(57)【要約】  本発明の目的は、比較的少量の細胞や組織から26Sプロテアソームを再構成する方法を提供することである。本発明によれば、hsp70, hsp70/hsp40, hsp90又はPA28の存在下において細胞又は組織のライセートをインキュベートすることを含む、26Sプロテアソームをインビトロで再構成する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
hsp70, hsp70/hsp40, hsp90又はPA28の存在下において細胞又は組織のライセートをインキュベートすることを含む、26Sプロテアソームをインビトロで再構成する方法。
【請求項２】
細胞又は組織のライセートが、細胞又は組織に緩衝液を加えてホモジナイズした液体を遠心することにより得られる上清である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ATPの存在下又は非存在下においてインキュベートを行う、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
hsp70, hsp70/hsp40, hsp90又はPA28が組み換え蛋白質である、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
hsp70, hsp70/hsp40, hsp90又はPA28が、精製のためのタグで標識された組み換え蛋白質である、請求項１から４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
インキュベーション後に、前記タグを利用して26Sプロテアソームを精製する工程をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
hsp70, hsp70/hsp40, hsp90又はPA28の存在下において細胞又は組織のライセートをインキュベートすることによって得られる、インビトロで再構成された26Sプロテアソーム。
【請求項８】
細胞又は組織のライセートが、細胞又は組織に緩衝液を加えてホモジナイズした液体を遠心することにより得られる上清である、請求項７に記載の26Sプロテアソーム。
【請求項９】
ATPの存在下又は非存在下においてインキュベートを行う、請求項７又は８に記載の26Sプロテアソーム。
【請求項１０】
hsp70, hsp70/hsp40, hsp90又はPA28が組み換え蛋白質である、請求項７から９の何れかに記載の26Sプロテアソーム。
【請求項１１】
hsp70, hsp70/hsp40, hsp90又はPA28が、精製のためのタグで標識された組み換え蛋白質である、請求項７から１０の何れかに記載の26Sプロテアソーム。
【請求項１２】
インキュベーション後に、前記タグを利用して26Sプロテアソームを精製する、請求項１１に記載の26Sプロテアソーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、26Sプロテアソームを再構成するための新規な方法、並びに当該方法により再構成された26Sプロテアソームに関するものである。より詳細には、本発明は、hsp70、hsp70/hsp40、hsp90、又はPA28などの分子シャペロンを用いた26Sプロテアソームの再構成方法、並びに当該方法により再構成された26Sプロテアソームに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞内において不要なタンパク質が分解されるメカニズムとして、ユビキチン依存性の分解経路が知られている。ユビキチンは76アミノ酸からなる小タンパク質であり、酵母からヒトまで生物界において広く保存されている。ユビキチンはC末端のグリシン残基でATP依存性にE1(ユビキチン活性化酵素)のシステイン残基と結合した後、E1からE2(ユビキチン結合酵素)に転移され、E3(ユビキチンリガーゼ)によって認識される標的タンパク質のリジン側鎖にイソペプチド結合する。標的タンパク質のリジン残基に結合したユビキチンのリジン残基にユビキチンのC末端がイソペプチド結合を繰り返すことにより、ポリユビキチン鎖が形成される。上記したようなユビキチンシステムにより標的タンパク質に付加されたポリユビキチン鎖は26Sプロテアソームによって認識され、ユビキチン化されたタンパク質は26Sプロテアソームにより分解される。【０００３】
上記の通り、26Sプロテアソームは、細胞内蛋白の最も主要な分解酵素である。この26Sプロテアソームはαββαリングからなる酵素触媒部位20Sプロテアソームとその両側に結合する19Scap分子からなる。20Sプロテアソームの各リングは7個のサブユニットからなり、従って20Sプロテアソームは7×4＝28個の分子から構成される。一方、19Scap分子は6個のATPaseサブユニットと約12個のnon-ATPaseサブユニットの合計18個の分子から構成されている。従って、26Sプロテアソームは28＋18＋18＝64個もの分子が集まった巨大複合分子であり、その分子量は約2.5MDaにも及ぶ。26Sプロテアソームの生化学的に精製することは、その構造が巨大複合分子であることから簡単ではない。【０００４】
従来の26Sプロテアソーム精製法は、20Sプロテアソームと19Scap分子を別々に精製して最後に両分子を混合して作成する方法であった。あるいは、ゲル濾過とイオン交換クロマトグラフィーを用いて一度に精製を行う方法も知られている（Alexei F. Kisselev,他、The size of peptides generated from protein by mammalian 26 and 20S proteasomes. J.Biol.Chem. 274, 3363-3371, 1999）。これらの方法は、生化学的には十分認知されたものであるが、相当規模の細胞数（〜1010）や組織（ラット肝臓、ウサギ脾臓など）からでないと途中のロスが多いため精製が困難である。また、任意の、例えばヒトなどの少量の末梢血（〜106）、臓器・組織の一部（0.1cm3）などから簡便に精製することが困難であるなどの問題点がある。従って、従来の26Sプロテアソーム精製法を使用する場合は、ごく限られた研究室等で得られた限られた種類のプロテアソームしか入手することができない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、比較的少量の細胞や組織から26Sプロテアソームを再構成する方法を提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、任意の試料（例えば、少量しか入手できない試料など）から26Sプロテアソームを簡便な操作で再構成する方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、任意の少量の細胞・組織ライセート（〜106細胞）を出発材料として使用し、分子シャペロン（hsp70,hsp40或はhsp90）の存在下においてこれらの細胞・組織ライセートをインキュベートすることによって、短時間のうちに26Sプロテアソームを再構成できることを意外にも見出した。本発明は、この知見に基づいて完成したものである。【０００７】
即ち、本発明によれば、hsp70, hsp70/hsp40, hsp90又はPA28の存在下において細胞又は組織のライセートをインキュベートすることを含む、26Sプロテアソームをインビトロで再構成する方法が提供される。【０００８】
本発明の別の側面によれば、hsp70, hsp70/hsp40, hsp90又はPA28の存在下において細胞又は組織のライセートをインキュベートすることによって得られる、インビトロで再構成された26Sプロテアソームが提供される。【０００９】
好ましくは、細胞又は組織のライセートは、細胞又は組織に緩衝液を加えてホモジナイズした液体を遠心することにより得られる上清である。
好ましくは、ATPの存在下又は非存在下においてインキュベートを行う。【００１０】
好ましくは、hsp70, hsp70/hsp40, hsp90又はPA28は組み換え蛋白質である。
好ましくは、hsp70, hsp70/hsp40, hsp90又はPA28は、精製のためのタグで標識された組み換え蛋白質である。
好ましくは、本発明の方法は、インキュベーション後に、前記タグを利用して26Sプロテアソームを精製する工程をさらに含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明について具体的に説明する。
本発明は、hsp70, hsp70/hsp40, hsp90又はPA28の存在下において細胞又は組織のライセートをインキュベートすることを含む、26Sプロテアソームをインビトロで再構成する方法、並びに上記方法により得られるインビトロで再構成された26Sプロテアソームに関する。【００１２】
本発明で用いる細胞又は組織としては、ヒトを含む任意の生物の組織又は器官（腎臓、肝臓、胃、小腸、大腸、心臓、脳、肺、胸腺などの任意の臓器を含む）、任意の微生物、又は任意の細胞（培養細胞を含む）を出発材料として使用することができる。より具体的には、本発明の方法では、上記材料の細胞質画分から26Sプロテアソームを再構成することができる。細胞質分画の調製は、通常の細胞質分画法によることができる。例えば、上記記載の細胞をホモジネートし、遠心分離することにより、細胞膜、核、ミトコンドリア、リソゾームおよびミクロソームの分画を除き、その上清を細胞質分画として使用することができる。【００１３】
細胞又は組織のライセートの調製方法の一例としては、以下の実施例に記載されている通り、下記（１）〜（５）の操作を挙げることができるが、これに準ずる任意の方法でもよい。
（１）細胞ペレット又は肝臓組織などのウエットボリュームを1とした時に、その4〜10倍量に相当する26SバッファーA（25mM Tris-HCl(pH7.5), 2mM ATP, 1mM DTT, 0.25M sucrose, 1%NP40, 0.5mM PMSF）を加え、ホモジェナイザーにてよくホモジェナイズする。
（２）氷上にて30分間静置する。
（３）7,000rpm  10分間遠心
（４）上清を回収、さらに15,000rpm  30分間遠心する。
（５）上清を回収【００１４】
本発明の方法では、上記のようにして得た細胞又は組織のライセートを、hsp70, hsp70/hsp40, hsp90又はPA28の存在下においてインキュベートする。このインキュベーションは、ATPの存在下で行ってもよいし、ATPの非存在下で行ってもよいが、より活性の高い26Sプロテアソームを得るためには、ATPの存在下で行う方が好ましい。【００１５】
本発明で用いるhsp70, hsp70/hsp40, hsp90又はPA28は何れも公知であり、例えば、以下の文献等に記載されている。
Hsp70: Soulier S,他、Developmental regulation of murine integrin β1 subunit- and Hsc73-encoding genes in the mammary gland: sequence of a new mouse Hsc73 cDNA. Gene 172(2), 285-289 (1996), 登録番号NCBI Accession U27129
Hsp40(Homo sapiens DnaJ): Strausberg RL 他、Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(26), 16899-16903 (2002), 登録番号NCBI Accession BC002352【００１６】
Hsp90: Yamazaki M et al. Nucleotide sequence of a full-length cDNA for 90 kDa heat-shock protein from human peripheral blood lymphocytes. Nucleic Acids Res. 17(17), 7108 (1989), 登録番号NCBI Accession X15183
PA28; Jiang H他、Sequence and expression of mouse proteasome activator PA28 and the related autoantigen Ki. Immunogenetics 46(2), 93-98(1997), 登録番号NCBI Accession NM#011189【００１７】
本発明で用いるhsp70, hsp70/hsp40, hsp90又はPA28は、天然由来の蛋白質、組換え蛋白質、又は化学合成した蛋白質の何れでもよいが、調製の便宜の観点からは組換え蛋白質が好ましい。また、本発明の方法で再構成した26Sプロテアソームの単離・精製を容易にするという観点から、本発明で使用するhsp70, hsp70/hsp40, hsp90又はPA28は、精製のためのタグで標識されていることが好ましい。精製のためのタグとしては、ヒスチジンタグ〔例えば、6 x Hisタグ〕、又はFlagタグなどが挙げられる。ヒスチジンタグで標識された蛋白質はＮｉカラムにより精製することができ、Flagタグで標識された蛋白質は抗Flag抗体で精製することができる。本発明の方法では、26Sプロテアソームの再構成の際に用いるhsp70, hsp70/hsp40, hsp90又はPA28は何れも再構成された26Sプロテアソーム中に含有されることになるため、hsp70, hsp70/hsp40, hsp90又はPA28に精製のためのタグを標識しておくことによって、再構成された26Sプロテアソームを精製することが容易になる。再構成された26Sプロテアソームの精製が容易であることは、本発明の利点の一つである。【００１８】
hsp70, hsp70/hsp40, hsp90又はPA28の使用量は、26Sプロテアソームが再構成できる限り特に限定されないが、例えば、出発材料として107個の細胞ペレットを使用するような場合は、５μｇ程度使用すれば十分である。【００１９】
26Sプロテアソームの再構成のためのインキュベーションは、適当な温度（例えば、４℃から室温、好ましくは４℃）にて数分から１０時間、好ましくは１時間から５時間程度行えばよい。インキュベーションの際、混合物を震盪混和することが好ましい。【００２０】
本発明の方法で再構成される26Sプロテアソームの酵素活性は、適当な蛍光基質（例えば、Suc-LLVY-AMC（N-スクシニル-Leu-Leu-Val-Tyr-7-アミノ- 4-メチル-クマリン）など）を用いて行うことができる。このSuc-LLVY-AMCは、プロテアソームにより切断されると蛍光を発するようになるので、その蛍光の強度を測定することにより、プロテアソームの酵素活性を評価することができる。【００２１】
本発明の方法で再構成される26Sプロテアソームは、プロテアーゼとしての20Sプロテアソームとその他の制御因子とから構成されるものであり、ユビキチン化した蛋白質を認識して分解することができる。本発明の方法で再構成される26Sプロテアソームは、当該酵素の機能の解明やユビキチン化した蛋白質の分解機構の解明のために用いることができる。また、各種の疾患の診断や治療のためにも使用することができる。ある種の癌遺伝子は、ユビキチン依存性の分解経路で分解されることが報告されている。従って、本発明の方法で再構成される２６Ｓプロテアソームは、癌化のメカニズムの解明や癌の治療および診断などにも有用である。また、アルツハイマー病患者の脳内にはユビキチン化した蛋白質が異常蓄積していることから、アルツハイマー病の原因の一つとして、細胞内における蛋白質分解系の異常が示唆されている。従って、本発明の方法で再構成される26Sプロテアソームは、アルツハイマー病のメカニズムの解明やアルツハイマー病の治療および診断にも有用である。【００２２】
さらにまた、上記した通りプロテアソームは各種疾患に関与していることから、プロテアソーム阻害剤はそのような疾患の治療薬となり得る可能性がある。本発明の方法で再構成される26Sプロテアソームは、プロテアソーム阻害剤のスクリーニング系において使用することもできる。【００２３】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００２４】
実施例１：hsp70,hsp70/hsp40, hsp90, PA28による26Sプロテアアソームの再構成法
マウス正常肝臓組織10μlから精製を開始し、hsp70, hsp70/hsp40, hsp90, PA28により、ATP存在下又は非存在下でのバッファー条件で26Sプロテアソームをin vitroで再構成した。組み合わせから以下の合計8種類のプロテアソームを再構成した。
Hsp70-26S      ATP(-)
Hsp70-26S      ATP(+)
Hsp70/hsp40-26S  ATP(-)
Hsp70/hsp40-26S  ATP(+)
Hsp90-26S      ATP(-)
Hsp90-26S      ATP(+)
PA28-26S       ATP(-)
PA28-26S       ATP(+)【００２５】
（方法）
（１）細胞ペレット又は肝臓組織などのウエットボリュームを1とした時に、その4〜10倍量に相当する26SバッファーA（25mM Tris-HCl(pH7.5), 2mM ATP, 1mM DTT, 0.25M sucrose, 1%NP40, 0.5mM PMSF）を加え、ホモジェナイザーにてよくホモジェナイズする。
（２）氷上にて30分間静置する。
（３）7,000rpm  10分間遠心
（４）上清を回収、さらに15,000rpm  30分間遠心する。
（５）上清を回収
（６）リコンビナントhsp70 (5μg), hsp40 (5μg)を加え、4℃にて3時間震盪混和する。リコンビナント蛋白はそのN末に6 x His.タグがついたものを使用した。リコンビナント蛋白の加えるべき量は、細胞数107個のペレットであれば各5μg(hsp70, hsp40, hsp90, PA28)で十分である。
（７）  （６）にNi2+ -agarose (Qiagen社) 〜20μl(ゲルボリューム)を加え、さらに1時間4℃にて震盪混和する。
（８）2,500rpm 1分間遠心。
（９）上清を捨てる。
（１０）  26SバッファーB（25mM Tris-HCl(pH7.5), 2mM ATP, 1mM DTT,0.25M sucrose, 1%NP40, 0.5mM PMSF, 25mM Imidazole）を十分量加えsuspensionした後に転倒混和10回ほど行い、再度2,500rpm 1分間遠心。この際、ボルテックスはしない。
（１１）  上清を捨てる。（９）を４回繰り返す。
（１２）  26SバッファーC（25mM Tris-HCl(pH7.5), 2mM ATP, 1mM DTT, 0.25M sucrose）を用いて上記（８）と（９）の操作を2回繰り返す。
（１３）  26SバッファーD（25mM Tris-HCl(pH7.5), 2mM ATP, 1mM DTT,0.25M sucrose, 0.2M Imidazole）100 μlでプロテアソームを溶出する。
（１４）  2,500rpm 1分間遠心後、上清を回収する。この時点で、crudeの26Sプロテアソームが回収されたことになる。
（１５）（１４）で得られた分画の酵素活性はプロテアソームの蛍光基質（Suc-LLVY-AMC）を用いて行う。アッセイは96wellプレートを用いて以下のように行った。【００２６】
（ATP非存在下でのアッセイの場合）
0.5M Tris-HCl (pH8.0)  20μl
Suv-LLVY-amc            1μl
Reconstituted sample   20μl
DDW                    59μl
100μl【００２７】
（ATP存在下でのアッセイの場合）
0.5M Tris-HCl (pH8.0)  20μl
Suc-LLVY-amc            1μl
Reconstituted sample   20μl
DDW                    55μl
ATP (50 mM)             4μl
100μl【００２８】
reconstituted 26S proteasome sample は約1μgの組織重量から再構成したプロテアソームである。【００２９】
図１に8種類の得られたcrude 26Sの酵素活性についての結果を示す。図１の結果から明らかなように、ATPが存在しなくともhsp70/hsp40, hsp90, PA28によりある程度活性のある26Sプロテアソームが回収される。一方、hsp70単独で再構成を行った場合の活性は低かった。即ち、hsp40の存在はATP要求性を減少させる。また、いずれの場合もATP 0.2mM存在下では最高度に活性のある26Sプロテアソームが再構成される。【００３０】
実施例２：26SプロテアソームによるMHCクラスＩ抗原ペプチドの前駆ペプチドの切断
実施例１で再構成された26Sプロテアソームにより、MHCクラスＩ抗原ペプチドの前駆ペプチド（C末フランキングを付加したもの）を切断し、実際にMHCクラスＩ抗原ペプチドが切り出されるかについて実験を行った。用いたモデルペプチドはOVA257-269 (SIINFEKL TEWTS), マラリア抗原CSP280-294 (SYVPSAEQILEFVKQ), メラノーマ抗原TRP2180-193(SVYDFFVWL HYYSV)の3種類である。OVA257-264, TRP2180-188, はKbに提示されるペプチドであり、CSP 280-288はKdに提示される。これらの合成ペプチド各10μgを図１のようにして得られたプロテアソームで0,1,3,12時間切断し（最終ボリューム100μl）、低分子量のものをセントリコン10で回収した。反応液の組成は、実施例１におけるSuc-LLVY-amcのATP存在下での加水分解活性の測定の場合と同様に行った。【００３１】
OVA257-264, TRP2180-188を含んでいると思われるものはマウスEL4(H-2b)に、またCSP 276-284を含んでいると思われるものはp815(H-2d)にパルスし、それぞれのペプチドに特異的な細胞傷害性T細胞(cytotoxic T lymphocyte;CTL)による標的細胞の傷害活性をクロム51遊離試験にて観察した。傷害活性が高く出れば、即ちMHCクラスI抗原ペプチドが多く切り出されたということになる。その結果を図２に示す。【００３２】
OVA257-269はhsp90-based, PA28-basedのプロテアソーム両方でMHCクラスＩリガンドが切断されるのに対し、CSP280-294はhsp90-basedプロテアソームのみで、さらにTRP2180-193はPA28-basedのプロテアソームのみでリガンドが切り出されてくるという事実が判明した。即ち、プロテアソームの種類により産生される抗原ペプチドの種類が異なるものと解釈される。【００３３】
実施例３：in vitro 再構成してきた26Sプロテアソームの分画
in vitroで再構成した26Sプロテアソームをゲル濾過カラム（アマシャムSuperose 6）を用いて分子量に応じてさらに分画した。再構成したプロテアソームを100μlに濃縮し、それをAKTAFPLCシステムへインジェクションした。流速0.5ml/分で流し、1 ml/フラクションで分画した。移動相は、26SバッファーCを用いた。各フラクションのSuc-LLVY-amcの分解活性を実施例１に示した方法に従って測定した。各フラクションNO.を横軸に、その酵素活性を縦軸にプロットした。既知の精製法で得られた26Sをコントロールにしてhsp90, hsp70/hsp40で再構成したプロテアソームの大きさを検証してみた。図３にその結果を示す。実施例１で再構成されたプロテアソームの大きさは明らかに26Sプロテアソームとほぼ同じ大きさであることがわかる。ちなみに精製20Sプロテアソームは、その酵素活性がフラクション12に認められる。【００３４】
続いてフラクション7〜12にどのような蛋白分子が含まれているかを調べるためにウエスタンブロットを用いて検討した。図４に示すように、酵素活性フラクション（No11〜12）に一致して20Sが観察される。19Sはもちろん活性部位にも認められるが、それ以外のフラクションにも比較的幅広く見られる。大切な事は、既存の方法でマイルドにとってきた26Sプロテアソームの活性フラクションにやはりhsp90, hsp70, hsp40が認められることである。また、hsp70/hsp40で再構成したプロテアソームは既知の26Sプロテアソームの分子構成パターンによく似ていることがわかった。内在性のHsp90が含まれているのは以外である。Hsp90で再構成したプロテアソームの場合、活性フラクション部位にはもちろんhsp90が含まれるが、内在性hsp70/hsp40の含有量は低い。【００３５】
実施例４：26SプロテアソームのSuc-LLVY-AMC分解活性におけるゲルダナマイシンによる抑制効果
３種類の26Sプロテアソーム（即ち、既知の方法でとった26Sプロテアソーム、hsp90で再構成した26Sプロテアソーム、及びhsp70/hsp40で再構成された26Sプロテアソーム）のSuc-LLVY-AMC分解活性におけるゲルダナマイシン（hsp90特異的阻害剤0〜50μM）による抑制効果を検討した。その結果を図５に示す。【００３６】
その結果、hsp90で再構成したプロテアソームの酵素活性はゲルダナマイシンで濃度依存的に抑制されることが明らかになった。一方、既知の26S或はhsp70/hsp40で再構成されたプロテアソームの場合はゲルダナマイシンで部分的に抑制される。ネガテイブコントロールとして用いた精製20SプロテアソームのSDSによる人工的な活性はゲルダナマイシンで全く抑制されなかった。以上の結果より、従来26Sと考えられてきたものはhsp90依存性, hsp70/hsp40依存性のプロテアソームに亜分類される可能性が考えられる。あるいは、 hsp90依存性のものはhsp70/hsp40依存性のプロテアソームが完成する前の前段階(あるいはその逆)のものである可能性も排除できない。【００３７】
実施例５：Hsp90及びPA28αによるプロテアソームのアッセンブリ促進
PA28α-/-β-/- 細胞のライセートにリコンビナントPA28α又はhsp90を加え、30分間室温にてインキュベーションし、これを3−20％のNative-PAGEにかけ、泳動後ゲルをsuc-LLVY-amcを含む溶液に浸す。37℃、10分間インキュベーションし、360nmのUV照射により、460nmのフィルターにより加水分解活性を視覚化した（図６）。【００３８】
PA28αの添加により、フットボール型プロテアソームの出現と、ハブリッド型プロテアソームの形成が促進される。一方、hsp90によりシングルキャップ型26Sプロテアソームの形成が促進されるが、ゲルダナマイシン5μM又はEDTA 0.1mMの存在下では消失する。【００３９】
即ち、Hsp90によるプロテアソームのアッセンブリ促進は、ATP除去により、あるいはMg2+のキレート化による消失する一方、PA28αによるそれは影響を受けないことが分かった。【００４０】
実施例６：hsp90によるシングルキャップ型26Sプロテアソームのアッセンブリ促進
ヒスチジンタグの付いたリコンビナントhsp90をPA28α-/-β-/-細胞のライセートに添加し、30分間室温にてインキュベーションし、これを3−15％のNative-PAGEにかける。その後、ニトロセルロース膜に転写後、抗ヒスチジンタグ抗体、抗20Sα2抗体、19S Rpt6抗体でウエスタンブロットを行った。その結果、hsp90はシングルキャップ型26Sプロテアソームの位置に泳動し、この泳動パターンは、EDTA存在下では変化がないが、ゲルダナマイシン存在下では完全に消失した（図７）。また、hsp90により20S、19S Rpt6の量が有意に増加している。これは一番左の図の加水分解活性の増加と完全に一定する。即ち、hsp90はHsp90はシングルキャップ型26Sプロテアソームに結合して、シングルキャップ型26Sプロテアソームのアッセンブリを促進することが分かった。【００４１】
実施例７：PA28α及びhsp90によるプロテアソームの再構成
PA28αをATP非存在下若しくは存在下で、また、hsp90をATP存在下でマウスEL4細胞あるいはPA28α-/-β-/-細胞のライセートに添加し、30分インキュベーション後にpull downを行った。SDS-PAGEに続くウエスタンブロット法にて、結合している分子の同定を行い、また、Native-PAGE後に20Sプロテアソーム及び19Scap Rpt1に対する抗体でウエスタンブロットを行い、形成されたプロテアソームの種類を特定した。その結果、ATP非存在下では、PA28αはフットボール型プロテアソームを沈降し、ATP存在下ではハイブリッドプロテアソームを沈降してきたが、注目すべきはこの中に内在性hsp90が一緒に入ってくることである（図８）。一方、hsp90はATP存在下において、ハイブリッドプロテアソームを沈降するがこのときもちろん内在性PA28も一緒に沈降される（図８）。また、PA28α-/-β-/-細胞のライセートからはhsp90によりシングルキャップ型26Sプロテアソームが沈降される（図８）。従って、hsp90のシングルキャップ型26Sプロテアソームへの結合にはPA28は全く関係ない。【００４２】
以上の結果から以下のことが分かった。PA28αはATP非存在下ではフットボール型プロテアソームを、又ATP存在下ではハイブリッド型プロテアソームを再構成する。一方、hsp90はATP存在下でハイブリッド型プロテアソームを再構成する。もちろんPA28α-/-β-/-細胞のライセートからはシングルキャップ型26Sプロテアソームを再構成する。【００４３】
実施例８：
図８で沈降されてきたプロテアソーム複合体のsuc-LLVY-amc（キモトリプシン様活性）, Boc-LRR-amc（トリプシン様活性）に対する加水分解活性がゲルダナマイシン存在下でどのような影響を受けるのかを検討した。ATP(-)又は(+)の条件下で、EL4或はPA28α-/-β-/-細胞抽出液から、リコンビナントPA28α, hsp90を用いて図９に示すようなプロテアソーム複合体を精製した。各プロテアソーム複合体を、ゲルダナマイシン(GA)25mMで30分処理したものとしないものを作製した。その酵素活性をSuc-LLVY-amc、 Boc-LRR-amcを用いてそれぞれキモトリプシン様活性、トリプシン様活性を測定した。【００４４】
その結果、ATP存在下で沈降してきたプロテアソーム（即ちhsp90を含む）のキモトリプシン様活性のみが有意に低下することが明らかになった（図９）。即ち、hsp90はハイブリッドプロテアソーム、シングルキャップ型26Sプロテアソームのキモトリプシン様活性に重要な役割を担うことが明らかになった。即ち、Hsp90を含むプロテアソームはハイブリッドプロテアソームか、シングルキャップ型26Sプロテアソームであるが、これらのキモトリプシン様活性のみがhsp90の特異的阻害剤ゲルダナマイシンで抑制されることが分かった。【００４５】
以上PA28α、hsp90によるプロテアソームの再構成過程をまとめたものを図１０に示す。任意の細胞ライセートにPA28α又はhsp90を加えることによりフットボール型、シングルキャップ26S、及びハイブリッドプロテアソームの再構成が可能になる。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明は、任意の、極めて少量の細胞・組織の一部ライセートからリコンビナント蛋白としての分子シャペロン（hsp70,hsp40或はhsp90）を用いて26Sプロテアソームをin vitro再構成できることを可能にする。これにより、従来法よりもより簡便に細胞・組織からプロテアソームを取り出すことが可能になる。このことは個々の細胞・組織に特徴的に発現する異なる種類のプロテアソームを任意に取り出すことを可能にするものでもある。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、hsp70,hsp70/hsp40, hsp90, 又はPA28の存在下で再構成した26Sプロテアアソームの酵素活性を測定した結果を示す。
【図２】図２は、26SプロテアソームによるMHCクラスＩ抗原ペプチドの前駆ペプチドの切断を調べた結果を示す。  白のバー；PA28α-assembled プロテアソーム  黒のバー；PA28αΔC5-assembled プロテアソーム(PA28αのドミナントネガテイブ)  灰色のバー；hsp90- assemledプロテアソーム  斜線のバー；合成ペプチド（あり又はなし）でパルスした標的細胞
【図３】図３は、in vitroで再構成した26Sプロテアソームをゲル濾過カラム（アマシャムSuperose 6）を用いて分子量に応じて分画した結果を示す。
【図４】図４は、26Sプロテアソームをゲル濾過カラムで分画した各フラクション中の蛋白分子を調べるためのウエスタンブロットの結果を示す。
【図５】図５は、26SプロテアソームのSuc-LLVY-AMC分解活性におけるゲルダナマイシンによる抑制効果を調べた結果を示す。
【図６】図６は、Hsp90及びPA28αによるプロテアソームのアッセンブリ促進を調べた結果を示す。
【図７】図７は、hsp90によるシングルキャップ型26Sプロテアソームのアッセンブリ促進を調べた結果を示す。
【図８】図８は、PA28α及びhsp90によるプロテアソームの再構成を調べた結果を示す。
【図９】図９は、プロテアソーム複合体のsuc-LLVY-amc（キモトリプシン様活性）、Boc-LRR-amc（トリプシン様活性）に対する加水分解活性がゲルダナマイシン存在下でどのような影響を受けるのかを検討した結果を示す。
【図１０】図１０は、PA28α及びhsp90によるプロテアソームの再構成過程を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図９】
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【図１０】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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