(57)【要約】  電気泳動チップ１１１のチャネル１０７に保液部１０８を設ける。また、電気泳動チップ１１１を内部に保持し、調湿液１１７を収容することにより電気泳動チップ１１１の温度を調整する機構を備えた電気泳動槽１１８を用いて電気泳動を行う。【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、該基板の表面に設けられた試料泳動用のチャネルとを有し、
前記チャネルは、その上部が開放された開放部と、その底部に多数の突起部が規則的に配置さている保液部と、を有し、
前記保液部が、電気泳動槽内での電気泳動操作時にも解放状態が維持されている開放部内、またはその近傍に設けられている
ことを特徴とする電気泳動チップ。
【請求項２】
請求項１に記載の電気泳動チップにおいて、前記チャネルの一端の近傍から他端の近傍にわたって前記保液部が設けられている電気泳動チップ。
【請求項３】
請求項１または２に記載の電気泳動チップにおいて、前記保液部が占める面積に対する前記保液部の表面積の比αと、前記チャネル底面の平坦面に対する試料を含む液体の接触角θとの積αｃｏｓθが、
｜αｃｏｓθ｜＞１
を満たすように前記保液部が構成されている電気泳動チップ。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかに記載の電気泳動チップにおいて、前記保液部は、略同一形状を有する複数の錐台形の柱状体が前記チャネルの延在方向に沿って規則的に配置された列の複数が、互いに平行に配置された構成を有する電気泳動チップ。
【請求項５】
請求項４に記載の電気泳動チップにおいて、前記柱状体の高さと前記チャネルの深さとが略等しい電気泳動チップ。
【請求項６】
請求項４または５に記載の電気泳動チップにおいて、前記保液部の底面または側面の少なくとも一部が前記柱状体の上面よりも親液化されている電気泳動チップ。
【請求項７】
請求項４乃至６のいずれかに記載の電気泳動チップにおいて、前記柱状体の上面または側面の少なくとも一部が前記保液部の底面よりも疎液化されている電気泳動チップ。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれかに記載の電気泳動チップにおいて、前記チャネル底部の前記保液部に隣接して、多数の突起を有する疎液部が設けられている電気泳動チップ。
【請求項９】
請求項３乃至７のいずれかに記載の電気泳動チップにおいて、前記保液部の外周を取り囲む平坦面を有する電気泳動チップ。
【請求項１０】
請求項８に記載の電気泳動チップにおいて、前記疎液部が平坦面を介して前記保液部に隣接している電気泳動チップ。
【請求項１１】
請求項１乃至１０のいずれかに記載の電気泳動チップにおいて、湿度調節機能を有する電気泳動槽中で用いられることを特徴とする電気泳動チップ。
【請求項１２】
請求項１乃至１１のいずれかに記載の電気泳動チップが収容される電気泳動槽と、
前記電気泳動槽内の湿度を調整する調湿手段と、
を備えることを特徴とする電気泳動装置。
【請求項１３】
請求項１２に記載の電気泳動装置において、前記調湿手段が、前記電気泳動槽の内部に設けられ、調湿液を収容する調湿液槽を有する電気泳動装置。
【請求項１４】
請求項１３に記載の電気泳動装置において、前記電気泳動チップの温度および前記調湿液槽の温度を調整する温度調整手段を備える電気泳動装置。
【請求項１５】
請求項１２乃至１４のいずれかに記載の電気泳動装置において、前記チャネルへの試料の供給のためのキャピラリを有し、該キャピラリが前記チャネルに電圧を印加するための電極を挿入し得る構造を有する電気泳動装置。
【請求項１６】
請求項１２〜１５のいずれかに記載の電気泳動装置を用いた試料の電気泳動方法であって、
前記電気泳動装置の有する電気泳動槽内に前記電気泳動チップを配置する工程と、
前記調湿手段により前記電気泳動槽の内部の湿度を調整する工程と、
試料を前記チャネルに導入する工程と、
前記チャネルに電圧を印加して前記試料の電気泳動を行う工程と、
を有することを特徴とする電気泳動方法。
【請求項１７】
前記試料の前記チャネルへの導入が、請求項１５に記載のキャピラリにより行なわれ、前記チャネルへの電圧印加が該チャネルに挿入した電極を介して行なわれる請求項１６に記載の電気泳動方法。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載の電気泳動方法であって、
電気泳動を行った後、前記調湿手段により前記電気泳動槽の内部の湿度を調節し、前記チャネル内の試料を乾燥させる電気泳動方法。
【請求項１９】
請求項１６乃至１８のいずれかに記載の電気泳動方法であって、
前記温度調節手段により前記電気泳動チップの温度を前記調湿液槽の温度以上に保持しながら電気泳動を行う電気泳動方法。
【請求項２０】
請求項１６乃至１９のいずれかに記載の電気泳動装置の使用方法であって、前記電気泳動を行った後、前記調湿液槽の温度を低下させて、前記試料を乾燥させる電気泳動方法。
【請求項２１】
請求項１６乃至２０のいずれかに記載の電気泳動方法であって、
前記電気泳動を行った後、前記電気泳動チップの温度を前記調湿液槽の温度以上としつつ、前記電気泳動チップおよび前記調湿液槽の温度を低下させて、前記試料を凍結させる電気泳動装方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の電気泳動装置の使用方法において、前記試料を凍結させた後、前記調湿液槽の温度をさらに低下させて、前記試料を凍結乾燥する電気泳動方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気泳動チップおよびそれを用いた電気泳動装置、ならびに電気泳動方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、マイクロエレクトロ−メカニカルシステム（ＭＥＭＳ）技術の発展により、マイクロ流体チップ内に作製したチャネルを用いて試料溶液に含まれるタンパク質やＤＮＡを電気泳動によって分離し、チップとオンラインで接続したエレクトロスプレーイオン化質量分析装置（ＥＳＩ−ＭＳ）を用いて分離したサンプルを分析するシステムの開発が盛んに行われている。しかしながらタンパク質の同定において同じく代表的なマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）とオンラインで接続できるチップ、あるいはインターフェースの開発はあまり行われていない。これはＭＡＬＤＩ−ＭＳの場合には、サンプルが乾燥しマトリックスと一緒に結晶化していることが前提であり、一方でチップ内では液状のサンプルを扱っているため、乾燥工程を連続的に取り扱うことが難しいためである。このような状況を打開するために、非特許文献１に、サンプル分離工程とＭＡＬＤＩ−ＭＳによる分析工程を分け、かつインターフェースを揃えることによりオンライン接続に準ずる利便性を持ったシステムが記載されている。【０００３】
非特許文献１には、チップ内に作製された、シールされていない、すなわちチャネル上面を開放構造とした溝状のチャネルを用いてマトリックスを含んだサンプルを分離し、チャネル内の溶媒を乾燥、分離後のサンプルを結晶化してチャネル上に固定化し、そのチャネルをレーザーでスキャンすることにより、分離したサンプルをレーザー脱離イオン化し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳで質量分析する方法が記載されている。【０００４】
非特許文献１に開示の技術によれば、チャネルのサイズは、各々深さが２５０μｍまたは２００μｍ、幅が２５０μｍまたは１５０μｍとなっている。これは、通常直径１００μｍ以下であるＥＳＩ−ＭＳ接続チップのチャネルと比較して大きい。
（非特許文献１）Jun  Liu,  Ken  Tseng,  Ben  Garcia,  Carlito  B.  Lebrilla,  Eric  Mukerjee,  Scott  Collins,  and  Rosemary  Smith,  "Electrophoresis  Separation  in  Open  Microchannels.  A  Methode  for  Coupling  Electrophoresis  with  MALDI-MS,"Analytical  Chemistry,  Vol.  73(2001),  No.  9,  pp.2147-2151
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ここで、ＭＡＬＤＩ−ＭＳはＥＳＩ−ＭＳと比較して感度がａｍｏｌ〜ｐｍｏｌ程度と高いことが知られている。このため、ＭＡＬＤＩ−ＭＳに供する試料の調製には、本来、上述した非特許文献１の構成のように断面積の大きいチャネルを必要とはしない。【０００６】
ところが、このチップでチャネルの断面積を小さくした場合、普通の室内では、または非特許文献１記載の水冷による温度管理だけでは、チャネル内の溶媒が容易に乾燥してしまうため、安定して試料溶液をチャネルに導入することができなかった。特に、ＭＡＬＤＩ−ＭＳに適用する場合、レーザー径は１００μｍ程度であり、チャネルの幅をこのレーザー径未満にすると、有効なレーザーの照射面積が減少し、効率が低下する懸念があった。【０００７】
また、チャネルの断面積を小さくするために、チャネルの深さをより浅くすることが考えられる。この場合、チャネルの幅は確保される。ところが、チャネルの深さを浅くすると、チャネルの体積と比較した溶媒の蒸発する表面積が増大してしまう。また、チャネルの深さを浅くすると、液体を重力のみでチャネル内に保持することは難しくなり、容易にチャネル外にあふれ出る懸念があった。また、試料溶液のボリュームを一定にした状態で、分離能を向上させるためにチャネルを長くした場合にも、溶媒の蒸発する表面積が増大してしまい、チャネル内に溶液を保持しておくことが困難であった。【０００８】
また、上述した非特許文献１に記載されているように、ジュール熱を原因とする液体サンプルの昇温により、サンプルが蒸発することがあった。また、液体への電極のコンタクトを安定化させるという点でも改善の余地があった。【０００９】
このように、ＭＡＬＤＩ−ＭＳに適用される試料の分離を電気泳動にて行う場合、微量の試料に対応するためにチャネルを小型化しようとすると、安定的な分離に反する要因となる。このため、電気泳動による微量の試料中の成分の分離とＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによる分析との両立は、上述した従来の方法によっては対応できておらず、従来の方法とは異なる対応が求められる。【００１０】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、微量の試料の電気泳動を安定的に行う技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の電気泳動チップは、
基板と、該基板の表面に設けられた試料泳動用のチャネルとを有し、
前記チャネルは、その上部が開放された開放部と、その底部に多数の突起部が規則的に配置さている保液部と、を有し、
前記保液部が、電気泳動槽内での電気泳動操作時にも解放状態が維持されている開放部内、またはその近傍に設けられている
ことを特徴とする。【００１２】
本発明の電気泳動装置は、上記構成の電気泳動チップが収容される電気泳動槽と、前記電気泳動槽内の湿度を調整する調湿手段と、を備えることを特徴とする。【００１３】
本発明の電気泳動方法は、
上記構成の電気泳動装置を用いた試料の電気泳動方法であって、
前記電気泳動装置の有する電気泳動槽内に前記電気泳動チップを配置する工程と、
前記調湿手段により前記電気泳動槽の内部の湿度を調整する工程と、
試料を前記チャネルに導入する工程と、
前記チャネルに電圧を印加して前記試料の電気泳動を行う工程と、
を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
以上説明したように本発明によれば、チャネルに規則的な凹凸構造からなる保液部が設けられた電気泳動チップと調湿手段とを有する電気泳動装置を用いることにより、微量の試料の電気泳動を安定的に行う技術が実現される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施形態１に係るの電気泳動チップの構成を模式的に示す平面図である。
【図２】図１のＡ−Ａ'断面図である。
【図３】実施形態１に係る電気泳動装置の構成を模式的に示す断面図である。
【図４】実施形態１に係る電気泳動装置の電気泳動槽の湿度変化を示す図である。
【図５】実施例１に係る電気泳動チップの上面像を示す図である。
【図６】実施例１に係る電気泳動チップのチャネルの構成を模式的に示す断面図である。
【図７】実施例１に係る電気泳動チップのチャネルの走査型電子顕微鏡像を示す上面図である。
【図８】実施例１に係る電気泳動チップのチャネルの走査型電子顕微鏡像を示す斜視図である。
【図９】実施例１に係る電気泳動装置の構成を模式的に示す断面図である。
【図１０】実施形態２に係る電気泳動チップを示す図である。
【図１１】実施形態２に係る電気泳動装置の構成を模式的に示す断面図である。
【符号の説明】
【００１６】
１００  電気泳動チップ
１０１  基板
１０２  第一の凹凸構造
１０３  親液性膜
１０４  平坦部
１０５  第二の凹凸構造
１０６  疎液性膜
１０７  チャネル
１０８  保液部
１０９  疎液部
１１０  電気泳動装置
１１１  電気泳動チップ
１１２  支持台
１１３  冷却加熱機構
１１４  支持板
１１５  温度センサ
１１６  温度調節装置
１１７  調湿液
１１８  電気泳動槽
１１９  冷却加熱機構
１２０  支持台
１２１  温度センサ
１２２  温度調節装置
１２３  断熱容器
１２４  内蓋
１２５  外蓋
１２６  キャピラリ
１２７  電極
１２８  電源
１２９  フッ素樹脂膜
１３０  ねじ
１３１  ファン
１３２  熱伝導性ゲルシート
１４０  電気泳動チップ
１４１  チャネル
１４２  リザーバ
１４３  リザーバ
１４４  ボトルネック
１４５  ボトルネック
１４６  リザーバ
１４７  チタン薄膜
１４８  金薄膜
１５０  電気泳動装置
１６１  貫通孔
１６２  調湿液槽
１６３  チップ設置槽
２０１、２０２  蒸気圧調整のために設けられたチャネル
２０３、２０４  揮発性の溶媒を保持しておくためのリザーバ
２０５、２０６  電極液を保持しておくためのリザーバ
２０７、２０８  塩橋
２０９、２１０  試料を含む溶液導入部分
２１１  ガラス蓋
２１２  液冷用冷却板
２１３  冷却液循環用パイプ穴
２１４  パッキン
２１５  排気口
２１６  ガス導入口
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明にかかる電気泳動チップは、基板と、該基板の表面に設けられた試料泳動用のチャネルとを有し、チャネルはその底部に多数の突起部が規則的に配置さている保液部を有する。このチャネルは、電気泳動チップが電気泳動装置に設置されて電気泳動を行う際に、その上面が開放された開放部を有する構造を採る。【００１８】
本発明の電気泳動チップでは、チャネル内の底部から突出する多数の突起が規則的に配置された第一の凹凸構造からなる保液部が設けられている。第一の凹凸構造を設けることにより、チャネルの表面が平坦面である場合よりも液体保持力を高くすること、すなわち見かけの親液性を高めることができる。このため、試料を含む液体を保液部に安定的に保持することができる。また、このチップでは、第一の凹凸構造の表面を通じて電気泳動チップとチャネルに導入された液体とが熱交換する構成となっている。このため、本発明の電気泳動チップは、電気泳動時のジュール熱を原因とするチャネル中の試料を含む液体の昇温を緩和することができ、電気泳動を安定的に行うことができる。前記第一凹凸構造は、親液性の表面を有する構成とすることができる。【００１９】
本発明において、チャネルは基板表面から凹んだ底部及び側面を含む構造を有し、その上面は、その少なくとも一部が、電気泳動装置内での電気泳動を行う際に開放された状態となる構造を有する。例えば、後述するキャピラリ（図３参照）やリザーバ（図１１参照）を設置した際にも、チャネル上部が開放された開放部を有するようにチップを形成する。なお、このチェネルの開放部を部分的に設ける場合には、カバーなどによりチャネル上面を部分的に覆うことで開放部を部分的に形成することができる。すなわち、チャネルの上面の一部または全面が開放部であってもよい。チャネルに保液部が設けられているため、チャネルが開放部を有している場合にも、チャネル中に確実に試料を含む液体を保持することが可能である。このため、安定的な電気泳動が可能な構成となっている。【００２０】
また、保液部は、チャネルに供給される試料を含む液体を受ける受容部（図３におけるキャピラリの先端が配置される部分や、図１１におけるリザーバが配置された部分）内、またはその近傍に設けられていることが好ましい。このような位置に保液部を設けることで、供給された試料を含む液体を速やかにチャネル内に分配保持可能となる。また、受容部を泳動用の通路部分よりも広くい領域を保液部として設け、保液部の周囲を凹凸を設けない平端部として形成する構成も好ましい。例えば、図５のリザーバ１４６及び図１１のリザーバ２０５、２０８の配置位置（チャネル端部）にこの広く形成した保液部を設け、その周囲（チャネル端部から通路中央方向へ保液部を有する場合は、その部分を除く）を平坦部として形成することで、試料を含む液体のチャネル内への供給をスムーズに行なうことが可能となる。【００２１】
チャネルは基板表面に形成された溝として設けてもよい。チャネルの底部全面を保液部としてもよい。【００２２】
また、本発明において、チャネルは、保液部となる規則的に配置された凹凸構造を有する構成であるため、単に基板の表面を粗面化するだけでは得ることができない。この点については後述する。ここで規則的に配置された凹凸構造とは、凹凸構造の形状、配置等が規則性を持って形成されており、ランダムな構造ではないことを意味する。【００２３】
チャネル内の電気泳動に用いる領域全体、例えばチャネル内のほぼ全面を第一凹凸構造を有する保液部とすることができる。例えば、起点から終点に向けて線状に伸びるチャネルを用いた場合には、チャネルの一端の近傍から他端の近傍にわたって保液部を設けることができる。【００２４】
保液部が占める面積に対する前記保液部の表面積の比αと、保液部と同じ表面状態の平坦面に対する試料を含む液体の接触角θとの積αｃｏｓθが、
｜αｃｏｓθ｜＞１
を満たすように保液部を形成することが好ましい。この式を満たすように形成された保液部を用いることにより、試料を含む液体が液滴に分割されることなく保液部を一様に満たすことが可能となる。よって、試料を含む液体をチャネル内に安定的に保持させることができる。なお、本発明において、平坦面は第一の凹凸構造と同一材料から形成することができる。【００２５】
本発明の電気泳動チップにおいて、前記保液部は、略同一形状を有する複数の錐台形の柱状体が前記チャネルの延在方向に沿って規則的に配置された列が互いに平行に複数配置された構成を有してもよい。こうすれば、簡素な構成で保液部の表面積を平坦面である場合に比べて充分に大きくすることができる。また、第一の凹凸構造を、エッチング技術やエンボッシング技術を用いた製造に適した構成とすることができる。【００２６】
なお、本発明において、複数の錘台形が略同一形状を有するとは、凹凸構造形成時の加工精度も勘案し、保液部に確実に液体が保持され、特定の場所から液体が漏出してしまうことがない程度に柱状体の形状の同一性が保たれていることをいう。【００２７】
本発明の電気泳動チップにおいて、前記柱状体の高さと前記チャネルの深さとが、略等しい（等しい場合を含む）構成とすることができる。こうすることにより、ドライエッチング等の技術を用いてチャネル形成と同時に第一の凹凸構造を得ることが可能な構成とすることができる。また、本発明において、チャネル形成と同時に第一の凹凸構造を得ることが可能な程度であれば、柱状体の高さとチャネルの深さとが若干異なっていてもよい。【００２８】
本発明の電気泳動チップにおいて、前記第一の凹凸構造の底面または側面の少なくとも一部が前記柱状体の上面よりも親液化されていてもよい。こうすることにより、試料を含む液体を親液化された領域に確実に保持し、閉じこめ効果を高めることができる。よって、試料を含む液体の保液部からの漏れ出しを確実に抑制することができる。また、たとえば基板の表面が疎液性である場合、第一の凹凸構造の少なくとも底面と側面の一部を親液性とすることにより、試料を含む液体の保持が可能となる。【００２９】
本発明の電気泳動チップにおいて、前記柱状体の上面と、側面の少なくとも一部と、が前記第一の凹凸構造の底面よりも疎液化されていてもよい。こうすることにより、第一の凹凸構造の底面と側面の一部が選択的に親液化された構成とすることができる。そのため、試料を含む液体の閉じ込め効果を高め、チャネル外への漏れ出しを抑制できる。特に開放部におけるチャネルの上面からの試料を含む液体の漏れ出しを抑制することができる。また、この構造は、たとえば親液性の基板上に疎液性膜を形成した後、疎液性膜と基板を、例えば、レジスト膜を用いたドライエッチング法などのエッチング法を用いた種々の加工方法により一括で加工して、第一の凹凸構造を形成することで容易に作製できる。これにより、柱状体の上面は疎液性膜で疎液性になり、側面の上側は疎液性膜の断面に当たるため疎液性に、また、底面と側面下側は親液性基板により親液性とすることができる。【００３０】
本発明の電気泳動チップにおいて、チャネル底面の保液部の外側に、保液部に隣接して、多数の突起が底部から突出する第二の凹凸構造からなる疎液部が設けられた構成とすることができる。こうすることにより、チャネル内に第二の凹凸構造からなる疎液部を設けることにより、保液部に液体をさらに確実に閉じこめることができる。このため、試料を含む液体をチャネル内にさらに安定的に保持することができる。また、かかる構成は、製造容易性に優れた構成となっている。たとえば、溝状のチャネル内に形成した凹凸構造を形成し、凹凸構造の表面が疎液性であればその一部の領域を親液性コーティングすることによって得ることができる。また、凹凸構造の表面が親液性であれば、その一部の領域を疎液性コーティングすることにより得ることができる。【００３１】
本発明の電気泳動チップにおいて、前記保液部に隣接した位置に平坦面を有してもよい。保液部を取り囲む位置に平坦面を配置してもよい。こうすることにより、凹凸構造を有しない平坦面においては液体が液滴となるために広がらない構成とすることができる。このため、液体を保水部にさらに確実に保持し、また、液体が万一第一の凹凸構造の外側に漏れ出した場合にも、平坦部において堰きとめられる。また、第一の凹凸構造は平坦部よりも親水化されているため、液体を第一の凹凸部分の側に戻すことが可能となる。このため、試料を含む液体をチャネル内に確実に保持し、チャネル外への漏れ出しを抑制することができる。【００３２】
本発明の電気泳動チップにおいて、前記平坦面の外周を取り囲む位置に第二の凹凸構造からなる疎液部を有する構成とすることができる。こうすることにより、平坦部の外側に試料を含む液体が漏出した場合にも、平坦部よりも疎液化された表面を有する疎液部において試料を含む液体を確実にせき止めることができる。保液部に先に述べた平坦部を介してこの疎液部を配置していもよい。好ましくは、保液部、平坦部、および疎液部がチャネルの中央から側方に向かってこの順に設けられた構成とすることができる。こうすれば、微細加工技術を用いて安定的に製造可能な構成とすることができる。たとえば、電気泳動チップの表面にコーティングを施すことによりチャネルを形成する場合、平坦部を目合わせマ−ジンとすることができる。【００３３】
本発明の電気泳動チップにおいて、湿度調節機能を有する電気泳動槽中で用いられる構成とすることができる。こうすることにより、チャネルに導入された液体の蒸発をより一層確実に抑制することができる。【００３４】
本発明によれば、前記電気泳動チップが収容される電気泳動槽と、前記電気泳動槽の内部の湿度を調整する調湿手段と、を備えることを特徴とする電気泳動装置が提供される。【００３５】
本発明の電気泳動装置には、チャネル上面の少なくとも一部に開放部を有する状態で電気泳動チップが設置される。また、本発明の電気泳動装置には、調湿手段が備えられている。このため、電気泳動チップを電気泳動槽内に設置し、その電気泳動槽内の試料を含む液体の溶媒かそれに準じる液体の湿度を飽和蒸気圧以下で充分高くすることにより、電気泳動時のチャネル内の溶媒の蒸発を抑制することができる。【００３６】
本発明の電気泳動装置において、前記調湿手段が、前記電気泳動槽の内部に設けられ、調湿液を収容する調湿液槽を有する構成とすることができる。また、本発明において、前記調湿液は、試料を含む液体中に含まれる溶媒またはそれに準ずる液体とすることができる。こうすることにより、調湿液の飽和蒸気で電気泳動槽内を満たすことが可能となる。このため、チャネル上面の少なくとも一部が開放部であるにも拘らず、開放部近傍の雰囲気の湿度を充分に確保することができる。よって、電気泳動時のチャネル内の液体の蒸発を抑制することができる。【００３７】
本発明の電気泳動装置において、前記電気泳動チップの温度および前記調湿液槽の温度を調整する温度調整手段を備えてもよい。これにより、調湿液槽から生じる調湿液の飽和蒸気圧とチップ上のチャネルに保持されている液体の飽和蒸気圧とを個別に調整できる。また、電気泳動時のジュール熱を原因とする試料を含む液体の昇温を抑制できる。【００３８】
本発明の電気泳動装置において、前記チャネルへの試料を含む液体の供給のためのキャピラリを配置することができる。このキャピラリとしては、前記チャネルに電圧を印加するための電極を挿入し得る構造を有するものが好ましい。この場合、キャピラリの試料供給端が電気泳動チップのチャネルの所定箇所に配置できるように電気泳動装置を構成する。キャピラリを設けることにより、電気泳動槽内を密閉した状態、あるいは、ほぼ密閉した状態で、試料を含む液体や電極液をチャネルに導入できる。また、電極液がチャネルに接触した状態でキャピラリ内にも電極液を保持させることにより、キャピラリに電極を挿入するだけで電極の液体へのコンタクトを安定的に確保することができる。また、試料を含む液体を、チャネルに接触した状態にあるキャピラリ内にも保持することにより、試料のチャネル内への充填時に、チャネル内の試料を含む液体の表面を一定に保持することができる。【００３９】
本発明によれば、上記構成の電気泳動装置を用いた試料の電気泳動方法であって、前記電気泳動装置の有する電気泳動槽内に前記電気泳動チップを配置する工程と、
前記調湿手段により前記電気泳動槽の内部の湿度を調整する工程と、
試料を前記チャネルに導入する工程と、
前記チャネルに電圧を印加して前記試料の電気泳動を行う工程と、
を有することを特徴とする電気泳動方法が提供される。【００４０】
チャネル内への試料の供給及び電圧の印加は、上記の構成を有するキャピラリを用いて行うことができる。【００４１】
本発明の電気泳動方法には、試料の電気泳動を行った後、前記調湿手段により前記電気泳動槽の内部の湿度を調節し、前記試料を乾燥させる工程を追加することができる。【００４２】
本発明の電気泳動方法では、前記温度調節手段により前記電気泳動チップの温度を前記調湿液槽の温度以上に保持しながら試料の電気泳動を行ってもよい。【００４３】
本発明の電気泳動方法では、電気泳動チップのチャネルの深さを浅くした場合にも、チャネルに導入された液体の蒸発を抑制し、安定した電気泳動を行うことができる。【００４４】
本発明の電気泳動方法では、試料の電気泳動を行った後、前記調湿液槽の温度を低下させて、前記試料を乾燥してもよい。【００４５】
本発明の電気泳動方法では、試料の電気泳動を行った後、前記電気泳動チップの温度を前記調湿液槽の温度以上としつつ、前記電気泳動チップおよび前記調湿液槽の温度を低下させて、前記試料を含む液体を凍結させてもよい。【００４６】
本発明の電気泳動方法では、前記試料を凍結させた後、前記調湿液槽の温度をさらに低下させて、前記試料を凍結乾燥してもよい。【００４７】
本発明の電気泳動方法によれば、電気泳動後、簡便な方法でチャネル上で凍結または乾燥した試料を得ることができる。このため、たとえばＭＡＬＤＩ−ＭＳ等の質量分析に供するのに好適な試料を確実に得ることができる。【００４８】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。なお、すべての図面において、共通する構成要素には同じ符号を付し、適宜説明を省略する。
（実施の形態１）
図１は、実施形態１に係る電気泳動チップの構成を模式的に示す平面図である。また、図２は、図１のＡ−Ａ'断面図である。図１および図２に示した電気泳動チップ１１１は、基板１０１と、基板１０１の表面に設けられ、試料を含む液体を保持するチャネル１０７を有し、チャネル１０７の上面全面が開放された構成となっている。また、チャネル１０７の一端から他端にわたって規則的な第一の凹凸構造１０２からなる保液部１０８が設けられている。【００４９】
基板１０１は、たとえば石英ガラスとすることができる。また、テフロン（登録商標）等の樹脂基板を用いてもよい。また、表面に酸化膜を形成して親水化するとともに電気絶縁性を確保したシリコン基板等も用いることができる。【００５０】
チャネル１０７は、チャネルの流路方向に直交する断面における中央部から側部に向かって保液部１０８、平坦部１０４および疎液部１０９を有する。すなわち保液部１０８、平坦部１０４およびチャネル１０７は、この順に外側に向かって設けられている。【００５１】
保液部１０８は、第一の凹凸構造１０２からなり、試料を含む液体を保持するように構成されている。保液部１０８の表面は、表面コーティング膜である親液性膜１０３により被覆されている。ここで、試料を含む液体は、電気泳動対象物質としての試料と、所定の液媒体を含む。試料は、泳動可能な状態であれば、液体中で、溶解状態、分散状態などの種々の状態で存在できる。液媒体としては、水、または水を含む液媒体を挙げることができる。媒体が、水、または水を主体とする液体である場合は、上述の親液性膜として、親水性膜が用いられる。電気泳動により所望の試料の分離を行なう場合は、２種以上の試料の混合物が泳動対象となる。また、単一試料の泳動距離を求める場合は、単一試料が泳動対象となる。親水性膜としては、非架橋ポリアクリルアミドの膜などが利用できるが、これに限定されない。具体例としては、基板との接着用にシランカップリング剤（3-メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン）を用い、接着剤を塗布した基板表面に、アクリルアミド、重合剤としての過硫酸アンモニウム、重合促進剤としてTEMED（テトラメチルエチレンジアミン）を含む親水性膜形成用の重合性組成物を塗布して重合させて親水性膜を形成した。【００５２】
保液部１０８は、基板１０１の表面に設けられた規則的な第一の凹凸構造１０２からなる。第一の凹凸構造１０２は、略同一形状を有する複数の錐台形の柱状体がチャネル１０７の延在方向に沿って配置された列が互いに平行に複数配置された構成とすることができる。たとえば、第一の凹凸構造１０２は、基板１０１に四角柱状の柱状体が複数設けられて規則的な凹凸構造をなす構成とすることができる。これらの柱状体は同じ向きで格子配置される。ここで、複数の錘台形が略同一形状を有するとは、凹凸構造形成時の加工精度も勘案し、保液部１０８の特定の領域から液体が漏出することなく液体が保持される程度の同一性を有する形状であることをいう。また、柱状体の形状は、たとえば、角錐台形、円錐台形、楕円錐台形等とすることができる。また、角錐の角部がＲ加工されることで、滑らかな曲面を形成していてもよい。【００５３】
図２においては、柱状体の高さと前記チャネルの深さとが等しい構成となっている。これにより、チャネル１０７と保液部１０８の同時成形が可能であり、製造容易性が確保されている。【００５４】
保液部１０８の表面積は、保液部１０８の形成領域の面積よりも大きい。また、保液部１０８は、その外周に設けられた疎液性膜１０６を有する領域よりも親液化されている。このため、チャネル１０７は、製造容易性および製造安定性にすぐれた簡素な構成でありつつ、保液部１０８を選択的に親液化し、保液部１０８に確実に液体を保持することができる構成となっている。試料を含む液体が液媒体として水または水を主体とする液体を含む場合は、疎液膜として、疎水性膜が用いられる。疎水膜の形成には、種々の公知あるいは市販の材料を用いることができる。具体例としては、アモルファスフッ素樹脂（旭硝子株式会社、商品名CYTOP）を、スピンコート法で成膜した膜を使用した。【００５５】
ここで、保液部１０８が形成された領域の面積に対する当該保液部１０８の第一の凹凸構造１０２の表面積の比を制御することにより、保液部１０８における親液化程度を制御可能である。この比を大きくすることにより、保液部１０８をより一層親液化することができる。このため、保液部１０８に選択的に液体を保持させることができる。さらに、第一の凹凸構造１０２の規則的な配置として、例えば保液部１０８の中心に向って表面積比が大きくなるように配置すれば、なお一層、保液部１０８の外側に液体が溢れ出す可能性を低く出来る。なお、表面積の比は、ウエンゼルの式すなわち下記（１）式におけるラフネスファクターαであり、表面が平坦な場合と比較して、凹凸構造を有する表面の面積が何倍になったかを表す因子である。
ｃｏｓθr＝αｃｏｓθ  （１）
但し、この上記式（１）は｜αｃｏｓθ｜≪１の条件下で成立する式である。【００５６】
なお、上記式（１）において、θは、保液部１０８の表面と同じ表面状態の材料からなる平坦面に置かれた所定の液体の液滴の接触角である。また、θrは、第一の凹凸構造１０２からなる保液部１０８に置かれた当該液滴の接触角である。親液性とは接触角が０度以上９０度未満の状態を指し、疎液性とは接触角が９０度より大きく１８０度以下である状態を指す。【００５７】
保液部１０８において、たとえば第一の凹凸構造１０２の段差の大きさを充分に大きくして、平坦面と比較した表面積の増加率を高めるのがよい。こうすれば、保液部１０８に確実に液体を保持しておくことができる。
また、上述のαおよびθが、下記式（２）を満たす構成とすることができる。
｜αｃｏｓθ｜＞１  （２）
αｃｏｓθの絶対値が１を超える構成とすることにより、超親液性または超疎液性とすることが可能であり、所定の液体に対して親液性の基板１０１の表面に設けられた保液部１０８において、αｃｏｓθ＞１とすることにより、保液部１０８を超親液性とすることができる。このため、第一の凹凸構造１０２からなる保液部１０８に液体を確実に保持しておくことができる。また、試料を含む液体は液滴を形成せず、試料を含む液体がチャネル１０７に一様に満たされる。【００５８】
平坦部１０４は、保液部１０８の外周を取り囲み、保液部１０８の両側面を挟むように設けられている。平坦部１０４は、第一の凹凸構造１０２と異なり、凹凸構造の形成による表面積が増加した構成ではないため、保液部１０８よりも親液性が低い領域である。また、平坦部１０４の表面において、保液部１０８の側は親液性膜１０３により被覆されており、疎液部１０９の側は疎液性膜１０６により被覆されている。このため、保液部１０８に試料を含む液体を確実に保持し、親液性膜１０３が設けられた領域の外側に試料を含む液体が漏出することを抑制できる。【００５９】
また、疎液部１０９は、平坦部１０４の外周を取り囲み、平坦部１０４の両側を挟むように設けられている。疎液部１０９は、第二の凹凸構造１０５からなり、試料を含む液体との親和性の低い領域である。疎液部１０９の表面は、表面コーティング膜である疎液性膜１０６により被覆されている。【００６０】
なお、疎液部１０９についても、上記式（１）または上記式（２）が適用可能であり、第二の凹凸構造１０５の表面積を制御することにより、疎液化の程度を調節することができる。また、｜αｃｏｓθ｜＞１とすることにより、疎液部１０９の超疎液化が可能である。【００６１】
次に、電気泳動チップ１１１の製造方法を説明する。電気泳動チップ１１１は、基板１０１の微細加工の際に使用されるリソグラフィー技術とエッチング技術で同時に凹凸構造を形成することにより得ることができる。ただし、保液部１０８は、液体を保持できる条件を満たす特殊な第一の凹凸構造１０２を有するため、このような凹凸構造を基板１０１上に形成する必要がある。このため、単に基板１０１の表面を粗面化したり、基板１０１上に複数の柱状体を設けたりするだけではこのような構造を得ることが困難である。【００６２】
保液部１０８において、柱状体を表面積の大きい形状とし、これを保液部１０８の領域内に密に配設することにより、保液部１０８の表面積を増加させて充分に親液化することができる。具体的には、柱状体の構成および配置をたとえば以下のようにすることができる。柱状体の幅は、たとえば、０．０１μｍ以上５０μｍ以下とすることができる。また、柱状体底面の間隙幅は０．０１μｍ以上５０μｍ以下とすることができる。【００６３】
なお、装置内に電気泳動可能な状態で設置した際に、電気泳動チップ１１１のチャネル１０７の上面は少なくとも一部が開放されていればよい。保液部１０８は、少なくとも開放された領域の近傍に形成されていればよい。少なくとも開放部内、またはその近傍に保液部１０８を設けることにより、開放部からの液体の蒸発を抑制することができる。【００６４】
また、電気泳動チップ１１１において、保液部１０８の底面及び／または側面の少なくとも一部を第一の凹凸構造１０２の上面すなわち柱状体の上面よりも親液化してもよい。また、電気泳動チップ１１１において、第一の凹凸構造１０２の上面すなわち柱状体の上面または側面の少なくとも一部を第一の凹凸構造１０２の底面よりも疎液化してもよい。これにより、保液部１０８の上面からの液体が溢れ出す可能性をさらに確実に抑制することができる。【００６５】
次に、電気泳動チップ１１１が適用される電気泳動装置の構成を説明する。電気泳動チップ１１１は、湿度調節機能を有する電気泳動槽中で好適に用いられる。図３は、実施形態１に係る電気泳動装置の構成を模式的に示す断面図である。【００６６】
図３に示した電気泳動装置１１０は、図１および図２に示した電気泳動チップ１１１と、電気泳動チップ１１１を収容する電気泳動槽１１８と、電気泳動槽１１８内の湿度を調節する調湿手段を有する。図３においては、電気泳動槽１１８内に、調湿手段として、調湿液１１７を収容する調湿液槽１６２が設けられている。【００６７】
図１および図２に示した電気泳動チップ１１１は、電気泳動槽１１８の内部に配置される。電気泳動チップ１１１は支持台１１２上に配置され、支持台１１２は冷却加熱機構１１３を介して支持板１１４に支持される。【００６８】
温度調節装置１１６は、電気泳動チップ１１１の温度を調節する。冷却加熱機構１１３は、温度センサ１１５により検出される電気泳動チップ１１１の温度に基づき、温度調節装置１１６により、その出力が調節される。【００６９】
支持板１１４は、冷却加熱機構１１３およびその上部に設けられる電気泳動チップ１１１の保持部材であるとともに、電気泳動槽１１８を上下に二室に区画している。支持板１１４の上部は前述した電気泳動チップ１１１が設置されるチップ設置槽１６３となっている。また、支持板１１４の下部は調湿液槽１６２になっており、調湿液１１７が収容されている。調湿液１１７は、たとえば試料を含む液体中に含まれる液媒体とする。または、それに準ずる液体とする。【００７０】
また、支持板１１４には、貫通孔１６１が設けられており、チップ設置槽１６３は調湿液槽１６２に連通している。貫通孔１６１が設けられているため、調湿液槽１６２とチップ設置槽１６３との間で雰囲気中の気体が移動可能である。このため、調湿液槽１６２で生成される飽和蒸気を電気泳動チップ１１１上に移動させることができる。【００７１】
調湿液槽１６２は、冷却加熱機構１１９を介して支持台１２０上に設置される。温度調節装置１２２は、調湿液槽１６２の温度を調節する。冷却加熱機構１１９は、温度センサ１２１により検出される調湿液槽１６２の温度に基づき、温度調節装置１２２によりその出力を調節される。【００７２】
電気泳動槽１１８の外側面は、断熱容器１２３により被覆されており、外気から断熱されている。また、電気泳動槽１１８の上面に、内蓋１２４および外蓋１２５がこの順に設置される。電気泳動槽１１８は、これらの蓋により密閉される。内蓋１２４および外蓋１２５の材料は、たとえばガラス等、透明で使用温度に対する耐性を有する材料とすることができる。こうすれば、電気泳動を確実に行うとともに、電気泳動チップ１１１上の試料を含む液体の様子を上方から観察することができる。ここで、蓋が二重になっている理由は、内蓋１２４と外蓋１２５の間に隙間を設けることにより、断熱効果を高めるためである。これにより、蓋が結露して曇るようなことを防止できる。【００７３】
キャピラリ１２６は、内蓋１２４および外蓋１２５を貫通して電気泳動チップ１１１上に設置されている。図３に示した電気泳動装置１１０では、チャネルの両端近傍の上部にキャピラリ１２６の下端が位置するように、内蓋１２４および外蓋１２５に貫通孔が設けられている。キャピラリ１２６は、電気泳動チップ１１１に設けられたチャネルに接続し、キャピラリ１２６を通して、試料を含む液体や電極液をチャネルに導入できる。また、試料を含む液体を、チャネルに接触した状態のキャピラリ１２６内にも保持することにより、チャネル１０７内の液面を一定に保持することができる。また、電極液のチャネル内への供給時に、電極液がチャネルに接触した状態でキャピラリ１２６内に電極液を保持させることにより、キャピラリ１２６に電極１２７を挿入するだけで電極１２７の液体への接触を安定的に確保させることができる。電極１２７は、キャピラリ１２６中に挿入され、電源１２８に接続される。【００７４】
次に、図１および図２に示した電気泳動チップ１１１を用いた電気泳動装置１１０の使用方法を説明する。【００７５】
まず、電気泳動チップ１１１を電気泳動装置１１０の支持台１１２の上に配置する。そして、温度調節装置１１６および温度調節装置１２２を調節して、電気泳動チップ１１１の温度を電気泳動時の温度に設定する。また、調湿液槽１６２の温度が電気泳動チップ１１１の温度よりも低くなるように調節するとよい。これにより、チップ上に余分に溶媒が結露することを抑制できる。この際、電気泳動チップ１１１と調湿液槽１６２との温度差を２℃以下にとどめるのがよい。こうすれば、電気泳動チップ１１１上の試料を含む液体からの液媒体蒸発を確実に抑制することができる。【００７６】
また、調湿液槽１６２を用いてチップ設置槽１６３の湿度を調節する。図４は、チップ設置槽１６３中の湿度変化を示す図である。図４において、横軸は調湿液槽１６２の温度である。また、縦軸は、調湿液槽１６２の温度と電気泳動チップ１１１の温度との温度差である。調湿液槽１６２の湿度の値はグラフ中に％で示した。図４より、調湿液槽１６２の湿度および温度を調節することにより、調湿液槽１６２と電気泳動チップ１１１との温度差を調節し、電気泳動チップ１１１を所定の温度とすることができることがわかる。通常、電気泳動は０℃以上１０℃以下の温度で実施される。たとえば、調湿液槽１６２と電気泳動チップ１１１との温度差が２℃以下とする場合、チップ設置槽１６３内の湿度を９０％以上とすることができる。【００７７】
電気泳動チップ１１１の温度が安定した段階で、目的に応じて適宜キャピラリ１２６から試料を含む液体を電気泳動チップ１１１のチャネルに導入する。このとき、電気泳動チップ１１１のチャネルには保液部１０８が形成されているため、試料を含む液体が速やかにチャネルに導入されて、保液部１０８に保持される。このように、保液部１０８が設けられた電気泳動チップ１１１にキャピラリ１２６を接続することにより、簡便な方法で微量の試料を含む液体をチャネル１０７に確実に導入し、チャネルの所定の領域を一様に満たすことができる。そして、キャピラリ１２６に電極液を導入する。電極液は、目的に応じて選択できる。タンパク質などの生体物質の場合は、生体物質の電気泳動に通常使用されている電解液としての緩衝液が用いられる。【００７８】
その後、キャピラリ１２６に電極１２７を挿入し、電極１２７を電源１２８に接続する。電源１２８を入れて二本の電極１２７間に電圧を印加し、電気泳動を行う。このとき、電気泳動チップ１１１の温度を調湿液槽１６２の温度以上に保持しながら電気泳動するとよい。これにより、電気泳動チップ１１１に導入された試料の電気泳動を安定的に行うことができる。【００７９】
電気泳動終了後、電気泳動チップ１１１の温度を所定の温度に保持した状態で、温度調節装置１２２を調節して調湿液槽１６２の温度を低下させる。そして、調湿液槽１６２の中に収容されている調湿液１１７を凍結させる。その後、温度調節装置１１６を調節して電気泳動チップ１１１の温度も低下させ、チャネル上で移動した試料を含む液体も凍結させる。この凍結処理により、チャネル内で泳動した試料の位置をチャネル内で固定することができる。また、調湿液槽１６２の温度を電気泳動チップ１１１よりも先に低下させることにより、電気泳動チップ１１１の表面に結露が生じることを防止できる。このチャネル内で泳動した試料の位置をチャネル内で固定する際に、保液部１０８内が複数の規則的な柱状構造の配列から構成されていることにより、凍結時にチャネル内で泳動した試料の位置が動きにくいという副次的効果もある。また、単純に液体状態から加熱乾燥した場合にもチャネル内で泳動した試料の位置が動きにくいという副次的効果もある。さらに、液体状態であっても、拡散が抑制されるためにチャネル内で泳動した試料の位置が動きにくいという副次的効果がある。【００８０】
そして、調湿液槽１６２の温度を電気泳動チップ１１１の温度より低く保つことにより、チャネル内の試料を凍結乾燥する。乾燥速度が遅い場合には、後述するように。電気泳動槽１１８の内部を真空排気してもよい。試料が乾燥したら、冷却を停止し、電気泳動チップ１１１の温度をたとえば２０℃程度の室温まで戻す。そして、電気泳動チップ１１１を電気泳動槽１１８から取り出す。【００８１】
以上の方法により、図３に示した電気泳動装置１１０を用いた電気泳動および泳動後の試料の乾燥が行われる。その後、この電気泳動チップ１１１を質量分析装置のホルダに設置し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析してもよい。チップ上の所定の位置に成分が固定されているため、チップごと質量分析に適用することができる。このとき、イオン化を支援するマトリックスは、予め試料を含む液体中に添加しておいてもよい。また、試料の乾燥後にマトリックスをチャネル上に噴霧することにより添加してもよい。【００８２】
このように、図３に示した電気泳動装置１１０に図１に記載の電気泳動チップ１１１を適用することにより、たとえばＭＡＬＤＩ−ＭＳ等の質量分析に供する試料の精製を確実に行うことができる。電気泳動チップ１１１には保液部１０８が設けられており、また、調湿液槽１６２内が調湿されているため、チャネル１０７に導入された試料が微量の場合にもその乾燥を抑制し、確実に成分の分離を行うことができる。また、チャネル１０７の深さを浅くした場合、試料を含む液体中の液溶媒の蒸発が顕著となるが、図１および図２に示した電気泳動チップ１１１を用いることにより、チャネル１０７内に安定的に試料を含む液体を保持することができる。また、電気泳動チップ１１１および図３に示した電気泳動装置１１０を用いて電気泳動を行うことにより、試料を含む液体からの液媒体の蒸発をより一層確実に抑制することができる。【００８３】
また、電気泳動装置１１０は、簡素な構成でジュール熱を原因とする試料を含む液体の昇温を確実に緩和する構成となっている。また、電極１２７の液体へのコンタクトを安定的に行う構成となっている。【００８４】
また、冷却加熱機構１１３および冷却加熱機構１１９を用いて電気泳動チップ１１１および調湿液槽１６２の温度制御を行うことにより、電気泳動を安定的に行うとともに、電気泳動による分離の後、チャネル１０７上に分離された試料を保持した状態で試料の凍結および乾燥が可能である。このため、MALDI-MSによる分析に好適な試料を確実に調製することができる。【００８５】
なお、図３に示した電気泳動装置１１０において、電気泳動槽１１８を減圧可能に構成し、真空ポンプ等の減圧装置に接続してもよい。こうすれば、チャネル内の試料を凍結乾燥する際に、常圧では乾燥速度が遅い場合にも、速やかに乾燥させることができる。また、電気泳動槽１１８内の雰囲気を交換できるようにしても良い。例えば、等電点電気泳動を電気泳動チップ１１１で行うと、液中に空気中の二酸化炭素等が溶け込んで、チャネルに形成された水素イオン濃度勾配を不安定にすることがある。このような場合には電気泳動槽１１８内の雰囲気を十分に不活性な高純度の窒素ガス等で置換することにより、泳動条件を安定させることが出来る。【００８６】
また、図１および図２に示した電気泳動チップ１１１において、保液部１０８は、略同一形状を有する複数の錐台形の柱状体がチャネル１０７の延在方向に沿って配置された列が互いに平行に複数配置された構成を有し、列の延在方向におけるチャネル１０７の単位長さあたりの保液部１０８の断面輪郭の長さが、延在方向と非平行な他の方向におけるチャネル１０７の単位長さあたりの保液部１０８の断面輪郭の長さよりも大きい構成とすることができる。他の方向は、たとえば、延在方向に垂直な方向とすることができる。また、たとえば保液部１０８の断面が櫛歯型である場合、断面輪郭は櫛歯形状となる。
また、電気泳動チップ１１１において、第一の凹凸構造１０２は、複数の柱状体が市松格子状等の斜格子状に配置されている構成とすることができる。また、チャネル１０７の延在方向に垂直な方向に直線状の溝ができないように構成されていてもよい。こうすれば、配置された直線に沿って大きく親液性が変化することがなくなる。また、保液部１０８からチャネル１０７の側方への液体の漏出がより一層確実に抑制された構成とすることができる。【００８７】
(実施の形態２)
本実施形態２では、図１０に模式的に示す電気泳動チップと図１１に模式的に示す電気泳動槽を用いて、タンパク質の等電点電気泳動を行った。本実施形態２においては、実施形態１と、チップ上に蒸気圧調整用リザーバを配置したこと、電気泳動槽内のペルチェ素子の廃熱を液冷により処理したこと、及びチップ上に配置したリザーバ下部にpH固定化ポリアクリルアミドゲルを含浸させた濾紙を接着して用いたことが特に異なる。【００８８】
図１０は電気泳動チップのレイアウトを示す上面図である。チップ上には3本のチャネル107と201、及び202が配置されている。このうち、107は電気泳動を行うチャネルであり、201と202は蒸気圧調整のために設けられたチャネルである。この201と202のチャネルの端には、揮発性の溶媒を保持しておくためのリザーバ203と204が配置されている。リザーバ203と204の底は貫通しており、溶媒を入れると、その溶媒は201と202のチャネルに流れ込むようになっている。即ち、この201と202のチャネルは面積を広げて溶媒蒸気を発生させやすくするために形成されている。一方、チャネル107の両端にはリザーバ205と206が配置されており、電極液を保持できるようになっている。このリザーバ205と206の底面には破線で描いたように濾紙207と208が接着されている。この濾紙によりチャネル107に電極液が流入するのを抑制できる。なお、等電点電気泳動の際に水素イオン濃度勾配の形成を安定化させるために、濾紙207と208には予め所望のpH固定化ポリアクリルアミドゲルを含浸させておくことが望ましい。そのリザーバ205と206よりチャネル107側に少し広いチャネル部分209と210が形成されている。これはタンパク質を含む溶液サンプルをチャネル107中に導入するために設けられている。ここにピペットやディスペンサ等を用いてサンプルを滴下することにより、チャネル107にサンプル溶液が導入される。なお、この209と210はチャネル107の両端に設けられているが、片側一方のみでも良いし、さらにチャネル中に多数設けても良い。両端に設けると、一端にのみサンプル導入部分を設けた場合より早くなるという効果がある。
【実施例】
【００８９】
（実施例１）
本実施例では、図５および図６に示した電気泳動チップ１４０を図９に示した電気泳動装置に電気泳動チップ１１１として用い、タンパク質の等電点電気泳動を行った。電気泳動は、流路長約60mmに対して印加電圧3.5kV、泳動時間10分間の条件で行った。タンパク質としては、ラクトグロブリンまたはミオグロビンを用いた。電極液としては、ベックマン・コールター社の等電点分離キット付属のcIEFゲルとアンフォライトを用いた。蛍光マーカとしては、シグマアルドリッチ社の蛍光IEFマーカを数種類混合したものを使用した。なお、後述する実施例２でもこの条件を使用した。なお、これらの条件は、試料の種類に応じて選択することができる。【００９０】
図５は、電気泳動チップ１４０の上面像を示す図である。図５に示した電気泳動チップ１４０には、約２５ｃｍの長さのチャネル１４１がメアンダ状に配置されている。蛇行した形状のチャネル１４１の両端には電極液を溜めるリザーバ１４２およびリザーバ１４３が設けられている。リザーバ１４２は、ボトルネック１４４を介してチャネル１４１に接続されている。また、リザーバ１４３は、ボトルネック１４５を介してチャネル１４１に接続されている。ボトルネック１４４およびボトルネック１４５を設けることにより、リザーバ１４２およびリザーバ１４３のそれぞれについて、導入された電極液のチャネル１４１への拡散を抑制することができる。また、チャネル１４１の途中には、チャネル１４１に連通し、試料を含む液体をチャネル１４１に導入するためのリザーバ１４６が設けられている。試料を含む液体として、本実施例ではタンパク質の溶液を用いる。【００９１】
図６は、図５に示した電気泳動チップ１４０のチャネル１４１の構成を模式的に示す断面図である。図６の断面は、チャネル１４１の延在方向に垂直な断面を示す。図６に示した断面構成は、基本的には図２に示した断面構成と同様であるが、基板１０１の上面を疎水化して疎液部１０９として用いた点が異なる。また、本実施例では、基板１０１として、電気絶縁性の石英ガラス基板を用いた。また、本実施例では、タンパク質が等電点電気泳動で移動する様子を蛍光顕微鏡で観察するため、基板１０１の裏面からの蛍光も利用する。このため、基板１０１の裏面に接着力を高めるためのチタン薄膜１４７を介して金薄膜１４８を裏面に形成した。【００９２】
チャネル１４１の形成領域の内側に、第一の凹凸構造１０２からなる保液部１０８、平坦部１０４および疎液部１０９をチャネル１４１の中央から外側に向かってこの順に形成した。第一の凹凸構造１０２および平坦部１０４は、基板１０１をドライエッチングすることにより形成した。そして、第一の凹凸構造１０２の表面および平坦部１０４における第一の凹凸構造１０２の側の表面に親液性膜１０３としてポリアクリルアミド膜を形成した。また、平坦部１０４の疎液部１０９側の表面および疎液部１０９となる平坦部１０４外周の基板１０１表面に疎液性膜１０６としてフッ素樹脂膜を形成した。第一の凹凸構造１０２は、高さ４μｍ、図６に示したチャネル１４１の断面における幅２．５μｍ、ギャップ２．５μｍとした。【００９３】
図７および図８は、得られた電気泳動チップ１４０のチャネル１４１の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）像を示す図である。図７は、チャネル１４１の上面図であり、図８は、図７中に四角で囲まれた領域を拡大した斜視図である。図７および図８に示したように、チャネル１４１の延在方向におけるチャネル１４１の単位長さあたりの第一の凹凸構造１０２の稜線の長さすなわち断面輪郭の長さがチャネル１４１の延在方向に垂直な方向におけるチャネル１４１の単位長さあたりの第一の凹凸構造１０２の断面輪郭の長さよりも大きい構成とした。【００９４】
また、チャネル１４１の短手方向に隣接する二つの柱状体の間の領域が、一直線上に形成されず、ジグザグ状に配置されるように、柱状体を市松格子状に配置した。このように、チャネル１４１の延在方向には第一の凹凸構造１０２の断面輪郭の長さを長くし、また、複数の柱状体を斜格子状に配置することにより、サンプル溶液がチャネル１４１にスムーズに導入され、かつチャネル１４１の側面から漏れ出ることがなかった。このチップを図９に示す電気泳動槽に設置した。【００９５】
図９は、本実施例で用いた電気泳動装置の構成を模式的に示す断面図である。図９に示した電気泳動装置１５０の基本構成は、図３に示した電気泳動装置１１０と同様としたが、チップ設置槽１６３の側方の外周を囲むように調湿液槽１６２を設けた。電気泳動装置１５０において、電気泳動チップ１１１として図５〜図８に示した電気泳動チップ１４０を用いた。また、支持台１１２および電気泳動槽１１８の材料はアルミニウムとした。また、支持台１１２および電気泳動槽１１８の表面の一部をフッ素樹脂膜１２９で被覆し、汚れを防止した。【００９６】
また、支持台１１２の上に熱伝導性ゲルシート１３２を設け、熱伝導性ゲルシート１３２の上に電気泳動チップ１１１を設置した。熱伝導性ゲルシート１３２を設けることにより、良好な熱伝導特性を保持した状態で電気泳動チップ１１１が支持される構成とすることができる。また、断熱容器１２３はフッ素樹脂製とした。【００９７】
内蓋１２４、外蓋１２５、およびキャピラリ１２６の材料は石英ガラスとした。これにより、電気泳動チップ１１１の観察が容易になっている。温度センサ１２１および温度センサ１１５には、白金測温抵抗体を用いた。また、冷却加熱機構１１３および冷却加熱機構１１９としてペルチェ素子を用いた。調湿液１１７としては、純水を用いた。【００９８】
断熱容器１２３に外周を覆われた電気泳動槽１１８を、冷却加熱機構１１９であるペルチェ素子からの排熱を引き受けるアルミニウム製の支持台１２０上にねじ１３０で固定した。ねじ１３０はすべて断熱性に優れる樹脂製とした。支持台１２０には、放熱のためにフィンが形成されている。さらに、フィンの上にファン１３１を取りつけた。なお、本実施例では、フィンとファン１３１による空冷を用いたが、水冷等他の放熱方法を用いることもできる。【００９９】
本実施例では、こうして得られた電気泳動装置１５０を蛍光顕微鏡に取りつけ、タンパク質の等電点電気泳動を行うとともに、その様子を観察した。【０１００】
温度調節装置１１６を用いて、電気泳動チップ１４０すなわち図９における電気泳動チップ１１１の温度を１０℃に調節した。また、温度調節装置１２２を用いて調湿液槽１６２の温度を９．８℃とした。温度が安定した後、まず、ベックマン・コールター社製キャピラリ等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）キットに含まれるｃＩＥＦゲルおよびアンフォライト、質量分析時にタンパク質のイオン化を支援するマトリックス、ならびに共有結合性の蛍光色素で標識したラクトグロブリンを混合した水溶液をサンプル溶液としてキャピラリ１２６を通してタンパク質溶液導入用のリザーバ１４６からチャネル１４１に導入した。【０１０１】
チャネル１４１が一様にタンパク質溶液で満たされた後、キャピラリ１２６を通してアノード用電極液およびカソード用電極液をそれぞれリザーバ１４２および１０３に導入した。その後、キャピラリ１２６に白金電極を挿入し、電源１２８より約１０ｋＶの電圧を電極１２７に印加した。通電から４分後にタンパク質の蛍光スポットを蛍光顕微鏡で観察した。チャネル１４１の所定の領域に、タンパク質のスポットが確認された。【０１０２】
その後、本実施例では、まず調湿液槽１６２の調湿液１１７すなわち純水を凍結させた。その後、電気泳動チップ１４０上のタンパク質溶液を凍結させた。そして、内蓋１２４および外蓋１２５を取り去り、電気泳動チップ１４０を加熱した。すると、チャネル１４１上のスポットが崩れることなく、タンパク質溶液の溶媒が蒸発し、乾燥した。このように保液部に柱状体があると、凍結時、あるいは乾燥時に液の移動が抑制できるため、分離したスポットが乱れることなく凍結、あるいは乾燥が可能となる。以上により、本実施例では電気泳動チップ１４０上で電気泳動により分離した乾燥サンプルが得られた。得られたサンプルは、チャネル１４１上に保持された状態でイオン化促進剤を噴霧法により添加した後、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより分析することができた。【０１０３】
（実施例２）
図１０に示す電気泳動チップを図11に示す通り、電気泳動槽に設置して測定した。リザーバ２０３，２０４，２０５，２０６は電気泳動槽中に不図示の固定板を設け固定している。電極１２７の固定方法はいろいろあるが、例えばガラス蓋211を通してリザーバ206中に挿入される。なお、リザーバ205の場合も同様である。チップ111は熱伝導性ゲルシート132を介して支持台112に固定される。等電点電気泳動する際には電極間に数kV掛かるため、支持台112は、例えばシェイパルやシェイパルMのような窒化アルミといった、電気絶縁性の良い熱伝導性セラミックスで作製することが望ましい。その支持台の下に温度センサを設置する。チップ温度を精度良く測定するためには、温度センサ115はチップ111下部といったチップに成るべく近い場所に設置した方が良いが、一方で高電圧印加時にリークした際に温度センサ115が壊れることを防ぐためには、電気絶縁性の良い支持台112の下部に設置した方が良い。支持台112の下には、チップ111と湿度調整用リザーバ203と204の温度を調整するための冷却過熱機構となるペルチェ素子113が配置される。ペルチェ素子113は冷却加熱能力さえ十分ならば、小型のものでかまわない。チップの加熱冷却に関する面内均一性は支持台112を良熱伝導性の材料とすることで確保する。ペルチェ素子113の廃熱処理のために液冷用冷却板212が配置される。液冷用冷却板212中には冷却液循環用のパイプ穴213が貫通しており、その中をチラーから送り込まれる冷却液が循環して、廃熱を処理することが出来る。従って、液冷用冷却板212の材料としては例えばアルミや銅のような熱の良導体が好ましいし、耐食性を向上させるにはアルミ表面を参加処理したりすると良い。冷却液としては水やナイブライン等を用いることが出来る。この液冷用冷却板212とペルチェ素子113の間、またはペルチェ素子113と支持台112の間の接触面には熱伝導グリス等の表面粗さを補って熱接触を良くするためのペースト等が塗布されることが望ましい。これら全体は図示の通り、パッキン214を挟んで断熱容器123とガラス蓋211で覆われる。これにより、断熱容器内部123内部に密閉空間が形成される。なお、断熱容器123の材料としては例えば熱伝導性の悪く、電気絶縁性の良好で、耐薬品性にも優れるテフロン等の材料が望ましい。この断熱容器内を排気したり、ガス置換するために、排気口215とガス導入口216を設けることが望ましい。なお、この排気口215とガス導入口216の断熱容器123外側出口直近にバルブが設けられることが望ましい。これは成るべく断熱容器外側と熱絶縁を保ち、密閉空間内の蒸気圧を精度良く制御するためである。【０１０４】
次にこの電気泳動チップと電気泳動槽の使用方法を説明する。まず、図11の通り、電気泳動チップ111は電気泳動槽内に設置される。次にチラーから冷却液をパイプ穴213を通して循環させ冷却板212を所望の温度とする。次にペルチェ素子113を温度調節器に接続して動作を開始し、温度センサ115の温度を所望の温度とする。チップ温度を所望の温度、例えば等電点電気泳動を行う際に一般的な10℃としたところで、まず湿度調整用リザーバ203と204に溶媒のみを入れ、チャネル201と202に広がらせて蒸発させて、電気泳動槽内の湿度を高くする。この実施形態２の場合、溶媒蒸気を供給するチャネル201と202がチップ上にあるため、例えばチップに結露しないで且つ成るべく高い湿度を実現するといったようには湿度を精度良く制御できない。しかしながら、汚れやすく、手入れの煩雑な溶媒蒸気供給源をチップ上に配置して消耗品とすることにより、使用方法が容易になるというメリットがある。さらに蓋をした後に液を出し入れすることが無いため、真空排気のための密閉構造を容易に形成できる。密閉構造を形成した後は例えばガス導入口216から不活性ガスを流し、排気口215から排気することにより、密閉層内部のガスを置換できる。これにより、空気中の二酸化炭素ガスが溶液に溶け込んで水素イオン濃度勾配形成に悪影響を及ぼすことを抑制できる。この際、チャネル201と202からの溶媒の蒸発速度より十分ゆっくりガス置換することで、湿度変化することなくガス置換することが出来る。十分湿度の高くなった状態で、まず、等電点分離するペプチドやポリペプチド、あるいはタンパク質等の両性担体を含み、実施例１と同じくｃＩＥＦゲルおよびアンフォライトを含む溶液をチップ上の209と210からピペットで滴下して導入する。滴下後、超親水性のチャネル107は速やかに液が満たされ、さらに乾燥していたpH固定化ポリアクリルアミドゲルの含浸された濾紙207と208は溶媒を含んで塩橋として動作できる状態となる。この状態でリザーバ205と206に各々酸かアルカリの電極液を導入する。濾紙207と208により、チャネル107に電極液が流れ込むのを抑制できる。さらに電解液の微妙なpHの再現性の無さを補完して、pH固定化ゲルの効果によりチャネル両端の水素イオン濃度が再現性良く実現できるため、電圧印加時に形成される水素イオン濃度勾配を安定化させることが出来る。溶液導入後、ガラス蓋211を設置し容器123内を密閉すると共に、白金電極127をリザーバ206に差し込む。なお、不図示のリザーバ205にも片方の電極が同じく挿入される。電極間に高電圧を酸側正極、アルカリ側負極にして印加して水素イオン濃度勾配を形成し、かつ両性担体を分離する。その後、ペルチェ素子113を使用して分離後の溶液を凍結させても良いし、あるいは加熱して溶媒を蒸発させ乾燥させても良い。加熱乾燥時にチャネル107内に柱状体があると、液の移動が抑制され、分離後の両性担体のパターンを乱すことなく乾燥できる。また凍結した場合は、真空排気して凍結乾燥することにより、同じく分離後の両性担体のパターンを乱すことなく乾燥できる。その後イオン化促進剤を噴霧したりディスペンサにより適宜添加し、質量分析装置で両性担体を検出できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年12月12日(2005.12.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２０】請求項１６乃至１９のいずれかに記載の電気泳動方法であって、前記電気泳動を行った後、前記調湿液槽の温度を低下させて、前記試料を乾燥させる電気泳動方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２１】請求項１６乃至２０のいずれかに記載の電気泳動方法であって、
前記電気泳動を行った後、前記電気泳動チップの温度を前記調湿液槽の温度以上としつつ、前記電気泳動チップおよび前記調湿液槽の温度を低下させて、前記試料を凍結させる電気泳動方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２２】請求項２１に記載の電気泳動方法において、前記試料を凍結させた後、前記調湿液槽の温度をさらに低下させて、前記試料を凍結乾燥する電気泳動方法。
【国際調査報告】
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