(57)【要約】本発明により、安価な食用担子菌に含まれる化合物若しくは食用担子菌由来の組成物を含有する、経口でも効果を有する抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤又は血管新生抑制剤、及び当該化合物若しくは組成物を含有する抗腫瘍活性、アポトーシス誘発活性又は血管新生抑制活性を有する食品を得ることができる。よって、本発明は特に医薬や健康食品分野において特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１つを有効成分として含有することを特徴とする抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤又は血管新生抑制剤。
【化１】
2005115364.tif 000025
（式中、ｍは１〜９の整数、ｎは１〜７の整数を示す。ただし、ｍ＋ｎ＝５〜１１である。またＲは水素原子又は水酸基を示す。）
【請求項２】
一般式（１）で表される化合物が下記式（２）〜（１１）で表される少なくとも１つの化合物である請求項１記載の抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤又は血管新生抑制剤。
【化２】
2005115364.tif 000026
【化３】
2005115364.tif 000027
【化４】
2005115364.tif 000028
【化５】
2005115364.tif 000029
【化６】
2005115364.tif 000030
【化７】
2005115364.tif 000031
【化８】
2005115364.tif 000032
【化９】
2005115364.tif 000033
【化１０】
2005115364.tif 000034
【化１１】
2005115364.tif 000035
【請求項３】
一般式（１）で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１つを含有することを特徴とする抗腫瘍活性、アポトーシス誘発活性又は血管新生抑制活性を有する食品。
【請求項４】
一般式（１）で表される化合物が式（２）〜（１１）で表される少なくとも１つの化合物である請求項３記載の食品。
【請求項５】
式（２）〜（１１）で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１つを含有するブナシメジ由来組成物を有効成分として含有することを特徴とする抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤又は血管新生抑制剤。
【請求項６】
ブナシメジ由来組成物が、ブナシメジの酢酸エチル抽出物をシリカゲルカラムに吸着させた後、溶出させることにより得られる組成物であることを特徴とする請求項５記載の抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤又は血管新生抑制剤。
【請求項７】
式（２）〜（１１）で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１つを含有するブナシメジ由来組成物を含有することを特徴とする抗腫瘍活性、アポトーシス誘発活性又は血管新生抑制活性を有する食品。
【請求項８】
ブナシメジ由来組成物が、ブナシメジの酢酸エチル抽出物をシリカゲルカラムに吸着させた後、溶出させることにより得られる組成物であることを特徴とする請求項７記載の食品。
【請求項９】
式（２）〜（１１）で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１つを含有するブナシメジ由来組成物であって、ブナシメジの酢酸エチル抽出物をシリカゲルカラムに吸着させた後、溶出させることにより得られるブナシメジ由来組成物。
【請求項１０】
抗腫瘍作用、アポトーシス誘発作用又は血管新生抑制作用を必要とする疾患を有する被験体に、有効量の上記一般式（１）で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１つを投与することを含む、該疾患の治療方法。
【請求項１１】
抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤又は血管新生抑制剤の製造のための、上記一般式（１）で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１つの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、きのこ由来の生理活性成分を有効成分とする抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤又は血管新生抑制剤、及びそれを含有する食品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  シイタケ、マイタケ、エノキタケ等の種々の食用担子菌が抗腫瘍性を有することは広く知られており、これらの子実体又は菌糸体よりこれまでに様々な抗腫瘍性組成物が調製されてきた。また、食用担子菌の一つであるブナシメジが抗腫瘍性を有することも明らかにされてきており、例えば蛋白質含量３〜２０％、糖含量２０〜５０％を有する子実体熱水抽出物、及びその精製多糖体が（例えば、特許文献１）、さらには水又は親水性溶媒に懸濁後、加熱処理により得られる分子量６，０００〜６０，０００の生理活性物質ＥＥＭ−Ｓが抗腫瘍活性を有することが明らかにされている（例えば、特許文献２）。【０００３】  悪性腫瘍が形成され増殖すると血管新生が誘導されることが知られている。血管新生が誘導されると、腫瘍に栄養が運ばれるようになり急速に腫瘍細胞が増殖して悪性化したり、血管に腫瘍細胞が侵入して種々の組織に移動し、転移が起こりやすくなる。すなわち、血管新生を抑制すれば腫瘍細胞の増殖、悪性化や転移を抑制できると考えられる。このような発想から医薬品の開発も進められてきたが、いまだ商品化されたものはない。【０００４】  一方、腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する物質についての報告は、数多く存在する。しかしながら、アポトーシス誘発物質は、増殖能力が高い新生血管の内皮細胞もターゲットになり得る。このような観点から開発された腫瘍を抑制する物質の報告もある（例えば、非特許文献２）。このような物質は、腫瘍細胞そのものに対してはアポトーシスを起こすような作用は弱いが、腫瘍細胞が誘導する血管新生を抑制して、いわゆる兵糧攻めにする効果を有することから、副作用も少ないことが想定される。【０００５】  きのこ由来の成分でも血管新生を抑制する作用があることが報告されている。たとえば、姫マツタケ（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｌａｚｅｉ  Ｍｕｒｉｌｌ）由来のエルゴステロールである（非特許文献３）。【０００６】  テルペン化合物（テルペノイド）は、多くの植物に存在する有機化合物であり、炭素数が５の倍数で、ｎ個のイソプレンあるいはイソペンタンから構成される前駆物質に由来する。ｎ＝２のものは、モノテルペン、ｎ＝３はセスキテルペン、ｎ＝４はジテルペン、ｎ＝５はセスタテルペン、ｎ＝６はトリテルペン、ｎ＝８はテトラテルペン、それ以上はポリテルペンと称される。テルペン化合物にはアポトーシスを誘発する作用も知られており、たとえば、トリテルペンのアポトーシス誘発作用の報告など、数多く存在する。【０００７】  ブナシメジ由来の生理活性成分としては、ＳＢＳという物質が血小板凝集抑制作用および抗発ガンプロモーター作用を有していることが知られている（特許文献３）。また、ブナシメジには苦味成分である種々のポリテルペンが含まれていることが知られている（例えば、非特許文献１）。【０００８】
【特許文献１】特開平５−３０６２３３号
【特許文献２】国際公開第０１／５１０１７０号パンフレット
【特許文献３】特開平４−１０４７９５号
【非特許文献１】Ｓａｗａｂｅ  Ａ．他３名，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，１９９６年，Ｖｏｌ．３１，Ｐ９２１−９２５
【非特許文献２】Ｓｃｈｗａｒｚ  Ｒ．Ｅ．他１名，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．，２００４年，ｖｏｌ．１２０，Ｎｏ．１，Ｐ６４−７２
【非特許文献３】Ｔａｋａｋｕ  Ｔ．他２名，Ｊ．Ｎｕｔｒ．，２００１年，ｖｏｌ．１３１，Ｎｏ．５，Ｐ１４０９−１４１３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】  各種食用担子菌の子実体が抗腫瘍性を有することは明らかとなっているが、効果を得るためには一定量を日常的に食すことが必要である。しかしながら、食用担子菌といえども味に癖があり、料理に工夫をしても日常的に一定量食すことは難しい。
一方、ある種の担子菌から得られる抗腫瘍性、免疫賦活活性等を有する有効成分を配合した健康食品が広く市場に流通しているが、原料の担子菌が希少のため、生産される健康食品も非常に高価なものとならざるを得ない。
本発明の課題は、安価な食用担子菌由来の抗腫瘍活性を有する化合物を利用した、経口でも効果を示す医薬又は食品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】  本発明者らは上記課題を解決するため、鋭意研究した結果、ブナシメジの子実体由来のポリテルペンが抗腫瘍活性、アポトーシス誘発活性および血管新生抑制活性を有することを見出し、本発明を完成した。【００１１】  すなわち本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、下記一般式（１）で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１つを有効成分として含有することを特徴とする抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤又は血管新生抑制剤に関する。【００１２】
【化１】
2005115364.tif 000002
【００１３】（式中、ｍは１〜９の整数、ｎは１〜７の整数を示す。ただし、ｍ＋ｎ＝５〜１１である。またＲは水素原子又は水酸基を示す。）【００１４】  本発明の第２の発明は、一般式（１）で表される化合物が下記式（２）〜（１１）で表される少なくとも１つの化合物である第１の発明の抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤又は血管新生抑制剤に関する。【００１５】
【化２】
2005115364.tif 000003
【００１６】
【化３】
2005115364.tif 000004
【００１７】
【化４】
2005115364.tif 000005
【００１８】
【化５】
2005115364.tif 000006
【００１９】
【化６】
2005115364.tif 000007
【００２０】
【化７】
2005115364.tif 000008
【００２１】
【化８】
2005115364.tif 000009
【００２２】
【化９】
2005115364.tif 000010
【００２３】
【化１０】
2005115364.tif 000011
【００２４】
【化１１】
2005115364.tif 000012
【００２５】  本発明の第３の発明は、一般式（１）で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１つを含有することを特徴とする抗腫瘍活性、アポトーシス誘発活性又は血管新生抑制活性を有する食品に関する。【００２６】  本発明の第４の発明は、一般式（１）で表される化合物が式（２）〜（１１）で表される少なくとも１つの化合物である第３の発明の食品に関する。【００２７】  本発明の第５の発明は、式（２）〜（１１）で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１つを含有するブナシメジ由来組成物を有効成分として含有することを特徴とする抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤又は血管新生抑制剤に関する。【００２８】  本発明の第６の発明は、ブナシメジ由来組成物が、ブナシメジの酢酸エチル抽出物をシリカゲルカラムに吸着させた後、溶出させることにより得られる組成物であることを特徴とする第５の発明の抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤又は血管新生抑制剤に関する。【００２９】  本発明の第７の発明は、式（２）〜（１１）で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１つを含有するブナシメジ由来組成物を含有することを特徴とする抗腫瘍活性、アポトーシス誘発活性又は血管新生抑制活性を有する食品に関する。【００３０】  本発明の第８の発明は、ブナシメジ由来組成物が、ブナシメジの酢酸エチル抽出物をシリカゲルカラムに吸着させた後、溶出させることにより得られる組成物であることを特徴とする第７の発明の食品に関する。【００３１】  本発明の第９の発明は、式（２）〜（１１）で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１つを含有するブナシメジ由来組成物であって、ブナシメジの酢酸エチル抽出物をシリカゲルカラムに吸着させた後、溶出させることにより得られるブナシメジ由来組成物に関する。【００３２】  本発明の第１０の発明は、抗腫瘍作用、アポトーシス誘発作用又は血管新生抑制作用を必要とする疾患を有する被験体に、有効量の上記一般式（１）で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１つを投与することを含む、該疾患の治療方法に関する。【００３３】  本発明の第１１の発明は、抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤又は血管新生抑制剤の製造のための、上記一般式（１）で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１つの使用に関する。
【発明の効果】
【００３４】  本発明により、安価な食用担子菌に含まれる化合物若しくは食用担子菌由来の組成物を含有する、経口でも効果を有する抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤又は血管新生抑制剤、及び当該化合物若しくは組成物を含有する抗腫瘍活性、アポトーシス誘発活性又は血管新生抑制活性を有する食品を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ＨＬ−６０細胞をＦＣＳ無添加ＲＰＭＩ−１６４０培地で３７℃、６時間培養した際のアセトン溶出画分のアポトーシス誘発作用を示す図である。図中、Ｖｅｈｉｃｌｅは１％エタノール水溶液を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】  ブナシメジは自然界においては秋期に種々の広葉樹の枯れ木に叢生あるいは離生しており、他のきのこと比較して形や歯切れのよい肉質のため、美味なきのことして採食されてきた。また、近年ではオガクズに米糠やその他の栄養源を配合した培養基を用いて、ビン又は箱で栽培を行う菌床人工栽培法が確立され、季節に関係なく一年を通じて安定してきのこを収穫できるようになっている。すなわち、本発明の有効、成分の原料となるブナシメジは安価に入手でき、医薬や健康食品原料としても適している。【００３７】  原料として使用されるブナシメジは天然のものでも人工栽培品でもよいが、好適にはＬｙｏｐｈｙｕｕｍ  ｕｌｍａｒｉｕｍ  Ｍ−８１７１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４１５、寄託日：１９８６年８月２３日）、又はＬｙｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｕｌｍａｒｉｕｍ  Ｋ−０２５９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１２９８１、寄託日：１９９２年６月２日）が例示される（これらの菌株はいずれも、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている）。また、これらの菌株は、商品名「やまびこほんしめじ（登録商標）」もしくは「Ｓｕｐｅｒやまびこしめじ（登録商標）」として市場に流通している。子実体は生のものでも加熱乾燥、天日乾燥、凍結乾燥等で乾燥された子実体乾燥物でもよい。また子実体は株のままでも粉砕したものでも原料として使用することができる。また、原料としてブナシメジの菌糸体やその凍結乾燥物を使用することもできる。【００３８】  本発明者らは、ブナシメジ由来の抗腫瘍活性を有する物質の探索を行った結果、一般式（１）で表されるポリテルペンに、経口でも効果が見られる強力な抗腫瘍活性、アポトーシス誘発活性及び血管新生抑制活性を有することを見出した。【００３９】  本発明において使用される一般式（１）で表される化合物としては、式（２）〜（１１）で表される化合物が例示され、特に好適にはブナシメジ子実体中の含有量が多く、製造しやすいという観点から、式（３）で表される化合物が使用される。【００４０】  なお、本発明の有効成分の一部である式（３）で表される化合物は特開平４−１０４７９５号に記載の新規物質ＳＢＳと同一化合物であり（以下、式（３）で表される化合物をＳＢＳと称することがある。）、当該特許にはＳＢＳはエプシュタイン−バールウィルス活性化の抑制作用を有することから当該化合物に抗発ガンプロモーター作用を有することが記載されている。しかしながら、当該公報には本発明のような経口投与で抗腫瘍活性、アポトーシス誘発活性及び血管新生抑制活性を示すことは開示されていない。すなわち、特開平４−１０４７９５号は腫瘍の発生に対して予防的な活性を見出したものであるのに対し、本発明は後述の実施例１にも示すとおり、ＳＢＳが経口投与で癌の治療や進行、転移を抑える効果を有することを見出したものであり、ＳＢＳの新規な用途に関する発明である。また、ＳＢＳの化学構造については、本発明者らが後述の実施例により解析したところ、沢辺らの文献（Ｓａｗａｂｅ  Ａ．他３名，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，１９９６年，Ｖｏｌ．３１，Ｐ９２１−９２５）に記載されている、ｈｙｐｓｉｚｉｐｒｅｎｏｌ  Ａ９と同一物質であった。【００４１】  本発明に使用される式（１）で表される化合物の製造方法としては、特に限定されるものではなく、化学合成や天然物（例えば、前述のブナシメジ）からの抽出等の公知の方法により製造することができ、例えばＳＢＳを製造する場合は、特開平４−１０４７９５号に記載の方法を適用することができ、また、式（２）〜（１１）で表される化合物を製造する場合は上記の沢辺らの文献の方法に準じて製造することもできる。また、下記調製例１に記載の方法によって、得られる抽出物を元に各種クロマトグラフィーにより式（２）〜（１１）で表される化合物を生成することもできる。【００４２】  本発明で使用される一般式（１）で表される化合物の誘導体としては、例えばエステルなど、体内で容易に加水分解し、所望の効果を発揮し得る誘導体（プロドラッグ）が挙げられる。また、本発明の化合物をほ乳動物に投与して代謝されてできた誘導体も本発明の誘導体に包含される。かかるプロドラッグの調製は公知の方法に従えばよい。なお、かかる誘導体は、それらの塩であってもよい。【００４３】  また、一般式（１）で表される化合物又はその誘導体の塩としては薬理学的に許容される塩が用いられる。また、プロドラッグとして機能し得る当該化合物の誘導体であってもよい。また、本発明に使用される化合物の光学異性体、ケト−エノール互変異性体、幾何異性体などの各種異性体、各異性体の単離されたものであっても、抗腫瘍活性、アポトーシス誘発活性又は血管新生抑制活性を有する限り、全て本発明において使用することができる。【００４４】  一般式（１）で表される化合物の薬理学的に許容される塩としては、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、有機塩基との塩などが例示される。なお、本発明において使用される薬理学的に許容される塩とは生物に対して実質的に無毒であって、かつ抗腫瘍活性、アポトーシス誘発活性、又は血管新生抑制活性を有する化合物の塩を意味する。当該塩としては、たとえば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウムまたはプロトン化されたベンザチン（Ｎ，Ｎ′−ジ−ベンジルエチレンジアミン）、コリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグラミン（Ｎ−メチルグルカミン）、ベネタミン（Ｎ−ベンジルフェネチルアミン）、ピペラジンもしくはトロメタミン（２−アミノ−２−ハイドロキシメチル−１，３−プロパンジオール）等の塩が挙げられる。かかる塩の調製もまた、公知の方法に従えばよい。【００４５】  また、本発明の第５〜８の発明において、前記の式（化２）〜（化１１）で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１つを含有するブナシメジ由来組成物が使用される。当該組成物としては、特に限定は無いが、例えばブナシメジの酢酸エチル抽出物をシリカゲルカラムに吸着させた後、適当な溶出溶媒により溶出させることにより得ることができる組成物が例示される。【００４６】  前述のブナシメジの酢酸エチル抽出物を得るための抽出操作としては、たとえばブナシメジの生鮮子実体を使用する場合���生鮮子実体１重量部に対して好適には１〜１０重量部、より好適には１〜５重量部の酢酸エチルを使用でき、また子実体乾燥物を使用する場合は、感燥物１重量部に対して好適には５〜５０重量部、より好適には１０〜２５重量部の酢酸エチルを使用することができる。酢酸エチルは沸点が低く、しかも食品の抽出溶媒として使用されており、安全面においても優れている。抽出温度は、特に限定はないが、例えば５℃〜酢酸エチルの沸点付近の温度（７７．１℃）、好ましくは１０〜７０℃、さらに好ましくは１５〜６５℃が例示される。抽出時間も特に限定はなく、例えば３０分〜２４時間、好ましくは１〜２０時間、さらに好ましくは２〜１０時間が例示される。抽出処理は静置して行なっても、攪拌下に行なっても良い。【００４７】  このようにして得られた酢酸エチル抽出物からの不溶物の除去は通常の方法で行なえばよく、例えばろ過または遠心分離により不溶物を除去することができる。ここで、不溶物とは、ろ過の場合、市販のろ紙（例えば、アドバンテック社製Ｎｏ．２フィルター）によりろ別される抽出物中の不溶性の成分を、遠心分離の場合、少なくとも５０００×ｇの遠心力により沈降し得る抽出物中の不溶性の成分をいう。【００４８】  シリカゲルカラムとしては特に限定はないが、例えばポアサイズ０．０６３−０．２００ｍｍのシリカゲルを充填したカラムが使用できる。どこに上記の酢酸エチル抽出物を供し、その後必要に応じて酢酸エチルで洗浄した後、各種溶媒にて溶出することができる。溶出溶媒としては、特に限定はないが、例えばアセトンが使用できる。【００４９】  得られた溶出液はそのまま本発明の組成物として使用することもできるが、たとえば当該溶出液を減圧乾固した後、エタノールで再溶解し、さらに減圧乾固することにより本発明の組成物とすることができる。該組成物中における式（２）〜（１１）で表される化合物の含有量としては、特に制限は無いが、好ましくは０．００１〜１００重量％、より好ましくは０．０１〜１０重量％である。かかる濃度に式（２）〜（１１）で表される化合物を調整するためには、特に限定はないが、デキストリン等の賦形剤を添加してもよい。中でも、該組成物中における式（３）で表される化合物の含有量が０．０００１〜１０重量％であることが好ましく、０．００１〜１重量％であればより好ましい。【００５０】  なお、本発明の抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤又は血管新生抑制剤において使用される一般式（１）で表される化合物、その誘導体、薬理学的に許容されるそれらの塩、又は上記のブナシメジ由来組成物を、本発明の有効成分と称し、本発明の有効成分を含有する抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤又は血管新生抑制剤を本発明の医薬と称することがある。【００５１】  本発明の有効成分には、後述するように特に毒性は認められない。また、副作用の発生の心配もない。それゆえ、安全かつ適切に抗腫瘍活性、アポトーシス誘発活性および血管新生抑制活性を発現することができる。【００５２】  また、本発明において、抗腫瘍剤の対象となる疾患としては、治療に抗腫瘍作用を要する疾患であれば特に限定はないが、例えば、悪性腫瘍全般、例えば胃がん、大腸がん、食道がん、皮膚がん、子宮がん、��立腺がん、膀胱がん、肺がん等が前記の疾患として例示される。さらに白血病のような造血器官の悪性腫瘍も本願発明の抗腫瘍剤の対象疾患とすることができる。尚、抗腫瘍活性は、培養がん細胞に薬剤を添加して所定の時間培養した後、がん細胞の生存率を測定したり、マウス等の実験動物にがん細胞を移植し、薬剤を一定期間投与した後、実験動物体内に生じた固形腫瘍の大きさや重量を測定すること等により測定することができる。【００５３】  また、本発明において、アポトーシス誘発剤の対象となる疾患としては、治療にアポトーシス誘発作用を要する疾患であれば特に限定はないが、例えば、前記悪性腫瘍全般の他、シェーグレン症候群のような自己免疫疾患等が例示される。さらに白血病のような造血器官の悪性腫瘍も本願発明のアポトーシス誘発剤の対象疾患とすることができる。本発明におけるアポトーシス誘発活性は、マウス正常細胞を用いた場合には確認されないことから、かかる活性を有する本発明のアポトーシス誘発剤は前記の疾患に対して極めて有用性の高いものである。尚、アポトーシス誘発活性は、培養細胞に薬剤を添加して所定の時間培養後、ヨウ化プロピジウム等で核染色を行った後、顕微鏡下で観察するか、フローサイトメーター等を用いて測定することができる。【００５４】  また、本発明において、血管新生抑制剤の対象となる疾患としては、治療に血管新生抑制作用を要する疾患であれば特に限定はないが、例えば、前記悪性腫瘍全般の他、リウマチ様関節炎、乾癬、変形性関節症、加齢性黄班変性症、血管腫、肥大性の瘢痕、歯周病、強皮症等が例示される。尚、血管新生抑制活性は、血管新生を誘発する繊維芽細胞増殖因子等を添加したマトリゲル（細胞外基質）をマウスの皮下に移植するモデルにおいて、マトリゲル内に浸潤してくる赤血球のヘモグロビン量を、吸光度計を用いて測定する方法により評価することができる。【００５５】  本発明の医薬としては、本発明に係る前記有効成分を公知の医薬用担体と組み合わせて製剤化したものが挙げられる。本発明の医薬には、有効成分としての塩は薬理学的に許容され得る塩を用いる。また、本発明の医薬としては、前記有効成分を当該有効成分と同じ用途に使用可能な他の成分、例えば、公知の抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤、又は血管新生抑制剤と配合したり、併用したりすることができる。【００５６】  本発明の医薬の製造は、通常、前記有効成分を薬学的に許容できる液状または固体状の担体と配合することにより行われ、所望により溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とすることができる。また、使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品や、その他、外用剤とすることもできる。【００５７】  医薬用担体は、本発明の医薬の投与形態および剤型に応じて選択することができる。固体組成物からなる経口剤とする場合は、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤等とすることができ、たとえば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩などが担体として利用される。また経口剤の調製に当���ては、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料などを配合することもできる。たとえば、錠剤または丸剤とする場合は、所望によりショ糖、ゼラチン、ハイドロキシプロピルセルロースなどの糖衣または胃溶性もしくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよい。液体組成物からなる経口剤とする場合は、薬理学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などとすることができ、たとえば、精製水、エタノールなどが担体として利用される。また、さらに所望により湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、防腐剤などを添加してもよい。なお、本発明の有効成分は経口投与によっても十分な効果を発揮することから、その投与の簡便性の観点から経口投与用の医薬とするのか好適な形態である。【００５８】  一方、非経口剤とする場合は、常法に従い本発明の前記有効成分を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、落花生油、大豆油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどに溶解ないし懸濁させ、必要に応じ、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤などを加えることにより調製することができる。また、固体組成物を製造し、使用前に無菌水または無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。【００５９】  外用剤としては、経皮投与用または経粘膜（口腔内、鼻腔内）投与用の、固体、半固体状または液状の製剤が含まれる。また、座剤なども含まれる。たとえば、乳剤、ローション剤などの乳濁剤、外用チンキ剤、経粘膜投与用液剤などの液状製剤、油性軟膏、親水性軟膏などの軟膏剤、フィルム剤、テープ剤、パップ剤などの経皮投与用または経粘膜投与用の貼付剤などとすることができる。【００６０】  以上の各種製剤は、それぞれ公知の医薬用担体などを利用して、適宜、常法により製造することができる。また、かかる製剤における有効成分の含有量は、その投与形態、投与方法などを考慮し、好ましくは後述の投与量範囲で当該有効成分を投与できるような量であれば特に限定されるものではない。本発明の医薬中の有効成分の含有量としては、０．１〜１００重量％程度である。【００６１】  本発明の抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤又は血管新生抑制剤は、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなく、内用、外用および注射によることができる。注射剤は、たとえば静脈内、筋肉内、皮下、皮内などに投与し得、外用剤では、たとえば、座剤をその適する投与方法により投与すればよい。【００６２】  本発明の医薬の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的および当該医薬の投与対象である患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではない。一般には、有効成分として一般式（１）で表される化合物を使用する場合、製剤中に含有される前記有効成分の投与量で、例えば成人１日当り０．１μｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、好適には０．５μｇ〜４００ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好適には１μｇ〜３００ｍｇ／ｋｇ体重である。また、有効成分として、上記ブナシメジ由来組成物（減圧乾固したもの）を使用する場合は、例えば成人１日当り０．１μｇ〜１ｇ／ｋｇ体重、好適には０．５μｇ〜７５０ｍｇ／ｋｇ体��、さらに好適には１μｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ体重である。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。投与は、所望の投与量範囲内において、１日内において単回で、または数回に分けて行ってもよい。投与期間も任意である。また、本発明の医薬はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。【００６３】  本発明の食品は一般式（１）で表される化合物、その誘導体、薬理学的に許容されるそれらの塩、及び／又は前述のブナシメジ由来組成物を含有する抗腫瘍活性、アポトーシス誘発活性又は血管新生抑制活性を有する食品であり、本発明の食品を摂取、喫食することにより生体の恒常性が維持されることにおいて特に有用である。なお、当該食品としては、例えば抗腫瘍活性、アポトーシス誘発活性、又は血管新生抑制活性による所望の効果の発現のために用いられるものである旨の表示を付した健康食品（特定保健用食品）とすることもできる。【００６４】  本発明の食品の製造法に特に限定はない。たとえば、配合、調理、加工などは一般の食品のものに従えばよく、それらの製造法により製造することができ、得られた食品に本発明に係る前記有効成分が含有されていれば良い。【００６５】  なお、本発明の食品において「含有」とは、含有、添加および／または希釈を意味する。ここで、「含有」とは食品中に本発明で使用される有効成分が含まれるという態様を、「添加」とは食品の原料に、本発明で使用される有効成分を添加するという態様を、「希釈」とは本発明で使用される有効成分に、食品の原料を添加するという態様をいうものである。【００６６】  本発明の食品は、特に限定するものではないが、例えば、穀物加工品（例、小麦粉加工品、デンプン類加工品、プレミックス加工品、麺類、マカロニ類、パン類、あん類、そば類、麩、ビーフン、はるさめ、包装餅等）、油脂加工品（例、可塑性油脂、てんぷら油、サラダ油、マヨネーズ類、ドレッシング等）、大豆加工品（例、豆腐類、味噌、納豆等）、食肉加工品（例、ハム、ベーコン、プレスハム、ソーセージ等）、水産製品（例、冷凍すりみ、かまぼこ、ちくわ、はんぺん、さつま場げ、つみれ、すじ、魚肉ハム、ソーセージ、かつお節、魚卵加工品、水産缶詰、つくだ煮等）、乳製品（例、原料乳、クリーム、ヨーグルト、バター、チーズ、練乳、粉乳、アイスクリーム等）、野菜・果実加工品（例、ペースト類、ジャム類、漬物類、果実飲料、野菜飲料、ミックス飲料等）、菓子類（例、チョコレート、ビスケット類、菓子パン類、ケーキ、餅菓子、米菓類等）、アルコール類（例、日本酒、中国酒、ワイン、ウイスキー、焼酎、ウオッカ、ブランデー、ジン、ラム酒、ビール、清涼アルコール飲料、果実酒、リキュール等）、嗜好飲料（例、緑茶、紅茶、ウーロン茶、コーヒー、清涼飲料、乳酸飲料等）、調味料（例、しょうゆ、ソース、酢、みりん等）、缶詰・瓶詰・袋詰食品（例、牛飯、釜飯、赤飯、カレー、その他の各種調理済食品等）、半乾燥または濃縮食品（例、レバーペースト、その他のスプレッド、そば・うどんの汁、濃縮スープ類等）、乾燥食品（例、即席麺類、即席カ���ー、インスタントコーヒー、粉末ジュース、粉末スープ、即席味噌汁、調理済食品、調理済飲料、調理済スープ等）、冷凍食品（例、すき焼き、茶碗蒸し、うなぎかば焼き、ハンバーグステーキ、シュウマイ、餃子、各種スティック、フルーツカクテル等）、固形食品、液体食品（例、スープ等）、香辛料類等の農産・林産加工品、畜産加工品、水産加工品等が挙げられる。【００６７】  本発明の食品は、前記有効成分が単独もしくは複数含有、添加および／または希釈されており、その含有量が抗腫瘍活性、アポトーシス誘発活性又は血管新生抑制活性を発現するための必要量に相当するものであれば特にその形状に限定はなく、タブレット状、顆粒状、カプセル状等の形状の経口的に摂取可能な形状物も包含する。また、前記有効成分にグリセリン等を添加して、有効成分が濃縮された健康食品とすることもできる。【００６８】  本発明の食品中の前記有効成分の含有量は特に限定されず、その官能と活性発現の観点から適宜選択できるが、例えば一般式（１）で表される化合物を使用する場合、食品中、好ましくは０．００００１重量％以上、より好ましくは０．０００１〜１０重量％、更に好ましくは０．０００６〜６重量％である。また、上記ブナシメジ由来組成物（減圧乾固したもの）を使用する場合は、食品中、好ましくは１重量％以上、より好ましくは５〜９５重量％、更に好ましくは１０〜９０重量％である。また本発明の食品は、好ましくは、それらに含有される上記成分が、例えば一般式（１）で表される化合物を使用する場合、成人１日当たり０．１μｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．５μｇ〜４００ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは１μｇ〜３００ｍｇ／ｋｇ体重となるように摂取すればよい。また、上記ブナシメジ由来組成物（減圧乾固したもの）を使用する場合は、例えば成人１日当り０．１μｇ〜１ｇ／ｋｇ体重、好適には０．５μｇ〜７５０ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好適には１μｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ体重である。【００６９】  本発明の第１０の発明はまた、抗腫瘍作用、アポトーシス誘発作用又は血管新生抑制作用を必要とする疾患を有する被験体に、有効量の上記一般式（１）で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１つを投与することを含む、該疾患の治療方法を提供する。【００７０】  本明細書中において被験体は、好ましくはヒトであるが、これに限定されず、例えば、養殖動物、ペット動物などでもよい。養殖動物としてはウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ラマなどの家畜、マウス、ラット、モルモット、ウサギなどの実験動物、ニワトリ、アヒル、七面鳥、駝鳥などの家禽が例示される。ペット動物としてはイヌ、ネコなどが例示される。【００７１】  また、本明細書中において有効量とは、一般式（１）で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１つを（有効成分）を上記被験体に投与した場合に、該有効成分を投与していない被験体と比較して、抗腫瘍作用、アポトーシス誘発作用または血管新生抑制作用を生じる該成分の量である。具体的な有効量としては、投与形態、投与方法、使用目的および被験体の年齢、体重、症状等によって適宜設定され一定ではないが、好ましくは、上記の医薬と同様に、前記有効成分の量で、ヒト（例えば成人）１日当り０．０１μｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ体重である。【００７２】  本発明の治療方法においては、有効量の一般式（１）で表される化合物、その誘導体及び薬理学的に許容されるそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１つをそのまま上記被験体に投与してもよく、また、上記のような医薬又は食品として投与してもよい。また、投与方法にも限定はなく、例えば、上記の医薬と同様に、経口投与や注射等により投与すればよい。【００７３】  本発明の治療方法によれば、前記の本発明の医薬又は食品の対象となる疾患を治療することができ、例えば、癌の治療や進行、転移を抑える効果が発揮され得る。【００７４】  本発明で有効成分として使用されるＳＢＳを２５ｍｇ／マウス／日で経口投与しても毒性は認められない。
【実施例】
【００７５】  以下、本発明を実施例をもって詳細に説明するが本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。尚、実施例の記載において、用語「腫瘍抑制活性」は、抗腫瘍活性と同義の用語として用いられる。【００７６】調製例１
ブナシメジＬｙｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｕｌｍａｒｉｕｍ  Ｍ−８１７１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４１５）の子実体乾燥粉末２５０ｇに酢酸エチル５Ｌを加え、室温で３時間攪拌後、ろ過（アドバンテック社製  Ｎｏ．２フィルター）し、残さを除去することにより５Ｌのろ液を得た。シリカゲル６０（０．０６３−０．２００ｍｍ）（メルク社製）１５０ｇを約８００ｍｌの酢酸エチルで洗浄し、直径５ｃｍのガラス製カラムに充填して得られたシリカゲルカラムに、上記のろ液を静かに注ぎ入れた後、３Ｌの酢酸エチルで洗浄することにより非吸着物質を除去した。次に３Ｌのアセトンで溶出させることにより、溶出液３Ｌを得た。該溶出液を減圧乾固した後、１００％エタノール１００ｍｌを添加し再び減圧乾固することにより、アセトンが除去されたアセトン溶出画分３．６ｇを得た。
ＮＭＲ及びＬＣ−ＭＳの分析の結果、該画分には式（２）〜（１１）で表される化合物が含有されており、その主要構成成分は式（３）で表される化合物（ＳＢＳ）であることを確認した。【００７７】調製例２
ブナシメジがＬｙｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｕｌｍａｒｉｕｍ  Ｋ−０２５９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１２９８１）である以外は調製例１と同様の方法によりアセトン溶出画分１．１ｇを得た。ＮＭＲ及びＬＣ−ＭＳの分析の結果、該画分には式（２）〜（１１）で表される化合物が含有されていることを確認した【００７８】実施例１
ＩＣＲマウス（日本エスエルシー社）は、５週齢の雌を購入し６週齢で使用した。Ｓａｒｃｏｍａ−１８０（以下Ｓ−１８０）腫瘍細胞は、ＩＣＲマウスの腹腔に移植して腹水をつくり、７日毎に別のマウスに移植して継代した。継代して７日目の腹水を採取し、リン酸緩衝液で遠心洗浄後、同緩衝液に懸濁して細胞数カウント後、５×１０７個／ｍＬとなるように調整した。この細胞懸濁液０．１ｍＬをＩＣＲマウスの右側腹部皮下に移植し、７日後の固形腫瘍の大きさを測定した。腫瘍の大きさの平均が各群で均等になり、１群１０匹となるようにマウスを群分けした。ブナシメジ由来のアセトン溶出画分は、調製例１で調製したものを１００％エタノールに溶解させた後、通常の粉末飼料ＣＥ−２に混ぜてマウスに与えた。投与量はブナシメジ粉末に換算して、粉末試料ＣＥ−２に対して体積比で１０％混ぜて与えた場合と同等になるように用いた。実際の投与量（アセトン溶出画分）は、約２５０ｍｇ／ｋｇ／／日となる。コントロール群にはＣＥ−２のみを与えた。腫瘍の大きさは、Ｓ−１８０移植後４週目に測定した。また、腫瘍の大きさは長径と短径を測定し、以下の計算式にしたがって体積を算出して比較した。
腫瘍体積（ｍｍ３）＝（長径）×（短径）２／２
腫瘍抑制活性は、以下の計算式にしたがって算出した。
腫瘍抑制活性（％）＝（コントロール群の腫瘍体積−アセトン溶出画分投与群の腫瘍体積）／コントロール群の腫瘍体積×１００【００７９】
【表１】
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【００８０】  ２回の実験を行った結果を表１に示した。いずれの実験においてもコントロール群に比べて、ブナシメジ由来アセトン溶出画分を投与した群においてＳ−１８０固形腫瘍増殖の抑制がみられた。【００８１】実施例２
ＣＤＦ１マウス（日本エスエルシー社）は、６週齢の雌を購入し７週齢で使用した。ＩＭＣ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ（以下ＩＭＣ）腫瘍細胞は、ＣＤＦ１マウスの腹腔に移植して腹水をつくり、７日毎に別のマウスに移植して継代した。継代して７日目の腹水を採取し、リン酸緩衝液で遠心洗浄後、同緩衝液に懸濁して細胞数カウント後、５×１０７個／ｍＬとなるように調整した。この細胞懸濁液０．１ｍＬをＣＤＦ１マウスの右側腹部皮下に移植し、７日後の固形腫瘍の大きさを測定した。腫瘍の大きさの平均が各群で均等になり、１群１０匹となるようにマウスを群分けした。ブナシメジ由来のアセトン溶出画分は、調製例１で調製したものを１００％エタノールに溶解させた後、通常の粉末飼料ＣＥ−２に混ぜてマウスに与えた。投与量はブナシメジ粉末に換算して、粉末試料ＣＥ−２に対して体積比で１０％混ぜて与えた場合と同等になるように用いた実際の投与量は、約２５０ｍｇ／ｋｇ／日となる。コントロール群にはＣＥ−２のみを与えた。腫瘍の大きさは、ＩＭＣ移植後４週目に測定した。また、腫瘍の大きさは長径と短径を測定し、実施例１と同様に体積と腫瘍抑制活性を算出して比較した。結果を表２に示す。【００８２】
【表２】
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【００８３】  コントロール群に比べて、ブナシメジ由来アセトン溶出画分を投与した群においてＩＭＣ固形腫瘍増殖の抑制がみられた。ＩＭＣ  ｃａｒｃｉｎｏｍａは、ＣＤＦ１マウスに対して同系であり、このような同系腫瘍に対してもブナシメジ由来アヤトン溶出画分は、増殖を抑制することが明らかとなった。【００８４】実施例３
ＨＬ−６０細胞は、１０％牛胎仔血清とＧｅｎｔａｍｙｃｉｎを終濃度５０μｇ／ｍｌで添加したＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて１週間に２回、継代したものを用いた。細胞を血清を添加しないＲＰＭＩ−１６４０培地で２回洗浄し、同培地に懸濁して細胞数をカウントした。細胞を２×１０６／ｍＬとなるように希釈し、２４穴培養プレートに１ｍＬずつ分注した。調製例１で調製したアセトン溶出画分を０．２μＭ、２μＭあるいは２０μＭとなるように添加し、３７℃インキュベータで６時間培養した。ネガティブコントロールには、ｖｅｈｉｃｌｅ（１％エタノール水溶液）を、また、ポジティブコントロールには、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄの１μｇ／ｍＬを用いた。６時間培養後に遠心分離にて細胞を回収した。アポトーシス細胞の検出は以下のように行った。細胞を４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）室温で１５分固定したのち、７０％エタノールに懸濁して−２０℃で一晩、静置した。これをリン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））で洗浄後、リボヌクレアーゼＡ溶液を加えて３７℃で約２０分インキュベートした。遠心分離で細胞を回収後、ヨウ化プロピジウム溶液を加えて染色して、フローサイトメーター（ベックマン・コールター社製）を用いてアポトーシス細胞の比率を測定した。また、一部をスライドガラスにとり、蛍光顕微鏡下でアポトーシスが起こっていることを確認した。結果を図１に示す。【００８５】実施例４
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（日本エスエルシー社）は、６週齢の雌を購入し７週齢で使用した。Ｍａｔｒｉｇｅｌを用いた血管新生の評価は、Ｐａｓｓａｎｉｔｉら（Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６７：５１９−５２８，１９９２）の方法に従って行った。すなわち、アシディック・フィブロブラスト・グロス・ファクター（ａＦＧＦ）１μｇ／ｍＬ、ヘパリンを６４Ｕ／ｍＬとなるように添加したＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に、調製例１で調製したアセトン溶出画分を表３に示す濃度となるように添加し、この０．５ｍＬをマウスの右側腹部皮下に移植した。コントロールには、アセトン溶出画分の溶解に用いたｖｅｈｉｃｌｅ（１％エタノール水溶液）をアセトン溶出画分の代わりに添加した。１５日後にＭａｔｒｉｇｅｌを摘出した。血管新生の度合は、摘出したＭａｔｒｉｇｅｌをホモゲナイズし、ヘモグロビン量を測定することで比較した。ヘモグロビン量の測定は、ヘモグロビン  Ｂ−テストワコー（和光純薬社製）を用いた。結果を表３に示す。【００８６】
【表３】
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【００８７】  以上のように、アセトン溶出画分を作用させることにより、ヘモグロビン濃度が抑制された。すなわち、Ｍａｔｒｉｇｅｌへの血管新生が抑制されたために、Ｍａｔｒｉｇｅｌ内に侵入する血液量が抑えられた結果である。【００８８】実施例５
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（日本エスエルシー社）は、６週齢の雌を購入し７週齢で使用した。Ｍａｔｒｉｇｅｌを用いた血管新生の評価は、実施例４と同様に行った。すなわち、ａＦＧＦとヘパリンを添加したＭａｔｒｉｇｅｌをマウスの皮下に注射し、５日後に摘出してヘモグロビン量を測定した。ブナシメジ由来のアセトン溶出画分は、調製例１で調製したものを凍結乾燥後、通常の粉末飼料ＣＥ−２に混ぜてマウスに与えた。投与量はブナシメジ粉末に換算して、粉末試料ＣＥ−２に対して体積比で１０％混ぜて与えた場合と同等になるように用いた。実際の投与量は、約２２０ｍｇ／ｋｇ／日となる。コントロール群にはＣＥ−２のみを与えた。結果を表４に示す。【００８９】
【表４】
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【００９０】  アセトン溶出画分を餌に混ぜて投与した場合にもＭａｔｒｉｇｅｌに対する血管新生を抑制した。これによりアセトン溶出画分による血管新生抑制作用が示された。また、アセトン溶出画分混餌投与した際にみられる腫瘍増殖抑制作用は、腫瘍の血管新生を抑制することにより生じた作用である可能性も示唆された。【００９１】実施例６
Ｕ９３７細胞（ヒトリンパ腫細胞）を、１０％牛胎仔血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁し、細胞数をカウントして５×１０４個／ｍＬとなるように調整した。これを２ｍＬずつ細胞培養用プレートに分注した。調製例１で調製したアセトン溶出画分を１または２ｍＭとなるようにエタノールで希釈し、２０μＬずつ添加して、それぞれ終濃度１０または２０μＭとした。コントロールにはエタノールのみを添加した。３７℃、５％ＣＯ２条件下でインキュベートし、６時間後、２４時間後、４８時間後あるいは７２時間後に細胞を回収し、０．３重量％トリパンブルーで染色して全細胞数と死細胞数をカウントした。生細胞数のみをカウントした結果を表５に示す。また、以下の計算式により算出した細胞の生存率の結果を表６に示す。実験はＮ＝４で行い、結果は平均値を示した。また、生存率は下記式のとおり算出した。【００９２】生存率（％）＝（生細胞数／全細胞数）×１００【００９３】
【表５】
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【００９４】
【表６】
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【００９５】  以上のように、アセトン溶出画分は、ヒトリンパ腫細胞に対して抗腫瘍活性の一種である細胞傷害活性を示すことがあきらかになった。【００９６】実施例７
ＭＫＮ４５細胞（ヒト胃癌細胞）を、１０％牛胎仔血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁し、細胞数をカウントして５×１０４個／ｍＬとなるように調整した。これを２ｍＬずつ細胞培養用プレートに分注し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養後、培地を除き、新たに１ｍＬの培地を入れた。調製例１で調製したアセトン溶出画分を２または４ｍＭとなるようにエタノールで希釈し、１０μＬずつ添加して、それぞれ終濃度２０または４０μＭとした。コントロールにはエタノールのみを添加した３７℃、５％ＣＯ２条件下でインキュベートし、６時間後、２４時間後、４８時間後あるいは７２時間後にトリプシン−ＥＤＴＡ処理にて細胞を回収し、０．３重量％トリパンブルーで染色して全細胞数と死細胞数をカウントし、実施例６と同様に生存率を算出した。生細胞数のみをカウントした結果を表７に示す。また、生存率の結果を表８に示す。なお、実験はＮ＝４で行い、結果は平均値を示した。【００９７】
【表７】
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【００９８】
【表８】
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【００９９】  以上のように、アセトン溶出画分は、ヒト胃癌細胞に対しても抗腫瘍活性の一種である細胞傷害活性を示すことがあきらかになった。【０１００】実施例８
Ｓ−１８０細胞（マウス癌細胞）あるいはＩＭＣ細胞（マウス癌細胞）は、それぞれＩＣＲマウスあるいはＣＤＦ１マウスを用いて腹水継代されているものを、移植継代後、７日目に腹水を採取して用いた。リン酸緩衝液で遠心、洗浄した後、１０％牛胎仔血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０に懸濁し、細胞数をカウントして１×１０６個／ｍＬとなるように調整した。これを１ｍＬずつシャーレに分注した。調製例１で調製したアセトン溶出画分を１、２あるいは４ｍＭとなるようにエタノールで希釈し、１０μＬずつ添加してそれぞれ終濃度１０、２０、４０μＭとした。コントロールにはエタノールのみを添加した。３７℃、５％ＣＯ２条件下でインキュベートし、６時間後、２４時間後、４８時間後あるいは７２時間後に細胞を回収し、０．２％トリパンブルーで染色して全細胞数と死細胞数をカウントし、実施例６と同様に生存率を算出した（表９および表１０）。【０１０１】
【表９】
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【０１０２】
【表１０】
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【０１０３】  以上のように、アセトン溶出画分は、マウス癌細胞に対しても抗腫瘍活性の一種である細胞傷害活性を示すことがあきらかになった。【０１０４】調製例３
ブナシメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｕｍ  ｕｌｍａｒｉｕｍ  Ｍ−８１７１）子実体粉末３００ｇに酢酸エチルを加え、全量を５Ｌとし、室温で３時間撹拌して酢酸エチル可溶性成分を抽出した。吸引ろ過により不溶物を除去し酢酸エチル可溶画分とした。これをＳｉｌｉｃａｇｅｌ６０カラム（３００ｍＬ容）にかけ、３Ｌの酢酸エチルを流して非吸着画分を溶出させた後、アセトン３Ｌを流してアセトン溶出画分を回収した。減圧濃縮後、エタノールを加えて、再度減圧濃縮乾固し重量を測定した。この操作を１０回行い、最終的に３ｋｇのブナシメジ子実体粉末より、アセトン溶出画分を３５．２ｇ得た。この５００ｍｇを、Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０カラムにかけ、酢酸エチル：アセトン（５０：５０）より、（０：１００）までグラジエントをかけて主要成分を回収した。減圧濃縮で溶剤を除去した後、メタノール：エタノール：水（３：４：４）の混合溶媒に溶解し、ＯＤＳカラム（ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  Ｃ１８  ＵＧ１２０Å  ５μｍ  φ２０ｘ２５０ｍｍ）を用いた高速液体クロマトグラフィーにより、流速１０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長２１０ｎｍの条件でＳＢＳを分取した。溶出溶媒にはＳＢＳを溶解した溶媒を用いた。分取したＳＢＳを濃縮乾固して、２６０ｍｇの精製ＳＢＳを得た。【０１０５】実施例９
ＨＬ−６０細胞（ヒト白血病細胞）を、１０％牛胎仔血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０に懸濁し、細胞数をカウントして５×１０５個／ｍＬとなるように調整した。これを２ｍＬずつシャーレに分注した。調製例３で調製したＳＢＳを２ｍＭとなるようにジメチルスルホキシドで希釈し、２０μＬずつ添加して終濃度２０μＭとした。コントロールにはジメチルスルホキシドのみを添加した。３７℃、５％ＣＯ２条件下で６時間インキュベートした後、細胞を回収しリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で遠心、洗浄した。細胞に４％パラホルムアルデヒドを加え、室温で３０分間静置することにより固定した。遠心後、上清を除き、ＰＢＳを加えて遠心、洗浄し、２００μＬのＰＢＳに細胞を懸濁した。０．０５ｍｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウムを５００μＬ添加し、４℃で１０分間インキュベートした後、全細胞数と、アポトーシスを起こした細胞数を測定し、下記式に従ってアポトーシスを誘発した割合を算出した（表１１）。【０１０６】アポトーシス誘発率（％）＝（アポトーシスを誘発している細胞数／全細胞数）×１００【０１０７】
【表１１】
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【０１０８】  以上のように、精製されたＳＢＳも癌細胞にアポトーシスを誘発させることがあきらかになった【０１０９】実施例１０
ＣＤＦ１マウス（日本エスエルシー社）は、６週齢の雌を購入し７週齢で使用した。ＩＭＣ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ（以下ＩＭＣ）腫瘍細胞は、ＣＤＦ１マウスの腹腔に移植して腹水をつくり、７日毎に別のマウスに移植して継代した。移植継代して７日後の腹水を採取し、リン酸緩衝液で懸濁後遠心分離し、沈澱を同緩衝液に懸濁して細胞数をカウントした。その細胞数が５×１０７個／ｍＬとなるように調整し、この０．１ｍＬをＣＤＦ１マウスの右側腹部皮下に移植した。移植７日目に腫瘍の生着を確認し、固形腫瘍の大きさを測定した。腫瘍の大きさの平均が各群で均等になり、１群１２あるいは１１匹となるようにマウスを群分けした。ＳＢＳは、調製例３で調製したものをエタノールに溶解し、エタノール濃度が１０％となるように落花生油で希釈してマウスに経口投与した。実際の投与量は、約１５．６ｍｇ／ｋｇ／日となる。コントロール群は、エタノール１０％を含む落花生油を投与した。ＩＭＣ腫瘍移植後３週目に腫瘍の長径と短径を測定し、実施例１と同様に腫瘍体積と腫瘍抑制活性を算出して比較した。結果を表１２に示す。【０１１０】
【表１２】
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【０１１１】  以上のようにＳＢＳを経口投与した動物群においては、コントロール群に比べて、有意な腫瘍増殖抑制が見られた。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】  本発明により、安価な食用担子菌から単離されたポリテルペン又はブナシメジ由来組成物を有効成分として含有する抗腫瘍剤、アポトーシス誘発剤、又は血管新生抑制剤、および抗腫瘍活性、アポトーシス誘発活性又は血管新生抑制活性を有する食品を得ることができる。よって、本発明は特に医薬や健康食品分野において特に有用である。
【図１】
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【国際調査報告】
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