(57)【要約】  本発明は、種々のプロトコールに対応することができ且つ再現性を向上させて信頼性の高い解析結果を得ることが可能な試料調製装置等を提供することを目的とする。本発明による試料調製装置は、生体分子を含む物質から被検体試料を調製するものであって、その物質が収容される第一の容器と、第一の容器内へ注入される溶液が収容される第二の容器と、第二の容器に収容された溶液を第一の容器へ注入する分注手段と、第一の容器を移動自在に保持する移動保持手段と、移動保持手段を振とうさせて第一の容器内の物質及び溶液を撹拌する振とう手段と、振とうされた後の溶液を第一の容器から排出させて被検体試料を第三の回収する回収手段とを備える。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子を含む物質から被検体試料を調製するための装置であって、
前記物質が収容される第一の容器と、
前記第一の容器内へ注入される溶液が収容される第二の容器と、
前記第二の容器に収容された前記溶液を前記第一の容器へ注入する分注手段と、
前記第一の容器を移動自在に保持する移動保持手段と、
前記移動保持手段を振とうさせて前記第一の容器内の前記物質及び前記溶液を撹拌する振とう手段と、
前記振とうされた後の前記溶液を前記第一の容器から排出させて前記被検体試料を第三の容器に回収する回収手段と、
を備える試料調製装置。
【請求項２】
前記第二の容器は、種類が互いに異なる複数の溶液が個別に収容されるものである、
請求項１記載の試料調製装置。
【請求項３】
前記振とう手段は、前記溶液の種類に応じて撹拌速度が調節されるものである、
請求項２記載の試料調製装置。
【請求項４】
前記第一の容器が載置される領域及び前記第二の容器が載置される領域が連設されており、
前記振とうが実施される領域及び前記被検体試料が回収される領域が、前記第一の容器が載置される領域及び前記第二の容器が載置される領域と併設されている、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の試料調製装置。
【請求項５】
前記振とうされた後の前記溶液を含む前記第一の容器内へガスを供給して該第一の容器内を加圧する加圧手段を更に備える、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の試料調製装置。
【請求項６】
前記生体分子を含む物質は、生体分子を含む担体である、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の試料調製装置。
【請求項７】
前記振とう手段は、アーム状の保持手段を有するものである、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の試料調製装置。
【請求項８】
前記振とう手段は、前記第一の容器又は該第一の容器の保持具を側方から保持するものである、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の試料調製装置。
【請求項９】
生体分子を含む物質から被検体試料を調製するための方法であって、
前記物質を第一の容器へ収容する担体収容工程と、
前記第一の容器内へ注入される溶液を第二の容器へ収容する溶液収容工程と、
前記第二の容器に収容された前記溶液を前記第一の容器へ注入する分注工程と、
前記第一の容器を所定の領域に移動せしめて保持する移動保持工程と、
前記保持手段を振とうさせて前記第一の容器内の前記物質及び前記溶液を撹拌する振とう工程と、
前記振とう工程を実施した後に、前記溶液を前記第一の容器から排出させて前記被検体試料を第三の容器に回収する回収工程と、
を備える試料調製方法。
【請求項１０】
前記溶液収容工程においては、前記第二の容器として、種類が互いに異なる複数の溶液が個別に収容されるものを用いる、
請求項９記載の試料調製方法。
【請求項１１】
前記回収工程においては、前記第一の容器にガスを供給して該第一の容器内を加圧する、
請求項９又は１０に記載の試料調製方法。
【請求項１２】
前記生体分子を含む物質として生体分子を含む担体を用いる、
請求項９〜１１のいずれか一項に記載の試料調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子を含む担体等の物質から被検体試料を調製するための装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポストゲノム時代の重要な研究として、プロテオーム解析が注目されている。プロテオーム解析では、生体を構成する細胞内に含まれるタンパク質の網羅的な解析が行われ、近年、二次元電気泳動に代表されるゲル電気泳動よるタンパク質分離、及び質量分析を用いたタンパク質プロファイリングが頻繁に行われている。代表的な解析手順としては、まず、電気泳動用に調製した生体試料を、ポリアクリルアミドゲル上に分離させ、染色、画像解析を行い、その結果に基づいて各タンパク質のスポットの切り出しを行う。次に、切り出したスポットに対してゲル内タンパク質酵素消化を施した後、溶液試薬等を用い、質量分析用の被検体試料としての消化ペプチド断片を含むサンプルを回収する。それから、ペプチド断片の質量分析を実施し、データベースから予想されるペプチド断片の理論上の質量スペクトルと、実測された質量スペクトルのパターンとを、タンパク質同定用検索エンジンを用いて比較照合し、消化前のタンパク質を同定する。【０００３】
ここで、最終的に質量分析によってタンパク質同定を行う際の分析感度、同定の確度、及び再現性は、電気泳動で分離され切り出されたスポットから質量分析用の被検体試料を調製するまでの一連の処理に依るところが大きい。それに加え、多検体の試料を処理して解析のスループットを向上させる観点、及び再現性を確実に高める観点から、試料調製のための各種自動機器が開発されている。【０００４】
例えば、非特許文献１には、二次元電気泳動ゲルから回収されたタンパク質を含むゲルプラグをプレート内で酵素消化し、その後、別のプレートへペプチド分注する処理を自動で行うゲル酵素消化処理装置（製品名：Ettan Digester）が記載されている。また、非特許文献２には、サンプリング、分注、希釈、及びプレート洗浄といった一連の作業が自動化されたラボラトリーオートメーションシステム（製品名：BIOMEK（登録商標）2000）が記載されている。【０００５】
さらに、非特許文献３には、電気泳動で単離したタンパク質のインゲル酵素消化、脱塩・濃縮、及び質量分析計ターゲットプレートへのスポッティングを自動化した質量分析前処理自動化装置（製品名：MultiPROBE II）が記載されている。またさらに、非特許文献４には、電気泳動で分離したタンパクのゲル内消化を自動で行うゲル内タンパク消化自動化システム（製品名：Investigator ProGest）、質量分析用サンプル調製装置（製品名：Investigator ProMS）、サンプル調製自動化システム（製品名：Investigator ProPrep）等が記載されている。
【非特許文献１】アマシャム バイオサイエンス株式会社 『スポットピッキング＆酵素処理  ゲル酵素消化処理装置』パンフレット
【非特許文献２】ベックマン・コールター株式会社  BIOMEK（登録商標）2000 ラボラトリーオートメーションシステム
【非特許文献３】株式会社パーキンエルマージャパン 『ライフサイエンス予算申請カタログ２００３→２００４』パンフレット 第２６頁下段（質量分析前処理自動化装置MultiPROBE II）
【非特許文献４】ニップンテクノラクタス株式会社  『ゲル内タンパク消化自動化システム Investigator ProGest（商標）Protein Digestion Station』 パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、従来の各種自動化装置では、質量分析用試料の回収率において不十分であり、特に、試料の性状、要求感度、プロトコールの種類によっては、質量分析用試料の調製は、熟練者の技能に頼らざるを得ないことも多々あった。この場合、質量分析用試料の回収率は、作業者の相違や作業状況の相違によって差異が生じることがある。その結果、質量分析において、そのような差異に基づく解析結果のばらつき（同定の確度の低下）、及び再現性が問題となっていた。殊に、近時、例えば、発現量が低いタンパク質を同定するための高感度微量分析を行う必要性が更に高まっており、解析結果のばらつきや再現性の問題が一層顕在化する傾向にある。【０００７】
そこで、本発明は、かかる事情に鑑みてなされたものであり、種々のプロトコールに対応することができ、かかるばらつきを十分に抑え、且つ、再現性を向上させて信頼性の高い解析結果を得ることが可能な試料調製装置及び方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明による試料調製装置は、生体分子を含む物質（例えば、電気泳動によって分離され切り出された各種タンパク質のゲルスポット等の担体に生体分子が担持された試料、その他液状又は固状の試料等；以下「生体分子含有物質」と称する場合がある）から被検体試料を調製するためのものであって、その生体分子含有物質が収容される第一の容器と、第一の容器内へ注入される溶液が収容される第二の容器と、第二の容器に収容された溶液を第一の容器へ注入する分注手段と、第一の容器を移動自在に保持する移動保持手段と、保持手段を振とうさせて第一の容器内の生体分子含有物質及び溶液を撹拌する振とう手段と、振とうされた後の溶液を第一の容器から排出させて被検体試料を第三の容器に回収する回収手段とを備える。【０００９】
このように構成された試料調製装置においては、第一の容器に生体分子含有物質が第一の容器に収容される。一方、第二の容器には、その第一の容器内へ注入される適宜の溶液が収容される。この溶液は、分注手段によって、第二の溶液から第一の容器内へ注入される。この第一の容器は、移動保持手段によって所望の位置に移動され、その状態で保持される。【００１０】
適宜の位置に移動保持された第一の容器は、振とう手段によって振とうされ、これにより、第一の容器内の生体分子を含む物質と溶液とが撹拌される。このとき、移動保持手段を介して第一の容器を振とうさせるようにしてもよい。こうして、その生体分子含有物質に含まれる生体分子と溶液とが十分に混合される。よって、単に生体分子含有物質へ溶液を注入して静止した状態でインキュベーション等の処理を行う場合に比して、生体分子含有物質中の生体分子と溶液との接触頻度が増大され、化学反応や化学操作が不均一に進行してしまうことが抑制される。更には、質量分析において妨げとなる各種塩を効率的に洗浄除去することもできる。また、第一の容器を移動させて所望の位置で所望の振とう操作、更には、必要であれば他の操作が可能なので、複数の処理、すなわち、複数種類の溶液と生体分子含有物質との相互作用を順次実施するようなプロトコールにおける一連の処理を、連続して自動で処理し得る。【００１１】
さらに、このように振とう処理が行われた後の溶液が第一の容器から排出され、生体分子含有物質中の生体分子と相互作用した溶液が、他の処理操作用の被検体試料として第三の容器に回収される。このような回収処理も、例えば、移動保持手段によって、第一の容器を適宜の所望の場所に移動せしめて実施し得るので、回収のための機構、装置等を装備し易くなる。【００１２】
また、第二の容器は、種類が互いに異なる複数の溶液が個別に収容されるものであると好ましい。通常のプロトコールの手順は、工程毎に種々の溶液（例えば、化学試薬、消化酵素等）を生体分子含有物質に供給して所定の条件でインキュベーションした後に、その溶液を都度回収する。そのようなプロトコールに必要な種々の溶液が第二の容器に収容されていれば、各溶液と生体分子含有物質との相互作用が、移動保持手段及び振とう手段を用いて好適に実施される。【００１３】
さらに、振とう手段が、溶液の種類に応じて撹拌速度が調節されるものであることがより好ましい。各溶液と生体分子含有物質との混合条件は、それらの相互作用によって好適な条件が異なる。よって、本発明による試料調製装置は、振とう手段での撹拌速度を各溶液に応じて一定の値に調節することにより、生体分子含有物質中の生体分子と溶液との相互作用が、十分に且つ再現性よく実施される。【００１４】
より具体的には、第一の容器が載置される領域及び第二の容器が載置される領域が連設されており、振とうが実施される領域及び被検体試料が回収される領域が、第一の容器が載置される領域及び第二の容器が載置される領域と併設されているものであると、一層好適である。こうすれば、言わば静的な処理である第二の容器から第一の容器への分注操作を行う領域（エリア）と、動的な処理である振とう操作等を行う領域とを分離できるので、プロセス管理上好ましい。【００１５】
加えて、振とうされた後の溶液を含む第一の容器内へガスを供給して第一の容器内を加圧する加圧手段を更に備えると一層好適である。また、加圧手段は、より効率的に加圧するため、加圧に際して密閉手段（例えば、シリコンゴム等の弾性体等）を備えることが好ましい。【００１６】
また、本発明による試料調製方法は、本発明による試料調製装置を用いて有効に実施される方法であり、生体分子含有物質から被検体試料を調製するための方法であって、その生体分子含有物質を第一の容器へ収容する収容工程と、第一の容器内へ注入される溶液を第二の容器へ収容する溶液収容工程と、第二の容器に収容された溶液を第一の容器へ注入する分注工程と、第一の容器を所定の領域に移動せしめて保持する移動保持工程と、保持手段を振とうさせて第一の容器内の生体分子含有物質及び溶液を撹拌する振とう工程と、振とう工程を実施した後に、溶液を第一の容器から排出させて被検体試料を第三の容器に回収する回収工程とを備える。【００１７】
この場合、溶液収容工程においては、第二の容器として、種類が互いに異なる複数の溶液が個別に収容されるものを用いると有用である。【００１８】
さらに、回収工程においては、第一の容器にガスを供給して第一の容器内を加圧すると好適である。また、回収工程においては、加圧に際して密閉手段（例えば、シリコンゴム等の弾性体等）を用いることが好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の試料調製装置及び方法によれば、第一の容器に収容した生体分子含有物質に、第二の容器から溶液を供給し、その後、移動保持手段によって第一の容器が移動保持され、さらに、所望の条件でその第一の容器が振とうされることにより十分に撹拌される。そして、その溶液が被検体試料として回収されるので、生体分子含有物質からの目的成分の抽出分離が高い効率で実施され、且つ、処理操作の再現性が極めて高められる。よって、種々のプロトコールに対応した処理を実現することができ、被検体試料が供される分析処理におけるばらつきを十分に抑え、且つ、その再現性を向上させて信頼性の高い解析結果を得ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、上下左右等の位置関係は、特に断らない限り、図面に示す位置関係に基づくものとする。また、図面の寸法比率は、図示の比率に限られるものではない。【００２１】
図１は、本発明による試料調製装置の好適な一実施形態を概略的に示す正面図である。また、図２は、図１におけるII−II線に沿う断平面図である。さらに、図３は、図１に示す試料調製装置の右側面図である。処理装置１００（試料調製装置）は、質量分析に供する被検体試料を調製するための前処理装置、例えば、後述するゲル内酵素消化を利用したペプチドマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ）法により、二次元電気泳動によって分離されたタンパク質スポット同定用の質量分析に供する被検体試料を調製するための前処理装置である。処理装置１００は、筐体１内のベース２上に、チップ廃棄部３、チップステージ４、試薬リザーバ５，６（共に、第二の容器）が一列に配置され、それらに対して、チップ温度調節部７、バキュームマニホールド８，９が併設されたものである。【００２２】
チップステージ４は、複数のチップ４２が例えばアレイ状に配置されたチップホルダ４１が載置されるものである。チップ４２は、細長尺の略筒状をなしており、チップホルダ４１上への配置数は特に制限されないが、図示の例では、容量２００μＬのチップが８列×１２行（処理装置１００の奥行き方向に直交する方向を‘列’方向とする。以下同様。）で９６個配置される。また、試薬リザーバ５（第二の容器）は、水平断面において奥行きが広く幅狭に形成された凹部５１を有しており、その凹部５１内に適宜の試薬（溶液）が収容されるようになっている。また、試薬リザーバ５は、凹部５１内に収容された試薬を、一定の温度、例えば常温に保持する恒温槽として機能する。【００２３】
さらに、試薬リザーバ６（第二の容器）は、凹部５１と同等形状の凹部６１が処理装置１００の長手方向に複数（図示の例では１０個）設けられたものであり、各凹部６１内に互いに異なる適宜の試薬溶液（溶液）が収容されるようになっている。またさらに、試薬リザーバ６は、凹部６１，…内に収容された試薬を、例えば４℃といった低温に保持する（４℃インキュベーション）恒温槽として機能する。【００２４】
また、一列に配置されたこれらのチップ廃棄部３、チップステージ４、及び試薬リザーバ５，６の鉛直上方には、分注ヘッド１０（分注手段）が設けられている。分注ヘッド１０は、奥行き方向にチップ４２，…と同数分（図示の例では８つ）並列配置された分注用シリンジプローブ１１を備えている。分注ヘッド１０は、それ自体が、列方向（図示矢印Ｘ方向）及び奥行き方向（図示矢印Ｙ方向）に駆動されると共に、シリンジプローブ１１が、鉛直方向（図示矢印Ｚ方向）に駆動されるようになっている。分注ヘッド１０の駆動方法は、特に制限されず、例えば、分注ヘッド１０上方に設けられた公知のガイドレールを有する一方向ステージやＸ−Ｙステージ等を利用できる。また、シリンジプローブ１１の鉛直方向の駆動方法も特に制限されず、公知のモータ装置を利用でき、或いは、分注ヘッド１０と共に可動するＸ−Ｙ−Ｚステージを用いてもよい。【００２５】
さらに、チップ温度調節部７、及びバキュームマニホールド８，９の装置後方には、把持振とうユニット１５が隣設されている。把持振とうユニット１５は、列方向（図示Ｘ方向）に駆動されるステージ１５１に、フィルタープレート８１（保持具）を把持可能であり且つ奥行き方向（図示Ｙ方向）に駆動されるアーム状のロボットハンド１５２（保持手段）が取り付けられたものである。また、把持振とうユニット１５は、ロボットハンド１５２に接触するＰＺＴ素子１５３を有している。これにより、ロボットハンド１５２に把持された状態のフィルタープレート８１が所定の振とう速度で振とうされる。このように、把持振とうユニット１５は、本発明の移動保持手段と振とう手段とを兼ねたものである。【００２６】
さらに、把持振とうユニット１５には、ロボットハンド１５２で把持したフィルタープレート８１の上部全体を覆うように開閉可能で且つ遮光性を有するカバー（図示せず）が設けられている。このカバーが閉じられた状態で、フィルタープレート８１が封止且つ遮光されると共に、窒素ガス供給口２１に接続された窒素ガス源（図示せず）から供給される窒素ガスによって、その封止空間が窒素パージされるようになっている。【００２７】
ここで、フィルタープレート８１は、例えば、複数のウェル８２（第一の容器）が配置されているものが挙げられる。複数のウェル８２の配置数は、特に制限されないが、例えば、８列×１２行で９６個配置されるものが挙げられる。また、ウェル８２は、底面にフィルター８３を有することが好ましい。フィルター８３としては、例えば、ＰＶＤＦメンブレン等が挙げられる。【００２８】
一方、チップ温度調節部７は、把持振とうユニット１５によって移動されてきたフィルタープレート８１が載置されるものであり、且つ、フィルタープレート８１に搭載された状態のウェル８２，…（第一の容器）の内容物を、例えば３７℃といった温度に保持する（３７℃インキュベーション）恒温槽として機能する。また、バキュームマニホールド９は、図示しない減圧排気系が接続された排気口２０に接続されており、把持振とうユニット１５によって移動されてきたフィルタープレート８１上の各ウェル８２の内容物を、いわゆる‘真空引き’によってウェル８２から回収するためのものである。さらに、バキュームマニホールド８も、図示しない減圧排気系が接続された排気口２０に接続されており、ウェル８２内の残液排出／減圧洗浄を行うものである。【００２９】
また、筐体１には、棒状の取手部Ｈが設置された前方扉１ａが設けられており、前方扉１ａを上方に押し上げた状態で、ベース２上方の空間が開放され、前方扉１ａが下方に押し下げられた状態で、ベース２上方の空間が外部から遮断される。さらに、前方扉１ａにはガラス窓Ｗ１が設けられており、またさらに、筐体１の側壁には、ガラス窓Ｗ２が設けられており、これらにより内部が視認可能とされている。【００３０】
また、前方扉１ａ下の前面パネル３０は、下方にせり出すように傾斜しており、非常停止ボタン３１、タッチパネル３２、バキュームマニホールド８，９内の減圧モニタ３３、等が設けられている。さらにまた、前面パネル３０と連通する側面３４には、窒素ガス圧力計３５、排熱口３６、チップ温度調節部７の温度調節器３７、及び試薬リザーバ６の温度調節器３８が設けられている。【００３１】
このように構成された処理装置１００を用いた本発明による試料調製方法の一実施形態を実施する手順の一例について、以下に説明する。この手順は、ゲル内酵素消化を利用したＰＭＦ法により、二次元電気泳動によって分離されたタンパク質スポットからペプチドを抽出し、質量分析用の被検体試料を調製する方法である。【００３２】
まず、生体分子含有物質として、タンパク質スポットのゲル片を切り出し、洗浄する。具体的には、二次元電気泳動に供されたポリアクリルアミドゲル上から等電点又は分子量に偏在が極力なく且つ含有量が比較的高いタンパク質スポットを画像処理等によって複数選択する。次に、選択されたタンパク質スポットを含むゲル片を切り出す。【００３３】
次いで、上記各ゲル片（生体分子含有物質の一例）をフィルタープレート８１の各ウェル８２内に収容する（収容工程）。このフィルタープレート８１をバキュームマニホールド８に載置する。これと並行して、以下の各試薬を準備し、試薬リザーバ５，６の適宜の位置の凹部５１，６１，…内に収容する（溶液収容工程；以下、試薬リザーバ６に収容されているものとして説明する。）。【００３４】
・ｐＨを８．５に調製したＴｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ液  
・還元用液
・アルキル化用液
・水／メタノール／酢酸＝４：５：１の混合液
・炭酸水素アンモニウム
・脱染色液
・アセトニトリル１００％液
・トリプシン（０．１％オクチルグリコシド、又は０．１％５−ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−ｐｅｎｔｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅ）
・アセトニトリル／水／０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）＝１：１の混合液
・アセトニトリル／水／０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）＝７：３の混合液【００３５】
次に、ゲル内消化に先立って脱染色を実施する。具体的には、まず、分注ヘッド１０のシリンジプローブ１１，…が、チップホルダ４１に載置されたチップ４２上に位置するように、分注ヘッド１０を移動させる。さらに、シリンジプローブ１１，…を下方へ移動させ、各シリンジプローブ１１にチップ４２を装着させる。次に、分注ヘッド１０のシリンジプローブ１１，…が、試薬リザーバ６に収容された脱染色液に位置するように、分注ヘッド１０を初期位置から移動させる。次いで、複数のシリンジプローブ１１，…を、チップ４２の先端が脱染色液に浸漬するまで下方に移動させて停止し、適宜の量（例えば２００μＬ）を吸入した後、シリンジプローブ１１，…が鉛直方向の初期位置に来るように上方に移動させる。【００３６】
それから、分注ヘッド１０のシリンジプローブ１１，…が、バキュームマニホールド８に載置されたフィルタープレート８１の各ウェル８２上に位置するように、分注ヘッド１０を移動させる。さらに、シリンジプローブ１１，…を下方へ移動させ、チップ４２の内部に吸入保持していた脱染色液をウェル８２内に注入する（分注工程）。この分注操作は、溶液が異なっても同様であり、以下の説明では詳述を省略する。【００３７】
この分注操作を繰り返し、フィルタープレート８１上の全てのウェル８２に脱染色液を分注する。次に、フィルタープレート８１を把持振とうユニット１５で把持し、ステージ１５１とロボットハンド１５２とを駆動させて、フィルタープレート８１をチップ温度調節部７の所定位置に設置する（移動保持工程）。この把持状態のまま、ＰＺＴ素子１５３を運転し、５分間、ウェル８２内に収容されたゲル片及び脱染色液を、比較的高速な振とう速度で撹拌する（振とう工程）。以下、比較的低速な条件での振とう撹拌を「低速撹拌」といい、比較的高速な条件での振とう撹拌を「高速撹拌」という。【００３８】
振とう後、把持振とうユニット１５を駆動させ、フィルタープレート８１をバキュームマニホールド８に移載し、減圧排気系を運転してウェル８２内に残存する脱染色液を吸引排出する。それから、把持振とうユニット１５を駆動させ、フィルタープレート８１をチップ温度調整部７又はバキュームマニホールド８に移載する。【００３９】
以上の分注、振とう撹拌、及び吸引排出に至る操作は、他の試薬溶液に対しても同様に実行されるので、以下の説明においては、重複する内容を適宜省略する。【００４０】
次に、脱染色液の代わりに還元用液を分注し、室温で３０分間、高速撹拌した後、残存液を吸引排出する。それに引き続き、アルキル化用液を分注し、室温で３０分間、高速撹拌した後、残存液を吸引排出する。これらの処理により、ゲル片に含まれるタンパク質を還元・アルキル化せしめる。【００４１】
それから、水／メタノール／酢酸混合液を分注し、３０分間高速撹拌し、残存液を吸引排出する一連の処理を４〜５回繰り返して洗浄した後、炭酸水素アンモニウムを分注し、３分間低速撹拌した後、残存液を吸引排出することにより、ゲル片を平衡化する。【００４２】
次に、還元・アルキル化され洗浄及び平衡化されたゲル片にゲル内消化を施す。具体的には、アセトニトリルを分注して、５分間高速撹拌した後、残存液を吸引排出して、ゲル片の脱水を行う。それから、トリプシンを、例えば０．５〜３μＬ程度分注し、５〜１０分程静置してゲル片を膨潤させる。【００４３】
次いで、炭酸水素アンモニウムを、例えば１０〜２０μＬ程度分注し、３７℃で５〜１２時間程度保温した後、アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ水溶液＝１：１の混合液を、例えば１００μＬ分注し、１５分間高速撹拌した後、把持振とうユニット１５を駆動させ、フィルタープレート８１をバキュームマニホールド９に移載し、減圧排気系を運転してウェル８２内の溶液（被検体試料）を回収プレート９１上のウェル９２（第三の容器）に吸引回収する（回収工程）。さらに、アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ水溶液＝７：３の混合液を、１５分間高速撹拌した後、バキュームマニホールド９にて、ウェル８２内の溶液（被検体試料）を回収プレート９１上のウェル９２に吸引回収する（回収工程）。以上により、ゲル内消化、及びそれによって生じたペプチドが回収液へ抽出される。【００４４】
そして、被検体試料として処理装置１００から回収されたこれらの回収液を合わせ、例えば１〜５μＬ程度になるまで遠心濃縮する。さらに、それを完全に乾燥させた後、別途調製しておいた５％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ混合液（例えば５μＬ程度）に溶解し、質量分析用の試料を得る。なお、不要となったチップ４２は、チップ廃棄部３へ廃棄される。【００４５】
このように構成された処理装置１００及びそれを用いた本発明の試料調製方法によれば、アレイ状に多数配置されたウェル８２，…に収容されたゲル片に、プロトコールに応じた試薬溶液が分注され、把持振とうユニット１５によって、フィルタープレート８１ごとチップ温度調節部７へ移載される。そして、適宜の撹拌速度で振とう・撹拌が施される。これにより、一連の自動化処理の中で、ゲル片に含まれるタンパク質分子と試薬溶液とが十分に混合される。【００４６】
よって、単にゲル片へ試薬溶液を注入して静止した状態でインキュベーション等の処理を行う場合に比して、ゲル片中のタンパク質分子と溶液との接触頻度が増大され、化学反応や化学操作が不均一に進行してしまうことを抑制でき、また、脱塩、洗浄などの操作を効率的に行うことができる。したがって、最終的にゲル片から抽出される被検体試料中の目的成分の濃度が高められると共に抽出効率の再現性を向上できる。これにより、被検体試料を用いて行われる質量分析においても、高感度、高確度、高精度、及び高い再現性を有する解析結果を得ることができる。また、自動化処理によるので、操作者の技能の差異に起因するような再現性の低下を抑止できる。【００４７】
さらに、フィルタープレート８１が、把持振とうユニット１５のアーム状のロボットハンド１５２の先端部に保持された状態、すなわち、把持振とうユニット１５の基部よりも距離が離れた状態で振とうされるので、フィルタープレート８１内の内容物をより激しく撹拌し易くなる。よって、ゲル片に含まれるタンパク質分子と試薬溶液とが更に良く混合され、抽出効率を一層向上できる。【００４８】
またさらに、把持振とうユニット１５によってフィルタープレート８１をバキュームマニホールド８，９に適宜移載し、その場で、ウェル８２内の残存液の吸引排出や、被検体試料の吸引回収を実施できるので、それらのバキュームマニホールド８，９のような溶液を回収／排出洗浄するための機構の配置設計裕度を高めることができる。さらにまた、試薬リザーバ６に異なる複数種類の試薬溶液を収容しておくことできるので、工程毎に種々の試薬溶液を必要とするプロトコールを実施する際の処理性能（スループット）を向上できる。しかも、把持振とうユニット１５によって、試薬溶液の種類に応じて撹拌速度を再現性よく調節できるので、最終的な回収試料の回収効率（化学収率）及び回収量の再現性を一層高めることができる。【００４９】
加えて、筐体１内のベース２上に、チップ廃棄部３、チップステージ４、試薬リザーバ５，６（共に、第二の容器）が一列に配置され、それらに対して、チップ温度調節部７、バキュームマニホールド８，９が併設されているので、フィルタープレート８１が静置された言わば静的な処理である分注操作を行う領域（エリア）と、フィルタープレート８１を振とうさせるような言わば動的な処理である操作を行う領域とを分離でき、プロセス管理上好ましい。また、チップ温度調節部７において、窒素ガスパージを行うことにより、不活性な雰囲気下で、振とう操作を実行できるので、空気中の例えば酸素による酸化等の不都合な反応を抑制することができ、回収試料中の抽出成分の濃度等における再現性を更に確実に維持できる。【００５０】
また、フィルタープレート８１を側方（横方向）からロボットハンド１５２で把持するので、フィルタープレート８１の直下方にバキュームマニホールド８，９を位置させることができ、これにより、フィルタープレート８１を下方から支える場合に比してウェル８２内の試薬溶液を回収し易くすることができる。【００５１】
ここで、図４は、本発明による試料調製装置の好適な他の実施形態の要部を概略的に示す右側断面図である。処理装置２００（試料調製装置）は、窒素ガス加圧ヘッド７０（加圧手段）を備えること以外は、処理装置１００と同様に構成されたものである。【００５２】
窒素ガス加圧ヘッド７０は、奥行き方向（図示矢印Ｙ方向）にウェル８２，…と同数分（図示の例では一部省略しているが８つ）並列配置されたノズル７１を備えている。窒素ガス加圧ヘッド７０は、それ自体が、列方向（図２における矢印Ｘ方向）及び奥行き方向（図示矢印Ｙ方向）に駆動されると共に、ノズル７１が、鉛直方向（図示矢印Ｚ方向）に駆動されるようになっている。窒素ガス加圧ヘッド７０の駆動方法は、分注ヘッド１０と同様に特に制限されず、例えば、窒素ガス加圧ヘッド７０上方に設けられた公知のガイドレールを有する一方向ステージやＸ−Ｙステージ等を利用できる。また、ノズル７１の鉛直方向の駆動方法も特に制限されず、公知のモータ装置を利用でき、或いは、窒素ガス加圧ヘッド７０と共に可動するＸ−Ｙ−Ｚステージを使用してもよい。【００５３】
また、ノズル７１の先端部（図示下端部）には、環状溝Ｒが形成されており、その環状溝Ｒには、シリコンゴム等の弾性体で形成された環状リング７２(密閉手段)が嵌合されている。さらに、ノズル７１は、環状リング７２よりも先端の部分にテーパが形成されており、その先端がフィルタープレート８１に並置されたウェル８２の内部に挿入されるようになっている。またさらに、ノズル７１の他方端（図示上端）には、窒素ガス供給口２１（図２参照）に接続された窒素ガス供給管７３が継手７４を介して接続されている。【００５４】
このように構成された処理装置２００によれば、ゲル片Ｇと試薬溶液Ｌが収容されて振とう操作が施されたウェル８２を含むフィルタープレート８１をロボットハンド１５２で把持してバキュームマニホールド９上に移載させた後、窒素ガス加圧ヘッド７０のノズル７１，…が各ウェル８２上に位置するように、窒素ガス加圧ヘッド７０をバキュームマニホールド９の上方の所定位置に移動させる。それから、ノズル７１，…を下方へ移動させ、ノズル７１の先端をウェル８２内へ挿入し且つ環状リング７２をウェル８２の上端周縁に当接させてウェル８２の上部開放端を環状リング７２で封止する。【００５５】
このとき、ノズル７１の環状リング７２を含む先端部をバネ等の弾性体で予め付勢しておき、環状リング７２がウェル８２の上端周縁と当接した状態で環状リング７２がウェル８２側へ所定の押付圧で押し付けられるようにすると、ウェル８２と環状リング７２との密着性ひいてはウェル８２内の密閉性がより高まるので好ましい。【００５６】
この状態で、図示しない窒素ガス源から窒素ガス供給管７３を通して窒素ガス（Ｎ２）を所定圧で各ノズル７１へ供給する。ノズル７１の内部空間Ｋを流通した窒素ガスＮｇは、ノズル７１の先端からウェル８２内に送出される。これにより、窒素ガスＮｇによってウェル８２内部が加圧され、試料溶液Ｌがウェル８２の下方開放端８２ａから下方へ押し出される。そして、試料溶液Ｌは、フィルター８３を通過してバキュームマニホールド９内で回収プレート９１のウェル９２内に回収される（回収工程）。【００５７】
この際、環状リング７２によってウェル８２の上方端が封止され、ウェル８２内部が密閉状態とされるので、供給された窒素ガスＮｇの圧力がウェル８２の外部へ散逸せずにウェル８２の内圧が十分に高められる。よって、ウェル８２内に収容された試薬溶液Ｌの回収効率を更に高めることができる。したがって、窒素ガス加圧ヘッド７０を備える処理装置２００は、試料の回収効率が特に重要視されるプロテオーム解析（プロテオミクス）に特に有用である。【００５８】
なお、処理装置２００においても、上述した処理装置１００と同等の作用効果が奏されるが、重複した説明を避けるため、ここでの詳述は省略する。【００５９】
また、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、その要旨を変更しない限度において様々な変形が可能である。例えば、処理装置１００，２００で処理される試料はゲル片に限られず、ゲル片以外の固（体）状、又は液（体）状試料でもよい。また、処理装置１００，２００は、ゲル内消化を伴う処理操作のみに限られず、生体試料を含む他の担体の種々の前処理に適用できる。さらに、フィルタープレート８１に保持されるウェル８２、及び回収プレート９１のウェル９２の数量や、試薬リザーバ６に設けられた凹部６１の員数、ベース２上のレイアウト等は図示に限定されない。またさらに、シリンジ１１とノズル７１とを共通化して一体に設けてもよく、或いはそれぞれ個別に別体のものとして設けてもよい。【００６０】
また、実施形態で説明したプロトコールに用いる各種試薬溶液の種類、それらの具体的な組成や混合割合、及び使用量はあくまでも例示であって、本発明がそれらに限定されることはない。さらにまた、試薬溶液のうちトリプシンに用いる界面活性剤として、０．１％オクチルグリコシド、又は０．１％５−ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−ｐｅｎｔｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅを一例として列挙したが、これらのなかでは、０．１％５−ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−ｐｅｎｔｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅがより好ましい。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
以上説明した通り、本発明による試料調製装置及び方法は、第一の容器を移動自在に保持する移動保持手段と、その移動保持手段を振とうさせて第一の容器内の生体分子含有物質及び溶液を撹拌する振とう手段とを備えるので、種々のプロトコールに対応することができ、従来の試料前処理で問題となっていたばらつきを十分に抑え、且つ、再現性を向上させて信頼性の高い解析結果を得ることが可能となる。よって、生体分子を含む物質の分析及びそのための試料調製に広く利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明による試料調製装置の好適な一実施形態を概略的に示す正面図である。
【図２】図１におけるII−II線に沿う断平面図である。
【図３】図１に示す試料調製装置の右側面図である。
【図４】本発明による試料調製装置の好適な他の実施形態の要部を概略的に示す右側断面図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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