(57)【要約】本発明の目的は、ホスホロチオエート結合を有する光学活性なオリゴ核酸化合物を製造するのに有用な新規な核酸ダイマー化合物を提供することである。次の一般式（２ａ）又は（２ｂ）で表される光学活性な核酸ダイマー化合物。2006043521.tif 000052［式中、Ｂｘ１、Ｂｘ２は、それぞれ独立して、保護基を有していてもよい核酸塩基を表す。Ｒ１ａ１、Ｒ１ａ２は、それぞれ独立して、水素、アルコキシ又はシリルオキシを表す。Ｒ２は、アシル、又は次の一般式（３ａ）  若しくは（３ｂ）で表される置換基を表す。 2006043521.tif 000053［式中、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂは、同一又は異なって、アルキルを表すか、又はＲ２ａ、Ｒ２ｂが隣接する窒素原子と一緒になって形成する、５〜６員の飽和アミノ環基を表す。Ｒ２ｄはアリール又は１〜２環性の複素環基を表す。Ｒ２ｃ、Ｒ２ｅは、アルキルを表す。］Ｒ３は、アルキル、アリール又は１〜２環性の複素環基を表す。Ｒ４は、水素又は酸性条件下で脱離する基を表す。］【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸合成ユニットとして、次の一般式（２ａ）又は（２ｂ）で表される光学活性な核酸ダイマー化合物を少なくとも１つ使用することを特徴とする、次の一般式（１）で表される光学活性なオリゴ核酸化合物の製法。
【化１】
2006043521.tif 000041
［式中、各Ｂは、それぞれ独立して、核酸塩基を表す。ｎは、１〜９９の範囲内にある整数を表す。各Ｒ１は、それぞれ独立して、水素、水酸基又はアルコキシを表し、各Ｒ１のうち、少なくとも１つは水酸基を表す。各Ｙは、それぞれ独立して、次の一般式（１ａ）、一般式（１ｂ）又は一般式（１ｃ）で表される置換基を表し、少なくとも１つは置換基（１ａ）又は置換基（１ｂ）を表す。但し、隣り合う構成モノマーのＹがいずれも置換基（１ａ）又は置換基（１ｂ）である場合を除く。
【化２】
2006043521.tif 000042
Ｚは、水素又はリン酸基を表す。
Ｂｘ１、Ｂｘ２は、同一又は異なって、保護基を有していてもよい核酸塩基を表す。Ｒ１ａ１、Ｒ１ａ２は、同一又は異なって、水素、アルコキシ又はシリルオキシを表す。Ｒ２は、アシル、又は次の一般式（３ａ）若しくは（３ｂ）で表される置換基を表す。
【化３】
2006043521.tif 000043
［式中、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂは、同一又は異なって、アルキルを表すか、又はＲ２ａ、Ｒ２ｂが隣接する窒素原子と一緒になって形成される、５〜６員の飽和アミノ環基を表す。Ｒ２ｄはアリール又は１〜２環性の複素環基を表す。Ｒ２ｃ、Ｒ２ｅは、アルキルを表す。］
Ｒ３は、アルキル、アリール又は１〜２環性の複素環基を表す。Ｒ４は、水素又は酸性条件下で脱離する基を表す。］
【請求項２】
次の一般式（２ａ）又は（２ｂ）で表される光学活性な核酸ダイマー化合物。
【化４】
2006043521.tif 000044
［式中、Ｂｘ１、Ｂｘ２は、同一又は異なって、保護基を有していてもよい核酸塩基を表す。Ｒ１ａ１、Ｒ１ａ２は、同一又は異なって、水素、アルコキシ又はシリルオキシを表す。Ｒ２は、アシル、又は次の一般式（３ａ）若しくは（３ｂ）で表される置換基を表す。
【化５】
2006043521.tif 000045
［式中、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂは、同一又は異なって、アルキルを表すか、又はＲ２ａ、Ｒ２ｂが隣接する窒素原子と一緒になって形成される、５〜６員の飽和アミノ環基を表す。Ｒ２ｄはアリール又は１〜２環性の複素環基を表す。Ｒ２ｃ、Ｒ２ｅは、アルキルを表す。］
Ｒ３は、アルキル、アリール又は１〜２環性の複素環基を表す。Ｒ４は、水素又は酸性条件下で脱離する基を表す。］
【請求項３】
次の一般式（１）で表される、光学活性なオリゴ核酸化合物。
【化６】
2006043521.tif 000046
［式中、各Ｂは、それぞれ独立して、核酸塩基を表す。ｎは、１〜９９の範囲内にある整数を表す。各Ｒ１は、それぞれ独立して、水素、水酸基又はアルコキシを表し、各Ｒ１のうち、少なくとも１つは水酸基を表す。各Ｙは、それぞれ独立して、次の一般式（１ａ）、一般式（１ｂ）又は一般式（１ｃ）で表される置換基を表し、少なくとも１つは置換基（１ａ）又は置換基（１ｂ）を表す。但し、隣り合う構成モノマーのＹがいずれも置換基（１ａ）又は置換基（１ｂ）である場合を除く。
【化７】
2006043521.tif 000047
Ｚは、水素又はリン酸基を表す。］
【請求項４】
次の一般式（４）で表される、請求項３記載のオリゴ核酸化合物。
【化８】
2006043521.tif 000048
［式中、各Ｂは、それぞれ独立して、核酸塩基を表す。ｍは、１〜４９の範囲内にある整数を表す。各Ｒ１は、それぞれ独立して、水素、水酸基又はアルコキシを表し、各Ｒ１のうち、少なくとも１つは水酸基を表す。
Ｙ１、Ｙ２は、それぞれ異なって、一方は、次の一般式（１ａ）又は一般式（１ｂ）で表される置換基を表し、もう一方は次の一般式（１ｃ）で表される置換基を表す。
【化９】
2006043521.tif 000049
Ｔ１は、水素又は次の一般式（５ａ）で表される置換基を表す。
【化１０】
2006043521.tif 000050
［式中、Ｂ、Ｒ１は、前記と同義である。］
Ｔ２は、水酸基又は次の一般式（５ｂ）若しくは（５ｃ）で表される置換基を表す。
【化１１】
2006043521.tif 000051
［式中、Ｂ、Ｒ１は前記と同義である。］］
【請求項５】
ｎが、１０〜５０の範囲内にある整数である、請求項３記載のオリゴ核酸化合物。
【請求項６】
ｎが、１５〜３０の範囲内にある整数である、請求項３記載のオリゴ核酸化合物。
【請求項７】
ｍが、５〜２５の範囲内にある整数である、請求項４記載のオリゴ核酸化合物。
【請求項８】
ｍが、７〜１５の範囲内にある整数である、請求項４記載のオリゴ核酸化合物。
【請求項９】
オリゴ核酸化合物中に存在するホスホロチオエート結合が、全てＲｐの立体配置であるか又は全てＳｐの立体配置である、請求項５〜８のいずれかに記載のホスホロチオエート結合を有するオリゴ核酸化合物。
【請求項１０】
オリゴ核酸化合物を細胞内に移行させるのに有効な担体と請求項５〜９のいずれかに記載のオリゴ核酸化合物との複合体を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１１】
オリゴ核酸化合物を細胞内に移行させるのに有効な担体が、カチオン性担体である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
オリゴ核酸化合物１重量部に対してオリゴ核酸化合物を細胞内に移行させるのに有効な担体を１〜２００重量部を含む、請求項１０又は１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
オリゴ核酸化合物１重量部に対してオリゴ核酸化合物を細胞内に移行させるのに有効な担体を２．５〜１００重量部を含む、請求項１０又は１１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
オリゴ核酸化合物１重量部に対してオリゴ核酸化合物を細胞内に移行させるのに有効な担体を１０〜２０重量部を含む、請求項１０又は１１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
請求項５〜９のいずれかに記載のオリゴ核酸化合物を用いて一部又は全部において二本鎖を形成する二本鎖オリゴ核酸化合物。
【請求項１６】
二本鎖オリゴ核酸化合物を細胞内に移行させるのに有効な担体と請求項１５記載の二本鎖オリゴ核酸化合物との複合体を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１７】
二本鎖オリゴ核酸化合物を細胞内に移行させるのに有効な担体が、カチオン性担体である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
二本鎖オリゴ核酸化合物１重量部に対して二本鎖オリゴ核酸化合物を細胞内に移行させるのに有効な担体を１〜２００重量部を含む、請求項１６又は１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
二本鎖オリゴ核酸化合物１重量部に対して二本鎖オリゴ核酸化合物を細胞内に移行させるのに有効な担体を２．５〜１００重量部を含む、請求項１６又は１７に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
二本鎖オリゴ核酸化合物１重量部に対して二本鎖オリゴ核酸化合物を細胞内に移行させるのに有効な担体を１０〜２０重量部を含む、請求項１６又は１７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療薬、診断薬又は研究試薬として有用な、ホスホロチオエート結合を有する光学活性なオリゴ核酸化合物及びその製法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、特定の遺伝子の発現抑制を行う方法として、オリゴＤＮＡによるアンチセンス法が知られている。ターゲット遺伝子（ｍＲＮＡ）と相補的な構造を有するアンチセンス分子は、ガン細胞などの増殖を遺伝子レベルで制御することが理論的に可能なことから、新しい医薬品としての利用が期待されている。すでに、ターゲット遺伝子（ｍＲＮＡ）と相補的な構造を有する天然型のオリゴＤＮＡは、ターゲット遺伝子（ｍＲＮＡ）と安定な二重鎖を形成しアンチセンス分子として機能することが明らかにされている。しかし、天然型のオリゴＤＮＡは、細胞内の種々の酵素によりそのリン酸架橋部や核酸塩基部が代謝を受け、アンチセンス分子としての機能が失われることが明らかとされている。アンチセンス法を有効な遺伝子治療法とするために、ターゲット遺伝子（ｍＲＮＡ）への親和性の向上、細胞内への透過性向上、核酸分解酵素に対する安定性向上などの特徴を有する核酸分子の創製が有効である。【０００３】
上記目的を達成するために、オリゴＤＮＡに対して種々の化学修飾が研究されてきた。特に、ホスホロチオエート結合を有するオリゴＤＮＡは最も研究されている化合物であり、種々のターゲット遺伝子（ｍＲＮＡ）に対してアンチセンス効果があることが確認されている。
しかしながら、通常の化学合成によって合成されたホスホロチオエート結合を有するオリゴＤＮＡは、各ホスホロチオエート結合部位がＲｐとＳｐのジアステレオ混合物であり、Ｎ個のホスホロチオエート結合が分子内にあれば、理論上、２Ｎ個のジアステレオ混合物が存在する。このＰ−キラルの問題は、ターゲット遺伝子（ｍＲＮＡ）への親和性、核酸分解酵素に対する安定性等に大きく影響することが予想され、光学活性な核酸化合物の合成が望まれている。【０００４】
いくつかの研究グループから、オリゴＤＮＡにおいて、Ｒｐ異性体は、ターゲットであるＲＮＡに対して結合能力を増強し、Ｓｐ異性体は、エキソヌクレアーゼに対して十分に安定であることが報告されている。
最近、ホスホロチオエート結合を有する光学活性なオリゴＤＮＡの合成がなされた（特許文献１、非特許文献１参照）。しかしながら、縮合工程において、不斉中心を有するホスホロチオエート結合が生じる工程を含むので、必ずしも純度の高いオリゴＤＮＡを得られるとは限らない。また、ホスホロチオエート結合を有する光学活性なオリゴＲＮＡ又はＲＮＡを分子内に有するオリゴ核酸化合物は未だ製造されていない。【０００５】
一方、最近、ＲＮＡそのものが、種々の機能、活性を有することが判ってきた。例えば、ＲＮＡ干渉においてみられるような遺伝子発現抑制が知られている。
しかしながら、ホスホロチオエート結合を有する光学活性なオリゴＲＮＡ又はＲＮＡを分子内に有するオリゴ核酸は未だ合成されていないので、該化合物の効果についても研究が充分になされていない。【０００６】
【特許文献１】国際公開第０１／４０５１５Ａ１号パンフレット
【非特許文献１】Ｗｏｊｃｉｅｃｈ  Ｊ．Ｓｔｅｃら，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１２０（２９），７１５６（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、主として治療薬、診断薬又は研究試薬として有用となり得るホスホロチオエート結合を有する、光学活性なオリゴ核酸化合物及びその製法並びにその原料となる核酸ダイマーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、ホスホロチオエート結合を有する光学活性な核酸ダイマー化合物を利用することにより、上記目的を達成し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
Ｉ．ホスホロチオエート結合を有する光学活性なオリゴ核酸化合物の製法
次の一般式（１）で表されるホスホロチオエート結合を有する光学活性なオリゴ核酸化合物は、核酸合成ユニットとして、次の一般式（２ａ）又は（２ｂ）で表される光学活性な核酸ダイマー化合物を少なくとも１つ使用することによって製造することができる。以下それを詳述する。
【化１】
2006043521.tif 000002
［式中、各Ｂは、それぞれ独立して、核酸塩基を表す。ｎは、１〜９９の範囲内にある整数を表す。各Ｒ１は、それぞれ独立して、水素、水酸基又はアルコキシ基を表し、各Ｒ１は、少なくとも１つは水酸基を表す。各Ｙは、それぞれ独立して、次の一般式（１ａ）、（１ｂ）又は（１ｃ）で表される置換基を表し、各Ｙは、少なくとも１つは置換基（１ａ）又は（１ｂ）を表す。但し、隣り合う構成モノマーのＹがいずれも置換基（１ａ）又は（１ｂ）である場合を除く。
【化２】
2006043521.tif 000003
Ｚは、水素又はリン酸基を表す。
Ｂｘ１、Ｂｘ２は、同一又は異なって、保護基を有していてもよい核酸塩基を表す。Ｒ１ａ１、Ｒ１ａ２は、同一又は異なって、水素、アルコキシ又はシリルオキシを表す。Ｒ２は、アシル、又は次の一般式（３ａ）若しくは（３ｂ）で表される置換基を表す。
【化３】
2006043521.tif 000004
［式中、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂは、同一又は異なって、アルキルを表すか、又はＲ２ａ、Ｒ２ｂが隣接する窒素原子と一緒になって形成される、５〜６員の飽和アミノ環基を表す。Ｒ２ｄはアリール又は１〜２環性の複素環基を表す。Ｒ２ｃ、Ｒ２ｅは、アルキルを表す。］
Ｒ３は、アルキル、アリール又は１〜２環性の複素環基を表す。Ｒ４は、水素又は酸性条件下で脱離する基を表す。］
【００１０】
Ｂ、ＢＸ１、ＢＸ２に係る「核酸塩基」は、核酸の合成に使用されるものであれば特に制限されない。例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン又はそれらの修飾体を挙げることができる。
核酸塩基の「修飾体」とは、核酸塩基が任意の置換基で置換されている化合物をいう。
Ｂ、ＢＸ１、ＢＸ２の修飾体に係る置換基としては、例えば、ハロゲン、アシル、アルキル、アリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、シアノ及びニトロからなる群から１〜３個の同一又は異なる置換基を選択することができる。【００１１】
ここで、本発明おいて「ハロゲン」としては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。
本発明において「アシル」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１〜６のアルカノイル、炭素数７〜１３のアロイルを挙げることができる。具体的には、例えば、ホルミル、アセチル、ｎ−プロピオニル、イソプロピオニル、ｎ−ブチリル、イソブチリル、ｔｅｒｔ−ブチリル、バレリル、ヘキサノイル、ベンゾイル、ナフトイル、レブリニルを挙げることができる。当該「アシル」は置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノ、ニトロ、トリメチルシリルを挙げることができ、これらが１〜３個置換されている。なかでも、Ｒ２に係る「アシル」としては、例えば、レブリニル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、ベンゾイル、４−アニソイル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル、４−イソプロピルフェノキシアセチルを挙げることができる。【００１２】
本発明において「アルキル」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１〜５のものを挙げることができる。具体的には、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルを挙げることができる。当該「アルキル」は置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノ、ニトロ、トリメチルシリルを挙げることができ、これらが１〜３個置換されている。なかでも、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂに係る「アルキル」としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルを挙げることができ、Ｒ２ｃ、Ｒ２ｄ、Ｒ３に係る「アルキル」としては、例えば、メチル、２−シアノエチル、２−ニトロエチル、２−トリメチルシリルエチルを挙げることができる。
本発明において「アリールアルキル」、「アルコキシアルキル」、「モノアルキルアミノ」及び「ジアルキルアミノ」のアルキル部分は、上記「アルキル」と同じものを挙げることができる。【００１３】
本発明において「アリール」としては、例えば、炭素数６〜１２のものを挙げることができる。具体的には、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、ビフェニルを挙げることができる。当該「アリール」は置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが１〜３個置換されている。なかでも、Ｒ２ｄ、Ｒ３に係る「アリール」としては、例えば、２−クロロフェニル、２−クロロ−４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルを挙げることができる。
本発明において「アリールアルキル」のアリール部分は、上記「アリール」と同じものを挙げることができる。【００１４】
本発明において「アルコキシ」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１〜４のものを挙げることができる。具体的には、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシを挙げることができる。当該「アルコキシ」は置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、アルキル、アルコキシを挙げることができ、これらが１〜３個置換されていてもよい。なかでも、Ｒ１、Ｒ１ａ１、Ｒ１ａ２に係る「アルコキシ」としては、例えば、メトキシ、エトキシ、メトキシエトキシを挙げることができる。
本発明において「アルコキシアルキル」のアルコキシ部分も、上記「アルコキシ」と同じものを挙げることができる。【００１５】
本発明において「アシル」、「アルキル」、「アリール」の置換基である「ハロゲン」、「アルキル」及び「アルコキシ」としては、各々前記と同じものを挙げることができる。【００１６】
ＢＸ１、ＢＸ２に係る「核酸塩基」は保護されていてもよく、なかでもアミノ基を有する核酸塩基、例えば、アデニン、グアニン、シトシンは、アミノ基が保護されているのが好ましい。かかる「アミノ基の保護基」としては、核酸の保護基として使用されるものであれば特に制限されず、具体的には、例えば、ベンゾイル、４−アニソイル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル、４−イソプロピルフェノキシアセチルを挙げることができる。【００１７】
Ｒ１ａ１、Ｒ１ａ２に係る「シリルオキシ」としては、例えば、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、トリイソプロピルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルを挙げることができる。【００１８】
Ｒ２ｄ、Ｒ３に係る「１〜２環性の複素環基」としては、例えば、窒素原子、酸素原子、硫黄原子からなる群から選択されるヘテロ原子１〜３個を含み、１〜６個の不飽和結合を有していてもよく、置換されていてもよい５〜１２員の単環又は縮合環を挙げることができる。かかる置換基としては、例えば、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、ニトロからなる群から選択される１〜３個の同一又は異なる置換基を挙げることができる。なかでも、１−ベンゾトリアゾール、１−モルホリノが好ましい。【００１９】
Ｒ４に係る「酸性条件下で脱離する基」としては、例えば、トリチル、４，４’−ジメトキシトリチル、９−フェニルキサンテン−９−イル、２−テトラヒドロピラニル、１−メトキシ−４−テトラヒドロピラニルを挙げることができる。
Ｒ２ａ、Ｒ２ｂに係る「５〜６員の飽和アミノ環基」としては、例えば、ピロリジン−１−イル、ピペリジン−１−イル、モルホリン−１−イルを挙げることができる。【００２０】
本発明において製造されるオリゴ核酸化合物に存在するホスホロチオエート結合部位のリン原子上の不斉中心は、全て光学活性な核酸ダイマー化合物（２ａ）又は（２ｂ）によって導入される。
本発明に係るオリゴ核酸化合物の製法において使用する核酸ダイマー化合物（２ａ）又は（２ｂ）は、いわゆる固相法において製造するか、又は、いわゆる液相法において製造するかによって異なる。
以下、ホスホロチオエート結合を有するオリゴ核酸化合物の固相法による製法及び液相法による製法について詳述する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、（Ｒｐ）−ＡｓＡ（１）の逆相ＨＰＬＣ分析により得られたクロマトグラムを表す。図中、縦軸は、時間（分）を示し、横軸は、吸収強度を示す。
【図２】図２は、（Ｓｐ）−ＡｓＡ（２）の逆相ＨＰＬＣ分析により得られたクロマトグラムを表す。図中、縦軸は、時間（分）を示し、横軸は、吸収強度を示す。
【図３】図３は、（Ｒｐ）−ＡｓＡ（１）と（Ｓｐ）−ＡｓＡ（２）との混合物の逆相ＨＰＬＣ分析により得られたクロマトグラムを表す。図中、縦軸は、時間（分）を示し、横軸は、吸収強度を示す。
【図４】図４は、実施例８において合成されたオリゴ核酸化合物（３）のイオン交換ＨＰＬＣ分析により得られたクロマトグラムを表す。図中、縦軸は、時間（分）を示し、横軸は、吸収強度を示す。
【図５】図５は、実施例９において合成されたオリゴ核酸化合物（４）のイオン交換ＨＰＬＣ分析により得られたクロマトグラムを表す。図中、縦軸は、時間（分）を示し、横軸は、吸収強度を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
Ｉ（ａ）．ホスホロチオエート結合を有する光学活性なオリゴ核酸化合物の固相法による製法
ホスホロチオエート結合を有するオリゴ核酸化合物の固相法による製法は、例えば、次に示す工程１〜工程７の操作を経ることにより、段階的に３’から５’の方向へ核酸合成ユニットを縮合し、核酸重合度が２〜１００のホスホロチオエート結合を有するオリゴ核酸化合物を製造することができる。当該製法は、マニュアル又は自動合成機を用いるいずれの方法によっても実施することができるが、操作法の簡便化、また合成の正確性の点から自動合成機を用いる方法が望ましい。また、反応式に記載されている化合物及び試薬のうち、核酸合成ユニット以外については、オリゴＤＮＡ合成に一般的に使用されているものであれば特に限定されない。
【００２３】
（１）工程１：固相担体に担持された核酸化合物に酸を作用させることによって５’位の水酸基の保護基を脱離する工程。
本工程は、固相担体に担持された次の一般式（６）、（６ａ）、（６ｂ）で表される核酸化合物、又は、後述する工程Ａ〜工程Ｄの操作を行うことにより製造される固相担体に担持されたオリゴＲＮＡ若しくはオリゴＤＮＡ（以下、「固相担体に担持された核酸化合物」という。）に酸を作用させることにより実施することができる。
【化４】
2006043521.tif 000005
［式中、Ｂｘ、Ｂｘ１、Ｂｘ２、Ｒ１ａ、Ｒ１ａ１、Ｒ１ａ２、Ｒ３、Ｒ４は前記と同義である。Ｒ２Ｌは、次の一般式（７）で表される置換基である。
【化５】
2006043521.tif 000006
［式中、Ｌは、単結合又は次の一般式（８）で表される置換基を表す。
【化６】
2006043521.tif 000007
［式中Ｒ２ｅは、前記と同義である。］］］【００２４】
「固相担体」としては、例えば、定孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ；ＣＰＧ）、オキサリル化−定孔ガラス（例えば、Ａｌｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９１，１９，１５２７を参照）、ＴｅｎｔａＧｅｌ支持体−アミノポリエチレングリコール誘導体化支持体（例えば、Ｗｒｉｇｈｔら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９３，３４，３３７３を参照）、Ｐｏｒｏｓ−ポリスチレン／ジビニルベンゼンのコポリマーを挙げることができる。【００２５】
「リンカー」としては、例えば、３−アミノプロピル、スクシニル、２，２’−ジエタノールスルホニル、ロング−チェーンアルキルアミノ（ＬＣＡＡ）を挙げることができる。
化合物（６）、（６ａ）、（６ｂ）は、公知の方法に従い製造される又は市販品として入手できる固相担体に担持された核酸化合物である。化合物（６）、（６ａ）、（６ｂ）におけるＲ２Ｌの好ましい態様としては、次の一般式（９ａ）、（９ｂ）で表される置換基を挙げることができる。
【化７】
2006043521.tif 000008
［式中、Ｒ２ｅは、前記と同義である。］
Ｒ２Ｌが置換基（９ａ）又は（９ｂ）である化合物（６ａ）又は（６ｂ）は、例えば、核酸ダイマー化合物（２ａ）又は（２ｂ）から公知の方法（例えば、Ｓｔｅｖｅｎ  Ｐ．  Ａｄａｍｓら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１０５，６６１（１９８３）、  Ｔ．Ｈｏｒｎら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２７，４７０５（１９８６）、  Ａ．Ｇｕｚａｅｖら，アメリカ特許第５９５９０９０号公報を参照）に従い製造することができる。【００２６】
本工程に使用しうる「酸」としては、例えば、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、酢酸等を挙げることができる。本工程に使用する酸は、適当な溶媒で希釈して使用することもできる。反応溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、水又はこれらの混合溶媒を挙げることができる。上記反応における反応温度は、２０℃〜５０℃が適当である。反応時間は、使用する酸の種類、反応温度によって異なるが、通常１分〜１時間が適当である。使用する試薬の量は固相担体に担持された核酸化合物に対して１〜１００倍モル量が適当であり、１〜１０倍モル量が好ましい。
【００２７】
（２）工程２：工程１において製造された、固相担体に担持された核酸化合物に活性化剤を用いて核酸合成ユニットを縮合させる工程。
本工程は、固相担体に担持された核酸化合物に核酸合成ユニットと活性化剤とを作用させることにより実施することができる。【００２８】
固相法に用いる「核酸合成ユニット」としては、例えば、核酸モノマーユニット、核酸ダイマーユニット、核酸オリゴマーユニットを挙げることができる。【００２９】
「核酸モノマーユニット」としては、例えば、公知の方法に従い製造又は市販品として入手可能な次の一般式（１０ａ）で表される化合物を挙げることができる。
【化８】
2006043521.tif 000009
［式中、Ｂｘ、Ｒ１ａ、Ｒ４は、上記と同義である。Ｒ２ｐａは、一般式（３ａ）で表される置換基を表す。
【化９】
2006043521.tif 000010
［式中、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃは、前記と同義である。］］【００３０】
「核酸ダイマーユニット」としては、例えば、次の一般式（２ａ１）又は（２ｂ１）で表される光学活性な核酸ダイマー化合物を挙げることができる。
【化１０】
2006043521.tif 000011
［式中、Ｂｘ１、Ｂｘ２、Ｒ１ａ１、Ｒ１ａ２、Ｒ２ｐａ、Ｒ３、Ｒ４は、前記と同義である。］【００３１】
「オリゴ核酸ユニット」としては、例えば、次の一般式（１１ａ）で表されるオリゴ核酸化合物を挙げることができる。
【化１１】
2006043521.tif 000012
［式中、Ｂｘ、Ｒ１ａ、Ｒ２ｐａ、Ｒ３、Ｒ４は、前記と同義である。ｑは、１〜９８の範囲内にある整数を表す。］【００３２】
「活性化剤」としては、例えば、１Ｈ−テトラゾール、５−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−テトラゾール、又はジイソプロピルアミノテトラゾリドを挙げることができる。上記反応における反応温度は、２０℃〜５０℃が適当である。反応時間は、使用する活性化剤の種類、反応温度によって異なるが、通常１分〜１時間が適当である。使用する試薬の量は固相担体に担持された核酸化合物に対して１〜１００倍モル量が適当であり、１〜１０倍モル量がより好ましい。
【００３３】
（３）工程３：工程２において未反応であった、固相担体に担持された核酸化合物の５’位の水酸基をキャッピングする工程。
本工程は、前記工程２において未反応であった、固相担体に担持された核酸化合物の５’位の水酸基を保護する反応であり、固相担体に担持された核酸化合物にキャップ化剤を作用することにより実施することができる。【００３４】
「キャップ化剤」としては、例えば、無水酢酸又はフェノキシ酢酸無水物を挙げることができる。キャップ化剤は、０．０５〜１Ｍの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。反応溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ピリジン、ジクロロメタン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン又はこれらの混合溶媒を挙げることができる。また、必要に応じて、「反応促進剤」として、例えば、４−ジメチルアミノピリジン、Ｎ−メチルイミダゾールを使用することができる。上記反応における反応温度は、２０℃〜５０℃が適当である。反応時間は、使用するキャップ化剤の種類、反応温度によって異なるが、通常１分〜３０分が適当である。使用する試薬の量は固相担体に担持された核酸化合物に対して１〜１００倍モル量が適当であり、１〜１０倍モル量が好ましい。
【００３５】
（４）工程４：工程２において製造された核酸化合物に酸化剤を作用させることによって亜リン酸基をリン酸基に変換する工程。
本工程は、３価のリンから５価のリンに酸化剤を使用して変換する反応であり、固相担体に担持された核酸化合物に酸化剤を作用させることにより実施することができる。【００３６】
「酸化剤」としては、例えば、ヨウ素、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドを挙げることができる。また、本工程に使用する酸化剤は、０．０５〜２Ｍの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。反応溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ピリジン、テトラヒドロフラン、水又はこれらの混合溶媒を挙げることができる。例えば、ヨウ素／水／ピリジン−テトラヒドロフランあるいはヨウ素／ピリジン−酢酸、過酸化剤（例えば、ｔｅｒｔ−ブチルハイドロパーオキシド／ジクロロメタン）を用いることができる。反応温度は、２０℃〜５０℃が適当である。反応時間は、使用する酸化剤の種類、反応温度によって異なるが、通常１分〜３０分が適当である。使用する試薬の量は固相担体に担持された核酸化合物に対して１〜１００倍モル量が適当であり、１０〜５０倍モル量が好ましい。
【００３７】
（５）工程５：上記工程１〜４を繰り返すことにより製造された、所望の鎖長のホスホロチオエート結合を有するオリゴ核酸化合物を固相担体から切り出し、各核酸塩基部分及び各２’位の水酸基の保護基を脱離する工程。
本工程は、所望の鎖長のホスホロチオエート結合を有するオリゴ核酸化合物を切り出し剤によって、固相担体及びリンカーから外す反応であり、所望の鎖長のホスホロチオエート結合を有するオリゴ核酸化合物が担持された固相担体に切り出し剤を添加することにより実施することができる。また、本工程において、各核酸塩基部の保護基を脱離することができる。【００３８】
「切り出し剤」としては、例えば、濃アンモニア水、メチルアミンを挙げることができる。本工程に使用する「切り出し剤」は、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン又はこれらの混合溶媒で希釈して使用することもできる。なかでも、エタノールが好ましい。
反応温度は、１５℃〜７５℃が適当であり、１５℃〜３０℃が好ましく、１８℃〜２５℃がより好ましい。脱保護反応時間は、１〜３０時間が適当であり、１〜２４時間が好ましく、１２〜２４時間がより好ましい。脱保護に使用される溶液中の水酸化アンモニウムの濃度は、２０〜３０重量％が適当であり、２５〜３０重量％が好ましく、２８〜３０重量％がより好ましい。使用する試薬の量は、固相担体に担持された核酸化合物に対して１〜１００倍モル量が適当であり、１０〜５０倍モル量が好ましい。【００３９】
２’位の水酸基の保護基を脱離する工程は、「２’位の水酸基の保護基を脱保護する試薬」、例えば、テトラｎ−ブチルアンモニウムフルオリド、三フッ化水素・トリエチルアミン塩を固相担体から切り出された所望の鎖長のホスホロチオエート結合を有するオリゴ核酸化合物に作用させることにより行うことができる。反応溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、テトラヒドロフラン、Ｎ−メチルピロリドン、ピリジン又はこれらの混合溶媒を挙げることができる。反応温度は、２０℃〜８０℃が適当である。反応時間は、使用する脱保護剤の種類、反応温度によって異なるが、通常１時間〜１００時間が適当である。使用する試薬の量は除去される保護基に対して５０〜５００倍モル量が適当であり、５０〜１００倍モル量が好ましい。
上記反応混合物から通常の分離手段、例えば、抽出、濃縮、中和、濾過、遠心分離、再結晶、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、透析、限界ろ過などの手段を用いることにより、５’位が保護されたオリゴ核酸化合物を単離することができる。
【００４０】
（６）工程６：工程５において製造されたオリゴ核酸化合物の５’位水酸基の保護基を脱離する工程。
本工程は、最終的にオリゴ核酸化合物の５’位水酸基の保護基を脱離する反応であり、固相担体から切り出されたホスホロチオエート結合を有するオリゴ核酸化合物に酸を作用させることにより実施することができる。【００４１】
「酸」としては、例えば、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、酢酸等を挙げることができる。本工程に使用する酸は、適当な溶媒で希釈して使用することもできる。反応溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、ジクロロメタン、アセトニトリル、水、ｐＨが２〜５の緩衝液又はこれらの混合溶媒を挙げることができる。緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液を挙げることができる。反応温度は、２０℃〜５０℃が適当である。反応時間は、使用する酸の種類、反応温度によって異なるが、通常１分〜１時間が適当である。使用する試薬の量は固相担体に担持された核酸化合物に対して１〜１００倍モル量が適当であり、１〜１０倍モル量が好ましい。
【００４２】
（７）工程７：工程６において製造されたオリゴ核酸化合物を分離精製する工程。
「分離精製工程」とは、上記反応混合物から通常の分離精製手段、例えば、抽出、濃縮、中和、濾過、遠心分離、再結晶、Ｃ８からＣ１８の逆相カラムクロマトグラフィー、Ｃ８からＣ１８の逆相カートリッジカラム、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、透析、限界ろ過などの手段を単独若しくは組み合わせて用いることにより、所望のホスホロチオエート結合を有するオリゴ核酸化合物を単離精製する工程である。【００４３】
「溶出溶媒」としては、例えば、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、水の単独溶媒もしくは任意の比率の混合溶媒を挙げることができる。この場合添加物として、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸トリエチルアンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、トリス塩酸、エチレンジアミン四酢酸を１ｍＭ〜２Ｍの濃度で添加し、溶液のｐＨを１〜９の範囲で調整することもできる。
【００４４】
上記工程１〜工程４の操作を繰り返すことにより、所望の鎖長のホスホロチオエート結合を有するオリゴ核酸化合物（１）を製造することができる。なお、本製法においてホスホロチオエート結合を有するオリゴ核酸化合物を製造するための出発原料として、化合物（６）、（６ａ）、（６ｂ）等を使用することができる。但し、出発原料として、化合物（６）を使用した場合、核酸合成ユニットとして、少なくとも１つは核酸ダイマー化合物（２ａ１）又は（２ｂ１）を使用する必要がある。
また、本製法において、上記工程５の操作を行う前に上記工程６の操作を行い、その後上記工程５の操作を行い、次いで上記工程７の操作を行うことによりオリゴＲＮＡを単離精製することもできる。
さらに、本製法において、上記工程５の操作を行った後に、上記工程７の操作を行い、その後、上記工程６、次いで再度上記工程７の操作を行うことによりオリゴＲＮＡを単離精製することもできる。
【００４５】
Ｉ（ｂ）．ホスホロチオエート結合を有する光学活性なオリゴ核酸化合物の液相法による製法
ホスホロチオエート結合を有するオリゴ核酸化合物の液相法による製法は、例えば、次に示す工程ａ〜ｄの操作を経ることにより、段階的に核酸合成ユニットを縮合し、核酸重合度が２〜１００のホスホロチオエート結合を有するオリゴ核酸化合物を製造することができる。当該合成法において、反応式に記載されている化合物及び試薬のうち、核酸合成ユニット以外については、オリゴＤＮＡ合成に一般的に使用されているものであれば特に限定されない。【００４６】
液相法に用いる「核酸合成ユニット」としては、例えば、核酸モノマーユニット、核酸ダイマーユニット、核酸オリゴマーユニットを挙げることができる。【００４７】
「核酸モノマーブロック」としては、公知の方法に従い製造又は市販品として入手可能な次の一般式（１０ｂ）で表される化合物を挙げることができる。
【化１２】
2006043521.tif 000013
［式中、Ｂｘ、Ｒ１ａ、Ｒ４は、上記と同義である。Ｒ２ｐｂは、アシル又は次の一般式（３ｂ）で表される置換基を表す。
【化１３】
2006043521.tif 000014
［式中、Ｒ２ｄ、Ｒ２ｅは、前記と同義である。］］
Ｒ２ｐｂに係る「アシル」としては、前記と同じものを挙げることができる。なかでも、Ｒ２と同じものを挙げることができる。【００４８】
「核酸ダイマーユニット」としては、例えば、次の一般式（２ａ２）又は（２ｂ２）で表される光学活性な核酸ダイマー化合物を挙げることができる。
【化１４】
2006043521.tif 000015
［式中、Ｂｘ１、Ｂｘ２、Ｒ１ａ１、Ｒ１ａ２、Ｒ２ｐｂ、Ｒ３、Ｒ４は前記と同義である。］【００４９】
「オリゴ核酸ユニット」としては、例えば、次の一般式（１１ｂ）で表される化合物、又は、工程ａ〜ｂを経ることにより、核酸モノマーユニット、核酸ダイマーユニット若しくはオリゴ核酸ユニット（１１ｂ）を縮合して製造されるオリゴ核酸化合物を挙げることができる。
【化１５】
2006043521.tif 000016
［式中、Ｂｘ、Ｒ１ａ、Ｒ２ｐｂ、Ｒ３、Ｒ４は、前記と同義である。ｑは、１〜９８の範囲内にある整数を表す。］
【００５０】
（１）工程ａ：選択的脱保護の工程。
選択的脱保護工程は、核酸合成ユニットに、５’位又は３’位の水酸基の保護基を脱離する試薬を作用させることによって、選択的に脱保護された化合物を製造する工程である。具体的には、例えば、核酸合成ユニットである、核酸モノマーユニット、核酸ダイマーユニット又はオリゴ核酸ユニットにおいて、５’位の水酸基に置換している保護基である、例えば、４，４’−ジメトキシトリチル、又は３’位の水酸基に置換しているリン酸基上の保護基である、例えば、シアノエチル基を除去する工程である。
「シアノエチル基を除去する試薬」としては、例えば、ピリジン−トリエチルアミン−水（３：１：１）溶液を挙げることができる。
「４，４’−ジメトキシトリチル基を除去する試薬」としては、例えば、トリクロロ酢酸、酢酸を挙げることができる。
「４，４’−ジメトキシトリチル基を除去する試薬」、「シアノエチル基を除去する試薬」の使用量は、除去される４，４’−ジメトキシトリチル基あるいはシアノエチル基に対して、１〜２０倍モル量、より好ましくは、１〜１０倍モル量である。上記反応における反応温度は、例えば、−２０℃〜１００℃が適当あり、０℃〜８０℃が好ましく、５℃〜３０℃がより好ましい。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度によって異なるが、通常１分〜１時間が適当である。
【００５１】
（２）工程ｂ：縮合工程。
本工程は、通常、適当な溶媒中、過剰の有機アミン存在下において、２種類の選択的に脱保護された核酸合成ユニット、（例えば、５’位の水酸基の保護基が脱離した核酸合成ユニットと３’位の水酸基の保護基が脱離した核酸合成ユニット）に縮合試薬を作用させることにより実施することができる。
反応溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４−ジオキサンなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、ベンゼン、トルエンなどの炭化水素、ピリジンなどの有機アミン類又はこれらの混合溶媒が挙げられる。縮合試薬の使用量は、核酸合成ユニットである、核酸モノマーユニット、核酸ダイマーユニット、又は、オリゴ核酸ユニットに対して、１〜２０倍モル量が適当であり、１〜１０倍モル量が好ましい。反応温度は、例えば、−２０℃〜１００℃が適当あり、０℃〜８０℃が好ましく、５℃〜３０℃がより好ましい。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度によって異なるが、通常３０分〜１００時間が適当である。
「縮合試薬」としては、例えば、１−（２−メシチレンスルホニル）−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール、２，４，６−トリメチルベンゼンスルホニルテトラゾール又１−（２，４，６−トリイソプロピルベンゼンスルホニル）−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾールを挙げることができる。
【００５２】
（３）工程ｃ：全ての保護基を脱離する工程。
本工程は、上記工程ａと工程ｂとの繰り返しにより製造される所望の鎖長の保護されたオリゴ核酸化合物のすべての保護基を脱離する工程である。
本工程において使用する「各保護基を除去するための試薬」としては、例えば、アンモニア類、シリル基を除去する試薬、酸を挙げることができる。
「アンモニア類」としては、例えば、水酸化アンモニウム水溶液及びアンモニア／メタノール溶液を挙げることができる。反応温度は、１８℃〜７５℃が適当であり、１８℃〜６５℃が好ましく、２５℃〜５５℃がより好ましい。反応時間は、１〜３０時間が適当であり、１〜２４時間が好ましい。脱保護に使用される溶液中の水酸化アンモニウムの濃度は、２０〜３０重量％が適当であり、２５〜３０重量％が好ましい。使用する試薬の量は、除去される保護基に対して１〜１００倍モル量が適当であり、１０〜５０倍モル量が好ましい。
「シリル基を除去する試薬」として、２’位の水酸基の保護基がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基である場合、例えば、テトラｎ−ブチルアンモニウムフルオリド、三フッ化水素・トリエチルアミン塩を挙げることができる。反応溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、テトラヒドロフラン、Ｎ−メチルピロリドン、ピリジン、トリエチルアミン又はこれらの混合溶媒を挙げることができる。反応温度は、２０℃〜８０℃が適当であり、５５℃〜７０℃が好ましい。反応時間は、使用する脱保護剤の種類、反応温度によって異なるが、通常１時間〜１００時間が適当である。使用する試薬の量は、除去される保護基に対して５０〜５００倍モル量が適当であり、５０〜１００倍モル量が好ましい。
「酸」としては、例えば、トリクロロ酢酸、酢酸等を挙げることができる。酸は、適当な溶媒で希釈して使用することもできる。反応溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、水又はこれらの混合溶媒を挙げることができる。反応温度は、２０℃〜５０℃が適当である。反応時間は、使用する酸の種類、反応温度によって異なるが、通常１分〜１時間が適当である。使用する試薬の量は固相担体に担持されている化合物に対して１〜１００倍モル量が適当であり、１〜１０倍モル量が好ましい。
【００５３】
（４）工程ｄ：精製工程。
「精製工程」とは、上記反応混合物から通常の分離精製手段、例えば、抽出、濃縮、中和、濾過、遠心分離、再結晶、Ｃ８からＣ１８の逆相カラムクロマトグラフィー、Ｃ８からＣ１８の逆相カートリッジカラム、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、透析、限界ろ過などの手段を単独若しくは組み合わせて用いることにより、所望のホスホロチオエート結合を有するオリゴ核酸化合物を単離精製する工程である。
「溶出溶媒」としては、例えば、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、水の単独溶媒もしくは任意の比率の混合溶媒を挙げることができる。この場合添加物として、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸トリエチルアンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、トリス塩酸、エチレンジアミン四酢酸を１ｍＭ〜２Ｍの濃度で添加し、溶液のｐＨを１〜９の範囲で調整することもできる。
上記工程ａ、工程ｂを繰り返し行うことにより、所望の鎖長のオリゴ核酸化合物を製造することができる。なお、本製法においてホスホロチオエート結合を有するオリゴ核酸化合物を製造するため、核酸合成ユニットとして、少なくとも１つは核酸ダイマー化合物（２ａ２）又は（２ｂ２）を使用し、及びオリゴ核酸化合物の構成モノマーとしてリボ核酸化合物を少なくとも１つ使用する必要がある。
【００５４】
Ｉ（ｃ）．総括
本発明は、少なくとも１つは、ラセミ化を起こさないよう高度にホスホロチオエート結合部位が保護された核酸ダイマー化合物（２ａ）又は（２ｂ）（固相法による場合は、核酸ダイマー化合物（２ａ１）又は（２ｂ１）、液相法による場合は、核酸ダイマー化合物（２ａ２）又は（２ｂ２））を使用するオリゴ核酸化合物（１）の製法である。また、本発明は、従来から知られているホスホロチオエート結合を有するオリゴ核酸化合物の製法とは異なり、通常のオリゴ核酸化合物の製法と同様にリン酸ジエステル結合のみを形成する方法である。
したがって、本発明は、核酸合成ユニットの１つとして純度の高い核酸ダイマー化合物（２ａ）又は（２ｂ）を使用することにより、純度の高いオリゴ核酸化合物を容易に製造することができる製法である。本発明により製造されるオリゴ核酸化合物の純度としては、例えば、５０％〜１００％が適当であり、９５〜９９．９９％が好ましく、９９〜９９．９％がより好ましい。
【００５５】
ＩＩ．ホスホロチオエート結合を有する光学活性な核酸ダイマー化合物
本発明として、次の一般式（２ａ）又は（２ｂ）で表される光学活性な核酸ダイマー化合物（以下、「本発明核酸ダイマー」という。）を挙げることができる。
【化１６】
2006043521.tif 000017
［式中、Ｂｘ１、Ｂｘ２、Ｒ１ａ１、Ｒ１ａ２、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、前記と同義である。］
【００５６】
本発明核酸ダイマーは、高度に保護された光学活性なホスホロチオエート結合部位を有するので、ラセミ化を起こさないという特徴を有する。したがって、本発明核酸ダイマーは、例えば、ホスホロチオエート結合を有する光学活性なオリゴ核酸化合物（１）を製造するための原料化合物として有用である。
【００５７】
本発明核酸ダイマーの具体例としては、次の１．〜１４．の化合物を挙げることができる。
１．  （Ｒｐ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシル−［３’→５’］−Ｏ−（２−シアノエチル）チオホスホリル−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）
２．  （Ｒｐ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルウリジル−［３’→５’］−Ｏ−（２−シアノエチル）チオホスホリル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルウリジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）
３．  （Ｒｐ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシル−［３’→５’］−Ｏ−（２−シアノエチル）チオホスホリル−２−Ｎ−イソブチリル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルグアノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）
４．  （Ｒｐ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｎ−イソブチリル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルグアノシル−［３’→５’］−Ｏ−（２−シアノエチル）チオホスホリル−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）
５．  （Ｒｐ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルウリジル−［３’→５’］−Ｏ−（２−シアノエチル）チオホスホリル−４−Ｎ−（４−アニソイル）−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルシチジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）
６．  （Ｒｐ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシル−［３’→５’］−Ｏ−（２−シアノエチル）チオホスホリル−４−Ｎ−（４−アニソイル）−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルシチジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）
７．  （Ｒｐ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｎ−イソブチリル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルグアノシル−［３’→５’］−Ｏ−（２−シアノエチル）チオホスホリル−チミジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）
８．  （Ｓｐ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシル−［３’→５’］−Ｏ−（２−シアノエチル）チオホスホリル−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）
９．  （Ｓｐ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルウリジル−［３’→５’］−Ｏ−（２−シアノエチル）チオホスホリル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルウリジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）
１０．  （Ｓｐ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシル−［３’→５’］−Ｏ−（２−シアノエチル）チオホスホリル−２−Ｎ−イソブチリル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルグアノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）
１１．  （Ｓｐ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｎ−イソブチリル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルグアノシル−［３’→５’］−Ｏ−（２−シアノエチル）チオホスホリル−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）
１２．  （Ｓｐ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルウリジル−［３’→５’］−Ｏ−（２−シアノエチル）チオホスホリル−４−Ｎ−（４−アニソイル）−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルシチジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）
１３．  （Ｓｐ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシル−［３’→５’］−Ｏ−（２−シアノエチル）チオホスホリル−４−Ｎ−（４−アニソイル）−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルシチジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）
１４．  （Ｓｐ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｎ−イソブチリル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルグアノシル−［３’→５’］−Ｏ−（２−シアノエチル）チオホスホリル−チミジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）
【００５８】
ＩＩＩ．本発明核酸ダイマーの製法
本発明核酸ダイマーは、次のようにして製造することができる。
以下の製法において、原料に反応させたくない置換基（例えば、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ）が存在する場合は、当該原料をあらかじめ公知の方法に従い、保護基（例えば、ベンゾイル又は４−アニソイル基）で保護した後に反応に用いるのが一般的である。反応後に、接触還元、アルカリ処理、酸処理などの公知の方法に従い保護基を脱離することができる。
本発明核酸ダイマーは、公知の化合物又は容易に製造可能な中間体から、例えば、次の工程Ａ〜工程Ｄを経ることにより製造することができる。
以下、それらの工程を詳細に説明する。
【００５９】
（１）工程Ａ：核酸ダイマー化合物（１５）を製造する工程。
【化１７】
2006043521.tif 000018
［式中、Ｂｘ１、Ｂｘ２、Ｒ１ａ１、Ｒ１ａ２、Ｒ３、Ｒ４は、前記と同義である。Ｒ２ｙはアシルを表す。
Ｒ２ｘは、次の一般式（１３ａ）〜（１３ｅ）で表される置換基を表す。
【化１８】
2006043521.tif 000019
［式中、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂは、同一又は異なって、アルキルを表す。Ｒ３ｃ、Ｒ３ｄ、Ｒ３ｅは、アルキルを表す。Ｒ３ｆは、アルキル、アリール又は１〜２環性の複素環を表す。ｑ、ｒ、ｓ、ｔは、それぞれ独立して１〜２の範囲内にある整数を表す。］］
Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ３ｃ、Ｒ３ｄ、Ｒ３ｅ、Ｒ３ｆに係る「アルキル」としては、前記と同じものを挙げることができる。なかでも、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ３ｅに係る「アルキル」は、前記Ｒ２ａ、Ｒ２ｂに係る「アルキル」と同じものを挙げることができる。また、Ｒ３ｃ、Ｒ３ｄ、Ｒ３ｆに係る「アルキル」は、前記Ｒ２ｃに係る「アルキル」と同じものを挙げることができる。
Ｒ３ｆに係る「アリール」、「１〜２環性の複素環」は、前記と同じものを挙げることができる。なかでも、Ｒ３ｆに係る「アリール」は、前記Ｒ２ｄに係る「アリール」と同じものを挙げることができる。
Ｒ２ｙに係る「アシル」としては、前記と同じものを挙げることができる。なかでも、前記Ｒ２に係る「アシル」と同じものを挙げることができる。
【００６０】
本工程では、核酸化合物（１２）を適当な溶媒に溶解し、適当なリン酸化試薬を作用させることによって、核酸化合物（１３）を製造することができる。この反応自体は公知の方法に従い実施することができる。
反応溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、トルエン又はこれらの混合溶媒が挙げられる。「リン酸化試薬」としては、例えば、２−クロロフェニルジクロロチオフォスフェート、２，４−ジクロロフェニルジクロロチオフォスフェート、２−シアノエチル  ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト、２−シアノエチル  テトライソプロピルホスホロジアミダイトを挙げることができる。リン酸化試薬の使用量は、化合物（１２）に対して、１〜２０倍モル量がよく、より好ましくは、１〜１０倍モル量である。上記反応における反応温度は、０℃〜５０℃が好ましい。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度によって異なるが、通常３０分〜１００時間が適当である。
【００６１】
次に、核酸化合物（１３）を適当な溶媒に溶かし、核酸化合物（１４）と適当な活性化剤又は縮合剤と反応させることにより、核酸ダイマー化合物（１５）を製造することができる。この反応自体は公知の方法で行うことができる。
「活性化剤」としては、例えば、１Ｈ−テトラゾール、５−エチルチオテトラゾール、３，４−ジクロロイミダゾール、３，４−ジシアノイミダゾール、ベンゾトリアゾールトリフラート、イミダゾールトリフラート、５−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−テトラゾール、ジイソプロピルアミノテトラゾリドを挙げることができる。「縮合剤」としては、例えば、１−（２−メチシレンスルホニル）−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール、２，４，６−トリメチルベンゼンスルホニルテトラゾール又は１−（２，４，６−トリイソプロピルベンゼンスルホニル）−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾールを挙げることができる。活性化剤又は縮合剤の使用量は、核酸化合物（１３）に対して、１〜２０倍モル量がよく、より好ましくは、１〜１０倍モル量である。反応溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、トルエン又はこれらの混合溶媒が挙げられる。反応温度は、０℃〜５０℃が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常３０分〜１００時間が適当である。
この時、Ｒ２ｘが置換基（１３ａ）〜（１３ｄ）である場合、例えば、硫化試薬で酸化することにより、核酸ダイマー化合物（１５）を製造することができる。「硫化試薬」としては、例えば、硫黄、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン  １，１−ジオキシド（ビューケージ試薬）、３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（ＡＤＴＴ）を挙げることができる。硫化試薬の使用量は、核酸化合物（１３）に対して、１〜２０倍モル量がよく、より好ましくは、１〜１０倍モル量である。硫化試薬で酸化する際において使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、ピリジン又はこれらの混合溶媒が挙げられる。
通常、本工程において製造される核酸ダイマー化合物（１５）は、ホスホロチオエート結合のリン原子に不斉中心を有するので、１対１のジアステレオ混合物である。Ｒ２ｘが、光学活性な置換基（１３ｄ）である核酸化合物（１３）を使用した場合、その比率が片方のジアステレオマーに片寄るので、次の工程の分離工程を簡素化できる場合がある。
【００６２】
（２）工程Ｂ：分離により光学活性な核酸ダイマー化合物（１５ａ）又は（１５ｂ）を製造する工程。
【化１９】
2006043521.tif 000020
［式中、Ｂｘ１、Ｂｘ２、Ｒ１ａ１、Ｒ１ａ２、Ｒ２ｙ、Ｒ３、Ｒ４は、上記と同義である。］
ジアステレオマー混合物である核酸ダイマー化合物（１５）は、シリカゲルクロマトカラム精製等の分離操作により、ホスホロチオエート結合を有する光学活性な核酸ダイマー化合物（１５ａ）、（１５ｂ）に分割することができる。
本工程において製造される核酸ダイマー化合物（１５ａ）、（１５ｂ）は、Ｒ２がアシルである本発明核酸ダイマーである。
【００６３】
（３）工程Ｃ：核酸ダイマー化合物（１５ａ）又は（１５ｂ）のＲ２ｙを選択的に除去する工程。
【化２０】
2006043521.tif 000021
［式中、Ｂｘ１、Ｂｘ２、Ｒ１ａ１、Ｒ１ａ２、Ｒ２ｙ、Ｒ３、Ｒ４は、上記と同義である。］
核酸ダイマー化合物（１５ａ）又は（１５ｂ）を適当な溶媒に溶解し、Ｒ２ｙを選択的に除去する試薬を作用させることによって、核酸ダイマー化合物（１６ａ）又は（１６ｂ）を製造することができる。
反応溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ピリジン、アセトニトリル又はこれらの混合溶媒が挙げられる。「Ｒ２ｙを選択的に除去する試薬」としては、例えば、Ｒ１ａ１又はＲ１ａ２がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルであり、Ｒ４が４，４’−ジメトキシトリチルであり、Ｒ３が２−シアノエチルであり、且つ、Ｒ２ｙがレブリニルである場合には、Ｒ２ｙを選択的に除去する試薬としては、０．５Ｍヒドラジン一水和物／酢酸−ピリジン（１：４）溶液を挙げることができる。「Ｒ２ｙを選択的に除去する試薬」の使用量は、核酸ダイマー化合物（１５ａ）又は（１５ｂ）に対して、１〜２０倍モル量がよく、より好ましくは１〜１０倍モル量である。反応温度は、０℃〜５０℃が好ましい。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常３０分〜１００時間が適当である。
【００６４】
（４）工程Ｄ：核酸ダイマー化合物（１７ａ）又は（１７ｂ）を製造する工程。
【化２１】
2006043521.tif 000022
［式中、Ｂｘ１、Ｂｘ２、Ｒ１ａ１、Ｒ１ａ２、Ｒ３、Ｒ４は、上記と同義である。Ｒ２ｐは、次の一般式（３ａ）又は（３ｂ）で表される置換基を表す。
【化２２】
2006043521.tif 000023
［式中、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ、Ｒ２ｄ、Ｒ２ｅは、前記と同義である。］］
本発明において、核酸ダイマー化合物（１６ａ）又は（１６ｂ）を適当な溶媒に溶解し、リン酸化試薬を作用させて、核酸ダイマー化合物（１７ａ）又は（１７ｂ）を製造することができる。
本工程において製造される核酸ダイマー化合物（１７ａ）、（１７ｂ）は、Ｒ２が置換基（３ａ）、（３ｂ）である本発明核酸ダイマーである。
反応溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、トルエン又はこれらの混合溶媒が挙げられる。「リン酸化試薬」としては、例えば、２−シアノエチル  ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト、２−シアノエチル  テトライソプロピルホスホロジアミダイト、２−クロロフェニルホスホリルジクロライドを挙げることができる。リン酸化試薬は、核酸ダイマー化合物（１６ａ）又は（１６ｂ）に対して、１〜２０倍モル量、より好ましくは、１〜１０倍モル量である。反応温度は、例えば、−２０℃〜１００℃が適当であり、０℃〜８０℃が好ましく、５℃〜３０℃がより好ましい。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度によって異なるが、通常３０分〜１００時間が適当である。
【００６５】
ＩＶ．本発明オリゴ核酸
次の一般式（１）で表される光学活性なオリゴ核酸化合物（以下、「本発明オリゴ核酸」という）について詳述する。
【化２３】
2006043521.tif 000024
［式中、Ｂ、ｎ、Ｒ１、Ｙ、Ｚは、前記と同義である。］
ｎは、１〜９９の範囲内にある整数が適当であり、１０〜５０の範囲内にある整数が好ましく、１５〜３０の範囲内にある整数がより好ましい。
また、本発明として、次の一般式（４）で表されるホスホロチオエート結合を有する光学活性なオリゴ核酸化合物（オリゴ核酸化合物（１）とあわせて「本発明オリゴ核酸」ともいう。）を挙げることができる。
【化２４】
2006043521.tif 000025
［式中、Ｂ、Ｒ１は、前記と同義である。
ｍは、１〜４９の範囲内にある整数を表す。
Ｙ１とＹ２はそれぞれ異なって、一方が、次の一般式（１ａ）又は一般式（１ｂ）で表される置換基であり、もう一方が次の一般式で表される（１ｃ）で表される置換基を表す。
【化２５】
2006043521.tif 000026
を表す。
Ｔ１は、水素又は次の一般式（５ａ）で表される置換基を表す。
【化２６】
2006043521.tif 000027
［式中、Ｂ、Ｒ１は、前記と同義である。］
Ｔ２は、水酸基、又は次の一般式（５ａ）、（５ｂ）で表される置換基を表す。
【化２７】
2006043521.tif 000028
［式中、Ｂ、Ｒ１は、前記と同義である。］］
ｍは、１〜４９の範囲内にある整数が適当であり、５〜２５の範囲内にある整数が好ましく、７〜１５の範囲内にある整数がより好ましい。
【００６６】
本発明オリゴ核酸は遊離の酸のまま用いることもできるが、公知の方法に従い塩の形で用いることもできる。かかる「塩」としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩又は、トリエチルアミン、ピリジンなどの三級有機アミン塩を挙げることができる。
また、本発明として、例えば、その分子内に存在するホスホロチオエート結合が、全てＲｐの立体配置であるか又は全てＳｐの立体配置である本発明オリゴ核酸又はその塩を挙げることができる。
さらに、本発明として、純度の高い本発明オリゴ核酸を挙げることができる。本発明オリゴ核酸の純度としては、例えば、５０％〜１００％が適当であり、９５〜９９．９９％が好ましく、９９〜９９．９％がより好ましい。
【００６７】
本発明者らは、本発明オリゴ核酸が、二重鎖融解温度の測定をした結果、それと相補鎖を形成しうるＲＮＡに対して、天然型のオリゴＲＮＡと同様又はそれ以上の親和性を有し、熱力学的に安定なハイブリッドを形成することが明らかとなった（試験例１）。
したがって、本発明オリゴ核酸は、アンチセンス分子として有用な化合物であることが明らかとなった。なかでも、ホスホロチオエート結合が全てＲｐの立体配置である本発明オリゴ核酸は、アンチセンス分子として特に有用である。
また、本発明者らは、本発明オリゴ核酸が、同一配列を有する天然型のオリゴＲＮＡよりも、核酸分解酵素（ホスホジエステラーゼＩ、ウシ血清）に対して抵抗性を示すことを明らかにした（試験例３、試験例４）。
【００６８】
Ｖ．本発明二本鎖オリゴ核酸
本発明として、本発明オリゴ核酸と相補的な配列を有する天然型のオリゴＲＮＡ又は本発明オリゴ核酸との二本鎖オリゴ核酸化合物を挙げることができる。
本発明において二本鎖オリゴ核酸化合物とは、１０から５０塩基対の二重鎖形成部を有する１２から５２塩基のオリゴ核酸化合物の対であって、このオリゴ核酸化合物の対の細胞内への導入により二本鎖オリゴ核酸化合物と相補的なｍＲＮＡを切断することで、そのｍＲＮＡがコードする遺伝子産物の合成が抑制される活性を有するオリゴ核酸の対と定義される。また、本明細書において二本鎖オリゴ核酸化合物は、Ｔｕｓｃｈｌらが報告しているｓｉＲＮＡに限るものではない。例えば、本発明二本鎖オリゴ核酸においては、１２〜５２塩基のオリゴ核酸化合物の対であり、より好ましくは１５〜３０塩基のオリゴ核酸化合物の対である。
本発明二本鎖オリゴ核酸は、リポソームとの複合体として細胞内に導入することにより、同一配列である全てホスホジエステル結合からなるオリゴＲＮＡのニ本鎖オリゴＲＮＡと同等のＲＮＡ干渉を示し、タンパク発現を抑制することを明らかにした（試験例２）。したがって、本発明二本鎖オリゴ核酸は、ｓｉＲＮＡとして有用な化合物であることが明らかとなった。
さらに、本発明者らは、本発明オリゴ核酸と相補的な配列を有する天然型のオリゴＲＮＡとの二本鎖オリゴ核酸化合物を形成した場合における核酸分解酵素（ホスホジエステラーゼＩ）に対する抵抗性を調べた結果、分解抵抗性を有することを明らかにした（試験例５）。
【００６９】
ＶＩ．医薬組成物
本発明は、本発明オリゴ核酸と当該オリゴ核酸を細胞内に移行させるのに有効な担体との複合体を含むことを特徴とする医薬組成物又は本発明二本鎖オリゴ核酸と当該二本鎖オリゴ核酸を細胞内に移行させるのに有効な担体との複合体を含むことを特徴とする医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、例えば、Ｂｃｌ−２タンパク質の過剰発現が原因となっている疾患、アポトーシスの促進が所望される疾患、または血液学的悪性疾患などの治療および／または予防のために用いることができる。これらの疾患は、具体的には、リンパ腫及び白血病の両方を含む血液学的悪性疾患、および固形腫瘍、例えば、肝臓癌、皮膚癌、乳癌、肺癌、消化器癌、前立腺癌、子宮癌、膀胱癌などである。
本発明オリゴ核酸又は本発明二本鎖オリゴ核酸との複合体を形成する担体は、本発明オリゴ核酸又は本発明二本鎖オリゴ核酸を細胞内に移行させるのに有効な、カチオン性リポソームおよびカチオン性ポリマーなどのカチオン性担体、またはウイルスエンベロープを利用した担体などを用いてよい。カチオン性リポソームとして望ましいものは、２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールを含有するリポソーム（以下リポソームＡと表記する）、オリゴフェクトアミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、リポフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、リポフエクトアミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、リポフエクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ）、ＴｒａｎｓＩＴ  ＴＫＯ（Ｍｉｒｕｓ）、などである。カチオン性ポリマーとして望ましいものは、ＪｅｔＳＩ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）、Ｊｅｔ−ＰＥＩ（ポリエチレンイミン；Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）などである。ウイルスエンベロープを利用した担体として望ましいものは、ＧｅｎｏｍｅＯＮＥ（ＨＶＪ−Ｅリポソーム；石原産業）などである。
本発明の医薬組成物に含まれる本発明オリゴ核酸又は本発明二本鎖オリゴ核酸と担体との複合体は、当業者に既知の方法により調製することができる。簡単に述べると、適当な濃度の担体分散液と本発明オリゴ核酸又は本発明二本鎖オリゴ核酸の溶液とを混合して調製する。カチオン性担体を用いる場合、本発明オリゴ核酸又は本発明二本鎖オリゴ核酸は水溶液中で負電荷を帯びているため、常法により水溶液中で混合することによって本発明オリゴ核酸又は本発明二本鎖オリゴ核酸とカチオン性担体は容易に複合体を形成する。複合体形成のために用いる水性溶媒としては、注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水などの電解質液、ブドウ糖液、マルトース液などの糖液などを用いてよい。また、複合体を形成させる際のｐＨおよび温度などの条件は当業者が適宜選択できる。例えば、リポソームＡの場合、１０％マルトース水溶液中の１６ｍｇ／ｍｌのリポソーム分散液に、１０％マルトース水溶液中の本発明オリゴ核酸又は本発明二本鎖オリゴ核酸の溶液を、ｐＨ７．４、２５℃で撹拝しながら徐々に添加して調製できる。
複合体は、必要ならば超音波分散装置や高圧乳化装置などを用いて分散処理を行うことにより、均一な組成物とすることもできる。当業者であれば、本発明オリゴ核酸又は本発明二本鎖オリゴ核酸と担体との複合体の調製に最適な方法および条件は、用いる担体に依存するので、上記の方法にとらわれることなく、用いる担体に最適な方法を選択できる。
本発明の医薬組成物に含まれる本発明オリゴ核酸又は本発明二本鎖オリゴ核酸と担体との複合体の配合比は、本発明オリゴ核酸又は本発明二本鎖オリゴ核酸１重量部に対して担体１〜２００重量部が適当である。望ましくは、本発明オリゴ核酸又は本発明二本鎖オリゴ核酸１重量部に対して２．５〜１００重量部、さらに望ましくは１０〜２０重量部である。
本発明の医薬組成物には本発明オリゴ核酸又は本発明二本鎖オリゴ核酸と担体との複合体の他に、医薬的に許容できるキャリアーまたは希釈剤などを含んでいてもよい．医薬的に許容できるキャリアーまたは希釈剤などは、本質的に化学的に不活性および無害な組成物であり、本発明の医薬組成物の生物学的活性に全く影響を与えないものである。そのようなキャリアーまたは希釈剤の例は、塩溶液、糖溶液、グリセロール溶液、エタノールなどがあるが、これらに限定されない。
本発明の医薬組成物は、治療および／または予防に有効量の複合体を含み、かつ、患者に適切に投与できるような形態で提供される。本発明の医薬組成物の製剤形態は、例えば注射剤、点滴剤などの液剤、例えば軟膏、ローションなどの外用剤、または凍結乾燥製剤であってもよい。
液剤の場合、本複合体が、０．００１〜２５％（ｗ／ｖ）の濃度範囲内に存在しているものが適当であり、好ましくは０．０１〜５％（ｗ／ｖ）の濃度範囲内に存在し、より好ましくは０．１〜２％（ｗ／ｖ）の濃度範囲内に存在するのが適当である．本発明の医薬組成物は医薬的に許容される任意の添加剤、例えば、乳化補助剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調製剤を適当量含有していてもよい．具体的には、炭素数６〜２２の脂肪酸（例えば、カブリル酸、カブリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸）やその医薬的に許容される塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩）；アルブミン、デキストランなどの乳化補助剤；コレステロール、ホスフアチジン酸などの安定化剤；塩化ナトリウム、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロースなどの等張化剤；塩酸、硝酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミンなどのｐＨ調製剤；などを挙げることができる。医薬的に許容される任意の添加剤は、本複合体の分散前でも分散後でも適当な工程で添加することができる。
凍結乾燥製剤は、本発明オリゴ核酸又は本発明二本鎖オリゴ核酸と担体との複合体を分散処理した後、凍結乾燥処理することにより調製することができる。凍結乾燥処理は、常法により行うことができる。例えば、上記の分散処理後の複合体溶液を無菌状態にて所定量をバイアル瓶に分注し、約−４０〜−２０℃の条件で予備乾燥を約２時間程度行い、約０〜１０℃で減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約１５〜２５℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥することができる。そして、一般的にはバイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓して本発明医薬組成物の凍結乾燥製剤を得ることができる。
本発明の凍結乾燥製剤は、一般には任意の適当な溶液（再溶解液）の添加によって再溶解し使用することができる。このような再溶解液としては、注射用水、生理食塩水などの電解質液、ブドウ糖液、その他一般輸液を挙げることができる。この再溶解液の液量は、用途などによって異なり、特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の０．５〜２倍量、または５００ｍｌ以下が適当である。
本発明の医薬組成物は、投与単位形態で投与することが望ましく、ヒトを含む動物に対し、静脈内投与、動脈内投与、経口投与、組織内投与、経皮投与、経粘膜投与または経直腸投与することができ、患者の症状に合わせた適切な方法により投与してよい。特に静脈投与、経皮投与、経粘膜投与が好ましい。また、癌内局所投与などの局所投与することもできる。これらの投与方法に適した剤型、例えば各種の注射剤、経口剤、点滴剤、吸収剤、点眼剤、軟膏剤、ローション、坐剤等で投与されるのはもちろんである。
例えば、本発明の医薬組成物の用量は、薬物、剤型、年齢や体重などの患者の状態、投与経路、病気の性質と程度などを考慮した上で決定することが望ましいが、通常は、成人に対して本発明オリゴ核酸又は本発明オリゴ核酸の量として１日当たり、０．１ｍｇ〜１０ｇ／日／ヒトの範囲が、好ましくは１ｍｇ〜５００ｍｇ／日／ヒトの範囲が一般的である。場合によっては、これ以下でも十分であるし、また逆にこれ以上の用量を必要とすることもある．また１日１〜数回投与、または１〜数日の間隔で投与することができる。
また、本発明の別の態様においては、本発明二本鎖オリゴ核酸を生じるために用いられるＤＮＡを医薬的に許容される添加剤などと一緒に医薬組成物とすることができる。ここで、本発明二本鎖オリゴ核酸を生じるために用いられるＤＮＡは、本発明二本鎖オリゴ核酸の二重鎖形成部の塩基配列をデオキシリボヌクレオチドとして有する（ここで、ヌクレオチド配列中のウラシルはチミンに変換される）ＤＮＡを含む、本発明二本鎖オリゴ核酸を生産するためのプラスミドなどを意味する。このような医薬組成物は患者に投与されると、患者の生体内において本発明二本鎖オリゴ核酸を生じるので、前述した本発明二本鎖オリゴ核酸と適切な担体を含む医薬組成物と同様の効果を有する、すなわち、Ｂｃｌ−２の過剰発現が原因となっている疾患などの治療および／または予防に有効である。投与形態および投与経路は、本発明オリゴ核酸又は本発明二本鎖オリゴ核酸と担体との複合体を含む医薬組成物の場合と同様に、患者の症状に合わせた適切な方法により投与してよく、用量もまた同様に、薬物、剤型、年齢や体重などの患者の状態、投与経路、病気の性質と程度などを考慮した上で決定してよい。
【実施例】
【００７０】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
ここで、ＤＭＴｒは、４，４−ジメトキシトリチルを、ｐｓは、Ｏ−（２−シアノエチル）チオホスホリルを、ｓは、チオホスホリルを、Ｌｅｖは、レブニリルを、ＣＥＰは、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイトを、ＴＢＤＭＳは、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルを、Ａは、アデノシンを、Ｃは、シチジンを、Ｇは、グアノシンを、Ｕは、ウリジンを、ｄＴは、チミジンを、ｐＡ、ｐＣ、ｐＧ、ｐＵは、それぞれ保護された核酸を表す。Ｒｐ、Ｓｐは、ホスホロチオエート結合のリン原子上の立体を表す。
また、化合物名の後に付している数字は、光学活性な化合物であることを表し、最初にジアステレオマーを分割した時に、Ｒｆ値が大きい化合物に１を、Ｒｆ値の小さい化合物に２を付した。それら原料化合物を使用し製造される化合物名の後ろには、原料化合物の数字を継承し、その数字を付している。
【００７１】
実施例１
工程１
３’−Ｏ−［５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシル］−５’−Ｏ−［６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−Ｏ−レブリニルアデノシル］ホスホチオエート  Ｏ−（２−シアノエチル）エステル（ＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＡ−ＯＬｅｖ）のジアステレオマー分離工程

６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−Ｏ−レブリニルアデノシン２ｇと５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）４．０６ｇ、１Ｈ−テトラゾール５７７ｍｇをアルゴン雰囲気下アセトニトリル３０ｍｌに溶解し、４０分室温にて攪拌した。これに３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（ＡＤＴＴ）９３２ｍｇをアルゴン雰囲気下、２７０ｍｌのアセトニトリル、３０ｍｌのピリジンに溶解させたものを加え、室温で１０分間攪拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムにて溶媒乾燥後、濾過してさらに溶媒留去、減圧乾燥を行い、ジアステレオ混合物として粗生成物を黄色固体として得た。これをシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し、ＴＬＣでＲｆ値が大きいジアステレオマー（ＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＡ−ＯＬｅｖ−１；実施例１−１）（１．７ｇ、６６％収率）と小さいジアステレオマー（ＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＡ−ＯＬｅｖ−２；実施例１−２）（２．１８ｇ、８５％収率）とに分離し、白色泡状物質として目的化合物を得た。
【００７２】
工程２−１
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシル−〔３’→５’〕−Ｏ−（２−シアノエチル）チオホスホリル−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）−１（ＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＡ−ＯＣＥＰ−１；実施例１−３）

ＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＡ−ＯＬｅｖ−１  ０．７ｇにピリジン：酢酸＝４：１にて調製した０．５Ｍヒドラジン溶液  ９ｍｌを加え、室温で２０分攪拌した。氷冷下反応液に２ｍｌのアセトンを加え、そのまま５分間攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にあけ、酢酸エチルにて抽出した。飽和食塩水にて有機層を洗浄後、無水硫酸マグネシウムにて溶媒乾燥させたのち濾過してさらに溶媒留去、減圧乾燥を行い、得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し、白色泡状物質として脱レブリニル化合物０．５３ｇ（８１％収率、ＥＳＩ−Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）＝１４０４．４（Ｍ＋））を得た。
次に、脱レブリニル化合物０．５ｇをアルゴン雰囲気下４ｍｌのアセトニトリルに溶解し、氷冷下ジイソプロピルエチルアミン０．７３ｍｌを加えた。この溶液に０．６８ｇの２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトを滴下し、２時間室温にて攪拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にあけ、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムにて溶媒乾燥させたのち濾過してさらに溶媒留去、減圧乾燥を行い、得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し、白色泡状物質として目的化合物０．９３ｇ（８２％収率）を得た。
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）＝１６０４．６（Ｍ＋）
【００７３】
工程２−２
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシル−〔３’→５’〕−Ｏ−（２−シアノエチル）チオホスホリル−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）−２（ＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＡ−ＯＣＥＰ−２；実施例１−４）
ＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＡ−ＯＬｅｖ−２を用い、実施例１  工程２−１と同様の方法を用いて目的化合物を得た。
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）＝１６０４．７（Ｍ＋）
【００７４】
工程３−１  
ＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＡ−ＯＬｅｖ−１の全ての保護基を脱離し、ＡｓＡ−１を得る工程

ＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＡ−ＯＬｅｖ−１  に７ｍｇをピリジン２ｍｌに溶解し、濃アンモニア水１０ｍｌを加えて５５℃で１６時間攪拌した。反応液を濃縮乾固し、残渣に１Ｍテトラｎ−ブチルアンモニウムフルオリドのＴＨＦ溶液１ｍｌを加えて室温で終夜攪拌した。反応液を濃縮後５０％ピリジン水に溶解し、ＤＯＷＥＸ  ５０Ｗ（ピリジン型）を加えて１０分後ろ過した。ろ液を濃縮後、逆相クロマトグラフィーを用いて精製し、４，４’−ジメトキシトリチル基を含むフラクションを集め濃縮乾固した。このものに８０％酢酸２ｍｌを加え、室温で１時間攪拌後濃縮し、酢酸エチル−水で分液後、水層を凍結乾燥した。このものを更に逆相クロマトグラフィーを用いて精製し、凍結乾燥して目的化合物を１１ｍｇ得た。
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）＝６１３．２（Ｍ＋）
【００７５】
工程３−２
ＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＡ−ＯＬｅｖ−２の全ての保護基を脱離し、ＡｓＡ−２を得る工程

ＤＭＴｒＯ−ＡｐｓＡ−ＯＬｅｖ−２を実施例１  工程３−１と同様の方法を用いて目的化合物を製造した。
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）＝６１３．１（Ｍ＋）
【００７６】
工程４  
構造決定＜Ｒｐ、Ｓｐの同定＞

実施例１  工程３−１と実施例１  工程３−２で得られた、ＡｓＡ−１、ＡｓＡ−２を文献記載（Ｂ．Ｋａｒｗｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．  １１（２００１）１００１−１００３）の方法に従って、蛇毒ホスホジエステラーゼ（ｓｖＰＤＥ）及び、ヌクレアーゼＰ１（ＮＰ１）で処理し、ｓｖＰＤＥで加水分解されるＡｓＡ−１をＲｐ、ＮＰ１で加水分解されるＡｓＡ−２をＳｐと同定した。
即ち、実施例１において製造された化合物は、表１に示す化学構造を有する。
【表１】
2006043521.tif 000029
また、図１〜３に示す逆相ＨＰＬＣ分析の結果より、実施例１  工程３−１と実施例１  工程３−２で得られたＡｓＡ−１、ＡｓＡ−２が、それぞれ単一のジアステレオマーであり高純度であることを確認した。測定条件は下記のとおりである。
測定条件：
ＨＰＬＣ  装置  
送液ユニット：ＬＣ−６Ａ（島津製作所社製）
検出器：ＳＰＤ−６Ａ（島津製作所社製）
逆相ＨＰＬＣカラム
Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ  ＲＰ−１８ＧＰ＜４．６ｍｍφｘ１５ｃｍ＞（関東化学社製）
カラム温度  ：３５℃
移動相
グラジエント：リニアグラジエント２０分（Ｂ液：０％−７０％）
Ａ液：５％アセトニトリルを含む５０ｍＭトリエチルアミン−酢酸緩衝液
Ｂ液：９０％アセトニトリルを含む５０ｍＭトリエチルアミン−酢酸緩衝液
移動相の流量  ：１ｍｌ／分
【００７７】
実施例２
工程１
３’−Ｏ−［５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルウリジル］−５’−Ｏ−［２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−Ｏ−レブリニルウリジル］ホスホチオエート  Ｏ−（２−シアノエチル）エステル（ＤＭＴｒＯ−ｐＵｐｓｐＵ−ＯＬｅｖ）のジアステレオマー分離工程

２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２−Ｎ−イソブチリル−３’−Ｏ−レブリニルグアノシン３ｇと５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）７．８５ｇを用い、実施例１  工程１と同様の方法を用いて目的化合物を製造した。
Ｒｆ値が大きいジアステレオマー（ＤＭＴｒＯ−ｐＵｐｓｐＵ−ＯＬｅｖ−１；実施例２−１）：１．０５ｇ、７７％収率
小さいジアステレオマー（ＤＭＴｒＯ−ｐＵｐｓｐＵ−ＯＬｅｖ−２；実施例２−２）：１．１２ｇ、８２％収率
【００７８】
工程２−１
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルウリジル−〔３’→５’〕−Ｏ−（２−シアノエチル）チオホスホリル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルウリジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）−１（ＤＭＴｒＯ−ｐＵｐｓｐＵ−ＯＣＥＰ−１；実施例２−３）

ＤＭＴｒＯ−ｐＵｐｓｐＵ−ＯＬｅｖ−１を用い、実施例１  工程２−１と同様の方法を用いて、白色泡状物質として１．３７ｇの目的化合物を得た。
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）＝１３５０．７（Ｍ＋）
【００７９】
工程２−２
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルウリジル−〔３’→５’〕−Ｏ−（２−シアノエチル）チオホスホリル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルウリジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）−２（ＤＭＴｒＯ−ｐＵｐｓｐＵ−ＯＣＥＰ−２；実施例２−４）
ＤＭＴｒＯ−ｐＵｐｓｐＵ−ＯＬｅｖ−２を用い、実施例１  工程２−１と同様の方法を用いて、目的化合物を製造した。
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）＝１３５０．７（Ｍ＋）、１３７２．６（［Ｍ＋Ｎａ］＋）
【００８０】
工程３  
実施例１  工程３−１と同様にして、ＤＭＴｒＯ−ｐＵｐｓｐＵ−ＯＣＥＰ−１からＵｓＵ−１を、ＤＭＴｒＯ−ｐＵｐｓｐＵ−ＯＣＥＰ−２からＵｓＵ−２をそれぞれ製造し、実施例１  工程４と同様にして、ＵｓＵ−１、ＵｓＵ−２の構造決定を行った。その結果を表２に示す。
【表２】
2006043521.tif 000030
また、逆相ＨＰＬＣ分析の結果より、実施例２  工程３で得られた化合物ＵｓＵ−１、ＵｓＵ−２が、それぞれ単一のジアステレオマーであり高純度であることを確認した。
【００８１】
実施例３
工程１
３’−Ｏ−［５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシル］−５’−Ｏ−［２−Ｎ−イソブチリル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−Ｏ−レブリニルグアノシル］ホスホチオエート  Ｏ−（２−シアノエチル）エステル（ＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＧ−ＯＬｅｖ）のジアステレオマー分離工程

２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２−Ｎ−イソブチリル−３’−Ｏ−レブリニルグアノシン３ｇと５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）７．８５ｇを用い、実施例１  工程１と同様の方法を用いて目的化合物を製造した。
Ｒｆ値が大きいジアステレオマー（ＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＧ−ＯＬｅｖ−１；実施例３−１）：３．１４ｇ、ＥＳＩ−Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）＝１４８４．７（Ｍ＋）
Ｒｆ値が小さいジアステレオマー（ＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＧ−ＯＬｅｖ−２；実施例３−２）：３．５１ｇ、ＥＳＩ−Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）＝１４８４．５（Ｍ＋）
【００８２】
工程２−１
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシル−〔３’→５’〕−Ｏ−（２−シアノエチル）チオホスホリル−２−Ｎ−イソブチリル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルグアノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）−１（ＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＧ−ＯＣＥＰ−１；実施例３−３）

ＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＧ−ＯＬｅｖ−１を用い、実施例１  工程２−１と同様にして目的化合物を得た。
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）＝１５８６．８（Ｍ＋）
【００８３】
工程２−２
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシル−〔３’→５’〕−Ｏ−（２−シアノエチル）チオホスホリル−２−Ｎ−イソブチリル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルグアノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）−２（ＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＧ−ＯＣＥＰ−２；実施例３−４）

ＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＧ−ＯＬｅｖ−２を用い、実施例１  工程２−１と同様の方法を用いて目的化合物を製造した。
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）＝１５８６．８（Ｍ＋）
【００８４】
工程３  
実施例１  工程３−１と同様にして、ＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＧ−ＯＣＥＰ−１からＡｓＧ−１を、ＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＧ−ＯＣＥＰ−２からＡｓＧ−２をそれぞれ製造し、実施例１  工程４と同様にして、ＡｓＧ−１、ＡｓＧ−２の構造決定を行った。その結果を表３に示す。
【表３】
2006043521.tif 000031
また、逆相ＨＰＬＣ分析の結果より、実施例３  工程３で得られたＡｓＧ−１、ＡｓＧ−２が、それぞれ単一のジアステレオマーであり高純度であることを確認した。
【００８５】
実施例４
工程１
３’−Ｏ−［５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｎ−イソブチリル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルグアノシル］−５’−Ｏ−［６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−Ｏ−レブリニルアデノシル］ホスホチオエート  Ｏ−（２−シアノエチル）エステル（ＤＭＴｒＯ−ｐＧｐｓｐＡ−ＯＬｅｖ）

６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−Ｏ−レブリニルアデノシン２．５ｇと５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２−Ｎ−イソブチリルグアノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）７．３８ｇを用い、実施例１  工程１と同様の方法を用いて目的化合物を製造した。
Ｒｆ値が大きいジアステレオマー（ＤＭＴｒＯ−ｐＧｐｓｐＡ−ＯＬｅｖ−１；実施例４−１）：１．４０ｇ、ＥＳＩ−Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）＝１４８４．６（Ｍ＋）
Ｒｆ値が小さいジアステレオマー（ＤＭＴｒＯ−ｐＧｐｓｐＡ−ＯＬｅｖ−２；実施例４−２）：１．８９ｇ、ＥＳＩ−Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）＝１４８４．７（Ｍ＋）
【００８６】
工程２−１
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｎ−イソブチリル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルグアノシル−〔３’→５’〕−Ｏ−（２−シアノエチル）チオホスホリル−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）−１（ＤＭＴｒＯ−ｐＧｐｓｐＡ−ＯＣＥＰ−１；実施例４−３）

ＤＭＴｒＯ−ｐＧｐｓｐＡ−ＯＬｅｖ−１を用い、実施例１  工程２−１と同様の方法を用いて目的化合物を製造した。
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）＝１５８７．８（Ｍ＋）
【００８７】
工程２−２
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｎ−イソブチリル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルグアノシル−〔３’→５’〕−Ｏ−（２−シアノエチル）チオホスホリル−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）−２（ＤＭＴｒＯ−ｐＧｐｓｐＡ−ＯＣＥＰ−２；実施例４−４）

ＤＭＴｒＯ−ｐＧｐｓｐＡ−ＯＬｅｖ−２を用い、実施例１  工程２−１と同様の方法を用いて目的化合物を製造した。
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）＝１５８７．７（Ｍ＋）
【００８８】
工程３
実施例１  工程３−１と同様にして、ＤＭＴｒＯ−ｐＧｐｓｐＡ−ＯＣＥＰ−１からＧｓＡ−１を、ＤＭＴｒＯ−ｐＧｐｓｐＡ−ＯＣＥＰ−２からＧｓＡ−２をそれぞれ製造し、実施例１  工程４と同様にして、ＧｓＡ−１、ＧｓＡ−２の構造決定を行った。その結果を表４に示す。
【表４】
2006043521.tif 000032
また、逆相ＨＰＬＣ分析の結果より、実施例４  工程３で得られたＧｓＡ−１、ＧｓＡ−２が、それぞれ単一のジアステレオマーであり高純度であることを確認した。
【００８９】
実施例５
工程１
３’−Ｏ−［５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルウリジル］−５’−Ｏ−［４−Ｎ−（４−アニソイル）−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−Ｏ−レブリニルシチジル］ホスホチオエート  Ｏ−（２−シアノエチル）エステル（ＤＭＴｒＯ−ｐＵｐｓｐＣ−ＯＬｅｖ）

４−Ｎ−（４−アニソイル）−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−Ｏ−レブリニルシチジン３．５ｇと５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルウリジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）７．７ｇを用い、実施例１  工程１と同様の方法を用いて目的化合物を製造した。
Ｒｆ値が大きいジアステレオマー（ＤＭＴｒＯ−ｐＵｐｓｐＣ−ＯＬｅｖ−１；実施例５−１）：３．１２ｇ
Ｒｆ値が大きいジアステレオマー（ＤＭＴｒＯ−ｐＵｐｓｐＣ−ＯＬｅｖ−２；実施例５−２）：３．７０ｇ
【００９０】
工程２−１
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルウリジル−〔３’→５’〕−Ｏ−（２−シアノエチル）チオホスホリル−４−Ｎ−（４−アニソイル）−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルシチジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）−１（ＤＭＴｒＯ−ｐＵｐｓｐＣ−ＯＣＥＰ−１；実施例５−３）

ＤＭＴｒＯ−ｐＵｐｓｐＣ−ＯＬｅｖ−１を用い、実施例１  工程２−１と同様の方法を用いて目的化合物を製造した。
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）＝１４８３．５（Ｍ＋）
【００９１】
工程２−２
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルウリジル−〔３’→５’〕−Ｏ−（２−シアノエチル）チオホスホリル−４−Ｎ−（４−アニソイル）−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルシチジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）−２（ＤＭＴｒＯ−ｐＵｐｓｐＣ−ＯＣＥＰ−２；実施例５−４）

ＤＭＴｒＯ−ｐＵｐｓｐＣ−ＯＬｅｖ−２を用い、実施例１  工程２−１と同様の方法を用いて目的化合物を製造した。
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）＝１４８３．８（Ｍ＋）
【００９２】
工程３
実施例１  工程３−１と同様にして、ＤＭＴｒＯ−ｐＵｐｓｐＣ−ＯＣＥＰ−１からＵｓＣ−１を、ＤＭＴｒＯ−ｐＵｐｓｐＣ−ＯＣＥＰ−２からＵｓＣ−２をそれぞれ製造し、実施例１  工程４と同様にして、ＵｓＣ−１、ＵｓＣ−２の構造決定を行った。その結果を表５に示す。
【表５】
2006043521.tif 000033
また、逆相ＨＰＬＣ分析の結果より、実施例５  工程３で得られたＵｓＣ−１、ＵｓＣ−２が、それぞれ単一のジアステレオマーであり高純度であることを確認した。
【００９３】
実施例６
工程１
３’−Ｏ−［５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシル］−５’−Ｏ−［４−Ｎ−（４−アニソイル）−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−Ｏ−レブリニルシチジル］ホスホチオエート  Ｏ−（２−シアノエチル）エステル（ＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＣ−ＯＬｅｖ）

４−Ｎ−（４−アニソイル）−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−Ｏ−レブリニルシチジン３ｇと５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）６．０３ｇを用い、実施例１  工程１と同様の方法を用いて目的化合物を製造した。
Ｒｆ値が大きいジアステレオマー（ＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＣ−ＯＬｅｖ−１；実施例６−１）：３．５７ｇ
Ｒｆ値が小さいジアステレオマー（ＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＣ−ＯＬｅｖ−２；実施例６−２）：３．６４ｇ
【００９４】
工程２−１
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシル−〔３’→５’〕−Ｏ−（２−シアノエチル）チオホスホリル−４−Ｎ−（４−アニソイル）−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルシチジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）−１（ＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＣ−ＯＣＥＰ−１；実施例６−３）

ＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＣ−ＯＬｅｖ−１を用い、実施例１  工程２−１と同様の方法を用いて目的化合物を製造した。
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）＝１６１０．６（Ｍ＋）
【００９５】
工程２−２
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシル−〔３’→５’〕−Ｏ−（２−シアノエチル）チオホスホリル−４−Ｎ−（４−アニソイル）−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルシチジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）−２（ＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＣ−ＯＣＥＰ−２；実施例６−４）

ＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＣ−ＯＬｅｖ−２を用い、実施例１  工程２−１と同様の方法を用いて目的化合物を製造した。
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）＝１６１０．５（Ｍ＋）
【００９６】
工程３
実施例１  工程３−１と同様にして、ＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＣ−ＯＣＥＰ−１からＡｓＣ−１を、ＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＣ−ＯＣＥＰ−２からＡｓＣ−２をそれぞれ製造し、実施例１  工程４と同様にして、ＡｓＣ−１、ＡｓＣ−２の構造決定を行った。その結果を表６に示す。
【表６】
2006043521.tif 000034
また、逆相ＨＰＬＣ分析の結果より、実施例６  工程３で得られたＡｓＣ−１、ＡｓＣ−２が、それぞれ単一のジアステレオマーであり高純度であることを確認した。
【００９７】
実施例７
工程１
３’−Ｏ−［５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｎ−イソブチリル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルグアノシル］−５’−Ｏ−［３’−Ｏ−レブリニルチミジル］ホスホチオエート  Ｏ−（２−シアノエチル）エステル（ＤＭＴｒＯ−ｐＧｐｓｄＴ−ＯＬｅｖ）

３’−Ｏ−レブリニルチミジン２ｇと５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２−Ｎ−イソブチリルグアノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）６．８４ｇを用い、実施例１  工程１と同様の方法を用いて目的化合物を製造した。
Ｒｆ値が大きいジアステレオマー（ＤＭＴｒＯ−ｐＧｐｓｄＴ−ＯＬｅｖ−１；実施例７−１）：３．１８ｇ
Ｒｆ値が大きいジアステレオマー（ＤＭＴｒＯ−ｐＧｐｓｄＴ−ＯＬｅｖ−２；実施例７−２）：２．８６ｇ
【００９８】
工程２−１
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｎ−イソブチリル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルグアノシル−〔３’→５’〕−Ｏ−（２−シアノエチル）チオホスホリル−チミジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）−１（ＤＭＴｒＯ−ｐＧｐｓｄＴ−ＯＣＥＰ−１；実施例７−３）

ＤＭＴｒＯ−ｐＧｐｓｄＴ−ＯＬｅｖ−１を用い、実施例１  工程２−１と同様の方法を用いて目的化合物を製造した。
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）＝１３４３．６（Ｍ＋）、１３６５．６（［Ｍ＋Ｎａ］＋）
【００９９】
工程２−２
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｎ−イソブチリル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルグアノシル−〔３’→５’〕−Ｏ−（２−シアノエチル）チオホスホリル−チミジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）−２（ＤＭＴｒＯ−ｐＧｐｓｄＴ−ＯＣＥＰ−２；実施例７−４）

ＤＭＴｒＯ−ｐＧｐｓｄＴ−ＯＬｅｖ−２を用い、実施例１  工程２−１と同様の方法を用いて目的化合物を製造した。
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）＝１３４３．７（Ｍ＋）、１３６６．６（［Ｍ＋Ｎａ］＋）
【０１００】
工程３
実施例１  工程３−１と同様にして、ＤＭＴｒＯ−ｐＧｐｓｄＴ−ＯＣＥＰ−１からＧｓｄＴ−１を、ＤＭＴｒＯ−ｐＧｐｓｄＴ−ＯＣＥＰ−２からＧｓｄＴ−２をそれぞれ製造し、実施例１  工程４と同様にして、ＧｓｄＴ−１、ＧｓｄＴ−２の構造決定を行った。その結果を表７に示す。
【表７】
2006043521.tif 000035
また、逆相ＨＰＬＣ分析の結果より、実施例７  工程３で得られたＧｓｄＴ−１、ＧｓｄＴ−２が、それぞれ単一のジアステレオマーであり高純度であることを確認した。
＜オリゴ核酸化合物の製造＞【０１０１】
実施例８
（Ｒｐ）−５’−ＡｓＡＡｓＡＡｓＡＡｓＡＡｓＡＡｓＡＡｓＡＡｓＡＡｓＡＡｓＡＡ−３’（配列番号１）

Ｒｐ体であるＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＡ−ＯＣＥＰ−１をアセトニトリルに溶解し、核酸自動合成機（ＥｘｐｅｄｉｔｅＴＭ）によりオリゴ核酸化合物の合成を行った。固相担体は市販のアデニンＣＰＧカラム、縮合触媒はテトラゾール、酸化剤はヨウ素溶液、キャッピング溶液は無水酢酸と、Ｎ−メチルイミダゾール溶液を用いた。合成終了後のＣＰＧカラム（ＤＭＴｒ−ＯＮ）を濃アンモニア水／エタノール（３／１）で処理して固相担体から切り出した後、５５℃で１７時間インキュベーションし塩基保護基を脱保護した。このものを濃縮乾固し、３ＨＦ／ＴＥＡ、ＴＥＡ、Ｎ−メチルピロリジン、Ｎ−メチルピロリドンの混合溶液中５５℃で２時間攪拌して、２’位の水酸基の保護基を脱保護した。反応液を室温まで冷却後、２−プロパノールに注ぎ、生じた沈殿を遠心分離して集めた。このものを逆相クロマトグラフィーを用いて精製し、４，４’−ジメトキシトリチル基を含むフラクションを集め濃縮乾固した。次いで８０％酢酸で４，４’−ジメトキシトリチル基を脱保護し、濃縮乾固後、酢酸エチル−水で分液し、水層を凍結乾燥した。得られた粗生成物をイオン交換クロマトグラフィーにより精製し、目的化合物を含むフラクションを集め凍結乾燥した後、脱塩して再度凍結乾燥し目的化合物を得た。
ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ７０１２．０５
Ｆｏｕｎｄ  ７０１１．３
図４のイオン交換ＨＰＬＣ分析の結果より、目的化合物がほぼ単一であることは明らかである。測定条件は下記のとおりである。
測定条件：
ＨＰＬＣ  装置  
送液ユニット：ＬＣ−６Ａ（島津製作所社製）
検出器：ＳＰＤ−６Ａ（島津製作所社製）
イオン交換ＨＰＬＣカラム
ＤＥＡＥ−ＮＰＲ＜４．５ｍｍφｘ３．５ｃｍ＞（東ソー社製）
カラム温度  ：３５℃
移動相
グラジエント：リニアグラジエント１５分（Ｂ液：２５％−９０％）、Ｂ液９０％５分
Ａ液：１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ  ７）
Ｂ液：１ＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ  ７）
移動相の流量  ：１ｍｌ／分
紫外線可視分光器検出波長：２６０ｎｍ
【０１０２】
実施例９
（Ｓｐ）−５’−ＡｓＡＡｓＡＡｓＡＡｓＡＡｓＡＡｓＡＡｓＡＡｓＡＡｓＡＡｓＡＡ−３’（配列番号２）

Ｓｐ体であるＤＭＴｒＯ−ＡｐｓＡ−ＯＣＥＰ−２を用い、実施例８と同様の方法を用いて目的化合物を合成した。
ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ７０１２．０５
Ｆｏｕｎｄ  ７０１３．７２
図５のイオン交換ＨＰＬＣ分析の結果より、目的化合物がほぼ単一であることは明らかである。測定条件は実施例８と同じ条件を使用した。
【０１０３】
実施例１０
（Ｒｐ）−５’−ＵｓＵＵｓＵＵｓＵＵｓＵＵｓＵＵｓＵＵｓＵＵｓＵＵｓＵＵｓＵＵ−３’（配列番号３）

Ｒｐ体であるＤＭＴｒＯ−ＵｐｓＵ−ＯＣＥＰ−１を用い、実施例８と同様の方法を用いて目的化合物を合成した。イオン交換ＨＰＬＣ分析を用いて目的化合物がほぼ単一であることを確認した。測定条件は実施例８と同じ条件を使用した。
ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ６５２８．２１
Ｆｏｕｎｄ  ６５３０．３
【０１０４】
実施例１１
（Ｓｐ）−５’−ＵｓＵＵｓＵＵｓＵＵｓＵＵｓＵＵｓＵＵｓＵＵｓＵＵｓＵＵｓＵＵ−３’（配列番号４）

Ｓｐ体であるＤＭＴｒＯ−ＵｐｓＵ−ＯＣＥＰ−２を用い、実施例８と同様の方法を用いて目的化合物を合成した。イオン交換ＨＰＬＣ分析を用いて目的化合物がほぼ単一であることを確認した。測定条件は実施例８と同じ条件を使用した。
ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ６５２８．２１
Ｆｏｕｎｄ  ６５２９．６
（実配列の合成）
５’−ＡｓＧＧｓＡＧｓＡＡｓＡＵｓＣＡｓＡＡｓＣＡｓＧＡｓＧＧｓｄＴｄＴ−３’
【０１０５】
実施例１２
（Ｒｐ）−５’−ＡｓＧＧｓＡＧｓＡＡｓＡＵｓＣＡｓＡＡｓＣＡｓＧＡｓＧＧｓｄＴｄＴ−３’（配列番号５）

Ｒｐ体であるＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＧ−ＯＣＥＰ−１、Ｒｐ体であるＤＭＴｒＯ−ｐＧｐｓｐＡ−ＯＣＥＰ−１、Ｒｐ体であるＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＡ−ＯＣＥＰ−１、Ｒｐ体であるＤＭＴｒＯ−ｐＵｐｓｐＣ−ＯＣＥＰ−１、Ｒｐ体であるＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＣ−ＯＣＥＰ−１、Ｒｐ体であるＤＭＴｒＯ−ｐＧｐｓｄＴ−ＯＣＥＰ−２をそれぞれ０．１Ｍになるようにアセトニトリルに溶解したアミダイト溶液、及び、固相担体は市販のチミジンＣＰＧカラム、縮合触媒はテトラゾール、酸化剤は２．０Ｍ  ｔｅｒｔ−ブチルハイドロパーオキサイドのジクロロメタン溶液、キャッピング溶液は無水酢酸と、Ｎ−メチルイミダゾール溶液を用いて実施例８と同様に核酸自動合成機（ＥｘｐｅｄｉｔｅＴＭ）によりオリゴ核酸化合物の合成を行い、目的化合物を得た。逆相ＨＰＬＣ分析を用いて目的化合物がほぼ単一であることを確認した。測定条件は実施例１と同じ条件を使用した。
ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ６９８６．９３
Ｆｏｕｎｄ  ６９９０．９４６
【０１０６】
実施例１３
（Ｓｐ）−５’−ＡｓＧＧｓＡＧｓＡＡｓＡＵｓＣＡｓＡＡｓＣＡｓＧＡｓＧＧｓｄＴｄＴ−３’（配列番号６）

Ｓｐ体であるＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＧ−ＯＣＥＰ−２、Ｓｐ体であるＤＭＴｒＯ−ｐＧｐｓｐＡ−ＯＣＥＰ−２、Ｓｐ体であるＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＡ−ＯＣＥＰ−２、Ｓｐ体であるＤＭＴｒＯ−ｐＵｐｓｐＣ−ＯＣＥＰ−２、Ｓｐ体であるＤＭＴｒＯ−ｐＡｐｓｐＣ−ＯＣＥＰ−２、Ｓｐ体であるＤＭＴｒＯ−ｐＧｐｓｄＴ−ＯＣＥＰ−１を用いて、実施例８と同様の方法を用いてオリゴ核酸化合物を合成し、目的化合物を得た。逆相ＨＰＬＣ分析を用いて目的化合物がほぼ単一であることを確認した。測定条件は実施例１と同じ条件を使用した。
ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ６９８６．９３
Ｆｏｕｎｄ  ６９８９．９４３
【０１０７】
試験例１  
核酸二重鎖の安定性評価＜Ｔｍ値＞
実施例８で合成したオリゴ核酸化合物、実施例９で合成したオリゴ核酸化合物、又は、天然のアデノシンの２１ｍｅｒ（Ａ２１）の最終濃度がそれぞれ１．６μＭの濃度になるように、サンプルと同量のポリウリジル酸（Ｐｏｌｙ（Ｕ））を含むリン酸緩衝溶液（０．１Ｍ  塩化ナトリウム、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）を調製した。こうして調製したそれぞれのサンプル溶液を７０℃に加熱した後ゆっくりと室温まで冷却し、次いで、日立製Ｕ−３２１０形自記分光光度計を用いて２０℃から８０℃まで１２０分かけて昇温しながら２６０ｎｍの吸光度を測定した。得られた吸光度−温度曲線から、それぞれの二重鎖融解温度（Ｔｍ値）を求めた。
同様にして、実施例１０において製造したオリゴ核酸化合物、実施例１１において製造したオリゴ核酸化合物、又は、天然のウリジンの２１ｍｅｒ（Ｕ２１）とポリアデニル酸（Ｐｏｌｙ（Ａ））とのＴｍ値を求めた。表８に結果を表す。
【表８】
2006043521.tif 000036
表８の結果より、本発明オリゴ核酸は、天然型のオリゴＲＮＡと同様又はそれ以上のＲＮＡに対する親和性を有することが明らかとなった。なかでも、オリゴ核酸化合物内の全てのホスホロチオエート結合がＲｐであるオリゴ核酸化合物は、顕著に親和性を向上することが明らかとなった。
【０１０８】
試験例２  
タンパク質発現抑制活性の評価
二本鎖オリゴ核酸化合物を担体と共にＡ４３１細胞に導入し、Ｂｃｌ−２タンパク質発現抑制活性をウエスタンブロッティングにより定量的に評価した。
二本鎖オリゴ核酸化合物と担体の複合体の調製
担体として２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールと精製卵黄レシチンを含むリポソームＡを用い、二本鎖オリゴ核酸化合物との複合体を調製した。
二本鎖オリゴ核酸化合物  １重量部に対してリポソームＡ１６重量部を混合して複合体を調製した。以下に、二本鎖オリゴ核酸化合物の終濃度３００ｎＭの複合体溶液、２ｍｌの調製について表す。ただし、二本鎖オリゴ核酸化合物複合体の濃度は、二本鎖オリゴ核酸化合物が完全に二本鎖形成していると仮定したときに複合体に含まれている二本鎖オリゴ核酸化合物のモル濃度で示している。
注射用水に溶解したセンス鎖およびアンチセンス鎖を１０％マルトースで希釈し、両鎖をそれぞれ６００ｎＭの濃度で含む二本鎖オリゴ核酸化合物溶液を調製した。１６ｍｇ／ｍｌのリポソームＡ分散液を１０％マルトースで０．１３０ｍｇ／ｍｌに希釈した。このリポソーム分散液に対し、同容量の二本鎖オリゴ核酸化合物溶液を撹拝しながら徐々に添加した。以上の操作により、二本鎖オリゴ核酸化合物の終濃度が３００ｎＭである二本鎖オリゴ核酸化合物−リポソーム複合体溶液を調製した。この複合体を６００Ｗのバス型超音波装置を用いて１５秒間分散処理することにより複合体の粒子を均一にした。
ウエスタンブロッティング
上記の二本鎖オリゴ核酸化合物−リポソーム複合体を用いて二本鎖オリゴ核酸化合物が細胞内にトランスフェクションされることで、Ｂｃｌ−２タンパク質の発現が抑制されるかどうかをウエスタンブロッティングによりＢｃｌ−２タンパク質の量の変化で評価した。
６ｃｍ径のシャーレにＡ４３１細胞（上皮癌細胞）を２×１０５ｃｅｌｌｓ／６ｃｍ  ｄｉｓｈで播種し、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児仔血清）を含むＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ，Ｄ６０４６）中、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。翌日、培養ディッシュから培地を吸引し、２．７ｍｌの１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ，Ｄ６０４６）を加えて培地交換した。そこに、１０％マルトース水溶液中で混合した二本鎖オリゴ核酸化合物／リポソームＡ複合体（重量比は二本鎖オリゴ核酸化合物：リポソームＡ＝１：１６）溶液を０．３ｍｌ添加し、終量を３ｍｌとした。このときの二本鎖オリゴ核酸化合物の最終濃度は１０ｎＭである。３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内にて７２時間培養した。細胞をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）で２回洗浄し、セルスクレーバーを用いて１．５ｍｌチューブに移した。１０００×ｇで２分間遠心分離し、上清を取り除いた後、６０μｌのＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％ＮＰ−４０）を加えて細胞を溶解した。氷上で３０分間静置し、１００，０００×ｇで２０分間遠心後、上清を新しいチューブに移し、電気泳動用サンプルとした。
電気泳動はポリアクリルアミドゲル（ＡＴＴＯ  Ｅ−Ｔ５２０Ｌ）を用い、１レーンあたり１５μｇのサンプルをアプライした。泳動終了後、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜にゲル内のタンパク質を転写し、５％スキムミルク含有ＰＢＳＴ（ＰＢＳＴ−ＭＬＫ；ここで、ＰＢＳＴの組成は、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ緩衝液）中室温で１時間ブロッキングした。まず、Ｂｃｌ−２タンパク質の検出を行った。ブロッキングが終了したＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴ−ＭＬＫで５００倍に希釈したマウス抗ヒトＢｃｌ−２モノクローナル抗体（ＤＡＫＯ  Ｍ０８８７）中にて、４℃で一晩振盪して一次抗体と結合させた。ＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴで洗浄後、ＰＢＳＴ−ＭＬＫで２０００倍に希釈したＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）標識抗マウスＩｇ抗体（ＤＡＫＯ  ＰＯ２６０）中にて室温で９０分間振盪し、二次抗体と結合させた。ＰＢＳＴで洗浄後、ＷｅｓｔｅｒｎＬｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｌｕｓ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて発光させ、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（ＢｉｏＲａｄ）によりＢｃｌ−２タンパク質を定量した。
Ｂｃｌ−２タンパク質の検出終了後、同じＰＶＤＦ膜をＭｉｌｌｉＱ水で洗浄し、Ｂｃｌ−２と同様にＡｃｔｉｎタンパク質の検出を行った。一次抗体にはヤギ抗ヒトＡｃｔｉｎ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−１６１６）を、二次抗体にはＨＲＰ標識抗ヤギＩｇ抗体（ＤＡＫＯ  Ｐ０４４９）を用いた。それぞれＰＢＳＴ−ＭＬＫで５００倍、１５００倍に希釈して使用した。
ルシフェラーゼの発現を抑制する二本鎖オリゴ核酸化合物（ＧＬ３）をトランスフェクションした時のＢｃｌ−２タンパク質の量を陰性対照とした。
使用した二本鎖オリゴ核酸化合部物を以下に示す。
Ｂ６２２：
センス鎖
５’−ＣＣＵＣＵＧＵＵＵＧＡＵＵＵＣＵＣＣＵｄＴｄＴ−３’（配列番号７）  
アンチセンス鎖
５’−ＡＧＧＡＧＡＡＡＵＣＡＡＡＣＡＧＡＧＧｄＴｄＴ−３’（配列番号８）
Ｂ６２２−Ｒｐ：アンチセンス鎖が実施例１２のオリゴ核酸化合物である二本鎖オリゴ核酸化合物
センス鎖
５’−ＣＣＵＣＵＧＵＵＵＧＡＵＵＵＣＵＣＣＵｄＴｄＴ−３’（配列番号７）  
アンチセンス鎖
（Ｒｐ）−５’−ＡｓＧＧｓＡＧｓＡＡｓＡＵｓＣＡｓＡＡｓＣＡｓＧＡｓＧＧｓｄＴｄＴ−３’（配列番号８；実施例１２）
Ｂ６２２−Ｓｐ：アンチセンス鎖が実施例１３のオリゴ核酸化合物である二本鎖オリゴ核酸化合物
センス鎖
５’−ＣＣＵＣＵＧＵＵＵＧＡＵＵＵＣＵＣＣＵｄＴｄＴ−３’（配列番号７）  
アンチセンス鎖
（Ｓｐ）−５’−ＡｓＧＧｓＡＧｓＡＡｓＡＵｓＣＡｓＡＡｓＣＡｓＧＡｓＧＧｓｄＴｄＴ−３’（配列番号６；実施例１３）
これらの二本鎖オリゴ核酸化合物の活性をウエスタンブロティングにより評価した結果を表９に示す。
【表９】
2006043521.tif 000037
アンチセンス鎖を構成するチオエート結合が全てＲｐである二本鎖オリゴ核酸化合物は、天然型とほぼ同等にＢｃｌ−２タンパク質の発現を抑制することが明らかとなった。
【０１０９】
試験例３．  
一本鎖オリゴ核酸化合物のエキソヌクレアーゼに対する分解抵抗性評価
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより一本鎖オリゴ核酸化合物の５’末端を３２Ｐで標識した。取り込まれなかった３２Ｐ−ＡＴＰは、Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ  Ｇ−２５  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で除去した。１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．９）  １８０μｌ中で３２Ｐ標識ＲＮＡ３．３ｐｍｏｌに対し、０．２ｍＵ  のＰｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  Ｉ（Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｃｒｏｔａｌｕｓ  Ａｄａｍａｎｔｅｕｓ  Ｖｅｎｏｍ；  Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）  を加えて３７℃で１５分間インキュベートした。４０μｌをフェノール／クロロホルムで抽出することによって反応を停止させた。ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ；１６％ポリアクリルアミド／８Ｍ尿素；アクリルアミド：ビス−アクリルアミド１９：１；８９ｍＭ  Ｔｒｉｓ／８９ｍＭホウ酸／２ｍＭ  ＥＤＴＡ）によって分析した。ゲルを乾燥後、ＢＡＳ−２５００（ＦＵＪＩ  ＦＩＬＭ）を用いて２１塩基ＲＮＡを定量化した。酵素添加直後に回収した一本鎖オリゴ核酸化合物を残存率１００％とした。
使用した一本鎖オリゴ核酸化合物を以下に示す。
５’−ＡＧＧＡＧＡＡＡＵＣＡＡＡＣＡＧＡＧＧｄＴｄＴ−３’（配列番号８）
（Ｒｐ）−５’−ＡｓＧＧｓＡＧｓＡＡｓＡＵｓＣＡｓＡＡｓＣＡｓＧＡｓＧＧｓｄＴｄＴ−３’（配列番号５；実施例１２）
（Ｓｐ）−５’−ＡｓＧＧｓＡＧｓＡＡｓＡＵｓＣＡｓＡＡｓＣＡｓＧＡｓＧＧｓｄＴｄＴ−３’（配列番号６；実施例１３）
これらの一本鎖オリゴ核酸化合物のエキソヌクレアーゼに対する分解抵抗性の結果を表１０に示す。
【表１０】
2006043521.tif 000038
ホスホロチオエート結合を有する本発明オリゴ核酸は、天然型と比較して、非常に多くの化合物が残存しており、エキソヌクレアーゼに対する分解抵抗性が高いことがわかった。そのなかでも、チオエート結合が全てＳｐである本発明オリゴ核酸がその効果が顕著であることが明らかとなった。
【０１１０】
試験例４  
一本鎖オリゴ核酸化合物のウシ血清に対する分解抵抗性評価
試験例３と同様の方法で３２Ｐ標識一本鎖オリゴ核酸化合物を得た。４０μｌの１０％ウシ血清中で３２ＰラベルＲＮＡ３．３ｐｍｏｌを  ３７℃で３０分間インキュベートした。９μｌを回収し、フェノール／クロロホルムで抽出することによって反応を停止させた。試験例３の方法でＰＡＧＥを行い２１塩基ＲＮＡを定量化した。ウシ血清添加直後に回収した一本鎖オリゴ核酸化合物を残存率１００％とした。
使用した一本鎖オリゴ核酸化合物を以下に示す。
５’−ＡＧＧＡＧＡＡＡＵＣＡＡＡＣＡＧＡＧＧｄＴｄＴ−３’（配列番号８）
（Ｒｐ）−５’−ＡｓＧＧｓＡＧｓＡＡｓＡＵｓＣＡｓＡＡｓＣＡｓＧＡｓＧＧｓｄＴｄＴ−３’（配列番号５；実施例１２）
（Ｓｐ）−５’−ＡｓＧＧｓＡＧｓＡＡｓＡＵｓＣＡｓＡＡｓＣＡｓＧＡｓＧＧｓｄＴｄＴ−３’（配列番号６；実施例１３）
これらの一本鎖オリゴ核酸化合物のウシ血清に対する分解抵抗性の結果を表１１に示す。
【表１１】
2006043521.tif 000039
ホスホロチオエート結合を有する本発明オリゴ核酸は、天然型と比較して、非常に多くの化合物が残存しており、エキソヌクレアーゼに対する分解抵抗性が高いことがわかった。そのなかでも、チオエート結合が全てＳｐである本発明オリゴ核酸がその効果が顕著であることが明らかとなった。
【０１１１】
試験例５  
二本鎖ＲＮＡのエキソヌクレアーゼに対する分解抵抗性評価
ｓｅｎｓｅ鎖とａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖それぞれ２０μＭをＡｎｎｅａｌｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  酢酸カリウム，  ３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、  ２ｍＭ  酢酸マグネシウム、  ｐＨ７．４）中９０℃で１分間、７０度で１分間おき、７０℃から３７℃まで１時間かけて温度を下げることにより二本鎖ＲＮＡを形成させた。ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｇ−２５  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で脱塩した。
３３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．９）、０．６７ｍＭ  ＭｇＣｌ２中で二本鎖ＲＮＡ４００ｐｍｏｌに対し、２５８ｍＵ  のＰｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  Ｉ（Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｃｒｏｔａｌｕｓ  Ａｄａｍａｎｔｅｕｓ  Ｖｅｎｏｍ；  Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）  を加えて３７℃で１５分間インキュベートした。インキュベート後１０μｌをフェノール／クロロホルムで抽出することによって反応を停止させた。水層をＰＡＧＥで確認した。
二本鎖ＲＮＡはポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ；１２％ポリアクリルアミド；アクリルアミド：ビス−アクリルアミド１９：１；８９ｍＭ  Ｔｒｉｓ／８９ｍＭホウ酸／２ｍＭ  ＥＤＴＡ）で分析した。エチジウムブロマイドで染色後、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて１９塩基対ＲＮＡを定量した。酵素添加直後に回収した１９塩基対ＲＮＡの残存率を１００％とした。
使用した二本鎖オリゴ核酸化合物を以下に示す。
Ｂ６２２：
センス鎖
５’−ＣＣＵＣＵＧＵＵＵＧＡＵＵＵＣＵＣＣＵｄＴｄＴ−３’（配列番号７）  
アンチセンス鎖
５’−ＡＧＧＡＧＡＡＡＵＣＡＡＡＣＡＧＡＧＧｄＴｄＴ−３’（配列番号８）
Ｂ６２２−Ｒｐ：アンチセンス鎖が実施例１２のオリゴ核酸化合物である二本鎖オリゴ核酸化合物
センス鎖
５’−ＣＣＵＣＵＧＵＵＵＧＡＵＵＵＣＵＣＣＵｄＴｄＴ−３’（配列番号７）  
アンチセンス鎖
（Ｒｐ）−５’−ＡｓＧＧｓＡＧｓＡＡｓＡＵｓＣＡｓＡＡｓＣＡｓＧＡｓＧＧｓｄＴｄＴ−３’（配列番号５；実施例１２）
Ｂ６２２−Ｓｐ：アンチセンス鎖が実施例１２のオリゴ核酸化合物である二本鎖オリゴ核酸化合物
センス鎖
５’−ＣＣＵＣＵＧＵＵＵＧＡＵＵＵＣＵＣＣＵｄＴｄＴ−３’（配列番号７）  
アンチセンス鎖
（Ｓｐ）−５’−ＡｓＧＧｓＡＧｓＡＡｓＡＵｓＣＡｓＡＡｓＣＡｓＧＡｓＧＧｓｄＴｄＴ−３’（配列番号６；実施例１３）
これらの二本鎖オリゴ核酸化合物のエキソヌクレアーゼに対する分解抵抗性の結果を表１２に示す。
【表１２】
2006043521.tif 000040
天然型の二本鎖オリゴ核酸化合物は、全くエキソヌクレアーゼに対する分解抵抗性を有しないが、ホスホロチオエート結合を有する本発明オリゴ核酸は、非常に多くの化合物が残存しており、エキソヌクレアーゼに対する分解抵抗性が非常に高いことがわかった。そのなかでも、チオエート結合が全てＳｐである本発明オリゴ核酸がその効果が顕著であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明に係るホスホロチオエート結合を有する光学活性なオリゴ核酸化合物の製法は、従来から知られているホスホロチオエート結合を有するオリゴ核酸化合物の製法とは異なり、通常のオリゴ核酸化合物の製法と同様にリン酸ジエステル結合のみを形成する方法である。
したがって、核酸合成ユニットとして、純度の高いホスホロチオエート結合を有する光学活性な核酸ダイマー化合物を使用することにより、純度の高いホスホロチオエート結合を有する光学活性なオリゴ核酸化合物を容易に製造することができる製法である。
また、本発明核酸ダイマーは、ホスホロチオエート結合を有する核酸ダイマー化合物であるので、ホスホロチオエート結合を有する光学活性なオリゴ核酸化合物を製造することができる原料化合物として有用である。
本発明核酸ダイマーを少なくとも１つ使用して製造することができる、ホスホロチオエート結合を有する光学活性なオリゴ核酸化合物は、それと相補鎖を形成しうるＲＮＡに対して、天然型のオリゴＲＮＡと同様又はそれ以上の親和性を有することが明らかとなった。
また、本発明核酸ダイマーを少なくとも１つ使用して製造することができる、ホスホロチオエート結合を有する光学活性なオリゴ核酸化合物は、同じ配列を有する天然型のオリゴ核酸化合物と比較して、エキソヌクレアーゼ又はウシ血清に対して非常に高い分解抵抗性を示した。
さらに、該オリゴ核酸化合物を含む二本鎖オリゴ核酸化合物においても、同じ配列を有する天然型の二本鎖オリゴ核酸化合物と比較して、エキソヌクレアーゼに対して非常に高い分解抵抗性を示した。
即ち、ターゲット遺伝子（ｍＲＮＡ）に対して切断活性を有する天然型のオリゴＲＮＡと同様の配列を有する、ホスホロチオエート結合を有する光学活性なオリゴ核酸化合物は、天然型のオリゴＲＮＡとほぼ同様又はそれ以上の親和性やほぼ同等のターゲット遺伝子（ｍＲＮＡ）に対する切断活性を有するので、種々酵素耐性を有する本発明オリゴ核酸は、治療薬、診断薬又は研究試薬として有用である。
【図１】
2006043521.tif 000054
【図２】
2006043521.tif 000055
【図３】
2006043521.tif 000056
【図４】
2006043521.tif 000057
【図５】
2006043521.tif 000058
【配列表】
2006043521000001.app
【国際調査報告】
2006043521.tif 000059
2006043521.tif 000060
2006043521.tif 000061
2006043521.tif 000062
2006043521.tif 000063
2006043521.tif 000064