌクレオチドは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓを検出するために使用することができる。従って、本発明は、タンナーゼ遺伝子のポリヌクレオチドと被験試料とを接触させることにより、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓを検出する方法も提供される。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの長さは、少なくとも１５ヌクレオチドである。プライマーとして使用する場合、ポリヌクレオチドの長さは、好ましくは１５〜４０ヌクレオチド、好ましくは２０〜３５ヌクレオチドであり、「ハイブリダイズ」の条件は通常のＰＣＲの条件である。またプローブとして用いられる場合、長さに特に制限は無く数ｋｂのプローブであっても許される。「ハイブリダイズ」の条件は前記のもとの同様である。
ヒト糞便から直接得られたＤＮＡ、あるいはヒト糞便を培養、好ましくは嫌気培養した菌体より得られたＤＮＡを鋳型とし、適当な遺伝子増幅操作、例えば配列番号１に示される塩基配列情報を元に１５〜４０ヌクレオチドの長さを有する適当なプライマーを設定してＰＣＲを行うことにより、タンナーゼ遺伝子を検出することができ、それによりタンナーゼ産生細菌、特にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓを検出することができる。また、検出手法は上記ＰＣＲ法のほか、サザンブロッティング、ノーザンブロッティングなどが挙げられる。上記ポリヌクレオチドは、ＰＣＲの場合はプライマーとして使用され、サザンブロッティング及びノーザンブロッティングの場合はプローブとして使用される。
以下にその方法について説明する。
（２−１）ヒト糞便からのＰＣＲ用試料の調製法
ヒト糞便からのＰＣＲ用試料の採取方法としては、いずれの方法も用いうるが、例えば、肛門に綿棒を挿入することにより行ってもよい。そして、糞便が付着した綿棒を適当な液体培地に入れて培養する。培地や培養条件は上記したように嫌気培地を用いて適当な条件のもとに行うことができるが、例えば、ストレプトコッカス選択サプリメント含有ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）液体培地に入れ、３７℃で一晩嫌気培養を行うこともできる。培養後の培養液からＤＮＡ試料を得るには、公知の方法を用いることができるが、例えば、培養後の培養液を滅菌水と混合して、遠心分離機にかけて適当な条件で遠心分離することにより培養菌体を沈殿させる。上清を除去後、滅菌水を加え、懸濁したものをＰＣＲ用ＤＮＡ試料とすることができる。
（２−２）ＰＣＲによるタンナーゼ遺伝子増幅方法
上記の操作によって得られたＰＣＲ用ＤＮＡ試料、各プライマーおよびＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を加え、滅菌精製水により用量を調整する。なお、用いるプライマーとしては、少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは２０ヌクレオチド以上の鎖長を有するポリヌクレオチド、例えば、
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などがある。
タンナーゼ遺伝子の増幅は、公知の方法を用いることができるが、例えばサーマルサイクラーを用いた以下の条件で行うこともできる。すなわち、９５℃で３分間の加熱により細胞を破壊させた後、９５℃で３０秒間のＤＮＡ変性、５０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長反応の行程を５サイクル後、さらに９４℃で２０秒間のＤＮＡ変性、５０℃で２０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長反応の行程を２５サイクル行い、最後に７２℃で５分間の伸長反応の行程により行うものである。増幅産物は適当な濃度のａｇａｒｏｓｅ  Ｘ  ｇｅｌ（Ｎｉｐｐｏｎ  ｇｅｎｅ）にて電気泳動し、タンナーゼ遺伝子の有無の検出に供する。上記のプライマーを用いた場合は、２２３ｂｐのバンドとして検出される。
上記のようにヒト糞便から得た菌につき、ＰＣＲによりタンナーゼ遺伝子の検出を行うと共に、タンニン酸を上層させたＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ａｇａｒ培地（Ｏｘｏｉｄ）を用いて培養し、タンナーゼ産生を示す溶解斑を確認するとともに、タンナーゼ産生菌の分離同定を行うことができる。
検出結果は、ＰＣＲ法によりタンナーゼ遺伝子の検出の有無を観察すること、培養法によってタンナーゼ産生を示す溶解斑を確認することにより、及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓの分離同定の可否の結果を各々単独で又はこれらの結果を組み合わせることにより確認することができる。
（２−３）サザンブロッティング又はノーザンブロッティング法による検出
サザンブロッティング（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行う場合は、特定の制限酵素で切断した遺伝子を電気泳動にかけ、ニトロセルロースなどの膜にブロット（転写）する。転写した核酸を膜上に固定した後、ラベルしたプローブとハイブリダイズさせてタンナーゼ遺伝子の存在を検出する。プローブのラベルには、例えばリンの放射性同位体の他、ディゴキシゲン（ＤＩＧ）等が用いられる。
ノーザンブロッティング（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）の場合は、サンプルから抽出したＲＮＡを電気泳動によって展開し、メンブレンに転写したのち、標識したプローブを用いて検出を行う。
細胞からフェノール試薬などを用いてヌクレオチドを抽出した後、ＲＮａｓｅフリーのＤＮａｓｅによってＤＮＡのみを消化し、アガロース電気泳動などによってゲル上に展開する。このゲルを膜に転写（ブロット）し、さらに検出目的のＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチドを標識したプローブをハイブリさせることで、標的ＲＮＡの量及びサイズを検出する。標識には例えばＤＩＧを用いることができる。
（３）大腸癌診断薬
本発明のタンナーゼタンパク質の検出方法、又はタンナーゼ遺伝子の検出方法を大腸癌診断等に適用する場合、特別の条件、操作などは必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作に準じて行われ、必要であれば若干の修飾を加えて好適な測定系が構築できる。
そのためのもっとも簡便かつ効率的に測定を行うことを可能とするのは、上記診断薬をキット化することである。そうしたキット化により、通常の検査室または実験室で、特殊な分析機器、熟練した操作、高度の知識は必要とせずに、効率的に定量を行うことができる。従って、本発明は、本発明の抗体又はその断片、及び本発明のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するポリヌクレオチドからなる群から選ばれる少なくともーつを含む、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ検出用キット、又は大腸癌検出用キットを提供する。上記の診断方法または治療の判定方法を実施するためのアッセイキットの構成および形態は、特に限定されるものでなく所定の目的を達成できるものであればその内容は限定されない。一般には上記被験試料について、アッセイ方法を実行し得られた結果を解釈するための使用説明書、反応試薬、反応が行われる場となる反応媒体、アッセイの場を提供する基材などから構成される。さらに所望により、比較基準とするためのあるいは検量線を作成するための照合サンプル、検出器なども含んでもよい。
以下に、具体的な例をもって本発明を示すが、本発明はこれに限られるものではない。
【実施例１】  タンナーゼ遺伝子のクローニングと同定
（１）使用菌株とベクター
大腸ガン患者の糞便から分離したタンナーゼ産生Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（Ｓ．）ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ  ３１５−１をタンナーゼ遺伝子の供与菌株として使用した。またクローニングの宿主として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（Ｅ．）ｃｏｌｉ（大腸菌）ＤＨ５α［ｓｕｐＥ４４，ΔｌａｃＵ１６９，（Δ８０ｌａｃＺΔＭ１５），ｒｅｃＡ１，ｅｎｄＡ１，ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−，ｍｋ＋），ｔｈｉ−１，ｇｙｒＡ９６，ｒｅｌＡ１］を用いた。ベクターはｐＵＣ１８を用いた。
（２）使用培地
Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓの培養には、Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ：Ｄｉｆｃｏ）培地を用いた。寒天培地はＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ａｇａｒ（Ｏｘｏｉｄ）培地を用いた。大腸菌の増殖培養には、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地［Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ）１０ｇ，Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ）５ｇ，ＮａＣｌ  １０ｇ，精製水１，０００ｍＬ（ｐＨ７．２）］を用いた。寒天培地は、液体培地に１．５％寒天（Ｂａｃｔｏ  Ａｇａｒ：Ｄｉｆｃｏ）を加えたものを用いた。大腸菌の形質転換用の培地は、ＳＯＢ液体培地［Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  ４ｇ，Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  １ｇ，ＮａＣｌ  １１６ｍｇ，ＫＣｌ  ３７ｍｇ，精製水２００ｍＬ（ｐＨ７．０）に２Ｍ  Ｍｇ溶液（１Ｍ  ＭｇＣｌ２と１Ｍ  ＭｇＳＯ４）を２ｍＬ加えたもの］とＳＯＣ液体培地（ＳＯＢ培地２００ｍＬに２Ｍ  Ｇｌｕｃｏｓｅ溶液を１ｍＬ加えたもの）を用いた。形質転換株の一次選択（スクリーニング）には、５０μｇ／ｍＬのａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ）、５０μｇ／ｍＬの５−Ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−１Ｈ−ｉｎｄｏｌ−３−ｙｌ  β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｘ−ｇａｌ）、２００μｇ／ｍＬのＩｓｏｐｒｏｐｙｌ  β−Ｄ（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）含有ＬＢ寒天培地を用いた。形質転換株のタンナーゼ活性のスクリーニングには、メンブランフィルター（０．４５μｍ：ＡＤＶＡＮＴＥＣ）でろ過滅菌した２％（ｗ／ｖ）タンニン酸（Ｋａｎｔｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）リン酸緩衝液（ＰＢＳ：０．１４Ｍ  ＮａＣｌ，２．７ｍＭ  ＫＣｌ，８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ，１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）を用いてＢＨＩ平板寒天培地表面を処理したタンニン処理ＢＨＩ寒天培地を用いた。
（３）ＤＮＡの抽出、精製法
（３−１）Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓの染色体ＤＮＡの抽出：
ＢＨＩ液体培地で、３７℃、一晩振とう培養したＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓの培養液１ｍＬをマイクロ遠心チューブに移し、遠心（１５，０００ｒｐｍ，１分間）にて集菌した。上清除去後、沈澱菌体をＣｅｌｌ  Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ２Ｎａ，１００μｇ／ｍＬ  ＲＮａｓｅ  Ａ］２００μＬに懸濁した。１００μｇ／ｍＬアクロモペプチダーゼ含有Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １００μＬを加え、５０℃、３０分間溶菌処理した。２％Ｓｏｄｉｕｍ  ｌａｕｒｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ）を３００μＬ加え溶菌させた。６００μＬのＰｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ溶液［平衡化Ｐｈｅｎｏｌ  ５０ｍＬ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ  ４８ｍＬ，ｉｓｏ−Ａｍｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ２ｍＬ，０．１Ｍ  Ｔｈｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１０ｍＬ］を加え、よく混合し、遠心（１５，０００ｒｐｍ，５分間）後、上清の水相を回収した。２倍量のＥｔｈａｎｏｌを加え、遠心（１５，０００ｒｐｍ，５分間）により染色体ＤＮＡを沈殿として回収した。遠心上清を除去し、沈殿に適当量の７０％Ｅｔｈａｎｏｌを加え、再遠心後、上清を除去した。減圧遠心によりＥｔｈａｎｏｌ残渣を除去後、滅菌水に溶かしたものを精製染色体ＤＮＡ溶液とした。
（３−２）プラスミドＤＮＡの抽出：
プラスミドＤＮＡの抽出にはＷｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。ＬＢ液体培地に菌を接種後、３７℃、一晩振とう培養し、この培養液２ｍＬを遠心（１５，０００ｒｐｍ，１分間）にて集菌した。上清除去後、沈澱を３００μＬのＣｅｌｌ  Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎに懸濁させた。ＣｅｌＩ  Ｌｙｓｉｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ［０．２Ｍ  ＮａＯＨ，１％ＳＤＳ］を３００μＬ加え、溶菌させた。Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ［１．３２Ｍ  ＣＨ３ＣＯＯＫ（ｐＨ４．８）］を３００μＬ加え、よく混合した。遠心（１５，０００ｒｐｍ，５分間）後、上清を回収し、Ｗｉｚａｒｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｏｎ  Ｒｅｓｉｎ  １ｍＬを加え、良く混合してＲｅｓｉｎにＤＮＡを吸着させた。このＲｅｓｉｎ混合液をＷｉｚａｒｄ  Ｍｉｎｉｃｏｌｕｍｎに通し、さらにＣｏｌｕｍｎ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ［８０ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＫ，８．３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），４０μＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ，５５％Ｅｔｈａｎｏｌ］２ｍＬで洗浄後、プラスミドＤＮＡを水で溶出したものを精製プラスミドＤＮＡとした。
（４）制限酵素切断とＤＮＡ連結反応
（４−１）制限酵素切断反応：
ＤＮＡ１−３μｇを５０μＬに溶解し、約１０ｕｎｉｔの制限酵素を加えて２時間反応させた。反応溶液及び反応温度は、制限酵素の至適条件に従った。
（４−２）ＤＮＡ連結反応：
ＤＮＡ断片１−３μｇとＴ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ  Ｃｏ．）を１，０００−２，０００ｕｎｉｔｓ、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ［６６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），６６ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１００ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ  ＡＴＰ］を２μＬ加え、全量を２０μＬとし、１６℃で１６時間反応させた。
（５）大腸菌への形質転換法
大腸菌への形質転換は、Ｈａｎａｈａｎ法により行った。
（５−１）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞の調製：
ＬＢ寒天培地で生育させた大腸菌を１０ｍＬのＳＯＢ液体培地に接種し、３７℃で振とう培養した。Ｏ．Ｄ．ａｔ６００ｎｍ約０．５に達したら、直ちに１ｍＬずつマイクロ遠心チューブに移し、氷中に５分間放置した。遠心（１，５０００ｒｐｍ，１分間）にて集菌し、上清をできる限り除去した。氷冷したＣＰＧ  ｂｕｆｆｅｒ［１００ｍＭ  ＫＣｌ，５０ｍＭ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ，１０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１０ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＫ（ｐＨ７．５）］を５００μＬ加え、ミキサーで縣濁した。氷中に３０分間放置後、遠心（１，５０００ｒｐｍ、１分間）にて集菌し、上清をできる限り除去した。氷冷したＣＰＧ  ｂｕｆｆｅｒを１００μＬ加え、ミキサーで十分に縣濁し、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞縣濁液とした。
（５−２）形質転換法：
滅菌マイクロ遠心チューブにＣｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞縣濁液１００μＬとＤＮＡ溶液を１−１０μＬ入れ、穏やかに混和した。氷中に３０分間放置後、４２℃で１分間加温した。直ちに氷中に戻し、２−５分間放置した。１ｍＬのＳＯＣ液体培地に加え、６０分間振とう培養した。この菌液を０．１５ｍＬずつ、選択薬剤含有ＬＢ寒天培地に塗抹した。３７℃で１夜培養し、生じたコロニーを形質転換株とした。
（６）ＤＮＡ塩基配列の決定法
（６−１）ＤＮＡの増幅と精製：
鋳型として塩基配列を決定するＤＮＡを挿入したｐＵＣ１８、プライマーとしてｐＵＣ−Ｆ（配列番号３）とｐＵＣ−Ｒ（配列番号４）およびＬＡ  ＴａｑＴＭ（Ｔａｋａｒａ）を用いて、サーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００により挿入ＤＮＡ断片を増幅した。反応は、９５℃で２分間の加熱により、ＤＮＡを変性させた後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で４分間の伸長反応の行程を５ｃｙｃｌｅｓ、９４℃で２０秒間の変性、５５℃で２０秒間のアニーリング、７２℃で４分間の伸長反応の行程を２５ｃｙｃｌｅｓ、７２℃で１０分間の伸長反応の行程で行った。精製はＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行った。
2006073133.tif 000003
（６−２）塩基配列決定サンプルの調製：
塩基配列の決定には、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。（１）のＰＣＲより得られたＰＣＲ産物のＤＮＡ約３０ｎｇを用い、ＰＣＲ反応は添付マニュアルに準じて行った。Ｃｅｔｒｉ−Ｓｅｐスピンカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により精製した反応液を減圧遠心乾燥後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動時には、ローディング溶液［脱イオン化Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ  ５ｍＬ，ブルーデキストラン溶液（５０ｍｇ／ｍＬ  ｂｌｕｅ  ｄｅｘｔｒａｎ，２５ｍＭ  ＥＤＴＡ）１ｍＬ］４μＬに溶解、またはキャピラリー電気泳動時には、Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＳＲ：ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ）２０μＬに溶解した。塩基配列を決定する試料を９５℃で２分間加熱後、直ちに氷冷し、オートシーケンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはオートシーケンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３１０  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＤＮＡ塩基配列を決定した。
（６−３）塩基配列の解析：
得られたＤＮＡ塩基配列のデータ解析は、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ＳｏｆｔｗａｒｅＴＭ（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ）、ＡｕｔｏＡｓｓｅｍｂｌｅｒＴＭ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ２．１（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ）、ＤＮＡ解析プログラムＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ  Ｖｅｒ．１１（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）を用いて行った。
（７）タンナーゼ遺伝子のクローニング結果
Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ  ３１５−１株からＳＤＳ−Ｐｈｅｎｏｌ法で抽出した染色体ＤＮＡの２μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで部分分解後、ＨｉｎｄＩＩＩにより完全切断したｐＵＣ１８の１μｇを加え、Ｅｔｈａｎｏｌ沈殿した。混合ＤＮＡを連結後、大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ  ５０μｇ／ｍＬ、Ｘ−ｇａｌ  ５０μｇ／ｍｌ、ＩＰＴＧ  ２００μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地に塗抹し、一次選択した。増殖した約３，０００の白色コロニーをタンニン酸培地にレプリカし、３７℃、７２時間、嫌気条件下、培養した。タンニン酸の分解によるコロニー周辺の透明斑を形成した３株（Ｔａｎ１８、Ｔａｎ２４、Ｔａｎ３７）を分離した。ｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩＩ切断部位周辺のプライマーｐＵＣ−ＦとｐＵＣ−Ｒを用いたＰＣＲと制限酵素の切断解析から、得られた３株は、いずれも約７ｋｂのＤＮＡ断片がｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に挿入していた。制限酵素による切断解析は、ベクターに挿入したＤＮＡの切断パターンは異なっていたが、ベクター以外に共通のＤＮＡ断片を有していた。形質転換株Ｔａｎ１８が持つｐＴＺｔａｎ１８についてＤＮＡ塩基配列を決定した。
（８）タンナーゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定
得られた組換えベクターｐＴＺｔａｎ１８の挿入ＤＮＡ断片を、ｐＵＣ−ＦとｐＵＣ−Ｒのプライマーを用いて増幅し、タンナーゼ遺伝子の塩基配列決定の鋳型とした。ＤＮＡ塩基配列はプライマー・ウォーキングにより、ＤＮＡシーケンサ３１０を用い順次プライマーをデザインして決定した。ＤＮＡ塩基配列は再度ＤＮＡシーケンサ３７７による解析で確認した。決定したＤＮＡ塩基配列（配列番号５）に関する物理的地図を図１に示した。クローニングしたＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓのタンナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片は６，９９４ｂｐから成り、Ｇ＋Ｃ含量は３４．７％であった。遺伝子の解析から、タンパク質をコード可能なｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）が３つ検出された。ＯＲＦ１は６５３ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ｎｔ）の開始コドンＡＴＧから始まり２，５５７ｎｔ終止コドンで終わる６３５ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ（ａａ）から成る分子量６９，１９０ｋｄのタンパク質を、ＯＲＦ２は２，５８１ｎｔの開始コドンＡＴＧから始まり４，０１７ｎｔの終止コドンで終わる４７９ａａから成る分子量５４，９８７ｋｄのタンパク質を、ＯＲＦ３は６，０３４ｎｔの開始コドンＡＴＧから始まり４，１９６ｎｔの終止コドンで終わる６１３ａａから成る分子量６７，９７１ｋｄのタンパク質をコード可能であった。
（９）タンナーゼ遺伝子の同定
（９−１）ＤＮＡ断片欠失ベクターの作製：
ＤＮＡ塩基配列の決定したｐＴＺｔａｎ１８を用い、ＯＲＦ３の欠失を行った。制限酵素ＥｃｏＲＩはＯＲＦ３とｐＵＣ１８上のみに切断部位が存在した。そこで、ｐＴＺｔａｎ１８をＥｃｏＲＩで切断後、自己連結反応を行い、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。ＡＢＰＣ５０μｇ／ｍＬ含有ＬＢ寒天培地により選択し、約４ｋｂの挿入断片を持った欠失ベクター、ｐＴＺｔａｎ１８ＥｃＲＩを持つ株を複数分離した。ｐＴＺｔａｎ１８ＥｃＲＩを持つ株をタンニン酸培地で３日以上培養したが、透明斑は観察されなかった（図１）。
（９−２）ＯＲＦ２とＯＲＦ３のサブクローニング：
ｐＴＺｔａｎ１８を鋳型として、ＯＲＦ２を含んだＤＮＡ断片を増幅するプライマーＴａｎ−ＯＲＦ２−Ｆ（Ｂａｍ）（配列番号６）とＴａｎ−ＯＲＦ２−Ｒ（Ｓａｌ）（配列番号７）およびＯＲＦ３を含んだＤＮＡ断片を増幅するプライマーＴａｎ−ＯＲＦ３−Ｆ（Ｓａｌ）（配列番号８）とＴａｎ−ＯＲＦ３−Ｒ（Ｂａｍ）（配列番号９）を用いて、各々、ＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を増幅した。これらのプライマーの５’−末端には、各々、ＢａｍＨＩとＳａｌＩの切断認識配列をあらかじめ付加した。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩにより切断し、ｐＵＣ１８のＢａｍＨＩとＳａｌＩ部位に組み込み、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。ＡＢＰＣ５０μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地で形質転換株を選択し、ＯＲＦ２を持つ約２．１ｋｂ  ＤＮＡ断片を挿入したｐＴＺｔａｎ１８−ＯＲＦ２Ｐを持った株と、ＯＲＦ３を持つ約２．６ｋｂのＤＮＡ断片を挿入したｐＴＺｔａｎ１８−ＯＲＦ３Ｐを持った株を分離した。タンニン酸培地で３日以上培養したところ、ｐＴＺｔａｎ１８−ＯＲＦ２Ｐを持った株ではタンニン酸を分解する透明斑がコロニー周辺に観察できなかったが、ｐＴＺｔａｎ１８−ＯＲＦ３Ｐを持った株では明瞭な透明斑が観察された（図１）。したがって、タンナーゼをコードする遺伝子はＯＲＦ３であることが明らかとなった。
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【実施例２】  タンナーゼタンパク質発現ベクターの作製
（１）使用菌株とベクター
宿主として大腸菌ＪＭ１０９［ｒｅｃＡ１，ｅｎｄＡ１，ｇｙｒＡ９６，ｔｈｉ，ｈｓｄＲ１７，ｓｕｐＥ４４，ｒｅｌＡ１，Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）／Ｆ’（ｔｒａＤ３６，ｐｒｏＡＢ，ｌａｃＩｑ，ｌａｃＺΔＭ１５））］とＢＬ２１［Ｆ−，ｏｍｐＴ，ｈｓｄＳｂ（ｒＢ−ｍＢ），ｇａｌ（λ，ｃＩ８５７，ｉｎｄ１，Ｓａｍ７，ｎｉｎ５，ｌａｃＵＶ５−Ｔ７ｇｅｎｅ１）］を使用した。ベクターはｐＧＥＸ−４Ｔ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）［ＡＢＰＣｒ，Ｐｔａｃ，ｌａｑＩｑ，ｇｓｔ  ｇｅｎｅ］を使用した。
（２）制限酵素切断とＤＮＡ連結反応
制限酵素処理及びＤＮＡ連結反応は、実施例１と同様に行った。
（３）大腸菌の形質転換
大腸菌への形質転換は、実施例１と同様、Ｈａｎａｈａｎ法により行った。
（４）発現ベクターの作製
（４−１）ＰＣＲ
フォワードプライマーＯＲＦ３−Ｆ（ＢａｍＨＩ）（配列番号１０）はＯＲＦ３の開始コドンＡＴＧの５’側に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列を持つように、リバースプライマーＯＲＦ３−Ｒ（ＸｈｏＩ）（配列番号１１）はＯＲＦ３の終止コドンＴＡＧの３’側に制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を持つように設計した。合成はＳＩＧＭＡ社に依頼した。
ｐＴＺｔａｎ１８を鋳型とし、ＯＲＦ３−Ｆ（Ｂａｍ）とＯＲＦ３−Ｒ（Ｘｈｏ）をプライマーとして、ＯＲＦ３のＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅した。
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ＰＣＲは、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いて行った。２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ＴＯＹＯＢＯ）５μＬ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ２μＬ、１０×Ｂｕｆｆｅｒ＃１（ＴＯＹＯＢＯ）［１．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１００ｍＭ  ＫＣｌ，６０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４，１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ］５μＬ，各プライマー２５ｐｍｏｌ，鋳型ＤＮＡ  ２μＬ，ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ２．５Ｕｎｉｔｓを加え、超純水で全量を５０μＬとし、反応液とした。サーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００を用い、９５℃、２分間の加熱によりＤＮＡを変性させた後、９５℃・３０秒間の変性、５５℃・３０秒間アニーリング、７４℃・２分間の伸長反応の行程を５ｃｙｃｌｅｓ、９４℃・２０秒間の変性、６０℃・２０秒間のアニーリング、７４℃・２分間の伸長反応の行程を２０ｃｙｃｌｅｓ、７４℃で５分間の伸長反応の行程で行った。ＰＣＲ産物の精製はＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行った。
（４−２）発現ベクターへの挿入
精製したＤＮＡ断片と発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１を制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断し、混合した。Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅによる連結反応後、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。ＡＢＰＣ  ５０μｇ／ｍＬ含有ＬＢ寒天培地で形質転換株を選択し、増殖したＡＢＰＣ耐性形質転換株をタンニン酸培地で３日以上培養した。コロニー周辺に透明斑が観察されたＡＢＰＣ耐性形質転換株のプラスミドを調べたところ、すべて約１．８ｋｂ−ＤＮＡ断片が挿入されていた。その内、４株（ｐＧＥＸｔａｎ８，ｐＧＥＸｔａｎ３５，ｐＧＥＸｔａｎ６５，ｐＧＥＸｔａｎ１３）について、保有するプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩとＸｈｏＩを用いて切断パターンを解析し、４つのプラスミドすべてにおいて、同じバンドが確認された。
（５）挿入されたＤＮＡの塩基配列の確認
４つのプラスミドのうちｐＧＥＸｔａｎ８とｐＧＥＸｔａｎ６５について、これらを鋳型として、ＧＳＴ−１（＋）（配列番号１２）とＧＳＴ−２（−）（配列番号１３）をプライマーとし、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて挿入ＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅後、挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を確認した。塩基配列の決定及び解析は実施例１と同様に行った。
この２種のプラスミドにおいて、ＤＮＡの塩基配列は完全に同じであり、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼと同一フレームでタンナーゼ遺伝子が挿入していた。タンナーゼ遺伝子の開始コドンＡＴＧの５’側にＢａｍＨＩが終止コドンＴＡＧの３’側にＸｈｏＩの認識配列があることを確認した。
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【実施例３】  各種標準菌株および臨床分離株からのＰＣＲ法によるタンナーゼ遺伝子の検出
（１）使用菌株
標準菌株としてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ  ＡＴＣＣ４３８０９、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ２５９２３、スタフィロコッカス・エピデルミジス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）ＡＴＣＣ１４９９０、スタフィロコッカス・ホミニス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ）ＪＣＭ２４１９、スタフィロコッカス・シュレイフェリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ）ＡＴＣＣ４３８０８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ１１７７５、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ６６３３、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）ＡＴＣＣ１９４３３、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＴＯＡ１０８８、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＡＣＭ３６１１を用いた。
また、ヒト糞便から分離したタンナーゼ陽性の臨床分離株として、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ  ３１５−１、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ６７、ラクトバチルス・ペントサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ）Ｓｔ０６７、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ  ３０３を用いた。
（２）標準菌株および臨床分離株におけるＰＣＲ用試料の調製法
各種菌株および臨床分離株は、増殖用寒天平板培地に増殖したコロニー１個を滅菌爪楊枝でかき取り、滅菌水１００μＬに懸濁した菌液をＰＣＲ用のＤＮＡ試料溶液とした。
（３）ＰＣＲによるタンナーゼ遺伝子増幅方法
ＰＣＲ用ＤＮＡ試料１μＬ、各プライマー５０ｐｍｏｌおよびＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）１２．５μＬを加え、滅菌精製水により全量を２５μＬとした。なお、プライマーとしてＴａｎ−Ｆ−Ｆ６（配列番号１４）とＴａｎ−Ｆ−Ｒ７（配列番号１５）を用いた。サーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により、タンナーゼ遺伝子を増殖させた。反応は、９５℃で３分間の加熱により細胞を破壊させた後、５℃で３０秒間のＤＮＡ変性、５０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長反応の行程を５サイクル後、さらに９４℃で２０秒間のＤＮＡ変性、５０℃で２０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長反応の行程を２５サイクル行い、最後に７２℃で５分間の伸長反応の行程によりＰＣＲを行った。増幅産物は２．５％ａｇａｒｏｓｅ  Ｘ  ｇｅｌ（Ｎｉｐｐｏｎ  ｇｅｎｅ）にて電気泳動し、タンナーゼ遺伝子（２２３ｂｐ）の有無を調べた。
2006073133.tif 000007
（４）ＰＣＲによる標準菌株および臨床分離株からのタンナーゼ遺伝子の検出結果
標準菌株および臨床分離株の計１４株についてＰＣＲによりタンナーゼ遺伝子の検出を行った結果、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ  ２株のみでタンナーゼ遺伝子が検出された。この結果より、本発明に係るタンナーゼ遺伝子は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓに特異的な遺伝子であることが明らかとなった。
【実施例４】  ヒト糞便からのＰＣＲ法によるタンナーゼ遺伝子の検出
（１）ヒト糞便からのＰＣＲ用試料の調製法
肛門に挿入した綿棒を０．４％ストレプトコッカス選択サプリメント含有ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）液体培地２ｍｌに入れ、３７℃で一晩嫌気培養を行った。その培養液１００μＬを滅菌水５００μＬと混合し、１５００ｒｐｍ，１ｍｉｎ遠心により培養菌体を沈殿させた。上清を除去後、滅菌水１００μＬを加え、懸濁したものをＰＣＲ用ＤＮＡ試料とした。
（２）ＰＣＲによるタンナーゼ遺伝子増幅方法
ＰＣＲ用ＤＮＡ試料３μＬ、各プライマー５０ｐｍｏｌおよびＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）１２．５μＬを加え、滅菌精製水により全量を２０μＬとした。なお、プライマーとしてＴａｎ−Ｆ−Ｆ６（配列番号１４）とＴａｎ−Ｆ−Ｒ７（配列番号１５）を用いた。サーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により、タンナーゼ遺伝子を増殖させた。反応は、９５℃で３分間の加熱により細胞を破壊させた後、９５℃で３０秒間のＤＮＡ変性、５０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長反応の行程を５サイクル後、さらに９４℃で２０秒間のＤＮＡ変性、５０℃で２０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長反応の行程を２５サイクル行い、最後に７２℃で５分間の伸長反応の工程によりＰＣＲを行った。増幅産物は２．５％ａｇａｒｏｓｅ  Ｘ  ｇｅｌ（Ｎｉｐｐｏｎ  ｇｅｎｅ）にて電気泳動し、タンナーゼ遺伝子（２２３ｂｐ）の有無を調べた。
（３）ＰＣＲによるヒト糞便からタンナーゼ遺伝子の検出結果
４名のヒト糞便から得た菌につき、ＰＣＲによりタンナーゼ遺伝子の検出を行うと共に、タンニン酸を上層させたＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ａｇａｒ培地（Ｏｘｏｉｄ）を用いて培養し、タンナーゼ産生を示す溶解斑を確認するとともに、タンナーゼ産生菌の分離同定を行った。
その結果、１名の糞便からＰＣＲ法によってタンナーゼ遺伝子が検出されるとともに、培養法によってタンナーゼ産生を示す溶解斑が確認され、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓが分離同定された。また残りの３名から得た菌については、ＰＣＲ法によってタンナーゼ遺伝子は検出されず、培養法によってもタンナーゼ産生は陰性でＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓは分離されなかった。
これらの結果より、ヒト糞便中のタンナーゼ産生菌はタンナーゼ遺伝子をＰＣＲにより検出することにより検出可能であることが判った。
【実施例５】  大腸菌によるＧＳＴ融合タンナーゼタンパク質の作製
（１）使用した発現ベクターとＧＳＴ融合タンナーゼタンパク質の発現
実施例２にて作製した遺伝子組換えタンナーゼタンパク質発現ベクター（ｐＧＥＸｔａｎ８）を組み込んだ大腸菌ＢＬ２１株を使用した。大腸菌を５０μｇ／ｍＬ濃度のａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ）を含有する１ＬのＬＢ培地で、３７℃、一晩振とう培養後、０．５ｍＭ濃度になるようにＩｓｏｐｒｏｐｙｌ  β−Ｄ（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ）を加え、さらに４時間振とう培養した。増殖した大腸菌を遠心チューブに移し、遠心（８，０００ｒｐｍ、５分間）にて集菌した。
（２）ＧＳＴ融合タンナーゼタンパク質の精製
集菌した大腸菌に、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ：０．１４Ｍ  ＮａＣｌ，２．７ｍＭ  ＫＣｌ，８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ，１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）１５ｍＬを加えて浮遊させた後、−８０℃で一晩凍結させた。解凍後、超音波ホモゲナイザーにて、３分間菌を破砕し、遠心（１０，０００ｒｐｍ、１０分間）して上清を集めた。上清をゲル容量２ｍＬのＧｌｕｔａｔｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に流し、２０ｍＬのリン酸緩衝液で洗浄した。その後、１０ｍＬの溶出緩衝液（１０ｍＭ  Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０）をカラムに流し、結合したＧＳＴ融合タンナーゼタンパク質を溶出した。
（３）ＧＳＴ融合タンナーゼタンパク質の電気泳動解析
得られたＧＳＴ融合タンナーゼタンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧミニ「第一」１０／２０、第一化学薬品）電気泳動によって解析した。分子量マーカーとともに、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌｙｓａｔｅ（精製前の大腸菌溶解液）、ＧＳＴ−ｔａｎｎａｓｅ（精製したＧＳＴ融合タンナーゼ）、ＧＳＴのみを電気泳動した結果を図２に示した。タンナーゼ遺伝子の塩基配列に基づくアミノ酸配列より予測されるＧＳＴ融合タンナーゼタンパク質の推定分子量は、約９４，０００であり、それに相当すると考えられるタンパク質のバンド（矢印で示す）が確認された。
（４）ＧＳＴ融合タンナーゼタンパク質のタンナーゼ活性の確認
得られたＧＳＴ融合タンナーゼタンパク質（１００μｇ／ｍＬ）５μＬを、タンニン酸処理ＢＨＩ寒天培地に滴下し、３７℃、２４時間、嫌気培養した結果、滴下部位にタンニン酸の分解による透明班が形成された。この結果より、作製したＧＳＴ融合タンナーゼタンパク質は、タンナーゼ活性を有することが確認された。
【実施例６】  抗タンナーゼモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
（１）マウス免疫と細胞融合
実施例５にて作製したＧＳＴ融合タンナーゼタンパク質を１０μｇづつＢａｌｂ／ｃマウスに２週間隔で４回免疫した。最終免疫３日後にマウスより脾臓細胞を取り出し、マウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）と混合し（脾臓細胞数：ミエローマ細胞数が３：１の割合）、ポリエチレングリコール１５００（Ｒｏｃｈｅ）を用いて融合させた。その後ＨＡＴ培地（ＧＩＢＣＯ）を加え、９６ｗｅｌｌのプレート５枚に分注し、３７℃で培養した。１０日後に細胞コロニーの出現したｗｅｌｌを選択し、ｗｅｌｌ内の培養上清について抗タンナーゼ抗体活性をスクリーニングした。
（２）抗体活性のスクリーニング
抗体活性のスクリーニングは、ウエスタンブロット法によって実施した。すなわち、ＧＳＴ融合タンナーゼタンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル（１２．５％濃度）で電気泳動後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写して抗原転写膜を作製した。抗原転写膜を短冊状に切断し、反応トレイ内にてスクリーニングする培養上清を加えて室温で１時間反応させた。抗原転写膜を洗浄し、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ）を加えて室温で１時間反応させた。その後抗原転写膜を洗浄し、過酸化水素を含む４−Ｃｈｌｏｒｏ−１−ｎａｐｈｔｈｏｌ（Ｓｉｇｍａ）発色液にて発色させた。分子量９４，０００のＧＳＴ融合タンナーゼタンパク質のバンドに発色が認められた場合に陽性と判定した。
（３）クローニング
抗体活性が陽性であったｗｅｌｌ内の細胞を２４ｗｅｌｌのプレートに移し、ＨＡＴ培地を加えて３７℃で７日間培養した。ｗｅｌｌ内の培養上清につきウエスタンブロット法で抗体活性のスクリーニングを行った後、抗体活性が陽性であったｗｅｌｌ内の細胞につき、限界希釈法によるクローニングを行った。すなわち、ＨＡＴ培地で細胞濃度が１５／ｍＬ、５／ｍＬ、１．５／ｍＬになるように希釈系列を作製した。各希釈系列について０．２ｍＬを９６ｗｅｌｌのプレートに分注し、３７℃で１０日間培養した。ｗｅｌｌあたり１細胞コロニーが出現したｗｅｌｌを選択し、培養上清についてウエスタンブロット法にて抗体活性のスクリーニングを行った。抗体活性の認められた２種類の細胞を選択し、クローン名「２Ｂ５」、「２Ｆ６」と命名した。（以下で上記クローン名は、細胞及び抗体の両方について用いる。）
（４）抗体の特異性確認
クローン２Ｂ５と２Ｆ６の培養上清につき、ウエスタンブロット法により抗体の特異性確認を行った。結果を図３に示した。レーン１にはタンナーゼ陽性臨床分離株（Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ  ３１５−１）の菌体抽出タンパク質、レーン２にはタンナーゼ陰性標準株（Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ  ＡＴＣＣ４３８０９）の菌体抽出タンパク質、レーン３にはマウスの免疫に使用した遺伝子組換えＧＳＴ融合タンナーゼタンパク質、レーン４にはＧＳＴタンパク質のみが転写されている。クローン２Ｂ５と２Ｆ６ともにレーン１のタンナーゼ陽性臨床分離株において推定分子量６８，０００のタンナーゼタンパク質とのみ反応したが、レーン２のタンナーゼ陰性標準株とは全く反応しなかった。またレーン３のＧＳＴ融合タンナーゼタンパク質においては、推定分子量６８，０００のタンナーゼタンパク質と推定分子量９４，０００のＧＳＴ融合タンナーゼタンパク質と強い反応を示すとともに、タンナーゼ分解産物と考えられる分子量の比較的小さいいくつかのタンパク質との反応が認められた。レーン４のＧＳＴタンパク質とは全く反応しなかった。以上の結果より、クローン２Ｂ５と２Ｆ６の産生する抗体は、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ由来のタンナーゼに対する特異的なモノクローナル抗体であることが確認された。
【実施例７】  ＥＩＡ法によるタンナーゼ測定法
（１）抗タンナーゼモノクローナル抗体の精製
実施例６にて作製した抗タンナーゼモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ２Ｂ５と２Ｆ６を１０５／ｍＬ濃度で無血清培地エス・クロン（三光純薬）にて培養した。各培養上清約５００ｍＬを集め、ゲル容量５ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に通し、ＩｇＧを吸着させた後、５０ｍＬのリン酸緩衝液（ＰＢＳ：０．１４Ｍ  ＮａＣｌ，２．７ｍＭ  ＫＣｌ，８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ，１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）で洗浄した。その後、１０ｍＬの溶出緩衝液（０．１Ｍ  Ｇｌｙｓｉｎ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ２．５）をカラムに流して結合したＩｇＧを溶出し、直ちに１／１０量の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて中和した。
（２）ＥＩＡ法
精製した２Ｂ５抗体をリン酸緩衝液にて１０μｇ／ｍＬ濃度に調整し、９６ｗｅｌｌマイクロタイタープレートのｗｅｌｌに１００μＬづつ分注し、２０℃にて一晩放置してｗｅｌｌ内面へＩｇＧを固相化した。ｗｅｌｌ内を精製水で洗浄後、被験検体を１００μＬづつ注入し、３７℃、１時間反応させた。ｗｅｌｌ内を洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ７．５）で洗浄後、１０％ウサギ血清にて１μｇ／ｍＬ濃度に調整したＨＲＰ標識２Ｆ６抗体を１００μＬづつ注入し、３７℃、１時間反応させた。ｗｅｌｌ内を洗浄液で洗浄後、基質液としてＴＭＢＺ（３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ）を１００μＬづつ加え、３７℃、１５分間反応させた。その後１Ｍ硫酸を１００μＬづつ加えて反応を停止し、マイクロプレートリーダーにて吸光値（４５０ｎｍ）を測定した。
（３）Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓからのタンナーゼの部分精製
大腸癌患者の糞便より分離したタンナーゼ陽性のＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ  ３１５−１株を、タンニン酸処理したＢＨＩ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ）（直径９０ｍｍのシャーレ１００枚）にて３７℃、５日間嫌気条件下で培養した。培養後シャーレ１枚あたり５ｍＬのリン酸緩衝液（ＰＢＳ：０．１４Ｍ  ＮａＣｌ，２．７ｍＭ  ＫＣｌ，８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ，１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）を加え、培地表面上に増殖した菌を集めた。菌液を遠心（７，０００ｒｐｍ，１０分間，４℃）集菌し、リン酸緩衝液１０ｍＬで懸濁した。リン酸緩衝液で１０ｍｇ／ｍＬ濃度に調整したｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ（Ｓｉｇｍａ）を１００μＬ加え、３７℃、３０分間好気条件下で反応させた。さらに菌懸濁液を超音波破砕後、遠心（７，０００ｒｐｍ，１０分間，４℃）し、上清を回収し粗酵素液とした。
粗酵素液１０ｍＬをＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｒｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を充填したＣｏｌｕｍｎ（２．６×２０ｃｍ）に吸着させ、流速を５ｍＬ／ｍｉｎとして０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）３００ｍＬで非吸着物を溶出させた。その後、０Ｍから０．５Ｍ  ＮａＣｌの濃度勾配でタンパク質を溶出させた。溶出液は５ｍＬずつ分画し、タンパク質濃度とタンナーゼ活性の測定を行った。
タンナーゼ活性の測定は、Ｏｓａｗａらの方法（Ｖｉｓｕａｌ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔａｎｎａｓｅ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５９；１２５１−１２５２，１９９３）に準じて発色法により行った。すなわち、リン酸緩衝液に溶解した１０ｍＭ没食子酸メチルと各分画とを２：１の割合で混合し、３７℃、６０分間好気条件下で反応させた。反応後、飽和ＮａＨＣＯ３液を等量加え、２０分間室温で静置させた後、分光光度計を用いて４４０ｎｍにおける吸光度を測定した。
ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｒｏｗのイオン交換クロマトグラフィーで得られたタンナーゼ活性を有する分画を集め、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−２０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にて約２ｍＬまで遠心濃縮し、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を充填したＣｏｌｕｍｎ（１．６×５０ｃｍ）にてゲルろ過した。溶出液として０．０５Ｍ  ＮａＣｌ含有０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を使用した。流速を５ｍＬ／ｍｉｎとし、２ｍＬずつ分画した。各分画についてタンパク質濃度とタンナーゼ活性の測定を行い、タンナーゼ活性を有する分画を集めた。
同様にしてタンナーゼ陰性の標準株（Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ  ＡＴＣＣ４３８０９）をタンニン酸処理していないＢＨＩ寒天培地で培養し、精製過程で上記タンナーゼ分画に相当する分画を集めた。
（４）ＥＩＡ法によるタンナーゼ測定結果
組換えＧＳＴ融合タンナーゼタンパク質をＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）にてＢＳＡを基準としてタンパク質量を定量し、リン酸緩衝液で６０μｇ／ｍＬから０．１１７μｇ／ｍＬまで２倍段階希釈し、ＥＩＡ法にて測定した。ＧＳＴ融合タンナーゼタンパク質濃度とＥＩＡ吸光度との関係を図４に示すが、良好な検量線が得られた。
次いでタンナーゼ陽性のＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ  ３１５−１株より部分精製したタンナーゼタンパク質と、タンナーゼ陰性のＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ  ＡＴＣＣ４３８０９株より部分精製したタンナーゼ相当タンパク質につき、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）にてＢＳＡを基準としてタンパク質量を定量し、リン酸緩衝液で２３０μｇ／ｍＬから０．４４９μｇ／ｍＬまで２倍段階希釈したものについてＥＩＡ法で測定した。各菌株より部分精製したタンナーゼタンパク質濃度およびタンナーゼ相当タンパク質濃度とＥＩＡ吸光度との関係を図５に示した。タンナーゼ陽性のＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ３１５−１株より部分精製したタンナーゼタンパク質を測定すると良好な検量線が得られたが、タンナーゼ陰性のＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ  ＡＴＣＣ４３８０９株より部分精製したタンナーゼ相当タンパク質とは全く反応しなかった。以上の結果より本ＥＩＡ法は、大腸癌患者より分離したＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓが産生するタンナーゼを特異的に測定できることが証明された。
【産業上の利用可能性】  当該タンナーゼ遺伝子の塩基配列を利用した遺伝子検出法により、糞便中のタンナーゼ産生菌の高感度な検出が可能となった。また、当該タンナーゼ遺伝子を適当な宿主細胞に導入することにより、タンナーゼタンパク質を大量に産生させることが可能となり、タンナーゼタンパク質に対する抗体を作製することが可能である。当該抗体を用いた免疫化学的な方法により糞便中のタンナーゼを簡便かつ迅速に測定することが可能になる。
【配列表フリーテキスト】配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
配列番号９：合成ＤＮＡ
配列番号１０：合成ＤＮＡ
配列番号１１：合成ＤＮＡ
配列番号１２：合成ＤＮＡ
配列番号１３：合成ＤＮＡ
配列番号１４：合成ＤＮＡ
配列番号１５：合成ＤＮＡ
【図１】
2006073133.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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