(57)【要約】特定の塩基配列を有する２本鎖ＲＮＡが、細胞増殖性疾患の治療に有用である。この２本鎖ＲＮＡは、Ｒａｄ５１遺伝子のｓｉＲＮＡとして作用する。本発明における２本鎖ＲＮＡは、それ自身が細胞増殖を抑制する。また本発明の２本鎖ＲＮＡを化学療法剤とともに投与することによって、その薬理作用を更に増強する。核酸合成阻害作用、あるいは核酸障害作用を有する薬剤との併用は、特に効果的である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される２本鎖ＲＮＡであって、センス鎖の長さが１００塩基以下である２本鎖ＲＮＡ。
【請求項２】
配列番号：１を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される２本鎖ＲＮＡであって、センス鎖の長さが１００塩基以下である２本鎖ＲＮＡを発現するベクター。
【請求項３】
請求項１に記載の２本鎖ＲＮＡ、または請求項２に記載のベクターを有効成分として含有する、Ｒａｄ５１遺伝子の発現抑制剤。
【請求項４】
Ｒａｄ５１遺伝子がヒトＲａｄ５１遺伝子である請求項３に記載のＲａｄ５１遺伝子の発現抑制剤。
【請求項５】
配列番号：１を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される２本鎖ＲＮＡ、またはそれを発現することができるベクターを有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項６】
配列番号：１を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される２本鎖ＲＮＡ、またはそれを発現することができるベクター、および化学療法剤を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項７】
がんまたは悪性腫瘍の治療用である請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
化学療法剤が、制がん剤（ｃａｒｃｉｎｏｓｔａｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、抗がん剤（ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔ）、および抗腫瘍剤（ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｇｅｎｔまたはａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）からなる群から選択される請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
化学療法剤が、核酸合成阻害作用、および核酸障害作用のいずれか、または両方を有する化学療法剤である請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
化学療法剤が、ブレオマイシン類、アントラキノン系制がん剤、マイトマイシン類、アクチノマイシン類、カンプトテシン類、シスプラチン類、ストレプトゾトシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）およびその誘導体、ピラルビシン、およびそれらの薬理学的に許容される塩からなる群から選択されるいずれかの化合物の少なくとも１つである、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ブレオマイシン類が、ブレオマイシン、およびペプロマイシンからなる群から選択されるいずれかの化合物である請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ブレオマイシン類の薬理学的に許容される塩が、塩酸ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、および硫酸ペプロマイシンからなる群から選択されるいずれかの化合物である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
シスプラチン類が、シスプラチン、パラプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ）、およびブリプラチン（Ｂｒｉｐｌａｔｉｎ）からなる群から選択されるいずれかの化合物である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
化学療法剤が、２本鎖ＲＮＡとともにウイルスエンベロープベクターに封入されていることを特徴とする、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ウイルスエンベローブベクターが、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科、およびヘパドナウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルスのエンベロープで構成されている、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ウイルスエンベローブベクターが、センダイウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスまたはインフルエンザウイルスからなる群から選択されたいずれかのウイルスのエンベロープで構成されている、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
（ａ）配列番号：１を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される２本鎖ＲＮＡを有効成分として含有する医薬組成物、及び（ｂ）化学療法剤を有効成分として含有する医薬組成物を含む、組み合わせ物。
【請求項１８】
（ａ）配列番号：１を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される２本鎖ＲＮＡを発現することができるベクターを有効成分として含有する医薬組成物、及び（ｂ）化学療法剤を有効成分として含有する医薬組成物を含む、組み合わせ物。
【請求項１９】
がんまたは悪性腫瘍の治療用である請求項１７または１８のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
【請求項２０】
化学療法剤が、制がん剤（ｃａｒｃｉｎｏｓｔａｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、抗がん剤（ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔ）、および抗腫瘍剤（ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｇｅｎｔまたはａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）からなる群から選択される請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
【請求項２１】
化学療法剤が、核酸合成阻害作用、および核酸障害作用のいずれか、または両方を有する化学療法剤である請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
【請求項２２】
化学療法剤が、ブレオマイシン類、アントラキノン系制がん剤、マイトマイシン類、アクチノマイシン類、カンプトテシン類、シスプラチン類、ストレプトゾトシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）およびその誘導体、ピラルビシン、およびそれらの薬理学的に許容される塩からなる群から選択されるいずれかの化合物の少なくとも１つである、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
【請求項２３】
ブレオマイシン類が、ブレオマイシン、およびペプロマイシンからなる群から選択されるいずれかの化合物である請求項２２に記載の組み合わせ物。
【請求項２４】
ブレオマイシン類の薬理学的に許容される塩が、塩酸ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、および硫酸ペプロマイシンからなる群から選択されるいずれかの化合物である、請求項２２に記載の組み合わせ物。
【請求項２５】
シスプラチン類が、シスプラチン、パラプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ）、およびブリプラチン（Ｂｒｉｐｌａｔｉｎ）からなる群から選択されるいずれかの化合物である、請求項２２に記載の組み合わせ物。
【請求項２６】
２本鎖ＲＮＡが、ウイルスエンベロープベクターに封入されていることを特徴とする、請求項１７または１８のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
【請求項２７】
ウイルスエンベローブベクターが、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科、およびヘパドナウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルスのエンベロープで構成されている、請求項２６に記載の組み合わせ物。
【請求項２８】
ウイルスエンベローブベクターが、センダイウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスまたはインフルエンザウイルスからなる群から選択されたいずれかのウイルスのエンベロープで構成されている、請求項２６に記載の組み合わせ物。
【請求項２９】
請求項１に記載の２本鎖ＲＮＡ、または請求項２に記載のベクターを細胞に投与する工程を含む、Ｒａｄ５１の発現抑制方法。
【請求項３０】
配列番号：１を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される２本鎖ＲＮＡまたはそれを発現することができるベクター、および化学療法剤を投与する工程を含む、がんまたは悪性腫瘍の治療方法。
【請求項３１】
２本鎖ＲＮＡまたはそれを発現することができるベクター、および化学療法剤を投与する工程が、２本鎖ＲＮＡおよび化学療法剤が封入されたウイルスエンベロープベクターを投与する工程である、請求項３０に記載の治療方法。
【請求項３２】
２本鎖ＲＮＡまたはそれを発現することができるベクター、および化学療法剤を投与する工程が、２本鎖ＲＮＡまたはそれを発現することができるベクターを有効成分として含有する医薬組成物、及び化学療法剤を有効成分として含有する医薬組成物を別々に投与する工程である、請求項３０に記載の治療方法。
【請求項３３】
がんまたは悪性腫瘍を治療するための医薬組成物の調製のための、請求項１に記載の２本鎖ＲＮＡ、または請求項２に記載のベクターの使用。
【請求項３４】
医薬組成物が化学療法剤を含む、請求項１に記載の２本鎖ＲＮＡ、または請求項２に記載のベクターの使用。
【請求項３５】
ブレオマイシンまたはその薬学的に許容される塩、およびＲａｄ５１インヒビターを含む、医薬組成物。
【請求項３６】
シスプラチンまたはその薬学的に許容される塩、およびＲａｄ５１インヒビターを含む、医薬組成物。
【請求項３７】
（ａ）ブレオマイシンまたはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物、および（ｂ）Ｒａｄ５１インヒビターを有効成分として含有する医薬組成物を含む、組み合わせ物。
【請求項３８】
（ａ）シスプラチンまたはその薬学的に許容される塩有効成分として含有する医薬組成物、および（ｂ）Ｒａｄ５１インヒビターを有効成分として含有する医薬組成物を含む、組み合わせ物。
【請求項３９】
がんまたは悪性腫瘍の治療用である請求項３７または３８のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、Ｒａｄ５１の発現抑制剤、該発現抑制剤を有効成分として含む医薬、該医薬を調製する方法、あるいはがんまたは悪性腫瘍の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  ここ１０余年来、日本における死亡原因の第１位はがんによって占められている。がん細胞は、細胞分裂の制御機構に異常を生じた細胞が、際限の無い分裂増殖を開始した状態と説明することができる。がん細胞の無秩序な増殖が正常な組織やその機能を障害する疾患が、がんである。【０００３】  がんの治療には、物理科学的な治療、外科的な治療、および投薬による治療などが行われている。物理科学的な治療は、放射線や陽子線をがん病巣に照射し、その細胞障害作用によって、がん細胞を攻撃する。外科的な治療は、固形がんを手術によって取り除く治療方法である。投薬による治療は、がん細胞の生存あるいは増殖に対して阻害的に作用する薬剤の投与によって行われる。【０００４】  化学的に合成された化合物、あるいはヒト以外の生物から単離された化合物を有効成分として含有する薬剤の投与によってがんを治療する方法は、特に化学療法（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）と呼ばれている。化学療法に用いられる薬剤が、化学療法剤（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）である。更に化学療法剤は、その作用によって以下のように分類することができる。【０００５】  制がん剤（ｃａｒｃｉｎｏｓｔａｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）：がん細胞の増殖を抑制する作用を有する薬剤。がん細胞は、その無秩序な増殖が疾患の原因となっている。したがって、たとえがん細胞を死滅させることができなくても、増殖を抑制することが可能であれば、治療効果を期待できる。
抗がん剤（ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔ）：制がん剤ががん細胞の増殖を抑制するのに対して、がん細胞に対して殺傷効果を有する薬剤を特に抗がん剤と言う。制がん剤ではがんの拡大は抑制されるが、縮退効果は小さい。これに対して抗がん剤においては、がんの縮退効果が期待できる。抗がん剤は制がん剤に含まれる概念である。
抗腫瘍剤（ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｇｅｎｔまたはａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）：制がん剤あるいは抗がん剤は、がん、すなわち悪性腫瘍に対する作用を有する薬剤を指す用語である。これに対して抗腫瘍剤は、良性腫瘍を含む腫瘍全般に対する作用を有する薬剤を言う。抗腫瘍剤は、増殖性細胞（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ）を抑制する薬剤と言うこともできる。【０００６】  その他、宿主に抗腫瘍免疫を誘導する、いわゆるがんワクチンや、免疫増強剤の投与も、投薬による治療に含まれる。更に、がんを傷害する抗体、あるいはがんに結合する抗体を細胞障害性化合物で標識した抗体の投与も、投薬による治療に含まれる。これらの治療方法は、がんの種類、進行状態、そして宿主の状態などを考慮して、適切な治療方法が選択される。また、一般にこれらの治療方法は、複数の治療方法が併用される。【０００７】  更に、がんの発生や増殖に関与する遺伝子の発現を調節によるがんの治療は、既に臨床応用が検討されている。たとえば以下の遺伝子の発現阻害による、がんの治療が公知である。遺伝子の発現阻害には、アンチセンスやリボザイムが利用された。
ｃ−ｍｙｃ
Ｈ−ｒａｓ
ｃ−ｒａｆキナーゼ【０００８】  その他に、がんが有する細胞の修復機構の阻害によって、がんの治療効果を高める試みも報告された。細胞は、電離放射線やある種の抗がん剤によっておこるＤＮＡの損傷を修復する機構を備えている。たとえば、相同組換え修復機構、あるいは非相同組換え修復機構は、ＤＮＡ二本鎖の切断を修復する。相同組換え修復機構においては、２本鎖切断時に相同染色体や姉妹染色体分体を鋳型として組換えが行われ、切断部分が修復される。相同組換え修復に必要な酵素として次のような酵素が知られている。これらの酵素の中で、Ｒａｄ５１の発現をアンチセンスオリゴヌクレオチドで抑制すると腫瘍の放射線感受性を増強できることが知られている（ＵＳ２００３／０２２９００４、ＷＯ  ０３／１３４８８）。更にＲＡＤ５１の阻害によってｐ５３の遺伝子治療効果が高まることも公知である（ＷＯ  ０２／５８７３８）。
Ｒａｄ５１    Ｒａｄ５２    Ｒａｄ５４    Ｒａｄ５１Ｂ    Ｒａｄ５１Ｃ    Ｒａｄ５１Ｄ
ＸＲＣＣ２    ＸＲＣＣ３【０００９】  一方、遺伝子の発現制御技術としてＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ＲＮＡｉ）が注目されている。ＲＮＡｉは、ｍＲＮＡと同じ塩基配列を含む２本鎖構造を有するＲＮＡによって、そのｍＲＮＡが切断される結果、蛋白質の発現が抑制される現象である（Ｎａｔｕｒｅ，１９９８  Ｆｅｂ  １９；３９１（６６６９）：８０６−１１；Ｎａｔｕｒｅ，２００１  Ｍａｙ  ２４；４１１（６８３６）：４９４−８）。同じ遺伝子の発現制御技術であるアンチセンスオリゴヌクレオチドによる発現抑制効果と比較して、その効果は１０３〜１０７倍に及ぶと報告されている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２９６：１０００−１００４，２００２）。ＲＮＡｉ効果を示す２本鎖ＲＮＡを、特にｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）と呼ぶ。たとえば、その変異ががんの原因となっていることが知られている以下のような遺伝子について、ｓｉＲＮＡによるがんの治療効果が明らかにされている。
ｋ−ｒａｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３１：７００−７０７，２００３）
ｐ５３（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９９：１４８４９−１４８５４，２００２）
【特許文献１】ＵＳ  ２００３／０２２９００４
【特許文献２】ＷＯ  ０３／１３４８８
【特許文献３】ＷＯ  ０２／５８７３８
【非特許文献１】Ｆｉｒｅ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９８  Ｆｅｂ  １９；３９１（６６６９）：８０６−１１
【非特許文献２】Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ＳＭ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００１  Ｍａｙ  ２４；４１１（６８３６）：４９４−８
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２９６：１０００−１００４，２００２
【非特許文献４】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３１：７００−７０７，２００３
【非特許文献５】Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ＬＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９９：１４８４９−１４８５４，２００２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】  本発明の課題は、細胞増殖性疾患の治療技術の提供である。より具体的には、本発明は、Ｒａｄ５１の発現制御によるがんの治療技術の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】  Ｒａｄ５１は、大腸菌のＲｅｃＡの哺乳類におけるホモログである。Ｒａｄ５１をノックアウトしたマウスは、胎生致死となることが報告されている。これらの情報から、Ｒａｄ５１が生体で極めて重要な機能を果たしていることが強く示唆されている。更に、Ｒａｄ５１の発現をアンチセンスオリゴヌクレオチドで抑制すると、腫瘍の放射線感受性を増強できることが知られている。【００１２】  本発明者らは、Ｒａｄ５１のｓｉＲＮＡによる発現抑制を実現すれば、腫瘍の治療に有用であると考え、効果的なｓｉＲＮＡの探索を重ねた。その結果、配列番号：１に記載の塩基配列を含む２本鎖ＲＮＡが、Ｒａｄ５１のｓｉＲＮＡとして有効であることを見出した。更に、当該ｓｉＲＮＡと化学療法剤との併用によって著しい細胞増殖抑制作用が見られることを明らかにした。加えて本発明者は、ｓｉＲＮＡあるいは化学療法剤との組成物の投与に、ウイルスエンベロープベクターの利用が有利であることを見出した。すなわち本発明は、以下の医薬組成物、あるいはｓｉＲＮＡとして有用な２本鎖ＲＮＡ、並びにそれらの使用に関する。【００１３】〔１〕配列番号：１を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される２本鎖ＲＮＡであって、センス鎖の長さが１００塩基以下である２本鎖ＲＮＡ。
〔２〕配列番号：１を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される２本鎖ＲＮＡであって、センス鎖の長さが１００塩基以下である２本鎖ＲＮＡを発現するベクター。
〔３〕〔１〕に記載の２本鎖ＲＮＡ、または〔２〕に記載のベクターを有効成分として含有する、Ｒａｄ５１遺伝子の発現抑制剤。
〔４〕Ｒａｄ５１遺伝子がヒトＲａｄ５１遺伝子である〔３〕に記載のＲａｄ５１遺伝子の発現抑制剤。
〔５〕配列番号：１を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される２本鎖ＲＮＡ、またはそれを発現することができるベクターを有効成分として含有する医薬組成物。
〔６〕配列番号：１を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される２本鎖ＲＮＡ、またはそれを発現することができるベクター、および化学療法剤を有効成分として含有する医薬組成物。
〔７〕がんまたは悪性腫瘍の治療用である〔６〕に記載の医薬組成物。
〔８〕化学療法剤が、制がん剤（Ｃａｒｃｉｎｏｓｔａｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、抗がん剤（ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔ）、および抗腫瘍剤（ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｇｅｎｔまたはａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）からなる群から選択される〔６〕に記載の医薬組成物。
〔９〕化学療法剤が、核酸合成阻害作用、および核酸障害作用のいずれか、または両方を有する化学療法剤である〔６〕に記載の医薬組成物。
〔１０〕化学療法剤が、ブレオマイシン類、アントラキノン系制がん剤、マイトマイシン類、アクチノマイシン類、カンプトテシン類、シスプラチン類、ストレプトゾトシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）およびその誘導体、ピラルビシン、およびそれらの薬理学的に許容される塩からなる群から選択されるいずれかの化合物の少なくとも１つである、〔６〕に記載の医薬組成物。
〔１１〕ブレオマイシン類が、ブレオマイシン、およびペプロマイシンからなる群から選択されるいずれかの化合物である〔１０〕に記載の医薬組成物。
〔１２〕ブレオマイシン類の薬理学的に許容される塩が、塩酸ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、および硫酸ペプロマイシンからなる群から選択されるいずれかの化合物である、〔１０〕に記載の医薬組成物。
〔１３〕シスプラチン類が、シスプラチン、パラプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ）、およびブリプラチン（Ｂｒｉｐｌａｔｉｎ）からなる群から選択されるいずれかの化合物である、〔１０〕に記載の医薬組成物。
〔１４〕化学療法剤が、２本鎖ＲＮＡとともにウイルスエンベロープベクターに封入されていることを特徴とする、〔６〕に記載の医薬組成物。
〔１５〕ウイルスエンベローブベクターが、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科、およびヘパドナウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルスのエンベロープで構成されている、〔１４〕に記載の医薬組成物。
〔１６〕ウイルスエンベローブベクターが、センダイウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスまたはインフルエンザウイルスからなる群から選択されたいずれかのウイルスのエンベロープで構成されている、〔１４〕に記載の医薬組成物。
〔１７〕（ａ）配列番号：１を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される２本鎖ＲＮＡを有効成分として含有する医薬組成物、及び（ｂ）化学療法剤を有効成分として含有する医薬組成物を含む、組み合わせ物。
〔１８〕（ａ）配列番号：１を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される２本鎖ＲＮＡを発現することができるベクターを有効成分として含有する医薬組成物、及び（ｂ）化学療法剤を有効成分として含有する医薬組成物を含む、組み合わせ物。
〔１９〕がんまたは悪性腫瘍の治療用である〔１７〕または〔１８〕のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
〔２０〕化学療法剤が、制がん剤（ｃａｒｃｉｎｏｓｔａｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、抗がん剤（ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔ）、および抗腫瘍剤（ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｇｅｎｔまたはａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）からなる群から選択される〔１７〕〜〔１９〕のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
〔２１〕化学療法剤が、核酸合成阻害作用、および核酸障害作用のいずれか、または両方を有する化学療法剤である〔１７〕〜〔１９〕のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
〔２２〕化学療法剤が、ブレオマイシン類、アントラキノン系制がん剤、マイトマイシン類、アクチノマイシン類、カンプトテシン類、シスプラチン類、ストレプトゾトシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）およびその誘導体、ピラルビシン、およびそれらの薬理学的に許容される塩からなる群から選択されるいずれかの化合物の少なくとも１つである、〔１７〕〜〔１９〕のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
〔２３〕ブレオマイシン類が、ブレオマイシン、およびペプロマイシンからなる群から選択されるいずれかの化合物である〔２２〕に記載の組み合わせ物。
〔２４〕ブレオマイシン類の薬理学的に許容される塩が、塩酸ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、および硫酸ペプロマイシンからなる群から選択されるいずれかの化合物である、〔２２〕に記載の組み合わせ物。
〔２５〕シスプラチン類が、シスプラチン、パラプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ）、およびブリプラチン（Ｂｒｉｐｌａｔｉｎ）からなる群から選択されるいずれかの化合物である、〔２２〕に記載の組み合わせ物。
〔２６〕２本鎖ＲＮＡが、ウイルスエンベロープベクターに封入されていることを特徴とする、〔１７〕または〔１８〕のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
〔２７〕ウイルスエンベローブベクターが、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科、およびヘパドナウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルスのエンベロープで構成されている、〔２６〕に記載の組み合わせ物。
〔２８〕ウイルスエンベローブベクターが、センダイウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスまたはインフルエンザウイルスからなる群から選択されたいずれかのウイルスのエンベロープで構成されている、〔２６〕に記載の組み合わせ物。
〔２９〕〔１〕に記載の２本鎖ＲＮＡ、または〔２〕に記載のベクターを細胞に投与する工程を含む、Ｒａｄ５１の発現抑制方法。
〔３０〕配列番号：１を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される２本鎖ＲＮＡまたはそれを発現することができるベクター、および化学療法剤を投与する工程を含む、がんまたは悪性腫瘍の治療方法。
〔３１〕２本鎖ＲＮＡまたはそれを発現することができるベクター、および化学療法剤を投与する工程が、２本鎖ＲＮＡおよび化学療法剤が封入されたウイルスエンベロープベクターを投与する工程である、〔３０〕に記載の治療方法。
〔３２〕２本鎖ＲＮＡまたはそれを発現することができるベクター、および化学療法剤を投与する工程が、２本鎖ＲＮＡまたはそれを発現することができるベクターを有効成分として含有する医薬組成物、及び化学療法剤を有効成分として含有する医薬組成物を別々に投与する工程である、〔３０〕に記載の治療方法。
〔３３〕がんまたは悪性腫瘍を治療するための医薬組成物の調製のための、〔１〕に記載の２本鎖ＲＮＡ、または〔２〕に記載のベクターの使用。
〔３４〕医薬組成物が化学療法剤を含む、〔１〕に記載の２本鎖ＲＮＡ、または〔２〕に記載のベクターの使用。
〔３５〕ブレオマイシンまたはその薬学的に許容される塩、およびＲａｄ５１インヒビターを含む、医薬組成物。
〔３６〕シスプラチンまたはその薬学的に許容される塩、およびＲａｄ５１インヒビターを含む、医薬組成物。
〔３７〕（ａ）ブレオマイシンまたはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物、および（ｂ）Ｒａｄ５１インヒビターを有効成分として含有する医薬組成物を含む、組み合わせ物。
〔３８〕（ａ）シスプラチンまたはその薬学的に許容される塩有効成分として含有する医薬組成物、および（ｂ）Ｒａｄ５１インヒビターを有効成分として含有する医薬組成物を含む、組み合わせ物。
〔３９〕がんまたは悪性腫瘍の治療用である〔３７〕または〔３８〕のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
【発明の効果】
【００１４】  本発明により、Ｒａｄ５１のｓｉＲＮＡとして有用な２本鎖ＲＮＡが提供された。本発明の２本鎖ＲＮＡは、Ｒａｄ５１の発現を効果的に抑制する。本発明の２本鎖ＲＮＡは、がん細胞の増殖抑制剤として有用である。あるいは放射線や陽子線の照射によるがんの治療方法において、その治療効果を高める効果を有する。Ｒａｄ５１のアンチセンスががんの放射線に対する感受性を増強することが知られている。本発明の２本鎖ＲＮＡは、アンチセンスよりもはるかに強力に遺伝子発現を抑制する。したがって、放射線に対する感受性の増強効果もより強力であると予測される。
また本発明の２本鎖ＲＮＡは、化学療法剤との併用によって、更に顕著な制がん作用を示す。すなわち本発明によって、２本鎖ＲＮＡと化学療法剤を含む医薬組成物が提供された。本発明の医薬組成物は、がんの治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】［図１］５種類のＲａｄ５１  ｓｉＲＮＡの標的部位を示した図である。ｓｉＲＮＡ  ３２１、４６２、９８９、８９、及び８２８は、それぞれ配列番号：１、２、３、４、及び５に対応する。ｓｉＲＮＡ  ３２１（配列番号：１）のみで発現抑制効果が見られ、他のｓｉＲＮＡでは抑制効果は見られなかった。
［図２］ｓｉＲＮＡによるＲａｄ５１のノックダウンを示す写真である。ＨＶＪエンベロープベクターによりＲａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（ターゲット３２１）をＨｅＬａ細胞に導入し、Ｒａｄ５１蛋白の発現を経日的に調べた。対照として、スクランブルｓｉＲＮＡ（配列番号：６）を用いた。蛋白質量の内部標準としてβ−アクチンを検出した。Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（３２１）は、長期にわたってＲａｄ５１蛋白の発現を抑制できることが示されている。
［図３］アンチセンスオリゴ核酸に対するｓｉＲＮＡの優位性を示す写真である。（Ａ）Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（３２１）、スクランブル配列（配列番号：６）からなるｓｉＲＮＡ（ＳＣ  ｓｉＲＮＡ）、またはウイルスベクターのみ（Ｅｍｐｔｙ  ＨＶＪ−Ｅ）をそれぞれ導入したＨｅＬａ細胞のノーザンブロットを示す。（Ｂ）同様に、従来使われてきたＲａｄ５１のアンチセンスオリゴ核酸（Ｒａｄ５１  ＡＳ＃１またはＲａｄ５１  ＡＳ＃２）またはＲａｄ５１のアンチセンスオリゴ核酸のスクランブル配列（ＳＣＡＳ）をそれぞれ導入したＨｅＬａ細胞のノーザンブロットを示す。
［図４］Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡとブレオマイシンとの併用による抗腫瘍効果を示す図である。（Ａ）実験のスケジュールを示す。（Ｂ）Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（ターゲット３２１）（Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ）または対照のスクランブルｓｉＲＮＡ（ＳＣ  ｓｉＲＮＡ）をＨＶＪエンベロープベクターによりそれぞれ導入したがん細胞における生存細胞数を示す。Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（３２１）の導入は、抗がん剤効果を約２倍増強することが示されている。
［図５］Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡによるがん細胞のシスプラチン感受性の増強を示す図である。（Ａ）実験のスケジュールを示す。（Ｂ）ＨＶＪエンベロープベクターにより、Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（ターゲット３２１）（ＨＶＪ−Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ）または対照のスクランブルｓｉＲＮＡ（ＨＶＪ−ＳＣ  ｓｉＲＮＡ）をＨｅＬａ細胞に導入し、経日的に細胞相対数の変化を調べた細胞増殖曲線を示す。（Ｃ）また、シスプラチンを図示した濃度で添加し、相対コロニー数を調べたコロニー形成能を示す。Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡとシスプラチンとの併用により、がん細胞のコロニー形成が有意に抑制されることが示されている。
［図６］Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（３２１）及びシスプラチン（ＣＤＤＰ）の併用による、各種ヒトがん細胞のシスプラチン感受性の増強を示す図および写真である。（Ａ）各種ヒトがん細胞として、ＰＡＮＣ−１（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、ＡｓＰＣ−１（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、Ａ５４９（ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）、ＤＵ１４５（ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ）、ＭＣＦ７（ｍａｍｍａｒｙ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、及びＨｅＬａ  Ｓ−３（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）における蛋白レベルを示す。内部標準として用いたＫｕ７０及びβアクチンはほぼ同レベルであるのに対し、Ｒａｄ５１蛋白レベルは様々であることが示されている。（Ｂ）ｓｉＲＮＡに加えてＣＤＤＰ（０．１μｇ／ｍｌ）を投与した場合の細胞の生存率を示す。対照のスクランブルｓｉＲＮＡ（ＳＣ  ｓｉＲＮＡ＋０．１μｇ／ｍｌ  ＣＤＤＰ）の場合は８０％以上の細胞が生存したのに対し、Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（３２１）（Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ＋０．１μｇ／ｍｌ  ＣＤＤＰ）の場合はどのがん細胞においてもＣＤＤＰ感受性が３０％以上増加した。
［図７］Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（３２１）を正常ヒト細胞またはがん細胞に導入したときの、シスプラチン（ＣＤＤＰ）感受性の変化を示す図である。（Ａ）Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（３２１）を導入したヒト正常２倍体繊維芽細胞（Ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｐｌｏｉｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＮＨＤＦ）またはＨｅＬａ細胞におけるシスプラチン濃度依存性を示す。ＮＨＤＦでは、シスプラチン濃度の上昇に伴う感受性の変化は観察されず、約９０％の細胞が生存していたのに対し、ＨｅＬａ細胞ではＣＤＤＰの濃度依存性に感受性が増強された。（Ｂ）Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（３２１）を導入したＮＨＤＦまたはＨｅＬａ細胞において、ＣＤＤＰの有無によるアポトーシスの率の相違を、アネキシンＶ（ＡｎｎｅｘｉｎＶ）陽性細胞の割合として測定した。ＣＤＤＰ非存在下（Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ＋Ｍｅｄｉｕｍ）ではアポトーシス細胞の率はＨｅＬａ細胞（４．０±１．１％）とＮＨＤＦ（３．２  ±０．５％）とで変化がなかった。しかしＣＤＤＰ存在下（Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ＋０．１μｇ／ｍｌ  ＣＤＤＰ）では、アポトーシス細胞の率はＨｅＬａ細胞で１５．０％に増加したのに対し、ＮＨＤＦではほとんど増加しなかった（４．９％）。
［図８］Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（３２１）とシスプラチンとの併用によるインビボにおける抗腫瘍効果を示す図である。マウスにＨｅＬａ細胞を移植して形成させた腫瘍塊に、Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（ターゲット３２１）（Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ）、対照のスクランブルｓｉＲＮＡ（ＳＣ  ｓｉＲＮＡ）をＨＶＪエンベロープベクターにより導入し、さらにシスプラチン（ＣＤＤＰ）を腹腔内投与して腫瘍体積の変化を調べた。Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（３２１）とシスプラチンの併用により、腫瘍増殖が完全に抑制できることが示されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】  本発明は、配列番号：１を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される２本鎖ＲＮＡであって、センス鎖の長さが１００塩基以下である２本鎖ＲＮＡに関する。本発明の２本鎖ＲＮＡを構成するセンス鎖の長さは、少なくとも１９塩基（配列番号：１）、通常１９〜５０塩基、たとえば１９〜３０塩基、好ましくは１９〜２５塩基、あるいは１９〜２３塩基である。本発明の２本鎖ＲＮＡを構成するセンス鎖の塩基配列には、２本鎖ＲＮＡがＲａｄ５１の発現を抑制する機能を有する限り、ヒトＲａｄ５１のｍＲＮＡを構成する塩基配列と完全に同一でない塩基配列が含まれる。たとえば、１−５塩基の変異は許容される。より具体的には、配列番号：１における１塩基の変異は許容される。【００１７】  本発明の２本鎖ＲＮＡにおいて、センス鎖の塩基配列が配列番号：１に記載の塩基配列よりも長い塩基配列で構成される場合には、配列番号：１の塩基配列に対して任意の塩基配列が付加される。本発明において、配列番号：１の塩基配列に付加される塩基配列は、好ましくは、ヒトＲａｄ５１のｍＲＮＡを構成する塩基配列から選択することができる。配列番号：１に示した塩基配列は、ヒトＲａｄ５１のｍＲＮＡを構成する塩基配列中、３２１〜３３９塩基に相当する領域の塩基配列である。したがって、当該領域を含む連続する塩基配列は、本発明における付加される塩基配列として好ましい。【００１８】  更に、本発明の２本鎖ＲＮＡを構成するアンチセンス鎖は、センス鎖に対して高度な相補性を有する塩基配列で構成される。本発明において高度な相補性とは、たとえば９０％以上、通常９５％以上、好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の相補性を言う。塩基配列の相補性は、ｂｌａｓｔｎなどの公知のアルゴリズムによって決定することができる。本発明の２本鎖ＲＮＡを構成するアンチセンス鎖の塩基配列には、２本鎖ＲＮＡがＲａｄ５１の発現を抑制する機能を有する限り、センス鎖に対して完全に相補的でない塩基配列が含まれる。たとえば、１−５塩基の変異は許容される。より具体的には、アンチセンス鎖における１塩基の変異は許容される。【００１９】  本発明において、２本鎖ＲＮＡとは、塩基対結合によって相補鎖をともなった構造を有するＲＮＡを言う。２本鎖ＲＮＡを構成するセンス鎖とアンチセンス鎖は、異なる分子であっても良いし、同一の分子であることもできる。同一の分子の場合には、互いに相補的な塩基配列が同一のＲＮＡ分子の上に配置される。通常、このような分子は、センス鎖とアンチセンス鎖の間の塩基対結合によって、ステムループ構造を構成する。すなわち本発明の２本鎖ＲＮＡには、２本鎖ＲＮＡ構造を部分構造として含むステムループＲＮＡが含まれる。【００２０】  本発明の２本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼを利用して酵素的にＲＮＡを合成することによって得ることができる。ＲＮＡの酵素的な合成方法は公知である。すなわち、ＲＮＡポリメラーゼの認識配列（プロモーター）の下流に目的とするＲＮＡをコードするＤＮＡを配置した鋳型ＤＮＡを合成する。２本鎖ＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖を異なる分子として発現させる場合には、それぞれをコードするＤＮＡがプロモーターの制御下に発現するように��ザインする。センス鎖とアンチセンス鎖を同一のベクターに配置することもできるし、異なるベクターに組み込んで同一の細胞に共形質転換することもできる。あるいは、同一分子として両者を発現させるには、目的とするステムループを構成するＲＮＡをコードするＤＮＡをベクターに組み込めばよい。ステムループ構造を与えるＲＮＡにおいて、ループ部分を構成する塩基配列は任意である。一般には、５−２０塩基程度の任意の塩基配列が利用される。たとえば、５’−ｕｇｕｇｃｕｇｕｃ−３’（９塩基）などの塩基配列は、効果的なステムループ構造のｓｉＲＮＡを与える。
鋳型ＤＮＡに、リボヌクレオチド基質の存在下、ＲＮＡポリメラーゼを作用させれば、鋳型ＤＮＡの塩基配列がＲＮＡに転写される。ＲＮＡポリメラーゼは、細胞内、あるいは細胞外において、鋳型ＤＮＡに作用させることができる。ＲＮＡの転写には、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼなどを利用することができる。細胞外で転写されたセンス鎖とアンチセンス鎖は、ハイブリダイズさせることによって２本鎖ＲＮＡを構成する。【００２１】  細胞内で目的とするＲＮＡを合成するためには、通常、目的とするＲＮＡをコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターが細胞に導入される。ｓｉＲＮＡを細胞内で発現させるためのベクターは公知である。たとえば、以下の報告においては、ＰｏｌＩＩＩ転写系を利用したｓｉＲＮＡの発現ベクターとして、Ｕ６プロモーター、あるいはＨ１プロモーターなどを含む発現ベクターが利用されている。ＰｏｌＩＩＩ転写系によって転写されたＲＮＡは、転写産物の３’末端に４つのｕが付加される。
Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６：５５０−５５３，２００２
Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，：Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：５００−５０５，２００２
Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，：Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：４９７−５００，２００２
Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，：Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．，１６：９４８−９５８，２００２
Ｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：５５１５−５５２０，２００２
Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，：Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：５０５−５０８，２００２
Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：６０４７−６０５２，２００２
Ｔｕｓｃｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，：Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：４４６−４４８，２００２
ＭｃＭａｎｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，：Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，３：７３７−７４７，２００２
Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，：Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７７：７１７４−７１８１，２００３【００２２】  ＰｏｌＩＩＩ転写系を利用したｓｉＲＮＡ発現用ベクターとして、以下の市販のベクター（宝バイオ製）を利用することもできる。Ｕ６プロモーターを利用したｓｉＲＮＡ発現ベクター：
ｐＢＡｓｉ−ｈＵ６  ＤＮＡ：ｈｕｍａｎ  Ｕ６  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｘ０７４２５）
ｐＢＡｓｉ−ｍＵ６  ＤＮＡ：ｍｏｕｓｅ  Ｕ６  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｘ０６９８０）
Ｈ１プロモーターを利用したｓｉＲＮＡ発現ベクター：
ｐＢＡｓｉ−ｈＨ１  ＤＮＡ：ｈｕｍａｎ  Ｈ１  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｓ６８６７０）【００２３】  更に、次のようなウイルスベクターにｓｉＲＮＡコンストラクトを導入し、長期にわたって細胞中でｓｉＲＮＡを発現させる試みも知られている。これらのウイルスベクターも、本発明の２本鎖ＲＮＡを発現させるためのベクターとして利用することができる。
アデノウイルス（Ｚｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：７７９７−７８０２，２００３；Ｘｉａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：１００６−１０１０，２００２）
レンチウイルス（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：１８３−１８８，２００３）
レトロウイルス（Ｂａｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１４９４３−１４９４５，２００２）
アデノ随伴ウイルス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，９：１５３９−１５４４，２００３）
その他、ＲＮＡを化学的に合成することもできる。ＲＮＡを化学的に合成する方法は公知である。【００２４】  本発明の２本鎖ＲＮＡはＲＮＡｉ効果によって、Ｒａｄ５１遺伝子を発現する細胞において、その発現を抑制する。すなわち本発明の２本鎖ＲＮＡは、Ｒａｄ５１の発現を制御するｓｉＲＮＡとして有用である。すなわち本発明は、配列番号：１を含むセンス鎖とその相補鎖（アンチセンス鎖）とで構成される２本鎖ＲＮＡであって、センス鎖の長さが１００塩基以下である２本鎖ＲＮＡ、またはそれを発現するベクターを含有する、ヒトＲａｄ５１遺伝子の発現抑制剤を提供する。あるいは本発明は、配列番号：１を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される２本鎖ＲＮＡであって、センス鎖の長さが１００塩基以下である２本鎖ＲＮＡ、またはそれを発現するベクターを投与する工程を含む、Ｒａｄ５１の発現抑制方法に関する。【００２５】  がん細胞におけるＲａｄ５１の発現抑制が、がん細胞の放射線感受性を増強することがアンチセンスヌクレオチドを用いた実験で明らかにされている。本発明の２本鎖ＲＮＡは、アンチセンスヌクレオチドよりも強力にＲａｄ５１の発現を抑制する。したがって本発明の２本鎖ＲＮＡは、Ｒａｄ５１の発現抑制を通じて、細胞増殖性疾患の治療に利用することができる。すなわち本発明は、配列番号：１を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される２本鎖ＲＮＡ、またはそれを発現することができるベクターを有効成分として含有する医薬組成物に関する。【００２６】  更に本発明者は、本発明の２本鎖ＲＮＡが、化学療法剤の治療効果を増強することを確認した。すなわち本発明は、配列番号：１を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される２本鎖ＲＮＡ、またはそれを発現することができるベクター、および化学療法剤の両方を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。【００２７】  さらに本発明の医薬組成物は、配列番号：１を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される２本鎖ＲＮＡまたはそれを発現することができるベクター、および化学療法剤のそれぞれを有効成分として含有する別々の医薬組成物の組み合わせ物としても提供される。本発明の医薬組成物は、特に細胞増殖性疾患の治療に有用である。本発明における細胞増殖性疾患には、たとえばがんが含まれる。【００２８】  一方、本発明において、化学療法剤は、制がん剤（ｃａｒｃｉｎｏｓｔａｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、抗がん剤（ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔ）、および抗腫瘍剤（ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｇｅｎｔ，ｏｒ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）を含む。本発明における望ましい化学療法剤は、核酸合成阻害作用、および核酸障害作用のいずれか、または両方を有する化学療法剤である。本発明において、核酸合成阻害作用とは、ＤＮＡあるいはＲＮＡの合成を阻害することを言う。核酸障害作用には、核酸の修飾、あるいは切断などの作用が含まれる。具体的には、たとえば以下の化学療法剤を好ましい化学療法剤として示すことができる。以下に示す化学療法剤の中で、ブレオマイシンとシスプラチンは、２本鎖ＲＮＡとの組み合わせによって、特にがん細胞に対する障害作用に優れる組成物とすることができる。すなわち、ブレオマイシンまたはシスプラチ���は、本発明における化学療法剤として好ましい。【００２９】ブレオマイシン類（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｓ）：
ブレオマイシン類は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｓから得られた抗生物質群である。構造的には、水溶性塩基性の糖ペプチド化合物である。ブレオマイシンＡ２、ブレオマイシンＢ２、並びにペプロマイシンなどが制がん剤として実用化されている。ＤＮＡ分子の切断作用、並びにＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼの阻害作用を有する。扁平上皮がんの治療などに用いられている。ブレオマイシン類の薬学的に許容される塩としては、塩酸ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、および硫酸ペプロマイシンなどを示すことができる。【００３０】アントラキノン系制がん剤：
Ｓｔｒｅｐｏｔｏｍｙｃｅｓ属の産物で、特に急性白血病に対して治療効果を持つものが多い。更にダウノシルビシンの構造を化学的に修飾して得られたドキソルビシンが合成され、固形腫瘍にも強い薬理活性を持つことがわかった。アントラキノン系制がん剤の薬理作用には、多くのメカニズムが関与することが明らかにされている。具体的には、ＤＮＡ内への挿入、トポイソメラーゼＩＩとの相互作用、フリーラジカルの産生、あるいは細胞膜への作用などが報告されている。ミトキサントロンは、骨髄性白血病や乳がんの治療に用いられる。イダルビシンは経口投与が可能である。
塩酸ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）
塩酸アクラルビシン（ａｃｉａｒｕｂｉｃｉｎ）
塩酸イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）【００３１】マイトマイシン類（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎｓ）：
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｓから単離された抗生物質、およびその誘導体である。分子構造中に、キノン、ウレタン、アジリジンという３つの制がん作用を有する構造を持つ。ＤＮＡのアルキル化によってＤＮＡの側鎖に結合し合成を阻害する。作用スペクトルが広く、多様ながんに対する有効性が知られている。【００３２】アクチノマイシン類（ａｃｔｉｎｏｍｙｓｉｎｓ）：
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属の放線菌から単離された複数の化合物、並びにその誘導体が知られている。たとえば、Ｓｔｒｅｏｍｙｃｅｓ  ｐａｒａｕｌｌｕｓから単離されたアクチノマイシンＤは、橙黄色発色団とペプチドが結合した構造を有する巨大分子である。ＤＮＡの二重らせん構造のグアニンとアクチノマイシンＤが結合し、転写を阻害する。ウイルスムス腫瘍やホジキン病等の治療に用いられる。【００３３】カンプトテシン類：
クロタキカズラ科クサミズキ（Ｎｏｔｈａｐｏｄｙｔｅｓ  ｆｏｅｔｉｄａ）、ヌマミズキ科カンレンボク（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ  ａｃｕｍｉｎａｔａ）などから抽出された植物アルカロイド、並びにその類縁化合物である。分子構造に、キノリン骨格を有する。イリノテカン（トポテシン）、ノギテカン、エキサテカンは、植物カンプトテシンの誘導体である。【００３４】シスプラチン類（ｃｉｓｐｌａｔｉｎｓ）：
シスプラチンは、構造中に白金を含む錯体化合物で、がんの成長を抑制する働きがある。シスプラチン類に含まれる制がん剤として、カルボプラチン、およびネダプラチンなどが知られている。いずれの化合物も、ＤＮＡのグアニンと結合することによって制がん作用をもたらすと考えられている。シスプラチン、パラプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ）、およびブリプラチン（Ｂｒｉｐｌａｔｉｎ）などが知られている。【００３５】ストレプトゾトシン：
メチルニトロソウレアとして膵島細胞に直接の毒性はあるものの、臨床的に抗がん剤として有用であることが確認された。ストレプトゾトシンは、膵のインスリノーマや消化管内分泌腫瘍の治療手段の一つとなりうる。【００３６】５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）およびその誘導体：
ピリミジン代謝拮抗物質（ａｎｔｉｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ）に分類される制がん剤には、以下のような化合物が知られている。これらの化合物はＤＮＡ合成においてピリミジンと拮抗し、ＤＮＡポリメラーゼを阻害する。各種の固形がんや白血病に対する有効性が確認されている。
５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）
５−フルオロデオキシウリジン（ＦＵＤＲ）
テガフール
シタラビン
アンシタビン
アザウリジン【００３７】ピラルビシン：
心毒性の少ない新しいアンスラサイクリン抗生物質を微生物（放線菌）の培養液中から探索し、１９７５年にアクラルビシン（ａｃｌａｒｕｂｉｃｉｎ）（アクラシノマイシンＡ）が発見された。さらにアドリアマイシン誘導体の合成研究から得られた心毒性の弱いピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）は、現在有用ながん化学療法剤として使用されている。【００３８】  本発明者らの知見によれば、化学療法剤であるブレオマイシンあるいはシスプラチンの抗がん作用が、Ｒａｄ５１の発現を抑制することによって増強された。言い換えれば、Ｒａｄ５１インヒビターは、ブレオマイシンあるいはシスプラチンの抗がん作用を増強する。すなわち本発明は、ブレオマイシンまたはその薬学的に許容される塩、若しくはシスプラチンまたはその薬学的に許容される塩と、Ｒａｄ５１インヒビターを含む、医薬組成物を提供する。あるいは本発明は、ブレオマイシンまたはその薬学的に許容される塩、若しくはシスプラチンまたはその薬学的に許容される塩と、Ｒａｄ５１インヒビターの、細胞増殖性疾患の治療のための医薬組成物の製造における使用に関する。また本発明は、ブレオマイシンまたはその薬学的に許容される塩、若しくはシスプラチンまたはその薬学的に許容される塩と、Ｒａｄ５１インヒビターとを投与する工程を含む、細胞増殖性疾患の治療方法を提供する。本発明における好ましい細胞増殖性疾患は、がんである。【００３９】  本発明において、Ｒａｄ５１インヒビターとは、Ｒａｄ５１の発現、および活性のいずれか、または両方を抑制することができる任意の化合物を含む。好ましいＲａｄ５１インヒビターは、ｓｉＲＮＡである。たとえば配列番号：１に示す塩基配列をセンス鎖に含む２本鎖ＲＮＡは、Ｒａｄ５１の発現を強力に抑制する。また、Ｒａｄ５１の発現を抑制するアンチセンス核酸が公知である（ＵＳ  ２００３／０２２９００４）。【００４０】  本発明の２本鎖ＲＮＡ、あるいは２本鎖ＲＮＡを発現することができるＤＮＡは、がん細胞に導入することにより、がんの治療に利用することができる。がん細胞への導入には、任意の方法を利用することができる。たとえば、各種のトランスフェクション用の試薬が公知である。あるいはリポソームやウイルスエンベロープベクターに封入し、がん細胞に導入することもできる。
また２本鎖ＲＮＡと化学療法剤とを含む本発明の医薬組成物も同様に、任意の方法によってがん細胞に導入し、その治療に利用することができる。たとえば、リポソームやウイルスエンベロープベクターは、２本鎖ＲＮＡと化学療法剤とを含む本発明の医薬組成物をがん細胞に導入するためのキャリアとして好ましい。【００４１】  たとえば、リポソームをウイルス外膜と共に利用するｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子導入方法、あるいはＨＶＪ−リポソーム媒介遺伝子導入法が開発されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：３７５−３７８（１９８９）；Ａｎａｌ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：１２６−１３９（１９９５））。既に、該方法を用いて肝臓、腎臓、血管壁、心臓及び脳を含む種々の組織へのｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子導入が成功している（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：４１７−４２７（２０００）；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：３７５−３７８（１９８９）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８６：１２９−１３４（１９９２）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：８４７４−８４７８（１９９３）；Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７１（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．４０）：Ｒ１２１２−Ｒ１２２０（１９９６））。【００４２】  ところが、ＨＶＪ−リポソーム法においては、ウイルス及びリポソームという異なるビヒクルが必須であり、準備が複雑である。また、ＨＶＪをリポソームと融合することによってウイルス粒子よりも平均直径が１．３倍大きくなる。その結果、細胞との融合活性が野生型ウイルスの１０％以下に減少すること、及び遺伝子導入が不可能な組織、または導入効率の悪い組織が存在することが知られている。そこで、より安全で高効率な遺伝子治療を可能にする方法として、ウイルスエンベロープベクターを用いた遺伝子導入法が開発されている（特開２００１−２８６２８２）。この方法では、ウイルス蛋白質を複製しない不活性化ウイルスをウイルスエンベロープとし、その中へ遺伝子などを封入することにより、培養細胞、生体組織等への遺伝子導入ベクターとして用いることができる。このようなウイルスエンベロープベクターを使用することにより、肝臓、骨格筋、子宮、脳、眼部、頚動脈、皮膚、血管、肺、心臓、腎臓、脾臓、がん組織、神経、Ｂリンパ球、呼吸器官の組織、浮遊細胞等に安全、且つ高効率に遺伝子を導入できることが知られている。【００４３】  ウイルスエンベロープは、精製されたウイルスに目的とする医薬組成物を界面活性剤存在下で混和するか、または、ウイルスと医薬組成物との混合液を凍結融解することにより調製することができる（特開２００１−２８６２８２）。ここで医薬組成物とは、２本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡを発現するＤＮＡ、あるいは２本鎖ＲＮＡと化学療法剤を含む医薬組成物を用いることができる。【００４４】  ウイルス−エンベロープ法において用いることができるウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、トガウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルス、ブニヤウイルス、ラブドウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、ヘパドナウイルス���の科に属するウイルスを挙げることができる。より具体的には、センダイウイルス（ＨＶＪ）、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスまたはインフルエンザウイルスを用いることができる。ウイルスとしては、野生型及び組換え型のいずれのウイルスを用いることができる。特にＨＶＪとしては、Ｈａｓａｎ  Ｍ．Ｋ．ら（Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０（１９９７））、または、Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ  Ｙ．ら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：９７０−９７３（２０００））等により報告されている組換え型のＨＶＪを用いることもできる。【００４５】  一般に、ＨＶＪ−リポソーム法及びＨＶＪ−エンベロープ法において用いるＨＶＪとしてはＺ株（ＡＴＣＣより入手可能）が好ましいが、基本的には他のＨＶＪ株（例えばＡＴＣＣ  ＶＲ−９０７やＡＴＣＣ  ＶＲ−１０５等）も用いることができる。また、ウイルスエンベロープの調製する際に、精製されたウイルスをＵＶ照射等により不活性化した後に、所望の発現ベクターを混和しても良い。ウイルスと医薬組成物を混和する際に用いることができる界面活性剤としては、例えば、オクチグルコシド、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＣＨＡＰＳ、ＮＰ−４０等が挙げられる。このようにして調製されたウイルスエンベロープベクターは、注射等により治療または予防の標的となる組織に導入することができる。また、−２０℃で凍結することにより、少なくとも２〜３ヶ月保存することも可能である。【００４６】  本発明の医薬組成物を含むウイルスエンベロープベクターの患者への導入法としては、遺伝子治療剤を直接体内に導入するｉｎ  ｖｉｖｏ法及びヒトからある種の細胞を取り出して体外で遺伝子治療剤を該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すｅｘ  ｖｉｖｏ法が挙げられる（日経サイエンス、１９９４年４月号：２０−４５頁；月刊薬事３６（１）：２３−４８（１９９４）；実験医学増刊１２（１５）：（１９９４）；日本遺伝学治療学会編  遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス（１９９９））。本発明では、ｉｎ  ｖｉｖｏ法が特に好ましい。【００４７】  製剤形態としては、上記の各投与形態に合った種々の公知の製剤形態（例えば液剤等）をとり得る。例えば有効成分である２本鎖ＲＮＡ、あるいは２本鎖ＲＮＡと化学療法剤を含有する注射剤として製剤する場合、このような注射剤は定法により調製することができ、例えば適切な溶剤（ＰＢＳ等の緩衝液、生理食塩水、滅菌水等）に溶解した後、必要に応じてフィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。必要に応じて、注射剤には慣用の担体等を加えても良い。また、ＨＶＪ−リポソーム等のリポソーム製剤としては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等の形態が挙げられる。【００４８】  本発明の医薬組成物は治療目的のがんの、症状等に応じた適当な投与方法及び投与部位が選択される。特に、非経口的な投与が好ましい。本発明における２本鎖ＲＮＡの投与量の範囲は、通常、０．５〜１００ｍｍｏｌ／腫瘍、たとえば１〜５０ｍｍｏｌ／腫瘍を例示することができる。また２本鎖ＲＮＡを発現す���ＤＮＡとして投与される場合には、通常、１〜１０００μｇ／腫瘍、たとえば１０〜５００μｇ／腫瘍を例示することができる。更に、化学療法剤を組み合わせる場合には、各化学療法剤において設定されている標準的な投与スケジュールを適用することができる。たとえば化学療法剤としてブレオマイシンを組み合わせる場合、成人１人（体重６０ｋｇ）あたり、通常、０．１〜１００ｍｇ（力価）／ｄａｙ、たとえば１〜５０ｍｇ（力価）／ｄａｙ、好ましくは５〜３０ｍｇ（力価）／ｄａｙを例示することができる。あるいはシスプラチンを組み合わせる場合、成人１人（体重６０ｋｇ）あたり、通常１〜１０００ｍｇ／ｍ２（体表面積）、たとえば５〜５００ｍｇ／ｍ２（体表面積）、好ましくは１０〜１００ｍｇ／ｍ２（体表面積）を例示することができる。【００４９】  更に本発明における投与スケジュールとしては、たとえば以下のようなスケジュールを示すことができる。すなわち、化学療法剤としてブレオマイシンを用いる場合には、１５〜３０ｍｇ（静脈注射、筋肉内注射、あるいは皮下注射の場合）、あるいは５〜１５ｍｇ（動脈注射）を、１週間２回を原則として、１日１回投与することができる。投与回数は、経過を観察しながら、１週間１回に調節することもできる。【００５０】  またシスプラチンを化学療法剤として用いる場合には、１５〜２０ｍｇ／ｍ２（体表面積）を５日投与（１日１回））し、２週間の休養の後、同じスケジュールの投与を繰り返す（反復投与）ことができる。反復投与のスケジュールは、適宜調節することができる。たとえば、７０−９０ｍｇ／ｍ２（体表面積）を５日投与（１日１回））し、３週間の休養の後、同じスケジュールの投与を繰り返す（反復投与）こともできる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００５１】  以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。
［実施例１］Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡの作成と細胞への導入
ヒトのＲａｄ５１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿００２８７５）のｓｉＲＮＡとして、米国Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社に製造を依頼し、以下に示した５種類の塩基配列からなるセンス鎖と、その相補配列からなるアンチセンス鎖で構成されたｓｉＲＮＡを合成した（図１）。
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これら５種類のｓｉＲＮＡを、ＨＶＪエンベロープベクターを用いてＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ．ＣＣＬ−２；Ｇｅｙ，Ｇ．Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１２：２６４−２６５，１９５２）に導入した。【００５２】  Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡは以下の条件で導入した。ｓｉＲＭＡのトランスフェクションの前日に、１ｘ１０５のＨｅＬａ細胞を６ウェルプレートに撒いた。
公知の方法（Ｋａｎｅｄａ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００２  Ａｕｇ；６（２）：２１９−２６．）にしたがって、不活化ＨＶＪを調製した。６０００  ＨＡＵ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ）の不活化ＨＶＪを含むサンプルチューブに、６０μｌの４０μＭ  Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（配列番号：１〜５のいずれかを含む）または対照のスクランブル配列（５’−ｇｃｇｃｇｃｕｕｕｇｕａｇｇａｕｕｃｇ−３’）からなるｓｉＲＮＡ（配列番号：６）を加え、さらに６μｌの２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加えた。１００００  ｘｇで１０分間遠心した後、上清を除き、沈殿を１８０μｌのＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）に懸濁した。１５μｌの１０ｍｇ／ｍｌ硫酸プロタミンを加え（終濃度５０μｇ／ｍｌ）、３ｍｌのＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）を加えた。このＨＶＪエンベロープベクターおよび各ｓｉＲＮＡを含む溶液５００μｌ（１０００ＨＡＵ）を、各ウェル中のＨｅＬａ細胞に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、ＨＶＪエンベロープベクター溶液を除去し、３７℃、５％  ＣＯ２で細胞を培養した。【００５３】  各ｓｉＲＮＡ導入１日後のＲａｄ５１  ｍＲＮＡをノーザンブロットで調べた結果、Ｒａｄ５１発現に対して抑制効果のあったｓｉＲＮＡは１種類で、その配列はコドン３２１からの１９塩基（＋２塩基のオーバーハング）を持つＧＡＧＣＵＵＧＡＣＡＡＡＣＵＡＣＵＵＣ（配列番号：１）であった（図１；以後「３２１」とも称す）。その他の４候補（配列番号：２〜５）は全く抑制効果がなかった。そこで、抑制効果のあったＲａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（３２１、配列番号：１）を用いて以降の実験を行った。【００５４】［実施例２］ｓｉＲＮＡによるＲａｄ５１蛋白の発現抑制
効果のあった１種類（３２１、配列番号：１）のＲａｄ５１  ｓｉＲＮＡを、実施例１のようにしてＨｅＬａ細胞に導入し、Ｒａｄ５１蛋白の発現抑制効果を経日的に調べた。対照として、スクランブル配列からなるｓｉＲＮＡ（配列番号：６）を同様にＨｅＬａ細胞に導入し、Ｒａｄ５１蛋白の発現を経日的に調べた。Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（３２１）は、４日間は完全にＲａｄ５１蛋白の発現を検出感度以下に抑制した。５日目においてもその発現量は導入前の１０％以下であった（図２）。【００５５】［実施例３］ｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸によるＲａｄ５１蛋白の発現抑制の比較
Ｒａｄ５１のアンチセンスオリゴ核酸として、文献（Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｔ．，Ｔａｋｉ，Ｔ．，Ｈｉｒａｇａ，Ｓ．，Ａｒｉｔａ，Ｎ．，Ｍｏｒｉｔａ，Ｔ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｄｉｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａｓ  ｂｙ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒａｄ５１  ｇｅｎｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９９８；２４５：３１９−３２４．）に基づき、１５ｂｐからなるＲａｄ５１  ＡＳ＃１（５’ｇｇｃｔｔｃａｃｔａａｔｔｃｃ  ３’）及びＲａｄ５１  ＡＳ＃２（５’  ｃｇｔａｔｇａｃａｇａｔｃｔｇ  ３’）を作成した。Ｒａｄ５１  ＡＳ＃１は、Ｒａｄ５１遺伝子の３６８〜３８２番目の塩基に相当し、Ｒａｄ５１  ＡＳ＃２は、Ｒａｄ５１遺伝子の５７８〜５９２番目の塩基に相当する。【００５６】  Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（３２１）、Ｒａｄ５１  ＡＳ＃１、またはＲａｄ５１  ＡＳ＃２のそれぞれ約８０ｐｍｏｌｅを、実施例１のようにして１０万個のＨｅＬａ細胞に導入した。対照として、スクランブル配列（配列番号：６）からなるｓｉＲＮＡ（ＳＣ  ｓｉＲＮＡ）、ウイルスベクターのみ（Ｅｍｐｔｙ  ＨＶＪ−Ｅ）、またはＲａｄ５１のアンチセンスオリゴ核酸のスクランブル配列（ＳＣ  ＡＳ、５’ｔｃｇｃｇａｔｃａｃｃｔｔａｔ  ３’）を同様にＨｅＬａ細胞に導入した。内部標準として、Ｇ３ＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を用いた。【００５７】  Ｒａｄ５１蛋白の発現抑制効果をノーザンブロットで調べたところ、Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（３２１）を導入したＨｅＬａ細胞においては、１日後にＲａｄ５１のｍＲＮＡはノーザンブロットで完全に同定できない程度まで抑制された（図３Ａ）。これに対し、Ｒａｄ５１のアンチセンスオリゴ核酸（Ｒａｄ５１  ＡＳ＃１またはＲａｄ５１  ＡＳ＃２）は効果が低く（図３Ｂ）、アンチセンスオリゴ核酸に対するｓｉＲＮＡの優位性が示された。【００５８】［実施例４］ブレオマイシンとの併用によるＲａｄ５１  ｓｉＲＮＡの抗がん作用の増強
Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（３２１）または対照のスクランブルｓｉＲＮＡ（配列番号：６）を、ＨＶＪエンベロープベクターによりそれぞれ実施例１のようにしてＨｅＬａ細胞に導入し、２日後に抗がん剤のブレオマイシン（ＢＬＭ、１μｇ／ｍｌ）で１８時間処理した（図４Ａ）。ブレオマイシン（ＢＬＭ）で処理した場合、ブレオマイシン処理しなかったものと比較して、その抗がん剤効果は約２倍増強された（図４Ｂ）。【００５９】［実施例５］シスプラチンとの併用によるＲａｄ５１  ｓｉＲＮＡの抗がん作用の増強
また、本発明者らは、Ｒａｄ５１はシスプラチン（ｃｉｓ−ｄｉａｍｍｉｎｅｄｉｃｈｌｏｒｏｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＩ）；ＣＤＤＰ）による二重鎖切断の修復にも関与していることを見出した。本発明者らは、ＣＤＤＰをがん細胞に添加するとＲａｄ５１が約２倍増強されること、およびＲａｄ５１遺伝子を強発現させるとＣＤＤＰに耐性になることを突き止めた。したがって、Ｒａｄ５１の発現を阻害することは、細胞のＣＤＤＰへの耐性を減少させると考えられる。そこで、Ｒａｄ５１が強く発現しているがん細胞であるＨｅＬａにＲａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（３２１）または対照のスクランブル配列（配列番号：６）を導入し、経日的に細胞相対数の変化を調べた。導入２日後にシスプラチン（ＣＤＤＰ）で３時間処理し、９日後にコロニー数を計測した（図５Ａ）。Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（３２１）を導入した細胞は、対照と比較して、細胞増殖能がやや低下した（図５Ｂ）。しかし図５Ｃに示すように、Ｒａｄ５１のｓｉＲＮＡ（３２１）を導入し、２日後に図示した濃度のシスプラチン（ＣＤＤＰ）で３時間処理すると、対照のスクランブル配列と比較して、Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（３２１）導入群ではコロニー形成能が著明に低下し、がん細胞のコロニー形成能が有意に抑制されることが示された。【００６０】［実施例６］各種ヒトがん細胞におけるＲａｄ５１  ｓｉＲＮＡとシスプラチンとの併用による抗がん作用の増強
Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（３２１）或いはスクランブルｓｉＲＮＡ（配列番号：６）をＨＶＪエンベロープベクターを用いて各種ヒトがん細胞、ＰＡＮＣ−１（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ），ＡｓＰＣ−１（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ），Ａ５４９（ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ），ＤＵ１４５（ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ），ＭＣＦ７（ｍａｍｍａｒｙ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ），ＨｅＬａ  Ｓ−３（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）に導入しシスプラチン（ＣＤＤＰ）を同時投与して、２日後に細胞増殖アッセイを行った。内部標準として、Ｋｕ７０及びβアクチンを用いた。各細胞の蛋白レベルを調べた結果、各種ヒトがん細胞のＫｕ７０、βアクチンはほぼ同レベルであったが、Ｒａｄ５１蛋白レベルは様々であった（図６Ａ）。シスプラチン（ＣＤＤＰ、０．１μｇ／ｍｌ）を同時投与すると、スクランブルｓｉＲＮＡを導入した場合には８０％以上の細胞が生存したのに対し、Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（３２１）を導入した場合はどのがん細胞においても細胞の生存率が減少し、ＣＤＤＰ感受性が３０％以上増加したことが示された（図６Ｂ）。したがって、Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（３２１）は多くのヒトがん細胞においても同様のシスプラチン感受性増強効果を発揮することが示された。【００６１】［実施例７］正常ヒト細胞とがん細胞とのシスプラチン感受性の比較
Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（３２１）をＨＶＪエンベロープベクターを用いて正常ヒト細胞またはがん細胞に導入し、ＣＤＤＰ感受性の相違を調べた。正常ヒト細胞として用いたヒト正常２倍体繊維芽細胞（ＮＨＤＦ、Ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｐｌｏｉｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）にＲａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（３２１）を導入した場合、シスプラチンの濃度の上昇に伴う感受性の変化は観察されず、約９０％の細胞が生存していた。一方、がん細胞として用いたＨｅＬａ細胞では、Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（３２１）の導入後、シスプラチン濃度の上昇に伴って生存細胞が減少し、ＣＤＤＰの濃度に依存して感受性が増強されることが示された（図７Ａ）。そこで、Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（３２１）導入後、ＮＨＤＦとＨｅＬａ細胞において０．１μｇ／ｍｌ  ＣＤＤＰの有無によるアポトーシスの率を、アネキシンＶ（ＡｎｎｅｘｉｎＶ）陽性細胞の割合で測定した（図７Ｂ）。ＣＤＤＰ非存在下では、アポトーシス細胞の率はＨｅＬａ細胞（４．０±１．１％）とＮＨＤＦ（３．２±０．５％）とで変化がなかった。これに対しＣＤＤＰ存在下では、アポトーシス率はＨｅＬａ細胞で１５．０％に増加したのに対し、ＮＨＤＦではほとんど増加しなかった（４．９％）。以上のデータより、Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（３２１）によるＣＤＤＰの感受性増強はがん細胞に選択的に見られる現象であり、治療法としての安全性は高いことが示された。【００６２】［実施例８］Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡによるがん治療効果の増強
ヌードマウスにＨｅＬａ細胞を移植して腫瘍塊をつくらせた。まずＲａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（３２１）を腫瘍塊に導入後、２日後に腹腔内にＣＤＤＰ  ２００μｇを投与し、同時にｓｉＲＮＡ（３２１）を腫瘍塊内に再注入した。さらにその２日後にもＲａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（３２１）を腫瘍塊に注入した。Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（３２１）注入のみでは腫瘍増殖抑制作用はかなり弱く、さらにスクランブルｓｉＲＮＡおよびＣＤＤＰの併用ではその腫瘍の増殖は一部抑制されたのみであったが、Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡ（３２１）とＣＤＤＰとの併用では腫瘍の増殖がほぼ完全に抑制され、顕著な制がん作用が示された（図８）。なおＲａｄ５１  ｓｉＲＮＡをＨＶＪエンベロープベクターで投与したとき、その腫瘍塊に対する導入効率は４０−５０％であった。
【産業上の利用可能性】
【００６３】  本発明の２本鎖ＲＮＡ、あるいはそれを含む組成物は、Ｒａｄ５１の発現制御に有用である。Ｒａｄ５１の発現制御により、がん細胞の増殖抑制、あるいはがん細胞そのものの障害が可能である。またＲａｄ５１の発現抑制は、がん細胞の放射線に対する感受性の増強に有用である。更に、本発明の２本鎖ＲＮＡは化学療法剤との併用によって、強力な制がん作用を発揮することが明らかにされた。以上のように、本発明は、がんの治療に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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