(57)【要約】  ストレスに対処可能な抗ストレス物資を効率よくスクリーニングすることを目的として、ラット等の実験動物に、Ｌ−トリプトファンを投与しその後２４時間に排泄された尿総量中のＭＨＰＧ／ＮＡ排泄比を測定する。次いで、被験物質とＬ−トリプトファンを同時投与しその後２４時間に排泄された尿総量中のＭＨＰＧ／ＮＡ比を測定し、両者の変化を見て、被験物質の抗ストレス作用を調べる。この方法で効果ありとされた物質（例えば本願におけるＢＥ）は、中枢で生じた内因性ＢＥとの相乗的作用で生体内ホメオスタシス機構、特に神経−免疫系（Ｔ細胞活性亢進）の調節に作用させるものであり、効果が高い抗ストレス作用剤を迅速かつ確実にスクリーニングできるものと考えられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−トリプトファンを投与することにより慢性ストレス状態を作り出す実験モデル動物の作製方法。
【請求項２】
前記実験モデル動物は、ラットである請求項１の実験モデル動物の作製方法。
【請求項３】
Ｌ−トリプトファンを投与することにより慢性ストレス状態にした実験モデル動物に被験物質を投与し、その後に排泄された尿中ＭＨＰＧ／ＮＡ比を指標としてその改善の有無を測定する抗ストレス物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
請求項３記載のスクリーニング方法で得られた抗ストレス物質。
【請求項５】
β−エンドルフィンである請求項４に記載の抗ストレス物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗ストレス物質、特に慢性的なストレスを改善するための薬剤、及び当該薬剤となりうる化合物の効率的なスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年における社会的問題の一つとして、ストレスによる精神的、肉体的影響が挙げられる。ストレスとは、社会一般には何らかの原因によって生じた状態を意味することが多いが、厳密な意味においては、この状態を意味するのではなく、１９７６年にセリエが提唱した「外界からのあらゆる要求に対する生体の非特異的な反応」を言う。すなわち、生理的ストレス因子（生理的ストレッサー）、例えば、温度や光などの物理的ストレッサー、有害化学物質や金属イオンなどの化学的ストレッサー、飢餓、炎症、感染などの複合ストレッサーや、心理的ストレッサー、例えば、家族の病気・死亡、離婚などの生活上のストレッサー、人間関係などの職業上のストレッサー、戦争や災害などその他の種々のストレッサーによって引き起こされ、その結果、体内に生じた重要な生物学的変化（ストレス）を言うのであって、この生物学的な変化が症候（一般適応症候群）となって現れると言われている。そして、本願においては、これらのストレスを抑制する化合物を抗ストレス物質と称する。【０００３】
近年、いわゆるストレスに対して種々の事柄が明らかにされており、一定レベル以上の運動負荷によってストレス状態に置かれた生体では、視床下部−下垂体−副腎皮質系による非特異的反応が惹起され、ＡＣＴＨやコルチコステロンなどのストレス抵抗ホルモンが分泌されると言われている（非特許文献１参照）。また、運動やスポーツにはいわゆるストレス解消効果が期待されており、実際に身体的ストレス状態や精神的ストレス状態を鎮静化させる効果が認められている。そして、このときに血中に増加するβ−エンドルフィン（「ＢＥ」と称する）と呼ばれる内因性麻薬様物質が運動のリラクセーション効果に影響を与えるとも言われている（非特許文献２参照）。【０００４】
ところが、先に上げた非特許文献１において、トレッドミル上を走行させることによりラットにストレスを負荷した後、視床下部から分泌されるＢＥを測定したところ、長期間にわたって同様の運動を繰り返すほど著しくＢＥ量が増加することが見出されたが、血漿コルチコステロン濃度の上昇が必ずしも伴わないことから、結果的にはＢＥとストレスとの関係はないと結論づけられている。つまり、運動やスポーツは視床下部−下垂体−副腎皮質系による非特異的反応と関係なく中枢内におけるＢＥ濃度を上昇させ、ストレス時の各種代謝亢進やストレス性疲労の遅延や軽減と関係していることを推測させるにすぎない。【０００５】
ＢＥなどのオピオイド系物質は脳−血液関門を通過できないことより、中枢性のＢＥと末梢系のＢＥとではその役割が異なっていることを否定できない。中枢においては、前記非特許文献１によれば、長期間の繰り返し運動を中止した後に視床下部のＢＥが増加することより、情動（例えば倦怠感）の発現に何らかの関係があることが示唆されている。一方、末梢において血漿中ＢＥも増加し、膵臓からグルカゴンを上昇させて、糖代謝に関係する内分泌系への影響がある点についても示唆されているが（非特許文献１参照）、これまでに末梢系におけるＢＥ投与と免疫系の回復を介在させたストレス解消との関連は明らかにされていない。【０００６】
このようにストレスに関し、生体内ＢＥの出現との関係については種々の研究が進められているが、現時点ではストレッサーとストレスとの関係が科学的に解明されているとは言い切れず、このようなストレッサー、特に慢性的なストレスに対する防御物質として、何が有効なのか推測の域を出ず全く手探りの状況である。【０００７】
一方、本願発明者は、ラットをトレッドミル上で走行させた上で、トリプトファンの脳内への取り込みと中枢性神経の疲労との関連を調べていたところ、トレッドミル上の走行がトリプトファンの脳内への取り込みを促進し、トリプトファンが中枢性神経の疲労原因物質であることを突き止め、この取り込みを抑制する物質（中枢性疲労回復または予防剤）を探索すべく、トレッドミル上の走行を利用した中枢性神経の疲労回復（予防）剤をスクリーニングする方法を考案している（特許文献１参照）。
【特許文献１】国際公開公報  ＷＯ０２／３４２５７
【非特許文献１】朝比奈  茂ら、体力科学 52(2003), p.159-166
【非特許文献２】見正  富美子ら、体力科学 45(1996), p.519-526
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このような状況下において、本願発明者はトレッドミル上の走行が慢性的なストレスをラットに負荷していることに着目し、トリプトファンの投与によっても同様なストレス状態を作り出せることを発見した。そして、こうして得られたストレス状態のラットを用いて種々の代謝物質の測定を行ったところ、尿中におけるノルアドレナリン（ＮＡ）とその代謝物質の主要なもののひとつである3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol（ＭＨＰＧ）の排泄量比がストレス状態と正常な状態とで異なり、ＢＥの投与によってこの比が正常状態に戻ることを見出し、本願発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の実験モデル動物の作製方法はＬ−トリプトファンを投与することにより慢性ストレス状態を作り出す方法であって、当該実験モデル動物として、例えばラットを用いることができる。【００１０】
また、本発明の抗ストレス物質のスクリーニング方法は、Ｌ−トリプトファンを投与することにより慢性ストレス状態にした実験モデル動物に被験物質を投与し、その後に排泄される尿中ＭＨＰＧ／ＮＡ比を指標としてその改善の有無を調べる方法である。【００１１】
そして、本発明の抗ストレス物質は、上記本発明のスクリーニング方法で得られた抗ストレス物質であって、例えばβ−エンドルフィンを抗ストレス物質として利用することができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ストレスに対処可能な抗ストレス物資を効率よくスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】慢性的情動ストレスとトリプトファン情報の入力に対する神経−免疫系応答とβ−エンドルフィンによる修飾における生理学的な関連を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
ストレスには、快ストレス（eustress:健康にとって有益になるようなストレス）と、不快ストレス（distress:生体にとって有害となるようなストレス）とがあると言われているが、本発明においては、主として後者としてのストレスを意味するが、必ずしもそれに限られるものではない。【００１５】
本発明のストレス状態である実験モデル動物の作製方法は、Ｌ−トリプトファンを投与することをその内容とするものである。モデルにできる動物は、広く一般に実験動物として用いられる動物、例えばラット、マウス、ウサギ等であるが、これらに限定されるものではない。また、ヒトを対象とすることもできる。投与の方法も、静脈内投与もしくは腹腔内投与の方法いずれであってもよく、ヒトや犬等をモデルにする場合にあっては、もちろん飲用（服用）による方法も行い得る。もちろん、中枢への投与も考えられるが、中枢への投与は実験的にも非常に困難な方法であり、前記静脈内への投与や飲用による方法は中枢内への投与に比べると動物に対して物理的な負荷等を与えることなくストレス状態を作り出せる点で非常に有用な方法であると言える。Ｌ−トリプトファンの投与量は対象動物の体重や対象動物等によって適宜変更できるものであるが、ラットの場合には５０ｍｇ／体重ｋｇ以上、おおよそ１００ｍｇ／体重ｋｇもあれば十分である。【００１６】
本発明の抗ストレス物質のスクリーニング方法においては、上記のようにしてＬ−トリプトファンが投与された実験動物が用いられる。すなわち、Ｌ−トリプトファンの投与により慢性ストレス状態を作り出した上で、抗ストレス物質となる被験物質を投与して、抗ストレス効果を測定すればよい。抗ストレス効果の測定は、Ｌ−トリプトファンの投与後一定時間内に排出される尿中の3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol（ＭＨＰＧ）とノルアドレナリン（ＮＡ）の総量の比を比較することにより行われる。両者の量は、ＨＰＬＣなど適当な定量方法などを用いて測定すればよい。また、集める尿は、Ｌ−トリプトファンの代謝等を考慮すれば通常投与後２４時間で十分であるが、実験条件によって適宜変更しても差し支えない。こうして被験物質の非投与時と投与時におけるＭＨＰＧ／ＮＡ比を比較することによって、被験物質の効果を知ることができる。なお、Ｌ−トリプトファンを投与した際にＭＨＰＧ／ＮＡ比が上昇する場合が見られるが、この場合は効果の判定から除外される。また、被験物質の投与時期は、先に投与したＬ−トリプトファンによる影響を除くため、先のＬ−トリプトファンの投薬の後十分なウォッシュアウト時間、好ましくは１週間程度の期間を置くのがよい。【００１７】
被験物質の投与は、Ｌ−トリプトファンの投与と同時あるいはＬ−トリプトファンの投与からしばらく時間が経ってからの投与いずれでもよいが、好ましくはＬ−トリプトファンの投与と同時である。投与用法も末梢におけるものであればいずれの方法でもよく、Ｌ−トリプトファンの投与と同じく、例えば静脈内投与や腹腔内投与の方法が挙げられる。また、ヒトや犬等の場合には、飲用（服用）することにしても差し支えない。【００１８】
このように、Ｌ−トリプトファンの投与により作り出された慢性的ストレス状態の動物に被験物質を投与すれば、極めて簡単に抗ストレス物質、特に慢性的なストレス状態を改善可能な薬物を見つけ出すことができる。【００１９】
以下、本発明について下記実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されないのは言うまでもない。
【実施例１】
【００２０】
一群６匹のラットにＬ−トリプトファンを投与することにより慢性ストレス状態にした。そして、β−エンドルフィンを投与しない場合と投与した場合の双方において、Ｌ−トリプトファン投与後２４時間に排泄した尿中の3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol（ＭＨＰＧ）及びノルアドレナリン（ＮＡ）を下記条件によるＨＰＬＣ（Yamamoto et. al., Brain Research Bulletin 43(1), 1997, P43〜46）によって測定することにより、β−エンドルフィンの抗ストレス効果について調べた。【００２１】
<ＭＨＰＧ及びＮＡの測定条件>
カラム：ＴＳＫゲル ＯＤＳ−８０ＴＭ（TOSOH JAPAN）  Ｃ−１８  逆相系  ５μｍ，４．６ｍｍ×１５０ｍｍ
温度：  ２５℃
溶離液：リン酸系バッファー（ｐＨ４．１３）
検出器：ＥＣＤ（０．７Ｖ）【００２２】
被験ラットには、室温２２℃、７：００〜１９：００（明時）の明暗サイクル下で、飼料及び水を自由摂取にして飼育した２００〜２６０ｇのウィスター系の雌ラット（日本ＳＬＣ）を用いた。【００２３】
〔実験１〕
６３ｍｇ／ｋｇ及び１２５ｍｇ／ｋｇ当たりのＬ−トリプトファンをラットに投与して、疲労に至るまでのランニング時間を測定した。その結果を表１に示す。この結果、トリプトファンを６３ｍｇ／ｋｇ当たり投与することにより、ランニング時間の減少が見られ、慢性ストレス状態を作り出せることが確認された。
【表１】
2006080087.tif 000002
【００２４】
〔実験２〕
次に、ＢＥによる慢性ストレスへの効果を確かめるべく実験を行った。まず実験の開始前２４時間の排尿を集め、予め正常状態（対照）におけるＭＨＰＧ／ＮＡの比を測定した。そして６３ｍｇ／ｋｇ当たりのＬ−トリプトファンを投与することによりラットに慢性ストレス状態を作り出し、Ｌ−トリプトファン投与後２４時間に排泄された尿を集め、全排泄尿中のＭＨＰＧ／ＮＡの比を測定した。次に、１週間のウォッシュアウトの経過後、再び同量のＬ−トリプトファン及びＢＥ５０ｎｇ／匹を同時に投与し、その後２４時間に排泄された全尿中のＭＨＰＧ／ＮＡの比を測定した（慢性ストレス状態＋ＢＥ）。その結果を表２に示す。慢性ストレス状態におけるＭＨＰＧ／ＮＡ比は、正常状態に比べて６匹中４匹（＃１，２，４，５）が低下するのに対し、ＢＥを投与した場合には、ＭＨＰＧ／ＮＡ比がＢＥ非投与時に比べて上昇し、正常状態の比にほぼ戻ったラットが６匹中２匹現れた（＃４，５：３３％が回復）。
【表２】
2006080087.tif 000003
【００２５】
〔実験３〕
ＢＥの投与量を１００ｎｇ／匹にして、実験２と同様な実験を行った。その結果を表３に示す。この結果、慢性ストレス状態におけるＭＨＰＧ／ＮＡ比は、正常状態に比べて６匹中４匹（＃２，３，５，６）が低下するのに対し、ＢＥを投与した場合には（ストレス状態＋ＢＥ）、ＭＨＰＧ／ＮＡ比がβ−ストレス非投与時に比べて上昇し、非投与時に低下した全てのラットが、１匹の例外を除いて正常状態にほぼ戻ることができた。なお、この例外であるラット（＃５）の正常状態の値が他のラットに比べて大きすぎることから、何らかの要因で正常状態における値が高くなったにすぎず、ＢＥの投与により正常状態に戻っているものと考えられる。
【表３】
2006080087.tif 000004
【００２６】
以上の実験２、３から、慢性ストレス状態にすることによりＭＨＰＧ／ＮＡ比の低下が７０％のラット（８匹／１２匹中）で観察できた。そして、ＢＥ投与量の増加に伴い、ＭＨＰＧ／ＮＡ比が正常状態に戻るラット数が増加し、ストレスの負荷で血中に増加するＢＥ濃度（約５ｎｇ／ｍｌ：測定データ示さず）の２倍量（個体中）程度を腹腔内に注入すれば、７０％のラット（６匹／８匹中）で速やかにＭＨＰＧ／ＮＡ比が対照レベルにまで復帰している。このように、ＢＥの投与により交感神経系の活動が回復し、ＢＥが免疫系の回復に連動して慢性ストレス状態の改善に寄与していることが裏付けられた。【００２７】
図１に、慢性的情動ストレスとトリプトファン情報の入力に対する神経−免疫系応答とβ−エンドルフィンによる修飾における生理学的な関連を示した。繰り返されたストレスや持続的なストレスにより生じた慢性的なストレスは、脳内の広範囲でトリプトファン濃度の上昇を招き、情動発現の中枢である扁桃核のような大脳辺縁系−視床下部（視床下部前核）に至る回路やこの領域に存在するＢＥの発動を促進すると考えられる。そして、中枢で産生されたＢＥは神経性、例えば大脳辺縁系領域のストレス閾値を上げてストレス発現を遅らせ、その結果ストレス感の軽減として発現される可能性もある。また、慢性ストレス形成の初期には、下垂体前葉から副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）が分泌されることによって、コルチコステロンの上昇や交感神経系の亢進（図中Ａ：ノルアドレナリンの上昇＝ＭＨＰＧ／ＮＡ比の低下）が見られるが、このことは脾臓産生Ｔ細胞の減少が見られる一方で、下垂体や副腎髄質から由来した末梢ＢＥの産生がその修復に努める可能性があることを示している。やがて、慢性ストレスの回復期には、交感神経系機能亢進状態が減少（図中Ｂ：ノルアドレナリンの減少＝ＭＨＰＧ／ＮＡ比の上昇）し、免疫活性が高まる（Ｂ細胞や抗体の上昇）方へ転じるものと推測される。【００２８】
このように、ストレスが引き金（警告反応期）となって、内分泌−神経−免疫系活性が動的に作動（抵抗期）し、ストレス感（被憊期）などの情動形成を発現するが、同時に修復機構の作動（修復期）によってホメオスタシス機構が維持されるものと考えられる。すなわち、この方法で効果ありとされた被験物質（例えば本願におけるＢＥ）は、中枢で生じた内因性ＢＥとの相乗的作用で生体内ホメオスタシス機構、特に神経−免疫系（Ｔ細胞活性亢進）の調節に作用し、被験物質の投与によって慢性的なストレスが解消されると、それにより低下したＭＨＰＧ／ＮＡ比が上昇することになるのであって、本発明はこの機構に基づいてなされたものである。【００２９】
したがって、トリプトファンの投与により慢性ストレス状態にしたラットを用い、その後尿中に排泄されるＭＨＰＧ／ＮＡ比を測定することによって、慢性ストレス状態の改善度を知ることができる。その結果、慢性ストレス解消のための抗ストレス作用剤を効率よくスクリーニングすることができる。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明によると、効率よく抗ストレス物質、特に慢性的なストレスに対する抗ストレス物質をスクリーニングすることができ、近年、重要視されている各種ストレス症状の改善に大きく寄与できる。
【図１】
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【国際調査報告】
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