(57)【要約】  肥満に関与する新たなターゲット因子の同定および、あらたな肥満の治療・予防剤、新規なヒトメルトリンαアンチセンス化合物および新規な抗ヒトメルトリンα抗体の提供。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メルトリンαアンタゴニストを有効成分とする、肥満、肥満症または肥満に起因ないし関連する疾患の予防・治療剤。
【請求項２】
メルトリンαアンタゴニストが、メルトリンαの発現を抑制することによる、請求項１に記載の予防・治療剤。
【請求項３】
メルトリンαアンタゴニストがヒトメルトリンαに対するアンチセンス化合物である請求項２に記載の予防・治療剤。
【請求項４】
ヒトメルトリンαアンタゴニストがヒトメルトリンαに対するsiＲＮＡである請求項２に記載の予防・治療剤。
【請求項５】
メルトリンαアンタゴニストが、メルトリンαの活性を阻害することによる請求項１に記載の予防・治療剤。
【請求項６】
ヒトメルトリンαを認識する抗メルトリンα抗体を有効成分として含有する請求項５に記載の予防・治療剤。
【請求項７】
抗体がヒト抗体である請求項６に記載の予防・治療剤。
【請求項８】
抗体がヒト化抗体である請求項６に記載の予防・治療剤。
【請求項９】
アンタゴニストが、低分子化合物である請求項５に記載の予防・治療剤。
【請求項１０】
肥満症、脂肪肝、高脂血症、高血糖または高インスリン血症のいずれか１以上の所見が認められる患者に投与される請求項１ないし９のいずれかに記載の予防・治療剤。
【請求項１１】
下記より選ばれるいずれか１以上の作用を示す、請求項１ないし１０のいずれかに記載の予防・治療剤。
（１）白色脂肪細胞の蓄積を抑制する
（２）白色脂肪細胞の増殖を抑制する
（３）内臓への脂肪細胞の蓄積を抑制する
（４）血中コレステロールを低下させる作用を有する
（５）エネルギー代謝を亢進させる作用を有する
（６）脂肪肝の形成、進行、肝障害の発症を抑制する。
【請求項１２】
前記肥満に起因ないし関連する疾患が糖尿病である、請求項１ないし１０のいずれかに記載の予防・治療剤。
【請求項１３】
メルトリンαアンタゴニストを有効成分とする、糖尿病の予防・治療剤。
【請求項１４】
配列表の配列番号３において、塩基番号６１〜３６０または２５８１〜３０２０に対応する領域に対するメルトリンαアンチセンス化合物。
【請求項１５】
配列表の配列番号３において、塩基番号２５８１〜２６８０、２７０１〜２７６０、２７７１〜２８００、２８４９〜２９０５または２９７１〜３０２０に対応する領域に対するメルトリンαアンチセンス化合物。
【請求項１６】
表６ないし表８に記載の何れかの塩基配列を含有するメルトリンαアンチセンス化合物。
【請求項１７】
請求項１３ないし１６のいずれかに記載のメルトリンαアンチセンス化合物を有効成分とする、請求項３または１０ないし１２のいずれかに記載の予防・治療剤。
【請求項１８】
ヒトメルトリンαを認識する抗体であって、エネルギー代謝の亢進、脂肪前駆細胞の増殖の阻害、脂肪細胞の分化の阻害及びヒトメルトリンαメタロプロテアーゼ活性の阻害より選ばれるいずれか１つ以上の活性を有する抗体もしくはその活性断片またはそれらの誘導体。
【請求項１９】
配列番号５１、５３及び５５、配列番号６３、６５及び６７、または、配列番号７５、７７及び７９のアミノ酸配列を、それぞれＶＨ ＣＤＲ1、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３に有する抗体の重鎖もしくはその活性断片またはそれらの誘導体。
【請求項２０】
配列番号５７、５９及び６１、配列番号６９、７１及び７３、または、配列番号８１、８３及び８５のアミノ酸配列を、それぞれＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３に有する抗体の軽鎖もしくはその活性断片またはそれらの誘導体。
【請求項２１】
配列番号５１、５３、５５、５７、５９及び６１のアミノ酸配列、配列番号６３、６５、６７、６９、７１及び７３のアミノ酸配列、または配列番号７５、７７、７９、８１、８３及び８５のアミノ酸配列のアミノ酸配列をそれぞれＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３にそれぞれ有する抗体もしくはその活性断片またはそれらの誘導体。  
【請求項２２】
請求項１８ないし２１のいずれかに記載の抗体もしくはその活性断片またはそれらの誘導体のＨ鎖及び／またはＬ鎖をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肥満または肥満を伴う疾患の予防・治療剤およびヒトメルトリンαに対するアンチセンス化合物または抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、脂肪組織が過剰に蓄積した状態であり、糖尿病や高血圧症、高脂血症、冠動脈疾患、虚血性脳疾患等の生活習慣病の発症に大きな影響を及ぼす。これらの生活習慣病を予防するためにも、積極的な肥満予防の必要性が指摘されている。
肥満／肥満症の治療薬として開発中の薬物は、大きく分けて中枢の神経伝達物質の働きに作用するもの、消化管での吸収を抑制するもの、熱産生促進作用を持つもの、脂肪分解促進並びに合成阻害作用を有する薬物に分けることができる。中枢に作用する薬剤としてはアドレナリン・ノルアドレナリン作動薬、セロトニン作動薬、アドレナリン・セロトニン作動薬、レプチン等の中枢性摂食関連ペプチド等が挙げられる。吸収抑制を持つ薬物としては脂質や糖の分解酵素阻害剤等が挙げられる。また、脂肪分解及び熱産生を亢進させるものとしてはβ３アドレナリン受容体刺激薬がその代表である。しかしながら、その多くで、十分な臨床効果が得られておらず、新たな薬物ターゲットの同定が課題となっている。【０００３】
例えば、脂肪細胞に焦点をおいた研究が数多く成され、例えば脂肪細胞の増殖分化やエネルギー代謝に中心的な役割を担う因子として、Ｃ／ＥＢＰやＰＰＡＲファミリー、ＵＣＰなどが同定されている。【０００４】
また、細胞外マトリックスのリモデリングが脂肪細胞分化に関与することも知られており、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰと略す）の脂肪細胞分化への影響が、報告されている。しかし、その作用は、個々のＭＭＰによって様々であり、例えば、ＭＭＰ-２とＭＭＰ-９を抗体で阻害した場合には脂肪細胞の分化が抑制されることが報告されてている（非特許文献１参照）。一方、ＭＭＰ-３やＭＭＰ-１１のノックアウトマウスでは高脂肪食を負荷することにより、野生型のマウスより体重並びに脂肪組織重量が増大するという報告もある（非特許文献２〜３参照）。このように、ＭＭＰおよび細胞外マトリクスのリモデリングが、脂肪細胞へ及ぼす影響についてはまだ解明すべきことが多く、肥満との関わりも不明であり明確にはなっていない。【０００５】
メルトリンα（ＡＤＡＭ１２）は、本発明者の１人である瀬原らによりマウス筋芽細胞由来ライブラリーｃDNAライブラリーから、筋細胞の融合・凝集にかかわる物質としてクローニングされた蛋白質であり（非特許文献４参照）、その分子内に、ディスインテグリンドメインおよびメタロプロテアーゼドメインを有する構造からＡＤＡＭ（adisintegrin and metalloprotease）ファミリーに分類されている蛋白質である。
最近、Kawaguchi等は、ヒトメルトリンαのトランスジェニックマウスにおいて、骨格筋中に脂肪の出現を報告している（非特許文献５参照）。Kawaguchi等によると、メルトリンαを過剰発現させたマウスのうち、１歳のメスマウスでは、体重増加、総脂肪量の顕著な増加が認められた。この効果は、メルトリンαのメタロプロテアーゼドメインおよびプロドメインを欠損させたメルトリンのトランスジェニックマウスでは認められなかったことから、Kawaguchi等は、メルトリンαのプロテアーゼ部位が、脂肪形成を誘導すると指摘している。しかしながら、上記トランスジェニックマウスの体重増加、脂肪量の増加は若いメスやオスでは明確には認めらておらず、また、これらの動物で、血清インスリン値、コレステロール値、トリグリセリド値には変化はなかったとの記載もあり、体重増加や脂肪量の増加にメルトリンが本質的に関わっているのか否かは不明である。
また、Kawguchi等は、脂肪前駆細胞である３Ｔ３-Ｌ１細胞に、メルトリンαを過剰発現させると、細胞中のアクチンストレスネットワークが消失し、細胞形体が丸く変化することを報告している。そして、３Ｔ３-Ｌ１細胞に、メルトリンαに対するsiＲＮＡを導入すると,分化誘導しても、細胞の形状変化が生じず、ストレスファイバーが維持されることから、メルトリンαが細胞骨格の再構築に関わっており、それは脂肪前駆細胞や中胚葉性の前駆細胞における分化や成熟に関与していると指摘している（非特許文献６参照）。【０００６】
一方、本発明者らはメルトリンαノックアウトマウスの解析結果を報告している（非特許文献７参照）。メルトリンαノックアウトマウスでは、仔の３０％は早期に死亡し、それらの個体では、褐色脂肪組織の形成不全や肩甲間の筋形成不全が認められた。このことから、これら組織の発生に、メルトリンαが関与している可能性が示されたが、成体マウスでは、メルトリンαを発現していないにもかかわらず、褐色脂肪組織および白色脂肪組織は、野生型と差がなく、脂肪形成の異常は認められなかった。この知見は、siＲＮＡを用いた上記Kawaguchiらの知見と解離する。
以上のように、メルトリンαに関しては、それが発生における少なくともある時期において脂肪の形成に関与することは示唆されているものの、成体マウスでの脂肪形成におけるメルトリンαの役割は依然と不明であり体重増加や脂肪蓄積、肥満との関連性は何ら明らかにされていない。【０００７】
以上のように、近年、肥満の要因となる脂肪の形成や、蓄積、エネルギー代謝については、解明が進んできているものの、それらの本質的な調節因子のすべてが明らかになったとはいえない。また、脂肪の形成や蓄積への関与が示された物質が、生体内、特に病的負荷のかかった状態でも脂肪の蓄積や形成を調節しうるか否かは不明であり、抗肥満薬のターゲット分子となる因子の解明が必要とされている。
【非特許文献１】Anne B., et.al, Diabetes, 2001, 50, p2080-2086
【非特許文献２】H.R. Lijnen et.al., Thromb.Heamost., 2002, 87, p530-535
【非特許文献３】Erik M.,et.al., Thromb.Heamost., 2003, 89, p696-704
【非特許文献４】Nature, 1995  Vol.377, No.19, p652-656
【非特許文献５】Am J. Pathol., 1985, 160(5)
【非特許文献６】J. Cell. Science, 2003, 116(19),3893-3904
【非特許文献７】Kurisaki T. et.al., Mol. Cell Biol., 2003, 23, p55-61
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、肥満に関与する新たなターゲット因子の同定および、あらたな肥満の治療・予防剤、新規なヒトメルトリンαアンチセンス化合物および新規な抗ヒトメルトリンα抗体の提供にある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、肥満の予防・治療剤を開発すべく、肥満にかかわる新たなターゲット因子を見出すことを目的として、研究を重ねてきた。本発明者らは、通常状態における脂肪の形成と、いわゆる病的負荷のかかった状態における脂肪の蓄積では、それを制御する因子やその役割が異なっているのではないかとの考えに基づき、高脂肪負荷を行ったときに認められる、生理活性蛋白の機能に注目して研究を進めた。その結果、驚くべきことに、成体では、野生型と顕著な違いが確認されなかったメルトリンαノックアウトマウスが、高脂肪食負荷を行ったときにおいては、野生型と明らかに異なる特性を示すことを見出した。すなわち、高脂肪食摂餌により野生型マウスは体重増加と脂肪の蓄積をきたし、いわゆる肥満の症状を示すが、メルトリンαノックアウトマウスではそのような肥満の症状は認められなかった。しかも、メルトリンαノックアウトマウスでは糖質および脂質の代謝が亢進されており、血中脂質の改善も認められた。さらに、野生型の高脂肪食摂餌マウスでは肝臓に脂肪が蓄積しており脂肪肝の様相を呈したが、メルトリンαノックアウトマウスにおいては、その傾向は認められなかった。肥満は、糖尿病や高脂血症等、生活習慣病の発症原因となるが、メルトリンαノックアウトマウスで認められたこれらの現象は、メルトリンαを阻害することにより、肥満はおろか、それに伴う生活習慣病の症状をも改善・予防できること示すものである。また、メルトリンαノックアウトマウスでは、野生型マウスと比べ、有害な症状や、異常な所見は認められなかった。これら知見から、本発明者等は、メルトリンαを阻害する薬剤が、安全な肥満の治療および予防剤となることを見出し、本発明を完成させた。【００１０】
すなわち本発明第一の態様は、メルトリンαアンタゴニストを含有することを特徴とする、肥満、肥満症または肥満に起因ないし関連する疾患の予防・治療剤に関する。
本発明第二の様態は、新規なヒトメルトリンαアンチセンス化合物に関する。
本発明第三の態様は、脂肪細胞の増殖・分化測定系において、脂肪細胞の増殖・分化を阻害する活性を示す、抗ヒトメルトリンα抗体もしくはその活性断片またはそれらの誘導体に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、肥満、肥満症および肥満に起因ないし関連する疾患の新規な予防・治療剤が提供される。また該予防・治療剤の有効成分として利用できる新規なメルトリンαアンチセンス化合物および抗メルトリンα抗体が提供される。当該予防・治療剤により、肥満における体重増加や脂肪量の増加を抑制するのみでなく、エネルギー代謝の亢進や、内臓脂肪の抑制、高脂血症などを総合的に予防・治療するために使用することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】メルトリンαの高脂肪食負荷肥満における作用の検討における野生型ならびにメルトリンαＫＯマウスの体重変化を示す図である。縦軸は体重（ｇ）を示し、横軸は飼育日数を示す。図中、ＷＴ：野生型、Melα-／-：メルトリンαＫＯ、ＨＦＤ：高脂肪食、ＮＤ：低脂肪食を示す。
【図２】メルトリンαの脂肪組織重量および肝重量に及ぼす影響の検討における野生型ならびにメルトリンαＫＯマウスの各臓器重量を示す図である。図中、ＷＴ：野生型、Melα-／-：メルトリンαＫＯ、ＨＦＤ：高脂肪食、ＮＤ：低脂肪食を示す。
【図３】メルトリンαのマウス高脂肪食負荷時の脂肪組織ならびに肝臓に対する作用検討における野生型ならびにメルトリンαＫＯマウスの脂肪ならびに肝組織像を示す図である。図中、ＷＴ：野生型、Melα-／-：メルトリンαＫＯを示す。
【図４】メルトリンαの脂肪細胞数に及ぼす影響：メルトリンαＫＯマウスの脂肪組織中の脂肪細胞数を野生型マウスの脂肪細胞数を１００％として示す図である。図中、ＷＴ：野生型、Melα-／-：メルトリンαＫＯ、ＨＦＤ：高脂肪食、ＮＤ：低脂肪食を示す。
【図５】高脂肪食摂餌後のメルトリンαＫＯマウスならびに野生型マウスにおける投与したＲＩ標識物の呼気中への移行量でみた糖脂質代謝を示し、図５-１は、１４Ｃパルミチン酸投与による呼気中ＲＩ量、図５-２は、１４Ｃグルコース投与による呼気中ＲＩ量を示す図である。図中、□：野生型マウス、◆：メルトリンＫＯマウスを示す。
【図６】高脂肪食摂餌後のメルトリンαＫＯマウスならびに野生型マウスに投与したＲＩ標識物の排泄を示し、図６-１は、１４Ｃパルミチン酸投与による糞中ＲＩ量、図６-２は、１４Ｃグルコース投与による尿中ＲＩ量を示す図である。
【図７】メルトリンα発現プラスミドの構築を示す図である。
【図８】Ｃｏｓ-１細胞にｐＥＦ―ＭｅｌｓＦを導入して生産した、精製メルトリンα―ＦＬＡＧの銀染色像とウエスタンブロッティング像を示す図である。  図中、Ｍ：分子量マーカー銀染色。Lane１：銀染色、Lane２：抗ＦＬＡＧ抗体によるウエスタン解析。９２ｋＤａは全長型メルトリンα、６８ｋＤａはプロドメインが削除されたメルトリンαである。
【図９】メルトリンαドメイン別発現プラスミドを示す図である。  構築したメルトリンαの各ドメインの構造を示す。プラスミド名の横に発現されるメルトリンαタンパクを模式的に示す。
【図１０】各ドメイン別メルトリンαの発現を、抗ＦＬＡＧ抗体により染色した各ドメイン蛋白質のウエスタンブロッティング像で示す図である。  図中、Lane１：Ｐｒｏドメイン、Lane２：Ｐｒｏ―ＭＰドメイン、Lane３：ＭＰドメイン、Lane４：Ｄｉｓドメイン、Lane５：Ｃｙｓリッチドメイン；Ｐｒｏ：プロ配列、ＭＰ：メタロプロテアーゼ、Dis：ディスインテグリン、Ｃｙｓ：システインリッチを示す。
【図１１】抗メルトリンαのメルトリンαメタロプロテアーゼ阻害活性を示す組換えヒトIGF-BP3のメルトリンα消化後のウエスタンブロッティング像を示す図である。  図中、Lane１: 抗体なし、Lane２:抗体Ｎｏ．２０、Lane３：抗体Ｎｏ．２１， Lane４：抗体Ｎｏ．１０７、Lane５：抗体Ｎｏ．１２９  各３００μｇ／ｍＬ
【図１２】低分子化合物のメルトリンαメタロプロテアーゼ阻害活性を示す組換えヒトＩＧＦ―ＢＰ３のメルトリンα消化後のウエスタンブロッティング像を示す図である。  Lane１:サンプルなし、２：ＩＧＦ―ＢＰ３、３：ＩＧＦ―ＢＰ３＋Ｐｒｏドメインありメルトリン４: ＩＧＦ―ＢＰ３＋活性型メルトリン、５：４＋Ｍ８２４６３  １０μｇ／ｍＬ
【図１３】メルトリンαsiＲＮＡの脂肪細胞メルトリンαの発現抑制効果を示す図である。  siＲＮＡを投与しない群の値を１００％として示す。
【図１４】メルトリンαアンチセンスの脂肪細胞メルトリンα発現抑制効果を示す図である。センス配列ＤＮＡ導入群の値を１００％として示す。
【図１５】Ｍ８２４６３の脂肪細胞増殖分化抑制を脂肪細胞のＡｄｉｏＲｅｄ染色による蛍光発色値で示す図である。
【図１６】メルトリンαアンチセンスオリゴの脂肪細胞増殖分化抑制を脂肪細胞のＡｄｉｏＲｅｄ染色による蛍光発色値で示す図である。
【図１７】メルトリンαsiＲＮＡの脂肪細胞増殖分化抑制を脂肪細胞のＡｄｉｏＲｅｄ染色による蛍光発色値で示す図である。
【図１８】高脂肪食負荷したマウスの体重を示す。野生型マウスおよびメルトリンαへテロ欠損マウス、メルトリンαKOマウスの高脂肪食負荷24週後の体重を示した。
【図１９】高脂肪食負荷したマウスのレプチン濃度を示す。野生型マウスおよびメルトリンαへテロ欠損マウス、メルトリンαKOマウスの高脂肪食負荷24週後に採血し、分離した血清中のレプチン濃度をELISA法により測定した。
【図２０】高脂肪食負荷したマウスのインスリン濃度を示す。野生型マウスおよびメルトリンαへテロ欠損マウス、メルトリンαKOマウスの高脂肪食負荷24週後に採血し、分離した血清中のインスリン濃度をELISA法により測定した。
【図２１】高脂肪食負荷したマウスの血糖値を示す。野生型マウスおよびメルトリンαへテロ欠損マウス、メルトリンαKOマウスの高脂肪食負荷24週後に採血し、分離した血清中のグルコース濃度を測定した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の第一の態様の予防・治療剤は、メルトリンαアンタゴニストを含有することを特徴とする。
ここでいうメルトリンαアンタゴニストはヒトメルトリンαを阻害する物質であり、その阻害の方法はメルトリンαの発現を阻害しても、メルトリンαの活性を阻害してもよい。メルトリンαの発現を阻害するとは、生体内のメルトリン産生細胞においてメルトリンα蛋白質の産生を阻害することであり、好ましくは、メルトリンαに対するｍRNAの転写のレベルを阻害することである。また、メルトリンα活性を阻害するとは、高脂肪食摂餌動物で体重増加を抑制することであり、好ましくは、脂肪量の増加を抑制する、糖質および脂質代謝を亢進する、血中コレステロール値を低下させる、脂肪肝の形成を抑制する、のいずれか１以上の作用を有することである。後述の実施例で示すように、本発明者らは、メルトリンαを阻害することによって、脂肪細胞の増殖が抑制されること、または分化刺激後の脂肪細胞への中性脂肪の取り込み量が抑制されることを確認しており、したがって、メルトリンαの活性を抑制する物質とは、これらの抑制効果を有することであってもよい。本発明者らは後述の実施例で、これらの測定方法を示しており、その系を用いればメルトリンαの活性を抑制する物質を評価することもできるが、必ずしもその系に限定されるものではない。【００１４】
メルトリンαアンタゴニストによる発現抑制、活性抑制の程度は、１００％に近いほど高い効果が予想されるが、必ずしも、１００％の抑制である必要は無く、対照群と比較して差が認められればよい。しかしながら特にin vitroのアッセイ系においては、メルトリンの発現または活性を５０％以上、好ましくは７０％以上抑制する物質が、当該予防・治療剤の有効成分として好ましい。
メルトリンαの発現を抑制するアンタゴニストとしてはメルトリンαに対するアンチセンス化合物や、siＲＮＡがある。また、メルトリンαの活性を抑制する物質としては、メルトリンαに対する抗体、低分子化合物があり、それぞれについて後に詳述する。【００１５】
本発明の予防・治療剤は、有効成分がアンチセンス化合物やsiＲＮＡの場合、有効性分量として０.１mg／kg／日〜１００mg／kg／日、有効成分が抗体の場合、有効性分量として０.１mg／kg／日〜１００mg／kg／日を、有効成分が低分子化合物の場合、有効性分量として０.１mg／kg／日〜２０mg／kg／日を患者に投与する。
投与量や投与経路、投与回数、投与間隔などは患者の症状や年齢、性別、体重、合併症の有無などを考慮して最適な方法を適宜実施できる。アンチセンス化合物やsiＲＮＡ、抗体の場合、１日１回から２回に分けて、２〜１５週間の連日投与、もしくは１〜２週間に１回の間隔で１日量を、２〜１５週間投与することが例示できる。また低分子化合物の場合は、1日１回から２回に分けて、連日投与することが例示できる。【００１６】
本発明の予防・治療剤は、肥満、肥満症および肥満に起因ないし関連する疾患を有する患者に投与される。肥満のひとつの指標はＢＭＩ値である。たとえばＷＨＯや米国ＮＩＨではＢＭＩ値３０以上を肥満の目安としているが、日本では２５以上を目安としており、人種や食生活などによって、肥満の定義は異なるのが現状である。日本肥満学会によると、「肥満症とは、肥満に起因ないし関連する健康障害を合併するか、その合併が予測される場合で、医学的に減量を必要とする病態をいい、疾患単位として取り扱う」と定義されている。つまり、ＢＭＩ２５以上で肥満と判定されたもののなかで、１）肥満に起因ないし関連し、減量を要する健康障害を有するか、２）上半身肥満を疑われＣＴで確定診断された内臓脂肪型肥満、のいずれかであれば肥満症と診断すると規定されている（肥満研究第6巻18-28頁2000年、Adiposcience第1巻56-61頁2004年）。したがって、本発明において肥満とは、好ましくはＢＭＩ値２５以上の患者をいうが、それに限定されず、患者本人や医療従事者が、内臓脂肪または体重を削減したほうがよいと考える場合も、ここでいう肥満に含まれる。【００１７】
また、肥満に起因ないし関連する疾患とは、肥満が１つの原因となって発症する疾患であり、たとえば糖尿病、特に、２型糖尿病もしくは耐糖能障害、脂質代謝異常、脂肪肝、高脂血症、高血圧、高尿酸血症もしくは痛風、虚血性心疾患（たとえば心筋梗塞もしくは狭心症等の冠動脈疾患）、脳血管障害（たとえば脳梗塞、脳血栓症もしくは一過性脳虚血発作等）、動脈硬化、睡眠時無呼吸症候群、Pickwick症候群、変形性関節症もしくは腰椎症等の整形外科的疾患、月経異常などが代表的である。実際の医療現場においては、明確な診断基準のもとに疾患名をつける場合があるが、ここでは、血糖値や血中脂質、血中コレステロールの１つ以上が正常値域よりも高値である状態や、ＣＴやエコーなどによる臓器や血管の画像診断、生検等の１つ以上において、病変が認められた状態であって、上記の糖尿病、脂肪肝、高脂血症、虚血性心疾患、脳血管障害、動脈硬化等が疑われる場合も、肥満に起因ないし関連する疾患に含まれる。
本発明の予防・治療剤は上述した肥満および肥満に関係する疾患の治療に使用することができ、食生活や生活習慣、遺伝的素因等から総合的に判断して、上記疾患が発症する確立が高いと医療従事者が判断した場合などに予防的に使用することができる。また、医療用に限らず、肥満や肥満に関係する疾患の予防・治療を目的とした健康食品や機能性食品に含有させて使用する事もできる。
本発明の予防・治療剤のさらに詳しい使用方法については、後述する。【００１８】
また、本発明は、メルトリンαアンタゴニストを含有する、糖尿病（例、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病等）の予防・治療剤、耐糖能不全［ＩＧＴ（Impaired Glucose Tolerance）］の予防・治療剤、インスリン分泌促進剤、耐糖能不全から糖尿病への移行抑制剤、及び、糖代謝改善剤を提供する。
糖尿病の判定基準については、１９９９年に日本糖尿病学会から新たな判定基準が報告されている。この報告によれば、糖尿病とは、空腹時血糖値（静脈血漿におけるグルコース濃度）が１２６ｍｇ／ｄｌ以上、７５ｇ経口ブドウ糖負荷試験（７５ｇＯＧＴＴ）２時間値（静脈血漿におけるグルコース濃度）が２００ｍｇ／ｄｌ以上、随時血糖値（静脈血漿におけるグルコース濃度）が２００ｍｇ／ｄｌ以上のいずれかを示す状態である。また、上記糖尿病に該当せず、かつ、「空腹時血糖値（静脈血漿におけるグルコース濃度）が１１０ｍｇ／ｄｌ未満または７５ｇ経口ブドウ糖負荷試験（７５ｇＯＧＴＴ）２時間値（静脈血漿におけるグルコース濃度）が１４０ｍｇ／ｄｌ未満を示す状態」（正常型）でない状態を、「境界型」と呼ぶ。また、糖尿病の判定基準については、１９９７年にＡＤＡ（米国糖尿病学会）から、１９９８年にＷＨＯから、新たな判定基準が報告されている。これらの報告によれば、糖尿病とは、空腹時血糖値（静脈血漿におけるグルコース濃度）が１２６ｍｇ／ｄｌ以上であり、かつ、７５ｇ経口ブドウ糖負荷試験２時間値（静脈血漿におけるグルコース濃度）が２００ｍｇ／ｄｌ以上を示す状態である。【００１９】
また、上記報告によれば、耐糖能不全とは、空腹時血糖値（静脈血漿におけるグルコース濃度）が１２６ｍｇ／ｄｌ未満であり、かつ、７５ｇ経口ブドウ糖負荷試験２時間値（静脈血漿におけるグルコース濃度）が１４０ｍｇ／ｄｌ以上２００ｍｇ／ｄｌ未満を示す状態である。さらに、ＡＤＡの報告によれば、空腹時血糖値（静脈血漿におけるグルコース濃度）が１１０ｍｇ／ｄｌ以上１２６ｍｇ／ｄｌ未満の状態をＩＦＧ（Impaired Fasting Glucose）と呼ぶ。一方、ＷＨＯの報告によれば、該ＩＦＧ（Impaired Fasting Glucose）のうち、７５ｇ経口ブドウ糖負荷試験２時間値（静脈血漿におけるグルコース濃度）が１４０ｍｇ／ｄｌ未満である状態をＩＦＧ（Impaired Fasting Glycemia）と呼ぶ。
本発明の予防治療剤（メルトリンαアンタゴニスト）は、上記した新たな判定基準により決定される糖尿病、境界型、耐糖能異常、ＩＦＧ（Impaired Fasting Glucose）およびＩＦＧ（Impaired Fasting Glycemia）の予防・治療剤としても用いられる。さらに、本発明の予防治療剤は、境界型、耐糖能異常、ＩＦＧ（Impaired Fasting Glucose）またはＩＦＧ（Impaired Fasting Glycemia）から糖尿病への進展を防止することもできる。【００２０】
本発明の予防治療剤は、例えば、糖尿病性合併症［例、神経障害、腎症、網膜症、白内障、大血管障害、骨減少症、糖尿病性高浸透圧昏睡、感染症（例、呼吸器感染症、尿路感染症、消化器感染症、皮膚軟部組織感染症、下肢感染症）、糖尿病性壊疽、口腔乾燥症、聴覚の低下、脳血管障害、末梢血行障害］、糖尿病性悪液質、腎臓疾患（例、糖尿病性ネフロパシー、糸球体腎炎、糸球体硬化症、ネフローゼ症候群、高血圧性腎硬化症、末期腎臓疾患）、インスリン抵抗性症候群、シンドロームＸ、メタボリックシンドローム（2型糖尿病、耐糖能異常あるいはインスリン抵抗性の内、少なくとも一つを有し、肥満、脂質代謝異常、高血圧あるいは微量アルブミン尿の内、少なくとも2つ以上を併せ持つ状態）、クッシング症候群、高インスリン血症、高インスリン血症における知覚障害などの予防・治療剤としても用いることができる。また、上記した各種疾患の２次予防および進展抑制にも用いられる。
本発明の予防治療剤の抗糖尿病作用は、適当な疾患モデル動物、例えば、自然発症の糖尿病、例えば、自然発症２型糖尿病モデルマウスであるｄｂ/ｄｂマウス、ｏｂ／ｏｂマウスもしくはＫＫ-Ａｙマウス、薬物誘発の糖尿病のマウスおよびラット、特殊飼料（高脂肪食、高ショ糖食など）誘発の糖尿病マウスおよびラットなどを用いて、血糖値および血清インスリン等を測定することにより、または、一晩絶食後、経口グルコース負荷を行った後、経時的に血糖値を測定して耐糖能を試験することにより確認し得る。かかる試験は、例えば、Endocrinology 144（11）：4755-4762、2003年記載の方法を参考に実施することができる。
本発明の予防・治療剤のさらに詳しい使用方法については、後述する。【００２１】
（有効成分としてのメルトリンαアンチセンス化合物またはその修飾体を含む予防・治療剤）
（１）アンチセンス化合物
本発明の予防・治療剤の有効成分として好ましいアンチセンス化合物は、少なくとも、ヒトメルトリンαをコードする遺伝子すなわちＤＮＡまたはＲＮＡ、具体的には、ＤＮＡもしくはそれから転写されたＲＮＡ、特にｍＲＮＡに結合し、その発現、転写または翻訳等を抑制するものである。通常、アンチセンス化合物は、目的遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６-ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループなどをターゲットとし、それに相補的な塩基配列を有するように製造される。すなわち、配列番号１および３に示されたヒトメルトリンαの配列から、上記ターゲットなる部位を選び出し、それに相補的な塩基配列を有するように公知方法で化学合成する。もしくは、ＮＣＢＩが提供する配列データベースで登録番号NT_035040として登録されているメルトリンα遺伝子を含むゲノムＤＮＡ上、メルトリンα遺伝子をコードする領域内の配列のうち、イントロンとエクソンにまたがる部分をターゲットとすることもできる。【００２２】
ヒトメルトリンαに対するアンチセンス化合物は、ヒトメルトリンαをコードする核酸に結合して、その発現、転写または翻訳等を抑制するものであれば、その長さはおよび結合部位は特に限定されないが、好ましくは１０ないし４０塩基のオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンス化合物を細胞内に取り込ませるには、その長さはあまり長すぎても不適当であるため、より好ましくは１５ないし３０塩基、さらに好ましくは１８ないし２５塩基からなるものである。また、ヒトメルトリンαをコードするＤＮＡにおいては、５’上流領域が比較的短いため、それ以外をターゲットとした方が、特異性、結合能、発現抑制能の点でバリエーションに富み、より目的にかなった分子を選択することができる。ヒトのみでなく他の動物でも効果が確認できるという利点においては、ヒトと、マウスやラット等の小動物とで、ホモロジーの高い部位をターゲットとすることも好ましい。このような部位としては、配列番号１および３の１〜２４２０の領域をあげることができ、この中から、１０ないし４０塩基で、相補的な配列を有するアンチセンス化合物を化学合成することができる。【００２３】
本発明の予防・治療剤に含まれるアンチセンス化合物は、膜型のヒトメルトリンαの発現を抑制するものであっても、遊離型のヒトメルトリンαの発現を抑制するものであってもよく、ヒトメルトリンαをコードする全ての配列をターゲットとして作製すればよいが、生体内でのメルトリンの作用を効率的に阻害するという観点からは、膜型・遊離型のいずれのメルトリンαの発現をも阻害するものが好ましい。このようなアンチセンス化合物は、５’上流の非翻訳領域を含め、開始コドン以降の膜型、遊離型に共通な配列をターゲットとして作製することができる。【００２４】
具体的には、本発明の第二の態様であるアンチセンス化合物を本発明の予防治療剤の有効成分として使用可能であり、具体的には、後述の表６および表８に示すヌクレオチド配列からなる、または、該配列を含有するアンチセンス化合物が挙げられる。また、公知の配列でもよく、例えば、後述の表７に示すヌクレオチド配列からなる、または、該配列を含有するアンチセンス化合物が挙げられる。
これらの内、抑制率（スコア）の高いものはより有用である。アンチセンス化合物のメルトリンα発現抑制活性は、アンチセンス化合物を導入した細胞の細胞抽出液または培養液中のメルトリンα蛋白量を、ウエスタンブロッティング等で確認すればよい。【００２５】
当該アンチセンス化合物は、２-デオキシ-Ｄ-リボースを含有しているオリゴヌクレオチド、Ｄ-リボースを含有しているオリゴヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ-グリコシドであるその他のタイプのオリゴヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマーのいずれであってもよい。また、当該アンチセンス化合物は、非修飾オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチドのいずれであってもよい。【００２６】
修飾の例としては、ヌクレアーゼ耐性を持ち最も汎用されているホスホロチオエイト誘導体の他に、ヌクレアーゼ耐性を持ちかつＲＮＡと高い親和性を付与するピラノース環変換体であるヘキシトール核酸（Hexitol nucleic acids：ＨＮＡｓ)、モルフィリノＤＮＡ、ペプチド核酸（Peptide nucleic acids：ＰＮＡｓ）,3'-アミノ-ＤＮＡ、2',4'-エチレン架橋核酸（2',4'-ethylene bridged nucleic acid：ＥＮＡ）そして2',4'-メチレン架橋核酸（2',4'-methylene bridged nucleic acid：2',4'-ＢＮＡ）などがある。そしてその他にもキャップの付いたもの、メチル化されたもの、オリゴヌクレオチド内に、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなどを持つもの、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなどを持つもの、ポリ-Ｌ-リジン等のポリペプチドや、糖、インターカレント化合物（たとえばアクリジン、ソラレンなど）、キレート化合物、アルキル化剤を含有するものなどが挙げられる。【００２７】
これら核酸修飾体は、ヌクレアーゼ耐性能および標的ＲＮＡとの高い親和性をアンチセンス化合物に付与することができる。特に標的ＲＮＡの特定部位の塩基配列に相補的にハイブリダイズし蛋白質への翻訳を阻害したりＲＮaseＨ依存的に標的ＲＮＡを分解することにより作用するアンチセンス化合物は、特異的でかつ有効にハイブリダイズできる標的ＲＮＡ配列に相補的な配列をどのように選択できるかによりその有効性が大きく左右されてきた。例えば有効なアンチセンス化合物を設計するためには二本鎖構造部分であるステム構造を避けて一本鎖構造をとりやすいループを選択する必要がある。【００２８】
しかしながら、ＲＮＡの多次構造を正確に予測することは困難であるので、アンチセンス化合物が二本鎖ＲＮＡのハイブリダイズ能よりも高いハイブリダイズ能を付与することにより限定された特定の配列に制限されずより有効性の高いアンチセンス化合物を設計できる。このような理由によりにＲＮＡにより親和性の高い修飾体が開発されてきた。初期の頃開発された修飾体としてはＰＮＡが挙げられる。ＰＮＡはフレキシブルに標的ＲＮＡに結合できる。【００２９】
一方近年は、よりリジッドな構造をもつ化学修飾体、例えばブリッジ型アンチセンス化合物が指向されるようになってきた（蛋白質核酸酵素第48巻，1616-1624，2003年）。この修飾体では核酸糖部フラノース環のパッカリング様式をＮ型配座に固定化することによりssＲＮＡやdsＤＮＡへの結合性を高めることができるため、アンチセンス化合物ばかりでなくリボザイム、アンチジーン、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡi）、デコイ核酸法への利用も考えられている。このブリッジ型アンチセンス化合物の代表例として2',4'-エチレン架橋核酸（2',4'-ethylene bridged nucleic acid：ＥＮＡ）そして2',4'-メチレン架橋核酸（2',4'-methylene bridged nucleic acid：2',4'-ＢＮＡ）、3'-アミノ-2',3'-ＢＮＰなどあるが、この修飾オリゴヌクレオチドはＲＮＡ相補鎖へのハイブリダイズ能は極めて高いにもかかわらず高い認識配列特異性を持ち十分なヌクレアーゼ耐性能も持っている。【００３０】
このようなフラノース環の固定以外に核酸糖部の配座自由度を束縛する方法としては、ＲＮＡの2'-ＯＨ基やＤＮＡの3'-ＯＨ基を化学修飾した、2'-Ｏ-アルキル体（炭素数１ないし４程度、例えば-ＣＨ３、-ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３：2'-O-methoxyethyl（ＭＯＥ）、-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２：ＡＰ）や、2'-Ｆ置換体、3'-ＮＨ２置換体などがある。【００３１】
ところでこのように高いハイブリダイズ能とヌクレアーゼ耐性能を持つ修飾体の多くはアンチセンス化合物の作用発現に重要なＲＮaseＨの認識能を喪失している。しかしながら、ギャップマーという構造をとることによりＲＮaseＨ依存性作用機作を付与しつつ上記修飾体を導入することが容易にできることが分かっている。すなわちＲＮaseＨの基質となりえるホスホロチオエイトや未修飾の核酸をアンチセンスオリゴヌクレオチドの一部に使用し、より頻繁にはアンチセンスオリゴヌクレオチドの中心に置き、その両端に上記修飾核酸配列を配置したアンチセンス化合物を設計することにより、高いハイブリダイズ能とヌクレアーゼ耐性能持ちかつＲＮaseＨ依存性の作用機作で稼動できるアンチセンス化合物を得ることができる。
これらのオリゴヌクレオチドの修飾は後述する本発明の第二の態様のアンチセンス化合物においても同様である。
オリゴヌクレオチドおよびその誘導体は、公知方法で製造することができる（たとえばスタンレー  ティー  クルーク（Stanley T. Crooke）およびベルナール  ルブロー（Bernald Lebleu）編、in Antisense Research and Applications，ＣＲＣ出版，フロリダ，1993年，Methods In Enzymology，313巻，314巻，Academic Press，2000年）。【００３２】
（２）アンチセンス化合物を含有する予防・治療剤
上記アンチセンス化合物を含む予防・治療剤は、例えばApplied Antisense Oligonucleotide Technology（1998，Wiley-Liss，Inc.）等を参考にして公知方法で製造することができる。アンチセンス分子は、微量注入、リポソームカプセル化、適当なベクターに組み込み、細胞に導入することができる。ベクターとしては、アンチセンス配列を発現させる通常のプラスミドやウイルスベクターの他に、ペプチドベクターや非ウイルスベクターなども使用できる。【００３３】
本発明の予防・治療剤は、有効成分としてのアンチセンス化合物を含有する。必要に応じて、薬理学的に許容される、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、乳化剤、安定化剤、矯味矯臭剤、希釈剤等の補助成分を１以上含ませることもできる。【００３４】
賦形剤の例としては、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトールの等の糖誘導体、デンプン、デキストリン等の澱粉粉誘導体、結晶セルロースの等のセルロース誘導体、アラビアゴム、デキストラン等の有機系賦形剤、珪酸塩、炭酸塩、硫酸塩等の無機系賦形剤を挙げることができる。滑沢剤の例としては、ステアリン酸金属塩、ワックス、ラウリル硫酸塩、珪酸類、澱粉誘導体などがあり、結合剤の例としては、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等があげられる。崩壊剤の例としては、セルロース誘導体等、乳化剤の例としては、ベントナイト、ビーガムのようなコロイド性粘土、金属水酸化物、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤等が、安定剤の例としては、パラオキシ安息香酸エステル類、アルコール類、フェノール類、ソルビン酸等が挙げられる。また、矯味矯臭剤の例としては、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を使用できる。【００３５】
当該アンチセンス化合物を含有する予防・治療剤は、好ましくは、注射剤として、皮下投与、皮内投与、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与にて使用され、もしくは、マイクロカプセルにして皮下に埋め込んで使用される。注射剤は連日または、１〜２週間に１回程度での間隔で投与されるが、それに限らず経口投与、経皮投与、直腸投与、経鼻投与など、患者の年齢や症状に見合った方法で間隔投与される。【００３６】
（有効成分としてメルトリンαsiＲＮＡを含む予防・治療剤）
（１）siＲＮＡ
siＲＮＡは、少なくともヒトメルトリンαをコードするｍＲＮＡに相補的な配列を有するＲＮＡを含んでおり、このＲＮＡがＲＩＳＣと呼ばれるＲＮase活性を持つタンパク複合体に取り込まれて、メルトリンαのｍＲＮＡを特異的に分解する。siＲＮＡの配列は、公知方法よりターゲットとなる部位を選び出し、そのうちの１ないし２５塩基程度からなる配列に相補的な塩基配列を有するように公知方法で化学合成する。ターゲットとする部位は、上記アンチセンス化合物のターゲットとなる領域であってもよい。【００３７】
前述の配列番号１および３に示したＤＮＡは、遊離型および膜結合型のヒトメルトリンαをコードしている。配列番号２および４は、それぞれ配列番号１および３のＤＮＡの発現する遊離型および膜型のヒトメルトリンαのアミノ酸配列である。ヒトメルトリンαには、オルタナティブスプライシングによって、膜貫通領域を持たない、遊離型メルトリンαがあることが知られている。この遊離型をコードするＤＮＡは、膜型をコードするＤＮＡと、開始コドンから数えて２１１３番目以降の配列が異なっている。本発明の予防・治療剤に含まれるｓｉＲＮＡは、膜型のヒトメルトリンαの発現を抑制するものであっても、遊離型のヒトメルトリンαの発現を抑制するものであってもよく、その場合、ヒトメルトリンαの全ての配列をターゲットとして作製すればよいが、生体内でのメルトリンαの作用を効率的に阻害するという観点からは、膜型・遊離型のいずれかのメルトリンαの発現も阻害するものが好ましい。このようなｓｉＲＮＡは、５’上流の非翻訳領域を含め、開始コドン以降の膜型、遊離型に共通な配列をターゲットとして作製する。
siＲＮＡを用いる方法としては上記により設計合成した方法以外に、ｔＲＮＡプロモータや組織や刺激に応じた特異的な発現を誘導する従来のポリメラーゼII系のプロモータ下にsiＲＮＡ配列が発現するように設計構築したプラスミドやウイルスベクターを用いても良い。【００３８】
（２）siＲＮＡを含有する予防・治療剤の製造
本発明の予防・治療剤は有効成分としてのsiＲＮＡを含有する。必要に応じて、薬理学的に許容される、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、乳化剤、安定化剤、矯味矯臭剤、希釈剤等の補助成分を含ませることもでき、上述のアンチセンス化合物と同様に患者に投与することができる。【００３９】
（有効性分としてのメルトリンαを認識する抗体を含む予防・治療剤）
・  抗メルトリンα抗体
本発明の予防・治療剤が含有する抗メルトリンα抗体は、ヒトメルトリンにαに結合し、メルトリンα活性を抑制する抗体である。好ましくは、高脂肪食摂食時の体重増加を低下させる抗体、脂肪量を低下させる抗体、エネルギー代謝を亢進させる活性を有する抗体、血中脂質を低下させる抗体、脂肪肝を抑制する抗体、高脂肪または高栄養負荷状態での脂肪細胞の増殖を抑制する抗体、もしくは分化刺激後の脂肪細胞への油滴の取り込みを抑制する活性を有する抗体である。ヒトメルトリンαとマウスメルトリンαの間には蛋白質の一次配列上、高いホモロジーが認められることから、マウス以外の他の動物においても、ヒトメルトリンαとの高いホモロジーを示す可能性がある。したがって、ヒト以外の動物種のメルトリンαを抗原として得られた抗体であっても、ヒトメルトリンαに結合し、その活性を阻害する場合もあり、このような抗体はいずれも、本発明の予防・治療剤の有効成分となり得る。しかしながら、当該有効成分として用いる抗体は、好ましくはヒトメルトリンαを抗原として得られる抗体である。【００４０】
ここで、ヒト及びヒト以外の動物、例えば、マウスまたはラット等、特に、マウスのメルトリンαと交差反応性を示す抗体は、当該ヒト以外の動物を用いたin vivo実験に応用可能である点で有用である。また、構造上の相同性を有する他のＡＤＡＭファミリー蛋白質、特に、メルトリンβ及びメルトリンγとの反応性が明確にされた抗体が好ましく、メルトリンαに反応し、メルトリンβ及びメルトリンγとは反応しない抗体が特異性の観点ではより好ましい。【００４１】
免疫グロブリンの構造は重鎖（Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌ鎖）とからなり、重鎖のクラス（γ、α、μ、δ、ε）により５つのイソタイプ（ＩgＧ、ＩgＡ、ＩgＭ、ＩgＤ、ＩgＥ）に分けられる。このうちＩgＧとＩgＡは重鎖の違い（例えばヒトの場合、γ１、γ２、γ３、γ４、α１、α２）からサブクラス（例えばヒトの場合ＩgＧ１、ＩgＧ２、ＩgＧ３、ＩgＧ４、ＩgＡ１、ＩgＡ２）に分けられる。軽鎖は、κまたはλのいずれかのタイプに分類される。本発明において、メルトリンαアンタゴニストとして用いられる抗体は、クラス、サブタイプまたはイソタイプは限定されず、いずれに分類されるものでもあってもよいが、好ましくはイソタイプがＩgＧの抗体であり、さらに好ましくは補体結合性のないという点においてサブクラスがＩgＧ４の抗体である。【００４２】
（２）抗体の作製方法
（２-１）動物の免疫
当該抗体の作製は、通常、「免疫実験操作法、日本免疫学会編、日本免疫学会発行」等、成書を参考に行うことができる。まず、動物に、免疫抗原としてヒトメルトリンαまたはその断片、もしくはヒト以外の動物のメルトリンαを、必要に応じてフロイントの完全アジュバ・ント（ＦＣＡ）や不完全アジュバント（ＦＩＡ）等の適切なアジュバントとともに接種し、必要があれば２〜４週間の間隔で追加免疫する。しかしながら、抗原としてヒトメルトリンαの部分断片を使用した場合、また、ヒトメルトリンαを使用した場合でも、定法でマウスを免疫しても抗体価が上がらない。これは、上述したように、動物間で配列のホモロジーが極めて高いことに起因すると考えられる。したがって、免疫する動物と抗原の組合せ、アジュバントや抗原の処理方法が、抗体の産生効率に大きく影響する。【００４３】
より効率的に抗体を得るためには、強力なアジュバントを用いたり、もしくは投与抗原に何らかの変性を加えて抗原性を高たりする等の工夫をすることが好ましい。
例えば、ヒトメルトリンαを抗原として、マウスに免疫する場合には、アジュバントとしてＣｐＧを用いることが好ましい。もしくは、抗原であるヒトメルトリンαを含む溶液に、ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＰ）、グルタルアルデヒド（ＧＡ）、等から選ばれる１以上の変性剤で、２５℃で１０〜６０分処理するか、９５℃以上で５分間の熱変性処理を行うことが好ましい。また、アジュバントとしてＣｐＧを使用し、かつ、変性剤で処理した抗原を使用すれば、免疫効率は特段に増加し、目的の抗体を得ることが容易になる。【００４４】
免疫する動物として、メルトリンα遺伝子をノックアウトした動物を用いることも、好ましい手段である。メルトリンαノックアウト動物は、ノックアウトマウスが公知（Kurisaki T. et.al., Mol. Cell Biol., 23, p55-61, 2003）であり、他の動物でも同様に作製することができる。ノックアウト動物を用いることにより、抗原とするヒトメルトリンαを変性剤等で処理しなくとも、効率よく抗体を得ることができ、その場合、高いホモロジーを有する領域に対する抗体であっても、効率よく作成することができる。
なお、後述の実施例に示したように、上記ＣｐＧアジュバントを用いた場合とノックアウト動物を用いた場合とでは、後者の方が高い抗体価を得やすく、また、後者の方が、メタロプロテアーゼドメインやシステインリッチドメイン等のメルトリンα中の主要なドメインに結合する抗体や中和抗体の作製に適している。したがって、ヒトメルトリンαを認識する抗体、特に中和抗体やメタロプロテアーゼやシステインリッチドメインに特異的な抗体の作製方法として、ノックアウト動物を用いることがより好ましい。【００４５】
（２-２）ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の作製
動物を免疫後（もしくは追加免疫後）、採血を行い、抗血清を得る。ポリクローナル抗体は、得られた抗血清を精製することによって得る事が出来る。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて行えば良い。【００４６】
モノクローナル抗体は、常法（例えば、Kohler et al.: Nature 256, p.495-497, 1975）により得ることができる。まず、上述の免疫した動物から脾細胞もしくはリンパ球等の抗体産生細胞を採取し、ポリエチレングリコール、センダイウイルス、電気パルス等を用いる公知方法によって、ミエローマ細胞株等と融合し、ハイブリドーマを作製する。その後、ヒトメルトリンαに対するウエスタンブロッティング等を行って、培養上清中に目的の抗体を産生しているクローンを選択し、その選択されたクローンの培養上清を、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて用い、モノクローナル抗体を得ることができる。【００４７】
抗体は、遺伝子工学的な方法を用いても得ることができる。例えば、免疫した動物の脾細胞、リンパ球あるいは、上述のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからmＲＮＡを採取し、これをもとにcＤＮＡライブラリーを作成する。抗原と反応する抗体を産生しているクローンをスクリーニングし、得られたクローンを培養し、培養混合物から目的とする抗体を精製することができる。【００４８】
（２-３）キメラ抗体の作製
ヒトに対する医薬として用いる場合、抗原性の問題からヒトの体内で免疫原性を示さない抗体を有効成分とすることが望ましい。このような抗体 の例として、「キメラ抗体」、「ヒト型抗体」および「ヒト抗体」 が挙げられる。
「キメラ抗体」とは、その可変領域がヒト以外の動物の免疫グロブリン由来であり且つその定常領域がヒト免疫グロブリン由来の抗体である。このようなキメラ抗体は、次のような手法で得ることができる。まず、ヒトメルトリンαに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマより該抗体をコードするＤＮＡを単離し、該ＤＮＡより活性なＶＨ遺伝子（Ｈ鎖可変領域をコードする再配列されたＶＤＪ遺伝子）及びＶＬ遺伝子（Ｌ鎖可変領域をコードする再配列されたＶＪ遺伝子）を単離する。得られたＶＨ遺伝子の下流にヒト免疫グロブリンをコードするＤＮＡ由来のＣＨ遺伝子（Ｈ鎖定常領域をコードするＣ遺伝子）を、ＶＬ遺伝子の下流にＣＬ遺伝子（Ｌ鎖定常領域をコードするＣ遺伝子）をそれぞれ機能発現が可能なように１つの発現ベクターに組み込んで、宿主細胞を形質転換する。得られた形質転換宿主細胞の培養物より公知の抗体の精製方法に従って単離精製する。【００４９】
（２-４）ヒト型抗体の作製
「ヒト型抗体」とは、可変領域内の相補性決定領域（Complementarity-determining region：ＣＤＲと略する）の一部又は全部がヒト以外の動物のモノクローナル抗体由来であり、且つその可変領域内のＣＤＲ以外の領域すなわち枠組領域（Framework region：以下、ＦＲ）の大部分又は全部がヒトイムノグロブリン由来であり、且つその定常領域がヒトイムノグロブリン由来であることを特徴とする抗体である。例えば、ヒト型抗体の例としては、ＣＤＲがマウスモノクローナル抗体由来であり、ＦＲおよび定常領域がヒトイムノグロブリン由来である抗体などがあげられる。
このようなヒト型抗体は、次のような方法で得ることできる。まず、マウスもしくはメルトリンαノックアウトマウスを用いてヒトメルトリンαに対するマウスモノクローナル抗体 を作製する。次に、得られたマウスモノクローナル抗体のＣＤＲ-領域（ＣＤＲ-１、２および３）をヒトＩgＧのＣＤＲ領域に移植するＣＤＲ-grafting（Winter and Milstein：Nature ３４９, p２９３―２９９, １９９１参照）を行い、目的の抗体を得ることができる。【００５０】
「相補性決定領域（ＣＤＲ）」の定義およびその位置を決定する方法は複数報告されており、これらの何れも採用し得るが、代表的なものとしてKabatの定義（Sequences of proteins of immunological interest, 5th ed., U.S. Department of Health and Human Services,1991）とChothiaの定義（チョシアおよびレスク，J. Mol. Biol., 1987；196：901-917）がある。本発明においては、Kabatの定義によるＣＤＲを好適な例として採用するが、必ずしもこれに限定されない。また、場合によっては、Kabatの定義とChothiaの定義の両方を考慮して決定しても良く、例えば、各々の定義によるＣＤＲの重複部分を、または、各々の定義によるＣＤＲの両方を含んだ部分をＣＤＲとすることもできる。そのような方法の具体例としては、Kabatの定義とChothiaの定義の折衷案である、Oxford Molecular's AbM antibody modelling softwareを用いたMartin らの方法（Proc. Natl.Acad.Sci. USA, 1989; 86:9268-9272）がある。【００５１】
（２-５）ヒト抗体の作製
「ヒト抗体」とは、免疫グロブリンを構成する全ての領域がヒト免疫グロブリンをコードする遺伝子に由来する抗体である。ヒト抗体 の製造方法としては、ヒト以外の哺乳動物の遺伝子中にヒト免疫グロブリン遺伝子を組込むことにより作製されたトランスジェニック動物を用いる方法（ＷＯ９４／２５５８５号公報等）、ヒト末梢血リンパ球を、Severe combined immune deficiency（ＳＣＩＤ）マウスに移植し、このＳＣＩＤマウスを用いる方法（Mosier D. E. et al.: Nature 335, p256-259, 1988; Duchosal M. A. et al.: Nature 355, p258-262, 1992）等が知られており、ヒトメルトリンαをこれらの動物またはマウスに投与することにより、ヒトメルトリンαを認識するポリクローナルヒト抗体、モノクローナルヒト抗体を得ることができる。【００５２】
（２-６）活性断片の作製
本発明の予防・治療剤の有効性成分には、抗体分子そのもの（重鎖２本と軽鎖２本からなる抗体）のほかに、抗体の活性断片等も使用することができる。。抗体の活性断片としては、例えばFab （fragment of antigen binding ）、Fab'、F(ab')2があり、抗体の活性断片をリンカー等で結合したものとして例えば一本鎖抗体（single chain Fv ： scFv ）やジスルフィド安定化抗体（disulfide stabilized Fv ：dsFv）があり、抗体の活性断片を含むペプチドとしては、例えばＣＤＲを含有するペプチドが挙げられる。これらは、いずれも、得られたヒトメルトリンαに対する抗体を用いて公知の方法で製造することができる。【００５３】
Fabは、抗体がＩgＭの場合はタンパク質分解酵素ペプシンで処理して、ＩgＧの場合はタンパク分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のFabをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、Fabを製造することができる。
F(ab')2は、抗体を、タンパク質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のFab'をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させ、作製することができる。
Fab'は、F(ab')2を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。【００５４】
scFvを得るには、まず、上記ハイブリドーマから抗体のＶＨおよびＶＬをコードするcＤＮＡを取得し、scFvをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、scFvを製造することができる。
dsFvは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。ＶＨおよびＶＬをコードするcＤＮＡは前述のハイブリドーマから取得することができる。システイン残基に置換するアミノ酸残基はReiterらにより示された方法［Protein Engineering, 7, 697 (1994)］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができ、目的のアミノ酸の置換は、部位特異的突然変異法（site-directed mutagenesis）等により行うことができる。その後、該ＤＮＡ を原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することによりdsFvを製造することができる。【００５５】
（２-７）目的とする抗体のスクリーニング
得られた抗血清または抗体が、ヒトメルトリンαを認識するものであることは、後述する実施例に示されているように、ヒトメルトリンαを使用したＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロッティングで確認することができる。
また、膜型のメルトリンαを発現する細胞の抽出液を用いたウエスタンブロッティングや発現細胞を用いたＦＡＣＳにより、抗体の膜型メルトリンαに対する反応性を確認することもできる。【００５６】
得られた抗血清または抗体のヒトメルトリンα活性を抑制する効果は、好ましくは、得られた抗体の活性は、高脂肪食摂食動物の体重増加の抑制、脂肪量の低下、エネルギー代謝の亢進、血中脂質の低下、脂肪肝の抑制等より選ばれる１以上の効果において確認することができる。
また、上記に代えて、高脂肪または高栄養負荷状態における脂肪細胞の増殖抑制、たとえば分化刺激後の脂肪細胞の中性脂肪の取り込みの抑制などを指標とした、脂肪細胞の分化成熟の抑制で確認することもできる。【００５７】
後述する実施例に示されているように、メタロプロテアーゼ阻害活性の認められるもので、かつ、脂肪細胞の分化の阻害活性が認められる抗体があるので、メタロプロテアーゼ阻害活性で一次スクリーニングを実施し、その後、体重増加抑制や、脂肪細胞の増殖分化に対する活性でスクリーニングすることも可能である。【００５８】
（２-８）抗体の精製および抗体を有効成分とする医薬組成物
上記の、ヒトメルトリンαを認識する各種抗体は、抗体の精製に通常使用される精製方法（たとえば、プロテインＡや、ヒトメルトリンαをリガンドとした抗体アフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ＨＰＬＣＮ等）を組み合わせることにより医薬品として使用しうる純度にまで精製することができる。【００５９】
本発明の予防・治療剤は、上記抗体を０.１〜１００ｍｇ含有する。また必要に応じて薬理学的に許容される、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、乳化剤、安定化剤、矯味矯臭剤、希釈剤等の補助成分を１以上含有することもできる。補助成分の具体的な例はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む予防・治療剤の項で説明したとおりである。当該抗体を含有する予防・治療剤は、好ましくは、注射剤として、皮下投与、皮内投与、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与にて使用され、もしくは、マイクロカプセルにして皮下に埋め込んで使用される。注射剤は連日投与または、１〜２週間に１回程度での間隔で投与されるが、それに限らず経口投与、経皮投与、直腸投与、経鼻投与など、患者の年齢や症状に見合った方法で間隔投与される。【００６０】
（有効成分として低分子化合物を含有する予防・治療剤）
本発明の予防・治療剤が有効成分として含有する低分子化合物は、その構造や分子量は特に限定されない。化合物ライブラリー等から、ヒトメルトリンαに結合するものを選択し、その中から、メルトリンαの活性を阻害するものをさらに選択して用いることができる。ヒトメルトリンα阻害活性は、上述した抗体のスクリーニングと同様、高脂肪食を摂餌させた動物における体重増加の抑制、脂肪量の抑制、脂肪肝の形成、血清脂質の上昇、エネルギー代謝を改善させる活性にて調べることができる。また、高脂肪または高栄養付加時の脂肪細胞の増殖の抑制や、分化刺激後の脂肪細胞へ中性脂肪の取り込みの抑制などでも調べることができる。より、効率的には、上記のうち、in vitroにおける脂肪細胞への中性脂肪の取り込みの抑制によってスクリーニングすることが好ましい。また、メルトリンαのメタロプロテアーゼ活性を阻害する物質を第一次スクリーニングで選別し、さらに、上記いずれかのスクリーニングを行って、効率的に、目的の化合物を得ることもできる。【００６１】
本発明の予防・治療剤は、選択された低分子化合物を０.１〜２０ｍｇ含有する。必要に応じて薬理学的に許容される、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、乳化剤、安定化剤、矯味矯臭剤、希釈剤等の補助成分を１以上含有していてもよい。補助成分の具体的な例はアンチセンス化合物を含む予防・治療剤の項で説明したとおりである。本発明の予防・治療薬は、皮下投与、皮内投与、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与の他、経口投与、経皮投与、直腸投与、経鼻投与などにて使用される。本発明の予防・治療薬は、１日１〜２回、連日投与することが好ましいが、患者の年齢、症状に応じて適宜、投与方法、間隔を選ぶことができる。【００６２】
（本発明の予防・治療剤の特徴）
本発明の予防・治療剤は、肥満、肥満症もしくはは肥満に起因ないし関係する疾患、または、糖尿病等の疾患を有する患者およびその危険性が予想される患者に投与される。【００６３】
予防・治療効果の現れ方は、用いられる患者の肥満の程度や合併症の有無、食生活などによって様々であり、本発明の予防・治療剤は、上述のような疾患の諸症状および検査値、画像などのうち少なくとも１つを改善することを期待して投与される医薬組成物である。しかしながら、好ましくは、以下に示すいずれか1以上の作用を示すことを特徴とする。
（１）白色脂肪細胞の蓄積を抑制する
（２）白色脂肪細胞の増殖を抑制する
（３）内臓への脂肪細胞の蓄積を抑制する
（４）血中コレステロール値を低下させる作用を有する
（５）エネルギー代謝を亢進させる作用を有する
（６）脂肪肝の形成、進行、肝障害の発症を抑制する
（７）血糖値低下作用を有する
（８）血中インスリン濃度低下作用を有する
（９）耐糖能改善作用を有する【００６４】
（５）のエネルギー代謝の亢進は、メルトリンαアンタゴニストによる抗肥満作用の重要かつ新規な作用機序の１つであり、この作用により、本発明の医薬組成物は、代謝亢進型の抗肥満剤として、糖尿病患者またはその恐れのある患者に適用できる。（４）もまた重要な特徴の１つであり、この効果により、高脂血症の患者、またはその恐れのある患者に適用できる。さらに、（３）も重要な特徴の１つであり、この効果により、脂肪肝など内臓脂肪の蓄積が認められる患者またはその恐れのある患者、特に（６）に示すように、脂肪肝や、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、それに伴う肝機能の低下が認められる患者の予防・治療に適用できる。【００６５】
（本発明の予防・治療剤の使用方法）
本発明の予防・治療剤は、肥満、肥満症もしくは肥満に起因ないし関連する疾患、または、糖尿病等の疾患の予防・治療に、単独で使用されてもよいし、他の抗肥満剤、抗糖尿病剤や、他の薬剤と併用して用いることもできる。
特に、作用機序の異なる抗肥満剤または抗糖尿病剤との組み合わせにおいて、安全かつ高い治療効果を示すことが期待され、このような作用機序の異なる抗肥満剤または抗糖尿病剤をさらに含む医薬組成物、もしくは、このような作用機序の異なる抗肥満剤または抗糖尿病剤と本発明の医薬組成物とが、単一の包装形態中に含まれる医薬組成物も、本発明の医薬組成物に含まれる。
本発明の予防・治療剤は、新たな作用機序に基づくものであり、他の抗肥満剤または抗糖尿病剤に抵抗性を示す患者に対しても、抗肥満効果または抗糖尿病効果を示すことが期待される。【００６６】
本発明の第二の態様は、ヒトメルトリンαアンチセンス化合物である。その好ましい標的の領域は、配列表の配列番号３においては塩基番号６１〜３６０または２５８１〜３０２０であり、より好ましくは塩基番号２５８１〜２６８０、２７０１〜２７６０、２７７１〜２８００、２８４９〜２９０５または２９７１〜３０２０に対応する領域である。本発明で提供するアンチセンス化合物としては、具体的には、後述の実施例として表６および表８に例示するヌクレオチド配列からなる、または該配列を含有するアンチセンス化合物が挙げられる。これらの内、抑制率（スコア）の高いものはより有用である。本発明に係る第二の態様のヒトメルトリンαアンチセンス化合物は、第一の態様の予防治療剤の有効成分として使用可能である。また、第一の態様の予防治療剤におけるアンチセンス化合物の記載は、第二の態様のアンチセンス化合物の記載として援用する。
以下にさらに詳述する。【００６７】
本発明は、メルトリンαをコードする核酸分子の機能を調節する際に使用するための、究極的には産生されるメルトリンαの量を調節する際に使用するためのものとして、オリゴマーアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドを利用する。これは、メルトリンαをコードする１またはそれ以上の核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物を提供することにより達成される。
本明細書において、用語“標的核酸”および“メルトリンαをコードする核酸”は、メルトリンαをコードするＤＮＡ、このようなＤＮＡから転写されるＲＮＡ（プレ-ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む）、およびこのようなＲＮＡに由来するｃＤＮＡも含む意味で使用される。
オリゴマー化合物のその標的核酸との特異的ハイブリダイゼーションは、核酸の正常な機能を妨害する。標的核酸の機能のそれに特異的にハイブリダイズする化合物によるこのモジュレーションは、一般的に“アンチセンス”といわれる。妨害すべきＤＮＡの機能には、複製および転写が含まれる。妨害されるべきＲＮＡの機能には、すべての生存に必要な機能、たとえばＲＮＡのタンパク質翻訳部位への転移、ＲＮＡからタンパク質への翻訳、１またはそれ以上のｍＲＮＡ種を得るためのＲＮＡのスプライシング、およびＲＮＡに含まれる触媒活性またはＲＮＡにより促進される触媒活性、が含まれる。標的核酸機能によるこのような妨害の全体的な効果は、メルトリンαの発現のモジュレーションである。本明細書において、“モジュレーション”とは、遺伝子の発現における増加（刺激）または減少（阻害）のいずれかを意味する。本明細書において、阻害は遺伝子発現のモジュレーションの好ましい形態であり、そしてｍＲＮＡは好ましい標的である。【００６８】
アンチセンスに対する特異的核酸を標的とすることが好ましい。特定の核酸に対してアンチセンス化合物を“標的化する”とは、本明細書において、複数工程のプロセスである。プロセスは通常、その機能を調節すべき核酸配列の同定からはじめる。たとえばこのことは、その発現が特定の症状または疾患状態と関連する細胞の遺伝子（あるいはその遺伝子から転写されるｍＲＮＡ）、または感染性病原体に由来する核酸分子でありうる。本発明において、標的はメルトリンαをコードする核酸分子である。標的化のプロセスにはまた、アンチセンス相互作用のためにこの遺伝子内部に１または複数の部位を決定し、所望の効果、たとえばタンパク質の発現の検出またはモジュレーションを結果として生じるようにすることを含む。本明細書において、好ましい遺伝子内部部位は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始コドンあるいは終止コドンを含む領域である。当該技術分野において既知であるように、翻訳開始コドンは、典型的には５’−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子において；対応するＤＮＡ分子においては５’−ＡＴＧ）であるので、翻訳開始コドンはまた、“ＡＵＧコドン”、“スタートコドン”または“ＡＵＧスタートコドン”とも呼ばれる。少数の遺伝子は、ＲＮＡ配列５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧまたは５’−ＣＵＧを有する翻訳開始コドンを有し、そして５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧおよび５’−ＣＵＧが、in vivoで機能することが示された。このように、それぞれの事例における開始アミノ酸は典型的にはメチオニン（真核細胞において）またはホルミルメチオニン（原核細胞において）であるにもかかわらず、用語“翻訳開始コドン”および“スタートコドン”は、多くのコドン配列を含むことができる。真核細胞の遺伝子および原核細胞の遺伝子は、２またはそれ以上の代わりのスタートコドンを有する場合があり、そのいずれもが好ましくは特定の細胞型または組織においてまたは特定の条件のセットのもとにおいて、翻訳開始のために利用することができる、ということも、当該技術分野において既知である。本明細書において、“スタートコドン”および“翻訳開始コドン”は、そのようなコドンの１またはそれ以上の配列にかかわらず、in vivoで使用して、メルトリンαをコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡ分子の翻訳を開始する、１またはそれ以上のコドンのことをいう。【００６９】
遺伝子の翻訳終止コドン（または“停止コドン”）は、３つの配列、すなわち、５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧおよび５’−ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列は、それぞれ、５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧおよび５’−ＴＧＡ）のうちの一つを有しうることも、当該技術分野において既知である。用語“スタートコドン領域”および“翻訳開始コドン領域”は、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち、５’または３’）に約２５から約５０の連続するヌクレオチドを含む、ｍＲＮＡあるいは遺伝子の部分のことを言う。同様に、用語“停止コドン領域”および“翻訳終止コドン領域”は、翻訳終止コドンからいずれかの方向（すなわち、５’または３’）に約２５から約５０の連続するヌクレオチドを含む、ｍＲＮＡまたは遺伝子の部分のことを言う。【００７０】
翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとのあいだの領域のことを言うと当該技術分野において知られているオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または“コード領域”はまた、効果的に標的化されうる領域でもある。その他の標的領域には、翻訳開始コドンから５’方向におけるｍＲＮＡの部分、そしてしたがってｍＲＮＡの５’キャップ部位と翻訳開始コドンとのあいだのヌクレオチドまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドを含むもの、のことをいうと当該技術分野において知られている５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、そして翻訳終止コドンから３’方向におけるｍＲＮＡの部分、そしてしたがってｍＲＮＡの翻訳終止コドンと３’末端とのあいだのヌクレオチドまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドを含むもの、のことをいうと当該技術分野において知られている３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、が含まれる。ｍＲＮＡの５’キャップには５’−５’三リン酸結合を介して、ｍＲＮＡの最も５’側の残基と結合するＮ７−メチル化グアノシン残基を含む。ｍＲＮＡの５’キャップ領域は、５’キャップ構造それ自体だけでなく、キャップに隣接する最初の５０ヌクレオチドも含むと考えられている。５’キャップ領域もまた、好ましい標的領域でありうる。【００７１】
いくつかの真核細胞ｍＲＮＡ転写物は直接的に翻訳されるが、多くは１またはそれ以上の“イントロン”として知られる領域を含有し、それらは翻訳される前に転写物から切り出される。残りの（そしてしたがって翻訳される）領域は、“エクソン”として知られ、そして一緒にスプライシングされて連続的なｍＲＮＡ配列を形成する。ｍＲＮＡスプライス部位、すなわち、イントロン−エクソン結合もまた、好ましい標的領域である場合があり、そして特に異常なスプライシングが疾患に関与しているか、あるいは特定のｍＲＮＡスプライス産物の過剰産生が疾患に関与している状況において、特に有用である。再構成または欠損による異常な融合結合もまた、好ましい標的である。イントロンも有効である場合があり、そしてしたがって、たとえばＤＮＡまたはプレ-ｍＲＮＡを標的とするアンチセンス化合物のための標的領域が好ましい場合があることもまた、見出した。【００７２】
いったん１またはそれ以上の標的部位を同定したら、標的に対して十分に相補的な、すなわち、十分によくそして十分に特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドを選択し、所望の効果を得る。【００７３】
本明細書において、“ハイブリダイゼーション”とは、相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間のワトソン−クリック水素結合、フーグスティーン水素結合または逆フーグスティーン水素結合でありうる、水素結合を意味する。たとえばアデニンおよびチミンは相補的な核塩基であり、水素結合を形成することを通じて対合する。本明細書において、“相補的”とは、２つのヌクレオチド間で正確に対合するための能力のことをいう。たとえばオリゴヌクレオチドの特定の位置のヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡ分子の同一の位置でヌクレオチドと水素結合することができる場合、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡは、その位置において互いに相補的であると考えられる。オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡは、それぞれの分子中での十分な数の対応する位置が、互いに水素結合することができるヌクレオチドにより占められている場合、互いに相補的である。したがって、“特異的にハイブリダイズ可能”および“相補的”は、安定でそして特異的な結合がオリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡ標的とのあいだで生じるような、十分な程度の相補性または正確な対合を示すために使用される用語である。アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸の配列と１００％の相補性または相同性がある必要はないことは、当該技術分野において理解されている。アンチセンス化合物は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子に対する化合物の結合が標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能を妨害して利用できないようにし、そして特異的な結合が所望される条件下、すなわち、in vivoアッセイまたは治療の場合には生理学的条件下、そしてin vitroアッセイの場合には、アッセイを行う条件下にて、非−標的配列に対するアンチセンス化合物の非−特異的結合を妨害するための十分な程度の相補性が存在する場合、特異的にハイブリダイズ可能である。【００７４】
アンチセンス化合物は、一般的に、研究用試薬および診断薬として使用される。たとえば当業者はしばしば、正確な特異性により遺伝子発現を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、特定遺伝子の機能を解明する。たとえばアンチセンス化合物を使用して、生物学的経路の様々なメンバーの機能どうしを区別することもある。【００７５】
アンチセンス調節ならびにアンチセンスの特異性および感受性は、治療用途として利用することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、動物およびヒトにおける疾患状態を治療する際の治療部分として使用される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトに対して安全にそして効果的に投与され、そして多くの臨床試験が現在進行中である。したがって、オリゴヌクレオチドは、細胞、組織および動物、特にヒトの治療のための治療計画において有用なものとして形成することができ、有用な治療様式でありうることを確立することができる。本明細書において、用語“オリゴヌクレオチド”とは、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマーまたはポリマー、またはそれらの擬似体のことをいう。この用語には、天然に存在する核塩基、糖および共有ヌクレオシド間（骨格）結合、および同様に機能する非−天然に存在する部分を有するオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが含まれる。このような修飾されたまたは置換されたオリゴヌクレオチドは、たとえば細胞取り込みの亢進、核酸標的に対する親和性の亢進、そしてヌクレアーゼの存在下における安定性の増加などの望ましい特性のため、しばしば天然の型より好ましい。【００７６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンス化合物の好ましい形態である一方、本発明は、以下に記載するようなオリゴヌクレオチド擬似体（しかし、これらのものには限定されない）を含む、その他のオリゴマーアンチセンス化合物を包含する。本発明に従うアンチセンス化合物は、好ましくは、１０〜４０核塩基（すなわち、１０〜４０の連結したヌクレオシド）を含む。具体的な好ましいアンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜３０核塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。当該技術分野において知られているように、ヌクレオシドは塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常はヘテロ環式塩基である。ヘテロ環式塩基の最も一般的な２種は、プリンとピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むそれらのヌクレオシドに対して、リン酸基は、糖の２'、３'または５'ヒドロキシル部分のいずれかに結合することができる。オリゴヌクレオチドを形成する際に、リン酸基が隣接するヌクレオシドと互いに共有結合し、直鎖ポリマー化合物を形成する。引き続いて、この直鎖ポリマー化合物のそれぞれの末端がさらに一緒になって、環状構造を形成することができるが、しかしながら、開環直鎖構造が一般的には好ましい。オリゴヌクレオチド構造中において、リン酸基とは、一般的には、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成するものと言われる。ＲＮＡおよびＤＮＡの正常な結合または骨格は、３'から５'のホスホジエステル結合である。【００７７】
本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物の具体的な例には、修飾骨格または非−天然ヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書中で定義する場合、修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドには、骨格中にリン原子を保有するものや、骨格中にリン原子を有さないものが含まれる。本明細書において、そのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドであるといえる。【００７８】
好ましい修飾オリゴヌクレオチド骨格には、たとえばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3'-アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよびその他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、3'-アミノホスホールアミデートおよびアミノアルキルホスホールアミデートを含むホスホールアミデート、チオノホスホールアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および正常な3'-5'結合を有するボラノホスホネート、2'-5'結合したこれらの類似体、そしてヌクレオシドユニットの隣接する塩基対が、5’-3'に対して3'-5'または5’-2'に対して2'-5'に結合する、逆向きの極性を有するもの、が含まれる。様々な塩、混合塩、そして遊離酸型も含まれる。【００７９】
上述したリン含有結合の調製を教示する代表例としては、米国特許：３,６８７,８０８；４,４６９,８６３；４,４７６,３０１；５,０２３,２４３；５,１７７,１９６；５,１８８,８９７；５,２６４,４２３；５,２７６,０１９；５,２７８,３０２；５,２８６,７１７；５,３２１,１３１；５,３９９,６７６；５,４０５,９３９；５,４５３,４９６；５,４５５,２３３；５,４６６,６７７；５,４７６,９２５；５,５１９,１２６；５,５３６,８２１；５,５４１,３０６；５,５５０,１１１；５,５６３,２５３；５,５７１,７９９；５,５８７,３６１；および５,６２５,０５０が挙げられるが、これらには限定されない。またこれらに特定される記載は、それを引用して本明細書中にも記載されるものとする。【００８０】
リン原子を含まない好ましい修飾オリゴヌクレオチド骨格としては、短鎖アルキルあるいはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合へテロ原子そしてアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１またはそれ以上の短鎖へテロ原子またはヘテロ環式ヌクレオシド間結合により形成される骨格を挙げることができる。たとえばモルホリノ結合（部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；および混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成要素部分を有するその他のものなどが挙げることができる。【００８１】
上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表例としては、米国特許：５,０３４,５０６；５,１６６,３１５；５,１８５,４４４；５,２１４,１３４；５,２１６,１４１；５,２３５,０３３；５,２６４,５６２；５,２６４,５６４；５,４０５,９３８；５,４３４,２５７；５,４６６,６７７；５,４７０,９６７；５,４８９,６７７；５,５４１,３０７；５,５６１,２２５；５,５９６,０８６；５,６０２,２４０；５,６１０,２８９；５,６０２,２４０；５,６０８,０４６；５,６１０,２８９；５,６１８,７０４；５,６２３,０７０；５,６６３,３１２；５,６３３,３６０；５,６７７,４３７；および５,６７７,４３９が挙げられるが、これらには限定されない。またこれらに特定される記載は、それを引用して本明細書中にも記載されるものとする。【００８２】
その他の好ましいオリゴヌクレオチド擬似体において、ヌクレオチドユニットの糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち、骨格を、新規の基により置換する。塩基ユニットは、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されるようなオリゴマー化合物であるオリゴヌクレオチド擬似体の一つに、ペプチド核酸（ＰＮＡ）がある。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖−骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格により置換される。核塩基を保持し、そして骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表例として、米国特許：５,５３９,０８２；５,７１４,３３１；および５,７１９,２６２が挙げられるが、これらには限定されない。またこれらに特定される記載は、それを引用して本明細書中にも記載されるものとする。ＰＮＡ化合物は、ニールセン（Nielsen）ら（Science，1991，254，1497-1500）も教示している。【００８３】
本発明の好ましい態様は、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシドであり、特に前述の米国特許５,４８９,６７７の−ＣＨ２-ＮＨ-Ｏ-ＣＨ２−、−ＣＨ２-Ｎ（ＣＨ３）-Ｏ-ＣＨ２−〔メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格〕、−ＣＨ２-Ｏ-Ｎ（ＣＨ３）-ＣＨ２−、−ＣＨ２-Ｎ（ＣＨ３）-Ｎ（ＣＨ３）-ＣＨ２−および−Ｏ-Ｎ（ＣＨ３）-ＣＨ２-ＣＨ２−〔なお、天然のホスホジエステル骨格は−Ｏ-Ｐ-Ｏ-ＣＨ２−として示される〕そして前述の米国特許５,６０２,２４０のアミド骨格である。前述の米国特許５,０３４,５０６のモルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドもまた好ましい。【００８４】
修飾オリゴヌクレオチドは、１またはそれ以上の置換糖部分も含有する。好ましいオリゴヌクレオチドは、２'位で以下のものの一つを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、ここでアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルでありうる。Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２、ここでｎおよびｍは１から約１０である、が特に好ましい。その他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２'位に以下のものの一つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０の低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、リポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を向上するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬理特性を向上するための基、そして同様の特性を有するその他の置換基を含む。好ましい修飾には、2'-メトキシエトキシ（2'-Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、2'-Ｏ-（2-メトキシエチル）または2'-ＭＯＥとしても知られる）（Martin et al.，Helv.Chim.Acta，1995，78，486−504）、すなわち、アルコキシアルコキシ基が含まれる。さらに好ましい修飾には、2'-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、本明細書の以下の実施例に記載する場合、2'-ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、そして2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野において2'-Ｏ-ジメチルアミノエトキシエチルまたは2'-ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、本明細書中の以下の実施例において2'-Ｏ-ＣＨ２-Ｏ-ＣＨ２-Ｎ（ＣＨ２）２とも記載される、が含まれる。【００８５】
その他の好ましい修飾には、2'-メトキシ（2'-Ｏ-ＣＨ３）、2'-アミノプロポキシ（2'-ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および2'-フルオロ（2'-Ｆ）が含まれる。同様の修飾もまた、オリゴヌクレオチドのその他の位、特に３'末端ヌクレオチドまたは２'−５'結合オリゴヌクレオチド中の糖の３'位および５'末端ヌクレオチドの５'位において作製することもできる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖擬似体を有する場合もある。このような修飾糖構造の調製を教示する代表例として米国特許：４,９８１,９５７；５,１１８,８００；５,３１９,０８０；５,３５９,０４４；５,３９３,８７８；５,４４６,１３７；５,４６６,７８６；５,５１４,７８５；５,５１９,１３４；５,５６７,８１１；５,５７６,４２７；５,５９１,７２２；５,５９７,９０９；５,６１０,３００；５,６２７,０５３；５,６３９,８７３；５,６４６,２６５；５,６５８,８７３；５,６７０,６３３；および５,７００,９２０が挙げられるが、これらには限定されない。またこれらに特定される記載は、それを引用して本明細書中にも記載されるものとする。【００８６】
オリゴヌクレオチドには、核塩基（しばしば当該技術分野において単に“塩基”としても呼ばれる）修飾または置換を含むことができる。本明細書において、“非修飾”または“天然”核塩基としては、プリン塩基、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、そしてピリミジン塩基、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾核塩基としては、その他の合成および天然核塩基、たとえば5-メチルシトシン（5-me-Ｃ）、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよびその他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよびその他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾのウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル（シュードウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよびその他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよびその他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニンおよび3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンが挙げられる。さらに、核塩基としては、米国特許３,６８７,８０８に開示されたもの、Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering，８５８−８５９、Kroschwitz，J.Ｉ.，ed. John Wiley ＆ Sons，1990に開示されたもの、Englisch et al.， Angewandte Chemie，International Edition，1991，30，613に開示されたもの、そしてSanghvi，Y．S.，Chapter 15，Antisense Research and Applications，289-302，Crooke，S．T．and Lebleu，B.，ed．，CRC Press，1993により開示されたものが挙げられる。これらの核塩基の特定のものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるために特に有用である。これらには、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンを含む、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンおよびＮ-2、Ｎ-6およびＯ-6置換プリンが含まれる。5-メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０.６〜１.２℃増加させることが示され（Sanghvi，Y.S.， Crooke，S.T. and Lebleu，B.，eds.，Antisense Research and Applications，CRC Press，Boca Raton，1993，276-278）、そして現在は好ましい塩基置換であり、2'-Ｏ-メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合にさらにより特に好ましい。【００８７】
上述した修飾核塩基の特定のものおよびその他の修飾核塩基の調製を教示する代表例として、前記米国特許３,６８７,８０８、および米国特許：４,８４５,２０５；５,１３０,３０２；５,１３４,０６６；５,１７５,２７３；５,３６７,０６６；５,４３２,２７２；５,４５７,１８７；５,４５９,２５５；５,４８４,９０８；５,５０２,１７７；５,５２５,７１１；５,５５２,５４０；５,５８７,４６９；５,５９４,１２１；５,５９６,０９１；５,６１４,６１７；５,６８１,９４１および米国特許５,７５０,６９２が挙げられるが、これらには限定されない。またこれらに特定される記載は、それを引用して本明細書中にも記載されるものとする。【００８８】
本発明のオリゴヌクレオチドのその他の修飾には、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを向上する、化学的にオリゴヌクレオチドに結合する１またはそれ以上の部分または複合体が含まれる。そのような部分としては、脂質部分たとえばコレステロール部分（Letsinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86，6553-6556）、コール酸（Manoharan et al.，Bioorg. Med. Chem.Let.，1994，4，1053-1060）、チオエーテルたとえばヘキシル-Ｓ-トリチルチオール（Manoharan et al.，Ann. N. Y. Acad.Sci.，1992，660，306-309；Manoharan et al.，Bioorg.Med. Chem.Let.，1993，3，2765-2770）、チオコレステロール（Oberhauser et al.，Nucl.Acids Res.，1992，20，533-538）、脂肪族鎖たとえばドデカンジオールまたはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al.，EMBO J.，1991，10，1111-1118；Kabanov et al.，FEBS Lett.，1990，259，327-330；Svinarchuk et al.，Biochimie，1993，75，49-54）、リン脂質たとえばジ−ヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-Ｏ-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-Ｈ−ホスホネート（Manoharan et al.，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-654；Shea et al.，Nucl.Acids Res.，1990，18，3777-3783）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al.，Nucleosides ＆ Nucleoside，1995，14，969-973）、またはアダマンタン酢酸（Manoharan et al.，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654）、パルミチル部分（Mishra et al.，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264，229-237）またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Crooke et al.，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277，923-37）が挙げられるが、これらには限定されない。【００８９】
このようなオリゴヌクレオチド複合体の調製を教示する代表例としては、米国特許：４,８２８,９７９；４,９４８,８８２；５,２１８,１０５；５,５２５,４６５；５,５４１,３１３；５,５４５,７３０；５,５５２,５３８；５,５７８,７１７, ５,５８０,７３１；５,５８０,７３１；５,５９１,５８４；５,１０９,１２４；５,１１８,８０２；５,１３８,０４５；５,４１４,０７７；５,４８６,６０３；５,５１２,４３９；５,５７８,７１８；５,６０８,０４６；４,５８７,０４４；４,６０５,７３５；４,６６７,０２５；４,７６２,７７９；４,７８９,７３７；４,８２４,９４１；４,８３５,２６３；４,８７６,３３５；４,９０４,５８２；４,９５８,０１３；５,０８２,８３０；５,１１２,９６３；５,２１４,１３６；５,０８２,８３０；５,１１２,９６３；５,２１４,１３６；５,２４５,０２２；５,２５４,４６９；５,２５８,５０６；５,２６２,５３６；５,２７２,２５０；５,２９２,８７３；５,３１７,０９８；５,３７１,２４１, ５,３９１,７２３；５,４１６,２０３, ５,４５１,４６３；５,５１０,４７５；５,５１２,６６７；５,５１４,７８５；５,５６５,５５２；５,５６７,８１０；５,５７４,１４２；５,５８５,４８１；５,５８７,３７１；５,５９５,７２６；５,５９７,６９６；５,５９９,９２３；５,５９９,９２８および５,６８８,９４１が挙げられるが、これらには限定されない。またこれらに特定される記載は、それを引用して本明細書中にも記載されるものとする。【００９０】
所定の化合物中のすべての位置を均一に修飾されることが必要とはされず、そして実際に、一つ以上の上述した修飾を、単一の化合物中あるいはオリゴヌクレオチド中の単一のヌクレオシドにおいても組み込むことができる。本発明には、キメラ化合物であるアンチセンス化合物も含まれる。本明細書において、“キメラ”アンチセンス化合物または“キメラ”は、２つまたはそれ以上の化学的に特徴的な領域を含有するアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドであり、それぞれが少なくとも一つのモノマーユニット、すなわち、オリゴヌクレオチド化合物の場合にヌクレオチドから形成される。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には少なくとも一つの領域を含有し、ここでオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに対して、増加したヌクレアーゼ分解耐性、増加した細胞取り込みおよび／または標的核酸に対する増加した結合親和性を付与するように、修飾される。オリゴヌクレオチドの追加の領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素に対する基質として働くことができる。例を挙げると、ＲＮaseＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する、細胞性のエンドヌクレアーゼである。ＲＮaseＨの活性化により、したがって、結果としてＲＮＡ標的の切断を引き起こし、それにより遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を非常に向上させる。結果として、キメラオリゴヌクレオチドを使用する場合に、同一の標的領域に対してハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドの場合と比較して、しばしばより短いオリゴヌクレオチドにより匹敵する結果を得ることができる。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動により、そして必要な場合には当該技術分野において既知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技術により、日常的に検出することができる。【００９１】
本発明のキメラアンチセンス化合物は、２つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／または上述したオリゴヌクレオチド擬似体の混成の構造として形成することができる。このような化合物は、当該技術分野においてハイブリッドまたはギャップマーとも呼ばれている。このようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許には、Ｕ.Ｓ.：５,０１３,８３０；５,１４９,７９７；５,２２０,００７；５,２５６,７７５；５,３６６,８７８；５,４０３,７１１；５,４９１,１３３；５,５６５,３５０；５,６２３,０６５；５,６５２,３５５；５,６５２,３５６；および５,７００,９２２が含まれるが、これらには限定されず、それらの特定のものは、本出願により一般に所有されるものであり、そしてそのそれぞれは全体として参考文献として本明細書中に援用される。【００９２】
本発明に従って使用されるアンチセンス化合物は、周知の固相合成技術を介して、容易にそして日常的に作製することができる。このような合成のための装置は、たとえばApplied Biosystems（Foster City，ＣＡ）を含むいくつかの供給者により販売されている。このような合成のための当該技術分野において既知のいずれかその他の手段を、追加的にまたは代替的に使用することができる。同様な技術を使用してホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製することは周知である。【００９３】
本発明の化合物を、取り込み、分布および／または吸収を助けるために、たとえばリポソーム、受容体標的化分子、経口、直腸、局所またはその他の製剤として、混合し、カプセル化し、複合体化することができ、またはそうでなければ、その他の分子、分子構造、または化合物の混合物と結合させてもよい。そのような取り込み、分布および／または吸収を助ける製剤の調製を教示する代表例としては、米国特許：５,１０８,９２１；５,３５４,８４４；５,４１６,０１６；５,４５９,１２７；５,５２１,２９１；５,５４３,１５８；５,５４７,９３２；５,５８３,０２０；５,５９１,７２１；４,４２６,３３０；４,５３４,８９９；５,０１３,５５６；５,１０８,９２１；５,２１３,８０４；５,２２７,１７０；５,２６４,２２１；５,３５６,６３３；５,３９５,６１９；５,４１６,０１６；５,４１７,９７８；５,４６２,８５４；５,４６９,８５４；５,５１２,２９５；５,５２７,５２８；５,５３４,２５９；５,５４３,１５２；５,５５６,９４８；５,５８０,５７５；および５,５９５,７５６が挙げられるが、これらには限定されない。またこれらに特定される記載は、それを引用して本明細書中にも記載されるものとする。【００９４】
本発明のアンチセンス化合物は、いずれかの医薬的に許容可能な塩、エステル、またはそのようなエステルの塩、またはヒトを含む動物に投与する際にその生物学的に活性な代謝物または残留物を（直接的にまたは間接的に）提供することができるいずれか他の化合物を包含する。したがって、たとえば開示から、プロドラッグおよび医薬的に許容可能な本発明の化合物の塩、そのプロドラッグの医薬的に許容可能な塩、およびその他の生物学的等価物も導き出される。【００９５】
用語“プロドラッグ”は、内在性の酵素またはその他の化学物質および／または条件の作用により、その体内または細胞内で活性化型（すなわち、薬物）に変換される、不活性型で調製される治療剤のことを示す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグ版は、GosselinらのＷＯ ９３／２４５１０（１９９３年１２月９日に発行）またはImbachらのＷＯ ９４／２６７６４に開示された方法に従うＳＡＴＥ［（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）ホスフェート］誘導体として調製される。【００９６】
用語“医薬的に許容可能な塩”とは、生理学的または医薬的に許容可能な本発明の化合物の塩：すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、そしてそれについての所望しない毒性効果を与えない塩のことをいう。【００９７】
医薬的に許容可能な塩基付加塩は、金属またはアミン、たとえばアルカリおよびアルカリ土類金属または有機アミンなどにより形成される。カチオンとして使用される金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどである。適したアミンの例は、Ｎ,Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、およびプロカイン（たとえばBerge et al.，“Pharmaceutical Salts，”J.of Pharma Sci.，1977，66，1-19を参照）である。前記酸性化合物の塩基付加塩は、遊離酸型を十分な量の所望の塩基と接触させて、共有結合様式で塩を生成することにより、調製する。遊離酸型は、塩型を酸と接触させることにより、そして遊離酸を従来の様式で単離することにより、再生することができる。遊離酸型は、そのそれぞれの塩型とは、極性溶媒中への溶解性などの特定の生理学的特性においていくらか異なっているが、しかしそれ以外は、本発明の目的のためには、塩はそれらそれぞれの遊離酸と等価である。本明細書中で使用される場合、“医薬的な付加塩”には、本発明の組成物の構成要素の一つの酸型の医薬的に許容可能な塩が含まれる。これらには、アミンの有機酸塩または無機酸塩が含まれる。好ましい酸塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩およびリン酸塩である。その他の適した医薬的に許容可能な塩は、当業者に周知であり、そして様々な無機酸および有機酸の塩基性塩が含まれ、たとえば無機酸を有するものとしては、たとえば塩酸、臭化水素酸、硫酸またはリン酸など；有機酸を有するものとしてはカルボン酸、スルホン酸、スルホ酸またはリン酸またはＮ−置換スルファミン酸、たとえば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、サリチル酸、4-アミノサリチル酸、2-フェノキシ安息香酸、2-アセトキシ安息香酸、エンボン酸（embonic acid）、ニコチン酸またはイソニコチン酸；そしてアミノ酸を有するものとしては、本来はタンパク質の合成に関連する２０個のα−アミノ酸、たとえばグルタミン酸、またはアスパラギン酸など、そしてまた、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン-1,2-ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、4-メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、ナフタレン-1,5-ジスルホン酸、2-または3-ホスホグリセリン酸、グルコース-6-ホスフェート、Ｎ-シクロヘキシルスルファミン酸（シクラメートの形成を伴う）を有するもの、またはその他の酸有機化合物、たとえばアスコルビン酸などを有するものが含まれる。化合物の医薬的に許容可能な塩もまた、医薬的に許容可能なカチオンにより調製することができる。適した医薬的に許容可能なカチオンは、当業者に周知であり、そしてアルカリ、アルカリ土類、アンモニウムおよび第四アンモニウムカチオンが含まれる。炭酸塩または炭酸水素塩もまた可能である。【００９８】
オリゴヌクレオチドについて、医薬的に許容可能な塩の好ましい例には、（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、スペルミンおよびスペルミジンなどのポリアミンなどのカチオンにより形成される塩；（ｂ）無機酸、たとえば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などにより形成される酸付加塩；（ｃ）有機酸、たとえば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などにより形成される塩；そして（ｄ）塩素、臭素、およびヨウ素などの元素アニオンから形成される塩；が含まれるが、これらには限定されない。【００９９】
本発明は、メルトリンαアンチセンス化合物を用いることを特徴とする肥満、肥満症または肥満に起因ないし関連する疾患の予防・治療方法をも提供する。本発明の予防・治療方法で用いるメルトリンαアンチセンス化合物は、本発明の第一および第二の態様で述べたとおりである。本発明の予防・治療方法は、好ましくは、メルトリンαの発現を抑制できるアンチセンス化合物を用いる方法であり、さらに好ましくは、メルトリンαに対するアンチセンス化合物、siＲＮＡを用いる方法である。
本発明の予防・治療方法は、肥満、肥満症または肥満に起因ないし関連する疾患と診断された患者またはその可能性があると医療従事者により認められた患者に対して施される。本発明の予防・治療法は、ＢＭＩ値、血糖値、血中脂質、血中コレステロール値などが正常の範囲を超えている患者、ＣＴやエコーなどの画像診断、生検等で、脂肪の蓄積や病変が認められた患者に施されるが、これらの値が正常値の範囲であっても、他の検査値や食生活などの生活習慣とから総合的に判断して、必要があると認められた患者に対して施すことができる。本発明の予防・治療方法は、具体的には、本発明第一の態様で説明した医薬組成物を、患者の年齢や性別、体重や、症状に応じた投与方法や投与量、投与間隔で投与する。たとえば１日１回〜数回、２〜１５週間連日投与、もしくは１〜４週間に１回有効量を投与することができる。本発明の予防・治療方法は、必要があれば、食事療法、運動療法、もしくは他の薬剤と組み合わせることが可能である。【０１００】
本発明の第三の態様は、ヒトメルトリンαを認識する抗体であって、エネルギー代謝の亢進脂肪前駆細胞の増殖の阻害、脂肪細胞の分化の阻害、ヒトメルトリンαメタロプロテアーゼ活性の阻害より選ばれるいずれか１つ以上の活性を有する抗体もしくはその活性断片またはそれらの誘導体である。当該抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、また、キメラ抗体、ヒト型抗体、ヒト抗体のいずれであってもよい。本発明の抗体もしくはその活性断片またはそれらの誘導体は、本発明第一の態様の（メルトリンαに対する抗体）の項で説明した手法で作成およびスクリーニングすることができる。
本発明の抗体は上述のいずれか１つ以上の活性を有しているが、その阻害の程度は必ずしも１００％である必要はないが、このましくはいずれか１以上の活性を３０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上阻害する抗体である。【０１０１】
ところで、後述するメルトリンαのメタロプロテアーゼ活性を阻害する抗体の実施例で示すように、メルトリンαの脂肪細胞の分化活性の阻害には、メタロプロテアーゼ阻害が部分的に連動しているか、メタロプロテアーゼ活性部位近傍の構造が関与するものとと予想される。また、メルトリンαに限らず、プロテアーゼ活性を有する蛋白質は、生体内の不活性な生理活性物質を切断することによって活性化すること、その逆に活性型の生理活性物質を不活性化することが知られている。したがって、メタロプロテアーゼ阻害活性を有する抗体は、さらに多彩な生理効果を示すことが期待される。したがって、本発明の抗体は、より好ましくは、上述した活性のうち、少なくともメタロプロテアーゼ阻害活性を有する抗体である。メルトリンαのメタロプロテアーゼ活性を阻害する活性は、例えば、後述の実施例で示したように、メルトリンαによるＩＧＦ-ＢＰ３切断を阻害する活性として確認することができる。【０１０２】
本発明は、メルトリンαアンタゴニストを用いることを特徴とする肥満または肥満に関与する疾患の予防・治療方法をも提供する。
本発明の予防・治療方法で用いるメルトリンαアンタゴニストは、メルトリンの発現を抑制するものであっても、メルトリンの活性を抑制するものであってもよく、それぞれの詳細は、本発明第一の態様で述べたとおりである。本発明の予防・治療方法は、好ましくは、メルトリンαの発現を抑制できるアンタゴニストを用いる方法であり、さらに好ましくは、アンタゴニストとして、メルトリンαに対するアンチセンス、siＲＮＡ、メルトリンαを認識する抗体を用いる方法である。
本発明の予防・治療方法は、肥満または肥満が関与する疾患と診断された患者またはその可能性があると医療従事者により認められた患者に対して施される。本発明の予防・治療法は、ＢＭＩ値、血糖値、血中脂質、血中コレステロール値などが正常の範囲を超えている患者、ＣＴやエコーなどの画像診断、生検等で、脂肪の蓄積や病変が認められた患者に施されるが、これらの値が正常値の範囲であっても、他の検査値や食生活などの生活習慣とから総合的に判断して、必要があると認められた患者に対して施すことができる。本発明の予防・治療方法は、具体的には、本発明第一の態様で説明した医薬組成物を、患者の年齢や性別、体重や、症状に応じた投与方法や投与量、投与間隔で投与する。例えば、１日１回〜数回、２〜１５週間連日投与、もしくは１〜４週間に１回有効量を投与することができる。
本発明の予防・治療方法は、必要があれば、食事療法、運動療法、もしくは他の薬剤と組み合わせることが可能である。
【実施例】
【０１０３】
以下、実施例をもって、本発明を説明するが、これらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）ＫＯマウスを用いたメルトリンα抗肥満作用の検討
メルトリンαの抗肥満作用を確認するため、メルトリンα遺伝子をノックアウトしたマウス（以下ＫＯマウスと記載する場合がある）と野生型のマウス（以下ＷＴマウスと記載する場合がある）に高脂肪食を摂餌し、その体重変化を経時的に測定した。また、高脂肪食を摂餌後マウスの解剖を行い、各組織の重量測定及び病理解析を行った。
使用したメルトリンαＫＯマウスは栗崎ら（Mol.Cell.Biol.23：55-61；2003）が作製し、１２時間明暗サイクル下で温度調節された飼育設備で繁殖飼育した個体を使用した。また、野生型はＫＯマウスと同種のC57BL／6J（雄６週齢，日本クレア）を使用した。高脂肪食は脂肪を６０％含む餌をオリエンタル酵母（株）で調製した。またコントロールとして脂肪を１０％含む餌（以下低脂肪食と記載する場合がある）を用いた。【０１０４】
まず、４週齢の雄マウスをそれぞれ高脂肪食摂餌群、低脂肪食摂餌群に分け毎週体重測定を行った。また、摂餌量を定期的に測定した。その結果、図１に示すように低脂肪食摂餌群ではメルトリンαＫＯマウス、ＷＴマウスともに平均的な体重増加を示した。一方、高脂肪食を摂餌したＷＴマウスでは低脂肪食群に比較して約２倍の体重増加が認められたのに対してメルトリンαＫＯマウスでは体重増加が有意に抑制され、メルトリンαの発現抑制が抗肥満作用を有していることが明らかになった。【０１０５】
また、摂餌量には差が認められなかったことから、メルトリンαＫＯマウスの抗肥満作用が摂餌量の低下に由来することは否定された。高脂肪食摂餌１５週後のマウスを解剖し各臓器の重量を測定した。図２に示すように褐色脂肪細胞を含む組織及び肝臓では低脂肪食群、高脂肪食群共に重量に大きな差は認められなかったが、メルトリンαＫＯマウスの高脂肪食群では鼠径部脂肪組織、精巣上皮脂肪組織において白色脂肪（ＷＡＴ）の有意な減少が観察され、メルトリンαの抑制が脂肪組織重量の減少に効果があることが明らかになった。【０１０６】
さらに、肝臓の組織所見では図３に示すようにＷＴマウスでは脂肪肝が形成されたのに対してメルトリンαＫＯマウスでは脂肪肝が形成されていないことが明らかになり、メルトリンαの抑制が脂肪肝形成の抑制作用も有することが示された。【０１０７】
次に脂肪組織の重量の減少が脂肪細胞の大きさの差に由来するのか、脂肪細胞数の差に由来するのかを検討した。すなわち、脂肪組織を４％パラホルムアルデヒド溶液で固定化し、エタノールで脱水後パラフィンに浸し４μｍの薄さで切片を作製した。脱パラフィン後ヘマトキシリンとエオシンで染色し、Picardら（Cell  111：931-41；2002）の方法に従って単位面積当たりの脂肪細胞数を測定し、組織中の細胞数をメルトリンαＫＯマウスとＷＴマウスで比較した。図４に示すようにＷＴマウスの脂肪細胞数を１００％とした場合、低脂肪食群では両者に差が認められなかったが、高脂肪食群ではメルトリンαＫＯマウスでＷＴマウスに比べ有意に脂肪細胞数の減少が認められた。また、両者の脂肪細胞の大きさには差が認められないことから、メルトリンαの発現抑制は脂肪細胞の増加抑制を伴って抗肥満作用を示すことが初めて明らかになった。【０１０８】
（実施例２）メルトリンαＫＯマウスの高脂肪食接餌後の脂質、糖代謝の亢進
メルトリンαＫＯマウスの高脂肪食摂餌後の脂質及び糖のエネルギー代謝を解析するため、１４ＣでＲＩ標識したパルミチン酸またはグルコースをマウス尾静脈より投与し、放射活性の各臓器、尿、糞及び呼気中ＣＯ２への移行量を測定した。すなわち、メルトリンαＫＯマウス（雄6週齢）及びＷＴマウスC57BL／6J（雄6週齢）に６０％脂肪を含む高脂肪食（オリエンタル酵母）を７〜１０週間摂餌した。摂餌終了後採血を行い、マウスをマウス用代謝試験装置メタボリカ（杉山元医理器）に移した。マウスの尾静脈より[Ｕ-１４Ｃ]パルミチン酸（第一化学薬品）又はＤ-[Ｕ-１４Ｃ]グルコース（アマシャムバイオサイエンス）を１.８５ＭＢｑ／ｋｇで投与した。投与後マウスをメタボリカで飼育し、尿及び糞は２４時間後に全量回収し、排出されたＲＩ量を測定した。また、呼気中のＣＯ２へのＲＩ移行量は呼気を２０％モノエタノールアミン水溶液に吸収させることにより回収した。投与後継時的にモノエタノールアミン水溶液１ｍＬを回収し、ＲＩを測定した。【０１０９】
ＲＩの測定は以下のように行った。尿は５０μＬをソルエン-350（Packard）と混合し、ハイオニックフロー（Packard）と混合後シンチレーションカウンター（LS6000TA、Beckman）を用いて測定した。また、糞は１０ｍｇを水化後、ソルエン-350を添加し５０℃で２時間処理し、イソプロピルアルコールを添加しさらに５０℃で２時間処理後過酸化水素水を添加、ハイオニックフローを添加して同様に測定した。呼気中ＲＩ量はサンプリングしたモノエタノールアミン水溶液をハイオニックフローと混合し測定した。その結果、図５-１ならびに図５-２に示すようにパルミチン酸投与、グルコース投与においても呼気中へのＲＩの排出量はＫＯマウスで上昇し、メルトリンαＫＯマウスでの糖脂質代謝の亢進が確認された。さらに、図６-１ならびに図６-２に示すようにパルミチン酸投与では糞中へのＲＩ移行量がＷＴマウスに比較して高く、グルコース投与では尿中で高いことから、メルトリンαＫＯマウスでは速やかに代謝・排泄されているものと推定された。【０１１０】
（実施例３）メルトリンαＫＯマウスの高脂肪食摂餌後の血中脂質濃度
実施例２に記載のメルトリンαＫＯマウス及びＷＴマウスの空腹時における高脂肪食摂餌後の血中トリグリセド（ＴＧ）、コレステロール（ＴＣ）、遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）及びレプチン（leptin）を測定した。ＴＧ、ＴＣ及びＮＥＦＡは和光純薬（株）の試薬を使用し、COBAS  MIRA  PLUS（ロッシュ）を用いて測定した。また、レプチンはマウスレプチンキット（モリナガ）を使用して測定した。表１に、メルトリンαＫＯマウス及びＷＴマウスの平均値を示す。結果が示すように、メルトリンαＫＯマウスではＷＴマウスに比べコレステロール値及びレプチン値の低下が確認され、メルトリンαの抑制が肥満におけるコレステロールの抑制に効果があることを示している。なお、レプチン値の低下は脂肪細胞組織重量の低下と関連していると推定された。【０１１１】
【表１】
2006013904.tif 000002
ＴＧ:中性脂肪、ＴＣ:総コレステロール、ＮＥＦＡ：遊離脂肪酸【０１１２】
（実施例４）ヒトメルトリンα遺伝子のクローニングと発現プラスミドの構築
（１）可溶型（遊離型）および膜結合型（膜型）ヒトメルトリンα遺伝子のクローニング
HeLa gＤＮＡを鋳型とし、プライマー（メルトリンα-a（配列番号５）およびメルトリンα-q（配列番号１６））を用いた１回目のＰＣＲ反応で、（a-q）断片を増幅し、同様にプライマー（メルトリンα-r（配列番号１７）およびメルトリンα-s（配列番号１８））を用いて（r-s）断片を増幅した。これらの増幅断片を混合して鋳型とし、プライマー（メルトリンα-b（配列番号６）およびメルトリンα-s（配列番号１８））を用いた２回目のＰＣＲ反応で、（b-s）断片を増幅した。この（b-s）断片をpT7-Blue（T）ベクターにＴＡクローニングし、可溶型および膜結合型メルトリンα遺伝子の５’側領域をもつpT7-Meltrinbsを構築した。【０１１３】
（２）可溶型および膜型ヒトメルトリンαをコードするｃＤＮＡのクローニング
Placenta cＤＮＡ libraryを鋳型とし、プライマー（メルトリンα-t（配列番号１９）およびメルトリンα-c（配列番号７））を用いた１回目のＰＣＲ反応で（t-c）断片を増幅した。同様に、プライマー（メルトリンα-d（配列番号８）およびメルトリンα-e（配列番号９））を用いて（d-e）断片を、プライマー（メルトリンα-f（配列番号１０）およびメルトリンα-i（配列番号１１））を用いて（f-i）断片を、プライマー（メルトリンα-j（配列番号１２）およびメルトリンα-l（配列番号１４））を用いて（j-l）断片を増幅した。
これら４つの増幅断片を混合して鋳型とし、プライマー（メルトリンα-t（配列番号１９）およびメルトリンα-k（配列番号１３））を用いた２回目のＰＣＲ反応で、（t-k）断片を増幅した。
この（t-k）断片をpT7-Blue（T）ベクターにＴＡクローニングし、可溶型メルトリンα遺伝子の３’側領域をもつpT7-Meltrintkを構築した。上述の、pT7-Meltrinbsを制限酵素BamH Iで切断し、その断片をBamH Iで切断したpT7-Meltrintkにライゲーションして、pT7-Meltrinbkを得た。pT7-Meltrinbkを制限酵素Sal IとEcoR Iで切断し、その断片をpBluescriptII（SK+）のSal IとEcoR I部位に挿入することで、可溶型メルトリンα全長遺伝子（配列番号１）をもつpTK-2169を構築した。【０１１４】
また、Placenta cＤＮＡ libraryを鋳型とし、プライマー（メルトリンα-j（配列番号１２） およびメルトリンα-o（配列番号１５））を用いたＰＣＲ反応で（j-o）断片を増幅した。この（j-o）断片と、上記で増幅した（d-e）断片および（f-i）断片を混合して鋳型とし、プライマー（メルトリンα-t（配列番号１９）およびメルトリンα-o（配列番号１５））を用いた２回目のＰＣＲ反応で（t-o）断片を増幅した。この（t-o）断片をpT7-Blue（T）ベクターにＴＡクローニングし、膜結合型メルトリンα遺伝子の３’側領域をもつpT7-Meltrintoを取得した。
次に、pT7-Melrtrinbkを制限酵素Hind IIIとEco RIで切断し、断片Ａを調製した。さらに、pT7-MeltrintoをHind IIIとSal Iで切断し、断片Ｂを調製した。これらの断片をpBluescriptII（SK+）のSal IとEco RI部位に断片Ａ＋断片Ｂとなるように挿入することで、膜結合型メルトリンα全長遺伝子（配列番号３）をもつpEF-MelLを構築した（図７）。【０１１５】
（３）Ｃ末端にFlagタグを有する可溶型メルトリンα発現プラスミドの構築
pTK-2169を鋳型とし、プライマー（メルトリンα-j（配列番号１２）およびメルトリンα-v（配列番号２０））を用いたＰＣＲ反応で（j-v）断片を増幅した。この（j-v）断片をpT7-Blue（T）ベクターにＴＡクローニングし、可溶型メルトリンα遺伝子の３’末端に、制限酵素Xho Iの切断部位をもつpT7-Meltrinjvを構築した。このpT7-Meltrinjvを制限酵素Sph IおよびXho Iで切断し、断片Ｃを調製した。
pTK-2169を制限酵素Xba IおよびSph Iで切断し、断片Ｄを調製した。
FlagタグペプチドをコードするオリゴＤＮＡ断片（FLAG-S（配列番号２１）およびFLAG-A（配列番号２２））をリン酸化した後、アニーリングさせることで断片Ｅを調製した。尚、この断片Ｅには、５’側にXho I、３’側にXba Iの粘着末端を有するように設計してある。
哺乳細胞発現ベクターであるpEF-BOSを制限酵素Xba Iで切断した後、EF-1αプロモーターの下流に、断片Ｄ＋断片Ｃ＋断片Ｅとなるように連結し、発現プラスミドpEF-MelSFを構築した（図７）。【０１１６】
（４）Ｃ末端にHisタグを有する可溶型メルトリンα発現プラスミドの構築
HisタグペプチドをコードするオリゴＤＮＡ断片（HIS-S（配列番号２３）およびHIS-A（配列番号２４））をリン酸化した後、アニーリングさせることで断片Ｆを調製した。なお、この断片Ｆには、５’側にXho I、３’側にXba Iの粘着末端を有するように設計してある。
哺乳細胞発現ベクターであるpEF-BOSを制限酵素Xba Iで切断した後、EF-1αプロモーターの下流に、断片Ｄ＋断片Ｃ＋断片Ｆとなるように連結し、発現プラスミドpEF-MelSHを構築した（図７）。【０１１７】
（５）Furin切断部位をThrombin切断部位に置換した、Flagタグを有する可溶型メルトリンα発現プラスミドの構築
メルトリンαのＰｒｏ体からＰｒｏドメインが切断された活性型メルトリンαの生成を、人為的に調節することは、メルトリンαのメタロプロテアーゼ活性を測定する上で、有用である。その１つの手段として、メルトリンα中のFurin切断部位が既知のプロテアーゼ切断部位の配列に置換されたメルトリンαを得ることを考えた。具体的には、Furin切断部位をThrombin切断部位に置換した変異型メルトリンαを作製した。このような変異型は、後述の実施例９で示すようにトロンビンによって人為的に活性型に変換することができる。プラスミドの作製は以下のように行った。【０１１８】
pTK-2169を鋳型とし、プライマー（メルトリンα-t（配列番号１９）およびメルトリンα-thrombin2（配列番号２６））を用いた１回目のＰＣＲ反応で（t-At2）断片を増幅。同様に、プライマー（メルトリンα-g（配列番号３８）およびメルトリンα-thrombin1（配列番号２５））を用いて（g-At1）断片を増幅した。これら２つの増幅断片を混合して鋳型とし、プライマー（メルトリンα-t（配列番号１９）およびメルトリンα-g）を用いた２回目のＰＣＲ反応で、（t-g）断片を増幅した。この（t-g）断片をpT7-Blue（T）ベクターにＴＡクローニングし、pTK-2220とした。
pTK-2220を制限酵素Nco IおよびHind IIIで切断し、断片Ｇを調製した。
pTK-2169を制限酵素Xba IおよびNco Iで切断し、断片Ｈを調製した。
pTK-2169を制限酵素Hind IIIおよびSph Iで切断し、断片Ｉを調製した。
哺乳細胞発現ベクターであるpEF-BOSを制限酵素Xba Iで切断し、EF-1αプロモーターの下流に、断片Ｈ＋断片Ｇ＋断片Ｉ＋断片Ｃ＋断片Ｅとなるように連結し、発現プラスミドpEF-MelSTFを構築した（図７）。
なお、上記（１）ないし（５）で使用したプライマーは、配列表に記載した。【０１１９】
（実施例５）メルトリンα蛋白質の調製
FuGene６（ロッシュ）を用い、実施例４で作成したプラスミドpEF-MelSFもしくはpEF-MelSTF もしくはpEF-MelSHでＣｏｓ-１細胞をそれぞれ形質転換した。形質転換体を、５％ＣＯ２存在下３７℃で７２時間培養後上清を回収し、新たに４８ｍＬの１％非働化ウシ胎児血清を含むＤ-ＭＥＭを添加し培養をさらに７２時間継続後、上清を回収した。回収した上清は１０００rpm、２０℃で５分間遠心し、上清を０.２２μｍステリカップ（日本ミリポア）にてろ過した後、以下の精製に供した。【０１２０】
pEF-MelSFおよびをpEF-MelSTFを導入した形質転換体の培養上清は、anti-FLAG Ｍ２ antibody agarose （シグマ）を充填したカラムを用いて精製し、ヒトメルトリンα-FLAG、ヒトメルトリンα-STFLAGを得た。pEF-MelSHを導入した上清はニッケルキレートカラム（Hitrap Chelating HP、アマシャムバイオサイエンス）を用いて精製し、精製蛋白ヒトメルトリンα-Hisを得た。【０１２１】
ヒトメルトリンα-FLAG の純度をＳＤＳ-ＰＡＧＥで確認し、抗FLAG-Ｍ２抗体（SIGMA）を使用してウエスタンブロティング法により目的の蛋白質であることを確認した。その結果、銀染色でほぼ均一な２本のバンドが検出された。ウエスタンブロティングで検出された２本のバンドと銀染色で検出された2本のバンドが一致し、それぞれ推定分子量よりプロドメインを含むヒトメルトリンα（分子量９２kDa）とプロドメインが削除されたメルトリンα（分子量６８kDa）であることが推定された（図８）。一方、ヒトメルトリンα- STFLAGでは、プロドメインを含むヒトメルトリンα（分子量９２kDa）の単一なバンドが得られた。【０１２２】
（実施例６）メルトリンαＫＯマウスを用いたマウス抗ヒトメルトリンα抗体の作製
栗崎らが作製したメルトリンαＫＯマウス（メス、５週齢）の腹腔内に精製ヒトメルトリンα-FLAG２０μｇをＦＣＡ（GIBCO）と等量混合して投与した。２週間後、抗原２０μｇをＦＩＡ（GIBCO）と等量混合し追加投与した。１週間後採血し、抗体価を測定した。抗体価の測定は、実施例５で得られた、FLAG配列を持たないヒトメルトリンα-Hisとの特異的反応性で測定した。【０１２３】
抗体価の上昇したマウスに投与抗原２０μｇを腹腔内に最終投与し、３日後マウスより脾臓を摘出して細胞融合した。すなわち、脾臓よりリンパ球を分離し、ミエローマ細胞（P3U1；P3×63-Ag.8.U1）と混合後、ポリエチレングリコール（SIGMA）を用いて安東民衛・千葉丈／著「単クローン抗体実験操作入門」83ページ、1991年（講談社）にしたがって細胞融合した。ＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選択し、１０日後ヒトメルトリンα-Hisと特異的に反応するウエルを選択した。反応したウエルは限界希釈法（安東民衛・千葉丈／著「単クローン抗体実験操作入門」97ページ、1991年（講談社））によりクローニングした。１０日後、同様にスクリーニングを行い、抗メルトリンαモノクローナル抗体を産生するクローン９４クローンを得た。各クローンを１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ-１６４０培地（GIBCO）で培養後、Hybridoma-ＳＦＭ培地（GIBCO）で培養し抗体を産生させ、Prosep-Ａカラム（ミリポア）を用いて培養上清から抗体を精製した。得られた抗体のサブタイプをIsoStrip Mouse Monoclonal antibody Isotyping Kit（Roche）を用いて決定した。表２にサブタイプを示す。【０１２４】
（実施例７）野生型マウスを用いたマウス抗ヒトメルトリンα抗体の作製
精製ヒトメルトリンα-FLAGに最終濃度１％ジニトロフルオロベンゼン（和光）となるように添加し、室温で２０分間反応後、生理食塩水に透析した。調製したＤＮＰ化メルトリンα-FLAGを投与抗原として以下の方法によりマウスを免疫した。すなわち、ＤＮＰ化メルトリンα２０μｇとＣｐＧアジュバント（ImmunoEasy Mouse Adjyubant、QIAGEN）２０μＬを混合し、ｄｄＹマウス（メス、８週齢、ＳＬＣ）のフットパッドに投与した。２週間後、投与抗原２０μｇを同様に投与し、最終投与後リンパ球を分離し、実施例６と同様に細胞融合した。ＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選択し、１０日後目的の抗体を産生しているハイブリドーマのスクリーニングを行った。精製ヒトメルトリンα-Hisと反応した細胞を限界希釈法によりクローニングし、１０日後同様にスクリーニングした。その結果、精製ヒトメルトリンα-Hisと反応する抗体を産生するクローン３７クローンを得た。選択したハイブリドーマを１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ-１６４０培地（GIBCO）で培養後、Hybridoma-ＳＦＭ培地（GIBCO）で培養し抗体を産生させ、培養上清からProsep-Ａカラム（ミリポア）を用いて抗体を精製した。得られた抗体のサブタイプをIsoStrip Mouse Monoclonal antibody Isotyping Kit（ロッシュ）を用いて決定した。表２に抗体のサブタイプを示す。【０１２５】
【表２】
2006013904.tif 000003
【０１２６】
（実施例８）抗ヒトメルトリンαモノクローナル抗体の結合活性解析
実施例６および７で得られた、各精製抗体の結合活性を以下の（１）または（２）の方法で測定した。
（１）抗原固相系における結合活性の確認（Ａ法）
精製ヒトメルトリンα-FLAGをＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Maxisorb、NUNC）に５０μＬ／ウエル添加した。４℃で一晩反応後、イオン交換水で５回洗浄し、０.５％ＢＳＡを含むＰＢＳを各ウエルに１００μＬ添加しブロッキングした。次に、実施例６および７で得られた各抗体を、０.１％ＢＳＡを含むＰＢＳで５μｇ／ｍＬに希釈して各ウエルに添加し３７℃で１時間反応した後、０.０５％Tween20を含む生理食塩水（以下、洗浄液と記載する場合がある）で３回洗浄した。各ウエルにペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ）を１０％ウサギ血清／ＰＢＳで１０００倍に希釈し各ウエルに５０μＬ添加し３７℃で１時間反応後、同様に５回洗浄しＴＭＢ溶液（BioFix）を各ウエルに添加した。室温で１０分間反応後、０.５Ｍ硫酸溶液で反応を停止したし、プレート分光光度計（E-Max、モレキュラデバイス）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。表３に測定結果を示す。吸光度が０.５以上を示す抗体を＋と表記した。【０１２７】
【表３】
2006013904.tif 000004
【０１２８】
（２）サンドイッチＥＩＡ系による結合活性の確認（Ｂ法）
中根らの方法（J. Histochem.Cytochem.，22，1084，1974）に従い、１ｍｇのペルオキシダーゼ（東洋紡）を蒸留水に溶解し、蒸留水で溶解した１００ｍＭの過ヨウ素酸を添加し、２５℃で２０分間反応した。反応終了後１.５％エチレングリコールを添加し２５℃で１０分間反応後１ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４.４）に対して透析した。次に、抗FLAG-Ｍ２抗体（SIGMA）を１０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９.５）で透析し、抗体１ｍｇに対して１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９.５）を添加して活性化した１ｍｇのペルオキシダーゼを混合し２５℃で２時間反応した。４ｍｇ／ｍＬの水素化ホウ素ナトリウムを添加し、さらに２時間４℃で反応した。反応液をＰＢＳに透析しペルオキシダーゼ標識抗体を得た。【０１２９】
作製した標識抗体を用いて以下の方法でサンドイッチＥＬＩＳＡ系を構築した。すなわち、実施例６および７で得られた各抗体をＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Maxisorp、NUNC）の各ウエルに５０μＬ添加し、４℃にて一夜反応した。次にイオン交換水で５回洗浄し、２％StabilGuard（Surmodics）／ＰＢＳを各ウエルに１００μＬ添加しブロッキングした。標準品は精製メルトリンα-FLAGを０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈し使用した。ブランクは０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳを使用した。【０１３０】
測定は、まずプレートのブロッキング液を廃棄し、調製した標準品及びブランクを５０μＬ添加し３７℃で1時間反応した。続けて洗浄液で３回洗浄し、調製したペルオキシダーゼ標識抗FLAG-Ｍ２抗体を２％ラット血清、１％マウス血清、０.０５％Tween20を含むＰＢＳにより１μｇ／ｍＬに希釈して添加し、３７℃で1時間反応した。プレートを洗浄液で５回洗浄し、ＴＭＢ溶液（BioFX）を各ウエルに添加した。室温で１０分間反応後、０.５Ｍ硫酸溶液で反応を停止し、プレート分光光度計（E-Max、モレキュラデバイス）で４５０ｎｍの吸光度を測定し、ブランクで吸光度が上昇せず、精製メルトリンα-FLAGで吸光度が上昇する抗体を選択した。表４に結果を示す。吸光度が０.１以上を示す抗体を＋と表示した。【０１３１】
【表４】
2006013904.tif 000005
【０１３２】
（３）メルトリンαの測定系の構築
上記で得られた抗メルトリンα抗体を用いて、検体中のメルトリンαを測定するためのサンドイッチＥＬＩＳＡ系を構築した。すなわち、中根らの方法（J.Histochem.Cytochem.，22，1084，1974）に従いペルオキシダーゼ標識抗体を作製し、サンドイッチＥＬＩＳＡ系が作製可能な抗体の組合せを選択した。次に選択した２種類の抗体を用いて以下のように測定系を作製し、血清測定を行った。まず、イムノプレート（Maxisorp、NUNC）にNo.１０２の抗体を固相化後、標準品として精製メルトリンαを、検体として各種ヒト検体を添加し反応させた後、調製したペルオキシダーゼ標識No.１０１抗体を添加し反応した。プレートを洗浄液で５回洗浄し、ＴＭＢ溶液（BioFX）を添加後、０.５Ｍ硫酸溶液で反応を停止し、プレート分光光度計（Ｅ-Ｍａｘ、モレキュラデバイス）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。標準曲線より検体中の可溶型メルトリンα濃度を算出しところ、妊婦血清で正常人より高い濃度のメルトリンαが検出され、濃度は妊娠月数に伴って増加した。【０１３３】
（４）各種ヒトメルトリンαドメイン蛋白質の調製
ヒトメルトリンαの各ドメインを有するペプチドを発現する発現プラスミドpEF-Pro、pEF-Mp、pEF-MPdel、pEF-DC、pEF-Cyを構築した。各プラスミドは、発現を確認できるようにそれぞれのペプチドのC末端にFLAGタグ配列を有するように構築した。図９に構築した各配列と予想される分子量を示した。FuGene6（ロッシュ・ダイアグノスティクス）を用い、pEF-Pro、pEF-Mp、pEF-MPdel、pEF-DC、pEF-CyをＣｏｓ-１細胞にトランスフェクションした。細胞をセルスクレイパー（コースター）で回収し、ダルベッコＰＢＳ（以下Ｄ-ＰＢＳと記載する場合がある）で洗浄し、細胞数をカウントした。各細胞を適量のＤ-ＰＢＳに懸濁した後、等量のトリスＳＤＳサンプル処理液（第一化学薬品）を加え超音波処理（5202-P2T、大岳製作所、５０ワット，１０sec×３）し、ヒトメルトリンα各ドメイン蛋白質細胞抽出液を調製した。【０１３４】
（５）ヒトメルトリンα各ドメイン蛋白質と抗体との反応性の確認
ヒトメルトリンα各ドメイン蛋白質の発現はウエスタンブロティング法により確認した。すなわち、ヒトメルトリンα各ドメイン発現細胞抽出液（２００cells相当）及び実施例５で得られたメルトリンα-FLAG（２００ｎｇ）をＳＤＳ-ＰＡＧＥ（５-２０％、ATTO）にて泳動し、電気泳動終了後、ＰＶＤＦ膜（ミリポア）に転写した。転写後、５％スキンミルク（明治乳業）／Ｔ-ＰＢＳ（０.０５％Tween20を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）を示す）でブロッキングした。次に５％スキンミルクを含む／Ｔ-ＰＢＳで１.０μｇ／ｍＬに希釈した抗FLAG抗体（Ｍ２、SIGMA）及び実施例６〜７で作製した各マウス抗メルトリンαモノクローナル抗体と４℃、オーバーナイトで反応し、Ｔ-ＰＢＳで洗浄した。続けて０.５％ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと記載する場合がある）を含むＴ-ＰＢＳで１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（DAKO）と室温で１時間反応させ同様にメンブレンを洗浄後、ECL-Plus（アマシャム）と反応させ、生じた化学発光を冷却ＣＣＤカメラ（ライトキャプチャー、ATTO）で検出した。【０１３５】
図１０に抗FLAG抗体を用いた場合の染色像を示した。その結果、作製した各ドメイン蛋白質が目的の分子量で発現していることが確認された。同様に、各マウス抗ヒトメルトリンαモノクローナル抗体が認識するドメインの解析を行った。その結果、抗体No.２０及び抗体No.１０１、抗体No.１０３、抗体No.１０７はＭＰ領域に特異的に結合することが明らかになった。さらに、抗体No.１８、抗体No.２１及び抗体No.８８、抗体No.１１９はシステインリッチ領域に結合することが明らかになった。
なお、ここで特異的結合の認められた抗体のうち、No.１０３抗体以外は、すべて、ＫＯマウスを用いて作製された抗体であった。【０１３６】
（実施例９）メルトリンαのプロテアーゼ活性化能の測定
（１）メルトリンαの活性化
実施例５で調製した精製メルトリンα-STFLAGにThrombin（アマシャムバイオサイエンス）を添加し、２５℃で１５時間保温した。反応後の溶液を実施例５と同様の方法で確認したところ、プロドメインを含むヒトメルトリンα（分子量９２kDa）がプロドメインの削除された成熟型メルトリンα（分子量６８kDa）に変換されていた。メルトリンαの酵素活性測定にはThrombinによるプロドメインの切断後、１０ｍＭのAPMSF（和光純薬）にてThrombinを失活させた溶液を用いた。また、この溶液にThrombin活性が残存していないことを、反応溶液にThrombinの合成基質を用いて確認した。【０１３７】
（２）メルトリンαのプロテアーゼ活性測定
５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８.０），１００ｍＭ ＣａＣｌ２，０.０５％ Brij-35, ０.０１％ＢＳＡを含む緩衝液に、Thrombinでプロドメインを切断したメルトリンα（終濃度２０μｇ／ｍＬ）とメルトリンαの基質の１つとして報告されているIGF-BP3（Frosty Loechel ら、BBRC(2000), 278, p511-515）として、組換えヒトIGF-BP3（GT社GT2675，以下、rhIGF-BP3）（終濃度０.５μｇ／ｍＬ）を混合し、３７℃で２４時間反応させた。反応溶液にトリスＳＤＳサンプル処理液（第一化学薬品）を等量加え、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ（５-２０％、ATTO）で泳動し、ＰＶＤＦ膜（ミリポア）に転写した。転写後、５％スキムミルク（明治乳業）／Ｔ-ＰＢＳ（０.０５％Tween20を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）を示す）でブロッキングした。次に０.５％ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと記載する場合がある）／Ｔ-ＰＢＳで０.１μｇ／ｍＬに希釈したビオチン化ヤギ抗ヒトIGF-BP3抗体（GT社GT44675）と室温で１時間反応し、Ｔ-ＰＢＳで洗浄した。続けて０.５％ＢＳＡ／Ｔ-ＰＢＳで１００００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗Streptavidin（GIBCO BRL）と反応させ、同様にメンブレンを洗浄後、ECL-Plus（アマシャム）と反応させ、生じた化学発光を冷却ＣＣＤカメラ（ライトキャプチャー、ATTO）で検出した。【０１３８】
（実施例１０）抗ヒトメルトリンα抗体のメルトリンαプロテアーゼ阻害活性
実施例９のプロテアーゼ活性測定系を用いて、実施例６および７で得られた抗ヒトメルトリンα抗体の、メルトリンαプロテアーゼ阻害活性を測定した。実施例９の測定系で、各種抗ヒトメルトリンα抗体をrhIGF-BP3添加前に３００μｇ／ｍＬの濃度で添加して３０分間反応させた。この後rhIGF-BP3を加え３７℃で２４時間反応させた。反応後、反応溶液をＳＤＳ-ＰＡＧＥ電気泳動後ウエスタンブロッティングによりrhIGF-BP3を検出した。実施例９で確認されたのと同様に、プロドメインを切断したメルトリンαによりrhIGF-BP3のバンドは消失したが、抗ヒトメルトリンα抗体No.２０、２１、１０７，１２９の添加によりrhIGF-BP3バンドの消失は抑制された（図１１）。【０１３９】
これらの結果より抗体No.２０，２１、１０７，１２９はメルトリンαのプロテアーゼ活性を抑制することが判明した。これらの抗体の酵素阻害特異性をＭＭＰ-１（BIOMOL社製），ＭＭＰ-９（Yagai co.社製）を使用し、市販蛍光合成基質（ＭＭＰ-１/-９substrate (ＤＮＰ-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(N-Me-Abz)-ＮＨ２，CALBIOCHEM）を用いて、Bickettらの方法（Anal. Biochem. 212, 58, 1993）に従って測定した。その結果、いずれの抗体もＭＭＰ-１およびＭＭＰ-９阻害活性を有しておらず、本発明の抗体がメタロプロテアーゼを非特異的に阻害する物ではない事が確認された。
なお、ここで、高い中和活性の見られた抗体はいずれも、ＫＯマウスを用いて作製した抗体であった。【０１４０】
（実施例１１）低分子化合物のメルトリンαプロテアーゼ阻害活性
実施例９の方法に従い、低分子化合物のメルトリンαプロテアーゼ阻害活性を測定した。すなわち、実施例９のプロテアーゼ活性測定系で、rhIGF-BP3添加前に低分子化合物を１０μｇ／ｍＬの濃度で添加して３０分間反応させた。この後rhIGF-BP3を加え３７℃で２４時間反応させた。反応後、反応溶液をＳＤＳ-ＰＡＧＥ電気泳動後ウエスタンブロッティングによりrhIGF-BP3を検出した。
図１２に、低分子化合物７、-[フェニル（ピリジン-２-イルアミノ）メチル]キノリン-８-オール（ASINEX社製  BAS0917466、M８２４６３と称する）の結果を示した。
プロドメインを切断したメルトリンα添加群ではrhIGF-BP3のバンドはプロテアーゼ活性による消化により消失していた。これに対して、Ｍ８２４６３添加によりrhIGF-BP3の消失が抑制されていた（図１２）。この結果は、低分子化合物Ｍ８２４６３はメルトリンαのプロテアーゼ活性を抑制することを示す。【０１４１】
（実施例１２）メルトリンαアンチセンスＤＮＡの調製と細胞への導入
ヒトのメルトリンαのコーディング領域の５’末端付近に対するアンチセンス配列HS0307A（配列番号２７）：CACGGGCAGCGGGCGCGCTGCCATと、対照として同じ部分のセンス配列HS0307S（24）（配列番号２８）： ATGGCAGCGCGCCCGCTGCCCGTGにphosphorothionate修飾したオリゴＤＮＡを合成（SIGMA Genosys Japan）した。【０１４２】
まずアッセイに使用するヒト前駆脂肪細胞（Human Preadipocytes-sq donor10547, POIETICS ＃PT-5001, Lot.3F0242三光純薬）を細胞濃度１×１０５cells／ｍＬに調製し、９６穴培養プレートに１×１０２〜１×１０４cells／well／１００μＬで添加し、一晩培養した。また、６穴プレートに１×１０５cells／ｍＬの脂肪前駆細胞懸濁培地１６００μＬ／wellと、４００μＬ／wellの増殖培地を添加し一晩培養した。合成したオリゴＤＮＡ１μｇ〜５０μｇを無血清の脂肪細胞増殖培地もしくは無血清のＤ-ＭＥＭに添加し、オリゴＤＮＡ１μｇあたり３μＬのFugene６を加え、１５〜４５分間室温で静置した。前述の６穴プレートから培地４００μＬ／wellを除去後、前記オリゴＤＮＡを含む培地溶液４００μＬ／wellを添加し、３７℃,５％ＣＯ２存在下で１８時間培養後、実施例１５のメルトリン発現量の検討に供した。また、９６穴プレートからは、培地１０μＬ／wellを除去後、前述のオリゴＤＮＡを含む培地溶液１０μＬ／wellを添加し、これを実施例１６の脂肪細胞増殖分化の検討に供した。【０１４３】
（実施例１３）メルトリンαsiＲＮＡの調製と細胞への導入
配列１（配列番号２９）：AUGCGAGAUGAGAGAUGCU（TT），配列２（配列番号３０）：GUGUGGAAUGACAUGGACA（TT），配列３（配列番号３１）：GAAUCAUCCAGAAGUGCUG（TT）および各配列に相補的なＲＮＡ（配列番号３２〜３４）を合成した（タカラバイオ）。
相補的なＲＮＡを１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ-ＫＯＨ（ｐＨ７.４）,２ｍＭ 酢酸マグネシウム溶液中でsiＲＮＡ濃度２０pmol／μＬとなるよう混合し、この溶液を９５℃１分に続いて７０℃１分加熱し、その後１時間かけて３７℃に冷却し、アニールさせ２本鎖のsiＲＮＡを調製した。【０１４４】
脂肪細胞増殖分化検討用に１２μｇのsiＲＮＡに培地１１８５.７μＬと７２μＬのＲＮＡ fect（キアゲン）を混合した。室温で１５分間静置後、実施例１２と同様にヒト前駆脂肪細胞を巻き込んだ９６穴プレートから培地を２５μＬ／well除去した後、siＲＮＡを含む培地溶液を２５μＬ／well添加した、実施例１５の脂肪細胞の増殖分化の検討に供した。また、発現抑制効果検討用には、実施例１２と同様に、ヒト前駆脂肪細胞を巻き込んだ６穴プレートから培地を４００μＬ／well除去した後、siＲＮＡを含む培地を４００μＬ／well添加し、３７℃,５％ＣＯ２存在下で１８時間培養後、ＲＮＡを回収して、実施例１４に使用した。【０１４５】
（実施例１４）siＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドによるヒトメルトリンα発現量の定量
（１）ＲＮＡ回収
実施例１２および１３で調製した６穴プレートから培地を除去し、ＰＢＳ（−）にて２回洗浄した。
ＰＢＳを除去したプレートにTrizol Reagent（Invitrogen）を０.５ｍＬ／well添加し、ピペッティングで細胞を溶かし、エッペンドルフチューブに移し変えた。次にクロロフォルム１００μＬを加えて攪拌し、室温にて２〜２分放置し、その後１５０００回転４℃で１０分間遠心した後に上清を除去した。沈殿を７５％エタノールで洗浄し室温で乾燥させた。乾燥後、沈殿をＲＮＡseを含まない水に溶解し、波長２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＲＮＡの濃度を決定した（１ＯＤ＝４０μｇ／ｍＬ）。【０１４６】
（２）cＤＮＡ合成
回収したＲＮＡ０.２μｇ,１０×TaqMan buffer ２μＬ，２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ４.４μＬ, ２.５ｍＭ ｄＮＴＰ Mix ４μＬ, ５０μＭ Random Hexamers １.０μＬ, ２０Ｕ／μＬ ＲＮase inhibitor ０.４μＬ, ５０Ｕ／μＬ MultiScribe Reverse Transcriptase（以上プライドバイオシステム）を加え、水で全量を２０μＬに調製した。この溶液を２５℃で１０分４８℃で３０分、９５℃で５分間それそれ保温し、逆転写反応を行ないcＤＮＡを合成した。【０１４７】
（３）リアルタイムＰＣＲ
TaqMan Universal ＰＣＲ Master Mix １０μＬ,１０μM TaqMan MGB Probe（配列番号３５）（配列5’FAM-caccgaaggacaatccca-MGB-3' ）０.４μＬ,メルトリンα検出用５０μＭ Forward（配列番号３６）（配列ggaagccgccagattcct），Reverse（配列番号３７）（配列aggaagcactcgctgagttga）のPrimer各０.１μＬ（アプライドバイオシステム）、（２）のｃＤＮＡ溶液５μＬ、水４.４μＬの合計２０μＬの溶液を作成し、ABI Prism 7000にて５０℃２分、９５℃１０分の保温後、９５℃１５秒６０℃１分の繰り返しで４０回ＰＣＲ反応を行なった。検量線をヒトメルトリンα全長を含むプラスミドpEF-MelLを鋳型としてリアルタイムＰＣＲにより作成し、各サンプル中のメルトリンαのＲＮＡコピー数を定量した。【０１４８】
（４）結果
siＲＮＡを挿入したヒト脂肪前駆細胞より回収したＲＮＡのメルトリンαmＲＮＡの発現量は、用いた３種のsiＲＮＡすべてにおいて、対照群に比べて６０〜９０％抑制された（図１３）。またアンチセンスＤＮＡを挿入したヒト脂肪前駆細胞のメルトリンαの発現量は、センスオリゴＤＮＡ導入群のメルトリンα発現量を１００％とすると約７０％抑制された（図１４）。これらのことより本検討に用いたsiＲＮＡならびにアンチセンスＤＮＡはヒト脂肪細胞のメルトリンαmＲＮＡの発現量を低下させる事が確認された。【０１４９】
（実施例１５）siＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドの脂肪細胞増殖分化に対する検討
（１）脂肪前駆細胞の分化刺激
分化培地は増殖培地１００ｍＬに添加試薬キットＰＧＭSingleQuots，＃PT-9500, Lot.08101163（三光純薬）を添加したものを用いた。実施例１２で調製した９６穴プレートより、上清５０μＬを除去し、５０μＬの分化培地で調整したsiＲＮＡもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドを添加し、ＣＯ２インキュベータで５日から１５日間培養を行なった。【０１５０】
（２）増殖分化の検討
脂肪細胞中の中性脂肪の蓄積をAdipo Red染色液による蛍光測定により定量した。
９６穴プレートをＣＯ２インキュベータより取り出した後、室温になるまで静置した。プレートを３００ｇ（１２００rpm.）で１０分間、室温で遠心し培地を除去する。次にＰＢＳ（シグマ）を２００μＬ／wellでやさしく洗浄した後、ウェルに２００μＬ／well のＰＢＳを添加した。
次に５μＬ／wellのAdipo Red Assay Reagent （Adipo Red, Cat. ＃PT-7009, Lot.3F0497, A Cambrex Company）を添加し、１０分間以上室温にて静置し脂肪細胞に蓄積した中性脂肪を染色した。これを蛍光測定装置にて励起光４８５ｎｍ,  発光波長５３５ｎｍで測定し脂肪の蓄積を計測した。【０１５１】
（３）脂肪細胞に対する毒性の検討
脂肪細胞に対する被検物質の毒性をＷＳＴ１アッセイにて検討した。具体的には（Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System,宝酒造株式会社）を１０μＬ／well添加、３７℃  ＣＯ２インキュベータにて６０分間インキュベートした後、吸光度測定（４５０ｎｍ-６５０ｎｍ）を行ない、脂肪細胞に対する影響を検討した。
（４）結果
分化刺激５日後に脂肪細胞をAdipoRed染色し、脂肪の蓄積を検討した。その結果、アンチセンスオリゴヌクレオチド導入群はセンス配列導入群に比べて、分化刺激した前駆脂肪細胞への中性脂肪の蓄積が抑制されていた（図１６）。また、siＲＮＡ導入群では分化刺激１２日後に脂肪細胞をAdipoRedで染色し、脂肪の蓄積を検討した。その結果、導入したsiＲＮＡ配列１，２，３ともに導入試薬のみの対照群に比べて分化刺激した前駆脂肪細胞への中性脂肪の蓄積が抑制されていた（図１７）。【０１５２】
以上より、ヒトメルトリンαの発現を抑制するアンチセンスオリゴＤＮＡならびにsiＲＮＡはヒト脂肪細胞の増殖分化を抑制し、中性脂肪の蓄積が抑制する事が明らかとなった。ノックアウトマウスで肥満効果が認められたことに加えて、アンチセンスまたはsiＲＮＡの投与による後天的なメルトリンα遺伝子発現抑制によっても、脂肪細胞増殖分化阻害および細胞内への脂肪の蓄積の抑制が認められたことにより、メルトリンαの発現抑制が抗肥満作用に有効であることが示された。アンチセンスオリゴヌクレオチドやsiＲＮＡ等のメルトリンαの発現を抑制する薬剤は、これらの点からも、抗肥満剤として有効であると考えられる。【０１５３】
（実施例１６）低分子化合物の脂肪分化増殖抑制作用の検討
実施例１１でメルトリンαメタロプロテアーゼ阻害活性を有することが確認されたＭ８２４６３の脂肪細胞増殖分化における作用を検討した。
実施例１５の方法に準じて、ヒト脂肪前駆細胞培養系にＭ８２４６３をＤＭＳＯの最終濃度が０.２％となるよう０.３〜１０μｇ／ｍＬの濃度で添加した。対照としてＤＭＳＯのみを最終濃度が０.２％となるよう添加した群を用いた。その結果、Ｍ８２４６３は用量依存的に脂肪細胞の増殖分化を抑制していた（図１５）。また、アッセイに用いた濃度ではＭ８２４６３には細胞毒性は認められなかった。【０１５４】
（実施例１７）抗ヒトメルトリンα抗体の脂肪分化増殖抑制作用の検討
実施例６および実施例７で調製した抗ヒトメルトリンα抗体を生理食塩水に対して一晩透析後、波長２８０ｎｍの吸光度（Factor=1）により定量した。
抗体の濃度を生理食塩水で０.１００ｍｇ／ｍＬに調製した後に１量の抗体溶液に対して９量の脂肪細胞分化培地を添加し、０.２２μｍ径のフィルター（MILLEX-GV ０.２２μｍ Filter unit, 3slgv013SL, Lot.R2NN83622，MILLIPORE社）でろ過滅菌した。この抗体を含む培地溶液を、ヒト前駆脂肪細胞を蒔き込んだ９６穴プレートからあらかじめ５０μＬの培地を除去した後に、５０μＬ／well添加した。抗体の終濃度は５μＬ／ｍＬである。培地添加の１５日後に実施例１５の方法に準じてAdipoiRedで染色定量した。
その結果、抗ヒトメルトリンα抗体の中から分化刺激した前駆脂肪細胞への中性脂肪の蓄積抑制、増殖分化を抑制する抗体が見出された（表５）。抑制活性の認められた抗体の大多数は、ＫＯマウスを用いて得られた抗体であった。【０１５５】
脂肪細胞に顕著な作用を示した抗体には、メタロプロテアーゼドメインおよびシステインリッチドメインに結合する抗体が含まれており、また、メタロプロテアーゼ阻害活性を有する抗体も認められた。一方、メタロプロテアーゼ活性に影響を及ぼさない抗体も存在していた。これらの結果と低分子化合物での結果より、メルトリンαアンタゴニスト作用を有する物質は、脂肪細胞への中性脂肪の蓄積抑制、増殖分化抑制により、抗肥満薬として有効であることが示された。そして、その抗肥満作用の一部に、メタロプロテアーゼ活性部位近傍およびシステインリッチドメイン近傍の構造が関与している事が示唆された。これらにより、メルトリンαメタロプロテアーゼ活性の阻害能の測定は、抗肥満活性を示すメルトリンαアンタゴニストをスクリーニングする１ステップとして利用できるものと考えられた。【０１５６】
【表５】
2006013904.tif 000006
表中、以下の基準で抗体を表記した。
＋＋＋：７０％以上抑制
＋＋：５０％以上抑制
＋：２５−５０％抑制【０１５７】
（実施例１８）メルトリンαアンタゴニストのin vivo抗肥満作用
実施例１に準じて、高脂肪食は脂肪を６０％含む餌を調製する。またコントロールとして脂肪を１０％含む低脂肪食を用いる。まず、マウスをそれぞれ高脂肪食摂餌群、低脂肪食摂餌群に分け、各々の餌を与えつづける。この動物にメルトリンαアンタゴニストを、アンチセンスＤＮＡまたは、siＲＮＡでは０.１〜１０ｍｇ／ｋｇを１日２回から２週間に１回、抗メルトリンα抗体では０.１〜１００ｍｇ／ｋｇを１〜２週間に１回の頻度で２〜１５週間投与する。低分子化合物では０.１〜１００ｍｇ／ｋｇを毎日投与する。実験期間の間、毎週体重測定を行う。また、摂餌量を定期的に測定する。その結果、低脂肪食摂餌群ではメルトリンαアンタゴニスト投与マウス、溶媒投与マウスともに平均的な体重増加を示す。これに対して、高脂肪食を摂餌した溶媒投与マウスでは低脂肪食摂餌群より顕著な体重増加が認められるのに対して、メルトリンαアンタゴニスト投与マウスでは体重増加が抑制される。このことより、メルトリンαの発現抑制や活性の抑制作用を持つアンタゴニストが抗肥満作用を有していることを明らかにすることができる。
また、投与開始の２〜１５週間後に解剖を行ない、各臓器を摘出する。このとき臓器重量計測ならびに組織所見を検討することにより、メルトリンαアンタゴニストの内臓脂肪の増加抑制効果ならびに、脂肪肝の形成が抑制されている事を確認することが出来る。【０１５８】
（実施例１９）メルリンαアンタゴニストの高脂肪食接餌後の脂質、糖代謝の亢進
メルトリンαアンタゴニストの高脂肪食摂餌後の脂質及び糖のエネルギー代謝亢進作用は、低脂肪食飼育もしくは高脂肪食飼育により肥満を誘導したマウスにメルトリンアンタゴニストを実施例１８に準じた用量で１〜１５週間投与を行なった後、実施例２の方法に準じて１４ＣでＲＩ標識したパルミチン酸またはグルコースをマウス尾静脈より投与し、放射活性の各臓器、尿、糞及び呼気中ＣＯ２への移行量を測定することにより行う。メルトリンαアンタゴニスト投与により、パルミチン酸投与、グルコース投与において呼気中へのＲＩの排出量は上昇し、糖、脂質代謝が亢進することが確認できる。パルミチン酸投与で糞中へのＲＩ移行量が溶媒投与マウスに比較して高く、グルコース投与では尿中で高いことが示され、メルトリンαアンタゴニスト投与マウスでは、糖、脂質が速やかに代謝・排泄されていることが確認される。【０１５９】
（実施例２０）メルトリンαアンタゴニストの毒性検討
メルトリンアンタゴニストを実施例１８に準じた用量をマウスに投与する。いずれの用量においても死亡例などの著明な毒性は認められない。このことより、本発明のメルトリンαアンタゴニストは治療薬として生体に投与することが可能であると考えられる。【０１６０】
アンチセンス化合物の合成
表６および表７に記載の塩基配列で示されるホスフォロチオエート型のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、ならびに表８に記載の塩基配列で示されるキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、プロオリゴ・ジャパン株式会社に合成を委託し、化学合成されたものを以下の実施例２１または２２の試料として用いた。なお、表８の場合、５’側及び３’側のそれぞれ５ヌクレオチド（大文字で表記）は２’−メトキシヌクレオチドであり、中間の１０ヌクレオチド（小文字で表記）はホスフォロチオエート型ヌクレオチドである。【０１６１】
（実施例２１）アンチセンス化合物によるヒトメルトリンα発現の抑制
（１）アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの導入
まずＲＤ細胞（ＡＴＣＣ）を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、SIGMA）含有ＤＭＥＭ培地に懸濁し、６穴培養プレートに２.５×１０５cells／well／２ｍＬ播きこんだ。３７℃、５％ＣＯ２存在下で一晩培養の後、血清を含まないＤＭＥＭ培地で細胞を２回洗浄しOpti-ＭＥＭ培地（GIBCO）を８００μＬ/wellを添加した。
遺伝子導入試薬Lipofectin（In vitrogen）を２０μｇ/ｍＬとなるようにOpti-ＭＥＭ培地で希釈して室温で３０分静置した。次に合成したアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを９０℃で３分間加熱後、氷上で急冷し、最終添加濃度の１０倍濃度となるようにOpti-ＭＥＭ培地で希釈した。このLipofectinならびにアンチセンスオリゴＤＮＡのOpti-ＭＥＭ培地溶液を等量混合し、室温で１５分間インキュベート後６穴プレートに２００μＬ/well添加した。
３７℃、５％ＣＯ２存在下で４時間培養し、Lipofectinを含む培養上清を除去した。血清を含まないＤＭＥＭ培地で細胞を２回洗浄し、１ｍＬ/wellのOpti-ＭＥＭ培地を添加して、３７℃、５％ＣＯ２存在下で１８時間培養後、以下のようにメルトリンαＲＮＡ発現量の測定に供した。【０１６２】
（２）ＲＮＡ回収
（１）で調製した６穴プレートから培地を除去し、ＰＢＳ（−）にて２回洗浄した。
洗浄後、細胞よりＲＮＡ回収キット、RNeasy Micro Kit（キアゲン社）を用い、キットのプロトコールに準じてＲＮＡを回収し、分光光度計Nano Drop（（株）エル・エム・エス)を用いて波長２６０nmの吸光度を測定し、ＲＮＡ濃度を定量した（１ＯＤ＝４０μｇ／ｍＬ）。定量後ＲＮＡをＤＥＰＣ処理水を用いて濃度０.１μｇ/μＬに調製した。【０１６３】
（３）ｃＤＮＡ合成
回収したＲＮＡ０.３５μｇ、１０×TaqMan buffer ３.５μＬ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ７.７μＬ、２.５ｍＭ eachｄＮＴＰ Mix ７.０μＬ、５０μＭ Random Hexamers １.７５μＬ、２０Ｕ／μＬ ＲＮaseインヒビター０.７μＬ、５０Ｕ／μＬ MultiScribe Reverse Transcriptase０.９μＬ（以上アプライドバイオシステムズ）を加え、水で全量を３５μＬに調製した。この溶液を２５℃で１０分間、４８℃で３０分間、９５℃で５分間それそれ保温し、逆転写反応を行ないｃＤＮＡを合成した。【０１６４】
（４）リアルタイムＰＣＲ
TaqMan Universal ＰＣＲ Master Mix １０μＬ、１０μＭ TaqMan MGB Probe（配列５’FAM-caccgaaggacaatccca-MGB-３'：アプライドバイオシステムズ）０.４μＬ、メルトリンα検出用５０μＭ Forward primer（配列ggaagccgccagattcct）０.１μＬ、同５０μＭ Reverse primer（配列aggaagcactcgctgagttga）０.１μＬ（以上、SIGMA Genosys）、（３）のｃＤＮＡ溶液５μＬ、水４.４μＬの合計２０μＬの溶液を作成し、ABI Prism 7000にて５０℃２分、９５℃１０分の保温後、９５℃１５秒６０℃１分の繰り返しで４０回ＰＣＲ反応を行なった。
ヒトメルトリンαＲＮＡの定量はヒトメルトリンαをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを鋳型としてリアルタイムＰＣＲにより検量線を作成し、各サンプル中のメルトリンαのＲＮＡコピー数を算出した。また、ヒトＧＡＰＤＨ用のリアルタイムＰＣＲ用プライマー・プローブセットPre-Developed TaqMan Assay Reagents Human ＧＡＰＤＨ (20×)（Cat#4310884E、アプライドバイオシステムズ）を用いて、ＧＡＰＤＨの発現量を求めた。【０１６５】
（５）発現抑制率の算出
メルトリンαのリアルタイムＰＣＲの結果をＧＡＰＤＨの発現量で補正して抑制率を算出した。すなわち、各試料のメルトリンα限界サイクル（Ｃｔ）値／（各試料のＧＡＰＤＨ  Ｃｔ値／試料不添加ＧＡＰＤＨ  Ｃｔ値）を各試料の補正メルトリンαＣｔ値とし、各試料の補正メルトリンαＣｔ値よりコピー数を算出後、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを添加しなかった細胞のメルトリンα遺伝子の発現量（コピー数）を１００％として、各アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを添加した場合の発現抑制率を求めた。結果を表６ないし表８に示す。なお、各濃度において、抑制率３０％以上を＋、５０％以上を＋＋、７０％以上を＋＋＋としてスコア化した。【０１６６】
【表６】
2006013904.tif 000007
【０１６７】
【表７】
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【０１６８】
【表８】
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【０１６９】
【表９】
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【０１７０】
【表１０】
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【０１７１】
【表１１】
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【０１７２】
【表１２】
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【０１７３】
【表１３】
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【０１７４】
【表１４】
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【０１７５】
【表１５】
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【０１７６】
【表１６】
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【０１７７】
（実施例２２）アンチセンス化合物の脂肪細胞増殖分化に及ぼす影響
（１）細胞の播きこみ
まずヒト前駆脂肪細胞（Human Preadipocytes-sq  POIETICS ＃PT-5020三光純薬）を増殖培地（＃PT-8200、三光純薬）にて懸濁し、９６穴培養プレートに１×１０４cells／well／１００μＬで添加し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で一晩培養した。【０１７８】
（２）アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの導入
脂肪前駆細胞を一晩培養の後、血清を含まないＤＭＥＭ培地で細胞を２回洗浄しOpti-ＭＥＭ培地を８０μＬ/wellを添加した。
遺伝子導入試薬Lipofectinを２０μｇ/mLとなるようにOpti-ＭＥＭ培地で希釈して室温で３０分静置した。次に合成したアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを９０℃で３分間加熱後、氷上で急冷し、最終添加濃度の１０倍濃度となるようにOpti-ＭＥＭ培地で希釈した。このLipofectinならびにアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドのOpti-ＭＥＭ培地溶液を等量混合し、室温で１５分間インキュベート後９６穴プレートに２０μＬ/well添加した。３７℃、５％ＣＯ２存在下で４時間培養し、以下の検討に供した。【０１７９】
（３）脂肪前駆細胞の分化刺激
分化培地は、増殖培地（＃PT-8200、三光純薬）および添加試薬キットＰＧＭ Single Quots，＃PT-9500（三光純薬）を用いてキットの説明書に従って調製した。次に（２）で調製した９６穴プレートより、Lipofectinを含む培養上清を除去した。血清を含まないＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、作成した分化培地を１００μＬ/well添加し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で５日から１５日間培養を行なった。【０１８０】
（４）増殖分化の検討
脂肪細胞中の中性脂肪の蓄積をAdipo Red染色液による蛍光測定により定量した。
９６穴プレートをＣＯ２インキュベータより取り出した後、室温になるまで静置した。プレートを３００ｇ（１２００rpm.）で１０分間、室温で遠心し培地を除去した。次にＰＢＳ(ＳＩＧＭＡ)を２００μＬ／wellでやさしく洗浄した後、ウェルに２００μＬ／well のＰＢＳを添加した。
次に５μＬ／wellのＡｄｉｐｏ Ｒｅｄ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ(Ａｄｉｐｏ Ｒｅｄ， Ｃａｔ． ＃ＰＴ―７００９， Ｌｏｔ．３Ｆ０４９７， Ａ Ｃａｍｂｒｅｘ Ｃｏｍｐａｎｙ)を添加し、１０分間以上室温にて静置し脂肪細胞に蓄積した中性脂肪を染色した。これを蛍光測定装置にて励起光４８５ｎｍ,  発光波長５３５ｎｍで蛍光強度を測定することで脂肪の蓄積を計測した。【０１８１】
（５）脂肪細胞分化の判定
アンチセンス化合物を導入しないウェルの蛍光強度を１００％として、アンチセンス化合物導入群のウェルの蛍光強度を換算し、脂肪細胞分化の抑制率を算出し、結果を表７に示す。抑制率２５％以上を＋、５０％以上を＋＋、７５％以上を＋＋＋としてスコア化した。
【０１８２】
(６)アンチセンス化合物の脂肪細胞増殖分化に及ぼす影響  表６に記載されたアンチセンス化合物の内、表９に記載したもののヒト脂肪細胞分化抑制作用を実施例２１の方法に準じて検討した。その結果、表９に記載したアンチセンス化合物もヒト脂肪細胞の分化を抑制することが示された。【０１８３】
【表１７】
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【０１８４】
(実施例２３)アンチセンス化合物のRNaseH依存活性の検討
実施例２１においてメルトリンα発現抑制活性を示したアンチセンス化合物において、ＲＮaseＨにより認識されない様に、配列中の全ての塩基に2'-メトキシ（2'-Ｏ-ＣＨ３）修飾したアンチセンス化合物を合成した。このアンチセンス化合物と元のホスホロチオエート体を実施例２１の方法に準じてメルトリンα発現抑制活性を比較検討した。その結果、表９に示した配列の内、番号Ｈ１３０、Ｈ１３１Ｈ１４４＋１８及びＨ１５１はホスホロチオエート体に比べて2'-メトキシ修飾体でメルトリンα発現抑制活性が低下したことから、各々ＲＮaseＨ依存活性を有していることが確認された。【０１８５】
（実施例２４）メルトリンαの高脂肪食負荷における血中パラメータに対する作用
メルトリンαの糖代謝に対する影響を検討するため、栗崎ら(Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２３：５５―６１；２００３)により作製されたメルトリンαＫＯマウス及びメルトリンαへテロ欠損マウスならびに野生型マウスに高脂肪食負荷を２４週間実施し、マウス個体の体重ならびに血中インスリン、レプチン、グルコース濃度を測定した。インスリンの濃度はレビスＲインスリンーマウス  Ｕタイプ（シバヤギ）を、レプチンの濃度はマウスレプチン測定キット（モリナガ）を各々用いて測定した。またグルコースの測定はグルコースＣIIテストワコー（和光純薬）を用いて測定した。図１８ないし２１に示すように、メルトリンαの発現が抑制されることで、ＫＯマウスでは高脂肪食負荷による体重の増加ならびに血中インスリン濃度及び血糖値の上昇が抑えられ、へテロ欠損マウスでは高脂肪食負荷による血中インスリン濃度及び血糖値の上昇が抑えられた。この結果は、野生型マウスとヘテロ欠損マウスの体重が同程度であることから、血中インスリン濃度と血糖値への作用が単に体重増加抑制の結果でないことを示している。このことから、メルトリンαの抑制により、肥満形成を阻害する（抗肥満）のみならず、高血糖及び高インスリン血症の発症を抑制（抗糖尿病）することが示された。【０１８６】
（実施例２５）メルトリンαアンタゴニストの糖尿病予防・治療効果
（１）１型糖尿病に対する効果
１型糖尿病モデル動物の一種であるストレプトゾトシン（ＳＴＺ）糖尿病モデルラットを用いて、メルトリンαアンタゴニストの１型糖尿病予防・治療効果を次のようにして調べる。約４週齢の雄のＳＤラットに６５ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシンを腹腔内に投与し、糖尿病を誘発させる。１週間後に高血糖，尿糖，多食，多飲を示したラットについて以下の実験に供する。作製したＳＴＺ糖尿病モデルラットに、実施例１８に準じた用量でメルトリンαアンタゴニストを１〜１５週間投与し、飼育開始から１週間毎に２０時間絶食後のラット尾静脈から採血し、血糖値を測定する。さらに、０週目より隔週でブドウ糖負荷試験を行なう。すなわち、２０時間の絶食後、ゾンデを用いて２ｇ／ｋｇのブドウ糖を経口投与し、ブドウ糖投与前（０時間）、投与０時間後，０．５時間後，１時間後，１．５時間後，２時間後にそれぞれ尾静脈から採血し血糖値を測定する。試験期間中の空腹時血糖値の変化の結果から、空腹時血糖値の上昇の抑制が、及び／または、糖負荷試験の結果から、耐糖能の改善が確認され、メルトリンαアンタゴニストには１型糖尿病の予防・治療効果があることが示される。【０１８７】
（２）２型糖尿病に対する効果
２型糖尿病モデル動物の１種であるＫＫＡY糖尿病モデルマウスを用い、１型糖尿病と同様にメルトリンαアンタゴニストの効果を次のようにして調べる。約４週齢のＫＫＡY／ＴａＪｃｌマウスを１週間予備飼育した後、実施例１８に準じた用量でメルトリンαアンタゴニストを１〜１５週間投与する。飼育開始から１週間毎に、５時間絶食後のマウス眼底からキャピラリー採血管を用いて採血し、血糖値を測定する。さらに、飼育開始から５週後にブドウ糖負荷試験を行なう。すなわち、２０時間絶食した後、ゾンデを用いて２ｇ／ｋｇのブドウ糖を経口投与し、ブドウ糖投与前（０時間），投与後０．５時間，１時間，１．５時，２時間後に眼底から採血し血糖値及び血中インスリン値を測定する。試験期間中の空腹時血糖値の変化の結果から、空腹時血糖値もしくは血中インスリン値の上昇の抑制が、および／または、糖負荷試験の結果から、耐糖能の改善が確認され、メルトリンαアンタゴニストには２型糖尿病の予防・治療効果があることが示される。【０１８８】
(実施例２６)抗メルトリンα抗体の可変領域アミノ酸配列の決定
実施例１０のメルトリンαプロテアーゼ阻害活性を持つ抗体(抗体Ｎｏ．１２９、クローンＮｏ．Ｆ１１９６−１５２−２)ならびに実施例１０と同様の方法にてメルトリンαプロテアーゼ阻害活性が確認された抗メルトリンα抗体(Ｆ１１９６−１１４−２、Ｆ１１９６−１１３−１)の可変領域のアミノ酸配列決定の例を示す。すなわち、目的とする抗メルトリンαモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからＲＮｅａｓｙＭｉｃｒｏ Ｋｉｔ (キアゲン)を用いてトータルＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒRT-PCRキット(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)にて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。得られた一本鎖ｃＤＮＡを鋳型としたＭｏｕｓｅＩｇ−Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ(Ｎｏｖａｇｅｎ)によるＰＣＲで可変領域を増幅し、このＰＣＲ増幅で得られたＤＮＡ断片を鋳型に常法に従い重鎖可変領域および軽鎖可変領域の塩基配列を決定した。クローンＮｏ．Ｆ１１９６−１１３−１、Ｆ１１９６−１１４−２及びＦ１１９６−１５２−２の塩基配列（重鎖可変領域；配列番号３９ないし４１、軽鎖可変領域；配列番号４２ないし４４）およびそれらにコードされるアミノ酸配列（重鎖可変領域；配列番号４５ないし４７、軽鎖可変領域；配列番号４８ないし５２）を配列表および表１０に示した。これらの内、Ｆ１１９６−１５２−２の軽鎖については、５’端の約50塩基が解読不能であったため、公開データデース中の最も相同性の高い配列（XM_485751）との比較から推定される塩基数分の配列を「ｎ」として配列表に記載した。また、可変領域のアミノ酸配列におけるCDR部分の配列をKabatの定義に従って、表１０に示した。なお、これらのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ３株は、２００５年８月２日付で日本国茨城県つくば市東一丁目１番１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託された（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０３８３［Ｆ１１９６−１１３−１］、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０３８４［Ｆ１１９６−１１４−２］、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０３８５［Ｆ１１９６−１５２−２］）。【０１８９】
【表１８】
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【０１９０】
（実施例２７）遺伝子組換えによるマウス-ヒトキメラ抗体の産生
抗原結合活性を有するV領域がハイブリドーマ抗体由来、すなわちマウス抗体由来であり、C領域がヒト由来の抗体（キメラ抗体）を以下のように作製する。【０１９１】
（１）マウス-ヒトキメラ抗体発現プラスミドの構築
抗メルトリンα抗体マウス-ヒトキメラ抗体発現プラスミドの構築は以下のように行う。
まず重鎖可変領域をコードする遺伝子断片Ｃを調製する。一方、重鎖定常領域をコードする遺伝子断片Ｄを調製する。これらの断片を、発現ベクターｐＥＦ２ｃｅｗのEFプロモーター下流に、断片Ｃ+断片Ｄとなるように連結し、重鎖発現プラスミドを構築する。次に軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ断片Ｅを調製する。また、ヒト軽鎖定常領域をコードするＤＮＡ断片Ｆを調製し、これらの断片を発現ベクターｐＥＦ２ｃｅｗのＥＦプロモーター下流に断片Ｅ+断片Ｆとなるように連結し、各軽鎖発現プラスミドを構築する。【０１９２】
（２）組換えマウス-ヒトキメラ抗体の発現およびメルトリンαに対する結合活性の確認
構築したマウス-ヒトキメラ抗体発現プラスミドの発現および精製は実施例５と実施例７に示した方法と準じて行う。すなわち、目的とするクローンのマウス-ヒトキメラ抗体の重鎖発現プラスミドおよび軽鎖発現プラスミドをＣＯＳ−１細胞に対してコトランスフェクションし、３７℃にて３日間培養後、その培養上清をプロテインＡカラムにて精製する。得られたマウス-ヒトキメラ抗体はＳＤＳ−ＰＡＧＥにてその精製度を確認した後、ヒトメルトリンαに対する結合能を確認する。まず、実施例５にて作製したヒトメルトリンαをＤ−ＰＢＳで２μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、ＮＵＮＣ）に５０μＬ／ウェル添加する。次に、３７℃で１時間反応後、イオン交換水で５回洗浄し、２％ＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ）を含むＤ−ＰＢＳを各ウエルに１００μＬ添加することによりブロッキングする。次に精製したマウス-ヒトキメラ抗体を各ウエルに添加し３７℃で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で３回洗浄する。ペルオキシダーゼ標識抗ヒト軽鎖Κ抗体（ＤＡＫＯ）を１０％ウサギ血清含有Ｄ−ＰＢＳで１０００倍に希釈し、各ウエルに５０μＬ添加する。３７℃で１時間反応後、同様に５回洗浄しＴＭＢ溶液（ＢｉｏＦｉｘ）を各ウエルに添加する。室温で１０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止し、プレート分光光度計（マルチスキャンＪＸ、大日本製薬）で４５０ｎｍの吸光度を測定する。その結果、作製したマウス-ヒトキメラ抗体はヒトメルトリンαに結合することが確認される。【０１９３】
（実施例２８）ヒト化抗体の作製
Ａ．ヒト化抗体の作製（方法１）
（１）ヒト化Ｆ抗体可変領域のコンピューターモデリング
ヒト化抗体で高い親和性を保持するために、クイーンらの一般的な方法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６:１００２９，１９８９）に準じてフレームワーク残基の選択を行う。ヒト配列はＫａｂａｔら(Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ ｅｄ．， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， １９９１)のκ軽鎖及び重鎖配列データベースに基づき、抗ヒトメルトリンαマウスモノクローナル抗体に高いフレームワーク相同性を有する配列を選択する。さらに、コンピューター解析により最も適したフレームワーク中のアミノ酸の改変を行う。具体的にはコンピュータープログラムＥＮＣＡＤ（レビット、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｏｉｌ．１６８＊５９５(１９８３)）や、Ｈｏｍｍｏｌｏｇｙ(アクセルリス社)、FAMS（ＳＧＩ社）などのタンパク質モデリングツールを用いて抗体可変領域の分子モデルの構築を行う。抗体データベースより得られたヒトＥｕ抗体分子モデル（Ｓｔｅｐｈｅｎｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８５ (４)， ６６８−６７４ (１９９５)に抗体のＣＤＲ配列をＦＲ中に移植する。分子最適化計算や分子動力学計算などの最適化やシミュレーション解析を通じて、コンピューターモデル上でＣＤＲとＦＲが本来のヒト抗体モデルとは異なり、有意な接触を示すＦＲ領域で、アミノ酸置換を行うことによりＣＤＲとＦＲとの接触が改善されると予想される位置についてマウス抗体由来のアミノ酸の置換を行う。また、ヒト抗体のデータベース中でその位置においてまれにしか現れないＦＲ中のアミノ酸残基はそれらの位置におけるヒトコンセンサンスアミノ酸に置換する。アミノ酸置換の良否は実際の活性により確認することになるため、アミノ酸置換の異なるタイプの抗体を数種類作製する。【０１９４】
（２）ヒト化抗体の構築
実施例２６で選択された配列を基に、シグナルペプチド、スプライス供与シグナル及び制限サイトを含むアミノ酸配列をコードする遺伝子を構築する。構築した遺伝子は合成ヌクレオチド（８０塩基長程度）を数種類オーバーラップするように調製する。すなわち、オリゴを対にしてアニールし、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片で伸長し、２本鎖断片を得る。この断片を変性し１本鎖にした後、同様にアニールし、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片で伸長し、全長の遺伝子をコードする２本鎖断片を得る。得られる断片をＰＣＲで増幅し、精製後に制限酵素で切断し精製する。精製した断片をヒトIgGs定常領域遺伝子のＣＨ1エクソンからＣＨ３エクソンまでを含む遺伝子断片と連結し、発現ベクターpEF2cewのEFプロモーター下流に組み込むことでヒト化重鎖発現プラスミドを構築する。また、置換するアミノ酸の数が少ない場合は部位特異的突然変異法によりアミノ酸変異を発現プラスミドに導入することも可能である。軽鎖可変領域配列は上記と同様に構築可能である。
抗体を産生する形質転換体を作製するため、重鎖及び軽鎖プラスミドを制限酵素で切断して直線化後、マウスミエローマ細胞Ｓｐ2-Ｏ-ａｇ１４（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）中へジーンパルサー（ＢＩＯＲＡＤ）を用いて導入する。例えば直線化したＤＮＡ断片約２０μｇを1×107細胞に３６０Ｖ、２５μＦＤのキャパシタンスでエレクトポレーションを行う。次に細胞を９６穴プレートに植え込み、２日間培養後、プラスミド断片が組み込まれた細胞を選択するため、10％ＦＣＳ、1×ＨＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２５mg／mlXanthine、1μg／mlMycophenolic  acidを含むＤ-ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、更に２週間培養する。培養後上清中の抗体を解析することにより、目的とするヒト化抗メルトリンα抗体産生細胞株を選択する。すなわち、培養上清中の抗体が固相化したメルトリンαと結合し、結合する抗体をペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧｓ抗体で検出する。結合が認められた抗体産生細胞株はコンフルエントになるまで10％ＦＣＳを含む培地で培養し、無血清培地（Hybridoma  SFM、Invitrogen）に交換する。培養上清を回収し、培養上清中に含まれる抗体をプロテインＡ（Ｐｒｏｓｅｐ-Ａ、ミリポア）に結合させ、0.1Ｍ  グリシン塩酸（ｐＨ３．０）で溶出する。精製抗体をＰＢＳ-（Ｓｉｇｍａ）で透析し、２８０ｎｍの吸光度より抗体濃度を算出する（ヒト抗体１ｍｇ／ｍＬは約１．３の吸光度を示す）。【０１９５】
（３）ヒト化抗体の評価
ヒト化抗体のメルトリンαとの結合活性は実施例8の方法に準じて確認される。また、ヒト化抗体と元のマウス抗体の結合能をＢＩＡＣＯＲＥシステム（ＢＩＡＣＯＲＥ社）を用いて測定する。すなわち、ＢｉＡＣＯＲＥ３０００のマニュアルにしたがってＣＭ５チップ（ＢＩＡＣＯＲＥ社）に精製ヒトメルトリンαを固定化する。次にＨＢＳ-ＥＰバッファー（ＢＩＡＣＯＲＥ社）で希釈した抗体希釈列を作製し、各サンプルをインジェクトする。得られたデータをＢＩＡＣＯＲＥの解析プログラム（ＢＩＡ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ、ＢＩＡＣＯＲＥ）を用いて解析し、アフィニティー（Ｋｄ）を算出し、ヒト化抗体と元のマウス抗体の結合能を比較する。【０１９６】
Ｂ．ヒト化抗体の作製（方法２）
（１）ヒト化抗体遺伝子の作製
ヒト化抗体において移植するＣＤＲ配列が活性を有する適切なドメイン構造として維持させるためには元のＦＲ領域の配列も合わせて移植する方法もまた有効である。ＣＤＲドメイン構造の維持にどのアミノ酸が関与しいているかは、ＦＲ中のアミノ酸の性質（疎水性、親水性、酸性、塩基性、分子サイズ等）から推定でき、またコンピューターを用いたモデリングにより推定可能である。すなわち、シリコングラフィック上で起動するソフトウエアーＱＵＡＮＴＡ/ＣＨＡＲＭｍあるいはModeler（モレキュラー・シュミレーションズ）を用いてモデリングを行う。Brookhaven  Protein  Data  Bank（ＰＤＢ）に登録されているヒト抗体配列より抗メルトリンα抗体のＶＨ及びＶＬ領域と相同性の高い抗体の三次元構造を検索し、それに基づき抗メルトリンα抗体の三次元構造を推定する。推定三次元構造上で重鎖及び軽鎖のＣＤＲに水素結合しているＦＲ領域中のアミノ酸群（第1群）を選出し、更にそれらに水素結合しているＦＲ領域中のアミノ酸群（第２群）を選出する。同様に、ＣＤＲに静電的相互作用やファンデルワールス力等のエネルギー結合により結合していると推定されるＦＲ領域中のアミノ酸群（第１群）と更にそれらに結合していると推定されるＦＲ領域中のアミノ酸群（第２群）を選択する。このようにして選択したＦＲ領域中のアミノ酸群をＣＤＲアミノ酸と併せてヒト抗体配列上に移植するが、Ｋａｂａｔらの分類(Sequences of proteins of immunological interest， ５th ed．， U．S． Department of Health and Human Services， 1991)やＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）等より得られるヒト抗体配列の可変領域アミノ酸には存在しないような配列が生じる場合は、そのアミノ酸は移植しない。このようにして得られた情報に基づきヒト抗体配列ＶＨ及びＶＬに移植する配列を決定し、ヒト化抗体作製に用いる遺伝子を構築する。
構築した遺伝子はアマシャムのキット(Oligonucleotide―directed in vitro mutagenesis system version ２)とＰＣＲ法を組み合わせる方法、また数種類の長鎖合成ヌクレオチドを組み合わせて増幅する方法、キメラ抗体のＶＨあるいはＶＬ遺伝子を鋳型に数種類のプライマーを用いて増幅後、さらにそれら増幅遺伝子断片を鋳型として全長遺伝子断片を得る方法により作製する。得られた増幅遺伝子断片を定常領域遺伝子断片と連結し、発現ベクターpEF2cewのEFプロモーター下流に組み込むことで、ヒト化抗体発現プラスミドを構築する。作製したプラスミドは実施例２８のＡ（２）に記載の方法により細胞に導入し、形質転換体を得、同様に精製抗体を作製する。また、実施例２８のＡ（３）と同様に抗体の評価を行う。【０１９７】
【表１９】
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【０１９８】
【表２０】
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【０１９９】
【表２１】
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【０２００】
【表２２】
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【０２０１】
【表２３】
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【０２０２】
【表２４】
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【０２０３】
【表２５】
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【０２０４】
【表２６】
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【０２０５】
【表２７】
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【０２０６】
【表２８】
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【０２０７】
【表２９】
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【０２０８】
【表３０】
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【０２０９】
【表３１】
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【０２１０】
【表３２】
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【０２１１】
【表３３】
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【０２１２】
【表３４】
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【０２１３】
【表３５】
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【０２１４】
【表３６】
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【０２１５】
【表３７】
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【０２１６】
【表３８】
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【０２１７】
【表３９】
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【０２１８】
【表４０】
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【０２１９】
【表４１】
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【０２２０】
【表４２】
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【０２２１】
【表４３】
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【０２２２】
【表４４】
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【０２２３】
【表４５】
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【０２２４】
【表４６】
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【０２２５】
【表４７】
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【０２２６】
【表４８】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図３】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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