(57)【要約】本発明は、ｐＨ応答性高分子ミセルの調製に用いる新規ブロック共重合体及びその製造法を提供することを課題とする。  アスパラギン酸ベンジルエステル構造を含む高分子に対して、ヒドラジンを反応させることにより、アスパラギン酸ベンジルエステル部分をアスパラギン酸ヒドラジドに変換することを特徴とする、アスパラギン酸ヒドラジド構造を含む高分子の製造法により、上記課題を解決する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスパラギン酸ベンジルエステル構造を含む高分子に対して、ヒドラジンを反応させることにより、アスパラギン酸ベンジルエステル部分をアスパラギン酸ヒドラジドに変換することを特徴とする、アスパラギン酸ヒドラジド構造を含む高分子の製造法。
【請求項２】
アスパラギン酸ベンジルエステル構造を含む高分子が、ポリアスパラギン酸ベンジルエステルである、請求項１に記載の製造法。
【請求項３】
アスパラギン酸ベンジルエステル構造を含む高分子が、ポリアミノ酸誘導体であり、構成するアミノ酸誘導体の一部がアスパラギン酸ベンジルエステルである、請求項１に記載の製造法。
【請求項４】
アスパラギン酸ベンジルエステル構造を含む高分子が、グラフト共重合体であり、その主鎖またはグラフト鎖の少なくともいずれか一方にアスパラギン酸ベンジルエステル構造を含むものである、請求項１に記載の製造法。
【請求項５】
アスパラギン酸ベンジルエステル構造を含む高分子が、ブロック共重合体であり、その一部の構成セグメントにアスパラギン酸ベンジルエステル構造を含むものである、請求項１に記載の製造法。
【請求項６】
ブロック共重合体が、ポリエチレングリコールもしくはその誘導体とポリアミノ酸誘導体とのブロック共重合体であり、そのポリアミノ酸誘導体を構成するアミノ酸誘導体の一部がアスパラギン酸ベンジルエステルである、請求項５に記載の製造法。
【請求項７】
ブロック共重合体が、ポリエチレングリコールもしくはその誘導体とポリアスパラギン酸ベンジルエステルとのブロック共重合体である、請求項５に記載の製造法。
【請求項８】
ブロック共重合体の構造が、下記式（Ｉ）または（ＩＩ）で示されるものである、請求項６または７に記載の製造法。
2006115293.tif 000022
（上式中、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは水素原子または未置換もしくは置換された直鎖状、分枝状もしくは環状のＣ１−１２アルキル基を表し、Ｌ１及びＬ２は連結基を表し、Ｒ２は水素原子、保護基、疎水性基または重合性基を表し、Ｒ３は水酸基または開始剤残基を表し、Ｒ４ａ及びＲ４ｂ並びにＲ５ａ及びＲ５ｂはそれぞれ独立して保護基を表し、ｍは５〜２０，０００の整数であり、ｎは２〜５０００の整数であり、ｙは０〜４，９９９の整数であり、ｚは０〜４，９９９の整数であるが、ｙ＋ｚはｎよりも小さいものとし、また、上記一般式における各繰り返し単位は記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムに存在できる。）
【請求項９】
Ｒ１ａ及びＲ１ｂがメチル基である、請求項８に記載の製造法。
【請求項１０】
Ｒ１ａ及びＲ１ｂが置換されたアルキル基であり、その置換基が、保護されていてもよいマレイミド基、アミノ基、チオール基及び活性エステル基からなる群より選択される抗体もしくは抗体断片が導入可能な官能基、またはリガンド構造を含むものである、請求項８に記載の製造法。
【請求項１１】
Ｒ１ａ及びＲ１ｂが下記式に示す葉酸誘導体である、請求項８に記載の製造法。
2006115293.tif 000023
【請求項１２】
Ｒ２がアセチル基である、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項１３】
Ｒ３が−ＮＨ−Ｘであり、ここでＸは未置換または置換されたＣ１−１２アルキル基を表す、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項１４】
Ｌ１が−（ＣＨ２）ａ−ＮＨ−であり、ここでａは１〜５の整数である、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項１５】
Ｌ２が−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ−であり、ここでｂは１〜５の整数である、請求項８〜１１及び１３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項１６】
ｙ＝０である、請求項８〜１５のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項１７】
ｚ＝０である、請求項８〜１６のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項１８】
アスパラギン酸誘導体構造を含む高分子であって、アスパラギン酸誘導体中の８０％以上がアスパラギン酸ヒドラジドである高分子。
【請求項１９】
アスパラギン酸誘導体構造を含む高分子であって、アスパラギン酸誘導体中の９０％以上がアスパラギン酸ヒドラジドである高分子。
【請求項２０】
アスパラギン酸誘導体構造を含む高分子であって、アスパラギン酸誘導体中の９５％以上がアスパラギン酸ヒドラジドである高分子。
【請求項２１】
アスパラギン酸誘導体構造を含む高分子が、ポリアスパラギン酸誘導体である、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の高分子。
【請求項２２】
アスパラギン酸誘導体構造を含む高分子が、ポリアミノ酸誘導体であり、構成するアミノ酸誘導体の一部がアスパラギン酸誘導体である、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の高分子。
【請求項２３】
アスパラギン酸誘導体構造を含む高分子が、グラフト共重合体であり、その主鎖またはグラフト鎖の少なくともいずれか一方にアスパラギン酸誘導体構造を含むものである、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の高分子。
【請求項２４】
アスパラギン酸誘導体構造を含む高分子が、ブロック共重合体であり、その一部の構成セグメントにアスパラギン酸誘導体構造を含むものである、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の高分子。
【請求項２５】
ブロック共重合体が、ポリエチレングリコールもしくはその誘導体とポリアミノ酸誘導体とのブロック共重合体であり、そのポリアミノ酸誘導体を構成するアミノ酸誘導体の一部がアスパラギン酸誘導体である、請求項２４に記載の高分子。
【請求項２６】
ブロック共重合体が、ポリエチレングリコールもしくはその誘導体とポリアスパラギン酸誘導体とのブロック共重合体である、請求項２４に記載の高分子。
【請求項２７】
ブロック共重合体の構造が、下記式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で示されるものである、請求項２５または２６に記載の高分子。
2006115293.tif 000024
（上式中、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは水素原子または未置換もしくは置換された直鎖状、分枝状もしくは環状のＣ１−１２アルキル基を表し、Ｌ１及びＬ２は連結基を表し、Ｒ２は水素原子、保護基、疎水性基または重合性基を表し、Ｒ３は水酸基または開始剤残基を表し、Ｒ６ａ及びＲ６ｂはそれぞれ独立して水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−ＮＨ２または−ＮＨ−Ｙを表すが、少なくとも１つは−ＮＨ−ＮＨ２であり、ここでＹはそれぞれ独立して未置換もしくは置換されたＣ１−２０アルキル基であり、Ｒ７ａ及びＲ７ｂはそれぞれ独立して水酸基、オキシ−保護基、−ＮＨ−ＮＨ２または−ＮＨ−Ｙを表し、Ｙはそれぞれ独立して未置換もしくは置換されたＣ１−２０アルキル基であり、Ｒ８ａ及びＲ８ｂはそれぞれ独立して水素原子または保護基を表し、ｍは５〜２０，０００の整数であり、ｎは２〜５，０００の整数であり、ｘは０〜５，０００の整数であり、ｙは０〜４，９９９の整数であり、ｚは０〜４，９９９の整数であるが、ｙ＋ｚはｎよりも小さいものとし、また、上記一般式における各繰り返し単位は記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムに存在できる。）
【請求項２８】
Ｒ１ａ及びＲ１ｂがメチル基である、請求項２７に記載の高分子。
【請求項２９】
Ｒ１ａ及びＲ１ｂが置換されたアルキル基であり、その置換基が、保護されていてもよいマレイミド基、アミノ基、チオール基及び活性エステル基からなる群より選択される抗体もしくは抗体断片が導入可能な官能基、またはリガンド構造を含むものである、請求項２７に記載の高分子。
【請求項３０】
下記式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で示されるブロック共重合体であって、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは置換された直鎖状、分枝状または環状のＣ１−１２アルキル基を表し、その置換基が、保護されていてもよいマレイミド基、アミノ基、チオール基及び活性エステル基からなる群より選択される抗体もしくは抗体断片が導入可能な官能基、またはリガンド構造を含むものである高分子。
2006115293.tif 000025
（上式中、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは水素原子または未置換もしくは置換された直鎖状、分枝状もしくは環状のＣ１−１２アルキル基を表し、Ｌ１及びＬ２は連結基を表し、Ｒ２は水素原子、保護基、疎水性基または重合性基を表し、Ｒ３は水酸基または開始剤残基を表し、Ｒ６ａ及びＲ６ｂはそれぞれ独立して水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−ＮＨ２または−ＮＨ−Ｙを表すが、少なくとも１つは−ＮＨ−ＮＨ２であり、ここでＹはそれぞれ独立して未置換もしくは置換されたＣ１−２０アルキル基であり、Ｒ７ａ及びＲ７ｂはそれぞれ独立して水酸基、オキシ−保護基、−ＮＨ−ＮＨ２または−ＮＨ−Ｙを表し、Ｙはそれぞれ独立して未置換もしくは置換されたＣ１−２０アルキル基であり、Ｒ８ａ及びＲ８ｂはそれぞれ独立して水素原子または保護基を表し、ｍは５〜２０，０００の整数であり、ｎは２〜５，０００の整数であり、ｘは０〜５，０００の整数であり、ｙは０〜４，９９９の整数であり、ｚは０〜４，９９９の整数であるが、ｙ＋ｚはｎよりも小さいものとし、また、上記一般式における各繰り返し単位は記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムに存在できる。）
【請求項３１】
Ｒ１ａ及びＲ１ｂが下記式に示す葉酸誘導体である、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の高分子。
2006115293.tif 000026
【請求項３２】
Ｒ２がアセチル基である、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の高分子。
【請求項３３】
Ｒ３が−ＮＨ−Ｘであり、ここでＸは未置換または置換されたＣ１−１２アルキル基を表す、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の高分子。
【請求項３４】
Ｌ１が−（ＣＨ２）ａ−ＮＨ−であり、ここでａは１〜５の整数である、請求項２７〜３２のいずれか１項に記載の高分子。
【請求項３５】
Ｌ２が−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ−であり、ここでｂは１〜５の整数である、請求項２７〜３０及び３３のいずれか１項に記載の高分子。
【請求項３６】
ｙ＝０である、請求項２７〜３５のいずれか１項に記載の高分子。
【請求項３７】
ｚ＝０である、請求項２７〜３６のいずれか１項に記載の高分子。
【請求項３８】
下記式（Ｖ）または（ＶＩ）に示すブロック共重合体の製造法であって、
2006115293.tif 000027
（上式中、Ｌ１及びＬ２は連結基を表し、Ｒ２は水素原子、保護基、疎水性基または重合性基を表し、Ｒ３は水酸基または開始剤残基を表し、Ｒ６ａ及びＲ６ｂはそれぞれ独立して水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−ＮＨ２または−ＮＨ−Ｙを表すが、少なくとも１つは−ＮＨ−ＮＨ２であり、ここでＹはそれぞれ独立して未置換もしくは置換されたＣ１−２０アルキル基であり、Ｒ７ａ及びＲ７ｂはそれぞれ独立して水酸基、オキシ−保護基、−ＮＨ−ＮＨ２または−ＮＨ−Ｙを表し、Ｙはそれぞれ独立して未置換もしくは置換されたＣ１−２０アルキル基であり、Ｒ８ａ及びＲ８ｂはそれぞれ独立して水素原子または保護基を表し、ｍは５〜２０，０００の整数であり、ｎは２〜５，０００の整数であり、ｘは０〜５，０００の整数であり、ｙは０〜４，９９９の整数であり、ｚは０〜４，９９９の整数であるが、ｙ＋ｚはｎよりも小さいものとし、また、上記一般式における各繰り返し単位は記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムに存在できる。）
下記式（ＶＩＩ）または（ＶＩＩＩ）に示すポリエチレングリコール末端にベンズアルデヒド基を有するブロック共重合体に、
2006115293.tif 000028
（上式中、Ｌ１及びＬ２は連結基を表し、Ｒ２は水素原子、保護基、疎水性基または重合性基を表し、Ｒ３は水酸基または開始剤残基を表し、Ｒ４ａ及びＲ４ｂ並びにＲ５ａ及びＲ５ｂはそれぞれ独立して保護基を表し、ｍは５〜２０，０００の整数であり、ｎは２〜５，０００の整数であり、ｙは０〜４，９９９の整数であり、ｚは０〜４，９９９の整数であるが、ｙ＋ｚはｎよりも小さいものとし、また、上記一般式における各繰り返し単位は記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムに存在できる。）
下記式（ＩＸ）に示す葉酸誘導体をシッフベースにより結合させ、還元した後、
2006115293.tif 000029
ヒドラジンを反応させることにより、アスパラギン酸ベンジルエステル部分をアスパラギン酸ヒドラジドに変換する製造法。
【請求項３９】
Ｒ２がアセチル基である、請求項３８に記載の製造法。
【請求項４０】
Ｒ３が−ＮＨ−Ｘであり、ここでＸは未置換または置換されたＣ１−１２アルキル基を表す、請求項３８に記載の製造法。
【請求項４１】
Ｌ１が−（ＣＨ２）ａ−ＮＨ−であり、ここでａは１〜５の整数である、請求項３８または３９に記載の製造法。
【請求項４２】
Ｌ２が−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ−であり、ここでｂは１〜５の整数である、請求項３８または４０に記載の製造法。
【請求項４３】
ｙ＝０である、請求項３８〜４２のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項４４】
ｚ＝０である、請求項３８〜４３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項４５】
請求項１８〜３７のいずれか１項に記載の高分子、または請求項１〜１７及び３８〜４４のいずれか１項に記載の製造法により製造された高分子と、カルボニル基を有する化合物との高分子−化合物複合体であって、前記高分子中のアスパラギン酸ヒドラジドと前記化合物中のカルボニル基とがシッフベースを形成することにより結合した高分子−化合物複合体。
【請求項４６】
請求項２５〜３７のいずれか１項に記載の高分子、または請求項６〜１７及び３８〜４４のいずれか１項に記載の製造法により製造された高分子と、カルボニル基を有する化合物との高分子−化合物複合体が形成するコア−シェル型高分子ミセルであって、当該複合体は、前記高分子中のアスパラギン酸ヒドラジドと前記化合物中のカルボニル基とがシッフベースを形成することにより結合したものであり、前記化合物が結合したアスパラギン酸ヒドラジドを含むセグメントが主にコアに存在し、ポリエチレングリコールもしくはその誘導体セグメントが主にシェルに存在することを特徴とする高分子ミセル。
【請求項４７】
請求項２９〜３７のいずれか１項に記載の高分子、または請求項１０〜１７及び３８〜４４のいずれか１項に記載の製造法により製造された高分子と、カルボニル基を有する化合物との高分子−化合物複合体が形成するコア−シェル型高分子ミセルであって、当該複合体は、前記高分子中のアスパラギン酸ヒドラジドと前記化合物中のカルボニル基とがシッフベースを形成することにより結合したものであり、前記化合物が結合したアスパラギン酸ヒドラジドを含むセグメントが主にコアに存在し、ポリエチレングリコールもしくはその誘導体セグメントが主にシェルに存在し、官能基に結合した抗体もしくは抗体断片、またはリガンドが表層付近に存在することを特徴とする高分子ミセル。
【請求項４８】
酸性条件下でシッフベース結合が解裂して前記化合物が遊離することを特徴とする、請求項４５に記載の高分子−化合物複合体。
【請求項４９】
化合物が生理活性を持つ薬剤である、請求項４８に記載の高分子−化合物複合体。
【請求項５０】
薬剤が抗癌剤である、請求項４９に記載の高分子−化合物複合体。
【請求項５１】
抗癌剤がアドリアマイシンである、請求項５０に記載の高分子−化合物複合体。
【請求項５２】
酸性条件下でシッフベース結合が解裂して前記化合物が遊離することを特徴とする、請求項４６または４７に記載の高分子ミセル。
【請求項５３】
化合物が生理活性を持つ薬剤である、請求項５２に記載の高分子ミセル。
【請求項５４】
薬剤が抗癌剤である、請求項５３に記載の高分子ミセル。
【請求項５５】
抗癌剤がアドリアマイシンである、請求項５４に記載の高分子ミセル。
【請求項５６】
アスパラギン酸ベンジルエステルに対するヒドラジンの仕込量を変えることにより、アスパラギン酸ヒドラジドへの変換率を制御することを特徴とする、請求項１〜１７及び３８〜４４のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項５７】
請求項５６に記載の製造法により製造された高分子とカルボニル基を有する化合物との高分子−化合物複合体、または当該高分子−化合物複合体が形成するコア−シェル型高分子ミセルから、当該複合体またはミセルに導入されたアスパラギン酸ヒドラジドの変換率に応じて、前記化合物を遊離または放出させることを特徴とする、前記化合物の遊離または放出速度の制御方法。
【請求項５８】
請求項５７に記載の方法により化合物の遊離または放出速度が制御された、請求項４５及び４８〜５１のいずれか１項に記載の高分子−化合物複合体。
【請求項５９】
請求項５７に記載の方法により化合物の遊離または放出速度が制御された、請求項４６及び５２〜５５のいずれか１項に記載の高分子ミセル。
【請求項６０】
請求項４５〜５５、５８及び５９のいずれか１項に記載の高分子−化合物複合体または高分子ミセルを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍組織に抗癌剤をターゲッティングすることにより、治療効果を高め、副作用を軽減することを目的としたドラッグデリバリーシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の化学療法において、抗癌剤の重篤な副作用がその使用の大きな制約となっている。抗癌剤を腫瘍組織に選択的に集め、正常組織にはできるだけ行かないようにできれば、効果の増強と副作用の軽減が可能となる。腫瘍組織においては正常組織に比べ新生血管の増生と血管壁の透過性の著しい昂進が見られ、かつリンパ系が未発達であるため、高分子量の物質でも血中から組織に移行することができ、かつ組織から回収されにくいため、結果的に高分子またはナノサイズの粒子が腫瘍組織に集積しやすいという、いわゆるＥＰＲ効果により、抗癌剤を内包したリポソームや高分子ミセルのようなナノサイズの粒子は、腫瘍組織に集積することが知られている。
この場合、キャリアーであるリポソームや高分子ミセルに抗癌剤が安定に内包されている方が血中安定性及び腫瘍集積性は高くなる。一方で腫瘍組織に到達した後では抗癌剤はキャリアーから放出されないと薬効を発揮できない。アドリアマイシンを内包したリポソーム製剤であるＤｏｘｉｌと高分子ミセル製剤であるＮＫ９１１の比較では、Ｄｏｘｉｌの方が血中安定性及び腫瘍集積性において優れていた。一方、ＮＫ９１１は局所に到達した後の薬剤遊離能において優れていた（濱口哲弥、ミセル内包化剤の臨床試験、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，１９−５，４２９−４３７（２００４））。理想的には、血中においては薬剤がキャリアーと安定に結合しており、腫瘍組織に到達した後には速やかに薬剤を放出するようなシステムが望まれる。
本発明者らは、ポリエチレングリコール（以下ＰＥＧともいう）−ポリアスパラギン酸ヒドラジドブロック共重合体にアドリアマイシン（塩酸ドキソルビシン）をシッフベース形成により結合させたシステムを報告した（Ｙｏｕｎｓｏｏ  Ｂａｅ，Ｓｈｉｇｅｔｏ  Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，Ａｔｓｕｓｈｉ  Ｈａｒａｄａ，ａｎｄ  Ｋａｚｕｎｏｒｉ  Ｋａｔａｏｋａ，Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｍｉｃｅｌｌｅｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｔｏ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ  Ｃｈａｎｇｅ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４２，４６４０−４６４３（２００３））。このシステムにおいては、血中ではブロック共重合体とアドリアマイシンの結合は解裂せず、癌細胞に取り込まれて細胞内の酸性環境に応答して結合が解裂し薬剤が放出される。細胞及び動物を使用した実験において、優れた効果が確認されている。（Ｙｏｕｎｓｏｏ  Ｂａｅ，Ｎｏｂｕｈｉｒｏ  Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，Ｓｈｉｇｅｔｏ  Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，Ｈｉｒｏｙｕｋｉ  Ｋｏｙａｍａ，Ｙａｓｕｈｉｒｏ  Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｋａｚｕｎｏｒｉ  Ｋａｔａｏｋａ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍｉｃｅｌｌｅ  ｄｒｕｇ  ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｄｒｕｇ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｙ：Ｔｕｍｏｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ，ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｉｃａｃｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，１６（１），１２２−１３０（２００５））
“Ｙｏｕｎｓｏｏ  Ｂａｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４２，４６４０−４６４３（２００３）”（上掲）においては、ＰＥＧ−ポリアスパラギン酸ヒドラジドブロック共重合体を以下のスキームにより合成していた。
2006115293.tif 000002
この方法は反応が多段階にわたるため収率が低下すること、ヒドラジドへの変換率が最高でも７５％程度までしか上がらないことなどから、さらに高収率かつ高変換率でブロック共重合体を合成するためには、上記方法の改良が望まれる。
また、キャリアーに細胞表面に存在するレセプターと特異的に結合するリガンドを導入することにより、ターゲッティングの効率を高めることも検討されており、リガンドを導入する方法の一つとして、アセタール末端のＰＥＧを用いたブロック共重合体のアセタールをアルデヒドに変換して、アミノ基またはヒドラジド基を導入したリガンドと結合させる系が有用であるが、“Ｙｏｕｎｓｏｏ  Ｂａｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４２，４６４０−４６４３（２００３）”（上掲）の合成法はこの系には適用できない。なぜなら、ヒドラジドへの変換を先に行おうとすると、反応時の酸性条件でアセタールがアルデヒドに変換されてしまい、アルデヒドとヒドラジドで反応してしまうからである。一方、リガンド結合を先に行おうとすると、結合したリガンドを強酸条件にさらすことになり、分解や失活が起こるからである。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、抗癌剤の組織または細胞への送達に有用なドラッグキャリアーを簡便に再現性よく製造する方法を提供し、さらにアクティブターゲッティングのためのリガンドまたは抗体などを導入したドラッグキャリアーを提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、アスパラギン酸ベンジルエステル構造を含む高分子に対して、ヒドラジンを反応させることにより、一段階の反応でアスパラギン酸ヒドラジドへの変換ができ、この反応は定量的に再現性よく進行することを見出した。さらにアスパラギン酸ヒドラジドへの変換率を変えることにより、薬剤の放出速度を制御できることも見出した。さらにリガンドを導入したドラッグキャリアーを製造し、従来のドラッグキャリアー以上の優れた機能を確認し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
本発明の第１態様では、アスパラギン酸ベンジルエステル構造を含む高分子に対して、ヒドラジンを反応させることにより、アスパラギン酸ベンジルエステル部分をアスパラギン酸ヒドラジドに変換することを特徴とする、アスパラギン酸ヒドラジド構造を含む高分子の製造法が提供される。
アスパラギン酸ベンジルエステル構造を含む高分子としては、ポリアスパラギン酸ベンジルエステルであってもよく、ポリアミノ酸誘導体であり、構成するアミノ酸誘導体の一部がアスパラギン酸ベンジルエステルであってもよい。さらには、グラフト共重合体であり、その主鎖またはグラフト鎖の少なくともいずれか一方にアスパラギン酸ベンジルエステル構造を含むものであってもよく、ブロック共重合体であり、その一部の構成セグメントにアスパラギン酸ベンジルエステル構造を含むものであってもよい。
ドラッグキャリアーとしての性能、特に高分子ミセル形成という観点からは、ブロック共重合体であることが好ましい。さらに、生体適合性の高さから、ブロック共重合体が、ポリエチレングリコールもしくはその誘導体とポリアミノ酸誘導体とのブロック共重合体であり、そのポリアミノ酸誘導体を構成するアミノ酸誘導体の一部がアスパラギン酸ベンジルエステルであるか、または、ポリエチレングリコールもしくはその誘導体とポリアスパラギン酸ベンジルエステルとのブロック共重合体であることがより好ましい。
ブロック共重合体のより具体的な構造として、下記式（Ｉ）または（ＩＩ）が挙げられる。
2006115293.tif 000003
（上式中、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは水素原子または未置換もしくは置換された直鎖状、分枝状もしくは環状のＣ１−１２アルキル基を表し、Ｌ１及びＬ２は連結基を表し、Ｒ２は水素原子、保護基、疎水性基または重合性基を表し、Ｒ３は水酸基または開始剤残基を表し、Ｒ４ａ及びＲ４ｂはそれぞれ独立して各種保護基を表し、ここで保護基とは、例えば、通常カルボキシル基の保護基として用いられるベンジル基及びメチル基等であり、Ｒ５ａ及びＲ５ｂはそれぞれ独立して各種保護基を表し、ここで保護基とは、例えば、通常アミノ基の保護基として用いられるＺ基、Ｂｏｃ基、Ｆｍｏｃ基、アセチル基及びトリフルオロアセチル基等であり、ｍは５〜２０，０００の整数であり、ｎは２〜５，０００の整数であり、ｙは０〜４，９９９の整数であり、ｚは０〜４，９９９の整数であるが、ｙ＋ｚはｎよりも小さいものとし、また、上記一般式における各繰り返し単位は記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムに存在できる。）
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、メチル基であってもよいし、あるいは、置換された直鎖状、分枝状もしくは環状のＣ１−１２アルキル基であり、その置換基が、保護されていてもよいマレイミド基、アミノ基、チオール基及び活性エステル基からなる群より選択される抗体もしくは抗体断片が導入可能な官能基、またはリガンド構造（例えば、糖類、ペプチド類及び葉酸等）を含むものであってもよい。
また、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、下記式に示す葉酸誘導体であってもよい。
2006115293.tif 000004
Ｒ２はアセチル基であることが好ましい。
Ｒ３はＮＨ−Ｘであり、ここでＸは未置換または置換されたＣ１−１２アルキル基を表すものであることが好ましい。
Ｌ１は（ＣＨ２）ａ−ＮＨであり、ここでａは１〜５の整数であることが好ましい。
Ｌ２は（ＣＨ２）ｂ−ＣＯであり、ここでｂは１〜５の整数であることが好ましい。
ｙ及びｚは少なくとも一方が０であっても構わない。ｙ＝０、ｚ＝０の場合は、ポリエチレングリコールもしくはその誘導体とポリアスパラギン酸ベンジルエステルとのブロック共重合体となる。
本発明の第２態様では、アスパラギン酸ヒドラジド構造を含む高分子が提供される。従来の方法では、最高でも７５％程度の変換率であったため、アスパラギン酸誘導体構造を含む高分子であって、アスパラギン酸誘導体中の８０％以上、さらには９０％以上、さらには９５％以上がアスパラギン酸ヒドラジドである高分子は新規である。
アスパラギン酸誘導体構造を含む高分子の種類としては、第１態様と対応して、ポリアスパラギン酸誘導体であってもよく、ポリアミノ酸誘導体であり、構成するアミノ酸誘導体の一部がアスパラギン酸誘導体であってもよく、グラフト共重合体であり、その主鎖またはグラフト鎖の少なくともいずれか一方にアスパラギン酸誘導体構造を含むものであってもよく、ブロック共重合体であり、その一部の構成セグメントにアスパラギン酸誘導体構造を含むものであってもよい。
ドラッグキャリアーとしての性能、特に高分子ミセル形成という観点からは、ブロック共重合体であることが好ましい。さらに、生体適合性の高さから、ブロック共重合体が、ポリエチレングリコールもしくはその誘導体とポリアミノ酸誘導体とのブロック共重合体であり、そのポリアミノ酸誘導体を構成するアミノ酸誘導体の一部がアスパラギン酸誘導体であるか、または、ポリエチレングリコールもしくはその誘導体とポリアスパラギン酸誘導体とのブロック共重合体であることがより好ましい。
ブロック共重合体のより具体的な構造として、下記式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）が挙げられる。
2006115293.tif 000005
（上式中、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは水素原子または未置換もしくは置換された直鎖状、分枝状もしくは環状のＣ１−１２アルキル基を表し、Ｌ１及びＬ２は連結基を表し、Ｒ２は水素原子、保護基、疎水性基または重合性基を表し、Ｒ３は水酸基または開始剤残基を表し、Ｒ６ａ及びＲ６ｂはそれぞれ独立して水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−ＮＨ２または−ＮＨ−Ｙを表すが、少なくとも１つは−ＮＨ−ＮＨ２であり、ここでＹはそれぞれ独立して未置換もしくは置換されたＣ１−２０アルキル基であり、Ｒ７ａ及びＲ７ｂはそれぞれ独立して水酸基、オキシ−保護基、−ＮＨ−ＮＨ２または−ＮＨ−Ｙを表し、ここで保護基とは、例えば、通常カルボキシル基の保護基として用いられるベンジル基及びメチル基等であり、Ｙはそれぞれ独立して未置換もしくは置換されたＣ１−２０アルキル基であり、Ｒ８ａ及びＲ８ｂはそれぞれ独立して水素原子または保護基を表し、ここで保護基とは、例えば、通常アミノ基の保護基として用いられるＺ基、Ｂｏｃ基、Ｆｍｏｃ基、アセチル基及びトリフルオロアセチル基等であり、ｍは５〜２０，０００の整数であり、ｎは２〜５，０００の整数であり、ｘは０〜５，０００の整数であり、ｙは０〜４，９９９の整数であり、ｚは０〜４，９９９の整数であるが、ｙ＋ｚはｎよりも小さいものとし、また、上記一般式における各繰り返し単位は記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムに存在できる。）
Ｒ１ａ及びＲ１ｂはメチル基であってもよいし、あるいは、置換された直鎖状、分枝状もしくは環状のＣ１−１２アルキル基であり、その置換基が、保護されていてもよいマレイミド基、アミノ基、チオール基及び活性エステル基からなる群より選択される抗体もしくは抗体断片が導入可能な官能基、またはリガンド構造（例えば、糖類、ペプチド類及び葉酸等）を含むものであってもよい。
また、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、下記式に示す葉酸誘導体であってもよい。
2006115293.tif 000006
Ｒ１ａ及びＲ１ｂが置換された直鎖状、分枝状もしくは環状のＣ１−１２アルキル基を表し、その置換基が、保護されていてもよいマレイミド基、アミノ基、チオール基及び活性エステル基からなる群より選択される抗体もしくは抗体断片が導入可能な官能基、またはリガンド構造（例えば、ペプチド類、糖類及び葉酸等）を含むものであるブロック共重合体、あるいは、Ｒ１ａ及びＲ１ｂが上記式に示す葉酸誘導体であるブロック共重合体は、アスパラギン酸誘導体中の割合に拘らず、アスパラギン酸ヒドラジド構造を含めば新規である。
Ｒ２はアセチル基であることが好ましい。
Ｒ３は−ＮＨ−Ｘであり、ここでＸは未置換または置換されたＣ１−１２アルキル基を表すものであることが好ましい。
Ｌ１は−（ＣＨ２）ａ−ＮＨ−であり、ここでａは１〜５の整数であることが好ましい。
Ｌ２は−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ−であり、ここでｂは１〜５の整数であることが好ましい。
ｙ及びｚは少なくとも一方が０であっても構わない。ｙ＝０、ｚ＝０の場合は、ポリエチレングリコールもしくはその誘導体とポリアスパラギン酸誘導体とのブロック共重合体となる。
本発明の第３態様では、葉酸リガンドが導入されたブロック共重合体の製造法が提供される。
具体的には、下記式（Ｖ）または（ＶＩ）に示すブロック共重合体の製造法であって、
2006115293.tif 000007
（上式中、Ｌ１及びＬ２は連結基を表し、Ｒ２は水素原子、保護基、疎水性基または重合性基を表し、Ｒ３は水酸基または開始剤残基を表し、Ｒ６ａ及びＲ６ｂはそれぞれ独立して水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−ＮＨ２または−ＮＨ−Ｙを表すが、少なくとも１つは−ＮＨ−ＮＨ２であり、ここでＹはそれぞれ独立して未置換もしくは置換されたＣ１−２０アルキル基であり、Ｒ７ａ及びＲ７ｂはそれぞれ独立して水酸基、オキシ−保護基、−ＮＨ−ＮＨ２または−ＮＨ−Ｙを表し、ここで保護基とは、例えば、通常カルボキシル基の保護基として用いられるベンジル基及びメチル基等であり、Ｙはそれぞれ独立して未置換もしくは置換されたＣ１−２０アルキル基であり、Ｒ８ａ及びＲ８ｂはそれぞれ独立して水素原子または保護基を表し、ここで保護基とは、例えば、通常アミノ基の保護基として用いられるＺ基、Ｂｏｃ基、Ｆｍｏｃ基、アセチル基及びトリフルオロアセチル基等であり、ｍは５〜２０，０００の整数であり、ｎは２〜５，０００の整数であり、ｘは０〜５，０００の整数であり、ｙは０〜４，９９９の整数であり、ｚは０〜４，９９９の整数であるが、ｙ＋ｚはｎよりも小さいものとし、また、上記一般式における各繰り返し単位は記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムに存在できる。）
下記式（ＶＩＩ）または（ＶＩＩＩ）に示すポリエチレングリコール末端にベンズアルデヒド基を有するブロック共重合体に、
2006115293.tif 000008
（上式中、Ｌ１及びＬ２は連結基を表し、Ｒ２は水素原子、保護基、疎水性基または重合性基を表し、Ｒ３は水酸基または開始剤残基を表し、Ｒ４ａ及びＲ４ｂはそれぞれ独立して各種保護基を表し、ここで保護基とは、例えば、通常カルボキシル基の保護基として用いられるベンジル基及びメチル基等であり、Ｒ５ａ及びＲ５ｂはそれぞれ独立して各種保護基を表し、ここで保護基とは、例えば、通常アミノ基の保護基として用いられるＺ基、Ｂｏｃ基、Ｆｍｏｃ基、アセチル基及びトリフルオロアセチル基等であり、ｍは５〜２０，０００の整数であり、ｎは２〜５，０００の整数であり、ｙは０〜４，９９９の整数であり、ｚは０〜４，９９９の整数であるが、ｙ＋ｚはｎよりも小さいものとし、また、上記一般式における各繰り返し単位は記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムに存在できる。）
下記式（ＩＸ）に示す葉酸誘導体をシッフベースにより結合させ、還元した後、
2006115293.tif 000009
ヒドラジンを反応させることにより、アスパラギン酸ベンジルエステル部分をアスパラギン酸ヒドラジドに変換する製造法が提供される。
Ｒ２はアセチル基であることが好ましい。
Ｒ３は−ＮＨ−Ｘであり、ここでＸは未置換または置換されたＣ１−１２アルキル基を表すものであることが好ましい。
Ｌ１は−（ＣＨ２）ａ−ＮＨ−であり、ここでａは１〜５の整数であることが好ましい。
Ｌ２は−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ−であり、ここでｂは１〜５の整数であることが好ましい。
ｙ及びｚは少なくとも一方が０であっても構わない。ｙ＝０、ｚ＝０の場合は、ポリエチレングリコールもしくはその誘導体とポリアスパラギン酸誘導体から成るブロック共重合体の製造法となる。
本発明の第４態様では、本発明の第２態様で提供される高分子、または本発明の第１態様または第３態様で提供される製造法により製造された高分子と、カルボニル基を有する化合物との高分子−化合物複合体であって、前記高分子中のアスパラギン酸ヒドラジドと前記化合物中のカルボニル基とがシッフベースを形成することにより結合した高分子−化合物複合体、またはその高分子−化合物複合体が形成する高分子ミセルが提供される。
高分子がポリエチレングリコールもしくはその誘導体とポリアミノ酸誘導体とのブロック共重合体である場合、カルボニル基を有する化合物との高分子−化合物複合体が形成するコア−シェル型高分子ミセルであって、当該複合体は、前記高分子中のアスパラギン酸ヒドラジドと前記化合物中のカルボニル基とがシッフベースを形成することにより結合したものであり、前記化合物が結合したアスパラギン酸ヒドラジドを含むセグメントが主にコアに存在し、ポリエチレングリコールもしくはその誘導体セグメントが主にシェルに存在することを特徴とする高分子ミセルを形成することもある。
さらにブロック共重合体のポリエチレングリコールもしくはその誘導体の末端にリガンドが導入されている場合、カルボニル基を有する化合物との高分子−化合物複合体が形成するコア−シェル型高分子ミセルであって、当該複合体は、前記高分子中のアスパラギン酸ヒドラジドと前記化合物中のカルボニル基とがシッフベースを形成することにより結合したものであり、前記化合物が結合したアスパラギン酸ヒドラジドを含むセグメントが主にコアに存在し、ポリエチレングリコールもしくはその誘導体セグメントが主にシェルに存在し、官能基に結合した抗体もしくは抗体断片、またはリガンドが表層付近に存在することを特徴とする高分子ミセルを形成することもある。
これらの高分子−化合物複合体、または高分子ミセルは、酸性条件下でシッフベース結合が解裂して、化合物が遊離してくることが好ましい。
また実用面では、化合物が生理活性を持つ薬剤であることが好ましい。
さらに薬剤が抗癌剤であれば、癌治療に有用なシステムが提供される。
抗癌剤としては例えばアドリアマイシンが挙げられる。
本発明の第５態様では、高分子−化合物複合体、または高分子ミセルからの化合物の遊離または放出速度の制御方法、または化合物の遊離または放出速度が制御された高分子−化合物複合体、または高分子ミセルが提供される。
具体的には、アスパラギン酸ベンジルエステルに対するヒドラジンの仕込量を変えることにより、アスパラギン酸ヒドラジドへの変換率を制御することが可能であり、アスパラギン酸ヒドラジドへの変換率を変えることにより、化合物の遊離または放出速度を制御することが可能である。
本発明の第６態様では、本発明の第４態様、または第５態様で提供される高分子−化合物複合体、または高分子ミセルを含む医薬組成物が提供される。例えば、本発明の高分子ミセルはｐＨ応答性を有するものであるため、薬物のターゲッティング等に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ヒドラジドの置換率と薬物放出挙動との関係を示す図である。
図２は、アドリアマイシン（ＡＤＲ）、葉酸表面装着型ミセル（ＦＭＡ）、及び葉酸表面非装着型ミセル（ＭＡ）を、それぞれヒト咽頭癌細胞（ＫＢ細胞）に２４時間接触させた際の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ殺細胞性評価結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２００５−１２５３３６号明細書の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての先行技術文献、並びに公開公報、特許公報及びその他の特許文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
本発明の第１態様におけるアスパラギン酸ベンジルエステル構造を含む高分子としては、ポリアスパラギン酸ベンジルエステルであってもよく、ポリアミノ酸誘導体であり、構成するアミノ酸誘導体の一部がアスパラギン酸ベンジルエステルであってもよい。その場合、他のアミノ酸誘導体としては、特に限定されないが、例えばグルタミン酸誘導体、リシン誘導体が挙げられる。
さらには、グラフト共重合体であり、その主鎖またはグラフト鎖のどちらかにアスパラギン酸ベンジルエステル構造を含むものであってもよい。その場合、アスパラギン酸ベンジルエステル構造を含まない側の主鎖またはグラフト鎖を構成する高分子としては、特に限定されないが、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリサッカライド、ポリアクリルアミド、ポリ置換アクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリ置換メタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、非荷電性ポリアミノ酸、又はそれらの誘導体由来の各種の重合体が挙げられる。
さらには、ブロック共重合体であり、その一部の構成セグメントにアスパラギン酸ベンジルエステル構造を含むものであってもよい。その場合アスパラギン酸ベンジルエステル構造を含まない側のセグメントを構成する高分子としては、特に限定されないが、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリサッカライド、ポリアクリルアミド、ポリ置換アクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリ置換メタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、非荷電性ポリアミノ酸、又はそれらの誘導体由来の各種の重合体が挙げられる。
これらの高分子を製造する方法は、特に限定されないが、例えば保護アミノ酸のＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）を重合させる方法等が用いられる。
ドラッグキャリアーとしての性能、特に高分子ミセル形成という観点からは、ブロック共重合体であることが好ましい。さらに、生体適合性の高さから、ブロック共重合体が、ポリエチレングリコールもしくはその誘導体とポリアミノ酸誘導体から成るブロック共重合体であり、そのポリアミノ酸誘導体を構成するアミノ酸誘導体の一部がアスパラギン酸ベンジルエステルであるか、または、ポリエチレングリコールもしくはその誘導体とポリアスパラギン酸ベンジルエステルから成るブロック共重合体であることがより好ましい。
ブロック共重合体のより具体的な構造として、下記式（Ｉ）または（ＩＩ）が挙げられる。
2006115293.tif 000010
上式中、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、水素原子または未置換もしくは置換された直鎖状、分枝状もしくは環状のＣ１−１２アルキル基を表すが、抗体または抗体断片の導入及びリガンドの導入を考えない場合には、メチル基であることが好ましい。
一方、抗体または抗体断片を導入する場合には、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、置換された直鎖状、分枝状もしくは環状のＣ１−１２アルキル基であり、その置換基が、抗体または抗体断片が導入可能な官能基であることが好ましい。ここで、当該官能基としては、マレイミド基、アミノ基、チオール基及び活性エステル基からなる群より選択される官能基が好ましく挙げられ、これら官能基は、各種保護基により保護されているものであってもよい。
また、リガンドを導入する場合には、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、置換された直鎖状、分枝状もしくは環状のＣ１−１２アルキル基であり、その置換基が、リガンド構造を含むものであることが好ましい。
ここで、本発明において、「抗体」は、細胞の表面抗原を特異的に認識するものであれば特に限定されず、特に癌細胞の表面抗原を認識するモノクローナル抗体が好ましく、「抗体断片」は、細胞（特に癌細胞）の表面抗原を特異的に認識できるものであれば断片の長さは限定されず、特に（Ｆａｂ’）２またはＦａｂが好ましい。また、「リガンド」とは、細胞表面に存在するレセプターと特異的に結合し、レセプター介在性エンドサイトーシスにより細胞への取り込みを促進することが可能な分子を意味する。リガンドとしては、例えば糖類、ペプチド類及び葉酸等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。下記式に示す葉酸誘導体は、上記置換基がリガンド構造を含んでいる化合物の好ましい一例である。
2006115293.tif 000011
なお、Ｒ１ａ及びＲ１ｂが前述の置換されたアルキル基である場合、当該置換基として、保護されていてもよい各種官能基を導入する方法としては、例えば、保護された官能基を有するポリエチレングリコールを用いて、公知の方法でポリエチレングリコールセグメントを合成し、次いで、本明細書に開示した方法（後述）でブロック共重合体を合成することができる。保護基は、官能基の導入の必要性に応じて、脱保護することができる。
また、上記官能基に抗体または抗体断片を導入する（結合させる）場合は、各種官能基に適した公知の方法で導入することができる。例えば、官能基としてマレイミド基末端を有するポリエチレングリコールセグメントに抗体またはその断片を導入する場合は、抗体またはその断片にチオール基を導入し、公知の方法で導入することができる。官能基としてアミノ基末端を有するポリエチレングリコールセグメントに抗体またはその断片を導入する場合は、抗体またはその断片のアルデヒドにシッフベースを形成させ、還元するか、あるいは、抗体またはその断片のカルボキシル基と縮合反応させることによって導入することができる。官能基としてチオール基末端を有するポリエチレングリコールセグメントに抗体またはその断片を導入する場合は、当該チオール基と、抗体またはその断片のチオール基とをジスルフィド結合させることにより導入することができる。官能基として活性エステル基末端を有するポリエチレングリコールセグメントに抗体またはその断片を導入する場合は、当該活性エステル基と、抗体またはその断片のアミンとを反応させることにより導入することができる。
上記式（Ｉ）又は（ＩＩ）において、Ｌ１及びＬ２は連結基を表すが、ブロック共重合体を製造する方法に適切なポリエチレングリコールの末端構造に由来する。上記式（Ｉ）のブロック共重合体は、例えば、アミノ末端のポリエチレングリコールを開始剤として、保護アミノ酸のＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）を重合させることにより得られる。Ｌ１は−（ＣＨ２）ａ−ＮＨ−であり、ここでａは１〜５の整数であるが、より好ましくは２または３である。上記式（ＩＩ）のブロック共重合体は、例えば、適当な開始剤により重合されたポリ保護アミノ酸の末端アミノ基と、ポリエチレングリコール末端のカルボキシル基とを、縮合剤等を用いて結合させることにより得られる。Ｌ２は−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ−であり、ここでｂは１〜５の整数であるが、より好ましくは１〜３の整数である。
Ｒ２は水素原子、保護基、疎水性基または重合性基を表す。保護基としては、Ｃ１−６アルキルカルボニル基が挙げられ、好ましくはアセチル基である。疎水性基としては、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン及びピレン等の誘導体が挙げられる。重合性基としては、メタクリロイル基及びアクリロイル基等が挙げられる。このような重合性基を上記式（Ｉ）または（ＩＩ）のブロック共重合体が有する場合には、これらの共重合体は、いわゆるマクロマーとして使用でき、例えば、ミセルを形成した後、必要により他のコモノマーを用い、これらの重合性基を介して架橋させることもできる。これらの保護基、疎水性基または重合性基を共重合体の末端に導入する方法としては、酸ハロゲン化物を用いる方法、酸無水物を用いる方法、及び活性エステルを用いる方法等、通常の合成で用いられている手法が挙げられる。
Ｒ３は水酸基または開始剤残基を表すが、例えば、−Ｘ−ＮＨ２を開始剤として保護アミノ酸のＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）を重合させた場合にはＮＨ−Ｘとなる。
Ｒ４ａ及びＲ４ｂはそれぞれ独立して各種保護基を表し、ここで保護基とは通常カルボキシル基の保護基として用いられるベンジル基及びメチル基等である。
Ｒ５ａ及びＲ５ｂはそれぞれ独立して各種保護基を表し、ここで保護基とは通常アミノ基の保護基として用いられるＺ基、Ｂｏｃ基、Ｆｍｏｃ基、アセチル基及びトリフルオロアセチル基等であり、温和な条件で脱保護できることから、トリフルオロアセチル基がより好ましい。
ｍは５〜２０，０００の整数であるが、好ましくは２０〜１，０００の整数であり、より好ましくは１００〜５００の整数である。
ｎは２〜５，０００の整数であるが、好ましくは５〜１，０００の整数であり、より好ましくは１０〜２００の整数である。
ｙは０〜４，９９９の整数であり、ｚは０〜４，９９９の整数であるが、ｙ＋ｚはｎよりも小さいものとし、また、上記一般式における各繰り返し単位は記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムに存在できる。
上記式（Ｉ）のブロック共重合体を、アミノ末端のポリエチレングリコールを開始剤として、保護アミノ酸のＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）を重合させることにより製造する場合、反応は通常溶媒中で行われる。溶媒としては、脂肪族または芳香族の有機溶媒が用いられ、ポリエチレングリコール及びＮＣＡの両方が溶解するものが好ましいが、必ずしもそれに限定はされない。例えば、溶媒としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ジクロロメタン、クロロホルム、またはそれらの混合溶媒が好ましく用いられる。反応は、０℃〜１００℃の温度範囲で行われ、好ましくは２０℃〜８０℃、より好ましくは３０℃から５０℃の温度範囲で行われる。圧力は、例えば、常圧であってもよい。反応時間は、反応が充分に進行する時間であれば特に限定されないが、通常８時間〜４日間である。
副反応が起こらないように、ブロック共重合体のＮ末端をアセチル化等によりブロックすることがより好ましい。例えば、アセチル化は、ブロック共重合体と無水酢酸を溶媒中で混合することにより行われる。無水酢酸は通常ブロック共重合体に対して１〜１０当量用いられる。溶媒としては、脂肪族または芳香族の有機溶媒が用いられ、ブロック共重合体及び無水酢酸が溶解するものが好ましい。例えば、溶媒としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ジクロロメタン、クロロホルム、またはそれらの混合溶媒が好ましく用いられる。反応は、０℃〜１００℃の温度範囲で行われ、好ましくは２０℃〜８０℃、より好ましくは３０℃から５０℃の温度範囲で行われる。圧力は、例えば、常圧であってもよい。反応時間は、反応が充分に進行する時間であれば特に限定されないが、通常３０分〜２時間である。
上記式（Ｉ）または（ＩＩ）のブロック共重合体に対して、ヒドラジンを反応させることにより、アスパラギン酸ベンジルエステル部分をアスパラギン酸ヒドラジドに変換する反応は通常溶媒中で行われる。溶媒としては、脂肪族または芳香族の有機溶媒が用いられ、ブロック共重合体及びヒドラジンの両方が溶解するものが好ましい。例えば、溶媒としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、クロロホルム、またはそれらの混合溶媒が好ましく用いられる。また、使用する溶媒は極力水を含まないことが好ましい。ヒドラジンの仕込量は、反応がほぼ定量的に進行することから、通常アスパラギン酸ベンジルエステルに対して導入したいだけの量を仕込む。例えば、ベンジルエステルに対して５０％導入する場合は、０．５倍当量のヒドラジンを仕込み、７５％導入する場合は、０．７５倍当量のヒドラジンを仕込む。１００％導入する場合はヒドラジンを多少過剰に仕込んでもよい。反応は、０℃〜１００℃の温度範囲で行われ、好ましくは２０℃〜８０℃、より好ましくは３０℃から５０℃の温度範囲で行われる。圧力は、常圧であることが好ましい。反応時間は、反応が充分に進行する時間であれば特に限定されないが、通常２時間〜２日間である。
本発明の第２態様では、アスパラギン酸ヒドラジド構造を含む高分子が提供される。従来の方法では、最高でも７５％程度の変換率であったため、アスパラギン酸誘導体構造を含む高分子であって、アスパラギン酸誘導体中の８０％以上、さらには９０％以上、さらには９５％以上がアスパラギン酸ヒドラジドである高分子は新規である。
アスパラギン酸誘導体構造を含む高分子の種類としては、第１態様と対応して、ポリアスパラギン酸誘導体であってもよく、あるいは、ポリアミノ酸誘導体であり、構成するアミノ酸誘導体の一部がアスパラギン酸誘導体であってもよく、グラフト共重合体であり、その主鎖またはグラフト鎖のどちらかにアスパラギン酸誘導体構造を含むものであってもよく、ブロック共重合体であり、その一部の構成セグメントにアスパラギン酸誘導体構造を含むものであってもよい。これらの高分子の構成要素については、本発明の第１態様において説明したのと同様である。
ドラッグキャリアーとしての性能、特に高分子ミセル形成という観点からは、ブロック共重合体であることが好ましい。さらに、生体適合性の高さから、ブロック共重合体が、ポリエチレングリコールもしくはその誘導体とポリアミノ酸誘導体とから成るブロック共重合体であり、そのポリアミノ酸誘導体を構成するアミノ酸誘導体の一部がアスパラギン酸誘導体であるか、または、ポリエチレングリコールもしくはその誘導体とポリアスパラギン酸誘導体とから成るブロック共重合体であることがより好ましい。
ブロック共重合体のより具体的な構造として、下記式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）が挙げられる。
2006115293.tif 000012
上式中、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｌ１、Ｌ２、Ｒ２、Ｒ３、ｍ、ｎ、ｙ、ｚについては、本発明の第１態様において説明したのと同様である。
Ｒ６ａ及びＲ６ｂはそれぞれ独立して水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−ＮＨ２、−ＮＨ−Ｙを表すが、少なくとも１つは−ＮＨ−ＮＨ２であり、ここでＹはそれぞれ独立して未置換もしくは置換されたＣ１−２０アルキル基である。
Ｒ７ａ及びＲ７ｂはそれぞれ独立して水酸基、オキシ−保護基、−ＮＨ−ＮＨ２−ＮＨ−Ｙを表すが、大部分（通常８５％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上）が水酸基であることが好ましい。ここで保護基とは通常カルボキシル基の保護基として用いられるベンジル基及びメチル基等であり、Ｙはそれぞれ独立して未置換または置換されたＣ１−２０アルキル基である。
Ｒ８ａ及びＲ８ｂはそれぞれ独立して水素原子または保護基を表すが、大部分（通常８５％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上）が水素原子であることが好ましい。ここで保護基とは通常アミノ基の保護基として用いられるＺ基、Ｂｏｃ基、Ｆｍｏｃ基、アセチル基及びトリフルオロアセチル基等である。
ｘは０〜５，０００の整数であり、また、上記一般式における各繰り返し単位は記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムに存在できる。
ただし、ｙ＋ｚはｎよりも小さいものとする。
ブロック共重合体は塩を形成していてもよい。この場合塩を形成する対イオンとしては、Ｎａ＋、Ｋ＋、ＮＨ４＋、（１／２Ｍｇ）＋、（１／２Ｃａ）＋、（１／２Ｂａ）＋、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、（１／２ＳＯ４）−、ＮＯ３−、（１／２ＣＯ３）−、（１／３ＰＯ４）−、ＣＨ３ＣＯＯ−、ＣＦ３ＣＯＯ−、ＣＨ３ＳＯ３−、ＣＦ３ＳＯ３−等が挙げられる。
本発明の第３態様では、葉酸リガンドが導入されたブロック共重合体の製造法が提供される。
具体的には、下記式（Ｖ）または（ＶＩ）に示すブロック共重合体の製造法であって、
2006115293.tif 000013
下記式（ＶＩＩ）または（ＶＩＩＩ）に示すポリエチレングリコール末端にベンズアルデヒド基を有するブロック共重合体に、
2006115293.tif 000014
下記式（ＩＸ）に示す葉酸誘導体をシッフベースにより結合させ、還元した後、
2006115293.tif 000015
ヒドラジンを反応させることにより、アスパラギン酸ベンジルエステル部分をアスパラギン酸ヒドラジドに変換する製造法が提供される。
上記式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）中、Ｌ１、Ｌ２、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、Ｒ８ａ、Ｒ８ｂ、ｍ、ｎ、ｘ、ｙ、ｚについては、本発明の第１態様または第２態様において説明したのと同様である。また、上記一般式における各繰り返し単位は記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムに存在できる。
ポリエチレングリコール末端にベンズアルデヒド基を有するブロック共重合体は、ポリエチレングリコール末端にベンジルアセタール基を有するブロック共重合体を、酸性の溶液中で脱アセタール処理することにより得られる。酸としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸等が用いられる。アセチル化の反応と同時に脱アセタールを行うことも可能である。
シッフベース形成、及び還元反応は通常溶媒中で行われる。溶媒としては、脂肪族または芳香族の有機溶媒が用いられ、ブロック共重合体及び葉酸誘導体の両方が溶解するものが好ましい。例えば、溶媒としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、メタノール、またはそれらの混合溶媒が好ましく用いられる。反応は、０℃〜１００℃の温度範囲で行われ、好ましくは１０℃〜７０℃、より好ましくは２０℃から４０℃の温度範囲で行われる。圧力は、常圧であることが好ましい。反応時間は、反応が充分に進行する時間であれば特に限定されないが、通常１日〜１０日間である。反応の際、モレキュラーシーブスのような脱水剤を共存させてもよい。また、反応において、葉酸誘導体は通常ブロック共重合体に対して過剰量、すなわち１〜２０倍当量用いる。未反応の葉酸誘導体は、例えば、ゲルろ過等の処理により除去できる。還元剤としては、ＬｉＡｌＨ４、ＮａＢＨ４及びＮａＢＨ３ＣＮ等、通常の還元反応に用いられる還元剤が使用できるが、好ましくはＮａＢＨ３ＣＮを用いるのがよい。還元剤の量はブロック共重合体に対して過剰量、すなわち１〜２０倍当量用いる。還元剤は、葉酸誘導体とブロック共重合体を混合して、しばらく反応させてから加える方が好ましく、また、何回かに分けて加えることもできる。また未反応の葉酸誘導体を除去してから加えてもよい。
本発明の第４態様では、本発明の第２態様で提供される高分子、または本発明の第１態様または第３態様で提供される製造法により製造された高分子と、カルボニル基を有する化合物が、アスパラギン酸ヒドラジドとカルボニル基がシッフベースを形成することにより結合した高分子−化合物複合体、またはその高分子−化合物複合体が形成する高分子ミセルが提供される。
ドラッグキャリアーとしての性能の観点から、高分子がブロック共重合体であり、高分子−化合物複合体がミセルを形成することがより好ましい。
シッフベース結合を形成できるカルボニル基を有する化合物としては、アルデヒドまたはケトンが挙げられる。
高分子と化合物を結合させる反応は通常溶媒中で行われる。溶媒としては、脂肪族または芳香族の有機溶媒が用いられ、高分子及び化合物の両方が溶解するものが好ましい。例えば、溶媒としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、メタノール、またはそれらの混合溶媒が好ましく用いられる。反応は、０℃〜１００℃の温度範囲で行われ、好ましくは１０℃〜７０℃、より好ましくは２０℃から４０℃の温度範囲で行われる。圧力は、常圧であることが好ましい。反応時間は、反応が充分に進行する時間であれば特に限定されないが、通常１日〜１０日間である。また、反応において、化合物は通常アスパラギン酸ヒドラジドに対して過剰量、すなわち１〜２０倍当量用いる。反応後、未反応の化合物は、例えば、ゲルろ過等の操作により除去できる。
高分子ミセルの形成は、例えば、このようにして製造された高分子−化合物複合体をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド及びメタノール等の溶媒に溶解させ、水またはバッファーに対して透析するか上記高分子−化合物複合体を揮発性の有機溶媒に溶解後、有機溶媒を除去し、水性媒体を添加して激しく撹拌するなどの公知の方法により行われる。また、高分子ミセル溶液を凍結乾燥して粉末製剤とすることも可能である。
これらの高分子−化合物複合体、または高分子ミセルは、酸性条件下でシッフベース結合が解裂して、化合物が遊離してくることが好ましい。
また実用面では、化合物が生理活性を持つ薬剤であることが好ましい。薬剤としては、抗癌剤、抗ウィルス剤及び抗炎症剤等が挙げられ、抗癌剤であれば、癌治療に有用なシステムが提供される。
カルボニル基を有する抗癌剤としては、アドリアマイシン、塩酸ダウノルビシン、パクリタキセル及びドセタキセル等が挙げられる。
本発明の第５態様では、高分子−化合物複合体、または高分子ミセルからの化合物の遊離、放出速度の制御方法、または化合物の遊離、放出速度が制御された高分子−化合物複合体、または高分子ミセルが提供される。
具体的には、アスパラギン酸ベンジルエステルに対するヒドラジンの仕込量を変えることにより、アスパラギン酸ヒドラジドへの変換率を制御することが可能であり、アスパラギン酸ヒドラジドへの変換率を変えることにより、化合物の遊離、放出速度を制御することが可能である。
化合物の遊離、放出速度については、時間的に分のオーダーで大部分の化合物が放出されるものから、数時間たってもほとんど放出されないものまで、幅広く制御可能である。治療に用いる場合の薬剤の最適な遊離、放出速度は、薬剤の種類、治療の目的、患者の状態、及び投与スケジュール等により異なると考えられ、幅広く制御できる手段を持つことは非常に重要と考えられる。
このようなｐＨに応答した薬剤の制御された放出性能は、例えば癌細胞へのターゲッティングに有用である。すなわち、本発明の高分子−化合物複合体、または高分子ミセルを静脈内投与した場合、血中では薬剤の放出はほとんど起こらず、癌細胞に取り込まれて細胞内のエンドソームやリソソームの酸性環境下においてはじめて薬剤の放出が起こる。さらに、抗体もしくは抗体断片、またはリガンドの導入により、細胞内への取り込みが高まり、薬効が増強されることが期待される。
本発明の高分子−化合物複合体、または高分子ミセルはフィルターを用いてろ過することも可能である。フィルターとしては、例えば、滅菌に用いる０．２２μｍのポアサイズのもの等が用いられる。安定な高分子ミセルの場合、フィルターろ過を行ってもミセル構造が破壊されることなく維持される性質を有するが、このような安定性もヒドラジドの導入率によって制御することができる。
本発明の第６態様における医薬組成物に含まれる薬剤の量は、当業者であれば適宜設定することができる。投与形態としては、例えば注射が挙げられ、通常の静脈内及び動脈内等の全身投与のほか、筋肉、関節内、皮下及び皮内等に局所投与することができる。さらに、カテーテルを用いた投与形態を採用することも可能である。この場合、通常は単位投与量アンプルまたは多投与量容器の形態で提供され、使用する際に適当な担体、例えばパイロジェンフリーの滅菌水で再溶解させる粉体であってもよい。また、これらの剤形に対し、製剤上一般に使用される添加剤を含有させることもできる。その投与量、投与形態、及び投与スケジュールは、目的により任意に設定することができる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例においては、蒸留により精製可能な試薬は蒸留して用いた。
【実施例１】
【０００６】
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡの合成
片末端メトキシ、片末端アミノプロピルのポリエチレングリコール（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ２、平均分子量１２，０００）２ｇをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）２０ｍｌに溶解し、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート  Ｎ−カルボン酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ、８．３ｍｍｏｌ、Ｍｗ  ２４９．２３）２．０８ｇを２０．８ｍｌのＤＭＳＯに溶かした溶液を加え、アルゴン雰囲気下４０℃で２日間反応させた。ＩＲ測定によって、ＮＣＡ特有のピークが消失したことを確認した後、反応液を５００ｍｌのジエチルエーテル中に注ぎ再沈殿した。沈殿をフィルターでろ過した後ベンゼンに再溶解して凍結乾燥を行い、粉末のメトキシポリエチレングリコール−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）ブロック共重合体（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ測定からＰＢＬＡの重合度は４０と算出された（ＰＥＧの分子量１２，０００、ＰＢＬＡの重合度４０であることを「１２−４０」と略記する）。得られたＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡは下記の構造を有し、平均値としてｍ＝２７２、ｎ＝４０である。
2006115293.tif 000016
【実施例２】
【０００７】
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐ（Ａｓｐ−Ｈｙｄ）の合成
実施例１で得られたＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ（１２−４０）５００ｍｇをベンゼンに溶解し凍結乾燥した後、１０ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させた。ベンジルエステルに対し１０倍当量の無水ヒドラジン（９．８ｍｍｏｌ、Ｍｗ  ３２．０５）を加え、４０℃で２４時間反応させた。反応後、反応液に含まれている過剰量の未反応ヒドラジンを酢酸で中和させた後、分画分子量６，０００〜８，０００の透析膜に入れて、０．２５％アンモニア水溶液１リットルを外液として、２時間おきに３回、次いで水で１回、透析を行った。ポリマーは透析終了後、凍結乾燥によって回収した。ヒドラジドの導入率は、無水酢酸を用いてラベリングを行い、１Ｈ−ＮＭＲによりメチル基とＰＥＧのメチレン基の面積比から算出したところ１００％であった。
同様にして、無水ヒドラジンの仕込量を、ベンジルエステルに対して０．１倍当量、０．２５倍当量、０．５倍当量、０．７５倍当量として、それぞれ反応を行った。ヒドラジドの導入率はそれぞれ１１％、２５％、５４％、７９％であった。このことから、仕込んだヒドラジンはほとんど定量的に反応していることがわかった。
得られた５種類のＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐ（Ａｓｐ−Ｈｙｄ）は下記の構造を有し、平均値としてｍ＝２７２、ｎ＝４０であり、Ｒ６ａは−ＮＨＮＨ２、−ＯＨまたは−ＯＨの塩であり、各サンプルによりその比が異なる。
2006115293.tif 000017
【実施例３】
【０００８】
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐ（Ａｓｐ−Ｈｙｄ−ＡＤＲ）の合成及びミセルの調製
実施例２で得られた、ヒドラジド基が１１％、２５％、５４％、７９％、１００％のＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐ（Ａｓｐ−Ｈｙｄ）を、２ｍｇ／ｍｌとなるようにＤＭＦに溶解し、抗癌剤であるアドリアマイシンをヒドラジド基に対して１．５倍当量ずつ加えて、室温、遮光下で６日間反応させた。アドリアマイシンは１３番目の炭素位にカルボニル基を有しており、ヒドラジドとシッフ塩基で結合可能である。合成されたＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐ（Ａｓｐ−Ｈｙｄ−ＡＤＲ）は、ＭｅＯＨ又はＤＭＦで膨潤させたＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０を用いたゲル濾過により精製し、非結合のアドリアマイシンを除去した。精製されたポリマーの５０ｍｇを再びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）の１０ｍｌに溶かして、２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）１リットルを外液として５回透析することによって、ミセルを調製した。アドリアマイシンの結合率は５種類すべてヒドラジドに対して約９０％であった。
【実施例４】
【０００９】
アドリアマイシンの放出挙動の検討
実施例３で調製した各ミセル（２ｍｇ／ｍｌ）の１００μｌを１％酢酸水溶液（ｐＨ＝３．０）１９００μｌに加えて２４時間インキュベーションし、薬物放出挙動を確認した。放出されたアドリアマイシンの定量は逆相ＨＰＬＣで行った。なお、逆相ＨＰＬＣは以下の測定条件で行った。
Ｃｏｌｕｍｎ：μ−Ｂｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ  ５μ  Ｃ４  １００Ａ
Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：１ｍｌ／ｍｉｎ
Ｅｌｕｅｎｔ：ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ  ｗｉｔｈ  １％ＡｃＯＨ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＵＶ  ｗｉｔｈ  ４８５ｎｍ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ
Ｇｒａｄｉｅｎｔ：［ｍｉｎ（ＣＨ３ＣＮ％）：０．９（１５），１６（８５），２０（８５），２５（１５），３０（１５）］
また、ミセルの粒子径は、０．４５μｍフィルタ−（Ｍｉｌｌｅｘ−ＨＶ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）処理した後、動的光散乱（ＤＬＳ−７０００、大塚電子）により求められた。
以上の結果を表１及び図１に示す。興味深いことに、ヒドラジド置換率５０％以上の場合、薬物の放出がゆっくり進行している反面、２５％以下の場合では、薬物放出が１時間以内でほぼ完了していることが確認された。また、１００％置換した系の場合、効果的な薬物放出が認められず、５０％以下の置換率で合成されたポリマーからはミセルの形状を作れなかったことから、５０〜１００％未満の置換率でもっとも理想的なミセルの形成及び薬物放出が実現できると考えられる。
【表１】
2006115293.tif 000018
表１において、
０．２２μｍフィルタ−（Ｍｉｌｌｅｘ−ＨＶ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）ろ過に対する安定性については、
「○」は安定、即ちミセルの粒径がろ過前後で大きく変化しないことを意味し、
「×」は不安定、即ちろ過後ではミセルの粒径が測定不能であることを意味する。
また、ｐＨ応答性については、
「◎」は薬剤放出がほぼ１時間以内で完了、
「○」は薬剤放出が数時間〜１日程度で完了、
「●」は薬剤放出がほとんど見られないことを意味する。
【実施例５】
【００１０】
ＣＨＯ−Ｂｚ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ａｃの合成
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ２の代わりに、片末端ベンジルアセタール、片末端アミノエチルのポリエチレングリコール（ＡｃｅＢｚ−ＰＥＧ−ＮＨ２、平均分子量１２，０００）を用いて、実施例１と同様の操作により、アセタールベンジルポリエチレングリコール−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）ブロック共重合体（ＡｃｅＢｚ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ測定からＰＢＬＡの重合度は３２と算出された（１２−３２）。続いて、末端アミノ基を無水酢酸を用いて保護した。ＤＭＦにポリマーを５０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、ポリマー末端のアミンのモル量に対して５倍量の蒸留した無水酢酸をアルゴン下で添加し、室温で３時間反応後、エーテルで再沈殿して回収した。さらに、ポリマーを１０ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＳＯに溶解し、０．１Ｎ塩酸水溶液で１時間処理することにより、アセタールをアルデヒドに変換した。その後、純水に対して透析を行い、凍結乾燥してポリマーを回収した。得られたＣＨＯ−Ｂｚ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ａｃは下記の構造を有し、平均値としてｍ＝２６８、ｎ＝３２である。
2006115293.tif 000019
【実施例６】
【００１１】
Ｆｏｌ−ＰＥＧ−ｐ（Ａｓｐ−Ｈｙｄ）−Ａｃの合成
予め、葉酸ヒドラジド（Ｆｏｌ−Ｈｙｄ）を以下の方法で合成した。すなわち、葉酸（１０ｇ）を氷で冷やした無水ＴＨＦ（１００ｍｌ）に加えた後、ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ（２８ｍｌ）を滴下しながら加えた。１０時間の反応後、氷（１０ｇ）を加えて、Ｎ１０−（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｙｌ）−ｐｙｒｏｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄを調製した。その後、エーテルによる再沈殿によって精製を行い、ｄｉｏｘａｎｅで凍結乾燥して、黄色の粉末を得た。続いて、Ｎ１０−（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｙｌ）−ｐｙｒｏｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄ（５ｇ）を無水ＤＭＦ（２５ｍｌ）に加えた後、２５℃の条件でＫ２ＣＯ３をゆっくり加えた。溶液を５％塩酸水溶液を用いて酸性にし、沈殿質を水とエーテルで洗浄した。得られたＰｙｒｏｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄは真空乾燥によって回収した。続いて、Ｐｙｒｏｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄ（５００ｍｇ）を２０ｍｌの無水ＤＭＦに溶かした後、１０当量のＣＡｔ−ＢＥ（１．６ｇ）と反応させた。２４時間後、ｆｏｌａｔｅ−ｈｙｄｒａｚｉｄｅ−ＢＯＣをエーテルに再沈殿し、次いで、ｆｏｌａｔｅ−ｈｙｄｒａｚｉｄｅ−ＢＯＣのＢＯＣ保護基をｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＴＦＡ）で脱保護した後、アンモニアで末端を活性化させることによってｆｏｌａｔｅ−ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（Ｆｏｌ−Ｈｙｄ）を回収した。
実施例５で合成されたＣＨＯ−Ｂｚ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ａｃ（２５０ｍｇ）と上記Ｆｏｌ−Ｈｙｄ（５０ｍｇ：１０倍当量）をＤＭＦ溶媒中で室温で反応させてシッフベースを形成させ、結合が可逆的に解離しないようにＮａＢＨ３ＣＮ（２ｍｇ／ｍｌ）を使用して、遮光下で７日間反応させて還元させた。過剰量の未反応の葉酸ヒドラジド分子はゲル濾過により精製した。導入の確認はＧＰＣと１Ｈ−ＮＭＲにより行った。続いて、Ｆｏｌ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ａｃのベンジル基をヒドラジド基へと置換した。５００ｍｇのＦｏｌ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ａｃを１０ｍｌｍｌのＤＭＦに溶かして、無水ヒドラジン０．６２ｍｍｏｌを加え、４０℃で２４時間反応させた。反応後、残りのベンジルエステル基は０．１ＮＮａＯＨ水溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）中、室温で攪拌しながら３時間反応させ脱保護した。その後、１リットルの０．２５％のアンモニア水で、２時間おきに３回、次いで１リットルの純水で２時間、透析を行い、凍結乾燥によって回収した。得られたＦｏｌ−ＰＥＧ−ｐ（Ａｓｐ−Ｈｙｄ）−Ａｃは下記の構造を有し（Ｍｗ１６４８８）、平均値としてｍ＝２６８、ｎ＝３２であり、Ｒ６ａは６６％が−ＮＨＮＨ２であり３４％が−ＯＨまたはその塩であった。
2006115293.tif 000020
【実施例７】
【００１２】
Ｆｏｌ−ＰＥＧ−ｐ（Ａｓｐ−Ｈｙｄ−ＡＤＲ）−Ａｃの合成とミセルの調製
実施例６で得られたＦｏｌ−ＰＥＧ−ｐ（Ａｓｐ−Ｈｙｄ）−Ａｃ  （１００ｍｇ）を５０ｍｌのＤＭＦに溶解して、ヒドラジド基に対して１．５倍当量のアドリアマイシン（ＡＤＲ）を加えて、室温、遮光下で５日間反応させた後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０を用いて未反応のＡＤＲを除去した。精製されたＦｏｌ−ＰＥＧ−ｐ（Ａｓｐ−Ｈｙｄ−ＡＤＲ）−ＡｃをＤＭＦに溶解した後、透析法によってミセルを調製した。ミセルの粒径は約６０ｎｍであることが動的光散乱測定によって確認された。なお、ここで特に記載していない実験条件は、実施例３と同様の条件とした。
【実施例８】
【００１３】
ミセルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ殺細胞性評価
Ｆｏｌ−ＰＥＧ−ｐ（Ａｓｐ−Ｈｙｄ−ＡＤＲ）−Ａｃブロック共重合体からなる葉酸表面装着型ミセル（ＦＭＡ）のリガンドによる細胞内取り込み亢進効果を確認するために、ヒト咽頭癌細胞（ＫＢ細胞）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ殺細胞性評価を行った。評価方法はＭＴＴアッセイで、３または２４時間接触後、培地を交換、その後更に２４時間のポストインキュベーションを行った。比較としては葉酸表面非装着型ミセル（ＭＡ）を用いて、癌細胞に対する薬効（ＩＣ５０：細胞の増殖を５０％阻害する薬剤の濃度）をアドリアマイシン単剤（ＡＤＲ）の値を基準として換算した。実験の結果、本葉酸ミセルは葉酸が結合していないミセルに比べて２４時間接触では約８倍の薬効の亢進効果、すなわち約１／８の濃度で同等の細胞成長阻害効果が認められた（図２）。興味深いことに、その薬効は短い接触時間（３時間）でも効果が得られており（表２）、その理由としては、表面に葉酸受容体が過剰発現していると言われているＫＢ細胞の生物学的な特徴から、葉酸とその受容体の働きによって細胞内薬物輸送効率が上がったためであると考えられる。
【表２】
2006115293.tif 000021
ａＫＢ細胞は８回の独立した実験に使われた（ｎ＝８）。
ｂＩＣ５０とは細胞の増殖を５０％阻害可能な薬物の濃度である。値はＡＤＲ換算で求められた。
ｃ比較係数とはコントロールと比較対象との比と定義する。ここでは、２４時間ＡＤＲを接触した場合の値をコントロールとしてミセルの増殖阻害効果を比較した。
【産業上の利用可能性】
【００１４】
本発明の方法により、アスパラギン酸ヒドラジド構造を含む高分子を簡易に製造することができる。また、本発明により、ｐＨ応答性と標的指向性を備えた、新しいドラッグデリバリーシステムが提供される。このシステムによれば、アスパラギン酸ベンジルエステルに対するヒドラジンの仕込量を変えることにより、アスパラギン酸ヒドラジドへの変換率を制御することができ、これにより、高分子−化合物複合体または高分子ミセルから、導入されたアスパラギン酸ヒドラジドの変換率に応じて前記化合物の遊離または放出速度を制御することが可能となる。
【図１】
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【図２】
2006115293.tif 000031
【国際調査報告】
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