(57)【要約】本発明は、免疫応答を惹起するためのアジュバントおよびその利用に関するものである。１つの局面において、本発明は、ｒｔＴＬＲ５ＳポリペプチドまたはｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むアジュバントを提供する。他の局面において、本発明は、ｒｔＴＬＲ５ＳポリペプチドまたはｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を含むワクチン組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を含む、ワクチン組成物。
【請求項２】
前記免疫原成分が抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記抗原性ペプチドが鞭毛細菌である、請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号５または７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記アジュバント成分が、配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドを導入した形質転換細胞をさらに含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を含む、ワクチン組成物。
【請求項９】
前記免疫原成分が抗原性ペプチドを含む、請求項８に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
前記抗原性ペプチドが鞭毛細菌である、請求項９に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
前記抗原性ペプチドが、配列番号６または８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項９に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
前記アジュバント成分が、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをさらに含む、請求項８に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドをさらに含む、請求項８に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
ｈｕＴＬＲ５ポリペプチド発現細胞をさらに含む、請求項８に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を備えている、ワクチン用キット。
【請求項１６】
前記免疫原成分が抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１５に記載のワクチン用キット。
【請求項１７】
前記抗原性ペプチドが鞭毛細菌である、請求項１６に記載のワクチン用キット。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号５または７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項１６に記載のワクチン用キット。
【請求項１９】
前記アジュバント成分が、配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１５に記載のワクチン用キット。
【請求項２０】
ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドをさらに備えている、請求項１５に記載のワクチン用キット。
【請求項２１】
ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドを導入した形質転換細胞をさらに備えている、請求項１５に記載のワクチン用キット。
【請求項２２】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を備えている、ワクチン用キット。
【請求項２３】
前記免疫原成分が抗原性ペプチドを含む、請求項２２に記載のワクチン用キット。
【請求項２４】
前記抗原性ペプチドが鞭毛細菌である、請求項２３に記載のワクチン用キット。
【請求項２５】
前記抗原性ペプチドが、配列番号６または８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項２３に記載のワクチン用キット。
【請求項２６】
前記アジュバント成分が、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをさらに含む、請求項２２に記載のワクチン用キット。
【請求項２７】
ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドをさらに備えている、請求項２２に記載のワクチン用キット。
【請求項２８】
ｈｕＴＬＲ５ポリペプチド発現細胞をさらに備えている、請求項２２に記載のワクチン用キット。
【請求項２９】
配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を含む、ガンまたは感染症を予防するため薬学的組成物。
【請求項３０】
ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２９に記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドを導入した形質転換細胞をさらに含む、請求項２９に記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を含む、ガンまたは感染症を予防するため薬学的組成物。
【請求項３３】
ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドをさらに含む、請求項３２に記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
ｈｕＴＬＲ５ポリペプチド発現細胞をさらに含む、請求項３２に記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を備えている、ガンまたは感染症を予防するためキット。
【請求項３６】
ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドをさらに備えている、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドを導入した形質転換細胞をさらに備えている、請求項３５に記載のキット。
【請求項３８】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を備えている、ガンまたは感染症を予防するためキット。
【請求項３９】
ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドをさらに備えている、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
ｈｕＴＬＲ５ポリペプチド発現細胞をさらに備えている、請求項３８に記載のキット。
【請求項４１】
配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む、被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するための検出薬。
【請求項４２】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するための検出薬。
【請求項４３】
配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを備えている、被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するための検出キット。
【請求項４４】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを備えている、被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するための検出キット。
【請求項４５】
配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを導入した細胞を、被験体サンプルとインキュベートする工程を包含する、被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するための検出方法。
【請求項４６】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを、被験体サンプルとインキュベートする工程を包含する、被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するための検出方法。
【請求項４７】
配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む、アジュバント。
【請求項４８】
配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをさらに含む、請求項４７に記載のアジュバント。
【請求項４９】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、アジュバント。
【請求項５０】
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをさらに含む、請求項４９に記載のアジュバント。
【請求項５１】
注入可能な形態である、請求項４７〜５０のいずれか１項に記載のアジュバント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、免疫応答を惹起するためのアジュバントおよびその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  マクロファージや樹状細胞などの自然免疫担当細胞は、ウイルスおよび／または細菌に対する初期の免疫応答に関与する微生物レセプターと呼ばれるレセプターファミリーを介して外来異物を識別し、サイトカインの放出および／または副刺激分子の発現を誘導してリンパ球を活性化する。【０００３】  Ｔｏｌｌ様レセプター（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＬＲ）は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉａ）において発生と免疫の両者に関与する膜タンパク質（Ｄｒｏｓｏｐｈｉａ  Ｔｏｌｌ）のホモログであり、微生物レセプターの１つである。ＴＬＲは、ヒトでは１０種類、マウスでは１２種類見つかっており、これらは、ＴＬＲファミリーと呼ばれる一群のレセプターファミリーを形成している。【０００４】  ＴＬＲは、外来性物質を認識し、全身性様式でクリアランスおよび免疫応答を惹起する（非特許文献１を参照のこと）。免疫応答に重要なＮＦ−κＢ活性化経路およびＩ型ＩＦＮ産生経路は、通常、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と称される細菌性構成物に応答して活性化される（非特許文献２を参照のこと）。ＴＬＲは、ｃａｔｃｈ−ｕｐレセプター（オプソニンレセプターなど）とともに自然免疫（先天性免疫）系に関与するシグナル伝達レセプターであり、ＴＬＲシグナルは、Ｔリンパ球およびＢリンパ球を含む獲得免疫（後天性免疫）系の活性化よりも先に生じる。自然免疫系（ＴＬＲを含む）は脊椎動物および無脊椎動物全てにおいて存在する。そのため、ＴＬＲの機能的特性は、ヒトおよびマウスにおいて広範に調べられている。これらの研究は、総じてＤｒｏｓｏｐｈｉｌａの相同物と比較されているが、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＴｏｌｌファミリータンパク質の機能的特性は、ヒトまたはマウスのものとはかなり異なっている（非特許文献３を参照のこと）。また、下等脊椎動物におけるＴＬＲの機能的特性は未だ報告されていない。【０００５】  ヒトにおいて、ＴＬＲファミリーの１０個のメンバー（ＴＬＲ１〜１０）が同定されている（非特許文献１〜４を参照のこと）。全てのＴＬＲが、Ｃ末端領域に隣接するロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を含む細胞外ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメイン（Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１レセプターホモロジードメイン（ＴＩＲ））を有している（非特許文献１〜４を参照のこと）。各ＴＩＲが、異なるリガンドを認識し、異なる（しかし時折重複する）免疫応答を惹起する（非特許文献２を参照のこと）。主要な抗原提示細胞である樹状細胞（ＤＣ）において、種々の免疫応答がＴＬＲを介して誘導される（非特許文献１を参照のこと）。抗原提示細胞は、最初に外来物質に遭遇してリンパ球に提示するためにその抗原をマウントする。ＤＣの活性化は、ＴＬＲ、およびＴＬＲのＴＩＲドメインを結合するアダプターによって差示的に調節され、適切なシグナル伝達経路を選択しそして出力を生じる（非特許文献２を参照のこと）。【０００６】  フグ（Ｆｕｇｕ  ｒｕｂｒｉｐｅｓ）ゲノムプロジェクトによると、ＴＩＲドメインの特性は進化を超えて保存されている（非特許文献５を参照のこと）。ヒトと比較した場合の主要な３つの差異が、フグＴｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｆｇＴＬＲ）にお���て同定された：（１）魚類にはＴＬＲ５の可溶性形態が存在するが、ヒトには存在しない；（２）魚類においてＴＬＲ４オルソログは同定されなかった；および、（３）ＴＬＲ２１およびＴＬＲ２２と名付けられたＴＬＲが魚類において新規に見出され、これらは魚類に特異的であった。ｆｇＴＬＲ２、ｆｇＴＬＲ３、ｆｇＴＬＲ５、ｆｇＴＬＲ７、ｆｇＴＬＲ８およびｆｇＴＬＲ９は、哺乳動物ＴＬＲのｆｇＴＬＲ２、ｆｇＴＬＲ３、ｆｇＴＬＲ５、ｆｇＴＬＲ７、ｆｇＴＬＲ８およびｆｇＴＬＲ９と構造的に対応する。ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ２１およびＴＬＲ２２が、魚類および哺乳動物の両方で、共通の祖先ゲノムにおいて存在すると解釈され得る。ＴＬＲ４は、魚類系統において欠損するが、ＴＬＲ２１およびＴＬＲ２２は、哺乳動物系統において欠損する。唯一ホヤ類（Ｃｉｏｎａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）が、３つの推定のＴｏｌｌ−ｌｉｋｅタンパク質を有し、このＴｏｌｌ−ｌｉｋｅタンパク質は、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  Ｔｏｌｌと同様に、Ｔｏｌｌファミリーに広がる前の原始形態を示す（非特許文献６および７を参照のこと）。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａは９つのＴＬＲを有し、これらの機能的特性は、ほとんどがボディパタニング（ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ）および宿主防御に関する（非特許文献８を参照のこと）。最近の証拠は、ＴＬＲ遺伝子の発生は魚類の発生より早いがホヤ類の発生より遅く、哺乳動物とは分かれているということを示唆する。種々の調査の結果は、哺乳動物の自然免疫系が、獲得免疫のアセンブリより前またはそれと同時に確立されたということを結論付ける。【０００７】  本発明者らは、ニジマスが、ｆｇＴＬＲ５Ｓに類似する２つのＴＬＲアイソフォーム（膜結合形態（ＴＬＲ５Ｍ）および可溶性形態（ＴＬＲ５Ｓ））を有することを見出している（非特許文献９を参照のこと）。しかし、魚類ＴＬＲの機能的特性に関する情報はほとんど得られていない。
【非特許文献１】Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，Ｒ．（２００１）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１，１３５−１４５
【非特許文献２】Ａｋｉｒａ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．（２００４）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４，４９９−５１１
【非特許文献３】Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ  Ｒｅｉｃｈｈａｒｔ，Ｊ．Ｍ．（２００２）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３，１２１−１２６
【非特許文献４】Ａｋｉｒａ，Ｓ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，３８１０５−３８１０８
【非特許文献５】Ｏｓｈｉｕｍｉ，Ｈ．，Ｔｓｕｊｉｔａ，Ｔ．，Ｓｈｉｄａ，Ｋ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｉｋｅｏ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｓｅｙａ，Ｔ．（２００３）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５４，７９１−８００
【非特許文献６】Ａｚｕｍｉ，Ｋ．，Ｄｅ  Ｓａｎｔｉｓ，Ｒ．，Ｄｅ  Ｔｏｍａｓｏ，Ａ．，Ｒｉｇｏｕｔｓｏｓ，Ｉ．，Ｙｏｓｈｉｚａｋｉ，Ｆ．，Ｐｉｎｔｏ，Ｍ．Ｒ．，Ｍａｒｉｎｏ，Ｒ．，Ｓｈｉｄａ，Ｋ．，Ｉｋｅｄａ，Ｍ．，Ｉｋｅｄａ，Ｍ．，Ａｒａｉ，Ｍ．，Ｉｎｏｕｅ，Ｙ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｔ．，Ｓａｔｏｈ，Ｎ．，Ｒｏｋｈｓａｒ，Ｄ．Ｓ．，Ｄｕ  Ｐａｓｑｕｉｅｒ，Ｌ．，Ｋａｓａｈａｒａ，Ｍ．，Ｓａｔａｋｅ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｎｏｎａｋａ，Ｍ．（２００３）Ｉｍｍｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５５，５７０−５８１
【非特許文献７】Ｐｕｊｏｌ，Ｎ．，Ｌｉｎｋ，Ｅ．Ｍ．，Ｌｉｕ，Ｌ．Ｘ．，Ｋｕｒｚ，Ｃ．Ｌ．，Ａｌｌｏｉｎｇ，Ｇ．，Ｔａｎ，Ｍ．Ｗ．，Ｒａｙ，Ｋ．Ｐ．，Ｓｏｌａｒｉ，Ｒ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｅｗｂａｎｋ，Ｊ．Ｊ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１１，８０９−８２１
【非特許文献８】Ｉｍｌｅｒ，Ｊ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｊ．Ａ．（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１，３０４−３１１
【非特許文献９】Ｔｓｕｋａｄａ，Ｈ．，Ｏｓｈｉｕｍｉ，Ｈ．，Ｆｕｋｕｉ，Ａ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｓｅｙａ，Ｔ．（２００１）Ｊｐｎ．Ｓｏｃ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６，１０２（ａｂｓｔｒ．）。
【０００８】  本発明者らは、ニジマスにおけるＴＬＲ５様タンパク質についてその特性を調べたところ、ニジマスの有する２つのＴＬＲ５の形態は、細菌の鞭毛タンパク質であるフラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）を認識することを見出した。本発明者らはさらに、ニジマスにおけるＴＬＲ５依存性免疫応答を調べたところ、２段階のフラジェリン応答が、サカナにおける細菌感染に対する宿主防御のために生じることを見出した：（ａ）フラジェリンは先ず膜ＴＬＲ５を介してＮＦ−κＢの基本的な活性化を誘導し、可溶性ＴＬＲ５および最小限の急性期タンパク質の産生を容易にした；（ｂ）誘導可能な可溶性ＴＬＲ５が、ポジティブフィードバック様式で、膜ＴＬＲ５媒介性細胞応答を増幅する。また、より詳細な検討を重ねた結果、ニジマスの可溶性ＴＬＲ５はフラジェリンに結合し、ニジマスの膜ＴＬＲ５だけでなくヒトのＴＬＲ５（ｈｕＴＬＲ５）を媒介するＮＦ−κＢ活性化を顕著に増強することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、ニジマス内におけるＴＬＲ５関連シグナル伝達の制御機構を明らかにしたにとどまらず、ニジマスタンパク質が種を越えてヒトにおいても機能するという、従来予想し得なかった画期的な効果を奏することが見出されたことに基づいて完成されたものである。このように、本発明は、種を越えて機能する、ＴＬＲ５シグナル伝達の増強因子として作動し得る魚類可溶性形態のＴＬＲ５およびその利用に関するものである。
【発明の開示】
【０００９】  本発明に係るアジュバントは、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを含むことを特徴としている。本発明において、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドは、ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチドであって、（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、であることが好ましい。なお、本発明において、ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチドは、（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列の２９〜５９７位からなるポリペプチド、または、（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列の２９〜５９７位において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、であってもよい。
【００１０】  本発明に係るアジュバントは、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリペプチドをさらに含むことが好ましい。本発明において、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリペプチドは、ｒｔＴＬＲ５Ｍ活性を有するポリペプチドであって、（１）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、（２）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、であることが好ましい。なお、本発明において、ｒｔＴＬＲ５Ｍ活性を有するポリペプチドは、（１）配列番号４に示されるアミノ酸配列の２１〜５９６位からなるポリペプチド、または、（２）配列番号４に示されるアミノ酸配列の２１〜５９６位において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、であってもよい。
【００１１】  本発明に係るアジュバントは、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むことを特徴としている。本発明において、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドは、ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、（１）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、（２）配列番号１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、（３）配列番号１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または、（４）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド、であることが好ましい。
【００１２】  本発明に係るアジュバントは、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリヌクレオチドをさらに含むことが好ましい。本発明において、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリヌクレオチドは、ｒｔＴＬＲ５Ｍ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、（１）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、（２）配列番号３に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、（３）配列番号３に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または、（４）配列番号３に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド、であることが好ましい。なお、本発明において、ｒｔＴＬＲ５Ｍ活性を有するポリペプチドは、（１）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、（２）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、であっても、（３）配列番号４に示されるアミノ酸配列の２１〜５９６位からなるポリペプチド、または、（４）配列番号４に示されるアミノ酸配列の２１〜５９６位において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、であってもよい。
【００１３】  本発明に係るアジュバントは、注入可能な形態であることが好ましい。
【００１４】  本発明に係るワクチン組成物は、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を含むことを特徴としている。
【００１５】  本発明に係るワクチン組成物において、上記免疫原成分は抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことが好ましい。
【００１６】  本発明に係るワクチン組成物において、上記抗原性ペプチドは鞭毛細菌であることが好ましい。
【００１７】  本発明に係るワクチン組成物において、上記ポリヌクレオチドは、配列番号５または７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドであることが好ましい。
【００１８】  本発明に係るワクチン組成物において、上記アジュバント成分は、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリヌクレオチドをさらに含むことが好ましい。
【００１９】  本発明に係るワクチン組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドをさらに含むことが好ましい。本発明に係るワクチン組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドの代わりにｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドを導入した形質転換細胞を含んでもよい。
【００２０】  本発明に係るワクチン組成物は、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を含むことを特徴としている。
【００２１】  本発明に係るワクチン組成物において、上記免疫原成分は抗原性ペプチドを含むことが好ましい。
【００２２】  本発明に係るワクチン組成物において、上記抗原性ペプチドは鞭毛細菌であってもよい。
【００２３】  本発明に係るワクチン組成物において、上記抗原性ペプチドは、配列番号６または８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。
【００２４】  本発明に係るワクチン組成物において、上記アジュバント成分は、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリペプチドをさらに含むことが好ましい。
【００２５】  本発明に係るワクチン組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドをさらに含むことが好ましい。本発明に係るワクチン組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドの代わりにｈｕＴＬＲ５ポリペプチド発現細胞を含んでもよい。
【００２６】  本発明に係るワクチン用キットは、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を備えていることを特徴としている。
【００２７】  本発明に係るワクチン用キットにおいて、上記免疫原成分は抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことが好ましい。
【００２８】  本発明に係るワクチン用キットにおいて、上記抗原性ペプチドは鞭毛細菌であってもよい。
【００２９】  本発明に係るワクチン用キットにおいて、上記ポリヌクレオチドは、配列番号５または７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。
【００３０】  本発明に係るワクチン用キットにおいて、上記アジュバント成分は、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリヌクレオチドをさらに含むことが好ましい。
【００３１】  本発明に係るワクチン用キットは、ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドをさらに備えていることが好ましい。本発明に係るワクチン組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドの代わりにｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドを導入した形質転換細胞を備えていてもよい。
【００３２】  本発明に係るワクチン用キットは、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を備えていることを特徴としている。
【００３３】  本発明に係るワクチン用キットにおいて、上記免疫原成分は抗原性ペプチドを含むことが好ましい。
【００３４】  本発明に係るワクチン用キットにおいて、上記抗原性ペプチドは鞭毛細菌であることが好ましい。
【００３５】  本発明に係るワクチン用キットにおいて、上記抗原性ペプチドは、配列番号６または８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが好ましい。
【００３６】  本発明に係るワクチン用キットにおいて、上記アジュバント成分は、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリペプチドをさらに含むことが好ましい。
【００３７】  本発明に係るワクチン用キットは、ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドをさらに備えていることが好ましい。本発明に係るワクチン組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドの代わりにｈｕＴＬＲ５ポリペプチド発現細胞を備えていてもよい。
【００３８】  本発明に係る薬学的組成物は、ガンまたは感染症を予防するために、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を含むことを特徴としている。
【００３９】  本発明に係る薬学的組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドをさらに含むことが好ましい。本発明に係る薬学的組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドの代わりにｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドを導入した形質転換細胞を含んでもよい。
【００４０】  本発明に係る薬学的組成物は、ガンまたは感染症を予防するために、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を含むことを特徴としている。
【００４１】  本発明に係る薬学的組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドをさらに含むことが好ましい。本発明に係る薬学的組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドの代わりにｈｕＴＬＲ５ポリペプチド発現細胞を含んでもよい。
【００４２】  本発明に係るキットは、ガンまたは感染症を予防するために、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を備えていることを特徴としている。
【００４３】  本発明に係るキットは、ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドをさらに備えていることが好ましい。本発明に係るキットは、ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドの代わりにｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドを導入した形質転換細胞を備えていてもよい。
【００４４】  本発明に係るキットは、ガンまたは感染症を予防するために、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を備えていることを特徴としている。
【００４５】  本発明に係るキットは、ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドをさらに備えていることが好ましい。本発明に係るキットは、ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドの代わりにｈｕＴＬＲ５ポリペプチド発現細胞を備えていてもよい。
【００４６】  本発明に係る検出薬は、被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するために、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むことを特徴としている。
【００４７】  本発明に係る検出薬は、被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するために、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを含むことを特徴としている。
【００４８】  本発明に係る検出キットは、被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するために、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを備えていることを特徴としている。
【００４９】  本発明に係る検出キットは、被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するために、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを備えていることを特徴としている。
【００５０】  本発明に係る検出方法は、被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するために、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを導入した細胞を、被験体サンプルとインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００５１】  本発明に係る検出方法は、被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するために、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを、被験体サンプルから単離した血球細胞とインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００５２】  本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明に明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１Ａ】ｒｔＴＬＲ５Ｍを単離するための縮重プライマーの設計を示した図である。
【図１Ｂ】ｒｔＴＬＲ５ＭおよびｒｔＴＬＲ５ＳのｃＤＮＡ配列に基づく推定のアミノ酸配列の整列を示した図である。
【図１Ｃ】ｒｔＴＬＲ５ＳおよびｒｔＴＬＲ５Ｍのドメイン配向を示す模式図である。
【図１Ｄ】ｒｔＴＬＲ５ＳおよびｒｔＴＬＲ５Ｍの組織分布を示すＲＴ−ＰＣＲの結果を示した図である。
【図２Ａ】ｒｔＴＬＲ５ＳおよびｒｔＴＬＲ５Ｍのエクソン−イントロン構造を示した図である。
【図２Ｂ】プローブＳによって検出したサザン分析の結果を示した図である。
【図２Ｃ】プローブＭによって検出したサザン分析の結果を示した図である。
【図３】死菌Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍでの細胞刺激後のｒｔＴＬＲ５Ｍ、ｒｔＴＬＲ５ＳおよびｒｔＩＬ−１βのｍＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲによってモニタリングした、Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍに対するＲＴＨ−１４９細胞の応答を示した図である。
【図４Ａ】精製したＧＳＴ融合フラジェリン（ＧＳＴ−ＦｌａＡおよびＧＳＴ−ＦｌａＣ）を示した図である。
【図４Ｂ】ＧＳＴをトロンビン消化して除去したｒＦｌａＡおよびｒＦｌａＣを示した図である。
【図４Ｃ】ｒＦｌａＡで刺激したＲＴＨ−１４９細胞およびＲＴＧ−２細胞におけるＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。
【図４Ｄ】誘導性ｒｔＴＬＲ５Ｓの定量的ＰＣＲ分析を示した図である。
【図５Ａ】Ｈｅｌａ形質転換体におけるＳ−キメラのシグナル伝達を示す。Ｈｅｌａ  Ｓ−キメラ形質転換体およびｈｕＴＬＲ５形質転換体におけるＮＦ−κＢ活性を測定するためのルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイの結果を示した図である。
【図５Ｂ】Ｈｅｌａ  Ｓ−キメラ形質転換体を種々のＴＬＲリガンドで刺激した際のルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイの結果を示した図である。
【図６Ａ】Ｍ−キメラを発現するＣＨＯ細胞（左）およびＨｅｌａ細胞（右）におけるＮＦ−κＢ活性測定についてのルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイの結果を示した図である。
【図６Ｂ】Ｍ−キメラまたはｈｕＴＬＲ５を発現する細胞を種々のＴＬＲリガンドで刺激した結果を示した図である。
【図６Ｃ】Ｍ−キメラを発現するＣＨＯ細胞（左パネル）またはＨｅｌａ細胞（右パネル）において、ｒｔＴＬＲ５Ｓ発現細胞の上清を添加することによるフラジェリン依存的ＮＦ−κＢ活性化の効果を示した図である。
【図７Ａ】精製したＨｉｓタグ化ｒｔＴＬＲ５Ｓがフラジェリンと結合することを示した図である。
【図７Ｂ】Ｍ−キメラを発現する細胞において、精製したｒｔＴＬＲ５Ｓを添加することによるフラジェリン依存的ＮＦ−κＢ活性化の効果を示した図である。
【図８Ａ】ｒｔＴＬＲ５Ｓとｈｕ／ｍｏ／ｆｇＴＬＲ５の細胞外ＬＲＲドメインとを比較したアラインメントを示した図である。
【図８Ｂ】ｒｔＴＬＲ５のＫ−Ｄプロット分析の結果を示した図である。
【図９Ａ】ｒｔＴＬＲ５Ｓキメラレセプターを発現するＨｅｌａ細胞におけるキメラレセプターを介したフラジェリン応答性ＮＦ−κＢ活性化を示す。
【図９Ｂ】キメラレセプターが種々の起源のフラジェリンに応答してＮＦ−κＢを活性化することを示す。
【図９Ｃ】ｈｕＴＬＲ５およびＳ−キメラを種々のＴＬＲリガンドで刺激した際のＮＦ−κＢレポーター活性を示した図である。
【図１０】ｒｔＴＬＲ５Ｓありまたはなしの条件下でｈｕＴＬＲ２，ｈｕＴＬＲ４またはｈｕＴＬＲ５のｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞を種々のＴＬＲリガンドで刺激した際のＮＦ−κＢレポーター活性を示した図である。
【図１１Ａ】ｈｕＴＬＲ５のみを発現するＨｅｌａ細胞またはｈｕＴＬＲ５およびｒｔＴＬＲ５Ｓを発現するＨｅｌａ細胞をフラジェリンＡで刺激した際のＮＦ−κＢレポーター活性を示した図である。
【図１１Ｂ】免疫沈降を用いてフラジェリンとｒｔＴＬＲ５Ｓとの直接的な相互作用を示した図である。
【図１１Ｃ】免疫沈降を用いてフラジェリンとｒｔＴＬＲ５Ｓとの直接的な相互作用を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】  運動性を有する細菌は、スピロヘータを除いて、鞭毛（ｆｌａｇｅｌｌａ）という１本以上の線維状の付属物を有する。鞭毛は、その大部分または全部がタンパク質で構成されている。鞭毛のタンパク質はフラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）と呼ばれ、動物の菌線維の構成タンパク質であるミオシンと同種であると考えられている。【００５５】  グラム陰性通性嫌気性桿菌であるＶｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅに属するＶｉｂｒｉｏ  ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ（Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）は、養殖魚にしばしば大きな被害をもたらす重要な魚病細菌である。Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍによる感染症は、ビブリオ病と呼ばれ、急性では出血性敗血症、慢性感染では体表に潰瘍または斑状出血を生じる。【００５６】  哺乳動物ＴＬＲは種々の微生物パターン分子を認識する。例えば、ヒトＴＬＲ５（ｈｕＴＬＲ５）およびマウスＴＬＲ５（ｍｏＴＬＲ５）は、フラジェリンを認識し、転写因子ＮＦ−κＢを活性化するシグナルを送達する（Ｈａｙａｓｈｉ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１０：１０９９−１１０３（２００１）を参照のこと）。ＴＬＲ５およびＴＬＲ４はまた、フラジェリンに応答してインターフェロン調節因子３（ＩＲＦ３）を活性化する（Ｍｉｚｅｌ  ＳＢ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：６２１７−６２２３（２００３）を参照のこと）。【００５７】  フラジェリンはまた、ヒトＴＬＲ５またはマウスＴＬＲ５を活性化して樹状細胞応答を惹起することが知られている。ＴＬＲ５は、単独では主にＮＦ−κＢを、ＴＬＲ４と複合体を形成した場合はＩＦＮ−α／βを活性化して、炎症性サイトカインを惹起する。【００５８】  上述したように、ニジマスは、フグのｆｇＴＬＲ５Ｓに類似する２つのＴＬＲアイソフォーム（膜結合形態（ＴＬＲ５Ｍ）および可溶性形態（ＴＬＲ５Ｓ））を有する（非特許文献９を参照のこと）。これらの知見に基いて、本発明者らは、魚類のＴＬＲ５がフラジェリンに起因する感染症の制御に関与していると考えた。【００５９】  本発明者らは、ＴＬＲ５とフラジェリンとの応答を魚類（ニジマス）において観察すると、微量のフラジェリン刺激によって、弱いサイトカイン産生が最初に誘起され、６時間以上経過すると、強力なサイトカイン産生が生じることを見出した。この機構をニジマスの細胞株においてさらに調べると、フラジェリン投与後４時間以内に可溶性形態であるｒｔＴＬＲ５Ｓが最初に発現し、続いて強いサイトカイン誘導が生じることが判明した。【００６０】  さらなる研究によって、本発明者らは、ｒｔＴＬＲ５Ｓが弱いフラジェリンシグナルを感知する能力を有し、フラジェリンｒｔＴＬＲ５Ｓ複合体が膜結合形態ＴＬＲ５を強力に活性化し、その結果、顕著なＮＦ−κＢ活性化および強いサイトカイン産生誘導が生じることを見出した。すなわち、本発明者らは、魚類の可溶性形態ＴＬＲ５は、鞭毛細菌に対する強力なアジュバントであることを見出した。本発明者らはまた、この魚類の可溶性形態ＴＬＲ５による効果が、魚類における特殊現象ではなく、ヒトＴＬＲ５発現細胞においてもまた同様にもたらされることを見出した。【００６１】  本明細書中において使用される場合、用語「鞭毛細菌」は、鞭毛を有する細菌が意図される。鞭毛細菌としては、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい鞭毛細菌は、Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍである。【００６２】  本明細書中において使用される場合、用語「鞭毛タンパク質」は、鞭毛を構成するタンパク質であり、主にフラジェリンであることが意図される。フラジェリンには、ＦｌａＡ、ＦｌａＣなどのアイソフォームがあり、本明細書中において使用される場合、これらのいずれかに限定されない。【００６３】  〔１〕ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドおよびポリヌクレオチド
本発明は、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを提供する。【００６４】  本明細書中において使用される場合、「ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチド」は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、あるいはこれらの変異体が意図される。本明細書中においてタンパク質またはポリペプチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチドが意図される。本明細書中で使用される場合、用語「ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチド」は、膜結合形態のＴＬＲ５（ｈｕＴＬＲ５、ｒｔＴＬＲ５Ｍ、ｍｏＴＬＲ５など）の活性を増幅する機能（すなわち、ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性）を有するポリペプチドが意図される。また、用語「ｒｔＴＬＲ５Ｍ活性を有するポリペプチド」は、フラジェリンを認識して、強いサイトカイン誘導および／または樹状細胞の成熟化を引き起こす機能を有するポリペプチドが意図される。なお、「ｈｕＴＬＲ５」および「ｍｏＴＬＲ５」は、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号「ＡＢ０６０６９５」および「ＡＦ１８６１０７」によって提供されることを、当業者は容易に認識する。よって、本明細書中で使用される場合、「ｈｕＴＬＲ５ポリペプチド」および「ｍｏＴＬＲ５ポリペプチド」は、上記データベース情報に記載のポリペプチドであり、「ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチド」および「ｍｏＴＬＲ５ポリヌクレオチド」は、上記データベース情報に記載のポリヌクレオチドであることが意図される。【００６５】  本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明に係るポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。【００６６】  用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。【００６７】  本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明に係るポリペプチドは、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。さらに、本発明に係るポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。【００６８】  本発明に係るポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖およびイソプレノ��ド基等を挙げることができるが、特に限定されない。【００６９】  また、本発明に係るポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。【００７０】  一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドまたはその変異体であって、ここで当該変異体は、ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチドであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが好ましい。【００７１】  このような変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性の残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が挙げられる。特に、ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しない。【００７２】  ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。【００７３】  当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望のｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するか否かを容易に決定し得る。【００７４】  好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係るポリペプチドのｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を変化させない。【００７５】  代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。【００７６】  このように、本発明に係るｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドは、ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチドであって、（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、であることが好ましい。なお、後述する実施例からも明らかなように、ｒｔＴＬＲ５���ポリペプチドは、（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列の２９〜５９７位からなるポリペプチド、または、（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列の２９〜５９７位において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、であってもよい。【００７７】  他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドまたはその変異体であって、ここで当該変異体は、ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチドであって、配列番号１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。【００７８】  他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドまたはその変異体であって、ここで当該変異体は、ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチドであって、配列番号１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。【００７９】  ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。【００８０】  本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０ｎｔより長いポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。このようなポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）は、本明細書中においてより詳細に考察されるような検出用プローブとしても有用である。【００８１】  他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、ｒｔＴＬＲ��Ｓポリペプチドまたはその変異体であって、ここで当該変異体は、ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチドであって、配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。【００８２】  例えば、「本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの参照（ＱＵＥＲＹ）塩基配列に少なくとも９５％同一の塩基配列からなるポリヌクレオチド」によって、対象塩基配列が、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの参照塩基配列の１００ヌクレオチチド（塩基）あたり５つまでの不一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）を含み得ることを除いて、参照配列に同一である、ということが意図される。換言すれば、参照塩基配列に少なくとも９５％同一の塩基配列からなるポリヌクレオチドを得るために、参照配列における塩基の５％までが、欠失され得るかまたは別の塩基で置換され得るか、あるいは参照配列における全塩基の５％までの多くの塩基が、参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの不一致は、参照塩基配列の５’または３’末端位置または参照配列における塩基中で個々にかまたは参照配列内の１以上の隣接した群においてのいずれかで分散されて、これらの末端部分の間のどこでも起こり得る。【００８３】  任意の特定の核酸分子が、例えば、配列番号１に示される塩基配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラム（例えば、Ｂｅｓｔｆｉｔ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１）を使用して決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の最も良好な相同性セグメントを見出す（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２〜４８９（１９８１））。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列プログラムを用いて、特定の配列が、本発明に従う参照配列に対して、例えば、９５％同一であるか否かを決定する場合は、同一性のパーセントが参照塩基配列の全長にわたって計算され、そして参照配列におけるヌクレオチド数全体の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように、パラメーターが設定される。【００８４】  特定の実施形態では、参照（ＱＵＥＲＹ）配列（本発明に係る配列）と対象配列との間の同一性（全体的な配列整列ともいわれる）は、Ｂｒｕｔｌａｇらのアルゴリズム（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７〜２４５（１９９０））に基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定される。％同一性を計算するために、ＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好ましいパラメーターは：Ｍ��ｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝５００または対象塩基配列の長さ（どちらかより短い方）である。この実施形態に従って、対象配列が、５’または３’欠失に起因して（内部の欠失が理由ではなく）ＱＵＥＲＹ配列よりも短い場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、同一性パーセントを算定する場合に、対象配列の５’短縮化および３’短縮化を考慮しないという事実を考慮して、手動の補正が結果に対してなされる。ＱＵＥＲＹ配列と比較して５’末端または３’末端が短縮化された対象配列については、同一性パーセントは、一致／整列していない、対象配列の５’および３’であるＱＵＥＲＹ配列の塩基数を、ＱＵＥＲＹ配列の総塩基のパーセントとして計算することにより補正される。ヌクレオチドが一致／整列しているか否かの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセントが、指定されたパラメーターを使用する上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算された同一性パーセントから差し引かれ、最終的な同一性パーセントスコアに到達する。この補正されたスコアが、本実施形態の目的で使用されるものである。ＱＵＥＲＹ配列と一致／整列していない対象配列の５’塩基および３’塩基の外側の塩基のみが、ＦＡＳＴＤＢ整列に示されるように、同一性パーセントスコアを手動で調整する目的で計算される。例えば、９０塩基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために１００塩基のＱＵＥＲＹ配列と整列される。その欠失は、対象配列の５’末端で生じ、従ってＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０塩基の一致／整列を示さない。１０個の不対合塩基は、配列の１０％（整合していない５’末端および３’末端での塩基の数／ＱＵＥＲＹ配列中の塩基の総数）を表し、そのため１０％が、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。残りの９０残基が完全に整合する場合、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００塩基のＱＵＥＲＹ配列と比較される。この場合、その欠失は内部欠失であり、そのためＱＵＥＲＹ配列と整合／整列しない対象配列の５’末端または３’末端の塩基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正されない。再度、ＱＵＥＲＹ配列と整合／整列しない対象配列の５’末端および３’末端の塩基のみが手動で補正される。他の手動の補正は、本実施形態の目的のためにはなされない。【００８５】  このように、本発明に係るｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドは、ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチドであって、（１）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、（２）配列番号１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、（３）配列番号１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または、（４）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド、によってコードされるポリペプチドであることが好ましい。なお、後述する実施例からも明らかなように、ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチドは、（１）配列番号１に示される塩基配列の８８〜１７９１位からなるポリヌクレオチド、（２）配列番号１に示される塩基配列の８８〜１７９１位において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、（３）配列番号１に示される塩基配列の８８〜１７９１位において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または、（４）配列番号１に示される塩基配列の８８〜１７９１位と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド、によってコードされるポリペプチドであってもよい。【００８６】  本発明はまた、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを提供する。【００８７】  本明細書中において使用される場合、「ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチド」は、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその変異体が意図される。本明細書中においてＤＮＡまたはポリヌクレオチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが意図される。【００８８】  本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、「配列番号１に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。【００８９】  本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。【００９０】  本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレ��チドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化合合成されてもよい。【００９１】  本発明に係るポリヌクレオチドはまた、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。【００９２】  一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドまたはその変異体であって、ここで当該変異体はｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドをコードし、かつ以下のポリヌクレオチドのいずれであることが好ましい：
・配列番号１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
・配列番号１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
・配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド。【００９３】  このように、本発明に係るｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドは、ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、（１）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、（２）配列番号１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、（３）配列番号１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または、（４）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド、であることが好ましい。なお、後述する実施例からも明らかなように、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドは、（１）配列番号１に示される塩基配列の８８〜１７９１位からなるポリヌクレオチド、（２）配列番号１に示される塩基配列の８８〜１７９１位において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、（３）配列番号１に示される塩基配列の８８〜１７９１位において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または、（４）配列番号１に示される塩基配列の８８〜１７９１位と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド、であってもよい。【００９４】  本発明に係るポリヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列またはベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。【００９５】  本発明に係るポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、生物材料（例えば、ヒトまたはマウスなどの諸器官）であることが好ましい。本明細書中で使用される場合、用語「生物材料」は、生物学的サンプル（生物体から得られた組織サンプルまたは細胞サンプル）が意図される。下述する実施例においては、ニジマス血球細胞を用いているが、これに限定されない。【００９６】  本発明に係るポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、本明細書中にさらに記載されるように、ガンまたは感染疾患に対する免疫応答を惹起するためのワクチンにおけるアジュバントとして使用され得る。また、本発明を使用すれば、種々の疾患（例えば、ウイルス感染症、細菌感染症もしくは寄生虫感染症、ガン、アレルギー、または自己免疫疾患など）を罹患する被験体（好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒト）を防御または治療するために、あるいは上記���患を予防するために適用することができる。さらに、本発明を使用すれば、鞭毛細菌感染を検出することができる。【００９７】  本発明の目的は、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチド、およびｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリペプチド作製方法およびポリヌクレオチド作製方法等に存するのではない。従って、上記各方法以外によって取得されるｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチド、およびｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。【００９８】  〔２〕ベクター
本発明は、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを生成するために使用されるベクターを提供する。本発明に係るベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであっても組換え発現に用いるベクターであってもよい。【００９９】  本発明に係るベクターは、上述した本発明に係るポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されない。例えば、ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターなどが挙げられる。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。【０１００】  ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明に係るポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係るポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。また、発現ベクターによる宿主の形質転換もまた、慣用的な手法に従って行うことができる。【０１０１】  上記発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、培養、栽培または飼育した後、培養物等から慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等）に従って、目的タンパク質を回収、精製することができる。【０１０２】  発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、およびＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。【０１０３】  上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明に係るポリペプチドを昆虫で転移発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。【０１０４】  本発明に係るベクターを使用すれば、上記ポリヌクレオチドを生物または細胞に導入すれば、当該生物または細胞中にｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチドを発現させることができる。さらに、本発明に係るベクターを無細胞タンパク質合成系に用いれば、ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチドを合成することができる。【０１０５】  このように、本発明に係るベクターは、少なくとも、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含めばよいといえる。すなわち、発現ベクター以外のベクターも、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。【０１０６】  〔３〕形質転換体
本発明は、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換体」は、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体をも含むことが意図される。【０１０７】  本発明に係る形質転換体は、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドが発現されていることを特徴とする。本発明に係る形質転換体は、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドが安定的に発現することが好ましい。【０１０８】  一実施形態において、本発明に係る形質転換体は、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドが発現され得るように生物中に導入することによって取得される。本実施形態に係る形質転換体は、原核生物であっても真核生物であってもよい。本実施形態に係る形質転換体は、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリペプチドが発現され得るように生物中に導入されてもよい。この場合、ｒｔＴＬＲ５ＳポリヌクレオチドおよびｒｔＴＬＲ５Ｍポリヌクレオチドの導入は、同時であっても別々であってもよい。【０１０９】  本明細書中において使用される場合、「ｒｔＴＬＲ５Ｍポリペプチド」は、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、あるいはこれらの変異体が意図される。用語「ｒｔＴＬＲ５Ｍ活性を有するポリペプチド」は、上述したように、フラジェリンを認識して、強いサイトカイン誘導および／または樹状細胞の成熟化を引き起こす機能を有するポリペプチドが意図される。【０１１０】  すなわち、本発明において、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリペプチドは、ｒｔＴＬＲ５Ｍ活性を有するポリペプチドであって、（１）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、（２）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、であることが好ましい。なお、後述する実施例からも明らかなように、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリペプチドは、（１）配列番号４に示されるアミノ酸配列の２１〜５９６位からなるポリペプチド、または、（２）配列番号４に示されるアミノ酸配列の２１〜５９６位において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、であってもよい。【０１１１】  また、本発明において、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリペプチドは、ｒｔＴＬＲ５Ｍ活性を有するポリペプチドであって、（１）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、（２）配列番号３に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、（３）配列番号３に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または、（４）配列番号３に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、��５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド、によってコードされるポリペプチドであることが好ましい。なお、後述する実施例からも明らかなように、ｒｔＴＬＲ５Ｍ活性を有するポリペプチドは、（１）配列番号３に示される塩基配列の６４〜１７８８位からなるポリヌクレオチド、（２）配列番号３に示される塩基配列の６４〜１７８８位において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、（３）配列番号３に示される塩基配列の６４〜１７８８位において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または、（４）配列番号３に示される塩基配列の６４〜１７８８位と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド、によってコードされるポリペプチドであってもよい。【０１１２】  本明細書中において使用される場合、「ｒｔＴＬＲ５Ｍポリヌクレオチド」は、配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその変異体が意図され、ここで当該変異体はｒｔＴＬＲ５Ｍポリペプチドをコードし、かつ以下のポリヌクレオチドのいずれであることが意図される：
・配列番号３に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
・配列番号３に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
・配列番号３に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド。【０１１３】  すなわち、本発明において、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリヌクレオチドは、ｒｔＴＬＲ５Ｍ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、（１）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、（２）配列番号３に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、（３）配列番号３に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または、（４）配列番号３に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド、であることが好ましい。なお、本発明において、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリヌクレオチドは、（１）配列番号３に示される塩基配列の６４〜１７８８位からなるポリヌクレオチド、（２）配列番号３に示される塩基配列の６４〜１７８８位において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、（３）配列番号３に示される塩基配列の６４〜１７８８位において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または、（４）配列番号３に示される塩基配列の６４〜１７８８位と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド、であってもよい。【０１１４】  〔４〕アジュバント
本発明はまた、ｒｔＴＬＲ５ＳポリペプチドまたはｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むアジュバントを提供する。【０１１５】  「アジュバント」は、「免疫賦活剤」とも呼ばれ、抗原と混合または組み合わせることによって、抗体産生の増大または免疫応答の増強を生じさせる物質の総称であり、［１］抗原を不溶化することによって組織に長く貯留し、抗原を徐々に長時間遊離させる；［２］抗原をマクロファージに貪食されやすい状態にする；または、［３］免疫に関する細胞を非特異的に活性化する、の少なくともいずれか１つの性質を有する。抗原または他の免疫原性物質を投与する際に用いられるアジュバントの有用性は、以前から認められている。なお、本明細書中で使用される場合、用語「アジュバント」は「アジュバント成分」と交換可能に使用され得る。【０１１６】  種々のアジュバントが、宿主種に依存して、免疫学的応答を増加させるために使用され得る。このようなアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル（ｍｉｎｅｒａｌ  ｇｅｌ）、リゾレシチンのような表面活性物質、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍのような潜在的に有用なヒトアジュバント。また、このようなアジュバントは当該分野で周知である。【０１１７】  アジュバントは、生成される抗体の量を増加させるとともに、注射に必要な抗原量、すなわち、注射回数を低減させる。ヒトにおいて使用されているアジュバントとしては、日本ではアルミニウム化合物（水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）のみであり、破傷風トキソイド、ジフテリア・百日咳・破傷風混合ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、および蛇毒トキソイドにおいて使用されている。また、フランスでは、リン酸カルシウムが、ジフテリア・百日咳・破傷風混合ワクチンやポリオワクチンなどに使用されている。【０１１８】  本発明者らは、上述したように、ｒｔＴＬＲ５Ｓが弱いフラジェリンシグナルを感知する能力を有し、フラジェリンｒｔＴＬＲ５Ｓ複合体が膜結合形態ＴＬＲ５を強力に活性化し、その結果、顕著なＮＦ−κＢ活性化および強いサイトカイン産生誘導が生じることを見出した。すなわち、本発明者らは、魚類の可溶性形態ＴＬＲ５は、鞭毛細菌に対する強力なアジュバントであることを見出した。【０１１９】  本発明に係るアジュバントは、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを含むことが好ましい。一実施形態において、本発明に係るアジュバントは、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリペプチドをさらに含むことが好ましい。【０１２０】  本発明に係るアジュバントは、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むことが好ましい。本発明に係るアジュバントは、当該ポリヌクレオチドによってコードされるｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドが発現することによってアジュバント能を発揮する。一実施形態において、本発明に係るアジュバントは、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリヌクレオチドをさらに含むことが好ましい。【０１２１】  本明細書中に���いて使用される場合、「ｒｔＴＬＲ５Ｍポリヌクレオチド」は、配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその変異体が意図される。本明細書中においてＤＮＡまたはポリヌクレオチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、ｒｔＴＬＲ５Ｍ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが意図される。【０１２２】  後述する実施例から明らかなように、ｒｔＴＬＲ５Ｓが有するアジュバント能によってもたらされる効果は、魚類における特殊現象ではなく、ヒトＴＬＲ５発現細胞においてもまた同様にもたらされる。すなわち、本発明に係るアジュバントを使用すれば、これまで困難であったヒトへの応用が可能となる。【０１２３】  〔５〕ワクチン
本発明は、ｒｔＴＬＲ５ＳポリペプチドまたはｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むアジュバント成分を含むワクチン組成物を提供する。一実施形態において、本発明に係るワクチン組成物は、免疫原成分をさらに含むことが好ましい。【０１２４】  本明細書中において使用される場合、用語「ワクチン」は、生体の免疫系を刺激することによって疾病（疾患、障害）を予防するために使用される薬剤が意図される。用語「免疫系」は、例えば、インターフェロン産生のような、多細胞生体が生体細胞または生体外液に侵入した抗原性物質に対して抗体を産生する機構を含み、このようにして産生された抗体は、免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、ＧまたはＭ（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）という免疫学的分類のいずれかに属する。ＩｇＡが温血動物の分泌系統から得られる主要免疫グロブリンであることに注目すれば、特に興味あるワクチンはＩｇＡの産生を刺激するワクチンである。しかし、本明細書中において使用される場合、「ワクチン」はＩｇＡの産生を刺激するワクチンに限定されない。すなわち、「ワクチン」は、広範な免疫反応を起こし得る。【０１２５】  脊椎動物は、魚類、両生類、爬虫類、鳥類および哺乳類を含む脊椎動物亜門の一員であり、いずれも軟骨性脊柱を有することが特徴であり、全ての脊椎動物が免疫系を有する。従って、本明細書中において使用される場合、「ワクチン」の適用対象は、哺乳動物に限定されない。【０１２６】  動物において免疫応答を誘発することができる抗原（主に細菌成分、すなわち、ポリペプチド）を動物系中へ導入することによって動物を感染から防御する伝統的なワクチン接種技術が長年にわたって知られている（本明細書中において使用される場合、このようなワクチンをペプチドワクチンという）。近年、プラスミドＤＮＡを動物細胞にインビボで直接導入することができるようになり、その結果、抗原性ペプチドをコードするＤＮＡを動物中に直接導入することによって動物において免疫応答を誘発するワクチン接種技術が開発されている。このような技術は、「ＤＮＡ免疫化（ＤＮＡ  ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ）」または「ＤＮＡワクチン接種（ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）」と呼ばれており、本明細書中において使用される場合、このようなワクチンをＤＮＡワクチンという。【０１２７】  本発明に係るワクチン組成物は、ペプチドワクチンであってもＤＮＡワクチンであってもよい。【０１２８】  一実施形態において、本発明に係るワクチン組成物は、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を含む、いわゆるペプチドワクチンであり得る。本実施形態に係るワクチン組成物において、上記免疫原成分は抗原性ペプチドを含むことが好ましい。上記抗原性ペプチドは鞭毛細菌であることが好ましく、配列番号６または８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（すなわち、ＦｌａＡタンパク質またはＦｌａＣタンパク質）であることがより好ましい。【０１２９】  本発明に係るワクチン組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドをさらに含んでいてもよい。また、本発明に係るワクチン組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドの代わりにｈｕＴＬＲ５ポリペプチド発現細��を含んでいてもよい。【０１３０】  他の実施形態において、本発明に係るワクチン組成物は、ＤＮＡワクチンであり得る。ＤＮＡワクチンは、通常、強力なプロモーターが挿入される細菌プラスミドベクター、免疫原をコードする目的の遺伝子およびポリアデニル化／転写停止配列から構成される。目的の遺伝子がコードする免疫原は、タンパク質であっても、病原体もしくは腫瘍または防御されることを意図される他の作用物質に関連する抗原性ペプチドであってもよい。プラスミドは、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）において増殖させた後に単離され、宿主に投与される前に、意図される投与経路に応じて適切な培地中にて調製される。ＤＮＡワクチン接種は、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｊら、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７−６４８（１９９７）（その開示の全てが本明細書中において参考として援用される）を参照のこと。【０１３１】  本実施形態に係るワクチン組成物は、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を含み得る。本実施形態に係るワクチン組成物において、上記免疫原成分は抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことが好ましい。上記抗原性ペプチドは鞭毛細菌であることが好ましく、配列番号５または７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（すなわち、ＦｌａＡまたはＦｌａＣのｃＤＮＡ）によってコードされることがより好ましい。【０１３２】  本発明に係るワクチン組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。また、本発明に係るワクチン組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドの代わりにｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドを導入した形質転換細胞を含んでもよい。【０１３３】  フラジェリンは自然免疫のアジュバント機能を介する抗ガン活性および／または抗感染活性を有する。従って、抗原性を有する物質と組み合わせてｒｔＴＬＲ５Ｓをヒトに投与すれば、感作増強されたワクチンを提供することができる。ヒトには可溶性形態のＴＬＲ５は存在しない。にもかかわらず、魚類由来の可溶性形態のＴＬＲ５によって、ヒトＴＬＲ５（ｈｕＴＬＲ５）の機能が増強されるという知見は全く予想し得ないものであった。後述する実施例から明らかなように、ｒｔＴＬＲ５Ｓはフラジェリンと複合体化するので、本発明に係るワクチン組成物は、その投与形態にかかわらずｈｕＴＬＲ５に基づく免疫応答を首尾よく増強し得る。【０１３４】  本発明に係るワクチン組成物は、アジュバント成分および免疫原成分以外に薬学的に受容可能なキャリアを含んでもよい。ワクチン組成物中に使用される薬学的に受容可能なキャリアは、ワクチン組成物の投与形態および剤型に応じて選択することができる。【０１３５】  本明細書中で使用される場合、薬理学的に受容可能なキャリアとしては、製剤素材として使用可能な各種有機または無機のキャリア物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、または崩壊剤、あるいは、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁剤、等張化剤、緩衝剤、または無痛化剤などとして配合される。【０１３６】  賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、デン���ン、結晶セルロースなどが挙げられ、滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。【０１３７】  結合剤としては、例えば、α化デンプン、メチルセルロース、結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、トレハロース、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。【０１３８】  崩壊剤としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウムなどが挙げられる。【０１３９】  溶剤としては、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、トリカプリリンなどが挙げられる。【０１４０】  溶解補助剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。【０１４１】  懸濁剤としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤、あるいは、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子が挙げられる。【０１４２】  等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールなどが挙げられる。【０１４３】  緩衝剤としては、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。【０１４４】  無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコールなどが挙げられる。【０１４５】  防腐剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。【０１４６】  抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。【０１４７】  本実施形態に係るワクチン組成物は、製剤技術分野において慣用的な方法に従って製造することができる。【０１４８】  本実施形態に係るワクチン組成物の形態は、血中にて高濃度をもたらすことができる形態、すなわち、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下、および関節内の注射に適切な「注入可能な形態」であることが好ましいがこれらに限定されず、例えば、錠剤、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含むが、徐放性であることが好ましい）、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口剤、あるいは、注射剤、坐剤、ペレット、点滴剤などの非経口剤であってもよい。本発明に係るワクチン組成物は、毒性が低いので経口的または非経口的に投与することができる。用語「非経口」は、本明細書中で使用される場合、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下、および��節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。【０１４９】  また、ＤＮＡワクチンとしての本発明に係るワクチン組成物の形態は、リポソームまたはポリラクチドコグリコリド粒子内に封入した経口、経鼻または経気管支での投与に適した形態が好ましい。ＤＮＡワクチンとしての本発明に係るワクチン組成物およびワクチン用キットのさらに好ましい投与形態は、遺伝子銃を用いる形態である。遺伝子銃を用いるＤＮＡ導入技術は当該分野において公知であり、例えば、Ｈａｙｎｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４４：３７−４２（１９９６）（この全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されている。【０１５０】  本実施形態に係るワクチン組成物の投与量は、投与対象、投与経路、症状などによっても異なるが、当業者は、これら投与対象、投与経路、症状などに応じて、最適な条件を適宜設定することができる。【０１５１】  本実施形態に係るワクチン組成物は、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与することができる。投与方法も特に限定はなく、内用、外用および注射によって適用することができる。注射剤は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与することができる。【０１５２】  本明細書において使用される場合、「ワクチン組成物」は、アジュバント成分および免疫原成分を単一形態中に含む。従って、当該２成分を別々に投与することが意図される場合、「ワクチン組成物」は、アジュバント成分および免疫原成分を別個に備えるワクチン用キットとして提供される。【０１５３】  一実施形態において、本発明に係るワクチン用キットは、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を備え得る。好ましくは、これら２成分はそれぞれ別個の容器中に収容され得る。本実施形態に係るワクチン用キットにおいて、上記免疫原成分は抗原性ペプチドを含むことが好ましい。上記抗原性ペプチドは鞭毛細菌であることが好ましく、配列番号６または８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（すなわち、ＦｌａＡタンパク質またはＦｌａＣタンパク質）であることがより好ましい。【０１５４】  本発明に係るワクチン用キットは、ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドをさらに備えていてもよい。また、本発明に係るワクチン用キットは、ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドの代わりにｈｕＴＬＲ５ポリペプチド発現細胞を備えていてもよい。【０１５５】  他の実施形態において、本発明に係るワクチン用キットは、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を備え得る。好ましくは、これら２成分はそれぞれ別個の容器中に収容され得る。本実施形態に係るワクチン用キットにおいて、上記免疫原成分は抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことが好ましい。上記抗原性ペプチドは鞭毛細菌であることが好ましく、配列番号５または７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（すなわち、ＦｌａＡまたはＦｌａＣのｃＤＮＡ）によってコードされることがより好ましい。【０１５６】  本発明に係るワクチン用キットは、ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドをさらに備えていてもよい。また、本発明に係るワクチン用キットは、ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドの代��りにｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドを導入した形質転換細胞を備えていてもよい。【０１５７】  本発明に係るワクチン用キットにおけるアジュバント成分は、異なる種々の投与経路（例えば、経口、鼻、肺、筋肉内、皮下、皮内または局所経路）によって投与することができる。好ましくは、成分は皮内または局所経路により投与される。当該アジュバント成分は、免疫原成分と異なる経路によって、異なる時期に投与されてもよいが、実質的に同時に同一部位に投与される場合がもっとも好ましい。「実質的に同時」とは、アジュバント成分の投与と免疫原成分の投与とが好ましくは同時、またはいずれかの投与の前後少なくとも数時間以内であることが意図される。【０１５８】  本発明に係るワクチン組成物およびワクチン用キットは、種々の疾患（例えば、ウイルス感染症、細菌感染症もしくは寄生虫感染症、ガン、アレルギー、または自己免疫疾患など）を罹患する被験体（好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒト）を防御または治療するために、あるいは上記疾患を予防するために適用することができる。【０１５９】  従来のワクチンには、病原性死菌、病原性細菌から精製された特異成分、生ワクチンとしての病原性細菌の無毒誘導体、または生ワクチンを事前に希釈ホルマリン処理によって弱毒化されるかもしくは部分的に不活性化された、いわゆる弱毒化ワクチンなどが使用されている。しかし、細菌を不活性化させるホルマリン処理は、細菌の一時的な弱毒化に過ぎないので、細菌が途中で回復すると、予防というよりは感染という重大な問題を招くおそれがある。【０１６０】  さらに、投与経路として最も好ましい経口投与形態を用いると、有効成分のほとんどが、抗原の大部分が胃腸内の酵素によって死滅したり、そのまま体外に放出されたり、または非免疫形態で吸収されてしまう。その結果、有効免疫反応を刺激することのできる物質量が少なくなる。従って、経口投与を用いる場合、必要な抗原の投与量は多くする必要がある。【０１６１】  本発明に係るワクチン組成物またはワクチン用キットを用いれば、極微量の免疫原物質を用いるだけで所望の免疫効果を得ることができ、上述のような従来のワクチンの有する問題点を克服することができる。本発明に係るワクチン組成物またはワクチン用キットを用いて所望の免疫効果を得ることができたかどうかを確認するための手段は、当該分野において公知の検出方法を用いればよいが、例えば、皮内注射後に免疫反応に基づく腫脹を確認する方法が最も簡便かつ好ましい。【０１６２】  このように、本発明に係るワクチン組成物は、少なくとも、ｒｔＴＬＲ５ＳポリペプチドまたはｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むアジュバント成分を含んでいればよいといえる。また、本発明に係るワクチン用キットは、少なくとも、ｒｔＴＬＲ５ＳポリペプチドまたはｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むアジュバント成分を備えていればよいといえる。本発明が上記構成を採ることによって、任意の鞭毛細菌感染に対して有効な免疫効果を得ることができる。なぜなら、列挙した疾患は、本発明に係るアジュバント（すなわち、ｒｔＴＬＲ５ＳポリペプチドまたはｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチド）を含むワクチンが予め投与されている��、該アジュバントが樹状細胞を有意に活性化するので、鞭毛細菌が侵入だけで種々の免疫担当細胞（ＮＫ細胞、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、抗体産生細胞など）が有効に活性化され、目的の免疫効果を得ることができるからである。本明細書を読んだ当業者は、このことを容易に理解することができる。また、鞭毛細菌侵入以外に起因する疾患に対してもまた、免疫原成分を別途投与することによって同様に種々の免疫担当細胞が有効に活性化され、目的の免疫効果を得ることができることを当業者は容易に理解する。またこの場合でも特定の疾患に限定されず、本発明に係るワクチン組成物およびワクチン用キットは、あらゆるウイルス感染症、細菌感染症および寄生虫感染症、ガン、アレルギー、ならびに自己免疫疾患などの疾患に対して有効な免疫効果をもたらすことができることを、本明細書の記載を読んだ当業者は容易に理解する。【０１６３】  〔６〕ガンまたは感染症を予防するための薬学的組成物、キットおよび方法
本発明は、ｒｔＴＬＲ５ＳポリペプチドまたはｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むアジュバント成分を含む、ガンまたは感染症を予防するための薬学的組成物およびキットを提供する。一実施形態において、本発明に係る薬学的組成物およびキットは、免疫原成分をさらに含むことが好ましい。さらに本発明は、ｒｔＴＬＲ５ＳポリペプチドまたはｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むアジュバント成分を用いる、ガンまたは感染症を予防するための方法を提供する。一実施形態において、本発明に係る方法は、さらに免疫原成分を用いることが好ましい。【０１６４】  一実施形態において、本発明に係るガンまたは感染症を予防するための薬学的組成物は、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を含み得る。本実施形態に係る薬学的組成物において、上記免疫原成分は抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことが好ましい。上記抗原性ペプチドは鞭毛細菌であることが好ましく、配列番号５または７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（すなわち、ＦｌａＡまたはＦｌａＣのｃＤＮＡ）によってコードされることがより好ましい。【０１６５】  本発明に係る薬学的組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。また、本発明に係る薬学的組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドの代わりにｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドを導入した形質転換細胞を含んでもよい。【０１６６】  他の実施形態において、本発明に係るガンまたは感染症を予防するための薬学的組成物は、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を含み得る。本実施形態に係る薬学的組成物において、上記免疫原成分は抗原性ペプチドを含むことが好ましい。上記抗原性ペプチドは鞭毛細菌であることが好ましく、配列番号６または８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（すなわち、ＦｌａＡタンパク質またはＦｌａＣタンパク質）であることがより好ましい。【０１６７】  本発明に係る薬学的組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドをさらに含んでいてもよい。また、本発明に係る薬学的組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドの代わりにｈｕＴＬＲ５ポリペプチド発現細胞を含んでいてもよい。【０１６８】  本明細書において使用される場合、「薬学的組成物」は、アジュバント成分および免疫原成分を単一形態中に含む。従って、当該２成分を別々に投与することが意図される場合、「薬学的組成物」は、アジュバント成分および免疫原成分を別個に備えるキットとして提供される。【０１６９】  本発明に係る薬学的組成物は、アジュバント成分および免疫原成分以外に薬学的に受容可能なキャリアを含んでもよい。薬学的組成物中に使用される薬学的に受容可能なキャリアは、薬学的組成物の投与形態および剤型に応じて選択することができる。薬学的に受容可能なキャリア、投与形態、剤型などについては、上記「ワクチン」の項を参照のこと。【０１７０】  一実施形態において、本発明に係るガンまたは感染症を予防するためのキットは、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を備え得る。好ましくは、これら２成���はそれぞれ別個の容器中に収容され得る。本実施形態に係るキットにおいて、上記免疫原成分は抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことが好ましい。上記抗原性ペプチドは鞭毛細菌であることが好ましく、配列番号５または７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（すなわち、ＦｌａＡまたはＦｌａＣのｃＤＮＡ）によってコードされることがより好ましい。【０１７１】  本発明に係るガンまたは感染症を予防するためのキットは、ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドをさらに備えていてもよい。また、本発明に係るガンまたは感染症を予防するためのキットは、ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドの代わりにｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドを導入した形質転換細胞を備えていてもよい。【０１７２】  他の実施形態において、本発明に係るガンまたは感染症を予防するためのキットは、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を備え得る。好ましくは、これら２成分はそれぞれ別個の容器中に収容され得る。本実施形態に係るキットにおいて、上記免疫原成分は抗原性ペプチドを含むことが好ましい。上記抗原性ペプチドは鞭毛細菌であることが好ましく、配列番号６または８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（すなわち、ＦｌａＡタンパク質またはＦｌａＣタンパク質）であることがより好ましい。【０１７３】  本発明に係るガンまたは感染症を予防するためのキットは、ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドをさらに備えていてもよい。また、本発明に係るガンまたは感染症を予防するためのキットは、ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドの代わりにｈｕＴＬＲ５ポリペプチド発現細胞を備えていてもよい。【０１７４】  フラジェリンは自然免疫のアジュバント機能を介する抗ガン活性および／または抗感染活性を有する。従って、抗原性を有する物質と組み合わせてｒｔＴＬＲ５Ｓをヒトに投与すれば、フラジェリン依存性の樹状細胞療法、抗ガン免疫療法などという、安全かつ効果的な療法を提供することができる。また、本明細書の記載に基づけば、本発明に係る薬学的組成物またはキットを用いるガンまたは感染症を予防するための方法もまた、本発明の技術的範囲に属することを、当業者は容易に理解する。【０１７５】  〔７〕被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するための検出薬、キットおよび方法
本発明に係るｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドは、鞭毛細菌、特に、鞭毛タンパク質のフラジェリンを認識して、ヒトまたはマウスのような哺乳動物が有するｒｔＴＬＲ５を活性化し、フラジェリンに起因するＮＦ−κＢ活性化およびサイトカイン産生を増強させる。従って、ＮＦ−κＢ活性化およびサイトカイン産生を指標にすれば、ｒｔＴＬＲ５を発現している脊椎動物の被験体サンプル中における鞭毛細菌の存在を、本発明に係るｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを用いて検出することができる。【０１７６】  すなわち、本発明は、被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するための検出薬、キットおよび方法を提供する。【０１７７】  被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するために、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを含む試薬を被験体サンプルに添加してインキュベートし、当該被験体サンプル中に産生されたサイトカインの量を測定し、試薬添加前における被験体サンプル中のサイトカインの量と比較することによって、被験体サンプル中における鞭毛細菌の存在を検出することができる。【０１７８】  一実施形態において、本発明に係る検出薬は、被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するために、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを含み得る。【０１７９】  本発明に係る検出薬はまた、キットの形態で提供され得る。すなわち、一実施形態において、本発明に係る検出キットは、被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するために、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを備え得る。【０１８０】  本明細書中の記載に基づけば、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含む試薬もまた、本発明に係る被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するための検出薬の技術的範囲に属することを、当業者は容易に理解する。さらに、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを備えるキットもまた、本発明に係る被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するための検出キットの技術的範囲に属することを、当業者は容易に理解する。【０１８１】  本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これに限定されるべきではない。
【実施例】
【０１８２】  〔実施例１：ｒｔＴＬＲ５ＳおよびｒｔＴＬＲ５Ｍのクローニングおよび組織分布〕
Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍに曝露したニジマス由来のＥＳＴクローン（ＡＦ２８１３４６）をクローニングし、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して３’−ＲＡＣＥおよび５’−ＲＡＣＥを行い、その結果、ｒｔＴＬＲ５Ｓ  ｃＤＮＡの全長を、クローニングした。【０１８３】  具体的には、肝臓ｃＤＮＡテンプレート、および、プライマー１特異的エンドプライマーまたはプライマー２特異的エンドプライマー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のいずれかと対のｒｔＴＬＲ５Ｓ遺伝子特異的内部プライマー（５’−ＲＡＣＥについて：Ｓ−ＧＳＰ／Ｆ（配列番号９）およびＳ−ＮＧＳＰ／Ｆ（配列番号１０）、３’−ＲＡＣＥについて：Ｓ−ＧＳＰ／Ｒ（配列番号１１））（表１）を用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に直接クローニングし、いくつかの別個の形質転換体を、ＡＢＩ３１００  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用するＤＮＡ配列決定に供して、配列精度を評価した。プライマーＳＦ（配列番号１２）およびＳＲ（配列番号１３）（表１）を用いるＲＴ−ＰＣＲによって、肝臓ｃＤＮＡライブラリーよりｒｔＴＬＲ５ＳのｃＤＮＡ全長を得た。シグナル配列を除くｒｔＴＬＲ５ＳをコードするｃＤＮＡを、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ部位に挿入した。【０１８４】
【表１】
2006085411.tif 000002
モチーフ検索、Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  ｐｌｏｔ、およびＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ比較の結果は、アミノ酸配列がヒトＴＬＲ５の細胞外ＬＲＲドメインに対応し、驚くことに、膜貫通領域またはＴＩＲドメインを含まないことを示した（図１Ｂ）。ＳＭＡＲＴ分析は、このタンパク質中に１０個のＬＲＲを規定した（図１Ｃ）。これらの結果に基づいて、本発明者らは、この推定のタンパク質をニジマスの可溶性形態のＴＬＲ５（ｒｔＴＬＲ５Ｓ）と名付けた。また、ｍＲＮＡならびにＳＦプライマー（配列番号１２）およびＳＲプライマー（配列番号１３）（表１）を使用して、ｒｔＴＬＲ５Ｓについて７つの別々のＲＴ−ＰＣＲ産物をクローニングした。【０１８５】  次いで、ニジマスにおける膜結合形態のＴＬＲ５を同定するために、ヒトＴＬＲ５、マウスＴＬＲ５およびｆｇＴＬＲ５のＴＩＲの間で保存されている配列に従って、縮重プライマーを設計した（図１Ａ）。縮重プライマーを使用するＰＣＲ、引き続くＲＡＣＥ法によって、さらなるＴＬＲ５様ｃＤＮＡ（ｒｔＴＬＲ５Ｍの部分配列）をクローニングした。得られたフラグメントの配列を、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ（ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／）を使用して整列させた（図１Ａ）。【０１８６】  図１Ａは、ｒｔＴＬＲ５Ｍを単離するための縮重プライマーの設計を示す。ヒトＴＬＲ５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０６０８９５）、マウスＴＬＲ５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１８６１０７）およびフグＴＬＲ５（Ａｋｉｒａ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４，４９９−５１１（２００４）を参照のこと）のＴＩＭドメインを、ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムによって整列させた。縮重プライマーを、高度に保存された領域（四角で囲む）を参照して設計した。縮重プライマーの配列を整列の下に示す（配列番号３６および３７）。ｈｕはヒト；ｍｏはマウス；ｆｇはフグを示す。【０１８７】  Ｈ−ＭＬＶ（−）ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ニジマス肝臓より調製したランダムにプライムしたＲＮＡテンプレートから第１鎖ｃＤＮＡを逆転写した。次に、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ｒｔＴＬＲ５Ｍ全長配列を得た。肝臓ｃＤＮＡテンプレート、およびアダプタープライマー１（ＡＰ１）またはＡＰ２特異的末端プライマー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒに直接連結し、いくつかの別個の形質転換体を以下に記載のようにＤＮＡ配列決定に供した。最終的に、プライマーＭＦ（配列番号１８）およびＭＲ（配列番号１９）（表１）を使用するＲＴ−ＰＣＲによって肝臓ｃＤＮＡから全長ｒｔＴＬＲ５Ｍ  ｃＤＮＡを得た。シグナル配列を欠失したｒｔＴＬＲ５ＭをコードするｃＤＮＡを、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶプラスミドのＳａｌＩ−ＮｏｔＩ部位の間に挿入した。【０１８８】  相同性検索分析によって、このｃＤＮＡがヒトＴＬＲ５のオルソログであることがわかった。このオルソログは、推定のシグナルペプチド、１１個のＬＲＲ（ＬＲＲ  Ｃ末端隣接領域を含む）、およびＴＩＲドメインを含んだ（図１ＢおよびＣ）。また、ＭＦプライマー（配列番号１８）およびＭＲプライマー（配列番号１９）（表１）を使用して、ｒｔＴＬＲ５Ｍについて４つの別々のＲＴ−ＰＣＲ産物をクローニングした。【０１８９】  ｒｔＴＬＲ５ＭおよびｒｔＴＬＲ５ＳのｃＤＮＡ配列に基づく推定のアミノ酸配列の整列を、図１Ｂに示す。ここで、２つの型のｒｔＴＬＲ５細胞外ドメインの間の相同性を示す。推定のシグナル配列に太い下線を付す。ＥＳＴクローン（ＡＦ２８１３４６．１）の位置に下線を付す。縮重プライマーを用いて得たｃＤＮＡフラグメントに二重下線を付す。保存されたシステインを四角で囲む。ｒｔＴＬＲ５ＭおよびｒｔＴＬＲ５ＳのＬＲＲ領域は、８１．０％の相同性を示した。【０１９０】  ｒｔＴＬＲ５Ｓの総合的な配列は、１９９２ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および１１６８ｂｐの３’−ＵＴＲからなる。３つのポリアデニル化シグナルを３’−ＵＴＲ中に見出した。その最後の１つの後ろにポリ（Ａ）テールが続く。このｃＤＮＡの推定のアミノ酸配列は、６６４アミノ酸である。ｒｔＴＬＲ５Ｓは、ヒトＴＬＲ５およびマウスＴＬＲ５とそれぞれ３５．６％および３７．１％の相同性を有する。ｒｔＴＬＲ５Ｓは、他のヒトＴＬＲまたはマウスＴＬＲの細胞外ドメインと２５％未満の相同性を示した。ｍｏ／ｈｕＴＬＲ５のＬＲＲドメイン中のシステイン１１個中９個が、ｒｔＴＬＲ５Ｓにおいて保存されていた。【０１９１】  ｒｔＴＬＲ５Ｍの総合的な配列は、２６８７ｂｐのＯＲＦおよび５４４ｂｐの３’−ＵＴＲからなる。３’−ＵＴＲ中のポリアデニル化シグナルの後ろにポリ（Ａ）テールが続く。このｃＤＮＡの推定のアミノ酸配列は、８７９アミノ酸である（図１Ｂ）。ｒｔＴＬＲ５Ｍは、ヒトＴＬＲ５、マウスＴＬＲ５およびｆｇＴＬＲ５とそれぞれ４０．１、４０．５％および４８．５％の相同性を有する。ｒｔＴＬＲ５Ｍは、他のヒトＴＬＲ５、マウスＴＬＲ５およびｆｇＴＬＲ５と２５％未満の相同性を示した。マウスＴＬＲ５およびヒトＴＬＲ５の細胞外ドメイン中に存在する１０個のシステインが、ｒｔＴＬＲ５Ｍにおいて保存されていた。【０１９２】  図１Ｃは、ｒｔＴＬＲ５ＳおよびｒｔＴＬＲ５Ｍのドメイン配向を示す模式図である。各ドメインを、ＳＭＡＲＴプログラムを用いて予測した。ＬＲＲ−ＣＴは、あるＬＲＲドメインと類似するＣ末端隣接領域を示す。【０１９３】  さらに、表１に示す特異的プライマーセットを使用して、ｒｔＴＬＲ５Ｍ特異的メッセージおよびｒｔＴＬＲ５Ｓ特異的メッセージについて、７つの組織を調べた。ｒｔＴＬＲ５ＳおよびｒｔＴＬＲ５Ｍの組織分布を示すＲＴ−ＰＣＲの結果を図１Ｄに示す。ｒｔＴＬＲ５Ｍは全ての組織で普遍的に発現していたが、ｒｔＴＬＲ５Ｓは肝臓に優勢に存在した。【０１９４】  なお、ｃＤＮＡのアラインメントおよびモチーフ分析を、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ  Ｇ４上で、ＧＥＮＥＴＹＸ，Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗを用いて行った。ニジマス（ｒｔ）の遺伝子配列（ＩＬ−１β（ＡＪ００４８２１）、ＴＮＦ−α（ＡＪ２７７６０４）、およびβ−アクチン（ＡＪ４３８１５８）を、ＮＣＢＩより得た。【０１９５】  〔実施例２：ｒｔＴＬＲ５ＳおよびｒｔＴＬＲ５Ｍの遺伝子特性〕
ｒｔＴＬＲ５ＳおよびｒｔＴＬＲ５Ｍの遺伝子特性を調べた。ｒｔＴＬＲ５ＳおよびｒｔＴＬＲ５Ｍのエクソン−イントロン構造を、図２Ａに示す。黒バーは、ｒｔＴＬＲ５ＳおよびｒｔＴＬＲ５Ｍのコード領域を示す。挿入領域でのイントロンを、灰色のバー（７５７ｂｐ）で示す。【０１９６】  図２Ａに示すように、ｒｔＴＬＲ５Ｓ遺伝子は、シグナルペプチドの近く（ＡＴＧ開始コドンから２０ｂｐ）に７５７ｂｐのイントロンを有したが、ｒｔＴＬＲ５Ｍの遺伝子は、イントロンを有さない。【０１９７】  次いで、サザンブロット分析を行うために以下のようなプローブを設計した：ｒｔＴＬＲ５ＭのＴＩＲ領域をカバーするプローブ（プローブＭ：ｒｔＴＬＲ５Ｍの１８６７〜２７０７ｎｔ、８４１ｂｐ）；ならびに、ｒｔＴＬＲ５ＳおよびｒｔＴＬＲ５Ｍに大きく共通するＬＲＲ領域をカバーするプローブ（プローブＳ：ｒｔＴＬＲ５Ｓの３５４〜１３１４ｎｔ、９６１ｂｐ）。【０１９８】  サザンブロットを以下のように行った。ニジマス肝臓から抽出した１０μｇのゲノムＤＮＡを、種々の制限エンドヌクレアーゼで消化し、標準的な電気泳動分離法によって１．０％アガロースゲル上で分離した。製造業者の指示書に従って、アガロースゲルからナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上にＤＮＡを転写した。ＭｅｇａＰｒｉｍｅ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＰＣＲ増幅したプローブＳおよびＭ（図２Ａ）を、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識した。ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で１時間、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、ブロットを、０．１％  ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にて５０℃で２０分間を２回洗浄した。ブロットを、イメージングプレートに供して、ＦＬＡ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ，Ｊａｐａｎ）を使用して分析した。【０１９９】  図２Ｂおよび図２Ｃは、サザン分析の結果を示す。プローブＳおよびプローブＭを、それぞれ図２Ｂおよび図２Ｃでのサザン分析に使用した。１０μｇのニジマスゲノムＤＮＡを、示した制限酵素によって消化した。消化物を、アガロースゲル電気泳動に供し、そしてＨｉ−ｂｏｎｄ  Ｎ＋  ｎｙｌｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅに転写した。プローブＳ（図２Ｂ）およびプローブＭ（図２Ｃ）によって検出したバンドをそれぞれ示す。マーカーを左側に示す。【０２００】  ｒｔＴＬＲ５のＤＮＡのＯＲＦ、イントロン、および３’−ＵＴのヌクレオチド配列に基づけば、ｒｔＴＬＲ５Ｓ中においてプローブＳの下流にＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩが各々１つ存在する（図中、制限部位を、Ｅ（ＥｃｏＲＩ）、Ｈ（ＨｉｎｄＩＩＩ）およびＰｓ（ＰｓｔＩ）で示す）。従って、制限フラグメントの長さに基づけば、フラグメントのサイズは２．４ｋｂｐより長いはずである。各レーンにおいて予想された２つのフラグメントに加え、サザンブロットにおいて得られた実際のフラグメントは、２．４ｋｂｐ未満であった（図２Ｂ）。このことは、同様の配列ではあるが異なる配列を有するさらなる遺伝子の存在を示唆する。ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩで消化した場合に、プローブＳを用いて約１．５ｋｂｐのフラグメントを検出した。このことは、さらにこの点を確認する。【０２０１】  図２Ｃに示すように、ＥｃｏＲＩで消化したレーンまたはＰｓｔＩで消化したレーンにおいて、約１ｋｂｐのフラグメントを検出した。このことは、ｒｔＴＬＲ５Ｍ遺伝子の存在を反映する。ＨｉｎｄＩＩＩ消化の際に得た３．５ｋｂｐのフラグメントは、ｒｔＴＬＲ５Ｍ遺伝子に対応し得る。さらに上のバンド（薄いバンド）は、同様のＴＩＲ配列を含むさらなる配列の存在を示唆する。さらに、本発明者らはまた、ｒｔＴＬＲ５Ｍに類似のペプチドをコードする推定のコード領域中に多くの終始コドンを有する偽遺伝子（第３の遺伝子）を配列決定した（データは示さず）。【０２０２】  〔実施例３：ｒｔＴＬＲ５ＳはＶ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍに反応して誘導される〕
次に、ｒｔＴＬＲ５ＳがＶ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍでの感染によって上方制御されるか否かを調べた。具体的には、死菌Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍでの細胞刺激後のｒｔＴＬＲ５Ｍ、ｒｔＴＬＲ５ＳおよびｒｔＩＬ−１βのｍＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲによってモニタリングして、Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍに対するＲＴＨ−１４９細胞の応答を調べた。Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍは、Ｄｒ．Ｔａｋａｊｉ  Ｉｉｄｓ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｇｅｎｃｙ）より供与された。【０２０３】  ＲＴ−ＰＣＲを以下のように行った。ＴＲＩｓｏｌ試薬を使用して、総ＲＮＡを、ＲＴＨ−１４９細胞から単離した。精製したＲＮＡサンプルを、逆転写反応のテンプレートとして使用した。各タイプのｒｔＴＬＲ５、ｒｔＩＬ−１β、ｒｔＴＮＦ−α、およびコントロールとしてのｒｔβ−アクチンについて特異的なプライマーを使用して、以下の条件を用いてＰＣＲを行った：９４℃で２分間の最初の変性、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で１分間を２５〜４０サイクル。ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーの配列を表２に示す。ＰＣＲ産物を、１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで分離し、エチジウムブロミド（１μｇ／ｍｌ）で可視化した。３回の独立した実験を行い、代表的な一例を図３に示した。【０２０４】
【表２】
2006085411.tif 000003
図３に示すように、休止期のＲＴＨ−１４９細胞において、ｒｔＴＬＲ５Ｓ  ｍＲＮＡはわずかに検出可能であった。ｒｔＴＬＲ５Ｓ  ｍＲＮＡは、細菌刺激４時間後に誘導された。ｍＲＮＡレベルは、６時間で最大となり、次いで、徐々に減少した。一方、ｒｔＴＬＲ５ＭのｍＲＮＡは、この細胞株において刺激に関係なく構成的に発現した。同一の条件下で、急性期のサイトカインであるｒｔＩＬ−１βは、１時間以内に上方制御されそして３〜１０時間にわたるピークを示した。【０２０５】  これらの結果より、ｒｔＴＬＲ５Ｓは、刺激に応答する急性期のタンパク質であることがわかった。生殖系のリンパ細胞株であるＲＴＧ−２においてｒｔＴＬＲ５Ｓの誘導プロファイルを観察し、定量的ＰＣＲによって確認したところ、ＲＴＨ−１４９細胞において得られた結果と同様であった（データは示さず）。【０２０６】  以上のことから、ｒｔＩＬ−１βおよびｒｔＴＬＲ５Ｓの急性期の応答は、主に細菌刺激によって生じ、おそらくｒｔＴＬＲ５の膜結合形態を介すると考えられた。【０２０７】  〔実施例４：リコンビナントＶ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍフラジェリンの精製〕
リコンビナントＧＳＴ−ＦｌａＡおよびＧＳＴ−ＦｌａＣをＥ．ｃｏｌｉにおいて生成し、これらのタンパク質を、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて精製した（図４Ａ）。【０２０８】  具体的には、リコンビナントフラジェリンの産生を以下のように行った。Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍのゲノムＤＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２００１））によって単離した。ｆｌａＡ（ＡＡＢ０６９９５）およびｆｌａＣ（Ｕ５２１１９）をＧＳＴとインフレームで融合させるために、ゲノムＤＮＡからコード領域を増幅した。ｆｌａＡをクローニングするためにプライマー（５’−ｃｃｇｇａｔｃｃａｔｇａｃｃａｔｔａｃａｇｔａａａｔａｃｔａａｃｇｔｃｔｃａｇｃａａｔｇ−３’（配列番号３２）および５’−ａｔｃｃｃｇｇｇｔｔａｃｔｇｃａａｔａｇｔｇａｃａｔｔｇｃａｇａａｔｔｔｇｇｃａａｃｔｇ−３’（配列番号３３））を、ｆｌａＣをクローニングするためにプライマー（５’−ｃｃｇｇａｔｃｃａｔｇｇｃｇｇｔｔａａｔｇｔａａａｃａｃｔａａｃｇｔｔｔｃａｇｃ−３’（配列番号３４）および５’−ｃｃｇａａｔｔｃｔｔａａｃｃａａｇｃａａａｃｃａａｇａｇｃａｇｃａｔｔａｇｇ−３’（配列番号３５））を使用した。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に先ずクローニングし、次いで、ｐＧＥＸ−２Ｔ  ｖｅｃｔｏｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のＢａｍＨＩ／ＳｍａＩ部位（ｆｌａＡ）およびＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位（ｆｌａＣ）にクローニングし、それぞれｐＧＥＸ２Ｔ／ＦｌａＡおよびｐＧＥＸ２Ｔ／ＦｌａＣと名付けた。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ細胞を、ｐＧＥＸ２Ｔ／ＦｌａＡまたはｐＧＥＸ２Ｔ／ＦｌａＣで形質転換し、ＧＳＴタグ化フラジェリンＡ（ＧＳＴ−ＦｌａＡ）およびＧＳＴタグ化フラジェリンＣ（ＧＳＴ−ＦｌａＣ）を、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造業者の指示書に従って使用して、可溶化した細胞から精製した。精製したＧＳＴ−ＦｌａＡおよびＧＳＴ−ＦｌａＣを、製造業者の指示書に従ってトロンビンで消化して、リコンビナントフラジェリンＡ（ｒＦｌａＡ）およびリコンビナントフラジェリンＣ（ｒＦｌａＣ）と名付けた。これら産物の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。【０２０９】  リコンビナントフラジェリン調製物中のＬＰＳ夾雑は、ＬＰＳ検出キットの検出限界未満であった（＜０．０２ｐＭ）。ＬＰＳの影響のわずかな可能性を完全に排除するために、精製した物質を、ポリミキシンＢでさらに試験した。【０２１０】  精製したｒＦｌａＡおよびｒＦｌａＣをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ゲル）によって分離し、Ｂｉｏ−ＳａｆｅＴＭクーマシーブルーで染色した結果を、図４Ａおよび図４Ｂに示す。図４Ａは、ＧＳＴ−フラジェリン融合タンパク質を示し、図４Ｂは、トロンビンによってＧＳＴが除かれ���フラジェリンタンパク質を示す。精製したＧＳＴ融合タンパク質は６０ｋＤａであり、これは、フラジェリン配列＋ＧＳＴタグから予測される分子量に一致した。【０２１１】  〔実施例５：リコンビナントフラジェリンタンパク質によるＲＴＨ−１４９細胞またはＲＴＧ−２細胞の刺激〕
血球細胞においてｒｔＴＬＲ５Ｍがフラゲリンを認識するか否かを試験するために、ＲＴＨ−１４９細胞を精製したｒＦｌａＡで刺激した。【０２１２】  ＲＴＨ−１４９細胞およびＲＴＧ−２細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｒ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ，Ｎｉｓｓｕｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、０．１ｍＭ  ＭＥＭ  非必須アミノ酸溶液および１ｍＭ  ＭＥＭ  ピルビン酸ナトリウム溶液中で培養し、６ｃｍディッシュプレート中に播種し、２日毎に培地を交換した。細胞（１×１０７細胞）を、凍結融解したｒＦｌａＡ（１μｇ／ｍｌ）で刺激した。総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して単離し、上述したようにＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を、１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで分離し、エチジウムブロミドで染色した。ｉＱ  ＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘを用いて定量的ＰＣＲを行い、増幅したＰＣＲ産物をｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって測定した。【０２１３】  ｒＦｌａＡで刺激したＲＴＨ−１４９細胞およびＲＴＧ−２細胞における種々のｍＲＮＡについてのＲＴ−ＰＣＲの結果を、図４Ｃに示す。図４Ｃに示すように、精製したｒＦｌａＡでの細胞刺激後のｒｔＴＬＲ５Ｍ、ｒｔＴＬＲ５Ｓ、ｒｔＩＬ−１βおよびｒｔＴＮＦ−αのｍＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲによってモニタリングした。ｒｔ−β−アクチンをコントロールに使用した。ＰＣＲ産物を、ゲル電気泳動（１．５％  ＴＡＥアガロース）によって分析し、エチジウムブロミド（１μｇ／ｍｌ）で可視化した。３回の独立した実験のうち、代表的な一例を示した。【０２１４】  ｒＦｌａＡ刺激は、Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ刺激の場合と同様に、ｒｔＴＬＲ５ＳおよびｒｔＩＬ−１βの誘導を導いた。ｒｔＴＬＲ５ＳおよびｒｔＩＬ−１βのｍＲＮＡレベルは、実施例３で示した細菌感染によって生じるプロファイルと同様のプロファイルでフラゲリンによって誘導された。しかし、精製したｒＦｌａＡを用いてｒｔＴＬＲ５Ｍを誘導することはできなかった。ＲＴＧ−２細胞を用いた場合もまた、ｒＦｌａＡに反応するサイトカインおよびｒｔＴＬＲ５Ｓに関する同様の誘導プロファイルを観察した。【０２１５】  これらの結果を定量的ＰＣＲによってさらに確認した結果を、図４Ｄに示す。図４Ｄにおいて、ｒＦｌａＡ刺激４８時間後までの示した時間点におけるｒｔＴＬＲ５ＳおよびｒｔＴＬＲ５ＭのｍＲＮＡレベルを示した。図４Ｄに示すように、Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ媒介性のｒｔＴＬＲ５Ｓの上方制御が観察された。【０２１６】  以上のように、魚類において、血球細胞によるフラゲリン認識は、Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ媒介性のｒｔＴＬＲ５Ｓ上方制御の主要な原因であると考えられる。ｒｔＴＬＲ５Ｍはこれらの細胞株において構成的に発現しているので、ｒｔＴＬＲ５Ｍはこれらの細胞株における最初のフラゲリン認識に関与し得る。実際に、ＲＴＨ−１４９細胞でのフラゲリンによるサイトカイン誘導の持続時間は、ヒト樹状細胞において観察されるものと一致した。従って、細菌感染に起因するｒｔＴＬＲ５Ｓの誘導は、外因的に添加されたフラゲリンによって模倣され得る。【０２１７】  〔実施例６：レポーターアッセイのための構築物〕
フラジェリンはヒトＴＬＲ５およびマウスＴＬＲ５に対するリガンドであるので、ｒｔＴＬＲ５Ｓがフラジェリンを認識するか否かを試験するために、ｒｔＴＬＲ５Ｓと、ヒトＴＬＲ５の膜貫通ドメインおよびＴＩＲドメインとからなる融合レセプターｃＤＮＡを作製した。【０２１８】  具体的には、ＦＬＡＧタグ化したｒｔＴＬＲ５Ｓ細胞外ドメイン（アミノ酸２９〜５９７位）をコードするｃＤＮＡを、ｈｕＴＬＲ５のＣ末端隣接領域、膜貫通領域および細胞内ドメイン（アミノ酸５７４〜８５８位）をコードするｃＤＮＡに融合することによって、Ｓ−キメラを構築した。この構築物を、ｐＥＦＢＯＳ発現ベクター中にクローニングした。【０２１９】  全長ｈｕＴＬＲ５を、プライマーｈｕ５Ｆ（配列番号２０）およびｈｕ５Ｒ（配列番号２１）（表１）を使用するＲＴ−ＰＣＲによって、ヒト単球ｃＤＮＡから得た。ｈｕＴＬＲ５のｃＤＮＡをｐＥＦＢＯＳプラスミド中に挿入した。【０２２０】  ヒトＥ−セレクチン（ＥＬＡＭ）のプロモーター領域（−２４１〜−５４）を、ｐＧＶ−Ｅ２（Ｔｏｙｏ  Ｉｎｃ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結した。このプラスミド（ｐＥＬＡＭ−ｌｕｃと名付けた）を、ＮＦ−κＢ活性化についてのレポーターとして、以下の実験において使用した。ｐｈＲＬ−ＴＫベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を内部標準として使用した。【０２２１】  〔実施例７：Ｓ−キメラタンパク質によるフラジェリンの認識〕
ＮＦ−κＢについてのレポーター遺伝子アッセイを以下のように行って、ＮＦ−κＢ活性化を試験した。【０２２２】  Ｈｅｌａ細胞（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を、５〜１０％の熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；ＪＲＨ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養し、２４ウェルプレート（１×１０６細胞／ウェル）に播き、１２時間インキュベートした。次いで、Ｓ−キメラ、ｈｕＴＬＲ５（１００ｎｇ）の発現のためのｐＥＦＢＯＳ、またはコントロールとしてのベクター単独を、ｐＥＬＡＭ−ｌｕｃレポーター遺伝子（１００ｎｇ）とともにＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  Ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、上記細胞に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトしたＤＮＡの総量（４００ｎｇ）を、空ベクターを添加することによって調整した。ｐｈＲＬ−ＴＫ（０．１ｎｇ）を内部標準として使用した。３６時間培養した後、トランスフェクションを行った。【０２２３】  次いで、細胞を、ｒＦｌａＡ（０．０１、０．１、１μｇ／ｍｌ）で、３７℃で５時間処理した。【０２２４】  細胞をｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解し、ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の試薬およびプロトコルを使用して、ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（ｍｏｄｅｌ：ＢＬＲ−２０１，Ａｌｏｋａ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で、ルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。Ｒｅｎｉｌａ  ｌｕｓｉｆｅｒａｓｅ内部標準を用いる光強度測定より比活性を算出した。値を、別々の３回の実験での最小値からの相対刺激平均±Ｓ．Ｄ．として示した。【０２２５】  ネイティブなＨｅｌａ細胞は、ＴＬＲ５を発現せず、フラジェリンに反応しない（データは示さず）。このキメラのｃＤＮＡをＨｅｌａ細胞にトランスフェクトし、キメラタンパク質の発現を、抗ＦＬＡＧ抗体を用いるイムノブロッティングによって確認した（データは示さず）。ｒｔＴＬＲ５Ｓがフラジェリンに反応する能力を有している場合、このキメラレセプターは、エクトドメインによってフラジェリンの存在を認識し、Ｈｅｌａ細胞においてＴＩＲを介してＮＦ−κＢを活性化し得る。【０２２６】  Ｈｅｌａ  Ｓ−キメラ形質転換体およびｈｕＴＬＲ５形質転換体におけるＮＦ−κＢ活性を測定するためのルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイの結果を、図５Ａに示す。図５Ａにおいて、Ｈｅｌａ細胞に、ＥＬＡＭ−ルシフェラーゼレポータープラスミドとともに、空ベクター（左）、Ｓ−キメラ（中央）、またはｈｕＴＬＲ５（右）をトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞を、示した濃度のＦｌａＡで５時間刺激した。ＮＦ−κＢ活性化の程度を、細胞溶解物でのルシフェラーゼアッセイによって測定した。【０２２７】  図５Ａに示すように、Ｓ−キメラ分子は、Ｈｅｌａ細胞において、同様の発現レベルのヒトＴＬＲ５と同程度にまでＮＦ−κＢレポーター遺伝子を活性化した。また、ｒＦｌａＡおよびｒＦｌａＣは、同一のＳ−キメラ刺激能��有した（データは示さず）。【０２２８】  特異性を試験するために、Ｓ−キメラを、ＭＡＬＰ−２（ＴＬＲ２のリガンド）、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（ＴＬＲ３のリガンド）、ＬＰＳ（ＴＬＲ４のリガンド）、非メチル化ＣｐＧ−ＯＤＮ（ＴＬＲ９のリガンド）およびｒＦｌａＡ（ＴＬＲ５のリガンド）で刺激した結果を、図５Ｂに示す。ＬＰＳをＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）より購入した。ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｕｃｈｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）より入手した。ＭＡＬＰ−２をＢｉｏｌｏｇｉｃａ（Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）において合成した。ペプチドグリカン（ＰＧＮ）をＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓから精製した。Ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  ＢをＳｉｇｍａより入手した。ヌクレオチドプライマーおよびＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）（ＣｐＧ−ＯＤＮ）の全てをＨｏｋｋａｉｄｏ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｐｐｏｒｏ，Ｊａｐａｎ）で合成した。【０２２９】  図５Ｂは、ｒＦｌａＡ（１μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（０．１μｇ／ｍｌ）、ＰＧＮ（１０μｇ／ｍｌ）、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（２μｇ／ｍｌ）またはＣｐＧ−ＯＤＮ（２μＭ）で細胞を６時間刺激し、図５Ａ同様にＮＦ−κＢ活性を測定した結果を示す。実験を三連で行い、結果を平均±Ｓ．Ｄ．で示した。３回の実験のうち１つを示した。【０２３０】  Ｓ−キメラまたはｈｕＴＬＲ５を発現する細胞は、排他的にｒＦｌａＡを認識してＮＦ−κＢレポーター遺伝子を活性化したが、ＭＡＬＰ−２（１００ｎＭ）（データは示さず）だけでなく他のいずれの刺激にも応答しなかった。【０２３１】  以上の結果より、ｒＦｌａＡとｒｔＴＬＲ５Ｓとの間に機能的な相互作用が存在することがわかった。【０２３２】  〔実施例８：Ｍ−キメラタンパク質はｒｔＴＬＲ５Ｓと組み合わせることによってフラジェリンを認識する〕
全長ｒｔＴＬＲ５Ｍを発現させたＨｅｌａ細胞およびＣＨＯ細胞において、ＮＦ−κＢ応答を検出しなかった（データは示さず）。そこで、ｒｔＴＬＲ５ＭのＬＲＲとｈｕＴＬＲ５のＴＭおよびＴＩＲとからなるキメラを用いて、ＮＦ−κＢ活性化を測定した。【０２３３】  Ｓ−キメラと同様に、ＦＬＡＧタグ化したｒｔＴＬＲ５Ｍ細胞外ドメイン（アミノ酸２１〜５９６位）をコードするｃＤＮＡを、ｈｕＴＬＲ５のＣ末端隣接領域、膜貫通領域および細胞内ドメイン（アミノ酸５７４〜８５８位）をコードするｃＤＮＡに融合することによって、Ｍ−キメラを構築した。【０２３４】  チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２  ｍｅｄｉｕｍ（Ｎｉｓｓｕｉ）中で培養した。【０２３５】  Ｈｅｌａ細胞またはＣＨＯ細胞を、２４ウェルプレート（１×１０６細胞／ウェル）に播き、１２時間インキュベートした。次いで、Ｍ−キメラ、ｈｕＴＬＲ５の発現のためのｐＥＦＢＯＳ（１００ｎｇ）、またはコントロールとしてのベクター単独を、ｐＥＬＡＭ−ｌｕｃレポーター遺伝子（１００ｎｇ）とともにＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  Ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、上記細胞に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトしたＤＮＡの総量（４００ｎｇ）を、空ベクターを添加することによって調整した。ｐｈＲＬ−ＴＫ（０．１ｎｇ）を内部標準として使用した。３６時間培養した後、トランスフェクションを行った。また、示したように、Ｍ−キメラ発現細胞におけるＮＦ−κＢプロモーター活性に対する外因的に添加したｒｔＴＬＲ５Ｓの効果を測定した。すなわち、Ｍ−キメラでトランスフェクトした２４時間後、Ｍ−キメラ発現細胞の培養培地を、ｐＥＦＢＯＳ／ｒｔＴＬＲ５Ｓ  ｃＤＮＡ（１、１０、１００ｎｇ）を一過性にトランスフェクトして１２時間培養したＣＨＯ細胞またはＨｅｌａ細胞の馴化培地と置換した。【０２３６】  次いで、細胞を、ｒＦｌａＡ（０．０１、０．１、１μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（０．１μｇ／ｍｌ）、ＰＧＮ（１０μｇ／ｍｌ）、ｐｏｌｕ（Ｉ：Ｃ）（２μｇ／ｍｌ）、またはＣｐＧ−ＯＤＮ（２μＭ）で、３７℃で５時間処理した。必要に応じて、リコンビナントｒｔＴＬＲ５Ｓ（１、１０、１００ｎｇ／ｍｌ）を、Ｍ−キメラ発現細胞培地に、ｒＦｌａＡの刺激１２時間前に直接添加した。細胞をｒＦｌａＡで５時間刺激した。細胞をｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解し、ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の試薬およびプロトコルを使用して、ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（ｍｏｄｅｌ：ＢＬＲ−２０１，Ａｌｏｋａ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で、ルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。Ｒｅｎｉｌａ  ｌｕｓｉｆｅｒａｓｅ内部標準を用いる光強度測定より比活性を算出した。値を、別々の３回の実験での最小値からの相対刺激平均±Ｓ．Ｄ．として示した。【０２３７】  ＥＬＡＭ−ルシフェラーゼレポータープラスミドとともに空ベクター（左バー）またはＭ−キメラ（右バー）をトランスフェクトしたＣＨＯ形質転換体およびＨｅｌ���形質転換体におけるＭ−キメラのシグナル伝達を、図６に示す。図６Ａは、Ｍ−キメラを発現するＣＨＯ細胞（左）およびＨｅｌａ細胞（右）におけるＮＦ−κＢ活性測定についてのルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイの結果であり、トランスフェクションの３６時間後、細胞を、示した濃度のＦｌａＡで５時間刺激した。ＮＦ−κＢ活性化の程度を、細胞溶解物でのルシフェラーゼアッセイによって測定した。【０２３８】  Ｍ−キメラのｒＦｌａＡ（１μｇ／ｍｌ）に対する応答（図６Ａ）およびｒＦｌａＣに対する応答（データは示さず）を、ＣＨＯ系におけるＮＦ−κＢ活性化として検出したが、応答の程度は低かった。また、Ｍ−キメラ発現Ｈｅｌａ細胞において検出されたフラジェリン媒介性ＮＦ−κＢ活性化はわずかであったが、これはおそらく、トランスフェクション効率が低いことに起因すると考えられた。【０２３９】  Ｍ−キメラまたはｈｕＴＬＲ５を発現する細胞を種々のＴＬＲリガンドで刺激した結果を、図６Ｂに示す。ＣＨＯ（上パネル）またはＨｅｌａ（下パネル）を、ｒＦｌａＡ（１μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（０．１μｇ／ｍｌ）、ＰＧＮ（１０μｇ／ｍｌ）、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（２μｇ／ｍｌ）またはＣｐＧ−ＯＤＮ（２μＭ）で６時間刺激し、図６Ａ同様にＮＦ−κＢ活性を測定した。【０２４０】  図６Ｂに示すように、ＴＬＲリガンド（ＬＰＳ（０．１μｇ／ｍｌ）、ＰＧＮ（１０μｇ／ｍｌ）、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（２μｇ／ｍｌ）およびＣｐＧ−ＯＤＮ（２μＭ））は、これらの最適な濃度においてでさえＮＦ−κＢの活性化を誘導しなかったことから、Ｍ−キメラ発現細胞におけるＮＦ−κＢの活性化は、ｒＦｌａＡに特異的であることがわかった。【０２４１】  以上のことから、哺乳動物のアダプター分子に対してｒｔＴＬＲ５ＭのＴＩＲが適合しないのでＮＦ−κＢ応答を生じないと考えられた。【０２４２】  次いで、ｒｔＴＬＲ５ＭとｒｔＴＬＲ５Ｓとを組み合わせた効果を調べた。ｒｔＴＬＲ５Ｓ発現ＣＨＯ細胞の馴化培地（ｒｔＴＬＲ５Ｓを含む）を、Ｍ−キメラ発現細胞に添加して、ｒＦｌａＡでこの細胞を処理した。Ｍ−キメラを発現するＣＨＯ細胞（左パネル）またはＨｅｌａ細胞（右パネル）において、ｒｔＴＬＲ５Ｓ発現細胞の上清を添加することによるフラジェリン依存的ＮＦ−κＢ活性化の効果を、図６Ｃに示す。実験を三連で行い、結果を平均±Ｓ．Ｄ．で示した。【０２４３】  Ｍ−キメラ発現ＣＨＯ細胞は、ｒＦｌａＡ（左から２番目）にわずかに応答したが、空ベクターを有する細胞（コントロール；左）では効果はなかった。種々の量のｒｔＴＬＲ５Ｓプラスミド（１〜１００μｇ）をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培養上清を、刺激１２時間前にＭ−キメラ発現細胞に添加した。ｒＦｌａＡ刺激後５時間のインターバルをおいて、細胞を回収し、細胞溶解物でのＮＦ−κＢ活性を、ルシフェラーゼアッセイによって測定した（左パネル）。Ｍ−キメラ発現Ｈｅｌａ細胞において、同様の実験を行った。Ｍ−キメラを有するＨｅｌａ細胞は、わずかにｒＦｌａＡに応答したが（左から２番目）、馴化培地存在下で、ｒＦｌａＡに有意に応答した（右パネル）。【０２４４】  以上のように、Ｍ−キメラ発現細胞において、トランスフェクトされたｒｔＴＬＲ５Ｓ（ＣＨＯ細胞培地中に存在する）のｃＤＮＡの用量に比例するＮＦ−κＢ活性化を生じた。同一の系においてＭ−キメラ発現細胞の上清を添加しても、このようなＮＦ−κＢ活性化の上方制御を生じなかった（データは示さず）。Ｍ−キメラ発現Ｈｅｌａ細胞において、フラジェリン媒介性ＮＦ−κＢ活性化は、ｒｔＴＬＲ５Ｓ発現Ｈｅｌａ細胞の馴化培地の存在下でより強く生じた。【０２４５】  〔実施例９：フラジェリンに対するｒｔＴＬＲ５Ｓの物理的な結合〕
ＮＦ−κＢ活性化におけるｒｔＴＬＲ５Ｍに対するｒｔＴＬＲ５Ｓの協同効果を確認するために、Ｂａｃ−Ｔｏ−Ｂａｃ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、バキュロウイルス系においてリコンビナントｒｔＴＬＲ５Ｓを生成し、ｒｔＴＬＲ５Ｓタンパク質のＧＳＴ−ＦｌａＡに対する物理的な結合を調べた。【０２４６】  具体的には、Ｈｉｓ６タグをＣ末端に有するｒｔＴＬＲ５Ｓ全長を、ＰＣＲを用いて作製した。ｃＤＮＡを、ｐＦａｓｔＢａｃ１プラスミドのＳａｌＩ−ＮｏｔＩ位の間に挿入し、ｐＦａｓｔ−Ｂａｃ１／ｒｔＴＬＲ５Ｓと名付けた。Ｈｉｓ６タグを有するｒｔＴＬＲ５ＳをコードするＢａｃｍｉｄ  ＤＮＡを作製するために、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂａｃ細胞を、この細胞のトランスポジション活性を用いてｐＦａｓｔ−Ｂａｃ１／ｒｔＴＬＲ５Ｓで形質転換した。標準的方法によって細胞からｂａｃｍｉｄ  ＤＮＡを得、ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によってＳｆ２１細胞に移入してリコンビナントウイルスを作製した。このリコンビナントウイルスを使用して、多重度５で無血清培地中にて単層のＳｆ２１細胞を感染させた。３日間培養した後、ｎｉｃｋｅｌ−ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｅａｄｓ（Ｑｉａｇｅｎ）およびＭｏｎｏ  Ｑイオン交換カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ｒｔＴＬＲ５Ｓタンパク質を培地から精製した。抗Ｈｉｓ６タグ抗体を使用するイムノブロッティングによってタンパク質を同定した。この手順で、５００ｍｌの培養培地から５μｇのｒｔＴＬＲ５Ｓを得た。【０２４７】  次いで、フラジェリンに対するｒｔＴＬＲ５Ｓの物理的な結合を、Ｈｉｓ６標識ｒｔＴＬＲ５ＳのＧＳＴ−ＦｌａＡに対する結合能を指標にするＧＳＴ−プルダウンアッセイによって評価した。【０２４８】  簡単には、３００μｌのＰＢＳ（ｐＨ８．０）中に２０ｎｇのｒｔＴＬＲ５Ｓおよび示した量（０〜５μｇ）のＧＳＴまたはＧＳＴ−ＦｌａＡを、４℃で２時間インキュベートし、１０μｌのｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂとともに穏やかに振騰させながら４℃でインキュベートした。Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを、遠心分離によって回収し、ＰＢＳで４回洗浄した。還元条件下でＳｅｐｈａｒｏｓｅからタンパク質を溶出した。溶出物を、抗Ｈｉｓ６抗体（０．２μｇ／ｍｌ）を用いてイムノブロッティングに供した。ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ｓｅｃｏｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢＩＯ−ＳＯＵＲＣＥ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）およびＥＣＬ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて発色させた。結果を、図７Ａに示す。【０２４９】  また、結合タンパク質の量を、ＧＳＴ−ＦｌａＡとは結合しないｌａｍｐｒｅｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ３（ＡＹ３５９８６１）の量と比較したところ、ｒｔＴＬＲ５ＳとＧＳＴ−ＦｌａＡとの結合は特異的であることがわかった（データは示さず）。すなわち、この結合アッセイは、ｒｔＴＬＲ５Ｓがフラジェリ��に対する親和性を有することを示した。【０２５０】  〔実施例１０：ｒｔＴＬＲ５Ｓの機能的特性〕
次いで、ｒｔＴＬＲ５Ｓの機能的特性を、Ｍ−キメラ発現細胞において試験した。【０２５１】  上述したように、Ｍ−キメラ発現ＣＨＯ細胞およびＭ−キメラ発現Ｈｅｌａ細胞を作製した。バキュロウイルス系を用いて作製した上述のリコンビナントｒｔＴＬＲ５Ｓをこれらの細胞に添加して、上述のＮＦ−κＢレポーターアッセイを用いてｒＦｌａＡに対する感受性を調べた。【０２５２】  Ｍ−キメラを発現する細胞において、精製したｒｔＴＬＲ５Ｓを添加することによるフラジェリン依存的ＮＦ−κＢ活性化の効果を。図７Ｂに示す。Ｍ−キメラを発現するＣＨＯ細胞（上パネル）またはＨｅｌａ細胞（左パネル）は、空ベクターを有する細胞（白バー、コントロール）と比較して、わずかにｒＦｌａＡに応答した（斜線バー、右）。種々の量の精製ｒｔＴＬＲ５Ｓ（１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌ）を、刺激１２時間前にＭ−キメラ発現細胞に添加した。ｒＦｌａＡ刺激後５時間のインターバルをおいて、細胞を回収し、細胞溶解物でのＮＦ−κＢ活性を、ルシフェラーゼアッセイによって測定した。実験を三連で行い、結果を平均±Ｓ．Ｄ．で示した。【０２５３】  図７Ｂに示すように、可溶性形態であるｒｔＴＬＲ５Ｓタンパク質（１〜１００ｎｇ／ｍｌ）は、ＮＦ−κＢレポーターアッセイにおいて、Ｍ−キメラ発現ＣＨＯ細胞およびＭ−キメラ発現Ｈｅｌａ細胞をｒＦｌａＡに対してより感受性にした。特に、ｒｔＴＬＲ５Ｍを有するＨｅｌａ細胞は、ｒｔＴＬＲ５Ｓに対して顕著に応答した。すなわち、リコンビナントｒｔＴＬＲ５Ｓの外因的な添加が、Ｍ−キメラ発現細胞におけるｒＦｌａＡ依存的ＮＦ−κＢ活性化を誘導した。【０２５４】  以上の結果より、ｒｔＴＬＲ５Ｍによるフラジェリンの最初の認識が、ｒｔＴＬＲ５Ｓおよび炎症性サイトカインを肝臓における基底レベルまで誘導し、次に、ｒｔＴＬＲ５Ｍと誘導された循環系ｒｔＴＬＲ５Ｓとの組み合わせが、強いＮＦ−κＢ活性化を刺激し、全身でのフラジェリンに対する完全な応答を導くと考えられる。【０２５５】  〔実施例１１：可溶性形態のニジマスＴｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ５オルソログ〕
可溶性形態のＴｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ５オルソログ（ＴＬＲ５Ｓ）は、魚類にのみ存在し、哺乳動物においてはこのような分子は存在しない。このような独特の分子種であるニジマスＴＬＲ５Ｓ（ｒｔＴＬＲ５Ｓ）について、さらなる解析を行った。【０２５６】  ｒｔＴＬＲ５Ｓの推定のアミノ酸配列、およびｒｔＴＬＲ５Ｓと他の種のＴＬＲ５とのアラインメントを図８に示す。【０２５７】  図８Ａは、ｒｔＴＬＲ５Ｓとｈｕ／ｍｏ／ｆｇＴＬＲ５の細胞外ＬＲＲドメインとを比較したアラインメントを示す。ｃＤＮＡのアラインメントおよびモチーフ分析を、ＧＥＮＥＴＹＸ，Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗを用いて行った。ニジマス（ｒｔ）の遺伝子配列を、ＮＣＢＩより得た。ＢＬＡＳＴ検索分析を、Ｆｕｇｕ  ＢＬＡＳＴサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｆｕｇｕ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ｂｌａｓｔ／）にてｔｂｌａｓｔｎプログラムを使用して行った。エクソン／イントロン境界を予測するために、ＧｅｎｅＭａｒｋ，ｈｍｍ（ｈｔｔｐ：／／ｏｐａｌ．ｂｉｏｌｏｇｙ．ｇａｔｅｃｈ．ｅｄｕ／ＧｅｎｅＭａｒｋ／）プログラムおよびＧｅｎｅＳｃａｎ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｓ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ＧｅｎｅＭａｒｋ／）プログラムを使用した。得られた結果を、哺乳動物ＴＬＲと手動で比較することによってさらに改善した。ドメイン構造を、ＳＭＡＲＴプログラムを使用して予測した。さらに、ＴＭＨＭＭ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ−２．０／）プログラムを使用して、ｒｔＴＬＲ５Ｓ中の膜貫通ドメインを予測した。このプログラムはまた、ｒｔＴＬＲ５Ｓ中に膜貫通ドメインが存在しないことを支持した。ＴＬＲタンパク質配列のアラインメントを、ＤＤＢＪのＷＷＷサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｈｙｐｅｒｎｉｇ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ）においてＣｌｕｓｔａｌ  Ｗを使用して行った。【０２５８】  図８Ａにおいて、哺乳動物および魚類を超えて保存されているシステインを四角で囲む。ＴＭは膜貫通ドメイン、ＴＩＲはＴＩＲドメインを示す。星印は、保存されたアミノ酸を示す。ｈｕＴＬＲ５、ヒトＴＬＲ５（配列番号３９）；ｍｏＴＬＲ５、マウスＴＬＲ５（配列番号４１）；ｒｔＴＬＲ５、ニジマス可溶性形態ＴＬＲ５（配列番号２）；ｆｇＴＬＲ５、ｆｕｇｕ  ＴＬＲ５（配列番号４３）；ｆｇＴＬＲ５Ｓ、ｆｕｇｕ可溶性形態ＴＬＲ５（配列番号４５）。各ドメインを、ＳＭＡＲＴプログラムを使用して予測した。いくつかの膜貫通領域をＴＭＨＭＭプログラムによって予測した。【０２５９】  その結果、ｒｔＴＬＲ５のアミノ酸一次配列（ＡＢ０６２５０４）は、１９９２ｂｐのＯＲＦおよび１２２３ｂｐの３’−ＵＴＲからなる。ＳＭＡＲＴ分析は、このタンパク質中の１１個のＬＲＲが、可溶性形態のｆｇＴＬＲ５と高い相同性（５８％）を有することを示した。ｒｔＴＬＲ５Ｓは、ｈｕＴＬＲ５およびｍｏＴＬＲ５のＬＲＲドメインとそれぞれ３７％および３８％の相同性を有した。ｒｔＴＬＲ５Ｓは、ヒトまたはマウスの他のＴＬＲのＬＲＲドメインとは２５％未満の相同性を示した。ｍｏ／ｈｕＴＬＲ５のＬＲＲドメイン中のシステイン１１個中９個が、ｒｔＴＬＲ５Ｓにおいて保存されていた。ＢＬＡＳＴ検索���析は、このタンパク質が哺乳動物ではマウスＴＬＲ５に最も類似することを示唆した。【０２６０】  図８Ｂは、ｒｔＴＬＲ５のＫ−Ｄプロット分析の結果を示す。モチーフ検索、Ｋ−ＤプロットおよびＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ比較は、この魚類ＬＲＲタンパク質が膜貫通部分およびＴＩＲを有さないことを示した。【０２６１】  〔実施例１２：ｒｔＴＬＲ５ＳとヒトＴＬＲ５のＴＩＲとのキメラによるフラジェリンの認識〕
フラジェリンは、ｈｕ／ｍｏＴＬＲ５のリガンドであるので、ｒｔＴＬＲ５Ｓが種々の細菌由来のフラジェリンを認識するか否かを試験した。【０２６２】  本試験のために、本発明者らは、ｒｔＴＬＲ５ＳのｃＤＮＡとｈｕＴＬＲ５の膜貫通ドメインおよびＴＩＲドメインのｃＤＮＡとのキメラレセプターｃＤＮＡ（Ｓ−キメラ）を作製した。【０２６３】  ｒｔＴＬＲ５Ｓ  ｃＤＮＡの全長を、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ロイシンリッチリピートを含むＥＳＴクローン（ＡＦ２８１３４６）よりクローニングした。肝臓ｃＤＮＡテンプレート、および、プライマー１特異的エンドプライマーまたはプライマー２特異的エンドプライマー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のいずれかと対のｒｔＴＬＲ５Ｓ遺伝子特異的内部プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲアンプリコンをクローニングして配列精度を評価した。最終的に、プライマーＦ２（ｃａｇｔｇｃｔｔｃａａｇｔｔａｔｃｔｇｃｇａｇｇ（配列番号２４））およびプライマーＲ２（ｔｃｃａｃａｔｃｇｔｔｔｃｃａｇｔｃａａａａｃｃ（配列番号２５））を用いるＲＴ−ＰＣＲによって、肝臓ｃＤＮＡライブラリーよりｒｔＴＬＲ５ＳのｃＤＮＡ全長を得た。シグナル配列を除くｒｔＴＬＲ５ＳをコードするｃＤＮＡを、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ部位に挿入した。【０２６４】  ＦＬＡＧタグ化したｒｔＴＬＲ５Ｓ細胞外ドメイン（アミノ酸２９〜５９７位）をコードするｃＤＮＡを、ヒトＴＬＲ５のＣ末端隣接領域、膜貫通領域および細胞内ドメイン（アミノ酸５７４〜８５８位）をコードするｃＤＮＡに融合することによって、キメラｃＮＤＡを構築した（Ｓ−キメラを名付けた）。この構築物を、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ発現ベクター中にクローニングした。実施例６と同様に、ＲＴ−ＰＣＲによってヒト単球ｃＤＮＡより全長ｈｕＴＬＲ５を得た。ヒトＥ−セレクチン（ＥＬＡＭ）のプロモーター領域（−２４１〜−５４）を、ｐＧＶ−Ｅ２（Ｔｏｙｏ  Ｉｎｃ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結した。このプラスミド（ｐＥＬＡＭ−ｌｕｃと名付けた）を、ＮＦ−κＢ活性化についてのレポーターとして使用した。ｐ−１２５ｌｕｃ（ＩＦＮ−β）レポータープラスミドを使用するレポーターアッセイによって、ＩＦＮ−βプロモーターの活性化を測定した。【０２６５】  ヒト子宮頚癌細胞株Ｈｅｌａにおいて、ＮＦ−κＢレポーターアッセイを行った。【０２６６】  Ｈｅｌａ細胞およびＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を、５〜１０％の熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；ＪＲＨ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。【０２６７】  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入した。Ｐ．ａｖｅｎａｅのフラジェリンをＮａｒａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにて精製した。組換えフラジェリンＡおよび組換えフラジェリンＣを、Ｖ．ａｎ���ｕｉｌｌａｒｕｍのｃＤＮＡより精製した。ＬＰＳをＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）より購入した。ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｕｃｈｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）より入手した。ＭＡＬＰ−２をＢｉｏｌｏｇｉｃａ（Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）において合成した。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのペプチドグリカン（ＰＧＮ）およびＰｏｌｙｍｙｘｉｎ  ＢをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より入手した。ヌクレオチドプライマーの全てをＨｏｋｋａｉｄｏ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｐｐｏｒｏ，Ｊａｐａｎ）で合成した。【０２６８】  使用したＨｅｌａ細胞のサブラインは、細胞表面上にＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４およびＴＬＲ５を発現していない。Ｈｅｌａ細胞を、２４ウェルプレート（１×１０５細胞／ウェル）に播いた。２４時間後に、Ｓ−キメラ、ｈｕＴＬＲ５、ｒｔＴＬＲ５Ｓ（１００ｎｇ）の発現のためのｐＦＬＡＧ−ＣＭＶまたはコントロールとしてのベクター単独を、ｐＥＬＡＭ−ｌｕｃレポーター遺伝子（１００ｎｇ）とともにＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  Ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって上記細胞に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトしたＤＮＡの総量（４００ｎｇ）を、空ベクターを添加することによって調整した。ｐｈＲＬ−ＴＫ（１ｎｇ）を内部標準として使用した。【０２６９】  トランスフェクションの３６時間後、細胞を、フラジェリンＡ（１０００ｎｇ／ｍｌ）、フラジェリンＣ（１０００ｎｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（１０００ｎｇ／ｍｌ）またはＭＡＬＰ−２（１μＭ）を用いて、３７℃で５時間処理した。これらは、それぞれＴＬＲ５、ＴＬＲ４、ＴＬＲ３およびＴＬＲ２のリガンドである。【０２７０】  ＩＦＮ−βプロモーター活性化の測定のために、２４ウェルプレート中のＨＥＫ２９３細胞（２×１０５細胞）に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｐ−１２５ｌｕｃ（ＩＦＮ−β）レポータープラスミド（１００ｎｇ）を、示した量の試薬またはプラスミドとともにトランスフェクトした。【０２７１】  Ｈｅｌａ細胞に、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ／ｈｕＴＬＲ５（１００ｎｇ）、種々の量（０〜５０ｎｇ）のｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ／ｒｔＴＬＲ５Ｓ、ｐＥＬＡＭ−ｌｕｃまたはｐ−１２５ｌｕｃ（各１００ｎｇ）およびｐｈＲＬ−ＴＫ（１ｎｇ）をトランスフェクトした。２４時間後、細胞を９６ウェルプレートに移し、次いで、０〜１０００ｎｇのフラジェリンＡで刺激した後、５時間静置した。Ｄｕａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の試薬およびプロトコルを使用して、ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（ｍｏｄｅｌ：ＢＬＲ−２０１，Ａｌｏｋａ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で、以前に記されたようにルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。【０２７２】  上記の手順に従って、Ｓ−キメラタンパク質をＨｅｌａ細胞に首尾よく発現させた。また、この発現を、抗ＨｉｓタグＡｂを使用して確認した。ｒｔＴＬＲ５Ｓはフラジェリンを認識する能力を���する場合、このキメラレポーターは、エクトドメインによってフラジェリンの存在を認識し、そしてヒトＴＩＲを介してＨｅｌａ細胞においてＮＦ−κＢを活性化する。このキメラ発現Ｈｅｌａ細胞を使用した代表的な結果を、図９Ａに示す。【０２７３】  図９Ａは、キメラ形質転換体およびｈｕＴＬＲ５形質転換体におけるＮＦ−κＢ活性化の測定のためのルシフェラーゼレポーターアッセイを示す。ＥＬＡＭ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポータープラスミドを、空ベクター（ベクターコントロール：左）、ｈｕＴＬＲ５（中央）またはキメラ（右側）とともにＨｅｌａ細胞に同時トランスフェクトした。３６時間後、細胞をフラジェリンＡで示した濃度にて５時間刺激した。ＮＦ−κＢ活性化の程度を、細胞溶解物中のルシフェラーゼアッセイによって決定した。【０２７４】  図９Ａに示すように、Ｓ−キメラ分子は、Ｈｅｌａ細胞においてｈｕＴＬＲ５と同程度にＮＦ−κＢレポーター遺伝子を活性化した。ここで、これらの発現レベルはほぼ同一であった。フラジェリンＡおよびフラジェリンＣは、同一のｒｔＴＬＲ５刺激能を有した。【０２７５】  Ｓ−キメラが種々の起源のフラジェリンに応答することを図９Ｂに示す。ｈｕＴＬＲ５またはこのキメラを発現する細胞を、フラジェリンＡ（１０００ｎｇ／ｍｌ）、フラジェリンＣ（１０００ｎｇ／ｍｌ）またはＰ．ａｖｅｎａｅフラジェリンで６時間刺激した。ＮＦ−κＢ活性化を、図９Ａと同様に決定した。【０２７６】  図９Ｂに示すように、他の植物細菌Ｐ．ａｖｅｎａｅのフラジェリンは、同様にこのキメラを刺激した。これらの結果は、別の細胞株ＨＥＫ２９３において再現可能であった（データは示さず）。一方、ｒｔＴＬＲ５ＳおよびｈｕＴＬＲ５は、そのＬＲＲドメインを介して広範な種々のフラジェリンと相互作用した。【０２７７】  これらの相互作用の特異的を試験するために、本発明者らは、ｈｕＴＬＲ５およびＳ−キメラを、ＭＡＬＰ−２（ＴＬＲ２のリガンド）、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（ＴＬＲ３のリガンド）、ＬＰＳ（ＴＬＲ４のリガンド）およびフラジェリンＣ（ＴＬＲ５のリガンド）で刺激した（図９Ｃ）。このキメラ分子およびヒトＴＬＲ５は、排他的にフラジェリンを認識してＮＦ−κＢレポーター遺伝子を活性化した。【０２７８】  次いで、Ｈｅｌａ細胞におけるｒｔＴＬＲ５Ｓのパートナーの特異性を試験した。ｒｔＴＬＲ５Ｓありまたはなしの条件下でｈｕＴＬＲ２，ｈｕＴＬＲ４（ＭＤ−２およびＣＤ１４と一緒に）またはｈｕＴＬＲ５のｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞を、種々のＴＬＲリガンドで刺激した（図１０）。ｈｕＴＬＲ２発現細胞において、ＭＡＬＰ−２およびＰａｍ３によってＮＦ−κＢレポーター活性を示し、ｈｕＴＬＲ４発現細胞においてＬＰＳによって、ＮＦ−κＢレポーター活性を示した。しかし、この活性は、ｒｔＴＬＲ５Ｓの同時発現によってもたらされたものではなかった。ｈｕＴＬＲ５とフラジェリンを発現する細胞においてのみＴＬＲ５Ｓ媒介性レポーター増幅を観察した（図１０）。よって、ｒｔＴＬＲ５Ｓの活性は、ｈｕＴＬＲ５およびフラジェリンに特異的であることがわかった。【０２７９】  〔実施例１３：ｒｔＴＬＲ５Ｓは、形質転換体におけるｈｕＴＬＲ５媒介性ＮＦ���κＢ活性化を増大させる〕
実施例１０に従うと、ｒｔＴＬＲ５ＳがｒｔＴＬＲ５によるＮＦ−κＢ活性化を誘導した。そこで、この可溶性形態のＴＬＲ５が、ヒト膜結合形態ＴＬＲ５によって誘導されたフラジェリン媒介性ＮＦ−κＢ活性化を増大し得るか否かを試験した。【０２８０】  実施例１２に記載した細胞およびアッセイ方法を用いて、ｈｕＴＬＲ５のみを発現するＨｅｌａ細胞、またはｈｕＴＬＲ５＋ｒｔＴＬＲ５Ｓを発現するＨｅｌａ細胞を、フラジェリンＡで刺激した。図１１に示すように、Ｈｅｌａ細胞に示した組み合わせのベクターをトランスフェクトし、この細胞を、フラジェリンＡ（示した用量）またはコントロールＧＳＴタンパク質（１０００ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。間をおいて（典型的には５時間）、ＮＦ−κＢレポーターアッセイを行った。【０２８１】  図１１Ａに示すように、ＮＦ−κＢレポーターは、ｒｔＴＬＲ５Ｓが同時トランスフェクトされた細胞において有意に増大された。ｈｕＴＬＲ５（他のＴＬＲ５ではない）を種々のフラジェリン種とともに天然に発現するＨＥＫ２９３細胞を用いて、同様の結果を得た（データは示さず）。しかし、ｐ−１２５−ｌｕｃを使用する同様のレポーターアッセイにおいて、Ｈｅｌａ細胞におけるＩＦＮ−βプロモーターの活性化をわずかに検出した。【０２８２】  このフラジェリンの機能的様式を物理的に確認するために、本発明者らは、ＧＳＴタグ化フラジェリンとＦＬＡＧタグ化ｒｔＴＬＲ５Ｓとの直敵的な相互作用をＧＳＴ−プルダウンおよびイムノブロッティングによって調べた。ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ／ｒｔＴＬＲ５ＳをＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクトし、この細胞および上清からのフラジェリン結合タンパク質を、抗ＦＬＡＧ  Ａｂでプローブした。あるいは、このタンパク質を、抗ＦＬＡＧ  Ａｂで免疫沈降させて抗ＧＳＴ  Ａｂを使用するイムノブロッティングによって分析した。【０２８３】  具体的には、６０ｍｍディッシュにて、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ／ｒｔＴＬＲ５ＳまたはｈｕＴＬＲ２（コントロール）を、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００試薬を使用してＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に一過性にトランスフェクトし、２４時間静置させた。細胞を溶解し、ＧＳＴ−フラジェリンＡまたはコントロールＧＳＴ（１０００ｎｇ）をこの溶解物または培養上清に添加した。ＧＳＴ−フラジェリンに結合したＦＬＡＧ標識タンパク質を、抗ＧＳＴ  Ａｂ（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を用いて免疫沈降した。免疫沈降物を洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７．５％ゲル）で分離し、示した抗体を使用するイムノブロッティングによって可視化した。【０２８４】  図１１Ａ（内側のパネル）に示すように、ｈｕＴＬＲ５の発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、引き続く抗ＦＬＡＧ  Ａｂを用いるイムノブロッティングによって確認した。ｒｔＴＬＲ５ＳとｈｕＴＬＲ５との同時トランスフェクションは、ｈｕＴＬＲ５発現レベルにほとんど影響を与えなかった。ｒｔＴＬＲ５Ｓのバンドは、細胞溶解物または上清中には検出されなかった。【０２８５】  フラジェリンのこの機能的態様を物理的に確認するために、免疫沈降を用いて、ＧＳＴタグ化フラジェリンとＦＬＡＧタグ化ｒｔＴＬＲ５Ｓとの直接的な相互作用をチェックした。ＨＥＫ２９３Ｔ���胞を、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ／ｒｔＴＬＲ５Ｓでトランスフェクトし、細胞および上清からのタンパク質を、ブロッティング分析によって抗ＦＬＡＧ  Ａｂでプローブした。あるいは、これらのタンパク質を、抗ＧＳＴ  Ａｂで免疫沈降し、抗ＦＬＡＧ  Ａｂを使用するイムノブロッティングにより分析した（図１１Ｂ）。ｒｔＴＬＲ５Ｓ（矢頭）と７７ｋＤａのマーカーとの位置を示す。これらの結果は、さらなる実験において確認された（図１１Ｃ）。これらのことより、ｒｔＴＬＲ５Ｓはフラジェリンとアセンブリすることによって宿主ＴＬＲ５応答を増幅する、ということを示す。【０２８６】  これらの結果は、ｒｔＴＬＲ５Ｓの生理学的役割が、ＴＬＲ５の種を超えて生じるフラジェリン／ＴＬＲ５依存的ＮＦ−κＢ応答を増強することであることを示す。すなわち、魚類の可溶性形態ＴＬＲ５は、細胞種に関係なく膜結合形態ＴＬＲ５ポジティブ細胞における強いＮＦ−κＢ活性化を導くフラジェリン応答についてのポジティブフィードバックループに従う。【０２８７】  尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する特許請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用可能性】
【０２８８】  本発明は、免疫応答（特に、ガンまたは感染疾患に対する）を惹起するためのワクチンにおけるアジュバントとして使用することができるので、種々の疾患（例えば、ウイルス感染症、細菌感染症もしくは寄生虫感染症、ガン、アレルギー、または自己免疫疾患など）を罹患する被験体（好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒト）の治療の開発に貢献できる。特に、従来のワクチンの有する不利益を克服した新規ワクチンを提供することができる。
【図１（Ａ）】
2006085411.tif 000004
【図１（Ｂ）】
2006085411.tif 000005
【図１（Ｃ）】
2006085411.tif 000006
【図１（Ｄ）】
2006085411.tif 000007
【図２Ａ】
2006085411.tif 000008
【図２Ｂ】
2006085411.tif 000009
【図２Ｃ】
2006085411.tif 000010
【図３】
2006085411.tif 000011
【図４Ａ】
2006085411.tif 000012
【図４Ｂ】
2006085411.tif 000013
【図４Ｃ】
2006085411.tif 000014
【図４Ｄ】
2006085411.tif 000015
【図５Ａ】
2006085411.tif 000016
【図５Ｂ】
2006085411.tif 000017
【図６Ａ】
2006085411.tif 000018
【図６Ｂ】
2006085411.tif 000019
【図６Ｃ】
2006085411.tif 000020
【図７Ａ】
2006085411.tif 000021
【図７Ｂ】
2006085411.tif 000022
【図８Ａ】
2006085411.tif 000023
【図８Ｂ】
2006085411.tif 000024
【図９Ａ】
2006085411.tif 000025
【図９Ｂ】
2006085411.tif 000026
【図９Ｃ】
2006085411.tif 000027
【図１０】
2006085411.tif 000028
【図１１Ａ】
2006085411.tif 000029
【図１１Ｂ】
2006085411.tif 000030
【図１１Ｃ】
2006085411.tif 000031
【国際調査報告】
2006085411.tif 000032
2006085411.tif 000033
2006085411.tif 000034
2006085411.tif 000035
2006085411.tif 000036
2006085411.tif 000037
2006085411.tif 000038
2006085411.tif 000039