(57)【要約】  極微量な光学活性試料を識別定量でき、かつ従来よりも高感度な円二色性熱レンズ顕微鏡装置の提供することを課題とする。  光学顕微鏡に励起光と検出光を入射し、励起光が試料中に照射されることにより形成される熱レンズに検出光を入射し、熱レンズによる検出光の拡散を測定することにより試料中の物質の検出を行う熱レンズ顕微鏡装置であって、励起光を位相変調素子により変調することで光学異性体の識別もしくは定量を行う、円二色性熱レンズ顕微鏡装置により、課題を解決する。【選択図】  図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
波長の異なる励起光と検出光を放射する発振手段をそれぞれ設け、対物レンズを介して該励起光と該検出光を試料中に導入し、該励起光が試料中に形成する熱レンズによる検出光の透過光量変化を、光検出器を設置して熱レンズ信号として測定する熱レンズ顕微鏡装置であって、さらに該励起光を左右の円偏光に変調可能な位相変調手段を該発振手段と試料の間の励起光の経路に配置するとともに、前記左右の円偏光の照射による熱レンズ信号の差（以下、円二色性熱レンズ信号）を測定して光学異性体の識別もしくは定量を行うことを特徴とする、円二色性熱レンズ顕微鏡装置。
【請求項２】
前記対物レンズの開口数が0.1以上であることを特徴とする、請求項１記載の円二色性熱レンズ顕微鏡装置。
【請求項３】
前記位相変調手段が電気光学変調素子であることを特徴とする、請求項１又は２記載の円二色性熱レンズ顕微鏡装置。
【請求項４】
前記電気光学変調素子の結晶材料が、KDP（KH2PO4）、DKDP（KD2PO2）又はBBO（BaB2O4）からなる群のうちの何れか１種から構成されていることを特徴とする、請求項３記載の円二色性熱レンズ顕微鏡装置。
【請求項５】
同期検波手段を更に備え、該同期検波手段により前記円二色性熱レンズ信号から前記電気光学変調素子の変調周波数と同期する成分を抽出することで、前記円二色性熱レンズ信号の強度もしくは位相を測定することを特徴とする、請求項３又は４の何れか１項記載の円二色性熱レンズ顕微鏡装置。
【請求項６】
励起光の強度変調手段を更に備え、該強度変調手段により発生する熱レンズ信号（以下、強度変調熱レンズ信号）強度と、円二色性熱レンズ信号強度を測定することにより、試料の光学純度を測定することを特徴とする、請求項５記載の円二色性熱レンズ顕微鏡装置。
【請求項７】
波長の異なる励起光と検出光を放射する発振手段をそれぞれ設け、試料中に該励起光の焦点を結ぶ対物レンズを介して、該励起光と該検出光を試料中に導入し、試料を透過した検出光の強度を測定する円二色性熱レンズ顕微鏡装置において、
該励起光のみを左右の円偏光に選択的に変調可能な位相変調手段を該発振手段と試料の間の励起光の経路に配置するとともに、前記試料を透過した検出光の強度を該位相変調手段の変調に同期して検出可能な同期検波手段を含み、前記試料を透過した検出光の強度から前記位相変調に同期する成分を抽出し該同期成分の位相差を少なくとも求めることを特徴とする、円二色性熱レンズ顕微鏡装置。
【請求項８】
前記位相変調手段とは独立に変調可能な励起光の強度変調手段を更に備え、前記位相変調手段による円偏光とされた励起光が照射されたときに試料を透過した検出光の強度と該強度変調手段による偏りのない励起光が試料に照射されたときに試料を透過した検出光の強度をそれぞれ計測し、その強度の比を更に求めることを特徴とする、請求項７記載の円二色性熱レンズ顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、円二色性熱レンズ顕微鏡装置に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、円二色性分光法を熱レンズ顕微鏡により実現することで、高感度かつマイクロチャネル中の試料などの微量な試料を測定することを可能にする円二色性熱レンズ顕微鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体試料を初めとする各種の液体試料等の分析や測定を行う場合にあっては、これまで種々の分光分析法が利用されているものの、試料が破壊ないし損傷される等の問題があることから、溶液あるいは生体組織中等の超微量の試料を扱う場合には、光学領域の顕微鏡が広く利用されている。【０００３】
しかしその一方で、高精度で高い空間分解能での分析が必要とされる場合、実際上利用可能な分析ツールとしてはレーザ蛍光顕微鏡のみであって、自ずと分析対象は蛍光物質に限定されてきたが、非蛍光物質についても適用可能で、高精度かつ高空間分解能の分析ツールとしての光学顕微鏡の実現が求められてきた。【０００４】
かかる条件を満たす分析ツールとして、熱レンズ効果を利用した光学顕微鏡系が検討されたが、熱レンズ効果を利用する場合、励起光が試料中に入射されることにより形成される熱レンズに検出光を入射し、試料透過後の検出光の拡散から試料物質の検出を行うものとすることが欠かせないにも拘わらず、光学顕微鏡系では、色収差等が高度に補正されているなど、励起光と検出光の焦点位置が一致してしまうことにより、実現が非常に困難であった。【０００５】
そして、本発明者らは、これらの問題を解消するための分析ツールとして、励起光と検出光の波長を異なるものとし、色収差のあるレンズを対物レンズとして用いることにより、試料中における励起光および検出光の焦点位置が一致させないようにした光学調整装置と、試料透過光の集光装置とを採用し、励起光と検出光が接眼レンズに入射されて対物レンズより試料ステージ上の試料に放射され、その試料透過光を集光装置により集光しつつ該透過光のうち検出光のみから分析が行われる、熱レンズ顕微鏡超微量分析装置等を、この出願に先立ち提供してきた（特許文献１参照のこと。）。【０００６】
しかしながら、この特許文献１に係る熱レンズ顕微鏡超微量分析装置は、分析を行う微小空間における分析対象の濃度を感度良く検出できるものの、励起光照射時と非照射時の透過検出光の拡散の差を測定して（すなわち励起光は強度変調）、光吸収を示す全溶質のトータルな濃度を、熱レンズ効果として測定する手法であるために、酷似した物性を有する複数の物質が共存する分析条件下においては、それぞれを区別して定量的に検出することはきわめて困難であった。【０００７】
特に、いわゆる光学活性な試料の場合、光学異性体間の吸光特性における差は、きわめて小さく、常法による励起光を用いた熱レンズ顕微鏡装置では、両者の識別並びに定量が困難であると考えられてきた。【０００８】
一方、こうした光学活性な試料を効率的に合成する装置としては、ガラス、樹脂、シリコンなどに、１〜100μmの溝を刻んで、その上で迅速に合成を行うマイクロチップが近年利用されるようになってきたため（非特許文献１参照のこと。）、かかる装置で合成された試料量は従来の1/10,000以下の極微量となっており、被分析物の光路長が大幅に短縮されるのにともない、一層、検出が困難になってきている。【０００９】
なお、かかるマイクロチップを利用する場合に限らず、反応条件のスクリーニングに際しては、多種多様な反応条件を検討する必要があることから、それぞれの分析に供しうる試料量は、可能な限り微量であることが望ましいことはいうまでもない。【００１０】
また、光学活性な試料は、そのキラリティに応じて、生体の生理作用に大きな影響を及ぼすことが広く知られており、製薬分野においては、光学活性試料のキラリティを正確に識別し、定量することが重要な課題となっている。【００１１】
こうした光学活性試料の測定法としては、物質が示す右円偏光と左円偏光の吸収度の差（円二色性）に基づいて測定する円二色性測定装置や、直線偏光の回転（旋光角）を測定する旋光計などが知られている。特に、円二色性測定装置は旋光計よりも温度変化やほこり、気泡などの外乱要因に強いため、重要不可欠な手段となっている。【００１２】
具体的には、光照射手段から照射された光の偏光状態を周期的に変調する偏光調整手段を備え、変調された光を試料に照射し、該試料からの拡散反射光を、積分球を介して検出手段により検出する円二色性測定装置が知られている（例えば、特許文献２を参照のこと。）。【００１３】
また、光を強く絞らない熱レンズ測定で光学活性を測定した例はある（例えば、非特許文献２を参照のこと。）。
【特許文献１】特開２００４−４５４３４号公報
【特許文献２】特開２００４−３２５３３６号公報
【非特許文献１】"Macromolecular Rapid Communications", No.25, (2004), pp.158-168
【非特許文献２】"ANALYTICAL  CHEMISTRY", Vol.62, No.22、（1990.11.15.) pp.2467-2471
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
生体の生理作用についての理解を進めていく上で、光学活性試料の識別定量化の問題は益々その重要性を増していくものと予想されるが、従来の円二色性測定装置等では、その検出感度が十分とはいえず、また、被分析物の局在性の高い試料や極微量の試料に対しては、有効な分析ツールとは言い難い。【００１５】
特に、その試料量については今後いっそう厳しい制限を受けることになると予想されるため、検出感度の観点から円二色性測定装置等では今後のニーズに対処出来ないことは明かであり、しかも、これらの分析ツールは、元々空間分解能において劣っていることから、特定の細胞表面といった局在性の高い分析対象への応用はほとんど期待できない。【００１６】
一方、既存の熱レンズ顕微鏡装置は、複数種の光学異性体が共存する被検査試料では、光学異性体間の通常用いられる励起光の吸収特性における差があまりに小さいことから、かかる光学活性試料に対して適用したとしても、複数種の光学異性体に亘っての平均化された概略の濃度を求められるに過ぎず、具体的にどのタイプの光学異性体が多いのかまでは識別できない。【００１７】
また、非特許文献２に例示される方法では、光学活性を熱レンズ測定で測定はしているものの、この方法は、感度が低く微量な試料には適用できなかった。またこの手法で用いられている電気化学変調手段の結晶材料ADP（NH4H2PO4）を熱レンズ顕微鏡に適用して円二色性熱レンズ信号を測定すると、後述の図４に例示されるとおり、予想外にバックグラウンド信号が大きく増加して測定精度が低下することを発見した。【００１８】
従って、解決すべき技術的課題としては、測定原理的に光学活性試料を識別することが困難な従来の熱レンズ顕微鏡装置に、如何にして光学活性試料を識別する機能を付加し、マイクロチップといった極微量の試料にも適用可能な、より高感度かつ高空間分解能を達成するかということにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、上述の背景技術における技術的な課題を解決するためになされたものである。すなわち、光学活性試料の場合、光学異性体を含むが故に、一般的な物理的化学的な性質は酷似しているものの、互いに逆の旋光性を示すといったキラルな構造を有していることから、この出願の発明者らは、熱レンズ顕微鏡における励起光を左右の円偏光に制御可能な構成を付加することができれば、円二色性を利用して吸収特性に光学異性体間で有意な差をもって検出できるのではないかとの着想に思い至った。【００２０】
しかしながら、左右の円偏光を励起光として導入できるようにするだけでは、例えば、後述の図２に例示される、光学異性体（［（＋）Co(en)3］3+）の場合、左円偏光と右円偏光との間の検出光の吸光度における差（Δε+（532nm）＝εL−εR）は、+3.2×10-1（M-1cm-1）であり、その比（Δε+／ε(532nm)）は、0.032に過ぎない。一方、その光学異性体である［（−）Co(en)3］3+）の場合にも、吸光度における差（Δε-（532nm）＝εL−εR）は、-3.2×10-1（M-1cm-1）であり、その比（Δε-／ε(532nm)）は、0.032であって、濃度測定と光学異性体の種類を同時に精度よく特定することは難しい。【００２１】
そこで、この出願の発明者らは、励起光を、所定の周期で右円偏光と左円偏光とに切換え可能な光変調素子を介して試料に照射することにより、熱レンズ効果の大きさに周期性のある変化を付与し、かかる熱レンズ領域を透過し検出光の強度のうち、光変調素子の周波数と同期した成分を測定して濃度を精度よく検出しつつ、微弱な信号の周期性における位相差をもって光学異性体の種類を同定することに成功した。【００２２】
本発明（１）は、波長の異なる励起光と検出光を放射する発振手段をそれぞれ設け、対物レンズを介して該励起光と該検出光を試料中に導入し、該励起光が試料中に形成する熱レンズによる検出光の透過光量変化を、光検出器を設置して熱レンズ信号として測定する熱レンズ顕微鏡装置であって、さらに該励起光を左右の円偏光に変調可能な位相変調手段を該発振手段と試料の間の励起光の経路に配置するとともに、前記左右の円偏光の照射による熱レンズ信号の差（以下、円二色性熱レンズ信号）を測定して光学異性体の識別もしくは定量を行うことを特徴とする、円二色性熱レンズ顕微鏡装置である。
本発明（２）は、前記対物レンズの開口数が0.1以上であることを特徴とする、本発明（１）の円二色性熱レンズ顕微鏡装置である。
本発明（３）は、前記位相変調手段が電気光学変調素子であることを特徴とする、本発明（１）又は本発明（２）の円二色性熱レンズ顕微鏡装置である。
本発明（４）は、前記電気光学変調素子の結晶材料が、KDP（KH2PO4）、DKDP（KD2PO2）又はBBO（BaB2O4）からなる群のうちの何れか１種から構成されていることを特徴とする、本発明（３）の円二色性熱レンズ顕微鏡装置である。
本発明（５）は、同期検波手段を更に備え、該同期検波手段により前記円二色性熱レンズ信号から前記電気光学変調素子の変調周波数と同期する成分を抽出することで、前記円二色性熱レンズ信号の強度もしくは位相を測定することを特徴とする、本発明（３）又は本発明（４）の何れか１発明の円二色性熱レンズ顕微鏡装置である。
本発明（６）は、励起光の強度変調手段を更に備え、該強度変調手段により発生する熱レンズ信号（以下、強度変調熱レンズ信号）強度と、円二色性熱レンズ信号強度を測定することにより、試料の光学純度を測定することを特徴とする、本発明（５）の円二色性熱レンズ顕微鏡装置である。
本発明（７）は、波長の異なる励起光と検出光を放射する発振手段をそれぞれ設け、試料中に該励起光の焦点を結ぶ対物レンズを介して、該励起光と該検出光を試料中に導入し、試料を透過した検出光の強度を測定する円二色性熱レンズ顕微鏡装置において、
該励起光のみを左右の円偏光に選択的に変調可能な位相変調手段を該発振手段と試料の間の励起光の経路に配置するとともに、前記試料を透過した検出光の強度を該位相変調手段の変調に同期して検出可能な同期検波手段を含み、前記試料を透過した検出光の強度から前記位相変調に同期する成分を抽出し該同期成分の位相差を少なくとも求めることを特徴とする、円二色性熱レンズ顕微鏡装置である。
本発明（８）は、前記位相変調手段とは独立に変調可能な励起光の強度変調手段を更に備え、前記位相変調手段による円偏光とされた励起光が照射されたときに試料を透過した検出光の強度と該強度変調手段による偏りのない励起光が試料に照射されたときに試料を透過した検出光の強度をそれぞれ計測し、その強度の比を更に求めることを特徴とする、請求項７記載の円二色性熱レンズ顕微鏡装置である。【００２３】
ここで、本発明にいう「位相変調素子」とは、励起光に左右の円偏光を付与するためのものであって、互いに直角な、90°位相のずれた平面偏光を重ね合わせると、螺旋を描き円偏光となるが、その位相のずれる方向により、螺旋の向きが左右に変化することから、重ね合わせる位相を制御して円偏光の向きを制御する変調素子の総称であって、「電気光学変調素子」や「光弾性変調素子」がある。例えば、ポッケルス効果を利用したポッケルスセルに代表される。【００２４】
また、「開口数(N.A.)」は、入射ひとみ（絞り）の半径が物点において張る角ｕの正弦と物体空間の絶対屈折率ｎとの積ｎsinｕであり、顕微鏡の場合には、互いに分離して認めうる２点の最短間隔（分解能）は開口数に逆比例することから、採用した顕微鏡の光学系が特定されている場合に開口数の範囲を限定することは、実質的に分析対象試料の透過長さ（試料の厚さ）を間接的に特定することになる。従って、「開口数が0.1以上である」なる限定は、従来の円二色性測定装置が想定するボリュームの大きな分析対象を除外することを意味する。【００２５】
さらに、「光学純度」とは、一対の鏡像異性体だけからなる混合物中に存在する一方の鏡像異性体の過剰量を百分率で表した値であって、「％e.e. (enantiomeric excess)」をもって表し、
e.e.＝（Ｃ(+)−C(-)）／（Ｃ(+)＋Ｃ(-)）×100％
をもって定義され、検出感度の一つの指標となる。【００２６】
なお、従前の検出光の透過光量変化であるいわゆる広義の「熱レンズ信号」と区別する目的で、本発明においては、励起光を強度変調したときの信号を「強度変調熱レンズ信号」と呼び、励起光を位相変調したときの信号を「円二色性熱レンズ信号」と呼ぶ。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明にかかる円二色性熱レンズ顕微鏡装置の概要を示す図
【図２】本発明の実施例において用いられた鏡像光学異性体の構造を示す図
【図３】本発明の実施例１にかかる濃度の検量線の一例を示す図
【図４】電気光学変調素子としてADP（NH4H2PO4）を採用した際の円二色性熱レンズ信号におけるバックグラウンド信号強度の経時的変化を示す参考図
【図５】本発明の実施例２にかかる光学純度の検量線の一例を示す図
【図６】本発明の実施例３にかかる強度変調／位相変調した励起光に対する熱レンズ信号強度の経時的変化の一例を示す図
【符号の説明】
【００２８】
１  励起光発振器
２  検出光発振器
３  位相変調素子
４  ビームスプリッタ
５  顕微鏡
６  ミラー
７  対物レンズ
８  試料
９  レンズ
１０  ミラー
１１  励起光カットフィルタ
１２  ピンホール
１３  フォトダイオード
１４  ロックインアンプ
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下に、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。まず、本発明の円二色性熱レンズ顕微鏡装置の一例についての概要を図１に示す。図１中、１は励起光発振器であって、具体的には、波長532nm、出力100mW のNd:YAGレーザを採用し、２は検出光発振器であって、具体的には、波長633nm、出力15mWのHe-Neレーザを採用した。これらの波長としては、試料が励起光に対しては吸収を示し、検出光に対しては吸収のない波長が選択されることが望ましい。励起光および検出光の光発振器には、白色光であるインコヒーレント光発振器を用いることもできるが、単色光であり光密度が高くできるレーザ発振器であることが望ましい。【００３０】
そして、励起光発振器１から放出された励起光は、ポッケルスセルにて構成される、DKDP（KD2PO2）の位相変調素子３に導入され、1kHzで右円偏光と左円偏光とが切り替わる励起光を出力し、前記検出光発振器２から放出された検出光とビームスプリッタ４を介して合成され、顕微鏡５内に導入される。変調周波数は低い方が熱レンズ信号の強度が大きくなる、すなわち感度が向上するが、あまり低く設定すると光ノイズや電気ノイズの影響が相対的に大きくなるので、信号強度とノイズの比が大きくなるよう、最適な周波数を選択することが望ましい。【００３１】
かかる合成光を、励起光が試料８内に焦点を結ぶように調整された、集光能力に優れた対物レンズ７（並びに必要に応じて配置されるミラー６）を介して、試料に照射する。但し、対物レンズ７等の光学系は、集光能力に優れているものではあるが、励起光と検出光の焦点が一致しないような構成のものを採用することが望ましい。また、必ずしも対物レンズを用いる必要はなく、集光能力に優れたレンズもしくは組み合わせレンズ（アクロマティックレンズ）などを用いても構わない。さらに本例では、顕微鏡の筐体を用いているが、励起光およびプローブ光を集光能力に優れたレンズによって、試料８内に集光できるような構成であればよい。【００３２】
一方、前記焦点と共焦点となるように、もう一つのレンズ９を対向配置し、試料８を透過した合成光を、ミラー１０を介して顕微鏡５の外に導き出す。励起光カットフィルタ１１により励起光の影響を除去しつつ、ピンホール１２を通過した検出光をフォトダイオード１３に導き、検出光の光量が電気信号に変換される。その電気信号は同期検波手段の一例であるロックインアンプ１４に導かれ、励起光の右円偏光照射時と左円偏光照射時の熱レンズ信号の位相および強度を信号として出力する。そして、それぞれが円二色性熱レンズ信号となり、右もしくは左円偏光の吸収の強弱を表す位相から光学活性試料の識別が、強度から濃度の定量が可能となる。光学純度が100％である試料については、これら強度と位相からそのまま識別と定量が可能となる。【００３３】
なお、励起光の経路に光チョッパーなどを介在させ、光の強度変調に同期して検出することができるように構成することが望ましい。この場合、励起光をある変調周波数でオン・オフすなわち強度変調するので、光学活性体の識別はできず、ロックインアンプの出力信号である強度変調熱レンズ信号の強度は試料のトータルな濃度を意味する。そして、前記円二色性熱レンズ信号強度と強度変調熱レンズ信号強度の比を測定すれば、トータルな濃度に対する鏡像異性体の過剰量、すなわち、光学純度が推定できる。また、前記円二色性熱レンズ信号の位相から過剰な鏡像異性体の識別が可能となる。このように、光チョッパーなどの強度変調手段を併設することで、光学純度の測定も可能となる。さらに、信号処理はロックインアンプなどの同期検波手段からの信号から位相変調および強度変調時の比を取る操作のみでよいので、パソコンなどに取り込めば簡単に演算できるし、専用の演算ボードを設けても構わない。【００３４】
また、同期検波手段を用いなくても、励起光を右円偏光にして一定時間後フォトダイオード１３の出力を測定し、さらに左円偏光にして同様に一定時間後のフォトダイオード１３の出力を測定し、その出力信号の差の絶対値と符号を測定すれば、前記同期検波手段であるロックインアンプの強度と位相に相当する円二色性熱レンズ信号が得られる強度変調の場合についても、励起光を一定時間照射後および一定時間非照射後のそれぞれのフォトダイオード１３の出力の差の絶対値を同様に測定すれば、強度変調熱レンズ信号の強度に相当する信号が得られる。これらは同様に比を測定するという簡単な演算で、光学純度を算出することが可能となる。この場合もパソコンや専用のボードを用いればよい。【００３５】
さらに、前記位相変調手段による右円偏光および左円偏光の出力が不安定な場合は、位相変調手段から出力された励起光をビームスプリッタなどを用いて一部取り出し、それらの強度変化を別のフォトダイオードなどで測定することが望ましい。そして、前記円二色性信号と前記強度変化を同時に測定して割り算などの演算操作で補正するか、もしくは別々に測定してパソコンなどのメモリーに取り込み後演算操作を行うことで、出力に由来する円二色性熱レンズ信号の精度低下を防止することが可能になる。【００３６】
また、本発明の円二色性熱レンズ顕微鏡装置は、以上の構成に限定されるものではなく、その他通常の光学顕微鏡系に採用されている種々の光学的素子や配置が、本発明の検出の障害とならない範囲で採用できる。【００３７】
ここで、光学活性な試料としては、［（＋）Co(en)3］3+と［（−）Co(en)3］3+の一対の鏡像光学異性体を採用した。その構造を図２に示す。前述のとおり、光学異性体（［（＋）Co(en)3］3+）の場合、左円偏光と右円偏光による吸光度における差（Δε+（532nm）＝εL−εR）は、+3.2×10-1（M-1cm-1）であり、その比（Δε+／ε(532nm)）は、0.032に過ぎない。一方、その光学異性体である［（−）Co(en)3］3+）の場合にも、吸光度における差（Δε-（532nm）＝εL−εR）は、-3.2×10-1（M-1cm-1）であり、その比（Δε-／ε(532nm)）は、0.032である。【００３８】
なお、図２中で「（＋）」と記載した構造を有するものについての値には、"＋"の添え字をして表記し、「（−）」と記載した構造を有するものについての値には、"−"の添え字をして表記した。また吸光度(Abs.)は、ε(M-1cm-1)×濃度（M）×光路長(cm)によって定義されることから、左円偏光による吸光度と右円偏光の吸光度との差（Abs.））は、Δε(M-1cm-1)×濃度（M）×光路長(cm)である。
【実施例１】
【００３９】
かかる図２の一対の鏡像光学異性体について、それぞれ別々に種々の濃度の試料（100μmの深さのマイクロチャネル中に試料溶液を貯留。）を作成し、図１の円二色性熱レンズ顕微鏡装置を用いて、左円偏光と右円偏光に対する円二色性熱レンズ信号強度と試料に照射される励起光の変調に対する円二色性熱レンズ信号の位相を測定した。その結果を横軸に濃度をとってまとめたものを、図３に示す。【００４０】
図３の上の図より、広範な濃度範囲に亘って、光学異性体のタイプ毎に位相が略一定しており、しかも両者の位相の差が180°であることが判る。これにより、光学異性体のタイプ毎に左右何れか一方の円偏光をよく吸収を示すのに対し、他方の円偏光には相対的に低い吸収しか示しておらず、かつその関係は光学異性体間で逆転するという、いわゆる円二色性が極微量かつ極度限定された空間についても成り立っていることを示しており、円二色性熱レンズ顕微鏡装置の広汎な実用性の証左といえよう。この図３の上の図を用いれば、試料中にどちらのタイプの光学異性体が多いかを明確に峻別できる。【００４１】
また、図３の下の図より、濃度に対する良好な直線性が見出され、濃度の検量線として十分利用できることが示された。因みに、濃度０の点に隣接する各点（濃度０上の点は除く。）は、（＋）が9.4×10-5Mの試料についての点であり、（−）が6.3×10-5Mの試料についての点であることから、検出限界は、それぞれ、2.6×10-7（Abs.）（＝3.2×10-1（＝Δε）×9.4×10-5M×0.01cm（マイクロチャネルの深さ）×0.85（光学純度））と、1.9×10-7(Abs.)（＝3.2×10-1（＝Δε）×6.3×10-5M×0.01cm（マイクロチャネルの深さ）×0.93（光学純度））と見積もられた。ここで、用いられた光学純度の値は、十分量用意した試料を市販の円二色性測定装置によって測定した値である。【００４２】
この検出感度は、市販の円二色性測定装置の検出限界が10-5Abs.程度であるといわれていることからすると、約２桁優れたものであって、極めて高感度なる分析ツールといえる。【００４３】
一方、非特許文献２に例示される、ADP（NH4H2PO4）の電気光学変調素子を用いた技術における吸光度の検出限界は、1.9×10-6(Abs.)に過ぎず、この実施例の結果に比べおよそ一桁劣るものであった。【００４４】
しかも、本実施例の光学系に代えて、電気光学変調素子にADP（NH4H2PO4）を用いて、試料として、円二色性のないサンセットイエロー水溶液を測定した結果（測定を３回実施。）を比較例として図４に示す。この図４から明かであるように、バックグラウンド信号が経時的に増加する傾向が何れの回の測定にあっても観測され、かつその信号レベルは測定精度に大きく影響するものであった。【００４５】
これに対し、電気光学変調素子として、本発明のDKDP （KD2PO2）を採用した場合には、バックグラウンド信号は1μV以下で安定した結果を示した。さらに、DKDP （KD2PO2）に代えて KDP（KH2PO4）又はBBO（BaB2O4）を採用した場合にも、ほぼ同様の結果を得ることができた。
【実施例２】
【００４６】
次に、本発明の円二色性熱レンズ顕微鏡装置を試料における光学純度の計測に利用した。まず、図２の両鏡像光学異性体を種々の配合比で混合し、トータルの濃度が16mMとなるように調製した試料を用意し、かかる試料について、本発明の円二色性熱レンズ顕微鏡装置を用いて熱レンズ信号強度（μV）と位相（°）を計測した。【００４７】
その結果を、横軸にe.e.（enatiomeric excess（％）＝（Ｃ(+)−Ｃ(-)）／（Ｃ(+)＋Ｃ(-)）×100％）をとって、ラセミ体の結果が中央になるようにまとめたものを図５に示す。上の図は、位相（°）についてであり、下の図は、熱レンズ信号強度（μV）についての結果である。【００４８】
図５の下の図のとおり、光学純度（e.e.）に対し熱レンズ信号強度は広範囲に亘って良好な直線性を示しており、光学純度の検量線として十分利用可能であることが示された。【００４９】
ここで、e.e.＝0％のラセミ体についての結果に隣接する点は、それぞれ、e.e.が「＋1.77％」と「−1.65％」の試料についての点であることから、（−）に対する吸収光度＝9.1×10-7（Abs.）（＝0.32×1.77％／100×0.016M×0.01cm）であり、（＋）に対する吸収光度＝8.5×10-7（Abs.）（＝0.32×1.65％／100×0.016M×0.01cm）と見積もられ、市販の円二色性測定装置の10-5（Abs.）程度に対し、約一桁高感度であることから、鏡像光学異性体の混合溶液からなる試料に対しても十分な優位性があることが示された。
【実施例３】
【００５０】
実施例２は、光学純度についての検量線を予め求めておく手法であるが、他の手法によっても光学純度を推定することができる。この実施例では、励起光の導入経路に光チョッパーなどの強度変調素子を介在させ、円偏光でない生の励起光を直接試料に照射できるように設計した円二色性熱レンズ顕微鏡装置を用いた。【００５１】
まず、予め、ラセミ体の試料と、（＋）のタイプの光学異性体が多い試料と、（−）のタイプの光学異性体が多い試料を用意した。これらの試料に対し、該装置を適用し、最初に強度変調素子のみを駆動し位相変調素子を駆動させない励起光をそれぞれの試料に照射した。その際の強度変調熱レンズ信号強度の励起光ON−OFF後の経時的変化を示したのが、図６の左のグラフである。ここで、励起光は約1kHzで強度変調されており、ここでいう励起光のON-OFFとは1kHzで強度変調された励起光を数秒レベル（すなわち強度変調周波数に対して十分長い時間スケール）で照射−非照射することを意味しており、このON-OFF自体は強度変調ではない。以下、位相変調においても同様である。一方、位相変調素子のみを駆動させて、左右何れかの円偏光とした励起光を前記の３つの試料にそれぞれ照射した際の熱レンズ信号強度の励起光の経時的変化を示したのが、図６の右のグラフである。【００５２】
従って、図６の左のグラフから、全方位の成分を含む励起光であることから、試料全体の吸光度が見積もられる一方、図６の右のグラフからは、円偏光に対する吸光度、すなわち、何れか一方の光学異性体の他方に対する過剰量に起因する吸収度が見積もられることになるので、その比をとれば、光学純度を求められる。【００５３】
なお、ラセミ体の場合は、左右何れの円偏光が照射されている時も、それぞれ試料の半分ずつが相対的に高い吸収光度を示すことになるので、一定の熱レンズ効果が得られてしまい、その熱レンズ信号強度は過剰量がある場合に比べ低い値を示す。【００５４】
ここで、（ΔAbs.／Abs.）の値はｇ因子と呼ばれ、物質固有の値を示す。これは、本測定においては、（円二色性熱レンズ信号／強度変調熱レンズ信号）に相当する。そこで、光学純度100％のときのｇ因子が市販の円二色性測定装置と本装置で一致すれば、図５の結果からe.e.と円二色性熱レンズ信号強度に比例関係が得られているので、（円二色性熱レンズ信号／強度変調熱レンズ信号／ｇ因子×100％）という簡単な演算によって、光学純度を測定することが可能となる。実際に図６から（＋）が光学純度100％の試料で、本測定のｇ因子は0.026（＝10.8μV／407μV）であり、（−）が光学純度100％の試料で、本測定のｇ因子は0.029（＝11.7μV／407μV）であった。一方、同じ試料について市販の円二色性測定装置で測定したｇ因子は、（＋）が光学純度100％の試料で0.029、（−）の試料で0.032であった。このように、ｇ因子は同様な値が得られ、円二色性熱レンズ信号と強度変調熱レンズ信号から簡単な演算で光学純度を推定することができるようになった。また、円二色性熱レンズ信号の位相からどちらが過剰であるか推定できるようになった。【００５５】
以上の実施例はすべて、ロックインアンプの出力（強度と位相）をそのまま測定するか、もしくは比を取るという簡単な演算で達成することができることはいうまでもない。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明は、光学活性試料を識別定量でき、かつ従来よりも高感度な円二色性熱レンズ顕微鏡装置を提供するものである。また、本発明は、マイクロチャネルといった極微量な試料に対しても適用可能であって、かつ高空間分解能をも備えた、光学活性試料を識別定量する高感度な円二色性熱レンズ顕微鏡装置を提供するものである。さらに、本発明は、光学純度についても簡便かつ高感度に検出可能な円二色性熱レンズ顕微鏡装置を提供するものである。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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【国際調査報告】
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