(57)【要約】  本発明は、従来のエキソサイトシス測定法と比較し、利便性、特異性、検出感度において格段に優れ、非侵襲的にインビボで、繰り返し測定することのできるエキソサイトシスの計測方法、及びそのためのへテロ動物を提供する。  本発明は、ｖ−ＳＮＡＲＥの１種と蛍光タンパク質との融合タンパク質ならびにＣｒｅリコンビナーゼを発現するヘテロ動物又はその系統を用いて、細胞内小胞によるエキソサイトシスを検出、定量する方法、その方法に使用するヘテロ動物又はその系統、及びそれを用いたスクリーニング方法に関する。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
発現プロモーター配列、５’末端ならびに３’末端にｌｏｘＰ配列を有するポリA配列を含む任意の遺伝子配列及びｖ−ＳＮＡＲＥの１種と蛍光タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子配列をこの順序で転写方向に連結させてなる遺伝子が導入された動物と、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現し得る同種の動物とをかけ合わせて得られる、ｖ−ＳＮＡＲＥの１種と蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現し得るヘテロ動物又はその系統。
【請求項２】
発現プロモーター配列がＣＡＧプロモーターである、請求項１に記載のヘテロ動物又はその系統。
【請求項３】
Ｃｒｅ遺伝子の発現が発現調節可能なプロモーターによって制御される、請求項１に記載のヘテロ動物又はその系統。
【請求項４】
Ｃｒｅ遺伝子の発現がＣＡＧプロモーターによって制御される、請求項１に記載のヘテロ動物又はその系統。
【請求項５】
ヘテロ動物が哺乳類動物である、請求項１に記載のヘテロ動物又はその系統。
【請求項６】
哺乳類動物がげっ歯目動物である、請求項５に記載のヘテロ動物又はその系統。
【請求項７】
げっ歯目動物がマウスである、請求項６に記載のヘテロ動物又はその系統。
【請求項８】
ヘテロ動物がコンディショナルターゲッティング法により製造されたものである、請求項１に記載のヘテロ動物又はその系統。
【請求項９】
ｖ−ＳＮＡＲＥの１種がＶＡＭＰ−２である、請求項１に記載のヘテロ動物又はその系統。
【請求項１０】
蛍光強度がｐＨ依存性の蛍光タンパク質である、請求項１に記載のヘテロ動物又はその系統。
【請求項１１】
蛍光タンパク質がスーパーエクリプティクフルオリン（superecliptic pHluorin）である、請求項１０に記載のヘテロ動物又はその系統。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載のヘテロ動物またはその系統に蛍光を照射して、細胞内小胞によるエキソサイトシスを検出又は定量する方法。
【請求項１３】
器官特異的な細胞内小胞によるエキソサイトシスを検出又は定量する方法である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
物理的刺激、化学的刺激又は被検物質を与えたときの細胞内小胞によるエキソサイトシスを検出又は定量する、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子改変動物を用いた生体の細胞における系統的なエキソサイトシスを計測するための方法に関する。より詳細には、本発明は、ｖ−ＳＮＡＲＥの１種と蛍光タンパク質との融合タンパク質ならびにＣｒｅリコンビナーゼを発現するヘテロ動物、及び該ヘテロ動物を用いてエキソサイトシスを検出、定量する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物の細胞内では、多くの化学物質が生産、代謝されるなど、複雑な化学反応が多種多様に行われている。細胞は、必要な化学物質を細胞外から取り込んで細胞内オルガネラに輸送したり、生成された物質や不要になった物質を輸送して細胞外へ放出したりする機能を有している。その様な輸送システムの主なものとして、生体膜による包摂と開放によって物質の取込や放出を行う、エンドサイトシスならびにエキソサイトシスと呼ばれる膜能動輸送を挙げることができる。細胞の膜能動輸送において、細胞外への輸送をエキソサイトシス、細胞内への輸送をエンドサイトシスといい、生体内のあらゆる臓器や組織において認められる輸送システムである。【０００３】
細胞内外からの化学的シグナルに応じて細胞内で誘導される物質は、細胞内のゴルジ体において分泌顆粒様の膜（小胞膜）で包摂される。小胞膜に包摂された物質は、小胞膜の形質膜への輸送、小胞膜と形質膜との接着、融合、開口という過程を経て、細胞外へ放出される。例えば、小胞体で産生された分泌タンパク質などは、ゴルジ体を経由して細胞膜に輸送され、細胞外へエキソサイトシスされる。【０００４】
エキソサイトシスは主にタンパク質などの高分子化合物の細胞外への輸送を行っているが、低分子化合物の輸送を行うこともある。例えば、中枢神経系や筋肉におけるシナプス伝達は、エキソサイトシスによる神経伝達物質の放出を介して行われる。神経細胞においては、神経細胞終末に神経伝達物質を含んだ小胞が蓄えられており、活動電位が伝わることが引き金になって小胞が形質膜と融合し、神経伝達物質がエキソサイトシスされる。放出された神経伝達物質は、シナプスを受けている神経細胞の受容体に結合し、情報を下流の神経細胞に伝える。エキソサイトシスされた小胞膜はエンドサイトシスにより回収され、神経伝達物質が補充、再利用される。この様に、神経細胞終末においては、エキソサイトシスやエンドサイトシスの制御メカニズムによるシグナル伝達の制御が行われている。【０００５】
また、多くのホルモンの分泌は、内分泌細胞のエキソサイトシスにより行われる。糖代謝を制御しているホルモンであるインシュリンは、膵臓ランゲルハンス島のβ細胞で合成され、細胞内小胞に濃縮されている。血糖値の上昇などの分泌刺激が加わることにより、小胞膜が形質膜に融合し、インシュリンがエキソサイトシスされる。このような血糖値の制御も、基本的にはエキソサイトシスによって行われているということもできる。【０００６】
さらに、Ｂリンパ球からの抗体分泌やマスト細胞からのヒスタミン分泌も、エキソサイトシスによって行われている。アレルギー反応においてヒスタミンを分泌するマスト細胞は、ヒスタミンを含んだ細胞内顆粒を多数含んでいる。アレルギー抗原などの分泌刺激に応答して、これらの細胞内顆粒と形質膜が融合し、顆粒内部のヒスタミンがエキソサイトシスされる。このマスト細胞におけるヒスタミンの放出は顕微鏡により観察できることから、観察可能なエキソサイトシスの例として古くから知られている。【０００７】
このように、多くの薬物や環境要因が、エキソサイトシスと関連して組織や臓器の機能を制御していると考えられるが、細胞のエキソサイトシスを直接計測できる優れた方法がなかったため、エキソサイトシス機能の詳細およびその制御手段を研究するのは、きわめて困難であった。【０００８】
エキソサイトシスにおける小胞膜と形質膜の融合は、多くの分子の関わる極めて複雑な反応によって制御されている。その詳細は未だ十分に解明されていないが、今日ではその機構についてＳＮＡＲＥ仮説が有力な説になっている。１９８７年にロースマン（Rothman）らは、膜融合に必須となるＮＳＦ（N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein）ならびにこのＮＳＦがアダプターとして働く細胞質因子ＳＮＡＰ（soluble NSF attachment protein）を発見し、このＳＮＡＰが結合する膜タンパク質因子をＳＮＡＲＥ（SNAP receptor）と呼ぶことを提唱した。【０００９】
このＳＮＡＲＥ仮説は、シナプトブレビン／ＶＡＭＰ（synaptobrevin/VAMP）などの小胞膜１回貫通型構造を有するタンパク質群ｖ−ＳＮＡＲＥと、形質膜に存在するシンタキシン（syntaxin）やＳＮＡＰ−２５などのタンパク質群ｔ−ＳＮＡＲＥとが複合体を形成することが、エキソサイトシスの基盤となるメカニズムであるとするものである（Sollner T., et al., (1993) Nature, 362:318-324）。現在までのところ、酵母で２４種類、哺乳動物で３５種類のＳＮＡＲＥが見出されており、これらのほとんどは、分子の大部分が細胞質側に露出したＣ末端アンカー型の膜貫通タンパク質であり、ＳＮＡＲＥモチーフと呼ばれるコイルドコイル構造を形成する部位を膜貫通領域に隣接する部位に有している。【００１０】
ＶＡＭＰ−２はｖ−ＳＮＡＲＥの代表的な分子であり、その細胞質側（小胞膜の外側）の構造がＶＡＭＰ−２の主要な機能ドメインである。小胞膜の内側にも数個のアミノ酸残基が存在しているが、これらのアミノ酸構造は機能をもたないと考えられている。【００１１】
ＶＡＭＰ−２の構造を応用してエキソサイトシスを計測する試みが報告されている（Miesenbock G, et al., (1998) Nature 394:192-195、Sankaranarayanan S, et al., (2000) Biophysical Journal 79:2199-2208）。これは、ＶＡＭＰ−２と蛍光タンパク質との融合タンパク質を利用する方法である。【００１２】
小胞膜の外側のｐＨは約７．４の中性であるのに対し、細胞内小胞の内腔のｐＨは約５．６の酸性になっていることが知られている。これは、細胞内小胞の膜に存在しているプロトンポンブの働きによるものである。一方、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）およびその改変体は、生体分子のマーカーとしてさまざまな研究目的に応用されているが、その蛍光強度はｐＨ依存性であることが知られている。例えば、代表的なＧＦＰ改変体のＥＧＦＰの蛍光強度は、ｐＨが５．６から７．４に変化したとき３．５倍に増大する。また、ロースマン（Rothman）らのグループが作製したＧＦＰ改変体のスーパエクリプティクフルオリン（superecliptic pHluorin）は、ｐＨ５．６から７．４の変化に対し２０倍の蛍光強度の増加を引き起こす。【００１３】
ここで、シナプス小胞膜のタンパクであるＶＡＭＰ−２の小胞内腔ドメインとスーパエクリプティクフルオリン（superecliptic pHluorin）との融合タンパク質であるシナプトフルオリンを強制発現させることにより、該融合タンパク質を取り巻く環境のｐＨ変化、すなわち小胞膜の包摂と開放の有無をモニターすることができる。この方法は、小胞が細胞内にあるすなわち小胞膜が包摂状態にあるときはシナプトフルオリンの蛍光は殆ど観察されず、形質膜と融合して開放（エキソサイトシス）されると蛍光が観察され、エンドサイトシスにより小胞が再び包摂状態となり、小胞体内部のｐＨが元に戻ると蛍光が観察されなくなる、という原理を利用したものである。サンカラナラヤナン（Sankaranarayanan）らは、この方法によりエクソ-エンドサイトシスをリアルタイムに計測できることを報告した（Sankaranarayanan S, et al., (2000) Biophysical Journal 79:2199-2208）。【００１４】
しかし、シナプトフルオリンの応用は、これまでのところ遺伝子導入が容易な培養神経細胞に限られており、生体の臓器や組織にこの手法を系統的に応用する試みはなされていなかった。 
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、きわめて容易にエキソサイトシスを計測することが可能な方法を構築するものであり、従来のエキソサイトシス測定法と比較し、利便性、特異性、検出感度において格段に優れ、非侵襲的にインビボで繰り返し測定することのできるエキソサイトシスの計測方法、そのためのへテロ動物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、エキソサイトシスの機構解明や、同機構を通じた薬物や生理活性物質の生体内での動態を解明するために、マウスのような実験動物個体による手法の開発を検討してきたところ、コンディショナルターゲッティング法を利用して、極めて有効な実験モデル動物を製造することができることを見出した。【００１７】
即ち本出願は、以下の発明を提供するものである。【００１８】
１）発現プロモーター配列、５’末端ならびに３’末端にｌｏｘＰ配列を有するポリＡ配列を含む任意の遺伝子配列及びｖ−ＳＮＡＲＥの１種と蛍光タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子配列をこの順序で転写方向に連結させてなる遺伝子が導入された動物と、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現し得る同種の動物とをかけ合わせて得られる、ｖ−ＳＮＡＲＥの１種と蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現し得るヘテロ動物又はその系統。【００１９】
２）発現プロモーター配列がＣＡＧプロモーターである、１）に記載のヘテロ動物又はその系統。【００２０】
３）Ｃｒｅ遺伝子の発現が発現調節可能なプロモーターによって制御される、１）に記載のヘテロ動物又はその系統。【００２１】
４）Ｃｒｅ遺伝子の発現がＣＡＧプロモーターによって制御される、１）に記載のヘテロ動物。【００２２】
５）ヘテロ動物が哺乳類動物である、１）に記載のヘテロ動物又はその系統。【００２３】
６）哺乳類動物がげっ歯目動物である、５）に記載のヘテロ動物又はその系統。【００２４】
７）げっ歯目動物がマウスである、６）に記載のヘテロ動物又はその系統。【００２５】
８）ヘテロ動物がコンディショナルターゲッティング法により製造されたものである、１）に記載のヘテロ動物又はその系統。【００２６】
９）ｖ−ＳＮＡＲＥの１種がＶＡＭＰ−２である、１）に記載のヘテロ動物又はその系統。【００２７】
１０）蛍光強度がｐＨ依存性の蛍光タンパク質である、１）に記載のヘテロ動物又はその系統。【００２８】
１１）蛍光タンパク質がスーパーエクリプティクフルオリン（superecliptic pHluorin）である、１０に記載のヘテロ動物又はその系統。【００２９】
１２）１）〜１１）のいずれかに記載のヘテロ動物又はその系統を用いて、細胞内小胞によるエキソサイトシスを検出または定量する方法。【００３０】
１３）器官特異的な細胞内小胞によるエキソサイトシスを検出又は定量する方法である、１２）に記載の方法。【００３１】
１４）物理的刺激、化学的刺激又は被検物質を与えたときの細胞内小胞によるエキソサイトシスを検出又は定量する、１３）に記載の方法。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の方法は、従来のエキソサイトシス測定法と比較し、利便性、特異性、検出感度において格段に優れている。また、光を当てるだけで測定できるので、非侵襲的であり、生きた動物において、繰り返し測定することのできる利点がある。また、部位特異的、時期特異的または薬剤誘導特異的にＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子を発現させることにより、部位特異的、時期特異的あるいは薬剤誘導特異的に融合タンパク質を発現させることができる。従って、本発明は今後多くの研究開発領域において継続的に利用されることが予想され、基礎研究のみならず、応用研究の分野において極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、本発明の計測手法の原理を模式的に示したものである。
【図２】図２は、本発明のヘテロマウスの作製方法、及びそれに必要とされる導入遺伝子の構造を模式的に示したものである。
【図３】図３は、本発明のヘテロマウスの脳のスライスから得られた海馬領域における蛍光タンパク質の発現を示す図面に代わる写真である。
【図４】図４は、本発明のヘテロマウスの嗅球と副嗅球における蛍光タンパク質の発現を示す図面に代わる写真である。
【図５】図５は、本発明のヘテロマウスの脳のスライスから得られたマスト細胞における蛍光タンパク質の発現、及び各種の刺激による蛍光タンパク質の蛍光強度の変化を示す図面に代わる写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明において、エキソサイトシスによりｖ−ＳＮＡＲＥの１種と蛍光タンパク質との融合タンパク質が蛍光を発する仕組みを模式的にして図１に示す。２重線で囲まれているのが細胞膜を示す。細胞内に存在する顆粒小胞を丸い二重線で示す。顆粒小胞の膜部分に貫通して示されている楕円形のものはｖ−ＳＮＡＲＥの一種であるＶＡＭＰ−２を示し、その先の丸印は蛍光タンパク質の一種であるフルオリン（ｐＨｌｕｏｒｉｎ）を示す。図１の左下の丸は顆粒小胞が生成して輸送を開始したところを示している。この顆粒小胞内のｐＨは約５．６の酸性であり、融合タンパク質はほとんど蛍光を発していない。そして、顆粒小胞に物質が封入され移動している様子を示したのが、その上の丸印である。やがて、顆粒小胞は細胞膜に達し、融合し、開口する。この状態を示したのが、図１の上側の丸印が開口しているものである。このとき、顆粒小胞が開口し、外界と交わり、そのｐＨは外界と同じ約７．４になる。ｐＨの上昇に伴って、融合タンパク質の蛍光強度が増し、ここで緑色に明るい蛍光を観察することができることになる。物質を細胞外に放出した顆粒小胞（図１の右側）は、開口部を閉じて細胞内に移行し、プロトンポンプの作用により、再びｐＨが約５．６の酸性になる。これに伴って融合タンパク質の蛍光強度が低下し、再び蛍光を観察できない状態となる。【００３５】
以下に、本発明におけるヘテロ動物の作製とその使用方法の概要を、マウスを例として具体的に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。【００３６】
ヘテロマウスの作製に使用した組換え遺伝子の概要を図２に示す。この組換え遺伝子は、ニワトリβ−アクチンのプロモーター、ＣＭＶ−ＩＥエンハンサー及びウサギのβ−グロビン−ポリＡ付加シグナルの組み合わせからなる部位非特異的なＣＡＧプロモーター配列の下流に、５’末端と３’末端にｌｏｘＰ配列を連結したＣＡＴ遺伝子と（クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ）とポリＡからなる配列、さらにその下流にｖ−ＳＮＡＲＥの１種と蛍光タンパク質との融合タンパク質の一種であるシナプトフルオリンをコードする塩基配列が連結されたものである（図２の上段参照）。ここで使用したシナプトフルオリンをコードする塩基配列は、ロースマン（Rothman）らが報告したものであり、その塩基配列を配列表の配列番号１に示す。この塩基配列は、全部で１１１３ｂｐからなるものであるが、その１３〜３６０番の部分がＶＡＭＰ−２をコードする配列であり、３６１〜３８７番目の部分はペプチドリンカー配列であり、３８８〜１１０７番目の部分が蛍光タンパク質の一種であるスーパーエクリプティクフルオリン（superecliptic pHluorin）をコードしている領域である。【００３７】
この組換え遺伝子が組み込まれたトランスジェニックマウス（以下、Ｔｇ−ｌｏｘＰと言う）を、Bristerら（Brister R. L., Cell, Vol.27, pp.223-231, 1981）の方法に従って作製した。さらに、このＴｇ−ｌｏｘＰと、ＣＡＧプロモーターの制御下にあるＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子を有するトランスジェニックマウス（図２中のＸ−Ｃｒｅトランスジェニックマウス）とかけ合わせてヘテロマウスを作製した。Ｔｇ−ｌｏｘＰと野生型マウスとを掛け合わせて得られたトランスジェニックマウスの受精卵は、ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７０８として２００４年３月２日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託され、これは、平成１７年３月１８日付けで国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０２９８を付与されている。本発明におけるシナプトフルオリンを発現するヘテロマウスは、この寄託された受精卵から発生するマウスとＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子を有するトランスジェニックマウスとを掛け合わせることで、作製することができる。【００３８】
このヘテロマウスでは、Ｃｒｅリコンビナーゼが発現され、当該Ｃｒｅリコンビナーゼに認識されたｌｏｘＰ配列が切り取られることにより（図２の下段参照）、その下流に存在するシナプトフルオリンが発現される。  
このヘテロマウスの一つにおいて融合タンパク質が発現しているかどうかを蛍光顕微鏡（オリンパスBX51）で観察した。その結果、脳においては、記憶形成の場の海馬の苔状線維終末に強く発現していることが認められた。この結果を図３に図面に代わる写真で示す。図３の左側上段は、スライスした脳全体であり、その下段は海馬領域を拡大したものであり、右側上段は、さらにその一部を拡大したものである。図３の右下段は、その一部をさらに拡大したものである。海馬周辺に極めて鮮やかな緑色蛍光を確認することができ、ヘテロマウスによる発現が確認された。【００３９】
さらに、脳においてもっとも強いシナプトフルオリンの発現が認められたのは、嗅球および副嗅球の糸球体である。この結果を図４に図面に代わる写真で示す。嗅球は、においの情報処理の研究対象としての有用性が示唆される器官であり、副嗅球は、フェロモン感覚の情報処理の研究対象としての有用性が示唆される器官である。図４の左側は嗅球のものであり、中側はその拡大写真であり、その下段は、同じ部位を免疫染色した結果を示している。図４の右側は副嗅球のものであり、その下段は同じ箇所を免疫染色したものである。【００４０】
マスト細胞にもＶＡＭＰ−２が発現しており、ヒスタミンなどのアレルギー誘発物質を含んだ顆粒のエキソサイトシスを担っている。そこで、前記で作製したヘテロマウスから採取したマスト細胞を観察した。その結果を図５に図面に代わる写真で示す。図５の上段の左側は採取されたマスト細胞を示し、その右側は当該マスト細胞を蛍光顕微鏡で観察したものである。この結果、マスト細胞にもシナプトフルオリンの発現が認められた。エキソサイトシスを促進する薬物である物質４８／８０により蛍光強度の上昇が認められた。また、ヒスタミン含有顆粒の内腔をアルカリ化するアンモニウムイオンにより、蛍光強度の上昇が認められた。その結果のチャートを図５の下段に示す。このチャートの縦軸方向は蛍光強度を示し、横軸は時間（秒）を示す。時間は、その右に示されるバーが１００秒を示している。上向きの２つの矢印は左側が、５０μｇ／ｍｌの４８／８０を添加した時点を示しており、右側が５０ｍｍｏｌのアンモニウムイオンを添加した時点を示している。【００４１】
ＶＡＭＰ−２は、次の表１に示されるように脳以外にも全身の臓器に広く分布し、重要な機能を担っている。
【表１】
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表１中のアジポサイト（adipocyte）は脂肪細胞の１種であり、ブドウ糖の取り込みを行っている。よって、この細胞のエンドサイトシスやエキソサイトシスを解明することは、肥満や糖尿病に関連する疾患の治療や予防に有益である。また、インシュリン刺激によって、グルコーストランスポーターの脂肪細胞内部あるいは骨格筋細胞内部から細胞表面への輸送が誘導され、その結果該細胞へのブドウ糖の取り込みが促進され、血液中のブドウ糖濃度が低下する。さらに、すい臓ランゲルハンス島のベータ細胞においては、インシュリンのエキソサイトシスをＶＡＭＰ−２が制御している。従って、本発明のヘテロ動物は、これらの臓器機能の基礎的研究のみならず、糖尿病の病態の解明および治療法の開発、アレルギーなどの病態の解明、薬物などの治療法の開発にも有用である。【００４２】
また、内皮細胞においては、ＶＡＭＰ−２の関与するエクソ−エンドサイトシスがトランスサイトシスによる物質輸送を担っていることが報告されている。したがって、脳血管関門を通過しないような高分子の薬物などを効率よく脳内投与する技術や、がん細胞に選択的に抗がん剤を取り込ませる技術などの研究・開発を、本発明のヘテロ動物を使用することにより急速に推し進めることができる。【００４３】
本発明における動物は、ヒト以外の動物、好ましくはヒト以外の遺伝子改変に使用できる哺乳動物である。本発明に利用可能な動物としては、マウス、ラットなどげっ歯目動物や、ウサギ、ウシなどを挙げることができるが、多数の遺伝子改変技術が確立されているマウスの利用が好ましい。本発明で利用可能なマウスの系統としては、遺伝子改変に使用できるものであれば特に制限はなく、市販され入手可能となっている系統でもよい。また、本発明において使用される発現調節が可能なプロモーターの制御下にあるＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子が導入されたマウスは、特別なプロモーターを用いて新たに作製することができるが、既にかかるＣｒｅ遺伝子が導入されている市販トランスジェニックマウスを使用することも可能である。【００４４】
本発明で利用されるｖ−ＳＮＡＲＥとしては、小胞膜１回貫通型構造を有するＳＮＡＲＥタンパク質であれば特に制限はないが、生体内で広く発現しているＶＡＭＰ−２が好ましい。また、本発明で利用される蛍光タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質などの各種の蛍光タンパク質を挙げることができるが、蛍光強度のｐＨ依存性が高い蛍光タンパク質が好ましく、特にＥＧＦＰやスーパーエクリプティクフルオリン（superecliptic pHluorin）が好ましい。なお、本発明で利用されるｖ−ＳＮＡＲＥの１種と蛍光タンパク質との融合タンパク質の好適な例としては、ＶＡＭＰ−２とスーパーエクリプティクフルオリン（superecliptic pHluorin）との融合タンパク質であるシナプトフルオリンを挙げることができ、これをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１に示しておく。【００４５】
本発明におけるｖ−ＳＮＡＲＥタンパク質と蛍光タンパク質との融合タンパク質の製造は、従来の融合タンパク質の製造方法を準用して行うことができる。ｖ−ＳＮＡＲＥタンパク質は、そのＣ末端側が小胞の内側になるような構造であるから、蛍光タンパク質はそのＣ末端側に融合するのが好ましい。【００４６】
本発明で利用されるｌｏｘＰ配列で挟まれた切り取り可能な遺伝子とは、５’末端ならびに３’末端にそれぞれｌｏｘＰ配列を有する任意の遺伝子をいう。バクテリオファージ由来のＣｒｅ（Cyclization recombination）リコンビナーゼとｌｏｘＰ配列とを用いた遺伝子工学的手法は、１９９３年にフアらにより報告されている（Gu Hua, et al., (1993) Cell, 73:1155-1164）。Ｐ１バクテリオファージの分子量３８ｋＤａのＣｒｅＤＮＡリコンビナーゼは、２つのｌｏｘＰ配列に挟まれた領域を環状ＤＮＡとして除去し、両ｌｏｘＰ配列の外側にある核酸配列を１つのｌｏｘＰ配列を挟んで連結する機能を有している。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ひとつの核酸分子上で１００ｋｂ以上離れた２つのｌｏｘＰ配列や、異なる核酸分子上に存在するｌｏｘＰ配列も認識して、上記の連結反応を進行させることも報告されている。本発明におけるコンディショナルターゲッティング法とは、上記のＣｒｅ−ｌｏｘＰ系を用いた遺伝子欠損方法であるジーンターゲッティング法を意味し、この方法で作製された遺伝子欠損マウスは、一般にコンディショナルノックアウトマウスと呼ばれている。【００４７】
本発明で利用される５’末端ならびに３’末端にそれぞれｌｏｘＰ配列を有する任意の遺伝子としては、トランスジェニック動物の製造や選別を容易にするために、ＣＡＴやＮｅｏなどの各種の薬剤耐性遺伝子を用いるのが好ましい。【００４８】
また、ｌｏｘＰで挟まれた領域及び融合タンパク質をコードする遺伝子が導入するゲノムの位置には特に制限はないが、導入された遺伝子が発現可能な位置であって、かつ発現したＣｒｅリコンビナーゼがｌｏｘＰ配列を認識できる位置であることが好ましい。【００４９】
本発明のヘテロ動物の製造方法としては、コンディショナルターゲッティング法により行われる。例えば、まず、トランスジェニック法により、シナプトフルオリン遺伝子を組み込んだｌｏｘＰターゲッティング動物を作製し、ついで、このマウスとＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子を発現する同種の動物と交配して、本発明のへテロ動物を製造することができる。【００５０】
本発明におけるｌｏｘＰ配列で挟まれた任意の遺伝子の発現を制御するプロモーターとしては、各種の発現用のプロモーターを使用することができるが、本発明において使用される融合タンパク質に応じて、当該タンパク質の発現が容易となるプロモーターを選定することが好ましい。また、このプロモーターの下流に位置する遺伝子にコードされる融合タンパク質の最終的な発現は、Ｃｒｅ遺伝子の発現を制御するプロモーターの活性によっても調節可能であるので、ｌｏｘＰ配列で挟まれた任意の遺伝子の発現を制御するプロモーターには、強力な発現誘導活性を有するプロモーターの使用が好ましい。その様な好ましいプロモーターとしては、ＣＡＧプロモーターなどを挙げることができる。【００５１】
また、本発明におけるＣｒｅ遺伝子の上流側のプロモーターとしては、ＣＡＧプロモーターであってもよいが、部位特異的、時期特異的又は条件特異的な各種のプロモーターを使用することができる。発現のコントロールが可能なプロモーターとして、部位特異的、時期特異的、又は薬剤誘導特異的なプロモーターを使用することにより、器官特異的、組織特異的、時期特異的、又は薬剤誘導特異的にシナプトフルオリンを発現するようなマウスを作製することができる。【００５２】
また、本発明における、ｖ−ＳＮＡＲＥの１種と蛍光タンパク質との融合タンパク質ならびにＣｒｅリコンビナーゼを発現し得るヘテロ動物に、物理的刺激若しくは化学的刺激を与えて、又は被検物質を投与して、当該ヘテロ動物の細胞内小胞によるエキソサイトシスを検出、定量することからなる、刺激又は被検物質の生理活性を検出又は定量する方法は、各種の薬剤のスクリーニングに適用することができる。物理的刺激としては電気刺激や傷害などを、化学的刺激としては毒物や生理活性物質などを、それぞれ挙げることができる。【００５３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００５４】
ヘテロマウスの製造
ＣＡＴ（クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ）遺伝子の３’末端側にポリＡ（ｐＡ）配列を連結し、さらにその５’末端と３’末端の両端にｌｏｘＰ配列を連結したＤＮＡを調製した。得られたＤＮＡの上流側にＣＡＧプロモーターを連結し、下流側に配列番号１に示されるシナプトフルリオンをコードする塩基配列とポリＡ（ｐＡ）配列を連結して、Ｔｇ−ｌｏｘＰ作製用の導入遺伝子を構築した（図２参照）。この遺伝子を有するトランスジェニックマウスを、トランスジェニックマウスの作製ガイダンス（Brister R. L., Cell, Vol.27, pp.223-231, 1981）に従って作製した。生まれた子孫を選別してＴｇ−ｌｏｘＰを得た。Ｔｇ−ｌｏｘＰと野生型マウスとを掛け合わせて得られたトランスジェニックマウスの受精卵を、ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７０８として２００４年３月２日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託し、これは平成１７年３月１８日付で国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０２９８を付与されている。【００５５】
ＣＡＧプロモーターの制御下にあるＣｒｅ遺伝子を導入したトランスジェニックマウスとＴｇ−ｌｏｘＰトランスジェニックマウスを交配させて、シナプトフルオリン遺伝子が発現しているマウスを選別して、本発明のヘテロマウスを得た。
【実施例２】
【００５６】
トランスジェニックマウスの脳スライスにおけるシナプトフルオリンの発現
実施例１で得られたヘテロマウスをエーテル麻酔後失血死させ、すみやかに脳を摘出した。脳を、９５％Ｏ２、５％ＣＯ２混合ガスで飽和した重炭酸緩衝塩液（１２７ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４、１６ｍＭグルコース、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で１分間氷冷した。脳を左右の半球に分離し、脳幹部摘出の後、海馬を摘出した。摘出した海馬を重炭酸緩衝塩液中で１分間氷冷の後、アガロースゲルに包埋し、マイクロスライサーに固定した後、冷却重炭酸緩衝塩液中で２００−４００μｍのスライスを作製した。海馬を摘出した残りの脳も同様にアガロースゲルに包埋し、２００−４００μｍの厚みで嗅球および副嗅球のスライスを作製した。作製したスライスは、３３度に保った９５％Ｏ２、５％ＣＯ２混合ガスで飽和した重炭酸緩衝塩液中で、１−４時間保存した。【００５７】
スライスをスライドグラスにおき、カバーグラスをかけた後、蛍光顕微鏡（オリンパスBX51）で観察した。観察には、ＮＩＢＡ蛍光フィルターユニット（オリンパス）を用い、ポラロイドＤＭＣ  ２で画像をデジタル化し、コンピュータ（デルDimension）で記録した。【００５８】
免疫組織化学的観察は以下の様にして行なった。エーテル麻酔下のトランスジェニックマウスに、氷冷した４％のパラフォルムアルデヒドと０．１％のグルタルアルデヒドを含有する０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ、  ｐＨ７．２）を経心臓的に潅流した後、脳を摘出した。脳を、４％のパラフォルムアルデヒドを含有する０．１Ｍ  ＰＢＳ中で、さらに一晩後固定した。ついで、３０％スクロースを含有する０．１Ｍ  ＰＢＳで置換し、クライオスタットを用いて５０μｍの浮遊切片を作製し、５％の正常ヤギ血清を含有するＰＢＳ中で３０分間室温に置いた。ついで、切片を抗ＥＧＦＰ抗体（１：５００）と４℃で一晩反応させた。数回の洗浄の後、切片をビオチン化抗ウサギＩｇＧ抗体（１：２００、 Vector Laboratories社）と1時間反応させ、ベクスタインＡＢＣ（Vecstain ABC）キット（Vector Laboratories社）と反応させた。ペルオキシダーゼ存在部位は、５０ｍＭトリス―塩酸緩衝液（ｐＨ  ７．５）中で、３，３’−ジアミノベンジジン−テトラハイドロクロライド（3、3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride）（０．０１％）と０．００２％過酸化水素を１５分間反応させることにより可視化した。観察には、ライカ社の顕微鏡（DMRXE DC Viewer）を用い、ＣＣＤカメラで画像を記録した。【００５９】
海馬における結果を図３に示し、嗅球及び副嗅球における結果を図４に示す。
【実施例３】
【００６０】
マスト細胞調整法およびエキソサイトシスの計測
実施例２において脳を摘出したマウスの腹腔にタイロード液（１３４ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、１１ｍＭ  グルコース、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を２ｍｌ注入した。腹部を２分間マッサージした後、腹腔を開き、液をプラスチックスポイトで集めてプラスチック遠心管（１５ｍｌ）に採取した。さらに２ｍｌのタイロード液を再度腹腔内に入れ、同様の操作を繰り返した。室温で１５０×ｇで２分間遠心分離し、上清を取り除いて細胞を回収した。これを３回繰り返して、さらに細胞をタイロード液で洗浄した。最終的に細胞をタイロード液約０．５ｍｌに浮遊させ、氷水中で保存した。細胞浮遊液の１滴をカバーグラス上で３０分間静置し、マスト細胞をカバーグラスに付着させた。これをスライドグラスにのせ、蛍光顕微鏡で観察記録した。【００６１】
マスト細胞を付着させたカバーグラスを測定用チェンバー（容量２ｍｌ）に入れ、タイロード液を潅流した。顕微鏡測光装置（オリンパスOSP-1）でＢ励起フィルターユニットを用いて蛍光強度を測定した。照射時間１００ｍｓで１Ｈｚでタイムラプス測定し、コンピューター（NEC PC9801FA）に記録した。【００６２】
マスト細胞のエキソサイトシスを引き起こすために、マスト細胞活性化因子（物質４８／８０、シグマ−アルドリッチ）を５０ｍｇ／ｍｌの濃度で含むタイロード液を２００秒間潅流した。通常のタイロード液で洗浄の後、潅流を止め、塩化アンモニウム溶液（１Ｍ）を８０ｍｌ加え、細胞内顆粒を中性化した。結果を図５に示す。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明は、細胞のエキソサイトシスを、非侵襲的に、生きた動物において繰り返し測定することができ、また部位特異的、時期特異的または薬剤誘導特異的に極めて容易にエキソサイトシスを計測することを可能にしたものであり、しかも利便性、特異性、検出感度において格段に優れている計測手法を提供するものである。したがって、エキソサイトシスの制御機構を分子レベルで解析することができ、ホルモンなどの分泌の制御、薬物などの化学物質の代謝、タンパク質などの細胞間の輸送、神経の伝達機構などの生体の基本的な機能を分子レベルで計測することを可能とし、これらが関与している各種の疾患や異常の原因を究明することや、その対処方法の開発に極めて有用なものであり、産業上の有用なものである。
【配列表フリーテキスト】
【００６４】
配列番号１：       ＶＡＭＰ−２と蛍光タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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