(57)【要約】本発明は、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を安定に保持する種々のストレス耐性が改良されたイネ及びその子孫；該植物の作出方法；該植物のカルスの作出方法に関する。また、本発明は、本発明は、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を安定に保持する生産性ないし形質が改良されたイネ及びその子孫；該植物の作出方法；該植物のカルスの作出方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を安定に保持し、且つ該核酸配列を有していない比較対照植物に比べて栽培環境と無関係に生産性ないし形質が改良された、及び／又は、少なくとも1種のストレス耐性が改良されたイネ科植物及びその子孫。
【請求項２】
ポリアミン量を調節する核酸配列が外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子である請求項１記載のイネ科植物及びその子孫。
【請求項３】
該生産性ないし形質、あるいは、該ストレス耐性が改良された植物が、植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を含む発現ベクターで、該核酸配列を有していない植物を形質転換して得られる形質転換植物である、請求項１記載のイネ科植物及びその子孫。
【請求項４】
該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）をコードする遺伝子、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）をコードする遺伝子、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）をコードする遺伝子、スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）をコードする遺伝子、スペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）をコードする遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種である請求項２に記載のイネ科植物及びその子孫。
【請求項５】
該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、スペルミジン合成酵素をコードする遺伝子である請求項４記載のイネ科植物及びその子孫。
【請求項６】
該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の塩基配列を有するスペルミジン合成酵素遺伝子である、請求項２記載のイネ科植物及びその子孫。
（ａ）配列番号１（ＳＰＤＳ、１３２８）に示される塩基配列中塩基番号７７〜１０６０で示される塩基配列、
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項７】
該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の塩基配列を有するＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子である、請求項２記載のイネ科植物及びその子孫。
（ａ）配列番号３（ＳＡＭＤＣ、１８１４）に示される塩基配列中塩基番号４５６〜１５４７で示される塩基配列、
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項８】
該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の塩基配列を有するアルギニン脱炭酸酵素遺伝子である、請求項２記載のイネ科植物及びその子孫。
（ａ）配列番号５（ＡＤＣ、３０３７）に示される塩基配列中塩基番号５４１〜２６６１で示される塩基配列、
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアルギニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つアルギニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項９】
塩ストレス耐性が改良されたイネ科植物である請求項１に記載のイネ科植物及びその子孫。
【請求項１０】
低温ストレス耐性が改良されたイネ科植物である請求項１に記載のイネ科植物及びその子孫。
【請求項１１】
病原菌ストレス耐性及び／又は害虫ストレス耐性が改良されたイネ科植物である請求項１に記載のイネ科植物及びその子孫。
【請求項１２】
生産性ないし形質が改良される器官が、穂、稈、種子、籾、米、穎果、分げつおよび小穂からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載のイネ科植物及びその子孫。
【請求項１３】
生産性ないし形質が分げつ期、穂ばらみ期、幼穂形成期において顕著に改良される請求項１に記載のイネ科植物及びその子孫。
【請求項１４】
イネ科植物がイネである請求項１に記載のイネ科植物及びその子孫。
【請求項１５】
穂、稈、種子、籾、米、穎果、分げつまたは小穂の形態である請求項１に記載のイネ科植物及びその子孫。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載のイネ科植物及びその子孫から得られる穂、稈、種子、籾、米、穎果、分げつまたは小穂。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれかに記載のイネ科植物及びその子孫から得られる有用物質。
【請求項１８】
植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を安定に保持し、且つ該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換する工程を含む、該核酸配列を有していない比較対照植物に比べて栽培環境と無関係に生産性ないし形質が改良された、及び／又は、少なくとも1種のストレス耐性が改良されたイネ科植物を作出する方法。
【請求項１９】
ポリアミン量を調節する核酸配列が外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を含む発現ベクターで、該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換する工程を含む、該核酸配列を有していない比較対照植物に比べて栽培環境と無関係に生産性ないし形質が改良された、及び／又は、少なくとも1種のストレス耐性が改良されたイネ科植物を作出する方法。
【請求項２１】
ポリアミン量を調節する核酸配列が外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子である請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
該形質転換細胞からイネ科植物を再生する工程をさらに含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）をコードする遺伝子、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）をコードする遺伝子、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）をコードする遺伝子、スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）をコードする遺伝子、スペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）をコードする遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種である請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の塩基を有するスペルミジン合成酵素遺伝子である、請求項２１記載の方法。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列中塩基番号７７〜１０６０で示される塩基配列、
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項２５】
該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の塩基を有するＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子である、請求項２１記載の方法。
（ａ）配列番号３に示される塩基配列中塩基番号４５６〜１５４７で示される塩基配列、
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項２６】
該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の塩基を有するアルギニン脱炭酸酵素遺伝子である、請求項２１記載の方法。
（ａ）配列番号５に示される塩基配列中塩基番号５４１〜２６６１で示される塩基配列、
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアルギニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つアルギニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項２７】
器官が、穂、稈、分げつ、種子、籾、米、穎果および小穂からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
改良されたストレス耐性を有するイネ科植物が、塩ストレス耐性が改良されたイネ科植物である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
改良されたストレス耐性を有するイネ科植物が、低温ストレス耐性が改良されたイネ科植物である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
改良された病原菌ストレス耐性及び／又は害虫ストレス耐性を有するイネ科植物が、塩ストレス耐性が改良されたイネ科植物である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
イネ科植物がイネである請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
生産性ないし形質が分げつ期、穂ばらみ期、幼穂形成期において顕著に改良される請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
以下の工程：
（１）植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を含む発現ベクターで、該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換し、
（２）該形質転換細胞から、該核酸配列を有していない植物に比べて改良された生産性ないし形質を有する植物体を再生し、
（３）該植物体から受粉により種子を採取し、および
（４）該種子を栽培して得られる植物体から受粉により得られる種子における該核酸配列を検定して該核酸配列のホモ接合体を選抜すること
を含む、該核酸配列についてホモ接合体である、該核酸配列を有していない比較対照植物に比べて栽培環境と無関係に生産性ないし形質が改良された、及び／又は、少なくとも1種のストレス耐性が改良されたイネ科植物を作出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良されたストレス耐性、耐倒伏性、生産性ないし形質を有するイネ科植物、詳細には改良された塩ストレス耐性、低温ストレス耐性、あるいは、改良された穂、稈、種子、籾、コメ、穎果、分げつ、小穂などの生産性ないし形質を有するイネ科植物に関する。【０００２】
また、本発明は該イネ科植物の作出方法に関する。【０００３】
さらに、本発明は、該イネ科植物から有用物質（例えばデンプン、タンパク質）或いはその誘導体（例えば生分解性プラスチック）を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
植物はそれぞれの生息地の温度や塩などの様々な環境ストレスに適応して生活している。しかし、例えば温度ストレスにおいては、植物が生育適温の上限または下限を越えるような環境に遭遇すると高温ストレスや低温ストレスを受け、徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて障害をひきおこす。これまで、種々の温度環境に適応した野生の植物を食料作物や工芸作物などに利用するために、選抜や交雑育種など育種的手段によって作物の温度適応性の拡大に努めてきた。しかし、特に日本は南北に長く、地域によっては気候が著しく異なるとともに、四季の変化が著しいので地域や季節によっては作物は生育に不適な温度環境にさらされる危険性が大きい。例えば、熱帯を起源とするイネは、明治以来の品種改良によって東北地方や北海道などの冷涼地でも栽培できるようになり、現在ではこれらの地域の基幹作物として栽培されているが、これらの地域では初夏に異常低温があると冷害を受け、著しい減収になることが現在でも問題になっている。近年、地球温暖化やエルニーニョ現象が原因と考えられる異常気象によって作物が重大な被害を受け、１９９３年のひどい冷害による米不足は記憶に新しい。【０００５】
塩ストレスについては全陸地面積の約１０％が塩害地域といわれ、近年東南アジアやアフリカなどの乾燥地を中心に塩類土壌の拡大が農業上深刻な問題となっている。【０００６】
乾燥ストレス、水ストレスは植物にとって重要なストレスで、温度が制限要因とならないときには降雨量とその分布によって大きな影響を受ける。特に、主要な作物栽培地域である半乾燥地帯などでは、作物の生育や収量は乾燥ストレス、水ストレスによって著しく左右される。【０００７】
また、地球規模で食料危機が問題となっており、植物の生産性ないし形質（生産ポテンシャル、以下、背景技術の欄において単に「生産性」ということがある）を向上させることは重要な課題となっている。【０００８】
種々の環境ストレス耐性を高めるために交雑育種、最近の遺伝子工学技術を利用した育種、植物ホルモンや植物調節剤の作用を利用した方法等が行われている。【０００９】
これまでに遺伝子工学技術を利用した、環境ストレス耐性植物の作出が行われている。低温ストレス耐性の改良に用いられた遺伝子としては、生体膜脂質の脂肪酸の不飽和化酵素遺伝子（ω−３デサチュラーゼ遺伝子、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ遺伝子、ステアロイル−ＡＣＰ−不飽和化酵素遺伝子）や光合成に関与するピルビン酸リン酸ジキナーゼ遺伝子、凍結保護・防止活性を持つタンパク質をコードする遺伝子（ＣＯＲ１５、ＣＯＲ８５、ｋｉｎ１）等が報告されている。【００１０】
塩ストレスや乾燥・水ストレス耐性の改良に用いられた遺伝子としては、浸透圧調節物質のグリシンベタイン合成酵素遺伝子（コリンモノオキシゲナーゼ遺伝子、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子）、プロリン合成酵素遺伝子（１−ピロリン−５−カルボン酸シンテターゼ）等が報告されている。【００１１】
しかし、これらの遺伝子を形質転換した植物の多くは、実際には産業上利用可能な程度に十分な効果は得られておらず、実用化に至っていないのが現状である。【００１２】
一方、植物の生産性を改良するために交雑育種、最近の遺伝子工学技術を利用した育種、植物ホルモンや植物調節剤の作用を利用した方法等が行われている。特に、イネを中心に交雑育種で生産性の改良が試みられており、これまでに生産性が飛躍的に向上した多収性品種も数多く開発されている。遺伝子工学技術による育種では光合成や炭水化物代謝などに関するキー酵素の遺伝子を用いた生産性の改良が行われている。【００１３】
例えば、ラン藻由来のフルクトース−１，６−ビスホスファターゼ／セドヘプツロース−１，７−ビスホスファターゼ遺伝子をタバコの葉緑体中で発現させることで、光合成能が強化されて光合成代謝中間体（ヘキソース、シュクロース、デンプン）の含量が増加し、生育が促進され生産性が向上した（特許文献１）。さらに、炭水化物代謝のショ糖リン酸合成酵素（ＳＰＳ）が炭素分配だけでなくて生産能力の向上にも影響すると考えられ、ＳＰＳ遺伝子がトマト、ジャガイモ、タバコに導入された。トマトではＳＰＳ遺伝子を導入することで、栄養生長期の地上部の乾物重が多くなる傾向が確認された（非特許文献１）。ジャガイモでは地上部（葉と茎）および塊茎の乾物重が増大していることが確認された（非特許文献２；非特許文献３）。しかしながら、これらの遺伝子により形質転換された植物の多くは、実際には産業上利用可能な程度に十分な効果は得られておらず、実用化に至っていないのが現状である。【００１４】
ポリアミンとは第１級アミノ基を２つ以上もつ脂肪族炭化水素の総称で生体内に普遍的に存在する天然物であり、２０種類以上のポリアミンが見いだされている。代表的なポリアミンとしてはプトレシン、スペルミジン、スペルミンがある。ポリアミンの主な生理作用としては(1)核酸との相互作用による核酸の安定化と構造変化(2)種々の核酸合成系への促進作用(3)タンパク質合成系の活性化(4)細胞膜の安定化や物質の膜透過性の強化などが知られている。植物におけるポリアミンの役割としては細胞増殖や分裂時に核酸、タンパク質生合成の促進効果や細胞保護が報告されているが、最近ではポリアミンと環境ストレス耐性との関わりも注目されている。【００１５】
近年、ポリアミンの種々の環境ストレスに対する関わりが報告されている（特許文献２）。低温ストレス（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）、塩ストレス（非特許文献７：Plant Physiol., 91, 500-504, 1984）、酸ストレス（非特許文献８）、浸透ストレス（非特許文献９）、病原菌感染ストレス（非特許文献１０）、除草剤ストレス（非特許文献１１）などとの関わりが報告されているが、いずれの報告も生長発育反応やストレス抵抗性とポリアミン濃度の変化の関連性からポリアミンの関与を推定したものであり、ポリアミン代謝関連酵素をコードするポリアミン代謝関連酵素遺伝子と環境ストレス耐性との遺伝子レベルでの関与については十分に調べられていない。【００１６】
植物のポリアミン生合成に関わるポリアミン代謝関連酵素としてはアルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）、スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）、スペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）等が知られている。これらのポリアミン代謝関連酵素をコードするポリアミン代謝関連遺伝子については植物から既に幾つか単離されている。ＡＤＣ遺伝子はエンバク（非特許文献１２）、トマト（非特許文献１３）、シロイヌナズナ（非特許文献１４）、エンドウ（非特許文献１５）、ＯＤＣ遺伝子はチョウセンアサガオ（Datura）（非特許文献１６）、ＳＡＭＤＣ遺伝子はジャガイモ（非特許文献１７）、ホウレンソウ（非特許文献１８）、タバコ、ＳＰＤＳ遺伝子はシロイヌナズナ（非特許文献１９）等から単離されている。【００１７】
さらに、ポリアミンの形態形成に対する関わりが報告されている。アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）の活性が抑えられたシロイヌナズナ変異体では、根の成長が変化した（非特許文献２０）ことが報告されているが、ポリアミン濃度の変化の関連性からポリアミンの関与を推定したものであり、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子と生産性との遺伝子レベルでの関与については十分に調べられていない。【００１８】
さらに、ジャガイモ由来のＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子をジャガイモにセンス方向で導入したところ形質転換体が得られず、アンチセンス方向で導入したところ生育異常が見られたこと（非特許文献２１）、エンバク由来のアルギニン脱炭酸酵素遺伝子をタバコに導入したところ生育異常が見られたこと（非特許文献２２）を各々開示しているが、イネ科植物の生産性の改良については全く調べられていない。
【特許文献１】特許第3357909号
【特許文献２】ＷＯ０２／２３９７４
【非特許文献１】Plant Physiol., 101, 535, 1993、Planta, 196, 327, 1995
【非特許文献２】Jpn. J. Crop Sci., 65, 102, 1996
【非特許文献３】Jpn. J. Crop Sci, 65, 143, 1996
【非特許文献４】J. Japan Soc. Hortic. Sci., 68, 780-787, 1999
【非特許文献５】J. Japan Soc. Hortic. Sci., 68, 967-973, 1999
【非特許文献６】Plant Physiol. 124, 431-439, 2000
【非特許文献７】Plant Physiol., 91, 500-504, 1984
【非特許文献８】Plant Cell Physiol., 38(10), 156-1166, 1997
【非特許文献９】Plant Physiol. 75, 102-109, 1984
【非特許文献１０】New Phytol., 135, 467-473, 1997
【非特許文献１１】Plant Cell Physiol., 39(9), 987-992, 1998
【非特許文献１２】Mol. Gen. Genet., 224, 431-436, 1990
【非特許文献１３】Plant Physiol., 103, 829-834, 1993
【非特許文献１４】Plant Physiol., 111, 1077-1083, 1996
【非特許文献１５】Plant Mol. Biol., 28, 997-1009, 1995
【非特許文献１６】Biocem. J., 314, 241-248, 1996
【非特許文献１７】Plant Mol. Biol., 26, 327-338, 1994
【非特許文献１８】Plant Physiol., 107, 1461-1462, 1995
【非特許文献１９】Plant Cell Physiol., 39(1), 73-79, 1998
【非特許文献２０】The Plant Journal，13（2），231-239，1998
【非特許文献２１】The Plant Journal，9（2），147-158，1996
【非特許文献２２】The Plant Journal，11（3），465-473，1997
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、ポリアミン代謝に関連する遺伝子の発現を人為的に制御して、ポリアミンレベルを変化させることによって、生産性が改良されたイネ科植物を作出することを目的とする。【００２０】
また、本発明は、イネ科植物の収量と生産性を向上させ、さらに有用物質をより多く産生させることを目的とする。【００２１】
さらに、本発明は、実用的な植物の生産性ないし形質を高める技術を提供することを目的とする。【００２２】
イネ科植物（イネ、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オオムギ、エンバク、シバを含む）、例えばイネは熱帯性植物であることから低温ストレス障害（冷害）を受けやすく低温ストレス耐性の向上は極めて重要な課題となっている。イネ科植物の低温ストレス耐性を高めることができれば、特に寒冷地域(例えば北海道や東北地域)で問題となっている冷害による穀物（コメ、小麦、大麦、トウモロコシなど）収量の低下を軽減することができ穀物の安定供給が可能となる。さらに、塩ストレス耐性を高めることができれば、高塩障害によって栽培が困難な地域でもイネ科植物の栽培が可能となる。【００２３】
本発明は、ポリアミン代謝に関連する遺伝子の発現を人為的に制御して、ポリアミンレベルを変化させることによって、種々のストレス耐性が改良されたイネ科植物を作出することを目的とする。【００２４】
また、本発明は、イネ科植物の収量と生産性を向上させ、さらに有用物質をより多く産生させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明者らは上記の目的を達成すべく鋭意努力した結果、ポリアミン生合成に関わるポリアミン代謝関連酵素遺伝子を単離して、該遺伝子をイネ科植物に導入して過剰発現することによって、ポリアミン代謝を操作してポリアミン濃度を変化させることによって、栽培環境と無関係に、換言すれば環境ストレスがあってもなくても生産性ないし形質のパラメーターが改良されることを見出した。さらには、ポリアミン濃度を変化させることによって、種々のストレス耐性のパラメーターが改良された植物が得られることが明らかになった。【００２６】
例えば、穂ないし稈が形成される分げつ期にポリアミン量が増加すると穂数、稈数、稈地上部生体重、地上部乾燥重、籾収量が有意に増加することが示された。さらに、イネ科植物は、出穂期、花粉形成期ないし穂ばらみ期に低温、乾燥、塩、除草剤、病害虫などの種々のストレスがかかると稔実性が低下あるいは不稔性になるが、この時期に増加量のポリアミンが作用することで種々の環境ストレスに対する稔実性の改善（不稔性の阻止）がなされることを見出した。【００２７】
本発明は、以下の発明を提供するものである。
１．  植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を安定に保持し、且つ該核酸配列を有していない比較対照植物に比べて栽培環境と無関係に生産性ないし形質が改良された、及び／又は、少なくとも1種のストレス耐性が改良されたイネ科植物及びその子孫。
１７．  項１に記載のイネ科植物及びその子孫から得られる有用物質。
１８．  植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を安定に保持し、且つ該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換する工程を含む、該核酸配列を有していない比較対照植物に比べて栽培環境と無関係に生産性ないし形質が改良された、及び／又は、少なくとも1種のストレス耐性が改良されたイネ科植物を作出する方法。
２０．  植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を含む発現ベクターで、該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換する工程を含む、該核酸配列を有していない比較対照植物に比べて栽培環境と無関係に生産性ないし形質が改良された、及び／又は、少なくとも1種のストレス耐性が改良されたイネ科植物を作出する方法。
３３．  以下の工程：
（１）植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を含む発現ベクターで、該核酸配列を有していない植物の細胞を形質転換し、
（２）該形質転換細胞から、該核酸配列を有していない植物に比べて改良された生産性ないし形質を有する植物体を再生し、
（３）該植物体から受粉により種子を採取し、および
（４）該種子を栽培して得られる植物体から受粉により得られる種子における該核酸配列を検定して該核酸配列のホモ接合体を選抜すること
を含む、該核酸配列についてホモ接合体である、該核酸配列を有していない比較対照植物に比べて栽培環境と無関係に生産性ないし形質が改良された、及び／又は、少なくとも1種のストレス耐性が改良されたイネ科植物を作出する方法。
【発明の効果】
【００２８】
本発明により、イネ科植物の生産性を改良することができ、植物の器官や組織の品質、価値、生産性、収量の向上などが期待できる。具体的には、穂、稈、分げつ、種子、籾、米、穎果、小穂の数や大きさが増加することによって、該器官が農作物として生産される場合、品質、生産性、収量の増加が期待される。特に、ポリアミンが分げつ期、穂ばらみ期に作用することによって、イネ科植物(特にイネ)は１株当たりの穂、稈、種子（籾）数が増加することで収穫量が増大することが期待できる。【００２９】
本発明のストレス耐性が改良されたイネ科植物は、環境ストレスを受ける地域のみならず、環境ストレスを受けない地域であっても予想できない環境ストレスに対処するため使用（生育）されるものであるが、環境ストレスを受ける地域にのみ、専ら使用されるものであってもよい。【００３０】
本発明により、イネ科植物の種々の環境ストレス耐性を改良することができ、イネ科植物の生育過程において遭遇する様々な環境ストレスによる障害の回避や生長抑制を軽減することができ栽培の安定化、生産性の向上、栽培地域の拡大などが期待できる。【００３１】
特に穂ばらみ期におけるストレスに対しても耐性を有し、稔実性を向上させるため、収穫量の低下を回避できる。【００３２】
さらに、分げつ期において増加量のポリアミンが穂、稈、分げつに作用することで、穂数、稈数が増大し、収量が増大するだけでなく、野生株に比べて背丈が低く耐倒伏性が向上し、台風(ハリケーン)による収量低下も抑制され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を含む発現コンストラクトの構造を示す図である。
【図２】ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入したイネのウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図３】ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入したイネと野生株との塩ストレス耐性（生育）の比較を示す図である。
【図４】ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入したイネと野生株との塩ストレス耐性（草姿）の比較を示す図である。
【図５】ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入したイネと野生株との低温ストレス耐性（生育）の比較を示す図である。
【図６】ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入したイネと野生株との低温ストレス耐性（草姿）の比較を示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
ポリアミンは分子中にアミンを多く含む塩基性物質であり、代表的なポリアミンとしては二分子のアミンを含むプトレシン、三分子のアミンを含むスペルミジン、四分子のアミンを含むスペルミン等がある。植物において、これらのポリアミン生合成に関わるポリアミン代謝関連酵素としてはプトレシンについてはＡＤＣ、ＯＤＣ、スペルミジンについてはＳＡＭＤＣ、ＳＰＤＳ、スペルミンについてはＳＡＭＤＣ、ＳＰＭＳ等が見つかっている。これらのポリアミン代謝関連酵素をコードしているポリアミン代謝関連酵素遺伝子についても既に幾つかの植物で単離されている。例えば、植物のポリアミン生合成に関わるポリアミン代謝関連酵素としてはアルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）、スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）、スペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）等が知られている。これらのポリアミン代謝関連酵素をコードするポリアミン代謝関連遺伝子については植物から既に幾つか単離されている。ＡＤＣ遺伝子はエンバク（Mol. Gen. Genet., 224, 431-436, 1990）、トマト（Plant Physiol., 103, 829-834, 1993）、シロイヌナズナ（Plant Physiol., 111, 1077-1083, 1996）、エンドウ（Plant Mol. Biol., 28, 997-1009, 1995）、ＯＤＣ遺伝子はチョウセンアサガオ（Datura）（Biocem. J., 314, 241-248, 1996）、ＳＡＭＤＣ遺伝子はジャガイモ（Plant Mol. Biol., 26, 327-338, 1994）、ホウレンソウ（Plant Physiol., 107, 1461-1462, 1995）、タバコ、ＳＰＤＳ遺伝子はシロイヌナズナ（Plant cell Physiol., 39(1), 73-79, 1998）等から単離されている。さらに、幾つかのポリアミン代謝関連酵素遺伝子については植物への導入が試みられているが、得られた形質転換植物で生産性ないし形質の改良については報告されていない。【００３５】
イネ科植物は、穂を形成する時期（穂ばらみ期）にストレスを受けると、それ以外の時期にストレスがなくても不稔性となり収穫量が大きく低下してしまう。本発明者は、穂ばらみ期のストレスに対してもポリアミン代謝関連酵素遺伝子（ＳＰＤＳ、ＳＡＭＤＣ、ＡＤＣ等）が有効であり、稔実性を改善（不稔性を阻止）できることを見出した。【００３６】
また、イネ科植物は、穂ないし稈と呼ばれる根元から伸びる組織により構成され、この穂ないし稈を形成する時期(分げつ期)に増大量のポリアミンの作用を受けると、穂数／稈数が増大し、結果として収量の増加、あるいは草丈(背丈)の低下による耐倒伏性の改善が得られることを本発明者は見出した。【００３７】
ポリアミン量は分げつ期（稈数、穂数、分げつ数に関与する時期）あるいは穂ばらみ期・幼穂形成期（花粉形成、穂形成、稔実性／不稔性に関与する時期）において、全樹において形質転換前の植物（例えば野性株）と比較してポリミン量（特にスペルミジン量とスペルミン量）が１．１〜３倍程度（好ましくは１．３〜２．５倍程度）増加する。このポリアミン量の増加に伴い、分げつ期中の稈、穂、分げつ形成を活性化して稈数、穂数、分げつ数を増加させることにより、また、穂ばらみ期、幼穂形成期のストレスによる花粉形成や穂形成阻害や稔実性の低下、不稔性を回避でき収量の増大と背丈の低下（耐倒伏性の向上）を達成できる。従って、本発明において、ポリアミン量の増加は分げつ期又は穂ばらみ期、幼穂形成期において、全樹において形質転換前の植物（例えば野性株）と比較してポリアミン量が１．１〜３倍程度（好ましくは１．３〜２．５倍程度）増加するように、遺伝子、プロモーター、エンハンサー等を調節し、あるいは、このようなポリアミン量を実現できる形質転換植物を選抜することができる。【００３８】
本発明において「ストレス」とは、環境から受けるあらゆるストレスで、例えば高温、低温、低ｐＨ、低酸素、酸化、塩、浸透圧、乾燥、水、冠水、カドミウム、銅、オゾン、大気汚染、紫外線、強光、弱光、病原体、病原菌、害虫、除草剤などを指す。【００３９】
イネはイネ科イネ属で野生イネと栽培イネに分類され、栽培イネはアジアイネ（Oryza sativa L.）とアフリカイネ(Oryza. grabbelima L.)の2種で他の種は野生イネである。イネは食用や家畜の飼料として利用されるばかりでなく、デンプンは工業原料としても利用されている。【００４０】
本発明において「生産性ないし形質が改良される」とは、植物のあらゆる器官（組織）、例えば、穂、稈、種子、籾、米、穎果、分げつ、小穂などのサイズ、総重量、数量などが増大することや生育期間が短縮すること（生産性の改良）、該器官（組織）に関わる形質（例えば、イネ、トウモロコシなどは穂、稈の数や大きさの増大、イネ、トウモロコシなどは種子（胚乳）の数や大きさの増大、その他、形の変化、着色（例えば色素間のバランスの変化や色素産生量の増大）など）が改良されることをいう。これらの改良は、分げつ期および穂ばらみ期のようなイネ科植物に特有の時期におけるポリアミンの作用に基づく。【００４１】
１つの好ましい実施形態において、本発明で得られる植物は、栽培環境（例えば環境ストレス）に左右されずポリアミンの発現量が増大し、生産性を改良することができる。【００４２】
本明細書において、「イネ科植物」とは、栽培イネ、野生イネ、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オオムギ、エンバク、シバを意味する。【００４３】
ポリアミン量を調節する核酸配列としては、外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子または内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子が挙げられる。外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子は植物体中のポリアミン量を増大させることができ、内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子は植物体中のポリアミン量を減少と増大させることができる。【００４４】
本発明において「該ポリアミン量を調節する核酸配列を有していない比較対照植物」、とは該核酸配列（例えば外因性のポリアミン代謝関連酵素遺伝子又は内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子）を導入する前のあらゆる植物を意味する。従って、いわゆる野生種のほか、通常の交配によって樹立された栽培品種、それらの自然または人工変異体、並びにポリアミン代謝関連酵素遺伝子以外の外因性遺伝子を導入されたトランスジェニック植物などをすべて包含する。【００４５】
本発明で言うところの「ポリアミン」は生物体内に普遍的に存在する一般的な天然物であり、第一級アミノ基を２つ以上もつ脂肪族炭化水素化合物である。例えば、１，３−ジアミノプロパン、プトレシン、カダベリン、カルジン、スペルミジン、ホモスペルミジン、アミノプロピルカダベリン、テルミン、スペルミン、テルモスペルミン、カナバルミン、アミノペンチルノルスペルミジン、Ｎ，Ｎ−ビス（アミノプロピル）カダベリン、ホモスペルミン、カルドペンタミン、ホモカルドペンタミン、カルドヘキサミン、ホモカルドヘキサミンなどが挙げられる。
ポリアミン代謝関連酵素遺伝子
本発明において「ポリアミン代謝関連酵素遺伝子」とは、植物におけるポリアミンの生合成に関与する酵素のアミノ酸をコードする遺伝子であり、例えば代表的なポリアミンであるプトレシンについてはアルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）遺伝子とオルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）遺伝子、スペルミジンについてはＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）遺伝子とスペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）遺伝子、スペルミンについてはＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）遺伝子とスペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）遺伝子が関与し、律速になっていると考えられている。【００４６】
アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ：arginine decarboxylase EC4.1.1.19.）はＬ−アルギニンからアグマチンと二酸化炭素を生成する反応を触媒する酵素である。オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ：ornithine decarboxylase EC4.1.1.17.）はＬ−オルニチンからプトレシンと二酸化炭素を生成する反応を触媒する酵素である。Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ：S-adenosylmethionine decarboxylase EC4.1.1.50.）はＳ−アデノシルメチオニンからアデノシルメチルチオプロピルアミンと二酸化炭素を生成する反応を触媒する酵素である。スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ：spermidine synthase EC2.5.1.16.）はプトレシンとアデノシルメチルチオプロピルアミンからスペルミジンとメチルチオアデノシンを生成する反応を触媒する酵素である。【００４７】
これらの遺伝子は、いずれの由来であってもいいが、例えば、種々の植物から単離することができる。具体的には、双子葉植物、例えばウリ科；ナス科；シロイヌナズナ等のアブラナ科；アルファルファ、カウピー（Vigna unguiculata）等のマメ科；アオイ科；キク科；アカザ科；ヒルガオ科からなる群から選ばれたもの、又は単子葉植物、例えばイネ、小麦、大麦、トウモロコシ等のイネ科などが含まれる。好ましくは、ウリ科植物、より好ましくはクロダネカボチャがよい。【００４８】
本発明の植物由来のポリアミン代謝関連酵素遺伝子を単離する植物組織としては種子形態、または生育過程にあるものである。生育中の植物は全体、あるいは部分的な組織から単離することができる。単離することができる部位としては、特に限定はされないが、好ましくは穂、花序、稈、穎果、種子、粒、穀粒、籾、米、全樹、蕾、花、子房、果実、葉、茎、根などである。さらに好ましくはストレス抵抗性を示す部位である。【００４９】
本発明において使用されるポリアミン代謝関連酵素遺伝子の好ましい例として、スペルミジン合成酵素遺伝子、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子、アルギニン脱炭酸酵素遺伝子を挙げることができる。具体的には、
・配列番号１に示される塩基配列中塩基番号77〜1060で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
・配列番号３に示される塩基配列中塩基番号456〜1547で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
・配列番号５に示される塩基配列中塩基番号541〜2661で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
が挙げられる。さらに、
・該上記いずれかの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有し、且つ該配列と同等のポリアミン代謝関連酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが挙げられる。更に、
・該上記いずれかの配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり且つ該配列と同等のポリアミン代謝関連酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが挙げられる。【００５０】
ここでいう「ストリンジェント条件」とは、特定ポリアミン代謝関連酵素遺伝子配列にコードされるポリアミン代謝関連酵素と同等のポリアミン代謝関連酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列のみが該特定配列とハイブリット（いわゆる特異的ハイブリット）を形成し、同等の活性を有しないポリペプチドをコードする塩基配列は該特定配列とハイブリット（いわゆる非特異的ハイブリット）を形成しない条件を意味する。当業者は、ハイブリダイゼーション反応および洗浄時の温度や、ハイブリダイゼーション反応液および洗浄液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。具体的には、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ，０．０９Ｍ  クエン酸三ナトリウム）または６×ＳＳＰＥ（３Ｍ  ＮａＣｌ，０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ、さらに４２℃で０．５×ＳＳＣにより洗浄する条件が、本発明のストリンジェントな条件の１例として挙げられるが、これに限定されるものではない。【００５１】
ここでいう「１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列」とは、一般的に生理活性を有するタンパク質のアミノ酸配列において１個もしくは複数のアミノ酸が置換、削除、挿入または付加された場合であっても、その生理活性が維持される場合があることは当業者において広く認識されている。本発明にはこのような修飾が加えられ、かつポリアミン代謝関連酵素をコードする遺伝子も本発明の範囲に含まれる。例えば、polyＡテールや５’、３’末端の非翻訳領域が「欠失」されてもよいし、アミノ酸を欠失するような範囲で塩基が「欠失」されてもよい。また、フレームシフトが起こらない範囲で塩基が「置換」されてもよい。また、アミノ酸が付加されるような範囲で塩基が「付加」されてもよい。但し、そのような修飾があっても、ポリアミン代謝関連酵素活性を有することが必要である。好ましくは、「１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された遺伝子」がよい。【００５２】
このような改変されたＤＮＡは例えば、部位特異的変異法（Nucleic Acid Research, Vol.10, No. 20, 6487-6500, 1982）等によって、特定の部位のアミノ酸が置換、削除、挿入、付加されるように本発明のＤＮＡの塩基配列を改変することによって得られる。
ストレス耐性が改良されたイネ科植物及びその子孫
本発明において、「ストレス」としては、上述のごとく、高温、低温、低ｐＨ、低酸素、酸化、塩、浸透圧、乾燥、水、冠水、カドミウム、銅、オゾン、大気汚染、紫外線、強光、弱光、病原体、病原菌、害虫、除草剤などの環境から受けるストレスが例示される。この中で「高温ストレス」とは、植物の生育適温度の上限を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物が受けるストレスであり、高温ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「低温ストレス」とは、植物の生育適温度の下限を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物が受けるストレスであり、低温ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「塩ストレス」とは、植物の生育適塩濃度の上限を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物が受けるストレスであり、塩ストレスを受けた植物は過剰な塩が細胞内に流入して徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「乾燥ストレス」とは、植物の生育適水分濃度の下限を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物が受けるストレスであり、乾燥ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「水ストレス」とは、植物の生育適水分濃度の下限を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物が受けるストレスであり、水ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「弱光ストレス」とは、植物の生育適光強度の下限を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物が受けるストレスであり、弱光ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「病原菌ストレス」とは、植物が病原菌に遭遇または感染することによって植物が受けるストレスであり、病原菌ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「害虫ストレス」とは、植物が害虫に遭遇することによって植物が受けるストレスであり、害虫ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。【００５３】
本発明において、「ストレス耐性が改良されたイネ科植物」および「改良されたストレス耐性を有するイネ科植物」とは、外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入することによって、導入前に比してストレス耐性（抵抗性）が付与若しくは向上したイネ科植物をいう。例えば、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を植物に導入することにより、低温ストレス抵抗性（耐性）、塩ストレス抵抗性（耐性）、除草剤ストレス抵抗性（耐性）、大気汚染ストレスに対する抵抗性（耐性）、病原菌ストレスに対する抵抗性（耐性）、乾燥ストレスに対する抵抗性（耐性）、若しくは浸透圧ストレスに対する抵抗性（耐性）、有用物質ないし米の収量、数などが、該外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を有していない植物に比べて向上した植物などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。【００５４】
具体的には、「塩ストレス耐性が改良されたイネ科植物」とは、イネ科植物の生育過程において遭遇する塩ストレスによる生長抑制や傷害を回避若しくは低減することができたイネ科植物である。「低温ストレス耐性が改良されたイネ科植物」とは、イネ科植物の生育過程において遭遇する低温ストレスによる生長抑制や傷害を回避若しくは低減することができたイネ科植物である。「病原菌ストレス耐性が改良されたイネ科植物」とは、イネ科植物の生育過程において遭遇する病原菌ストレスによる生長抑制や傷害を回避若しくは低減することができたイネ科植物である。「害虫ストレス耐性が改良されたイネ科植物」とは、イネ科植物の生育過程において遭遇する害虫ストレスによる生長抑制や傷害を回避若しくは低減することができたイネ科植物である。これによって、栽培の安定化、生産性、収量の向上、栽培地域、面積の拡大などが期待できる。さらに、イネ科植物、米の生産性や収量が高まることによって、イネ科植物から得られる種々の有用物質（澱粉、タンパク質等）の生産性の向上も期待することができる。【００５５】
特にイネ科植物の場合には、穂ばらみ期にストレスを受けると不稔性になるが、本発明のトランスジェニックイネ科植物は、穂ばらみ期のストレスに対して特に耐性があり、イネ科植物が不稔性になるのを有効に防止し得る。【００５６】
本明細書において、「穂ばらみ期」とは、イネ科植物の出穂期の前の一定期間（例えば数日から２ないし３週間程度）であって、穂が実るのに重要な時期をいう。一般に、穂ばらみ期に低温ストレスなどのストレスがかかると、穂（トウモロコシ）、穀粒（小麦、大麦）ないし粒（コメ）が収穫できなくなる。「分げつ期」とは、穂、稈、分げつを形成する時期であって、穂数、稈数、分げつ数を決めるのに重要な時期をいう。穂数、稈数が増加すると、収量の増加に直結するだけでなく、イネ科植物の背丈(草丈)の低下を通して耐倒伏性も向上させる。
生産性が改良された植物及びその子孫
本発明において、「生産性」としては、上述のごとく、イネ科植物のあらゆる器官（組織）、例えば、穂、稈、分げつ、種子、籾、米、穎果、小穂などを包含し、該器官（組織）の形質として数量、生育期間、形、着色、性質、特性が例示される。【００５７】
本発明において、「生産性が改良されたイネ科植物」および「改良された生産性を有するイネ科植物」とは、外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子または内因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の抑制因子を導入することによって、導入前に比して生産性に関わる形質である、数量、生育期間、形、着色、性質、特性が付与若しくは向上若しくは抑制したイネ科植物をいう。例えば、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子または該抑制因子を植物に導入することにより、穂、稈、分げつ、種子、籾、米、穎果、小穂に関わる形質が、該外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子または該抑制因子を有していないイネ科植物に比べて向上したイネ科植物などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。【００５８】
イネ科植物体内のポリアミン量は、分げつ期において、穂、稈、分げつに高濃度(例えば野生株の１．１〜３倍程度)存在することにより、稈、穂、分げつ形成を活性化して稈数、穂数、分げつ数を増加させる。【００５９】
これによってイネ科植物（器官・組織など）の生産性、収量、収穫量、品質の向上、商品性の向上などが期待できる。また、イネ科植物では、食用部分（米、トウモロコシ、小麦、大麦など）のポリアミン量を減らすことで品質などの特性に好影響を与える可能性がある。従って、これらの部分では抑制因子を発現させ、その他の部分ではポリアミン関連酵素遺伝子を発現させて品質を向上しつつ収量の向上を図ることも可能である。【００６０】
本発明の植物には、イネ科植物体全体（全樹）に限らず、そのカルス、種子、あらゆる植物組織、葉、茎、穂、稈、塊茎、根、塊根、蕾、花、花弁、子房、果実、さや、胚珠、繊維、籾、米などが含まれる。更にその子孫も本発明の植物に含まれる。イネ科植物で重要な部位は、穂、稈、分げつ、種子、籾、米、穎果、小穂である。【００６１】
本発明において「イネ科植物及びその子孫から得られる有用物質」とは、外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入することによって、導入前に比して生産性が向上したイネ科植物およびその子孫で生産された有用物質をさし、有用物質としては例えば、アミノ酸、油脂、デンプン、タンパク質、フェノール、炭化水素、セルロース、天然ゴム、色素、酵素、抗体、ワクチン、医薬品、生分解性プラスチックなどが含まれる。【００６２】
イネ科植物からはデンプン等の糖質が大量に得られ、該糖質は生分解性プラスチックの製造原料とすることができる。生分解性プラスチックとしては、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシバリレート、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリブチレンサクシネート、ポリブチレンアジペート、ポリエチレンサクシネート、ポリ（Ｄ，Ｌ，ＤＬ）乳酸（ポリラクチド）、ポリグリコール酸（ポリグリコシド）、酢酸セルロース、キトサン／セルロース／デンプン、変性デンプンなど、或いはこれらの２元共重合体、３元共重合体が例示される。これらの生分解性プラスチックは公知であり、公知の発酵法、化学合成法などを用いて製造することができる。【００６３】
本発明の植物は、該外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を有していない植物に、遺伝子工学的手法により外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が導入され、且つ安定に保持されたものである。ここで「安定に保持される」とは、少なくともポリアミン代謝関連酵素遺伝子が導入された当代の植物体で該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子が発現し、それによってストレス耐性が改良するのに十分な期間、該植物細胞内に保持されることをいう。従って、現実的には、該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子は宿主植物の染色体上に組み込まれるのが好ましい。該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子は次世代に安定に遺伝することがより好ましい。【００６４】
また、ここで「外因性」とは、植物が生来有しておらず、外部より導入されたものを意味する。従って、本発明の「外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子」は、遺伝子操作により外部より導入される、宿主植物と同種の（すなわち、該宿主植物由来の）ポリアミン代謝関連酵素遺伝子であってもよい。コドン使用（codon usage）の同一性を考慮すれば、宿主由来のポリアミン代謝関連酵素遺伝子の使用もまた好ましい。【００６５】
外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子はいかなる遺伝子工学的手法によって植物に導入されてもよく、例えば、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を有する異種植物細胞とのプロトプラスト融合、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を発現するように遺伝子操作されたウイルスゲノムを有する植物ウイルスによる感染、あるいはポリアミン代謝関連酵素遺伝子を含有する発現ベクターによる宿主植物細胞の形質転換が挙げられる。【００６６】
好ましくは、本発明の植物は、植物中で機能し得るプロモーターの制御下にある外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を含む発現ベクターで、該外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を有していない植物の細胞を形質転換することにより得られる、トランスジェニック植物である。【００６７】
植物中で機能し得るプロモーターとしては、例えば、植物細胞で構成的に発現するカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子（ＮＯＳ）プロモーター、オクトピン合成酵素遺伝子（ＯＣＳ）プロモーター、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）遺伝子プロモーター、カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）遺伝子プロモーター等を挙げることができる。さらにこれらに限定されない公知の植物プロモーターも挙げられる。【００６８】
３５Ｓプロモーターのような器官全体に恒常的に発現させるプロモーターだけでなく、器官または組織特異的プロモーターを用いれば、特定の器官、又は組織だけに目的遺伝子を発現させることができ、特定の器官又は組織だけストレス耐性を改良することができる。例えば、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子と花器に特異的に働くプロモーター（例えば、WO99/43818、特開平11-178572、特開2000-316582）を用いることによって、花の器官のみで花の数や花の大きさを改良することができる。さらに、種子、果実、子房に特異的に働くプロモーター（例えば、Plant Mol. Biol., 11, 651-662, 1988）を用いることによって、種子、子房、果実の数や大きさを改良することができる。さらに、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子と植物が低温に遭遇した時だけ転写を起こさせ得るプロモーター（例えば、BN115プロモーター：Plant physiol.,106, 917-928, 1999）を用いることによって、低温時のみ植物体のポリアミン代謝を制御し低温ストレス抵抗性を改良することができる。さらに、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子と植物が乾燥に遭遇した時だけ転写を起こさせ得るプロモーター（例えば、Atmyb2プロモーター：The Plant Cell, 5, 1529-1539, 1993）を用いることによって、乾燥時のみ植物体のポリアミン代謝を制御し乾燥ストレス抵抗性を改良することができる。【００６９】
また、器官、または組織特異的なプロモーターを用いれば、特定の器官、又は組織だけに目的遺伝子を発現させることができる。例えば、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子と種子に特異的に働くプロモーターを用いることによって、種子のみでストレス耐性を改良することができる。時期特異的なプロモーターを用いれば、特定の時期だけに目的遺伝子を発現させることができ、特定の時期だけにストレス耐性を改良することができる。例えば、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子と栄養生長期に働くプロモーターを用いることによって、栄養生長期のみでストレス耐性を改良することができる。【００７０】
時期特異的なプロモーターを用いれば、特定の時期だけに目的遺伝子を発現させることができ、特定の時期だけに生産性を改良することができる。例えば、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子と栄養生長期に働くプロモーターを用いることによって、栄養生長期のみで生産性を改良することができる。【００７１】
本発明の発現ベクターにおいて、外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子は、植物中で機能し得るプロモーターによりその転写が制御されるように、該プロモーターの下流に配置される。該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の下流には、植物で機能し得る転写終結シグナル（ターミネーター領域）がさらに付加されていることが好ましい。例えば、ターミネーターＮＯＳ（ノパリン合成酵素）遺伝子等が挙げられる。【００７２】
本発明の発現ベクターは、エンハンサー配列等のシス調節エレメントをさらに含んでもよい。また、該発現ベクターは、薬剤耐性遺伝子マーカーなどの形質転換体選抜のためのマーカー遺伝子、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（ＮＰＴII）遺伝子、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子、グリフォセート耐性遺伝子等をさらに含んでもよい。選択圧をかけない条件では、組み込まれた遺伝子が脱落する現象が起こる場合があるので、除草剤耐性遺伝子をベクター上で共存させておけば、栽培中該除草剤を使用することにより、常に選択圧がかかった条件を実現できるという利点もある。【００７３】
さらに、大量調製および精製を容易にするために、該発現ベクターは、大腸菌での自律複製を可能にする複製起点および大腸菌での選択マーカー遺伝子（例えばアンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等）を含むことが望ましい。本発明の発現ベクターは、簡便には、ｐＵＣ系またはｐＢＲ系の大腸菌ベクターのクローニング部位に上記ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現カセットと必要に応じて選択マーカー遺伝子を挿入することにより構築することができる。【００７４】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）やアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）による感染を利用して外因性ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入する場合には、該細菌が保持するＴｉまたはＲｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域（植物染色体に転移する領域）内に該ポリアミン代謝関連酵素遺伝子発現カセットを挿入して用いることができる。現在、アグロバクテリウム法による形質転換の標準的な方法ではバイナリーベクター系が使用される。Ｔ−ＤＮＡ転移に必要な機能は、Ｔ−ＤＮＡ自身とＴｉ（またはＲｉ）プラスミドの両者から独立に供給され、それぞれの構成要素は別々のベクター上に分割できる。バイナリープラスミドはＴ−ＤＮＡの切り出しと組込みに必要な両端の２５ｂｐボーダー配列を有し、クラウンゴール（または毛状根）を引き起こす植物ホルモン遺伝子が除去されており、同時に外来遺伝子の挿入余地を与えている。このようなバイナリーベクターとして、例えばｐＢＩ１０１やｐＢＩ１２１（Clontech社製）などが市販されている。なお、Ｔ−ＤＮＡの組込みに作用するＶｉｒ領域は、ヘルパープラスミドと呼ばれる別のＴｉ（またはＲｉ）プラスミド上にあってトランスに作用する。【００７５】
植物の形質転換には、従来公知の種々の方法を使用することができる。例えば、セルラーゼやヘミセルラーゼなどの細胞壁分解酵素処理により、植物の細胞からプロトプラストを単離し、該プロトプラストと上記ポリアミン代謝関連酵素遺伝子の発現カセットを含む発現ベクターとの懸濁液にポリエチレングリコールを加えてエンドサイトーシス様の過程で該発現ベクターをプロトプラスト内に取り込ませる方法（ＰＥＧ法）、ホスファチジルコリン等の脂質膜小胞内に超音波処理等により発現ベクターを入れ、該小胞とプロトプラストをＰＥＧ存在下に融合させる方法（リポソーム法）、ミニセルを用いて同様の過程で融合させる方法、プロトプラストと発現ベクターの懸濁液に電気パルスを印加して外液中のベクターをプロトプラスト内に取り込ませる方法（エレクトロポレーション法）が挙げられる。しかしながら、これらの方法は、プロトプラストから植物体へ再分化させる培養技術を必要とする点で煩雑である。細胞壁を有するインタクトな細胞への遺伝子導入手段としては、マイクロピペットを細胞に刺し込み、油圧やガス圧でピペット内のベクターＤＮＡを細胞内に注入するマイクロインジェクション法、およびＤＮＡをコーティングした微小金粒子を火薬の爆発やガス圧を利用して加速し、細胞内に導入するパーティクルガン法等の直接導入法と、アグロバクテリウムによる感染を利用した方法とがある。マイクロインジェクションは操作に熟練を要し、また、扱える細胞数が少ないという欠点がある。従って、操作の簡便性を考慮すれば、アグロバクテリウム法および、パーティクルガン法により植物を形質転換することが好ましい。パーティクルガン法は、栽培中の植物の頂端分裂組織に直接遺伝子を導入することが可能である点さらに有用である。また、アグロバクテリウム法において、バイナリーベクターに植物ウイルス、例えばトマトゴールデンモザイクウイルス（ＴＧＭＶ）等のジェミニウイルスのゲノムＤＮＡをボーダー配列の間に同時に挿入することにより、栽培中の植物の任意の部位の細胞に注射筒などを用いて菌懸濁液を接種するだけで、植物体全体にウイルス感染が拡がり、同時に目的遺伝子も植物体全体に導入される。これらの方法は、当該分野に置いて周知であり、形質転換する植物に適した方法が、当該者により適宜選択され得る。【００７６】
上記に示した方法で作製された形質転換植物は、サザン解析やノーザン解析でポリアミン代謝関連酵素遺伝子の遺伝子発現解析、ポリアミン量の分析、ストレス耐性の評価、生産性の評価を行うことができる。【００７７】
例えば、ポリアミンの定量は、０．０５〜１ｇの試料をサンプリングして、５％過塩素酸水溶液を加えて、ポリアミンを抽出する。抽出したポリアミンの定量はダンシル化またはベンゾイル化等で標識した後、蛍光又はＵＶ検出器を接続した高速液体クロンマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて内部標準法で分析することができる。【００７８】
例えば、生産性の評価として穂、稈については、トランスジェニックイネ科植物、またはトランスジェニックイネ科植物の自家受粉で得られたＴ１種子又はＴ２種子を適当な生育培地又は生育土壌に定植あるいは播種し、長日条件下（昼／夜：１６時間／８時間日長）、２０〜３０℃で生育させて穂、稈（例えば分けつ）の数、大きさ、形等を調べることにより評価することができる。花序、穎果、種子、穀粒、籾、米については、トランスジェニックイネ科植物、またはトランスジェニックイネ科植物の自家受粉で得られたＴ１種子又はＴ２種子を適当な生育培地又は生育土壌に定植あるいは播種し、長日条件下（昼／夜：１６時間／８時間日長）、２０〜３０℃で生育させて花序、穎果、種子、穀粒、籾、米の数、大きさ、形等を調べることにより評価することができる。【００７９】
例えば、低温ストレス耐性は、０〜２０℃に１〜１０日間低温処理後、２５〜３０℃で生育させて生育状況や低温傷害等を調べることにより評価することができる。１０℃〜１８℃でイネ科植物を全期間生育させて生育状況や生体重（収量）を調べることにより低温ストレス耐性を評価することができる。高温ストレス耐性は、３５〜５０℃に１〜１０日間低温処理後、２５〜３０℃で生育させて生育状況や高温傷害等を調べることにより評価することができる。３５℃〜４５℃でイネ科植物を全期間生育させて生育状況や生体重（収量）を調べることにより高温ストレス耐性を評価することができる。塩ストレス耐性は、１０〜３００ｍＭ  ＮａＣｌを含んだ培地中で、２５〜３０℃で生育させて生育状況や塩ストレス障害等を調べることにより評価できる。１０〜１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含んだ培養土でイネ科植物を全期間生育させて生育状況や生体重（収量）調べることにより塩ストレス耐性を評価できる。乾燥・水ストレス耐性は、水の供給を停止させて停止後の生育状況や障害程度を調べることにより評価することができる。潅水制限した培養土でイネ科植物を全期間生育させて生育状況や生体重（収量）調べることにより乾燥・水ストレスを評価できる。病原菌ストレスは、イネにイネいもち病菌やイネ白葉枯病菌を接種して接種後の病斑、罹病性反応、生育状況や障害程度を調べることにより評価することができる。害虫ストレスは、イネや米にウンカ、ツマグロヨコバイ、コクゾウを放飼して食害程度や生育状況を調べることにより評価することができる。【００８０】
本発明において、生産性の向上（改良）方法とは、植物を植物中で機能し得るプロモーターの制御下にあるポリアミン量を調節する核酸配列を安定に保持することで比較対照植物に比して花序、穎果、種子、穀粒、籾、米（例えばイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ）、などの収量ないし有用物質（例えばデンプン、油脂、タンパク質、セルロース等）の量（含有率）が増大する方法をいう。好ましくは、該方法により食用物質の味覚は劣化せず、比較対照植物と同等以上である。【００８１】
本発明の形質転換されるイネ科植物は、特に限定されるものではないが、単子葉植物などが挙げられる。例えば、栽培イネ、野生イネ、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オオムギ、エンバク等が挙げられる。好ましくは、イネ、トウモロコシである。【００８２】
本発明は、例えばイネについて好適に実施できる。【００８３】
イネ科植物からはデンプン等の糖質が得られ、該糖質は生分解性プラスチックの製造原料とすることができる。生分解性プラスチックとしては、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシバリレート、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリブチレンサクシネート、ポリブチレンアジペート、ポリエチレンサクシネート、ポリ（Ｄ，Ｌ，ＤＬ）乳酸（ポリラクチド）、ポリグリコール酸（ポリグリコリド）、酢酸セルロース、キトサン／セルロース／デンプン、変性デンプンなど、或いはこれらの２元共重合体、３元共重合体が例示される。これらの生分解性プラスチックは公知であり、公知の発酵法、化学合成法などを用いて製造することができる。
【実施例】
【００８４】
以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。【００８５】
なお、以下の実施例ではイネ科植物としてイネを使用した例を記載するが、トウモロコシ、コムギ、オオムギ等の他のイネ科植物についても同様に種々の環境ストレス耐性、収量が増大する。
実施例１：植物由来のポリアミン代謝関連酵素遺伝子のクローニング
ＷＯ０２／２３９７４の実施例２の記載に従い、完全長のクロダネカボチャ由来のスペルミジン合成酵素遺伝子（ＦＳＰＤ１；配列番号１，２）、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子（ＦＳＡＭ２４；配列番号３，４）、アルギニン脱炭酸酵素遺伝子を（ＦＡＤＣ７６；配列番号５，６）を得た。
実施例２：トランスジェニックイネの作製と解析
（１）発現コンストラクトの作製
配列番号１に示したポリアミン代謝関連遺伝子ＦＳＰＤ１の塩基配列よりオープンリーディングフレームをすべて含むように、ＸｈｏＩで切断し、グラスミルク法で精製した。次にｐＧＥＭ−７Ｚｆ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）をＸｈｏＩ切断して、ＦＳＰＤ１断片をセンスとアンチセンス方向にそれぞれサブクローニングした。ｐＧＥＭ−７Ｚｆのマルチクローニングサイトの制限酵素ＸｂａＩとＫｐｎＩで再度ＦＳＰＤ１断片を切り出して、３５Ｓプロモーターが連結しているバイナリーベクターｐＢＩ１０１−Ｈｍ２にサブクローニングした。これらのプラスミドをｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＤ１＋／−と命名した。その発現コンストラクトの構造を図１に示した。なお、形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＤ１＋／−と命名した。【００８６】
配列番号３に示したポリアミン代謝関連遺伝子ＦＳＡＭ２４の塩基配列よりオープンリーディングフレームをすべて含むように、ＮｏｔＩで切断し、それぞれ平滑末端化した。これらの断片を平滑末端化した３５Ｓプロモーターが連結しているバイナリーベクターｐＢＩ１０１−Ｈｍ２にセンス方向とアンチセンス方向にサブクローニングした。これらのプラスミドをｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＡＭ２４＋／−と命名した。その発現コンストラクト（センス方向のみ）の構造を図１に示した。なお、形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＡＭ２４＋／−と命名した。【００８７】
配列番号５に示したポリアミン代謝関連遺伝子ＦＡＤＣ７６の塩基配列よりオープンリーディングフレームをすべて含むように、ＮｏｔＩで切断し、それぞれ平滑末端化した。これらの断片を平滑末端化した３５Ｓプロモーターが連結しているバイナリーベクターｐＢＩ１０１−Ｈｍ２にセンス方向とアンチセンス方向にサブクローニングした。これらのプラスミドをｐＢＩ３５Ｓ−ＦＡＤＣ７６＋／−と命名した。その発現コンストラクト（センス方向のみ）の構造を図１に示した。なお、形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＡＤＣ７６＋／−と命名した。
（２）プラスミドのアグロバクテリウムへの導入
（１）で得られた大腸菌ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＤ１＋／−、大腸菌ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＡＭ２４＋／−、大腸菌ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＡＤＣ７６＋／−とヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３を持つ大腸菌ＨＢ１０１株を、それぞれ５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で３７℃で１晩、アグロバクテリウムＥＨＡ１０１株を５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で３７℃で２晩培養した。各培養液１．５ｍｌをエッペンドルフチューブに取り集菌したのち、ＬＢ培地で洗浄した。これらの菌体を１ｍｌのＬＢ培地に懸濁後、３種の菌を１００μｌずつ混合し、ＬＢ培地寒天培地にまき、２８℃で培養してプラスミドをアグロバクテリウムに接合伝達（三者接合法）させた。１から２日後に一部を白金耳でかきとり、５０ｍｇ／ｌカナマイシン、２０ｍｇ／ｌハイグロマイシン、２５ｍｇ／ｌクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。２８℃で２日間培養した後、単一コロニーを選択した。得られた形質転換体をＥＨＡ１０１／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＤ１＋／−、ＥＨＡ１０１／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＡＭ２４＋／−、ＥＨＡ１０１／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＡＤＣ７６＋／−と命名した。
（３）イネの形質転換
イネの形質転換はＨｉｅｉ  Ｙ．らの方法（Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，６，２７１−２８２，１９９４）を参考にした。イネ品種‘ゆきひかり’（以下「ゆきひかり」又は「野生株」という）の完熟種子を籾を取り除いた後、７０％エタノールで５分浸漬の後、同様に滅菌したビーカーに入れた滅菌液（５％次亜塩素酸ナトリウム、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）に２０分浸漬して滅菌を行った。滅菌した種子は、滅菌ビーカーに入れた滅菌水で３回洗浄を行った。洗浄後、カルス誘導培地〔Ｎ６Ｃｌプレート：Ｎ６無機塩、Ｎ６ビタミン、２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、３０ｇ／ｌ シュクロース、２ｇ／ｌ ゲルライト、ｐＨ５．８〕上に置床し、植物インキュベーター（サンヨー社製、ＭＬＲ−３５０ＨＴ）中で２５℃、明所（６０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、１６時間明期／８時間暗期、以下この光条件を明所とする）条件下にて培養した。約１ヶ月後、増殖した組織より植物体への再分化能を持つ胚性カルスを選抜した。選抜した胚性カルスは以後、１ヶ月毎に新しいＮ６Ｃｌプレートに移植し、増殖させた。アグロバクテリウムの感染は形質転換アグロバクテリウム株ＥＨＡ１０１／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＤ１＋／−、ＥＨＡ１０１／ｐＢＩＣ２−ＦＳＰＤ１＋／−（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼプロモーターに置き換えたもの）、ＥＨＡ１０１／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＡＭ２４＋／−、ＥＨＡ１０１／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＡＤＣ７６＋／−を５０ｍｇ／ｌカナマイシン及び５０ｍｇ／ｌハイグロマイシンを含むＬＢ寒天培地にて２７℃、２晩培養後、菌体を飯粒２粒程度掻き取り、感染培地（ＡＡ：ＡＡ無機塩、アミノ酸、Ｂ５ビタミン、２０ｇ／ｌ シュクロース、２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、０．２ｍｇ／ｌ カイネチン、１０ｍｇ／ｌ アセトシリンゴン、ｐＨ５．８）に懸濁した。この菌体懸濁液を、滅菌したステンレスネット製バスケットを入れた３００ｍｌ滅菌ビーカーに移した。ビーカーに前培養した胚性カルスをこのビーカーのバスケットに入れて２分間浸したのち、２枚重ねた滅菌濾紙上にバスケットごと乗せて余分な水分を除き、共存培養培地（Ｎ６ＣＯプレート：Ｎ６無機塩、Ｎ６ビタミン、３０ｇ／ｌ シュクロース、１０ｇ／ｌ グルコース、２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、１０ｍｇ／ｌ アセトシリンゴン、２ｇ／ｌ ゲルライト、ｐＨ５．８）に移して、２８℃、暗黒条件下にて３日間共存培養した。３日間共存培養した胚性カルスを、除菌液（滅菌水にカルベニシリンを終濃度５００ｍｇ／ｌとなるように加えたもの）５０ｍｌを入れた滅菌したステンレスバスケット入り３００ｍｌビーカーのバスケットに移し、ピンセットでバスケットをつまみ、数分間良く洗浄した。次に胚性カルスを、バスケットごと除菌液を入れた３００ｍｌ滅菌ビーカーに移し、再び洗浄を行った。同じ操作を再度繰り返した後、滅菌濾紙上で余分な水分を除き、選抜培地（Ｎ６ＳＥプレート：Ｎ６無機塩、Ｎ６ビタミン、３０ｇ／ｌ シュクロース、２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、５０ｍｇ／ｌ ハイグロマイシン、５００ｍｇ／ｌ カルベニシリン、２ｇ／ｌ ゲルライト、ｐＨ５．８）に並べて２５℃、暗黒条件下にて約３〜４週間培養した。ほぼ全てのカルスを再分化培地（ＭＳＲＥプレート：ＭＳ無機塩、ＭＳビタミン、３０ｇ／ｌ シュクロース、３０ｇ／ｌ ソルビトール、２ｇ／ｌ ｃａｓａｍｉｎｏ酸、１ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、２ｍｇ／ｌ ＢＡＰ ２５０ｍｇ／ｌ カルベニシリン、５０ｍｇ／ｌ ハイグロマイシン、４ｇ／ｌ ゲルライト、ｐＨ５．８）に移植して２５℃、暗黒条件下にて再分化するまで培養した。得られた形質転換体について導入遺伝子の確認と発現解析を行った。具体的には導入遺伝子の確認については、ゲノムＤＮＡを調整した後に、ＰＣＲ法とサザンハイブリダーゼーションを行った。導入遺伝子の発現解析は、ノーザン解析とウエスタン解析を行った。ウエスタン解析は４系統の形質転換イネ（ＲＳＰ−ＳＳ−１−１，ＲＳＰ−ＳＳ−１−２，ＲＳＰ−ＣＳ−３−１，ＲＳＰ−ＣＳ−３−２，ＲＳＰ−ＣＳ−３−３，ＲＳＰ−ＣＳ−３−４）から葉をサンプリングしてタンパク質を抽出した。抽出したタンパク質を常法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥした後にエレクトロブロット法でメンブレンに転写した。ＦＳＰＤ１のペプチド抗体（ＳＰＤＳ−ＳＰ３：ＬＣＳＴＥＧＰＰＬＤＦＫＨＰ）を用いてウエスタンブロッティングを行った。その結果を図２に示した。図２の結果から明らかなように形質転換イネ（ＲＳＰ−ＳＳ−１−１，ＲＳＰ−ＳＳ−１−２，ＲＳＰ−ＣＳ−３−１，ＲＳＰ−ＣＳ−３−２，ＲＳＰ−ＣＳ−３−３，ＲＳＰ−ＣＳ−３−４）はＦＳＰＤ１ペプチド抗体と免疫反応を示すバンドが検出され、目的遺伝子が転写、翻訳されていることが示された。以上のことから、目的遺伝子が導入されている形質転換イネを得ることができた。
（４）ポリアミンの解析
（３）で作製した形質転換イネについて、ＰＣＲ（またはサザン解析）、ノーザン解析、ウエスタン解析の結果からセルラインの選抜を行った。確実にポリアミン代謝関連酵素遺伝子が導入され、且つ該遺伝子を安定的に発現している系統についてポリアミン分析を行った。ＦＳＰＤ１がセンス方向（＋）で導入されているセルライン、ＲＳＰ−ＳＳ−１−１、ＲＳＰ−ＳＳ−１−２、ＲＳＰ−ＣＳ−３−１、ＲＳＰ−ＣＳ−３−２、ＲＳＰ−ＣＳ−３−３、ＲＳＰ−ＣＳ−３−４を選抜し、ＲＳＰ−ＳＳ−１−１、ＲＳＰ−ＳＳ−１−２はプロモーターとしてＣａＭＶ３５Ｓプロモーターが導入されている系統、ＲＳＰ−ＣＳ−３−１、ＲＳＰ−ＣＳ―３−２、ＲＳＰ−ＣＳ−３−３、ＲＳＰ−ＣＳ−３−４は西洋わさび由来のペルオキシダーゼプロモーター（Ｃ２プロモーター）が導入されている系統である。ＦＳＰＤ１がアンチセンス方向（−）で導入されているセルライン、ＲＳＰ−ＳＡ−１、ＲＳＰ−ＳＡ−２を選抜し、いずれもＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターが導入されている系統である。ＦＳＡＭ２４がセンス方向（＋）で導入されているセルライン、ＲＳＰ−ＳＭ−１−１、ＴＳＰ−ＳＭ−１−２を選抜し、ＲＳＰ−ＳＭ−１−１、ＲＳＰ−ＳＭ−１−２はプロモーターとしてＣａＭＶ３５Ｓプロモーターが導入されている系統である。同時に栽培を行った野生株（ＷＴ）と形質転換体（ＴＳＰ）から約０．３〜１．０ｇの若葉をサンプリングして凍結保存した。サンプリングした試料に希釈内部標準液（１，６−ｈｅｘａｎｅｄｉａｍｉｎｅ、内部標準量＝７．５又は１２ｎｍｏｌ）と５％過塩素酸水溶液（試料生体重１．０ｇ当たり５〜１０ｍｌ）を加え、オムニミキサーを用いて室温下で十分に磨砕抽出した。磨砕液を、
４℃・３５，０００×ｇで２０分間遠心分離して上清液を採取し本液を遊離型ポリアミン溶液とした。スクリューキャップ付きのマイクロチューブに４００μｌの遊離型ポリアミン溶液、２００μｌの飽和炭酸ナトリウム水溶液、２００μｌのダンシルクロライド／アセトン溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えて軽く混和した。チューブの栓をしっかりと閉めたのちアルミ箔で覆い、６０℃のウォーターバスで１時間加温してダンシル化を行った。チューブを放冷した後、プロリン水溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）を２００μｌ加えて混和した。アルミ箔で覆ってウォーターバスで３０分間再加温した。放冷後、窒素ガスを吹き付けてアセトンを除いた後に、６００μｌのトルエンを加えて激しく混和した。チューブを静置して２相に分かれた後に、上層のトルエン層を３００μｌマイクロチューブに分取した。分取したトルエンに窒素ガスを吹き付けてトルエンを完全除去した。チューブに２００μｌのメタノールを加えてダンシル化遊離型ポリアミンを溶解させた。プトレシン、スペルミジン、スペルミンの遊離型ポリアミン量の定量は蛍光検出器（励起波長：365nm・発光波長：510nm）を接続した高速液体クロマトグラフィーを用いて内部標準法で分析した。ＨＰＬＣカラムはμＢｏｎｄａｐａｋ  Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ社製：０２７３２４、３．９×３００ｍｍ、粒子径１０μｍ）を使用した。試料中のポリアミン含量は標準液と試料のＨＰＬＣチャートから、それぞれ各ポリアミンと内部標準のピーク面積を求めて算出した。その結果、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子をセンス方向に導入したセルラインは、プトレシン含量、スペルミジン含量、スペルミン含量が野生株（ＷＴ）より有意に増加し、総ポリアミン含量も野生株（ＷＴ）より有意に増大していることが明らかとなった。特にスペルミジンとスペルミン含量の増加が顕著であった。さらに、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子をアンチセンス方向に導入したセルラインは、プトレシン含量は増加したが、特にスペルミジン含量とスペルミン含量が野生株（ＷＴ）より有意に減少し、総ポリアミン含量も野生株（ＷＴ）より有意に減少していることが明らかとなった。以上の結果から、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子をイネにセンス方向又はアンチセンス方向で遺伝子導入することで、内性のポリアミン含量を増加又は減少させることが可能であることが明らかとなった。これらのことから、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を植物に遺伝子導入することで、ポリアミン代謝を操作してポリアミン含量を制御できることが示された。
実施例３：生産性の評価
野生株（ＷＴ）と形質転換イネ（ＲＳＰ−ＳＳ−１−１，ＲＳＰ−ＳＳ−１−２，ＲＳＰ−ＣＳ−３−１，ＲＳＰ−ＣＳ−３−２，ＲＳＰ−ＣＳ−３−３，ＲＳＰ−ＣＳ−３−４）の種子を一粒ずつピンセットで籾を取り外した。種子に５ｍｌの種子滅菌液（２．５％ アンチホルミン、Ｔｗｅｅｎ２０）を加えて、１５０ｒｐｍで３０分間振とうした。種子滅菌液を捨てて、１０ｍｌの滅菌水を加えて、１５０ｒｐｍ、１０分間振とうしてこの操作を４回繰り返した。野生株（ＷＴ）の種子は生育培地（ＲＧＭ：ＭＳ無機塩、ＭＳビタミン、３０ｇ／ｌ シュクロース、８ｇ／ｌ ファイトアガー、ｐＨ５．８）、形質転換イネの種子は選抜生育培地（ＲＧＭ：ＭＳ無機塩、ＭＳビタミン、３０ｇ／ｌ シュクロース、８ｇ／ｌ ファイトアガー、５０ｍｇ／ｌ カナマイシン、２０ｍｇ／ｌ ハイグロマイシン、ｐＨ５．８）にそれぞれ播種した。２６℃、弱光条件（４０００ルクス）、１６時間日長（１６時間明期／８時間暗期）に設定したグロースチャンバーで生育させた。播種７〜１０日目に野生株と形質転換イネについて生育がそろった個体を選抜し、市販の培養土を詰めたプラスチック製の鉢に定植した。多湿順化させた後に閉鎖系ガラス室（設定気温昼／夜：２３〜２４℃／２１〜２２℃、湿度５５％、自然日長）で栽培試験を始めた。生育状況として穂ばらみ期、出穂期、開花期、成熟期などを調べた。その結果、穂ばらみ期、出穂期、開花期は野生株と形質転換イネで違いは見られなかった。成熟期については形質転換イネで野生株に比べて４〜７日程遅くなる傾向が見られた。播種日から４ヶ月後に収量構成要素を調べた。その結果を表１に示した。表１の結果から、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入した形質転換イネでは野生株に比べて生産性ないし形質が改良できることが確認された。【００８８】
【表１】
2006057306.tif 000002
【００８９】
実施例４：形質転換イネの種々のストレス耐性の評価
（１）塩ストレス耐性の評価
野生株（ＷＴ）と形質転換イネ（ＲＳＰ−ＳＳ−１−１，ＲＳＰ−ＳＳ−１−２）の種子を一粒ずつピンセットで籾を取り外した。種子に５ｍｌの種子滅菌液（２．５％ アンチホルミン、Ｔｗｅｅｎ２０）を加えて、１５０ｒｐｍで３０分間振とうした。種子滅菌液を捨てて、１０ｍｌの滅菌水を加えて、１５０ｒｐｍ、１０分間振とうしてこの操作を４回繰り返した。野生株（ＷＴ）の種子はＮａＣｌを含む（７５ｍＭ ＮａＣｌ，１００ｍＭ ＮａＣｌ）か含まない生育培地（ＲＧＭ：ＭＳ無機塩、ＭＳビタミン、３０ｇ／ｌ シュクロース、８ｇ／ｌ ファイトアガー、ｐＨ５．８）、形質転換イネ（ＲＳＰ−ＳＳ−１−１，ＲＳＰ−ＳＳ−１−２）の種子はＮａＣｌを含む（７５ｍＭ ＮａＣｌ，１００ｍＭ ＮａＣｌ）か含まない選抜生育培地（ＲＧＭ：ＭＳ無機塩、ＭＳビタミン、３０ｇ／ｌ シュクロース、８ｇ／ｌ ファイトアガー、５０ｍｇ／ｌ カナマイシン、２０ｍｇ／ｌ ハイグロマイシン、ｐＨ５．８）にそれぞれ播種した。２６℃、弱光条件（４０００ルクス）、１６時間日長（１６時間明期／８時間暗期）に設定したグロースチャンバーで生育試験を行った。播種１０日目に生体重（全体）とシュート長を調査した。【００９０】
ＮａＣｌを含まない区（非ストレス区）では野生株と形質転換イネは播種２日目から同じように発芽した。一方、塩ストレス区では形質転換イネは３日目から発芽したのに対して、野生株では発芽が遅れ４〜５日目から発芽した。形質転換イネは野生株に比べて、塩ストレス条件下での発芽勢が優れていることが確認された。播種１０日目の生育調査（生体重・シュート長）の結果を図３、７５ｍＭ ＮａＣｌ区の草姿を図４に示した。図３の結果から非ストレス区では野生株と形質転換イネでは生体重やシュート長に違いは見られなかったが、塩ストレス区では生体重とシュート長ともに形質転換イネでは野生株に比べて有意に大きく、優れた生長を示した。図４の結果からも明らかなように、形質転換イネでは野生株に比べてシュート・根ともに生育が顕著に優れていた。以上の結果から、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入した形質転換イネでは野生株に比べて塩ストレス耐性が高まっていることが示された。
（２）低温ストレス耐性の評価
野生株（ＷＴ）と形質転換イネ（ＲＳＰ−ＳＳ−１−１，ＲＳＰ−ＳＳ−１−２）の種子を一粒ずつピンセットで籾を取り外した。種子に５ｍｌの種子滅菌液（２．５％ アンチホルミン、Ｔｗｅｅｎ２０）を加えて、１５０ｒｐｍで３０分間振とうした。種子滅菌液を捨てて、１０ｍｌの滅菌水を加えて、１５０ｒｐｍ、１０分間振とうしてこの操作を４回繰り返した。野生株（ＷＴ）の種子は生育培地（ＲＧＭ：ＭＳ無機塩、ＭＳビタミン、３０ｇ／ｌ シュクロース、８ｇ／ｌ ファイトアガー、ｐＨ５．８）、形質転換イネ（ＲＳＰ−ＳＳ−１−１，ＲＳＰ−ＳＳ−１−２）の種子は選抜生育培地（ＲＧＭ：ＭＳ無機塩、ＭＳビタミン、３０ｇ／ｌ シュクロース、８ｇ／ｌ ファイトアガー、５０ｍｇ／ｌ カナマイシン、２０ｍｇ／ｌ ハイグロマイシン、ｐＨ５．８）にそれぞれ播種した。２６℃、弱光条件（４０００ルクス）、１６時間日長（１６時間明期／８時間暗期）に設定したグロースチャンバーで３日間育成して、同じように発芽させた。その後、野生株と形質転換イネの半分の個体を低温ストレス条件（１８℃・４０００ルクス）に設定したグロースチャンバー移し、残りの半分の個体は２６℃に設定したグロースチャンバーでそのまま生育を続けた。播種１０日目に生体重（全体）とシュート長を調査した。【００９１】
播種１０日目の生育調査（生体重・シュート長）の結果を図５、播種７日目の草姿を図６に示した。図５の結果から非ストレス区では野生株と形質転換イネでは生体重やシュート長に違いは見られなかったが、低温ストレス区では生体重とシュート長ともに形質転換イネでは野生株に比べて有意に大きく、優れた生長を示した。図６の結果からも明らかなように、形質転換イネでは野生株に比べてシュート・根ともに生育が顕著に優れていた。以上の結果から、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入した形質転換イネでは野生株に比べて低温ストレス耐性が高まっていることが示された。【００９２】
また、本発明で作製したイネは、低温、高温、日照不足、高塩などの稔実性を低下させることが知られている各種ストレスに対し耐性を示すことを本発明者は確認しているので、穂ばらみ期において低温ストレス、塩ストレス、日照不足、乾燥ストレス、水ストレスなどの各種ストレスをかけた場合にも、稔実性の低下が起こらないものである。
実施例５：通常栽培条件下または塩ストレス条件下でのコメ収量の評価
実施例２記載のRSP-SS-1-1、RSP-SS-1-2の形質転換イネからホモ系統としてRSP-SS-1-1-2とRSP-SS-1-2-3を選抜した。【００９３】
野生株（ＷＴ、品種‘ゆきひかり’）と形質転換イネ（ＲＳＰ−ＳＳ−１−１−２，ＲＳＰ−ＳＳ−１−２−３）のＴ２種子を一粒ずつピンセットで籾を取り外した。種子を水が入ったビーカーに移して吸水処理を行った。吸水させた種子を市販の培養土（イネ育苗用ラブリー培養土，ヰセキ社製）を詰めた深底バットに播種した。バットをサランラップで覆い、多湿条件下で順化させた後に閉鎖系ガラス温室（昼夜温度２５℃／２２℃，湿度５５％，自然光）に移して育成を開始した。３週間後に生育が揃った苗をセルライン（系統）当たり１６株づつ選抜した。選抜した幼苗を１５Ｌの市販の培養土（イネ育苗用ナウエル培養土，ヰセキ社製）を詰めた３０Ｌ用大型プランターに８株づつ定植した（田植え）。定植したプランターの内の半分は無処理区（通常栽培条件：無）として前記の市販培養土を１５Ｌのみを詰めているが、残りの半分は塩ストレス区（塩ストレス条件：塩）として市販の培養土に加えてＮａＣｌを４３．８ｇ（５０ｍＭ  ＮａＣｌ濃度）添加し十分に攪拌混和させたものを詰めている。地表から５．５ｃｍの位置まで給水させて常に維持して評価試験を始めた。生育状況として分げつ期、穂ばらみ期、出穂期、開花期、成熟期などを調べた。播種日から４ヶ月後に収穫を行い、生育特性を評価した。その結果を表２に示した。表２の結果からストレス処理に関わらず形質転換イネでは野性株に比べて穂数、地上部生体重、地上部乾燥重が有意に増加することが示された。さらに、塩ストレス区における籾収量を野生株（ＷＴ）と形質転換イネ（ＲＳＰ−ＳＳ−１−１−２，ＲＳＰ−ＳＳ−１−２−３）の両方について調べた。結果を表３に示す。【００９４】
栽培期間中にポリアミン含量を調べたところ、形質転換イネでは野性株に比べてスペルミジン含量やスペルミン含量が１．５〜２．０倍の範囲内で高く維持されていた。スペルミジン合成酵素遺伝子（ＦＳＰＤ１）を過剰発現させた形質転換イネではポリアミンレベル（特にスペルミジン、スペルミン）が野性株に比べて高く維持されることで、ストレス処理の有無に関わらず生育や生長が優れることが明らかとなった。【００９５】
特に穂数の増加については、ポリアミンレベルが高く維持されることで、特に分げつ期中における細胞分裂活性が高まり分げつ形成が促進されたのではないかと考えられる。野性株に比べて優れた生育や生長を示した形質転換イネでは、穂数が増加することで籾や米の収量が有意に増加することが確認された。さらに、形質転換イネでは背丈が低くなり、耐倒伏性が改善されたことが明らかになった。加えて形質転換イネでは、栽培試験中に病原菌や虫による被害が全く観察されなかったことから、スペルミジン合成酵素遺伝子を過剰発現させることでスペルミジンやスペルミン含量が高く維持された結果、病原菌ストレスや害虫ストレス耐性も向上していることが示された。【００９６】
【表２】
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【００９７】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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