(57)【要約】詳しくは、サイクリン依存性キナーゼ（以下、Cdkと略す）５阻害剤を有効成分とする電位依存性L型Ca2+チャネル制御剤を含む糖尿病治療薬の提供。サイクリン依存性キナーゼ（Cdk）５阻害剤を有効成分として含む電位依存性L型Ca2+チャネル制御剤、該制御剤を含むインスリン分泌促進剤および該制御剤を含む糖尿病治療剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイクリン依存性キナーゼ（Cdk）５阻害剤を有効成分として含む電位依存性L型Ca2+チャネル制御剤。
【請求項２】
膵臓ランゲルハンス島細胞において、低血糖時に電位依存性L型Ca2+チャネルを活性化せず、高血糖時に電位依存性L型Ca2+チャネルを介してCa2+の細胞内への流入を促進する請求項１記載の電位依存性L型Ca2+チャネル制御剤。
【請求項３】
Cdk5阻害剤が、ATP拮抗型Cdk阻害剤である請求項１または２に記載の電位依存性L型Ca2+チャネル制御剤。
【請求項４】
Cdk5阻害剤が、プリン誘導体Cdk5阻害剤である請求項３記載の電位依存性L型Ca2+チャネル制御剤。
【請求項５】
Cdk5阻害剤が、下記式（I）で表される化合物である請求項４記載の電位依存性L型Ca2+チャネル制御剤。
【化１】
2006051951.tif 000012
[式中、R1はNY1Y2であり、Y1およびY2は各々独立にHまたはC1-4アルキルまたはC1-4ヒドロキシアルキルであり、R2はHまたはC1-4アルキルであり、WはNHまたはOである。]
【請求項６】
Cdk5阻害剤が、下記式（II）で表される化合物である請求項４記載の電位依存性L型Ca2+チャネル制御剤。
【化２】
2006051951.tif 000013
[式中、R3はNZ1Z2であり、Z1およびZ2は各々独立にHまたはC1-4アルキルまたはC1-4ヒドロキシアルキルであり、R4はHまたはC1-4アルキルであり、R5は、HまたはC1-4アルキルであり、R6はハロゲンであり、XはNHまたはOである。]
【請求項７】
Cdk5阻害剤が、オロモーシン、ロスコビチン、パーバラノールAおよびそれらの類似体からなる群から選択される請求項３または４記載のCa2+チャネル制御剤。
【請求項８】
Cdk5阻害剤が、ペプチド性のCdk5阻害剤である請求項１または２に記載の電位依存性L型Ca2+チャネル制御剤。
【請求項９】
ペプチド性のCdk5阻害剤が、サイクリン依存性キナーゼアクチベーターであるp35またはp39の断片ペプチドである請求項８記載の電位依存性L型Ca2+チャネル制御剤。
【請求項１０】
ペプチド性のCdk5阻害剤が、配列番号１のアミノ酸配列の第154番目のCysから第279番目のProまでのアミノ酸配列を有するペプチドまたは配列番号１のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項９記載の電位依存性L型Ca2+チャネル制御剤。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか１項に記載の電位依存性L型Ca2+チャネル制御剤を有効成分として含むランゲルハンス島細胞におけるインスリン分泌促進剤。
【請求項１２】
請求項１から１０のいずれか１項に記載の電位依存性L型Ca2+チャネル制御剤を有効成分として含む糖尿病治療薬。
【請求項１３】
投与被験体に低血糖障害を起こさない請求項１２記載の糖尿病治療薬。
【請求項１４】
in vitroで、ランゲルハンス島細胞に候補Cdk5阻害剤である被験物質を作用させ、細胞内へのCa2+の流入または細胞からのインスリン分泌の増加を指標に糖尿病治療薬をスクリーニングする方法。
【請求項１５】
ランゲルハンス島細胞が、膵臓β細胞由来の培養細胞である請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
in vivoで、非ヒト動物に候補Cdk5阻害剤である被験物質を投与し、高血糖時における膵臓β細胞におけるインスリン分泌の増加または動物の血糖値の低下を指標に糖尿病治療薬をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低血糖障害等の副作用の少ない糖尿病治療薬に関する。詳しくは、サイクリン依存性キナーゼ（以下、Cdkと略す）５阻害剤を有効成分とする電位依存性L型Ca2+チャネル制御剤を含む糖尿病治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は膵臓インスリンの絶対的または相対的欠乏により起こる。もっとも有効な糖尿病治療法としては、ヒトインスリンの皮下投与が知られている。特に糖尿病性昏睡、インスリン依存性糖尿病などにおいては、ヒトインスリンの皮下投与が絶対に必要な治療法である。【０００３】
また、軽症の成人型糖尿病においては、食事療法、運動療法だけでは調節できない場合、血糖値の正常化、尿糖消失などを目的として、経口血糖降下薬が用いられている。代表的な経口血糖降下薬として、トルブタミドなどのスルホニル尿素類が知られている（たとえば、非特許文献１参照）。【０００４】
スルホニル尿素類は、ランゲルハンス島β細胞にあるATPで抑制されるKチャネルを抑制することにより、β細胞を脱分極し、電位依存性カルシウムチャネルを開き、細胞内カルシウムを上昇することにより内因性インスリン分泌を促進して血糖を降下する（たとえば、非特許文献１参照）。【０００５】
このような作用機構から、インスリンやスルホニル尿素類は、過血糖、糖尿、多尿、多飲、血管障害などの症状を呈する代謝疾患である糖尿病には有効である。このように高血糖を低減する現在の治療は、主に膵臓β細胞のATP感受性K+（K+ATP）チャネルをターゲットとしてインスリン分泌を増加させる。しかしながら、現在のアプローチは、しばしば低血糖の副作用を伴う。インスリン過剰によって引き起こされる低血糖により意識障害、痙攣、心悸亢進などの副作用が問題となっている（たとえば、非特許文献２参照）。これらの副作用は、脳を障害するものであり、特に注意が必要とされる。【０００６】
一方、オロモーシンは、式（III）：
【化１】
2006051951.tif 000002
【０００７】
の構造を有する化合物であり、一般にサイクリン依存性キナーゼの阻害剤として知られている（たとえば、非特許文献３参照）。【０００８】
現在オロモーシンは、前記作用にもとづき細胞の増殖の同期、インターロイキンに刺激されたリンパ細胞のDNA合成の阻害を目的に研究で使用されている（たとえば、非特許文献３参照）のみであり、医薬としての使用は報告されていない。【０００９】
オロモーシンによって阻害されるサイクリン依存性キナーゼとしては、Cdk2／サイクリンＡ（IC50＝７μM）、Cdk2／サイクリンＥ（IC５０＝７μM））およびCdk5（IC50＝３μM）があり、このうち、Cdk2／サイクリンＡおよびCdk2／サイクリンＥは、通常増殖する細胞でのみ働き、分化した膵臓β細胞では活性をもたないことが知られている（たとえば、非特許文献３参照）。一方、Cdk5は、主に分化した神経細胞や膵臓β細胞に豊富に存在しているが、神経細胞におけるCdk5の機能がよく研究されている。Cdk5は、セリン/スレオニンキナーゼであって、哺乳類組織で遍在的に発現される(Tsai, LH. et al. Development 119, 1029-1040 (1993))。しかしながら、アクチベーターである、p35および39のニューロンにおける支配的な発現により、キナーゼ活性はニューロンでは制限される（Lew, J. et al. Nature 371, 423-426 (1994); Tsai, LH. et al. Nature 371, 419-423 (1994); Tang, D. et al. J. Biol. Chem. 270, 26897-26903 (1995)）。Cdk5は、ニューロンにおいて、ニューロン遊走、皮質形成、シナプス伝達、ニューロン変性および薬の常用などの多機能を有する（Cruz, JC. et al. Curr. Opin. Neurobiol. 14, 390-394 (2004); Bibb, JA. et at. Neurosignals 12, 191-199 (2003)）。ごく最近の調査により、p35とp39が膵臓β細胞で発現されることが示された（Ubeda, M. et al. Endocrinology 145, 3023-3031. (2004); Lilja, L. et al. J. Biol. Chem. 279, 29534-29541 (2004)）。また、Cdk5は、β細胞の細胞膜および細胞質に存在し、その局在は、グルコース濃度により制御を受ける。すなわち、低グルコース濃度では、細胞膜に結合し、高グルコース濃度では、細胞質にその局在が変化するとの報告がされているが（非特許文献４参照）、その作用メカニズムについての詳細は明らかになっていない。
【非特許文献１】「ステイミュレーション  オブ  インスリン  リリース  バイ  レパグリニド  アンド  グリベンクラミド  インボルブズ  ボス  コモン  アンド  ディスティンクト  プロセシズ（Stimulation of Insulin Release by RePaglinide and Glibenclamide Involves Both Common and Distinct Processes）」、ダイアビース（Diabetes）、１９９８年、５月、４７巻、Ｐ．３４５〜３５１
【非特許文献２】「ニュー  ドラッグ  ターゲッツ  フォー  タイプ２  ダイアビース  アンド  ザ  メタボリック  シンドローム（New drug targets for type 2 diabetes and the metabolic syndrome）」、ネイチャー（Nature）、２００１年、１２月、４１４巻、ｐ．８２１〜８２７
【非特許文献３】「インヒビション  オブ  サイクリン−ディペンデント  キナーゼズ  バイ  プリン  アナログズ（Inhibition of cyclin-dependent kinases by purine an alogues）」、ユーロピアン  ジャーナル  オブ  バイオケミストリー（European journal of biochemistry）、１９９４年、２２４巻、ｐ．７７１〜７８６
【非特許文献４】「サイクリン-ディペンデント  キナーゼ５  プロモーツ  インスリン  エキソサイトーシス(Cyclin-dependent Kinase 5 Promotes Insulin Exocytosis)」、ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー(The journal of biological chemistry)、２００１年、２７６巻、３６号、ｐ.３４１９９〜３４２０５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
糖尿病治療のターゲット分子を探求するために、インスリン分泌の生化学的メカニズムを広範囲に調べた。インスリンは、血中グルコース濃度の上昇に反応して膵臓β細胞から分泌される。糖代謝による細胞内のATPの増加は、ATP感受性のK+（K+ATP）チャネルの閉鎖を招き、次いで、細胞膜脱分極とL型電位依存性Ca2+チャネル（L-VDCC）の開口が起こる（Inagaki, N. et al. Science 270, 1166-1170 (1995); Bratanova-Tochkova, TK. et al. Diabetes 51, S83-90 (2002)）。細胞内におけるCa2+の増加は、SNARE（N-ethylmaleimide-sensitive attachment factor receptor）タンパク質相互作用とその後のインスリンを含む顆粒の開口分泌を誘発する(Gerber, SH. et al. Diabetes 51, S3-11 (2002))。細胞膜を直接脱分極するスルホニル尿素などのK+ATPチャネルのブロッカーは、高血糖の低下に広く用いられている。しかしながら、ブロッカーで治療される患者において低血糖症のメカニズムに基づく重要な副作用が、観察される(Moller, DE. Nature 414, 821-827 (2001))。従って、生理反応に依存する新しいアプローチが、非常に望まれている。【００１１】
本発明はかかる従来の問題点を解決し、電位依存性L型Ca2+チャネルを制御することにより、既存のインスリンあるいはインスリン分泌促進剤が有する低血糖障害などの副作用が少なく、かつ糖尿病に有効な血糖降下治療薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、オロモーシンやペプチド性Cdk5阻害剤などのCdk5阻害剤がインスリン分泌に関与する電位依存性L型Ca2+チャネルを制御し得ることを見出し、上記阻害剤が糖尿病の治療薬として極めて有用であり、低血糖を引き起こす副作用がまったくなく、インスリンの分泌を促進させ、血糖値を正常な値にまで降下させることを見出した。【００１３】
すなわち、ラット膵臓ランゲルハンス島由来のMIN6細胞およびp35欠損マウスの膵臓β細胞において、サイクリン依存性キナーゼ５（Cdk5）/p35の阻害が高グルコースにより刺激されるインスリン分泌を増加させるが、低グルコース状態では増加させないことを見出した。【００１４】
キナーゼの阻害は、グルコース刺激がなければL型電位依存性Ca2+チャネル（L-VDCC）からのCa2+流入に影響を及ぼさなかった。一方、キナーゼの阻害はβ細胞での高グルコース刺激があると全細胞での内向きCa2+電流を増強させ、VDCCからのCa2+流入を増加させた。Cdk5に依存するインスリン分泌の促進の分子的メカニズムは、Cdk5がSer783の部位でL-VDCCのLoopII-IIIをリン酸化し、リン酸化がSNAREタンパク質（SNAP25、シンタキシンなど）との結合を低下させ、その結果、L-VDCCの活性が低下するため、Cdk5を阻害すればL-VDCCの活性が増加するというメカニズムである。これらの結果より、本発明者らは、Cdk5/p35が低血糖副作用のない高血糖のコントロールのための薬剤ターゲットとして用い得ることを見出し本発明を完成させるに至った。【００１５】
すなわち本発明は、サイクリン依存性キナーゼ（Cdk）５阻害剤を含有してなる電位依存性L型Ca2+チャネル制御剤、該制御剤を含むインスリン分泌促進剤および該制御剤を含む糖尿病治療薬に関する。【００１６】
前記電位依存性L型Ca2+チャネル制御剤、該制御剤を含むインスリン分泌促進剤および該制御剤を含む糖尿病治療薬において、Cdk5阻害剤は、オロモーシン、ロスコビチン（Roscovitine）、パーバラノールＡ（Purvalanol A）またはそれらの類似体を含むATP拮抗型Cdk５阻害剤あるいはプリン誘導体Cdk５阻害剤ならびにペプチド性のCdk5阻害剤であることが好ましい。【００１７】
すなわち、本発明の態様は以下の通りである。【００１８】
[１]  サイクリン依存性キナーゼ（Cdk）５阻害剤を有効成分として含む電位依存性L型Ca2+チャネル制御剤。【００１９】
[２]  膵臓ランゲルハンス島細胞において、低血糖時に電位依存性L型Ca2+チャネルを活性化せず、高血糖時に電位依存性L型Ca2+チャネルを介してCa2+の細胞内への流入を促進する[１]の電位依存性L型Ca2+チャネル制御剤。【００２０】
[３]  Cdk5阻害剤が、ATP拮抗型Cdk阻害剤である[１]または[２]の電位依存性L型Ca2+チャネル制御剤。【００２１】
[４]  Cdk5阻害剤が、プリン誘導体Cdk5阻害剤である[３]の電位依存性L型Ca2+チャネル制御剤。【００２２】
[５]  Cdk5阻害剤が、下記式（I）で表される化合物である[４]の電位依存性L型Ca2+チャネル制御剤。
【化２】
2006051951.tif 000003
【００２３】
[式中、R1はNY1Y2であり、Y1およびY2は各々独立にHまたはC1-4アルキルまたはC1-4ヒドロキシアルキルであり、R2はHまたはC1-4アルキルであり、WはNHまたはOである。]
[６]  Cdk5阻害剤が、下記式（II）で表される化合物である[４]の電位依存性L型Ca2+チャネル制御剤。
【化３】
2006051951.tif 000004
【００２４】
[式中、R3はNZ1Z2であり、Z1およびZ2は各々独立にHまたはC1-4アルキルまたはC1-4ヒドロキシアルキルであり、R4はHまたはC1-4アルキルであり、R5は、HまたはC1-4アルキルであり、R6はハロゲンであり、XはNHまたはOである。]
[７]  Cdk5阻害剤が、オロモーシン、ロスコビチン、パーバラノールAおよびそれらの類似体からなる群から選択される[３]または[４]のCa2+チャネル制御剤。【００２５】
[８]  Cdk5阻害剤が、ペプチド性のCdk5阻害剤である[１]または[２]の電位依存性L型Ca2+チャネル制御剤。【００２６】
[９]  ペプチド性のCdk5阻害剤が、サイクリン依存性キナーゼアクチベーターであるp35またはp39の断片ペプチドである[８]の電位依存性L型Ca2+チャネル制御剤。【００２７】
[１０]  ペプチド性のCdk5阻害剤が、配列番号１のアミノ酸配列の第154番目のCysから第279番目のProまでのアミノ酸配列を有するペプチドまたは配列番号１のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列を有するペプチドである、[９]の電位依存性L型Ca2+チャネル制御剤。【００２８】
[１１]  [１]から[１０]のいずれかの電位依存性L型Ca2+チャネル制御剤を有効成分として含むランゲルハンス島細胞におけるインスリン分泌促進剤。【００２９】
[１２]  [１]から[１０]のいずれかの電位依存性L型Ca2+チャネル制御剤を有効成分として含む糖尿病治療薬。【００３０】
[１３]  投与被験体に低血糖障害を起こさない[１２]の糖尿病治療薬。【００３１】
[１４]  in vitroで、ランゲルハンス島細胞に候補Cdk5阻害剤である被験物質を作用させ、細胞内へのCa2+の流入または細胞からのインスリン分泌の増加を指標に糖尿病治療薬をスクリーニングする方法。【００３２】
[１５]  ランゲルハンス島細胞が、膵臓β細胞由来の培養細胞である[１４]の方法。【００３３】
[１６]  in vivoで、非ヒト動物に候補Cdk5阻害剤である被験物質を投与し、高血糖時における膵臓β細胞におけるインスリン分泌の増加または動物の血糖値の低下を指標に糖尿病治療薬をスクリーニングする方法。
【発明の効果】
【００３４】
本発明による、Cdk5阻害剤を有効成分とする電位依存性L型Ca2+チャネル制御剤、インスリン分泌阻害剤および糖尿病治療剤は、その電位依存性L型Ca2+チャネルを制御するメカニズムから、高血糖時にインスリン分泌を促進し、低血糖時にはインスリン分泌を促進しない、従って、副作用が少なく、β細胞が全て消失していない限りほとんどの型の糖尿病に対して有効であり、高血糖を改善させる。【００３５】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2004-329165号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】単離ランゲルハンス島を低糖濃度刺激する時のインスリン分泌量に対するオロモーシンの効果を示した図である。
【図２】単離ランゲルハンス島を高糖濃度刺激する時のインスリン分泌量に対するオロモーシンの効果を示した図である。図中の＊はP<0.05を示す。
【図３】MIN6細胞を高糖濃度刺激する時のインスリン分泌量に対するロスコビチンおよびオロモーシンの効果を示した図である。
【図４】オロモーシンとイソオロモーシンのインスリン分泌量に対する効果を示した図である。
【図５】低糖濃度時においてオロモーシンとグリベングラミドとの効果を比較した図である。
【図６ａ】ラット組織とMIN6細胞中のCdk5活性の比較を示す図である。
【図６ｂ】ラット膵臓ランゲルハンス島およびMIN6細胞中のp35 mRNAの相対的発現を示す図である。
【図６ｃ】MIN6細胞におけるインスリン分泌に対するオロモーシンの効果を示す図である。
【図６ｄ】インスリン分泌に対するイソオロモーシンの効果を示す図である。
【図６ｅ】低グルコース（2.8mM）を含むKRB中でグリベンクラミド誘発インスリン分泌に対するオロモーシンの効果を示す図である。
【図６ｆ】高グルコース（17.6mM）を含むKRB中でグリベンクラミド誘発インスリン分泌に対するオロモーシンの効果を示す図である。
【図６ｇ】ジアゾキシドによるオロモーシン誘発インスリン分泌の阻害を示す図である。
【図６ｈ】フォルスコリン刺激インスリン分泌に対するオロモーシンの効果を示す図である。
【図７ａ−１】グルコースで刺激した場合のMIN6細胞中のCa2+動態に対するオロモーシンの効果をCa2+濃度変化により示す図である。
【図７ａ−２】グルコースで刺激した場合のMIN6細胞中のCa2+動態に対するオロモーシンの効果を最大Ca2+流入により示す図である。
【図７ｂ−１】グリベンクラミドで刺激した場合のMIN6細胞中のCa2+動態に対するオロモーシンの効果をCa2+濃度変化により示す図である。
【図７ｂ−２】グリベンクラミドで刺激した場合のMIN6細胞中のCa2+動態に対するオロモーシンの効果を最大Ca2+流入により示す図である。
【図７ｃ】MIN6細胞におけるVDCCを通しての全体の細胞Ba2+電流の電流-電圧の関係を示す図である。
【図７ｄ】野生型マウス（黒丸）またはp35 KOマウス（白丸）から単離された１個のβ細胞中の全体の細胞Ba2+電流を示す図である。
【図８ａ】loopII-IIIドメインの保存ドメインを下線（一重および二重）で示した図であり、二重下線部は、Cdk5によってリン酸化されると思われるモチーフを示す。
【図８ｂ】CaV1.2（754a.a.-900a.a.）由来loopII-IIIとのGSTコンジュゲートまたはセリン783のアラニンへの変異を含むloopII-IIIのリン酸化を示す図である。
【図８ｃ】loopII-IIIのリン酸化をリン酸セリン783に対する特異的抗体を用いてウエスタンブロットで測定した結果を示す図である。
【図８ｄ】オロモーシンで処理されたまたはされていないMIN6細胞の溶解物の免疫沈降の結果を示す図である。
【図８ｅ】リン酸化したGST-loopII-IIIをシナタキシン(synataxin)１ＡまたはSNAP-25と共にインキュベートした後に、結合したタンパク質をウエスタンブロットにより検出した結果を示す図である。
【図８ｆ】シンタキシンおよびSNAP-25との相互作用に対するloopII-IIIドメインのリン酸化の効果を示す図である。
【図９ａ】単離したランゲルハンス島におけるグルコースで刺激されたインスリン分泌を示す図である。
【図９ｂ】野生型マウス（黒丸）およびp35-/-マウス（白丸）の血漿中インスリンレベルを示す図である。
【図９ｃ】野生型マウス（黒丸）およびp35 KOマウス（白丸）における腹腔内グルコースチャレンジに反応しての血漿グルコースの変化を示す図である。
【図１０】電位依存性L型Ca2+チャネルの構造を示す図である。
【図１１】インスリン分泌のメカニズムを示す図である。
【図１２】Cdk5によりVDCC-SNARE相互作用が制御されてインスリン分泌が調節されるメカニズムを示す図である。
【図１３】糖尿病モデルマウスにロスコビチンを投与した場合の血糖値の変化を示す図である。
【図１４】糖尿病モデルマウスにロスコビチンを投与した場合の体重変化を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
以下、本発明を詳細に説明する。【００３８】
本発明に使用するCdk5阻害剤としては、ATP拮抗型Cdk5阻害剤やプリン誘導体Cdk５阻害剤が挙げられる。また、ペプチド性のCdk5阻害剤も好適に用いることができる。ATP拮抗阻害剤は、ATPと拮抗することによりCdk5の活性を阻害する化合物であり、プリン誘導体はプリンおよびプリン核の種々の部分が置換された誘導体である。ATP拮抗阻害剤およびプリン誘導体Cdk5阻害剤として以下のオロモーシン、ロスコビチン、パーバラノールＡが例示できる。【００３９】
例えば、プリン誘導体Cdk5阻害剤として下記式（Ｉ）または（ＩＩ）で示される化合物を用いることができる。
【化４】
2006051951.tif 000005
【００４０】
[式中、R1はNY1Y2であり、Y1およびY2は各々独立にHまたはC1-4アルキルまたはC1-4ヒドロキシアルキルであり、R2はHまたはC1-4アルキルであり、WはNHまたはOである。]
式（I）において、R1はNH2またはNCH2CH2OHが好ましく、R2はCH2またはCH(CH3)C2H5が好ましく、WはNHが好ましい。
【化５】
2006051951.tif 000006
【００４１】
[式中、R3はNZ1Z2であり、Z1およびZ2は各々独立にHまたはC1-4アルキルまたはC1-4ヒドロキシアルキルであり、R4はHまたはC1-4アルキルであり、R5はHまたはC1-4アルキルであり、R6はハロゲンであり、XはNHまたはOである。]
式（II）において、R3はNH2またはNCH2CH2CH(CH3)OHが好ましく、R4はCH2が好ましく、R5はHまたはCH(CH3)2が好ましく、R6はClが好ましく、XはNHが好ましい。【００４２】
式（Ｉ）で示される化合物の具体例として、例えば、オロモーシン、ロスコビチンおよびそれらの類似体などがあげられ、（ＩＩ）で示される化合物の具体例として、例えば、パーバラノールＡ、パーバラノールＢ、compound52およびそれらの類似体などがあげられる。オロモーシン、ロスコビチンおよびパーバラノールＡの化学式をそれぞれ以下の式（III）、（IV）および（V）に示す。
【化６】
2006051951.tif 000007
【化７】
2006051951.tif 000008
【化８】
2006051951.tif 000009
【００４３】
ここで、「類似体」とは、Cdk5阻害作用を有する化合物と類似した構造を有し、Cdk5の酵素活性を阻害し、それぞれ該化合物と同様の作用を有するものをいう。類似した構造とは、例えば、Cdk5阻害作用を発揮する部位の構造は変化しないが、該部位の構造に影響を与えない基を他の基、例えば大きさが大きく異ならない基で置換した構造をいう。【００４４】
本発明において、上記Cdk5阻害作用を有する化合物のプロドラッグも包含する。プロドラッグとは、該プロドラッグを投与した生体内で加水分解等により本発明のCdk5阻害剤に変換し得る化合物をいう。また、上記化合物の薬学的に許容できる塩も本発明のCdk5阻害剤に含められる。【００４５】
また、さらに本発明のCdk5阻害剤として、ペプチド性のCdk5阻害剤を用いることができる。ペプチド性のCdk5阻害剤として、Cdk5に結合するペプチドが挙げられ、例えば、サイクリン依存性キナーゼアクチベータータンパク質のペプチド断片が挙げられる。これらのペプチド性Cdk5阻害剤は、例えば、酵母two-hybrid法によりCdk5に結合するペプチドをスクリーニングすることにより得ることができる。本発明のCdk5阻害剤として、p35（CDK5R1）由来のペプチド断片（例えば、Ya-Li Zheng et al. Eur.J.Biochem. 26, 4427-4434 (2002)に記載されている）またはp39（CDK5R2）由来のペプチド断片が挙げられる。p35の全長アミノ酸配列を配列番号１に、p39の全長アミノ酸配列を配列番号２に示す。これらの全長アミノ酸配列からなるペプチドのCdk5に結合するが、Cdk5を活性化しないペプチド断片をCdk5阻害剤として用いることができる。p35の活性を有する最小ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列の第138番目のProから第291番目のAsnからなるアミノ酸配列を有するペプチド(p16)であり、Cdk5阻害剤として、例えば該ペプチド(p16)のアミノ酸配列において１個から数十個のアミノ酸を欠失、置換したものが挙げられる。一例として、第138番目のProから第291番目のAsnからなるアミノ酸配列を有するペプチド(p16)において、N末端の11アミノ酸およびC末端の４アミノ酸を欠失した配列番号１のアミノ酸配列の第150番目のGluから第287番目のSerからなるアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。さらに、配列番号１のアミノ酸配列のうちの第154番目のCysから第279番目のProまでのアミノ酸配列を有するペプチド等も好適に用いることができる。【００４６】
さらに、Cdk5阻害作用を有するペプチドのアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列を有するペプチドもペプチド性Cdk5阻害剤として用いることができる。ここで、「数個」とは、10個以下、好ましくは５個以下、さらに好ましくは３個以下、特に好ましくは２個以下をいう。ペプチド性のCdk阻害剤は、生体適合性が高く、副作用が生じにくい。【００４７】
候補化合物または候補ペプチドがCdk5阻害作用を有するか否か、および候補化合物または候補ペプチドのCdk5に対するIC50は、以下の方法により決定することができる。【００４８】
候補化合物または候補ペプチドにトレーサーとして放射性同位体であるガンマ32p-ATPを用いて、Cdk5およびその活性化サブユニットであるp35またはp25（p35の限定分解産物）を含有する溶液に基質となるヒストンH1を添加する。異なる濃度のCdk5阻害剤存在下におけるヒストンH1のガンマ32Pの取り込みを測定することによりCdk5のIC50を決定することができる。【００４９】
本発明によれば、Cdk5阻害剤はβ細胞に存在するCdk5に作用し、Cdk5の酵素活性を阻害する。インスリンは、グルコースが膵臓ランゲルハンス島細胞に取り込まれ、ATPが合成され、ATPが増加すると、該ATPが細胞膜に作用し、K+チャネルを閉鎖し、脱分極が起こり、脱分極により、電位依存性L型Ca2+チャネルが開口し、細胞外からCa2+が流入することにより、分泌される。この際、細胞膜の脱分極により電位依存性L型Ca2+チャネルが開口すると、電位依存性L型Ca2+チャネルのloopII-IIIにSNAREタンパク質（SNAP25、シンタキシンなど）が結合し、Ca2+が流入し易くなりインスリンが分泌される。loopII-IIIとは電位依存性L型Ca2+チャネルにおいて、ドメインIIおよびIIIの間の細胞内に形成されるループ構造部分をいう（図１０）Cdk5は、LoopII-IIIのアミノ酸配列783番目のセリンをリン酸化し、SNAREタンパク質の結合を阻害することにより、Ca2+の流入を妨げ、インスリンの分泌を抑制する（図１１）。本発明のCdk5阻害剤は、Cdk5阻害剤が上記セリンをリン酸化するのを阻害し、電位依存性L型Ca2+チャネルを制御し、電位依存性L型Ca2+チャネルを通ってのCa2+の流入を促進することにより、インスリンの分泌を促進する（図１２）。β細胞の脱分極は上記のようにグルコースの刺激により起こるので、低血糖時には、細胞膜の脱分極が起こらず電位依存性L型Ca2+チャネルは開口しないので、Cdk5の阻害の有無に拘わらず影響はない。一方、高血糖時には、脱分極が起こって電位依存性L型Ca2+チャネルが開口し、このときCdk5を阻害することにより、上記のようにリン酸化を阻害することによってインスリンの分泌を促進する。このように、本発明で用いる阻害剤は、高血糖時のみに電位依存性L型Ca2+チャネルを制御し、インスリンの分泌を促進する。従って、本発明で用いるCdk5阻害剤は、低血糖時にインスリンの分泌を促進することなく、高血糖時のみにインスリンの分泌を促進するので、低血糖障害を起こすことがない。ここで、低血糖とは、血糖レベルが正常値以下または正常値付近以下の場合をいい、血中グルコース濃度が、100mg/dL以下、好ましくは90mg/dL以下、さらに好ましくは80mg/dL以下、特に好ましくは70mg/dL以下の場合をいう。【００５０】
糖尿病はインスリン依存型とインスリン非依存型に分けられる。インスリン依存型は若年に発症し、膵臓ランゲルハンス島β細胞の病変によりインスリンの絶対的欠如によって起こる。インスリン非依存型は肥満や遺伝子の変異などにより、体細胞のインスリンに対する応答性が悪化したり、インスリンの分泌が低下するなどして起こる。Cdk5阻害剤は、β細胞に作用してインスリンの分泌を促進することができるため、β細胞がすべて消失していないかぎりすべての型の糖尿病において大きな治療効果が期待できる。【００５１】
本発明の治療薬の投与経路としては、経皮、静脈内、筋肉内、皮下、経口があげられる。高血糖時にすみやかに作用できるように食前の経口投与が好ましい。また、膵臓に局所投与してもよい。膵臓局所投与は、膵臓またはその近傍へ本発明の薬剤を直接注入すればよい。例えば、膵臓治療に使用される内視鏡に中空の針を設ける等の修飾を加えて、膵臓組織中に薬剤を直接注入できるようにすればよい。また、経皮針を膵臓組織への経腹注入に用いることができる。【００５２】
治療剤の剤形は、投与方法によって適宜設定することができる。具体的には、たとえば、水溶液、乳剤、懸濁液などの液剤、または錠剤などがあげられる。通常は、経口投与が好ましいため、水溶液または錠剤が好ましい。【００５３】
投与量は、投与方法、適用する患者の年齢、体重、病状などによって適宜設定することができるが、Cdk5阻害剤がプリン誘導体阻害剤である場合、有効成分に換算して一回に0.0003〜0.03mg/kg体重が好ましく、0.003mg/kg体重〜0.015mg/kg体重がより好ましい。これ以上の量を投与してもよく、例えば1〜1000mg/kg体重、20〜500mg/kg体重または50〜500mg/kg体重の範囲で投与すればよい。0.0003mg/kg体重より少ないと糖尿病治療薬としての効果が得られなくなる恐れがある。また、Cdk5阻害剤がペプチド性阻害剤である場合、有効成分に換算して一回に0.005〜５mg/kg体重が好ましく、0.005〜１mg/kg体重がより好ましい。【００５４】
本発明の治療剤としての製剤化には、その剤形に合わせて通常当業者により使用される様々な添加物を使用することができる。たとえば、希釈剤、等張化剤、担体、pH安定剤などがあげられる。【００５５】
投与方法の具体例としては、点滴静注する場合、一回につき有効成分0.003〜0.015mg/kg体重で投与すればよく、さらにこれ以上の量を投与してもよく、例えば1〜1000mg/kg体重、20〜500mg/kg体重または50〜500mg/kg体重の範囲で投与すればよい。ペプチド性Cdk5阻害剤の場合は0.005〜５mg/kg体重を生理食塩水等に溶解して10〜50μMとし投与することができる。筋肉注射の場合、一回につき有効成分0.003〜0.015mg/kg体重、ペプチド性Cdk5阻害剤の場合は0.005〜５mg/kg体重を生理食塩水等に溶解して投与することができる。投与は一日三回、食前に行われることが好ましい。【００５６】
本発明のCdk5阻害剤の血糖降下作用は、単離したランゲルハンス島、膵臓β細胞由来の培養細胞における糖負荷に対するインスリンの分泌量を測定することにより評価することができる。また、非ヒト動物に投与した場合のインスリン分泌量または血糖の低下の程度を測定することによっても評価することができる。該測定方法を用いることにより、本発明の電位依存性L型Ca2+チャネル制御剤の有効成分として用い得るCdk5阻害剤をスクリーニングすることができる。すなわち、in vitroで単離したランゲルハンス島、単離した膵臓β細胞またはインスリン分泌能を有するラットMIN6細胞などの膵臓β細胞由来の培養細胞に候補Cdk阻害剤である被験物質を作用させ、細胞の電位依存性L型Ca2+チャネルが制御され、Ca2+の細胞内への流入が促進されたこと、または細胞からのインスリンの分泌が促進されたことを指標に被験物質が本発明の電位依存性L型Ca2+チャネル制御剤の有効成分として用い得るかどうかを決定することができる。この際、ランゲルハンス島、膵臓β細胞および膵臓β細胞由来の培養細胞の由来動物は限定されず、ヒト、マウス、ラット等由来のランゲルハンス島細胞を用いることができる。また、被験物質を非ヒト動物、好ましくは血糖値の高い糖尿病モデルマウスに投与し、該動物において膵臓β細胞からのインスリン分泌量が増加したこと、または該動物の血糖値が低下したことを指標に、被験物質が物質が本発明の電位依存性L型Ca2+チャネル制御剤の有効成分として用い得るかどうかを決定することができる。特に高血糖時にインスリン分泌量を増加させ血糖値を低下させるが、低血糖時にはインスリン分泌量を増加させず血糖値を低下させないことを指標に決定すればよい。この際、非ヒト動物は限定されないが、マウス、ラット等を用いることができる。
【実施例】
【００５７】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【００５８】
実施例１
低糖濃度時におけるオロモーシンの作用
（１）ランゲルハンス島の調製
後藤らの文献（Transplantaion、第43巻、725〜730頁、1987年）に従い、６週齢のオスのウィスターラットよりランゲルハンス島を単離した。ラットをエーテル麻酔下で開胸し、總胆管を剥離してコラゲナーゼ溶液（320U/ml、シグマ社製）をゆっくり注入し、膨らんだ膵臓を摘出した。コラゲナーゼを含んだ膵臓を37℃のウォーターバスにて３０分間消化したのち、ピペットで分散し、Ficoll溶液（Amersham Pharmacia社製）の濃度勾配を用いてランゲルハンス島を単離した。ランゲルハンス島を、95％O2および５％CO2の混合ガスで飽和させたリンガー液（119mM 塩化ナトリウム、4.74mM 塩化カリウム、1.19mM リン酸二水素一ナトリウム、25mM 炭酸水素ナトリウム、10mM HEPES，2.54mM 塩化カルシウム、1.19mM 塩化マグネシウム、0.2％ BSA）中に37℃に保ちながら30分インキュベーションした。【００５９】
（２）オロモーシンの作用
前記ランゲルハンス島を実体顕微鏡（オリンパス光学工業（株）製）下で15個を一組としてピックアップし、図１に示した各濃度のオロモーシン（シグマ社製）を含むリンガー液（3.3mMグルコース）0.5mlに入れ30分間インキュベーションしたのち、同じ糖濃度およびオロモーシン濃度のリンガー液0.5mlを刺激液として入れ替えた。入れ替えから30分後の刺激液中に含まれるインスリンをインスリン検出キット（Abビーズインスリン、栄研化学（株）製）を用いて、該キットのプロトコールにしたがって検出した。各濃度群につきｎ＝６で試験を行なった。【００６０】
図１に示したように、3.3mMグルコース下でのインスリン濃度はオロモーシンの存在に関わらずほぼ同程度であった。すなわち、低糖濃度時においてオロモーシンはランゲルハンス島のインスリン分泌にまったく影響を及ぼさなかった。これは、オロモーシンは低血糖時に服用しても、より低血糖になり重大な副作用を引き起こすことがまったくないということを示す。【００６１】
実施例２
高糖濃度時におけるオロモーシンの作用
実施例１の（１）と同様にして調製したランゲルハンス島を、実体顕微鏡（オリンパス光学工業（株）製）下で15個を一組としてピックアップし、図２に示した各濃度のオロモーシンを含むリンガー液（3.3mMグルコース）0.5mlに入れ30分間インキュベーションしたのち、同じ濃度のオロモーシン（シグマ社製）を含む高糖濃度リンガー液（17.3mMグルコース）0.5mlを刺激液として入れ替えた。入れ替えから30分後の刺激液中に含まれるインスリンをインスリン検出キット（Abビーズインスリン、栄研化学（株）製）を用いて、該キットのプロトコールにしたがって検出した。各濃度群につきｎ＝６で試験を行なった。【００６２】
図２に示したように、オロモーシン存在下でのインスリン分泌量は、オロモーシン非存在下と比べて有意に上昇した。またインスリン分泌量はオロモーシンの濃度の高さに依存して増加した。これは、オロモーシンの濃度を調節することにより異なる症状の糖尿病に対応できることを示す。【００６３】
実施例３
ロスコビチンのインスリン分泌促進作用
（１）インスリン分泌細胞MIN6の培養
インスリン分泌能を有するMIN6細胞（千葉県千葉市稲毛区弥生町１−３３、千葉大学大学院医学研究院先端応用医学講座細胞分子医学の清野進教授より提供）を前らの方法（American Journal of Physiological Endocrinal Metabolism、2000年、第274巻、773〜781頁）に従って培養した。５×105個の細胞をDMEM培地（GIBCO社製）に懸濁し、直径35ミリのカルチャーディッシュ（コーニング社製）に撒き５％CO2濃度のインキュベーター（サンヨウ社製）の中で２日間培養した。【００６４】
（２）ロスコビチンの作用
（１）で培養したMIN6細胞の培養液を、予め20μMのロスコビチン（ガルバイオケム（Calbiochem）社製）を含む低糖濃度のリンガー液（3.3mMグルコース）0.5mlおよび20μMのオロモーシン（シグマ社製）を含む低糖濃度のリンガー液（3.3mMグルコース）0.5mlでそれぞれ入れ替え、30分インキュベーションしたのち、同じ濃度のロスコビチンを含む高糖濃度のリンガー液（17.6mMグルコース）0.5mlおよび同じ濃度のオロモーシンを含む高糖濃度のリンガー液（17.6mMグルコース）0.5mlをそれぞれ刺激液として入れ替えた（それぞれ、ｎ＝６）。対照としてはロスコビチンおよびオロモーシンのいずれも含有しないリンガー液を用いた（ｎ＝６）。２時間培養したのち、培地中に含まれるインスリンをインスリン検出キット（Abビーズインスリン、栄研化学（株）製）を用いて、該キットのプロトコールに従って検出した。【００６５】
図３に示したように、ロスコビチン存在下ではMIN6細胞のインスリン分泌が促進された。このことは、ロスコビチンは同じCdk5阻害剤であるオロモーシンと同様にインスリン分泌を促す作用を有することを意味するものである。【００６６】
試験例１
実施例１の（１）と同様にして調製したランゲルハンス島を、実体顕微鏡（オリンパス光学工業（株）製）下で15個を一組としてピックアップし、10μMのオロモーシンまたは10μMのイソオロモーシン（ガルバイオケム社製）を含むリンガー液（3.3mMグルコース）0.5mlに入れ30分間インキュベーションしたのち、同じ濃度のオロモーシン（シグマ社製）またはイソオロモーシン（ガルバイオケム社製）を含む低糖濃度リンガー液（3.3mMグルコース）0.5mlを刺激液として入れ替えた（それぞれ、ｎ＝６）。対照としては、オロモーシンおよびイソオロモーシンのどちらも含まないリンガー液を用いた（ｎ＝６）。入れ替えから30分後の刺激液中に含まれるインスリンをインスリン検出キット（Abビーズインスリン、栄研化学（株）製）を用いて、該キットのプロトコールにしたがって検出した。【００６７】
オロモーシンと類似した構造を持ちながらもCdk5阻害効果のない異性体であるイソオロモーシンを用いて、インスリン分泌促進効果はオロモーシンの作用によるものであること確認した。結果を図４に示す。イソオロモーシンの構造は以下の式(VI)の通りである。
【化９】
2006051951.tif 000010
【００６８】
オロモーシン（10μM）存在下で高糖濃度のリンガー液はインスリン分泌を有意に促進したが、オロモーシンの異性体であるイソオロモーシン（10μM）はまったくインスリンの分泌を促進しなかった。これは、オロモーシンのCdk5阻害効果がインスリンの分泌を促進していることを意味するものである。【００６９】
試験例２
実施例１の（１）と同様にして調製したランゲルハンス島を、実体顕微鏡（オリンパス光学工業（株）製）下で15個を一組としてピックアップし、それぞれ対照（ｎ＝６）、試料Ａ（ｎ＝６）、試料Ｂ（ｎ＝６）、試料Ｃ（ｎ＝６）とした。対照および試料Ａは、リンガー液（3.3mMグルコース）0.5mlに入れ、試料Ｂおよび試料Ｃは、10μMのオロモーシンを含むリンガー液0.5mlに入れ30分問インキュベーションしたのち、対照はオロモーシンもグリベンクラミドも含まない低糖濃度リンガー液（3.3mMグルコース）0.5mlを用い、試料Ａは200nMのグリベンクラミドを含有する低糖濃度リンガー液（3.3mMグルコース）0.5ml、試料Ｂは10μMのオロモーシンを含有する低糖濃度リンガー液（3.3mMグルコース）0.5ml、試料Ｃは200nMのグリベンクラミドと10μMのオロモーシンとを含有する低糖濃度リンガー液（3.3mMグルコース）0.5mlを刺激剤として入れ替えた。入れ替えから３０分後の刺激液中に含まれるインスリンをインスリン検出キット（Abビーズインスリン、栄研化学（株）製）を用いて、該キットのプロトコールに従って検出した。さらに、ランゲルハンス島を超音波処理することにより細胞を破壊し、ランゲルハンス島内のインスリン含有量を前記と同様にインスリン検出キット（Abビーズインスリン、栄研化学（株）製）を用いて、該キットのプロトコールに従って検出した。【００７０】
低糖濃度時においてオロモーシンと糖尿病治療薬として使用されているスルホニル尿素類であるグリベンクラミドとの効果を、ランゲルハンス島内のインスリン含有量に対するインスリンの分泌割合により比較した。なお、インスリンの分泌割合は以下の式により算出した。
【式１】
【００７１】
2006051951.tif 000011
結果を図５に示す。
【００７２】
グリベンクラミドは、低濃度におけるランゲルハンス島のインスリン分泌を有意に上昇させたが、オロモーシンは、インスリン分泌に影響を及ぼさなかった。これは、オロモーシンはスルホニル尿素類の治療薬と異なり、低血糖を引き起こすことがまったくなく、高糖濃度時にのみインスリン分泌を促進することを意味するものである。
【００７３】
実施例４
サイクリン依存性キナーゼ５阻害剤によるインスリン分泌促進の分子的機構
本実施例は、以下の方法により実施した。
【００７４】
細胞培養とCa2+イメージング
MIN6細胞は、15%ウシ胎児血清、25mMグルコース、71mM ２-メルカプトエタノールおよび2mMグルタミンを含むDMEM中で培養した（Lilla, V. et al. Endocrinology 144, 1368-1379 (2003); Minami, K. et al. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 279, 773-781 (2000)）。細胞（1×106細胞）を、35mmのガラス底ディッシュ（IWAKI、東京、日本）上に播き、48時間増殖させた。Ca2+イメージングのために、細胞は2.8mMグルコースを含むクレブス-リンゲル重炭酸塩HEPES改変緩衝液（KRB;125mM NaCl、4.74mM KCl、1mM CaCl2、1.2mM KH2PO4、5mM NaHCO3、25mM HEPES（pH7.4）、および0.1%BSA）中で37℃で2時間プレインキュベートした。50μMのオロモーシン（Sigma）の存在下で30分間5μMのfura-2/アセトキシメチルエステル（Molecular Probe）を負荷し、細胞を２度洗浄し、17.6mMグルコースまたは100nMグリベンクラミドを含むKRBで置換した。細胞内のCa2+は、Axiovert 200倒立顕微鏡（Ｃarl Zeiss MicroImaging）を用いて二重励起波長方法（340/380）で測定した。
【００７５】
電気生理学的分析
膵臓ランゲルハンス島は、コラゲナーゼ消化法によって単離した(Wollheim, CB. et al. Methods Enzymol. 192, 188-223.(1990))。分散したランゲルハンス島細胞は35mmディッシュ中のCellocate Coverslips（Eppendorf）上で10%のウシ胎児血清を補足したDMEMで培養した。細胞は、実験の前に、24〜72時間、37℃でインキュベートした。膵臓β細胞の１個の細胞全体の記録は、公知の方法により行った（Beguin, P. et al. Nature 411, 701-706 (2001)）。実験後、膵臓β細胞を、抗インスリン抗体を用いた免疫染色によって識別した。
【００７６】
インスリン分泌の測定
MIN6細胞（0.4×106）を、使用前に24ウェルディッシュ（IWAKI）上に播いて48時間置いた。次いで、細胞を2.8mMグルコースを含むKRBを用いて2時間インキュベートし、オロモーシンを含むかまたは含まないKRBを用いて30分間インキュベートした。次に、細胞を1時間オロモーシンの存在または非存在下で種々の分泌促進剤で刺激した。インスリン濃度は、製造業者のプロトコルに従い、ラジオイムノアッセイ（栄研化学）を使用して測定した。
【００７７】
p35欠損マウスの作製
P35ノックアウトマウスを作製し、129/Sv×C57BL/6Jバックグラウンドで維持した（Ohshima, T. et al Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 98, 2764-2769 (2001); Ohshima, T. et al. Genomics 35, 372-375 (1996)）。
【００７８】
腹腔内グルコース負荷試験
終夜絶食後、腹腔内グルコース投与（2g/Kg）の15、30、60および120分後にマウスから血液を採取した。グルコース濃度をglucometer（NIPRO）を用いて測定し、インスリンレベルをエンザイムイムノアッセイ（Pharmacia Biosciences）を用いて測定した。
【００７９】
LoopII-IIIのリン酸化
VDCCのヒトα1CサブユニットのLoopII-IIIをコードするリコンビナントcDNAを、pGEX6P（Amersham Bioscience）中にサブクローニングした。セリン783のアラニンへの変異は、製造業者（Stratagene）の指示に従って実行した。精製されたリコンビナントタンパク質は、公知の方法によりin vitroでCdk5/p35（Upstate）によってリン酸化した（Tomizawa, K. et al. J. Cell. Biol. 163, 813-824 (2003)）。細胞におけるCdk5によるloopII-IIIのリン酸化を測定するために、MIN6細胞を30分間オロモーシンで処理し、溶解バッファー（50mMトリス-HCl、pH 7.5、5mM MgCl2、1mM EGTA、1mM EDTA、1%CHAPS、1μM FK506、100nMオカダ酸、プロテアーゼ阻害剤カクテル）を用いてホモジナイズした。α1Cサブユニットを、抗α1Cサブユニット抗体（Sigma、C1603）を用いて、細胞可溶化物から免疫沈降した。Ser783部位においてリン酸化されたα1Cサブユニットの発現は、CLARTApSPEKKペプチドを注射したウサギの血清から得たリン酸化特異的抗体を用いて測定した。サブユニットの総量を、抗α1Cサブユニット抗体（Chemicon）を用いてウエスタンブロット分析によって検出した。
【００８０】
相対的遺伝子発現
p35mRNAの定量分析は、製造業者の指示に従ってABI PRISM 7000 Sequence Detection System（Applied Biosystems）を用いて行った。簡潔に説明すると、トータルRNAを、RNeasyキット（Qiagen）を用いて、ラット脳、膵臓ランゲルハンス島およびMIN6細胞から単離した。トータルRNAを、オリゴdTプライマー（Invitrogen）を用いた第１鎖cDNA合成に供した。p35mRNAの相対的定量は、p35のための特異的なプライマー（センス、GCCCTTCCTGGTAGAGAGCTGTA（配列番号３）；アンチセンス、CTGACCGCTCTCATTCTTCAAGT（配列番号４））を用いてABI Prism 7000配列検出システム（Applied Biosystems）で測定した。内部標準として、FKBPのmRNAのコピー数を、TaqMan FKBP Control Reagents（Applied Biosystems）を用いて測定した。p35mRNAのcDNAコピー数は、同じサンプルボリュームのFKBPの結果に対して標準化した。定量分析は、分析ソフトウェア（7000v1.1（Applied Biosystems）を用いて行った。
【００８１】
統計解析
データは、平均値（±S.E.M.）として示される。データは、2条件を比較するStudent’s ｔ検定またはANOVAにより分析し、他条件の比較を計画した。P<0.05は、有意であるとした。
【００８２】
この結果、以下のことが判明した。
【００８３】
本実施例により、膵臓β細胞およびβ細胞由来細胞株であるMIN6細胞における高レベルのCdk5活性およびp35発現が見出された（図６aおよび６b）。
【００８４】
膵臓β細胞でのCdk5の生理的役割を調査するために、MIN6細胞を最初にオロモーシン（膜透過性Cdk5インヒビター）で処理した（Vesely, J. et al. Eur. J. Biochem. 224, 771-786 (1994)）。30分間、種々の濃度のオロモーシンを用いて細胞をプレインキュベートした後に、細胞を16.7mMのグルコースで１時間刺激し、培地中へのインスリン分泌を測定した。興味深いことに、オロモーシンは用量依存的に高グルコース刺激インスリン分泌を促進した。一方、低グルコース条件下では、オロモーシンによるCdk5の阻害はインスリン分泌を促進しなかった（図６c）。さらに、イソオロモーシン（オロモーシンの構造異性体）は、インスリン分泌に影響を及ぼさなかった（図６d）。Cdk5阻害によるインスリン分泌の誘導は、また、ロスコビチン（別の、周知のCdk5インヒビター）を用いても確認された（データなし）。
【００８５】
K+ATPチャネル遮断薬であって、糖尿病の治療に広く使われているグリベンクラミドは、膜脱分極を直接誘発し、次いで高グルコース刺激なしにインスリン分泌を誘起することができる（図６e、対照、42.5±2.9；グリベンクラミド116.3±1.0μg/h）。オロモーシンは、グリベンクラミドによって誘発されたインスリン分泌を劇的に促進した（図６e、グリベンクラミド+オロモーシン、278.8±28.7μg/h）。オロモーシンのこの相加作用は、高グルコース状態でも観察された（図６f、グリベンクラミド、412.5±35.7；グリベンクラミド+オロモーシン、636.3±35.9μg/h）。高グルコースによって刺激されるインスリン分泌のオロモーシン依存性促進は、ジアゾキシド（K+ATPチャネル開口剤）によって、完全に抑制された（図６g）。インスリン分泌は、K+ATPチャネルに依存する経路とサイクリックAMPが重要なメディエーターであるK+ATPチャネル非依存的経路の二つの異なる経路によって主に刺激される（Renstrom, E. et al. J. Physiol. 502, 105-118 (1997)）。Cdk5がサイクリックAMP依存性インスリン分泌を調節するかどうかを、次に調べた。フォルスコリンは、高グルコース刺激なしでMIN6細胞におけるインスリン分泌を誘発し、オロモーシンはフォルスコリンによって誘発されたインスリン分泌に影響を及ぼさなかった（図６h、フォルスコリン、122.7±9.3；フォルスコリン±オロモーシン、136.5±5.3、P > 0.05）。これらの結果は、Cdk5がグルコースに刺激されたインスリン分泌をK+ATPチャネルの下流で調節することを示唆し、Cdk5阻害は高グルコースで刺激されたインスリン分泌を促進するが、低グルコース状態では促進しない。
【００８６】
図６は、Cdk5阻害は、MIN6細胞においてグルコースで刺激されたインスリン分泌を促進することを示す。
【００８７】
図６aは、各々のラット組織とMIN6細胞中のCdk5活性の比較を示す。Cdk5は、抗Cdk5抗体（SantaCruz、C8）を用いて、示された組織とMIN6細胞から免疫沈降した。キナーゼ活性は、基質としてヒストン H1を用いて測定した。
【００８８】
図６bは、ラット膵臓ランゲルハンス島およびMIN6細胞中のp35 mRNAの相対的発現を示す。p35 mRNAの発現は、FKBPに対して標準化し、相対的定量的PCRを用いてラット脳での発現と比較した。
【００８９】
図６cは、MIN6細胞におけるインスリン分泌に対するオロモーシンの効果を示す。
【００９０】
細胞は、示された濃度のオロモーシンで30分間処理され、オロモーシンの存在下で2.8mMグルコース（白色バー）または17.6mMグルコース（グレーバー）を含むKRBにより１時間刺激した。インスリン濃度は、RIAで測定した。各々n = 6で *P < 0.01（**P < 0.001）である。
【００９１】
図６dは、インスリン分泌に対するイソオロモーシンの効果を示す。
【００９２】
MIN6細胞を、20μMオロモーシンまたは20μMのイソオロモーシンで処理した。インスリン分泌は、図６cで示される方法と同一の方法で比較した。各々n=5で、*P < 0.01である。
【００９３】
図６eおよび図６fは、低グルコース（2.8mM（図６e））または高グルコース（17.6mM（図６f））を含むKRB中でグリベンクラミド誘発インスリン分泌に対するオロモーシンの効果を示す。各々n=5で、*P < 0.01（**P < 0.001）である。
【００９４】
図６gは、ジアゾキシドによるオロモーシン誘発インスリン分泌の阻害を示す。
【００９５】
細胞は、50μMオロモーシンの存在または非存在下で30分間処理し、インスリン分泌を100μMジアゾキシドの存在下で17.6mMグルコースによって刺激した。各々n = 6である。
【００９６】
図６hは、フォルコリン刺激インスリン分泌に対するオロモーシンの効果を示す。
【００９７】
細胞を50μMオロモーシンで30分間プレインキュベートし、2.8mMグルコースを含むKRB中の10μMフォルスコリンによりインスリン分泌を刺激した。各々n = 6である。
【００９８】
膵臓β細胞でのK+ATPチャネルの閉鎖の後、続いてL-VDCCを通してのCa2+流入が起こる（Bratanova-Tochkova, TK. et al. Diabetes 51, S83-90 (2002)）。Cdk5がグルコース刺激の後にCa2+流入に影響する可能性がある。グルコースおよびグリベンクラミドによる刺激の後のMIN6細胞の中のCa2+の動態は、Ca2+イメージングを用いて調べられた。オロモーシンは、グルコースおよびグリベンクラミドの非存在下では、Ca2+流入に影響を及ぼさなかった（図７a-1、７a-2、７b-1および７b-2）。しかしながら、オロモーシン存在下ではグルコース（114.4±2.1%、図７a-1および７a-2）およびグリベンクラミド（129±4.5%、図７b-1および７b-2）によって刺激されるCa2+流入が促進された。これらの結果は、Cdk5阻害によるインスリン分泌の増加がオロモーシンによって増強されたCa2+流入によることを示す。オロモーシンが直接L-VDCC活性に影響を及ぼしたかどうかを調査するために、MIN6細胞において細胞全体のCa2+電流に対する阻害剤の影響を調べた。オロモーシンによるCdk5の阻害は、-40mVから+60mVのステップ-パルスによって誘導される内向きCa2+電流を増強した（図７c）。オロモーシン処理したMIN6細胞で10mVまでの脱分極によって誘導されるピークCa2+電流（-20.1±1.59 A/F）は、対照細胞（-15.1±1.67 A/F）よりかなり高かった。さらに、Cdk5によるCa2+電流の調節を確認するために、Cdk5キナーゼ活性が非常に低いp35ノックアウトマウスから単離したβ細胞のCa2+電流を調べた（図７d）。p35欠損マウスのβ細胞で20mVまでの脱分極によって誘導されるCa2+電流は、野生型マウスに比較して増強された（p35欠損、-18.9±2.16 A/F；野生型、-27.4±3.48 A/F）。これらの結果は、Cdk5が膵臓β細胞におけるVDCCの調節に重要な役割を果たすことを示唆する。
【００９９】
図７は、MIN6細胞中のCa2+動員に対するオロモーシンの効果を示す。
【０１００】
図７a-1、７a-2、７b-1および７b-2に示す検討において、細胞を、50μMのオロモーシンの存在または非存在下で30分間5μM Fura-2で負荷した。洗浄後、細胞を17.6mMのグルコース(７a-1および７a-2)、または100nMグリベンクラミド（7b-1および７b-2）で刺激した。Ca2+の濃度は340/380nmの蛍光発光の比として示した。左のグラフはCa2+濃度変化の代表的な跡を示し、右のグラフは最大Ca2+流入を示す。20〜30の個々の細胞からのデータを実験毎に集め、全体の平均を算出し、3〜4の実験毎に標準化した。*P < 0.01である。
【０１０１】
図７cに示すように、MIN6細胞におけるVDCCを通しての全体の細胞Ba2+電流の電流-電圧の関係が50μMオロモーシンの存在（黒丸）または非存在（白丸）下で示された。各々n=15（*P < 0.04）である。
【０１０２】
図７dは、野生型マウス（黒丸）またはp35 KOマウス（白丸）から単離された１個のβ細胞中の全体の細胞Ba2+電流を示す。各々n=18（*P < 0.05）である。
【０１０３】
次に、膵臓β細胞におけるVDCCからのCdk5に依存するCa2+流入の調節の正確な機構を調べた。Ca2+チャネル電流の変化はまだ知られていないが、Cdk5はニューロンにおいてP/Q型Ca2+チャネルのα1Aサブユニットをリン酸化することが報告されている（Tomizawa, K. et al. J. Neurosci. 22, 2590-2597 (2002)）。プロテインキナーゼＡ（PKA）およびプロテインキナーゼC（PKC）はVDCCのα1Cサブユニットの心臓性アイソフォームのCOOHおよびNH2末端をリン酸化する（De, Jongh, KS. et al. Biochemistry 35, 10392-10402. (1996); Gao, T. et al. Neuron 19, 185-196 (1997); McHugh D et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 97, 12334-12338 (2000)）。膵臓β細胞で、α1Cサブユニットは主要なカルシウムチャネルであり、インスリン分泌のために必要である（Schulla, V. et al. EMBO. J. 22, 3844-3854 (2003)）。しかしながら、膵臓細胞中のL-VDCCのα1CサブユニットのNH2およびCOOH末端ドメインにCdk5が選好するアミノ酸配列は存在しない。本発明者らは、サブユニット中の細胞内LoopII-III（LII-III）がin vitroでCdk5によってリン酸化されることを発見した。GST-融合マウスLII-IIIは、in vitroにおいてCdk5の良い基質であった（図８b）。LII-IIIのSer783の部位のアミノ酸配列（SPEK）がCdk5が選好する配列であり、配列は哺乳類とゼブラフィッシュ間で保存されているので、Cdk5がLII-IIIのSer783の部位でリン酸化したと推測された（図８a）。Ser783がAlaへ変わった変異体LII-IIIは、Cdk5に依存するリン酸化が阻止された（図８b）。Cdk5が膵臓β細胞でSer783の部位でL-VDCCのα1Cサブユニットをリン酸化するかどうかを示すために、リン酸化Ser783に対する特異的な抗体を作製し（図８c）、該抗体を用いてMIN6細胞におけるリン酸化を調べた。細胞において、Cdk5インヒビター存在下でリン酸化が減少したのに対して、Ser783の部位はオロモーシン非存在下でリン酸化された（図８d）。Ｎ型およびP/Q型VDCCは25kDa（SNAP-25）およびシンタキシンのシナプトソームのタンパク質などの開口分泌機構に関係するいくつかのタンパク質と会合しており、いくつかのタンパク質はニューロンにおいて小胞膜タンパク質のシナプトブレビンとのSNARE複合体を含む（Yokoyama, CT. et al. J. Neurosci. 17, 6929-6938 (1997)）。シナプスタンパク質の相互作用（synprint）部位はVDCCの細胞内のLoopII-III（LII-III）に局在化しており、会合はリン酸化によって調節される。本発明において、Ser783の部位のリン酸化がin vitroでSNAREタンパク質とSNAP-25とシンタキシン1aなどとの相互作用に影響したかどうかを調べた。精製したシンタキシンおよびSNAP-25をCdk5/p35の存在下または非存在下でGST- LII-IIIと共にインキュベートし、相互作用をウエスタンブロット分析によって調べた（図８e）。Cdk5/p35およびATPの存在下で、シンタキシンおよびSNAP-25とLII-IIIの結合が阻害された（図８e）。SNAREタンパク質相互作用によるLII-IIIのCdk5依存性リン酸化の阻害効果は、MIN6細胞の抽出液を用いてさらに確認された。Cdk5/p35によりリン酸化されたGST-LII-IIIを細胞可溶化物と共にインキュベートし、SNAP-25およびシンタキシンとの相互作用を調べた。Cdk5によるLII-IIIのリン酸化は、SNAP-25およびシンタキシンとの結合を有意に阻害した（図８e）。これらの結果は、Cdk5が膵臓β細胞でL-VDCCのLII-IIIをリン酸化し、その結果、SNAREタンパク質との相互作用を破壊することを示唆する。
【０１０４】
図８は、シンタキシンおよびSNAP-25との相互作用に対するloopII-IIIドメインのリン酸化の効果を示す。
【０１０５】
図８aは、loopII-IIIドメインの保存ドメインを下線（一重および二重）で示した。二重下線部は、Cdk5によってリン酸化されると思われるモチーフを示す。
【０１０６】
図８bに示す検討において、CaV1.2（754a.a.-900a.a.）由来loopII-IIIとのGSTコンジュゲートまたはセリン783のアラニンへの変異を含むloopII-IIIを示された時間32℃でCdk5/p35によってリン酸化した。32P-ATPの取込みをチェレンコフカウント（c.p.m.）により測定した。
【０１０７】
図８cに示す検討において、野生型loopII-IIIまたはloopII-IIIのアラニン変異体（S783A）をCdk5/p35により１時間リン酸化した。loopII-IIIのリン酸化をリン酸セリン783に対する特異的抗体を用いてウエスタンブロットで測定した。
【０１０８】
図８dに示す検討において、50μMのオロモーシンで処理されたまたはされていないMIN6細胞を溶解した。CaV1.2は免疫沈降され、セリン783のリン酸化はウエスタンブロットで測定した。
【０１０９】
図８eに示す検討において、グルタチオンビーズ上に固定化されたGST-loopII-III（100pmol）をCdk5/p35によってリン酸化し、シナタキシン(synataxin)１Ａ（50pmol）またはSNAP-25（50pmol）と共にインキュベートした。結合したタンパク質は、ウエスタンブロットによって検出した。
【０１１０】
図８fに示す検討において、リン酸化または非リン酸化GST-loopII-IIIを、MIN6溶解液からSNAP-25およびシンタキシンを共沈させるのに用いた。
【０１１１】
ラット膵臓ランゲルハンス島からのインスリン分泌に対するCdk5阻害剤の効果を調べた。MIN6細胞を用いた結果（図６a）によれば、オロモーシンは単離したランゲルハンス島で用量依存的にグルコース刺激インスリン分泌を促進したのに対して、低グルコースでは、阻害剤は分泌に影響を及ぼさなかった（図９a）。最後に、Cdk5阻害がin vivoでインスリン分泌を促進するかどうかを調べた。腹腔内グルコース負荷試験を、p35欠損マウスを用いて行った。p35欠損マウスのグルコース注入15分後の血中インスリンレベル（0.56±0.07ng/ml）は、野生型マウスのインスリンレベル（0.34±0.06ng/ml）より高かった（図９b）。さらに、p35欠損マウスは、野生型マウスと比較して、グルコース適用後に血糖値の顕著な減少を示した（図９c）。
【０１１２】
図９は、Cdk5の阻害は、単離したランゲルハンス島およびin vivoでインスリン分泌を促進することを示す。
【０１１３】
図９aに示す検討において、単離したランゲルハンス島におけるグルコースで刺激されたインスリン分泌を、示された濃度のオロモーシンの存在下で調べた。各々n=6（*P<0.05.）である。
【０１１４】
図９bは、示された時間測定された野生型マウス（黒丸）およびp35-/-マウス（白丸）の血漿中インスリンレベルを示す。各々n=6（*P<0.05.）である。
【０１１５】
図９cに示す検討において、腹腔内グルコースチャレンジ（2g/Kg体重）に反応しての血漿グルコースの変化を野生型マウス（黒丸）およびp35 KOマウス（白丸）で調べた。各々n=6（*P < 0.05）である。
【０１１６】
本検討により、膵臓β細胞においてグルコース刺激で調節される新規なシグナルカスケードが見出された。Cdk5の阻害により、in vitroおよびin vivoでグルコース濃度の上昇に反応して、インスリン分泌が促進された。その効果は、synprint部位におけるリン酸化およびSNAREタンパク質との相互作用の調節を通してのL-VDCCの変化に起因していた。インスリン分泌のCdk5依存性調節の分子的機構を示したことに加えて、本検討の結果は、Cdk5が糖尿病に対する新しい治療のターゲットであり得ることを示す。
【０１１７】
実施例５
糖尿病モデルKK-Ayマウスにおける血糖降下作用
８週令の雄性KK-Ayマウス（日本クレア）３２匹を血糖値について群間で差が出ないように８匹ずつ群分けし、CDK5阻害剤であるロスコビチン（LC Laboratories）の血糖降下作用を検討した。
【０１１８】
ロスコビチンは1mg/kg、10mg/kg、および100mg/kgの用量になるように、0.5%メチルセルロース/生理食塩液にて懸濁液を用いて調整し、1日1回、2週間連日皮下投与を行った。対照群には溶媒のみを投与した。血糖値は実験前日、3日目、7日目、10日目、14日目に測定し、血糖測定器（フリースタイル、ニプロ）により測定を行った。
【０１１９】
図１３に、各群のマウスの経時的な血糖値の変化を、図１４に各群のマウスの経時的な
体重変化を示す。図１３の縦軸の単位はmg/dL、図１４の縦軸の単位はｇである。
【０１２０】
その結果、ロスコビチンの1mg/kgおよび10mg/kg投与群では明らかな血糖降下作用は認められなかったが、100mg/kg投与群において統計学的に有意に血糖値の低下が起こることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
2006051951.tif 000020
【図６ｃ】
2006051951.tif 000021
【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【図６ｆ】
2006051951.tif 000024
【図６ｇ】
2006051951.tif 000025
【図６ｈ】
2006051951.tif 000026
【図７ａ−１】
2006051951.tif 000027
【図７ａ−２】
2006051951.tif 000028
【図７ｂ−１】
2006051951.tif 000029
【図７ｂ−２】
2006051951.tif 000030
【図７ｃ】
2006051951.tif 000031
【図７ｄ】
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【図８ａ】
2006051951.tif 000033
【図８ｂ】
2006051951.tif 000034
【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図８ｅ】
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【図８ｆ】
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【図９ａ】
2006051951.tif 000039
【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2006051951.tif 000048
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2006051951.tif 000050
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