(57)【要約】  甲虫ルシフェリン／ルシフェラーゼを利用した発光反応の半減期を延長させ、安定化した発光系を提供する。  ピロリン酸および／またはピロリン酸塩の存在下で、ルシフェリンと甲虫ルシフェラーゼを反応させ、発光半減期が５分以上である発光を生ぜしめることを特徴とする、ルシフェリン／ルシフェラーゼの発光方法。その利用法、発光試薬および発光試薬キットも提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピロリン酸および／またはピロリン酸塩の存在下で、ルシフェリンと甲虫ルシフェラーゼを反応させ、発光半減期が５分以上である発光を生ぜしめることを特徴とする、ルシフェリン／ルシフェラーゼの発光方法。
【請求項２】
ピロリン酸および／またはピロリン酸塩が0.01mM〜10mMの濃度で存在する、請求項１記載のルシフェリン／ルシフェラーゼの発光方法。
【請求項３】
さらに、アデノシン三リン酸およびマグネシウムイオンが存在する、請求項１記載のルシフェリン／ルシフェラーゼの発光方法。
【請求項４】
さらに、有機イオウ試薬が存在する、請求項１〜３のいずれかに記載のルシフェリン／ルシフェラーゼの発光方法。
【請求項５】
有機イオウ試薬が10mM以下の濃度で存在する、請求項４記載のルシフェリン／ルシフェラーゼの発光方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法を利用して、試料中の甲虫ルシフェラーゼ量を測定する方法。
【請求項７】
請求項１記載の方法を利用して、試料中のATP量を測定する方法。
【請求項８】
請求項１記載の方法を利用して、試料中のルシフェリン量を測定する方法。
【請求項９】
請求項１記載の方法で発光を生ぜしめるための発光試薬であって、ピロリン酸および／またはピロリン酸塩を含む前記発光試薬。
【請求項１０】
試料中の甲虫ルシフェラーゼ量を測定するためのルシフェラーゼアッセイ試薬として用いられる、請求項９記載の発光試薬。
【請求項１１】
試料中のATP量を測定するためのATPアッセイ試薬として用いられる、請求項９記載の発光試薬。
【請求項１２】
試料中のルシフェリン量を測定するためのルシフェリンアッセイ試薬として用いられる、請求項９記載の発光試薬。
【請求項１３】
請求項９記載の発光試薬を含む発光試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、甲虫ルシフェラーゼの発光反応を安定化させる方法、その利用法、および発光試薬に関する。本発明の発光試薬は、ルシフェラーゼ酵素をレポーターおよびシグナルとしたあらゆるルシフェラーゼアッセイ法、ならびにATPアッセイ法、さらにはルシフェリンアッセイ法に適用できる。
【背景技術】
【０００２】
従来、in vitro で甲虫ルシフェリン／ルシフェラーゼによる発光反応を行わせる際、その発光パターンはフラッシュ状に観察されるため、試薬注入の特別な機構を持つ装置を用いなければ発光反応を正確に測定することができなかった。【０００３】
これを改善すべく、ルシフェラーゼの検出方法（ルシフェラーゼアッセイ法）として補酵素Ａ（Coenzy,me A：CoA）及びジチオスレイトール（DTT）などのチオール試薬類を用いる方法により発光の半減期をおよそ５分間と延長し、かつ発光量を増大させ得る手法が発明された（特許文献１参照）。この方法により、ルシフェラーゼによる発光量の正確な測定が試薬の自動注入装置を持たないルミノメーターや液体シンチレーションカウンターによっても可能となり、培養細胞の中でレポーターとして発現されたルシフェラーゼを高感度で測定するレポーターアッセイ法に広く用いられるようになった。【０００４】
しかし、薬剤の開発に向けた多検体のサンプルに対するHigh-throughput スクリーニング(HTS)にレポーターアッセイを適用する場合、発光半減期が５分間では試薬を随時添加してその度ごとに測定をしなければならないため、更なる発光半減期の延長が求められていた。それに対応して、ルシフェリン／ルシフェラーゼ反応系にAMＰを共存させる方法（特許文献２参照）や炭酸ガスを溶存させる方法（特許文献３参照）が発明され、発光半減期を８時間まで延長させる系が報告されている。しかしながら、これらの何れの方法においても、反応溶液中に高価なCoAならびに5mM以上の高濃度のDTTなどチオール試薬を共存させる必要があった。これらチオール試薬類は構造上SH基を持つため、特に高濃度の水溶液中では劣化し易く、溶存酸素などにより酸化もしくは劣化したチオール試薬類は、ルシフェリン／ルシフェラーゼ反応の効率を著しく阻害することが知られている。【０００５】
これらCoAならびにDTTなどのチオール試薬を用いずに発光反応を改善する例として、ピロリン酸塩を反応系に加えることによる発光強度の増加が確認（文献４，５、特許文献６参照）されてはいるが、発光反応の安定化に対する効果は見られなかった。また、甲虫ルシフェリン／ルシフェラーゼ発光反応の主要な用途として認知されている、試料中のATP量を発光反応により測定するATPアッセイ法における発光反応に対しては、ピロリン酸塩を反応系に加えても発光半減期の延長に対する効果は認められなかった。【０００６】
塩濃度を高めて発光反応を阻害することにより発光半減期を延長させる発明は為されてはいる（特許文献7参照）が、ルシフェラーゼアッセイ法ならびにATPアッセイ法、さらにはルシフェリンアッセイ法の何れに対しても適用可能な発光半減期を延長させる方法は見いだされていない。【０００７】
【特許文献１】特許第３１７１５９５号公報
【特許文献２】US5,866,348
【特許文献３】US6,060,261
【非特許文献４】J.Biol.Chem. 233, 1528-1537 (1958)
【非特許文献５】Arch. Biochem.Biophys. 46, 399-416 (1953)
【特許文献６】特開平８−４７３９９号公報
【特許文献７】US6,503,723
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ルシフェリン／ルシフェラーゼの発光反応の半減期を延長させ、安定化した発光系を供給することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ルシフェリン／ルシフェラーゼの発光反応にピロリン酸あるいはピロリン酸塩を介在させることにより、発光半減期を延長させ、発光反応を安定化させることに成功し、本発明を完成させるに至った。【００１０】
本発明の要旨は以下の通りである。【００１１】
（１）  ピロリン酸および／またはピロリン酸塩の存在下で、ルシフェリンと甲虫ルシフェラーゼを反応させ、発光半減期が５分以上である発光を生ぜしめることを特徴とする、ルシフェリン／ルシフェラーゼの発光方法。【００１２】
（２）  ピロリン酸および／またはピロリン酸塩が0.01mM〜10mMの濃度で存在する、（１）記載のルシフェリン／ルシフェラーゼの発光方法。【００１３】
（３）  さらに、アデノシン三リン酸およびマグネシウムイオンが存在する、（１）記載のルシフェリン／ルシフェラーゼの発光方法。【００１４】
（４）  さらに、有機イオウ試薬が存在する、（１）〜（３）のいずれかに記載のルシフェリン／ルシフェラーゼの発光方法。【００１５】
（５）  有機イオウ試薬が10mM以下の濃度で存在する、（４）記載のルシフェリン／ルシフェラーゼの発光方法。【００１６】
（６）  （１）記載の方法を利用して、試料中の甲虫ルシフェラーゼ量を測定する方法。【００１７】
（７）  （１）記載の方法を利用して、試料中のATP量を測定する方法。【００１８】
（８）  （１）記載の方法を利用して、試料中のルシフェリン量を測定する方法。【００１９】
（９）  （１）記載の方法で発光を生ぜしめるための発光試薬であって、ピロリン酸および／またはピロリン酸塩を含む前記発光試薬。【００２０】
（１０）  試料中の甲虫ルシフェラーゼ量を測定するためのルシフェラーゼアッセイ試薬として用いられる、（９）記載の発光試薬。【００２１】
（１１）  試料中のATP量を測定するためのATPアッセイ試薬として用いられる、（９）記載の発光試薬。【００２２】
（１２）  試料中のルシフェリン量を測定するためのルシフェリンアッセイ試薬として用いられる、（９）記載の発光試薬。【００２３】
（１３）  （９）記載の発光試薬を含む発光試薬キット。【００２４】
本発明者らは、発光甲虫によるin vitroルシフェリン／ルシフェラーゼ発光反応のキネティクスや発光強度に影響を与えるピロリン酸の効果を明らかにし、ピロリン酸が産業用途に適した発光反応系の制御に向けて有望な因子となる可能性を確認した。【００２５】
既に産業用途で広く活用されているホタルルシフェラーゼによる発光反応では、ピロリン酸の使用により発光強度ならびに発光半減期を制御できることを明らかにした。また、ピロリン酸を適切な濃度で使用することにより、ルシフェラーゼアッセイ法のみならず、ATPアッセイ法においても、実用化に広く用いられてきたCoAやDTTなどのチオール試薬を用いることなく、発光強度が一定で、数時間レベルの発光半減期を持つ、High-through put スクリーニング（HTS）法で展開が可能な発光反応系の構築が可能となることを確認した。これは、初期発光反応を制御し、かつルシフェラーゼ酵素のターンオーバーを促進させるピロリン酸の２種類の作用によって、長時間にわたって発光反応を持続できる発光反応系が構築できたものと考えられる。しかしながら、本仮説の詳細な検証ならびに明確な作用メカニズムは未だ明らかとされていない。また、従来、CoAが存在する発光反応系では、DTTなどの有機イオウ試薬の存在が必要とされたが、ピロリン酸によって可能となった数時間レベルの発光半減期を持つ発光反応系において、有機イオウ試薬（実施例では、ジエチルジチオカルバミン酸ソーダを使用）が反応に及ぼす顕著な効果は確認されなかった。ピロリン酸を用いた発光反応系での有機イオウ試薬の役割についてもさらに詳細な検討が待たれる。【００２６】
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2004‐229197号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００２７】
本発明により、迅速性と高感度を特徴としていた従来のルシフェラーゼの発光測定法に代わり、持続性と安定性に優れた発光反応が可能となる。【００２８】
例えば、本発明により、ルシフェリン／ルシフェラーゼの発光反応の発光半減期を5分から６時間まで自在に制御することができる。【００２９】
ルシフェリン／ルシフェラーゼの発光反応系にピロリン酸および／またはピロリン酸塩を添加することにより、発光半減期を２倍以上に延長することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ルシフェラーゼ発光試薬における種々のピロリン酸カリウム濃度での、ルシフェリン／ルシフェラーゼ発光反応の発光強度の時間経過を示す。
【図２】ルシフェラーゼ発光試薬におけるピロリン酸カリウムの存在・不存在下でのルシフェリン／ルシフェラーゼ発光反応の発光強度の時間経過を示す。
【図３】ルシフェラーゼ発光試薬におけるピロリン酸カリウムおよびジエチルジチオカルバミン酸ソーダの存在・不存在下でのルシフェリン／ルシフェラーゼ発光反応の発光強度の時間経過を示す。
【図４】ATP発光試薬におけるピロリン酸カリウムおよびジエチルジチオカルバミン酸ソーダの存在・不存在下でのルシフェリン／ルシフェラーゼ発光反応の発光強度の時間経過を示す。
【図５】ルシフェラーゼ発光試薬におけるピロリン酸、ピロリン酸カリウムまたはピロリン酸ナトリウムの存在下・不在下でのルシフェリン／ルシフェラーゼ発光反応の発光強度の時間経過を示す。
【図６】ATP発光試薬におけるピロリン酸、ピロリン酸カリウムまたはピロリン酸ナトリウムの存在下・不在下でのルシフェリン／ルシフェラーゼ発光反応の発光強度の時間経過を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明で使用されるルシフェラーゼは、甲虫由来のホタル・ルシフェリン、即ち多複素式有機酸Ｄ−（−）−２−（６‘ヒドロキシ−２’−ベンゾチアゾリル）−△２−チアゾリン−４−カルボン酸（以降は特に記載のない限り「ルシフェリン」と表記する）を発光基質とし、これを酸化触媒して光子を発する酵素で、ホタル科を始め、コメツキ科、ホタルモドキ科、イリオモテボタル科など甲虫由来で発光反応に与る酵素全てを含む。この中には組換えDNA技術や変異技術などにより、酵素タンパク自体の安定性や発光特性などが人為的に改変された酵素も含まれる。【００３２】
ルシフェリン／ルシフェラーゼの発光反応系におけるルシフェラーゼの濃度は、ルシフェラーゼアッセイ法の場合、100 femto g/mL〜100μg/mLが適当であり、好ましくは1pg/mL〜10μg/mLである。またATPアッセイ法やルシフェリンアッセイ法の場合、0.1μg/mL〜100μg/mLが適当であり、好ましくは1 μg/mL〜20 μg/mLである。【００３３】
本発明で使用するルシフェリンは、上記の甲虫ルシフェリンであり、甲虫より直接抽出および精製されたものや、化学合成されたものを含む。さらには甲虫ルシフェリンの誘導体で、ある酵素の消化を受けた後に発光活性を持つ発光基質も含まれる。このような甲虫ルシフェリンの誘導体としては、4-メチル-D-ルシフェリン、D-ルシフェニル-L-メチオニン、６-O-ガラクトピラノシル-ルシフェリン、ＤＥＶＤ−ルシフェリン、ルシフェリン-6’メチルエステル、ルシフェリン6’-クロロエチルエステル、6’-デオキシルシフェリン、ルシフェリン6’ベンジルエステルなどを挙げることができる。ルシフェリンおよびその誘導体は塩の形態であってもよい。塩としては、カリウム塩、ナトリウム塩などを挙げることができる。【００３４】
ルシフェリン／ルシフェラーゼの発光反応系におけるルシフェリンの濃度は、0.001 mM〜100 mMが適当であり、好ましくは0.01 mM〜10 mMである。【００３５】
本発明で使用するピロリン酸および／またはピロリン酸塩は、水溶性のものが好ましく、溶液のピロリン酸を初め、ピロリン酸ナトリウム、ピロリン酸カリウム、ピロリン酸アンモニウム、ピロリン酸水素ナトリムなどを用いることができる。【００３６】
ピロリン酸および／またはピロリン酸塩の使用濃度は、0.0001 mMから100 mMが適当であり、好ましくは0.001 mMから10 mMである。【００３７】
本発明のルシフェリン／ルシフェラーゼの発光反応においては、さらに、有機イオウ試薬、アデノシン三リン酸、マグネシウムイオンを添加してもよい。また、緩衝成分を添加してもよい。【００３８】
本発明で用いる有機イオウ試薬は、一般的には還元剤としてルシフェラーゼ酵素を保護する作用があると考えられている。有機イオウ試薬としては、ジチオカルバミン酸塩類、キサントゲン酸塩類、チオりん酸塩、チアゾール類、さらにはチオール試薬などを挙げることができる。【００３９】
ジチオカルバミン酸塩類としては、ペンタメチレンジチオカルバミン酸ピペリジン、メチルペンタメチルジチオカルバミン酸ピペコリン、ジメチルジチオカルバミン酸亜鉛、ジエチルジチオカルバミン酸亜鉛、ジブチルジチオカルバミン酸亜鉛、エチルフェニルジチオカルバミン酸亜鉛、ジメチルジチオカルバミン酸ソーダ、ジエチルジチオカルバミン酸ソーダ、ジブチルジチオカルバミン酸ソーダ、ジメチルジチオカルバミン酸カリ、ジメチルジチオカルバミン酸銅、ジメチルジチョカルバミン酸鉄、エチルフェニルジチカルバミン酸鉛、ジエチルジチカルバミン酸セレン、ジエチルジチオカルバミン酸テルル、ジエチルジチオカルバミン酸アンモニウムなどを挙げることができるが、金属塩はこれに限定されることは無く目的に応じて周期律表に記載の金属塩であれば使用可能である。【００４０】
キサントゲン酸塩類としては、キサントゲン酸カリウム、ブチルキサントゲン酸亜鉛、イソプロピルキサントゲン酸ソーダなどを挙げることができるが、これに限定されることはなく、周期律表に記載の金属と塩が形成可能であれば使用可能である。【００４１】
チオりん酸塩としては、ピペリジンービスー（ｏ，ｏ−ジステアリルジチオフォスフェート）などを挙げることができる。【００４２】
チアゾール類としては２−メルカプトベンゾチアゾール、２−メルカプトベンゾチアゾール亜鉛塩、２−メルカプトベンゾチアゾールナトリウム塩、２−メルカプトベンゾチアゾールシクロヘキシルアミン塩、２−メルカプトベンゾチアゾール銅塩などを挙げることができるが、これに限定されることは無く、周期律表に記載の金属と塩あるいは錯体を形成可能なら使用可能である。【００４３】
本発明においては、CoAやDTTなどのチオール試薬類を用いない反応系でも、ピロリン酸及び／又はその塩の添加により、フラッシュ発光を抑えたグロー発光反応へ改良することが可能であるが、DTT、ジチオエリトルトール、βメルカプトエタノール、２−メルカプトプロパノール、３−メルカプトプロパノール、２，３−ジチオプロパノール、グルタチオン、CoAなどのチオール試薬類を使用してもよい。これらのチオール試薬類を添加する場合には、CoAの濃度は、500μＭ以下、好ましくは、300μＭ以下にすることができる。また、DTTの濃度は、50 mM以下、好ましくは、10 mM以下にすることができる。【００４４】
有機イオウ試薬は単独で使用することもできるが、混合して使用することも可能である。【００４５】
有機イオウ試薬の使用濃度は、0 mM〜50 mMが適当であり、好ましくは0.01 mM〜10 mMであるが、2 mM以下の濃度で使用することが可能である。場合によっては、有機イオウ試薬を添加しなくてもよい。【００４６】
アデノシン三リン酸は、ルシフェラーゼとの反応により、ルシフェリンからルシフェリル-AMP（アデニレート）を生成し、発光反応に寄与する。アデノシン三リン酸は塩の形態であってもよい。塩としては、２ナトリウム塩、２カリウム塩、マグネシウム塩などを挙げることができる。【００４７】
アデノシン三リン酸の使用濃度は、0.01ｐM〜50 mMが適当であり、好ましくは0.01 mM〜10 mMである。【００４８】
マグネシウムイオンは、発光反応の補因子として考えられている。マグネシウムイオンを含む化合物としては、塩化マグネシウム、炭酸水酸化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、リン酸水素マグネシムなどを挙げることができる。【００４９】
マグネシウムイオンの使用濃度は、0.001 mM〜100 mMが適当であり、好ましくは0.1 mM〜50 mMである。【００５０】
緩衝成分は、pHの安定化、発光反応の最適化の効果を奏する。緩衝成分としては、トリス−硫酸、Tricineなどを挙げることができる。緩衝成分の種類は、発光反応を利用する各種アッセイの種類に応じて決めるとよい。【００５１】
緩衝成分の使用濃度は、1 mM〜500 mMが適当であり、好ましくは5 mM〜100 mMである。【００５２】
発光反応の制御に寄与するのは、上記成分がメインであるが、その他、培養細胞の溶解に必要な界面活性剤やグリセリンなど、発光反応の利用法に応じてさまざまな組成を添加することができる。【００５３】
ルシフェリン／ルシフェラーゼの発光反応は、20℃〜25℃の温度で、pH5.0〜8.5の条件下で行うとよい。【００５４】
本発明のルシフェリン／ルシフェラーゼ発光反応において、発光半減期を５分以上、１０分以上、３０分以上、１時間以上または２時間以上(例えば6時間)に制御することができる。【００５５】
また、本発明のルシフェリン／ルシフェラーゼ発光反応において、ピロリン酸及び／又はピロリン酸塩を添加しない場合と比較して、発光半減期を２倍以上、４倍以上、１２倍以上、２４倍以上または４８倍以上（例えば144倍）に制御することができる。【００５６】
本発明の方法によるルシフェリン／ルシフェラーゼの発光反応は、甲虫ルシフェラーゼ量の測定（ルシフェラーゼアッセイ法）、ATP量の測定（ATPアッセイ法）、ルシフェリン量の測定（ルシフェリンアッセイ法）などに利用することができる。【００５７】
ルシフェラーゼアッセイ法は、レポータージーンにルシフェラーゼ遺伝子を用いてその発光活性を測定することにより、遺伝子の転写活性を調べる方法である。例えば、解析対象のプロモーター下流にルシフェラーゼ遺伝子を結合させたベクターを培養細胞にトランスフェクションし、培養を行う。細胞の増殖過程で、プロモーターの転写活性が強ければ細胞内に多くのルシフェラーゼ酵素が産生され、また、活性が弱ければルシフェラーゼ酵素の産生量が低下する。本発明の方法によるルシフェリン／ルシフェラーゼの発光反応により、ルシフェラーゼ酵素の量を高感度かつ簡便に定量することができる。ルシフェラーゼアッセイ法は、遺伝子発現の解析（プロモーター、エンハンサーの転写活性解析）、細胞中のmRNAの作用機序の解析、レセプターなど遺伝子調節機能を持つ蛋白質の構造と作用機序の解明、トランスジェニック植物における器官特異的な発現様式の解析などに利用することができる。【００５８】
ATPアッセイ法は、ATP量を測定する方法である。ATPとはAdenosine triphosphate（アデノシン三リン酸）の略称で、分子量507.2の高エネルギー物質であり、生物の種々の代謝活動に関与している。生物は食物から吸収した物質を用い、代謝経路を介してATP等の化合物を合成し、エネルギーを一時ATPという形で体内に貯蔵し、必要に応じてATPを分解し、エネルギーを得る。このATPを迅速、高感度に測定するために、ルシフェリン／ルシフェラーゼ反応を利用することができる。ルシフェリン／ルシフェラーゼ反応はATP量に依存する反応である。ルシフェリンとATPが反応し、アデニル酸ルシフェリンとなり、このアデニル酸ルシフェリンと酸素がルシフェラーゼ酵素の存在下で酸化的脱炭酸反応により分解され、この反応の過程において得られるエネルギーの一部が発光という反応として現れる。この発光を定量することでATPの定量を行う。【００５９】
【化１】
2006013837.tif 000002
【００６０】
本発明の方法によるルシフェリン／ルシフェラーゼの発光反応により、ATPの定量を高感度かつ簡便に行うことができる。このATPアッセイ法は、ATPaseなどの酵素活性の測定、生きている微生物の定量、生きている細胞の定量などに利用することができる。【００６１】
ルシフェリンアッセイ法は、ルシフェラーゼが触媒することによって発光反応を生じる発光基質ルシフェリン量を測定する方法である。甲虫由来のホタル・ルシフェリンは発光甲虫の発光器官にしか存在しない分子量280.3の化合物であり、その基本構造の周囲に位置する置換基に修飾を施した化合物は発光活性を持たないことが広く知られている。そこで、ルシフェリンの置換基にガラクトースを結合させた６-O-ガラクトピラノシル-ルシフェリンは、ルシフェラーゼ酵素や充分量のATPが存在しても発光反応は生じない。しかし、β−ガラクトシダーゼによる酵素反応が行われ６-O-ガラクトピラノシルが遊離することにより発光活性を持つＤ-ルシフェリンが生じる。このＤ-ルシフェリン量をルシフェリン／ルシフェラーゼの発光反応による発光量を測定すれば、Ｄ-ルシフェリン量の生成量すなわちβ-ガラクトシダーゼの酵素活性が測定できる。本アッセイ法はルシフェリン／ルシフェラーゼの発光反応を用いていることから、従来法の呈色反応に比べ高感度による酵素活性の測定が可能となる。この方法の適用例としては、ルシフェリン6’-クロロエチルエステル、6’-デオキシルシフェリン、ルシフェリン6’ベンジルエステル、からＤ-ルシフェリンを生成・定量するキナーゼ活性の測定、またＤＥＶＤ−ルシフェリンによるカスパーゼ活性の測定法などがある。【００６２】
本明細書において、「発光半減期」とは、発光量が最大発光量の１／２になるのに要する時間をいう。発光半減期は、経時発光量を測定することにより、求めることができる。ルシフェリン／ルシフェラーゼの発光反応の発光量は、公知の方法により測定することができる。例えば、市販のルミノメーターにより発光強度を測定する。【００６３】
発光量の測定は、所望の期間にわたり、所望の時間間隔で行えばよい。例えば、ルシフェラーゼアッセイ法においては、発光反応の開始２秒後から、１〜20秒間の積算発光の測定、または薬剤の開発に向けた多検体のサンプルに対するHigh-throughput スクリーニング（HTS）では、発光反応開始から８時間までの0.1秒から10秒間あたりのそれぞれの検体からの発光量が測定される。【００６４】
ATPアッセイ法においては、発光反応の開始２秒後から、１〜20秒間の積算発光の測定、または薬剤の開発に向けた多検体のサンプルに対するHigh-throughput スクリーニング(HTS)では、発光反応開始から５時間までの0.1秒から10秒間あたりのそれぞれの検体からの発光量が測定される。【００６５】
ルシフェリンアッセイ法においては、発光反応の開始２秒後から、１〜20秒間の積算発光の測定、または薬剤の開発に向けた多検体のサンプルに対するHigh-throughputスクリーニング(HTS)では、発光反応開始から５時間までの0.1秒から10秒間あたりのそれぞれの検体からの発光量が測定される。【００６６】
本発明は、本発明の方法で発光を生ぜしめるための発光試薬であって、ピロリン酸および／またはピロリン酸塩を含む前記発光試薬も提供する。本発明の発光試薬は、試料中の甲虫ルシフェラーゼ量を測定するためのルシフェラーゼアッセイ法、試料中のATP量を測定するためのATPアッセイ法、試料中のルシフェリン量を測定するためのルシフェリンアッセイ法などに使用することができる。本発明の発光試薬は、ピロリン酸および／またはピロリン酸塩の他、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、アデノシン三リン酸、有機イオウ試薬、マグネシウムイオン、緩衝成分、その他の成分（例えば、培養細胞の溶解に必要な界面活性剤、グリセリンなど）を含んでもよい。本発明の発光試薬に含まれるこれらの成分は上記の通りである。本発明の発光試薬は、各成分を溶解した水溶液状態であってもよいし、凍結乾燥した状態であってもよい。水溶液状態の発光試薬は凍結品として供給し、解凍後十分に室温に戻した後に使用するとよい。また、発光試薬を凍結乾燥する場合には、試薬成分の内、溶液中では比較的不安定な成分（ルシフェリン、ルシフェラーゼ、アデノシン三リン酸など）のみを凍結乾燥し（これを試薬Aとする）、ピロリン酸および／またはピロリン酸塩の他、有機イオウ試薬、マグネシウムイオン、緩衝成分、その他の成分（例えば、培養細胞の溶解に必要な界面活性剤、グリセリンなど）それぞれを使用時の溶液と同じ濃度となるように水に溶解した水溶液（これを試薬Bとする）とに分けて、凍結乾燥品（試薬Ａ）を冷凍保存、また水溶液（試薬Ｂ）を冷蔵または冷凍保存するとよい。この場合、試薬Ｂを十分に室温に戻した後、試薬Ａに加えて溶解し、溶液状態にしてから、使用するとよい。【００６７】
本発明の発光試薬における組成の例を以下の表にまとめる。【００６８】
【表１】
2006013837.tif 000003
【００６９】
以上の組成を持つ発光試薬をキット化する場合は、上記組成の溶液を凍結させた１液系の凍結品として供給するとよい。これは-70℃以下で保存し、解凍後十分に室温に戻した後に使用する。また上記成分の内、溶液中では比較的不安定な成分であるルシフェリン、アデノシン三リン酸などを凍結乾燥した試薬Ａと、使用直前にその他の成分から成る試薬Ｂを加え溶解させて使用する２液系の試薬キットとしても供給できる。この場合、凍結乾燥品の試薬Aは-20℃で、また試薬Ｂは冷蔵(４℃)または冷凍(-20℃)で保存される。【００７０】
【表２】
2006013837.tif 000004
【００７１】
以上の組成を持つ発光試薬をキット化する場合は、上記組成の溶液を凍結させた１液系の凍結品として供給するとよい。これは-70℃以下で保存し、解凍後十分に室温に戻した後に使用する。また上記成分の内、溶液中では比較的不安定な成分であるルシフェリン、ルシフェラーゼなどを凍結乾燥した試薬Ａと、使用直前にその他の成分から成る試薬Ｂを加え溶解させて使用する２液系の試薬キットとしても供給できる。この場合、凍結乾燥品の試薬Aは-20℃で、また試薬Ｂは冷蔵(４℃) または冷凍(-20℃)で保存される。【００７２】
【表３】
2006013837.tif 000005
【００７３】
以上の組成を持つ発光試薬をキット化する場合は、上記組成の溶液を凍結させた１液系の凍結品として供給するとよい。これは-70℃以下で保存し、解凍後十分に室温に戻した後に使用する。また上記成分の内、溶液中では比較的不安定な成分であるルシフェラーゼ、アデノシン三リン酸などを凍結乾燥した試薬Ａと、使用直前にその他の成分から成る試薬Ｂを加え溶解させて使用する２液系の試薬キットとしても供給できる。この場合、凍結乾燥品の試薬Aは-20℃で、また試薬Ｂは冷蔵(４℃) または冷凍(-20℃)で保存される。【００７４】
本発明は、本発明の発光試薬を含む発光試薬キットも提供する。本発明のキットは、本発明の発光試薬の他、取扱説明書、大まかな使用法を示した操作法のフローチャートなどを含むとよい。【００７５】
取扱説明書には、発光反応の概要や測定原理、製品の特徴、保存条件、試薬の調製法ならびに操作法、関連製品、トラブルシューティングなどが記載されているとよい。本発明のキットは、さらに、用途に応じて、標準品となるルシフェラーゼ酵素（ルシフェラーゼアッセイ法に用いる場合）、標準品となるATP溶液（ATPアッセイ法に用いる場合）、標準品となるルシフェリン（ルシフェリンアッセイ法に用いる場合）などを含んでもよい。【００７６】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００７７】
「ピッカジーン発光キット（東洋インキ製造株式会社製：製品番号PGL100）」に添付されている取り扱い説明書に記載されている組成に従い、20mMトリシン、1.07mM(MgCO3)4Mg(OH)2・5H2O、2.67mM硫酸マグネシウム、0.1mM EDTA、470μMルシフェリン、530μMアデノシン３リン酸(ATP)、pH7.8なる「ルシフェラーゼ発光試薬」を調製した。なお同処方に記載のチオール試薬である270μM CoAならびに33.3mM DTTは添加していない。次にこの「ルシフェラーゼ発光試薬」にピロリン酸カリウム（和光純薬工業株式会社製）ならびに有機イオウ試薬であるジエチルジチオカルバミン酸ソーダ（川口工業株式会社）を終濃度がそれぞれ50μM、2mMとなるように加えた「ルシフェラーゼ発光試薬(＋改良)」を用意した。【００７８】
「ピッカジーン発光キット（東洋インキ製造株式会社製：製品番号PGL100）」に含まれている「ルシフェラーゼ・スタンダード酵素(10μg/mL)」を「ピッカジーン培養細胞溶解剤LUC：製品番号PGC50（東洋インキ製造株式会社製）」で希釈して調製した100ng/mLのルシフェラーゼ酵素溶液を、ルミノメーター(Berthold社製 LB9506)用のキュベットに10μL採った。まず調製した上記の「ルシフェラーゼ発光試薬」100μLを添加し、即座にルミノメーターにセットして試薬添加直後から25秒間経過ごとの経時発光量(RLU／秒)を200秒後まで測定した。続いて「ルシフェラーゼ発光試薬(＋改良)」についても同様の発光量を測定しそれぞれの測定値を得た（表４）。【００７９】
【表４】
2006013837.tif 000006
【００８０】
CoAとDTTのチオール試薬を使用しない「ルシフェラーゼ発光試薬」による発光反応では、試薬添加直後から急速に発光が減衰するフラッシュ発光が観察され、半減期は約2分半であったが、ピロリン酸カリウムと有機イオウ試薬を適用した「ルシフェラーゼ発光試薬(＋改良)」による発光反応では、試薬添加直後の僅かな減衰の後に200秒間にわたってほぼ一定値を持続するグロー発光が確認され、半減期は5分間以上となった。【００８１】
さらに、上記の「ルシフェラーゼ発光試薬」において、ジエチルジチオカルバミン酸ソーダを終濃度が2 mMとなるように、またピロリン酸カリウム(PPiK)を終濃度がそれぞれ10 μM、25 μM、50 μM、75 μM、100 μMとなるように加え、上記の操作を繰り返した。結果を図１に示す。【００８２】
ピロリン酸カリウムの添加濃度が低い10μMでは初期発光量が高いものの発光は速やかに減衰したが、発光の半減期は5分間以上となった。これに対してピロリン酸カリウムの添加濃度が高くなるに従い初期発光量はそれに応じて減少はするが、発光量の安定化への効果は高くなる傾向が認められ、ピロリン酸カリウムを100μM添加させた場合には、発光半減期は10分間以上に延長された。これにより初期発光量と発光の安定化は、ピロリン酸カリウムの濃度によって制御することができることが確認された。これは、甲虫ルシフェリン/ルシフェラーゼ発光反応において、初期発光反応を制御し、かつルシフェラーゼ酵素のターンオーバーを促進させる、ピロリン酸が持つ2種類の作用による効果と考えられる。
【実施例２】
【００８３】
「ピッカジーン発光キット（東洋インキ製造株式会社製：製品番号PGL100）」に添付されている取り扱い説明書に記載されている組成に従い、20mMトリシン、1.07mM(MgCO3)4Mg(OH)2・5H2O、2.67mM硫酸マグネシウム、0.1mM EDTA、33.3mM DTT、470μMルシフェリン、270μM CoA、530μMアデノシン３リン酸(ATP)、pH7.8なる「ルシフェラーゼ発光試薬」を調製した。一方、同処方に記載のチオール試薬である270μM CoAならびに33.3mM DTTは添加していない代わりにピロリン酸カリウム（和光純薬工業株式会社製）ならびに有機イオウ試薬であるジエチルジチオカルバミン酸ソーダをそれぞれ終濃度が1.5mM、2mMとなるように加えた「ルシフェラーゼ発光試薬(＋改良)」を調製した。さらにそれぞれについて、ルシフェラーゼ酵素の安定化を促進させるため終濃度10%のグリセロールならびに1mM DTTを共存させた。【００８４】
「ピッカジーン発光キット（東洋インキ製造株式会社製：製品番号PGL100）」に含まれている「ルシフェラーゼ・スタンダード酵素(10μg/mL)」を「ピッカジーン培養細胞溶解剤LUC：製品番号PGC50（東洋インキ製造株式会社製）」で希釈して調製した100ng/mLのルシフェラーゼ酵素溶液を、マイクロタイタープレートのウェル内に10μLづつ分注した。続いて調製した上記発光試薬をそれぞれの酵素溶液に100μL加え、速やかにルミノメーター（Berthold製 LB96V Plus)内に移し、装置内で測定を開始してから５時間の経時発光量の変動を測定した（表５および６、図２）。なおルシフェリン／ルシフェラーゼ発光反応は温度によって大きく影響を受ける為、全ての操作ならびにルミノメーターによる測定は23℃に設定された恒温室にて行った。【００８５】
【表５】
2006013837.tif 000007
【００８６】
【表６】
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【００８７】
「ルシフェラーゼ発光試薬」による発光反応は、測定開始より高い発光量を示したが、除々に減衰し、測定開始後60分間で発光量は50.4%にまで低下したことから発光半減期は61分間であった。これに対して「ルシフェラーゼ発光試薬(＋改良)」による発光反応では、開始してから10分後に発光量(RLU/秒)は一定値を取って安定化しながら、徐々に減衰した。その後5時間を経過した時点でも最大発光量の62.1％の発光量を維持しており、発光半減期は５．５時間であった。【００８８】
さらに、上記の「ルシフェラーゼ発光試薬」において、(1)ジエチルジチオカルバミン酸ソーダもピロリン酸カリウムも添加しないもの、(2) ピロリン酸カリウム（終濃度2 mM)を添加したもの、(3) ジエチルジチオカルバミン酸ソーダ（終濃度2 mM)を添加したもの、(4) ジエチルジチオカルバミン酸ソーダ（終濃度2 mM)とピロリン酸カリウム（終濃度2 mM)を添加したものを用意し、上記の操作を繰り返した。結果を表７および図３に示す。なおこの実験系では、ルシフェラーゼ酵素の安定化のために10%のグリセロールは共存させたが、有機イオウ試薬の効果を厳密に比較するためにDTTは一切加えていない。【００８９】
【表７】
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【００９０】
2mMピロリン酸カリウムの添加により、初期発光の増加ならびにその急速な減衰が抑えられ、発光半減期の延長に顕著な効果があることが認められた。すなわちピロリン酸カリウムを添加しない場合、有機イオウ試薬を含まない系で発光半減期が28分間、有機イオウ試薬を含んだ場合にも50分間程度であるのに対し、ピロリン酸カリウムを加えた場合、有機イオウ試薬がない場合で187分間、有機イオウ試薬存在下では169分間と発光半減期の大幅な延長ならびに発光反応の安定化が確認され、この安定化への効果はピロリン酸カリウム添加により顕著となることが確認された。【００９１】
CoAなどのチオール試薬存在下におけるルシフェラーゼアッセイ法の発光反応を数十秒間単位で計測する際には、その発光反応における発光強度の増加と発光キネティクスの安定化においてジエチルジチオカルバミン酸ソーダ等の有機イオウ試薬は顕著な効果を示した。しかしながら、CoAなどのチオール試薬が存在せず、かつ発光持続時間を数時間レベルまで延長させた反応系では、有機イオウ試薬は発光の減衰を抑制させ発光強度を維持する若干の効果を示したが、発光安定化に寄与する効果はピロリン酸の方が遥かに大きいことが確認された。これは、ピロリン酸自身が甲虫ルシフェリン/ルシフェラーゼ発光反応の制御により直接的に作用するのに対し、有機イオウ試薬はその補助的な役割を担っていることに拠ると推察される。
【実施例３】
【００９２】
「ATP測定試薬キット（東洋インキ製造株式会社製：製品番号 LL100-1）」に含まれるATP発光試薬10mL（1 mM DTT含有）を調製し、分け取った5mLに対してピロリン酸カリウム(PPiK)（和光純薬工業株式会社製）を終濃度1mMとなるよう加えた。続いて同キットに含まれるATP標準試薬(ATP濃度=1×10-12M)をマイクロタイタープレートのウェル内に100μL分注した。速やかにルミノメーター（Berthold製 LB96V Plus)内に移し、装置内で測定を開始してから５時間の経時発光量の変動を測定した（表８）。なおルシフェリン／ルシフェラーゼ発光反応は温度によって大きく影響を受ける為、全ての操作ならびにルミノメーターによる測定は23℃に設定された恒温室にて行った。ピロリン酸カリウムを添加していないATP発光試薬についても上記の操作を行った。【００９３】
【表８】
2006013837.tif 000010
【００９４】
ピロリン酸カリウムを添加していないATP発光試薬による発光反応は、測定開始より高い発光量を示したが、急速に減衰し、測定開始後15分間で発光量は45%にまで低下したことから発光半減期は11分間であった。これに対してピロリン酸カリウムを終濃度1mM加えた発光試薬による発光反応では、開始してから5分後に発光量(RLU/秒)は一定値を取って安定化し、その後徐々に減衰する。その後5時間を経過した時点でも最大発光量の50.3％の発光量を維持しており、発光半減期はおよそ５時間であった。【００９５】
さらに、上記のATP発光試薬に、(1)ジエチルジチオカルバミン酸ソーダもピロリン酸カリウムも添加しないもの、(2) ピロリン酸カリウム（終濃度1 mM)を添加したもの、(3) ジエチルジチオカルバミン酸ソーダ（終濃度2 mM)を添加したもの、(4) ジエチルジチオカルバミン酸ソーダ（終濃度2 mM)とピロリン酸カリウム（終濃度1 mM)を添加したものを用意し、上記の操作を繰り返した。結果を表９および図４に示す。【００９６】
【表９】
2006013837.tif 000011
【００９７】
1mMピロリン酸カリウムの添加により、初期発光の増加ならびにその急速な減衰が抑えられ、発光半減期の延長に顕著な効果があることが認められた。またこの際に併せて有機イオウ試薬としてジエチルジチオカルバミン酸ソーダを添加したが、効果としては若干の発光量の低下に作用しているが、発光反応の安定化に対する効果は認められなかった。【００９８】
これまでATPアッセイ法における発光反応系では、その発光半減期の延長や発光キネティクスの安定化に対して、ルシフェラーゼアッセイ法の発光反応系で効果を示したチオール試薬、炭酸ガス、AMPなどの何れの制御因子を用いても効果は認められなかった。これに対し、ピロリン酸を反応系に加えることにより、初期発光反応を抑制するとともに発光半減期を顕著に延長できる効果を確認した。ATPアッセイ法における発光反応系においても、初期発光反応の抑制、及びルシフェラーゼ酵素のターンオーバー向上による発光反応の継続促進にピロリン酸が効果を及ぼした結果、発光反応の安定化が為されたものと考えられる。
【実施例４】
【００９９】
「ピッカジーン発光キット（東洋インキ製造株式会社製：製品番号PGL100）」に添付されている取り扱い説明書に記載されている組成に従い、20mMトリシン、1.07mM(MgCO3)4Mg(OH)2・5H2O、2.67mM硫酸マグネシウム、0.1mM EDTA、470μMルシフェリン、530μMアデノシン３リン酸(ATP)、pH7.8なる「ルシフェラーゼ発光試薬」を調製した。なお同処方に記載のチオール試薬である270μM CoAならびに33.3mM DTTは添加していない。次にこの「ルシフェラーゼ発光試薬」にピロリン酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）ならびに有機イオウ試薬であるジエチルジチオカルバミン酸ソーダを終濃度がともに2mMとなるように加えた「ルシフェラーゼ発光試薬(＋改良)」を用意した。さらにそれぞれについて、ルシフェラーゼ酵素の安定化を促進させるため終濃度10%のグリセロールを共存させた。【０１００】
「ピッカジーン発光キット（東洋インキ製造株式会社製：製品番号PGL100）」に含まれている「ルシフェラーゼ・スタンダード酵素(10μg/mL)」を「ピッカジーン培養細胞溶解剤LUC：製品番号PGC50（東洋インキ製造株式会社製）」で希釈して調製した100ng/mLのルシフェラーゼ酵素溶液を、ルミノメーター(Berthold社製 LB9506)用のキュベットに10μL採った。まず調製した上記の「ルシフェラーゼ発光試薬」100μLを添加し、即座にルミノメーターにセットして試薬添加直後から25秒間経過ごとの経時発光量(RLU／秒)を200秒後まで測定した。続いて「ルシフェラーゼ発光試薬(＋改良)」についても同様の発光量を測定しそれぞれの測定値を得た。さらに、上記の「ルシフェラーゼ発光試薬(＋改良)」のピロリン酸ナトリウムの代わりにピロリン酸カリウム（和光純薬工業株式会社製）またはピロリン酸（和光純薬工業株式会社製）を終濃度がそれぞれ2mMとなるように加えた「ルシフェラーゼ発光試薬(＋改良)」を用意して、上記の操作を繰り返した。結果を表１０および図５に示す。【０１０１】
【表１０】
2006013837.tif 000012
【０１０２】
「ルシフェラーゼ発光試薬」による発光反応は、測定開始より高い発光量を示したが、その後速やかに減衰を続け、測定開始後60分間で発光量は47%にまで低下し、発光半減期は約46分間であった。これに対してピロリン酸ならびにピロリン酸塩を加えた「ルシフェラーゼ発光試薬(＋改良)」による発光反応では、開始してから6から12分後に発光量(RLU/秒)は最大値を取って安定化しながら徐々に減衰した。ピロリン酸を加えた反応系では加えないものに比べ最大発光量は55.4%であったが、発光半減期は111分間に延長された。またピロリン酸塩を加えた発光反応系では、最大発光反応はそれぞれ24から26%に抑えられたが、２時間以上の発光半減期と安定した発光反応が得られた。【０１０３】
ピロリン酸(PPi)に比べて、2mMと同濃度のPPiKやPPiNaのピロリン酸塩はより強く発光を抑制する効果が認められたが、これは水溶液中にピロリン酸イオンの解離の効率の違いによるものと考えられる。反応液中でピロリン酸イオンを遊離する化合物であれば、その作用の強弱は解離定数で異なるにしても、ルシフェラーゼアッセイ法において発光反応を制御する効果を持つものと考察される。
【実施例５】
【０１０４】
「ATP測定試薬キット（東洋インキ製造株式会社製：製品番号 LL100-1）」の中のATP発光試薬10mL（1 mM DTT含有）を調製し、分け取った5mLに対してピロリン酸（和光純薬工業株式会社製）を終濃度1mMとなるよう加えた。続いて同キットに含まれるATP標準試薬(ATP濃度=1×10-12M)をマイクロタイタープレートのウェル内に100μL分注した。速やかにルミノメーター（Berthold製 LB96V Plus)内に移し、装置内で測定を開始してから５時間の経時発光量の変動を測定した。なおルシフェリン／ルシフェラーゼ発光反応は温度によって大きく影響を受ける為、全ての操作ならびにルミノメーターによる測定は23℃に設定された恒温室にて行った。ピロリン酸を添加していないATP発光試薬についても上記の操作を行った。さらに、ピロリン酸の代わりにピロリン酸カリウムまたはピロリン酸ナトリウムを終濃度1mMとなるよう加えたATP発光試薬も用意して、上記の操作を行った。結果を表１１および図６に示す。【０１０５】
【表１１】
2006013837.tif 000013
【０１０６】
ピロリン酸を添加していないATP発光試薬による発光反応は、測定開始より５分間後に最も高い発光量を示したが、急速に減衰し、測定開始後30分間には発光量は66.6%にまで低下したことから発光半減期は約42分間であった。これに対してピロリン酸を終濃度1mM加えた発光試薬による発光反応では、初期発光量こそ「ATP発光試薬」の50%弱と抑えられているが、発光反応開始後5分間で発光量(RLU/秒)は最大値を取り、その後一定の割合で徐々に減衰し、その発光半減期は136.5分間に延長された。さらにピロリン酸塩を添加した反応系では、それぞれ24から26％に最大発光量は抑えられたが、カリウム塩では243.5分間、ナトリウム塩では262.7分間の発光半減期も顕著な延長が確認された。【０１０７】
ピロリン酸(PPi)に比べて、1mMと同濃度のPPiKやPPiNaのピロリン酸塩はより強く発光を抑制する効果が認められたが、これは水溶液中にピロリン酸イオンの解離の効率の違いによるものと考えられる。反応液中でピロリン酸イオンを遊離する化合物であれば、その作用の強弱は解離定数で異なるにしても、ATPアッセイ法において発光反応を制御する効果を持つものと考察される。【０１０８】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明のルシフェリン／ルシフェラーゼ発光方法は、ルシフェラーゼアッセイ法、ATPアッセイ法、ルシフェリンアッセイ法などに利用できる。従って、本発明のルシフェリン／ルシフェラーゼ発光方法を利用することにより、遺伝子の転写活性の測定、ATPaseなどの酵素活性の測定、生きている微生物の定量、生きている細胞の定量、カスパーゼやβガラクトシダーゼなどの酵素活性の測定、細胞に対する薬剤の毒性試験などを正確、かつ大量の検体を取り扱うHTSにおいて簡便に行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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