(57)【要約】  本発明の課題は、正常細胞におよぼすアポトーシス作用が低く抑えられ、抗腫瘍効果の増強された抗腫瘍治療薬を提供することである。  特定の抗腫瘍薬、特にアポトーシス作用を有する抗腫瘍薬および黄ごん由来成分を併用することによる。アポトーシス作用を有する抗腫瘍薬単独では正常細胞に対するアポトーシスによる副作用が生じるのに対し、黄ごん由来成分を併用することで、正常細胞に対するアポトーシス作用が軽減し、腫瘍細胞に対する抗腫瘍薬によるアポトーシス作用を維持し、または増強させることができ、優れた抗腫瘍効果を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
黄ごん由来成分とアポトーシス作用を有する抗腫瘍薬とを併用することを特徴とする抗腫瘍治療薬。
【請求項２】
前記アポトーシス作用を有する抗腫瘍薬が、トポイソメラーゼ阻害剤、アルカロイド系抗腫瘍薬、白金複合体、抗生物質、またはアルキル化剤である請求の範囲第１項に記載の抗腫瘍治療薬。
【請求項３】
前記トポイソメラーゼ阻害剤が、エトポシドまたはカンプトテシンまたはそれらの誘導体である請求の範囲第２項に記載の抗腫瘍治療薬。
【請求項４】
前記アルカロイド系抗腫瘍薬が、ビンブラスチンまたはその誘導体である請求の範囲第２項に記載の抗腫瘍治療薬。
【請求項５】
前記白金複合体が、シスプラチンまたはその誘導体である請求の範囲第２項に記載の抗腫瘍治療薬。
【請求項６】
前記抗生物質が、ドキソルビシンまたはその誘導体である請求の範囲第２項に記載の抗腫瘍治療薬。
【請求項７】
前記アルキル化剤が、カルボコンまたはその誘導体である請求の範囲第２項に記載の抗腫瘍治療薬。
【請求項８】
黄ごん由来成分が、フラボノイドを含む成分である請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１に記載の抗腫瘍治療薬。
【請求項９】
フラボノイドを含む成分が、オウゴニンである請求の範囲第８項に記載の抗腫瘍治療薬。
【請求項１０】
アポトーシス作用を有する抗腫瘍薬が引き起こす、正常細胞に対するアポトーシスによる副作用を防御しうる量の黄ごん由来成分を併用することを特徴とする請求の範囲第１項〜第９項のいずれか１に記載の抗腫瘍治療薬。
【請求項１１】
黄ごん由来成分とアポトーシス作用を有する抗腫瘍薬の使用する割合が、モル比に換算して10 : 1 〜 1 : 10である請求の範囲第１０項に記載の抗腫瘍治療薬。
【請求項１２】
請求の範囲第１項〜第１１項のいずれか１に記載の抗腫瘍治療薬を含む医薬組成物。
【請求項１３】
血液癌または固形癌に対して使用する請求の範囲第１２項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
白血病または肺癌に対して使用する請求の範囲第１２項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、併用効果の優れた抗腫瘍治療薬に関し、より詳細には併用することにより副作用の少ない抗腫瘍治療薬に関し、さらには併用することにより、より効果的に抗腫瘍効果を発揮しうる抗腫瘍治療薬に関する。【０００２】
本出願は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願特願２００４−１１４１７３号からの優先権を請求する。
【背景技術】
【０００３】
抗腫瘍薬は、アルキル化剤（シクロホスファミド、イホスファミド、カルボコン等）、核酸に影響する抗生物質（ドキソルビシン、ブレオマイシン等）、白金複合体（シスプラチン等）、アルカロイド系抗腫瘍薬（ビンクリスチン、ビンブラスチン等）、代謝拮抗剤（5-フルオロウラシル等）、トポイソメラーゼ阻害剤（エトポシド、カンプトテシン等）、生体反応調整剤（インターフェロン等）、ホルモン療法剤（タモキシフェン等）のような幾つかのカテゴリーに分類される。【０００４】
抗腫瘍薬には、DNAを障害して癌・腫瘍細胞に壊死を引き起こすという作用機序の他に、アポトーシスを引き起こす機序もある。癌細胞・腫瘍細胞にアポトーシスを引き起し、癌・腫瘍細胞を選択的に死滅させることで抗腫瘍効果をもたらす。しかしながら、癌・腫瘍細胞を死滅させるのに十分な量の抗腫瘍薬を使用すると、正常細胞にもアポトーシスを引き起こし、細胞が傷害されることによる副作用の問題がある。【０００５】
抗腫瘍薬による化学療法が導入された初期の治療薬は、単一の薬剤による療法が主流であり、血中濃度を一定に維持するように投与することが目標であった。しかし、抗腫瘍薬の単剤投与では、投与量の増加に伴って正常細胞への毒性が増し、投与量に限界が生ずることから、２種以上の抗腫瘍薬による併用療法が試みられてきた。【０００６】
例えば白血病に対する抗腫瘍薬による化学療法の併用療法は1950年代後半に試みられ、後に固形癌にも応用されるようになった。以後、抗腫瘍薬による化学療法は、相加若しくは相乗効果を期待した多剤併用が中心となり、現在に至っている。こうした背景から、白血病治療において作用機序の異なる薬剤、ara-Cおよびエトポシドの併用について試みられてきた（非特許文献１）。【０００７】
上記の各種の抗腫瘍薬は癌化した細胞を殺傷することを目的としているため、癌化細胞の殺傷に十分な抗癌剤を投与すると生体の正常細胞にも無視できない悪影響を及ぼし、副作用が強く生じるという問題が生じていた。【０００８】
近年、野菜等に含まれるビタミン、例えば、ビタミンCやEあるいはβ−カロチン等が発癌抑制作用を有することが報告されており、安全性の高いものとして注目されている。
また、N-アセチルシステイン、レチノイド、ピロキシカム、アスピリン等の医薬も抗発癌活性を有することが報告されている。薬理作用を有する種々の化合物の複合物である生薬や、この生薬の混合物である漢方方剤に着目し、特定の生薬、具体的には大黄、山梔子、黄連または黄ごんの一種若しくはこれらを組合せたものが発癌抑制剤として使用しうることが報告されている（特許文献１）。また、生薬として知られている黄ごん中に含まれるフラボノイドから、特に抗発癌プロモーター作用が顕著な抗発癌プロモーター剤についての報告がある（特許文献２）。【０００９】
また、生体が癌や抗体産生細胞などの非自己を識別して自己を守るための生体反応として免疫がある。例えば細胞の生存にとって有害な侵襲が加わった場合、細胞が自らを守るために、免疫を活性化するような一群の蛋白質である熱ショックタンパク質を生産することは知られている。この熱ショックタンパク質は正常細胞においても細胞周期や細胞分化に関与し、細胞と組織の生理機能維持のために重要な役割をはたしている。
生薬としての黄ごんおよび印度蛇木の抽出エキスが、細胞のストレス蛋白産生を大幅に増加させることのできることが報告されている（特許文献３）。【００１０】
しかしながら、生薬由来成分と抗腫瘍薬を併用する抗腫瘍治療薬についての報告はない。
【非特許文献１】YAKUKAGAKU ZASSHI,122(7),471-480(2002)
【特許文献１】特開平８−３３７５３５号公開公報
【特許文献２】特開平５−２５０４１号公開公報
【特許文献３】特開２００１−３９８７５号公開公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、正常細胞に及ぼすアポトーシス作用が低く抑えられ、腫瘍細胞に対するアポトーシス作用が維持または増強された抗腫瘍治療薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、アポトーシス作用を有する抗腫瘍薬の単剤投与では、腫瘍に対する有効量を投与すると正常細胞にもアポトーシスによる副作用を与えてしまうのに対し、生薬成分、特に黄ごん由来成分を併用することで、正常細胞に対するアポトーシス作用が軽減され、かつ腫瘍細胞に対するアポトーシス作用が維持若しくは増強された優れた抗腫瘍治療薬となりうることを見出し、本発明を完成した。【００１３】
すなわち本発明は以下よりなる。
１．黄ごん由来成分とアポトーシス作用を有する抗腫瘍薬とを併用することを特徴とする抗腫瘍治療薬。
２．前記アポトーシス作用を有する抗腫瘍薬が、トポイソメラーゼ阻害剤、アルカロイド系抗腫瘍薬、白金複合体、抗生物質、またはアルキル化剤である前項１に記載の抗腫瘍治療薬。
３．前記トポイソメラーゼ阻害剤が、エトポシドまたはカンプトテシンまたはそれらの誘導体である前項２に記載の抗腫瘍治療薬。
４．前記アルカロイド系抗腫瘍薬が、ビンブラスチンまたはその誘導体である前項２に記載の抗腫瘍治療薬。
５．前記白金複合体が、シスプラチンまたはその誘導体である前項２に記載の抗腫瘍治療薬。
６．前記抗生物質が、ドキソルビシンまたはその誘導体である前項２に記載の抗腫瘍治療薬。
７．前記アルキル化剤が、カルボコンまたはその誘導体である前項２に記載の抗腫瘍治療薬。
８．黄ごん由来成分が、フラボノイドを含む成分である前項１〜７のいずれか１に記載の抗腫瘍治療薬。
９．フラボノイドを含む成分が、オウゴニンである前項８に記載の抗腫瘍治療薬。
１０．アポトーシス作用を有する抗腫瘍薬が引き起こす、正常細胞に対するアポトーシスによる副作用を防御しうる量の黄ごん由来成分を併用することを特徴とする前項１〜９のいずれか１に記載の抗腫瘍治療薬。
１１．黄ごん由来成分とアポトーシス作用を有する抗腫瘍薬の使用する割合が、モル比に換算して10 : 1 〜 1 : 10である前項１０に記載の抗腫瘍治療薬。
１２．前項１〜１１のいずれか１に記載の抗腫瘍治療薬を含む医薬組成物。
１３．血液癌または固形癌に対して使用する前項１２に記載の医薬組成物。
１４．白血病または肺癌に対して使用する前項１２に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１４】
黄ごん由来成分とアポトーシス作用を有する抗腫瘍薬とを併用することにより、正常細胞に対するアポトーシス作用が軽減され、腫瘍細胞に対するアポトーシス作用が維持若しくは増強することが確認され、正常細胞に対する損傷による副作用が軽減された抗腫瘍治療薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】正常細胞にYO-2またはエトポシドとオウゴニンとを併用したときのDNA断片化率を示す図である。（実施例１）
【図２】正常細胞にエトポシドとオウゴニンとを併用したときのカスパーゼ-3様活性を示す図である。（実施例２）
【図３】Jurkat細胞にエトポシドまたはシスプラチンとオウゴニンとを併用したときのDNA断片化率を示す図である。（実施例３）
【図４】HL-60細胞にエトポシドまたはシスプラチンとオウゴニンとを併用したときのDNA断片化率を示す図である。（実施例４）
【図５】Jurkat細胞にエトポシドとオウゴニンとを併用したときの核の形態を示す写真である。（実施例５）
【図６】A549細胞にドキソルビシンとオウゴニンとを併用したときの細胞生存率に及ぼす効果を示す図である。（実施例６）
【図７】A549細胞にシスプラチンとオウゴニンとを併用したときの細胞生存率に及ぼす効果を示す図である。（実施例７）
【図８】A549細胞にカルボコンとオウゴニンとを併用したときの細胞生存率に及ぼす効果を示す図である。（実施例８）
【図９】A549細胞にビンブラスチンとオウゴニンとを併用したときの細胞生存率に及ぼす効果を示す図である。（実施例９）
【図１０】A549細胞にカンプトテシンとオウゴニンとを併用したときの細胞生存率に及ぼす効果を示す図である。（実施例１０）
【図１１】A549細胞にエトポシドとオウゴニンとを併用したときの細胞生存率に及ぼす効果を示す図である。（実施例１１）
【図１２】NCI-H226細胞にエトポシドとオウゴニンとを併用したときの細胞生存率に及ぼす効果を示す図である。（実施例１２）
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の抗腫瘍治療薬は、黄ごん由来成分とアポトーシス作用を有する抗腫瘍薬とを併用することによる。本明細書において、アポトーシス作用を有する抗腫瘍薬は、単に「抗腫瘍薬」という場合もあり、本発明の併用による「抗腫瘍治療薬」とは区別される。【００１７】
黄ごん由来成分で、従来生薬として使用されてきた成分はフラボノイドを含み、その主成分はオウゴニン、バイカリン、バイカレインなどが挙げられる。本発明の併用による抗炎症治療薬に使用される成分も、黄ごん由来成分であり、フラボノイドを含み、具体的にはオウゴニン、バイカリン、バイカレイン等を使用することができ、好ましくはオウゴニンを用いることができる。また、本発明の黄ごん由来成分として、天然物より抽出された成分に限定されず、フラボノイドを含み、生薬として実質的に黄ごん由来成分と同等の効果を有する成分も含まれる。このような成分であれば、合成によって得られた成分であっても良い。【００１８】
フラボノイドを含む上記成分を示す化合物は、次の（化１）に表される基本骨格を含む構造によって表される。
【化１】
2005099736.tif 000002
【００１９】
フラボノイドを含む化合物として、具体的には次の（化２）〜（化６）で表される化合物が例示される。（化２）〜（化６）の各化合物について、式中、R1 〜 R5は、各々について水素原子、水酸基、メトキシ基、またはメチレンジオキシ基を示す。これらの化合物のうち好ましい化合物は、（化２）で表される化合物であるオウゴニンおよびその誘導体であり、特に好ましいのはオウゴニンである。オウゴニンとは、（化２）においてR1 〜 R5の全てが水素原子の化合物である。
【化２】
2005099736.tif 000003
【化３】
2005099736.tif 000004
【化４】
2005099736.tif 000005
【化５】
2005099736.tif 000006
【化６】
2005099736.tif 000007
【００２０】
本発明のアポトーシス作用を有する抗腫瘍薬は、トポイソメラーゼ阻害剤、アルカロイド系抗腫瘍薬、白金複合体、抗生物質、アルキル化剤等に分類される抗腫瘍薬から選択することができ、好ましくは白金複合体、およびトポイソメラーゼ阻害剤から選択することができる。【００２１】
トポイソメラーゼ阻害薬は、トポイソメラーゼIIの阻害を介した間接的なDNA鎖の切断またはトポイソメラーゼI阻害によるDNA合成阻害を作用機序とする。トポイソメラーゼII阻害薬の例としてエトポシド(etoposide)、トポイソメラーゼI阻害薬の例としてカンプトテシン(camptotecin)が挙げられる。
トポイソメラーゼIIは２量体酵素で、DNAの5'-末端に共有結合を生じ、ATP依存的に核内でDNAと結合し、一過性のDNA鎖切断を起こし、DNA鎖の構造を変えた後、切断されたDNAを再結合させることにより、その３次元構造に変化をもたらす。
エトポシドは、DNAおよびトポイソメラーゼIIの三者からなるコンプレックスをつくり、一過性に切断されたDNA鎖の再結合を阻害することにより抗腫瘍効果を発揮すると考えられている。【００２２】
アルカロイド系抗腫瘍薬は、チュブリンと結合して有糸分裂を阻止し、細胞周期のＭ期特異的に作用し、カポジ肉腫や悪性リンパ腫の治療に用いられる。アルカロイドの例としてビンブラスチン(vinblastine)が挙げられる。【００２３】
白金複合体は、グアニンと結合してDNA構造を歪曲する細胞周期非特異性抗癌剤であり、精巣腫瘍・膀胱癌・卵巣腫瘍をはじめ非小細胞肺癌、食道癌、子宮頚癌、神経芽細胞腫、胃癌等さまざまな固形悪性腫瘍の治療に用いられる。白金複合体として、具体的にはシスプラチン(cisplatin)を挙げることができる。
シスプラチンがCl-の豊富な細胞外環境からCl-の少ない細胞内に入ると、シスプラチンのCl-基は水の水酸基によって置換され、２つある水酸基がそれぞれの細胞内のDNAのグアニンと共有結合を形成するためDNA構造が歪曲される。この結果、DNAの複製と転写が阻害され、抗腫瘍効果を発揮すると考えられている。【００２４】
抗腫瘍効果を有する抗生物質として、具体的にはドキソルビシン(doxorubicin)が例示される。ドキソルビシンはアントラサイクリン系、ストレプトマイセス属の産物から抽出された抗腫瘍抗生物質である。ドキソルビシンは、腫瘍細胞内のDNAと結合し、細胞分裂の際にDNAの開裂を妨げ、DNA複製、RNA合成阻害を引き起こすという作用機序を有する。またDNA依存性RNAポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレアーゼを抑制する作用がある。【００２５】
アルキル化剤は、DNA、RNAをアルキル化することにより、腫瘍細胞のDNA、RNA生合成を阻害する。特にDNA生合成を阻害する。アルキル化剤の例として、具体的にはカルボコン(carboquone)が例示される。【００２６】
本発明の抗腫瘍治療薬において、併用する黄ごん由来成分とアポトーシス作用を有する抗腫瘍薬の量は、腫瘍細胞および正常細胞に対するアポトーシス作用に基づいて決定することができる。【００２７】
例えばアポトーシス作用を有する抗腫瘍薬は、単独使用の場合には腫瘍細胞および正常細胞に対してアポトーシス作用を示す量またはアポトーシス作用を示さない量であっても使用することができる。
抗腫瘍薬単独使用で腫瘍細胞および正常細胞に対してアポトーシス作用を示す量を用いる場合には、併用する黄ごん由来成分は、前記抗腫瘍薬の腫瘍細胞に対するアポトーシス作用を維持するか若しくは増強させることができ、かつ前記抗腫瘍薬の正常細胞に対するアポトーシス作用を軽減させうる量を使用することができる。
また、抗腫瘍薬単独使用で腫瘍細胞および正常細胞に対してアポトーシス作用を示さない量を用いる場合には、併用する黄ごん由来成分は、前記抗腫瘍薬の腫瘍細胞に対するアポトーシス作用を増強させることができ、かつ前記抗腫瘍薬の正常細胞に対するアポトーシス作用を示さない量を使用することができる。【００２８】
このように、腫瘍細胞に対するアポトーシス作用を最大限に発揮させ、正常細胞に対するアポトーシス作用による副作用を可能な限り低減させうる量の黄ごん由来成分と抗腫瘍薬との併用量は、抗腫瘍薬や、治療目的とする腫瘍細胞の種類により適宜選択することができる。例えば、黄ごん由来成分：抗腫瘍薬の割合は、モル比に換算して10 : 1 〜 1 : 10の範囲から選択することができ、好ましくは2 : 1 〜 1 : 2の範囲から選択することができる。【００２９】
具体的には、前記抗腫瘍薬は培養細胞条件下で0.01 〜 100 μM、好ましくは0.1 〜 50 μM、より好ましくは1 〜 30 μMとなるように使用することができる。それに対して、黄ごん由来成分は上記条件を満たす量であり、100 〜 0.1 μM、好ましくは50 〜 0.1 μM、より好ましくは30 〜 1 μMとなる範囲から選択することができる。【００３０】
アポトーシス作用は、生化学的、形態学的に確認することができる。たとえば、DNAの断片化を測定することにより、アポトーシスを確認することができる。DNAの断片化の測定は公知の方法に従って行うことができる（McConkey, D. J., et al., Glucocorticoids activate a suicide process in thymocytes through an elevation of cytosolic Ca2+ concentration. Arch.Biochem.Biophys., 269: 365-370, 1989）。【００３１】
また、アポトーシスにより細胞が破壊すると、カスパーゼ-3様活性が認められることから、該活性の測定により、アポトーシスを確認することができる。カスパーゼ-3様活性の測定は公知の方法により行うことができる（Takahashi, A., et al., Affinity labeling displays the stepwise activation of ICE-related proteases by Fas, staurosporine, and CrmA-sensitive caspase-8. Oncogene, 14: 2741-2752, 1997）。【００３２】
アポトーシス作用による細胞に及ぼす形態学的影響は、公知の方法に従って観察することができる（Lee, E. et al., A novel DNA cleaving agent, 2,2'-bis (2-aminoethyl) -4,4'-bithiazole, induces thymocyte apoptosis. Biochem.Mol.Biol.Int., 40: 151-157, 1996）。【００３３】
本発明の抗腫瘍治療薬は、悪性腫瘍に対してアポトーシス作用により効果的に抗腫瘍作用を示す。腫瘍の種類は特に限定されず、血液癌および固形癌に対して使用することができる。例えば、血液癌については白血病に対し、また固形癌については、肺癌などに使用することができる。【００３４】
本発明は、黄ごん由来成分とアポトーシス作用を有する抗腫瘍薬とを併用することを特徴とする抗腫瘍治療薬に関する。また、本発明は抗腫瘍治療薬を含み、上記悪性腫瘍に対して効果を発揮する医薬組成物にまで及ぶ。医薬組成物には、薬理学的に許容される塩を含むことができる。「薬理学的に許容される塩」とは、慣用の無毒性の塩すなわち酸付加塩および各種塩基との塩を挙げることができる。より具体的には、塩酸、硝酸、硫酸等の無機酸塩、酢酸、クエン酸、フマル酸、酒石酸等の有機酸塩、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等のスルホン酸塩およびアラニン、ロイシン、グルタミン酸等のアミノ酸塩並びにアルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（例えばマグネシウム塩、カルシウム塩等）等の無機塩基塩およびトリエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、エタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩等の有機アミン塩が挙げられる。【００３５】
本発明の抗腫瘍治療薬を含む医薬組成物は、各種抗腫瘍薬の性質に応じて、経口投与、静脈内注射投与、筋肉内注射投与等、最適な投与方法を選択して投与することができる。
【実施例】
【００３６】
以下により本発明の理解を深めるために実施例を用いて説明するが、これらは具体例のひとつであって本発明はこれらに限定されるものではない。【００３７】
（実施例１）  正常細胞に各種化学療法剤とオウゴニンを併用したときのDNA断片化について
幼若雄性ラット (4-5週齢) の胸腺より胸腺細胞を採取し、10％ウシ胎児血清を含むRPMI 1640培地中で細胞密度10×106 cells/mlとした。細胞は採取直後に実験に供した。
抗腫瘍薬として、YO-2(Lee, E., et al., Biochem. Pharmacol., 63: 1315-23, 2002; Okada, Y., et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10: 2217-21, 2000)（30 μM）、エトポシド（10 μM）を加えて、5％ CO2、37 ℃条件下で６時間培養した系と、各々についてオウゴニンを100 μM加えて培養した系について、DNA断片化を測定することによりアポトーシス作用を確認した。DNA断片化率は断片化DNAと非断片化DNAを分離し、定量することにより測定した。DNA量は、McConkey, D. J., et al., Glucocorticoids activate a suicide process in thymocytes through an elevation of cytosolic Ca2+ concentration. Arch.Biochem.Biophys., 269: 365-370, 1989に記載の方法に従って、ジフェニルアミン法により測定した。総DNA量 (断片化DNA＋非断片化DNA) に対する断片化DNA量の割合を％で表示した。【００３８】
その結果、抗腫瘍薬単独の場合にはDNA断片化の傾向が認められ、オウゴニンを添加するとDNA断片化の軽減が認められた。その効果は、エトポシドに関し、特に顕著であった（図１）。このことから、抗腫瘍薬は正常細胞に対してアポトーシス作用があるが、オウゴニンの添加により正常細胞に対するアポトーシス作用が軽減されることが確認された。このことから、抗腫瘍薬による副作用が、オウゴニンの添加により軽減されることが示唆された。【００３９】
（実施例２）  正常細胞にエトポシドとオウゴニンを併用したときのカスパーゼ-3様活性について
胸腺細胞（100×106 cells/ml）をオウゴニン100 μM存在下または非存在下でエトポシド10 μMとともに１〜４時間培養した後、50 μlの抽出用緩衝液 (50 mM PIPES-NaOH (pH 7.4)、50 mM KCl、5 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 20 μM サイトカラシンB, 1 mM フェニルメチルスルホニルフルオリド, 1 mM ジチオスレイトール、 1 μg/ml キモスタチン、1 μg/ml ロイペプチン、1 μg/ml ペプスタチン A、2.83 μg/ml E-64-d) に懸濁して凍結融解を繰り返したものを酵素標品とした。活性測定用緩衝液 (100 mM HEPES-KOH、 10% スクロース、0.1% 3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホン酸 (CHAPS)、10 mM ジチオスレイトール、0.1 mg/ml オボアルブミン) で酵素標品を希釈した後、100 μM アセチル-Asp-Glu-Val-Asp-α-(4メチル-クマリル-7-アミド) (Ac-DEVD-MCA) と37 ℃で反応し、7-アミノ-4-メチル-クマリン (AMC) の蛍光を測定した。【００４０】
その結果、何も加えないコントロール条件では、培養時間の経過に伴うカスパーゼ-3様活性の急激な増加は認められず、オウゴニンを単独で加えた系でもほぼコントロールと同じ傾向を示した。一方、エトポシドを単独で10 μM加えた系で培養した場合には、培養時間の経過に従いカスパーゼ-3様活性の上昇を認めたが、エトポシド10 μMとオウゴニン100 μM加えた系では、エトポシド単独の場合に比べてカスパーゼ-3様活性の上昇が抑えられた（図２）。
この結果からエトポシド10 μMとオウゴニン100 μMとを加えた系では、エトポシド単独の系よりカスパーゼ-3様活性が低く抑えられたので、正常細胞に対するエトポシドのアポトーシス作用が軽減されることが示唆された。【００４１】
（実施例３）  腫瘍細胞（Jurkat細胞）にエトポシドとオウゴニンを併用したときのDNA断片化について
Jurkat細胞（急性リンパ芽球性白血病患者の末梢血由来細胞）は、10％ウシ胎児血清を含むRPMI 1640培地を用いて細胞密度が1×105 cells/mlとなるように調製したものを、5％ CO2、37 ℃条件下で培養し、４日ごとに継代した。10％ウシ胎児血清を含むRPMI 1640培地を用いて細胞密度が3×106 cells/mlとなるように調製したものを、各濃度のオウゴニン存在下または非存在下で、エトポシド5 μM若しくはシスプラチン30 μMと共に６時間培養したのち、該Jurkat細胞のDNA断片化率を調べた。DNA断片化の測定は、実施例１に記載の方法に従った。【００４２】
その結果を図３に示した。図３より、オウゴニン単独ではDNA断片化は認められず、本細胞に対するアポトーシス作用は認められなかった。
また、エトポシド5 μMの系で検討した結果、オウゴニンを加えない場合はエトポシドによるDNA断片化は認められなかったのに対し、エトポシドに各濃度のオウゴニンを加えて培養した系では、加えたオウゴニンの濃度に応じて、DNA断片化の上昇が観察され、アポトーシス作用を有することが認められた。
このことから、Jurkat細胞に対しては、エトポシド単独ではアポトーシス作用が認められない場合であっても、オウゴニンを併用することによりアポトーシス作用による抗腫瘍効果が得られることが示唆された。【００４３】
一方、シスプラチン30 μMの系で検討した結果、オウゴニンを加えない場合はシスプラチンによるDNA断片化は認められず、各濃度のオウゴニンを添加してもDNA断片化は変化しなかった。このことから、Jurkat細胞に対しては、本濃度のシスプラチンではシスプラチン単独およびシスプラチンとオウゴニンの併用であってもアポトーシスによる抗腫瘍効果を示さないことが示唆された。【００４４】
（実施例４）  腫瘍細胞（HL-60細胞）にエトポシドとオウゴニンを併用したときのDNA断片化について
HL-60細胞（急性前骨髄性白血病患者の末梢血由来細胞）は、10％ウシ胎児血清を含むRPMI 1640培地を用いて細胞密度が1.5×105 cells/mlとなるように調製したものを、5％ CO2、37 ℃条件下で培養し、４日ごとに継代した。10％ウシ胎児血清を含むRPMI 1640培地を用いて細胞密度が4×106 cells/mlとなるように調製したものを、各濃度のオウゴニン存在下または非存在下で、エトポシド5 μM若しくはシスプラチン30 μMと共に６時間培養したのち、該HL-60細胞のDNA断片化率を調べた。DNA断片化の測定は、実施例１に記載の方法に従った。【００４５】
その結果を図４に示した。図４より、オウゴニン単独ではDNA断片化は認められなかった。
また、エトポシド5 μMの系で検討した結果、オウゴニンを加えない場合はエトポシドによるDNA断片化率は10％程度であったのに対し、エトポシドに各濃度のオウゴニンを加えて培養した系では、加えたオウゴニンの濃度に応じて、DNA断片化の上昇が観察され、アポトーシス作用の増強が認められた。
このことから、HL-60細胞に対しては、エトポシド単独でのアポトーシス作用よりも、オウゴニンを併用することで、より効果的にアポトーシス作用による抗腫瘍効果が得られることが示唆された。【００４６】
一方、シスプラチン30 μMの系で検討した結果、オウゴニンを加えない場合はシスプラチンによるDNA断片化率は12％であり、シスプラチンに各濃度のオウゴニンを添加した場合はDNA断片化率が若干上昇した。
このことから、HL-60細胞に対しては、シスプラチンのアポトーシス作用による抗腫瘍効果がオウゴニンの併用により増強される傾向が示唆された。【００４７】
（実施例５）  腫瘍細胞（Jurkat細胞）に対するエトポシドとオウゴニンの併用効果について（形態学的観察）
Jurkat細胞を10 μMオウゴニン存在下または非存在下で、5 μMエトポシドとともに６時間培養した後、5％ ホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝化生理食塩液 (PBS) で固定した（4℃、15分間以上）。300×g、10分間遠心分離して細胞を回収し、PBSに再懸濁した。該細胞懸濁液に12.3 μg/ml Hoechst 33342を加えて室温で10分間反応させて核を染色し、PBSで洗浄したものについて、共焦点レーザー顕微鏡 (LSM GB 200, オリンパス工業株式会社) を用いて細胞核を観察した（40倍）。
その結果、エトポシトおよびオウゴニンを加えないコントロール、オウゴニン単独を加えた場合には、各細胞について正常な核が認められるのに対し、エトポシド単独加えた場合場合には、アポトーシスの形態学的特徴であるアポトーシス小体がわずかに認められた（図５）。エトポシドとオウゴニンを加えた場合は、エトポシド単独の場合に比べて凝縮した核やアポトーシス小体が著明に増加した。このことから、オウゴニン添加により、エトポシドのアポトーシス作用を増強することが示唆された。【００４８】
（実施例６）  ヒト肺癌細胞（A549細胞）に対するドキソルビシンとオウゴニンの併用効果について（細胞生存率測定）
A549細胞（ヒューマンサイエンス振興財団より分与）を25 μMオウゴニン存在下または非存在下で0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200および500 μMのドキソルビシンとともに培養した後の細胞生存率を調べた。
MEM培地に10％ウシ胎児血清(FCS)を添加したものを培養液とし、A549細胞の培養に使用した。
A549細胞を1 〜 1.5×105 cells/mlとなるように上記培養液で懸濁し、該細胞懸濁液を直径100 mmの培養用ディッシュに10 ml播種し、5％ CO2 条件下、37℃で培養した。2 〜 3日毎に培養液を交換し、細胞を80 〜 90％（サブコンフルエント）まで増殖させた。該サブコンフルエントに増殖した細胞を、0.25％トリプシン溶液で処理して細胞を培養用ディッシュから剥離し、培養液で洗浄した後、細胞数5×104 cells/mlの細胞懸濁液を調製した。【００４９】
細胞数5×104 cells/mlの細胞懸濁液を、200 μlずつ96ウェルマイクロプレートの各ウェルに播いた。このとき、各ウェルの細胞数は、1×104 cells/ウェルである。
5％ CO2 条件下、37℃で24時間培養後、各ウェルの培養液を吸引除去し、200 μl／ウェルの新規培養液に交換した。さらに、24時間培養後、各ウェルの培養液を吸引除去し、0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200および500 μMのドキソルビシンおよびオウゴニン(0, 25 μM)を含む培養液を200 μl／ウェル添加した。
各濃度のドキソルビシンおよびオウゴニンを含む培養液中でさらに24時間培養した後、各ウェルの培養液を吸引除去し、ドキソルビシンおよびオウゴニンを含まない新規培養液を100 μl／ウェル添加し、さらに細胞生存率測定用試薬（Cell Counting kit-8:同仁化学研究所製）を10 μl／ウェル添加した。5％ CO2 条件下、37℃で２時間反応後、生成したホルマザン量をマイクロプレートリーダーを用いて波長A450の吸光度により測定した。ドキソルビシンおよびオウゴニンを含まない培養液で培養したものを対照とし、該対照の吸光度を100％とし、各濃度の薬剤を添加したときの細胞生存率を算出した。【００５０】
その結果、ドキソルビシンの添加量が100 μM以上の場合に、細胞生存率の低下が確認された（図６）。また、オウゴニンを添加した系でも、ドキソルビシンの細胞毒性効果を阻害することはなかった。【００５１】
（実施例７）  ヒト肺癌細胞（A549細胞）に対するシスプラチンとオウゴニンの併用効果について（細胞生存率測定）
A549細胞（ヒューマンサイエンス振興財団より分与）を25 μMオウゴニン存在下または非存在下で0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200および500 μMのシスプラチンとともに培養した後の細胞生存率を調べた。
各薬剤の濃度、A549細胞の培養条件、細胞生存率の計算は、実施例６と同手法により行った。
その結果、シスプラチンの添加量が100 μM以上の場合に、細胞生存率の低下が確認された（図７）。また、オウゴニンを添加した系でも、シスプラチンの細胞毒性効果を阻害することはなかった。【００５２】
（実施例８）  ヒト肺癌細胞（A549細胞）に対するカルボコンとオウゴニンの併用効果について（細胞生存率測定）
A549細胞（ヒューマンサイエンス振興財団より分与）を25 μMオウゴニン存在下または非存在下で0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200および500 μMのカルボコンとともに培養した後の細胞生存率を調べた。
各薬剤の濃度、A549細胞の培養条件、細胞生存率の計算は、実施例６と同手法により行った。
その結果、カルボコンの添加量が5 μM以上の場合に、細胞生存率の低下が確認された（図８）。また、オウゴニンを添加した系では、カルボコンの細胞毒性効果を阻害することはなく、増強する傾向が認められた。【００５３】
（実施例９）  ヒト肺癌細胞（A549細胞）に対するビンブラスチンとオウゴニンの併用効果について（細胞生存率測定）
A549細胞（ヒューマンサイエンス振興財団より分与）を25 μMオウゴニン存在下または非存在下で0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200および500 μMのビンブラスチンとともに培養した後の細胞生存率を調べた。
各薬剤の濃度、A549細胞の培養条件、細胞生存率の計算は、実施例６と同手法により行った。
その結果、ビンブラスチンの添加量が50 μM以上の場合に、急激な細胞生存率の低下が確認された（図９）。また、オウゴニンを添加した系では、ビンブラスチンの細胞毒性効果を阻害することはなかった。【００５４】
（実施例１０）  ヒト肺癌細胞（A549細胞）に対するカンプトテシンとオウゴニンの併用効果について（細胞生存率測定）
A549細胞（ヒューマンサイエンス振興財団より分与）を25 μMオウゴニン存在下または非存在下で0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200および500 μMのカンプトテシンとともに培養した後の細胞生存率を調べた。
各薬剤の濃度、A549細胞の培養条件、細胞生存率の計算は、実施例６と同手法により行った。
その結果、カンプトテシンの添加量が10 μM以上の場合に、細胞生存率の低下が確認された（図１０）。また、1〜50 μMのカンプトテシン存在下にオウゴニンを添加した系では、カンプトテシンの細胞毒性効果を増強する傾向が確認された。【００５５】
（実施例１１）  ヒト肺癌細胞（A549細胞）に対するエトポシドとオウゴニンの併用効果について（細胞生存率測定）
A549細胞（ヒューマンサイエンス振興財団より分与）を25 μMオウゴニン存在下または非存在下で0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200および500 μMのエトポシドとともに培養した後の細胞生存率を調べた。
各薬剤の濃度、A549細胞の培養条件、細胞生存率の計算は、実施例６と同手法により行った。
その結果、エトポシドの添加量が1 μM以上の場合に、細胞生存率の低下が確認された（図１１）。また、エトポシドの添加量が1 〜 100 μMの場合には、オウゴニンを添加した系で明らかにエトポシドの細胞毒性効果を増強する傾向が確認された。【００５６】
（実施例１２）  ヒト肺癌細胞（NCI-H226細胞、ATCC No.CRL-5826）に対するエトポシドとオウゴニンの併用効果について（細胞生存率測定）
NCI-H226細胞（ATCCより購入）を25 μMオウゴニン存在下または非存在下で0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200および500 μMのエトポシドとともに培養した後の細胞生存率を調べた。
RPMI培地に10％ウシ胎児血清(FCS)を添加したものを培養液とし、NCI-H226細胞の培養に使用したほかは、細胞の培養条件（温度、時間等）、薬剤濃度、細胞生存率の計算は、実施例１１と同手法により行った。
その結果、エトポシドの添加量が10 μM以上の場合に、細胞生存率の低下が確認された（図１２）。また、オウゴニンを添加した系では明らかにエトポシドの細胞毒性効果を増強する傾向が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
以上説明したように、本発明の黄ごん由来成分と抗腫瘍薬の併用による抗腫瘍治療薬により、正常細胞に対するアポトーシスが軽減化され、腫瘍細胞に対するアポトーシスは維持または増強させることができ、抗腫瘍薬による副作用が軽減されることが確認された。これにより、より効果的な抗腫瘍効果を示し、正常細胞に対する副作用が軽減化された抗腫瘍治療薬および該抗腫瘍治療薬を含む医薬組成物を提供することができる。また、これらの抗腫瘍治療薬は、血液癌のみならず、肺癌のような固形癌に対しても適用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図５】
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【国際調査報告】
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