(57)【要約】  血管新生を促進する低酸素ストレス応答に関与する因子として、HIF2α結合因子と結合活性を有するInt6を新たに同定することに成功した。また、Int6は、HIF2αとの相互作用を介して、HIF2αの低酸素ストレス応答遺伝子の転写を抑制することを見出した。Int6の発現もしくは機能を阻害する物質は、HIF2αの低酸素ストレス応答遺伝子転写促進作用を増強させることにより、血管新生を促進し、心筋梗塞等の種々の血管疾患に対して治療効果を有することが期待される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Int6タンパク質の発現抑制物質または機能抑制物質を有効成分として含有する、低酸素ストレス応答促進剤。
【請求項２】
Int6タンパク質の発現抑制物質が、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物である、請求項１に記載の低酸素ストレス応答促進剤。
（ａ）Int6遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）Int6遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）Int6遺伝子の発現をRNAi効果による阻害作用を有する核酸
【請求項３】
Int6タンパク質の発現抑制物質が、女性ホルモン、女性ホルモン分泌促進剤、または女性ホルモン受容体アゴニストである、請求項１に記載の低酸素ストレス応答促進剤。
【請求項４】
Int6タンパク質の機能抑制物質が、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物である、請求項１に記載の低酸素ストレス応答促進剤。
（ａ）Int6タンパク質と結合する抗体
（ｂ）Int6タンパク質と結合する低分子化合物
（ｃ）Int6タンパク質とHIF2αタンパク質との結合活性を阻害する化合物
【請求項５】
低酸素ストレス応答促進が血管新生の誘導である、請求項１〜４のいずれかに記載の低酸素ストレス応答促進剤。
【請求項６】
Int6タンパク質の発現亢進物質または機能亢進物質を有効成分として含有する、低酸素ストレス応答抑制剤。
【請求項７】
Int6タンパク質の発現亢進物質が、女性ホルモン抑制剤である、請求項６に記載の低酸素ストレス応答抑制剤。
【請求項８】
低酸素ストレス応答抑制が血管新生の抑制である、請求項７に記載の低酸素ストレス応答抑制剤。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれかに記載の低酸素ストレス応答促進剤を有効成分として含有する、血管疾患治療薬。
【請求項１０】
血管疾患が、虚血性脳もしくは心疾患、神経変性疾患、外傷性脳障害、または、肝、膵、筋肉、もしくは皮膚疾患である、請求項９に記載の血管疾患治療薬。
【請求項１１】
請求項６〜８のいずれかに記載の低酸素ストレス応答抑制剤を有効成分として含有する、血管新生関連疾患治療薬。
【請求項１２】
血管新生関連疾患が癌疾患である、請求項１１に記載の血管新生関連疾患治療薬。
【請求項１３】
Int6遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１４】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの核酸の作用により、Int6遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする、請求項１３に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
（ａ）Int6遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）Int6遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）Int6遺伝子の発現をRNAi効果によって阻害する作用を有する核酸
【請求項１５】
血管新生効果が促進されていることを特徴とする、請求項１３または１４に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１６】
Int6遺伝子の発現量もしくはInt6タンパク質の活性を低下させる化合物を選択することを特徴とする、血管疾患治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１７】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管疾患治療薬のスクリーニング方法。
（ａ）Int6遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞におけるInt6遺伝子の発現量を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、発現量を低下させる化合物を選択する工程
【請求項１８】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管疾患治療薬のスクリーニング方法。
（ａ）Int6遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
【請求項１９】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管疾患治療薬のスクリーニング方法。
（ａ）Int6タンパク質、または該タンパク質を発現する細胞もしくは細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記タンパク質の活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記タンパク質の活性を低下させる化合物を選択する工程
【請求項２０】
Int6タンパク質とHIF2αタンパク質との結合活性を抑制する化合物を選択することを特徴とする、血管疾患治療薬のスクリーニング方法。
【請求項２１】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管疾患治療薬のスクリーニング方法。
（ａ）Int6タンパク質およびHIF2αタンパク質と、被検化合物とを接触させる工程
（ｂ）Int6タンパク質とHIF2αタンパク質との結合活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記結合活性を低下させる化合物を選択する工程
【請求項２２】
Int6遺伝子の発現量もしくはInt6タンパク質の活性を上昇させる化合物を選択することを特徴とする、血管新生関連疾患治療薬のスクリーニング方法。
【請求項２３】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管新生関連疾患治療薬のスクリーニング方法。
（ａ）Int6遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞におけるInt6遺伝子の発現量を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、発現量を上昇させる化合物を選択する工程
【請求項２４】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管新生関連疾患治療薬のスクリーニング方法。
（ａ）Int6遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
【請求項２５】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管新生関連疾患治療薬のスクリーニング方法。
（ａ）Int6タンパク質、または該タンパク質を発現する細胞もしくは細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記タンパク質の活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記タンパク質の活性を上昇させる化合物を選択する工程
【請求項２６】
Int6タンパク質とHIF2αタンパク質との結合活性を亢進させる化合物を選択することを特徴とする、血管新生関連疾患治療薬のスクリーニング方法。
【請求項２７】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管新生関連疾患治療薬のスクリーニング方法。
（ａ）Int6タンパク質およびHIF2αタンパク質と、被検化合物とを接触させる工程
（ｂ）Int6タンパク質とHIF2αタンパク質との結合活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記結合活性を上昇させる化合物を選択する工程
【請求項２８】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管新生関連疾患治療薬のスクリーニング方法。
（ａ）請求項１３〜１５のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物に被検化合物を投与する工程
（ｂ）前記トランスジェニック非ヒト動物におけるInt6の発現量もしくは活性、あるいは、該動物における血管新生効果を測定する工程
（ｃ）被検化合物を投与しない場合と比較して、Int6の発現量もしくは活性を上昇させる化合物、あるいは、血管新生効果を低下させる化合物を選択する工程
【請求項２９】
Int6のドミナントネガティブ変異体を有効成分として含有する、血管新生誘導剤。
【請求項３０】
Int6のドミナントネガティブ変異体が、Int6タンパク質のC末領域のPINT領域が欠損されたInt6タンパク質変異体である、請求項２９に記載の血管新生誘導剤。
【請求項３１】
Int6タンパク質、または、Int6タンパク質を発現するベクターを有効成分として含有する、血管新生抑制剤。
【請求項３２】
Int6遺伝子の発現が抑制され血管新生が誘導されていることを特徴とするキャリヤー細胞。
【請求項３３】
Int6遺伝子に対するsiRNAが導入された、請求項３２に記載のキャリヤー細胞。
【請求項３４】
請求項３１に記載の血管新生抑制剤、または、請求項３２もしくは３３に記載のキャリヤー細胞を有効成分として含有する、血管疾患治療薬。
【請求項３５】
単離されたキャリヤー細胞へ、Int6遺伝子に対するsiRNAを導入する工程を含む、血管疾患治療薬の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低酸素ストレス応答を制御するInt6タンパク質、および該タンパク質の発現もしくは機能を制御する物質を含有する血管疾患治療剤または抗癌剤、並びに、該薬剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物は様々な環境の変化に適応しながらその生命を維持し続けている。それら環境ストレスへの応答反応は生理的レベルのみならず、細胞レベルでも行われており、今日においてその分子レベルでのストレス応答機構が解明されつつある。その中でも酸素の存在は地球上で生存する全ての生物にとって最も重要な環境因子の一つである。【０００３】
生物にとって酸素は細胞機能の存続に必要なエネルギー源であるため、酸素の欠乏は生命の存続に関わる重要な問題である。生体が低酸素状態になる原因としては貧血や心肺機能の異常、高地生活などが挙げられる。このとき、生体内の各細胞は様々な遺伝子の発現様式を変化させ、低酸素ストレスに適応しようとする。例えば、細胞の低酸素ストレス応答反応として、解糖系の活性化や血管新生の誘導などが起こる。【０００４】
低酸素ストレス応答に関与するような遺伝子の中には、上流にHRE (hypoxia response elements)が存在するものがある。このHREに転写因子HIF（hypoxia-inducible factor；低酸素反応性因子）が結合し、転写を促進させる。HIFについては詳細な解析が行われており、腫瘍の血管新生に必須であるVEGF（血管内皮細胞増殖因子）を作り出し、さらには、ミトコンドリアでのエネルギー代謝に関わる多くの解糖系酵素の転写制御を行うことが知られている。固形腫瘍（例えば癌）では、血流が豊富にあるにも関わらず、腫瘍内部ではかなり低酸素状態となっており、この状態が更に血管新生を促す結果となっている。血管新生のほかにも、HIFは細胞内においてさまざまな役割を担っており、エネルギー代謝系、赤血球増殖、鉄代謝、細胞増殖、細胞死、ドーパミン代謝等に関与しているという報告がある。例えば低酸素時の赤血球増殖にはエリスロポエチン遺伝子の発現亢進が必要であり、血管新生にはVEGF遺伝子の発現増加が重要である。これら低酸素応答性遺伝子の発現調節には、転写因子HIF1α（hypoxia inducible factor 1α）やHLF（HIF1 like factor）、GATA-2などが重要な役割を果たしていることが知られている。HIF1αは低酸素による細胞の応答に深く関与し、通常の酸素濃度(21%)ではユビキチン・プロテアソームによって分解されているが、低酸素状態ではこの分解から免れ核に移行し転写因子としてさまざまな因子の誘導を惹起する。【０００５】
通常の酸素濃度でHIF1αを分解する因子の一つとしてpVHLがあげられる。pVHLはHIF1αに結合し、ユビキチン化することによりHIF1αは分解される。このときPHD (proline hydroxylase) がHIF1αのプロリン残基を水酸化することによって、pVHLがその部位を認識することができるようになる。【０００６】
HIFはHIF1α、HIF2α、HIF3αの３種に大きく分かれ、HIF1αがユビキタスに発現するのと異なり、HIF2αは血管内皮細胞、骨格筋、心筋などに、HIF3αは脳神経系に特異的に発現する。HIF1αは脳梗塞あるいは心筋梗塞等の虚血疾患に関連することが明らかとなっている（非特許文献１〜４参照）。HIF2αは、低酸素ストレスが関連する疾患の中でも癌の血管新生に関与する（非特許文献５参照）。このHIF2αに関しては、結合する因子が幾つか報告されているものの、その機能を制御する因子に関しては明らかになっていない。【０００７】
【非特許文献１】Semenza GL.著、「HIF-1 and mechanisms of hypoxia sensing.」、Curr Opin Cell Biol.、2001年Apr、Vol.13(2)、p.167-71.
【非特許文献２】Giaccia A,外２名著、「HIF-1 as a target for drug development.」、2003年Oct、2(10)、p.803-11.
【非特許文献３】Jelkmann W.著、「Effects of erythropoietin on brain function.」、Curr Pharm Biotechnol.、2005年Feb、Vol.6(1)、p.65-79
【非特許文献４】Marti HH.著、「Erythropoietin and the hypoxic brain.」、J Exp Biol.、2004年Aug、Vol.207(Pt 18)、p.3233-42.
【非特許文献５】Favier J, 外３名著、「Coexpression of endothelial PAS protein 1 with essential angiogenic factors suggests its involvement in human vascular development.」、Dev Dyn.、2001年Nov、Vol.222(3)、p.377-88
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明はこのような状況に鑑みて為されたものであり、血管新生に関連する低酸素ストレス時の遺伝子発現応答のメカニズムの解明を目的とし、さらに、特に血管新生を誘導する低酸素ストレス応答を促進するHIF2αの機能を制御する因子の同定を目的とする。より詳しくは、低酸素ストレス応答を制御する薬剤、および血管疾患に対して治療効果を有する薬剤、並びに、該薬剤のスクリーニング方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行い、その結果、血管新生を促進する低酸素ストレス応答に関与する因子として、HIF2αと結合活性を有するInt6を新たに同定することに成功した。【００１０】
低酸素ストレス下においては、HIF2αの働きによって、低酸素応答遺伝子の転写が促進されることが知られている。本発明により、その際のHIF2αの転写機能をInt6が制御していることが明らかとなった。より詳しくは、Int6は、HIF2αとの相互作用を介して、HIF2αの低酸素ストレス応答遺伝子の転写を抑制することを見出した。【００１１】
Int6遺伝子の発現、もしくはInt6の機能（例えば、HIF2αとの結合活性）を阻害する物質は、HIF2αの低酸素ストレス応答遺伝子転写促進作用を増強させることにより、血管新生効果を上昇させることが期待される。該物質は、高い血管新生効果が期待され、閉塞性動脈硬化症、経皮的血管拡張術（PCT）後再狭窄、心筋梗塞等の種々の血管疾患に対して治療効果を有することが期待される。【００１２】
また、本発明者らは、Int6遺伝子の発現がsiRNAによって抑制された実験動物を作製し、該実験動物において実際に血管新生効果が上昇していることを見出した。従って、Int6の発現もしくは機能を阻害する物質は、実際に血管新生効果を効果的に上昇させることを、動物実験レベルで確認することに成功した。とりわけ、Int6遺伝子の特異的発現抑制効果が期待されるsiRNAは、転写制御因子の発現抑制により、血管疾患に対して治療効果を有する遺伝子の発現を亢進させるという、全く新しいコンセプトの血管疾患治療薬となることが大いに期待される。【００１３】
また、Int6の発現もしくは機能を亢進させる物質は、HIF2αの低酸素ストレス応答遺伝子転写促進作用を低下させることにより、血管新生効果を抑制させることが期待される。癌組織において血管新生効果が上昇していることから、該物質は、血管新生を抑制することを機序とする新たな抗癌剤となるものと考えられる。【００１４】
さらに本発明者らは、女性ホルモンがInt6の発現を抑制することを初めて見出した。即ち、女性ホルモンは、Int6遺伝子の発現を抑制することにより、HIF2αの低酸素ストレス応答遺伝子転写促進作用を亢進させ、その結果、血管新生を促進させるものと考えられる。従って、女性ホルモンは、例えば、血量の改善によって病態を改善し得る疾患（閉塞性動脈硬化症等）の治療に有効である。一方、女性ホルモン抑制剤は、血管新生を抑制することにより、例えば、抗癌作用を有することが期待される。【００１５】
また、本発明者らによって見出された上記知見を基に、血管疾患治療剤もしくは抗癌剤等のスクリーニングを実施することが可能である。【００１６】
本発明は、低酸素ストレス応答を制御する薬剤、および血管疾患もしくは癌に対して治療効果を有する薬剤、並びに、該薬剤のスクリーニング方法に関し、より詳しくは、
〔１〕  Int6タンパク質の発現抑制物質または機能抑制物質を有効成分として含有する、低酸素ストレス応答促進剤、
〔２〕  Int6タンパク質の発現抑制物質が、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物である、〔１〕に記載の低酸素ストレス応答促進剤、
（ａ）Int6遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）Int6遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）Int6遺伝子の発現をRNAi効果による阻害作用を有する核酸
〔３〕  Int6タンパク質の発現抑制物質が、女性ホルモン、女性ホルモン分泌促進剤、または女性ホルモン受容体アゴニストである、〔１〕に記載の低酸素ストレス応答促進剤、
〔４〕  Int6タンパク質の機能抑制物質が、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物である、〔１〕に記載の低酸素ストレス応答促進剤、
（ａ）Int6タンパク質と結合する抗体
（ｂ）Int6タンパク質と結合する低分子化合物
（ｃ）Int6タンパク質とHIF2αタンパク質との結合活性を阻害する化合物
〔５〕  低酸素ストレス応答促進が血管新生の誘導である、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の低酸素ストレス応答促進剤、
〔６〕  Int6タンパク質の発現亢進物質または機能亢進物質を有効成分として含有する、低酸素ストレス応答抑制剤、
〔７〕  Int6タンパク質の発現亢進物質が、女性ホルモン抑制剤である、〔６〕に記載の低酸素ストレス応答抑制剤、
〔８〕  低酸素ストレス応答抑制が血管新生の抑制である、〔７〕に記載の低酸素ストレス応答抑制剤、
〔９〕  〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の低酸素ストレス応答促進剤を有効成分として含有する、血管疾患治療薬、
〔１０〕  血管疾患が、虚血性脳もしくは心疾患、神経変性疾患、外傷性脳障害、または、肝、膵、筋肉、もしくは皮膚疾患である、〔９〕に記載の血管疾患治療薬、
〔１１〕  〔６〕〜〔８〕のいずれかに記載の低酸素ストレス応答抑制剤を有効成分として含有する、血管新生関連疾患治療薬（例えば抗癌剤）、
〔１２〕  血管新生関連疾患が癌疾患である、〔１１〕に記載の血管新生関連疾患治療薬、
〔１３〕  Int6遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト動物、
〔１４〕  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの核酸の作用により、Int6遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする、〔１３〕に記載のトランスジェニック非ヒト動物、
（ａ）Int6遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）Int6遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）Int6遺伝子の発現をRNAi効果によって阻害する作用を有する核酸
〔１５〕  血管新生効果が促進されていることを特徴とする、〔１３〕または〔１４〕に記載のトランスジェニック非ヒト動物、
〔１６〕  Int6遺伝子の発現量もしくはInt6タンパク質の活性を低下させる化合物を選択することを特徴とする、血管疾患治療薬のスクリーニング方法、
〔１７〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管疾患治療薬のスクリーニング方法、
（ａ）Int6遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞におけるInt6遺伝子の発現量を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、発現量を低下させる化合物を選択する工程
〔１８〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管疾患治療薬のスクリーニング方法、
（ａ）Int6遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔１９〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管疾患治療薬のスクリーニング方法、
（ａ）Int6タンパク質、または該タンパク質を発現する細胞もしくは細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記タンパク質の活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記タンパク質の活性を低下させる化合物を選択する工程
〔２０〕  Int6タンパク質とHIF2αタンパク質との結合活性を抑制する化合物を選択することを特徴とする、血管疾患治療薬のスクリーニング方法、
〔２１〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管疾患治療薬のスクリーニング方法、
（ａ）Int6タンパク質およびHIF2αタンパク質と、被検化合物とを接触させる工程
（ｂ）Int6タンパク質とHIF2αタンパク質との結合活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記結合活性を低下させる化合物を選択する工程
〔２２〕  Int6遺伝子の発現量もしくはInt6タンパク質の活性を上昇させる化合物を選択することを特徴とする、血管新生関連疾患治療薬（例えば抗癌剤）のスクリーニング方法、
〔２３〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管新生関連疾患治療薬（例えば抗癌剤）のスクリーニング方法、
（ａ）Int6遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞におけるInt6遺伝子の発現量を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、発現量を上昇させる化合物を選択する工程
〔２４〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管新生関連疾患治療薬（例えば抗癌剤）のスクリーニング方法、
（ａ）Int6遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
〔２５〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管新生関連疾患治療薬（例えば抗癌剤）のスクリーニング方法、
（ａ）Int6タンパク質、または該タンパク質を発現する細胞もしくは細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記タンパク質の活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記タンパク質の活性を上昇させる化合物を選択する工程
〔２６〕  Int6タンパク質とHIF2αタンパク質との結合活性を亢進させる化合物を選択することを特徴とする、血管新生関連疾患治療薬（例えば抗癌剤）のスクリーニング方法、
〔２７〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管新生関連疾患治療薬（例えば抗癌剤）のスクリーニング方法、
（ａ）Int6タンパク質およびHIF2αタンパク質と、被検化合物とを接触させる工程
（ｂ）Int6タンパク質とHIF2αタンパク質との結合活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記結合活性を上昇させる化合物を選択する工程
〔２８〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管新生関連疾患治療薬（例えば抗癌剤）のスクリーニング方法、
（ａ）〔１３〕〜〔１５〕のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物に被検化合物を投与する工程
（ｂ）前記トランスジェニック非ヒト動物におけるInt6の発現量もしくは活性、あるいは、該動物における血管新生効果を測定する工程
（ｃ）被検化合物を投与しない場合（対照）と比較して、Int6の発現量もしくは活性を上昇させる化合物、あるいは、血管新生効果を低下させる化合物を選択する工程、を提供するものである。
さらに本発明は、以下を提供する。
〔２９〕  Int6のドミナントネガティブ変異体を有効成分として含有する、血管新生誘導剤。
〔３０〕  Int6のドミナントネガティブ変異体が、Int6タンパク質のC末領域のPINT領域が欠損されたInt6タンパク質変異体である、〔２９〕に記載の血管新生誘導剤。
〔３１〕  Int6タンパク質、または、Int6タンパク質を発現するベクターを有効成分として含有する、血管新生抑制剤。（好ましくは、癌細胞における血管新生抑制剤）
〔３２〕  Int6遺伝子の発現が抑制され血管新生が誘導されていることを特徴とするキャリヤー細胞。
〔３３〕  Int6遺伝子に対するsiRNAが導入された、〔３２〕に記載のキャリヤー細胞。
〔３４〕  〔３１〕に記載の血管新生抑制剤、または、〔３２〕もしくは〔３３〕に記載のキャリヤー細胞を有効成分として含有する、血管疾患治療薬。
〔３５〕  単離されたキャリヤー細胞へ、Int6遺伝子に対するsiRNAを導入する工程を含む、血管疾患治療薬の製造方法。
〔３６〕  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかを有効量投与する工程を含む、血管疾患の治療方法。
（ａ）本発明の低酸素ストレス応答促進剤
（ｂ）本発明の血管新生誘導剤
（ｃ）本発明のキャリヤー細胞
〔３７〕  以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、血管疾患の治療方法。
（ａ）単離されたキャリヤー細胞へ、Int6遺伝子に対するsiRNAを導入する工程
（ｂ）工程（ａ）のsiRNAが導入されたキャリヤー細胞を、有効量投与する工程
〔３８〕  以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、自家移植療法。
（ａ）キャリヤー細胞を採取する工程
（ｂ）採取したキャリヤー細胞へ、Int6遺伝子に対するsiRNAを導入する工程
（ｃ）工程（ａ）のsiRNAが導入されたキャリヤー細胞を、有効量投与する工程
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、Int6遺伝子の発現を抑制するsiRNA発現ベクターの構造（配列）を示す図である。
【図２】図２は、Int6によるHIF2αの転写活性の抑制効果を示す図である。
【図３】図３は、Int6のsiRNAによる内在性Int6遺伝子の発現抑制効果を示す図および写真である。
【図４】図４は、Int6のsiRNAによる血管新生促進効果を示す写真である。
【図５】図５は、MCF-7細胞を、エストラジオール（E2）、progesteron (Progestin)、あるいはestrogen受容体抑制剤タモキシフェン(4OH-TAM)で処理し、２４時間培養した細胞のInt6 mRNAの発現を定量した結果を示すグラフである。横軸に示す記号は、以下の通りである。A-1 : E2(-)、A-2 : E2(1nM)、A-4 : Progestin(1nM)、A-5 : E2(1nM)+Progestin(1nM)、A-8 : 4OH-TAM(1μM)、A-12: E2(1nM)+4OH-TAM(1μM)。
【図６】図６は、ユビキチンによるHIFの制御機構と転写活性により誘導される因子群を表す図である。
【図７】図７は、酵母Two Hybrid法にて同定された新規HIF2α結合因子に関する事項をまとめた図である。
【図８】図８は、MMTVによるInt6の変異とHIF2αとの関連を示す図である。
【図９】図９は、合成Int6-siRNAの導入により血管新生因子群を分泌する「siRNA処理血管新生誘導細胞」を用いた自家移植による新生血管バイパス治療法の基本概念を示す図である。
【図１０】図１０は、siRNA処理血管新生誘導細胞による新生血管バイパス治療法の概念図である。
【図１１】図１１は、Int6のHIF2αに対する結合特性を表す図である。
【図１２】図１２は、Int6のHIF2α結合部位を示す図である。
【図１３】図１３は、正常酸素状態あるいは低酸素状態における、Int6野生型、および恒常不活性化型（ドミナントネガティブ）変異体Int6ΔCの、HIF1α、HIF2α、およびHIF3αの転写活性を示すグラフである。
【図１４】図１４は、Int6-siRNA発現ベクターによるマウス皮下の顕著な血管新生誘導の結果を示す写真である。
【図１５】図１５は、Int6-siRNAによる血管新生の定量的解析結果を示すグラフである。左側グラフが新生血管面積（AREA）を示し、右側グラフが新生血管長（LENGTH）を示す。
【図１６】図１６は、Int6-siRNAによって新生した血管の病理組織像を示す写真である。写真内の矢印は新生された血管を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明によって、Int6の発現もしくは機能（活性）を抑制（阻害）する物質は、HIF2α転写制御因子の機能を亢進させることにより、低酸素ストレス応答を促進させる機能を有することが見出された。
従って本発明は、Int6タンパク質の発現を抑制する物質または機能を抑制する物質を有効成分として含有する、低酸素ストレス応答促進剤を提供する。【００１９】
本発明のInt6遺伝子は、ヒトをはじめとする種々の生物において存在することが知られている。Int6遺伝子は、翻訳調節因子Translation Initiation Factorのコンポーネントの一つであるeIF3e/p48と同一の遺伝子であることが知られており、ヒト、マウス、ラット、カエル等においてInt6遺伝子に相当する遺伝子（相同遺伝子、ホモログ）が同定されている。【００２０】
本発明のInt6タンパク質は、ヒトInt6タンパク質であることが好ましいが、その由来する生物種は特に制限されず、ヒトInt6タンパク質のヒト以外の生物種、例えば、オランウータン、チンパンジー、イヌ、マウス、ドブネズミ（ラット）等の哺乳動物、あるいはニワトリ等の鳥類、アフリカツメガエル等の両生類におけるホモログ等であってもよい。ヒトInt6遺伝子の公共遺伝子データベースGenBankにおけるアクセッション番号は、NM_001568である。なお上記ヒト以外の生物種におけるInt6ホモログに関する遺伝子データベースの名称および該遺伝子データベースにおけるアクセッション番号を以下に示す。（gbはGenBank、embはEMBL、refはRefSeqデータベースを示す。）オランウータン（emb：CR860517.1）、イヌ（ref：XM_532304.1）、ドブネズミ（gb：BC082087.1）、マウス（ref：NM_008388.1）、チンパンジー（ref：XM_519906.1）、ニワトリ（emb：AJ719829.1、ref：NM_001006349.1）、アフリカツメガエル（gb：AF162775.1、AF162775）。【００２１】
ヒトにおけるInt6をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号：１に示す。また該塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。上記以外のタンパク質であっても、例えば本願配列表に記載された配列と高い相同性（通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上）を有し、かつInt6が有する機能（例えば、HIF2αタンパク質と結合する機能）を持つタンパク質は、本発明のInt6に含まれる。上記タンパク質とは、例えば配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が付加、欠失、置換、挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、通常変化するアミノ酸数は30アミノ酸以内、好ましくは10アミノ酸以内、より好ましくは5アミノ酸以内、最も好ましくは3アミノ酸以内である。【００２２】
本発明の「Int6タンパク質」は、天然のタンパク質の他、遺伝子組換え技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。天然のタンパク質は、例えばInt6タンパク質が発現していると考えられる細胞（組織）の抽出液に対し、Int6タンパク質に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いる方法により調製することが可能である。一方、組換えタンパク質は、Int6タンパク質をコードするDNAで形質転換した細胞を培養することにより調製することが可能である。【００２３】
本発明において低酸素ストレス応答剤とは、より具体的には、低酸素ストレスに起因して応答する遺伝子（本明細書において、「低酸素ストレス応答遺伝子」と記載する場合あり）の発現を上昇させるような機能を有する薬剤であると言うことができる。さらに詳細には、本発明における該低酸素ストレス応答遺伝子は、HIF2αによって転写が制御されている遺伝子であり、通常、血管新生の誘導に関与する遺伝子である。通常、種々の生物において複数の低酸素ストレス応答遺伝子が存在する。【００２４】
本発明の低酸素ストレス応答遺伝子としては、例えば、ヒトのVEGF(血管内皮増殖因子；Vascular endothelial growth factor)、エリスロポエチン(erythropoietin)、IGF(インシュリン成長因子；insulin growth factor)-1、グルコース輸送体炭酸脱水酵素(glucose transporter carbonic anhydrase)IX、形質転換成長因子(Transforming growth factor)をコードする遺伝子を例示することができる。【００２５】
即ち、本発明のInt6の発現もしくは機能を抑制する物質は、例えば、上述の遺伝子の発現を亢進させる機能を有する。【００２６】
本発明の低酸素ストレス応答促進剤によって、治療効果が期待される疾患としては、一般的に血流が少なくなる虚血が伴い、その虚血を血管新生による血量の改善によって病態を改善し得る疾患が挙げられる。例えば血管疾患等が挙げられる。より具体的には、閉塞性動脈硬化症、経皮的血管拡張術後再狭窄、心筋梗塞、脳梗塞あるいは脳出血などの虚血性脳疾患、アルツハイマー病あるいはパーキンソン病、または脊髄小脳変性症などの神経変性疾患、脊髄損傷あるいは脳挫傷など外傷性脳障害を含めた神経疾患、肝硬変などの肝疾患、萎縮性筋肉疾患等を挙げることができる。【００２７】
本発明においてInt6タンパク質の発現抑制物質には、例えばInt6の転写もしくは該転写産物からの翻訳を阻害する物質が含まれる。本発明の上記発現抑制物質の好ましい態様として、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物（核酸）を挙げることができる。
（ａ）Int6遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）Int6遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）Int6遺伝子の発現をRNAi効果による阻害作用を有する核酸(siRNA)【００２８】
本発明における「核酸」とはRNAまたはDNAを意味する。また所謂PNA (peptide nucleic acid)等の化学合成核酸アナログも、本発明の核酸に含まれる。PNAは、核酸の基本骨格構造である五単糖・リン酸骨格を、グリシンを単位とするポリアミド骨格に置換したもので、核酸によく似た３次元構造を有する。また本発明の核酸には、所謂LNA(Locked Nucleic Acid)も含まれる。【００２９】
特定の内在性遺伝子の発現を阻害する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者によく知られている。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を阻害する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。即ち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ(A)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を阻害する（平島および井上, 新生化学実験講座2 核酸IV遺伝子の複製と発現, 日本生化学会編, 東京化学同人, 1993, 319-347.）。【００３０】
本発明で用いられるアンチセンス核酸は、上記のいずれの作用によりInt6遺伝子の発現を阻害してもよい。一つの態様としては、Int6遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、Int6遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで、所望の動物へ形質転換できる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換される動物が持つ内在性Int6遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子(Int6)の発現を効果的に抑制するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも15塩基以上25塩基未満であることが好ましいが、本発明のアンチセンス核酸は、必ずしもこの長さに限定されず、例えば、100塩基以上、または500塩基以上であってもよい。【００３１】
本発明のアンチセンスは、特に制限されないが、例えば、GenBankのアクセッション番号NM_001568で取得されるInt6遺伝子の塩基配列等を基に作成することができる。【００３２】
また、Int6遺伝子の発現の阻害は、リボザイム、またはリボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子を指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、RNAを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループIイントロン型やRNase Pに含まれるM1 RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.）。【００３３】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15という配列のC15の3'側を切断するが、その活性にはU14とA9との塩基対形成が重要とされ、C15の代わりにA15またはU15でも切断され得ることが示されている（Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 228, 228.）。基質結合部位が標的部位近傍のRNA配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することができる（Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 239, 285.、小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.、Koizumi, M. et al., Nucl Acids Res, 1989, 17, 7059.）。【００３４】
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される（Buzayan, JM., Nature, 1986, 323, 349.）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なRNA切断リボザイムを作出できることが示されている（Kikuchi, Y.＆ Sasaki, N., Nucl Acids Res, 1991, 19, 6751.、菊池洋, 化学と生物, 1992, 30, 112.）。このように、リボザイムを用いて本発明におけるInt6遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を阻害することができる。【００３５】
遺伝子の発現を特異的に抑制する方法としては、リボザイムを用いる方法が用いられて来た（Beger C. et al., Proc Natl Acad Sci USA 98: 130-135, 2001）が、最近、より効果的に遺伝子発現を抑制できる手法としてRNA干渉（RNA interference、以下「RNAi」と略称する）が脚光を浴びている。RNAi効果による阻害作用を有する核酸は、一般的にsiRNAとも呼ばれる。RNAiは、標的遺伝子のmRNAと相同な配列からなるセンスRNAとこれと相補的な配列からなるアンチセンスRNAとからなる短鎖二本鎖RNA（以下、「dsRNA」と略称する）を細胞等に導入することにより、標的遺伝子mRNAの破壊を誘導し、標的遺伝子の発現を抑制し得る現象である。このようにRNAiは、標的遺伝子の発現を抑制し得ることから、従来の煩雑で効率の低い相同組換えによる遺伝子破壊方法に代わる簡易な遺伝子ノックアウト方法として、または、遺伝子治療への応用可能な方法として注目を集めている。RNAiに用いるRNAは、Int6遺伝子もしくは該遺伝子の部分領域と必ずしも完全に同一である必要はないが、完全な相同性を有することが好ましい。【００３６】
本発明の上記（ｃ）の核酸(siRNA)の好ましい態様として、Int6遺伝子に対してRNAi効果を有する二本鎖RNA（siRNA）を挙げることができる。より具体的には、配列番号：１に記載の塩基配列の部分配列に対するセンスRNAおよびアンチセンスRNAからなる二本鎖RNA(siRNA)を挙げることができる。【００３７】
RNAi機構の詳細については未だに不明な部分もあるが、DICERといわれる酵素（RNase III核酸分解酵素ファミリーの一種）が二本鎖RNAと接触し、二本鎖RNAがsmall interfering RNAまたはsiRNAと呼ばれる小さな断片に分解されるものと考えられている。本発明におけるRNAi効果を有する二本鎖RNAには、このようにDICERによって分解される前の二本鎖RNAも含まれる。即ち、そのままの長さではRNAi効果を有さないような長鎖のRNAであっても、細胞においてRNAi効果を有するsiRNAへ分解されることが期待されるため、本発明における二本鎖RNAの長さは、特に制限されない。【００３８】
例えば、本発明のInt6遺伝子のmRNAの全長もしくはほぼ全長の領域に対応する長鎖二本鎖RNAを、例えば、予めDICERで分解させ、その分解産物を本発明の薬剤として利用することが可能である。この分解産物には、RNAi効果を有する二本鎖RNA分子(siRNA)が含まれることが期待される。この方法によれば、RNAi効果を有することが期待されるmRNA上の領域を、特に選択しなくともよい。即ち、RNAi効果を有する本発明のInt6遺伝子のmRNA上の領域は、必ずしも正確に規定される必要はない。【００３９】
なお、上記RNA分子において一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構造を有するsiRNA(shRNA)も本発明に含まれる。即ち、分子内において二本鎖RNA構造を形成し得る一本鎖RNA分子もまた本発明に含まれる。【００４０】
本発明の上記「RNAi効果により抑制し得る二本鎖RNA」は、当業者においては、該二本鎖RNAの標的となる本発明のInt6遺伝子の塩基配列を基に、適宜作製することができる。一例を示せば、配列番号：１に記載の塩基配列をもとに、本発明の二本鎖RNAを作製することができる。即ち、配列番号：１に記載の塩基配列をもとに、該配列の転写産物であるmRNAの任意の連続するRNA領域を選択し、この領域に対応する二本鎖RNAを作製することは、当業者においては、通常の試行の範囲内において適宜行い得ることである。また、該配列の転写産物であるmRNA配列から、より強いRNAi効果を有するsiRNA配列を選択することも、当業者においては、公知の方法によって適宜実施することが可能である。また、一方の鎖（例えば、配列番号：１に記載の塩基配列）が判明していれば、当業者においては容易に他方の鎖（相補鎖）の塩基配列を知ることができる。siRNAは、当業者においては市販の核酸合成機を用いて適宜作製することが可能である。また、所望のRNAの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。【００４１】
さらに、本発明の上記RNAを発現し得るDNA（ベクター）もまた、本発明のInt6遺伝子の発現を抑制し得る化合物の好ましい態様に含まれる。例えば、本発明の上記二本鎖RNAを発現し得るDNA（ベクター）は、該二本鎖RNAの一方の鎖をコードするDNA、および該二本鎖RNAの他方の鎖をコードするDNAが、それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するDNAである。本発明の上記DNAは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的には、本発明のRNAをコードするDNAを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。【００４２】
また、本発明の発現抑制物質には、例えば、Int6の発現調節領域（例えば、プロモーター領域）と結合することにより、Int6の発現を抑制する化合物が含まれる。該化合物は、例えば、Int6のプロモーターDNA断片を用いて、該DNA断片との結合活性を指標とするスクリーニング方法により、取得することが可能である。また、当業者においては、所望の化合物について、本発明のInt6の発現を抑制するか否かの判定を、公知の方法、例えば、レポーターアッセイ法等により適宜実施することができる。【００４３】
さらに、本発明の上記RNAを発現し得るDNA（ベクター）もまた、本発明のInt6遺伝子の発現を抑制し得る化合物の好ましい態様に含まれる。例えば、本発明の上記二本鎖RNAを発現し得るDNA（ベクター）は、該二本鎖RNAの一方の鎖をコードするDNA、および該二本鎖RNAの他方の鎖をコードするDNAが、それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するDNAである。本発明の上記DNAは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的には、本発明のRNAをコードするDNAを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。【００４４】
本発明の上記ベクターの好ましい態様としては、Int6の発現を抑制するsiRNAを発現するベクターを挙げることができる。一例を示せば、該ベクターにおいてsiRNAを発現する領域の塩基配列として、図１に示す配列（配列番号：５〜７）を挙げることができるが、これらに特に限定されるものではない。【００４５】
本発明のsiRNAとしては、一例を示せば、図１に示す各塩基配列において、センスオリゴおよびアンチセンスオリゴと記載された領域のそれぞれの配列がハイブリダイズされた構造からなるsiRNAを好適に示すことができる。【００４６】
また、本発明の発現抑制物質には、例えば、Int6の発現調節領域（例えば、プロモーター領域）と結合することにより、Int6の発現を抑制する化合物が含まれる。該化合物は、例えば、Int6のプロモーターDNA断片を用いて、該DNA断片との結合活性を指標とするスクリーニング方法により、取得することが可能である。また、当業者においては、所望の化合物について、本発明のInt6の発現を抑制するか否かの判定を、公知の方法、例えば、レポーターアッセイ法等により適宜実施することができる。【００４７】
また本発明は、Int6タンパク質の機能抑制物質を有効成分として含む低酸素ストレス応答促進剤を提供する。Int6タンパク質がHIF2αと結合し、HIF2αの機能を抑制する機能を有することから、Int6タンパク質の機能を抑制することにより、HIF2αの機能が活性化され低酸素ストレス応答遺伝子の転写機能が亢進される。従って、Int6タンパク質の機能を抑制する物質は、低酸素ストレス応答促進剤として有効であるものと考えられる。【００４８】
本発明におけるInt6タンパク質の機能抑制物質としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）の化合物を挙げることができる。
（ａ）Int6タンパク質と結合する抗体
（ｂ）Int6タンパク質と結合する低分子化合物
（ｃ）Int6タンパク質とHIF2αタンパク質との結合活性を阻害する化合物【００４９】
Int6タンパク質に結合する抗体（抗Int6抗体）は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして得ることができる。天然のInt6タンパク質、あるいはGSTとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させたリコンビナント（組み換え）Int6タンパク質、またはその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、Int6タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、Int6タンパク質若しくはその部分ペプチドをマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、Int6タンパク質に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、Int6タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。【００５０】
本発明の抗体は、本発明のInt6タンパク質に結合する限り特に制限はなく、上記ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の他に、ヒト抗体、遺伝子組み換えによるヒト型化抗体、さらにその抗体断片や抗体修飾物も含まれる。【００５１】
抗体取得の感作抗原として使用される本発明のInt6タンパク質は、その由来となる動物種について制限されないが、哺乳動物、例えばマウス、ヒト由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。ヒト由来のタンパク質は、当業者においては、本明細書に開示される遺伝子配列又はアミノ酸配列を用いて、適宜、取得することができる。【００５２】
本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、完全なタンパク質あるいはタンパク質の部分ペプチドであってもよい。タンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、タンパク質のアミノ基（N）末端断片やカルボキシ（C）末端断片が挙げられる。本明細書における「抗体」とはタンパク質の全長又は断片に反応する抗体を意味する。【００５３】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばEBウィルスに感染したヒトリンパ球をin vitroでタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。【００５４】
本発明のInt6タンパク質に対する抗体は、Int6タンパク質と結合することにより、Int6タンパク質の機能を阻害し、例えば、血管疾患の治療や改善効果が期待される。得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。【００５５】
さらに本発明は、Int6タンパク質の機能を阻害し得る物質として、Int6タンパク質に結合する低分子量物質（低分子化合物）も含有する。本発明のInt6タンパク質に結合する低分子量物質は、天然または人工の化合物であってもよい。通常、当業者に公知の方法を用いることによって製造または取得可能な化合物である。また本発明の化合物は、後述のスクリーニング方法によって、取得することも可能である。【００５６】
上記（ｂ）のInt6タンパク質に結合し、その機能を抑制する低分子化合物としては、例えばInt6に対して親和性が高い化合物等が挙げられる。【００５７】
また本発明のInt6機能抑制物質の好ましい態様としては、Int6とHIF2αとの結合（相互作用）を阻害する化合物が挙げられる。該化合物は、HIF2αとInt6との結合を阻害することにより、フリーな状態で転写因子として機能するHIF2αの量を上昇させ、その結果、低酸素ストレス応答遺伝子の転写を促進するものと考えられる。【００５８】
さらに、本発明のInt6タンパク質の機能を抑制し得る物質として、Int6タンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するInt6タンパク質変異体（Int6ドミナントネガティブタンパク質）を挙げることができる。「Int6タンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するInt6タンパク質変異体」とは、該タンパク質をコードする遺伝子を発現させることによって、内在性の野生型タンパク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有するタンパク質を指す。より具体的には、該Int6ドミナントネガティブタンパク質としては、例えば、HIF2αとの結合活性が消失しているようなタンパク質を挙げることができる。【００５９】
上記Int6ドミナントネガティブタンパク質としては、例えば、Int6タンパク質のC末が欠損したタンパク質(Int6-ΔC)を挙げることができる。該Int6-ΔCは、具体的には、Int6タンパク質のC末領域のPINT領域が欠損されたInt6タンパク質変異体（図２参照）を挙げることができる。【００６０】
また、本発明によって提供される低酸素ストレス応答促進剤は、血管新生を誘導（促進）する効果を有することから、血管疾患に対して治療効果を有することが期待される。
従って本発明は、本発明の低酸素ストレス応答促進剤を有効成分として含有する、血管疾患治療薬（医薬組成物）を提供する。【００６１】
また、本発明のInt6の発現もしくは機能を亢進させる物質は、HIF2α転写制御因子の機能を低下させることにより、低酸素ストレス応答を低下させる機能を有するものと期待される。
従って本発明は、Int6タンパク質の発現もしくは機能を亢進させる物質を有効成分として含む、低酸素ストレス応答抑制剤を提供する。上記「タンパク質の発現亢進」には、遺伝子からの転写の亢進、および該転写産物からの翻訳の亢進が含まれる。【００６２】
上記物質としては、例えば、Int6とHIF2αとの結合（相互作用）を促進させる物質等が挙げられる。該物質は、Int6タンパク質とHIF2αタンパク質との結合活性を指標として、結合活性が亢進される物質をスクリーニングすることにより、適宜取得することができる。【００６３】
また、本発明によって提供される低酸素ストレス応答抑制剤は、血管新生を抑制（阻害）する効果を有することから、血管新生に関連する疾患（血管新生関連疾患）、例えば、癌に対して治療効果を有することが期待される。治療効果の期待される癌として好ましくは、乳癌、大腸癌、口腔内癌、咽頭・喉頭癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌等を挙げることができる。癌以外にも、血管新生を抑制することにより治療効果が期待できる疾患として、例えば糖尿病性の網膜症などの網膜に異常な血管が増加する疾患、肺高血圧症等を挙げることができる。なお、HIF2α転写制御因子の機能の抑制は、血管新生を抑制（阻害）するだけでなく、赤血球増加症や糖尿病におけるブドウ糖代謝異常などにも効果を有する可能性が考えられる。【００６４】
本発明者らは、女性ホルモンがInt6の発現を抑制することを見出した。即ち、女性ホルモンは、Int6遺伝子の発現を抑制することにより、HIF2αの低酸素ストレス応答遺伝子転写促進作用を亢進させ、その結果、血管新生を促進させるものと考えられる。従って、女性ホルモンは、例えば、血量の改善によって病態を改善し得る疾患（例えば、閉塞性動脈硬化症等）の治療に有効である。【００６５】
本発明におけるInt6の発現抑制物質としては、女性ホルモンを好適に示すことができる。女性ホルモンは、より具体的には、エストロゲン、プロゲステロン等を例示することができる。また、Int6タンパク質の発現もしくは機能を亢進させる物質としては、女性ホルモン以外にも、例えば、女性ホルモン分泌促進剤、女性ホルモン受容体のアゴニスト等を示すことができる。【００６６】
また、女性ホルモン抑制剤は、Int6遺伝子の発現を亢進することにより、HIF2αの低酸素ストレス応答遺伝子転写促進作用を低下させ、その結果、血管新生を低下させることが期待される。従って、女性ホルモン抑制剤は、例えば、血管新生の抑制によって病態を改善し得る疾患（例えば、癌疾患等）の治療に有効である。
さらに本発明は、Int6遺伝子の発現が抑制され、血管新生が誘導されていることを特徴とするキャリヤー細胞に関する。該細胞は、血管疾患に対する治療効果が期待される。本発明における「キャリヤー細胞」とは、例えば、線維芽細胞、グリア細胞等を挙げることができる。Int6遺伝子の発現抑制は、例えば、Int6遺伝子に対するsiRNAを用いて行うことができる。【００６７】
本発明は、本発明の低酸素ストレス応答抑制剤を有効成分として含有する、血管新生関連疾患治療薬（例えば抗癌剤、抗腫瘍医薬組成物）を提供する。該血管新生関連疾患治療薬の好ましい一つの態様としては、女性ホルモン抑制剤を有効成分として含有する、血管新生関連疾患治療薬を挙げることができる。【００６８】
さらに本発明は、Int6遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト動物（本明細書においては、「トランスジェニック非ヒト動物」、「ノックアウト非ヒト動物」、あるいは単に「動物」と記載する場合あり）を提供する。【００６９】
本発明の上記トランスジェニック非ヒト動物は、例えば低酸素ストレス応答を制御することを必要とする疾患の治療のための薬剤のスクリーニングに好適に用いることが可能である。また、低酸素ストレス応答、および上記疾患のメカニズム解明の研究のための実験モデル動物として、非常に有用である。【００７０】
本発明におけるトランスジェニック非ヒト動物には、アンチセンスRNAもしくはsiRNAの作用により遺伝子の発現が抑制された所謂「ノックダウン動物」も含まれる。【００７１】
本発明において「Int6遺伝子の発現が人為的に抑制されている」には、例えば（１）Int6遺伝子の遺伝子対の一方または双方に、ヌクレオチドの挿入、欠失、置換等の遺伝子変異を有することにより該遺伝子の発現が抑制されている状態、（２）本発明の核酸（例えば、アンチセンスRNAまたはsiRNA等）の作用により遺伝子の発現が抑制されている状態、等を挙げることができる。【００７２】
本発明における「抑制」には、Int6遺伝子の発現が完全に抑制されている場合、および、本発明の動物におけるInt6の発現量が野生型動物におけるInt6遺伝子の発現量と比較して有意に低下している場合、が含まれる。【００７３】
上記（１）には、Int6遺伝子の遺伝子対の一方の遺伝子の発現のみが抑制されている場合も含まれる。本発明における遺伝子変異の存在する部位は、該遺伝子の発現が抑制されるような部位であれば特に制限されず、例えばエクソン部位、プロモーター部位等を挙げることができる。【００７４】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、当業者においては一般的に公知の遺伝子工学技術により作製することができる。例えば、以下のようにして遺伝子ノックアウトマウスを作製することができる。まず、マウスから本発明のInt6遺伝子のエクソン部分を含むDNAを単離し、このDNA断片に適当なマーカー遺伝子を挿入し、ターゲッティングベクターを構築する。このターゲッティングベクターをエレクトロポレーション法などによりマウスのES細胞株に導入し、相同組み換えを生じた細胞株を選抜する。挿入するマーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子が好ましい。抗生物質耐性遺伝子を挿入した場合には、抗生物質を含む培地で培養するだけで相同組み換えを生じた細胞株を選抜することができる。また、より効率的な選抜を行うためには、ターゲッティングベクターにチミジンキナーゼ遺伝子などを結合させておくことも可能である。これにより、非相同組み換えを起こした細胞株を排除することができる。また、PCRおよびサザンブロットにより相同組み換え体の検定を行い、本発明の遺伝子の遺伝子対の一方が不活性化された細胞株を効率よく得ることもできる。【００７５】
相同組み換えを生じた細胞株を選抜する場合、相同組み換え箇所以外にも、遺伝子挿入による未知の遺伝子破壊の恐れがあることから、複数のクローンを用いてキメラ作製を行うことが好ましい。得られたES細胞株をマウス胚盤葉にインジェクションし、キメラマウスを得ることができる。このキメラマウスを交配させることで、本発明のInt6遺伝子の遺伝子対の一方を不活性化したマウスを得ることができる。さらに、このマウスを交配させることで、本発明の遺伝子の遺伝子対の双方を不活性化したマウスを取得することができる。マウス以外のES細胞が樹立された動物においても、同様の手法により、遺伝子改変を行うことができる。【００７６】
本発明の上記ノックアウト動物は、好ましくは、本発明の上記核酸を非ヒト動物へ導入することによってInt6遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする、ノックアウト（ノックダウン）動物である。【００７７】
上記ノックダウン動物は、本発明の核酸（アンチセンスRNAまたはsiRNA等）を発現し得る構造のベクターを、非ヒト動物へ導入することによっても作製することができる。【００７８】
一例を示せば、配列番号：５〜７に記載の塩基配列を有するsiRNA発現ベクターを、非ヒト動物の頸背部皮下へ注入することにより、Int6の発現が低下した非ヒト動物を作製することができる。より詳しくは、後述の実施例に記載の方法によって、本発明のトランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。【００７９】
本発明のトランスジェニック動物の種類は、非ヒト動物であれば特に制限されないが、通常、哺乳類であり、好ましくは霊長類である。より具体的には、本発明の動物として、好ましくはマウス、ラット、ハエ、線虫（C. Elegans）、ウシ、ブタ、トリ、ヒツジであり、より好ましくは、マウスである。また、植物においてInt6に相当する遺伝子が存在する場合、該遺伝子をターゲットとするノックダウン（トランスジェニック）植物を作製することも可能である。【００８０】
好ましい態様においては、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、特に限定されるものではないが、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの核酸の作用により、Int6遺伝子の発現が抑制されている動物である。
（ａ）Int6遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）Int6遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）Int6遺伝子の発現をRNAi効果による阻害作用を有する核酸【００８１】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、Int6遺伝子の発現が抑制され血管新生が誘導されているため、例えば、血管新生を阻害する物質あるいは薬剤（血管新生関連疾患治療薬（例えば抗癌剤））のスクリーニング、および、血管新生のメカニズムの解析に非常に有用である。【００８２】
また本発明は、Int6の発現量もしくは活性を指標とする、血管疾患治療薬のスクリーニング方法を提供する。【００８３】
Int6遺伝子の発現量を低下（抑制）させる化合物は、血管疾患治療のための薬剤となることが期待される。反対にInt6遺伝子の発現量を上昇（亢進）させる化合物は血管新生に起因する疾患、例えば、癌等に対する治療のための薬剤となることが期待される。【００８４】
本発明の上記方法の好ましい態様は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管疾患治療薬のスクリーニング方法である。
（ａ）Int6遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞におけるInt6遺伝子の発現量を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、発現量を低下させる化合物を選択する工程【００８５】
また本発明の方法の別の態様としては、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管新生関連疾患治療薬（例えば抗癌剤）のスクリーニング方法である。
（ａ）Int6遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞におけるInt6遺伝子の発現量を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、発現量を上昇させる化合物を選択する工程【００８６】
上記方法においては、まずInt6遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる。用いられる「細胞」の由来としては、ヒト、マウス、ラット等に由来する細胞が挙げられるが、これらに由来する細胞に特に制限されず、Int6を発現するように形質転換された大腸菌、酵母等の微生物細胞を利用することも可能である。「Int6遺伝子を発現する細胞」としては、内在性のInt6遺伝子を発現している細胞、または外来性のInt6遺伝子が導入され、該遺伝子が発現している細胞を利用することができる。外来性のInt6遺伝子が発現した細胞は、通常、Int6遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより作製することができる。該発現ベクターは、一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。【００８７】
本方法に用いる被検化合物としては、特に制限されないが、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられる。【００８８】
Int6遺伝子を発現する細胞への被検化合物の「接触」は、通常、Int6遺伝子を発現する細胞の培養液に被検化合物を添加することによって行うが、この方法に限定されない。被検化合物がタンパク質等の場合には、該タンパク質を発現するDNAベクターを、該細胞へ導入することにより、「接触」を行うことができる。【００８９】
本方法においては、次いで、該Int6遺伝子の発現量を測定する。ここで「遺伝子の発現」には、転写および翻訳の双方が含まれる。遺伝子の発現量の測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、Int6遺伝子を発現する細胞からmRNAを定法に従って抽出し、このmRNAを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法またはRT-PCR法を実施することによって該遺伝子の転写量の測定を行うことができる。また、Int6遺伝子を発現する細胞からタンパク質画分を回収し、Int6タンパク質の発現をSDS-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳量の測定を行うこともできる。さらに、Int6タンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実施することにより該タンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳量の測定を行うことも可能である。Int6タンパク質の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。【００９０】
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、該発現量を低下させる化合物あるいは上昇させる化合物を選択する。低下させる化合物は、血管疾患治療のための薬剤となり、反対に上昇させる化合物は、血管新生を抑制することによって治療効果を発揮し得る疾患（例えば、癌等）に対する治療薬となる。【００９１】
本発明のスクリーニング方法の他の態様は、本発明のInt6遺伝子の発現レベルを低下あるいは上昇させる化合物を、レポーター遺伝子の発現を指標として選択する方法である。【００９２】
本発明の上記方法の好ましい態様は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管疾患治療薬のスクリーニング方法である。
（ａ）Int6遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記発現レベルを低下させる化合物を選択する工程【００９３】
また本発明の上記方法の別の態様は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管新生関連疾患治療薬（例えば抗癌剤）のスクリーニング方法である。
（ａ）Int6遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程【００９４】
本方法においては、まず、Int6遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる。ここで「機能的に結合した」とは、Int6遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、Int6遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、Int6遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。Int6遺伝子のcDNA塩基配列に基づいて、当業者においては、ゲノム中に存在するInt6遺伝子の転写調節領域を周知の方法により取得することが可能である。【００９５】
本方法に用いるレポーター遺伝子としては、その発現が検出可能であれば特に制限はなく、例えば、CAT遺伝子、lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、およびGFP遺伝子等が挙げられる。「Int6遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」として、例えば、このような構造が挿入されたベクターを導入した細胞が挙げられる。このようなベクターは、当業者に周知の方法により作製することができる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェタミン法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。「Int6遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」には、染色体に該構造が挿入された細胞も含まれる。染色体へのDNA構造の挿入は、当業者に一般的に用いられる方法、例えば、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により行うことができる。【００９６】
「Int6遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞抽出液」とは、例えば、市販の試験管内転写翻訳キットに含まれる細胞抽出液に、Int6遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを添加したものを挙げることができる。【００９７】
本方法における「接触」は、「Int6遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」の培養液に被検化合物を添加する、または該DNAを含む上記の市販された細胞抽出液に被検化合物を添加することにより行うことができる。被検化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質を発現するDNAベクターを、該細胞へ導入することにより行うことも可能である。【００９８】
本方法においては、次いで、該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポーター遺伝子の発現レベルは、該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がCAT遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。レポーター遺伝子がlacZ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、さらに、GFP遺伝子である場合には、GFPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。【００９９】
本方法においては、次いで、測定したレポーター遺伝子の発現レベルを、被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、低下（抑制）あるいは上昇（亢進）させる化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物は、血管疾患治療のための薬剤となり、反対に上昇（亢進）させる化合物は、血管新生を抑制することによって治療効果を発揮し得る疾患（例えば、癌等）に対する治療薬となる。【０１００】
本発明のスクリーニング方法の他の態様は、Int6タンパク質の活性を指標とする方法である。上記方法は、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管疾患治療薬のスクリーニング方法である。
（ａ）Int6タンパク質、または該タンパク質を発現する細胞もしくは細胞抽出液と被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記タンパク質の活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記タンパク質の活性を低下させる化合物を選択する工程【０１０１】
また本発明の上記方法の別の態様としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管新生関連疾患治療薬（例えば抗癌剤）のスクリーニング方法である。
（ａ）Int6タンパク質、または該タンパク質を発現する細胞もしくは細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記タンパク質の活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記タンパク質の活性を上昇させる化合物を選択する工程【０１０２】
本方法においては、まず、Int6タンパク質または該タンパク質を発現する細胞もしくは細胞抽出液と、被検化合物を接触させる。【０１０３】
次いでInt6タンパク質の活性を測定する。Int6タンパク質の活性としては、例えばHIF2αとの結合活性（相互作用活性）等が挙げられる。該活性の測定は当業者においては、公知の手法、例えば、免疫沈降法、酵母ツーハイブリッド法等によって適宜実施することができる。【０１０４】
Int6との結合に関与するHIF2α上のアミノ酸領域は、HIF2αのアミノ酸領域（配列番号：４）の571〜700位である。従って、例えば、HIF2αタンパク質の前記アミノ酸領域を含むポリペプチド断片を利用して、上記結合活性を測定することができる。なお、HIF2α遺伝子の塩基配列を配列番号：３に、該遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：４に記載する。なお、HIF2α遺伝子の公共の遺伝子データベースにおけるアクセッション番号はNM_001430である。【０１０５】
さらに、被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該タンパク質の活性を低下（抑制）あるいは上昇（亢進）させる化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物は血管疾患治療のための薬剤となり、反対に上昇（亢進）させる化合物は血管新生を抑制することによって治療効果を発揮し得る疾患（例えば、癌等）に対する治療薬となる。【０１０６】
また本発明のスクリーニング方法の別の態様としては、Int6タンパク質とHIF2αタンパク質との結合活性を指標とする方法を挙げることができる。本発明のInt6タンパク質は、HIF2αタンパク質に対して結合（相互作用）活性を有するタンパク質である。従って、Int6タンパク質とHIF2αタンパク質の結合活性を指標として、該結合活性を増強させる物質、あるいは低下（抑制）させる物質を選択することにより、血管疾患治療のための薬剤もしくは血管新生を抑制することにより治療効果を発揮し得る疾患（例えば、癌等）に対する治療薬のスクリーニングを行うことが可能である。【０１０７】
本発明の上記方法は例えば以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管疾患治療薬のスクリーニング方法である。
（ａ）Int6タンパク質およびHIF2αタンパク質と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）Int6タンパク質とHIF2αタンパク質との結合活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記結合活性を低下させる化合物を選択する工程【０１０８】
また本発明の上記方法としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管新生関連疾患治療薬（例えば抗癌剤）のスクリーニング方法を挙げることができる。
（ａ）Int6タンパク質およびHIF2αタンパク質と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）Int6タンパク質とHIF2αタンパク質との結合活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記結合活性を上昇させる化合物を選択する工程【０１０９】
本方法においてはまず、Int6タンパク質およびHIF2αタンパク質と、被検化合物を接触させる。次いで、Int6タンパク質とHIF2αタンパク質との結合活性を測定する。【０１１０】
通常、Int6タンパク質とHIF2αタンパク質の結合（相互作用）活性を測定することは、当業者においては簡便に行い得ることであり、上記工程（ｂ）の結合活性の測定は、一般的な方法、例えば免疫共沈降方法等を利用して、適宜、実施することが可能である。【０１１１】
また、上記方法に使用するInt6タンパク質およびHIF2αタンパク質は、変異を含まない野生型タンパク質であることが好ましいが、相互作用活性を有するものであれば、これらタンパク質の一部のアミノ酸配列が置換・欠失されたタンパク質（ポリペプチド）であってもよい。【０１１２】
上記方法において用いられるInt6タンパク質は、変異を含まない野生型タンパク質（全長タンパク質）であることが好ましいが、HIF2αタンパク質との結合活性を保持している限り、その部分断片ペプチドであってもよく、また、タンパク質の一部のアミノ酸配列が置換・欠失されたタンパク質（ポリペプチド）であってもよい。
HIF2αタンパク質との結合に関与するInt6タンパク質における領域は、通常、N末に存在する「Domain1」と呼ばれる領域である。従って、上記方法において使用するInt6タンパク質は、「Domain1」を含む該タンパク質の部分断片ペプチドであってもよい。なお、該「Domain1」は、配列番号：２に記載のInt6タンパク質のアミノ酸配列において、１位〜８０位に相当する領域である。【０１１３】
上記方法は次いで、被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該結合活性を低下（抑制）あるいは上昇（亢進）させる化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物は血管疾患治療のための薬剤となり、上昇（亢進）させる化合物は血管新生を抑制することによって治療効果を発揮し得る疾患（例えば、癌等）に対する治療薬となる。【０１１４】
本発明の上記トランスジェニック非ヒト動物は、Int6遺伝子の発現が抑制されており、その結果、高い血管新生効果が観察される。該トランスジェニック非ヒト動物を用いることにより、血管新生を抑制させる化合物を、効率的にスクリーニングすることが可能である。該スクリーニング方法によって取得される化合物は、血管新生関連疾患治療薬（例えば抗癌剤）として期待される。【０１１５】
本発明のスクリーニング方法は、本発明のトランスジェニック非ヒト動物を利用し、Int6発現もしくは機能（活性）、あるいは、血管新生効果を指標とする方法である。【０１１６】
例えば、上記方法は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管疾患治療薬のスクリーニング方法である。
（ａ）本発明のトランスジェニック非ヒト動物に被検化合物を投与する工程
（ｂ）前記トランスジェニック非ヒト動物におけるInt6の発現量もしくは活性、あるいは、該動物における血管新生効果を測定する工程
（ｃ）被検化合物を投与しない場合（対照）と比較して、Int6の発現量もしくは活性を上昇させる化合物、あるいは、血管新生効果を低下させる化合物を選択する工程【０１１７】
本方法においてはまず、トランスジェニック非ヒト動物に被検化合物を投与する。被検化合物の投与は、経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、被検化合物がペプチドである場合には、非経口投与が好ましい。具体的には、血管投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与等が挙げられる。血管投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等が挙げられ、全身または局部的に投与することができる。【０１１８】
被検化合物がDNAである場合、生体内に投与する場合には、レトロウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターやリポソームなどの非ウイルスベクターを利用することができる。投与方法としては、in vivo法およびex vivo法を例示することができる。【０１１９】
次いで、トランスジェニック非ヒト動物（または該動物由来の組織もしくは細胞）におけるInt6の発現量もしくは活性を測定する。あるいは、該動物（または該動物由来の組織）における血管新生効果を観察する。【０１２０】
次いで、被検化合物を投与しない場合（対照）と比較して、Int6遺伝子の発現量もしくは活性を低下させる化合物、あるいは、血管新生を抑制させる化合物を選択する。【０１２１】
本発明の薬剤は、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合し、医薬組成物として経口、あるいは非経口的に投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型とすることができる。非経口剤としては、注射剤、点滴剤、外用薬剤、あるいは座剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。外用薬剤には、経鼻投与剤、あるいは軟膏剤等を示すことができる。主成分である本発明の薬剤を含むように、上記の剤型とする製剤技術は公知である。【０１２２】
例えば、経口投与用の錠剤は、本発明の薬剤に賦形剤、崩壊剤、結合剤、および滑沢剤等を加えて混合し、圧縮整形することにより製造することができる。賦形剤には、乳糖、デンプン、あるいはマンニトール等が一般に用いられる。崩壊剤としては、炭酸カルシウムやカルボキシメチルセルロースカルシウム等が一般に用いられる。結合剤には、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、あるいはポリビニルピロリドンが用いられる。滑沢剤としては、タルクやステアリン酸マグネシウム等が公知である。【０１２３】
本発明の薬剤を含む錠剤は、マスキングや、腸溶性製剤とするために、公知のコーティングを施すことができる。コーティング剤には、エチルセルロースやポリオキシエチレングリコール等を用いることができる。【０１２４】
また注射剤は、主成分である本発明の薬剤を適当な分散剤とともに溶解、分散媒に溶解、あるいは分散させることにより得ることができる。分散媒の選択により、水性溶剤と油性溶剤のいずれの剤型とすることもできる。水性溶剤とするには、蒸留水、生理食塩水、あるいはリンゲル液等を分散媒とする。油性溶剤では、各種植物油やプロピレングリコール等を分散媒に利用する。このとき、必要に応じてパラベン等の保存剤を添加することもできる。また注射剤中には、塩化ナトリウムやブドウ糖等の公知の等張化剤を加えることができる。更に、塩化ベンザルコニウムや塩酸プロカインのような無痛化剤を添加することができる。【０１２５】
また、本発明の薬剤を固形、液状、あるいは半固形状の組成物とすることにより外用剤とすることができる。固形、あるいは液状の組成物については、先に述べたものと同様の組成物とすることで外用剤とすることができる。半固形状の組成物は、適当な溶剤に必要に応じて増粘剤を加えて調製することができる。溶剤には、水、エチルアルコール、あるいはポリエチレングリコール等を用いることができる。増粘剤には、一般にベントナイト、ポリビニルアルコール、アクリル酸、メタクリル酸、あるいはポリビニルピロリドン等が用いられる。この組成物には、塩化ベンザルコニウム等の保存剤を加えることができる。また、担体としてカカオ脂のような油性基材、あるいはセルロース誘導体のような水性ゲル基材を組み合わせることにより、座剤とすることもできる。【０１２６】
本発明の薬剤は、安全とされている投与量の範囲内において、ヒトを含む哺乳動物に対して、必要量が投与される。本発明の薬剤の投与量は、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、最終的には医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。【０１２７】
なお、本発明における「治療薬」とは、治療効果を有する薬剤のほかに、予防効果を有するものも含まれる。【０１２８】
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１２９】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕  酵母を用いたツーハイブリッドライブラリースクリーニング
酵母ツーハイブリッド法(Clontech社)を用いて、タカラ社のヒト心臓または脳由来のライブラリー（pACT2-cDNA）を用いて1.2x10６個の遺伝子をスクリーニングしたところ、CL263クローンを得ることができた。シークエンスの結果、CL263クローンがHIF2αと結合している領域のアミノ酸配列がInt6の3aa-151aaと一致していたため、CL263クローンはInt6であることが分かった。Int6の機能は大部分が未解明である。今までに、Int6が３つのパーツを有することが知られている。いくつかの証拠から、正常なInt6の機能はマウスやヒトの乳腺腫瘍発生の予防に重要であることが示唆されている。【０１３０】
〔実施例２〕  酵母細胞におけるHIF1α、HIF2α、およびHIF3αとInt6の特異的な相互作用
酵母ツーハイブリッド法によって、Int6とHIF2αとの結合（相互作用）活性を評価した。結果を表１に示す。【０１３１】
【表１】
2006123644.tif 000002
その結果、HIF2αおよびInt6の組み合わせだけ、αガラクトシダーゼ活性およびβ-αガラクトシダーゼ活性を有することが分かり、HIF2αとInt6が相互作用することが判明した。【０１３２】
〔実施例３〕  MCF7、A549、COS7細胞におけるHIF2αとInt6の相互作用
プラスミドpMepHA-Int6wtを、MCF7、A549、COS7の３種の細胞にトランスフェクションした。その後、Int6は主に細胞のサイトソルで発現することが分かった。しかし細胞死を起こしたため、IF上での確認が困難であった。しかし一部核へ移行したInt6はHIF2αとの共局在が観察された。
また、Int6はHIF2αと共にコトランスフェクションすると、HIF2αの発現を抑えることが分かった（表２）。【０１３３】
【表２】
2006123644.tif 000003
【０１３４】
〔実施例４〕  Int6によるHIF2αの転写活性の制御
MCF7細胞において、Int6のPINT（PCI）ドメインの有無がHIF2α転写活性に影響を及ぼすか否か、また、Int6によってHIF2αの転写活性が制御されるか否かについて実験を行った。HIF2α、Int6PINT(PCI)ドメインが存在するInt6野生型（Int6 wt）、およびInt6 PINT(PCI)ドメインを分子生物学的に削除した変異体（Int6-ΔC）を用いて、酸素正常状態および低酸素状態で４時間あるいは24時間MCF7細胞を培養した。【０１３５】
その結果、Int6は、PINT（PCI）ドメインを介してHIF2α転写活性を調節することが分かった（図２）。またInt6-ΔCはHIF2αとの共発現により、正常酸素状態でも低酸素状態下でもHIF2αの転写活性を促進した。また、Int6 wtは、MCF7細胞の細胞死を起こし、正常酸素状態でも低酸素状態下でもHIF2αの転写活性を抑制した（図２）。【０１３６】
〔実施例５〕Int6のsiRNAによる内在性Int6遺伝子の発現抑制
siRNAによって、内在性Int6が抑制されるか否かについて実験を行った。Ambion社のpSilence2.1-U6のベクターを用いて、ヘアピンsiRNA1（Int6 siRNA 145）、2（Int6 siRNA 219）、3（Int6 siRNA 358）のインサートを設計し、siRNA発現プラスミドを作製した。そして、siRNA発現プラスミドとInt6-ΔCをMCF7細胞にコトランスフェクションした。【０１３７】
正常酸素状態あるいは低酸素状態でHRE (hypoxia response elements)ルシフェラーゼ活性を確認したところ、siRNA2が正常酸素状態でも低酸素状態でも内在性Int6を最も抑制することが分かった（図３Ａ）。また正常酸素状態で、MCF7細胞におけるInt6-ΔCの発現が、免疫染色法により確認されたが、siRNA2によってInt6-ΔCの発現は確認されなかった（図３Ｂ）。さらに低酸素状態で、MCF7細胞におけるHIF2αの発現がsiRNA2によって増加したことが確認された（図３Ｃ）。【０１３８】
siRNAのin vitro抑制効果について、免疫染色法により確認した。その結果、Int6-ΔCの発現率はsiRNA１、２、３によって50%、100%、70%抑制されることが示された。
使用したヒトInt6オリゴ配列は以下の通りである。【０１３９】
1. 5-Int6RNAi-145: 
gAT CCC / AAC ATg gTA gAC TTT gCT A / TTC AAg AgA / T AgC AAA gTC TAC CAT gTT / TTT TTT / ggA AA（配列番号：８）
2. 5-Int6RNAi-219: 
gAT CCC / AAg AAC CAC AgT ggT TgC A / TTC AAg AgA / T gCA ACC ACT gTg gTT CTT / TTT TTT / ggA AA（配列番号：５）
3. 5-Int6RNAi-358: 
gAT CCC / AAg CAT ggT TTT Agg CAg g / TTC AAg AgA / C CTg CCT AAA ACC ATg CTT / TTT TTT / ggA AA（配列番号：６）【０１４０】
上記のそれぞれの塩基配列において、下線は「センスオリゴ」および「アンチセンスオリゴ」を表す。該領域を二本鎖とするRNA分子は、siRNAとして機能する。【０１４１】
〔実施例６〕siRNAによるInt6遺伝子発現ノックダウン動物
（１）HVJ-E封入siRNAの調製
マウス１匹分のHVJ-E封入siRNAの調製を以下のように行った。
40μl：1AU  HVJ Envelope(HVJ-E)：GenomONE-Neo（石原産業）をマイクロチューブにとる
↓遠心：12,000rpm、4℃、5分間
Ppt
↓10μl 0.5mg/mlのpsilencer1.0V6 mouse Int6-219あるいは対照としてpsilencer1.0V6 mouseGAPDHを加える
混合
↓1μl試薬B（封入剤）
混合
↓遠心：12,000rpm、4℃、5分間
Ppt
40μlのPBSを加え、20-30回のピペッティングで懸濁する。
以上は、GenomONE-Neo（石原産業）の使用書に従って行った。【０１４２】
（２）siRNA（Int6）のマウス血管新生作用の検討
生後10週令のメスBALB/Cマウス（体重25g前後）を実験に使用した。Int6のベクター型siRNAを皮下注射する前々日に、マウスの頸背部分を除毛クリームで処理した。実験当日に、マウスをハロセン麻酔し、頸背部皮下に27GX3/4のシリンジで、50μlのHVJ-Eに封入したsiRNAを注入した。その後、普通給餌・給水で５日間飼育した。続いて、該マウスを頚椎脱臼により屠殺し、siRNA注入部を中心に1.5cm2ほどの皮膚を切除した。皮膚裏面を撮影後、ホルマリンで固定した。
対照siRNAと比較した結果、Int6 siRNA1、Int6 siRNA3、Int6 siRNA2の順に血管新生を高く促進することが示された。【０１４３】
使用したマウスInt6オリゴ配列を以下に示す。各オリゴ配列はマウスの配列をもとに作製した。
（１）Int6 siRNA1 145
5’-AAT ATg gTg gAC TTT gCT A/TTC AAg AgA/T AgC AAA gTC CAC CAT ATT/TTT TTT（配列番号：９）
（2）Int6 siRNAi -2-219: 
5’-AAg AAC CAC AgT TgT TgC g / TTC AAg AgA / C gCA ACA ACT gTg gTT CTT / TTT TTT（配列番号：１０）
（3）Int6 siRNAi -3 358
5’-AAA CAT ggg TTT Agg CAA g/TTC AAg AgA/C TTg CCT AAA CCC ATg TTT/TTT TTT（配列番号：１１）
上記のそれぞれの塩基配列において、下線は「センスオリゴ」および「アンチセンスオリゴ」を表す。該領域を二本鎖とするRNA分子は、siRNAとして機能する。
【０１４４】
〔実施例７〕ホルモン処理によるInt6 mRNAの発現抑制
乳癌の培養細胞株MCF-7にestrogen (エストラジオール、E2)、またはprogesteron (Progestin)、estrogen受容体抑制剤タモキシフェン(4OH-TAM)を加え、２４時間培養した後、細胞のmRNAを抽出し、Real Time PCRにてmRNA量を定量した。
その結果、図５に示すように各種女性ホルモン処理によって、Int6遺伝子の発現が抑制されることが分った。また、エストラジオール(E2)よりもprogesteronによる抑制効果がより明確に観察された。【０１４５】
〔実施例８〕HIF2αを介したInt6の血管新生の制御機構
酵母Two Hybrid法およびVEGFプロモーターアッセイを用いた研究結果から、Int6はHIF2αと直接相互作用をすること（図１１）、および、HIF2αのC端にある571-640aaの領域に結合部位があること（図１２）が判明し、さらにHIF1αにおけるVHLと同様に、HIF2αの低酸素ストレス応答遺伝子の転写を強く抑制することを見出した。
一方、MMTVで変異した際に作られるC末端の欠損した恒常不活化型（ドミナントネガティブ）変異体は、野生型とは正反対に、HIF2αの発現と転写活性を約２倍に上昇させた（図１３）。この結果は、MMTVのゲノムへのインテグレート(integration)の際に起こるInt6の変異が、HIF2αの長期間にわたる活性上昇による細胞増殖、血管新生を誘導し、癌化に至るという新たな癌化の機序を明らかにするものである。
Int6はC末端にプロテアゾームのリッド（蓋の部分）に結合する領域を持ち、Int6に結合したHIF2αをプロテアゾームに引き込むことによって分解させることがInt6のHIF2α制御の本質であると理解できる。これまではHIF2αの低酸素非依存的側面が報告されていたが、本発明者らによって、HIF1αが100%低酸素依存的であることに反し、HIF2αの低酸素非依存的分解はInt6で制御されていることが明らかになった。即ち、HIF2αの制御は主としてInt6により行われていると考えられる。
Int6遺伝子の発現もしくはInt6の機能（HIF2αとの結合活性等）を阻害する物質は、低酸素とは関係なくHIF2αの発現、核内への移行を促進することにより、低酸素ストレス応答遺伝子群の転写を促進させ、血管新生効果を示すことが期待される。このような物質は、高い血管新生効果と特異性が期待され、閉塞性動脈硬化症、経皮的血管拡張術（PCT）後再狭窄、心筋梗塞等の種々の血管疾患に対して治療効果を有することが期待される。【０１４６】
〔実施例９〕Int6遺伝子に対するマウスsiRNA(Int6-siRNA)のマウス皮下導入による正常血管新生
siRNAの発現ベクターをマウスの皮下にGenomeOne（HVJ-エンベロープ遺伝子導入試薬：石原産業）を用いて遺伝子導入したところ、導入５日後には、顕著な血管新生効果が得られることを見出した（図１４）。新生血管の解析ソフト（クラボウ）を用いた結果、血管面積、血管長とも5-10倍の増加が有意に認められた（図１５）。
これらの結果は導入したベクターの量に比例し、発現したsiRNAの効果依存性が明確に観察された。また、in vitro 血管新生解析キット（クラボウ）を用いて詳細な解析を行った結果、合成型siRNAによる効果も容量依存的に確認され、さらに、HIF2αの過剰発現による血管新生効果も明確であり、Int6-siRNAが内因性のHIF2αの発現誘導を起こし、血管新生因子群が誘導されたことが強く示唆された。
病理学的解析では、新生された血管は、内皮、弾力繊維を持つ正常動脈であり、腫瘍性血管新生で見られるような出血斑は皆無であった。また、Int6のsiRNA発現ベクターは主として血管内皮の線維芽細胞に導入され、この線維芽細胞から血管新生因子群が分泌されていることが示唆された（図１６）。【０１４７】
〔実施例１１〕Int6-siRNAの細胞導入による癌化の否定の確認
Int6は、乳がんやその他の癌化の際に癌抑制因子として作用することが明確になった。このことは、特異的siRNAの細胞への導入の際に、癌化を起こす恐れが懸念され、特に臨床応用される場合には大きな問題となりうる。この問題を詳細に検討するため、本発明者らは、細胞導入時に常時Int6-siRNAを発現するベクター型siRNAを細胞に導入し長期間観察した。MCF-7やHeLa細胞などの癌化細胞株では、内因性Int6を完全に抑制するベクター型siRNAの導入によって、細胞の生存が短縮され、７週間以内に細胞の増殖が止まり、細胞死を誘導した。これは、Int6の役割のひとつとして翻訳調節があり、完全な抑制は翻訳調節に異常をきたすことによるためと解釈できる。
さらにマウスから得られた初代培養線維芽細胞を用いた実験、およびクラボウ社の血管新生解析用培養細胞を用いた実験では、１１日間の観察の結果、siRNA発現ベクター及び合成型siRNAの導入にて、有効な血管新生が見られたものの、癌化は全く観察されなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１４８】
低酸素ストレス応答に関与する遺伝子の中に転写因子HIF（hypoxia-inducible factor；低酸素反応性因子）が報告されている。この因子は、腫瘍の血管新生に必須であるVEGF（血管内皮細胞増殖因子）を作り出し、さらには、ミトコンドリアでのエネルギー代謝に関わる多くの解糖系酵素の転写制御を行うことが知られている。固形腫瘍（例えば癌）では、血流が豊富にあるにも関わらず、腫瘍内部ではかなり低酸素状態となっており、この状態が更に血管新生を促す結果となっている。血管新生のほかにも、HIFは細胞内においてさまざまな役割を担っており、例えば低酸素時の赤血球増殖にはエリスロポエチン遺伝子の発現亢進が必要であり、血管新生にはVEGF遺伝子の発現増加が重要である（図６）。【０１４９】
HIF1αは、通常の酸素濃度(21%)ではユビキチン・プロテアソームによって分解されているが、低酸素状態ではこの分解から免れて核内に移行することにより転写因子としてさまざまな因子の誘導を惹起する。HIF自体はHIF1α、HIF2α、HIF3αの３種に大きく分かれ、HIF1αがユビキタスに発現するのと異なり、HIF2αは血管内皮、脳のグリア、線維芽細胞、骨格筋や心筋に、HIF3αは脳神経系に特異的に発現する。HIF1αは脳梗塞あるいは心筋梗塞等の虚血疾患に関連することが明らかとなっている。一方、HIF2αは、低酸素ストレスが関連する疾患の中でも癌の血管新生に関与する。HIF1αの細部内挙動が明らかにされつつあるのに対し、HIF2αに関しては結合する因子が幾つか報告されているものの、その機能を制御する因子に関しては全く明らかにされていない。HIF2αは血管新生に深く関与することから、その細胞内挙動を制御することにより、新たな血管新生の誘導が可能となることが予想されたため、本発明者らはこのHIF2αに関して新たな制御因子の解析を行った。【０１５０】
本発明者らは、酵母Two Hybrid法を用いて、ヒトの心筋または脳のライブラリーから、HIF2αと相互作用を示す因子として新たに６因子の同定に成功した（図７）。この中でInt6はマウス及びヒトにて乳がんの癌抑制因子として報告されてきたが、作用機序は全く不明のままであった。【０１５１】
Int6はもともと翻訳調節因子の１つであるeIF3e/p48であるが、マウス乳がん発症ウイルス(MMTV:Mouse Mammalian Tumor Virus)がマウスに感染した際に９カ所の遺伝子座にインテグレート(integration)され、その箇所の標的遺伝子を破壊する。この破壊された遺伝子の６番目のインテグレート(integration) サイトに当たることからInt6として命名された。MMTVの感染によりInt6はC末端の一部が欠損した、いわば恒常不活化型(ドミナントネガティブ)変異体（Int6-ΔC）が生じ、乳がんを発症することが発見された（図８）。しかしながら、何故この変異体が乳がんを発症するかについての機序は不明であった。【０１５２】
本発明によって、HIF2αに結合する因子としてInt6タンパク質が同定され、さらにInt6の発現もしくは機能を阻害する物質、およびInt6のドミナントネガティブ変異体（Int6-ΔC）は、HIF2αの低酸素ストレス応答遺伝子転写促進作用を増強させることにより、血管新生効果を上昇させることが可能であることが初めて見出された。【０１５３】
特に、Int6の発現抑制効果を有する物質は、高い血管新生効果が期待され、閉塞性動脈硬化症、経皮的血管拡張術（PCT）後再狭窄、心筋梗塞等の治療への応用が期待される。中でも、Int6の特異的発現抑制効果が期待されるsiRNAは、転写制御因子の機能抑制により、治療効果を有する遺伝子の発現を亢進させるという、全く新しいコンセプトの治療薬となる可能性がある。【０１５４】
また本発明者らは、従来、翻訳調節因子（eIF3e）、あるいは乳がん癌抑制因子として報告されたInt6を、siRNA発現ベクターでノックダウンすることにより、癌化を全くおこさず正常な動脈の新生が可能であることをマウスを用いた動物実験で示した。また、siRNAの標的細胞は線維芽細胞等のキャリヤー細胞であることを明らかにした。このことは、患者から採取した線維芽細胞等のキャリヤー細胞を培養・増殖させ、ex vivoで合成siRNAを導入後、患部に自家移植することにより、新しい動脈を発生させうる可能性を強く示すものである。siRNAを導入した患者から採取した細胞（siRNA処理血管新生誘導細胞）を患部に戻す自家移植法を行えば、siRNA薬開発のボトルネックであるキャリアー開発は不要となる。【０１５５】
治療法の開発を目指す閉塞性動脈硬化症、心筋梗塞、脳梗塞などの疾患は、生活習慣病の増加に伴い、今後、益々患者数の増加が見込まれ、新生血管を構築することにより治癒が期待される疾患である。また、肝硬変における肝実質細胞への血流再開や神経筋変性疾患の際の血管造成による筋肉再生にも応用が期待できる。一方、胎生幹細胞（ES細胞）や間質幹細胞を用いた再生医療においても、再構築された組織への血液循環を確保する上で、血管新生は不可欠である。【０１５６】
本発明においては、Int6に対する合成siRNAで処理した患者自身の線維芽細胞等のキャリヤー細胞（siRNA処理血管新生誘導細胞）を自家移植することにより、閉塞性動脈硬化症、心筋梗塞、脳梗塞の治療、肝臓再生など再生医療に応用可能な新生血管バイパス治療法を提供する。本発明の新生血管バイパス治療法の一例として、該方法の基本概念図を図９に示す。【０１５７】
本願の実施例で示すように、本発明者らは、Int6の発現若しくは機能を阻害する物質が、動脈性血管新生を効果的に上昇させること、および、動物実験レベルで確認することを実証した。とりわけ、Int6遺伝子の特異的発現抑制効果が期待されるsiRNAは、転写制御因子の発現抑制により、血管疾患に対して治療効果を有する遺伝子群の発現を亢進させるという、全く新しいコンセプトの血管疾患治療薬となることが大いに期待される。従来の血管新生を目的とした遺伝子治療が、目的遺伝子のみを強制的に発現させていたのに対し、本コンセプトのsiRNA薬（血管新生誘導siRNA薬）は、標的遺伝子の発現を特異的に抑制することにより血管新生に必須な目的遺伝子群の発現を全体的に上昇させることが可能であることから、高い治療効果が得られることが期待される。【０１５８】
本発明の動物実験の結果の詳細な検討から、血管新生誘導siRNAは繊維芽細胞において効果を発現している可能性が示唆された。このことは、繊維芽細胞においてInt6遺伝子の発現を特異的に抑制することにより、血管新生に効果的な低酸素ストレス応答遺伝子群を網羅的に発現する、全く新しいコンセプトの「siRNA処理血管新生誘導細胞」として利用できる可能性を示している（図１０）。繊維芽細胞は患者自身から入手し、増殖させた後、自家移植が容易であることから、「siRNA処理血管新生誘導細胞」移植時の拒絶反応等の可能性は低いと予想される。【０１５９】
線維芽細胞等のキャリヤー細胞の自家移植に関しては、既に人工皮膚として利用されている実績があり、その際のプロトコールに従って「siRNA処理血管新生誘導細胞」の調製が可能であると考えられる。具体的には、患者自身のウイルス検査陰性の皮膚小片から線維芽細胞等のキャリヤー細胞を採取し、大量培養してマスターセルとワーキングセルを作成する。このマスターセルについては、再度ウイルス検査を行い陰性であることを確認した後、ワーキングセルを順次解凍して継代培養して「siRNA処理血管新生誘導細胞」用のキャリヤー細胞を調製する。調製の際、マイコプラズマ検査ならびに細菌・真菌検査を行い陰性であることを確認することが必要となる。調製した「siRNA処理血管新生誘導細胞」用のキャリヤー細胞は凍結保存し、必要に応じて供給が可能である。【０１６０】
さらに、血管新生誘導性siRNAの患者由来繊維芽細胞への導入を、ex vivoでのエレクトロポレーション法等を介して行うことにより、高い導入効率が達成可能である。この方法は、目的遺伝子発現ベクターにより移植用の細胞を調製する方法（遺伝子治療法）と比較して、siRNAによる一過性の「siRNA処理血管新生誘導細胞」化であるため、遺伝子改変による細胞の癌化等の可能性が低く、極めて安全性の高い方法であると言える。同時に、従来のsiRNA薬開発において問題といわれていた特殊なデリバリーシステムを必要としない。【０１６１】
また、本発明の「siRNA処理血管新生誘導細胞」におけるキャリヤー細胞は、患者からの採取および増幅が容易である。また骨髄単核球細胞移植においては、血管新生効果を発揮する本体である血管内皮前駆細胞が血流を通じて供給されるため、著しく血流が停滞した部分には効果が発揮しにくいことが予想される。また、本実用化研究における「siRNA処理血管新生誘導細胞」は、直接注射により任意の部位に移植することが可能であるため、血流の停滞部位にも効果が期待される。加えて、血流停滞部では低酸素状態になっており、この低酸素状態がさらに「siRNA処理血管新生誘導細胞」の内因性HIF2α活性を上昇させることが期待でき、相乗的な効果を得られる可能性が考えられる。【０１６２】
本発明によってInt6が、創薬のための好適なターゲット分子となることが見出された。本発明によって見出された各種知見は、低酸素ストレス応答のメカニズムの解明のための学術的な知見としても非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図３】
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【図４】
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【図８】
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【図９】
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【図１４】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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