(57)【要約】  本発明の目的は、ＨＣＶの複製を抑制するオリゴ二本鎖ＲＮＡ及びＨＣＶに感染することにより引き起こされる疾患を治療及び／又は予防するための当該オリゴ二本鎖ＲＮＡを含む医薬組成物を提供することにある。  本発明は、ＨＣＶの複製を抑制する、配列番号３及び配列番号４の各塩基配列の３’末端から２塩基のデオキシチミジン一リン酸（以下、「ｄＴ」という）を除いた塩基配列からなるＲＮＡの対又は配列番号２及び配列番号５の各塩基配列の３’末端から２塩基のｄＴを除いた塩基配列からなるＲＮＡの対で形成されている二重鎖形成部を有することを特徴とするオリゴ二本鎖ＲＮＡ及び当該オリゴ二本鎖ＲＮＡと適当な担体とを含む医薬組成物に関するものである。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３及び配列番号４の各塩基配列の３’末端から２塩基のデオキシチミジン一リン酸（ｄＴ）を除いた塩基配列からなるＲＮＡの対又は配列番号２及び配列番号５の各塩基配列の３’末端から２塩基のデオキシチミジン一リン酸（ｄＴ）を除いた塩基配列からなるＲＮＡの対で形成されている二重鎖形成部を有することを特徴とするオリゴ二本鎖ＲＮＡ。
【請求項２】
二重鎖形成部の塩基配列中に、１ないし複数の核酸塩基が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつＣ型肝炎ウイルスの複製抑制活性を有する、請求項１に記載のオリゴ二本鎖ＲＮＡ。
【請求項３】
二重鎖形成部を構成するリボヌクレオチドの一部が、デオキシリボヌクレオチドないし修飾デオキシリボヌクレオチドに置換されており、かつＣ型肝炎ウイルスの複製抑制活性を有する、請求項１に記載のオリゴ二本鎖ＲＮＡ。
【請求項４】
二重鎖形成部の少なくとも一方のＲＮＡの３’末端又は５’末端に突出部としてヌクレオチドが１ないし４塩基付加されており、かつＣ型肝炎ウイルスの複製抑制活性を有する、請求項１に記載のオリゴ二本鎖ＲＮＡ。
【請求項５】
突出部としてのヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドである、請求項４に記載のオリゴ二本鎖ＲＮＡ。
【請求項６】
突出部としてのヌクレオチドがデオキシチミジン一リン酸（ｄＴ）であって、これが二重鎖形成部を構成する少なくとも一方のＲＮＡの３’末端に２塩基付加されている、請求項４に記載のオリゴ二本鎖ＲＮＡ。
【請求項７】
二重鎖形成部を構成する一部のヌクレオチドのリボース又はリン酸バックボーンが修飾されており、かつＣ型肝炎ウイルスの複製抑制活性を有する、請求項１に記載のオリゴ二本鎖ＲＮＡ。
【請求項８】
リボース又はリン酸バックボーンの修飾が、リボースの２’位の水酸基をＯＲ、Ｒ、Ｒ’ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、Ｎ３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩから選択される置換基に置換する修飾（Ｒはアルキル又はアリールを表し、Ｒ’はアルキレンを表す）、リボースの４’位をチオ体とする修飾、及び、リン酸バックボーンをホスホロチオエート体、ホスホロジチオエート体、アルキルホスホネート体又はホスホロアミデート体とする修飾から選択される１又は複数の修飾である、請求項７に記載のオリゴ二本鎖ＲＮＡ。
【請求項９】
配列番号２、配列番号３又は配列番号５の塩基配列の３’末端から２塩基のデオキシチミジン一リン酸（ｄＴ）を除いた塩基配列からなるＲＮＡであって、かつその相補的な塩基配列からなるＲＮＡとオリゴ二本鎖ＲＮＡを構成したときにＣ型肝炎ウイルスの複製抑制活性を有することを特徴とするＲＮＡ。
【請求項１０】
塩基配列中に、１ないし複数の核酸塩基が欠失、置換、挿入又は付加されている、請求項９に記載のＲＮＡ。
【請求項１１】
ＲＮＡを構成するリボヌクレオチドの一部がデオキシリボヌクレオチドないし修飾ヌクレオチドに置換されている、請求項９に記載のＲＮＡ。
【請求項１２】
ＲＮＡの３’末端又は５’末端にヌクレオチドが１ないし４塩基付加されている、請求項９に記載のＲＮＡ。
【請求項１３】
付加されているヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドである、請求項１２に記載のＲＮＡ。
【請求項１４】
３‘末端に２塩基のヌクレオチドが付加されており、かかるヌクレオチドがデオキシチミジン一リン酸（ｄＴ）である、請求項１２に記載のＲＮＡ。
【請求項１５】
ヌクレオチドを構成するリボース又はリン酸バックボーンの少なくとも一部が修飾されている、請求項９に記載のＲＮＡ。
【請求項１６】
請求項９〜１５のいずれかに記載のＲＮＡを構成するリボヌクレオチドの糖がＤ−２−デオキシリボースであり、かつ塩基の内、ウラシル（Ｕ）がチミン（Ｔ）であることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項１７】
請求項１６に記載のＤＮＡが挿入された、ＲＮＡの発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１〜８のいずれかに記載のオリゴ二本鎖ＲＮＡと担体とを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１７に記載の発現ベクターと担体とを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２０】
担体がカチオン性担体である、請求項１８又は１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
カチオン性担体が、２−Ｏ−（２―ジエチルアミノエチル）カルバモイルー１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール及びリン脂質を必須構成成分として形成されるリポソームである、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
リン脂質がレシチンである請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
Ｃ型肝炎ウイルスの複製抑制が所望される疾患の治療及び／又は予防のための請求項１８又は１９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２４】
Ｃ型肝炎ウイルスの複製抑制が所望される疾患が、慢性肝炎、肝硬変又は肝細胞癌である、請求項２１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴ二本鎖ＲＮＡ及び当該オリゴ二本鎖ＲＮＡを含む医薬組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（以下、「ＨＣＶ」という）は、そのｇｅｎｏｔｙｐｅにより、ｇｅｎｏｔｙｐｅ  １ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、３ｂに分類される。ＨＣＶの感染者数は、全ｇｅｎｏｔｙｐｅを合わせて、全世界で約１．７億人であり、日本では約１５０〜２００万人であると言われている。ＨＣＶ感染の約８０％が慢性化し、慢性肝炎を経て、約２０〜３０年で肝硬変や肝細胞癌へと進行する。日本においては、ｇｅｎｏｔｙｐｅ  １ｂのＨＣＶに感染しており、かつ血清中に大量の当該ウイルスが存在する患者が、全ＨＣＶ感染者の約８０％を占めている。また、肝細胞癌での死者は年間３．４万人であり、そのうち約７５％がＨＣＶ由来である。【０００３】
ＨＣＶ感染の治療としては、インターフェロンを中心とした抗ウイルス療法が行われており、当該療法による肝細胞癌の発生予防効果や延命効果等が証明されている。しかしながら、インターフェロン療法では、日本人患者の大多数を占める高ウイルス、ｇｅｎｏｔｙｐｅ  １ｂのＨＣＶ感染者に対しての完全著効率（治療終了後２４週間以上、血清中のＨＣＶ  ＲＮＡが陰性である患者の割合を表す）が、全症例の内、１６％程度にしか過ぎず、その効果は限定されたものである。そのため、インターフェロンに次ぐ次世代の抗ＨＣＶ治療薬が期待されている。ＨＣＶ感染及びその治療方法に関する総説については、以下の文献を参照されたい（例えば、非特許文献１を参照）。【０００４】
ＲＮＡ干渉［ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（以下、「ＲＮＡｉ」という）］は、二本鎖ＲＮＡ（以下、「ｄｓＲＮＡ」という）を細胞内に導入することにより、導入したｄｓＲＮＡと相補的なＲＮＡが特異的に分解され、したがって当該ＲＮＡのコードする遺伝子産物の合成が抑制される現象である。また、ＲＮＡｉによるタンパク質発現抑制活性を有する短い二本鎖のＲＮＡを、ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（以下、「ｓｉＲＮＡ」という）という。ｓｉＲＮＡを用いたＲＮＡｉに関する総説については、以下の文献を参照されたい（例えば、非特許文献２ないし３を参照）。【０００５】
ｓｉＲＮＡの細胞内への導入方法としては、カチオン性リポソーム又はその他のカチオン性担体等の担体をベクターとして用いる方法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法又はマイクロインジェクション法等により細胞内に直接導入する方法等が用いられている。また、ｓｉＲＮＡを細胞内で発現するようｓｉＲＮＡをコードする塩基配列を組み込んだ発現ベクターを細胞内に導入する方法も研究されている（例えば、非特許文献４ないし５を参照）。【０００６】
近年、ＨＣＶ  ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡに関してもいくつかの報告がされているが、いずれも充分満足できる効果は得られていない（例えば、特許文献１ないし特許文献２、ならびに非特許文献６ないし７を参照）。【０００７】
【特許文献１】国際公開第０３／０７０７５０号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０２／０８１４９４号パンフレット
【非特許文献１】八橋  弘、坪田  昭人、泉  並木、加藤  直也、「ＰＲＯＧＲＥＳＳ  ＩＮ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ」、２００３年、４巻、ｐ．１１０９−１１３１
【非特許文献２】森田  隆及び吉田  佳世、「タンパク質  核酸  酵素」、２００２年、４７巻、ｐ．１９３９−１９４５
【非特許文献３】Ｊ．Ｍａｒｔｉｎｅｚら、“Ｃｅｌｌ”、２００２年９月６日、１１０巻、５号、ｐ．５６３−５７４
【非特許文献４】Ｍ．Ｍｉｙａｇｉｓｈｉら、“Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”、２００２年５月、２０巻、５号、ｐ．４９７−５００
【非特許文献５】Ｔ．Ｒ．Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら、“Ｓｃｉｅｎｃｅ”、２００２年４月１９日、２９６巻、ｐ．５５０−５５３
【非特許文献６】Ｇ．Ｒａｎｄａｌｌら、“Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”、２００３年、１００巻、１号、ｐ．２３５−２４０
【非特許文献７】Ｊ．Ａ．Ｗｉｌｓｏｎら、“Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”、２００３年、１００巻、５号、ｐ．２７８３−２７８８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、主として、ＨＣＶの複製を抑制することができるオリゴ二本鎖ＲＮＡ及びＨＣＶに感染することにより引き起こされる疾患を治療及び／又は予防するための当該オリゴ二本鎖ＲＮＡを含む医薬組成物を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、ＨＣＶの複製を抑制する、配列番号３及び配列番号４の各塩基配列の３’末端から２塩基のデオキシチミジン一リン酸（以下、「ｄＴ」という）を除いた塩基配列からなるＲＮＡの対又は配列番号２及び配列番号５の各塩基配列の３’末端から２塩基のｄＴを除いた塩基配列からなるＲＮＡの対で形成されている二重鎖形成部を有することを特徴とするオリゴ二本鎖ＲＮＡが上記目的を解決しうることを見出し、本発明を完成した。【００１０】
本発明としては、例えば、下記（１）〜（６）を挙げることができる。
（１）配列番号３及び配列番号４の各塩基配列の３’末端から２塩基のｄＴを除いた塩基配列からなるＲＮＡの対又は配列番号２及び配列番号５の各塩基配列の３’末端から２塩基のｄＴを除いた塩基配列からなるＲＮＡの対で形成されている二重鎖形成部を有することを特徴とするオリゴ二本鎖ＲＮＡ（以下、「本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡ」という）。
（２）配列番号２、配列番号３又は配列番号５のいずれか１つの塩基配列の３’末端から２塩基のｄＴを除いた塩基配列からなるＲＮＡであって、かつその相補的な塩基配列からなるＲＮＡとオリゴ二本鎖ＲＮＡを構成したときにＨＣＶの複製抑制活性を有することを特徴とするＲＮＡ（以下、「本発明ＲＮＡ」という）。
（３）上記（２）のＲＮＡを構成するリボヌクレオチドの糖がＤ−２−デオキシリボースであり、かつ塩基の内、ウラシル（Ｕ）がチミン（Ｔ）であることを特徴とするＤＮＡ（以下、「本発明ＤＮＡ」という）。
（４）上記（３）の本発明ＤＮＡが挿入された、ＲＮＡの発現ベクター。
（５）上記（１）のオリゴ二本鎖ＲＮＡと担体とを含むことを特徴とする医薬組成物（以下、「本発明組成物」という）。
（６）上記（４）の発現ベクターと担体とを含むことを特徴とする医薬組成物。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
I．本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡ
本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡとして、配列番号３及び配列番号４の各塩基配列の３’末端から２塩基のｄＴを除いた塩基配列からなるＲＮＡの対又は配列番号２及び配列番号５の各塩基配列の３’末端から２塩基のｄＴを除いた塩基配列からなるＲＮＡの対で形成されている二重鎖形成部を有するオリゴ二本鎖ＲＮＡを挙げることができる。【００１２】
配列番号１及び配列番号２の塩基配列の３’末端から２塩基のｄＴを除いた塩基配列からなる両ＲＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０８０２９９として登録されている塩基配列（配列番号６）からなるＨＣＶ  ＲＮＡ中のｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ）の一部分と相同な塩基配列からなるＲＮＡ（センス鎖ＲＮＡ）である。配列番号４及び配列番号５の各塩基配列の３’末端から２塩基のｄＴを除いた塩基配列からなる両ＲＮＡは、それぞれ配列番号１及び配列番号２の各塩基配列の３’末端から２塩基のｄＴを除いた塩基配列と相補的な塩基配列からなるＲＮＡ（アンチセンス鎖ＲＮＡ）である。配列番号３の塩基配列の３’末端から２塩基のｄＴを除いた塩基配列からなるＲＮＡは、配列番号１の塩基配列の３’末端から２塩基のｄＴを除いた塩基配列の３’末端に位置するＣ塩基をＡ塩基に置換した塩基配列からなるＲＮＡである。【００１３】
上記「二重鎖形成部」とは、本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡを構成する核酸の対が二重鎖を形成している部分であって、ＨＣＶ  ＲＮＡに相同な塩基配列を含む部分をいう。そして、それぞれのＲＮＡの二重鎖形成部につづく３’側及び／又は５’側に対を形成しない一本鎖がある場合には、これを突出部と呼ぶ。【００１４】
上記「ＨＣＶの複製抑制活性」とは、本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡを細胞にトランスフェクションした場合に、本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡが存在しない場合に比べてＨＣＶの複製を抑制する活性をいう。「ＨＣＶの複製抑制活性を有する」とは、具体的には、本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡを添加した細胞のＨＣＶ  ＲＮＡ量が、陰性対照のＨＣＶ  ＲＮＡ量と等しい場合を抑制率（％）が０％であるとして評価した場合に、その抑制率（％）が５０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは９０％以上である場合をいう。【００１５】
本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡは、ＨＣＶの複製抑制活性を保持していれば、二重鎖形成部のＲＮＡの塩基配列中に、１ないし複数（例えば、４以下）の核酸塩基が欠失、置換、挿入又は付加されていてもよい。【００１６】
また、本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡは、ＨＣＶの複製抑制活性を保持していれば、二重鎖形成部の一方又は両方のＲＮＡを構成するリボヌクレオチドの一部が、デオキシリボヌクレオチド又は修飾デオキシリボヌクレオチドに置換されていてもよい。ここで、修飾デオキシリボヌクレオチドとは、例えば、ヌクレアーゼ耐性等、生体内における安定性を高めるために、デオキシリボヌクレオチドを構成するデオキシリボース又はリン酸バックボーン等の、少なくとも一部が修飾されているものを意味する。かかる修飾としては、例えば、デオキシリボースの２’位の修飾、デオキシリボースのその他の部分の修飾、リン酸バックボーンの修飾を挙げることができる。デオキシリボースの２’位の修飾としては、例えば、デオキシリボースの２’位の水素をＯＲ、Ｒ、Ｒ’ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、Ｎ３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉに置換する修飾を挙げることができる。ここで、Ｒはアルキル又はアリールを表す。Ｒのアルキルとしては、直鎖状または分枝鎖状の炭素数１〜６のアルキルが好ましい。具体的には、例えば、メチル、エチル、ｎ―プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、およびイソヘキシルが挙げられる。当該アルキルは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが１〜３個置換されていてもよい。かかるハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。アルキルとしては上記のアルキルと同様のものを挙げることができる。アルコキシとしては直鎖状または分枝鎖状の炭素数１〜６のアルコキシ、例えばメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシ等を挙げることができる。とりわけ、炭素数１〜３のアルコキシが好ましい。Ｒのアリールとしては、炭素数６〜１０のアリールが好ましい。具体的には、例えば、フェニル、α―ナフチル、β―ナフチルを挙げることができる。とりわけフェニルが好ましい。また、Ｒ’はアルキレンを表す。Ｒ’のアルキレンとしては、直鎖状または分枝鎖状の炭素数１〜６のアルキレンが好ましい。具体的には、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、２−（エチル）トリメチレン、１−（メチル）テトラメチレンを挙げることができる。デオキシリボースのその他の部分の修飾としては、例えば、４’位をチオ体とする修飾を挙げることができる。リン酸バックボーンの修飾としては、例えば、ホスホロチオエート体、ホスホロジチオエート体、アルキルホスホネート体、ホスホロアミデート体とする修飾を挙げることができる。【００１７】
また、本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡは、ＨＣＶの複製抑制活性を保持していれば、二重鎖形成部の少なくとも一方のＲＮＡの３’末端又は５’末端に突出部として１ないし４塩基のヌクレオチドを有していてもよい。突出部を有する場合には、突出部を構成するヌクレオチドはリボヌクレオチドかデオキシリボヌクレオチドかを問わない。突出部としてヌクレオチドを２塩基有する本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡが好ましく、その中でも、本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡに係るセンス鎖ＲＮＡ及び／又はアンチセンス鎖ＲＮＡの３’末端に突出部として、２塩基のｄＴ若しくはウリジン一リン酸（以下、「Ｕ」という）を有するか、本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡに係るセンス鎖ＲＮＡの塩基配列と一致するＨＣＶ  ＲＮＡ上の塩基配列の３’側に続く２塩基の塩基配列を当該センス鎖ＲＮＡの３’末端側に有するか、又は本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡに係るアンチセンス鎖ＲＮＡと相補的な塩基配列と一致するＨＣＶ  ＲＮＡ上の塩基配列の５’側に続く２塩基の塩基配列と相補的な塩基配列を当該アンチセンス鎖ＲＮＡの３’末端側に有する本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡがより好ましい。【００１８】
さらに、本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡは、ＨＣＶの複製抑制活性を保持していれば、例えば、ヌクレアーゼ耐性等、生体内における安定性を高めるために、そのリボヌクレオチドを構成するリボース又はリン酸バックボーン等の、少なくとも一部が修飾されていてもよい。かかる修飾としては、例えば、リボースの２’位の修飾、リボースのその他の部分の修飾、リン酸バックボーンの修飾を挙げることができる。リボースの２’位の修飾としては、例えば、リボースの２’位の水酸基をＯＲ、Ｒ、Ｒ’ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、Ｎ３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉに置換する修飾を挙げることができる。ここで、Ｒはアルキル又はアリールを表す。Ｒのアルキルとしては、直鎖状または分枝鎖状の炭素数１〜６のアルキルが好ましい。具体的には、例えば、メチル、エチル、ｎ―プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、およびイソヘキシルが挙げられる。当該アルキルは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが１〜３個置換されていてもよい。かかるハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。アルキルとしては上記のアルキルを挙げることができる。アルコキシとしては直鎖状または分枝鎖状の炭素数１〜６のアルコキシ、例えばメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシ等を挙げることができる。とりわけ、炭素数１〜３のアルコキシが好ましい。Ｒのアリールとしては、炭素数６〜１０のアリールが好ましい。具体的には、例えば、フェニル、α―ナフチル、β―ナフチルを挙げることができる。とりわけフェニルが好ましい。また、Ｒ’はアルキレンを表す。Ｒ’のアルキレンとしては、直鎖状または分枝鎖状の炭素数１〜６のアルキレンが好ましい。具体的には、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、２−（エチル）トリメチレン、１−（メチル）テトラメチレンを挙げることができる。リボースのその他の部分の修飾としては、例えば、４’位をチオ体とする修飾を挙げることができる。リン酸バックボーンの修飾としては、例えば、ホスホロチオエート体、ホスホロジチオエート体、アルキルホスホネート体、ホスホロアミデート体とする修飾を挙げることができる。【００１９】
本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡは、一方のＲＮＡ１モル当量に対して、他方を０．５〜２モル当量の範囲内で、好ましくは０．９〜１．１モル当量の範囲内で、更に好ましくは等モル当量で混合した後に、アニーリングすることにより調製することができる。アニーリングは、当業者に自明な方法により行うことができる。例えば、選択した２つのＲＮＡを混合し、９４℃程度で５分程度加熱した後、室温まで徐冷することにより行うことができる。また、選択した２つのＲＮＡを混合した後、アニーリングする工程を省いても本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡを調製することができる。【００２０】
本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡは、後述する担体を用いて細胞内にトランスフェクションしてもよい。また、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法又はマイクロインジェクション法等により、直接細胞内に導入することもできる。【００２１】
II．本発明ＲＮＡ及び本発明ＤＮＡ
本発明ＲＮＡとして、配列番号２、配列番号３又は配列番号５のいずれか１つの塩基配列の３’末端から２塩基のｄＴを除いた塩基配列からなるＲＮＡであって、かつその相補的な塩基配列からなるＲＮＡとオリゴ二本鎖ＲＮＡを構成したときにＨＣＶの複製抑制活性を有するＲＮＡを挙げることができる。【００２２】
本発明ＲＮＡは、当該塩基配列中に、１ないし複数（例えば、４以下）の核酸塩基が欠失、置換、挿入又は付加されていてもよい。【００２３】
本発明ＲＮＡは、上述した本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡの場合と同様に、本発明ＲＮＡを構成するリボヌクレオチドの一部が、デオキシリボヌクレオチド又は修飾デオキシリボヌクレオチドに置換されていてもよい。【００２４】
本発明ＲＮＡは、３’末端又は５’末端に更にヌクレオチドを１ないし４塩基有していてもよい。当該ヌクレオチドはリボヌクレオチドかデオキシリボヌクレオチドかを問わない。当該ヌクレオチドを２塩基有する本発明ＲＮＡが好ましく、その中でも、当該ヌクレオチドとして、２塩基のｄＴ若しくはＵを有するか、本発明ＲＮＡがセンス鎖ＲＮＡの場合は、本発明ＲＮＡと一致するＨＣＶ  ＲＮＡ上の塩基配列の３’側に続く２塩基の塩基配列を本発明ＲＮＡの３’末端側に有するか、又は、本発明ＲＮＡがアンチセンス鎖ＲＮＡの場合は、本発明ＲＮＡと相補的な塩基配列と一致するＨＣＶ  ＲＮＡ上の塩基配列の５’側に続く２塩基の塩基配列と相補的な塩基配列を本発明ＲＮＡの３’末端側に有する本発明ＲＮＡがより好ましい。【００２５】
本発明ＲＮＡは、上述した本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡの場合と同様に、例えば、ヌクレアーゼ耐性等、生体内における安定性を高めるために、そのリボヌクレオチドを構成しているリボース又はリン酸バックボーン等の、少なくとも一部が修飾されていてもよい。【００２６】
本発明ＤＮＡとしては、本発明ＲＮＡを構成するリボヌクレオチドの糖がＤ−２−デオキシリボースであり、かつ塩基の内、ウラシル（Ｕ）がチミン（Ｔ）であることを特徴とするＤＮＡを挙げることができる。【００２７】
本発明ＤＮＡは、本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡを発現するためのプラスミドに組み込まれてもよく、本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡをインビトロ転写反応で得るためのテンプレートＤＮＡとして用いることができる。また、アンチセンスプローブとして用いることができる。【００２８】
本発明ＲＮＡ及び本発明ＤＮＡは、当業者に既知のホスホアミダイト法又はトリエステル法による固相合成法で、または液相合成法で得ることがきる。最も一般的な態様は、ホスホアミダイト法による固相合成法であり、核酸自動合成機又は手動にて合成することができる。固相での合成が終了した後は、固相からの脱離、保護基の脱保護及び目的物の精製等を行う。最終的に得られた本発明ＲＮＡ及び本発明ＤＮＡの純度は、９０％以上が適当であり、９５％以上が好ましい。【００２９】
III．本発明組成物
本発明組成物として、本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡと担体とを含む医薬組成物を挙げることができる。当該担体とは、本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡを細胞内へ移行させるのに有効な担体をいう。本発明組成物はＨＣＶに感染することにより引き起こされる疾患の治療及び／又は予防のために用いることができる。ＨＣＶに感染することにより引き起こされる疾患としては、例えば、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞癌を挙げることができる。【００３０】
本発明組成物に係る担体としては、医薬上許容されるものであれば特に制限されず、例えば、カチオン性リポソーム、カチオン性ポリマー等のカチオン性担体、またはウイルスエンベロープを利用した担体を挙げることができる。カチオン性リポソームとしては、例えば、２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールとリン脂質とを必須構成成分として形成されるリポソーム（以下、「リポソームＡ」という）、オリゴフェクトアミン（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、リポフェクチン（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、リポフェクトアミン（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、リポフェクトアミン２０００（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ＴｒａｎｓＩＴ  ＴＫＯ（登録商標）（Ｍｉｒｕｓ社製）を挙げることができる。それらの中で、リポソームＡが好ましい。カチオン性ポリマーとしては、例えば、ＪｅｔＳＩ（登録商標）（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社製）、Ｊｅｔ−ＰＥＩ（登録商標）（ポリエチレンイミン、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社製）を挙げることができる。ウイルスエンベロープを利用した担体としては、例えば、ＧｅｎｏｍｅＯｎｅ（登録商標）（ＨＶＪ−Ｅリポソーム、石原産業社製）を挙げることができる。【００３１】
本発明組成物中に含まれる本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡの濃度は、担体の種類等によって異なるが、０．１ｎＭ〜１００μＭの範囲内が適当であり、１ｎＭ〜１０μＭの範囲内が好ましく、１０ｎＭ〜１μＭの範囲内がより好ましい。また、本発明組成物中に含まれる本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡと担体との重量比（担体／本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡ）は、本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡの性質、担体の種類等によって異なるが、０．１〜１００の範囲内が適当であり、１〜５０の範囲内が好ましく、１０〜２０の範囲内がより好ましい。【００３２】
本発明組成物には、本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡと上述した担体以外に、任意に医薬上許容される添加剤を配合することができる。かかる添加剤として、例えば、乳化補助剤（例えば、炭素数６〜２２の脂肪酸やその医薬上許容される塩、アルブミン、デキストラン）、安定化剤（例えば、コレステロール、ホスファチジン酸）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース）、ｐＨ調整剤（例えば、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン）を挙げることができる。これらを一種又は二種以上使用することができる。本発明組成物中の当該添加剤の含有量は、９０重量％以下が適当であり、７０重量％以下が好ましく、５０重量％以下がより好ましい。【００３３】
本発明組成物は、担体の分散液に本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡを加え、適当に攪拌することにより調製することができる。また、添加剤は、本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡの添加前でも添加後でも適当な工程で添加することができる。本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡを添加させる際に用い得る水性溶媒としては、医薬上許容されるものであれば特に制限されず、例えば、注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水等の電解質液、ブドウ糖液、マルトース液等の糖液を挙げることができる。また、かかる場合のｐＨ及び温度等の条件は、当業者が適宜選択することができる。【００３４】
本発明組成物は、例えば、液剤やその凍結乾燥製剤とすることができる。当該凍結乾燥製剤は、常法により、液剤の形態を有している本発明組成物を凍結乾燥処理することにより調製することができる。例えば、液剤の形態を有している本発明組成物を適当な滅菌を行った後、所定量をバイアル瓶に分注し、約−４０〜−２０℃の条件で予備凍結を２時間程度行い、約０〜１０℃で減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約１５〜２５℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥することができる。そして、一般的にはバイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓して本発明組成物の凍結乾燥製剤を得ることができる。【００３５】
本発明組成物の凍結乾燥製剤は、一般には任意の適当な溶液（再溶解液）の添加によって再溶解し使用することができる。このような再溶解液としては、注射用水、生理食塩水、その他一般輸液を挙げることができる。この再溶解液の液量は、用途等によって異なり特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の０．５〜２倍量、又は５００ｍＬ以下が適当である。【００３６】
本発明組成物は、投与単位形態で投与することが望ましく、ヒトを含む動物に対し、静脈内投与、動脈内投与、経口投与、組織内投与、経皮投与、経粘膜投与又は経直腸投与することができる。特に静脈内投与、経皮投与、経粘膜投与が望ましい。これらの投与に適した剤型、例えば、各種の注射剤、経口剤、点滴剤、吸入剤、点眼剤、軟膏剤、ローション剤、座剤で投与されるのはもちろんである。【００３７】
本発明組成物を投与する際の用量としては、含有される本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡの種類、剤型、年齢や体重等の患者の状態、投与経路、疾患の性質と程度を考慮した上で調製することが望ましいが、成人に対して本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡ量として、１日当たり０．１ｍｇ〜１０ｇ／ヒトの範囲内が、好ましくは１ｍｇ〜５００ｍｇの範囲内が一般的である。この数値は標的とする疾患の種類、投与形態、標的分子によっても異なる場合がある。従って、場合によってはこれ以下でも十分であるし、また逆にこれ以上の用量を必要とするときもある。また１日１回から数回の投与又は１日から数日間の間隔で投与することができる。【００３８】
本発明組成物の別の態様として、本発明ＤＮＡが挿入された、ＲＮＡの発現ベクターと上述した担体とを含む医薬組成物を挙げることができる。かかる発現ベクターは、複数の本発明ＤＮＡが挿入されていてもよいし、また、公知のＤＮＡを含んでいてもよい。具体的には、例えば、本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡを構成するセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡの両方を発現することができるＤＮＡが挿入された発現ベクターを挙げることができる。当該組成物には、本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡを含有する本発明組成物と同様に、医薬上許容される添加剤を添加することができる。当該組成物中に含まれる発現ベクターの濃度は、担体の種類等によって異なるが、０．１ｎＭ〜１００μＭの範囲内が適当であり、１ｎＭ〜１０μＭの範囲内が好ましく、１０ｎＭ〜１μＭの範囲内がより好ましい。当該組成物中に含まれる発現ベクターと担体との重量比（担体／発現ベクター）は、発現ベクターの性質、担体の種類等によって異なるが、０．１〜１００の範囲内が適当であり、１〜５０の範囲内が好ましく、１０〜２０の範囲内がより好ましい。また、当該組成物中に含まれる担体の含有量は、本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡを含有する本発明組成物の場合と同様であり、その調製方法等に関しても、本発明組成物の場合と同様である。更に、投与形態及び投与経路は、本発明組成物の場合と同様に、患者の症状に合わせた適切な方法により投与してよく、用量もまた同様に、薬物、剤型、年齢や体重等の患者の状態、投与経路、疾患の性質と程度等を考慮した上で決定することが望ましい。
【実施例】
【００３９】
以下に、実施例及び試験例を掲げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は実施例に示される範囲に限定されるものではない。【００４０】
実施例  医薬組成物の調製
（１）オリゴ二本鎖ＲＮＡを構成するＲＮＡの合成
オリゴ二本鎖ＲＮＡを構成するＲＮＡの合成は、日本バイオサービス（埼玉県）に依頼した。
（２）１３０番に係るオリゴ二本鎖ＲＮＡの調製
１３０番に係るオリゴ二本鎖ＲＮＡの水溶液は、上記（１）で合成した配列番号１及び配列番号４の塩基配列を有する本発明ＲＮＡをそれぞれの濃度が１２０μＭになるように注射用水に溶解し、その後、それぞれ１６．６μｌを試験管中で混合した。これに９６６．８μｌの注射用水を添加することにより、調製した。
（３）１３０Ａ番に係るオリゴ二本鎖ＲＮＡの調製
１３０Ａ番に係るオリゴ二本鎖ＲＮＡの水溶液は、上記（１）で合成した配列番号３及び配列番号４の塩基配列を有する本発明ＲＮＡを用い、上記（２）と同様に調製した。
（４）２５８番に係るオリゴ二本鎖ＲＮＡの調製
２５８番に係るオリゴ二本鎖ＲＮＡの水溶液は、上記（１）で合成した配列番号２及び配列番号５の塩基配列を有する本発明ＲＮＡを用い、上記（２）と同様に調製した。
（５）医薬組成物の調製
担体として、２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール６重量部と精製卵黄レシチン１０重量部とを必須構成成分として形成される１６ｍｇ／ｍｌのリポソームＡ分散液を文献記載の方法（ＷＯ９４／１９３１４号公報参照）に従い調製した。このリポソームＡ分散液２６．６μｌに注射用水９７３．４μｌを添加してリポソームＡ分散液１ｍｌを調製した。このリポソーム分散液１ｍｌに上記（２）〜（４）で調製したオリゴ二本鎖ＲＮＡ水溶液１ｍｌを、撹拌しながら徐々に添加し、その後、６００Ｗのバス型超音波装置を用いて２分間分散処理することにより、混合した本発明ＲＮＡが完全に二本鎖を形成した場合のオリゴ二本鎖ＲＮＡの終濃度が１μＭである医薬組成物を調製した。【００４１】
試験例  オリゴ二本鎖ＲＮＡのスクリーニング
（１）使用細胞株
下記（２）のスクリーニングでは、ヒト肝癌由来の細胞株であるＨｕＨ−７＃５０−１細胞を用いた。ＨｕＨ−７＃５０−１細胞の詳細については、文献（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２０００年、２９３巻、ｐ．９９３−９９９）を参照されたい。スクリーニング時の当該細胞の培地としては、ＤＭＥＭ培地（ニッスイ社製）に１０％のＦＢＳ（三光純薬社製）を含有する培地を用いた。なお、スクリーニング時以外は、上記培地に、更に４００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）を含有する培地を用いた。
（２）スクリーニング方法及びその評価方法
６ｃｍ径のシャーレに細胞を３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。翌日、培養ディッシュから培地を吸引し、２．７ｍｌの培地を加えて培地交換を行った。そこに、本発明オリゴ二本鎖ＲＮＡの最終濃度として１００ｎＭとなるように、実施例にて調製した医薬組成物を０．３ｍｌ添加し、終量を３ｍｌとした。当該医薬組成物を添加後、ＣＯ２インキュベーター内にて９６時間培養した。細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、セルスクレーパーにて細胞を回収し、常法に従いトータルＲＮＡを単離した。
得られたトータルＲＮＡ２．５μｇを鋳型に、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを作成した。この逆転写反応液中に含まれるｃＤＮＡをＰＣＲ反応の鋳型に用い、リアルタイムＰＣＲ法による検出定量システム（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７０００）を用いてＨＣＶ  ＲＮＡ及び構成的発現遺伝子であるＧＡＰＤＨ（Ｄ−ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）  ｍＲＮＡ特異的なＰＣＲ増幅を行い、それぞれのＲＮＡ量の準定量を行った。ＨＣＶ  ＲＮＡのＰＣＲ増幅には、１００ｎｇのトータルＲＮＡ由来のｃＤＮＡを、ＧＡＰＤＨのＰＣＲ増幅には０．５ｎｇのトータルＲＮＡ由来のｃＤＮＡをそれぞれ鋳型に用いた。陰性対照としては蒸留水を添加した細胞より単離したトータルＲＮＡ由来のｃＤＮＡを用いた。ＨＣＶ  ＲＮＡ量は、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの量を１としたときの相対的な割合として算出した。得られた結果は、医薬組成物を添加した細胞のＨＣＶ  ＲＮＡ量が、陰性対照のＨＣＶ  ＲＮＡ量と等しい場合を抑制率０％として評価した。
（３）試験結果
上記スクリーニングの結果を表１に示す。その結果、１３０Ａ番（配列番号３及び配列番号４）及び２５８番（配列番号２及び配列番号５）の２つのオリゴ二本鎖ＲＮＡに顕著なＨＣＶ複製抑制活性が認められた。また、１３０Ａ番（配列番号３及び配列番号４）のオリゴ二本鎖ＲＮＡは、１３０番（配列番号１及び配列番号４）のオリゴ二本鎖ＲＮＡと比べて、非常に高いＨＣＶ複製抑制活性を有していた。【００４２】
【表１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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