(57)【要約】本発明は、遺伝子治療に用いて腫瘍細胞などの異常細胞を特異的に標的化して死滅させ治療する医薬を提供することを目的とする。本発明は、サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）の発現に依存して増殖するサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターを含む増殖型ベクターを有効成分とする医薬に関する。該医薬は、腫瘍に対する冶療を目的としても良い。該医薬は、アデノウイルスをベクターとして用いても良い。該医薬におけるアデノウイルスは、Ｅ１Ａ領域の内因性プロモーターをサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターで置換しても良い。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）の発現に依存して増殖するサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターを含む増殖型ベクターを有効成分とする医薬。
【請求項２】
腫瘍に対する冶療を目的とするものである請求の範囲第１項に記載の医薬。
【請求項３】
アデノウイルスをベクターとして用いるものである請求の範囲第１項又は請求の範囲第２項に記載の医薬。
【請求項４】
Ｅ１Ａ領域の内因性プロモーターをサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターで置換した請求の範囲第３項に記載の医薬。
【請求項５】
Ｅ１Ａ領域がＲｂ蛋白結合配列を欠失しているものである請求の範囲第４項に記載の医薬。
【請求項６】
Ｅ１Ｂ領域の内因性プロモーターをサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターで置換した請求の範囲第項に記載の医薬。
【請求項７】
Ｅ１Ｂ領域の蛋白質コーディング領域が１９ＫＤａ蛋白質コーディング領域及び／又は５５ＫＤａ蛋白質コーディング領域である請求の範囲第４項〜請求の範囲第６項のいずれかに記載の医薬。
【請求項８】
サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）の発現に依存して増殖するサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターを含む増殖型ベクターを有効成分とする医薬を用いるサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）が高度に発現する疾患の治療方法。
【請求項９】
遺伝子治療によるものである請求の範囲第８項に記載の治療方法。
【請求項１０】
サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）が高度に発現する疾患が悪性腫瘍又は良性腫瘍である請求の範囲第８項又は請求の範囲第９項に記載の治療方法。
【請求項１１】
サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）が高度に発現する疾患が関節リウマチである請求の範囲第８項又は請求の範囲第９項に記載の治療方法。
【請求項１２】
請求の範囲第２項〜請求の範囲第７項のいずれかに記載の医薬を用いる悪性腫瘍又は良性腫瘍の治療方法。
【請求項１３】
サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）の発現に依存して増殖するサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターを含む増殖型ベクターに治療遺伝子を導入したものを用いるサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）が高度に発現する疾患の治療方法。
【請求項１４】
治療遺伝子が自殺遺伝子又はアポトーシス誘導遺伝子である請求の範囲第１３項に記載の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターを含み、サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）の発現に依存して増殖することにより悪性腫瘍などを治療する増殖型ベクターを有効成分とする医薬に関する。
【背景技術】  悪性腫瘍である癌は日本人の死因の第１位を占め、未だに癌を根治できる決定的な治療法はない。癌を特異的に標的とする新しい治療法は、高い治療効果という観点だけでなく、副作用軽減の観点からも期待されているものであり、癌特異的標的化を目指した遺伝子治療法の開発が特に期待されている。腫瘍、癌を特異標的化するには様々な方法があるが、癌や腫瘍細胞でのみ高いレベルで発現する分子を何らかの形で利用する場合が多い。このような癌細胞に特異的に発現する腫瘍特異的分子は、腫瘍マーカーなどが数多く報告されているが、その目的のための理想的な分子とは、癌細胞でできるだけ強く発現し、正常細胞ではほとんど発現していない分子である。
現在、癌遺伝子治療において使用されている遺伝子を導入するベクターの大部分は、安全性を確保するため、ウイルスの感染後は治療遺伝子を導入するだけでウイルスが増殖しないように遺伝子工学的に改変された非増殖型ベクターである。ベクター自体の元来の能力としては高い遺伝子導入効率を示すものであっても、実際の臨床におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの投与の場合を考えた場合、ベクターが非増殖型である限りにおいて、ウイルス液が物理的に到達出来ない部位には当然遺伝子が導入できないという問題がある。非増殖型のベクターを用いて癌の遺伝子治療を行う場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験系でどれほど遺伝子導入効率の良いベクターを用いても、体内の癌細胞全てに遺伝子を導入することは不可能ということになる。
つまり非増殖型ベクターを用いた現在の遺伝子治療法は、遺伝子が導入されない細胞にもある程度影響を及ぼすような治療遺伝子を用いらざるを得ないという大きな制約があり、その場合でも全ての癌細胞を、しかも癌細胞のみを標的化して殺すことは不可能で、その治療効果は極めて限定的なものである。このような遺伝子が導入されない癌細胞からの再発という極めて大きな問題が克服されない限り、遺伝子治療により癌の根治を得ることは困難である。
そのため、これを克服するベクターとして、癌でのみ増殖するウイルスベクターが報告されている。その一つとして、癌細胞でウイルスが増殖し、正常細胞で増殖しないように制御するために、ウイルスベクターの増殖に必要なウイルス遺伝子を癌特異的な分子のプロモーターで発現させる試みがある（Ｒｏｄｒｕｇｕｅｚ，Ｒ．，ｅｔ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，５７，２５５９−２５６３，１９９７）。しかし、癌のみを標的化するという点での特異性、またそのプロモーター活性ともに不十分なものであり、未だ決定的に有効な増殖型ベクターの開発は成功していない。
このような状況下、１９９７年にｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ（ＩＡＰ）ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙの一員の新規蛋白としてサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）の報告がある。サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）の大きな特徴は、癌特異的に発現し、分化した正常組織での発現はみられないことである（Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ；Ｎａｔ  Ｍｅｄ．３，９１７−９２１，１９９７）。また、細胞の有糸分裂期であるＧ２／Ｍ期に最大発現しており、分裂していない静止期の細胞では発現が抑制される（Ｌｉ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ；Ｎａｔｕｒｅ．３９６，５８０−５８４，１９９８）。サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）遺伝子の発現を調節するサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターは、癌特異的に遺伝子を発現する活性を持ち（Ｂａｏ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ；Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｌ．９４，５２２−５２８，２００２）、正常細胞ではほとんど遺伝子発現の活性を持たないという特性を持つ。したがって、このサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）遺伝子のプロモーターを利用して、種々の癌治療遺伝子を癌細胞特異的に発現させれば、癌細胞を特異標的化して死滅させる医薬の開発が可能になると期待されるが、従来、サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターを含む増殖型ベクターを有効成分とする医薬についての提案はない。
【発明の開示】
本発明は、サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）の発現に依存して増殖するサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターを含む増殖型ベクターを有効成分とする医薬を要旨とする。この医薬は、腫瘍に対する冶療を目的として用いることができる。アデノウイルスをベクターとして用いることができる。アデノウイルスは、Ｅ１Ａ領域の内因性プロモーターをサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターで置換でき、Ｅ１Ａ領域をＲｂ蛋白結合配列を欠失させても良い。アデノウイルスは、Ｅ１Ｂ領域の内因性プロモーターをサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターで置換できる。アデノウイルスは、Ｅ１Ｂ領域の蛋白質コーディング領域を１９ＫＤａ蛋白質コーディング領域及び／又は５５ＫＤａ蛋白質コーディング領域としても良い。
本発明は、サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）の発現に依存して増殖するサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターを含む増殖型ベクターを有効成分とする医薬を用いるサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）が高度に発現する疾患の治療方法を要旨とする。この治療方法は、遺伝子治療として行える。この治療方法において、サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）が高度に発現する疾患は悪性腫瘍、良性腫瘍あるいは関節リウマチである。上記に記載の医薬のいずれかを用いる悪性腫瘍又は良性腫瘍の治療方法を要旨とする。
本発明は、サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）の発現に依存して増殖するサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターを含む増殖型ベクターに治療遺伝子を導入したものを用いるサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）が高度に発現する疾患の治療方法を要旨とする。この治療法において、治療遺伝子を自殺遺伝子又はアポトーシス誘導遺伝子としても良い。
サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターは、必ずしもヒトサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターに限定されるものではなく、サル、マウス、ラットなど他の種のサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターを用いても良い。
サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターを含む増殖型ベクターは、以下に示すようなウイルスの増殖に必要な遺伝子をサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターの制御下に発現するベクターとできる。例えば、Ｅ１Ａ領域の内因性プロモーター又はＥ１Ｂ領域の内因性プロモーターをサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターで置換したアデノウイルス、Ｒｅｐ７８とＲｅｐ６８の内因性プロモーター（ｐ５プロモーター）又はＲｅｐ５２とＲｅｐ４０の内因性プロモーター（ｐ１９プロモーター）をサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターで置換したアデノ随伴ウイルス、ＩＣＰ０、４、２２、２７蛋白などの初期発現遺伝子又はチミジンキナーゼ遺伝子の内因性プロモーターをサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターで置換した単純ヘルプスウイルス、ＬＴＲ内の内因性プロモーターをサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターで置換したレトロウイルス、レンチナウイルスなどが挙げられるが、種々のウイルスの増殖に関連する遺伝子をサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーター依存性に発現させるウイルスベクターであれば、ここに挙げたものに限定されるものではない。アデノウイルスの場合、ヒトアデノウイルス５型、ヒトアデノウイルス２型、その他の型のヒトアデノウイルスをはじめ、他の動物種のアデノウイルスなどを用いることもできる。
上記のサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターを含む増殖型ベクターの作製は、以下の文献を参照して行うことができる。アデノウイルスの一般的な取り扱いに関しては、「Ｆｒａｎｋ  Ｌ．Ｇｒａｈａｍ著、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １１，ｐ１０９−１２８」および「Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（１９９１）」、アデノウイルスの作製に関しては、「Ｃｈｅｎ，Ｓ−Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｌｉｖｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ  ｏｆ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．（１９９５）９２，２４７７−２５８１．」に記載の方法に準じて行うことができる。また、特願２００３−２８３４２７（該出願後、ＷＯ  ２００５／０１２５３６、特開２００５−４６１０１）に記載の方法に基づき作製することもできる。アデノ随伴ウイルスの作製法に関しては、Ｌｕ  Ｙ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．１３（１）：１３３−４５，２００４、Ｇｒｉｍｍ  Ｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ．２８（２）：１４６−５７，２００２に準じて行うことができる。ヘルペスウイルスの作製に関しては、Ｂｕｒｔｏｎ  ＥＡ，ｅｔ  ａｌ，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２１（１２）：９１５−３６，２００２、Ｂｕｒｔｏｎ  ＥＡ，ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３（５）：４２４−８，２００２に準じて行うことができる。レトロウイルスの作製に関しては、Ｋｏｓａｉ  ＫＩ，ｅｔ  ａｌ，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９（９）：１２９３−３０１，１９９８、Ｋａｙ  ＭＡ，ｅｔ  ａｌ，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３（６）：６４１−７，１９９２に準じて行うことができる。レンチウイルスの作製に関しては、Ｎａｌｄｉｎｉ  Ｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９（５）：４５７−６３，１９９８に準じて行うことができる。また、プラスミド、ＤＮＡ、各種酵素、大腸菌、培養細胞などを取り扱う遺伝子工学技術は、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、（１９９４），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．」および「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ；Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、第２版（１９８７），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ」に記載の方法に準じて行うことができる。
本発明の医薬は、有効成分の増殖型ベクターと薬学的に許容される賦形剤、担体、溶剤などの助剤とを混合し、注射剤などの種々の製剤形態で用いることができる。また、本発明の医薬の投与態様は特に限定されず、例えば注射、カテーテル、バルーンカテーテルなどにより投与できる。
本発明の医薬の投与量は、投与を受ける者の病態、年齢、体重などを考慮して適宜増減できるが、ウイルス感染力価ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ））で１×１０１０ｐｆｕの増殖型アデノウイルスの投与がヒトにおける臨床試験において安全性が確認されている（Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０００  ６０：６３５９−６３６６）ので、同量が投与量の目安になる。ただし、疾患やウイルスベクターの種類によっては１×１０１０ｐｆｕ以下又は以上でも安全かつ有効に使用できる。
本発明の医薬は、遺伝子冶療に用いられ、サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）が高度に発現する疾患、病態、例えば腫瘍（悪性腫瘍、良性腫瘍）、関節リウマチ（関節滑膜細胞の抑制）、ウイルス性肝炎（ウイルス感染細胞の抑制）、血管・肝臓の損傷後に出てくる不良組織（線維組織、肉芽組織など）の抑制など異常細胞で特異的に増殖してこれを死滅させ、正常細胞では増殖しないので、副作用を抑制してこれらの疾患、病態を冶療できる。また、本発明の医薬は、増殖ベクターにこれらの疾患の治療遺伝子を組み込むことにより冶療効果を高めることもできる。
【図面の簡単な説明】  第１図は、プラスミドｐΔＰｒ．Ｅ１Ａ−ＣＭＶ．１９Ｋの作製に用いたＰＣＲプライマー及びＰＣＲ反応の条件を示す。第２図は、プラスミドｐΔＰｒ．Ｅ１Ａ−ＣＭＶ．１９Ｋの作製に用いたＰＣＲプライマー及びＰＣＲ反応の条件を示す。第３図は、各種癌細胞および正常細胞におけるサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）遺伝子の発現を示すアガロース電気泳動の写真像である。ｏｓｔ：骨芽細胞、Ｎｅｇ．：ネガティブコントロール、ＨＰＲＴ：インターナルコントロールである。第４図は、各種癌細胞および正常細胞におけるＴＥＲＴ遺伝子の発現を示すアガロース電気泳動の写真像である。Ｏｓｔｅｏ−ｂｌａｓｔ：骨芽細胞、Ｎｅｇ．：ネガティブコントロール、ＨＰＲＴ：インターナルコントロールである。第５図は、各種癌細胞および正常細胞におけるマウスサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターの活性をＲＳＶ、ＣＭＶプロモーターと比較した結果である。ＲＳＶプロモーターは、非特異的な（すべての細胞で活性を持つ）プロモーターである。
第６図は、各種癌細胞および正常細胞における増殖型アデノウイルスベクターの増殖を指標としてＥＧＦＰ陽性率をモニタリングしたグラフである。感染後の日数を横軸、ＭＯＩを縦軸にとり、それぞれＥＧＦＰ１００％となったポイントをプロットしたものである。第７図は、各種癌細胞及び正常細胞における増殖型アデノウイルスベクターの増殖を指標としてＣＰＥの出現をモニタリングしたグラフである。感染後の日数を横軸、ＭＯＩを縦軸にとり、それぞれＣＰＥが出現したポイントをプロットしたものである。第８図は、各種細胞にＡｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａ（増殖型ベクター）、Ａｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１ＡΔ２４（増殖型ベクター）及びＡｄ．ΔＥ１（非増殖型ベクター）をそれぞれ感染させ、フローサイトメーターで解析したＥＧＦＰ陽性率を示すグラフである。第９図は、各種細胞にＡｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａ、Ａｄ．ＴＥＲＴ−Ｅ１Ａ及びＡｄ．ΔＥ１をそれぞれ感染させ、フローサイトメーターで解析したＥＧＦＰ陽性率を示すグラフである。＊Ｐ＜０．０５で、＃は感染細胞がＣＰＥとなり、培養皿から剥がれて測定不能であったことを示す。第１０図は、Ａｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａ、Ａｄ．ΔＥ１を各々腫瘍内注入後の腫瘍体積の変化を示すグラフである。第１１図は、Ａｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａ、Ａｄ．ＴＥＲＴ−Ｅ１Ａ、Ａｄ．ΔＥ１を各々腫瘍内注入後の腫瘍体積の変化を示すグラフである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５はＡｄ．ΔＥ１に対するものである。第１２図は、サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーター、ＲＳＶ（Ｒｏｕｓ  Ｓａｒｃｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ）プロモーター及びＴＥＲＴ（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）プロモーターの活性を比較したグラフである。第１３図は、各種細胞でのサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターとＴＥＲＴプロモーターの活性をＣＭＶプロモーター活性に対する相対比として計算しプロットしたグラフで、縦軸はプロモーターの比活性を示す。第１４図は、ＴＥＲＴプロモーターを含む増殖型アデノウイルスとサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターを含む増殖型アデノウイルスの増殖能の比較を示すグラフである。第１５図は、各種細胞にＡｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａ、Ａｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１ＡΔ２４及びＡｄ．ΔＥ１を感染させ、それらの細胞死誘導能の解析したグラフで、縦軸は各種細胞の生存率を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１は非感染群に対するものである。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明をベクターとしてアデノウイルスを用いた実施例を挙げ説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例中のプラスミド、ＤＮＡ、各種酵素、大腸菌、培養細胞などを取り扱う遺伝子工学技術は、特に断らない限り、既述の文献に記載の方法に準じて行った。また、特に断りがない限り、アデノウイルスの一般的な取り扱い及びアデノウイルスの作製については、既述の文献に記載の方法に準じて行った。また、有意差の検定は、ｔ検定で行った。
【実施例１】（サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターを含む増殖型アデノウイルスベクターの作製）
ＢＡＬＢ／Ｃマウスより肝臓の一部を採取し、セパジーン（三光純薬社）を用いて、染色体ＤＮＡを採取した。このマウス染色体ＤＮＡを鋳型として、マウスサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターに特異的なプライマーセットを用いたｇｅｎｏｍｉｃ  ＰＣＲにより、マウスサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターをクローニングした。センスプライマー（５’−ＡＧＡＴＧＧＧＣＧＴＧＧＧＧＣＧＧＧＡＣ−３’、配列番号１）とアンチセンスプライマー（５’−ＴＣＣＧＣＣＡＡＧＡＣＧＡＣＴＣＡＡＡＣ−３’、配列番号２）は、北海道システム・サイエンス社に依頼して合成したものを用いた。これを電気泳動、精製後、サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターとしてＴベクターのｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）にＴ４ＤＮＡライゲース（宝酒造社）でライゲーションして挿入し、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ／ｍＳｕｒｖ．ｐを得た。クローニングしたサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターは、ＤＮＡシーケンサーにて正しい塩基配列であることを確認した。ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ／ｍＳｕｒｖ．ｐを制限酵素ＳｐｅＩで消化後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにて平滑末端化した。これをＮｏｔＩにより消化し、サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターを切り出した。
上記で得たマウスサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターを含む増殖型アデノウイルスベクターＡｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａ−ＣＭＶ−１９Ｋ／ＣＭＶ−ＥＧＦＰ（以下、「Ａｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａ」ということがある）を以下に示すように特願２００３−２８３４２７（該出願後、ＷＯ  ２００５／０１２５３６、特開２００５−４６１０１）に記載の方法で作製した。すなわち、Ｅ１Ａ遺伝子の発現がサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターにより制御され、Ｅ１Ｂ１９Ｋ遺伝子の発現がＣＭＶプロモーターにより制御されるプラスミドｐＳｕｒｖ．Ｅ１Ａ−ＣＭＶ．１９Ｋを作製し、次いでこのプラスミドに標識（マーカー）遺伝子としてＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が組み込まれたプラスミドｐＳｕｒｖ．Ｅ１Ａ−ＣＭＶ．１９Ｋ／ＣＭＶ−ＥＧＦＰを作製した。これを２９３細胞にトランスフェクションしてＡｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａ−ＣＭＶ−１９Ｋ／ＣＭＶ−ＥＧＦＰを作製した。以下、詳細に説明する。
まず、ｐΔＰｒ．Ｅ１Ａ−ＣＭＶ．１９Ｋを以下のように作製した。アデノウイルスベクターの構築プラスミドベクターとしてｐＨＭ５を用いた。ｐＨＭ５は、ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩの制限酵素認識配列を有するクローニングベクターで、Ｄｒ．Ｍａｒｋ  Ａ  Ｋａｙ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から供与をうけた（詳細は、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１０：２０１３−２０１７，１９９９に記載）。ヒト５型アデノウイルスゲノム５’側配列を含むプラスミドｐＸＣ１はＭｉｃｒｏｂｉｘ（Ｔｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）より購入した。アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ蛋白のコーディング領域からポリアデニレーションシグナルまでを含み、内因性のプロモーターは含まない領域（４７４〜１６５８ｂｐ）、Ｅ１Ｂ１９ＫＤａ蛋白のコーディング領域（１６８４〜２２８５ｂｐ）のみでその内因性のプロモーター及びポリアデニレーションシグナルは含まない領域は、それぞれｐＸＣ１を鋳型として、またＢｏｖｉｎｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＢＧＨｐ：牛成長因子ポリアデニレーションシグナル配列）はｐＲｃ／ＲＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ−１５０３０７）を鋳型として、第１図に示したプライマーセットによりＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡、カタログ番号ＫＯＤ−１０１）を用いたＰＣＲ法にて増幅し、クローニングした。なお、ここで用いたＥ１Ａのセンスプライマー（Ｓ−Ｅ１Ａ、配列番号３）にはＳｐｈＩ、ＮｏｔＩ、ＳｎａＢＩ、ＭｌｕＩ各制限酵素の認識配列、同アンチセンスプライマー（ＡＳ−Ｅ１Ａ、配列番号４）にはＳａｌＩ、ＡｖｒＩＩの認識配列、Ｅ１Ｂ１９ＫＤａのセンスプライマー（Ｓ−Ｅ１Ｂ１９Ｋ、配列番号５）にはＡｖｒＩＩ、ＳａｌＩ、ＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＶ、ＭｆｅＩ各制限酵素の認識配列、同アンチセンスプライマー（ＡＳ−Ｅ１Ｂ１９Ｋ、配列番号６）にはＢａｍＨＩの認識配列、ＢＧＨｐＡ用のセンスプライマー（Ｓ−ＢＧＨｐＡ、配列番号７）にはＢａｍＨＩの認識配列、同アンチセンスプライマー（ＡＳ−ＢＧＨｐＡ、配列番号８）には３４ｂｐのＬｏｘＨ配列とＥｃｏＲＩ認識配列がそれぞれ付加されている（各プライマーのシークエンスと各ＰＣＲの条件は第１図を参照）。
次に、上記で得たＥ１Ａのコーディング領域のＰＣＲ産物とｐＨＭ５を制限酵素ＳｐｈＩ（宝酒造、カタログ番号１１８０Ａ）とＳａｌＩ（東洋紡、カタログ番号ＳＡＬ−１１１）にて消化し、Ｔ４  ＤＮＡライゲース（宝酒造、カタログ番号６０２２）にてライゲーションを行ない、ｐＨＭ５にＥ１Ａのコーディング領域が組み込まれたプラスミドｐΔＰｒ．Ｅ１Ａを作製した。
また、上記で得たＥ１Ｂ１９Ｋのコーディング領域を含むＰＣＲ産物とｐΔＰｒ．Ｅ１Ａを、ＳａｌＩ、ＢａｍＨＩ（東洋紡、カタログ番号ＢＡＨ−１１１）で消化し、Ｔ４  ＤＮＡライゲースでライゲーションを行ない、プラスミドｐΔＰｒ．Ｅ１Ａ−ΔＰｒ．１９ＫΔｐＡを作製した。さらに、上記で得たＰＣＲ産物のＢＧＨｐＡとｐΔＰｒ．Ｅ１Ａ−ΔＰｒ１９ＫΔｐＡを共にＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ（東洋紡、カタログ番号ＥＲ０２７１）で消化し、ライゲーションを行ない、ｐΔＰｒ．Ｅ１Ａ−ΔＰｒ．１９Ｋ−ＢＧＨｐＡ（以下、ＢＧＨｐＡは省略し、ｐΔＰｒ．Ｅ１Ａ−ΔＰｒ．１９Ｋと表す）を作製した。クローニングにＰＣＲ法を用いたために起こり得る塩基配列の変異の可能性を除去するため、ｐΔＰｒ．Ｅ１Ａ−ΔＰｒ．１９ＫのＤＮＡ配列は、ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）にて正しい配列であること、また目的のＤＮＡ構築が作製できていることを確認した。以降も、ＰＣＲ法を用いてクローニングしたＤＮＡは、必ず同様にＤＮＡシークエンサーを用いて確認した。
このようにして作製したｐΔＰｒ．Ｅ１Ａ−ΔＰｒ．１９Ｋは、ｐＨＭ５のバックグラウンドを持つプラスミドで、その中に上流より、マルチクローニングサイトとしてＳｐｈＩ、ＮｏｔＩ、ＳｎａＢＩ、ＭｌｕＩの各制限酵素の認識配列、Ｅ１Ａ蛋白のコーディング領域、マルチクローニングサイトとしてＳａｌＩ、ＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＶ、ＭｆｅＩの各制限酵素の認識配列、Ｅ１Ｂ１９ＫＤａ蛋白のコーディング領域、ＢＧＨｐＡ、ＬｏｘＨ配列を含み、Ｅ１ＡとＥ１Ｂ１９ＫＤａの上流のマルチクローニングサイトを用いて、上流にプロモーターを自由に挿入することができる。また、このＥ１ＡとＥ１Ｂ１９ＫＤａの上流のマルチクローニングサイトにはＳｎａＢＩとＥｃｏＲＶという平滑断端となる制限酵素サイトをそれぞれ一つは用いているため、如何なる制限酵素で切り出してきたプロモーター配列でも、それを平滑断端処理した後にライゲーションすればｐΔＰｒ．Ｅ１Ａ−ΔＰｒ．１９Ｋに簡単に確実に組み込むことができる。
ｐΔＰｒ．Ｅ１Ａ−ΔＰｒ．１９Ｋに恒常的強発現プロモーターであるＣＭＶ（Ｃｙｍｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１，５２１−５３０，１９８５，Ｎｅｌｓｏｎ，ＪＡ．，ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７，４１２５−４１２９，１９８７）をＥ１Ｂ１９Ｋの上流に挿入したプラスミドを作製した。ＣＭＶプロモーターは、プラスミドｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ−１５０３０７）を鋳型として、ＳａｌＩ認識サイトをつけたセンスプライマー（Ｓ−ＣＭＶｐ、配列番号９）とＭｆｅＩ認識サイトをつけたアンチセンスプライマー（ＡＳ−ＣＭＶｐ、配列番号１０）でＰＣＲを行なった（各プライマーの配列とＰＣＲの条件は第２図に記載）。このＰＣＲ産物（ｐＲｃ／ＣＭＶの２３１〜８９３）と、ｐΔＰｒ．Ｅ１Ａ−ΔＰｒ．１９ＫをＳａｌＩ（東洋紡、カタログ番号ＳＡＬ−１１１）、ＭｆｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｒ０５８９Ｓ）で消化し、Ｔ４  ＤＮＡライゲースを用いてライゲーションを行ない、Ｅ１Ｂ１９Ｋの上流にＣＭＶプロモーターを挿入し、ｐΔＰｒ．Ｅ１Ａ−ＣＭＶ−１９Ｋを作製した。
ｐΔＰｒ．Ｅ１Ａ−ＣＭＶ．１９ＫをＭｌｕＩにて消化、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにて平滑末端化した後、ＮｏｔＩで消化した。さらに自己ライゲーション防止のためにＣａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ａｌｋａｌｉｎｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＣＩＰ：牛小腸アルカリホスファターゼ、宝酒造社）で脱リン酸化した後、上記で得たサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターをＴ４  ＤＮＡライゲースでライゲーションして挿入しｐＳｕｒｖ．Ｅ１Ａ−ＣＭＶ．１９Ｋを得た。
次いで、ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を組み込んだｐＳｕｒｖ．Ｅ１Ａ−ＣＭＶ．１９Ｋ／ＣＭＶ−ＥＧＦＰを以下のように作製した。
ｐＳｕｒｖ．Ｅ１Ａ−ＣＭＶ．１９ＫにＣｒｅリコンビネーション反応を利用して自由に挿入できるプラスミドを作製した。まず、ＬｏｘＰ配列を持ち、ＥＧＦＰおよびそのプロモーターを組み込めるプラスミドを以下のようにして作製した。ｐＵｎｉ／Ｖ５−ＨｉｓＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，製品番号ＥＴ００３−１１）のＫｎ（カナマイシン）耐性遺伝子をＢｇｌＩＩ（東洋紡、カタログ番号ＢＧＬ−２１１）とＳｍａＩ（東洋紡、カタログ番号ＳＭＡ−１１１）で切り出し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼにて平滑末端化し、自己ライゲーションを防ぐためにＣＩＰ処理した。ｐＢＲ３２２（東洋紡、カタログ番号ＤＮＡ−００３）よりＴｃ（テトラサイクリン）耐性遺伝子をＳｓｐＩ（東洋紡、カタログ番号ＳＳＰ−１０１）とＳｔｙＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、カタログ番号Ｒ００５０Ｓ）にて消化した後、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化した。これを、上記のようにＫｎ耐性遺伝子が除かれて平滑末端化されているｐＵｎｉ／Ｖ５−ＨｉｓＣにＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションして挿入し、Ｋｎ耐性遺伝子をＴｃ耐性遺伝子に入れ替えたプラスミドｐＵｎｉ／Ｖ５−ＨｉｓＣ−Ｔｃを作製した。さらに、このｐＵｎｉ／Ｖ５−ＨｉｓＣ−ＴｃをＸｈｏＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼによる平滑末端化、ＣＩＰにて処理した。一方、先に記したように、プラスミドｐＲｃ／ＣＭＶを鋳型としてＳａｌＩサイトをつけたセンスプライマー（Ｓ−ＣＭＶｐ、配列番号９）とＭｆｅＩサイトをつけたアンチセンスプライマー（ＡＳ−ＣＭＶｐ、配列番号１０）でＰＣＲすることにより得たＣＭＶプロモーターをＳａｌＩ、ＭｆｅＩ酵素で切り出し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化したものと、上記の平滑末端化されたｐＵｎｉ／Ｖ５−ＨｉｓＣ−ＴｃとをＴ４  ＤＮＡリガーゼでライゲーション反応を行ない、ｐＵｎｉ／Ｖ５−ＨｉｓＣ−Ｔｃ−ＣＭＶを作製した。ｐＵｎｉ／Ｖ５−ＨｉｓＣ−Ｔｃ−ＣＭＶは、ｐＵｎｉ／Ｖ５−ＨｉｓＣ−ＴｃにＣＭＶプロモーターを挿入したプラスミドであり、ＣＭＶプロモーターの下流に、発現させたい目的の遺伝子をマルチクローニングサイトのＡｇｅＩ、ＡｐａＩ、ＳｔｕＩのいずれかを用いて、挿入することができる。そして、ＣＭＶプロモーターと、その下流に挿入された遺伝子はＣｒｅ発現により、前項に記載したＥ１Ａを制御するｐＳｕｒｖ．Ｅ１Ａ−ＣＭＶ．１９Ｋに挿入することができる。
次いで、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ、カタログ番号６０８４−１）をＢｃｌＩ消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼにて平滑末端化した後、ＡｇｅＩ消化にてＥＧＦＰのｃＤＮＡを切り出した。一方、ｐＵｎｉ／Ｖ５−ＨｉｓＣ−Ｔｃ−ＣＭＶをＡｐａＩ消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼにて平滑末端化した後、ＡｇｅＩで消化して、これに上記の切り出したＥＧＦＰのｃＤＮＡ断片をＴ４  ＤＮＡリガーゼでライゲーションして挿入し、ｐＵｎｉ／Ｖ５−ＨｉｓＣ−Ｔｃ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰを得た。ｐＵｎｉ／Ｖ５−ＨｉｓＣ−Ｔｃ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰは、ＣＭＶプロモーターからＥＧＦＰが発現できる発現ベクターであると共に、Ｅ１Ａをサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）で制御するｐＳｕｒｖ．Ｅ１Ａ−ＣＭＶ．１９ＫにＣｒｅリコンビネーション反応によりＣＭＶ−ＥＧＦＰ遺伝子が挿入できるものである。
ｐＳｕｒｖ．Ｅ１Ａ−ＣＭＶ．１９ＫとｐＵｎｉ／Ｖ５−ＨｉｓＣ−Ｔｃ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰとは、Ｃｒｅリコンビナーゼで容易にリコンビネーション（ＬｏｘＰ、ＬｏｘＨ配列を認識して２つのプラスミドが１つに繋がる反応）することができる。ｐＳｕｒｖ．Ｅ１Ａ−ＣＭＶ−１９ＫとｐＵｎｉ／Ｖ５−ＨｉｓＣ−Ｔｃ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰをそれぞれ１００ｎｇずつＣｒｅリコンビナーゼと反応（３７℃、２０分間）させる。次いで、６５℃、５分間処理してＣｒｅを不活化し、反応を停止した。この反応液をコンピテント細胞ＤＨ５α（東洋紡、カタログ番号ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、テトラサイクリン（７．５μｇ／ｍｌ，和光純薬、カタログ番号２０５−０８５９１）を含むＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ，ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ，カタログ番号２００６６−９５）アガロースプレート上で培養する。ｐＳｕｒｖ．Ｅ１Ａ−ＣＭＶ．１９Ｋは、Ｋｎ耐性遺伝子のためコロニーを形成できず、ｐＵｎｉ／Ｖ５−ＨｉｓＣ−Ｔｃ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰもＲ６Ｋγという特殊なＯｒｉ（大腸菌複製開始点）をもつためＤＨ５αではコロニーを形成できない。これに対して、ｐＳｕｒｖ．Ｅ１Ａ−ＣＭＶ．１９ＫとｐＵｎｉ／Ｖ５−ＨｉｓＣ−Ｔｃ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰとがリコンビネーションして作製されたプラスミドはｐＵＣ  ＯｒｉとＴｃｒの両者を持つため、コロニーを形成することができる。Ｃｒｅリコンビナーゼは、Ｃｒｅ遺伝子を発現するアデノウイルスベクターＡｘＣＡＮＣｒｅ（理化学研究所ＤＮＡバンクより供与）を用いて抽出を行った。すなわち、アデノウイルスによる遺伝子導入効率の高いヒト肝癌細胞であるＨｅｐＧ２細胞（東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センターより供与）１０ｃｍ径培養皿１枚に３０  ＭＯＩ（多重感染度、１  ＭＯＩ＝１  ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ／ｃｅｌｌ）でＡｘＣＡＮＣｒｅを感染させ、３日後にトリプシン（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ、カタログ番号３５５５５−５４）処理にて細胞を剥がし、ＰＢＳにて洗浄後、Ｌｙｓｉｓバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１％ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｐ２７１４））２００μｌにて溶解し、凍結と融解を３回繰り返してＣｒｅリコンビナーゼを得た。このＣｒｅリコンビナーゼを用いて反応させたところコロニーが得られ、しかも出現したコロニーはすべて陽性クローンであった。この反応によってプラスミドｐＳｕｒｖ．Ｅ１Ａ−ＣＭＶ．１９Ｋ／ＣＭＶ−ＥＧＦＰを得た。
上記で得たｐＳｕｒｖ．Ｅ１Ａ−ＣＭＶ．１９Ｋ／ＣＭＶ−ＥＧＦＰをアデノウイルスゲノムを含む３０．３ｋｂのプラスミドｐＡｄＨＭ４（Ｄｒ．Ｍａｒｋ  Ａ．Ｋａｙ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから供与）に組み込み、ｐＡｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａ−ＣＭＶ−１９Ｋ／ＣＭＶ−ＥＧＦＰを得た。このｐＡｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａ−ＣＭＶ−１９Ｋ／ＣＭＶ−ＥＧＦＰを制限酵素ＰａｃＩにて消化、２９３細胞にトランスフェクションするとアデノウイルスのプラークが出現した。これを採取して２９３細胞に感染させて増幅し、塩化セシウムの濃度勾配超遠心法にて濃縮、脱塩カラム（Ｂｉｏｌａｄ社）にて精製し、増殖型アデノウイルスベクターＡｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａ−ＣＭＶ−１９Ｋ／ＣＭＶ−ＥＧＦＰを得た。
【実施例２】（種々の癌細胞、正常細胞におけるサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）遺伝子の発現）
各種癌細胞におけるサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）の発現を確認するために、ＲＴ−ＰＣＲを行った。まず、種々の癌細胞（ＭＫＮ−１、ＭＫＮ−２８、ＭＫＮ−４５、ＨＣＴ−１５、ＬｏＶｏ、Ｃｏｌｏ−２０５、Ｈｅｐ−Ｇ２、Ｈｅｐ−３Ｂ、Ｈｅｌａ、ＨＯＳ−ＭＮＮＧ、ＫＨＯＳ−ＮＰ、ＳａＯｓ−２）をトリプシン（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ社）処理により回収した後、セパゾールＲＮＡ  Ｉ  Ｓｕｐｅｒ（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ社  カタログ番号３０４−８６）１ｍｌを加えてホモジナイズし、クロロホルムにより水相とフェノール相に分離し、水相をイソプロパノールにて沈殿させた。
遠心後、７０％エタノールにて懸濁、再度遠心してＲＮＡを抽出した。１μｇのトータルＲＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて逆転写し、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を得た。また、正常細胞のＷＩ−３８、ヒト初代培養骨芽細胞（三光純薬）のＯＳＴ、陽性のコントロールとして２９３細胞についても同様に行った。
サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）のセンスプライマー（５’−ＧＣＡＴＧＧＧＴＧＣＣＣＣＧＡＣＧＴＴＧ−３’、配列番号１１）とアンチセンスプライマー（５’−ＧＣＴＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＧＣＣＴＣＡＡ−３’、配列番号１２）（Ｋａｊｉｗａｒａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ，：Ｃａｎｃｅｒ，９７，１０７７−１０８３，２００３）は北海道システム・サイエンス社に依頼して合成したものを用いた。インターナルコントロールにヒポキサンチンフォスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を用いた。ＰＣＲ法は、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｔａｑ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｍ１８６５）を使用し、熱変性９４℃、３０秒、アニーリング５６℃、１分、伸長反応７２℃、１分、４０サイクルで行った。ＨＰＲＴはアニーリング温度を５７℃として、３５サイクルで同様に行った。ＰＣＲサーマルサイクラーは、ＢｉｏｍｅｔｒａのＴ３  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒを使用した。結果は、第３図に示した通り、肝細胞癌（Ｈｅｐ−Ｇ２、Ｈｅｐ−３Ｂ）で発現が強く、大腸癌（ＨＣＴ−１５、Ｌｏｖｏ、Ｃｏｌｏ−２０５）で発現が弱いなど、癌細胞種間で発現の強弱に差がみられたが、全体的に癌細胞に広く発現を認めた。正常細胞のＷＩＩ−３８、ヒト初代培養骨芽細胞（三光純薬）のＯＳＴでも若干の発現を認めた。
【実施例３】（種々の癌細胞、正常細胞におけるＴＥＲＴ遺伝子の発現）
各種癌細胞におけるＴＥＲＴの発現を確認するために、ＲＴ−ＰＣＲを行った。まず種々の癌細胞（ＭＫＮ−１、ＭＫＮ−２８、ＭＫＮ−４５、ＨＣＴ−１５、ＬｏＶｏ、Ｃｏｌｏ−２０５、Ｈｅｐ−Ｇ２、Ｈｅｐ−３Ｂ、Ｈｅｌａ、ＨＯＳ−ＭＮＮＧ、ＫＨＯＳ−ＮＰ、ＳａＯｓ−２）をトリプシン（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ社）処理により回収した後、セパゾールＲＮＡ  Ｉ  Ｓｕｐｅｒ（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ社  カタログ番号３０４−８６）１ｍｌを加えてホモジナイズし、クロロホルムにより水相とフェノール相に分離し、水相をイソプロパノールにて沈殿させた。  遠心後、７０％エタノールにて懸濁、再度遠心してＲＮＡを抽出した。１μｇのトータルＲＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて逆転写し、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を得た。また、正常細胞のＷＩ−３８、ヒト初代培養骨芽細胞（三光純薬）のＯｓｔｅｏ−ｂｌａｓｔについても同様に行った。
ＴＥＲＴのセンスプライマー（５’−ＴＴＣＣＴＧＣＡＣＴＧＧＣＴＧＡＴＧＡＧＴＧＴ−３’、配列番号１３）とアンチセンスプライマー（５’−ＣＧＣＴＣＧＧＣＣＣＴＣＴＴＴＴＣＴＣＴＧ−３’、配列番号１４）（Ｙａｎ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ，：Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，５９，３１６６−３１７０，１９９９）は北海道システム・サイエンス社に依頼して合成したものを用いた。インターナルコントロールにヒポキサンチンフォスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を用いた。ＰＣＲ法は、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｔａｑ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｍ１８６５）を使用し、熱変性９４℃、３０秒、アニーリング５９℃、１分、伸長反応７２℃、１分、３５サイクルで行った。ＨＰＲＴはアニーリング温度を５７℃として、３５サイクルで同様に行った。  ＰＣＲサーマルサイクラーは、ＢｉｏｍｅｔｒａのＴ３  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒを使用した。結果は第４図に示した通り、癌細胞種間で発現の強弱に差がみられたが、全体的に癌細胞に広く発現を認めた。また、正常細胞のＷＩＩ−３８、ヒト初代培養骨芽細胞（三光純薬）では発現を認めなかった。
【実施例４】（サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターの活性）
上記でクローニングしたマウスサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターを組み込んだＡｄ．Ｓｕｒｖ−ＬａｃＺを作製・精製した。対照としてＡｄ．ＣＭＶ−ＬａｃＺ、Ａｄ．ＲＳＶ−ＬａｃＺを用いた。各種癌細胞を６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに５×１０５／ｗｅｌｌで培養し、翌日にＡｄ．ＣＭＶ−ＬａｃＺ、Ａｄ．ＲＳＶ−ＬａｃＺ、Ａｄ．Ｓｕｒｖ−ＬａｃＺをそれぞれＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、多重感染度：１ＭＯＩ＝１  ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ／ｃｅｌｌ）３０で感染させた。
翌日、蛋白回収し、１０μｇの蛋白量でβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ａｓｓａｙを行った。結果は第５図に示した。全体的にみて、サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターの活性はＣＭＶ、ＲＳＶと比べて強いことが分かった。個々を見ていくと、サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）が強く発現しているＨｅｐ−Ｇ２、Ｈｅｐ−３Ｂは強いプロモーター活性を示している。しかし、ＲＴ−ＰＣＲによるサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）遺伝子の発現とプロモーター活性の強さは必ずしも相関するものではなかった。なお、Ａｄ．ＣＭＶ−ＬａｃＺは、Ｄｒ．Ｚｏｎｇ  Ｓｈｅｎｇ  Ｇｕｏ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇより供与を受けた（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１９９６；３（９）：８０２−８１０に記載の方法と同様に作製したもの）。また、Ａｄ．ＲＳＶ−ＬａｃＺは以下のように作製した。プラスミドｐＭＶ−ＬａｃＺ（Ｄｒ．Ｇｒｅｔｃｈｅｎ  Ｄａｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｎｅより供与）を制限酵素ＮｏｔＩで消化してＬａｃＺコーディング領域を切り出し、制限酵素ＮｏｔＩで消化したプラスミドｐＡｄＬ．２／ＲＳＶ／ｈＰＡＨ（Ｄｒ．Ｚｏｎｇ  Ｓｈｅｂｇ  Ｇｕｏより供与）にライゲーションしてｐＡｄ．ＲＳＶ−ＬａｃＺを得た。更に、Ａｄ．Ｓｕｒｖ−ＬａｃＺは、以下のように作製した。プラスミドｐＨＭ−ＣＭＶ６（Ｄｒ．Ｍａｒｋ  Ａ  Ｋａｙより供与）からＣＭＶプロモーターを制限酵素ＭｕｎＩ／ＮｈｅＩで切り出して除いた平滑末端化したｐＨＭ−ΔＰｒ．６に、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙより制限酵素ＥｏＲＩで切り出したサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターを滑末端化してライゲーションし、ｐＨＭ−Ｓｕｒｖ．ｐを得た。これにｐＡｄ．ＲＳＶ−ＬａｃＺより制限酵素ＮｏｔＩで切り出したＬａｃＺ遺伝子をライゲーションしてｐＨＭ−Ｓｕｒｖ−ＬａｃＺを得た。このｐＨＭ−Ｓｕｒｖ−ＬａｃＺをＩ−Ｃｅｕ／ＰＩ−ＳｃｅＩで消化して、同様にＩ−Ｃｅｕ／ＰＩ−ＳｃｅＩで消化したｐＡｄ．ＨＭ４にライゲーションしてｐＡｄ．ＨＭ４−Ｓｕｒｖ−ＬａｃＺを得た。これを２９３細胞にトランスフェクションしてＡｄ．Ｓｕｒｖ−ＬａｃＺを得た。
【実施例５】（種々の癌細胞におけるサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターを含む増殖型アデノウイルスベクターの増殖能の解析）
各種癌細胞を２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに８×１０４個／ｗｅｌｌで培養し、翌日、増殖型ベクターのＡｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａ−ＣＭＶ−１９Ｋ／ＣＭＶ−ＥＧＦＰ（Ａｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａ）、対照としてＥ１欠失の非増殖型ＡＤＶであるＡｄ．ΔＥ１−ＧＦＰ（以下、Ａｄ．ΔＥ１ともいう）をそれぞれＭＯＩ  ０、０．０１、０．１、１、１０、１００で感染させた。翌日より蛍光顕微鏡下でＥＧＦＰ陽性率を観察しながら、細胞傷害（ＣＰＥ）の出現にて、経時的に増殖型アデノウイルスの増殖能をモニタリングした。結果は第６図、第７図に示した。すべての癌細胞で、Ａｄ．ΔＥ１に比べＡｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａの増殖が著明であった。Ａｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａを感染させた群は、感染後３日で、ＭＯＩ１００ではすべての癌細胞がＥＧＦＰ陽性率１００％、ＭＯＩ１０でもＫＨＯＳ−ＮＰ、ＳａＯｓ−２を除く他のすべての癌細胞ではＥＧＦＰ陽性率１００％であった。同じく感染後３日でＭＯＩ１００ではＫＨＯＳ−ＮＰ、ＳａＯｓ−２を除く他のすべての癌細胞でＣＰＥが出現しており、両者の関係はよく相関していた。時間の経過と共に程度の差はあるがＥＧＦＰの陽性率、ＣＰＥ共に増強していった。ＥＧＦＰというマーカー遺伝子で観察される増殖型アデノウイルスの増殖と、細胞の傷害を表すＣＰＥが相関して出現したことから、Ａｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａがサービビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）発現細胞で増殖し、その毒性により細胞を死滅させることができることが証明された。なお、Ａｄ．ΔＥ１−ＧＦＰは以下のように作製した。プラスミドｐＨＭ−ＣＭＶ６（Ｄｒ．Ｍａｒｋ  Ａ  Ｋａｙより供与）を制限酵素ＸｂａＩで消化、平滑末端化し、続いて制限酵素ＮｈｅＩで消化した。これにｐＥＧＦＰ−Ｃ１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）より制限酵素ＢｃｌＩで消化、平滑末端化し、続いて制限酵素ＮｈｅＩで消化して切り出したＥＧＦＰをライゲーションし、ｐＨＭ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰを得た。このｐＨＭ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰをＩ−Ｃｅｕ／ＰＩ−ＳｃｅＩで消化して、同様にＩ−Ｃｅｕ／ＰＩ−ＳｃｅＩで消化したｐＡｄ−ＨＭ４にライゲーションしてｐＡｄ．ＨＭ４−ＣＭＶ−ＥＧＦＰを得た。これを２９３細胞にトランスフェクションしてＡｄ．ΔＥ１−ＧＦＰを得た。
また、ＥＧＦＰ陽性細胞の割合を定量的に評価するためにフローサイトメーターによる解析を行った。すなわち、Ｈｅｐ−Ｇ２、ＨＯＳ−ＭＮＮＧ、ＷＩ−３８を１０ｃｍ径培養皿に培養し、翌日Ａｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａ（増殖型ベクター）、Ａｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１ＡΔ２４（増殖型ベクター）、Ａｄ．ΔＥ１（非増殖型ベクター）をそれぞれＭＯＩ  ０．１（Ｈｅｐ−Ｇ２）、ＭＯＩ  １（ＨＯＳ−ＭＮＮＧ、ＷＩ−３８）で感染させた。感染２４時間後に各細胞を回収し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）でＥＧＦＰ陽性率を測定した。図８に示すように、各種細胞でＡｄ．ΔＥ１感染群はほぼ同等のＥＧＦＰ陽性率となっている（つまり、ほぼ同等の導入効率の条件で行っている）が、Ａｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａ、Ａｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１ＡΔ２４感染群では癌細胞のＨｅｐ−Ｇ２、ＨＯＳ−ＭＮＮＧは９０％以上のＥＧＦＰ陽性率を示す一方、正常細胞のＷＩ−３８でのＥＧＦＰ陽性率は著しく抑えられていた。このように、Ａｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａ、Ａｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１ＡΔ２４は、高い腫瘍特異性を示した。なお、Ａｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１ＡとＡｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１ＡΔ２４とでは腫瘍特異性に有意な差が認められなかった。また、Ｒｂ蛋白結合配列を欠損したＡｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１ＡΔ２４は、後記のように特願２００３−２８３４２７（該出願後、ＷＯ  ２００５／０１２５３６、特開２００５−４６１０１）に記載の方法で作製した。
更に、上記のＥＧＦＰ陽性細胞の割合を定量的に評価するためのフローサイトメーターによる解析を、上記と同じ細胞にＡｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａ、Ａｄ．ＴＥＲＴ−Ｅ１Ａ及びＡｄ．ΔＥ１を感染させ行った。ＭＯＩはＨｅｐ−Ｇ２が０．０３、ＨＯＳ−ＭＮＮＧ、ＷＩ−３８が０．１で、感染後１、３、５、７日に細胞を回収し上記と同様に測定した。図９に示すように、時間の経過を通じて癌細胞のＨｅｐ−Ｇ２、ＨＯＳ−ＭＮＮＧは、Ａｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａの方がＡｄ．ＴＥＲＴ−Ｅ１Ａより効率よく増殖しており、正常細胞のＷＩ−３８ではＡｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａの方が増殖が抑えられており、Ａｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａは高い腫瘍特異性を示している。なお、Ａｄ．ＴＥＲＴ−Ｅ１Ａの作製方法は後述する。
【実施例６】（ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるサービビン（Ｓｕｖｉｖｉｎ）プロモーターを含む増殖型アデノウイルスベクターの抗腫瘍効果）
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける増殖型アデノウイルスの抗腫瘍効果を確認するため、ヌードマウスを用いた動物実験を行った。まず、５週齢ヌードマウスにヒト骨肉腫細胞株のＨＯＳ−ＭＮＮＧを５×１０６個、背部に皮下注入し、腫瘍径が７〜８ｍｍとなった時点で、１×１０８ｐｆｕのＡｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａ（ｎ＝８）を腫瘍内に一回のみ、Ａｄ．ΔＥ１（ｎ＝９）を腫瘍内に一回のみそれぞれ注入した。翌日より定期的に腫瘍径を計測し、ウイルス注入後の腫瘍体積（腫瘍体積は長径×短径×短径／２で計算）の変化を各群で比較検討した。結果は第１０図に示した。ウイルス注入後１１日〜１８日および２８日〜３８日で、Ａｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａ投与群はコントロールのＡｄ．ΔＥ１投与群よりも有意に（ウイルス注入後３８日でｐ＜０．００５）腫瘍増殖が抑制されていた。これらの結果は、サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモータを含む増殖型アデノウイルスベクターの癌遺伝子治療における有用性を示すものである。
また、上記と同様の実験をＡｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１ＡとＡｄ．ＴＥＲＴ−Ｅ１Ａとをそれぞれ感染させ行った。ｎはＡｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａ（ｎ＝８）、Ａｄ．ＴＥＲＴ−Ｅ１Ａ（ｎ＝９）、Ａｄ．ΔＥ１（ｎ＝１１）とした。第１１図に示すように、Ａｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａ、Ａｄ．ＴＥＲＴ−Ｅ１ＡはいずれもＡｄ．ΔＥ１に比べ、有意に腫瘍増殖を抑制していた。Ａｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１ＡとＡｄ．ＴＥＲＴ−Ｅ１Ａの間に有意な差は認められなかったが、コントロールのＡｄ．ΔＥ１に対するＰ値はＡｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａの方が小さく、Ａｄ．ＴＥＲＴ−Ｅ１Ａに比べて、Ａｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａの治療効果の高さを示している。なお、Ａｄ．ＴＥＲＴ−Ｅ１Ａの作製方法は、後述する。
【実施例７】（サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーター、ＲＳＶ（Ｒｏｕｓ  Ｓａｒｃｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ）プロモーター及びＴＥＲＴ（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）プロモーターの活性比較）
Ｈｅｌａ（ヒト子宮頸癌）細胞を５×１０５個ずつ培養し、２４時間後にＡｄ．ＲＳＶ−ＬａｃＺ、Ａｄ−ＴＥＲＴ−ＬａｃＺ、Ａｄ．Ｓｕｒｖｉｖｉｎ−ＬａｃＺをそれぞれＭＯＩ３０で感染させた。感染後２４時間で細胞を回収し、細胞抽出液とＸ−ｇａｌ基質（ＰＲＯＭＥＧＡ社、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を３０分間反応させて、４２０ｎｍにおける吸光度を測定し、β−ガラクトシダーゼ活性、すなわち、プロモーター活性を得た。結果は、第１２図に示した。３つのプロモーターの中で、サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターが最も強い値を示した。これは、サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターが既に報告されている腫瘍特異的なＴＥＲＴプロモーター（Ｔａｋａｋｕｒａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５９（３）：５５１−７．１９９９）と比較しても、腫瘍特異性だけでなく、プロモーター強度においても優れていることを示すものである。なお、Ａｄ．ＴＥＲＴ−ＬａｃＺは、以下のように作製した。プラスミドｐＨＭ−ＣＭＶ６（Ｄｒ．Ｍａｒｋ  Ａ  Ｋａｙより供与）からＣＭＶプロモーターを制限酵素ＭｕｎＩ／ＮｈｅＩで切り出して除いた平滑末端化したｐＨＭ−ΔＰｒ．６に、ＴＥＲＴプロモーターを含むプラスミドｐＧＬ３−１８１（金沢大学産婦人科、京  哲  氏より供与）を制限酵素ＭｌｕＩ、ＢｇｌＩＩで消化して切り出したＴＥＲＴプロモーターを平滑末端化して、ライゲーションし、ｐＨＭ−ＴＥＲＴ．ｐを得た。これに、ｐＡｄ．ＲＳＶ−ＬａｃＺより制限酵素ＮｏｔＩで切り出したＬａｃＺ遺伝子をライゲーションしてｐＨＭ−ＴＥＲＴ−ｌａｃＺを得た。このｐＨＭ−ＴＥＲＴ−ｌａｃＺをＩ−ＣｅｕＩ／ＰＩ−ＳｃｅＩで消化して、同様にＩ−ＣｅｕＩ／ＰＩ−ＳｃｅＩで消化したｐＡｄ．ＨＭ４にライゲーションしてｐＡｄ．ＨＭ４−ＴＥＲＴ−ＬａｃＺを得た。これを２９３細胞にトランスフェクションしてＡｄ．ＴＥＲＴ−ＬａｃＺを得た。
また、上記のＨｅｌａ（ヒト子宮頸癌）細胞と同様の方法で、細胞としてＨｅｐ−Ｇ２、ＨＯＳ−ＭＮＮＧ、ＷＩ−３８にそれぞれＡｄ．Ｓｕｒｖｉｖｉｎ−ＬａｃＺ、Ａｄ．ＴＥＲＴ−ＬａｃＺ、Ａｄ．ＣＭＶ−ＬａｃＺを感染させ、各プロモーター活性を比較した。第１３図は、各細胞でのサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターとＴＥＲＴプロモーターの活性を、ＣＭＶプロモーター活性に対する相対比として計算し比較した。
その結果、正常細胞のＷＩ−３８ではサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターとＴＥＲＴプロモーターがいずれも活性を持たない一方、癌細胞のＨｅｐ−Ｇ２、ＨＯＳ−ＭＮＮＧではいずれもサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターの方が、強い活性を示した。つまり、サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターは腫瘍特異性およびプロモーター強度の両面で、ＴＥＲＴプロモーターを凌いでいることが明かとなった。
【実施例８】（ＴＥＲＴプロモーターを含む増殖型アデノウイルスとサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターを含む増殖型アデノウイルスの増殖能の比較）
ＭＫＮ−２８（ヒト胃癌細胞）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝癌細胞）、ＨＯＳ−ＭＮＮＧ（ヒト骨肉腫細胞）に、Ａｄ．ＴＥＲＴ−Ｅ１Ａ−ＣＭＶ−１９Ｋ／ＣＭＶ−ＥＧＦＰ（以下、Ａｄ．ＴＥＲＴ−Ｅ１Ａ、ＴＥＲＴ依存性増殖型アデノウイルス）とＡｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａを種々の濃度で感染させ、ウイルスの増殖により誘導される細胞死を観察した。結果は、第１４図に示した。同じ増殖型ベクターでも、Ａｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａの方が早くて高いウイルス増殖能（細胞死誘導能）を有することが示された。これは、現在報告されている腫瘍特異的プロモーターの一つであるＴＥＲＴプロモーターにより制御された増殖型ウイルスベクター（Ｈｕａｎｇ  ＴＧ，ｅｔａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０（１５）：１２４１−７．２００３、Ｗｉｒｔｈ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３（１２）：３１８１−８．２００３）よりもサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターにより制御された増殖型ベクターの方が優れていることを示すものである。なお、Ａｄ．ＴＥＲＴ−Ｅ１Ａは、Ａｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａの作製とほとんど同様に作製できる。すなわち、ｐΔＰｒ．Ｅ１Ａ−ＣＭＶ−１９Ｋを制限酵素ＭｌｕＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した。ＴＥＲＴプロモーターを含むプラスミドｐＧＬ３−１８１（金沢大学産婦人科、京  哲氏より供与）を制限酵素ＭｌｕＩ、ＢｇｌＩＩで消化して切り出したＴＥＲＴプロモーターを平滑末端化し、ｐΔＰｒ．Ｅ１Ａ−ＣＭＶ−１９ＫにライゲーションしてｐＴＥＲＴ−Ｅ１Ａ−ＣＭＶ−１９Ｋを得た。以下、Ａｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａ−ＣＭＶ−１９Ｋ／ＣＭＶ−ＥＧＦＰ（Ａｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａ）と同様の方法で作製した。
また、Ｅ１Ａ内部のＲｂ蛋白結合配列（９２３〜９４７ｂｐ、２４ｂｐ）を欠失した変異型アデノウイルスは、腫瘍特異的にウイルス増殖を行なうという報告がある（Ｈｅｉｓｅ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０００；６（１０）：１１３４−９）ので、上記のサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）を含む増殖型アデノウイルスのＥ１Ａ領域のＲｂ蛋白結合配列を欠失させても良い。Ｒｂ蛋白結合配列を欠失したＥ１ＡΔ２４（例えば、上記の実施例５のＡｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１ＡΔ２４）は、上記のＥ１Ａ領域をアデノウイルスの少なくとも５’側のゲノムを含むプラスミドを鋳型としてＲｂ蛋白結合配列から設計したプライマーを用い、ＰＣＲ法を利用する変異導入法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，８．５．７〜８．５．９，１９９９）で得ることができる。上記のプラスミドｐΔＰｒ．Ｅ１Ａ−ΔＰｒ．１９ｋを制限酵素で消化した後、Ｅ１ＡΔ２４をライゲーションしてＲｂ蛋白結合配列を欠失したベクタープラスミドｐΔＰｒ．Ｅ１ＡΔ２４−ΔＰｒ．１９Ｋを得ることができる。
増殖型アデノウイルスは、Ｅ１Ｂ領域の内因性プロモーター、例えば、１９ＫＤａ及び／又は５５ＫＤａの蛋白質コーディング領域のプロモーターをサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターで置換しても良い。サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターを含む増殖型アデノウイルスは、Ａｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａ−ＣＭＶ−１９Ｋのように、治療遺伝子を発現しないものでも、ウイルス蛋白自体の毒性により、感染した細胞に細胞死を誘導できる。また、上記の実施例で示した増殖型アデノウイルスにおけるＥＧＦＰは、実験でのウイルスの増殖を観察し易いようにする目的のために導入されたものであり、実際にはサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）が強度に発現する疾患を冶療する冶療遺伝子、例えば自殺遺伝子（ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子など）、アポトーシス誘導遺伝子（ｐ５３遺伝子など）を導入することにより高い治療効果を期待できる。
【実施例９】（種々の癌細胞、正常細胞におけるサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターを含む増殖型アデノウイルスベクターの細胞死誘導能の解析）
各種癌細胞（ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨＯＳ−ＭＮＮＧ（ＭＯＩ１）、ＨＯＳ−ＭＮＮＧ（ＭＯＩ１０））、正常細胞（ＷＩ−３８）をそれぞれ９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに培養し、翌日、Ａｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１Ａ、Ａｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１ＡΔ２４、Ａｄ．ΔＥ１をＭＯＩ  ０．１（Ｈｅｐ−Ｇ２、Ｈｅｐ−３Ｂ）、ＭＯＩ  １（ＨＯＳ−ＭＮＮＧ、ＷＩ−３８）、ＭＯＩ  １０（ＨＯＳ−ＭＮＮＧ）で感染させた。感染後、３日目、５日目に、ＷＳＴ−８（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ社、カタログ番号０７５５３−４４）で、細胞生存率（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を評価した。非感染群を１００として相対比で示した。第１５図で示すように、増殖型ベクターのＡｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１ＡとＡｄ．Ｓｕｒｖ−Ｅ１ＡΔ２４のいずれも、癌細胞で時間、濃度依存的に効率よく細胞死を誘導する一方、正常細胞のへの傷害は最小限に抑えられていた。
本発明は、発明の実質的範囲に包含される限り、上記の実施例に限定されるものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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