(57)【要約】  疾病予知や薬効ならびに副作用にも関連したＥＧＦＲ遺伝子の欠損変異を迅速・簡便・高感度に検出する方法ならびにキット。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を包含することを特徴とする、試料中に含まれるＥＧＦＲ遺伝子のエキソン１９の欠損変異の有無を検出する方法：
ＥＧＦＲ遺伝子の欠損ジャンクション領域にアニーリング可能な少なくとも１つの欠損配列用プライマーおよび前記欠損配列用プライマーと対向するプライマーを用いて試料中の目的領域を増幅する工程、ここで当該欠損配列用プライマーの３’末端の塩基配列は当該欠損ジャンクションに隣接する３’側の非欠損部位由来の２から５塩基からなる塩基配列であり、当該欠損配列用プライマーと対向するプライマーは欠損変異及び正常遺伝子のいずれにもアニーリング可能なプライマーである；および
増幅産物の有無に基づいて欠損変異を検出する工程。
【請求項２】
さらに、欠損部位を認識するプローブおよび非欠損部位を認識するプローブを含む少なくとも２つのプローブを用いて、増幅反応と同一反応系で欠損変異を検出することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
配列表の配列番号６〜１０のいずれか記載の塩基配列を有するプライマーから選択される欠損配列用プライマー及び配列表の配列番号１１記載の塩基配列を有する前記欠損配列用プライマーと対向するプライマーを用いることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
配列表の配列番号１６、１７いずれか記載の塩基配列を有するプローブを用いる事を特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項５】
以下を含有することを特徴とする請求項１記載の方法のための組成物：
（１）ＥＧＦＲ遺伝子の欠損ジャンクション領域にアニーリング可能な欠損配列用プライマー、ここで当該欠損配列用プライマーの３’末端の塩基配列は当該欠損ジャンクションに隣接する３’側の非欠損部位由来の２から５塩基からなる塩基配列である、
（２）（１）の欠損配列用プライマーと対向するプライマー、ここで当該プライマーは欠損変異及び正常遺伝子のいずれにもアニーリング可能なプライマーである、および
（３）ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項６】
さらに、
（４）欠損部位を認識するプローブ、
（５）非欠損部位を認識するプローブ、ならびに
（６）標的配列にハイブリダイズした場合に上記プローブを開裂させるための酵素、を含有することを特徴とする請求項５記載の組成物。
【請求項７】
配列表の配列番号６〜１０のいずれか記載の塩基配列を有するプライマーから選択される欠損配列用プライマー及び配列表の配列番号１１記載の塩基配列を有する前記欠損配列用プライマーと対向するプライマーを含有することを特徴とする請求項５記載の組成物。
【請求項８】
配列表の配列番号１６、１７いずれか記載の塩基配列を有するプローブを含有する事を特徴とする請求項６記載の組成物。
【請求項９】
以下を含有することを特徴とする請求項１記載の方法のためのキット：
（１）ＥＧＦＲ遺伝子の欠損ジャンクション領域にアニーリング可能な欠損配列用プライマー、ここで当該欠損配列用プライマーの３’末端の塩基配列は当該欠損ジャンクションに隣接する３’側の非欠損部位由来の２から５塩基からなる塩基配列である、および
（２）（１）の欠損配列用プライマーと対向するプライマー、ここで当該プライマーは欠損変異及び正常遺伝子のいずれにもアニーリング可能なプライマーである。
【請求項１０】
さらに、
（３）欠損部位を認識するプローブ、ならびに
（４）非欠損部位を認識するプローブ、を含有することを特徴とする請求項９記載のキット。
【請求項１１】
配列表の配列番号６〜１０のいずれか記載の塩基配列を有するプライマーから選択される欠損配列用プライマー及び配列表の配列番号１１記載の塩基配列を有する前記欠損配列用プライマーと対向するプライマーを含有することを特徴とする請求項９記載のキット。
【請求項１２】
配列表の配列番号１６、１７いずれか記載の塩基配列を有するプローブを含有する事を特徴とする請求項１０記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は疾病予知や薬効ならびに副作用にも関連したＥＧＦＲ遺伝子の欠損変異を迅速・簡便・高感度に検出する方法ならびにキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子レベルでの多彩な変異（点変異、欠損、挿入、重複）が遺伝病のみに限らず、生活習慣病に密接に絡んでいることが明らかにされつつある。さらには、薬効予測や副作用予測といった薬理ゲノム解析が臨床にも応用されつつある。中でも、肺癌治療薬であるＥＧＦＲ阻害剤とＥＧＦＲの変異との関係が明らかにされた（非特許文献１、２、３、４参照）。
上記遺伝子変異のうち点変異の検出法としては、従来から様々な方法が報告されている（非特許文献５参照）。例えば、３’末端が変異特異的な配列を有するプライマーを用いて核酸増幅の有無を調べる方法（特許文献１参照）、プローブ技術を用いる方法（ＴａｑＭａｎ法、特許文献２、３参照）、Ｉｎｖａｄｅｒ法（特許文献４参照）、Ｃｙｃｌｉｎｇ  ｐｒｏｂｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（非特許文献６参照）、ＣａｔａＣｌｅａｖｅ  ｐｒｏｂｅ法（非特許文献７参照）、Ｃｙｃｌｅａｖｅ法（特許文献５参照）、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅ法（特許文献６参照）、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ法（非特許文献８参照）、シーケンス法、１塩基伸長法などがある。これらの方法は例えばＲａｓ変異、各種ＳＮＰタイピングに広く用いられており、ＥＧＦＲに存在する点変異（例えばエキソン２１に存在するコドン８５８のＬ−＞Ｒ変異）解析にも応用可能である。【０００３】
また、欠損変異解析もシーケンス法や高性能電気泳動法によって実施されてきた。例えば、ＣＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ５（ＣＣＲ５）遺伝子の＋／Δ３２欠損変異に代表される例では、上記遺伝子欠損変異は、その欠損パターンが一定であるため、正常配列に対する通常のプライマーで核酸増幅し、ＴａｑＭａｎなど正常配列および欠損ジャンクション領域に対する２種類のプローブを用いてシグナルの有無や強度を調べてタイピングしている（非特許文献９）。【０００４】
【特許文献１】特許第２８５３８６４号公報
【特許文献２】米国特許第５，２１０，０１５号明細書
【特許文献３】米国特許第５，４８７，９７２号明細書
【特許文献４】米国特許第５，８４６，７１７号明細書
【特許文献５】国際公開第０３／０７４６９６号パンフレット
【特許文献６】国際公開第９７／４６７１４号パンフレット
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０４，ｐ．１４９７−１５００（２００４）
【非特許文献２】Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｅｄｉｃｉｎｅ、３５０、ｐ．２１２９−２１３９（２００４）
【非特許文献３】Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、９３、ｐ．３５５−３６３（２００５）
【非特許文献４】Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１１（１２）、ｐ．４２８９−４２９４（２００５）
【非特許文献５】Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、３、ｐ．７４９−７６１（２００４）
【非特許文献６】ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２０、ｐ．２４０−２４８（１９９６）
【非特許文献７】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３３（２）、ｐ．２４６−２５５（２００４）
【非特許文献８】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２８、ｐ．２７５２−３７６１（２０００）
【非特許文献９】Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４６、ｐ．２４−３０（２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このように欠損パターンが一定の欠損変異解析については検討されているが、欠損パターンが一定でない非定型欠損変異の検出においては、個々の症例に応じてシーケンス解析、核酸増幅後の高性能電気泳動解析（例えばキャピラリー電気泳動）やＴＯＦ−ＭＳによる質量分析といった、大掛かりで煩雑な工程を経なければならず、簡便に迅速にできないという問題があった。さらに、検体ががん組織である場合には通常の遺伝子多型解析のように１００％か５０％かという混在率ではなく、大多数の正常細胞の存在下に混在するがん細胞由来の遺伝子を検出する必要がある。例えば、５％という混在率で存在する変異遺伝子を検出する事は困難であった。【０００６】
本発明の目的は、変異のパターンが多彩でありかつ欠損配列が短い、いわゆる欠損パターンが一定していないＥｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）遺伝子のエキソン１９における体細胞欠損変異について、抗癌剤（ＥＧＦＲ阻害剤）の効果予測、疫学調査、疾患予測の面から有用な、簡便で迅速でなおかつ高感度なスクリーニング法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは鋭意検討し、ＥＧＦＲ正常遺伝子中に５％の割合で混在する欠損変異遺伝子であっても検出することが可能な新規な技術を開発した。更には、前記の検出を同一反応系で閉鎖・密閉系で迅速に行う新規な技術を開発した。すなわち、シングルチューブで閉鎖・均一系でクロスコンタミの危険性を防げ、９０分という短時間で、多検体を同時測定でき、なおかつ正常遺伝子中に５％の欠損変異遺伝子が存在するだけで検出可能な高感度検出法ならびに試薬キットを開発し、本発明を完成させた。【０００８】
すなわち本発明の第１の発明は、以下の工程を包含することを特徴とする、試料中に含まれるＥＧＦＲ遺伝子のエキソン１９の欠損変異の有無を検出する方法に関する：
ＥＧＦＲ遺伝子の欠損ジャンクション領域にアニーリング可能な少なくとも１つの欠損配列用プライマーおよび前記欠損配列用プライマーと対向するプライマーを用いて試料中の目的領域を増幅する工程、ここで当該欠損配列用プライマーの３’末端の塩基配列は当該欠損ジャンクションに隣接する３’側の非欠損部位由来の２から５塩基からなる塩基配列であり、当該欠損配列用プライマーと対向するプライマーは欠損変異及び正常遺伝子のいずれにもアニーリング可能なプライマーである；および
増幅産物の有無に基づいて欠損変異を検出する工程。【０００９】
また、本発明の第１の発明において、さらに、欠損部位を認識するプローブおよび非欠損部位を認識するプローブを含む少なくとも２つのプローブを用いて、増幅反応と同一反応系で欠損変異を検出してもよい。【００１０】
また、特に限定はしないが、本発明の第１の発明においては、配列表の配列番号６〜１０いずれか記載の塩基配列を有するプライマーから選択される欠損配列用プライマー及び配列表の配列番号１１記載の塩基配列を有する前記欠損配列用プライマーと対向するプライマー、及び／又は配列表の配列番号１６〜１７記載の塩基配列を有するプローブを用いることが好ましい。【００１１】
本発明の第２の発明は、以下を含有することを特徴とする本発明の第１の発明の方法のための組成物に関する：
（１）ＥＧＦＲ遺伝子の欠損ジャンクション領域にアニーリング可能な欠損配列用プライマー、ここで当該欠損配列用プライマーの３’末端の塩基配列は当該欠損ジャンクションに隣接する３’側の非欠損部位由来の２から５塩基からなる塩基配列である、
（２）（１）の欠損配列用プライマーと対向するプライマー、ここで当該プライマーは欠損変異及び正常遺伝子のいずれにもアニーリング可能なプライマーである、および
（３）ＤＮＡポリメラーゼ。【００１２】
本発明の第２の発明において、さらに、（４）欠損部位を認識するプローブ（５）非欠損部位を認識するプローブ、ならびに（６）標的配列にハイブリダイズした場合に上記プローブを開裂させるための酵素、を含有してもよい。【００１３】
また、特に限定はしないが、本発明の第２の発明においては、配列表の配列番号６〜１０いずれか記載の塩基配列を有するプライマーから選択される欠損配列用プライマー及び配列表の配列番号１１記載の塩基配列を有する前記欠損配列用プライマーと対向するプライマー、及び／又は配列表の配列番号１６〜１７記載の塩基配列を有するプローブを含有する事が好ましい。【００１４】
本発明の第３の発明は、以下を含有することを特徴とする本発明の第１の発明の方法のためのキットに関する：
（１）ＥＧＦＲ遺伝子の欠損ジャンクション領域にアニーリング可能な欠損配列用プライマー、ここで当該欠損配列用プライマーの３’末端の塩基配列は当該欠損ジャンクションに隣接する３’側の非欠損部位由来の２から５塩基からなる塩基配列である、および
（２）（１）の欠損配列用プライマーと対向するプライマー、ここで当該プライマーは欠損変異及び正常遺伝子のいずれにもアニーリング可能なプライマーである。
本発明の第３の発明おいて、さらに、（３）欠損部位を認識するプローブ、ならびに（４）非欠損部位を認識するプローブ、を含有しても良い。【００１５】
また、特に限定はしないが、本発明の第３の発明においては、配列表の配列番号６〜１０いずれか記載の塩基配列を有するプライマーから選択される欠損配列用プライマー及び配列表の配列番号１１記載の塩基配列を有する前記欠損配列用プライマーと対向するプライマー、及び／又は配列表の配列番号１６〜１７記載の塩基配列を有するプローブを含有する事が好ましい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、ＥＧＦＲ遺伝子のエキソン１９における体細胞欠損変異について、抗癌剤（ＥＧＦＲ阻害剤）の効果予測、や疫学調査、疾患予測の面から有用な、簡便で迅速でなおかつ高感度なスクリーニングが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１−１】ＥＧＦＲ遺伝子のエキソン１９における欠損変異のパターンを示す図である。
【図１−２】ＥＧＦＲ遺伝子のエキソン１９における欠損変異のパターンを示す図である。
【図２】実施例５の各サンプルにおけるＦＡＭの蛍光強度当たりのＨＥＸの蛍光強度、ＨＥＸ／ＦＡＭ値を算出しプロットした図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本明細書において欠損変異とは、正常な配列を持つＤＮＡからＤＮＡの一部が欠けた変異のことを言う。【００１９】
本明細書において欠損部位とは、上記欠損変異で欠けるＤＮＡの部位のことをいう。【００２０】
本明細書において非欠損部位とは、上記欠損部位以外の部位のことをいう【００２１】
本明細書において欠損ジャンクションとは、欠損変異を有する遺伝子において、欠損部位の両側に隣接する塩基と塩基との間の部分を言う。即ち、欠損変異における非欠損部位同士の接合部分のことを言う。【００２２】
本明細書において欠損ジャンクション領域とは、欠損変異を有する遺伝子において、欠損部位の両側に隣接する塩基を含む領域のことを言う。即ち、欠損変異における非欠損部位同士の接合部分（即ち、欠損ジャンクション）の両側に隣接する塩基を含む領域のことを言う。【００２３】
本明細書において欠損配列用プライマーと対向するプライマーとは、核酸増幅反応において利用されるプライマー対を欠損配列用プライマーとともに構成するプライマーのことを言う。【００２４】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ａ）本発明のＥＧＦＲ遺伝子欠損変異の検出方法
本発明の検出方法は、
試料中に含まれるＥＧＦＲ遺伝子のエキソン１９の欠損変異の有無を検出する方法であって、ＥＧＦＲ遺伝子の欠損ジャンクション領域にアニーリング可能な少なくとも１つの欠損配列用プライマー、ここで当該欠損配列用プライマーの３’末端の塩基配列は当該欠損ジャンクションに隣接する非欠損部位由来の２から５塩基からなる塩基配列であり、ならびに前記欠損配列用プライマーと対向するプライマー、ここで当該プライマーは欠損変異および正常遺伝子のいずれにもアニーリング可能なプライマーであり、を用いて試料中の目的領域を増幅する事を特徴とする。増幅産物の検出方法に特に限定はなく、アガロースゲル電気泳動やプローブを用いた検出方法が例示される。
また、欠損部位を識別するプローブならびに非欠損部位を識別するプローブの少なくとも２つのプローブを用いて、増幅反応と同一反応系で欠損変異を検出しても良い。
本発明の検出対象となるＥＧＦＲ遺伝子のエキソン１９の欠損変異としては、ＥＧＦＲ遺伝子のエキソン１９のコドン７４６から７５２に出現する欠損変異が例示される。このような検出対象の好適例としては、前期非特許文献１〜４に記載された欠損変異が挙げられ、より好ましくは前記非特許文献１及び２に記載された欠損変異（図１）が例示される。図１において欠失Ｄｅｌ−１ａ、Ｄｅｌ−１ｂ、Ｄｅｌ−３、Ｄｅｌ−４、Ｄｅｌ−５、Ｄｅｌ−２はそれぞれ、塩基２２３５〜２２４９の欠失（アミノ酸Ｅ７４６〜Ａ７５０の欠失）、塩基２２３６〜２２５０の欠失（アミノ酸Ｅ７４６〜Ａ７５０の欠失）、塩基２２３９〜２２４７の欠失（アミノ酸Ｌ７４７〜Ｅ７４９の欠失、Ａ７５０Ｐの置換）、塩基２２４０〜２２５７の欠失（アミノ酸Ｌ７４７〜Ｓ７５２の欠失、Ｐ７５３Ｓの置換）、塩基２２３８〜２２５５の欠失（アミノ酸Ｌ７４７〜Ｓ７５２の欠失、Ｅ７４６Ｖの置換）、塩基２２５４〜２２７７の欠失（アミノ酸Ｓ７５２〜Ｉ７５９の欠失）である。図１および上記の塩基番号はヒトＥＧＦＲ遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを１とした場合の番号であり、アミノ酸番号は上記開始コドンによってコードされるメチオニン（Ｍｅｔ）を１とした場合の番号である。
また、本発明の方法のひとつの態様は、上記欠損変異を検出するための少なくとも１対のプライマー及び欠損部位ならびに非欠損部位を認識する少なくとも２つのプローブを用いることを特徴とする。また、本発明の方法の別の態様は、同一反応系で核酸増幅反応とシグナル検出を同時に行い、欠損変異の有無を迅速高感度に検出することを特徴とする。【００２５】
本発明の方法で用いるプライマーは、正常ＥＧＦＲ遺伝子は実質的に増幅せず、少なくとも一種の欠損変異を実質的に増幅可能なプライマーであればいずれもが好適に使用できる。特に限定はないが、例えば、本発明の方法で用いるプライマーの少なくとも１つはＥＧＦＲ遺伝子の欠損ジャンクション領域にアニーリング可能であり、当該プライマーの３’末端の塩基配列は欠損ジャンクションに隣接する３’側の非欠損部位由来の塩基配列から選ばれる。当該プライマーの３’末端の塩基配列は、好ましくは欠損ジャンクションに隣接する３’側の非欠損部位由来の２塩基〜５塩基であり、特に好ましくは２塩基〜３塩基である。また、２種類以上の前記プライマーを同一の反応系で核酸増幅反応に使用する事もできる。この事は、２種類以上の欠損変異を同一の反応系で検出できるという点において好ましい。前記プライマーを２種類以上用いる場合、欠損した塩基配列の鎖長をアカーロースゲル電気泳動等で鎖長を求めることによって同定するために、それぞれのプライマーの５’末端がアニーリングする位置が一致するようにプライマーを設定しても良い。前記プライマーとしては、例えば配列表の配列番号６〜１０のいずれか記載の塩基配列を有するものが好適に使用できる。【００２６】
また、本発明の方法で用いるプライマーのもう一方は、当該遺伝子の欠損変異及び正常遺伝子のいずれにもアニーリング可能なものであれば特に限定はないが、長鎖ＤＮＡの増幅が困難な、例えばパラフィン切片からのＤＮＡを増幅できるように設定されたプライマーが好ましい。前記プライマーとしては、核酸増幅反応によって得られる増幅産物の鎖長が１００ｂｐ以下となるように設定されているプライマーが好ましく、より好ましくは増幅産物の鎖長が８７ｂｐ以下となるように設定されているプライマーである。前記プライマーとしては、例えば配列表の配列番号１１記載の塩基配列を有するものが好適に使用できる。
本発明の方法において上記プライマー対により目的の欠損遺伝子を高感度に検出する事ができる。【００２７】
また、本発明の方法で用いるプライマーを設定する際には、上記の事項に加えて公知の文献、例えば内海らの文献（蛋白質、核酸、酵素、第３５巻、ｐ３１５７〜ｐ３１６３、１９９０年）に記載された、プライマーを作成するためのガイドラインを参考にする事もできる。【００２８】
本発明においては、本発明の方法により増幅されたＤＮＡ断片を、プローブを使用して検出しても良い。【００２９】
本発明の方法に用いるプローブは、欠損部位を認識する塩基配列ならびに非欠損部位を認識する塩基配列を有するものであれば特に限定はされないが、標的配列に相補的な配列を持つものが好ましい。前記プローブとしては、例えば標的配列にハイブリダイズした場合に特定の核酸分解酵素により切断を受けるプローブが好ましい。このようなプローブとしては、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡキメラプローブが挙げられる。特に好ましいプローブとしては、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡキメラプローブである。前記キメラプローブのＲＮＡ部分の鎖長は特に限定されないが、プローブの安定性の観点から１〜５塩基である事が好ましく、更に好ましくは１塩基である。プローブ全体の鎖長は、好ましくは６〜３０塩基であり、更に好ましくは１０〜１５塩基である。
上記プローブのうち、欠損部位を認識するプローブは、さまざまな欠損変異において共通して欠損している領域を選択することが好ましい。当該プローブの一部の配列は非欠損部位を含んでも構わないが、増幅された欠損ＤＮＡと当該プローブの非欠損部位とが増幅温度条件の範囲でアニールすることを避けることが好ましい。当該プローブの非欠損部位は、好ましくは０〜１２塩基、さらに好ましくは０〜６塩基である。特に限定はされないが、例えば配列表の配列番号１６に記載の塩基配列を有するものが好ましい。【００３０】
また、非欠損部位を認識するプローブは、さまざまな欠損において共通して欠損を受けない領域を選択されたものが好適に使用できる。特に限定はされないが、例えば配列表の配列番号１７に記載の塩基配列を有するものが好ましい。【００３１】
また、欠損部位に他の欠損変異と共通した領域が存在しないか、又は共通して欠損している領域の鎖長がプローブを設定するのに十分でない欠損変異が存在する場合、その欠損変異に対しては、上記の欠損部位を認識するプローブは非欠損部位を認識するプローブとして、非欠損部位を認識するプローブは欠損部位を認識するプローブとして用いることもできる。
特に限定はされないが、例えば図１に記載のＥＧＦＲ遺伝子のエキソン１９の欠損変異を例に挙げて説明すると、欠損配列Ｄｅｌ−１ａ、Ｄｅｌ−１ｂ、Ｄｅｌ−３、Ｄｅｌ−４、Ｄｅｌ−５の欠損部位を認識するプローブＤＦ（配列番号１６）は、欠損配列Ｄｅｌ−２に対しては非欠損部位を認識するプローブとして用いることができる。また、欠損配列Ｄｅｌ−１ａ、Ｄｅｌ−１ｂ、Ｄｅｌ−３、Ｄｅｌ−４、Ｄｅｌ−５の非欠損部位を認識するプローブＮＨ（配列番号１７）は、欠損配列Ｄｅｌ−２に対しては欠損部位を認識するプローブとして用いることができる。【００３２】
さらに本発明の方法において、特に限定はされないが例えば、ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法等などの当分野でよく用いられる遺伝子増幅法が利用できる。特に好ましい方法としては、例えばＰＣＲ法である。【００３３】
さらに本発明において利用できるリアルタイム検出法としては、ＴａｑＭａｎ法、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ法、Ｃｙｃｌｉｎｇ  ｐｒｏｂｅ法、ハイブリダイゼーションプローブ法、Ｃｙｃｌｅａｖｅ法などが挙げられる。特に限定はされないがＣｙｃｌｅａｖｅ法が好ましい。当該Ｃｙｃｌｅａｖｅ法では、増幅産物とＲＮＡ含有プローブでハイブリッドを形成させ、増幅産物とプローブの塩基配列が完全マッチのみ反応液中のＲＮａｓｅＨによりプローブのＲＮＡ部が切断され、ミスマッチの時はＲＮａｓｅＨによりＲＮＡ部は切断されない。このことを利用して、前記のプローブとして、波長の異なる２種以上の蛍光色素で標識され、前記蛍光色素間での蛍光の干渉が生じるようなプローブを使用した場合には、プローブの切断によってその蛍光物質の蛍光強度が変化する事から、変異の有無が判断できる。当該蛍光色素としては蛍光波長が２０ｎｍ以上へだたればよく、例えば６−ＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）とＨＥＸ（Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏ−６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、６−ＦＡＭとＲＯＸ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−Ｘ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、いずれもＡＢＩ社製）などの組合せが利用できる。【００３４】
また、当該プローブを蛍光物質と該蛍光物質の発する蛍光を消光する作用を有する物質、例えばＥｃｌｉｐｓｅ（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）またはＤＡＢＣＹＬ（４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏａｚｏｂｅｎｚｅｎｅ−４’−ｓｕｌｆｏｎｅ）との両者で、互いに適当な間隔をとって標識したものであってもよい。このようなプローブは、インタクトな状態では蛍光物質の発する蛍光の一部は消光物質によって熱エネルギーに変換されるが、切断されて蛍光物質と消光物質との距離が離れた場合には上記作用が解消され、検出される蛍光シグナル強度が上昇する。【００３５】
また、Ｃｙｃｌｅａｖｅ法では、同一反応系で２種類以上のプローブを使用することができる。このような場合、それぞれのプローブは波長の異なる蛍光色素で標識され、その蛍光強度変化の比から、より明確に変異の有無が判定できる。例えば、標的核酸中の欠損部位を検出するプローブと正常部位を検出するプローブをそれぞれ波長が異なる蛍光物質で標識し、Ｃｙｃｌｅａｖｅ法に用いた場合、欠損が存在する場合には、２つのプローブのうち欠損部位に相当するプローブによる蛍光シグナル強度の上昇は検出されず、正常部位に相当する他方のプローブによる蛍光シグナル強度の上昇のみを検出することができる。【００３６】
（Ｂ）本発明の方法のための組成物
本発明の組成物は、
上記（Ａ）記載の方法のための組成物であって、
（１）ＥＧＦＲ遺伝子の欠損ジャンクション領域にアニーリング可能な欠損配列用プライマー、ここで当該欠損配列用プライマーの３’末端の塩基配列は当該欠損ジャンクションに隣接する３’側の非欠損部位由来の２から５塩基からなる塩基配列であり、
（２）（１）の欠損配列用プライマーと対向するプライマー、ここで当該プライマーは欠損変異及び正常遺伝子のいずれにもアニーリング可能なプライマーであり、および
（３）ＤＮＡポリメラーゼを含有することを特徴とする。
更には、
（４）欠損部位を識別するプローブ、および
（５）非欠損部位を認識するプローブを含有する事を特徴とする。【００３７】
本発明の組成物において、特に限定はされないが例えば、配列表の配列番号６〜１０のいずれか記載の塩基配列を有するプライマーから選択される欠損配列用プライマー及び配列表の配列番号１１記載の塩基配列を有する前記欠損配列用プライマーと対向するプライマーを含有していてもよい。
さらには、配列表の配列番号１６、１７いずれか記載の塩基配列を有するプローブを含有していてもよい。
また、前記プローブは、上記（Ａ）に記載された標識を付されていてもよい。【００３８】
また、本発明の組成物に含有されるＤＮＡポリメラーゼとしては、特に限定するものではないが、ＤＮＡ増幅に一般的に利用されているＤＮＡポリメラーゼが好ましく、例えばＴａｑ（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ（Ｔｈｕｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ)由来ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ、および前記ＤＮＡポリメラーゼを２種類以上混合したＤＮＡポリメラーゼが挙げられ、より好ましくは、Ｔａｑ由来ＤＮＡポリメラーゼである。【００３９】
また、本発明の組成物には、当該組成物がＣｙｃｌｉｎｇ  ｐｒｏｂｅ法あるいはＣｙｃｌｅａｖｅ法に使用できるものであった場合には、プローブを開裂するための酵素を含有していてもよく、特に限定はされないが例えば、ＲＮａｓｅＨ（リボヌクレアーゼＨ）が挙げられる。ＲＮａｓｅＨは古細菌由来のものがより好適であり、特に、国際公開第０２／２２８３１号パンフレット記載の方法で調製することができるＲＮａｓｅＨ（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ）が好適に使用できる。さらに当該組成物においては核酸増幅反応試薬等を含有していてもよい。【００４０】
（Ｃ）本発明の方法のためのキット
本発明のキットは、
上記（Ａ）記載の方法のためのキットであって、
（１）ＥＧＦＲ遺伝子の欠損ジャンクション領域にアニーリング可能な欠損配列用プライマー、ここで当該欠損配列用プライマーの３’末端の塩基配列は当該欠損ジャンクションに隣接する３’側の非欠損部位由来の２から５塩基からなる塩基配列であり、および
（２）（１）の欠損配列用プライマーと対向するプライマー、ここで当該プライマーは欠損変異及び正常遺伝子のいずれにもアニーリング可能なプライマーであり、を含有する事を特徴とする。
更には、
（３）欠損部位を識別するプローブ、ならびに
（４）非欠損部位を認識するプローブを含有することを特徴とする。【００４１】
本発明のキットにおいて、特に限定はされないが例えば、配列表の配列番号６〜１０のいずれか記載の塩基配列を有するプライマーから選択される欠損配列用プライマー及び配列表の配列番号１１記載の塩基配列を有する前記欠損配列用プライマーと対向するプライマーを含有していてもよい。
さらには、配列表の配列番号１６、１７いずれか記載の塩基配列を有するプローブを含有していてもよい。また、前記プローブは、上記（Ａ）に記載された標識を付されていてもよい。【００４２】
また、本発明のキットに含有されるＤＮＡポリメラーゼとしては、上記（２）で例示されたものが好適に使用できる。【００４３】
また、本発明のキットには、上記（２）で例示された酵素を含有していてもよい。さらに核酸増幅反応試薬等を含有していてもよい。【００４４】
上記の、本発明の組成物及び／又は本発明のキットを使用する事により、ＥＧＦＲ遺伝子における欠損変異の有無を簡便に検出する事が可能となる。【００４５】
以下に実施例をもって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４６】
まず、コントロールテンプレートＤＮＡ、欠損配列検出用プライマーの合成を行った。即ち、ヒトＥＧＦＲ遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ２８８７３８）の１６４８５６番目〜１６４９４８番目の核酸配列より、正常配列コントロールテンプレートＤＮＡ（配列表の配列番号１）をＤＮＡ合成機により合成した。この配列は、ヒトＥＧＦＲ遺伝子エキソン１９（配列表の配列番号１８）の一部を含む。また、Ｐａｅｚらの文献、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０４、１４９７−１５００（２００４）に報告されたＥＧＦＲエキソン１９の欠損配列Ｄｅｌ−１ａ、Ｄｅｌ−１ｂ、Ｄｅｌ−３、Ｄｅｌ−４のアミノ酸配列情報および上記のヒトＥＧＦＲ遺伝子配列情報より、ＣＴＤｅｌ−１ａ（配列表の配列番号２）、ＣＴＤｅｌ−１ｂ（配列表の配列番号３）、ＣＴＤｅｌ−３（配列表の配列番号４）、及びＣＴＤｅｌ−４（配列表の配列番号５）をそれぞれＤＮＡ合成機により合成し、欠損配列コントロールテンプレートＤＮＡとした。得られた正常配列コントロールテンプレートＤＮＡ及び欠損配列コントロールテンプレートＤＮＡは、滅菌蒸留水でそれぞれ１００ｆｇ／μｌとなるように調製した。【００４７】
次にＥＧＦＲエキソン１９の欠損配列Ｄｅｌ−１ａ、Ｄｅｌ−１ｂ、Ｄｅｌ−３、Ｄｅｌ−４の検出用上流プライマーとして、Ｆ１Ｄ１ａ（配列表の配列番号６）、Ｆ２Ｄ１ｂ（配列表の配列番号７）、Ｆ３Ｄ３（配列表の配列番号８）、Ｆ４Ｄ４（配列表の配列番号９）及びＦ５Ｄ５（配列表の配列番号１０）をそれぞれＤＮＡ合成機により合成した。また、ＥＧＦＲエキソン１９の欠損配列および正常配列に共通の検出用下流プライマーとして、ＲＶ（配列表の配列番号１１）をＤＮＡ合成機により合成した。さらに、ＥＧＦＲエキソン１９の欠損配列Ｄｅｌ−１ａ、Ｄｅｌ−１ｂ、Ｄｅｌ−３、Ｄｅｌ−４の検出用上流プライマーとして、３’末端一塩基のみが正常配列と異なるＦ１−２Ｄ１ａ（配列表の配列番号１２）、Ｆ２−２Ｄ１ｂ（配列表の配列番号１３）、Ｆ３−２Ｄ３（配列表の配列番号１４）、及びＦ４−２Ｄ４（配列表の配列番号１５）についても、それぞれＤＮＡ合成機により合成した。図１に下流プライマーＲＶの位置を示す。図１において、それぞれの上流プライマーの位置を下線で示す。
【実施例２】
【００４８】
実施例１で調製した欠損配列用プライマーを用いたマルチプレックスＰＣＲ法によるＥＧＦＲエキソン１９欠損遺伝子の高感度検出について検討した。まず、鋳型となるＤＮＡを以下のようにして調製した。即ち、欠損配列ＣＴＤｅｌ−１ａが全コントロールテンプレートに対して５モル％となるように、実施例１で調整した１００ｆｇ／μｌ  ＣＴＤｅｌ−１ａ欠損配列コントロールテンプレートＤＮＡ溶液を１００ｆｇ／μｌ  正常配列コントロールテンプレートＤＮＡ溶液で希釈し、５モル％ＣＴＤｅｌ−１ａ欠損配列コントロールテンプレートＤＮＡ溶液とした。同様に、ＣＴＤｅｌ−１ｂ溶液、ＣＴＤｅｌ−３溶液、及びＣＴＤｅｌ−４溶液についても、それぞれ１００ｆｇ／μｌ  正常配列コントロールテンプレートＤＮＡ溶液で希釈し、５モル％欠損配列コントロールテンプレートＤＮＡ溶液とした。【００４９】
上記で調製した各５モル％欠損配列コントロールテンプレートＤＮＡ溶液中の欠損配列ＤＮＡの検出をマルチプレックスＰＣＲ法によって行った。反応液組成は、１０×ＰＣＲバッファー（タカラバイオ社製）、鋳型として１００ｆｇの５モル％の欠損配列を含むコントロールテンプレートＤＮＡまたは１００ｆｇの正常配列コントロールテンプレートＤＮＡ、並びに１．２５ＵのＴａＫａＲａ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を使用し、最終濃度が０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２μＭ  Ｆ１Ｄ１ａプライマー、０．２μＭ  Ｆ２Ｄ１ｂプライマー、０．２μＭ  Ｆ３Ｄ３プライマー、０．２μＭ  Ｆ４Ｄ４プライマー、０．２  μＭ  Ｆ５Ｄ５プライマー、０．２μＭ  ＲＶプライマーとなるように調製した。なお、反応液容量は、２５μｌである。ＰＣＲ増幅装置は、サーマルサイクラーＭＰ（タカラバイオ）を用い、反応条件は、９５℃  ３０秒、６０℃  ３０秒、７２℃  ３０秒を１サイクルとする３５サイクル反応とした。反応終了後、増幅産物を３％ＮｕＳｉｅｖｅ３：１アガロース（タカラバイオ社製）で電気泳動し、エチジウムブロマイド染色を行いて増幅産物を検出した。【００５０】
その結果、４種類の５モル％欠損配列コントロールテンプレートを鋳型にしたすべてのサンプルにおいて、それぞれの欠損配列コントロールＤＮＡに特異的な増幅鎖長に相当する増幅バンドのみが検出された。また、正常配列コントロールテンプレートＤＮＡを鋳型にしたサンプルでは、正常増幅鎖長に相当する８７ｂｐの増幅バンドは確認できなかった。このことから、本発明の方法によって、サンプル中の欠損配列を正確に増幅できることを確認した。
【実施例３】
【００５１】
ＡＲＭＳ法として報告されている３’末端１塩基のみが正常配列と異なる欠損配列用プライマーを用いたマルチプレックスＰＣＲ法によるＥＧＦＲエキソン１９欠損遺伝子検出と本発明の方法について比較・検討した。
即ち、実施例１で調製した３’末端の１塩基のみがＥＧＦＲエキソン１９正常配列と異なるＥＧＦＲエキソン１９欠損配列用上流プライマーＦ１−２Ｄ１ａ、Ｆ２−２Ｄ１ｂ、Ｆ３−２Ｄ３、Ｆ４−２Ｄ４、及びＦ５−２Ｄ５を用いて、５モル％欠損配列コントロールテンプレートＤＮＡ溶液中の欠損配列ＤＮＡの検出を行った。使用する欠損配列検出用上流プライマー以外は、ＰＣＲ条件とその後の増幅産物の検出は、実施例２と同様の条件で行った。【００５２】
その結果、Ｄｅｌ−１およびＤｅｌ−１ｂの５モル％欠損配列コントロールテンプレートＤＮＡを鋳型とした場合は、正常配列ＤＮＡを鋳型とした増幅鎖長に相当する８８ｂｐの増幅産物のみが検出された。また、Ｄｅｌ―４では正常配列ＤＮＡを鋳型とした増幅鎖長に相当する８８ｂｐの増幅産物と、Ｄｅｌ―４欠損配列ＤＮＡに特異的な増幅鎖長に相当する７０ｂｐの増幅産物が１：１の割合で検出された。
以上の結果および実施例２の結果より、大多数の正常配列ＤＮＡ存在下の欠損配列ＤＮＡの高感度検出には、実施例２で用いたような欠損配列に特異的かつプライマーの３’末端が正常配列と２塩基乃至３塩基異なる配列を有するプライマーが有効であることが確認できた。
【実施例４】
【００５３】
本発明の検出方法のＥＧＦＲエキソン１９欠損遺伝子検出の検出限界について検討した。
即ち、実施例２で調製した１００ｆｇ／μｌの５モル％欠損配列コントロールテンプレートＤＮＡ溶液をさらに１００ｆｇ／μｌの正常配列コントロールテンプレートＤＮＡ溶液で希釈し、１、０．１、０．０１モル％の欠損配列コントロールテンプレートＤＮＡ溶液を調製した。これらのＤＮＡをそれぞれ１００ｆｇ用いて、実施例２と同様の条件でＰＣＲ増幅を行い、正常配列ＤＮＡ存在下の欠損ＤＮＡに対する検出感度を検討した。その結果、Ｄｅｌ−１ａ及びＤｅｌ−１ｂは１モル％まで、Ｄｅｌ−３及びＤｅｌ―４は０．１モル％まで欠損配列コントロールテンプレートＤＮＡを検出することができた。
【実施例５】
【００５４】
欠損特異的プライマーマルチプレックスＰＣＲ法によるＥＧＦＲ  エキソン１９欠損遺伝子増幅産物のサイクリングプローブ法を用いた簡便検出について検討した。検出に用いるＥＧＦＲ  エキソン１９欠損配列検出用プローブとして、５’末端をＦＡＭ（アプライドバイオシステムズ社製）標識し、３’末端をＥｃｌｉｐｓｅクエンチャー（エポック社製）標識したプローブＤＦ（配列表の配列番号１６）、及び５’末端をＨＥＸ（アプライドバイオシステムズ社製）標識し、３’末端をＥｃｌｉｐｓｅクエンチャー標識したプローブ  ＮＨ（配列表の配列番号１７）をそれぞれＤＮＡ合成機により合成した。【００５５】
上記のプローブを用いて、欠損特異的プライマーマルチプレックスＰＣＲ法によるＥＧＦＲ  エキソン１９欠損遺伝子増幅産物のサイクリングプローブ法を用いた簡便検出を行った。反応液組成は、１０×ＰＣＲバッファー（タカラバイオ社製）、鋳型として１００ｆｇの５モル％の欠損配列を含むコントロールテンプレートＤＮＡ、１００ｆｇの正常配列コントロールテンプレートＤＮＡあるいは１００ｎｇの正常ゲノムＤＮＡ、１．２５ＵのＴａＫａＲａ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）並びに５０Ｕ  Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  ＩＩ（タカラバイオ  国際公開第０２／２２８３１号パンフレット）を使用し、最終濃度が０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２μＭ  Ｆ１Ｄ１ａプライマー、０．２μＭ  Ｆ２Ｄ１ｂプライマー、０．２μＭ  Ｆ３Ｄ３プライマー、０．２μＭ  Ｆ４Ｄ４プライマー、０．２μＭ  Ｆ５Ｄ５プライマー、０．２μＭ  ＲＶプライマー、０．２μＭ  プローブＮＨ、０．２μＭ  プローブＤＦとなるように調製した。なお、反応液容量は、２５μｌである。ＰＣＲ増幅および蛍光強度の検出には、ＡＢＩ７５００  ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社）を用いた。ＰＣＲ条件は、９５℃  １５秒、６０℃  ４０秒、７２℃  ３０秒を１サイクルとする４０サイクル反応で行った。また、ＰＣＲと同時にＡＢＩ７５００  ｓｙｓｔｅｍによりＦＡＭおよびＨＥＸの蛍光強度を測定した。【００５６】
その結果、欠損を受けない領域のプローブＮＨのＲＮａｓｅＨによる開裂によって起こるＨＥＸの蛍光強度の上昇は、５モル％欠損配列コントロールテンプレートＤＮＡを用いた全ての反応において顕著に認められた。一方、共通して欠損を受ける領域のプローブＤＦのＲＮａｓｅＨによる開裂によって起こるＦＡＭの蛍光強度の上昇は、５モル％欠損コントロールテンプレートＤＮＡを鋳型にした全ての反応においてほとんど確認されなかった。一方、正常配列コントロールテンプレートＤＮＡおよび正常ゲノムＤＮＡを鋳型とした反応では、プローブＤＦのＲＮａｓｅＨによる開裂及びプローブＮＨのＲＮａｓｅＨによる開裂によって起こる蛍光強度の上昇はほとんど確認されなかった。このことから、上記プローブを用いてリアルタイム検出ができることを確認した。【００５７】
さらに正常配列ＤＮＡを鋳型にした場合と変異配列ＤＮＡを鋳型にした場合における蛍光強度上昇の差を明らかにするために、各サンプルにおけるＦＡＭの蛍光強度当たりのＨＥＸの蛍光強度、ＨＥＸ／ＦＡＭ値を算出しプロットした。その結果を図２に示す。ここで、Ｎは正常配列コントロールテンプレートＤＮＡを鋳型とした場合のＨＥＸ／ＦＡＭ値を、Ｎ１〜Ｎ５は正常ゲノムＤＮＡを鋳型とした場合のＨＥＸ／ＦＡＭ値を、Ｄｅｌ１−１ａ、Ｄｅｌ１−１ｂ、Ｄｅｌ−３、Ｄｅｌ−４は欠損配列コントロールテンプレートＤＮＡを鋳型とした場合のＨＥＸ／ＦＡＭ値を示す。図２に示したように正常配列コントロールテンプレートＤＮＡおよび５種類の正常ゲノムＤＮＡを鋳型にした反応においては、すべて０．５以下の極めて低いＨＥＸ／ＦＡＭ値を示したのに対して、５モル％欠損配列コントロールテンプレートＤＮＡではＨＥＸ／ＦＡＭ値は５．８〜５２．５であり、欠損配列コントロールテンプレートＤＮＡを含むサンプルでは、正常配列ＤＮＡのみを含むサンプルに比べて１０倍以上の高い値を示した。この様に、ＨＥＸ／ＦＡＭ値を指標にすることにより、ＥＧＦＲ  エキソン１９欠損配列の存在を明確に判定できることが示された。
以上のように、サイクリングプローブ法と欠損配列特異的プライマーマルチプレックスＰＣＲ法を組み合わせる事により、正常遺伝子存在下においてもＥＧＦＲ  エキソン１９欠損遺伝子の５モル％混在を検出することができ、高感度で簡便なシングルチューブでの検出法が有効であることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明によって、欠損パターンが一定していないＥＧＦＲ遺伝子のエキソン１９における体細胞欠損変異の簡便で迅速でなおかつ高感度な検出方法が提供される。該検出方法は、抗癌剤の効果予測や疫学調査、疾患予測において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００５９】
SEQ ID NO:1:Control template DNA
SEQ ID NO:2:Control template DNA CTDel-1a
SEQ ID NO:3:Control template DNA CTDel-1b
SEQ ID NO:4:Control template DNA CTDel-3
SEQ ID NO:5:Control template DNA CTDel-4
SEQ ID NO:6:PCR primer F1D1a to amplify a deletion mutant "Del-1a"
SEQ ID NO:7:PCR primer F2D1b to amplify a deletion mutant "Del-1b"
SEQ ID NO:8:PCR primer F3D3 to amplify a deletion mutant "Del-3"
SEQ ID NO:9:PCR primer F4D4 to amplify a deletion mutant "Del-4"
SEQ ID NO:10:PCR primer F5D5 to amplify a deletion mutant "Del-5"
SEQ ID NO:11:PCR primer RV to amplify a deletion mutant of EGFR exon 19
SEQ ID NO:12:PCR primer F1-2D1a to amplify a deletion mutant "Del-1a"
SEQ ID NO:13:PCR primer F2-2D1b to amplify a deletion mutant "Del-1b"
SEQ ID NO:14:PCR primer F3-2D3 to amplify a deletion mutant "Del-3"
SEQ ID NO:15:PCR primer F4-2D4 to amplify a deletion mutant "Del-4"
SEQ ID NO:16:Chimeric oligonucleotide probe DF to detect the DNA fragment of human mutant type EGFR exon 19. "nucleotides 4 is a ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO:17:Chimeric oligonucleotide probe NH to detect the DNA fragment of human mutant type EGFR exon 19. "nucleotides 5 is a ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides"
【図１−１】
2006070667.tif 000002
【図１−２】
2006070667.tif 000003
【図２】
2006070667.tif 000004
【配列表】
2006070667000001.app
【国際調査報告】
2006070667.tif 000005
2006070667.tif 000006