(57)【要約】  高濃度のエリスロポエチンを産生するトランスジェニック鳥類、およびその作製方法を提供する。  鳥類受精卵を孵卵し、産卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降に形成される初期胚へ、外来性エリスロポエチン遺伝子を含有する複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させることによって得られるＧ０トランスジェニックキメラ鳥類。【特許請求の範囲】
【請求項１】
鳥類受精卵を孵卵し、産卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降に形成される初期胚へ、外来性エリスロポエチン遺伝子を含有する複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させることによって得られるＧ０トランスジェニックキメラ鳥類。
【請求項２】
外来性エリスロポエチン遺伝子が哺乳類由来である請求項１に記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類。
【請求項３】
外来性エリスロポエチン遺伝子がヒト由来である請求項２に記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類。
【請求項４】
外来性エリスロポエチン遺伝子が組織非特異的なプロモーターによって制御されたものである請求項１〜３のいずれかに記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類。
【請求項５】
組織非特異的なプロモーターがニワトリβ−アクチン遺伝子由来である請求項４に記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類。
【請求項６】
外来性エリスロポエチン遺伝子が組織特異的なプロモーターによって制御されたものである請求項１〜３のいずれかに記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類。
【請求項７】
組織特異的なプロモーターがニワトリオボアルブミン遺伝子由来である請求項６に記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類。
【請求項８】
外来性エリスロポエチン遺伝子に転写後調節配列が付加されている請求項１〜７のいずれかに記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類。
【請求項９】
転写後調節配列がＷＰＲＥである請求項８に記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類。
【請求項１０】
複製能欠失型レトロウイルスベクターがＭｏＭＬＶまたはＭＳＣＶ由来である請求項１〜９のいずれかに記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類。
【請求項１１】
複製能欠失型レトロウイルスベクターがＶＳＶ−Ｇシュードタイプである請求項１〜１０のいずれかに記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類。
【請求項１２】
複製能欠失型レトロウイルスベクターとして、複製能欠失型レトロウイルスベクターのタイターが１×１０８ｃｆｕ／ｍｌ以上１×１０１０ｃｆｕ／ｍｌ以下のウイルス液を用いて感染を行う請求項１〜１１のいずれかに記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類。
【請求項１３】
初期胚が孵卵開始後２４時間以後６０時間以前に形成されたものである請求項１〜１２のいずれかに記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類。
【請求項１４】
初期胚が孵卵開始後４８時間以後６０時間以前に形成されたものである請求項１３に記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類。
【請求項１５】
初期胚に形成される心臓内または血管内へのマイクロインジェクションにより感染を行う請求項１〜１４のいずれかに記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類。
【請求項１６】
初期胚に形成される心臓内へのマイクロインジェクションにより感染を行う請求項１５に記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を該Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類、その子孫または野生型鳥類と交配することにより得られるＧ１トランスジェニック鳥類およびその子孫。
【請求項１８】
請求項１７に記載のＧ１トランスジェニック鳥類を該Ｇ１トランスジェニック鳥類、その子孫、野生型鳥類または請求項１〜１６のいずれかに記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類と交配することにより得られるＧ２トランスジェニック鳥類およびその子孫。
【請求項１９】
鳥類がニワトリまたはウズラである請求項１〜１８のいずれかに記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれかに記載のトランスジェニック鳥類が産んだ卵。
【請求項２１】
請求項２０に記載の卵からエリスロポエチンを抽出、精製することから成るエリスロポエチンの生産法。
【請求項２２】
請求項１〜１９のいずれかに記載のトランスジェニック鳥類の血液からエリスロポエチンを抽出、精製することを含むエリスロポエチンの生産法。
【請求項２３】
請求項１〜１９のいずれかに記載のトランスジェニック鳥類の精子。
【請求項２４】
鳥類受精卵を孵卵し、産卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降に形成される初期胚へ、外来性エリスロポエチン遺伝子を含有する複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させることを特徴とする、Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類作製法。
【請求項２５】
外来性エリスロポエチン遺伝子が哺乳類由来である請求項２４に記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類作製法。
【請求項２６】
外来性エリスロポエチン遺伝子がヒト由来である請求項２５に記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類作製法。
【請求項２７】
外来性エリスロポエチン遺伝子が組織非特異的なプロモーターによって制御されたものである請求項２４〜２６のいずれかに記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類作製法。
【請求項２８】
組織非特異的なプロモーターがニワトリβ−アクチン遺伝子由来である請求項２７に記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類作製法。
【請求項２９】
外来性エリスロポエチン遺伝子が組織特異的なプロモーターによって制御されたものである請求項２４〜２６のいずれかに記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類作製法。
【請求項３０】
組織特異的なプロモーターがニワトリオボアルブミン遺伝子由来である請求項２９に記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類作製法。
【請求項３１】
外来性エリスロポエチン遺伝子に転写後調節配列が付加されている請求項２４〜３０のいずれかに記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類作製法。
【請求項３２】
転写後調節配列がＷＰＲＥである請求項３１に記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類作製法。
【請求項３３】
複製能欠失型レトロウイルスベクターがＭｏＭＬＶまたはＭＳＣＶ由来である請求項２４〜３２のいずれかに記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類作製法。
【請求項３４】
複製能欠失型レトロウイルスベクターがＶＳＶ−Ｇシュードタイプである請求項２４〜３３のいずれかに記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類作製法。
【請求項３５】
複製能欠失型レトロウイルスベクターとして、複製能欠失型レトロウイルスベクターのタイターが１×１０８ｃｆｕ／ｍｌ以上１×１０１０ｃｆｕ／ｍｌ以下のウイルス液を用いて感染を行う請求項２４〜３４のいずれかに記載のＧ０トランスジェニック鳥類作製法。
【請求項３６】
初期胚が孵卵開始後２４時間以後６０時間以前に形成されたものである請求項２４〜３５のいずれかに記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類作製法。
【請求項３７】
初期胚が孵卵開始後４８時間以後６０時間以前に形成されたものである請求項３６に記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類作製法。
【請求項３８】
初期胚に形成される心臓内または血管内へのマイクロインジェクションにより感染を行う請求項２４〜３７のいずれかに記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類作製法。
【請求項３９】
初期胚に形成される心臓内へのマイクロインジェクションにより感染を行う請求項３８に記載のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類作製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品等に利用できる有用生理活性タンパクを安価に生産するために鳥類のゲノムを操作して、該タンパクの遺伝子を機能状態で染色体に保有し、該タンパクを卵などへ高発現する遺伝子組換え（トランスジェニック）鳥類を作製する方法、ならびに該方法により得られるトランスジェニック鳥類に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年数多くのタンパク医薬製剤が利用されるようになった。微生物や培養細胞に目的タンパクの遺伝子を導入する遺伝子組換え技術が開発・応用され、これらの遺伝子組換え体を培養することでタンパク質を工業生産できるようになったためである。糖タンパクの一つであるエリスロポエチンは、糖鎖付加機能のある動物由来培養細胞を宿主として生産されているが、この生産方法はコストが高いという難点があった。
従来動物由来培養細胞でしか生産できないタンパクをより安価に生産するための手法として期待されているのがトランスジェニック動物の利用である。トランスジェニック哺乳動物の開発が先行したが、これらの動物は成熟期間が長く、広い飼育スペースが必要であるなど工業利用するには必ずしも有利と言えない。これに対し、ニワトリやウズラに代表される家禽類は、成熟期間が短く、飼育スペースも小さくて済むなどの利点があるため、有用タンパク生産へのトランスジェニック鳥類の利用は大いに期待が持たれた。
特許文献１及び２は、複製能欠失型エビアン・ロイコシス・ウイルス（ＡＬＶ）ベクターを用いて作製したヒトエリスロポエチン産生トランスジェニック鳥類を開示する。しかし、その産生量は７０ｎｇ／ｍｌと非常に少ない。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／００１９９２２号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４／００１９９２３号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
特許文献１及び２が開示するヒトエリスロポエチン産生トランスジェニック鳥類は、エリスロポエチン産生量が少ないという点で問題がある。したがって、本発明は高濃度のエリスロポエチンを産生するトランスジェニック鳥類、およびその作製方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、鋭意検討の結果、鳥類受精卵を孵卵し、産卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降に形成される初期胚へ、外来性エリスロポエチン遺伝子を含有する複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させることからなる方法によって、高濃度のエリスロポエチンを産生するトランスジェニック鳥類が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００５】
本発明で使用する鳥類としては特に限定されず、例えば、ニワトリ、七面鳥、カモ、ダチョウ、ウズラなど、食肉、採卵目的で家畜化されている家禽鳥類や愛玩用鳥類を挙げることができる。なかでもニワトリやウズラは、入手が容易で、産卵種としても多産である点が好ましい。【０００６】
本発明で使用する外来性エリスロポエチン遺伝子としては特に限定されず、哺乳類に由来するものが好ましく、具体的には、ヒト由来のもの、あるいは、イヌなどの愛玩動物に由来するものなどが挙げられる。【０００７】
本発明で使用する外来性エリスロポエチン遺伝子は、鳥類細胞内で発現するために、適当なプロモーターの下流に連結されていることが好ましい。
上記プロモーターとしては、鳥類の全ての体細胞で常に活性のある組織非特異的なプロモーター、または、鳥類の特定の組織・細胞でのみ活性のある組織特異的なプロモーターが挙げられる。【０００８】
上記組織非特異的なプロモーターを用いた場合、エリスロポエチンは血中にも発現するため、雛の段階でそれを検出できるという利点がある。
上記組織非特異的なプロモーターとしては特に限定されないが、例えば、ニワトリβ−アクチンプロモーターなどが挙げられる。また、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウスザルコーマウイルス（ＲＳＶ）プロモーターなどのウイルス由来プロモーターが挙げられる。【０００９】
上記組織特異的なプロモーターを用いた場合、外来性エリスロポエチンが鳥類の発生に阻害的に働いて高発現が困難になるという可能性を排除できる利点がある。
上記組織特異的なプロモーターとしては特に限定されないが、例えば、オボアルブミンプロモーター（特にニワトリオボアルブミンプロモーター）、リゾチームプロモーター、オボトランスフェリンプロモーター、オボムコイドプロモーターなどが挙げられる。これらの卵白特異的プロモーターを用いた場合、エリスロポエチンを卵白中にのみ高発現させることができる観点から好ましい。【００１０】
本発明で使用する外来性エリスロポエチン遺伝子には転写後調節配列が付加されていてもよい。転写後調節配列は、遺伝子の転写により形成されるｍＲＮＡの中に存在すると、ｍＲＮＡの安定維持に寄与することが知られている。
上記転写後調節配列としては特に限定されないが、例えば、ＷＰＲＥ（ウッドチャック肝炎ウイルス由来転写後調節配列、米国特許６１３６５９７）などが挙げられる。【００１１】
エリスロポエチンの分泌のためにはエリスロポエチン遺伝子に分泌シグナル配列が備わっていることが好ましいが、自己の配列に限定されるものではない。【００１２】
本発明で使用する外来性エリスロポエチン遺伝子にはマーカー遺伝子が付加されていてもよい。
上記マーカー遺伝子としては特に限定されないが、例えば、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）等の蛍光タンパクをコードする遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ネオマイシン耐性（Ｎｅｏｒ）遺伝子等が挙げられる。【００１３】
本発明で使用するレトロウイルスベクターとしては特に限定されないが、例えば、マウスを宿主とするレトロウイルスやレンチウイルスに由来するもの等が挙げられる。なかでもヒトの遺伝子治療にも利用され安全性の高いモロニー・ミューリン・ロイケミア・ウイルス（ＭｏＭＬＶ）に由来するものが好ましいが、マウス・ステム・セル・ウイルス（ＭＳＣＶ）等、鳥類を宿主としないウイルスであれば、レトロウイルスベクターの複製の可能性を排除できる観点から好ましい。【００１４】
本発明で使用するレトロウイルスベクターは、安全性を考慮して、ウイルス粒子の複製に必要なｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖの遺伝子のうちいずれかまたは全てを欠くことにより、自己複製能を欠失したものである。
鳥類細胞にこのウイルスベクターを効率的に感染させるため、本発明で使用するレトロウイルスベクターは、外皮タンパクｅｎｖを人為的にウシ水疱性口内炎ウイルスのＶＳＶ−Ｇにしたシュードタイプとすることが好ましいが、このウイルスタイプに限定されるものではない。【００１５】
本発明で使用するレトロウイルスベクターのコンストラクトについて好ましい一態様を説明する。
外来性エリスロポエチン遺伝子は、プロモーターなどの遺伝子発現に好ましい要素、及び／又は、マーカー遺伝子が付加された後、それら全てが、前述のウイルスに由来するＬＴＲ（５’ＬＴＲ、３’ＬＴＲ）に挟まれた構造をとっている。ＬＴＲ配列は宿主染色体に組込まれる遺伝子の両端として認識される。【００１６】
さらに、この遺伝子構造は、前述のウイルスに由来するウイルスパッケージングシグナル配列を含んでいる。ウイルスパッケージングシグナル配列はウイルス粒子にパッケージされる目印として機能する。
ＬＴＲはプロモーターおよびターミネーターとしての活性も有するが、レトロウイルスベクターの複製の可能性を完全に排除するためには鳥類細胞でプロモーター活性がないものが望ましい。この観点から、マウスなど、鳥類以外を宿主とするウイルス由来のＬＴＲが好ましい。
これらの遺伝子構造は単一のコンストラクトによって提供される。詳細は本発明者らが既に開示した方法（特開２００２−１７６８８０号公報）に記載される。【００１７】
次に、本発明で使用する複製能欠失型シュードタイプレトロウイルスベクターの調製について好ましい一態様を説明する。
ウイルス粒子の複製に必要とされるｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖの遺伝子のうちｇａｇおよびｐｏｌの遺伝子を保有するパッケージング細胞株と呼ばれる細胞にエリスロポエチン遺伝子とＶＳＶ−Ｇ遺伝子を共導入し、培養上清をウイルス液とする。あるいは望ましくは、このように調製したウイルスベクターをパッケージング細胞に感染させることで得られる高コピーのエリスロポエチン遺伝子を染色体に組込んだ安定パッケージング細胞にＶＳＶ−Ｇ遺伝子を導入し、培養上清をウイルス液とする。培養上清は遺伝子導入後２〜３日目のものを使用することが望ましく、必要に応じて濃縮してウイルス液とする。しかし、このような方法に限定されるものではない。【００１８】
上記ウイルス液において、複製能欠失型レトロウイルスベクターのタイターは、１×１０８ｃｆｕ／ｍｌ以上１×１０１０ｃｆｕ／ｍｌ以下が好ましく、１×１０９ｃｆｕ／ｍｌ以上１×１０１０ｃｆｕ／ｍｌ以下がより好ましい。このレベルの高タイターのウイルス液は、上述の転写後調節配列の効果を用いれば、前述の方法で得られたウイルス液を超遠心濃縮することにより容易に得ることができる。【００１９】
上記ウイルス液のタイターは、このウイルス液をＮＩＨ３Ｔ３細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手）に共存させた時にウイルスが感染した細胞の数によって定義する。例えば、２４ウェル培養プレートの各ウェル（底面積約１．９ｃｍ２）に存在する３×１０４個のＮＩＨ３Ｔ３細胞に、１０２から１０６倍の希釈率で希釈したウイルス溶液を１ｍｌ加え、マーカーＧＦＰを発現している細胞の割合を測定すると、タイターは次の計算式で表される。
ウイルスベクターのタイター＝３×１０４×希釈率×ＧＦＰ発現割合（ｃｆｕ／ｍｌ）。【００２０】
次に、本発明にいう複製能欠失型レトロウイルスベクターの鳥類初期胚への感染について説明する。
複製能欠失型レトロウイルスベクターは、産卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降に形成される初期胚（好ましくは初期胚に形成される血管内、心臓内）に感染させる。当該感染の手段としては特に限定されず、マイクロインジェクション法（Ｂｏｓｓｅｌｍａｎ，Ｒ．Ａら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３，５３３）、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が挙げられるが、マイクロインジェクション法が好ましい。【００２１】
複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させる初期胚は、産卵直後の鳥類受精卵を孵卵環境、例えばニワトリならば３７．７〜３７．８℃、湿度５０〜７０％程度の環境においた孵卵開始時間から２４時間以上経過していることが望ましい。より望ましくは孵卵開始から４８時間以上経過した初期胚である。好ましくは、孵卵開始から６０時間以前の初期胚である。これらの時間は孵卵温度や気候などの外的条件によって変動するため、より正確には、ＨａｍｂｕｒｇｅｒとＨａｍｉｌｔｏｎ（Ｈ＆Ｈ，Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ，Ｖ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｈ．Ｌ．（１９５１）Ｊ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．８８，４９）の定義による発生ステージ１４〜１６の初期胚が望ましい。より望ましくは、Ｈ＆Ｈの定義による発生ステージ１５の初期胚である。この発生ステージの鳥類胚には心臓の拍動を観察することができる。この心臓内あるいはこれにつながる血管内への複製能欠失型レトロウイルスベクターのマイクロインジェクションが最も望ましい感染方法である。【００２２】
その後引き続き孵卵を進め、複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させた鳥類初期胚を孵化させる。例えばニワトリの場合、孵卵開始から２１日目にＧ０トランスジェニックキメラ鳥類の雛が誕生する。詳細は本発明者らが既に開示した方法（国際公開第２００４／０１６０８１号パンフレット）にしたがう。【００２３】
本発明で作製されるＧ０トランスジェニックキメラ鳥類は、全て又は一部の体細胞及び／又は生殖細胞に外来性エリスロポエチン遺伝子を保有している。【００２４】
本発明のＧ１トランスジェニック鳥類は、生殖細胞に外来性エリスロポエチン遺伝子を保有するＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を、該Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類、その子孫または野生型鳥類と交配させることにより作製される。交配型はＧ０トランスジェニックオスと野生型メス、Ｇ０トランスジェニックメスと野生型オス、Ｇ０トランスジェニックのオスとメス等が考えられ、さらに子孫とその親による戻し交配も可能である。なかでもＧ０オスと野生型メスの交配型は、１羽のＧ０オスに対し、野生型メス３羽から１０羽を交配させることができるため、効率の点から好ましい。【００２５】
交配に用いるＧ０オスは、予めＰＣＲ法等により精子中の外来性エリスロポエチン遺伝子の有無を確認しておくことができ、外来性エリスロポエチン遺伝子を確認したＧ０オスを用いることにより効率よくＧ１トランスジェニック鳥類を得ることができる。【００２６】
本発明で作製されるＧ１トランスジェニック鳥類は、好ましくは、全ての体細胞に均一に外来性エリスロポエチン遺伝子を保有している。ＰＣＲ法等により血球等の体細胞内の外来性エリスロポエチン遺伝子を確認することで見分けられる。【００２７】
本発明のＧ２以降の世代のトランスジェニック鳥類は、Ｇ１トランスジェニック鳥類を該Ｇ１トランスジェニック鳥類、その子孫、野生型鳥類または上記Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類と交配させることにより作製される。交配型はＧ１トランスジェニックオスと野生型メス、Ｇ１トランスジェニックメスと野生型オス、Ｇ１トランスジェニックのオスとメス等が考えられ、さらに子孫とその親による戻し交配も可能である。なかでもＧ１オスと野生型メスの交配型は、１羽のＧ１オスに対し、野生型メス３羽から１０羽を交配させることができるため、効率の点から好ましい。【００２８】
本発明のエリスロポエチン生産法は、前述のトランスジェニック鳥類からエリスロポエチンを回収することを特徴とする。より詳細には、作製されたトランスジェニック鳥類の血中および／または卵中からエリスロポエチンを回収、精製することを特徴とする。回収、精製に用いる方法としては特に限定されず、例えば、抗体、陰イオン交換、逆相、ゲル濾過、ヒドロキシアパタイト、ブルーセファロース、フェニルホウ酸などの各種カラムを用いるクロマトグラフィー、限外濾過、精密濾過、遠心分離、及び／又は、これらを組み合わせた方法などが挙げられる。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、高濃度のエリスロポエチンを産生するトランスジェニック鳥類、およびその作製方法が提供される。本発明のトランスジェニック鳥類は、ＣＨＯ細胞が産生する従来のエリスロポエチンと比較して同等以上の比活性（具体的には、エリスロポエチン依存性細胞の増殖性を指標とする比活性）を示すエリスロポエチンを生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。【００３１】
（実施例１）
ヒトエリスロポエチン遺伝子発現用ベクターコンストラクトの構築
ヒトエリスロポエチン遺伝子発現用ベクターコンストラクトｐＭＳＣＶ／ＧΔＡｈＥＰＯＷは以下のように構築した。【００３２】
１．ｐＭＳＣＶｎｅｏ（クロンテック社製）から一連のミューリン・ホスホグリセレート・キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびＮｅｏｒ遺伝子を含む断片を制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩによって除去し、残ったベクター断片のセルフライゲーションによりプラスミドｐＭＳＣＶを構築した。【００３３】
２．ｐＧＲＥＥＮ  ＬＡＮＴＥＲＮ−１（ギブコＢＲＬ社製）からＧＦＰ遺伝子断片を制限酵素ＮｏｔＩによって切り出し、ｐＺｅｏＳＶ２（＋）（インビトロジェン社製）のＮｏｔＩサイトに挿入した。Ｔ７プロモーターと同方向にＧＦＰ遺伝子が挿入された構造のプラスミドをｐＺｅｏ／ＧＦＰとした。【００３４】
３．ｐＺｅｏ／ＧＦＰからＧＦＰ遺伝子断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩによって切り出し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩによって処理したｐＭＳＣＶのベクター断片に連結し、プラスミドｐＭＳＣＶ／Ｇを構築した。【００３５】
４．２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ａｃｇｃｇｔｃｇａｃｇｔｇｃａｔｇｃａｃｇｃｔｃａｔｔｇ−３’（配列番号１、下線部はＳａｌＩ制限酵素サイト）および５’−ａｃｇｃｇｔｃｇａｃａａｃｇｃａｇｃｇａｃｔｃｃｃｇ−３’（配列番号２、下線部はＳａｌＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲ（９４℃／１５秒→５０℃／３０秒→６８℃／１分：１０サイクル；９４℃／１５秒→６２℃／３０秒→６８℃／１分：３０サイクル；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製））によりｐＭｉｗＺ（Ｓｕｅｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆ．Ｄｅｖ．２９：１８１−１８５）からΔＡｃｔプロモーター断片を増幅後、制限酵素ＳａｌＩによってΔＡｃｔプロモーター断片を切り出し、ｐＥＴＢｌｕｅ−２（ノバジェン社製）のＳａｌＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＥＴＢｌｕｅ／ΔＡｃｔを構築した。【００３６】
５．ｐＥＴＢｌｕｅ／ΔＡｃｔからΔＡｃｔプロモーター断片を制限酵素ＳａｌＩによって切り出し、ｐＭＳＣＶ／ＧのＸｈｏＩサイトに挿入した。ＧＦＰ遺伝子と同方向にΔＡｃｔプロモーターが挿入された構造のプラスミドをｐＭＳＣＶ／ＧΔＡとした。【００３７】
６．２つの化学合成オリゴヌクレオチド対５’−ｇｃｇｃｃｃｃａｃｃａｃｇｃｃｔｃａｔｃｔｇｔｇａｃａｇｃｃ−３’（配列番号３）と５’−ｇｇｃｔｇｔｃａｃａｇａｔｇａｇｇｃｇｔｇｇｔｇｇｇｇｃｇｃ−３’（配列番号４）および５’−ｇｃｔｃｔｇｇｇａｇｃｃｃａｇａａｇｇａａｇｃｃａｔｃｔｃｃ−３’（配列番号５）と５’−ｇｇａｇａｔｇｇｃｔｔｃｃｔｔｃｔｇｇｇｃｔｃｃｃａｇａｇｃ−３’（配列番号６）を用いてＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＸＬ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）によりプラスミドｐｃＤＮＡ３．１／ＧＳ／ｈＥＰＯ（クローンＲＧ００１７２０、インビトロジェン社製）が含むヒトエリスロポエチン遺伝子に２箇所部位特異的変異を導入し、アムジェン社型のヒトエリスロポエチン遺伝子（ジェンバンク  アクセッション番号Ｍ１１３１９）を含むプラスミドｐｃＤＮＡ３．１／ＧＳ／αｈＥＰＯを構築した。【００３８】
７．２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ａｇｃｃａａｇｃｔｔａｃｃａｔｇｇｇｇｇｔｇｃａｃｇａａ−３’（配列番号７）および５’−ｃｇａｔａａｇｃｔｔａｃｇｃｇｔｔｃａｔｃｔｇｔｃｃｃｃｔｇｔｃｃｔｇｃａｇｇｃｃｔｃｃ−３’（配列番号８）（下線部はＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲによりｐｃＤＮＡ３．１／ＧＳ／αｈＥＰＯからヒトエリスロポエチン遺伝子断片（含分泌シグナル配列）を増幅後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによって切り出し、ｐＭＳＣＶ／ＧΔＡのＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入した。ΔＡｃｔプロモーターと同方向にヒトエリスロポエチン遺伝子が挿入された構造のプラスミドをｐＭＳＣＶ／ＧΔＡｈＥＰＯとした。【００３９】
８．２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ｃｃａｔｃｇａｔａａｔｃａａｃｃｔｃｔｇｇａｔｔａｃａａａａｔｔｔｇｔｇａ−３’（配列番号９）および５’−ｃｃａｔｃｇａｔｃａｇｇｃｇｇｇｇａｇｇｃｇ−３’（配列番号１０）（下線部はＣｌａＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲによりｐＷＨＶ８（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション４５０９７）からＷＰＲＥを増幅後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）（ストラタジーン社製）のＥｃｏＲＶサイトに挿入して、プラスミドｐＢｌｕｅ／ＷＰＲＥを構築した。ｐＢｌｕｅ／ＷＰＲＥはｄａｍ−の大腸菌ＪＭ１１０（ストラタジーン社製）を宿主にして調製した。【００４０】
９．ｐＢｌｕｅ／ＷＰＲＥからＷＰＲＥを制限酵素ＣｌａＩによって切り出し、ｐＭＳＣＶ／ＧΔＡｈＥＰＯのＣｌａＩサイトに挿入した。ＷＰＲＥ中のＳａｃＩＩサイトがヒトエリスロポエチン遺伝子から遠い位置に来るようにＷＰＲＥが挿入された構造のプラスミドをｐＭＳＣＶ／ＧΔＡｈＥＰＯＷとした。
このように構築した複製能欠失型レトロウイルスベクターのベクターコンストラクトｐＭＳＣＶ／ＧΔＡｈＥＰＯＷの構造を図１に示した。なお、図１中のアンピシリン耐性遺伝子Ａｍｐｒ、ウイルスパッケージングシグナル配列Ψ＋、並びに、ロングターミナルリピート配列５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲはすべて、ｐＭＳＣＶｎｅｏに由来するものである。【００４１】
（実施例２）
ヒトエリスロポエチン遺伝子発現用レトロウイルスベクターの調製
実施例１で構築したベクターコンストラクトｐＭＳＣＶ／ＧΔＡｈＥＰＯＷよりレトロウイルスベクターを調製するため、パッケージング細胞ＧＰ２９３（クロンテック社製）を直径１００ｍｍの培養ディッシュに５×１０６細胞植え、培養した。培地を新鮮なＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）に交換し、ｐＶＳＶ−Ｇ（クロンテック社製）８μｇとｐＭＳＣＶ／ＧΔＡｈＥＰＯＷ８μｇをリポフェクション法により前記ＧＰ２９３細胞に導入した。４８時間後、ウイルス粒子を含む培養上清を回収し、０．４５μｍ酢酸セルロースフィルター（アドバンテック社製）を通して夾雑物を除去した。得られた溶液にポリブレン（シグマ社製）を８μｇ／ｍｌとなるように加えウイルス液とした。【００４２】
調製したウイルス液を別に培養したＧＰ２９３細胞に加え、４８時間培養後、細胞を限界希釈法によりクローニングした。ウイルスの感染によりＧＦＰを強く発現する株を安定パッケージング細胞株とした。【００４３】
得られた安定パッケージング細胞株を８０％コンフルエントとなるよう直径１００ｍｍディッシュに培養し、１６μｇのｐＶＳＶ−Ｇをリポフェクション法で導入した。４８時間後ウイルス粒子を含む培養上清を回収した。【００４４】
この培養上清を２０，０００×ｇ、４℃で５時間遠心を行い、ウイルスを沈殿させた。上清を除き、ウイルス粒子を含む沈殿物に２０μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液を加え、４℃で一晩放置後、よく懸濁してウイルス溶液を回収した。このようにして得られたウイルスベクターのタイターは２×１０９ｃｆｕ／ｍｌであった。【００４５】
ウイルスベクターのタイターの測定は次のように行った。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション  ＣＲＬ−１６５８）を２４ウェル培養プレートの各ウェル（底面積約１．９ｃｍ２）に１．５×１０４個播種した。一昼夜の培養により到達が想定される各ウェルの細胞数３×１０４個に対し、１０２から１０６倍の希釈率で希釈したウイルス溶液を１ｍｌ加え、４８時間後に蛍光顕微鏡によりＧＦＰを発現している細胞の割合を測定した。ウイルスベクターのタイターは以下の計算式により求めた。
ウイルスベクターのタイター＝３×１０４×希釈率×ＧＦＰ発現割合（ｃｆｕ／ｍｌ）【００４６】
（実施例３）
ＷＰＲＥを利用しない場合のレトロウイルスベクターの調製
実施例２と同様にして、実施例１で構築したＷＰＲＥを含有しないベクターコンストラクトｐＭＳＣＶ／ＧΔＡｈＥＰＯよりレトロウイルスベクターを調製した。ここで得られたウイルスベクターのタイターは４×１０８ｃｆｕ／ｍｌであった。【００４７】
（実施例４）
ニワトリ胚へのレトロウイルスベクターのマイクロインジェクションと人工孵化
ニワトリ受精卵（日本生物化学研究所）を自動転卵装置が内蔵された孵卵機（昭和フランキ社製Ｐ−００８型）内で３７．９℃、湿度６５％環境に置いた時刻を孵卵開始時刻（０時間）とし、以後１５分毎に９０度転卵しながら孵卵を行った。【００４８】
孵卵開始から約５５時間経過した頃（Ｈ＆Ｈの定義によるステージ１５）、孵卵機から卵を取り出し、その鋭端部を直径３．５ｃｍの円形にダイヤモンドカッター（ＭＩＮＯＭＯ７Ｃ７１０、ミニター社製）で切り取り、卵黄表面に胚を露出させた。この初期胚に観察される心臓に実体顕微鏡下ガラス製キャピラリ針を刺し、実施例２で調製したウイルス溶液約２μｌをマイクロインジェクションした。キャピラリ針はガラス管（ＧＤ−１、ナリシゲ社製）からマイクロピペット製作器（ＰＣ−１０、ナリシゲ社製）を用いて加工し、外径約２０μｍとなるよう先端を折って使用した。マイクロインジェクションには、マイクロインジェクター（Ｔｒａｎｓｊｅｃｔｏｒ５２４６、エッペンドルフ社製）を用いた。【００４９】
別に用意したニワトリニ黄卵の鈍端部に直径４．５ｃｍの穴を開け、中身を捨てた卵殻にインジェクション処理した受精卵の中身を移した。卵白に懸濁した５０ｍｇ／ｍｌ乳酸カルシウム液０．５ｍｌをこれに添加した後、卵白を糊としてポリ塩化ビニリデンラップ（サランラップ、旭化成社製）でこの穴を塞ぎ、これを孵卵機に戻した。１時間毎に３０度転卵しながら酸素供給下孵卵を行った。孵卵開始から１８日目に転卵を停止し、２１日目に雛がハシ打ちを始めたら卵殻を割って孵化させた。この人工孵化による孵化率は３０〜６０％だった。【００５０】
（実施例５）
人工孵化により産まれたニワトリの血清、卵白および卵黄のウェスタンブロット解析
実施例４により誕生した雛を飼育して成長させた。成鶏の翼下静脈より採血し、得られた血液を３０分室温静置後、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を血清サンプルとした。この血清と、雌成鶏が産卵した卵の卵白および卵黄の各サンプルを各々ＰＢＳで２０倍希釈してＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ゲル濃度は１０％とした。このゲルからブロッティングしたＰＶＤＦ膜を、ブロッキング溶液（５％スキムミルク、ＴＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）に浸した後、１次抗体として２μｇ／ｍｌ抗ヒトエリスロポエチンウサギ抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）に反応させ、続けて２次抗体として１μｇ／ｍｌパーオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体（サンタクルズ社製）に反応させた。これらの反応は室温下ブロッキング溶液中で１時間行った。最後に、ＥＣＬキット（アマシャム社製）によりＰＶＤＦ膜を用いてＸ線フィルムを感光させ、現像した（図２）。この結果、解析した４羽のニワトリの血清の全てにヒトエリスロポエチンの発現を確認できた。また、２羽の卵の結果では、ヒトエリスロポエチンの卵黄での発現は低かったが、卵白での発現は血清中よりも高いことを確認した。このようにヒトエリスロポエチンを産生するＧ０トランスジェニックキメラニワトリを作製することができた。【００５１】
（実施例６）
人工孵化により産まれたニワトリの血清、卵白および卵黄に発現したヒトエリスロポエチンの定量
実施例５と同様にして、血清、卵白および卵黄のサンプルを調製し、ＲＩＡ法を用いるリコンビジェンＥＰＯキット（三菱化学ヤトロン社製）によりこれらの中に存在するヒトエリスロポエチンの量を定量した。その結果、調べた６羽のニワトリ全てにおいて血清中のヒトエリスロポエチン濃度が２，０００Ｉ．Ｕ．／ｍｌを超え、最大３，０００Ｉ．Ｕ．／ｍｌを示す個体があった。また、卵黄中の濃度は平均で１Ｉ．Ｕ．／ｍｌとほとんど発現が見られなかったが、卵白中には平均で１，９００Ｉ．Ｕ．／ｍｌのヒトエリスロポエチンを検出し、最大５，４００Ｉ．Ｕ．／ｍｌの濃度を示す個体がいた。図３は個体＃１１１における卵白中の発現量の変化を示すが、１箇月にわたり約２，０００Ｉ．Ｕ．／ｍｌの発現量を維持していることがわかった。このようにヒトエリスロポエチンを高濃度に産生するＧ０トランスジェニックキメラニワトリを作製することができた。【００５２】
（実施例７）
人工孵化により産まれたニワトリに発現したヒトエリスロポエチンの活性測定
実施例６で測定した結果２０００Ｉ．Ｕ．／ｍｌのヒトエリスロポエチン濃度を示した血清サンプルを用いて活性を測定した。測定はエリスロポエチン依存的に増殖するＢａｆ／ＥｐｏＲ細胞を用いる細胞増殖アッセイ（特開平１０−９４３９３号公報）を用いた。Ｂａｆ／ＥｐｏＲ細胞用培地として、５％の牛胎児血清、５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、および、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０リキッド培地（ニッスイ社製）を用いた。
Ｂａｆ／ＥｐｏＲ細胞を培地で３回再懸濁と遠心分離を繰り返して洗浄した後、５．６×１０４Ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるように希釈し、９６ウェル培養プレートの各ウェル（底面積約０．３ｃｍ２）に９０μｌずつ播種した。前記血清サンプルおよび標準ヒトエリスロポエチン（カルビオケム社製，ＣＨＯ由来、２０００Ｉ．Ｕ．／ｍｌ）サンプルを培地で１６００Ｉ．Ｕ．／ｍｌより２倍ずつ段階希釈し、細胞を播種した９６ウェル培養プレートの各ウェルに１０μｌずつ加え、一様になるように懸濁した。対照実験には野生ニワトリ血清サンプルを用いた。各サンプルの各希釈液につき３つのウェルを準備した。２昼夜培養後、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（同人化学研究所社製）溶液を各ウェルに１０μｌずつ添加した。約１〜４時間呈色反応を行った後、０．１ｍｏｌ／ｍｌの塩酸を各ウェルに１０μｌずつ加え反応を停止し、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて各ウェルの４５０ｎｍの吸光度（ＯＤ）を測定した。各サンプルの各希釈液につき３つのウェルの測定結果を平均し、これを各サンプルにつきヒトエリスロポエチン濃度に対してプロットしたのが図４である。この結果から、血清サンプル中のヒトエリスロポエチンは標準ヒトエリスロポエチンに比べ同等以上の比活性（単位質量当たりの活性）を示すことが判明した。このように活性のあるヒトエリスロポエチンを産生するＧ０トランスジェニックキメラニワトリを作製することができた。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ヒトエリスロポエチン遺伝子発現用ベクターコンストラクトｐＭＳＣＶ／ＧΔＡｈＥＰＯＷの構造を示す。Ａｍｐｒはアンピシリン耐性遺伝子を示す。ＰΔａｃｔはβ−アクチンプロモーター遺伝子を示す。Ψ＋はウイルスパッケージングシグナル配列を示す。ｈＥＰＯはヒトエリスロポエチン遺伝子を示す。５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲはＭＳＣＶのロングターミナルリピート配列を示す。
【図２】ニワトリ胚へのヒトエリスロポエチン遺伝子発現用レトロウイルスベクターのマイクロインジェクションと人工孵化により産まれたニワトリの血清、卵白および卵黄のウェスタンブロット解析の結果を示す。＃は個体番号、ＮＴは野生のニワトリを示す。矢印はエリスロポエチンの分子量の位置を示す。
【図３】ニワトリ胚へのヒトエリスロポエチン遺伝子発現用レトロウイルスベクターのマイクロインジェクションと人工孵化により産まれたニワトリの卵白中ヒトエリスロポエチン濃度の経時変化を示す。
【図４】ニワトリ胚へのヒトエリスロポエチン遺伝子発現用レトロウイルスベクターのマイクロインジェクションと人工孵化により産まれたニワトリの血清中ヒトエリスロポエチンのエリスロポエチン依存性細胞による活性測定の結果を示す。横軸はヒトエリスロポエチン濃度、縦軸はＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８の測定結果を示す。ｓｔａｎｄａｒｄは標準ヒトエリスロポエチン、Ｇ０（＃１０３）はＧ０トランスジェニックキメラニワトリ血清サンプル、Ｗｉｌｄは野生ニワトリ血清サンプルを示す。
【図１】
2006112147.tif 000002
【図３】
2006112147.tif 000003
【図４】
2006112147.tif 000004
【図２】
2006112147.tif 000005
【配列表】
2006112147000001.app
【国際調査報告】
2006112147.tif 000006
2006112147.tif 000007
2006112147.tif 000008
2006112147.tif 000009
2006112147.tif 000010