(57)【要約】  Leu-Ileの新たな用途を提供する。(a)〜(c)のいずれかの化合物を有効成分として含有するAkt活性化剤：(a)Leu及びIleからなるペプチド；(b)Leu及びIleからなるペプチドの修飾体；(c)薬学的に許容可能な、(a)又は(b)の塩。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)〜(c)のいずれかの化合物を有効成分として含有するAkt活性化剤：
(a)Leu及びIleからなるペプチド；
(b)Leu及びIleからなるペプチドの修飾体；
(c)薬学的に許容可能な、(a)又は(b)の塩。
【請求項２】
前記ペプチドがLeu−Ileである、請求項１に記載のAkt活性化剤。
【請求項３】
Hsp90の結合によってAktが活性化される経路を介してAktを活性化することを特徴とする、請求項１又は２に記載のAkt活性化剤。
【請求項４】
パーキンソン病、脊髄損傷、アルツハイマー病、水頭症、脳損傷、脳梗塞、痴呆症、リューマチ症、又は統合失調症の治療又は予防に使用されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のAkt活性化剤。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載のAkt活性化剤を含有する食品。
【請求項６】
以下のステップを含む、パーキンソン病、脊髄損傷、アルツハイマー病、水頭症、脳損傷、脳梗塞、痴呆症、リューマチ症、又は統合失調症の予防又は治療方法：
(A)請求項１〜３のいずれかに記載のAkt活性化剤を生体に投与するステップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はAkt活性化剤に関する。本発明のAkt活性化剤はAktの活性化を介して、Aktが関与する疾患の治療や予防に利用できる。
【背景技術】
【０００２】
近年、日本の将来を担う若年層において薬物乱用者が増え、薬物依存症が大きな社会問題となりつつある。そのため、薬物依存形成機構の解明および治療法の開発は緊急を要する課題である。これまでの研究では、glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)が薬物依存を抑制することが報告されている（Green-Sadan et al., 2003; Messer, 2000（非特許文献１及び２））。しかし、GDNFは高分子タンパク質であり、血液脳関門を通過できずに血中のプロテアーゼによって分解されてしまうため、末梢からの投与では治療効果を得ることが困難である。そこで、我々はGDNFを産生誘導する低分子量の疎水性ジペプチドLeu-Ile (Nitta et al., 2004（非特許文献３）)を用いて薬物依存に対する治療効果を検討した。
国内で最も多く乱用されている覚醒剤メタンフェタミンを投与したマウスに対してLeu-Ileを投与したところ、Leu-Ileはメタンフェタミンによって引き起こされる場所嗜好性および運動量の増加を抑制し、すでに形成されてしまった場所嗜好性や運動量の増加に対しても抑制効果のあることが示された(Nitta et al., 2003（非特許文献４）)。これらの研究によって、Leu-Ileが薬物依存の治療薬となる可能性が示唆された。しかし、Leu-Ileが生体内でどのタンパク質と結合し、どの様なシグナル経路を介してGDNFを産生誘導しているのかはまだ解明されていない。
GDNFは薬物依存のみでなく、胎児中胚葉由来ドーパミン作動性神経を始め運動神経細胞、海馬神経細胞、大脳皮質神経細胞などに対して保護作用を持ち(Houenou et al., 1996; Lin et al., 1993; Trupp et al., 1997; Wang et al., 1997（非特許文献５〜８）)、パーキンソン病や脊髄損傷の治療薬としての応用も期待されている。厚生労働省の調査によると、日本国内のみでも、パーキンソン病の患者数は14万1千人（平成14年度患者調査）、脊髄損傷の患者数は10万人（平成13年身体障害児・身体障害者実態調査）となっており、多くの人々が、現在の医療技術では治療困難な神経変性疾患を抱えている。
文部科学省では、これらの疾患や動脈硬化症などの生活習慣病に対して再生医療を用いた新しい治療法の実用化を目指すため、平成1５年度より「再生医療の実現化プロジェクト」に着手した。再生医療が実現すれば、これまでの医療を根本的に変革する革新的医療技術となりうる。その中で、「幹細胞」を用いた再生医療を実現させるためには、細胞増殖や分化調節に関する機構の解明が必要である。初期神経発生にも深く関わりを持つGDNFなどの神経栄養因子は、神経幹細胞の増殖、分化に於いても重要な制御因子となると考えられている(Lee et al., 2005; Riaz et al., 2004; Roussa and Krieglstein., 2004; Tzeng et al., 2004; Yoo et al., 2003（非特許文献９〜１３）)。【０００３】
【非特許文献１】Green-Sadan T, Kinor N, Roth-Deri I, Geffen-Aricha R, Schindler CJ, Yadid G: Transplantation of glial cell line-derived neurotrophic factor-expressing cells into the striatum and nucleus accumbens attenuates acquisition of cocaine self-administration in rats. Eur J Neurosci, 18: 2093-2098 (2003)
【非特許文献２】Messer CJ, Eisch AJ, Carlezon WA Jr, Whisler K, Shen L, Wolf DH, Westphal H, Collins F, Russell DS, Nestler EJ: Role for GDNF in biochemical and behavioral adaptations to drugs of abuse. Neuron, 26: 247-257 (2000)
【非特許文献３】Nitta A, Nishioka H, Fukumitsu H, Furukawa Y, Sugiura H, Shen L, Furukawa S:  Hydrophobic dipeptide Leu-Ile protects against neuronal death by inducing brain-derived neurotrophic factor and glial cell line-derived neurotrophic factor synthesis. J Neurosci Res, 78: 250-258 (2004)
【非特許文献４】Nitta A, Yamada Y, Nakajima A, Noda Y, Yamada K, Nabeshima T: Candidate genes or compounds for therapeutic tools against methamphetamine and/or morphine-induced dependence. Folia Pharmacologica Japonica, 122: 81-83 (2003)
【非特許文献５】Houenou LJ, Oppenheim RW, Li L, Lo AC, Prevette D: Regulation of spinal motoneuron survival by GDNF during development and following injury. Cell Tissue Res, 286: 219-223 (1996)
【非特許文献６】Lin LF, Doherty DH, Lile JD, Bektesh S, Collins F: GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science, 260: 1130-1132 (1993)
【非特許文献７】Trupp M, Belluardo N, Funakoshi H, Ibanez CF: Complementary and overlapping expression of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), c-ret proto-oncogene, and GDNF receptor-alpha indicates multiple mechanisms of trophic actions in the adult rat CNS. J Neurosci, 17: 3554-3567 (1997)
【非特許文献８】Wang Y, Lin SZ, Chiou AL, Williams LR, Hoffer BJ: Glial cell line-derived neurotrophic factor protects against ischemia-induced injury in the cerebral cortex. J Neurosci, 17: 4341-4348 (1997)
【非特許文献９】Lee CS, Tee LY, Dusenbery S, Takata T, Golden JP, Pierchala BA, Gottlieb DI, Johnson EM Jr, Choi DW, Snider JB: Neurotrophin and GDNF family ligands promote survival and alter excitotoxic vulnerability of neurons derived from murine embryonic stem cells. Exp Neurol, 191: 65-76 (2005)
【非特許文献１０】Riaz SS, Theofilopoulos S, Jauniaux E, Stern GM, Bradford HF: The differentiation potential of human foetal neuronal progenitor cells in vitro. Brain Res Dev Brain Res, 153: 39-51 (2004)
【非特許文献１１】Roussa E, Krieglstein K: GDNF promotes neuronal differentiation and dopaminergic development of mouse mesencephalic neurospheres. Neurosci Lett, 361: 52-55 (2004)
【非特許文献１２】Tzeng SF, Tsai MJ, Hung SC, Cheng H: Neuronal morphological change of size-sieved stem cells induced by neurotrophic stimuli. Neurosci Lett, 367: 23-28 (2004)
【非特許文献１３】Yoo YM, Kim YJ, Lee U, Paik DJ, Yoo HT, Park CW, Kim YB, Lee SG, Kim WK, Yoo CJ: Neurotrophic factor in the treatment of Parkinson disease. Neurosurg Focus, 15: 1 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
GDNFは神経保護作用を有し、神経変性疾患治療への応用が期待される。しかし、GDNFは、末梢投与では血液脳関門を通過できず、血中のプロテアーゼによって分解されてしまうため、脳への作用は期待できない。そのため、経口投与によって、脳または神経組織内でGDNFの産生量を効果的に増やせるような薬の開発が望まれる。そのような化合物を探索する中で、本発明者らはLeu-Ileを見出した（既報）。しかしながら、Leu-IleがどのようにしてGDNFを産生誘導するのかについては全く分かっていない。
そこで本発明は、その作用点及び作用機序を明らかにすることでLeu-Ileの新たな用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らはLeu-IleのGDNF産生調節機構を解明することを目的として研究を行い、以下の知見を得るに至った。
(1)Leu-Ileは細胞膜透過性である。
(2)FITC標識したLeu-Ileとマウス脳ホモジナイズ液を反応させたところ、70KDの大きさのタンパク質が結合した。
(3)Leu-Ile結合タンパク質の質量分析を行った結果、Hsc70が同定された。
(4)水晶発振子バイオセンサーを用いてHsc70およびHsc70と相同性の高いHsp70とLeu-Ileの結合活性について検討したところ、Hsc70はKd = 1.83×10-8 M、Hsp70はKd = 1.24×10-8 Mの強さでLeu-Ileと特異的に結合した。
(5)分子シミュレーションを用いてHsc70とLeu-Ileの結合部位を予測し、相互ポテンシャルエネルギーを計算した結果、ATPaseドメインには-119.044 kCal、基質結合ドメインには-76.711 kCal、C末端ドメインには-64.337 kCalの強さでLeu-Ileが結合し、Hsc70はATPaseドメインと結合する可能性が高いことが示唆された。
(6)Leu-Ileを作用させた培養海馬神経細胞では、NF-κBが核内に移行し、活性化された。
(7)Leu-Ileを作用させた培養海馬神経細胞では、神経細胞死が抑制され、GDNFの産生が誘導されたが、NF-κB 阻害剤のsulfasalazineとLeu-Ileを同時に作用させた細胞群では、Leu-Ileの効果が抑制された。
(8)Leu-Ileを作用させた培養海馬神経細胞では、コントロール群に比べCREBのリン酸化の程度が増加した。
(9)CREBアンチセンスオリゴヌクレオチドを培養海馬神経細胞に作用させると、Leu-IleのGDNF産生誘導効果が抑制された。
(10)Leu-Ileを作用させた培養海馬神経細胞では、Aktのリン酸化の程度が増加したが、CaMKII、PKC-? およびERKについては変化がなかった。
(11)PI3K阻害剤のLY294002とLeu-Ileを同時に作用させた細胞では、Leu-Ileによって誘導されたAktおよびCREBのリン酸化は抑制されなかった。一方、Hsp90の阻害剤であるgeldanamycinとLeu-Ileを同時に作用させた細胞ではLeu-Ileによって誘導されたAktおよびCREBのリン酸化を抑制した。【０００６】
以上の知見からLeu-IleがHsc70に結合し、Hsp90/Aktの経路（Hsp90が結合することによってAktが活性化される経路）を介してNF-κBおよびCREBを活性化し、GDNFの産生を誘導すると考えられた。Hsp90/Aktのシグナル経路によってLeu-IleがGDNFを産生誘導することが分かり、GDNFの発現調節を担う新たなターゲット遺伝子としてHsc70およびHsp90/Aktを特定することができた。【０００７】
以上のように、Hsp90/Aktを介したシグナル経路によってLeu-IleがGDNFを産生誘導することが明かとなった。即ち、Leu-IleはAktを活性化する作用を有し、この作用が発揮される結果、GDNFの産生が誘導されることが判明した。
本発明者らは、Leu-IleがAkt活性化作用を有する点に注目した。Aktを活性化できるということは、Aktが関与する種々のシグナル経路を調節できることを意味する。従って、Aktが関与するグナル経路を調節することで治療効果や予防効果が得られる疾患に対してLeu-Ileが有効であるといえる。
本発明は、以上の知見及び考察に基づき完成されたものであって、以下の構成を提供する。
本発明は(a)〜(c)のいずれかの化合物を有効成分として含有するAkt活性化剤である。
(a)Leu及びIleからなるペプチド；
(b)Leu及びIleからなるペプチドの修飾体；
(c)薬学的に許容可能な、(a)又は(b)の塩。
本発明の一態様では、有効成分としてのペプチドがLeu−Ileであることを特徴とする。
本発明のAkt活性化剤は好ましくは、 パーキンソン病、脊髄損傷、薬物依存、アルツハイマー病、水頭症、脳損傷、脳梗塞、 痴呆症、リューマチ症、又は統合失調症の治療又は予防に使用される。
本発明の他の態様は、上記Akt活性化剤を含有する食品を提供する。
本発明は更に他の態様として、上記Akt活性化剤を生体に投与するステップを含む、パーキンソン病、脊髄損傷、薬物依存、アルツハイマー病、水頭症、脳損傷、脳梗塞、痴呆症、リューマチ症、又は統合失調症の予防又は治療方法を提供する。
尚、本明細書中では必要に応じて以下の略号を使用する。
AP2: activator protein 2、CEB: cytoplasmic extraction buffer、CREB: cAMP response element binding protein、CsA: cyclosporin A、DMEM: Dulbecco’s modified Eagle’s medium、DTT: dithiothreitol、EDTA: ethylenediamine tetracetic acid、egr-1: early growth response-1、egr-2: earlygrowth response-2、F12HAM: Ham’s nutrient mixture F12、FBS: fetal bovine serum、FGF: fibloblast growth factor、FITC: Fluorescein isothiocyanate isomer 1、FK506: tacrolimus、FKBP: FK506 binding protein、GCF: GC factor、GDNF: glial cell line-derived neurotrophic factor、GFR-α?: GDNF family receptor-α、IL-1β: interleukin-1beta、MALDI: Matrix-assisted laser desorption/ ionization、MNF: myocyte nuclear factor、MRE: metal response element、MS: Mass spectrometry、MTT: methyl thiazol tetrazolium、NCBI: National Center for Biotechnology Information、NEB: nuclear extraction buffer、NF-κB: nuclear factor-kappa B、NRSE: neural-restrictive silencer elements、ODN: oligodeoxynucleotide、PBS: phosphate buffer saline、PDB: protein data bank、PDVF: polyvinylidene fluoride、PI3K: phosphatidylinositol-3 kinase、PMSF: phenylmethansulfonylfluoride、RCSB: Research Collaboratory for Structural Bioinformatics、SDS: sodium dodecyl sulfate、Six2: sine oculis-related homeobox 2 homolog、SP1: trans-acting transcription factor 1、TBS: Tris buffer saline、TFA: trifluoroacetic acid、TNF-α: tumore necrosis factor-alpha、TOF: time of flight-time of flight、Tyr: tyrosine、USF: Up-stream stimulatory factor、YY1: yin yang-1。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】Leu-Ileの細胞膜透過性実験の結果。A：FITC標識Leu-Ile又はFITCのみを培養神経細胞の上清に添加し、30分後の細胞内のFITCの蛍光強度を測定することによって、これらの細胞膜透過の用量依存性を検討した。Ｂ：培養神経細胞にFITC標識Leu-Ile（10μg/ml）を加え、添加後の細胞膜透過に対する時間依存性を検討した。Ｃ：FITC標識Leu-Ile（10μg/ml）とさまざまな濃度のLeu-Ileを一緒に培養神経細胞に添加し、30分後の細胞内FITC蛍光強度を測定したところ、高濃度のLeu-Ileは、FITC標識Leu-Ile添加による蛍光強度増加を抑制した。Ｄ：一方、FITC（10μg/ml）とさまざまな濃度のLeu-Ileを一緒に培養神経細胞に添加し、30分後の細胞内FITC蛍光強度を測定しても、蛍光強度増加を抑制しなかった。
【図２】Leu-Ile結合蛋白の単離実験の結果。(A):レーン1:Ｎ末端側に蛍光標識したLeu-Ileとマウス脳溶解液を4℃または37℃で作用させた。レーン2:Ｃ末端側に蛍光標識したLeu-Ileとマウス脳溶解液を4℃または37℃で作用させた。これらの電気泳動像は、蛍光スキャナーで読み取った。(B):マウス脳溶解液をLeu-Ileを結合させたアフィゲル10(レーン1)又は結合させていないアフィゲル10(レーン2)と反応させ、Leu-Ile結合蛋白を精製した。Leu-Ile結合蛋白について、電気泳動後、銀染色を行い、質量解析を行った。レーン1;Leu-Ile結合蛋白。レーン2;コントロール。矢印は、質量解析を行った蛋白を示す。(C):質量解析に使用したサンプルで、Hsc70のウエスタンブロットを行った。
【図３】Leu-IleとHsc70またはHsp70との結合親和性を水晶振動子で測定した結果。(A):Leu-Ile、Pro-Leu又はIle-Proを、水晶振動子に吸着させ、PBS中に固定した。その後、25℃でHsc70、Hsp70、又は熱変性させたHsc70若しくはHsp70をPBS中に加えていった。そのときの振動数を計数した。解離定数は、ソフトウエアAQUAで計算させた。
【図４】Leu-IleとHscの結合部位を示す。Hsc70のATPaseドメイン（Flaherty et al.,1990）とLeu-Ileは結合する。
【図５】活性化されていないNF-κBの細胞数および、核内での不活性化NF-κB の発現量。(A):Leu-Ile (10 μg/ ml)、TNF-α(100 ng/ml)及びGDNF(50 ng/ml)を30分間細胞に作用させた。(A-a):典型的なNF-κBが活性化されていない細胞。(A-b):典型的なNF-κB-活性化細胞。(A-c):NF-κBが活性化されていない細胞の割合。１枚の各培養皿について、８つの視野について、計数を行い(それぞれ75×55μm)、４枚の培養皿を用いて検討を行った。*P<0.05  対コントロール(Sheffe test)。(B):Leu-Ile(10 μg/ ml)、TNF-α(100 ng/ml)及びGDNF(50 ng/ml)を30分間細胞に作用させ、ウエスタンブロットを行った。典型的な実験結果を示す。その強度についても検討を行い(n=4)、平均±標準偏差で示した。*P<0.05  対コントロール(Sheffe test)。
【図６】培養神経細胞における、細胞生存およびGDNF発現におよぼすNF-κBの影響。(A)sulfasalazine(25 μM)存在または非存在化で培養神経細胞にLeu-Ile(10 μg/ml)を3日間作用させた。細胞生存効果については、MTT法で検討した。Leu-Ileは生存細胞数を増加させたが、sulfasalazineはLeu-Ileのその効果を抑制した。値は(n=6)標準偏差で示した。*P<0.05  対コントロール(Sheffe test)。(B):sulfasalazine存在下または非存在下で、Leu-Ile(10 μg/ml)を１日間作用させた。GDNFの発現量をウエスタンブロットで検討した。典型的な実験結果を示す。実験結果は平均±標準偏差で示した。Leu-IleはGDNFの発現を誘導したが、sulfasalazineはその作用を抑制した。値は(n=4)平均±標準偏差で示した。*P<0.05  対コントロール(Sheffe test)。
【図７】CREBのリン酸化およびGDNFの発現量。(A):培養神経細胞にLeu-Ile(10 μg/ml)を0、10、20または30分間作用させ、リン酸化CREBをウエスタンブロットで測定した。リン酸化CREBは、Leu-Ileを作用させてから２０分後から増加し、３０分後まで維持された。典型的なウエスタンブロットの結果を示した。(B):培養神経細胞にCREBのアンチセンス又はセンスヌクレオチドを(ODN)24時間作用させた。CREBの蛋白量をウエスタンブロットで測定した。(C):CREBのアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの存在下または非存在下でLeu-Ile(10 μg/ml)を24時間作用させた。GDNFの発現量をウエスタンブロットで検討した。Leu-IleはGDNFの発現量を増加させるが、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その作用を抑制した。値は(n=4)平均±標準偏差で示した。*P<0.05  対コントロール(0時間)(Sheffe test)。
【図８】GDNF蛋白及びGDNF mRNAの発現に対するLeu-Ileの作用。Ａ：Leu-Ile、Pro-Leu又はIle-Pro(10μg/ml)を培養神経細胞に添加した場合の24時間後のGDNF蛋白の発現量。Leu-IleのみがGDNF蛋白の発現を増加させる。Ｂ：Leu-Ileを添加後のGDNF mRNAの発現量変化。Leu-Ile を添加後12又は18時間後にGDNF mRNAの発現量が増加している。
【図９】CREBおよびAktのシグナル伝達におけるLeu-Ileの作用。(A):培養神経細胞にLeu-Ile(10 μg/ml)を0、10、20または30分間作用させた。Akt、ERK、CaMKII、およびPKC-γのリン酸化の程度をウエスタンブロットで測定した。(B),(C):Leu-IleおよびPI3k阻害剤またはHsp90阻害剤を30分間作用させた。(B):Aktのリン酸化の程度をウエスタンブロットで測定した。(C):CREBのリン酸化の程度をウエスタンブロットで測定した。典型的なウエスタンブロットの実験結果を示す(上側)。バンドの強度を測定し、数値化した(下側)。値は(n=4)平均±標準偏差で示した。*P<0.05  対コントロール(0時間)(Sheffe test)。
【図１０】予想されるLeu-Ileの作用経路。
【図１１】マスコットサーチの結果。質量解析の結果から得られたアミノ酸断片をマスコットソフトウエアで解析を行った。10個のペプチドが、Hsc70の配列と一致した。
【図１２】ヒトGDNFプロモーターII、エキソン１及び第1イントロンの一部の塩基配列。1から174番目の塩基はエキソン１である。転写因子結合部位には下線を付した。これらのアミノ酸配列はGenBankのAF053749に掲載されている。略語: activator protein 2 (AP-2), early growth response-1 (egr-1), early growth response-2 (egr-2), GC factor (GCF), myocyte nuclear factor (MNF), metal response element-A (MRE-A), metal response element-B (MRE-B), trans-acting transcription factor 1 (SP1), Up-stream stimulatory factor (USF), yin yang-1 (YY1)。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本明細書では慣例の標記法に従い左端がアミノ末端、右端がカルボキシ末端となるようにペプチドを表記する。また、アミノ酸残基がL形の場合には、L形である旨の表示を省略することがある。また、特に記載のない限り本明細書では、ジペプチドをはじめ様々な長さのペプチドを含む用語として「ペプチド」を使用する。【００１０】
本発明の第１の局面はAkt活性化剤に関する。本明細書において「Akt活性化剤」とは、Aktを活性化する作用を有する物質のことをいう。AktはProtein Kinase B (PKB)とも呼ばれるセリン／スレオニンキナーゼであって、PI3キナーゼ経路で活性化される。Aktは細胞周期、インスリン代謝などの様々な現象に関与していることが報告されている。
Aktの活性化によって、Aktを介したシグナル経路が上方調節される。例えばAktの活性化によってNF-κBやCREBが活性化される。このことからAkt活性化剤を、NF-κBやCREBの活性化剤として捉えることもできる。一方、NF-κBやCREBの活性化はBDNFの産生誘導を促す。従って、Akt活性化剤を、BDNFの産生誘導剤として捉えることもできる。【００１１】
本発明のAkt活性化剤は、Aktの活性調節を通して、Aktが関与する疾患の治療、予防に効果を発揮することができる。従って、「Aktの調節によって予防効果又は治療効果が得られる疾患」に対して本発明のAkt活性化剤が適用され得る。「Aktの調節によって予防効果又は治療効果が得られる疾患」を「Atk活性の異常によって特徴づけられる疾患」と言い換えることができる。即ち、本発明の対象となる疾患（対象疾患）には、Akt活性が正常範囲から逸脱した結果として引き起こされる疾患が含まれる。例えば、パーキンソン病、脊髄損傷、アルツハイマー病、水頭症、脳損傷、脳梗塞、痴呆症、リューマチ症、又は統合失調症等がこのような疾患に該当する。【００１２】
本発明者らの研究によって、以下に詳述する本発明の有効成分がAktを介してGDNFの産生を誘導することが明らかとなった。この事実から、本発明のAkt活性化剤によればAktを介したGDNAの産生誘導を引き起こすことができる。従って、GDNFの産生誘導によって予防効果又は治療効果が得られる疾患は、本発明の好適な対象疾患の一つである。例えば、パーキンソン病、脊髄損傷、アルツハイマー病、水頭症、脳損傷、脳梗塞、痴呆症、リューマチ症、又は統合失調症等がこのような疾患に該当する。
尚、AKt又はGDNFと疾患との関連についていくつかの報告（Tas SW, Remans PH, Reedquist KA, Tak PP. Signal transduction pathways and transcription factors as therapeutic targets in inflammatory disease: towards innovative antirheumatic therapy. Curr Pharm Des. 2005;11(4):581-611.、Rickle A, Bogdanovic N, Volkman I, Winblad B, Ravid R, Cowburn RF. Akt activity in Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders. Neuroreport. 2004 Apr 29;15(6):955-9.）がある。
尚、本明細書において用語「疾患」は、疾病、病気、又は病態など、正常でない状態を表す言葉と交換可能に用いられる。【００１３】
本発明のAkt活性化剤はその一態様において、Leu及びIleからなるペプチド（ジペプチド）を有効成分として含む。Leu（ロイシン）は別名２−アミノイソカプロン酸と呼ばれ、そのL形は以下の化学式で表される。
【化１】
2006090555.tif 000002
一方、Ile（イソロイシン）は別名２−アミノ−３−メチル−ｎ−吉草酸と呼ばれ、そのL形は以下の化学式で表される。
【化２】
2006090555.tif 000003
本発明のペプチドでは好ましくはこれら二つのアミノ酸残基がN末端側からC末端側に向かってロイシン、イソロイシンの順に連結されている。
本発明において各アミノ酸残基はいずれもL形であることが好ましいが、アミノ酸残基の一部又は全部がD形であってもよい。【００１４】
一般に、ある化合物の一部に修飾を施して得られる化合物が修飾前の化合物と同様の性質や特性を有する場合がある。即ち、修飾が化合物の特定の性質等に影響を及ぼさない場合がある。このことを考慮すれば、上記ペプチドに修飾を施して得られる修飾体であっても、Akt活性化作用を維持する限りにおいて、本発明における有効成分として使用され得る。
そこで、本発明のAkt活性化剤は他の態様において、上記ペプチドの修飾体（以下、「ペプチド修飾体」という）を有効成分とする。本発明における「ペプチド修飾体」とは、LeuとIleからなる基本構造（ジペプチド）に対して、その一部（複数箇所であってもよい）を他の原子団等で置換すること、或いは他の分子を付加すること等の修飾を施すことによって、少なくとも一部において前記基本構造と相違する構造の化合物をいう。
当業者であれば、周知ないし慣用の手段を用いてLeuとIleからなるジペプチドを基本とした置換体などの修飾体をデザインすることができる。また、かかるデザインに基づき、周知ないし慣用の手段を用いて目的の修飾体を調製し、その性質や作用を調べることも当業者には容易と考えられる。【００１５】
本発明におけるペプチド修飾体の代表例としては、各アミノ酸残基において側鎖の一部（原子又は原子団）が他の原子又は原子団で置換されたペプチド誘導体を挙げることができる。このようなペプチド誘導体は、最終生成物として当該ペプチド誘導体が得られるように設計された任意の製造工程によって調製することができる。したがって、目的のペプチド誘導体が、あるペプチドにおいて一部（例えば側鎖の一部である原子団）が特定の原子団によって見かけ上置換されたものである場合には、当該目的のペプチド誘導体はこの見かけ上基本となるペプチドを出発材料として当該特定の原子団を用いた置換反応によって製造されたものであっても、或いは例えば他の構造のペプチドを出発材料として適当な置換反応等（場合によって複数工程であってもよい）によって製造されたものであってもよい。したがって例えばLeu-Ileからなるジペプチドの誘導体の場合、Leu-Ileからなるジペプチドが出発材料として用いられていなくともよい。
ここでの他の原子又は原子団としては、ヒドロキシル基、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等）、アルキル基（メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基等）、ヒドロキシアルキル基（ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基等）、アルコキシ基（メトキシ基、エトキシ基等）、アシル基（ホルミル基、アセチル基、マロニル基、ベンゾイル基等）等を例示することができる。【００１６】
尚、本発明のペプチド修飾体には、構成アミノ酸残基内の官能基が適当な保護基によって保護されているものも含まれる。このような目的に使用される保護基としては、アシル基、アルキル基、単糖、オリゴ糖、多糖等を用いることができる。このような保護基は、保護基を結合させるペプチド部位や使用する保護基の種類などに応じて、アミド結合、エステル結合、ウレタン結合、尿素結合等によって連結される。【００１７】
アミノ酸を付加（連結）することによって本発明のペプチド修飾体を形成することも可能である。但し、溶解性や生体内利用率の面からアミノ酸の付加数はあまり多くないことが好ましいと考えられる。具体的には付加するアミノ酸の数としては例えば１〜９個、好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１個又は２個である。尚、基本となるペプチド（又はペプチド修飾体）の両側においてアミノ酸の付加が行なわれていてもよい。【００１８】
本発明のペプチド修飾体の更なる例としては、糖鎖の付加による修飾が施されているものを挙げることができる。また、Ｎ末端又はＣ末端が他の原子等で置換されることによってアルキルアミン、アルキルアミド、スルフィニル、スルフォニルアミド、ハライド、アミド、アミノアルコール、エステル、アミノアルデヒド等に分類される各種ペプチド誘導体も本発明のペプチド修飾体に含まれる。【００１９】
尚、以上で説明した各種の修飾方法を組み合わせることによって構成されるペプチド誘導体を本発明のペプチド修飾体としてもよい。【００２０】
本発明のAkt活性化剤は更に他の態様において、上記ペプチド又は上記ペプチド修飾体の塩を有効成分とする。本発明の塩は薬学的に許容可能な限りその種類は特に限定されず、塩酸、リン酸、硫酸、硝酸、ホウ酸等との塩（無機酸塩）や、ギ酸、酢酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸等との塩（有機酸塩）をその例として挙げることができる。これらの塩の調製は慣用手段によって行なうことができる。【００２１】
本発明のAkt活性化剤に含有されるペプチド、ペプチド修飾体、或いはこれらいずれかの塩（以下、これらをまとめて「ペプチド等」という）は典型的には直鎖状であるが、環状構造を有する化合物の使用を排除するものではない。即ち、アミノ酸残基の側鎖同士の連結などによって部分的又は全体的に環状構造を形成するペプチド等を、本発明のAkt活性化剤の有効成分として使用することもできる。【００２２】
本発明におけるペプチド等は、公知のペプチド合成法（例えば固相合成法、液相合成法）によって製造することができる。但し、本発明のペプチド等が天然に存在する場合には、抽出、精製などの操作によってそれを調製することもできる。本発明のペプチド等の取得源としては例えば、動物細胞（ヒトを含む）、植物細胞、体液（血液、尿等）等が考えられる。
遺伝子工学的手法を用いて本発明のペプチド等を調製してもよい。即ち、本発明のペプチド等をコードする核酸を適当な宿主細胞に導入し、形質転換体内で発現されたペプチド等を回収することにより本発明のペプチド等を調製することもできる。回収されたペプチド等は必要に応じて精製される。回収されたペプチド等を適当な置換反応に供し、所望のペプチド修飾体に変換することもできる。
本発明におけるペプチド等の中で例えばLeu-Ile等は市販されており、国産化学株式会社（KOKUSAN CHEMICAL Co.,Ltd. 東京、日本）より入手することができる。【００２３】
本発明のAkt活性化剤は、特定の疾患に対する薬剤として利用可能であることは勿論のこと、例えば特定の疾患への罹患リスクを軽減するための食品（食品添加物）として、或いは特定の疾患の発症機構や進展機構を研究するための研究用試薬としても利用可能である。即ち、本発明のAkt活性調節剤は薬剤、食品（食品添加物）、研究用試薬などの形態で提供され得る。【００２４】
薬剤として提供される場合の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有させることができる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。【００２５】
製剤化する場合の剤型も特に限定されず、例えば錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、外用剤、及び座剤などとして調製できる。
このように製剤化した本発明の薬剤はその形態に応じて経口投与又は非経口投与（静脈内、動脈内、皮下、筋肉、腹腔内注射など）によって患者に適用され得る。
本発明の薬剤中における有効成分（ペプチド等）の含量は一般に剤型によって異なるが、所望の投与量を達成できるように例えば約0.001重量％〜約90重量％とする。【００２６】
本発明の他の局面では以上の薬剤を使用した対象疾患（パーキンソン病、脊髄損傷、アルツハイマー病、水頭症、脳損傷、脳梗塞、痴呆症、リューマチ症、又は統合失調症等）に対する予防方法又は治療方法（以下、これら二つの方法をまとめて「治療方法等」という）が提供される。本発明の治療方法等は、上記のペプチド、ペプチド修飾体、又はこれらいずれかの塩を有効成分として含む薬剤を生体に投与するステップを含む。投与経路は特に限定されず例えば経口、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、経皮、経粘膜などを挙げることができる。【００２７】
薬剤の投与量は症状、患者の年齢、性別、及び体重などによって異なるが、当業者であれば適宜適当な投与量を設定することが可能である。例えば、Leu-Ileを有効成分として含む薬剤を使用する場合には、成人（体重約60kg）を対象として一日当たりの有効成分量が約0.1〜約1000mg、好ましくは約1mg〜約100mgとなるよう投与量を設定することができる。投与スケジュールとしては例えば一日一回〜数回、二日に一回、或いは三日に一回などを採用できる。投与スケジュールの設定においては、患者の病状や薬剤の効果持続時間などを考慮することができる。【００２８】
本発明の更なる一態様では、本発明のAkt活性剤を含有した食品（又は食品添加物）が提供される。ここでの食品として牛乳や清涼飲料水等を例示できる。食品添加物の場合は粉末、顆粒末、タブレット等の形状で提供することができる。このような食品又は食品添加物としてAkt活性化剤を利用する場合の添加量は、治療的又は予防的効果が期待できる量とする。添加量は、対象となる者の病状、健康状態、年齢、性別、体重などを考慮して定めることができる。
Leu-Ileは高い溶解度を有し、また無味無臭である。また、Leu-Ileは生体内において定常的に存在する物質であることからその安全性も高いといえる。このように、食品に添加する物質として好ましい特性ないし特徴をLeu-Ileは備える。【００２９】
本発明の一態様では、本発明のAkt活性化剤が研究用試薬として提供される。この場合、予め標識化などの修飾を施しておいてもよい。また、Akt活性化剤を使用する際に必要な各種の試薬、又は反応用容器などを組み合わせたキットの形態で提供することもできる。
【実施例１】
【００３０】
１．マウス脳内におけるLeu-Ile結合タンパク質の同定
１−１  目的
臓器移植後の拒絶反応予防薬として用いられているcyclosporin A（CsA）やタクロリムス（FK506）は、内因性イムノフィリンと結合し、免疫抑制作用を示すイムノフィリンリガンドである。CsAやタクロリムスは免疫抑制作用のみでなく、様々な病態モデルにおける神経変性を抑制することが報告され、神経保護薬としての有用性についても研究が進められてきた（Ogawa et al., 1993; Sharkey and Butcher., 1994; Shiga et al., 1992; 田中と小川., 2004）。しかし、神経変性疾患の患者にとっては、これらの薬剤は神経保護作用を有していても同時に免疫機能を抑制してしまうため、大きな問題点が残る。そのため、神経保護作用のみを有する非免疫抑制性イムノフィリンリガンドについての研究が行われるようになった（Gold., 2000; Gold and Nutt., 2002; Herdegan et al., 2000; Snyder et al., 1998）。
Leu-Ileは非免疫抑制性イムノフィリンリガンドを探索する中で発見されたペプチドである。Leu-Ileはタクロリムスのイムノフィリン結合部位の構造と類似しており、タクロリムスと同様にGDNFの産生を誘導することが示されている。しかし、タクロリムスの結合タンパク質であるFK506 binding protein12（FKBP12）とは結合しない事が分かっており、Leu-Ileがタクロリムスとは異なる作用でGDNFを産生誘導している可能性が示唆されている（Nitta et al., 2002; 2004）。
そこで以下ではLeu-Ileがどのような仕組みでGDNFの産生を誘導しているのかを調べるため、マウス脳ホモジナイズ液を用いてLeu-Ile の脳内結合タンパク質の同定を行った。【００３１】
１−２  実験材料および方法
１−２−１  動物
実験には、７週齢のICR雄性マウス（日本SLC、静岡）を使用した。なお、本研究は名古屋大学医学部動物実験指針およびPrinciples of Laboratory Animal Care（National Institutes of Health Publication 85-23, 1985）に基づいて行った。【００３２】
１−２−２  Leu-Ileが細胞膜を透過することの証明実験
FITCで標識したLeu-Ilを培養神経細胞の培養上清に0〜1.5μg/mlの濃度になるように加え、10〜20分後に上清を取り除き、生理的緩衝液で洗浄し、細胞をラバーポリスマンで剥離回収した。遠心後、その上清中の蛍光（励起波長 485nm、蛍光波長518nm）強度を蛍光測定用プレートリーダーで測定した。実験毎に、FITC標識Leu-IleおよびFITCの検量線を作成した。【００３３】
１−２−３  fluorescein isothiocyanate（FITC）標識したLeu-Ileとマウス脳内タンパク質との結合実験
ペントバルビタールによる麻酔下で７週齢のICR雄性マウスから全脳を摘出し、ホモジナイズバッファー（（0.25M NaCl, 5mM ethylenediamine tetracetic acid（EDTA）, 1% TritonX-100, 0.25% dehydroacetic acid sodium salt monohydrate, 1mM phenylmethansulfonylfluoride（PMSF）, 1μg/ml leupeptin, 1μg/ml aprotinin, 5μg/ml pepstatinA）を含む20mM Tris-HCl (pH7.4)）を加え、30秒間ホモジナイザー（heat systems, NY, USA）でホモジナイズした。この液を4℃10,000gで1時間遠心し、上清を回収したものを脳ホモジナイズ液として実験に用いた。NまたはC末端側にFITCを結合させたLeu-Ile（Thermo Electron Corporation, Ulm, Germany）（10 mg/ ml）と脳ホモジナイズ液（総タンパク質量6 mg/ ml）を4℃または37℃で3時間反応させたのちサンプルバッファー（125 mM Tris-HCl, pH 6.8, 10% 2-mercaptoethanol, 4% sodium dodecyl sulfate (SDS), 10% sucrose, 0.004% bromophenol blue）を同用量加え95℃で5分間煮沸し、30 μgのタンパク質を10%ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った。蛍光バンドの検出にはFluorImager595（Molecular Dynamics, CA, USA）を用いた。【００３４】
１−２−４  Affigel-10によるLeu-Ile結合タンパク質の精製
アガロースビーズAffigel-10（BIO・RAD, CA, USA）を30 mlシリンジ（テルモ、東京）に充填し（直径22 mm、高さ26.5 mm）これをカラムとした。カラムに100 ml の0.1 M 炭酸水素ナトリウム溶液（pH 8.5）を流してビーズを洗浄し、0.1 M 炭酸水素ナトリウム溶液(pH 8.5)に溶解したLeu-Ile（国産化学、東京）（30 mg/ ml）とビーズを4℃で3時間反応させた。0.1 M リン酸緩衝液 (pH 7.4) でビーズを洗浄し、ビーズに結合しなかったLeu-Ileを除去した後に、２―２−２と同様の脳ホモジナイズ液（6 mg/ ml）20 mlをカラムに加え、Leu-Ileを結合したビーズと4℃で一晩反応させた。100 mlの0.1 M リン酸緩衝液 (pH 7.4)でビーズを洗浄した後、Leu-Ileに結合したタンパク質を0.17 M glycine-HCl溶液（pH 3）で溶出した。コントロールとしてLeu-Ileを結合させていないビーズを用い、同様の操作を行った。これを5-20% グラジュエントゲル（BIO・RAD）を用いて電気泳動し、銀染色「第一」キット（第一化学薬品、東京）を用いて銀染色を行った。【００３５】
１−２−５  Leu-Ile結合タンパク質のtrypsin処理と質量分析
１−２−４で銀染色したゲルを蒸留水で10分間3回洗い、外科用メスを用いて目的のタンパク質を含むゲル片を切りだした。ゲル片に100 μlの脱色液（18.5 mg/ ml NaCl, 18.5 mg/ ml CuSO4, 18.5 mg/ ml Na2S2O3）を5分間反応させ、ゲル片が透明になるまで蒸留水で洗浄した。acetonitrileによって脱水した後、ゲル片を真空遠心機で5分間乾燥させた。30 μlの10 mM dithiothreitol溶液をゲル片に浸透させ、室温で30 分間反応させた後、dithiothreitol溶液を取り除き、100 mM iodoacetamideを30 μl 加えてアルミホイルで遮光し、室温で30 分間アルキル化した。再度ゲル片にacetonitrileを加えて脱水、乾燥させ、10 μlのtrypsin（0.01 μg/ ul）（Promega, WI, USA）を浸透させた後、100 mM炭酸水素アンモニウム液を100 μl加えて37℃で一晩反応させた。(1)5 % acetonitrile、0.1 % trifluoroacetic acid（TFA）を含む100 mM炭酸水素アンモニウム液、(2)50% acetonitrile、0.1 % TFAを含む100 mM炭酸水素アンモニウム液、(3)80 % acetonitrile、0.1 % TFAを含む100 mM炭酸水素アンモニウム液を順次加え、ゲル片からペプチド断片を溶出した。溶出物を乾燥させ、5 % acetonitrile、0.1 % ギ酸、0.1 % TFAを含む水溶液に溶かし、質量分析装置Q-Tof2（Micromass, Manchester, UK）を用いてペプチド断片の配列を分析した。分析結果はマスコットサーチ（Matrix Science, MA, USA）を用いてNational Center for Biotechnology Information（NCBInr: http://www.ncbi. nlm.nih.gov/ Entrez/）のデータベース検索を行った（Perkins et al., 1999）。スコア計算はMowseアルゴリズムに基づいて行い、スコアが44以上のとき、統計学的に危険率5%以下の信頼性があることを示す（Pappin et al., 1993）。【００３６】
１−２−６  ウエスタンブロッティング
質量分析に用いたサンプルに等容量のサンプルバッファーを加え95℃で5分間煮沸し、5-20% グラジュエントゲル（BIO・RAD）を用いて電気泳動を行った。
ポリアクリルアミドゲルからsemi-dry transfer法によりpolyvinylidene fluoride（PDVF）膜（Millipore, MA, USA）へタンパク質を転写した後、膜をブロッキングバッファー（KPL, MD, USA）中で、穏やかに攪拌しながら2時間室温でブロッキングした。
次に、PDVF膜をブロッキングバッファーで1000倍に希釈した一次抗体（rat anti-Hsc70 antibodyまたはrabbit anti-Hsp70 antibody（Stressgen, BC, Canada））と4℃で一晩反応させた。Tris buffer saline（TBS）（10 mM Tris-HCl, 137 mM NaCl, 0.1% Tween-20）にて15分間3回洗浄した後、2次抗体（peroxidase labeled goat anti-rat IgG (H+L) antibody またはperoxidase labeled goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody（Kirkegaard & Perry Laboratries, MD, USA））と室温で2時間反応させた。その後TBSで3回洗浄し、ECLTM（Amersham Pharmacia Biotec, UK）を1分間反応させた。FPM100（富士写真フィルム、東京）現像機を用いてhyperfilm（Amersham Bioscience, NA, UK）に現像した。Hyperfilmに現像されたバンドの強度解析にはATTO Densito Graph（アトー、東京）を用いた。【００３７】
１−２−７  水晶発振子バイオセンサーによるheat shock cognate protein 70（Hsc70）およびheat shock protein 70（Hsp70）とLeu-Ileの結合力の検討
水晶発振子マイクロバランス法は分子の結合・解離、重合・分解によって変化する水晶発振子の絶対重量の増減を振動数の変化でとらえることにより、蛍光物質などで標識することなく分子反応をナノグラムレベルで定量することができる（Motomiya et al., 2003; 岡畑と古澤., 2004; Sauerbrey., 1959）。水晶体センサーチップ（イニシアム、東京）をピランハ溶液（7.5 % H2O2, 25 % H2SO4）で5分間2回洗浄後、5mM 3,3-dithiodipropionic acid 溶液を100 μlセンサーチップにのせて室温で30分間静置した。蒸留水で洗浄後、1-(3-dimethylaminopropyl-3-ethylcarbodiimide hydrochloride（100 mg/ ml）とN-hydroxysuccinimide（100 mg/ ml）の等量混合液100 μlをセンサーチップにのせて室温で30分間静置し、蒸留水で洗浄した。
Leu-Ile、Pro-Leu（国産化学）またはIle-Pro（国産化学）（10 μg/ ml）を含む100 μlのリン酸緩衝液をセンサーチップにのせて室温で約1時間反応させ、ジペプチドをセンサーチップに固定化した。Pro-LeuおよびIle-ProはLeu-Ileと同じ疎水性ジペプチドであるがGDNF産生誘導作用を示さないこと（Nitta et al., 2004）から、これらをネガティブコントロールとして用いた。
ジペプチドを固定化したセンサーチップをAFFINIX Q（イニシアム、東京）にセットし、リン酸緩衝液中で振動数を安定化させた後、Hsp70（Stressgen）（1.79, 3.57, 7.14, 14.3, 28.6 nM）またはHsc70（Stressgen）（1.79, 3.57, 7.14, 14.3, 28.6 nM）を含むリン酸緩衝液を逐次添加した。周波数変化はAFFINIX Q User Analysis（イニシアム）でモニターし、Hsp70またはHsc70とジペプチドの結合の程度を可視化した。周波数から濃度−結合飽和曲線を求め、解離定数（Kd値）を算出した。【００３８】
１−２−８  分子シミュレーションを用いたHsc70とLeu-Ileの結合部位の予測
Hsc70はN末端側から44KDのATPaseドメイン、18KDの基質結合ドメインおよび10KDのC末端ドメインに分けられ、それぞれの立体構造が既に明らかとなっているため、分子シュミレーションソフトウェアー（MOE; Chemical Computing GroupQuebec, Canada）を用いることによってLeu-IleがHsc70のどの部位に結合しているのかを予測することができる。Research Collaboratory for Structural Bioinformatics（SCSB）のデータベースサイトであるprotein data bank（PDB）（http://pdbbeta.rcsb.org/pdb/Welcome. do）から得られたそれぞれのドメインの3次元構造データ（3HSC（Flaherty et al.,1990）、7HSC（Morshauser et al., 1999）および1UOD（Chou et al., 2003））を利用し、MOE（分子力場：MMFF94x、カットオフ：9.5 nm）を用いてHsc70とLeu-Ileの結合部位の解析を行った。【００３９】
１−３  結果
１−３−１  Leu-Ileの膜透過性
FITC標識Leu-Ileが細胞膜を透過することを証明した。図１Ａに示すようにFITC標識Leu-Ileの濃度の上昇に伴って細胞内FITCの蛍光強度も増加した。また、時間経過との関係についても検討したところ、FITC標識Leu-Ileが細胞内に取り込まれるのは非常に早く、培養細胞への添加後120分で飽和状態となり、それ以上の取り込みは観察されなくなった(図１Ｂ)。FITCそのものも細胞膜を透過するが、FITC標識Leu-Ileのほうが、より透過しやすい。FITC標識Leu-Ileの膜透過性が、FITCでなくLeu-Ileに起因するものかどうかを検討するために、過剰量のLeu-IleをFITC標識Leu-IleまたはFITCと同時に培養上清に添加した。FITC標識Leu-Ileを用いた場合には、Leu-Ileの用量依存的に細胞内に取り込まれるFITCの蛍光強度は減少し、細胞膜通過性が抑制された(図１Ｃ)が、FITCと過剰量のLeu-Ileを同時に添加した場合には、FITCの細胞内取り込みは抑制されなかった。これらの結果から、Leu-Ileが細胞膜透過性を持つことが示された。【００４０】
１−３−２  FITC標識したLeu-Ileによる脳内結合タンパク質の検討
NまたはC末端にFITC標識したLeu-Ileとマウス脳ホモジナイズ液を反応させたものを電気泳動し、蛍光スキャナーによって画像を得た（図２Ａ）。C末端側にFITC標識したLeu-Ileに比べて、N末端側に標識したLeu-Ileの方がより多くのタンパク質と結合していたが、NおよびC末端側にFITC標識したLeu-Ile両方に70KDの大きさのタンパク質が結合した。また、それぞれの結合は4℃と37℃の温度差の影響をほとんど受けなかった。【００４１】
１−３−３  Leu-Ile結合タンパク質の同定
アガロースビーズAffigel-10によって精製した溶出液を電気泳動し、銀染色した結果、１−３−１で行った実験と同様に70KDの大きさにバンドが認められた（図２Ｂ）。これがLeu-Ileと特異的に結合しているタンパク質であると考え、trypsinによって消化した後、Matrix- assisted laser desorption/ ionization- time of flight/time of flight-Mass spectrometry（MALDI-TOF/TOF-MS）を用いてタンパク質の質量分析を行った。マスコットサーチを用いてNCBInrのデータベースを検索したところ10本のペプチド鎖がheat shock cognate protein 70（Hsc70）の配列と一致し、スコアが496であったことから、Hsc70がLeu-Ileの結合タンパク質である可能性が極めて高いと考えられた（図１１）。Hsc70の抗体を用いてAffigel-10によって精製した溶出液のウエスタンブロッティングを行った結果、Hsc70と考えられるバンドが検出された（図２Ｃ）。一方、Hsc70と81％の相同性を有するHsp70についてもウエスタンブロットを行ったが、バンドは検出されなかった（データ示さず）。Hsc70は恒常的に発現しているタンパク質であるが、Hsp70は熱や虚血などのストレスに暴露されたときに発現誘導されることが知られており（Dworniczak and Mirault., 1987）、今回実験に用いた脳が非ストレス下であったため、Hsp70とLeu-Ileとの結合が観察できなかったと考えられる。【００４２】
１−３−４  水晶発振子バイオセンサーによるHsc70およびHsp70とLeu-Ileの結合力の検討
Hsc70およびHsp70とLeu-Ileの結合活性について水晶発振子バイオセンサーを用いて測定した。Leu-Ile、Pro-LeuまたはIle-Proを結合させた水晶発振子にHsc70またはHsp70を反応させると、Leu-Ileを結合させたもののみ振動数が減少した（図３Ａ）。95℃で5分間インキュベートして熱変性させたHsc70およびHsp70を加えても、振動数が減少しなかったことから、熱変性させたHsc70およびHsp70はLeu-Ileと結合しないことが分かった（図３Ａ）。Hsc70またはHsp70とLeu-Ileの解離定数を求めた結果、Hsc70はKd = 1.83×10-8 M、Hsp70はKd = 1.24×10-8 Mの強さでLeu-Ileと結合する事が分かった（図３Ｂ）。水晶発振子バイオセンサーによる実験ではHsc70のみでなくHsp70もLeu-Ileと結合することが示された。【００４３】
１−３−５  分子シミュレーションを用いたHsc70とLeu-Ileの結合部位の予測
Hsc70はN末端側から44KDのATPaseドメイン、18KDの基質結合ドメインおよび10KDのC末端ドメインに分けられ、それぞれの立体構造が既に明らかとなっている（Chou et al., 2003; Flaherty et al.,1990; Morshauser et al., 1999）。Leu-Ileがどのドメインに結合しているのかを分子シミュレーションソフトウェアー（MOE）を用いて解析し、相互ポテンシャルエネルギーを計算した結果、ATPaseドメインには-119.044 kCal、基質結合ドメインには-76.711 kCal、C末端ドメインには-64.337 kCalの強さでLeu-Ileが結合することが示された（図４）。【００４４】
１−４  考察
FITCを結合したLeu-Ileと脳ホモジナイズ液を反応させた実験では、70KDのタンパク質がLeu-Ileと特異的に結合することが示された。この時、反応温度を4℃から37℃に変化させても結合の程度に差がなかったことから、これらの結合は温度の影響を受けやすい酵素的な反応ではないと考えられる。Leu-Ileと特異的に結合する70KDのタンパク質の質量分析を行ったところHsc70が同定され、水晶発振子バイオセンサーによる実験ではHsc70のみでなくHsp70もLeu-Ileと特異的に結合する可能性が示唆された。
タクロリムスはFKBP12に結合する事でカルシニューリンの脱リン酸化作用を抑制し、interleukin2の産生を抑制することで免疫抑制作用を発現すると考えられている（Griffith et al., 1995; Schreiber et al., 1991）。Leu-Ileはタクロリムスの部分構造の類似体として得られたが、FKBP12には結合せず、カルシニューリン阻害活性を持たない事からも、Leu-Ileは免疫活性を抑制することなく、神経保護作用を誘導することが示唆されている（Nitta et al., 2004）。
また、タクロリムスの神経保護作用に関する重要な因子はFKBP52（Hsp56）であることが示唆されいる（Gold et al., 1999）。本研究ではHsc70およびHsp70とLeu-Ileが結合することが示されたが、FKBP52とHsc70およびHsp70はHsp90と共にステロイド受容体に結合し、複合体を形成しているという報告があることから（Bagchi et al., 1991; McLaughlin et al., 2002）、タクロリムスとLeu-Ileはこれらの複合体に何らかの作用をおよぼすことによって神経保護作用を誘導している可能性が考えられる。
Hsc70とHsp70はヒートショックプロテイン70ファミリーに属し、81％のアミノ酸相同配列を有していることから、タンパク質のミスホールディングや凝集を防ぐ類似した機能を持ち（Dworniczak and Mirault., 1987; Young et al., 2003）、結合したタンパク質はATPのエネルギーを用いてHsp90に受け渡されるという報告がある（Bagchi et al., 1991; McLaughlin et al., 2002）。分子シミュレーションを用いた解析ではLeu-IleがHsc70のATPaseドメインに強く結合する可能性が示されたことから、ATPのエネルギーを用いたHsc70とHsp90間のタンパク質受け渡しにLeu-Ileが関与している可能性が示唆された。Hsp90は細胞周期、細胞増殖およびアポトーシスに関わる細胞内シグナルを調節する働きをもつので（Zhang and Burrows et al., 2004）、Leu-IleはHsp90を介したシグナル経路によってGDNFの産生誘導作用や神経保護作用を発現していると考えられる。
また、免疫細胞においては、Hsp70がIκB kinaseの活性を抑制する機能を有し、NF-κBの活性を抑えることによって、tumor necrosis factor-α（TNF-α）の転写を抑制するという報告がなされている（Beere et al., 2004; Feinstein et al., 1996; Yoo et al., 2000）。このことから、Leu-IleがHsc70およびHsp70の作用を抑制し、GDNFの転写因子でもあるNF-κBを活性化することによってGDNFを産生誘導している可能性が考えられた。そこで、以下では、Hsc70が調節しているシグナル経路とGDNFの転写因子に焦点をしぼり、GDNFの産生を誘導しているシグナルとHsc70との関係について検討を行った。
【実施例２】
【００４５】
２．ラット培養海馬神経細胞におけるLeu-IleのGDNF産生誘導作用
２−１  目的
GDNFは胎児黒質ドーパミン神経に対する栄養因子としてラットグリア細胞（B49）から得られ、黒質ドーパミン神経の変性によって起こるパーキンソン病の治療薬への応用が期待された（Lin et al., 1993）。その後、GNDFは脊髄運動神経や交感神経に対しても強力な生存効果を持つことが明らかとなり（Henderson et al., 1994）、発生段階に於いては、GDNFが神経冠細胞の腎臓、腸神経系への遊走制御や器官形成に重要な役割を果たしていることが明らかとなった（Moore et al., 1996; Pichel et al,. 1996; Sanchez et al., 1996.）。
ホモ二量体の分泌タンパク質であるGDNFは、細胞膜上のGDNF family receptor-α（GFRα1）に結合後、受容体RETと複合体を形成し、細胞内にシグナルを伝達する。リガンドであるGDNFは1993年に神経栄養因子としてみいだされた（Lin et al., 1993）。しかし、その受容体であるRETは癌遺伝子として1985年に発見され（Takahashi et al,. 1985）、古くからRETの突然変異がひき起こす疾患やRETの細胞内シグナル経路についての詳細な研究が行われてきた。RETの突然変異による疾患には多発性内分泌腺腫症、家族性甲状腺髄様癌があり、その病理的変化としては甲状腺，副甲状腺および副腎髄質での腫瘍性病変、または神経冠細胞由来の外胚葉に異常が認められる（Airaksinen et al., 1999; Mulligan et al., 1994; Romeo et al., 1994; Santoro et al., 1990）。この様にRET遺伝子が癌原遺伝子であることは、GDNF/RETのシグナルが細胞の生存、増殖および分化に強く関わっている事を裏付けるものであろう。
RETは膜貫通型チロシンキナーゼ受容体で、細胞内ドメインの長さが異なる3種のアイソフォーム（RET9、RET43、RET51）が細胞内にシグナルを伝えている（Lorenzo et al., 1995; Myers et al., 1995; Takahashi et al.,1989）。リガンドであるGDNF、neurturin、artemin、persephinがRETに結合すると、RETは二量体を形成し、チロシン残基(Tyr)を自己リン酸化することで細胞内シグナルを活性化する（Grimm et al., 2001; Schlessinger, 2000）。GDNFによりRETを刺激するとRETのTyr905、Tyr1015、Tyr1062およびTyr1096を自己リン酸化させるが（Coulpier et al., 2002; Ichihara et al., 2004）、この4つのチロシン残基のうち、Tyr1062がphosphatidylinositol-3 kinase (PI3K)/Akt経路を活性化することによって、GDNF/RETの神経保護作用が発現すると考えられている（Besset et al., 2000; Coulpier et al., 2002; Encinas et al., 2001; Hayashi et al., 2000; Kobayashi and Matsuoka., 2000; Takahashi., 2001）。
これまでの研究によってGDNF/RETによって活性化される細胞内シグナル経路についての解明は進んでいるが、GDNFの産生を促す転写調節機構についてはまだよく分かっていない。GDNFの産生を誘導する物質としては、TNF-α、interleukin-1? （IL-1? ）などの炎症性サイトカイン、fibloblast growth factor（FGF）などの栄養因子、興奮性アミノ酸などが報告されている（Marco et al., 2002; Taylor et al., 2003; Verity et al., 1999）。また、GDNFは脊髄損傷など障害を受けることによってもすばやく誘導されることが分かっている（Satake et al., 2000）。しかし、GDNFの発現調節パターンはグリア細胞または神経細胞によって異なり、例えば、IL-1? を膠芽細胞腫であるU-87MGに作用させるとGDNFの産生が促進されるが、IL-1? を神経芽腫であるSK-N-ASに作用させるとGDNFの産生を抑制することが報告されている（Verity et al., 1999）。このようなGDNFの複雑な発現パターンはそのプロモーター領域によって調節されていると考えられている（Tanaka et al., 2001）。
GDNFのプロモーター領域にはNF-κB、CREB、trans-acting transcription factor 1（SP1）、sine oculis-related homeobox 2 homolog（Six2）などの転写調節因子結合部位や転写を抑制するサイレンサーneural-restrictive silencer elements（NRSE）結合部位が存在し（Brodbeck et al., 2004; Tanaka et al., 2000; Woodbury et al., 1998）、これらの因子が複雑に影響しあうことで転写調節を行っている（図１２）。例えば、恒常的なGDNFの発現にはSP1が、発生段階での神経管や体節などにおけるGDNF発現誘導にはSix2が、障害やサイトカインによるGDNFの誘導にはNF-κB が関わる事が知られている（Baecker et al., 1999; Brodbeck et al., 2004; Grimm et al., 1998; Maruyama et al., 2004; Tanaka et al., 2001）。Leu-IleによるGDNFの産生誘導効果は、これらの転写調節因子のいずれかが活性化することによって発現すると考えられる。
上記１．ではHsp70およびHsc70がLeu-Ileの結合タンパク質である事を示したが、以下では、Leu-IleがHsp70およびHsc70が結合した後、どの様なシグナルを介してGDNFの産生を誘導するのかを調べるため、特に障害やサイトカインとの関係が深く、Hsp70を発現誘導することによって活性が抑制されるNF-κB（Yoo et al., 2000）、および、神経保護作用とつながりが深いCREBに焦点をしぼって検討した。【００４６】
２−２  実験材料および方法
２−２−１  動物
実験には、Wistar系STラット妊娠17日目（日本SLC）を使用した。なお、本研究は名古屋大学医学部動物実験指針およびPrinciples of Laboratory Animal Care（National Institutes of Health Publication 85-23, 1985）に基づいて行った。【００４７】
２−２−２  ラット海馬神経細胞培養方法
ペントバルビタールによる麻酔下でWistar系STラットから妊娠17日目の胎仔を取り出し、氷冷したL15倍地（シグマ アルドリッチ ジャパン、東京）中で海馬を取り出した。trypsin（Invitrogen, NY, USA）を37℃で15分間作用させた後、海馬に牛胎児血清（fetal bovine serum: FBS）を加えて反応を停止し、phosphate buffer saline（PBS）（1.3 mmol/l NaCl, 81 mmol/l Na2HPO4, 26.8 mmol/l KCl, 14.7 mmol/l KH2PO4）（pH 7.4）を海馬の入った容器に加えて穏やかに震とうし、PBSを取り除いた。これに10% FBSを含むDulbecco’s modified Eagle’s medium/ Ham’s nutrient mixture F12 (DMEM/ F12HAM)（シグマ アルドリッチ ジャパン）を10 ml加え、10回ピペッティングをくりかえすことで細胞を解離させ、96穴プレートまたは6 cmシャーレ（NALGE NUNC International, 東京）を用いてそれぞれ250,000 cells/ cm2の細胞密度で培養を開始した。37℃、5% CO2で1日間培養した後、N2サプリメント（Invitrogen）を含むDMEM/ F12HAM無血清培地に換え、さらに1日培養した細胞を免疫染色、ウエスタンブロッティング、またはmethyl thiazol tetrazolium（MTT）アッセイの実験に用いた。【００４８】
２−２−３  培養海馬神経細胞を用いたNF-κB免疫組織染色
２−２−２で培養した海馬神経細胞にLeu-Ile (10 μg/ml)、TNF-α (100 ng/ml)（大日本製薬（大阪）より恵与）またはGDNF(50 ng/ml)（Amgen, CA, USAより恵与）を2時間作用させた。細胞を-20℃のメタノールで20分間固定し、4℃のPBSで15分間3回洗浄した。2%牛胎児血清アルブミン（bovin serum albumin: BSA）、10%FBSを含むPBS溶液で細胞を37℃ 1時間インキュベーションし、PBSで1000倍に希釈したrabbit anti p65/ NF-κB antibody（Lockland, PA, USA）を加え4℃で一晩作用させた。ネガティブコントロールはPBSのみを細胞に加えて4℃中で一晩放置した。細胞をPBSで15分間3回洗浄した後、PBSで1000倍希釈したAlexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG（H+L）（Molecular Probes, OR, USA）を3時間反応させ、PBSで15分間3回洗浄した。染色した細胞はカバーガラスで封入し、蛍光顕微鏡axioscop 2 plus（Zeiss, NY, USA）で観察した（Zhu et al., 2004）。【００４９】
２−２−４  培養海馬神経細胞からの細胞核の単離
6 cmシャーレで培養した海馬神経細胞にLeu-Ile（10 μg/ml）を30分間作用させ、培養上清を取り除いた後、培養海馬神経細胞をPBSで洗い、cytoplasmic extraction buffer（CEB）（10 mM Tris-HCl (pH 7.9), 60 mM KCl, l mM EDTA, 1 mM dithiothreitol（DTT））と5分間氷上で反応させた。プロテアーゼ阻害剤（1 μg/ml leupeptin, 1 μg/ml pepstatin, 20 μg/ml phosphoramidon, 0.2 mg/ml EDTA, 2 μg/ml aprotinin, 0.5 mM PMSF）を含む0.4% Nonidet P-40/CEB 300 μlに5分間馴染ませた後、ラバーポリスマンで穏やかに細胞を剥ぎ取り回収し、1,000gで5分間遠心した。遠心して得られた沈殿物をプロテアーゼ阻害剤を含むCEBで洗浄し、nuclear extraction buffer（NEB）（20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 0.4 M NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1.5 mM EDTA, 1 mM DTT, 25% glycerol）を加え充分に撹拌した後、10分間氷上に放置した。この溶液を5分間16,000gで遠心し、上清を核抽出液として回収した（Yoo et al., 2000）。【００５０】
２−２−５  CREBアンチセンスオリゴヌクレオチド添加による培養海馬神経細胞のCREB発現抑制
CREBの開始コドン領域に対応するCREBアンチセンスオリゴヌクレオチド（5'-GCT CCA GAG TCC ATG GTC AT- 3'：配列番号１）またはCREBセンスオリゴヌクレオチド（5'-AT GAC CAT GGA CTC TGG AGC-3'：配列番号２）を1 μgずつ6cmシャーレに培養した海馬神経細胞に加え、Lipofectamine Plus transfection reagent (Invitrogen)を用いて遺伝子導入した（Gonzalez et al., 1989; Sato-Bigbee and DeVries., 1996）。CREBアンチセンスオリゴヌクレオチドを遺伝子導入した細胞にLeu-Ile（10 μg/ ml）を加え24時間培養したものを（Afshari et al., 2001; Johnson et al., 2000）、GDNFのウエスタンブロッティングのサンプルとして用いた。【００５１】
２−２−６  培養海馬神経細胞からのサンプル調製とウエスタンブロッティング
Akt、CaMKII、ERKおよびPKC-? のウエスタンブロッティングにはLeu-Ile（10 μg/ ml）を10、20または30分間作用させた培養海馬神経細胞を用い、GDNFのウエスタンブロッティングにはLeu-Ile（10 μg/ ml）を1日作用させた細胞を用いた。また、PI3Kの阻害剤であるLY294002（30 μM）（シグマ アルドリッチ ジャパン）またはHsp90の複合体形成を阻害するgeldanamycin（10 μM）（シグマ アルドリッチ ジャパン）とLeu-Ileを同時に30分間作用させた細胞を用いてAktおよびCREBのウエスタンブロッティングを行った。Leu-Ileを作用させた培養海馬神経細胞の培養上清を取り除き、細胞をPBSで洗い、precipitation buffer（20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 1 mM sodium orthovanadate, 2 mM EDTA, 50 mM NaF, 1% Nonidet P-40, 1 mM PMSF, 20 μg/ml aprotinin, 20 μg/ml leupeptin, , 20 μg/ml pepstatin）を300 μl加え、セルスクレイパーを用いて回収した。ホモジナイザーで30秒間細胞を破砕した後、4℃10,000ｇで1時間遠心し、その上清をウエスタンブロッティングのサンプルとした。
サンプルのタンパク質量はDC Protein Assey Kit II（BIO-RAD, CA, USA）で測定した。希釈したサンプルと等容量のサンプルバッファーを加え95℃で5分間煮沸し、10%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行った。
ポリアクリルアミドゲルからsemi-dry transfer法によりPDVF膜へタンパク質を転写した後、膜をブロッキングバッファー（KPL, MD, USA）中で、穏やかに攪拌しながら2時間室温でブロッキングした。
次に、PDVF膜をブロッキングバッファーで1000倍に希釈した一次抗体（mouse monoclonal anti-GDNF antibody（R＆D systems, MN, USA）、rabbit anti- phospho- CaMKII antibody（Promega, WI, USA）、rabbit anti-NF-κB antibody（Lockland）、mouse monoclonal anti-CREB antibody（Santa Cruz Biotechnology, CA, USA）、rabbit anti- phospho-CREB antibody（Cell Signaling Technology, MA, USA）、rabbit anti- phospho- Akt (Ser2448)（Cell Signaling Technology）、anti-Akt antibody（Cell Signaling Technology）、anti- phospho-PKC-? antibody（Cell Signaling Technology）、mouse monoclonal anti- phospho-ERK antibody（Cell Signaling Technology）、rat anti-Hsc70 antibodyまたはanti-Hsp90 antibody（Stressgen））と4℃で一晩反応させた。TBS（10 mM Tris-HCl, 137 mM NaCl, 0.1% Tween-20）にて15分間3回洗浄した後、2次抗体（peroxidase labeled goat anti-mouse IgG (H+L) antibody またはperoxidase labeled goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody（Kirkegaard & Perry Laboratries, MD, USA））と室温で2時間反応させた。その後TBSで3回洗浄し、ECLTM（Amersham Pharmacia Biotec, UK）を1分間反応させた。FPM100（富士写真フィルム、東京）現像機を用いてhyperfilm（Amersham Bioscience, NA, UK）に現像した。Hyperfilmに現像されたバンドの強度解析にはATTO Densito Graph（アトー、東京）を用いた。【００５２】
２−２−７  MTTアッセイ
MTTアッセイは生存細胞のミトコンドリアによって黄色のMTTが還元されてできた紫色のformazan生成物の結晶を可溶化し、発色量を測定する方法である。ミトコンドリアのMTT還元力は生存細胞数に比例するため、生成物の吸光度を測定する事で細胞生存率を測定することができ、培養実験系における生存細胞数の計数に汎用されている（Liptay et al., 1999; Uludag and Sefton., 1990）。
DMEM/ F12HAMに溶解したLeu-Ile（10 μg/ ml）およびNF-κBの阻害剤sulfasalazine（100 μM）（シグマ アルドリッチ ジャパン）を96穴プレートで培養した培養海馬神経細胞に加えて3日間培養した。10 μlのMTT溶液（シグマ アルドリッチ ジャパン）（10 mg/ ml）を加えて37℃で1時間インキュベーションした後、上清を取り除いた。MTTが還元されてできた紫色のformazan生成物の結晶をpH 4.7の50% dimethylformamide, 20% SDSを200 ul加えて可溶化し、570 nmの波長のマイクロプレートリーダー（Model 450, BIO・RAD）で吸光度を測定した。発色量は生存細胞数に比例するためコントロール細胞の吸光度を100%として生存率を求めた。【００５３】
２−２−８  GDNF mRNAの定量
GDNF mRNAの定量には、iCycler System(Bio-Rad 社)を利用したリアルタイムRT-PCR法を用いた。培養神経細胞からのmRNAの抽出にはRNeasy（登録商標） Mini Kit(Quiagen社)を用いた。mRNA 1μgからcDNAへの逆転写を行い、その際には、オリゴプライマーとSuperscriptII RT(Life Technologies)を用いた。20μlの反応生成物の中から1μｌをPCRに使用した。PCR反応にはPlatinum（登録商標） Quantitative PCR SuperMix-UDG (Invitrogen)を用いた。コントロールとして、リボゾームmRNAの定量（TaqMan Ribosaomal RNA Control Reagents; Applied Biosystem）も同時に行い、サンプル間のばらつきを補正した。GDNFの検出には、フォワードおよびリバースプライマーとして、それぞれ5'-AGCTGCCAGCCCAGAGAATT-3'(bp 288-307)（配列番号３）及び5'-GCACCCCCGATTTTTGC-3'(bp 354-370)（配列番号４）を用い、検出のためのプローブにはdye probe being 5'-CAGAGGGAAAGGTCGCAGAGGCC-3'(bp 309-331)（配列番号５）を用いた。【００５４】
２−２−９  統計解析
結果は全て平均値と標準誤差によって示した。統計解析には一元配置分散分析を行い、有意差が認められた場合、さらScheffeの多重比較検定を行った。なお、危険率が5%以下で差がある場合を有意な差があるとした。【００５５】
２−３  結果
２−３−１  Leu-IleによるNF-κBの核内移行
培養海馬初代神経細胞に、Leu-Ile、TNF-αまたはGDNFを作用させ、抗NF-κB抗体で免疫染色を行い、蛍光顕微鏡で細胞数を計測したところ、単位面積0.66mm2中に4500個の細胞があり、そのうち、細胞核が染まっていない細胞はコントロール群で7.9±1.31%、Leu-Ileを作用させた群で3.1±0.83%、TNF-αを作用させた群で2.1 ±0.54%、GDNFを作用させた群で2.4±0.59%であった。コントロール群に比べLeu-Ile、TNF-αおよびGDNFを作用させた細胞では、細胞核が染まっていない細胞数が有意に減少した（図５Ａ）。免疫染色では、コントロールにおいても多くの細胞でNF-κBの核移行が観察されたが、これまで報告されているとおりポジティブコントロールのTNF-αおよびGDNFがNF-κBの核内移行を促進し、Leu-IleもNF-κB核内移行を促進することが示された（Hayashi et al., 2000; Yoo et al., 2000; Zhu et al., 2004）。
また、細胞から核のみを単離し、核内のNF-κBの量をウエスタンブロッティングで検討したところ、Leu-Ileを作用させた細胞で核内に存在するNF-κBの量がコントロールに比べて196±16%に増加した（図５Ｂ）。【００５６】
２−３−２  Leu-Ileの細胞死抑制およびGDNF産生誘導におよぼすNF-κB阻害剤の作用
培養神経細胞は培養開始後、経時的に細胞死をおこし、3日目には培養開始時の58.6±2.7 %に細胞数が減少する。MTTアッセイを行った結果、コントロールに比べ、Leu-Ile（10 μg/ml）を加えた群は細胞数が119±1.4%に増加した。NF-κBの阻害剤であるsulfasalazine（100 μM）をLeu-Ileと同時に作用させた細胞群とコントロール群とでは生存細胞数の差はなく、Leu-Ileの効果が有意に抑制されていた(図６Ａ)。また、GDNFのウエスタンブロッティングを行った結果、コントロールに比べ、Leu-Ile（10 μg/ml）を作用させた細胞ではGDNFの発現量が188±13％に増加したが、sulfasalazine（100 μM）とLeu-Ile（10 μg/ml）を一緒に作用させた細胞ではGDNFの発現量は増加しなかった。sulfasalazineのみを作用させた細胞ではGDNFの発現量にコントロールとの差は無かった（図６Ｂ）。sulfasalazineがLeu-Ileの神経保護作用およびGDNF産生誘導作用も抑制したことから、Leu-Ileの神経保護作用とGDNF産生誘導作用はNF-κBを介している可能性が示唆された。【００５７】
２−３−３  Leu-IleによるCREBリン酸化作用とGDNF産生誘導作用
培養海馬神経細胞にLeu-Ileを作用させ、ウエスタンブロッティング法を用いてCREBのリン酸化の程度を検討したところ、30分間Leu-Ileを作用させた細胞ではコントロールの細胞に比べて164±14%にCREBのリン酸化が誘導された（図７Ａ）。
CREBアンチセンスオリゴヌクレオチドを培養海馬神経細胞に作用させることによって、CREBの発現量は63±13%に低下する（図７Ｂ）。この細胞にLeu-Ileを作用させた後、GDNFのウエスタンブロッティングを行った。コントロールに比べCREBアンチセンスオリゴヌクレオチドのみを作用させた細胞ではGDNFの発現量が72±10%に減少した。また、Leu-Ile（10 μg/ml）のみを作用させた細胞ではコントロールに比べGDNFの発現量が188±13%に増加したが、CREBアンチセンスオリゴヌクレオチドとLeu-Ileを一緒に作用させた細胞では、Leu-Ileのみを作用させた細胞に比べ69±9.2%に減少した。CREBセンスオリゴヌクレオチドを作用させた細胞はコントロールに比べCREBのリン酸化の程度に差は無かった（図７Ｃ）。CREBアンチセンスオリゴヌクレオチドを作用させ、CREBの発現を低下させた細胞ではGDNF産生誘導作用が抑制されたことから、Leu-IleのGDNF産生誘導作用にCREBが関与している可能性が示唆された。
Leu-Ile、Pro-Leu又はIle-Pro(10μg/ml)を培養神経細胞に添加した場合の24時間後のGDNF蛋白の発現増加について検討したところ、Leu-IleのみがGDNF蛋白の発現を増加させた(図８Ａ)。さらに、リアルタイムRT-PCR法を用いることによって、Leu-Ileを添加してから12又は18時間後にGDNF mRNAの発現が増加していることを見出した(図８Ｂ)。これらの実験結果は、我々の以前の報告(Nitta et al., 2004)と一致している。【００５８】
２−３−４  Hsp90/Aktを介したLeu-IleのCREBリン酸化作用とGDNF産生誘導作用
CREBの転写因子を活性化している分子を明らかにするためLeu-Ileを作用させた培養海馬神経細胞を用いてAkt、CaMKII、PKC-? およびERKのリン酸化の程度を調べた結果、Aktのリン酸化の程度は154±8.6%に増加したが、CaMKII、PKC-? およびERKについては今回の実験条件下でリン酸化の程度は増加しなかった（図９Ａ）。PI3Kの阻害剤であるLY294002（30 μM）とLeu-Ileを同時に30分間作用させた細胞ではLeu-Ileによって誘導されたAktのリン酸化は抑制されなかったが、Hsp90の複合体形成を阻害するgeldanamycin（10 μM）とLeu-Ileを同時に作用させた細胞ではLeu-Ileによって誘導されたAktのリン酸化を52±7.5%に抑制した（図９Ｂ）。また、LY294002とLeu-Ileを同時に30分間作用させた細胞ではLeu-Ileによって誘導されたCREBのリン酸化は抑制されなかったが、geldanamycinとLeu-Ileを同時に30分間作用させた細胞では50±8.2%に抑制された（図９Ｃ）。【００５９】
２−４  考察
本研究では、培養海馬初代神経細胞の生存に対するLeu-Ileの効果をMTTアッセイによって計測し、GDNFの発現量に対するLeu-Ileの効果をウエスタンブロッティング法を用いて検討した。生存細胞数を直接計数で検討し、GDNFの発現量を酵素免疫測定法を用いて検討した既報（Nitta et al., 2004）と同様にLeu-Ileは細胞死抑制作用およびGDNF産生誘導作用を有することが確認できた。
GDNFのプロモーター領域に結合配列を有する転写因子NF-κBおよびCREBの活性化がLeu-Ileを作用させた細胞で観察された。また、NF-κB阻害剤のsulfasalazineまたはCREBのアンチセンスオリゴヌクレオチドを作用させた細胞ではLeu-IleによるGDNFの産生誘導効果が観察されなくなったことから、Leu-IleはNF-κBおよびCREBを介してGDNFの産生を誘導していると考えられた。
これまでの研究で、TNF-αやFK960などがNF-κBまたはCREBを介してGDNFを誘導することが報告されているが（Koyama et al., 2004; Maruyama et al., 2004）、GDNFが活性化するシグナル経路上にもPI3K/Aktを介したNF-κBの活性化およびERKを介したCREBの活性化が観察される（Feng et al., 1999; Hayashi et al., 2000）。培養海馬神経細胞はGDNF、GFR-αおよびRETを共に発現しているため、誘導されたGDNFがRETに作用し、PI3K/AktおよびERKを介してNF-κBやCREBを活性化し、さらにGDNFの産生を誘導する正のフィードバック制御が働いている可能性も考えられる（Lenhard et al., 1998; 2002）。
そこで、CREBを活性化することが報告されている（Shaywitz and Greenberg., 1999; Wang et al., 1999）ERK、Akt、CaMKおよびPKCがLeu-Ileによって活性化されるかを調べた。この結果、Leu-Ileを加えてからCREBの活性化が観察される30分以内にはAktのリン酸化のみが観察された。さらに、Leu-Ileによって誘導されるAktのリン酸化がPI3Kを介しているかを調べるため、Leu-IleとPI3Kの阻害剤LY294002を同時に細胞に作用させたところ、Leu-Ileが誘導するAktのリン酸化は抑制されなかった。ヒト神経芽腫であるTGW細胞および初期神経外胚葉癌細胞であるSK-N-MCにおけるGDNF/ RETのシグナルはERKを介してCREBのリン酸化を促進し、PI3Kを介してAktのリン酸化を促進することが報告されている（Hayashi et al., 2000）。本研究ではLeu-Ileを作用させてもERKがリン酸化されないこと、および、PI3Kを介さずAktがリン酸化されていることから、Leu-Ileを短時間作用させた時に観察されるCREBのリン酸化はGDNF/RETのシグナルとは異なる経路を介して活性化されていると考えられた。
Aktのリン酸化を調節している因子にはPI3Kの他にHsp90も報告されており、Hsp90/ Aktのシグナル経路がCREBのリン酸化を調節していることも報告されている（Doong et al., 2003; Du and Montminy., 1998）。Hsp90の複合体形成を阻害するgeldanamycinを用いてAktおよびCREBのリン酸化の程度を調べた結果、Leu-Ileが誘導するAktのリン酸化およびCREBのリン酸化が抑制されたことから、Hsp90/Aktのシグナル経路を介してCREBを活性化し、GDNFを産生誘導していると考えられた。
Hsp90とHsc70は複合体を形成し、タンパク質の受け渡しや、活性の調節を行っている事が知られており（Bagchi et al., 1991; McLaughlin et al., 2002）、Leu-IleがHsc70とHsp90の結合能を変化させている可能性が考えられた。本研究では、Leu-Ileを作用させた時にHsp90とHsc70との相互作用がどの様に変化するのかを示す事はできなかった。しかし、Hsp90とHsc70が複合体を形成し、種々のタンパク質の受け渡しや活性調節を行っているという報告があることから、Leu-Ileがこれらの複合体の性質を変化させ、Hsp90がAktを活性化すると考えられる（図１０）。【００６０】
３．まとめ
以上の結果から以下の知見が得られた。
(1)Leu-Ileは細胞膜透過性である。
(2)FITC標識したLeu-Ileとマウス脳ホモジナイズ液を反応させたところ、70KDの大きさのタンパク質が結合した。
(3)Leu-Ile結合タンパク質の質量分析を行った結果、Hsc70が同定された。
(4)水晶発振子バイオセンサーを用いてHsc70およびHsc70と相同性の高いHsp70とLeu-Ileの結合活性について検討したところ、Hsc70はKd = 1.83×10-8 M、Hsp70はKd = 1.24×10-8 Mの強さでLeu-Ileと特異的に結合した。
(5)分子シミュレーションを用いてHsc70とLeu-Ileの結合部位を予測し、相互ポテンシャルエネルギーを計算した結果、ATPaseドメインには-119.044 kCal、基質結合ドメインには-76.711 kCal、C末端ドメインには-64.337 kCalの強さでLeu-Ileが結合し、Hsc70はATPaseドメインと結合する可能性が高いことが示唆された。
(6)Leu-Ileを作用させた培養海馬神経細胞では、NF-κBが核内に移行し、活性化された。
(7)Leu-Ileを作用させた培養海馬神経細胞では、神経細胞死が抑制され、GDNFの産生が誘導されたが、NF-κB 阻害剤のsulfasalazineとLeu-Ileを同時に作用させた細胞群では、Leu-Ileの効果が抑制された。
(8)Leu-Ileを作用させた培養海馬神経細胞では、コントロール群に比べCREBのリン酸化の程度が増加した。
(9)CREBアンチセンスオリゴヌクレオチドを培養海馬神経細胞に作用させると、Leu-IleのGDNF産生誘導効果が抑制された。
(10)Leu-Ileを作用させた培養海馬神経細胞では、Aktのリン酸化の程度が増加したが、CaMKII、PKC-? およびERKについては変化がなかった。
(11)PI3K阻害剤のLY294002とLeu-Ileを同時に作用させた細胞では、Leu-Ileによって誘導されたAktおよびCREBのリン酸化は抑制されなかった。一方、Hsp90の阻害剤であるgeldanamycinとLeu-Ileを同時に作用させた細胞ではLeu-Ileによって誘導されたAktおよびCREBのリン酸化を抑制した。【００６１】
以上の知見からLeu-IleがHsc70に結合し、Hsp90/Aktの経路を介してNF-κBおよびCREBを活性化し、GDNFの産生を誘導すると考えられた。Hsp90/Aktのシグナル経路によってLeu-IleがGDNFを産生誘導することが分かり、GDNFの発現調節を担う新たなターゲット遺伝子としてHsc70およびHsp90/Aktを特定することができた。【００６２】
引用文献
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【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明のAkt活性化剤は、Aktの調節によって予防効果又は治療効果が得られる疾患に対する薬剤又は食品として、或いは当該疾患の発症機構や進展機構などを研究するための試薬として利用され得る。本発明の有効成分は基本構造がジペプチドという非常に単純なものであるため、その調製が容易であるという利点を有する。【００６４】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
2006090555.tif 000004
【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2006090555.tif 000013
【図２】
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【図４】
2006090555.tif 000015
【配列表】
2006090555000001.app
【国際調査報告】
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