(57)【要約】ｐ５３の翻訳後修飾を修飾部位特異的に認識するモノクローナル抗体、前記抗体を基板上に固定した抗体マイクロアレイ等を提供する。配列番号１で表されるアミノ酸配列の所定のアミノ酸残基を含む少なくとも６個の連続したアミノ酸配列からなるペプチドであって、前記アミノ酸残基がリン酸化またはアセチル化されたペプチドまたは前記ペプチドに１乃至数個の任意のアミノ酸が付加されたペプチドと特異的に反応し、リン酸化またはアセチル化されていない前記ペプチドに反応しないモノクローナル抗体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下（ａ）、（ｂ）または（ｃ）いずれかのペプチドと特異的に反応し、リン酸化またはアセチル化されていない前記ペプチドに反応しないモノクローナル抗体。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の第６番目、第９番目、第１５番目、第１８番目、第２０番目、第３３番目、第３７番目、第４６番目、第５５番目、第８１番目、第９０番目、第３１５番目、第３７１番目、第３７６番目、第３７８番目または第３９２番目のアミノ酸残基を含む少なくとも６個の連続したアミノ酸配列からなるペプチドであって、前記アミノ酸残基がリン酸化されたペプチド
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の第３０５番目、第３２０番目、第３７０番目、第３７２番目、第３７３番目、第３８１番目または第３８２番目のアミノ酸残基を含む少なくとも６個の連続したアミノ酸配列からなるペプチドであって、前記アミノ酸残基がアセチル化されたペプチド、または
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のペプチドに、１乃至数個の任意のアミノ酸が付加されたペプチド
【請求項２】
前記（ａ）のペプチドが、
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６または配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであり、
前記（ｂ）のペプチドが、
配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、または配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
Ｐ５３Ｎｏ．１８  ４Ｂ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５６１）、
Ｐ５３Ｎｏ．５  １６Ａ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５６２）または
Ｐ５３Ｎｏ．１０  ６Ａ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５６３）
で標示されるハイブリドーマにより産生される請求項２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
Ｐ５３Ｎｏ．３  ３Ｂｃ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５７６）、
Ｐ５３Ｎｏ．４  １３Ｃ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５７７）、
Ｐ５３Ｎｏ．１１  ７Ｃ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５７８）、
Ｐ５３Ｎｏ．１２  １Ａ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５７９）、
Ｐ５３Ｎｏ．２２  １１Ｂ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５８０）または
Ｐ５３Ｎｏ．２３  １Ａ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５８１）
で標示されるハイブリドーマにより産生される請求項２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
請求項１〜４いずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項６】
Ｐ５３Ｎｏ．１８  ４Ｂ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５６１）、
Ｐ５３Ｎｏ．５  １６Ａ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５６２）または
Ｐ５３Ｎｏ．１０  ６Ａ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５６３）
で標示される請求項５に記載のハイブリドーマ。
【請求項７】
Ｐ５３Ｎｏ．３  ３Ｂｃ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５７６）、
Ｐ５３Ｎｏ．４  １３Ｃ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５７７）、
Ｐ５３Ｎｏ．１１  ７Ｃ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５７８）、
Ｐ５３Ｎｏ．１２  １Ａ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５７９）、
Ｐ５３Ｎｏ．２２  １１Ｂ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５８０）または
Ｐ５３Ｎｏ．２３  １Ａ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５８１）
で標示される請求項５に記載のハイブリドーマ。
【請求項８】
請求項１〜４いずれかに記載のモノクローナル抗体を基板上に固定化したことを特徴とする抗体マイクロアレイ。
【請求項９】
請求項１〜４いずれかに記載のモノクローナル抗体または請求項８に記載の抗体マイクロアレイを含むｐ５３タンパク質の翻訳後修飾状態の測定キット。
【請求項１０】
請求項１〜４いずれかに記載のモノクローナル抗体または請求項８に記載の抗体マイクロアレイを用いることを特徴とするｐ５３タンパク質の翻訳後修飾状態の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、癌抑制遺伝子産物ｐ５３（以下、「ｐ５３」または「ｐ５３タンパク質」ということがある）の翻訳後修飾を修飾部位特異的に認識するモノクローナル抗体、前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、抗体マイクロアレイおよびｐ５３タンパク質の翻訳後修飾の測定キット等に関し、特にｐ５３の生理機能発現制御機構の研究、抗癌剤や免疫抑制剤の開発等に有用である。なお、２００５年４月１日に日本国特許庁提出の日本特許出願ＪＰ２００５−１０６１３０号に含まれる明細書、特許請求の範囲、図面及び要約は、その全ての内容を引用することによって本願に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】  ｐ５３は、様々な細胞ストレスにより活性化され、標的遺伝子の特異的ＤＮＡ配列に結合してその転写活性を制御する転写因子である。ｐ５３は、複数の標的遺伝子の発現制御を通じて、ＤＮＡ修復、細胞周期停止、アポトーシス誘導などの種々の生理機能を発揮する。【０００３】  ｐ５３は、通常、細胞内において低いレベルで維持されているが、細胞が様々なストレス、例えば、放射線照射、紫外線照射、アドリアマイシン等の抗がん剤等によるＤＮＡ損傷、熱ショック、浸透圧ショック、低酸素ショック等の細胞ストレスを受けると、安定化されて核内に蓄積し、転写因子として活性化される。活性化したｐ５３はチェックポイント制御に関与するｐ２１ＷＡＦ１、ＤＮＡ修復に関与するＤＤＢ２、ｐ５３Ｒ２、アポトーシスに関与するＢＡＸ、ｐ５３ＡＩＰ１等の遺伝子の発現を誘導する。【０００４】  近年、この生理機能の発現制御には、ｐ５３のリン酸化やアセチル化などの翻訳後修飾が深く関与していることが明らかにされている。【０００５】  Ｘ線や紫外線照射により軽度のＤＮＡ損傷が生じた場合、ＡＴＭ（Ａｔａｘｉａ  Ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ  Ｍｕｔａｔｅｄ）、ＡＴＲ（Ａｔａｘｉａ  Ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ  Ｒｅｌａｔｅｄ）が活性化され、その下流のＣｈｋ１、Ｃｈｋ２をリン酸化し、Ｃｈｋ１、Ｃｈｋ２はｐ５３の２０番目のセリン（以下、「Ｓｅｒ２０」ということがある）をリン酸化し、ＭＤＭ２との会合を阻害することによって、ｐ５３がユビキチン化されプロテアソームにより分解されることを抑制し、ｐ５３が安定化される。また、ｐ５３の１５番目のセリン（以下、「Ｓｅｒ１５」ということがある）は、ＡＴＭ、ＡＴＲにより直接リン酸化されて、ＭＤＭ２タンパク質とｐ５３との結合を阻害し、ｐ５３が安定化および活性化される。安定・活性化したｐ５３は、Ｇ１停止期関連遺伝子ｐ２１ＷＡＦ１、あるいはＤＮＡ修復関連遺伝子ｐ５３Ｒ２のプロモーターに結合し、これらの発現を誘導する。【０００６】  重度のＤＮＡ損傷が生じた場合には、Ｓｅｒ４６キナーゼが活性化されて、活性化されたｐ５３はさらに、４６番目のセリン（以下、「Ｓｅｒ４６」ということがある）がリン酸化される。Ｓｅｒ４６リン酸化ｐ５３は、ｐ５３ＡＩＰ１遺伝子のプロモーターに結合し、ｐ５３ＡＩＰ１遺伝子が発現誘導され、ｐ５３依存性アポトーシス経路が活性化し、細胞はアポトーシスで死滅する。また、紫外線照射や抗癌剤により活性化されたｐ３８ＭＡＰＫがｐ５３の３３番目のセリン（以下、「Ｓｅｒ３３」ということがある）をリン酸化し、ｐ５３依存性アポトーシスに関与するという報告もある。さらに、ｐ５３のＣ末端領域に存在する３７６番目のセリン（以下、「Ｓｅｒ３７６」ということがある）と３７８番目のセリン（以下、「Ｓｅｒ３７８」ということがある）は、通常の状態の細胞内ではともにリン酸化されているが、放射線照射により細胞がＤＮＡ損傷を受けると、Ｓｅｒ３７６のリン酸化状態は維持されるが、Ｓｅｒ３７８は脱リン酸化されることが報告されている。【０００７】  また、ｐ５３の生理機能発現は、ｐ５３のアセチル化によっても制御されている。ｐ５３は、転写共役因子（コファクター）との相互作用���介して標的遺伝子の転写を制御しているが、前記転写共役因子のうち、ｐ３００／ＣＢＰ、ＰＣＡＦ等はヒストンアセチル化酵素（ＨＡＴ）活性を有する。ｐ５３は、これらＨＡＴと相互作用して、標的遺伝子のヒストンアセチル化を促進するほか、ｐ５３自身もアセチル化される。アセチル化されるのはｐ５３のＣ末端の３２０番目、３７３番目および３８２番目のリジン（以下、それぞれ「Ｌｙｓ３２０」、「Ｌｙｓ３７３」および「Ｌｙｓ３８２」ということがある）である。ＰＣＡＦ／ＧＣＮ５はＬｙｓ３２０、ｐ３００／ＣＢＰはＬｙｓ３７３およびＬｙｓ３８２を特異的にアセチル化する。ｐ５３はアセチル化されるとＤＮＡへの特異的結合能が強化される。これは、Ｃ末端の正電荷がアセチル化により中和され、ｐ５３の構造変化を引き起こし、ｐ５３のＤＮＡドメインが露出するためと考えられている。また、ＤＮＡ損傷などにより活性化された場合、まずＮ末端がリン酸化され、そのＮ末端にｐ３００／ＣＢＰ等のＨＡＴが結合し、Ｃ末端をアセチル化するというモデルも考えられている。【０００８】  ヒトｐ５３タンパク質は３９３アミノ酸残基からなり、大きく３つの領域、（ｉ）１−１００アミノ酸残基：転写活性化ドメインおよびプロリンリッチドメイン、（ｉｉ）１００−３００アミノ酸残基：配列特異的ＤＮＡ結合ドメイン、および（ｉｉｉ）３００−３９３アミノ酸残基：四量体形成ドメインおよび塩基性調節ドメイン、に大別され、転写活性化ドメインおよびプロリンリッチドメインを含むＮ端領域に７個のリン酸化部位（Ｓｅｒ１５、Ｓｅｒ２０、Ｓｅｒ３３、３７番目のセリン（以下、「Ｓｅｒ３７」ということがある）、Ｓｅｒ４６、８１番目のスレオニン（以下、「Ｔｈｒ８１」ということがある）、９０番目のセリン（以下、「Ｓｅｒ９０」ということがある））、Ｃ端領域に５個のリン酸化部位（３１５番目のセリン（以下、「Ｓｅｒ３１５」ということがある）、３７１番目のセリン（以下、「Ｓｅｒ３７１」ということがある）、Ｓｅｒ３７６、Ｓｅｒ３７８、３９２番目のセリン（以下、「Ｓｅｒ３９２」ということがある））、および３個のアセチル化部位（Ｌｙｓ３２０、Ｌｙｓ３７３、Ｌｙｓ３８２）の存在が既に明らかにされている。【０００９】  ヒト癌で最も高頻度に変異が検出されるｐ５３遺伝子において、その変異のほとんどはＤＮＡ結合領域に集中している。このことは、ｐ５３変異による癌化が、その発現制御系の異常に起因するものであることを示唆している。したがって、ｐ５３変異を介した発癌機構の解明には、上述したｐ５３の翻訳後修飾による生理機能の発現制御機構の解明が不可欠であり、ｐ５３の特定の部位におけるリン酸化および／またはアセチル化を検出または定量できるツール（例えば抗体）や測定方法の開発等が強く求められている。【００１０】  これらの要求に鑑み、従来から、Ｃｈｋ１、Ｃｈｋ２、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＤＮＰ−ＰＫの酵素活性を測定する方法が提案されており、これらの方法において使用されるｐ５３の翻訳後修飾部位特異的ポリクローナル抗体が知られている（特許文献１〜５、非特許文献１〜１８）。
【特許文献１】国際公開第９９／３６５３２号パンフレット
【特許文献２】特開２０００−３２５０８６号公報
【特許文献３】特開２００１−１６１３９８号公報
【特許文献４】特表２００２−５２４０９２号公報
【特許文献５】特開２００３−９３０５６号公報
【非特許文献１】Ｔａｎａｋａ，Ｈ他：Ｎａｔｕｒｅ，４０４：４２−４９，２０００
【非特許文献２】Ｏｄａ，Ｋ他：Ｃｅｌｌ，１０２：８４９−８６２，２０００
【非特許文献３】Ｃｈｅｈａｂ，Ｎ．Ｈら：Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖ．，１４：２７８−２８８，２０００
【非特許文献４】Ｓｈｉｅｈ，Ｓ．Ｙ他：Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖ．，１４：２８９−３００，２０００
【非特許文献５】Ｂａｎｉｎ，Ｓ他：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１：１６７４−１６７７，１９９８
【非特許文献６】Ｔｉｂｂｅｔｔｓ，Ｒ．Ｓ他：Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖ．，１３：１５２−１５７，１９９９
【非特許文献７】Ｄｕｍａｚ，ＮおよびＭｅｅｋ，Ｄ．Ｗ：ＥＭＢＯ  Ｊ．，１８：７００２−７０１０，１９９９
【非特許文献８】Ｂｕｌａｖｉｎ，Ｄ．Ｖ他，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１８：６８４５−６８５４，１９９９
【非特許文献９】Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｒｉｅｔｏ，Ｒ：Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６０：２４６４−２４７２，２０００
【非特許文献１０】Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｊ．Ｆ他：Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，１９：１７５−１７９，１９９８
【非特許文献１１】Ｇｕ，ＷおよびＲｏｅｄｅｒ，Ｒ．Ｇ．：Ｃｅｌｌ，９０：５９５−６０６，１９９７
【非特許文献１２】Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｋ他：Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖ．，１２：２８３１−２８４１，１９９８
【非特許文献１３】Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｐ．Ｆ他：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：３３０４８−３３０５３，１９９８
【非特許文献１４】田矢洋一編、実験医学、１９（Ｎｏ．９）：１０５０−１０８４、２００１
【非特許文献１５】田矢洋一、細胞工学Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．１，ｐ２９−３３、２００３
【非特許文献１６】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０００  Ｊｕｌｙ  ２８；２７５（３０）：２３１９９−２３２０３
【非特許文献１７】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００２  Ａｐｒｉｌ  １２；２７７（１５）：１２４９１−１２４９４
【非特許文献１８】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００３  Ｊｕｌｙ  １１；２７８（２８）：２５５６８−２５５７６
【発明の開示】
【００１１】  しかしながら、上記従来の方法およびポリクローナル抗体では、翻訳後修飾部位に対する特異性が十分とはいえず、ｐ５３の翻訳後修飾部位の修飾状態を並列かつ独立に検出することができるツールの開発が求められている。また、ヒトｐ５３には、前述の翻訳後修飾部位のほかに、４個のリン酸化部位（６番目のセリン残基（以下「Ｓｅｒ６」ということがある）、９番目のセリン残基（以下「Ｓｅｒ９」ということがある）、１８番目のスレオニン残基（以下、「Ｔｈｒ１８」ということがある）、５５番目のスレオニン残基（以下、「Ｔｈｒ５５」という））、４個のアセチル化部位（３０５番目のリジン（以下、「Ｌｙｓ３０５」ということがある）、３７０番目のリジン（以下、「Ｌｙｓ３７０」と
いうことがある）、３７２番目のリジン（以下、「Ｌｙｓ３７２」ということがある）、３８１番目のリジン（以下、「Ｌｙｓ３８１」ということがある））がさらに存在し、前記従来技術では、ｐ５３のリン酸化／脱リン酸化およびアセチル化／脱アセチル化による生理機能発現制御を十分に解析することができない。さらに、ｐ５３は、複数の翻訳後修飾シグナルを介して分子内構造変化を引き起こし、分子内のみならずｐ５３分子間でも相互作用していることが予想され、ｐ５３上の複数の翻訳後修飾部位の修飾状態を同時かつ網羅的に検出、定量することができるツールの開発が強く求められている。
【００１２】  そこで、本発明の目的は、ｐ５３の翻訳後修飾を修飾部位特異的に認識するモノクローナル抗体、前記抗体を基板上に固定した抗体マイクロアレイ等を提供することにある。
【００１３】  本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究したところ、以下のモノクローナル抗体、抗体マイクロアレイ等により本発明の目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】  即ち、本発明は、
（１）以下（ａ）、（ｂ）または（ｃ）いずれかのペプチドと特異的に反応し、リン酸化またはアセチル化されていない前記ペプチドに反応しないモノクローナル抗体、
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の第６番目、第９番目、第１５番目、第１８番目、第２０番目、第３３番目、第３７番目、第４６番目、第５５番目、第８１番目、第９０番目、第３１５番目、第３７１番目、第３７６番目、第３７８番目または第３９２番目のアミノ酸残基を含む少なくとも６個の連続したアミノ酸配列からなるペプチドであって、前記アミノ酸残基がリン酸化されたペプチド
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の第３０５番目、第３２０番目、第３７０番目、第３７２番目、第３７３番目、第３８１番目または第３８２番目のアミノ酸残基を含む少なくとも６個の連続したアミノ酸配列からなるペプチドであって、前記アミノ酸残基がアセチル化されたペプチド、または
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のペプチドに、１乃至数個の任意のアミノ酸が付加されたペプチド。
（２）前記（ａ）のペプチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６または配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであり、
前記（ｂ）のペプチドが、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、または配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである上記（１）記載のモノクローナル抗体、
（３）Ｐ５３Ｎｏ．１８  ４Ｂ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５６１）、Ｐ５３Ｎｏ．１７  １６Ｂ（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４７８）、Ｐ５３Ｎｏ．２３  １Ｃ（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４７９）、Ｐ５３Ｎｏ．５  １６Ａ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５６２）、Ｐ５３Ｎｏ．１０  ６Ａ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５６３）またはＰ５３Ｎｏ．２  ２０Ｇ（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４８０）で標示されるハイブリドーマにより産生される上記（２）に記載のモノクローナル抗体、
さらに好ましくは、Ｐ５３Ｎｏ．１８  ４Ｂ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５６１）、Ｐ５３Ｎｏ．５  １６Ａ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５６２）またはＰ５３Ｎｏ．１０  ６Ａ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５６３）で標示されるハイブリドーマにより産生される上記（２）に記載のモノクローナル抗体、
（４）Ｐ５３Ｎｏ．３  ３Ｂｃ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５７６）、
Ｐ５３Ｎｏ．４  １３Ｃ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５７７）、
Ｐ５３Ｎｏ．１１  ７Ｃ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５７８）、
Ｐ５３Ｎｏ．１２  １Ａ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５７９）、
Ｐ５３Ｎｏ．２２  １１Ｂ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５８０）または
Ｐ５３Ｎｏ．２３  １Ａ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５８１）で標示されるハイブリドーマにより産生される上記（２）に記載のモノクローナル抗体である。
（５）上記（１）〜（４）いずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、
（６）Ｐ５３Ｎｏ．１８  ４Ｂ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５６１）、Ｐ５３Ｎｏ．１７  １６Ｂ（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４７８）、Ｐ５３Ｎｏ．２３  １Ｃ（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４７９）、Ｐ５３Ｎｏ．５  １６Ａ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５６２）、Ｐ５３Ｎｏ．１０  ６Ａ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５６３）またはＰ５３Ｎｏ．２  ２０Ｇ（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４８０）で標示される上記（５）記載のハイブリドーマ、
（７）Ｐ５３Ｎｏ．３  ３Ｂｃ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５７６）、
Ｐ５３Ｎｏ．４  １３Ｃ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５７７）、
Ｐ５３Ｎｏ．１１  ７Ｃ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５７８）、
Ｐ５３Ｎｏ．１２  １Ａ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５７９）、
Ｐ５３Ｎｏ．２２  １１Ｂ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５８０）または
Ｐ５３Ｎｏ．２３  １Ａ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５８１）で標示される上記（５）記載のハイブリドーマ、
（８）上記（１）〜（４）いずれかに記載のモノクローナル抗体を基板上に固定化したことを特徴とする抗体マイクロアレイ、
（９）上記（１）〜（４）いずれかに記載のモノクローナル抗体または上記（８）に記載の抗体マイクロアレイを含むｐ５３タンパク質の翻訳後修飾状態の測定キット、
（１０）上記（１）〜（４）いずれかに記載のモノクローナル抗体または上記（８）に記載の抗体マイクロアレイを用いることを特徴とするｐ５３タンパク質の翻訳後修飾状態の測定方法等に関する。
【００１５】  本発明のモノクローナル抗体は、ｐ５３の翻訳後修飾部位の修飾アミノ酸残基およびその近傍のアミノ酸残基を特異的に認識して結合し、翻訳後修飾部位のアミノ酸残基が修飾を受けていない場合には結合しない。このため、ｐ５３上の複数の翻訳後修飾部位の修飾状態の独立かつ並列な検出、定量に使用することができ、ｐ５３研究並びに癌の診断に極めて有用である。特に、ｐ５３のリン酸化は、ｐ５３の不活性化の抑制及びシグナルの増強を行い、相互依存的な修飾酵素とｐ５３分子内修飾の２次的な活性化と、種々のストレスからのシグナルの統合を含む２つのカスケードによって調整されている。これらの修飾部位の相互依存的なカスケードが成立されていることが予想される中で、ｐ５３の複数の翻訳後修飾部位のリン酸化状態を網羅的に検出できる本発明の抗体マイクロアレイ、キットは有用である。本発明の抗体マイクロアレイは、ｐ５３上の複数の翻訳後修飾部位の修飾状態の同時かつ網羅的な検出、定量に使用することができ、ｐ５３の癌化抑制メカニズムの解明ばかりでなく癌の診断や治療に関しても極めて有用なツールとなる。さらに、本発明の測定キットおよび測定方法は、ｐ５３の翻訳後修飾状態の簡便かつ迅速な検出・定量に使用することができ、ｐ５３研究並びに癌の診断・治療にきわめて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】種々のコーティングスライドガラスにＤＯ−１抗体をスポットしたときの、シグナル強度を示すグラフである。
【図２】種々の保存条件における、ＤＯ−１抗体のスポット状態を示すものである。
【図３】抗体の固定化量とシグナル強度との関係を示すグラフである。
【図４】モノクローナル抗体との交叉反応性の結果を示す図である。
【図５】モノクローナル抗体との交叉反応性の結果を示す図である。
【図６】モノクローナル抗体との交叉反応性の結果を示す図である。
【図７】モノクローナル抗体との交叉反応性の結果を示す図である。
【図８】モノクローナル抗体との交叉反応性の結果を示す図である。
【図９】モノクローナル抗体との交叉反応性の結果を示す図である。
【図１０】モノクローナル抗体との交叉反応性の結果を示す図である。
【図１１】モノクローナル抗体との交叉反応性の結果を示す図である。
【図１２】アセチル化認識抗体交叉反応性におけるモノクローナル抗体の濃度依存性を示す図である。
【図１３】アセチル化認識抗体交叉反応性におけるモノクローナル抗体の濃度依存性を示す図である。
【図１４】３８２Ａｃ−１Ａ抗体を用いたウエスタンブロットの結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】  以下、本発明において、アミノ酸、（ポリ）ペプチドの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定［ＩＵＰＡＣ−ＩＣＢ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８：９（１９８４）］、「塩基配列またはアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）に従う。【００１８】  本発明において、「（ポリ）ペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合により結合した化合物を指し、その鎖長は問わない。したがって、タンパク質も本発明における「（ポリ）ペプチド」に含まれる。また、本発明において、「タンパク質」や「（ポリ）ペプチド」には、特定のアミノ酸配列で示される「タンパク質」や（ポリ）ペプチド」だけでなく、これらと生物学的機能が同等であることを限度として、その同族体（ホモログやスプライスバリアント）、変異体、誘導体、成熟体およびアミノ酸修飾体などが包含される。ここでホモログとしては、ヒトのタンパク質に対応する他の生物種のタンパク質が例示でき、これらは遺伝子の塩基配列から演繹的に同定することができる。また、変異体には、天然に存在する変異体、存在しない変異体、および人為的に欠失、置換、付加および挿入されることにより改変されたアミノ酸配列を有する変異体が含まれる。なお、上記変異体としては、変異のないタンパク質または（ポリ）ペプチドと、少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％相同なものを挙げることができる。【００１９】  本発明において、「翻訳」とは、ゲノムＤＮＡ（時にはＲＮＡ）から転写により生じたｍＲＮＡの情報を読み取って、リボソーム上でアミノ酸配列に変換し、タンパク質が生成されることをいう。また、「翻訳後修飾」とは、翻訳により生成したタンパク質が、その役割、活動に応じて、さらに種々の修飾を受けることをいい、具体的には、特異的プロテアーゼによるペプチド鎖の切断（プロセッシング）、リン酸化、アセチル化、メチル化、アデニリル化、ＡＤＰリボシル化、糖鎖付加などのアミノ酸残基の修飾等が挙げられる。本発明においては、特に言及しない限り、「翻訳後修飾されたｐ５３」とは翻訳後にリン酸化および／またはアセチル化されたｐ５３を、「修飾（ポリ）ペプチド」および「修飾
された（ポリ）ペプチド」とは、特に言及しない限り、リン酸化および／またはアセチル化された（ポリ）ペプチドを、「修飾されていない（ポリ）ペプチド」および「非修飾の（ポリ）ペプチド」とは、リン酸化およびアセチル化されていない（ポリ）ペプチド、を指す。【００２０】  ヒトｐ５３は、３９３個のアミノ酸からなり、そのアミノ酸配列は配列番号１に示されている。本発明において、ｐ５３の翻訳後修飾部位とは、特に限定しない限り、インビボまたはインビトロにおいて、Ｃｈｋ１、Ｃｈｋ２、ＡＴＭ、ＡＴＲ、Ｓｅｒ４６キナーゼ、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＰＫＣ、ＣＫＩＩ等のリン酸化酵素やｐ３００／ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＧＣＮ５等のＨＡＴにより翻訳後修飾（リン酸化またはアセチル化）され得るアミノ酸残基を指し、具体的なｐ５３のリン酸化部位としては、ヒトｐ５３の第６番目のセリン、第９番目のセリン、第１５番目のセリン、第１８番目のスレオニン、第２０番目のセリン、第３３番目のセリン、第３７番目のセリン、第４６番目のセリン、第５５番目のスレオニン、第８１番目のスレオニン、第９０番目のセリン、第３１５番目のセリン、第３７１番目のセリン、第３７６番目のセリン、第３７８番目のセリンまたは第３９２番目のセリン等を挙げることができ、アセチル化部位としては、ヒトｐ５３の第３０５番目のリジン、第３２０番目のリジン、第３７０番目のリジン、第３７２番目のリジン、第３７３番目のリジン、第３８１番目のリジンまたは第３８２番目のリジン等を挙げることができる。【００２１】  本発明のモノクローナル抗体は、以下（ａ）、（ｂ）または（ｃ）いずれかのペプチドと特異的に反応し、リン酸化またはアセチル化されていない前記ペプチドとは反応しないことを特徴とする。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の第６番目、第９番目、第１５番目、第１８番目、第２０番目、第３３番目、第３７番目、第４６番目、第５５番目、第８１番目、第９０番目、第３１５番目、第３７１番目、第３７６番目、第３７８番目または第３９２番目のアミノ酸残基を含む少なくとも６個の連続したアミノ酸配列からなるペプチドであって、前記アミノ酸残基がリン酸化されたペプチド
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の第３０５番目、第３２０番目、第３７０番目、第３７２番目、第３７３番目、第３８１番目または第３８２番目のアミノ酸残基を含む少なくとも６個の連続したアミノ酸配列からなるペプチドであって、前記アミノ酸残基がアセチル化されたポリペプチド
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のペプチドにおいて、１乃至数個の任意のアミノ酸が付加、置換若しくは挿入されたペプチド（但し、リン酸化アミノ酸残基またはアセチル化アミノ酸残基が置換される場合を除く）
本発明のモノクローナル抗体は、上記（ａ）〜（ｃ）いずれかの修飾ペプチドと特異的に反応し、非修飾の上記ペプチドとは反応しない。すなわち、ｐ５３の翻訳後修飾されたアミノ酸残基およびその周辺のアミノ酸残基を認識して結合し、翻訳後修飾部位のアミノ酸残基が修飾を受けていない場合には結合しない。この特異性により、ｐ５３タンパク質上の複数の翻訳後修飾部位の修飾（リン酸化またはアセチル化）を並列かつ独立に検出、定量することが可能となる。【００２２】  上記（ａ）のペプチドは、ヒトｐ５３における、リン酸化Ｓｅｒ６、リン酸化Ｓｅｒ９、リン酸化Ｓｅｒ１５、リン酸化Ｔｈｒ１８、リン酸化Ｓｅｒ２０、リン酸化Ｓｅｒ３３、リン酸化Ｓｅｒ３７、リン酸化Ｓｅｒ４６、リン酸化Ｔｈｒ５５、リン酸化Ｔｈｒ８１、リン酸化Ｓｅｒ９０、リン酸化Ｓｅｒ３１５、リン酸化Ｓｅｒ３７１、リン酸化Ｓｅｒ３７６、リン酸化Ｓｅｒ３７８またはリン酸化Ｓｅｒ３９２を含む連続したアミノ酸配列からなるペプチドであり、リン酸化Ｓｅｒ６、リン酸化Ｓｅｒ９、リン酸化Ｓｅｒ２０、リン酸化Ｔｈｒ５５、リン酸化Ｔｈｒ８１、リン酸化Ｓｅｒ９０、リン酸化Ｓｅｒ３１５、リン酸化Ｓｅｒ３７１、リン酸化Ｓｅｒ３７６、またはリン酸化Ｓｅｒ３７８を含むリン酸化ペプチドが好ましく、リン酸化Ｓｅｒ９、リン酸化Ｓｅｒ２０、またはリン酸化Ｔｈｒ８１を含むリン酸化ペプチドがさらに好ましい。また、そのアミノ酸長は６個〜全長であり、より好ましくは６〜２０個、さらに好ましくは６〜１４個である。【００２３】  上記（ａ）のペプチドとしてさらに好ましくは、ＭＥＥＰＱＳ（Ｐ）ＤＰＳＶＥＰ（配列番号２）、ＰＱＳＤＰＳ（Ｐ）ＶＥＰＰＬＳ（配列番号３）、ＥＰＰＬＳ（Ｐ）ＱＥＴＦＳＤＬ（配列番号４）、ＰＬＳＱＥＴ（Ｐ）ＦＳＤＬＷＫ（配列番号５）、ＳＱＥＴＦＳ（Ｐ）ＤＬＷＫＬＬ（配列番号６）、ＰＥＮＮＶＬＳ（Ｐ）ＰＬＰＳＱＡ（配列番号７）、ＬＳＰＬＰＳ（Ｐ）ＱＡＭＤＤＬ（配列番号８）、ＤＤＬＭＬＳ（Ｐ）ＰＤＤＩＥＱ（配列番号９）、ＩＥＱＷＦＴ（Ｐ）ＥＤＰＧＰＤ（配列番号１０）、ＡＰＡＡＰＴ（Ｐ）ＰＡＡＰＡＰ（配列番号１１）、ＰＡＰＡＰＳ（Ｐ）ＷＰＬＳＳＳ（配列番号１２）、ＮＮＴＳＳＳ（Ｐ）ＰＱＰＫＫＫ（配列番号１３）、ＳＳＨＬＫＳ（Ｐ）ＫＫＧＱＳＴ（配列番号１４）、ＳＫＫＧＱＳ（Ｐ）ＴＳＲＨＫＫ（配列番号１５）、ＫＫＧＱＳＴＳ（Ｐ）ＲＨＫＫＬＭＦ（配列番号１６）、またはＦＫＴＥＧＰＤＳ（Ｐ）Ｄ（配列番号１７）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであり、これらのうちさらに好ましくは、ＭＥＥＰＱＳ（Ｐ）ＤＰＳＶＥＰ（配列番号２）、ＰＱＳＤＰＳ（Ｐ）ＶＥＰＰＬＳ（配列番号３）、ＳＱＥＴＦＳ（Ｐ）ＤＬＷＫＬＬ（配列番号６）、ＩＥＱＷＦＴ（Ｐ）ＥＤＰＧＰＤ（配列番号１０）、ＡＰＡＡＰＴ（Ｐ）ＰＡＡＰＡＰ（配列番号１１）、ＰＡＰＡＰＳ（Ｐ）ＷＰＬＳＳＳ（配列番号１２）、ＮＮＴＳＳＳ（Ｐ）ＰＱＰＫＫＫ（配列番号１３）、ＳＳＨＬＫＳ（Ｐ）ＫＫＧＱＳＴ（配列番号１４）、ＳＫＫＧＱＳ（Ｐ）ＴＳＲＨＫＫ（配列番号１５）、またはＫＫＧＱＳＴＳ（Ｐ）ＲＨＫＫＬＭＦ（配列番号１６）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであり、これらの��ち特に好ましくは、ＰＱＳＤＰＳ（Ｐ）ＶＥＰＰＬＳ（配列番号３）、ＳＱＥＴＦＳ（Ｐ）ＤＬＷＫＬＬ（配列番号６）、またはＡＰＡＡＰＴ（Ｐ）ＰＡＡＰＡＰ（配列番号１１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである。ここで、上記アミノ酸配列において、Ｓ（Ｐ）はリン酸化セリン、Ｔ（Ｐ）はリン酸化スレオニンを表す。【００２４】  上記（ｂ）のペプチドは、ヒトｐ５３における、アセチル化Ｌｙｓ３０５、アセチル化Ｌｙｓ３２０、アセチル化Ｌｙｓ３７０、アセチル化Ｌｙｓ３７２、アセチル化Ｌｙｓ３７３、アセチル化Ｌｙｓ３８１またはアセチル化Ｌｙｓ３８２を含む、連続したアミノ酸配列からなるペプチドであり、アセチル化Ｌｙｓ３０５、アセチル化Ｌｙｓ３２０、アセチル化Ｌｙｓ３７０、アセチル化Ｌｙｓ３７２、またはアセチル化Ｌｙｓ３８１を含むアセチル化ペプチドが好ましく、アセチル化Ｌｙｓ３０５またはアセチル化Ｌｙｓ３２０を含むアセチル化ペプチドがさらに好ましい。また、そのアミノ酸長は６個〜全長、より好ましくは６〜２０個、さらに好ましくは６〜１４個である。【００２５】  上記（ｂ）のペプチドとしてさらに好ましくは、ＰＰＧＳＴＫ（Ａｃ）ＲＡＬＰＮＮ（配列番号１８）、ＳＰＱＰＫＫ（Ａｃ）ＫＰＬＤＧ（配列番号１９）、ＨＳＳＨＬＫ（Ａｃ）ＳＫＫＧＱ（配列番号２０）、ＳＨＬＫＳＫ（Ａｃ）ＫＧＱＳＴ（配列番号２１）、ＨＬＫＳＫＫ（Ａｃ）ＧＱＳＴＳ（配列番号２２）、ＳＴＳＲＨＫ（Ａｃ）ＫＬＭＦＫ（配列番号２３）、またはＴＳＲＨＫＫ（Ａｃ）ＬＭＦＫＴ（配列番号２４）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであり、これらのうちさらに好ましくは、ＰＰＧＳＴＫ（Ａｃ）ＲＡＬＰＮＮ（配列番号１８）、ＳＰＱＰＫＫ（Ａｃ）ＫＰＬＤＧ（配列番号１９）、ＨＳＳＨＬＫ（Ａｃ）ＳＫＫＧＱ（配列番号２０）、ＳＨＬＫＳＫ（Ａｃ）ＫＧＱＳＴ（配列番号２１）、またはＳＴＳＲＨＫ（Ａｃ）ＫＬＭＦＫ（配列番号２３）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであり、これらのうちで特に好ましくは、ＰＰＧＳＴＫ（Ａｃ）ＲＡＬＰＮＮ（配列番号１８）またはＳＰＱＰＫＫ（Ａｃ）ＫＰＬＤＧ（配列番号１９）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである。ここで、上記アミノ酸配列中、Ｋ（Ａｃ）はアセチル化リジンを表す。【００２６】  上記（ｃ）のペプチドとしては、例えば、上記（ａ）または（ｂ）のペプチドにおいて、１〜５個の任意のアミノ酸が付加されたペプチド、１〜５個のアミノ酸が置換されたペプチド（但し、上記（ａ）または（ｂ）のペプチドにおいて、リン酸化セリン残基、リン酸化スレオニン残基またはアセチル化リジン残基が置換される場合を除く）、若しくは１〜５個の任意のアミノ酸が挿入されたペプチドを挙げることができるが、１または２個のアミノ酸が付加、置換若しくは挿入されたペプチドが好ましい。【００２７】  本発明のモノクローナル抗体には、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ等の抗体断片が含まれ、生物種や製造方法は特に限定されない。また、ハイブリッド抗体、改変抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体等のハイブリドーマを用いずに製造されたもの（例えば、抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体から産生される遺伝子組換え抗体）も含まれる。前記抗体断片は、例えば、本発明のモノクローナル抗体をパパインやペプシンなどのタンパク質分解酵素で処理することにより得ることができる。【００２８】  本発明のモノクローナル抗体は、使用目的に応じて、適宜適当な標識物質により標識することができる。標識物質としては、使用目的に応じて適宜選択されるが、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、アセチルコリンエステラーゼなどの酵素、Ｃｙ３、Ｃｙ５、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等の蛍光物質、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４Ｃ、３Ｈ、３２Ｐ、３５Ｓなどの放射性同位元素、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリンなどの発光物質、ビオチン、ランタニド元素などを用いることができる。
また、本発明の抗体を標識することなく、本発明の抗体と特異的に結合する二次抗体、プロテインＡなどを上記標識物質により標識してもよい。また、酵素を標識物質として用いた場合には、その活性を測定するため、基質、発色剤などが用いることができる。例えば、酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼを用いる場合には、基質にＨ２Ｏ２を用い、発色剤に２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸］アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、５−アミノサリチル酸、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）等、酵素にアルカリフォスファターゼを用いる場合には、基質として、オルトニトロフェニルフォスフェート等、酵素にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合には、基質としてフルオレ
セイン−ジ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシド）等を用いることができる。【００２９】  本発明のモノクローナル抗体は、上記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）いずれかのペプチドを抗原として得ることができる。上記ペプチドのうち、修飾アミノ酸を含まない部分に対する抗体が産生されることを極力避けるため、上記修飾アミノ酸残基が上記ペプチドの中央部に位置するペプチドを抗原として使用することが好ましい。また、後述するキャリアータンパク質との結合のため、上記ペプチドのＮ末端またはＣ末端にシステインを付加したものやＮ末端のαアミノ基を保護するためＮ末端のαアミノ基にアセチル基を導入したものを用いてもよい。【００３０】  前記抗原の調製方法は、従来公知の方法がいずれも使用可能であるが、例えば、ペプチド自動合成装置を用いた公知のペプチド合成方法によって、あるいは前記抗原をコードするＤＮＡを含む形質転換体を培養することにより調製することができる。【００３１】  前記ペプチド自動合成装置を用いた公知のペプチド合成方法としては、固相合成法、液相合成法のいずれを用いてもよく、例えば、固相合成法により合成する場合には、ペプチドが結合した固相担体をフッ化水素で処理して、ペプチドを固相担体より遊離させ、同時にアミノ酸側鎖の保護基を除去することにより目的のペプチドを得ることができる。得られたペプチド粗生成物は、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶等により精製単離することができる。【００３２】  上記抗原をコードするＤＮＡを含む形質転換体を用いて前記抗原を調製する場合には、例えば、前記抗原のアミノ酸配列に基づいてデザインされたＤＮＡプローブまたはプライマーを用いて、上記抗原をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を得る。この形質転換体を常法に従って培養すると、細胞内または細胞外に目的のポリペプチドが産生される。産生されたペプチドは、通常の精製方法、例えば、限外ろ過、分子ふるいクロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーにより精製することができる。【００３３】  上記のようにして得られるペプチド抗原を用いた、本発明のモノクローナル抗体の作製方法を以下に説明する。【００３４】  まず、上記抗原で動物を免疫する。上記抗原は、不溶化したものを直接免疫してもよく、上記抗原とキャリアータンパク質との複合体を免疫してもよい。キャリアータンパク質としては、特に限定されず、例えば、オボアルブミン、γグロブリン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＨＬ）、ＢＳＡ等の従来公知の各種タンパク質を挙げることができる。上記抗原をキャリアータンパク質に結合する方法としては、システイン残基のＳＨ基を利用する方法（ＭＢＳ法）、アミノ基を利用する方法（ビスイミドエステル法、グルタルアルデヒド法）、フェノールを利用する方法（ビス−ジアゾベンチジン法）、カルボキシル基を利用する方法（カルボジイミド法）などを挙げることができる。これらの方法に
は、種々の架橋剤を用いることができ、例えば、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミド、ビス−ビアゾ化ベンジジン等を用いることができる。前記動物としてはウサギ、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ハムスター、ニワトリ等を挙げることができる。上記免疫は、動物の腹腔内、静脈内、皮下等に前記抗原または前記複合体を投与することにより行い、投与に際して、前記抗原とともに、適当なアジュバント、例えば、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント等を投与してもよい。抗原の投与は、例えば、通常、１〜６週おきに１回ずつ計２〜１０回程度行う。血清中の抗体価の測
定は、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）、酵素免疫検定法（ＥＩＡ）、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫検定法（ＦＩＡ）等の従来公知の方法が何れも使用できるが、検出感度、迅速性等の観点から、ＥＬＩＳＡ法が好適である。免疫に用いた上記抗原に対して、十分な抗体価を示した動物から本発明のモノクローナル抗体を調製する。【００３５】  上記十分な抗体価を示した動物の脾臓またはリンパ節を摘出し、これらに含まれる抗体産生細胞（脾臓細胞またはリンパ球）と骨髄腫細胞とを融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製する。【００３６】  前記抗体産生細胞の採取は、従来公知の方法に従い行うことができ、例えば、脾臓細胞の場合、動物より摘出した脾臓を両端で切除し、押し出し、ガーゼでこすことによって、融合用の脾臓細胞を得ることができる。【００３７】  細胞融合に用いられる骨髄腫細胞には特に制限はなく、公知の細胞株から適宜選択できるが、前記骨髄腫細胞としては、Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＮＳ−１、ＳＰ２／０、Ｘ６３．６５３、Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８（Ｐ３）、ＦＯ等を挙げることができ、Ｐ３Ｕ１が特に好ましい。これらの細胞株は、適当な培地、例えば、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０倍地にグルタミン、２−メルカプトエタノール、ゲンタマイシン及びウシ胎児血清を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに８−アザグアニンを加えた培地〕で継代し、細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日に２×１０７個以上の細胞数を確保しておくことが好ましい。【００３８】  上記のように免疫した抗体産生細胞と骨髄腫細胞との融合およびハイブリドーマの選択は、従来公知の方法により行うことができる。細胞融合の方法としては、例えば、センダイウイルスを使用する方法、ポリエチレングリコール等の高分子ポリマーを使用する化学的方法や高電圧パルスによる電気穿孔法等を挙げることができ・ＢＲ＞驕Ｂ例えば、ポリエチレングリコールを用いる方法の場合、抗体産生細胞数と骨髄腫細胞数の好ましい比率としては、１：１〜１０：１程度であり、分子量１０００〜６０００のポリエチレングリコールを１０〜５０％の濃度で添加し、通常、室温、好ましくは３７℃で、通常５分間インキュベートすることにより細胞融合を実施することができる。ハイブリドーマの選択は、通常、ＨＡＴ培地（正常培地にヒポキサンチン、アミノプリテン、チミジンを加えた培地）で未融合細胞とハイブリドーマを培養して、アミノプリテン耐性を備えたハイブリドーマのみを選択的に増殖させることにより行うことができる。【００３９】  上記のようにして得られたハイブリドーマのクローニングは、従来公知の方法を使用することができ、例えば、メチルセルロース法、軟アガロース法、限界希釈法等を挙げることができるが、限界希釈法が特に好適である。この方法では、例えば、通常培地で１〜２週間程度培養し、免疫原に対して抗対価の認められるものについて、限界希釈法により、さらにクローニングを２回程度繰り返し、安定して高い抗体価の認められたものを本発明のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。抗体価の測定は、上記抗血清の抗体価測定法に準じて行うことができる。【００４０】  このようにしてクローニングされたハイブリドーマ株としては、ハイブリドーマＰ５３Ｎｏ．１８  ４Ｂ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５６１、２００５年２月１８日付国際寄託）、ハイブリドーマＰ５３Ｎｏ．１７  １６Ｂ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４７８、２００５年３月２５日付寄託）、ハイブリドーマＰ５３Ｎｏ．２３  １Ｃ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４７９、２００５年３月２５日付寄託）、ハイブリドーマＰ５３Ｎｏ．５  １６Ａ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５６２、２００５年３月２５日付国際寄託）、ハイブリドーマＰ５３Ｎｏ．１０  ６Ａ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５６３、２００５年３月２５日付国際寄託）、ハイブリドーマＰ５３Ｎｏ．２  ２０Ｇ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４８０、２００５年３月２９日付寄託）等があり、これらは独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。【００４１】  上記のハイブリドーマ株としては、ハイブリドーマＰ５３Ｎｏ．１８  ４Ｂ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５６１）、ハイブリドーマＰ５３Ｎｏ．５  １６Ａ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５６２）、ハイブリドーマＰ５３Ｎｏ．１０  ６Ａ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５６３）が好ましい。【００４２】  また、上記のようにクローニングされた他のハイブリドーマ株としては、Ｐ５３Ｎｏ．３３Ｂｃ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５７６）、Ｐ５３Ｎｏ．４  １３Ｃ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５７７）、Ｐ５３Ｎｏ．１１  ７Ｃ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５７８）、Ｐ５３Ｎｏ．１２  １Ａ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５７９）、Ｐ５３Ｎｏ．２２  １１Ｂ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５８０）またはＰ５３Ｎｏ．２３  １Ａ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５８１）等があり、これらは独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００６年３月２７日付で国際寄託されている。【００４３】  上記のようにして得られたハイブリドーマを適当な培地中で培養し、その培養上清を従来公知の方法により精製することによって本発明のモノクローナル抗体を製造することができる。この方法は、高純度のモノクローナル抗体を得る場合に好適に用いることができる。また、上記ハイブリドーマをマウスの腹腔内に注射すると腹水癌化し、本発明のモノクローナル抗体を含む腹水が得られる。これを従来公知の方法により精製することによっても本発明のモノクローナル抗体を製造することができる。この方法は、モノクローナル抗体を大量生産する場合に好適に用いることができる。上記モノクローナル抗体の既知の精製方法としては、例えば、硫安塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法等を挙げることができる。【００４４】  上記のようにして得られた本発明のモノクローナル抗体を使用して、ｐ５３タンパク質の翻訳後修飾の状態を修飾部位特異的に検出、定量することが可能である。具体的な検出、測定には、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）、酵素免疫検定法（ＥＩＡ）、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫検定法（ＦＩＡ）、発光免疫検定法等、従来公知の方法が何れも使用することがで���る。これらの測定方法は、一般的な競合法やサンドイッチ法等の手法に従って実施することができる。【００４５】  また、本発明によれば、上記本発明のモノクローナル抗体を基板上に固定化したことを特徴とする抗体マイクロアレイが提供される。ここで、抗体マイクロアレイ（抗体チップ、プロテインチップともいう）とは、基板上に抗体を整列（アレイ）して固定化させたデバイスを意味する。【００４６】  本発明の抗体マイクロアレイは、１種または２種以上の上記モノクローナル抗体を含んでいればよく、基板に固定化されるモノクローナル抗体の数は特に限定されない。また、前記基板上に固定化されるモノクローナル抗体には、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ等の抗体断片も含まれ、生物種や製造方法には限定されない。また、ハイブリッド抗体、改変抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体等ハイブリドーマを用いずに製造されたものも含まれる。複数種の上記モノクローナル抗体を固定化した抗体マイクロアレイは、一つの試料に対して、同時かつ網羅的にｐ５３の翻訳後修飾の有無および量を修飾部位特異的に検出することが可能であり、翻訳後修飾されたｐ５３のプロファイリング、翻訳後修飾シグナル経路の検出等に好適に用いることができる。【００４７】  前記基板上に固定化されるモノクローナル抗体は、使用目的に応じて、適宜適当な標識物質により標識することができる。標識物質としては、使用目的に応じて適宜選択されるが、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、アセチルコリンエステラーゼなどの標識酵素、Ｃｙ３、Ｃｙ５、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等の蛍光物質、放射性同位元素、ビオチンなどを用いることができる。また、本発明の抗原を標識することなく、本発明の抗体と特異的に結合する二次抗体、プロテインＡなどを標識して使用してもよい。【００４８】  上記抗体マイクロアレイは、上記モノクローナル抗体を基板上に固定化することにより作製することができる。基板の材質、大きさ、形状は特に限定されない。抗体マイクロアレイの基板としては、例えば、ガラス、ポリスチレン、ニトロセルロース、フッ化ビニリデン等、従来公知の何れの基板も使用することができ、これらを化学表面処理（シラン化、アミノ化、アルデヒド化、チオール化、エポキシ化、活性エステル化）、金被覆、アルミニウム被覆、ポリリジンなどのカチオン性ポリマー被覆、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲルなどの親水性ポリマー被覆したものなどを用いることができる。具体的には、高密度アミノ基導入タイプ、アミノシランコートタイプ、ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅタイプ、アルデヒド基導入タイプ、Ｔａｋａｒａ−ＨｕｂｂｌｅＳｌｉｄｅ  Ｇｌａｓｓ等市販のコーティング済スライドガラスを例示することができるが、安定にシグナルを得ることができるという点で、Ｘ基−アミノ修飾オリゴＤＮＡ固定用マイクロアレイ用コートが好ましい。【００４９】  また、前記基板に抗体を固定化する方法としては、光リソグラフィー法、マイクロスタンプ法、メカニカルマイクロスポット（接触型）法、マイクロピペッティング法、マ��クロディスペンシング（非接触型）法、ジェットプリント法、エレクトロスプレーデポジッション（ＥＳＤ）法、ナノリソグラフィー法、その他従来公知の方法が何れも使用することができる。マイクロアレイした後の固定化は、基材の種類にもよるが、物理吸着、イオン結合、共有結合（アミド結合、シッフ塩基、エーテル結合、ジスルフィド結合、化学架橋、光固定等）、アフィニティ結合（ＧＳＴタグ、Ｈｉｓタグ、ビオチン−アビジン）を挙げることができ、安定化、高感度化のためには、共有結合が好ましい。コーティングスライドガラスを基材として用いる場合には、必要に応じてコーティングスライドガラスを前処理してもよい。抗体のスポッティングに使用するスポッティング溶液には、従来公知のスポッティング溶液を使用することができるが、等張液が好ましく、ＰＢＳが特に好ましい。スポッティングは従来公知のアレイ機等を用いて行うことができる。スポッティングの後には、必要に応じて非特異的反応が起こらないようブロッキング処理を行うことが好ましい。ブロッキング溶液としては、従来公知のブロッキング溶液を適宜選択して使用することができるが、エタノールアミン、グリシン、ＢＳＡが好ましく、エタノールアミンが特に好ましい。【００５０】  本発明の抗体マイクロアレイを用いた検出、測定方法としては、蛍光色素のシグナル強度を検出する方法、酵素化学発光を利用した検出方法、表面プラズモン共鳴現象を利用する方法、マススペクトルを利用する方法や電気化学的に測定する方法がある。蛍光色素のシグナル強度を検出する方法としては、例えば、試料中のタンパク質をＣｙ５、コントロールをＣｙ３で標識し、これを混合して、本発明の抗体マイクロアレイに接触させ、各タンパク質の蛍光色の相違を利用する方法を挙げることができる。また、試料中のタンパク質をビオチンでラベルして、本発明の抗体マイクロアレイにより検出してもよい。酵素化学発光を利用する方法としては、例えば、サンドイッチ法の場合、本発明の抗体マイクロアレイと抗原を結合させた後、ビオチン標識された２次抗体を結合させ、ストレプトアビジン標識西洋ワサビペルオキシダーゼを用いて化学発光を検出することができる。電気化学的方法の場合、上記モノクローナル抗体をプローブとして固定化する基材に伝導性物質を用い、これを電極として使用することができる。【００５１】  本発明の抗体マイクロアレイによれば、ｐ５３上の複数の翻訳後修飾部位の修飾状態を同時かつ網羅的に検出することができる。例えば、本発明の抗体マイクロアレイにストレスを受けた細胞由来のｐ５３タンパク質を反応させる。その結果、例えば、３７３番目のリジン残基がアセチル化され、３９２番目のセリン残基がリン酸化されていることがわかれば、このストレスを受けた場合のｐ５３修飾部位の修飾状況を明らかにすることができる。【００５２】  また、他の態様としては、本発明の抗体マイクロアレイを疾患（特に癌）の診断に使用することができる。例えば、ある癌患者由来のｐ５３タンパク質をＣｙ５で標識し、健常者由来のｐ５３タンパク質をＣｙ３で標識して、これらを混合し、本発明の抗体マイクロアレイと接触させ、市販のレーザーを用いたマイクロアレイ・リーダー��より、蛍光色素の蛍光強度を測定すれば、癌患者由来のｐ５３の翻訳後修飾の状態を検出・定量することができる。さらに、他の態様としては、本発明の抗体マイクロアレイを用いて、抗癌剤や免疫抑制剤に有用な化合物をスクリーニングすることができる。【００５３】  また、本発明によれば、本発明のモノクローナル抗体または本発明の抗体マイクロアレイ若しくはその両方を含むｐ５３タンパク質の翻訳後修飾の測定キットが提供される。本発明の測定キットによれば、ｐ５３タンパク質の翻訳後修飾の状態を簡便かつ迅速に測定することができる。本発明の測定キットに含まれるモノクローナル抗体および抗体マイクロアレイに固定化された抗体プローブは、検出を容易にするため適当な標識物資で標識することが好ましく、特にＦＩＴＣ、ビオチンにより標識することが好ましい。【００５４】  また、本発明の測定キットには、本発明のモノクローナル抗体または抗体マイクロアレイのほか、測定、検出を実施するに際して必要な任意の他の試薬を更に包含することができる。具体的には、例えば、前述の修飾ペプチド抗原または蛍光標識した修飾ペプチド抗原、アッセイ緩衝液、検出用抗体、蛍光標識２次抗体、ブロッキング液等を例示することができ、酵素標識を用いる場合には、基質、発色剤等も例示することができる。【００５５】  さらに、本発明によれば、本発明のモノクローナル抗体または抗体マイクロアレイを用いることを特徴とする、ｐ５３タンパク質の翻訳後修飾状態の測定方法が提供される。かかる方法によれば、ｐ５３タンパク質の翻訳後修飾の状態を簡便かつ迅速に測定することができる。【００５６】  上記測定方法は、例えば、次のように行うことができる。種々の細胞ストレスを負荷した条件下で細胞を培養し、これからｐ５３を調製する。次いで、調整されたｐ５３と本発明のモノクローナル抗体とを接触（反応）させ、ストレス負荷条件下におけるｐ５３の翻訳後修飾の状態を部位特異的に検出する。検出に本発明の抗体マイクロアレイを用いれば、ｐ５３上の複数の翻訳後修飾部位の修飾状態を同時かつ網羅的に測定することができ好ましい。【００５７】  その他の実施態様としては、本発明のモノクローナル抗体または抗体マイクロアレイを用いることを特徴とする、癌の診断方法も本発明により提供される。具体的には、例えば、ある癌患者由来のｐ５３タンパク質をＣｙ５で標識し、健常者由来のｐ５３タンパク質をＣｙ３で標識して、これらを混合し、本発明のモノクローナル抗体、抗体マイクロアレイと接触させ、色素蛍光強度の相対変化量を測定すれば、癌患者由来のｐ５３の翻訳後修飾の状態を検出・定量でき、これを前記癌の診断に利用することができる。また、本発明のモノクローナル抗体または抗体マイクロアレイを用いることを特徴とする抗癌剤として有用な化合物をスクリーニングする方法も提供される。さらには、本発明のモノクローナル抗体を有効成分として含有する医薬組成物、抗癌剤も本発明により提供される。
【実施例】
【００５８】  以下、本発明の構成と効果を具体的に示す実施例等について説明する。なお、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
＜実施例１＞
（１）抗原ペプチドの選択および合成
３９３アミノ酸残基からなるｐ５３タンパク質のうち、目的とするｐ５３翻訳後修飾部位を含むペプチド配列をデザインし、それらのペプチドを合成した。該ペプチドはＮ末端あるいはＣ末端にシステインを付加し、かつＮ末端αアミノ基をアセチル基で保護した。表１（表中、Ａｃはアセチル基、Ｓ（Ｐ）はリン酸化セリン、Ｔ（Ｐ）はリン酸化スレオニン、Ｋ（Ａｃ）はアセチル化リジンを表す）に示すように、配列番号２５〜４７で表されるアミノ酸配列からなる修飾ペプチド、配列番号４８〜７０で表されるアミノ酸配列からなる非修飾ペプチド（配列番号２５〜４７で表されるアミノ酸配列と同配列のペプチドであって、リン酸化またはアセチル化されていないペプチド）および配列番号７１〜９３で表されるアミノ酸配列からなる修飾ペプチド（配列番号２５〜４７で表されるアミノ酸配列からなる修飾ペプチドのＮ末端に１乃至２残基のアミノ酸を付加した修飾ペプチド）を合成した。合成方法を以下に説明する。【００５９】
【表１】
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ペプチド合成はＦｍｏｃ  ｃｈｅｍｉｓｔｏｒｙを用いた手動固相合成法で行った。合成スケールは０．２ｍｍｏｌ、リン酸化セリン（Ｓｅｒ（Ｐ））、リン酸化スレオニン（Ｔｈｒ（Ｐ））、アセチル化リジン（Ｌｙｓ（Ａｃ））は、それぞれＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＰＯ（ＯＢｚｌ）ＯＨ）−ＯＨ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ＰＯ（ＯＢｚｌ）−ＯＨ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−ＯＨを用いて導入した（表２：Ｆｍｏｃ−アミノ酸残基）。Ｎ末端は、無水酢酸（１ｍｍｏｌ）でアセチル化した。合成ペプチドは、ＲｅａｇｅｎｔＫ（８２．５％トリフルオロ酢酸、５％水、５％チオアニソール、５％フェノール、２．５％１，２−エタンジチオール）、室温、３時間で脱樹脂・脱保護反応を行った。【００６０】
【表２】
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上記のようにして得られたペプチドは、ＰＲＥ−ＰＡＣＫＥＤ  ＣＯＬＵＭＮ  ＲＴ  ２５０−２０（ＭＩＧＨＴＹＳＩＳ  ＲＰ−１８  ＧＰ  ５μｍ）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製した。溶出は０．０５％ＴＦＡ−アセトニトリルの直線濃度勾配により行った。精製されたペプチドを含む画分を回収後、凍結乾燥した。最終的に、精製されたペプチドの純度は、ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ＰＲＥ−ＰＡＣＫＥＤ  ＣＯＬＵＭＮ  ＲＴ  ２５０−４．６（ＭＹＧＨＴＹＳＩＳ  ＲＰ−１８  ＧＰ  ５μｍ）を用いた高速液体クロマトグラフィーおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＰＲＯ）によって確認した。得られた各合成ペプチドの質量分析の結果を表３に示す。【００６１】
【表３】
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（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
ＫＬＨ（ＰＩＥＲＣＥ社製、Ｎｏ．７７６００）に対して、Ｎ−（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）スクシンイミド〔Ｎ−（ｍ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：以下、ＭＢＳという〕（ＰＩＥＲＣＥ社製、Ｎｏ．２２３１１）１ｍｇ／０．４ｍＬ  Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以下、ＤＭＦＡという）を混合し、１時間、室温で反応させた後、０．０５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化した脱塩カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５、ファルマシア社製）に供し、遊離のＭＢＳを除去して、ＫＬＨ−マレイミド１０ｍｇを得た。上記（１）で合成した、配列番号２５〜４７で表されるアミノ酸配列からなる修飾ペプチド５ｍｇに対してＫＬＨ−マレイミドを１０ｍｇ加えて室温で２時間反応させ、得られたペプチド−ＫＬＨ複合体を抗原として用いた。【００６２】  予備飼育したＢＡＬＢ／ｃマウス（各ペプチド当たり５匹使用）に対して、ＫＬＨ−複合体を５０μｇ／匹となるよう、完全フロイントアジュバント（ＩＣＮ／Ｃａｐｐｅｌ社製、Ｎｏ．５５８２）とともに、マウス背部に１０箇所程度皮下投与した。以後２週間おきに同量の免疫原を完全フロイントアジュバントとともに５回追加免疫した。マウス尾静脈より採血し、その血清抗体価を下記（３）のＥＬＩＳＡ測定法で調べた。【００６３】  （３）抗体価のＥＬＩＳＡ測定法
９６ウェルの免疫プレート（ＮＵＮＣ社製）に上記（１）で合成した抗原ペプチド５μｇ／ｍｌをそれぞれ１００μｌ／ウェルずつ分注し、４℃で一晩放置して抗原をプレートにコートした。次いで、液除去後、洗浄液（０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液）にて２回洗浄した後、洗浄液で各ウェルを満たし、室温で２時間インキュベートした。溶液を除去後、希釈液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液）にて希釈した抗血清（１０００倍より２段階希釈）を各ウェルに１００μｌ加え、室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、溶液を除去し、洗浄液で３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社製）を各ウェルに１００μｌ加え、室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、溶液を除去し、洗浄液で３回洗浄した後、基質液（オルトフェニレンジアミン１０ｍｇをクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）２５ｍｌに溶解した溶液に、過酸化水素５μｌを加えた溶液）を各ウェルに１００μｌ加え、２０分間発色させ、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を１００μｌ加えて発色を停止させ、Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＲａｄ社製）で４９２ｎｍの吸光度を測定した。【００６４】  （４）モノクローナル抗体の精製
十分な抗体価を示したマウスから最終免疫４日後に脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁して脾臓細胞懸濁液を得た。細胞融合に用いるミエローマ細胞としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来ミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（３ＰＵ１）を用いた。１２．５ｍＭＨＥＰＥＳを含む無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で、脾臓細胞およびミエローマ細胞を数回洗浄し、脾臓細胞とミエローマ細胞の細胞比が１０：１になるよう両細胞を混合した後、室温で遠心して培地を除去した。沈殿した細胞をよくほぐし、そこに３７℃に加温したポリエチレングリコール（ＰＥＧ、シグマ社製）を１ｍｌ加え、細胞とＰＥＧをよく混和させ、３７℃で５分程度静置して融合を行った後、３７℃に加温した１０％胎児牛血清（ＦＣＳ）を含むＴＩＬメディア（ＩＢＬ社製）１５ｍｌを約５分間かけて滴下し、さらに１０％ＦＣＳを含むＴＩＬメディア２０ｍｌを加えて室温で遠心し、上清を吸引除去した。次いで、３７℃に加温した１０％ＦＣＳを含むＴＩＬメディアを加え、静かにピペットで混和後、９６ウェルのマイクロプレートに脾臓細胞が２×１０５個／ウェルとなるように１００μｌずつ分注した。１日後、１０％ＦＣＳを含むＨＡＴ培地（コスモバイオ社製）を加えて、３７℃、５％炭酸ガス下で培養した。１日後、２日後、さらに２〜３日後ごとに培地の半量を吸引除去し、１０％ＦＣＳを含むＨＡＴ培地を添加した。１０日〜２週間後に培地の半量を吸引除去し、１０％ＦＣＳを含むＨＴ培地（ギブコ社製）に交換し、適当な時期に、以下（５）のＥＬＩＳＡ測定法により、抗体産生ハイブリドーマを検索した。【００６５】  （５）ハイブリドーマ培養上清のＥＬＩＳＡ測定法
９６ウェルの免疫プレート（ＮＵＮＣ社製）に前記（１）で合成した抗原ペプチド１μｇ／ｍｌをそれぞれ５０μｌ／ウェルずつ分注し、４℃で一晩放置して抗原ペプチドをプレートにコートした。次いで、溶液除去後、洗浄液（０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液）にて２回洗浄した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を各ウェルに加え、室温で２時間インキュベートした。液除去後、培養上清を各ウェルに５０μｌ加え、室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、溶液を除去し、洗浄液で３回洗浄した後、希釈液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液）にてＨＲＰＯ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社製）を１０，０００倍希釈したものを各ウェルに５０μｌ加え、室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、溶液を除去し、洗浄液で３回洗浄した後、基質液（オルトフェニレンジアミン１０ｍｇをクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）２５ｍｌに溶解した溶液に、過酸化水素５μｌを加えた溶液）を各ウェルに５０μｌ加え、２０分間発色させ、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を１００μｌ加えて発色を停止させ、Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＲａｄ社製）で４９２ｎｍの吸光度を測定した。【００６６】  （６）抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニング
上記のようにして得られたハイブリドーマのうち、以下３点の条件を満たすハイブリドーマをスクリーニングした。
１．免疫した抗原修飾ペプチドに対して、ポジティブである。
２．抗原ペプチドのＮ末端に１残基付加したペプチドに対してポジティブである。
３．抗原ペプチドと同じ配列であるが修飾（リン酸化またはアセチル化）されていないペプチドに対してネガティブである。
スクリーニングには、上記（５）のＥＬＩＳＡ測定法を用いた。特に、精度よくかつ効率よく抗体を作製するため、選択した２０ウェルを培養後凍結保存するとともに、５＋１ウェルのクローニングを開始し、１次スクリーニングあるいはクローニングの際に適当なものがない場合には、１段階戻ったストックから再度実施した。また、ＥＬＩＳＡ測定の精度を高めるため、同一プレート内で３種のペプチドに対するスクリーニングを実施した。
クローニングは、限界希釈法および上記（５）のＥＬＩＳＡ測定を数回繰り返すことにより行い、本発明のハイブリドーマを得た。得られたハイブリドーマは視覚的判断によりモノクローンであった。【００６７】  このようにしてクローニングされたハイブリドーマ株としては、ハイブリドーマＰ５３Ｎｏ．１８  ４Ｂ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５６１、２００５年２月１８日付国際寄託）、ハイブリドーマＰ５３Ｎｏ．１７  １６Ｂ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４７８、２００５年３月２５日付寄託）、ハイブリドーマＰ５３Ｎｏ．２３  １Ｃ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４７９、２００５年３月２５日付寄託）、ハイブリドーマＰ５３Ｎｏ．５  １６Ａ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５６２、２００５年３月２５日付国際寄託）、ハイブリドーマＰ５３Ｎｏ．１０  ６Ａ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５６３、２００５年３月２５日付国際寄託）、ハイブリドーマＰ５３Ｎｏ．２  ２０Ｇ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４８０、２００５年３月２９日付寄託）等があり、これらは独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。【００６８】  上記のハイブリドーマ株としては、ハイブリドーマＰ５３Ｎｏ．１８  ４Ｂ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５６１）、ハイブリドーマＰ５３Ｎｏ．５  １６Ａ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５６２）、ハイブリドーマＰ５３Ｎｏ．１０  ６Ａ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５６３）が好ましい。【００６９】  また、上記のようにクローニングされた他のハイブリドーマ株としては、Ｐ５３Ｎｏ．３  ３Ｂｃ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５７６）、Ｐ５３Ｎｏ．４  １３Ｃ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５７７）、Ｐ５３Ｎｏ．１１  ７Ｃ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５７８）、Ｐ５３Ｎｏ．１２  １Ａ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５７９）、Ｐ５３Ｎｏ．２２  １１Ｂ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５８０）またはＰ５３Ｎｏ．２３  １Ａ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０５８１）等があり、これらは独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００６年３月２７日付で国際寄託されている。【００７０】  クローニング後、得られたハイブリドーマを無血清培地に交換して、本発明のモノクローナル抗体を得た。【００７１】  上記（５）のＥＬＩＳＡ測定法を用いて、得られたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体の修飾抗原ペプチドおよび非修飾抗原ペプチドに対する反応性を確認した。その結果の一部を表４及び表５に示す（表中、「ｐ５３Ｎｏ．１７  １６Ｂａ」、「ｐ５３Ｎｏ．１８  ４Ｂａ」等は、各クローニング細胞から産生されるモノクローナル抗体を表し、各数値は４９２ｎｍにおける吸光度を表す）。【００７２】
【表４】
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表４が示すように、得られたハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体は、修飾抗原ペプチドおよび修飾抗原ペプチドのＮ末端にアミノ酸を１残基付加したペプチドと特異的に反応し、非修飾抗原ペプチドとは反応しないことが確認された。【００７３】
【表５】
2006106957.tif 000009
表５に示すように、得られたハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体は、修飾抗原ペプチドおよび修飾抗原ペプチドのＮ末端にアミノ酸を１残基付加したペプチドと特異的に反応し、非修飾抗原ペプチドとは反応しないことが確認された。【００７４】［リン酸化認識抗体交叉（交差）反応性］
９６ウェルの免疫プレート（ＮＵＮＣ社製）に表１の配列番号２５〜４０（リン酸化修飾抗原ペプチド）の各ペプチドを１μｇ／ｍｌをぞれぞれ５０μｌ／ウェルで分注し、室温で一晩放置して抗原ペプチドをプレートにコートした。次いで、溶液除去後、洗浄液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ溶液）にて５回洗浄した後、４％ＢＳＡを含むＴＢＳ溶液を各ウェルに２００μｌずつ加え、室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、溶液を除去し、洗浄液で５回洗浄した後、ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳ培養上清、及びＣＯＳＭＥＤＩＵＭ培養上清（グラフ中の（Ｎ）はＣＯＳＭＥＤＩＵＭ培養上清を示す。）を各ウェルに４５μｌずつ加え、室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、溶液を除去し、洗浄液で５回洗浄した後、希釈液（４％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ溶液）にてＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、製品Ｎｏ．ＳＣ−２０３１）を５０００倍希釈したものを各ウェルに４０μｌ加え室温で３０分インキュベートした。インキュベーション後、溶液を除去し、洗浄液で５回洗浄した後、基質液（ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ  ＦＡＳＴ）５０ｓｅｔ（Ｓｉｇｍａ社製：製品Ｎｏ．Ｐ９１８７）を各ウェルに１００μｌ加え、２０分間反応させた。１０％Ｈ２ＳＯ４を５０μｌ加えて発色を停止させ、（ＩｍｍｕｎｏＭｉｎｉ  ＮＪ−２３００）（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。Ｆｉｇ．４〜１０は、モノクローナル抗体との交叉反応性の結果を示す。縦軸は、４９０ｎｍでの吸光度の数値である。【００７５】  Ｆｉｇ．４に示すように、ｐ５３Ｎｏ．３  ３Ｂａ、ｐ５３Ｎｏ．３  ３Ｂｂ、ｐ５３Ｎｏ．３  ３Ｂｃは、リン酸化修飾Ｓｅｒ１５と特異的に反応することが確かめられた。また、ＣＯＳＭＥＤＩＵＭ培養上清と反応させたペプチドであっても、ｐ５３Ｎｏ．３  ３Ｂａ（Ｎ）、ｐ５３Ｎｏ．３  ３Ｂｂ（Ｎ）は、リン酸化修飾Ｓｅｒ１５と特異的に反応することが確かめられた。【００７６】  Ｆｉｇ．５に示すように、ｐ５３Ｎｏ．４  １３Ａ、ｐ５３Ｎｏ．４  １３Ｂ、ｐ５３Ｎｏ．４  １３Ｃは、リン酸化修飾Ｔｈｒ１８と特異的に反応することが確かめられた。また、ＣＯＳＭＥＤＩＵＭ培養上清と反応させたペプチドであっても、ｐ５３Ｎｏ．４  １３Ａ（Ｎ）、ｐ５３Ｎｏ．４  １３Ｃ（Ｎ）、は、リン酸化修飾Ｔｈｒ１８と特異的に反応することが確かめられた。【００７７】  Ｆｉｇ．６に示すように、ｐ５３Ｎｏ．５  ２Ｂ等は、リン酸化修飾Ｓｅｒ２０と特異的に反応することが確かめられた。【００７８】  Ｆｉｇ．７は、ｐ５３Ｎｏ．５  ２Ｂ（Ｎ）等のＣＯＳＭＥＤＩＵＭ培養上清と反応させたペプチドとの交叉反応性の結果を示す。Ｆｉｇ．７に示すように、ｐ５３Ｎｏ．５  ２Ｂ（Ｎ）等は、リン酸化修飾Ｓｅｒ２０と特異的に反応することが確かめられた。【００７９】  Ｆｉｇ．８に示すように、ｐ５３Ｎｏ．１０  ６Ａ、ｐ５３Ｎｏ．１０  ６Ｃは、リン酸化修飾Ｔｈｒ８１と特異的に反応することが確かめられた。また、ＣＯＳＭＥＤＩＵＭ��養上清と反応させたペプチドであっても、ｐ５３Ｎｏ．１０  ６Ａ（Ｎ）、ｐ５３Ｎｏ．１０  ６Ｂ（Ｎ）は、リン酸化修飾Ｔｈｒ８１と特異的に反応することが確かめられた。【００８０】  Ｆｉｇ．９に示すように、ｐ５３Ｎｏ．１１  ７Ａ、ｐ５３Ｎｏ．１１  ７Ｃは、リン酸化修飾Ｓｅｒ９０と特異的に反応することが確かめられた。【００８１】  Ｆｉｇ．１０に示すように、ｐ５３Ｎｏ．１２  １Ａ等は、リン酸化修飾Ｓｅｒ３１５と特異的に反応することが確かめられた。【００８２】［アセチル化認識抗体交叉（交差）反応性］
９６ウェルの免疫プレート（ＮＵＮＣ社製）に表１の配列番号４１、４２、４３、９０、４５、４６、４７（アセチル化修飾抗原ペプチド）の各ペプチドを１μｇ／ｍｌ、コントロールとして牛血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ  社製、製品Ｎｏ．Ａ７９０６）をぞれぞれ５０μｌ／ウェルで分注し、室温で一晩放置して抗原ペプチドをプレートにコートした。次いで、溶液除去後、洗浄液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ溶液）にて５回洗浄した後、４％ＢＳＡを含むＴＢＳ溶液を各ウェルに２００μｌずつ加え、室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、溶液を除去し、洗浄液で５回洗浄した後、ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳ培養上清、及びＣＯＳＭＥＤＩＵＭ培養上清（グラフ中の（Ｎ）はＣＯＳＭＥＤＩＵＭ培養上清を示す。）を各ウェルに４５μｌずつ加え、室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、溶液を除去し、洗浄液で５回洗浄した後、希釈液（４％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ溶液）にてＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、製品Ｎｏ．ＮＡ９３１Ｖ）を５０００倍希釈したものを各ウェルに４０μｌ加え室温で３０分インキュベートした。インキュベーション後、溶液を除去し、洗浄液で５回洗浄した後、基質液（ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ  ＦＡＳＴ）５０ｓｅｔ（Ｓｉｇｍａ社製：製品Ｎｏ．Ｐ９１８７）を各ウェルに１００μｌ加え、２０分間反応させた。１０％Ｈ２ＳＯ４を５０μｌ加えて発色を停止させ、（ＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＲｅａｄｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ５５０）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。Ｆｉｇ．１１は、モノクローナル抗体との交叉反応性の結果を示す。縦軸は、４９０ｎｍでの吸光度の数値である。【００８３】  Ｆｉｇ．１１に示すように、ｐ５３Ｎｏ．１８  ４Ｂはアセチル化修飾Ｌｙｓ３２０と、ｐ５３Ｎｏ．２２  １１Ｂはアセチル化修飾Ｌｙｓ３８１と、ｐ５３Ｎｏ．２３  １Ｄはアセチル化修飾Ｌｙｓ３８２と、各々特異的に反応することが確かめられた。また、また、ＣＯＳＭＥＤＩＵＭ培養上清と反応させたペプチドであっても、ｐ５３Ｎｏ．２３  １Ａ（Ｎ）は、アセチル化修飾Ｌｙｓ３８２と特異的に反応することが確かめられた。【００８４】［アセチル化認識抗体交叉（交差）反応性におけるモノクローナル抗体の濃度依存性］
（ｐ５３Ｎｏ．１８  ４Ｂ）９６ウェルの免疫プレート（ＮＵＮＣ社製）に表１の配列番号４２、６５の各ペプチドを１μｇ／ｍｌ、コントロールとして牛血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ  社製、製品Ｎｏ．Ａ７９０６）をぞれぞれ５０μｌ／ウェルで分注し、室温で一晩放置して抗原ペプチドをプレートにコートした。次いで、溶液除去後、洗浄液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ溶液）にて５回洗浄した後、４％ＢＳＡを含むＴＢＳ溶液を各ウェルに２００μｌずつ加え、室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、溶液を除去し、洗浄液で５回洗浄した後、ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳ培養上清を各ウェルに４５μｌずつ加え、室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、溶液を除去し、洗浄液で５回洗浄した後、希釈液（４％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ溶液）にてＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、製品Ｎｏ．ＮＡ９３１Ｖ）を５０００倍希釈したものを各ウェルに４０μｌ加え室温で３０分インキュベートした。インキュベーション後、溶液を除去し、洗浄液で５回洗浄した後、基質液（ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ  ＦＡＳＴ）５０ｓｅｔ（Ｓｉｇｍａ社製：製品Ｎｏ．Ｐ９１８７）を各ウェルに１００μｌ加え、２０分間反応させた。１０％Ｈ２ＳＯ４を５０μｌ加えて発色を停止させ、（ＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＲｅａｄｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ５５０）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。その結果をＦｉｇ．１２に示す。【００８５】  Ｆｉｇ．１２に示すように、ｐ５３Ｎｏ．１８  ４Ｂはアセチル化修飾Ｌｙｓ３２０を有する配列番号４２のペプチドと特異的に反応する（非修飾のペプチド（配列番号６５のペプチド）と比較して）ことが確かめられ、且つ、ｐ５３Ｎｏ．１８  ４Ｂの濃度低下によっても特異的反応が維持されていることが確かめられた。また、抗体濃度が高い場合でも優位にアセチル化を認識していることが確かめられた。【００８６】（ｐ５３Ｎｏ．２３  １Ａ）
９６ウェルの免疫プレート（ＮＵＮＣ社製）に表１の配列番号４７，７０の各ペプチドを１μｇ／ｍｌ、コントロールとして牛血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ  社製、製品Ｎｏ．Ａ７９０６）をぞれぞれ５０μｌ／ウェルで分注し、室温で一晩放置して抗原ペプチドをプレートにコートした。次いで、溶液除去後、洗浄液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ溶液）にて５回洗浄した後、４％ＢＳＡを含むＴＢＳ溶液を各ウェルに２００μｌずつ加え、室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、溶液を除去し、洗浄液で５回洗浄した後、ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳ培養上清を各ウェルに４５μｌずつ加え、室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、溶液を除去し、洗浄液で５回洗浄した後、希釈液（４％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ溶液）にてＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、製品Ｎｏ．ＮＡ９３１Ｖ）を５０００倍希釈したものを各ウェルに４０μｌ加え室温で３０分インキュベートした。インキュベーション後、溶液を除去し、洗浄液で５回洗浄した後、基質液（ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ  ＦＡＳＴ）５０ｓｅｔ（Ｓｉｇｍａ社製：製品Ｎｏ．Ｐ９１８７）を各ウェルに１００μｌ加え、２０分間反応させた。１０％Ｈ２ＳＯ４を５０μｌ加えて発色を停止させ、（ＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＲｅａｄｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ５５０）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。その結果をＦｉｇ．１３に示す。【００８７】  Ｆｉｇ．１３に示すように、ｐ５３Ｎｏ．２３  １Ａはアセチル化修飾Ｌｙｓ３８２を有する配列番号４７のペプチドと特異的に反応することが確かめられ、且つ、ｐ５３Ｎｏ．２３  １Ａの濃度低下によっても特異的反応が維持されていることが確かめられた。また、抗体濃度が高い場合でも優位にアセチル化を認識していることが確かめられた。【００８８】［ウエスタンブロット］
本発明における３８２Ａｃ−１Ａ抗体（ｐ５３Ｎｏ．２３  １Ａモノクローナル抗体）を用いたウエスタンブロットの結果をＦｉｇ．１４に示す。実験方法は以下の通りである。ＥＧＦＰ−ｐ５３Ｒ２７３Ｈ  ｉｎ  Ｈ１２９９  ｃｅｌｌ（ＡＴＣＣ社製、製品Ｎｏ．ＣＲＬ５８０３）に２５Ｊ／ｍ２（ジュール／平方メートル）の紫外線（ＵＶ）を照射させた後、２４時間後にｐ５３を含む細胞抽出液を回収した。本細胞抽出液に対して、３８２Ａｃ−１Ａ抗体を用いてウエスタンブロットを行ったところ、Ｆｉｇ．１４に示すように、ＵＶ依存的なｐ５３の３８２位アセチル化を検出できた。コントロールとしてｐ５３  ＤＯ−１ＩｇＧ２ａ抗体を用いた。【００８９】  ＜参考例１＞
（１）抗体マイクロアレイ作製上の諸条件の検討
本発明の抗体マイクロアレイに適したコーティングスライドガラスの検討を行った。検討は、Ｘ基−アミノ修飾オリゴＤＮＡ固定用マイクロアレイ用コート（松浪硝子工業株式会社製）、Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅコート（松浪硝子工業株式会社製）、高密度アミノ基導入コート（松浪硝子工業株式会社製）、エポキシ基導入コート（松浪硝子工業株式会社製）、ＴＹＰＥ７スライド（アマシャム社製）、アルデヒド基導入コート（松浪硝子工業株式会社製）、ＴａＫａＲａ−ＨｕｂｂｌｅＳｌｉｄｅ  Ｇｌａｓｓ（タカラバイオ）、ＳＭＢ  ＳｐｏｔＯｎＴＭ  ＤＮＡ  Ｓｌｉｄｅｓ（Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ  Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏｄｅｖｉｃｅｓ  Ａ／Ｓ社製）、Ｓｌｉｄｅ  Ａ（ＳＣＨＯＴＴ社製）、Ｇｅｎｅｓｌｉｄｅ１（東洋鋼板株式会社製）、Ｇｅｎｅｓｌｉｄｅ２（東洋鋼板株式会社製）、ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｒＴＭＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ  ｓｌｉｄｅｓ（ＥＸＩＱＯＮ社製）、ＣＭＴ−ＧＡＰＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）、ＳｕｐｅｒｃｈｉｐＣ１８（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）、およびＳｕｐｅｒｃｈｉｐＣ１８−３Ｄ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）コーティングスライドガラスについて行った。上記コーティングスライド上にｐ５３  ＤＯ−１ＩｇＧ２ａ抗体（以下、「ＤＯ−１抗体」という）を種々の濃度（５０、１００、５００、１０００μｇ／ｍｌ）でスポッティングし、３時間のインキュベーション後、５０ｍＭエタノールアミン（ｐＨ９．０）でブロッキングを行った。検出は、Ｃｙ５標識ＩｇＧ（４２．５ｎＭ）で行った。反応条件は室温、１時間であった。Ｆｉｇ．１（Ｆｉｇ．中、Ｘ：Ｘ基−アミノ修飾オリゴＤＮＡ固定用マイクロアレイ用コート、７−１：Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅコート、７−３：エポキシ基導入コート、７−５：ＴａＫａＲａ−ＨｕｂｂｌｅＳｌｉｄｅ  Ｇｌａｓｓ、７−６：アルデヒド基導入コート、７−７：ＳＭＢ  ＳｐｏｔＯｎＴＭ  ＤＮＡ  Ｓｌｉｄｅｓ、７−９：ｇｅｎｅｓｌｉｄｅ１、７−１０：ｇｅｎｅｓｌｉｄｅ２、７−１４：ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｒＴＭＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ  ｓｌｉｄｅｓを表す）に示すように、全てのスライドの中で、Ｘ基−アミノ修飾オリゴＤＮＡ固定用マイクロアレイ用コートが最も安定にシグナルを検出できた。【００９０】  ＜参考例２＞
（２）抗体マイクロアレイの保存状態の検討
タンパク質は乾燥状態に放置しておくと失活する可能性がある。そこで、乾燥状態を避けるため、保存条件の検討を行った。検討は次の３つの保存条件について行った。
１）スポッティング・固定化反応後、ＰＢＳ、４０％グリセロール、０．１％ＮａＮ３を含む溶液中で保存する。スライドをブロッキング後、スキャナーで検出する。
２）スポッティング・固定化反応後、ブロッキングを行い、ＰＢＳ、４０％グリセロール、０．１％ＮａＮ３を含む溶液中で保存し、スキャナーで検出する。
３）スポッティング・固定化反応後、ブロッキングを行い、スキャナーで検出する。
Ｆｉｇ．２に示すように、スポッティングを行った後、固定化反応を３時間行っただけでは、スポッティング後に保存液に放置しておくとスポットが流れてしまうことが確認された。しかし、上記２）の条件で保存すれば、スポットが流れることがなく、良好な状態でスライドを保存できることが示された。【００９１】  ＜参考例３＞
（３）スポッティング溶液の検討
コーティングスライドガラスに最も適したスポッティング溶液の検討を行った。ＤＯ−１抗体を種々のスポッティング溶液（Ａ：ＰＢＳ／４０％グリセロール／０．１％ＮａＮ３、Ｂ：ＰＢＳ／５０％ＤＭＳＯ／０．１％ＮａＮ３、Ｃ：ＰＢＳ／０．１％ＮａＮ３、およびＤ：Ｓｏｌ．Ｘ／０．１％ＮａＮ３）にてスポットし、固定化・ブロッキング後、Ｃｙ５標識ＩｇＧと反応させ、スキャナーで検出した。タンパク質の安定性、タンパク質を含むスポッティング溶液の揮発を防ぐためには、グリセロールやＤＭＳＯを添加すべきであるが、ＰＢＳ／０．１％ＮａＮ３が最適であった。【００９２】  ＜参考例４＞
４）抗体の固定化量の検討
５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌのＤＯ−１抗体、ならびに５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌのＣｙ３標識ＤＯ−１抗体をコーティングスライドガラス（松浪硝子工業株式会社製、アミノ修飾オリゴＤＮＡ固定マイクロアレイ用コート）上にスポットし、シグナル強度および固定化量を測定した。Ｆｉｇ．３に示すように、スポット量が増加するにつれて、固定化量は増加するが、シグナルを得るための固定化量は５００μｇ／ｍｌの濃度で飽和していることから、スポット量は５００μｇ／ｍｌが最適であることがわかる。【００９３】  ＜参考例５＞
（５）ブロッキング溶液の検討
スライドガラスコーティングに適したブロッキングの検討を行った。Ｃｙ３標識ＤＯ−１抗体を固定化した抗体マイクロアレイを以下のブロッキング溶液（エタノールアミン、グリシン）でブロッキングし、スキャナー（富士写真フイルム社製）で検出した。エタノールアミンでブロッキングを行った場合、グリシンでブロッキングを行った場合、ともに効率よくブロッキングが行われた。タンパク質同士の反応の阻害とならないことを考慮すると、エタノールアミンがブロッキング溶液として好ましい。【００９４】［配列表フリーテキスト］
配列番号２〜１７：合成ペプチド（リン酸化）
配列番号１８〜２４：合成ペプチド（アセチル化）
配列番号２５〜４０：合成ペプチド（リン酸化）
配列番号４１〜４７：合成ペプチド（アセチル化）
配列番号４８〜７０：合成ペプチド（非修飾）
配列番号７１〜８６：合成ペプチド（リン酸化）
配列番号８７〜９３：合成ペプチド（アセチル化）
【図１】
2006106957.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2006106957.tif 000023
【手続補正書】
【提出日】平成19年10月9日(2007.10.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
これらの要求に鑑み、従来から、Ｃｈｋ１、Ｃｈｋ２、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＤＮＰ−ＰＫの酵素活性を測定する方法が提案されており、これらの方法において使用されるｐ５３の翻訳後修飾部位特異的ポリクローナル抗体が知られている。
【特許文献１】国際公開第９９／３６５３２号パンフレット
【特許文献２】特開２０００−３２５０８６号公報
【特許文献３】特開２００１−１６１３９８号公報
【特許文献４】特表２００２−５２４０９２号公報
【特許文献５】特開２００３−９３０５６号公報
【非特許文献１】Tanaka, H他: Nature, 404:42-49, 2000
【非特許文献２】Oda, K 他: Cell, 102: 849-862, 2000
【非特許文献３】Chehab, N. Hら: Gene Dev., 14: 289-300, 2000
【非特許文献４】Shieh, S. Y他: Gene Dev., 14: 289-300, 2000
【非特許文献５】Banin, S他: Science, 281: 1674-1677, 1998
【非特許文献６】Tibbetts, R. S他:Gene Dev., 13:152-157, 1999
【非特許文献７】Dumaz, NおよびMeek, D. W: EMBO J., 18:7002-7010, 1999
【非特許文献８】Bulavin, D. V他, EMBO J., 18: 6845-6854, 1999
【非特許文献９】Sanchez-Prieto, R: Cancer Res., 60: 2464-2472, 2000
【非特許文献１０】Waterman, M. J. F他: Nature Genet., 19:175-178, 1998
【非特許文献１１】Gu, WおよびRoeder, R. G.: Cell, 90:595-606, 1997
【非特許文献１２】Sakaguchi, K他: Gene Dev., 12: 2831-2841, 1998
【非特許文献１３】Lambert, P. F他: J. Biol. Chem., 273:33048-33053, 1998
【非特許文献１４】田矢洋一編、実験医学、１９（Ｎｏ．９）：1050-1084、2001
【非特許文献１５】田矢洋一、細胞工学Vol. 22, No.1, p29-33、2003
【非特許文献１６】J Biol Chem. 2000 July 28 ; 275 (30) : 23199-23203
【非特許文献１７】J Biol Chem. 2002 April 12 ; 277 (15) : 12491-12494
【非特許文献１８】J Biol Chem. 2003 July 11 ; 278 (28) : 25568-25576
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】 
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
上記のように免疫した抗体産生細胞と骨髄腫細胞との融合およびハイブリドーマの選択は、従来公知の方法により行うことができる。細胞融合の方法としては、例えば、センダイウイルスを使用する方法、ポリエチレングリコール等の高分子ポリマーを使用する化学的方法や高電圧パルスによる電気穿孔法等を挙げることができる。例えば、ポリエチレングリコールを用いる方法の場合、抗体産生細胞数と骨髄腫細胞数の好ましい比率としては、１：１〜１０：１程度であり、分子量１０００〜６０００のポリエチレングリコールを１０〜５０％の濃度で添加し、通常、室温、好ましくは３７℃で、通常５分間インキュベートすることにより細胞融合を実施することができる。ハイブリドーマの選択は、通常、ＨＡＴ培地（正常培地にヒポキサンチン、アミノプリテン、チミジンを加えた培地）で未融合細胞とハイブリドーマを培養して、アミノプリテン耐性を備えたハイブリドーマのみを選択的に増殖させることにより行うことができる。 
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
上記のようにして得られたハイブリドーマのクローニングは、従来公知の方法を使用することができ、例えば、メチルセルロース法、軟アガロース法、限界希釈法等を挙げることができるが、限界希釈法が特に好適である。この方法では、例えば、通常培地で１〜２週間程度培養し、免疫原に対して抗体価の認められるものについて、限界希釈法により、さらにクローニングを２回程度繰り返し、安定して高い抗体価の認められたものを本発明のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。抗体価の測定は、上記抗血清の抗体価測定法に準じて行うことができる。 
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
【表３：合成ペプチドの質量分析の結果を示す】
【表３】
2006106957.tif 000024
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
ＫＬＨ（ＰＩＥＲＣＥ社製、Ｎｏ．７７６００）に対して、Ｎ−（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）スクシンイミド〔Ｎ−（ｍ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：以下、ＭＢＳという〕（ＰＩＥＲＣＥ社製、Ｎｏ．２２３１１）１ｍｇ／０．４ｍＬ  Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以下、ＤＭＦＡという）を混合し、１時間、室温で反応させた後、０．０５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化した脱塩カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５、ファルマシア社製）に供し、遊離のＭＢＳを除去して、ＫＬＨ−マレイミド１０ｍｇを得た。上記（１）で合成した、配列番号２５〜４７で表されるアミノ酸配列からなる修飾ペプチド５ｍｇに対してＫＬＨ−マレイミドを１０ｍｇ加えて室温で２時間反応させ、得られたペプチド−ＫＬＨ複合体を抗原として用いた。
【国際調査報告】
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