(57)【要約】【課題】実験用小動物に移植された細胞を観測する動物モデル実験に於いて、移植された細胞のみの位置又は空間的な広がりを経時的に精度よく検出・観測することができ且つ複数種類の移植細胞を見分けられる方法を提供すること。【解決手段】本発明の小動物体内に移植された移植細胞をin  vivoにて検出する方法は、移植細胞として、該細胞の細胞膜上にペプチド又はタンパク質の一部であるタグを発現する遺伝子が導入された細胞を準備する過程と、移植細胞を小動物に移植する過程と、小動物に於いてタグを検出する過程とを含む。タグは、そのタグに対する蛍光標識された抗体を小動物に投与し、その抗体からの蛍光をイメージングすることにより検出されてよい。【選択図】        図３
2009300110.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
小動物体内に移植された移植細胞をin  vivoにて検出する方法であって、
前記移植細胞として用いられる、細胞膜上にペプチド又はタンパク質の一部であるタグを発現する遺伝子が導入された細胞を準備する過程と、
前記移植細胞を前記小動物の任意の部位に移植する過程と、
前記小動物に於いて前記タグを検出する過程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１の方法であって、前記移植細胞として、互いに異なるタグを発現する複数の種類の細胞が準備され、前記複数の種類の細胞が単一の小動物個体に移植され、前記小動物個体に於いて前記互いに異なるタグがそれぞれ検出されることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１又は２の方法であって、前記小動物に於いて前記タグを検出する過程に於いて、前記小動物の外部から前記タグを光学的に検出することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかの方法であって、前記小動物に於いて前記タグを検出する過程に於いて、前記小動物の画像が取得され、前記画像に於いて前記タグの存在領域を検出することを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかの方法であって、前記小動物に於いて前記タグを検出する過程に於いて、前記タグに対する抗体が前記小動物に投与され、前記タグに結合した抗体を検出することにより前記タグが検出されることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかの方法であって、前記小動物に於いて前記タグを検出する過程に於いて、前記タグが蛍光標識され、前記タグからの蛍光を検出することにより前記タグが検出されることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかの方法であって、前記小動物に於いて前記タグを検出する過程に於いて、前記タグに対する蛍光標識された抗体が前記小動物に投与され、前記タグに結合した抗体からの蛍光を検出することにより前記タグが検出されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項６又は７の方法であって、前記小動物に於いて前記タグを検出する過程に於いて、前記小動物を蛍光観察することにより前記小動物の蛍光画像が取得され、前記蛍光画像に於いて前記タグからの蛍光の存在領域を検出することにより前記タグが検出されることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれかの方法であって、前記小動物に於いて前記タグを検出する過程に於いて、前記検出されたタグの存在領域に基づいて前記移植細胞の位置又は空間的な広がりを計測することを特徴とする方法。
【請求項１０】
小動物体内に移植された移植細胞をin  vivoにて検出する方法であって、
前記移植細胞として用いられる、細胞膜上にペプチド又はタンパク質の一部であるタグを発現する遺伝子が導入された細胞を準備する過程と、
前記移植細胞を前記小動物の任意の部位に移植する過程と、
前記タグに対する蛍光標識された抗体を前記小動物に投与する過程と、
前記小動物の蛍光画像を取得し蛍光画像に於いて前記タグに結合した前記抗体からの蛍光の存在領域を検出することにより前記移植細胞の存在領域を検出する過程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０の方法であって、前記移植細胞として互いに異なるタグを発現する複数の種類の細胞が準備され、前記複数の種類の細胞が単一の小動物個体に移植され、前記互いに異なるタグの各々に対する抗体が互いに異なる発光波長を有する蛍光物質にて標識され、前記小動物個体に於ける前記互いに異なるタグに結合した互いに異なる発光波長を有する前記抗体からの蛍光の存在領域がそれぞれ検出され、これにより、前記移植細胞の存在領域が細胞の種類毎に検出されることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１又は１０の方法であって、前記タグが、抗原性を有するタンパク質、ＨＡ−ｔａｇペプチド、Ｍｙｃ−ｔａｇペプチド、Ｈｉｓ−ｔａｇペプチド、Ｔ７−ｔａｇペプチド、Ｆｌａｇ−ｔａｇペプチド、メタルアフィニティ−ｔａｇペプチド、Ｖ５−ｔａｇペプチド、ＶＳＶ−Ｇ−ｔａｇペプチド、Ｓ−ｔａｇペプチド、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−ｔａｇペプチド、ＨＳＶ−ｔａｇペプチドから成る群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１又は１０の方法であって、前記移植細胞が哺乳類由来の腫瘍細胞であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小動物、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ等の実験用小動物に移植された細胞（以下、「移植細胞」とする。）をin  ｖｉｖｏにて検出する方法に係り、より詳細には、移植細胞を光学的に検出又はイメージングする方法に係る。
【背景技術】
【０００２】
医学的、薬学的又は生物学的研究の分野に於いて、実験用小動物に任意の腫瘍細胞又はその他の細胞を移植し、しかる後、実験用小動物の体内（体表を含む。以下同様。）に於いて、移植細胞を観測又は追跡するといった動物モデル実験が行われることがある。かかる実験に於いて、移植細胞は、生きた動物の体内環境下で成長・転移・増殖又は死滅することとなるので、その移植細胞の挙動（成長・転移・増殖又は死滅）を観測することにより、in  vivoでの細胞（特に、腫瘍細胞）の転移・成長・増殖又は死滅のメカニズムに関する有用な情報を得ることができる。特に、抗がん剤の開発の現場に於いては、腫瘍細胞が移植された動物にその任意の薬剤（例えば、抗がん剤の候補となる薬剤）を投与した際の腫瘍の大きさや位置が計測され、計測結果がその任意の薬剤の腫瘍細胞に対する影響の評価に用いられる。
【０００３】
上記の如き実験用小動物に移植された細胞を観測する動物モデル実験に於いて、移植細胞を観測する具体的な方法は、従前では一般的には、実験用小動物を屠殺して腫瘍を摘出し、細胞の位置、体積又は質量を計測するといった方法が取られていた（例えば特許文献１）。しかしながら、近年では、種々のin  vivo生体イメージング技術と遺伝子組換え技術の進歩により、これらの技術を用いて、非侵襲又は低侵襲に移植細胞の位置、体積又は質量を経時的に計測するといった試みが為されている。例えば、非特許文献１に於いては、或る酵素（cathepsin  D）を産生し放出する腫瘍細胞が移植された小動物に、かかる酵素と反応するよう構成された蛍光試薬を投与することによって、小動物内での腫瘍細胞のイメージングに成功したことが報告されている。また、非特許文献２は、予め蛍光色素にて標識された白血球細胞を小動物に投与し、その投与された白血球細胞が小動物内で蛍光によるトモグラフィー等を用いて追跡できることを示した（蛍光標識された白血球細胞が腫瘍に集まることが蛍光イメージングにより示された。）。更に、小動物体内の腫瘍細胞の検出技術として、放射性標識、ＰＥＴなどの放射性物質によるイメージングを採用することも提案されている（例えば、非特許文献３、４参照）。そして、特許文献２−５に於いては、遺伝子導入技術によりＧＦＰなどの蛍光タンパク質やルシフェラーゼなどの発光タンパク質を細胞内にて産生するよう調製された腫瘍細胞を実験用小動物に移植し、移植された腫瘍細胞内で発現した蛍光タンパク質又は発光タンパク質からの蛍光又は発光をイメージングすることにより、移植された腫瘍細胞の挙動を観測することが提案されている。
【０００４】
特に、上記の蛍光タンパク質又は発光タンパク質を用いた蛍光・発光イメージング法では、移植された細胞のみが“光る”こと、そして、移植された細胞が動物の体内で分裂・増殖を繰り返しても移植時の細胞と同様に光り続けることから、経時的に精度よく移植細胞の挙動を追跡・観測することができる（移植された腫瘍細胞の産生する酵素と特異的に反応する蛍光物質又は蛍光標識された白血球を用いたイメージング方法では、移植細胞以外の部位にても光を発するので、移植細胞のみを“特異的に”イメージングできるとは限らず、精度が落ちる。）。更に、蛍光タンパク質又は発光タンパク質を用いた方法は、放射性物質の取り扱いを必要としないので、実験の準備・操作が簡単であり、また、放射線を検出するための大掛かりの装置・設備を要しない点で有利である。
【特許文献１】特開２００３−２６１４４８
【特許文献２】特許第３７８６９０３号
【特許文献３】特表２００１−５１７０９０
【特許文献４】特表２００２−５３４３９８
【特許文献５】特開２００５−６６６０
【非特許文献１】ツォン・チンフサン（Tung,  Ching-Hsuan）他３名  キャンサーリサーチ（Cancer  Research）  60,  4953-4958  2000年9月1日
【非特許文献２】スビルスキ−フィリップ・ケー(Swirski,  Filip-K)他６名  プロスワン(PLos  ONE)  10  e1075  2007年10月
【非特許文献３】細胞工学別冊  実験プロトコールシリーズ「ＲＩの逆襲」岡田誠治  監修、秀潤社、132-137頁  ２００７年１２月
【非特許文献４】細胞工学別冊  実験プロトコールシリーズ「ＲＩの逆襲」岡田誠治  監修、秀潤社、138-147頁  ２００７年１２月
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、上記の如き実験用小動物に移植された細胞を観測する動物モデル実験に於いて、移植細胞として用いられる細胞は、多種多様であり得る。例えば、或る薬剤の抗がん剤としての有用性を評価するために複数種の又は複数の系統の腫瘍細胞に対する影響を調べる場合には、調べられるべき種類の腫瘍細胞のそれぞれが小動物に移植され、その挙動が観察されることとなる。
【０００６】
しかしながら、これまでに知られている非侵襲又は低侵襲的なイメージングにより実験用小動物に移植された細胞を観測する方法に於いては、一つの動物個体で、同時に複数の種類の移植細胞を見分けながら、移植細胞をイメージングすることは困難である。例えば、上記の放射性標識、ＰＥＴなどの放射性物質によるイメージングでは、移植された腫瘍細胞を検出する際に、同時に複数種類の移植細胞を見分けることはできない。また、蛍光タンパク質又は発光タンパク質を産生する移植細胞を用いた実験で蛍光・発光イメージング法により移植細胞を検出する方法の場合、移植細胞に於いて発現可能な蛍光タンパク質又は発光タンパク質の種類が限られているため、検出される光の波長選択の自由度が比較的低く、同時に複数の種類の移植細胞を見分けられる実験条件を必ずしも達成できるとは限らない。特に、in  vivoイメージングの場合、検出光として生体の透過性の高い波長の光を選択する必要があるところ、蛍光タンパク質又は発光タンパク質として生体透過性の高い波長の光を発するタンパク質が移植細胞内で産生できなければ、精度のよい或いは鮮明な移植細胞の画像が得られないこととなる。実際、現在までに報告されている蛍光タンパク質又は発光タンパク質を産生する移植細胞を用いた実験では、一時に検出される移植細胞の種類は、一種類に留まっており、もし複数の細胞種について上記の実験を行おうとする場合には、細胞種毎に別々の動物個体を準備する必要がある。
【０００７】
かくして、上記の如き実験用小動物に移植された細胞を観測する動物モデル実験に於いて、もし移植された細胞のみの位置又は空間的な広がりを経時的に精度よく検出・観測することができ、しかも、その際に複数種類の移植細胞を見分けられる方法があれば、従前に比して、多種多様の細胞が用いられ、種々の態様にて実験用小動物に於ける移植細胞を観測する動物モデル実験を実行できることとなろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によれば、実験用小動物に移植された細胞を観測する動物モデル実験に於いて、同時に複数種類の移植細胞を見分けられるようにするために、移植細胞として、その細胞膜上にタグとなるペプチド又はタンパク質を発現する遺伝子が導入された細胞が採用される。そして、その細胞膜上に“生（は）やされた”タグを検出することにより、移植細胞の位置・空間的な広がりを検出する新規な方法が提供される。かかるタグとなるペプチド又はタンパク質としては、多種類のものが選択できるので、例えば、移植される細胞の種類毎に異なるタグを生やすようにすることによって、一つの動物個体に複数種の細胞を移植した後、細胞膜上のタグを検出し、これにより、細胞種毎に移植細胞の小動物体内に於ける位置・空間的広がりを経時的に追跡・観測するといったことが可能となる。
【０００９】
上記の本発明の一つの態様によれば、小動物体内に移植された移植細胞をin  vivoにて検出する方法であって、移植細胞として用いられる、細胞膜上にペプチド又はタンパク質の一部であるタグを発現する遺伝子が導入された細胞を準備する過程と、移植細胞を小動物の任意の部位に移植する過程と、小動物に於いて前記のタグを検出する過程とを含むことを特徴とする方法が提供される。かかる構成に於いて、小動物は、この分野に於いて通常使用される任意の実験用動物であってよく、移植細胞は、ヒト、マウス、ラットなどの哺乳類由来の腫瘍細胞であってよい。移植細胞の細胞膜上に発現されるタグは、アビジン、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などの抗原性を有するタンパク質又はＨＡ−ｔａｇペプチド、ｃ−Ｍｙｃ−ｔａｇペプチド、Ｈｉｓ−ｔａｇペプチド、Ｔ７−ｔａｇペプチド、Ｆｌａｇ−ｔａｇペプチド、メタルアフィニティ−ｔａｇペプチド、Ｖ５−ｔａｇペプチド、ＶＳＶ−Ｇ−ｔａｇペプチド、Ｓ−ｔａｇペプチド、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−ｔａｇペプチド、ＨＳＶ−ｔａｇペプチドから成る群から任意に選択されたものであってよい（ペプチドのアミノ酸配列は、実施形態の欄を参照。）。
【００１０】
上記の本発明の一つの態様に於いては、基本的な処理過程は、従前の実験用小動物に移植された細胞を観測する動物モデル実験と同様であるが、注目されるべき点として、細胞膜上に、タグとして、上に列記の如きペプチド又はタンパク質を発現させるようにして、その細胞膜上に生やされたタグが移植細胞の目印として検出されるようになっている。既に触れたように、この分野に於いては、既に遺伝子導入技術を用いると、任意の細胞に、多種類のタンパク質やペプチドを細胞膜上に選択的に発現させることが可能となっている。そこで、移植細胞の目印として、選択の幅の少ない蛍光タンパク質やルシフェラーゼを用いるのではなく、上記の如き多種類のタンパク質やペプチドの中から任意のものを選択的に用いることにより、多種類の細胞を別々に特徴付けることが可能になる。そして、それらのタンパク質やペプチドである“タグ”は、移植された細胞が、生体内で分裂、増殖しても各細胞で維持されることとなるので、“タグ”を任意の手法で検出することにより、移植細胞が検出され、同一の動物個体に於いて継代的に又は経時的に移植細胞の挙動を追跡・観測することが可能となる。
【００１１】
従って、上記の本発明の方法に於いては、移植細胞として、互いに異なるタグを発現する複数の種類の細胞が準備され、複数の種類の細胞が単一の小動物個体に移植され、小動物個体に於いて互いに異なるタグがそれぞれ検出されるようになっていてよく、これにより、単一の小動物個体に複数の種類の細胞を移植し、同時に、それらの複数種の細胞の挙動を別々に追跡・観測することが可能となることは理解されるべきである。しかしながら、勿論、一時に移植される細胞種が一つの場合であっても、細胞膜上にタグを発現する細胞が移植細胞として用いられてもよい。また、移植される細胞種が一つの場合に別々のタグを発現させるようにした複数の細胞群が移植細胞として採用されてもよい（例えば、同一動物個体に於いて、複数箇所に細胞を移植するなどの実験態様が考えられる。）。
【００１２】
上記の本発明の構成に於いて、小動物に於いてタグを検出する過程では、典型的には、小動物の外部から“タグ”を光学的に、例えば、実体顕微鏡、光学顕微鏡を用いて検出するようになっていてよい。光学的に検出することにより、放射性物質を用いた検出方法の如く、シールドされた部屋や大掛かりな実験装置を要せずに、放射性物質を用いた検出方法に比して、簡易に且つ安全に実験を行うことが可能となる。そして、タグを光学的に検出する場合、任意の方法が採用されてよいところ、典型的には、小動物の画像が取得され、画像に於いてタグの存在領域が検出され、これにより、小動物の移植細胞の位置又は空間的な広がりを簡便に決定することが可能となる。
【００１３】
また、上記の本発明の小動物に於いてタグを検出する過程に於いて、タグを検出する手法としては、この分野に於いて知られている任意の手法が用いられてよいところ、一つの好適な態様として、各タグに対する抗体が小動物に投与され、小動物内に於いて、タグに結合した抗体を検出することによりタグが検出されるようになっていてよい。当業者に於いて良く知られている如く、抗体は、その抗原に特異的に結合することとなるので、上記の操作によれば、各タグに対する抗体は、小動物内に於いて、自動的に移植細胞に集積することとなる。従って、抗体を検出することにより、精度よく“特異的に”移植細胞又は移植細胞の群を検出することが可能となる。
【００１４】
更に、上記の抗体を検出する手法としては、抗体を予め蛍光標識しておき、小動物に於いてタグに結合した抗体からの蛍光を検出するようになっていてよい。かかる態様によれば、任意の蛍光イメージング技術等を用いて簡便に抗体の集積領域、即ち、移植細胞の存在領域を決定することが可能となる。理解されるべきことは、抗体を蛍光標識するので、蛍光標識に用いられる蛍光物質の選択の幅は広く、非特異的な反応や自家蛍光の影響を防ぎつつ、生体透過性の高い蛍光波長を有する蛍光物質を用いて、感度又は精度の高い移植細胞の観測が可能となるということである。
【００１５】
なお、タグを検出する手法に於いて、単に、タグが蛍光標識され、タグからの蛍光を検出することによりタグが検出されるようになっていてもよいことは理解されるべきである。例えば、抗体に限らず、タグに特異的に結合する分子であって蛍光標識されたものを小動物に投与すれば、その蛍光標識された分子は、移植細胞に集積することとなる（例えば、アビジンをタグとして用いる場合には、蛍光標識されたビオチンが用いられてよい。）。そこで、その蛍光を任意の蛍光イメージング技術を用いて検出すれば、移植細胞の存在、位置・空間的な広がりが検出される。
【００１６】
そして、上記の蛍光イメージング技術等を用いてタグを検出する場合には、典型的には、小動物を蛍光観察することにより小動物の蛍光画像が取得され、蛍光画像に於いてタグからの蛍光の存在領域を検出することによりタグが検出されるようになっていてよい。かかる手法によれば、実質的な蛍光（自家蛍光等を除く蛍光）は、移植細胞からのものとなっていると考えられるので、精度よく且つ簡便に、或いは、多種類の移植細胞を区別しながら、移植細胞の挙動を経時的に追跡・観察することが可能となる。
【００１７】
なお、後に説明される実験例に示されている如く、本発明の方法に於いて、蛍光イメージング技術を用いて、タグからの蛍光の存在領域を検出することによれば、小動物内に於ける移植細胞の位置と大きさが蛍光の存在領域に基づいて推定できることが明らかになった。従って、本発明の一つの態様に於いて、検出されたタグの存在領域に基づいて移植細胞の位置又は空間的な広がりを計測することを特徴とする方法が提供される。かかる方法によれば、実際に移植細胞を摘出することなく、移植細胞の位置又は空間的な広がりを計測することが可能となり、これにより、実験の効率（使用する動物個体数の低減などについて）が良くなり、また、同一個体で、継続的に移植細胞の位置又は空間的な広がりを計測し続けることが可能となり、有利である。
【００１８】
かくして、上記の本発明の一連の態様の作用効果を実現する実施の形態として、好適には、小動物体内に移植された移植細胞をin  vivoにて検出する方法に於いて、移植細胞として用いられる、細胞膜上にペプチド又はタンパク質の一部であるタグを発現する遺伝子が導入された細胞を準備する過程と、移植細胞を小動物の任意の部位に移植する過程と、タグに対する蛍光標識された抗体を小動物に投与する過程と、小動物の蛍光画像を取得しその蛍光画像に於いてタグに結合した抗体からの蛍光の存在領域を検出することにより移植細胞の存在領域を検出する過程とが順次実行されるようになっていてよい。また、かかる実施の形態に於いて、移植細胞として互いに異なるタグを発現する複数の種類の細胞が準備され、それらの複数の種類の細胞が単一の小動物個体に移植され、前記の互いに異なるタグの各々に対する抗体が互いに異なる発光波長を有する蛍光物質にて標識され、小動物個体に於ける互いに異なるタグに結合した互いに異なる発光波長を有する抗体からの蛍光の存在領域がそれぞれ検出され、これにより、移植細胞の存在領域が細胞の種類毎に検出されるようになっていてよい。上記の実施の形態に於いて、細胞が移植される小動物の体内の部位は、例えば、動物の皮下、頭部、首部、脚部、尾部、各臓器、体腔など任意の部位であってよい。
【発明の効果】
【００１９】
総じて、上記の本発明の方法によれば、細胞膜上にタグが生やされる細胞を移植細胞として採用することにより、従前に比して多種多様の実験の態様が考えられるようになるということである。従来の技術に於ける非侵襲的又は低侵襲的に実験用小動物に移植された細胞を観測する動物モデル実験では、いずれの場合も、in  vivoにての移植細胞の検出に際して、複数種の細胞を識別するといったことは非常に困難であった。しかしながら、本発明の上記の特徴によれば、複数種のタグを同時に用いることにより、一時に複数種の細胞を識別しながら、移植細胞を検出することが可能となり、従って、種々の組み合わせの移植細胞を用いて実験用小動物に移植された細胞を観測する動物モデル実験を行うことが可能となる。その際、特に、光学的検出方法又は蛍光イメージング技術を用いることによって、実験操作・設備を簡便なものとすることができ、上記の動物モデル実験の実行可能な環境が拡大され、より広範囲にて、かかる動物モデル実験が実行されるようになることが期待され、そうなれば、本発明は、新薬の開発の促進等、医療関係に於ける技術促進にも寄与するものと考えられる。
【００２０】
本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下に添付の図を参照しつつ、本発明を幾つかの好ましい実施形態について詳細に説明する。図中、同一の符号は、同一の部位を示す。
【００２２】
動物モデル実験の概要
本実施形態の実験用小動物に移植された細胞を観測する動物モデル実験に於いては、概して述べれば、従前の同様の実験と同様に、（ａ）移植細胞の調製過程、（ｂ）実験用小動物への移植細胞の移植過程、（ｃ）移植細胞の観測過程が順次実行される。ここで、移植細胞は、典型的には、任意の腫瘍細胞であり、移植細胞の観測過程に於いては、小動物に移植された細胞が、如何に、成長、転移、増殖又は死滅するかが、経時的に観測される。しかしながら、特に、本発明による実験に於いては、移植細胞としては、該細胞の細胞膜上にペプチド又はタンパク質の一部であるタグを発現する遺伝子が導入された細胞が採用され、小動物体内に於ける移植細胞の同定又は検出は、細胞膜上のタグを検出することにより行われる。タグは、実質的に移植された細胞の継代細胞（分裂・増殖後の細胞）の全てに於いて発現することが期待されるので、本実施形態の実験に於いては、細胞の成長、転移、増殖後に於いても移植細胞又は移植細胞群を継続的に且つ一定の感度にて観測することが可能となる（例えば、もし移植細胞に単に蛍光標識を付与した場合には、継代細胞は、蛍光標識を担持しないか、或いは、細胞当たりの標識の量が順々に低下していくので、検出感度が低下することとなる。）。
【００２３】
また、本実施形態の実験に於いて、小動物体内でのタグの検出は、小動物に、タグをエピトープとする抗体であって蛍光標識されたものを投与した後、小動物を蛍光イメージングにより観察することにより行われる。前記の抗体は、小動物に投与された後、移植細胞の細胞膜上のタグに特異的に結合し、これにより、移植細胞の周囲に集積すると期待される。そして、その状態で小動物を蛍光イメージングにより観察すれば、小動物の蛍光画像上に於ける抗体から発せられる蛍光の分布から、移植細胞の位置、空間的な広がりが分かることとなる。
【００２４】
なお、理解されるべきことは、「発明の開示」の欄に於いても記載されている如く、細胞膜上に生やすことのできるタグは、多種類のものが選択可能であること、また、更に、そのタグに結合させる抗体に標識可能な蛍光物質も多種類のものが選択可能であることから、移植細胞として、別々のタグを発現する複数の移植細胞を準備し、且つ、各タグに対する抗体に別々の波長帯域の蛍光物質を標識することにより、一つの動物個体上に於いて、同時に複数の移植細胞を移植し、更に、それらの複数の移植細胞を区別して検出するといった観測が可能となるということである。
【００２５】
以下、実験の処理過程の具体例について順に説明する。
【００２６】
移植細胞の調製
実験に於いて移植される細胞は、以下の手順により調製されてよい。
（１）ヒト、マウス、ラットなどの哺乳類由来の細胞の細胞膜表面上にタンパク質又はペプチドを発現させることのできるプラスミドベクター（細胞膜通過領域と細胞膜外側にて膜上に固定される領域が融合されたタンパク質を発現するようにデザインされているプラスミドベクター）に、細胞膜上でタグとなり得る抗原性を持ったタンパク質又はペプチドのいずれかを細胞膜上に発現させる遺伝子を組み込む。そのようなタンパク質としては、例えば、アビジン、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などであってよく、そのようなペプチドとしては（括弧内は、各ペプチドのアミノ酸配列を示している。）、
HA-tagペプチド（Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala）、
c-Myc-tagペプチド（Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu）、
His-tagペプチド（His-His-His-His-His-His）、
T7-tagペプチド（Met-Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly）、
Flag-tagペプチド（Asp-Tyr-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys）、
メタルアフィニティ−ｔａｇペプチド（His-Asn-His-Arg-His-Lys-His）、
V5-tagペプチド(Gly-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr）、
VSV-G-tagペプチド（Thy-Thr-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys）、
S-tagペプチド(Lys-Glu-Thr-Ala-Ala-Ala-Lys-Phe-Glu-Arg-Gln-His-Met-Asp-Ser）、
Glu-Glu-tagペプチド（Glu-Tyr-Met-Pro-Met-Glu）、
HSV-tagペプチド（Ser-Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp-Cys）
であってよいが、これらに限定されない。プラスミドベクターへの遺伝子の組み込み方法は、この分野で利用可能な任意の手法により行われてよい。なお、一つのプラスミドベクターに於いて複数種のタグを発現させる遺伝子が組み込まれていてもよい。また、一つの動物個体上で、複数の細胞又は細胞群を識別して検出したいときには、互いに異なるタグとなるタンパク質又はペプチドを発現させる遺伝子が組み込まれた複数の種類のプラスミドベクターが調製される。
【００２７】
（２）上記（１）にて調製されたプラスミドベクターを、ヒト、マウス、ラットなどの哺乳類由来腫瘍細胞（Hela、HT1080、LLC、Hepa1-6など）に導入する。導入方法は、例えば、トランスフェクション試薬（リポフェクトアミンなど）を用いた方法或いはエレクトロポーレーション法など、この分野で利用可能な任意の方法であってよい。なお、一つの動物個体上で、複数の細胞又は細胞群を識別して検出したいときには、識別されるべき複数の細胞又は細胞群に対して別々のタグを発現させるプラスミドベクターが導入されてよい。しかる後、プラスミドベクターが導入された細胞は、培養され、ジェネティシン添加培地などの選択培地で選別を行う。
【００２８】
実験用小動物への移植細胞の移植
上記の如く、細胞膜上に任意のタグを発現するよう作成され細胞群が培養された各培地から、105〜107個程度の細胞が収集され、実験用小動物へ、皮下注射又は静脈注射により、移植される。小動物は、この分野で通常使用されている任意の動物であってよく、例えば、マウス、ラット、ウサギなどの哺乳類であってよい。細胞が移植された動物は、移植細胞の観測が行われるまで、通常の態様にて飼育される。
【００２９】
蛍光標識された抗体の調製
既に述べた如く、細胞が移植された動物体内に於ける移植細胞の検出は、その細胞膜上に発現したタグに特異的に結合する抗体であって蛍光標識されたものを動物に投与し、その動物に於いて、抗体からの蛍光を検出することによって為される。かかる抗体は、以下の如く調製されてよい。
【００３０】
（１）細胞膜上に発現しているタグとなるタンパク質又はペプチドに対する抗体（抗アビジン抗体、抗GST抗体、抗マルトース結合タンパク質抗体、抗HA-tagペプチド抗体、抗c-Myc-tagペプチド抗体、抗His-tagペプチド抗体、抗T7-tagペプチド抗体、抗Flag-tagペプチド抗体、抗メタル・アフィニティtagペプチド抗体、抗V5-tagペプチド抗体、抗VSV-G-tag抗体、抗S-tagペプチド抗体、抗Glu-Glu-tagペプチド抗体、抗HSV-tagペプチド抗体など）が、任意の手法にて準備され（市販のものを購入したものであってもよい。）、かかる抗体にAlexa系蛍光色素、Cy系蛍光色素、ATTO系蛍光色素、ローダミン系蛍光色素などの蛍光色素が、任意の手法にて付与される。なお、蛍光色素は、任意のものであってよいが、in  vivoにての蛍光イメージングが実行されるので、生体透過性の高い蛍光波長帯域が高いのもの（６５０ｎｍ以上）が選択される。また、一つの動物個体上で、複数の細胞又は細胞群を識別して検出するべく、複数の種類の、互いに異なるタグとなるタンパク質又はペプチドを発現する細胞群が動物に移植される場合には、互いに異なるタグに対応する抗体毎に互いに異なる蛍光波長帯域を有する別々の色素が付与される。例えば、互いに異なる蛍光波長帯域の蛍光色素の組み合わせとしては、例えば、Alexa680とAlexa750、Cy5.5とCy7、Vivotag680とVivotag750であってよいが、これらに限定されず、或いは、三種以上の蛍光色素の組み合わせが採用されてよい。
【００３１】
（２）蛍光標識が施された抗体は、未反応の色素を除くべく、BioGelP-30などのゲルろ過カラムやマイクロコン(ミリポア社)などの限外ろ過スピンカラムなどを用いて、精製される。
【００３２】
移植細胞の検出−実験用小動物の蛍光観察
細胞が移植された動物体内に於ける移植細胞の検出は、上記の蛍光標識抗体を動物に投与した後、蛍光イメージングにより動物の蛍光観察し、抗体からの蛍光をイメージングすることにより行われる。その手順は、以下の通りであってよい。
【００３３】
（１）移植細胞が移植された動物個体へ、その移植細胞上に発現するタグに対応する蛍光標識抗体を静脈注射、腹腔内注射などで投与する。
【００３４】
（２）動物体内に於いて、抗体が移植細胞に集積する時間の経過後、任意の、実体顕微鏡又は光学顕微鏡を備えた蛍光イメージング装置、例えば、OV110（オリンパス社）を用いて、蛍光標識抗体を投与した小動物の蛍光観察を行う。典型的には、蛍光標識抗体の発する蛍光波長帯域の小動物の蛍光画像が撮影され、後に実施される画像解析のために、任意の記憶装置に保存される。なお、一つの動物個体上で、複数の細胞又は細胞群を識別して検出する場合には、動物に移植されている細胞にて発現されたタグに対応する蛍光標識抗体の蛍光波長帯域毎に小動物の蛍光画像が撮影され、記憶装置に保存される。なお、画像の取得にカラー撮影が可能な撮影装置が使用される場合には、一時に複数の蛍光波長帯域の蛍光画像が取得されるようになっていてよい。
【００３５】
（３）撮影された蛍光画像上には、移植細胞周囲に集積した抗体の蛍光像が撮影されていることが期待される。そこで、その画像に於けるデータから、移植細胞の位置、大きさ又は分布などが任意の画像解析ソフトを用いて計測されてよい。
【００３６】
上記の実験に於いて、理解されるべきことは、既に述べた如く、移植細胞の目印として、各移植細胞の細胞膜上に遺伝的にタグを発現させるようになっている点である。かかる構成により、タグに蛍光標識された抗体を作用させ、その抗体の蛍光を検出することが可能となり、タグの選択の幅、抗体に標識する蛍光色素の選択の幅の広さによって、任意の組み合わせにて、複数の種類の細胞群を一つの動物に移植し、かかる移植細胞を同時に種類毎に区別しながら検出することが可能となっている。ここで、タグは、移植細胞上のみに存在し、抗体は、実質的にタグにのみ結合すると期待されること、及び、抗体に付与される蛍光色素の蛍光波長を生体透過性の高い帯域に選択できることなどから、移植細胞の検出精度を従前に比して高くすることも可能である。また、移植細胞の検出に於いて、所謂蛍光イメージングを用いているため、大きな実験設備や放射性物質を要することなく、簡便に実験を実行できることとなる。
【００３７】
上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。
【実施例】
【００３８】
本実施例に於いては、一つのモデルマウス個体にHT1080細胞を移植した場合と、一つのモデルマウス個体にHT1080細胞とHepa1-6細胞とを同時に移植した場合とで、それぞれのモデルマウス個体に於いて、それぞれの細胞が腫瘍を形成することを細胞種を識別できる態様にて観察した。操作処理過程は、以下の通りとした。
【００３９】
１．細胞膜通過領域と細胞膜上に固定される領域とを有するタンパク質が発現されるようにデザインされているプラスミドベクターpDisplay  vector（invitrogen社）を改変して、HA（ヘムアグルチニン抗原）-tagペプチドを哺乳類細胞膜表面に発現できるプラスミドベクター（ａ）と、HA-tagペプチドとc-Myc-tagペプチドの双方を哺乳類細胞膜表面に発現できるプラスミドベクター（ｂ）とを作製した。
【００４０】
２．トランスフェクション用試薬：lipofectamine2000（インビトロゲン（invitrogen）社）を用いて、HT1080細胞に上記のプラスミドベクター（ａ）を、Hepa1-6細胞にプラスミドベクター（ｂ）を、それぞれ、使用説明書に従って導入した。
【００４１】
３．上記のプラスミドベクターが導入されたHT1080細胞とHepa1-6細胞は、それぞれ、600μg/mｌのジェネティシン（G-418，インビトロゲン社）を含むMEM培地（+10％FBS、+ペニシリン・ストレプトマイシン）を用いて培養し、プラスミドベクターの入った細胞を薬剤選別した。
【００４２】
４．上記のHT1080細胞とHepa1-6細胞は、5％CO2、37℃の条件下にて、同様の培地を用いて継代培養した。しかる後、それぞれの細胞種について、2×106個の細胞を集め（100μL）、それらをbacb/c系nudeマウスの背部皮下又は上腕部皮下に注射により移植した。
【００４３】
５．一方、上記のマウスへ投与される蛍光標識抗体として、市販の抗HA-tagペプチド抗体（COVANC社、HA.11  Monoclonal  Antibody）にAlexa  Fluor（登録商標）750  サクシニミジルエステル反応性色素（インビトロゲン社）を使用説明書に従って反応させたものと、市販の抗c-Myc-tagペプチド抗体（MBL社、Anti-Myc-Tag）にAlexa  Fluor（登録商標）680  サクシニミジルエステル反応性色素（インビトロゲン社）を使用説明書に従って反応させたものとを、それぞれ、調製した。これらの蛍光標識抗体は、それぞれ、PBSで膨潤させたBioGel
P-30ゲル（バイオラッド社）が充填された10mm×300mmのカラムを用いて、ゲルろ過し、未反応の蛍光色素を除去し、蛍光標識抗体溶出部位を分別収集した。
【００４４】
６．上記のHT1080細胞を皮下に注射移植し腫瘍を形成させたモデルマウスに対してAlexa750にて蛍光標識した抗HA-tagペプチド抗体を15μg／匹にて静脈より投与し、生体内でHA-tagペプチドを細胞膜上に発現したHT1080細胞腫瘍と反応させた。また、上記のHT1080細胞とHepa1-6細胞とを皮下に注射移植し腫瘍を形成させたモデルマウスに対しては、Alexa750にて蛍光標識した抗HA-tagペプチド抗体と、Alexa680にて蛍光標識した抗c-Myc-tagペプチド抗体とを、それぞれ15μg／匹にて静脈注射より投与し、HA-tagペプチドを細胞膜上に発現したHT1080細胞腫瘍又はHA-tagペプチドとc-Myc-tagペプチドを細胞膜上に発現したHepa1-6細胞腫瘍と反応させた。
【００４５】
７．蛍光標識抗体を投与３日目に、in  vivo生体観察システムＯＶ１１０（実体顕微鏡と蛍光像撮影装置とを組み合わせてなるシステム）を用いて、それぞれのマウス個体の明視野像とAlexa680及びAlexa750の蛍光波長帯域に於ける蛍光像を撮影した。
【００４６】
図１は、上記の操作に従って、HA-tagペプチドが細胞膜上に発現する調製されたHT1080細胞を皮下に注射移植し、しかる後にAlexa750にて蛍光標識した抗HA-tagペプチド抗体を投与したモデルマウスの細胞移植３日後（Ａ、Ｂ）と細胞移植１４日後の明視野像と蛍光像（Ｃ、Ｄ）とを示している。蛍光像Ｂ、Ｄから明らかな如く、腫瘍が形成されていると思われる部位に於いて、輝度が高くなることが示された（蛍光発光領域）。そこで、複数の動物個体について、蛍光像に於ける蛍光の存在領域（蛍光発光領域）の面積（生体観察システムに於けるソフトウェアを使用して算出）と、対応するそれぞれの蛍光の存在領域から摘出された腫瘍の重さとを比較したところ、図２に示されている如く、蛍光の存在領域の面積は、腫瘍の重さと共に増大した。この結果は、蛍光領域の面積によって、移植細胞の大きさ、位置などを計測することが可能であることを示唆し、本発明の方法により、腫瘍の大きさの評価が可能であることを示している。
【００４７】
更に、図３は、上記の操作に従って、HA-tagペプチドが細胞膜上に発現する調製されたHT1080細胞と、HA-tagペプチドとc-Myc-tagペプチドの双方が細胞膜上に発現する調製されたHepa1-6細胞とを、それぞれ、皮下に注射移植し、しかる後にAlexa750にて蛍光標識した抗HA-tagペプチド抗体とAlexa680にて蛍光標識した抗c-Myc-tagペプチド抗体とを投与したモデルマウスの蛍光像を示している。同図に於いて、ＡがAlexa750の蛍光波長帯域に於ける蛍光像であり、ＢがAlexa680の蛍光波長帯域に於ける蛍光像である。これらの蛍光像から明らかな如く、Alexa750の蛍光波長帯域に於ける蛍光像に於いては、２箇所にて蛍光が発せられているのに対し、Alexa680の蛍光波長帯域に於ける蛍光像に於いては、Alexa750の蛍光波長帯域に於ける蛍光像で蛍光を発している部位のうちの一方に対応する部位のみ蛍光が発せられた。本サンプルに於いては、HT1080細胞腫瘍の存在領域では、Alexa750の蛍光波長帯域のみで蛍光が発せられ、Hepa1-6細胞腫瘍の存在領域では、Alexa750の蛍光波長帯域とAlexa680の蛍光波長帯域との双方の蛍光が発せられることが期待されるので、図３の結果は、ＡとＢの両方で蛍光が発せられている領域αがHepa1-6細胞腫瘍の存在領域であり、Ａのみで蛍光を発している領域βがHT1080細胞腫瘍の存在領域であると推定される。そして、この結果は、本発明の方法によれば、一つの動物個体に複数種の細胞を移植し、それらの移植細胞を識別して観測することが可能であることを示している。
【００４８】
以上の説明は、本発明の実施の形態に関連してなされているが、当業者にとつて多くの修正及び変更が容易に可能であり、本発明は、上記に例示された実施形態のみに限定されるものではなく、本発明の概念から逸脱することなく種々の装置に適用されることは明らかであろう。
【００４９】
例えば、上記の実施形態に於いては、動物の外部から蛍光イメージングにより非侵襲的に移植細胞の存在領域を検出するようになっているが、移植細胞の近傍を切開した状態でイメージングを行うようになっていてもよい。その場合も、蛍光波長を決定するだけで、移植細胞の種類が特定されることとなる点で有利である。また、本発明によれば、一つの種類の腫瘍細胞に於いて、別々のタグが発現するよう複数の細胞群を調製し、しかる後に一つの動物個体に於いて、移植部位、移植時期又は移植方法毎に異なるタグを発現する細胞群を移植して、それぞれの移植細胞群を追跡・観測するといった実験の態様も可能となる。重要なことは、本発明の方法によれば、移植細胞のマーカーの種類の選択の自由度が、従前に比して大きくなるため、従来では困難であった種々の実験のパターンが可能となるということである。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、HA-tagペプチドが細胞膜上に発現する調製されたHT1080細胞が皮下に注射移植され、しかる後にAlexa750にて蛍光標識した抗HA-tagペプチド抗体が投与されたモデルマウスの明視野像と蛍光像である。Ａ、Ｂは、それぞれ、細胞の移植から３日後の明視野像と蛍光像であり、Ｃ、Ｄは、それぞれ、細胞の移植から１４日後の明視野像と蛍光像である。蛍光像は、蛍光生体観察システムＯＶ１１０に付属の７５０ｎｍ用フィルターを用いて撮影した。
【図２】図２は、HA-tagペプチドが細胞膜上に発現する調製されたHT1080細胞が皮下に注射移植され、しかる後にAlexa750にて蛍光標識した抗HA-tagペプチド抗体が投与されたモデルマウスの蛍光像に於ける蛍光発光領域の面積と、その蛍光発光領域に存在した腫瘍の重さ（摘出後測定）との関係を示す図である。縦軸は、任意単位であり、横軸は、ｇである。蛍光発光領域の面積の算出に於いては、蛍光生体観察システムＯＶ１１０に付属のソフトウェアのＲＯＩ解析を用い、蛍光画像上にて平均輝度値が１００〜１２０の範囲となるように腫瘍の存在する領域（蛍光輝度が局所的に強い領域）を囲い、その囲われた領域の面積を「蛍光発光領域の面積」とした。図中、実線は、最小自乗法による相関直線である。相関係数は、Ｒ２＝０．９２５であった。なお、図示の例では、蛍光発光領域の面積の算出の際、背景光の低い蛍光色素を用いたため、輝度値に於いて、背景光の減算等の処理は行っていないが、必要に応じて、背景光の減算等の処理が行われてよい。
【図３】図３は、HA-tagペプチドが細胞膜上に発現する調製されたHT1080細胞と、HA-tagペプチドとc-Myc-tagペプチドの双方が細胞膜上に発現する調製されたHepa1-6細胞とが、それぞれ、皮下に注射移植され、しかる後にAlexa750にて蛍光標識した抗HA-tagペプチド抗体とAlexa680にて蛍光標識した抗c-Myc-tagペプチド抗体とが投与されたモデルマウスの蛍光像である。Ａは、Alexa750の蛍光波長帯域のみの蛍光像であり、Ｂは、Alexa680の蛍光波長帯域のみの蛍光像である。ＡとＢに於いて、領域αは、同一の領域であり、Hepa1-6細胞の腫瘍が形成され、Ａに於いて、領域βは、HT1080細胞の腫瘍が形成されていると考えられる。
【図２】
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【図１】
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【図３】
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【配列表】
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