(57)【要約】本発明は、培養細胞の画像を撮影するための手段と、撮影された細胞の画像を、前記培養細胞の培養経過時間と関連するパラメータを指標としてテクスチャ解析する手段とを備えた培養細胞監視システムを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養細胞の画像を撮影するための手段と、撮影された細胞の画像を、前記培養細胞の培養経過時間と関連するパラメータを指標としてテクスチャ解析する手段とを備えた培養細胞監視システム。
【請求項２】
前記培養細胞がヒト由来の細胞である、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記ヒト由来の細胞が再生医療用の細胞である、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
培養細胞の画像を撮影する工程と、撮影された細胞の画像を、前記培養細胞の培養経過時間と関連するパラメータを指標としてテクスチャ解析する工程とを含む培養細胞監視方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養細胞（細胞集団）の状態を経時的にモニタリングすることができる培養細胞監視システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞を所望の目的のために培養するに際しては、その培養状態が正常であるかどうか、例えばコンタミネーション等のトラブルによる異常が無いかどうかを、経時的に（適当な時間間隔で）監視する必要がある。従来、例えば目的以外の細胞が混在していないか、あるいは細胞が所望の分化をしているか等の培養状態の確認は、顕微鏡観察に加え、培養中の細胞を一部サンプリングして破砕等し、生化学的な解析処理を行うことによりなされるのが一般的であった。
しかし、このような監視の仕方では、毎回の培養状態の確認に長い時間を要し、その確認手段も容易とは言えないため、いち早く異常を発見することが困難である。また、サンプル中に病原性の細胞等が混在していた場合は確認作業中に感染する危険性もある。さらに、サンプリング時にコンタミネーション等のトラブルを誘発するおそれも生じる。
そこで、培養細胞を簡易に監視できる方法の開発が望まれていた。
細胞の状態を簡易に判別する方法として、「テクスチャ解析による肉腫分類法」や「テクスチャ解析による色素性母斑のパターン分類法」がすでに公知となっている（村瀬曜子、田中敏幸，テクスチャ解析による肉腫分類法，電子情報通信学会１９９９年総合  大会講演論文集，Ｎｏ．Ｄ−１６−６，（２０００−０３）；Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ  Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｖｕｓ  ｗｉｔｈ  Ｔｅｘｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｔｈｅ  ２６ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＥＥＥ  ＢＭＥＳ）。これらの方法は、いずれも、腫瘍細胞を対象とするものである。そして、公知の３種の腫瘍表面パターン（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｐａｔｔｅｒｎ，ｇｌｏｂｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎ，ｒｅｔｉｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎ）について、その大きさや形の均一性に着目し、これを特定のパラメータとした上で、画像処理の一手法であるテクスチャ解析を使って自動的に分類し、腫瘍の良悪性を鑑別する前段階としての簡易な判別のために利用するものである。また、これらの方法は、撮影された細胞の画像を基にして判別する方法であるため、前述したような確認作業中の感染やコンタミネーション等のおそれは無く、しかも短時間で確認することができる点で優れている。
しかしながら、上記方法は、いずれも、患者サンプルに対して適応され、細胞の種類を判別するための方法であるため、培養細胞の状態を経時的に監視するための方法であるとは言えない。また、対象とする細胞は腫瘍細胞に限定されており、それ以外の種々の細胞についても適用できるものではない。
【発明の開示】
【０００３】
本発明が解決しようとする課題は、目的細胞の経時的な培養状態の確認を、容易にかつ短時間で行うことができ、しかも確認時における感染や培養細胞のコンタミネーション等の生じるおそれが無い、培養細胞監視システムを提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、培養細胞の経時的な監視に、前述した画像処理の手法であるテクスチャ解析を採用し、この解析を培養細胞の培養経過時間と関連するパラメータを指標として行うようにすれば、前述した課題を一挙に解決できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）培養細胞の画像を撮影するための手段と、撮影された細胞の画像を、前記培養細胞の培養経過時間と関連するパラメータを指標としてテクスチャ解析する手段とを備えた培養細胞監視システム。
上記システムにおいては、培養細胞がヒト由来の細胞であってもよく、例えば、再生医療用の細胞であることが好ましい。
（２）培養細胞の画像を撮影する工程と、撮影された細胞の画像を、前記培養細胞の培養経過時間と関連するパラメータを指標としてテクスチャ解析する工程とを含む培養細胞監視方法。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、本発明の培養細胞監視システムの概略図である。
図２は、実施例１中の予備実験１において撮影された写真及び解析結果を示すグラフである。
図３は、実施例１中の予備実験２において撮影された写真及び解析結果を示す図である。
図４は、実施例１中の予備実験３において撮影された写真及び解析結果を示すグラフである。
図５は、実施例１中の予備実験４における結果を示すグラフである。
図６は、実施例１中の予備実験５における結果を示すグラフである。
図７は、実施例１中の予備実験６において撮影された写真及び解析結果を示す図である。
図８は、実施例１中の監視例１における解析結果を示すグラフである。
図９は、実施例２における結果を示す写真及び解析結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明の検出方法について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２００５−６３７０９号明細書の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての先行技術文献、並びに公開公報、特許公報及びその他の特許文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
１．本発明の概要
本発明は、培養細胞の経時的な監視に、画像処理の手法であるテクスチャ解析における種々のパラメータを利用することを特徴とする。テクスチャ解析による監視においては、培養細胞に対する作業としてはその画像を撮影することで十分であるため、培養状態の毎回の確認が容易にかつ短時間でなされる。その結果、例えば多数の培養細胞系の一括監視が必要な場合であっても、従来に比べ格段に簡便となる。しかも、サンプリング等のように培養細胞に直接接触したりすることもないため、感染やコンタミネーション等のおそれも生じ得ない。
一般に、テクスチャ解析には、同時生起行列、差分統計量、濃度ヒストグラムを用いて画像解析を行う手法があることが知られており、それぞれ、空間濃度レベル依存法（ＳＧＬＤＭ）、濃度レベル差分法（ＧＬＤＭ）、濃度ヒストグラム法（ＧＬＨＭ）と称されている。これらは、その手法ごとに、テクスチャの特徴量となる所定のパラメータについて計算される。
本発明においては、さらに上記テクスチャ解析が、培養細胞の培養経過時間と関連するパラメータを指標として行われる点が重要となる。このようなパラメータとしては、上述したテクスチャの特徴量となる所定のパラメータの中から、最適なものが適宜選択され採用され得る。培養経過時間と関連するパラメータを指標とすることにより、培養細胞の状態が正常であるか否かについて、実際の経過時間に応じた妥当な判断及び確認が容易になされる。また、本発明においては、上記指標となるパラメータは、一般に、培養細胞の種類ごとに特有のもの（１種又は２種以上）が採用され得るため、監視可能な細胞は、特定の種類には限定されず、この点で本発明の有用性は非常に高いと言える。
さらに本発明は、特に再生医療の分野において、極めて高い有用性を示すものである。再生医療分野においては、患者数に相当する数十から数千といった多数の培養細胞系を一度に管理する必要性が高まることは必至であると考えられ、また、通常の細胞培養に比べ、細胞数及び形態の変化、増殖及び分化の状態、不良細胞の有無等の多くのファクターについて同時に且つ一定の信頼性をもって管理する必要性が高い。こういった事情に対し、本発明は、これらの必要性を一挙に充足し得るものであると言え、極めて有用性が高く、顕著な効果を示すものである。
２．培養細胞監視システム
本発明の培養細胞監視システムは、前述のとおり、培養細胞の画像を撮影するための手段（以下、「撮影手段」という）と、撮影された細胞の画像をテクスチャ解析する手段（以下、「解析手段」という）とを備え、前記テクスチャ解析が前記培養細胞の培養経過時間と関連するパラメータを指標として行われるものであることを特徴とするシステムである。
（１）培養細胞
本発明の培養細胞監視システムにおいて、監視対象となる培養細胞は、限定はされず、例えば、動物細胞、植物細胞、及び昆虫細胞等が挙げられるが、なかでも動物細胞が本発明における監視対象として好ましい。
動物細胞としては、限定はされないが、例えば、ヒト由来の細胞、サル由来の細胞（サル腎由来細胞（Ｃｏｓ細胞（Ｃｏｓ１細胞））等）、マウス由来の細胞（マウス血管内皮細胞（Ｐｒｏ５細胞）等）、及びブタ由来の細胞等が挙げられる。
ヒト由来の細胞としては、限定はされず、例えば、各種組織細胞（口腔粘膜細胞、脂肪細胞、及び軟骨細胞等）、並びに腫瘍細胞（良性及び悪性の癌細胞（ヒト消化器癌由来細胞（ＨＣＴ１５細胞）等）を含む）等が挙げられるが、本発明の効果が十分に発揮され得る点で、再生医療用の細胞が好適である。なお、ヒト以外に由来する動物細胞としても、同様の理由で、再生医療用の細胞を好ましく用いることができる。
再生医療用の細胞としては、例えば、各種多能性幹細胞（具体的には、全能性幹細胞及び組織幹細胞）等が好ましく挙げられるが、限定はされない。
全能性幹細胞とは、全ての体細胞に分化し得る細胞であり、例えば、ＥＳ細胞（胚幹細胞・胚性幹細胞）及びＥＧ細胞等が挙げられるが、これらに限定はされない。
組織幹細胞とは、特定の臓器や組織を構成する複数の細胞種に分化し得る細胞であり、例えば、神経幹細胞、造血幹細胞（骨髄細胞等）、及び脂肪細胞等が挙げられるが、これらに限定はされない。
監視対象となる培養細胞は、その種類に応じ、適宜、公知の培養容器内で培養されているものであればよく限定はされないが、当該容器のままで後述する撮影手段に供されるためには透明（好ましくは無色透明）であることが好ましい。培養容器としては、例えば、プラスチック製のシャーレ、プラスチック製のフラスコ、ガラス製のシャーレ等が挙げられる。また、細胞を含む上記培養容器は、一般には、温度調節等がなされた公知のインキュベーター（培養器）内に置かれ、培養される。
（２）撮影手段
培養細胞の画像を撮影するための手段としては、限定はされないが、少なくとも、培養細胞を拡大視できる機器（機器（ａ））、培養細胞の静止画を撮影できる機器（機器（ｂ））、及び、撮影された静止画に基づく画像データ（電子データ）であって後述する解析手段に用い得るものを構築できる機器（機器（ｃ））が挙げられる。なお、これら機器（機器（ａ）〜（ｃ））は、すべて又はいずれか２つが一体化されている機器（実質的に各機器の機能を併せ持った機器）であってもよいし、少なくとも２つが別々である機器であってもよく、限定はされない。
上記機器（ａ）としては、限定はされないが、例えば、倒立顕微鏡、光学顕微鏡、レーザー顕微鏡等の各種顕微鏡などが挙げられる。
上記機器（ｂ）としては、限定はされないが、例えば、各種カメラ等が挙げられる。
上記機器（ｃ）としては、限定はされないが、例えば、スキャナ等が挙げられる。
また、上記機器（ｂ）及び（ｃ）の機能を併せ持った機器としては、限定はされないが、例えば、デジタルカメラ（カメラ機能付きデジタルビデオも含む）等が挙げられる。
撮影手段としては、さらに他の機器等を備えていてもよく、例えば、自動焦点装置、自動露光時間測定装置等が挙げられる。
撮影手段（その一部又は全部）は、インキュベーター（培養器）の中に配置されても外に配置されてもよく、限定はされない。また、撮影手段（その一部又は全部、特に上記機器（ａ））は、培養容器の数（サンプル数）に併せて複数設けられていてもよいし、１つの撮影手段を移動させて複数の培養容器を監視できるようにされていてもよく、限定はされない。
撮影手段（特に機器（ｂ））による培養細胞の撮影間隔は、監視対象とする培養細胞の種類により適宜設定すればよく、限定はされないが、例えば、培養開始の初日から１日間隔であってもよく、１時間間隔であってもよく、１分間隔であってもよい。
（３）解析手段
撮影された培養細胞の画像をテクスチャ解析する手段としては、限定はされないが、例えば、撮影手段により得られた画像データについてテクスチャ解析することができるコンピュータ等が挙げられる。テクスチャ解析には、既存のソフトウェアが使用可能であり、例えば、ＰｏｐＩｍａｇｉｎｇ（デジタル・ビーイング・キッズ社製）等が例示できる。
なお、当該コンピュータは、例えば、デジタルカメラ等の電子機器（撮影手段）の撮影条件や位置等の制御など、他の手段の制御も併せて行うものであってもよい。デジタルカメラの制御には、既存のソフトウェアが使用可能であり、例えば、Ａｑｕａｃｏｓｍｏｓ（浜松フォトニクス社製）、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ（ＮＩＨ製）、Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）等が例示できる。
テクスチャ解析には、前述したように、３つの手法（空間濃度レベル依存法、濃度レベル差分法、濃度ヒストグラム法）がある。これら方法について以下に詳述する。
空間濃度レベル依存法とは、一般には、画像における濃度ｉの画素からθ方向に距離ｄだけ離れた画素の濃度がｊである確率Ｐ（ｉ，ｊ）（ｉ，ｊ＝０，１，２，・・・，ｎ−１）を要素とする同時生起行列を求め、その行列からテクスチャの特徴を求める方法である。当該方法では、テクスチャの特徴量として、「エネルギー、エントロピー、相関、局所一様性、慣性」という５つのパラメータについて計算される。各パラメータの計算方法（計算式）については、公知の方法が採用される。
濃度レベル差分法とは、一般には、ある画素からθ方向に距離ｄだけ離れた画素の濃度差がｋである確率Ｐ（ｋ）（ｋ＝０，１，２，・・・，ｎ−１）を要素とする行列を求め、その行列からテクスチャの特徴を求める方法である。当該方法では、テクスチャの特徴量として、「コントラスト、角度別２次モーメント、エントロピー、平均、逆差分モーメント」という５つのパラメータについて計算される。各パラメータの計算方法（計算式）については、公知の方法が採用される。なお、エントロピーの計算におけるｌｏｇは自然対数（底＝ｅ）が用いられる。
濃度ヒストグラム法とは、一般には、全体が１になるように正規化された濃度ヒストグラムＰ（ｉ）からテクスチャの特徴を求める方法である。当該方法では、テクスチャの特徴量として、「平均、分散、歪度、尖度」という４つのパラメータについて計算される。なお、歪度は、濃度ヒストグラムの対称性形状特徴、すなわち濃度ヒストグラムの形状が対称な形からどれだけずれているかを表すパラメータであり、尖度は、濃度ヒストグラムの分布形状特徴、すなわち濃度ヒストグラムの分布がどれだけ平均値の回りに集中しているかを表すパラメータである。各パラメータの計算方法（計算式）については、公知の方法が採用される。
テクスチャ解析では、撮影手段により得られた画像データは、均等な面積に細分化され（桝目状に区切られ）、各桝目についてそれぞれ前述したようなパラメータ値が測定されるのが一般的であるが、これに限定はされず、画像データ全体について測定されてもよい。
本発明におけるテクスチャ解析では、培養細胞の経時的な監視に有効なパラメータを指標として行われることが必要であり、具体的には、前述のとおり、培養細胞の培養経過時間と関連するパラメータを指標として行われることが重要である。ここで、「培養細胞の培養経過時間と関連するパラメータを指標として行われること」とは、一般には、テクスチャ解析におけるパラメータの測定が初めから上記指標となり得るパラメータのみについて行われること（この場合、指標となり得るパラメータを予め調べておく必要がある）を意味するが、これに限定はされず、例えば、種々のパラメータについて経時的に測定を行いつつ、その測定結果から上記指標となり得るパラメータを適宜選定することをも含む意味である。
本発明において、培養細胞の培養経過時間と関連するパラメータとは、培養経過時間（Ｘ軸）に対し、経時的に測定されたパラメータ値（Ｙ軸）をプロットした場合に、実質的な相関関係が増加及び減少のいずれかのみの傾向で認められるものであればよく、限定はされないが、例えば、培養経過時間（Ｘ軸）に対し、測定値（Ｙ軸）が実質的に一定の割合で増加又は減少傾向（比例関係）を示すパラメータが好ましく挙げられる。この場合（例えば比例関係を示す場合）は、培養経過時間に対し、測定値の増加及び減少が交互に認められるパラメータ、増加又は減少傾向が一定でないパラメータ、実質的に変動が認められないパラメータ等は、培養細胞の培養経過時間と関連するパラメータには含まれないこととなる。なお、当該パラメータは、一般には、培養細胞の種類により異なる特有のものであるため、特定の種類に限定はされない。また、１種であってもよいし２種以上であってもよく限定はされない。
（４）その他の手段
本発明の培養細胞監視システムは、上記撮影手段及び解析手段以外に、その他の手段を備えていてもよく、限定はされない。例えば、培養状態の異常など何らかの異変があった場合に知らせることができる手段等が挙げられる。これらは、１種のみ備えていてもよいし、２種以上併せて備えていてもよく、限定はされない。
異変を知らせる手段としては、限定はされないが、例えば、警報装置等の機器が挙げられ、具体的には、前記解析手段に用いるコンピュータから信号が送られ作動するものが好ましい。
（５）監視システムの使用態様
本発明の培養細胞監視システムにおける各手段の配置等については、図１に示される概略図が参照できる。
本発明の培養細胞監視システムの使用態様としては、限定はされないが、例えば下記（ｉ）、（ｉｉ）の態様が好ましく挙げられる。
（ｉ）テクスチャ解析の指標となるパラメータを予め選定しておく態様
この使用態様では、本発明のシステムの使用に先立ち、予め、対象とする培養細胞の監視に有効なパラメータを選定するための予備実験を行う。当該予備実験では、対象とする細胞を正常な培養状態（実際に実現しようとする所望の培養経過状態）で培養し、各種パラメータの値を経時的に測定する。そして、培養経過時間（Ｘ軸）に対し、パラメータごとに測定値（Ｙ軸）をプロットしてグラフ（折線グラフ）を作成した上で、どのパラメータが、前述した「培養細胞の培養経過時間と関連するパラメータ」として適当か判断し、当該細胞に特有の１種又は２種以上のパラメータを選定する。
その後、監視対象とする細胞の培養（１サンプル又は２サンプル以上）を開始し、本発明のシステムを使用して、サンプルごとに、上記選定した各パラメータの値を培養経過に沿って（経時的に）測定する。そして測定値について、上記予備実験と同様にプロットしたときに、少なくとも１種のパラメータに関して、予備実験段階で作成したグラフから有意に外れる値を示したサンプルについては、正常な培養状態から逸脱したもの（所望の培養経過状態が得られなかったもの）と判断することができる。
（ｉｉ）テクスチャ解析の指標となるパラメータを当該解析を行いつつ選定する態様
この使用態様では、本発明のシステムを使用しながら、対象とする培養細胞の監視に有効なパラメータを選定するので、上記（ｉ）の態様のように、予備的な実験を行う必要が無い点で時間的及びコスト的な面等から有用性が高い。また、新たなパラメータの研究開発にも使用できる。なお、この態様では、監視対象とする細胞のサンプル数は、少なくとも３以上であることが必要であり、信頼性を高めるためには、１０以上であることが好ましく、さらに好ましくは２０以上であり、特に好ましくは１００以上である。
監視対象とする細胞の培養（３サンプル以上）を、所望の培養経過状態となる条件で開始し、本発明のシステムを使用して、各サンプルにおける各種パラメータの測定を経時的に行う。その一方で、当該培養の経過とともに、培養経過時間（Ｘ軸）に対し、パラメータごとに測定値（Ｙ軸）をプロットしてグラフ（折線グラフ）を作成する作業も並行して行う。経時的測定の度に、各サンプル間で上記グラフを比較した結果、培養経過時間に対する測定値の挙動が、過半数（例えば１／２以上、好ましくは２／３以上、より好ましくは１９／２０以上、さらに好ましくは９９／１００以上）のサンプルにおいて共通するパラメータが認められれば、前述した「培養細胞の培養経過時間と関連するパラメータ」として適当な、当該細胞に特有の１種又は２種以上のパラメータを選定することができる。選定後も同様に各種パラメータの測定及びグラフ作成を行い（選定したパラメータに限定してもよい）、選定したパラメータのうち、少なくとも１種について、上記過半数のサンプル中の他のサンプルのグラフから有意に外れる値を示したサンプルについては、正常な培養状態から逸脱したもの（所望の培養経過状態が得られなかったもの）と判断することができる。
（６）撮影条件の影響
培養細胞の種類により至適撮影条件は異なるのが一般であるが、撮影条件により解析結果が大きく変わるようでは、多種の細胞の自動解析が困難になる。よって、本発明の培養細胞監視システムを使用する場合は、予め、撮影条件により影響されないか又は影響が少ないパラメータを選択しておくことが好ましい。検討しておくべき撮影条件としては、限定はされないが、例えば、露光時間、焦点等が挙げられる。
３．培養細胞監視方法
本発明の培養細胞監視方法は、前述のとおり、培養細胞の画像を撮影する工程（以下、「撮影工程」という）と、撮影された細胞の画像をテクスチャ解析する工程（以下、「解析工程」という）とを含み、前記テクスチャ解析を前記培養細胞の培養経過時間と関連するパラメータを指標として行うことを特徴とする方法である。
（１）培養細胞
本発明の培養細胞監視方法において監視対象となる培養細胞については、限定はされないが、前記本発明のシステムと同様の説明が好ましく適用できる。
（２）撮影工程
培養細胞の画像を撮影する工程は、限定はされないが、少なくとも、培養細胞を拡大視できる機器（機器（ａ））、培養細胞の静止画を撮影できる機器（機器（ｂ））、及び、撮影された静止画に基づく画像データ（電子データ）であって後述する解析手段に用い得るものを構築できる機器（機器（ｃ））を用いて実施できる。なお、これら機器（機器（ａ）〜（ｃ））は、すべて又はいずれか２つが一体化されている機器（実質的に各機器の機能を併せ持った機器）であってもよいし、少なくとも２つが別々である機器であってもよく、限定はされない。上記機器の例示、及び、培養細胞の撮影間隔については、前記本発明のシステムと同様の説明が好ましく適用できる。
（３）解析工程
撮影された培養細胞の画像をテクスチャ解析する工程は、限定はされないが、例えば、撮影工程により得られた画像データについてテクスチャ解析することができる（テクスチャ解析用ソフトウェアが組込まれた）コンピュータ等を用いて実施できる。
テクスチャ解析には、前述したように、３つの手法（空間濃度レベル依存法、濃度レベル差分法、濃度ヒストグラム法）がある。これら手法の詳細、及び、画像データの細分化に関する説明は、前記本発明のシステムと同様の記載が好ましく適用できる。また、本発明の方法の特徴である、「テクスチャ解析を、培養細胞の経時的な監視に有効なパラメータ（具体的には、培養細胞の培養経過時間と関連するパラメータ）を指標として行うこと」、及び、当該パラメータに関する説明についても、前記本発明のシステムと同様の記載が好ましく適用できる。
（４）その他の工程
本発明の培養細胞監視方法は、上記撮影工程及び解析工程以外に、その他の工程を含むものであってもよく、限定はされない。
（５）監視方法の使用態様
本発明の培養細胞監視方法の使用態様については、限定はされないが、前記本発明のシステムと同様の例示及び説明が好ましく適用できる。
（６）撮影条件の影響
本発明の培養細胞監視方法を行う場合の撮影条件の影響については、前記本発明のシステムと同様の例示及び説明が好ましく適用できる。
以下に、実施例等を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
テクスチャ解析の指標として有効なパラメータを予め選定しておく実施態様
＜予備実験１：撮影条件による影響＞
テクスチャ解析における各パラメータのうち、撮影条件（露光時間）に影響されないパラメータを選択した。
まず、図１の概略図に示すような培養細胞監視システムを準備した。具体的には、撮影手段としては、倒立顕微鏡（オリンパス社製、製品名：ＩＸ７１）、及び当該顕微鏡による画像を撮影できるように接続されたデジタルカメラ（浜松フォトニクス社製、製品名：ＯＲＣＡ−ＥＲ）を採用し、解析手段としては、当該画像データを解析できるコンピュータ（エプソン社製、製品名：Ｅｎｄｅａｖｏｒ）、及び画像解析ソフト（デジタル・ビーイング・キッズ社製、商品名：ＰｏｐＩｍａｇｉｎｇ）を採用し、上記撮影手段は、必要に応じ、任意に温度設定・調節できる培養器内に配置できるようにした。なお、以下に示す予備実験、監視例、及び実施例においては、特に言及はしないが、すべて上記監視システムを用いて培養及びテクスチャ解析等を実施した。
次に、２４時間培養した培養細胞（Ｐｒｏ５細胞）について、上記監視システムを用い、デジタルカメラの露光時間を２４４ｍｓ（ミリ秒）、３６５ｍｓ、５４７ｍｓ、７３０ｍｓと変えて撮影した画像（図２Ａ）を、それぞれテクスチャ解析した。得られた解析結果（パラメータ値）について、２４４ｍｓでの値を１としたときの各露光時間での値をプロットした。そのグラフを図２Ｂに示した。
上記グラフより、ＧＬＤＭ法でのコントラスト、角度別二次モーメント、エントロピー及び平均、並びにＳＧＬＤＭ法でのエントロピー、相関及び局所一様性というパラメータは、露光時間の違いにより大きな影響を受けないため、培養細胞の状態を評価するのに好適なパラメータであると考えられた。
＜予備実験２：細胞密度の監視＞
培養細胞を撮影した写真を小区域に分割してテクスチャ解析することにより、細胞が培養容器の底面をどの程度覆っているか判断することができる。図３Ａに見るように、写真を等面積の１６区域に分割し、それぞれについて、ＧＬＤＭ法でのコントラストをパラメータとして解析した。その結果、各区域ごとに図３Ｂに示す値が得られた。この値の大きさを基にして、図３Ｃに見るように各区域を濃淡で表した。これにより、テクスチャ解析が培養容器内の細胞密度やそのばらつきの判定に、肉眼と同程度に有効であることが示された。
＜予備実験３：培養トラブルの検出＞
Ｐｒｏ５細胞について、培養中にその培養液から血清を除くことで意図的に培養状態に変化（異常：トラブル）を起こし、その変化をテクスチャ解析により経時的に監視して評価した。
培養中のある時点（この時点を「０時間」とする）で培養液を血清を含まないものに換えた細胞（非対照群）と、終始通常の血清を含む培養液で培養した細胞（対照群）について、ＧＬＤＭ法のコントラストをパラメータとして経時的にテクスチャ解析を行い、パラメータ値をグラフ化して比較した。これにより、無血清培養液に換えたことによる影響を調べた。
その結果、１時間後には、対照群と非対照群とで既にパラメータ値に大きな差が認められた（図４Ａ）。ここで、図４Ｂの写真に見るように、無血清培養液に換えた細胞（非対照群）は、０時間の時点（血清除去前）と１時間の時点とで細胞数には有意な差はなかったが、細胞形態については変化したことが認められた。そのため、この形態変化がテクスチャ解析により検出されたと言える。なお、６時間以降に生じたパラメータ値の差は細胞数の差によるものであると考えられる。
＜予備実験４：培養細胞の監視の指標となる有効なパラメータの選択＞
（１）Ｐｒｏ５細胞
Ｐｒｏ５細胞を播き、翌日から１日毎に写真撮影を行い、ＳＧＬＤＭエントロピー、ＳＧＬＤＭ相関、ＳＧＬＤＭ局所一様性、ＧＬＤＭコントラスト、ＧＬＤＭ角度別二次モーメント、ＧＬＤＭエントロピー、ＧＬＤＭ平均について評価した。その結果（グラフ）を図５Ａに示した。
当該グラフより、培養細胞の培養経過時間と関連するパラメータ（培養状態の監視の指標となるもの）としては、ＳＧＬＤＭエントロピー、ＳＧＬＤＭ局所一様性、ＧＬＤＭコントラスト、ＧＬＤＭ角度別二次モーメント、ＧＬＤＭエントロピー、ＧＬＤＭ平均が選定できる。
（２）ＣＯＳ細胞
ＣＯＳ細胞を播き、翌日から１日毎に写真撮影を行い、ＳＧＬＤＭエントロピー、ＳＧＬＤＭ相関、ＳＧＬＤＭ局所一様性、ＧＬＤＭコントラスト、ＧＬＤＭ角度別二次モーメント、ＧＬＤＭエントロピー、ＧＬＤＭ平均について評価した。その結果（グラフ）を図５Ｂに示した。
当該グラフより、培養細胞の培養経過時間と関連するパラメータ（培養状態の監視の指標となるもの）としては、ＳＧＬＤＭエントロピー、ＳＧＬＤＭ局所一様性、ＧＬＤＭコントラスト、ＧＬＤＭ角度別二次モーメント、ＧＬＤＭエントロピー、ＧＬＤＭ平均が選定できる。
（３）ＨＣＴ１５細胞
ＨＣＴ１５細胞を播き、翌日から１日毎に写真撮影を行い、ＳＧＬＤＭエントロピー、ＳＧＬＤＭ相関、ＳＧＬＤＭ局所一様性、ＧＬＤＭコントラスト、ＧＬＤＭ角度別二次モーメント、ＧＬＤＭエントロピー、ＧＬＤＭ平均について評価した。その結果（グラフ）を図５Ｃに示した。
当該グラフより、培養細胞の培養経過時間と関連するパラメータ（培養状態の監視の指標となるもの）としては、ＳＧＬＤＭエントロピー、ＳＧＬＤＭ局所一様性、ＧＬＤＭコントラスト、ＧＬＤＭ角度別二次モーメント、ＧＬＤＭエントロピー、ＧＬＤＭ平均が選定できる。
＜予備実験５：細胞種の区別＞
予備実験４における結果（培養５日目の値）を基に、Ｐｒｏ５細胞、ＣＯＳ細胞、及びＨＣＴ１５細胞について、ＳＧＬＤＭ法の各パラメータ（エントロピー、局所一様性、ＧＬＤＭ法のコントラスト、角度別二次モーメント、エントロピー及び平均）の値を測定し、Ｐｒｏ５細胞における値を標準値（１とする）として、細胞種ごとの特徴を比較した。その結果を図６に示した。
具体的には、いずれのパラメータについても、Ｐｒｏ５細胞における値を１としたときの換算値を示した。ＣＯＳ細胞は他の２種の細胞と明らかに異なるプロフィールを持っており、細胞種の区別もある程度可能であることがわかった。
＜予備実験６：混在する細胞種の識別＞
培養容器内に複数種の細胞が混在する場合、テクスチャ解析がどのような結果を示すか実験した。培養容器に、ＣＯＳ細胞とＰｒｏ５細胞をうすく播き、５日後にそれぞれが集落を作った時点で写真撮影を行った（図７Ａ）。写真を当面積で１６区域に分割し、それぞれの区域について、テクスチャ解析を行い（パラメータは、ＧＬＤＭ法でのコントラスト、角度別二次モーメント、エントロピー及び平均、並びにＳＧＬＤＭ法でのエントロピー及び局所一様性）、得られたパラメータ値を示した（図７Ｂ）。
各区域に応じた１６個の数値が、８個ずつに分けることのできる数値を境界値として、それより大きい数字と小さい数字で各区域を色分けした（図７Ｂ）。
図７Ａの写真に示したように、右上部はＰｒｏ５細胞の集落、左下部はＣＯＳ細胞の集落により占められている。その境界には両細胞が混在する領域が左上から右下へ斜めに広がっている。テクスチャ解析の結果は、以下のような３つのパターンに分かれた。
（１）ＧＬＤＭ法のコントラストとＧＬＤＭ法の平均では、細胞種により異なる値を示した。この両指標により２細胞種の存在が検出できると考えられる。
（２）ＳＧＬＤＭ法の局所一様性とＧＬＤＭ法のエントロピーでは、両細胞の混在域で小さい値を示した。
（３）ＧＬＤＭ法のエントロピーとＳＧＬＤＭ法のエントロピーでは、両細胞の混在域で大きい値を示した。
以上の解析により、複数種の細胞の存在とその領域、及びその重なり具合についても、肉眼観察と同程度の判断結果が得られることが示された。
＜監視例１：Ｐｒｏ５細胞の培養状態の監視（ＧＬＤＭコントラストを用いた培養器の故障の検出）＞
Ｐｒｏ５細胞を培養皿に播き、１日後から観察を開始した。正常群の解析よりＧＬＤＭ法のコントラストが細胞増殖の評価に適当であることは、前述の通り既知であるので（予備実験４（１）参照）、当該コントラストを指標として培養状態の監視を行った。サンプルとして、培養２日後の撮影終了後、培養器のスイッチを切り、意図的に細胞の培養状態に異常をきたす状況を作った。
培養３日後の解析では、サンプルのコントラストは、明らかに既知の正常範囲（図５Ａ）から逸脱した結果となり、培養状態が異常であることが確認できた。その結果（グラフ）を図８に示した。なお、グラフ中の各値は「平均値±ＳＤ」で示した。
【実施例２】
【０００７】
テクスチャ解析を行いつつ指標として有効なパラメータを選定する実施態様
Ｃｏｓ１細胞を６枚の培養皿に播いて培養を開始し、２日間観察した後、３枚の培養液中に１０ｎｇ／ｍｌの上皮細胞増殖因子を添加し（非対照群）、その後の細胞形態の変化について上皮細胞増殖因子を添加しなかった残り３枚（対照群）と比較した。添加後１日毎に写真を撮影して観察するとともに、当該写真（画像データ）に基づき「ＧＬＤＭコントラスト、ＧＬＤＭ角度別二次モーメント、ＧＬＤＭエントロピー、ＧＬＤＭ平均、ＳＧＬＤＭエントロピー、ＳＧＬＤＭ局所一様性」を指標としてテクスチャ解析を行うことで、培養状態を監視した。
添加後２日目（すなわち培養４日目）の写真を、図９Ａ及び図９Ｂに示した。図９Ａは対照群の細胞であり、図９Ｂは上皮細胞増殖因子を加えた細胞（非対照群の細胞）である。非対照群の細胞は、添加後２日で細胞の形が明らかに変化し、大きく広がった線維芽細胞様の形が、細胞の厚みが増して上皮様の細胞へと分化したことを示す。
一方、テクスチャ解析による経時的な監視結果については、「ＧＬＤＭ角度別二次モーメント、ＧＬＤＭエントロピー、ＳＧＬＤＭエントロピー、ＳＧＬＤＭ局所一様性」を指標とした場合は、対照群であるか非対照群であるかに関わらず、添加後に顕著な変動傾向が認められなかったが、「ＧＬＤＭコントラスト、ＧＬＤＭ平均」を指標とした場合は、対照群では安定な経時的変化が認められたのに対し、非対照群では顕著な変動傾向が認められた。「ＧＬＤＭコントラスト」及び「ＧＬＤＭ平均」を指標とした場合の結果を、図９Ｃ（ＧＬＤＭコントラスト）及び図９Ｄ（ＧＬＤＭ平均）に示した。なお、図９Ｃ及び図９Ｄのいずれのグラフにおいても、実線で示した折れ線グラフ（３種）が対照群を表し、点線で示した折れ線グラフ（３種）が非対照群を表す。矢印は、非対照群の細胞に上皮細胞増殖因子を添加した時点（培養２日後）を示す。
以上の結果から、Ｃｏｓ１細胞の培養状態（特に細胞形態）をテクスチャ解析を用いて経時的に監視するに当たっては、「ＧＬＤＭコントラスト」及び「ＧＬＤＭ平均」が指標として有効なパラメータであることが示され、同時に、上記の細胞分化を確認できるパラメータとしても有効であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０００８】
本発明によれば、目的細胞の経時的な培養状態の確認を、容易にかつ短時間で行うことができ、しかも確認時における感染や培養細胞のコンタミネーション等の生じるおそれが無い、培養細胞監視システムを提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年12月28日(2006.12.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】請求の範囲
【請求項１】培養細胞の画像を撮影するための手段と、撮影された細胞の画像を、前記培養細胞の培養経過時間と関連するパラメータを指標としてテクスチャ解析する手段とを備えた培養細胞監視システム。
【請求項２】前記培養細胞がヒト由来の細胞である、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】前記ヒト由来の細胞が再生医療用の細胞である、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】培養細胞の画像を撮影する工程と、撮影された細胞の画像を、前記培養細胞の培養経過時間と関連するパラメータを指標としてテクスチャ解析する工程とを含む培養細胞監視方法。
【請求項５】培養細胞の画像を撮影するための手段と、
撮影された細胞の画像について、前記培養細胞の培養経過時間と関連するパラメータを指標とし、空間濃度レベル依存法、濃度レベル差分法又は濃度ヒストグラム法を用いたテクスチャ解析をする手段と
を備えた培養細胞監視システム。
【請求項６】前記培養細胞がヒト由来の細胞である、請求項５に記載のシステム。
【請求項７】前記ヒト由来の細胞が再生医療用の細胞である、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】培養細胞の画像を撮影する工程と、
撮影された細胞の画像について、前記培養細胞の培養経過時間と関連するパラメータを指標とし、空間濃度レベル依存法、濃度レベル差分法又は濃度ヒストグラム法を用いたテクスチャ解析をする工程と
を含む培養細胞監視方法。
【国際調査報告】
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