(57)【要約】本発明によれば、配列番号１若しくは２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、または配列番号１若しくは２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損した染色体ＤＮＡを有し、かつ有用物質を生産する能力を有する微生物、および該菌株を用いた有用物質の製造法、特にタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸および脂質からなる群より選ばれる有用物質の製造法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１若しくは２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、または配列番号１若しくは２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損した染色体ＤＮＡを有し、かつ有用物質を生産する能力を有する微生物。
【請求項２】
配列番号１または２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子が配列番号３または４で表される塩基配列を有する遺伝子である、請求項１記載の微生物。
【請求項３】
微生物が以下の［１］〜［５］から選ばれる方法によって有用物質を生産する能力が強化された微生物である、請求項１または２記載の微生物。
［１］有用物質の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和または解除する方法
［２］有用物質の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法
［３］有用物質の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
［４］有用物質の生合成経路から該有用物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化または遮断する方法
［５］野生型株に比べ、該有用物質のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法
【請求項４】
微生物がＥｒｗｉｎｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属またはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属に属する微生物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の
微生物。
【請求項５】
微生物がＥｒｗｉｎｉａ ｂｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｒｅｔｔｇｅｒｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄａｃｕｎｈａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｈａｚｄｉｎｏｐｈｉｌｕｍ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｖｙｚａｅおよびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｐｅｓｔｒｉｓからなる群より選ばれる微生物である請求項１〜４のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の微生物を培地に培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物から該有用物質を採取する、有用物質の製造法。
【請求項７】
有用物質がタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸および脂質からなる群より選ばれる有用物質である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、有用物質を生産する能力を有する微生物、および該微生物を用いた有用物質の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】  微生物を用いたアミノ酸等の有用物質の製造法はこれまで数多く報告されているが、そのほとんどは（１）有用物質の生合成酵素遺伝子の発現が強化された微生物、（２）該遺伝子の脱感作型変異遺伝子を有する微生物、または（３）有用物質の分解酵素遺伝子が破壊された微生物等を用いた製造法である（非特許文献１〜３）。
上記（１）〜（３）以外の微生物を用いた有用物質の製造法としては、増殖速度を低下させる活性を有する蛋白質をコードするｒｍｆ遺伝子を破壊したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを用いたリジンの製造法（特許文献１）などが知られている。しかしながら、一般的には間接的に有用物質の生合成の促進や分解の抑制に関与している遺伝子を特定することは困難である。【０００３】  多くの微生物では、その染色体ＤＮＡの全塩基配列が明らかになっている（非特許文献４）。また、相同組換え手法を用いて、微生物の染色体ＤＮＡ上にある特定の遺伝子または染色体ＤＮＡ上の領域を意図した通りに欠損させる方法は知られている（非特許文献５）。また染色体ＤＮＡの全塩基配列情報、および相同組換え手法を利用して微生物の染色体ＤＮＡ上の各遺伝子を網羅的に破壊した変異株ライブラリー、および２０ｋｂｐ程度の削除可能な染色体ＤＮＡ上の領域のそれぞれを網羅的に欠損させた変異株ライブラリーなども作製されている（非特許文献６および７）。【０００４】 Ｅ．ｃｏｌｉのｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｈｏｓｔ  ｆａｃｔｏｒ［ｉｈｆＡ（ｈｉｍＡ）遺伝子産物およびｉｈｆＢ（ｈｉｍＤ）遺伝子産物の複合体。以下、ｉｈｆＡＢ遺伝子産物複合体という］を構成する蛋白質のアミノ酸配列、および該蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列は既に知られている（非特許文献８）。また、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、ｉｈｆＡＢ遺伝子産物複合体が大腸菌染色体上の様々な部位に結合し、様々な遺伝子の転写制御を行っていることも知られている（非特許文献９）が、ｉｈｆＡＢ遺伝子産物複合体の活性と有用物質の生産性との関係は知られていない。
【特許文献１】特開２００２−３０６１９１号公報
【非特許文献１】ＡＤＶＡＮＣＥＳ  ＩＮ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，７９，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ社刊（２００３）
【非特許文献２】核酸発酵，講談社サイエンティフィク社刊（１９７６年）
【非特許文献３】Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９０，５２２（２０００）
【非特許文献４】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｔｄｂ／ｍｄｂ／ｍｄｂｃｏｍｐｌｅｔｅ．ｈｔｍｌ
【非特許文献５】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８０，２０６３（１９９８）
【非特許文献６】蛋白質  核酸  酵素、第４６巻、２３８６頁、２００１年
【非特許文献７】Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０，１０１８（２００２）
【非特許文献８】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７，１４５３（１９９７）
【非特許文献９】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８１，３２４６（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  本発明の目的は、有用物質の生産性が向上した微生物、および該微生物を用いた有用物質の製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】  本発明は、以下の（１）〜（７）に関する。
（１）配列番号１若しくは２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、または配列番号１若しくは２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損した染色体ＤＮＡを有し、かつ有用物質を生産する能力を有する微生物。
（２）配列番号１または２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子が配列番号３または４で表される塩基配列を有する遺伝子である、上記（１）の微生物。
（３）微生物が以下の［１］〜［５］から選ばれる方法によって有用物質を生産する能力が強化された微生物である、上記（１）または（２）の微生物。
［１］有用物質の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和または解除する方法
［２］有用物質の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法
［３］有用物質の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
［４］有用物質の生合成経路から該有用物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化または遮断する方法
［５］野生型株に比べ、該有用物質のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法
（４）微生物がＥｒｗｉｎｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属またはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属に属する微生物である、上記（１）〜（３）のいずれか１つの微生物。
（５）微生物がＥｒｗｉｎｉａ ｂｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｒｅｔｔｇｅｒｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄａｃｕｎｈａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｈａｚｄｉｎｏｐｈｉｌｕｍ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｖｙｚａｅおよびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｐｅｓｔｒｉｓからなる群より選ばれる微生物である上記（１）〜（４）のいずれか１つの微生物。
（６）上記（１）〜（５）のいずれか１つの微生物を培地に培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物から該有用物質を採取する、有用物質の製造法。
（７）有用物質がタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸および脂質からなる群より選ばれる有用物質である、上記（１）〜（６）のいずれか１つの製造法。
【発明の効果】
【０００７】  本発明により、有用物質の生産性が向上した微生物、および該微生物を用いた有用物質の製造法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】１．本発明の微生物
本発明の微生物としては、配列番号１若しくは２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質（ＩｈｆＡ蛋白質若しくはＩｈｆＢ蛋白質）をコードする遺伝子、または配列番号１若しくは２で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有する蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損した染色体ＤＮＡを有し、かつ有用物質を生産する能力を有する微生物をあげることができる。なお、本明細書中では、遺伝子は構造遺伝子およびプロモーター、オペレーターなどの特定の制御機能を有する領域を含んでいる。【０００９】  アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。【００１０】  配列番号１若しくは２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、または配列番号１若しくは２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する蛋白質をコードする遺伝子（以下、ｉｈｆ遺伝子またはそのホモログ遺伝子と称す）の一部または全部が欠損した染色体ＤＮＡを有する微生物としては、染色体ＤＮＡ上の該遺伝子の塩基配列中に塩基の欠失、置換または付加があるため、（１）ｉｈｆ遺伝子またはそのホモログ遺伝子のプロモーターまたはオペレーターなどの転写制御が機能せず、ｉｈｆ遺伝子またはそのホモログ遺伝子にコードされる蛋白質（以下、Ｉｈｆ蛋白質またはそのホモログ蛋白質と称す）を発現しない微生物、（２）フレームシフトが生じ、Ｉｈｆ蛋白質またはそのホモログ蛋白質が活性ある蛋白質として発現しない微生物、（３）ｉｈｆ遺伝子またはそのホモログ遺伝子中の構造遺伝子の一部または全部が欠損しているため、Ｉｈｆ蛋白質またはそのホモログ蛋白質が活性ある蛋白質として発現しない微生物、などをあげることができ、好ましくは（３）の微生物をあげることができる。【００１１】  上記（３）の微生物として、より具体的には、配列番号３または４で表される塩基配列において、構造遺伝子の一部または全部が欠損しているため、Ｉｈｆ蛋白質またはそのホモログ蛋白質が活性ある蛋白質として発現しない微生物をあげることができる。一部が欠損しているとは、配���番号１または２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質がその活性を喪失する欠損であれば、配列番号３または４で表される塩基配列中の構造遺伝子部分の１塩基の欠失でもよく、好ましくは配列番号３または４で表される塩基配列からなる遺伝子に含まれる構造遺伝子中の５〜１０塩基、より好ましくは該遺伝子中の１０〜５０塩基、さらに好ましくは該遺伝子中の５０〜１００塩基の欠失をあげることができる。【００１２】  本発明の微生物が生産する有用物質は、微生物が生産することができる工業上有用とされている物質であればいずれでもよく、好ましくはタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸および脂質などをあげることができ、より好ましくはタンパク質としては、イノシンキナーゼ、Ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ５−ｋｉｎａｓｅ（ＥＣ  ２．７．２．１１）、Ｇｌｕｔａｍａｔｅ−５−ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＥＣ  １．２．１．４１）、Ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ−５−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＥＣ  １．５．１．２）、ヒト顆粒球コロニー刺激因子などをあげることができ、ペプチドとしては、グルタチオンなどをあげることができ、アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、グリシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−システイン、Ｌ−３−ヒドロキシプロリン、Ｌ−４−ヒドロキシプロリンなどをあげることができ、核酸としては、イノシン、グアノシン、イノシン酸、グアニル酸などをあげることができ、ビタミンとしては、リボフラビン、チアミン、アスコルビン酸などをあげることができ、糖としては、キシロース、キシリトールなどをあげることができ、脂質としては、ＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）やＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）などをあげることができる。【００１３】  また、本発明の微生物は、上記したように染色体ＤＮＡ上のｉｈｆ遺伝子またはそのホモログ遺伝子の一部または全部が欠損し、かつ有用物質を生産する能力を有する微生物であれば、いずれの属に属する微生物であってもよく、好ましくは原核生物、より好ましくは細菌をあげることができる。
細菌としてはＥｒｗｉｎｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属またはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属に属する微生物、より好ましくはＥｒｗｉｎｉａ ｂｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉ ａｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｒｅｔｔｇｅｒｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄａｃｕｎｈａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｈａｚｄｉｎｏｐｈｉｌｕｍ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｖｙｚａｅまたはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｐｅｓｔｒｉｓをあげることができ、さらに好ましくはＥ．ｃｏｌｉをあげることができる。
２．本発明の微生物の製造法
本発明の微生物は、（１）有用物質を生産する能力を有する微生物の染色体ＤＮＡ上に存在するｉｈｆ遺伝子またはそのホモログ遺伝子の一部または全部を欠損させる方法、または（２）染色体ＤＮＡ上のｉｈｆ遺伝子またはそのホモログ遺伝子の一部または全部が欠損した微生物に、有用物質の生産性を付与する方法により製造することができる。【００１４】  有用物質を生産する能力を有する微生物は、１種以上の有用物質を生産する能力を有する微生物であればいずれの微生物であってもよく、該微生物としては自然界から分離された株自身が該能力を有する場合は該株そのもの、公知の方法により所望の有用物質を生産する能力を人為的に付与した微生物などをあげることができる。
当該公知の方法としては、
（ａ）有用物質の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和または解除する方法、
（ｂ）有用物質の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、
（ｃ）有用物質の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、
（ｄ）有用物質の生合成経路から該有用物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化または遮断する方法、および
（ｅ）野生型株に比べ、有用物質のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独または組み合わせて用いることができる。【００１５】  上記（ａ）〜（ｅ）の具体的な方法は、例えば有用物質がアミノ酸である場合については、上記（ａ）の方法に関してはＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４３，１０５−１１１（１９７９）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１１０，７６１−７６３（１９７２）およびＡｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３９，３１８−３２３（１９９３）などに記載されている。上記（ｂ）の方法に関しては、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４３，１０５−１１１（１９７９）およびＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１１０，７６１−７６３（１９７２）などに記載されている。上記（ｃ）の方法に関しては、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３９，３１８−３２３（１９９３）およびＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３９，３７１−３７７（１９８７）などに記載されている。上記（ｄ）の方法に関しては、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．，３８，１８１−１９０（１９７９）およびＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４２，１７７３−１７７８（１９７８）などに記載されている。上記（ｅ）の方法に関しては、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３６，１６７５−１６８４（１９７２）、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４１，１０９−１１６（１９７７）、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７，２０１３−２０２３（１９７３）およびＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，２０８９−２０９４（１９８７）などに記載されている。上記文献等を参考に各種アミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物を調製することができる。【００１６】  さらに上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかまたは組み合わせた方法によるアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物の調製方法については、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｖｏｌ．６，Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｏｆ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，１９９６）ｓｅｃｔｉｏｎ  １４ａ，１４ｂやＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７９，１−３５（２００３）、アミノ酸発酵、学会出版センター、相田  浩ら（１９８６）に多くの例が記載されており、また上記以外にも具体的なアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物の調製方法は、特開２００３−１６４２９７、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３９，１５３−１６０（１９７５）、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３９，１１４９−１１５３（１９７５）、特開昭５８−１３５９９、Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４，２７２−２８３（１９５８）、特開昭６３−９４９８５、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７，２０１３−２０２３（１９７３）、ＷＯ９７／１５６７３、特開昭５６−１８５９６、特開昭５６−１４４０９２および特表２００３−５１１０８６など数多くの報告があり、上記文献等を参照することにより１種以上のアミノ酸を生産する能力を有する微生物を調製することができる。【００１７】  染色体���ＮＡ上のｉｈｆ遺伝子またはそのホモログ遺伝子の一部または全部が欠損した微生物は、該微生物を取得できる方法であれば、その取得方法に制限はないが、例えば下記した微生物の染色体ＤＮＡ上の配列番号１または２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、またはｉｈｆ遺伝子のホモログ遺伝子の塩基配列情報を利用して、微生物の染色体ＤＮＡ上にあるｉｈｆ遺伝子またはそのホモログ遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入する方法により取得することができる。ｉｈｆ遺伝子のホモログ遺伝子の塩基配列は、配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡの全部または一部をプローブに用いた、各種微生物の染色体ＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーションによりｉｈｆ遺伝子のホモログ遺伝子を同定、取得し、または配列番号３または４で表される塩基配列に基づき設計したプライマーＤＮＡを用い、各種微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによりｉｈｆ遺伝子のホモログ遺伝子を同定、取得した後、常法により該遺伝子の塩基配列を解析することにより決定することができる。サザンハイブリダイゼーションおよびＰＣＲに供する染色体ＤＮＡは、いずれの微生物の染色体ＤＮＡであってもよく、好ましくは、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属またはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属に属する微生物、より好ましくはＥｒｗｉｎｉａ ｂｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｒｅｔｔｇｅｒｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄａｃｕｎｈａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｈａｚｄｉｎｏｐｈｉｌｕｍ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｖｙｚａｅおよびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｐｅｓｔｒｉｓの染色体ＤＮＡをあげることができる。【００１８】  具体的なｉｈｆ遺伝子のホモログ遺伝子の塩基配列としては、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ由来のｉｈｆＡおよびｉｈｆＢ遺伝子の塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＢＸ９５０８５１）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のｉｈｆＡおよびｉｈｆＢ遺伝子の塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＥ００４０９１）、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｐｅｓｔｒｉｓ由来のｉｈｆＡおよびｉｈｆＢ遺伝子の塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＥ００８９２２）などをあげることができる。【００１９】  微生物の染色体ＤＮＡ上の遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入する方法としては、相同組換えを利用した方法をあげることができる。一般的な相同組換えを利用した方法としては、塩基の欠失、置換または付加が導入された変異遺伝子を、塩基の欠失等���導入したい宿主細胞内では自立複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法をあげることができる。【００２０】  該相同組換え用プラスミドを常法により宿主細胞に導入した後、薬剤耐性を指標にして相同組換えによって染色体ＤＮＡ上に該相同組換え用プラスミドが組込まれた形質転換株を選択する。得られた形質転換株を該薬剤を含有しない培地で数時間〜１日間培養した後、該薬剤含有寒天培地、および該薬剤非含有寒天培地に塗布し、前者の培地で生育せず、後者の培地で生育できる株を選択することで、染色体ＤＮＡ上において２回目の相同組換えが生じた株を取得することができる。染色体ＤＮＡ上の欠失等を導入した遺伝子が存在する領域の塩基配列を決定することで、染色体ＤＮＡ上の目的遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことを確認することができる。【００２１】  上記方法により、染色体ＤＮＡ上の目的遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入することができる微生物としては、例えばエシェリヒア属に属する微生物をあげることができる。
また、複数の遺伝子に効率よく塩基の欠失、置換または付加を導入する相同組換えを利用した方法としては、直鎖ＤＮＡを用いた方法をあげることができる。【００２２】  具体的には、塩基の欠失、置換または付加を導入したい遺伝子を含有する直鎖ＤＮＡを細胞内に取り込ませ、染色体ＤＮＡと導入した直鎖ＤＮＡとの間で相同組換えを起こさせる方法である。本方法は、直鎖ＤＮＡを効率よく取り込む微生物であれば、いずれの微生物にも適用でき、好ましい微生物としてはエシェリヒア属、より好ましくはエシェリヒア・コリ、さらに好ましくはλファージ由来の組換えタンパク質群（Ｒｅｄ組換え系）を発現しているシェリヒア・コリをあげることができる。【００２３】  λＲｅｄ組換え系を発現しているエシェリヒア・コリとしては、λＲｅｄ組換え系遺伝子を有するプラスミドＤＮＡであるｐＫＤ４６［エシェリヒア・コリ  ジェネティック  ストック  センター（米国エール大学）より入手可能］を保有するエシェリヒア・コリＪＭ１０１株等をあげることができる。
相同組換えに用いられるＤＮＡとしては、
（ａ）薬剤耐性遺伝子の両端に、塩基の欠失、置換もしくは付加の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相同性があるＤＮＡを有する直鎖ＤＮＡ、
（ｂ）塩基の欠失、置換もしくは付加の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡ、または該ＤＮＡと相同性があるＤＮＡを直接連結した直鎖ＤＮＡ、
（ｃ）薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が連結したＤＮＡの両端に、塩基の欠失、置換もしくは付加の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相同性があるＤＮＡを有する直鎖ＤＮＡ、および
（ｄ）上記（ａ）の直鎖ＤＮＡにおいて、薬剤耐性遺伝子と染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡの間に、さらに酵母由来のＦｌｐ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８２，５８７５（１９８５）〕が認識する塩基配列を有するＤＮＡ、
をあげることができる。【００２４】  薬剤耐性遺伝子としては、宿主微生物が感受性を示す薬剤に対し、薬剤耐性を付与する薬剤耐性遺伝子であれば、いずれの薬剤耐性遺伝子も使用することができる。宿主微生物にエシェリヒア・コリを用いた場合は、薬剤耐性遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子等をあげることができる。【００２５】  ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子とは、宿主微生物で該遺伝子を発現させたとき、一定培養条件下においては、該微生物に致死的である遺伝子のことをいい、該遺伝子としては例えば、バチルス属に属する微生物由来のｓａｃＢ遺伝子〔Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５９，１３６１−１３６６（１９９３）〕、およびエシェリヒア属に属する微生物由来のｒｐｓＬ遺伝子〔Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，７２，９９−１０４（２００１）〕等をあげることができる。【００２６】  上記の直鎖ＤＮＡの両末端に存在する、染色体ＤＮＡ上の置換または欠失の導入対象となる領域の両外側に位置するＤＮＡと相同性があるＤＮＡは、直鎖ＤＮＡにおいて、染色体ＤＮＡ上の方向と同じ方向に配置され、その長さは１０ｂｐ〜１００ｂｐ程度が好ましく、２０ｂｐ〜５０ｂｐ程度がより好ましく、３０〜４０ｂｐ程度がさらに好ましい。
酵母由来のＦｌｐ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが認識する塩基配列とは、該蛋白質が認識し、相同組換えを触媒する塩基配列であれば、特に限定されないが、好ましくは配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡ、および該ＤＮＡにおいて１個〜数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有し、かつ酵母由来のＦｌｐ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが認識し、相同組換えを触媒する塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。【００２７】  相同性があるとは、上記直鎖ＤＮＡが、染色体ＤＮＡ上の目的とする領域において、相同組換えが起こる程度の相同性を有することであり、具体的な相同性としては、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは１００％の相同性をあげることができる。
上記塩基配列の相同性は、上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて決定することができる。【００２８】  上記直鎖ＤＮＡは、ＰＣＲにより作製することができる。また上記直鎖ＤＮＡを含むＤＮＡをプラスミド上にて構築した後、制限酵素処理にて目的の直鎖ＤＮＡを得ることもできる。
微生物の染色体ＤＮＡに塩基の欠失、置換または付加を導入する方法としては、以下の方法１〜４があげられる。
方法１：上記（ａ）または（ｄ）の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する方法。
方法２：上記方法１により取得された形質転換株に、上記（ｂ）の直鎖ＤＮＡを導入し、該方法により染色体ＤＮＡ上に挿入された薬剤遺伝子を削除することにより、微生物の染色体ＤＮＡ上の領域を置換または欠失させる方法。
方法３：
［１］上記（ｃ）の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
［２］染色体ＤＮＡ上の置換または欠失の対象領域の両外側に存在するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを、染色体ＤＮＡ上における方向と同一の方向で連結したＤＮＡを合成し、上記［１］で得られた形質転換株に導入する、
［３］ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が発現する条件下において、上記［２］の操作を行った形質転換株を培養し、該培養において生育可能な株を、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が染色体ＤＮＡ上から削除された株として選択する方法。
方法４：
［１］上記（ｄ）の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
［２］上記［１］で得られた形質転換株にＦｌｐ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ遺伝子発現プラスミドを導入し、該遺伝子を発現させた後、上記［１］で用いた薬剤に感受性である株を取得する方法。【００２９】  上記方法で用いられる、直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入する方法としては、該微生物へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４２）、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）〕等をあげることができる。【００３０】  方法２または方法３［２］で用いられる直鎖ＤＮＡにおいて、該ＤＮＡの中央部付近に、染色体ＤＮＡ上に挿入したい任意の遺伝子を組み込こんだ直鎖ＤＮＡを用いることにより、薬剤耐性遺伝子等を削除するのと同時に、任意の遺伝子を染色体ＤＮＡ上に挿入することができる。
上記方法２〜４では、最終的に得られる形質転換株の染色体ＤＮＡ上には薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子等の外来遺伝子を残さない方法であるため、該方法を用いることにより、同一の薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を用いて、該方法の操作を繰り返すことにより、容易に染色体ＤＮＡ上の位置の異なる２以上の領域に塩基の欠失、置換または付加を有する微生物を製造することができる。
３．本発明の微生物を用いた有用物質の製造法
上記２の本発明の微生物を培地に培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物から有用物質を採取することにより、該有用物質を製造することができる。【００３１】  該微生物を培地に培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
すなわち、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれも用いることができる。
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。【００３２】  窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。【００３３】  無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。【００３４】  また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。【００３５】  培養物中に生成、蓄積した有用物質の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
以下に実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３６】ｉｈｆＡ遺伝子が欠損した有用物質生産株の造成
（１）直鎖ＤＮＡによる染色体ＤＮＡ上の相同組換えが可能なＥ．ｃｏｌｉの造成
（ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０ｒｅｄ株の造成
直鎖ＤＮＡによる染色体ＤＮＡ上の相同組換えが可能なＥ．ｃｏｌｉ  ＫＭ２２株［Ｇｅｎｅ，２４６，３２１−３３０（２０００）］よりＰ１ファージを以下の方法により調製した。【００３７】 Ｅ．ｃｏｌｉ  ＫＭ２２株を２０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地［１０ｇ／ｌバクトトリプトン（ディフコ社製）、５ｇ／ｌバクトイーストエキストラクト（ディフコ社製）、５ｇ／ｌ塩化ナトリウム、１ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム］を用いて３０℃にて一晩培養した後、０．５ｍｌの培養液、１．４ｍｌの新しいＬＢ液体培地および１００μｌの０．１ｍｏｌ／ｌの塩化カルシウム溶液を混合した。【００３８】  該混合溶液を３０℃で５〜６時間振とう培養した後、４００μｌの該混合液を滅菌したチューブに移した。そこに２μｌのＰ１ファージストック溶液を添加し、３７℃で１０分間保温した後、５０℃に保温したソフトアガー溶液（１０ｇ／ｌバクトトリプトン、５ｇ／ｌバクトイーストエキストラクト、５ｍｍｏｌ／ｌ塩化カルシウム、１ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム、３ｇ／ｌ寒天）を３ｍｌ添加して、よく攪拌し、Ｃａ−ＬＢ寒天培地プレート（１０ｇ／ｌバクトトリプトン、５ｇ／ｌバクトイーストエキストラクト、５ｍｍｏｌ／ｌ塩化カルシウム、１ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム、１５ｇ／ｌ寒天、プレートの直径は１５ｃｍ）上にまいた。【００３９】  該プレートを３７℃で７時間培養した後、スプレッダーでソフトアガー部分を細かく砕いて回収し、１５００ｇ、４℃、１０分間遠心分離した。上清１．５ｍｌに対し１００μｌのクロロホルムを添加し、４℃にて一晩保存した。翌日、溶液を１５０００ｇにて２分間遠心分離し、上清をファージストックとして４℃で保存した。
次に、取得したファージを用いてＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株を形質転換した。Ｃａ−ＬＢ液体培地で３０℃、４時間培養したＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０株の培養液を２００μｌ分取し、ファージストックを１μｌ添加した。３７℃で１０分間保温した後、５ｍｌのＬＢ液体培地と２００μｌの１ｍｏｌ／ｌのクエン酸ナトリウム溶液を添加し、攪拌した。１５００ｇ、２５℃、１０分間遠心分離した後、上清を捨て、沈殿した細胞に１ｍｌのＬＢ液体培地と１０μｌの１ｍｏｌ／ｌのクエン酸ナトリウム溶液を加え３０℃で２時間保温した。１００μｌの該溶液を２０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むアンチバイオティックメディウム３寒天平板培地に塗布し、３０℃で一晩培養した。各々の欠損導入株毎に出現したコロニー２４個をそれぞれ、２０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むアンチバイオティックメディウム３寒天平板培地（０．１５％肉エキス、０．１５％酵母エキス、０．５％ペプトン、０．１％グルコース、０．３５％塩化ナトリウム、０．１３２％リン酸水素二カリウム、１．５％寒天、ｐＨ７．０）に塗布し、その薬剤感受性を確認し、カナマイシン耐性株を選抜することにより、直鎖ＤＮＡによる染色体ＤＮＡ上の相同組換えを可能とする染色体ＤＮＡ領域［Δ（ｒｅｃＣ  ｐｔｒ  ｒｅｃＢ  ｒｅｃＤ）：：Ｐｌａｃ−ｒｅｄ  ｋａｎ］が形質導入されたＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０ｒｅｄ株を取得した。
（ｉｉ）Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０ｒｅｄ＿ｔｅｔ株の造成
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０ｒｅｄ株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号６および７で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＬＡ−Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用い、染色体ＤＮＡ１０ｎｇ、プライマーＤＮＡ各５０ｐｍｏｌを含む１００μｌの反応液をＬＡ−Ｔａｑに添付の指示書に従い調製し、９４℃で２分間保温後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で３分間のサイクルを３０回繰り返した後、７２℃で１０分間保温するという条件で行った。【００４０】  目的とするＤＮＡ断片が増幅していることをアガロースゲル電気泳動法にて確認した後、該ＤＮＡ断片をゲルから切り出して精製した。
次に、Ｔｎ１０トランスポゾンを染色体ＤＮＡ上に持つＥ．ｃｏｌｉ  ＣＧＳＣ７４６５株（米国Ｙａｌｅ大学で運営されているＣｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒから入手可能）の染色体ＤＮＡを鋳型に用い、配列番号８および９で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＬＡ−Ｔａｑを用い、染色体ＤＮＡ１０ｎｇ、プライマーＤＮＡ各５０ｐｍｏｌを含む１００μｌの反応液をＬＡ−Ｔａｑに添付の指示書に従い調製し、９４℃で２分間保温後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で９０秒間のサイクルを３０回繰り返した後、７２℃で１０分間保温するという条件で行った。【００４１】  目的とするＤＮＡ断片が増幅していることをアガロースゲル電気泳動法にて確認した後、該ＤＮＡ断片をゲルから切り出して精製した。
次に、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０ｒｅｄ株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１０および１１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＬＡ−Ｔａｑを用い、染色体ＤＮＡ  １０ｎｇ、プライマーＤＮＡ各５０ｐｍｏｌを含む１００μｌの反応液をＬＡ−Ｔａｑに添付の指示書に従い調製し、９４℃で２分間保温後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で３分間のサイクルを３０回繰り返した後、７２℃で１０分間保温するという条件で行った。【００４２】  目的とするＤＮＡ断片が増幅していることをアガロースゲル電気泳動法にて確認した後、該ＤＮＡ断片をゲルから切り出して精製した。
次に、上記ＰＣＲで得られた３つのＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号１２および１３で表されるＤＮＡをプライマーセットに用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＬＡ−Ｔａｑを用い、増幅ＤＮＡ断片各１０ｎｇ、プライマーＤＮＡ各５０ｐｍｏｌを含む１００μｌの反応液をＬＡ−Ｔａｑに添付の指示書に従い調製し、９４℃で２分間保温後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で３分間のサイクルを３０回繰り返した後、７２℃で１０分間保温するという条件で行った。【００４３】  上記ＰＣＲにより、カナマイシン耐性遺伝子に相同性のある配列を両端に持ち、中央部にテトラサイクリン耐性遺伝子を有するＤＮＡ断片が増幅していることをアガロースゲル電気泳動法にて確認した後、該ＤＮＡ断片（以下、ｔｅｔ遺伝子断片という）をゲルから切り出して精製した。
次に、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０ｒｅｄ株のコンピテントセルを、Ｇｅｎｅ，２４６，３２１−３３０（２０００）に記載の方法に従って調製し、１μｇのｔｅｔ遺伝子断片を用いて形質転換を行った。形質転換は、０．１ｃｍのキュベット（ＢｉｏＲａｄ社製）中で、１．８ＫＶ、２５μＦの条件で、エレクトロポレーションにより行った。【００４４】  形質転換した細胞を、２ｍｍｏｌ／ｌのＩＰＴＧを含む１ｍｌのＳＯＣ液体培地［２０ｇ／ｌバクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｇ／ｌバクトイーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５ｇ／ｌ塩化ナトリウム、０．２ｍｌ／ｌの５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＯＨ、１０ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ塩化マグネシウム、１０ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ硫酸マグネシウム、１０ｍｌ／ｌの２Ｍグルコース］を用いて３０℃で３時間培養した後、２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天プレート（ＬＢ液体培地に寒天を１．５％含むもの）上に塗布し、３７℃で一晩培養した。【００４５】  生育してきた株は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０ｒｅｄ株の染色体ＤＮＡ上のカナマイシン耐性遺伝子がテトラサイクリン耐性遺伝子と置換されている株であることを確認し、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０ｒｅｄ＿ｔｅｔ株と命名した。
（２）プロリン生産株の造成
上記（１）で取得したＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０ｒｅｄ株にプロリンを生産する能力を以下の方法により付与した。
（ｉ）ｐｕｔＡ遺伝子欠損株の造成
ｐＨＳＧ３９８プラスミドＤＮＡ（タカラバイオ社より購入）を鋳型にし、配列番号１４および１５で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲは、ＥＸ−Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いて、精製プラスミドＤＮＡ２０ｎｇ、プライマーＤＮＡ各５０ｐｍｏｌを含む反応液１００μｌをＥＸ−Ｔａｑに添付の指示書に従い調製し、９５℃で１分間保温後、９４℃で３０秒間、６４℃で３０秒間、７２℃で１分間のサイクルを３０回繰り返した後、７２℃で３分間保温するという条件で行った。増幅ＤＮＡ断片をＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、３０μｌのＤＮＡ溶液を得た。【００４６】  次に、混入している微量のプラスミドｐＨＳＧ３９８を分解するため、該ＤＮＡ溶液に制限酵素ＰｓｔＩとＢｇｌＩそれぞれを１０Ｕずつ添加し、３７℃で２時間保温後、増幅ＤＮＡ断片をＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製し、３０μｌのＤＮＡ溶液を得た。
次に、該ＤＮＡ溶液０．１μｌを鋳型として、配列番号１６および１７で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより、クロラムフェニコール耐性遺伝子を中央部に持ち、両端に配列番号１８であらわされる塩基配列からなるＤＮＡ（ｐｕｔＡ遺伝子の５’末端側のＤＮＡ）および配列番号１９であらわされる塩基配列からなるＤＮＡ（ｐｕｔＡ遺伝子の３’末端側のＤＮＡ）を有するＤＮＡ断片を増幅した。【００４７】  ＰＣＲは、ＥＸ−Ｔａｑを用いて、精製鋳型ＤＮＡ１０ｎｇ、プライマーＤＮＡ各５０ｐｍｏｌを含む１００μｌの反応液をＥＸ−Ｔａｑに添付の指示書に従い調製し、９５℃で１分間保温後、９４℃で３０秒間、５１℃で３０秒間、７２℃で１分間のサイクルを３０回繰り返した後、７２℃で３分間保温するという条件で行い、増幅ＤＮＡ断片を上記と同様の方法で精製した。
次に、該ＤＮＡ１μｇを用いてＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０ｒｅｄ株の形質転換を行った。形質転換は上記（１）のエレクトロポレーションと同様の条件で行った。【００４８】  形質転換した細胞を、２ｍｍｏｌ／ｌのＩＰＴＧを含む１ｍｌのＳＯＣ液体培地を用いて３０℃で３時間培養した後、５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレート（ＬＢ液体培地に寒天を１．５％含むもの。以下、ＬＢｃｍ寒天培地プレートと略す）上に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきた株は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０ｒｅｄ株の染色体ＤＮＡ上のｐｕｔＡ遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換された株であることを確認し、該株をＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０ｒｅｄΔｐｕｔＡ：：ｃａｔ株と命名した。
（ｉｉ）ｐｒｏＢＡオペロン欠損株の造成
次に、プラスミドｐＦａｓｔＢＡＣｄｕａｌ（インビトロジェン社より購入）を鋳型にし、配列番号２０および２１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより、ゲンタマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲは、ＬＡ−Ｔａｑを用いて、精製プラスミドＤＮＡ１０ｎｇ、プライマーＤＮＡ各２０ｐｍｏｌを含む２５μｌの反応液をＬＡ−Ｔａｑに添付の指示書に従い調製し、９４℃で３分間保温後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１分間のサイクルを３０回繰り返した後、７２℃で１０分間保温するという条件で行った。【００４９】  反応終了後、増幅ＤＮＡ断片を上記と同様の方法で精製し、５０μｌのＤＮＡ溶液を得た。上記ＰＣＲで得られた増幅ＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号２２および２３で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより、ゲンタマイシン耐性遺伝子を中央部に持ち、両端に配列番号２４で表される塩基配列からなるＤＮＡ（ｐｒｏＢＡオペロンの５’末端側のＤＮＡ）、および配列番号２５で表される塩基配列からなるＤＮＡ（ｐｒｏＢＡオペロンの３’末端側のＤＮＡ）を有するＤＮＡ断片を増幅した。【００５０】  ＰＣＲは、ＬＡ−Ｔａｑを用いて、増幅ＤＮＡ断片１０ｎｇ、プライマーＤＮＡ各２０ｐｍｏｌを含む２５μｌの反応液をＬＡ−Ｔａｑに添付の指示書に従い調製し、９４℃で３分間保温後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１分間のサイクルを３０回繰り返した後、７２℃で１０分間保温するという条件で行った。得られた増幅ＤＮＡ断片（増幅ＤＮＡ断片Ａという）は上記と同様の方法で精製した。【００５１】  また、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０ｒｅｄ株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２６および２７で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いたＰＣＲにより、ｐｒｏＢＡオペロンの５’側上流域約１ｋｂｐのＤＮＡ断片を、配列番号２８および２９で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いたＰＣＲにより、ｐｒｏＢＡオペロンの３’側下流域約１ｋｂｐのＤＮＡ断片を、それぞれ増幅した。【００５２】  ＰＣＲは、染色体ＤＮＡ１０ｎｇ、プライマーＤＮＡ各２０ｐｍｏｌを含む２５μｌの反応液をＬＡ−Ｔａｑに添付の指示書に従い調製し、９４℃で３分間保温後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１分間のサイクルを３０回繰り返した後、７２℃で１０分間保温する条件で行った。増幅ＤＮＡ断片（増幅ＤＮＡ断片ＢおよびＣ）は上記と同様の方法で精製した。
次に上記で得られた増幅ＤＮＡ断片Ａ、ＢおよびＣを鋳型に用い、配列番号２６および配列番号２９で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用い、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＬＡ−Ｔａｑを用い、増幅ＤＮＡ断片Ａ、ＢおよびＣ各１０ｎｇ、プライマーＤＮＡ各２０ｐｍｏｌを含む２５μｌの反応液をＬＡ−Ｔａｑに添付の指示書に従い調製し、９４℃で３分間保温後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で３分間のサイクルを３０回繰り返した後、７２℃で１０分間保温するという条件で行った。【００５３】  ＤＮＡ断片Ａ、ＢおよびＣが連結したＤＮＡ断片が増幅されていることをアガロースゲル電気泳動法にて確認した後、該ＤＮＡ断片をゲルから切り出して精製した。該ＤＮＡ断片は、両端にそれぞれ染色体ＤＮＡ上のｐｒｏＢＡオペロンの５’側上流および３’側下流の１ｋｂｐのＤＮＡに相同性のある配列、中央部にゲンタマイシン耐性遺伝子を有するＤＮＡ断片である。【００５４】  次に該ＤＮＡ断片１μｇを用い、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０ｒｅｄΔｐｕｔＡ：：ｃａｔ株の形質転換を行った。形質転換は、上記したＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０ｒｅｄ株の形質転換法と同様にエレクトロポレーションで行った。ただし、形質転換株の選択培地は５μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含むＬＢ寒天プレートを用いた。該寒天プレート上で生育してきた株は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０ｒｅｄΔｐｕｔＡ：：ｃａｔ株の染色体ＤＮＡ上のｐｒｏＢＡオペロンがゲンタマイシン耐性遺伝子と置換された株であることを確認し、該株をＥ．ｃｏｌｉ  ＰＫ株と命名した。【００５５】 Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰＫ株をＭ９最小寒天培地および８ｍｇ／ｌのプロリンを含むＭ９最小寒天培地に塗布して、３０℃にて一晩培養し、Ｅ．ｃｏｌｉＰＫ株はプロリンを含む最小培地では生育するが、プロリンを含まない最小培地では生育しないことを確認した。
（ｉｉｉ）変異型ｐｒｏＢＡオペロン導入株の造成
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０ｒｅｄ株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号２６および２９で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより、ｐｒｏＢＡオペロンを含む４ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲは、ＬＡ−Ｔａｑを用いて、染色体ＤＮＡ１０ｎｇ、プライマーＤＮＡ各２０ｐｍｏｌを含む２５μｌの反応液をＬＡ−Ｔａｑに添付の指示書に従い調製し、９４℃で３分間保温後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で４分間のサイクルを３０回繰り返した後、７２℃で１０分間保温する条件で行った。【００５６】  目的とするＤＮＡ断片が増幅されていることをアガロースゲル電気泳動法にて確認した後、該ＤＮＡ断片をゲルから切り出して精製し、ＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、プラスミドｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐにクローン化しすることで、プラスミドｐＰＣＲ  ｐｒｏＢＡを作製した。
次に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてｐＰＣＲ  ｐｒｏＢＡのｐｒｏＢ遺伝子に点突然変異ｐｒｏＢ７４〔Ｇｅｎｅ，６４，１９９−２０５（１９８８）〕を該Ｋｉｔに添付されている指示書に従って導入し、プラスミドｐＰＣＲ  ｐｒｏＢ７４を作製した。変異点導入のために用いたプライマーＤＮＡの塩基配列は配列番号３０に示した。【００５７】  次に、プラスミドｐＰＣＲ  ｐｒｏＢ７４を制限酵素ＢｓｒＧＩを用いて切断した後、アガロース電気泳動法にて変異型ｐｒｏＢＡオペロンを含むＤＮＡ断片を分離し、ゲルから回収、精製した。該ＤＮＡ断片２μｇを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰＫ株の形質転換を行った。形質転換は上記したＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０ｒｅｄ株の形質転換法と同様にエレクトロポレーションで行った。ただし、形質転換株の選択培地はＭ９最小寒天培地にて行い、プロリン要求性を示さない株を選択することにより、プロリンを生産する能力を有するＥ．ｃｏｌｉ  ＰＫＢ７４株を取得した。
（３）ｉｈｆＡ遺伝子が欠損したプロリン生産株の造成
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０ｒｅｄ株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、各々の３’末端の２５塩基は、Ｗ３１１０ｒｅｄ株染色体ＤＮＡ上のカナマイシン耐性遺伝子の両末端にハイブリダイズするように設計してある配列番号３１および３２で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用い、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＬＡ−Ｔａｑを用いて、染色体ＤＮＡ断片１０ｎｇ、プライマーＤＮＡ各２０ｐｍｏｌを含む２５μｌの反応液をＬＡ−Ｔａｑに添付の指示書に従い調製し、９４℃で２分間保温後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１分間のサイクルを３０回繰り返した後、７２℃で１０分間保温するという条件で行った。【００５８】  カナマイシン耐性遺伝子の５’末端側上流に配列番号３３で表される塩基配列、３’末端側下流に配列番号３４で表される塩基配列が付加した増幅ＤＮＡ断片を上記と同様の方法で精製した。
次に該ＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号３５および３６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用い、ＰＣＲを行った。配列番号３５で表される塩基配列からなるＤＮＡは、５’末端側にｉｈｆＡ遺伝子の５’末端側領域付近との相同配列を有する４０塩基からなる塩基配列を有し、３’末端側に配列番号３３で表される塩基配列からなるＤＮＡを有するＤＮＡである。配列番号３６で表される塩基配列を有するＤＮＡは、５’末端側にｉｈｆＡ遺伝子の３’末端側領域付近と相同配列を有する４０塩基からなる塩基配列塩基配列を有し、３’末端側に配列番号３４で表される塩基配列にハイブリダイズする２５塩基からなるＤＮＡを有するＤＮＡである。【００５９】  ＰＣＲは、ＬＡ−Ｔａｑを用いて、増幅ＤＮＡ断片１０ｎｇ、プライマーＤＮＡ各２０ｐｍｏｌを含む２５μｌの反応液をＬＡ−Ｔａｑに添付の指示書に従い調製し、９４℃で２分間保温後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１分間のサイクルを３０回繰り返した後、７２℃で１０分間保温するという条件で行った。
両末端にｉｈｆＡ遺伝子の両末端の４０塩基と相同な領域を有するカナマイシン耐性遺伝子（ｋｍ遺伝子）を含むＤＮＡ断片が増幅していることを確認し、該ＤＮＡ断片を上記と同様の方法で精製した。【００６０】  該ＤＮＡ断片１μｇを用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＰＫＢ７４＿ｔｅｔ株を形質転換した。形質転換は、上記したＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０ｒｅｄ株の形質転換法と同様にエレクトロポレーションで行った。形質転換した細胞をＳＯＣ培地を用いて上記と同様に培養した後、培養液を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天プレート上に塗布し、３０℃で一晩培養した。
生育してきた株は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰＫＢ７４＿ｔｅｔ株の染色体ＤＮＡ上のｉｈｆＡ遺伝子が欠損していることを確認し、該株をＥ．ｃｏｌｉ  ＰＫＢ７４＿ｔｅｔΔｉｈｆＡ株と命名した。
【実施例２】
【００６１】ｉｈｆＡ遺伝子欠損株を用いた有用物質の製造
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰＫＢ７４＿ｔｅｔΔｉｈｆＡ株および対照株であるＥ．ｃｏｌｉ  ＰＫＢ７４＿ｔｅｔ株を、それぞれ５ｍｌのＬＢ液体培地を入れた試験管に植菌し、３０℃にて２０時間、振とう培養し培養液を得た。５００μｌの該培養液を、５０ｍｌのＭｅｄ７液体培地（３％グルコース、０．８％ペプトン、０．１％リン酸二水素カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム・七水和物、０．００２％塩化カルシウム、１％炭酸カルシウム、１％硫酸アンモニウム、０．２％塩化ナトリウム、０．０３％硫酸鉄）が入った３００ｍｌ容の三角フラスコに植菌し、３０℃で振とう培養した。【００６２】  培養開始から３０時間目、３３時間目および３６時間目に培養液の一部をサンプリングして遠心分離し、その上清を１０００倍に希釈してダイオネクス社製のアミノ酸直接分析システムＤＸａ−５００を用いて培養液中のプロリン蓄積量を測定した。結果を表１に示す。【００６３】
【表１】
2006025477.tif 000002
【００６４】  表１に示すように、プロリン生産株であるＥ．ｃｏｌｉ  ＰＫＢ７４＿ｔｅｔから造成したｉｈｆＡ遺伝子欠損株であるＥ．ｃｏｌｉ  ＰＫＢ７４＿ｔｅｔΔｉｈｆＡ株のプロリン生産性はＥ．ｃｏｌｉ  ＰＫＢ７４＿ｔｅｔより優れていることが明らかになった。
【実施例３】
【００６５】Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰＫＢ７４＿ｔｅｔΔｉｈｆＡ株の遺伝子発現プロファイル解析
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰＫＢ７４＿ｔｅｔΔｉｈｆＡ株とその親株であるＥ．ｃｏｌｉ  ＰＫＢ７４＿ｔｅｔ株の遺伝子発現プロファイル解析を以下のように行った。
実施例２に記載の培養において、培養開始２８時間目のそれぞれの株の培養液を一部サンプリングし、大島らの方法［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４５，６７３−６９５（２００２）］に従い、ＤＮＡスライドアレイを用いた転写パターンの比較を行った。ＤＮＡスライドアレイはタカラバイオが発売している大腸菌用のものを購入して使用した。【００６６】 Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰＫＢ７４＿ｔｅｔ株におけるｍＲＮＡ量を基準にして、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰＫＢ７４＿ｔｅｔΔｉｈｆＡ株の各遺伝子の発現量を解析したところ、解糖系の律速段階の酵素６−ホスホフラクトキナーゼの構造遺伝子であるｐｆｋＢ遺伝子の発現量が１２倍に上昇していることが判明した。またＴＣＡサイクルを構成する酵素構造遺伝子群中の、ａｃｎＡ遺伝子およびｓｕｃＡＢ遺伝子の発現量がそれぞれ８倍および３倍に上昇していた。【００６７】  一方でプロリン生合成系遺伝子であるｐｒｏＢＡ遺伝子およびｐｒｏＣ遺伝子の発現量はＥ．ｃｏｌｉ  ＰＫＢ７４＿ｔｅｔと同等であった。
以上より、ｉｈｆＡ遺伝子欠損株のプロリン生産性の向上は、解糖系およびＴＣＡサイクルなどの中央代謝系の活性増強によりもたらされたことが明らかになった。したがって、ｉｈｆＡ遺伝子欠損株はプロリン等のアミノ酸だけでなく、解糖系およびＴＣＡサイクルを経由して生成される各種有用物質、例えばタンパク質、ペプチド、核酸、ビタミン、糖、有機酸および脂質などの生産性も向上することが示された。
【実施例４】
【００６８】ｉｈｆＡ遺伝子欠損株の造成
実施例１の（３）で作製したＥ．ｃｏｌｉ  ＰＫＢ７４＿ｔｅｔΔｉｈｆＡ株に実施例１の（１）記載の方法にてＰ１ファージを感染させ、そこから形質導入用のファージストックを回収した。取得した形質導入用ファージストックをＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株に感染させ、実施例１の（１）記載の方法を用いてカナマイシン耐性株を分離した。このカナマイシン耐性株は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株のｉｈｆＡ遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子により置換的に欠失した株であった。本菌株をＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０ΔｉｈｆＡ株と命名した。
【実施例５】
【００６９】ｉｈｆＡ遺伝子欠損株を用いた有用物質の製造
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０ΔｉｈｆＡ株および親株であるＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株を、それぞれ５ｍｌのＬＢ液体培地を入れた試験管に植菌し、３０℃にて２０時間、振とう培養し培養液を得た。３００μｌの該培養液を、３０ｍｌのＭｅｄ７液体培地（３％グルコース、０．８％ペプトン、０．１％リン酸二水素カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム・七水和物、０．００２％塩化カルシウム、１％炭酸カルシウム、１％硫酸アンモニウム、０．２％塩化ナトリウム、０．０３％硫酸鉄）が入った３００ｍｌ容の三角フラスコに植菌し、３０℃で振とう培養した。【００７０】  培養開始から１８時間目、３０時間目および４２時間目に培養液の一部をサンプリングして遠心分離し、その上清を１０００倍に希釈してダイオネクス社製のアミノ酸直接分析システムＤＸａ−５００を用いて培養液中のグルタミン酸の蓄積量を測定した。結果を表２に示す。【００７１】
【表２】
2006025477.tif 000003
【００７２】  表２に示すように、ｉｈｆＡ遺伝子欠損株は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株の約２倍のグルタミン酸生産性を有することがわかった。
【実施例６】
【００７３】ｉｈｆＢ遺伝子欠損株の造成
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０ｒｅｄ株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、各々の３’末端側の２５ｍｅｒは、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０ｒｅｄ株の染色体ＤＮＡ上のカナマイシン耐性遺伝子の両末端にハイブリダイズするように設計した配列番号３１および３２で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用い、ＰＣＲを行った。【００７４】  ＰＣＲは、ＬＡ−Ｔａｑを用いて、染色体ＤＮＡ断片１０ｎｇ、プライマーＤＮＡ各２０ｐｍｏｌを含む２５μｌの反応液をＬＡ−Ｔａｑに添付の指示書に従い調製し、９４℃で２分間保温後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１分間のサイクルを３０回繰り返した後、７２℃で１０分間保温するという条件で行った。
上記ＰＣＲにより、カナマイシン耐性遺伝子の５’側上流に配列番号３３で表される塩基配列、３’側下流に配列番号３４で表される塩基配列が付加したＤＮＡ断片が増幅していることを確認し、上記と同様の方法で該ＤＮＡ断片を精製した。【００７５】  次に、該ＤＮＡ断片を鋳型として、５’末端側の４０ｍｅｒにｉｈｆＢ構造遺伝子の５’末端側と同じ塩基配列を有し、３’末端側に配列番号３３で表される２５ｍｅｒの塩基配列を有するＤＮＡである、配列番号３７で表される塩基配列からなるＤＮＡ、および５’末端側の４０ｍｅｒにｉｈｆＢ構造遺伝子の３’末端側とハイブリダイズする塩基配列を有し、３’末端側に配列番号３４で表される塩基配列にハイブリダイズする２５ｍｅｒの塩基配列を有するＤＮＡである、配列番号３８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。【００７６】  ＰＣＲは、ＬＡ−Ｔａｑを用いて、増幅ＤＮＡ断片１０ｎｇ、プライマーＤＮＡ各２０ｐｍｏｌを含む２５μｌの反応液をＬＡ−Ｔａｑに添付の指示書に従い調製し、９４℃で２分間保温後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１分間のサイクルを３０回繰り返した後、７２℃で１０分間保温するという条件で行った。
上記ＰＣＲにより、その両末端に、ｉｈｆＢ構造遺伝子の両末端の４０塩基と同一の塩基配列を有するカナマイシン耐性遺伝子（ｋｍ遺伝子）を含むＤＮＡ断片が増幅していることを確認し、上記と同様の方法で該ＤＮＡ断片を精製した。【００７７】  該ＤＮＡ  １μｇを用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＰＫＢ７４＿ｔｅｔ株を形質転換した。形質転換は、上記したＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０ｒｅｄ株の形質転換法と同様にエレクトロポレーションで行った。形質転換した細胞をＳＯＣ培地を用いて上記と同様に培養した後、培養液を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天プレート上に塗布し、３０℃で一晩培養した。
生育してきた株は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰＫＢ７４＿ｔｅｔ株の染色体ＤＮＡ上のｉｈｆＢ遺伝子が欠損していることを確認し、該株をＥ．ｃｏｌｉ  ＰＫＢ７４＿ｔｅｔΔｉｈｆＢ株と命名した。
【実施例７】
【００７８】ｉｈｆＢ遺伝子欠損株を用いた有用物質の製造
実施例２と同様の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰＫＢ７４＿ｔｅｔΔｉｈｆＢ株および対照株であるＥ．ｃｏｌｉ  ＰＫＢ７４＿ｔｅｔ株を培養し、培養液中のＬ−プロリン蓄積量を測定した。結果を表３に示す。【００７９】
【表３】
2006025477.tif 000004
【００８０】  表３に示すように、プロリン生産株であるＥ．ｃｏｌｉ  ＰＫＢ７４＿ｔｅｔから造成したｉｈｆＢ遺伝子欠損株であるＥ．ｃｏｌｉＰＫＢ７４＿ｔｅｔΔｉｈｆ株のプロリン生産性はＥ．ｃｏｌｉ  ＰＫＢ７４＿ｔｅｔより優れていることが明らかになった。
よって、ｉｈｆＢ遺伝子欠損株は、ｉｈｆＡ遺伝子欠損株と同様、各種有用物質の生産性が向上することが明らかになった。
【配列表フリーテキスト】
【００８１】配列番号５−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号１５−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号１８−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号１９−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号２６−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号２７−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号２８−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
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配列番号３０−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号３１−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号３２−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号３３−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
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配列番号３７−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号３８−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
【国際調査報告】
2006025477.tif 000005
2006025477.tif 000006
2006025477.tif 000007