(57)【要約】  本発明の微粒子は、両親媒性ポリマーを含み、両親媒性ポリマーの親水性セグメントからなる内核、及び、両親媒性ポリマーの疎水性セグメントからなる疎水性外層とからなり、疎水性外層に表面改質剤が結合した微粒子である。  本発明の微粒子は、両親媒性ポリマーの親水性セグメントからなる内核に親水性かつ分子量の大きいタンパク質・ペプチド医薬、核酸医薬などを効果的に内包し、生体内での安定化や吸収促進に好適な微粒子である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
両親媒性ポリマーを含み、両親媒性ポリマーの親水性セグメントからなる内核、及び、両親媒性ポリマーの疎水性セグメントからなる疎水性外層とからなり、疎水性外層に表面改質剤が結合した微粒子。
【請求項２】
表面改質剤が、親水性ポリマーである請求項１に記載の微粒子。
【請求項３】
親水性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ−１，３−ジオキソラン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー、ポリ−１，３，６−トリオキサン、ポリアミノ酸、タンパク質、もしくは多糖類のいずれかである請求項２に記載の微粒子。
【請求項４】
親水性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ−１，３−ジオキソラン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー、ポリ−１，３，６−トリオキサン、ポリアミノ酸、タンパク質もしくは多糖類のいずれかの類縁体である請求項２に記載の微粒子。
【請求項５】
ポリアミノ酸が、ポリアスパラギン酸もしくはポリグルタミン酸の類縁体である請求項３または４に記載の微粒子。
【請求項６】
タンパク質が、ゼラチン、カゼインまたはアルブミンのいずれかである請求項３または４に記載の微粒子。
【請求項７】
多糖類が、セルロース、キチン、キトサン、ジェランガム、アルギン酸、ヒアルロン酸、プルランもしくはデキストランのいずれかである請求項３または４に記載の微粒子。
【請求項８】
多糖類が、セルロース、キチン、キトサン、ジェランガム、アルギン酸、ヒアルロン酸、プルランもしくはデキストランのいずれかの類縁体である請求項３または４に記載の微粒子。
【請求項９】
表面改質剤が、両親媒性化合物である請求項１に記載の微粒子。
【請求項１０】
両親媒性化合物が、界面活性剤である請求項９に記載の微粒子。
【請求項１１】
界面活性剤が、ポリオキシエチレンポリプロピレングリコール共重合体、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンジ脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリンモノ脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリンジ脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、アルキル硫酸塩またはレシチンのいずれかである請求項１０に記載の微粒子。
【請求項１２】
両親媒性ポリマーの親水性セグメントが、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ−１，３−ジオキソラン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー、ポリ−１，３，６−トリオキサン、ポリアミノ酸もしくは多糖類のいずれかを含む請求項１に記載の微粒子。
【請求項１３】
両親媒性ポリマーの親水性セグメントが、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ−１，３−ジオキソラン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー、ポリ−１，３，６−トリオキサン、ポリアミノ酸もしくは多糖類のいずれかの類縁体を含む請求項１に記載の微粒子。
【請求項１４】
両親媒性ポリマーの疎水性セグメントが、脂肪族ポリエステル、ポリオルトエステル、ポリシアノアクリル酸エステル、ポリアルキレングリコール、ポリウレタン、ポリシロキサン、ポリアミノ酸もしくはポリ酸無水物のいずれかを含む請求項１に記載の微粒子。
【請求項１５】
両親媒性ポリマーの疎水性セグメントが、脂肪族ポリエステル、ポリオルトエステル、ポリシアノアクリル酸エステル、ポリアルキレングリコール、ポリウレタン、ポリシロキサン、ポリアミノ酸もしくはポリ酸無水物のいずれかの類縁体を含む請求項１に記載の微粒子。
【請求項１６】
脂肪族ポリエステルが、ポリ（イプシロン−カプロラクトン）、ポリ乳酸またはポリグリコール酸である、請求項１４または１５に記載の微粒子。
【請求項１７】
両親媒性ポリマーの疎水性セグメントが、生分解性ポリマーである請求項１に記載の微粒子。
【請求項１８】
両親媒性ポリマーが、ブロック構造、グラフト構造またはブランチ構造のいずれかの構造を有するコポリマーである請求項１に記載の微粒子。
【請求項１９】
平均粒径が５０〜１０００ｎｍである請求項１に記載の微粒子。
【請求項２０】
両親媒性ポリマーの親水性セグメントからなる内核と該両親媒性ポリマーの疎水性セグメントからなる疎水性外層とからなる微粒子であって、
（Ａ）両親媒性ポリマーの疎水性セグメントが、脂肪族ポリエステル、ポリオルトエステル、ポリシアノアクリル酸エステル、ポリアルキレングリコール、ポリウレタン、ポリシロキサン、ポリアミノ酸またはポリ酸無水物のいずれかを含み、かつ、
（Ｂ）両親媒性ポリマーの親水性セグメントが、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ−１，３−ジオキソラン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー、ポリ−１，３，６−トリオキサンまたは多糖類のいずれかを含む微粒子。
【請求項２１】
平均粒径が２５ｎｍから５μｍである請求項２０に記載の微粒子。
【請求項２２】
両親媒性ポリマーの親水性セグメントからなる内核に薬物を含有する請求項１または２０に記載の微粒子。
【請求項２３】
請求項１または２０に記載の微粒子を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性物質、薬剤、造影剤、遺伝子等を効果的に送達する微粒子および医薬品組成物に関する。本発明は、いわゆるドラッグデリバリーシステム(Drug Delivery System)としての微粒子および医薬品組成物に関する。更に詳しくは、本発明は、例えば、親水性かつ分子量の大きいタンパク質・ペプチド医薬、核酸医薬などを効果的に内包する微粒子および医薬品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
微粒子に薬剤を封入した微粒子製剤が開発され、薬物のキャリアとして用いることが検討されている。これらの微粒子は、マイクロパーティクル（microparticle）、マイクロスフィア（microsphere）、マイクロカプセル、ナノパーティクル（nanoparticle）、あるいは、ナノスフィア（nanosphere）などと呼ばれている。【０００３】
しかしながら、通常用いられる微粒子である生分解性ポリマーからなる微粒子や高分子ミセルでは、通常、薬剤を内包すべきコンパートメント（compartment）は疎水的環境であり、親水性薬物を微粒子内に封入する効率は低い。また、一方、リポソームなどの脂質からなる微粒子は、薬剤の封入効率が悪く、内包薬物を徐放させることが難しい。特に、親水性かつ分子量の大きいタンパク質・ペプチド医薬を、生理活性を保った状態で、該粒子に封入することは難しい。【０００４】
しかしながら、タンパク質・ペプチド医薬や核酸医薬などは、生体内に存在する分解酵素によって加水分解されることが問題となっている。微粒子の内部にタンパク質・ペプチド医薬を封入し微粒子製剤化することで、酵素による分解を回避し、生体内で安定化することが求められている。また、Florenceらが薬物を内包していない微粒子を使用した実験において示したように、粒径が小さいほど腸管への吸収が促進される (非特許文献１参照)。極微小の微粒子にタンパク質・ペプチド医薬や核酸医薬などを封入することにより、痛みを伴う注射以外の投与法への適用も期待される。【０００５】
このような課題を満たすために、タンパク質・ペプチド医薬などの親水性薬物を封入した微粒子として、親水性薬物の水溶液を両親媒性ポリマーを添加した有機溶媒中で、所謂、逆ミセルを形成させた後、微粒子を形成する方法が提案されてきた (特許文献１，２) 。【０００６】
特許文献1では、疎水性セグメントとして生体内分解性ポリマーを親水性セグメントとしてポリアミノ酸を有する両親媒性ブロックコポリマーを使用して逆相ミセルを形成させ、内部が親水環境であり外層が疎水的である微粒子が記載されている。しかしながら、ポリアミノ酸はしばしば強い抗原性を示すことが知られている。内包する薬物としてタンパク質を選択する場合は、親水性セグメントを形成しうるポリアミノ酸の多くは、電荷を有しており、電荷を有したポリマーを使用するとタンパク質の生理活性が損なわれることが知られている。また、ポリアミノ酸は、アミノ酸N-カルボキシ無水物モノマーから重合する場合は、重合が脱水条件で行わなければならないなどの短所がある。【０００７】
特許文献2では、機能性物質がブロックポリマーに内包されている粒子を含有する化粧剤または洗浄剤として、ビニルエーテル系の両親媒性ブロックコポリマーを使用して逆相ミセルを形成させ、内部が親水環境であり、外層が疎水的である微粒子が記載されている。この微粒子は、ビニルエーテル系の両親媒性ブロックコポリマーが生分解性を有しないために注射や経口投与などによる生体内への投与には適用できない。また、外層が疎水的である微粒子であるために、この微粒子を、生体内への投与に好適な水系分散体にすることは困難である。
【特許文献１】特開平１１−２６９０９７号公報
【特許文献２】特開２００４−１８４３８号公報
【非特許文献１】ピー  ユー  ジャニ(P.U. Jani)、外３名、「ラットの消化管粘膜によるナノ粒子の取り込み：定量法および粒子粒径依存性」（Nanoparticle uptake by the rat gastrointestinal mucosa: quantitation and particle size dependency）、ジャーナル  オブ  ファーマシー  アンド  ファーマコロジー(Journal of Pharmacy and Pharmacology)、1990年、第42巻、第１２号、p.821-826.
【発明の開示】
【０００８】
本発明の第１の発明は以下のような構成を有する。
【０００９】
両親媒性ポリマーを含み、両親媒性ポリマーの親水性セグメントからなる内核、及び、両親媒性ポリマーの疎水性セグメントからなる疎水性外層とからなり、疎水性外層に表面改質剤が結合した微粒子。
【００１０】
本発明の第２の発明は以下のような構成を有する。
【００１１】
両親媒性ポリマーの親水性セグメントからなる内核と該両親媒性ポリマーの疎水性セグメントからなる疎水性外層とからなる微粒子であって、
（Ａ）両親媒性ポリマーの疎水性セグメントが、脂肪族ポリエステル、ポリオルトエステル、ポリシアノアクリル酸エステル、ポリアルキレングリコール、ポリウレタン、ポリシロキサン、ポリアミノ酸またはポリ酸無水物のいずれかを含み、かつ、
（Ｂ）両親媒性ポリマーの親水性セグメントが、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ−１，３−ジオキソラン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー、ポリ−１，３，６−トリオキサンまたは多糖類のいずれかを含む微粒子。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】西洋わさびペルオキシダーゼを封入したポリエチレングリコール-ポリ(イプシロン-カプロラクトン)からなる微粒子の粒径分布の例を示す。
【図２】表面改質剤の添加濃度に依存した微粒子の粒径変化の様子を示す。
【図３】両親媒性ブロックコポリマーのポリ(イプシロン-カプロラクトン)分子量に依存した粒径変化である。
【図４】微粒子に各種条件で封入された薬剤インシュリンの内封率を示す。
【図５】生理条件下で微粒子からの蛋白質の徐放挙動を示す。
【図６】表面改質剤の添加濃度に依存した微粒子の粒径変化の様子を示す。
【図７】インシュリン内包微粒子のマウス皮下投与による血中グルコース濃度の変化を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
まず、本発明の第一の発明について説明する。【００１４】
本発明の第一の発明は、両親媒性ポリマーを含み、両親媒性ポリマーの親水性セグメントからなる内核、及び、両親媒性ポリマーの疎水性セグメントからなる疎水性外層とからなり、該疎水性外層に表面改質剤が結合した微粒子である。【００１５】
本発明における両親媒性ポリマーは、少なくとも２種類以上のセグメントから構成され、そのうち少なくとも１種類以上のセグメントが親水性であり、更に少なくとも１種類以上のセグメントが疎水性である。ここで、親水性とは、任意のセグメントの水への溶解度が、他のセグメントより高いとき、そのセグメントを親水性であると言う。親水セグメントは、水に可溶であることが望ましいが、難溶であっても他のセグメントと比較して、水への溶解度が高ければ良い。また、疎水性とは、任意のセグメントの水への溶解度が、他のセグメントより低いとき、そのセグメントを疎水性であるという。疎水性セグメントは、水に不溶であることが望ましいが、可溶であっても他のセグメントと比較して、水への溶解度が低ければ良い。【００１６】
本発明の微粒子は、両親媒性ポリマーの親水性セグメントが、生体適合性高分子であることが好ましい。本発明において、生体適合性高分子とは、生体に投与した際に著しく有害な影響を及ぼさないものを言い、より具体的には、ラットに該高分子を経口投与する場合のＬＤ５０が２，０００ｍｇ／ｋｇ以上のものを言う。【００１７】
本発明における微粒子の両親媒性ポリマーの親水性セグメントは、特に限定されない。【００１８】
本発明における微粒子の両親媒性ポリマーの親水性セグメントは、好ましくは、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ−１，３−ジオキソラン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー、ポリ−１，３，６−トリオキサン、ポリアミノ酸または多糖類のいずれかを含む。【００１９】
本発明における微粒子の両親媒性ポリマーの親水性セグメントは、より好ましくは、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ−１，３−ジオキソラン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー、ポリ−１，３，６−トリオキサン、ポリアミノ酸または多糖類である。【００２０】
本発明における微粒子の両親媒性ポリマーの親水性セグメントは、好ましくは、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ−１，３−ジオキソラン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー、ポリ−１，３，６−トリオキサン、ポリアミノ酸もしくは多糖類のいずれかの類縁体を含む。【００２１】
本発明における微粒子の両親媒性ポリマーの親水性セグメントは、より好ましくは、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ−１，３−ジオキソラン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー、ポリ−１，３，６−トリオキサン、ポリアミノ酸もしくは多糖類のいずれかの類縁体である。【００２２】
本発明における微粒子の両親媒性ポリマーの親水性セグメントは、好ましくは、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ−１，３−ジオキソラン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー、ポリ−１，３，６−トリオキサン、ポリアミノ酸もしくは多糖類のいずれかの共重合体を含む。【００２３】
本発明における微粒子の両親媒性ポリマーの親水性セグメントは、より好ましくは、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ−１，３−ジオキソラン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー、ポリ−１，３，６−トリオキサン、ポリアミノ酸もしくは多糖類のいずれかの共重合体である。【００２４】
本発明における微粒子の両親媒性ポリマーの親水性セグメントにおいて、ポリアミノ酸としては、例えば、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリセリン、ポリスレオニン、ポリチロシン、ポリヒスチジン、ポリシステイン、ポリアスパラギン、ポリグルタミンが挙げられる。また、多糖類としては、セルロース、キチン、キトサン、ジェランガム、アルギン酸、ヒアルロン酸、プルランもしくはデキストランが挙げられる。【００２５】
両親媒性ポリマー親水性セグメントの分子量は、５０,０００以下であることが望ましく、より好ましくは５,０００以下である。【００２６】
本発明の微粒子の両親媒性ポリマーの疎水性セグメントは、特に限定されない。【００２７】
本発明の微粒子の両親媒性ポリマーの疎水性セグメントは、ポリエステル、ポリオルトエステル、ポリシアノアクリル酸エステル、ポリエーテル、ポリビニル、ポリウレタン、ポリシロキサン、ポリアミノ酸またはポリ無水物のいずれかを含むことが好ましい。【００２８】
本発明の微粒子の両親媒性ポリマーの疎水性セグメントは、ポリエステル、ポリオルトエステル、ポリシアノアクリル酸エステル、ポリエーテル、ポリビニル、ポリウレタン、ポリシロキサン、ポリアミノ酸またはポリ無水物のいずれかであることがより好ましい。【００２９】
本発明の微粒子の両親媒性ポリマーの疎水性セグメントは、好ましくは、脂肪族ポリエステル、ポリオルトエステル、ポリシアノアクリル酸エステル、ポリアルキレングリコール、ポリウレタン、ポリシロキサン、ポリアミノ酸もしくはポリ酸無水物のいずれかの類縁体を含む。【００３０】
本発明の微粒子の両親媒性ポリマーの疎水性セグメントは、より好ましくは、脂肪族ポリエステル、ポリオルトエステル、ポリシアノアクリル酸エステル、ポリアルキレングリコール、ポリウレタン、ポリシロキサン、ポリアミノ酸もしくはポリ酸無水物のいずれかの類縁体である。【００３１】
本発明の微粒子の両親媒性ポリマーの疎水性セグメントでは、ポリエステルとしては、後述の生分解性などの観点から、脂肪族ポリエステルであることが好ましく、ポリエーテルとしては、ポリプロピレングリコールなどのポリアルキレングリコールが特に好ましい。
本発明の微粒子の両親媒性ポリマーの疎水性セグメントは、具体的には、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ（２−ヒドロキシ酪酸）、ポリ（２−ヒドロキシ吉草酸）、ポリ（２−ヒドロキシカプロン酸）、ポリ（２−ヒドロキシカプリン酸）、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（クエン酸）、ポリベンジルマロラクトナート、ポリマライトベンジルエステル、ポリ｛３−〔（ベンジルオキシカルボニル）メチル〕−１，４−ジオキサン−２，５−ジオン｝｝、ポリ（β−プロピオラクトン）、ポリ（δ−バレロラクトン）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−セリン−β−ラクトン）、ポリ〔１，３−ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）メタン〕、ポリ（テレフタル酸−セバシン酸無水物）、ポリ｛３，９−ビス（エチリデン−２，４，８，１０−テトラオキサスピロ〔５，５〕ウンデカン−１，６−ヘキサンジオール）、ポリ−α−シアノアクリル酸イソブチル、ポリプロピレンオキサイド、ポリアルキルメタクリレート、ポリビニル酢酸、ポリシロキサン、ポリアラニン、ポリロイシン、ポリイソロイシン、ポリバリン、ポリプロリン、ポリフェニルアラニン、ポリメチオニンまたはこれらの高分子化合物の誘導体ならびに共重合体が挙げられる。【００３２】
本発明の微粒子は、両親媒性ポリマーの疎水性セグメントが、生体適合性高分子であることが好ましい。本発明において、生体適合性高分子とは、生体に投与した際に著しく有害な影響を及ぼさないものを言い、より具体的には、ラットに該高分子を経口投与する場合のＬＤ５０が２，０００ｍｇ／ｋｇ以上のものを言う。【００３３】
本発明の微粒子は、両親媒性ポリマーの疎水性セグメントが、生体投与時に著しく有害な影響を与えるものでないことが好ましく、生分解性高分子であることがより好ましい。本発明において、生分解性高分子とは、生体投与後に該高分子が代謝を受け低分子化し、体外に排泄されうるものを言う。【００３４】
本発明の微粒子の両親媒性ポリマーの疎水性セグメントは、ポリ(イプシロン−カプロラクトン)、ポリ乳酸、または、ポリグリコール酸のいずれかを含むことが好ましい。【００３５】
本発明の微粒子の両親媒性ポリマーの疎水性セグメントは、ポリ(イプシロン−カプロラクトン)、ポリ乳酸、または、ポリグリコール酸のいずれかであることが、より好ましい。【００３６】
本発明の微粒子の両親媒性ポリマーの疎水性セグメントは、ポリ（乳酸−グリコール酸）、ポリ（乳酸−イプシロン−カプロラクトン）、などの共重合体も好ましい。【００３７】
本発明の微粒子の両親媒性ポリマーの疎水性セグメントの分子量は、１０００から１００,０００であることが好ましい。【００３８】
本発明における両親媒性ポリマーの構造は、特に限定されないが、ブロック型、グラフト型、ブランチ型いずれかの構造を有するコポリマーであることが好ましい。ブロック型の場合、親水性セグメント／疎水性セグメント（Ａ／Ｂ）の配列が、ＡＢ型、ＡＢＡ型、ＢＡＢ型が特に好ましい。三成分以上のブロック共重合体の場合、複数の成分の親水性セグメントまたは疎水性セグメントが共存していても良い。また、グラフト型の場合、親水性セグメント、疎水性セグメントのいずれか一方が主鎖となり、他方がグラフト鎖となることが好ましい。【００３９】
本発明における両親媒性ポリマーは、親水性セグメントの平均分子量に対する疎水性セグメントの平均分子量の値は、望ましくは、０．１倍から１０倍であり、更に望ましくは、２倍から７倍である。【００４０】
本発明における微粒子の平均粒径は、２５から５０００ナノメートルであることが好ましく、さらに５０から１０００ナノメートルであることが望ましく、より好ましくは１５０ナノメートル以下である。粒子の平均粒径は、レーザー散乱型粒度分布計（たとえばＭｉｃｒｏｔｒａｃ  ＡＳＶＲ／Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ−ＨＲＡ（９３２０−Ｘ１００））を用いると直接平均粒径を知ることができる。
本発明における微粒子の形状は特に限定されないが、球状、楕円状、不定形であることができる。【００４１】
本発明は、両親媒性ポリマーを含む微粒子の疎水性外層に表面改質剤が結合した微粒子である。【００４２】
本発明における表面改質剤は、両親媒性ポリマーを含む微粒子の疎水性外層に結合しており、当該結合は非共有結合であっても共有結合であっても良い。非共有結合は、好ましくは疎水的な相互作用であるが、静電相互作用、水素結合、ファン・デル・ワールス力でも良く、それらが複合した結合でも良い。非共有結合においては、両親媒性ポリマーを含む微粒子の疎水性外層と後述の表面改質剤の疎水部分とが、疎水的な相互作用により結合していることが好ましい。この場合、微粒子の分散媒が水、緩衝液、生理食塩水、表面改質剤水溶液または親水性溶媒である微粒子分散体であることがとくに好ましい。【００４３】
本発明における表面改質剤は、好ましくは、両親媒性ポリマーを含む微粒子の疎水性外層に非共有結合で結合している。【００４４】
本発明における表面改質剤は、好ましくは、両親媒性ポリマーを含む微粒子の疎水性外層に共有結合している。共有結合は、より好ましくは、両親媒性ポリマーの疎水性セグメントの末端または側鎖への結合である。共有結合は、特に限定されるものではないが、アミド結合、エステル結合、ウレタン結合、ジスルフィド結合、スルフィド結合、ヒドラゾン結合が例として挙げられる。【００４５】
本発明では、表面改質剤は、微粒子形成後に表面に結合させても良いし、両親媒性ポリマーに結合させた後に微粒子を形成させても良い。【００４６】
本発明における表面改質剤は、表面改質剤が溶媒または微粒子外部に存在する物質と接触可能な場所に存在することが好ましい。【００４７】
本発明における表面改質剤としては、望ましくは微粒子のコロイド安定性を向上させる性質、生体投与後の微粒子の体内動態に影響を与える性質の何れか若しくは両者を有する化合物である。表面改質剤は、１種でも複数の混合物でも良い。ここでコロイド安定性を向上させるとは、微粒子の溶媒中における凝集を防ぐことまたは遅延させることを言う。微粒子を生体投与した後に、該微粒子の体内動態に影響を与える化合物としては、特に限定されないが、生物学的障壁の表面へ付着するか、該障壁の中へ侵入するか、または該障壁を横切ることを促す化合物が挙げられる。特に、消化管に存在する粘膜、上皮細胞層を横切ることを促す化合物であることが望ましい。該微粒子の体内動態に影響を与える化合物としては、微粒子と蛋白質や細胞などの生体内に存在する物質との相互作用を減ずる化合物でも良い。【００４８】
表面改質剤は、限定されるものではないが、親水性ポリマーであることが好ましい。【００４９】
本発明の微粒子の表面改質剤は、親水性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ−１，３−ジオキソラン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー、ポリ−１，３，６−トリオキサン、ポリアミノ酸、タンパク質、または、もしくは多糖類のいずれかであることが好ましい。【００５０】
本発明の微粒子の表面改質剤は、親水性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ−１，３−ジオキソラン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー、ポリ−１，３，６−トリオキサン、ポリアミノ酸、タンパク質もしくは多糖類のいずれかの類縁体であることが好ましい。【００５１】
該親水性ポリマーの類縁体としては、親水性ポリマーを長鎖アルキルなどの疎水基を部分的に修飾するなどした界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。【００５２】
本発明の微粒子の表面改質剤は、親水性ポリマーがポリエチレングリコールの場合、BASFから市販されるPluronic（BASFの登録商標）もしくは同等品が好ましい。【００５３】
本発明の微粒子の表面改質剤のポリアミノ酸としては、ポリアスパラギン酸もしくはポリグルタミン酸またはこれらの類縁体が好ましい。とくに、ポリアスパラギン酸もしくはポリグルタミン酸の一部に長鎖アルキル基を導入した類縁体はとくに好ましい。【００５４】
本発明の微粒子の表面改質剤のタンパク質は、ゼラチン、カゼインまたはアルブミンが粒子の分散性向上のために好ましい。【００５５】
本発明の微粒子の表面改質剤の多糖類としては、セルロース、キチン、キトサン、ジェランガム、アルギン酸、ヒアルロン酸、プルランもしくはデキストランが好ましく、特にコレステロール化プルランは、粒子の分散性向上のために好ましい。【００５６】
本発明の微粒子の表面改質剤の多糖類は、セルロース、キチン、キトサン、ジェランガム、アルギン酸、ヒアルロン酸、プルランもしくはデキストランのいずれかの類縁体が好ましい。【００５７】
本発明では、表面改質剤は、両親媒性化合物であることが好ましい。【００５８】
本発明の微粒子の表面改質剤では、両親媒性化合物は、脂質であることが好ましい。【００５９】
本発明の微粒子の表面改質剤では、両親媒性化合物は、界面活性剤であることが好ましい。【００６０】
本発明の微粒子の表面改質剤では、界面活性剤としては、ポリオキシエチレンポリプロピレングリコール共重合体、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンジ脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリンモノ脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリンジ脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の非イオン性活性剤や、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム、ステアリル硫酸ナトリウムなどのアルキル硫酸塩またはレシチンが好ましい。【００６１】
さらに、本発明の微粒子の表面改質剤は、ペプチド、蛋白質、糖類およびその類縁体が好ましく、例えば、ターゲッティング抗体や塩基性ペプチドが挙げられる。これらのペプチド、蛋白質、糖類は、長鎖アルキルなどの疎水基を部分的に修飾するなどした類縁体や前述の親水性ポリマーや両親媒性化合物を修飾した類縁体が特に好ましい。【００６２】
本発明の微粒子の表面改質剤の結合量は、好ましくは、粒子重量に対して０．０００１％から１％である。【００６３】
次に、本発明の第二の発明について説明する。【００６４】
本発明の第二の発明は、両親媒性ポリマーの親水性セグメントからなる内核と該両親媒性ポリマーの疎水性セグメントからなる疎水性外層とからなる微粒子であって、
（Ａ）両親媒性ポリマーの疎水性セグメントが、脂肪族ポリエステル、ポリオルトエステル、ポリシアノアクリル酸エステル、ポリアルキレングリコール、ポリウレタン、ポリシロキサン、ポリアミノ酸またはポリ酸無水物のいずれかを含み、かつ、
（Ｂ）両親媒性ポリマーの親水性セグメントが、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ−１，３−ジオキソラン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー、ポリ−１，３，６−トリオキサンまたは多糖類のいずれかを含む
微粒子である。【００６５】
両親媒性ポリマーは、とくに生体適合性または生分解性のセグメントで構成されていることが好ましく、このような両親媒性ポリマーの親水性セグメント／疎水性セグメントの組み合わせ例としては、ポリエチレングリコール／ポリ(イプシロン-カプロラクトン)、ポリエチレングリコール／ポリ（乳酸）共重合体、ポリビニルピロリドン／ポリ（乳酸）、デキストラン／ポリ（乳酸）などが好ましい。【００６６】
本発明の第二の発明において、両親媒性ポリマーの構造は、特に限定されないが、ブロック型、グラフト型、ブランチ型いずれかの構造を有するコポリマーであることが好ましい。ブロック型の場合、親水性セグメント／疎水性セグメント（Ａ／Ｂ）の配列が、ＡＢ型、ＡＢＡ型、ＢＡＢ型が特に好ましい。また、グラフト型の場合、親水性セグメント、疎水性セグメントのいずれか一方が主鎖となり、他方がグラフト鎖となることが好ましい。【００６７】
本発明の第二の発明において、親水性セグメントの平均分子量に対する疎水性セグメントの平均分子量の値としては、望ましくは、０．１倍から１０倍であり、更に望ましくは、２倍から７倍である。【００６８】
また、本発明の第二の発明において、微粒子の平均粒径は、２５ｎｍから５μｍであることが好ましく、より好ましくは５０ｎｍから１０００ｎｍである。【００６９】
本発明の微粒子は、第１の発明、第２の発明いずれにおいても、薬物を含有していても良い。薬物は、１種でも２種以上を混在させても良い。【００７０】
本発明の微粒子は、好ましくは、両親媒性ポリマーの親水性セグメントからなる内核に薬物を含有する。【００７１】
本発明の微粒子は、親水性薬物を含有する微粒子を含有してなる医薬組成物として使用することが好ましい。本発明における「親水性薬物」は、粒子の親水性内核に分配しうるものを言う。親水性薬物としては、特に限定されるものではないが、低分子化合物、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核酸または診断用途の造影成分が例示される。本発明の微粒子を含有する医薬組成物は、親水性薬物が、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または、修飾核酸のいずれかから選択される微粒子を含有してなる医薬組成物であることが好ましい。また、薬物が疎水性薬物の場合であっても、可溶化剤などで水溶性とすることで本発明の微粒子に含有させても良い。可溶化剤としては、シクロデキストリンやその類縁体がとくに好ましい。【００７２】
本発明の微粒子を含有してなる医薬組成物で使用される生理活性タンパクとしては、ペプチドホルモン、生理活性タンパク、酵素タンパク、抗体などがある。例えば、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、カルシトニン、インスリン、アンギオテンシン、グルカゴン、ガストリン、成長ホルモン、プロラクチン（黄体刺激ホルモン）、ゴナドトロピン（性腺刺激ホルモン）、サイロトロピックホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、バソプレシン、オキシトシン、プロチレリン、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、コルチコトロピン、ソマトロピン、チロトロピン（甲状腺刺激ホルモン）、ソマトスタチン（成長ホルモン刺激因子）、視床下部ホルモン（ＧｎＲＨ）、Ｇ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン類、ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）類、ＢＭＰ（骨形成蛋白）類、スーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ウロキナーゼ、リゾチーム、ワクチン等をあげることができる。これら生理活性タンパクは、天然のタンパクまたはペプチドであっても、その配列の一部を改変した誘導体であっても、ポリエチレングリコールや糖鎖などで修飾したものであっても構わない。核酸としては、カチオン性界面活性剤、カチオン性脂質、カチオン性ポリマーおよびそれらの類縁体と複合化したものであってもよい。【００７３】
本発明における微粒子は、両親媒性ポリマーおよび薬物以外の物質を含んでいても良い。【００７４】
本発明の微粒子に含有される物質は、特に限定はされないが、粒子粒径、粒子構造、粒子の安定性、両親媒性ポリマーの安定性、薬物の安定性、薬物の生理活性に影響を与える物質を添加することができる。【００７５】
本発明の微粒子には、粒子内核、粒子外層のいずれの場所に添加物が存在していても良い。本発明の微粒子に添加できる添加物は、特に限定されないが、緩衝剤、抗酸化剤、塩、ポリマーまたは糖であることができる。【００７６】
本発明の微粒子を含有する医薬組成物は、緩衝剤、抗酸化剤、塩、ポリマーまたは糖を含む微粒子を含有しても良い。【００７７】
本発明の微粒子に添加できる添加物は、例えば、水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（HSA）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。【００７８】
本発明の微粒子を含有する医薬品製剤は、本発明の微粒子を含有する医薬品製剤と薬学的に許容される添加剤からなる粉末形態、あるいは、微粒子製剤と水等の媒体との混合物や多糖類、水等の媒体および該媒体以外の薬学的に許容される基剤との混合物等からなる液状形態、さらには、粒子製剤を薬学的に許容される基剤との組み合わせにより固形化または半固形化した形態をとることができる。固形化した形態としては、カプセル剤（例、硬カプセル剤、軟カプセル剤等）、顆粒剤、散剤等が好ましく、半固形化した形態としては、微粒子をハイドロゲルに分散させた形態や、ワセリン、ポリエチレングリコールなどに分散させた形態が好ましい。ハイドロゲルとしては、ＰＶＡゲル、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドゲル、ゼラチンゲル、寒天ゲル、セルロース系ハイドロゲルなどが特に好ましい。【００７９】
基剤としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機物質が挙げられ、例えば賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤、吸収促進剤等が挙げられる。【００８０】
本発明の微粒子の分散媒としては、水、水溶液または水混和性液体を用いることが好ましく、例えば、グリセリンまたはポリエチレングリコール等、もしくは薬学的に許容される非水溶媒が用いられる。水溶液は非等張性または等張性溶液のいずれであってもよい。水溶液としては、水と１種もしくは複数種の他の成分、例えば、グリセリン、マンノース、グルコール、フルクトース、キシロース、トレハロース、マンニット、ソルビット、キシリットもしくはポリエチレングリコールのような他のポリオールまたは塩化ナトリウムのような電解質を混合して調製されるものが例示される。非水溶媒としては、アセチルグリセリン脂肪酸エステル、液糖、オレイン酸、オレンジ油、還元麦芽糖水アメ、クエン酸トリエチル、高果糖液糖、高ブドウ糖水アメ、小麦胚芽糖、サフラワー油、サフラワー油脂肪酸、蛇油、ジメチルポリシロキサン、ショウキョウ油、大豆レシチン、中鎖脂肪酸トリグリセリド、天然ビタミンE、トリアセチン、トリオレイン酸ソルビタン、ピペロニルブトキシド、ヒマワリ油、フィチン酸、フタル酸ジエチル、フタル酸ジブチル、ブチルフタリルブチルグリコレート、ブドウ糖果糖液糖、ポリソルベート、水アメ、ミリスチン酸オクチルドデシル、綿実油、モノオレイン酸ソルビタン、酪酸エチル、リン酸、レモン油が例示される。【００８１】
本発明における微粒子は、例えば、（ａ）両親媒性ポリマーを有機溶媒に溶解させ、該ポリマー溶液に薬物水溶液を攪拌しつつ添加する工程、（ｂ）該有機溶媒を他の溶媒に置換する工程、（ｃ）表面改質剤を微粒子表面に結合させる工程を含む方法で製造できるが、これらに限定されるものではない。【００８２】
有機溶媒は、該両親媒性ポリマーの疎水性セグメントが可溶で且つ、親水性セグメントが難溶または不溶であることが望ましいが、両セグメントが難溶もしくは両セグメントが可溶いずれであっても良い。また、表面改質剤を、両親媒性ポリマーの親水性セグメントからなる内核、及び、疎水性セグメントからなる疎水性外層とからなる微粒子外層に結合させる方法としては、微粒子の形成後に表面改質剤を添加して微粒子外層に結合しても良いし、一旦、微粒子を凍結乾燥などにより単離した後、単離した微粒子を表面活性剤を含む分散媒に添加しても良い。【００８３】
本発明の微粒子を医薬品として使用する場合においては、有機溶媒は、生体に著しい影響を与えないものが望ましい。有機溶媒は、特に限定されないが、アセトニトリル、クロロベンゼン、クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、シクロヘキサン、１，２−ジクロロエテン、ジクロロメタン、１，２−ジメトキシエタン、Ｎ,Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、１，４−ジオキサン、２−エトキシエタノール、エチレングリコール、ホルムアミド、ヘキサン、メタノール、２−メトキシエタノール、メチルブチルケトン、メチルシクロヘキサン、Ｎ−メチルピロリドン、ニトロメタン、ピリジン、スルホラン、テトラリン、トルエン、１，１，２−トリクロロエテン、キシレン、酢酸、アセトン、アニソール、１−ブタノール、２−ブタノール、酢酸n-ブチル、t-ブチルメチルエーテル、クメン、ジメチルスルホキシド、エタノール、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ギ酸エチル、ギ酸、ヘプタン、酢酸イソブチル、酢酸イソプロピル、酢酸メチル、炭酸ジメチル、３−メチル−１−ブタノール、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、２−メチル−１−プロパノール、ペンタン、１−ペンタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、酢酸プロピル、テトラヒドロフランまたはこれらの混合溶媒が挙げられる。【００８４】
両親媒性ポリマーを有機溶媒に溶解させる方法としては、攪拌、加熱、超音波処理、透析などが挙げられるが、これらに特に限定されない。【００８５】
本発明の微粒子の粒径は、両親媒性ポリマーの構造、両親媒性ポリマー濃度、薬物水溶液の添加量、有機溶媒組成、攪拌速度、薬物水溶液への添加剤によって制御することができる。添加剤は、薬物水溶液に添加しても良く、別途添加剤水溶液を添加しても良く、有機溶媒に添加しても良い。
微粒子形成後に、内核水の蒸発や、粒子形成時の有機溶媒を水と相溶な溶媒に置換することで、内核水を除くができる。形成された微粒子は、凍結乾燥、ろ過、遠心操作、再沈殿によって回収しうる。【００８６】
粒子形成用の有機溶媒が凍結乾燥などに不適な場合等に、凍結乾燥に好適な溶媒に置換することが好ましく、溶媒置換の工程は、:溶媒除去の工程と別の溶媒を添加する工程からなる方法で行うことができる。または、単に粒子分散液を他の溶媒へ添加しても良い。凍結乾燥に好適な溶媒としては、ジオキサン、酢酸、tert-ブタノール、炭酸ジメチル、モルフォリン、パラキシレン、シクロヘキサンなどがとくに好ましい。溶媒除去の方法としては、例えば、蒸発、透析、凍結乾燥、遠心操作、ろ過、再沈殿が挙げられる。【００８７】
表面改質剤は、例えば、該両親媒性ポリマーの疎水性セグメントの末端に化学結合することで微粒子表面に呈示することが出来る。もしくは、例えば、両親媒性ポリマーから微粒子を形成した後に、表面改質剤を微粒子表面に結合させることもできる。微粒子調製後に表面改質剤を結合させる方法としては、特に限定するものではないが、表面改質剤を含有する溶媒に微粒子を添加する方法が挙げられる。【００８８】
本発明の微粒子は、水を内核の成分の一つとして含む微粒子が好ましく、微粒子の水を蒸発させることで調製した微粒子が好ましい。【００８９】
本発明の微粒子を含有する医薬品組成物の投与方法および応用分野は特に限定されるものではないが、多岐の利用が可能である。例えば、該医薬品組成物は、薬剤を経口投与、非経口投与、経腸投与、経肺投与、局所投与（鼻、皮膚、眼）および体腔投与等に利用できる。【００９０】
非経口投与の場合には、次の投与法が特に例示しうる。
（１）静脈内投与［作用物質、例えば、ペプチド薬剤、細胞増殖抑制剤、免疫刺激剤、発育因子、例えば、コロニー刺激因子（白血球調整因子）および成長因子等を制御下で放出する微粒子を血中に循環させることによって肝臓、脾臓または骨髄を標的化する］。
（２）筋肉内投与（作用物質、例えば、ペプチド薬剤またはホルモンを長期間にわたって供与するデポー製剤の投与）。
（３）関節内投与（例えば、関節炎の治療の際の抗リウマチ剤や免疫抑制剤の投与）。
（４）窩洞内投与（例えば、腹膜や胸膜腔における癌の治療のための細胞増殖抑制剤やペプチド薬剤の投与）。
（５）皮下投与（例えば、皮膚癌を治療するための細胞増殖抑制剤のデポー製剤投与）。【００９１】
経腸投与の場合には、次の態様が特に考慮されるべきである。
（１）ビタミンの投与。
（２）リンパ液の吸着（例えば、細胞増殖抑制剤等の作用物質によるリンパ節の標的化）。
（３）抗原の供与（例えば、パイエル板を利用する経口免疫化）。
（４）Ｍ細胞を利用するペプチド薬剤の摂取。【００９２】
経肺投与の場合には、特に次の態様が考慮される。
（１）エアゾール剤または配量エアゾール剤（微粒子製剤の水性分散液の噴霧投与）。
（２）該分散液の点滴注入。【００９３】
局所投与の場合には、例えば次の態様が考慮される。
・  皮膚科用薬剤、例えば、コルチコイドまたは抗黴剤等の投与。
・  歯周病治療薬としての歯周ポケットへの投与剤。
・  例えば、ベータ−遮断剤用の点眼剤または眼科用ゲル。
・  リポソーム製剤に類似した化粧品。【００９４】
本発明により、タンパク質の生体内での安定性向上や体内動態の改善が実現することができる。本発明により、生理活性タンパク質の経口または経腸投与が可能となり、従来の注射による投与法に比べ、簡便で患者に優しい薬物治療が実現し、これまでのタンパク質製剤の概念を根底から変え、画期的製剤の創製につながる。【００９５】
タンパク質を皮下注射する場合、本発明の微粒子を使用することで、長期間に渡る放出が可能となり、従来の投与方法と比較して、経済性に優れるとともに、患者の負担の低減が可能となる。【００９６】
以下に実施例を示すが、本発明はこれらの実施例により限定されるものでない。【００９７】
実施例１
微粒子の製造：
両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコール-ポリ(イプシロン-カプロラクトン)（
ポリエチレングリコールの分子量５,０００、ポリ(イプシロン-カプロラクトン)の分子量
１０，０００）１０ｍｇをクロロホルム５００μＬに溶解させた。該溶液を、２ｍＬのヘ
キサン、クロロホルム混合溶媒（ヘキサン１．６ｍＬ、０．４ｍＬ）に添加しポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液を、攪拌速度１,６００ｒｐｍで攪拌しつつ、２５ｗｔ％のウシ血清アルブミン溶液1０-１００μＬを滴下した。更に５分間攪拌することで微粒子を製造した。該微粒子分散液をシリウコンウェハー上に展開した後、真空下で充分乾燥させ、白金を蒸着し走査型電子顕微鏡（HITACH S-4800）で観察した。【００９８】
＜結果＞
直径数マイクロメーターから数百マイクロメーターの微粒子が観察された。乾燥後に観察された粒子形状は、ポリマー外層が覆った粒子内にタンパク質が存在する微粒子構造と矛盾しなかった。【００９９】
実施例２
微粒子の製造：
両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコール-ポリ(イプシロン-カプロラクトン)（ポリエチレングリコールの分子量５,０００、ポリ(イプシロン-カプロラクトン)の分子量１０，０００もしくは３７,０００）１０ｍｇを酢酸エチル２ｍＬに加熱し溶解させた。該ポリマー溶液を、攪拌速度１,６００ｒｐｍで攪拌しつつ、西洋わさびペルオキシダーゼ水溶液（１ｗｔ％西洋わさびペルオキシダーゼ、９ｗｔ％スクロース、１０ｍＭ Tris-HCl pH 7.4） ５０―２００μＬを滴下した。更に１時間攪拌することで微粒子を製造した。該微粒子の粒径は、（装置Zetasizer３０００HSA(MALVERN INSTRUMENTS)）を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデータはCONTIN法およびヒストグラム法によって解析し、粒径を算出した。【０１００】
＜結果＞
最小数平均粒径が２５．１ｎｍに達する微粒子が形成された（図１）。ｚ−平均粒径は、検討したポリマー濃度範囲において、２００ｎｍから数ミクロンに渡って変化した。【０１０１】
実施例３
微粒子の製造：
両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコール−ポリ(イプシロン-カプロラクトン)（ポリエチレングリコールの分子量５,０００、ポリ(イプシロン-カプロラクトン)の分子量３７，０００）１０ｍｇを酢酸エチル２ｍＬに溶解し、ポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液を、攪拌速度１,６００ｒｐｍで攪拌しつつ、１ｗｔ％の西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液１００μＬを滴下した。更に１時間攪拌した後、１０倍量のジオキサンに添加した。溶媒を蒸発させ約２ｍＬまで濃縮した後、該粒子分散液を、種々の濃度のPluronic（BASFの登録商標）F68（PEO-PPO-PEOブロックポリマー）を含有したリン酸緩衝液（１０ｍＬ）に添加した。該微粒子の粒径は、（装置Zetasizer３０００HSA(MALVERN INSTRUMENTS)）を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデータはCONTIN法およびヒストグラム法によって解析し、粒径を算出した。【０１０２】
＜結果＞
表面改質剤としてPluronic（BASFの登録商標）F68（PEO-PPO-PEOブロックポリマー）をリン酸緩衝液に添加することで、粒子表面にPluronic（BASFの登録商標）F68が結合した水中で安定な微粒子が形成された。光散乱測定の結果から、Pluronic（BASFの登録商標）F68の濃度に依存して粒径が変化することが明らかとなった（図２）。Pluronic（BASFの登録商標）F68１ｍｇ／ｍＬでは粒径は約９５ｎｍであったが、Pluronic（BASFの登録商標）F68濃度と共に減少し、０．００２ｍｇ／ｍＬでは約８０ｎｍとなった。【０１０３】
実施例４
微粒子の製造：
両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコール−ポリ(イプシロン-カプロラクトン)（ポリエチレングリコールの分子量５,０００、ポリ(イプシロン-カプロラクトン)の分子量３７，０００）１０ｍｇを酢酸エチル２ｍＬに溶解し、ポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液を、攪拌速度１,６００ｒｐｍで攪拌しつつ、１ｗｔ％のインシュリン溶液１００μＬを滴下した。更に１時間攪拌した後、１０倍量のジオキサンに添加した。溶媒を蒸発させ約２ｍＬまで濃縮した後、該粒子分散液を１ｗｔ％のポリビニルアルコールを含有したリン酸緩衝液（１０ｍＬ）に添加した。試料を凍結乾燥した後、２ｍＬの水を添加し粒子を再分散させた。該微粒子の粒径は、（装置Zetasizer３０００HSA(MALVERN INSTRUMENTS)）を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデータはCONTIN法およびヒストグラム法によって解析し、粒径を算出した。【０１０４】
＜結果＞
表面改質剤としてポリビニルアルコールを使用し、薬剤としてインシュリンを内封した微粒子が調製された。凍結乾燥後、再分散させた微粒子の平均粒径は１２１ｎｍであった。【０１０５】
実施例５
微粒子の製造：
両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコール−ポリ(イプシロン-カプロラクトン)（ポリエチレングリコールの分子量５,０００、ポリ(イプシロン-カプロラクトン)の分子量５，０００、１０，０００、１６，３００、２４，５００、３７，０００）１０ｍｇを酢酸エチル２ｍＬに溶解し、ポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液を、攪拌速度１,６００ｒｐｍで攪拌しつつ、１ｗｔ％のインシュリン溶液１００μＬを滴下した。更に１時間攪拌した後、１０倍量のジオキサンに添加した。溶媒を蒸発させ約２ｍＬまで濃縮した後、該粒子分散液を１ｗｔ％のポリビニルアルコールを含有したリン酸緩衝液（１０ｍＬ）に添加した。試料を凍結乾燥した後、２ｍＬの水を添加し粒子を再分散させた。該微粒子の粒径は、（装置Zetasizer３０００HSA(MALVERN INSTRUMENTS)）を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデータはCONTIN法およびヒストグラム法によって解析し、粒径を算出した。【０１０６】
＜結果＞
粒子粒径は、両親媒性ブロックコポリマーのポリ(イプシロン-カプロラクトン)セグメント分子量と共に１３０から１８０ｎｍの間で変化した（図３）。【０１０７】
実施例６
微粒子の製造：
両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコール−ポリ（乳酸）-ポリエチレングリコール（ポリエチレングリコールの分子量２３，０００、ポリ(乳酸)の分子量２０，０００）１０ｍｇを酢酸エチル２ｍＬに溶解し、ポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液を、攪拌速度１,６００ｒｐｍで攪拌しつつ、１ｗｔ％の西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液１００μＬを滴下した。更に１時間攪拌した後、１０倍量のジオキサンに添加した。溶媒を蒸発させ約２ｍＬまで濃縮した後、該粒子分散液を１ｗｔ％のポリビニルアルコールを含有したリン酸緩衝液（１０ｍＬ）に添加した。試料を凍結乾燥した後、２ｍＬの水を添加し粒子を再分散させた。該微粒子の粒径は、（装置Zetasizer３０００HSA(MALVERN INSTRUMENTS)）を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデータはCONTIN法およびヒストグラム法によって解析し、粒径を算出した。【０１０８】
＜結果＞
両親媒性ポリマーとしてポリエチレングリコール−ポリ（乳酸）-ポリエチレングリコールを使用し、西洋ワサビペルオキシダーゼを内封した微粒子が調製された。凍結乾燥後、再分散させた微粒子の平均粒径は７５ｎｍであった。【０１０９】
実施例７
薬剤内包量の決定：
両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコール−ポリ(イプシロン-カプロラクトン)（ポリエチレングリコールの分子量５,０００、ポリ(イプシロン-カプロラクトン)の分子量３７，０００）１０ｍｇを酢酸エチル２ｍＬに溶解し、ポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液を、攪拌速度１,６００ｒｐｍで攪拌しつつ、１ｗｔ％のインシュリン溶液１００μＬ（９ｗｔ％スクロース含有、非含有）を滴下した。更に１時間攪拌した後、１０倍量のジオキサンに添加した。溶媒を蒸発させ約２ｍＬまで濃縮した後、該粒子分散液を、１ｗｔ％の表面改質剤Pluronic（BASFの登録商標）F68もしくはポリビニルアルコールを含有したリン酸緩衝液（１０ｍＬ）に添加した。試料を凍結乾燥した後、２ｍＬの水を添加し粒子を再分散させた。薬剤の内封率は、液体クロマトグラフィー測定および限外濾過後の濾液の蛋白質濃度をクーマシー・ブリリアント・ブルー染色で定量し決定した。【０１１０】
＜結果＞
薬剤インシュリンの内包量は、表面改質剤の種類で変化しなかったが、粒子内の添加剤の有無で変化した（図４）。Pluronic（BASFの登録商標）F68、ポリビニルアルコール使用時ともに、スクロース添加時は内封率５０％、非添加時は約８０％となった。【０１１１】
実施例８
微粒子からの薬剤の徐放：
両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコール−ポリ(イプシロン-カプロラクトン)（ポリエチレングリコールの分子量５,０００、ポリ(イプシロン-カプロラクトン)の分子量３７，０００）１０ｍｇを酢酸エチル２ｍＬに溶解し、ポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液を、攪拌速度１,６００ｒｐｍで攪拌しつつ、１ｗｔ％のフルオレセインで標識した血清アルブミン水溶液１００μＬを滴下した。更に１時間攪拌した後、１０倍量のジオキサンに添加した。溶媒を蒸発させ約２ｍＬまで濃縮した後、該粒子分散液を、１ｗｔ％の表面改質剤ポリビニルアルコールを含有したリン酸緩衝液（１０ｍＬ）に添加した。試料を凍結乾燥した後、２ｍＬの水を添加し粒子を再分散させた。試料をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１０分の１に希釈し、３７℃でインキュベーションした。所定の時間でサンプリングし、放出された蛋白質の量を定量した。【０１１２】
＜結果＞
微粒子は生理的条件下で、徐々に分解し内包した蛋白質を徐々に放出することが明らかとなった（図５）。徐放の時間尺度は数日から数週間単位であった。【０１１３】
実施例９
微粒子の製造：
両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコール−ポリ(イプシロン-カプロラクトン)（ポリエチレングリコールの分子量５，０００、ポリ(イプシロン-カプロラクトン)の分子量１０，０００）１０ｍｇを酢酸エチル２ｍＬに溶解し、ポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液に１０ｍｇ／ｍＬのインシュリン溶液１００μＬを滴下し、ホモジナイザーで攪拌した（１５０００ｒｐｍ、５分）。攪拌後、２０ｍＬのジオキサンに添加した。溶媒を蒸発させ約２ｍＬまで濃縮した後、該粒子分散液を５００ｍｇのPluronic（BASFの登録商標）F68を含有したジオキサン（６ｍＬ）に添加した。試料を凍結乾燥した後、８ロット分を８０ｍＬの純水に分散させた。分画分子量１０万の濾過膜を装着した限外濾過装置で１０ｍＬまで濃縮した後、５０ｍＬの純水を添加し再び５ｍＬまで濃縮した。濃縮操作をもう一度行った後純水を添加することで４０ｍＬとした。その後、６ｍｇ／ｍＬのPluronic（BASFの登録商標）F68溶液４０ｍＬを添加し凍結乾燥した。凍結乾燥後、得られた粉末状サンプルに水を添加し再分散させた。該微粒子の粒径は、（装置Zetasizer３０００HSA(MALVERN INSTRUMENTS)）を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデータはCONTIN法およびヒストグラム法によって解析し、粒径を算出した。インシュリンの封入率は、粒子試料を６Ｎ  ＨＣｌ中１０５℃で２２時間加水分解した後、アミノ酸分析を行いタンパク質量を定量することで決定した。【０１１４】
＜結果＞
２７８．２ｍｇの３００ｎｍの粒径を有する粒子が得られた。アミノ酸分析によるインシュリン封入率は２５％となった。【０１１５】
実施例１０
微粒子の製造：
両親媒性ポリマーであるポリビニルピロリドン−ポリ（乳酸）（ポリビニルピロリドンの分子量１，７００、ポリ(乳酸)の分子量２，２００）１０ｍｇを酢酸エチル２ｍＬに溶解し、ポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液に、１０ｍｇ／ｍＬのインシュリン溶液１００μＬを滴下し、数秒間攪拌した。その後、１０倍量のジオキサンに添加した。溶媒を蒸発させ約２ｍＬまで濃縮した後、該粒子分散液を５００ｍｇのPluronic（BASFの登録商標）F68を含有したジオキサン（２０ｍＬ）に添加した。試料を凍結乾燥した後、２ｍＬの水を添加し粒子を再分散させた。該微粒子の粒径は、（装置Zetasizer３０００HSA(MALVERN INSTRUMENTS)）を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデータはCONTIN法およびヒストグラム法によって解析し、粒径を算出した。【０１１６】
＜結果＞
再分散後沈殿が認められたが、沈殿を遠心操作で除去後粒径測定を行ったところ、９０−１３０ｎｍの粒子が形成されていることが明らかとなった。【０１１７】
実施例１１
粒子製造：
両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコール−ポリ(イプシロン-カプロラクトン)（ポリエチレングリコールの分子量５，０００、ポリ(イプシロン-カプロラクトン)の分子量１０，０００）１０ｍｇを酢酸エチル２ｍＬに溶解し、ポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液に１０ｍｇ／ｍＬのインシュリン溶液１００μＬを滴下し、ホモジナイザーで攪拌した（１５０００ｒｐｍ、５分）。攪拌後、２０ｍＬのジオキサンに添加した。溶媒を蒸発させ約２ｍＬまで濃縮した後、該粒子分散液を種々の濃度のCremophor（BASFの登録商標） EL(ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油)を含有したジオキサン（８ｍＬ）に添加した。試料を凍結乾燥した後、１０ｍＬの純水を添加し、超音波処理により分散させた。該微粒子の粒径は、（装置Zetasizer３０００HSA(MALVERN INSTRUMENTS)）を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデータはCONTIN法およびヒストグラム法によって解析し、粒径を算出した。【０１１８】
＜結果＞
純水への分散後の粒子粒径はCremophor（BASFの登録商標） EL濃度とともに減少し、ジオキサン中のCremophor（BASFの登録商標） EL濃度１０００ｍｇ／ｍＬでは６１ｎｍとなった（図６）。【０１１９】
実施例１２
インシュリン内包粒子の薬効持続性：
実施例９の方法にて調製したヒトインシュリン15μg（WAKO社）を内包する微粒子製剤を１００μｌ生理食塩水（大塚製薬）に分散して、１２時間絶食させた７週齢のオスBALB／ｃマウス（体重１９〜２４ｇ）の背部皮下に２９Ｇ注射針（テルモ社）を用いて投与した。（比較データとしては、インシュリン15μｇを溶解した１００μｌ生理食塩水（大塚製薬）を用いた。）投与後の動物はそれぞれ独立したケージで絶食状態を維持し、投与前・および投与後に尾部動脈より採取した血液を生化学自動分析装置（富士フイルム社富士ドライケム３５００Ｖ）、測定スライド（富士フイルム社GLU-WIII）を用いて血液中グルコース濃度の変化を経時的に測定し、２匹ずつの血中グルコース濃度の変化の平均値を算出した。【０１２０】
＜結果＞
インシュリンのみを投与したマウスの血液中グルコース濃度が１０時間で投与前と比較し８０％まで回復するのに対し、インシュリン内包微粒子製剤を添加したマウスでは血中グルコース濃度の低下が持続し１０時間後では４０％程度、２３時間が経過した後でも投与開始前の７０％程度に保たれており、本微粒子の徐放性に由来するインシュリンの薬効持続性が示された（図７）。
【産業上の利用可能性】
【０１２１】
本発明の微粒子は、親水性かつ分子量の大きいタンパク質・ペプチド医薬、核酸医薬などの生体内での安定性向上や体内動態の改善が実現する。生理活性タンパク質の経口または経腸投与が可能となり、従来の注射による投与法に比べ、簡便で患者に優しい薬物治療が可能となる。注射による投与においても、皮下投与における徐放、血中投与における血中滞留時間の延長が可能となり、注射回数の低減が可能となる。
本発明の微粒子を含む医薬品製剤は、薬理効果の持続が期待できる。また、本発明の微粒子を含む医薬品製剤は、マトリックス形成材料の選択により、薬物の放出特性の制御も可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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