(57)【要約】本発明は、ＭＣＡＦ１又はＭＣＡＦ２に対する抗体を含む、肺癌、子宮頸癌、胃癌、または乳癌等の腫瘍の診断剤、診断キット、およびＭＣＡＦ１又はＭＣＡＦ２に対する抗体を用いる診断方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２に対する抗体を含む、腫瘍の診断剤。
【請求項２】
ＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２に対する抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメントまたはＦａｂ’フラグメントを含む、腫瘍の診断剤。
【請求項３】
前記腫瘍が、肺癌、子宮頸癌、胃癌、または乳癌である、請求項１または２に記載の診断剤。
【請求項４】
前記腫瘍が、子宮頸癌である、請求項３に記載の診断剤。
【請求項５】
被験者由来のサンプルとＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２に対する抗体を接触させる工程；および
前記サンプル中のＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２を検出または測定する工程、
を含む、腫瘍の診断方法。
【請求項６】
前記ＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２に対する抗体として、ＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２に対する抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメントまたはＦａｂ’フラグメントを使用する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
酵素免疫測定法または放射性免疫測定法に従う、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記腫瘍が、肺癌、子宮頸癌、胃癌、または乳癌である、請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記腫瘍が、子宮頸癌である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプルが、被験者由来の組織、細胞、血清、唾液、または尿である、請求項５〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２に対する抗体を含む、腫瘍の診断のためのキット。
【請求項１２】
ＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２に対する抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメントまたはＦａｂ’フラグメントを含む、腫瘍の診断のためのキット。
【請求項１３】
前記腫瘍が、肺癌、子宮頸癌、胃癌、または乳癌である、請求項１１または１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記腫瘍が、子宮頸癌である、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
ＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２に対する抗体を含む、前癌病変の診断剤。
【請求項１６】
前記前癌病変が、子宮頸部の前癌病変である、請求項１５に記載の診断剤。
【請求項１７】
ＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２に対する抗体を含む、前癌病変の診断のためのキット。
【請求項１８】
前記前癌病変が、子宮頸部の前癌病変である、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前癌病変の診断方法であって、
被験者由来のサンプルとＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２に対する抗体とを接触させる工程；および
前記サンプル中のＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２を検出または測定する工程、
を含む、方法。
【請求項２０】
子宮頸癌の前癌病変の診断方法であって、
被験者の子宮頸部またはその近傍組織由来のサンプルと、ＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２に対する抗体を接触させる工程、および
前記サンプル中のＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２を検出または測定する工程、
を含む、方法。
【請求項２１】
ＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２に対する抗体を含む、リンパ節転移の診断剤。
【請求項２２】
前記リンパ節転移が、子宮頸癌のリンパ節転移である、請求項２１に記載の診断剤。
【請求項２３】
ＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２に対する抗体を含む、リンパ節転移の診断のためのキット。
【請求項２４】
前記リンパ節転移が、子宮頸癌のリンパ節転移である、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
リンパ節転移の診断方法であって、
被験者のリンパ節由来のサンプルと、ＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２に対する抗体を接触させる工程、および
前記サンプル中のＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２を検出または測定する工程、
を含む、方法。
【請求項２６】
子宮頸癌のリンパ節転移の診断方法である、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍の診断剤、診断方法、及び診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
一つの個体内で様々に分化した体細胞、幹細胞、異常な場合の不死化細胞、および癌細胞はそれぞれ異なる細胞個性を持っているが、基本的には同一のゲノムを有している。細胞個性の成立は、ゲノムのエピジェネティックな状態が異なることで遺伝子発現パターンが違うことに由来する。一般に、ゲノムのエピジェネティックな状態は、ＤＮＡメチル化とクロマチンによって決められている。発生・発がんの過程で、これらのエピジェネティックな状態が大きく変化することが知られている。
メチル化ＤＮＡ結合ドメイン（ＭＢＤ）タンパク質はメチル化ＤＮＡに特異的に結合して、ヒストン分子の脱アセチル化酵素やメチル化酵素、ヘテロクロマチンタンパク質ＨＰ１等をリクルートすることで、転写不活性なクロマチンを形成している。このように、ＤＮＡメチル化とクロマチンが協調的に遺伝子発現を制御するためには、両者を結びつけるＭＢＤタンパク質複合体の存在が必要である。しかしながら、ＭＢＤタンパク質に結合する因子については十分に解明されていない。
一方、臨床医学・医療において、腫瘍性病変を早期に発見して治療を適用することは極めて重要である。そのためには、腫瘍に特異的な物質あるいは関連物質（以下、腫瘍マーカーと呼ぶ）を体液中または腫瘍細胞・腫瘍組織で検出することが有用な技術となっている。
従来の腫瘍マーカーとしては、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、α−フェトプロテイン、腫瘍関連抗原（ＣＡ１９−９，ＣＡ１２５，前立腺特異抗原）、酵素（前立腺酸フォスファターゼ，ＬＤＨ）、癌遺伝子産物（ｎｅｕ／ｅｒｂＢ２，Ｎ−ｍｙｃ）、ホルモン（ｈＣＧ，ＡＣＴＨ等の異所性ホルモン）が知られている。その検出法として、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫酵素法（ＥＬＩＳＡ）が主に用いられてきた。これらの従来の方法では、特定の組織型の癌を限定的に検出できるが、多種の組織型の腫瘍性病変を共通に検出できない。つまり、組織型が不明の腫瘍性病変に関しては、従来の腫瘍マーカーは効率的な補助診断法ではないという欠点があった。
婦人科のがんで最も一般的な子宮がんの１つに、子宮頸癌がある。子宮頸癌の診断方法には、細胞診、組織診、およびコルポ診がある。細胞診では、癌の部分からこすりとった細胞や、癌から落ちてきたものをガラス板に塗り、色素で染めて顕微鏡で見る。子宮頸癌は、外子宮口の付近から発生することが多いため、この部分を綿棒またはヘラのようなものでこすって細胞診を行う。組織診では、子宮頸部の疑わしい部分から小さな組織をとり、標本をつくって顕微鏡で診断する。コルポ診では、コルポスコープという拡大鏡のような機械で、子宮頸部粘膜表面を拡大して、細かい部分を観察する。
子宮頸癌の進行期分類としては、０期：上皮内癌、Ｉ期：子宮頸部に限局、ＩＩ期：頸部を超えて広がっているが、骨盤壁または膣壁下１／３に達していない、ＩＩＩ期：浸潤が骨盤壁に達するか膣壁下１／３に達する、ＩＶ期：小骨盤をこえて広がっているか、膀胱・直腸粘膜を侵すもの、となっている。０期の癌の前に異形成（軽度、中等度、高度）が前癌病変として存在する。すなわち頸部病変は、軽度異形成および高度異形成を経て上皮内癌、浸潤癌へと進行する。しかし、全ての異形成が癌化するものではなく、高度異形成の２０％が癌に進行し、軽度異形成の２．２％が高度異形成に、０．３％が癌に移行するという報告がある。一方異形成が自然消失するのは生検による組織消失のためであり、細胞診とコルポ診のみの経過観察ではそのほとんどが癌化するという報告もある。他部位の癌と同様に子宮頸癌についても、早期発見・早期治療が癌の治癒率を高めるためには重要である。
細胞診のクラス分類は、Ｉ：正常細胞、ＩＩ：炎症性変化、ＩＩＩａ：軽度異形成、ＩＩＩｂ：高度異形成、ＩＶ：上皮内癌、およびＶ：浸潤癌となっている。細胞診の正診率は、それ単独で癌であると診断することができるほど高くはない。
【発明の開示】
【０００３】
上記のような状況下で、腫瘍の早期診断に有用な腫瘍マーカーが求められている。
本発明は、腫瘍の早期診断に有用な腫瘍マーカーを見出し、これを利用した腫瘍の診断剤、診断方法、及び診断キットを提供することを目的とする。
本発明者らは、ヒトＭＢＤ１カルボキシル末端の転写抑制ドメインに結合する因子として、酵母２ハイブリッド法でＭＣＡＦ（ＭＢＤ１−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ）の２つのヒト分子（ＭＣＡＦ１、ＭＣＡＦ２）を新たに同定した。ＭＣＡＦ１が既知のマウスＡＭ（ＡＴＦａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）のヒト相同分子であったことから、ＭＣＡＦ／ＡＭファミリーと名付けた。ＭＣＡＦ１はヒストンＨ３の９番目のリジン（Ｈ３Ｋ９）のメチル化酵素であるＳＥＴＤＢ１と結合して、そのメチル化酵素活性に必要であること、ＭＢＤ１−ＭＣＡＦ１−ＳＥＴＤＢ１複合体の存在が明らかになった。メチル化ＤＮＡ領域でＭＢＤ１−ＭＣＡＦ１−ＳＥＴＤＢ１はＨ３Ｋ９をメチル化することで、転写抑制とヘテロクロマチン形成を行っている。一方、非メチル化ＤＮＡ領域では、ＭＣＡＦ分子はＳｐ１等の転写因子とともに転写活性化を促進する結果を得た。このように、ＭＣＡＦ／ＡＭファミリーは新しいエピジェネティクス制御因子に位置づけられる。
さらに、本発明者らは、ＭＣＡＦポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法や免疫染色法を行うことにより、ＭＣＡＦ分子が多種類のヒト培養癌細胞株や癌組織で極めて高く発現していることを明らかにした。ＭＣＡＦの癌細胞株や癌組織での発現は、正常の線維芽細胞、癌組織周辺の正常組織での低い発現とは全く異なっていた。これは、ＭＣＡＦ分子が発癌に関連すること、広く癌細胞・癌組織を検出する腫瘍マーカーになり得ることを示唆している。
癌細胞では、ゲノムのエピジェネティックな状態、ヘテロクロマチンが正常細胞とは大きく変化しており、ＭＣＡＦファミリー分子による転写制御およびクロマチン形成が重要な役割を果たす可能性を示唆する。
癌の初期スクリーニングとしては、特定の組織型の癌を検出する腫瘍マーカーではなく、広範囲の組織型の腫瘍性病変を感度良く検出できる腫瘍マーカーを提供することが重要である。本発明で用いる、ＭＣＡＦタンパク質はこのような目的に適した腫瘍マーカーであり、特異的なポリクローナル抗体を用いる腫瘍細胞・腫瘍組織の免疫染色法を行うことにより腫瘍の診断を行うことができる。例えば、ＭＣＡＦ１の染色性に基づいて、染色されない正常細胞と強染色される腫瘍細胞を鑑別することが可能である。
さらに本発明者らは、子宮頸癌が疑われる被験者または子宮頸癌患者由来のサンプルを用いて、抗ＭＣＡＦ１抗体を用いた免疫染色により、ＭＣＡＦ１が子宮頸癌の前癌病変、初期浸潤癌、およびリンパ節転移巣においても高発現していることを見出した。特に、前癌病変、リンパ節転移巣において高発現していることは、子宮頸癌の早期治療、および的確な治療指針の確立にＭＣＡＦタンパク質が非常に有用な診断マーカーとなり得ることを意味する。
したがって、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）ＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２に対する抗体を含む、腫瘍の診断剤。
（２）ＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２に対する抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメントまたはＦａｂ’フラグメントを含む、腫瘍の診断剤。
（３）前記腫瘍が、肺癌、子宮頸癌、胃癌、または乳癌である、上記（１）または（２）に記載の診断剤。
（４）前記腫瘍が、子宮頸癌である、上記（３）に記載の診断剤。
（５）被験者由来のサンプルとＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２に対する抗体を接触させる工程；および
前記サンプル中のＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２を検出または測定する工程、
を含む、腫瘍の診断方法。
（６）前記ＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２に対する抗体として、ＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２に対する抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメントまたはＦａｂ’フラグメントを使用する、上記（５）に記載の方法。
（７）酵素免疫測定法または放射性免疫測定法に従う、上記（５）または（６）に記載の方法。
（８）前記腫瘍が、肺癌、子宮頸癌、胃癌、または乳癌である、上記（５）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）前記腫瘍が、子宮頸癌である、上記（８）に記載の方法。
（１０）前記サンプルが、被験者由来の組織、細胞、血清、唾液、または尿である、上記（５）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）ＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２に対する抗体を含む、腫瘍の診断のためのキット。
（１２）ＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２に対する抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメントまたはＦａｂ’フラグメントを含む、腫瘍の診断のためのキット。
（１３）前記腫瘍が、肺癌、子宮頸癌、胃癌、または乳癌である、上記（１１）または（１２）に記載のキット。
（１４）前記腫瘍が、子宮頸癌である、上記（１３）に記載のキット。
（１５）ＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２に対する抗体を含む、前癌病変の診断剤。
（１６）前記前癌病変が、子宮頸部の前癌病変である、上記（１５）に記載の診断剤。
（１７）ＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２に対する抗体を含む、前癌病変の診断のためのキット。
（１８）前記前癌病変が、子宮頸部の前癌病変である、上記（１７）に記載のキット。
（１９）前癌病変の診断方法であって、
被験者由来のサンプルとＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２に対する抗体とを接触させる工程；および
前記サンプル中のＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２を検出または測定する工程、
を含む、方法。
（２０）子宮頸癌の前癌病変の診断方法であって、
被験者の子宮頸部またはその近傍組織由来のサンプルと、ＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２に対する抗体を接触させる工程、および
前記サンプル中のＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２を検出または測定する工程、
を含む、方法。
（２１）ＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２に対する抗体を含む、リンパ節転移の診断剤。
（２２）前記リンパ節転移が、子宮頸癌のリンパ節転移である、上記（２１）に記載の診断剤。
（２３）ＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２に対する抗体を含む、リンパ節転移の診断のためのキット。
（２４）前記リンパ節転移が、子宮頸癌のリンパ節転移である、上記（２３）に記載のキット。
（２５）リンパ節転移の診断方法であって、
被験者のリンパ節由来のサンプルと、ＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２に対する抗体を接触させる工程、および
前記サンプル中のＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２を検出または測定する工程、
を含む、方法。
（２６）子宮頸癌のリンパ節転移の診断方法である、上記（２５）に記載の方法。
ＭＣＡＦ１タンパク質およびＭＣＡＦ２タンパク質は正常な細胞・組織でほとんど染色されないが、とりわけ、ＭＣＡＦ１は広範囲の組織型の悪性腫瘍（肺癌、子宮癌、子宮頸癌等）で極めて強い染色性を認めた。従って、ＭＣＡＦタンパク質は新しい腫瘍マーカーとして有用であり、その特異抗体を用いた免疫染色法は多種の組織型の腫瘍性病変を病理学的に診断する目的で利用できると考えられる。
ＭＣＡＦタンパク質に対するポリクローナル抗体を用いた臨床検体（細胞診、生検、手術切除組織など）の免疫染色法は、広範囲の組織型の腫瘍細胞の同定、原発巣および浸潤・転移巣での腫瘍細胞の同定、正常組織と腫瘍組織の境界などを明らかにすることができ、腫瘍性病変の診断・治療・予後に大きく貢献すると期待できる。
さらに、ＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２タンパク質に対する抗体を用いた本発明の腫瘍の診断方法、診断剤または診断キットによれば、子宮頸癌の早期発見が可能となる。例えば、０期前の前癌病変（高度異形成）での子宮頸癌リスク群のスクリーニング、または早期ステージ（例えば、Ｉ期〜ＩＩ期；子宮頸部に限局〜初期浸潤癌）での子宮頸癌の診断が可能である。したがって、本発明により、早期治療による子宮頸癌の予防および治癒率の向上を図ることができる。
また、本発明は、子宮頸癌のリンパ節転移の診断にも用いることができるため、的確な治療指針の策定を可能にするという利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、正常肺組織および異なる組織型の肺癌におけるＭＣＡＦ１の免疫染色の結果を示す光学顕微鏡写真である。
図２は、子宮頸癌、子宮体癌、胃癌、乳癌におけるＭＣＡＦ１の免疫染色の結果を示す光学顕微鏡写真である。
図３は、子宮頸癌患者の前癌病変（高度異形成）由来の検体における、ＭＣＡＦ１の免疫染色の結果を示す光学顕微鏡写真である。
図４は、子宮頸癌患者の早期ステージ（初期湿潤癌）由来の検体における、ＭＣＡＦ１の免疫染色の結果を示す光学顕微鏡写真である。
図５は、子宮頸癌患者のリンパ節転移巣由来の検体における、ＭＣＡＦ１の免疫染色の結果を示す光学顕微鏡写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明者らは、ＭＣＡＦ１又はＭＣＡＦ２が腫瘍の診断に有用な腫瘍マーカーであることを見いだした。即ち、本発明は、ＭＣＡＦ１又はＭＣＡＦ２に対する抗体を含む腫瘍の診断剤に関する。
ＭＣＡＦ１又はＭＣＡＦ２のアミノ酸配列は公知であり、例えば、ヒトＭＢＤ１−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ−１（ＭＣＡＦ１、旧名ＭＣＡＦ）は、ＮＣＢＩデータベースに登録番号ＡＦ４２５６５０として登録されており、また、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．２３，ｐ．２８３４−２８４３，２００３に記載されている。また、ヒトＭＢＤ１−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ−２（ＭＣＡＦ２）は、ＮＣＢＩデータベースに登録番号ＮＭ０２４９９７として登録されている。従って、ＭＣＡＦ１タンパク質、ＭＣＡＦ２タンパク質、並びにそれらをコードする遺伝子は当業者であれば容易に取得することができる。なお、本明細書中、ＭＣＡＦ１タンパク質およびＭＣＡＦ２タンパク質それぞれを、単にＭＣＡＦ１およびＭＣＡＦ２と呼ぶことがある。
（診断剤）
本発明は、ＭＣＡＦ１又はＭＣＡＦ２に対する抗体を含む腫瘍の診断剤を提供する。
本明細書中、「抗ＭＣＡＦ１（またはＭＣＡＦ２）抗体」または「ＭＣＡＦ１（またはＭＣＡＦ２）に対する抗体」は、ＭＣＡＦ１（またはＭＣＡＦ２）に特異的に結合する抗体をいう。本発明に使用する抗体は、以下に詳述するように、動物を免疫化し、血清（ポリクローナル）または脾臓細胞を回収すること（適切な細胞との融合によるハイブリドーマの作製のため）を含む、従来の方法により作製することができる。
本明細書中、抗体が、あるタンパク質またはその断片に「特異的に結合する」とは、その抗体が他のアミノ酸配列に対するその親和性よりも、これらのタンパク質またはその断片の特定のアミノ酸配列に対して実質的に高い親和性で結合することを意味する。ここで、「実質的に高い親和性」とは、所望の測定装置によって、その特定のアミノ酸配列を他のアミノ酸配列から区別して検出することが可能な程度に高い親和性を意味し、典型的には、結合定数（Ｋａ）が少なくとも１０７Ｍ−１、好ましくは、少なくとも１０８Ｍ−１、より好ましくは、１０９Ｍ−１、さらにより好ましくは、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１またはそれより高い、例えば、最高で１０１３Ｍ−１またはそれより高いものであるような結合親和性を意味する。
本発明で用いるＭＣＡＦ１又はＭＣＡＦ２に対する抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、それらは当業者に公知の方法（例えば、「新生化学実験講座１，タンパク質Ｉ，３８９−４０６，東京化学同人」参照）により調製することが可能である。ＭＣＡＦ１又はＭＣＡＦ２タンパク質はアミノ酸配列が前記のように公知であり、該アミノ酸配列に基づいて通常のタンパク質発現技術を用いて製造することができる。また、ＭＣＡＦ１又はＭＣＡＦ２の部分ペプチドは、ＭＣＡＦ１又はＭＣＡＦ２のアミノ酸配列から適当な部分配列を選択し、通常のペプチド合成技術を用いて製造できる。
ＭＣＡＦ１又はＭＣＡＦ２に対するポリクローナル抗体の調製は、例えば、ウサギ、モルモット、マウス、ニワトリなどの動物に適量のＭＣＡＦ１又はＭＣＡＦ２タンパク質またはその部分ペプチドを投与する。投与は、抗体産生を促進するアジュバント（ＦＩＡやＦＣＡ）と共に行ってもよい。投与は、通常、数週間ごとに行う。免疫を複数回行うことにより、抗体価を上昇させることができる。最終免疫後、免疫動物から採血を行うことにより抗血清が得られる。この抗血清に対し、例えば、硫酸アンモニウム沈殿や陰イオンクロマトグラフィーによる分画、プロテインＡや固定化抗原を用いたアフィニティー精製を行うことにより、ポリクローナル抗体を調製することができる。
一方、ＭＣＡＦ１又はＭＣＡＦ２に対するモノクローナル抗体の調製は、例えば、ＭＣＡＦ１又はＭＣＡＦ２タンパク質もしくはその部分ペプチドを、上記と同様に動物に免疫し、最終免疫後、この免疫動物から脾臓またはリンパ節を採取する。この脾臓またはリンパ節に含まれる抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコールなどを用いて融合し、ハイブリドーマを調製する。目的のハイブリドーマをスクリーニングし、これを培養し、その培養上清からモノクローナル抗体を調製することができる。モノクローナル抗体の精製は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿や陰イオンクロマトグラフィーによる分画、プロテインＡや固定化抗原を用いたアフィニティー精製により行うことができる。尚、本発明の目的のためには、抗体はＭＣＡＦ１又はＭＣＡＦ２のいかなるエピトープを認識するものであってもよい。
また、本発明では、上記した抗体の断片を使用してもよい。抗体の断片としては、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント等が挙げられる。これらの断片は、元の抗体と実質的に同じ抗原特異性を示すものとする（本明細書中、「機能的断片」と呼ぶ）。抗体の機能的断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）、もしくはＣＤＲを含むペプチドのような抗体の機能的断片が含まれる。さらに、ヒト型（またはヒト化）抗体（例えば、ＣＤＲ移植完全ヒト型抗体）のような誘導体なども含まれる。
診断剤としての正確性のためには、ＭＣＡＦ１又はＭＣＡＦ２に対する抗体はヒト型抗体もしくはヒト抗体であることが好ましい。ヒト型抗体は、例えば、マウス−ヒトキメラ抗体であれば、ＭＣＡＦ１又はＭＣＡＦ２タンパク質に対する抗体を産生するマウス細胞から抗体遺伝子を単離し、そのＨ鎖定常部をヒトＩｇＥ  Ｈ鎖定常部遺伝子に組換え、マウス骨髄腫細胞に導入することにより調製できる。また、ヒト抗体は、免疫系をヒトと入れ換えたマウスにＭＣＡＦ１又はＭＣＡＦ２タンパク質を免疫することにより調製することが可能である。
本明細書の実施例において具体的に記載するように、本発明のＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２に対する抗体を含有する診断剤は、ＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２を発現または高発現することによって特徴づけられる任意の疾患（例えば、子宮頸癌、子宮体癌、肺癌、乳癌、胃癌など）の診断に適している。
本発明の癌の診断剤に使用するためのＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２に対する抗体は、必要に応じて、モニタリング等のための標識物質（例えば、放射性同位元素、蛍光物質など）で標識されていてもよい。
本発明において使用するＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２に対する抗体が、放射性同位元素または蛍光物質などの標識物質で標識されている薬剤は、公知の手法に基づいて作製することができる。
本発明の診断剤には、上記ＭＣＡＦ１又はＭＣＡＦ２に対する抗体の他に、常法に従い、必要に応じて適切な担体、賦形剤等を適宜含有させることができる。例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。
本発明の診断剤で診断できる腫瘍の種類は特に限定されず、良性腫瘍及び悪性腫瘍の全てを包含する。悪性腫瘍である癌の具体例としては、悪性黒色腫、悪性リンパ腫、消化器癌、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、尿管腫瘍、胆嚢癌、胆管癌、胆道癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、睾丸腫瘍、上顎癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮体癌、前立腺癌、甲状腺癌、脳腫瘍、カポジ肉腫、血管腫、白血病、真性多血症、神経芽腫、網膜芽腫、骨髄腫、膀胱腫、肉腫、骨肉腫、筋肉腫、皮膚癌、基底細胞癌、皮膚付属器癌、皮膚転移癌、皮膚黒色腫などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。なお、本明細書中、用語「腫瘍」と「癌」とは、互換的に使用される。
（診断方法）
本発明はさらに、サンプルとＭＣＡＦ１又はＭＣＡＦ２に対する抗体または上記本発明の診断剤を接触させることを含む、腫瘍の診断方法を提供する。
本発明において、「サンプル」は、腫瘍に罹患しているおそれのある被験者または腫瘍に罹患している被験者から得られる細胞、組織、血清、唾液、尿等が挙げられるが、特に好ましくは組織又は血清である。サンプルと上記抗体との接触は、当分野において通常行われている方法に基づいて行えばよく、特に限定するものではない。診断は、例えばサンプルと上記抗体との接触の後、サンプル中に存在し得るＭＣＡＦ１又はＭＣＡＦ２に対する抗体との特異的結合を、蛍光物質や発光物質、酵素等で標識した二次抗体等を使用して定量的に検出することにより行うことができる。また、診断のための反応をウェル等の液相中で行ってもよく、あるいはＭＣＡＦ１又はＭＣＡＦ２に対する抗体を固定した固相支持体上で行ってもよい。このような方法は、ＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２を例えば、正常細胞と比較して高発現することによって特徴づけられる疾患、代表的には、肺癌、子宮頸癌、胃癌、乳癌等を含む癌の診断のために使用することができる。通常、ＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２と抗ＭＣＡＦ１（またはＭＣＡＦ２）抗体との結合体のレベル（または量）に基づいて、生体試料中のＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２のレベル（または量）が評価される。生体試料中のＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２のレベルと正常なヒトのコントロールで測定したレベルとを比較し、その変化（または差違）に基づいて、癌の存在が診断される。
この場合、腫瘍に罹患していない正常なサンプル、あるいは腫瘍であることが判明しているサンプルを用いて予め作製した標準値と比較することによって、測定された値が腫瘍として陽性であるか否かを判定することができる。また、診断の際には、多数の腫瘍患者と健常人の血清中のＭＣＡＦ１又はＭＣＡＦ２の量を測定して、カットオフ値を設定することができる。通常、正常ヒトコントロールと比較して高いＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２のレベルは、癌の存在を示す。この場合、より好ましくは、少なくとも２倍、最も好ましくは、５倍程度高いＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２のレベルが、被験者が癌を有することを示す陽性結果である。あるいは、生体試料中のＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２の存在そのもの（すなわち、利用できる検出手段により検出可能な量のＭＣＡＦ１またはＭＣＡＦ２）が、被験者における癌の存在を示し得る。
ＭＣＡＦ１又はＭＣＡＦ２に対する抗体を用いて、サンプル中のＭＣＡＦ１又はＭＣＡＦ２を免疫学的に検出する方法の具体例としては、サンドイッチＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、又は放射性免疫測定法（ＲＩＡ）などがあり、これらの技術は当業者に周知である。例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡでは、抗原認識部位の異なる２種類の抗体を用意し、一方の抗体はプレートに吸着させておく。サンプルをプレートに接触させて反応を行い、さらに抗原認識部位の異なる他方の抗体を反応させ、さらにペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素で標識した抗イムノグロブリン抗体を反応させる。酵素により発色する基質を添加して発色反応させた後、分光光度計により発色強度を測定することにより、サンプル中のＭＣＡＦ１又はＭＣＡＦ２の検出または測定を行うことができる。また、放射性免疫測定法では、酵素でなく１２５Ｉ等の放射性物質で標識した抗体を用いて、酵素免疫測定法と同様の操作を行い、シンチレーションカウンターで放射線を測定する。
上記に例示した個々の測定法以外にも、例えば、ウエスタンブロット分析、サンドイッチ免疫測定法、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、時間分解蛍光免疫測定法（ＴＲＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、ラテックス凝集法、免疫沈降アッセイ、沈降素反応法、ゲル拡散沈降素反応法、免疫拡散検定法、凝集素検定法、補体結合検定法、免疫放射分析検定法、蛍光免疫検定法、またはプロテインＡ免疫検定法などのいずれかの免疫学的な測定方法を本発明において用いることができる。
本発明の診断方法は、腫瘍に罹患しているか否かの診断に用いることができる他、腫瘍に対する治療の効果を確認するために経時的に行うこともできる。
本明細書中、「子宮頸部またはその近傍組織」という場合の「近傍組織」とは、子宮頸部の周囲の組織、例えば、子宮傍組織、骨盤壁、膀胱・直腸の粘膜などの、子宮頸部の癌が拡がる可能性のある組織を指すものとする。
（診断キット）
本発明はさらに、ＭＣＡＦ１又はＭＣＡＦ２に対する抗体を含む、腫瘍の診断のためのキットを提供する。本発明のキットには、上記したＭＣＡＦ１又はＭＣＡＦ２に対する抗体が少なくとも含まれ、その他に、サンプル中のＭＣＡＦ１又はＭＣＡＦ２を検出するのに必要な試薬（例えば、二次抗体、発色試薬、緩衝液など）、または製造業者の使用説明書などを適宜含めることができる。また、ＭＣＡＦ１又はＭＣＡＦ２に対する抗体は、マイクロタイタープレートなどのポリスチレンプレート、ガラス製または合成樹脂製の粒状物（ビーズ）、ガラス製または合成樹脂製の球状物（ボール）、ラテックス、磁性粒子、ニトロセルロース膜などの各種メンブレン、合成樹脂製の試験管、シリカゲルプレートなどの固相支持体に結合された状態で本発明のキットに含まれていてもよい。
以下、実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０００６】
［実施例１］ＭＣＡＦ１のリコンビナントタンパク質とポリクローナル抗体の作成
（１）ＭＣＡＦ１のリコンビナントタンパク質の合成
ヒトＭＣＡＦ１のアミノ基末端領域（アミノ酸番号：１−３３４）に対応するｃＤＮＡを下記の合成オリゴヌクレオチド・プライマーを用いたＰＣＲ法で増幅する。鋳型としては、ｐｃＤＮＡ３−ＭＣＡＦ１のベクター（Ｉｃｈｉｍｕｒａ  Ｔ，Ｗａｔａｎａｂｅ  ＳＳ，Ｓａｋａｍｏｔｏ  Ｙ，Ａｏｔｏ  Ｔ，Ｆｕｊｉｔａ  Ｎ，ａｎｄ  Ｎａｋａｏ  Ｍ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＭＢＤ１  ａｎｄ  ＭＣＡＦ／ＡＭ  ｆａｍｉｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８０：１３９２８−１３９３５，２００５；及びＦｕｊｉｔａ  Ｎ，Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｓ，Ｉｃｈｉｍｕｒａ  Ｔ，  Ｏｈｋｕｍａ  Ｙ，Ｃｈｉｂａ  Ｔ，Ｓａｙａ  Ｈ，Ｎａｋａｏ  Ｍ，ＭＣＡＦ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ＭＢＤ１−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２３：２８３４−２８４３，２００３）を使用する。増幅条件は、９４℃（１分間）、６０℃（１分間）、７２℃（２分間）の３５サイクルで行う。プライマー配列は、センス鎖  ５’−ＣＧＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＣＡＧＴＴＴＡＧＡＡＧＡＡＣＣＴＣＡＧ−３’（配列番号１）、アンチセンス鎖  ５’−ＴＴＴＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＴＴＧＡＧＴＣＴＴＴＡＣＴＣＴＧＡＡＴＴＴＧＣＴＣ−３’（配列番号２）を用いる（下線が制限酵素配列）。ＰＣＲ産物の両端を制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化して、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合のタンパク質発現用ベクターｐＧＥＸ−２ＴＨ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に組み込む。できたＧＳＴ−ＭＣＡＦ１（１−３３４）発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１ｓｔａｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に導入して、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ、以下ａｍｐと略）を含むＬＢプレート（１リットル当たり、ＮａＣｌ  １０ｇ，ｔｒｙｐｔｏｎｅ  １０ｇ，ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ  ５ｇ，ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整）の上で選択する。１．５リットルのＬＢ／ａｍｐ培地の中で、ＧＳＴ−ＭＣＡＦ１（１−３３４）を発現する大腸菌を３７で培養する。大腸菌濃度のＯ．Ｄ．値が約１．０になる時点で培養温度を２５℃に下げて、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−Ｔｈｉｏ−β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．２ｍＭになるように加えた後に、２５℃で２０時間培養を行う。大腸菌を６，０００ｒｐｍ、５分間の遠心にて回収して、１％トリトンＸ−１００を含むｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）にて溶解し、超音波破砕法で大腸菌を破砕する。１，２００ｒｐｍ、２０分の遠心で不溶性の分画を沈殿させて、上清を別容器に移し、グルタチオンアガロースビーズ（２００ｍｇ）を加えた後に、４℃で１時間振盪する。ビーズを１％トリトン  Ｘ−１００を含むＰＢＳで洗浄し、さらにＰＢＳ単独で洗浄を行うことで、不純物等を除く。最終的にビーズに結合したタンパク質は５ｍＭのグルタチオン（ＧＳＨ）を加えることでビーズから流出する。得られたリコンビナントタンパク質溶液を半透膜チューブに入れて、ＰＢＳに対して透析を行う。
（２）ＭＣＡＦ１に対するポリクローナル抗体の作成
ＧＳＴ融合ＭＣＡＦ１タンパク質（１ｍｇ）を含む溶液に等量のＦｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｔｅを加えて、よく混合した後にウサギ（１２週令）に皮内接種を行う。以後３週間ごとに、同リコンビナントタンパク質（０．５ｍｇ）を含む溶液に等量のＦｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｉｍｃｏｍｐｌｅｔｅを加えて、同様に接種することで繰り返し免疫を行う。４回の増幅接種を行った後に、ウサギの抗血清を採取する。
（３）ＭＣＡＦ１に対するポリクローナル抗体の精製
抗体のアフィニティー精製のために、ＭＣＡＦ１の同じアミノ基末端領域（アミノ酸番号：１−３３４）をＨｉｓ融合タンパク質発現用ベクターｐＲＳＥＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み込み、この発現用ベクターを大腸菌ＢＬ２１ｓｔａｒに導入して、１．５リットルのＬＢ／ａｍｐ培地で３７℃にて培養を行う。大腸菌のＯ．Ｄ．値が約１．０になった段階で培養温度を２５℃に下げて、ＩＰＴＧを最終濃度０．２ｍＭになるように加えた後、２５℃にて２０時間の培養を行う。大腸菌を６，０００ｒｐｍ、５分間遠心にて回収して、１％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳで溶解して、超音波破砕法で大腸菌を破砕する。１，２００ｒｐｍ、２０分間の遠心で不溶性の分画を沈殿させて、上清を別容器に移して、ニッケルビーズをゲル容量（２ｍｌ）加えた後に、４℃で１時間振盪する。ビーズを１％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳで洗浄して、さらにＰＢＳ単独で洗浄を行い、不純物等を除く。最終的にビーズに結合したタンパク質を３００ｍＭイミダゾールで流出させて、ＰＢＳに対して透析を行う。抗体精製用のＨｉｓ融合ＭＣＡＦ１（１−３３４）タンパク質（１ｍｇ）を２００ｍｌ容量のＡｆｆｉｇｅｌ  １５（ＢｉｏＲａｄ）と混合し、ビーズ上に同タンパク質を固定する。エタノールアミン溶液（１Ｍ）を用いて余分の結合基を飽和させた後に、ウサギ抗血清と混合し、４℃で１２時間程度振盪する。ビーズを抗体洗浄バッファー（１Ｍ  ｕｒｅａ，１Ｍ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４））にて洗浄後、溶出バッファー（０．１Ｍ  ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．５），１０％ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）にて溶出し、直ちに２０分の１容量の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を用いて中和を行う。その後、抗体溶液をＰＢＳに対して透析して、ＭＣＡＦ１のアミノ基末領領域を認識する特異的な抗体を得る。
［実施例２］ＭＣＡＦ２のリコンビナントタンパク質とポリクローナル抗体の作成
（１）ＭＣＡＦ２のリコンビナントタンパク質の合成
ヒトＭＣＡＦ２の完全長（アミノ酸番号：１−６８１）を下記の合成オリゴヌクレオチド・プライマーを用いたＰＣＲ法によって遺伝子増幅する。鋳型としては、ｐｃＤＮＡ３−ＭＣＡＦ２のベクター（Ｉｃｈｉｍｕｒａ  Ｔ，Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｓ，Ｓａｋａｍｏｔｏ  Ｙ，Ａｏｔｏ  Ｔ，Ｆｕｊｉｔａ  Ｎ，ａｎｄ  Ｎａｋａｏ  Ｍ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＭＢＤ１  ａｎｄ  ＭＣＡＦ／ＡＭ  ｆａｍｉｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８０：１３９２８−１３９３５，２００５）を使用する。増幅条件は、９４℃（１分間）、６０℃（１分間）、７２℃（２分間）の３５サイクルで行う。プライマー配列は、センス鎖  ５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＣＡＡＧＴＣＣＡＧＡＴＡＧＡＡＧＴＡ−３’（配列番号３）、アンチセンス鎖  ５’−ＡＴＴＧＧＴＡＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＧＴＡＡＧＡＴＴＴＴＣＡＧＡＡＡＡＣＣ−３’（配列番号４）を用いる（下線が制限酵素配列）。ＰＣＲ産物の両端を制限酵素ＸｈｏＩを用いて消化して、ＧＳＴ融合のタンパク質発現用ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ１に組み込む。できたＧＳＴ−ＭＣＡＦ２（１−６８１）発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１ｓｔａｒに導入して、１．５リットルのＬＢ／ａｍｐ培地で３７℃にて培養を行う。大腸菌濃度のＯ．Ｄ．値が約１．０になる時点で培養温度を２５℃に下げて、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−Ｔｈｉｏ−β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．２ｍＭになるように加えた後、２５℃にて２０時間培養を行う。大腸菌を６，０００ｒｐｍ、５分間の遠心にて回収して、１％トリトンＸ−１００を含むＰｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）にて溶解し、超音波破砕法で大腸菌の細胞壁を破壊する。１，２００ｒｐｍ、２０分の遠心にて不溶性の分画を沈殿させて、上清を別容器に取り、グルタチオンアガロースビーズ（２００ｍｇ）を加えた後に、４℃で１時間振盪する。ビーズを１％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳで洗浄して、さらにＰＢＳ単独で洗浄を加えて、不純物等を除く。以上の過程はＭＣＡＦ１の場合と同様であるが、ＭＣＡＦ２の完全長タンパク質はＧＳＨによるビーズからの流出効率が極めて低いために、タンパク質を結合したビーズ自体をサンプルバッファー（２％  ＳＤＳ，１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１００ｍＭ  ＤＴＴ，６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８），０．００２％  ｂｒｏｍｏ  ｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ）でＳＤＳ化して、８％アクリルアミドゲル電気泳動を行い、分子量約１２５ｋＤａに泳動されるＧＳＴ融合ＭＣＡＦ２タンパク質のバンドをゲルから切り出す。
（２）ＭＣＡＦ２のポリクローナル抗体の作成と精製
ＧＳＴ融合ＭＣＡＦ２タンパク質（約１ｍｇ）を含むゲル片を細かくホモジナイズした後に、ウサギ皮下に接種する。初回と同量のゲル片を３週間ごとに接種して、合計５回の接種の後に血清を回収する。ポリクローナル抗体のアフィニティー精製のために、ＭＣＡＦ２のアミノ基末端領域（アミノ酸番号：１−３２８）を制限酵素ＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩで切り出して、Ｈｉｓ融合タンパク質発現ベクターｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に組み込む。このベクターを大腸菌ＢＬ２１ｓｔａｒに導入して、ＬＢ／ａｍｐ培地（１．５リットル）で可溶性のＭＣＡＦ２タンパク質を合成する。ＭＣＡＦ１の場合と同様の手順でアフィニティー精製を行い、ＭＣＡＦ２のアミノ基末領領域を認識する特異的な抗体を精製する。
［実施例３］正常肺組織および異なる組織型の肺癌におけるＭＣＡＦ１の免疫染色
パラフィン組織切片（正常肺組織および異なる組織型の肺癌）を載せたスライドグラスを、キシレン（５分間３回）にて脱パラフィン処理後、１００％、９０％、８０％、７０％エタノールに順次浸けて親水処理を行い、水で洗浄する。抗原賦活化法として、切片を１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中でマイクロウエーブ（日新ＥＭ社、ＭＷＦ−２型）を用いて９５℃１５分間の熱処理を行い（この処理は、１次抗体の濃度を２−３倍濃い状態で染色を行う場合は必要ない）、液温が６０℃になるまで放置し、水で洗浄する。内因性ペルオキシダーゼを失活させる目的で、切片を１００分の１容量の３０％過酸化水素溶液を加えたメタノールに浸けて室温で１５分間反応を行う。水で再び洗浄した後に、組織切片を風乾し、スライドグラス上でその切片の周囲をＰａｐＰｅｎ（大同産業）で囲う。切片を洗浄バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．３），０．１％  ｔｗｅｅｎ２０加）で１５分間洗浄する。Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ（パーキンエルマー社）水溶液で室温５分間ブロッキングを行った後に、１次抗体（ウサギ抗ＭＣＡＦ１抗体：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｉｌｕｅｎｔ（ＤＡＫＯ社）で３００倍希釈あるいは１５０倍希釈）を加えて、湿潤箱中で室温で１時間反応する。洗浄バッファーで５分間３回洗った後に、エンビジョンプラス抗ウサギ２次抗体（ＤＡＫＯ社）を加えて、室温で４５分間反応を行う。切片は、洗浄バッファーで５分間３回洗浄し、ＤＡＢ溶液（ＤＡＫＯ  ＤＡＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  ｓｙｓｔｅｍ）を加えて約４分間の発色の後に、水洗で反応を停止する。陰性コントロールとして、１次抗体の代わりにウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社）を用いて、同様に染色反応を行う。その後、切片は、核染色としてヘマトキシリンで染色を施し、７０％、８０％、９０％、１００％エタノールにより脱水し、キシレンによる透徹後、カバーグラスをかけ封入し、光学顕微鏡観察に供する。
結果を図１に示す。正常な肺胞上皮組織ではＭＣＡＦ１はほとんど染色されないが、組織型の異なる肺癌組織（小細胞癌、扁平上皮癌、腺癌）の癌細胞でＭＣＡＦ１は極めて高く発現している。癌組織の中の正常な間質細胞（線維芽細胞等）は染色されていない。ＭＣＡＦ１の免疫組織染色とヘマトキシリン・エオジン染色で検出した。
［実施例４］子宮頸癌、子宮体癌、胃癌、乳癌におけるＭＣＡＦ１の免疫染色
実施例３と同様の方法で、組織型の異なる癌組織（子宮頸癌、子宮体癌、胃癌、乳癌）におけるＭＣＡＦ１の免疫染色を行った。結果を図２に示す。組織型の異なる癌組織（子宮頸癌、子宮体癌、胃癌、乳癌）の癌細胞でＭＣＡＦ１は極めて高く発現している。癌組織の中の正常な間質細胞（線維芽細胞等）は染色されていない。ＭＣＡＦ１の免疫組織染色とヘマトキシリン・エオジン染色で検出した。
［実施例５］子宮頸癌の前癌病変（高度異形成）、早期ステージ（初期浸潤癌）、およびリンパ節転移巣におけるＭＣＡＦ１の免疫染色
実施例３と同様の方法で、子宮頸癌の患者由来の前癌病変（高度異形成）検体（パラフィン切片）、早期ステージ（初期浸潤癌）検体、およびリンパ節転移巣検体を用いて、ＭＣＡＦ１の免疫染色を行った。結果を、それぞれ図３、４、および５に示す。示されるように、子宮頸癌の患者由来の前癌病変、早期ステージ、およびリンパ節転移巣の検体において、ＭＣＡＦ１は強い染色性を示した。これらの結果は、ＭＣＡＦ１がこれらの組織において高発現していることを示す。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明の腫瘍の診断方法、診断剤、および診断キットは、広範囲の組織型の腫瘍の診断に有用である。また、本発明の腫瘍の診断方法、診断剤、および診断キットは、子宮頸癌の前癌病変、初期浸潤癌、およびリンパ節転移の診断に用いることができるため、子宮頸癌の早期治療および的確な治療指針の策定等に特に有用である。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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