(57)【要約】本発明は、哺乳動物の内因性リガンドに対して親和性を有し且つ実質的にそれを中和しない抗体を含有してなる該内因性リガンドの血中安定性改善剤、並びに内因性リガンドの血中濃度を増加および／または血中半減期を延長させることが予防・治療上有効である疾患の予防・治療用である上記製剤を提供する。内因性リガンドと同一もしくは実質的に同一の化合物を併用投与することなく、上記製剤を単独で哺乳動物に投与すれば、該内因性リガンドの血中安定性が増大してその受容体活性調節作用が増強される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の内因性リガンドに対して親和性を有し且つ実質的にそれを中和しない抗体を含有してなる該内因性リガンドの血中安定性改善剤。
【請求項２】
内因性リガンドの血中安定性の改善によりその受容体活性調節作用が増強されることを特徴とする請求項１記載の剤。
【請求項３】
抗体の中和活性が約８０％以下である請求項１記載の剤。
【請求項４】
哺乳動物に投与することにより、内因性リガンドの血中濃度が該抗体を投与していない場合の血中濃度の約２倍以上となる請求項１記載の剤。
【請求項５】
内因性リガンドと抗体との複合体の血中半減期が該内因性リガンド単独の場合の約２倍以上である請求項１記載の剤。
【請求項６】
遊離の内因性リガンドの血中半減期が約１週間以下である請求項１記載の剤。
【請求項７】
内因性リガンドがペプチド性化合物である請求項１記載の剤。
【請求項８】
内因性リガンドがＧ蛋白質共役型受容体に対するものである請求項７記載の剤。
【請求項９】
内因性リガンドがセクレチン／グルカゴンスーパーファミリーに属するものである請求項８記載の剤。
【請求項１０】
内因性リガンドがＧＬＰ−１、カルシトニン、ＰＡＣＡＰ、ＶＩＰおよびそれらの類縁体からなる群より選択される請求項９記載の剤。
【請求項１１】
内因性リガンドがＬＨＲＨ、メタスチン、ＧＰＲ７／ＧＰＲ８リガンド、ＭＳＨ、グレリン、アペリンおよびその類縁体からなる群より選択される請求項８記載の剤。
【請求項１２】
内因性リガンドがＥＰＯ、ＴＰＯ、インシュリン、インターフェロン、成長ホルモン、ＧＭ−ＣＳＦ、レプチン、アディポネクチンおよびそれらの類縁体からなる群より選択される請求項７記載の剤。
【請求項１３】
内因性リガンドがＡＮＰ、ＢＮＰ、ＣＮＰ、ベーターセルリン、ベータセルリン−δ４、アドレノメジュリンおよびそれらの類縁体からなる群より選択される請求項７記載の剤。
【請求項１４】
内因性リガンドの血中濃度を増加および／または血中半減期を延長させることが予防・治療上有効である疾患の予防・治療用である請求項１記載の剤。
【請求項１５】
疾患が代謝疾患、骨・軟骨疾患、循環器疾患、脳・神経疾患、感染症、ガン、血液疾患、泌尿器疾患、不妊・勃起不全症、成長不全および免疫不全からなる群より選択される疾患の予防・治療剤である請求項１４記載の剤。
【請求項１６】
内因性リガンドの血中濃度を増加および／または血中半減期を延長させることが予防・治療上有効である疾患の予防・治療方法であって、該内因性リガンドと同一もしくは実質的に同一の化合物を投与することなく、該内因性リガンドに対して親和性を有し且つ実質的にそれを中和しない抗体の有効量を哺乳動物に投与して該内因性リガンドの血中安定性を増大させることにより、その受容体活性調節作用を増強することを特徴とする方法。
【請求項１７】
内因性リガンドの血中濃度を増加および／または血中半減期を延長させることが予防・治療上有効である疾患の予防・治療剤の製造のための、該内因性リガンドに対して親和性を有し且つ実質的にそれを中和しない抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は抗体の新規医薬用途に関する。より詳細には、本発明は、内因性リガンドの血中安定性を改善することにより該リガンドの受容体活性化作用を増強するための、該内因性リガンドに対して親和性を有するがそれを完全には中和しない抗体の利用に関する。
【背景技術】  抗体はその特異性の高さと血中半減期の長さから、副作用が少なく薬効持続性が長いという医薬品としての優れた特性を備えている。疾患特異的な抗原を標的とした今日的な意味での抗体医薬第一号は、１９８６年に米国で急性拒絶反応治療剤として認可されたマウス抗ＣＤ３モノクローナル抗体（商品名：ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ）であるが、マウスモノクローナル抗体は、ヒトに投与した場合ＨＡＭＡ（Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）と呼ばれる抗マウスイムノグロブリン（Ｉｇ）ヒト抗体が産生され、半減期短縮による薬効低下やアナフィラキシー症状を惹き起こす；抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）や補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を利用する場合、マウスＦｃではヒト体内での該作用が著しく低下する等の難点があったため、抗体医薬の開発はその後長らく頓挫していた。
しかし、１９９０年代に入ってキメラ抗体やヒト化抗体、さらには完全ヒト抗体の作製技術が確立し、抗原性・薬効低下の問題が回避されたことで抗体医薬は再び脚光を浴びることとなり、癌・移植拒絶・循環器疾患・感染症・自己免疫疾患など、難病治療薬を中心として次々と実用化され、臨床段階のものを含めると、現在までに１００を超える抗体医薬が開発されている。
開発中のものを含め、従来の抗体医薬のほとんどは、（１）標的抗原に結合してその機能を阻害（即ち、中和）する［例：抗ＴＮＦα抗体（商品名：レミケード）抗ＲＳＶ表面蛋白質抗体（商品名：シナジス）］；（２）標的抗原を発現する病原細胞に薬物（例えば、化学療法剤、毒素、放射性同位元素、サイトカイン等）を送達するためのキャリアとして働く［例：９０Ｙ結合抗ＣＤ２０抗体（商品名：Ｚｅｖａｌｉｎ）、カリキアマイシン結合抗ＣＤ３３抗体（商品名：Ｍｙｌｏｔａｒｇ）］；（３）ＡＤＣＣやＣＤＣを利用して標的抗原を発現する細胞を攻撃する［例：抗ＨＥＲ２抗体（商品名：ハーセプチン）、抗ＣＤ２０抗体（商品名：リツキサン）］のいずれかの作用機序に基づいている。
これに対し、次世代の抗体医薬として、標的抗原を中和したり抗原発現細胞を殺傷したりするのではなく、標的抗原の機能を増強することを目的としたいわゆるアゴニスト抗体の開発が模索されている。例えば、チロシンキナーゼ型の受容体のようにリガンドが結合することによってオリゴマーを形成し、シグナル伝達作用が活性化される受容体のモノマー分子に対する抗体を用いて、該モノマー分子同士を架橋して受容体を活性化させる方法が提唱されている（例えば、国際公開第０１／７９４９４号パンフレットを参照）。
しかしながら、細胞表面の受容体に対してリガンド分子として働くサイトカインや増殖因子等の体液性の生理活性ペプチド（蛋白質）を標的とする抗体医薬に関しては、標的抗原の機能（即ち、受容体活性化作用）を阻害する中和抗体が専ら利用されている。
生理活性ペプチド（蛋白質）は生体において種々の薬理作用を示すリガンド分子であることから、医薬品として利用されているが、これらはペプチダーゼ（プロテアーゼ）に対する感受性が高く、また分子量が小さいため腎クリアランスを受けやすく一般的に活性体の生体内での半減期が短い。そのため、薬効持続性に難点があり頻回投与を必要とする場合が多い。サイトカイン等の生理活性蛋白質を活性成分とする医薬を投与するに際して、蛋白質の生理活性を損なわない部位で該蛋白質と結合する抗体を併用することにより該蛋白質の血中半減期を延長させ、薬効持続性を改善しようする試みがなされているが（例えば、特表昭６０−５０２１０４号を参照）、実用化されるには至っていない。
また、従来の抗体医薬は、サイトカイン等の低用量で薬効を示す他のバイオ医薬品の場合とは異なり、一般に臨床投与量が莫大で数百ｍｇに及ぶ場合もある。現在、抗体医薬はＣＨＯ細胞などの動物細胞を用いて組換え生産されているが、抗体産生量や培養規模に制限があるため非常に高価であり、そのため抗体医薬の適応疾患は既存の治療薬では十分な治療効果が得られない難病に限られているのが現状である。現在臨床開発中のものの中には患者数の多い慢性疾患（例：関節リウマチ）治療薬も含まれているが、今後糖尿病や高脂血症などの生活習慣病の領域にまで抗体医薬の市場を拡大するためには、コスト面での課題を克服することがきわめて重要となる。
さらに、抗体医薬の投与量を低減することは、安全性の面からも重要である。現在開発中の抗体医薬の大半はキメラもしくはヒト化抗体であるが、これらはマウス由来の可変領域もしくはＣＤＲを含むがために抗Ｉｇヒト抗体（ＨＡＣＡもしくはＨＡＨＡ）を産生させてしまう場合がある。完全ヒト抗体作製技術の確立により抗Ｉｇヒト抗体産生の問題はほぼ回避されるが、抗体はその本質的宿命として宿主にとって非自己であるという性質を有しているために、大量に投与すれば抗ヒトＩｇヒト抗体が産生される可能性を否定できない。
【発明の開示】
本発明の目的は、従来の抗体医薬とは基本コンセプトを異にする次世代型の抗体医薬を提供することである。特に、生活習慣病などの、既存の抗体医薬が対象としておらず且つ市場規模の大きい疾患領域の治療薬として有用な新規抗体医薬を提供することである。別の側面において、本発明は、従来の抗体医薬と比較してきわめて低用量で治療効果を発揮し得る抗体医薬を提供することにより治療コースあたりの抗体使用量を低減し、もって医療経済に寄与することを目的とする。
本発明は、部分的には、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）のある部分配列を抗原決定基とする抗ＰＡＣＡＰモノクローナル抗体が、ＰＡＣＡＰの作用（アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）活性化作用）を阻害しないこと、および該抗ＰＡＣＡＰ抗体を単独でマウスに投与すると、通常血中に検出されない内因性のＰＡＣＡＰが該抗体との複合体として検出される（即ち、血中安定化される）ことの発見に基づいている。本発明者らは、かかる知見に基づいて、投与対象動物の内因性リガンドに対して親和性を有し且つ該リガンドの作用を完全には阻害しない抗体（非中和抗体）を、該動物に単独で（即ち、該リガンドまたはその同等物を投与することなく）投与することにより、内因性リガンドの生理作用を保持させたままその血中安定性を向上（即ち、血中リガンド濃度を増大）させることができ、その結果該リガンドの受容体活性化作用を増強することができると発想した。そこで、本発明者らは、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）に対する非中和抗体を新たに作製し、これをラットに投与することにより、血漿中のＧＬＰ−１濃度を薬効が発揮される領域まで上昇させることに成功して、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
［１］哺乳動物の内因性リガンドに対して親和性を有し且つ実質的にそれを中和しない抗体を含有してなる該内因性リガンドの血中安定性改善剤、
［２］内因性リガンドの血中安定性の改善によりその受容体活性調節作用が増強されることを特徴とする上記［１］記載の剤、
［３］抗体の中和活性が約８０％以下である上記［１］記載の剤、
［４］哺乳動物に投与することにより、内因性リガンドの血中濃度が該抗体を投与していない場合の血中濃度の約２倍以上となる上記［１］記載の剤、
［５］内因性リガンドと抗体との複合体の血中半減期が該内因性リガンド単独の場合の約２倍以上である上記［１］記載の剤、
［６］遊離の内因性リガンドの血中半減期が約１週間以下である上記［１］記載の剤、
［７］内因性リガンドがペプチド性化合物である上記［１］記載の剤、
［８］内因性リガンドがＧ蛋白質共役型受容体に対するものである上記［７］記載の剤、
［９］内因性リガンドがセクレチン／グルカゴンスーパーファミリーに属するものである上記［８］記載の剤、
［１０］内因性リガンドがＧＬＰ−１、カルシトニン、ＰＡＣＡＰ、ＶＩＰおよびそれらの類縁体からなる群より選択される上記［９］記載の剤、
［１１］内因性リガンドがＬＨＲＨ、メタスチン、ＧＰＲ７／ＧＰＲ８リガンド、ＭＳＨ、グレリン、アペリンおよびその類縁体からなる群より選択される上記［８］記載の剤、
［１２］内因性リガンドがＥＰＯ、ＴＰＯ、インシュリン、インターフェロン、成長ホルモン、ＧＭ−ＣＳＦ、レプチン、アディポネクチンおよびそれらの類縁体からなる群より選択される上記［７］記載の剤、
［１３］内因性リガンドがＡＮＰ、ＢＮＰ、ＣＮＰ、ベータセルリン、ベータセルリン−δ４、アドレノメジュリンおよびそれらの類縁体からなる群より選択される上記［７］記載の剤、
［１４］内因性リガンドの血中濃度を増加および／または血中半減期を延長させることが予防・治療上有効である疾患の予防・治療用である上記［１］記載の剤、
［１５］疾患が代謝疾患、骨・軟骨疾患、循環器疾患、脳・神経疾患、感染症、ガン、血液疾患、泌尿器疾患、不妊・勃起不全症、成長不全および免疫不全からなる群より選択される疾患の予防・治療剤である上記［１４］記載の剤、
［１６］内因性リガンドの血中濃度を増加および／または血中半減期を延長させることが予防・治療上有効である疾患の予防・治療方法であって、該内因性リガンドと同一もしくは実質的に同一の化合物を投与することなく、該内因性リガンドに対して親和性を有し且つ実質的にそれを中和しない抗体の有効量を哺乳動物に投与して該内因性リガンドの血中安定性を増大させることにより、その受容体活性調節作用を増強することを特徴とする方法、および
［１７］内因性リガンドの血中濃度を増加および／または血中半減期を延長させることが予防・治療上有効である疾患の予防・治療剤の製造のための、該内因性リガンドに対して親和性を有し且つ実質的にそれを中和しない抗体の使用、
などに関する。
本発明の抗体は、内因性リガンドに対して親和性を有するがそれを完全には中和しないという特性により、動物に投与すると内因性リガンドと結合してこれを安定化し、血中リガンド濃度を増大せしめ、結果として該リガンドの受容体活性調節作用を増強し得る。また、本発明の抗体は、元来血中に微量しか存在しないリガンドを捕捉するのに十分な量で効果を奏するので、既存の抗体医薬に比べて臨床投与量を顕著に低減することができ、より安全且つ安価な製剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、各種の抗ＰＡＣＡＰモノクローナル抗体［（ａ）ＰＡ−１Ｎａ；（ｂ）ＰＡ−３Ｎａ；（ｃ）ＰＡ−５Ｎａ；（ｄ）ＰＡ−６Ｎａ；（ｅ）ＰＡ−２Ｃａ；（ｆ）ＰＡ−１Ｃａ］とＰＡＣＡＰ３８およびその部分ペプチドならびにＶＩＰとの結合性を示す。縦軸は［測定された標識量（Ｂ）］／［競合ペプチド非添加時の標識量（Ｂ０）］×１００（％）、横軸は競合ペプチドの濃度（Ｍ）を示す。−〇−：ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２；−●−：ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ２；−▲−：ＰＡＣＡＰ（４−２７）ＯＨ；−■−：ＰＡＣＡＰ（１−１３）ＯＨ；−×−：ＶＩＰ；−△−：ＰＡＣＡＰ（１４−３８）ＮＨ２；−□−：ＰＡＣＡＰ（３１−３８）ＮＨ２
図２は、各種の抗ＰＡＣＡＰモノクローナル抗体の抗原認識部位を示す模式図である。上段のボックスがＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２を示し、その上の各数字はアミノ酸番号を示す。矢じりはＰＡＣＡＰ２７のプロセッシング部位を示す。ボックスの白ヌキ部分はＶＩＰとの共通のアミノ酸配列を、ハッチ部分はＶＩＰと相違するアミノ酸配列をそれぞれ示す。
図３は、ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２に対する各種の抗ＰＡＣＡＰモノクローナル抗体の中和活性を示す。縦軸はｃＡＭＰ濃度（ｐｍｏｌ／１０５細胞）、横軸は抗体濃度（ｎＭ）を示す。−〇−：ＰＡ−１Ｎａ；−△−：ＰＡ−３Ｎａ；−□−：ＰＡ−５Ｎａ；−■−：ＰＡ−６Ｎａ；−▲−：ＰＡ−２Ｃａ；−●−：ＰＡ−１Ｃａ
図４は、抗ＰＡＣＡＰ非中和モノクローナル抗体ＰＡ−６Ｎａの、ＤＰＰ−ＩＶによるＰＡＣＡＰ３８分解作用の抑制効果を示す。縦軸はＰＡＣＡＰ受容体への１２５Ｉ−ＰＡＣＡＰ２７の結合度（実験１と実験２とにおける残存放射活性の差を、過剰のＰＡＣＡＰ３８で受容体の結合サイトを飽和させて測定した残存放射活性を０％、ＰＡＣＡＰ３８の非存在下で測定した活性を１００％として％で表した）、横軸はＤＰＰ−ＩＶ発現細胞膜画分の希釈度を示す。−〇−：ＰＡ−６Ｎａ存在下；−●−：ＰＡ−６Ｎａ非存在下
図５は、抗ＰＡＣＡＰ非中和モノクローナル抗体（ＰＡ−６Ｎａ）の、組換えＤＰＰ−ＩＶによるＰＡＣＡＰ３８分解作用の抑制効果を示す。縦軸はＰＡＣＡＰ受容体への１２５Ｉ−ＰＡＣＡＰ２７の結合度（インプットした１２５Ｉ−ＰＡＣＡＰ２７の放射活性を１００％としたときの残存放射活性の割合）を示し、横軸はＤＰＰ−ＩＶの希釈度を示す。−□−：ＰＡ−６Ｎａ存在かつＤＰＰ−ＩＶ阻害剤非存在下；−■−：ＰＡ−６ＮａおよびＤＰＰ−ＩＶ阻害剤共存下；−〇−：抗体およびＤＰＰ−ＩＶ阻害剤非存在下；−●−：抗体非存在かつＤＰＰ−ＩＶ阻害剤存在下の各条件を示す。
図６は、ＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅに対する抗ＧＬＰ−１抗体（図６Ａ：ＧＬＩＴ２−３２９（１）２４（非中和抗体）および図６Ｂ：ＧＬＩＴ１−４９２（１）２（中和抗体））のレポータージーンアッセイの結果を示す。縦軸は２ｎＭ  ＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅに各濃度の抗エリスロポエチンモノクローナル抗体を反応させた場合のＧＬＰ−１活性を１００％とした、抗ＧＬＰ−１抗体添加時のＧＬＰ−１残存活性を示す。横軸の各数字はＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅ濃度に対する抗ＧＬＰ−１抗体濃度のモル比を示す。
図７は、ＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅに対する抗ＧＬＰ−１抗体（ＧＬＩＴ２−３２９（１）２４およびＧＬＩＴ１−４９２（１）２）のＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１受容体結合阻害アッセイの結果を示す。縦軸は２００ｐＭ  ＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅに実施例３より得られた抗ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２非中和抗体（ＰＡ−６Ｎａ）を反応させた場合のＩ１２５標識ＧＬＰ−１のＧＬＰ−１受容体膜画分への結合量を１００％とした、抗ＧＬＰ−１抗体添加時のＩ１２５標識ＧＬＰ−１のＧＬＰ−１受容体膜画分への結合率（残存結合活性）を示し、横軸の各数字はＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅ濃度に対する抗ＧＬＰ−１抗体濃度のモル比を示す。
図８は、抗ＧＬＰ−１非中和モノクローナル抗体（ＧＬＩＴ２−３２９（１）２４）がＤＰＰ−ＩＶによるＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅの分解を抑制することを示す。縦軸はＤＰＰ−ＩＶ消化後のＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅ残存量をＥＬＩＳＡで測定し、抗体およびＤＰＰ−ＩＶ非存在下のＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅ量を１００％として％表示した値を示す。ＧＬＩＴ２−３２９（１）２４：ＧＬＩＴ２−３２９（１）２４存在下；Ａｎｔｉ−ＥＰＯ  Ａｂ：抗エリスロポエチン抗体存在下；Ｎｏｎｅ：抗体非存在下；ＤＰＰ−ＩＶ（＋）：ＤＰＰ−ＩＶ存在下；ＤＰＰ−ＩＶ（−）：ＤＰＰ−ＩＶ非存在下の各条件を示す。
図９は、飽食Ｗｉｓｔｅｒ  Ｆａｔｔｙラット（各群３匹）に生理食塩水、マウスＩｇＧ（２０ｍｇ／ｋｇ）および抗ＧＬＰ−１非中和モノクローナル抗体ＧＬＩＴ２−３２９（１）２４（２０ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ腹腔内投与して１日後の、血漿中ＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅ濃度を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の血中安定性改善剤に用いられる抗体は、哺乳動物（例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、ハムスター、モルモット等）の内因性リガンドに対して親和性を有し、且つ実質的にそれを中和しないものであれば特に制限はない。
ここで「内因性」とは、生体内（体発明においては、体発明の血中安定性改善剤の投与対象である哺乳動物の体内）に生来存在する（＝内在する）ことを意味する。従って、生体内に生来存在する物質と同一物質であっても、体外から該動物に投与されたものは含まれない。
また、「リガンド」とは、細胞に存在して外的刺激を認識・伝達する機能を有すを分子（即ち、受容体）に特異的に結合して受容体の該機能を活性化し得る（＝作動性）もしくは活性化しない（拮抗性）分子を意味し、例えば、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、造血因子、神経伝達物質などが挙げられるが、これらに限定されない。
内因性リガンドを「実質的に中和しない」とは、内因性リガンド分子の生理活性（即ち、受容体活性調節作用）を全く阻害しないか、あるいは内因性リガンドが全体として、生体にとって必要な生理活性を発揮し得る程度にしか内因性リガンド分子を阻害しないことを意味する。即ち、抗体が内因性リガンドを安定化することにより血中リガンド濃度が増大するために、個々の内因性リガンド分子の活性が部分的に阻害されても全体として所望のリガンド活性を発揮し得る場合があるので、見かけ上該抗体は内因性リガンドを中和しない。本明細書においては、内因性リガンドを実質的に中和しない抗体を、以下「非中和抗体」と称する場合もある。
好ましくは、本発明に用いられる非中和抗体は、中和活性が約８０％以下、より好ましくは約５０％以下、特に好ましくは約２０％以下のものである。ここで「中和活性」とは、内因性リガンド分子の活性を阻害する割合を意味する。リガンド活性とは受容体活性調節作用を意味し、リガンドが作動性であれば受容体の活性（エフェクターの活性調節作用）、拮抗性であれば受容体との結合性などを指標として測定することができる。中和活性は下記式により算出することができる。
中和活性（％）＝（［Ａｆｒｅｅ］−［Ａｂｏｕｎｄ］）／［Ａｆｒｅｅ］ｘ１００
Ａｆｒｅｅ：抗体の非存在下におけるリガンド活性
Ａｂｏｕｎｄ：抗体の存在下におけるリガンド活性
本発明の血中安定性改善剤が標的とする内因性リガンドは、抗体により安定化された結果増強される該リガンドの生理活性が、生体にとって望ましい効果を奏するものであれば特に制限されず、抗体よりも血中半減期の短いいかなるリガンド分子であってもよい。
好ましくは、本発明により安定化され得る内因性リガンドとしては、ペプチド性化合物が例示される。ここで「ペプチド性化合物」とは、分子内に１もしくは２以上のペプチド結合を有する任意の化合物を意味するが、好ましくは、複数のアミノ酸がペプチド結合により重合した「ペプチド」もしくは「蛋白質」が挙げられる。
本明細書においてアミノ酸配列にて示されるペプチドもしくは蛋白質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。本発明における内因性リガンドであるペプチドもしくは蛋白質は、Ｃ末端がカルボキシル基、カルボキシレート、アミドまたはエステルの何れであってもよい。また、該ペプチドもしくは蛋白質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、該カルボキシル基がアミド化またはエステル化されていてもよい。さらに、該ペプチドもしくは蛋白質は、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が、例えばホルミル基、アセチル基などで置換されているもの、Ｎ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が他の置換基（例えば、ホルミル基、アセチル基など）で置換されたものであってもよい。
あるいは、糖鎖、脂肪酸、脂質、核酸などがペプチド鎖に結合した複合蛋白質（ペプチド）も本発明におけるペプチドもしくは蛋白質に包含される。
内因性リガンドとしてのペプチド性化合物の好ましい具体例としては、例えば、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、造血因子、神経伝達物質等の生理活性物質として機能するペプチドもしくは蛋白質が挙げられる。
ホルモンの例としては、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、カルシトニン、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、血管作動性腸管ポリペプチド（ＶＩＰ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨ−ＲＨ）、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、グレリン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インシュリン、成長ホルモン、レプチン、アディポネクチン、アドレノメジュリン、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、一本鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｓｃｕ−ＰＡ）、二本鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔｃｕ−ＰＡ）、アンジオテンシンＩ、アンジオテンシンＩＩＩ、アンジオテンシンＩＩインヒビター、ブラジキニン、コルチコトロピン、ダイノルフィン、キョートルフィン、エンドルフィン、エンケファリン、セクレチン、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、ニューロテンシン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、オキシトシン、バソプレシン、バソトシン、ソマトスタチン、チロトロピン放出ホルモン（ＴＲＨ）、甲状腺刺激ホルモン、プロラクチンなどが拳げられる。
サイトカインの例としては、インターロイキン類（例：ＩＬ−１〜ＩＬ−２０）、インターフェロン類（例：ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ）、顆粒球・マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージ−コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、リンホトキシン、Ｔ細胞代替因子（ＴＲＦ）、抗原特異的サプレッサー因子（ＴｓＦ）、可溶性免疫反応抑制因子（ＳＩＲＦ）、サプレッサー誘導因子（ＳＩＦ）、マクロファージ活性化因子（ＭＡＦ）、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）などが挙げられる。
ケモカインの例としては、ＥＮＡ−８、ＧＣＰ−２、ＧＲＯ−α、ＧＲＯ−β、ＧＲＯ−γ、ＢＣＡ−１、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、ＰＦ−４などのＣＸＣケモカイン、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−３β、エオタキシン、エオタキシン−２、ＭＣＰ−１〜４、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳなどのＣＣケモカイン、リンホタクチンなどのＣケモカイン、フラクタルキン、ニューロタクチンなどのＣＸ，Ｃケモカインなどが挙げられる。
増殖因子の例としては、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ベータセルリン、ベータセルリン−δ４、トフンスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）などのＥＧＦファミリー、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などのＰＤＧＦファミリー、線維芽細胞増殖因子（例：ＦＧＦ−１〜９）などのＦＧＦファミリー、インシュリン様増殖因子（例：ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ）などのＩＧＦファミリー、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などのＨＧＦファミリー、トランスフォーミング増殖因子−β（例：ＴＧＦ−β１〜５）などのＴＧＦ−βファミリー、ニューロトロフィン類（例：ＮＴ１〜５）などのＮＧＦファミリーなどが挙げられる。
造血因子の例としては、上記ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦなどが挙げられる。
神経伝達物質の例としては、上記ダイノルフィン、キョートルフィン、エンドルフィン、エンケファリンなどが挙げられる。
好ましい一実施態様において、本発明の血中安定性改善剤は、Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に対する内因性リガンドであるペプチド性化合物を安定化する。ＧＰＣＲの例としては、ニューロペプチド受容体、ケモカイン受容体等のクラスＡＧＰＣＲ、グルカゴン受容体、カルシトニン受容体、ＰＴＨ受容体等のクラスＢ  ＧＰＣＲ等が挙げられるが、これらに限定されない。クラスＢ  ＧＰＣＲに対する内因性リガンドとしては、例えばＧＬＰ−１、カルシトニン、ＰＡＣＡＰ、ＶＩＰなどのセクレチン／グルカゴンスーパーファミリーに属するペプチドもしくは蛋白質が挙げられる。また、クラスＢ以外のＧＰＣＲに対する内因性リガンドとしては、例えばＬＨ−ＲＨ、メタスチン、ＧＰＲ７に特異的なリガンド（ニューロペプチドＢ（ＮＰＢ）とも呼ばれる）およびＧＰＲ７、ＧＰＲ８の双方に対するリガンド（ニューロペプチドＷ（ＮＰＷ）とも呼ばれる）（本明細書ではこれらを包括してＧＰＲ７／ＧＰＲ８リガンドと表記する）、ＭＳＨ、グレリン、ＡＰＪ受容体に特異的なリガンド（アペリン（ａｐｅｌｉｎ）と呼ばれる）等が挙げられる。
別の好ましい実施態様において、本発明の血中安定性改善剤は、ＧＰＣＲ以外の受容体に対する内因性リガンドであるペプチドもしくは蛋白質を安定化する。そのようなペプチドの例としては、ＡＮＰ、ＢＮＰ、ＣＮＰ、ベータセルリン、ベータセルリン−δ４、アドレノメジュリン等が、また蛋白質の例としては、ＥＰＯ、ＴＰＯ、インシュリン、インターフェロン、成長ホルモン、ＧＭ−ＣＳＦ、レプチン、アディポネクチン等が挙げられる。
上記したペプチドもしくは蛋白質は、投与対象である哺乳動物にとって内因性であり且つリガンドとしての作用を保持する限り、公知のアミノ酸配列とは１もしくは２以上のアミノ酸において異なるアミノ酸配列を有するものであってもよい。ここで「リガンドとしての作用を保持する」とは受容体との結合能を保持することを意味し、作動性／拮抗性の程度は異なっていてもよい。そのような例としては、遺伝子多型、スプライスバリアント、翻訳後プロセッシングにより生じるフラグメント等が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書においては、これらを包括して「類縁体」と称することとする。
本発明は、非中和抗体を作製し得る限り、ペプチド性化合物以外のいかなる内因性リガンドにも適用することができる。そのような内因性リガンドとしては、例えば、ステロイド（例：グルココルチコイド、エストラジオール、エストリオール、テストステロン等）などの非ペプチド性ホルモン、生体アミン類（例：アドレナリン、ドーパミン、ヒスタミン、アセチルコリン、ノルアドレナリン等）、脂質（例：アナンダミド、カンナビノイド、ロイコトリエン、リソホスファチジン酸、血小板活性化因子等）、脂肪酸（例：ＧＰＲ４０リガンド等）、エイコサノイド（例：プロスタグランジン、トロンボキサン等）、胆汁酸（例：ＴＧＲ５リガンド等）、アミノ酸もしくはその誘導体（例：代謝性グルタミン酸、ＧＡＢＡ等）、プリンもしくは核酸（例：アデノシン、ｃＡＭＰ、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＡＤＰ、ＵＤＰ等）などの、ＧＰＣＲや核内受容体に対するリガンドが挙げられる。
本発明の血中安定性改善剤は、抗体との免疫複合体形成により内因性リガンドの血中半減期を延長することを特徴とする。例えば、生理活性ペプチドのようなペプチド性の内因性リガンドは、生体内のペプチダーゼによる分解を受け易く、また腎クリアランスが早いことなどから、血中半減期が非常に短い。一方、抗体の血中半減期は非常に長く、例えば完全抗体分子の場合、通常約３週間といわれている。生理活性ペプチドがそれに対する抗体と免疫複合体を形成すると、抗体分子によってペプチダーゼなど、生理活性ペプチドを不安定化する因子がペプチド分子の標的切断部位に近づけなくなる、またペプチド−抗体複合体としての分子サイズが大きくなり腎クリアランスを受け難くなる等の理由により、該ペプチドの血中安定性が向上する（例えば、ＧＬＰ−１やＰＡＣＡＰ等のペプチドは、ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ（本明細書においては、ＤＰＰ−ＩＶと略記する場合がある）によりＮ末端が切断されるが、その結果生じるフラグメントは受容体に対してアンタゴニスト活性を有するので、これらのペプチドに対する非中和抗体を含有する本発明の血中安定性改善剤は、該ペプチドのＤＰＰ−ＩＶによる分解抑制剤として特に有用である）。
従って、本発明の血中安定性改善剤は、遊離状態での血中半減期が抗体より短い内因性リガンド（具体的には、遊離状態での血中半減期が約１週間以下である内因性リガンド）の血中安定性改善に一般に用いることができるが、好ましくは、遊離状態での血中半減期が約１日以下、より好ましくは約１２時間以下、いっそう好ましくは約６時間以下、特に好ましくは２時間以下、最も好ましくは１時間以下である内因性リガンドなどに適用することができる。
本発明に用いられる抗体は、抗原である内因性リガンドを実質的に中和しない限り、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、通常、抗原を中和することなく結合し得る領域は限定されるので、比較的容易に非中和抗体を得るにはモノクローナル抗体を使用することが好ましい。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＡ、特に好ましくはＩｇＧが挙げられる。
また、本発明に用いられる抗体は、標的抗原を特異的に認識し結合するための相補性決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも有するものであれば特に制限はなく、完全抗体分子の他、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等のフラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の蛋白質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。
本発明に用いられる抗体がモノクローナル抗体である場合、例えば、以下の方法によって調製することができる。
（１）免疫原の調製
免疫原としては、標的抗原またはその誘導体と同一の抗原決定基を１種あるいは２種以上有する化合物を使用することができる。例えば、標的抗原がペプチドもしくは蛋白質などのペプチド性化合物である場合には、該抗原またはその誘導体は、（ａ）例えばヒト、サル、ラット、マウスなどの哺乳動物の抗原産生組織または細胞から自体公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて単離・精製する、（ｂ）ペプチド・シンセサイザー等を使用する自体公知のペプチド合成方法で化学的に合成する、あるいは（ｃ）該抗原またはその誘導体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養する、（ｄ）該抗原またはその誘導体をコードする核酸を鋳型として無細胞転写／翻訳系を用いて生化学的に合成することによって取得することができる。
（ａ）哺乳動物の組織または細胞から抗原を調製する場合、該組織または細胞をホモジナイズした後、酸、またはアルコールなどで抽出を行い、該抽出液を自体公知の蛋白質分離技術（例：塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等）に付すことにより単離・精製することができる。得られた抗原ペプチド（蛋白質）をそのまま免疫原とすることもできるし、ペプチダーゼ等を用いた限定分解により部分ペプチドを調製してそれを免疫原とすることもできる。
（ｂ）化学的に抗原もしくはそのフラグメントまたはその誘導体を合成する場合、該合成ペプチドとしては、例えば、上述した天然より精製される抗原ペプチド（蛋白質）と同一の構造を有するもの、具体的には、該抗原ペプチド（蛋白質）のアミノ酸配列において３個以上、好ましくは６個以上のアミノ酸からなる任意の箇所のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を１種あるいは２種以上含有するペプチドなどが用いられる。
（ｃ）ＤＮＡを含有する形質転換体を用いて抗原もしくはそのフラグメントまたはその誘導体を製造する場合、該ＤＮＡは、公知のクローニング方法［例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（２ｎｄ  ｅｄ．；Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法など］に従って作成することができる。該クローニング方法としては、例えば、（ｉ）抗原ペプチド（蛋白質）をコードする遺伝子配列に基づきデザインしたＤＮＡプローブを用い、ｃＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼーション法により該抗原をコードするＤＮＡを単離するか、（ｉｉ）抗原ペプチド（蛋白質）をコードする遺伝子配列に基づきデザインしたＤＮＡプライマーを用い、ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により該抗原もしくはそのフラグメントをコードするＤＮＡを調製し、該ＤＮＡを宿主に適合する発現ベクターに挿入した後、該発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体を適当な培地中で培養する方法などが挙げられる。
（ｄ）無細胞転写／翻訳系を利用する場合、上記（ｃ）と同様の方法により調製した抗原もしくはそのフラグメントをコードするＤＮＡを挿入した発現ベクター（例えば、該ＤＮＡがＴ７、ＳＰ６プロモーター等の制御下におかれた発現ベクターなど）を鋳型とし、該プロモーターに適合するＲＮＡポリメラーゼおよび基質（ＮＴＰｓ）を含む転写反応液を用いてｍＲＮＡを合成した後、該ｍＲＮＡを鋳型として公知の無細胞翻訳系（例：大腸菌、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽等の抽出液）を用いて翻訳反応を行わせる方法などが挙げられる。塩濃度等を適当に調整することにより、転写反応と翻訳反応を同一反応液中で一括して行うこともできる。
免疫原としては完全な抗原ペプチド（蛋白質）分子や部分アミノ酸配列を有するペプチドを用いることができる。完全な抗原ペプチドを免疫原とする場合は、中和活性および抗原決定基マッピングを指標に選抜を行うこととなる。一方、特定の抗原決定基（エピトープ）を認識する抗体を系統的に作製して中和活性を指標に選抜を行う場合には、免疫原として抗原ペプチド（蛋白質）の部分アミノ酸配列を有するペプチドが用いられる。
部分アミノ酸配列としては、例えば３個以上の連続するアミノ酸残基からなるもの、好ましくは４個以上、より好ましくは５個以上、いっそう好ましくは６個以上の連続するアミノ酸残基からなるものが挙げられる。あるいは、該アミノ酸配列としては、例えば２０個以下の連続するアミノ酸残基からなるもの、好ましくは１８個以下、より好ましくは１５個以下、いっそう好ましくは１２個以下の連続するアミノ酸残基からなるものが挙げられる。これらのアミノ酸残基の一部（例：１ないし数個）は置換可能な基（例：Ｃｙｓ、水酸基等）によって置換されていてもよい。免疫原として用いられるペプチドは、このような部分アミノ酸配列を１ないし数個含むアミノ酸配列を有する。
このようなペプチドは、上記（ｂ）〜（ｄ）の方法に従って、または上記（ａ）〜（ｄ）の方法により調製した抗原ペプチド（蛋白質）またはその誘導体を適当なペプチダーゼ等で切断することによって製造することができるが、種々の部分アミノ酸配列を有するペプチドを系統的に調製するには、公知のペプチド合成法を用いるのが好ましい。
ペプチドの合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、該ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の１）または２）に記載された方法等が挙げられる。
１）Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド  シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６６年）
２）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ  ペプチド（Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６５年）
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて該ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
ペプチドのアミド体は、アミド形成に適した市販のペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするペプチドの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、目的のペプチドを取得する。あるいはクロロトリチル樹脂、オキシム樹脂、４−ヒドロキシ安息香酸系樹脂等を用い、部分的に保護したペプチドを取り出し、更に常套手段で保護基を除去し目的のペプチドを得ることもできる。
上記した保護されたアミノ酸の縮合に関しては、ペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としてはＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが挙げられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔなど）とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護されたアミノ酸の活性化を行ったのちに樹脂に添加することができる。保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。たとえばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどの三級アミン類、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜約５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常約１．５ないし約４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、ならびにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手段から適宜選択しうる。
原料アミノ酸のアミノ基の保護基としては、たとえば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが挙げられる。カルボキシル基の保護基としては、たとえばＣ１−６アルキル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ７−１４アラルキル基、２−アダマンチル、４−ニトロベンジル、４−メトキシベンジル、４−クロロベンジル、フェナシルおよびベンジルオキシカルボニルヒドラジド、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド、トリチルヒドラジドなどが挙げられる。
セリンおよびスレオニンの水酸基は、たとえばエステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えばアセチル基などの低級（Ｃ１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが挙げられる。また、エーテル化に適する基としては、たとえばベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ターシャリーブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、たとえばＢｚｌ、Ｃｌ−Ｂｚｌ，２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが挙げられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、たとえばＴｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、Ｂｏｍ、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが挙げられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、たとえば対応する酸無水物、アジド、活性エステル［アルコール（たとえば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル］などが挙げられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、たとえば対応するリン酸アミドが挙げられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、たとえばＰｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども挙げられる。上記酸処理による脱離反応は一般に−２０℃〜４０℃の温度で行われるが、酸処理においてはアニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、まず、カルボキシル末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除いたペプチド（またはアミノ酸）とを製造し、この両ペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ペプチドを得ることができる。この粗ペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のペプチドのアミド体を得ることができる。
ペプチドのエステル体を得るにはカルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ペプチドのアミド体と同様にして所望のペプチドのエステル体を得ることができる。
例えば、後述の実施例において詳述する通り、固相法によりＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２あるいはＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２の部分ペプチドを合成する場合には、不溶性樹脂として当該技術分野で知られたもの、例えばクロロメチル樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、４−オキシメチルフェニルアセタミドメチル樹脂等これら何れかの樹脂を用い、ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２あるいはＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２の部分ペプチドのＣ末端側から保護アミノ酸を常法に従って順次縮合する。次いでフッ化水素処理で全保護基を除去して、高速液体クロマトグラフィー等のそれ自体公知の方法による精製後、目的とするＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２あるいはＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２の部分ペプチドを得ることができる。
例えば、Ｎ−保護アミノ酸としては、α−アミノ基をＢｏｃ基で保護し（Ｂｏｃ−Ｘａａのように表記する）、セリンおよびスレオニンの水酸基はＢｚｌ基で（Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）のように表記する）、グルタミン酸、アスパラギン酸のω−カルボン酸はＯＢｚｌ基で（Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）のように表記する）、リジンのε−アミノ基はＣｌ−Ｚ基で（Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）と表記する）、チロシンの水酸基はＢｒ−Ｚ基で（Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）と表記する）、アルギニンのグアニド基はＴｏｓ基で（Ａｒｇ（Ｔｏｓ）と表記する）、ヒスチジンのイミダゾール基はＴｏｓ基で（Ｈｉｓ（Ｔｏｓ）と表記する）保護する方法で製造することができる。
抗原は、免疫原性を有していれば不溶化したものを直接免疫することもできるが、分子内に１ないし数個の抗原決定基しか有しない低分子量（例えば、分子量約３，０００以下）の抗原（例えば、上記のペプチドなど）を用いる場合には、これらの抗原は通常免疫原性の低いハプテン分子なので、適当な担体（キャリアー）に結合または吸着させた複合体として免疫することができる。担体としては天然もしくは合成の高分子を用いることができる。天然高分子としては、例えばウシ、ウサギ、ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンや例えばウシ、ウサギなどの哺乳動物のサイログロブリン、例えばニワトリのオボアルブミン、例えばウシ、ウサギ、ヒト、ヒツジなどの哺乳動物のヘモグロビン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などが用いられる。合成高分子としては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類などの重合物または共重合物などの各種ラテックスなどが挙げられる。該キャリアーとハプテンとの混合比は、担体に結合あるいは吸着させた抗原に対する抗体が効率よく産生されれば、どのようなものをどのような比率で結合あるいは吸着させてもよく、通常ハプテンに対する抗体の作製にあたり常用されている上記の天然もしくは合成の高分子キャリアーを、重量比でハプテン１に対し０．１〜１００の割合で結合あるいは吸着させたものを使用することができる。
ハプテンとキャリアーのカップリングには、種々の縮合剤を用いることができる。例えば、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架橋するビスジアゾ化ベンジジンなどのジアゾニウム化合物、アミノ基同士を架橋するグルタルアルデビトなどのジアルデヒド化合物、トルエン−２，４−ジイソシアネートなどのジイソシアネート化合物、チオール基同士を架橋するＮ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミドなどのジマレイミド化合物、アミノ基とチオール基を架橋するマレイミド活性エステル化合物、アミノ基とカルボキシル基とを架橋するカルボジイミド化合物などが好都合に用いられる。また、アミノ基同士を架橋する際にも、一方のアミノ基にジチオピリジル基を有する活性エステル試薬（例えば、ＳＰＤＰなど）を反応させた後還元することによりチオール基を導入し、他方のアミノ基にマレイミド活性エステル試薬によりマレイミド基を導入後、両者を反応させることもできる。
（２）モノクローナル抗体の作製
抗原は、温血動物に対して、例えば腹腔内注入、静脈注入，皮下注射、皮内注射などの投与方法によって、抗体産生が可能な部位にそれ自体単独であるいは担体、希釈剤と共に投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常１〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。温血動物としては、例えばサル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ニワトリなどが挙げられる。抗Ｉｇ抗体産生の問題を回避するためには投与対象と同一種の哺乳動物を用いることが好ましいが、モノクローナル抗体作製には一般にマウスおよびラットが好ましく用いられる。
ヒトに対する人為的免疫感作は倫理的に困難であることから、本発明の血中安定性改善剤がヒトを対象とする場合には、（ｉ）後述する方法に従って作製されるヒト抗体産生動物（例：マウス）を免疫してヒト抗体を得る、（ｉｉ）後述する方法に従ってキメラ抗体、ヒト化抗体もしくは完全ヒト抗体を作製する、あるいは（ｉｉｉ）体外免疫法とウイルスによる細胞不死化、ヒト−ヒト（もしくはマウス）ハイブリドーマ作製技術、ファージディスプレイ法等とを組み合わせてヒト抗体を得ることが好ましい。尚、体外免疫法は、通常の免疫では抗体産生が抑制される抗原に対する抗原を取得できる可能性があることの他、ｎｇ〜μｇオーダーの抗原量で抗体を得ることが可能であること、免疫が数日間で終了することなどから、不安定で大量調製の困難な抗原に対する抗体を得る方法として、非ヒト動物由来の抗体を調製する場合にも好ましく用いられ得る。
体外免疫法に用いられる動物細胞としては、ヒトおよび上記した温血動物（好ましくはマウス、ラット）の末梢血、脾臓、リンパ節などから単離されるリンパ球、好ましくはＢリンパ球等が挙げられる。例えば、マウスやラット細胞の場合、４〜１２週齢程度の動物から脾臓を摘出・脾細胞を分離し、適当な培地（例：ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、ハムＦ１２培地等）で洗浄した後、抗原を含む胎仔ウシ血清（ＦＣＳ；５〜２０％程度）添加培地に浮遊させて４〜１０日間程度ＣＯ２インキュベーターなどを用いて培養する。抗原濃度としては、例えば０．０５〜５μｇが挙げられるがこれに限定されない。同一系統の動物（１〜２週齢程度が好ましい）の胸腺細胞培養上清を常法に従って調製し、培地に添加することが好ましい。
ヒト細胞の体外免疫では、胸腺細胞培養上清を得ることは困難なので、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６等数種のサイトカインおよび必要に応じてアジュバント物質（例：ムラミルジペプチド等）を抗原とともに培地に添加して免疫感作を行うことが好ましい。
モノクローナル抗体の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物（例：マウス、ラット）もしくは動物細胞（例：ヒト、マウス、ラット）から抗体価の上昇が認められた個体もしくは細胞集団を選択し、最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取もしくは体外免疫後４〜１０日間培養した後に細胞を回収して抗体産生細胞を単離し、これと骨髄腫細胞とを融合させることにより抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。血清中の抗体価の測定は、例えば標識化抗原と抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。
骨髄腫細胞は多量の抗体を分泌するハイブリドーマを産生し得るものであれば特に制限はないが、自身は抗体を産生もしくは分泌しないものが好ましく、また、細胞融合効率が高いものがより好ましい。また、ハイブリドーマの選択を容易にするために、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）感受性の株を用いることが好ましい。例えばマウス骨髄腫細胞としてはＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１等が、ラット骨髄腫細胞としてはＲ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ  １．２．３等が、ヒト骨髄腫細胞としてはＳＫＯ−００７、ＧＭ  １５００−６ＴＧ−２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２、ＵＣ７２９−６等が挙げられる。
融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６巻、４９５頁（１９７５年）］に従って実施することができる。融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧなどが用いられる。ＰＥＧの分子量は特に制限はないが、低毒性で且つ粘性が比較的低いＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００が好ましい。ＰＥＧ濃度としては例えば１０〜８０％程度、好ましくは３０〜５０％程度が例示される。ＰＥＧの希釈用溶液としては無血清培地（例：ＲＰＭＩ１６４０）、５〜２０％程度の血清を含む完全培地、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝液等の各種緩衝液を用いることができる。所望によりＤＭＳＯ（例：１０〜２０％程度）を添加することもできる。融合液のｐＨとしては、例えば４〜１０程度、好ましくは６〜８程度が挙げられる。
抗体産生細胞（脾細胞）数と骨髄細胞数との好ましい比率は、通常１：１〜２０：１程度であり、通常２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で通常１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
抗体産生細胞株はまた、リンパ球をトランスフォームし得るウイルスに抗体産生細胞を感染させて該細胞を不死化することによっても得ることができる。そのようなウイルスとしては、例えばエプスタイン−バー（ＥＢ）ウイルス等が挙げれらる。大多数の人は伝染性単核球症の無症状感染としてこのウイルスに感染した経験があるので免疫を有しているが、通常のＥＢウイルスを用いた場合にはウイルス粒子も産生されるので、適切な精製を行うべきである。ウイルス混入の可能性のないＥＢシステムとして、Ｂリンパ球を不死化する能力を保持するがウイルス粒子の複製能力を欠損した組換えＥＢウイルス（例えば、潜伏感染状態から溶解感染状態への移行のスイッチ遺伝子における欠損など）を用いることもまた好ましい。
マーモセット由来のＢ９５−８細胞はＥＢウイルスを分泌しているので、その培養上清を用いれば容易にＢリンパ球をトランスフォームすることができる。この細胞を例えば血清及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）添加培地（例：ＲＰＭＩ１６４０）もしくは細胞増殖因子を添加した無血清培地で培養した後、濾過もしくは遠心分離等により培養上清を分離し、これに抗体産生Ｂリンパ球を適当な濃度（例：約１０７細胞／ｍＬ）で浮遊させて、通常２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で通常０．５〜２時間程度インキュベートすることにより抗体産生Ｂ細胞株を得ることができる。ヒトの抗体産生細胞が混合リンパ球として提供される場合、大部分の人はＥＢウイルス感染細胞に対して傷害性を示すＴリンパ球を有しているので、トランスフォーメーション頻度を高めるためには、例えばヒツジ赤血球等とＥロゼットを形成させることによってＴリンパ球を予め除去しておくことが好ましい。また、可溶性抗原を結合したヒツジ赤血球を抗体産生Ｂリンパ球と混合し、パーコール等の密度勾配を用いてロゼットを分離することにより標的抗原に特異的なリンパ球を選別することができる。さらに、大過剰の抗原を添加することにより抗原特異的なＢリンパ球はキャップされて表面にＩｇＧを提示しなくなるので、抗ＩｇＧ抗体を結合したヒツジ赤血球と混合すると抗原非特異的なＢリンパ球のみがロゼットを形成する。従って、この混合物からパーコール等の密度勾配を用いてロゼット非形成層を採取することにより、抗原特異的Ｂリンパ球を選別することができる。
トランスフォーメーションによって無限増殖能を獲得したヒト抗体分泌細胞は、抗体分泌能を安定に持続させるためにマウスもしくはヒトの骨髄腫細胞と戻し融合させることができる。骨髄腫細胞としては上記と同様のものが用いられ得る。
ハイブリドーマのスクリーニング、育種は通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、５〜２０％ＦＣＳを含む動物細胞用培地（例：ＲＰＭＩ１６４０）もしくは細胞増殖因子を添加した無血清培地で行われる。ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンの濃度としては、例えばそれぞれ約０．１ｍＭ、約０．４μＭおよび約０．０１６ｍＭ等が挙げられる。ヒト−マウスハイブリドーマの選択にはウワバイン耐性を用いることができる。ヒト細胞株はマウス細胞株に比べてウワバインに対する感受性が高いので、１０−７〜１０−３Ｍ程度で培地に添加することにより未融合のヒト細胞を排除することができる。
ハイブリドーマの選択にはフィーダー細胞やある種の細胞培養上清を用いることが好ましい。フィーダー細胞としては、ハイブリドーマの出現を助けて自身は死滅するように生存期間が限られた異系の細胞種、ハイブリドーマの出現に有用な増殖因子を大量に産生し得る細胞を放射線照射等して増殖力を低減させたもの等が用いられる。例えば、マウスのフィーダー細胞としては、脾細胞、マクロファージ、血液、胸腺細胞等が、ヒトのフィーダー細胞としては、末梢血単核細胞等が挙げられる。細胞培養上清としては、例えば上記の各種細胞の初代培養上清や種々の株化細胞の培養上清が挙げられる。
また、ハイブリドーマは、抗原を蛍光標識して融合細胞と反応させた後、蛍光活性化セルソータ（ＦＡＣＳ）を用いて抗原と結合する細胞を分離することによっても選択することができる。この場合、標的抗原に対する抗体を産生するハイブリドーマを直接選択することができるので、クローニングの労力を大いに軽減することが可能である。
標的抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローニングには種々の方法が使用できる。
アミノプテリンは多くの細胞機能を阻害するので、できるだけ早く培地から除去することが好ましい。マウスやラットの場合、ほとんどの骨髄腫細胞は１０〜１４日以内に死滅するので、融合２週間後からはアミノプテリンを除去することができる。但し、ヒトハイブリドーマについては通常融合後４〜６週間程度はアミノプテリン添加培地で維持される。ヒポキサンチン、チミジンはアミノプテリン除去後１週間以上後に除去するのが望ましい。即ち、マウス細胞の場合、例えば融合７〜１０日後にヒポキサンチンおよびチミジン（ＨＴ）添加完全培地（例：１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０）の添加または交換を行う。融合後８〜１４日程度で目視可能なクローンが出現する。クローンの直径が１ｍｍ程度になれば培養上清中の抗体量の測定が可能となる。
抗体量の測定は、例えば標的抗原またはその誘導体あるいはその部分ペプチド（抗原決定基として用いた部分アミノ酸配列を含む）を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質（例：１２５Ｉ，１３１Ｉ，３Ｈ，１４Ｃ）、酵素（例：β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン）などで標識した抗免疫グロブリン（ＩｇＧ）抗体（もとの抗体産生細胞が由来する動物と同一種の動物由来のＩｇＧに対する抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合した標的抗原（抗原決定基）に対する抗体を検出する方法、抗ＩｇＧ抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、上記と同様の標識剤で標識した標的抗原またはその誘導体あるいはその部分ペプチドを加え、固相に結合した標的抗原（抗原決定基）に対する抗体を検出する方法などによって行うことができる。
クローニング方法としては限界希釈法が通常用いられるが、軟寒天を用いたクローニングやＦＡＣＳを用いたクローニング（上述）も可能である。限界希釈法によるクローニングは、例えば以下の手順で行うことができるがこれに限定されない。
上記のようにして抗体量を測定して陽性ウェルを選択する。適当なフィーダー細胞を選択して９６ウェルプレートに添加しておく。抗体陽性ウェルから細胞を吸い出し、完全培地（例：１０％  ＦＣＳおよびＰ／Ｓ添加ＲＭＰＩ１６４０）中に３０細胞／ｍＬの密度となるように浮遊させ、フィーダー細胞を添加したウェルプレートに０．１ｍＬ（３細胞／ウェル）加え、残りの細胞懸濁液を１０細胞／ｍＬに希釈して別のウェルに同様にまき（１細胞／ウェル）、さらに残りの細胞懸濁液を３細胞／ｍＬに希釈して別のウェルにまく（０．３細胞／ウェル）。目視可能なクローンが出現するまで２〜３週間程度培養し、抗体量を測定・陽性ウェルを選択し、再度クローニングする。ヒト細胞の場合はクローニングが比較的困難なので、１０細胞／ウェルのプレートも調製しておく。通常２回のサブクローニングでモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることができるが、その安定性を確認するためにさらに数ヶ間定期的に再クローニングを行うことが望ましい。
ハイブリドーマはインビトロまたはインビボで培養することができる。
インビトロでの培養法としては、上記のようにして得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、細胞密度を例えば１０５〜１０６細胞／ｍＬ程度に保ちながら、また、ＦＣＳ濃度を徐々に減らしながら、ウェルプレートから徐々にスケールアップしていく方法が挙げられる。
インビボでの培養法としては、例えば、腹腔内にミネラルオイルを注入して形質細胞腫（ＭＯＰＣ）を誘導したマウス（ハイブリドーマの親株と組織適合性のマウス）に、５〜１０日後に１０６〜１０７細胞程度のハイブリドーマを腹腔内注射し、２〜５週間後に麻酔下に腹水を採取する方法が挙げられる。
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法［例：塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例：ＤＥＡＥ、ＱＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法など］に従って行われる。
以上のようにして、ハイブリドーマを温血動物の生体内又は生体外で培養し、その体液または培養物から抗体を採取することによって、モノクローナル抗体を製造することができる。
本発明に用いられる抗体は抗原である内因性リガンドを実質的に中和しないものでなければならないので、得られたモノクローナル抗体の中和活性の程度について調べる必要がある。中和活性は、抗体の存在下および非存在下におけるリガンドに対する受容体のエフェクター活性調節作用、あるいはリガンドと受容体との結合性を比較することにより測定することができる。例えば、内因性リガンドがアデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）活性を促進もしくは抑制するＧ蛋白質と共役するＧＰＣＲに対するものである場合、リガンドの単独存在下およびリガンド−抗体複合体の存在下において、例えば、１）該ＧＰＣＲおよびＡＣを細胞膜上に含む細胞もしくはその膜画分にＡＴＰを添加し、生成するｃＡＭＰ量を、抗ｃＡＭＰ抗体を用いて放射性物質（例：１２５Ｉ）、酵素（例：アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ）、蛍光物質（例：ＦＩＴＣ、ローダミン）等で標識したｃＡＭＰとの競合イムノアッセイにより測定する方法、２）上記細胞もしくはその膜画分に［α−３２Ｐ］ＡＴＰを添加し、生成する［３２Ｐ］ｃＡＭＰをアルミナカラム等で分離後、その放射活性を測定する方法、３）ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）の制御下にあるリポーター遺伝子（例：ルシフェラーゼ遺伝子）を導入した形質転換細胞における該遺伝子の発現量を測定する方法、４）該ＧＰＣＲを含む膜画分に［３５Ｓ］ＧＴＰ−γＳ（Ｇ蛋白質αサブユニットのＧＴＰａｓｅ活性によって加水分解を受けないＧＴＰアナログ）を添加し、膜に結合した放射活性を測定する方法、５）該ＧＰＣＲとリガンドとの結合を、放射性物質（例：１２５Ｉ）、酵素（例：アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ）、蛍光物質（例：ＦＩＴＣ、ローダミン）等で標識した該リガンドとの競合イムノアッセイにより測定する方法等が挙げられる。内因性リガンドに対する受容体がホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）をエフェクターとするＧＰＣＲである場合には、上記１）〜３）に代えて、１）該ＧＰＣＲおよびＰＬＣを細胞膜に含む細胞もしくはその膜画分にホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸を添加し、生成するイノシトールリン酸量を測定する方法、２）該ＧＰＣＲおよびＰＬＣを細胞膜に含む細胞内のＣａ２＋量を測定する方法、３）Ｃａ２＋によりアップレギュレートされるＴＰＡ（１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート）応答エレメント（ＴＲＥ）の制御下にあるリポーター遺伝子を導入した形質転換細胞における該遺伝子の発現量を測定する方法等を用いることができる。尚、細胞内Ｃａ２＋量は、蛍光プローブ（ｆｕｒａ−２、ｉｎｄｏ−１、ｆｌｕｏｒ−３、Ｃａｌｃｉｕｍ−Ｇｒｅｅｎ  Ｉ等）を用いて分光学的に測定するか、カルシウム感受性発光蛋白質であるエクオリン等を用いて測定することができる。蛍光プローブを用いた分光学的測定に適した装置として、ＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）システムが挙げられる。
上記の測定法を実施した結果、例えば、中和活性が約８０％以下、好ましくは約５０％以下、より好ましくは約２０％以下の抗体を、本発明に用いられる非中和抗体の候補として選択することができる。
好ましい実施態様において、本発明の血中安定性改善剤はヒトを投与対象とする医薬品であることから、本発明に用いられる抗体（好ましくはモノクローナル抗体）はヒトに投与した場合に抗原性を示す危険性が低減された抗体、具体的には、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス−ヒトキメラ抗体などであり、特に好ましくは完全ヒト抗体である。ヒト化抗体およびキメラ抗体は、後述する方法に従って遺伝子工学的に作製することができる。また、完全ヒト抗体は、上記したヒト−ヒト（もしくはマウス）ハイブリドーマより製造することも可能ではあるが、大量の抗体を安定に且つ低コストで提供するためには、後述するヒト抗体産生動物（例：マウス）またはファージディスプレイ法を用いて製造することが望ましい。
（１）キメラ抗体の作製
本明細書において「キメラ抗体」とは、Ｈ鎖およびＬ鎖の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）の配列がある哺乳動物種に由来し、定常領域（ＣＨおよびＣＬ）の配列が他の哺乳動物種に由来する抗体を意味する。可変領域の配列は、例えばマウス等の容易にハイブリドーマを作製することができる動物種由来であることが好ましく、定常領域の配列は投与対象となる哺乳動物種由来であることが好ましい。
キメラ抗体の作製法としては、例えば米国特許第６，３３１，４１５号に記載される方法あるいはそれを一部改変した方法などが挙げられる。具体的には、まず、上述のようにして得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（例えば、マウス−マウスハイブリドーマ）から、常法に従ってｍＲＮＡもしくは全ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成する。該ｃＤＮＡを鋳型として、適当なプライマー（例えば、センスプライマーとしてＶＨおよびＶＬの各Ｎ末端配列をコードする塩基配列を含むオリゴＤＮＡ、アンチセンスプライマーとしてＣＨおよびＣＬのＮ末端配列をコードする塩基配列とハイブリダイズするオリゴＤＮＡ（例えばＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：８８−８９，１９９１参照））を用い、常法に従ってＰＣＲでＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを増幅・精製する。同様の方法により、他の哺乳動物（例：ヒト）のリンパ球等より調製したＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによりＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを増幅・精製する。常法を用いてＶＨとＣＨ、ＶＬとＣＬをそれぞれ連結し、得られたキメラＨ鎖ＤＮＡおよびキメラＬ鎖ＤＮＡを、それぞれ適当な発現ベクター（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、マウス骨髄腫細胞等で転写活性を有するプロモーター（例：ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター等）を含むベクターなど）に挿入する。両鎖をコードするＤＮＡは別個のベクターに挿入してもよいし、１個のベクターにタンデムに挿入してもよい。得られたキメラＨ鎖およびキメラＬ鎖発現ベクターで宿主細胞を形質転換する。宿主細胞としては、動物細胞、例えば上記したマウス骨髄腫細胞の他、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、サル由来のＣＯＳ−７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ラット由来のＧＨＳ細胞などが挙げられる。形質転換は動物細胞に適用可能ないかなる方法を用いてもよいが、好ましくはエレクトロポレーション法などが挙げられる。宿主細胞に適した培地中で一定期間培養後、培養上清を回収して上記と同様の方法で精製することにより、キメラモノクローナル抗体を単離することができる。あるいは、宿主細胞としてウシ、ヤギ、ニワトリ等のトランスジェニック技術が確立し、且つ家畜（家禽）として大量繁殖のノウハウが蓄積されている動物の生殖系列細胞を用い、常法によってトランスジェニック動物を作製することにより、得られる動物の乳汁もしくは卵から容易に且つ大量にキメラモノクローナル抗体を得ることもできる。さらに、トウモロコシ、イネ、コムギ、ダイズ、タバコなどのトランスジェニック技術が確立し、且つ主要作物として大量に栽培されている植物細胞を宿主細胞として、プロトプラストへのマイクロインジェクションやエレクトロポレーション、無傷細胞へのパーティクルガン法やＴｉベクター法などを用いてトランスジェニック植物を作製し、得られる種子や葉などから大量にキメラモノクローナル抗体を得ることも可能である。
得られたキメラモノクローナル抗体をパパインで分解すればＦａｂが、ペプシンで分解すればＦ（ａｂ’）２がそれぞれ得られる。
また、マウスＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを適当なリンカー、例えば１〜４０アミノ酸、好ましくは３〜３０アミノ酸、より好ましくは５〜２０アミノ酸からなるペプチド（例：［Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）ｍ］ｎもしくは［（Ｇｌｙ）ｍ−Ｓｅｒ］ｎ（ｍは０〜１０の整数、ｎは１〜５の整数）等）をコードするＤＮＡを介して連結することによりｓｃＦｖとすることができ、さらにＣＨ３をコードするＤＮＡを適当なリンカーを介して連結することによりｍｉｎｉｄｏｄｙモノマーとしたり、ＣＨ全長をコードするＤＮＡを適当なリンカーを介して連結することによりｓｃＦｖ−Ｆｃとすることもできる。このような遺伝子工学的に修飾（共役）された抗体分子をコードするＤＮＡは、適当なプロモーターの制御下におくことにより大腸菌や酵母などの微生物で発現させることができ、大量に抗体分子を生産することができる。
マウスＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを１つのプロモーターの下流にタンデムに挿入して大腸菌に導入すると、モノシストロニックな遺伝子発現によりＦｖと呼ばれる二量体を形成する。また、分子モデリングを用いてＶＨおよびＶＬのＦＲ中の適当なアミノ酸をＣｙｓに置換すると、両鎖の分子間ジスルフィド結合によりｄｓＦｖと呼ばれる二量体が形成される。
（２）ヒト化抗体
本明細書において「ヒト化抗体」とは、可変領域に存在する相補性決定領域（ＣＤＲ）以外のすべての領域（即ち、定常領域および可変領域中のフレームワーク領域（ＦＲ））の配列がヒト由来であり、ＣＤＲの配列のみが他の哺乳動物種由来である抗体を意味する。他の哺乳動物種としては、例えばマウス等の容易にハイブリドーマを作製することができる動物種が好ましい。
ヒト化抗体の作製法としては、例えば米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号および第５，６９３，７６２号に記載される方法あるいはそれらを一部改変した方法などが挙げられる。具体的には、上記キメラ抗体の場合と同様にして、ヒト以外の哺乳動物種（例：マウス）由来のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを単離した後、常法により自動ＤＮＡシークエンサー（例：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製等）を用いてシークエンスを行い、得られる塩基配列もしくはそこから推定されるアミノ酸配列を公知の抗体配列データベース［例えば、Ｋａｂａｔ  ｄａｔａｂａｓｅ（Ｋａｂａｔら，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ編，第５版，１９９１参照）等］を用いて解析し、両鎖のＣＤＲおよびＦＲを決定する。決定されたＦＲ配列に類似したＦＲ配列を有するヒト抗体のＬ鎖およびＨ鎖をコードする塩基配列［例：ヒトκ型Ｌ鎖サブグループＩおよびヒトＨ鎖サブグループＩＩもしくはＩＩＩ（Ｋａｂａｔら，１９９１（上述）を参照）］のＣＤＲコード領域を、決定された異種ＣＤＲをコードする塩基配列で置換した塩基配列を設計し、該塩基配列を２０〜４０塩基程度のフラグメントに区分し、さらに該塩基配列に相補的な配列を、前記フラグメントと交互にオーバーラップするように２０〜４０塩基程度のフラグメントに区分する。各フラグメントをＤＮＡシンセサイザーを用いて合成し、常法に従ってこれらをハイブリダイズおよびライゲートさせることにより、ヒト由来のＦＲと他の哺乳動物種由来のＣＤＲを有するＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを構築することができる。より迅速かつ効率的に他の哺乳動物種由来ＣＤＲをヒト由来ＶＨおよびＶＬに移植するには、ＰＣＲによる部位特異的変異誘発を用いることが好ましい。そのような方法としては、例えば特開平５−２２７９７０号公報に記載の逐次ＣＤＲ移植法等が挙げられる。このようにして得られるＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを、上記キメラ抗体の場合と同様の方法でヒト由来のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡとそれぞれ連結して適当な宿主細胞に導入することにより、ヒト化抗体を産生する細胞あるいはトランスジェニック動植物を得ることができる。
ヒト化抗体もキメラ抗体と同様に遺伝子工学的手法を月いてｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｍｉｎｉｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、Ｆｖなどに改変することができ、適当なプロモーターを用いることで大腸菌や酵母などの微生物でも生産させることができる。
ヒト化抗体作製技術は、例えばハイブリドーマの作製技術が確立していない他の動物種に好ましく投与し得るモノクローナル抗体を作製するのにも応用することができる。例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどの家畜（家禽）として広く繁殖されている動物やイヌやネコなどのペット動物などが対象として挙げられる。
（３）ヒト抗体産生動物を用いた完全ヒト抗体の作製
内因性免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子をノックアウト（ＫＯ）した非ヒト温血動物に機能的なヒトＩｇ遺伝子を導入し、これを抗原で免疫すれば、該動物由来の抗体の代わりにヒト抗体が産生される。従って、マウス等のようにハイブリドーマ作製技術が確立している動物を用いれば、従来のマウスモノクローナル抗体の作製と同様の方法によって完全ヒトモノクローナル抗体を取得することが可能となる。まず、ヒトＩｇのＨ鎖およびＬ鎖のミニ遺伝子を通常のトランスジェニック（Ｔｇ）技術を用いて導入したマウスと、内因性マウスＩｇ遺伝子を通常のＫＯ技術を用いて不活性化したマウスとを交配して得られたヒト抗体産生マウス（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１７：３９１−３９７，１９９６を参照）を用いて作製されたヒトモノクローナル抗体のいくつかは既に臨床段階にあり、現在までのところ抗ヒトＩｇヒト抗体（ＨＡＨＡ）の産生は報告されていない。
その後、Ａｂｇｅｎｉｘ社［商品名：ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１５：１４６−１５６，１９９７；米国特許第５，９３９，５９８号等を参照）］やＭｅｄａｒｅｘ社［商品名：Ｈｕ−Ｍａｂ  Ｍｏｕｓｅ（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：８４５−８５１，１９９６；米国特許第５，５４５，８０６号等を参照）］が酵母人工染色体（ＹＡＣ）ベクターを用いてより大きなヒトＩｇ遺伝子を導入したＴｇマウスを作製し、よりレパートリーに富んだヒト抗体を産生し得るようになった。しかしながら、ヒトＩｇ遺伝子は、例えばＨ鎖の場合、約８０種のＶ断片、約３０種のＤ断片および６種のＪ断片が様々に組み合わされたＶＤＪエクソンが抗原結合部位をコードすることによりその多様性を実現しているため、その全長はＨ鎖が約１．５Ｍｂ（１４番染色体）、κＬ鎖が約２Ｍｂ（２番染色体）、λＬ鎖が約１Ｍｂ（２２番染色体）に達する。ヒトにおけるのと同様の多様な抗体レパートリーを他の動物種で再現するためには、各Ｉｇ遺伝子の全長を導入することが望ましいが、従来の遺伝子導入ベクター（プラスミド、コスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣ等）に挿入可能なＤＮＡは通常数ｋｂ〜数百ｋｂであり、クローニングしたＤＮＡを受精卵に注入する従来のトランスジェニック動物作製技術では全長の導入は困難であった。
Ｔｏｍｉｚｕｋａら（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１６：１３３−１４３，１９９７）は、Ｉｇ遺伝子を担持するヒト染色体の自然断片（ｈＣＦ）をマウスに導入して（染色体導入（ＴＣ）マウス）、完全長ヒトＩｇ遺伝子を有するマウスを作製した。即ち、まず、Ｈ鎖遺伝子を含む１４番染色体およびκＬ鎖遺伝子を含む２番染色体を例えば薬剤耐性マーカー等で標識したヒト染色体を有するヒト−マウスハイブリッド細胞を４８時間程度紡錘糸形成阻害剤（例：コルセミド）で処理して、１〜数体の染色体もしくはその断片が核膜に被包されたミクロセルを調製し、微小核融合法によりマウスＥＳ細胞に染色体を導入する。薬剤を含む培地を用いてヒトＩｇ遺伝子を有する染色体もしくはその断片を保持するハイブリッドＥＳ細胞を選択し、通常のＫＯマウス作製の場合と同様の方法によりマウス胚へ顕微注入する。得られるキメラマウスからコートカラーを指標にする等して生殖系列キメラを選択し、ヒト１４番染色体断片を伝達するＴＣマウス系統（ＴＣ（ｈＣＦ１４））およびヒト２番染色体断片を伝達するＴＣマウス系統（ＴＣ（ｈＣＦ２））を樹立する。常法により内因性Ｈ鎖遺伝子およびκＬ鎖遺伝子をＫＯされたマウス（ＫＯ（ＩｇＨ）およびＫＯ（Ｉｇκ））を作製し、これら４系統の交配を繰り返すことにより、４種の遺伝子改変をすべて有するマウス系統（ダブルＴＣ／ＫＯ）を樹立することができる。
上記のようにして作製されるダブルＴＣ／ＫＯマウスに、通常のマウスモノクローナル抗体を作製する場合と同様の方法を適用すれば、抗原特異的ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製することができる。しかしながら、κＬ鎖遺伝子を含むｈＣＦ２がマウス細胞内で不安定なため、ハイブリドーマ取得効率は通常のマウスの場合に比べて低いという欠点がある。
一方、前記Ｈｕ−Ｍａｂ  ＭｏｕｓｅはκＬ鎖遺伝子の約５０％を含むが、可変領域クラスターが倍加した構造を有するため完全長を含む場合と同等のκ鎖の多様性を示し（他方、Ｈ鎖遺伝子は約１０％しか含まないのでＨ鎖の多様性は低く、抗原に対する応答性が不十分である）、且つＹＡＣベクター（Ｉｇκ−ＹＡＣ）によりマウス染色体中に挿入されているので、マウス細胞内で安定に保持される。この利点を生かし、ＴＣ（ｈＣＦ１４）マウスとＨｕ−Ｍａｂ  Ｍｏｕｓｅとを交配してｈＣＦ１４とＩｇκ−ＹＡＣとを安定に保持するマウス（商品名：ＫＭマウス）を作製することにより、通常のマウスと同等のハイブリドーマ取得効率および抗体の抗原親和性を得ることができる。
さらに、より完全にヒトにおける多様な抗体レパートリーを再現するために、λＬ鎖遺伝子をさらに導入したヒト抗体産生動物を作製することもできる。かかる動物は、上記と同様の方法でλＬ鎖遺伝子を担持するヒト２２番染色体もしくはその断片を導入したＴＣマウス（ＴＣ（ｈＣＦ２２））を作製し、これと上記ダブルＴＣ／ＫＯマウスやＫＭマウスとを交配することにより得ることもできるし、あるいは、例えばＨ鎖遺伝子座とλＬ鎖遺伝子座とを含むヒト人工染色体（ＨＡＣ）を構築してマウス細胞に導入することにより得ることもできる（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８：１０８６−１０９０，２０００）。
本発明に用いられる抗体は非中和抗体でなければならないことからモノクローナル抗体であることが望ましいが、抗原として小さなハプテン分子を用いれば、標的抗原の特異的部位に結合する抗体が得られるので、ポリクローナル抗体であっても非中和抗体を得ることは原理的には可能である。本発明に用いられる抗体がポリクローナル抗体である場合には、ハイブリドーマの利用を要しないので、ハイブリドーマ作製技術は確立されていないがトランスジェニック技術は確立されている動物種、好ましくはウシ等の有蹄動物を用いて、上記と同様の方法によりヒト抗体産生動物を作製すれば、より大量のヒト抗体を安価に製造することも可能である（例えば、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：８８９−８９４，２００２参照）。得られるヒトポリクローナル抗体は、ヒト抗体産生動物の血液、腹水、乳汁、卵など、好ましくは乳汁、卵を採取し、上記と同様の精製技術を組み合わせることによって精製することができる。
（４）ファージディスプレイヒト抗体ライブラリーを用いた完全ヒト抗体の作製
完全ヒト抗体を作製するもう１つのアプローチはファージディスプレイを用いる方法である。この方法はＰＣＲによる変異がＣＤＲ以外に導入される場合があり、そのため臨床段階で少数のＨＡＨＡ産生の報告例があるが、その一方で宿主動物に由来する異種間ウイルス感染の危険性がない点や抗体の特異性が無限である（禁止クローンや糖鎖などに対する抗体も容易に作製可能）等の利点を有している。
ファージディスプレイヒト抗体ライブラリーの作製方法としては、例えば、以下のものが挙げられるが、これに限定されない。
用いられるファージは特に限定されないが、通常繊維状ファージ（Ｆｆバクテリオファージ）が好ましく用いられる。ファージ表面に外来蛋白質を提示する方法としては、ｇ３ｐ、ｇ６ｐ〜ｇ９ｐのコート蛋白質のいずれかとの融合蛋白質として該コート蛋白質上で発現・提示させる方法が挙げられるが、よく用いられるのはｇ３ｐもしくはｇ８ｐのＮ末端側に融合させる方法である。ファージディスプレイベクターとしては、１）ファージゲノムのコート蛋白質遺伝子に外来遺伝子を融合した形で導入して、ファージ表面上に提示されるコート蛋白質をすべて外来蛋白質との融合蛋白質として提示させるものの他、２）融合蛋白質をコードする遺伝子を野生型コート蛋白質遺伝子とは別に挿入して、融合蛋白質と野生型コート蛋白質とを同時に発現させるものや、３）融合蛋白質をコードする遺伝子を有するファージミドベクターを持つ大腸菌に野生型コート蛋白質遺伝子を有するヘルパーファージを感染させて融合蛋白質と野生型コート蛋白質とを同時に発現するファージ粒子を産生させるものなどが挙げられるが、１）の場合は大きな外来蛋白質を融合させると感染能力が失われるため、抗体ライブラリーの作製のためには２）または３）のタイプが用いられる。
具体的なベクターとしては、Ｈｏｌｔら（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１１：４４５−４４９，２０００）に記載されるものが例示される。例えば、ｐＣＥＳ１（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：１８２１８−１８２３０，１９９９参照）は、１つのラクトースプロモーターの制御下にｇ３ｐのシグナルペプチドの下流にκＬ鎖定常領域をコードするＤＮＡとｇ３ｐシグナルペプチドの下流にＣＨ３をコードするＤＮＡ、Ｈｉｓ−ｔａｇ、ｃ−ｍｙｃ  ｔａｇ、アンバー終止コドン（ＴＡＧ）を介してｇ３ｐコード配列とが配置されたＦａｂ発現型ファージミドベクターである。アンバー変異を有する大腸菌に導入するとｇ３ｐコート蛋白質上にＦａｂを提示するが、アンバー変異を持たないＨＢ２１５１株などで発現させると可溶性Ｆａｂ抗体を産生する。また、ｓｃＦｖ発現型ファージミドベクターとしては、例えばｐＨＥＮ１（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７，１９９１）等が用いられる。
一方、ヘルパーファージとしては、例えばＭ１３−ＫＯ７、ＶＣＳＭ１３等が挙げられる。
また、別のファージディスプレイベクターとして、抗体遺伝子の３’末端とコート蛋白質遺伝子の５’末端にそれぞれシステインをコードするコドンを含む配列を連結し、両遺伝子を同時に別個に（融合蛋白質としてではなく）発現させて、導入されたシステイン残基同士によるＳ−Ｓ結合を介してファージ表面のコート蛋白質上に抗体を提示し得るようにデザインされたもの（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ社のＣｙｓＤｉｓｐｌａｙＴＭ技術）等も挙げられる。
ヒト抗体ライブラリーの種類としては、ナイーブ／非免疫ライブラリー、合成ライブラリー、免疫ライブラリー等が挙げられる。
ナイーブ／非免疫（ｎｏｎ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）ライブラリーは、正常なヒトが保有するＶＨおよびＶＬ遺伝子をＲＴ−ＰＣＲにより取得し、それらをランダムに上記のファージディスプレイベクターにクローニングして得られるライブラリーである。通常、正常人の末梢血、骨髄、扁桃腺などのリンパ球由来のｍＲＮＡ等が鋳型として用いられる。疾病履歴などのＶ遺伝子のバイアスをなくすため、抗原感作によるクラススイッチが起こっていないＩｇＭ由来のｍＲＮＡのみを増幅したものを特にナイーブライブラリーと呼んでいる。代表的なものとしては、ＣＡＴ社のライブラリー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７，１９９１；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：３０９−３１４，１９９６参照）、ＭＲＣ社のライブラリー（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５，１９９４参照）、Ｄｙａｘ社のライブラリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９（上述）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１４：７９６９−７９７４，２０００参照）等が挙げられる。
合成ライブラリーは、ヒトＢ細胞内の機能的な特定の抗体遺伝子を選び、Ｖ遺伝子断片の、例えばＣＤＲ３等の抗原結合領域の部分を適当な長さのランダムなアミノ酸配列をコードするＤＮＡで置換し、ライブラリー化したものである。最初から機能的なｓｃＦｖやＦａｂを産生するＶＨおよびＶＬ遺伝子の組み合わせでライブライリーを構築できるので、抗体の発現効率や安定性に優れているとされる。代表的なものとしては、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ社のＨｕＣＡＬライブラリー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９６：５７−８６，２０００参照）、ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ社のライブラリー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８：８５２，２０００参照）、Ｃｒｕｃｅｌｌ社のライブラリー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：３９３８，１９９５；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２７２：２１９−２３３，２００３参照）等が挙げられる。
免疫（ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）ライブラリーは、癌、自己免疫疾患、感染症等の患者やワクチン接種を受けた者など、標的抗原に対する血中抗体価が上昇したヒトから採取したリンパ球、あるいは上記体外免疫法により標的抗原を人為的に免疫したヒトリンパ球等から、上記ナイーブ／非免疫ライブラリーの場合と同様にしてｍＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲ法によってＶＨおよびＶＬ遺伝子を増幅し、ライブラリー化したものである。最初から目的の抗体遺伝子がライブラリー中に含まれるので、比較的小さなサイズのライブラリーからでも目的の抗体を得ることができる。
ライブラリーの多様性は大きいほどよいが、現実的には、以下のパンニング操作で取り扱えるファージ数（１０１１〜１０１３ファージ）と通常のパンニングでクローンの単離および増幅に必要なファージ数（１００〜１，０００ファージ／クローン）を考慮すれば、１０８〜１０１１クローン程度が適当であり、約１０８クローンのライブラリーで通常１０−９オーダーのＫｄ値を有する抗体をスクリーニングすることができる。
標的抗原に対する抗体をファージディスプレイ法で選別する工程をパンニングという。具体的には、例えば、抗原を固定化した担体とファージライブラリーとを接触させ、非結合ファージを洗浄除去した後、結合したファージを担体から溶出させ、大腸菌に感染させて該ファージを増殖させる、という一連の操作を３〜５回程度繰り返すことにより抗原特異的な抗体を提示するファージを濃縮する。抗原を固定化する担体としては、通常の抗原抗体反応やアフィニティークロマトグラフィーで用いられる各種担体、例えばアガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス、金属などからなるマイクロプレート、チューブ、メンブレン、カラム、ビーズなど、さらには表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のセンサーチップなどが挙げられる。抗原の固定化には物理的吸着を月いてもよく、また、通常蛋白質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。例えばビオチン−（ストレプト）アビジン系等が好ましく用いられる。標的抗原である内因性リガンドがペプチドなどの小分子である場合には、抗原決定基として用いた部分が担体との結合により被覆されないように特に注意する必要がある。非結合ファージの洗浄には、ＢＳＡ溶液などのブロッキング液（１−２回）、Ｔｗｅｅｎ等の界面活性剤を含むＰＢＳ（３−５回）などを順次用いることができる。クエン酸緩衝液（ｐＨ５）などの使用が好ましいとの報告もある。特異的ファージの溶出には、通常酸（例：０．１Ｍ塩酸など）が用いられるが、特異的プロテアーゼによる切断（例えば、抗体遺伝子とコート蛋白質遺伝子との連結部にトリプシン切断部位をコードする遺伝子配列を導入することができる。この場合、溶出するファージ表面には野生型コート蛋白質が提示されるので、コート蛋白質のすべてが融合蛋白質として発現しても大腸菌への感染・増殖が可能となる）や可溶性抗原による競合的溶出、あるいはＳ−Ｓ結合の還元（例えば、前記したＣｙｓＤｉｓｐｌａｙＴＭでは、パンニングの後、適当な還元剤を用いて抗体とコート蛋白質とを解離させることにより抗原特異的ファージを回収することができる）による溶出も可能である。酸で溶出した場合は、トリスなどで中和した後で溶出ファージを大腸菌に感染させ、培養後、常法によりファージを回収する。
パンニングにより抗原特異的抗体を提示するファージが濃縮されると、これらを大腸菌に感染させた後プレート上に播種してクローニングを行う。再度ファージを回収し、上述の抗体価測定法（例：ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡ等）やＦＡＣＳあるいはＳＰＲを利用した測定により抗原結合活性を確認する。
選択された抗原特異的抗体を提示するファージクローンからの抗体の単離・精製は、例えば、ファージディスプレイベクターとして抗体遺伝子とコート蛋白質遺伝子の連結部にアンバー終止コドンが導入されたベクターを用いる場合には、該ファージをアンバー変異を持たない大腸菌（例：ＨＢ２１５１株）に感染させると、可溶性抗体分子が産生されペリプラズムもしくは培地中に分泌されるので、細胞壁をリゾチームなどで溶解して細胞外画分を回収し、上記と同様の精製技術を用いて行うことができる。Ｈｉｓ−ｔａｇやｃ−ｍｙｃ  ｔａｇを導入しておけば、ＩＭＡＣや抗ｃ−ｍｙｃ抗体カラムなどを用いて容易に精製することができる。また、パンニングの際に特異的プロテアーゼによる切断を利用する場合には、該プロテアーゼを作用させると抗体分子がファージ表面から分離されるので、同様の精製操作を実施することにより目的の抗体を精製することができる。
このようにして得られた抗体が非中和抗体であることの確認は、上記の異種モノクローナル抗体の場合と同様に行うことができる。
ヒト抗体産生動物およびファージディスプレイヒト抗体ライブラリーを用いた完全ヒト抗体作製技術は、他の動物種のモノクローナル抗体を作製するのにも応用することができる。例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどの家畜（家禽）として広く繁殖されている動物やイヌやネコなどのペット動物などが対象として挙げられる。非ヒト動物においては標的抗原の人為的免疫に対する倫理的問題が少ないので、免疫ライブラリーの利用がより有効である。
上記のようにして得られる内因性リガンドに対する非中中和抗体（好ましくはモノクローナル抗体）は、必要に応じて薬理学的に許容し得る担体とともに混合して医薬組成物とした後に、該内因性リガンドの血中安定性改善剤として用いることができる。
ここで、薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、賦形剤、溶剤（分散剤）、溶解補助剤、懸濁化剤、安定化剤、等張化剤、緩衝剤、ｐＨ調節剤、無痛化剤などとして配合される。また必要に応じて、保存剤、抗酸化剤などの製剤添加物を用いることもできる。
賦形剤の好適な例としては、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、デンプン、α化デンプン、デキストリン、結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アラビアゴム、プルラン、軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどが挙げられる。
溶剤の好適な例としては、注射用水、生理的食塩水、リンゲル液、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油、綿実油などが挙げられる。
溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどが挙げられる。
懸濁化剤の好適な例としては、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子；ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが挙げられる。
安定化剤の好適な例としては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ピロ亜硫酸ナトリウム、ロンガリット、メタ亜硫酸水素ナトリウムなどが挙げられる。
等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、ブドウ糖などが挙げられる。
緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。
ｐＨ調節剤の好適な例としては、塩酸、水酸化ナトリウムなどの酸または塩基が挙げられる。
無痛化剤の好適な例としては、ベンジルアルコールなどが挙げられる。
保存剤の好適な例としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸塩などが挙げられる。
前記医薬組成物の剤形としては、例えば注射剤（例：皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、動脈内注射剤など）、点滴剤等の注入型製剤が挙げられる。
医薬組成物は、製剤技術分野において慣用の方法、例えば日本薬局方に記載の方法等により製造することができる。以下に、製剤の具体的な製造法について詳述する。医薬組成物中の抗体含量は、剤形、投与量などにより異なるが、例えば約０．１ないし１００重量％である。
例えば、注射剤は、抗体を分散剤（例：ポリソルベート８０，ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０，ポリエチレングリコール，カルボキシメチルセルロース，アルギン酸ナトリウムなど）、保存剤（例：メチルパラベン，プロピルパラベン，ベンジルアルコール，クロロブタノール，フェノールなど）、等張化剤（例：塩化ナトリウム，グリセリン，Ｄ−マンニトール，Ｄ−ソルビトール，ブドウ糖など）などと共に水性溶剤（例：蒸留水，生理的食塩水，リンゲル液等）あるいは油性溶剤（例：オリーブ油，ゴマ油，綿実油，トウモロコシ油などの植物油、プロピレングリコール等）などに溶解、懸濁あるいは乳化することにより製造される。この際、所望により溶解補助剤（例：サリチル酸ナトリウム，酢酸ナトリウム等）、安定化剤（例：ヒト血清アルブミン等）、無痛化剤（例：ベンジルアルコール等）等の添加物を用いてもよい。注射液は、必要に応じて、例えばメンブレンフィルター等を用いた濾過滅菌などの滅菌処理を行い、通常、アンプル等の適当な容器に充填される。
注射剤は、上記液剤を真空乾燥などによって粉末とし、用時溶解（分散）して使用することもできる。真空乾燥法の例としては、凍結乾燥法、スピードバックコンセントレーター（ＳＡＶＡＮＴ社）を用いる方法などが挙げられる。凍結乾燥を行う際には、−１０℃以下に冷却されたサンプルを用いて、実験室ではフラスコ中で、工業的にはトレイを用いて、あるいはバイアル中で凍結乾燥させることが好ましい。スピードバックコンセントレーターを用いる場合は、０〜３０℃程度で、約２０ｍｍＨｇ以下、好ましくは約１０ｍｍＨｇ以下の真空度で行われる。乾燥させる液剤中には、リン酸塩などの緩衝剤を添加してｐＨを３〜１０程度とすることが好ましい。真空乾燥により得られる粉末製剤は長期間安定な製剤として、用時注射用水、生理食塩水、リンゲル液等に溶解、もしくはオリーブ油，ゴマ油，綿実油，トウモロコシ油、プロピレングリコール等に分散することにより注射剤とすることができる。
上記のようにして得られる本発明の血中安定性改善剤は安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）の皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、動脈内、脳室内に投与することができる。
本発明の血中安定性改善剤の投与量は、投与対象である哺乳動物における内因性リガンドの血中濃度を、該動物が罹患するかもしくは罹患するおそれのある疾患の治療もしくは予防に有効な範囲にまで増加させ得る、および／または該内因性リガンドの血中半減期を当該疾患の治療もしくは予防に有効な程度まで延長させ得る量であれば特に制限はない。例えば、本発明の血中安定性改善剤を内因性ＧＬＰ−１の血中安定性改善を目的としてヒトに皮下投与する場合、ＧＬＰ−１およびその機能的フラグメントの血中に必要な濃度は合計１００ｐＭ程度と見積もられる。すべての血中ＧＬＰ−１と免疫複合体を形成するために１０〜１００倍量の抗ＧＬＰ−１抗体が必要であるとすると、必要な血中ＧＬＰ−１濃度を実現するためには１〜１０ｎＭ程度、重量換算すると１０〜１００μｇ／ｋｇ体重程度を１回あたり投与すればよい。この量を、例えば１〜数週間毎に投与することができる。
しかしながら、投与量は、標的となる内因性リガンドの正常な血中濃度、血中半減期、抗体分子の安定性、リガンド−抗体複合体の組織移行性、抗体の抗原親和性、抗体の中和活性、対象疾患、重症度、さらに動物種、齢、投与経路などによっても異なる。従って、一般的な本発明の血中安定性改善剤の投与量の範囲はより広く、例えば、１回あたり０．１μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ程度、好ましくは１μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ程度が用いられ得る。
好ましくは、本発明の血中安定性改善剤を哺乳動物に投与した場合の内因性リガンドと抗体との複合体の血中半減期は、該内因性リガンド単独（即ち、遊離状態）の場合の約２倍以上、より好ましくは約１０倍以上、特に好ましくは約５０倍以上に延長される。かかる延長効果の結果として、本発明の血中安定性改善剤を哺乳動物に投与した場合の内因性リガンドの血中濃度は、該製剤を投与していない場合の血中濃度の約２倍以上、より好ましくは約５倍以上、特に好ましくは約１０倍以上となる。ここで血中濃度は投与から次回投与までの任意の時期に測定されたものである。
本発明の血中安定性改善剤は、上記の通り該製剤の有効成分である抗体の作用により内因性リガンドを安定化することができ、しかも該抗体は抗原である内因性リガンドを実質的に中和しないので、該内因性リガンドの血中濃度を増加および／または血中半減期を延長させることにより、該リガンドの受容体活性調節作用を増強することが予防・治療上有効である疾患の予防・治療剤として用いられ得る。
かかる疾患としては、例えば、代謝疾患、骨・軟骨疾患、循環器疾患、脳・神経疾患、感染症、ガン、血液疾患、泌尿器疾患、不妊・勃起不全症、成長不全および免疫不全などが挙げられるが、これらに限定されない。
標的抗原となる個々の内因性リガンドとの関連において、対象疾患をさらに詳細に説明すると、代謝疾患としては、例えば糖尿病（標的リガンド：ＧＬＰ−１、カルシトニン、ＰＡＣＡＰ、ＶＩＰ、インシュリン、ベータセルリン、ベータセルリン−δ４等）、肥満症（標的リガンド：レプチン、アディポネクチン、ＧＰＲ７／ＧＰＲ８リガンド（ＮＰＷ）、ＭＳＨなど）、拒食症（標的リガンド：グレリンなど）等；骨・軟骨疾患としては、例えば骨粗鬆症（標的リガンド：カルシトニン、ＰＴＨなど）等；循環器疾患としては、例えば虚血性心疾患（心筋梗塞、狭心症）（標的リガンド：グレリン、アドレノメジュリンなど）、高血圧症（標的リガンド：ＡＮＰ、ＢＮＰ、ＣＮＰなど）等；脳・神経疾患としては、例えば虚血性脳神経障害（標的リガンド：グレリン、ＶＩＰなど）、アルツハイマー病（標的リガンド：ＬＨ−ＲＨなど）等；感染症としては、例えばウイルス感染症（標的リガンド：インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦなど）等；ガンとしては、例えば前立腺ガン、乳ガン（標的リガンド：ＬＨ−ＲＨなど）、各種臓器の原発ガンもしくは転移ガン（標的リガンド：メタスチン、インターフェロン、ＴＮＦ、ＩＬ−２、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦなど）等；血液疾患としては、例えば貧血症（標的リガンド：ＥＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦなど）等；泌尿器疾患としては、例えば排尿障害（標的リガンド：ＡＮＰ、ＢＮＰ、ＣＮＰなど）等；不妊・勃起不全症としては、例えば不妊症（標的リガンド：メタスチンなど）、勃起不全症（標的リガンド：ＶＩＰなど）等；成長不全としては、例えば成長ホルモン分泌不全性低身長症（下垂体性小人症）、Ｔｕｒｎｅｒ症候群、Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ症候群（標的リガンド：成長ホルモン）等；免疫不全としては、例えばＨＩＶ感染、移植や自己免疫疾患治療時の免疫抑制剤投与後（標的リガンド：ＧＭ−ＣＳＦなど）等が挙げられる。
本明細書においてアミノ酸等を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｉｏｎｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。アミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＰＡＭ  ：フェニルアセタミドメチル
ＢＨＡ  ：ベンツヒドリルアミン
Ｂｏｃ  ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ：２−クロロ−ベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ：２−ブロモ−ベンジルオキシカルボニル
Ｂｚｌ  ：ベンジル
ＯＢｚｌ：ベンジルエステル
Ｔｏｓ  ：ｐ−トルエンスルホニル
ＨＯＢｔ：１−ベンゾトリアゾール
ＤＣＣ  ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
Ｇｌｙ  ：グリシン
Ａｌａ  ：アラニン
Ｖａｌ  ：バリン
Ｌｅｕ  ：ロイシン
Ｉｌｅ  ：イソロイシン
Ｓｅｒ  ：セリン
Ｔｈｒ  ：スレオニン
Ｃｙｓ  ：システイン
Ｍｅｔ  ：メチオニン
Ｇｌｕ  ：グルタミン酸
Ａｓｐ  ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ  ：リジン
Ａｒｇ  ：アルギニン
Ｈｉｓ  ：ヒスチジン
Ｐｈｅ  ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ  ：チロシン
Ｔｒｐ  ：トリプトファン
Ｐｒｏ  ：プロリン
Ａｓｎ  ：アスパラギン
Ｇｌｎ  ：グルタミン
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは単なる例示であって本発明の範囲を何ら限定するものではない。
なお、後述の実施例で得られた抗ＰＡＣＡＰ抗体産生ハイブリドーマは、１９９０年３月１６日から通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（当時）［現：独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）；〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１−１−１  中央第６］に以下の受託番号で寄託されている。
ハイブリドーマ細胞
ＰＡ−１Ｎ：ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８１１
ＰＡ−３Ｎ：ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８１２
ＰＡ−５Ｎ：ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８１３
ＰＡ−６Ｎ：ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８１４
ＰＡ−２Ｃ：ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８１５
ＰＡ−１Ｃ：ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８１６
尚、以下の実施例では、上記各ハイブリドーマ細胞から得られる抗体について
は細胞名の後にａを付けた名称（例えば、ＰＡ−１Ｎ細胞から得られる抗体はＰＡ−１Ｎａ）で表記している。
また、抗ＧＬＰ−１非中和抗体ＧＬＩＴ２−３２９（１）２４を産生するハイブリドーマ（ＧＬＩＴ２−３２９（１）２４）は、２００５年３月１７日付で、ＩＰＯＤ（上述）に受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２９７を付されて受領されている。
参考例１
（１）ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２の合成
市販のｐ−メチルＢＨＡ樹脂（アプライド  バイオシステムズ社製）１．０４ｇ
（０．５ｍｍｏｌｅ）を用い、ペプチド合成機（アプライド  バイオシステムズ社製モデル４３０Ａ）を使用してＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２（配列番号：１）を合成した。
最初のアミノ酸、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）をＨＯＢｔ／ＤＣＣで活性化し、樹脂に縮合した後、樹脂上のＢｏｃ基を５０％−トリフルオロ酢酸／塩化メチレンで処理し、アミノ基を遊離させ、このアミノ基に、Ｂｏｃ−Ａｓｎ，Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ），Ｂｏｃ−Ｖａｌ，Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ），Ｂｏｃ−Ｇｌｎ，Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ），Ｂｏｃ−Ｇｌｙ，Ｂｏｃ−Ｌｅｕ，Ｂｏｃ−Ａｌａ，Ｂｏｃ−Ｍｅｔ，Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ），Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ），Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ），Ｂｏｃ−Ｐｈｅ，Ｂｏｃ−Ｉｌｅ，Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｏｓ）をＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２のアミノ酸配列通り、順にＨＯＢｔ／ＤＣＣで活性化し縮合した。さらにＤＣＣまたはＨＯＢｔ／ＤＣＣで活性化した同じアミノ酸誘導体で再度縮合をした後、未反応のアミノ基は無水酢酸でアセチル化し、保護ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２樹脂２．４２ｇを得た。
この保護ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２樹脂０．５１ｇをｐ−クレゾール０．６ｇ共存下無水フッ化水素５ｍｌで０℃、６０分間処理した後、フッ化水素を減圧留去し、残渣をエチルエーテル５ｍｌで２回洗浄した後、残渣を５０％−酢酸水６ｍｌで抽出した。不溶物を濾去し、５０％−酢酸水５ｍｌで洗浄した。濾液、洗液を合し、２〜３ｍｌに減圧濃縮し、セファデックスＬＨ−２０（２×９０ｃｍ）のカラムに付し、５０％−酢酸で溶出した。主要画分を集め減圧留去の後、残留物を、０．１％−トリフルオロ酢酸水１００ｍｌに溶解し、ＹＭＣ−ＯＤＳ  ＡＭ１２０  Ｓ−５０樹脂カラム（１．６×７ｃｍ）に付し、０．１％−トリフルオロ酢酸水と５０％−アセトニトリル（０．１％−トリフルオロ酢酸含有）の間での直線型濃度勾配で溶出した。
主要画分を合し、凍結乾燥し、６０ｍｇの白色粉末を得た。これを０．０５Ｍ−酢酸アンモニア水２０ｍｌに溶解し、ＣＭ−セルロファインの樹脂カラム（１×６ｃｍ）に付し、０．０５Ｍから１．０Ｍ−酢酸アンモニア水の直線型濃度勾配で溶出した。主要画分を合し、再度ＹＭＣ−ＯＤＳカラム（２．６×７ｃｍ）に付し、０〜４０％までのアセトニトリル水溶液（０．１％−トリフルオロ酢酸含有）の直線型濃度勾配溶出を行い、アセトニトリル２８〜３０％の画分を集め凍結乾燥し、白色粉末２１．６ｍｇを得た。
アミノ酸分析値：
Ａｓｐ  ２．９０（３），Ｔｈｒ  ０．８４（１），Ｓｅｒ  ２．１０（３），Ｇｌｕ  ２．２１（２），Ｇｌｙ  ２．００（２）
Ａｌａ  ３．２９（３），Ｖａｌ  ３．１９（３），Ｍｅｔ  １．０１（１），Ｉｌｅ  ０．８７（１），Ｌｅｕ  ２．０９（２）
Ｔｙｒ  ３．９４（４），Ｐｈｅ  ０．９２（１），Ｌｙｓ  ７．１８（７），Ｈｉｓ  ０．９６（１），Ａｒｇ  ４．１９（４）
質量分析による（Ｍ＋Ｈ）＋：４５３０
ＨＰＬＣ溶出時間：１９．６分
カラム条件
カラム：ＹＭＣ−ＯＤＳ（ＡＭ−３０１，Ｓ−５  １２０Ａ）
溶離液：Ａ液（０．１％−トリフルオロ酢酸水）
Ｂ液（０．１％−トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル）
を用い、Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（５０分）
流速：１．０ｍｌ／分
（２）ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ２の合成
市販のｐ−メチルＢＨＡ樹脂（アプライド  バイオシステムズ社製）１．０４ｇ（０．５ｍｍｏｌｅ）を用い、ペプチド合成機（アプライド  バイオシステムズ社製モデル４３０Ａ）を使用してＰＡＣＡＰ２７ＮＨ２（配列番号：２）を合成した。
最初のアミノ酸、Ｂｏｃ−ＬｅｕをＨＯＢｔ／ＤＣＣで活性化し、樹脂に縮合した後、樹脂上のＢｏｃ基を５０％−トリフルオロ酢酸／塩化メチレンで処理し、アミノ基を遊離させ、このアミノ基に、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ），Ｂｏｃ−Ｖａｌ，Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ），Ｂｏｃ−Ｇｌｎ，Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ），Ｂｏｃ−Ｇｌｙ，Ｂｏｃ−Ｌｅｕ，Ｂｏｃ−Ａｌａ，Ｂｏｃ−Ｍｅｔ，Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ），Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ），Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ），Ｂｏｃ−Ｐｈｅ，Ｂｏｃ−Ｉｌｅ，Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｏｓ）をＰＡＣＡＰ２７ＮＨ２のアミノ酸配列通り、順にＨＯＢｔ／ＤＣＣで活性化し縮合した。さらにＤＣＣまたはＨＯＢｔ／ＤＣＣで活性化した同じアミノ酸誘導体で再度縮合をした後、未反応のアミノ基は無水酢酸でアセチル化し、保護ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ２樹脂２．３１ｇを得た。
この保護ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ２樹脂０．７９ｇをｐ−クレゾール１．２ｇ共存下無水フッ化水素１０ｍｌで０℃、６０分間処理した後、フッ化水素を減圧留去し、残渣をエチルエーテル５ｍｌで２回洗浄した後、残渣を５０％−酢酸水５ｍｌで抽出した。不溶物を濾去し、５０％−酢酸水５ｍｌで洗浄した。濾液、洗液を合し、２〜３ｍｌに減圧濃縮し、セファデックスＬＨ−２０（２×７５ｃｍ）のカラムに付し、５０％−酢酸で溶出した。主要画分を集め減圧留去の後、残留物を、０．１％−トリフルオロ酢酸水１００ｍｌに溶解し、ＹＭＣ−ＯＤＳ  ＡＭ１２０  Ｓ−５０樹脂カラム（２．６×７ｃｍ）に付し、０．１％−トリフルオロ酢酸水と５０％−アセトニトリル（０．１％−トリフルオロ酢酸含有）の間での直線型濃度勾配で溶出した。主要画分を合し、再度ＹＭＣ−ＯＤＳカラム（２．６×７ｃｍ）に付し、１５〜３５％までのアセトニトリル水溶液（０．１％−トリフルオロ酢酸含有）の直線型濃度勾配溶出を行い、アセトニトリル３０〜３２％の画分を集め凍結乾燥した。これを０．０５Ｍ−酢酸アンモニア水２０ｍｌに溶解し、ＣＭ−セルロファインの樹脂カラム（１×６ｃｍ）に付し、水から０．３３Ｍ−酢酸アンモニア水の直線型濃度勾配で溶出した。主要画分（０．１８〜０．２２Ｍ）を合して凍結乾燥し、白色粉末２０ｍｇを得た。
アミノ酸分析値：
Ａｓｐ  １．９６（２），Ｔｈｒ  ０．９４（１），Ｓｅｒ  ２．５７（３），Ｇｌｕ  １．０７（１），Ｇｌｙ  ０．９５（１）
Ａｌａ  ３．００（３），Ｖａｌ  １．９６（２），Ｍｅｔ  ０．８８（１），Ｉｌｅ  ０．８８（１），Ｌｅｕ  １．９３（２）
Ｔｙｒ  ２．８７（３），Ｐｈｅ  ０．９０（１），Ｌｙｓ  ２．９１（３），Ｈｉｓ  ０．９４（１），Ａｒｇ  ２．１７（２）
質量分析による（Ｍ＋Ｈ）＋：３１４６．７
ＨＰＬＣ溶出時間：２１．２分
カラム条件：
カラム：ＹＭＣ−ＯＤＳ（ＡＭ−３０１，Ｓ−５  １２０Ａ）
溶離液：Ａ液（０．１％−トリフルオロ酢酸水）
Ｂ液（０．１％−トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル）
を用い、Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（５０分）
流速：１．０ｍｌ／分
（３）ＰＡＣＡＰ（１４−３８）ＮＨ２の合成
市販のｐ−メチルＢＨＡ樹脂（アプライド  バイオシステムズ社製）１．０４ｇ（０．５ｍｍｏｌｅ）を用い、ペプチド合成機（アプライド  バイオシステムズ社製モデル４３０Ａ）を使用してＰＡＣＡＰ（１４−３８）ＮＨ２（配列番号：３）を合成した。
最初のアミノ酸、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＬ−Ｚ）をＨＯＢｔ／ＤＣＣで活性化し、樹脂に縮合した後、樹脂上のＢｏｃ基を５０％−トリフルオロ酢酸／塩化メチレンで処理し、アミノ基を遊離させ、このアミノ基に、Ｂｏｃ−Ａｓｎ，Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ），Ｂｏｃ−Ｖａｌ，Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ），Ｂｏｃ−Ｇｌｎ，Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ），Ｂｏｃ−Ｇｌｙ，Ｂｏｃ−Ｌｅｕ，Ｂｏｃ−Ａｌａ，Ｂｏｃ−ＭｅｔをＰＡＣＡＰ（１４−３８）ＮＨ２のアミノ酸配列通り、順にＨＯＢｔ／ＤＣＣで活性化し縮合した。さらにＤＣＣまたはＨＯＢｔ／ＤＣＣで活性化した同じアミノ酸誘導体で再度縮合をした後、未反応のアミノ基は無水酢酸でアセチル化し、保護ＰＡＣＡＰ（１４−３８）ＮＨ２樹脂２．００ｇを得た。この保護ＰＡＣＡＰ（１４−３８）ＮＨ２樹脂０．４８ｇをｐ−クレゾール０．４８ｇ共存下無水フッ化水素５ｍｌで０℃、６０分間処理した後、フッ化水素を減圧留去し、残渣をエチルエーテル５ｍｌで２回洗浄した後、残渣を５０％−酢酸水５ｍｌで抽出した。不溶物を濾去し、５０％−酢酸水５ｍｌで洗浄した。濾液、洗液を合し、２〜３ｍｌに減圧濃縮し、セファデックスＬＨ−２０（２×７５ｃｍ）のカラムに付し、５０％−酢酸で溶出した。主要画分を集め減圧留去の後、残留物を、０．１％−トリフルオロ酢酸水１００ｍｌに溶解し、ＹＭＣ−ＯＤＳ  ＡＭ１２０  Ｓ−５０樹脂カラム（２．６×７ｃｍ）に付し、０．１％−トリフルオロ酢酸水と３０％−アセトニトリル（０．１％−トリフルオロ酢酸含有）の間での直線型濃度勾配で溶出した。主要画分を合して凍結乾燥し、白色粉末２０．２ｍｇを得た。
アミノ酸分析値：
Ａｓｐ  １．０１（１），Ｇｌｕ  ２．０１（２），Ｇｌｙ  １．００（１），Ａｌａ  ３．０１（３），Ｖａｌ  ２．８５（３）
Ｍｅｔ  ０．８６（１），Ｌｅｕ  ２．０８（２），Ｔｙｒ  １．９８（２），Ｌｙｓ  ６．３７（７），Ａｒｇ  ３．２４（３）
質量分析による（Ｍ＋Ｈ）＋：３００３．６
ＨＰＬＣ溶出時間：１３．１分
カラム条件
カラム：ＹＭＣ−ＯＤＳ（ＡＭ−３０１，Ｓ−５  １２０Ａ）
溶離液：Ａ液（０．１％−トリフルオロ酢酸水）
Ｂ液（０．１％−トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル）
を用い、Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分）
流速：１．０ｍｌ／分
（４）ＰＡＣＡＰ（１−１３）ＯＨの合成
市販のＢｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）−ＯＣＨ２−ＰＡＭ樹脂（アプライド  バイオシステムズ社製）０．８７ｇ（０．５ｍｍｏｌｅ）を用い、ペプチド合成機（アプライド  バイオシステムズ社製モデル４３０Ａ）を使用してＰＡＣＡＰ（１−１３）ＯＨ（配列番号：４）を合成した。
樹脂上のＢｏｃ基を５０％−トリフルオロ酢酸／塩化メチレンで処理し、アミノ基を遊離させた後、このアミノ基に、Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ），Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ），Ｂｏｃ−Ｇｌｙ，Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ），Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ），Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ），Ｂｏｃ−Ｐｈｅ，Ｂｏｃ−Ｉｌｅ，Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｏｓ）をＰＡＣＡＰ（１−１３）ＯＨのアミノ酸配列通り、順にＨＯＢｔ／ＤＣＣで活性化し縮合した。さらにＤＣＣまたはＨＯＢｔ／ＤＣＣで活性化した同じアミノ酸誘導体で再度縮合をした後、未反応のアミノ基は無水酢酸でアセチル化し、保護ＰＡＣＡＰ（１−１３）ＯＨ２−ＰＡＭ樹脂１．８６ｇを得た。
この樹脂０．７０ｇをｐ−クレゾール０．８１ｇ共存下無水フッ化水素１０ｍｌで０℃、６０分間処理した後、フッ化水素を減圧留去し、残渣をエチルエーテル５ｍｌで２回洗浄した後、残渣を５０％−酢酸水５ｍｌで抽出した。不溶物を濾去し、５０％−酢酸水５ｍｌで洗浄した。濾液、洗液を合し、２〜３ｍｌに減圧濃縮し、セファデックスＬＨ−２０（２×７５ｃｍ）のカラムに付し、５０％−酢酸で溶出した。主要画分を集め減圧留去の後、残留物を、０．１％−トリフルオロ酢酸水１００ｍｌに溶解し、ＹＭＣ−ＯＤＳ  ＡＭ１２０  Ｓ−５０樹脂カラム（２．６×７ｃｍ）に付し、０．１％−トリフルオロ酢酸水と３３％−アセトニトリル（０．１％−トリフルオロ酢酸含有）の間での直線型濃度勾配で溶出した。主要画分を合し、再度同じカラム条件で精製、主要画分を集め凍結乾燥し、白色粉末３８ｍｇを得た。
アミノ酸分析値：
Ａｓｐ  ２．００（２），Ｔｈｒ  ０．９３（１），Ｓｅｒ  ２．４３（３），Ｇｌｕ  １．０５（１），Ｇｌｙ  １．００（１）
Ｔｙｒ  １．８２（２），Ｐｈｅ  １．０２（１），Ｈｉｓ  １．１３（１），Ａｒｇ  １．１２（１）
質量分析による（Ｍ＋Ｈ）＋：１５４７．５
ＨＰＬＣ溶出時間：１２．３分
カラム条件：
カラム：ＹＭＣ−ＯＤＳ（ＡＭ−３０１，Ｓ−５  １２０Ａ）
溶離液：Ａ液（０．１％−トリフルオロ酢酸水）
Ｂ液（０．１％−トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル）
を用い、Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分）
流速：１．０ｍｌ／分
（５）ＰＡＣＡＰ（４−２７）ＯＨの合成
市販のＢｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＣＨ２−ＰＡＭ樹脂（アプライド  バイオシステムズ社製）０．６０ｇ（０．５ｍｍｏｌｅ）を用い、ペプチド合成機（アプライド  バイオシステムズ社製モデル４３０Ａ）を使用してＰＡＣＡＰ（４−２７）ＯＨ（配列番号：５）を合成した。
樹脂上のＢｏｃ基を５０％−トリフルオロ酢酸／塩化メチレンで処理し、アミノ基を遊離させた後、このアミノ基に、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ），Ｂｏｃ−Ｖａｌ，Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ），Ｂｏｃ−Ｇｌｎ，Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ），Ｂｏｃ−Ｇｌｙ，Ｂｏｃ−Ｌｅｕ，Ｂｏｃ−Ａｌａ，Ｂｏｃ−Ｍｅｔ，Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ），Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ），Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ），Ｂｏｃ−Ｐｈｅ，Ｂｏｃ−ＩｌｅをＰＡＣＡＰ（４−２７）ＯＨのアミノ酸配列通り、順にＨＯＢｔ／ＤＣＣで活性化し縮合した。さらにＤＣＣまたはＨＯＢｔ／ＤＣＣで活性化した同じアミノ酸誘導体で再度縮合をした後、未反応のアミノ基は無水酢酸でアセチル化し、保護ＰＡＣＡＰ（４−２７）ＯＣＨ２−ＰＡＭ樹脂１．０８ｇを得た。
この保護ＰＡＣＡＰ（４−２７）ＯＣＨ２−ＰＡＭ樹脂０．２９ｇをｐ−クレゾール０．４９ｇ共存下無水フッ化水素５ｍｌで０℃、６０分間処理した後、フッ化水素を減圧留去し、残渣をエチルエーテル５ｍｌで２回洗浄した後、残渣を５０％−酢酸水５ｍｌで抽出した。不溶物を濾去し、５０％−酢酸水５ｍｌで洗浄した。濾液、洗液を合し、２〜３ｍｌに減圧濃縮し、セファデックスＬＨ−２０（２×７５ｃｍ）のカラムに付し、５０％−酢酸で溶出した。主要画分を集め減圧留去の後、残留物を、０．１％−トリフルオロ酢酸水１００ｍｌに溶解し、ＹＭＣ−ＯＤＳＡＭ１２０  Ｓ−５０樹脂カラム（２．６×７ｃｍ）に付し、１５％−アセトニトリル（０．１％−トリフルオロ酢酸含有）と５０％−アセトニトリル（０．１％−トリフルオロ酢酸含有）の間での直線型濃度勾配で溶出した。主要画分を合して凍結乾燥し、白色粉末３３ｍｇを得た。これを０．０５Ｍ−酢酸アンモニア水２０ｍｌに溶解し、ＣＭ−セルロファインの樹脂カラム（１×６ｃｍ）に付し、水から０．０３Ｍ−酢酸アンモニア水の直線型濃度勾配で溶出した。主要画分（０．１８〜０．２２Ｍ）を合して凍結乾燥し、白色粉末３３ｍｇを得た。
アミノ酸分析値：
Ａｓｐ  １．０２（１），Ｔｈｒ  ０．９８（１），Ｓｅｒ  １．７８（２），Ｇｌｕ  １．０７（１），Ｇｌｙ  １．０２（１）
Ａｌａ  ３．０４（３），Ｖａｌ  １．８９（２），Ｍｅｔ  ０．８１（１），Ｉｌｅ  ０．８９（１），Ｌｅｕ  ２．００（２）
Ｔｙｒ  ２．９１（３），Ｐｈｅ  ０．９０（１），Ｌｙｓ  ２．８９（３），Ａｒｇ  ２．２０（２）
質量分析による（Ｍ＋Ｈ）＋：２８０８．５
ＨＰＬＣ溶出時間：１４．５分
カラム条件：
カラム：ＹＭＣ−ＯＤＳ（ＡＭ−３０１，Ｓ−５  １２０Ａ）
溶離液：Ａ液（０．１％−トリフルオロ酢酸水）
Ｂ液（０．１％−トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル）
を用い、Ａ液からＢ液の直線型濃度勾配溶出（３５分）
流速：１．０ｍｌ／分
（６）ＰＡＣＡＰ（３１−３８）ＮＨ２の合成
市販のｐ−メチルＢＨＡ樹脂（アプライド  バイオシステムズ社製）０．９８ｇ（０．５ｍｍｏｌｅ）を用い、ペプチド合成機（アプライド  バイオシステムズ社製モデル４３０Ａ）を使用してＰＡＣＡＰ（３１−３８）ＮＨ２（配列番号：６）を合成した。
最初のアミノ酸、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）をＨＯＢｔ／ＤＣＣで活性化し、樹脂に縮合した後、樹脂上のＢｏｃ基を５０％−トリフルオロ酢酸／塩化メチレンで処理し、アミノ基を遊離させ、このアミノ基に、Ｂｏｃ−Ａｓｎ，Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ），Ｂｏｃ−Ｖａｌ，Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ），Ｂｏｃ−Ｇｌｎ，Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）をＰＡＣＡＰ（３１−３８）ＮＨ２のアミノ酸配列通り、順にＨＯＢｔ／ＤＣＣで活性化し縮合した。さらにＤＣＣまたはＨＯＢｔ／ＤＣＣで活性化した同じアミノ酸誘導体で再度縮合をした後、未反応のアミノ基は無水酢酸でアセチル化し、保護ＰＡＣＡＰ（３１−３８）ＮＨ２樹脂２．００ｇを得た。
この保護ＰＡＣＡＰ（３１−３８）ＮＨ２樹脂０．４３ｇをｐ−クレゾール０．６ｇ共存下無水フッ化水素５ｍｌで０℃、６０分間処理した後、フッ化水素を減圧留去し、残渣をエチルエーテル５ｍｌで２回洗浄した後、残渣を５０％−酢酸水５ｍｌで抽出した。不溶物を濾去し、５０％−酢酸水５ｍｌで洗浄した。濾液、洗液を合し、２〜３ｍｌに減圧濃縮し、セファデックスＬＨ−２０（２×７５ｃｍ）のカラムに付し、５０％−酢酸で溶出した。主要画分を集め減圧留去の後、残留物を、０．１％−トリフルオロ酢酸水１００ｍｌに溶解し、ＹＭＣ−ＯＤＳ  ＡＭ１２０Ｓ−５０樹脂カラム（２．６×７ｃｍ）に付し、０．１％−トリフルオロ酢酸水と３３％−アセトニトリル（０．１％−トリフルオロ酢酸含有）の間での直線型濃度勾配で溶出した。主要画分を合して凍結乾燥し、白色粉末４５ｍｇを得た。
アミノ酸分析値：
Ａｓｐ  １．０２（１），Ｇｌｕ  １．０５（１），Ｖａｌ  １．００（１），Ｔｙｒ  ０．９０（１），Ｌｙｓ  ２．９８（３）
Ａｒｇ  １．１２（１）
質量分析による（Ｍ＋Ｈ）＋：１０６２．７
ＨＰＬＣ溶出時間：１１．６分
カラム条件：
カラム：ＹＭＣ−ＯＤＳ（ＡＭ−３０１，Ｓ−５  １２０Ａ）
溶離液：Ａ液（０．１％−トリフルオロ酢酸水）
Ｂ液（０．１％−トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル）
を用い、Ａ液からＡ：Ｂ（４：１）混合液へ直線型濃度勾配溶出（２０分）
流速：１．０ｍｌ／分
【実施例１】（１）ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２を含む免疫原の作製
上記参考例１（１）で得られたＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２と牛サイログロブリン（ＢＴＧ）との複合体を作製し、免疫原とした。即ち、ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２  ２．８ｍｇとＢＴＧ  ８．４ｍｇとを１ｍｌの０．１Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ６．９）に溶解させ、最終濃度が０．０４％となるようにグルタルアルデヒドを加え、室温で２時間反応させた。反応後、生理食塩水に対し４℃で２日間透析した。
（２）ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２−ＢＴＧ複合体の免疫
６〜８週齢のＢＡＬＢ／Ｃ雌マウスに上記（１）で得られた免疫原ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２−ＢＴＧ複合体８０μｇ／匹を完全フロイントアジュバントとともに皮下免疫した。以後４週間おきに同量の免疫原を不完全フロイントアジュバントとともに２〜３回追加免疫した。
【実施例２】（１）西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識化ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２の作製
上記参考例１（１）で得られたＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２とＨＲＰとを架橋し、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）の標識体とした。即ち、ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２  １８０ｎｍｏｌを５００μｌの０．１Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解させ、ＧＭＢＳ  ４５０ｎｍｏｌを含むＤＭＦ溶液５０μｌと混合し、室温で３０分反応させた。反応後、セファデックスＧ−１５カラムで分画を行い、マレイミド基の導入されたポリペプチド１００ｎｍｏｌを得た。一方、ＨＲＰ  ７．９ｍｇ（２００ｎｍｏｌ）を０．１５Ｍの食塩を含む０．０２Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）０．９５ｍｌに溶解させ、〔Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリミジルジチオ）プロピオネート〕（ＳＰＤＰ）１．５４ｍｇ（４．９μｍｏｌ）を含むＤＭＦ溶液５０μｌと混合し、室温で４０分間反応させた。反応後、ジチオスレイトール８．２ｍｇ（５３μｍｏｌ）を含む０．１Ｍ−酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）０．３３ｍｌを加え、室温で２０分反応させた後、セファデックスＧ−２５カラムで分画を行い、ＳＨ基の導入された酵素６ｍｇ（１００ｎｍｏｌ）を得た。次に、マレイミド基導入ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２  １００ｎｍｏｌとＳＨ基導入ＨＲＰ  １００ｎｍｏｌとを混合し、４℃、１６時間反応させた。反応後ウルトロゲルＡｃＡ４４（ＬＫＢ−ファルマシア社製）カラムで分画し、ＨＲＰ標識化ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２を得た。
（２）マウス抗血清中の抗体価の測定
マウス抗血清中の抗体価を以下の方法により測定した。抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートを作製するため、まず抗マウスイムノグロブリン抗体（ＩｇＧ画分、カッペル社製）を１００μｇ／ｍｌ含む０．１Ｍ−炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）溶液を９６ウェルマイクロプレートに１００μｌずつ分注し、４℃で２４時間放置した。次に、プレートをＰＢＳで洗浄した後、ウェルの余剰の結合部位をふさぐため２５％ブロックエース（雪印乳業社製）を含むＰＢＳを３００μｌずつ分注し、４℃で少なくとも２４時間処理した。上記、抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートの各ウェルにバッファーＥ［１０％−ブロックエース、２ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．４Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１％  ＮａＮ３を含む０．０２Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）］５０μｌおよびバッファーＥで希釈したマウス抗ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２抗血清５０μｌを加え４℃で１６時間反応させた。次に、該プレートをＰＢＳで洗浄した後、上記実施例２（１）で作製したＨＲＰ標識化ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２［２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．０２Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（バッファーＨ）で２００倍希釈］１００μｌを加え、室温で６時間反応させた。反応後ＰＢＳで洗浄し、固相上の酵素活性を測定するため０．２％−オルソフェニレンジアミン、０．０２％−過酸化水素を含む０．１Ｍ−クエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）を１００μｌずつ分注して、室温で１０分間反応させた。４Ｎ−硫酸１００μｌを加えて反応を停止させた後、４９２ｎｍの吸収をプレートリーダー（ＭＴＰ−３２、コロナ社製）で測定した。その結果、免疫した８匹のマウスのうち４匹において抗ＰＡＣＡＰ３８抗体価の上昇が認められた。
【実施例３】（１）細胞融合
上記実施例２において比較的高い血清抗体価を示したマウスＮｏ．５に対して２００μｌの免疫原を生理食塩水０．２５ｍｌに溶解させたものを静脈内に接種することにより最終免疫を行なった。最終免疫４日後のマウスから脾臓を摘出し、ステンレスメッシュで圧迫、ろ過し、イーグルズ・ミニマム・エッセンシャルメデイウム（ＭＥＭ）に浮遊させ、脾臓細胞浮遊液を得た。細胞融合に用いる細胞として、ＢＡＬＢ／Ｃマウス由来ミエローマ細胞Ｐ３×６３．Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）を用いた（Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１：１，１９７８）。細胞融合は、原法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５，１９５７）に準じて行った。即ち、脾臓細胞およびＰ３Ｕ１をそれぞれ血清を含有しないＭＥＭで３度洗浄し、脾臓細胞とＰ３Ｕ１数の比率を５：１になるよう混合して、８００回転で１５分間遠心を行って細胞を沈澱させた。上清を十分に除去した後、沈澱を軽くほぐし、４５％−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００（コッホライト社製）を０．３ｍｌ加え、３７℃温水槽中で７分間静置して融合を行った。融合後細胞に毎分２ｍｌの割合でＭＥＭを添加し、合計１２ｍｌのＭＥＭを加えた後６００ｒｐｍで１５分間遠心して上清を除去した。この細胞沈殿物を１０％牛胎児血清を含有するＧＩＴメデイウム（和光純薬）（ＧＩＴ−１０ＦＣＳ）にＰ３Ｕ１が１ｍｌ当り２×１０６個になるように浮遊させ、２４穴マルチデイシュ（リンブロ社製）に１ウェル１ｍｌずつ１２０ウェルに播種した。播種後、細胞をＣＯ２インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ２／９５％大気の雰囲気下で培養した。２４時間後ＨＡＴ（ヒポキサンチン１×１０−４Ｍ、アミノプテリン４×１０−７Ｍ、チミジン１．６×１０−３Ｍ）を含んだＧＩＴ−１０ＦＣＳ培地（ＨＡＴ培地）を１ウェル当り１ｍｌずつ添加することにより、ＨＡＴ選択培養を開始した。ＨＡＴ選択培養は、培養開始３、６、９日後に旧液を１ｍｌ捨てた後、１ｍｌのＨＡＴ培地を添加することにより継続した。ハイブリドーマの増殖は、細胞融合後９〜１４日で認められ、培養液が黄変したとき（約１×１０６細胞／ｍｌ）上清を採取し、抗体価を測定した。
（２）ハイブリドーマのスクリーニング
抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートにバッファーＥ  ５０μｌとハイブリドーマ培養上清５０μｌとを加え、室温で６時間反応させた。プレートをＰＢＳで洗浄した後、上記実施例２（１）で作製したＨＲＰ標識化ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２〔バッファーＨで２００倍に希釈〕１００μｌを加え、４℃で１６時間反応させた。次に、プレートをＰＢＳで洗浄した後、固相上の酵素活性を上記実施例２（２）記載の方法により測定した。このようにして、ハイブリドーマの増殖が認められた全１２０ウェルの上清を調べたところ、１８ウェルに抗体価が認められた。
（３）クローニング
抗体活性が陽性を示したウェルのうち、Ｎｏ．４４、Ｎｏ．４９、Ｎｏ．９７、Ｎｏ．１１３の各ハイブリドーマを限界希釈法によるクローニングに付した。即ち、ハイブリドーマが１．５個／ｍｌになるようＲＰＭＩ１６４０−２０ＦＣＳに浮遊させ、９６穴マイクロプレート（ヌンク社製）に１ウェル当り０．２ｍｌずつ分注した。分注する際、フィーダー細胞としてＢＡＬＢ／Ｃマウスの胸腺細胞をウェル当り５×１０５個になるように加えた。約１週間後には細胞の増殖が認められるようになり、上清中の抗体価を上記実施例２（２）記載のＥＩＡ法により調べたところ、Ｎｏ．４４のハイブリドーマでは３０クローン中２８クローンが、Ｎｏ．４９のハイブリドーマでは５０クローン中４７クローンが、Ｎｏ．９７のハイブリドーマでは５０クローン中４９クローンが、Ｎｏ．１１３のハイブリドーマでは５０クローン中４８クローンが抗体を産生していた。
これらのクローンのうち、Ｎｏ．４４−２より得られたクローンＰＡ−６Ｎおよびその産生するモノクローナル抗体ＰＡ−６Ｎａ、Ｎｏ．４９−３より得られたクローンＰＡ−１Ｎおよびその産生するモノクローナル抗体ＰＡ−１Ｎａ、Ｎｏ．９７−２より得られたクローンＰＡ−２Ｃおよびその産生するモノクローナル抗体ＰＡ−２Ｃａ、Ｎｏ．１１３−５より得られたクローンＰＡ−５Ｎおよびその産生するモノクローナル抗体ＰＡ−５Ｎａに注目し、以下の実験を実施した。また、同様にして、免疫中の他のマウスの脾臓細胞を用いて細胞融合実験を実施し、Ｎｏ．２８−１２より得られたクローンＰＡ−１Ｃおよびその産生するモノクローナル抗体ＰＡ−１ＣａおよびＮｏ．１０−３より得られたクローンＰＡ−３Ｎおよびその産生するモノクローナル抗体ＰＡ−３Ｎａにも注目し、以下の実験を実施した。
（４）モノクローナル抗体の精製
ミネラルオイル０．５ｍｌを腹腔内投与されたマウス、あるいは未処置マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）に上記ハイブリドーマ１〜３×１０３細胞／匹を腹腔内注射した後、６〜２０日後に抗体含有腹水を採取した。この腹水よりプロテインＡカラム、あるいはジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セルロースカラムによりモノクローナル抗体を精製した。即ちＰＡ−１Ｎの腹水６ｍｌを等量の結合緩衝液（３．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３を含む１．５Ｍ−グリシン（ｐＨ９．０））で希釈した後、あらかじめ結合緩衝液で平衡化したプロテインＡ−セファロース（ファルマシア製）カラムに供し、特異抗体を溶離緩衝液（０．０５％  ＮａＮ３を含む０．１Ｍ−クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０））で溶出した。以上の操作により２８ｍｇの特異抗体を得た。同様にして、ＰＡ−５Ｎの腹水５ｍｌより２３ｍｇの特異抗体を、ＰＡ−６Ｎの腹水７．５ｍｌより１３ｍｇの特異抗体を、また、ＰＡ−１Ｃの腹水１４ｍｌより４５ｍｇの特異抗体を得た。一方、ＰＡ−３Ｎの腹水２０ｍｌに最終濃度４５％の飽和硫安溶液を加えて塩析後、遠心分離（２０，０００×ｇ，３０分）し、沈殿画分を０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．０２Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８）（ＢＢＳ）に対して透析し、さらに、０．０１ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍ−リン酸緩衝液に対して透析した。該抗体画分をＤＥＡＥ−セルロースカラム（２．５×１０ｃｍ、ワットマン社製ＤＥ−５２）に供し、ＮａＣｌ濃度の直線勾配（０．０１Ｍ−０．３５Ｍ）１００ｍｌで溶出した。以上の操作により特異抗体１３６ｍｇを得た。同様にして、ＰＡ−２Ｃの腹水７．５ｍｌから特異抗体５７ｍｇを得た。
【実施例４】  モノクローナル抗体のクラス・サブクラスの決定
ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２  ５μｇ／ｍｌを含む０．１Ｍ−炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）溶液を９６ウェルマイクロプレートに１００μｌずつ分注し、４℃で２４時間放置した。上記実施例５で述べた方法に従って、ウェルの余剰の結合部位をブロックエースでふさぎＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２結合プレートを作製した。次に該プレートにＰＡ−１Ｎ、ＰＡ−３Ｎ、ＰＡ−５Ｎ、ＰＡ−６Ｎ、ＰＡ−２ＣまたはＰＡ−１Ｃの培養上清１００μｌを加え、室温で３時間反応させた後、アイソタイプタイピングキット（Ｍｏｕｓｅ−ＴｙｐｅｒＴＭ  Ｓｕｂ−Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔバイオラッド社製）を用いるＥＬＩＳＡによってクラス、サブクラスを調べた。その結果ＰＡ−１Ｎａ、ＰＡ−６Ｎａ、ＰＡ−２ＣａおよびＰＡ−１ＣａはＩｇＧ１、κ、ＰＡ−５ＮａはＩｇＧ２ａ、κ、ＰＡ−３ＮａはＩｇＧ２ｂ、κであった。
【実施例５】（１）Ｆ（ａｂ’）２画分の調製
ＰＡ−６Ｎａをコロジオンバッグ（エムエス機器社製）で８ｍｇ／５００μｌにまで濃縮した後、０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む０．１Ｍ−酢酸緩衝液に対して透析した。該抗体溶液にペプシン（シグマ社、２回結晶）０．４ｍｇを加え、３７℃で１６時間反応させた後、０．１Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化したスーパーロース１２カラムを用いるＦＰＬＣ（ファルマシア社製）でＦ（ａｂ’）２画分を精製した。同様の手法により、ＰＡ−１Ｃａ  ８．９ｍｇに０．４４５ｍｇのペプシンを加え、Ｆ（ａｂ’）２画分を調製した。
（２）ＨＲＰ標識化抗ＰＡＣＡＰモノクローナル抗体の作製
ＰＡ−６Ｎａ  Ｆ（ａｂ’）２画分［２．２ｍｇ（２２ｎｍｏｌ）／ｍｌ］１ｍｌにＧＭＢＳ（２６０ｎｍｏｌ）を含むＤＭＦ５０μｌを加え、室温で４０分反応させた。反応液をセファデックスＧ−２５カラム（１×３０ｃｍ、溶離液、０．１Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ６．７））で分離し、得られたマレイミド基の導入されたＦ（ａｂ’）２画分１．５ｍｇと、上記実施例２（１）記載の方法により調製されたＳＨ基の導入されたＨＲＰ５．５ｍｇとを混合し、コロジオンバッグで約０．３ｍｌにまで濃縮した後、４℃で１６時間放置した。反応液を溶離液に０．１Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を用いるウルトロゲルＡｃＡ３４カラム（１０ｍｍφ×４０ｍｍ）に供し、Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰ複合体画分を精製した。２８０ｎｍと４０３ｎｍの吸光度から、Ｆ（ａｂ’）２１分子あたり２．４個のＨＲＰが導入されたことが確認された。同様の方法により、ＰＡ−１Ｃａ  Ｆ（ａｂ’）２画分２．９ｍｇを用いてＦ（ａｂ’）２−ＨＲＰ複合体を作製した。さらに、ＰＡ−２Ｃａ精製画分６．４ｍｇ（４３ｎｍｏｌに１５倍ｍｏｌ量のＧＭＢＳを加え、マレイミド基を導入後、同様の方法により、ＳＨ基を導入されたＨＲＰと反応させ、ＩｇＧ１分子あたり２．４個のＨＲＰが導入された標識体を作製した。
【実施例６】  各モノクローナル抗体が認識する抗原部位の検討
（１）ＰＡ−１Ｎａ
上記実施例２（２）記載の抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートに、バッファーＨで５０倍に希釈したＰＡ−１Ｎ培養上清５０μｌ、およびＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２、ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ２、ＰＡＣＡＰ（４−２７）ＯＨ、ＰＡＣＡＰ（１−１３）ＯＨ、ＰＡＣＡＰ（１４−３８）ＮＨ２、ＰＡＣＡＰ（３１−３８）ＮＨ２あるいはＶＩＰ（配列番号：７）のバッファーＨ溶液５０μｌを加え、室温で２時間反応させた後、上記実施例２（１）で得られたＨＲＰ標識化ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２（バッファーＨで１００倍希釈）を５０μｌ加え、４℃で１６時間反応させた。反応後ＰＢＳで洗浄し、固相上の酵素活性を上記実施例２（２）記載の方法により測定した。結果を図１（ａ）に示す。ＰＡ−１ＮａがＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２、ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ２、ＰＡＣＡＰ（１−１３）ＯＨ、ＰＡＣＡＰ（４−２７）ＯＨと反応し、ＰＡＣＡＰ（１４−３８）ＮＨ２、ＰＡＣＡＰ（３１−３８）ＮＨ２と反応せず、また、ＶＩＰとも反応しないことから（交差反応性０．１％以下（対ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２））、該抗体はＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２のＮ端部分を認識することが分った。
（２）ＰＡ−３Ｎａ
上記（１）記載の方法により、ＰＡ−３Ｎａ（ＰＡ−３Ｎの培養上清を５０倍希釈）を用いる競合ＥＩＡを実施した。結果を図１（ｂ）に示す。ＰＡ−３ＮａがＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２、ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ２、ＰＡＣＡＰ（１−１３）ＯＨ、ＰＡＣＡＰ（４−２７）ＯＨと反応し、ＰＡＣＡＰ（１４−３８）ＮＨ２、ＰＡＣＡＰ（３１−３８）ＮＨ２と反応せず（交差反応性０．１％以下（対ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２））、一方、ＶＩＰとは１％の交差反応性を示す（対ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２）ことから、該抗体はＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２のＮ端部分を認識することが分った。
（３）ＰＡ−５Ｎａ
上記（１）記載の方法により、ＰＡ−５Ｎａ（ＰＡ−５Ｎの培養上清を７０倍希釈）を用いる競合ＥＩＡを実施した。結果を図１（ｃ）に示す。ＰＡ−５ＮａがＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２、ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ２、ＰＡＣＡＰ（１−１３）ＯＨ、ＰＡＣＡＰ（４−２７）ＯＨと反応し、ＰＡＣＡＰ（１４−３８）ＮＨ２、ＰＡＣＡＰ（３１−３８）ＮＨ２と反応せず、また、ＶＩＰとも反応しないことから（交差反応性０．１％以下（対ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２））、該抗体はＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２のＮ端部分を認識することが分った。なお、ＰＡ−１ＮａとＰＡ−５Ｎａとは、ＰＡＣＡＰ（１−１３）ＯＨとの交差反応性（対ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２）において異っており、該交差反応性は前者が後者の１０倍以上強かった。
（４）ＰＡ−６Ｎａ
上記（１）記載の方法により、ＰＡ−６Ｎａ（ＰＡ−６Ｎの培養上清を４０倍希釈）を用いる競合ＥＩＡを実施した。結果を図１（ｄ）に示す。ＰＡ−６ＮａがＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２、ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ２、ＰＡＣＡＰ（４−２７）ＯＨと反応し、ＰＡＣＡＰ（１−１３）ＯＨ、ＰＡＣＡＰ（１４−３８）ＮＨ２、ＰＡＣＡＰ（３１−３８）ＮＨ２と反応せず、また、ＶＩＰとも反応しない（交差反応性０．１％以下（対ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２））ことから、該抗体はＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２のＮ端部分から中央部分に至る領域を認識することが分った。
（５）ＰＡ−２Ｃａ
上記（１）記載の方法により、ＰＡ−２Ｃａ（ＰＡ−２Ｃの培養上清を３４０倍希釈）を用いる競合ＥＩＡを実施した。結果を図１（ｅ）に示す。ＰＡ−２ＣａがＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２、ＰＡＣＡＰ（１４−３８）ＮＨ２と反応し、ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ２、ＰＡＣＡＰ（４−２７）ＯＨ、ＰＡＣＡＰ（１−１３）ＯＨ、ＰＡＣＡＰ（３１−３８）ＮＨ２と反応せず、また、ＶＩＰとも反応しない（交差反応性０．１％以下（対ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２））ことから、該抗体はＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２のＣ端部分から中央部分に至る領域を認識することが分った。
（６）ＰＡ−１Ｃａ
上記（１）記載の方法により、ＰＡ−１Ｃａ（ＰＡ−１Ｃの培養上清を３５倍希釈）を用いる競合ＥＩＡを実施した。結果を図１（ｆ）に示す。ＰＡ−１ＣａがＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２、ＰＡＣＡＰ（１４−３８）ＮＨ２、ＰＡＣＡＰ（３１−３８）ＮＨ２と反応し、ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ２、ＰＡＣＡＰ（４−２７）ＯＨ、ＰＡＣＡＰ（１−１３）ＯＨと反応せず、また、ＶＩＰとも反応しない（交差反応性０．１％以下（対ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２））ことから、該抗体はＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２のＣ端部分を認識することが分った。
以上の結果を基に、上記６種の抗ＰＡＣＡＰモノクローナル抗体が認識する抗原部位を図２にまとめた。
【実施例７】  抗ＰＡＣＡＰモノクローナル抗体の中和活性の検討
ラット副腎褐色細胞腫株ＰＣ−１２ｈ（大阪大学蛋白研究所、畠中博士（当時）より供与；Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，２２２（２）：２２５−３３，１９８１）をコラーゲン処理した４８ウェルマルチウェルプレート（住友ベークライト社製）上に、５×１０４細胞／ウェルの割合で播き、１０％のＦＣＳを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で７〜１０日間培養した。該プレートの培地を０．０５％のＢＳＡを含むハンクス液（ＨＢＳＳ：Ｈａｎｋｓ’ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に変換し、３０分間培養した後、上記６種の各抗ＰＡＣＡＰモノクローナル抗体（最終濃度２、２０あるいは２００ｎＭ）とあらかじめ４℃で１時間反応させたＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２（最終濃度２ｎＭ）を加えた。さらに２時間培養した後、培養上清中のｃＡＭＰ濃度をｃＡＭＰ測定キット（アマシャム社製）で測定した。結果を図３に示す。６種の抗ＰＡＣＡＰモノクローナル抗体のうち、２種（ＰＡ−６ＮａおよびＰＡ−１Ｃａ）がＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２に対して中和活性を有しないことがわかった。
【実施例８】  抗ＰＡＣＡＰ３８非中和抗体のＤＰＰ−ＩＶによるＰＡＣＡＰ分解抑制の検討
（１）ＣａＣｏ−２細胞内在のＤＰＰ−ＩＶによる分解作用の抑制効果
ＣａＣｏ−２細胞（ヒト結腸腺癌由来細胞）に発現したＤＰＰ−ＩＶ（ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ＩＶ）を用いて、抗ＰＡＣＡＰ３８非中和抗体がＤＰＰ−ＩＶによる分解を抑制するかどうか検討した。
Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ−ＣＨＡＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５），５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．１％ＢＳＡ，０．０５％ＣＨＡＰＳ）中にＣａＣｏ−２細胞膜画分を入れて段階的に希釈した後、終濃度１．０×１０−８Ｍ  ＰＡＣＡＰ３８を１．３×１０−７  Ｍ  ＰＡ−６Ｎａ存在または非存在の条件下で添加し、４．５時間３７℃でインキュベートした（実験１）。ＣａＣｏ−２細胞膜画分へのＰＡＣＡＰ３８の非選択的な吸着を評価するために、あらかじめＤＰＰ−ＩＶ阻害剤（ＩＣ５０＝５ｎＭ）を４×１０−７Ｍ添加し、実験１と同様の条件でインキュベートした（実験２）。実験１の試料に上記ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を４×１０−７  Ｍ添加して反応を終結させた後、実験１および２の反応液を１０倍に希釈し、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ−Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５），５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．１％  ＢＳＡ，０．０５％  Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ，０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ，１０μｇ／ｍｌ  Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ，２０μｇ／ｍｌ  Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，４μｇ／ｍｌ  Ｅ−６４）中に１００ｐＭ  ＰＡＣＡＰ受容体（Ｏｈｔａｋｉ，Ｔ．ｅｔａｌ．：Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３，１５４６４−７３．（１９９８）に記載の方法を一部改変して精製）および１００ｐＭ  １２５Ｉ−ＰＡＣＡＰ２７（Ｏｈｔａｋｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７１，８３８−８４４）を添加した。７５分間２５℃でインキュベートした後、ポリエチレンイミン処理したＧＦ／Ｆグラスフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ）を用いて吸引ろ過し、フィルター上に捕捉された１２５Ｉ−ＰＡＣＡＰ２７の放射活性をγカウンターにより検出した。測定はｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで実施した。結果を図４に示す。残存放射活性が大きいほど１２５Ｉ−ＰＡＣＡＰ２７の受容体結合量が大きく、したがって前もって添加したＰＡＣＡＰ３８が減少していることを示す。この図から、ＤＰＰ−ＩＶはＰＡ−６Ｎａ非存在下で濃度依存的なＰＡＣＡＰ３８分解作用を示すが、ＰＡ−６Ｎａは調べられたＤＰＰ−ＩＶの濃度範囲でＰＡＣＡＰ３８の分解をほぼ完全に抑制することが判明した。
（２）組換えＤＰＰ−ＩＶによる分解作用の抑制効果
反応条件などはＣａＣｏ−２使用時と同一で、ＣａＣｏ−２膜画分の代りに組換えＤＰＰ−ＩＶ粗精製品を用いて（１）と同様の実験を行った。組換えＤＰＰ−ＩＶを用いることで、ＣａＣｏ−２膜画分でのＰＡＣＡＰ３８分解の評価時に問題となった非選択的結合が減弱し、基質分解活性も向上した（図５、−□−）。ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の有無にかかわらず、ＰＡ−６ＮａはＰＡＣＡＰ３８のＤＰＰ−ＩＶによる分解を１−１００倍希釈のＤＰＰ−ＩＶ濃度域で抑制した（図５、−■−および−〇−）。即ち、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を事前に添加することなしに、ＰＡ−６ＮａのＤＰＰ−ＩＶによるＰＡＣＡＰ３８分解作用の抑制が明瞭に検出された。
【実施例９】  ＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅを含む免疫原の調製
ＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅ（ＡｎａＳｐｅｃ社製）４ｍｇとＢＳＡ  ７．２ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）２ｍｌに溶解し、これに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で０．１％に希釈したグルタルアルデヒド２ｍｌを静かに滴下して氷冷下で５時間反応させた。反応混合物をカルシウム、マグネシウム不含ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ（−））に対し透析した後、−８０℃に小分け保存し、これを免疫原として用いた。
【実施例１０】  抗ＧＬＰ−１抗体濃度の測定（酵素免疫測定法）
抗マウスイムノグロブリンヤギ抗体（ＩｇＧ画分、ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ社製）を０．０１Ｍ  ＮａＣｌ含有０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で５μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、これを９６ウェルハーフエリアプレート（コーニング社製）に５０μｌずつ分注し、４℃で一晩吸着させた。この溶液を除去後、２５％ブロックエース（大日本製薬株式会社製）含有Ｄ−ＰＢＳ（−）を１００μｌずつ添加し、３７℃で１時間処理した。
このプレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄後、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳで段階希釈した抗血清を５０μｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄後、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）で１０  ｎｇ／ｍｌに希釈したビオチン標識ＧＬＰ−１［ＧＬＰ−１（７−３６）−Ｌｙｓ（Ｂｉｏｔｉｎ），ａｍｉｄｅ］（ＡｎａＳｐｅｃ社製）を５０μｌずつ分注し、３７℃で１時間反応させた。プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄後、０．１％  Ｔｗｅｅｎ含有Ｄ−ＰＢＳ（−）で０．３μｇ／ｍｌに希釈した西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジン（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ社製）を５０μｌずつ分注し、室温で３０分間反応させた。さらにプレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄後、ＨＲＰ基質（ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ＥＩＡ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ，バイオラッド社製）を５０μｌずつ分注して発色させ、１Ｎ硫酸を５０μｌずつ分注して反応停止後、プレートリーダー（マルチスキャン；ラボシステムズ）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【実施例１１】（１）ＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅ複合体の免疫
実施例９で調製したＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅ／ＢＳＡ複合体溶液をフロイント完全アジュバントと等容量混合して作製したエマルションを、ＢＡＬＢ／ｃマウス（１３週齢、雌）１０匹に５０μｇ／匹で皮下免疫した。２回目以降は、ＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅ／ＢＳＡ複合体とフロイント不完全アジュバントとで作製したエマルションを２週間隔で免疫した。３回目の免疫１週後に、実施例１０に記載するＥＬＩＳＡにおいて高い血清抗体価を示した個体に、上述の免疫原を生理食塩水１００μｌに溶解させたものを静脈内投与することにより最終免疫を行った。
（２）抗ＧＬＰ−１抗体産生ハイブリドーマの取得
最終免疫から３日後にマウスから脾臓を摘出し、遠心洗浄操作により約１０８個の脾臓細胞を取得した。この脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３．Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）とを５：１の細胞数比となるよう混合した後、ポリエチレングリコール１５００（ロシュ社製）を用い、ケーラーとミルスタインの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５，１９５７）に準じて融合させた。この融合細胞を１０％牛胎児血清を含むＩＨ培地（ＩＭＤＭ（インビトロジェン社製）とＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２（インビトロジェン社製）との等量混合培地）（ＩＨ−ＦＣＳ）に再懸濁させ、９６穴マルチプルウェルプレート（コーニング社製）にＰ３Ｕ１として２×１０４個／１００μｌ／ウェル播種し、ＣＯ２インキュベーターを用いて３７℃、５％ＣＯ２濃度で終夜培養した。翌日、各ウェルにヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含むＩＨ−ＦＣＳ（ＨＡＴ培地）を１００μｌ／ウェル添加し、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２濃度下で選択培養した。ＨＡＴ選択培養は、細胞融合４日後および７日後に各ウェルの培養上清の３／４を新鮮なＨＡＴ培地に交換し、培養を継続した。細胞融合後８日目から２週間後にかけてハイブリドーマ増殖の見られたウェルの培養上清を実施例１０に記載のＥＬＩＳＡに供して、１５種類の抗ＧＬＰ−１（７−３６）モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ［ＧＬＩＴ１−１７５（１）１８、ＧＬＩＴ１−２３８（１）６、ＧＬＩＴ１−２５４（１）６、ＧＬＩＴ１−２５６（１）３１、ＧＬＩＴ１−４６４（１）１５、ＧＬＩＴ１−４９２（１）２、ＧＬＩＴ２−１０５（１）６、ＧＬＩＴ２−１３０（１）３６、ＧＬＩＴ２−１９７（１）６６、ＧＬＩＴ２−２３４（２）６５、ＧＬＩＴ２−３２９（１）２４、ＧＬＩＴ２−３５７（１）１０、ＧＬＩＴ２−８０６（１）４、ＧＬＩＴ２−８５１（１）１１、ＧＬＩＴ２−８６３（１）３５］を選択取得し、限界希釈法によりクローン化株を樹立した。
（３）抗ＧＬＰ−１モノクローナル抗体の精製取得
上記で得られた１５種類の抗ＧＬＰ−１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、１０％  Ｕｌｔｒａ  ｌｏｗ  ＩｇＧ  ＦＣＳ（インビトロジェン社製）含有ＩＨ培地中、ＣＯ２インキュベーターを用いて３７℃、５％ＣＯ２濃度で培養し、遠心分離により回収した培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムクロマトグラフィーに供して精製抗体を得た。これらの精製抗体のサブクラスをＩｓｏＳｔｒｉｐ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて決定した。これらの抗ＧＬＰ−１抗体は、実施例１０に記載のＥＬＩＳＡにおいて、ビオチン標識ＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅに対し、ＥＣ５０：１×１０−９〜１×１０−１１Ｍの高い結合活性を示した。また、同ＥＬＩＳＡにおいて、抗マウスイムノグロブリンヤギ抗体感作プレートに一定濃度の各種抗ＧＬＰ−１抗体を捕捉させた後、一定濃度（１０ｎｇ／ｍＬ）のビオチン標識ＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅと、これに対して０．００３〜３００倍モル量のＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅ（ＡｎａＳｐｅｃ社製）またはＧＬＰ−１（９−３６）ａｍｉｄｅ（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社製）とを添加して、結合阻害試験を行った結果、全ての抗体はＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅにより強く阻害されるが、ＧＬＰ−１（９−３６）ａｍｉｄｅによる阻害を受けない、ＧＬＰ−１のＮ末端領域を特異的に認識する抗体であることが分かった。以上の結果を表１にまとめて示す。
【表１】
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【実施例１２】  抗ＧＬＰ−１非中和モノクローナル抗体の選定
実施例１１で作製した１５種類の抗ＧＬＰ−１モノクローナル抗体の中からＧＬＰ−１とＧＬＰ−１受容体との結合を阻害しない非中和抗体を選択するために、下記の２種類の活性測定試験を行った。
（１）ＧＬＰ−１受容体レポータージーンアッセイ
ＧＬＰ−１受容体を細胞膜表面に発現させ、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ（ＭＲＥ）／ｃＡＭＰ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ（ＣＲＥ）−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子を導入した安定発現ＣＨＯ細胞株を１０％牛胎児血清、１μｇ／ｍｌブラストシジン、５００μｇ／ｍｌ  ジェネティシン、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有するＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２（インビトロジェン社製）培地に懸濁させ、９６穴ホワイトプレート（コスター社製）に１×１０４細胞／１ウェルで播種し、ＣＯ２インキュベーターを用いて３７℃、５％  ＣＯ２濃度で２日間培養した。培地を吸引除去後、予め室温で１時間反応させておいたＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅ（２ｎＭ）と１−３００倍モル量の精製抗ＧＬＰ−１モノクローナル抗体との反応混合物（Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２（インビトロジェン社製）で希釈）１００μｌを添加し、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、５％  ＣＯ２濃度下で５．５時間培養した。培地を吸引除去後、ピッカジーンＬＴ−ＦＲ（東洋インキ製造社製）とハンクス液（ＨＢＳＳ：Ｈａｎｋｓ’  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）の１：１混合液を４０μｌ／ウェル添加し、室温で２０分間反応後、Ｗａｌｌａｃ  １４２０  ＡＲＶＯＭＸ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌｃｏｕｎｔｅｒ（パーキンエルマー・ジャパン社製）を用いてＭＲＥ／ＣＲＥに作用する転写活性をルシフェラーゼの活性を指標に定量した。
（２）ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１受容体結合阻害アッセイ
ＧＬＰ−１受容体を過剰発現させた細胞膜画分は以下のようにして調製した。すなわち、ヒトＧＬＰ−１受容体遺伝子を組み込んだｐＦａｓｔＢａｃＴＭプラスミド（インビトロジェン・ライフテクノロジー社製）から定法により組換えバキュロウィルス液を調製し、これを昆虫細胞株（Ｓｆ９）に感染させてＧＬＰ−１受容体を一過性発現させた。この感染細胞を遠心分離で回収し、界面活性剤存在下でポリトロン破砕処理した後６００  ｘ  ｇで遠心分離して細胞残渣を除き、その上澄液を１００，０００  ｘ  ｇで超遠心分離してＧＬＰ−１受容体を含む膜画分を調製した。
２００ｐＭの１２５Ｉ標識ＧＬＰ−１（ＩＭ３２３、アマシャム・バイオサイエンス製）と、これに対して１〜１，０００倍モル量の抗ＧＬＰ−１抗体とを混合し、３７℃で１時間インキュベートした後、上記のＧＬＰ−１受容体膜画分を添加して室温で７５分間インキュベートした後、ポリエチレンイミン処理したグラスフィルター（ＧＦ／Ｆ、ワットマン製）を用いてＢ／Ｆ分離し、γカウンターを用いてＧＬＰ−１受容体に結合した１２５Ｉ標識ＧＬＰ−１量を定量した。
（１）および（２）の結果を表２にまとめて示す。ＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅに対し１，０００倍モル量加えてもＧＬＰ−１とＧＬＰ−１受容体の結合を阻害せず、３００倍モル量加えてもＧＬＰ−１受容体レポータージーンアッセイにおいてＧＬＰ−１活性を中和しない抗体（図６および図７参照）を抗ＧＬＰ−１非中和抗体とした。得られた２種類の抗ＧＬＰ−１非中和抗体（表２）の中から、物理的安定性の良好なＧＬＩＴ２−３２９（１）２４を抗ＧＬＰ−１非中和抗体として選択し、以下の実験に供した。
【表２】
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【実施例１３】  抗ＧＬＰ−１非中和モノクローナル抗体（ＧＬＩＴ２−３２９（１）２４）のＤＰＰ−ＩＶによるＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅ分解抑制作用
実施例１２で選択した抗ＧＬＰ−１非中和モノクローナル抗体（ＧＬＩＴ２−３２９（１）２４）のＤＰＰ−ＩＶによるＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅ分解抑制作用をＥＬＩＳＡ法によって調べた。ＰＢＳ−Ｔで希釈した抗ＧＬＰ−１モノクローナル抗体（ＧＬＩＴ２−３２９（１）２４；最終濃度５ｍｇ／ｍｌ）とＤｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）（Ｒ＆Ｄシステムズ社；最終濃度２００ｎｇ／ｍｌ）混合液に、ＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で１２時間反応させた。反応液を９５℃で５分間熱処理後、１８００ｒｐｍで遠心分離し、上清中に残存するＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅ量を以下の方法により測定した。ＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅのＮ末端領域に結合し、ＧＬＰ−１（９−３６）ａｍｉｄｅには結合しない抗ＧＬＰ−１抗体（ＧＬＩＴ１−２５４（１）６）をＤ−ＰＢＳ（−）で０．１５μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、これを９６ウェルハーフエリアプレート（コーニング社製）に５０μｌずつ分注し、４℃で一晩吸着させた。この溶液を除去後、２５％ブロックエース（大日本製薬株式会社製）含有Ｄ−ＰＢＳ（−）を１００μｌずつ添加し、室温で１時間処理した。このプレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄後、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）で段階希釈した反応液と、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）で５ｎｇ／ｍｌに希釈したビオチン標識ＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅとを２５μｌずつ分注し、３７℃で２時間反応させた。プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄後、０．１％  Ｔｗｅｅｎ含有Ｄ−ＰＢＳ（−）で０．３μｇ／ｍｌに希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ社製）を５０μｌずつ分注し、室温で３０分間反応させた。さらにプレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄後、ＨＲＰ基質（ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ＥＩＡ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ，バイオラッド社製）を５０μｌずつ分注して発色させ、１Ｎ硫酸を５０μｌずつ分注して反応停止後、プレートリーダー（マルチスキャン；ラボシステムズ）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
抗体非存在下（Ｎｏｎｅ）および抗エリスロポエチン抗体（Ａｎｔｉ−ＥＰＯ  Ａｂ）存在下では、ＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅはＤＰＰ−ＩＶによって９０％以上分解されたが、抗ＧＬＰ−１非中和モノクローナル抗体（ＧＬＩＴ２−３２９（１）２４）存在下ではＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅは約１０％しか分解されず、この抗ＧＬＰ−１非中和モノクローナル抗体がＤＰＰ−ＩＶによるＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅの分解を抑制し得ることが分かった（図８）。
【実施例１４】  抗ＧＬＰ−１非中和モノクローナル抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ投与実験
（１）ラット腹腔内への抗体の投与
飽食状態のＷｉｓｔｅｒ  ｆａｔｔｙラット（雌）に生理食塩水、抗ＧＬＰ−１非中和モノクローナル抗体（ＧＬＩＴ２−３２９（１）２４）または対照としてマウスＩｇＧ（ＣｈｒｏｍｏＰｕｒｅ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ，ｗｈｏｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ；ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ社製）を２０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与し、１日後に腹部大動脈より全採血を行い、速やかにＤＰＰ−ＩＶインヒビター（ＤＰＰ４，ＬＩＮＣＯ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を添加した。遠心分離操作により血漿を調製し、冷凍保存した。
（２）ラット血漿中のＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅ濃度の測定
ラット血漿中のＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅ濃度は下記の前処理を行った後、ＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅ測定キット（リンコ社製）を用いて測定した。すなわち、上記各投与群のラットから採取した血漿サンプル０．７５ｍＬに対し、等量のＢｕｆｆｅｒ  Ａ（１％  ＴＦＡ  ｉｎ  ９９％  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ）を添加した。４℃、５ｍｉｎ反応後、遠心分離を行い、上清を回収した。回収した上清を、Ｂｕｆｆｅｒ  Ａで平衡化したＣ１８カラム（Ｓｅｐ−ｃｏｌｕｍｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ２００ｍｇ  ｏｆ  Ｃ１８、ペニンシュラ・ラボラトリーズ社製）に通し、Ｂｕｆｆｅｒ  Ａで洗浄後、Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ（６０％  ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ  ｉｎ  １％  ＴＦＡ  ｉｎ  ３９％  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ）で溶出した。溶出液を減圧濃縮乾固し、残渣を上記ＥＬＩＳＡキットに付属のＡｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ  ３７５μＬに再溶解し、熱処理（９５℃、５ｍｉｎ）後、遠心分離し、その上清を上記ＥＬＩＳＡキットに供してＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅ濃度を測定した。なお、ラット血漿中にＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅを添加して、サンプルと同様の前処理を行った添加回収実験の結果から、前処理によるＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅの回収率は３０％であった。この回収率で補正したラット血漿中ＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅ濃度を図９に示す。
生理食塩水を投与した飽食Ｗｉｓｔｅｒ  Ｆａｔｔｙラットの投与１日後の血漿中活性型ＧＬＰ−１（７−３６）濃度は４．７±０．６ｐＭであり、マウスＩｇＧ投与群の活性型ＧＬＰ−１（７−３６）濃度は７．１±１．２ｐＭであった。これに対し、抗ＧＬＰ−１非中和抗体（ＧＬＩＴ２−３２９（１）２４）投与群の活性型ＧＬＰ−１（７−３６）濃度は１４．１±４．０ｐＭであり、対照として用いたマウスＩｇＧ投与群に比べて有意に高かった（ｐ＜０．０５）。この結果は、抗ＧＬＰ−１非中和抗体の投与によりラット生体内の活性型ＧＬＰ−１（７−３６）の血中半減期を延長させ、血中レベルを高められることを示している。
なお、Ｚｕｃｋｅｒ  ｆａｔｔｙラットに十二指腸より糖負荷する実験系にＤＰＰ−ＩＶ阻害薬を前投与した報告によれば、化合物によるインスリン分泌促進と血糖上昇抑制が認められた時の血獎中活性型ＧＬＰ−１濃度の最大値は約１０ｐＭであった（Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５１，１４６１−１４６９，２００２）。この結果から、本実施例の抗ＧＬＰ−１非中和抗体（ＧＬＩＴ２−３２９（１）２４）投与群で認められた活性型ＧＬＰ−１（７−３６）濃度、１４．１±４．０ｐＭは、活性型ＧＬＰ−１の薬効領域であると考えられる。
【産業上の利用可能性】  本発明の血中安定性改善剤は、動物に投与すると有効成分である非中和抗体が内因性リガンドと結合してこれを安定化し、血中リガンド濃度を増大および／またはリガンドの血中半減期を延長せしめ、該リガンドの受容体活性調節作用を増強し得るので、該受容体活性の異常が関与する疾患の予防・治療に有用である。特に、ペプチド性化合物等の血中半減期が非常に短い内因性リガンドが関与する疾患、あるいはアゴニストが容易に取得できない受容体が関与する疾患等に有用である。
また、本発明の血中安定性改善剤は、所望の血中リガンド濃度を得るのに十分な抗体量でその効果を奏するので、既存の抗体医薬に比べて臨床投与量を顕著に低減することができ、より安全且つ安価な製剤を提供することができる。従って、医療コストの低減に寄与するとともに、抗体医薬の適応分野の拡大にも大いに寄与する。
本出願は、日本で出願された特願２００４−０９８５９５（出願日：２００４年３月３０日）を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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