(57)【要約】（１）６．２Ｍより大きい亜硫酸濃度を有する亜硫酸塩組成物、（２）（１）の亜硫酸塩組成物を用いるＤＮＡの脱アミノ化方法、（３）（１）の亜硫酸塩組成物を用いるメチル化ＤＮＡの検出方法、及び（４）（１）の亜硫酸塩組成物を含んでなるＤＮＡの脱アミノ化用又はメチル化ＤＮＡの検出用キット。【特許請求の範囲】
【請求項１】
６．２Ｍより大きい亜硫酸濃度を有する亜硫酸塩組成物。
【請求項２】
６．２Ｍより大きく１０Ｍ以下の亜硫酸濃度を有する請求項１記載の亜硫酸塩組成物。
【請求項３】
ｐＨが５．０から５．６である請求項１に記載の亜硫酸塩組成物。
【請求項４】
２種以上の亜硫酸塩を含有する請求項１に記載の亜硫酸塩組成物。
【請求項５】
亜硫酸のアンモニウム塩及びナトリウム塩からなる群から選ばれる２種以上の亜硫酸塩を含有する請求項１に記載の亜硫酸塩組成物。
【請求項６】
亜硫酸アンモニウム、亜硫酸水素アンモニウム及び亜硫酸水素ナトリウムを含有する請求項１に記載の亜硫酸塩組成物。
【請求項７】
下記工程を有するＤＮＡの脱アミノ化方法：
（１）１本鎖ＤＮＡを含有する試料を、６．２Ｍより大きい亜硫酸濃度を有する亜硫酸塩組成物で処理する工程、
（２）（１）で処理した試料をアルカリで処理する工程。
【請求項８】
工程（１）の前に下記工程（０）を有する請求項７に記載のＤＮＡの脱アミノ化方法：
（０）試料中の二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性する工程。
【請求項９】
工程（１）におけるＤＮＡがシトシンを含んでなるＤＮＡである、請求項７に記載のＤＮＡの脱アミノ化方法。
【請求項１０】
工程（１）における亜硫酸塩組成物が、６．２Ｍより大きく１０Ｍ以下の亜硫酸濃度を有する亜硫酸組成物である請求項７に記載のＤＮＡの脱アミノ化方法。
【請求項１１】
工程（１）が、ｐＨの範囲が５〜５．６程度で処理する工程である請求項７に記載のＤＮＡの脱アミノ化方法。
【請求項１２】
工程（１）が、６０〜９５℃程度の温度で、５〜６０分程度処理する工程である請求項７に記載のＤＮＡの脱アミノ化方法。
【請求項１３】
以下の工程を有するメチル化ＤＮＡの検出方法：
（ａ）１本鎖ＤＮＡを含有する試料を、６．２Ｍより大きい亜硫酸濃度を有する亜硫酸塩組成物で処理した後、アルカリ処理して、脱アミノ化処理する工程、
（ｂ）（ａ）で得られた試料中のメチル化ＤＮＡを検出する工程。
【請求項１４】
工程（ａ）におけるＤＮＡがシトシンを含んでなるＤＮＡであり、工程（ｂ）が（ａ）で得られた試料中のメチル化シトシンを検出する工程である請求項１３に記載のメチル化ＤＮＡの検出方法。
【請求項１５】
工程（ｂ）が、塩基配列決定、ＤＮＡチップまたは制限酵素のいずれかを用いて試料中のメチル化シトシンを検出する工程である、請求項１４に記載のメチル化ＤＮＡの検出方法。
【請求項１６】
工程（ｂ）が、ＤＮＡのシトシンがウラシルに変換された場合に核酸増幅できる少なくとも１つのプライマー、及びシトシンがウラシルに変換されない場合に核酸増幅できる少なくとも１つのプライマーを用いて、試料中のＤＮＡを増幅させ、増幅の有無により、５−メチルシトシンとウラシルの存在位置を同定する手段によりメチル化シトシンを検出する工程である請求項１４記載のメチル化ＤＮＡの検出方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の亜硫酸塩組成物を含んでなるＤＮＡの脱アミノ化用キット。
【請求項１８】
請求項１に記載の亜硫酸塩組成物を含んでなるメチル化ＤＮＡの検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ＤＮＡの脱アミノ化用組成物及びＤＮＡの脱アミノ化方法に関する。更に、試料中のメチル化ＤＮＡの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  ゲノムＤＮＡのメチル化は真核生物における遺伝子の発現を制御することが知られている。このため、メチル化ＤＮＡの検出により、重要な遺伝情報が得られ得る。【０００３】  中でも、５−メチルシトシンは、真核生物のゲノムにおいて存在する唯一の生理的修飾塩基であり、ＤＮＡメチル化の異常により遺伝性疾患やがんが起こることも知られている。従って、ゲノム中の特定塩基配列のシトシンのメチル化状態の検出は、特に重要である。【０００４】  しかし、５−メチルシトシンは、シトシンと同じくグアニンと相補的塩基対を形成するため、そのままでは配列決定やＰＣＲにより検出することは極めて困難である。【０００５】  この問題を解決する手段としてもっとも良く使われる方法は、ゲノムＤＮＡと亜硫酸塩とを反応させ、シトシンを脱アミノ化し、その後のアルカリ加水分解によりウラシルに変化させる方法である。５−メチルシトシンはこの試薬との反応性が非常に低い（例えば、Ｈａｙａｔｓｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ．９、ｐ．２８５８−２８６５（１９７０）を参照）。したがってこのような処理を行ったのちに塩基配列決定を行うと、シトシンはチミンと判断され、５−メチルシトシンの位置だけがシトシンと判定されるため、５−メチルシトシンの位置の同定が可能となる（例えば、Ｆｏｒｍｍｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、Ｖｏｌ．８９、ｐ．１８２７−１８３１（１９９２）参照）。【０００６】  ここで、ＤＮＡと亜硫酸塩との反応条件は、４．９Ｍの亜硫酸水素ナトリウム溶液（ｐＨ５）中で、５０℃、１２時間から１６時間とすることが一般的である（例えば、Ｅａｄｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２００、ｐ．７１−８５（２００２）参照）。しかし、このような長時間の反応は、メチル化シトシンの検出が迅速に行えない原因の１つとなっていた。【０００７】  一方、近年ライフサイエンス関連産業やバイオ関連産業の発展に伴い、ＤＮＡに関する大量の情報処理や遺伝情報の迅速な取得が要請されるようになってきている。【０００８】  従って、ＤＮＡの脱アミノ化を迅速に行い、メチル化ＤＮＡの検出を迅速に行う方法の開発が望まれていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】  本発明の主な課題は、ＤＮＡの脱アミノ化反応を迅速に行い、試料中のメチル化ＤＮＡを短時間で検出する方法を提供することである。より詳細には、シトシンの脱アミノ化反応を迅速に行い、試料中のメチル化シトシンを短時間で検出する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】  本発明者らは上記課題を解決するため、鋭意研究した結果、ＤＮＡを高い亜硫酸濃度の亜硫酸塩溶液と反応させることにより、極めて短時間でシトシンの脱アミノ化反応が進むことを見出し、更に検討を重ねて、本発明を完成するに到った。【００１１】  即ち、本発明は、以下の、亜硫酸塩組成物、ＤＮＡの脱アミノ化方法、メチル化ＤＮＡの検出方法、並びにＤＮＡの脱アミノ化用又はメチル化ＤＮＡの検出用キットに関する。【００１２】  項１：６．２Ｍより大きい亜硫酸濃度を有する亜硫酸塩組成物。【００１３】  更に詳細には、６．２Ｍより大きい亜硫酸濃度を有するＤＮＡの脱アミノ化用又はメチル化ＤＮＡの検出用亜硫酸塩組成物である。別言すると、ＤＮＡの脱アミノ化のため又はメチル化ＤＮＡの検出のための、６．２Ｍより大きい亜硫酸濃度を有する亜硫酸塩組成物の使用に関する発明である。【００１４】  項２：６．２Ｍより大きく１０Ｍ以下である亜硫酸濃度を有する項１記載の亜硫酸塩組成物。【００１５】  項３：ｐＨが５．０から５．６である項１又は２に記載の亜硫酸塩組成物。【００１６】  項４：２種以上の亜硫酸塩を含有する項１〜３のいずれかに記載の亜硫酸塩組成物。【００１７】  項５：亜硫酸のアンモニウム塩及びナトリウム塩からなる群から選ばれる２種以上の亜硫酸塩を含有する項１〜４のいずれかに記載の亜硫酸塩組成物。【００１８】  項６：亜硫酸アンモニウム、亜硫酸水素アンモニウム及び亜硫酸水素ナトリウムを含有する項１〜５のいずれかに記載の亜硫酸塩組成物。【００１９】  項７：下記工程を有するＤＮＡの脱アミノ化方法：
（１）１本鎖ＤＮＡを含有する試料を、６．２Ｍより大きい亜硫酸濃度を有する亜硫酸塩組成物で処理する工程、
（２）（１）で処理した試料をアルカリ処理する工程。
より詳細には、工程（１）における亜硫酸塩組成物は、項１〜６のいずれかに記載の亜硫酸塩組成物である。【００２０】  項８：工程（１）の前に下記工程（０）を有する項７に記載のＤＮＡの脱アミノ化方法：
（０）試料中の二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性する工程。【００２１】  項９：工程（１）におけるＤＮＡがシトシンを含んでなるＤＮＡである、項７〜８のいずれかに記載のＤＮＡの脱アミノ化方法。【００２２】  項１０：工程（１）における亜硫酸塩組成物が、６．２Ｍより大きく１０Ｍ以下の亜硫酸濃度を有する亜硫酸組成物である項７〜９のいずれかに記載のＤＮＡの脱アミノ化方法。【００２３】  項１１：工程（１）が、ｐＨの範囲が５〜５．６程度で処理する工程である、項７〜１０のいずれかに記載のＤＮＡの脱アミノ化方法。【００２４】  項１２：工程（１）が、６０〜９５℃程度の温度で、５〜６０分程度処理する工程である項７〜１１のいずれかに記載のＤＮＡの脱アミノ化方法。【００２５】  好ましくは、工程（１）が、７０〜９０℃程度の温度で、５〜６０分程度処理する工程である項７〜１１のいずれかに記載のＤＮＡの脱アミノ化方法である。【００２６】  項１３：以下の工程を有するメチル化ＤＮＡの検出方法：
（ａ）１本鎖ＤＮＡを含有する試料を、６．２Ｍより大きい亜硫酸濃度を有する亜硫酸塩組成物で処理した後、アルカリ処理して、脱アミノ化処理する工程、
（ｂ）（ａ）で得られた試料中のメチル化ＤＮＡを検出する工程。【００２７】  より詳細には、工程（ａ）は、項７〜１２のいずれかに記載の方法で脱アミノ化処理する工程である。【００２８】  項１４：工程（ａ）におけるＤＮＡがシトシンを含んでなるＤＮＡであり、工程（ｂ）が（ａ）で得られた試料中のメチル化シトシンを検出する工程である項１３に記載のメチル化ＤＮＡの検出方法。【００２９】  項１５：工程（ｂ）が、塩基配列決定、ＤＮＡチップまたは制限酵素のいずれかの手段を用いて、試料中のメチル化シトシンを検出する工程である、項１４に記載のメチル化ＤＮＡの検出方法。【００３０】  より詳細には、工程（ｂ）は、（ｉ）試料中のＤＮＡをＰＣＲにて増幅後、塩基配列決定によりシトシンとチミンの存在位置を同定する手段、（ｉｉ）試料中のＤＮＡをＰＣＲにて増幅後、シトシンがチミンに変化した場合にＤＮＡにハイブリダイゼーションするプローブと、シトシンがチミンに変化しない場合にハイブリダイゼーションするプローブを固定化したＤＮＡチップを用いて、シトシンとチミンを同定する手段、または、（ｉｉｉ）試料中のＤＮＡをＰＣＲにて増幅後、シトシンがチミンに変化することにより、ＤＮＡを切断する制限酵素及び／又は切断しなくなる制限酵素を用いて、ＤＮＡの切断の有無により、シトシンとチミンを判定する手段のいずれかを用いて、試料中のメチル化シトシンを検出する工程である。【００３１】  項１６：工程（ｂ）が、試料ＤＮＡ中のシトシンがウラシルに変換された場合に核酸増幅できる少なくとも１つのプライマー、及びシトシンがウラシルに変換されない場合に核酸増幅できる少なくとも１つのプライマーを用いて、試料中のＤＮＡを増幅させ、増幅の有無により、５−メチルシトシンとウラシルの存在位置を同定する手段によりメチル化シトシンを検出する工程である項１４に記載のメチル化ＤＮＡの検出方法。【００３２】  項１７：項１に記載の亜硫酸塩組成物を含んでなるＤＮＡの脱アミノ化用キット。【００３３】  より詳細には、項１〜６のいずれかに記載の亜硫酸塩組成物を含んでなるＤＮＡの脱アミノ化用キットである。【００３４】  好ましくは、更にＤＮＡの検出手段を含むキットである。又は、更にＤＮＡの増幅用プライマーを含むＤＮＡの脱アミノ化用キットである。【００３５】  項１８：項１に記載の亜硫酸塩組成物を含んでなるメチル化ＤＮＡの検出用キット。【００３６】  より詳細には、項１〜６のいずれかに記載の亜硫酸塩組成物を含んでなるメチル化ＤＮＡの検出用キットである。【００３７】  好ましくは、更にＤＮＡの検出手段を含むメチル化ＤＮＡの検出用キットである。又は、更にＤＮＡの増幅用プライマーを含むメチル化ＤＮＡの検出用キットである。【００３８】 発明を実施するための形態
以下、本発明を詳細に説明する。【００３９】 亜硫酸塩組成物
本発明の態様の一つは、高い亜硫酸濃度を示す亜硫酸塩組成物である。
本発明における亜硫酸には、化学式で表して、Ｈ２ＳＯ３，ＨＳＯ３−，ＳＯ３−などが含まれる。本発明の好ましい形態である酸性条件下では、ほとんどが重亜硫酸イオン（ＨＳＯ３−）として存在する。【００４０】  本発明の亜硫酸塩組成物における亜硫酸濃度は、６．２Ｍより大きく、好ましくは８Ｍ以上である。また、好ましくは１０Ｍ以下である。濃度が低すぎるとＤＮＡの脱アミノ化反応速度が低下する傾向がある。一方、濃度が高すぎると結晶が析出しやすい。【００４１】  本発明の亜硫酸塩組成物におけるｐＨは、ＤＮＡの脱アミノ化反応の最適ｐＨとほぼ同一であることが好ましい。従って、本発明の亜硫酸塩組成物におけるｐＨの範囲は、好ましくは４．０〜６．０程度、更に好ましくは５．０〜５．６程度である。【００４２】  よって、本発明の亜硫酸塩組成物の最も好ましい態様は、亜硫酸濃度が８Ｍ以上１０Ｍ以下であって、かつｐＨが５．０〜５．６の場合である。【００４３】  このような高い亜硫酸濃度の本発明の亜硫酸塩組成物は、２種以上の亜硫酸塩を含有していることが好ましい。【００４４】  亜硫酸塩の種類としては、亜硫酸のナトリウム塩、アンモニウム塩、カリウム塩などが挙げられる。【００４５】  具体的には、亜硫酸水素ナトリウム（ＮａＨＳＯ３）、亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）、亜硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ３）、亜硫酸水素アンモニウム（（ＮＨ４）ＨＳＯ３）、亜硫酸カリウム（Ｋ２ＳＯ３）などが挙げられる。【００４６】  中でも、溶解度及びｐＨの調製に関する理由により、亜硫酸ナトリウム塩及び亜硫酸アンモニウム塩からなる群から選ばれる２種以上の亜硫酸塩を組合せて用いることが好ましい。【００４７】  更には、亜硫酸水素アンモニウム、亜硫酸アンモニウム及び亜硫酸水素ナトリウムを組合せて用いることが好ましい。【００４８】  本発明の亜硫酸塩組成物の調製法は特に限定されないが、例えば、亜硫酸水素アンモニウム、亜硫酸アンモニウム及び亜硫酸水素ナトリウムの組合せの場合には、亜硫酸水素アンモニウム溶液に亜硫酸水素ナトリウム及び亜硫酸アンモニウムの粉末を添加し、５分から４０分程度、更に好ましくは１０〜２０分程度、５０〜９５℃、好ましくは７０〜９０℃で、加温することが好ましい。【００４９】  本発明の亜硫酸塩組成物は、ＤＮＡの脱アミノ化用又はメチル化ＤＮＡの検出用として好適に用いられる。【００５０】 ＤＮＡの脱アミノ化方法
本発明の態様の一つは、ＤＮＡの脱アミノ化方法である。【００５１】  本発明のＤＮＡの脱アミノ化方法は、（１）一本鎖ＤＮＡを含有する試料を、上記本発明の亜硫酸塩組成物で処理する工程、及び、（２）（１）で処理した試料をアルカリ処理する工程を有する。【００５２】  試料が二本鎖ＤＮＡを含有する場合は、更に、試料中の二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性する工程を、（１）の工程の前に含めてもよい。【００５３】  さらに、高分子ＤＮＡ、例えば、ゲノムＤＮＡを処理する場合には、変性する工程の前に、ＤＮＡを制限酵素で切断し、断片化する工程を適宜加えてもよい。【００５４】  二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性する方法としては、例えば、熱処理、アルカリ処理等があげられる。熱処理の条件は、特に限定されないが、例えば、９５〜１００℃程度で５分から１０分程度処理する。アルカリ処理の条件も特に限定されないが、例えば、０．２Ｎ以上のアルカリで、約３０℃〜４２℃で、２０分から６０分程度で処理する。このうち、約０．３Ｎの水酸化ナトリウムを用いて、３０〜３７℃程度で３０分程度処理する方法が好ましい。【００５５】  （１）の工程においては、６．２Ｍより大きく、好ましくは８Ｍ以上、また１０Ｍ以下である亜硫酸濃度を有する亜硫酸塩組成物を用いることが好ましい。濃度が低すぎると脱アミノ化反応速度が低下する。一方、濃度が高すぎると結晶が析出しやすくなる。【００５６】  また亜硫酸塩組成物による試料の処理は、５．０〜５．６程度のｐＨの範囲で行うことが好ましい。ｐＨが低すぎても、高すぎても脱アミノ化率が低下する。【００５７】  処理の温度は６０〜９５℃程度、更に好ましくは７０℃から９０℃程度であることが好ましい。温度が低すぎると亜硫酸塩が析出し、反応が進みにくい。また温度が高すぎると、ＤＮＡの分解が急速に進行し、後の解析に支障がでる可能性がある。【００５８】  処理時間は、５分から６０分程度であることが好ましい。時間が短すぎると脱アミノ化が不充分になる。一方、長すぎるとＤＮＡの分解等、試料の損傷が起こりやすくなる。【００５９】  （１）の工程は、亜硫酸濃度が高いほど速く進行する傾向がある。そのため、（１）の工程の際は、試料と亜硫酸塩組成物以外の不要な溶液を入れることはできるだけ避けることが好ましい。【００６０】  （２）の工程におけるアルカリ処理は、核酸に結合した亜硫酸基が脱離できる処理であれば特に限定されない。例えば試料に水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア及び／又はトリス等を加えて、ｐＨ９．０以上にし、１０分から１２０分程度処理することがあげられる。中でも、試料に０．２Ｎ程度の水酸化ナトリウムを加えて、１０分程度処理することが好ましい。【００６１】  本発明の対象とする試料の種類は特に限定されず、血液、がん細胞、培養細胞等を含む各種細胞や組織に適用し得る。ＤＮＡの種類も限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ等に適用し得る。ＤＮＡの由来も特に限定されず、例えば、ヒト、マウスを含む各種動物、酵母、細菌等に適用し得る。【００６２】  本発明のＤＮＡの脱アミノ化方法は、特にシトシンを含んでなるＤＮＡの脱アミノ化に好適に用いられる。具体的には、（１）シトシンを含んでなる一本鎖ＤＮＡを含有する試料を、上記本発明の亜硫酸塩組成物で処理する工程、及び、（２）（１）で処理した試料をアルカリ処理して、シトシンをウラシルに変換する工程を有するＤＮＡの脱アミノ化方法として用い得る。【００６３】 メチル化ＤＮＡの検出方法
本発明の態様の一つは、メチル化ＤＮＡの検出方法である。【００６４】  本発明のメチル化ＤＮＡの検出方法は、以下の工程を有する。
（ａ）１本鎖ＤＮＡを含有する試料を、６．２Ｍより大きい亜硫酸濃度を有する亜硫酸塩組成物で処理した後、アルカリ処理して、脱アミノ化処理する工程、
（ｂ）（ａ）で得られた試料中のメチル化ＤＮＡを検出する工程。【００６５】  （ａ）の工程は、具体的には、上記本発明のＤＮＡの脱アミノ化方法に従って、ＤＮＡを脱アミノ化する工程である。亜硫酸塩組成物の亜硫酸濃度は、好ましくは、８Ｍ以上である。また、１０Ｍ以下であることが好ましい。また、亜硫酸組成物による処理は、ｐＨの範囲が５〜５．６程度で行うことが好ましい。また処理温度は、６０〜９５℃、更には、７０〜９０℃であることが好ましい。また処理時間は、１０〜６０分程度であることが好ましい。【００６６】  また、（ａ）の工程においては、更に、試料中の二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性する処理を行ってもよい。さらに、高分子ＤＮＡ、例えば、ゲノムＤＮＡを処理する場合には、変性する工程の前に、ＤＮＡを制限酵素で切断し、断片化する工程を適宜加えてもよい。【００６７】  本発明の検出方法は、メチル化ＤＮＡのうち、特にメチル化シトシンの検出に好適に用いられる。具体的には、（ａ）シトシンを含んでなる一本鎖ＤＮＡを含有する試料を、本発明の亜硫酸塩組成物で処理した後、アルカリ処理して、ＤＮＡを脱アミノ化し、ＤＮＡ中のシトシンをウラシルに変換する工程、（ｂ）（ａ）で処理した試料中のメチル化シトシンを検出する工程を有する方法として用い得る。
（ｂ）の工程において、メチル化シトシンの検出は、例えば、塩基配列決定、ＤＮＡチップまたは制限酵素を用いる手段により行うことができる。【００６８】  具体的に、塩基配列決定を用いる手段とは、（ｉ）試料中のＤＮＡをＰＣＲにて増幅後、塩基配列決定によりシトシンとチミンの存在位置を同定する手段である。ＤＮＡチップを用いる手段とは、（ｉｉ）試料中のＤＮＡをＰＣＲにて増幅後、シトシンがチミンに変化した場合にＤＮＡにハイブリダイゼーションするプローブと、シトシンがチミンに変化しない場合にハイブリダイゼーションするプローブを固定化したＤＮＡチップを用いて、シトシンとチミンを同定する手段である。また、制限酵素を用いる手段とは、（ｉｉｉ）試料中のＤＮＡをＰＣＲにて増幅後、シトシンがチミンに変化することにより、ＤＮＡを切断する制限酵素及び／又は切断しなくなる制限酵素を用いて、ＤＮＡの切断の有無により、シトシンとチミンを判定する手段である。【００６９】  また、（ｂ）の工程においては、（ｉｖ）試料ＤＮＡ中のシトシンがウラシルに変換された場合に核酸増幅できる少なくとも１つのプライマー、及びシトシンがウラシルに変換されない場合に核酸増幅できる少なくとも１つのプライマーをそれぞれ用いて該試料を増幅反応させ、増幅の有無により、シトシンとチミンを判定する手段を用いて、メチル化シトシンの検出を行ってもよい。【００７０】  いずれの手段においても、ＰＣＲのようなＤＮＡ増幅法を介する方法が好ましい。【００７１】 キット
本発明の態様の一つは、ＤＮＡの脱アミノ化用キット、又は、メチル化ＤＮＡの検出用キットである。【００７２】  本発明のキットは、上記本発明の亜硫酸塩組成物を含むことを特徴とする。【００７３】  本発明のキットには、更に、ＤＮＡの脱アミノ化、又はメチル化ＤＮＡの検出のための適当な検出手段や、ＤＮＡ精製手段、標識手段、試薬等を、適宜含めることができる。また、ＰＣＲ等に用い得るＤＮＡの増幅用プライマーを含めることもできる。【００７４】  検出手段としては、各種プライマー、プローブ、制限酵素、蛍光色素及び／又は各種媒体等が挙げられる。【００７５】  本発明のキットは、上記本発明のＤＮＡの脱アミノ化方法及びメチル化ＤＮＡの検出方法の実施に、特に好適に用いることができる。
【発明の効果】
【００７６】  本発明の高い亜硫酸濃度の亜硫酸塩組成物を用いることにより、ＤＮＡの脱アミノ化処理を短時間で行うことができる。【００７７】  従来は、ＤＮＡの脱アミノ化処理に１２〜１６時間程度の長時間を要し、メチル化ＤＮＡの検出を迅速に行うことが困難であった。しかし、本発明によれば、ＤＮＡの脱アミノ化を短時間で行うことができ、更にメチル化ＤＮＡの検出を迅速に行うことも可能になる。【００７８】  特に、本発明によって、シトシンからウラシルへの変換を短時間で行うことが可能になり、更にメチル化シトシンの検出を迅速に行うことが可能となる。【００７９】  本発明は、遺伝情報の取得やＤＮＡ関連技術の開発など種々の技術に利用できる。例えば、メチル化ＤＮＡの異常は、がんなどの種々の疾患と関連していることが報告されているが、本発明によるメチル化ＤＮＡの迅速な検出により、診断や遺伝子検査などが大幅に効率化される。また、メチル化ＤＮＡの研究ツールとしても、本発明は有用である。【００８０】  このように、本発明は、医療を含むライフサイエンス産業やバイオ関連産業の推進に大きく寄与するものである。
【図面の簡単な説明】
【００８１】［図１］図１は、亜硫酸塩組成物を用いて処理した試料における脱アミノ化率をシトシンの残存量で示した図面である。●は、２’−デオキシシチジンを９Ｍの亜硫酸水素ナトリウム−アンモニウム溶液を用いて７０℃で処理した場合を表す。◇は、２’−デオキシシチジンを５．３Ｍの亜硫酸水素ナトリウム溶液を用いて７０℃で処理した場合を表す。□は５−メチル−２’−デオキシシチジンを９Ｍの亜硫酸水素ナトリウム−アンモニウム溶液を用いて７０℃で処理した場合を表す。▲は５−メチル−２’−デオキシシチジンを９Ｍの亜硫酸水素ナトリウム−アンモニウム溶液を用いて９０℃で処理した場合を表す。
［図２］図２は、ＤＮＡの脱アミノ化反応のｐＨ依存性を示した図面である。
［図３］図３は、サケ睾丸ＤＮＡ試料をＨＰＬＣで分析した結果を示した図面である。図３ａは本発明の亜硫酸塩組成物で処理した試料、図３ｂは未処理の試料の分析結果である。図３中、Ｃは２’−デオキシシチジンを表す。Ｕは、２’−デオキシウリジンを表す。ｍＣは５−メチル−２’−デオキシシチジンを表す。Ｇは２’−デオキシグアノシンを表す。Ｔはチミジンを表す。Ａは２’−デオキシアデノシンを表す。
［図４］図４は、ＭＣＦ−７細胞におけるＣＤＨ１遺伝子の亜硫酸塩処理による解析に関する図面である。図４（Ａ）は増幅させたゲノム領域を示す。図４（Ｂ）は増幅させた領域の配列を示す。太文字はＣｐＧジヌクレオチドを示す。図４（Ｃ）は亜硫酸処理したゲノムＤＮＡを段階希釈した時のＰＣＲ増幅結果を示す。ａは従来法（３．６Ｍ亜硫酸濃度の亜硫酸塩組成物を用いて５５℃で２０時間）で処理したものである。ｂは本発明の亜硫酸塩組成物を用いて９０℃で２０分処理したものである。ｃは、本発明の亜硫酸塩組成物を用いて７０℃で４０分処理したものである。レーン１では５００ｎｇ、レーン２では５０ｎｇ、レーン３では５ｎｇ、レーン４では５００ｐｇ、レーン５では５０ｐｇのＤＮＡを鋳型として使用した。図４（Ｄ）はプラスミドクローンの塩基配列分析結果を示す。各列は個々のプラスミドクローンを示す。○及び●はそれぞれチミン及びシトシンを示す。ポジション２のドットサークルは、このポジションがＭＣＦ−７細胞ではヘテロ接合体であるためカウントしていない。矢印はＣｐＧヌクレオチドにおけるシトシンの位置を示す。
［図５］図５は、ＭＣＦ−７細胞におけるＲＡＳＳＦ１Ａ遺伝子の亜硫酸塩処理による解析に関する図面である。図５（Ａ）は増幅させたゲノム領域を示す。図５（Ｂ）は増幅させた領域の配列を示す。太文字はＣｐＧジヌクレオチドを示す。相補鎖を鋳型として使用したため、相補鎖のメチル化シトシンの位置はグアニン残基として示される。図５（Ｃ）は亜硫酸処理したゲノムＤＮＡを段階希釈した時のＰＣＲ増幅結果を示す。ａは従来法（３．６Ｍ亜硫酸濃度の亜硫酸塩組成物を用いて５５℃で２０時間）で処理したものである。ｂは本発明の亜硫酸塩組成物を用いて９０℃で２０分で処理したものである。ｃは、本発明の亜硫酸塩組成物を用いて、７０℃で４０分処理したものである。レーン１では５００ｎｇ、レーン２では５０ｎｇ、レーン３では５ｎｇ、レーン４では５００ｐｇ、レーン５では５０ｐｇのＤＮＡをテンプレートとして使用した。図５（Ｄ）はプラスミドクローンの塩基配列分析結果を示す。各列は個々のプラスミドクローンを示す。○及び●はそれぞれチミン及びシトシンを示す。矢印はＣｐＧヌクレオチドにおけるシトシンの位置を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８２】  以下、実施例及び実験例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００８３】  ［測定方法］
０−Ａ．亜硫酸濃度の測定
亜硫酸濃度の測定は、塩酸溶液中で亜硫酸塩から二酸化硫黄が生成し、生成した二酸化硫黄の量に依存して、２７６ｎｍの吸光度（Ａ２７６）が変化することを利用して行った。【００８４】  吸光度測定用のキュベット（１ｘ１ｘ４ｃｍ、株式会社日立ハイテクノロジーズ製）に３ｍｌの０．１Ｎ塩酸（和光純薬工業株式会社製）をいれた。蒸留水にて希釈した亜硫酸塩溶液３０μｌを、該キュベットに加えて、パラフィルムで蓋をして、３回転倒攪拌した後に、分光光度計（日立計測器サービス株式会社製、モデルＵ−２８００）を用いて、２７６ｎｍの吸光度を測定した。【００８５】  ０．２ｍＭから３ｍＭに希釈した亜硫酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）溶液を標準液として同様に吸光度を測定し、標準液と試料の吸光度値から試料の亜硫酸濃度を算出した。【００８６】  この方法にて市販の５０％亜硫酸水素アンモニウム（和光純薬工業株式会社製）の亜硫酸濃度を測定したところ、６．０Ｍから６．２Ｍであった。【００８７】 ０−Ｂ．溶解度の測定
亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、及び亜硫酸アンモニウム１水和物（いずれも和光純薬工業株式会社製）の溶解度は、次のように測定した。【００８８】  ３０℃又は７０℃にて、１０ｍｌの蒸留水に、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、又は亜硫酸アンモニウム１水和物を加え、溶解しなくなるまで添加して溶液を調製し、その時の質量、体積及びｐＨを測定した。また各溶液について、上記０−Ａの方法に従って、亜硫酸濃度を測定した。【００８９】  表１に、測定値、及び、それらから計算した濃度を示す。
表中の濃度において、計算値とは溶解した各亜硫酸塩の質量と分子量から計算した亜硫酸濃度（Ｍ（ｍｏｌ／ｌ））を表す。また、測定値とは上記０−Ａの方法に従って測定した亜硫酸濃度（Ｍ）を表す。【００９０】
2005100240.tif 000002
2005100240.tif 000003
【００９１】  ７０℃での溶解度は、亜硫酸水素ナトリウムで５．９Ｍ、亜硫酸ナトリウムで２．１Ｍ、亜硫酸アンモニウム１水和物で４．３Ｍであった。
【実施例１】
【００９２】 １−Ａ．高濃度亜硫酸塩溶液の調製
５．０ｍｌの５０％亜硫酸水素アンモニウム溶液に２．０８ｇの亜硫酸水素ナトリウム及び０．６７ｇの亜硫酸アンモニウムを加えて７０℃で５分間攪拌して、溶解した。得られた溶液のｐＨは５．４、亜硫酸濃度は１０Ｍであった。この溶液のｐＨ及び亜硫酸濃度は７０℃、４時間でも変化なかった。【００９３】  以下、得られた溶液を、亜硫酸水素ナトリウム−アンモニウム混合溶液とも称する。【００９４】 １−Ｂ．２’−デオキシシチジン及び５−メチル−２’−デオキシシチジンの脱アミノ化反応速度の評価
脱アミノ化反応物の定量はＳｏｎｏらの文献（Ｓｏｎｏら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、Ｖｏｌ．９６、ｐ．４７４５−４７４９、（１９７３））に記載の方法に従った。【００９５】  ２’−デオキシシチジン又は５−メチル−２’−デオキシシチジン（シグマ社製）を、それぞれ０．２Ｍになるように蒸留水に溶解した溶液を調製した。【００９６】  ２’−デオキシシチジン溶液２５μｌに、０−Ｂに従って作成した５．９Ｍの亜硫酸水素ナトリウム溶液（反応終濃度は５．９×２５０÷（２５０＋２５）≒約５．３Ｍになる）、又は実施例１で調製した１０Ｍの亜硫酸水素ナトリウム−アンモニウム溶液（反応終濃度は１０．０×２５０÷（２５０＋２５）≒約９．０Ｍになる）をそれぞれ２５０μｌ加えて、０から１０分間処理し、５００μｌの冷水を加えて反応を停止した。７５μｌの反応液を５ｍｌの０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）と混合して室温で４０分放置した後に分光光度計（日立計測器サービス株式会社社製、モデルＵ−２８００）にて２７０ｎｍの吸光度を測定した。【００９７】  未反応試料（亜硫酸溶液処理をしていない同濃度の２’−デオキシシチジン溶液）の吸光度は０．８であった。９Ｍの亜硫酸水素ナトリウム−アンモニウム溶液のみの吸光度は０．０５であった。未反応試料の吸光度を１００％とし、反応試料の吸光度の減少から、脱アミノ化反応産物を定量した。【００９８】  ５−メチル−２’−デオキシシチジンについては、２７７ｎｍの吸光度を測定する以外、上記２’−デオキシシチジン溶液の場合と同様の測定定量を行った。【００９９】  図１に脱アミノ化反応の結果を示す。【０１００】  ７０℃、ｐＨ５．４の条件で処理した場合に、デオキシシチジンの半分がデオキシウリジンに変換する時間（ｔ１／２）は、５．３Ｍの亜硫酸水素ナトリウム溶液を用いた場合は３分であった。一方、９Ｍの亜硫酸水素ナトリウム−アンモニウム混合溶液を用いた場合は、１．８分であった。【０１０１】  ｔ１／２（亜硫酸濃度５．３Ｍの亜硫酸水素ナトリウム溶液を用いた場合）／ｔ１／２（亜硫酸濃度９Ｍの亜硫酸水素ナトリウム−アンモニウム混合溶液を用いた場合）は１．７であり、これは濃度比（９．０／５．３）と一致する。すなわち脱アミノ化反応速度が亜硫酸の濃度に依存することを示していた。【０１０２】  また１０Ｍの亜硫酸水素ナトリウム−アンモニウム溶液を段階希釈して、２Ｍから９Ｍの濃度で反応させて脱アミノ化反応処理を行ったところ、脱アミノ化反応の速度が亜硫酸塩濃度依存的であることがわかった。【０１０３】  また、５−メチル−２’−デオキシシチジンを９Ｍの亜硫酸水素ナトリウム−アンモニウム混合溶液で処理した場合の脱アミノ化率（５−メチル−２−デオキシシチジンが脱アミノ化されてチミンに変換した割合）は、７０℃、１０分間の処理条件で１６％、９０℃、１０分間の処理条件で２３％であった。【０１０４】 １−Ｃ．脱アミノ化反応の温度依存性
１−Ｂと同様の方法にて、９Ｍ亜硫酸水素ナトリウム−アンモニウム溶液（ｐＨ５．４）を用いて、９０℃、５０℃、３７℃で処理した場合における、デオキシシチジンのｔ１／２を測定した。その結果、それぞれ１分以下、５分及び１７分であった。【０１０５】 １−Ｄ．１００％脱アミノ化時間の測定
以下の手順に従って、２’−デオキシシチジンが完全に２’−デオキウリジンに変換する時間を測定した。【０１０６】  （測定方法）
０．２Ｍの２’−デオキシシチジン溶液２５μｌに、１−Ａで調製した１０Ｍの亜硫酸水素ナトリウム−アンモニウム溶液（反応終濃度９Ｍ）を２５０μｌ加えて、種々の時間処理した後、５００μｌの冷水を加えて反応を停止した。７５μｌの反応液を５ｍｌの０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）と混合して室温で４０分放置した。【０１０７】  次いで、上記処理後の試料１０μｌを、以下に示すＨＰＬＣ分析に供して２’−デオキシシチジンと２’−デオキウリジン量を測定した。【０１０８】  （ＨＰＬＣ分析）
ＨＰＬＣ分析システム（日立計測器サービス株式会社製）にウルトラスフェアーＯＤＳ４．６ｍｍ×２５ｃｍカラム（ベックマン−コールター社製）を接続した。緩衝液Ａ（１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０））、及び緩衝液Ｂ（９０％メタノール、１ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０））を調製した。ＨＰＬＣシステムのプログラムは流速０．７ｍｌ／分、緩衝液濃度プロファイルは、１００％Ａ：０分、１００％Ａ：５分、８５％Ａ：２５分、５５％Ａ：３５分、０％Ａ：６０分とした。【０１０９】  この条件における２’−デオキシシチジンの溶出時間は１９分、２’−デオキウリジンは２２分、５−メチル−２’−デオキシシチジンは２５分、２’−デオキシグアノシンで２６分、チミジンは２８分、２’−デオキシアデノシンは３２分であった。濃度はチャート面積から算出した。【０１１０】  （測定結果）
測定の結果、９Ｍ亜硫酸水素ナトリウム−アンモニウム溶液（ｐＨ５．４）を用いて脱アミノ化処理を行う場合、２’−デオキシシチジンが完全に（１００％）、２’−デオキウリジンに変換する時間は、７０℃で３０分、９０℃で８分であることがわかった。【０１１１】 １−Ｅ．脱アミノ化反応のｐＨ依存性
５０％亜硫酸水素アンモニウム溶液に、任意の割合の亜硫酸水素ナトリウムと亜硫酸ナトリウムを溶解させ、ｐＨ４．０から６．０の７Ｍ亜硫酸塩溶液を調製した。この溶液を用いて、１−Ｂの記載と同様の方法にて、２−デオキシシチジンの脱アミノ化率を測定した。反応時間は５分、温度は６０℃とした。【０１１２】  その結果、図２に示すように至適ｐＨは５．０から５．６であった。
【実施例２】
【０１１３】ゲノムＤＮＡの脱アミノ化反応
サケ睾丸ＤＮＡ（シグマ社製）を１．６ｍｇ／ｍｌになるように滅菌水で溶解した。この溶液５０μｌに３Ｎ水酸化ナトリウム（和光純薬社製）を５μｌ加えて、３０℃、３０分間処理して、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性した。【０１１４】  得られた溶液に５５０μｌの１０Ｍ亜硫酸アンモニウム−ナトリウム溶液（ｐＨ５．４）を加えて良く混合後、９０℃、１０分間反応させた（亜硫酸塩の終濃度は９Ｍ）。【０１１５】  次いで、反応液をＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で緩衝化したセファデックス  Ｇ−５０カラム（φ１５ｘ４０ｍｍ、バイオラッドエコノパック１０、バイオラッド社製）にアプライし、脱塩操作を行った。ＵＶモニタリングによりＤＮＡ画分を回収し、回収したＤＮＡ画分の２．５倍の体積の冷エタノール（和光純薬社製）、回収したＤＮＡ画分の１０分の１倍の体積の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を加えてＤＮＡを沈澱させた。【０１１６】  遠心操作によって沈澱したＤＮＡを分離回収した後、１００μｌの滅菌水に溶解した。９０μｌの試料に、１１μｌの２Ｎ水酸化ナトリウムを添加して１０分間処理し、試料ＤＮＡ中のシトシンを脱アミノ化してウラシルに変換させた。【０１１７】  処理後の液に、３０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、７０μｌの滅菌水及び５００μｌの冷エタノール（和光純薬製）を加えて、−２０℃で１時間放置した。沈澱したＤＮＡを回収して４０μｌの滅菌水に溶解した。３０μｌのＤＮＡ溶液に１．５μｌの反応緩衝液（０．１Ｍ塩化マグネシウム、０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８））、１０μｇのＤＮａｓｅ  Ｉ（ロシュ社製）を加えて３７℃、２時間処理した後、０．４ユニットのヘビ毒フォスフォジエステラーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社製）を追加し、さらに９０分間反応させた。次いで０．２ユニットのフォスフォジエステラーゼと２ユニットのアルカリフォスファターゼ（プロメガ社製）を添加して９０分間処理することによってＤＮＡをヌクレオシドに分解した。分解反応物をエタノール沈澱操作によって蛋白質や未反応物と分離した後、溶液を吸引乾燥した。３０μｌの滅菌水に溶解後、上記１−Ｄ記載のＨＰＬＣ分析の方法でヌクレオシド量を測定した。【０１１８】  図３にＨＰＬＣ分析のチャートを、表２に各ヌクレオシドの比率を示した。【０１１９】
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【０１２０】  表２中、Ｃは２’−デオキシシチジンを表す。Ｕは、２’−デオキシウリジンを表す。ｍＣは５−メチル−２’−デオキシシチジンを表す。Ｇは２’−デオキシグアノシンを表す。Ｔはチミジンを表す。Ａは２’−デオキシアデノシンを表す。
９Ｍの亜硫酸アンモニウム−ナトリウム溶液中、９０℃、１０分間処理した時のゲノムＤＮＡ中のシトシンの脱アミノ化率（シトシンからウラシルへの変換率）は９９．６％であった。また５−メチルシトシンの変換率は１０％以下であった。さらに他の塩基の変換は認められなかった。７０℃及び３７℃で同様の脱アミノ化率が得られる反応時間は、それぞれ１６分と１７０分であった。
【実施例３】
【０１２１】９Ｍ重亜硫酸塩組成物処理後のＤＮＡがＰＣＲの鋳型として使えるかどうかの検討
１μｇの制限酵素ＳｃａＩ（ＮＥＢ社製）で処理したｐＵＣ１１９（タカラバイオ社製）を、５０μｌの０．３Ｎ水酸化ナトリウム溶液中で３７℃、３０分間処理して１本鎖ＤＮＡに変性した。処理液に５００μｌの１０Ｍアンモニウム−ナトリウム亜硫酸溶液（ｐＨ５．４）を加えて良く混合してミネラルオイルを重層し、７０℃または９０℃で、５分から４０分間反応させた。反応液１３０μｌを抜き取り、氷冷した等量の滅菌水と混合した。取扱い説明書にしたがって、Ｗｉｚａｒｄ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰシステム（プロメガ社製）を用いてＤＮＡを精製し、９０μｌの滅菌水に溶解した。１１μｌの２Ｎ水酸化ナトリウム溶液を添加して３７℃、１０分間処理した。１０μｇの酵母ｔＲＮＡ（シグマ社製）をキャリアーとしてエタノール沈澱操作によりＤＮＡを回収し、１００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解した。【０１２２】  この溶液１μｌをサンプルとして、配列表の配列番号１及び２に示す２種類のプライマー、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（アプライドバイオシステム社製）を用いて５０μｌの反応系でＰＣＲを行った。サイクル条件は９５℃、３分後９５℃、３０秒→５７℃、３０秒→７０℃、３分を３０サイクルで行い、その他の条件は取扱い説明書にしたがった。ＰＣＲ後、１μｌの試料をアガロースゲル電気泳動で分析し、増幅量を確認した。【０１２３】  その結果、未処理のＤＮＡと、７０℃または９０℃で５分から４０分間処理した試料の、ＰＣＲにおけるＤＮＡの増幅量はほぼ同じであった。このことは亜硫酸処理したＤＮＡがＰＣＲの鋳型として使用できないまでに切断などの損傷を受けてはいないことを示している。さらに７０℃、２０分処理したサンプルと９０℃、１０分処理した試料のＰＣＲ産物をＢｉｇＤｙｅＴＭ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（アプライドバイオシステム社製）、ＡＢＩモデル３７００オートシーケンサー（アプライドバイオシステム社製）を用いて塩基配列決定を行ったところ、シトシンがチミンに変化していた。
【実施例４】
【０１２４】高分子ＤＮＡの脱アミノ化及びメチル化ＤＮＡの検出
ＭＣＦ−７細胞において、ＣＤＨ１遺伝子とＲＡＳＳＦ１Ａ遺伝子のＣｐＧ島はそれぞれ非メチル化、又はメチル化されていることが報告されている（Ｋｏｉｚｕｍｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０，４７７０−４７８０，２００２及び、Ｄａｍｍａｎｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６１，３１０５−３１０９，２００１等参照）。そこで、９Ｍの亜硫酸塩組成物の処理後、これらのＣｐＧ島のメチル化状態が再現されるかを調べた。【０１２５】 ４−Ａ．亜硫酸処理ＭＣＦ−７ゲノムＤＮＡの調製
ヒト乳ガン細胞ＭＣＦ−７細胞から得たゲノムＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＴＳＰ５０９Ｉで消化した。フェノール−クロロホルム処理及びエタノール沈殿処理を行って、乾燥後、ＤＮＡを４５μｌの滅菌水に溶解し、更に３Ｎ水酸化ナトリウム５μｌ加えて、３７℃、３０分間処理して１本鎖ＤＮＡに変性した。１本鎖に変性したＤＮＡ溶液に１０Ｍ亜硫酸塩組成物５６５μｌ（９０℃）、５４５μｌ（７０℃）を加えて、９０℃で２０分、又は、７０℃で４０分処理した。反応後、取扱い説明書にしたがって、Ｗｉｚａｒｄ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰシステム（プロメガ社製）を用いてＤＮＡを精製し、９０μｌの滅菌水に溶解した。１１μｌの２Ｎ水酸化ナトリウム溶液を添加して３７℃、１０分間処理した。１０μｇの酵母ｔＲＮＡ（シグマ社製）をキャリアーとしてエタノール沈澱操作によりＤＮＡを回収し、１６μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解した。【０１２６】  比較のために、従来の方法でも処理した。すなわち、上記と同様に消化したＭＣＦ−７ＤＮＡ４μｇを０．３Ｎ水酸化ナトリウム溶液５０μｌ中にて３７℃で３０分処理して一本鎖に変性した後、４Ｍ亜硫酸ナトリウム／１ｍＭヒドロキノン溶液５００μｌと混合させ、ミネラルオイルで重層し、暗所で、２０時間、５５℃で処理した。反応後、取扱い説明書にしたがって、Ｗｉｚａｒｄ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰシステム（プロメガ社製）を用いてＤＮＡを精製し、９０μｌの滅菌水に溶解した。１１μｌの２Ｎ水酸化ナトリウム溶液を添加して３７℃、１０分間処理した。１０μｇの酵母ｔＲＮＡ（シグマ社製）をキャリアーとしてエタノール沈澱操作によりＤＮＡを回収し、１６μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解した。【０１２７】 ４−Ｂ．ＭＣＦ−７細胞におけるＣＤＨ１遺伝子の解析
まず、ＭＣＦ−７細胞におけるＣＤＨ１遺伝子のメチル化状態を解析した。亜硫酸塩組成物で処理した後の試料を鋳型として、図４Ｂ（又は配列表の配列番号３）に示される配列２８０塩基対の断片を増幅した。ＰＣＲ解析は、以下の手順で行った。【０１２８】  （ＰＣＲ解析）
亜硫酸塩組成物で処理後のＭＣＦ−７ＤＮＡを、酵母ｔＲＮＡ１．２５ｍｇ／ｍｌを含むＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））で段階的に希釈した。９５℃で３分間インキュベートした後、Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＳｔｏｆｆｅｌフラグメントを加えて、第１段階の増幅を９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の条件で２０サイクル行った。反応は、Ｋｏｉｚｕｍｅらの文献（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０，ｐ．４７７０−４７８０，（２００２））に従った。鋳型ＤＮＡは、５００ｎｇ、５０ｎｇ、５ｎｇ又は５００ｐｇの量で使用した。またＰＣＲプライマーは表３又は配列表の配列番号４（ＣＤＨ１−Ｌ１）及び配列番号５（ＣＤＨ１−Ｒ１）に示す配列を用いた。次いで、第１段階のＰＣＲ反応液２μｌ、ＰＣＲプライマーとして、表３又は配列表の配列番号６（ＣＤＨ１−Ｌ２）及び配列番号７（ＣＤＨ１−Ｒ２）に示す配列を用いて３０サイクル行う以外は上述したのと同様の条件で、ｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。【０１２９】
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【０１３０】  ａ：小文字は、制限エンドヌクレアーゼのために導入された配列を示す。【０１３１】  （測定結果）
初めに、どの程度の量のＤＮＡが鋳型として用い得るかについて調べた。従来の方法で処理したＭＣＦ−７ＤＮＡを鋳型として使用した場合（図４Ｃ，ａ，レーン２）、９Ｍの重亜硫酸組成物で９０℃で２０分（図４Ｃ，ｂ，レーン２）及び７０℃で４０分（図４Ｃ，ｃ，レーン２）処理したＭＣＦ−７ＤＮＡを使用した場合いずれも５０ｎｇのＤＮＡを適用した際、明瞭なＰＣＲ産物が検出された。【０１３２】  次いで、各実験において５００ｎｇのＤＮＡをテンプレートとして使用して得られたＰＣＲ産物のクローンを作成し、１２個のプラスミドクローンを採集して、それらのヌクレオチド配列を解析した。解析した鎖は増幅領域に１０６のシトシン残基を含んでおり、そのうち２９がＣｐＧ部位にあった。【０１３３】  従来の方法で処理したＭＣＦ−７ＤＮＡの場合、解析した１２のプラスミドにおける全てのシトシン残基がウラシルに変換された。９Ｍ亜硫酸塩組成物を用いて９０℃で２０分又は７０℃で４０分処理したＭＣＦ−７ＤＮＡをテンプレートとして使用した場合も、ほとんど同様の結果が得られた。【０１３４】  これらの結果は、９Ｍの亜硫酸塩組成物を用いて高い温度でヒトゲノムＤＮＡを処理することにより、シトシンからウラシルへの変換を迅速に行うことを可能にすることを示している。【０１３５】 ４−Ｃ．ＭＣＦ−７細胞におけるＲＡＳＳＦ１Ａ遺伝子の解析
次いで、ＭＣＦ−７細胞におけるＲＡＳＳＦ１Ａ遺伝子のＣｐＧ島のメチル化状態を解析した。亜硫酸塩組成物で処理した後の試料を鋳型として、図５Ｂ（又は配列表の配列番号８）に示される配列１５１塩基対の断片を増幅した。【０１３６】  （ＰＣＲ解析）
次に示す点以外は、上記４−Ｂと同様の方法でＰＣＲ解析を行った。第１段階ＰＣＲプライマーとして、表３又は配列表の配列番号９（ＲＡＳＳＦ１Ａ−Ｌ１）及び配列番号１０（ＲＡＳＳＦ１Ａ−Ｒ１）に示す配列を用いた。ｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲにおいては、第一段階ＰＣＲ反応液を６μｌ使用した。ＰＣＲプライマーとしては、表３又は配列表の配列番号９（ＲＡＳＳＦ１Ａ−Ｌ１）及び配列番号１１（ＲＡＳＳＦ１Ａ−Ｒ２）に示す配列を使用した。【０１３７】  （測定結果）
従来の方法で処理したＭＣＦ−７ＤＮＡを鋳型として使用した場合、ＰＣＲ産物は５０ｎｇのＤＮＡを適用したときに検出された（図５Ｃ，ａ，レーン２）。しかし、９Ｍ亜硫酸塩組成物を用いて９０℃で２０分又は７０℃で４０分処理したＭＣＦ−７ＤＮＡを鋳型として使用した場合、ＰＣＲ産物は、５００ｎｇのＤＮＡを適用した際にのみ検出された。【０１３８】  これらの結果は、９Ｍ亜硫酸塩組成物を用いて高温で処理することによるＤＮＡ分解の状態は、ヌクレオチド配列によって変化することを示唆している。【０１３９】  解析した鎖は増幅した領域に４８のシトシンを含み、そのうち１６がＣｐＧ部位にあった。従来の方法でＭＣＦ−７ＤＮＡを処理したとき、解析した１２のプラスミドクローン全てにおいて、非ＣｐＧ部位におけるほとんど全てのシトシンがウラシルに変換された。対照的に、ＣｐＧ部位におけるほとんどのシトシンが変換されなかった。９Ｍ亜硫酸塩組成物で、９０℃で２０分又は７０℃で４０分処理したＭＣＦ−７ＤＮＡを鋳型として用いた場合も同様の結果が得られた。【０１４０】  上記実施例の結果から明らかなように、本発明の高い亜硫酸濃度の亜硫酸塩組成物を用いてゲノムＤＮＡを処理することにより、シトシンからウラシルへの変換が短時間に行われ、一方で、５−メチルシトシンのほとんどは変化しないことがわかった。【０１４１】  従来は、シトシンからウラシルへの変換処理に１２〜１６時間程度の長時間の処理を要していたが、本発明によって、シトシンからウラシルへの変換が短時間に行われ、さらにメチル化シトシンの検出も迅速に行えることがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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