(57)【要約】ヒトステロイドスルファターゼ（Ｓｔｅｒｏｉｄ  ｓｕｌｆａｔａｓｅ；以下、ＳＴＳと略記する）と特異的に結合する抗体が求められている。  本発明により、ヒトＳＴＳと特異的に結合し、ヒトＳＴＳ以外のアリルサルファターゼに結合しない抗体または抗体断片、該抗体を生産するハイブリドーマが提供される。また、本発明は、該抗体または抗体断片を用いる、ヒトＳＴＳの免疫学的検出方法または免疫学的定量方法、ヒトＳＴＳの免疫学的検出用試薬またはキットおよび免疫学的定量用試薬またはキットさらには、ヒトＳＴＳ関連疾患を判定、ヒトＳＴＳ関連疾患の治療に適する薬剤の選択およびヒトＳＴＳ関連疾患の病態を判定するための、該抗体または抗体断片を用いる、ヒトＳＴＳの免疫学的検出方法または免疫学的定量方法、ヒトＳＴＳの免疫学的検出用試薬またはキットおよび免疫学的定量用試薬またはキットが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトステロイドスルファターゼ（以下、ＳＴＳと略記する）と特異的に結合し、ヒトＳＴＳ以外のアリルスルファターゼに結合しない抗体または抗体断片。
【請求項２】
ヒトＳＴＳ以外のアリルスルファターゼが、アリルスルファターゼＡ、アリルスルファターゼＢ、アリルスルファターゼＤ、アリルスルファターゼＥまたはアリルスルファターゼＦである請求項１記載の抗体または抗体断片。
【請求項３】
抗体が、モノクローナル抗体である請求項１または２に記載の抗体または抗体断片。
【請求項４】
モノクローナル抗体が、ハイブリドーマＫＭ１０５３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００１５）から生産されるモノクローナル抗体が結合するエピトープと結合するモノクローナル抗体である請求項３に記載のモノクローナル抗体または抗体断片。
【請求項５】
ハイブリドーマＫＭ１０５３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００１５）から生産される請求項３に記載のモノクローナル抗体または抗体断片。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または抗体断片を生産するハイブリドーマ。
【請求項７】
ハイブリドーマが、ハイブリドーマＫＭ１０５３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００１５）である請求項６に記載のハイブリドーマ。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を用いることを特徴とする、検体中のヒトＳＴＳの免疫学的検出方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を用いることを特徴とする、検体中のヒトＳＴＳの免疫学的定量方法。
【請求項１０】
免疫学的定量方法が、酵素免疫測定法である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
検体が、ヒト由来の生体試料である請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を用いて検体中のヒトＳＴＳを免疫学的に検出または定量し、ヒトＳＴＳ関連疾患を判定するための、検体中のヒトＳＴＳの免疫学的検出方法または免疫学的定量方法。
【請求項１３】
ヒトＳＴＳ関連疾患が、ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患である請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾患から選ばれる疾患である請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を用いて、検体中のヒトＳＴＳを免疫学的に検出または定量し、検出または定量結果よりヒトＳＴＳ関連疾患の治療に適する薬剤を選択するための、検体中のヒトＳＴＳの免疫学的検出方法または免疫学的定量方法。
【請求項１６】
ヒトＳＴＳ関連疾患が、ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾患から選ばれる疾患である請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ヒトＳＴＳ関連疾患の治療に適する薬剤がホルモン療法剤またはＳＴＳ阻害剤である請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を用いて、検体中のヒトＳＴＳを免疫学的に検出または定量し、検出または定量結果よりヒトＳＴＳ関連疾患の病態を判定するための、ヒトＳＴＳの免疫学的検出方法または免疫学的定量方法。
【請求項２０】
ヒトＳＴＳ関連疾患が、ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾患から選ばれる疾患である請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を含有することを特徴とする、検体中のヒトＳＴＳの免疫学的検出用試薬またはキット。
【請求項２３】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を含有することを特徴とする、検体中のヒトＳＴＳの免疫学的定量用試薬またはキット。
【請求項２４】
免疫学的定量が、酵素免疫測定法を用いる定量である請求項２３に記載の試薬またはキット。
【請求項２５】
検体が、ヒト由来の生体試料である請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の試薬またはキット。
【請求項２６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を含有することを特徴とする、ヒトＳＴＳ関連疾患判定用試薬またはキット。
【請求項２７】
ヒトＳＴＳ関連疾患が、ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患である請求項２６に記載の試薬またはキット。
【請求項２８】
ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾患から選ばれる疾患である請求項２７記載の試薬またはキット。
【請求項２９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を含有することを特徴とする、ヒトＳＴＳ関連疾患の治療に適する薬剤選択用試薬またはキット。
【請求項３０】
ヒトＳＴＳ関連疾患が、ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患である請求項２９に記載の試薬またはキット。
【請求項３１】
ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾患から選ばれる疾患である請求項３０記載の試薬またはキット。
【請求項３２】
ヒトＳＴＳ関連疾患治療に適する薬剤が、ホルモン療法剤またはＳＴＳ阻害剤である請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の試薬またはキット。
【請求項３３】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を含有することを特徴とする、ヒトＳＴＳ関連疾患の病態判定用試薬またはキット。
【請求項３４】
ヒトＳＴＳ関連疾患が、ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患である請求項３３に記載の試薬またはキット。
【請求項３５】
ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患が、悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾患から選ばれる疾患である請求項３４記載の試薬またはキット。
【請求項３６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を含有することを特徴とする、ヒトＳＴＳ関連疾患の診断薬。
【請求項３７】
ヒトＳＴＳ関連疾患が、ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患である請求項３６に記載の診断薬。
【請求項３８】
ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾患から選ばれる疾患である請求項３７に記載の診断薬。
【請求項３９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を含有することを特徴とする、ヒトＳＴＳ関連疾患の病態の診断薬。
【請求項４０】
ヒトＳＴＳ関連疾患が、ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患である請求項３９に記載の診断薬。
【請求項４１】
ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾患から選ばれる疾患である請求項４０に記載の診断薬。
【請求項４２】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を用いて、検体中のヒトＳＴＳを免疫学的に検出または定量し、検出または定量結果よりヒトＳＴＳ関連疾患を診断する方法。
【請求項４３】
ヒトＳＴＳ関連疾患が、ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患である請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾患から選ばれる疾患である請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を用いて、検体中のヒトＳＴＳを免疫学的に検出または定量し、検出または定量結果よりヒトＳＴＳ関連疾患の治療に適する薬剤を選択する方法。
【請求項４６】
ヒトＳＴＳ関連疾患が、ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患である請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾患から選ばれる疾患である請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ヒトＳＴＳ関連疾患の治療に適する薬剤がホルモン療法剤またはＳＴＳ阻害剤である請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を用いて、検体中のヒトＳＴＳを免疫学的に検出または定量し、検出または定量結果よりヒトＳＴＳ関連疾患の病態を診断する方法。
【請求項５０】
ヒトＳＴＳ関連疾患が、ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患である請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾患から選ばれる疾患である請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
請求項２２〜４１のいずれか１項に記載の試薬、キットまたは診断薬を製造するための請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片の使用。
【請求項５３】
請求項６または７に記載のハイブリドーマを培地に培養し、培養物中に請求項３〜５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または抗体断片を生成蓄積させ、培養物から抗体または抗体断片を採取することを特徴とする請求項３〜５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または抗体断片の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ヒトステロイドスサファターゼ（Ｓｔｅｒｏｉｄ  ｓｕｌｆａｔａｓｅ；以下、ＳＴＳと略記する）と特異的に結合し、ヒトＳＴＳ以外のアリルサルファターゼ（以下、ＡＲＳと略記する）に結合しない抗体または抗体断片、該抗体を生産するハイブリドーマに関する。また、本発明は、該抗体または抗体断片を用いる、ヒトＳＴＳの免疫学的検出方法または免疫学的定量方法、ヒトＳＴＳの免疫学的検出用試薬またはキットおよび免疫学的定量用試薬またはキット、さらには、ヒトＳＴＳ関連疾患を判定、ヒトＳＴＳ関連疾患の治療に適する薬剤の選択およびヒトＳＴＳ関連疾患の病態の判定のための、該抗体または抗体断片を用いる、ヒトＳＴＳの免疫学的検出方法または免疫学的定量方法、ヒトＳＴＳの免疫学的検出用試薬またはキットおよび免疫学的定量用試薬またはキットに関する。
【背景技術】
【０００２】  ステロイドサルファターゼ（ＳＴＳ）（Ｅ．Ｃ．３．１．６．２．）は３β−ステロイド硫酸を脱硫酸化する酵素である。表皮上層において角質の正常な剥離に必須な、コレステロール硫酸からコレステロールへの変換は、ＳＴＳにより触媒されており、ＳＴＳの先天的欠損は魚鱗症を惹起する（非特許文献１）。また、ＳＴＳは生体内において、エストロゲンの前駆体であるエストロン硫酸からエストロンへの変換を触媒する（非特許文献２）。生成したエストロンはさらにデヒドロゲナーゼの働き活性化ホルモンであるエストラジオールに変換される。エストラジオールはエストロゲンの一種である。【０００３】  乳癌、卵巣癌および子宮癌の一部はその発生と増殖にエストロゲンが深く関与するホルモン依存性腫瘍である。乳癌や子宮体癌組織ではエストロゲン／エストロン硫酸の比、あるいはＳＴＳの酵素活性が正常組織に比べ有意に高い（非特許文献３、非特許文献４）。また、ＳＴＳに対する抗体を用いた解析により、ホルモン依存性腫瘍でのＳＴＳは蛋白質レベルで発現亢進している。【０００４】  抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体を用いた免疫組織染色により、乳癌組織では、周囲の正常組織に比べＳＴＳの発現が亢進していることが知られている（非特許文献５）。また、抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体を用いて１１３例の浸潤性乳管癌患者の癌部の免疫組織染色を行った結果、７４．３％がＳＴＳ陽性であり、さらにＳＴＳの発現が腫瘍の大きさ、再発リスクおよび予後の不良と正の相関を示した（非特許文献６）。【０００５】  乳癌はその発生部位によって、乳管癌、小葉癌、パジェット病に大きく分類できる。乳管内のみにある癌を非浸潤性癌と呼び、間質に浸潤しているものを浸潤性癌と呼ぶ。
子宮体癌は子宮体部の内膜にできる癌であるが、近年日本人において増加傾向が見られる。子宮体癌細胞において、ＳＴＳ活性の存在が確認されている（非特許文献８）。
子宮内膜症とは、子宮内膜に類似した組織が、子宮内腔以外の場所に異所性に存在する類腫瘍性の良性疾患である。子宮内膜はエストロゲンによって増殖するので、子宮内膜症ではエストロゲンによって増生する。子宮腺筋症とは、子宮内膜症の亜型で、子宮内膜が子宮筋層内に侵入したものである。２１例の子宮腺筋症患者のうち、その７８％の腺筋組織にＳＴＳの発現が認められ、ＳＴＳの発現は腺上皮細胞に限局していた（非特許文献７）。一方、正常子宮組織においては、内膜基底層の腺上皮細胞にＳＴＳの発現が認められたことから、内膜基底層および腺筋組織がＳＴＳによって産生されたエストロゲンの供給原となっていると考えられる。【０００６】  ＳＴＳの発現を調べる方法としては、酵素活性測定方法（非特許文献４）、ｍＲＮＡ量の定量などの方法（非特許文献９）、または抗体を用いた検出方法および定量方法（非特許文献５、６）が知られている。
ヒトＳＴＳに対する抗体としては、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の報告されている（非特許文献６、１０）。【０００７】  ＳＴＳはＡＲＳファミリーに属する蛋白質である。現在までにＡＲＳ  Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆの６種類のＡＲＳが知られており、ヒトＳＴＳはＡＲＳ  Ｃと同一の蛋白質である。
【非特許文献１】ＬａｎｃｅｔＩ，７０（１９７８）
【非特許文献２】Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，９０，３９０（１９７２）
【非特許文献３】Ｊ．ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３３，１０４９（１９８９）
【非特許文献４】Ａｓｉａ−Ｏｃｅａｎｉａ，Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．，１５，１０１（１９８９）
【非特許文献５】Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ，６，３３１（１９９９）
【非特許文献６】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６３，２７６（２００３）
【非特許文献７】Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ＆  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ，９８，８１５（２００１）
【非特許文献８】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，６５，１６４（１９８７）
【非特許文献９】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５９，３７７（１９９９）
【非特許文献１０】Ｃｅｌｌ，４９，４４３（１９８７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】  本発明の目的は、ヒトＳＴＳと特異的に結合し、ヒトＳＴＳ以外のＡＲＳに結合しない抗体または抗体断片、該抗体を生産するハイブリドーマを提供することにある。また、本発明の目的は、該抗体または抗体断片を用いる、ヒトＳＴＳの免疫学的検出方法または免疫学的定量方法、ヒトＳＴＳの免疫学的検出用試薬またはキットおよび免疫学的定量用試薬またはキット、さらには、ヒトＳＴＳ関連疾患を判定、ヒトＳＴＳ関連疾患の治療に適する薬剤の選択およびヒトＳＴＳ関連疾患の病態の判定のための、該抗体または抗体断片を用いる、ヒトＳＴＳの免疫学的検出方法または免疫学的定量方法、ヒトＳＴＳの免疫学的検出用試薬またはキットおよび免疫学的定量用試薬またはキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】  本発明は以下の（１）〜（５３）に関する。
（１）ヒトステロイドスルファターゼ（以下、ＳＴＳと略記する）と特異的に結合し、ヒトＳＴＳ以外のアリルスルファターゼに結合しない抗体または抗体断片。
（２）ヒトＳＴＳ以外のアリルスルファターゼが、アリルスルファターゼＡ、アリルスルファターゼＢ、アリルスルファターゼＤ、アリルスルファターゼＥまたはアリルスルファターゼＦである（１）に記載の抗体または抗体断片。
（３）抗体が、モノクローナル抗体である（１）または（２）に記載の抗体または抗体断片。【００１０】（４）モノクローナル抗体が、ハイブリドーマＫＭ１０５３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００１５）から生産されるモノクローナル抗体が結合するエピトープと結合するモノクローナル抗体である（３）に記載のモノクローナル抗体または抗体断片。
（５）ハイブリドーマＫＭ１０５３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００１５）から生産される（３）に記載のモノクローナル抗体または抗体断片。
（６）（３）〜（５）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または抗体断片を生産するハイブリドーマ。
（７）ハイブリドーマが、ハイブリドーマＫＭ１０５３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００１５）である（６）に記載のハイブリドーマ。【００１１】（８）（１）〜（５）のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を用いることを特徴とする、検体中のヒトＳＴＳの免疫学的検出方法。
（９）（１）〜（５）のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を用いることを特徴とする、検体中のヒトＳＴＳの免疫学的定量方法。
（１０）免疫学的定量方法が、酵素免疫測定法である（９）に記載の方法。
（１１）検体が、ヒト由来の生体試料である（８）〜（１０）のいずれか１項に記載の方法。【００１２】（１２）（１）〜（５）のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を用いて検体中のヒトＳＴＳを免疫学的に検出または定量し、ヒトＳＴＳ関連疾患を判定するための、検体中のヒトＳＴＳの免疫学的検出方法または免疫学的定量方法。
（１３）ヒトＳＴＳ関連疾患が、ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患である（１２）に記載の方法。
（１４）ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾患から選ばれる疾患である（１３）に記載の方法。
（１５）（１）〜（５）のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を用いて、検体中のヒトＳＴＳを免疫学的に検出または定量し、検出または定量結果よりヒトＳＴＳ関連疾患の治療に適する薬剤を選択するための、検体中のヒトＳＴＳの免疫学的検出方法または免疫学的定量方法。【００１３】（１６）ヒトＳＴＳ関連疾患が、ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患である（１５）に記載の方法。
（１７）ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾患から選ばれる疾患である（１６）に記載の方法。
（１８）ヒトＳＴＳ関連疾患の治療に適する薬剤がホルモン療法剤またはＳＴＳ阻害剤である（１５）〜（１７）のいずれか１項に記載の方法。
（１９）（１）〜（５）のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を用いて、検体中のヒトＳＴＳを免疫学的に検出または定量し、検出または定量結果よりヒトＳＴＳ関連疾患の病態を判定するための、ヒトＳＴＳの免疫学的検出方法または免疫学的定量方法。
（２０）ヒトＳＴＳ関連疾患が、ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患である（１９）に記載の方法。【００１４】（２１）ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾患から選ばれる疾患である（２０）に記載の方法。
（２２）（１）〜（５）のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を含有することを特徴とする、検体中のヒトＳＴＳの免疫学的検出用試薬またはキット。
（２３）（１）〜（５）のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を含有することを特徴とする、検体中のヒトＳＴＳの免疫学的定量用試薬またはキット。
（２４）免疫学的定量が、酵素免疫測定法を用いる定量である（２３）に記載の試薬またはキット。【００１５】（２５）検体が、ヒト由来の生体試料である（２２）〜（２４）のいずれか１項に記載の試薬またはキット。
（２６）（１）〜（５）のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を含有することを特徴とする、ヒトＳＴＳ関連疾患判定用試薬またはキット。
（２７）ヒトＳＴＳ関連疾患が、ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患である（２６）に記載の試薬またはキット。【００１６】（２８）ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾患から選ばれる疾患である（２７）に記載の試薬またはキット。
（２９）（１）〜（５）のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を含有することを特徴とする、ヒトＳＴＳ関連疾患の治療に適する薬剤選択用試薬またはキット。
（３０）ヒトＳＴＳ関連疾患が、ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患である（２９）に記載の試薬またはキット。【００１７】（３１）ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾患から選ばれる疾患である（３０）に記載の試薬またはキット。
（３２）ヒトＳＴＳ関連疾患治療に適する薬剤が、ホルモン療法剤またはＳＴＳ阻害剤である（２９）〜（３１）のいずれか１項に記載の試薬またはキット。
（３３）（１）〜（５）のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を含有することを特徴とする、ヒトＳＴＳ関連疾患の病態判定用試薬またはキット。
（３４）ヒトＳＴＳ関連疾患が、ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患である（３３）に記載の試薬またはキット。【００１８】（３５）ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患が、悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾患から選ばれる疾患である（３４）に記載の試薬またはキット。
（３６）（１）〜（５）のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を含有することを特徴とする、ヒトＳＴＳ関連疾患の診断薬。
（３７）ヒトＳＴＳ関連疾患が、ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患である（３６）に記載の診断薬。【００１９】（３８）ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾患から選ばれる疾患である（３７）に記載の診断薬。
（３９）（１）〜（５）のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を含有することを特徴とする、ヒトＳＴＳ関連疾患の病態の診断薬。
（４０）ヒトＳＴＳ関連疾患が、ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患である（３９）に記載の診断薬。【００２０】（４１）ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾患から選ばれる疾患である（４０）に記載の診断薬。
（４２）（１）〜（５）のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を用いて、検体中のヒトＳＴＳを免疫学的に検出または定量し、検出または定量結果よりヒトＳＴＳ関連疾患を診断する方法。
（４３）ヒトＳＴＳ関連疾患が、ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患である（４２）に記載の方法。【００２１】（４４）ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾患から選ばれる疾患である（４３）に記載の方法。
（４５）（１）〜（５）のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を用いて、検体中のヒトＳＴＳを免疫学的に検出または定量し、検出または定量結果よりヒトＳＴＳ関連疾患の治療に適する薬剤を選択する方法。
（４６）ヒトＳＴＳ関連疾患が、ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患である（４５）に記載の方法。【００２２】（４７）ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾患から選ばれる疾患である（４６）に記載の方法。
（４８）ヒトＳＴＳ関連疾患の治療に適する薬剤がホルモン療法剤またはＳＴＳ阻害剤である（４５）〜（４７）のいずれか１項に記載の方法。
（４９）（１）〜（５）のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を用いて、検体中のヒトＳＴＳを免疫学的に検出または定量し、検出または定量結果よりヒトＳＴＳ関連疾患の病態を診断する方法。
（５０）ヒトＳＴＳ関連疾患が、ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患である（４９）に記載の方法。【００２３】（５１）ヒトＳＴＳが関与するエストロゲン依存性疾患が悪性腫瘍、良性腫瘍および皮膚疾患から選ばれる疾患である（５０）に記載の方法。
（５２）（２２）〜（４１）のいずれか１項に記載の試薬、キットまたは診断薬を製造するための（１）〜（５）のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片の使用。
（５３）（６）または（７）に記載のハイブリドーマを培地に培養し、培養物中に（３）〜（５）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または抗体断片を生成蓄積させ、培養物から抗体または抗体断片を採取することを特徴とする（３）〜（５）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または抗体断片の製造方法。【００２４】  以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００４年１２月２日に出願された日本国特許出願２００４−３５０２４６号の優先権を主張するものであり、当該特許出願の明細書および図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１には、抗原として用いたヒト胎盤から精製したヒトＳＴＳのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動のクマシーブリリアント染色像を示した。左のレーンはヒト胎盤から精製したヒトＳＴＳを、右のレーンは分子量マーカーを示す。精製したヒトＳＴＳは矢印で示す。
【図２】図２には、モノクローナル抗体の、バインディングＥＬＩＳＡにおけるヒト胎盤由来精製ヒトＳＴＳに対する反応性を示した。左右のカラムはそれぞれ抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０４９および抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３での反応性を示す。縦軸は４１５ｎｍでの吸光度を示す。黒塗りのカラムは、抗原としてヒト胎盤から精製したヒトＳＴＳを、白抜きのカラムはＢＳＡを固相化した場合の結果を示す。
【００２６】
【図３】図３には、ウェスタンブロッティングでの抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０４９および抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３のヒト胎盤由来精製ヒトＳＴＳおよび大腸菌発現ヒトＳＴＳとの反応性をそれぞれ示した。レーン１は大腸菌発現のヒトＳＴＳを、レーン２はヒト胎盤由来精製ヒトＳＴＳをそれぞれ示す。
【図４】図４には、ヒトＳＴＳ遺伝子導入細胞のＡＲＳ活性を示した。縦軸は単位蛋白質量当たりの酵素活性を示す。ｃＤＮＡ３−１はヒトＳＴＳ遺伝子が含まれていないプラスミドを導入したコントロール細胞の、ｃｓ３−１はヒトＳＴＳ遺伝子を導入した細胞の活性をそれぞれ示す。
【００２７】
【図５】図５には、免疫沈降法でのモノクローナル抗体とヒトＳＴＳ遺伝子を導入した細胞ｃｓ３−１細胞由来のヒトＳＴＳとの反応性を示す。レーン１は、陰性対照であるモノクローナル抗体ＫＭ１０６３で、レーン２は抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３で、レーン３は抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０４９で免疫沈降を行った結果をそれぞれ示す。
【図６】図６には、免疫細胞染色（フローサイトメトリー）でのモノクローナル抗体とヒトＳＴＳ遺伝子導入細胞との反応性を示した。白抜きのクロマトグラムは陰性対照であるモノクローナル抗体ＫＭ１０６３を、黒塗りのクロマトグラムは抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３を用いた場合の結果を示す。ＡにはヒトＳＴＳ遺伝子が含まれていないプラスミドを導入したコントロール細胞ｃＤＮＡ３−１細胞での、ＢにはヒトＳＴＳ遺伝子を導入した細胞ｃｓ３−１細胞での結果を示した。
【００２８】
【図７】図７には、各種ＡＲＳ遺伝子導入細胞のＡＲＳ活性を示した。いずれの図も縦軸は細胞当たりのＡＲＳ活性を示す。いずれの図も左のカラムは陰性対照の各種ＡＲＳ遺伝子を導入していない細胞のＡＲＳ活性を、右のカラムは各種ＡＲＳ遺伝子を導入した細胞のＡＲＳ活性をそれぞれ示す。ＡにはＡＲＳ  Ａ遺伝子導入細胞の、ＢにはＡＲＳ  Ｂ遺伝子導入細胞の、ＣにはＡＲＳ  Ｄ遺伝子導入細胞の、ＤにはＡＲＳ  Ｅ遺伝子導入細胞の、ＥにはＡＲＳ  Ｆ遺伝子導入細胞の結果を示す。
【図８】図８には、ウェスタンブロッティングでの、モノクローナル抗体ＫＭ１０４９との各種ＡＲＳ遺伝子導入細胞由来のＡＲＳとの反応性を示す。レーン１はＡＲＳ  Ａ、レーン２はＡＲＳ  Ｂ、レーン３はＡＲＳ  Ｃ、レーン４はＡＲＳ  Ｄ、レーン５はＡＲＳ  Ｅ、レーン６はＡＲＳ  Ｆをそれぞれ示す。
【００２９】
【図９】図９には、免疫沈降での、抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３の各種ＡＲＳ遺伝子導入細胞由来ヒトＳＴＳとの反応性を示した。レーン１はＡＲＳ  Ａ、レーン２はＡＲＳ  Ｂ、レーン３はＡＲＳ  Ｃ、レーン４はＡＲＳ  Ｄ、レーン５はＡＲＳ  Ｅ、レーン６はＡＲＳ  Ｆをそれぞれ示す。
【図１０】図１０は、バインディングＥＬＩＳＡでの抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０４９および抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３の各種ＡＲＳとの反応性を示した。Ａは、抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０４９を用いた結果を、Ｂは、抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３を用いた結果をそれぞれ示す。縦軸は４１５ｎｍの吸光度を、横軸は抗体濃度をそれそれ示す。●は動物細胞発現精製ＡＲＳ  Ｃを、破線の▲はＡＲＳ  Ａを、■はＡＲＳ  Ｂをそれぞれ示す。
【００３０】
【図１１】図１１には、抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３とビオチン化抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０４９を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによる動物細胞由来精製ヒトＳＴＳの検量曲線を示した。横軸は蛋白質濃度、縦軸は４１５ｎｍの吸光度をそれぞれ示す。●は動物細胞発現精製ヒトＳＴＳを、破線の△は陰性対照である組換え精製ＩＬ−１βをそれぞれ示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】  本発明は、ヒトＳＴＳに特異的に結合し、ヒトＳＴＳ以外のＡＲＳに結合しない抗体に関する。
ヒトＳＴＳ以外のＡＲＳとしては、ＡＲＳのＡ、Ｂ、Ｄ、ＥおよびＦがあげられる。本発明のヒトＳＴＳと特異的に結合し、ヒトＳＴＳ以外のＡＲＳに結合しない抗体としては、ヒトＳＴＳ（ＡＲＳ  Ｃ）に特異的に結合し、ＡＲＳのＡ、Ｂ、Ｄ、ＥおよびＦには結合しない抗体などがあげられる。【００３２】  本発明の抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体などがあげられるが、好ましくはモノクローナル抗体があげられる。
ポリクローナル抗体としては、免疫を施された動物の抗血清、または該抗血清から精製されたポリクローナル抗体をあげることができる。本発明のポリクローナル抗体としては、ヒトＳＴＳと特異的に結合し、ＳＴＳ以外のＡＲＳに交叉反応性を示さないポリクローナル抗体であればいかなるものも包含されるが、具体的には、ヒト以外の哺乳動物にヒトＳＴＳを免疫して、その動物の血清を採取し、ヒトＳＴＳ以外のＡＲＳであるＡＲＳのＡ、Ｂ、Ｄ、ＥおよびＦに反応性を示す画分を除去した画分を公知のアフィニティー精製法により、調製したポリクローナル抗体などがあげられる。ヒト以外の哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリなどがあげられる。【００３３】  モノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより生産された抗体または抗体断片、あるいは抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝子組換え抗体または抗体断片をあげることができる。
本発明のモノクローナル抗体の具体例としては、ハイブリドーマ細胞株ＫＭ１０５３が生産する抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３をあげることができる。ハイブリドーマ細胞株ＫＭ１０５３は平成１６年４月２７日付でブタペスト条約に基づき独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−１００１５として寄託されている。【００３４】  また、本発明のモノクローナル抗体としては、上記のハイブリドーマ細胞株ＫＭ１０５３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００１５）により生産されるモノクローナル抗体が結合するエピトープと同一のエピトープに結合するモノクローナル抗体なども包含される。
遺伝子組換え抗体は、上記本発明のモノクローナル抗体を遺伝子組換え技術を用いて改変したものである。遺伝子組換え抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体または抗体断片など、遺伝子組換えにより製造される抗体などがあげられる。本発明の遺伝子組換え抗体をしては、遺伝子組換え抗体において、モノクローナル抗体の特徴を保持している抗体があげられる。【００３５】  ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体の抗体重鎖（以下、Ｈ鎖と表記する）Ｖ領域（以下、抗体重鎖可変領域をＶＨと表記する）、および抗体軽鎖（Ｌ鎖と表記する）Ｖ領域（以下、抗体可変領域軽鎖をＶＬと表記する）と、ヒト抗体の重鎖定常領域（以下、ＣＨと表記する）またはヒト抗体の軽鎖定常領域（以下、ＣＬと表記する）とからなる抗体を意味する。【００３６】  本発明のヒト型キメラ抗体は、本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマから、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターに挿入したヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ製造することができる。
本発明のヒト型キメラ抗体の構造としては、いずれのイムノグロブリン（Ｉｇ）クラスに属するものでもよいが、ＩｇＧ型、さらにはＩｇＧ型に属するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などのイムノグロブリンのＣ領域が好ましい。【００３７】  ヒト化抗体は、ヒト型相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ；以下、ＣＤＲと表記する）移植抗体または新形態抗体（ｒｅｓｈａｐｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）などとも呼ばれる。
ヒト化抗体は、本発明のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列で任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列をそれぞれ置換したＶ領域をコードする遺伝子を構築し、ヒト抗体のＣＨおよびヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ導入し、発現させることにより製造することができる。【００３８】  本発明のヒト化抗体のＣ領域の構造としては、いずれのイムノグロブリン（Ｉｇ）クラスに属するものでもよいが、ＩｇＧ型、さらにはＩｇＧ型に属するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などのイムノグロブリンのＣ領域が好ましい。
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体を意味するが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリー、およびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体なども包含する。【００３９】  ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト抗体を産生するヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルスなどを感染させて不死化、単一クローン化することにより、該抗体を産生するリンパ球を抗体再生細胞として培養することができ、培養物中より該抗体を精製することができる。
ヒト抗体ファージライブラリーは、Ｂ細胞またはリンパ球などのヒト抗体産生細胞から調製した抗体ｃＤＮＡをファージベクター中に挿入することにより、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなどの抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーのことをいう。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、さらに遺伝子工学的手法を用いて、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子に変換することも可能である。【００４０】  ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子がゲノム内に組み込まれた動物を意味する。具体的には、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞を他のマウス初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニック動物を創製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイブリドーマを取得し、培養することで培養物中より該抗体を精製することができる。【００４１】  本発明の抗体断片としては、抗体を適当なペプチダーゼで消化して得られる抗体断片または遺伝子組換えにより作製される抗体断片があげられる。抗体断片は、Ｆａｂ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（Ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ；以下、ｓｃＦｖと称す）［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３（１９８８）］、２量体化可変領域（Ｄｉａｂｏｄｙとも称す）［Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，６２９（１９９７）］、およびジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｆｖ；以下、ｄｓＦｖと称す）［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２，２４９（１９９５）］などが包含される。また、抗体断片としては、上記ＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を含むペプチド（以下、ＣＤＲを含むペプチドと表記する）［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，２９６６（１９９６）］も包含する。あるいは、ＶＨとＶＬをジスルフィド結合によって一体化せず、それぞれ別の分子（それぞれＶＨ分子、ＶＬ分子として表記する）として発現させたもの［Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４，１７１４（１９９６）］も抗体断片として包含する。【００４２】  Ｆａｂは、ＩｇＧのヒンジ領域で２本のＨ鎖を架橋している２つのジスルフィド結合の上部のペプチド部分を酵素パパインで切断して得られるＨ鎖のＮ末端側半分と、Ｌ鎖全体で構成される分子量約３万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂは、本発明のモノクローナル抗体を酵素パパインで処理して取得することができる。または、該抗体のＦａｂ断片をコードするＤＮＡを原核生物発現ベクターあるいは真核生物発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物に導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することができる。【００４３】  Ｆａｂ’は、下記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ間のジスルフィド結合を切断して得られる分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂ’は、本発明のモノクローナル抗体のＦ（ａｂ’）２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。また、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物発現ベクターあるいは真核生物発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物に導入することにより発現させ、Ｆａｂ’を製造することもできる。【００４４】  Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧのヒンジ領域の２対のジスルフィド結合の下部を酵素トリプシンで処理して得ることができる、２つのＦａｂ領域がヒンジ部分で結合した分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦ（ａｂ’）２は、本発明のモノクローナル抗体を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のＦ（ａｂ’）２断片をコードするＤＮＡを原核生物発現ベクターあるいは真核生物発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物に導入することにより発現させ、Ｆ（ａｂ’）２を製造することができる。【００４５】  ｓｃＦｖは、一本のＶＨと一本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと表記する）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドに示される。本発明で使用されるｓｃＦｖに含まれるＶＨおよびＶＬは、本発明のモノクローナル抗体のいずれのものも用いることができる。
本発明のｓｃＦＶは、本発明のモノクローナル抗体から、ＶＨならびにＶＬをｃＤＮＡを取得し、該抗体のｓｃＦｖ断片をコードするＤＮＡを原核生物発現ベクターあるいは真核生物発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物に導入することにより発現させ、ｓｃＦｖを製造することができる。【００４６】  Ｄｉａｂｏｄｙは、抗原結合特異性の同じまたは異なるｓｃＦｖが２量体を形成した抗体断片で、同じ抗原に対する２価の抗原結合活性、または異なる抗原に対する２特異的な抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＤｉａｂｏｄｙは、本発明のモノクローナル抗体から、ＶＨならびにＶＬをｃＤＮＡを取得し、該抗体のＤｉａｂｏｄｙ断片をコードするＤＮＡを原核生物発現ベクターあるいは真核生物発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物に導入することにより発現させ、Ｄｉａｂｏｄｙを製造することができる。【００４７】  ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドをジスルフィド結合により結合させたものである。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらに示された方法［Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４）］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明のｄｓＦｖに含まれるＶＨならびにＶＬは、本発明のモノクローナル抗体のいずれのものも用いることができる。【００４８】  本発明のｄｓＦｖは、本発明のモノクローナル抗体から、ＶＨならびにＶＬをｃＤＮＡを取得し、該抗体のｄｓＦｖ断片をコードするＤＮＡを原核生物発現ベクターあるいは真核生物発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物に導入することにより発現させ、ｄｓＦｖを製造することができる。
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることによって製造することができる。【００４９】  ＶＨ分子とＶＬ分子は、本発明のモノクローナル抗体の生産ハイブリドーマから調製されたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＶＨまたはＶＬを含む遺伝子断片をそれぞれ、ＰＣＲなどの方法でクローニングし、これを適当な発現ベクターと宿主の組み合わせで発現することによって製造することができる。ヒトＳＴＳ分子との親和性のよい分子を得るために、該発現ベクターをファージ発現ベクター、宿主を大腸菌とすることも好ましい態様と言える。ＶＨ分子とＶＬ分子を所望の蛋白質との融合蛋白質として発現し製造することもできる。【００５０】  本発明のＣＤＲを含むペプチドは、本発明のモノクローナル抗体から、ＶＨならびにＶＬをｃＤＮＡを取得し、該抗体のＣＤＲを含むペプチドをコードするＤＮＡを原核生物発現ベクターあるいは真核生物発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物に導入することにより発現させ、ＣＤＲを含むペプチドを製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法よって製造することもできる。【００５１】  本発明のモノクローナル抗体または抗体断片は、該抗体または抗体断片に放射性同位元素、蛋白質、または薬剤などを化学的に、あるいは遺伝子工学的に導入または結合させた抗体の誘導体を包含する。
本発明の抗体の誘導体は、本発明のモノクローナル抗体または抗体断片のＨ鎖あるいはＬ鎖の、Ｎ末端側あるいはＣ末端側、さらには抗体あるいは抗体断片中の適当な置換基あるいは側鎖、さらには抗体または抗体断片中の糖鎖に放射性同位元素、蛋白質、または薬剤などを化学的に結合させることにより製造することができる［抗体工学入門、金光修著、（株）地人書館（１９９４）］。【００５２】  または、抗ヒトＳＴＳ抗体または抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたい蛋白質をコードするＤＮＡを連結させたＤＮＡを原核生物発現ベクターあるいは真核生物発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物に導入することにより発現させて遺伝子工学的に製造することができる。
薬剤としては、放射線同位元素、蛋白質、低分子などいかなるものでもよい。【００５３】  本発明の抗体の誘導体を検出方法、定量方法、検出試薬、定量試薬または診断薬として使用する場合の薬剤としては、通常の免疫学的測定法で用いられる標識体があげられる。標識体としては、放射性同位元素、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼなどの酵素、アクリジニウムエステル、ロフィンなどの発光物質、フルオレッセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、ローダミンイソチオシアナート（ＲＩＴＣ）などの蛍光物質などがあげられる。また、薬剤として、ビオチンなどの物質も標識体として用いることが可能である。該物質は、放射性同位元素、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼなどの酵素、アクリジニウムエステル、ロフィンなどの発光物質、ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣなどの蛍光物質などが結合された、例えばアビジンなどの、該物質に特異的かつ高親和性をもって結合しうる２次標識物質を使用可能せしめる物質である。【００５４】  また、本発明は上記の本発明の抗体または抗体断片を用いる検体中のヒトＳＴＳを、免疫学的検出方法または免疫学的定量方法に関する。免疫学的検出方法または免疫学的定量方法としては、蛍光抗体法、免疫酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）などの免疫学的測定法、免疫細胞染色法、免疫組織染色法などの免疫化学染色法、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法［単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）、続生化学実験講座５免疫生化学研究法、東京化学同人（１９８６）］などがあげられる。【００５５】  免疫学的測定法としては、任意の公知の免疫学的測定方法があげられる。
上述のように、免疫学的測定法は標識方法の違いにより、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、発光免疫測定法（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、物理化学的検出法（ＴＩＡ、ＬＡＰＩＡ、ＰＣＩＡ）などがあげられるが、好ましくは酵素免疫測定法があげられる。【００５６】  酵素免疫測定法で用いる標識体としては、任意の公知（石川榮次ら編、酵素免疫測定法、医学書院）の酵素を用いることができる。例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼなどを用いることができる。
発光免疫測定法で用いる標識体としては、任意の公知［今井一洋編、生物発光と化学発光、廣川書店；臨床検査４２（１９９８）］の発光物質を用いることができる。例えば、アクリジニウムおよびその誘導体、ルテニウム錯体化合物、ロフィンなどを用いることができる。ルテニウム錯体化合物としては、例えばＣｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７，１５３４（１９９１）などに記載されたものが好ましい。該化合物は電子供与体と共に電気化学的に発光する。【００５７】  蛍光免疫測定法で用いる標識体としては、任意の公知（川生明著、蛍光抗体法、ソフトサイエンス社製）の蛍光物質を用いることができる。例えば、ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣなどを用いることができる。その他の蛍光物質として、例えばｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１，２０１６（１９９８）］があげられる。または、フィコエリスリンなどのフィコビリ蛋白質、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）あるいはこれの類縁蛋白質のように蛍光を発する蛋白質であってもよい。【００５８】  免疫学的測定法とは、上述した各種標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体量または抗原量を測定する方法である。本発明の免疫学的測定法としては、抗原の検出または測定を行う方法であればいかなる方法でもよい。例えば、競合法、サンドイッチ法［免疫学イラストレイテッド  第５版、南光堂］があげられるが、サンドイッチ法が好ましい。
サンドイッチ法は、固相に第一の抗体を結合させた後、測定したい抗原をトラップさせ、標識した第二の抗体を反応させる方法である。サンドイッチ法に用いる抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれを用いてもよく、上述したＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２などの抗体断片を用いてもよい。サンドイッチ法で用いる２種類の抗体の組み合わせとしては、異なるエピトープを認識する抗体あるいは抗体断片の組み合わせでもよいし、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体あるいは抗体断片の組み合わせでもよい。具体的には、本発明のモノクローナル抗体の一例である抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３および公知の抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０４９［Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６３，２７６２（２００３）］の組み合わせなどがあげられる。【００５９】  蛍光抗体法とは、ヒトＳＴＳを含むと考えられる検体に、本発明の抗体または抗体断片を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質でラベルした抗マウスイムノグロブリン（Ｉｇ）抗体またはイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体あるいは抗体断片を反応させた後、蛍光色素をフローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡などで測定する方法である。該方法は、蛍光物質で直接的に本発明の抗体または抗体断片を標識した誘導体も使用可能であり、また、ビオチンなどで該抗体または抗体断片で標識した誘導体を反応せしめ、次にまたは同時に、蛍光物質で標識された２次標識物質を反応させた後、蛍光色素をフローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡などで測定する方法であってもよい。【００６０】  蛍光物質の代わりにアクリジニウムエステル、ロフィンなどの発光物質を使用して上記の方法を実施することも可能である。この場合、測定器は発光測定器を用いることができる。
免疫酵素抗体法とは、ヒトＳＴＳを含むと考えられる検体に、本発明の抗体または抗体断片を反応させ、さらにペルオキシダーゼなどの酵素標識を施した抗マウスＩｇ抗体またはＩｇＧ抗体あるいは抗体断片を反応させた後、酵素の基質が酵素反応の結果色原体を生ずる物質であった場合には、その色素呈色反応を吸光光度計などで測定する方法である。該方法は、酵素で直接的に本発明の抗体または抗体断片を標識した誘導体も使用可能であり、また、ビオチンなどで該抗体または抗体断片で標識した誘導体を反応せしめ、次にまたは同時に、酵素で標識された２次標識物質を反応させた後、色素呈色反応を吸光光度計などで測定する方法であってもよい。【００６１】  また、酵素の基質が酵素反応の結果、化学発光を呈する物質であった場合には、該発光を発光測定器で測定することも可能である。酵素により化学発光を呈する化合物としては、パーオキシダーゼの基質として、例えばルミノール化合物、ルシゲニン化合物などがあげられる。あるいはアルカリフォスファターゼの基質として、例えば３−（２’−ａｄａｍａｎｔｙｌ）−４−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−（３”−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ−１，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ塩、アクリジニウムのリン酸誘導体であるＡＰＳ２，ＡＰＳ３，ＡＰＳ５など［以上Ｌｕｍｉｇｅｎ  Ｉｎｃの発光化合物、Ｈ．Ａｋｈａｖａｎ−Ｔａｆｔｉ，Ｚ．Ａｒｇｈａｖａｎｉ  ｅｔ  ａｌ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，４９７（１９９７）］があげられる。あるいはルシフェラーゼの基質としてルシフェリン、セレンテラジンなどがあげられる。【００６２】  放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）とは、ヒトＳＴＳを含むと考えられる検体に、本発明の抗体または抗体断片を反応させ、さらに放射性物質標識を施した抗マウスＩｇ抗体またはＩｇＧ抗体あるいは抗体断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する方法である。該方法は、放射性物質で直接的に本発明の抗体または抗体断片を標識した誘導体も使用可能であり、また、ビオチンなどで該抗体または抗体断片で標識した誘導体を反応せしめ、次にまたは同時に、放射性物質で標識された２次標識物質をを反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する方法であってもよい。【００６３】  免疫化学染色法とは、ヒトＳＴＳまたはヒトＳＴＳを発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞に、本発明の抗体を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した本発明の抗体あるいは抗体断片を反応させた後、顕微鏡またはフローサイトメトリーなどを用いて観察する方法である。
免疫細胞染色法は、ヒトまたは動物の生体組織などから採取した細胞または微生物、ヒトまたは動物あるいは昆虫などに由来する培養細胞などに、本発明の抗体または抗体断片を結合させた後、フローサイトメトリーなど単一細胞の抗体の結合量または結合状態を解析する手技を用いて、ヒトＳＴＳの発現を解析する方法である。免疫細胞染色法は、上記の細胞をスライドガラス上に直接固着またはスライドガラス上で培養した後、本発明の抗体または抗体断片を反応させた後、該細胞に含まれるヒトＳＴＳの発現を顕微鏡またはカメラなどを用いて観察または定量する方法も包含する。また、免疫細胞染色法は、上記の細胞を固定液を用いて固定化した後または固定化せず、アガロースなどにて凝塊を作製し、その後、該凝塊を凍結またはパラフィンへ包埋し、該組織片を切片へスライスし、該切片をガラスなどのスライドガラスに固着せしめ、上記と同様の処置によってヒトＳＴＳの発現を顕微鏡またはカメラなどを用いて観察または定量する方法であってもよい。【００６４】  免疫組織染色法は、ヒトまたは動物の生体組織から採取した組織片などを、ホルマリンやエタノールなどの固定液を用いて固定化した後または固定せず、該組織片を凍結またはパラフィンへ包埋し、該組織片から組織切片を調製し、該組織切片をガラスなどのスライドガラスに固着せしめ、脱パラフィンなどの不要物を除く処理、さらに必要に応じて抗原と抗体の反応性を向上させる処理を施した後、本発明の抗体または抗体断片で反応させた後、組織切片に含まれるヒトＳＴＳの発現を顕微鏡またはカメラなどを用いて観察または定量する方法である。【００６５】  上記免疫染色法において、蛍光物質、発光物質、酵素、放射性物質標識抗体を用いた免疫染色法が可能であり、それぞれの標識に適した上述の免疫学的測定法と同様の手技によって検出または測定が可能である。
ウェスタンブロッティング法とは、ヒトＳＴＳまたはヒトＳＴＳを発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞などの細胞抽出液などをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］で分画した後、分画した蛋白質群をゲルからＰＶＤＦ膜あるいはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に本発明の抗体または抗体断片を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した、本発明の抗体に結合できる二次抗体抗体または抗体断片を反応させた後、確認する方法である。【００６６】  ドットブロッティング法とは、ヒトＳＴＳまたはヒトＳＴＳを発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞の細胞抽出液などをニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に本発明の抗体を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した、本発明の抗体に結合できる二次抗体抗体または抗体断片を反応させた後、確認する方法である。【００６７】  免疫沈降法とは、ヒトＳＴＳまたはヒトＳＴＳを発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞の細胞抽出液を本発明の抗体または抗体断片と反応させた後、プロテインＧ−セファロースなどのイムノグロブリンに特異的な結合能を有する担体を加えて抗原抗体複合体を沈降させる方法である。
以下に、本発明の抗体の作製方法、並びに該抗体の利用方法を詳細に説明する。
１．本発明の抗体の作製【００６８】  本発明の抗体は例えば、以下のようにして作製することができる。
（１）抗原の調製
ヒトＳＴＳをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などに導入して組換えヒトＳＴＳを得る。免疫原である組換え蛋白質のＣ末又はＮ末にタグ蛋白質を融合させた融合蛋白質を免疫原として用いることもできる。ここで、「タグ蛋白質」とは、目的蛋白質のアフィニティー精製により分離を容易に行うためやその他、目的蛋白質の挙動を追跡するためなどの目的で、所望の蛋白質の末端に余分に付加する蛋白質をいう。タグ蛋白質としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、プロテインＡ、β−ガラクトシダーゼ、マルトース−バインディングプロテイン（ＭＢＰ）などがあげられる。あるいは、胎盤などのＳＴＳを多量に発現しているヒト組織からヒトＳＴＳを精製し、抗原に用いることもできる。また、ヒトＳＴＳ部分配列を有する合成ペプチドを抗原に用いることもできる。【００６９】  例えば、ヒト胎盤組織からのヒトＳＴＳの精製は以下のように行う。操作は全て４℃で行う。胎盤組織は細断後バッファーＡ［０．２５ｍｏｌ／Ｌサッカロース、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡで含む、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７．０）］中でホモジネートを調製する。１００００×ｇで２０分間遠心分離して得られた上清を、さらに１０５０００×ｇで１時間遠心分離して得られた沈殿をミクロソーム画分とする。得られたミクロソーム画分はバッファーＢ［１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、１ｍｍｏｌ／Ｌジチオエリスレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｅｒｙｔｈｒｅｉｔｏｌ；ＤＴＥ）、０．０５％フェニルメチルスルフォニルフルオロイド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ；ＰＭＳＦ）、０．５％トリトンＸ−１００を含む１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）］を加えて室温１時間攪拌し、可溶化する。１０５０００×ｇで１時間遠心分離して不溶性画分を除く。得られた上清をバッファーＢ（ｐＨ８．０）で平衡化したＰＢＥ９４カラムに通塔し、２倍容量の同バッファーにて洗浄後、バッファーＣ［１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＥ、０．０５％ＰＭＳＦ、０．５％トリトンＸ−１００を含む、１２．５％ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒ７４（ｐＨ４．０）］で溶出する。さらに溶出画分はバッファーＢで平衡化したフェニルセファロースカラムに通塔し、充分量の同バッファーで洗浄後１．２５％トリトンＸ−１００を加えた同バッファーで溶出し、溶出画分を精製ヒトＳＴＳとして用いる。この様にして得られたヒトＳＴＳは、以下の抗体産生細胞を作製する際の抗原としての使用できる以外に、ヒトＳＴＳの検出方法または定量方法において、標準物質として使用することもできる。【００７０】（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
３〜２０週令のマウス、ラットまたはハムスターに上記（１）に記載の方法で調製した抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。
免疫は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント〔例えば、フロインドの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ）や水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とともに抗原を投与することにより行う。抗原が部分ペプチドである場合には、ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略記する）やキーホーリンプトヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ；以下、ＫＬＨと略記する）などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。【００７１】  抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに５〜１０回行う。各投与後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が抗原と反応することを酵素免疫測定法〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）〕などで調べる。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示したマウス、ラットまたはハムスターを抗体産生細胞の供給源とする。【００７２】  抗体産生細胞と骨髄腫細胞の融合に供するにあたって、抗原の最終投与後３〜７日目に、免疫したマウス、ラットまたはハムスターより脾臓などを摘出し、脾細胞を採取する。脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去し、ＭＥＭ培地で３回洗浄して抗体産生細胞として提供する。【００７３】（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）［Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１８，１（１９７８）］、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４１（ＮＳ−１）［Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１（１９７６）］、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４（ＳＰ−２）［Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３，１５４８（１９７９）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７，１９７５）などが用いられる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍＬ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）を加えた培地（以下、正常培地という。）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍＬ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０７個以上の細胞数を確保する。【００７４】（４）細胞融合
上記（２）で免疫した抗体産生細胞と上記（３）で得られた骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇ、ＭＥＭ  ２ｍＬおよびジメチルスルホキシド０．７ｍＬの混液を１０８個の抗体産生細胞当たり０．２〜１ｍＬを加え、１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにする。遠心分離（９００ｒｐｍ、５分間）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかに細胞をＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（１０−４ｍｏｌ／Ｌ）、チミジン（１．５×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）およびアミノプテリン（４×１０−７ｍｏｌ／Ｌ）を加えた培地〕１００ｍＬ中に懸濁する。この懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μＬ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。【００７５】  培養後、培養上清の一部をとり後述（６）の酵素免疫測定法などにより、ヒトＳＴＳに結合し、ヒトＳＴＳを含まない抗原およびＳＴＳ以外のＡＲＳに結合しないものを選択する。ついで、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものを抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。【００７６】（５）モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（４）で得られた抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞２×１０６〜５×１０７細胞／匹を腹腔内注射する。１０〜２１日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分間）して固形分を除去後、４０〜５０％硫酸アンモニウムで塩析した後、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラムあるいはゲル濾過カラムによる精製を行ない、ＩｇＧあるいは、ＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋白質量の定量は、ローリー法または２８０ｎｍでの吸光度より算出する。【００７７】（６）酵素免疫測定法（バインディングＥＬＩＳＡ）
抗原としては、精製された組換えヒトＳＴＳ、ヒト胎盤などから得られた精製ヒトＳＴＳあるいはヒトＳＴＳ部分ペプチドを用いる。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡやＫＬＨなどのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製して、これを用いる。【００７８】  これらを９６穴のＥＩＡ用プレートに１〜５０μｇ／ｍＬで１０〜１００μＬ／穴ずつ分注し、４℃で一晩放置してプレートにコートする。次いで、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳと記す）を１００〜２００μＬ／穴分注し、室温で１〜２時間または、４℃で１〜２晩放置して、プレート上に残った蛋白質との結合残基をブロック（ブロッキング）する。その後、ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、ＰＢＳでよく洗浄した後、第一抗体として被免疫動物血清、本発明のモノクローナル抗体のハイブリドーマ培養上清もしくは精製抗体１〜１０μｇ／ｍＬを２０〜１００μＬ／穴で分注し、室温で２〜３時間または、４℃で一晩放置する。ＰＢＳまたは、０．０５％トゥイーン２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと記す）で、よく洗浄した後、第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物などで標識した抗イムノグロブリン抗体１〜５０μｇ／ｍＬを５０〜１００μＬ／穴ずつ分注し、室温１〜２時間反応させる。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳでよく洗浄した後、第二抗体の標識物質に応じた反応を行う。【００７９】２．本発明の抗体の利用
本発明の抗体は、免疫学的手法を用いて、検体中に含まれるヒトＳＴＳまたはヒトＳＴＳを発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞などを検出または定量することができる。免疫学的手法としては、任意の公知の免疫学的測定法などが用いられるが、本発明の免疫学的測定法としては、ウェスタンブロッティング、免疫沈降法、免疫細胞染色、免疫組織染色またはサンドイッチＥＬＩＳＡ法などが好適に用いられる。【００８０】  検体としては、例えばヒト由来の生体試料、ヒトＳＴＳを発現すると考えられる微生物、動物あるいは昆虫などに由来する細胞または組織などがあげられるが、ヒト由来の生体試料が好ましい。
ヒト由来の生体試料としては、ヒトＳＴＳが関連する疾患に羅患したことが疑われるヒト個体から採取した生体試料などがあげられる。生体試料としては、具体的には、疾患部位の組織または細胞、あるいは疾患部位から遊離し血液やリンパ液、腹腔液、乳汁、子宮粘液、尿、汗などの体液に含まれる組織または細胞も包含される。さらに、上記組織または細胞中から遊離したＳＴＳを含む上記体液も包含される。また、生体試料としては、ヒト腫瘍培養細胞、ヒトＳＴＳが関連する疾患に羅患したことが疑われるヒト個体から採取した組織または細胞および該組織または該細胞より調製した抽出液なども包含される。また、これらのヒト個体から採取した生体試料を加工処理したサンプルも生体試料として使用してもよい。加工処理としては、例えば希釈、濃縮、抽出、病理切片作製上の処理などがあげられる。病理切片作製上の処理としては、例えばホルマリン固定、切出し、包埋、薄切、伸展などの一連の処理があげられる。【００８１】  上記組織または細胞の採取方法としては、穿刺吸引細胞診、針生検（マンモトーム）、外科生検、乳頭分泌液細胞診（乳汁細胞診）、乳管内視鏡による細胞採取などがあげられる。
血液、リンパ液、腹腔液、乳汁、子宮粘液、尿、汗などの体液サンプルは、遠心分離またはフィルター処理などにより、血漿または血清などの液体画分と細胞などの固体画分を分画してから使用することが望ましい。この場合、分画した液体画分と固体画分を生体試料として、用いることもできる。組織または細胞は、疾患部位から直接採取することが望ましいが、疾患部位から遊離した生体試料であっても本発明の検体として用いることができる。疾患部位としては、例えば、ＳＴＳが関連する疾患が転移性の癌である場合には、原発巣であっても、転移巣であってもよい。【００８２】  上記の組織または細胞などから、抽出液を調製する方法としては、採取した組織または細胞を液体とともに激しく攪拌する方法、酸またはアルカリで細胞膜を破壊する方法、界面活性剤で細胞膜を破壊する方法、超音波で破砕する方法、低張液で細胞を破壊する方法、凍結および融解を繰り返す方法などによって組織または細胞を破壊し細胞質を得る方法があげられる。上記方法で細胞を破壊後、遠心操作などによって抽出液から破壊されていない細胞片などを取り除く操作を行うことが望ましい。
以下に、具体的にヒトＳＴＳまたはヒトＳＴＳを発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞などを検出または定量する方法について記載する。【００８３】（１）ウェスタンブロッティング法
本発明の抗体を用い、ヒトＳＴＳをウェスタンブロッティングにより検出するには、以下のように行うことができる。
抗原としては大腸菌などで発現した組換えヒトＳＴＳを用いるか（１〜１０μｇ／レーン）、あるいはヒト胎盤組織、各種ヒト腫瘍培養細胞またはバイオプシーなどにより患者より採取した細胞から調製した細胞溶解液（５×１０６〜５×１０７細胞／ｍＬ）を用いる（１０〜５０μｇ／レーン）。ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８〕にて分画後、ＰＶＤＦ膜あるいはニトロセルロース膜にブロッティングする。ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキング後、本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマの培養上清もしくは精製した本発明のモノクローナル抗体１〜１０μｇ／ｍＬを室温で２時間または４℃で一晩反応させる。ＰＢＳまたはＴｗｅｅｎ−ＰＢＳでよく洗浄した後、第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物などで標識した抗イムノグロブリン抗体１〜５０μｇ／ｍＬを室温１〜２時間反応させる。よく洗浄した後、第二抗体の標識物質に応じた反応を行ない、ヒトＳＴＳと特異的に結合し、ＳＴＳ以外のＡＲＳに結合しない抗体がヒトＳＴＳのアミノ酸配列より予測される分子量の蛋白質と反応し、ヒトＳＴＳを含まない抗原およびＳＴＳ以外のＡＲＳとは反応しないことを確認する。【００８４】（２）免疫沈降法
本発明の抗体を用いた免疫沈降は以下の方法で行うことができる。
抗原としては大腸菌などで発現した組換えヒトＳＴＳを用いるか（１〜１０μｇ／レーン）、あるいはヒト胎盤組織、各種ヒト腫瘍培養細胞またはバイオプシーなどにより患者より採取した細胞から調製した細胞溶解液（５×１０６〜５×１０７細胞／ｍＬ）を用いる（１０〜５０μｇ／レーン）。【００８５】  上記のように調製したサンプルに本発明の抗体（１〜１０μｇ／反応）を加え、４℃で１時間反応させる。そこにさらにプロテインＧ−セファロースなどイムノグロブリンに特異的な結合能を有する担体を５〜２０μＬ加え４℃、１時間反応させた後、遠心分離し沈殿画分を得る。沈殿画分は細胞抽出バッファーにて数回洗浄後、免液沈降物として、ウェスタンブロッティングに供する。【００８６】  あるいは以下のような方法によっても行うことができる。すなわち、ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートに本発明の抗体を固相化した後、ＢＳＡ−ＰＢＳによりブロッキングする。抗体がモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清である場合には、ハイブリドーマの調製に用いた抗体産生細胞の動物のイムノグロブリンに結合する抗体またはプロテインＡあるいはプロテインＧなどをあらかじめＥＬＩＳＡ用９６穴プレートに固相化しＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングした後、ハイブリドーマ株培養上清を分注して結合させる。ＢＳＡ−ＰＢＳを捨てＰＢＳで洗浄した後、上記のように調製したサンプルを２０〜１００μＬ／穴で分注し、室温で２時間または４℃で一晩反応させる。細胞抽出バッファーまたはＴｗｅｅｎ−ＰＢＳでよく洗浄した後のプレートの各ウェルに残存するサンプルを上記のウェスタンブロッティングに供し、免疫沈降されたヒトＳＴＳの検出または定量を行う。【００８７】（３）免疫細胞染色法
本発明の抗体を用い、以下のようにして、ヒトＳＴＳの免疫細胞染色により検出することができる。
各種ヒト腫瘍細胞は、浮遊細胞はＰＢＳにて洗浄し、付着細胞はトリプシン、ＥＤＴＡなどで浮遊化させた後ＰＢＳで洗浄する。またバイオプシーなどにより患者より採取した細胞魂はコラゲナーゼなどで処理した後、ＰＢＳで洗浄する。これらの細胞は抗体の通過性を良くするため界面活性剤やメタノールなどで処理する。正常ヒト血清などを用いてブロッキングした後１×１０５〜１×１０６細胞／チューブで分注し、本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマの培養上清もしくは精製した本発明のモノクローナル抗体１〜１０μｇ／ｍＬを室温で３０分間反応させる。洗浄後、蛍光色素で標識した抗イムノグロブリン抗体１〜５０μｇ／ｍＬを１００〜５００μＬ／チューブずつ分注し、室温３０分間遮光反応させる。よく洗浄した後、グリセリンで封入し蛍光顕微鏡にて顕鏡するか、あるいはフローサイトメトリーにて解析する。【００８８】（４）免疫組織染色法
本発明の抗体を用い、以下のようにして、ヒトＳＴＳを免疫組織染色により検出または定量することができる。
ヒト組織の採取については、手術時あるいはバイオプシーなどによって得られる病変部位など目的とする組織を含む組織を採取する方法などがあげられる。採取した組織はそのまま検体として使用することができる。
検体は、採取後、適当な方法により切片を作製して抗体との反応に供する。また、必要に応じて抗原の賦活化、内因性物質の阻止反応などの操作を加えて行ってもよい。【００８９】  切片を作製する方法としては、未固定で凍結し、凍結切片を作製後、固定する方法、固定後凍結し、凍結切片を作製する方法および固定後にパラフィンなどに包埋し、切片を作製する方法などがあげられる。
未固定で凍結し、凍結切片を作製後、固定する方法としては、組織を細切した後、ＯＣＴコンパウンドなどの凍結包埋剤に入れてドライアイス・アセトンなどにて急速に凍結し、アセトンを風乾後、切片を作製し、下記の固定液を用いて固定する方法などが用いられる。直ちに切片を作製しない場合には、アセトン風乾後、密封して凍結細胞塊としてディープフリーザー中で保管することができる。【００９０】  固定後凍結し、凍結切片を作製する方法としては、組織を細切した後、下記の固定液を用いて固定し、例えばＰＢＳまたは１０〜２０％のショ糖を含むＰＢＳなどで洗浄し、ＯＣＴコンパウンドなどの凍結包埋剤に入れてドライアイス・アセトンなどにて急速に凍結し、アセトンを風乾後、切片を作製する方法などが用いられる。直ちに切片を作製しない場合には、アセトン風乾後、密封して凍結細胞塊としてディープフリーザー中で保管することができる。【００９１】  固定後にパラフィンなどに包埋し、切片を作製する方法としては、組織を細切し、下記の固定液により固定した後、エタノール、キシレンなどで脱水、透徹し、パラフィン包埋して、パラフィンブロックを作製し、パラフィンブロックから切片を作製する方法などが用いられる。直ちに切片を作製しない場合には、パラフィンブロックとして保管することができる。【００９２】  固定方法としては、浸漬固定、注入固定、脱気固定、凍結置換固定、凍結乾燥固定などがあげられる。浸漬固定の場合の固定時間は、半日〜１週間が好ましいが、一般的には１〜２日間がより好ましい。また、マイクロウェーブや家庭用電子レンジを利用することで固定時間を数時間に短縮することもできる。
切片を作製する方法としては、凍結切片の場合にはクリオスタットを用いる方法が、またはパラフィン切片の場合にはミクロトームを用いる方法があげられる。【００９３】  固定液としては、アルデヒド系を中心とした蛋白質・ペプチド鎖に架橋形成を生じさせるアルデヒド系固定液および蛋白質の凝固沈殿を基本とする有機溶剤系固定液などがあげられる。アルデヒド系固定液としては例えば、１０〜２０％の非緩衝ホルマリン、１０％緩衝ホルマリン、緩衝４％パラホルムアルデヒド、ＰＬＰ（ｐｅｒｉｏｄａｔｅ−ｌｙｓｉｎｅ−ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）、ザンボニ液、ブアン液（飽和ピクリン酸：ホルマリン原液：氷酢酸＝１５：５：１）、グルタールアルデヒドなどがあげられる。有機溶剤系固定液として例えば、エタノール、アセトン、カルノア液（エタノール：クロロホルム：氷酢酸＝６：３：１）、メタカン液（メタノール：クロロホルム：氷酢酸＝６：３：１）などがあげられる。また、別の固定液（「改訂四版  渡辺・中根  酵素抗体法」、名倉宏、長村義之、堤寛  編集  学際企画株式会社出版）として、カルボジイミド固定液、パラベンゾキノン液、アクロレイン液、昇汞加ホルマリン系固定液、ホルマリン・エタノール混合液（ホルマリン原液：１００％エタノール：水＝１：８：１）、酢酸エタノール・ホルマリン混合液（ホルマリン原液：氷酢酸：エタノール＝２：１：１７）なども用いられる。【００９４】  ヒトまたは動物の生体組織などから採取した血液細胞や微生物、ヒトまたは動物あるいは昆虫などの培養細胞などについては、それが浮遊細胞の場合には、サイトスピンを用いてスライドガラスへ貼付する方法、遠心分離によって細胞をペレット化した後、凝塊を作らせ、該凝塊から上記方法に従って切片を作製することができる。凝塊を作らせる方法としては、アガロースに封入する方法あるいはフィブリノーゲン次いでトロンビンを添加して人工的なフィブリン塊を作らせる方法などがあげられる。【００９５】  酵素標識抗体法を用いる切片の染色は、例えば、以下の方法で行うことができる。
凍結切片の場合には、切片を適切な洗浄液で洗浄後、内因性物質の活性阻止を行った後、ブロッキング液にてブロッキングを行う。ブロッキング後、酵素標識した本発明の抗体または抗体断片を希釈液で希釈した液を反応させ、後述する洗浄液で洗浄後、発色反応を行う。適宜、メチルグリーンなどで核染色を行うこともできる。あるいは、細胞像を明瞭にするためにヘマトキシリンなどで染色を行うこともできる。【００９６】  パラフィン切片の場合には、キシレン、トルエン、ベンゼンなどで脱パラフィン操作を行った後、１００％エタノール、７０％エタノールになじませた後に水洗し、内因性物質の活性阻止を行う。この場合、内因性物質の活性阻止より後の操作は、凍結切片の場合と同様に行うことができる。
また、内因性物質の活性化阻止は、本発明の抗体または抗体断片の反応後に行ってもよい。【００９７】  内因性物質の活性阻止は、例えば、下記の溶液を用いて、室温で５分〜１時間反応させることでできるが、用いる溶液や切片の種類毎の適切な反応条件で行うことが好ましい。
内因性物質としては、免疫組織染色において、作製した切片中に存在する、反応に影響を与える物質があげられ、具体的には、内因性ペルオキシダーゼ、内因性アルカリフォスファターゼおよび内因性ビオチンなどがあげられる。【００９８】  内因性ペルオキシダーゼの活性阻止のためには、０．２〜２％の過ヨウ素酸水溶液、１〜５％過酸化水素水、０．１〜０．５％過酸化水素加メタノールまたは０．１〜０．５％過酸化水素を含む０．０５〜０．２％アジ化ナトリウム水溶液などを、内因性アルカリフォスファターゼの活性阻止のためには、レバミゾールの希釈液などを用いて切片を処理する方法が用いられる。内因性ビオチンの活性阻止の場合には、０．０１〜０．１％のアビジン水溶液を反応させた後、次いで０．００１〜０．０１％のビオチン水溶液を用いて切片を処理する方法などが用いられる。【００９９】  洗浄液としては、洗浄液として用いられるものであれば、いかなるものでもよいが、ＰＢＳまたはリン酸緩衝液またはトリス塩酸緩衝液などを用いることができる。ｐＨは６．５〜７．８が好適で、７．２〜７．６がより好ましい。緩衝液の濃度は０．２〜０．００５ｍｏｌ／Ｌが好適であるが、０．１〜０．０１ｍｏｌ／Ｌがより好ましい。
ブロッキング液としては、正常動物血清、ＢＳＡ、スキムミルク、カゼイン溶液などが好適に用いられる。正常動物血清に用いられる動物としては、ヒトまたはマウス以外ではすべての動物種が使用できるが、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ブタなどが好適である。後述の酵素非標識の本発明の抗体により免疫組織染色法を行う場合には、二次抗体として用いる抗マウスＩｇまたはＩｇＧ抗体の由来の動物種と同種の正常血清を用いるのが好ましい。使用する際の血清の濃度は０．１〜２０％の範囲で任意に選べるが、１〜５％が好適である。ブロッキング温度は４℃〜３７℃の範囲で自由に設定できる。ブロッキング時間は反応温度にしたがって適切に設定できるが、室温の場合には１０分〜１時間が好ましい。【０１００】  抗体の希釈液としては、希釈液として用いられるものであれば、いかなるものでもよいが、ＢＳＡを含むＰＢＳが好適に用いられる。ＢＳＡの濃度は０．１〜５％が好ましい。さらに、界面活性剤を添加することできる。添加する界面活性剤の種類としては、トライトンＸ−１００、ツイーン２０などが用いることができる。界面活性剤の濃度は０．００５〜０．５％が好ましく、０．０１〜０．２％がより好ましい。【０１０１】  酵素標識した本発明の抗体または抗体断片を反応させる場合には、抗体濃度は０．３３〜３０μｇ／ｍＬで反応させるのが好適であるが、１〜２５μｇ／ｍＬがより好ましく、４〜１６μｇ／ｍＬが特に好ましい。反応温度は抗体の反応性が変化しない範囲であればよく、４℃〜３７℃の範囲で自由に設定することができる。反応時間は反応温度にしたがって設定することができ、例えば、反応温度が４℃の場合には反応時間は１時間以上であり、反応温度が室温の場合には反応時間は１０分〜８時間が好ましい。【０１０２】  発色反応液としては、ペルオキシダーゼを標識酵素とする場合には、３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＤＡＢ）液、３−アミノ−９−エチルカルバゾール溶液および４−クロロ−１−ナフトールなどを用いることができる。ＤＡＢ液は使用時に過酸化水素水を添加して使用することが望ましい。ＤＡＢ液を用いる発色反応の増感剤として、イミダゾールを添加してもよい。
アルカリフォスファターゼを標識酵素とする場合には、ファストレッドまたはファストレッドバイオレットまたはファストブルーの各塩を発色剤とすることもができ、また、ニューフクシン液（Ｍｅｒｃｋ社製）あるいはＢＣＩＰ／ＮＢＴ液（Ｓｉｇｍａ社製）を利用することもできる。【０１０３】  グルコースオキシダーゼを標識酵素とする場合には、例えばグルコース、ｐｈｅｎａｚｉｎｅｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ（ＰＭＳ）および色原体を含む混合液が用いられる。色原体としてはＰＭＳによって還元されて不溶性の色素を生じるものであればいかなる色原体であってもよいが、例えば、ＮＢＴ、ＴＮＢＴ、ＢＳＰＴ、ＩＮＴ（いずれもＰｉｅｒｃｅ社製）などのテトラゾリウム塩などがあげられる。この場合の発色反応時間としては、３０秒〜２０分間が好ましく、１〜１０分間がより好ましい。【０１０４】  上記は、酵素標識した本発明の抗体または抗体断片を用いた免疫細胞染色法の例示であるが、以下のようにして酵素非標識の本発明の抗体または抗体断片を用いることも可能である。
酵素非標識の本発明の抗体または抗体断片を上記希釈液で希釈した液を検体に反応させ、上記洗浄液などで洗浄後、本発明の抗体または抗体断片に結合できる二次抗体を反応させ、洗浄液で再び洗浄した後に、発色反応を行うことも可能である。【０１０５】  二次抗体としては、本発明の抗体または抗体断片に結合できる抗体であって、検出のために標識化されていればいかなるものでもよい。具体的には、本発明の抗体がマウスモノクローナル抗体の場合には、酵素標識抗マウスＩｇまたはＩｇＧ抗体などを用いることができる。
酵素非標識の本発明の抗体または抗体断片の反応条件および本発明の抗体または抗体断片結合できる、酵素標識した二次抗体の反応条件については、上記酵素標識した本発明の抗体または抗体断片を反応させる際の反応条件と同様である。【０１０６】  ホルマリン固定パラフィン包埋された切片では、アルデヒド固定によってしばしば抗原が隠された状態になるため抗原と抗体の接触が阻害されることがある。この場合、抗原の賦活化処理によって、染色性を向上させることが可能である。
賦活化処理としては、例えば、該切片を蛋白質分解酵素処理または加熱処理などがあげられる。蛋白質分解酵素は抗原上の抗体認識部位に対して切断活性がなければ任意のものが使用できるが、特に限定分解酵素が好ましく、例えば、トリプシン、プロナーゼ、ペプシン、アクチナーゼ、フィシン、プロテイナーゼＫ、サブチリシン、パパインなどがあげられる。【０１０７】  加熱処理としては、水または任意の緩衝液中で、マイクロウェーブ照射器、電子レンジ、オートクレーブ、圧力鍋、ウォーターバス、蒸し器、ホットプレートなどによる加熱操作をすることがあげられる。加熱処理に用いられる緩衝液としては、例えば、クエン酸緩衝液、ＥＤＴＡ溶液、水酸化ナトリウム加クエン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、炭酸緩衝液、酢酸緩衝液などを用いることができる。緩衝液の塩濃度は０．０００５〜０．２ｍｏｌ／Ｌで、好ましくは０．００１〜０．１ｍｏｌ／Ｌである。緩衝液のｐＨは５．０〜１０で、好ましくはｐＨ５．５〜９．５である。さらには、尿素水溶液、塩化アルミニウム水溶液、過ヨウ素酸水溶液なども用いることができる。これらの水溶液の濃度は、０．１〜７％が好ましく、１〜５％がより好ましい。
また、賦活化処理としては、酸またはアルカリ処理などの処理も用いることができる。アルカリ処理には、ＮａＯＨ、ＫＯＨなどが用いられ、酸処理には、塩酸、ギ酸、酢酸などが用いられる。さらに、抗原の賦活化処理には、尿素、グアニジンなどの蛋白質変性剤を用いることもできる。【０１０８】  染色強度を向上させる目的で以下の高感度染色法［「改訂四版  渡辺・中根  酵素抗体法」、名倉宏、長村義之、堤寛  編集  学際企画株式会社出版］を行ってもよい。
高感度染色法としては、ＰＡＰ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ａｎｔｉ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）法あるいはその変法としての四段階ＰＡＰ法、Ｄｏｕｂｌｅ  ｂｒｉｄｇｅ  ＰＡＰ法、Ｆａｂ  ｆｒａｇｍｅｎｔを用いるＰＡＰ法、Ｈａｐｔｅｎ  ｓａｎｄｗｉｃｈ法、アビジン・ビオチン複合体形成の原理を応用したＡＢＣ（ａｖｉｄｉｎ  ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ）法、ＬＡＢ（ｌａｂｅｌｅｄ  ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ）法、ＢＲＡＢ（ｂｒｉｄｇｅ  ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ）法、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを利用したＬＳＡＢ（ｌａｂｅｌｌｅｄ  ｓｔｒｅｐｔ  ａｖｉｄｉｎ  ｂｉｏｔｉｎ）法、ＳＡＢＣ（ｓｔｒｅｐｔ  ａｖｉｄｉｎ  ｂｉｏｔｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ）法、ビオチン化したｔｙｒａｍｉｄを使用したＣＳＡ（ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｓｉｇｎａｌ  ａｍｐｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＡＢＣ法の変法として抗アビジン抗体を用いる方法、ビオチン化プロテインＡを用いる方法、ＰＡＰ法とＡＢＣ法を組み合わせる方法、コロイド金標識抗ペルオキシダーゼ抗体によるＡＢＣ法、酵素標識プロテインＡを用いる方法、酵素標識ポリマー法、金属標識抗体を用いたイムノコロイド法などが用いられる。【０１０９】  酵素標識ポリマー法は、デキストランなどの高分子ポリマーに酵素と一次抗体、または酵素と二次抗体を結合させたものを利用する方法である。
また、高感度染色法としては、発色酵素をペルオキシダーゼの代わりにアルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどの発色酵素を利用できる。アビジン・ビオチン複合体とこれらの発色酵素の組み合わせ、ＡＰＡＡＰ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ａｎｔｉａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）法またはペルオキシダーゼ標識抗ＦＩＴＣ抗体を用いる間接法などもあげられる。【０１１０】  本発明の免疫組織染色法には、上記の原理を使用した市販のキットも利用することができる。市販のキットとしては、例えばＶｅｃｔｏｒ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ社製）、Ｓｔｒｅｐｔ  ＡＢ  Ｃｏｍｐｌｅｘ（ＤＡＫＯ社製）、ＡＢ  Ｃｏｍｐｌｅｘ（ＤＡＫＯ社製）、ＳＡＢ−ＰＯキット（ニチレイ社製）、ＳＡＢ−ＡＰキット（ニチレイ社製）、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｕｓｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＧｅｎｅｘ社製）、Ｐｏｌｙｖａｌａｎｔ染色キット（ＳｃｙＴｅｋ社製）、ＥＰＯＳ  ｓｙｓｔｅｍ（ＤＡＫＯ社製）、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＤＡＫＯ社製）、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｎｏｎ−Ｂｉｏｔｉｎ  ＨＲＰ  Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｕｓｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＧｅｎｅｘ社製）、Ｓｉｍｐｌｅ  ｓｔａｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ニチレイ社製）などがあげられる。【０１１１】  ＬＡＢ法、ＬＳＡＢ法は、例えば以下の条件により行うことができる。
本発明の抗体あるいは抗体断片の反応後または内因性物質の活性阻止の後、洗浄液で洗浄し、ビオチン標識抗マウスＩｇ抗体またはビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体を反応し、次いでアビジン標識ペルオキシダーゼまたはストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼを反応させる。ビオチン標識抗マウスＩｇ抗体またはビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体およびアビジン標識ペルオキシダーゼの反応条件については、上記の酵素標識した本発明の抗体または抗体断片の反応条件と同様である。【０１１２】  また、上記の免疫細胞染色法を行うためには、市販の自動免疫染色装置などを使用することもできる。自動免疫染色装置としては、ＨＩＳ−２０（サクラ精機社製）、ｉ６０００（協和メデックス社製）、ＳＴ５０５０（ライカ社製）、ＨＸベンチマーク（ベンタナ・ジャパン社製）、Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ（ＤＡＫＯ社製）、Ｈｏｒｉｚｏｎ（ＤＡＫＯ社製）などがあげられる。
免疫染色像の定性的または定量的判定方法としては、抗体の標識物質に応じて適した方法を利用することができる。すなわち、酵素を標識物質として選択した場合には光学顕微鏡、共焦点レーザースキャン顕微鏡などを、蛍光物質を標識物質として選択した場合には蛍光顕微鏡、共焦点レーザースキャン顕微鏡、蛍光画像解析装置などを、放射性物質の場合にはオートラジオグラフィー、放射線画像解析装置などを、発光物質の場合には発光画像解析装置などを用いることができる。【０１１３】  顕微鏡で得られた画像について、目視にて染色陽性部位の形態および濃淡を検知することができ、これによって定性的または定量的判定ができる。
あるいは、顕微鏡で得られた画像に対して、目的に合った画像処理を行い、鮮明に表現するために、デジタルカメラなどのデジタル画像入力システムを用いて画像解析装置に画像データをデジタル信号として入力することができる。画像解析装置では、染色陽性部位の面積、最短径、最長径、周長などの計測、および染色陽性部位の透過率、光学的濃度、吸光度などを計測可能で、これらの測定値に基づいた反応産物の陽性率、分布など目的に応じた定量解析ができる。【０１１４】（５）サンドイッチＥＬＩＳＡ
本発明の抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより、検体中のヒトＳＴＳは例えば、以下の方法により定量することができる。
ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートに第一の抗ヒトＳＴＳ抗体を固相化した後、ＢＳＡ−ＰＢＳによりブロッキングする。ＢＳＡ−ＰＢＳを捨てＰＢＳでよく洗浄した後、濃度既知のヒトＳＴＳ標品あるいは濃度未知の被験サンプルを加え、４℃で１晩あるいは室温２時間反応させる。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳでよく洗浄した後、固層化した第一抗体とは認識するエピトープが異なる第二の抗ヒトＳＴＳ抗体を反応させる。第二抗体はあらかじめビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物などで標識しておく。二次抗体の反応後、洗浄し、第二抗体の標識物質に応じた検出反応を行う。濃度既知のヒトＳＴＳ標準物質を段階的に希釈して作製した検量線より、被験サンプルの濃度を算出することができる。該方法に用いられる第一の抗ヒトＳＴＳ抗体と第２のヒトＳＴＳ抗体のうちのいずれか一方の抗体が本発明の抗体であれば、ＳＴＳのみを特異的に測定することができる。第一の抗ヒトＳＴＳ抗体と第２のヒトＳＴＳ抗体の、具体的な組み合わせとしては、例えば、本発明のハイブリドーマＦＥＲＭ  ＢＰ−１００１５が生産する抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３と公知の抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０４９［Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６３，２７６２（２００３）］の組み合わせなどがあげられる。【０１１５】  本発明の抗ヒトＳＴＳ抗体を含む、ヒトＳＴＳの免疫学的検出試薬または免疫学的定量試薬は、上記の２．（１）〜（５）で示された免疫学的手法を用いる検出方法または定量方法に用いられ、該方法が実施できる構成要素を含むヒトＳＴＳの検出試薬または定量試薬の各構成要素と実質的に同一、またはその一部と実質的に同一な物質が含まれていれば、構成または形態が異なっていても、本発明の試薬に包含される。【０１１６】  構成要素としては、抗ヒトＳＴＳ抗体、抗ヒトＳＴＳ抗体を固定化するための担体、抗ヒトＳＴＳ抗体が固定化された固相、検出に用いる標識された二次抗体またはその抗体断片などがあげられ、また必要に応じ、生体試料の処理試薬、生体試料の希釈液、反応緩衝液、洗浄液、標識の検出用試薬またはヒトＳＴＳの標準物質などを含む、キットの形態であってもよい。【０１１７】  また、本発明のキットまたは試薬に、測定に適した機器を組み合わせて、キットとしてもよい。
抗ヒトＳＴＳ抗体としては、ヒトＳＴＳに特異的に結合し、ＳＴＳ以外のＡＲＳに交叉反応性を示さない抗体であれば特に制限はないが、例えば本発明のハイブリドーマＦＥＲＭ  ＢＰ−１００１５が生産する抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３などが好適に用いられる。本発明に用いられる抗ヒトＳＴＳ抗体は、必要に応じて断片化した抗体断片を用いることができる。【０１１８】  抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙおよびＣＤＲを含むペプチド、ＶＨまたはその融合蛋白質、ＶＬまたはその融合蛋白質などがあげられる。
上記の抗体あるいは抗体断片は、二次抗体を用いて検出することができ、また、該抗体を標識化して直接検出することもできる。
二次抗体を用いて検出する場合の、二次抗体としては、抗体に結合できる抗体であれば、いかなる抗体でも用いることができ、該抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体よく、あるいはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙおよびＣＤＲを含むペプチドなどを用いることができる。二次抗体に用いられる抗体あるいは抗体断片は、検出のために標識化して使用される。【０１１９】  上記の抗ヒトＳＴＳ抗体あるいは抗体断片または該抗体を検出するための二次抗体あるいは抗体断片を標識する物質としては、任意の公知（石川榮次ら編、酵素免疫測定法、医学書院）の酵素、発光物質、蛍光物質あるいは放射性同位元素などを用いることができる。例えば、標識が酵素であればアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼなどを、標識が発光物質であればアクリジニウムエステル、ロフィンなどを、標識が蛍光物質であればグリーンフルオレセンスプロテイン、レッドフルオレセンスプロテイン、ＦＩＴＣなどを、放射性同位元素であれば１４Ｃ、３２Ｐ、１２５Ｉなどを用いることができる。また、ビオチン標識を用いて、標識化されたアビジンやストレプトアビジンなどを用いて検出することもできる。【０１２０】  抗体あるいは抗体断片を上記の標識により標識化する方法としては、遺伝子工学的に結合させる方法や、化学的に結合させる方法が用いられる。遺伝子工学的に結合させる方法は、文献［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，９７４（１９９６）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，７８２６（１９９６）］記載の方法に従って行うことができる。化学的に結合させる方法は、文献［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６１，２１２（１９９３）］記載の方法に従って行うことができる。また、放射性同位元素を化学的に結合させる方法は、文献［Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，３，６０（１９９０）；Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１，２００３（１９９１）］記載の方法に従って行うことができる。【０１２１】  標識量を測定する方法としては、吸光度法（比色法）、蛍光法、発光法、放射活性法などがあげられる。標識が酵素である場合、酵素の基質を当該酵素と反応させ、生成した物質を測定することにより、標識量を測定することができる。
酵素がペルオキシダーゼである場合には、例えば吸光度法、蛍光法などによりペルオキシダーゼ量を測定することができる。吸光度法によりペルオキシダーゼ量を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素および酸化発色型色原体の組み合わせとを反応させ、反応液の吸光度を分光光度計などで測定する方法などがあげられる。酸化発色型色原体としては、例えばロイコ型色原体、酸化カップリング発色型色原体などがあげられる。【０１２２】  ロイコ型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼなどの過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、ｏ−フェニレンジアミン、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム塩（ＤＡ−６４）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）などがあげられる。【０１２３】  酸化カップリング発色型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼなどの過酸化活性物質の存在下、２つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する物質である。２つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類（トリンダー試薬）との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせなどがあげられる。カプラーとしては、例えば４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラジンなどがあげられる。アニリン類としては、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−��ルホプロピル）−４−フルオロ−３，５−ジメトキシアニリン（Ｆ−ＤＡＯＳ）などがあげられる。フェノール類としては、フェノール、４−クロロフェノール、３−メチルフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）などがあげられる。【０１２４】  蛍光法によりペルオキシダーゼ量を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素および蛍光物質の組み合わせとを反応させ、生成した蛍光の強度を測定する方法などがあげられる。当該蛍光物質としては、例えば４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、クマリンなどがあげられる。【０１２５】  酵素がアルカリ性ホスファターゼである場合には、例えば発光法などによりアルカリ性ホスファターゼ量を測定することができる。発光法によりアルカリ性ホスファターゼ量を測定する方法としては、例えばアルカリ性ホスファターゼとその基質とを反応させ、生成した発光の発光強度を発光強度計などで測定する方法などがあげられる。アルカリ性ホスファターゼの基質としては、例えば３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン・二ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）、２−クロロ−５−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル｝フェニル  ホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＤＰ−ＳｔａｒＴＭ）、３−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル｝フェニル  ホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＳＰＤＴＭ）、［１０−メチル−９（１０Ｈ）−アクリジニルイデン］フェノキシメチルリン酸・二ナトリウム塩（ＬｕｍｉｇｅｎＴＭ  ＡＰＳ−５）などがあげられる。【０１２６】  酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼである場合には、例えば吸光度法（比色法）などによりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ量を測定することができる。吸光度法（比色法）によりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ量を測定する方法としては、例えばβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとその基質とを反応させ、反応液の吸光度を分光光度計などで測定する方法などがあげられる。β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としては、例えば２−クロロ−４−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトシドなどがあげられる。【０１２７】  標識が、放射性同位元素である場合、放射性同位元素の量は、放射活性をシンチレーションカウンターなどにより測定することにより決定することができる。
抗ヒトＳＴＳ抗体を固定化するための担体としては、抗体を結合させて保持できるものであればいかなるものも包含されるが、各種高分子素材を用途に合うように成形した素材が用いられる。【０１２８】  抗体などを固定化させる担体の形状としてはチューブ、ビーズ、プレート、ラテックスなどの微粒子、スティックなどが、素材としてはポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、ポリエチレンテレフタレートなどの高分子素材、ガラス、セラミックス、磁性粒子や金属などがあげられる。【０１２９】  抗体の固相化の方法としては物理的方法と化学的方法またはこれらの併用など、公知の方法が用いられる。物理的結合としては、例えば物理吸着などがあげられる。化学的結合としては、例えば共有結合、非共有結合などがあげられる。非共有結合としては、例えば静電的結合、水素結合、疎水結合、配位結合などがあげられる。例えば、ポリスチレン製９６ウェルの免疫測定用マイクロタープレートにペプチドなどを疎水固相化したものがあげられる。【０１３０】  固定化させる抗体は、直接抗体を固相に固定化してもよいし、抗体をビオチン−アビジンなどを介してから、固相に固定化してもよい。
上記の抗ヒトＳＴＳ抗体を固定化させた固相は、ブロッキングにより、担体上に残存する官能基を保護する。免疫学的測定法のブロッキングに用いられる物質としては、通常蛋白質、界面活性剤および市販のブロッキング試薬などが用いられるが、本発明のブロッキングに用いられる通常の蛋白質としては、ＢＳＡ、ＫＬＨまたはガゼインなどが用いられる。【０１３１】  生体試料の希釈液としては、界面活性剤、緩衝剤などに安定化剤を含む水溶液などがあげられる。検体として全血を用いる場合には、水性溶液は、赤血球などの血球の膨張や収縮による血清中の成分濃度の変化を防止する目的で、塩類、糖類など、緩衝剤などにより等張液に調製されたものであることが好ましい。塩類としては、特に制限はないが、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウムなどのハロゲン化アルカリ金属塩などがあげられる。糖類としては、特に制限はないが、例えば、マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコールなどがあげられる。【０１３２】  反応緩衝液としては、抗体固定化固相の抗体と生体試料中の抗原とが結合反応をすることができればいかなるものであってもよい。また、必要に応じて、界面活性剤、防腐剤、安定化剤、反応促進剤あるいは酵素活性調節剤などを添加してもよい。
洗浄液としては、通常未反応の物質を除去、洗浄でき、抗原抗体反応に影響を与えなければ、いかなるものも使用することができる。また、必要に応じて、緩衝剤、界面活性剤、ＢＳＡやカゼインなどの蛋白質、防腐剤あるいは安定化剤などを添加してもよい。例えば、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳなどが使用される。【０１３３】  検体の希釈液、反応緩衝液あるいは洗浄液などに用いられる緩衝液としては、緩衝液に用いる緩衝剤は緩衝能を有するものならば特に限定されないが、ｐＨ１〜１１の例えば乳酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤（但し、標識がアルカリ性ホスファターゼである場合を除く）、トリエタノールアミン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、グッド緩衝剤などがあげられる。グッド緩衝剤としては、例えばＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）緩衝剤、ビス−トリス［ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン］緩衝剤、ＡＤＡ［Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸］緩衝剤、ＰＩＰＥＳ［ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）］緩衝剤、ＡＣＥＳ｛２−［Ｎ−（２−アセトアミド）アミノ］エタンスルホン酸｝緩衝剤、ＭＯＰＳＯ（３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、ＢＥＳ｛２−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］エタンスルホン酸｝緩衝剤、ＭＯＰＳ（３−モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤、ＴＥＳ〈２−｛Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸〉緩衝剤、ＨＥＰＥＳ［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−スルホエチル）ピペラジン］緩衝剤、ＤＩＰＳＯ｛３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸｝緩衝剤、ＴＡＰＳＯ〈２−ヒドロキシ−３−｛［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸〉緩衝剤、ＰＯＰＳＯ［ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸）］緩衝剤、ＨＥＰＰＳＯ［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）ピペラジン］緩衝剤、ＥＰＰＳ［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（３−スルホプロピル）ピペラジン］緩衝剤、トリシン［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン］緩衝剤、ビシン［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン］緩衝剤、ＴＡＰＳ｛３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノプロパンスルホン酸｝緩衝剤、ＣＨＥＳ［２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸］緩衝剤、ＣＡＰＳＯ［３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸］緩衝剤、ＣＡＰＳ［３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）プロパンスルホン酸］緩衝剤などがあげられる。【０１３４】  酵素活性調節剤、酵素安定化剤としては、例えばマグネシウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオンなどの金属イオンがあげられる。試薬中のこれらの金属イオン��含量としては、測定において、酵素が安定化される含量であれば特に制限はない。
防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質などがあげられる。試薬中のこれらの防腐剤の含量としては、測定において、検体中の被測定物質が適切に測定されるような含量であれば特に制限はない。【０１３５】  ヒトＳＴＳの標準物質としては、遺伝子組換え技術により取得された、あるいは生体試料から取得されたヒトＳＴＳや、ヒトＳＴＳが発現している細胞、ヒトＳＴＳの部分ペプチドなどがあげられる。
本発明の検体中のヒトＳＴＳの免疫学的検出試薬またはキット、並びに免疫学的定量試薬またはキットは、ヒトＳＴＳ関連疾患の判定または診断、ヒトＳＴＳ関連疾患の治療に適する薬剤の選択、ヒトＳＴＳ関連疾患の病態の判定または診断などに用いることができる。【０１３６】  ヒトＳＴＳ関連疾患は、軽度、重度に関わらず、ヒトＳＴＳが病態に関与する疾患であればいかなる疾患も包含される。ヒトＳＴＳ関連疾患としては、ヒトＳＴＳが病態に関与するエストロゲン依存性疾患があげられ、具体的には、ヒトＳＴＳが病態に関与するエストロゲン依存性腫瘍があげられる。【０１３７】  エストロゲン依存性腫瘍としては、エストロゲン依存的な細胞の増殖を伴う腫瘍があげられ、例えば悪性腫瘍、良性腫瘍、皮膚疾患などがあげられる。悪性腫瘍としては、具体的には乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、スキルス胃癌などがあげられるが、乳癌、子宮癌が好ましい。乳癌としては、例えば乳管癌、小葉癌、パジェット病などがあげられるが、乳管癌が好ましく、浸潤性乳管癌が特に好ましい。子宮癌であれば、子宮内膜癌とも呼ばれる子宮体癌が特に好ましい。【０１３８】  疾患が悪性腫瘍である場合、疾患部位としては、原発巣であっても転移巣であってもよい。良性腫瘍としては、例えば子宮内膜症、子宮腺筋症、子宮筋腫などがあげられるが、子宮内膜症、子宮腺筋症が好ましい。皮膚疾患としては、例えば魚鱗症などがあげられる。
本発明の検体中のヒトＳＴＳの免疫学的検出試薬またはキット、並びに免疫学的定量試薬またはキットによる検出または定量の結果、検体中のヒトＳＴＳが検出され、またはヒトＳＴＳが健常人または通常組織と比較して、ヒトＳＴＳの存在量が増大している場合には、ヒトＳＴＳが陽性である、またはヒトＳＴＳが発現亢進していると判断される。このような患者は、ヒトＳＴＳ関連疾患であると判定または診断される。【０１３９】  上記のようにして、ヒトＳＴＳ関連疾患であると判定または診断された患者には、ヒトＳＴＳ関連疾患の治療に適した薬剤を選択することができる。また、ヒトＳＴＳ関連疾患は、ヒトＳＴＳが病態に関与するエストロゲン依存性疾患を含むため、エストロゲン依存性疾患の治療に適した薬剤を選択してもよい。
ヒトＳＴＳ関連疾患の治療に適した薬剤としては、具体的には、ＳＴＳ阻害剤があげられる。【０１４０】  エストロゲン依存性疾患の治療に適した薬剤としては、例えば、ホルモン療法剤があげられる。
ＳＴＳ阻害剤としては、ＳＴＳの機能を阻害する機能を有する薬剤であれば、いかなるものでもよいが、具体的にはｎｏｒｔｒｏｐｉｎｙｌ−ａｒｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａまたはその誘導体［Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１３，３６７３（２００３）］、ｅｓｔｒｏｎｅ−３−Ｏ−ｓｕｌｆａｍａｔｅまたはその誘導体、２−ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｏｅｓｔｒｏｎｅ  ３−Ｏ−ｓｕｌｐｈａｍａｔｅ［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，３１７，１６９（２００４）］、ｂｉｐｈｅｎｙｌ−４−Ｏ−ｓｕｌｆａｍａｔｅまたはその誘導体、２’，４’−ｄｉｃｙａｎｏｂｉｐｈｅｎｙｌ−４−Ｏ−ｓｕｌｆａｍａｔｅ［Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，８７，１４１（２００３）］、エストロン誘導体［Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１，１６８５（２００３）］、２−Ａｌｋｙｌｃｈｒｏｍｅｎ−４−ｏｎｅ  ６−Ｏ−ｓｕｌｆａｍａｔｅｓ［Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４６，５０９１（２００３）］、クマリン誘導体、６６７  ＣＯＵＭＡＴＥ、２−ｍｅｔｈｏｘｙｏｅｓｔｒａｄｉｏｌ  ｂｉｓ−ｓｕｌｐｈａｍａｔｅ［Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，８６，４２３（２００３）］、３−ｓｕｌｆａｍｏｙｌｏｘｙ−１７ａｌｐｈａ−ｐ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｂｅｎｚｙｌ（ｏｒ  ｂｅｎｚｙｌ）ｅｓｔｒａ−１，３，５（１０）−ｔｒｉｅｎ−１７ｂｅｔａ−ｏｌ、並びに２−ｍｅｔｈｏｘｙ−３−ｓｕｌｆａｍｏｙｌｏｘｙ−１７ａｌｐｈａ−ｂｅｎｚｙｌｅｓｔｒａ−１，３，５（１０）−ｔｒｉｅｎ−１７ｂｅｔａ−ｏｌまたはこれらの類縁体［Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６３，６４４２（２００３）］などがあげられる。【０１４１】  また、ホルモン療法剤としては、エストロゲンの機能を阻害する機能を有する薬剤であればいかなる薬剤も包含されるが、抗エストロゲン剤、選択的アロマターゼ阻害剤、黄体ホルモン分泌刺激ホルモン抑制剤またはプロゲステロン製剤などがあげられ、具体的には、クエン酸タモキシフェン、クエン酸トレミフェン、フルベストラント、酢酸リュープロレリン、メピチオスタン、エチニルエストラジオール、アナストロゾール、レトロゾール、エクセメスタン、塩酸ファドロゾール水和物、ゴセラリン、酢酸メドロキシプロゲステロンなどがあげられる。【０１４２】  さらに、本発明の検体中のヒトＳＴＳの免疫学的検出試薬またはキット、並びに免疫学的定量試薬またはキットは、ヒトＳＴＳ関連疾患の病態の判定または診断などに用いることができる。
ヒトＳＴＳ関連疾患の病態の判定または診断としては、例えばヒトＳＴＳ関連疾患の現状を把握することや予後を予測することなどがあげられる。ヒトＳＴＳ関連疾患の現状としては、例えば疾患の進展度、進行度、増悪度または治療薬投与後の寛容度などがあげられる。疾患の予後としては、再発の可能性、病巣の転移度または罹患患者の生存率などがあげられる。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０１４３】抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体の作製
（１）抗原の調製
ヒト胎盤組織から以下のようにして精製ヒトＳＴＳを取得した。操作は全て４℃で行った。
胎盤組織ははさみで細断後、バッファーＡ［０．２５ｍｏｌ／Ｌサッカロース，５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡで含む１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７．０）］中で細胞懸濁液を調製し、該細胞顕濁液を１００００×ｇで２０分間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清をさらに１０５０００×ｇで１時間遠心分離して得られた沈殿をミクロソーム画分とした。【０１４４】  得られたミクロソーム画分はバッファーＢ［１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ，１ｍｍｏｌ／Ｌジチオエリスレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｅｒｙｔｈｒｅｉｔｏｌ；ＤＴＥ）、０．０５％フェニルメチルスルフォニルフルオロイド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ；ＰＭＳＦ）、０．５％トリトンＸ−１００を含む１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）］を加えて室温にて１時間攪拌し、可溶化した。可溶化後、該溶液を１０５０００×ｇで１時間遠心分離して不溶性画分を除き、得られた上清を、バッファーＣ［１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ，１ｍｍｏｌ／Ｌジチオエリスレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｅｒｙｔｈｒｅｉｔｏｌ；ＤＴＥ）、０．０５％フェニルメチルスルフォニルフルオロイド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ；ＰＭＳＦ）、０．５％トリトンＸ−１００を含む１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）］で平衡化したＰＢＥ９４カラムに通塔し、２倍容量の同バッファーにて洗浄後、バッファーＤ［１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ，１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＥ，０．０５％ＰＭＳＦ，０．５％トリトンＸ−１００を含む１２．５％ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒ７４（ｐＨ４．０）］で溶出した。さらに溶出画分はバッファーＢで平衡化したフェニルセファロースカラムに通塔し、充分量の同バッファーで洗浄後１．２５％トリトンＸ−１００を加えた同バッファーで溶出した。このようにして得られた溶出画分を精製ヒトＳＴＳとして用いた。精製ヒトＳＴＳはＳＤＳ変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと表記する）を用いて、純度を検定した。【０１４５】  図１に得られた精製ヒトＳＴＳのＳＤＳ−ＰＡＧＥのクマシーブリリアントブルーでの染色の結果を示した。矢印の位置に示されるように、精製ヒトＳＴＳは分子量６３ＫＤａの単一バンドとして染色され、精製ヒトＳＴＳの純度は、９０％以上と推定された。【０１４６】（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
上記（１）で得られた精製ヒトＳＴＳをアルミニウムゲル２ｍｇおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）１×１０９細胞とともに５週令雌マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に投与し、２週間後より同様に調製した免疫原を１週間に１回、計４回投与した。眼底静脈叢より採血し、その血清抗体価を以下に示す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したマウスから最終免疫の３日後に脾臓を摘出した。【０１４７】  脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去し、ＭＥＭ培地で３回洗浄して細胞融合に用いた。【０１４８】（３）酵素免疫測定法
アッセイ用の抗原には上記（１）で得られた精製ヒトＳＴＳを用いた。陰性対照の抗原にはＢＳＡを用いた。【０１４９】  ９６穴のＥＩＡ用プレートに精製ヒトＳＴＳ、あるいはＢＳＡを５０μＬ／穴で分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／穴で加え、室温１時間反応させて残っている活性基をブロックした。ＢＳＡーＰＢＳを捨て、被免疫マウス抗血清、抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体の培養上清もしくは精製モノクローナル抗体を５０μＬ／穴で分注し２時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン（ダコ社製）を５０μＬ／穴で加えて室温、１時間反応させ、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μＬ／穴で加えて発色させ、４１５ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４１５などと表記する）をプレートリーダー（ＮＪ２００１；日本インターメッド社製）にて測定した。【０１５０】（４）マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｕ１［Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１（１９７６）］を正常培地で培養し、細胞融合時に２×１０７個以上の細胞を確保し、細胞融合に供した。【０１５１】（５）ハイブリドーマの作製
上記（２）で得られたマウス脾細胞と（４）で得られた骨髄腫細胞とを１０：１になるよう混合し、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を除き、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇ、ＭＥＭ培地２ｍＬおよびジメチルスルホキシド０．７ｍＬの混液を１×１０８個マウス脾細胞当たり０．２〜１ｍＬを加え、１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにした。遠心分離（９００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を除き、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吸出しでゆるやかに細胞をＨＡＴ培地１００ｍＬ中に懸濁した。【０１５２】  この懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μＬ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１０〜１４日間培養した。この培養上清を上記（３）に記載した酵素免疫測定法で調べ、精製ヒトＳＴＳに反応してＢＳＡに反応しない穴の細胞を選び、さらにＨＴ培地、続いて正常培地を用いる２回クローニングを行い、抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体産生ハイブリドーマＫＭ１０５３とＫＭ１０４９が得られた。ハイブリドーマ細胞株ＫＭ１０５３およびハイブリドーマ細胞株ＫＭ１０４９が産生するモノクローナル抗体をそれぞれ抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３および抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０４９と称す。【０１５３】（６）モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した８週令ヌード雌マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に上記（５）で得られたハイブリドーマ株を５〜２０×１０６細胞／匹それぞれ腹腔内注射した。１０〜２１日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹水のたまったマウスから、腹水を採取（１〜８ｍＬ／匹）し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分間）して固形分を除去した。得られた腹水は、カプリル酸沈殿法［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）］により精製し、精製モノクローナル抗体とした。【０１５４】  抗体のサブクラスはサブクラスタイピングキット（ＺＹＭＥＤ社製）を用いて酵素免疫測定法により行ない決定した。結果を表１に示した。
【表１】
2006059712.tif 000002
【０１５５】（７）モノクローナル抗体の胎盤由来精製ヒトＳＴＳとの反応性（バインディングＥＬＩＳＡ）
上記（５）で選択された抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体の精製ヒトＳＴＳとの反応性を（３）に示した酵素免疫測定法にて調べた。図２に示すように、得られた抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３および抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０４９はいずれも精製ヒトＳＴＳに特異的に結合した。
【実施例２】
【０１５６】抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体の反応性
（１）大腸菌発現組換えヒトＳＴＳの作製
ヒトＳＴＳ遺伝子を含むプラスミドｐＳＶＬ−ＳＴＳ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１３８６５（１９８９）］（１ｎｇ／μＬ）を０．５μＬ、１０倍濃度のＰｆｕ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ緩衝液５μＬ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰ  ２μＬ、４０μｍｏｌ／Ｌの配列番号１および２に示された塩基配列のプライマーをそれぞれ０．５μＬ、ＤＭＳＯ  ５μＬ、Ｐｆｕ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）０．５μＬ、滅菌水３６μＬからなる溶液にミネラルオイルを上層し、９４℃で５分間加熱した後、９４℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応サイクルを１６サイクル行い、続けて７２℃で７分間反応させた。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分画し、得られた約１．７ｋｂの増幅断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用いて抽出した。得られた抽出断片をＢａｍＨＩとＳｍａＩで消化し、ＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造社製）によりＢａｍＨＩとＳｍａＩで消化したｐＱＥ３０（ＱＩＡＧＥＮ社製）に連結した後、コーエンらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，６９，２１１０（１９７２）］により大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。得られた形質転換体よりプラスミド抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドを抽出し、発現プラスミドｐＱＥ−ＳＴＳを取得した。ｐＱＥ−ＳＴＳのＤＮＡ配列をＤＮＡシークエンサー３７３（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）およびＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して確認したところ、意図的にプライマーに変異を導入した箇所以外に変異は認められなかった。【０１５７】  ｐＱＥ−ＳＴＳを上記と同様の方法で大腸菌Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］株に導入し、ヒトＳＴＳ発現大腸菌株Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］／ｐＱＥ−ＳＴＳを作製した。
（２）ウェスタンブロッティング
実施例１（５）で得られた抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロッティングによるヒトＳＴＳを以下のようにして検出した。【０１５８】  上記（１）で作製されたＳＴＳ発現大腸菌株Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］／ｐＱＥ−ＳＴＳ株を５０ｍｇ／Ｌアンピシリンおよび１０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＬＢ培地にて３７℃で一晩シード培養し、培養液を５０倍に希釈して１時間培養した後、終濃度が４ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＩＰＴＧを添加した。４時間の培養後、菌体を遠心分離により回収した。
回収したヒトＳＴＳ発現大腸菌株体およびヒト胎盤由来精製ヒトＳＴＳを１倍濃度のＰＡＧＥ  ｂｕｆｆｅｒ［２％ＳＤＳ、６２ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）、１０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ］に溶解して９５℃で５分間加熱処理し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）〕にて分画後、ＰＶＤＦ膜にブロッティングした。該膜をＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキング後、抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３または抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０４９を室温で２時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄した後、第二抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ社製）を室温で１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳでよく洗浄した後、検出はＥＣＬ−ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（アマシャム社製）を用いて行い、Ｘ線フィルム上に感光させた。【０１５９】  図３に結果を示した。抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３および抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０４９は、いずれも実施例１（１）で得られた胎盤由来精製ヒトＳＴＳだけでなく、大腸菌発現の組換えヒトＳＴＳにも反応した。
以上のことから、抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３および抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０４９はウェスタンブロッティングによりヒトＳＴＳを検出することができ、ＳＴＳが関与する各種疾病の判定または診断に応用できることが示された。【０１６０】（３）ヒトＳＴＳ遺伝子導入細胞株の造成
ヒトＳＴＳ遺伝子を含むプラスミドｐＳＶＬ−ＳＴＳ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１３８６５（１９８９）］を制限酵素ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、得られた消化断片をアガロースゲル電気泳動で分離後、約２．４ｋｂのヒトＳＴＳ遺伝子を含む断片を抽出した。抽出した断片をＸｂａＩとＢａｍＨＩで消化したｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）に連結した後、コーエンらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，６９，２１１０（１９７２）］により大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。得られた形質転換体よりプラスミド抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドを抽出し、ｐＢＳ−ＳＴＳを取得した。ｐＢＳ−ＳＴＳをＮｏｔＩおよびＸｈｏＩで消化し、上記と同様にしてヒトＳＴＳ遺伝子含む断片を得た。該断片を動物細胞発現用ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＮｏｔＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入し、発現プラスミドｐｃＳＴＳを取得した。【０１６１】  ｐｃＳＴＳは、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］により以下のようにして、ＣＨＯ／ｄＤＸＢ１１細胞［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７，４２１６（１９８０）］へ導入した。
ＣＨＯ／ｄＤＸＢ１１細胞は、５％ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、０．０９％重曹（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を添加したαＭＥＭ１９００培地（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）（以下、Ａ３培地とする）で継代培養した細胞を用いた。【０１６２】  ＣＨＯ／ｄＤＸＢ１１細胞をＫ−ＰＢＳ緩衝液［１３７ｎｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム、２．７ｎｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、８．１ｍｍｏｌ／Ｌリン酸一水素二ナトリウム、１．５ｎｍｏｌ／Ｌリン酸二水素一ナトリウム、４ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム緩衝液］に懸濁して８×１０６細胞／ｍＬとし、細胞懸濁液２００μＬ（１．６×１０６個の細胞を含む）を上記プラスミド４μｇと混和した。該混和液をキュベット（電極間距離２ｍｍ）に移し、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＩＩ（ＢｉｏＲａｄ社製）装置を用いてパルス電圧０．３５ｋＶ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。キュベットを氷上で静置後、キュベット中の細胞懸濁液を、Ａ３培地を含む細胞培養用容器に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。２４時間の培養後、５％ウシ胎児透析血清（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、０．０９％重曹（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、６００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８  ｓｕｌｆａｔｅを添加したαＭＥＭ２０００培地（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）（以下、Ｂ３培地と表記する）に培地交換し、培養を続けた。途中希釈しながら継代を続け、遺伝子導入より約２週間後に、Ｇ４１８に耐性を持つ形質転換細胞株を取得した。【０１６３】  得られた形質転換細胞を１．２５細胞／ｍＬとなるようＢ３培地で希釈し、希釈液を９６穴プレートに２００μＬずつ分注し、シングルセルクローニングを行い、形質転換細胞ｃｓ３−１細胞株を取得した。
上記で取得された形質転換細胞のアリルサルファターゼ活性を測定することにより、ヒトＳＴＳが導入された細胞を選択した。ＴＴ緩衝液［１％トリトンＸ−１００を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）］に懸濁した細胞を超音波破砕し、約８０００×ｇで５分間遠心分離した上清５０μＬとｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｓｕｌｆａｔｅ（ＮＰＳ）基質溶液［２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＰＳを含む２５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ８．２）］５０μＬを混和し、３７℃、１時間反応を行った。反応後、該反応液に１Ｎ  ＮａＯＨ  ４００μＬを添加して反応を停止し、４２０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４２０）をＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ  Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて測定し、細胞の酵素活性を求めた。ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ（ＮＰ）のモル吸光係数をＥ１ｍｍｏｌ／Ｌ＝１９．６、１時間に１μｍｏｌ／ＬのＮＰを生じる酵素量を１Ｕｎｉｔとして定義した。【０１６４】  結果を、図４に示した。ヒトＳＴＳ遺伝子を含まないｐｃＤＮＡ３プラスミドを導入したコントロール株ｃＤＮＡ３−１およびｐｃＳＴＳプラスミドを導入した形質転換株ｃｓ３−１細胞株のアリルサルファターゼ酵素活性を比較した場合、ｃｓ３−１細胞株で有意な活性の上昇が認められた。
従って、ヒトＳＴＳ遺伝子の導入により、アリルサルファターゼ酵素活性を発現する細胞株が得られたことが確認できた。【０１６５】（４）免疫沈降
実施例１（５）で得られた抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体を用いて、免疫沈降によるヒトＳＴＳを以下のようにして検出した。
上記（３）で造成したヒトＳＴＳ遺伝子導入細胞株ｃｓ３−１細胞を溶解緩衝液［１％トリトンＸ−１００を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）］にて溶解した後、遠心分離を行い、上清を回収した。【０１６６】  回収した上清１００μＬに対し、抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３または抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０４９を産生するハイブリドーマの培養上清５０μＬあるいは陰性対照のマウスＩｇＧ１クラスモノクローナル抗体を混合し、氷上に６０分間静置して反応させた。反応後、溶解緩衝液で平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）１００μＬを加え、４℃にて６０分間、撹拌しながら反応させた。反応後、１４０００ｒｐｍ、４℃で１５秒間の遠心分離を行った後、上清を除去し、沈殿したビーズを回収した。該ビーズは上記の溶解緩衝液で３回洗浄した。洗浄後、該ビーズに３５μＬの２倍濃度のＰＡＧＥ  ｂｕｆｆｅｒ［４％ＳＤＳ、１２４ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）、２０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ］を加え、９５℃で５分間加熱処理し、沈殿したビーズに吸着した蛋白質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによる電気泳動に供した。分画した蛋白質をＰＶＤＦ膜に転写し、上記（２）に記載の方法と同様にしてウェスタンブロッティング法を行った。ウェスタンブロッティング法の一次抗体にはＫＭ１０４９を、二次抗体にはＨＲＰ標識ウサギ抗マウス抗体（ＤＡＫＯ社製）をそれぞれ用いた。結果を図５に示した。【０１６７】  抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３はヒトＳＴＳを免疫沈降することができたが、抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０４９はヒトＳＴＳを免疫沈降することはできなかった。
以上のことから、抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３は免疫沈降により、ヒトＳＴＳを検出することができ、ＳＴＳが関与する各種疾病の診断に応用できることが示された。【０１６８】（５）免疫細胞染色
実施例１（５）で得られた抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体を用いた免疫細胞染色法によりヒトＳＴＳを以下のようにして検出した。
細胞は、上記（３）で造成したヒトＳＴＳ遺伝子導入細胞株ｃｓ３−１細胞と、陰性対照として親株であるＣＨＯ／ｄＤＸＢ１１細胞にヒトＳＴＳ遺伝子が含まれていないｐｃＤＮＡ３プラスミドを導入したｃＤＮＡ３−１細胞用いた。
細胞をＥＤＴＡにより剥離し、ＰＢＳで洗浄した後、細胞膜の抗体透過性を上げるため、氷冷した１００％メタノールにて４℃で１０分間処理した。ＰＢＳで洗浄後、１ｍｇ／ｍＬヒトイムノグロブリン（カッペル社製）にて室温で３０分間ブロッキングした。反応当たり１×１０５細胞／となるように分注し、抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３産生ハイブリドーマの培養上清を加えて室温で３０分間反応させた。反応後、ＰＢＳで洗浄後、ＦＩＴＣ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（マウスイムノグロブリンに特異的に反応する抗体；和光純薬）を１００μＬ／チューブで分注し、４℃、３０分間遮光反応させた。ＰＢＳで洗浄した後、セルアナライザー（コールター社；ＥＰＩＣＳ  ＸＬ  ｓｙｓｔｅｍＩＩ）にて解析した。【０１６９】  結果を図６に示した。図６に示されるように、免疫細胞染色法において、抗ヒトＳＴＳモノクローナルＫＭ１０５３はヒトＳＴＳを発現していないｃＤＮＡ３−１細胞には反応せず、ヒトＳＴＳ遺伝子が導入された細胞株ｃｓ３−１細胞に特異的な反応性を示した。また、陰性対照のマウスＩｇＧ１クラスのモノクローナル抗体はいずれの細胞とも反応しなかった。
以上のことから、抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３は免疫細胞染色により、ヒトＳＴＳを検出することができ、ＳＴＳが関与する各種疾病の診断に応用できることが示された。【０１７０】（６）免疫組織染色
実施例１（５）で選択された抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３を用いて、免疫組織染色法によるヒトＳＴＳを以下のようにして検出した。
乳管癌標本２５例を用いた。標本は、１０％ホルマリンで固定後、パラフィン包埋されたブロックから、切片を調製して使用した。【０１７１】  切片は、後述する検出段階で用いたヒストファインＳＡＢ−ＰＯ（Ｍ）（以下、ヒストファインと記す。ニチレイ社製）に添付のウサギ正常血清由来のブロッキング溶液を用いて室温にて、３０分間ブロッキングした。ブロッキング後、該標本を第一次抗体希釈液［０．５％ＢＳＡ、０．０５％アザイドを含むＰＢＳ（リン酸二ナトリウム３２．２７ｇ、リン酸一ナトリウム４．５ｇ、食塩８０ｇ、蒸留水１リットル）］で８．３３μｇ／ｍＬに希釈した抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３で４℃にて、一晩反応させた。この時、同時に第一次抗体の陰性対照として、正常マウスＩｇＧを用いた。【０１７２】  反応後、洗浄し、内因性ペルオキシダーゼ（以下、ペルオキシダーゼと記す）の活性をブロックするため、ペルオキシダーゼブロッキング液（１ｍＬの３０％過酸化水素水をメタノールで全量を１００ｍＬに調整）で室温にて３０分間反応させた。反応後、洗浄し、ヒストファインに添付の第二次抗体溶液（ビオチン標識抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭウサギ抗体）を用いて、室温にて３０分間反応させた。反応後、洗浄し、ヒストファインに添付のアビジン標識ペルオキシダーゼ溶液を用いて、室温にて３０分間反応させた。反応後、洗浄し、ＤＡＢ発色を行った。ＤＡＢ発色は以下の通りに行った。【０１７３】  １００ｍＬの５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）に、６ｍＬのＤＡＢ溶液｛４０ｍＬの２５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）に１ｇのＤＡＢ（３，３’−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；同仁社製）を溶解し、同緩衝液で２００ｍＬに調整｝および２０μＬの３０％過酸化水素水を添加したＤＡＢ発色溶液を調製しＤＡＢ発色反応に供した。発色反応は１〜５分間行った。
ＤＡＢ発色後、洗浄し、細胞像をわかりやすくするために、定法に従ってヘマトキシリン染色を行った後、顕微鏡下で観察した。【０１７４】  ２５例の標本の癌部のうち、シグナルが観察された領域が５０％以上であった標本は（２＋）、１０％〜５０％であった標本は（１＋）、１０％未満であった標本は（−）として、各標本をそれぞれ分類した。
結果は、（２＋）と判定された標本は９例（３６％）、（１＋）と判定された標本は１４例（５４％）、（−）と判定された標本は２例（８％）であった。一方、第一次抗体に陰性対照を用いた場合には、全ての標本においてシグナルは観察されなかった。【０１７５】  以上のことから、癌組織の９０％以上を染色することが可能な抗ヒトＳＴＳモノクローナルＫＭ１０５３は、癌の免疫組織染色法に適した抗体であり、抗ヒトＳＴＳモノクローナルＫＭ１０５３は免疫細胞染色により、ヒトＳＴＳを検出することができるので、ＳＴＳが関与する各種疾病の診断に応用できることが示された。
【実施例３】
【０１７６】抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体の反応特異性
（１）各種ＡＲＳ遺伝子導入細胞株の造成
（１−１）ＡＲＳ  Ａ遺伝子導入細胞の造成
ｈｕｍａｎ  ｐｌａｃｅｎｔａ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）よりＡＲＳ  Ａ遺伝子のＰＣＲクローニングを行った。ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ（０．５μｇ／μＬ）２０μＬ、１０倍濃度のＫＯＤ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ緩衝液５μＬ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰ２μＬ、４０μｍｏｌ／Ｌの配列番号１および２記載の塩基配列で示されるプライマーをそれぞれ０．５μＬ、ＤＭＳＯ５μＬ、ＫＯＤ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）０．５μＬ、滅菌水２１．５μＬからなる溶液にミネラルオイルを上層し、９４℃で５分間加熱した後、９４℃で１分間、４５℃で１分間、７２℃で２分間の反応サイクルを２５サイクル行い、続いて７２℃で１０分間反応を行なった。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分画し、得られた約１．５ｋｂの増幅断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用いて抽出した。抽出した断片を鋳型として上記と同様のＰＣＲ反応を行い、上記と同様にして増幅断片の抽出を行なった。得られた増幅断片をＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで消化し、ＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造社製）によりＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）に連結した後、コーエンらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，６９，２１１０（１９７２）］により大腸菌ＪＭ１１０（ｄａｍ−，ｄｃｍ−）に形質転換した。得られた形質転換体よりプラスミド抽出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてプラスミドを抽出し、ｐＢＳ−ＡＲＳ  Ａ２とｐＢＳ−ＡＲＳ  ５を得た。ｐＢＳ−ＡＲＳ  Ａ２とｐＢＳ−ＡＲＳ  ５のＤＮＡ配列をＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）およびＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して確認したところ、ｐＢＳ−ＡＲＳ  Ａ２には一ヶ所の変異、ｐＢＳ−ＡＲＳ  Ａ５には４６４−５２６位に欠失変異が存在することがわかった。それぞれ変異が導入された領域が異なっていたので、ｐＢＳ−ＡＲＳ  Ａ２をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｍＢＩで消化しアガロースゲル電気泳動で分離後、抽出した断片（０．８ｋｂｐ）をｐＢＳ−ＡＲＳ  Ａ５のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｍＢＩ断片（３．５ｋｂｐ）に挿入することにより完全型ＡＲＳ  Ａの翻訳領域を含むｐＢＳ−ＡＲＳ  Ａ’を取得した。ｐＢＳ−ＡＲＳ  Ａ’をＡｐａＩ消化してアガロース電気泳動の解析により０．５、０．６および３．４ｋｂｐの断片が出現すること、および変異点近傍のシーケンスを行うことにより、目的としたプラスミドｐＢＳ−ＡＲＳ  Ａ’を取得したことを確認した。【０１７７】  ｐＢＳ−ＡＲＳ  Ａ’をＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで消化し、上記と同様にしてＡＲＳ  Ａを含む断片を得た。該断片を動物細胞発現用ベクターｐＡＧＥ２１０［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩサイトに挿入し、発現プラスミドｐＡＧＥ２１０−ＡＲＳ  Ａを取得した。
ｐＡＧＥ２１０−ＡＲＳ  ＡはＦｓｐＩで消化し、線状化した。フェノールクロロホルム抽出処理の後、エタノール沈殿を行い、回収した線状化プラスミドをＴＥに１μｇ／μＬとなるよう溶解した。一方、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞［Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２，５５５（１９８６）］は、１０％ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、１％  ＨＴ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、１％  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）（以下、Ａ１培地とする）で継代したものを用いた。ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞をＫ−ＰＢＳ緩衝液［１３７ｎｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム、２．７ｎｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、８．１ｍｍｏｌ／Ｌリン酸一水素二ナトリウム、１．５ｎｍｏｌ／Ｌリン酸二水素一ナトリウム、４ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム緩衝液］に懸濁して８×１０６細胞／ｍＬとし、細胞懸濁液２００μＬ（１．６×１０６個の細胞を含む）を上記線状化プラスミド４μｇと混和した。該混和液を電極間距離２ｍｍのキュベットに移し、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＩＩ（ＢｉｏＲａｄ社製）装置を用いてパルス電圧０．３０ｋＶ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。キュベットを氷上で静置後、キュベット中の細胞懸濁液を１０ｍＬのＡ１培地に懸濁し、１００μＬずつ９６穴ｐｌａｔｅに分注したものを３７℃、５％炭酸ガス培養器中で培養した。１日間培養後、１０％ウシ胎児透析血清（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、３００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢを添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）（以下、Ｂ１培地とする）に培地交換し、培養を続けた。途中希釈しながら継代を続け、遺伝子導入より約２週間後に、ハイグロマイシンＢに耐性を持つ形質転換細胞株を取得した。【０１７８】  導入遺伝子の増幅を行うため、得られた形質転換細胞を、５０、１００または５００ｎｍｏｌ／ＬのＭｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ（ＭＴＸ）を添加したＢ１培地中で順次３回の継代（約２週間）を行い、各濃度のＭＴＸに耐性を有する株を取得した。また、得られた発現株をＥＸ−ＣＥＬＬ  ３０１（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）培地で継代培養することにより無血清馴化を行ない、ＡＲＳ  Ａが導入された形質転換細胞を取得した。【０１７９】  上記で取得された形質転換細胞のアリルサルファターゼ活性を以下の方法により測定し、ＡＲＳ  Ａが導入された細胞を選択した。
形質転換細胞の培養上清１００μＬとｐ−Ｎｉｔｒｏｃａｔｅｃｈｏｌｓｕｌｆａｔｅ（ＮＣＳ）基質溶液［１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｋ２ＮＣＳを含む５００ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）］１００μＬを混和し、３７℃で反応を行った。反応開始から０および３０分後に該反応液を１００μＬ抜き取り、１Ｎ  ＮａＯＨ  ５０μＬと混和して反応を停止後、４９０ｎｍにおける吸光度をＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ  Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて測定し、細胞の酵素活性を求めた。その結果を、図７−Ａに示した。ＡＲＳ  Ａ遺伝子を含まないプラスミドｐＡＧＥ２１０を導入したコントロール細胞株Ｖｅｃｔｏｒ１細胞株およびＡＲＳ  Ａ遺伝子を含むｐＡＧＥ２１０−ＡＲＳ  Ａプラスミドを導入した形質転換株Ａ７（１００）細胞株のアリルサルファターゼ活性を比較したところ、形質転換株Ａ７（１００）細胞株は、アリルサルファターゼ活性を有していることが確認された。【０１８０】（１−２）ＡＲＳ  Ｂ遺伝子導入細胞の造成
ヒト由来ＡＲＳ  Ｂ遺伝子を含むプラスミドｐＭＰＳＶＨＥ−ＡＳＢ［Ｇｅｎｅ，６８，２１３（１９８８）］を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化しＢｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造）により平滑末端化したものを、ＢａｍＨＩで消化した。得られた消化断片をアガロースゲル電気泳動で分離後、約２．３ｋｂのＡＲＳ  Ｂを含む断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用いて抽出した。抽出断片をＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造社製）により動物細胞発現用ベクターｐＡＧＥ２１０［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］のＢａｍＨＩ−ＳｍａＩサイトに挿入し、該断片挿入ベクターを用いてコーエンらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，６９，２１１０（１９７２）］により大腸菌ＪＭ１１０株（ｄａｍ−，ｄｃｍ−）を形質転換した。得られた形質転換体よりプラスミド抽出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてプラスミドを抽出し、ｐＡＧＥ２１０−ＡＲＳ  Ｂを取得した。【０１８１】 ＦｓｐＩで消化し、線状化したｐＡＧＥ２１０−ＡＲＳ  Ｂを用い、上記（１−１）と同様にＣＨＯ／ＤＧ４４細胞［Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２，５５５（１９８６）］へ導入し、形質転換株を取得した。
導入遺伝子の増幅を行うため、得られた形質転換細胞を、５０、１００または５００ｎｍｏｌ／ＬのＭｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ（ＭＴＸ）を添加したＢ１培地中で順次３回の継代（約２週間）を行い、各濃度のＭＴＸに耐性を有する株を取得した。また、得られた発現株をＥＸ−ＣＥＬＬ  ３０１（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）培地で継代培養することにより無血清馴化を行なった。【０１８２】  上記で取得された形質転換細胞のアリルサルファターゼ活性を測定することにより、ＡＲＳ  Ｂが導入された細胞を選択した。培養上清１００μＬとｐ−Ｎｉｔｒｏｃａｔｅｃｈｏｌｓｕｌｆａｔｅ（ＮＣＳ）基質溶液［１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｋ２ＮＣＳを含む５００ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）］１００μＬを混和し、３７℃で反応を行った。反応開始から３０および９０分後に、該反応液の４９０ｎｍにおける吸光度をＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ  Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて測定し、細胞の酵素活性を求めた。【０１８３】  その結果を、図７−Ｂに示した。ＡＲＳ  Ｂ遺伝子を含まないｐＡＧＥ２１０プラスミドを導入したコントロール細胞株Ｖｅｃｔｏｒ１細胞株およびＡＲＳ  Ｂ遺伝子を含むｐＡＧＥ２１０−ＡＲＳ  Ｂプラスミドを導入した形質転換株Ｂ４５（１００）細胞株のアリルサルファターゼ活性を比較したところ、形質転換株Ｂ４５（１００）細胞株は、明らかにアリルサルファターゼ活性を有していることが確認された。【０１８４】（１−３）ＡＲＳ  Ｄ遺伝子導入細胞の造成
ヒト由来ＡＲＳ  Ｄ遺伝子を含むプラスミドｐｃＤＬ−ＳＲ２９６（ＡＲＳＤ）［Ｃｅｌｌ，８１，１５（１９９５）］を制限酵素ＸｈｏＩで消化し、得られた消化断片をアガロースゲル電気泳動で分離後、約２ｋｂのＡＲＳ  Ｄ遺伝子を含む断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用いて抽出した。抽出断片をＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（Ｔ宝酒造社製）により動物細胞発現用ベクターｐＡＧＥ２１０［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］のＳａｌＩサイトに挿入し、コーエンらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，６９，２１１０（１９７２）］により大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体よりプラスミド抽出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてプラスミドを抽出し、ｐＡＧＥ２１０−ＡＲＳ  Ｄを取得した。【０１８５】  ｐＡＧＥ２１０−ＡＲＳ  Ｄは、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］により以下のようにしてＣＨＯ／ＤＧ４４細胞［Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２，５５５（１９８６）］へ導入した。
ｐＡＧＥ２１０−ＡＲＳ  ＤはＢｓｔＥＩＩで消化し、線状化した。該反応液をフェノールクロロホルム抽出したの後、エタノール沈殿法を行い回収し、回収した線状化プラスミドをＴＥに溶解した。一方、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞は、１０％ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、１％のＨＴ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）（以下、Ａ４培地とする）で継代したものを用いた。ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞をＫ−ＰＢＳ緩衝液［１３７ｎｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム、２．７ｎｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、８．１ｍｍｏｌ／Ｌリン酸一水素二ナトリウム、１．５ｎｍｏｌ／Ｌリン酸二水素一ナトリウム、４ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム緩衝液］に懸濁して８×１０６細胞／ｍＬとし、細胞懸濁液２００μＬ（１．６×１０６個の細胞を含む）を上記線状化プラスミド４μｇと混和した。該混和液をキュベット（電極間距離２ｍｍ）に移し、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＩＩ（ＢｉｏＲａｄ社製）装置を用いてパルス電圧０．３０ｋＶ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。キュベットを氷上で静置後、キュベット中の細胞懸濁液を１２ｍＬのＡ培地を含む１０ｃｍディッシュ４枚に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養した。１日間培養後、１０％ウシ胎児透析血清（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、３００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢを添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）（以下、Ｂ４培地とする）に培地交換し、培養を続けた。途中希釈しながら継代を続け、遺伝子導入より約２週間後に、ハイグロマイシンＢに耐性を持つ形質転換細胞株を取得した。【０１８６】  導入遺伝子の増幅を行うため、得られた形質転換細胞を、５０、１００または５００ｎｍｏｌ／ＬのＭｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ（ＭＴＸ）を添加したＢ１培地中で約２週間毎に順次３回の継代を行い、各濃度のＭＴＸに耐性を有する株を取得した。また、得られた発現株をＢ４培地で継代培養することにより無血清馴化を行なった。
上記で取得された形質転換細胞のアリルサルファターゼ活性を測定することにより、ＡＲＳ  Ｄが導入された細胞を選択した。１００ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した細胞を超音波破砕し、約８０００×ｇで５分間遠心分離した上清の蛋白質量をＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて測定した。２ｍｇ／ｍＬ蛋白質濃度に調製した該上清５０μＬとｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｓｕｌｆａｔｅ（ＮＰＳ）基質溶液［２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＰＳを含む１００ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）］５０μＬを混和し、３７℃、４時間反応を行った。該反応液の４１５ｎｍにおける吸光度をＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ  Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて測定し、細胞のアリルサルファターゼ活性を求めた。【０１８７】  結果を、図７−Ｃに示した。ＡＲＳ  Ｄ遺伝子を含まないｐＡＧＥ２１０プラスミドを導入したコントロール細胞株Ｖｅｃｔｏｒ２細胞株およびＡＲＳ  Ｄ遺伝子を含むｐＡＧＥ２１０−ＡＲＳ  Ｄプラスミドを導入した形質転換株Ｄ−ｂ−１００Ｍ細胞株のアリルサルファターゼ活性を比較したところ、形質転換株Ｄ−ｂ−１００Ｍ細胞株は、明らかにアリルサルファターゼ活性を有していることが確認された。【０１８８】（１−４）ＡＲＳ  Ｅ遺伝子導入細胞の造成
ヒト由来ＡＲＳ  Ｅ遺伝子を含むプラスミドｐｃＤＬ−ＳＲ２９６（ＡＲＳＥ）［Ｃｅｌｌ，８１，１５（１９９５）］を制限酵素ＸｈｏＩおよびＣｌａＩで消化し、得られた消化断片をアガロースゲル電気泳動で分離後、約２．５ｋｂのＡＲＳ  Ｅを含む断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用いて抽出した。抽出断片をＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造社製）によりＸｈｏＩとＣｌａＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）に連結した後、コーエンらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，６９，２１１０（１９７２）］により大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体よりプラスミド抽出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてプラスミドを抽出し、ｐＢＳ−ＡＲＳ  Ｅを取得した。ｐＢＳ−ＡＲＳ  ＥをＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、上記と同様にしてＡＲＳ  Ｅを含む断片を得た。該断片を動物細胞発現用ベクターｐＡＧＥ２１０［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］のＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入し、発現プラスミドｐＡＧＥ２１０−ＡＲＳ  Ｅを取得した。【０１８９】 ＦｓｐＩで消化し、線状化したｐＡＧＥ２１０−ＡＲＳ  Ｅを用い、上記（１−１）と同様にＣＨＯ／ＤＧ４４細胞［Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２，５５５（１９８６）］へ導入し、形質転換株を取得した。
得られた形質転細胞を１．２５細胞／ｍＬとなるようＢ４培地で希釈し、９６穴プレートに２００μＬずつ分注し、シングルセルクローニングを行った。さらに、導入遺伝子の増幅を行うため、得られた形質転換細胞を、５０、１００または５００ｎｍｏｌ／ＬのＭｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ（ＭＴＸ）を添加したＢ４培地中で順次３回の継代（約２週間）を行い、各濃度のＭＴＸに耐性を有する株を取得した。また、得られた発現株をＢ４培地で継代培養することにより無血清馴化を行なった。【０１９０】  上記で取得された形質転換細胞のアリルサルファターゼ活性を測定することにより、ＡＲＳ  Ｅが導入された細胞を選択した。ＴＣ緩衝液［１％  ＣＨＡＰＳを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）］に懸濁した細胞を、約８０００×ｇで５分間遠心分離した上清５０μＬとｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｓｕｌｆａｔｅ（ＮＰＳ）基質溶液［２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＰＳ，１％ＣＨＡＰＳを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）］５０μＬを混和し、３７℃、５分間反応を行った。該反応液の４１５ｎｍにおける吸光度をＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ  Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて測定し、細胞の酵素活性を求めた。ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ（ＮＰ）のモル吸光係数をＥ１ｍｍｏｌ／Ｌ＝３２．７とし、５分間に１μｍｏｌ／ＬのＮＰを生産する酵素量を１Ｕｎｉｔとして定義した。また、該上清の蛋白質濃度はＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて測定した。【０１９１】  結果を、図７−Ｄに示した。宿主細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞およびＡＲＳ  Ｅ遺伝子を含むｐＡＧＥ２１０−ＡＲＳ  Ｅプラスミドを導入した形質転換株Ｅ−ａ２１−５０Ｍ細胞株のアリルサルファターゼ活性を比較したところ、形質転換株Ｅ−ａ２１−５０Ｍ細胞株は、明らかにアリルサルファターゼ活性を有していることが確認された。【０１９２】（１−５）ＡＲＳ  Ｆ遺伝子導入細胞の造成
ヒト由来ＡＲＳ  Ｆ遺伝子を含むプラスミドｐｃＤＬ−ＳＲ２９６（ＡＲＳ  Ｆ）［ＧＥＮＯＭＩＣＳ，４２，１９２（１９９７）］を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、得られた消化断片をアガロースゲル電気泳動で分離後、約２ｋｂのＡＲＳ  Ｆを含む断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用いて抽出した。抽出断片をＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造社製）によりＥｃｏＲＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）に連結した後、コーエンらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，６９，２１１０（１９７２）］により大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体よりプラスミド抽出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてプラスミドを抽出し、ｐＢＳ−ＡＲＳ  Ｆを取得した。ｐＢＳ−ＡＲＳ  ＦをＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、上記と同様にしてＡＲＳ  Ｆをコードする遺伝子を含む断片を得た。該断片を動物細胞発現用ベクターｐＡＧＥ２１０［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］のＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入し、発現プラスミドｐＡＧＥ２１０−ＡＲＳ  Ｆを取得した。【０１９３】 ＦｓｐＩで消化し、線状化したｐＡＧＥ２１０−ＡＲＳ  Ｆを用い、上記（１−１）と同様にＣＨＯ／ＤＧ４４細胞［Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２，５５５（１９８６）］へ導入し、形質転換株を取得した。
得られた形質転換細胞を１．２５細胞／ｍＬとなるようＢ４培地で希釈し、９６穴プレートに２００μＬずつ分注し、シングルセルクローニングを行った。さらに、導入遺伝子の増幅を行うため、得られた形質転換細胞を、５０、１００または５００ｎｍｏｌ／ＬのＭｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ（ＭＴＸ）を添加したＢ４培地中で順次３回の継代（約２週間）を行い、各濃度のＭＴＸに耐性を有する形質転換細胞株を取得した。【０１９４】  上記で取得された形質転換細胞株のアリルサルファターゼ活性を測定することにより、ＡＲＳ  Ｆが導入された細胞を選択した。ＴＴＮ緩衝液［１％トリトンＸ−１００，１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む１００ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）］に懸濁した細胞を、約８０００×ｇで５分間遠心分離した上清の蛋白質量をＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて測定した。０．２ｍｇ／ｍＬ蛋白質濃度に調製した該上清２０μＬと４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌｓｕｌｆａｔｅ（ＭＵＳ）基質溶液［０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭＵＳ，１００ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）］２０μＬを混和し、３７℃、５分間反応を行った。該反応液に４ｍｏｌ／Ｌ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ（ｐＨ１０．３）１６０μＬを添加することで反応を停止し、３５５ｎｍ（励起波長）／４６０ｎｍ（蛍光波長）における蛍光強度をＡＲＶＯ  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  ｃｏｕｎｔｅｒ（ＷＡＬＬＡＣ社製）を用いて測定し、細胞の酵素活性を求めた。【０１９５】  結果を、図７−Ｅに示した。宿主細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞およびＡＲＳ  Ｆ遺伝子を含むｐＡＧＥ２１０−ＡＲＳ  Ｆプラスミドを導入した形質転換株Ｆ−ａ３１細胞株のアリルサルファターゼ活性を比較したところ、形質転換株Ｅ−ａ２１−５０Ｍ細胞株は、明らかにアリルサルファターゼ活性を有していることが確認された。【０１９６】（２）抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０４９の反応特異性
上記（１）で造成した各種ＡＲＳ遺伝子導入細胞を用いて抗ヒトＳＴＳモノクローナルＫＭ１０４９のＳＴＳ特異性を以下のように検討した。
上記（１−１）で得られたＡＲＳ  Ａ遺伝子導入細胞および上記（１−２）で得られたＡＲＳ  Ｂ遺伝子導入細胞の無血清培養上清（７．５μＬ／レーン）、実施例１（１）で得られたヒトＳＴＳ遺伝子導入細胞の無細胞抽出液［１００ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した細胞を超音波破砕し、約８０００×ｇで５分間遠心分離した上清の蛋白質５μｇ／レーン］、およびＡＲＳ  Ｄ、ＡＲＳ  Ｅ、ＡＲＳ  Ｆ各遺伝子導入細胞の無細胞抽出液［１００ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した細胞を超音波破砕し、約８０００×ｇで５分間遠心分離した上清の蛋白質、２０μｇ／レーン］をＳＤＳ−ポリアクリル電気泳動にて分画後、ＰＶＤＦ膜に転写した。ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキング後、抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０４９を室温で２時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳでよく洗浄した後、第二抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体〔ダコ社製〕を室温で１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄した後、検出はＥＣＬ−ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（アマシャム社製）を用いて行い、Ｘ線フィルム上に感光させた。
結果を図８に示した。抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０４９はＳＴＳ（ＡＲＳ  Ｃ）以外にも、ＡＲＳ  Ｄ、ＡＲＳ  Ｅ、ＡＲＳ  Ｆに対しても結合することが明らかになった。【０１９７】（３）抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３の反応特異性
上記（１）で造成した各種ＡＲＳ遺伝子導入細胞を用いて抗ヒトＳＴＳモノクローナルＫＭ１０５３のヒトＳＴＳ特異性を、免疫沈降を用いて以下のようにして検討した。
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ  ＣＬ−４Ｂ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）をマイクロチューブ中で蒸留水に膨潤させながら、ビーズの量が約２０μＬになるように目で確認しながら加えた。ボルテックスで攪拌後、氷上で１０分間静置し、ビーズを自然沈降させた後、上清を捨て、再度蒸留水１ｍＬでビーズを洗浄後、卓上簡易遠心機で１２秒間遠心してビーズを沈降させた（以降、ビーズの沈降は同様に卓上簡易遠心機を用いた）。上清を捨て、Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ［０．０５％トゥイーン２０を含む０．１ｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）］を１ｍＬ加え、氷上で１０分間静置した後、ビーズを自然沈降させ、上清を除去した。２μｇの抗ヒトＳＴＳモノクローナルＫＭ１０５３を、ビーズを含む反応液に添加し、ボルテックスで攪拌した。Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒを９８０μＬ加えボルテックスで攪拌後、ローテーターで攪拌しながら４℃で一晩反応させた。ビーズを沈降後、Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  ９８０μＬで２回ビーズを洗浄した。【０１９８】  上記（２）で調製した各アリルサルファターゼ溶液を蛋白質量で一反応当たり１ｍｇとなるように添加し、ボルテックスで攪拌後Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒを最終容量が１ｍＬになるように添加した。また、陰性対照はＷａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒのみ９８０μＬ添加した。攪拌しながら４℃で２時間反応させ、各酵素溶液をビーズに吸着させた。ビーズを沈降し上清を除去後、０．５ｍＬのＷａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒで２回ビーズを洗浄し、さらに０．５ｍＬの０．１ｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ７．５）緩衝液で２回ビーズを洗浄した。ビーズを自然沈降後、上清を除去し、各アリルサルファターゼ溶液が吸着したビーズに１．２倍濃度のＳａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ［７５ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、２．４％ＳＤＳ、６％２−メルカプトエタノール、０．００４５％ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ］６０μＬ添加した。ボルテックスで攪拌後、９５℃で５分間インキュベートした。上清をＳＤＳ−ポリアクリル電気泳動にて分画後、ＰＶＤＦ膜にブロッティングした。ＢＳＡ―ＰＢＳでブロッキング後、抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０４９を室温で２時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳでよく洗浄した後、第二抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体を室温で１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳでよく洗浄した後、検出はＥＣＬ−ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（アマシャム社製）を用いて行い、Ｘ線フィルム上に感光させた。【０１９９】  結果を図９に示した。図９に示すように、抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３による免疫沈降によりヒトＳＴＳのシグナルのみが検出され、図９で認められたＡＲＳ  Ｄ、ＡＲＳ  Ｅ，ＡＲＳ  Ｆのシグナルが消失したことから抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３がＡＲＳ  Ｄ、ＡＲＳ  Ｅ，ＡＲＳ  Ｆに結合しないことが明らかとなった。
（４）抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０４９および抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３のＡＲＳ  Ａ、ＡＲＳ  Ｂに対する交叉反応性の検討
ＡＲＳ  Ａ、ＡＲＳ  ＢおよびＡＲＳ  ＣであるヒトＳＴＳを固層化したバインディングＥＬＩＳＡにより抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０４９および抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３のＡＲＳ  Ａ、ＡＲＳ  Ｂに対する交叉反応性を検討した。動物細胞発現精製ＡＲＳ  Ａ、ＡＲＳ  Ｂおよび実施例１（１）に記載の方法で取得した精製ヒトＳＴＳを２μｇ／ｍＬでプレートに固相化し、実施例１（３）に記載の方法と同様にしてバインディングＥＬＩＳＡを行い、結果を図１０に示した。【０２００】  図１０に示されるように、抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３および抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０４９は、いずれもＡＲＳ  ＡまたはＡＲＳ  Ｂに対する交叉反応性は示さなかった。
上記（２）、（３）および（４）の結果、抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３はヒトＳＴＳ以外のアリルサルファターゼに反応せず、ヒトＳＴＳに特異的なモノクローナル抗体であることが示された。
【実施例４】
【０２０１】ヒトＳＴＳ定量系の構築
（１）抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０４９のビオチン化
抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０４９精製抗体を、ＮＨＳ−Ｌｃ−Ｂｉｏｔｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いてビオチン化した。すなわち、１ｍＬの１ｍｇ／ｍＬの濃度の精製された抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０４９に、２５０μＬの０．５ｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝液（ｐＨ９．２）を加え、２５０μＬの１ｍｇ／ｍＬの濃度のＮＨＳ−Ｌｃ−Ｂｉｏｔｉｎ（１ｍｇ／ｍＬ）を加えて、室温で、３時間撹拌した。ＰＢＳで終夜透析したものを、ビオチン化抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０４９として用いた。【０２０２】（２）ヒトＳＴＳ精製
ヒトＳＴＳ遺伝子導入細胞株ｃｓ３−１細胞より抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３抗体カラムを用いて、以下のようにしてヒトＳＴＳを精製した。【０２０３】  ５ｍＬ容積のＨｉ−Ｔｒａｐ  ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）に、抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３を１０ｍｇカップリングさせた。実施例２（３）で得られたｃｓ３−１細胞（約５０×１０７ｃｅｌｌｓ）はシャーレにて、Ｂ３培地で静置培養を行った。該シャーレをＰＢＳで洗浄した後、セルスクレイパーでシャーレ上の細胞を回収した。これを５０ｍＬのＴＣＳ  ｂｕｆｆｅｒ［１％ＣＨＡＰＳ，０．５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）］で懸濁し、氷上にてマイクロチップをつなげたＵｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ  ＭＯＤＥＬ  ＵＲ−２００Ｐ（ＴＯＭＹ社製）で、出力６にて５秒ごとのｏｎ−ｏｆｆを１０〜１２回繰り返して超音波破砕を行った後、冷却遠心機で１００００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心分離し、その上清を０．４５μｍのフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）に通し、ＴＣＳ  ｂｕｆｆｅｒで平衡化した抗体カラムに、流速２．５ｍＬ／ｍｉｎで通塔し、吸着させた。これを２５ｍＬのＴＣＳ  ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後、ＤｉｏＣ  ｂｕｆｆｅｒ［１０％Ｄｉｏｘａｎｅ，１％ＣＨＡＰＳ，０．５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ１１）］にて溶出した。最初の４ｍＬは廃棄し、次の２６ｍＬを予め１．３ｍＬの１ｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）を分注した容器に回収し、回収と同時に中和した。回収した溶液をｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ５０（ａｍｉｃｏｎ社製）に移し、スイングローターで３０００ｒｐｍ、約２０分間室温にて遠心分離し、約５ｍＬに濃縮されたところで等量のＴＣ  ｂｕｆｆｅｒ［１％ＣＨＡＰＳを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）］を加えさらに遠心分離した。この操作を５回繰り返して脱塩、濃縮を行い、液量が約４ｍＬになったところで、ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ３０（ａｍｉｃｏｎ社製）に移し替え、約１ｍＬになるまで濃縮し、精製ヒトＳＴＳを得た。得られたＳＴＳはＳＴＳ定量系の標準抗原として用いた。【０２０４】（３）ヒトＳＴＳ定量系
９６穴のＥＩＡ用プレートに１０μｇ／ｍＬの濃度の精製した抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３を５０μＬ／穴で分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／穴で加え、室温１時間反応させて残っている活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、上記（２）で取得した精製ヒトＳＴＳあるいはコントロール蛋白質（組換え精製ＩＬ−１β）を１μｇ／ｍＬから作製した２倍希釈系列の溶液を５０μＬ／穴で分注し４℃で一晩反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、上記（１）で調製した１０μｇ／ｍＬの濃度のビオチン化抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０４９を５０μＬ／穴で加えて５０μＬ／穴で分注し、さらにＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後アビジン−ＨＲＰ（ＶＥＣＴＯＲ社製）を５０μＬ／穴で分注し室温、１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液を用いて発色させＯＤ４１５ｎｍの吸光度をプレートリーダー（ＮＪ２００１；日本インターメッド社製）にて測定した。図１１に結果を示した。【０２０５】  図１１に示されるように、抗ヒトＳＴＳモノクローナル抗体ＫＭ１０５３を用いることにより、ヒトＳＴＳを定量することができ、その検出限界濃度は約０．０１μｇ／ｍＬであった。
【産業上の利用可能性】
【０２０６】  本発明によれば、ヒトステロイドスサファターゼ（Ｓｔｅｒｏｉｄ  ｓｕｌｆａｔａｓｅ；以下、ＳＴＳと略記する）と特異的に結合し、ヒトＳＴＳ以外のアリルサルファターゼ（以下、ＡＲＳと略記する）に結合しない抗体または抗体断片、該抗体を生産するハイブリドーマが提供される。また、本発明によれば、該抗体または抗体断片を用いる、ヒトＳＴＳの免疫学的検出方法または免疫学的定量方法、ヒトＳＴＳの免疫学的検出用試薬またはキットおよび免疫学的定量用試薬またはキット、さらには、ヒトＳＴＳ関連疾患を判定、ヒトＳＴＳ関連疾患の治療に適する薬剤の選択およびヒトＳＴＳ関連疾患の病態の判定のための、該抗体または抗体断片を用いる、ヒトＳＴＳの免疫学的検出方法または免疫学的定量方法、ヒトＳＴＳの免疫学的検出用試薬またはキットおよび免疫学的定量用試薬またはキットが提供される。
【配列表フリーテキスト】配列番号１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【図１】
2006059712.tif 000003
【図２】
2006059712.tif 000004
【図３】
2006059712.tif 000005
【図４】
2006059712.tif 000006
【図５】
2006059712.tif 000007
【図６】
2006059712.tif 000008
【図７】
2006059712.tif 000009
【図８】
2006059712.tif 000010
【図９】
2006059712.tif 000011
【図１０】
2006059712.tif 000012
【図１１】
2006059712.tif 000013
【国際調査報告】
2006059712.tif 000014
2006059712.tif 000015
2006059712.tif 000016
2006059712.tif 000017