(57)【要約】  二本鎖ＲＮＡ切断酵素によるｓｉＲＮＡと同様の塩基配列を有するものを人工的に調製するために当該塩基配列を簡便で効率的にスクリーニングする方法ならびに該方法によって得られた塩基配列データベース含むｓｉＲＮＡ構築装置。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を包含することを特徴とする、ＲＮＡ干渉に有効なｓｉＲＮＡのスクリーニング方法：
（ｉ）所定の遺伝子の塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）をｄｓＲＮＡ分解酵素で処理してＲＮＡ切断産物を得る工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られたＲＮＡ切断産物の塩基配列を特定する工程。
【請求項２】
ｄｓＲＮＡ分解酵素が、ＤｉｃｅｒあるいはＲＮａｓｅＩＩＩあるいはそれらの誘導体であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
ｄｓＲＮＡをｄｓＲＮＡ分解酵素で処理する時に、ＲＮＡシャペロニンを添加することを特徴とする請求項１の方法。
【請求項４】
塩基配列を特定する方法が、質量分析方法及び／又はＲＮＡリガーゼ法であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
さらにＲＮＡの高次構造解析方法を組み合わせることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
以下の工程を包含することを特徴とする、目的の遺伝子のＲＮＡ干渉に有効なｓｉＲＮＡの構築方法：
（ｉ）請求項１記載のスクリーニング方法で得られたＲＮＡ干渉に有効なｓｉＲＮＡの塩基配列情報を基に構築されたデータベースと目的の遺伝子の塩基配列を比較し、ｓｉＲＮＡの候補となる塩基配列を選択する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）で選択した塩基配列に基づいてｓｉＲＮＡを構築する工程。
【請求項７】
工程（ｉ）のデータベースがｓｉＲＮＡのＲＮＡ干渉能及び／又は目的の遺伝子由来のＲＮＡの高次構造に関する情報を含んでいることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
以下を含むことを特徴とする、目的の遺伝子のＲＮＡ干渉に有効なｓｉＲＮＡを構築するための装置：
（ｉ）目的の遺伝子の塩基配列に関する情報を入力する手段；
（ｉｉ）請求項１記載のスクリーニング方法で得られたＲＮＡ干渉に有効なｓｉＲＮＡの塩基配列を保持した塩基配列データベース；
（ｉｉｉ）前記塩基配列データベース中の塩基配列と入力された目的の遺伝子の塩基配列を比較し、ｓｉＲＮＡ候補の塩基配列を選択する手段。
【請求項９】
さらに塩基配列データベースが塩基配列に基づくＲＮＡ干渉能及び／又はＲＮＡの高次構造に関する情報を含んでいることを特徴とする請求項８記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学的に有用なＲＮＡ干渉技術に関するものであり、当該ＲＮＡ干渉において有用なｓｉＲＮＡのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、低分子ｄｓＲＮＡを利用する遺伝子工学的手法が報告されている。
例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ干渉：ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）によってその塩基配列特異的にｍＲＮＡが分解され、その結果遺伝子発現が抑制される現象である。ｄｓＲＮＡによって遺伝子サイレンシングができることがわかった発端は、線虫におけるアンチセンスを用いた研究からであった。１９９５年、ＧｕｏとＫｅｍｐｈｕｅｓはｐａｒ−１と呼ばれる遺伝子をアンチセンスＲＮＡで抑制する実験を行なった。アンチセンスＲＮＡを加えると、予想通りｐａｒ−１の発現を抑制したが、驚いたことに、コントロールとして用いたセンスＲＮＡも同様にｐａｒ−１の発現を抑制し、ｐａｒ−１変異株の表現形を示した。（例えば、非特許文献１）
この矛盾は、１９９８年にＦｉｒｅらによって解き明かされた。アンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡを、それぞれＲＮＡポリメラーゼを用いて合成するとき、わずかに非特異的に逆向きのＲＮＡができてしまう。そのコンタミネーションよってできるｄｓＲＮＡが遺伝子サイレンシングの本体であり、アンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡは遺伝子の発現を抑制できないこと、またアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡをアニールさせたｄｓＲＮＡが効率よく遺伝子の発現を抑制できることが明らかとなった。（例えば、非特許文献２）【０００３】
上記ＲＮＡ干渉においては、Ｄｉｃｅｒと呼ばれる酵素がｄｓＲＮＡから小分子のＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を生成させる。（例えば、非特許文献３）
上記Ｄｉｃｅｒとしてはヒト由来Ｄｉｃｅｒ（例えば、非特許文献４）が例示され、さらにリコンビナントＤｉｃｅｒ（例えば、非特許文献５）がジーンセラピーシステムズ社あるいはストラタジーン社より販売されている。
この酵素の作用により生じたｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）と呼ばれる複合体に取り込まれ、該複合体が標的ｍＲＮＡを認識し、分解すると考えられている。しかしながら、ＲＮＡ干渉に関与すると考えられる各因子についての正確な機能についてはまだまだ未知の部分が多いのが現状であった。（例えば、非特許文献６）【０００４】
上記ＲＮＡ干渉を効率よく行うためには、標的となるｍＲＮＡに対して効果的にその分解を促進するような塩基配列を有するｓｉＲＮＡを効率よく生成させることが重要である。
このＲＮＡ干渉に有効なｓｉＲＮＡの設計方法に関しては、ノックダウンしたい遺伝子の塩基配列情報から有効な塩基配列の候補を予測するソフトが開発され、それを用いて予測した塩基配列の候補を全て化学合成し、それらについて効果を検討する方法が取られてきた。しかしながら上記方法は、あくまで予測であり、必ずしも有効なものを１回の検討で選ぶことは容易ではなかった。また、上記塩基配列の候補中に有効なものが見つからなければ、塩基配列候補の予測からやり直す必要があった。【０００５】
一方、目的遺伝子の全長あるいは一部に由来する２本鎖ＲＮＡを単にＤｉｃｅｒ、あるいは、ＲＮａｓｅＩＩＩで切断しただけの様々な塩基配列のｓｉＲＮＡを含むバルクを細胞に導入しても、特定の塩基配列を合成した合成ＲＮＡオリゴヌクレオチドと同等以上のノックダウンが生じることから、上記バルクの中には非常に効率よく、目的の遺伝子をノックダウンする塩基配列が含まれている可能性があったが、どのような配列の切断産物が含まれているのか同定するには至っていない。
従来において塩基配列を解析するために、質量分析法により解析する方法（例えば、特許文献１、２）、あるいはＲＮＡリンカーとＲＮＡリガーゼを利用して塩基配列を解析する方法（例えば、特許文献３）が知られているが、ｓｉＲＮＡバルク中の塩基配列に利用できるかどうかは不明であった。【０００６】
また、ＲＮＡは多様な構造をとることから、ｄｓＲＮＡ中には、両ＲＮＡ鎖のセンス、アンチセンスの関係から形成される二本鎖構造のみならず、それぞれのＲＮＡ鎖が分子内で高次構造をとることにより生じる分子内二本鎖構造などが存在している可能性がある。このような二本鎖構造をｄｓＲＮＡ分解酵素が認識し、切断しているかについても不明であった。【０００７】
すなわち、この目的遺伝子の全長あるいは一部に由来する２本鎖ＲＮＡをＤｉｃｅｒ、Ｄｉｃｅｒ誘導体、あるいはＲＮａｓｅＩＩＩで切断したｓｉＲＮＡバルクの中にどのような塩基配列が存在するかを簡単に確認する方法さえないのが現状であった。
また、ＲＮＡ干渉とｓｉＲＮＡの塩基配列との関係（例えば、非特許文献７）についてもまだまだ十分解析されているとはいえない状況である。【０００８】
【特許文献１】特許第３１９５３５８号明細書
【特許文献２】特表２００２−５３１０５３号公報
【特許文献３】国際公開第２００４／００７７６８号パンフレット
【非特許文献１】Ｇｕｏ  Ｓ．他１名  Ｃｅｌｌ  １９９５年  ｖｏｌ．８１、ｐ６１１−６２０
【非特許文献２】Ｆｉｒｅ  Ａ．他５名  Ｎａｔｕｒｅ  １９９８年  ｖｏｌ．３９、ｐ８０６−８１１
【非特許文献３】Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  Ｅ．他３名  Ｎａｔｕｒｅ  ２００１年  ｖｏｌ．４０９、ｐ３６３−３６６
【非特許文献４】Ｚｈａｎｇ  Ｈ．他４名  Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００２年  ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．２１，ｐ５８７５−５８８５
【非特許文献５】Ｍｙｅｒｓ  Ｊ．Ｗ．他３名  Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００３年  ｖｏｌ．２１、ｐ３２４−３２８
【非特許文献６】Ｔａｂａｒａ  Ｈ．他３名  Ｃｅｌｌ  ２００２年  ｖｏｌ．１０９、ｐ８６１−８７１
【非特許文献７】Ｕｉ−Ｔｅｉ  Ｋ．他７名  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００４年  ｖｏｌ．３２、Ｎｏ．３、ｐ９３６−９４８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、上記従来技術を鑑みて行われたものであり、二本鎖ＲＮＡ切断酵素によるｓｉＲＮＡと同様の塩基配列を有するものを人工的に調製するために当該塩基配列を簡便で効率的にスクリーニングする方法ならびに該方法によって得られた塩基配列データベースを含むｓｉＲＮＡ構築装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ＲＮＡ干渉に有効なｓｉＲＮＡの塩基配列を従来よりも簡便に決定する方法を見出した。さらに、該方法によって得られた塩基配列情報に基づき、ｓｉＲＮＡを化学合成し、そのＲＮＡ干渉能を確認し、ＲＮＡ干渉に有効なｓｉＲＮＡの特徴を見い出し本発明を完成させた。【００１１】
すなわち、本発明の第１の発明は、以下の工程を包含することを特徴とする、ＲＮＡ干渉に有効なｓｉＲＮＡのスクリーニング方法に関する：
（ｉ）所定の遺伝子の塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）をｄｓＲＮＡ分解酵素で処理してＲＮＡ切断産物を得る工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られたＲＮＡ切断産物の塩基配列を特定する工程。【００１２】
本発明の第１の発明においてｄｓＲＮＡ分解酵素は、ＤｉｃｅｒあるいはＲＮａｓｅＩＩＩあるいはそれらの誘導体であってもよく、ｄｓＲＮＡをｄｓＲＮＡ分解酵素で処理する時に、ＲＮＡシャペロニンを添加してもよい。上記塩基配列を特定する方法は、質量分析方法及び／又はＲＮＡリガーゼ法であってもよく、さらにＲＮＡの高次構造解析方法を組み合わせてもよい。【００１３】
本発明の第２の発明は、以下の工程を包含することを特徴とする、目的の遺伝子のＲＮＡ干渉に有効なｓｉＲＮＡの構築方法に関する：
（ｉ）本発明の第１の発明のスクリーニング方法で得られたＲＮＡ干渉に有効なｓｉＲＮＡの塩基配列情報を基に構築されたデータベースと目的の遺伝子の塩基配列を比較し、ｓｉＲＮＡの候補となる塩基配列を選択する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）で選択した塩基配列に基づいてｓｉＲＮＡを構築する工程。【００１４】
本発明の第２の発明において、工程（ｉ）のデータベースがｓｉＲＮＡのＲＮＡ干渉能及び／又は目的の遺伝子由来のＲＮＡの高次構造に関する情報を含んでいてもよい。【００１５】
本発明の第３の発明は、以下を含むことを特徴とする、目的の遺伝子のＲＮＡ干渉に有効なｓｉＲＮＡを構築するための装置に関する：
（ｉ）目的の遺伝子の塩基配列に関する情報を入力する手段；
（ｉｉ）本発明の第１の発明のスクリーニング方法で得られたＲＮＡ干渉に有効なｓｉＲＮＡの塩基配列を保持した塩基配列データベース；
（ｉｉｉ）前記塩基配列データベース中の塩基配列と入力された目的の遺伝子の塩基配列を比較し、ｓｉＲＮＡ候補の塩基配列を選択する手段。【００１６】
本発明の第３の発明において、塩基配列データベースが塩基配列に基づくＲＮＡ干渉能及び／又はＲＮＡの高次構造に関する情報を含んでいてもよい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によりＤｉｃｅｒ、ＲＮａｓｅＩＩＩなどの二本鎖ｄｓＲＮＡ切断酵素で切断されたｓｉＲＮＡの塩基配列を簡便に特定する事ができ、ＲＮＡ干渉への利用について効率よく実施することができる。さらに、本発明の構築装置からＲＮＡ干渉において効果的なｓｉＲＮＡを無駄なく構築することが可能となり、コストダウンにつなげることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ｓｉＲＮＡのマススペクトルを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本明細書においてｄｓＲＮＡ分解酵素とは、二本鎖ＲＮＡを分解する活性を有するポリペプチドのことを言う。特に本発明においては、特定の長さのｄｓＲＮＡに分解する酵素が好適に使用できる。例えば、以下に示すＤｉｃｅｒ及びＲＮａｓｅＩＩＩあるいはそれらの誘導体が例示される。上記ｄｓＲＮＡ分解酵素は、ＲＮＡ干渉において有効なｓｉＲＮＡを生成できるものであれば、その由来は限定されない。さらに、本明細書におけるｄｓＲＮＡ分解酵素は、ＣｓｐＢをはじめとするＲＮＡシャペロニンなどの物質を添加していてもよい。【００２０】
本明細書においてＤｉｃｅｒとは、ＲＮＡ干渉の初期段階で長鎖の二本鎖ＲＮＡをｓｉＲＮＡにプロセッシングできる機能を有するタンパク質のことを言う。天然型のＤｉｃｅｒとしては、とくに限定はされないが例えばＮ末端側よりＡＴＰ結合ドメイン、ＲＮＡヘリカーゼドメイン、機能未知なＰＡＺドメイン、ＲＮａｓｅＩＩＩａ及びｂドメイン、さらにｄｓＲＮＡ結合ドメインから構成されているものが挙げられる。本発明においては、上記Ｄｉｃｅｒと同等以上の活性を有する誘導体も上記タンパク質に含まれる。特に限定はされないが、実施例記載のＤｉｃｅｒ誘導体であってもよい。本明細書において、誘導体とは、タンパク質を変異（アミノ酸の置換、欠失、付加、挿入）させたもの（変異体）や化学的な修飾などにより、酵素の理化学的性質や製造効率、操作の手順を改変したもののことをいう。さらに、Ｐｅｒｆｅｃｔ  ＤＢ配列、Ｈｉｓ  ｔａｇ配列、並びにＦａｃｔｏｒ  Ｘａ配列などの配列を付加したポリペプチドも誘導体に含まれる。【００２１】
本明細書においてＲＮａｓｅＩＩＩとは、二本鎖ＲＮＡに特異的に作用する酵素をいう。例えば、大腸菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩは、５’−末端リン酸基を持つ平均１５ヌクレオチド程度のｄｓＲＮＡ切断産物を生成することが知られている。また、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ属細菌のＲＮａｓｅＩＩＩは、ＲＮＡ干渉に適した長さのｄｓＲＮＡ切断産物を調製するのに適している。さらに本発明においては、上記ＲＮａｓｅＩＩＩと同等以上の活性を有する誘導体も上記タンパク質に含まれる。【００２２】
本明細書においてｄｓＲＮＡとは、二本鎖の構造を有するＲＮＡのことであり、２つのＲＮＡがハイブリダイズしたＲＮＡ、１つのＲＮＡが分子内で二本鎖構造を形成してもよい。特に限定はされないが、ＲＮＡ干渉の対象となる遺伝子から転写されたスプライシング前のＲＮＡあるいはスプライシング後のＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の全長あるいはその一部と、これらに相補的な塩基配列を有するＲＮＡが２本鎖構造を形成したＲＮＡであってもよい。さらに、スプライシング前のＲＮＡあるいはスプライシング後のＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の全長あるいはその一部が分子内で形成した二本鎖構造であってもよい。【００２３】
本明細書においてｄｓＲＮＡの分解反応による生成物としては、例えばｓｉＲＮＡがある。当該ｓｉＲＮＡは、特に限定はされないが例えば、約１０〜１００塩基対の範囲の特定の長さのものが好適である。さらに、約１５〜４０塩基対の範囲の特定の長さ、特に２０〜３０塩基対の範囲の特定の長さのｄｓＲＮＡであっても良い。【００２４】
本明細書においてＲＮＡシャペロニンとは、ＲＮＡに直接あるいは間接的に作用し、ＲＮＡの立体構造などの高次構造、理化学的性質を変化させるもののことをいう。特に限定はされないが、例えばＲＮＡ結合タンパク質の１つであるＣｓｐＢ（コールドショックプロテイン）が好適に使用できる。さらに、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ  マリティマ）由来のＣｓｐＢが好適に使用できる。【００２５】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明のｓｉＲＮＡのスクリーニング方法
本発明の方法においてＤｉｃｅｒ、Ｄｉｃｅｒ誘導体、ＲＮａｓｅＩＩＩ、ＲＮａｓｅＩＩＩ誘導体、さらに必要に応じてＣｓｐＢなどのＲＮＡシャペロニンを添加したカクテル酵素で切断されたｄｓＲＮＡの配列を特定し、その配列からＲＮＡ断片（ｓｉＲＮＡ）をスクリーニングし、より効率的に、かつＲＮＡ干渉の効果の高いｓｉＲＮＡをスクリーニングすることを特徴とする。すなわち、特に限定はされないが例えば、本発明の方法により、ｄｓＲＮＡをＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有する酵素で切断した多数の配列を有するｓｉＲＮＡの混合物の中から、ＲＮＡ干渉に関して高い活性を有するｓｉＲＮＡの候補を絞り込むことが可能となる。例えば、Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｃｅｒで実際にｄｓＲＮＡを切断したものの中から有効な塩基配列をスクリーニングすることはヒトの細胞内におけるＲＮＡ干渉のメカニズムに非常に沿っており、当該塩基配列情報から調製したｓｉＲＮＡは、目的の遺伝子に対してノックダウン効率の高いものである。
本発明のスクリーニング方法により得られたｓｉＲＮＡの塩基配列は、ＲＮＡ干渉における有効性を決定することができる。有効性を決定する方法としては、特に限定はされないが、実際に細胞に導入してＲＮＡ干渉を確認する方法、過去に得られた塩基配列情報との比較、高次構造を予測するプログラムソフトにより得られる情報との比較などが例示される。
本発明のスクリーニング方法においては、特に限定はされないが、例えばヒト由来のＤｉｃｅｒ、実施例に例示されるようなＤｉｃｅｒ誘導体、あるいはＳｈｅｗａｎｅｌｌ属細菌由来のＲＮａｓｅＩＩＩ、当該ＲＮａｓｅＩＩＩ誘導体が利用できる。さらに、本発明のスクリーニング方法においては、ｄｓＲＮＡ分解酵素とＲＮＡシャペロニンとのカクテル酵素も好適に使用できる。【００２６】
本発明のスクリーニング方法の一態様としては、質量分析法を利用する方法が例示される。質量分析法での塩基配列の特定には、塩基配列の推定も包含される。
本発明において質量分析する対象となるｄｓＲＮＡ切断産物は、ＲＮＡ干渉に用いることができるものであれば特に限定はない。例えば、細胞中に存在する天然のＤｉｃｅｒあるいは当該Ｄｉｃｅｒの誘導体を用いて基質となるｄｓＲＮＡを切断したＲＮＡ断片及びｄｓＲＮＡを切断できる天然のＲＮａｓｅＩＩＩあるいは当該ＲＮａｓｅＩＩＩの誘導体を用いて基質となるｄｓＲＮＡを切断したＲＮＡ断片のいずれもが好適に使用できる。さらに上記切断処理においては、ｄｓＲＮＡ分解酵素にＲＮＡシャペロニンを添加してもよい。
上記酵素により処理したＲＮＡ断片は、従来の塩基配列から理論計算した全ての組み合わせのＲＮＡ断片の場合に比較して、生体内において実際に生成されるものと同等である可能性が高い。従って、ＲＮＡ干渉においてもその効果は十分期待されるものである。【００２７】
また、本発明においては、上記ＲＮＡ断片混合物を直接質量分析にかけてその塩基配列を解析できることから、非常に操作が簡便であり、数多くの目的遺伝子に有効なｓｉＲＮＡの塩基配列をハイスループットに同定する事ができる。
さらに、当該同定した塩基配列から、各酵素に特徴的な塩基配列単位を見いだすことができる。
本発明の方法に用いることができる質量分析方法は、上記ｓｉＲＮＡの塩基配列を解析できるものであれば特に限定はされない。本発明の方法において、例えば、ＴＯＦ−ＭＡＳＳ法、ＬＣ−ＭＡＳＳ法等が好適に使用できる。【００２８】
本発明の方法においては、質量分析法を用いることにより、生物的な選択圧が生じることなく、物理的に正確な解析が可能となる。【００２９】
本発明のスクリーニング方法の別態様としては、ＲＮＡリガーゼを利用するシークエンシング方法が例示される。以下に本明細書におけるリガーゼ法を示す。
本発明においてＲＮＡリガーゼによるライゲーションの対象となるｄｓＲＮＡ切断産物は、ＲＮＡ干渉に用いることができるものであれば特に限定はない。例えば、細胞中に存在する天然のＤｉｃｅｒあるいは当該Ｄｉｃｅｒの誘導体を用いて基質となるｄｓＲＮＡを切断したＲＮＡ断片及びｄｓＲＮＡを切断できる天然のＲＮａｓｅＩＩＩあるいは当該ＲＮａｓｅＩＩＩの誘導体を用いて基質となるｄｓＲＮＡを切断したＲＮＡ断片のいずれもが好適に使用できる。さらに上記切断処理においては、ｄｓＲＮＡ分解酵素にＲＮＡシャペロニンを添加してもよい。
上記酵素により処理したＲＮＡ断片は、従来の塩基配列から理論計算した全ての組み合わせのＲＮＡ断片の場合に比較して、生体内において実際に生成されるものと同等である可能性が高い。従って、ＲＮＡ干渉においてもその効果は十分期待されるものである。【００３０】
また、本発明においては、上記ＲＮＡ断片を一本鎖にしたのち、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の界面活性剤の存在下でＲＮＡリガーゼで連結する。得られた一本鎖のＲＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに変換しその塩基配列を解析することで、酵素により切断されたＲＮＡ断片単位で塩基配列を同定することができる。当該塩基配列を解析することによって、各酵素に特徴的な塩基配列単位を見いだすことができる。
さらに、上記ｄｓＲＮＡ切断産物をそのままライゲーションしてもよい。【００３１】
本発明の方法に用いることができるＲＮＡリガーゼは、上記ｓｉＲＮＡを効率よく連結でき、その後の塩基配列を解析できるものであれば特に限定はされない。本発明の方法において、例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ等が好適に使用できる。【００３２】
本発明の方法においては、ＲＮＡリガーゼを用いることにより、複数のｄｓＲＮＡ切断産物の塩基配列を直接解析できる。【００３３】
本発明のスクリーニング方法においては、ｄｓＲＮＡ分解酵素によるｄｓＲＮＡ切断産物の解析方法として、選択圧が生じることなく解析できる質量分析法と、塩基配列情報を直接的に解析できるＲＮＡリガーゼ法を組み合わせることで、さらに詳細で精度の高いｄｓＲＮＡ切断産物の解析が可能となる。【００３４】
さらに、本発明の方法において、ＲＮＡの高次構造解析方法を組み合わせることができる。ＲＮＡの高次構造解析方法は、２次構造や３次構造などが解析、予測が可能な方法であれば何でもよい。特に限定はされないが、例えばＺｕｋｅｒ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｚｕｋｅｒ  Ｍ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８９年  ｖｏｌ．２４４  ｐ．４８−５２）や市販のプログラムソフトウエアなどの公知の方法が利用できる。ＲＮＡは多様な構造をとることから、ｄｓＲＮＡ中には、両ＲＮＡ鎖のセンス、アンチセンスの関係から形成される二本鎖構造のみならず、それぞれのＲＮＡ鎖が分子内で高次構造をとることにより生じる分子内二本鎖構造などが存在している可能性がある。従って、ＲＮＡの高次構造に関する情報を組み合わせることで、ｄｓＲＮＡ分解酵素の基質となるｄｓＲＮＡについて、より効果的なｓｉＲＮＡのスクリーニングが可能となる。【００３５】
以上のように本発明のスクリーニング方法で得られた各酵素に特徴的な塩基配列単位の情報は、データベースとして使用できる。さらに当該塩基配列単位あるいは塩基配列の特徴とＲＮＡ干渉能の効率データ及び／又はＲＮＡの高次構造に関する情報を組み合わすことにより、目的遺伝子に応じた最適なｓｉＲＮＡの予測作業を早く正確に行う方法ならびに最適な酵素の選択方法を提供する事ができる。
また、本発明の方法で得られた塩基配列情報とＲＮＡ干渉能は、データベース化できることから、新規酵素のＲＮＡ干渉への利用性を評価することができる。【００３６】
（２）本発明の塩基配列データベースを含むｓｉＲＮＡ構築方法ならびに装置
本発明の塩基配列データベースを含むｓｉＲＮＡ構築方法ならびに装置は、上記（１）記載の方法により得られた塩基配列情報を蓄積したデータベースを使用することなどにより、（１）記載の方法により得られた塩基配列情報と目的の遺伝子の塩基配列を比較することを特徴とする。上記（１）の方法で得られた塩基配列は、プログラムソフトウエアでのみ予測された塩基配列に比べて、実際に生体内で生成されるｓｉＲＮＡの塩基配列と同等もしくは近いものであると考えられる。従って、これらの塩基配列情報を蓄積したデータベースはｓｉＲＮＡの構築や構築する装置において有用である。このデータベースは、（１）記載の方法、例えば質量分析方法及び／又はＲＮＡリガーゼ法で解析された塩基配列情報を蓄積したものである。さらに、使用する酵素と得られるｓｉＲＮＡの塩基配列の情報、各酵素に共通のｓｉＲＮＡの塩基配列情報、さらには各酵素特異的なｓｉＲＮＡの塩基配列情報を含んでいてもよい。
本発明においては、上記塩基配列情報は、当該塩基配列を有するｓｉＲＮＡのＲＮＡ干渉能に関する情報を含んでいてもよい。また、上記塩基配列情報は、ＲＮＡの高次構造に関する情報を含むこともできる。ＲＮＡの高次構造に関する情報を組み合わせることで、ｄｓＲＮＡ分解酵素の基質となるｄｓＲＮＡについての１次構造のみならず高次構造を加味した解析が可能となる。【００３７】
すなわち、本発明のｓｉＲＮＡの構築方法は、
（ｉ）ＲＮＡ干渉の目的とする遺伝子の塩基配列に関する情報を準備するステップ、
（ｉｉ）（１）に記載のｓｉＲＮＡのスクリーニング方法で得られた塩基配列情報を保持した塩基配列データベースを準備するステップ、
（ｉｉｉ）前記塩基配列データベース中の塩基配列と前記準備した塩基配列を比較し、ｓｉＲＮＡ候補の塩基配列を選択するステップ、
を含むｓｉＲＮＡ構築方法であってもよい。塩基配列に基づくＲＮＡ干渉能及び／又はＲＮＡの高次構造に関する情報を含んでいる上記塩基配列データベースも該構築方法に好適に使用できる。【００３８】
また、本発明のｓｉＲＮＡを構築するための装置は、
（ｉ）ＲＮＡ干渉の目的とする遺伝子の塩基配列に関する情報を入力する手段、
（ｉｉ）（１）に記載のｓｉＲＮＡのスクリーニング方法で得られた塩基配列情報を保持した塩基配列データベース、
（ｉｉｉ）前記塩基配列データベース中の塩基配列と入力された塩基配列を比較し、ｓｉＲＮＡ候補の塩基配列を提示する手段
を備えることを特徴とするｓｉＲＮＡ構築装置である。塩基配列に基づくＲＮＡ干渉能及び／又はＲＮＡの高次構造に関する情報を含んでいる上記塩基配列データベースも該構築装置に好適に使用できる。【００３９】
また、これらの情報の蓄積したデータベースは、使用する酵素ごとに特徴づけることができる。さらに本発明の塩基配列情報データベースを用いることにより、ＲＮＡ干渉のターゲットとなる遺伝子についてその塩基配列からどの酵素を用いて調製したｓｉＲＮＡが効率よくＲＮＡ干渉できるかということが予想でき、使用すべき酵素の選択において有効である。【００４０】
すなわち、本発明のｓｉＲＮＡ構築方法は、目的とする遺伝子の塩基配列的特徴からＲＮＡ干渉に好適なｓｉＲＮＡの塩基配列ならびに使用すべき酵素を選択することができる。使用者は、当該ｓｉＲＮＡの塩基配列に基づき化学合成してもよいし、選択された酵素を用いて目的のｓｉＲＮＡを酵素的に調製してもよい。【００４１】
また、本発明のｓｉＲＮＡ構築装置は、目的の遺伝子の塩基配列を入力することにより、その塩基配列の特徴からＲＮＡ干渉に好適なｓｉＲＮＡの塩基配列ならびに使用すべき酵素について出力することができる。使用者は、当該ｓｉＲＮＡの塩基配列に基づき化学合成してもよいし、出力された酵素を用いて目的のｓｉＲＮＡを酵素化学的に調製してもよい。
さらに、新規のｄｓＲＮＡ分解活性を有するポリペプチドについて、上記（１）記載の方法で該酵素の特徴的な塩基配列切断パターンを解析し、その結果を本発明の装置に入力することにより、ＲＮＡ干渉に適した酵素であるかどうかを判断することができる。
【実施例】
【００４２】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
また、本明細書に記載の操作のうち、プラスミドの調製、制限酵素消化などの基本的な操作については２００１年、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー  クローニング：ア  ラボラトリー  マニュアル第３版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．）に記載の方法によった。【００４３】
参考例１  ｈＤｉ−Ｒの調製
Ｄｉｃｅｒ変異体酵素液の調製を、以下の通り行った。配列表の配列番号１記載のヒト由来Ｄｉｃｅｒ  アミノ酸配列のＮ末端側よりアミノ酸１２７１〜１９２４（塩基番号３８１１〜５７７２）、Ｐｅｒｆｅｃｔ  ＤＢ配列、Ｈｉｓ  ｔａｇ配列、並びにＦａｃｔｏｒ  Ｘａ配列よりなるポリペプチドを発現させるため、以下のようにして発現ベクターを構築した。
まず、ジーンバンク登録Ｎｏ．ＡＢ０２８４４９で公開されている塩基配列より、配列表の配列番号２及び３記載の塩基配列を有する合成プライマー１及び２をＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマー１は、制限酵素ＫｐｎＩの認識配列を塩基番号９〜１４に、さらにヒト由来Ｄｉｃｅｒのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸番号１２７１〜１２７７に相当する塩基配列を塩基番号１６〜３６にもつ合成ＤＮＡである。また、合成プライマー２は、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を塩基番号９〜１４に、さらにヒト由来Ｄｉｃｅｒのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸番号１９１９〜１９２４に相当する塩基配列を塩基番号１８〜３６に持つ。【００４４】
上記合成プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。
すなわち、鋳型ＤＮＡ（ヒトｃＤＮＡライブラリー、Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｓ、タカラバイオ社製）２μｌ、５μｌの１０×ＬＡ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）、５μｌのｄＮＴＰ混合液（タカラバイオ社製）、１０ｐｍｏｌの合成プライマー１、１０ｐｍｏｌの合成プライマー２、０．５ＵのＴａｋａｒａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を５０μｌとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰ（タカラバイオ社製）にセットし、９４℃  １分、５５℃  １分、７２℃  ３分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。【００４５】
反応終了後、該反応液５μｌを１．０％アガロースゲル電気泳動に供した。確認された目的の約２ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを電気泳動ゲルより回収・精製し、エタノール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを５μｌの滅菌水に懸濁し、制限酵素ＫｐｎＩ（タカラバイオ社製）及び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製）で２重消化し、１．０％アガロース電気泳動によりそのＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化物を抽出精製し、ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【００４６】
次に国際公開ＷＯ９９／２７１１７号パンフレットの実施例１〜６記載の方法に従い、ｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２ベクターを調製した。
調製後ｐＣｏｌｄ０８ベクターを上記ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片を調製した時に用いたのと同じ制限酵素で切断し、末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液２０μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）上で生育させた。【００４７】
目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドは、シークエンシングすることにより確認し、この組み換えプラスミドをｐＣｏｌｄ０８  ｈＤｉ−Ｒとした。当該プラスミドは、ｐｌａｓｍｉｄ  ｐＣｏｌｄ０８  ｈＤｉ−Ｒと命名、表示され、平成１５年８月１１日（原寄託日）より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＦＥＲＭ  ＢＰ−１００７４として寄託されている。このｐＣｏｌｄ０８  ｈＤｉ−Ｒは、ヒト由来Ｄｉｃｅｒ  アミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸番号１２７１〜１９２４のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むプラスミドである。【００４８】
上記で調製したｐＣｏｌｄ０８  ｈＤｉ−Ｒを用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）上で生育させた。生育したコロニーを２．５ｍｌのＬＢ液体培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）に植菌し、３７℃で一晩培養した。この一部を１００ｍｌの同ＬＢ培地に植菌し、３７℃で対数増殖期まで培養した。前記培養後、１５℃に保温したインキュベーター内で１０分間振とうした後、ＩＰＴＧを終濃度１．０ｍＭになるように添加し、そのまま１５℃で２４時間培養して発現誘導させた。その後菌体を遠心分離により集め、５ｍｌの細胞破砕溶液［５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ（トライトン）Ｘ−１００、１ｍＭ  ジチオスレイトール、２ｍＭ  フェニルメチルスルフォニルフルオライド］に再懸濁した。超音波破砕により菌体を破砕し、遠心分離（１１，０００ｒｐｍ  ２０分）により上清の抽出液と沈殿とに分離した。【００４９】
上記上清の抽出液  約５ｍｌを用いてさらにニッケルカラムによる精製を以下のように行なった。
すなわち、樹脂容積にして１ｍｌ分のＮｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅ（キアゲン社製）にｂｕｆｆｅｒＡ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  ジチオスレイトール、０．１％トライトンＸ−１００］を１０ｍｌ添加し、混和後、１，５００  ｒｐｍで数分間遠心し、上清を廃棄して、約１ｍｌの樹脂を回収した。菌体破砕液より調製した約５ｍｌの上清を添加し、４℃で約１時間、ロータリーシェイカーで穏やかに混和した。その後、この目的タンパク質の吸着した樹脂をφ１５ｍｍのカラムに充填し、５ｍｌのｂｕｆｆｅｒＡで２回洗浄した。次に５ｍｌのｂｕｆｆｅｒＢ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  ジチオスレイトール、０．１％トライトンＸ−１００、４０ｍＭ  イミダゾール］で樹脂を洗浄後、５ｍｌのｂｕｆｆｅｒＣ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、８００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  ジチオスレイトール、０．１％トライトンＸ−１００、４０ｍＭ  イミダゾール］、続いて５ｍｌのｂｕｆｆｅｒＢで洗浄を行い目的以外の不要タンパク質の除去を行った。【００５０】
洗浄後、３ｍｌのｂｕｆｆｅｒＤ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  ジチオスレイトール、０．１％トライトンＸ−１００、１００ｍＭ  イミダゾール］で溶出操作を行った。次に、５００ｍｌのｂｕｆｆｅｒＥ［５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％トリトンＸ−１００、１ｍＭ  ジチオスレイトール］で透析を行ない、その後、セントリコン（アミコン社製）を用いて約１０倍まで濃縮を行なった。この精製濃縮サンプルの一部について１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、分子量約７６，８００のところに目的タンパク質のバンドが確認された。さらに、当該サンプルについてＡｎｔｉ  Ｈｉｓ  ＨＲＰ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（キアゲン社製）を用い、その添付プロトコルに従って抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウエスタンブロッティング検出を行なったところ、目的のタンパク質バンドが発色検出された。以下、このヒト由来Ｄｉｃｅｒ  ＲＮａｓｅＩＩＩドメインタンパク質をｈＤｉ−Ｒと称する。【００５１】
参考例２  ｈＤｉ−ＡＳＩの調製
（１）発現ベクターの構築
配列表の配列番号１記載のヒト由来Ｄｉｃｅｒ  アミノ酸配列のＮ末端側よりアミノ酸６７９〜１９２４（塩基番号２０３５〜５７７２）、Ｐｅｒｆｅｃｔ  ＤＢ配列、Ｈｉｓ  ｔａｇ配列、並びにＦａｃｔｏｒ  Ｘａ配列よりなるポリペプチドを発現させるため、以下のようにして発現ベクターを構築した。
まず、ジーンバンク登録Ｎｏ．ＡＢ０２８４４９で公開されている塩基配列より、配列表の配列番号４及び５記載の塩基配列を有する合成プライマー３及び４をＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマー５は、制限酵素ＫｐｎＩの認識配列を塩基番号９〜１４に、さらにヒト由来Ｄｉｃｅｒのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸番号６７９〜６８５に相当する塩基配列を塩基番号１６〜３６にもつ合成ＤＮＡである。また、合成プライマー６は、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を塩基番号９〜１４に、さらにヒト由来Ｄｉｃｅｒのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸番号１９１９〜１９２４に相当する塩基配列を塩基番号１８〜３５にもつ。【００５２】
上記合成プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。
すなわち、鋳型ＤＮＡ（ヒトｃＤＮＡライブラリー、Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｓ、タカラバイオ社製）２μｌ、５μｌの１０×ＬＡ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）、５μｌのｄＮＴＰ混合液（タカラバイオ社製）、１０ｐｍｏｌの合成プライマー５、１０ｐｍｏｌの合成プライマー６、０．５ＵのＴａｋａｒａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を５０μｌとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰ（タカラバイオ社製）にセットし、９４℃  １分、５５℃  １分、７２℃  ３分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。【００５３】
反応終了後、該反応液５μｌを１．０％アガロースゲル電気泳動に供した。確認された目的の約２．７ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを電気泳動ゲルより回収・精製し、エタノール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを５μｌの滅菌水に懸濁し、制限酵素ＫｐｎＩ（タカラバイオ社製）及び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製）で２重消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化物を抽出精製し、ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【００５４】
次に参考例１で調製したｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２ベクターを上記ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片を調製した時に用いたのと同じ制限酵素で切断し、末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液２０μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）上で生育させた。【００５５】
目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドは、シークエンシングすることにより確認し、この組み換えプラスミドをｐＣｏｌｄ０８  ｈＤｉ−ＡＳＩとした。当該プラスミドは、ｐｌａｓｍｉｄ  ｐＣｏｌｄ０８  ｈＤｉ−ＡＳＩと命名、表示され、平成１５年９月２６日（原寄託日）より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＦＥＲＭ  ＢＰ−１００７６として寄託されている。このｐＣｏｌｄ０８  ｈＤｉ−ＡＳＩは、ヒト由来Ｄｉｃｅｒ  アミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸番号６７９〜１９２４のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むプラスミドである。【００５６】
（２）発現、精製
上記（１）で調製したｐＣｏｌｄ０８  ｈＤｉ−ＡＳＩを用いて、大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）上で生育させた。生育したコロニーを２００ｍｌのＴＢ液体培地（ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ  ２．４ｇ、ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ４．８ｇ、ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ０．８ｍｌ、１７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、７２ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、アンピシリン１０ｍｇ）に植菌し、３７℃で一晩培養した。この培養液２００ｍｌ分を２０リットルのＴＢ液体培地（ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ  ２４０ｇ、ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ４８０ｇ、ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ８０ｍｌ、１７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、７２ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、アンピシリン１ｇ）を含む３０リットルジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製）に植菌後、１００ｒｐｍ、Ａｉｒ＝６リットル／ｍｉｎ、３７℃の条件で対数増殖期まで培養し、その後、１５℃に冷却した。冷却後にＩＰＴＧを終濃度１．０ｍＭになるように添加し、１００ｒｐｍ、Ａｉｒ＝６リットル／ｍｉｎ、１５℃の条件で２４時間培養して発現誘導させた。その後菌体を遠心分離により集め、２６ｇの湿菌体を得た。湿菌体の一部１２ｇを４８ｍｌの細胞破砕溶液［５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、プロテアーゼインヒビター（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ、ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ、ベーリンガーマンハイム社製）］に再懸濁した。超音波破砕により菌体を破砕し、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ  ３０分）により上清の抽出液と沈殿とに分離した。
上記上清の抽出液  約５６ｍｌを用いてさらにニッケルカラムによる精製を以下のように行なった。【００５７】
すなわち、樹脂容積にして１６ｍｌ分のＮｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅ（キアゲン社製）に細胞破砕溶液を５０ｍｌ添加し、混和後、１，５００ｒｐｍで数分間遠心し、上清を廃棄する操作を２回繰り返して、約８ｍｌの樹脂を回収した。菌体破砕液より調製した約５６ｍｌの上清を添加し、４℃で約１時間、ロータリーシェイカーで穏やかに混和した。その後、この目的タンパク質の吸着した樹脂をφ２０ｍｍのカラムに充填し、４０ｍｌの細胞破砕溶液［５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、プロテアーゼインヒビター（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ，ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ、ベーリンガーマンハイム社製）］で洗浄した。次に４０ｍｌのｂｕｆｆｅｒＡ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、１０％  グリセロール、２０ｍＭ  イミダゾール］で樹脂を洗浄後、４０ｍｌのｂｕｆｆｅｒＢ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、８００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、１０％  グリセロール、２０ｍＭ  イミダゾール］、続いて４０ｍｌのｂｕｆｆｅｒＡで洗浄を行い目的以外の不要タンパク質の除去を行った。
洗浄後、２４ｍｌのｂｕｆｆｅｒＣ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、１０％  グリセロール、１００ｍＭ  イミダゾール］で溶出操作を行った。次に、３００ｍｌのｂｕｆｆｅｒＤ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、１０％  グリセロール］に対して透析を行なった。【００５８】
透析後の酵素溶液をφ１０ｍｍのカラムに充填した１ｍｌのＨｅｐａｒｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂ（アマシャムバイオサイエンス社製）に添加し、５ｍｌのｂｕｆｆｅｒ  Ｄ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、１０％  グリセロール］で洗浄を行なった。次に、５ｍｌのｂｕｆｆｅｒ  Ｅ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、２００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、１０％  グリセロール］、その後、５ｍｌのｂｕｆｆｅｒ  Ｆ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、４００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、１０％  グリセロール］、５ｍｌのｂｕｆｆｅｒ  Ｇ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、８００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、１０％  グリセロール］でタンパク質の溶出を行なった。その後、各溶出サンプルについてＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ−１０（アミコン社製）を用いて約２０倍まで濃縮を行ない、約２５０μｌのタンパク質サンプルを得た。その一部について１０％ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動に供したところ、分子量約１４４，０００の位置に目的タンパク質のバンドが確認された。以下、このヒト由来Ｄｉｃｅｒ  ＰＡＺ＋ＲＮａｓｅＩＩＩドメインタンパク質をｈＤｉ−ＡＳＩとする。【００５９】
参考例３  ＣｓｐＢの調製
サーモトガ  マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のＣｓｐＢタンパク質の調製を以下のように行った。Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ  ｓｔｒａｉｎ  ＭＳＢ８を、ドイッチェ  ザムルンク  フォン  ミクロオルガニスメン  ウント  ツェルクルツレンＧｍｂＨより購入（ＤＳＭ３１０９）し、プロテイン  サイエンス（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第８巻、３９４−４０３頁（１９９９）記載の方法に従い遺伝子工学的に組換え体を製造した。【００６０】
実施例１  ＜ｔｏｆ  ｍａｓｓ解析＞
（１）ｄｓＲＮＡ切断産物の作製
まず、活性測定に用いた基質となるｄｓＲＮＡは、ＴａＫａＲａ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｔ７  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、その添付プロトコルに従って合成した。
すなわち、プラスミドｐＱＢＩ１２５（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．社製）に挿入されているＲｅｄ−ｓｈｉｆｔ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（以下ｒｓＧＦＰと称する）をコードする遺伝子（配列表の配列番号６）について、プラスミドｐＤＯＮ−ＡＩ（タカラバイオ社製）に挿入したｐＤＯＮ−ｒｓＧＦＰを鋳型とし、配列表の配列番号７記載のＴ７プロモーター配列をもった合成プライマーＢと配列表の配列番号８記載の合成プライマーＣを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を得た。次に得られた２本鎖ＤＮＡを鋳型として、ＲＮＡ合成反応により約７００ｂｐの長さのｄｓＲＮＡを調製した。【００６１】
参考例１で調製したｈＤｉ−Ｒを酵素として用いた場合、ｈＤｉ−Ｒ  ５μｌ、基質となるｄｓＲＮＡ（ｒｓＧＦＰをターゲットとして作製した約７００ｂｐ）５μｇ、１０ｍＭ  ＡＴＰ溶液  ５μｌ、５０ｍＭ  塩化マグネシウム溶液  ５μｌ、５×反応緩衝液Ｉ（２５０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ８．５）、５００ｍＭ  塩化ナトリウム、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５ｍＭ  ＤＴＴ）１０μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えて、容量を５０μｌとしたものを反応液とした。さらに市販のＤｉｃｅｒ（ＧＴＳ社製）の場合は、酵素液５μｌ、基質となるｄｓＲＮＡ  ５μｇ、１０ｍＭ  ＡＴＰ溶液  ５μｌ、５０ｍＭ  塩化マグネシウム溶液  ２．５μｌ、付属の反応緩衝液  ２０μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えて、容量を５０μｌとしたものを反応液とした。この他、ｓｉＲＮａｓｅＩＩＩ（タカラバイオ社製）も同様に用いた。参考例２記載のｈＤｉ−ＡＳＩを酵素として用いた場合、ｈＤｉ−ＡＳＩ  ５μｌ、基質となるｄｓＲＮＡ  ５μｇ、５×反応緩衝液ＩＩ（１００ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ８．５）、７５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１２．５ｍＭ  塩化マグネシウム溶液  ５μｌ）１０μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えて、容量を５０μｌとしたものを反応液とした。参考例３記載のＣｓｐＢタンパク質を添加する場合には、上記の各反応液に終濃度で９．２ｎｇ／μｌになるように添加した。【００６２】
以上の反応液を調製し、３７℃で１８時間反応後、３μｌを１５％ポリアクリルアミド電気泳動に供し、エチジウムブロマイドによる染色を行い、分解産物を確認したところ、各サンプルともに約２１ｍｅｒの分解産物が確認された。その後、等量の５Ｍ酢酸アンモニウムと４倍量のエタノールを添加し、室温放置後、１４，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心にて沈殿を回収した。１００μｌの８０％エタノールを加えて、１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心して沈殿を洗浄し、さらに同様に８０％エタノールを加えた後、遠心して沈殿を洗浄した。減圧乾燥後、この沈殿を１０μｌの注射用水（大塚製薬）で懸濁し、ＯＤ２６０ｎｍを測定することでＤＮＡ濃度を測定したところ、ｈＤｉ−Ｒ  ６１ｎｇ／μｌ、ｈＤｉ−ＲにＣｓｐＢを添加したもの  １１４ｎｇ／μｌ、市販のＤｉｃｅｒの場合８１ｎｇ／μｌであった。【００６３】
（２）ｔｏｆ  ｍａｓｓによる測定
ｔｏｆ  ｍａｓｓ（製品名：Ａｕｔｏ  ＦＬＥＸ（ＢＲＵＫＥＲ  ＤＡＬＴＯＮＩＣＳ社製））へ供するサンプルは、以下のように作製した。
５０％  ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏに溶かしたｍａｔｒｉｘ  ３ＨＰＡ（３−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｉｃｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ、ＢＲＵＫＥＲ  ＤＡＬＴＯＮＩＣＳ社製）５０ｍｇ／ｍｌと１／１０量の水に溶かしたＡＨＣ（ｄｉ−Ａｍｍｏｎｉｕｍｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｃｉｔｒａｔｅ（１００ｍｇ／ｍｌ）１μｌをサンプルの数だけ４００μｍアンカー（ＭＴＰ  Ａｎｃｈｏｒ  Ｃｈｉｐ  ４００／３８４  Ｔ  Ｆ、ＢＲＵＫＥＲ  ＤＡＬＴＯＮＩＣＳ社製）にアプライし、約１分間、減圧して乾燥させた。その上に上記（１）で調製したサンプル１０ｐｍｏｌ分（約１μｌ）をアプライし、さらに約１分間、減圧して乾燥させた。分子量スタンダード（スタンダード名：Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｓｔａｎｄａｒｄ、ＢＲＵＫＥＲ  ＤＡＬＴＯＮＩＣＳ社製）、塩基配列；（ＡＣＧＴ）４  １６ｍｅｒ  ＭＷ＝３６４５．４、（ＡＣＧＴ）５  ２０ｍｅｒ  ＭＷ＝６１１７．０、（ＡＧＣＴ）７ＡＣ  ３０ｍｅｒ  ＭＷ＝９１９１の混合物）も上記と同様に処理した。【００６４】
Ａｕｔｏ  ＦＬＥＸ（ＢＲＵＫＥＲ  ＤＡＬＴＯＮＩＣＳ社製）のトレイ上に４００μｍアンカーをセットし、測定パラメータをレーザーパワー＝５０％、ｍａｓｓ  ｒａｎｇｅを２０００から１６２８０に指定した。まず分子量スタンダードから測定し、キャリブレーション操作を行なった。スタンダード測定終了後、サンプル測定操作を行ったところ、数１０種類のピークを検出し、そこから推測される分子量を算出した。マススペクトルを図１に示す。
なお、この操作により検出されるピークは二本鎖のＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が解離してできる一本鎖ＲＮＡ由来のものである。【００６５】
（３）分子量とリンクした塩基配列表の作成
ターゲットとして用いたｒｓＧＦＰの塩基配列（７１８ｂｐ）から、一本鎖ＲＮＡの形で２１ｍｅｒ単位の長さで考えられる全ての塩基配列についての分子量の表を作成した。これの一部を表１に示す。表中、塩基番号は、配列表の配列番号６記載の塩基番号を示す。【００６６】
【表１】
2005095647.tif 000002
【００６７】
（４）分解産物の塩基配列の特定
実施例１−（２）で測定したｔｏｆ  ｍａｓｓで得られたピーク分子量を実施例１−（３）で計算により算出された分子量と比較することで、ｔｏｆ  ｍａｓｓで得られた各ピーク分子量に相当する塩基配列が決定できた。
すなわち、この塩基配列が（１）のＤｉｃｅｒ変異体（ｈＤｉ−Ｒ）及び市販ＤｉｃｅｒによるｄｓＲＮＡ切断産物中に含まれていると考えられる。
従って、Ｔｏｆ  ｍａｓｓ解析を行なうことでｓｉＲＮＡ混合物中の特定のｓｉＲＮＡ塩基配列を推測することができ、どのような塩基配列のｓｉＲＮＡが存在するのか確認することができた。【００６８】
（５）同定されたｓｉＲＮＡの合成及びＲＮＡ干渉への有効性の検討
上記実施例１−（４）で特定された塩基配列のＲＮＡ干渉における有効性を確認するために、決定された塩基配列から二本鎖ＲＮＡを化学合成した。
対照として、配列表の配列番号９、１０記載の合成オリゴヌクレオチドより作成したｓｉＲＮＡを用いた。ＲＮＡ干渉は以下のようにして検討した。
すなわち、ｓｉＲＮＡ導入を行なう２４時間前に２９３細胞を、１０％  ＦＢＳおよび１％  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＤ−ＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ社製）で適当量（ｃｅｌｌ数：１．５×１０５）を２４ｗｅｌｌ穴プレートにまき、一晩ＣＯ２インキュベーター内で培養した。この培養細胞が約９５％コンフレントになった時点で、４９μｌの無血清培地に１μｌのＧｅｎｅｊｕｉｃｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラバイオ社製）を加え、激しく撹拌した。室温で５分間放置し、０．３μｇのｐＱＢＩ２５（タカラバイオ社製）を加えて、穏やかに混和し、５分間室温で放置した。
同時に、別チューブに４７μｌの無血清培地に３μｌのＲｉｂｏｊｕｉｃｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラバイオ社製）を加えたものを用意し、激しく撹拌した。室温で５分間放置し、上記ｓｉＲＮＡを５５．６ｎｇを加えて穏やかに混和し、５分間室温で放置した。
このように調製した２種類の溶液を、Ｗｅｌｌ中の１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を２５０μｌになるように添加したものに滴下し、Ｗｅｌｌ内の溶液が均一になるように穏やかに混和を行なった。またコントロールとして、ベクター（ＤＮＡ）のみを添加したもの、また滅菌水のみを加えたものも同時に行なった。その後ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。この細胞をＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（ベクトン・ディッキンソン社製）を用いたフローサイトメトリーに供し、ベクター（ＤＮＡ）のみを導入したものに対するＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ溶液を導入した場合のｒｓＧＦＰ発現の阻害効果を測定した。【００６９】
その結果、実施例１−（４）で得られた情報に基づき合成した二本鎖ＲＮＡに、ｒｓＧＦＰ発現阻害活性が確認できた。
以上のことから、本発明の方法は、効率のよい、しかもＲＮＡ干渉効果の高いｓｉＲＮＡ調製に有用であることが確認できた。【００７０】
実施例２  ＜ＲＮＡリガーゼ解析＞
（１）ｄｓＲＮＡ切断産物の作製
活性測定に用いた基質となるｄｓＲＮＡとｄｓＲＮＡ分解酵素は、実施例１−（１）で使用したものと同様のものを用いた。【００７１】
ｈＤｉ−Ｒを酵素として用いた場合、酵素液２０μｌ、基質となるｄｓＲＮＡ  ２０μｇ、１０ｍＭ  ＡＴＰ溶液  ２０μｌ、５０ｍＭ  塩化マグネシウム溶液  ２０μｌ、５×反応緩衝液Ｉ  ４０μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えて、容量を２００μｌとしたものを反応液とした。
またｈＤｉ−ＡＳＩを酵素として用いた場合、酵素液  ２０μｌ、基質となるｄｓＲＮＡ  ２０μｇ、５×反応緩衝液ＩＩ  ４０μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えて、全量を２００μｌとしたものを反応液とした。
さらに市販のＤｉｃｅｒ（ＧＴＳ社製）の場合は、酵素液２０μｌ、基質となるｄｓＲＮＡ  ２０μｇ、１０ｍＭ  ＡＴＰ溶液  ２０μｌ、５０ｍＭ  塩化マグネシウム溶液  １０μｌ、付属の反応緩衝液  ８０μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えて、容量を２００μｌとしたものを反応液とした。ＣｓｐＢタンパク質を添加する場合には、上記の各反応液に終濃度で９．２ｎｇ／μｌになるように添加した。【００７２】
以上の反応液を調製し、３７℃で１８時間反応後、全量を１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイドによる染色を行い約２１ｍｅｒのバンドを切り出した。切り出したゲル片を各１ｍｌのＴＥ緩衝液に浸し、室温で６時間振とうした後、１００００ｒｐｍ、１０分間の遠心により抽出液を回収した。その後、等量の５Ｍ酢酸アンモニウムと４倍量のエタノールを添加し、−８０℃で３０分間静置した後、１４，０００ｒｐｍ、１５分間の遠心にて沈殿を回収した。８０％エタノールを加えて、１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心して沈殿を洗浄した後、減圧乾燥し、この沈殿を１６μｌの注射用水（大塚製薬）で懸濁した。【００７３】
（２）Ｔ４リガーゼ反応、ｃＤＮＡライブラリーの作製及び塩基配列解析
上記実施例２−（１）ので調製したｄｓＲＮＡ切断産物全量を１００℃、５分間加熱後、氷中で急冷し、１０×反応緩衝液５μｌ、０．１％  ＢＳＡ  ３μｌ、５０％ＰＥＧ＃６０００  ２５μｌ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ（タカラバイオ社製）１μｌを添加して１５℃で１６時間静置した。１５０μｌの注射用水で希釈した後、等量の５Ｍ酢酸アンモニウムと４倍量のエタノールを添加し、−８０℃で３０分間静置した。１４，０００ｒｐｍ、１５分間の遠心にて沈殿を回収した後、８０％エタノールを加えて、１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心して沈殿を洗浄した。この沈殿を減圧乾燥し、１１μｌのジエチルピロカーボネート処理水で懸濁した。これを６５℃、５分間加熱後、氷中で急冷したのち、ｃＤＮＡ合成反応の鋳型に用いた。【００７４】
２本鎖ｃＤＮＡ合成反応および末端平滑化はｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用い、添付プロトコルに従って行った。
得られたｃＤＮＡ全量をｐＵＣ１１９（タカラバイオ社製）のＳｍａＩサイトにＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結した後、大腸菌ＪＭ１０９（タカラバイオ社製）を形質転換した。この組換え体からプラスミドを調製し、常法により塩基配列の解析を行った。【００７５】
塩基配列解析の結果、酵素処理後のｄｓＲＮＡ切断産物の塩基配列が決定できた。その結果を表２〜４に示した。表中、配列塩基番号は配列表の配列番号６記載の塩基番号、長さは配列の長さを示す。
このことから、本発明の方法を用いて任意のｄｓＲＮＡ分解酵素のｄｓＲＮＡ分解物の特徴的な塩基配列を解析することができることを確認した。【００７６】
【表２】
2005095647.tif 000003
【表３】
2005095647.tif 000004
【表４】
2005095647.tif 000005
【００７７】
（３）同定されたｓｉＲＮＡの合成及びＲＮＡ干渉への有効性の検討
上記実施例２−（２）で同定された塩基配列に基づき、実施例１−（５）記載の方法で当該塩基配列を有するｓｉＲＮＡのＲＮＡ干渉における有効性を確認した。その結果、本発明の方法に従って検索、作製されたｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉に有効であることが示された。一方、ランダムな位置で設計したｓｉＲＮＡも調製し、実施例１−（５）記載の方法でＲＮＡ干渉における有効性を調べた。その結果、本発明の方法で選択したｓｉＲＮＡと比べてＲＮＡ干渉効果が低いｓｉＲＮＡが確認できた。
以上のことから、本発明の方法は、効率のよい、しかもＲＮＡ干渉効果の高いｓｉＲＮＡ調製に有用であることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明により効率のよい、しかもＲＮＡ干渉効果の高いｓｉＲＮＡのスクリーニング方法が提供される。
【配列表フリーテキスト】
【００７９】
SEQ ID NO:2; Synthetic primer 1 to amplify a gene encoding human dicer
SEQ ID NO:3; Synthetic primer 2 to amplify a gene encoding human dicer
SEQ ID NO:4; Synthetic primer 3 to amplify a gene encoding human dicer
SEQ ID NO:5; Synthetic primer 4 to amplify a gene encoding human dicer
SEQ ID NO:7; Synthetic primer B to amplify a gene encoding rsGFP
SEQ ID NO:8; Synthetic primer C to amplify a gene encoding rsGFP
SEQ ID NO:9; Synthetic oligonucleotide for RNAi
SEQ ID NO:10; Synthetic oligonucleotide for RNAi
【図１】
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【配列表】
2005095647000001.app
【国際調査報告】
2005095647.tif 000007
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