(57)【要約】   本発明の目的は、極めて少量の細胞数から細胞遺伝子発現プロファイルを作成することによって、これまでサンプルが少量に限られていて扱えなかった病理サンプル、微細組織、微細動物などへの応用、更には、病理診断などで用いられる抹消血中細胞に対する遺伝子発現プロファイルをも可能にすることである。  本発明は、国際公開第02/48352号パンフレットに開示される高カバー率遺伝子発現プロファイル解析法(HiCEP：Highcoverage expression profiling analysis) の改良法であって、ＲＮＡポリメレースの作用により二本鎖ｃＤＮＡ配列に相補的な増幅ＲＮＡを得ることにより、出発原料に含まれていたｍＲＮＡ量を増大させ、且つ、ＰＣＲを利用してＸプライマーとＹプライマーが付加された二本鎖ｃＤＮＡ数を増大させることを特徴とする方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子発現プロファイルを作製する方法であって、
（ａ）ポリ（Ａ）ＲＮＡを鋳型として一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程であって、該一本鎖ｃＤＮＡを基準として５’末端が固相に固定されているか、又は、５’末端にタグ物質が付加された一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｂ）工程（ａ）で合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として二本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡを第１の制限酵素Ｘで切断する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片から固相に固定されているか、又はタグ物質が付加されている３’末端断片を精製する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で精製された断片の第１の制限酵素Ｘによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列、Ｘプライマー配列及びプロモータ配列を含むＸ−プロモータアダプターを結合させて、二本鎖ｃＤＮＡを基準として５’末端側にＸ−プロモータアダプターが結合している二本鎖ｃＤＮＡ断片を得る工程、
（ｆ）工程（ｅ）で生成された二本鎖ｃＤＮＡ断片を鋳型にして、該プロモータ配列に結合するＲＮＡポリメレースで当該二本鎖ｃＤＮＡ配列に相補的な増幅ＲＮＡ（amplifiedＲＮＡ：ａＲＮＡ）を得る工程、
（ｇ）工程（ｆ）で合成されたａＲＮＡを鋳型として、Ｘプライマーに相補的な配列を有する一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｈ）工程（ｇ）で合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、二本鎖ｃＤＮＡを基準として５’末端又は３’末端が固相に固定されているか、又は５’末端又は３’末端にタグ物質が付加された二本鎖ｃＤＮＡ断片二本鎖ｃDNAを合成する工程、
（ｉ）工程（ｈ）で合成された二本鎖ｃＤＮＡを、該二本鎖ｃDNAを基準として５’末端側に位置する該Ｘプライマー配列部分を切断しない第２の制限酵素Ｙで切断する工程、
（ｊ）工程（ｉ）で得られた断片の中から、二本鎖ｃDNAを基準として３’末端に第２の制限酵素Ｙによる切断部位を含む二本鎖ｃDNA断片を精製する工程、
（ｋ）工程（ｊ）で回収された二本鎖ｃDNA断片の第２の制限酵素Ｙによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びＹプライマー配列を含むＹアダプターを結合させて、二本鎖ｃＤＮＡ断片を基準として３’末端側にＹアダプターが結合している二本鎖ｃＤＮＡ断片を得る工程、
（ｌ）工程（ｋ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片を鋳型として、ＸプライマーとＹプライマーとからなるプライマーセットを用いて、工程（ｋ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片を鋳型としてＰＣＲを行ない該二本鎖ｃＤＮＡ断片を増幅する工程、
（ｍ）該Ｘプライマーを基準として３’末端に２塩基配列であるＮ１Ｎ２（Ｎ１及びＮ２は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＸ１プライマーと、該Ｙプライマーを基準として３’末端に２塩基配列であるＮ３Ｎ４（Ｎ３及びＮ４は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＹ１プライマーとからなるプライマーセットを用いて、工程（ｌ）で得られた二本鎖配列を鋳型としてＰＣＲ反応を行う工程、及び、
（ｎ）得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、その移動距離及びピークを検出することにより遺伝子発現プロファイルを作製する工程、
を含む前記方法。
【請求項２】
遺伝子発現プロファイルを作製する方法であって、
（ａ）ポリ（Ａ）ＲＮＡを鋳型として一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程であって、該一本鎖ｃＤＮＡを基準として５’末端が固相に固定されているか、又は、５’末端にタグ物質が付加された一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｂ）工程（ａ）で合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として二本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡを第１の制限酵素Ｘで切断する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片から固相に固定されているか、又はタグ物質が付加されている３’末端断片を精製する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で精製された断片の第１の制限酵素Ｘによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列、Ｘプライマー配列及びプロモータ配列を含むＸ−プロモータアダプターを結合させて、二本鎖ｃＤＮＡを基準として５’末端側にＸ−プロモータアダプターが結合している二本鎖ｃＤＮＡ断片を得る工程、
（ｆ）工程（ｅ）で生成された二本鎖ｃＤＮＡ断片を鋳型にして、該プロモータ配列に結合するＲＮＡポリメレースで当該二本鎖ｃＤＮＡ配列に相補的な増幅ＲＮＡ（amplifiedＲＮＡ：ａＲＮＡ）を得る工程、
（ｇ）工程（ｆ）で合成されたａＲＮＡを鋳型として、Ｘプライマーに相補的な配列を有する一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｈ）工程（ｇ）で合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、二本鎖ｃＤＮＡを基準として５’末端又は３’末端が固相に固定されているか、又は５’末端又は３’末端にタグ物質が付加された二本鎖ｃＤＮＡ断片二本鎖ｃDNAを合成する工程、
（ｉ）工程（ｈ）で合成された二本鎖ｃＤＮＡを、該二本鎖ｃDNAを基準として５’末端側に位置する該Ｘプライマー配列部分を切断しない第２の制限酵素Ｙで切断する工程、
（ｊ）工程（ｉ）で得られた断片の中から、二本鎖ｃDNAを基準として３’末端に第２の制限酵素Ｙによる切断部位を含む二本鎖ｃDNA断片を精製する工程、
（ｋ）工程（ｊ）で回収された二本鎖ｃDNA断片の第２の制限酵素Ｙによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びＹプライマー配列を含むＹアダプターを結合させて、二本鎖ｃＤＮＡ断片を基準として３’末端側にＹアダプターが結合している二本鎖ｃＤＮＡ断片を得る工程、
（ｍ）該Ｘプライマーを基準として３’末端に２塩基配列であるＮ１Ｎ２（Ｎ１及びＮ２は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＸ１プライマーと、該Ｙプライマーを基準として３’末端に２塩基配列であるＮ３Ｎ４（Ｎ３及びＮ４は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＹ１プライマーとからなるプライマーセットを用いて、工程（ｋ）で得られた二本鎖配列を鋳型としてＰＣＲ反応を行う工程、及び、
（ｎ）得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、その移動距離及びピークを検出することにより遺伝子発現プロファイルを作製する工程、
を含む前記方法。
【請求項３】
（ｈ）工程で、相補的に合成されるｃＤＮＡのプライマーとして、固相に固定されているか又はタグ物質が付加されたＸプライマー配列又はその一部を有するオリゴマーをプライマーとして使用することにより、（ｇ）で合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、二本鎖ｃＤＮＡを基準として５’末端が固定されているか又はタグ物質が付加された二本鎖ｃDNAを得ることを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
（ｇ）工程において、固相に固定されているか又はタグ物質が付加されたオリゴＴプライマーを使用することにより、（ｈ）工程で、（ｇ）で合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、二本鎖ｃＤＮＡを基準として３’末端が固定されているか又はタグ物質が付加された二本鎖ｃDNAを得ることを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
プロモータ配列がＴ７プロモータ配列である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
遺伝子発現プロファイルを作製する方法であって、
（ａ）ポリ（Ａ）ＲＮＡを鋳型として一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程であって、該一本鎖ｃＤＮＡを基準として５’末端が固相に固定されているか、又は、５’末端にタグ物質が付加された一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｂ）工程（ａ）で合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として二本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡを第１の制限酵素Ｘで切断する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片から固相に固定されているか、又はタグ物質が付加されている３’末端断片を精製する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で精製された断片の第１の制限酵素Ｘによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びＸプライマー配列を含むＸアダプターを結合させて、二本鎖ｃＤＮＡを基準として５’末端側にＸアダプターが結合している二本鎖ｃＤＮＡ断片を得る工程、
（ｉ）工程（ｅ）で回収された二本鎖ｃＤＮＡ断片を、該二本鎖ｃDNA断片を基準として５’末端側に位置する該Ｘプライマー配列部分を切断しない第２の制限酵素Ｙで切断する工程、
（ｊ）工程（ｉ）で得られた断片の中から、二本鎖ｃDNAを基準として３’末端に第２の制限酵素Ｙによる切断部位を含む二本鎖ｃDNA断片を精製する工程、
（ｋ）工程（ｊ）で回収された二本鎖ｃDNA断片の第２の制限酵素Ｙによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びＹプライマー配列を含むＹアダプターを結合させて、二本鎖ｃＤＮＡ断片を基準として３’末端側にＹアダプターが結合している二本鎖ｃＤＮＡ断片を得る工程、
（ｌ）工程（ｋ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片を鋳型として、ＸプライマーとＹプライマーとからなるプライマーセットを用いて、工程（ｋ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片を鋳型としてＰＣＲを行ない該二本鎖ｃＤＮＡ断片を増幅する工程、
（ｍ）該Ｘプライマーを基準として３’末端に２塩基配列であるＮ１Ｎ２（Ｎ１及びＮ２は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＸ１プライマーと、該Ｙプライマーを基準として３’末端に２塩基配列であるＮ３Ｎ４（Ｎ３及びＮ４は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＹ１プライマーとからなるプライマーセットを用いて、工程（ｌ）で得られた二本鎖配列を鋳型としてＰＣＲ反応を行う工程、及び、
（ｎ）得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、その移動距離及びピークを検出することにより遺伝子発現プロファイルを作製する工程、
を含む前記方法。
【請求項７】
工程（ｆ）において、二本鎖ｃＤＮＡ断片数の約１０〜５００倍の増幅ＲＮＡを得ることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｌ）において、ＰＣＲサイクル数を７〜１０回とすることによって、二本鎖ｃＤＮＡ断片数を１２８〜１０２４倍に増幅することを特徴とする、請求項１又は３〜６に記載の方法。
【請求項９】
固相に固定された各ＤＮＡ配列を使用する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
タグ物質が付加された各ＤＮＡ配列を使用する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、国際公開第02/48352号パンフレットに開示される高カバー率遺伝子発現プロファイル解析法(HiCEP：High
coverage expression profiling analysis) において、極めて微量な試料からでも充分な遺伝子発現プロファイルが得られる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
西暦２００２年、ヒトゲノム配列がほぼ完全に解読された。得られた塩基データからオーダーメード治療等の開発が期待されているが、その為には生体内でどの遺伝子がどの程度発現しているかの解明、すなわち遺伝子発現ネットワークの解明が非常に重要である。そして、遺伝子発現ネットワークの解明に当たっては、ある時点における生体内でどの遺伝子がどの程度発現しているかを示す遺伝子発現プロファイルを作製する必要がある。【０００３】
現在、遺伝子発現プロファイル作製方法として、ディファレンシャルディスプレー法、遺伝子発現の逐次分析法(SAGE)、マイクロアレイ又はDNAチップを用いた方法、及び、上記のHiCEP法などがある。これらの遺伝子発現プロファイル作製方法の中で、HiCEP法は、未知の遺伝子を含む広範囲の遺伝子をカバーする遺伝子発現プロファイルを簡便に作製する方法として優れた方法である。【０００４】
但し、上述の何れの方法においても精度の高い遺伝子発現プロファイルを作成する為には、材料として遺伝子転写産物の一種であるRNAを多量に準備しなければならない。例えば、HiCEP法の場合、他の方法に比べ比較的少量で済むが、それでも安定した再現性の良い遺伝子発現プロファイル結果を得るには、1.5μgのmRNA（Total
RNA換算で約75μg：非特許文献１参照）から最低でも0.1μg（Total RNA換算で約5μg）を用いる必要がある。通常、マウスの培養細胞などからmRNAを最良の条件下で抽出した場合、106個細胞数から約0.2μgから0.1μg程度（Total
RNA換算で約10μgから約5μg）である。しかるに、生体細胞あるいは組織などを研究材料とする場合には、大きさとして小指大ほどの材料を必要とし、臨床現場などから得られるサンプルに対しては現実的に不可能か、あるいは、精度を犠牲にした遺伝子発現プロファイルを余儀無くされる場合もある。【０００５】
一方、DNAチップなどでは、材料が多量に供給できない場合、mRNA自体を増幅するT7
RNA増幅法（非特許文献２）などが知られている。この方法による一般的な増幅率は10から100倍で、要求するTotal RNAの量は、0. 1から0. 01μg、細胞数にして104から103個細胞である。しかし、加工工程数が多く操作が煩雑であり、このため実験毎の揺らぎが増してしまう危険性がある。
【特許文献１】国際公開０２／４８３５２号パンフレット
【非特許文献１】R, Fukumura. et al.: Nucleic AcidsResearch, 2003, Vol. 31, No. 16 e94
【非特許文献２】Eberwine, J. et al.: Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 89: 3010-3014, 1992
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
遺伝子の発現量は、遺伝子の種類及びその発現時期に依存して異なる。したがって、遺伝子発現ネットワークを解明するためには、その前提となる遺伝子発現プロファイル作製方法が発現遺伝子に対して高い検出感度を有していることが望まれる。【０００７】
従って、本発明の目的は、これまで扱えなかった103個の細胞数以下で、細胞遺伝子発現プロファイルを作成することによって、これまでサンプルが少量に限られていて扱えなかった病理サンプル、微細組織、微細動物などへの応用、更には、病理診断などで用いられる抹消血中細胞に対する遺伝子発現プロファイルをも可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
即ち、本発明は第一の態様として、以下の方法に係る。
遺伝子発現プロファイルを作製する方法であって、
（ａ）ポリ（Ａ）ＲＮＡを鋳型として一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程であって、該一本鎖ｃＤＮＡを基準として５’末端が固相に固定されているか、又は、５’末端にタグ物質が付加された一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｂ）工程（ａ）で合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として二本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡを第１の制限酵素Ｘで切断する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片から固相に固定されているか、又はタグ物質が付加されている３’末端断片を精製する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で精製された断片の第１の制限酵素Ｘによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列、Ｘプライマー配列及びプロモータ配列を含むＸ−プロモータアダプターを結合させて、二本鎖ｃＤＮＡを基準として５’末端側にＸ−プロモータアダプターが結合している二本鎖ｃＤＮＡ断片を得る工程、
（ｆ）工程（ｅ）で生成された二本鎖ｃＤＮＡ断片を鋳型にして、該プロモータ配列に結合するＲＮＡポリメレースで当該二本鎖ｃＤＮＡ配列に相補的な増幅ＲＮＡ（amplifiedＲＮＡ：ａＲＮＡ）を得る工程、
（ｇ）工程（ｆ）で合成されたａＲＮＡを鋳型として、Ｘプライマーに相補的な配列を有する一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｈ）工程（ｇ）で合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、二本鎖ｃＤＮＡを基準として５’末端又は３’末端が固相に固定されているか、又は５’末端又は３’末端にタグ物質が付加された二本鎖ｃＤＮＡ断片二本鎖ｃDNAを合成する工程、
（ｉ）工程（ｈ）で合成された二本鎖ｃＤＮＡを、該二本鎖ｃDNAを基準として５’末端側に位置する該Ｘプライマー配列部分を切断しない第２の制限酵素Ｙで切断する工程、
（ｊ）工程（ｉ）で得られた断片の中から、二本鎖ｃDNAを基準として３’末端に第２の制限酵素Ｙによる切断部位を含む二本鎖ｃDNA断片を精製する工程、
（ｋ）工程（ｊ）で回収された二本鎖ｃDNA断片の第２の制限酵素Ｙによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びＹプライマー配列を含むＹアダプターを結合させて、二本鎖ｃＤＮＡ断片を基準として３’末端側にＹアダプターが結合している二本鎖ｃＤＮＡ断片を得る工程、
（ｌ）工程（ｋ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片を鋳型として、ＸプライマーとＹプライマーとからなるプライマーセットを用いて、工程（ｋ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片を鋳型としてＰＣＲを行ない該二本鎖ｃＤＮＡ断片を増幅する工程、
（ｍ）該Ｘプライマーを基準として３’末端に２塩基配列であるＮ１Ｎ２（Ｎ１及びＮ２は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＸ１プライマーと、該Ｙプライマーを基準として３’末端に２塩基配列であるＮ３Ｎ４（Ｎ３及びＮ４は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＹ１プライマーとからなるプライマーセットを用いて、工程（ｌ）で得られた二本鎖配列を鋳型としてＰＣＲ反応を行う工程、及び、
（ｎ）得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、その移動距離及びピークを検出することにより遺伝子発現プロファイルを作製する工程、
を含む前記方法。【０００９】
本発明方法においては、（ｆ）工程にて、ＲＮＡポリメレースの作用により、二本鎖ｃＤＮＡ配列に相補的な増幅ＲＮＡを得ることにより、出発原料に含まれていたｍＲＮＡ量を増大させ、且つ、（ｌ）工程にて、ＰＣＲを利用してＸプライマーとＹプライマーが付加された二本鎖ｃＤＮＡ数を増大させることを特徴とする。【００１０】
上記本発明の第一の態様における（ｆ）工程で、遺伝子発現プロファイル解析に必要な充分な数の増幅ＲＮＡが得られるような場合には、（ｌ）工程を省略することも出来る。従って、本発明は第二の態様として、以下の方法に係る。【００１１】
遺伝子発現プロファイルを作製する方法であって、
（ａ）ポリ（Ａ）ＲＮＡを鋳型として一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程であって、該一本鎖ｃＤＮＡを基準として５’末端が固相に固定されているか、又は、５’末端にタグ物質が付加された一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｂ）工程（ａ）で合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として二本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡを第１の制限酵素Ｘで切断する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片から固相に固定されているか、又はタグ物質が付加されている３’末端断片を精製する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で精製された断片の第１の制限酵素Ｘによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列、Ｘプライマー配列及びプロモータ配列を含むＸ−プロモータアダプターを結合させて、二本鎖ｃＤＮＡを基準として５’末端側にＸ−プロモータアダプターが結合している二本鎖ｃＤＮＡ断片を得る工程、
（ｆ）工程（ｅ）で生成された二本鎖ｃＤＮＡ断片を鋳型にして、該プロモータ配列に結合するＲＮＡポリメレースで当該二本鎖ｃＤＮＡ配列に相補的な増幅ＲＮＡ（amplifiedＲＮＡ：ａＲＮＡ）を得る工程、
（ｇ）工程（ｆ）で合成されたａＲＮＡを鋳型として、Ｘプライマーに相補的な配列を有する一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｈ）工程（ｇ）で合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、二本鎖ｃＤＮＡを基準として５’末端又は３’末端が固相に固定されているか、又は５’末端又は３’末端にタグ物質が付加された二本鎖ｃＤＮＡ断片二本鎖ｃDNAを合成する工程、
（ｉ）工程（ｈ）で合成された二本鎖ｃＤＮＡを、該二本鎖ｃDNAを基準として５’末端側に位置する該Ｘプライマー配列部分を切断しない第２の制限酵素Ｙで切断する工程、
（ｊ）工程（ｉ）で得られた断片の中から、二本鎖ｃDNAを基準として３’末端に第２の制限酵素Ｙによる切断部位を含む二本鎖ｃDNA断片を精製する工程、
（ｋ）工程（ｊ）で回収された二本鎖ｃDNA断片の第２の制限酵素Ｙによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びＹプライマー配列を含むＹアダプターを結合させて、二本鎖ｃＤＮＡ断片を基準として３’末端側にＹアダプターが結合している二本鎖ｃＤＮＡ断片を得る工程、
（ｍ）該Ｘプライマーを基準として３’末端に２塩基配列であるＮ１Ｎ２（Ｎ１及びＮ２は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＸ１プライマーと、該Ｙプライマーを基準として３’末端に２塩基配列であるＮ３Ｎ４（Ｎ３及びＮ４は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＹ１プライマーとからなるプライマーセットを用いて、工程（ｋ）で得られた二本鎖配列を鋳型としてＰＣＲ反応を行う工程、及び、
（ｎ）得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、その移動距離及びピークを検出することにより遺伝子発現プロファイルを作製する工程、
を含む前記方法。【００１２】
更に、上記本発明の第一の態様における（ｌ）工程において、ＰＣＲにより遺伝子発現プロファイル解析に必要な充分な数の二本鎖ｃＤＮＡが増幅することが可能である場合には、（ｆ）〜（ｈ）工程を省略することが出来る。従って、本発明は第三の態様として、以下の方法に係る。【００１３】
遺伝子発現プロファイルを作製する方法であって、
（ａ）ポリ（Ａ）ＲＮＡを鋳型として一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程であって、該一本鎖ｃＤＮＡを基準として５’末端が固相に固定されているか、又は、５’末端にタグ物質が付加された一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｂ）工程（ａ）で合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として二本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡを第１の制限酵素Ｘで切断する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片から固相に固定されているか、又はタグ物質が付加されている３’末端断片を精製する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で精製された断片の第１の制限酵素Ｘによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びＸプライマー配列を含むＸアダプターを結合させて、二本鎖ｃＤＮＡを基準として５’末端側にＸアダプターが結合している二本鎖ｃＤＮＡ断片を得る工程、
（ｉ）工程（ｅ）で回収された二本鎖ｃＤＮＡ断片を、該二本鎖ｃDNA断片を基準として５’末端側に位置する該Ｘプライマー配列部分を切断しない第２の制限酵素Ｙで切断する工程、
（ｊ）工程（ｉ）で得られた断片の中から、二本鎖ｃDNAを基準として３’末端に第２の制限酵素Ｙによる切断部位を含む二本鎖ｃDNA断片を精製する工程、
（ｋ）工程（ｊ）で回収された二本鎖ｃDNA断片の第２の制限酵素Ｙによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びＹプライマー配列を含むＹアダプターを結合させて、二本鎖ｃＤＮＡ断片を基準として３’末端側にＹアダプターが結合している二本鎖ｃＤＮＡ断片を得る工程、
（ｌ）工程（ｋ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片を鋳型として、ＸプライマーとＹプライマーとからなるプライマーセットを用いて、工程（ｋ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片を鋳型としてＰＣＲを行ない該二本鎖ｃＤＮＡ断片を増幅する工程、
（ｍ）該Ｘプライマーを基準として３’末端に２塩基配列であるＮ１Ｎ２（Ｎ１及びＮ２は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＸ１プライマーと、該Ｙプライマーを基準として３’末端に２塩基配列であるＮ３Ｎ４（Ｎ３及びＮ４は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＹ１プライマーとからなるプライマーセットを用いて、工程（ｌ）で得られた二本鎖配列を鋳型としてＰＣＲ反応を行う工程、及び、
（ｎ）得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、その移動距離及びピークを検出することにより遺伝子発現プロファイルを作製する工程、
を含む前記方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明方法においては、（ｆ）工程にて、例えば、10から500倍、及び（ｌ）工程にて、例えば128から1,024倍することにより出発材料に含まれていた基のｍＲＮＡを最終的に約1,000から500,000倍に増幅することができる。
その結果、従来のＨｉＣＥＰで用いられていた106個の細胞数を103個から１個ないし数個の細胞数（Total RNA換算で約10ngから約20pg）まで減らすことができる。この細胞数は、これまでDNAチップで可能（下限界）とされていた103個細胞数を下回り、これまでサンプルが少量に限られていて扱えなかった病理サンプル、微細組織、微細動物など遺伝子発現プロファイル解析を可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明方法における工程（ａ）の概略を示す。
【図２】本発明方法における工程（ｂ）及び（ｃ）の概略を示す。
【図３】本発明方法における工程（ｄ）及び（ｅ）の概略を示す。
【図４】本発明方法における工程（ｆ）の概略を示す。
【図５】本発明方法における工程（ｇ）の概略を示す。
【図６】本発明方法における工程（ｈ）の概略を示す。
【図７】本発明方法における工程（ｉ）及び（ｊ）の概略を示す。
【図８】本発明方法における工程（ｋ）の概略を示す。
【図９】本発明方法における工程（ｌ）の概略を示す。
【図１０】本発明方法における工程（ｍ）の概略を示す。
【図１１】本発明方法における工程（ｎ）の概略を示す。
【図１２】Total RNA 10μg、細胞数換算 106個細胞を用いた遺伝子発現プロファイル解析結果を示す（T10uLot1（黒線）とT10uLot2（青線））
【図１３】Total RNA 10ng、細胞数換算 103個細胞を用いた遺伝子発現プロファイル解析結果を示す（T10nLot1（黒線）とT10nLot2（青線））。
【図１４】Total RNA 20pg、細胞数換算 2個細胞を用いた遺伝子発現プロファイル解析結果を示す（T20pLot1（黒線）とT20pLot2（青線））。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、従来のＨｉＣＥＰ法におけるcDNA作成工程とPCR増幅工程の改良を主な特徴とする方法である。【００１７】
ＨｉＣＥＰ法は、制限酵素ＤＮＡ断片長多型（ＲＦＬＰ）とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づき開発された遺伝子発現プロファイル法であり、ＰＣＲ産物の電気泳動から得られる移動距離とピークのデータから、ある条件下における特定の細胞における遺伝子の発現パターン、公知及び未知遺伝子の発現の有無、それらの発現量等に関する情報から成る遺伝子発現プロファイルを得、それらに基づき、遺伝子発現頻度の解析及び各遺伝子の同定をすることが出来る。このＨｉＣＥＰ法では、擬陽性シグナルを２％以下にすることが可能であり、その結果、存在率の高い４塩基認識制限酵素を使用することにより、８０％という非常に高いカバー率（全発現転写物の中で観察可能な転写物の割合）を達成することが出来、更に、1.2 倍までの発現差を検出することも可能である。【００１８】
上記の本発明方法で、遺伝子プロファイル作成に際して、プライマーのミスアニーリングに起因する偽ピークの発生を減少させるためには、工程（ｌ）及び／又は（ｍ）において、Xプライマー又はX１プライマー、及びYプライマー又はY１プライマーのそれぞれXアダプター及びYアダプターへのアニーリングを、プライマーのTmMAX+6℃〜TmMAX+14℃の温度で行うことが好ましい。又、特に断りのないかぎり、二本鎖cDNAのセンス鎖(鋳型となるポリ(A)RNAに相同な配列を有する鎖)の5'末端側を二本鎖cDNAの5'末端側とし、当該センス鎖の3'末端側を二本鎖cDNAの3'末端側とする。【００１９】
「制限酵素」とは、一般的に、制限エンドヌクレアーゼとも称される酵素であり、特定の配列において二本鎖DNAを加水分解し切断する酵素である。本発明においては、適切な断片を得るために2種類の制限酵素X及びYを組み合わせて使用する。本発明に使用可能な制限酵素は、発現された遺伝子であるmRNAから合成された二本鎖cDNAを、識別可能な長さを有する断片に切断することが可能な酵素が好ましい。また、得られた当該二本鎖のより多くを、好ましくはほとんど全ての二本鎖を切断するような酵素が好ましい。例えば、国際公開０２／４８３５２号パンフレットに記載されているような当業者に公知の６塩基認識酵素又は４塩基認識酵素を使用することが出来る。但し、既に記載したように、高いカバー率を達成する為には、例えば、ＭｓｐＩ及びＭｓｅＩのような４塩基認識酵素を組み合わせて使用することが好ましい。【００２０】
「アダプター」は、該アダプターは第１又は第２の制限酵素による切断部位に相補的な配列を有しているために、該切断部位と結合することができる。そして、Ｘプライマー又はＹプライマー配列を有するために、その後の工程（ｌ）において、各プライマーを使用してＰＣＲ反応によりそれらに挟まれた配列を増幅することができる。使用する制限酵素及びプライマーの構造に種類等に応じて適宜設計することが出来る。安定したＰＣＲ反応を行わせるためには、通常、プライマーの長さは３０塩基程度である。【００２１】
「Ｘプライマー」、「Ｘ１プライマー」、「Ｙプライマー」及び「Ｙ１プライマー」は、対象ＲＮＡ配列と出来るだけ一致させないために、１６塩基以上の長さを有することが好ましい。更に、例えば、「バイオラッド実験イラストレイテッド（３）新版  本当にふえるＰＣＲ」中山広樹  著、秀潤社、２００２年、第２版、第４刷に記載されているような、ＰＣＲプライマーとして一般的に要求される条件を満たしている必要がある。また、各プライマーは当業者に公知の一般的なプライマー合成方法（Letsinger eet al., Nucleic Acids Research, 20, 1879-1882, 1992; 特開平１１−０８０１８号公報）に従い調製することができる。【００２２】
更に、ＰＣＲ反応後の検出を容易にするために、これらプライマーの少なくともいずれかの末端に、当業者に公知の任意の蛍光物質等の標識物質が結合していることが好ましい。例えば、適当な蛍光物質として、６−カルボキシフルオレッセイン（ＦＡＭ）、４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロー６−カルボキシフルオレッセイン（ＨＥＸ）、ＮＥＤ（アプライドシステムズジャパン社）及び６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（Ｒｏｘ）等を挙げることが出来る。【００２３】
本発明方法の（ｆ）工程及び／又は（ｌ）工程における増幅の程度は、出発材料又は試験材料（それに元来含まれるｍＲＮＡ量）、使用するポリメレース及びプロモータ配列の種類、並びに、各工程の反応条件等に応じて当業者が適宜決めることが出来るが、正確な遺伝子発現プロファイル解析をするには、これらの増幅過程において、試験材料に元来含まれている各ｍＲＮＡ量間の比率が維持されることが必要である。その為には、工程（ｆ）において、二本鎖ｃＤＮＡ断片数の約１０〜５００倍の増幅ＲＮＡを得ることが好ましい。又、工程（ｌ）においては、ＰＣＲサイクル数を７〜１０回とすることによって、二本鎖ｃＤＮＡ断片数を１２８〜１０２４倍に増幅することが好ましい。【００２４】
本発明方法で使用するＲＮＡポリメレース及びプロモータ配列に特に制限はなく、当業者に公知の任意のものを使用することが可能である。例えば、大腸菌に感染するファージ由来のＴ３プロモータ配列又はＴ７プロモータ配列、及びＳＰ６プロモータ配列、並びに、これら各配列に結合するＲＮＡポリメレースを挙げることが出来る。【００２５】
本発明方法の（ｈ）工程で、（ｇ）で合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、二本鎖ｃＤＮＡを基準として５’末端が固定されているか又はタグ物質が付加された二本鎖ｃDNA断片を得る場合には、相補的に合成されるｃＤＮＡのプライマーとして、固相に固定されているか又はタグ物質が付加されたＸプライマー配列又はその一部を有するオリゴマーをプライマーとして使用すればよい。
又、（ｈ）工程で、（ｇ）で合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、二本鎖ｃＤＮＡを基準として３’末端が固定されているか又はタグ物質が付加された二本鎖ｃDNA断片を得る場合には、その前の（ｇ）工程において、工程（ａ）と同様に、オリゴｄＴビーズのような固相に固定されているか又はタグ物質が付加されたオリゴＴプライマーを使用すればよい。【００２６】
更に、工程（ｈ）で得られる二本鎖ｃDNA断片の５’末端又は３’末端のいずれが固定されているか又はタグ物質が付加されているかに応じて、（ｊ）工程において、固相に固定されているか又はタグ物質が付加された二本鎖ｃDNA断片が回収・精製の対象となるか、又は、除去の対象となるかが決まる。【００２７】
ここで、固相は、当業者に公知の任意の物質から適宜選択することができ、例えば、ポリスチレンビーズ、磁気ビーズ及びシリカゲルビース等を挙げることが出来る。【００２８】
「タグ物質」及び「タグ物質に高親和性を有する物質」とは、互いに高親和性をもって特異的に結合することが可能な結合対を構成する一方の物質を意味する。互いに高親和性をもって特異的に結合するこが可能な結合対であれば使用することが可能である。本発明に使用可能なタグ物質とタグ物質に高親和性を有する物質との組合せの例には、ビオチンとストレプトアビジン、ビオチンとアビジン、FITCとFITC抗体、DIGとanti-DIG及びプロテインAとマウスIgG及びラテックス粒子等が含まれるが、これらに限られるものではない。タグ物質のDNA配列への付加は、当業者に公知の適当な条件により達成することが可能である。又、これらのタグ物質と該タグ物質に高親和性を有する物質との反応を介して各配列を固相に固定することも可能である。【００２９】
本発明方法の各工程において、タグ物質が付加されている二本鎖ｃＤＮＡ断片を回収する場合には、該タグ物質に高い親和性を有する物質との特異的な反応を利用することが出来る。又、固相に固定されている二本鎖ｃＤＮＡ断片は、それ以外の断片を洗浄等によって反応系から除去することにより、容易に回収することが出来る。これらの各反応は当業者に公知の適当な条件により達成することが可能である。【００３０】
更に、ＨｉＣＥＰ法の実施に際してのその他の条件及び使用する装置等は、国際公開０２／４８３５２号の記載を参照することが出来る。尚、得られた遺伝子発現プロファイルは、当業者に公知の解析ソフトウェア、例えば、ＧｅｎｅＳｃａｎ（登録商標：アプライドバイオシステムズジャパン社）を使用して解析することが出来る。
【実施例】
【００３１】
以下に、固相を用いる本発明の第一の態様に対応する実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はそれらに限定されるものではない。尚、以下の実施例の概略を図１〜図１１に示す。【００３２】
材料
ＴＴ２細胞（インビトロジェン社）を培養し、107個の細胞を得た。
この細胞から、インビトロジェン社 RNAeasy Total RNA抽出キットを用いて、100μgのTotal RNAを得た。このTotal RNAをサンプル表に示す量に分割し、試験材料とした。尚、実験の再現性を確認する為に、各サンプルは2つのLotを用意した。【００３３】
【表１】
2005118791.tif 000002
【００３４】
（ａ）ポリ（Ａ）ＲＮＡを鋳型として一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程であって、該一本鎖ｃＤＮＡを基準として５’末端が固相に固定された一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程。【００３５】
合成5’末端Biotin修飾dT30Vオリゴマー（配列番号１）
Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTV  (V = A or C or G)
2.6μg（約250pmol）とDYNAL社製DynabeadsM280（Streptavidinコート磁気ビーズ）1mlを室温で30分混和し、Biotin-Streptavidin結合反応を起こさせた。この磁気ビーズ固相化dT30Vオリゴマー液を磁石の上にセットし、磁気ビーズを吸着させ、上清を取り除き、未反応dT30Vオリゴマーを取り除いた。回収した磁気ビーズ固相化dT30Vオリゴマーを10μlの水に溶解し、磁気ビーズ固相化dT30Vオリゴマーを得た。この磁気ビーズ固相化dT30Vオリゴマー溶液をT10u
Lot1溶液1μl（濃度10μg／μl）、T10u Lot2 溶液1μl（濃度10μg／μl）、T10n Lot1溶液1μl（濃度10ng／μl）、T10n
Lot2 溶液1μl（濃度10ng／μl）、T20p Lot1溶液1μl（濃度20pg／μl）、T20p Lot2 溶液1μl（濃度20pg／μl）へそれぞれ1μl加えた。以後の操作は各サンプル、各Lotに対して共通であるので、T10u
Lot1を代表とし、T10uL1と表記して記載する。T10uL1溶液を用いてInvitorgen社製SuperScript III First-Strand Synthesis System とそのプロトコルにしたがって、下記操作にてT10uL1の1st cDNA合成を行なった。【００３６】
【表２】
2005118791.tif 000003
【００３７】
この溶液を、65℃、
5分間インキュベーションし、磁気ビーズ固相化dT30VオリゴマーにmRNAをハイブリダイゼーションした。次いで下記1st cDNA合成反応の溶液を加えた。【００３８】
【表３】
2005118791.tif 000004
【００３９】
50℃、60分反応後、85℃
5分間加温し、SuperScript III RTを失活させた。【００４０】
（ｂ）工程（ａ）で合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として二本鎖ｃＤＮＡを合成する工程。【００４１】
【表４】
2005118791.tif 000005
【００４２】
この反応溶液を16℃
120分放置後、次いで、70℃ 15分インキュベーションし反応を行なった。得られた反応液を磁石の上にセットし、磁気ビーズを吸着させ、上清を取り除き、不要となった酵素や未反応試薬を取り除いた。更に、500μlの0.1X
TE bufferで2回洗浄した。次いで、水を40.4μl加えて、磁石からはずし、磁気ビーズを分散させた。【００４３】
（ｃ）工程（ｂ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡを第１の制限酵素Ｘで切断する工程。【００４４】
【表５】
2005118791.tif 000006
【００４５】
この溶液を37℃,
4時間反応させた。【００４６】
（ｄ）工程（ｃ）で得られたｃＤＡＮ断片から固相に固定された3’末端断片を精製する工程
工程（ｃ）で得られた反応液を磁石の上にセットし、磁気ビーズを吸着させ、上清を取り除き、不要となった酵素や反応残渣を取り除いた。更に、500μlの0.1X TE bufferで2回洗浄した。次いで、水を20μl加えて、磁石からはずし、磁気ビーズを分散させた。【００４７】
（ｅ）工程（ｄ）で精製された断片の第１の制限酵素Ｘによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びＸプライマー配列とＴ７プロモータ配列を含むＸ−Ｔ７アダプターを結合させて、二本鎖ｃＤＮＡを基準として５’末端側にＸ−Ｔ７アダプターが結合している断片を得る工程【００４８】
Ｘ−Ｔ７アダプター作成
合成ＤＮＡオリゴマー：
Ｘ−Ｔ７Ｓ（配列番号２）
TAGGTAATACGACTCACTATAGGGAATGGCTACACGAACTCGGTTCATGACA
Ｘ−Ｔ７ＡＳ（配列番号３）
CGTGTCATGAACCGAGTTCGTGTAGCCATTCCCTATAGTGAGTCGTATTACCTA
各100pmol/μlを用意した。それぞれを、50μlずつ混合し、95℃ 5分加温後、室温になるまで放置した。これにより、2本鎖DNAであるＸ−Ｔ７アダプター溶液（50pmol/μl）が作成された。【００４９】
【表６】
2005118791.tif 000007
【００５０】
この溶液を25℃ 4時間加温した。得られた反応液を磁石の上にセットし、磁気ビーズを吸着させ、上清を取り除き、不要となった酵素や未反応試薬を取り除した。更に、500μlの0.1X
TE bufferで2回洗浄した。次いで、水を12μl加えて、磁石からはずし、磁気ビーズを分散させた。【００５１】
（ｆ）工程（ｅ）で生成された二本鎖ｃＤＮＡを鋳型にして、Ｔ７ＲＮＡポリメレースで当該二本鎖ｃＤＮＡ配列に相補的なamplifiedＲＮＡ（ａＲＮＡ）合成と当該二本鎖ｃＤＮＡ数の10から500倍数のａＲＮＡを得る工程。【００５２】
【表７】
2005118791.tif 000008
【００５３】
工程（ｅ）で得られた磁気ビーズにａＲＮＡ合成反応溶液20μlを加え懸濁した。この懸濁溶液を40℃
60分加温後、85℃ 5分加熱した。得られた反応液を磁石の上にセットし、磁気ビーズを吸着させ、上清を取った。この上清に増幅されたａＲＮＡが含まれていた。【００５４】
（ｇ）工程（ｆ）で合成されたａＲＮＡを鋳型として一本鎖ｃＤＡＮを合成する工程であって、Ｘプライマーに相補的な配列を有する一本鎖ｃＤＡＮを合成する工程【００５５】
dT30Vオリゴマー（配列番号１）
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTV  (V = A or C or G)
50pM溶液に調整した。【００５６】
【表８】
2005118791.tif 000009
【００５７】
この溶液を、65℃
5分間インキュベーションし、dT30VオリゴマーにmRANをハイブリダイゼーションした。次いで下記1st cDNA合成反応の溶液を加えた。【００５８】
【表９】
2005118791.tif 000010
【００５９】
50℃,60分反応後、E.coli
RNAse H (1u/μl) 2μlを加え、50℃ 10分加温後、85℃ 5分間加温し、酵素を失活させた。【００６０】
（ｈ）工程（ｇ）で合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として二本鎖ｃＤＮＡを合成する工程であって、該一本鎖ｃＤＮＡを基準として相補的に合成されるｃＤＡＮの５’末端が固相に固定された二本鎖ｃＤＮＡを合成する工程。【００６１】
合成5’末端Biotin修飾ａＲＮＡ2ndオリゴマー
Biotin−GGGAATGGCTACACGAACTCGGTTCATGACACGG（配列番号４）
2.8μg（約250pmol）とDYNAL社製DynabeadsM280（Streptavidinコート磁気ビーズ）100μlを室温で30分混和し、Biotin-Streptavidin結合反応を起こさせた。この磁気ビーズ固相化ａＲＮＡ2ndオリゴマー液を磁石の上にセットし、磁気ビーズを吸着させ、上清を取り除き、未反応ａＲＮＡ2ndオリゴマーを取り除いた。【００６２】
回収した磁気ビーズ固相化ａＲＮＡ2ndオリゴマーに工程（ｇ）溶液27μl加え、この溶液を、65℃ 5分間インキュベーションし、磁気ビーズ固相化ａＲＮＡ2ndオリゴマーにａＲＮＡをハイブリダイゼーションした。得られた反応液を磁石の上にセットし、磁気ビーズを吸着させ、上清を取り除き、不要となった酵素や未反応試薬を取り除した。更に、500μlの0.1X
TE bufferで2回洗浄し、磁石からはずした。次いで下記2nd cDNA合成反応の溶液を加えた。【００６３】
【表１０】
2005118791.tif 000011
【００６４】
この溶液を、16℃
60分、22℃ 60分、70℃ 10分の順でインキュベーションした。次いで、T4 DNA Polymerase (10u/μl) を2μl加え、37℃ 10分インキュベーションする。得られた反応液を磁石の上にセットし、磁気ビーズを吸着させ、上清を取り除き、不要となった酵素や未反応試薬を取り除いた。更に、500μlの0.1X
TE bufferで2回洗浄した。次いで、水を176μl加えて、磁石からはずし、磁気ビーズを分散させた。【００６５】
（ｉ）工程（ｈ）で合成された二本鎖ｃＤＮＡを、該二本鎖ｃDNAを基準として５’末端側に位置する該Ｘプライマー配列部分を切断しない第２の制限酵素Ｙで切断する工程。【００６６】
【表１１】
2005118791.tif 000012
【００６７】
（ｊ）工程（ｉ）で得られた断片の中から固相に固定された断片を精製する工程。
工程（ｉ）で得られた反応液を磁石の上にセットし、磁気ビーズを吸着させ、上清を取り除き、不要となった酵素や反応残渣を取り除いた。更に、500μlの0.1X TE bufferで2回洗浄する。次いで、水を20μl加えて、磁石からはずし、磁気ビーズを分散させた。【００６８】
（ｋ）工程（ｊ）で回収された断片の第２の制限酵素Ｙによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びＹプライマー配列を含むＹアダプターを結合させて、二本鎖ｃＤＮＡを基準として３’末端側にＹアダプターが結合している二本鎖配列を得る工程。【００６９】
Ｙアダプター作成
合成ＤＮＡオリゴマー：
ＹＳ ： TACGCAGTAGGACGCCTCGTGACGATACTT（配列番号５）
ＹＡＳ ：AAGTATCGTCACGAGGCGTCCTACTGCG（配列番号６）【００７０】
各100pmol/μlを用意する。それぞれを、50μlずつ混合し、95℃
5分加温後、室温になるまで放置した。これにより、2本鎖DNAであるＹアダプター溶液（50pmol/μl）が作成された。【００７１】
【表１２】
2005118791.tif 000013
【００７２】
この溶液を25℃ 4時間加温する。得られた反応液を磁石の上にセットし、磁気ビーズを吸着させ、上清を取り除き、不要となった酵素や未反応試薬を取り除いた。更に、500μlの0.1X
TE bufferで2回洗浄した。次いで、水を30μl加えて、磁石からはずし、磁気ビーズを分散させた。【００７３】
（ｌ）工程（ｋ）で得られた、５’末端側にＸプライマーに相補的な配列を、３’末端にＹプライマーに相補的な配列を有する二本鎖ｃＤＮＡに対して、ＸプライマーとＹプライマーを付加してＰＣＲにて該二本鎖ｃＤＮＡ数を27から210倍（約128から1,024倍）増幅する工程。【００７４】
Ｘプライマー（配列番号７）
TGGCTACACGAACTCGGTTC
Ｙプライマー  （配列番号８）
TCCTGCGGAGCACTGCTATG 
ＸプライマーとＹプライマーを各100pmol/μl溶液に調整した。【００７５】
【表１３】
2005118791.tif 000014
【００７６】
PCR温度ステップ
ステップ１ 95℃、5min、
ステップ２ （95℃ 20sec、68℃ 15min）x ７回、
ステップ３ 60℃、30min。【００７７】
得られた反応液を磁石の上にセットし、磁気ビーズを吸着させ、上清を取った。この上清に増幅されたｃＤＮＡが含まれていた。【００７８】
（ｍ）該Ｘプライマーを基準として３’末端に２塩基配列であるＮ１Ｎ２（Ｎ１及びＮ２は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＸ１プライマーと、該Ｙプライマーを基準として３’末端に２塩基配列であるＮ３Ｎ４（Ｎ３及びＮ４は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＹ１プライマーとからなるプライマーセットを用いて、工程（ｌ）で得られた二本鎖配列を鋳型としてＰＣＲ反応を行う工程。【００７９】
Ｘ１プライマー：Ｘアダプターと相補的な配列と２塩基の組合せ配列を持ち、５’末端が蛍光色素で標識されているオリゴマー【００８０】
【表１４】
2005118791.tif 000015
【００８１】
【表１５】
2005118791.tif 000016
【００８２】
以上の合計32本のオリゴマーを合成し、各プライマーを2μM濃度に調整した。各プライマー溶液を2μlずつＸ１プライマーとＹ１プライマーの組合せ表に従ってPCRチューブ256本へそれぞれ分注した。【００８３】
【表１６】
2005118791.tif 000017
【００８４】
【表１７】
2005118791.tif 000018
【００８５】
次いで、ＰＣＲ反応液を各チューブに16μlずつ分注し、PCR装置にセットし、PCRを行なった。【００８６】
PCR温度ステップ
ステップ１ 95℃、1min、
ステップ２ （98℃ 20sec、71.5℃ 30sec、72℃
1min）x ２８回、
ステップ３ 60℃、30min。【００８７】
（ｎ）得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、その移動距離及びピークを検出することにより遺伝子発現プロファイルを作製する工程。
工程（ｍ）で得られたＰＣＲ産物をApplied Biosystems社製ABI PRISM（登録商標） 3100 Genetic Analyzerにて、そのマニュアルに従って、電気泳動と解析を行なった。得られた、各サンプルの各Lotの256チューブを全て解析した結果、全てのサンプルに置いて同じＸ１プライマーとＹ１プライマーの組合せに関して、電気泳動波形パターンが一致していることを確認した。例として、サンプルT10uL1とT10uL2（サンプル名T10uのLot1とLot2）、T10nL1とT10nL2（サンプル名T10nのLot1とLot2）、T20pL1とT20pL2（サンプル名T20pのLot1とLot2）のＸ１プライマーがX-AAとＹ１プライマーがY-GAの結果を、ぞれぞれ、図１２〜１４に示す。【００８８】
【表１８】
2005118791.tif 000019
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明方法は、これまでサンプルが少量に限られていて扱えなかった病理サンプル、微細組織、微細動物など遺伝子発現プロファイル解析で有利に使用することが出来る。
【図１】
2005118791.tif 000020
【図２】
2005118791.tif 000021
【図３】
2005118791.tif 000022
【図４】
2005118791.tif 000023
【図５】
2005118791.tif 000024
【図６】
2005118791.tif 000025
【図７】
2005118791.tif 000026
【図８】
2005118791.tif 000027
【図９】
2005118791.tif 000028
【図１０】
2005118791.tif 000029
【図１１】
2005118791.tif 000030
【図１２】
2005118791.tif 000031
【図１３】
2005118791.tif 000032
【図１４】
2005118791.tif 000033
【配列表】
2005118791000001.app
【国際調査報告】
2005118791.tif 000034
2005118791.tif 000035
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