(57)【要約】  ビオプテリン類は医薬品や機能性食品に利用される有用な化合物である。従来、藍藻などごく一部を除き、微生物ではビオプテリン類の生合成に関与するセピアプテリン・レダクターゼ（ＳＰＲ）の存在は確認されておらず、微生物を用いてビオプテリン類を効率とく生産する上で、微生物由来のＳＰＲ遺伝子の取得及び利用が望まれていた。  本発明者らは、酵母のＹＩＲ０３５Ｃ遺伝子または枯草菌のｙｕｅＤ遺伝子を酵母又は大腸菌に形質転換した場合、形質転換微生物はビオプテリン類を培養液中に分泌することを見出した。この発見に基づき、本発明は、微生物を用いたビオプテリン製造に有用な、ポリペプチド、それをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体を提供する。また、該形質転換体を用いたビオプテリン類の効率的な製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチド：
（Ａ）配列番号１または２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列において１つもしくは数個のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつセピアプテリン・レダクターゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
以下の（a）または（b）の単離されたＤＮＡ：
（a）配列番号３または４の塩基配列を含むＤＮＡ、
（b）配列番号３または４に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセピアプテリン・レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項４】
請求項３の組換えベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項５】
前記宿主が大腸菌（Escherichia coli）である請求項４記載の形質転換体。
【請求項６】
前記宿主が酵母（Saccharomyces cerevisiae）である請求項４記載の形質転換体。
【請求項７】
更にＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ遺伝子が形質転換されている請求項４記載の形質転換体。
【請求項８】
更にＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ遺伝子及びピルボイルテトラヒドロプテリン・シンターゼ遺伝子が形質転換されている請求項４記載の形質転換体。
【請求項９】
請求項４から８のいずれかの形質転換体を培養してテトラヒドロビオプテリンを生産し、必要に応じて酸化処理を行った後、テトラヒドロビオプテリン、ジヒドロビオプテリン、又はビオプテリンの少なくとも１つを採取することを特徴とするビオプテリン類の製造方法。
【請求項１０】
形質転換体の培養に際し、培養開始から一定時間後に培地に、グアニン誘導体又はイノシン誘導体と、界面活性剤とを添加し、更に培養を続ける請求項９記載のビオプテリン類の製造方法。
【請求項１１】
前記グアニン誘導体がＧＭＰ（グアノシン5'-リン酸）であり、前記イノシン誘導体がＩＭＰ（イノシン5'-リン酸）であり、前記界面活性剤がトリトンＸ−１００又はザルコシン酸ナトリウムである請求項１０記載のビオプテリン類の製造方法。
【請求項１２】
前記ＧＭＰ又はＩＭＰの濃度が添加後の培地中０．１〜５０ｍＭであり、前記トリトンＸ−１００又はザルコシン酸ナトリウムの濃度が添加後の培地中０．０１〜５％である請求項１１記載のビオプテリン類の製造方法。
【請求項１３】
前記一定時間が培養開始から５から２４時間後である請求項１０記載のビオプテリン類の製造方法。
【請求項１４】
請求項４から８のいずれかの形質転換体を用い、以下の（１）から（４）のいずれかの反応を行うことを特徴とする、ビオプテリン類の製造方法：
（１）6-ピルボイルテトラヒドロプテリンを基質として6-1'-ヒドロキシ-2'-オキソプロピルテトラヒドロプテリンを生成させ、更に6-1'-ヒドロキシ-2'-オキソプロピルテトラヒドロプテリンを基質としてテトラヒドロビオプテリンを生成させる反応、
（２）6-ラクトイルテトラヒドロプテリンを基質としてテトラヒドロビオプテリンを生成させる反応、
（３）6-1'-ヒドロキシ-2'-オキソプロピルテトラヒドロプテリン、又は6-ラクトイルテトラヒドロプテリンをそれぞれ基質とし、これら２つの化合物を相互変換させ、又はこれらのいずれかからテトラヒドロビオプテリンを生成させる反応、
（４）セピアプテリンを基質としてジヒドロビオプテリンを生成させる反応。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物由来のテトラヒドロビオプテリンの生合成に関わる酵素の遺伝子及びそれを導入した形質転換細胞及びそれを用いたビオプテリン類の製造法に関する。
【関連出願の相互参照】
【０００２】
日本国特許２００５−０３２７３６号（２００５年２月９日出願）の明細書、請求の範囲、図面および要約を含む全開示内容は、これら全開示内容を参照することによって本出願に合体される。
【背景技術】
【０００３】
本明細書においてテトラヒドロビオプテリンとはＬ-エリスロ-5,6,7,8-テトラヒドロビオプテリン(以下ＢＨ４と略す)を指し、その酸化体であるＬ-エリスロ-7,8-ジヒドロビオプテリン(以下ＢＨ２と略す)、Ｌ-エリスロ-ビオプテリン(以下ビオプテリンと略す)を含めビオプテリン類と称する。【０００４】
本発明の方法によって製造されるビオプテリン類に関しては、1955年にパターソン(Petterson)らによってトリパノゾーマの成長因子として酸化体のビオプテリンがヒト尿より始めて単離され（非特許文献１参照）、各種臓器、ある種の爬虫類、両生類、魚類の皮膚、ショウジョウバエの眼などにも比較的多量に存在することが知られている。【０００５】
ビオプテリン類を生産する従来の方法としては、化学合成的方法と生物学的方法とが知られている。
化学合成的方法の例としては、ラムノースなどの糖類からの有機合成法が用いられており、工業的に医薬品としてのＢＨ４の生産に用いられている。しかし、現在の化学合成による製造方法では、基質として用いるラムノースなどが高価であることに加え、反応操作が複雑で、取扱いが困難な薬品を使用しなければならないなどの問題がある。【０００６】
一方、生物学的方法としては、上記の生物より抽出する方法に加え、微生物（特許文献１および特許文献２参照）や生合成酵素を用いた方法（特許文献３参照）も検討されたが、いずれも生産性が大幅に不足しており、現在のところ実用化されていない。【０００７】
ＢＨ４生合成には、一般的に、グアノシン３リン酸（以後ＧＴＰと略す）を基質として、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ（以後ＧＣＨＩと略す）、ピルボイルテトラヒドロプテリン・シンターゼ（以後ＰＴＰＳと略す）及びセピアプテリン・レダクターゼ（以後ＳＰＲと略す）の３種類の生合成酵素が関与している。これらの酵素を大量発現させ、基質としてＧＴＰを多量に供給出来ればＢＨ４の大量生産が可能になると考えられる。藍藻類など一部のものを除けば、微生物ではＰＴＰＳ及びＳＰＲの遺伝子が知られておらず、ＢＨ４自体も生産されていないため、これら２つの生合成酵素遺伝子に関しては哺乳動物などの、由来が微生物以外の遺伝子を用いる必要があった。【０００８】
最近になって、遺伝子組換えの手法を用いて大腸菌で相当レベルの生産性が達成されている（特許文献４参照）。
【特許文献１】特公平5-33989号公報
【特許文献２】特公平5-33990号公報
【特許文献３】特開平4-82888号公報
【特許文献４】再公表WO2002-018587号公報
【非特許文献１】J. Am. Chem. Soc., 77, 3167-3168 (1955)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、上記特許文献４の技術では哺乳類由来の生合成遺伝子などを複数組合わせて用いているため、発現が不安定になる可能性がある。【００１０】
ビオプテリン類は医薬品としての作用に加え、機能性食品としての効果も期待できるなど用途及び利用が拡大しつつあり、安心できる品質のものが効率よく大量生産できることが望まれている。特に機能性食品などの食品として利用する際には安心できる品質のものを安定して供給できる生産系であることが重要である。微生物による生産がこれらの点で優っていると考えられるが、現在の技術では生合成酵素遺伝子としてラットなど哺乳動物由来の酵素遺伝子を用いており、大腸菌や酵母などの微生物により生産する際には生合成酵素の発現が不安定になったり、遺伝子自体の安定性が不十分であったりして、効率よく安定して用いることが困難と考えられ、微生物由来の生合成酵素遺伝子の取得及び利用が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らはビオプテリン類の生合成遺伝子の１つであるＳＰＲに関して、ヒト又はマウスのＳＰＲの酵素蛋白質の配列に対して相同性の高い配列を、微生物の既知遺伝子をデータベースより広く検索した。酵母では、ビオプテリン類の生合成経路が存在することは知られていないが、酵母Saccharomyces cerevisiaeのＹＩＲ０３５Ｃ遺伝子が比較的相同性の高い配列として見出された（ヒトＳＰＲ遺伝子に対して２８％、マウスＳＰＲ遺伝子に対して２６％）。その発現蛋白にＳＰＲ活性が確認されていないことからその効果を検討することにした。又、ＳＰＲ活性が確認されていないＳＰＲ類似配列の１つである枯草菌由来の遺伝子ｙｕｅＤについてもその効果の検討を行った。【００１２】
その結果、驚くべきことに、酵母ＹＩＲ０３５Ｃ又は枯草菌ｙｕｅＤのＤＮＡをそれぞれ酵母又は大腸菌に導入したところ、それら酵母や大腸菌が、通常は産生しないビオプテリン類を培養液中に分泌することを見出した。更に、ＢＨ４生合成酵素の遺伝子である各種生物由来のＧＣＨＩやＰＴＰＳ等の遺伝子を同時に微生物に導入することによりビオプテリン類の生産が大幅に増大することを見出した。【００１３】
よって、本発明は、以下の１または複数の特徴を含む。
（１）以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチド：
（Ａ）配列番号１または２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列において１つもしくは数個のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつセピアプテリン・レダクターゼ活性を有するポリペプチド。
（２）以下の（a）または（b）の単離されたＤＮＡ：
（a）配列番号３または４の塩基配列を含むＤＮＡ、
（b）配列番号３または４に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセピアプテリン・レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（３）（２）に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
（４）（３）に記載の組換えベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
（５）宿主が大腸菌（Escherichia coli）である（４）の形質転換体。
（６）宿主が酵母（Saccharomyces cerevisiae）である（４）の形質転換体。
（７）更にＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ遺伝子が形質転換されている（４）の形質転換体。
（８）更にＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ遺伝子及びピルボイルテトラヒドロプテリン・シンターゼ遺伝子が形質転換されている（４）の形質転換体。
（９）前記（４）から（８）のいずれかの形質転換体を培養してテトラヒドロビオプテリンを生産し、必要に応じて酸化処理を行った後、テトラヒドロビオプテリン、ジヒドロビオプテリン、又はビオプテリンの少なくとも１つを採取することを特徴とするビオプテリン類の製造方法。
（１０）形質転換体の培養に際し、培養開始から一定時間後に培地にグアニン誘導体又はイノシン誘導体と、界面活性剤とを添加し、更に培養を続ける（９）のビオプテリン類の製造方法。
（１１）前記グアニン誘導体がＧＭＰ（グアノシン5'-リン酸）であり、前記イノシン誘導体がＩＭＰ（イノシン5'-リン酸）であり、前記界面活性剤がトリトンＸ−１００又はザルコシン酸ナトリウムである（１０）のビオプテリン類の製造方法。
（１２）前記ＧＭＰ又はＩＭＰの濃度が添加後の培地中０．１〜５０ｍＭであり、前記トリトンＸ−１００又はザルコシン酸ナトリウムの濃度が添加後の培地中０．０１〜５％である（１１）のビオプテリン類の製造方法。
（１３）前記一定時間が培養開始から５から２４時間後である（１０）のビオプテリン類の製造方法。
（１４）（４）から（６）のいずれかの形質転換体を用い、以下の１）から４）のいずれかの反応を行うことを特徴とする、ビオプテリン類の製造方法：
１）6-ピルボイルテトラヒドロプテリンを基質として6-1'-ヒドロキシ-2'-オキソプロピルテトラヒドロプテリンを生成させ、更に6-1'-ヒドロキシ-2'-オキソプロピルテトラヒドロプテリンを基質としてテトラヒドロビオプテリンを生成させる反応、
２）6-ラクトイルテトラヒドロプテリンを基質としてテトラヒドロビオプテリンを生成させる反応、
３）6-1'-ヒドロキシ-2'-オキソプロピルテトラヒドロプテリン、又は6-ラクトイルテトラヒドロプテリンをそれぞれ基質とし、これら２つの化合物を相互変換させ、又はこれらのいずれかからテトラヒドロビオプテリンを生成させる反応、または、
４）セピアプテリンを基質としてジヒドロビオプテリンを生成させる反応。
【発明の効果】
【００１４】
本発明者が見出した酵母ＹＩＲ０３５Ｃ様配列又は枯草菌ｙｕｅＤ様配列の両ＤＮＡ配列を用いることにより、医薬品や機能性食品としての効果が期待できるビオプテリン類を微生物により効率よく生産することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
[背景技術]に前述のとおり、本明細書においてテトラヒドロビオプテリンとはL-エリスロ-5,6,7,8-テトラヒドロビオプテリン(以下ＢＨ４と略す)を指し、その酸化体であるL-エリスロ-7,8-ジヒドロビオプテリン(以下ＢＨ２と略す)、L-エリスロ-ビオプテリン(以下ビオプテリンと略す)を含めビオプテリン類と称する。【００１６】
１．セピアプテリン・レダクターゼ
１態様では、本発明は、以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチドを提供する：
（Ａ）配列番号１または２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列において１つもしくは数個のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつセピアプテリン・レダクターゼ活性を有するポリペプチド。【００１７】
「数個のアミノ酸」とは、好ましくは３０アミノ酸以下であり、より好ましくは２０アミノ酸以下、さらに好ましくは１０アミノ酸以下、最も好ましくは、９、８、７、６、５、４、３、または２アミノ酸以下である。【００１８】
１態様では、本発明はまた、以下の（a）または（b）の単離されたＤＮＡを提供する：
（a）配列番号３または４の塩基配列を含むＤＮＡ、
（b）配列番号３または４に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセピアプテリン・レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。【００１９】
以下、この態様における配列番号３に関する実施態様を酵母ＹＩＲ０３５様遺伝子、および配列番号４に関する実施態様を、枯草菌ｙｕｅＤ様遺伝子と称する。【００２０】
本明細書にいう「セピアプテリン・レダクターゼ」とは、ＢＨ４生合成の最終ステップを触媒する酵素であり、主にヒトやラットなどの哺乳動物やニワトリなどの鳥類でその存在が古くより知られ（Matsubara、M., et.al.,Biochim. Biophys. Acta 122,202-212 (1966)）、その遺伝子も既に取得されている。具体的には、セピアプテリン・レダクターゼとは、7,8-ジヒドロビオプテリン：NADP+ オキシドレダクターゼ(EC 1.1.1.153)を指し、6-ピルボイルテトラヒドロプテリンに作用して6-1'-ヒドロキシ-2'-オキソプロピルテトラヒドロプテリンを、6-1'-ヒドロキシ-2'-オキソプロピルテトラヒドロプテリン、又は6-ラクトイルテトラヒドロプテリンに作用してＢＨ４を、セピアプテリンに作用してＢＨ２を生成する反応を触媒し、また、6-1'-ヒドロキシ-2'-オキソプロピルテトラヒドロプテリンと6-ラクトイルテトラヒドロプテリンとの相互変換も触媒できる酵素である。【００２１】
ある遺伝子がコードするポリペプチドが該「セピアプテリン・レダクターゼ活性」を有するか否かは、加藤らのアッセイ方法（Katoh,S., Arch. Biochem. Biophys., 146, 202-214 (1971)）により直接測定することも可能であるが、遺伝子を微生物に形質転換してＢＨ４の生成を確認できれば、生体内での作用も含めて確認することが出来る。【００２２】
本明細書にいう「ストリンジェントな条件」とは、試験遺伝子に含まれる塩基配列が、試験遺伝子と実質的に同等の機能を有する遺伝子に含まれる塩基配列とハイブリダイズする限り特に限定されないが、好ましくは、約５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と約０．５％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と約１０μｇ／ｍｌ  変性断片化サケ精子ＤＮＡを含む溶液中約５０℃でハイブリダイゼーションを行い、約２×ＳＳＣ、約０．１％のＳＤＳ中５０℃で洗浄を行う条件である。【００２３】
より望ましくは上記と同じ条件でハイブリダイゼーションを行い、約１×ＳＳＣ、約０．１％のＳＤＳ中約５０℃で洗浄を行う条件である。より望ましくは上記と同じ条件でハイブリダイゼーションを行い、約０．５×ＳＳＣ、約０．１％のＳＤＳ中約５０℃で洗浄を行う条件である。より好ましくは上記と同じ条件でハイブリダイゼーションを行い、約０．１×ＳＳＣ、約０．１％のＳＤＳ中約５０℃で洗浄を行う条件である。更に好ましくは上記と同じ条件でハイブリダイゼーションを行い、約０．１×ＳＳＣ、約０．１％のＳＤＳ中約６５℃で洗浄を行う条件である。【００２４】
もっとも、該条件は、ＤＮＡの長さ、該配列、および異なる環境パラメーターに依存して異なり得る。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの詳細なガイドは、例えばTijssen(1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2''Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay''Elsvier, New Yorkに見出される。【００２５】
上記ポリペプチドまたはＤＮＡを得るための方法は特に限定されないが、例えば後述の実施例に記載の方法にしたがって生産し得る。【００２６】
２．ベクター
ここにいうベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクターのいずれも使用可能であるが、適当な抗生物質などの薬剤耐性遺伝子に加え、外来遺伝子を組込むための制限酵素切断サイト、及びその上流にプロモーター配列を有するものが好ましい。【００２７】
上記ベクターの例は、タカラバイオやストラタジーン（Stratagene）社などから市販されているものが使用可能で、大腸菌の系ではｐＵＣ系やｐＳＴＶ系など、プロモーターを持つ汎用的なベクターが使用可能であり、酵母の系ではｐＥＳＣ系やｐＡＵＲ系などのベクターが利用できる。【００２８】
実験の簡便さの観点から好ましくは、上記ベクターは大腸菌の系では市販のベクターを改良したｐＵＣＮｄｅ（後述の実施例７参照）やｐＳＴＶＮｄｅ（後述の実施例７参照）などから選択され、酵母の系ではｐＥＳＣ-ＵＲＡ（ストラタジーン社）、ｐＥＳＣ-ＬＥＵ（ストラタジーン社）などから選択される。【００２９】
３．宿主および形質転換体
ここにいう宿主とは、当業者に周知の技術に基づき、導入遺伝子を組込み発現可能なベクターによって形質転換する方法が確立できる宿主ならいずれも使用可能である。【００３０】
上記宿主の例は、大腸菌Eschericha coli、枯草菌Bacillus subtilis、Corynebacterium、Rhizobiumなどの細菌、Streptomycesなどの放線菌、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Pichia pastolisなどの酵母、Aspergillusなどのカビ、動物細胞、植物細胞なども利用可能である。【００３１】
物質生産に関する実用性の観点から好ましくは、上記宿主は、細菌や酵母などの微生物が有利であり、大腸菌、E. coliおよび酵母、S. cerevisiaeなどから選択される。【００３２】
本発明者が見出した酵母ＹＩＲ０３５Ｃ様遺伝子又は枯草菌ｙｕｅＤ様遺伝子の両ＤＮＡは、前記の適切なプラスミドベクターと連結して酵母、大腸菌などの宿主に形質転換することにより、形質転換体を得ることができる。【００３３】
４．培養
必要な栄養源を含む培地で形質転換体を培養することにより、ビオプテリン類を生産することができる。【００３４】
培養終了後、ビオプテリン類は培養液中にも分泌されているが、好気的に培養した場合には生合成されたＢＨ４の一部又は大部分が酸化を受けてＢＨ２やビオプテリンになって培地中などに存在する場合がある。そこで、培養液からのビオプテリン類（特に、ビオプテリン）の採取工程を簡略化するという観点から、必要により生産されたＢＨ４、およびこれが酸化されたＢＨ２を酸化処理してもよい。ここにいう酸化処理は化学的な方法、酵素などを用いた生化学的な方法などが実施可能であり、ビオプテリン類を分解しない限りその方法は特に限定されないが、酸化剤を用いる化学的方法が簡便であり、ヨウ化カリウムなどの酸化剤を培養液又はその処理物に加えるというような方法によって実施できる。【００３５】
５．ビオプテリン類の採取
培養液中に産生されたビオプテリン類は、採取後、公知の精製法などによって精製することによって、目的とする種類のビオプテリン類（例えばＢＨ４、ＢＨ２、またはビオプテリン）を得ることが出来る。【００３６】
ここにいう採取工程としては、まず培養液より菌体を濾過、又は遠心分離などの方法で分離する。菌体よりビオプテリン類を抽出する場合は、超音波処理やブラウン・ホモジナイザー（homogenizer (Braun, Melsungen, Germany)）などにより菌体を物理的に破壊することも可能であるが、小橋ら（Kohashi,et al. Agric.Biol.Chem.,44,2089-2094 (1980)）による抽出法、すなわち０．１Ｎ塩酸中に菌体を懸濁後、１２０℃、２分間処理する方法などにより有利に行うことが出来る。また、培養上清や菌体抽出液からのビオプテリン類の単離は、例えば活性炭、フロリジル、アルミナ、ケイ酸塩、粉末濾紙などや多孔性合成ポリマー担体（例えばアンバーライトＸＡＤ-２(ローム・アンド・ハース社)やダイヤイオン(三菱化学)など）、各種イオン交換樹脂（例えばダウエックス50ＷＸ８(アクロス・オーガニクス)、アンバーライトＩＲＣ-５０(ローム・アンド・ハース社)、ＤＥＡＥセファロースＣＬ-６Ｂ(アマシャム・バイオサイエンス)など）、ゲル濾過担体（例えばセファデックスＧ-２５、(アマシャム・バイオサイエンス)、バイオゲルＰ-２(バイオラッド)など）、各種アフィニティー担体などを担体そのまま、又はカラムクロマトグラフィーとして適宜組合わせて、利用することができる。【００３７】
６．ＢＨ４生合成酵素遺伝子（ＧＣＨＩおよびＰＴＰＳ）
ＢＨ４生合成に関与する３種類の酵素遺伝子のうち、上述のＳＰＲ（セピアプテリン・レダクターゼ）遺伝子だけではなく、ＧＣＨＩ（ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ）および／またはＰＴＰＳ（ピルボイルテトラヒドロプテリン・シンターゼ）などの遺伝子を同様にプラスミドベクターに連結し、２または３種の遺伝子を同時に宿主に導入すればビオプテリン類の生産を大幅に増させることが出来る。その他、上記３種類の酵素遺伝子を１以上含む２または３種のプラスミドを宿主に導入してもよい。【００３８】
これらＧＣＨＩおよびＰＴＰＳ等の生合成遺伝子は、後述の実施例で説明するように、当業者に公知のそれらの遺伝子のＤＮＡ配列情報と、公知のデータベースとをもとに、それぞれの染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲ反応で取得出来る。好ましくは遺伝子両端部分に適切な制限酵素切断点を付加した配列となるようにＰＣＲプライマーを設計し、ＰＣＲ反応により取得すればベクターへの挿入が容易になる。【００３９】
これらの生合成遺伝子を発現するためには、上記ベクターの項で記載したベクター及び遺伝子を適切な制限酵素により切断し、ベクターを切断した際に用いた酵素と同じ酵素により切断した合成酵素遺伝子とライゲーションした後、宿主である大腸菌や酵母に形質転換することで生産菌株を作製することが出来る。【００４０】
組換え生産菌の培養は、大腸菌の場合は２ＹＴ培地、Ｌ培地などが利用可能で、酵母の場合はＳ培地（８ｇ グルコース, １３ｇ (ＮＨ４)２ＳＯ４, ７.９ｇ ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、 ３ｇ ポリペプトン、 ３ｇ 酵母エキス、 ２ｇ ＫＣｌ、 ０．８ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、 ０．１ｇ ＮａＣｌ、 ９０ｍｇ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、 ６０ｍｇ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、 １０ｍｇ ＭｎＳＯ４・４-６Ｈ２Ｏ、 ５ｍｇ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、脱イオン水１Ｌに溶解（以後、「／１Ｌ」と略す）、ｐＨ７．０)、ＳＤ−ＵｒａＬｅｕ培地（グルコース２０ｇ、Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ（アミノ酸・(ＮＨ４)２ＳＯ４不含）１．７ｇ、(ＮＨ４)２ＳＯ４ ５ｇ、アデニン硫酸塩 ２０ｍｇ、Ａｒｇ ２０ｍｇ、Ａｓｐ １００ｍｇ、Ｇｌｕ １００ｍｇ、Ｉｌｅ ３０ｍｇ、Ｌｙｓ ３０ｍｇ、Ｍｅｔ ２０ｍｇ、Ｐｈｅ ５０ｍｇ、Ｓｅｒ ４００ｍｇ、Ｔｈｒ ２００ｍｇ、Ｔｙｒ ３０ｍｇ、Ｖａｌ １５０ｍｇ、Ｈｉｓ ２０ｍｇ、Ｔｒｐ ２０ｍｇ／１Ｌ）などが使用でき、培養後の培養液よりビオプテリン類を分離することが出来る。【００４１】
以上、本発明の実施形態に基づいて、ビオプテリン類を微生物により有利に生産するために使用できる遺伝子、及びそれを導入した微生物、及び該微生物を用いたビオプテリン類の生産を説明した。
【実施例】
【００４２】
本発明の実施例を以下に示し、更に詳しく説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。なお、以下の遺伝子組換えに関する基本操作については、モレキュラー・クロニング、ア・ラボラトリー・マニュアル 第３版(Molecular Cloning， A Laboratory Manual， Third Edition) コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(2001)、メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology)、 vol．194 (1991)、生物工学実験書・改訂版、培風館 (2002)、実験医学別冊・酵母による遺伝子実験法、羊土社 (1994)などに記載された方法を用いた。また、市販のキットを用いる場合は、添付されている使用説明書の指示に従った。【００４３】
（実施例１）ＹＩＲ０３５Ｃ配列およびｙｕｅＤ配列
カビや酵母のある種の微生物がＢＨ４を生産することは、白石らにより(特許文献１及び２)明らかにされている。酵母Saccharomyces cerevisiaeは全ゲノム配列が決定されているため、まずデータベースより得られる全ゲノム配列を用い、種々の生物由来の既知のＳＰＲ配列（これらの配列は京都大学のKEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) Database（ＵＲＬ：http://www.genome.ad.jp/kegg/  参照）などより入手できる）に対して相同性の高い配列を配列比較ソフトウエアBlastを用いて検索したところ、ヒト及びマウスのＳＰＲ配列をもとに検索を行った場合に相同性が高い２つの配列、ＹＩＲ０３５Ｃ、ＹＩＲ０３６Ｃを見出した。
その内、ＹＩＲ０３６Ｃについては、その発現させた蛋白にＳＰＲ活性が認められないことが既に報告されている(Maruyama, R. et al., J. Biotechnol, 94, 157-169(2002))。一方、ＹＩＲ０３５ＣのＤＮＡ配列断片については機能についての推定などの検討が行われていないことを見出し、ＳＰＲとしての働きを示すかどうかを検討することにした。配列表の配列番号３は、酵母Saccharomyces cerevisiaeのＹＩＲ０３５遺伝子の塩基配列を示し、配列番号１は、その遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を示す。【００４４】
このＹＩＲ０３５Ｃ遺伝子は、上記ヒト、マウスのＳＰＲ配列とはそれぞれ28％、26％と相同性が非常に低く、酵母ゲノムプロジェクトの内容を公開しているデータベース（http://db.yeastgenome.org/）においても、ORF, Uncharacterized, Hypothetical proteinと記載されているのみである。また、ＹＩＲ０３５Ｃ遺伝子の由来である酵母一般について、ビオプテリン生合成経路が存在するか否かも不明であり、特許文献１および特許文献２を除けば、記載されている文献は見当たらない。さらに、ＹＩＲ０３５Ｃ遺伝子と相同性の高いＹＩＲ０３６ＣにＳＰＲ活性が認められない上記文献の情報に基づけば、当業者であればＹＩＲ０３５遺伝子を発現させた蛋白がＳＰＲ活性を有さないと予想するのが一般的である。このような技術的前提の下、後述するように、意外にもＹＩＲ０３５Ｃ遺伝子を発現させた蛋白がＳＰＲ活性を有することを見出したのは、本出願の発明者独自の知見である。【００４５】
また、発現させた蛋白にＳＰＲ活性が確認されていないＳＰＲ類似配列がいくつも知られているが、その中の１つである枯草菌由来のｙｕｅＤ配列についてもＳＰＲとしての働きを示すかどうかをＹＩＲ０３５Ｃと同様に検討を行なった。配列番号４は、枯草菌Bacillus subtilis ｙｕｅＤ遺伝子の塩基配列を示し、配列番号２は、その遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を示す。【００４６】
（実施例２）酵母及び枯草菌ＳＰＲ類似配列の取得及び各酵母用発現プラスミドの作製
まず、酵母（Saccharomyces cerevisiae NBRC10102株）のゲノムＤＮＡをＧｅｎとるくん（タカラバイオ）を用いて抽出した。そして、酵母ＹＩＲ０３５Ｃ配列をＰＣＲ法により取得するためのＰＣＲプライマーとしてセンスプライマー、ＹＩＲ０３５Ｃ−Ｆ（配列番号５: cggaattcatgggtaaagttattttagttacagg）及びアンチセンスプライマー、ＹＩＲ０３５Ｃ−Ｒ（配列番号６: cgggatccctcaaggcataaagtccgccaaggc）を設計した。上記のゲノムＤＮＡを鋳型とし、それら２つのＰＣＲプライマー用いてＰＣＲを行うことで、５’側及び３’側の非翻訳領域にそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ切断部位を有するＹＩＲ０３５Ｃ遺伝子を取得した。
このＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ｐＥＳＣ−ＵＲＡベクター（ストラタジーン（Stratagene）社）のＥｃｏＲＩ及びＢｇｌII部位に挿入し、酵母ＳＰＲ類似配列を有するプラスミドｐＥＵ（ＧＡＬ１０−ＹＩＲ０３５Ｃ）を作製した。
このプラスミドには、配列番号３で示されるＤＮＡ配列を含んでいることをＤＮＡシクエンサーを用いて確認した。【００４７】
次に、枯草菌（Bacillus subtilis ATCC14593株）よりゲノムＤＮＡをＧｅｎとるくんを用いて抽出し、枯草菌ｙｕｅＤ配列をＰＣＲ法により取得するために設計したセンスプライマー、ｙｕｅＤ−Ｆ（配列番号７: cggaattcatggaactttatatcatcaccggagc）及びアンチセンスプライマー、ｙｕｅＤ−Ｒ（配列番号８: cgggatccctacaaaaactctttaatatcataaatgcgg）を用いてＰＣＲを行うことで、５’側及び３’側の非翻訳領域にそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ切断部位を有するｙｕｅＤ遺伝子を取得した。
このＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ｐＥＳＣ−ＵＲＡベクター（ストラタジーン（Stratagene）社）のＥｃｏＲＩ及びＢｇｌII部位に挿入し、枯草菌ＳＰＲ類似配列を有するプラスミドｐＥＵ（ＧＡＬ１０−ｙｕｅＤ）を作製した。このプラスミドには、配列番号４で示されるＤＮＡ配列を含んでいることをＤＮＡシクエンサーを用いて確認した。【００４８】
（実施例３）ビオプテリン生合成系遺伝子の取得及び酵母用共発現プラスミドの作製
枯草菌（Bacillus subtilis ATCC14593株）ゲノムＤＮＡを鋳型に、枯草菌ｍｔｒＡ配列（枯草菌由来のＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ遺伝子）をＰＣＲ法により取得するために設計したセンスプライマー、ｍｔｒＡ−Ｆ（配列番号９: cgggatccatatgaaagaagttaataaagagcaaatcg）及びアンチセンスプライマー、ｍｔｒＡ−Ｒ（配列番号１０: ccgctcgagttagtcctggcgtttaatatgttcc）を用いてＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで消化し、ｐＥＳＣ−ＵＲＡベクター（ストラタジーン（Stratagene）社）のＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ部位に挿入し、プラスミドｐＥＵ（ＧＡＬ１−ｍｔｒＡ）を作製した。
このＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩによる消化断片を、上述したプラスミドｐＥＵ（ＧＡＬ１０−ＹＩＲ０３５Ｃ）及びプラスミドｐＥＵ（ＧＡＬ１０−ｙｕｅＤ）の各ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ部位に挿入し、プラスミドｐＥＵ（ＧＡＬ１−ｍｔｒＡ／ＧＡＬ１０−ＹＩＲ０３５Ｃ）及びプラスミドｐＥＵ（ＧＡＬ１−ｍｔｒＡ／ＧＡＬ１０−ｙｕｅＤ）を作製した。【００４９】
続いて、ラットｃＤＮＡライブラリー（ストラタジーン（Stratagene）社）を鋳型に、ラットＰＴＰＳ配列をＰＣＲ法により取得するために設計したセンスプライマー、ｒＰＴＰＳ−Ｆ（配列番号１１:ggaattccatatgaacgcggcggttggccttcggcgc）及びアンチセンスプライマー、ｒＰＴＰＳ−Ｒ（配列番号１２: gaagatctctattctcctttgtagaccacaatgttgttg）を用いてＰＣＲを行った。
このＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ及びＢｇｌIIで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＫＳ（−）ベクター（ストラタジーン（Stratagene）社）のＥｃｏＲＩ及びＢｇｌII部位に挿入後、ＳａｌＩ及びＸｂａＩ部位で消化した断片を、ｐＥＳＣ−ＬＥＵベクター（ストラタジーン（Stratagene）社）のＳａｌＩ及びＮｈｅＩ部位に挿入し、プラスミドｐＥＬ（ＧＡＬ１−ｐｔｐｓ）を作製した。【００５０】
（実施例４）形質転換酵母の取得
Saccharomyces cerevisiae YPH499株［mat A,ura3,leu2,trp1,his3,ade2,lys2］（ストラタジーン社）を、実施例３で作製した以下の、
（１）プラスミドｐＥＵ（ＧＡＬ１−ｍｔｒＡ／ＧＡＬ１０−ＹＩＲ０３５Ｃ）（実施例３参照）及びｐＥＬ（ＧＡＬ１−ｐｔｐｓ）（実施例３参照）、
（２）プラスミドｐＥＵ（ＧＡＬ１−ｍｔｒＡ／ＧＡＬ１０−ｙｕｅＤ）及びｐＥＬ（ＧＡＬ１−ｐｔｐｓ）、
（３）プラスミドｐＥＵ（ＧＡＬ１−ｍｔｒＡ）及びｐＥＬ（ＧＡＬ１−ｐｔｐｓ）、（４）プラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ及びｐＥＳＣ−ＬＥＵ、
で形質転換し、それぞれ（１）Ｙ４−ｍｐ５株、（２）Ｙ４−ｍｐｙ株、（３）Ｙ４−ｍｐ株、（４）Ｙ４−ＥＬ株を取得した。
形質転換体の取得には、ＦａｓｔＴｒａｃｋ−Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用い、ＳＤ−ＵｒａＬｅｕ寒天培地（グルコース２０ｇ、Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ（アミノ酸・硫酸アンモニウム不含）１．７ｇ、硫酸アンモニウム５ｇ、アデニン硫酸塩２０ｍｇ、Ａｒｇ２０ｍｇ、Ａｓｐ１００ｍｇ、Ｇｌｕ１００ｍｇ、Ｉｌｅ３０ｍｇ、Ｌｙｓ３０ｍｇ、Ｍｅｔ２０ｍｇ、Ｐｈｅ５０ｍｇ、Ｓｅｒ４００ｍｇ、Ｔｈｒ２００ｍｇ、Ｔｙｒ３０ｍｇ、Ｖａｌ１５０ｍｇ、Ｈｉｓ２０ｍｇ、Ｔｒｐ２０ｍｇ／１Ｌ、寒天培地には２％の寒天を添加）により選択した。【００５１】
（実施例５）形質転換酵母によるビオプテリン類の生産
実施例４で得られた形質転換酵母を５ｍｌの改良ＳＤ−ＵｒａＬｅｕ培地（グルコース２０ｇ、Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ（アミノ酸・硫酸アンモニウム不含）１３．６ｇ、硫酸アンモニウム５ｇ、アデニン硫酸塩１６０ｍｇ、Ａｒｇ１６０ｍｇ、Ａｓｐ８００ｍｇ、Ｇｌｕ８００ｍｇ、Ｉｌｅ２４０ｍｇ、Ｌｙｓ２４０ｍｇ、Ｍｅｔ１６０ｍｇ、Ｐｈｅ４００ｍｇ、Ｓｅｒ３２００ｍｇ、Ｔｈｒ１６００ｍｇ、Ｔｙｒ２４０ｍｇ、Ｖａｌ１２００ｍｇ、Ｈｉｓ１６０ｍｇ、Ｔｒｐ１６０ｍｇ／１Ｌ）で３０℃にて２４時間振とう培養し、２ｍｌのＳＧ−ＵｒａＬｅｕ培地（ガラクトース８０ｇ、Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ（アミノ酸・硫酸アンモニウム不含）１３．６ｇ、硫酸アンモニウム５ｇ、アデニン硫酸塩１６０ｍｇ、Ａｒｇ１６０ｍｇ、Ａｓｐ８００ｍｇ、Ｇｌｕ８００ｍｇ、Ｉｌｅ２４０ｍｇ、Ｌｙｓ２４０ｍｇ、Ｍｅｔ１６０ｍｇ、Ｐｈｅ４００ｍｇ、Ｓｅｒ３２００ｍｇ、Ｔｈｒ１６００ｍｇ、Ｔｙｒ２４０ｍｇ、Ｖａｌ１２００ｍｇ、Ｈｉｓ１６０ｍｇ、Ｔｒｐ１６０ｍｇ／１Ｌ）に５％植菌後さらに９６時間培養した培養液上清中のＢＰ（ビオプテリン）含有量を測定した。【００５２】
ＢＰ含有量の測定は、液体クロマトグラフィー（カラム；Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ−１８  ５μｍ、φ４×２５０ｍｍ、溶離液；５％メタノール、４０ｍＭクエン酸、２０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ３．０）、流速；１ｍｌ／ｍｉｎ、検出；蛍光  ３５０ｎｍ励起−４５０ｎｍ検出）により分析した。その結果、Ｙ４−ｍｐ５株が２０μｇ／ｍｌ、Ｙ４−ｍｐｙが１５μｇ／ｍｌ、Ｙ４−ｍｐが０．２μｇ／ｍｌ、Ｙ４−ＥＬが０．０１μｇ／ｍｌのビオプテリンを培養液中に産生していることが判明した。ベクターのみを導入した酵母、又はｍｔｒＡ及びラットＰＴＰＳ遺伝子を導入した酵母と比較して、ｍｔｒＡ及びラットＰＴＰＳ遺伝子に加えてＹＩＲ０３５Ｃ又はｙｕｅＤ遺伝子のいずれかを更に導入した酵母では明らかに生産性が向上していた。また、参考例２に示すラットＳＰＲ遺伝子を用いた場合より、ＳＰＲ遺伝子としてＹＩＲ０３５Ｃ又はｙｕｅＤ遺伝子を用いた方が高い生産性を示し、かつそれぞれの形質転換による生産性のばらつきも少なかった。【００５３】
（実施例６）形質転換酵母によるビオプテリン類の生産（添加培養）
実施例５と同様に、得られた形質転換酵母、Ｙ４−ｍｐ５株を５ｍｌの改良ＳＤ−ＵｒａＬｅｕ培地で３０℃にて２４時間振とう培養し、２ｍｌの改良ＳＧ−ＵｒａＬｅｕ培地に５％植菌し、培養開始８時間後に２ｍｇ ＧＭＰ、及び０．１ｍｌの２％ トリトンＸ−１００を添加し、さらに９６時間培養して培養液上清中のＢＰ含有量を測定した。その結果、培養上清中のビオプテリン含量は３７μｇ／ｍｌであり、グアニン及びトリトンＸ−１００を添加しない場合と比較して明らかに生産量が増加した。【００５４】
実施例では「グアニン誘導体」の例として「ＧＭＰ（添加濃度は、添加後の培地中０．１〜５０ｍＭが好ましい）」を例示したが、これに限られるものではなく、その他グアニン、グアノシン、ＧＤＰ、ＧＴＰを利用してもよい。実施例では「界面活性剤」の例として「トリトンＸ−１００」を例示したが、これに限られるものではなく、その他「ザルコシン酸ナトリウム（添加濃度は上記「トリトンＸ−１００」と同様、添加後の培地中０．０１〜５％が好ましい）を利用してもよい。【００５５】
実施例では、上記「グアニン誘導体」および「界面活性材」を添加するタイミングとして、培養開始から８時間後の例を示したが、これに限られるものではなく、その他、培養開始から５から２４時間後の範囲を採用可能である。【００５６】
また、上記のようにグアニン誘導体及び界面活性剤を添加することにより生産量が増加する原因の一つとしては、界面活性剤の添加により微生物の細胞膜や細胞壁の透過性が増加し、グアニン誘導体が細胞内に取込まれてビオプテリン類の生合成に利用される点が考えられる。【００５７】
（実施例７）形質転換大腸菌によるビオプテリン類の生産
実施例２で得られたＹＩＲ０３５Ｃ断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断し、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断したプラスミドｐＳＴＶＮｄｅ(ｐＳＴＶ２９(タカラバイオ)のＮｄｅＩ切断点を突出末端平滑化により無くし、ｌａｃＺ遺伝子の開始コドン部にＮｄｅＩ切断点を作製したプラスミド)と連結させ、大腸菌ＤＨ５α（東洋紡績社）に形質転換した。これをＩＰＴＧ、Ｘ-Ｇａｌ及びクロラムフェニコールを添加した２ＹＴプレートにスプレッドし、３７℃で培養して生育してきた白コロニーを選択し、目的のプラスミドｐＳＴＶＹＩＲ０３５Ｃを得た。【００５８】
実施例３で得られたＰＴＰＳ断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢｇｌII(タカラバイオ)で両末端部を切断し、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにより切断したプラスミド、ｐＵＣＮｄｅ(ｐＵＣ１９のＮｄｅＩ切断点を突出末端平滑化により無くし、ｌａｃＺ遺伝子の開始コドン部にＮｄｅＩ切断点を作製したプラスミド)と連結し、大腸菌ＤＨ５α（東洋紡績社）に形質転換した。これをＩＰＴＧ、Ｘ-Ｇａｌ及びアンピシリンを添加した２ＹＴプレートにスプレッドし、３７℃で培養して生育してきた白コロニーを選択し、目的のプラスミドｐＵＣＰＴＰＳを得た。【００５９】
このｐＵＣＰＴＰＳを有する組換え大腸菌を、常法により塩化カルシウム処理した後、ｐＳＴＶＹＩＲ０３５Ｃを形質転換し、アンピシリン及びクロラムフェニコールを添加した２ＹＴプレートにスプレッドし、３７℃で培養して生育してきたコロニーを選択した。このｐＳＴＶＹＩＲ０３５Ｃ及びｐＵＣＰＴＰＳを共に有する組換え大腸菌を５ｍｌのＮ培地（２０ｇ グリセロール、 １０ｇ カザミノ酸、 ４ｇ 酵母エキス、 ４ｇ Ｋ２ＨＰＯ４、 ４ｇ ＫＨ２ＰＯ４、 ２.７ｇ ＮａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、２ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、 １.２ｇ (ＮＨ４)２ＳＯ４,０.２ｇ ＮＨ４Ｃｌ,  ４０ｍｇ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、 ４０ｍｇ ＣａＣｌ2・２Ｈ２Ｏ、 １０ｍｇ ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、 １０ｍｇ ＡｌＣｌ3・６Ｈ２Ｏ、 ４ｍｇ ＣｏＣｌ2・６Ｈ２Ｏ、 ２ｍｇ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、 ２ｍｇ Ｎａ２ＭｏＯ4・２Ｈ２Ｏ、 １ｍｇ ＣｕＣｌ2・２Ｈ２Ｏ、 ０.５ｍｇ Ｈ３ＢＯ３、脱イオン水１Ｌに溶解(ｐＨ７．０)））に終濃度で５０ｍＭ ＩＰＴＧ、５０μｇ／ｍｌ アンピシリン、２０μｇ／ｍｌ クロラムフェニコールを添加した試験管培地(直径２４ｍｍ)に植菌し、３７℃で８時間振盪培養後、２ｍｇ グアニン誘導体としてのＧＭＰ（グアノシン5'-リン酸）、及び０．１ｍｌの２％ 界面活性剤としてのトリトンＸ−１００を添加し、さらに４８時間培養した。培養後、培養液を遠心分離し、その上清を液体クロマトグラフィーにより分析したところ、ビオプテリンのピークが得られ、その生産量は培地１ｍｌ当り１．０μｇであった。【００６０】
（参考例１）ラットSPR遺伝子の取得及び酵母用共発現プラスミドの作製
枯草菌ゲノムＤＮＡを鋳型に、枯草菌ｍｔｒＡ配列をＰＣＲ法により取得するために設計したセンスプライマー、ｍｔｒ−Ｆ２（配列番号１３： cggaattcatgaaagaagttaataaagagcaaatcg）及びアンチセンスプライマー、ｍｔｒ−Ｒ２（配列番号１４：cgggatccttagtcctggcgtttaatatgttcc）を用いてＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ｐＥＳＣ−ＵＲＡベクターのＥｃｏＲＩ及びＢｇｌII部位に挿入し、プラスミドｐＥＵ（ＧＡＬ１０−ｍｔｒＡ）を作製した。【００６１】
さらに、ラットｃＤＮＡライブラリー（Stratagene）を鋳型に、センスプライマー、ｒＳＰＲ−Ｆ（配列番号１５：cgggatcccatatggaaggaggcaggctaggttgcgctg）及びアンチセンスプライマー、ｒＳＰＲ−Ｒ（配列番号１６： ccgctcgagttaaatgtcatagaagtccacgtgggc）を用いてＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで消化し、上記ｐＥＵ（ＧＡＬ１０−ｍｔｒＡ）のＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ部位に挿入し、プラスミドｐＥＵ（ＧＡＬ１−ｓｐｒ／ＧＡＬ１０−ｍｔｒＡ）を作製した。このプラスミドには、配列番号１８で示されるＤＮＡ配列を含んでいることをＤＮＡシクエンサーを用いて確認した。なお、配列番号１８に示すＤＮＡがコードするアミノ酸配列を配列番号１７に示した。【００６２】
（参考例２）ラットＳＰＲ共発現酵母によるビオプテリン生産
Saccharomyces cerevisiae YPH499株を、参考例１で作製したプラスミドｐＥＵ（ＧＡＬ１−ｓｐｒ／ＧＡＬ１０−ｍｔｒＡ）及びｐＥＬ（ＧＡＬ１−ｐｔｐｓ）で形質転換し、Ｙ４−ｍｐｓ株を取得した。 得られた形質転換酵母を５ｍｌの改良ＳＤ−ＵｒａＬｅｕ培地で３０℃にて２４時間振とう培養し、２ｍｌのＳＧ−ＵｒａＬｅｕ培地に５％植菌後、さらに９６時間培養した培養液上清中のＢＰ含有量を測定した。その結果、最高４μｇ／ｍｌのビオプテリンを培養液中に産生していることが判明したが、それぞれの形質転換株により生産量に大きなバラツキが認められた。【００６３】
一方、実施例５の菌株の場合には、ビオプテリン類の生産量が多いことに加え、形質転換株によるバラツキが少なく、安定したビオプテリン類の生産が確認できている。この結果と合わせて考えると、酵母ではラットＳＰＲ遺伝子の配列が原因となって遺伝子が不安定で脱落しやすい可能性や、ｍＲＮＡが不安定となる可能性、遺伝子発現時の効率が微妙な環境の影響を受けてばらついたりするなどの可能性が考えられる。
【配列表】
2006085535000001.app
【国際調査報告】
2006085535.tif 000002
2006085535.tif 000003
2006085535.tif 000004
2006085535.tif 000005
2006085535.tif 000006
2006085535.tif 000007
2006085535.tif 000008
2006085535.tif 000009