(57)【要約】  CSFを有効成分とする低用量投与用治療剤であって、血流増加剤、血管新生促進剤及び虚血性疾患治療剤から選ばれる１以上の治療剤として用いられる前記治療剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
CSFを有効成分とする低用量投与用治療剤であって、血流増加剤、血管新生促進剤及び虚血性疾患治療剤から選ばれる１以上の治療剤として用いられる前記治療剤。
【請求項２】
虚血部位へ局所投与されることを特徴とする請求項１記載の治療剤。
【請求項３】
CSFがG-CSFである請求項１又は２記載の治療剤。
【請求項４】
血流増加剤として用いられる請求項１〜３のいずれかに記載の治療剤。
【請求項５】
血管新生促進剤として用いられる請求項１〜３のいずれかに記載の治療剤。
【請求項６】
虚血性疾患治療剤として用いられる請求項１〜３のいずれかに記載の治療剤。
【請求項７】
虚血性疾患が末梢循環障害である請求項６記載の治療剤。
【請求項８】
虚血性疾患が虚血性心疾患である請求項６記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、CSFを有効成分とする低用量投与用の治療剤に関する。本発明の治療剤は、血流増加剤、血管新生促進剤又は虚血性疾患の治療剤として有用である。
【背景技術】
【０００２】
ヒト顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）は顆粒球系造血幹細胞の分化誘導因子として発見された造血因子であり、生体内では好中球造血を促進することから、骨髄移植や癌化学療法後の好中球減少症治療剤として臨床応用されている。また、上記作用のほかにもヒトG-CSFは幹細胞に作用してその分化増殖を刺激する作用や骨髄中の幹細胞を末梢血中に動員する作用がある。実際に後者の作用に基づいて、臨床の現場では強力な化学療法を施行した後の癌患者の造血回復促進を目的として、ヒトG-CSFにより動員された末梢血造血幹細胞を移植する末梢血幹細胞移植術が行われている。【０００３】
又、G-CSFが血管新生促進作用を有し、虚血性疾患の治療剤として有用であることも報告されている（ＷＯ02/22163；Bussolino F. et al., Nature, 337:471-473, 1989）。これまでG-CSFを幹細胞動員、白血球増多、血管新生促進などの目的で用いる場合には、通常、10〜20μg/kg/dayという比較的高用量を皮下投与で投与することが一般的であった。【０００４】
しかしながら、G-CSFは非常に多様な活性を有している為、10〜20μg/kg/dayという比較的高用量を投与した場合に、本来の目的である血管新生促進作用以外の作用が現れる。
【特許文献１】ＷＯ02/22163
【非特許文献１】Bussolino F. et al., Nature, 337:471-473, 1989
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、G-CSFなどのコロニー刺激因子（CSF）を低用量で含有し、かつ血管新生促進作用を奏する治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、従来の投与量と比較して非常に低用量のG-CSFでも、局所投与をすることにより目的の作用を得ることが可能であることを見出し、本発明を完成させた。【０００７】
すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
（１）CSFを有効成分とする低用量投与用治療剤であって、血流増加剤、血管新生促進剤及び虚血性疾患治療剤から選ばれる１以上の治療剤として用いられる前記治療剤。
（２）虚血部位へ局所投与されることを特徴とする前記（１）記載の治療剤。
（３）CSFがG-CSFである前記（１）又は（２）記載の治療剤。
（４）血流増加剤として用いられる前記（１）〜（３）のいずれかに記載の治療剤。
（５）血管新生促進剤として用いられる前記（１）〜（３）のいずれかに記載の治療剤。
（６）虚血性疾患治療剤として用いられる前記（１）〜（３〜のいずれかに記載の治療剤。
（７）虚血性疾患が末梢循環障害である前記（６）記載の治療剤。
（８）虚血性疾患が虚血性心疾患である前記（６）記載の治療剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に従い、G-CSFなどのCSFを低用量で投与することにより、循環白血球増加などの好ましくない作用を引き起こすことなく、血流増加、血管新生促進又は虚血性疾患の治療に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）、ヒト真皮微小血管内皮細胞（HMVEC）、及びヒト冠状動脈内皮細胞（HCAEC）上におけるG-CSF受容体（G-CSFR）ｍRNAの発現を調べた電気泳動の図である。
【図２】rhG-CSFが、HUVECの遊走活性に及ぼす影響を試験した結果を示す顕微鏡写真の図である。
【図３】rhG-CSFが、HUVECの遊走活性に及ぼす影響を試験した結果を示すグラフである。
【図４】rhG-CSFが、HUVECの細胞増殖に及ぼす影響を試験した結果を示すグラフである。
【図５】rhG-CSFが、HUVECの内皮ネットワーク形成に及ぼす影響を試験した結果を示す顕微鏡写真の図である。
【図６】rhG-CSFが、HUVECの内皮ネットワーク形成に及ぼす影響を試験した結果を示すグラフである。
【図７】In vivo血管形成モデルを用いる実験プロトコルを示す図である。
【図８】rhG-CSFが、ラットの循環白血球数に及ぼす影響を示す図（末梢血の白血球数）である。
【図９】rhG-CSFが、ラットの後肢血流に及ぼす影響を示す図である。
【図１０】rhG-CSFが、ラットの組織毛細血管密度に及ぼす影響を示す顕微鏡写真の図（上図）及び毛細血管数を定量した結果を示すグラフ（下図）である。
【図１１】rhG-CSFが、マウス耳、皮下血管観察モデルを用いる血管形成に及ぼす影響を示す顕微鏡写真の図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の治療剤または方法に使用するCSFとしては、G-CSFの他に、強力な造血サイトカインである顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）インターロイキン３（IL-3）及びインターロイキン５（IL-5）を含む。最も好ましいのはG-CSFである。【００１１】
本発明において低用量投与とは、通常、CSFを0.01μg/kg/day以上10μg/kg/day未満の投与量で投与することであり、好ましくは0.1μg/kg/day以上10μg/kg/day未満の投与量で投与することであり、より好ましくは1μg/kg/day以上5μg/kg/day未満の投与量で投与することであり、さらに好ましくは1μg/kg/day以上3μg/kg/day未満の投与量で投与することである。また、0.01μg/kg/day以上1μg/kg/day未満、例えば0.1μg/kg/day以上1μg/kg/day未満の投与量も本発明の低用量投与に含まれる。本発明の治療剤の個々の患者に対する投与量は患者の年齢、体重、症状、投与経路などを考慮して医師により決定される。【００１２】
又、本発明における低用量投与の際には、徐放性製剤が用いられてもよい。徐放性製剤を使用する場合、1回の投与量は上記の低用量を超えてもよく、1日の間に徐放性製剤から体内に放出されるＣＳＦが上記の低用量となればよい。【００１３】
本発明の治療剤または方法においては、CSFは局所投与されることが好ましい。局所投与される部位は特に限定されず、血管新生促進や血流増加を起こしたい部位（組織、器官など）や虚血状態になっている部位などに投与することができる。具体的な局所投与部位の例としては、下肢骨格筋、上肢骨格筋、心臓（心筋）などを挙げることができる。【００１４】
局所投与は、全身に大きな影響を及ぼすことなく患部局所に効率的にCSFを投与できる方法であれば特に限定されず、通常の注射器、ニードル、局所針などを用いて局所投与することが可能である。【００１５】
本発明において局所投与とは、通常、血管新生促進や血流増加を起こしたい部位や虚血状態になっている部位などに直接ＣＳＦを投与することをいうが、血管新生促進や血流増加を起こしたい部位や虚血状態になっている部位などに直接つながっている血管に投与してもよい（例えば、肝臓が虚血部位である場合に、肝動脈にＣＳＦを投与する場合、など）。【００１６】
本発明の治療剤は、血流増加剤、血管新生促進剤又は虚血性疾患の治療剤として有用である。【００１７】
本発明において血流増加とは、CSFが局所投与された部位又は該部位より末梢に位置する部位における血流量が投与前に比べて増加すること、又は虚血組織に到達する血流量が増加することを意味する。血流増加作用が得られたかどうかについては、当業者に公知の方法により測定することが可能であり、例えば、フロー技術により放射活性ミクロスファーを用いて定量することが可能である（Am. J. Physiol. 243:H371-H378、(1982))。さらに、皮膚温、サーモグラフィー、レーザー血流計、下肢／上肢血圧比、組織酸素分圧などの方法により測定、確認することもできる。【００１８】
本発明において血管新生促進とは、血管新生の促進及び／又は血管の成長・発達の促進をいう。CSFにより新生、成長、発達などが促進される血管は特に限定されないが、動脈が好ましく、特に末梢動脈が好ましい。血管新生促進作用が得られたかどうかについては、当業者に公知の方法により測定することが可能であり、例えば、アルカリフォスファターゼ染色などを用いて毛細血管密度を測定すること等により可能である。さらには、血管造影などの方法で測定、確認することもできる。【００１９】
また、本発明の方法を用いることにより、血管の新生、成長、発達などを促進するだけでなく、リンパ管の新生、成長、発達、末梢神経への栄養、血管新生による神経障害の改善などを促進させることも可能である。【００２０】
本発明の治療剤は虚血性疾患の治療にも有用である。虚血性疾患は血管内腔の狭窄、血栓の生成、血管の閉塞、血管炎、血管の収縮、血液粘性の増加などの様々な要因により、血管における血流量が減少し、組織が虚血状態に陥る病状である。虚血性疾患の例としては、末梢循環障害、虚血性心疾患（虚血性心筋症、心筋梗塞症、虚血性心不全など）、虚血性脳血管障害、虚血性腎疾患、虚血性肺疾患、感染症に関連する虚血性疾患、などがある。本発明の治療剤の対象となる好ましい疾患は、末梢循環障害または虚血性心疾患である。【００２１】
末梢循環障害は血管内腔の狭窄、血栓の生成、血管の閉塞、血管炎、血管の収縮、血液粘性の増加などにより末梢動脈の血流が減少し、末梢の組織が虚血状態に陥る病状である。末梢循環障害を伴う疾患としては、閉塞性動脈硬化症、Buerger病などの慢性動脈閉塞症、進行性全身硬化症、全身性エリテマトーデス、レイノー病、振動病、動脈瘤、血管炎などを挙げることができる。【００２２】
本発明の治療剤または方法に用いるCSFがG-CSFである場合には、どのようなG-CSFでも用いることができるが、好ましくは高度に精製されたG-CSFであり、より具体的には、哺乳動物G-CSF、特にヒトG-CSFと実質的に同じ生物学的活性を有するものである。【００２３】
本発明で用いるG-CSFは、いかなる方法で製造されたものでもよく、例えば、ヒト腫瘍細胞やヒトG-CSF産生ハイブリドーマの細胞株を培養し、これから種々の方法で抽出し分離精製したG-CSF、あるいは遺伝子工学的手法により大腸菌、イースト菌、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、Ｃ１２７細胞、ＣＯＳ細胞、ミエローマ細胞、ＢＨＫ細胞、昆虫細胞、などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したG-CSFなどを用いることができる。本発明において用いられるG-CSFは、遺伝子工学的手法により製造されたG-CSFが好ましく、哺乳動物細胞（特にＣＨＯ細胞）を用いて製造されたG-CSFが好ましい（例えば、特公平１−４４２００号公報、特公平２−５３９５号公報、特開昭６２−１２９２９８号公報、特開昭６２−１３２８９９号公報、特開昭６２−２３６４８８号公報、特開昭６４−８５０９８号公報）。【００２４】
遺伝子組換え法により得られるG-CSFには、天然由来のG-CSFとアミノ酸配列が同じであるもの、あるいは該アミノ酸配列中の１または複数のアミノ酸を欠失、置換、付加等したもので、天然由来のG-CSFと同様の生物学的活性を有するもの等であってもよい。アミノ酸の欠失、置換、付加などは当業者に公知の方法により行うことが可能である。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275；Zoller, M.J. and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500；Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456；Kramer, W. and Fritz, H.J. (1987) Methods Enzymol. 154, 350-367；Kunkel, T.A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492；Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766）などを用いて、G-CSFのアミノ酸に適宜変異を導入することにより、G-CSFと機能的に同等なポリペプチドを調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。一般的に、置換されるアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に置換されることが好ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666；Zoller, M.J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500；Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433；Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413）。【００２５】
又、G-CSFと他のタンパク質との融合タンパク質を用いることも可能である。融合ポリペプチドを作製するには、例えば、G-CSFをコードするＤＮＡと他のタンパク質をコードするＤＮＡをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよい。本発明のG-CSFとの融合に付される他のタンパク質としては、特に限定されない。【００２６】
又、化学修飾したG-CSFを用いることも可能である。化学修飾したG-CSFの例としては、例えば、糖鎖の構造変換・付加・欠失操作を行ったG-CSFや、ポリエチレングリコール・ビタミンＢ１２等、無機あるいは有機化合物等の化合物を結合させたG-CSFなどを挙げることができる。【００２７】
本発明の治療剤には、必要に応じて、懸濁化剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、海面活性化剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を適宜添加することができる。【００２８】
懸濁剤の例としては、メチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等を挙げることができる。【００２９】
溶解補助剤としては、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マグロゴール、ヒマシ油脂肪酸エチルエステル等を挙げることができる。【００３０】
安定化剤としては、デキストラン４０、メチルセルロース、ゼラチン、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム等を挙げることができる。【００３１】
等張化剤としては例えば、Ｄ−マンニトール、ソルビート等を挙げることができる。【００３２】
保存剤としては例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等を挙げることができる。【００３３】
吸着防止剤としては例えば、ヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレンオキサイド・プロピレンオキサイド共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。【００３４】
含硫還元剤としては例えば、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、炭素原子数１〜７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられる。【００３５】
酸化防止剤としては例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸及びその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤が挙げられる。【００３６】
さらには、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機塩；クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、酢酸ナトリウムなどの有機塩などの通常添加される成分を含んでいてもよい。【００３７】
本発明を徐放性製剤として行う場合、徐放性製剤は公知の方法、例えば基剤としてポリマーを用いる方法などにより調製することが可能である。基剤として用いるポリマーは生体内で分解されるポリマーを用いることが好ましい。【００３８】
本発明者らは、後述の実施例に示したように、組換えヒトG-CSF（ｒｈG-CSF）のin vitroでの成熟内皮細胞の血管形成能への影響を調べ、また、末梢血での白血球増加を引き起こさないような、虚血組織への低用量のｒｈG-CSFの局所投与が血管形成を促進するかについて片側（unilateral）後肢虚血ラットモデルを用いて試験した（Murohara T. et al., J. Clin. Invest. 105:1527-1536, 2000）。その結果、非常に低用量のG-CSFであっても、著明な循環白血球増加を引き起こすことなく、血流を増加し、また血管新生促進作用を奏することを確認した。さらに、マウス耳の皮下血管観察モデルを用いた試験では、VEGF投与マウスでは微少動脈瘤の形成が観察されたのに対し、G-CSF投与マウスではこのような微少動脈瘤の形成が観察されず、きれいな血管を形成することが確認された。【００３９】
本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されない。種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。【００４０】
なお、以下の実施例における統計的解析は、全てのデータを平均値±SEで表す。群間の比較をANOVA、次いでフィッシャーの確率検定により行った。顕著な違いをp<０．０５で定義した。
【実施例】
【００４１】
実施例1：種々のヒト内皮細胞上におけるG-CSF受容体ｍRNAの発現の確認
逆転写PCR（RT-PCR）解析を用いて、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）、ヒト真皮微小血管内皮細胞（HMVEC）、及びヒト冠状動脈内皮細胞（HCAEC）上におけるG-CSF受容体（G-CSFR）ｍRNAの発現を調べた。上記細胞は三光純薬（株）から購入した。これらの細胞からグアニジウムイソチオシアネート−フェノールクロロホルム溶液（TRIzol試薬、Invitrogen社）を用いて全RNAを抽出し、２６０／２８０nmでの吸収の測定により定量し、RT-PCR解析にかけた。まず、各サンプル１μｇの全RNAをオリゴｄTプライマー及びRnase H- 逆転写酵素（SuperscriptII；Invitrogen社）を用いて逆転写した。【００４２】
なお、ヒトG-CSFRのプライマーとして以下のものを用いた。
センス鎖：5’-tcctcaccctgatgaccttga-3’（配列番号１）
アンチセンス鎖：5’-gaagttgagcagtggcccaaa-3’（配列番号２）
G-CSFRのRT-PCRにより、６２０bp(膜貫通型、GenBank M59818)、７０１bp(細胞質ドメイン挿入型、GenBank M59820), および５４８bp(可溶型、GenBank M59819)のサイズの３つのPCR産物が得られると予想された。【００４３】
低酸素環境下に曝された血管内皮細胞においては、ヒトグリセリルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（GAPDH）が誘導産生されることが知られている。本実施例で使用した種々の内皮細胞でもGAPDHが検出されるかを確認するため、GAPDHのRT-PCRを以下のプライマーを用いて行った。
センス鎖：5’-cttcaccaccatggaggagg-3’（配列番号３）
アンチセンス鎖：5’-tgaagtcagaggagaccacc-3’（配列番号４）
GAPDHのRT-PCRにより、得られるPCR産物は557bpと予測される。また、ポジティブコントロールとして骨髄単核球細胞（BM-MNC）上でG-CSF受容体を発現させた。【００４４】
得られたPCR産物をアガロースゲルの電気泳動にかけた結果を図1に示す。HUVEC、HMVEC及びHCAEC上のG-CSF受容体の発現が確認された。
実施例２：細胞遊走アッセイ
rhG-CSFの影響を調べるため、HUVECの遊走活性アッセイを行った。遊走能アッセイは、改良型Boyden Chamber装置(Neuroprobe, Gaithersburg, Maryland)を用いて行った。ポリビニルピロリドン（PVP）フリーの多孔（直径８ｍｍ）ポリカーボネートフィルターを0．1％ゼラチン及び５０mg/mLフィブロネクチンで被覆し、空気中で1時間乾燥させた。１％FBS及びG-CSF(１，１０．１００ng/mL)を補充した培地を装置の下室に入れた（rhG-CSFは中外製薬株式会社から恵与された）。ポジティブコントロールとしてrhVEGF(10ng/mL)を下室に入れた。半集密的(Subconfluent)HUVEC培養物を、細胞脱離に必要な最低時間洗浄及びトリプシン処理した。被覆PVPフリーポリカーボネートフィルターを上室及び下室の間に設置したのち、１％FBS（G-CSFを含まない）を含むMedium-199（５０ｍL）中に懸濁させたHUVEC(１×１０4細胞)を上室にまいた。装置全体を空気９５％、ＣＯ2５％の加湿インキュベーター中、３７℃で３時間インキュベートし、HUVECが膜を通して移動できるようにした。インキュベーション後、フィルターを取り出し、フィルター上面の非遊走HUVECをゴムベラで削り落とした。その後、フィルターをメタノールで10分固定し、May-Gruenwald液(Merck, Darmstadt, ドイツ)及びギームザ染色液（SIGMA）で染色した。各室について、フィルター下面に付着した遊走HUVECをランダムに選択した顕微鏡視野（×２００）で計測した。全ての実験は6回行われ、データは、遊走細胞の数／視野で表わした。【００４５】
得られた結果を図２の写真と図３のグラフに示す。rhG-CSFは濃度１００ng/mLで微走化性膜を通してHUVECの遊走を促進することが明らかになった。これらのin vitroでの知見により、rhG-CSFは成熟内皮細胞の遊走を促進することが示された。
実施例３：細胞増殖アッセイ
HUVECの増殖活性を、予備確認した比色MTS(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム)アッセイと電子結合試薬フェナジンメトスルフェート(CellTiter 96 AQ; Promega, Madison, WI)を用いて解析した。HUVECを９６穴プレートで２％FBS（G-CSF(０．１，１，１０，１００，１０００ng/mL)有りまたは無し）を含むMedium-199(０．２ml)中にまいた（１０００細胞／穴）。MTS/フェナジンメトサルフェート混合物（２０μｌ）を培養3日目に各穴に加え、３７℃で４時間インキュベートした。次いで、ELISAプレートリーダー（Model 680 Microplate Reader, Bio-Rad社）を用いて４９０nm/６５５nmの吸光度を測定した。ポジティブコントロールとして、１０ng/mlのVEGF（血管内皮細胞増殖因子）を用いた。【００４６】
得られた結果を図４に示す。ポジティブコントロールである１０ng/mlのVEGFは顕著にHUVECの増殖を刺激するのに対し、rhG-CSFは０．１，１，１０，１００及び１０００ng/mLの濃度でHUVECの増殖を促進しないことが明らかになった。
実施例４：In vitro血管形成モデル：基質ゲル培養上での内皮ネットワーク形成
培養皿上の血管新生反応である内皮ネットワーク形成へのrhG-CSFの影響を調べた。２％FBS（G-CSF(０．１，１，１０，１００，１０００ng/mL)有りまたは無し）を含むMedium-199（１ｍL）中に懸濁させた４×１０4個のHUVECを増殖因子減少マトリゲル（Becton Dickinson, San Jose, CA）上で培養した。３７℃、５％CO2の加湿空気中で１２時間インキュベーション後、各穴中のランダムに選択した視野で内皮ネットワーク形成を調べ、撮影した（×４０）。定量的評価のため、各画像でのネットワーク形成の長さをコンピューター上でWIN ROOF program（Mitani corporation, 東京、日本）により計算した。全ての実験は４度行われ、データはネットワーク形成の長さ／視野で表した。【００４７】
得られた結果を図５の写真と図６のグラフに示す。ｒｈG-CSF(１００ng/mL)との１2時間のインキュベーションで内皮管形成に顕著な刺激効果が見られた。ｒｈG-SCF(1または１０ng/mL)の低用量投与内皮ネットワーク形成を刺激する傾向がみられたが、影響は統計的に顕著ではなかった。
実施例５：in vivo血管形成モデル
in vivoでの実験プロトコルを図７に示す。雄ヌードラット(F344/N rnu/rnu)の左大腿動脈及び静脈の完全切除により手術誘引性片側(unilateral)後肢虚血を起こした。ｒｈG-CSF群のラットには、手術後１日目から６日間、虚血内転筋（各投与群において、n=8）上にrhG-CSF(２，１０または２０μg/kg/日)を与えた。一方、コントロールラット(n=4)には６日間、虚血内転筋上に生理食塩水を与えた。【００４８】
なお、全てのラットには通常の食事及び飲み水を与えた。全ての実験プロトコルは名古屋大学医学部内動物実験委員会により承認された。
（１）ラットにおける循環白血球数へのG-CSFの影響
rhG-CSFの動員効果の徴候として、全白血球細胞数を調べた。循環全白血球数計測のため、手術前、手術後３日目及び７日目に、尾静脈から血液サンプル（各動物０．２mL）を採取した。完全な血液細胞計測をSysmex KX-21(Sysmex,神戸、日本)により行った。【００４９】
得られた結果を図８に示す。術後３日目にrhG-CSF １０及び２０μg/kg群において、WBC計測数はコントロール群と比較してそれぞれ１．４及び１．３倍と、軽度に増加した。７日目に、計測数は最初の基準レベル（基準線と比べ、顕著な差がない）まで減少した。
（２）レーザードップラー血流解析
レーザードップラー血流（LDBF）解析器（moorLDI, Moor Instrument）を用いて、虚血／正常  後肢血流の比を計測した。予め決めた７回の時点（術前、及び術後１，３，７，１４，２１，２８日目）で関心のある部位（肢及び足）に２度の連続的レーザースキャンを行った。虚血及び非虚血足の平均潅流を血流の程度に関連したカラーピクセルのヒストグラムをもとに算出した。室内光による変動を最小化するため、血流を虚血／正常肢LDBF比により表した。【００５０】
得られた結果を図９に示す。術後１４，２１，２８日目において、生理食塩水処理群と比較して、rhG-CSF処置群は、虚血／正常  後肢血流比が投与量依存性で顕著に増大することが、LDBF解析により明らかになった。
（３）組織毛細血管密度解析
光学顕微鏡下での毛細血管内皮細胞数の計測により、血管新生へのrhG-CSF(もしくは生理食塩水)投与の影響を調べた。２８日目の内転骨格筋をOCT化合物(Miles)中に包埋し、液体窒素中で急凍結した。切片をアルカリホスファターゼ染色し、毛細血管内皮細胞を検出した。内皮細胞数を光学顕微鏡下で計測し(×２００)、毛細血管密度を決定した。毛細血管密度は、各動物の筋肉サンプルから５視野をランダムに選択し、計測した。【００５１】
得られた結果を図１０に示す。図１０中、上図の写真は、下肢虚血手術後２８日目の大腿内転骨格筋切片のアルカリホスファターゼ染色を示す。青紫色に染色されているのが内皮細胞である。Ａ：コントロール生理食塩水投与群、Ｂ：rhG-CSF(２μg/kg/日)投与群、Ｃ: rhG-CSF（１０μg/kg/日)投与群、Ｄ: rhG-CSF(２０μg/kg/日)投与群。Ｂ、Ｃ、ＤではＡに比べて内皮細胞の密度が高くなっていることが観察される。【００５２】
また、図１０中、下図のグラフは、視野あたりの毛細血管内皮細胞数に基づく定量的なデータを示す。これらの結果から、rhG-CSF群は生理食塩水コントロール群と比較して毛管密度が顕著に高まる（それぞれp<０．０１）ことが明らかになった。
実施例６：マウス耳  皮下血管観察モデルを用いる血管形成に及ぼすG-CSFの影響
試験初日にマウス（C57BL/6J、各群：３匹ずつ、日本クレア（株）から入手）をネンブタール（10倍希釈を0.3〜0.5 ml）で麻酔後に脱毛クリームで耳の毛を処理し、組換えタンパク質（rhG-CSFまたはrhVEGF）を皮下に投与した。投与は、29G注射針を用いて、組換えタンパク質150 ng / 15μl(PBS)で連続3日間行った。2日目からはエーテルで軽く麻酔をかけた後に皮下投与した。別途、コントロール生理食塩水投与群を準備した。【００５３】
投与開始から4日目に組織採取を行った。10倍希釈のネンブタールを0.3〜0.5ml腹腔内注射した。尾の腹側から見て正中に動脈、その両側に静脈が認められるので、23〜30Gの針で（インスリン皮下注用）FITC-Lycopersicon esculentum Lectinを100 μg / 生食100〜200 μl を静注した。【００５４】
2〜3分後に開胸し、1 ％ paraformaldehydeを含むPBS（約20 ml）を左室から流入させて血管の全身固定を行った。そのままPBSのみを流して洗浄した。【００５５】
続いて安楽死後、耳介を採取し軟骨面で2層に分けた。その際、できるだけ脂肪、筋肉を軟骨面に残さないようにし、特に炎症が誘導されているときは結合織が多いため丁寧に剥離する。これをプレパラートにし、蛍光染色したものをcon-focal顕微鏡で真皮面側から観察した。【００５６】
得られた顕微鏡写真を図１１に示す。コントロール生理食塩水投与群と比較して、rhVEGF投与マウスおよびrhG-CSF投与マウスで血管形成が観察された。rhVEGF投与マウスでは微少動脈瘤の形成が観察されたが、rhG-CSF投与マウスではこのような微少動脈瘤の形成が観察されず、きれいな血管を形成していた。
【図１】
2006075587.tif 000002
【図２】
2006075587.tif 000003
【図３】
2006075587.tif 000004
【図４】
2006075587.tif 000005
【図５】
2006075587.tif 000006
【図６】
2006075587.tif 000007
【図７】
2006075587.tif 000008
【図８】
2006075587.tif 000009
【図９】
2006075587.tif 000010
【図１０】
2006075587.tif 000011
【図１１】
2006075587.tif 000012
【配列表】
2006075587000001.app
【国際調査報告】
2006075587.tif 000013
2006075587.tif 000014
2006075587.tif 000015
2006075587.tif 000016