(57)【要約】  エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）若しくはタベルネモンタナ・ディバリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉に含まれるコノフィリンは、非腫瘍細胞をインスリン生成細胞へと分化誘導し、インスリンを生成させることができ、また、血糖値を低下させることができる。従って、本発明では、コノフィリンを含むエルウァタミア・ミクロフィラ若しくはタベルネモンタナ・ディバリカタの葉の乾燥物、及び抽出物を、糖尿病や肥満症を予防、改善するための健康食品や、血糖値を低下させるための健康食品として用いる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）の葉、前記葉の乾燥物、又は前記葉若しくは前記葉の乾燥物の抽出物を有効成分として含有する、糖尿病の予防若しくは改善をするための健康食品。
【請求項２】
さらに、肝細胞成長因子を含有することを特徴とする請求項１に記載の健康食品。
【請求項３】
さらに、ニコチンアミドを含有することを特徴とする請求項１又は２に記載の健康食品。
【請求項４】
エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）の葉、前記葉の乾燥物、又は前記葉若しくは前記葉の乾燥物の抽出物を有効成分として含有する、血糖値を低下させるための健康食品。
【請求項５】
エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）の葉、前記葉の乾燥物、又は前記葉若しくは前記葉の乾燥物の抽出物を原料として用いることを特徴とする糖尿病の予防若しくは改善をするための健康食品の製造方法。
【請求項６】
エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）の葉、前記葉の乾燥物、又は前記葉若しくは前記葉の乾燥物の抽出物を原料として用いることを特徴とする血糖値を低下させるための健康食品の製造方法。
【請求項７】
エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）の葉の乾燥物。
【請求項８】
エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）の葉又は前記葉の乾燥物の抽出物。
【請求項９】
タベルネモンタナ・ディバリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉、前記葉の乾燥物、又は前記葉若しくは前記葉の乾燥物の抽出物を有効成分として含有する、糖尿病の予防若しくは改善をするための健康食品。
【請求項１０】
さらに、肝細胞成長因子を含有することを特徴とする請求項９に記載の健康食品。
【請求項１１】
さらに、ニコチンアミドを含有することを特徴とする請求項９又は１０に記載の健康食品。
【請求項１２】
タベルネモンタナ・ディバリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉、前記葉の乾燥物、又は前記葉若しくは前記葉の乾燥物の抽出物を有効成分として含有する、血糖値を低下させるための健康食品。
【請求項１３】
タベルネモンタナ・ディバリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉、前記葉の乾燥物、又は前記葉若しくは前記葉の乾燥物の抽出物を原料として用いることを特徴とする糖尿病の予防若しくは改善をするための健康食品の製造方法。
【請求項１４】
タベルネモンタナ・ディバリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉、前記葉の乾燥物、又は前記葉若しくは前記葉の乾燥物の抽出物を原料として用いることを特徴とする血糖値を低下させるための健康食品の製造方法。
【請求項１５】
タベルネモンタナ・ディバリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉の乾燥物。
【請求項１６】
タベルネモンタナ・ディバリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉又は前記葉の乾燥物の抽出物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、健康食品及びその製造方法、並びにそれらの食品や製造方法において用いるエルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）若しくはタベルネモンタナ・ディバリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉の乾燥物又は抽出物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、代替医療を目的として天然由来の各種ハーブや漢方薬や、植物の花、葉、茎、根、又は皮などを利用した健康食品などのニーズが高まっている。現代、「栄養」や「おいしさ」が充分満たされた飽食の時代となり、人々の関心は、食べ物、食べ方を工夫して生活習慣病などを予防することに移ってきているからである。【０００３】
特に、病気の予防においては、医薬品より、サプリメント（栄養補助食品）や特定保健用食品などの健康食品などの方が副作用が少なく、より安全であるため、長期摂取も可能であり、一般に受け入れられやすい。また、複合疾患を抱える患者においては、薬の重複投与がリスクとなっており、一部又は全部の薬をやめて、健康食品を代替物として用いることが求められている。【０００４】
健康食品の中でも、特に生理系統の調節によって病気の予防に寄与する新食品を機能性食品と呼ぶが、これら健康食品は医薬品と異なり、疾病の予防、生体の調節手段として、主として健常な人が長期間食することを目的とする。【０００５】
ところで、キョウチクトウ科の植物であるエルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）の葉にはコノフィリンが含まれており、コノフィリンは抗腫瘍剤として有用であることが知られている（例えば、Drugs Exptl. Clin. Res. 22, 35-40, 1996参照）。また、コノフィリンが膵腺房腫瘍細胞株AR42J-B13細胞をインスリン生成細胞に誘導することが知られているが（第４５回日本糖尿病学会年次学術集会（東京；2002年5月18日に発行された要旨集の01-21）参照）、この条件下では誘導されたインスリン生成細胞は細胞外にインスリンを放出しない。【０００６】
また、コノフィリンが個体レベルで血糖値を低下させるかどうかは明らかではなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、糖尿病の予防若しくは改善するためのエルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）若しくはタベルネモンタナ・ディバリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉の乾燥物又は抽出物、並びに、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）若しくはタベルネモンタナ・ディバリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉、前記葉の乾燥物、又は前記葉若しくは前記葉の乾燥物の抽出物を有効成分として含有する健康食品、及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、クロロホルム１００Ｌを用いてエルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）の葉４ｋｇから抽出した油状物質（約１３０ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって分離・精製したコノフィリン（約５００ｍｇ）を、ストレプトゾトシンにより糖尿病を誘発させたラット個体に投与すると、血糖値が低下することを見出した。また、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）の葉の抽出物、及びサンユウカ（日本産のTabernaemontana divaricata）の葉の抽出物がコノフィリンと同様の薬効を示すことを見出した。このことから、これらの葉の抽出物中にコノフィリンの作用を阻害する阻害物質が含まれていないことが示唆された。さらに、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）の葉の抽出物を低濃度で使用する限り細胞毒性がないことが明らかになった。このようにして本発明を完成するに至った。なお、エルウァタミアとタベルネモンタナとは、同一の属であることが知られている（J. of Ethnopharmacology 10, 1-156, 1984参照）。本発明では、コノフィリンが天然物から得られたことを最大限に利用するものである。【０００９】
すなわち、本発明に係る健康食品は、糖尿病の予防若しくは改善をするためのものであって、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）若しくはタベルネモンタナ・ディバリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉、前記葉の乾燥物、又は前記葉若しくは前記葉の乾燥物の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。なお、前記健康食品は、糖尿病の予防若しくは改善をするために用いられるものである旨の表示を付したものである。【００１０】
また、本発明に係る健康食品は、血糖値を低下させるためのものであって、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）若しくはタベルネモンタナ・ディバリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉、前記葉の乾燥物、又は前記葉若しくは前記葉の乾燥物の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。なお、前記健康食品は、血糖値を低下させるために用いられるものである旨の表示を付したものである。【００１１】
なお、本発明に係る健康食品は、さらに肝細胞成長因子を含有することとしてもよいし、さらにニコチンアミドを含有することとしてもよい。【００１２】
本発明に係る製造方法は、糖尿病の予防若しくは改善をするための健康食品の製造方法であって、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）若しくはタベルネモンタナ・ディバリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉、前記葉の乾燥物、又は前記葉若しくは前記葉の乾燥物の抽出物を原料として用いることを特徴とする。【００１３】
また、本発明に係る製造方法は、血糖値を低下させるための健康食品の製造方法であって、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）若しくはタベルネモンタナ・ディバリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉、前記葉の乾燥物、又は前記葉若しくは前記葉の乾燥物の抽出物を原料として用いることを特徴とする。【００１４】
さらに、本発明には、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）若しくはタベルネモンタナ・ディバリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉の乾燥物や、前記葉又は前記葉の乾燥物の抽出物が含まれる。【００１５】
なお、上述の乾燥物には、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）若しくはタベルネモンタナ・ディバリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉をそのまま乾燥させたものや、前記葉を粉砕したものを乾燥させたものや、前記葉をそのまま乾燥させ、粉砕したものが含まれることとする。【００１６】
また、上述の抽出物とは、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）若しくはタベルネモンタナ・ディバリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉又はその乾燥物に溶媒を加え、葉又はその乾燥物に含まれる有効成分（特にコノフィリン）を溶媒中に溶出させた抽出液（葉の残渣を除去しても、しなくてもよい。また、濃縮したり、希釈したりしてもよい。）や、その抽出液中の溶媒を除去することにより得られる固形物を意味する。【００１７】
関連文献とのクロスリファレンス
なお、本願は、2004年4月14日付けで出願した日本国特願2004-118539号に基づく優先権を主張する。この文献を本明細書に援用する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の一実施例において、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）の葉がAR42J細胞に与える影響を示す図である。
【図２】本発明の一実施例において、コノフィリンがストレプトゾトシン投与ラットの血糖値に与える効果を示す図である。
【図３】本発明の一実施例において、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）の葉のメタノール抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより５つのフラクションに分画し、これらのフラクションに含まれる各成分の細胞毒性を調べた結果を示す図である。なお、図中の「○」はフラクション1の結果を、「□」はフラクション2の結果を、「×」はフラクション3の結果を、「△」はフラクション4の結果を、「＊」はフラクション5の結果をそれぞれ示す。
【図４】本発明の一実施例において、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）又はサンユウカ（日本産のTabernaemontana divaricata）の葉のメタノール抽出物がK-ras-NRK細胞に与える影響を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
上述のように、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）の葉に含まれるコノフィリンは、in vivoにおいて糖尿病を誘発させたラット個体の血糖値を低下させる作用を有し、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）の葉の抽出物がコノフィリンと同様の薬効を示すことから、コノフィリンを含有するエルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）の葉、前記葉の乾燥物、又は前記葉若しくは前記葉の乾燥物の抽出物を有効成分として含有する健康食品も血糖値を低下させることができると考えられる。また、同様にサンユウカ（日本産のTabernaemontana divaricata）の葉の抽出物もコノフィリンと同様の薬効を示すことから、コノフィリンを含有するサンユウカ（日本産のTabernaemontana divaricata）の葉、前記葉の乾燥物、又は前記葉若しくは前記葉の乾燥物の抽出物を有効成分として含有する健康食品も血糖値を低下させることができると考えられる。以上のことから、コノフィリンを含有するエルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）若しくはタベルネモンタナ・ディバリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉、前記葉の乾燥物、又は前記葉若しくは前記葉の乾燥物の抽出物を有効成分として含有する健康食品は、糖尿病（特に２型糖尿病）や肥満症の予防または改善に有用であると考えられる。一般に、医薬品による治療は必要ないが、放っておくと糖尿病や肥満症に罹患する可能性の高い人に対し、運動や食事制限等の指導は極めて難しい。しかし、こうした人々に対し、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）若しくはタベルネモンタナ・ディバリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉、前記葉の乾燥物、又は前記葉若しくは前記葉の乾燥物の抽出物を有効成分として含有する健康食品を与えることにより、運動や食事制限を施さないで、糖尿病や肥満症の予防や改善を行うことが可能になる。【００２０】
また、健康食品において、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）若しくはタベルネモンタナ・ディバリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉、前記葉の乾燥物、又は前記葉若しくは前記葉の乾燥物の抽出物を用いることにより、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）若しくはタベルネモンタナ・ディバリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉からの製造過程が煩雑で、かつ精製量が少ないとされるコノフィリンを有効に利用することが可能になる。【００２１】
＝＝健康食品の製造例＝＝
エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）若しくはタベルネモンタナ・ディバリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉の乾燥物は、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）若しくはタベルネモンタナ・ディバリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉又は粉砕したエルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）若しくはタベルネモンタナ・ディバリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉を、自然乾燥、凍結乾燥、温風乾燥などの方法によって乾燥することにより得ることができ、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）若しくはタベルネモンタナ・ディバリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉の乾燥粉末は、当該葉の乾燥物を粉砕することによって得ることができる。【００２２】
また、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）若しくはタベルネモンタナ・ディバリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉の抽出液は、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）若しくはタベルネモンタナ・ディバリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉又はその乾燥物に溶媒を加え、それらに含まれる有効成分を溶媒中に溶出させることにより得ることができる。前記溶媒としては、例えば、水、アルコール、酢酸エチル、クロロホルム、又は２種以上の混合溶媒を用いることができるが、水、エタノール、又はこれらの混合物を用いることが安全性の面から好ましい。なお、溶媒中への有効成分の溶出において、撹拌、粉砕、加熱などの二次的作用を加え、有効成分の溶出量の増加及び有効成分の溶出時間の短縮を図ることができる。本実施の形態においては、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）若しくはタベルネモンタナ・ディバリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉の抽出液から葉の残渣を除去せず、健康食品としてそのまま用いることとしているが、抽出液中の葉の残渣を濾過法又は遠心分離法により除去した抽出液を用いることとしてもよい。【００２３】
また、溶媒中へ有効成分を溶出させた抽出液から、その溶媒を蒸発させるか、あるいは乾燥させて除去することにより、固形物を得ることもできる。なお、抽出液の乾燥には、例えば、自然乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥などの方法を利用することができる。【００２４】
本発明に係る健康食品の使用形態としては、例えば、お茶のように乾燥葉をお湯に浸して抽出したもの、青汁のように水を加えてミキサーで粉砕したもの、漢方薬のように乾燥葉を煮出したもの、カプセル、錠剤、顆粒等の形状をしたサプリメント、チューインガム、アメ（キャンディ、ドロップなど）、ふりかけなどを挙げることができるが、これらに制限されるものではない。【００２５】
なお、本発明に係る健康食品の形状は、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）若しくはタベルネモンタナ・ディバリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉、前記葉の乾燥物、又は前記葉若しくは前記葉の乾燥物の抽出物を有効成分として含有するものであるが、膵内分泌細胞の前駆細胞から膵内分泌細胞へと分化を誘導する肝細胞成長因子（HGF：Hepatocyte Growth Factor）やニコチンアミドなどの他の物質が含まれていてもよい。それ以外には、糖尿病や肥満症の予防若しくは改善、血糖値の低下を損なわない物質、特に天然物又はそれに由来する物質が安全性の面から好ましく、例えば、デオキノジリマイジン、亜鉛、マグネシウム、クロム、ヒコリン酸クロム、抗酸化物質などを例示することができる。デオキノジリマイジンは、桑葉や茶葉に多く含まれており、でんぷんやショ糖をブドウ糖に分解するα−グルコシターゼの働きを抑制し、小腸からのブドウ糖の取り込みを抑制し、食後の血糖値の上昇を抑制することができる。また、亜鉛は、膵細胞のインスリンの生成や分泌を助けることができ、マグネシウム、クロム、ヒコリン酸クロムなどは、インスリンの感受性を高め、インスリンの働きを活性化させることができる。なお、抗酸化物質としては、例えば、ビタミンE、ビタミンC、β−カロチン、ポリフェノールなどを用いることができる。【００２６】
なお、本発明に係る健康食品は、最終的に、固形物、粉末、液状、液体状、クリーム状、ゲル状など、どんな形状であってもよい。また、本発明に係る健康食品は、基本的には健常人に投与することを目的とするが、この健康食品が有効である疾患を有する患者が、この健康食品を摂取してもよい。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例及び図を用いてより詳細に説明する。【００２８】
［実施例１］
クロロホルム１００Ｌを用いて、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla；タイのコンケン市で採取）の葉を６０℃で２時間乾燥させた乾燥物４ｋｇから抽出した油状物質（約１３０ｇ）を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（カラムに充填した約５００ｇのシリカゲルに５回流し、吸着物をクロロホルム：メタノールを ４０：１，２０：１の割合で含む溶液を順次用いて溶出した。）により分離し、K-Ras-NRK細胞の形態変化を誘導する活性画分を回収した。次に、この回収した活性画分を、ｎ−ヘキサン：酢酸エチルを１：２の割合で含む溶液，及び酢酸エチル溶液を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（約５００ｇのシリカゲルを使用）と、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル：クロロホルムを９：３：１，６：３：１の割合で含む溶液を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（約１５０ｇのシリカゲルを使用）によって分離し、活性画分を濃縮することによりコノフィリン（５００ｍｇ）を精製した。【００２９】
［実施例２］
本発明者らは、コノフィリンを添加した培養液でAR42J細胞（ATCC CRL 1492）を培養すると、当該細胞をインスリン生成細胞へと分化誘導することを見出している。そこで、Ervatamia microphyllaの抽出物がAR42J細胞をインスリン生成細胞へと分化誘導できるかどうかを調べた。なお、インスリン生成細胞の分化誘導とともに特徴的な細胞の形態変化が観察されるため、本実施例では分化誘導の指標としてAR42J細胞の形態変化を調べた。また、AR42J細胞の培養は、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM；日水製薬株式会社）を20 mM HEPES-NaOH存在下でpH7.4に調製した後ろ過滅菌し、0.6 g/l グルタミン (関東化学株式会社: Tokyo, Japan) 、0.2 g/l カナマイシン (Sigma Chemical Science; Sigma: St. Louis, MO, USA) 、100 unit/ml ペニシリンG (Sigma) 、5 mM NaHCO3、10％ ウシ胎児血清 (FBS; Sigma) を加えた培養液で行った。【００３０】
24 wellプラスチックプレート (Corning) に、AR42J細胞の懸濁液（4.0 × 105 cells/ml−培養液）を、1 wellあたり500 μlずつ (2 × 105 cells/well) 播種し、37 ℃、5% CO2の条件下で培養した。翌日、実施例１により精製したコノフィリンをメタノールで希釈した溶液（最終濃度0.1 μg（Ervatamia microphyllaの葉の乾燥物800 μgに相当）/ml）、Ervatamia microphyllaの葉の乾燥物の懸濁液（最終濃度30 μg/ml）を培養液に添加し、5％ CO2の条件下において37℃で3日間インキュベートした。なお、Ervatamia microphyllaの葉の乾燥物の懸濁液（ペースト状の液体）は、Ervatamia microphyllaの葉の乾燥物4.01 g に水60 ml を加えて、食品ミル（ミルサー；岩谷産業株式会社, Tokyo, Japan）で粉砕することにより得たものを用いた。【００３１】
３日後、培養液をエッペンドルフチューブに移し、PBS-（Ca2+及びMg2+を含んでいないリン酸塩緩衝液；8.0 g/l NaCl, 0.2g/l KCl, 0.916 g/l Na2HPO4, 0.2 g/l KH2PO4）200 μlで細胞を1回洗浄した後、新たなPBS- 200 μlを加え、生存した細胞の形態を観察し、顕微鏡に接続したカメラで150倍の倍率で写真を撮った。なお、コノフィリン及びErvatamia microphyllaの葉の抽出物を添加しない培養液で培養した細胞をコントロールとして用いた。これらの結果を図１に示す（コントロール；図１のＡ、コノフィリン溶液；図１のＢ、Ervatamia microphyllaの葉の乾燥物の懸濁液；図１のＣ）。【００３２】
図１に示すように、Ervatamia microphyllaの葉の乾燥物の懸濁液を添加したものは、コノフィリン溶液を添加したものと同様に、AR42J細胞の形を小さな丸い形態から平たく一部に突起のある形態に変化させること、すなわち、AR42J細胞をインスリン生成細胞へと分化誘導できることが明らかとなった。このことから、コノフィリンを精製しなくてもErvatamia microphyllaの葉を用いれば、細胞をインスリン生成細胞へと分化誘導できることが明らかとなった。【００３３】
また、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）の葉からコノフィリンを精製して使用するより、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）の葉を使用する方が、少ない葉の使用量でインスリン生成細胞への分化誘導を行うことができることがわかった。従って、コノフィリンを精製せず、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）の葉をそのまま用いても、インスリン生成細胞への分化誘導は阻害されないことが明らかになった。【００３４】
［実施例３］
生後一日齢のウィスター系ラット（静岡市のＳＬＣ社より購入）１０匹に、膵β細胞を破壊することによってインスリン産生を低下させ、その結果糖尿病を誘発させるストレプトゾトシン（和光純薬より購入、0.05 mM クエン酸緩衝液(pH4.5)に溶解）をそれぞれ85 μg/g−体重で腹腔内投与した。なお、ストレプトゾトシンを投与した日を０日と定義した。翌日（１日）より、５匹のラットに5 μg/g−体重で、実施例１により得られたコノフィリンの溶液（エタノール）を7日間毎日皮下注射し、随時血糖値を連日測定した。なお、対照群のラット５匹には同量の溶媒を投与した（コントロール）。その結果、図２に示すように、どのラットにおいても、ストレプトゾトシンを投与すると血糖値の著しい増加がみられたが、コノフィリンを投与したラット（●）においては、コントロール（○）に比べて明らかな血糖値の低下がみられ、コノフィリンの血糖値低下作用が示された（*: P<0.05, **P<0.01 vs コントロール）。【００３５】
このように、ラット個体においてコノフィリンの血糖値低下作用が確認された。従って、コノフィリンを含有するエルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）の葉又はその乾燥物をそのまま用いても、個体レベルにおいて血糖値を低下させることができると考えられる。この場合、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）の葉又はその乾燥物をそのまま用いることにより、少ない葉の使用量で血糖値を低下させることができると考えられる。【００３６】
［実施例４］
次に、コノフィリンを含む葉や抽出物を食料、飲料に利用するにあたり、Ervatamia葉の細胞毒性を調べた。【００３７】
エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）の葉5.0gをミキサーにて粉砕し、溶媒としてメタノールを加えて2時間撹拌し、葉に含まれる有効成分を溶媒中に溶出させて抽出液を作製した。その後、抽出液を吸引ろ過して固形物を取り除き、濃縮して乾燥させ、抽出物962.7mgを得た。得られた抽出物をメタノールに溶解させ、このメタノール溶液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、アセトン／トルエン（１：８）でアセトンの比率を上げて溶出し、その後溶媒をメタノール／クロロホルム（１：４）に変えてメタノールの比率（最終比率：メタノール１００％）を上げて溶出し、5つのフラクションに分画した。その後、5つのフラクションの溶液を濃縮して乾燥させ、各フラクションの溶液に含まれる成分を回収した。各フラクション中の成分をそれぞれメタノールに溶解させた後、1, 10, 100, 1000μg/mlの濃度でK-ras-NRK細胞（４×１０５個）培養液にそれぞれ添加し、24時間培養した後にトリパンブルー細胞外排出試験を行い、Ervatamia葉における各フラクションの細胞毒性を評価した。その結果を図３に示す。【００３８】
図３に示すように、フラクション3およびフラクション4を用いてK-ras-NRK細胞を高濃度（1000μg/ml）で処理すると、細胞死を顕著に引き起こすことが明らかになった。従って、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）の葉の抽出物を低濃度で使用する限り細胞毒性がないことが明らかになった。なお、他のフラクション（1, 2, 及び5）では細胞毒性はみられなかった。【００３９】
［実施例５］
コノフィリンは、K-ras-NRK細胞の形態変化を誘導することが知られている。そこで、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）の葉の抽出物がK-ras-NRK細胞の形態変化を誘導するかどうかを調べた。また、マレーシア産のTabernaemontana divaricataの葉には、コノフィリンが含まれていることが知られている（Org. Biomol. Chem. 1: 1292-1297, 2003）。そこで、日本産のTabernaemontana divaricataであるサンユウカの葉の抽出物もK-ras-NRK細胞の形態変化を誘導するかどうかを調べた。なお、各葉の抽出物は、実施例４に記載の方法と同様にメタノールで葉に含まれる有効成分を溶媒に溶出させ、その後、吸引ろ過して固形物を取り除いて濃縮して乾燥させ、得られた粉末をメタノールに溶解することにより調製した。【００４０】
24wellプラスチックプレートに、K-Ras NRK細胞の懸濁液（2.0×104cells/ml-培養液（5％ FBSを含むDMEMにグルタミン 0.6g/l、カナマイシン 0.2g/l、NaHCO3 2.25g/lを加えたもの））を1wellあたり500μlずつ（2.0×104cells/well）添加し、37 ℃、5% CO2の条件下で培養した。翌日、コノフィリン（最終濃度0.1μg/ml）、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）の葉の抽出物（最終濃度10μg/ml）、サンユウカの葉の抽出物（最終濃度10μg/ml）を培養液に添加し、5％ CO2の条件下において37℃で3日間インキュベートした。なお、コノフィリン、Ervatamia microphyllaの葉の抽出物、及びサンユウカの葉の抽出物を添加しない培養液で培養した細胞をコントロールとして用いた。その結果を図４に示す。【００４１】
図４に示すように、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）の葉の抽出物や、サンユウカの葉の抽出物で処理した細胞は、コノフィリンで処理した細胞と同様に形態の変化を示すことが明らかになった。このことは、これらの葉の抽出物中にコノフィリンの作用を阻害する阻害物質が含まれていないことを示唆する。従って、コノフィリンを精製しなくてもこれらの葉の抽出物等によりコノフィリンと同じ薬効を得ることができることが明らかになった。
【産業上の利用の可能性】
【００４２】
本発明によれば、糖尿病の予防若しくは改善するためのエルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）若しくはタベルネモンタナ・ディバリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉の乾燥物又は抽出物、並びに、エルウァタミア・ミクロフィラ（Ervatamia microphylla）若しくはタベルネモンタナ・ディバリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉、前記葉の乾燥物、又は前記葉若しくは前記葉の乾燥物の抽出物を有効成分として含有する健康食品、及びその製造方法を提供することができる。
【図２】
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【図３】
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【図１】
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【図４】
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【国際調査報告】
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