(57)【要約】本発明は、場合によって微小粒子の共存した、酵素と特定のポリマーとの複合体を提供する。ポリマーは、特に、ポリ（エチレングリコール）−ｂｌｏｃｋ−ポリ（アミノエチルメタクリル酸）が、都合よく使用でき、酵素の熱安定性を著しく高めることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性ポリマー鎖の末端に荷電性基もしくは疎水性基を１ないし多数有するポリマーと酵素とが非共有結合的にバインディングした酵素複合体。
【請求項２】
親水性ポリマー鎖が、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、ポリ（アクリル酸２−ヒドロキシエチル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド）、ポリ（ビニルピロリドン）、アガロースおよびデキストランからなる群より選ばれるポリマーに由来する請求項１に記載の酵素複合体。
【請求項３】
親水性ポリマー鎖が、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、ポリ（アクリル酸２−ヒドロキシエチル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド）、ポリ（ビニルピロリドン）、アガロースおよびデキストランからなる群より選ばれるポリマーに由来し、かつ、荷電性基が、一級、二級もしくは三級アミンを分子内に一種もしくは二種含む低分子アミン化合物に由来するか、または一級、二級もしくは三級アミンを反復単位の側鎖もしくは主鎖内に一種もしくは二種含むポリマー鎖に由来する請求項１に記載の酵素複合体。
【請求項４】
親水性ポリマー鎖がポリ（エチレングリコール）に由来し、かつ、荷電性基が一級、二級もしくは三級アミンを反復単位の主鎖もしくは側鎖内に一種もしくは二種含むポリマー鎖に由来する請求項１に記載の酵素複合体。
【請求項５】
親水性ポリマー鎖の末端に荷電性基を１ないし多数有するポリマーが、式（Ｉ）：
Ｒａ−Ｌ１−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｌ２−Ｘ                （Ｉ）
上式中、Ｒａは、水素、メチル基、アルデヒド基、アミノ基、カルボキシル基、マレイミド基、ｐ−トルエンスルホニル基またはビニルスルホニル基であり、
Ｌ１およびＬ２は、独立して、原子価結合またはリンカーを表し、
ｎは、２〜２０，０００の整数であり、そして
Ｘは、Ｎ−もしくはＮ，Ｎ−モノもしくはジ−Ｃ１−Ｃ３アルキル置換アミノＣ１−Ｃ１２アルキル、反復単位が２ないし２０，０００のオリゴもしくはポリ（Ｎ−もしくはＮ，Ｎ−モノもしくはジ−Ｃ１−Ｃ３アルキル置換アミノエチルメタアクリレート）鎖、ポリエチレンイミン鎖、スペルジミン鎖およびカダベリン鎖からなる群より選ばれる基またはオリゴもしくはポリマー鎖セグメントである、
で表される請求項１に記載の酵素複合体。
【請求項６】
親水性ポリマー鎖が、ポリ（エチレングリコール）に由来し、かつ、疎水性基がポリ（乳酸）に由来する請求項１に記載の酵素複合体。
【請求項７】
親水性ポリマー鎖の末端に荷電性基を１ないし多数有するポリマーが、式：
2005073370.tif 000005
上式中、ｍおよびｎは、独立して、２〜２０，０００の整数であり、ＲはＣ１−Ｃ３アルキル基である、
で表される請求項１に記載の酵素複合体。
【請求項８】
親水性ポリマー鎖の末端に荷電性基を１ないし多数有するポリマーが、式：
2005073370.tif 000006
上式中、ｍ，ｎおよびｘは、独立して、２〜２０，０００の整数であり、Ｒ１は水素またはメチル基であり、Ｒ２はＣ１−Ｃ３アルキル基であり、Ｒ３は水素またはＣ１−Ｃ５アルキル基である、
である請求項１に記載の酵素複合体。
【請求項９】
水不溶性微小粒子の表面に、親水性ポリマー鎖の末端に荷電性基もしくは疎水性基を１ないし多数有するポリマーおよび酵素が非共有結合的にバインディングした酵素複合体。
【請求項１０】
微小粒子が、コロイド状金、コロイド状銀、コロイド状酸化アルミニウム、コロイド状シリカ、コロイド状酸化チタン、微小磁鉄鋼粒子、およびコロイド状半導体からなる群より選ばれる請求項９に記載の酵素複合体。
【請求項１１】
親水性ポリマー鎖が、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、ポリ（アクリル酸２−ヒドロキシエチル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド）、ポリ（ビニルピロリドン）、アガロースおよびデキストランからなる群より選ばれるポリマーに由来する請求項９に記載の酵素複合体。
【請求項１２】
親水性ポリマー鎖が、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、ポリ（アクリル酸２−ヒドロキシエチル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド）、ポリ（ビニルピロリドン）、アガロースおよびデキストランからなる群より選ばれるポリマーに由来し、かつ、荷電性基が、一級、二級もしくは三級アミンを分子内に一種もしくは二種含む低分子アミン化合物に由来するか、または一級、二級もしくは三級アミンを反復単位の側鎖もしくは主鎖内に一種もしくは二種含むポリマー鎖に由来する請求項９に記載の酵素複合体。
【請求項１３】
親水性ポリマー鎖の末端に荷電性基を１ないし多数有するポリマーが、式（Ｉ）：
Ｒａ−Ｌ１−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｌ２−Ｘ                （Ｉ）
上式中、Ｒａは、水素、メチル基、アルデヒド基、アミノ基、カルボキシル基、マレイミド基、ｐ−トルエンスルホニル基またはビニルスルホニル基であり、
Ｌ１およびＬ２は、独立して、原子価結合またはリンカーを表し、
ｎは、２〜２０，０００の整数であり、そして
Ｘは、Ｎ−もしくはＮ，Ｎ−モノもしくはジ−Ｃ１−Ｃ３アルキル置換アミノＣ１−Ｃ１２アルキル、反復単位が２ないし２０，０００のオリゴもしくはポリ（Ｎ−もしくはＮ，Ｎ−モノもしくはジ−Ｃ１−Ｃ３アルキル置換アミノエチルメタアクリレート）鎖、ポリエチレンイミン鎖、スペルジミン鎖およびカダベリン鎖からなる群より選ばれる基またはオリゴもしくはポリマー鎖セグメントである、
で表される請求項１に記載の酵素複合体。
【請求項１４】
微小粒子を、酵素を溶解させた水溶液中に縣濁させて微小粒子上にバインディングさせ、次いで、こうして得られた縣濁液に親水性ポリマー鎖の末端に荷電性基もしくは疎水性基を１ないし多数有するポリマーを添加して酵素複合体が形成するのに十分な条件下でインキュベートして得られる請求項９に記載の酵素複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、場合により微小粒子が共存してもよい、酵素と、水溶性高分子との複合体に関する。
【背景技術】  穏和な条件下で極めて選択的な化学反応を進行させる酵素は従来から選択的合成反応等の触媒として工業的に広範に利用されてきた。ところで、タンパク質である酵素は、ある範囲を超える温度やｐＨ等によって容易に失活することや、反応後、生成物との分離が極めて困難であった。そこで、酵素を水不溶性の担体に固定して再利用しうるように修飾する、固定化酵素の概念が見いだされ、一部の酵素については工業化されているものもある（たとえば「固定化酵素」、千畑一郎、講談社）。
しかし、酵素を水不溶性担体または基材に固定した場合、一般的に、酵素活性が著しく低下してしまうことが避けられず、またある程度の耐熱性を酵素に付与できる場合があるものの、必ずしも満足のいく耐熱性が達成されるものでもない。
近年、担体として、コロイド状金（ｃｏｌｏｉｄａｌ  ｇｏｕｌｄ）粒子を用い酵素を元の状態をなるべく維持したままで安定化できることを示唆する酵素／コロイド状金のバイオコンジュゲートが提案されている（Ａ．Ｇｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２００１，Ｖｏｌ．１７，１６７４−１６７９）。また、アミンで機能化したゼオライト上に金ナノ粒子が集成された担体にペプシンを固定化したバイオコンジュゲートは、優れた酵素活性を示すとともに、高いｐＨおよび温度で良好な安定性を示すことも報告されている（Ｋ．Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２００３，Ｖｏｌ．１９，３８５８−３８６３）。さらに、ポリウレタンマイクロスフェアー−金ナノ粒子のコアーシェル構造体に酵素、例えば、エンドグルカナーゼを固定化すると、固定化された酵素はその活性を保持するとともに、水溶液において、遊離の酵素に比べて向上した熱安定性を示すことが報告されている（Ｓ．Ｐｈａｄｔａｒｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２００４，Ｖｏｌ．２０，１８４０−１８４６）。金表面に固定化されたこれらの酵素はほぼ半分は遊離の状態で酵素反応系に存在することが示唆されている。
水不溶性担体を用いることなく、水溶性高分子を酵素にバインディングさせての酵素の安定化等を目的に開発された酵素複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）またはコンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）も提案されている。代表的なものとして、例えば，以下のものを挙げることができる。α−アミラーゼをポリアミン、スペルミジン（ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）またはカダベリン（ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ）で処理することにより酵素活性を向上させると同時に安定性を高める得ることが報告されている（Ｒ．Ｄ．Ｄｕｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ，１９８０，Ｖｏｌ．７，４４３−４５６）。リパーゼをポリアミン、ジメチルスベリミイデート（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｂｅｒｉｍｉｄａｔｅ）で処理すると全体的に酵素活性が向上し、例えば、５０℃での耐熱性も高かまるこが知られている（Ｍ．Ｋａｗａｓｅ  ｅｔ  ａｌ，Ａｇｒｉｏ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．１９９０，Ｖｏｌ．５４，２６０５−２６０９）。高圧化で酵素にポリ（エチレンオキシド）を非共有結合的にバインディングすることで元の（ｎａｔｉｖｅ）酵素に比べて活性が相当低下するものの、熱安定性を若干増大できることが報告されている（Ｉ．Ｎ．Ｔｏｐｏｈｉｅｖａ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２０００，Ｖｏｌ．１１，２２−２９）。また、数種のポリアミン（例えば、ビス（エチルアミノ）オクタン、１，８−オクタンジアミン、１，５−ビス（エチルアミノ）ペンタン、１，８−ビス（エチルアミノ）−４−アザオクタン、スペルミジン、アグメチン等）を用いて酵素Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを修飾すると、酵素活性は維持されるものの、活性が記載順に低下することも知られている（Ｍ．Ｉｗａｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０００，Ｖｏｌ．８，２１８５−２１９４）。
その他、ポリ（エチレンオキシド）またはポリ（エチレンオキシド）−ｂｌｏｃｋ−ポリ（プロピレンのキシド）に酵素を化学的に共有結合することにより酵素のＫｍ値等を増加できることも知られている（Ｉ．Ｎ．Ｔｏｐｏｈｉｅｖａ，Ｐｏｌｙｅｔｈｙｒｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ，１９９７，１９３−２０６）。
【発明の開示】
以上に述べたとおり、ポリアミンまたはコロイド状金粒子もしくはコロイド状金を担持した担体に酵素を非共有結合的にバインディングすることで、ある程度の酵素活性を保持したまま酵素の安定化が達成されている。しかし、元の酵素活性を保持したまま、さらなる安定化、特に、熱安定性の向上した酵素複合体またはコンジュゲートを入手することに対するニーズは依然として存在する。熱安定性の向上は、基質化合物の工業的な酵素変換を実施する際には、反応速度を高め得るとの観点からも重要である。
そこで本発明者らは鋭意検討を積み重ねてきたところ、ある種の水溶性高分子、具体的には、場合により微小粒子の共存下で、親水性ポリマー鎖の末端に荷電性基もしくは疎水性基を１ないし多数有するポリマー、を用いて酵素を非共有結合的に処理すると上記のニーズに応え得る酵素複合体またはコンジュゲートが得られることを見出した。
したがって、本発明として、親水性ポリマー鎖の末端に荷電性基もしくは疎水性基を１ないし多数有するポリマーと酵素とが非共有結合的にバインディングした酵素複合体を提供する。
また、もう一つの態様の本発明として、水不溶性微小粒子の表面に、親水性ポリマー鎖の末端に荷電性基もしくは疎水性基を１ないし多数有するポリマーおよび酵素が非共有結合的にバインディングした酵素複合体を提供する。
従来技術の、例えば、Ｉ．Ｎ．Ｔｏｐｏｈｉｅｖａ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２０００，Ｖｏｌ．１１，２２−２９）によれば、スペルミジン、アグメチン等の分子量の大きいポリアミンの方が、低分子ビス−、もしくはジアミンで処理された酵素よりも活性の低下する程度が大きいが、本発明によれば、相当大きな分子量のポリ（エチレングリコール）鎖を有するポリアミンを用いた場合でも、得られる酵素複合体の酵素活性はほぼ元の酵素の活性を維持したまま、特に、熱安定性が著しく高くなる。
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明にいう酵素複合体は、場合によって微小粒子の共存下で、酵素と一定のポリマーとから非共有結合的に形成され、少なくとも、水性媒体における攪拌または遠心等の処理によっては、各構成成分が分離することなく保持される構造物を意味し、通常、コンプレックス、コンジュゲート、またはバイオコンジュゲートと称されているものを包含する。
複合体を構成する酵素は、本発明の目的に沿うものであれば如何なる酵素であってもよいが、現在工業的に用いられている酵素を好ましいものとして挙げることができる。このような酵素の例としては、限定されるものでないが、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、ケラチナーゼ、エラスターゼ、ズブチリシン、パパイン、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、等のプロテアーゼ、ガストリックリパーゼ、パンクレアチックリパーゼ、植物リパーゼ、ホスホリパーゼ、等のエステラーゼ、セルラーゼ、マルターゼ、サッカラーゼ、アミラーゼ等のカルボヒドラーゼ、リゾチーム、キチナーゼ、チトクロームＣ，ラクターゼ、デキストラナーゼを挙げることができる。
このような酵素または微小粒子と非共有結合的にバインディングする本発明で用いることのできるポリマーは、水性媒体（生理的条件もしくは非生理的条件下のｐＨに緩衝かされた水溶液、水混和性有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル等の混在する水溶液等）中で酵素と複合体を形成し得る、親水性ポリマー鎖の末端に荷電性基もしくは疎水性基を１ないし多数有するポリマーである。具体的には、親水性ポリマー鎖が、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、ポリ（アクリル酸２−ヒドロキシエチル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド）、ポリ（ビニルピロリドン）、アガロースおよびデキストランからなる群より選ばれる、また、荷電性基が、一級、二級もしくは三級アミンを分子内に一種もしくは二種含む低分子アミン化合物に由来するか、または一級、二級もしくは三級アミンを反復単位の側鎖もしくは主鎖内に一種もしくは二種含むポリマー鎖に由来し、または疎水性基がポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（ブチリックアシッド）等のポリエステルに由来するポリマーである。特に好ましいポリマーは、親水性ポリマー鎖が、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（エチレンオキシド）に由来するものである。具体的には、下記式（Ｉ）で表されるポリマーを挙げることができる。
Ｒａ−Ｌ１−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｌ２−Ｘ                （Ｉ）
上式中、Ｒａは、水素、メチル基、アルデヒド基、アミノ基、カルボキシル基、マレイミド基、ｐ−トルエンスルホニル基またはビニルスルホニル基であり、
Ｌ１およびＬ２は、独立して、原子価結合またはリンカーを表し、
ｎは、２〜２０，０００の整数であり、そして
Ｘは、Ｎ−もしくはＮ，Ｎ−モノもしくはジ−Ｃ１−Ｃ３アルキル置換アミノＣ１−Ｃ１２アルキル、反復単位が２ないし２０，０００のオリゴもしくはポリ（Ｎ−もしくはＮ，Ｎ−モノもしくはジ−Ｃ１−Ｃ３アルキル置換アミノエチルメタアクリレート）鎖、主鎖に二級もしくは三級アミン基を有するポリアミンに由来する、例えば、ポリエチレンイミン鎖、スペルジミン鎖およびカダベリン鎖からなる群より選ばれる基またはオリゴもしくはポリマー鎖セグメントである。
また、より具体的なポリマーには、次式であらわされるものが含まれる。
2005073370.tif 000002
上式中、ｍおよびｎは、独立して、２〜２０，０００の整数であり、ＲはＣ１−Ｃ３アルキル基である。
2005073370.tif 000003
上式中、ｍ，ｎおよびｘは、独立して、２〜２０，０００の整数であり、Ｒ１は水素またはメチル基であり、Ｒ２はＣ１−Ｃ３アルキル基であり、Ｒ３は水素またはＣ１−Ｃ５アルキル基である。
本発明に関し、Ｃ１−Ｃ１２アルキルというときは、炭素原子数が１〜１２個の直鎖または分岐アルキルを意味する。
以下、上記のポリマーに包含されるポリマーのさらに具体的なものには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ｂｌｏｃｋ−ポリ（メタクリル酸２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）（以下、ＰＥＧ−ＰＭＡＭＡと略記する）、ＰＥＧ−ｂｌｏｃｋ−ポリ（メタクリル酸２−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチル）（以下、ＰＥＧ−ＰＥＡＭＡと略記する）、ＰＥＧ−ｂｌｏｃｋ−ポリ（イソプロピルアクリルアミド）（以下、ＰＥＧ−ＰＮＩＰＡＭと略記する）、ＰＥＧ−ポリアクリルアミド、ＰＭＡＭＡ−ＰＮＩＰＡＭ、ＰＥＡＭＡ−ＰＮＩＰＡＭ、ＰＶＡ−ＰＭＡＭＡ、ＰＶＡ−ＰＥＡＭＡ等が包含される。
これらのポリマーの分子量については理論的に制限はないが、５００〜１，０００，０００が好ましく、２，０００〜５００，０００がより好ましく、合成の容易さから考えると３，０００〜１００，０００が、特に好ましい。以上のポリマーは、それ自体公知であるか、または公知のものに準ずる方法により容易に得ることができる。例えば、ＰＥＧ−ＰＭＡＭＡ、ＰＥＧ−ＰＥＡＭＡ等については、Ｙ．Ｎａｇａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９９７，１８，９２７、ポリエチレングリコール鎖のα−末端に各種官能基を導入する場合、分子量を調整する場合、また、疎水性ポリマー鎖を有するポリマーを入手する場合は、ＷＯ９６／３２４３４（ＵＳＰ  ５，９７３，０６９に対応）、ＷＯ９６／３３２３３（ＵＳＰ  ６，０９０，３１７に対応）、ＷＯ９７／０６２０２（ＵＳＰ  ５，９２９，１７７に対応）を参照することができる。
また、本発明の酵素複合体の構成成分とすることができる微小粒子は、上記のごときポリマーと酵素が非共有結合的（静電結合的、疎水結合的、水素結合的等の共有結合以外のあらゆる結合様式を包含する）にバインディングでき、本発明の目的に沿うものであれば材質、起源、等を問うことなく使用できる。また、微小と称しているのは、サイズが、サブもしくは数ｎｍ〜数ｍｍ、好ましくは、１ｎｍ〜数１００μｍ、さらに好ましくは、５ｎｍ〜１０００ｎｍであるものを意図している。従来技術では、コロイド状金に酵素をバインディングないし固定したものは、水性媒体中である程度の分散安定性を有するが、本発明によれば、コロイド状を超えたサイズの粒子も、酵素以外に、ポリマーがバインディングしていることにより、極めて良好な水性媒体中での分散安定性を示すことができる。
限定されるものでないが、これらの微小粒子の代表的なものとしては、コロイド状金、コロイド状銀、コロイド状酸化アルミニウム、コロイド状シリカ、コロイド状酸化チタン、微小磁鉄鋼粒子、およびコロイド状半導体を挙げることができる。このような粒子はいずれも市販品をそのまま、または精製して使用することができる。また、半導体微小粒子は、例えば、周期律表のＩＩＢ族もしくはＩＩＩＢ族元素の塩化物（例えば、塩化カドミウム）と同ＶＩＢ族元素のアルカリ金属塩（例えば、硫化ナトリウム）とを水性媒体中で反応させて調製することもできる。こうして調整できる半導体微小粒子の代表的なものには、ＣｄＳおよびＣｄＳｅ微小粒子が包含される。
これらの酵素複合体は、酵素とポリマーを前記の水性媒体中で、室温下、必要があれば、例えば冷却（数℃）下に混合攪拌するだけで作製することができる。こうして簡単に調製できるので、混合液をそのまま、必要により、濃縮しまたは希釈して、目的とする酵素反応系に供することができることも本発明の利点の一つである。
この場合、混合する割合は、使用する酵素およびポリマー、特にポリマーの種類により最適値が変動するので、通常、小実験を行って決定するのがよいが、酵素対ポリマーの重量比が０．０００１：１００００〜１００：１で利用が可能であり、１：１００００〜１０：１がさらに好ましい。また、たとえば、側鎖に三級アミンを担持するＰＥＧ−ＰＭＡＭＡ等を用いる場合には、三級アミン基が、酵素１モルに対して少なくとも１、好ましくは５以上、より具体的には、１〜５０００（例えば、リゾチーム）、または３０〜３０００（例えば、リパーゼ）当量となるように混合する。
これらの系に微小粒子を共存させる場合、まず、酵素と粒子を水性媒体において混合して粒子表面に酵素を吸着させるとともに、またその後に、親水性ポリマー鎖の末端に荷電性基もしくは疎水性基を１ないし多数有するポリマーを加えて、室温下、必要があれば、例えば冷却（数℃）下に混合攪拌することにより、酵素がバインディングした微小粒子表面をさらに該ポリマーで被覆することができる。酵素を粒子に担持させる場合には、例えばそのまま、必要により、酵素に一般的な方法でメルカプト基を導入し、たとえば金属表面へバインディングさせる方法を選ぶこともできる。酵素に対する粒子の割合も、通常、小実験を行って決定するのがよいが、酵素対微小粒子の比（重量基準）が０．０００１：１００００〜１００００：０．０００１で利用が可能であり、１：１００００〜１００００：１がさらに好ましい。効率的な利用では１：１０００〜１０００：１程度がもっとも好ましい。より具体的には、酵素（分子）対コロイド状金（個数）は、０．０１：１〜１０００：１、特に、２０：１〜１０００：１であることができる。
こうして得られる、酵素と特定のポリマーを含んでなるか、また、酵素と特定のポリマーが表面にバインディングした酵素複合体は、下記の実施例で具体的に説明するとおり、例えば、７０℃の高温に昇温し、１０分間保持した後冷却し、再度同昇温を行うサイクルを数回繰り返しても酵素活性を少なくとも５０％は保持する、強力な熱安定性を示す。
【図面の簡単な説明】  図１は、  ＰＥＧ−ＰＭＡＭＡブロック共重合体とリゾチームを様々な混合比で混ぜて昇温を繰り返した後の酵素活性の推移を示すグラフである。図中の記号：四角印はポリマーを含まない系（対照）であり、丸印は酵素に対して等重量のポリマーを含む系、三角印は酵素に対して２倍重量のポリマーを含む系、そして逆三角印は酵素に対して１０倍重量のポリマーを含む系の結果を示す。
図２は、  ＰＥＧ−ＰＥＡＭＡブロック共重合体とリゾチー厶を様々な混合比で混ぜて昇温を繰り返した後の酵素活性の推移を示すグラフである。図中の記号：四角印はポリマーを含まない系（対照）であり、菱型印は酵素に対して１０分の１重量のポリマーを含む系、白抜き丸印は酵素に対して等重量のポリマーを含む系、黒塗り丸印は酵素に対して２倍重量のポリマーを含む系、そして三角印は酵素に対して１０倍重量のポリマーを含む系の結果を示す。
図３は、ＰＮＩＰＡＭとリゾチームを様々な混合比で混ぜて昇温を繰り返した後の酵素活性の推移を示すグラフである。図中の記号：四角印はポリマーを含まない系（対照）であり、菱型印は酵素に対して１０分の１重量のポリマーを含む系、白抜き丸印は酵素に対して等重量のポリマーを含む系、黒塗り丸印は酵素に対して２倍重量のポリマーを含む系、そして三角印は酵素に対して１０倍重量のポリマーを含む系の結果を示す。
図４は、  ＰＥＧ−ＰＮＩＰＡＭグラフト共重合体とリゾチームを様々な混合比で混ぜて昇温を繰り返した後の酵素活性の推移を示すグラフである。図中の記号：四角印はポリマーを含まない系（対照）であり、黒塗り菱型印は酵素に対して１０分の１重量のポリマーを含む系、白抜き丸印は酵素に対して等重量のポリマーを含む系、黒塗り丸印は酵素に対して２倍重量のポリマーを含む系、白抜きひし形印は酵素に対して３倍重量のポリマーを含む系、黒塗り逆三角印は酵素に対して５倍重量のポリマーを含む系、そして白抜き三角印は酵素に対して１０倍重量のポリマーを含む系の結果を示す。
図５は、コロイド状金とＰＥＧ−ＰＭＡＭＡブロック共重合体とリゾチームを含む系に対して昇温を繰り返した後の酵素活性の推移を示すグラフである。図中の記号：四角印はポリマーおよびコロイド状金を含まない系（対照）、白抜き丸印は酵素およびポリマーを含む系（比較）、そして黒塗り丸印は酵素、ポリマーおよびコロイド状金を含む系の結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【実施例１】  この実施例は、ポリマー（ＰＥＧ−ＰＭＡＭＡ）
2005073370.tif 000004
（Ｙ．Ｎａｇａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９９７，１８，９２７に記載の方法に従って得られた。ＰＥＧ  Ｍｎ＝４，０００ｇ／ｍｏｌ、ＰＭＡＭＡ（ポリメタクリル酸（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル））Ｍｎ＝４，０００）を使用した例である。
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０，５０ｍＭ）５０ｍＬにリゾチーム２８．６ｍｇ、上記で合成したポリマー２８．６ｍｇをそれぞれ溶解させ、４０倍に希釈し、１．５ｍＬずつ混ぜたものを酵素溶液とした。また、バッファー１００ｍＬにミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ，シグマ、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４６９８）１６．１ｍｇを溶解させ、基質溶液の調製を行った。
まず、石英セルに基質溶液２．８ｍＬを加え、温度設定を３７℃にしたセルホルダーに保持した。そこへ、７０℃で１０分間保持した酵素溶液を３７℃に冷却し、０．２ｍＬ加え、吸光度の変化を１０分間測定した。
吸光度測定結果より求めた酵素活性と昇温回数の関係を図１に示す。ＰＥＧ−ＰＭＡＭＡを等倍以上混合した場合、７０℃に昇温しても全く活性が落ちることがなく、高い酵素活性を維持することが示された。
【実施例２】  ＰＥＧ−ＰＡＭＡの代わりにＰＥＧ−ＰＥＡＭＡ（ＰＥＧセグメント分子量５，０００；ＰＥＡＭＡセグメント分子量５，０００、上述の論文を参考に合成）を使用する以外は実施例１に記載の操作を繰り返した。吸光度測定結果より求めた酵素活性と昇温回数の関係を図２に示す。ＰＥＧ−ＰＥＡＭＡを２倍以上混合した場合、７０°Ｃに昇温しても全く活性が落ちることがなく、高い酵素活性を維持することが示された。
【実施例３】  ＰＥＧ−ＰＡＭＡの代わりにＰＮＩＰＡＭ（分子量２０，０００、ラジカル重合によって合成）を使用する以外は実施例１に記載の操作を繰り返した。吸光度測定結果より求めた酵素活性と昇温回数の関係を図３に示す。ＰＮＩＰＡＭを当量あるいは２倍量混合した場合、耐熱性が向上している効果が示された。
【実施例４】  ＰＥＧ−ＰＡＭＡの代わりにＰＮＩＰＡＭ−ＰＥＧグラフトポリマー（分子量６０，０００、ＰＥＧ鎖２，０００、ラジカル重合によって合成）を使用する以外は実施例１に記載の操作を繰り返した。吸光度測定結果より求めた酵素活性と昇温回数の関係を図４に示す。ＰＮＩＰＡＭ−ＰＥＧを当量以上混合した場合、耐熱性が向上している効果が示された。
【実施例５】  この実施例は、酵素溶液にコロイド状金（金コロイド）を加えた後、さらにポリマー（ＰＥＧ−ＰＭＡＭＡ：ポリメタクリル酸（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル））Ｍｎ＝４，００）を加えて処理した例を示す。
リパーゼ６．０ｍｇ（０．１μｍｏｌ）をメスフラスコに採り、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０，５０ｍＭ）で１００ｍＬに調整した。それぞれ、１ｍＬずつ分取し、金コロイド溶液（ＢＢＩ社、１０ｎｍ）５ｍＬを加え、４℃で１０分間静置した。次にポリマー２８．６ｍｇ（４μｍｏｌ）をそれぞれ溶解させ溶液を加えた。こして得られた溶液を酵素溶液とした。また、０．５ｍＭのｐ−ＮＰＰを基質として有する緩衝液２．０ｍＬを混合し、１０分間５８℃に加熱、５分間２５℃に冷却し、保温する工程を繰り返した。各工程毎に  吸光度を測定した結果を図５に示す。コロイド状金とＰＥＧ−ＰＭＡＭＡブロック共重合体とリゾチームを含む系に対して昇温を繰り返した後も酵素活性は、ほとんど低下しなかった。
【産業上の利用可能性】  本発明により、提供できる酵素複合体は、著しく高い熱安定性を示すので、工業的に利用できる酵素触媒の製造業および該酵素触媒を使用する各種化合物および材料の加工業で利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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