(57)【要約】  本発明は、プローブを安定して担体に固定化する技術を提供することを目的とする。この目的のため、本発明では、以下の式（１）で表される、リンカー用化合物を用いる。化９2006095830.tif 000010［式中、Ａは、水素原子、その他の置換基又は糖類その誘導体を表す。］【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（１）で表される、リンカー用化合物。
化１
2006095830.tif 000008
［式中、Ａは、水素原子、その他の置換基又は糖類若しくはその誘導体を表す。］
【請求項２】
前記Ａはリボース、デオキシリボース及びこれらの誘導体から選択される、ヌクレオシド誘導体である、請求項１に記載のリンカー用化合物。
【請求項３】
前記リボース又は前記デオキシリボースにおいて、Ｃ３’位の水酸基にはホスホルアミダイド基が導入され、Ｃ５’位の水酸基には、ジメトキシトリチル基が導入されている、請求項２に記載のリンカー用化合物。
【請求項４】
ヌクレオチド誘導体である、請求項２に記載のリンカー用化合物。
【請求項５】
プローブであって、
以下の式（２）で表される１又は２以上のリンカーユニットを備える、プローブ。
化２
2006095830.tif 000009
［式中、Ｘは、水素原子、水酸基、あるいは置換基を表す。］
【請求項６】
オリゴヌクレオチドプローブ又はポリヌクレオチドプローブである、請求項５に記載のプローブ。
【請求項７】
前記プローブは、ヘアピン構造又はループ構造を形成可能な配列を含んでいる、請求項５又は６に記載のプローブ。
【請求項８】
前記リンカーユニットを、前記プローブの端末、端末側又はその全長の中央側に備える、請求項５〜７のいずれかに記載のプローブ。
【請求項９】
前記プローブは、前記１又は２以上の前記リンカーユニットと、ハイブリダイゼーション配列と、該ハイブリダイゼーション配列と前記リンカーユニットの間に介在されるスペーサーとを備えている、請求項５〜８のいずれかに記載のプローブ。
【請求項１０】
ターゲット核酸に対するハイブリダイゼーション配列を有する、請求項５〜９のいずれかに記載のプローブ。
【請求項１１】
プローブが固定化された担体であって、
前記プローブは、請求項５〜１０のいずれかに記載のプローブである、プローブ固定化担体。
【請求項１２】
前記プローブは、前記担体表面に備えられるアミノ基を介した共有結合により固定化されている、請求項１１に記載のプローブ固定化担体。
【請求項１３】
前記アミノ基はシロキサン結合を介して前記担体に備えられる、請求項１２に記載のプローブ固定化担体。
【請求項１４】
前記担体は、平板状、粒子状及びキャピラリーの内層である、請求項１１〜１３のいずれかに記載のプローブ固定化担体。
【請求項１５】
前記担体は、平板状であり、前記プローブは、前記固定化担体に対してスポッティングにより供給される、請求項１１〜１４のいずれかに記載のプローブ固定化担体。
【請求項１６】
プローブ固定化担体の製造方法であって、
請求項５〜１０のいずれかに記載のプローブを含有する液体を準備する工程と、
前記液体をアミノ基を備える担体の表面に供給して前記プローブを前記担体に固定化させる工程と、
を備える、製造方法。
【請求項１７】
核酸のハイブリダイズ方法であって、
請求項１１〜１５のいずれかに記載のプローブ固定化担体を準備する工程と、
当該プローブ固定化担体に、ターゲット核酸を供給して前記プローブとターゲット核酸とをハイブリダイズさせる工程と、
を備える、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸のハイブリダイズ反応のためのプローブに用いるのに適したリンカー用化合物、プローブ、プローブ固定化担体、当該固定化担体の製造方法及び核酸ハイブリダイズ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイなど、オリゴヌクレオチドなどの核酸をプローブとする各種のハイブリダイゼーションアッセイにおいては、基板や粒子などの担体に対してプローブを固定する必要がある。例えば、ＰＣＲ産物等の長鎖ＤＮＡはポリ陽イオンをコーティングしたスライドガラスに静電結合により固定化し、合成オリゴヌクレオチドは予めアミノ基やアルデヒド基などの官能基を末端に導入しておいたうえでアルデヒド基やアミノ基を導入したスライドガラスと共有結合を介して固定化している（蛋白質 核酸 酵素Ｖｏｌ．４３．No.13, 2005頁）【０００３】
また、生体においてＤＮＡがＮＯ等と接触して生成するグアニン損傷塩基としてオキサニン（oxaninie）が知られている（J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 2515-2516）。二重鎖中の特定部位に塩基としてオキサニンを有するＤＮＡはＤＮＡグリコシラーゼとの間で架橋体を形成することが知られている。また、オキサニン塩基を有するデオキシリボヌクレオチドである、デオキシオキサノシンのグリシンとの反応生成物も知られている（Chem. Res. Toxicol. 2000, 13, 227-230）。さらに、ＤＮＡグリコシラーゼの特定アミノ酸残基の側鎖で架橋することも知られている（J. Biol. Chem. Vol.278、 No.27.pp26264-25272,2003）。また、オキサニンを塩基として有するオリゴヌクレオチドをＰＣＲを用いて合成することも知られている（Biochem., 1997, 36, 8013-8019, Biochem., 1998, 37, 11592-11598、）。
【発明の開示】
【０００４】
しかしながら、従来までのプローブの固定化方法では、これらのいずれの方法によっても、ハイブリダイズやその後の工程並びに固定化担体の保存工程を通じて、プローブの安定的固定化を実現するのは困難であった。また、共有結合により核酸を基板等に導入する際の反応性や特異性は必ずしも十分ではなく、核酸の基板に対する固定化形態を制御することも困難であった。
【０００５】
そこで、本発明では、プローブを安定して担体に固定化する技術を提供することを一つの目的とする。また、本発明では、プローブの固定化形態を制御できる技術を提供することを他の一つの目的とする。
【０００６】
本発明者らは、上記した課題について検討したところ、生体内においてＤＮＡがＮＯなどにより損傷を受けた際に生成される塩基であるオキサニンとアミノ基との間における不可逆反応に着目した。そして、この塩基をプローブに備えさせ、オキサニンとアミノ基との不可逆反応とその結合形態を利用することで、プローブを安定して担体に固定化できることを見出して、本発明を完成した。すなわち、本発明によれば、以下の手段が提供される。
【０００７】
本発明の一つの態様によれば、以下の式（１）で表される、リンカー用化合物が提供される。
2006095830.tif 000002
［式中、Ａは、水素原子、その他の置換基又は糖類若しくはその誘導体を表す。］
【０００８】
このリンカー用化合物においては、前記Ａはリボース、デオキシリボース及びこれらの誘導体から選択される、ヌクレオシド誘導体であることが好ましい。また、前記リボース又は前記デオキシリボースにおいて、Ｃ３’位の水酸基にはホスホアミダイド基が導入され、Ｃ５’位の水酸基には、ジメトキシトリチル基が導入されていることも好ましい。さらにまた、このリンカーは、ヌクレオチド誘導体であってもよい。
【０００９】
また、本発明の他の一つの態様によれば、以下の式（２）で表される１又は２以上のリンカーユニットを備える、プローブが提供される。
2006095830.tif 000003
［式中、Ｘは、水素原子、水酸基、あるいは置換基を表す。］
【００１０】
このプローブは、オリゴヌクレオチドプローブ又はポリヌクレオチドプローブとすることができる。また、前記リンカーユニットを前記プローブの端末、端末側又はその全長の中央側に備えることができる。さらにまた、前記プローブは、ターゲット核酸に対するハイブリダイゼーション配列を有することができ、前記１又は２以上の前記リンカーユニットと、ハイブリダイゼーション配列と、該ハイブリダイゼーション配列と前記リンカーユニットの間に介在されるスペーサーとを備えることができる。また、前記プローブは、ヘアピン構造又はループ構造を形成可能な配列を含んでいることができる。
【００１１】
本発明の他の一つの態様によれば、プローブが固定化された担体であって、前記プローブは、上記いずれかの態様のプローブである、プローブ固定化担体が提供される。この固定化担体によれば、前記プローブは、前記担体表面に備えられるアミノ基を介した共有結合により固定化されることができ、また、前記アミノ基はシロキサン結合を介して前記担体に備えられていてもよい。さらに、前記担体は、平板状、粒子状及びキャピラリーの内層とすることができる。さらにまた、前記担体は、平板状であり、前記プローブは、前記固定化担体に対してスポッティングにより供給されていてもよい。
【００１２】
本発明の他の一つの態様によれば、プローブ固定化担体の製造方法であって、上記いずれかの態様のプローブを含有する液体を準備する工程と、前記液体をアミノ基を備える担体の表面に供給して前記プローブを前記担体に固定化させる工程と、を備える、製造方法が提供される。
【００１３】
また、本発明の他の一つの態様によれば、核酸のハイブリダイズ方法であって、上記いずれかの態様のプローブ固定化担体を準備する工程と、当該プローブ固定化担体に、ターゲット核酸を供給して前記プローブとターゲット核酸とをハイブリダイズさせる工程と、
を備える、方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】オキサノシン修飾オリゴＤＮＡと担体表面のアミノ基との結合形態を示す図。
【図２】オキサノシン修飾オリゴＤＮＡの合成スキームの一例を示す図。
【図３】各種基板の保存期間と蛍光シグナル強度との関係を示す図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明のリンカー用化合物は、以下の式（１）で表される塩基を備える化合物である。
2006095830.tif 000004
［式中、Ａは、水素原子、その他の置換基又は糖類若しくはその誘導体を表す。］【００１６】
このリンカー用化合物は、図１に示す反応及び結合形態で担体に固定化されると考えられる。すなわち、このリンカー用化合物の６員環部分のカルボジイミドにより活性化されたカルボキシル基がアミノ基と反応して、新たなアミド結合を形成することができると考えられる。この反応は平衡反応でなく不可逆反応であるため、この新たなアミド結合が安定的に維持される。したがって、このリンカー用化合物を相補的核酸とのハイブリダイゼーションアッセイに用いられるプローブに連結させることで、アミノ基を有する担体やその他の化合物とプローブとを結合させることができる。【００１７】
こうしたリンカー用化合物をユニットとして有するプローブは、担体に対して安定的に保持されるため、長期間にわたり安定したハイブリダイゼーションによるシグナル強度及びハイブリダイゼーション効率を確保することができる。また、リンカー用化合物と担体アミノ基とは容易に反応するため、高い密度でプローブを担体に固定化することができる。また、このために高いシグナル感度を得ることができる。これらの結果、本プローブによれば、優れた検出感度と検出精度のハイブリダイゼーションアッセイを提供することができる。【００１８】
また、こうしたプローブは、ハイブリダイゼーションアッセイに付随する担体表面の前処理工程、ハイブリダイズ工程、洗浄工程等においても安定して担体への固定状態が維持されるため、こうした操作に関わらず再現性の高い結果を容易に得ることができる。【００１９】
また、こうしたプローブは、当該リンカー用化合物の連結位置においてアミノ基を備える担体表面と結合する。また、当該リンカー用化合物におけるこの結合反応性をプローブを構成する他の単位であるヌクレオチドは有していないため、プローブに備えられる他の官能基を保護する必要性がないものとなっている。【００２０】
また、本リンカー用化合物は、ヌクレオチドの形態を採ることができ、かつ当該形態において安定であるため、プローブの所望の位置に容易に導入される。このため、上記したリンカー用化合物を用いることで容易にプローブを作製することができる。また、プローブの担体に対する結合形態を自在に設計でき、プローブに対してハイブリダイゼーション効率を得やすい固定化形態を付与することもできるようになっている。【００２１】
さらに、こうしたプローブは、アミノ基保持担体との安定的な結合を容易に形成できるので、適用する担体形態として、平板状のほか、粒子やキャピラリーの内層などにも有効である【００２２】
以上の理由から、本プローブが固定化された担体は、ターゲット核酸とのハイブリダイゼーションアッセイに適したものとなっている。【００２３】
さらに、以上の理由から、本プローブ固定化担体を用いたハイブリダイズ方法は、検出感度と検出精度の良好なハイブリダイゼーションアッセイを実現することができる。【００２４】
また、以上の理由から、本プローブ固定化用担体の製造方法によれば、優れた検出感度と検出精度のハイブリダイゼーションアッセイを提供できるプローブ固定化担体を製造することができる。【００２５】
以下、本リンカー用化合物、プローブ、プローブ固定化担体、その製造方法について説明するとともに、本プローブ固定化担体を用いたハイブリダイゼーションアッセイについて説明する。【００２６】
（リンカー用化合物）
本リンカー用化合物は、式（１）に示される化合物である。前記Ａとしては、水素原子、その他の置換基又は糖類もしくはその誘導体とすることができる。Ａが水素であるとき、式（１）で表される化合物は、オキサニン塩基である。本塩基は、グアノシンがＮＯ又はＮＯ2により誘起される酸化的脱アミネーションされて形成される損傷塩基の一つである。なお、以下、本明細書において、オキサニンがリボース（フラノース型）と結合した形態をオキサノシンと称し、オキサニンがデオキシリボース（フラノース型）と結合した形態をデオキシオキサノシンと称し、オキサニンがリボース又はデオキシリボースと結合した形態を総称してオキサニンヌクレオシドと総称するものとする。【００２７】
オキサニンは、例えば、デオキシグアノシンをＮＯ及び／又はＮａＮＯ2と反応させることによってデオキシオキサノシンとして得ることができる。例えば、デオキシグアノニンにＮａＮＯ2を酸性下、例えば、酢酸ナトリウム緩衝液（３．０Ｍ、ｐＨ３．７）を用いて、３７℃、４時間反応させることによって得ることができる。こうした反応後、反応液をＮａＯＨで中和し、必要に応じ適宜減圧留去した後、逆相クロマトグラフィー等により精製し、乾燥することでデオキシオキサノシンを白色粉末として得ることができる。移動相としては、リン酸ナトリウム緩衝液（４００μＭ、ｐＨ７．４）等の中性の緩衝液とアセトニトリルなどの有機溶媒との混液（アセトニトリル１０％等）とすることで良好に分離できる。オキサニンは、デオキシオキサノシンを酸加水分解し、この反応液から逆相クロマトグラフィー等によって分取することができる。酸加水分解は、例えば、１Ｍ塩酸などの酸とともに３７℃で２時間という反応条件を採用することができる。【００２８】
前記Ａは、リボースやデオキシリボースなどのペントースを始めとする糖類とすることもできる。糖類の誘導体としては、糖類の炭素原子に結合した水素あるいは水酸基に替えて、アルコキシ、アルコキシアルキルオキシ、ハロゲン等の官能基を備えたものが挙げられる。【００２９】
本リンカー用化合物は、カルボジイミドで活性化されたカルボキシル基においてアミノ基との反応性が確保されていれば、どのような形態でオキサニンを備えていてもよい。好ましくは、リボース又はデオキシリボースなどのペントースと結合した形態で有することが好ましい。また、本塩基とペントースとの結合位置は、好ましくは、３位のＮ原子にペントースのＣ１’位炭素原子が結合する形態であることが好ましい。ペントースが１−β−リボフラノシルリボース又はリボフラノシルデオキシリボースのとき、本リンカー用化合物は、ヌクレオシド誘導体の形態を採ることになる。ヌクレオシド誘導体の形態の本リンカー用化合物は、既に説明したように、デオキシグアニンやデオキシグアノシンから容易に得ることができる。【００３０】
こうしたヌクレオシド誘導体形態の本リンカー用化合物は、化学合成によりオリゴヌクレオチドを取得するのに適した種々の修飾が施されていてもよい。例えば、リボース又はデオキシリボースのＣ３’位の水酸基やＣ５’位の水酸基は適宜修飾される。３’位の水酸基には、ホスホルアミダイト基が導入され、５’位の水酸基には、ジメトキシトリチル基等が導入されていることが好ましい。こうした修飾基としては、核酸の化学合成法において公知の方法を適宜用いることができる。ホスホアミダイト法による核酸の化学合成に適した本リンカー用化合物の例を以下に示す。
2006095830.tif 000005
［式中、Ｒ１は２−シアノエチル、４−ニトロフェニルエチル、２−トリメチルシチルエチル、又はメチルを表す］【００３１】
こうした本リンカー用化合物は、公知の核酸化学合成用モノマーの合成方法を適用して取得することができる。例えば、デオキシオキサノシンの懸濁液（溶媒としてはＤＭＦなど）にジメトキシトリチルクロライドを添加して、その後、イミダゾールとジイソプロピルエチルアンモニウムメシレートを添加し、この反応液を攪拌して均質化し、次いで、多量の水に投入し、沈殿を得、乾燥して粗精製物とする。この粗精製物をジクロロメタンなどの適当な溶媒に再溶解後、ヘキサン中で再結晶化することで、ＤＭＴ−デオキシオキサノシンを得ることができる。【００３２】
さらに、ＤＭＴ−デオキシオキサノシンをホスホアミダイト化するには、ＤＭＴ−デオキシオキサノシンを適当な溶媒に溶解し、その後、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ジイソプロピルホスホアミドを添加し、十分に反応させた後、メタノール、ジイソプロピルエチルアミン及び酢酸エチルの添加で反応を終了させ、１０％の炭酸水素ナトリウムで洗浄した後、有機相を脱水し濃縮した。この濃縮物をジクロロメタン等の適当な溶媒に再溶解し順相クロマトグラフィーにて分離した。移動相としては、例えば、酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝６５：３５：０．３３）などを採用することができる。【００３３】
さらに、本リンカー用化合物は、好ましくはリボース又はデオキシリボースの５位の炭素原子に結合した水酸基においてリン酸エステルの形態を採る。リン酸エステルは、３リン酸エステルとすることが好ましく、この場合、本リンカー用化合物は、ヌクレオチド誘導体の形態と採ることができる。このようなプローブ化合物は、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅手法により１００塩基以上の長鎖ＤＮＡなどの核酸を取得するのに好ましく用いることができる。ヌクレオチド誘導体としての本リンカー用化合物の例を以下の式に示す。
2006095830.tif 000006
【００３４】
（プローブ）
本発明のプローブは、こうしたリンカー用化合物をリンカーユニットとして備えている。プローブは、核酸、すなわち、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションアッセイのために用いられる。したがって、各種のＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ等の各種のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの形態を採ることができる。その他、プローブはＰＮＡであってもよい。なお、ここで、オリゴヌクレオチドとは、主として、ヌクレオチドが数個から好ましくは百数十以下、より好ましくは百程度以下の重合体を意味しており、主として化学合成等により得られるものを含んでいる。また、ポリヌクレオチドとは、主として、オリゴヌクレオチドよりも長鎖の重合体を意味しており、ＰＣＲ産物などを含んでいる。【００３５】
本プローブは、好ましくはデオキシリボースを有するオリゴデオキシリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドである。本プローブにおいては、本リンカーユニットはプローブを構成する他のモノマーユニットと同種のヌクレオチド誘導体として含まれていることが好ましい。【００３６】
ヌクレオチド誘導体としてのリンカーユニットを含むオリゴヌクレオチドは、公知のプローブ作製方法を適用して作製することができる。各種のＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ鎖伸長法を用いる場合には、例えば、本リンカー用化合物としてデオキシオキサノシン三リン酸（ｄＯＴＰ）を準備する。オキサニンは、シトシンやチミン（好ましくはシトシンである。）とそれぞれ２つの水素結合を形成して安定な塩基対合を形成することと推測される。こうした塩基対合を考慮して、所望のテンプレートと５’末端から本リンカー用化合物を導入しようとする所望の位置までのプライマーとを準備し、ｄＯＴＰのみを含む反応系で第１回目の伸長工程を実施する。その後、残存するｄＯＴＰを除去して、通常どおり必要なｄＮＴＰ（ＮはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧのいずれかあるいは２種類以上である。）の存在下で２回目以降の伸長工程を実施する。その後、必要に応じ、ｄＯＴＰのみの伸張工程を実施すれば、２以上の所望の部位に本リンカー用化合物を導入することができる。【００３７】
また、ホスホアミダイト法による場合には、例えば、既に説明したデオキシオキサノシンのホスホアミダイト化誘導体を準備し、合成中のオリゴデオキシヌクレオチドに対して所望の導入順位において添加して鎖延長反応を行う。こうすることによっても、プローブの１又は２以上の所望の部位に本リンカー用化合物を導入できる。【００３８】
本プローブは、ハイブリダイゼーションにおいては１本鎖核酸の形態で機能するが、取得時若しくは合成時又は固定化時においては、２本鎖の形態であってもよい。また、１本鎖の形態を採るとき、ループやヘアピン部位を有していてもよい。【００３９】
本プローブは、１又は２以上のリンカーユニットを備えることができる。リンカーユニットは、プローブにおいてもっぱら選択される担体固定部位である５’末端に備えることもできるが３’末端等それ以外の部位に備えることもできる。例えば、プローブの全長の中央近傍に備えていてもよい。また、５’末端側あるいは３’末端側にリンカーユニットを備えるようにし、このようなプローブを担体に固定したとき、該リンカー用化合物部位を含むプローブの上流側と下流側で部分的にヘアピン構造やループ構造を採らせるよう設計することもできる。特にリンカーユニットがヌクレオチド誘導体の形態を採ることにより、既に説明したように化学合成によっても酵素的な鎖延長法によっても任意の部位にリンカーを導入することができる。【００４０】
本プローブにおける、ターゲット核酸とのハイブリダイズ領域は、リンカーユニットを含まないことが好ましい。したがって、プローブの全長の中央近傍や末端近傍にリンカーユニットが導入される場合には、その近傍には、ハイブリダイズに関与しないスペーサー領域を形成することが好ましい。【００４１】
また、こうしたスペーサー領域は、プローブの５’末端などにリンカーユニットが導入される場合であっても同様であり、この場合、５’末端側からリンカーユニット−スペーサー領域−ハイブリダイズ領域とすることが好ましい。【００４２】
（プローブ固定化担体）
プローブ固定化担体は、本発明のプローブが固定化された固相担体である。固相担体としては、特に限定しないで、ハイブリダイゼーションアッセイに用いられる従来公知の各種の担体を用いることができる。例えば、ガラス、セラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、短繊維、メンブランフィルター等が挙げられる。好ましくは、ガラス、シリコン、ポリマーである。【００４３】
担体の形態も、本プローブを固定化可能であってかつターゲット核酸が供給可能な表面（内表面を含む）を有していれば特に限定しない。例えば、基板などの平板状、ビーズなどの粒子状、ファイバー状、内表面を固定化表面とするキャピラリー状等を採用することができる。【００４４】
本発明における担体は、プローブの固定化のために固定化表面にアミノ基（−ＮＲ1Ｒ2）を備えている。Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立に水素原子、または、置換基である。置換基は、炭素数が１以上１８以下、好ましくは、１以上６以下の直鎖アルキル基である。アミノ基は、リンカー用化合物との反応性を考慮すると１級アミノ基であることが好ましい。【００４５】
アミノ基を備える担体は、例えば、リジン、ヒスチジン及びアルギニンからなる１種以上のアミノ酸残基を備えることができる。こうしたアミノ酸残基は、ポリマーの形態でコーティング層として担体表面を構成していてもよい。また、ガラス製担体などシラノール基を備える担体のシラノール基に、アミノ基含有基を備える各種のモノ−、ジ−、トリ−アルコキシシランを導入することにより、シロキサン結合を介してアミノ基を備える担体を得ることもできる。アミノ基は、好ましくは末端に備えられるように設計される。アミノ基含有基は、適当なスペーサー部分を介してアミノ基を備えることができる。スペーサー部分は、炭素数２以上１０以下のアルキル基又は当該アルキル基の一部の炭素原子が窒素原子又はＳ原子により置換された形態が好ましい。アルキル基は、直鎖状あるいは分枝状とすることができるが、好ましくは直鎖状である。【００４６】
また、アルコキシシランにおけるアルコキシル基は、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。また、アルコキシシランにおける残余の基（アルコキシル基及びアミノ基アルキルアミノ基以外にＳｉに結合する基）としては、アルキル基であることが好ましい。当該アルキル基としては、炭素数１〜１０程度のアルキル基が好ましく用いられ、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、シクロヘキシル基、ｎ−オクチル基、ｔｅｒｔ−オクチル基、ｎ−デシル基が挙げられる。なお、シラノール基に導入するアルコキシシランはこれに限定するものではなく、その他各種のシラン化合物を用いることができる。なお、担体に使用することのできるシラン化合物の例を以下に示す。
2006095830.tif 000007
【００４７】
本発明のプローブ固定化担体においては、プローブは、そのリンカー用化合物のオキサニンのカルボジイミドで活性化されたカルボキシル基と担体表面のアミノ基とが反応して、アミド結合を形成した状態で固定化されている（図１参照）。【００４８】
プローブの固定化形態は、プローブにおけるリンカー用化合物の導入位置により異なり、５’末端にリンカー用化合物を備える場合には、プローブが１本鎖状に固定化されるであろうし、プローブ全長の中央近傍にリンカー用化合物を備える場合には、プローブはＵ字等状に固定化されるであろう。また、リンカー用化合物の導入部位近傍に対向して塩基対合を形成可能な配列等を有する場合には、リンカー用化合物導入部位近傍でヘアピンやループ構造を採るであろう。【００４９】
（プローブ固定化担体の製造方法）
プローブ固定化担体は、プローブを含有する液体を準備し、この液体を上記担体の表面に供給し、前記プローブにおけるリンカー用化合物のオキサニンと担体に備えられるアミノ基とを反応させることによって得ることができる。担体にプローブを供給する方法は従来公知のいずれの方法も採用できる。例えば、プローブ固定化担体として、基板等の表面に多数個のプローブスポットを配列されたアレイを作製するには、ピンによる接触型あるいはバブルジェット（登録商標）方式等によるプローブ含有液滴をスポット状に供給する。また、ビーズ等の粒子にプローブを供給するには、プローブ含有溶液中にビーズをディッピングするかプローブ含有溶液を噴霧するなどによることができる。【００５０】
プローブの担体への固定化は、通常行われるこうしたプローブ溶液のスポッティングやディッピング等の操作において可能である。アミノ基を備える担体へプローブ溶液が供給されれば、リンカー用化合物とアミノ基は速やかに反応することができる。なお、プローブ溶液には、有機溶媒を添加することでもきるし、また、必要に応じて、中性あるいは微酸性に調整することができる。温度やインキュベーション時間は、担体やプローブの種類等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、３０℃〜９０℃の所定温度とし、反応時間は数十分から１時間あるいは数時間程度とすることができる、担体表面にプローブ溶液を供給した後は、リハイドレーション、ブロッキング、変性、洗浄、乾燥等の工程を実施することができる。【００５１】
（ハイブリダイズ方法）
本発明の核酸ハイブリダイズ方法は、本発明のプローブ固定化担体を準備し、このプローブ固定化担体に対して核酸を供給してプローブとターゲット核酸とをハイブリダイズさせるものである。本ハイブリダイズ方法では、本プローブ固定化担体を用いる以外は、従来公知の方法で調製した各種のターゲット核酸を常法に従い供給しハイブリダイズさせればよい。
【実施例１】
【００５２】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。なお、図２に、実施例１〜４におけるデオキシオキサノシン修飾オリゴＤＮＡの合成スキームを示す。【００５３】
（２’−デオキシオキサノシンの合成）
デオキシグアニン３ｍｍｏｌを４００ｍｌの１００ｍＭのＮａＮＯ2含有酢酸ナトリウム緩衝液（３．０Ｍ、ｐＨ３．７）で３７℃、４時間インキュベートした。その後、５Ｍ ＮａＯＨで中和し、ロータリーエバポレータで溶媒の半量を減圧留去し、Millex-GS（０．２２μm：ミリポア（ブラッドフォード、ＭＡ）でろ過して、分取用逆相ＨＰＬＣシステム（Tosho PX-8010 (controller), CCPM (pump) and UV-8010 (UV detector) (Tosoh Co, Tokyo, Japan) Ultron VX-ODS column (250 x 20 mm, 5 μm; 信和化工株式会社製)に導入した。移動相は、１０％アセトニトリル含有リン酸ナトリウム緩衝液（４００μＭ、ｐＨ７．４）でアイソクラティックとし、流量は６ｍｌ／分とした。デオキシオキサノシンのフラクションをさらに精製し凍結乾燥すると、デオキシオキサノシンの白色粉末を得ることができた（０．４ｍｍｏｌ、収率１０％）【００５４】
２−デオキシオキサノシンのＮＭＲデータ：
1H NMR (600MHz, D2O at 30oC): δ = 7.98 (s, 1H, H-2), 6.26 (dd, 1H, H-1'), 4.61 (ddd, 1H, H-3'), 4.12 (ddd, 1H, H-4'), 3.79 (m, 2H, H-5',5"), 2.77 (ddd, 1H, H-2'), 2.52 (ddd, 1H, H-2"); UV: λmax = 245, 286 (pH 7); MS(FAB) m/z 269 (M+H+)
【実施例２】
【００５５】
（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシオキサノシン（ＤＭＴ−ｄＯｘｏ）の合成）
４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（０．４ｍｍｏｌ）をデオキシオキサノシンの懸濁液（０．４ｍｍｏｌ、脱水したＤＭＦ３ｍｌ）に添加し、その後、イミダゾール（０．８ｍｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアンモニウムメシレート（０．８ｍｍｏｌ）を添加した。【００５６】
室温で６時間この反応混合液を攪拌することで反応溶液は均質化した。次いで、この反応溶液を水９００ｍｌに投入して、得られた沈殿をろ取して室温で２４時間乾燥した。この粗精製物を、ジクロロメタンに再溶解して、ヘキサン中で再結晶化して、ＤＭＴ−デオキシオキサノシンの白色粉末を得た（０．２２ｍｍｏｌ、収率６９％）。【００５７】
ＤＭＴ−ｄＯｘｏのＮＭＲデータ：
1H NMR (600MHz, DMSO-d6 at 30oC): δ = 7.88 (br, 2H, NH2), 7.80 (s, 1H, H-2), 7.31-6.74 (m, 13H, Ar-H), 6.04 (dd, 1H, H-1'), 5.26 (s, 1H, 3'-OH), 4.39 (m, 1H, H-3'), 3.85 (m, 1H, H-4'), 3.75 (s, 6H, Ar-OCH3), 3.06 (m, 2H, H-5',5"), 2.54 (ddd, 1H, H-2'), 2.22 (ddd, 1H, H-2"); (MS(FAB) m/z 571 (M+H+)
【実施例３】
【００５８】
（5’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシオキサノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル ホスホアミダイト（ＤＭＴ−ｄＯｘｏ−アミダイト）の合成）
０．３５ｍｍｏｌＤＭＴ−デオキシオキサノシンを３ｍｌの０．３４ｍｍｏｌテトラゾール含有の無水アセトニトリルに溶解して、その後、０．５２５ｍｍｏｌの２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ジイソプロピルホスホアミドをこの溶液に添加した。この均一な混合物を、室温で４時間攪拌し、最終的に１ｍｌのメタノールを加えた後、０．１５ｍｌのジイソプロピルエチルアミンと３ｍｌの酢酸エチルを加えて反応を終了させ、その後、３ｍｌの１０％ＮＡＨＣＯ3で３回洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した後、粘調なオイルに濃縮した。この粗精製物を、ジクロロメタン２ｍｌに再溶解して、分取用順相ＨＰＬＣに導入した。移動相は、酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝６５：３５：０．３３のアイソクラティックとし、流量は６ｍｌ／分とした。目的化合物のフラクションを減圧下で留去して、ＤＭＴ−ｄＯｘｏ−アミダイトの白色粉末を得た（０．２９ｍｍｏｌ、収率７２．５％）。【００５９】
ＮＭＲデータ：
1H NMR (600MHz, DMSO-d6 at 30oC): δ = 7.88 (br, 2H, NH2), 7.80 (s, 1H, H-2), 7.31-6.74 (m, 13H, Ar-H), 6.04 (dd, 1H, H-1'), 5.26 (s, 1H, 3'-OH), 4.39 (m, 1H, H-3'), 3.85 (m, 1H, H-4'), 3.75 (s, 6H, Ar-OCH3), 3.06 (m, 2H, H-5',5"), 2.54 (ddd, 1H, H-2'), 2.22 (ddd, 1H, H-2"); (MS(FAB) m/z 571 (M+H+)
【実施例４】
【００６０】
（オキサノシン修飾オリゴＤＮＡプローブの合成及び精製）
オリゴデオキシヌクレオチドプローブの合成は、ホスホアミダイト法によってＣＰＧ支持体（０．２又は１μｍｏｌスケール）に結合された５’−ＤＭＴ−ＤＮＡ塩基から開始した。調製したプローブのハイブリダイゼーション用配列を以下に示す。ＤＭＴ−ｄＯｘｏ−アミダイトは、以下の配列を合成後の最終ステップにおいて５’末端に導入された。
オキサノシン修飾オリゴＤＮＡプローブ１：５’−agagaaaaccccttcaccaaagcgt−３’（配列番号：１）
オキサノシン修飾オリゴＤＮＡプローブ２：５’−aagaagctgaacgcttagtgaggcg−３’（配列番号２）
オキサノシン修飾オリゴＤＮＡプローブ３：５’−gcaggcagataaatcagagtggggg−３’（配列番号３）【００６１】
デオキシヌクレオシドホスホアミダイトの結合には、ＤＮＡシンセサイザー（ＡＢＩ）の通常のプロトコールを使用した。５’末端側のジメトキシトリチル基は、合成装置によっては取り除かれなかった。ＣＰＧ支持体からオリゴマーを分離し、３７℃、２４時間、０．５ＭのＮａＯＨで処理して保護基を外した。本実施例の化学合成においては、ステップ毎において９５％以上のカップリング率であった。【００６２】
２ＭのＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）による中和後、ｐｏｌｙ−Ｐａｋカートリッジ（グレンリサーチカンパニー）で脱塩し、さらに、逆相ＨＰＬＣで精製した。移動相は、５％（０分）−５％（５分）−３０％（２５分）―４０％（３０分）―５％（３７分）アセトニトリル含有１００ｍＭ ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）でグラディエントをかけた。流量は、２ｍｌ／分とした。【００６３】
精製物を、室温で３０分間、８０％酢酸で処理した後、減圧乾燥して、ジエチルエーテルで抽出した。得られた水相を、先と同じグラディエント条件（ただし、流量は１ｍｌ／分）による逆相ＨＰＬＣに供し、最終的な同定を行った。さらに、精製したオリゴＤＮＡを、１００μｌの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．９、０．５ｍＭ塩化亜鉛含有）中でヌクレアーゼＰ１とアルカリホスファターゼで処理した。反応処理液を、直接逆相ＨＰＬＣシステムに導入して、移動相を（０％（０分）−１５％（１５分）アセトニトリル含有１００ｍＭＴＥＡＡとしたリニアグラディエントで溶出させた。流量は１ｍｌ／分とした。得られたクロマトグラムから消化後のヌクレオチドを分析し、合成したオリゴＤＮＡにデオキシオキサノシンが導入されていることを確認した。
【実施例５】
【００６４】
（アミノ基含有ガラス基板の調製）
スライドガラス（２５．４ｍｍ×７６．２ｍｍ×１ｍｍ）をアセトンで洗浄し、ｐｉｒａｎｈａ溶液（濃硫酸／３０％Ｈ2Ｏ2、体積比で７／３）の超音波浴で３０分間処理した。その後、多量の水で洗浄して、１時間減圧吸引しながらデシケータ中で乾燥した。【００６５】
洗浄した基板を、メタノール、メタノールとトルエンとの混液（１：１）及びトルエンにてそれぞれ１０分間洗浄し、各種の２％シラン化合物（３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシシラン、２−（２−アミノエチルチオエチル）トリエトキシシラン、３−アミノプロピルジメチルエトキシシラン）に５時間浸漬し、２５℃で５時間、回転攪拌器（７０ｒｐｍ）で攪拌した。【００６６】
シラン化後、スライドガラスを、トルエン、メタノールとトルエンとの混液（１：１）及びメタノールにてそれぞれ１０分間洗浄し、１００℃の熱風オーブン中で１時間乾燥した。室温まで冷却後、スライドガラスを、トルエン、メタノールとトルエンとの混液（１：１）及びメタノールにてそれぞれ１０分間洗浄し、減圧吸引したデシケータ中で乾燥した。その後、さらに、この修飾ガラスは、２％シラン化合物溶液に８時間浸漬して２５℃で８時間振とうし、その後熱風乾燥し、同様にして洗浄（ただし、最後はメタノール）して、送風乾燥して、減圧デシケータに保存した。
【実施例６】
【００６７】
（オキサノシン修飾オリゴＤＮＡプローブの基板への固定化）
担体としての基板（以下、実施例基板という。）には、実施例５で調製したアミノ基修飾スライドガラスのうち、３−アミノプロピルトリエトキシシランで修飾したものを用いた。また、比較例用の基板１としては、アルデヒド修飾スライドガラス（TeleChem International,Inc.社製、アミノ基修飾オリゴＤＮＡ用、以下、比較例基板１という。）を用い、同基板２としては、エポキシ修飾スライドガラス（MWG社製、アミノ基修飾オリゴＤＮＡ用、以下、比較例基板２という。）を用いた。いずれのオリゴＤＮＡも化学合成により取得し、その５’末端にアミノ基が導入された。【００６８】
オキサノシン修飾オリゴＤＮＡとしては、実施例４で合成した３種類のオリゴＤＮＡを用いた。また、比較例基板１及び比較例基板２のそれぞれに用いるアミノ基修飾オリゴＤＮＡは、配列番号１〜３のそれぞれに記載のハイブリダイゼーション配列の５’末端にアミノ基を導入したものを調製した。【００６９】
次に、実施例、比較例１及び比較例２の各オリゴＤＮＡをＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．６）に溶解し、オリゴＤＮＡ濃度５０pmol/μｌの溶液を調製し、これをプローブ溶液として、ＧＥＮＥＳＨＯＴ（登録商標）スポッターを用いて、それぞれ実施例基板、比較例基板１及び比較例基板２に１スポット当たり約２００ｐＬスポットした。【００７０】
こうして調製した３種類の基板のそれぞれについて以下の操作を行った。
（実施例基板）
オキサノシン修飾オリゴＤＮＡ溶液をスポッティング後、８０℃で１時間ベークし、スライドガラスラックに基板を入れて、無水コハク酸溶液（２．５ｇ無水コハク酸を１６０ml 1-methyl-2-pyrrolidinoneに溶解し、０．２Ｍほう酸ナトリウム水溶液 (pH8.0)を１７．５ml加えて調製した。）に２０分間浸漬した。その後、滅菌水にスライドラックごと漬け１０回静かに揺動洗浄し、さらに新しい滅菌水にスライドラックごと漬け１０回静かに揺動洗浄した。次いで、沸騰滅菌水中に３分間浸漬した後、余分な水分を吸い取り、素早く冷エタノールに１分間浸漬し、脱水したうえ、余分なエタノールを吸い取り室温で乾燥した。【００７１】
（比較例基板１）
アミノ修飾オリゴＤＮＡ溶液をスポッティング後、８０℃、１時間ベークした後、スライドガラスラックに基板を入れて、ＮaＢＨ4溶液（エタノール４０mlとＰＢＳ１３５mlに１．５gのＮaＢＨ4を溶解し、調製した。）に５分間浸漬した。その後、滅菌水にスライドラックごと漬け１０回静かに揺動洗浄し、さらに新しい滅菌水にスライドラックごと漬け１０回静かに揺動洗浄した。次いで、沸騰滅菌水中に３分間浸漬した後、余分な水分を吸い取り、素早く冷エタノールに１分間浸漬し、脱水したうえ、余分なエタノールを吸い取り室温で乾燥した。【００７２】
（比較例基板２）
アミノ修飾オリゴＤＮＡ溶液をスポッティング後、相対湿度４５％、４２℃で一晩インキュベートした。その後、スライドガラスラックに基板を入れて、０．２％ＳＤＳ水溶液で室温にて２分間振とう洗浄し、さらに滅菌水で室温にて１分間振とう洗浄し、さらに新しい滅菌水で室温にて１分間振とう洗浄した。その後、５０℃の滅菌水中に２０分間浸漬。遠心し乾燥した。【００７３】
（ハイブリダイゼーションサンプルの調製）
オリゴＤＮＡの配列番号１〜３のハイブリダイゼーション配列に対してそれぞれ相補的な配列（配列番号４〜６）を持つとともに、５’末端をＣｙ３で標識したオリゴＤＮＡを滅菌水に溶解して使用した。試料液の終濃度は１００ｎＭとした。
相補鎖オリゴＤＮＡ１：５’−acgctttggtgaaggggttttctct−３’（配列番号４）
相補鎖オリゴＤＮＡ２：５’−cgcctcactaagcgttcagcttctt−３’（配列番号５）
相補鎖オリゴＤＮＡ３：５’−cccccactctgatttatctgcctgc−３’（配列番号６）【００７４】
（ハイブリダイゼーション）
濃度調製したハイブリダイゼーションサンプルに２０×ＳＳＣ、１０％ ＳＤＳを加え、終濃度５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳになるように調製した。このサンプルのそれぞれ２５μｌを基板上に滴下し、その上から静かにカバーガラスをかけ、相対湿度１００％、４２℃で一晩インキュベートした。その後、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ溶液で室温にて５分振とうし、１×ＳＳＣ溶液で室温にて５分振とうし、さらに０．１×ＳＳＣ溶液で室温にて５分振とうした後、１０００ｒｐｍで３分間遠心し乾燥した。【００７５】
（測定及び蛍光シグナル数値化）
ＳｃａｎＡｒｒａｙ４０００（商標）（Ｐａｃｋａｒｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社製）にて、レーザーパワー、ＰＭＴ（フォトマル）を適宜調節し測定した。ＧｅｎｅＰｉｘＰｒｏ（商標）（Ａｘｏｎ社製）を用いて、各スポットの蛍光シグナルを数値化した。【００７６】
実施例、比較例１及び比較例２について同時に調製したそれぞれ他のオリゴＤＮＡ固定化基板を室温にてデシケータ中に保存し、１ヶ月毎に各基板を取り出して、ハイブリダイゼーションを行い、蛍光シグナルを測定し数値化した。これらの結果を図３に示す。【００７７】
図３に示すように、実施例の基板にあっては、調製直後の蛍光シグナル強度が高いとともに、その後において蛍光シグナル強度の低下はほとんど観察されなかった。これに対し、比較例基板１及び２においては、当初の蛍光シグナル強度も低く、しかも、保存期間の経過に伴ってシグナル強度も低下した。したがって、本発明のオリゴＤＮＡプローブを固定化した基板によれば、固定化にも優れるとともに、高いハイブリダイゼーション効率でのハイブリダイズが可能であるほか、保存してもそのような能力が安定して維持されることがわかった。【００７８】
本発明は２００５年３月９日に出願された日本国特許出願第２００５−０６５９４８を優先権主張の基礎としており、その内容の全てが引用により含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明は、核酸のハイブリダイズに関わる技術分野に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００８０】
配列番号１〜３：オリゴヌクレオチドプローブ
配列番号４〜６：ターゲットサンプル
【図１】
2006095830.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【配列表】
2006095830000001.app
【国際調査報告】
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2006095830.tif 000015
2006095830.tif 000016
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