(57)【要約】水の接触角が４０°から９８°の範囲内にある高分子化合物を含む吸着材を、二価カチオンキレート剤の存在下で、体外循環法によって哺乳動物体液と接触させることからなるか、又は、活性炭を含む吸着材を、体外循環法によって哺乳動物体液と接触させることからなる、リンパ球増殖抑制状態を解除するための体液処理方法；及び、体液移送ポンプと、抗凝固剤注入用ポンプと、水の接触角が４０°から９８°の範囲内にある高分子化合物を含む吸着材を容器内に含んでなるデバイスとを備えるか、又は、体液移送ポンプと、活性炭を含む吸着材を容器内に含んでなるデバイスとを備える体外循環用システムに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
水の接触角が４０°から９８°の範囲内にある高分子化合物を含む吸着材を、二価カチオンキレート剤の存在下で、体外循環法によって哺乳動物体液と接触させることを特徴とする、リンパ球増殖抑制状態を解除するための体液処理方法。
【請求項２】
該二価カチオンキレート剤がクエン酸塩である請求項１記載の方法。
【請求項３】
該二価カチオンキレート剤として、クエン酸塩溶液を、該クエン酸塩溶液：該体液の体積比率が１：１０以上１：８０以下となる量で使用し、かつ該体液が０．０１ＩＵ／ｍｌから１．５ＩＵ／ｍｌのヘパリンを含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
該吸着材の排除限界分子量が１．５×１０５以下である、請求項１ないし３いずれか記載の方法。
【請求項５】
該高分子化合物が芳香族系高分子化合物である請求項１ないし４いずれか記載の方法。
【請求項６】
該芳香族系高分子化合物がポリスチレンまたはスチレン−ジビニルベンゼン共重合体である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
活性炭を含む吸着材を、体外循環法によって哺乳動物体液と接触させることを特徴とする、リンパ球増殖抑制状態を解除するための体液処理方法。
【請求項８】
該吸着材が、容器内に含まれてなるものである、請求項１ないし７いずれか記載の方法。
【請求項９】
体外循環用システムであって、体液移送ポンプと、抗凝固剤注入用ポンプと、水の接触角が４０°から９８°の範囲内にある高分子化合物を含む吸着材を容器内に含んでなるデバイスとを備えるシステム。
【請求項１０】
体外循環用システムであって、体液移送ポンプと、活性炭を含む吸着材を容器内に含んでなるデバイスとを備えたシステム。
【請求項１１】
該抗凝固剤注入用ポンプを、該デバイスより上流に連結して備える、請求項９または１０記載のシステム。
【請求項１２】
血漿分離膜をさらに備えた請求項９ないし１１いずれか記載のシステム。
【請求項１３】
該血漿分離膜を、該デバイスより上流に連結して備える、請求項１２記載のシステム。
【請求項１４】
哺乳動物体液のリンパ球増殖抑制状態を解除するためのものである、請求項９ないし１３いずれか記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液中の免疫担当細胞（特にリンパ球）が増殖不良又は増殖抑制状態にある、癌、感染症、免疫疾患などにおいて、体外循環にて血液中のリンパ球増殖抑制因子を吸着除去することにより、リンパ球増殖が抑制された状態を解除するための体外循環用システムおよび体液処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、血液中の免疫担当細胞（特にリンパ球）を体外に取り出して培養し、これを刺激・活性化して増殖したものを、再び体内にもどすことにより、癌の進行を抑制する活性化自己リンパ球療法が注目を集めている。本方法は、副作用をほとんど伴わず、治療中においても高いＱＯＬ（ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ）を維持出来ることから、特に癌治療分野において、主要な３大癌治療方法である外科的療法、放射線療法、化学療法に次ぐ第４の癌治療の選択肢として広く浸透しつつある。既に、テーラーメード型の高度先進医療の一つとして、大学病院、癌センター、専門のクリニックにて積極的に治療が行われており、さらなる拡大が期待されている。本方法は、通常、患者血液を採取した後に、リンパ球画分を密度勾配遠心法にて分取し、専用の培養液に自己血漿を添加して培養を行う。通常は一週間で初期培養リンパ球数の約１００倍前後増殖するが、なかには自己血漿ではリンパ球はほとんど増殖せず、他人の血漿（供血）で増殖可能な癌患者が存在することがわかってきている。このことは、自己の血漿中にリンパ球の増殖を抑制する因子の存在を示唆するものである。癌細胞はトランスフォーミング・グロウス・ファクター・ベータ（以下ＴＧＦ−βと略す）、インターロイキン４（以下ＩＬ４と略す）、インターロイキン６（以下ＩＬ６と略す）、インターロイキン１０（以下ＩＬ１０と略す）等のサイトカインや、プロスタグランジンＥ２（以下ＰＧＥ２と略す）等、細胞性免疫を抑制する因子を産生している。そこで該因子がリンパ球の増殖を抑制している可能性が考えられるが、これら因子は癌病巣局所での濃度は高いものの、癌患者の血液中の濃度は健常人と変わらない程度である。また、試薬として市販されている該因子を高濃度で血漿中に溶解させ、リンパ球の増殖性への影響を検討しても、ほとんど抑制がかからないこと等から、該因子以外でリンパ球の増殖を強く抑制しているサイトカイン類以外による、何らかのリンパ球増殖抑制因子の存在が示唆される。【０００３】
実際、これまでに免疫抑制性酸性蛋白質（ＩＡＰ）を吸着除去する吸着体（特許文献１）、体液中のインターロイキン類を吸着除去する吸着体（特許文献２）、体液中のＴＧＦ−βを吸着する吸着体（特許文献３）等が開示されているが、いずれもサイトカイン類の吸着除去に限定されており、リンパ球の増殖性を向上させる吸着材の報告はない。また、近年、活性化リンパ球療法の著しい発展により、該治療を受ける患者数は年々増加の一途をたどってはいるものの、リンパ球増殖不良で供血に頼る患者数も増加している。供血の場合、患者の治療サイクルに合わせて、非自己血漿を確保する必要がある。また、感染の問題等、安全上考慮すべき課題も多く、他の有用な物質を損失することなく、簡便な操作でリンパ球培養におけるリンパ球増殖が抑制されるのを解除する方法の開発が望まれている。さらに、自己体液で増殖可能な癌患者においても、リンパ球培養におけるリンパ球増殖が抑制されるのを解除することにより、さらなる増殖率、サイトカイン産生能等の活性の向上が期待されているが、このような吸着材、多孔質体、デバイスおよび処理方法は存在しない。また、サイトカイン類等の免疫抑制性蛋白質を吸着する材料を、水不溶性担体に結合させた吸着材が開示されている（特許文献４、５、６）。しかし、該吸着材は、アミン残基とサイトカイン類等の免疫抑制性蛋白質のアフィニティに基づく。したがって、該吸着材は、アミン残基の存在を要する。
【特許文献１】特開昭５６−０９２８２４号公報
【特許文献２】特開平０８−２５７３９８号公報
【特許文献３】特開２００１−２１８８４０号公報
【特許文献４】特開２００３−３１０７５１号公報
【特許文献５】特開２００３−３３９８５４号公報
【特許文献６】特開２００４−７３６１８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
血液中の免疫担当細胞（特にリンパ球）が増殖不良又は増殖抑制状態にある、癌、感染症、免疫疾患などにおいて、増殖不良のリンパ球の増殖性を向上させる（以下「リンパ球増殖抑制解除」という）処理が待望されている。
そこで、本発明の目的は、リンパ球増殖抑制状態を解除し、リンパ球の増殖性を向上させること、及び、体液中の有用物質を損失することなく体液を通液することが可能な、体液処理方法及び体外循環用システムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、鋭意研究を行ったところ、水の接触角が４０°から９８°の範囲内にある高分子化合物を含む吸着材を、二価カチオンキレート剤の存在下で、体液と接触させること、又は、活性炭を含む吸着材を、体液と接触させることにより、リンパ球増殖抑制状態を解除し、リンパ球の増殖性を向上させ、かつ、体液中の赤血球、白血球、血小板等の血球をほとんど損失せずに良好に通血することが可能であることを見出し、本発明の完成に至った。【０００６】
すなわち、本発明は、水の接触角が４０°から９８°の範囲内にある高分子化合物を含む吸着材を、二価カチオンキレート剤の存在下で、体外循環法によって哺乳動物体液と接触させることからなる、リンパ球増殖抑制状態を解除するための体液処理方法；
活性炭を含む吸着材を、体外循環法によって哺乳動物体液と接触させることからなる、リンパ球増殖抑制状態を解除するための体液処理方法；
体液移送ポンプと、抗凝固剤注入用ポンプと、水の接触角が４０°から９８°の範囲内にある高分子化合物を含む吸着材を容器内に含んでなるデバイスとを備える体外循環用システム；及び、
体液移送ポンプと、活性炭を含む吸着材を容器内に含んでなるデバイスとを備える体外循環用システムに関する。
以下に本発明を詳細に説明する。【０００７】
まず、本発明における吸着材について説明する。
本発明における吸着材は、水の接触角が４０°から９８°の範囲内にある高分子化合物を含んでなるものである。本発明における吸着材は、体液の体外循環において使用することができる。【０００８】
本発明における水の接触角は、主たる構成成分である高分子化合物よりなる平滑なフィルムを作製し、水平な状態でその上に微量注射器を用いて液滴を形成し、その接触角を室温で測定することにより求めることができる。また、高分子化合物が有機溶媒に溶解可能な場合は、高分子化合物を溶解後、溶解液を用いて平板上にキャストフィルムを作製して、接触角を測定することもできる。測定方法の詳細は、例えば「新実験化学講座１８  界面とコロイド」（丸善株式会社、昭和５２年１０月２０日発行、初版）等を参照することができる。【０００９】
すなわち、鏡面仕上げの平滑度をもつ平板試片を、測定する液体の飽和蒸気で満たされるように水平に置き、その上へ微量注射器を用いて液滴を作る。液滴の大きさは、接触径が約３ｍｍ以下になるようにする。接触角は、液滴を、固体表面に対して前進させるとき（液体を試料上に展開し、液体が広がった後に、液滴がある大きさに落ち着いたとき）に形成される角度を、測角器のついた読みとり顕微鏡（倍率２０倍程度）で測定することができる。鏡筒を１−２度水平より下方に傾けておくと、像の鮮明度が極めてよくなる。滴は、前方から乳白ガラスを通した光あるいは熱線吸収ガラスを通した平行光で照明する。
なお、本発明においては、後述の実施例で記載の方法により、接触角を測定した。【００１０】
水の接触角が４０°から９８°の範囲内にある代表的な高分子化合物としては、例えば、ナイロン６、ナイロン６，６、ナイロン１１、ポリエチレン、ポリ（塩化ビニリデン）、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、ポリ（トリフルオロエチレン）、ポリ（クロロトリフルオロエチレン）、ポリ（テレフタル酸エチレン）、ポリプロピレン、ポリアクリル酸エステル（ポリ（アクリル酸メチル）等）、ポリメタクリル酸エステル（ポリ（メタクリル酸メチル）等）、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアミド等の合成高分子化合物、セルロース等の水不溶性のものが挙げられるが、これらに限定されない。このうち、リンパ球増殖率の点から、芳香族系モノマー（例えば、スチレン；メチルスチレン、エチルスチレン等の、置換されても良いアルキルスチレン；ジビニルベンゼン；ジビニルナフタレン、ジビニルアントラセン等の置換されても良いベンゾ縮合環から選ばれるモノマー）を重合させた重合体または共重合体が好ましい。特に、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体が好ましい。【００１１】
ポリスチレンとしては、任意のポリスチレンを使用できる。ポリスチレンは、スチレン類（スチレン；メチルスチレン、エチルスチレン等の、置換されても良いアルキルスチレン）の単独重合体、および、上記スチレン類を主成分とする共重合体である。
スチレン−ジビニルベンゼン共重合体は、上記スチレン類を、所望により置換されてもよいｍ−、ｏ−またはｐ−ジビニルベンゼンで架橋させて得ることができる。【００１２】
上記高分子化合物は、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノスルホニル等で所望により置換されてもよい。上記置換基は、アミン基以外でさらに置換されることができ、上記置換基の置換基としては、アミド基、尿素基、エステル基、エーテル基以外が好ましい。
上記高分子化合物は、アミン基を結合していないものであることが好ましい。アミン基としては、例えば、アンモニア、第１〜３級アミン等が高分子化合物に化学的に結合した状態のもの等が挙げられる。
また、上記高分子化合物は、他の化合物が固定されていないものであることが好ましい。他の化合物としては、上記高分子化合物以外であれば特に限定されず、例えば、アミン類、アルコール類、グリシジルエーテル類、カルボン酸類とその誘導体、酸ハロゲン化物、ハロゲン化物、ハロゲン化シラン類、チオール類、アルデヒド類、抗体等が挙げられる。【００１３】
本発明の目的のために、つまりリンパ球増殖の促進の点から、上記水の接触角は、好ましくは約６０°から９６°、より好ましくは約７０°から９４°、さらに好ましくは約７５°から９１°である。水の接触角が４０°未満の場合、吸着材の親水性が高いために、リンパ球増殖抑制に関与するタンパク質などの吸着量が低下し、リンパ球増殖抑制状態が解除され難くなるものと推測される。一方、水の接触角が９８°を超えると吸着材の疎水性がさらに高くなり、タンパク質などの吸着性能が低下傾向を示す。結果として、リンパ球増殖抑制に関与するタンパク質などの吸着量も低下し、リンパ球増殖抑制状態が解除され難くなるものと推測される。
本発明において、吸着材は水不溶性であることが好ましい。【００１４】
また、本発明の吸着材は、上記高分子化合物を約５０重量％以上、好ましくは約６０重量％以上、より好ましくは約７０重量％以上、さらに好ましくは約８０重量％以上含むものである。
吸着材に含有させることのできる、水の接触角が４０°から９８°である上記高分子化合物以外の成分としては、例えば、ポリビニルアルコール（接触角３６°）、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル）（同１３°）、パラフィン（同１０５−１０６°）等が挙げられる。
なお、水の接触角が４０°から９８°である上記高分子化合物を２種以上併用することや、水の接触角が４０°から９８°である上記高分子化合物を主原料とし、上記高分子化合物以外の成分を副原料として配合すること等により、得られる高分子化合物の水の接触角を調節することができる。【００１５】
本発明の吸着材は、常温常圧で固体であり、かつ適当な大きさの細孔を有する、すなわち多孔構造を有する多孔質体であることが好ましい。
多孔質体中の細孔の大きさ、すなわちポリスチレンビーズを用いて測定した多孔質体の排除限界分子量は、好ましくは１．５×１０５以下である。より好ましくは１．４×１０５以下のものが用いられる。排除限界分子量が１．５×１０５より大きくなると非特異吸着が大きくなったり、体液中の有用蛋白質の損失が起こったり、リンパ球の増殖性が低くなり易い傾向がある。リンパ球の高い増殖率を維持しつつ、非特異吸着の影響をより少なくするためには、排除限界分子量は１．３×１０５以下であることがさらに好ましい。特に好ましくは１．２×１０５以下、最も好ましくは１．０×１０５以下である。
排除限界分子量の調節は、例えば、多孔質体作製時に、多孔質体を構成する主たる上記高分子化合物の含量を調節することにより、容易に制御可能である。すなわち、上記高分子化合物含量が多くなれば、限界排除分子量は小さくなり、上記高分子化合物含量が少なくなれば、排除限界分子量は大きくなる。【００１６】
排除限界分子量の測定は、以下のようにして行うことができる。粒子径の異なるポリスチレンビーズを、吸着材が充填されたカラムに流し、流出してきたポリスチレンビーズの流出曲線により、孔のサイズを求める。次に、直径と分子量がわかっている球状蛋白質（デキストラン等）へ、上記孔のサイズを外挿することにより、当該球状蛋白質換算の分子量を求め、排除限界分子量とする。【００１７】
吸着材の形状としては、粒状、粒子の集合体、繊維状、膜状またはホローファイバー状など任意の形状を選ぶことができる。
粒子状の担体を用いる場合において、血漿分離方式で使用する場合、その平均粒径は、約５μｍ〜２０００μｍが好ましく、より好ましくは約２０〜１０００μｍ、さらに好ましくは約３０〜８００μｍである。また直接血液還流方式で使用する場合は、下限平均粒径が８０μｍ未満では直接血液灌流が困難になる場合が生じる。そこでその平均粒径は８０μｍ以上２０００μｍ以下が好ましく、安定した直接血液灌流の実施および吸着性能面から１００μｍ以上１０００μｍ以下がより好ましい。特に好ましくは１２０μｍ以上８００μｍ以下である。【００１８】
直接血液灌流を安定的に行い、かつ必要以上に血球を活性化させないという意味からも、粒子の平均粒径分布を限定することが望ましい。平均粒径分布は広すぎると血球の付着や活性化などを誘発し、分布が狭いと乱流などの物理的な要因による付着や活性化は抑制される傾向を示す。そこで本発明では８０容量％以上の粒子の粒径が平均粒径の±７５％以内に分布していることが好ましく、さらに該吸着器自体による血球の活性化やそれに基づく付着を抑制し、安定した直接血液灌流を実施するためには、±５０％以内に分布していることがより好ましい。特に好ましくは±３０％以内に分布していることである。【００１９】
ここで言う平均粒径とは、粒子状の担体を光学顕微鏡などを用いて倍率を上げて撮影し、撮影画像中の粒子の直径を測定し、その直径の総和を、測定した粒子の全個数で割ることにより求めた値をいう。
また平均粒径分布は、測定した粒子の直径の標準偏差を計算し、平均±標準偏差で示した。【００２０】
撮影画像中の粒子の粒径を計測する手段としては、同様の倍率で撮影したスケールを用いて計測する方法、撮影画像中の粒子の直径をノギスなどにより計測した後に倍率で補正する方法、撮影画像を画像解析ソフト（Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  ｐｌｕｓ、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．製）などを用いて計測する方法などを用いることが出来る。また測定する粒子の個数は最低１００個以上が好ましい。【００２１】
本発明の吸着材は、例えば以下のようにして製造することができる。１種または２種以上の原料モノマー化合物を、適当な粘性の溶媒（例えば水）中に分散、懸濁させる。懸濁液を攪拌しつつ、公知方法によって懸濁重合させ、目的の吸着材を得る。【００２２】
さらに、本発明の吸着材は、活性炭からなるものであってもよい。
活性炭としては、例えば、フェノール系繊維状活性炭等の繊維状活性炭；ヤシ殻系活性炭、石油ピッチ系活性炭、ピート系活性炭、木炭系活性炭等の粒状活性炭等を使用することが出来る。
また、活性炭の平均粒径は特に限定されないが、約５μｍ〜２０００μｍが好ましく、より好ましくは約２０〜１０００μｍ、さらに好ましくは約３０〜８００μｍである。平均粒径は上述の方法で測定することができる。【００２３】
上記高分子化合物または活性炭からなる吸着材の成分のうち、リンパ球増殖率の点から、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、活性炭が好ましく、特にスチレン−ジビニルベンゼン共重合体が好ましい。【００２４】
次に、本発明の体液処理方法について説明する。
本発明の体液処理方法は、上述した水の接触角が４０°から９８°の範囲内にある高分子化合物を含む吸着材を、二価カチオンキレート剤の存在下で、体外循環法によって哺乳動物体液と接触させること、又は、上述した活性炭を含む吸着材を、体外循環法によって哺乳動物体液と接触させることにより、リンパ球増殖抑制状態を解除するための方法である。
本発明において体外循環方式を実施するにあたって、上記吸着材は、容器内に含まれていることが好ましい。上記容器については後述する。【００２５】
本発明のリンパ球増殖抑制状態を解除するための体液処理方法としては、具体的には、以下のような手順を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
（１）体液の流入口及び流出口を有し、体液は通過するが吸着材は通過しないフィルターを上記流出口に装着した容器に吸着材を充填し、この吸着デバイスを用いて、必要に応じて二価カチオンキレート剤の存在下で、体外循環方式にて体液処理を実施した後、処理された体液を患者に戻す方法。
（２）上記（１）の方法にて体液処理を実施し、処理された体液を患者に戻した後に、予め活性化させておいた自己リンパ球を患者体内に戻す方法。
（３）予め活性化させておいた自己リンパ球を患者体内に戻した後に、上記（１）の方法にて体液処理を実施し、処理された体液を患者に戻す方法。【００２６】
（１）の体外循環方法については、体液を体液移送ポンプ等により体外で循環させ一定時間吸着材と接触させる方法等がある。体外循環方法には、血球と血漿を、血漿分離膜などを使用して分離した後に、血漿を上記吸着デバイスにて処理し、これを血球成分と合わせて返血する血漿分離方式と、血漿と血球の分離を行わずに直接血液を還流する直接血液還流方式があるが、いずれの方式でも良い。
接触時間は、１５分間以上接触させることが好ましいが、吸着性能の面から約３０分から６時間の接触がより好ましい。十分な吸着性能と細胞処理効率の面から、より好ましくは約４５分間から４．５時間、さらに好ましくは約６０分間から３時間、接触させることが好ましい。【００２７】
本発明の体液処理方法において、吸着材として、水の接触角が４０°から９８°の範囲内にある高分子化合物を含む吸着材を用いる場合には、体液の抗凝固剤として二価カチオンキレート剤、又は、抗トロンビン活性を有する抗凝固剤を使用することができる。また、これらの抗凝固剤を併用することもできる。二価カチオンキレート剤を使用する場合、（１）の体外循環方式は、患者の体液が体外循環回路に入ってきた時に、当該体液に、二価カチオンキレート剤を、好ましい血中濃度になるように必要に応じて調整しながら持続的に注入することによって実施することができる。この後、オンラインで直接血液を吸着デバイス内に通血する、又は、血漿と血球を市販の血漿分離膜などにより分離した後に、血漿を吸着デバイスにて処理する方法が好ましい。
前記オンラインで直接血液を吸着デバイス内に通血する場合、抗凝固剤として二価カチオンキレート剤を単独で使用してもよいが、血液凝固系の活性化に伴うブラジキンの発生などを抑制するためには、二価カチオンキレート剤と抗トロンビン活性を有する抗凝固剤を併用することがより好ましい。【００２８】
吸着材として、活性炭を含む吸着材を用いる場合には、体液と吸着材の接触は、抗トロンビン活性を有する抗凝固剤の存在下で行うことが、通液性の観点から好ましい。またこの場合、２価カチオンキレート剤と抗トロンビン活性を有する抗凝固剤を併用してもよいし、２価カチオンキレート剤を単独で使用することもできる。
抗トロンビン活性を有する抗凝固剤の体液への注入方法としては、体外循環方式において、患者の体液が体外循環回路に入ってきた時に、体液の先端部に上記抗凝固剤をワンショットする方法や、体液処理の前に予め、患者に上記抗凝固剤を注入しておき、当該患者から上記抗凝固剤を含む体液を採取し、これを用いて上記の体液処理を行う方法等が挙げられる。
なお、二価カチオンキレート剤及び抗トロンビン活性を有する抗凝固剤の注入位置は、吸着デバイスの上流が好ましい。【００２９】
本発明で使用する二価カチオンキレート剤としては特に限定されないが、例えば、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）−２ナトリウム、ＥＤＴＡ−２カリウム、ＥＤＴＡ−３カリウム、シュウ酸アンモニウム、シュウ酸カリウム、クエン酸、クエン酸一ナトリウム、クエン酸二ナトリウム、クエン酸三ナトリウムなどが挙げられる。好ましくはクエン酸塩であり、クエン酸塩溶液を用いるのがより好ましい。ここで言うところのクエン酸塩溶液は、クエン酸、クエン酸一ナトリウム、クエン酸二ナトリウム、クエン酸三ナトリウムなどを少なくとも１種類以上含有する溶液を意味する。また、上記成分を少なくとも１種類以上含有する二価カチオンキレート剤溶液が好ましく、より好ましくは、市販されている二価カチオンキレート剤溶液であるＣＰＤ液、ＡＣＤ−Ａ液、ＡＣＤ−Ｂ液、ＭＡＰ液などである。【００３０】
本発明で使用する抗トロンビン活性を有する抗凝固剤としては特に限定されないが、例えば、メシル酸ナファモスタット、アルガトロバン、ヘパリン、低分子量ヘパリンなどが挙げられる。好ましくはヘパリン、低分子量ヘパリンである。【００３１】
本発明において、二価カチオンキレート剤の使用量は、二価カチオンキレート剤溶液（例えば、ＡＣＤ−Ａ液、ＡＣＤ−Ｂ液などのクエン酸溶液）と体液の比率（体積比）として、１：１０以上１：８０以下が好ましい。より好ましくは１：１５〜１：７０で、さらに好ましくは１：２０〜１：６０である。二価カチオンキレート剤は、添加量が多いと血中のイオン化カルシウムを大量にキレートしてしまうことによる、唇や手足のしびれ、吐気などのテタニー症状を引き起こす恐れがある。一方で添加量が少な過ぎると吸着体への血小板の粘着などが多くなり、通血に支障をきたす可能性がある。【００３２】
本発明において、抗トロンビン活性を有する抗凝固剤を使用する場合、抗トロンビン作用を有する抗凝固剤（例えばヘパリン、低分子量ヘパリンなど）の体液中濃度が０．０１ＩＵ／ｍｌから１．５ＩＵ／ｍｌとなる量で使用するのが好ましい。より好ましくは０．０５ＩＵ／ｍｌから１．０ＩＵ／ｍｌであり、さらに好ましくは０．１ＩＵ／ｍｌ〜１．０ＩＵ／ｍｌであり、特に好ましくは０．２ＩＵ／ｍｌ〜１．０ＩＵ／ｍｌである。抗トロンビン作用を有する抗凝固剤は、添加量が多すぎると止血し難くなり、添加量が少な過ぎると血液凝固し易くなる。【００３３】
抗トロンビン作用を有する抗凝剤剤は、血中濃度が低いために、持続注入しても良いが、一度に所定濃度になるようにワンショットしても良い。
二価カチオンキレート剤は、一度に血中濃度が所定濃度になるように注入すると、ショック症状を引き起こす恐れがあるため、体積比率が上記範囲になるように持続的に注入するのが好ましい。【００３４】
（２）上記（１）の体液処理に引き続き、予め活性化させておいた自己リンパ球を患者体内へ戻す場合、体外循環終了後１週間以内に、活性化リンパ球を戻すことが好ましい。リンパ球増殖抑制物質の血中濃度が上昇する前に行うことが望ましいことから、より好ましくは３日以内、さらに好ましくは１日以内に実施することが好ましい。なおリンパ球を活性化させるためには、汎用的に用いられている抗体等、例えば抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）、ＣＤ２８等を用いることができる。【００３５】
（３）は、予め薬剤などでリンパ球に活性化刺激を与える、または生体外で活性化、増殖させておいた自己リンパ球を患者体内へ戻した後に、上記吸着デバイスをもちいて体外循環を行い、リンパ球増殖抑制状態を解除する方法である。リンパ球活性化刺激後、上記吸着デバイスにて体外循環を行うまでの時間は、１週間以内が好ましく、より好ましくは３日以内であり、さらに好ましくは１日以内である。【００３６】
本発明の体液処理方法はこれらに限定されるものではないが、上記（１）、（２）の方法が体外循環におけるリンパ球増殖抑制状態を解除する方法として好ましく、（２）の方法が治療効果が高い疾患の処置方法として最も好ましい。【００３７】
なお、前述したように、リンパ球増殖が抑制されるためには未知のメカニズムがあり得る。また、該メカニズムには、未知の「リンパ球増殖抑制性因子」の関与があり得る。したがって、本発明の体液処理方法は、リンパ球増殖抑制性因子の吸着除去方法として機能し得る。【００３８】
次に、本発明の体外循環用システムについて説明する。
本発明の体外循環用システムは、体液移送ポンプと、抗凝固剤注入用ポンプと、上述した水の接触角が４０°から９８°の範囲内にある高分子化合物を含む吸着材を容器内に含んでなるデバイスとを備えるものであるか、又は、体液移送ポンプと、上述した活性炭を含む吸着材を容器内に含んでなるデバイスとを備えるものである。本システムは、体外循環において哺乳動物体液のリンパ球増殖抑制状態を解除するために用いることができ、具体的には、上記の本発明の体液処理方法を実施するのに用いることができる。【００３９】
吸着デバイスに用いる容器の形態、大きさ、材質には特に限定はない。
形態は、球、コンテナ、バッグ、チューブ、カラム等、任意の形態であってよい。好ましい具体例としては、例えば、容量約０．１〜４００ｍｌ程度、直径約０．１〜１０ｃｍ程度の透明または半透明の筒状容器等が挙げられる。【００４０】
容器は、任意の構造材料を使用して作成することができる。構造材料としては、具体的には、非反応性ポリマー、生物親和性金属、合金、ガラス等が挙げられる。
非反応性ポリマーとしては、アクリロニトリルブタジエンスチレンターポリマー等のアクリロニトリルポリマー；ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、テトラフルオロエチレンとヘキサフルオロプロピレンのコポリマー、ポリ塩化ビニル等のハロゲン化ポリマー；ポリアミド、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリドアクリルコポリマー、ポリカーボネートアクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリスチレン、ポリメチルペンテン等が挙げられる。
容器の材料として有用な金属材料は、ステンレス鋼、チタン、白金、タンタル、金、およびそれらの合金、並びに金メッキ合金鉄、白金メッキ合金鉄、コバルトクロミウム合金、窒化チタン被覆ステンレス鋼等が挙げられる。
特に好ましくは耐滅菌性を有する素材であるが、具体的には、シリコンコートされたガラス、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリメチルペンテン等が挙げられる。【００４１】
上記容器は、体液の流入口及び流出口を有しており、当該流出口に、体液及び体液に含まれる成分は通過するが吸着材は通過しないフィルターを装着したものが好ましい。吸着材は、上記容器に充填される。
吸着材として、水の接触角が４０°から９８°の範囲内にある高分子化合物を含む吸着材を用いる場合の本発明の体外循環システムは、このような吸着デバイスのほかに、患者の体液を当該吸着デバイスに移送するための体液移送ポンプと、二価カチオンキレート剤及び必要に応じて、抗トロンビン活性を有する抗凝固剤を体液中に注入するための抗凝固剤注入用ポンプとを備える。
吸着材として、活性炭を含む吸着材を用いる場合の本発明の体外循環システムは、上記吸着デバイスのほかに、患者の体液を当該吸着デバイスに移送するための体液移送ポンプを備える。さらに、二価カチオンキレート剤及び／又は抗トロンビン活性を有する抗凝固剤を体液中に注入するための抗凝固剤注入用ポンプを備えることが好ましい。【００４２】
二価カチオンキレート剤及び抗トロンビン活性を有する抗凝固剤の注入位置は吸着デバイスの上流にあることが望ましいことから、抗凝固剤注入用ポンプは、吸着デバイスの上流に連結して備わっていることが好ましい。抗凝固剤注入位置は、血液の凝固を抑制するために脱血ラインの脱血口により近い位置が好ましい。
また二価カチオンキレート剤と、抗トロンビン活性を有する抗凝固剤（例えば、ヘパリン）を併用する場合は、二価カチオンキレート剤を注入するための抗凝固剤注入用ポンプと、抗トロンビン活性を有する抗凝固剤を注入するための抗凝固剤注入用ポンプは、近い位置にあることが好ましいが、どちらかが上流にあってもよい。
また、血液を患者に返血する際には、体温の低下を防止するために、血液を加温する加温装置を通過させた後に返血してもよい。【００４３】
本発明の体外循環システムが血漿分離方式への使用を目的とした場合には、さらに、血漿分離膜を備えることが好ましい。血漿分離方式においては、血液から血漿と血球を分離した後、血漿を吸着デバイスに通液することが好ましいので、上記血漿分離膜は、吸着デバイスの上流に連結して備わっていることが好ましい。【００４４】
本発明の体外循環システムにおいては、オンラインで直接血液灌流を実施する、又は、血漿と血球を市販の血漿分離膜などにより分離した後に、血漿を該体液処理デバイスにて処理するため、吸着材の圧密化が生じると、充分な体液流量が得られなくなり、治療時間の延長さらに治療続行不可能となりうるので、吸着材は、圧密化を防ぐために、充分な機械的強度を有するもの（硬質）であることが好ましい。
ここでいう硬質とは、デキストラン、アガロース、アクリルアミド等の軟質な担体に比較し、溶媒による膨潤が少なく、また圧力により変形し難い担体のことをいう。硬質な担体と軟質な担体とは次の方法により区別することができる。すなわち担体を円筒状カラムに均一に充填し、水性液体を流した際の圧力損失と流量の関係が、硬質担体ではほぼ直線となるのに対し、軟質な担体では圧力がある点を越えると担体が変形し圧密化して流量が増加しなくなる。本発明では、少なくとも０．３Ｋｇ／ｃｍ２まで上記直線関係にあるものを硬質と称する。【００４５】
本明細書において、哺乳動物としては、ヒトのほか、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタなどの家畜等、ヒト以外の哺乳動物も含まれる。
本明細書において、体液としては、血液、血漿を含む。加えて、体液は、その他の体液、例えば腹水、リンパ液、関節内液およびこれらから得られた画分成分、ならびにその他の生体由来の液性成分も含むものである。【００４６】
本明細書において、リンパ球は、哺乳類末梢血中、リンパ管中、骨髄中に存在するＴ細胞、Ｂ細胞等をいう。また、当該リンパ球は、Ｔ細胞でもＢ細胞でもない、例えばナチュラルキラー細胞等も含む。Ｔ細胞は、特に限定されないが、ヘルパーＴ細胞、細胞障害性Ｔ細胞、キラーＴ細胞を含む。【００４７】
本発明でいうリンパ球増殖不良とは、患者体液をリンパ球培養系に添加した時のリンパ球増殖率が、健常人体液を使用して求めたリンパ球増殖率以下である場合を指す。また、リンパ球増殖率とは、吸着材で処理した患者体液、あるいは吸着材未処理の健常人体液を、培養液中に０．１％（Ｖ／Ｖ）〜２０％（Ｖ／Ｖ）添加した培養液を用いて、リンパ球を３７℃で１週間培養した時の増殖率（７日後の細胞数／播種細胞数）をいう。
【発明の効果】
【００４８】
本発明により、リンパ球を体外で活性化させた後に体内にもどすことにより治療効果がある疾患（例えば、癌、感染症、免疫疾患など）に罹患する対象、例えばリンパ球増殖不良癌対象の、体液中からリンパ球の増殖に必要な因子を吸着せずに、リンパ球増殖抑制因子を体外循環にて吸着除去することにより、リンパ球増殖抑制状態を解除し、リンパ球の増殖率を大幅に上昇させることが可能となった。また該体液処理方法は血漿分離方式、あるいは直接血液還流方式などで、血球のロスを最低限におさえ、安定した体外循環処理の実施が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００５０】
なお、下記実施例等において、水の接触角、排除限界分子量、平均粒径は以下のようにして測定した。
（１）水の接触角
高分子化合物の試料を、高圧で圧縮して平滑なフィルムを作製した。得られた平滑な平板試片を、水平に置き、その上へ微量注射器を用いて水滴を作った。水滴の大きさは、接触径が約１〜２ｍｍになるようにした。水滴を、固体表面に対して前進させるときに形成される角度を、測角器のついた読みとり顕微鏡（倍率２０倍程度）を用いて、室温（２０℃）で測定した。【００５１】
（２）排除限界分子量
粒子径の異なるポリスチレンビーズを、吸着材が充填されたカラムに流し、流出してきたポリスチレンビーズの流出曲線により、孔のサイズを求めた。次に、直径と分子量がわかっている球状蛋白質のデキストランへ、上記孔のサイズを外挿することにより、デキストラン換算の分子量を求め、排除限界分子量とした。【００５２】
（３）平均粒径
湿潤状態で、吸着材をシャーレに展開し、ＣＣＤカメラにて数十粒／一視野を撮影し、粒子数の合計が１００個以上になるように計測して求めた。次に、取り込んだ画像を、粒径測定ソフト（Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  ｐｌｕｓ、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．製）を用いて、平均粒径を算出した。【００５３】
（実施例１）
（１）リンパ球の調製
翼付静注針を健常人上腕部に穿刺した後、リンパ球分離用チューブ（バクティナーチューブ（ベクトンディッキンソン製））に血液を約７．５ｍｌ採取した。採血後、バクティナーチューブを速やかに３０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、室温にて遠心分離した。リンパ球層を回収し、生理食塩液を４０ｍｌ加え、１５００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃で遠心分離した。本操作を数回繰り返すことにより、リンパ球の洗浄を行い、ＫＢＭ４００培地（コージンバイオ製）に再懸濁し、所定濃度のリンパ球懸濁液を調製した。【００５４】
（２）ＯＫＴ３固相化プレートの調製
ＯＫＴ３（大日本製薬製）を生理食塩液にて５μｇ／ｍｌの濃度に調製し、２４穴ポリスチレンマイクロプレート（住友ベークライト製）に５００μｌずつ注入した。室温で約２時間静置した後に、ＯＫＴ３溶液を除去し、等量の生理食塩液で２回洗浄を行うことにより、ＯＫＴ３固相化プレートを調製した。【００５５】
（３）吸着材の調製
工業用ジビニルベンゼン（ジビニルベンゼンの含有量５７％）１００重量部、トルエン１００重量部、イソアミルアルコール６０重量部、過酸化ベンゾイル（含有量７５％）１重量部からなるモノマー混合物を、水５７２重量部、塩化ナトリウム２３重量部、ポリビニルアルコール１重量部、亜硝酸ナトリウム０．０３重量部からなる水溶液に添加し、モノマー混合液の液滴が分散懸濁するよう撹拌を行いつつ、窒素雰囲気下、８０℃で５時間、重合を行った。生成した重合体粒子を濾過、水洗の後、溶媒、モノマー、開始剤等の残存物をアセトンで抽出除去し、再度水および熱水でよく洗浄して、平均粒子径が約４００μｍのスチレン−ジビニルベンゼン共重合体からなる粒状多孔質体を得た（排除限界分子量が約８×１０４、水の接触角約８５°）。【００５６】
（４）血漿処理
該多孔質体を生理食塩液にて十分洗浄を行った後に、クライオチューブ内に０．１７ｍｌ計量した。該多孔質体中から生理食塩液を十分に除去し、ＡＣＤ−Ａ液：血漿の体積比率が１：２０で調製した癌患者血漿を１ｍｌ添加し、３７℃で２時間、ＭＩＸローター上で撹拌（４０ｒｐｍ）しながらインキュベートした。【００５７】
（５）リンパ球の培養
上記方法にて処理を行った血漿を、リンパ球培養液ＫＢＭ４００（コージンバイオ製）に９％（Ｖ／Ｖ）になるように添加した。該培養液を用い、リンパ球数が１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように調製し、先に調製したＯＫＴ３固相化プレートに４４４μｌ／ｗｅｌｌづつ播種した（ｎ＝３穴）。培養７日目にリンパ球を回収し、血球計算盤にて細胞数をカウントし、リンパ球増殖倍数を下式１）にて求め、その結果を表１に示した。
増殖倍数＝培養７日後のリンパ球数／播種時リンパ球数・・・１）
その結果、癌患者血漿を吸着材で処理した場合のリンパ球数は、播種時細胞数の１６．７倍（増殖倍数）まで上昇した。【００５８】
（６）通血実験
得られた該多孔質体をヘパリン（ヘパリンナトリウム注射液、吉富製薬（株））加生理食塩水（ヘパリンの最終濃度が１Ｕ／ｍｌになるように調製）で洗浄を行い、ヘパリンの平衡化を行った。次に該多孔質体の脱泡を行った後、沈降体積で２．５ｍｌをミニカラム（ポリプロピレン製、内径１３ｍｍ、高さ１９ｍｍ、テルモ社製）に充填した。カラム入口側にポリ塩化ビニル製のチューブ（内径１ｍｍ、外径３ｍｍ、長さ７０ｃｍ）を装着し、またカラム出口側にも同様のポリ塩化ビニル製のチューブ（長さ３０ｃｍ）を装着した。血液は健常人より１８Ｇの注射針を用い注意深く採血した。抗凝固剤はＡＣＤ−Ａ液（クエン酸ナトリウム；２．２０ｇ／ｄｌ、クエン酸；０．８０ｇ／ｄｌ、デキストロース；２．２０ｇ／ｄｌの組成の溶液）：血液＝１：２０（体積比）、及びヘパリンを最終濃度で０．５ＩＵ／ｍｌになるように添加した。抗凝固剤を添加した血液は、テフロン（登録商標）製三角フラスコ内（内容量５０ｍｌ、サンワ（株））に３０ｍｌ入れ、３７℃の恒温槽内にてスターラーチップにて低速で回転させ、流速２．９ｍｌ／ｍｉｎ（線速２．６ｃｍ／ｍｉｎ）で通血実験を開始した。カラム出口側から血液が出てきた時点を開始時点として、出口側チューブの先端を血液プールに戻し、灌流実験を１２０分間行った。血球数を測定するためのサンプリングは、開始後３０分、６０分、１２０分後に実施した。【００５９】
（７）血球数の測定
所定時間後（３０分、６０分、１２０分）にカラム入口及び出口側の血液を採取し、血液中の血球数（赤血球、白血球、血小板）を血球カウンター（Ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  ＣＣ−１８０  シスメックス（株））にて測定した。次に式（２）により各種細胞の通過率を求め、その結果を表２に示した。
通過率（％）＝カラム出口の血球数／カラム入口の血球数×１００・・・２）
その結果、赤血球、白血球の通過率は、約１００％であった。また血小板の通過率は、約９０％であった。【００６０】
（実施例２）
吸着材として平均粒径約５００μｍの石油ピッチ系活性炭（ＤＨＰ−１（商品名）、クラレ株式会社製）を用いた以外は、実施例１と同様の方法で、リンパ球増殖倍数を求めた。その結果、リンパ球数は、播種時細胞数の１０．６倍（増殖倍数）まで上昇した。血球の通過性に関しては、抗凝固剤をＡＣＤ−Ａ液からヘパリン（最終濃度で５ＩＵ／ｍｌ）に変えた他は、実施例１と同様の方法で評価した。その結果、赤血球の通過率は、約１００％であり、白血球に関しては約８０％、血小板については約６０％であった。【００６１】
（実施例３）
吸着材として、排除限界分子量が１×１０４以下、平均粒径約４００μｍのスチレン−ジビニルベンゼン共重合体からなる粒状多孔質体（水の接触角約８５°；工業用ジビニルベンゼンの使用量を１１５重量部に変更した以外は、実施例１と同様の方法で調製）を用いた以外は、実施例１と同様の方法で、リンパ球増殖倍数、および血球の通過率を求めた。その結果、リンパ球数は、播種時細胞数の１１．５倍（増殖倍数）まで上昇した。血球の通過率に関しては、赤血球、白血球が約１００％、血小板が８０％〜８５％であった。【００６２】
（実施例４）
吸着材の調製：
粘度約１０００ｃＰのセルロース溶液に、振動数約２００００Ｈｚの振動を直接加えながら、均一液滴として気相中に噴出させた。液滴が球形になる飛行距離以上飛行させた後に、凝固浴に捕捉し、脱溶剤し、洗浄することにより、平均粒径約４００μｍのセルロース多孔質体を得た（排除限界分子量３×１０４以下、水の接触角約５０°）。
吸着材として該多孔質体を用いた以外は実施例１と同様の方法で、リンパ球増殖倍数および血球の通過率を求めた。その結果、リンパ球数は、播種時細胞数の６．９倍（増殖倍数）まで上昇した。血球の通過率に関しては、赤血球が約１００％、白血球が約８０％、血小板が８０％〜９０％であった。【００６３】
（実施例５）
吸着材として、排除限界分子量が６×１０４以下、平均粒径約４００μｍのセルロース多孔質体（水の接触角約４０°；セルロース溶液を、特開昭６３−１１７０３９号公報に記載された方法（振動法）により液滴化し、凝固浴での捕捉によって凝固させることにより作製）を用いた以外は、実施例１と同様の方法で、リンパ球増殖倍数および血球の通過率を求めた。その結果、リンパ球数は、播種時細胞数の５．７倍（増殖倍数）まで上昇した。血球の通過率に関しては、赤血球が約１００％、白血球が７０％〜８０％、血小板が８５％〜９５％であった。【００６４】
（比較例１）
吸着材と接触させていない患者血漿を使用した以外は、実施例１と同様の方法で、リンパ球増殖倍数を求めた。また吸着材の入っていない、空カラムを用いた以外は実施例１と同様の方法にて血球の通過率を求めた。その結果を、リンパ球数は、播種時細胞数の３．９倍（増殖倍数）であった。血球の通過率に関しては、赤血球、白血球ともに約１００％、血小板が９５％〜１００％であった。【００６５】
（比較例２）
実施例４で使用した多孔質体に、デキストラン硫酸をエピクロルヒドリンにて結合した（排除限界分子量３×１０４以下、水の接触角約３５°）以外は、実施例１と同様の方法で、リンパ球増殖倍数および血球の通過率を求めた。その結果、リンパ球数は、播種時細胞数の３．６倍（増殖倍数）であった。血球の通過率に関しては、赤血球が約１００％、白血球が８０％〜９５％、血小板が８０％〜９０％であった。【００６６】
（比較例３）
実施例５で使用した多孔質体に、デキストラン硫酸をエピクロルヒドリンにて結合した（排除限界分子量３×１０４以下、水の接触角約３０°）以外は、実施例１と同様の方法で、リンパ球増殖倍数および血球の通過率を求めた。その結果、リンパ球数は、播種時細胞数の３．２倍（増殖倍数）であった。血球の通過率に関しては、赤血球が約１００％、白血球が８０％〜９０％、血小板が８０％〜８５％であった。【００６７】
なお、実施例１〜５、比較例１〜３のリンパ球増殖倍数を評価した結果を表１に、また血球の通過率を評価した結果を表２に示した。この結果より、本発明の特定の吸着材に体液を接触させることにより、リンパ球の増殖率を大幅に上昇でき、また直接血液還流を行っても、赤血球、白血球、血小板などの血球のロスはほとんどなく、高い通血性能を有していることがわかる。【００６８】
【表１】
2006106763.tif 000002
【００６９】
【表２】
2006106763.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明により、リンパ球を体外で活性化させた後に体内にもどすことにより治療効果がある疾患に罹患する対象、例えばリンパ球増殖不良癌対象の、体液中からリンパ球の増殖に必要な因子を吸着せずに、リンパ球増殖抑制因子を吸着し、リンパ球培養におけるリンパ球増殖が抑制されるのを解除し、リンパ球の増殖率を大幅に上昇させることが可能となった。本発明は、血液中の免疫担当細胞（特にリンパ球）を体外に取り出して培養し、これを刺激・活性化して増殖したものを再び体内にもどすことにより、疾患の処置または進行を抑制する、例えば活性化自己リンパ球療法において、対象体液についてリンパ球培養におけるリンパ球増殖が抑制されるのを解除するための吸着材、ならびにこの吸着材を利用したリンパ球増殖方法として有用である。
【国際調査報告】
2006106763.tif 000004
2006106763.tif 000005
2006106763.tif 000006
2006106763.tif 000007