(57)【要約】  本発明は十分な皮膚美白効果を有する美白剤を提供することを目的とする。  本発明は、アセロラ由来ポリフェノール化合物若しくはアセロラポリフェノール画分又はその他のポリフェノール化合物を有効成分として含有するメラニン生成抑制剤、アスコルビン酸若しくはアスコルビン酸誘導体を有効成分として更に含有するメラニン生成抑制剤に関する。本発明はまた、これらを含む美白剤、化粧品組成物、飲食品組成物又は医薬組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセロラ由来ポリフェノール化合物を有効成分として含有するメラニン生成抑制剤。
【請求項２】
アセロラ果汁又はアセロラ抽出物から得られたアセロラポリフェノール画分を有効成分として含有するメラニン生成抑制剤。
【請求項３】
アントシアニジン類化合物又はその配糖体（ただしシアニジン−３−グルコシドを除く）或いはそれらの生理的に許容される塩を有効成分として含有するメラニン生成抑制剤。
【請求項４】
前記アントシアニジン類化合物がシアニジン、ペラルゴニジン、デルフィニジン、マルビジン及びペオニジンからなる群から選択される少なくとも１種である請求項３に記載のメラニン生成抑制剤。
【請求項５】
前記配糖体が、ラムノース、グルコース、ガラクトース、マンノース、キシロース、リボース、アラビノース及びグルクロン酸からなる群から選択される単糖又は同一の若しくは異なる複数の前記単糖により構成されるオリゴ糖が前記アントシアニジン類化合物にグリコシド結合を介して結合したものである請求項３又は４に記載のメラニン生成抑制剤。
【請求項６】
アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体を有効成分として更に含有する請求項１〜５のいずれか１項に記載のメラニン生成抑制剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のメラニン生成抑制剤を有効成分として含有する美白剤。
【請求項８】
請求項７に記載の美白剤が配合されていることを特徴とする化粧品組成物。
【請求項９】
請求項７に記載の美白剤が配合されていることを特徴とする飲食品組成物。
【請求項１０】
請求項７に記載の美白剤が配合されていることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１１】
アセロラ由来ポリフェノール化合物を飲食品組成物１００ｇあたり０．１〜３０ｇ含有する飲食品組成物。
【請求項１２】
アセロラ由来ポリフェノール化合物とアスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体とを含有し、アセロラ由来ポリフェノール化合物とアスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体との重量比が５：１〜１：１０である飲食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラニン生成抑制剤、美白剤及び化粧品用、飲食品用又は医薬品用の組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アセロラはキントラノオ科ヒイラギトラノオ属の熱帯果実で、カリブ海諸島を原産としている。アセロラ果実は、約１，５００ｍｇ／１００ｇあるいはそれ以上のビタミンＣが含まれ、豊富なビタミンＣを含む植物として近年知られるようになっている。ビタミンＣには、組織や毛細血管の強化、メラニン生成抑制活性、あるいはコラーゲンの形成など、数々の生理・薬理作用が知られており、化粧品の分野でも頻繁に利用されている。そして、天然のビタミンＣを豊富に含むアセロラの果実も、その抽出物に含まれるビタミンＣによるチロシナーゼ阻害作用等を期待して化粧料等に用いられるようになっている（特許第２８１４０９４号公報）。また、特開平１０−３１６５３３号公報はビタミンＣを含まないアセロラの発酵体が白色化効果をもつことを教示している。これらは有機酸又はカルボン酸の寄与によるものとしているが、活性の本体は不明である。【０００３】
最近では、アセロラに含まれるポリフェノール成分の生理作用もまた注目されている。例えば、本発明者らは、アセロラにはアントシアニジン色素やケルセチン配糖体をはじめとするポリフェノールが約１００〜３００ｍｇ／１００ｇ程度含まれており、これらのアセロラポリフェノールが活性酸素消去作用（特願２００３−３７５９１３）、グルコース吸収阻害作用（特願２００３−３７５３２３）、マルターゼ阻害作用およびＡＧＥ生成阻害活性（特願２００３−３１４２０７）を有することで、血糖上昇や糖尿病合併症などの生活習慣病に対する予防に有効であることを見出している。【０００４】
一方、人の皮膚の色は、表皮中のメラニン量、毛細血管の血流量、角質層の厚さなどが影響している。特にメラニン量は最も重要な因子と報告されている。メラニン色素の生成過程は、色素細胞（メラノサイト）内でチロシンにチロシナーゼが作用することで、チロシンが酸化されて、ドーパ、ドーパキノンになり、さらに自動酸化しドーパクロム、５，６−ジヒドロキシインドールを経て重合し、最終的にメラニン色素になる。シミやソバカスなどの色素沈着はメラノサイトの活性化によりメラニン色素の生成が著しく亢進したものであり、中高年齢層や女性にとっては大きな悩みの１つとなっている。そこで、最近、皮膚中のメラニン量を少なくして、皮膚を白く保つための化粧品組成物が開発されている。これらの開発努力は、上記のようにメラニンの生成過程で中心的な役割をもつチロシナーゼの活性を抑制する白色化剤に集中している。例えば、ビタミンＣまたはビタミンＣ誘導体、アルブチン、コウジ酸、システイン、グルタチオンなどのチロシナーゼ活性抑制剤を化粧品に配合することが提案されている。また、胎盤抽出物、海藻抽出物（コンブ、ワカメなど）や植物抽出物（茶、アロエ、カンゾウなど）を利用した美白剤も知られている。【０００５】
非特許文献１にはデルフィニジン、シアニジン及びマルビジンがチロシナーゼ活性阻害作用を有していないことを示すデータが記載されている。
【特許文献１】特許第２８１４０９４号公報
【特許文献２】特開平１０−３１６５３３号公報
【非特許文献１】F.A. Badria and M.A. ElGayyar, Boll. Chim. Farmac. - Anno 140 - n. 4, p267-271 (2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記の美白成分又は美白剤では、皮膚に対する美白効果が充分に発揮されなかったり、製剤中での安定性や溶解性が悪く、また安全性の面で問題があるなど、実使用において満足すべきものではない。【０００７】
そこで本発明は十分な皮膚美白効果を有する美白剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下の発明を包含する。【０００９】
（１）アセロラ由来ポリフェノール化合物を有効成分として含有するメラニン生成抑制剤。【００１０】
（２）アセロラ果汁又はアセロラ抽出物から得られたアセロラポリフェノール画分を有効成分として含有するメラニン生成抑制剤。【００１１】
（３）アントシアニジン類化合物又はその配糖体（ただしシアニジン−３−グルコシドを除く）或いはそれらの生理的に許容される塩を有効成分として含有するメラニン生成抑制剤。【００１２】
（４）前記アントシアニジン類化合物がシアニジン、ペラルゴニジン、デルフィニジン、マルビジン及びペオニジンからなる群から選択される少なくとも１種である（３）に記載のメラニン生成抑制剤。【００１３】
（５）前記配糖体が、ラムノース、グルコース、ガラクトース、マンノース、キシロース、リボース、アラビノース及びグルクロン酸からなる群から選択される単糖又は同一の若しくは異なる複数の前記単糖により構成されるオリゴ糖が前記アントシアニジン類化合物にグリコシド結合を介して結合したものである（３）又は（４）に記載のメラニン生成抑制剤。【００１４】
（６）アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体を有効成分として更に含有する（１）〜（５）のいずれかに記載のメラニン生成抑制剤。【００１５】
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載のメラニン生成抑制剤を有効成分として含有する美白剤。【００１６】
（８）（７）に記載の美白剤が配合されていることを特徴とする化粧品組成物。【００１７】
（９）（７）に記載の美白剤が配合されていることを特徴とする飲食品組成物。【００１８】
（１０）（７）に記載の美白剤が配合されていることを特徴とする医薬組成物。【００１９】
（１１）アセロラ由来ポリフェノール化合物を飲食品組成物１００ｇあたり０．１〜３０ｇ、好ましくは０．５〜１０ｇ含有する飲食品組成物。【００２０】
（１２）アセロラ由来ポリフェノール化合物とアスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体とを含有し、アセロラ由来ポリフェノール化合物とアスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体との重量比が５：１〜１：１０、好ましくは３：１〜１：２である飲食品組成物。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、皮膚の黒色化を抑え、かつ、副作用などの心配のない美白剤が提供される。本美白剤は食品分野、化粧品分野、医薬分野など幅広い分野において有用である。【００２２】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2004-238702号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】アセロラ果汁Ｃ１８吸着画分のチロシナーゼ阻害活性を示した図である。
【図２】Ｃ１８吸着画分のマウスメラノーマＢ１６細胞を用いたメラニン生成抑制作用確認実験の結果を示した図である。
【図３】シアニジン−３−ラムノシド（Ｃ３Ｒ）のチロシナーゼ阻害活性を示した図である。
【図４】ペラルゴニジン−３−ラムノシド（Ｐ３Ｒ）のチロシナーゼ阻害活性を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明をより詳細に説明する。【００２５】
本発明者らはアセロラ由来ポリフェノール化合物がメラニン生成抑制作用（より具体的にはチロシナーゼ活性阻害作用）を有することを見出し、本発明を完成するに至った。【００２６】
アセロラ由来のポリフェノール化合物としては具体的には、シアニジン-3-ラムノシドとペラルゴニジン-3-ラムノシド等のアントシアニジン系色素、クエルシトリン（ケルセチン-3-ラムノシド）等のケルセチン配糖体が挙げられ、なかでもアントシアニジン系色素が好ましい。これらのポリフェノール類は複数のポリフェノール化合物からなる混合物としても優れたメラニン生成抑制作用を有するのであるが、個々のポリフェノール化合物が単離された形態で存在する場合、特にペラルゴニジン-3-ラムノシドが単離された形態で存在する場合にはより強力なメラニン生成抑制作用を有するため好ましい。【００２７】
ポリフェノール化合物の起源となるアセロラの部位に特に制限はなく、例えばアセロラの果実、根、茎、葉が挙げられる。なかでも果実から採取することが好ましい。ここで果実とは可食部と種部を含んだ果実全体を指す。【００２８】
アセロラからポリフェノール化合物を採取する方法は常法により行うことができる。例えばアセロラ果実を搾汁したアセロラ果汁や、アセロラの上記部位の抽出物から適宜精製して採取することができる。【００２９】
上記アセロラ抽出物を得る方法としては、例えば、水または有機溶媒で抽出する方法、アルコール等の親水性有機溶媒を含む水で抽出する方法、有機溶媒を用いて抽出された粗抽出液に、合成吸着剤を作用させて吸着させ、フラボノイドを有する抽出物を得る方法、超臨界流体を用いて抽出する方法等がある。抽出溶媒として用いられ得る水の種類には特に限定がなく、純水、精製水等であってよい。抽出溶媒として有機溶媒が用いられる場合、親水性有機溶媒、疎水性有機溶媒のいずれでもよい。親水性有機溶媒としては、例えば、メチルアルコール、エチルアルコール、グリセリン、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール等のアルコール、アセトン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、1,4-ジオキサン、ピリジン、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、酢酸等の公知の有機溶媒が挙げられる。上記の親水性有機溶媒は水との混合物として用いられてもよい。疎水性有機溶媒としては、例えば、ヘキサン、シクロヘキサン、四塩化炭素、クロロホルム、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン等の公知の有機溶媒が挙げられる。上記の親水性有機溶媒および疎水性有機溶媒はそれぞれ単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできる。【００３０】
抽出条件は特に限定されないが、好ましい温度範囲は５〜９０℃、特に２０〜４０℃である。ここで、高温で抽出を行った場合に、特に配糖体を形成しているポリフェノール等において加水分解を起こすことがある。このため低温抽出により得られるポリフェノールと高温抽出により得られるポリフェノールとが異なる可能性があるが、ポリフェノールの機能性の活性強度には何ら影響しない。抽出時間は１時間〜１０時間程度、特に１〜２時間程度が好ましく、また抽出に使用する溶媒量は原料に対して質量比で１倍量〜２０倍量が好ましい。【００３１】
抽出後、ろ過あるいは遠心分離により抽出残渣を除き抽出液を得る。この抽出液は必要により濃縮処理を行うこともできる。また抽出残渣に対して更に同様の抽出処理を行ってもよい。【００３２】
得られた抽出液には糖分や有機酸が非常に多く含まれることがあるため、それらを除く精製工程を行うことも好ましい。精製処理の方法として、順相又は逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過等が挙げられる。これらの方法を組み合わせて用いることもできる。【００３３】
上記のアセロラ果汁又はアセロラ抽出物からポリフェノール化合物を単離精製する方法は特に限定されないが、例えばＨＰＬＣ、合成吸着剤クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過等があり、特に合成吸着剤クロマトグラフィーが好ましい。この場合、溶出条件としては、例えば１０〜５０％エタノール溶液を用いて溶出することが好ましい。またさらに、アントシアニジン色素は酸性条件下で安定化するため、この溶出液に塩酸又は酢酸などを加え酸性にすることが特に好ましい。【００３４】
アセロラ果汁又はアセロラ抽出物から得られたアセロラポリフェノール画分もまたメラニン生成抑制作用を有する。ここでアセロラポリフェノール画分とは、アセロラ果汁又はアセロラ抽出物から上述の各種クロマトグラフィーにより上述の溶出条件で溶出された、ポリフェノール化合物を含有する画分を指す。アセロラポリフェノール画分には、溶出液、その濃縮物及びその乾燥物が包含される。【００３５】
本発明者らは更にまた、アセロラに由来するものに限らず、種々のアントシアニジン類化合物又はその配糖体（ただしシアニジン−３−グルコシドを除く）或いはそれらの生理的に許容される塩がメラニン生成抑制作用（より具体的にはチロシナーゼ活性阻害作用）を有することを見出した。本発明はまたこれらの成分を有効成分とするメラニン生成抑制剤に関する。【００３６】
前記アントシアニジン類化合物としては具体的にはシアニジン、ペラルゴニジン、デルフィニジン、マルビジン、ペオニジン及びペチュニジンが包含され、なかでも、シアニジン、ペラルゴニジン、デルフィニジン、マルビジン及びペオニジンが好ましい。【００３７】
本発明において「アントシアニジン類化合物」という用語は、アントシアニジン類化合物に加えて、アントシアニジン類化合物の誘導体であってメラニン生成抑制作用が実質的に同等なものをも包含する。このような誘導体としてはアントシアニジン類化合物のアシル化体、デオキシ体等が挙げられる。【００３８】
前記配糖体としては、ラムノース、グルコース、ガラクトース、マンノース、キシロース、リボース、アラビノース及びグルクロン酸からなる群から選択される単糖（より好ましくはラムノース）又は同一の若しくは異なる複数の前記単糖により構成されるオリゴ糖（例えば二糖又は三糖）が前記アントシアニジン類化合物にグリコシド結合（通常はＯ−グリコシド結合）を介して結合したものが好ましい。グリコシド結合は、通常は、前記アントシアニジン類化合物の３位、３’位、５位又は７位の水酸基と糖との結合により形成される。【００３９】
前記配糖体は、１分子のアントシアニジン類化合物に１分子の糖が結合したものには限定されず、１分子のアントシアニジン類化合物に、同種又は異種の複数の糖分子が結合したものであってもよい。【００４０】
前記アントシアニジン類化合物及びその配糖体のうち、シアニジン−３−ラムノシド、ペラルゴニジン−３−ラムノシド、シアニジン、ペラルゴニジン、デルフィニジン、ペオニジン及びマルビジンが特に好ましい。本発明は非特許文献１に記載された、デルフィニジン、シアニジン及びマルビジンがチロシナーゼ活性阻害作用を有さないとの知見とは正反対の知見に基づくものであり、当業者が容易に想到できるものではない。【００４１】
前記生理的に許容される塩としては有機酸又は無機酸との酸付加塩が挙げられ、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、糖酸塩、シクロヘキシルスルフアミン酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ナウタレンスルホン酸塩などが挙げられる。【００４２】
本発明のメラニン生成抑制剤中の、アセロラ由来ポリフェノール化合物の量は、メラニン生成抑制作用を奏することができる有効量であれば特に限定されないが、一例を挙げれば、製剤１００ｇあたり０．１〜３０ｇ、好ましくは０．５〜１０ｇである。【００４３】
本発明者らは更に驚くべきことに、アセロラ由来ポリフェノール化合物又はアセロラポリフェノール画分或いは上記の各種ポリフェノール化合物とアスコルビン酸とが組み合わされたときより優れたメラニン生成抑制作用が奏されることを見出し、本発明を完成するに至った。従来より、アスコルビン酸（ビタミンＣ）が主にその還元作用によりチロシナーゼによるメラニンの生成を抑制する効果があることは知られていた。今回新たに、アセロラ由来ポリフェノール化合物とアスコルビン酸とを組み合わせたときに両者によるメラニン生成抑制作用が相乗的に高まり、各々を単独で用いた場合と比較して少量の使用量で同等の効果が得られることが確認された。アスコルビン酸はその誘導体として提供されてもよく、アスコルビン酸誘導体としては例えばアスコルビン酸のカリウム、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム等の金属塩、リン酸エステルカリウム、リン酸エステルマグネシウム、リン酸エステルカルシウム等のリン酸エステル塩、硫酸エステルナトリウム、硫酸エステルカリウム等の硫酸エステル塩が挙げられる。本発明のメラニン生成抑制剤中にアセロラ由来ポリフェノール化合物とアスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体とが含有される場合、アセロラ由来ポリフェノール化合物とアスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体との重量比は４：１〜１：８であることが好ましいがこの範囲には限定されない。【００４４】
本発明のメラニン生成抑制剤は実施例に示す通り皮膚美白作用を有している。すなわち本発明はまた、上記のメラニン生成抑制剤を有効成分として含有する美白剤に関する。【００４５】
本発明の美白剤は典型的には化粧品組成物、飲食品組成物又は医薬組成物の成分として配合され皮膚美白に資することができるだけでなく、皮膚老化防止、皮膚癌の予防又は治療などの効果を奏するものと期待される。【００４６】
化粧品組成物としては通常の形態、例えば化粧用クリーム、乳液、化粧水、美容エッセンス、パック剤、パウダー、リップクリーム、口紅、アンダーメイクアップ、ファンデーション、サンケア、浴用剤、ボディシャンプー、ボディローション、石けん、クレンジングフォーム、軟膏、ゼリー剤、エアゾール剤等の形態で用いることができる。化粧品組成物には本発明の美白剤のほかに、本発明の所望の効果が損なわれない範囲で、油分、界面活性剤、アルコール、保湿剤、抗酸化剤、美白剤、紫外線吸収剤、防菌防かび剤、顔料、色素、香料などを適宜添加することができる。本発明の化粧品組成物中のアセロラ由来ポリフェノール化合物の量は、化粧品としての使用によりメラニン生成抑制作用を奏することができる有効量であれば特に限定されないが、一例を挙げれば、０．００１〜４重量％、好ましくは０．０４〜０．８重量％である。本発明の化粧品組成物中にアセロラ由来ポリフェノール化合物とアスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体とが含有される場合、アセロラ由来ポリフェノール化合物とアスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体との重量比は好ましくは５：１〜１：１０、より好ましくは３：１〜１：２であるがこの範囲には限定されない。【００４７】
飲食品組成物の形態としては、飲料、固形食品、半固形食品等が挙げられ、特定保健用食品にもなり得る。飲料としては、具体的には、果汁飲料、清涼飲料、アルコール飲料等が挙げられる。また、摂取時に水等を用いて希釈して摂取される形態であってもよい。固形食品としては、例えば、飴、トローチ等を含む錠剤（タブレット）や糖衣錠の形態、顆粒の形態、粉末飲料、粉末スープ等の粉末の形態、ビスケット等のブロック菓子類の形態、カプセル、ゼリー等の形態等、種々の形態の食品が挙げられる。半固形食品としては、例えばジャムのようなペーストの形態、チューイングガムのようなガムの形態が挙げられる。これらの飲食品組成物には本発明の美白剤のほかに、本発明の所望の効果が損なわれない範囲で、通常、食品原料として用いられる種々の成分を配合することができる。他の成分としては例えば水、アルコール類、甘味料、酸味料、着色料、保存剤、香料、賦形剤等が挙げられる。これらの成分は単独で、または組み合わされて使用され得る。本発明の飲食品組成物中のアセロラ由来ポリフェノール化合物の量は、摂食によりメラニン生成抑制作用を奏することができる有効量であれば特に限定されないが、一例を挙げれば、飲食品組成物１００ｇあたり０．１〜３０ｇ、好ましくは０．５〜１０ｇである。本発明の飲食品組成物中にアセロラ由来ポリフェノール化合物とアスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体とが含有される場合、アセロラ由来ポリフェノール化合物とアスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体との重量比は好ましくは５：１〜１：１０、より好ましくは３：１〜１：２であるがこの範囲には限定されない。【００４８】
医薬組成物の形態には特に制限はなく必要に応じ適宜選択され、経口投与用製剤または非経口投与用製剤の形態が可能である。経口投与用製剤としては例えば散剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、液剤、カプセル剤、丸剤、トローチ、内用液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤等の形態とすることができる。非経口投与用製剤としては例えば経鼻、経腸、経皮投与用製剤が挙げられ、注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、貼付剤、軟膏剤等の形態とすることができる。またこれらの製剤形態が症状に応じて単独で、または組み合わされて使用され得る。各種製剤形態への調製は、常法により行われる。その際使用される担体、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤、希釈剤等も慣用されているものから適宜選択される。本発明の医薬組成物中のアセロラ由来ポリフェノール化合物の量は、投与によりメラニン生成抑制作用を奏することができる有効量であれば特に限定されないが、一例を挙げれば、医薬組成物１００ｇあたり０．１〜３０ｇ、好ましくは０．５〜１０ｇである。本発明の医薬組成物中にアセロラ由来ポリフェノール化合物とアスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体とが含有される場合、アセロラ由来ポリフェノール化合物とアスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体との重量比は好ましくは５：１〜１：１０、より好ましくは３：１〜１：２であるがこの範囲には限定されない。【００４９】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５０】
[実施例１]
Ｃ１８吸着画分の調製
アセロラ果実１ｋｇから種子を除去した後、等倍量の精製水を添加し、ホモジナイズした。得られた懸濁液を遠心・ろ過後、Ｃ１８カートリッジカラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｖａｃ  ３５ｃｃ  Ｃ１８カートリッジカラム）に供し、蒸留水で洗浄し、０．２％ＴＦＡ／メタノール溶液で溶出した。溶出液を凍結乾燥し、１．２ｇの粉末を得た。この粉末をアセロラポリフェノール画分（Ｃ１８吸着画分）とした。Ｃ１８吸着画分の成分分析を行った結果、グルコース、フルクトース及びビタミンＣは含まれていなかった。次に、ポリフェノール含量をＦｏｌｉｎ−Ｄｅｎｉｓ法により測定した。検量線はカテキンを標準物質として作成した。その結果、ここで得られたＣ１８吸着画分の総ポリフェノール含量は４０．７％であった。なお、同画分の総ポリフェノール含量ははじめ２２％と算出されたが、この値は測定又は検量線作成操作における誤りが原因で導かれた正しくない値であり、同一試料について再度正確に測定及び検量線作成を行なったところ上記の如く４０．７％が適切な値であることが判明した。【００５１】
[実施例２]
アセロラ由来ポリフェノールの調製
アセロラ果実から種子を取り除き、残りの可食部をホモジナイズし３倍量のメタノールを添加して２７℃にて１時間抽出した。この操作を２回行い、遠心・ろ過後、凍結乾燥し、再度蒸留水に溶解した。この液をＣ１８カートリッジカラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｖａｃ  ３５ｃｃ  Ｃ１８カートリッジカラム）に供し、１０％メタノールで充分洗浄した後、０．１％ＴＦＡを含む２０％メタノール溶液で溶出される画分および０．１％ＴＦＡを含む３０％メタノール溶液で溶出される画分を採取した。逆層カラムを用いたＨＰＬＣにより、さらに精製し、２０％メタノール溶出画分からシアニジン−３−ラムノシド（以下Ｃ３Ｒと略記）とペラルゴニジン−３−ラムノシド（以下Ｐ３Ｒと略記）を得た。【００５２】
[実施例３]
Ｃ１８吸着画分のチロシナーゼ活性阻害
１／１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）７０μＬ、実施例１で得られたＣ１８吸着画分をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた各種濃度の試料溶液２μＬ、マッシュルーム由来チロシナーゼ（ＣＡＬＺＹＭＥ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の同緩衝液溶液７０μＬ（１０Ｕ）を加えて混合した後、２５℃で１０分間インキュベートした。その後１０ｍＭ Ｌ−ＤＯＰＡ  ７０μＬを加えて反応を開始し、波長４７５ｎｍの吸光度を２０秒ごとに２分間まで測定し、次式を用いてチロシナーゼ活性阻害率を算出した。その結果を図１に示した。【００５３】
チロシナーゼ活性阻害率（％）＝（１−ａ／ｂ）×１００
ａ：試料溶液を添加した反応溶液の単位時間当たりの吸光度変化
ｂ：試料溶液の代わりにＤＭＳＯを添加した反応溶液の単位時間当たりの吸光度変化
図１から明らかなように、Ｃ１８吸着画分にチロシナーゼ活性阻害効果が認められた。【００５４】
次に、ポリフェノールを吸着する性質を持つ樹脂であるＰｏｌｙ−ｖｉｎｙｌｐｏｌｙｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ（ＰＶＰＰ）を、実施例１で得られたＣ１８吸着画分の０．１３２％水溶液に５％となるように添加し、１．５時間攪拌の後、遠心分離（１，８００ｇ、１５分）して上清を得た。さらに、この上清に１％となるようにＰＶＰＰ樹脂を添加し、同様に１．５時間攪拌した後遠心分離し、その上清を得た。これを凍結乾燥させＰＶＰＰ非吸着画分として、３７℃で上記と同様にチロシナーゼ活性阻害を調べた。なお、ここでは試料をＤＭＳＯではなく、１／１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解した。また、ポリフェノール含量の測定は実施例１と同様に行った。それらの結果を表１に示す。表１から明らかなように、Ｃ１８吸着画分のチロシナーゼ活性阻害にはポリフェノール成分が強く関与していると考えられる。
【表１】
2006019114.tif 000002
【００５５】
[実施例４]
マウスメラノーマＢ１６細胞を用いたＣ１８吸着画分のメラニン生成抑制作用確認実験
実施例１で調製したＣ１８吸着画分を用いて、マウス由来Ｂ１６メラノーマ細胞を使用し、細胞レベルでの美白効果の確認試験を行った。この試験法によれば、動物細胞を使用することにより、生体内により近い環境下でメラニン色素の生成抑制作用及び細胞増殖に与える影響を確認することができる。【００５６】
シャーレにマウス由来Ｂ１６メラノーマ細胞を１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ播き込み、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２日間培養した。培養液を除去後、Ｃ１８吸着画分を１０、５０、７５又は１００μｇ／ｍＬの各濃度で添加した試験培地を１０ｍＬ／ｄｉｓｈ加え、更に３７℃、５％ＣＯ２条件下で３日間培養した。培養液を除去後、トリプシン溶液で細胞を剥がして遠心分離を行い、ＰＢＳに懸濁後、再度遠心分離を行った。上清を除いた細胞ペレットに１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を加え、加熱処理を行い、メラニン色素を溶解し、更に細胞由来の線維状物質をフィルター除去した。吸光度計にて溶解したメラニン色素の測定とＢＩＯ−ＲＡＤ社ＤＣ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  ＫＩＴを用いた蛋白量の測定を行った。【００５７】
ブランク試験群としてＣ１８吸着画分添加培地に代えて１０％ＦＢＳ／ＤＭＥ培地を用いて上記と同様の試験を行なった。またポジティブコントロール群としてＣ１８吸着画分添加培地に代えてアスコルビン酸を２０μｇ／ｍＬ添加した培地を用いて上記と同様の試験を行なった。【００５８】
ブランク試験群における蛋白質１ｍｇ当たりのメラニン生成量を１００％とした時の、各Ｃ１８吸着画分添加群のメラニン生成率を以下の式で算出した。結果を図２に示す。【００５９】
メラニン生成率（％）＝（［Ｃ１８吸着画分添加群における総蛋白１ｍｇ当たりのメラニン量の平均値］／［ブランク試験群における総蛋白１ｍｇ当たりのメラニン量の平均値］）ｘ１００
図２より、Ｃ１８吸着画分がアスコルビン酸と同程度のメラニン生成抑制作用をもつことが確認された。また、本試験で用いた濃度域においては総蛋白質量に変化がみられなかったことから、Ｃ１８吸着画分の添加が細胞増殖に与える影響はないと考えられた。【００６０】
[実施例５]
アセロラ由来ポリフェノール成分のチロシナーゼ活性阻害
実施例２で得られた２種類のアセロラ由来ポリフェノールＣ３Ｒ、Ｐ３Ｒを用いて、チロシナーゼ活性阻害試験を実施例３の手順に準じて行った。それらの結果を図３および図４に示した。図３および図４より、Ｃ３ＲおよびＰ３Ｒにおいてチロシナーゼの活性阻害効果が認められた。Ｃ３Ｒ、Ｐ３Ｒおよびコウジ酸についてチロシナーゼの活性を５０％阻害するときの濃度を算出し、表２に示した。ポジティブコントロールとして用いたのはチロシナーゼ活性阻害剤としてよく知られているコウジ酸である。コウジ酸はチロシナーゼ活性を阻害し、メラニンの生成を抑えるため、化粧品に添加されていたが、動物実験で肝がんを引き起こす可能性があることがわかり、平成１３年３月に厚生労働省の通達により現在化粧品への使用は中止されている。表２より、Ｃ３Ｒのチロシナーゼ阻害効果はコウジ酸と同程度であり、さらにＰ３Ｒにおいてはコウジ酸の約６倍の強いチロシナーゼ阻害効果をもつことがわかった。この結果はＣ３ＲおよびＰ３Ｒが天然物由来の美白剤として利用できる可能性を示すものである。
【表２】
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【００６１】
[実施例６]
アスコルビン酸との相乗効果
アスコルビン酸（ビタミンＣ）は、主にその還元作用により、チロシナーゼによるメラニンの生成を抑制する効果があることが知られている。そこで、アスコルビン酸とＣ１８吸着画分のチロシナーゼ阻害活性の相乗効果について検討した。アスコルビン酸による還元作用によるメラニン生成抑制もまた、実施例３に示す「チロシナーゼ活性阻害率」を用いて評価することが可能である。その結果を表３に示した。表３から少量のアスコルビン酸を添加することで、Ｃ１８吸着画分とアスコルビン酸が相乗的に作用し、少量のＣ１８吸着画分で充分なメラニン生成抑制効果が得られることが明らかになった。
【表３】
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【００６２】
[実施例７]
アセロラポリフェノール画分の大量調製１
種子を除去したアセロラ果実８０ｋｇを搾汁し、果汁と残渣を得た。残渣は蒸留水で洗浄し、この洗浄液と果汁を混ぜ合わせ凍結乾燥した。得られたサンプルを再度蒸留水に溶解し、この液を合成吸着樹脂（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ  １６ＨＰカラム）に供し、蒸留水で洗浄後、０．２％  ＴＦＡ／メタノール溶液で溶出した。その後、凍結乾燥を行いアセロラポリフェノール画分９６ｇを得た。この画分を成分分析した結果、グルコース、フルクトース及びビタミンＣは含まれておらず、総ポリフェノール含量（Ｆｏｌｉｎ−Ｄｅｎｉｓ法による）は約４０％であった。【００６３】
[実施例８]
アセロラポリフェノール画分の大量調製２
種子を除去したアセロラ果実を搾汁し、果汁と残渣を得た。得られた果汁８ｔを等量の蒸留水と混合し、よく攪拌した後、この液を合成吸着樹脂（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ  ７ＨＰカラム）に供し、蒸留水で洗浄後、リンゴ酸を添加した７０％エタノール溶液で溶出した。その後、凍結乾燥を行いアセロラポリフェノール画分の粉末５．９ｋｇを得た。この画分の総ポリフェノール含量（Ｆｏｌｉｎ−Ｄｅｎｉｓ法による）は約４０％であった。得られたアセロラポリフェノール画分の粉末中には、溶出液に添加されたリンゴ酸が１％含まれていた。【００６４】
[実施例９]
アセロラポリフェノールを配合したドリンク剤
実施例３〜６の結果からアセロラポリフェノールを配合したドリンク剤は肌のくすみやシミを防止又は改善することができるものと期待される。このようなドリンク剤の調製方法は特に限定されない。例えば実施例８で作製したアセロラポリフェノール画分２５０ｍｇを用いてドリンク剤２００ｍｌを常法により調製することができる。【００６５】
肌のくすみやシミが目立たなくなる効果を得るためのドリンク剤の摂取量及び摂取期間は適宜決定できるが、一例を挙げれば、１日当たり２００ｍｌの上記ドリンク剤を１２週間にわたって飲み続けることが好ましい。【００６６】
[実施例１０]
アセロラポリフェノール含有化粧水のヒトに対する美白作用
表４の処方に従ってアセロラポリフェノール含有化粧水を得た。なお調製は湯浴中で行なった。試験品Ａは対照品と同一組成である。下記試験１においてプラセボサンプルとして被験者に与えた。
【表４】
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【００６７】
試験１：使用感
１０名の被験者に対して、各自の手の甲に対照品及び試験品Ａ〜Ｄ計５種類を塗布させ、使用感についてアンケートを行なった。【００６８】
アンケートでは５項目（色、香り、さらさら感、しっとり感、透明感）について対照品を０点とし各試験品について−３点から３点まで１点刻みで、好ましいものほど高得点になるように点数をつけるよう依頼し、その平均点を算出して評価した。結果を表５に示す。
【表５】
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【００６９】
表５から明らかな通り、Ｃ１８吸着画分を配合した試験品、特に試験品Ｃ及びＤでは、しっとり感、透明感、さらさら感という化粧水の使用感に重要な項目について肯定的な評価が得られた。色についてはＣ１８吸着画分を０．５％配合した試験品Ｄでは化粧水として濃すぎるという意見が一部の被験者から寄せられた。【００７０】
試験２：美白効果
被験者９名を３人ずつ３組に分け、対照品と試験品Ｂを塗布する組、対照品と試験品Ｃを塗布する組、及び対照品と試験品Ｄを塗布する組とした。【００７１】
各被験者は一方の腕に対照品を塗布し、他方の腕に所定の試験品を塗布した。１日１回適当量を塗布し、２週間継続した。【００７２】
試験開始２週間後に各被験者に対してアンケートを行なった。アンケートでは美白効果について対照品を０点とし試験品について−３点から３点まで１点刻みで、美白効果が高いほど高得点になるように点数をつけるよう依頼し、その合計点を算出して評価した。結果を表６に示す。
【表６】
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【００７３】
表６に示される通り、Ｃ１８吸着画分を配合した化粧水、特に試験品Ｃ及びＤは美白作用を奏することが確認された。【００７４】
Ｃ１８吸着画分配合量が０．１％の試験品Ｃと同０．５％の試験品Ｄとは美白効果に差は認められなかった。試験１において試験品Ｄは化粧水として色が濃すぎるという指摘があったことも鑑みれば、化粧水におけるＣ１８吸着画分の添加量は０．１％程度が適当であるといえる。【００７５】
[実施例１１]
アントシアニジン類化合物等のチロシナーゼ活性阻害試験
実施例５では、アセロラに含まれるアントシアニジン類化合物の配糖体（シアニジン−３−ラムノシド及びペラルゴニジン−３−ラムノシド）がチロシナーゼ活性阻害作用を有することが示された。本実施例では表７に示す各種化合物についてチロシナーゼ活性阻害作用を確認した。
【表７】
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【００７６】
表７に示す化合物のうち、シアニジン−３−ラムノシド、ペラルゴニジン−３−ラムノシド、ケルセチン−３−ラムノシド、イソクエルシトリン、アスチルビン、及びヒペロシドはアセロラに由来するポリフェノールである。またシアニジン、ペラルゴニジン、デルフィニジン、ペオニジン、及びマルビジンはアントシアニジン類化合物である。なおイソクエルシトリンはケルセチン−３−グルコシドの別名であり、アスチルビンはデヒドロクエルシトリンの別名であり、ヒペロシドはケルセチン−３−ガラクトシドの別名である。【００７７】
各サンプル化合物をＤＭＳＯに溶解し、適当な濃度にＤＭＳＯで希釈した。【００７８】
９６穴プレートの各ｗｅｌｌに１／１５Ｍリン酸緩衝液７０μｌ、１Ｕ／μｌに緩衝液で調製したマッシュルーム由来チロシナーゼ溶液７０μｌ、ＤＭＳＯに溶解した各濃度のサンプル２μｌを入れ、よく混合した後、２５℃で１０分間インキュベートした。【００７９】
１０ｍＭ Ｌ−ＤＯＰＡ溶液７０μｌを素早く添加し、混合した後、４７５ｎｍの吸光度の変化を２０秒ごとに２分間測定した。反応は２５℃で行った。【００８０】
吸光度の単位時間あたりの変化量（傾き）を初速度とし、以下の式でチロシナーゼ活性阻害率を算出した。【００８１】
阻害率（％）＝｛１−（初速度サンプル／初速度コントロール）｝×１００
チロシナーゼ活性を５０％阻害するときの濃度を求め、それをＩＣ５０とした。各々のサンプルのＩＣ５０を表８に示す。
【表８】
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【００８２】
アントシアニジン類化合物であるシアニジン及びペラルゴニジンについては、配糖体としても遊離体（塩化物塩）としてもチロシナーゼ活性阻害作用が確認された。また他のアントシアニジン類化合物であるデルフィニジン、ペオニジン及びマルビジンについても遊離体（塩化物塩）としてチロシナーゼ活性阻害作用が確認され、特にペオニジン及びマルビジンについてはその作用が強力であることが示された。【００８３】
またシアニジン配糖体のうち、アセロラに由来するシアニジン−３−ラムノシド（同３３μＭ）は、黒豆等に含まれることが知られているシアニジン−３−グルコシド（ＩＣ５０＝８４μＭ）と比較してより強力なチロシナーゼ活性阻害剤であることも明らかとなった。【００８４】
ケルセチンは遊離体として強力なチロシナーゼ活性阻害作用（ＩＣ５０＝３．０μＭ）が認められたものの、配糖体としてはチロシナーゼ活性阻害作用が認められなかった。この点でアントシアニジン類化合物とは対照的であった。【００８５】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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