(57)【要約】本発明は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）のがん細胞の生存・増殖への関与を明らかにし、がんの治療・診断のための新たな手段を提供する。すなわち、ＧＳＫ３βの発現あるいは、その第２１６番チロシン残基のリン酸化により活性化されている前記酵素の活性を阻害することによりがん細胞の生存や増殖を抑制する方法、および前記阻害効果に基づく新規抗がん剤の開発と抗がん剤の評価方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）の発現あるいは、その第２１６番チロシン残基のリン酸化により活性化されている前記酵素の活性を阻害することにより、がん細胞の生存および／または増殖を抑制する方法。
【請求項２】
式（Ｉ）または（ＩＩ）の構造を有する化合物もしくはその薬理学的に許容される塩を作用させることを含む、請求項１に記載の方法
2006073202.tif 000014
（ここで、Ｑ１は−（ＣＨ２）ｎ−Ａｒ−Ｏ−（ｎは１〜５の整数、Ａｒは置換または非置換アリール）であり、Ｑ２はハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニルまたはアルキルスルホニルから選ばれる基である）
2006073202.tif 000015
（ここで、Ｒ１は水素、アルキル、アラルキル、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、アミノアルキル、モノアルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アジドアルキル、アシルアミノアルキル、アルキルスルホニルアミノアルキル、アリールスルホニルアミノアルキル、メルカプトアルキル、アルキルチオアルキル、グルコピラノシル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、ヒドロキシアルキルチオアルキル、メルカプトアルキルチオアルキル、アリールチオアルキルまたはカルボキシアルキルチオアルキルであり、
Ｒ２は水素、アルキル、アラルキル、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、アミノアルキル、モノアルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アシルアミノアルキル、アルキルスルホニルアミノアルキル、アリールスルホニルアミノアルキル、メルカプトアルキル、アルキルチオアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、アルキルチオまたはアルキルスルフィニルであり、
Ｒ３はハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニルおよびアルキルスルホニルからなる群より選ばれる１または２以上の置換基で置換されたフェニル基であり、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、互いに独立して、水素、ハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニルまたはアルキルスルホニルである）
【請求項３】
前記化合物が、Ｎ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ’―（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）ウレアまたは３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記がんが大腸癌、胃癌、膵癌、肝癌、および神経膠芽腫から選ばれるいずれか一つ以上である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記がんが大腸癌である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
式（Ｉ）または（ＩＩ）の構造を有する化合物もしくはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含む、がんの治療用医薬組成物：
2006073202.tif 000016
（ここで、Ｑ１は−（ＣＨ２）ｎ−Ａｒ−Ｏ−（ｎは１〜５の整数、Ａｒは置換または非置換アリール）であり、Ｑ２はハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニルまたはアルキルスルホニルから選ばれる基である）
2006073202.tif 000017
（ここで、Ｒ１は水素、アルキル、アラルキル、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、アミノアルキル、モノアルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アジドアルキル、アシルアミノアルキル、アルキルスルホニルアミノアルキル、アリールスルホニルアミノアルキル、メルカプトアルキル、アルキルチオアルキル、グルコピラノシル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、ヒドロキシアルキルチオアルキル、メルカプトアルキルチオアルキル、アリールチオアルキルまたはカルボキシアルキルチオアルキルであり、
Ｒ２は水素、アルキル、アラルキル、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、アミノアルキル、モノアルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アシルアミノアルキル、アルキルスルホニルアミノアルキル、アリールスルホニルアミノアルキル、メルカプトアルキル、アルキルチオアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、アルキルチオまたはアルキルスルフィニルであり、
Ｒ３はハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニルおよびアルキルスルホニルからなる群より選ばれる１または２以上の置換基で置換されたフェニル基であり、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、互いに独立して、水素、ハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニルまたはアルキルスルホニルである）
【請求項７】
前記化合物が、Ｎ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ’−（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）ウレアまたは３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンである、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記化合物が、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）の第２１６番目のチロシン残基のリン酸化により活性化される前記酵素の活性を阻害して、がん細胞の生存および／または増殖を抑制するものである、請求項６又は７記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記がんが大腸癌、胃癌、膵癌、肝癌、および神経膠芽腫から選ばれるいずれか一つ以上である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記がんが大腸癌である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）の第２１６番目チロシン残基のリン酸化による前記酵素の活性化に対する阻害効果を指標として、被験物質の抗がん剤としての効果を評価する方法。
【請求項１２】
下記の工程を含む、請求項１１に記載の方法：
１）細胞を被験物質の添加または非添加条件下で培養する；
２）上記細胞内における第２１６チロシン残基リン酸化ＧＳＫ３β蛋白質分画の発現量を検出するか、あるいはＧＳＫ３βの酵素活性を検出・測定する
３）被験物質の添加または非添加条件下における、上記発現量あるいは活性の相違に基づいて、該被験物質の抗がん剤としての効果を評価する。
【請求項１３】
細胞ががん患者から単離された細胞または癌細胞株である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
下記の工程を含む、請求項１１に記載の方法：
１）がんモデル動物を被験物質の投与または非投与の条件下で飼育する。
２）上記動物の血液または細胞中における第２１６チロシン残基リン酸化ＧＳＫ３β蛋白質分画の発現量を検出する。
３）被験物質の投与または非投与条件下における、上記発現量の相違と移植腫瘍の増殖の変化に基づいて、該被験物質の抗がん剤としての効果を評価する。
【請求項１５】
動物がマウスである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
蛋白質の発現量が、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＥＬＩＳＡ法、およびＲＩＡ法から選ばれるいずれか一つの方法によって検出されることを特徴とする、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第２１６番目チロシン残基がリン酸化されたグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）の活性を阻害すること、またはＧＳＫ３βの第２１６番目チロシン残基のリン酸化を阻害することによりがん細胞の生存や増殖を抑制する方法、ならびに前記阻害効果に基づく新規抗がん剤の開発および抗がん剤の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、大腸がんの発生・進展の分子機構においてβ−カテニンの安定化による活性化が、ｒａｓがん遺伝子産物のがん化作用とともに有力な新規がん化シグナルとして注目されている（非特許文献１および２参照）。β−カテニンは細胞増殖にかかわるＷｎｔシグナル伝達系の中心的な実行因子であり、そのがん化作用はこれまでｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験系やトランスジェニック動物モデルを用いた多数の研究により支持されている（非特許文献３参照）。
発明者らは、最近、腫瘍細胞核内におけるβ−カテニンの集積様式の違いから、ヒト大腸癌には２種類のβ−カテニン活性化パターンがあることを見出した（非特許文献４参照）。つまり、４０−５０％の大腸がん症例ではβ−カテニンの核内集積（ＮＡ）、すなわち活性化が腫瘍全体に認められる（ＮＡｄ）のに対し、１０−１５％の症例ではその集積（活性化）が腫瘍浸潤先進部に限局して検出される（ＮＡｉｎｖ）。そして、このβ−カテニンのＮＡｉｎｖ型活性化が大腸癌の病期の進行と術後の再発に有意に相関する。この結果は、大腸癌におけるβ−カテニンのがん化シグナル活性化パターンが、腫瘍の転移・再発や患者の術後生存率の信頼性の高い予測因子になり得ることを示唆する（非特許文献４および５参照）。
グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（以下、「ＧＳＫ３β」と記載する）は、このＷｎｔ／β−カテニンシグナル系の制御因子群（非特許文献２および３参照）の１つであり、生理的条件下の細胞においてβ−カテニンをリン酸化して、ＡＰＣがん抑制蛋白質やアキシン（いずれもＧＳＫ３βの基質）などから構成されるユビキチン分解系に誘導する。このことは、ＧＳＫ３β活性と大腸癌の仮説的接点として、ＧＳＫ３βの第９セリン残基リン酸化に伴う不活性化が標的基質であるβ−カテニンをユビキチン分解系から回避させ、がん化シグナルの活性化に導くことを示唆する。
ＧＳＫ３βは様々な細胞内シグナル伝達を媒介する多機能セリン・スレオニンキナーゼ（リン酸化酵素）であり、エネルギー代謝、転写調節、細胞増殖・生存等を含む広範な細胞調節過程を制御する（非特許文献６−９参照）。つまり、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナルの制御は本酵素の多彩な機能の１つにすぎない。ＧＳＫ３βは細胞内シグナル伝達を媒介する多くの蛋白質リン酸化酵素とは異なり、正常細胞において活性化型として存在し、種々の刺激によってその活性が抑制的に制御されている。ＧＳＫ３βの基質には、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｍｙｃ等の多様ながん化関連転写因子（非特許文献１０および１１参照）や、β−カテニン、Ｇｌｉ蛋白質等の原がん遺伝子産物（非特許文献１２および１３参照）が含まれ、これら基質の不活性化を介して細胞の腫瘍性形質転換や腫瘍発生を妨げる。また、ＧＳＫ３βはＮＦ−κＢ細胞不死化シグナルを介して細胞の生存に本質的な役割も果たしている（非特許文献１５および１６参照）。こうしたＧＳＫ３βの機能から、ＧＳＫ３β遺伝子を細胞の異常増殖マーカーとして利用することを報告した特許出願もある（特許文献１参照）。
最近、ＧＳＫ３βがインスリン非依存性糖尿病（ｎｏｎ−ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ［ＮＩＤＤＭ］：２型糖尿病）やアルツハイマー病をはじめとする神経変性疾患の発症にも関与していることがわかってきた（非特許文献１４参照）。そのため、ＧＳＫ３β阻害剤を神経変性疾患や２型糖尿病やがん等の治療に応用する特許出願もなされているが（特許文献２および３参照）、いずれも特定化合物のＧＳＫ３β阻害効果と既知の知見から当該化合物のこれら疾患への適用を予測するものにすぎず、とくにがんについては実証されていない。
上記のとおり、ＧＳＫ３βはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の負の制御因子であることから、ＧＳＫ３βを介したシグナル伝達制御機能の異常ががんにおけるβ−カテニンシグナル活性化パターンに関連しているかどうかを明らかにすることは重要な課題である。一方、本酵素遺伝子のノックアウト動物の解析により、ＧＳＫ３βはＮＦ−κＢ経路を介した細胞の生存と増殖を維持する作用が報告されている（非特許文献１２および１３参照）。また、前立腺癌由来細胞株において、ＧＳＫ３β阻害がＴＲＡＩＬ（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ）による薬剤感受性を亢進させたり、細胞増殖を抑制する報告もある（非特許文献１７、１８および１９参照）。このように、細胞生存・増殖やがん化にかかわる基幹的な細胞内シグナルに対して相反する作用が提唱されていることから、ＧＳＫ３βがＷｎｔシグナルとは異なる独自の分子メカニズムを介してがん細胞に影響を及ぼしている可能性があるのではないかと想定される。しかしながら、これまでＧＳＫ３βは細胞の腫瘍性形質転換や腫瘍発生に対し抑制的に作用するという仮説から、ＧＳＫ３β阻害剤には潜在的発がん性が予測されている。それゆえ、ＧＳＫ３βとがんの発生・進展との関与については報告が少なく、詳細な検討がなされてはいなかった。
【特許文献１】特表２００４−５２８８３７号公報
【特許文献２】特表２００４−５０４８３８号公報
【特許文献３】特表２００４−５０７５４５号公報
【非特許文献１】Ｊａｓｓ  ＪＲ，Ｗｈｉｔｅｈａｌｌ  ＶＬＪ，Ｙｏｕｎｇ  Ｊ，Ｌｅｇｇｅｔｔ  ＢＡ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２００２；１２３（３）：８６２−７６．
【非特許文献２】Ｗｏｎｇ  ＮＡ，Ｐｉｇｎａｔｅｌｌｉ  Ｍ．β−ｃａｔｅｎｉｎ−ａ  ｌｉｎｃｈｐｉｎ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００２；１６０（２）：３８９−４０１．
【非特許文献３】Ｐｏｌａｋｉｓ  Ｐ．Ｔｈｅ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  １９９９；９（１）：１５−２１．
【非特許文献４】Ｏｕｇｏｌｋｏｖ  ＡＶ，Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｋ，Ｍａｉ  Ｍ，Ｍｉｎａｍｏｔｏ  Ｔ．Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  β−ｃａｔｅｎｉｎ  ａｎｄ  ＭＭＰ−７（ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ）ｃｏｓｅｇｒｅｇａｔｅ  ｉｎ  ｌａｔｅ−ｓｔａｇｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２００２；１２２（１）：６０−７１．
【非特許文献５】Ｚｈａｎｇ  Ｂ，Ｏｕｇｏｌｋｏｖ  Ａ，Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｋ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｙ，Ｍａｉ  Ｍ，Ｍｉｎａｍｏｔｏ  Ｔ．β−ｃａｔｅｎｉｎ  ａｎｄ  ｒａｓ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ  ｄｅｔｅｃｔ  ｍｏｓｔ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００３；９（８）：３０７３−９．
【非特許文献６】Ｍａｎｏｕｋｉａｎ  ＡＳ，Ｗｏｏｄｇｅｔｔ  ＪＲ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ：ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｗｎｔｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ａｄｖ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００２；８４：２０３−２９．
【非特許文献７】Ｄｏｂｌｅ  ＢＷ，Ｗｏｏｄｇｅｔｔ  ＪＲ．ＧＳＫ−３：ｔｒｉｃｋｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｄｅ  ｆｏｒ  ａｍｕｌｔｉ−ｔａｓｋｉｎｇ  ｋｉｎａｓｅ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  ２００３；１１６（Ｐｔ  ７）：１１７５−８６．
【非特許文献８】Ｈａｒｗｏｏｄ  ＡＪ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＧＳＫ−３；ａ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｕｌｔｉｐｒｏｃｅｓｓｏｒ．Ｃｅｌｌ  ２００１；１０５（７）：８２１−４．
【非特許文献９】Ｋｉｍ  Ｌ，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａ，Ｋｉｍｍｅｌ  ＡＲ．Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＧＳＫ３  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｃｅｌｌ  ｆａｔｅｃｈｏｉｃｅ．Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  ２００２；３（４）：５２３−３２．
【非特許文献１０】Ｍｏｒｔｏｎ  Ｓ，Ｄａｖｉｓ  ＲＪ，ＭｃＬａｒｅｎ  Ａ，Ｃｏｈｅｎ  Ｐ．Ａｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｃ−Ｊｕｎ．ＥＭＢＯ  Ｊ  ２００３；２２（１５）：３８７６−８６．
【非特許文献１１】Ｇｒｅｇｏｒｙ  ＭＡ，Ｑｉ  Ｙ，Ｈａｎｎ  ＳＲ．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｋｉｎａｓｅ−３  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｃ−ｍｙｃ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｕｂｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００３：２７８（５１）：５１６０６−１２．
【非特許文献１２】Ｐｒｉｃｅ  ＭＡ，Ｋａｌｄｅｒｏｎ  Ｄ．Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｃｕｂｉｔｕｓ  ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｕｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３  ａｎｄ  ｃａｓｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  １．Ｃｅｌｌ  ２００２；１０８（６）：８２３−３５．
【非特許文献１３】Ｊｉａ  Ｊ，Ａｍａｎａｉ  Ｋ，Ｗａｎｇ  Ｇ，Ｔａｎｇ  Ｊ，Ｗａｎｇ  Ｂ，Ｊｉａｎｇ  Ｊ．Ｓｈａｇｇｙ／ＧＳＫ３  ａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｂｙ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｃｕｂｉｔｕｓ  ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｕｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００２；４１６（６８８０）：５４８−５２．
【非特許文献１４】Ｃｏｈｅｎ  Ｐ，Ｇｏｅｄｅｒ  Ｍ．ＧＳＫ３  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ２００４；３（６）：４７９−８７．
【非特許文献１５】Ｈｏｅｆｌｉｃｈ  ＫＰ，Ｌｕｏ  Ｊ，Ｒｕｂｉｅ  ＥＡ，Ｔｓａｏ  ＭＳ，Ｊｉｎ  Ｏ，Ｗｏｏｄｇｅｔｔ  ＪＲ．Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３β  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ＮＦ−κＢ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０００；４０６（６７９１）：８６−９０．
【非特許文献１６】Ｓｃｈｗａｂｅ  ＲＦ，Ｂｒｅｎｎｅｒ  ＤＡ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３  ｉｎ  ＴＮＦ−α−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＮＦ−κ  Ｂ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２００２；２８３（１）：Ｇ２０４−１１．
【非特許文献１７】Ｌｉａｏ  Ｘ，Ｚｈａｎｇ  Ｌ，Ｔｈｒａｓｈｅｒ  ＪＢ，Ｄｕ  Ｊ，Ｌｉ  Ｂ．Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３β  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２００３；２（１１）：１２１５−１２２２．
【非特許文献１８】Ｗａｎｇ  Ｌ，Ｌｉｎ  Ｈ−Ｋ，Ｈｕ  Ｙ−Ｃ，Ｘｉｅ  Ｓ，Ｙａｎｇ  Ｌ，Ｃｈａｎｇ  Ｃ．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３β  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００４；２７９（３１）：３２４４４−３２４５２．
【非特許文献１９】Ｍａｚｏｒ  Ｍ，Ｋａｗａｎｏ  Ｙ，Ｚｈｕ  Ｈ，Ｗａｘｍａｎ  Ｊ，Ｋｙｐｔａ  ＲＭ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３  ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ  ａｎｄｒｏｇｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００４；２３（４７）：７８８２−７８９２
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）とがんの発生・進展との関与を明らかにし、がんの治療・診断のための新たな手段を提供することにある。
発明者らは、上記課題を検討するために、大腸癌細胞株および同一大腸がん患者の非がん組織と癌組織におけるＧＳＫ３βの発現と第９セリン残基リン酸化解析を通じた酵素活性化の程度を比較解析した。さらに、ＧＳＫ３βの発現と活性をそれぞれ転写調節的ならびに薬理学的に修飾することにより大腸癌細胞の増殖に及ぼす本酵素の影響を研究した。
その結果、大部分の大腸癌組織や大腸癌細胞株においてそれぞれの非がん粘膜や細胞（ＨＥＫ２９３）に比べてＧＳＫ３βとその第２１６チロシン残基がリン酸化された活性化型ｐｈｏｓｐｈｏ−ＧＳＫ３βＴｙｒ２１６分画の発現が亢進し、一方、第９セリン残基がリン酸化された不活性化型ｐｈｏｓｐｈｏ−ＧＳＫ３βＳｃｒ９分画の発現はほとんど認められなかった。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて大腸癌細胞株や神経膠芽腫細胞株等のがん細胞の生存と増殖は低分子量タイプのＧＳＫ３β阻害剤の投与により用量（濃度）依存的に抑制され、同様にＧＳＫ３βに対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によっても抑制された。さらに、大腸がんモデル動物においてもＧＳＫ３β阻害剤投与による腫瘍組織の用量依存的縮小が観察された。このことは、従来の知見とは異なり、ＧＳＫ３βの発現や活性ががん（とくに大腸がん）の治療や予防の新たな標的となりうることを提示している。
すなわち本発明は、ＧＳＫ３βの発現や第２１６番目チロシン残基リン酸化による活性化阻害を通じて本酵素活性を抑制することにより、がん細胞の生存や増殖を抑制する方法に関する。
前記方法は、式（Ｉ）または（ＩＩ）の構造を有する化合物もしくはその薬理学的に許容される塩をがん細胞に作用させることによって実施できる。
2006073202.tif 000002
（ここで、Ｑ１は−（ＣＨ２）ｎ−Ａｒ−Ｏ−（ｎは１〜５の整数、Ａｒは置換または非置換アリール）であり、Ｑ２はハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニルまたはアルキルスルホニルから選ばれる基である）
2006073202.tif 000003
（ここで、Ｒ１は水素、アルキル、アラルキル、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、アミノアルキル、モノアルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アジドアルキル、アシルアミノアルキル、アルキルスルホニルアミノアルキル、アリールスルホニルアミノアルキル、メルカプトアルキル、アルキルチオアルキル、グルコピラノシル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、ヒドロキシアルキルチオアルキル、メルカプトアルキルチオアルキル、アリールチオアルキルまたはカルボキシアルキルチオアルキルであり、
Ｒ２は水素、アルキル、アラルキル、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、アミノアルキル、モノアルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アシルアミノアルキル、アルキルスルホニルアミノアルキル、アリールスルホニルアミノアルキル、メルカプトアルキル、アルキルチオアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、アルキルチオまたはアルキルスルフィニルであり、
Ｒ３はハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニルおよびアルキルスルホニルからなる群より選ばれる１または２以上の置換基で置換されたフェニル基であり、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、互いに独立して、水素、ハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニルまたはアルキルスルホニルである）
前記化合物の好ましい一例としては、例えば、下式に示されるＮ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ’−（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）ウレアまたは３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンを挙げることができる。
2006073202.tif 000004
本発明はまた、上記した化合物もしくはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含む、がんの治療用医薬組成物も提供する。本明細書では、前記医薬組成物の大腸がん、胃がん、膵がん、肝細胞がん、および神経膠芽腫細胞に対する効果や、ヌードマウス移植大腸癌に対する薬理効果を示したが、本発明の医薬組成物の効果はこれに限られるものでなく、あらゆるがんに対してその効果が期待される。
本発明はまた、ＧＳＫ３βの第２１６番目チロシン残基のリン酸化による本酵素の活性化に対する阻害効果を指標として、被験物質の抗がん剤としての効果を評価する方法を提供する。
前記方法は、たとえば、以下の工程により実施できる：
１）細胞を被験物質の添加または非添加条件下で培養する；
２）上記細胞内における第２１６チロシン残基リン酸化ＧＳＫ３β蛋白質分画の発現量を検出するか、あるいはＧＳＫ３β酵素活性を検出・測定する
３）被験物質の添加または非添加条件下における、上記の酵素発現量あるいは活性の相違に基づいて、該被験物質の抗がん剤としての効果を評価する。
前記方法において、細胞はがん患者から単離された細胞または癌細胞株、例えば、ＳＷ４８０，ＳＷ６２０，ＨＴ２９，ＬｏＶｏ，ＨＣＴ１１６，ＳＷ４８およびＲＫＯ等の大腸癌細胞株やＡ１７２，Ｔ９８Ｇ，Ｕ２５１，Ｕ８７等の神経膠芽腫細胞株等を用いることができる。
本発明の方法は、また、以下の工程によっても実施できる：
１）がんモデル動物を被験物質の投与または非投与の条件下で飼育する。
２）上記動物の血液または細胞中における第２１６チロシン残基リン酸化ＧＳＫ３β蛋白質分画の発現量を検出する。
３）被験物質の投与または非投与条件下における、上記発現量の相違と移植腫瘍の増殖の変化に基づいて、該被験物質の抗がん剤としての効果を評価する。
前記方法において、動物は齧歯類、特にマウスが好ましい。
また、本発明の方法において、蛋白質の発現量は、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＥＬＩＳＡ法、およびＲＩＡ法から選ばれるいずれか一つの方法によって検出することができる。
本発明によれば、ＧＳＫ３β抑制効果に基づく新規の抗がん剤の提供とそのスクリーニングが可能になる。また、ＧＳＫ３βレベルを指標とするがんの早期診断が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、大腸癌細胞株とヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３における、（Ａ）ウエスタンブロット法による総ＧＳＫ３βとｐｈｏｓｐｈｏ−ＧＳＫ３βＳｅｒ９（不活性化型）およびｐｈｏｓｐｈｏ−ＧＳＫ３βＴｙｒ２１６（活性化型）の発現をそれぞれ特異的抗体（ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓおよびＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて解析した結果、（Ｂ）ＧＳＫ３β活性を合成ヒトβ−カテニン蛋白を基質にして、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｋｉｎａｓｅ  ａｓｓａｙにより検出した（Ａｄｌｅｒ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９７；９４：１６８６−９１に記載されている検出方法を用いた）結果、（Ｃ）ＧＳＫ３β（シグナル）の上流で活性化されるプロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ／Ａｋｔ）の活性化を抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡｋｔＴｈｒ３０８抗体や抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡｋｔＳｅｒ４７３抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて検出した結果。
図２は、ＨＥＫ２９３細胞（上４枚の図）とＳＷ４８０大腸癌細胞株（下４枚の図）における総ＧＳＫ３β（赤色蛍光）とｐｈｏｓｐｈｏ−ＧＳＫ３βＳｅｒ９（緑色蛍光）の二重免疫蛍光細胞化学染色による発現と局在の観察結果を示す。図の尺度線は１００μｍに相当し、画像はすべて同一倍率で撮影された。
図３は、大腸がん症例の正常粘膜および腫瘍組織における、総ＧＳＫ３β、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＧＳＫ３βＳｅｒ９（不活性化型）およびｐｈｏｓｐｈｏ−ＧＳＫ３βＴｙｒ２１６（活性化型）分画の発現レベルを検出した結果を示す。各パネル上段の数字は患者ＩＤ番号（表２と対応）。Ｎ：非がん（正常）粘膜組織；Ｔ：癌組織。
図４は、ＡＲ−Ａ０１４４１８とＳＢ−２１６７６３のＨＥＫ２９３細胞および各種大腸癌細胞株のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける生存、増殖とアポトーシスにおよぼす影響（効果）を解析した結果を示す。Ａ，Ｂ，Ｅ：０日目から特定時間（２４，４８，７２および９６時間）経過した時点でＭＴＳアッセイにより計測した各ウェルの生細胞数。Ｃ，Ｄ：抗ＰＣＮＡ（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ）抗体による免疫蛍光法とＨｏｅｃｈｓｔにより２重染色し、蛍光顕微鏡で観察したときの、全観察細胞に占める増殖細胞核（ＰＣＮＡ陽性）（Ｄ）あるいは、アポトーシスを生じている核（Ｃ）の比率。
図５は、ＧＳＫ３βを標的とするｓｉＲＮＡのＨＥＫ２９３細胞（上）とＳＷ４８０大腸癌細胞（下）のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞生存率におよぼす効果を示す。
図６は、大腸癌細胞移植動物モデルに対するＧＳＫ３β阻害剤投与による治療実験プロトコールの概略を示している。
図７は、異なる用量のＧＳＫ３β阻害剤（ＡＲ−Ａ０１４４１８あるいはＳＢ−２１６７６３）、あるいはＤＭＳＯ投与開始して５週間後における大腸癌細胞移植マウスの写真である。
図８は、大腸癌細胞移植マウスにおいて、異なる用量のＧＳＫ３β阻害剤（ＡＲ−Ａ０１４４１８あるいはＳＢ−２１６７６３）、あるいはＤＭＳＯを投与開始後の移植腫瘍体積の経時的変化を示すグラフである。
図９は、各種の神経膠芽腫細胞株（Ｔ９８Ｇ、Ａ１７２、Ｕ２５１、Ｕ８７）の細胞生存におよぼす、異なる濃度のＧＳＫ３β阻害剤（ＡＲ−Ａ０１４４１８あるいはＳＢ−２１６７６３）、あるいはＤＭＳＯの作用を経時的に示すグラフである。
図１０は、各種の神経膠芽腫細胞株（Ａ１７２、Ｔ９８Ｇ、Ｕ２５１、Ｕ８７）および非がん細胞株（ＨＥＫ２９３）に対するＧＳＫ３β阻害剤（ＡＲ−Ａ０１４４１８あるいはＳＢ−２１６７６３）の影響を示す。（Ａ）は、ＡＲ−Ａ０１４４１８処理後９６時間の生存腫瘍細胞数を示すグラフである。（Ｂ）は、ＡＲ−Ａ０１４４１８あるいはＳＢ−２１６７６３処理後の腫瘍細胞におけるアポトーシス誘導を示すグラフである。（Ｃ）は、ＡＲ−Ａ０１４４１８あるいはＳＢ−２１６７６３処理後の増殖期細胞分画（ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙ−ｕｒｉｄｉｎｅ［ＢｒｄＵ］取り込み量）を示すグラフである。
図１１は、各大腸癌細胞株（ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６）および非がん細胞株（ＨＥＫ２９３）の細胞老化に対する、それぞれ２５μＭのＧＳＫ３β阻害剤（ＡＲ−Ａ０１４４１８あるいはＳＢ−２１６７６３）の影響をＤＭＳＯの場合と比較して、β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ活性の指標であるｘ−ｇａｌ染色により調べた結果を示す。
図１２は、各大腸癌細胞株（ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６）および非がん細胞株（ＨＥＫ２９３）をそれぞれ２５μＭのＧＳＫ３β阻害剤（ＡＲ−Ａ０１４４１８あるいはＳＢ−２１６７６３）あるいはＤＭＳＯにより処理して７２時間後の老化細胞比率の変化を、ｘ−ｇａｌ染色により調べた結果を示す。
図１３は、各大腸癌細胞株（ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６）および非がん細胞株（ＨＥＫ２９３）における、ｈｕｍａｎ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ｈＴＥＲＴ）の発現に対するＧＳＫ３β阻害剤（ＡＲ−Ａ０１４４１８あるいはＳＢ−２１６７６３）の影響を調べた結果である。
図１４は、各大腸癌細胞株（ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６）および非がん細胞株（ＨＥＫ２９３）における、ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ活性に対するＧＳＫ３β阻害剤（ＡＲ−Ａ０１４４１８あるいはＳＢ−２１６７６３）の影響を調べた結果である。
図１５は、各大腸癌細胞株（ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６）および非がん細胞株（ＨＥＫ２９３）における、（Ａ）ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ活性や（Ｂ）ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの発現に対するＧＳＫ３β発現阻害の影響を、ｓｉＲＮＡトランスフェクション（小分子干渉ＲＮＡ導入）により調べた結果を示す。
図１６は、本発明に係る非放射性試験管内ＧＳＫ３β酵素活性検出法（Ｎｏｎ−ＲＩ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｋｉｎａｓｅ  ａｓｓａｙ）の原理と概要を示す。
図１７は、非放射性試験管内ＧＳＫ３β酵素活性検出法により各種細胞株におけるＧＳＫ３β酵素活性を検出・比較した結果を示す。
図１８は、ＨＥＫ２９３細胞と各種の培養癌細胞株：ＳＷ４８０，ＨＣＴ１１６，ＨＴ２９（大腸癌）；ＭＫＮ−２８，ＮＫＰＳ，ＴＭＫ−１，ＮＵＧＣ−４（胃癌）；ＭＩＡ−ＰａＣａ−２，Ｃａｐａｎ−１，ＢｘＰＣ−３（膵臓癌）；ＨＥＰ−Ｇ２（肝細胞癌）におけるＧＳＫ３β酵素活性を非放射性試験管内ＧＳＫ３β酵素活性検出法により検出した結果を示している。Ｐ，Ｃ：同一細胞からの抽出蛋白質に対して抗ＧＳＫ３β抗体により免疫沈降した検体（Ｐ）と、同抗体の代わりに非特異的マウスＩｇＧを添加して同様に解析した検体（陰性対照）（Ｃ）。
図１９は、大腸癌細胞株（ＳＷ４８０とＨＣＴ１１６）から免疫沈降したＧＳＫ３β酵素活性に対する、それぞれ２５μＭのＧＳＫ３β阻害剤（ＡＲ−Ａ０１４４１８あるいはＳＢ−２１６７６３）と陰性対照であるＤＭＳＯの阻害効果を、非放射性試験管内ＧＳＫ３β酵素活性検出法を応用して検証した結果を示している。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００５−１３３号の明細書に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β阻害剤によるがんの治療
本発明は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（以下、「ＧＳＫ３β」と記載することもある）阻害剤の大腸がん治療用医薬組成物としての利用を提供する。
１．１  ＧＳＫ３β
ＧＳＫ３βはβ−カテニン原がん遺伝子産物を含む一連の細胞調節蛋白質をリン酸化し不活性化する抑制因子として作用する多機能蛋白質リン酸化酵素である。発明者らは、（１）大腸がん患者の癌組織や大腸癌細胞株で特異的なＧＳＫ３βの発現亢進が見られること、（２）ＧＳＫ３β阻害剤の投与により用量依存的に大腸癌細胞株の生存と増殖が抑制され、アポトーシスが誘導されるること、（３）大腸癌細胞株の増殖がＧＳＫ３βに対するｓｉＲＮＡによって抑制されることを初めて見出し、ＧＳＫ３β阻害剤が抗がん剤として有用であること、また、ＧＳＫ３β抑制効果が抗がん剤評価の指標として有用であることを実証した。
本発明に係るＧＳＫ３βにはヒトＧＳＫ３βのほか、マウスＧＳＫ３βなど、そのオーソログも含まれるが、本発明の目的においてはヒトＧＳＫ３βが最も好ましい。ＧＳＫ３β遺伝子やＧＳＫ３β蛋白質の配列情報は公知であり、公共データベースであるＧｅｎＢａｎｋより容易に入手することができる。例えば、マウスＧＳＫ３β遺伝子と対応するＧＳＫ３β蛋白質のアミノ酸配列は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＣ０６０７４３およびＡＡＨ６０７４３．１、あるいはＢＣ００６９３６およびＡＡＨ０６９３６．１として開示されている。また、ヒトＧＳＫ３β遺伝子と対応するＧＳＫ３β蛋白質のアミノ酸配列は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００２０９３およびＮＰ＿００２０８４として開示されている。もちろん、これらの配列は一例であって、本発明のＧＳＫ３β遺伝子やＧＳＫ３β蛋白質はこれら配列に限定されない。
１．２  ＧＳＫ３β阻害剤
本明細書において、ＧＳＫ３β阻害剤とは、ＧＳＫ３βの機能を物理的あるいは化学的に阻害する物質を意味する。こうした、ＧＳＫ３β阻害剤については、既に多くの化合物が同定されているが、その構造と作用メカニズムは多岐にわたる（Ｍｅｉｊｅｒ  Ｌ，Ｆｌａｊｏｌｅｔ  Ｍ，Ｇｒｅｅｎｇａｒｄ  Ｐ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  ２００４；２５（９）：４７１−４８０参照）。
こうしたＧＳＫ３β阻害剤の構造と製造方法は、例えば、以下の特許出願あるいは登録特許に詳細に記載されている：特表２００５−５３６５１７記載のピラゾロピリミジン、特表２００５−５３５５９３記載のチアゾリジンジチオン誘導体、特表２００５−５３４７１３記載のジヒドロピラゾロピリジン化合物、特表２００５−５３３０６６記載のアゾールメチリデンシアニド誘導体、特表２００５−５３１６０９記載のシスインドリル−マレイミド誘導体、特表２００５−５２６８３５記載の２−置換−１，３−チアゾール化合物、特表２００５−５２６８１４記載のモルホリン誘導体、特表２００５−５１９０８７記載の１−［アルキル］、１−［（ヘテロアリール）アルキル］および１−［（アリール）アルキル］−７−（ピリミジン−４−イル）−イミダゾ［１，２−ａ］ピリミジン−５（１Ｈ）−オン誘導体、特表２００５−５１９０８６記載のヘテロアリール置換２−ピリジニルおよび２−ピリミジニル−６，７，８，９−テトラヒドロピリミド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン誘導体、特表２００５−５１６９６１記載のオキシインドール誘導体、特表２００５−５１６９６０記載のオキシインドール誘導体、特表２００５−５１６９４８記載のキナゾリン類、特表２００５−５１３０８２記載のイソキノリン類、特表２００５−５０９６４１記載のヒドロキシアルキルインドロカルバゾール化合物、特表２００５−５０５５１５記載のアリールアミン、特表２００５−５０４８１０記載および特表２００５−５０４８０９記載の置換２−ピリジニル−６，７，８，９−テトラヒドロピリミド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オンおよび７−ピリジニル−２，３−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピリミジン−５（１Ｈ）オン誘導体、特表２００５−５０１８００記載のジヒドロピラゾロピリジン化合物、特表２００４−５３８３１記載の２，４−ジアミノチアゾール誘導体、特表２００４−５３６１１１記載の４−（４−メトキシベンジル）−Ｎ′−（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）尿素、特表２００４−５３６１１０記載の複素環式アミン、特表２００４−５２７４８６記載のピリミジン化合物、特表２００４−５２２７７７記載の２−アリルアミノ−ピリミジン、特表２００４−５１６２９７記載のトリアジン類、特表２００４−５１５４９９記載のインダゾリル置換ピロリン化合物、特表２００４−５０５０７８記載の３−インドリル−４−フェニル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン誘導体、特表２００３−５２８０９５記載の２−アミノ−３−（アルキル）−ピリミドン誘導体、特表２００３−５２７３０３記載のピリミジンまたはピリジン類、特表２００３−５１６９７４記載のピラジン誘導体、特表２００２−５２７４１９記載のピロール−２，５−ジオン類、再表０１／０８１３４５記載の芳香族アミド化合物、および特表平０１−２３３２８１記載のピロール類等。当業者であれば、これらの記載に基づいて、所望のＧＳＫ３β阻害剤を製造し、使用することができるであろう。
ＧＳＫ３βの活性は種々の段階：（ａ）転写後修飾（転写後の第９セリンと第２１６チロシン残基のリン酸化による制御）、（ｂ）タンパク複合体との相互作用、（ｃ）基質プライミング、（ｄ）細胞内分布、で制御されており、上記したＧＳＫ３β阻害剤はそのいずれかの段階でＧＳＫ３βに作用するものと思われる（Ｍｅｉｊｅｒ  Ｌ，Ｆｌａｊｏｌｅｔ  Ｍ，Ｇｒｅｅｎｇａｒｄ  Ｐ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  ２００４；２５（９），４７１−４８０参照）。
発明者らは、２つの代表的ＧＳＫ３β阻害剤（ＡＲ−Ａ０１４４１８およびＳＢ−２１６７６３）について、これらががんに対して特異的な抑制作用を有することを、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの両面で実証した。また、これらのＧＳＫ３β阻害剤が、がん細胞において転写後修飾（リン酸化）を受けたＧＳＫ３βの活性を阻害しうることを確認した。
（１）ＡＲ−Ａ０１４４１８
ＡＲ−Ａ０１４４１８は下記の式で示されるチアゾール誘導体である（ＣＡＳ  ＮＯ：４８７０２１−５２−３、ＷＯ２００３００４４７８、特表２００４−５３６１１１号参照）。
2006073202.tif 000005
ＡＲ−Ａ０１４４１８は、試薬としてＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ等により販売されており、一般に入手可能である。
上記化合物に限定されず、下記の一般式（Ｉ）で示されるチアゾール誘導体もまた、同様のＧＳＫ３β阻害作用を有する限り、ＡＲ−Ａ０１４４１８と同様、本発明に係るがん細胞の増殖抑制やがんの治療用医薬組成物として利用可能である。
2006073202.tif 000006
ここで、Ｑ１は−（ＣＨ２）ｎ−Ａｒ−Ｏ−（ｎは１〜５の整数、Ａｒは置換または非置換アリール）であり、Ｑ２はハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニルまたはアルキルスルホニルから選ばれる基である。
（２）ＳＢ−２１６７６３
ＳＢ−２１６７６３は、化学名を３−（２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−４−（１−ｍｅｔｈｙｌ−１Ｈ−ｉｎｄｏｌ−３−ｙｌ）−１Ｈ−ｐｙｒｒｏｌｅ−２，５−ｄｉｏｎｅと称し、下記の式で示されるピロール誘導体である（ＥＰ３２８０２６、特表０１−２３３２８１号  実施例４５参照）。
2006073202.tif 000007
ＳＢ−２１６７６３もまた、試薬としてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ等により販売されており、一般に入手可能である。
なお上記化合物に限定されず、下記の一般式（ＩＩ）で示されるピロール類もまた、同様のＧＳＫ３β阻害作用を有する限り、ＳＢ−２１６７６３と同様、本発明に係るがん細胞の増殖抑制やがんの治療用医薬組成物として利用可能である。
2006073202.tif 000008
（ここで、Ｒ１は水素、アルキル、アラルキル、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、アミノアルキル、モノアルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アジドアルキル、アシルアミノアルキル、アルキルスルホニルアミノアルキル、アリールスルホニルアミノアルキル、メルカプトアルキル、アルキルチオアルキル、グルコピラノシル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、ヒドロキシアルキルチオアルキル、メルカプトアルキルチオアルキル、アリールチオアルキルまたはカルボキシアルキルチオアルキルであり、
Ｒ２は水素、アルキル、アラルキル、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、アミノアルキル、モノアルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アシルアミノアルキル、アルキルスルホニルアミノアルキル、アリールスルホニルアミノアルキル、メルカプトアルキル、アルキルチオアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、アルキルチオまたはアルキルスルフィニルであり、
Ｒ３はハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニルおよびアルキルスルホニルからなる群より選ばれる１または２以上の置換基で置換されたフェニル基であり、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、互いに独立して、水素、ハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニルまたはアルキルスルホニルである）
さらに上記した化合物の薬学的に許容しうる塩、例えば塩基性の酸付加塩、無機もしくは有機の酸またはアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩等もまた、本発明に係るがん細胞の増殖抑制や医薬組成物に利用可能である。
１．３  ＧＳＫ３βのリン酸化とがんの治療
ＧＳＫ３βの生理的活性はリン酸化（第９セリン残基、不活性化型；第２１６チロシン残基、活性化型）により調節されている。大腸癌細胞や組織においてＧＳＫ３βの発現と活性はβ−カテニン活性化（核内集積）とは関係なく亢進し、非がん細胞や組織で検証された第９セリン残基のリン酸化（不活性化型）による酵素活性制御は認められなかった。一方で、癌細胞や癌組織特異的に第２１６チロシン残基がリン酸化されたＧＳＫ３β（活性化型）分画が高頻度に発現していた。
培養細胞のＧＳＫ３β活性を薬理学的阻害剤（ＡＲ−Ａ０１４４１８、ＳＢ−２１６７６３）を用いて抑制すると、阻害剤の用量依存的に癌細胞のアポトーシスが誘導され、増殖は阻止されるが、非がん細胞株（ＨＥＫ２９３）ではこうした効果は認められなかった。ＲＮＡ干渉法でＧＳＫ３β発現をノックダウンしても、薬理的阻害剤の効果と同様に癌細胞の生存と増殖が特異的に抑制された。以上の結果より、ＧＳＫ３β活性の増強、特に第２１６チロシン残基リン酸化ＧＳＫ３β（活性化型）分画の高発現が、癌細胞の生存・増殖を維持・促進するというがん化のあらたなメカニズムが明らかとなった。
すなわち、第２１６チロシン残基のリン酸化により活性化されているＧＳＫ３β活性を薬理学的ならびに転写調節的技法を駆使して修飾することにより、がんの治療や予防が可能になることがはじめて示された。
２．被験物質の抗がん剤としての効果を評価する方法
本発明は、ＧＳＫ３β遺伝子、またはＧＳＫ３β蛋白質に対する阻害効果、とくに第２１６番目チロシン残基のリン酸化により活性化されている本酵素活性に対する阻害効果を指標として、被験物質の抗がん剤としての効果を評価する方法を提供する。
前記方法は、１つの被験物質について、その投与（添加）および非投与条件下における、阻害効果を比較評価するものであってもよいし、２つ以上の被験物質についての同様な効果の比較評価であってもよい。あるいは、前記遺伝子や蛋白質の発現量や活性と抗腫瘍効果との相関関係が経験的に確立されれば、その関係に基づいて、比較対照なしに絶対評価するものであってもよい。
本発明の評価方法において、ＧＳＫ３β遺伝子やＧＳＫ３β蛋白質に対する阻害効果は、ＧＳＫ３β遺伝子やＧＳＫ３β蛋白質の発現量を指標として評価してもよいし、ＧＳＫ３β遺伝子やＧＳＫ３β蛋白質の活性（安定性含む）を指標として評価しても良い。また、評価系はｉｎ  ｖｉｖｏ系であってもよいし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系であってもよい。以下、本発明の評価方法の具体的な実施方法について説明する。
２．１  培養細胞
本発明の評価方法で用いられる細胞は、ＧＳＫ３β遺伝子を高発現する哺乳動物細胞であればとくに限定されない。好ましくは哺乳動物由来の癌細胞（好ましくは、初代培養細胞）や樹立された癌細胞株が好ましい。前記哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラットまたはハムスター等が好ましく、ヒトまたはマウスがより好ましい。また、ＧＳＫ３β遺伝子をそのプロモーター領域とともに導入し、該遺伝子を高発現するように組換えた細胞など、人為的に形質転換された細胞を使用してもよい。
細胞は、被検物質の添加または非添加条件下で培養する。培養方法は特に限定されず、当該細胞に適した培養方法を適宜選択すればよい。培養細胞への被検物質の添加方法や添加量も特に限定されず、上記細胞の培養前あるいは培養期間中の適当な時点で、被検物質を培養培地に添加し一定期間培養する。被験物質添加後の培養期間もとくに限定されないが、好ましくは３０分〜２４時間である。
２．２  がんモデル動物
本発明の方法で用いられるがんモデル動物は、非ヒト哺乳動物であれば特に限定されないが、齧歯類が好ましく、マウスが特に好ましい。そのようながんモデル動物は市販のものであっても、公知の方法にしたがって作製されたものでもよい。例えば、大腸がんモデルマウスは、既報（Ｇｕｐｔａ  ＲＡ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−δ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｄｅｎｏｍａ  ｇｒｏｗｔｈ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００４；１０（３）：２４５−２４７）に従って作製することができる。
前記動物は、被験物質の投与または非投与条件下で適当な期間飼育を行う。動物への被験物質の投与量は特に限定されず、被験物質の性状や動物の体重に合わせて、適宜用量を設定すればよい。また、動物への被験物質の投与方法および投与期間も特に限定されず、被験物質の性状に合わせて、適宜その投与経路と投与期間を設定すればよい。
被験物質の投与または非投与条件下で飼育された前記動物の血液または細胞を単離し、該血液または細胞中のＧＳＫ３β遺伝子や蛋白質の発現量を検出する。検出対象とする細胞としては、患部、すなわち癌組織細胞が好ましい。
２．３  ＧＳＫ３β遺伝子の検出
ＧＳＫ３β遺伝子の検出方法としては、例えば、単離された血液または細胞からまず全ＲＮＡを抽出し、該全ＲＮＡ中におけるｍＲＮＡの発現量を検出する方法を挙げることができる。
全ＲＮＡ中のＧＳＫ３β遺伝子の発現量は、得られた全ＲＮＡよりｃＲＮＡまたはｃＤＮＡを調製し、これを適当な標識化合物でラベルすることにより、そのシグナル強度として検出することができる。遺伝子の発現量の検出方法は特に限定されず、以下に説明する公知の方法から適宜選択して用いればよい。
遺伝子チップ、アレイ、メンブレンフィルター等の固相化試料を用いた解析では、検出対象である遺伝子が固相化されている、市販のＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ）、インテリジーン（宝酒造）、フィルター製マイクロアレイ  アトラスシステム（クローンテック）を用いて簡便に実施できる。あるいは、公知の方法（Ｌｉｐｓｈｕｔｚ  ＲＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １９９９；２１（ｓｕｐｐｌ）２０−２４）に基づいて作製されたＧＳＫ３β固相化試料を用いて解析してもよい。
ＲＴ−ＰＣＲ法やその１つであるリアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ）法は微量なＲＮＡを高感度かつ定量的に検出できるという点で本発明の評価方法に好適である。リアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ）法では、５’端を蛍光色素（レポーター）で、３’端を蛍光色素（クエンチャー）で標識した、目的遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが使用される。該プローブは、通常の状態ではクエンチャーによってレポーターの蛍光が抑制されている。この蛍光プローブを目的遺伝子に完全にハイブリダイズさせた状態で、その外側からＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行う。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進むと、そのエキソヌクレアーゼ活性により蛍光プローブが５’端から加水分解され、レポーター色素が遊離し、蛍光を発する。リアルタイムＰＣＲ法は、この蛍光強度をリアルタイムでモニタリングすることにより、鋳型ＤＮＡの初期量を正確に定量することができる。
上記以外に、遺伝子発現量を解析する方法としては、例えば、サブトラクション法（Ｓｉｖｅ  ＨＬ，Ｊｏｈｎ  Ｔ．Ｓｔ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９８８；１６：１０９３７、Ｗａｎｇ  Ｚ，Ｂｒｏｗｎ  ＤＤ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９１；８８：１１５０５−１１５０９）、ディファレンシャル・ディスプレイ法（Ｌｉａｎｇ  Ｐ，Ｐａｒｄｅｅ  ＡＢ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９２；２５７，９６７−９７１、Ｌｉａｎｇ  Ｐ，Ａｖｅｒｂｏｕｋｈ  Ｌ，Ｋｅｙｏｍａｒｓｉ  Ｋ，Ｓａｇｅｒ  Ｒ，Ｐａｒｄｅｅ  ＡＢ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９２；５２：６９６６−６９６８）、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法（Ｊｏｈｎ  Ｔ．Ｓｔ，Ｄａｖｉｓ  ＲＷ．Ｃｅｌｌ  １９７９；１６：４４３−４５２）、また、適当なプローブを用いたクロスハイブリダイゼーション法（”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．（１９８２）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）等を挙げることができる。
上記方法のほか、ＧＳＫ３β遺伝子のプロモーター支配下に、該プロモーター活性の検出を可能にする遺伝子（以下「レポーター遺伝子」と記載する。）を利用して、間接的にＧＳＫ３β遺伝子やＧＳＫ３β蛋白質の発現を検出することもできる。レポーター遺伝子としては、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、）緑色蛍光蛋白質（ｇｒｅｅｎ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）等を利用することができる。
以上のような、一過的な遺伝子導入法を利用した試験方法とは別に、レポーター遺伝子、およびＧＳＫ３β遺伝子の発現ベクターで、宿主細胞を二重に形質転換した細胞を利用した試験方法も採択可能である。この場合には、ｐＩＮＤ（インビトロジェン社製）やｐＴｅｔ−Ｏｎ（クロンテック社製）等の発現ベクターを利用して、ＧＳＫ３β遺伝子の発現を誘導する条件下で該レポーター遺伝子の発現が促進されるような細胞株を樹立することが必要となる。得られた細胞株を、ＧＳＫ３β遺伝子の発現が誘導される条件下におくと、該遺伝子の発現依存的にレポーター遺伝子の転写が促進される。したがって、レポーター遺伝子の発現が可能な条件下において、培地中に任意の被検物質を添加した場合と添加しない場合でのレポーター遺伝子の発現量変化をみれば、ＧＳＫ３βの発現量が評価できる。
２．４  ＧＳＫ３β蛋白質（第２１６チロシン残基リン酸化ＧＳＫ３β蛋白質）の検出
ＧＳＫ３β蛋白質（第２１６チロシン残基リン酸化ＧＳＫ３β蛋白質）の発現量は、該蛋白質に特異的に結合する抗体を用いて検出することができる。抗体を利用した蛋白質の検出方法は特に限定されないが、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＥＬＩＳＡ法、およびＲＩＡ法から選ばれるいずれか一つの方法であることが好ましい。
検体である血液または細胞（細胞抽出液として使用する）は、必要に応じて高速遠心を行うことにより不溶性の物質を除去した後、以下のようにＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料やウエスタンブロット用試料として調製する。
ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料は、例えば、回収した血清をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈したものを用いる。ウエスタンブロット用（電気泳動用）試料は、例えば、細胞抽出液をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用の２−メルカプトエタノールを含むサンプル緩衝液（シグマ−アルドリッチ社製等）と混合したものを用いる。ドット／スロットブロット用試料は、例えば、回収した細胞抽出液そのもの、または緩衝液で適宜希釈したものを、ブロッティング装置を使用するなどして、直接メンブレンへ吸着させたものを用いる。
本工程で用いられる「ＧＳＫ３β蛋白質（第２１６チロシン残基リン酸化ＧＳＫ３β蛋白質）に特異的に結合する抗体（以下、「抗ＧＳＫ３β抗体」と記載する。）」は、公知の方法にしたがって調製してもよいし、市販のものを用いてもよい。抗体は、常法により、抗原となるＧＳＫ３β蛋白質、あるいはそのアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを用いて動物を免疫し、該動物生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。また、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７，１９７５、Ｋｅｎｎｅｔ，Ｒ．ｅｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐ．３６５−３６７，１９８０，Ｐｒｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．）にしたがって、抗ＧＳＫ３β抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、これよりモノクローナル抗体を得ることもできる。
抗体作製用の抗原としては、ＧＳＫ３β蛋白質またはその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはこれらに任意のアミノ酸配列や担体（例えば、Ｎ末端付加するキーホールリンペットヘモシアニン）が付加された誘導体を挙げることができる。
前記抗原ポリペプチドは、ＧＳＫ３β蛋白質を遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、ＧＳＫ３β遺伝子を発現可能なベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して該遺伝子を発現させればよい。
抗ＧＳＫ３β抗体は、それを直接標識するか、または該抗体を一次抗体とし、該一次抗体を特異的に認識する（抗体を作製した動物由来の抗体を認識する）標識二次抗体と協同で検出に用いられる。
前記標識の種類として好ましいものは、酵素（アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）またはビオチン（ただし二次抗体のビオチンにさらに酵素標識ストレプトアビジンを結合させる操作が加わる）であるが、これらに限定されない。標識二次抗体（または標識ストレプトアビジン）としては、予め標識された抗体（またはストレプトアビジン）が、各種市販されている。なお、ＲＩＡの場合は１２５Ｉ等の放射性同位元素で標識された抗体を用い、測定は液体シンチレーションカウンター等を用いて行う。
これら標識された酵素の活性を検出することにより、抗原の発現量が測定される。アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼで標識する場合、これら酵素の触媒により発色する基質や発光する基質が市販されている。
発色する基質を用いた場合、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法を利用すれば、目視で検出できる。ＥＬＩＳＡ法では、市販のマイクロプレートリーダーを用いて各ウェルの吸光度（測定波長は基質により異なる）を測定し、定量することが好ましい。また上述の抗体作製に使用した抗原の希釈系列を調製し、これを標準抗原試料として他の試料と同時に検出操作を行い、標準抗原濃度と測定値をプロットした標準曲線を作成することにより、他の試料中の抗原濃度を定量することも可能である。
一方、発光する基質を使用した場合は、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法においては、Ｘ線フィルムまたはイメージングプレートを用いたオートラジオグラフィーや、インスタントカメラを用いた写真撮影により検出することができる。また、デンシトメトリーやモレキュラー・イメージャーＦｘシステム（バイオラッド社製）等を利用した定量も可能である。さらに、ＥＬＩＳＡ法で発光基質を用いる場合は、発光マイクロプレートリーダー（例えば、バイオラッド社製等）を用いて酵素活性を測定する。
２．５  被験物質の評価
被験物質の投与（添加）または非投与（非添加）における、ＧＳＫ３β遺伝子またはＧＳＫ３β蛋白質（第２１６チロシン残基リン酸化ＧＳＫ３β蛋白質）の発現量の相違に基づいて、該被験物質の抗がん剤としての効果を評価する。
すなわち、被験物質の投与条件下で非投与条件下よりもＧＳＫ３β遺伝子またはＧＳＫ３β蛋白質（第２１６チロシン残基リン酸化ＧＳＫ３β蛋白質）の発現量が有意に減少している場合、該被験物質は抗がん剤として有用であると評価できる。ここで、「有意に減少している」とは、例えば、被験物質の投与および非投与条件下でのＧＳＫ３β遺伝子またはＧＳＫ３β蛋白質（第２１６チロシン残基リン酸化ＧＳＫ３β蛋白質）の発現量に統計的有意差（ｐ＜０．０５）があることを意味する。
２．６  非放射性試験管内ＧＳＫ３β酵素活性検出法（Ｎｏｎ−ＲＩ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｋｉｎａｓｅ  ａｓｓａｙ）
ＧＳＫ３βの生理的活性はリン酸化（第９セリン残基、不活性化型；第２１６チロシン残基、活性化型）により調節されているので、各細胞におけるＧＳＫ３β活性はｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｋｉｎａｓｅ  ａｓｓａｙあるいは、第２１６チロシン残基リン酸化ペプチド特異抗体による免疫ブロッティングのいずれかの手法により検出あるいは推定することができる。また第２１６チロシン残基リン酸化ＧＳＫ３β蛋白質分画の発現量は、ＧＳＫ３βの酵素活性を相対的（あるいは、間接的）に反映しているに過ぎないため、ＧＳＫ３β活性を直接、検出・測定する手法は、本発明におけるＧＳＫ３β活性阻害効果の評価方法において重要といえる。発明者らは、このＧＳＫ３βの活性測定の新たな手段として、非放射性試験管内ＧＳＫ３β酵素活性検出法を開発した。
本検出法の概要は、図１６に示すとおりである。まず、一定量の細胞抽出液に抗ＧＳＫ３β特異的抗体を加え、ＧＳＫ３β蛋白質を免疫沈降させる（図１６のＳ）。コントロールとして、上記細胞抽出液に同濃度の非特異的ＩｇＧ（抗ＧＳＫ３β抗体を作成した動物種で、たとえばマウスＩｇＧ）を加える（図１６のＣ）。遠心後、上清の細胞抽出液を除去し、免疫沈降物をリン酸緩衝液とリン酸化反応用緩衝液で十分に洗浄する。ついで、リン酸化反応用緩衝液の存在下で、組換えヒトβカテニン蛋白質（基質）と（非放射性）ＡＴＰを加え、リン酸化反応を行う。その後、この反応液にＳＤＳ電気泳動用バッファー加えて加熱・変性したものをウエスタンブロッティングにより解析し、ＧＳＫ３β認識配列に特異的な抗リン酸化βカテニンペプチド抗体によりリン酸化組み換えヒトβカテニン蛋白質を検出する。この手法により検出されるβカテニン蛋白質のリン酸化の程度（ウエスタンブロッティングのシグナル強度）から、当該細胞（抽出液中）のＧＳＫ３β活性を計測することができる。組換えヒトβカテニン蛋白質をそのヒスチジン基を介してビーズ（ｒｅｓｉｎｓ）等に固定化すれば、ウエスタンブロッティングを用いることなく、ｏｎ−ｒｅｓｉｎｓ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙも可能となる。
３．抗がん剤評価用キット
本発明の方法を実施するためのキットとして、例えば、以下のａ）〜ｆ）の少なくとも一つ以上を含むキットを挙げることができる。
ａ）ＧＳＫ３β遺伝子またはＧＳＫ３β遺伝子を特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー
ｂ）ＧＳＫ３β遺伝子またはＧＳＫ３β遺伝子に特異的に結合し、該遺伝子を検出するための２０〜１５００塩基長の連続したポリヌクレオチドプローブ
ｃ）上記ｂ）記載のポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料
ｄ）ＧＳＫ３β蛋白質（第２１６チロシン残基リン酸化ＧＳＫ３β蛋白質）またはそのＧＳＫ３β蛋白質（第２１６チロシン残基リン酸化ＧＳＫ３β蛋白質）に特異的に結合し、該蛋白質を検出するための抗体
ｅ）上記ｄ）記載の抗体に特異的に結合しうる二次抗体
ｆ）ＧＳＫ３β蛋白質（第２１６チロシン残基リン酸化ＧＳＫ３β蛋白質）
前記ａ）記載のプライマーは、上記遺伝子の塩基配列に基づき、市販のプライマー設計ソフトを用いる等、常法にしたがい容易に設計し、増幅することができる。
前記ｂ）記載のプローブは、ノーザンハイブリダイゼーション法であれば、２０塩基長程度の１本鎖オリゴヌクレオチドか２本鎖ＤＮＡが好適に用いられる。マイクロアレイであれば、１００〜１５００塩基長程度の２本鎖ＤＮＡ、または２０〜１００塩基長程度の１本鎖オリゴヌクレオチドが好適に用いられる。Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅ  Ｃｈｉｐシステムであれば２５塩基長程度の１本鎖オリゴがよい。これらは、特にＧＳＫ３β遺伝子の配列特異性が高い部分に特異的にハイブリダイズするプローブとして設計することが好ましい。これらのプローブや前述のプライマーは、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよく、またビオチン、リン酸、アミン等により修飾されていてもよい。
前記ｃ）記載の固相化試料は、前記ｂ）記載のプローブをガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ等の固相に固定することにより作製される。
前記ｄ）およびｅ）記載の抗体やｆ）の蛋白質は、２．４に記載した方法により作製することができる。抗体は、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよいし、ビオチン等により適当に修飾されていてもよい。
本発明のキットは上記した構成要素のほか、必要に応じて、ハイブリダイゼーション、プローブの標識、あるいはラベル体の検出のための試薬、反応用緩衝液、酵素基質等、本発明の評価方法に実施に必要な他の要素を含んでいてもよい。
４．がんの診断方法
本発明者らは、ヒトＧＳＫ３β遺伝子やＧＳＫ３β蛋白質は、がん（特に大腸がん）患者の病変組織で特異的に活性化されていることを確認した。したがって、被験者から単離された検体中の、これら遺伝子や蛋白質の発現量を測定すれば、該被験者のがんの発症や病態を予測することができる。遺伝子や蛋白質の発現量の測定は、基本的に２で記載した方法にしたがって実施することができる。
【実施例】
【０００６】
［実施例１］  各種細胞株および大腸がん患者の腫瘍におけるＧＳＫ３β活性とＧＳＫ３β阻害剤の影響
１．対象と方法
細胞株：
７種類の大腸癌細胞株（表１：ＳＷ４８０，ＳＷ６２０，ＨＴ２９，ＬｏＶｏ，ＨＣＴ１１６，ＳＷ４８およびＲＫＯ）およびヒト胎児腎細胞株（ＨＥＫ２９３）はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｃｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入し、推奨プロトコールに従って培養・維持した。各細胞株はコンフルエントになる前の指数関数的増殖期に採取し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄・遠心して−８０℃で保管した。ＧＳＫ３βとｐｈｏｓｐｈｏ−ＧＳＫ３βＳｅｒ９の免疫細胞学的染色を行うために、カバーグラス上で培養した各細胞は４％パラフォルムアルデヒドで固定した。
大腸がん症例と組織検体：
対象患者は、２００２年および２００３年に金沢大学がん研究所病院で大腸がんが切除された２０例の患者（男性１３名、女性７名：年齢は４４−９３歳（平均７３歳））であり、本研究に登録されることを同意し、インフォームドコンセントを提出した者である。各患者の新鮮手術標本から採取した１組の正常粘膜と腫瘍組織検体は、液体窒素を用いてすみやかに凍結し、−８０℃で保管した。手術標本は１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、組織病理学的検索に供して腫瘍の性状やＴＮＭ分類に準拠した病期を決定した。各腫瘍の組織学的特性を代表するパラフィン切片は免疫組織化学的に解析し、β−カテニンの活性化を判定した。
ウエスタンブロッティング解析：
凍結保存してあった手術標本検体や培養細胞集塊（ペレット）から細胞蛋白質を、蛋白質分解酵素阻害剤と脱リン酸酵素阻害剤（いずれもＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を混入した溶解液（ＣｅｌＬｙｔｉｃＴＭ−ＭＴ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により抽出した。各検体の蛋白質濃度はＣｏｏｍａｓｉｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてＢｒａｄｆｏｒｄ法により測定した。
抽出された蛋白質１００μｇをＳＤＳ−ポリアクリルアミド（１０％）ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離し、ニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に転写後、それぞれ１０００倍に希釈したウサギポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を反応させ、化学発光検出試薬（ＥＣＬ（登録商標），Ａｍｅｒｓｈａｍ）で可視化することにより、第９セリン残基がリン酸化されたＧＳＫ３β分画（ｐｈｏｓｐｈｏ−ＧＳＫ３βＳｅｒ９）および第２１６チロシン残基がリン酸化された分画（ｐｈｏｓｐｈｏ−ＧＳＫ３βＴｙｒ２１６）をそれぞれ検出した。ついで、ラットＧＳＫ３βのＮ−末端側第１−１６０アミノ酸残基に対して作成されたマウスモノクローナル抗体（２５００倍希釈，ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を反応させ、同様にして（ヒト）総ＧＳＫ３βを検出した。
ＧＳＫ３β（シグナル）の上流で活性化される代表的キナーゼとして、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ、あるいはＡｋｔ）の活性化をｐｈｏｓｐｈｏ−ＡｋｔＴｈｒ３０８やｐｈｏｓｐｈｏ−ＡｋｔＳｅｒ４７３に対する抗体（それぞれ１０００倍希釈、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、同様に検出した。
ＧＳＫ３βのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｋｉｎａｓｅ  ａｓｓａｙ：
それぞれの細胞株から抽出した１ｍｇの蛋白質から、免疫沈降法によりＧＳＫ３βを調整し、その酵素活性を組換えヒトβ−カテニン蛋白質を基質にして、３２Ｐ標識ＡＴＰを用い、既報（Ａｄｌｅｒ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９７；９４：１６８６−９１）にしたがってｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｋｉｎａｓｅ  ａｓｓａｙにより検出した。β−カテニン蛋白質の放射性リン酸化シグナルはオートラジオグラフィーにより検出した。
免疫蛍光細胞化学的染色：
ＨＥＫ２９３細胞と各大腸癌細胞株をカバーグラス上で培養し、免疫蛍光染色により総ＧＳＫ３βとｐｈｏｓｐｈｏ−ＧＳＫ３βＳｅｒ９を検出した。一次抗体はウエスタンブロット法で用いた抗体（１００倍希釈）を使用し、二次抗体としてそれぞれ２００倍希釈したＣｙ３標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体およびＦＩＴＣ標識抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（いずれもＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用した。また、核染色にはＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｈｏｅｃｈｓｔ）を使用した。免疫蛍光染色のすべての手法は既報（Ｓｈａｋｏｏｒｉ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２００３；３１２（３）：８５０−７）に準じて行った。染色された細胞はＣＣＤデジタルカメラ（オリンパスＤＰ７０，Ｏｌｙｍｐｕｓ）に接続した蛍光顕微鏡（オリンパスＡＸ８０，Ｏｌｙｍｐｕｓ）により観察・記録した。
ＧＳＫ３βＳｅｒ９とＫ−ｒａｓ遺伝子における突然変異の検出：
大腸癌培養細胞株と手術標本から採取した正常粘膜および腫瘍組織からゲノムＤＮＡをプロティナーゼＫ消化とフェノール・クロロフォルム処理により抽出・精製した。ＧＳＫ３βの第９セリン残基をコードするコドン９を含むエクソン１を上流プライマー（５’−ＡＴＴＣＧＣＧＡＡＧＡＧＡＧＴＧＡＴＣＡＴ−３’：配列番号１）と下流プライマー（５’−ＣＡＣＴＧＣＴＡＡＣＴＴＴＣＡＴＧＣＴＧＣ−３’：配列番号２）を用いて９４℃  １分、５５℃  １分、７２℃  １分の３５サイクルプログラムとそれに続く７２℃１０分間伸長反応によりＰＣＲ増幅した。
ＧＳＫ３βコドン９（ＴＣＣ）の突然変異はＰＣＲ産物の制限酵素Ｍｎｌ  Ｉ（認識配列：ＣＣＴＣ［Ｎ］７；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）消化による制限酵素断片長多型（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）により解析した。この制限酵素は１１０塩基対の野生型コドン９のＰＣＲ産物をそれぞれ５２と５８塩基対の断片に切断し、一方、コドン９の第１あるいは第２塩基に変異を有するＰＣＲ産物は切断できない。Ｋ−ｒａｓ遺伝子コドン１２と１３の変異は既報（Ｚｈａｎｇ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００３；９（８）：３０７３−９．）にしたがい、それぞれ制限酵素Ｍｖａ  Ｉ（Ｔａｋａｒａ）とＢｇｌ  Ｉ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ミスマッチプライマーによるＰＣＲ産物のＰＣＲ−ＲＦＬＰ解析により検出した。
β−カテニン活性化の免疫組織化学的解析：
各症例において、大腸原発腫瘍の主要な組織学的特徴を代表する組織切片をアビジン−ビオチン複合体法を用いて免疫組織化学的に検索し、既報（Ｏｕｇｏｌｋｏｖ  ＡＶ，ｅｔ  ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２００２；１２２（１）：６０−７１）にしたがい、β−カテニンがん化シグナル活性化を判定した。抗β−カテニン抗体（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は１００倍希釈して使用した。原発腫瘍におけるβ−カテニンの発現は発明者らが最近、定義した３種類の特徴的パターン：細胞膜発現型（Ｍ）、正常の腺窩と同じ発現を示すもの；び慢性核内集積型（ＮＡｄ）、β−カテニンの核内集積を示す癌細胞が腫瘍全体に認められるもの；腫瘍浸潤先進部核内集積型（ＮＡｉｎｖ）、β−カテニンの核内集積を示す癌細胞が腫瘍浸潤先進部（腫瘍の浸潤最深部で間質と接する部分）に限局して認められ、それ以外の腫瘍部分における癌細胞はＭ型のβ−カテニン発現を示すもの、にしたがって分類した。
β−カテニンは核内に移行すると例外を除いて造腫瘍活性型であるという根拠（Ｗｏｎｇ  ＮＡ，ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００２；１６０（２）：３８９−４０１．，Ｐｏｌａｋｉｓ  Ｐ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  １９９９；９（１）：１５−２１．）に基づいて、本研究ではβ−カテニンの核内集積はその造腫瘍活性を示すものと見做した。経験豊富な２名の研究者（ＡＶ，ＢＺ）が対象腫瘍におけるＧＳＫ３βの活性に関する情報を知らされない状態で、それぞれ個別に腫瘍におけるβ−カテニン活性化パターンを判定した。そして、両者の判定はすべての腫瘍について一致した。
細胞増殖解析：
各大腸癌細胞株とＨＥＫ２９３細胞を９６穴培養プレートの各ウェルに３  ｘ  １０３個播種し、対応する培地中で一晩、培養した（この状態が０日）。既知のＧＳＫ３β阻害剤であるＡＲ−Ａ０１４４１８（Ｎ−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｙｌ）−Ｎ’−（５−ｎｉｔｒｏ−１，３−ｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）ｕｒｅａ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）とＳＢ−２１６７６３（３−（２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−４−（１−ｍｅｔｈｙｌ−１Ｈ−ｉｎｄｏｌ−３−ｙｌ）−１Ｈ−ｐｙｒｒｏｌｅ−２，５−ｄｉｏｎｅ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）はジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。第０日に各細胞株の培地を交換し、種々の濃度（５，１０，２５，５０μＭ）になるようにＡＲ−Ａ０１４４１８あるいはＳＢ−２１６７６３を添加した。対照として、細胞を含まないウェルに同濃度のＡＲ−Ａ０１４４１８あるいはＳＢ−２１６７６３を添加したものと、細胞を含むウェルにＤＭＳＯのみを添加したものを同時に解析した。
０日目から特定時間（２４，４８，７２および９６時間）経過した時点で各ウェルの生細胞数をＭＴＳ＊生存細胞測定キット（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６ＴＭ  Ａｑｕｅｏｕｓ，Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ）を用いて、同社のプロトコールにしたがって計測した。すなわち、各ウェルに２０μＬの直前に調製したＭＴＳ混合液を添加し、５％ＣＯ２の湿潤条件下において３７℃で３時間反応させ、４９０ｎｍ波長の吸光度をＴＨＥＲＭＯｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて計測した。各細胞は、それぞれの濃度について６ウェルずつ測定を行い、その平均吸光度を生細胞数として算出した。
＊３−［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−５−［３−ｃａｒｂｏｘｙ−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ］−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｉｎｎｅｒ  ｓａｌｔ
ｓｉＲＮＡトランスフェクション（小分子干渉ＲＮＡ導入）実験：
ヒトＧＳＫ３βを標的とする４種類の２本鎖ｓｉＲＮＡを混合したもの（ｓｉＲＮＡ  ＳＭＡＲＴｐｏｏｌＴＭ  ＧＳＫ−３  ｂｅｔａ）と陰性対照のｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＬＯＴＭ  ＲＩＳＫ−Ｆｒｅｅ  ｓｉＲＮＡ）はＤｈａｒｍａｃｏｎ  ＲＮＡ  Ｔｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）により合成・供給された。それぞれ１  ｘ  １０５個のＨＥＫ２９３細胞と各大腸癌細胞株を６穴細胞培養プレートに播き、１晩培養した。ｓｉＲＮＡ導入効果が最適となるような条件を検定するために、指定されたプロトコールに準拠して、約５０％コンフルエントの細胞にＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ＴＫＯトランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて異なる濃度のＧＳＫ３β特異的ｓｉＲＮＡあるいは同濃度の陰性対照ｓｉＲＮＡを導入した。ｓｉＲＮＡ導入のＧＳＫ３β発現に対する効果を調べるために、異なる濃度のそれぞれのｓｉＲＮＡを導入して４日後に収集した細胞から蛋白質を抽出し、ＧＳＫ３αとＧＳＫ３βをともに認識する抗ヒトＧＳＫ３抗体（１，０００倍希釈；Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてウエスタンブロット法により解析した。
この予備実験により決定されたｓｉＲＮＡの最適条件において、ＧＳＫ３β標的ｓｉＲＮＡ導入の細胞増殖に及ぼす効果を前項と同様にして細胞増殖解析法により解析した。すなわち、３  ｘ  １０３個のＨＥＫ２９３細胞と各大腸癌細胞株を９６穴細胞培養プレートの各ウェルに播き、対応する培地中で一晩、培養した。その後、最適濃度のＧＳＫ３βｓｉＲＮＡあるいは陰性対照ｓｉＲＮＡを各細胞に導入した。当日から起算して指定時間（２４，４８，７２および９６時間）後に各ウェル中の生細胞数をＭＴＳ細胞増殖解析キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて計測した。
２．結果
２．１  各種細胞株におけるＧＳＫ３β活性
本研究で用いた大腸癌細胞株はいずれもＨＥＫ２９３細胞に比べて高いＧＳＫ３βの発現レベルを示した。全ての大腸癌細胞株において、ＧＳＫ３β特異的抗体によるウエスタンブロット法により検出可能な不活性化型ｐｈｏｓｐｈ−ＧＳＫ３βＳｅｒ９分画の発現は認められなかったが、逆に活性化型のｐｈｏｓｐｈｏ−ＧＳＫ３βＴｙｒ２１６分画の発現はより高かった（図１Ａ）。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｋｉｎａｓｅ  ａｓｓａｙにより、これらの大腸癌細胞株におけるＧＳＫ３βの酵素活性が確認された（図１Ｂ）。これらの結果から、全ての大腸癌細胞株においてＧＳＫ３βは恒常的に活性化状態にあることが示された。
大腸癌細胞株で認められた結果とは対照的に、ＨＥＫ２９３細胞ではｐｈｏｓｐｈｏ−ＧＳＫ３βＳｅｒ９分画の発現が検出された。なお、この細胞ではβ−カテニンが安定した低発現を示すよう生理的に制御されていることを発明者らはこれまでに証明している（Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ  ＶＳ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２０００；５（５）：８７７−８２，Ｏｕｇｏｌｋｏｖ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ２００４；９６（１５）：１１６１−７０．）。
免疫蛍光細胞化学的染色により、ＧＳＫ３βはＨＥＫ２９３細胞とすべての大腸癌細胞の細胞質に局在し、一方、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＧＳＫ３βＳｅｒ９はＨＥＫ２９３細胞にのみ検出された（図２）。これらの細胞株における総ＧＳＫ３βとｐｈｏｓｐｈｏ−ＧＳＫ３βＳｅｒ９の発現レベルはウエスタンブロット法の結果（図１Ａ）と一致していた。以上の結果より、β−カテニンがＡＰＣ不活性化（ＳＷ４８０，ＳＷ６２０，ＬｏＶｏ）あるいはβ−カテニン遺伝子（ＣＴＮＮＢ１）変異（ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８）のいずれかによってＧＳＫ３βによるリン酸化から回避されて活性化されている大腸癌細胞株（表１）において、（総）ＧＳＫ３βの過剰発現とその不活性化型であるｐｈｏｓｐｈ−ＧＳＫ３βＳｅｒ９分画の低発現、および活性化型であるｐｈｏｓｐｈｏ−ＧＳＫ３βＴｙｒ２１６分画のが高発現していることが示された。
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２．２  大腸がん患者の腫瘍組織におけるＧＳＫ３β活性
樹立された培養細胞株は長期間の細胞発育が可能になるよう適応し、そして実際の生体における同種の腫瘍の特性を必ずしも反映しなくなっていることがあるので、２０例の大腸がん患者から採取した正常大腸粘膜と腫瘍組織におけるＧＳＫ３βの発現と第９セリン残基および第２１６チロシン残基のリン酸化を解析した。この解析で得られた結果をそれぞれの腫瘍におけるβ−カテニン活性化の有無やそのパターンと、臨床的ならびに病理組織学的因子と比較検討した。その結果、図３に示すように、ほとんどの症例において腫瘍におけるＧＳＫ３βの発現とｐｈｏｓｐｈｏ−ＧＳＫ３βＴｙｒ２１６分画は同一症例の正常粘膜におけるものに比べて高いレベルであった。ｐｈｏｓｐｈｏ−ＧＳＫ３βＳｅｒ９分画は非腫瘍性粘膜において高頻度に高いレベルで検出されたが、症例番号７４と７９を除いてほとんどの症例の腫瘍においてこの不活性化型酵素分画はわずかに検出されるのみかあるいはまったく検出されなかった（表２）。
大腸癌におけるβ−カテニンの過剰発現と核内集積の相関を示してきた発明者らのこれまでの報告（前掲）に基づいて、前記した方法で、β−カテニンの活性化はその腫瘍核内集積に基づいて判定した。その結果、β−カテニン活性化は１３例（６５％）の腫瘍に検出され、そのうち７例はＮＡｄ型、６例はＮＡｉｎｖ型であった。大腸癌細胞株における観察所見と同様に、これらの結果はＧＳＫ３βの抑制的制御を欠落した過剰発現は大腸癌における普遍的な特性であり、β−カテニン活性化の有無あるいは活性化パターン（ＮＡｄ，ＮＡｉｎｖ）とは無関係であることを示している（表２）。腫瘍におけるＧＳＫ３βの発現や活性と大腸がん症例の腫瘍病期や転移なども含めた臨床的特徴との間には特定の相関は認められなかった（表２）。
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２．３  ＧＳＫ３β活性を制御する因子
大腸癌におけるＧＳＫ３βの発現やその第９セリン残基や第２１６チロシン残基のリン酸化を介した不活性化を制御する可能性のある上流因子（シグナル）について検討した。ＧＳＫ３βを不活性化する上流のキナーゼ（リン酸化酵素）のうち最もよく知られているものはＰＫＢ／Ａｋｔであり、この酵素はリン酸イノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）依存的リン酸化により活性化される。ＰＩ３Ｋ活性化はインスリンおよびｒａｓシグナルの下流に生じるもので、とくに後者のシグナルは大腸癌においてＫ−ｒａｓ遺伝子の活性化突然変異によって高頻度に活性化されている（Ａｄｊｅｉ  ＡＡ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ２００１；９３（１４）：１０６２−７４，Ｍｉｎａｍｏｔｏ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇ  ２００２；２（６）：５６５−７５．）。これらのがん化シグナルネットワークを考慮して、大腸癌における活性化型ＰＫＢ／Ａｋｔ（ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡｋｔＴｈｒ３０８，ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡｋｔＳｅｒ４７３）とＫ−ｒａｓ原がん遺伝子の既知のホットスポット変異（コドン１２，１３）を解析し、これらの因子のいずれかがＧＳＫ３βの発現やその第９セリン残基や第２１６チロシン残基のリン酸化に影響しているかどうかを検討した。
いずれかの活性化型ＰＫＢ／Ａｋｔ分画は７種類の大腸癌細胞株のうち６種類に、また、２０例の大腸がん症例のうち１３例の腫瘍において検出された（図１Ｃ，表１および２）。Ｋ−ｒａｓ遺伝子の突然変異による活性化は６種類の大腸癌細胞株のうち４種類に検出され（表１）、そして２０例の大腸がん症例ではそのうち５例の腫瘍において検出された（表２）。対象とした大腸癌細胞株と２０例の大腸がん症例の腫瘍において、ＧＳＫ３βの活性とＰＫＢ／Ａｋｔのリン酸化による活性化あるいはＫ−ｒａｓの突然変異による活性化との間には明らかな相関は認められなかった。これは大腸癌細胞株や大腸がん症例の腫瘍においてｐｈｏｓｐｈｏ−ＧＳＫ３βＳｅｒ９が高頻度に欠落していることに起因する（表１，２）。この結果は、ＲａｓあるいはＰＫＢ／Ａｋｔ以外の未知のシグナルを介する上流因子あるいは分子機構が大腸癌におけるＧＳＫ３βの発現亢進あるいはその不活性化を抑制していることを示している。
最近、ＧＳＫ３βの第９セリン残基を別のアミノ酸に置換するような突然変異を同遺伝子のコドン９に人為的に導入することによりＧＳＫ３βは第９セリン残基リン酸化から回避され、恒常的に活性化されることが報告されている（Ｗａｎｇ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００４；２７９（３１）：３２４４４−５２．）。今回、大腸癌細胞株あるいは大腸がん症例の腫瘍組織検体のＤＮＡから増幅したＰＣＲ産物をＰＣＲ−ＲＦＬＰ法や塩基配列決定法により調べたが、ＧＳＫ３βコドン９に変異は検出されなかった（データ提示なし）。このことは、ＧＳＫ３βの第９セリン残基リン酸化を阻害するような遺伝子変異が大腸癌におけるＧＳＫ３β活性化の推測的（あるいは候補）機構ではないことを示す。
２．４  各種細胞株に対するＧＳＫ３β阻害剤の影響
実験的にＧＳＫ３βの活性や発現を抑制することが大腸癌細胞株のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける生存や増殖に影響を及ぼすかどうかを検討した。大腸癌細胞株のＳＷ４８０とＨＣＴ１１６を種々の濃度のＡＲ−Ａ０１４４１８あるいはＳＢ−２１６７６３により処理したところ、これらの細胞の生存（率）は各阻害剤の用量（濃度）依存的に減少した（図４Ａ）。ＧＳＫ３β阻害剤の同様の効果は他の大腸癌細胞株についても観察された（図４Ｂ，Ｅ）。しかし、これらの阻害剤の細胞生存抑制効果はＨＥＫ２９３細胞では観察されなかった（図４Ａ）。ＧＳＫ３β阻害剤を作用させた大腸癌細胞ではアポトーシス（Ｈｏｅｃｈｓｔ染色で観察・計測）の頻度は増加し、細胞増殖率（増殖細胞核抗原：ＰＣＮＡ標識率により計測）は低下したが、ＨＥＫ２９３細胞ではこれらの変化は軽微であった（図４Ｃ，Ｄ）。
さらに、大腸癌におけるＧＳＫ３βの発現増強の役割を解明するために、個々の大腸癌細胞の生存に及ぼすＧＳＫ３βを標的としたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の効果を観察した。ＧＳＫ３βに特異的な４種類のｓｉＲＮＡ（最終濃度はそれぞれ２５ｎＭ）を混合して細胞に導入したところ、ＨＥＫ２９３細胞と大腸癌細胞ＳＷ４８０におけるＧＳＫ３β蛋白質の発現は特異的に減少した（図５）。この選択的なＧＳＫ３βの発現抑制は、ＧＳＫ３αやアクチンの発現がＧＳＫ３β特異的ｓｉＲＮＡあるいは陰性対照ｓｉＲＮＡのいずれの導入によっても影響されないことでも裏付けられた（図５）。注目すべきことに、ＧＳＫ３βに対するＲＮＡｉは大腸癌細胞ＳＷ４８０やＨＥＫ２９３細胞におけるＧＳＫ３βの発現を同程度に抑制したのに対し、大腸癌細胞ＳＷ４８０の生存は抑制し、ＨＥＫ２９３細胞の増殖生存には影響しなかった（図５）。この結果は大腸癌細胞において過剰発現し活性化されているＧＳＫ３βの特異的がん化作用をさらに支持するものであった。
３．まとめ
種々の大腸癌細胞株や臨床的大腸癌におけるＧＳＫ３βの発現亢進と活性化、およびＧＳＫ３β阻害剤の大腸癌細胞増殖に対する顕著な抑制効果を示した今回の結果は、ＧＳＫ３βが既知のがん化シグナルに対して抑制的に作用し、それゆえＧＳＫ３β阻害剤には潜在的発がん性が予測されるという従来の知見を覆すものであった。すなわち、本研究により、癌細胞において第９セリン残基のリン酸化の欠如と第２１６チロシン残基のリン酸化を介して恒常的に活性化されているＧＳＫ３βの活性や発現を薬理学的ならびに転写調節的技法を駆使して修飾することにより、がんの新たな治療や予防が可能になることが示された。
［実施例２］  大腸癌細胞移植動物モデルに対するＧＳＫ３β阻害剤投与の効果
ＧＳＫ３β阻害（剤）のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける制がん効果を明らかにする目的で、以下の動物実験を実施した。
１．対象と方法
６週齢のヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡ  Ｊｃｌ，ｎｕ／ｎｕ，日本クレア）の左腋窩の皮下に１０７個の大腸がん細胞ＳＷ４８０を２３Ｇ（ゲージ）の注射針を用いて移植した。癌細胞を移植して２週間後に腫瘍生着が確認されたマウスを、ＡＲ−Ａ０１４４１８投与群（Ｎ＝１２）、ＳＢ−２１６７６３投与群（Ｎ＝１２）、ＤＭＳＯ投与（コントロール）群、（Ｎ＝５）の３群に分けた。さらに、ＡＲ−Ａ０１４４１８投与群とＳＢ−２１６７６３投与群をそれぞれ１ｍｇ／ｋｇ（培養細胞実験の５μＭに相当）投与群（Ｎ＝４）、２ｍｇ／ｋｇ（培養細胞実験の１０μＭに相当）投与群および５ｍｇ／ｋｇ（培養細胞実験の２５μＭに相当）投与群の３群、合計６群に分けて、治療実験を行った（表３，図６）。ＤＭＳＯに溶解した３種類の濃度のＡＲ−Ａ０１４４１８（２８３μｇ／ｍＬ＝０．３５ｍＭ；５６７μｇ／ｍＬ＝０．７ｍＭ；１４１９μｇ／ｍＬ＝１．７５ｍＭ）あるいはＳＢ−２１６７６３（２３５μｇ／ｍＬ＝０．３５ｍＭ；４７１μｇ／ｍＬ＝０．７ｍＭ；１１７７μｇ／ｍＬ＝１．７５ｍＭ）をそれぞれ０．２ｍｌずつ、ＤＭＳＯ投与群には同量のＤＭＳＯを週３回（隔日）、腹腔内に注入した。
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これらのＧＳＫ３β阻害剤投与量は、マウスの体液量を体重（２０ｇ程度）の７０％と想定して、培養細胞に使用した培養液中の濃度と同レベルになるように算出した。
すなわち、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇの阻害剤投与量はマウス体液量に換算して、それぞれ、細胞培養液中の阻害剤濃度の５μＭ、１０μＭおよび２５μＭに相当する。
各群のマウスにＤＭＳＯあるいはそれぞれの用量の阻害剤の投与期間に毎週、体重、食餌摂取量と移植腫瘍の大きさ（長径と短径）を計測した。ＤＭＳＯあるいは各阻害剤を投与して５週間後に、エーテル深麻酔によりマウスを安楽死させ、移植腫瘍と主要臓器（肺、肝、膵、腎、脾）を摘出した（図６）。腫瘍の体積は、以下の計算式により算出した。
腫瘍体積（ｃｍ３）＝０．５ｘ長径（ｃｍ）ｘ［短径（ｃｍ）］２
２．結果
図７は、治療実験開始５週間後、各群（４匹ずつ）の代表的な固体を示したものである。対照（ＤＭＳＯ投与）群の移植腫瘍に比べて、ＧＳＫ３β阻害剤を投与されたいずれの群でも左腋窩の皮下移植腫瘍の増殖が抑制されていることが確認された。図８は、異なる用量の各阻害剤投与後の腫瘍体積の変化を経時的に示したものである。このグラフから、移植腫瘍の増殖は、対照群の腫瘍に比べてＧＳＫ３β阻害剤の投与用量に依存して有意に抑制されていることが確認された。なお、対照群を含めていずれの群でも、食餌摂取量や体重変化などの観点から、明らかな有害事象は認められなかった。
この実施例により、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＧＳＫ３β阻害（剤）の抗腫瘍効果が初めて検証された。また、短期間の実験ではあるが、ＧＳＫ３β阻害剤の毒性あるいは有害事象はないものと考えられる。
［実施例３］  神経膠芽腫細胞に対するＧＳＫ３β阻害剤の作用
ＧＳＫ３β阻害（剤）の制がん効果が大腸癌に限定されず、それ以外のがん種、とくに難治性がんに対しても有効かどうかを明らかにすることは、本酵素の阻害に基づくがん治療法の開発には重要な課題である。そこで、大腸癌以外の難治性がん（胃癌、膵癌、肝細胞癌、脳腫瘍など）由来の細胞について実施している実験のうち、難治性がんの一例として神経膠芽腫を対象にした成果を記載する。
１．対象と方法
神経膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）は、極めて分化度が低く悪性度が最も高い神経膠腫で、原発性脳腫瘍の約９％を占める。実際の腫瘍は手術で完全摘出できないことが多く、既存の抗がん剤治療や放射線照射治療に対しても耐性を示し、極めて難治性である。このように、本腫瘍に対する有効な治療法がないことから、その生命予後は最近の２０−３０年間、改善されていない実情であり、新しい治療法の開発が切望されている。
本実施例では、４種類の神経膠芽腫細胞株Ａ１７２、Ｔ９８Ｇ、Ｕ２５１およびＵ８７（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ［ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ］から購入した）と、ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３を対象にした。これらの細胞株におけるＧＳＫ３βとそのリン酸化分画の発現を＜実施例１＞に準じて解析した。また、既知のＧＳＫ３β阻害剤（ＡＲ−Ａ０１４４１８あるいはＳＢ−２１６７６３）の、腫瘍細胞の生存、増殖やアポトーシスなどへの作用を、大腸がん細胞の場合と同様に解析した。
各細胞は一晩培養した後、それぞれＤＭＳＯに溶解したＡＲ−Ａ０１４４１８あるいはＳＢ−２１６７６３を所定の濃度（５μＭ，１０μＭ，２５μＭまたは４０μＭ，５０μＭ）となるように添加した培地で培養し、生存細胞数とアポトーシスの頻度を経時的に測定した。コントロールとして、同量のＤＭＳＯを添加して培養した細胞についても、その生存細胞数とアポトーシスの頻度を測定した。なお、＜実施例１＞とは異なり、生存細胞数の計測にはＷＳＴ−８＊＊アッセイキット（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８，和光，大阪）とＢｉｏ−Ｒａｄ社（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）製のマイクロプレートリーダーを使用した。また、増殖期細胞分画はｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙ  ｕｒｉｄｉｎｅ（ＢｒｄＵ）を取り込む細胞数をＣｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ  ＢｒｄＵ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｐａｎｚｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定し、腫瘍細胞の増殖に及ぼすＧＳＫ３β阻害剤（ＡＲ−Ａ０１４４１８あるいはＳＢ−２１６７６３）の影響を解析した。
＊＊ＷＳＴ−８：４−［３−（４−ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ５−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｏ］−１，３−ｂｅｎｚｅｎｅ  ｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ
２．結果
＜実施例１＞と同様にウエスタンブロット法により解析した結果、４種類の神経膠芽腫細胞株  Ａ１７２、Ｔ９８Ｇ、Ｕ２５１およびＵ８７のいずれにも、ＧＳＫ３βとその第２１６チロシン残基がリン酸化された活性化型分画が検出された（データの提示なし）。現在、これらの神経膠芽腫細胞におけるＧＳＫ３βの酵素活性を非放射性試験管内酵素活性検出法（後述の実施例５を参照）により検証している。
大腸癌細胞の場合と同様に、ＡＲ−Ａ０１４４１８およびＳＢ−２１６７６３で処置した神経膠芽腫細胞はいずれも、ＤＭＳＯで処理した場合（コントロール）に比較して、阻害剤の濃度依存的に生存細胞数が減少し、アポトーシスが顕著に誘導された（図９，１０Ａ，１０Ｂ）。一方、ＨＥＫ２９３細胞では、ＧＳＫ３β阻害剤を培地に加えることによりアポトーシスが軽度に誘導されるものの、ＤＭＳＯで処理した場合（コントロール）との有意差は認められなかった（図１０Ｂ）。また、これらの神経膠芽腫細胞では、ＧＳＫ３β阻害剤処理によって、その増殖が抑制された（図１０Ｃ）。
以上の結果より、大腸がんのほかに神経膠芽腫においても（活性化型）ＧＳＫ３βが腫瘍細胞の生存、増殖を支持し、アポトーシスを阻止していることが明らかにされた。そして、（活性化型）ＧＳＫ３βは大腸癌以外のがん種に対しても治療標的であることが示唆された。
［実施例４］  がん細胞の不死化に対するＧＳＫ３β阻害の影響
ＧＳＫ３β阻害（剤）の制がん効果の分子および細胞レベルのメカニズムを明らかにすることは重要である。そこで、がんに共通する重要な生物学的特性の１つである細胞の不死化（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）に対するＧＳＫ３β阻害（剤）の作用を、細胞の老化とテロメア（ｔｅｌｏｍｅｒｅ）維持機構に着目して解析した。
１．対象と方法
大腸癌細胞および非がん細胞をそれぞれＧＳＫ３β阻害剤あるいは特異的ＲＮＡ干渉により処理し、細胞老化や細胞不死化にかかわる細胞レベル、分子レベルでの変化を解析した。
＜実施例１＞にしたがって、各大腸癌細胞株（ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６）および非がん細胞株（ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３）を２５μＭのＧＳＫ３β阻害剤（ＡＲ−Ａ０１４４１８あるいはＳＢ−２１６７６３）、あるいはＧＳＫ３β特異的ＲＮＡ干渉で処理した。対照として、同じ細胞に対してＤＭＳＯ投与あるいは非特異的ＲＮＡ干渉を行った。そして、ＧＳＫ３βを阻害した細胞と対応する対照細胞における老化細胞の頻度を比較・解析した。また、これらの細胞に対して、細胞不死化の分子指標であるｈｕｍａｎ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ｈＴＥＲＴ）ｍＲＮＡの発現およびｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ活性の変化を経時的に比較解析した。
老化細胞は、β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ活性の指標であるｘ−ｇａｌ染色陽性の細胞として判定した。具体的には、本染色のためカバーグラス上で培養した細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、クエン酸・リン酸固定液（０．１Ｍクエン酸，０．２Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４，ｐＨ６．０）により室温で５分間固定した。ついで、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ｘ−ｇａｌ染色液（１ｍｇ／ｍＬ  ｘ−ｇａｌ［Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ］，５ｍＭ  Ｋ３Ｆｅ［ＣＮ］６，２ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸・リン酸緩衝液，５ｍＭ  Ｋ４Ｆｅ［ＣＮ］６）を３７℃で２０時間反応させた。染色した細胞をＰＢＳで洗浄後、４％パラフォルムアルデヒドで再固定し、光学顕微鏡観察によりｘ−ｇａｌ染色陽性細胞を同定した。老化細胞の頻度は強拡大で５視野観察し、各視野における全細胞数（約１００個の細胞）に占めるｘ−ｇａｌ染色陽性細胞の頻度の平均値として計測・算出した。
ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの発現は、対象細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。ＲＴ−ＰＣＲには上流ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＧＡＡＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＡＧＣＡＡ−３’：配列番号３）と下流ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＧＡＴＧＡＡＧＣＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡ−３’：配列番号４）を用い、（１５秒＠９４℃，１０秒＠５５℃，９秒＠７２℃）ｘ３６ないし３８サイクルのＲＴ−ＰＣＲプログラムによりｈＴＥＲＴ遺伝子を増幅した。ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅの活性は市販のキット（ＴＲＡＰＥＺＥ登録商標Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて、推奨プロトコールに準拠して検出した。ＧＳＫ３β阻害細胞と対照細胞におけるｈＴＥＲＴの発現レベルとｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ活性は、電気泳動上のシグナルをｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）により計測・定量し、比較解析した。
２．結果
２５μＭのＧＳＫ３β阻害剤で７２時間処理することにより、大腸癌細胞株ではいずれも、ＡＲ−Ａ０１４４１８、ＳＢ−２１６７６３、ＤＭＳＯ処理した対照細胞に比べてｘ−ｇａｌ染色陽性細胞として同定される老化細胞の頻度が有意に増加した。一方、ＨＥＫ２９３細胞では、いずれかのＧＳＫ３β阻害剤処理した細胞とＤＭＳＯ処理細胞の老化細胞の頻度に有意差はみとめられなかった（図１１，１２）。
つぎに、ｈＴＥＲＴの発現とｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ活性に対するＧＳＫ３β阻害の効果を検討した。その結果、大腸癌細胞株では、ＡＲ−Ａ０１４４１８、あるいはＳＢ−２１６７６３処理の７２ないし９６時間後にｈＴＥＲＴ発現およびｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ活性が抑制された。一方、ＨＥＫ２９３細胞では、ＧＳＫ３β阻害剤によるｈＴＥＲＴの発現変化あるいはｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ活性の抑制は認められなかった（図１３，１４）。また、これらの細胞において特異的ＲＮＡ干渉によりＧＳＫ３βの発現を減弱させることにより、ＧＳＫ３β阻害剤の場合と同様に大腸癌細胞ではｈＴＥＲＴ発現およびｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ活性が抑制されたが、ＨＥＫ２９３細胞では変化が認められなかった（図１５）。
以上の結果より、癌細胞の不死化の阻止と老化の促進が、ＧＳＫ３β阻害による制がん効果の分子・細胞レベルのメカニズムの１つである可能性が示唆された。
［実施例５］  非放射性試験管内ＧＳＫ３β酵素活性検出法（Ｎｏｎ−ＲＩ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｋｉｎａｓｅ  ａｓｓａｙ）の開発
第２１６チロシン残基リン酸化ＧＳＫ３β蛋白質分画の発現量は、ＧＳＫ３βの酵素活性を相対的（あるいは、間接的）に反映しているに過ぎないため、本酵素活性を直接、検出・測定する手法は、既存の物質のＧＳＫ３β活性阻害効果の評価のために重要である。また、本酵素（活性）が発病あるいは発症にかかわる疾患（２型糖尿病、アルツハイマー病、がんなど）の診断法の開発とともに、これらの疾患に対する薬剤開発の観点から、本酵素活性の阻害効果を有する可能性のある物質のスクリーニングや同定にも極めて有用である。ＧＳＫ３βに限らず、蛋白質リン酸化酵素の活性測定の従来法では放射性同位元素（３２Ｐなど）を標識したＡＴＰが必要とされることが、その実施上の制約となっている。そこで発明者らは、放射性同位元素を必要としない簡便なＧＳＫ３βの活性測定の新しい手法として、非放射性試験管内ＧＳＫ３β酵素活性検出法を開発した。
１．原理
本検出法の原理について、図１６を参照して概説する。まず、細胞抽出液に抗ＧＳＫ３β特異的抗体とビーズ（ｒｅｓｉｎｓ）を加え、ＧＳＫ３β蛋白質を免疫沈降させる（図中Ｓ）。陰性対照（コントロール）として、同じ細胞の抽出液に同濃度の非特異的マウスＩｇＧを加える（図中Ｃ）。ついで、ｋｉｎａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ存在下で、組換えヒトβ−ｃａｔｅｎｉｎ蛋白質（基質）と非放射性ＡＴＰ（図中Ｐ）を加え、リン酸化反応を行う。その後、この反応液をウエスタンブロット法により解析し、抗リン酸化β−ｃａｔｅｎｉｎペプチド抗体によりリン酸化ヒトβ−ｃａｔｅｎｉｎ蛋白質を検出する。組換えヒトβ−ｃａｔｅｎｉｎ蛋白質をそのヒスチジン基を介してビーズ（ｒｅｓｉｎｓ）等に固定化すれば、ウエスタンブロット法を用いることなく、ｏｎ−ｒｅｓｉｎｓ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙも可能である。
２．対象と方法
本法の開発にはＨＥＫ２９３細胞と各種の培養癌細胞株：ＳＷ４８０，ＨＣＴ１１６，ＨＴ２９（大腸癌）；ＭＫＮ−２８，ＮＫＰＳ，ＴＭＫ−１，ＮＵＧＣ−４（胃癌）；ＭＩＡ−ＰａＣａ−２，Ｃａｐａｎ−１，ＢｘＰＣ−３（膵臓癌）：ＨＥＰ−Ｇ２（肝細胞癌）を使用した。これらの細胞はいずれもＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入し、それぞれ推奨の培地と培養条件により培養した。
＜実施例１＞の方法にしたがって、細胞溶解用緩衝液（０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５，１．５Ｍ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，１０ｍＭ  ＥＧＴＡ，１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，２５ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，１０ｍＭ  β−ｇｌｙｃｅｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，１０ｍＭ，Ｎａ３ＶＯ４，Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｃｏｃｋｔａｉｌ［Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ］）を用いて、それぞれの細胞から蛋白質を抽出した。細胞由来の蛋白質１ｍｇ（１０００μｇ）から、定法にしたがってマウスモノクローナル抗ＧＳＫ３β抗体（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と２０μＬのＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ／Ｇ  Ａｇａｒｏｓｅ  ｒｅｓｉｎｓ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）によりＧＳＫ３βを免疫沈降して、ｒｅｓｉｎ上に精製した（以後、ＧＳＫ３βと記載する）。免疫沈降の陰性対照には、抗ＧＳＫ３β抗体の代わりに非特異的マウスＩｇＧを使用した。細胞由来のＧＳＫ３βをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回、ついでリン酸化反応用緩衝液（ｋｉｎａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ）（０．２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５，１０ｍＭ  β−ｇｌｙｃｅｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，２０ｍＭ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ［ＤＴＴ］，１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４，０．１Ｍ  ＭｇＣｌ２）を用いて２回洗浄した。この細胞由来のＧＳＫ３βをｋｉｎａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、１０ｍＭ  ＡＴＰ（非放射性）２μＬと４μｇの組換えヒトβ−ｃａｔｅｎｉｎ蛋白質（基質）を加えて計５０μＬとした。このｋｉｎａｓｅ反応溶液を温水槽中（３０℃）で３０分間反応させた後、等量の２ｘＳＤＳ電気泳動用サンプルバッファーを添加して９５℃で５分間過熱してリン酸化反応を停止した。
この反応液上清をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動で分離し、＜実施例１＞と同様に、ウエスタンブロット法により目的とする以下の蛋白質を解析した。ＧＳＫ３βによるリン酸化の基質として用いた組換えヒトβ−ｃａｔｅｎｉｎ蛋白質のリン酸化は、リン酸化β−ｃａｔｅｎｉｎペプチド（ｐ−β−ｃａｔｅｎｉｎＳｅｒ３３／３７Ｔｈｒ４１）特異抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）により検出した。ついで、反応液中のＧＳＫ３βと組換えヒトβ−ｃａｔｅｎｉｎ蛋白質を同様にウエスタンブロット法により検出した。これにより、それぞれの細胞におけるＧＳＫ３βの発現と相対的な活性の比較も可能になる。
この手法をさらに、ＧＳＫ３β阻害剤の酵素活性阻害効果の判定に応用した。具体的には、ｋｉｎａｓｅ反応液中に最終濃度が２５μＭになるようにＳＢ−２１６７６３あるいはＡＲ−Ａ０１４４１８を添加し、これらの反応液を同様にウエスタンブロット法により解析し、阻害剤の代わりにＤＭＳＯだけを添加した場合のβ−ｃａｔｅｎｉｎリン酸化と比較した。
２．結果
本検出法を用いて、まず、各種大腸癌細胞株（ＳＷ４８０、ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６）および非がん細胞株（ＨＥＫ２９３）を解析したところ、いずれの細胞においてもＧＳＫ３βの酵素活性が検出された（図１７）。リン酸化β−ｃａｔｅｎｉｎのシグナル強度から、ＨＥＫ２９３細胞に比べて大腸癌細胞のＧＳＫ３β活性は高く、この結果はウエスタンブロット法によるｐｈｏｓｐｈｏ−ＧＳＫ３βＴｙｒ２１６分画の検出結果（図１Ａ）と対応していると判断された。
つぎに、大腸癌を含めた種々の消化器癌細胞を対象にして、同様に解析した。その結果、大腸癌以外に、胃癌、膵癌および肝細胞癌の細胞株にもＧＳＫ３βの酵素活性が特異的に検出された。とくに、膵癌細胞（ＢｘＰＣ−３）と肝細胞癌（ＨＥＰ−Ｇ２）に強いＧＳＫ３β活性が検出された（図１８）。この解析により、それぞれの細胞種におけるＧＳＫ３β活性とともに、その総発現量を定量的に比較することが可能であり、同一細胞においては本酵素の発現量と活性に相関がみられた（図１８）。
さらに、本検出法を用いて、既知のＧＳＫ３β阻害剤の効果検証を試みた。その結果、２種類の大腸癌細胞株（ＳＷ４８０，ＨＣＴ１１６）におけるＧＳＫ３βの活性は２５μＭのＳＢ−２１６７６３あるいは同濃度のＡＲ−Ａ−０１４４１８により完全に阻害されることが確認された（図１９）。
一連の結果より、この非放射性試験管内ＧＳＫ３β酵素活性検出法の有用性が検証された。また、この検出法をｏｎ  ｒｅｓｉｎｓ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ法に深化させることにより、本酵素を指標にする疾患診断法の開発や、新しいＧＳＫ３β活性阻害物質のスクリーニング、ならびに本酵素阻害手法の開発に応用可能であることが示唆された。
［実施例６］胃癌、膵癌および肝細胞癌の細胞株におけるＧＳＫ３β阻害の作用
＜実施例３＞と同様の目的で、大腸癌以外の消化器系臓器の癌腫、とくに難治性の消化器癌から樹立された培養細胞株を対象にして、ＧＳＫ３βの発現と活性を解析した。＜実施例５＞と図１８ＡおよびＢに示したように、解析対象にした胃癌細胞株ＭＫＮ−２８、ＮＫＰＳ、ＴＭＫ−１、ＮＵＧＣ−４、膵癌細胞株ＭＩＡＰａＣａ−２、Ｃａｐａｎ１、ＢｘＰＣ−３、および肝細胞癌ＨＥＰ−Ｇ２のうち、ＭＫＮ−２８とＭＩＡＰａＣａ−２以外のすべての細胞株に明瞭なＧＳＫ３βの発現と活性が認められた。
本解析の結果に基づいて、これらの癌細胞の生存、増殖およびアポトーシスに対するＧＳＫ３β阻害（小分子阻害剤、およびＲＮＡ干渉法）の作用を＜実施例１＞および＜実施例３＞の方法により検討する。前記解析結果にしたがい、それぞれの臓器由来でＧＳＫ３βの高い活性を示す癌細胞株（たとえば、ＮＵＧＣ−４、ＢｘＰＣ−３、ＨＥＰ−Ｇ２）についてがん移植動物モデルを作成し、＜実施例２＞にしたがい、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるこれらの難治性消化器癌細胞に対するＧＳＫ３β阻害剤の（腫瘍増殖抑制）効果を検討する。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明は、がん治療や予防のための新規戦略の開発とがんの分子疫学的研究の展開に貢献するものと期待される。
【配列表フリーテキスト】
【０００８】
配列番号１−人工配列の説明：プライマー
配列番号２−人工配列の説明：プライマー
配列番号３−人工配列の説明：プライマー
配列番号４−人工配列の説明：プライマー
［配列表］
2006073202.tif 000012
2006073202.tif 000013
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2006073202.tif 000031
【図１５】
2006073202.tif 000032
【図１６】
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【図１７】
2006073202.tif 000034
【図１８】
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【図１９】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年7月10日(2006.7.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】請求の範囲
【請求項１】グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）の発現あるいは、その第２１６番チロシン残基のリン酸化により活性化されている前記酵素の活性を阻害することにより、がん細胞の生存および／または増殖を抑制する方法。
【請求項２】式（Ｉ）または（ＩＩ）の構造を有する化合物もしくはその薬理学的に許容される塩を作用させることを含む、請求項１に記載の方法
2006073202.tif 000037
（ここで、Ｑ１は−（ＣＨ２）ｎ−Ａｒ（ｎは１〜５の整数、Ａｒは置換基を有していてもよいアリール基）であり、Ｑ２はハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニルまたはアルキルスルホニルから選ばれる基である）
2006073202.tif 000038
（ここで、Ｒ１は水素、アルキル、アラルキル、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、アミノアルキル、モノアルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アジドアルキル、アシルアミノアルキル、アルキルスルホニルアミノアルキル、アリールスルホニルアミノアルキル、メルカプトアルキル、アルキルチオアルキル、グルコピラノシル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、ヒドロキシアルキルチオアルキル、メルカプトアルキルチオアルキル、アリールチオアルキルまたはカルボキシアルキルチオアルキルであり、
Ｒ２は水素、アルキル、アラルキル、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、アミノアルキル、モノアルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アシルアミノアルキル、アルキルスルホニルアミノアルキル、アリールスルホニルアミノアルキル、メルカプトアルキル、アルキルチオアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、アルキルチオまたはアルキルスルフィニルであり、
Ｒ３はハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニルおよびアルキルスルホニルからなる群より選ばれる１または２以上の置換基で置換されたフェニル基であり、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、互いに独立して、水素、ハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニルまたはアルキルスルホニルである）
【請求項３】前記化合物が、Ｎ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ’−（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）ウレアまたは３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】前記がんが大腸癌、胃癌、膵癌、肝癌、および神経膠芽腫から選ばれるいずれか一つ以上である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】前記がんが大腸癌である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】式（Ｉ）または（ＩＩ）の構造を有する化合物もしくはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含む、がんの治療用医薬組成物であって、該化合物がグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）の第２１６番目のチロシン残基のリン酸化により活性化される前記酵素の活性を阻害して、がん細胞の生存および／または増殖を抑制するものであり、かつ前記がんが大腸癌、胃癌、膵癌、肝癌、および神経膠芽腫から選ばれるいずれか一つ以上である前記医薬組成物：
2006073202.tif 000039
（ここで、Ｑ１は−（ＣＨ２）ｎ−Ａｒ（ｎは１〜５の整数、Ａｒは置換基を有していてもよいアリール基）であり、Ｑ２はハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニルまたはアルキルスルホニルから選ばれる基である）
2006073202.tif 000040
（ここで、Ｒ１は水素、アルキル、アラルキル、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、アミノアルキル、モノアルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アジドアルキル、アシルアミノアルキル、アルキルスルホニルアミノアルキル、アリールスルホニルアミノアルキル、メルカプトアルキル、アルキルチオアルキル、グルコピラノシル、カルポキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、ヒドロキシアルキルチオアルキル、メルカプトアルキルチオアルキル、アリールチオアルキルまたはカルボキシアルキルチオアルキルであり、
Ｒ２は水素、アルキル、アラルキル、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、アミノアルキル、モノアルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アシルアミノアルキル、アルキルスルホニルアミノアルキル、アリールスルホニルアミノアルキル、メルカプトアルキル、アルキルチオアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、アルキルチオまたはアルキルスルフィニルであり、
Ｒ３はハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニルおよびアルキルスルホニルからなる群より選ばれる１または２以上の置換基で置換されたフェニル基であり、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、互いに独立して、水素、ハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニルまたはアルキルスルホニルである）
【請求項７】前記化合物が、Ｎ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ’−（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）ウレアまたは３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンである、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】（削除）
【請求項９】（削除）
【請求項１０】前記がんが大腸癌である、請求項６または７に記載の医薬組成物。
【請求項１１】グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）の第２１６番目チロシン残基のリン酸化による前記酵素の活性化に対する阻害効果を指標として、被験物質の抗がん剤としての効果を評価する方法。
【請求項１２】下記の工程を含む、請求項１１に記載の方法：
１）細胞を被験物質の添加または非添加条件下で培養する；
２）上記細胞内における第２１６チロシン残基リン酸化ＧＳＫ３β蛋白質分画の発現量を検出するか、あるいはＧＳＫ３βの酵素活性を検出・測定する
３）被験物質の添加または非添加条件下における、上記発現量あるいは活性の相違に基づいて、該被験物質の抗がん剤としての効果を評価する。
【請求項１３】細胞ががん患者から単離された細胞または癌細胞株である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】下記の工程を含む、請求項１１に記載の方法：
１）がんモデル動物を被験物質の投与または非投与の条件下で飼育する。
２）上記動物の血液または細胞中における第２１６チロシン残基リン酸化ＧＳＫ３β蛋白質分画の発現量を検出する。
３）被験物質の投与または非投与条件下における、上記発現量の相違と移植腫瘍の増殖の変化に基づいて、該被験物質の抗がん剤としての効果を評価する。
【請求項１５】動物がマウスである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】蛋白質の発現量が、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＥＬＩＳＡ法、およびＲＩＡ法から選ばれるいずれか一つの方法によって検出されることを特徴とする、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
性化型ｐｈｏｓｐｈｏ−ＧＳＫ３βＴｙｒ２１６分画の発現が亢進し、一方、第９セリン残基がリン酸化された不活性化型ｐｈｏｓｐｈｏ−ＧＳＫ３βＳｅｒ９分画の発現はほとんど認められなかった。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて大腸癌細胞株や神経膠芽腫細胞株等のがん細胞の生存と増殖は低分子量タイプのＧＳＫ３β阻害剤の投与により用量（濃度）依存的に抑制され、同様にＧＳＫ３βに対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によっても抑制された。さらに、大腸がんモデル動物に  おいてもＧＳＫ３β阻害剤投与による腫瘍組織の用量依存的縮小が観察された。このことは、従来の知見とは異なり、ＧＳＫ３βの発現や活性ががん（とくに大腸がん）の治療や予防の新たな標的となりうることを提示している。
すなわち本発明は、ＧＳＫ３βの発現や第２１６番目チロシン残基リン酸化による活性化阻害を通じて本酵素活性を抑制することにより、がん細胞の生存や増殖を抑制する方法に関する。
前記方法は、式（Ｉ）または（ＩＩ）の構造を有する化合物もしくはその薬理学的に許容される塩をがん細胞に作用させることによって実施できる。
2006073202.tif 000041
（ここで、Ｑ１は−（ＣＨ２）ｎ−Ａｒ（ｎは１〜５の整数、Ａｒは置換基を有していてもよいアリール基）であり、Ｑ２はハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニルまたはアルキルスルホニルから選ばれる基である）
2006073202.tif 000042
（ここで、Ｒ１は水素、アルキル、アラルキル、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、アミノアルキル、モノアルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アジドアルキル、アシルアミノアルキル、アルキルスルホニルアミノアルキル、アリールスルホニルアミノアルキル、メルカプトアルキル、アルキルチオアルキル、グルコピラノシル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、ヒドロキシアルキルチオアルキル、メルカプトアルキルチオアルキル、アリールチオアルキルまたはカルボ
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
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ＡＲ−Ａ０１４４１８は、試薬としてＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ等により販売されており、一般に入手可能である。
上記化合物に限定されず、下記の一般式（Ｉ）で示されるチアゾール誘導体もまた、同様のＧＳＫ３β阻害作用を有する限り、ＡＲ−Ａ０１４４１８と同様、本発明に係るがん細胞の増殖抑制やがんの治療用医薬組成物として利用可能である。
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ここで、Ｑ１は−（ＣＨ２）ｎ−Ａｒ（ｎは１〜５の整数、Ａｒは置換基を有していてもよいアリール基）であり、Ｑ２はハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニルまたはアルキルスルホニルから選ばれる基である。
（２）  ＳＢ−２１６７６３
ＳＢ−２１６７６３は、化学名を３−（２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−４−（１−ｍｅｔｈｙｌ−１Ｈ−ｉｎｄｏｌ−３−ｙｌ）−１Ｈ−ｐｙｒｒｏｌｅ−２，５−ｄｉｏｎｅと称し、下記の式で示されるピロール誘導体である（ＥＰ３２８０２６、特表０１−２３３２８１号  実施例４５参照）。
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ＳＢ−２１６７６３もまた、試薬としてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ等により販売されており、一般に入手可能である。
なお上記化合物に限定されず、下記の一般式（ＩＩ）で示されるピロール類もまた、同様のＧＳＫ３β阻害作用を有する限り、ＳＢ−２１６７６３と同様、本発明に係るがん細胞の増殖抑制やがんの治療用医薬組成物として利用可能である。
【国際調査報告】
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