(57)【要約】  サッカロミセス（Saccharomyces）属酵母のｒＲＮＡ遺伝子内Ｄ２領域の一部又はその相補鎖から選択される標的領域の塩基配列を増幅し、（ａ）第１のセグメントとして、サッカロミセス属酵母のｒＲＮＡ遺伝子にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列と、（ｂ）第２のセグメントとして、第１のセグメントの３’側の塩基配列に相補的であり、第１のセグメントの５’側に位置する塩基配列と、を含むことを特徴とするプライマー。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サッカロミセス（Saccharomyces）属酵母のｒＲＮＡ遺伝子内Ｄ２領域の一部又はその相補鎖から選択される標的領域の塩基配列を増幅し、
（ａ）第１のセグメントとして、サッカロミセス属酵母のｒＲＮＡ遺伝子にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列と、
（ｂ）第２のセグメントとして、第１のセグメントの３’側の塩基配列に相補的であり、第１のセグメントの５’側に位置する塩基配列と、
を含むことを特徴とするプライマー。
【請求項２】
配列番号１〜５で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドセットからなり、サッカロミセス属酵母のｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を増幅可能なサッカロミセス属酵母検出用プライマーセット。
【請求項３】
検体中に存在するサッカロミセス属酵母の検出方法であって、サッカロミセス属酵母のｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を標的とし、請求項２に記載のプライマーセットで該ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を選択的に、ＬＡＭＰ法により増幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、サッカロミセス属酵母の検出方法。
【請求項４】
検体を増菌培養し、出現菌からＤＮＡ試料を分離し、該ＤＮＡ試料に対して、請求項２に記載のプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により増幅反応を行い、サッカロミセス属酵母のリボソームＲＮＡ遺伝子の特定領域を増幅させ、この増幅産物の有無を確認することを特徴とする、サッカロミセス属酵母の識別方法。
【請求項５】
デッケラ（Dekkera）属酵母のリボソームＲＮＡ遺伝子内Ｄ２領域の一部又はその相補鎖から選択される標的領域の塩基配列を増幅し、
（ａ）第１のセグメントとして、デッケラ属酵母のリボソームＲＮＡ遺伝子にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列と、
（ｂ）第２のセグメントとして、第１のセグメントの３’側の核酸配列に相補的であり、第１のセグメントの５’側に位置する塩基配列と、
を含むことを特徴とするプライマー。
【請求項６】
配列番号１及び５〜８で表される核酸配列を含むオリゴヌクレオチドセットからなり、デッケラ属酵母のｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を増幅可能なデッケラ属酵母検出用プライマーセット。
【請求項７】
検体中に存在するデッケラ属酵母の検出方法であって、デッケラ属酵母のｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を標的とし、請求項６に記載のプライマーセットで該リボソームＲＮＡ遺伝子の特定領域を選択的に、ＬＡＭＰ法により増幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、デッケラ属酵母の検出方法。
【請求項８】
検体を増菌培養し、出現菌からＤＮＡ試料を分離し、該ＤＮＡ試料に対して、請求項６に記載のプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により増幅反応を行い、デッケラ属酵母のリボソームＲＮＡ遺伝子の特定領域を増幅させ、この増幅産物の有無を確認することを特徴とする、デッケラ属酵母の識別方法。
【請求項９】
ブレタノミセス（Brettanomyces）属酵母のｒＲＮＡ遺伝子内Ｄ２領域の一部又はその相補鎖から選択される標的領域の塩基配列を増幅し、
（ａ）第１のセグメントとして、ブレタノミセス属酵母のｒＲＮＡ遺伝子にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列と、
（ｂ）第２のセグメントとして、第１のセグメントの３’側の核酸配列に相補的であり、第１のセグメントの５’側に位置する塩基配列と、
を含むことを特徴とするプライマー。
【請求項１０】
配列番号１、５及び９〜１２で表される核酸配列を含むオリゴヌクレオチドセットからなり、ブレタノミセス属酵母のｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を増幅可能なブレタノミセス属酵母検出用プライマーセット。
【請求項１１】
検体中に存在するブレタノミセス属酵母の検出方法であって、ブレタノミセス属酵母のｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を標的とし、請求項１０に記載のプライマーセットで該ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を選択的に、ＬＡＭＰ法により増幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、ブレタノミセス属酵母の検出方法。
【請求項１２】
検体を増菌培養し、出現菌からＤＮＡ試料を分離し、該ＤＮＡ試料に対して、請求項１０に記載のプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により増幅反応を行い、ブレタノミセス属酵母のリボソームＲＮＡ遺伝子の特定領域を増幅させ、この増幅産物の有無を確認することを特徴とする、ブレタノミセス属酵母の識別方法。
【請求項１３】
ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の一部又はその相補鎖から選択される標的領域の塩基配列を増幅し、
（ａ）第１のセグメントとして、ラクトバチルス・ブレビスのＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列と、
（ｂ）第２のセグメントとして、第１のセグメントの３’側の核酸配列に相補的であり、第１のセグメントの５’側に位置する塩基配列と、
を含むことを特徴とするプライマー。
【請求項１４】
配列番号１３〜１８で表される核酸配列を含むオリゴヌクレオチドセットからなり、ラクトバチルス・ブレビスのＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の特定領域を増幅可能なラクトバチルス・ブレビス検出用プライマーセット。
【請求項１５】
検体中に存在するラクトバチルス・ブレビスの検出方法であって、ラクトバチルス・ブレビスのＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の特定領域を標的とし、請求項１４に記載のプライマーセットで該ＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の特定領域を選択的に、ＬＡＭＰ法により増幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、ラクトバチルス・ブレビスの検出方法。
【請求項１６】
検体を増菌培養し、出現菌からＤＮＡ試料を分離し、該ＤＮＡ試料に対して、請求項１４に記載のプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により増幅反応を行い、ラクトバチルス・ブレビスのＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の特定領域を増幅させ、この増幅産物の有無を確認することを特徴とする、ラクトバチルス・ブレビスの識別方法。
【請求項１７】
配列番号１９で表される塩基配列を含むラクトバチルス・リンドネリ（Lactobacillus lindneri）のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の一部。
【請求項１８】
配列番号１９で表される塩基配列を含むラクトバチルス・リンドネリのＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の一部又はその相補鎖から選択される標的領域の塩基配列を増幅し、
（ａ）第１のセグメントとして、ラクトバチルス・リンドネリのＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列と、
（ｂ）第２のセグメントとして、第１のセグメントの３’側の核酸配列に相補的であり、第１のセグメントの５’側に位置する塩基配列と、
を含むことを特徴とするプライマー。
【請求項１９】
配列番号２０〜２５で表される核酸配列を含むオリゴヌクレオチドセットからなり、ラクトバチルス・リンドネリのＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の特定領域を増幅可能なラクトバチルス・リンドネリ検出用プライマーセット。
【請求項２０】
検体中に存在するラクトバチルス・リンドネリの検出方法であって、ラクトバチルス・リンドネリのＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の特定領域を標的とし、請求項１９に記載のプライマーセットで該ＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の特定領域を選択的に、ＬＡＭＰ法により増幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、ラクトバチルス・リンドネリの検出方法。
【請求項２１】
検体を増菌培養し、出現菌からＤＮＡ試料を分離し、該ＤＮＡ試料に対して、請求項１９に記載のプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により増幅反応を行い、ラクトバチルス・リンドネリのＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の特定領域を増幅させ、この増幅産物の有無を確認することを特徴とする、ラクトバチルス・リンドネリの識別方法。
【請求項２２】
ラクトバチルス・シュードコリノイデス（Lactobacillus pseudocollinoides）のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の一部又はその相補鎖から選択される標的領域の塩基配列を増幅し、
（ａ）第１のセグメントとして、ラクトバチルス・ブレビスのＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列と、
（ｂ）第２のセグメントとして、第１のセグメントの３’側の核酸配列に相補的であり、第１のセグメントの５’側に位置する塩基配列と、
を含むことを特徴とするプライマー。
【請求項２３】
配列番号２６〜３１で表される核酸配列を含むオリゴヌクレオチドセットからなり、ラクトバチルス・シュードコリノイデスのＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の特定領域を増幅可能なラクトバチルス・シュードコリノイデス検出用プライマーセット。
【請求項２４】
検体中に存在するラクトバチルス・シュードコリノイデスの検出方法であって、ラクトバチルス・シュードコリノイデスのＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の特定領域を標的とし、請求項２３に記載のプライマーセットで該ＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の特定領域を選択的に、ＬＡＭＰ法により増幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、ラクトバチルス・シュードコリノイデスの検出方法。
【請求項２５】
検体を増菌培養し、出現菌からＤＮＡ試料を分離し、該ＤＮＡ試料に対して、請求項２３に記載のプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により増幅反応を行い、ラクトバチルス・シュードコリノイデスのＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の特定領域を増幅させ、この増幅産物の有無を確認することを特徴とする、ラクトバチルス・シュードコリノイデスの識別方法。
【請求項２６】
ラクトバチルス・ヘキソーサス（Lactobacillus hexosus）の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の一部又はその相補鎖から選択される標的領域の塩基配列を増幅し、
（ａ）第１のセグメントとして、ラクトバチルス・ヘキソーサスの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列と、
（ｂ）第２のセグメントとして、第１のセグメントの３’側の核酸配列に相補的であり、第１のセグメントの５’側に位置する塩基配列と、
を含むことを特徴とするプライマー。
【請求項２７】
配列番号３２〜３７で表される核酸配列を含むオリゴヌクレオチドセットからなり、ラクトバチルス・ヘキソーサスの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を増幅可能なラクトバチルス・ヘキソーサス検出用プライマーセット。
【請求項２８】
検体中に存在するラクトバチルス・ヘキソーサスの検出方法であって、ラクトバチルス・ヘキソーサスの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を標的とし、請求項２７に記載のプライマーセットで該１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を選択的に、ＬＡＭＰ法により増幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、ラクトバチルス・ヘキソーサスの検出方法。
【請求項２９】
検体を増菌培養し、出現菌からＤＮＡ試料を分離し、該ＤＮＡ試料に対して、請求項２７に記載のプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により増幅反応を行い、ラクトバチルス・ヘキソーサスの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を増幅させ、この増幅産物の有無を確認することを特徴とする、ラクトバチルス・ヘキソーサスの識別方法。
【請求項３０】
ペディオコッカス・ダムノサス（Pediococcus damnosus）の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の一部又はその相補鎖から選択される標的領域の塩基配列を増幅し、
（ａ）第１のセグメントとして、ペディオコッカス・ダムノサスの１６Ｓ rＲＮＡ遺伝子にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列と、
（ｂ）第２のセグメントとして、第１のセグメントの３’側の核酸配列に相補的であり、第１のセグメントの５’側に位置する塩基配列と、
を含むことを特徴とするプライマー。
【請求項３１】
配列番号３２及び３７〜４０、又は配列番号３２、３７、３９、４０、５３及び５４で表される核酸配列を含むオリゴヌクレオチドセットからなり、ペディオコッカス・ダムノサスの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を増幅可能なペディオコッカス・ダムノサス検出用プライマーセット。
【請求項３２】
検体中に存在するペディオコッカス・ダムノサスの検出方法であって、ペディオコッカス・ダムノサスの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を標的とし、請求項３１に記載のプライマーセットで該１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を選択的に、ＬＡＭＰ法により増幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、ペディオコッカス・ダムノサスの検出方法。
【請求項３３】
検体を増菌培養し、出現菌からＤＮＡ試料を分離し、該ＤＮＡ試料に対して、請求項３１に記載のプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により増幅反応を行い、ペディオコッカス・ダムノサスの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を増幅させ、この増幅産物の有無を確認することを特徴とする、ペディオコッカス・ダムノサスの識別方法。
【請求項３４】
ペクチネイタス（Pectinatus）属菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の一部又はその相補鎖から選択される標的領域の塩基配列を増幅し、
（ａ）第１のセグメントとして、ペクチネイタス属菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列と、
（ｂ）第２のセグメントとして、第１のセグメントの３’側の核酸配列に相補的であり、第１のセグメントの５’側に位置する塩基配列と、
を含むことを特徴とするプライマー。
【請求項３５】
配列番号３２、３７及び４１〜４３で表される核酸配列を含むオリゴヌクレオチドセットからなり、ペクチネイタス属菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を増幅可能なペクチネイタス属菌検出用プライマーセット。
【請求項３６】
検体中に存在するペクチネイタス属菌の検出方法であって、ペクチネイタス属菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を標的とし、請求項３５に記載のプライマーセットで該１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を選択的に、ＬＡＭＰ法により増幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、ペクチネイタス属菌の検出方法。
【請求項３７】
検体を増菌培養し、出現菌からＤＮＡ試料を分離し、該ＤＮＡ試料に対して、請求項３５に記載のプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により増幅反応を行い、ペクチネイタス属菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を増幅させ、この増幅産物の有無を確認することを特徴とする、ペクチネイタス属菌の識別方法。
【請求項３８】
マレフィラス・シェルビシエ（Malephilus cerevisiae）の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の一部又はその相補鎖から選択される標的領域の塩基配列を増幅し、
（ａ）第１のセグメントとして、マレフィラス・シェルビシエの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列と、
（ｂ）第２のセグメントとして、第１のセグメントの３´側の核酸配列に相補的であり、第１のセグメントの５´側に位置する塩基配列と、
を含むことを特徴とするプライマー。
【請求項３９】
配列番号３２、３７及び４４〜４６で表される核酸配列を含むオリゴヌクレオチドセットからなり、マレフィラス・シェルビシエの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を増幅可能なマレフィラス・シェルビシエ検出用プライマーセット。
【請求項４０】
検体中に存在するマレフィラス・シェルビシエの検出方法であって、マレフィラス・シェルビシエの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を標的とし、請求項３９に記載のプライマーセットで該１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を選択的に、ＬＡＭＰ法により増幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、マレフィラス・シェルビシエの検出方法。
【請求項４１】
検体を増菌培養し、出現菌からＤＮＡ試料を分離し、該ＤＮＡ試料に対して、請求項３９に記載のプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により増幅反応を行い、マレフィラス・シェルビシエの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を増幅させ、この増幅産物の有無を確認することを特徴とする、マレフィラス・シェルビシエの識別方法。
【請求項４２】
下面ビール酵母のメリビアーゼ遺伝子の一部又はその相補鎖から選択される標的領域の塩基配列を増幅し、
（ａ）第１のセグメントとして、下面ビール酵母のメリビアーゼ遺伝子にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列と、
（ｂ）第２のセグメントとして、第１のセグメントの３’側の核酸配列に相補的であり、第１のセグメントの５’側に位置する塩基配列と、
を含むことを特徴とするプライマー。
【請求項４３】
配列番号４７〜５２で表される核酸配列を含むオリゴヌクレオチドセットからなり、下面ビール酵母のメリビアーゼ遺伝子の特定領域を増幅可能な下面ビール酵母検出用プライマーセット。
【請求項４４】
検体中に存在する下面ビール酵母の検出方法であって、下面ビール酵母のメリビアーゼ遺伝子の特定領域を標的とし、請求項４３に記載のプライマーセットで該メリビアーゼ遺伝子の特定領域を選択的に、ＬＡＭＰ法により増幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、下面ビール酵母の検出方法。
【請求項４５】
検体を増菌培養し、出現菌からＤＮＡ試料を分離し、該ＤＮＡ試料に対して、請求項４３に記載のプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により増幅反応を行い、下面ビール酵母のメリビアーゼ遺伝子の特定領域を増幅させ、この増幅産物の有無を確認することを特徴とする、下面ビール酵母の識別方法。
【請求項４６】
請求項１、２、５、６、９、１０、１３、１４、１８、１９、２２、２３、２６、２７、３０、３１、３４、３５、３８、３９、４２又は４３に記載のプライマー又はプライマーセット、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ及び反応緩衝液を少なくとも含むことを特徴とする、ビール中で増殖し得る微生物検出・識別用キット。
【請求項４７】
ＬＡＭＰ法に使用する試薬の保存方法であって、
第一の容器にＬＡＭＰ用プライマー及びＬＡＭＰ用反応液を収容して保存し、第二の容器に鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ及びミネラルオイルを収容して保存することを特徴とする保存方法。
【請求項４８】
ＬＡＭＰ法に使用するキットであって、
ＬＡＭＰ用プライマー及びＬＡＭＰ用反応液を収容する第一の容器と、
鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ及びミネラルオイルを収容する第二の容器と、
を少なくとも備えるキット。
【請求項４９】
ＬＡＭＰ法により核酸を増幅させる方法であって、
ＬＡＭＰ用プライマー及びＬＡＭＰ用反応液を収容する第一の容器にＤＮＡ試料を添加して混合液を調製し、
調製した混合液を、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ及びミネラルオイルを収容した第二の容器に添加し、
ＬＡＭＰ法により核酸を増幅させる方法。
【請求項５０】
ＬＡＭＰ法により核酸を増幅させる方法であって、
ＬＡＭＰ用プライマー及びＬＡＭＰ用反応液を収容する第一の容器にＤＮＡ試料を添加して混合液を調製し、
調製した混合液を９５〜１００℃に加熱し、当該混合液の温度を６０〜６５℃まで下げ、
当該混合液を鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ及びミネラルオイルを収容した第二の容器に添加し、
ＬＡＭＰ法により核酸を増幅させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビールを混濁させる酵母、乳酸菌及び偏性嫌気性菌の検出又は識別法に関する。本発明は、ビールを混濁させる酵母、乳酸菌及び偏性嫌気性菌のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子、ＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子又はメリビアーゼ遺伝子に特異的なプライマーに関する。さらに詳しくは、本発明は、ビールを混濁させる酵母、乳酸菌及び偏性嫌気性菌のリボソームＲＮＡ遺伝子、ＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子又はメリビアーゼ遺伝子の特定領域を増幅可能なビールを混濁させる微生物検出用プライマー又はプライマーセット並びに下面ビール酵母識別用プライマー又はプライマーセットに関する。本発明は、また、前記プライマー又はプライマーセットをＬＡＭＰ法に使用する、ビールを混濁させる微生物の検出・識別方法にも関する。本発明は、さらに、ＬＡＭ法に使用する試薬の保存方法、ＬＡＭＰ法に使用するキット、及びＬＡＭＰ法により核酸を増幅させる方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
近年のビールの生ビール化への流れは、ビール鮮度という新たな価値観をもたらした。こうした背景から、ビール製造会社にとっては、ビールの製造から出荷までの時間を劇的に短縮するために、ビール又は発泡酒を混濁させる微生物（以下、「ビール増殖菌」という。）の汚染を迅速かつ正確に判定する必要が高まっている。【０００３】
汚染事故を未然に防ぐために、ＰＣＲ法（Polymerase Chain Reaction）やＦＩＳＨ法（fluorescence in situ hybridization）を用いた各種検出法が既に報告されている（特許文献１〜５など）。しかし、何れの場合も高価な機器を必要とし、また煩雑な操作を伴うため、日々の微生物検査に使用するには問題がある。【０００４】
【特許文献１】特開平５−１５４００号公報
【特許文献２】特開平６−１４１８９９号公報
【特許文献３】特開平７−２８９２９５号公報
【特許文献４】特開平１０−２１０９８０号公報
【特許文献５】特開平１４−０３４５７８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の問題点に鑑み、従来技術の手法とは別の観点から、簡便かつ迅速なビール増殖菌の検出法及び識別法の開発が望まれている。したがって、本発明の目的は、前記の課題を解決し、製品ビールや発泡酒、製品として出来上がる前の醸造途中の液体（以下、「半製品」という。）、又は醸造環境におけるビール増殖菌の有無について、簡便かつ迅速な検出・識別法を提供することにある。
下面ビール酵母は、ろ過工程で取り除かれるものであるが、もし、ろ過漏れなどが生じ、製品ビールに混入した場合には、最発酵や増殖による混濁を引き起こす可能性がある。したがって、ろ過工程以降の検査で下面ビール酵母が検出された場合、下面ビール酵母もビール増殖菌として取り扱われる。そこで、本発明の目的は、下面ビール酵母の簡便かつ迅速な検出・識別法を提供することにある。
さらに、上記方法に関連して、本発明の目的は、ＬＡＭＰ法を実施するにあたり、必要とされる操作を簡便かつ効率良く実施する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、かかる課題を解決するべく検討を重ね、等温の遺伝子増幅反応であるLoop-mediated isothermal amplification（ＬＡＭＰ）法（国際特許公開ＷＯ００／２８０８２号パンフレット）を利用することにより、ビール増殖菌の検出・識別を簡便かつ迅速に行い得ることを見出した。【０００７】
すなわち、本発明はビール増殖菌のｒＲＮＡ遺伝子、ＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子又はメリビアーゼ遺伝子に特異的なプライマー又はプライマーセットを提供する。本発明は、また、ビール増殖菌の検出・識別方法を提供する。【０００８】
例えば、ビール増殖菌がサッカロミセス（Saccharomyces）属酵母の場合、本発明は下記（１）〜（４）を提供する。
（１）サッカロミセス属酵母のｒＲＮＡ遺伝子内Ｄ２領域の一部又はその相補鎖から選択される標的領域の塩基配列を増幅し、（ａ）第１のセグメントとして、サッカロミセス属酵母のｒＲＮＡ遺伝子にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列と、（ｂ）第２のセグメントとして、第１のセグメントの３’側の塩基配列に相補的であり、第１のセグメントの５’側に位置する塩基配列と、を含むことを特徴とするプライマー。
（２）配列番号１〜５で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドセットからなり、サッカロミセス属酵母のｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を増幅可能なサッカロミセス属酵母検出用プライマーセット。
（３）検体中に存在するサッカロミセス属酵母の検出方法であって、サッカロミセス属酵母のｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を標的とし、（２）に記載のプライマーセットで該ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を選択的に、ＬＡＭＰ法により増幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、サッカロミセス属酵母の検出方法。
（４）検体を増菌培養し、出現菌からＤＮＡ試料を分離し、該ＤＮＡ試料に対して、（２）に記載のプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により増幅反応を行い、サッカロミセス属酵母のリボソームＲＮＡ遺伝子の特定領域を増幅させ、この増幅産物の有無を確認することを特徴とする、サッカロミセス属酵母の識別方法。【０００９】
本発明は、また、ビール増殖菌のｒＲＮＡ遺伝子又はＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子に特異的なプライマー又はプライマーセット、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、反応緩衝液を少なくとも含むことを特徴とする、ビール中で増殖し得る微生物検出・識別用キットを提供する。【００１０】
本発明の所定のプライマーセットをＬＡＭＰ法に使用すると、対応するビール増殖菌のｒＲＮＡ遺伝子、ＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の特定領域にアニールする。これをＬＡＭＰ法で定める増幅条件の下で増幅すると、特定の遺伝子領域が増幅される。このような増幅産物の有無を、電気泳動法又は簡易検出法によって確認する。このようにして、ビール増殖菌を検出することができる。【００１１】
また、本発明の検出方法を特定の検体（例えば、ビールや発泡酒など）に適用するとき、検体から採取した菌を培養してＤＮＡ試料を分離し、このＤＮＡ試料に本発明の所定のプライマーセットを作用させ、増幅されたＤＮＡ増幅産物の有無を確認する。このようにして、ビール増殖菌を検出することができる。【００１２】
本発明は、また、下面ビール酵母のメリビアーゼ遺伝子に特異的なプライマー又はプライマーセット、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、反応緩衝液を少なくとも含むことを特徴とする下面ビール酵母の検出・識別方法を提供する。【００１３】
本発明の下面ビール酵母に特異的なプライマーセットをＬＡＭＰ法に使用すると、下面ビール酵母のメリビアーゼ遺伝子の特定領域にアニールする。これをＬＡＭＰ法で定める増幅条件の下で増幅すると、特定の遺伝子領域が増幅される。このような増幅産物の有無を、電気泳動法又は簡易検出法によって確認する。このようにして、下面ビール酵母を検出することができる。【００１４】
また、本発明の下面ビール酵母の検出方法を特定の検体（例えば、ビールや発泡酒など）に適用するとき、検体から採取した菌を培養してＤＮＡ試料を分離し、このＤＮＡ試料に本発明の所定のプライマーセットを作用させ、増幅されたＤＮＡ増幅産物の有無を確認する。このようにして、下面ビール酵母を検出することができる。【００１５】
ろ過工程以降の検査において、本発明のサッカロミセス属酵母検出用プライマーセットを用いた検査の結果が陽性となった場合、検出された酵母が下面ビール酵母なのか野生酵母のサッカロミセスなのか区別がつかない。本発明の下面ビール酵母検出用プライマーセットは、下面ビール酵母のメリビアーゼ遺伝子を特異的に増幅することが可能であって、野性酵母のサッカロミセスのメリビアーゼ遺伝子を増幅することはできない。したがって、本発明の下面ビール酵母検出用プライマーを用いることにより、検出酵母が下面ビール酵母なのか野生酵母なのか区別をすることが可能である。【００１６】
本発明は、さらに、（１）ＬＡＭＰ法に使用する試薬の保存方法であって、第一の容器にＬＡＭＰ用プライマー及びＬＡＭＰ用反応液を収容して保存し、第二の容器に鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ及びミネラルオイルを収容して保存することを特徴とする保存方法、（２）ＬＡＭＰ法に使用するキットであって、ＬＡＭＰ用プライマー及びＬＡＭＰ用反応液を収容する第一の容器と、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ及びミネラルオイルを収容する第二の容器と、を少なくとも備えるキット、（３）ＬＡＭＰ法により核酸を増幅させる方法であって、ＬＡＭＰ用プライマー及びＬＡＭＰ用反応液を収容する第一の容器にＤＮＡ試料を添加して混合液を調製し、調製した混合液を、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ及びミネラルオイルを収容した第二の容器に添加し、ＬＡＭＰ法により核酸を増幅させる方法、及び（４）ＬＡＭＰ法により核酸を増幅させる方法であって、ＬＡＭＰ用プライマー及びＬＡＭＰ用反応液を収容した第一の容器にＤＮＡ試料を添加して混合液を調製し、調製した混合液を９５〜１００℃に加熱し、当該混合液の温度を６０〜６５℃まで下げ、当該混合液を鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ及びミネラルオイルを収容した第二の容器に添加し、ＬＡＭＰ法により核酸を増幅させる方法を提供する。【００１７】
ＬＡＭＰ法に使用される酵素（鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ）溶液の添加量は１サンプルあたり０．５〜１μＬと極少量であり、操作性が悪いという問題点がある。しかし、本発明のＬＡＭＰ法に使用する試薬の保存方法、ＬＡＭＰ法に使用するキット及びＬＡＭＰ法により核酸を増幅する方法によれば、比較的容量の多いＬＡＭＰ用プライマー及びＬＡＭＰ用反応液を、極少量の酵素溶液及びミネラルオイルが分注されている容器に添加することが可能であり、操作性を改善することが可能である。【００１８】
また、ＬＡＭＰ反応を開始する前に、ＤＮＡ試料をＬＡＭＰ用プライマー及びＬＡＭＰ用反応液に混ぜた混合液を９５〜１００℃に加熱し、混合液の温度を６０〜６５℃まで下げることにより、ＤＮＡの変性及びプライマーとのアニーリングを生じさせることが可能である。これによりＬＡＭＰ法による核酸の増幅効率を上げることが可能である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、配列番号１〜１８及び２０〜５４で表される核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを組み合わせたプライマーセットをＬＡＭＰ法に使用して、ビール増殖菌の検出・識別を可能にする。【００２０】
また、本発明によるビール増殖菌の検出方法は、配列番号１〜１８及び２０〜５４で表される核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを組み合わせたプライマーセットを用いて、検体から得られたＤＮＡ試料にＬＡＭＰ法を施し、増幅産物の有無を確認することからなるので、ビール増殖菌の検出・識別を簡易、迅速かつ確実に行わしめる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、増幅時間と濁度の関係を表わす図である。（ａ）Pediococcus damnosus SBC8022株由来のゲノムＤＮＡに９５℃処理をしたサンプル（ｂ）Malephilus cerevisiae SBC8034株由来のゲノムＤＮＡに９５℃処理をしたサンプル（ｃ）Pediococcus damnosus SBC8022株由来のゲノムＤＮＡに９５℃処理をしなかったサンプル（ｄ）Malephilus cerevisiae SBC8034株由来のゲノムＤＮＡに９５℃処理をしなかったサンプル。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。【００２３】
本発明は、製品ビールや発泡酒、それらの半製品、あるいは醸造環境に、ビール増殖菌が存在するか否かを判定するために、ビール増殖菌に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＬＡＭＰ法による等温遺伝子増幅により、ビール増殖菌のｒＲＮＡ遺伝子、ＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子又はメリビアーゼ遺伝子の特定領域の増幅を行い、増幅産物の有無を確認することを基礎としている。【００２４】
なお、本明細書で使用する「ビール増殖菌」とは、ビール又は発泡酒中で増殖可能であり、ビール又は発泡酒に混濁や沈殿を生じさせ得る微生物のことを言う。「検体」とは、ビール増殖菌を含む可能性があり、本発明の検出・識別法の対象となるサンプルであるが、特に限定はない。例えば、製品ビールや発泡酒、それらの半製品あるいは醸造環境から直接採取あるいは適当な増菌培養を施したもの等を挙げることができる。また、本明細書で使用する「識別」とは、複数の菌種のなかで検出対象であるビール増殖菌を識別することを指す。また、本明細書で使用する「判定」とは、検出した菌がビール増殖菌か否かを判定することを指し、検出と同義に使用されることもある。【００２５】
本発明で使用されるＬＡＭＰ法は、ＰＣＲ法と異なり、増幅工程での温度調節（サイクル）を不要とし、一種類のＤＮＡ合成酵素を用いて、一定温度（等温）で増幅する遺伝子増幅法である（国際特許公開ＷＯ００／２８０８２号パンフレット、前掲）。【００２６】
本発明のビール増殖菌のリボソームＲＮＡ遺伝子、ＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子もしくはメリビアーゼ遺伝子に特異的なプライマーは、その特定領域を標的として、ループを形成する２種類の内部プライマー（ＦＩＰ、ＢＩＰ）と２種類の外部プライマー（Ｆ３、Ｂ３）の計４種類のセットとして、設計する。増幅する遺伝子の特定領域は、１００〜５００ｂｐ程度である。【００２７】
ここで、内部プライマーは、標的領域の塩基配列を増幅し、（ａ）第１のセグメントとして、標的遺伝子にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列と、（ｂ）第２のセグメントとして、第１のセグメントの３’側の塩基配列に相補的であり、第１のセグメントの５’側に位置する塩基配列と、を含むことを特徴とする。【００２８】
また、増幅反応の起点となるダンベル構造の５’末端側のループの１本鎖部分に相補的な配列を持つループプライマー（ＬｏｏｐＢ、ＬｏｏｐＦ）を用いることにより、ＤＮＡ合成の起点を増やすことが可能となる。このため、ループプライマーを利用すると、増幅効率が上がり、増幅に要する時間を１／３〜１／２に短縮することが可能である。そして、外部プライマーは、標的領域３’末端側にある塩基配列を認識し、かつ合成起点を与える塩基配列を有する。【００２９】
プライマーのオリゴヌクレオチドの核酸配列が決定されると、オリゴヌクレオチド自身の合成は、公知の手段、例えば、パーキンエルマー社製の自動ＤＮＡ合成装置を用いて実施できる。【００３０】
本発明において、ビール増殖菌の一種であるサッカロミセス属酵母を検出・識別するためのプライマーセットとして、例えば、配列番号１で表されるオリゴヌクレオチド（外部プライマー）と、配列番号２で表されるオリゴヌクレオチド（内部プライマー）と、配列番号３で表されるオリゴヌクレオチド（内部プライマー）と、配列番号４で表されるオリゴヌクレオチド（ループプライマー）と、配列番号５で表されるオリゴヌクレオチド（外部プライマー）と、を含むプライマーセットを挙げることができる。ここで、サッカロミセス属酵母用プライマーとは、当該酵母のｒＲＮＡ遺伝子内のＤ２領域を特異的に増幅可能なプライマーである。【００３１】
本発明において、ビール増殖菌の一種であるデッケラ属酵母を検出・識別するためのプライマーセットとして、例えば、配列番号１で表されるオリゴヌクレオチド（外部プライマー）と、配列番号６で表されるオリゴヌクレオチド（ループプライマー）と、配列番号７で表されるオリゴヌクレオチド（内部プライマー）と、配列番号８で表されるオリゴヌクレオチド（内部プライマー）と、配列番号５で表されるオリゴヌクレオチド（外部プライマー）と、を含むプライマーセットを挙げることができる。ここで、デッケラ属酵母用プライマーとは、当該酵母のｒＲＮＡ遺伝子内のＤ２領域を特異的に増幅可能なプライマーである。【００３２】
本発明において、ビール増殖菌の一種であるブレタノミセス属酵母を検出・識別するためのプライマーセットとして、例えば、配列番号１で表されるオリゴヌクレオチド（外部プライマー）と、配列番号９で表されるオリゴヌクレオチド（ループプライマー）と、配列番号１０で表されるオリゴヌクレオチド（内部プライマー）と、配列番号１１で表されるオリゴヌクレオチド（内部プライマー）と、配列番号１２で表されるオリゴヌクレオチド（ループプライマー）と、配列番号５で表されるオリゴヌクレオチド（外部プライマー）と、を含むプライマーセットを挙げることができる。ここで、ブレタノミセス属酵母用プライマーとは、その酵母のｒＲＮＡ遺伝子内のＤ２領域を特異的に増幅可能なプライマーである。【００３３】
本発明において、ビール増殖菌の一種である乳酸菌ラクトバチルス・ブレビスを検出・識別するためのプライマーセットとして、例えば、配列番号１３で表されるオリゴヌクレオチド（外部プライマー）と、配列番号１４で表されるオリゴヌクレオチド（ループプライマー）と、配列番号１５で表されるオリゴヌクレオチド（内部プライマー）と、配列番号１６で表されるオリゴヌクレオチド（内部プライマー）と、配列番号１７で表されるオリゴヌクレオチド（ループプライマー）と、配列番号１８で表されるオリゴヌクレオチド（外部プライマー）と、を含むプライマーセットを挙げることができる。ここで、ラクトバチルス・ブレビス用プライマーとは、その菌のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子を特異的に増幅可能なプライマーである。【００３４】
本発明において、ビール増殖菌の一種である乳酸菌ラクトバチルス・リンドネリを検出・識別するためのプライマーセットとして、例えば、配列番号２０で表されるオリゴヌクレオチド（外部プライマー）と、配列番号２１で表されるオリゴヌクレオチド（ループプライマー）と、配列番号２２で表されるオリゴヌクレオチド（内部プライマー）と、配列番号２３で表されるオリゴヌクレオチド（内部プライマー）と、配列番号２４で表されるオリゴヌクレオチド（ループプライマー）と、配列番号２５で表されるオリゴヌクレオチド（外部プライマー）と、を含むプライマーセットを挙げることができる。ここで、ラクトバチルス・リンドネリ用プライマーとは、その菌のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子を特異的に増幅可能なプライマーである。なお、ラクトバチルス・リンドネリのＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の一部の塩基配列を配列表の配列番号１９に示す。【００３５】
本発明において、ビール増殖菌の一種である乳酸菌ラクトバチルス・シュードコリノイデスを検出・識別するためのプライマーセットとして、例えば、配列番号２６で表されるオリゴヌクレオチド（外部プライマー）と、配列番号２７で表されるオリゴヌクレオチド（ループプライマー）と、配列番号２８で表されるオリゴヌクレオチド（内部プライマー）と、配列番号２９で表されるオリゴヌクレオチド（内部プライマー）と、配列番号３０で表されるオリゴヌクレオチド（ループプライマー）と、配列番号３１で表されるオリゴヌクレオチド（外部プライマー）と、を含むプライマーセットを挙げることができる。ここで、ラクトバチルス・シュードコリノイデス用プライマーとは、その菌のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子を特異的に増幅可能なプライマーである。【００３６】
本発明において、ビール増殖菌の一種である乳酸菌ラクトバチルス・ヘキソーサスを検出・識別するためのプライマーセットとして、例えば、配列番号３２で表されるオリゴヌクレオチド（外部プライマー）と、配列番号３３で表されるオリゴヌクレオチド（ループプライマー）と、配列番号３４で表されるオリゴヌクレオチド（内部プライマー）と、配列番号３５で表されるオリゴヌクレオチド（内部プライマー）と、配列番号３６で表されるオリゴヌクレオチド（ループプライマー）と、配列番号３７で表されるオリゴヌクレオチド（外部プライマー）と、を含むプライマーセットを挙げることができる。ここで、ラクトバチルス・ヘキソーサス用プライマーとは、その菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を特異的に増幅可能なプライマーである。【００３７】
本発明において、ビール増殖菌の一種である乳酸菌ペディオコッカス・ダムノサスを検出・識別するためのプライマーセットとして、例えば、配列番号３２で表されるオリゴヌクレオチド（外部プライマー）と、配列番号３８で表されるオリゴヌクレオチド（内部プライマー）と、配列番号３９で表されるオリゴヌクレオチド（内部プライマー）と、配列番号４０で表されるオリゴヌクレオチド（ループプライマー）と、配列番号３７で表されるオリゴヌクレオチド（外部プライマー）と、を含むプライマーセットを挙げることができる。さらに、別のプライマーセットの例として、上記プライマーセットのうち、配列番号３８で表されるオリゴヌクレオチド（内部プライマー）の代わりに、配列番号５３で表されるオリゴヌクレオチド（ループプライマー）及び配列番号５４で表されるオリゴヌクレオチド（内部プライマー）を含むプライマーセットを挙げることができる。ここで、ペディオコッカス・ダムノサス用プライマーとは、その菌の１６Ｓ  rＲＮＡ遺伝子を特異的に増幅可能なプライマーである。【００３８】
本発明において、ビール増殖菌の一種である偏性嫌気性菌ペクチネイタス属菌を検出・識別するためのプライマーセットとして、例えば、配列番号３２で表されるオリゴヌクレオチド（外部プライマー）と、配列番号４１で表されるオリゴヌクレオチド（ループプライマー）と、配列番号４２で表されるオリゴヌクレオチド（内部プライマー）と、配列番号４３で表されるオリゴヌクレオチド（内部プライマー）と、配列番号３７で表されるオリゴヌクレオチド（外部プライマー）と、を含むプライマーセットを挙げることができる。ここで、ペクチネイタス属菌用プライマーとは、その菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を特異的に増幅可能なプライマーである。【００３９】
本発明において、ビール増殖菌の一種である偏性嫌気性菌マレフィラス・シェルビシエを検出・識別するためのプライマーセットとして、例えば、配列番号３２で表されるオリゴヌクレオチド（外部プライマー）と、配列番号４４で表されるオリゴヌクレオチド（ループプライマー）と、配列番号４５で表されるオリゴヌクレオチド（内部プライマー）と、配列番号４６で表されるオリゴヌクレオチド（内部プライマー）と、配列番号３７で表されるオリゴヌクレオチド（外部プライマー）と、を含むプライマーセットを挙げることができる。ここで、マレフィラス・シェルビシエ用プライマーとは、その菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を特異的に増幅可能なプライマーである。【００４０】
本発明において、下面ビール酵母を検出・識別するためのプライマーセットとして、例えば、配列番号４７で表されるオリゴヌクレオチド（外部プライマー）と、配列番号４８で表されるオリゴヌクレオチド（内部プライマー）と、配列番号４９で表されるオリゴヌクレオチド（内部プライマー）と、配列番号５０で表されるオリゴヌクレオチド（外部プライマー）と、配列番号５１で表されるオリゴヌクレオチド（ループプライマー）と、配列番号５２で表されるオリゴヌクレオチド（ループプライマー）と、を含むプライマーセットを挙げることができる。ここで、下面ビール酵母用プライマーとは、その酵母のメリビアーゼ遺伝子を特異的に増幅可能なプライマーである。また、サッカロミセス属酵母として検出された酵母が、野生酵母なのか下面ビール酵母なのかを識別することが可能なプライマーである。【００４１】
検体中に存在するビール増殖菌の検出は、検出しようとするビール増殖菌に応じて上記したプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法に従い、等温遺伝子増幅（通常、６０〜６５℃で１５分〜１時間）を行う。プライマーセットを個別に、複数のプライマーセットを組み合わせて、又はプライマーセット全てを、１つの反応系に添加し、ＬＡＭＰ反応を行うことが可能である。検体から採取した菌株又は検体そのものを、適当な培地中で培養し、遠心分離等で集菌した後、公知の方法によって菌株のＤＮＡを分離して、このＤＮＡに対して、前記プライマーセットを用いて、増幅反応を行う。増幅したＤＮＡ増幅産物の有無は、ＬＡＭＰ法での簡易検出、又は通常の電気泳動によって検出できる。前者の簡易検出には、１）増幅反応液の白濁による目視確認（国際特許公開ＷＯ０１／８３８１７号パンフレット）および２）蛍光インターカレーターの目視確認がある。いずれも、目視により増幅産物（標的遺伝子の存在）の有無を確認することができる。【００４２】
ビール製造工程のうち、ろ過工程以前の工程における半製品には、下面ビール酵母が含まれている。したがって、ろ過工程以前の工程においては、ビール増殖菌用のプライマーセットは、サッカロミセス属酵母検出用プライマーを含まないことが好ましい。【００４３】
ろ過工程以降の工程における半製品又は製品には、下面ビール酵母が含まれていてはならない。したがって、ろ過工程以降の工程においては、ビール増殖菌用のプライマーセットは、サッカロミセス属酵母検出用プライマーセットを含んでいてよい。そして、下面ビール酵母検出用プライマーセットを組み合わせて用いることにより、検出された酵母が、下面ビール酵母なのか、野生酵母のサッカロミセスなのかを判定することが可能である。【００４４】
検出された酵母が下面ビール酵母であれば、ろ過工程に不具合があることが推定でき、検出された酵母が野生酵母であれば、充填室での飛び込みであることが推定できる。このようにして、トラブルの原因箇所（ビール増殖菌の混入箇所等）を予測することが可能となる。【００４５】
ＬＡＭＰ法に使用する試薬のうち、ＬＡＭＰ用プライマー及びＬＡＭＰ用反応液を第一の容器に収容して保存し、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ及びミネラルオイルを第二の容器に収容して保存することで、ＬＡＭＰ法の操作性を改善することが可能である。また、ＬＡＭＰ用プライマー及びＬＡＭＰ用反応液を収容する第一の容器と、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ及びミネラルオイルを収容する第二の容器と、を少なくとも備えるキットを用いることで、ＬＡＭＰ法の操作を改善することが可能である。
このような保存方法やキットにより、比較的容量の多いＬＡＭＰ用プライマー及びＬＡＭＰ用反応液を、極少量の酵素（鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ）溶液及びミネラルオイルが分注されている容器に添加することが可能であり、操作性を改善でき、ＬＡＭＰ法を簡便かつ効率よく実施することが可能でなる。【００４６】
また、ＬＡＭＰ反応を開始する前に、ＤＮＡ試料をＬＡＭＰ用プライマー及びＬＡＭＰ用反応液に混ぜた混合液を９５〜１００℃に加熱し、混合液の温度を６０〜６５℃まで下げることにより、ＤＮＡの変性及びプライマーとのアニーリングを生じさせることが可能である。これによりＬＡＭＰ法による核酸の増幅効率を上げることができ、ＬＡＭＰ法を簡便かつ効率よく実施することが可能である。【００４７】
ここで、ＬＡＭＰ用プライマーとは、ＬＡＭＰ反応に用いられるプライマーを指す。ＬＡＭＰ用反応液とは、ＬＡＭＰ反応を行うための反応液を指し、その組成は特に限定されないが、例えば、ＬＡＭＰ反応で通常用いられている反応液（Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）：４０ｍＭ、ＫＣｌ：２０ｍＭ、ＭｇＳＯ４：１６ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４：２０ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ２０：０．２％、Ｂｅｔａｉｎｅ：１．６Ｍ、ｄＮＴＰｓ：各２．８ｍＭ）などである。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例を挙げて本発明について更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００４９】
（実施例１）  ビール増殖菌の検出・識別
（ゲノムＤＮＡの調製）
ビール増殖菌を全麦芽ビール（ｐＨ４．５、苦味価３０、アルコール５％）に、酵母をＹＥＰＤ培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％、寒天２％）に、乳酸菌をＭＲＳ寒天培地（ベクトン・ディッキンソン社）、偏性嫌気性菌をＧＡＭ寒天培地（日水製薬社）にそれぞれ植菌し、３０℃にて、７〜１４日間、好気培養又は嫌気培養（タバイエスペック社製嫌気培養装置、Ｎ２：Ｈ２：ＣＯ２＝９０：５：５）を行った。培養した菌体から、ＤＮＡ抽出液PrepMan（商標）Ultra（アプライド・バイオシステム社）を用いてゲノムＤＮＡの抽出を行った。【００５０】
（微生物の同定）
上記方法により調製したゲノムＤＮＡについて、MicroSeq（商標）System（アプライド・バイオシステム社）を用いて微生物の同定を行った。【００５１】
（ＬＡＭＰ法による遺伝子増幅）
ＬＡＭＰ法による遺伝子増幅はLoopamp ＤＮＡ増幅試薬キット（栄研化学社製）、例えば、ＬＡＭＰ反応で通常用いられている反応液（Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）：４０ｍＭ、ＫＣｌ：２０ｍＭ、ＭｇＳＯ４：１６ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４：２０ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ２０：０．２％、Ｂｅｔａｉｎｅ：１．６Ｍ、ｄＮＴＰｓ：各２．８ｍＭ）を用いて行った。試薬反応液に上記ＤＮＡ溶液、及び配列番号１〜１８及び２０〜４６のオリゴヌクレオチドを加え、遺伝子の増幅反応を行った。増幅反応は６３℃で、９０分間行った。【００５２】
（増幅産物の検出）
増幅反応が進むにつれ、遊離してくるピロリン酸が、反応液中に存在するマグネシウムイオンとピロリン酸マグネシウムを形成する。増幅が起こっている場合のみ反応液が白濁する。この白濁を観察することで、増幅産物の有無を判断した。【００５３】
増幅結果をまとめたものが表１及び表２である。【００５４】
【表１】
2005093059.tif 000002
【００５５】
【表２】
2005093059.tif 000003
【００５６】
表１及び表２に示したように、全てのビール増殖菌において増幅産物が確認され、ビール増殖性の無い菌においては増幅産物は確認されなかった。【００５７】
（実施例２）下面ビール酵母の識別
（ＬＡＭＰ法による遺伝子増幅）
ＬＡＭＰ法による遺伝子増幅はLoopamp ＤＮＡ増幅試薬キット（栄研化学社製）、例えば、ＬＡＭＰ反応で通常用いられている反応液（Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）：４０ｍＭ、ＫＣｌ：２０ｍＭ、ＭｇＳＯ４：１６ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４：２０ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ２０：０．２％、Ｂｅｔａｉｎｅ：１．６Ｍ、ｄＮＴＰｓ：各２．８ｍＭ）を用いて行った。試薬反応液に上記ＤＮＡ溶液、および配列番号４７〜５２のオリゴヌクレオチドを加え、遺伝子の増幅反応を行った。増幅反応は６３℃で、９０分間行った。【００５８】
増幅結果をまとめたものが表３である。【００５９】
【表３】
2005093059.tif 000004
【００６０】
表３に示したように、全ての下面ビール酵母において増幅産物が確認され、野生酵母において増幅産物は確認されなかった。【００６１】
（実施例３）ＬＡＭＰ法の改良
配列番号１〜１８及び２０〜４６のオリゴヌクレオチドとＬＡＭＰ用反応液とをあらかじめ入れた容器（ａ）と、酵素溶液にミネラルオイルを添加した容器（ｂ）とを用意した。実施例１で調製したゲノムＤＮＡを（ａ）の容器に添加し、９５℃で３分処理したのち溶液の温度を６３℃まで下げ（以下、この処理を「９５℃処理」という。）、溶液を（ｂ）の容器に添加し、６３℃で１２０分間処理してＬＡＭＰ法による増幅反応を行った。増幅効率の比較は、Ｌｏｏｐａｍｐリアルタイム濁度測定装置ＬＡ−２００（テラメックス株式会社製）を用いて行った。【００６２】
図１は、増幅時間と濁度の関係を表わす図である。図１中（ａ）はPediococcus damnosus SBC8022株由来のゲノムＤＮＡに９５℃処理をしたサンプルを（ｂ）はMalephilus cerevisiae SBC8034株由来のゲノムＤＮＡに９５℃処理をしたサンプル（ｃ）Pediococcus damnosus SBC8022株由来のゲノムＤＮＡに９５℃処理をしなかったサンプルを（ｄ）はMalephilus cerevisiae SBC8034株由来のゲノムＤＮＡに９５℃処理をしなかったサンプルを表わす。【００６３】
図１に示したように、９５℃で３分処理した後に６３℃まで温度を下げる処理をした場合、この処理を行わなかった場合と比較して、増幅効率が上がることが確認できた。【００６４】
また、このキット化した方法を用いて、実施例１及び２で使用した全ての菌株について、表１〜３で得られた結果と同様の結果が得られることを確認した。【００６５】
Malephilus cerevisiae SBC8034株、Lactobacillus hexosus SBC8050株及びLactobacillus pseudocollinoides SBC8057株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に２００３年１０月２１日に寄託されており、受託番号は、それぞれ、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５２８、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５２９及びＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５３０である。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
ビール・発泡酒中で増殖し、混濁を生じる全ての微生物を迅速かつ簡便に検出・識別することが可能となった。サッカロミセス属酵母として検出された酵母が、野生酵母なのか下面ビール酵母なのかを迅速かつ簡便に識別することが可能となった。したがって、本発明のプライマー及びプライマーセット並びにそれらを用いるビール増殖菌の検出方法は、ビール・発泡酒等の製造現場で製品の品質管理に役に立つ。【００６７】
また、ビール増殖菌のいくつかは、ワインや日本酒などにおいても増殖し、品質を劣化させ得ることが知られている。したがって、本発明のプライマーセットおよびそれを用いる酵母、乳酸菌及び偏性嫌気性菌の検出方法は、ワインや日本酒などのアルコール飲料等の製造現場で製品の品質管理にも役に立つ。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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