(57)【要約】組込型の低線量放射線誘導性ウイルスベクターであって、ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列及び治療遺伝子配列を含むＤＮＡ配列を含むことを特徴とするベクター。本発明のベクターは遺伝子治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組込型の低線量放射線誘導性ウイルスベクターであって、
ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列及び治療遺伝子配列を含むＤＮＡ配列を含む
ことを特徴とするベクター。
【請求項２】
（ａ）Ｌｅｆｔ−ＩＴＲ、
（ｂ）ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列、
（ｃ）治療遺伝子配列、
（ｄ）ポリアデニル化シグナル配列、
（ｅ）Ｒｉｇｈｔ−ＩＴＲ、
を５’末端側から３’末端側に向かって（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）の順で含むＤＮＡ配列を含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
（ａ）Ｌｅｆｔ−ＩＴＲ、
（ｄ）ポリアデニル化シグナル配列の相補的配列、
（ｃ）治療遺伝子配列の相補的配列、
（ｂ）ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列の相補的配列、
（ｅ）Ｒｉｇｈｔ−ＩＴＲ
を５’末端側から３’末端側に向かって（ａ）、（ｄ）、（ｃ）、（ｂ）、（ｅ）の順で含むＤＮＡ配列を含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項４】
アデノ随伴ウイルスに由来するベクターである、請求項１〜３のいずれかに記載のベクター。
【請求項５】
ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列がｐ２１遺伝子プロモーター配列である、請求項１〜４のいずれかに記載のベクター。
【請求項６】
治療遺伝子配列として、ヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子配列を有する、請求項１〜５のいずれかにに記載のベクター。
【請求項７】
遺伝子治療用ベクターである、請求項１〜６のいずれかに記載のウイルスベクター。
【請求項８】
遺伝子治療により治療可能な疾患を治療するための医薬組成物であって、請求項１〜７のいずれかに記載の組込型の低線量放射線誘導性ウイルスベクターを含むことを特徴とする遺伝子治療用医薬組成物。
【請求項９】
遺伝子治療により治療可能な疾患が癌である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
遺伝子治療により治療可能な疾患の遺伝子治療方法であって、下記の工程：
（１）ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列及び治療遺伝子配列を含むＤＮＡ配列を含む組込型の低線量放射線誘導性ウイルスベクターを含む医薬組成物を提供する工程
（２）該医薬組成物を、遺伝子治療により治療可能な疾患を有する患者へ投与する工程、及び
（３）該患者の治療遺伝子の発現が必要とされる部位に、該患者の染色体に組み込まれたベクターのＤＮＡ配列を発現させるのに十分な線量の放射線を照射する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
組込型の低線量放射線誘導性ウイルスベクターが、
（ａ）Ｌｅｆｔ−ＩＴＲ、
（ｂ）ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列、
（ｃ）治療遺伝子配列、
（ｄ）ポリアデニル化シグナル配列、
（ｅ）Ｒｉｇｈｔ−ＩＴＲ、
を５’末端側から３’末端側に向かって（ａ）、（ｄ）、（ｃ）、（ｂ）、（ｅ）の順で含むＤＮＡ配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
組込型の低線量放射線誘導性ウイルスベクターが、
（ａ）Ｌｅｆｔ−ＩＴＲ、
（ｄ）ポリアデニル化シグナル配列の相補的配列、
（ｃ）治療遺伝子配列の相補的配列、
（ｂ）ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列の相補的配列、
（ｅ）Ｒｉｇｈｔ−ＩＴＲ
を５’末端側から３’末端側に向かって（ａ）、（ｄ）、（ｃ）、（ｂ）、（ｅ）の順で含むＤＮＡ配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
組込型の低線量放射線誘導性ウイルスベクターが、治療遺伝子配列として、ヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子配列を有する、請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
癌の遺伝子治療方法であって、下記の工程：
（１）ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列及び治療遺伝子配列を含むＤＮＡ配列を含む組込型の低線量放射線誘導性ウイルスベクターを含む医薬組成物を提供する工程
（２）該医薬組成物を、癌患者へ投与する工程、
（３）該患者の癌病巣部位に、該患者の染色体に組み込まれたベクターのＤＮＡ配列を発現させるのに十分な線量の放射線を照射する工程、及び
（４）該治療遺伝子が発現している部位に、癌を治療するのに十分な線量の放射線を照射する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
組込型の低線量放射線誘導性ウイルスベクターが、
（ａ）Ｌｅｆｔ−ＩＴＲ、
（ｂ）ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列、
（ｃ）治療遺伝子配列、
（ｄ）ポリアデニル化シグナル配列、
（ｅ）Ｒｉｇｈｔ−ＩＴＲ、
を５’末端側から３’末端側に向かって（ａ）、（ｄ）、（ｃ）、（ｂ）、（ｅ）の順で含むＤＮＡ配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
組込型の低線量放射線誘導性ウイルスベクターが、
（ａ）Ｌｅｆｔ−ＩＴＲ、
（ｄ）ポリアデニル化シグナル配列の相補的配列、
（ｃ）治療遺伝子配列の相補的配列、
（ｂ）ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列の相補的配列、
（ｅ）Ｒｉｇｈｔ−ＩＴＲ
を５’末端側から３’末端側に向かって（ａ）、（ｄ）、（ｃ）、（ｂ）、（ｅ）の順で含むＤＮＡ配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
組込型の低線量放射線誘導性ウイルスベクターが、治療遺伝子配列として、ヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子配列を有する、請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、遺伝子治療に有用な組込型の低線量放射線誘導性ベクター、該ベクターを含む遺伝子治療用医薬組成物、及び該医薬組成物を使用した遺伝子治療方法に関する。
【背景技術】  遺伝子治療においては、治療遺伝子を目的部位へ送達する技術が重要である。例えば、癌の遺伝子治療では、癌の増殖抑制に機能する治療遺伝子を病巣部へ的確に送達する技術が重要である。
かかる遺伝子送達を達成するために、組織特異的受容体やプロモーター配列／エンハンサー等が用いられている。例えば、癌胎児性抗原遺伝子のプロモーター配列を用い、当該プロモーター配列の制御下に治療遺伝子を置くことにより、当該治療遺伝子を癌胎児性抗原を産生している大腸癌や肺癌細胞において選択的に発現させることができる。
これらの送達手段の中で、放射線誘導性遺伝子のプロモーター配列を利用した治療遺伝子の癌組織への送達は有効な手段である。なぜなら、放射線誘導性遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれた治療遺伝子は、放射線照射によりその発現が誘導される（放射線誘導性）ので、放射線を照射した部位での選択的な遺伝子発現が可能になるからである。したがって、放射線誘導性遺伝子のプロモーター配列と、放射線治療分野で進展著しい定位照射技術とを組み合わせることにより、治療遺伝子の発現を空間的、時間的に精度よく制御することが可能となる。
早期増殖応答遺伝子Ｅｇｒ−１のプロモーター配列は、遺伝子治療用の放射線誘導性遺伝子のプロモーター配列として最も研究が進んでいるプロモーター配列である。このＥｇｒ−１遺伝子プロモーター配列の制御下に治療遺伝子としてのサイトカインＴＮＦα遺伝子を接続したベクター「ＴＮＦｅｒａｄｅ」が開発され、既に第１相の臨床試験が終了し、現在第２相の臨床試験が行われている（例えば、Ｓｅｎｚｅｒ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，２２，５９２−６０１，２００４，ＴＮＦｅｒａｄｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃ，ａｎ  ａｄｅｎｏｖｅｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ａ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ，ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｇｅｎｅ：ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ．参照）。ＴＮＦｅｒａｄｅは、アデノウイルスをベースとする染色体非組込型ベクターである。
しかしながら、Ｅｇｒ−１遺伝子プロモーター配列を用いて治療遺伝子を有意に発現させるには、高線量の放射線照射が必要である。実際、２Ｇｙ以下の放射線照射による成功例は報告されていない。かかる高線量放射線照射は、放射線治療と組み合わせた遺伝子治療にとって好ましいものではない。なぜなら、放射線誘導性遺伝子プロモーター配列の制御下置かれた治療遺伝子を用いる遺伝子治療では、放射線照射により治療遺伝子が発現し治療遺伝子産物が病巣部に蓄積して治療効果を発揮するまでに一定の期間を必要とするため、高線量放射線照射により治療遺伝子の発現を誘導した場合、高線量放射線による治療効果（放射線治療による効果）が現れる時期と治療遺伝子産物による治療効果（遺伝子治療による効果）が現れる時期との間に時間差が生じ、放射線治療と遺伝子治療との組み合わせによる相乗効果が得られなくなるからである。また、治療遺伝子の発現のために高線量の放射線を照射した後、更に、放射線照射による放射線治療を行うことは、患者への負担が大きくなるので好ましくない。
一方、低線量放射線誘導性の遺伝子発現系として、癌抑制遺伝子産物であるｐ５３が関与する系が知られている。かかる系では、低線量放射線照射によって活性化されたｐ５３が、その標的遺伝子のプロモーター配列（ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列）に作用して、当該プロモーター配列の制御下にあるｐ５３標的遺伝子の発現を活性化することが知られている（例えば、Ａｍｕｎｄｓｏｎ  ＳＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１，４４５−４５２，２００３，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｓｔｒｅｓｓ  ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  ｌｏｗ  ｄｏｓｅ−ｒａｔｅ  ｇａｍｍａ  ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ．参照）。更に、ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列を含む遺伝子治療用ベクターも開発されている（例えば、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｊ，Ｒｏｂｓｏｎ  Ｔ，Ｍｕｒｒａｙ  Ｍ，Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ  Ｍ，Ｋｅｉｌｔｙ  Ｇ，Ｈｉｒｓｔ  ＤＧ．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｔｏｎｅ  ｕｓｉｎｇ  ｉＮＯＳ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ａ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２０００；７：１１２６−１１３１．及びＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｊ，Ｒｏｂｓｏｎ  Ｔ，Ｏ’Ｋｅｅｆｆｅ  Ｍ，Ｈｉｒｓｔ  ＤＧ．Ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌ  ｒａｄｉｏｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ（ＣＭＶ）ａｎｄ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ（ＷＡＦ１）ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｔｏ  ｄｒｉｖｅ  ｔｈｅ  ｉＮＯＳ  ｇｅｎｅ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｕｉｃｉｄｅ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００２；９：２６３−２６９．参照）。前記ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列を含む遺伝子治療用ベクターは、非ウイルスベクター（カチオン性リポソームおよびポリソーム）をベースとする染色体非組込型ベクターである。
しかしながら、前記のｐ５３標的遺伝子プロモーター配列含有の非組込型ベクターは放射線照射による治療遺伝子の発現誘導性が低く、遺伝子治療用ベクターとしては満足できるものではなかった。
【発明の開示】
本発明者等は、ｐ５３によるｐ５３標的遺伝子の発現誘導が、高次の染色体構造に依存した機構と関連していることを示唆する報告（例えば、Ｅｓｐｉｎｏｓａ  ＪＭ，Ｅｍｅｒｓｏｎ  ＢＭ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐ５３  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ＤＮＡ／ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２００１；８：５７−６９．及びＢｒａａｓｔａｄ  ＣＤ，Ｈａｎ  Ｚ，Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ  ＥＡ．Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ＤＮａｓｅ  Ｉ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐ５３−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００３；２７８：８２６１−８２６８．参照）に基づき、宿主細胞へ遺伝子導入されたｐ５３標的遺伝子プロモーター配列及びｐ５３標的遺伝子（治療遺伝子）の宿主細胞内における存在状態に着目して鋭意研究を行った。その結果、染色体組込み型ベクターであるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを用いてｐ５３標的遺伝子プロモーター配列及び治療遺伝子を宿主細胞へ遺伝子導入すると、低線量の放射線照射で治療遺伝子の発現が高度に誘導されることを見出した。本発明は、この知見に基づいてなされたものである。
すなわち、本発明は、
（１）組込型の低線量放射線誘導性ウイルスベクターであって、
ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列及び治療遺伝子配列を含むＤＮＡ配列を含む
ことを特徴とするベクター；
（２）遺伝子治療により治療可能な疾患を治療するための遺伝子治療用医薬組成物であって、前記ウイルスベクターを含むことを特徴とする医薬組成物；並びに
（３）遺伝子治療方法であって、下記の工程：
（ｉ）前記ウイルスベクターを含む医薬組成物を提供する工程
（ｉｉ）該医薬組成物を、遺伝子治療により治療可能な疾患を有する患者へ投与する工程、及び
（ｉｉｉ）該患者の治療遺伝子の発現が必要とされる部位に、該患者の染色体に組み込まれたベクターのＤＮＡ配列を発現させるのに十分な線量の放射線を照射する工程
を含むことを特徴とする方法
に関するものである。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明の組込型の低線量放射線誘導性ウイルスベクターｒＡＡＶ−ＰＬＳのゲノム構造を示す模式図である。
図２は、実施例３及び比較例１で得られたルシフェラーゼ遺伝子発現の誘導率の線量依存性を示す図である。
図３は、ｒＡＡＶ−ＰＬＳ特異的プライマーを用いた、形質導入ＭＣＦ−７細胞ゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析の結果を示す図である。
図４は、制限酵素を用いた、形質導入ＭＣＦ−７細胞ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析の結果を示す図である。
図５は、本発明の組込型の低線量放射線誘導性ウイルスベクターｒＡＡＶ−ＰｔｋＳのゲノム構造を示す模式図である。
図６は、形質導入ＭＣＦ−７細胞におけるＨＳＶ−ｔｋ遺伝子及びアクチン遺伝子の発現についてのＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
図７は、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子導入ＭＣＦ−７細胞（ＰｔｋＳ−１及びＰｔｋＳ−２）並びにルシフェラーゼ遺伝子導入ＭＣＦ−７細胞（ＰＬＳ）のＸ線照射後の相対的な生残細胞数を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の組込型の低線量放射線誘導性ウイルスベクターは、ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列及び治療遺伝子配列を含むＤＮＡ配列を含んでいる。
本発明のウイルスベクターは、そのＤＮＡ配列を宿主細胞の染色体へ組み込むことができる染色体組込型ウイルスベクターである。本明細書では、前記の染色体組込型ウイルスベクターを単に組込型ウイルスベクターと称する。
組込型ウイルスベクターは、組込型ウイルスをベースとして作成することができる。
本発明に利用可能な組込型ウイルスとしては、レトロウイルス及びパルボウイルスが挙げられる。レトロウイルスの具体例としてはレンチウイルスが挙げられ、パルボウイルスの具体例としてはアデノ随伴ウイルスが挙げられる。これらのなかでは、レンチウイルス及びアデノ随伴ウイルスが好ましい。アデノ随伴ウイルスは、非病原性であり安全性が高く、更に、宿主領域が広いので分裂細胞だけでなく非分裂細胞にも遺伝子導入ができるので特に好ましい。
アデノ随伴ウイルスは、キャプシドの中に直鎖状一本鎖ＤＮＡを含むパルボウイルス科に属するウイルスである。アデノ随伴ウイルスとしては、１〜８型が挙げられるが、２型及び８型が好ましく、２型が特に好ましい。
本発明のウイルスベクターのＤＮＡ配列に含まれる「ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列」とは、低線量の放射線照射によって活性化されたｐ５３の作用を受けて、当該プロモーター配列の制御下にある治療遺伝子の発現を活性化することができるプロモーター配列をいう。
「ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列」は、活性化ｐ５３認識配列として以下の配列：
2006043354.tif 000002
（配列中、ＲはＡ又はＧ、ＷはＡ又はＴ、ＹはＣ又はＴである。）
を有している。好ましくは「ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列」は、以下の配列：
2006043354.tif 000003
及び／又は
2006043354.tif 000004
を有している。本発明に用いることができるｐ５３標的遺伝子プロモーター配列としては、ｐ２１遺伝子プロモーター配列、ＭＤＭ２遺伝子プロモーター配列、ＧＡＤＤ４５遺伝子プロモーター配列、１４−３−３σ遺伝子プロモーター配列、ＫＡＲＰ−１遺伝子プロモーター配列、ＢＡＸ遺伝子プロモーター配列、ＤＲ５遺伝子プロモーター配列、ＢＩＤ遺伝子プロモーター配列、ＰＵＭＡ遺伝子プロモーター配列及びＮＯＸＡ遺伝子プロモーター配列等が挙げられる。これらの中では、ＧＡＤＤ４５遺伝子プロモーター配列及びｐ２１遺伝子プロモーター配列が好ましく、ｐ２１遺伝子プロモーター配列が特に好ましい。これらのｐ５３標的遺伝子プロモーター配列は公知であり、例えば、ｐ２１遺伝子のプロモーター配列は、ＤＮＡ塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）上にアクセッションナンバーＺ８５９９６として公開されている。
本発明のウイルスベクターのＤＮＡ配列に含まれる「治療遺伝子配列」とは、遺伝子治療の際に宿主細胞内で治療効果を発揮する遺伝子産物をコードする配列をいう。治療遺伝子は、遺伝子治療の対象となる疾患の治療に有効な遺伝子であれば特に限定されない。例えば、遺伝子治療の対象が癌である場合、治療遺伝子としては、ＴＮＦα遺伝子、アポトーシス誘導タンパク質遺伝子、腫瘍抑制タンパク質遺伝子、脈管形成阻害タンパク質遺伝子、アンチセンス核酸遺伝子、プロドラッグ活性化剤遺伝子、放射線増感剤遺伝子等が挙げられる。これらの中では、ＴＮＦα遺伝子及びプロドラッグ活性化剤遺伝子が好ましく、プロドラッグ活性化剤遺伝子が特に好ましい。プロドラッグ活性化剤遺伝子の例としては、プロドラッグであるガンシクロビルを活性化してＤＮＡ合成阻害作用を発揮させることができるヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）をコードするＨＳＶ−ｔｋ遺伝子があげられる。これらの治療遺伝子の配列は公知であり、例えば、プロドラッグ活性化剤遺伝子の配列は、ＤＮＡ塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）上にアクセッションナンバーＶ００４７０として公開されている。
なお、ウイルスベクターへ挿入するＤＮＡ配列の大きさ（すなわち、ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列と治療遺伝子配列との合計の大きさ（後述する、Ｌｅｆｔ−ＩＴＲ、ポリアデニル化シグナル配列及びＲｉｇｈｔ−ＩＴＲ等を含む場合は、これらをも含めた大きさ）は、挿入されるウイルスベクターが許容しうる大きさの範囲内でなければならない。例えば、アデノ随伴ウイルスベクターの場合、挿入するＤＮＡ配列の大きさは４．７ｋｂ以下でなければならない。
また、治療遺伝子配列は、ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列の制御下で発現可能な状態で該プロモーター配列に結合していなければならない。
本発明のウイルスベクターのＤＮＡ配列の鎖の数は、ベースとするウイルスの種類に依存して変更しうるが、例えば、アデノ随伴ウイルスをベースとする場合、ウイルスベクターのＤＮＡ配列は一本鎖である。
本発明のウイルスベクターは、上記のＤＮＡ配列をキャプシド内に含むウイルス粒子の状態で存在する。例えば、アデノ随伴ウイルスをベースとする場合、本発明のウイルスベクターは直径約２０ｎｍの正２０面体状のキャプシドを有している。
本発明のウイルスベクターは「低線量放射線誘導性」を有する。「低線量放射線誘導性」を有するとは、ウイルスベクターのＤＮＡ配列を宿主細胞の染色体へ組み込んだ後に１Ｇｙの放射線を照射したとき、治療遺伝子の発現活性を、放射線非照射時の発現活性と比較して少なくとも１００％、好ましくは少なくとも２００％上昇させることができることをいう。
本発明のウイルスベクターは、一般的なウイルスベクターの構築方法、例えば、文献：Ｘｉａｏ  Ｘ，Ｌｉ  Ｊ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ＲＪ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｔｉｔｅｒ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｅｌｐｅｒ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９８；７２：２２２４−２２３２．及びＭａｔｓｕｓｈｉｔａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃａｎ  ｂｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １９９８；５：９３８−９４５．に記載の方法にしたがい構築することができる。
一態様において、本発明の組込型の低線量放射線誘導性ウイルスベクターは、
（ａ）Ｌｅｆｔ−ＩＴＲ、
（ｂ）ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列、
（ｃ）治療遺伝子配列、
（ｄ）ポリアデニル化シグナル配列、
（ｅ）Ｒｉｇｈｔ−ＩＴＲ、
を５’末端側から３’末端側に向かって（ａ）、（ｄ）、（ｃ）、（ｂ）、（ｅ）の順で含むＤＮＡ配列を含んでいる。
前記一態様のウイルスベクターのＤＮＡ配列に含まれる（ｂ）ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列及び（ｃ）治療遺伝子配列は前記と同様である。
前記一態様のウイルスベクターのＤＮＡ配列に含まれる（ａ）「Ｌｅｆｔ−ＩＴＲ」及び（ｂ）「Ｒｉｇｈｔ−ＩＴＲ」とは、それぞれ逆方向末端反復（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）とも呼ばれる配列をいう。「Ｌｅｆｔ−ＩＴＲ」及び「Ｒｉｇｈｔ−ＩＴＲ」は、それぞれ逆方向に相補的な塩基配列を含み、Ｔ字型のヘアピン構造を採ることができる。Ｌｅｆｔ−ＩＴＲ及びＲｉｇｈｔ−ＩＴＲは、ウイルスＤＮＡの宿主細胞染色体への組み込みにおいて重要な役割を果たすと考えられている。例えば、ウイルスベクターのベースとしてアデノ随伴ウイルスを用いる場合、Ｌｅｆｔ−ＩＴＲ及びＲｉｇｈｔ−ＩＴＲとしては、それぞれ配列番号４及び５で示される配列を用いることができる。
Ｌｅｆｔ−ＩＴＲ：
2006043354.tif 000005
Ｒｉｇｈｔ−ＩＴＲ：
2006043354.tif 000006
2006043354.tif 000007
前記一態様のウイルスベクターのＤＮＡ配列に含まれる（ｄ）「ポリアデニル化シグナル配列」とは、ｍＲＮＡにポリアデニル酸を付加する機能を有するポリ（Ａ）ポリメラーゼが認識する領域をコードする配列をいう。ポリアデニル化シグナル配列は、宿主細胞内で転写された治療遺伝子のｍＲＮＡの安定化に役立つと考えられる。「ポリアデニル化シグナル配列」は、以下の配列：ＡＡＴＡＡＡ（配列番号６）を有している。具体例としては、ＳＶ４０由来ポリアデニル化シグナル配列、ヒト成長ホルモン遺伝子由来ポリアデニル化シグナル配列及びヒトベータグロビン遺伝子由来ポリアデニル化シグナル配列等が挙げられる。これらの中では、ＳＶ４０由来ポリアデニル化シグナル配列及びヒトベータグロビン遺伝子由来ポリアデニル化シグナル配列が好ましく、ＳＶ４０由来ポリアデニル化シグナル配列が特に好ましい。これらのポリアデニル化シグナル配列は公知であり、例えば、ＳＶ４０由来ポリアデニル化シグナル配列は、文献：Ｌｅｖｉｔｔ  Ｎ，Ｂｒｉｇｇｓ  Ｄ，Ｇｉｌ  Ａ，Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ  ＮＪ．Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｏｌｙ（Ａ）ｓｉｔｅ．ＧＥＮＥＳ  ＤＥＶ．１９８９  ７：１０１９−２５．に記載されている。
前記一態様のウイルスベクターのＤＮＡ配列は、配列：（ａ）Ｌｅｆｔ−ＩＴＲ、（ｂ）ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列、（ｃ）治療遺伝子配列、（ｄ）ポリアデニル化シグナル配列、（ｅ）Ｒｉｇｈｔ−ＩＴＲを、５’末端側から３’末端側に向かって（ａ）、（ｄ）、（ｃ）、（ｂ）、（ｅ）の順で含んでいる。なお、治療遺伝子配列は、ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列の制御下で発現可能な状態で該プロモーター配列に結合していなければならない。
別の態様では、Ｌｅｆｔ−ＩＴＲとＲｉｇｈｔ−ＩＴＲとの間に含まれる配列として（ｂ）ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列の相補的配列、（ｃ）治療遺伝子配列の相補的配列、（ｄ）ポリアデニル化シグナル配列の相補的配列を使用することもできる。この場合、ウイルスベクターのＤＮＡ配列は、配列：（ａ）Ｌｅｆｔ−ＩＴＲ、（ｄ）ポリアデニル化シグナル配列の相補的配列、（ｃ）治療遺伝子配列の相補的配列、（ｂ）ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列の相補的配列、（ｅ）Ｒｉｇｈｔ−ＩＴＲを、５’末端側から３’末端側に向かって（ａ）、（ｄ）、（ｃ）、（ｂ）、（ｅ）の順で含んでいる。
本発明のウイルスベクターのＤＮＡ配列は、上記の配列の他にプロモーター上流域にポリアデニル化シグナル配列を含んでいてもよい。プロモーター上流域のポリアデニル化シグナル配列は、放射線非照射時のバックグランド抑制の点で有用である。具体例としては、合成ポリアデニル化シグナル配列、ヒト成長ホルモン遺伝子由来ポリアデニル化シグナル配列が挙げられる。これらの中では、合成ポリアデニル化シグナル配列が特に好ましい。
前記一態様のウイルスベクターは、例えばアデノ随伴ウイルスをベースとする場合、以下の工程を含む三重トランスフェクション法によりウイルスベクターを構築することができる。
（１）３種類のプラスミド：（イ）野生型アデノ随伴ウイルスのＬｅｆｔ−ＩＴＲとＲｉｇｈｔ−ＩＴＲとの間にｐ５３標的遺伝子プロモーター配列、治療遺伝子及びポリアデニル化シグナル配列を挿入したベクタープラスミド、（ロ）ウイルス複製及びウイルス粒子形成に必要な遺伝子（ｒｅｐ及びｃａｐ）を含むヘルパープラスミド、並びに、（ハ）アデノ随伴ウイルスベクター産生に必要なアデノウイルス遺伝子（Ｅ２Ａ、Ｅ４及びＶＡ）を含むアデノウイルス遺伝子発現プラスミドを作製する工程；
（２）該３種類のプラスミドを２９３細胞（Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ遺伝子を含む）にコトランスフェクトする工程、
（３）該細胞をインキュベートして、２９３細胞内でウイルスベクターを産生し、蓄積させる工程、
（４）該細胞を凍結融解してウイルスベクターを回収する工程、及び
（５）必要により、塩化セシウムを用いた密度勾配超遠心法又はアフィニティークロマトグラフィー法により、回収したウイルスベクターを精製及び／又は濃縮する工程。
本発明の医薬組成物は、前述の組込型の低線量放射線誘導性ウイルスベクターを含み、遺伝子治療により治療可能な疾患の治療に用いることができるものである。
本発明の医薬組成物の適用対象となるのは、遺伝子治療により治療可能な疾患である。具体例としては、癌、再狭窄、虚血性心疾患及び動脈硬化等が挙げられる。これらの疾患の中で、本発明の医薬組成物は、遺伝子治療と放射線治療との併用による相乗効果が得られる点で癌に対して特に優れた治療効果を発揮することができる。適用可能な癌としては、乳癌、前立腺癌及び脳腫瘍が挙げられる。これらの癌の中で、本発明の医薬組成物は、乳癌に対して優れた治療効果を発揮することができる。
本発明の医薬組成物は、有効成分として組込型の低線量放射線誘導性ウイルスベクターを単独で含んでいてもよく、その他の活性物質を更に含んでいてもよい。その他の活性物質としては、プロドラッグ、放射線増感剤及び免疫賦活剤等が挙げられる。
本発明の医薬組成物は、医薬的に許容しうる担体を含んでいてもよい。医薬的に許容しうる担体としては、水、生理的食塩水及び緩衝液等が挙げられる。
本発明の医薬組成物の剤型としては、直接体内に適用する注射剤（懸濁剤、乳剤を含む）等が挙げられる。
本発明の医薬組成物は、当該技術分野において周知の製剤方法にしたがい製造することができる。
本発明の遺伝子治療方法は、一般的に、下記の工程：
（１）ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列及び治療遺伝子配列を含むＤＮＡ配列を含む組込型の低線量放射線誘導性ウイルスベクターを含む医薬組成物を提供する工程
（２）該医薬組成物を、遺伝子治療により治療可能な疾患を有する患者へ投与する工程、及び
（３）該患者の治療遺伝子の発現が必要とされる部位に、該患者の染色体に組み込まれたベクターのＤＮＡ配列を発現させるのに十分な線量の放射線を照射する工程
を含んでいる。
前記（１）の工程は、前述した低線量放射線誘導性ウイルスベクター及び該ベクターを含む医薬組成物に関する記載にしたがい実施することができる。
前記（２）の工程において、治療対象となる疾患は、前述した本発明の医薬組成物の適用対象となる疾患と同一である。
患者への医薬組成物の投与は、ｉｎ  ｖｉｖｏで治療遺伝子を導入する直接投与法及びｅｘ  ｖｉｖｏで治療遺伝子を導入する自家移植法が挙げられる。
直接投与法では、ベクターを含む医薬組成物を患者へ直接注入する。この際、静脈注射、動脈注射等による全身投与も可能であるが、ベクターに対する免疫反応を最小限にすることができるので、病巣部へｉｎ  ｓｉｔｕで局所投与することが好ましい。
自家移植法では、患者の病巣部から採取した細胞を、ベクターを含む医薬組成物を用いて体外で処理し、その後、該ベクターのＤＮＡ配列を染色体中に組み込んだ細胞を再度患者へ戻す。
医薬組成物の投与量は、通常、疾患の種類及び患者の状態等に依存して変化するが、例えば、乳癌の場合、成人患者一人当たり、ウイルスベクターとして１回に１０８〜１０１１個、好ましくは１０９〜１０１１個、特に好ましくは１０１０〜１０１１個である。
また、投与回数は、１日１回〜２回でよく、投与期間は１日〜５日以上にわたってもよく、１〜１０回の投与を１セットとして、長期間にわたって断続的に多数セットを投与してもよい。
尚、本発明の医薬組成物は、患者の病巣部のｐ５３遺伝子の状態を検査し、当該病巣部でｐ５３遺伝子が正常に機能していることを確認した上で投与する。
前記（３）の工程において、照射する放射線の種類としては、Ｘ線、γ線、粒子線等が挙げられるが、γ線、粒子線が好ましく、粒子線が特に好ましい。
照射線量は、患者の染色体に組み込まれたベクターのＤＮＡ配列を発現させるのに十分な線量であればよく、一般的には、０．５〜２Ｇｙ、好ましくは０．５〜１Ｇｙである。
照射回数は、前記の線量の照射を１回すれば十分であるが、必要に応じて２〜３回以上行ってもよい。
照射は、定位照射技術を用いて、組み込まれたベクターのＤＮＡ配列を発現させることが必要な領域のみに行うことができる。定位照射は、例えば、装置：ＨＩＭＡＣ（製造者名：放射線医学総合研究所）を用いて行うことができる。
工程（２）にしたがい医薬組成物を投与した後、工程（３）にしたがい放射線を照射するまでの時間間隔としては、ベクターのＤＮＡ配列が患者の染色体に組み込まれるのに十分な時間が必要である。かかる時間間隔は、疾患の種類及び患者の状態等に依存して変化するが、例えば、乳癌の場合には、５〜９週間、好ましくは５〜７週間、特に好ましくは５〜６週間である。
治療対象となる疾患が癌である場合、本発明の遺伝子治療方法は、前記（１）〜（３）の工程に続いて以下の工程：
（４）該治療遺伝子が発現している部位に、癌を治療するのに十分な線量の放射線を照射する工程
を含んでいてもよい。すなわち、本発明の癌の遺伝子治療方法は、下記の工程：
（１）ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列及び治療遺伝子配列を含むＤＮＡ配列を含む組込型の低線量放射線誘導性ウイルスベクターを含む医薬組成物を提供する工程
（２）該医薬組成物を、癌患者へ投与する工程、
（３）該患者の癌病巣部位に、該患者の染色体に組み込まれたベクターのＤＮＡ配列を発現させるのに十分な線量の放射線を照射する工程、及び
（４）該治療遺伝子が発現している部位に、癌を治療するのに十分な線量の放射線を照射する工程
を含んでいる。
本発明の癌の遺伝子治療方法における（１）〜（３）の工程は、対象となる疾患が癌であり、放射線の照射部位が癌病巣部であることを除いて、前述の一般的な遺伝子治療方法における工程（１）〜（３）と同様である。
前記（４）の工程において、照射する放射線の種類としては、Ｘ線、γ線、粒子線等が挙げられるが、γ線、粒子線が好ましく、粒子線が特に好ましい。
照射線量は、癌を治療するのに十分な線量であればよく、癌の種類及び患者の状態等に依存して変化するが、例えば、乳癌の場合、一般的には、１０〜６０Ｇｙ、好ましくは１０〜３０Ｇｙ、特に好ましくは１０〜２０Ｇｙである。
照射回数は、癌の種類及び患者の状態等に依存して変化するが、例えば、乳癌の場合、一般的には、３０回である。
照射は、定位照射技術を用いて、癌病巣部のみに行うことができる。定位照射は、例えば、装置：ＨＩＭＡＣ（製造者名：放射線医学総合研究所）を用いて行うことができる。
工程（３）にしたがい患者の染色体に組み込まれたベクターのＤＮＡ配列を発現させるのに十分な線量の放射線を照射した後、工程（４）にしたがい放射線を照射するまでの時間間隔としては、工程（３）の放射線照射によって患者の体内で治療遺伝子が発現し、治療遺伝子産物が癌病巣部に蓄積するのに十分な時間が必要である。かかる時間間隔は、癌の種類及び患者の状態等に依存して変化するが、例えば、乳癌の場合には、３〜１２時間、好ましくは３〜８時間、特に好ましくは３〜６時間である。
（４）の工程を行うことにより、（１）〜（３）の工程による遺伝子治療の治療効果と、（４）の工程による放射線治療の治療効果との組み合わせによる相乗的な治療効果が得られる。
前述の癌の遺伝子治療方法は、哺乳類、特にヒトを治療対象とするものであるが、ヒトを対象とする治療法の確立に先だって行われる動物実験は、例えば、下記の工程：
（１）乳癌細胞をヌードマウスへ移植して、癌のモデルマウスを作成する工程、
（２）ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列及び治療遺伝子としてのヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ配列を含む組込型の低線量放射線誘導性ウイルスベクターを含む医薬組成物を提供する工程
（３）該医薬組成物を、該モデルマウスの癌病巣部位へ注射する工程、
（４）該モデルマウスの癌病巣部位に、該マウスの染色体に組み込まれた該ベクターのＤＮＡ配列を発現させるのに十分な線量の放射線を照射する工程
（５）該モデルマウスにガンシクロビル（ヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼににより細胞毒性を発現するプロドラッグ）を腹腔投与する工程、及び
（６）該治療遺伝子が発現している部位に、癌を治療するのに十分な線量の放射線を照射する工程
を含んでいる。
以下に実施例を示して具体的に説明するが、本発明は実施例により限定されるものではない。
【実施例】（実施例１）
組込型の低線量放射線誘導性ウイルスベクター
本実施例では、２型アデノ随伴ウイルスをベースとし、ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列としてｐ２１遺伝子プロモーター配列を有し、治療遺伝子配列に対応するものとしてルシフェラーゼ遺伝子配列を有する低線量放射線誘導性ウイルスベクターｒＡＡＶ−ＰＬＳを構築した。ｒＡＡＶ−ＰＬＳは、ＡＡＶ  Ｈｅｌｐｅｒ  Ｆｒｅｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いた三重トランスフェクション法（Ｘｉａｏ  Ｘ，Ｌｉ  Ｊ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ＲＪ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｔｉｔｅｒ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｅｌｐｅｒ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９８；７２：２２２４−２２３２．及び  Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  Ｔ，Ｅｌｌｉｇｅｒ  Ｓ，Ｅｌｌｉｇｅｒ  Ｃ，Ｐｏｄｓａｋｏｆｆ  Ｇ，Ｖｉｌｌａｒｒｅａｌ  Ｌ，Ｋｕｒｔｚｍａｎ  ＧＪ，Ｉｗａｋｉ  Ｙ，Ｃｏｌｏｓｉ  Ｐ．Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃａｎ  ｂｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １９９８；５：９３８−９４５．）により構築した。
はじめに、プラスミドｗｗｐ−Ｌｕｃ（Ｅｌ−Ｄｅｉｒｙ  ＷＳ，Ｔｏｋｉｎｏ  Ｔ，Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ  ＶＥ，Ｌｅｖｙ  ＤＢ，Ｐａｒｓｏｎｓ  Ｒ，Ｔｒｅｎｔ  ＪＭ，Ｌｉｎ  Ｄ，Ｍｅｒｃｅｒ  ＷＥ，Ｋｉｎｚｌｅｒ  ＫＷ，Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  Ｂ．ＷＡＦ１，ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｏｆ  ｐ５３  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  １９９３；７５：８１７−２５．）から、ＨｉｎｄＩＩＩを用いて、−２．２ｋｂ及び−１．４ｋｂにｐ５３認識部位を含むｐ２１遺伝子の５’フランキング領域（すなわち、ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列）：
2006043354.tif 000008
2006043354.tif 000009
2006043354.tif 000010
を切り出した。
切り出したｐ２１遺伝子の５’フランキング領域を、ルシフェラーゼ遺伝子配列及びＳＶ４０由来ポリアデニル化シグナルを含むｐＧＬ３基本ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Ｃａｔ．＃Ｅ１７５１））のマルチクローニング部位へ挿入してルシフェラーゼ発現プラスミドＰＬＳを構築した。プラスミドＰＬＳの塩基配列を以下に示す。
2006043354.tif 000011
2006043354.tif 000012
2006043354.tif 000013
2006043354.tif 000014
2006043354.tif 000015
当該塩基配列中、ｐ２１遺伝子の５’フランキング領域は以下の配列：
2006043354.tif 000016
2006043354.tif 000017
で表される領域であり、
ルシフェラーゼコード配列は以下の配列：
2006043354.tif 000018
2006043354.tif 000019
で表される領域であり、
ＳＶ４０由来ポリアデニル化シグナルは以下の配列：
2006043354.tif 000020
2006043354.tif 000021
で表される領域である。
構築したプラスミドＰＬＳから、ｐ２１遺伝子の５’フランキング領域、ルシフェラーゼコード配列及びＳＶ４０由来ポリアデニル化シグナルを含む４．３ｋｂのＸｈｏＩ／ＢａｍＨ１フラグメントを切り出し、平滑末端化した。得られたフラグメントを、Ｌｅｆｔ−ＩＴＲ及びＲｉｇｈｔ−ＩＴＲを有するｐＡＡＶ−ＭＣＳ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社  ＡＡＶ  Ｈｅｌｐｅｒ−Ｆｒｅｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃａｔ＃２４００７１）をＮｏｔＩで消化し、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）の使用により平滑末端化したものの両ＩＴＲ間に挿入してプラスミドｐＡＡＶ−ＰＬＳを得た。プラスミドｐＡＡＶ−ＰＬＳの塩基配列を以下に示す。
2006043354.tif 000022
2006043354.tif 000023
2006043354.tif 000024
2006043354.tif 000025
2006043354.tif 000026
当該塩基配列中、Ｌｅｆｔ−ＩＴＲは以下の配列：
2006043354.tif 000027
で表される領域であり、
ｐ２１遺伝子の５’フランキング領域は以下の配列：
2006043354.tif 000028
2006043354.tif 000029
2006043354.tif 000030
で表される領域であり、
ルシフェラーゼコード配列は以下の配列：
2006043354.tif 000031
2006043354.tif 000032
で表される領域であり、
ＳＶ４０由来ポリアデニル化シグナルは以下の配列：
2006043354.tif 000033
で表される領域であり、
Ｒｉｇｈｔ−ＩＴＲは以下の配列：
2006043354.tif 000034
で表される領域である。
ウイルス複製及びウイルス粒子形成に必要な遺伝子（ｒｅｐ及びｃａｐ）を含むヘルパープラスミドとして、アデノ随伴ウイルス由来ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードするｐＡＡＶ−ＲＣ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社  ＡＡＶ  Ｈｅｌｐｅｒ−Ｆｒｅｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃａｔ＃２４００７１）を使用した。
プラスミドｐＡＡＶ−ＲＣの塩基配列を以下に示す。
2006043354.tif 000035
2006043354.tif 000036
2006043354.tif 000037
2006043354.tif 000038
2006043354.tif 000039
アデノ随伴ウイルスベクター産生に必要なアデノウイルス遺伝子（Ｅ２Ａ、Ｅ４及びＶＡ）を含むアデノウイルス遺伝子発現プラスミドとして、アデノウイルス由来ＶＡ、Ｅ２Ａ及びＥ４遺伝子をコードするｐＨｅｌｐｅｒ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社  ＡＡＶ  Ｈｅｌｐｅｒ−Ｆｒｅｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃａｔ＃２４００７１）を使用した。
プラスミドｐＨｅｌｐｅｒの塩基配列を以下に示す。
2006043354.tif 000040
2006043354.tif 000041
2006043354.tif 000042
2006043354.tif 000043
2006043354.tif 000044
2006043354.tif 000045
2006043354.tif 000046
構築又は入手した３種のプラスミド：ｐＡＡＶ−ＰＬＳ、ｐＡＡＶ−ＲＣ及びｐＨｅｌｐｅｒを、ＰｒｏＦｅｃｔｉｏｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いたリン酸カルシウム法により、７×１０６の２９３細胞（アデノウイルスＥ１遺伝子を安定して発現するＨＥＫ２９３ヒト胚性腎細胞に由来する）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社  ＡＡＶ  Ｈｅｌｐｅｒ−Ｆｒｅｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃａｔ＃２４００７１）へコトランスフェクトした。
インキュベーション（１０％ウシ胎児血清を含む１０ｍｌのＤＭＥＭ中、５％炭酸ガスを含む３７℃雰囲気で培養）３日後、２９３細胞内で産生した低線量放射線誘導性ウイルスベクターｒＡＡＶ−ＰＬＳを、４回の凍解サイクル（ドライアイスで冷やしたエタノール中で１０分間凍らせた後、３７℃湯浴で融解）により回収し、続いて、１００００ｇで１０分間遠心分離して濃縮した。得られたｒＡＡＶ−ＰＬＳのゲノム構造を図１に示す。ｒＡＡＶ−ＰＬＳの塩基配列を以下に示す。
2006043354.tif 000047
2006043354.tif 000048
2006043354.tif 000049
当該塩基配列中、Ｌｅｆｔ−ＩＴＲは以下の配列：
2006043354.tif 000050
で表される領域であり、
ｐ２１遺伝子の５’フランキング領域は以下の配列：
2006043354.tif 000051
2006043354.tif 000052
2006043354.tif 000053
で表される領域であり、
ルシフェラーゼコード配列は以下の配列：
2006043354.tif 000054
2006043354.tif 000055
で表される領域であり、
ＳＶ−４０由来ポリアデニル化シグナルは以下の配列：
2006043354.tif 000056
で表される領域であり、
Ｒｉｇｈｔ−ＩＴＲは以下の配列：
2006043354.tif 000057
で表される領域である。したがって、ｒＡＡＶ−ＰＬＳは、（ａ）Ｌｅｆｔ−ＩＴＲ、（ｂ）ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列、（ｃ）治療遺伝子配列、（ｄ）ポリアデニル化シグナル配列、（ｅ）Ｒｉｇｈｔ−ＩＴＲ、を５’末端側から３’末端側に向かって（ａ）、（ｄ）、（ｃ）、（ｂ）、（ｅ）の順で含むＤＮＡ配列を含んでいた。
（実施例２）
組込型の低線量放射線誘導性ウイルスベクターを含む医薬組成物
２９３細胞内で産生した低線量放射線誘導性ウイルスベクターｒＡＡＶ−ＰＬＳを、４回の凍解サイクルにより回収し、続いて、１００００ｇで１０分間遠心分離して濃縮した。得られた濃縮物は、低線量放射線誘導性ウイルスベクターｒＡＡＶ−ＰＬＳ及び緩衝液を含んでいた。
（実施例３）
組込型ウイルスベクターを用いた形質導入
（１）形質導入
宿主細胞として、ｐ５３を発現するヒト乳癌細胞であるＭＣＦ−７細胞を使用した。
実施例２で作製した医薬組成物（ウイルス接種物）（５．５×１０８個のｒＡＡＶ−ＰＬＳウイルス粒子を含有）０．２５ｍｌと、１０５個のＭＣＦ−７細胞とを、１２ウェルマイクロプレート中で混合し、２４時間インキュベート（１０％ウシ胎児血清を含む２ｍｌのＲＰＭＩ１６４０中、５％炭酸ガスを含む３７℃雰囲気で培養）して、ウイルスベクターをＭＣＦ−７細胞に形質導入した（感染多重度：５．５×１０３）。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄してウイルス接種物を除去し、１０％ＦＢＳ（ＪＲＨ）、１００ユニット／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、３７℃、加湿雰囲気中の５％ＣＯ２下で培養した。
（２）Ｘ線照射
形質導入後６６日間培養したＭＣＦ−７細胞に、種々の線量（０．２Ｇｙ、０．５Ｇｙ、１Ｇｙ及び２Ｇｙ）のＸ線を照射した。Ｘ線は、０．５ｍｍ銅フィルター及び０．５ｍｍアルミニウムフィルターを備え、２００ｋＶｐ及び２０ｍＡで作動するＰａｎｔａｋユニットから生成した。また、照射は、１．０Ｇｙ／分の線量率で行った。
（３）ルシフェラーゼ遺伝子発現の測定
形質導入したルシフェラーゼ遺伝子の発現を、ＭＣＦ−７細胞中のルシフェラーゼによって生ずる発光量を指標として評価した。
Ｘ線照射６時間後のＭＣＦ−７細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解した。細胞ライセート中のルシフェラーゼ活性を、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、分析用照度計（ｍｏｄｅｌ  ＬＢ９５０６；Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）により測定した。対照として、Ｘ線照射を除いてＸ線照射ＭＣＦ−７細胞と同様の処理を行ったＸ線未照射ＭＣＦ−７細胞を用いた。得られた測定値から、下記計算式に基づき、各照射線量におけるルシフェラーゼ遺伝子発現の誘導率を算出した。
誘導率＝Ｘ線照射ＭＣＦ−７細胞の発光量／Ｘ線未照射ＭＣＦ−７細胞の発光量
（比較例１）
非組込型プラスミドベクターを用いたトランスフェクション
（１）トランスフェクション
比較例として、本発明の組込型ウイルスベクターの作製過程で生じた非組込型プラスミドベクターであるプラスミドＰＬＳを用いた。宿主細胞ＭＣＦ−７へのトランスフェクションは、文献（Ｎｅｎｏｉ  Ｍ，Ｉｃｈｉｍｕｒａ  Ｓ，Ｍｉｔａ  Ｋ，Ｙｕｋａｗａ  Ｏ，Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ  ＩＬ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｔａｌａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｂｙ  Ｓｐ１，ＣＣＡＡＴ−ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ，ａｎｄ  ａ  ＷＴ１／Ｅｇｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ＨＰ１００  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００１；６１：５８８５−５８９４）にしたがい、以下の手順で行った。
５×１０６個のＭＣＦ−７細胞を、ＦＢＳを含まないＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し、１０μｇのプラスミドＰＬＳと混合した。ＭＣＦ−７細胞とプラスミドＰＬＳとの混合物を、４ｍｍの電極間隙を有するエレクトロポレーションキュベットへ移し、氷中に５分間置いた後、９６０μＦのキャパシタンスを用いて２２０Ｖでパルスをかけた。氷中で１０分間インキュベートした後、ＦＢＳを含む４８ｍｌの予熱ＲＰＭＩ１６４０中に均一に懸濁し、Ｘ線照射までインキュベート（１０％ウシ胎児血清を含む２ｍｌのＲＰＭＩ１６４０中、５％炭酸ガスを含む３７℃雰囲気で培養）した。
（２）Ｘ線照射
トランスフェクション後４８時間培養したＭＣＦ−７細胞に、種々の線量（０．５Ｇｙ、１Ｇｙ、２Ｇｙ、３Ｇｙ及び５Ｇｙ）のＸ線を照射した。Ｘ線は、０．５ｍｍ銅フィルター及び０．５ｍｍアルミニウムフィルターを備え、２００ｋＶｐ及び２０ｍＡで作動するＰａｎｔａｋユニットから生成した。また、照射は、１．０Ｇｙ／分の線量率で行った。
（３）ルシフェラーゼ遺伝子発現の測定
トランスフェクトしたルシフェラーゼ遺伝子の発現を、ＭＣＦ−７細胞中のルシフェラーゼによって生ずる発光量を指標として評価した。
Ｘ線照射４８時間後のＭＣＦ−７細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解した。細胞ライセート中のルシフェラーゼ活性を、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、分析用照度計（ｍｏｄｅｌ  ＬＢ９５０６；Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）により測定した。対照として、Ｘ線照射を除いてＸ線照射ＭＣＦ−７細胞と同様の処理を行ったＸ線未照射ＭＣＦ−７細胞を用いた。得られた測定値から、下記計算式に基づき、各照射線量におけるルシフェラーゼ遺伝子発現の誘導率を算出した。
誘導率＝Ｘ線照射ＭＣＦ−７細胞の発光量／Ｘ線未照射ＭＣＦ−７細胞の発光量
ルシフェラーゼ遺伝子発現の放射線誘導率における組込型ウイルスベクターと非組込型プラスミドベクターとの比較
実施例３及び比較例１で得られたルシフェラーゼ遺伝子発現の誘導率の線量依存性を図２に示す。
比較例１の非組込型プラスミドベクターは、０．５Ｇｙ、１Ｇｙ、２Ｇｙ、３Ｇｙ及び５ＧｙのＸ線を照射したとき、それぞれ、非照射時の１．１倍（１０％）、１．３倍（３０％）、１．４倍（４０％）及び１．５倍（５０％）のルシフェラーゼ遺伝子発現誘導を示した（カッコ内の数値は非照射時の発現活性と比較したときの上昇率を示す）。この結果は、非組込型プラスミドベクターは、低線量放射線照射下で治療遺伝子発現を十分に誘導することができないことを示している。
一方、本発明の組込型ウイルスベクター（アデノ随伴ウイルスベクター）は、０．２Ｇｙ、０．５Ｇｙ、１Ｇｙ及び２ＧｙのＸ線を照射したとき、それぞれ、非照射時の１．３倍（３０％）、１．７倍（７０％）、２．１倍（１１０％）及び３．１倍（２１０％）のルシフェラーゼ遺伝子発現誘導を示した（カッコ内の数値は非照射時の発現活性と比較したときの上昇率を示す）。この結果は、本発明の組込型ウイルスベクターは、低線量放射線照射下で治療遺伝子発現を高度に誘導することができることを示している。
ここで、実施例３と比較例１とは、遺伝子導入後からＸ線を照射するまでの培養期間において相違（実施例：形質導入後６６日間；比較例：トランスフェクション後４８時間）している。しかしながら、（１）実施例３及び比較例１で用いた導入遺伝子は細胞の通常の生理状態に影響すると考えられる因子を含んでいないこと、及び、（２）遺伝子導入の操作から長時間が経過しており一過性の細胞変化は終息していることから、遺伝子導入後からＸ線を照射するまでの培養期間の相違は放射線誘導率に影響しないと考えられる。
この結果に関し、本発明は特定の理論に拘束されるものではないが、本発明のウイルスベクターが低線量放射線誘導性を有するのは、低線量放射線照射により活性化されたｐ５３による標的遺伝子の発現活性化が高次の染色体構造に依存した機構と関連するところ、本発明の組込型ウイルスベクターによりｐ５３標的遺伝子プロモーター配列及び治療遺伝子配列が宿主細胞の染色体に組み込まれた状態で存在しているためであると考えられる。
以上より、本発明の組込型ウイルスベクターは低線量放射線誘導性を有することが理解される。
（参考例）
ｒＡＡＶ−ＰＬＳを形質導入したＭＣＦ−７細胞における遺伝子導入状態
本発明の組込型ウイルスベクターが宿主染色体への遺伝子組み込みを起こすことができることを検証するために以下の２つの実験を行った。
（１）ｒＡＡＶ−ＰＬＳ特異的プライマーを用いた形質導入ＭＣＦ−７細胞ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析
実施例３（１）の形質導入法にしたがい、実施例１で作製した組込型の低線量放射線誘導性ウイルスベクターｒＡＡＶ−ＰＬＳを、ＭＣＦ−７細胞に形質導入した。
形質導入後６６日間培養したＭＣＦ−７細胞から、ＤＮＡｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＭＣＦ−７細胞のゲノムＤＮＡを単離した。単離したゲノムＤＮＡを、以下の配列：
2006043354.tif 000058
を有する２種のｒＡＡＶ−ＰＬＳ特異的プライマー、ＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造）及びＧＣバッファー（宝酒造）を用いてＰＣＲ増幅（反応条件：９５℃で１分、６０℃で３０秒、７２℃で１分）した。結果を図３に示す。
図３は、ｒＡＡＶ−ＰＬＳを形質導入したＭＣＦ−７細胞から単離したゲノムＤＮＡを鋳型として３１回以上のＰＣＲサイクルに付した結果、ｒＡＡＶ−ＰＬＳのＤＮＡ配列に特異的な生成物が明りょうなバンドとして現れたことを示している。この結果より、ｒＡＡＶ−ＰＬＳを形質導入したＭＣＦ−７細胞から単離したゲノムＤＮＡ配列中に、当該ｒＡＡＶ−ＰＬＳの一部に相当する配列が存在していることが理解される。
（２）制限酵素を用いた形質導入ＭＣＦ−７細胞ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析
本実験は、ｒＡＡＶ−ＰＬＳのＤＮＡがＭＣＦ−７細胞の染色体中へ実際に組み込まれていることを検証するために行った。
実施例３（１）の形質導入法にしたがい、実施例１で作製した組込型の低線量放射線誘導性ウイルスベクターｒＡＡＶ−ＰＬＳを、ＭＣＦ−７細胞に形質導入した。
形質導入後６６日間培養したＭＣＦ−７細胞から、ＤＮＡｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＭＣＦ−７細胞のゲノムＤＮＡを単離した。単離したゲノムＤＮＡを、３種類の制限酵素：ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨ１のいずれか１種で消化した。
ここで、ＢｇｌＩＩは、ｒＡＡＶ−ＰＬＳゲノム中のｐ２１プロモーターの５’末端付近だけでなく、ＭＣＦ−７細胞が固有に有するＭＣＦ−７細胞ゲノムＤＮＡ中のｐ２１プロモーターの５’末端付近の領域をも切断することができる制限酵素である。一方、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨ１は、ＭＣＦ−７細胞ゲノムＤＮＡを切断することができるが、ｒＡＡＶ−ＰＬＳゲノムを切断することができない制限酵素である。
各種制限酵素を用いて得られたそれぞれの消化物を０．７％アガロースゲル中での電気泳動に付し、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎナイロンフィルターにブロットした。
フィルターと、ｒＡＡＶ−ＰＬＳのＤＮＡ配列の一部（ルシフェラーゼコード配列及びｐ２１遺伝子プロモーター配列の一部）に相当する以下の配列：
2006043354.tif 000059
2006043354.tif 000060
を有するプローブとをハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションシグナル強度を、ＢＡＳ２０００  Ｂｉｏ−Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ）により測定した。結果を図４に示す。
形質導入ＭＣＦ−７細胞ゲノムＤＮＡをＢｇｌＩＩで消化したとき、＞１０ｋｂの位置及び５ｋｂの位置に２つのバンドが観察された。
＞１０ｋｂのバンドは、ＭＣＦ−７細胞が固有に有するｐ２１遺伝子プロモーター領域を含むフラグメントに対応するものであると考えられる。５ｋｂのバンドは、ｒＡＡＶ−ＰＬＳが縦列に連なった状態でＭＣＦ−７細胞ゲノムへ組み込まれ、各ｒＡＡＶ−ＰＬＳのＤＮＡ配列中に存在するｐ２１プロモーター領域中のＢｇｌＩＩ制限部位における切断によって生成したフラグメントに対応するものであると考えられる。
形質導入ＭＣＦ−７細胞ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化したとき、＞１０ｋｂの位置にバンドが観察された。このバンドは、ＭＣＦ−７細胞が固有に有するｐ２１遺伝子プロモーター領域を含むフラグメントに対応するものであると考えられる。
形質導入ＭＣＦ−７細胞ゲノムＤＮＡをＢａｍＨ１で消化したとき、＞５ｋｂの位置にバンドが観察された。このバンドは、ＭＣＦ−７細胞が固有に有するｐ２１遺伝子プロモーター領域を含むフラグメントに対応するものであると考えられる。
ＭＣＦ−７細胞へ導入されたｒＡＡＶ−ＰＬＳのＤＮＡがＭＣＦ−７細胞の染色体外に存在しているならば、ｒＡＡＶ−ＰＬＳゲノムを切断することができないＥｃｏＲＩ又はＢａｍＨ１で消化したとき、無傷のｒＡＡＶ−ＰＬＳのＤＮＡに対応する同一の大きさのバンドが現れるはずである。しかしながら、そのようなバンドは観察されなかった。したがって、ｒＡＡＶ−ＰＬＳのＤＮＡはＭＣＦ−７細胞の染色体中へ組み込まれていると考えられる。
ｒＡＡＶ−ＰＬＳのＤＮＡの染色体への組み込み状態について、ｒＡＡＶ−ＰＬＳのＤＮＡがＭＣＦ−７細胞染色体の特定の位置へ組み込まれるのであれば、ＥｃｏＲＩ又はＢａｍＨ１で消化した後、決まった長さの（ｒＡＡＶ−ＰＬＳのＤＮＡを含む）ＤＮＡフラグメントが生成するので、サザンブロット分析では、このフラグメントに対応するバンドが現れるはずである。一方、ｒＡＡＶ−ＰＬＳのＤＮＡがＭＣＦ−７細胞染色体へランダムに組み込まれるのであれば、ＥｃｏＲＩ又はＢａｍＨ１で消化した後、様々な（不定の）長さの（ｒＡＡＶ−ＰＬＳのＤＮＡを含む）ＤＮＡフラグメントが生成するので、サザンブロット分析では、バンドとしては現れず、スメアになるはずである。前記の実験結果では、ＭＣＦ−７細胞が固有に有するｐ２１遺伝子プロモーター領域を含むフラグメントに対応するバンドのみが観察された。したがって、ｒＡＡＶ−ＰＬＳのＤＮＡは、ＭＣＦ−７細胞染色体へランダムに組み込まれたと考えられる。
（実施例４）
組込型の低線量放射線誘導性ウイルスベクター
本実施例では、２型アデノ随伴ウイルスをベースとし、ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列としてｐ２１遺伝子プロモーター配列を有し、治療遺伝子配列としてヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子配列を有する低線量放射線誘導性ウイルスベクターｒＡＡＶ−ＰｔｋＳを構築した。ｒＡＡＶ−ＰｔｋＳは、ＡＡＶ  Ｈｅｌｐｅｒ  Ｆｒｅｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いた三重トランスフェクション法（Ｘｉａｏ  Ｘ，Ｌｉ  Ｊ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ＲＪ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｔｉｔｅｒ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｅｌｐｅｒ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９８；７２：２２２４−２２３２．及びＭａｔｓｕｓｈｉｔａ  Ｔ，Ｅｌｌｉｇｅｒ  Ｓ，Ｅｌｌｉｇｅｒ  Ｃ，Ｐｏｄｓａｋｏｆｆ  Ｇ，Ｖｉｌｌａｒｒｅａｌ  Ｌ，Ｋｕｒｔｚｍａｎ  ＧＪ，Ｉｗａｋｉ  Ｙ，Ｃｏｌｏｓｉ  Ｐ．Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃａｎ  ｂｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １９９８；５：９３８−９４５．）により構築した。
はじめに、プラスミドｐＯＲＦ−ＨＳＶｔｋ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）から、ＮｃｏＩとＮｈｅＩを用いて、ＨＳＶ−ｔｋコード配列を含む断片：
2006043354.tif 000061
2006043354.tif 000062
を切り出した。
一方、以下の配列：
2006043354.tif 000063
2006043354.tif 000064
2006043354.tif 000065
2006043354.tif 000066
2006043354.tif 000067
を有するｐＡＡＶ−ＰＬＳから、ＮｃｏＩとＸｂａＩを用いてＬｅｆｔ−ＩＴＲ、ｐ２１遺伝子の５’フランキング領域、ＳＶ４０由来ポリアデニル化シグナル、Ｒｉｇｈｔ−ＩＴＲを含む断片を切り出し、上記のＨＳＶ−ｔｋコード配列を含む断片を連結した。これによりＬｅｆｔ−ＩＴＲ、ｐ２１遺伝子の５’フランキング領域、ＨＳＶ−ｔｋコード配列、ＳＶ４０由来ポリアデニル化シグナル、Ｒｉｇｈｔ−ＩＴＲがこの順で連結されて含まれるｐＡＡＶ−ＰｔｋＳを得た。ｐＡＡＶ−ＰｔｋＳの塩基配列を以下に示す。
2006043354.tif 000068
2006043354.tif 000069
2006043354.tif 000070
2006043354.tif 000071
2006043354.tif 000072
当該塩基配列中、Ｌｅｆｔ−ＩＴＲは以下の配列：
2006043354.tif 000073
で表される領域であり、
ｐ２１遺伝子の５’フランキング領域は以下の配列：
2006043354.tif 000074
2006043354.tif 000075
2006043354.tif 000076
で表される領域であり、
ＨＳＶ−ｔｋコード配列は以下の配列：
2006043354.tif 000077
で表される領域であり、
ＳＶ４０由来ポリアデニル化シグナルは以下の配列：
2006043354.tif 000078
で表される領域であり、
Ｒｉｇｈｔ−ＩＴＲは以下の配列：
2006043354.tif 000079
で表される領域である。
ウイルス複製及びウイルス粒子形成に必要な遺伝子（ｒｅｐ及びｃａｐ）を含むヘルパープラスミドとして、実施例１と同様のアデノ随伴ウイルス由来ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードするｐＡＡＶ−ＲＣ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社  ＡＡＶ  Ｈｅｌｐｅｒ−Ｆｒｅｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃａｔ＃２４００７１）を使用した。
アデノ随伴ウイルスベクター産生に必要なアデノウイルス遺伝子（Ｅ２Ａ、Ｅ４及びＶＡ）を含むアデノウイルス遺伝子発現プラスミドとして、実施例１と同様のアデノウイルス由来ＶＡ、Ｅ２Ａ及びＥ４遺伝子をコードするｐＨｅｌｐｅｒ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社  ＡＡＶ  Ｈｅｌｐｅｒ−Ｆｒｅｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃａｔ＃２４００７１）を使用した。
構築又は入手した３種のプラスミド：ｐＡＡＶ−ＰｔｋＳ、ｐＡＡＶ−ＲＣ及びｐＨｅｌｐｅｒを、ＰｒｏＦｅｃｔｉｏｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いたリン酸カルシウム法により、７×１０６の２９３細胞（アデノウイルスＥ１遺伝子を安定して発現するＨＥＫ２９３ヒト胚性腎細胞に由来する）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社  ＡＡＶ  Ｈｅｌｐｅｒ−Ｆｒｅｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃａｔ＃２４００７１）へコトランスフェクトした。
インキュベーション（１０％ウシ胎児血清を含む１０ｍｌのＤＭＥＭ中、５％炭酸ガスを含む３７℃雰囲気で培養）３日後、２９３細胞内で産生した低線量放射線誘導性ウイルスベクターｒＡＡＶ−ＰｔｋＳを、４回の凍解サイクル（ドライアイスで冷やしたエタノール中で１０分間凍らせた後、３７℃湯浴で融解）により回収し、続いて、１００００ｇで１０分間遠心分離して濃縮した。得られたｒＡＡＶ−ＰｔｋＳのゲノム構造を図５に示す。ｒＡＡＶ−ＰｔｋＳの塩基配列を以下に示す。
2006043354.tif 000080
2006043354.tif 000081
2006043354.tif 000082
当該塩基配列中、Ｌｅｆｔ−ＩＴＲは以下の配列：
2006043354.tif 000083
で表される領域であり、
ｐ２１遺伝子の５’フランキング領域は以下の配列：
2006043354.tif 000084
2006043354.tif 000085
2006043354.tif 000086
で表される領域であり、
ＨＳＶ−ｔｋコード配列は以下の配列：
2006043354.tif 000087
で表される領域であり、
ＳＶ４０由来ポリアデニル化シグナルは以下の配列：
2006043354.tif 000088
で表される領域であり、
Ｒｉｇｈｔ−ＩＴＲは以下の配列：
2006043354.tif 000089
で表される領域である。したがって、ｒＡＡＶ−ＰｔｋＳは、（ａ）Ｌｅｆｔ−ＩＴＲ、（ｂ）ｐ５３標的遺伝子プロモーター配列、（ｃ）治療遺伝子配列（ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子）、（ｄ）ポリアデニル化シグナル配列、（ｅ）Ｒｉｇｈｔ−ＩＴＲ、を５’末端側から３’末端側に向かって（ａ）、（ｄ）、（ｃ）、（ｂ）、（ｅ）の順で含むＤＮＡ配列を含んでいた。
（実施例５）
組込型の低線量放射線誘導性ウイルスベクターを含む医薬組成物
２９３細胞内で産生した低線量放射線誘導性ウイルスベクターｒＡＡＶ−ＰｔｋＳを、４回の凍解サイクルにより回収し、続いて、１００００ｇで１０分間遠心分離して濃縮した。得られた濃縮物は、低線量放射線誘導性ウイルスベクターｒＡＡＶ−ＰｔｋＳ及び緩衝液を含んでいた。
（実施例６）
組込型ウイルスベクターを用いた形質導入
（１）形質導入
宿主細胞として、ｐ５３を発現するヒト乳癌細胞であるＭＣＦ−７細胞を使用した。
実施例５で作製した医薬組成物（ウイルス接種物）（５．５×１０８個のｒＡＡＶ−ＰｔｋＳウイルス粒子を含有）０．２５ｍｌと、１０５個のＭＣＦ−７細胞とを、１２ウェルマイクロプレート中で混合し、２４時間インキュベート（１０％ウシ胎児血清を含む２ｍｌのＲＰＭＩ１６４０中、５％炭酸ガスを含む３７℃雰囲気で培養）して、ウイルスベクターをＭＣＦ−７細胞に形質導入した（感染多重度：５．５×１０３）。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄してウイルス接種物を除去し、１０％ＦＢＳ（ＪＲＨ）、１００ユニット／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、３７℃、加湿雰囲気中の５％ＣＯ２下で培養した。
（２）ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を指標とした、Ｘ線照射によるＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の発現誘導の評価
本実施例では、Ｘ線照射によるＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の発現誘導を、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を指標としたＲＴ−ＰＣＲにより評価した。
実施例６にしたがい形質導入後、約３ヶ月間培養（７０〜８０日間の培養＋培養後の凍結保存＋溶解後の１０〜２０日間の培養）したＭＣＦ−７細胞に、線量５ＧｙのＸ線を照射した。５Ｇｙという線量は、Ｘ線照射によるＨＳＶ−ｔｋ遺伝子発現量の変化を明瞭に観察するために採用した。Ｘ線は、０．５ｍｍ銅フィルター及び０．５ｍｍアルミニウムフィルターを備え、２００ｋＶｐ及び２０ｍＡで作動するｐａｎｔａｋユニットから生成した。また、照射は、約１Ｇｙ／分の線量率で行った。
Ｘ線を照射しなかった（０Ｇｙ）サンプルを対照とした。
Ｘ線照射後、形質導入ＭＣＦ−７細胞のＨＳＶ−ｔｋ遺伝子及びアクチン遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＲＴ−ＰＣＲにより測定した。アクチン遺伝子は、ＭＣＦ−７細胞の内在性遺伝子であり、形質導入したＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の対照として使用した。ＲＴ−ＰＣＲは、下記の手順に従い行った。
形質導入ＭＣＦ−７細胞からＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを単離した後、オリゴテックス−ｄＴ３０（日本ロシュ）を用いてｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを単離した。これを鋳型としｃＤＮＡ合成キット（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）を用いてｃＤＮＡを合成した。次にそのｃＤＮＡを鋳型としてＨＳＶ−ｔｋコード配列あるいはアクチン遺伝子に特異的なＰＣＲプライマー、ＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造）、およびＧＣバッファー（宝酒造）を用いてＰＣＲ増幅（反応条件：９５℃１分、６０℃３０秒、７２℃１分）を行った。
使用したＰＣＲプライマーの配列は下記の通りである。
ＨＳＶ−ｔｋ：
2006043354.tif 000090
アクチン：
2006043354.tif 000091
上述の手順に従った実験を２回行った。結果を図６に示す。図６中、１回目の試験結果を（Ａ）ＰｔｋＳ−１として示し、２回目の試験結果を（Ｂ）ＰｔｋＳ−２として示す。
図６（Ａ）及び（Ｂ）において、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子についての２６〜２９の数字及びアクチン遺伝子についての１８〜２１の数字は、それぞれＲＴ−ＰＣＲのサイクル数を示す。
ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子について行ったＲＴ−ＰＣＲのサイクル数（２６〜２９）が、アクチン遺伝子について行ったＲＴ−ＰＣＲのサイクル数（１８〜２１）よりも多かったのは、外来性遺伝子であるＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の発現量が内在性遺伝子であるアクチン遺伝子の発現量（ｍＲＮＡ量）と比較して非常に少なかったため、Ｘ線照射によるＨＳＶ−ｔｋ遺伝子発現誘導の評価を行うためにより多くのサイクル数を必要としたからである。
図６（Ａ）においては、Ｘ線照射によっては発現量が変化しないことが知られているアクチン遺伝子と比較して、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子では、Ｘ線照射による発現量の増加が認められた。
図６（Ｂ）も図６（Ａ）と同様の傾向を示した。したがって、Ｘ線照射によるＨＳＶ−ｔｋ遺伝子発現量の増加について再現性のある結果が得られた。
これらの結果は、本発明のベクターｒＡＡＶ−ＰｔｋＳによりＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を形質導入したＭＣＦ−７細胞において、当該細胞内におけるＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の発現が、Ｘ線照射により誘導されたことを示している。
（３）形質導入細胞の生残率を指標とした、低線量Ｘ線照射によるＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の発現誘導の評価
形質導入したＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の発現産物であるヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）は、ガンシクロビルを活性化してＤＮＡ合成阻害作用を発揮させて、形質導入細胞を死滅させることができる。そこで、本実施例では、低線量Ｘ線照射によるＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の発現誘導を、ガンシクロビル存在下の形質導入細胞へ低線量Ｘ線を照射したときの生残率を指標として評価した。
サンプルとして、実施例６にしたがい形質導入後、約３ヶ月間培養（７０〜８０日間の培養＋培養後の凍結保存＋溶解後の１０〜２０日間の培養）したＨＳＶ−ｔｋ遺伝子導入ＭＣＦ−７細胞サンプル２つ（ＰｔｋＳ−１及びＰｔｋＳ−２）並びに実施例３にしたがい形質導入後、約３ヶ月間培養（６６日間の培養＋培養後の凍結保存＋溶解後の１０〜２０日間の培養）したルシフェラーゼ遺伝子導入ＭＣＦ−７細胞サンプル（ＰＬＳ）を用いた。
各細胞サンプルへ、１ｍｇ／ｍｌのガンシクロビル（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）存在下、１Ｇｙの低線量Ｘ線を１日２回（但し、ガンシクロビル投与日は１日１回照射）、計５日間（合計９Ｇｙ）照射した。Ｘ線は、０．５ｍｍ銅フィルター及び０．５ｍｍアルミニウムフィルターを備え、２００ｋＶｐ及び２０ｍＡで作動するＰａｎｔａｋユニットから生成した。また、照射は、約１Ｇｙ／分の線量率で行った。対照として、各細胞サンプルへ、ガンシクロビル非存在下で前記と同様のＸ線照射を行った。
Ｘ線照射２日後、Ｐｒｏｍｅｇａ社のキット「ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ」を用いたＭＴＴ法により生細胞の数を測定した。結果を図７に示す。図７の縦軸は、ガンシクロビル非存在下での生残細胞数に対するガンシクロビル存在下での生残細胞数の比（相対細胞数）を示す。
２つのＨＳＶ−ｔｋ遺伝子導入細胞サンプル（ＰｔｋＳ−１及びＰｔｋＳ−２）は、ガンシクロビル存在下での低線量Ｘ線照射により生残率の有意な低下を示した。一方、ルシフェラーゼ遺伝子導入細胞サンプル（ＰＬＳ）は、生残率の低下を示さなかった。この結果は、本発明のベクターｒＡＡＶ−ＰｔｋＳによりＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を形質導入したＭＣＦ−７細胞（ヒト乳癌細胞）へ、ガンシクロビルの存在下、低線量Ｘ線を照射したときに、当該細胞内でＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の発現が誘導されてＨＳＶ−ｔｋが産生し、この産生したＨＳＶ−ｔｋによってガンシクロビルが細胞毒性（ＤＮＡ合成阻害作用）を発揮し、その結果、ＭＣＦ−７細胞細胞が死滅したことを示していると考えられる。
以上より、本発明の組込型ウイルスベクターは、宿主へ導入されたときに、低線量放射線の照射により治療効果を発揮できることが理解される。
【産業上の利用可能性】  上述する実施例で示されるように、本発明の組込型ウイルスベクターは、低線量放射線の照射によって宿主細胞における治療遺伝子発現を高度に誘導することを可能にする。したがって、本発明は、遺伝子治療に利用可能である。
【図１】
2006043354.tif 000092
【図２】
2006043354.tif 000093
【図３】
2006043354.tif 000094
【図４】
2006043354.tif 000095
【図５】
2006043354.tif 000096
【図６】
2006043354.tif 000097
【図７】
2006043354.tif 000098
【配列表】
2006043354000001.xml
【国際調査報告】
2006043354.tif 000191
2006043354.tif 000192
2006043354.tif 000193
2006043354.tif 000194
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