(57)【要約】環境ＤＮＡの精製方法及び環境ＤＮＡからの機能タンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法を提供する。環境サンプルからＤＮＡを回収し、回収したＤＮＡをゲル濾過クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーに供することで、環境サンプル由来ＤＮＡを精製する。また、環境サンプル由来のＤＮＡのディスプレイライブラリーを作製し、上記ディスプレイライブラリーとリガンドとの相互作用に基づいてスクリーニングすることによって、タンパク質をコードする遺伝子をスクリーニングする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
環境サンプル由来の環境ＤＮＡのディスプレイライブラリーを作製し、
前記ライブラリーとリガンドとの相互作用に基づいてスクリーニングする、
ことを含む、タンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法。
【請求項２】
上記環境サンプル由来の環境ＤＮＡが、
環境サンプルからＤＮＡを回収し、
前記ＤＮＡをゲル濾過クロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィーに供する、
ことを含む環境サンプル由来の環境ＤＮＡの精製方法により精製されたものであることを特徴とする、請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法。
【請求項３】
上記環境サンプル由来の環境ＤＮＡの精製方法が、グラスビーズを用いて環境サンプルを破砕することによりＤＮＡを回収することを特徴とする、請求項２記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法。
【請求項４】
上記環境サンプル由来の環境ＤＮＡの精製方法が、環境サンプルからＤＮＡを回収した後、回収したＤＮＡを部分分解に供することを含む、請求項２記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法。
【請求項５】
上記ゲル濾過クロマトグラフィーにおける排除限界が１０５Ｄａ以上であることを特徴とする、請求項２記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法。
【請求項６】
上記環境サンプル由来の環境ＤＮＡの精製方法において精製したＤＮＡのサイズが０．５〜５Ｋｂｐであることを特徴とする、請求項２記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法。
【請求項７】
上記リガンドが糖類であることを特徴とする、請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法。
【請求項８】
上記糖類がシクロデキストリン、アミロース及びアカボースから成る群より選択されるものであることを特徴とする、請求項７記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法。
【請求項９】
上記スクリーニング前に、リガンドを固定化担体に固定化する工程を含む、請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法。
【請求項１０】
請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法でエンリッチしたＤＮＡ断片を、増幅し、まとめて発現ベクターに移し、宿主に導入し、挿入遺伝子から発現した活性に基づいて目的クローンをスクリーニングする方法。
【請求項１１】
２種以上のリガンドおよび／または担体の組み合わせによる請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法。
【請求項１２】
環境サンプルからＤＮＡを回収し、
前記ＤＮＡをゲル濾過クロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィーに供する、
ことを含む、環境サンプル由来の環境ＤＮＡの精製方法。
【請求項１３】
グラスビーズを用いて環境サンプルを破砕することによりＤＮＡを回収することを特徴とする、請求項１２記載の環境サンプル由来の環境ＤＮＡの精製方法。
【請求項１４】
環境サンプルからＤＮＡを回収した後、回収したＤＮＡを部分分解に供することを含む、請求項１２記載の環境サンプル由来の環境ＤＮＡの精製方法。
【請求項１５】
上記ゲル濾過クロマトグラフィーにおける排除限界が１０５Ｄａ以上であることを特徴とする、請求項１２記載の環境サンプル由来の環境ＤＮＡの精製方法。
【請求項１６】
上記精製したＤＮＡのサイズが０．５〜５Ｋｂｐであることを特徴とする、請求項１２記載の環境サンプル由来の環境ＤＮＡの精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、環境サンプル由来のＤＮＡ（以下、「環境ＤＮＡ」という）の精製方法及び環境ＤＮＡからのタンパク質をコードする遺伝子の効率的なスクリーニング方法に関する。
【背景技術】＜土壌からのＤＮＡ精製＞
従来、遺伝子工学において使用するＤＮＡは、通常、純粋培養した微生物や細胞からの抽出及び精製によって調製される。当該調製の際の夾雑物は、培地や微生物等に由来の物質に限られている。今日では、それら夾雑物からのＤＮＡの精製方法は、種々の場合に応じて確立されている。
以下で使用する「環境」とは、例えば、土壌、汚泥、下水、河川、湖沼、海水、海底、昆虫・動物・植物の個体の組織内部及び表面並びに排泄物などの微生物が生息している環境を意味する。
「環境サンプル」とは、環境から採取したサンプルを意味する。即ち、微生物や細胞等の純粋培養の場合とは異なり、土壌や汚泥等の環境サンプルからＤＮＡを抽出及び精製する場合には、環境サンプルに由来する様々な夾雑物からＤＮＡを分離する必要がある。特に、土壌はフミンと呼ばれる物質を多量に含む。フミンとは、動植物の遺体が微生物分解を受け、その分解物が重合した天然有機物質である。フミンは、通常の化学物質のような単一の分子構造を有していない。フミンの元素構成は、例えば炭素約５８％、水素約４％、窒素１．５〜６．０％であり、残りの大半は酸素で、その他２％以下の灰分等を含んでいる。フミンは、フミン酸、フルボ酸及びヒマトメラン酸に分類され、いずれもアルカリ可溶性である。アルカリ溶液でフミンを抽出し、次いで酸性にし、ｐＨ１での可溶成分がフルボ酸であり、沈殿物をアルコール抽出したアルコール可溶成分がヒマトメラン酸、その不溶成分がフミン酸である。なお、植物体起源のフミン酸は、腐植酸と呼ばれる場合もある。さらに、フミン酸には、海洋や湖沼の動物性プランクトン起源のものも含まれる。
ところで、フミン酸は、ＤＮＡと分子量分布や電荷が似ているために、環境サンプルからＤＮＡを精製する場合にはＤＮＡと挙動を共にし、大きな障害となる。ＤＮＡの精製度は、簡便には、紫外部−可視部の吸光度波形やλ２６０ｎｍ／２８０ｎｍ比及びλ２６０ｎｍ／２３０ｎｍ比で判断できる。ＤＮＡはλ２６０ｎｍに、タンパク質はλ２８０ｎｍに、そしてフミン酸はλ２３０ｎｍに極大吸収がある。ＤＮＡに対してタンパク質やフミン酸の混入が多い場合は、それぞれλ２６０ｎｍ／２８０ｎｍ比及びλ２６０ｎｍ／２３０ｎｍ比が低くなる。ＤＮＡの純度は、目的に応じて選択することができるが、一般的には、純度のよいＤＮＡは、λ２６０ｎｍ／２８０ｎｍ＝１．８〜２．０及びλ２６０ｎｍ／２３０ｎｍ＞２．０である。
今日まで幾つかの土壌サンプル由来のＤＮＡ（以下、「土壌ＤＮＡ」という）の精製方法に関する報告がなされている。それらの報告を、精製プロトコールとともに以下の表１にまとめた。
【表１】
2005121336.tif 000002
表１に示すように、従来の土壌ＤＮＡの精製方法において、精製した土壌ＤＮＡのλ２６０ｎｍ／２８０ｎｍ比及びλ２６０ｎｍ／２３０ｎｍ比は、最高でそれぞれ１．２程度及び１．４程度であり、純度は低い。なお、表１に示す非特許文献３においては、ゲル濾過担体の種類に応じたＤＮＡとフミン酸との分離効果を検討し、セファロース２Ｂが最も有用であることを報告している。
一方、特許文献１には、まずＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ及びポリビニルピロリドンを含むバッファーで土壌を超音波処理して抽出した後、ＴＥバッファーに溶解し、４つの精製プロトコールを用いて土壌ＤＮＡを回収することが記載されている。そして、精製した土壌ＤＮＡをＰＣＲに供することで、純度を評価している。４つのプロトコールのうち、プロトコールＡ（Ｅｌｕｔｉｐ  ｄカラム（陰イオン交換樹脂）のみを使用）及びプロトコールＢ（Ｓｅｐｈａｃｒｌ  Ｓ２００（ゲル濾過）とそれに続いてＥｌｕｔｉｐ  ｄカラムを使用）では、回収不能であるか又はＰＣＲにおいてＰＣＲ産物が検出されなかった。また、プロトコールＤ（Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ４００  ＨＲカラムとそれに続いてＥｌｕｔｉｐ  ｄカラムを使用）では、ＰＣＲにおいてＰＣＲ産物が検出された。
以上のように、従来の土壌ＤＮＡの精製方法において精製された土壌ＤＮＡの純度は、ＰＣＲにおける鋳型として使用できる程度で、未だ不十分であった。
近年、実験室において培養可能な微生物は、土壌などの環境中に存在する全微生物の１％足らずであることが認識されている（非特許文献８）。微生物を培養することなく、直接環境サンプルからＤＮＡを回収して、ライブラリー化することで従来、手付かずであった遺伝子にもアクセス可能となり、有用遺伝子のクローニング機会が飛躍的に増すことが期待できる。そこで、目的とするエンリッチ可能なライブラリー作製に用いることができる高純度の環境ＤＮＡを精製する方法が望まれる。
＜従来の酵素スクリーニング＞
従来の酵素スクリーニングによって微生物から見出された種々の酵素は、食品加工、化成品、医薬、農薬及びバイオマス等の様々な産業で利用されている。さらに、将来的にも、環境負荷軽減の社会的要請に伴い、グリーンケミストリーが提唱されていることから、より多くの工業プロセスへの生体触媒、すなわち、酵素の利用が検討されている（非特許文献９）。
今日、産業で利用されている多くの酵素は、目的とする触媒活性を有する微生物を土壌よりスクリーニングする方法によって単離・同定された。当該スクリーニング方法の共通する手順は、微生物の純粋培養である。個々の微生物を、種々の培地や条件下で培養し、コロニーを無作為に選択する。あるいは、培養後、抗生物質や栄養要求性などの選択的なふるいに供することで所定の微生物を選択する。さらに目的の酵素が微生物の生育に必要不可欠である条件を設定することで、目的の酵素を有する微生物を選択することができる。例えば、耐熱性酵素を得ようとする場合には、１００℃近い環境で生育できる微生物のみを選抜する。一方、低温下で活性の高い酵素を得る場合には、低温下でよく増殖する微生物を選抜する。また、標的とする特定の基質を分解又は変換させることができる酵素を得ようとする場合には、ハローや呈色反応により基質分解を識別できる培地で選択を行う。あるいは、標的とする特定の基質が唯一の炭素源又は窒素源である培地において増殖する微生物を選抜する。
＜従来の酵素スクリーニングの問題点＞
以上のように、従来の酵素スクリーニング方法では微生物の１次スクリーニング工程で、通常、何千、何万のものコロニーについてアッセイし、また微生物の増殖が確認できるまで３週間も要する場合がある。次いで、１次スクリーニング工程で得られた微生物が有する目的の酵素の活性を調べ、十分なレベルの性能を示すものを選択する。さらに、酵素遺伝子を単離する場合には、選択した微生物から酵素遺伝子を単離し、クローニングする必要がある。従って、従来の酵素スクリーニング方法は、かなりの労力と時間を要するという問題がある。
また、上述したように、実験室において培養可能な微生物は、土壌などの環境中に存在する全微生物の１％足らずであると云われていることから、環境中には、培養できない微生物が多く存在する。
＜メタゲノムライブラリー＞
そこで、近年、培養可能な微生物からの酵素スクリーニングに代わり、微生物を培養することなく、微生物を含む環境サンプルを使用することで、目的の遺伝資源にアクセスするアプローチがなされている（特許文献２〜３及び非特許文献１０〜１２）。そのアプローチの概要は、まず土壌などの環境サンプルからＤＮＡを精製する。次いで、精製したＤＮＡを適当なベクターに連結し、適当な宿主に導入したライブラリーを作製する。さらに作製したライブラリーから、目的の遺伝子を有するクローンを探すというものである。環境サンプルからＤＮＡを回収し、作製したライブラリーは、通常の１種の生物に由来するライブラリーとは異なり、多種類の生物に由来する混合ゲノムから成るライブラリーである。環境中の微生物の存在密度は、環境によって異なる。例えば、表層土壌は存在密度が高く、多いところで１ｇの土壌中に１０８〜１０１０個の微生物が存在する（非特許文献１３）。さらに、各微生物種の存在比率には差異があるが、少なくとも数千から１万に及ぶ多様な微生物種が環境では混在する（非特許文献１４）。従って、環境サンプルから作製したライブラリーは、極めて多様で複雑度の高い構成となる。このようなライブラリーは、メタゲノムライブラリーと呼ばれる場合がある（非特許文献１５）。
ところで、従来の遺伝子ライブラリーにおいて重要なパラメーターは、対象となる生物種が有する遺伝子数又はゲノムサイズ及び当該遺伝子数又はゲノムサイズを１００％包含するのに必要とされるライブラリーサイズである。例えば、ある有用なアミラーゼを生産するバシルス属細菌株からアミラーゼ遺伝子をクローニングすべく、遺伝子ライブラリーを作製する。当該細菌株のゲノムサイズが５Ｍｂｐであり、またアミラーゼ遺伝子が分断される場合も考慮すれば、アミラーゼ遺伝子を単離するための遺伝子ライブラリーは、１クローンの平均インサートが５Ｋｂｐとすると、インサート合計が約１０倍の５０Ｍｂｐのライブラリー、すなわち、１０４個の独立クローンを含むように作製すればよい。このように、１種類の生物種が有する遺伝子の中から、目的とする遺伝子の存在が明らかである場合には、遺伝子ライブラリーに含むべきクローン数を決定することができる。
＜従来のメタゲノムライブラリーの問題点＞
一方、メタゲノムライブラリーは、数千種以上の微生物が有する遺伝子を含む複雑度の高い混合ゲノムライブラリーである。従って、メタゲノムライブラリーから目的の遺伝子を単離しようとする場合には、膨大な数のクローンをスクリーニングする必要がある。このように、メタゲノムライブラリーは、これまで未知の機能を有する遺伝子を単離することが期待できる一方で、極めてハイスループットで行うことが重要となる。
既に報告されているメタゲノムライブラリーにおいては、ベクターは、２０Ｋｂｐ〜１００Ｋｂｐの大きなＤＮＡ断片を含むことができるコスミドベクターやＢＡＣベクターが採用されている。大きなＤＮＡ断片を含むことができるベクターを使用した場合には、目的の遺伝子が無傷で回収しやすい。しかしながら、メタゲノムライブラリー中のＤＮＡは、未知の微生物由来である。遺伝子の発現調節に関わる機構は、生物種によって異なることがよく知られている。例えば、開始コドン上流の存在するシャイン−ダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列は１６ＳリボソームＲＮＡ配列と相補的であり、当該配列の開始コドンまでの距離は翻訳開始頻度に影響する。なお、多くの大腸菌遺伝子の上流に存在するシャイン−ダルガルノ配列は、枯草菌中では認識されない。そのため、大腸菌遺伝子は、枯草菌に導入した場合には翻訳されない（非特許文献１６）。このように、異種遺伝子が、他の宿主で発現されるとは限らない。従って、メタゲノムライブラリーのスクリーニング手段が発現タンパク質に依存する場合には、宿主中で転写や翻訳開始シグナルなどが機能する遺伝子だけが発現することとなる。
＜ファージディスプレイライブラリー法およびインビトロ発現法＞
一方、ファージディスプレイライブラリー法は、以下の工程を含む方法である。まず、コートタンパク質に融合した無作為なアミノ酸配列のペプチドをファージ表面上にディスプレイさせる。次いで、ペプチドをディスプレイしたファージ集団から、アフィニティセレクションによってリガンドタンパク質に親和的に結合する配列を有するクローン群を選抜し、増幅する。この選抜と増幅のサイクルを繰り返すことで、目的のクローンをエンリッチする（Ｓ／Ｎ比を上げる）。なお、ファージディスプレイライブラリー法では、ペプチドをディスプレイしたファージとペプチドをコードする遺伝子とが関連している。さらに、ファージは増幅可能であることから、１回の操作で１０１０〜１０１２という多数のクローンを検索できる。ファージディスプレイライブラリーは、約２０年前に発表されて以来、種々の応用がなされている（非特許文献１７）。例えば、ランダムペプチドライブラリーを用いて、抗体のエピトープの同定又は新規な生理活性を有するオリゴペプチドの探索がなされている。また、抗体ライブラリーを用いて、短期間にモノクローナル抗体が取得される。さらに、抗体ライブラリーを用いて、より親和性の高い抗体が創出されている。あるいは、酵素変異体ライブラリーから酵素を得る試みがなされている。さらに、クローン増幅可能なコンビナトリアルライブラリー技術としてはファージに限らず、リボソームディスプレイ（非特許文献１８）に代表される、より多様度が高いｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写翻訳系での発現をベースとした方法にも採用されている。
【特許文献１】特表２００３−５２０５７８号公報
【特許文献２】特表２０００−５１３９３３号公報
【特許文献３】特表２００１−５２００５５号公報
【非特許文献１】Ｃ．Ｊｏｅ−Ｃｈａｎら，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３４（３）：２２９，１９９６
【非特許文献２】Ｄ．Ｎ．Ｍｉｌｌｅｒら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６５（１１）：４７１５，１９９９
【非特許文献３】Ｄ．Ｎ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，４４，４９，２０００
【非特許文献４】Ｃ．Ｓｃｈａｂｅｒｅｉｔｅｒ−Ｇｕｒｔｎｅｒら，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，４５：７７，２００１
【非特許文献５】Ｈ．Ｂｕｒｇｍａｎｎら，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，４５：７，２００１
【非特許文献６】Ｄ．Ａ．Ｓａｎｔｏｓａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７：５９，２００１
【非特許文献７】Ｅ．Ｍ．Ｊａｍｅｓら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｅｃｏｌ．，３６：１３９，２００１
【非特許文献８】Ａｍａｎｎ  ＲＩ，Ｌｕｄｗｉｇ  Ｗ，Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ  ＫＨ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．，５９（１）：１４３−６９，１９９５
【非特許文献９】太田博道，「生体触媒とグリーンケミストリー」，ケミカルエンジニヤリング，ｖｏｌ．４６，ｎｏ．７，ｐ４９−５３，２００１
【非特許文献１０】Ｒｏｎｄｏｎ，Ｍ．Ｒ．ら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６６（６）：２５４１−７，２０００
【非特許文献１１】ＭａｃＮｅｉｌ，Ｉ．Ａ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３（２）：３０１−８，２００１
【非特許文献１２】Ｋｎｉｅｔｓｃｈ  Ａ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５（１）：４６−５６，２００３
【非特許文献１３】今中忠行監修「微生物利用の大展開」エヌ・ティー・エヌ，ｐ．２５０−２５４，２００２
【非特許文献１４】Ｔｏｒｓｖｉｋ  Ｖ．ら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５６（３）：７８２−７，１９９０
【非特許文献１５】Ｈａｎｄｅｌｓｍａｎ  Ｊ，Ｒｏｎｄｏｎ  ＭＲ，Ｂｒａｄｙ  ＳＦ，Ｃｌａｒｄｙ  Ｊ，Ｇｏｏｄｍａｎ  ＲＭ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，５（１０）：Ｒ２４５−９，１９９８
【非特許文献１６】Ｂａｎｄ  Ｌ，Ｈｅｎｎｅｒ  ＤＪ．，ＤＮＡ．，３（１）：１７−２１，１９８４
【非特許文献１７】Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２（５）：６６８−７３，１９９１
【非特許文献１８】Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃ．，Ｂｈａｔｔ，Ｒ．Ｒ．及びＤｏｗｅｒ，Ｗ．Ｊ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９１，ｐ．９０２２，１９９４
【発明の開示】
上述したように、従来の土壌ＤＮＡの精製方法により精製された土壌ＤＮＡは、種々の遺伝子工学的処理に使用するには未だ純度が不十分であった。そこでファージパッケージング反応やインビトロ転写翻訳系のような夾雑物感受性の高い反応にも使用可能な高純度環境ＤＮＡを調製する。一方、メタゲノムライブラリー中の遺伝子は、未知の微生物に由来するので、使用した宿主中で発現するか否かは不明であった。そのため、メタゲノムライブラリーにおける遺伝子の中には、発現効率が低いもの又は発現しないものが存在するという問題があった。さらに、メタゲノムライブラリーをスクリーニングする際には、膨大な数のクローンをスクリーニングする必要があり、効率的に行うことが望まれる。
そこで、本発明は、上述した実状に鑑み、環境サンプルから夾雑物を除き、高純度の環境ＤＮＡを精製する方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、環境ＤＮＡを用いてディスプレイライブラリーを作製し、当該ディスプレイライブラリーからタンパク質をコードする遺伝子を効率的にスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、環境サンプルからＤＮＡを回収し、ＤＮＡをゲル濾過クロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィーに供することで、高純度の環境サンプル由来の環境ＤＮＡを得ることができることを見出した。さらに、環境サンプル由来の環境ＤＮＡのファージディスプレイライブラリーやインビトロ発現ライブラリーを作製し、上記ライブラリーとリガンドとの相互作用に基づいてスクリーニングすることにより、タンパク質をコードする遺伝子を効率的にスクリーニングできることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下を包含する。
（１）環境サンプル由来の環境ＤＮＡのディスプレイライブラリーを作製し、前記ライブラリーとリガンドとの相互作用に基づいてスクリーニングすることを含む、タンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法。
（２）上記環境サンプル由来の環境ＤＮＡが、環境サンプルからＤＮＡを回収し、前記ＤＮＡをゲル濾過クロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィーに供することを含む環境サンプル由来の環境ＤＮＡの精製方法により精製されたものであることを特徴とする、（１）記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法。
（３）上記環境サンプル由来の環境ＤＮＡの精製方法が、グラスビーズを用いて環境サンプルを破砕することによりＤＮＡを回収することを特徴とする、（２）記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法。
（４）上記環境サンプル由来の環境ＤＮＡの精製方法が、環境サンプルからＤＮＡを回収した後、回収したＤＮＡを部分分解に供することを含む、（２）記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法。
（５）上記ゲル濾過クロマトグラフィーにおける排除限界が１０５Ｄａ以上であることを特徴とする、（２）記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法。
（６）上記環境サンプル由来の環境ＤＮＡの精製方法において精製したＤＮＡのサイズが０．５〜５Ｋｂｐであることを特徴とする、（２）記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法。
（７）上記リガンドが糖類であることを特徴とする、（１）記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法。
（８）上記糖類がシクロデキストリン、アミロース及びアカボースから成る群より選択されるものであることを特徴とする、（７）記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法。
（９）上記スクリーニング前に、リガンドを固定化担体に固定化する工程を含む、（１）記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法。
（１０）（１）記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法でエンリッチしたＤＮＡ断片を、増幅し、まとめて発現ベクターに移し、宿主に導入し、挿入遺伝子から発現した活性に基づいて目的クローンをスクリーニングする方法。
（１１）２種以上のリガンドおよび／または担体の組み合わせによる（１）記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法。
（１２）環境サンプルからＤＮＡを回収し、前記ＤＮＡをゲル濾過クロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィーに供することを含む、環境サンプル由来の環境ＤＮＡの精製方法。
（１３）グラスビーズを用いて環境サンプルを破砕することによりＤＮＡを回収することを特徴とする、（１２）記載の環境サンプル由来の環境ＤＮＡの精製方法。
（１４）環境サンプルからＤＮＡを回収した後、回収したＤＮＡを部分分解に供することを含む、（１２）記載の環境サンプル由来の環境ＤＮＡの精製方法。
（１５）上記ゲル濾過クロマトグラフィーにおける排除限界が１０５Ｄａ以上であることを特徴とする、（１２）記載の環境サンプル由来の環境ＤＮＡの精製方法。
（１６）上記精製したＤＮＡのサイズが０．５〜５Ｋｂｐであることを特徴とする、（１２）記載の環境サンプル由来の環境ＤＮＡの精製方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る環境サンプル由来の環境ＤＮＡの精製方法は、環境サンプルからＤＮＡを回収し、ＤＮＡをゲル濾過クロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィーに供することを含む方法である。本発明に係る環境ＤＮＡの精製方法によれば、高純度の環境ＤＮＡを得ることができる。
本発明において「環境」とは、例えば、土壌、汚泥、下水、河川、湖沼、海水、海底、昆虫・動物・植物の個体の組織内部及び表面並びに排泄物などの微生物が生息している環境を意味する。
本発明において「環境サンプル」とは、環境から採取したサンプルであり、更に土壌、汚泥、海底等から採取したサンプルであることが好ましく、特にフミン酸を含有するものが好ましい。また、環境サンプルとは、環境から採取したサンプルに培地等を添加して培養したものではないものが好ましい。
本発明において「環境ＤＮＡ」とは、環境サンプルから得たＤＮＡを意味する。
本発明において「土壌ＤＮＡ」とは、環境サンプル中における土壌サンプルから得たＤＮＡを意味する。
本発明において「ディスプレイライブラリー」とは、ファージディスプレイライブラリーおよびインビトロ発現ライブラリーを意味する。
本発明において「粉砕」とは、環境サンプルが塊状である場合、この塊状を細かくすることを含むが、環境サンプル中の微生物等の細胞中からＤＮＡを細胞外に放出させる操作を意味する。
本発明に係る環境ＤＮＡの精製方法においては、まず、環境サンプルからＤＮＡを回収する。この方法について概要を記載する。
環境サンプルが塊状である場合にはよく破砕する。また、環境サンプル中に存在する微生物中のＤＮＡを抽出することができれば如何様な手段を用いてもよい。例えば、ＤＮＡ抽出手段として粉砕が挙げられる。この破砕手段としては、例えば、ビーズビーティング、ソニケーション等を用いることができる。
次いで、環境サンプルを適当量（例えば、環境サンプルと等量）のバッファーに懸濁する。バッファーとしては、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌやＰＢＳ等が挙げられる。なお、バッファーのｐＨは、中性から弱アルカリ、すなわち、ｐＨ７〜９が好ましく、より好ましくはｐＨ７〜８とする。また、バッファーの塩濃度は、０．１Ｍ〜２Ｍが好ましく、より好ましくは１Ｍ〜２Ｍとする。さらにバッファーにＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０等の界面活性剤を添加することで、環境サンプルの分散をよくすることができる。
次に、上記懸濁液に対して、グラスビーズを環境サンプルに加えて粉砕処理を行う。このグラスビーズの使用量は、環境サンプルに対し１／３〜２倍重量が好ましく、より好ましくは１／２〜同重量である。添加するグラスビーズの粒径は、５０〜１０００μｍが好ましく、１００μｍ〜５００μｍであることがより好ましい。
懸濁液及びグラスビーズを含む容器を密閉し振盪攪拌する。ビーズは硬質であればグラス以外の材質でもよい。当該操作により、環境サンプルに含まれる微生物の菌体を破砕することができる。あるいは、フレンチプレスや超音波処理等に供することで、微生物などの菌体を破砕してもよい。
環境サンプルに含まれる微生物の菌体を破砕した後に、例えば、遠心分離又は濾過により、環境ＤＮＡを含む上清を回収する。回収した上清をフェノール処理やエタノール沈殿等の一般的な方法に供することで、上清に含まれるタンパク質を除去し、環境ＤＮＡを抽出することができる。あるいは、上記において、懸濁液をグラスビーズとともに振盪攪拌した場合には、振盪攪拌後、懸濁液の塩濃度を１Ｍ〜２Ｍの高濃度に換えることで、ガラスビーズに環境ＤＮＡを吸着させる。吸着後、環境ＤＮＡが吸着したガラスビーズを洗浄し、ＤＮＡ溶出処理することで、環境ＤＮＡを回収することができる。このことから環境ＤＮＡを吸着できるガラスビーズを用いることにより、環境サンプルから容易に環境ＤＮＡを得ることができる。このことから、本発明において、このようなガラスビースを用いることがより好ましい。
本発明に係る環境ＤＮＡの精製方法において、回収した環境ＤＮＡをさらに低分子化する場合には、回収した環境ＤＮＡをデオキシリボヌクレアーゼ（以下、「ＤＮアーゼ」という）と反応させることで、部分分解してもよい。ＤＮアーゼとしては、タイプＩヌクレアーゼのような特異性の低いものが好ましく、例えば、ＤＮアーゼＩが挙げられる。あるいは、環境ＤＮＡを超音波処理に供し、物理的に環境ＤＮＡをせん断することで、低分子化してもよい。なお、部分分解の条件は、最終的に精製した際に、目的とするＤＮＡサイズが得られる条件を選択する。例えば、ＤＮアーゼＩを使用して、２Ｋｂｐサイズの環境ＤＮＡ断片が多く得られるための条件は、以下の表２に示す反応条件が挙げられる。
【表２】
2005121336.tif 000003
一方、本発明に係る環境ＤＮＡの精製方法では、回収した環境ＤＮＡをゲル濾過クロマトグラフィーに供する。ゲル濾過クロマトグラフィーにおける排除限界は、デキストラン換算で、１０５Ｄａ以上、好ましくは５ｘ１０６Ｄａ以上であることが好ましい。ゲル濾過クロマトグラフィーに使用する、ゲル濾過担体及び／又はカラムとしては、例えば、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００ＨＲ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００ＨＲ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−５００ＨＲ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ４Ｂ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ６Ｂ、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６及びＳｕｐｅｒｏｓｅ１２などが挙げられる。さらに、上記排除限界を有するものであれば、高速液体クロマトグラフィー（以下、「ＨＰＬＣ」という）用の担体及び／又はカラムを用いてもよい。
ゲル濾過クロマトグラフィーで使用するバッファーとしては、例えば、ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）、ＴＥＳ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．２Ｍ  ＮａＣｌ）等が挙げられる。
環境ＤＮＡをゲル濾過クロマトグラフィーに供した後、溶出することで得られた画分が環境ＤＮＡを含むか否かは、例えば、画分の一部をアガロースゲル電気泳動に供することで確認することができる。また、得られた画分の環境ＤＮＡの純度溶出位置は、画分の吸光度を測定し、紫外部−可視部の吸光度波形、λ２６０ｎｍ／２８０ｎｍ比及びλ２６０ｎｍ／２３０ｎｍ比で判断することができる。各画分の一部をアガロースゲル電気泳動に供し、目的のサイズの環境ＤＮＡを含む画分を選択してもよい。
本発明に係る環境ＤＮＡの精製方法では、さらに環境ＤＮＡの純度を上げるために、ゲル濾過クロマトグラフィーによって得られた環境ＤＮＡを含む画分をイオン交換クロマトグラフィーに供してもよい。樹脂はＤＥＡＥのような弱陰イオン交換樹脂を用いることが好ましい。例えば、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２Ｍ  ＮａＣｌ程度の低イオン強度のバッファーで環境ＤＮＡを吸着させ、同バッファーで塩濃度０．５Ｍ  ＮａＣｌ程度のもので環境ＤＮＡ以外の不純物を洗浄除去し、同バッファーで塩濃度１．０Ｍ  ＮａＣｌ程度のもので環境ＤＮＡを溶出する。
イオン交換クロマトグラフィーに供した後、得られた環境ＤＮＡの純度は、吸光度を測定し、紫外部−可視部の吸光度波形、λ２６０ｎｍ／２８０ｎｍ比及びλ２６０ｎｍ／２３０ｎｍ比で判断することができる。λ２６０ｎｍ／２８０ｎｍ比が１．８〜２．０である場合に、及び／又はλ２６０ｎｍ／２３０ｎｍ比が２．０以上である場合に、フミン酸及びタンパク質等の夾雑物から環境ＤＮＡを分離でき、純度の高い環境ＤＮＡが得られたと判断することができる。
本発明に係る環境ＤＮＡの精製方法では、ゲル濾過クロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーとの順番を上記記載と逆にしてもよく、単独で用いてもよい。本発明に係る環境ＤＮＡの精製方法において、ゲル濾過クロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーとを用いるものが好ましい。
本発明に係る環境ＤＮＡの精製方法では更にサイズを限定する場合には、アガロースゲル電気泳動後にゲルからＤＮＡ断片を切り出し、市販のスピンカラム、例えばキアゲン（株）のＱＩＡ  ｑｕｉｃｋで精製することができる。
本発明に係る環境ＤＮＡの精製方法では、例えば、環境ＤＮＡのサイズが０．５ｋｂｐ〜５ｋｂｐとなるように精製することができ、更に好ましくは０．６〜４ｋｂｐであり、特に好ましくは０．８〜３ｋｂｐである。
以上のように、本発明に係る環境ＤＮＡの精製方法によれば、純度の高い環境ＤＮＡを得ることができる。遺伝子ライブラリーの作製のための遺伝子工学的な処理、例えば制限酵素処理、ＰＣＲ、連結、形質転換、ファージ粒子へのパッケージング及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写翻訳などの種々の反応においては、夾雑物の影響を受けやすい。本発明に係る環境ＤＮＡの精製方法によって得られた環境ＤＮＡは、純度が高いので、上述した種々の反応において不都合なく使用することができる。
一方、本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法（以下、「本発明に係るスクリーニング方法」という）は、環境ＤＮＡのディスプレイライブラリーを作製し、上記ディスプレイライブラリーとリガンドとの相互作用に基づいてリガンド認識クローン群をエンリッチしてスクリーニングすることを含む方法である。本発明に係るスクリーニング方法によれば、リガンドを認識するタンパク質をコードする遺伝子を環境ＤＮＡの中より、多数のクローンを一括して検索することができるので、短期間で省力的にスクリーニングすることができる。ここで、「タンパク質をコードする遺伝子」とは、活性や機能を有するタンパク質をコードする遺伝子又は遺伝子断片を意味する。
本発明に係るスクリーニング方法で使用する環境ＤＮＡとしては、例えば上述した本発明に係る環境ＤＮＡの精製方法で精製された環境ＤＮＡが挙げられる。
本発明に係るスクリーニング方法では、まず環境ＤＮＡのディスプレイライブラリーを作製する。
ディスプレイライブラリーから所望のクローンを選抜する方法として、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法（Ｌ．Ｃ．Ｍａｔｔｈｅｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９１，ｐ．９０２２，１９９４）、エマルジョン法（Ｔａｗｆｉｋ  Ｄ．Ｓ．＆  Ｇｒｉｆｆｔｈ，Ａ．Ｄ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６，ｐ．６５２−６５６，１９９８．）、ＳＴＡＢＬＥ法（Ｄｏｉ，Ｎ．ａｎｄ  Ｙａｎａｇａｗａ，Ｈ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４５７，ｐ．２２７−２３０，１９９９）、インビトロウイルス法（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｗ  ＆  Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９４，ｐ．１２２９７）等が挙げられる。
ディスプレイライブラリーの作製においては、まず環境ＤＮＡをベクターに連結させる。このベクターとして使用できるものとしては、λ系ファージ、Ｔ７系ファージ、Ｍ１３系ファージ及びＴ４系ファージ等が挙げられる。
環境ＤＮＡをベクターに挿入するには、適当な制限酵素で環境ＤＮＡを切断し、次いでこれを適当なベクターＤＮＡの制限酵素切断部位又はマルチクローニングサイトに挿入して、ベクターに連結する方法が挙げられる。環境ＤＮＡを平滑末端化し、ベクターの制限酵素切断部位又はマルチクローニングサイトに適合するようにアダプターを連結することもできる。
また、ベクターにおいて、宿主で発現し得るタンパク質をコードする遺伝子の内部あるいは当該タンパク質のＮ末端又はＣ末端をコードする塩基配列に環境ＤＮＡを挿入することもできる。例えば、ファージディスプレイライブラリーにおいては、ファージ中のコートタンパク質をコードする遺伝子の内部あるいは当該コートタンパク質のＮ末端又はＣ末端をコードする塩基配列に環境ＤＮＡを挿入する。このことにより、環境ＤＮＡによってコードされるタンパク質又はペプチドをコートタンパク質との融合タンパク質として、ファージ上に提示させることができる。従って、環境ＤＮＡによってコードされるタンパク質又はペプチドはファージ上に提示される。
さらにベクターは、環境ＤＮＡの他に、例えば、遺伝子発現制御領域、レポーター遺伝子及び選択マーカーを含むことができる。遺伝子発現制御領域としては、例えば、プロモーター、翻訳開始シグナル、エンハンサーなどのシスエレメント等が挙げられる。レポーター遺伝子としては、例えば、ＧＦＰやルシフェラーゼのような蛍光、発光遺伝子、利用しやすい抗体の抗原となるタンパク質遺伝子等が挙げられる。選択マーカーとしては、例えば、Ａｍｐｒ、Ｔｅｔｒ、Ｃｍｒ、Ｋｍｒ、ＡＵＲ１−Ｃ等の抗生物質耐性遺伝子等が挙げられる。なお、遺伝子発現制御領域、レポーター遺伝子及び選択マーカー等のベクターへの挿入方法は、上述した環境ＤＮＡのベクターの挿入方法と同様である。
次いで、環境ＤＮＡを含む組換えベクターを、宿主中に導入することにより、形質転換体を得ることができる。宿主としては、上記組換えベクターを増殖させることができるものであれば特に限定されるものではない。
細菌への上記組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されない。例えば、ファージ感染、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
次いで、形質転換体を増殖させることで、環境ＤＮＡを含む組換えベクターを増幅することができる。
なお、組換えベクターに使用したベクターがλファージ、Ｔ７ファージ及びＴ４ファージなどのファージＤＮＡである場合には、パッケージング反応終了後に、大腸菌等の宿主に感染させることで、形質転換することができる。次いで、形質転換した大腸菌を増殖させることで、組換えファージＤＮＡを増幅させることができる。次いで、宿主を溶菌させることで、増幅したファージを得ることができる。
ファージディスプレイライブラリーでは、増幅したファージをそのままライブラリーとして使用することができる。ファージディスプレイライブラリーにおいて、ファージが環境ＤＮＡを有するか否かは、プラークＰＣＲ等のＰＣＲにより確認することができる。
インビトロ発現ライブラリーにおいては、細胞は用いずに細胞抽出液を用いて鋳型ＲＮＡから翻訳または鋳型ＤＮＡから転写翻訳を行わせライブラリーとする。環境ＤＮＡは細胞抽出液中でタンパク質として発現できるよう、プラスミドベクターと連結したり、プロモーターや翻訳開始信号を保有し、融合タンパク質相手をコードするＤＮＡ断片と連結して鋳型として用いる。
一方、本発明に係るスクリーニング方法では、環境ＤＮＡのディスプレイライブラリーに対する対象のリガンドを固定化担体に固定化することができる。あるいは、対象のリガンドを標識化することができる。
本発明に係るスクリーニング方法において、リガンドとしては、例えば多糖類、タンパク質、脂質等のような高分子の酵素基質；ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＦＭＮ、ＳＡＭ、アセチルＣｏＡ、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ｃＡＭＰ、ＧＳＴ、リボフラビン等のような補酵素；アミラーゼインヒビター、プロテアーゼインヒビター等の酵素インヒビター；糖、アミノ酸、脂肪等のような低分子酵素基質；生体内代謝産物；医薬品等の薬物等が挙げられる。特に、リガンドとしては、シクロデキストリン、アミロース及びアカボース等の糖類が挙げられる。
例えば、環境ＤＮＡのディスプレイライブラリーから、酵素又は酵素断片をスクリーニングする場合には、基質や補酵素や阻害剤をリガンドとする。なお、活性の高い加水分解酵素をスクリーニングする場合には、リガンドとは結合するが、リガンドが分解されない条件でスクリーニングを行う。さらに、デンプンやセルロースのような不溶性粒子をリガンドとする場合には、当該リガンドをそのまま固相として使用することができる。
２種以上のリガンドビーズや担体の使用を組み合わせて、両方のリガンドを認識する集団や片方のリガンドのみ認識する集団の選抜、または担体自体に結合するものの除去を行うことができる。
固定化担体としては、例えば、アガロースビーズ、イムノビーズ、親水性ビーズ及び磁性ビーズなどのビーズ、並びに酵素免疫測定法（ＥＩＡ）用のプレート等が挙げられる。あるいは、既に様々な物質を担持した市販のアガロースビーズ（例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）をそのまま使用することもできる。その場合には、当該アガロースビーズに担持された物質がリガンドとなる。
本発明に係るスクリーニング方法では、固定化担体に対して対象のリガンドを相互作用させ、当該対象のリガンドと固定化担体とを結合させる。例えば、固定化担体表面に配したアミノ基、カルボキシル基、水酸基、エポキシ基及びトシル基などの官能基を利用して、リガンドを共有結合させることができる。固定化担体の官能基がカルボキシル基である場合、例えば固定化対象のリガンドに存在するアミノ基と官能基との間で共有結合を形成、すなわちアミンカップリングを形成することができる。また、固定化担体の官能基がカルボキシル基である場合、カルボキシル基をＰＤＥＡ化することにより、対象のリガンドに存在する遊離のチオール基と反応基との共有結合を形成、すなわちリガンドチオールカップリングを形成することができる。さらに、対象のリガンドがカルボキシル基を有する場合、予め当該リガンドをＰＤＥＡ（２−（２−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｅｔｈａｎｅａｍｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）と反応させてカルボキシル基をＰＤＥＡ化する。また、固定化担体のカルボキシル基を活性化させた後に、当該カルボキシル基をｃｙｓｔａｍｉｎｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅと反応させ、その後ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ）で還元することによりチオール基に変換する。そして、ＰＤＥＡ化したカルボキシル基と、固定化担体側のチオール基との間で共有結合（ジスルフィド結合）を形成する。すなわち、サーフェスチオールカップリングを形成することができる。
また、本発明に係るスクリーニング方法では、対象のリガンドを標識化することで、当該標識に基づいてリガンドに結合したクローンを溶出することができる。標識化としては、例えば、ビオチン化や蛍光物質等による標識が挙げられる。例えば、対象のリガンドをビオチン化し、溶液中でリガンドとディスプレイライブラリーとを相互作用させる。次いで、ストレプトアビジンビーズを用いて、当該リガンドに結合したクローンを溶出することができる。
本発明に係るスクリーニング方法では、ディスプレイライブラリーとリガンドとの相互作用に基づいてスクリーニングする。ここで相互作用とは、ディスプレイライブラリーとリガンドとの親和的結合や酵素反応等を意味する。スクリーニングは、アフィニティーセレクションにより行われる。アフィニティーセレクションは、結合反応、洗浄及び溶出等の工程より成る。
バッファーには、ＥＩＡと同様に疎水性相互作用によるノイズを軽減するために、０．０５〜１％程度のＴｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００及びＮＰ−４０などの非極性界面活性剤を添加することができる。バッファーのｐＨは、ｐＨ２〜１２の範囲で目的に応じて一般的な生化学バッファーを選択すればよい。例えば、ファージディスプレイライブラリー中のファージの生存が許容できないバッファーのｐＨの範囲であっても、１サイクルのみのアフィニティーセレクションは可能である。
一方、リガンドを担持する固定化担体は、必要に応じて、０．１〜５％程度のＢＳＡ、スキムミルク、ゼラチン又はコラーゲンなどのタンパク質性ブロッキング剤中で１時間以上置き、ブロッキングする。低分子リガンドによってはブロッキングしない方が好ましい場合もある。
アフィニティーセレクションにおいての結合反応は、目的に応じて−１０℃〜８０℃で行うことができる。また、この結合反応の反応時間は、目的とする結合特性やＫｏｎ値に応じて１分〜２４時間の間で行えばよい。通常、ファージディスプレイライブラリーは、大腸菌等の宿主に感染させ、この宿主が溶菌した溶菌液を用いて操作する。この溶菌液中にリガンドとの結合反応を阻害するような物質が含まれている場合は、適当な孔サイズのゲル濾過膜又は透析により当該阻害物質を除去し、バッファーを置換することにより使用することができる。あるいは、この溶菌液中のファージをポリエチレングリコール等で沈殿させ、上清を交換したものを用いてもよい。
アフィニティーセレクションにおいて洗浄は、リガンドを担持する固定化担体の体積の１０倍〜５０倍程度の洗浄バッファーで１分以上混合し、バッファーを交換する。この交換の回数は、例えば１回〜２０回とすることができる。洗浄バッファーの除去は、リガンドを担持する固定化担体の遠心沈殿または遠心フィルター後、吸引除去などで行う。あるいは、フィルターユニットとスピンカラムまたはバキュアム方式によって洗浄バッファーを除去してもよい。また２相分配法や磁気ビーズを利用した洗浄もできる。
一方、アフィニティーセレクションにおいて溶出は、一般的には、対象のリガンドと競合するリガンド溶液を用いて、温和な条件で競合的に溶出するのが好ましい。必要に応じて対象のリガンドとディスプレイライブラリー中のクローンとの相互作用を壊すような、強い条件、例えば低いｐＨ若しくは高いｐＨ、高温下若しくは低温下、又は尿素や界面活性剤等を含むバッファーで溶出することも可能である。また溶出剤が以後の操作で宿主に不都合な場合は溶出操作は行わず、ビーズに結合したまま、宿主細菌に添加することもできる。
この溶出液は、通常はクローン増幅に供する。また、選択性を向上させるために更に異なるリガンドを用いてアフィニティーセレクションを行ってもよい。
ファージディスプレイライブラリーより得られた溶出液中のファージクローンは、大腸菌などの宿主に感染させることで増幅することができる。なお、溶出液に対象のリガンドを含む場合又は対象のリガンドと競合する溶液を用いた場合は、増幅サイクルを阻害するので、ファージクローンを宿主に感染後、ファージ感染宿主を遠心分離することによりこれを除去することができる。あるいは、ファージ感染宿主を溶菌した後、溶菌液からバッファー置換により、リガンド又はリガンドと競合する溶液を除去することができる。ファージクローンの増幅は、溶菌液のファージ力価をモニターすることにより確認することができる。
一方、ファージを利用しないディスプレイライブラリーの場合には、ＰＣＲ等により遺伝子増幅を行う。
ファージクローンの増幅又は遺伝子のＰＣＲ等による増幅後、ファージクローン又はＰＣＲ等の産物を鋳型としたプラークＰＣＲ等のＰＣＲにより、スクリーニングされた環境ＤＮＡを増幅する。次いで、この増幅したものをアガロースゲル電気泳動に供することで、環境ＤＮＡを確認することができる。さらに、環境ＤＮＡの配列決定分析により、環境ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
本発明に係るスクリーニング方法において、ディスプレイライブラリーがファージディスプレイライブラリーを用いた場合には、環境ＤＮＡから発現されるタンパク質やペプチドは、ファージ表面上に融合タンパク質として提示される。得られた環境ＤＮＡは、完全なコーディング配列ではなく、通常、Ｎ末端配列又はＣ末端配列を一部欠いている場合がある。そこで、得られたファージクローンが有する環境ＤＮＡの配列情報から、完全なコーディング領域を得るために、ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）と同様の手順で、上流もしくは下流のコーディング領域を補う必要がある。スクリーニング前のファージディスプレイライブラリーには、非翻訳領域があるために融合しなかったクローンも含まれている。そのため、上流もしくは下流のコーディング領域の配列情報を得るためには、クローンから得た配列情報に基づいて、外側に向かうプライマーとアダプター配列又はファージＤＮＡ配列を含むプライマーとを用いて、スクリーニング前のファージディスプレイライブラリーＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う。
このようにして上流又は下流のコーディング領域が得られたら、例えば、切りつなぎやリコンビナントＰＣＲ法（Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．，「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＰＣＲ」，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐ．１７７−１８３，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９０）によって連結し、完全なコーディング領域を得ることができる。
また、得られたファージクローンが有する環境ＤＮＡの配列情報を、塩基配列レベル又はアミノ酸配列レベルで遺伝子データベースと照合し、相同性分析を行うことで、当該環境ＤＮＡがコードするタンパク質の機能又は活性を予測することができる。
環境ＤＮＡから遺伝子又は遺伝子断片を単離し、同定した場合には、上述したように、当該遺伝子又は遺伝子断片を宿主に導入することで、形質転換体を得る。形質転換体において当該遺伝子又は遺伝子断片がコードするタンパク質又はペプチドを発現させることで、当該タンパク質又はペプチドが有する機能や活性を調べることができる。
エンリッチされた集団の中には、完全なコーディング領域ではなくとも触媒活性を発揮できる領域を保持したクローンが含まれていることがある。更に省力化できる手法として、エンリッチされた集団のインサートに対して、アダプター配列かベクター配列のような共通配列のプライマーを用いてまとめてＰＣＲ法などで増幅する。そして、これを適当な細胞内発現ベクターまたは分泌発現ベクターに連結し、形質転換体をまとめて得て、エンリッチされたミニ発現ライブラリーとすることもできる。これらを、従来法のように目視で選抜できるような試薬を含む寒天培地で活性クローンを選抜することができる。従来法と異なる点は、既に特定リガンドを認識して結合するクローン集団として例えば１０００倍程度、エンリッチされている点で、目的クローンの頻度向上が期待できる。
活性の検出方法としては、次のようにすることができる。例えば、糖やタンパク質や脂肪の加水分解活性を探す場合は、デンプン、カゼイン、油脂などの水不溶性基質を培地に混合して培養し、分解されたクリアーゾーンまたはハローを探す。その他、従来の酵素スクリーニングに用いられる、ｐＨ指示薬や種々の酵素活性測定用の呈色反応、蛍光反応、発光反応試薬、抗体などが利用できる。
以上のように本発明に係るスクリーニング方法によれば、環境ＤＮＡから作製したディスプレイライブラリーから目的のタンパク質をコードする遺伝子を効率的にスクリーニングすることができる。本発明に係るスクリーニング方法においてファージディスプレイライブラリーを採用した場合には、リガンドと結合したファージクローン群を濃縮し、増幅することができる。従って、目的のタンパク質をコードする遺伝子を選抜する際の労力と時間が大幅に節約することができる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００４−１７０１６１号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１Ａは、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎで回収した陽性対照である純粋ＤＮＡ標品（λファージ）の吸光度波形を示す。
図１Ｂは、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎで回収した土壌ＤＮＡの吸光度波形を示す。
図２は、ゲル濾過クロマトグラフィー後の土壌ＤＮＡを含む画分の吸光度波形を示す。
図３は、ＤＮａｓｅＩによる部分分解に供した土壌ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動パターンを示す。
図４Ａは、ＦＰＬＣの際の各画分の２８０ｎｍ吸光度を示す。
図４Ｂは、ＦＰＬＣ後の各画分のアガロースゲル電気泳動パターンを示す。
図５は、精製ファージλＤＮＡと比較した精製土壌ＤＮＡの吸光度スペクトルパターンを示す。
図６は、精製土壌ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動パターンを示す。
図７は、末端平滑化土壌ＤＮＡとアダプターとの連結のスキームを示す。
図８は、アダプター連結後にゲルから精製したＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動パターンを示す。
図９は、ライブラリー＃１７のアガロースゲル電気泳動パターンを示す。
図１０Ａは、各ラウンドのファージ溶液の力価推移を示す。
図１０Ｂは、各ラウンドのインプットファージ数に対する回収率推移を示す。
図１１は、各ラウンドのプラークＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動パターンを示す。
図１２は、Ｐ３１のアミノ酸配列と保存データベースの相同性配列とのアラインメントを示す。
図１３Ａは、Ｐ３１のアミノ酸配列との相同性が１位であるタンパク質のアミノ酸配列とのアラインメントを示す。
図１３Ｂは、Ｐ３１のアミノ酸配列との相同性が２位であるタンパク質のアミノ酸配列とのアラインメントを示す。
図１３Ｃは、Ｐ３１のアミノ酸配列との相同性が３位であるタンパク質のアミノ酸配列とのアラインメントを示す。
図１３Ｄは、Ｐ３１のアミノ酸配列との相同性が４位であるタンパク質のアミノ酸配列とのアラインメントを示す。
図１４Ａは、対照の野生型ファージＴ７ＳＣ１と比較したＰ３１提示ファージクローンのβ−及びγ−ＣＤ−セファロース６Ｂビーズへの結合を示す。
図１４Ｂは、対照のセファロース６Ｂビーズ（Ｓ６Ｂ）と比較した、Ｐ３１提示ファージクローンのβ−及びγ−ＣＤ−セファロース６Ｂビーズへの結合を示す。
図１４Ｃは、１％デンプンによるＰ３１提示ファージクローンとβ−及びγ−ＣＤ−セファロース６Ｂビーズとの結合阻害を示す。
図１５は、ＡＥ１のアミノ酸配列と相同性配列を有するタンパク質のアミノ酸配列とのアラインメントを示す。
図１６は、Ｐ３１をコードする遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を示す。
図１７は、ＡＥ１中のインサートＤＮＡを含む遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を示す。
図１８は、Ｅ．Ｃ．３．２．１ファミリーのβ−キシロシダーゼ、グルコシダーゼのアミノ酸配列と実施例７で得られた１種の遺伝子断片によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列とのアラインメントを示す。
図１９は、Ｅ．Ｃ．３．２．１．３，グルコアミラーゼのアミノ酸配列と実施例７で得られた１種の遺伝子断片によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列とのアラインメントを示す。
図２０は、実施例７で得られた１種の遺伝子断片の塩基配列及びこれによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を示す。
図２１は、実施例７で得られた１種の遺伝子断片の塩基配列及びこれによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を示す。
図２２は、Ｅ．Ｃ．４．２．１．１６，ｄＴＤＰグルコース脱水酵素のアミノ酸配列と実施例８で得られた遺伝子断片によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列とのアラインメントを示す。
図２３は、実施例８で得られた遺伝子断片の塩基配列及びこれによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【実施例】  以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕環境ＤＮＡの精製
１−１．土壌からのＤＮＡ抽出
つくば市大久保の森林において、落葉下表層土から下に１０ｃｍの位置にある黒色腐葉土を、２００１年１１月に採取した。この土壌サンプル１６ｇとＵｌｔｒａＣｌｅａｎＴＭ；Ｓｏｉｌ  ＤＮＡ  ｋｉｔ  Ｍｅｇａ  Ｐｒｅｐ（ＭｏＢｉｏ  Ｌａｂ．，Ｉｎｃ．），Ｃａｔａｌｏｇ＃１２９００−１０，Ｌｏｔ  ＃ＳＤ１Ｉ１３とを用いて、マニュアルに従って、ＤＮＡを抽出し、約１．４ｍｇのＤＮＡが得られた。得られたＤＮＡ溶液はやや褐色に着色していた。
土壌から得られたＤＮＡ（以下、「土壌ＤＮＡ」という）を、吸光度測定に供した。測定の結果、得られた吸光度波形を図１Ａ及びＢに示す。図１Ａは、陽性対照である純粋ＤＮＡ標品（λファージ）の吸光度波形である。一方、図１Ｂは、土壌ＤＮＡの吸光度波形である。
また、λ２６０ｎｍ／２３０ｎｍ比は、純粋ＤＮＡ標品（λファージ）が１．４９、土壌ＤＮＡが０．９５であった。
１−２．ゲル濾過クロマトグラフィーによる土壌ＤＮＡの予備検討
次に、上記１−１で得られた土壌ＤＮＡ溶液をゲル濾過クロマトグラフィーに供した。
ゲル濾過クロマトグラフィーは、以下の表３に示す分析条件で行った。
【表３】
2005121336.tif 000004
ゲル濾過クロマトグラフィーは、フロースルー画分であるＦｒ．＃４から土壌ＤＮＡの溶出が始まり、およそＦｒ．＃１０まで続いた。土壌ＤＮＡ溶液に含まれる褐色物質は、主に低分子側に分布した。
画分のＵＶ吸収波形を図２に示す。なお、図２において、Ａの実線は基準線であり、Ｂの破線は純粋ＤＮＡ標品（λファージＤＮＡ）である。また、Ｆｒ．＃４のλ２６０ｎｍ／２３０ｎｍ及びλ２６０ｎｍ／２８０ｎｍ比はそれぞれ、１．８３及び１．５７であった。さらに、Ｆｒ．＃８のλ２６０ｎｍ／２３０ｎｍ及びλ２６０ｎｍ／２８０ｎｍ比はそれぞれ、２．０及び１．１であった。
以上の結果から、当該分画範囲のゲル濾過は、λ２６０ｎｍ／２３０ｎｍ比が高いことから、大部分のフミン酸を分離するのに有効であった。しかし、当該分画範囲のゲル濾過は精製度の向上に有効ではあるものの、λ２６０ｎｍ／２８０ｎｍ比が低いことから、タンパク質が混在しており、不十分であることが判った。
１−３．土壌ＤＮＡの部分分解の条件検討
上記１−１で得られた土壌ＤＮＡを用いて、ＤＮａｓｅＩによる部分分解で２Ｋｂｐが最も多く生じる条件を調べた。ＤＮアーゼＩ以外の反応条件は、以下の表４に示す通りであった。反応は、５ｍＭＥＤＴＡを添加することで停止させた。
【表４】
2005121336.tif 000005
反応生成物をアガロースゲル電気泳動に供した。結果を図３に示す。図３において、各レーンは、以下に示すＤＮａｓｅＩ濃度（Ｕ／ｍｌ）で処理したサンプルである；レーン１：２４５Ｕ／ｍｌ、レーン２：１２２Ｕ／ｍｌ、レーン３：６１Ｕ／ｍｌ、レーン４：３０．６Ｕ／ｍｌ、レーン５：１５．３Ｕ／ｍｌ及びレーン６：０Ｕ／ｍｌ。また、レーンＭ及び７は、分子量マーカー（１Ｋｂ  ｌａｄｄｅｒ  ｍａｒｋｅｒ）である。
図３から判るように、約１５Ｕ／ｍｌ（すなわち、レーン５の１５．３Ｕ／ｍｌ）の濃度のＤＮアーゼＩで土壌ＤＮＡを処理した場合に、２ＫｂｐのＤＮＡ断片が最も多く生じることが判った。
１−４．土壌ＤＮＡのＦＰＬＣによる精製
上記１−１で得られた土壌ＤＮＡを、表４に示す条件下で、ＤＮアーゼＩ（１５Ｕ／ｍｌ）で処理し、部分分解することで、２ＫｂｐのＤＮＡ断片を得た。次いで、土壌由来夾雑物と低分子ＤＮＡを除く目的で、２ＫｂｐのＤＮＡ断片を含むサンプルを、ゲル濾過用カラムＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いたＦＰＬＣに供した。なお、ＦＰＬＣは、下記の表５に示す条件で行った。
【表５】
2005121336.tif 000006
ＦＰＬＣのチャート（各画分の２８０ｎｍ吸光度）を図４Ａに示す。また、及びＦｒ．＃６〜＃１１のアガロースゲル電気泳動パターンを図４Ｂに示す。
図４Ａから判るように、ＤＮＡはＦｒ．＃７以降に溶出した。なお、図４Ｂに示すアガロースゲル電気泳動パターンから、Ｆｒ．＃１６以降の吸収はＤＮＡ由来ではないことを確認した。
図４Ｂに示すアガロース電気泳動の結果に基づいて、０．５Ｋｂｐ以下のＤＮＡ断片を避けるために、小断片の少ないＦｒ．＃７〜＃９を回収し、プールした。精製度指標の吸光度比は、λ２６０／２８０＝約１．７及びλ２６０／２３０＝約０．５５であった。
１−５．イオン交換クロマトグラフィーによる精製
上記１−４で得られたＦｒ．＃７〜＃９のＤＮＡプールの純度をさらに上げるために、上記ＤＮＡプール４．５ｍｌを、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  ｋｉｔ（１００）を添付マニュアルに従って使用し、精製した。得られたＤＮＡの吸光度スペクトルパターンを図５に示す。図５において、Ｅｌｕｅｎｔ１がＤＮＡプールの精製ＤＮＡ、λ（ｃｏｎｃ．）及びλ（ｄｉｌ．）が、純粋なＤＮＡ標品のファージλＤＮＡを示す。
図５から判るように、吸光度スペクトルパターンに関して、最終精製ＤＮＡは、純粋なＤＮＡ標品のファージλＤＮＡと比較して全く遜色なかった。最終精製ＤＮＡの吸光度比は、λ２６０ｎｍ／２８０ｎｍ＝１．９１及びλ２６０ｎｍ／２３０ｎｍ＝２．１２であり、従来の精製土壌ＤＮＡと比べて、高純度な土壌ＤＮＡが得られた。図６は、ＤＮＡプールの精製ＤＮＡ（レーン４）の電気泳動パターンを示す。図６から判るように、分解は起きておらず、２Ｋｂｐ付近がメジャーとなっている。
〔実施例２〕メタゲノムディスプレイライブラリーの作製
２−１．アダプターの調製
Ｈｉｎｄアダプターを、以下の合成オリゴヌクレオチドＨｄＡｄ５とｐＨｄＡｄ３とをアニーリングさせることで作製した。
ＨｄＡｄ５：５’−ＨＯ−ＡＧＣＴＴＡＧＴＧＡＧＴＧＡＧＴＣＣＴ  ３’（配列番号１）
ｐＨｄＡｄ３：５’−ｐＡＧＧＡＣＴＣＡＣＴＣＡＣＴＡ  ３’（配列番号２）
（ｐはリン酸化を表す）
また、Ｅｃｏアダプターを、以下の合成オリゴヌクレオチドｐＥｃｏＲＩＬ３とＥｃｏＲＩＡｄ５とをアニーリングさせることで作製した。
ｐＥｃｏＲＩＬ３：５’−ｐＧＴＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧ  ３’（配列番号３）
（ｐはリン酸化を表す）
ＥｃｏＲＩＡｄ５：５’−ＨＯ−ＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＣＧＡＣ  ３’（配列番号４）
Ｈｉｎｄアダプターの作製において、ＨｄＡｄ５（１５μｌ）及びＰＨｄＡｄ３（１５μｌ）（各々終濃度３７．５μＭ）並びに２０×ＳＳＣ（１０μｌ）を混合した。一方、Ｅｃｏアダプターの作製において、ｐＥｃｏＲＩＬ３（１５μｌ）及びＥｃｏＲＩＡｄ５（１５μｌ）（各々終濃度３７．５μＭ）並びに２０×ＳＳＣ（１０μｌ）を混合した。次にこれらの溶液を、Ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒを用いて９６℃にて３分間インキュベートし、１時間かけて６０℃まで温度を下げた。次いで、溶液を、６０℃にて３０分間インキュベートした後、１時間かけて４０℃まで温度を下げた。さらに、溶液を、４０℃にて３０分インキュベートした後、直ちに２５℃まで温度を下げ、１０分間インキュベートすることで、Ｈｉｎｄ及びＥｃｏアダプターを得た。アダプターのアニール化は、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析することで確認した。
２−２．土壌ＤＮＡの末端平滑化
実施例１においてイオン交換クロマトグラフィーにより精製した土壌ＤＮＡを、ＴＡＫＡＲＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて末端平滑化を行った。次いで、０．５ｍｌチューブに、土壌ＤＮＡ２．５μｇ、１０×バッファー１．０μｌ及び蒸留水４．０μｌを加えた。この溶液を、７５℃にて５分間インキュベートした後、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ１．０μｌを加え、ピペットを用いて穏やかに攪拌した。さらに、溶液を３７℃にて５分間インキュベートした後、ボルテックスミキサーにて激しく攪拌して酵素を失活させた。溶液にＴＥバッファー４０μｌを添加した後、全溶液を１．５ｍｌチューブに移し替えた。
当該溶液に等量のフェノールを加えて２回抽出を行った後、等量のクロロホルムを加えて抽出を行い、ＤＮＡ水溶液約９０μｌを得た。このＤＮＡ水溶液にグリコーゲン２．０μｌ及び３Ｍ  ＮａＯＡｃ  ９．０μｌを加えて、よく攪拌した。さらに２．５倍容量の冷エタノールを添加してＤＮＡ溶液に加えて、ＤＮＡを沈殿させ、１５，０００ｒｐｍにて１０分間遠心を行った。次いで、上清を除き、沈殿物を７５％エタノールにて洗浄した。エタノールを完全に除いた後、沈殿物をＴＥバッファー１０μｌに溶解し、末端平滑化ＤＮＡ溶液を得た。
２−３．末端平滑化土壌ＤＮＡへのアダプター連結
末端平滑化土壌ＤＮＡとアダプターとの連結を、ＴＡＫＡＲＡ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２を用いて行った。末端平滑化土壌ＤＮＡとアダプターとの連結のスキームを図７に示す。まず、末端平滑化土壌ＤＮＡ４．４μｌ、蒸留水１１．６μｌ、並びに末端平滑化土壌ＤＮＡの約１００倍モル数のＥｃｏ及びＨｉｎｄアダプター（各２．０μｌ）を混合した。混合液に等量（２０μｌ）のＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩ溶液および２倍量（４０μｌ）のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ溶液を添加し、１６℃にて３０分間インキュベーションを行うことで、末端平滑化土壌ＤＮＡにアダプターを連結させた。このＤＮＡ溶液をフェノール及びクロロホルム抽出に供した後、さらにエタノール沈殿に供した。次いで、沈殿物をＴＥバッファーに溶解した。
２−４．アガロースゲル電気泳動による連結産物の精製
未反応のアダプターを除くために、上記２−３で得られたアダプター連結産物をアガロースゲル電気泳動に供し、同一ゲル内に流した分子量マーカーを指標に、０．５〜１．３Ｋｂｐ及び１．３〜２．０Ｋｂｐの断片を切り出した（図８）。図８において、レーンＭは分子量マーカーを示し、レーンＩＳ１１Ｃは０．５〜１．３Ｋｂｐの断片を含むアダプター連結産物ＩＳ１１Ｃを示す。また、レーンＩＳ１１Ｂは１．３〜２．０Ｋｂｐの断片を含むアダプター連結産物ＩＳ１１Ｂを示す。
ゲルから切り出したアダプター連結産物を、ＱＩＡＧＥＮ社のＭｉｎｉ  Ｅｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔをマニュアルに従って用いて抽出した。調製したアダプター連結産物に含まれる土壌ＤＮＡ由来のインサートＤＮＡを形質転換効率に従って評価するために、アダプター連結産物をベクターｐＵＣ９  Ｅｃｏ／Ｈｉｎｄに挿入し、次いで大腸菌（ＣＯＭＰＥＴＥＮＴ  Ｈｉｇｈ  ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ））に形質転換した。この際、陽性対照ＤＮＡとして精製プラスミド由来のｃｒｙ  １．５Ｋｂ  Ｅｃｏ／Ｈｉｎｄ  ＤＮＡ断片と比較して、アダプター連結産物の１００ｆｍｏｌ当たりの形質転換効率が３０％程度であることが確認された。
２−５．土壌ＤＮＡ由来インサートＤＮＡとベクターＤＮＡとのエタノール共沈殿
好ましいインサート／ベクター比となるようにアダプター連結産物（以下、「インサートＤＮＡ」という）とベクターＤＮＡ（Ｔ７  ＳＥＬＥＣＴ  １０−３ｂ）を以下の表６に示すように混合した。
【表６】
2005121336.tif 000007
次いで、混合液にグリコーゲン２μｌと１／１０容量の３Ｍ  ＮａＯＡｃを添加した。さらに、２．５倍量の冷エタノールを添加して、氷冷下で放置し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿物を１５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心することで回収し、７５％エタノールにて洗浄した後、残存するエタノールを減圧下で除去した。
なお、インサートＤＮＡ（アダプター連結産物）ＩＳ１１Ｂのライブラリー＃１６に関しても、同様にインサートＤＮＡ（アダプター連結産物）ＩＳ１１ＢとベクターＤＮＡとを共沈殿させた。
２−６．土壌ＤＮＡ由来インサートＤＮＡとベクターＤＮＡとの連結
上記インサートＤＮＡとベクターＤＮＡとの共沈殿物に、滅菌蒸留水（Ｓ．Ｄ．Ｗ．）；３．０μｌ、１０ｘバッファー；０．５μｌ、１０ｍＭ  ＡＴＰ；０．５μｌ及びＴ４  ＤＮＡリガーゼ；１．０μｌを加えて全量を５．０μｌとした。この反応液を、１６℃で１７時間、エアーインキュベーター内にてインキュベートすることにより、インサートＤＮＡとベクターＤＮＡとの連結反応を行った。反応後、溶液を次のパッケージング操作に備えて、減圧下で２．５μｌまで濃縮した。
２−７．Ｔ７ファージへのパッケージング
Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｅｘｔｒａｃｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｔ７  Ｓｅｌｅｃｔ  １０−３  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ）１２．５μｌに、上記２−６で得られたインサートＤＮＡ  ＩＳ１１Ｃを含む組換えベクター２．５μｌを加え、泡立たないように気をつけながら合わせた。この溶液を２２℃で２時間インキュベートした。２時間後、反応を停止させるために、溶液にＬＢ培地１３５μｌを加え、総量１５０μｌのインサートＤＮＡ  ＩＳ１１ＣをパッケージングしたＴ７ファージパッケージーング溶液（以下、「ライブラリー＃１７」という）を得た。
一方、インサートＤＮＡ  ＩＳ１１Ｂに関しては、ライブラリー＃１７の２倍スケールで行い、インサートＤＮＡ  ＩＳ１１ＢをパッケージングしたＴ７ファージパッケージーング溶液（以下、「ライブラリー＃１６」という）を得た。
Ｎｏｖａｇｅｎのマニュアルに従いプラークアッセイにより力価を確認したところ、ライブラリー＃１６の力価が９．１ｘ１０７ｐｆｕ／ｍｌであり、また、ライブラリー＃１７の力価が２．３７ｘ１０８ｐｆｕ／ｍｌであった。
２−８．インサーション頻度
ライブラリー＃１６と＃１７のインサーション頻度を調べるために、プラークＰＣＲを行った。まずライブラリー＃１６及び＃１７のファージ液をプレートに播き、各プレート上に形成されたプラークを妻楊枝にて突き、ＰＣＲ用Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（プライマー；０．１ｐｍｏｌ，Ｅｘ  Ｔａｑ  ｅｎｚｙｍｅ；０．０３Ｕを含む）１５〜２０μｌに懸濁した。その際プライマーはＮｏｖａｇｅｎ社のＴ７  ｕｐおよびＴ７  ｄｏｗｎを用いた。ＰＣＲ反応は、サーマルサイクラーを用いて、１）１サイクル；９６℃／３分、２）３３サイクル；９４℃／３０秒、５０℃／３０秒、７２℃／２分、及び３）１サイクル；７２℃／１０分で行った。反応終了後、ＰＣＲサンプル５μｌにＢＰＢ  ｄｙｅ  １μｌを添加し、０．８％アガロースゲルにて１００Ｖで３５分間電気泳動し、インサートＤＮＡを含むファージの割合を算出した。ライブラリー＃１７のアガロースゲル電気泳動の結果を図９に示す。図９において、各レーンの番号はＰＣＲサンプル番号を示し、またレーンＭは分子量マーカーを示す。ライブラリー＃１６において、インサーション頻度は約１５％であった。一方、ライブラリー＃１７において、インサーション頻度は約５０％であった。
２−９．ライブラリーの増幅
ライブラリー＃１６（３００μｌ）及びライブラリー＃１７（１５０μｌ）を、各々５ｍｌ及び１０ｍｌの宿主大腸菌ＢＬＴ５６１５に感染させた後、溶菌化させ、溶菌液ライブラリー＃１６Ｐ１及びライブラリー＃１７Ｐ１を調製した。溶菌液ライブラリー＃１６Ｐ１及びライブラリー＃１７Ｐ１の力価は、双方とも約５ｘ１０１０ｐｆｕ／ｍｌであった。一方、増幅処理によりインサーション頻度はやや低下した。ライブラリー＃１６Ｐ１において、インサーション頻度は約１０％であった。また、ライブラリー＃１７Ｐ１において、インサーション頻度は約３３％であった。
２−１０．インサートＤＮＡ塩基配列の解析
ライブラリー＃１７Ｐ１の中で、プラークＰＣＲによりインサートＤＮＡを含むことが確認された２０クローンのＰＣＲ産物の塩基配列を平均４６０塩基ほど調べた。そのＤＮＡ配列をＧｅｎｂａｎｋなどの既知塩基配列データベースに対してＢＬＡＳＴｎによる相同性検索に供した（２００２年７月現在）。その結果を表７に示す。
【表７】
2005121336.tif 000008
表７に示すように、相同性分析の結果、全てのインサートＤＮＡの塩基配列は相同性の高い意味のあるヒットはなく、新規なＤＮＡであった。この結果は、土壌中微生物の約９９％が未同定であることを裏付けており、それらの遺伝資源をディスプレイライブラリー化できることが確認された。
次にＴ７  ＳＥＬＥＣＴ１０−３ｂのディスプレイタンパク質の融合の相手であるＧｅｎｅ１０Ｂと順方向の５０アミノ酸以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の有無を調べた。表７に示すように、２クローン（クローンＮｏ．５及び１７）は、ｉｎ−ｆｒａｍｅでＯＲＦが融合していた。また、ＰＣＲ産物の１本鎖のみを配列決定しているため、配列精度は完全ではなかった。そこで、１塩基のフレームシフトＯＲＦも数えると、７クローン（クローンＮｏ．２、５、７、９、１０、１２及び１７）において、ＯＲＦ融合の可能性があった。
次いで、インサートＤＮＡを含むクローンについて、ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ＢＬＡＳＴｘによる相同性検索を行った。ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ＢＬＡＳＴｘは、クエリー塩基配列を６通りのフレームで翻訳して発生するアミノ酸配列と対象となるデータベースに登録されている各塩基配列を同様に６通りのフレームで翻訳したアミノ酸配列とを照合して、アミノ酸配列レベルで相同性検索を行うプログラムである。その結果、表７に示すように、クローンの約半数において、インサートＤＮＡがコードするアミノ酸配列と機能タンパク質のアミノ酸配列との相同性が見出された。一方、インサートＤＮＡにおいてＯＲＦが見出された場合でも、相同性が見つからず機能不明のタンパク質をコードするインサートＤＮＡが多く存在した。
〔実施例３〕シクロデキストリン−セファロース６Ｂビーズの調製
アフィニティービーズ用担体として、アマシャムバイオサイエンス社のエポキシ活性化セファロース６Ｂ（Ｌｏｔ．２８８９０４）を用いた。また、γ−シクロデキストリン（以下、「γ−ＣＤ」という）を和光純薬より購入した。乾燥ビーズ３ｇを量り取りｄＨ２Ｏで膨潤し、洗浄した。ｄＨ２Ｏをカップリングバッファー（０．０１Ｍ  ＮａＯＨ，ｐＨ１２．４）に置換した後、γ−ＣＤ、ビーズ及びカップリングバッファーを２５ｃｍ２細胞用フラスコに移し変え、攪拌しながら４５℃にて２０時間反応を行った（γ−ＣＤ／ビーズ／バッファー＝１．３ｇ／５ｍｌ／１０ｍｌ→２００μｍｏｌｅｓ  γ−ＣＤ／ｍｌゲル（活性基の５〜１０倍量））。一方、同様にして、β−シクロデキストリン（以下、「β−ＣＤ」という）とセファロース６Ｂビーズとをカップリングさせた（β−ＣＤ／ビーズ／バッファー＝０．１７８ｇ／５ｍｌ／１０ｍｌ→３０μｍｏｌｅｓ  β−ＣＤ／ｍｌゲル（活性基の０．７５〜１．５倍量））。この際、β−ＣＤは溶解度が低いため充分な量の添加ができないため、γ−ＣＤの場合と異なり、４５℃における２０時間の反応後、β−ＣＤを含むバッファーの入れ替えを行うことで追加し、４５℃にてさらに８時間反応させた。
カップリング終了後、ビーズをカラムに詰め、ｄＨ２Ｏで充分に洗浄し、余分なγ−ＣＤ又はβ−ＣＤやカップリングバッファーを完全に除いた。次いで、ブロッキングバッファー（１Ｍエタノールアミン，ｐＨ８．０）を用いて溶液置換した後、ビーズを再度フラスコに移し、ブロッキングバッファー存在下で攪拌しながら、４５℃で２０時間ブロッキング反応を行った。ブロッキング反応終了後、ビーズをカラムに詰め、ｄＨ２Ｏで充分に洗浄した後、洗浄バッファー１（０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）／０．５Ｍ  ＮａＣｌ）及び洗浄バッファー２（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／０．５Ｍ  ＮａＣｌ）にて、交互に洗浄する操作を４回繰り返した。最後にｄＨ２Ｏにて十分に洗浄することで、アフィニティービーズ（γ−ＣＤ−セファロース６Ｂビーズ又はβ−ＣＤ−セファロース６Ｂビーズ）を得た。
γ−ＣＤ及びβ−ＣＤは、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼと特異的に結合する。そこで、アフィニティービーズの結合能を、天野エンザイムより入手した粗精製コンチザイム（シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ））（Ｌｏｔ．ＣＧＴＲＺ０９５１８４  ２Ｌ）用いて評価した結果、ベッド体積１００μｌのビーズ当たり、ＣＧＴａｓｅ  ２００ｍｇと特異的に結合できることが確認された。
〔実施例４〕アフィニティースクリーニング
４−１．アフィニティースクリーニングに使用する材料
アフィニティースクリーニングにおいては、以下の材料を用いた。ライブラリー＃１６Ｐ１及びライブラリー＃１７Ｐ１を、それぞれ７．６  ｘ  １０１０ｐｆｕ／ｍｌ及び５．３  ｘ  １０１０ｐｆｕ／ｍｌの力価で使用した。また、スクリーニング用アフィニティービーズとして、実施例３で調製したγ−ＣＤ−セファロース６Ｂビーズを用い、対照としてセファロース６Ｂビーズを用いた。
さらに、容器壁面へのタンパクの非特異的吸着を抑制するために、容器は、アシスト社の１．５ｍｌシリコナイズチューブ２１５０Ｚを用いた。スクリーニング用洗浄バッファーとして、洗浄バッファー１（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０／０．１Ｍ  ＮａＣｌ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）、洗浄バッファー２（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０／０．２Ｍ  ＮａＣｌ／０．２％Ｔｗｅｅｎ２０）及び洗浄バッファー３（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．５／０．２Ｍ  ＮａＣｌ）を用いた。ビーズからの溶出には、１０ｍＭ  γ−ＣＤを含む溶出バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０／０．１Ｍ  ＮａＣｌ）を用いた。
Ｔ７ファージの増幅用宿主細胞として、Ｎｏｖａｇｅｎ社のＢＬＴ５６１５細胞を用いた。
ＰＣＲ試薬は、ＴａＫａＲａ社のＥｘ  Ｔａｑ  ｅｎｚｙｍｅ、Ｅｘ  Ｔａｑバッファー、ｄＮＴＰｍｉｘ及びＳＩＧＭＡｇｅｎｏｓｙｓ社に製造依頼したＴ７ｕｐおよびＴ７ｄｏｗｎ（オリジナルはＮｏｖａｇｅｎ社）プライマーを用いた。
ライブラリーＤＮＡの配列決定分析には、配列決定分析用プライマーとしてＴＣＧＴＡＴＴＣＣＡＧＴＣＡＧＧＴＧＴＧ（配列番号５）を設計して、（株）ベックスに依頼した。その他試薬類は和光純薬やＳＩＧＭＡ等の特級品を使用した。また各種バッファー類は標準的な手法にて調製し、必要に応じてオートクレーブによる滅菌を行った。
４−２．アフィニティースクリーニング
γ−ＣＤ−セファロース６Ｂビーズ（５０％スラリー）４０μｌを、１．５ｍｌシリコナイズチューブにとり、洗浄バッファー１（５００μｌ）を添加して、ビーズを平衡化した。次いで、チューブを１２，０００ｒｐｍにて遠心し、ビーズを沈殿させた後、上清を取り除いた。
次に、ライブラリー＃１６Ｐ１及びライブラリー＃１７Ｐ１を各５０μｌずつ別々のチューブに添加し、回転ミキサーを用いて、室温下４０ｒｐｍで１時間攪拌し、ビーズへの吸着を行った。１時間後、チューブを１２，０００ｒｐｍに２分間遠心して、ビーズを沈殿させ、上清を取り除いた。さらに、ビーズに洗浄バッファー１（５００μｌ）を添加して、Ｔｕｂｅ  Ｍｉｘｅｒにて５分間攪拌洗浄した。５分後、チューブを１２，０００ｒｐｍにて２分間遠心して、ビーズを沈殿させ、上清を取り除いた。この洗浄操作を５回繰り返した。
チューブ器壁に非特異に吸着しているファージの影響を取り除くため、新たなシリコナイズチューブにビーズを移し、チューブを１２，０００ｒｐｍにて遠心し、ビーズを沈殿させて、上清を取り除いた。次いで、ビーズに結合したファージを溶出するために、チューブに上記溶出バッファー２００μｌを加え、Ｔｕｂｅ  Ｍｉｘｅｒにて５分間攪拌した。５分後、チューブを１２，０００ｒｐｍにて遠心することでビーズを沈殿させ、上清を溶出液として回収した。
次に、この溶出液の増幅操作を以下のように行った。ＩＰＴＧで誘導したＢＬＴ５６１５細胞５００μｌに、溶出液１００μｌを加えた。ＢＬＴ５６１５細胞に溶出液中のファージを吸着させるために、３７℃にて正確に５分間培養した。５分間後、γ−ＣＤを除くために４，０００ｒｐｍ、２分の遠心操作にてファージが付着した菌体を沈殿させて、不要な上清部分を取り除いた。次に、沈殿させた菌体にＬＢ／Ａｍｐ／ＩＰＴＧ培地５００μｌを加えた後、溶菌が生じるまで３７℃にて旋回培養した。溶菌が生じたら、１２，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心操作にて不純物を沈殿させ、上清のファージ溶液を回収した。このファージ溶液のうち１００μｌを更なる増幅操作に使用した。同様にして７ラウンドまで増幅操作を繰り返した。なお、最終ラウンドであるラウンド７の増幅操作は、菌体と上清を分けずに溶菌を行った。
次いで、Ｔ７ファージプラークを、９ｃｍシャーレ１枚あたり２００個出現させるように、各ラウンド毎のファージ溶液を希釈して用いた。一般的な方法は次の通りであった。まずＢＬＴ５６１５細胞２５０μｌ、希釈したＴ７ファージ溶液１００μｌ、０．５Ｍ  ＩＰＴＧ溶液２４μｌ及び５０℃に加温したトップアーガー３ｍｌを、チューブ内にて混ぜ合わせた。混和後、直ちに当該混合液が冷めないうちに、ＬＢ／Ａｍｐ培地を含む９ｃｍプレート上に重層した。重層した寒天が固化した後、３７℃にて２時間のインキュベーションを行い、ファージプラークを生じさせた。なお、生じたプラーク数と希釈率からファージの力価も算出した。
ファージ溶液の力価は約１〜２  ｘ  １０１０Ｐｆｕ／ｍｌであった。各ラウンドのファージ溶液の力価推移とインプットファージ数に対する回収率推移を、表８及び図１０Ａ（力価推移）及び１０Ｂ（回収率推移）に示した。
【表８】
2005121336.tif 000009
表８と図１０Ａ及び１０Ｂから判るように、４ラウンドまでは、ラウンド毎にファージ溶液の力価と回収率の上昇が認められ、４ラウンド以降横ばいとなった。
次に、得られたファージがインサートＤＮＡを含むものがどの程度存在しているのか、また当該インサートＤＮＡがパンニングのラウンド毎にどのように変化するのかを調べるために、プラークＰＣＲを行った。
まずプレート上のファージプラーク１個を妻楊枝にて突き、ＰＣＲ用Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（プライマー；０．１ｐｍｏｌ，Ｅｘ  Ｔａｑ  ｅｎｚｙｍｅ；０．０３Ｕを含む）１５〜２０μｌに懸濁した。なお、プライマーはＮｏｖａｇｅｎ社のＴ７ｕｐ及びＴ７ｄｏｗｎを用いた。ＰＣＲ反応は、サーマルサイクラーを用いて１）１サイクル；９６℃／３分、２）３３サイクル；９４℃／３０秒、５０℃／３０秒、７２℃／２分、及び３）１サイクル；７２℃／１０分で行った。反応終了後、ＰＣＲサンプル５μｌにＢＰＢｄｙｅ１μｌを添加し、０．８％アガロースゲルにて１００Ｖで３５分間電気泳動し、ファージ中のインサートＤＮＡを比較した。結果を図１１に示す。図１１において、各レーンは、各ラウンドで得られたファージ溶液のプラークＰＣＲ産物である。
図１１から判るように、３ラウンドまでは異なるサイズのインサートＤＮＡが数個に１個の割合で見出されたが、４ラウンド以降においては、ほとんどが０．７Ｋｂｐの同一インサートＤＮＡのバンドが見出された。この結果は、アフィニティセレクションの結果として特定のクローンの濃縮が起きたことを示す。
この０．７ｋｂｐのインサートＤＮＡの塩基配列（配列番号６）を配列決定した結果、８８アミノ酸（配列番号７）からなるＯＲＦが確認された（図１６）。このクローンおよびＯＲＦをＰ３１と名付けた。
Ｐ３１について、米国ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の相同性検索プログラムＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）を使用してデータベース検索を行った。結果を図１２に示す。図１２に示すように、Ｐ３１は保存配列データベース（Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  ＤＢ）の２候補にヒットした。１つは、炭水化物の輸送及び代謝に関与するＳｎｆ１プロテインキナーゼ複合体（Ｓｎｆ１  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）のタンパク質であり、もう１つは、１，４−α−グルカン分岐酵素であった。ヒットしたタンパク質は、双方とも炭水化物を認識する機能を有していた。
Ｓｎｆ１プロテインキナーゼ複合体のタンパク質とＰ３１とは、アラインメント部分において、７３アミノ酸中２４アミノ酸が同一であって、３３％の相同性を有していた。また、類似アミノ酸を含めると、３７アミノ酸が一致し、５０％の相同性を有していた。以上から、保存配列との相同性により、Ｐ３１が糖認識機能を有するタンパク質の一部であることが強く示唆された。
さらに、Ｂｌａｓｔｐ検索により全ての配列データベースの検索した結果、上位４候補とｐ３１とのアラインメントを図１３Ａ〜Ｄに示した。図１３Ａ〜Ｄにおいて示すアライメントの結果において、Ｅ（Ｅｘｐｅｃｔ）値とは０〜１の間の数値であり、偶然一致する確率を示すパラメーターである。Ｅ値が０に近い程、信頼度が高い。一般的には、Ｅ値が約１０−１０でヒットした場合には、かなり高い確率で同様の機能を有するタンパク質であると考えられる。図１３Ａに示すＰ３１との相同性が１位であるタンパク質ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（テルモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ））のＥ値は、４  ｘ  １０−１１であった。従って、Ｐ３１を含むタンパク質は、ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎと同様の機能を有するタンパク質である可能性が高いことが示唆される。なお、図１３Ａに示すタンパク質ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎは、Ｏ型糖鎖分解酵素と推定されているタンパク質であった（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｇｏ／ＤｉｓｐｌａｙＧｏＴｅｒｍ？ｉｄ＝ＧＯ：０００４５５３参照）。また、図１３Ｂに示すＰ３１との相同性が２位のＧＬＰ＿５４６＿８５０５５＿８４３１８（ジアルジア・ランブリア（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ））ＡＴＣＣ  ５０８０３は、イソアミラーゼと会合するＡＭＰキナーゼのモチーフを含む（ｈｔｔｐ：／／ｋｒ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｎｉｃｅｐｒｏｔ．ｐｌ？Ｑ７Ｒ２Ｋ２参照）。さらに、図１３Ｃ及びＤに示す相同性３位及び４位であるアミロプルラナーゼ（ゲオバシラス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））及びプルランヒドロラーゼＩＩＩ型（テルモコッカス・アグレガンス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇｇｒｅｇａｎｓ））は１，４−α−グルカン分岐酵素であるアミロプルラナーゼであった。
以上の結果から、Ｐ３１を含むタンパク質は、糖認識機能を有するタンパク質である可能性が示唆された。
〔実施例５〕Ｐ３１のリガンド結合プロフィール
得られたＰ３１を提示するファージクローンを純化し、γ−ＣＤ結合プロフィールを調べた。
純化したＰ３１提示ファージクローン溶解物１００μｌ、Ｗ１Ｔバッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０、０．１Ｍ  ＮａＣｌ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０）１００μｌ及びＷ１Ｔバッファーで平衡化したγ−ＣＤ−セファロース６Ｂビーズ２０μｌを混合し、室温で１時間振盪した。次いで、混合液を１２０００ｒｐｍで２分間遠心し、上清を除いた。さらに、γ−ＣＤ−セファロース６ＢビーズにＷ１Ｔバッファー５００μｌを添加して、ミキサーで５分間振盪した。混合液を１２０００ｒｐｍで２分間遠心して、洗浄した。このような洗浄操作を計５回行った。なお、最後の洗浄操作においては、Ｔｗｅｅｎを含まないＷ１バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０、０．１Ｍ  ＮａＣｌ）を用いて行った。
洗浄後、γ−ＣＤ−セファロース６Ｂビーズに、Ｗ１バッファー１００μｌに溶解した８０ｍＭγ−ＣＤを添加して、５分間混合した。混合した後、混合液を１２０００ｒｐｍにて５分間遠心し、上清を回収した。
次いで、上清に存在するファージ濃度をプラークアッセイにおいて算出した。さらに、１％デンプン存在下でのＰ３１提示ファージクローンとγ−ＣＤ−セファロース６Ｂビーズとの結合試験を行った。デンプンは、可溶化デンプン（和光純薬）の１０％懸濁液を６０℃で保温して溶解したものを１／１０容量添加した。なお、同様にして、Ｐ３１提示ファージクローンのβ−ＣＤ結合プロフィールを調べた。
Ｐ３１提示ファージクローンに対する対照として野生型ファージＴ７ＳＣ１を用いた。さらに、γ−ＣＤ−セファロース６Ｂビーズ及びβ−ＣＤ−セファロース６Ｂビーズに対する対照としてセファロース６Ｂビーズ（Ｓ６Ｂ）を用いた。
結果を表９及び１０並びに図１４Ａ〜Ｃに示す。表９は、Ｐ３１提示ファージクローンのβ−ＣＤ−セファロース６Ｂビーズへの結合を示す。一方、表１０は、Ｐ３１提示ファージクローンのγ−ＣＤ−セファロース６Ｂビーズへの結合を示す。図１４Ａは、対照の野生型ファージＴ７ＳＣ１と比較したＰ３１提示ファージクローンのβ−及びγ−ＣＤ−セファロース６Ｂビーズへの結合を示す。図１４Ｂは、対照のセファロース６Ｂビーズ（Ｓ６Ｂ）と比較した、Ｐ３１提示ファージクローンのβ−及びγ−ＣＤ−セファロース６Ｂビーズへの結合を示す。さらに、図１４Ｃは、１％デンプンによるＰ３１提示ファージクローンとβ−及びγ−ＣＤ−セファロース６Ｂビーズとの結合阻害を示す。
【表９】
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【表１０】
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図１４Ａに示すように、Ｐ３１提示ファージクローンは、対照の野生型ファージと比べ、β−ＣＤ−セファロース６Ｂビーズに約１７００倍、γ−ＣＤ−セファロース６Ｂビーズに約４５０倍結合した。また、図１４Ｂに示すように、対照のセファロース６Ｂビーズ（Ｓ６Ｂ）と比較して、Ｐ３１提示ファージクローンは、β−ＣＤ−セファロース６Ｂビーズ及びγ−ＣＤ−セファロース６Ｂビーズにそれぞれ１０倍及び３５倍結合した。さらに、図１４Ｃに示すように、β−ＣＤ−セファロース６Ｂビーズ及びγ−ＣＤ−セファロース６ＢビーズへのＰ３１提示ファージクローンの特異的結合は、１％デンプンの存在によって７０〜８０％阻害された。野生型ファージとＰ３１クローンの違いはインサート部分であり、対照のＳ６ＢビーズとＣＤビーズの違いはＣＤ部分の有無である。ＣＤとデンプンの共通点は１，４−α−グルカンである。以上の結果から、Ｐ３１のインサートから発現するタンパク質は、配列相同性のみならず、１，４−α−グルカンを認識して結合することが示された。
〔実施例６〕新規アルドースエピメラーゼ類似遺伝子断片の取得
上記実施例４で得られたパンニングの３ラウンド後のファージ溶液をプレーティングし、ランダムに選択したシングルプラークのインサートＤＮＡの塩基配列を調べ、アルドース−１−エピメラーゼと相同性の高い配列を見出した（図１７、配列番号８および９）。このクローンをＡＥ１とした。
配列に関して、上記と同様に、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の相同性検索プログラムＢＬＡＳＴｐ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）を使用してデータベース検索を行った。その結果を図１５に示す。図１５に示すように、ＡＥ１中のインサートＤＮＡを含む遺伝子（配列番号８）によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号９）は、アミノ酸配列名ＱＵＢ７０、Ｐｕｔａｔｉｖｅａｌｄｏｓｅ−１−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ（ＥＣ  ５．１．３．３）［ＹＩＨＲ］（シゲラ・フレクスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ））と極めて低いＥ値（１  ｘ  １０−３２）で相同性を有していた。従って、ＡＥ１中のインサートＤＮＡを含む遺伝子（配列番号８）は、新規アルドース−１−エピメラーゼ遺伝子である可能性が示唆された。なお、アルドース−１−エピメラーゼはα−Ｄ−グルコースをβ−Ｄ−グルコースに変換する酵素である。従って、ＡＥ１は、ＣＤやアミロースの構成単位であるグルコースを認識して結合したと考えられた。
そこで、実施例５のＰ３１提示ファージクローンとＣＤ−セファロース６Ｂビーズとの結合と同様にして、ＡＥ１のアミロース樹脂（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）への結合を調べた。溶出は、２０ｍＭマルトースを用いて行った。なお、対照ファージとして、野生型ファージＴ７ＳＣ１を使用した。結果を表１１に示す。
【表１１】
2005121336.tif 000012
表１１に示すように、野生型ファージＴ７ＳＣ１と比較して、ＡＥ１は、アミロース樹脂に６７倍結合した。以上より、上述した配列相同性の結果と一致して、ＡＥ１中のインサートＤＮＡを含む遺伝子産物は、シクロデキストリンやアミロースの構成単位であるグルコースを認識して結合したことが示唆された。
本方法による３ラウンドは２日で終了し、シングルクローンの取得と解析は３日程度で終了する。以上のように、メタゲノムをディスプレイライブラリ化し、リガンドを用いたアフィニティエンリッチメントのサイクルにより、土壌中の未利用の遺伝資源から培養工程を経ることなく、リガンドを認識する機能タンパク質遺伝子群断片が、短時日で効率よくクローニングできることが示された。
〔実施例７〕アミロース磁性ビーズを用いたアフィニティスクリーニング
１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導をかけた大腸菌ＢＬＴ５６１５（１．５ｍｌ）に１５μｌのライブラリー＃１７Ｐ１を感染し、１時間振とう培養を行うことで溶菌液を得た。得られた溶菌液を１０，０００ｘｇで１０分間遠心した。遠心後、得られた上清をライブラリー＃１７Ｐ２とした。
ライブラリー＃１７Ｐ２（４００μｌ）からパンニングに用いるリガンドと競合し得る低分子を除くために、Ａｍｉｃｏｎ  ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−１００（カットオフＭｗ１００，０００）を用いて、３回遠心を行い、バッファーＷ２Ｔ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．０，０．２Ｍ  ＮａＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）に置換し、２００μｌとした。これにＷ２ＴｇＲ（Ｗ２Ｔ＋０．２％ｇｅｌａｔｉｎ，２００μｇ／ｍｌ  ｙｅａｓｔＲＮＡ）でブロッキングしたＡｍｙｌｏｓｅ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄｓ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）１ｍｇを添加し、アミロースと親和性を持つファージと結合反応をさせるために懸濁状態で１時間放置した。１時間の放置後、強力なマグネット（Ｄｙｎａｌ  ＭＰＣ−Ｓ）を用いてビーズと反応液を分離した。次にこれに対して５００μｌのＷ２ＴｇＲを添加、懸濁し、５分置いてビーズを分離した。これを４回繰り返した。次に５００μｌのＷ２ＴｇＲを添加、懸濁し、５分置いてビーズを分離し回収した。
回収した２５０μｌを、１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導をかけた大腸菌ＢＬＴ５６１５（１ｍｌ）に感染させ、溶菌液を上述同様に処理し、２サイクル目を行った。４回洗浄後、５００μｌのＷ２ＴｇＲを添加、懸濁し、５分置いて得られた分画（約５ｘ１０５ｐｆｕ）を回収した。
回収した分画を適当に希釈して、実施例４と同様にしてプラークアッセイを行い、さらにプラークＰＣＲを行った。プラークＰＣＲで得られたインサートの塩基配列を８クローンについて調べた結果、相同性の高い糖関連酵素としてＥ．Ｃ．３．２．１ファミリーのβ−キシロシダーゼ、グルコシダーゼ（ＴｒＥＭＢＬ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃Ｑ９Ａ３Ｚ６，ｃａｕｌｏｂａｃｔｏｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  ｘｙｌｏｓｉｄａｓｅ，ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ４８％，Ｅ＝８Ｅ−５１）、Ｅ．Ｃ．３．２．１．３，グルコアミラーゼ（ＴｒＥＭＢＬ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃Ｑ９８ＥＫ２，Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ  ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ，ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ３６％，Ｅ＝３Ｅ−１１）とそれぞれ考えられる遺伝子断片が２種得られた。
図１８には、Ｅ．Ｃ．３．２．１ファミリーのβ−キシロシダーゼ、グルコシダーゼ（ＴｒＥＭＢＬ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃Ｑ９Ａ３Ｚ６，ｃａｕｌｏｂａｃｔｏｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  ｘｙｌｏｓｉｄａｓｅ，ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ４８％，Ｅ＝８Ｅ−５１）のアミノ酸配列と得られた１種の遺伝子断片（配列番号１０：β−グルコシダーゼ相同クローンの塩基配列）によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１１：β−グルコシダーゼ相同クローンのアミノ酸配列）とのアラインメントを示す。なお、図１８において、Ｑｕｅｒｙ配列が、得られた遺伝子断片によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列であり、Ｓｂｊｃｔ配列がＥ．Ｃ．３．２．１ファミリーのβ−キシロシダーゼ、グルコシダーゼのアミノ酸配列である。また、図２０には、当該遺伝子断片の塩基配列（配列番号１０）及びこれによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１１）を示す。
さらに、図１９には、Ｅ．Ｃ．３．２．１．３，グルコアミラーゼ（ＴｒＥＭＢＬ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃Ｑ９８ＥＫ２，Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ  ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ，ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ３６％，Ｅ＝３Ｅ−１１）のアミノ酸配列と得られたもう１種の遺伝子断片（配列番号１２：グルコアミラーゼ相同クローンの塩基配列）によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１３：グルコアミラーゼ相同クローンのアミノ酸配列）とのアラインメントを示す。なお、図１９において、Ｑｕｅｒｙ配列が得られた遺伝子断片によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列であり、Ｓｂｊｃｔ配列がＥ．Ｃ．３．２．１．３，グルコアミラーゼのアミノ酸配列である。また、図２１には、当該遺伝子断片の塩基配列（配列番号１２）及びこれによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１３）を示す。
〔実施例８〕ストレプトアビジン磁性ビーズを用いたアフィニティスクリーニング
実施例７で得られたライブラリー＃１７Ｐ２（４００μｌ）からパンニングに用いるリガンドと競合し得る低分子を除くために、Ａｍｉｃｏｎ  ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−１００（カットオフＭｗ１００，０００）を用いて、３回遠心を行い、バッファーＷ２Ｔ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．０，０．２Ｍ  ＮａＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）に置換し、２００μｌとした。これに２ｍＭ  α１−３，α１−６−Ｄ−ｍａｎｎｏｔｒｉｏｓｅ−ｂｉｏｔｉｎ（１４−ａｔｏｍ  ｓｐａｃｅｒ，ＤＥＸＴＲＡ  Ｌａｂｏｒａｒｏｉｅｓ，Ｌｔｄ．）を１０μｌ添加混合し、室温に１．５時間置いた。次に、これにＷ５ＴｇＲ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．０，０．５Ｍ  ＮａＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０，０．２％ｇｅｌａｔｉｎ，２００μｇ／ｍｌ  ｙｅａｓｔＲＮＡ）でブロッキングしたＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄｓ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）１ｍｇを添加し、親和性を持つファージと結合反応をさせるために懸濁状態で１時間放置した。１時間の放置後、マグネット（Ｄｙｎａｌ  ＭＰＣ−Ｓ）を用いてビーズと反応液を分離した。次にこれに対して５００μｌのＷ５ＴｇＲを添加、懸濁し、５分置いてビーズを分離した。これを５回繰り返した。次に２００μｌの１０ｍＭ  ｍａｎｎｏｓｅを含むＷ５ＴｇＲを添加、懸濁し、５分置いてビーズを分離し、上清を回収した。
回収した上清を適当に希釈して、実施例４と同様にしてプラークアッセイを行い、さらに、プラークＰＣＲを行った。プラークＰＣＲで得られたインサートの塩基配列を７クローンについて調べた結果、相同性の高い糖関連酵素としてＥ．Ｃ．４．２．１．１６，ｄＴＤＰグルコース脱水酵素（ＴｒＥＭＢＬ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃Ｑ５Ｖ３Ｃ６，Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ  ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ，ｄＴＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ，ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ６６％，Ｅ＝４Ｅ−５９）と考えられる遺伝子断片が１種得られた。
図２２には、Ｅ．Ｃ．４．２．１．１６，ｄＴＤＰグルコース脱水酵素（ＴｒＥＭＢＬ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃Ｑ５Ｖ３Ｃ６，Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ  ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ，ｄＴＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ，ｈｏｍｏｌｏｇｙ６６％，Ｅ＝４Ｅ−５９）のアミノ酸配列と得られた遺伝子断片（配列番号１４：グルコース脱水酵素相同クローンの塩基配列）によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１５：グルコース脱水酵素相同クローンのアミノ酸配列）とのアラインメントを示す。なお、図２２において、Ｑｕｅｒｙ配列が得られた遺伝子断片によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列であり、Ｓｂｊｃｔ配列がＥ．Ｃ．４．２．１．１６，ｄＴＤＰグルコース脱水酵素のアミノ酸配列である。また、図２３には、当該遺伝子断片の塩基配列（配列番号１４）及びこれによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１５）を示す。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】  本発明に係る環境サンプル由来の環境ＤＮＡの精製方法によれば、高純度の環境サンプル由来のＤＮＡを得ることができる。得られた環境サンプル由来のＤＮＡは、高純度であるため、あらゆる遺伝子工学的処理に使用することができる。一方、本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法によれば、環境サンプル由来の環境ＤＮＡから作製したディスプレイライブラリーから目的のタンパク質をコードする遺伝子群を、所望するリガンドを用いてエンリッチする（Ｓ／Ｎ比を向上する）ことにより短期間で省力的にスクリーニングすることができる。
【配列表フリーテキスト】  配列番号１〜４は、合成オリゴヌクレオチドである。
配列番号５は、プライマーである。
配列番号６は、Ｐ３１をコードする遺伝子の塩基配列である。
配列番号７は、Ｐ３１のアミノ酸配列である。
配列番号８は、ＡＥ１中のインサートＤＮＡを含む遺伝子の塩基配列である。
配列番号９は、ＡＥ１中のインサートＤＮＡを含む遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号８において、ｎは、ａ、ｇ、ｃ又はｔを表す（存在位置：２５及び８４）。
配列番号１０は、β−グルコシダーゼ相同クローンの塩基配列である。
配列番号１１は、β−グルコシダーゼ相同クローンのアミノ酸配列である。
配列番号１２は、グルコアミラーゼ相同クローンの塩基配列である。
配列番号１３は、グルコアミラーゼ相同クローンのアミノ酸配列である。
配列番号１４は、グルコース脱水酵素相同クローンの塩基配列である。
配列番号１５は、グルコース脱水酵素相同クローンのアミノ酸配列である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2005121336.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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