(57)【要約】従来試みられてきた免疫療法は必ずしも充分な効果を得ることができず、制癌剤や放射線等による細胞への直接的攻撃に頼らざるを得なかった。本発明は、生体が本来的に有する免疫力を高めることにより従来の治療方法よりも副作用が少ない、しかもより効果的な治療方法を提供することを目的とする。即ち、本発明は、ＭＩＰ−１α又はその機能的誘導体を有効成分とする免疫増強剤である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＩＰ−１α又はその機能的誘導体を有効成分とする免疫増強剤
【請求項２】
炎症を生起させた状態でＭＩＰ−１α又はその機能的誘導体を投与することを特徴とする請求項１記載のガン治療用免疫増強剤
【請求項３】
炎症を生起させる手段が放射線照射、アジュバント投与、患部の凍結融解、超音波照射から選ばれることを特徴とする請求項２記載のガン治療用免疫増強剤
【請求項４】
（ａ）アジュバントを有効成分として含有する医薬と、（ｂ）ＭＩＰ−１α又はその機能的誘導体を有効成分として含む医薬とからなる免疫療法用組成物であって、（ａ）及び（ｂ）を同時に又は経時的に投与することを特徴とする免疫療法用医薬組成物
【請求項５】
ガン転移を予防するためにＭＩＰ−１α又はその機能的誘導体を投与することを特徴とする請求項１記載の免疫増強剤
【請求項６】
免疫異常疾患を治療するためにＭＩＰ−１α又はその機能的誘導体を投与することを特徴とする請求項１記載の免疫増強剤
【請求項７】
ＭＩＰ−１αの機能的誘導体がｅＭＩＰである請求項１〜６記載の免疫増強剤
【請求項８】
ＭＩＰ−１αの機能的誘導体が両親媒性高分子で化学修飾されたＭＩＰ−１α又はｅＭＩＰであることを特徴とする請求項１〜６記載の免疫増強剤
【請求項９】
ＭＩＰ−１αの機能的誘導体が部分アルキルエステル化スチレン−マレイン酸共重合体又はポリエチレングリコール誘導体化学修飾されたＭＩＰ−１α又はｅＭＩＰである請求項１〜６記載の免疫増強剤
【請求項１０】
ＭＩＰ−１α又はその機能的誘導体を投与する免疫増強方法
【請求項１１】
炎症を生起させた状態でＭＩＰ−１α又はその機能的誘導体を投与する免疫増強によるガン治療方法
【請求項１２】
炎症を生起させる手段が放射線照射、アジュバント投与、患部の凍結融解、超音波照射から選ばれることを特徴とする請求項１１記載のガン治療方法
【請求項１３】
（ａ）アジュバントを有効成分として含有する医薬と、（ｂ）ＭＩＰ−１α又はその機能的誘導体を有効成分として含む医薬とを用い、（ａ）及び（ｂ）を同時に又は経時的に投与することを特徴とする免疫増強方法
【請求項１４】
ＭＩＰ−１α又はその機能的誘導体を投与するガン転移予防方法
【請求項１５】
ＭＩＰ−１α又はその機能的誘導体を投与する免疫異常疾患を治療方法
【請求項１６】
ＭＩＰ−１αの機能的誘導体がｅＭＩＰである請求項１０〜１５記載の治療方法
【請求項１７】
ＭＩＰ−１αの機能的誘導体が両親媒性高分子で化学修飾されたＭＩＰ−１α又はｅＭＩＰである請求項１０〜１５記載の治療方法
【請求項１８】
ＭＩＰ−１αの機能的誘導体が部分アルキルエステル化スチレン−マレイン酸共重合体又はポリエチレングリコール誘導体で化学修飾されたＭＩＰ−１α又はｅＭＩＰである請求項１０〜１５記載の治療方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、免疫増強剤に関わり、例えば、ガン治療、ガン転移予防或いは花粉症等の免疫異常疾患の治療に役立つ免疫増強剤に関わる。
【背景技術】  生体内においては、毎日多くのガン細胞が発生している。多くの場合、発生したガン細胞は異常細胞の排除システムおよび免疫システムにより取り除かれている。加齢あるいはエイズなどの免疫疾患、免疫抑制剤の投与により免疫機能が低下するとガン発生率が上昇することが、免疫システムによるガン排除の可能性を裏付けている。このことから免疫を賦活することによりガンを撲滅せしめる免疫療法が近年注目を集めている。しかし現在行われているガンの免疫療法では、多くの場合十分なガンに対する免疫が誘導されず、効果的な治療とはなっていない。
ガンに対する免疫誘導において、樹状細胞が重要な働きをしていることが知られている。我々はすでにＭＩＰ−１α及びその機能的誘導体が炎症局所あるいはガン局所に樹状細胞を集積させる能力があること、さらに血中に樹状細胞前駆細胞を数十倍のオーダーで動員させうることを見出している（Ｙｏｎｅｙａｍａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．Ｖｏｌ．１９３（１）ｐｐ．３５−４９（２００１），Ｚｈａｎｇ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，Ｖｏｌ．９６，ｐｐ．２０１−２０９（２００４））。また免疫誘導のマウスモデルにおいて、ＭＩＰ−１αを免疫局所で発現させると、樹状細胞の集積が起こり、抗原特異的な免疫が誘導されることが報告されている（ＭｃＫａｙ  ＰＦ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．３４，ｐｐ．１０１１−１０２０（２００４））。
放射線療法は外科手術、化学療法、ホルモン療法などと組み合わせて利用され、癌細胞の増殖と転移を抑制するために用いられてきた。しかし、癌細胞を完全に排除することは困難であり、免疫系の抑制、食欲減退、貧血、白血球減少、血小板減少などの副作用も見られている。電子線による定位放射線治療では癌組織局所的に治療するので副作用はより低下するが、癌細胞を根絶することは困難である。  それに伴い、電子線照射によって癌組織に誘導した炎症反応や癌細胞に特異的なＴ細胞、樹状細胞の機能を発展・増強させ、より強力にする手段の開発が望まれてきた。
癌の転移という現象が癌患者の予後を決定する最も重要な因子であることは周知の事実である。しかしながら“転移”のメカニズムの解明、および有効な治療法は未だ確立していないのが現状である。癌転移に直接・間接に関与する生体成分も幾つか発見され、それらに対する抗体も作製され、癌転移動物モデルである程度の効果をしめしてはいるものの、ヒトに適用するには至っていない。また、既存の化学療法剤は固形腫瘍に対しては有効であるが、転移に関しては抗癌作用程の効果を示さないものが多い。また、癌細胞の転移抑制に関する薬剤開発が進んでいないという問題点もある。このような現状から、効果的に癌細胞転移を抑制し、癌患者の予後を改善する薬剤の開発が望まれてきた。
ＭＩＰ−１α（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−１α）は、アミノ酸約７０個からなるＣ−Ｃケモカインファミリーに属する分子である。活性化リンパ球、単球などから産生放出され、樹状細胞、単球、Ｔｈ１細胞などの遊走を誘導する。ＭＩＰ−１αは、未熟樹状細胞において発現しているケモカインレセプターであるＣＣＲ１、ＣＣＲ５に対するリガンドとして知られている。（例えば、中野英樹、細胞工学  Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．９，１３０４−１３１０（２０００）参照）。
ＭＩＰ−１αと同様の生物活性を有するＭＩＰ−１α機能的誘導体も知られており、例えば、ＭＩＰ−１αについては、ＭＩＰ−１αの２６番目のＡｓｐをＡｌａに置換し、アミノ末端がＳｅｒより始まる６９アミノ酸よりなるＭＩＰ−１α変異体（以下、ｅＭＩＰと言う）が知られている。このＭＩＰ−１α変異体は著しく改善された抗凝集能を有すると共に野生型と同等の活性を有することが見出され、癌化学療法の副作用である血中の顆粒球減少症の改善について検討されている（Ｅ．Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．７，ｐｐ．１０２３−１０２９（１９９８））。
両親媒性高分子の一種である部分ブチルエステル化スチレン−マレイン酸共重合体で化学的に修飾されたネオカルチノスタチンが制癌剤（一般名称：ジノスタチンスチマラマー）として既に知られている（特公平１−３３１１９号）。これは、血中に投与されたとき、固形腫瘍にほぼ選択的に集積し、長時間にわたり腫瘍内に維持されるという、所謂、ＥＰＲ効果を示すことが知られており、ガン特異的ターゲッティング型の制癌剤として使用されている。また、両親媒性高分子で化学修飾されたペプチド性アゴニスト又はその機能的誘導体も知られている（ＷＯ０１／８３５４８）。更に、ポリエチレングリコールで修飾されたキサンチンオキシダーゼも腫瘍細胞に対してＥＰＲ効果を示すこと
が知られている（特開平１１−０６０４９９号）。これらは、何れも、腫瘍細胞に対して直接的な攻撃性を有する物質を用いて抗腫瘍効果を達成するものであり、攻撃性物質を標的患部に選択的に集積させることにより、正常な細胞や組織への影響を少なくすることを目的としている。
また、両親媒性高分子の一種であるポリエチレングリコール誘導体でタンパク質を修飾することにより、生体内クリアランスを遅延させ、或いは抗原性を低下させることは知られている（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，７７，１２６４（１９８６）、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，７，１７５（１９８４）、特開昭６１−１７８９２６号公報、特開昭６２−１１５２８０号公報、特再表ＷＯ９６／２８４７５号公報、特表平１０−５１３１８７号公報、特開平１１−３１０６００号公報、特表２０００−５１７３０４号公報、）。更に、ポリエチレングリコールで修飾されたインターロイキン−１、インターロイキン−６、インターフェロン等が知られている（特開平５−１１７３００号公報、特開平６−２５６３９４号公報、特開平９−２５２９８号公報）。
【発明の開示】
上述の様に従来試みられてきた免疫療法は必ずしも充分な効果を得ることができず、制癌剤や放射線等による細胞への直接的攻撃に頼らざるを得なかった。本発明は、生体が本来的に有する免疫力を高めることにより従来の治療方法よりも副作用が少ない、しかもより効果的な治療方法を提供することを目的とする。
即ち、本発明者等は、ＭＩＰ−１α及びその機能的誘導体、例えばｅＭＩＰによる免疫力の増強作用に着目し、更には、これ等の両親媒性高分子による化学修飾を試み、化学修飾された物質がその活性を阻害されることなく、寧ろ活性が向上することを見出し、これ等を有効成分とする免疫増強剤を発明するに至った。
ここに、本発明は（１）ＭＩＰ−１α又はその機能的誘導体を有効成分とする免疫増強剤であり、更には、（２）炎症を生起させた状態でＭＩＰ−１α又はその機能的誘導体を投与することによりガンを治療するための免疫増強剤であり、ここで、（３）炎症を生起させる手段として、放射線照射、アジュバント投与、患部の凍結融解、超音波照射等を選ぶことができ、（４）（ａ）アジュバントを有効成分として含有する医薬と、（ｂ）ＭＩＰ−１α又はその機能的誘導体を有効成分として含む医薬とからなる免疫療法用組成物であって、（ａ）及び（ｂ）を同時に又は経時的に投与することを特徴とする免疫療法用医薬組成物である。
また、本発明は、（５）ガン転移を予防するためのＭＩＰ−１α又はその機能的誘導体を有効成分とする免疫増強剤であり、或いは、（６）免疫異常疾患を治療するためのＭＩＰ−１α又はその機能的誘導体を有効成分とする免疫増強剤であり、
（７）免疫異常疾患が花粉症である（６）記載の免疫増強剤である。
本発明で使用しうるＭＩＰ−１αの機能的誘導体として、（７）ｅＭＩＰを選ぶことができ、また、（９）両親媒性高分子で化学修飾されたＭＩＰ−１α又はｅＭＩＰを選ぶことができる。ここで、（１０）両親媒性高分子として部分アルキルエステル化スチレン−マレイン酸共重合体又はポリエチレングリコール誘導体を用いることができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、３ＬＬ坦癌マウスにおけるｅＭＩＰの放射線療法との併用効果を示す。
図２は、電子線放射後１６日間のｅＭＩＰによるアブスコパル効果の増強作用の変化を示す。
図３は、電子線放射後１７日目におけるｅＭＩＰのアブスコパル効果の増強作用を示す。
図４は、３ＬＬ腫瘍に対するアジュバント（Ｐ．ａｃｎｅｓ）療法とｅＭＩＰの併用治療効果を示す。
図５は、ｅＭＩＰによる３ＬＬの肺転移の抑制効果を示す。
図６は、３ＬＬ  ｉｖ移植マウスの肺重量を示す。
図７は、Ｂｕ−ＳＭＡ−ＢＢ１００１０のフラクション毎の２８０ｎｍにおける吸光度を示す。
図８は、Ｂｕ−ＳＭＡ−ＢＢ１００１０及び原料であるＢＢ１００１０のＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明における有効成分の代表例であるＭＩＰ−１αはＣＣサブファミリーに属するケモカインとして知られており、レセプターＣＣＲ１やＣＣＲ５のリガンド（アゴニスト）である。ヒト成熟型ＭＩＰ−１αは７０のアミノ酸よりなるとされているが、ＣＤ８＋Ｔ細胞やＨＴＬＶ−１感染細胞ＭＴ４培養上清から得られるものは６６アミノ酸を有することが知られている。ヒトＭＩＰ−１αには、個人により遺伝子コピー数の異なる非対立遺伝子ＬＤ７８βが存在し、７０アミノ酸型ＭＩＰ−１αとは配列が３残基異なるものが知られている。これ等は何れも本発明において使用できる。
本発明で使用できるＭＩＰ−１α又はその機能的誘導体とは、ケモカインレセプターであるＣＣＲ１またはＣＣＲ５に対するリガンド及びその誘導体であって、アゴニストとしての作用を有する物質を云う。即ち、ＭＩＰ−１αの機能的誘導体とは、ＭＩＰ−１αの誘導体であって、アゴニストとしてＭＩＰ−１αと同様の生物活性を示すものであり、かかる生物学的同等物の代表例としてｅＭＩＰ（既出、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．７，ｐｐ．１０２３−１０２９（１９９８））を挙げることができる。
本発明において免疫増強剤として使用されるＭＩＰ−１α等は部分アルキルエステル化スチレン−マレイン酸共重合体やポリエチレングリコール誘導体で代表される両親媒性高分子で化学的に修飾すると、その活性が維持されると共に、血中安定性が改善されることが確認された。かくして、本発明で使用されるＭＩＰ−１αの機能的誘導体は両親媒性高分子で化学的に修飾されることが好ましく、この様に両親媒性高分子で化学的に修飾されたＭＩＰ−１α及びその生物学的に同等な誘導体も、本明細書において「ＭＩＰ−１αの機能的誘導体」と呼ぶこととする。
本発明においてＭＩＰ−１α又はその生物学的同等物を化学修飾するために用いられる両親媒性高分子の好ましい例として、部分アルキルエステル化スチレン−マレイン酸共重合体を挙げることができ、更に、そのアルキル部分の例としては、直鎖または分枝していてもよい炭素数が１乃至５であるアルキル基を挙げることができ、これ等アルキル基は低級アルコキシ基で置換されていても良い。より具体的には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、３−メチル−１−ブチル、２−メチル−１−ブチル、２，３−ジメチル−１−プロピル、２−ペンチル、３−メチル−２−ブチル、３−ペンチル、２−メチル−２−ブチル、メチルセロソルブ、エチルセロソルブ等を挙げることができる。
好ましい部分アルキルエステル化スチレン−マレイン酸共重合体の例は、特公平１−３３１１９号に記載されている、部分ブチルエステル化スチレン−マレイン酸共重合体であって、平均分子量が１０００〜１００００で、重合度が１乃至１００、好ましくは３乃至３５のものが選ばれる。
本発明においてＭＩＰ−１α又はその生物学的同等物を化学修飾するために用いられる両親媒性高分子の好ましい他の例として、ポリエチレングリコール（以下ＰＥＧと記す場合もある）の誘導体を挙げることができる。ここで、ポリエチレングリコール誘導体とは、−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−で表されるＰＥＧ部分（ｎは２０乃至２８０の整数）がアゴニスト又はその生物学的同等物のペプチド鎖と結合し得る残基を有する化合物を意味する。ポリエチレングリコール誘導体の例としては、ペプチド鎖のアミノ基（Ｎ末アミノ基、リジン残基のアミノ基）に結合できる残基を有するものを挙げることができる。ポリエチレングリコール誘導体の他の例として、ペプチド鎖のカルボキシル基（Ｃ末カルボキシル基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基のカルボキシル基）に結合できる残基を有するものを挙げることができる。
更に、本発明において用いられる両親媒性高分子の他の例として、ポリビニルピロリドンその他を挙げることができる。
本発明に関わる両親媒性高分子で化学修飾されたＭＩＰ−１ａ及びその生物学的同等物は、両親媒性高分子とＭＩＰ−１α及びその生物学的同等物を、場合によりリンカーアームを介して化学結合させ、部分精製することにより得ることができる。即ち、両親媒性高分子とＭＩＰ−１α又はその生物学的同等物とを緩衝液中で反応させ、その後カラムクロマトグラフィを用いて精製し、溶出する各フラクションを分離する。
両親媒性高分子が部分アルキルエステル化スチレン−マレイン酸共重合体である場合を例にとり、より具体的に説明すれば、まず、スチレンと無水マレイン酸のラジカル共重合により得られるスチレン−マレイン酸共重合体（ＳＭＡ）の酸無水物をクメン等の有機溶媒に溶解させ、この溶液にｎ−ブタノールを攪拌下に滴下して反応させ、部分的に無水環をブチルエステル化することで、部分ブチルエステル化スチレン−マレイン酸共重合体（Ｂｕ−ＳＭＡ）を得ることができる。かくして得られるＢｕ−ＳＭＡとアゴニスト又はその生物学的同等物との結合は、両者をｐＨ８．５の重炭酸水素ナトリウム０．３Ｍ溶液中で反応させ、Ｂｕ−ＳＭＡ中の酸無水環とアゴニスト又はその生物学的同等物中のアミノ基との間にアミド結合を形成させることにより行なうことができる。ＭＩＰ−１α又はその生物学的同等物に対するＢｕ−ＳＭＡの結合数は１以上であればよく、好ましくは３乃至１０、より好ましくは６乃至８である。
両親媒性高分子としてＰＥＧを用いて、ＭＩＰ−１α又はその生物学的同等物のペプチド鎖のアミノ基を修飾する場合は、ＰＥＧの端末に、アミノ基と反応し得る官能基、例えば、カルボキシル基を導入することが好ましい。ＭＩＰ−１α又はその生物学的同等物のペプチド中のアミノ基に結合させるためには、該官能基を反応性基に変換することが好ましく、カルボキシル基の場合は、活性エステル法、混合酸無水物法等が好ましい例である。
具体的には、活性エステルの場合、ｐ−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル等のフェニルエステル類、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル等のジカルボン酸イミドエステル、Ｎ−ヒドロキシピペリジンエステル等のヒドロキシル系活性エステル等が挙げられる。これ等の活性エステルの調製は、常法に従って行うことができ、例えば、ＰＥＧ誘導体のカルボキシル基と上記の活性エステルに対応するアルコール体とをジシクロヘキシルカルボジイミドや１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド等の縮合剤を用いて−２０℃乃至室温にて１乃至２４時間反応させることにより行うことができる。或いは、ＰＥＧ誘導体のカルボキシル基と上記活性エステルに対応するハロゲン化物とを、トリエチルアミン等の塩基の存在下に、０℃乃至８０℃で１乃至７２時間反応させることによっても調製することができる。混合酸無水物法の場合は、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン等の塩基の存在下に、イソブチルクロロホルメート、エチルクロロホルメート、塩化イソバレリル等と−２０℃乃至０℃で１乃至３０分間反応させることにより調製することができる。
ＰＥＧ誘導体をＭＩＰ−１α又はその生物学的同等物のペプチド鎖に直接導入することもできるが、リンカーアームを介して導入することもできる。例えば、リジンを含む短いアミノ酸配列を目的とするペプチド鎖に導入し、そのリジンのアミノ基をＰＥＧ誘導体で修飾する。修飾反応においては、修飾されるペプチド鎖に含まれるアミノ基数に対して１０乃至３０倍モルのＰＥＧ誘導体を用いることが好ましい。
両親媒性高分子としてＰＥＧを用いて、ＭＩＰ−１α又はその生物学的同等物のペプチド鎖のカルボキシル基を修飾する場合は、ＰＥＧの端末に、カルボキシル基と反応し得る官能基、例えば、アミノ基を導入することが好ましい。
かくして得られる両親媒性高分子で化学修飾されたＭＩＰ−１α又はその生物学的同等物は、所謂、ＥＰＲ効果により固形腫瘍等の標的患部へと選択的に集積することが期待される。
本発明によるＭＩＰ−１αまたはその機能的誘導体は免疫賦活剤として提供される。すなわち、ＭＩＰ−１αが直接・間接に関与する炎症性疾患、臓器障害、癌の発症予防剤または治療剤として提供される。注射剤として用いられることが好ましいが、注射剤以外の剤形として、例えば、座剤、鼻腔製剤の形で利用することもできる。一般的に使用されている抗がん剤と併用することも可能である。
本発明によるＭＩＰ−１αまたはその機能的誘導体は、がん局所に炎症を誘導し、免疫誘導可能性を高めた上で投与することが好ましい。すなわち、放射線照射、アジュバント投与、患部の凍結融解、超音波照射といった方法により、ガン局所に炎症を生起させ、充分炎症反応が誘起されたと予想される時点で、ＭＩＰ−１αまたはその機能的誘導体を投与することが好ましい。
ガンの放射線療法においては、単にガン細胞を傷害せしめるだけではなく、放射線照射局所に炎症反応を誘起し、その結果照射部位以外のガンにおいても免疫反応を誘導することができることが知られている（ａｂｓｃｏｐａｌ  ｅｆｆｅｃｔ／アブスコパル効果）。本発明によるＭＩＰ−１αまたはその機能的誘導体は一般的に施行されている放射線療法と併用することにより、放射線照射によって生起されるアブスコパル効果を増強し、臨床的効果を更に増強することが可能であることが見出された。
本発明によるＭＩＰ−１αまたはその機能的誘導体は一般的に使用されているアジュバントと併用しアジュバントによって生起される免疫応答を増強し臨床的効果を増強することが可能である。アジュバントとしては、一般的に使用されているクレスチン、ピシバニール、レンチナン、ベスタチンあるいはＰ．ａｃｎｅｓ等と併用することが可能である。
本発明によるＭＩＰ−１αまたはその機能的誘導体は、癌組織の壊死を誘導する凍結融解療法と併用することで癌組織の壊死・退縮を誘導することができる。更に、本発明によるＭＩＰ−１αまたはその機能的誘導体は単独あるいは一般的に用いられている抗癌剤あるいは放射線・凍結融解療法・超音波療法との併用により腫瘍転移抑制作用を目的として使用することができる。
本発明によるＭＩＰ−１αまたはその機能的誘導体は花粉症等の免疫不全による疾病にも適用することができる。ＭＩＰ−１αまたはその機能的誘導体単独あるいは一般的に使用されている抗アレルギー剤、抗ヒスタミン剤等と併用することが可能である。
本発明に関わる免疫増強剤は、有効成分であるＭＩＰ−１α又はその機能的誘導体、即ちタンパク質を非経口的に投与するのが好ましく、例えば、水、若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液体との無菌性溶液又は懸濁液などの注射剤の形で投与されることが好ましい。注射の為の無菌組成物は注射用水のようなビヒクル、天然植物油などを用いて有効成分を溶解又は懸濁させるなどの通常の製剤手段に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、ヤシ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。
本発明で得られるＢｕ−ＳＭＡが結合したＭＩＰ−１α又はその生物学的同等物は、水溶性または油性注射用剤の形で用いることができる。水溶性注射用剤は主に静脈内投与に使用される。油性注射剤は、例えば、リピオドールなどの油剤に均一に分散させたＢｕ−ＳＭＡが結合したＭＩＰ−１α又はその生物学的同等物を腫瘍栄養動脈上流に固定したカテーテルにより腫瘍組織等の標的患部に投与される。Ｂｕ−ＳＭＡが結合したアゴニスト又はその生物学的同等物が血中でアルブミンと結合して高分子化合物として挙動すること及びＢｕ−ＳＭＡ結合物が油剤に可溶となることが本発明者等により見出されており、その結果、油剤化されたＢｕ−ＳＭＡ結合ＭＩＰ−１α又はその生物学的同等物を局所動脈に注射すれば、所謂、ＥＰＲ効果により固形腫瘍等の標的患部へと選択的に集積することが期待される。
このようにして得られる製剤は、例えば、ヒトまたは哺乳動物対して投与することができる。本発明の有効成分の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、非経口的に投与する場合の該有効成分の１回投与量は、例えば、成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一回につき約０．０１〜２０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。本発明に関わる免疫増強剤は、注射剤以外の剤形として、例えば、座剤、鼻腔製剤の形で利用することもできる。
参考例１
ＭＩＰ−１αの製法
ヒトＭＩＰ−１α遺伝子をＰＣＲ法により取得した。該ヒトＭＩＰ−１α遺伝子を発現シャトルベクターｐＮＣＭＯ２に組み込み、大腸菌にて増幅した。該ヒトＭＩＰ−１α遺伝子発現ベクターをＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ（Ｂ．ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）ＨＰＤ３１Ｓ５に導入した。該ヒトＭＩＰ−１α遺伝子導入Ｂ．ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓを培養して、その上清を採取した。該培養上清に４０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、沈殿生成後、遠心にて上清を分離して、さらに６０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、沈殿生成後遠心にて該沈殿物を回収した。該沈殿物をトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に溶解し、該溶解物を陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ；アマーシャム社製）にかけ分画した。各画分のうちＭＩＰ−１αを含む画分を集め、硫酸アンモニウムを加えて溶解した（終濃度１．５Ｍ）。該溶解物を疎水性クロマトグラフィー（ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＰＨＥ；アマーシャム社製）にかけ分画した。各画分のうちＭＩＰ−１αを含む画分（非吸着画分）を集め、硫酸アンモニウムを加えて硫安沈殿を行った（終濃度６０％飽和）。沈殿物をトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に溶解し、該溶解物を再度陰イオン交換クロマトグラフィー（ＲＥＳＯＵＲＣＥ  Ｑ；アマーシャム社製）にかけ分画した。各画分のうちＭＩＰ−１αを含む画分を集め、トリス塩を除く目的で２０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８．５）に対して透析を行った。この処理により生じた沈殿を遠心することにより精製ヒトＭＩＰ−１αを得た。これを凍結乾燥後ＰＢＳに溶解させ、以下の実験に用いた。
参考例２
ｅＭＩＰの製法（発現と精製）
ｅＭＩＰのｃＤＮＡは、ヒトＭＩＰ−１α  ｃＤＮＡをテンプレートとしＱｕｉｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて、部位特異的変異により調製した。すなわち、１２５ｎｇの変異プライマーＲＱ１：５’−ＣＣＡＧＣＧＡＡＧＣＣＧＧＣＡＧＧＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧ−３’（配列番号１）、ＲＱ２：５’−ＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＣＴＧＣＣＧＧＣＴＴＣＧＣＴＴＧＧ−３’（配列番号２）、テンプレートプラスミドＤＮＡ１０ｎｇに５０μＭ  ｄ  ＮＴＰを含む５０μｌの反応系にＰｆｕ−ｔｕｒｂｏ（２．５Ｕ／μｌ）１μｌ添加し、９５℃  ３０秒の変性に続き、９５℃  ３０秒、５５℃  １分、６８度  ７分を１２サイクルおこなった後、反応系に制限酵素ＤｐｎＩを１μｌ添加し、３７℃で１時間反応することによりテンプレートＤＮＡを切断することにより、変異プラスミドのみを回収した。変異部位が正しく置換されたことをＤＮＡ配列解析により確認した後、分裂酵母発現プラスミドベクターｐＴＬ２Ｍ５に挿入した。このプラスミドを用いてＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒａｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅを形質転換し、ｅＭＩＰ発現株を得た。続いて、１００μｇ／ｍｌ抗生物質Ｇ４１８を含むＹＰＤ培地（０．５％  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ，２％  Ｐｅｐｔｏｎｅ，２％  Ｇｌｕｃｏｓｅ）１６Ｌでジャーファーメンターにて３０℃、４８時間培養することにより、培地中に分泌発現させた。この培地上清を０．４５μｍのフィルターを用いて、ろ過除菌したものを精製の出発材料とした。
組換えｅＭＩＰ蛋白の精製は、ＡＫＴＡ−ｐｒｉｍｅシステム（アマシャムバイオサイエンス社）を用いて行った。すなわち、培地上清にギ酸緩衝液（０．５Ｍ  Ｆｏｒｍｉｃ  ａｃｉｄ（ｐＨ４．０））を添加し、終濃度０．０１％になるようにＴｗｅｅｎ２０を加えた。このサンプルを、陽イオン交換カラムＳＰ−ＸＬ（５ｍｌサイズを６本連結したもの、アマシャムバイオサイエンス社）に２ｍｌ／ｍｉｎにて、送液し吸着させた後、１Ｍ塩化ナトリウムを含むギ酸緩衝液（ｐＨ７．０）によりグラジエント溶出した。１０−２０％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にて確認した後、ピーク画分を回収した。これを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析した後、ヘパリンアフィニティーカラム（５ｍｌサイズを４本連結したもの、アマシャムバイオサイエンス社）に２ｍｌ／ｍｉｎにて、送液し吸着させた後、１Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）によるグラジエント溶出した。１０−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認した後、ピーク画分を回収した。収率は、１６Ｌの培養あたり１７５ｍｇであり、生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ（−）（ｐＨ７．４））に透析した後、動物実験に用いた。
参考例３
Ｂｕ−ＳＭＡ結合ｅＭＩＰの製法
参考例３で得られたｅＭＩＰを濃度が２ｍｇ／ｍｌとなるように、０．８Ｍ重炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解させた。この溶液１ｍｌに対し、ジエチルホルムアミドに溶解したＢｕ−ＳＭＡ  ２．６ｍｇ（モル比にして、Ｂｕ−ＳＭＡ：ｅＭＩＰ＝１０：１）を徐々に加え、一晩、２７度で反応させた。反応終了後、反応混合物をゲルろ過クロマトグラフィー（充填剤：バイオラッド社製Ｂｉｏ−ＧｅｌＰ６０、移動相：２０ｍＭ重炭酸水素アンモニウム溶液（ｐＨ８．５）、カラムサイズ：１．６×８３ｃｍ）に付してＢｕ−ＳＭＡ結合ｅＭＩＰを精製した。２ｍｌごとに９０本の試験管に分離した（図７）。次いで、２８０ｎｍにおける吸光度に基づき、試験管番号１６〜１８に溶出した画分（６ｍｌ）を凍結乾燥させて白色粉末状のＢｕ−ＳＭＡ結合ｅＭＩＰ（以下において、「Ｂｕ−ＳＭＡ−ｅＭＩＰ」と表示する）を得た。
得られたＢｕ−ＳＭＡ−ｅＭＩＰおよび原料であるｅＭＩＰのＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ（未変性１０−２０％グラジエントポリアクリルアミドゲル電気泳動）の結果を図８に示す。両者の泳動距離は、明らかに異なっている。これは、ｅＭＩＰのリジンのアミノ基がＳＭＡによって修飾されたことにより表面のプラスチャージが減少し、より陽極側に泳動されやすくなったためと考えられる。この両者の泳動距離の差およびフラクションＮｏ．１６〜１８のＢｕ−ＳＭＡ−ｅＭＩＰと、未反応のＢｕ−ＳＭＡおよびｅＭＩＰのアミノ基を蛍光試薬Ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ（０．３ｍｇ／ｍｌ  ｉｎ  ａｃｅｔｏｎｅ）と反応させ、分光蛍光計で、励起波長３９０ｎｍ、蛍光波長４７５ｎｍで測定し、定量し、１分子に２〜３個のＳＭＡが結合していると見積もられた。
【実施例１】ｅＭＩＰの放射線療法との併用
１）  実験方法
７週齢，雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスとＬｅｗｉｓ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ（３ＬＬ）を用い、固形腫瘍における電子線照射とｅＭＩＰの併用効果を評価した。
３ＬＬ  ４×１０５個を側腹部皮下移植後、固形癌の径が１ｃｍ程度になった時点（１９日後）で固形癌の大きさを揃えて再群分けし、癌組織に電子線を照射。翌日にｅＭＩＰを尾静脈より投与。以後週１回ｅＭＩＰ投与を継続し、計４回投与した。  対照薬として５Ｆｕを用い、電子線照射の翌日から２５ｍｇ／ｋｇで週２回腹腔内に投与した。
腫瘍体積は以下に示すＪａｎｉｋらの式に従って算出した。
（腫瘍体積）＝（腫瘍の長径）×（腫瘍の短径）２×０．５２３６
２）実験結果
３ＬＬ肺癌細胞の増殖において、電子線照射では２，６，１０Ｇｙで線量依存的に固形癌の増殖が抑制された。  ｅＭＩＰ  ５０・ｇ／ｍｏｕｓｅ単独でも抑制する傾向は見られたが、有意な作用ではなかった。  電子線照射とｅＭＩＰ  ５０・ｇ／ｍｏｕｓｅを併用すると、ｅＭＩＰは電子線６および１０Ｇｙの腫瘍抑制作用を有意に増強した（図１Ａ，Ｂ）。
図１（Ａ）はｅＭＩＰと電子線６Ｇｙの併用効果を示す。  ３ＬＬ担癌マウス（ｎ＝５）の固形癌径１ｃｍ前後の時点で電子線照射し、翌日にｅＭＩＰをｉｖ投与し、以後週１回ｉｖ投与した。図において
2006080171.tif 000002
はｅＭＩＰを投与した日を示す。
図１（Ｂ）は電子線照射１６日目におけるｅＭＩＰの抗腫瘍作用を示す（ｎ＝５）。  「＊」はｐ＜０．０５を、「＊＊」はｐ＜０．０１（ＡＮＯＶＡ）を、「＃」はｐ＜０．０５（ｔ−ｔｅｓｔ）を夫々示す。
【実施例２】アブスコパル効果の増強作用
１）  実験方法
７週齢，雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスとＬｅｗｉｓ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ（３ＬＬ）を用い、左右側腹部に移植した固形腫瘍に対する電子線照射と、ｅＭＩＰの併用効果とを比較して評価した。
３ＬＬ  ４×１０５個をＣ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部皮下に移植（ｐｒｉｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒ）し、同時に３ＬＬ  ２×１０５個を左側腹部皮下に移植した（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｔｕｍｏｒ）。右側腹部の腫瘍径が約１ｃｍになった時点（１９日目）で腫瘍径で再群分けを行い直線加速器により右側腹部の腫瘍に電子線照射を行った（電子線放射量６Ｇｙ）。電子線照射の翌日にｅＭＩＰを静脈内投与した。以後、８日後及び１５日後の計３回投与した。左右側腹部の腫瘍径を測定し、腫瘍体積により抗腫瘍作用を評価した。
腫瘍体積は以下に示すＪａｎｉｋらの式に従って算出した。
（腫瘍体積）＝（腫瘍の長径）×（腫瘍の短径）２×０．５２３６
２）  実験結果
電子線照射後１６日までの両側腹部腫瘍体積の変化を図．２に、１７日目の結果を図３に示した。なお、図２及び図３において、（Ａ）は、右側腹部腫瘍に対する電子線照射の変化を示し、（Ｂ）は左側腹部腫瘍に対する電子線照射の変化を示す。
図２（Ａ）の「−■−」が示すように、右側腹部腫瘍に対する電子線照射により右側腹部腫瘍の増殖は抑制されたが、図２（Ｂ）の「−■−」が示すように、逆側の左側腹部腫瘍は抑制されなかった。  興味深いことに、ｅＭＩＰの併用により、２μｇ／マウスの投与で電子線照射していない左側腹部腫瘍を６０％以上有意に抑制した。  また、電子線照射した右側部腫瘍においても２及び１０μｇ／マウスの投与で電子線の抗腫瘍効果を有意に増強した（図３）。なお、図４において、「＊」はコントロール群（Ｃｏｎｔ）に対する有意さがｐ＜０．０５であることを意味し、「＊＊」はｐ＜０．０１（ＡＮＯＶＡ）であることを意味する。
かかる結果は、ｅＭＩＰがアブスコパル効果を増強することを示すもので、ｅＭＩＰが放射線照射した腫瘍部位における炎症や免疫応答の増強だけではなく、全身的な抗腫瘍免疫応答を活性化することを示している。
実際、放射線照射及びｅＭＩＰの投与を行った３ＬＬ担癌マウスでは、脾臓中にγ−インターフェロン産生細胞が増加しており、その増加は対照及び放射線照射したのみのマウスより有意に高かった。
この結果から、ｅＭＩＰは電離放射線治療において、照射した腫瘍だけではなく転移巣などの非照射部位の腫瘍に対しても有効な治療法を提供すると言うことができる。
【実施例３】ｅＭＩＰとアジュバントとの併用効果
１）  実験方法
８−１０週齢，雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスとＬｅｗｉｓ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ（３ＬＬ）を用い、固形腫瘍におけるアジュバント療法とｅＭＩＰの併用効果を評価した。
３ＬＬ  ２×１０５個を皮下移植後、１，８，１５，２２日目に２０μｇのＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ（１１８２８；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）死菌を４０μＬのＰＢＳに懸濁したものを同所皮下注射し、２，９，１６，２３日目に２０μｇのｅＭＩＰを１００μｌのＰＢＳに溶解したものを尾静脈より投与した。
腫瘍の増殖は、腫瘍部の長径を測定することにより算定した。
２）実験結果
３ＬＬ肺癌細胞の増殖において、アジュバント（Ｐ．ａｃｎｅｓ）単独で有意な増殖抑制活性がみられた。さらにアジュバントに加えｅＭＩＰを週に一回投与することにより、腫瘍の増殖はほぼ完全に抑制された。ｅＭＩＰ単独では、有意な抑制効果は認められなかった（図４Ａ）。マウスの生存率もコントロール、ｅＭＩＰ単独では７０−１００日で全例死亡したが、アジュバント投与単独で５０％、アジュバントに加えてｅＭＩＰを週一回投与することにより１００％のマウスが１００日以上生存した（図４Ｂ）。図４Ａは、３ＬＬを皮下注射し、１，８，１５，２２日目にＰ．ａｃｎｅｓ死菌を皮下注射し、２，９，１６，２３日目にｅＭＩＰを尾静脈より投与した結果を示す。腫瘍の増殖は、腫瘍部の長径を測定することにより算定した。＊Ｐ＜０．０５＊Ｐ＜０．０５。  図４ＢはＡと同一実験におけるマウスの生存率を示す。×：ｅＭＩＰ＋Ｐ．ａｃｎｅｓ、□：Ｐ．ａｃｎｅｓのみ、○：ＭＩＰ−１αのみ、●：未処理の場合を夫々示している。
図４Ｂにおける数値の統計上の有意差は下表の通りである。
2006080171.tif 000003
【実施例４】ｅＭＩＰの腫瘍転移抑制効果
１）  実験方法
Ｌｅｗｉｓ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ（３ＬＬ）の肺転移の系を用いてｅＭＩＰの転移抑制作用を評価した。７週齢，雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いた。３ＬＬ  １０６個を尾静脈より注射し、２５日後に肺を摘出し、重量測定、Ｂｏｕｉｎ’ｓｏｌｕｔｉｏｎで固定した後、実体顕微鏡下で肺転移した癌組織の数を測定した。ｅＭＩＰは３ＬＬ移植３０分後に初回投与を行い、以後週１回４週連続投与した。また、３ＬＬ移稙７日後からの投与開始する系でも。ＭＩＰの効果を検討した。対照薬とした５Ｆｕは１週２回投与した。
２）  実験結果
結果を図５に示した。ｅＭＩＰは３ＬＬの肺転移を有意に抑制し、５Ｆｕ２５ｍｇ／ｍｏｕｓｅの投与では７８％の抑制率であった。  ３ＬＬ移植７日後から投与開始してもｅＭＩＰは肺転移を抑制した。また、３ＬＬの肺転移により増加した肺重量も肺転移抑制効果と相関して抑制された（図６）。図５において、ｄａｙ０：３ＬＬ移植３０分後よりｅＭＩＰ投与開始、ｄａｙ７：３ＬＬ移植７日後よりｅＭＩＰ投与開始の結果を示す。Ｃｏｎｔｒｏ群に対する有意差＊：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１（ＡＮＯＶＡ）。ｎ＝１０（ｃｏｎｔｒｏｌ群）、ｎ＝７（ｅＭＩＰ，５Ｆｕ投与群）。図４において、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対する有意差＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１（ＡＮＯＶＡ）。ｎ＝１０（ｃｏｎｔｒｏｌ群）、ｎ＝７（ｅＭＩＰ，５Ｆｕ投与群）。
【産業上の利用可能性】  本発明は、現在行われているガンの免疫療法を更に発展させ、ガンに対する免疫を誘導させる効果的な治療剤並びに花粉症等の免疫不全疾患の治療剤を提供する。
本発明においてガン局所に炎症反応を誘起した後、ＭＩＰ−１α又はその機能的誘導体を投与することにより、著明なガン増殖抑制および生存率の上昇がみられる。更に、ＭＩＰ−１α又はその機能的誘導体を投与することにより腫瘍の転移、花粉症等の免疫不全による疾病等に対して顕著な改善効果が見られる。
かくして本発明により、ＭＩＰ−１α及びその機能的誘導体が免疫反応を著明に亢進し、免疫療法の効率を飛躍的に高めることが示され、ＭＩＰ−１α及びその機能的誘導体の免疫増強剤としての可能性が明らかになったということができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年11月24日(2006.11.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
炎症を生起させた状態でＭＩＰ−１α又はその機能的誘導体を投与す  ることを特徴とするＭＩＰ−１α又はその機能的誘導体を有効成分とするガン治療剤
【請求項３】
炎症を生起させる手段が放射線照射、アジュバント投与、患部の凍結融解、超音波照射から選ばれることを特徴とする請求項２記載のガン治療剤
【請求項４】
（ａ）アジュバントを有効成分として含有する医薬と、（ｂ）ＭＩＰ−１α又はその機能的誘導体を有効成分として含む医薬とからなり、（ａ）及び（ｂ）を同時に又は経時的に投与することを特徴とするガン治療剤
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
ＭＩＰ−１αの機能的誘導体がｅＭＩＰである請求項２〜４記載のガン治療剤
【請求項８】
ＭＩＰ−１αの機能的誘導体が両親媒性高分子で化学修飾されたＭＩＰ−１α又はｅＭＩＰであることを特徴とする請求項２〜４記載のガン治療剤
【請求項９】
ＭＩＰ−１αの機能的誘導体が部分アルキルエステル化スチレン−マレイン酸共重合体又はポリエチレングリコール誘導体化学修飾されたＭＩＰ−１α又はｅＭＩＰである請求項２〜４記載のガン治療剤
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
（削除）
【請求項１８】
（削除）
【請求項１９】
炎症を生起させた状態でＭＩＰ−１α又はその機能的誘導体を投与することを特徴とするＭＩＰ−１α又はその機能的誘導体を有効成分とするガン転移予防剤
【請求項２０】
炎症を生起させる手段が放射線照射、アジュバント投与、患部の凍結融解、超音波照射から選ばれることを特徴とする請求項１９記載のガン転移予防剤
【請求項２１】
（ａ）アジュバントを有効成分として含有する医薬と、（ｂ）ＭＩＰ−１α又はその機能的誘導体を有効成分として含む医薬とを用い、（ａ）及び（ｂ）を同時に又は経時的に投与することを特徴とするガン転移予防剤
【請求項２２】
ＭＩＰ−１αの機能的誘導体がｅＭＩＰである請求項１９〜２１記載のガン転移予防剤
【請求項２３】
ＭＩＰ−１αの機能的誘導体が両親媒性高分子で化学修飾されたＭＩＰ−１α又はｅＭＩＰである請求項１９〜２１記載のガン転移予防剤
【請求項２４】
ＭＩＰ−１αの機能的誘導体が部分アルキルエステル化スチレン−マレイン酸共重合体又はポリエチレングリコール誘導体で化学修飾されたＭＩＰ−１α又はｅＭＩＰである請求項１９〜２１記載のガン転移予防剤
【手続補正書】
【提出日】平成19年9月11日(2007.9.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
技術分野
【0001】
本発明は、免疫増強剤に関わり、例えば、ガン治療、ガン転移予防或いは花粉症等の免疫異常疾患の治療に役立つ免疫増強剤に関わる。
背景技術
【0002】
生体内においては、毎日多くのガン細胞が発生している。多くの場合、発生したガン細胞は異常細胞の排除システムおよび免疫システムにより取り除かれている。加齢あるいはエイズなどの免疫疾患、免疫抑制剤の投与により免疫機能が低下するとガン発生率が上昇することが、免疫システムによるガン排除の可能性を裏付けている。このことから免疫を賦活することによりガンを撲滅せしめる免疫療法が近年注目を集めている。しかし現在行われているガンの免疫療法では、多くの場合十分なガンに対する免疫が誘導されず、効果的な治療とはなっていない。
【0003】
ガンに対する免疫誘導において、樹状細胞が重要な働きをしていることが知られている。我々はすでにMIP-1α及びその機能的誘導体が炎症局所あるいはガン局所に樹状細胞を集積させる能力があること、さらに血中に樹状細胞前駆細胞を数十倍のオーダーで動員させうることを見出している（Yoneyama H et al., J Exp Med. Vol.193(1) pp.35-49 (2001), Zhang Y et al., J. Natl. Cancer Inst., Vol.96, pp. 201-209 (2004)）。また免疫誘導のマウスモデルにおいて、MIP-1αを免疫局所で発現させると、樹状細胞の集積が起こり、抗原特異的な免疫が誘導されることが報告されている（McKay PF et al., Eur. J. immunol., Vol.34, pp. 1011-1020 (2004)）。
【0004】
放射線療法は外科手術、化学療法、ホルモン療法などと組み合わせて利用され、癌細胞の増殖と転移を抑制するために用いられてきた。しかし、癌細胞を完全に排除することは困難であり、免疫系の抑制、食欲減退、貧血、白血球減少、血小板減少などの副作用も見られている。電子線による定位放射線治療では癌組織局所的に治療するので副作用はより低下するが、癌細胞を根絶することは困難である。  それに伴い、電子線照射によって癌組織に誘導した炎症反応や癌細胞に特異的なT細胞、樹状細胞の機能を発展・増強させ、より強力にする手段の開発が望まれてきた。
【0005】
癌の転移という現象が癌患者の予後を決定する最も重要な因子であることは周知の事実である。しかしながら "転移"のメカニズムの解明、および有効な治療法は未だ確立していないのが現状である。癌転移に直接・間接に関与する生体成分も幾つか発見され、それらに対する抗体も作製され、癌転移動物モデルである程度の効果をしめしてはいるものの、ヒトに適用するには至っていない。また、既存の化学療法剤は固形腫瘍に対しては有効であるが、転移に関しては抗癌作用程の効果を示さないものが多い。また、癌細胞の転移抑制に関する薬剤開発が進んでいないという問題点もある。このような現状から、効果的に癌細胞転移を抑制し、癌患者の予後を改善する薬剤の開発が望まれてきた。
【0006】
MIP-1α（Macrophage Inflammatory Protein-1α）は、アミノ酸約７０個からなるC-Cケモカインファミリーに属する分子である。活性化リンパ球、単球などから産生放出され、樹状細胞、単球、Th1細胞などの遊走を誘導する。MIP-1αは、未熟樹状細胞において発現しているケモカインレセプターであるCCR1、CCR5に対するリガンドとして知られている。(例えば、中野英樹、細胞工学  Vol. 19, No.9, 1304−1310(2000)参照)。
【0007】
MIP-1αと同様の生物活性を有するMIP-1α機能的誘導体も知られており、例えば、MIP-1αについては、MIP-1αの26番目のAspをAlaに置換し、アミノ末端がSerより始まる69アミノ酸よりなるMIP-1α変異体（以下、eMIP又はBB10010と言う）が知られている。このMIP-1α変異体は著しく改善された抗凝集能を有すると共に野生型と同等の活性を有することが見出され、癌化学療法の副作用である血中の顆粒球減少症の改善について検討されている（E. Marshall et al., European Journal of Cancer, Vol. 34, No. 7, pp. 1023-1029 (1998))。
【0008】
両親媒性高分子の一種である部分ブチルエステル化スチレン−マレイン酸共重合体で化学的に修飾されたネオカルチノスタチンが制癌剤（一般名称：ジノスタチンスチマラマー）として既に知られている（特公平１−３３１１９号）。これは、血中に投与されたとき、固形腫瘍にほぼ選択的に集積し、長時間にわたり腫瘍内に維持されるという、所謂、ＥＰＲ効果を示すことが知られており、ガン特異的ターゲッティング型の制癌剤として使用されている。また、両親媒性高分子で化学修飾されたペプチド性アゴニスト又はその機能的誘導体も知られている（WO 01/83548）。更に、ポリエチレングリコールで修飾されたキサンチンオキシダーゼも腫瘍細胞に対してＥＰＲ効果を示すことが知られている（特開平11−060499号）。これらは、何れも、腫瘍細胞に対して直接的な攻撃性を有する物質を用いて抗腫瘍効果を達成するものであり、攻撃性物質を標的患部に選択的に集積させることにより、正常な細胞や組織への影響を少なくすることを目的としている。
【0009】
また、両親媒性高分子の一種であるポリエチレングリコール誘導体でタンパク質を修飾することにより、生体内クリアランスを遅延させ、或いは抗原性を低下させることは知られている(Yoshimoto et al., Jpn. J. Cancer Res., 77, 1264(1986)、Abuchowski et al., Cancer Biochem. Biophys., 7, 175(1984)、特開昭61−178926号公報、特開昭62−115280号公報、特再表WO96/28475号公報、特表平10−513187号公報、特開平11−310600号公報、特表2000−517304号公報、)。更に、ポリエチレングリコールで修飾されたインターロイキン−1、インターロイキン−６、インターフェロン等が知られている(特開平5−117300号公報、特開平6−256394号公報、特開平9−25298号公報)。
発明の開示
【0010】
上述の様に従来試みられてきた免疫療法は必ずしも充分な効果を得ることができず、制癌剤や放射線等による細胞への直接的攻撃に頼らざるを得なかった。本発明は、生体が本来的に有する免疫力を高めることにより従来の治療方法よりも副作用が少ない、しかもより効果的な治療方法を提供することを目的とする。
【0011】
即ち、本発明者等は、MIP-1α及びその機能的誘導体、例えばeMIPによる免疫力の増強作用に着目し、更には、これ等の両親媒性高分子による化学修飾を試み、化学修飾された物質がその活性を阻害されることなく、寧ろ活性が向上することを見出し、これ等を有効成分とする免疫増強剤を発明するに至った。
【0012】
ここに、本発明は（１）MIP-1α又はその機能的誘導体を有効成分とする免疫増強剤であり、更には、（２）炎症を生起させた状態でMIP-1α又はその機能的誘導体を投与することによりガンを治療するための免疫増強剤であり、ここで、（３）炎症を生起させる手段として、放射線照射、アジュバント投与、患部の凍結融解、超音波照射等を選ぶことができ、（４）（ａ）アジュバントを有効成分として含有する医薬と、（ｂ）MIP-1α又はその機能的誘導体を有効成分として含む医薬とからなる免疫療法用組成物であって、（ａ）及び（ｂ）を同時に又は経時的に投与することを特徴とする免疫療法用医薬組成物である。
【0013】
また、本発明は、（５）ガン転移を予防するためのMIP-1α又はその機能的誘導体を有効成分とする免疫増強剤であり、或いは、（６）免疫異常疾患を治療するためのMIP-1α又はその機能的誘導体を有効成分とする免疫増強剤であり、
（７）免疫異常疾患が花粉症である（６）記載の免疫増強剤である。
【0014】
本発明で使用しうるMIP-1αの機能的誘導体として、（8）eMIPを選ぶことができ、また、（９）両親媒性高分子で化学修飾されたMIP-1α又はeMIPを選ぶことができる。ここで、(10)両親媒性高分子として部分アルキルエステル化スチレン−マレイン酸共重合体又はポリエチレングリコール誘導体を用いることができる。
発明を実施するための最良の形態
【0015】
本発明における有効成分の代表例であるＭＩＰ−１αはＣＣサブファミリーに属するケモカインとして知られており、レセプターCCR1やCCR５のリガンド(アゴニスト)である。ヒト成熟型MIP−1αは70のアミノ酸よりなるとされているが、CD８+T細胞やHTLV−1感染細胞MT4培養上清から得られるものは66アミノ酸を有することが知られている。ヒトMIP−1αには、個人により遺伝子コピー数の異なる非対立遺伝子LD78βが存在し、70アミノ酸型MIP−1αとは配列が３残基異なるものが知られている。これ等は何れも本発明において使用できる。
【0016】
本発明で使用できるMIP-1α又はその機能的誘導体とは、ケモカインレセプターであるＣＣＲ１またはＣＣＲ５に対するリガンド及びその誘導体であって、アゴニストとしての作用を有する物質を云う。即ち、MIP−１αの機能的誘導体とは、MIP−１αの誘導体であって、アゴニストとしてMIP−１αと同様の生物活性を示すものであり、かかる生物学的同等物の代表例としてeMIP(既出、European Journal of Cancer, Vol. 14, No. 7, pp. 1023−1029(1998))を挙げることができる。
【0017】
本発明において免疫増強剤として使用されるMIP-1α等は部分アルキルエステル化スチレン−マレイン酸共重合体やポリエチレングリコール誘導体で代表される両親媒性高分子で化学的に修飾すると、その活性が維持されると共に、血中安定性が改善されることが確認された。かくして、本発明で使用されるMIP-1αの機能的誘導体は両親媒性高分子で化学的に修飾されることが好ましく、この様に両親媒性高分子で化学的に修飾されたMIP-1α及びその生物学的に同等な誘導体も、本明細書において「MIP-1αの機能的誘導体」と呼ぶこととする。
【0018】
本発明においてMIP-1α又はその生物学的同等物を化学修飾するために用いられる両親媒性高分子の好ましい例として、部分アルキルエステル化スチレン−マレイン酸共重合体を挙げることができ、更に、そのアルキル部分の例としては、直鎖または分枝していてもよい炭素数が1乃至5であるアルキル基を挙げることができ、これ等アルキル基は低級アルコキシ基で置換されていても良い。より具体的には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、３−メチル−１−ブチル、２−メチル−１−ブチル、２，３−ジメチル−１−プロピル、２−ペンチル、３−メチル−２−ブチル、３−ペンチル、２−メチル−２−ブチル、メチルセロソルブ、エチルセロソルブ等を挙げることができる。
【0019】
好ましい部分アルキルエステル化スチレン−マレイン酸共重合体の例は、特公平１−３３１１９号に記載されている、部分ブチルエステル化スチレン−マレイン酸共重合体であって、平均分子量が１０００〜１００００で、重合度が１乃至１００、好ましくは３乃至３５のものが選ばれる。
【0020】
本発明においてMIP-1α又はその生物学的同等物を化学修飾するために用いられる両親媒性高分子の好ましい他の例として、ポリエチレングリコール(以下ＰＥＧと記す場合もある)の誘導体を挙げることができる。ここで、ポリエチレングリコール誘導体とは、―Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)ｎ−で表されるＰＥＧ部分(ｎは２０乃至２８０の整数)がアゴニスト又はその生物学的同等物のペプチド鎖と結合し得る残基を有する化合物を意味する。ポリエチレングリコール誘導体の例としては、ペプチド鎖のアミノ基(Ｎ末アミノ基、リジン残基のアミノ基)に結合できる残基を有するものを挙げることができる。ポリエチレングリコール誘導体の他の例として、ペプチド鎖のカルボキシル基(Ｃ末カルボキシル基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基のカルボキシル基)に結合できる残基を有するものを挙げることができる。
【0021】
更に、本発明において用いられる両親媒性高分子の他の例として、ポリビニルピロリドンその他を挙げることができる。
【0022】
本発明に関わる両親媒性高分子で化学修飾されたMIP-1α及びその生物学的同等物は、両親媒性高分子とMIP-1α及びその生物学的同等物を、場合によりリンカーアームを介して化学結合させ、部分精製することにより得ることができる。即ち、両親媒性高分子とMIP-1α又はその生物学的同等物とを緩衝液中で反応させ、その後カラムクロマトグラフィを用いて精製し、溶出する各フラクションを分離する。
【0023】
両親媒性高分子が部分アルキルエステル化スチレン−マレイン酸共重合体である場合を例にとり、より具体的に説明すれば、まず、スチレンと無水マレイン酸のラジカル共重合により得られるスチレン−マレイン酸共重合体（SMA）の酸無水物をクメン等の有機溶媒に溶解させ、この溶液にｎ−ブタノールを攪拌下に滴下して反応させ、部分的に無水環をブチルエステル化することで、部分ブチルエステル化スチレン−マレイン酸共重合体（Bu-SMA）を得ることができる。かくして得られるBu-SMAとアゴニスト又はその生物学的同等物との結合は、両者をpH 8.5の重炭酸水素ナトリウム0.3M溶液中で反応させ、Bu-SMA中の酸無水環とアゴニスト又はその生物学的同等物中のアミノ基との間にアミド結合を形成させることにより行なうことができる。MIP-1α又はその生物学的同等物に対するBu-SMAの結合数は１以上であればよく、好ましくは３乃至１０、より好ましくは６乃至８である。
【0024】
両親媒性高分子としてＰＥＧを用いて、MIP-1α又はその生物学的同等物のペプチド鎖のアミノ基を修飾する場合は、ＰＥＧの端末に、アミノ基と反応し得る官能基、例えば、カルボキシル基を導入することが好ましい。MIP-1α又はその生物学的同等物のペプチド中のアミノ基に結合させるためには、該官能基を反応性基に変換することが好ましく、カルボキシル基の場合は、活性エステル法、混合酸無水物法等が好ましい例である。
【0025】
具体的には、活性エステルの場合、ｐ−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル等のフェニルエステル類、Ｎ―ヒドロキシフタルイミドエステル、Ｎ―ヒドロキシスクシンイミドエステル等のジカルボン酸イミドエステル、Ｎ―ヒドロキシピペリジンエステル等のヒドロキシル系活性エステル等が挙げられる。これ等の活性エステルの調製は、常法に従って行うことができ、例えば、ＰＥＧ誘導体のカルボキシル基と上記の活性エステルに対応するアルコール体とをジシクロヘキシルカルボジイミドや１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド等の縮合剤を用いて−２０℃乃至室温にて１乃至２４時間反応させることにより行うことができる。或いは、ＰＥＧ誘導体のカルボキシル基と上記活性エステルに対応するハロゲン化物とを、トリエチルアミン等の塩基の存在下に、０℃乃至８０℃で１乃至７２時間反応させることによっても調製することができる。混合酸無水物法の場合は、Ｎ―メチルモルホリン、Ｎ―エチルピペリジン等の塩基の存在下に、イソブチルクロロホルメート、エチルクロロホルメート、塩化イソバレリル等と−２０℃乃至０℃で１乃至３０分間反応させることにより調製することができる。
【0026】
ＰＥＧ誘導体をMIP-1α又はその生物学的同等物のペプチド鎖に直接導入することもできるが、リンカーアームを介して導入することもできる。例えば、リジンを含む短いアミノ酸配列を目的とするペプチド鎖に導入し、そのリジンのアミノ基をＰＥＧ誘導体で修飾する。修飾反応においては、修飾されるペプチド鎖に含まれるアミノ基数に対して１０乃至３０倍モルのＰＥＧ誘導体を用いることが好ましい。
【0027】
両親媒性高分子としてＰＥＧを用いて、MIP-1α又はその生物学的同等物のペプチド鎖のカルボキシル基を修飾する場合は、ＰＥＧの端末に、カルボキシル基と反応し得る官能基、例えば、アミノ基を導入することが好ましい。
かくして得られる両親媒性高分子で化学修飾されたMIP-1α又はその生物学的同等物は、所謂、EPR効果により固形腫瘍等の標的患部へと選択的に集積することが期待される。
【0028】
本発明によるMIP-1αまたはその機能的誘導体は免疫賦活剤として提供される。すなわち、MIP-1αが直接・間接に関与する炎症性疾患、臓器障害、癌の発症予防剤または治療剤として提供される。注射剤として用いられることが好ましいが、注射剤以外の剤形として、例えば、座剤、鼻腔製剤の形で利用することもできる。一般的に使用されている抗がん剤と併用することも可能である。
【0029】
本発明によるMIP-1αまたはその機能的誘導体は、がん局所に炎症を誘導し、免疫誘導可能性を高めた上で投与することが好ましい。すなわち、放射線照射、アジュバント投与、患部の凍結融解、超音波照射といった方法により、ガン局所に炎症を生起させ、充分炎症反応が誘起されたと予想される時点で、MIP-1αまたはその機能的誘導体を投与することが好ましい。
【0030】
ガンの放射線療法においては、単にガン細胞を傷害せしめるだけではなく、放射線照射局所に炎症反応を誘起し、その結果稀に照射部位以外のガンにおいても縮小効果を誘導することができることが知られている（abscopal effect／アブスコパル効果）。本発明によるMIP-1αまたはその機能的誘導体は一般的に施行されている放射線療法と併用することにより、放射線照射によって生起されるアブスコパル効果を増強し、臨床的効果を更に増強することが可能であることが見出された。
【0031】
本発明によるMIP-1αまたはその機能的誘導体は一般的に使用されているアジュバントと併用しアジュバントによって生起される免疫応答を増強し臨床的効果を増強することが可能である。アジュバントとしては、一般的に使用されているクレスチン、ピシバニール、レンチナン、ベスタチンあるいはP.acnes等と併用することが可能である。
【0032】
本発明によるMIP-1αまたはその機能的誘導体は、癌組織の壊死を誘導する凍結融解療法と併用することで癌組織の壊死・退縮を誘導することができる。更に、本発明によるMIP-1αまたはその機能的誘導体は単独あるいは一般的に用いられている抗癌剤あるいは放射線・凍結融解療法・超音波療法との併用により腫瘍転移抑制作用を目的として使用することができる。
【0033】
本発明によるMIP-1αまたはその機能的誘導体は花粉症等の免疫不全による疾病にも適用することができる。MIP-1αまたはその機能的誘導体単独あるいは一般的に使用されている抗アレルギー剤、抗ヒスタミン剤等と併用することが可能である。
【0034】
本発明に関わる免疫増強剤は、有効成分であるMIP-1α又はその機能的誘導体、即ちタンパク質を非経口的に投与するのが好ましく、例えば、水、若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液体との無菌性溶液又は懸濁液などの注射剤の形で投与されることが好ましい。注射の為の無菌組成物は注射用水のようなビヒクル、天然植物油などを用いて有効成分を溶解又は懸濁させるなどの通常の製剤手段に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、ヤシ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。
【0035】
本発明で得られるBu-SMAが結合したMIP-1α又はその生物学的同等物は、水溶性または油性注射用剤の形で用いることができる。水溶性注射用剤は主に静脈内投与に使用される。油性注射剤は、例えば、リピオドールなどの油剤に均一に分散させたBu-SMAが結合したMIP-1α又はその生物学的同等物を腫瘍栄養動脈上流に固定したカテーテルにより腫瘍組織等の標的患部に投与される。Bu-SMAが結合したアゴニスト又はその生物学的同等物が血中でアルブミンと結合して高分子化合物として挙動すること及びBu-SMA結合物が油剤に可溶となることが本発明者等により見出されており、その結果、油剤化されたBu-SMA結合MIP-1α又はその生物学的同等物を局所動脈に注射すれば、所謂、EPR効果により固形腫瘍等の標的患部へと選択的に集積することが期待される。
【0036】
このようにして得られる製剤は、例えば、ヒトまたは哺乳動物対して投与することができる。本発明の有効成分の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、非経口的に投与する場合の該有効成分の１回投与量は、例えば、成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一回につき約０．０１〜２０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。本発明に関わる免疫増強剤は、注射剤以外の剤形として、例えば、座剤、鼻腔製剤の形で利用することもできる。
【0037】
【参考例１】
ＭＩＰ−１αの製法
ヒトMIP-1α遺伝子をPCR法により取得した。該ヒトMIP-1α遺伝子を発現シャトルベクターpNCMO2に組み込み、大腸菌にて増幅した。該ヒトMIP-1α遺伝子発現ベクターをBrevibacillus choshinensis （B. choshinensis ）HPD31S5 に導入した。該ヒトMIP-1α遺伝子導入B. choshinensisを培養して、その上清を採取した。該培養上清に４０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、沈殿生成後、遠心にて上清を分離して、さらに６０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、沈殿生成後遠心にて該沈殿物を回収した。該沈殿物をトリス塩酸バッファー（pH 8.0）に溶解し、該溶解物を陰イオン交換クロマトグラフィー（Q Sepharose; アマーシャム社製）にかけ分画した。各画分のうちMIP-1αを含む画分を集め、硫酸アンモニウムを加えて溶解した（終濃度1.5M）。該溶解物を疎水性クロマトグラフィー（RESOURCE PHE; アマーシャム社製）にかけ分画した。各画分のうちMIP-1αを含む画分（非吸着画分）を集め、硫酸アンモニウムを加えて硫安沈殿を行った（終濃度60％飽和）。沈殿物をトリス塩酸バッファー（pH 8.0）に溶解し、該溶解物を再度陰イオン交換クロマトグラフィー（RESOURCE Q; アマーシャム社製）にかけ分画した。各画分のうちMIP-1αを含む画分を集め、トリス塩を除く目的で20mM NH4HCO3（pH 8.5）に対して透析を行った。この処理により生じた沈殿を遠心することにより精製ヒトMIP-1αを得た。これを凍結乾燥後ＰＢＳに溶解させ、以下の実験に用いた。
【0038】
【参考例２】
eMIPの製法（発現と精製）
eMIPのcDNAは、ヒトMIP-1αcDNAをテンプレートとしQuik Change Kit (Stratagene社)を用いて、部位特異的変異により調製した。すなわち、125ngの変異プライマーRQ1:5’-CCAGCGAAGCCGGCAGGTCT  GTGCTGACCCAG-3’(配列番号１)、RQ2:5’-CTGGGGTCAGCACAGACCTGCCGGCTTCGCTTGG -3’(配列番号２)、テンプレートプラスミドDNA10ngに 50μMｄNTPを含む50μlの反応系にPfu-turbo(2.5U/μl)1μl添加し、95℃  30秒の変性に続き、95℃  30秒、  55℃ 1分、  68度  7分を12サイクルおこなった後、反応系に制限酵素DpnIを1μｌ添加し、37℃で1時間反応することによりテンプレートDNAを切断することにより、変異プラスミドのみを回収した。変異部位が正しく置換されたことをDNA配列解析により確認した後、分裂酵母発現プラスミドベクターpTL2M5に挿入した。このプラスミドを用いてSchizosaccharamyces pombeを形質転換し、eMIP発現株を得た。続いて、100 μg / ml抗生物質G418を含むYPD培地 (0.5% Yeast Extract, 2% Peptone, 2% Glucose) 16Lでジャーファーメンターにて30℃、48時間培養することにより、培地中に分泌発現させた。この培地上清を0.45μmのフィルターを用いて、ろ過除菌したものを精製の出発材料とした。
【0039】
組換えeMIP蛋白の精製は、AKTA-prime システム（アマシャムバイオサイエンス社）を用いて行った。すなわち、培地上清にギ酸緩衝液（0.5M Formic acid(pH4.0)）を添加し、終濃度0.01%になるようにTween20を加えた。このサンプルを、陽イオン交換カラムSP-XL（5mlサイズを6本連結したもの、アマシャムバイオサイエンス社）に2ml / minにて、送液し吸着させた後、1M 塩化ナトリウムを含むギ酸緩衝液（pH7.0）によりグラジエント溶出した。10-20% SDS-ポリアクリルアミド電気泳動(SDS-PAGE)にて確認した後、ピーク画分を回収した。これを10mMリン酸緩衝液(pH7.0)に対して透析した後、へパリンアフィニティーカラム(5mlサイズを4本連結したもの、アマシャムバイオサイエンス社) に2ml / minにて、送液し吸着させた後、1M 塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（pH7.0）によるグラジエント溶出した。10-20% SDS-PAGEにて確認した後、ピーク画分を回収した。収率は、16Lの培養あたり175 mgであり、生理的リン酸緩衝液( PBS(-) (pH7.4) )に透析した後、動物実験に用いた。
【0040】
【参考例３】
Bu-SMA結合eMIPの製法
参考例２で得られたeMIPを濃度が2mg/mlとなるように、0.8M重炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH8.5）に溶解させた。この溶液1mlに対し、ジエチルホルムアミドに溶解したBu-SMA 2.6mg(モル比にして、Bu-SMA:eMIP=10:1)を徐々に加え、一晩、27度で反応させた。反応終了後、反応混合物をゲルろ過クロマトグラフィー（充填剤：バイオラッド社製Bio-GelP60、移動相：20mM重炭酸水素アンモニウム溶液（pH8.5）、カラムサイズ：1.6×83cm）に付してBu-SMA結合eMIPを精製した。2mlごとに90本の試験管に分離した（図７）。次いで、280nmにおける吸光度に基づき、試験管番号16〜18に溶出した画分（6ml）を凍結乾燥させて白色粉末状のBu-SMA結合eMIP(以下において、「Bu-SMA-eMIP」と表示する)を得た。
得られたBu-SMA-eMIPおよび原料であるeMIPのNative-PAGE（未変性10-20%グラジエントポリアクリルアミドゲル電気泳動）の結果を図８に示す。両者の泳動距離は、明らかに異なっている。これは、eMIPのリジンのアミノ基がSMAによって修飾されたことにより表面のプラスチャージが減少し、より陽極側に泳動されやすくなったためと考えられる。この両者の泳動距離の差およびフラクションNo.16〜18のBu-SMA−eMIPと、未反応のBu-SMAおよびeMIPのアミノ基を蛍光試薬Fluorescamine(0.3mg/ml in acetone)と反応させ、分光蛍光計で、励起波長390nm、蛍光波長475nmで測定し、定量し、１分子に２〜3個のSMAが結合していると見積もられた。
【0041】
【実施例１】
eMIP の放射線療法との併用
１）実験方法
7週齢, 雌性C57BL/6 マウスとLewis lung carcinoma（3LL）を用い、固形腫瘍における電子線照射とeMIPの併用効果を評価した。
３LL   4×105 個を側腹部皮下移植後、固形癌の径が1cm程度になった時点（19日後）で固形癌の大きさを揃えて再群分けし、癌組織に電子線を照射。翌日にeMIPを尾静脈より投与。以後週１回eMIP投与を継続し、計４回投与した。  対照薬として5Fuを用い、電子線照射の翌日から25mg/kgで週２回腹腔内に投与した。
腫瘍体積は以下に示す Janikらの式に従って算出した。
（腫瘍体積）＝（腫瘍の長径）×（腫瘍の短径）2×0.5236
【0042】
２）実験結果
３LL肺癌細胞の増殖において、電子線照射では２,６,10 Gyで線量依存的に固形癌の増殖が抑制された。  eMIP 50μg/mouse単独でも抑制する傾向は見られたが、有意な作用ではなかった。  電子線照射とeMIP 50μg/mouseを併用すると、eMIPは電子線６および10Gyの腫瘍抑制作用を有意に増強した（図１A,B）。
図１（Ａ）はeMIPと電子線６Gyの併用効果を示す。  3LL担癌マウス（ｎ＝５）の固形癌径1ｃｍ前後の時点で電子線照射し、 翌日にeMIPを iv投与し、 以後週１回iv投与した。図において上向白矢印はeMIPを投与した日を示す。
図１（Ｂ）は電子線照射 16日目におけるeMIPの抗腫瘍作用を示す（ｎ＝５）。  「*」は p<0.05を、「**」は p<0.01 (ANOVA)を、「#」は p< 0.05 (t-test)を夫々示す。
【0043】
【実施例２】
アブスコパル効果の増強作用
１）実験方法
7週齢, 雌性C57BL/6 マウスとLewis lung carcinoma（3LL）を用い、左右側腹部に移植した固形腫瘍に対する電子線照射と、eMIPの併用効果とを比較して評価した。
3LL 4×105個をC57BL/6マウスの右側腹部皮下に移植( primary tumor)し、同時に3LL 2×105個を左側腹部皮下に移植した(secondary tumor)。右側腹部の腫瘍径が約１cmになった時点（19日目）で、腫瘍径による再群分けを行い直線加速器により右側腹部の腫瘍に電子線照射を行った（電子線放射量６Gy）。電子線照射の翌日にeMIPを静脈内投与した。以後、８日後及び１５日後の計３回投与した。左右側腹部の腫瘍径を測定し、腫瘍体積により抗腫瘍作用を評価した。
腫瘍体積は以下に示す Janikらの式に従って算出した。
（腫瘍体積）＝（腫瘍の長径）×（腫瘍の短径）2×0.5236
【0044】
２）実験結果
電子線照射後 16日までの両側腹部腫瘍体積の変化を図.２に、17日目の結果を図３に示した。なお、図２及び図３において、（Ａ）は、右側腹部腫瘍に対する電子線照射の変化を示し、（Ｂ）は左側腹部腫瘍に対する電子線照射の変化を示す。
図２（Ａ）の「−■−」が示すように、右側腹部腫瘍に対する電子線照射により右側腹部腫瘍の増殖は抑制されたが、図２（Ｂ）の「−■−」が示すように、逆側の左側腹部腫瘍は抑制されなかった。  興味深いことに、eMIPの併用により、2μg/マウスの投与で電子線照射していない左側腹部腫瘍を60％以上有意に抑制した。  また、電子線照射した右側部腫瘍においても2及び10μg/マウスの投与で電子線の抗腫瘍効果を有意に増強した（図３）。なお、図４において、「*」はコントロール群（Cont）に対する有意さがｐ＜0.05であることを意味し、「**」はｐ＜0.01（ANOVA）であることを意味する。
【0045】
かかる結果は、eMIPがアブスコパル効果を増強することを示すもので、eMIPが放射線照射した腫瘍部位における炎症や免疫応答の増強だけではなく、全身的な抗腫瘍免疫応答を活性化することを示している。
実際、放射線照射及びeMIPの投与を行った3LL担癌マウスでは、脾臓中にγ−インターフェロン産生細胞が増加しており、その増加は対照及び放射線照射したのみのマウスより有意に高かった。
この結果から、eMIPは電子放射線治療において、照射した腫瘍だけではなく転移巣などの非照射部位の腫瘍に対しても有効な治療法を提供すると言うことができる。
【0046】
【実施例３】
eMIPとアジュバントとの併用効果
１）実験方法
8-10週齢, 雌性C57BL/6 マウスとLewis lung carcinoma（3LL）を用い、固形腫瘍におけるアジュバント療法とeMIPの併用効果を評価した。
３LL   2×105 個を皮下移植後、1, 8, 15, 22日目に20μg のPropionibacterium acnes (11828; American Type Culture Collection, Manassas, VA)死菌を40 μL のPBSに懸濁したものを同所皮下注射し、2, 9, 16, 23 日目に20 μgのeMIPを100 μlのPBSに溶解したものを尾静脈より投与した。
腫瘍の増殖は、腫瘍部の長径を測定することにより算定した。
【0047】
２）実験結果
３LL肺癌細胞の増殖において、アジュバント（P. acnes）単独で有意な増殖抑制活性がみられた。さらにアジュバントに加えeMIPを週に一回投与することにより、腫瘍の増殖はほぼ完全に抑制された。eMIP単独では、有意な抑制効果は認められなかった（図４A）。マウスの生存率もコントロール、eMIP単独では70-100日で全例死亡したが、アジュバント投与単独で５０％、アジュバントに加えてeMIPを週一回投与することにより１００％のマウスが100日以上生存した（図４B）。図４Ａは、３ＬＬを皮下注射し、1, 8, 15, 22日目にP. acnes死菌を皮下注射し、2, 9, 16, 23 日目にeMIPを尾静脈より投与した結果を示す。腫瘍の増殖は、腫瘍部の長径を測定することにより算定した。*P<0.05 **P<0.05。     図４ＢはＡと同一実験におけるマウスの生存率を示す。 ×：eMIP ＋ P.acnes、□： P.acnes のみ、 ○：MIP-1αのみ、 ●：未処理の場合を夫々示している。
図4Ｂにおける数値の統計上の有意差は下表の通りである。
2006080171.tif 000013
【0048】
【実施例４】
eMIPの腫瘍転移抑制効果
１）実験方法
Lewis lung carcinoma（3LL）の肺転移の系を用いてeMIPの転移抑制作用を評価した。7週齢, 雌性C57BL/6 マウスを用いた。3LL  106 個を尾静脈より注射し、25日後に肺を摘出し、重量測定、Bouin' solutionで固定した後、実体顕微鏡下で肺転移した癌組織の数を測定した。eMIPは3LL移植30分後に初回投与を行い、以後週１回４週連続投与した。また、3LL移植７日後からの投与開始する系でもeMIPの効果を検討した。対照薬とした５Fuは1週2回投与した。
【0049】
２）実験結果
結果を図５に示した。 eMIPは3LLの肺転移を有意に抑制し、5Fu25mg/mouseの投与では78％の抑制率であった。  3LL移植７日後から投与開始してもeMIPは肺転移を抑制した。また、3LLの肺転移により増加した肺重量も肺転移抑制効果と相関して抑制された（図６）。図５において、day0: 3LL移植30分後よりeMIP投与開始、day7: 3LL移植７日後よりeMIP投与開始の結果を示す。 Contro群に対する有意差  *: p<0.05, **: p< 0.01（ANOVA）。n=10(control群)、n＝7(eMIP, ５Fu投与群)。図６において、 Control群に対する有意差  *: p<0.05、 **: p< 0.01（ANOVA）。n=10(control群)、ｎ=7(eMIP, ５Fu投与群)。
産業上の利用可能性
【0050】
本発明は、現在行われているガンの免疫療法を更に発展させ、ガンに対する免疫を誘導させる効果的な治療剤並びに花粉症等の免疫不全疾患の治療剤を提供する。
本発明においてガン局所に炎症反応を誘起した後、MIP-1α又はその機能的誘導体を投与することにより、著明なガン増殖抑制および生存率の上昇がみられる。更に、MIP-1α又はその機能的誘導体を投与することにより腫瘍の転移、花粉症等の免疫不全による疾病等に対して顕著な改善効果が見られる。
かくして本発明により、MIP-1α及びその機能的誘導体が免疫反応を著明に亢進し、免疫療法の効率を飛躍的に高めることが示され、MIP-1α及びその機能的誘導体の免疫増強剤としての可能性が明らかになったということができる。
図面の簡単な説明
【0051】
図１は、3LL坦癌マウスにおけるeMIP の放射線療法との併用効果を示す。
図２は、電子線放射後16日間のｅMIP によるアブスコパル効果の増強作用の変化を示す。
図３は、電子線放射後17日目におけるｅMIP のアブスコパル効果の増強作用を示す。
図４は、3LL腫瘍に対するアジュバント(P.acnes)療法とeMIPの併用治療効果を示す。
図５は、eMIPによる3LLの肺転移の抑制効果を示す。
図６は、3LL iv移植マウスの肺重量を示す。
図7は、Bu-SMA-BB10010のフラクション毎の280nmにおける吸光度を示す。
図8は、Bu-SMA-BB10010及び原料であるBB10010のNative-PAGE電気泳動の結果を示す。
【国際調査報告】
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