(57)【要約】ＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を特異的に認識する抗ＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体や、ＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を標的とした、抗ＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体からなるエンドトキシンショック治療剤や、ＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を標的とした、抗ＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体によるエンドトキシンショック治療方法を提供するものである。インビトロでのＬＰＳ刺激による、Ｂ細胞の増殖抑制効果及びマクロファージにおけるＴＮＦ産生抑制効果を示さず、かつ、エンドトキシンショックに対してＴＮＦ産生を亢進して、エンドトキシンショックに対して抑制効果を有する抗ＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体を作製する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロでのＬＰＳ刺激による、Ｂ細胞の増殖抑制効果及びマクロファージにおけるＴＮＦ産生抑制効果を示さず、かつ、エンドトキシンショックに対して抑制効果を有することを特徴とするＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を特異的に認識するモノクローナル抗体。
【請求項２】
エンドトキシンショックに対して、ＴＮＦ産生を亢進することを特徴とする請求項１記載のＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を特異的に認識するモノクローナル抗体。
【請求項３】
ＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体におけるＴＬＲ４のＮ末端側の抗原決定基を認識する請求項１又は２記載のＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を特異的に認識するモノクローナル抗体。
【請求項４】
マウスＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体におけるマウスＴＬＲ４のＮ末端側の抗原決定基を特異的に認識する抗マウスＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体Ｓａ１５−２１。
【請求項５】
ヒトＴＬＲ４のＮ末端側の抗原決定基を特異的に認識する抗ヒトＴＬＲ４モノクローナル抗体ＴＦ９０４。
【請求項６】
ヒトＴＬＲ４のＮ末端側の抗原決定基を特異的に認識する抗ヒトＴＬＲ４モノクローナル抗体ＴＦ９０４を産生するハイブリドーマ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０１１８）。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか記載のＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を特異的に認識するモノクローナル抗体を含有することを特徴とするＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を標的としたエンドトキシンショックの予防・治療剤。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか記載のＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いることを特徴とするＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を標的としたエンドトキシンショックの予防・治療方法。
【請求項９】
マウスにエンドトキシンショックを生起させる前後に、マウスＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を特異的に認識する抗マウスＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体Ｓａ１５−２１と被検物質とをマウスに投与し、マウスのエンドトキシンショックの程度を評価することを特徴とするエンドトキシンショック抑制作用の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を特異的に認識する抗ＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体や、ＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を標的とした、抗ＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体からなるエンドトキシンショックの治療剤や、ＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を標的とした、抗ＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体によるエンドトキシンショックの治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  リポポリサッカライド（ＬＰＳ；ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）はグラム陰性菌細胞壁外葉の主たる構成成分で、免疫担当細胞ばかりでなく、血管内皮細胞、線維芽細胞など様々な細胞の活性化を誘導する。つまり、生体は分子或いは細胞レベルでＬＰＳを認識することによって、グラム陰性菌の侵入を察知している。ＬＰＳを認識しシグナルを伝達する分子は、長い間検索されてきた結果、最近になってようやく明らかにされた。３０年程前に見つかったＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスはＬＰＳ低応答性を示すミュータントマウスである。同様なＬＰＳ低応答性を示すマウスとしてＣ５７ＢＬ／１０ＳｃＣｒも報告されていたが、これらのマウスの原因遺伝子がポジショナルクローニングによってＴＬＲ４（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４）であると同定された（例えば、Ｐｏｌｔｒａｋ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２，２０８５−２０８８，１９９８、Ｑｕｒｅｓｈｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８９，６１５−６２５，１９９９参照）。【０００３】  ＴＬＲ４は、ショウジョウバエにおいて真菌を認識し感染防御を誘導する分子Ｔｏｌｌのヒト及びマウスホモローグである（例えば、Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３８８，３９４−３９７，１９９７参照）。長い間探し求められてきたＬＰＳ認識分子は、ハエからヒトにまで保存されている病原体認識分子の１つであることが確認された。しかしながら、ＬＰＳ認識は多くの分子が関与するプロセスで、ＴＬＲ４単独では説明できないことが明らかにされている。本発明者はＴＬＲ４のＬＰＳ認識を制御する分子として、ＲＰ１０５、ＭＤ−１、ＭＤ−２などを報告してきた。【０００４】  ＬＰＳ認識機構とＴＬＲｓ（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）の関係についても解明されてきた。ＬＰＳの活性中心はリピドＡと呼ばれ、Ｎアセチルグルコサミン２分子に脂肪酸が結合したものである。リピドＡにコア抗原、さらにＯ抗原とよばれる糖類がつながったものがＬＰＳである。ＬＰＳは低い濃度でもマクロファージ、Ｂ細胞、樹状細胞、好中球、血管内皮細胞、線維芽細胞など実に様々な細胞の活性化を誘導する。つまりこれらの細胞はＬＰＳを認識することができる。ＬＰＳ認識機構は多くの分子が関わる複雑なプロセスである（例えば、実験医学Ｖｏｌ．１９（２００１）Ｎｏ．５，Ｐ８１参照）。菌体上にあるＬＰＳはまず、血清中のＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）によって外膜から遊離され、もう一つのＬＰＳ結合タンパク質であるＣＤ１４へ単体の形で転送される。（例えば、Ｗｒｉｇｈｔ，Ｓ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，１４３１−１４３３，１９９０、Ｐｕｇｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１，５０９−５１６，１９９４参照）。【０００５】  ＣＤ１４は血清タンパク質として血中に、或いは細胞表面タンパク質として単球、マクロファージ上に存在している。ＣＤ１４／ＬＰＳ複合体はＬＰＳ単独の場合に比べて、１００〜１０，０００分の１の低い濃度で細胞の活性化を誘導する（例えば、Ｗｒｉｇｈｔ，Ｓ．Ｄ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５，６−８，１９９５参照）。しかし、ＣＤ１４は細胞質内ドメイン���もたないためにＬＰＳシグナルを細胞内へそれ自身では伝達することができない。そこでＬＰＳシグナルを細胞内へ伝達するための新たなレセプター分子の存在が指摘され、検索が続けられていた。最近ようやくそのＬＰＳレセプターの実体がＴＬＲ４であると同定された。【０００６】  ハエのＴｏｌｌレセプターは、個体発生の際に腹側への分化誘導シグナルを伝達するレセプター分子として発見されたが、その後真菌感染を察知して感染防御反応を誘導する役割をもっていることが報告された（例えば、Ｌｅｍａｉｔｒｅ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，８６，９７３−９８３，１９９６参照）。更に、Ｔｏｌｌによく似た分子ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）をマウスやヒトももっていることが１９９７年に明らかにされ、その１つであるＴＬＲ４が長い間謎であったＬＰＳ／エンドトキシン認識分子であった。ところが、細胞株を用いた実験で、ＴＬＲ４単独ではＬＰＳを認識できないという結果が報告された。【０００７】  マウスＩＬ−３依存性細胞株Ｂａ／Ｆ３やヒト腎臓由来２９３細胞株はそれ自身ＬＰＳに応答しないし、これらの細胞にヒトＴＬＲ４を発現させたトランスフェクタントもＬＰＳに対する応答性は認められない。その理由としてＬＰＳ応答にはＴＬＲ４に加えて他の分子が必要である可能性が考えられた。本発明者は，Ｒａｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  １０５（ＲＰ１０５）の細胞外ドメインのＬＲＲ（ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ）がＴＬＲ４のそれとよく似ていることに注目し、ｖ−ｍｙｂ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅの１つであるＭＤ−１がＲＰ１０５と会合するところから、ＴＬＲ４もＭＤ−１と会合するのではないかと考えた。しかしながら両方の遺伝子を細胞株に発現させ、免疫沈降で共沈降できるかどうかを調べたが有意な会合は検出できなかった。そこで、ＴＬＲ４に会合するＭＤ−１類似分子の存在を想定し、データベースで検索を行い、ヒト妊娠子宮由来の遺伝子を得ることに成功した（例えば、Ｓｈｉｍａｚｕ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｏ．Ｍｅｄ．，１８９，１７７７−１７８２，１９９９及び特開２０００−２６２２９０号公報参照）。【０００８】  この分子はアミノ酸１６０個からなり、ＭＤ−１とアミノ酸で約２３％一致していることから、ＭＤ−２という名前をつけた。ヒトＭＤ−２をマウスＩＬ−３依存性細胞株Ｂａ／Ｆ３に単独で発現させても細胞表面には検出されないが、ＴＬＲ４と共発現させると細胞表面で検出されるようになり、しかもその分布を共焦点レーザー顕微鏡で比較したところほぼ一致していた。さらに、抗ヒトＴＬＲ４モノクローナル抗体（ＨＴＡ１２５）でＴＬＲ４を免疫沈降すると、ＭＤ−２が共沈された。これらの実験結果から、ＲＰ１０５−ＭＤ−１と同様にＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体も細胞表面上に発現していることが確認された。【０００９】  ＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体によるＬＰＳ認識、シグナル伝達の機構を明らかにするために、ＴＬＲ４のＬＰＳ認識におけるＭＤ−２会合の役割が検討された。【００１０】  マウスＩＬ−３依存性細胞株Ｂａ／Ｆ３にヒトＴＬＲ４単独、或いはＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を発現させ、ＬＰＳ刺激によるＮＦ−κＢ活性化を、予めＢａ／Ｆ３細��株に導入しておいたＮＦ−κＢレポーター遺伝子を用いたルシフェラーゼアッセイで調べた結果、ＴＬＲ４単独ではＬＰＳ刺激によるＮＦ−κＢの活性化は検出されなかったが、ＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を発現した細胞株はＬＰＳ応答性を示した。そこで、ＭＤ−２を共発現させることによって、獲得されたＬＰＳ応答がＴＬＲ４を介しているかどうかを確認するために、ＴＬＲ４に対するモノクローナル抗体（ＨＴＡ１２５）を加えたところ、ＬＰＳ刺激によるＮＦ−κＢ活性化が特異的に阻害された。（例えば、実験医学Ｖｏｌ．１９（２００１）、Ｎｏ．５、Ｐ８３参照）。したがって、ＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体がＬＰＳを認識し、シグナルを伝達していることが明らかになった。【００１１】  上記するようなこれまでの結果は、全て細胞株を用いた実験であり、正常細胞においてＴＬＲ４−ＭＤ−２の発現やそのＬＰＳ認識について検討する必要があった。本発明者は新たに、マウスＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を特異的に認識するモノクローナル抗体（ＭＴＳ５１０）の確立に成功した（例えば、Ａｋａｓｈｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４，３４７１−３４７５，２０００参照）。この抗体を用いて腹腔マクロファージを染色したところ、ＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体の発現が確認された。また、ＬＰＳ刺激で誘導される腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ：ＴＮＦ）の産生をこの抗体は特異的に抑制した。更に、ＬＰＳで腹腔マクロファージを刺激すると、細胞表面上のＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体の発現が低下した。この発現低下はｎｇ／ｍｌという低濃度のＬＰＳ刺激でもみられるが、ペプチドグリカンなど他の病原体由来の物質による刺激では認められなかった。またＣＤ１４など他の細胞表面分子では同様な発現低下は認められず、ＴＬＲ４−ＭＤ−２に特異的な現象であった（例えば、Ｎｏｍｕｒａ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４，３４７６−３４７９，２０００参照）。【００１２】  これらの結果から、ＴＬＲ４−ＭＤ−２は正常マクロファージ表面上にも発現しており、ＬＰＳの認識やシグナル伝達を司っていることが明らかとなった。ＴＬＲ４やＭＤ−２はともに広範に発現されており、マクロファージばかりでなく、線維芽細胞や血管内皮細胞など、非免疫担当細胞においてもＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体がＬＰＳ認識にかかわっている可能性がある。【００１３】  以上のとおり、近年、グラム陰性菌細胞壁外葉の構成成分であるＬＰＳを認識してグラム陰性菌の進入を察知し、応答する機構における、ＴＬＲ４及びその会合分子であるＭＤ−２の役割については、徐々にその解明が進んできた。しかし、これまでの結果は、遺伝子や細胞レベルの実験を主とするものであり、今後は解析の方向として、ＴＬＲ４の病原体認識機構を更に分子レベルで明らかにするとともに、生体レベルの更なる解明が期待されていた。本発明者は、ＭＤ−２遺伝子を欠損したマウスを構築し、そのマウスがＬＰＳに全く応答しないことからＭＤ−２が生体レベルでもＬＰＳ応答に必須の分子であることを確認した（例えば、特開２００３−３１９７３４号公報参照）。【００１４】  抗生物質を中心とした今日までの感染症治療は、感染の現場であ���宿主自身の侵入細菌に対する免疫防御反応や、加えられた抗生物質および死滅した細菌に対する宿主の反応性に関しては全く考慮されていなかった。このような宿主自身の免疫力を考慮しない一律的な投与は多くの耐性菌や菌交代現象を生み出し、病院内での敗血症による死亡へとつながっていった。このことから宿主の免疫監視機能に基づいた治療法への変換が求められてきている。【００１５】  近年ハエのＴｏｌｌのヒトホモログであるＴＬＲが発見されてから、Ｔｏｌｌは種を越えて存在する病原体監視システムであることがわかってきた。この免疫システムは生体にとって最大の危険であるＬＰＳ（エンドトキシン）をはじめとする病原体由来の糖脂質をいち早く察知し排除するために専門化された自然免疫システムであるだけでなく、さらに獲得免疫発動へとつなげていく掛け橋の役目も果たすというまったく新しい認識分子群であった。病原体侵入により体内に入り込んできたＬＰＳをどうやって生体が認識し危険であるというシグナルを伝えるのかに関してこれまでほとんど分かっていなかったが、本発明者らはＴＬＲ４の会合分子ＭＤ−２を発見し、ＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体となって初めてＬＰＳ応答性が獲得されることを、独自に作製したモノクローナル抗体を用いた研究にて明らかにしてきた。【００１６】  本発明の課題は、ＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を特異的に認識する抗ＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体や、ＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を標的とした、抗ＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体からなるエンドトキシンショック治療剤や、ＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を標的とした、抗ＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体によるエンドトキシンショック治療方法を提供することにある。【００１７】  本発明者らは、マウスＴＬＲ４−ＭＤ−２に対する２種類のモノクローナル抗体、ＭＴＳ５１０とＳａ１５−２１を作製した。これらのモノクローナル抗体は互いに異なるエピトープを認識する。ＬＰＳ刺激によるＢ細胞増殖、マクロファージのサイトカイン産生を抑制する効果は、両方のモノクローナル抗体を同時に加えたときがもっとも強く、次にＭＴＳ５１０が強く、Ｓａ１５−２１による抑制効果は最も弱かった。次に、エンドトキシンショックのマウスモデルを用いて、この２つのモノクローナル抗体、ＣＤ１４に対するモノクローナル抗体の効果を調べた。モノクローナル抗体投与２時間後にＬＰＳとガラクトサミンを加えて、マウスの生存を調べたところ、モノクローナル抗体無投与、抗ＣＤ１４モノクローナル抗体、ＭＴＳ５１０では全部２４時間以内に死亡したのに対して、Ｓａ１５−２１を投与したマウスは、全く死ななかった。ＬＰＳで誘導される血中の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ，Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ）やＩＬ−１２を測定したが、Ｓａ１５−２１では抑制効果は全く認められなかった。インビトロでのＬＰＳ応答で、最も抑制効果を示したＭＴＳ５１０とＳａ１５−２１との同時投与も、ＭＴＳ５１０単独と同様にほとんどエンドトキシンショック抑制効果はなかった。これらの結果は、ＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を特異的に認識するモノクローナル抗体Ｓａ１５−２１によるエンドトキシンショック抑制効果は、ＬＰＳの作用を単独に遮断しているわけではなく、まったく新たな作用機構でエンドトキシンショックを防いでいる可能性が考えられた。本発明は以上の知見に基づき完成するに至ったものである。
【発明の開示】
【００１８】  すなわち本発明は、（１）インビトロでのＬＰＳ刺激による、Ｂ細胞の増殖抑制効果及びマクロファージにおけるＴＮＦ産生抑制効果を示さず、かつ、エンドトキシンショックに対して抑制効果を有することを特徴とするＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を特異的に認識するモノクローナル抗体や、（２）エンドトキシンショックに対して、ＴＮＦ産生を亢進することを特徴とする（１）記載のＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を特異的に認識するモノクローナル抗体に関する。
【００１９】  また本発明は、（３）（１）又は（２）記載のＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を特異的に認識するモノクローナル抗体を含有することを特徴とするＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を標的としたエンドトキシンショックの予防・治療剤や、（４）（１）又は（２）記載のＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いることを特徴とするＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を標的としたエンドトキシンショックの予防・治療方法に関する。
【００２０】  さらに本発明は、（５）マウスＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を特異的に認識する抗マウスＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体Ｓａ１５−２１や、（６）マウスにエンドトキシンショックを生起させる前後に、マウスＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を特異的に認識する抗マウスＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体Ｓａ１５−２１と被検物質とをマウスに投与し、マウスのエンドトキシンショックの程度を評価することを特徴とするエンドトキシンショック抑制作用の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法や、（７）（１）〜（５）のいずれか記載のＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を特異的に認識するモノクローナル抗体を含有することを特徴とするＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を標的としたエンドトキシンショックの予防・治療剤や、（８）（１）〜（５）のいずれか記載のＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いることを特徴とするＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を標的としたエンドトキシンショックの予防・治療方法や、（９）マウスにエンドトキシンショックを生起させる前後に、マウスＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を特異的に認識する抗マウスＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体Ｓａ１５−２１と被検物質とをマウスに投与し、マウスのエンドトキシンショックの程度を評価することを特徴とするエンドトキシンショック抑制作用の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】第１図は、本発明の抗ＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体Ｓａ１５−２１が、マウスＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体に特異的な抗体であることを示す図である。
【図２】第２図は、本発明の抗ＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体Ｓａ１５−２１と、抗ＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体ＭＴＳ５１０とが異なる抗原決定基を認識することを示す、クロスブロッキングの結果を示す図である。
【図３】第３図は、本発明の抗ＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体Ｓａ１５−２１が、ＬＰＳ刺激によるマウス脾臓細胞における増殖抑制効果を示さない結果を示す図である。
【図４】第４図は、本発明の抗ＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体Ｓａ１５−２１が、ＬＰＳ刺激によるマウスマクロファージにおけるＴＮＦ産生抑制効果を示さない結果を示す図である。
【図５】第５図は、本発明の抗ＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体Ｓａ１５−２１が、マウスエンドトキシンショックに対して、レスキュー効果を示す図である。
【図６】第６図は、マウスエンドトキシンショックに対して、抗ＣＤ１４モノクローナル抗体が全くレスキュー効果を示さない結果の図である。
【図７】第７図は、本発明の抗ＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体Ｓａ１５−２１が、ＬＰＳとガラクトサミン投与後１時間において、ＴＮＦの産生量を１０倍近く亢進していることを示す図である。
【図８】第８図は、本発明の抗ＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体Ｓａ１５−２１が、マウスＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体におけるマウスＴＬＲ４のＮ末端側の抗原決定基を認識すること、及び本発明の抗ＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体ＴＦ９０４が、ヒトＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体におけるヒトＴＬＲ４のＮ末端側の抗原決定基を認識することを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】  本発明のＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を特異的に認識するモノクローナル抗体としては、インビトロでのＬＰＳ刺激による、Ｂ細胞の増殖抑制効果及びマクロファージにおけるＴＮＦ産生抑制効果を示さず、かつ、エンドトキシンショックに対して抑制効果を有するモノクローナル抗体、好ましくはエンドトキシンショックに対して、ＴＮＦ産生を亢進するモノクローナル抗体、より好ましくはＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体におけるＴＬＲ４のＮ末端側の抗原決定基を認識するモノクローナル抗体であれば特に制限されるものではなく、かかるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７，１９７５）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４，７２，１９８３）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，ｐｐ．７７−９６，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）など任意の方法を用いて作製することができる。【００２３】  また、一本鎖抗体をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４５５，０３０号）を用いることができ、ヒト化抗体をつくるために、ヒト化抗体の調製法（米国特許第５，５８５，０８９号、Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２−５２５，１９８６、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４，７７３−７８３，１９９１）を用いることができ、キメラ抗体をつくるために、キメラ抗体の調製法（米国特許第４，８１６，５６７号、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９，１２０２−１２０７，１９８５、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４，２１４，１９８６、Ｎａｔｕｒｅ，３１２，６４３−６４６，１９８４、Ｎａｔｕｒｅ，３１４，２６８．２７０，１９８５）を用いることができる。【００２４】  例えば、ハイブリドーマ法により本発明のＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を特異的に認識するモノクローナル抗体を作製するには、ヒト、マウス等に由来するＴＬＲ４−ＭＤ−２を細胞表面に発現する細胞又はその細胞膜断片を感作抗原とし、かかる抗原を用いて、由来抗原とは異種のマウス、ラット等の哺乳動物に公知の免疫法により免疫し、免疫した動物から得られる脾細胞等の免疫細胞とマウス等のミエローマ細胞とを公知の細胞融合法により細胞融合させ、公知のクローニング技術により目的とするモノクローナル抗体産生ハイブリドーマをクローニングし、このハイブリドーマを培養することにより作製することができる。上記ヒト、マウス等に由来するＴＬＲ４−ＭＤ−２を細胞表面に発現する細胞又はその細胞膜断片としては、例えば、ＬＰＳ刺激あるいは遺伝子導入により、ヒト、マウス等に由来するＴＬＲ４及びＭＤ−２を共発現させた細胞株やその細胞膜断片を例示することができ、また、上記マウスのミエローマ細胞としては、８−アザグアニン耐性株を用いるのが有利であり、公知のものとしては、ＢＡＬＢ／ＣマウスのＰ３×６５Ａｇ８株、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１株、Ｐ３×６３ＡｇＵ１株、ＳＰ２／ＯＡｇ１４株、Ｐ３×６３Ａｇ８．６．５．３株、ＭＰＣ１１−４５．６．ＴＧ１．７株、ＳＰ−１株等を例示することができる。【００２５】  上記細胞融合は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等の融合促進剤の存在下に行われるが、融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を使用することもできる。免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して、免疫細胞を１〜１０倍程度とするのが好ましい。また、細胞融合に用いる培地としては、例えば、ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地等のこの種の細胞培養に使用される通常の培地が使用することができる。細胞融合は、免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培地内でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１，０００〜６，０００程度のＰＥＧを、通常、培地に約３０〜６０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で添加し、混合することによって行われる。続いて、適当な培地を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことにより目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作出することができる。【００２６】  クローン化されたハイブリドーマから、本発明のモノクローナル抗体を採取するには、当該ハイブリドーマを常法に従って培養し、その培養上清から得る方法や、あるいはハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳動物に投与して増殖させその腹水から得る方法などを例示することができる。こうして得られたモノクローナル抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、塩析、ゲル濾過等の通常の精製手段を用いることにより高純度に精製することができる。【００２７】  本発明のＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を特異的に認識するモノクローナル抗体には、本発明の抗ＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体のほか、便宜上当該抗体のＦａｂ断片やＦ（ａｂ’）２断片等も含まれ、例えば、Ｆａｂ断片は抗体をパパイン等で処理することにより、またＦ（ａｂ’）２断片はペプシン等で処理することにより調製することができる。【００２８】  また上記抗ＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓ又は３Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、上記ＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体の機能解析を行うことができる。また免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。【００２９】  本発明のＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を特異的に認識するモノクローナル抗体として、具体的には、マウスＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体におけるマウスＴＬＲ４のＮ末端側の抗原決定基を特異的に認識する抗マウスＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体Ｓａ１５−２１や、ヒトＴＬＲ４のＮ末端側の抗原決定基を特異的に認識する抗ヒトＴＬＲ４モノクローナル抗体ＴＦ９０４を挙げることができる。モノクローナル抗体Ｓａ１５−２１は、ＬＰＳ（リピドＡ）であらかじめ刺激しておいたマウスのＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を発現する正常ラット腎臓細胞を用いて、ラットの脚パッドにおいて免疫し、１週間後、リンパ節から得た免疫細胞とＳＰ２／０ミエローマ細胞とを融合させ、その培養上清が、マウスのＴＬＲ４−ＭＤ−２を発現するマウスＩＬ−３依存性細胞株Ｂａ／Ｆ３と特異的に反応するハイブリドーマを選択し、例えば、この選択したハイブリドーマをヌードマウスの腹腔に投与し、得られた腹水からカプリル酸を用いて精製することにより、モノクローナル抗体Ｓａ１５−２１を得ることができる。またモノクローナル抗体ＴＦ９０４は、ＬＰＳ（リピドＡ）であらかじめ刺激しておいたヒトＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を発現するマウスＩＬ−３依存性細胞株Ｂａ／Ｆ３を用いてマウス腹腔に３回免疫したのち脾臓から得た免疫細胞とＳＰ２／０ミエローマ細胞とを融合させ、その培養上清が、ヒトのＴＬＲ４−ＭＤ−２を発現するマウスＩＬ−３依存性細胞株Ｂａ／Ｆ３と特異的に反応するハイブリドーマを選択し、例えば、この選択したハイブリドーマをヌードマウスの腹腔に投与し、得られた腹水からカプリル酸を用いて精製することにより、モノクローナル抗体ＴＦ９０４を得ることができる。なお、モノクローナル抗体ＴＦ９０４産生ハイブリドーマ（Ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＴＦ９０４）は、２００４年９月７日に受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０１１８として、国際寄託当局である独立行政法人産業技術総合研究所  特許性物寄託センターに受託されている。
上記抗マウスＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体Ｓａ１５−２１と同様なエピトープ、すなわちＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体におけるＴＬＲ４のＮ末端側の抗原決定基を特異的に認識するヒト型モノクローナル抗体、例えば抗ヒトＴＬＲ４モノクローナル抗体ＴＦ９０４を用いると、全く新しいタイプのエンドトキシンショックの予防・治療方法が可能となる。【００３０】  すなわち、本発明のＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を標的としたエンドトキシンショックの予防・治療剤は、かかる本発明のヒト型抗ヒトＴＬＲ４モノクローナル抗体、例えば抗ヒトＴＬＲ４モノクローナル抗体ＴＦ９０４を含有するものであり、本発明のＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を標的としたエンドトキシンショックの予防・治療方法は、かかる本発明のヒト型抗ヒトＴＬＲ４モノクローナル抗体、例えば抗ヒトＴＬＲ４モノクローナル抗体ＴＦ９０４を用いることを特徴とする。【００３１】  上記本発明のＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を特異的に認識するモノクローナル抗体、例えば抗マウスＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体Ｓａ１５−２１や抗ヒトＴＬＲ４モノクローナル抗体ＴＦ９０４を用いると、エンドトキシンショック抑制作用の促進物質や抑制物質を有利にスクリーニングすることが可能になる。例えば、マウスに、モノクローナル抗体Ｓａ１５−２１を腹腔内投与し、２時間後にガラクトサミンとＬＰＳを腹腔内投与してエンドトキシンショックを誘導し、マウスの生存数をモノクローナル抗体Ｓａ１５−２１未投与の対照と比較することにより、あるいは、マウスに、モノクローナル抗体Ｓａ１５−２１を腹腔内投与し、２時間後にガラクトサミンとＬＰＳを腹腔内投与し、ＬＰＳとガラクトサミン投与後１時間の血中のＴＮＦをＥＬＩＳＡで測定し、血中ＴＮＦ濃度をＳａ１５−２１未投与の対照と比較することにより、エンドトキシンショック抑制作用の促進物質や抑制物質を有利にスクリーニングすることができる。【００３２】  以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３３】（試薬、マウス）
大腸菌由来のリポ多糖（ＬＰＳ）、サルモネラ・ミネソタ由来のリピドＡ、Ｄ−ガラクトサミンはＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。マウスは日本ＳＬＣからＢＡＬＢ／ｃマウス（５−１０週齢で使用）を購入した。ハイブリドーマ増殖用のＩＣＲヌードマウス（ＣＤ−１（ＩＣＲ）−ｎｕ）は、日本チャールズリバーより購入した。【００３４】（モノクローナル抗体の構築）
マウスＴＬＲ４−ＭＤ−２、ヒトＴＬＲ４−ＭＤ−２及びＣＤ１４に対するモノクローナル抗体を構築した。免疫源として用いる、マウスＴＬＲ４とマウスＭＤ−２、並びにマウスＣＤ１４を共発現する正常ラット腎臓細胞と、ヒトＴＬＲ４とヒトＭＤ−２を共発現するマウスＩＬ−３依存性細胞株Ｂａ／Ｆ３とを文献（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９．３．１）記載の方法に準じてそれぞれ作製した。１μｇ／ｍｌのリピドＡであらかじめ刺激しておいた、マウスＣＤ１４及びマウスＴＬＲ４−ＭＤ−２を発現する正常ラット腎臓細胞ラットの脚パッドにおいて免疫し、１週間後、リンパ節から得た免疫細胞とＳＰ２／０ミエローマ細胞とを融合させ、その培養上清が、マウスのＴＬＲ４−ＭＤ−２又はＣＤ１４を発現するマウスＩＬ−３依存性細胞株Ｂａ／Ｆ３と特異的に反応するハイブリドーマを選択し、抗マウスＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体Ｓａ１５−２１及び抗マウスＣＤ１４モノクローナル抗体Ｓａ２−８（ラットＩｇＧ２ａ／ｋ）を得た。またモノクローナル抗体ＴＦ９０４は、ＬＰＳ（リピドＡ）であらかじめ刺激しておいたヒトＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体を発現するマウスＩＬ−３依存性細胞株Ｂａ／Ｆ３を用いてマウス腹腔に３回免疫したのち脾臓から得た免疫細胞とＳＰ２／０ミエローマ細胞とを融合させ、その培養上清が、ヒトのＴＬＲ４−ＭＤ−２を発現するマウスＩＬ−３依存性細胞株Ｂａ／Ｆ３と特異的に反応するハイブリドーマ（Ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＴＦ９０４；ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０１１８）を選択し、抗ヒトＴＬＲ４モノクローナル抗体ＴＦ９０４を得た。また、これらモノクローナル抗体は、選択したハイブリドーマをＩＣＲヌードマウス（ＣＤ−１（ＩＣＲ）−ｎｕ、日本チャールズリバーより購入）の腹腔に投与し、得られた腹水からカプリル酸を用いて精製した。【００３５】（エンドトキシンショックの誘導）
マウスにＤ−ガラクトサミン２５ｍｇとＬＰＳ５００ｎｇを腹腔に投与し、その生存を経時的にモニターした。各モノクローナル抗体はＤ−ガラクトサミンとＬＰＳの併投与の２時間前に腹腔に投与した。【００３６】（Ｂ細胞精製、活性化）
マウス脾臓Ｂ細胞はＤｙｎａビーズ（ＤＹＮＡＬ）に抗ＣＤ４３抗体Ｓ７をつけたものを用いてＴ細胞を除去することで精製した。精製したＢ細胞は９６穴プレートに２×１０５／ウェルで蒔き、ＬＰＳで刺激した。培養３日目にトリチウム標識のサイミヂンを加え、６時間皿に培養した後にそのＤＮＡをグラスフィルターに回収し、取り込まれたトリチウムのカウントを測定することで、増殖反応を測定した。【００３７】（サイトカイン産生）
サイトカイン産生を、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏａｄｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）はＢｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌのキットを用いて測定した。【００３８】（細胞の染色）
細胞は抗体で染色した後にフローサイトメーター（ベクトンディッキンソン、ＦＡＣＳｃａｎ）を用いて解析した。【００３９】（Ｓａ１５−２１はマウスＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体に特異的な抗体である）
マウスＴＬＲ４−ＭＤ−２に対する新たに確立した抗体Ｓａ１５−２１抗原特異性を調べた。ＴＬＲ４−ＭＤ−２及びＴＬＲ４−ＭＤ−２をそれぞれ発現した細胞株Ｂａ／Ｆ３を、モノクローナル抗体Ｓａ１５−２１を用いて染色した後、フローサイトメーターを用いて解析した。結果を図１ａに示す。図１ａにおいて、白抜きのヒストグラムはＳａ１５−２１を加えていないサンプルの結果を示す。ＴＬＲ４（上段）及びＭＤ−２（中段）を発現する細胞においては、Ｓａ１５−２１抗体による染色は認められなかったが、ＴＬＲ４−ＭＤ−２（下段）を発現させた細胞株の表面のみがＳａ１５−２１抗体で染色され、モノクローナル抗体Ｓａ１５−２１がＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体に特異的な抗体であることを確認した。【００４０】  次に、ＴＬＲ４、ＴＬＲ４−ＭＤ−２、ＣＤ１４とＴＬＲ４、ＣＤ１４とＴＬＲ４−ＭＤ−２をそれぞれ発現する細胞株Ｂａ／Ｆ３をフラッグに対する抗体（上段）、あるいはＳａ１５−２１（下段）で免疫沈降し、電気泳動後、沈降したＴＬＲ４をＴＬＲ４に対するポリクローナル抗体で検出した。結果を図１ｂに示す。これら免疫沈降の結果は、モノクローナル抗体Ｓａ１５−２１がＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体に特異的な抗体であることを示している。【００４１】（抗マウスＴＬＲ４−ＭＤ−２抗体、ＭＴＳ５１０とＳａ１５−２１はそれぞれ異なる抗原決定基に結合する）
本発明者らが、すでに確立している抗マウスＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体ＭＴＳ５１０と、今回新しく確立した抗マウスＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体Ｓａ１５−２１とが、認識する抗原決定基の異同を、ＴＬＲ４−ＭＤ−２を発現する細胞表面でのクロスブロッキング（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）により調べた。前処理なし（上段）、あるいはＭＴＳ５１０（中段）かＳａ１５−２１（下段）で前処理した、ＴＬＲ４−ＭＤ−２を発現する細胞株Ｂａ／Ｆ３を、ビオチン化したＭＴＳ５１０（左）又はＳａ１５−２１（右）で染色した。結果を図２に示す。図２において、白抜きのヒストグラムはビオチン化抗体を加えていないサンプルの結果を示す。どちらのモノクローナル抗体も互いの結合を前処理でブロックできないことから、互いに異なる抗原決定基を認識していることがわかった。【００４２】（ＬＰＳ刺激によるマウス脾臓細胞増殖に対する抗体の効果）
インビトロでのＬＰＳ応答に対するＳａ１５−２１の影響を調べるために、ＬＰＳ刺激によるＢ細胞の増殖を調べた。Ｂ細胞をリピドＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）存在下又は非存在下で培養し、Ｂ細胞に取り込まれたトリチウムのカウントを測定することで、その増殖を測定した。結果を図３に示す。リピドＡ非存在下で培養した場合、脾臓Ｂ細胞の増殖は誘導されなかった。ＬＰＳ刺激によるＢ細胞増殖の抑制は、Ｓａ１５−２１単独では認められなかったが、ＭＴＳ５１０単独では弱い抑制効果が認められた。また、ＭＴＳ５１０とＳａ１５−２１の併用で最も強い抑制効果が認められた。【００４３】（ＬＰＳ刺激による、マウスマクロファージ細胞のＴＮＦ産生に及ぼすモノクローナル抗体の効果）
インビトロでのＬＰＳ応答に対するＳａ１５−２１の影響を調べるために、ＬＰＳ刺激によるマウスマクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４．７）におけるＴＮＦ産生量を調べた。リピドＡ（１ｎｇ／ｍｌ）でマクロファージ細胞を刺激し、又は刺激せず、その上清中のＴＮＦをＥＬＩＳＡで測定した。結果を図４に示す。リピドＡで刺激しなかった場合、マウスマクロファージによるＴＮＦ産生はほとんど認められなかった。ＬＰＳでマウスマクロファージを刺激した場合、Ｓａ１５−２１やＭＴＳ５１０それぞれ単独ではそれほどのＴＮＦ産生抑制効果は認められなかったが、ＭＴＳ５１０とＳａ１５−２１の併用やＭＴＳ５１０と抗ＣＤ１４抗体の併用で、マウスマクロファージによるＴＮＦ産生抑制効果が認められた。【００４４】（マウスエンドトキシンショックに対する抗体の効果１）
インビボにおける抗ＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体の効果を明らかにするために、エンドトキシンショックをガラクトサミンとＬＰＳで誘導し、抗体の効果を調べた。マウス一匹あたり抗体１００μｇずつ腹腔内投与し、２時間後にガラクトサミン２５ｍｇとＬＰＳ５００ｎｇを腹腔内投与してエンドトキシンショックを誘導し、マウスの生存数の経時変化により、マウスエンドトキシンショックに対する抗体の効果を調べた。結果を図５に示す。ＭＴＳ５１０、ＭＴＳ５１０とＳａ１５−２１の併用など、ＬＰＳ抑制効果がインビトロで認められた抗体ではわずかなレスキュー効果しか認められなかった。しかしながらＬＰＳ抑制効果のないＳａ１５−２１単独投与で、すべてのマウスがエンドトキシンショックから救われることがわかった。【００４５】（マウスエンドトキシンショックに対する抗体の効果２）
ＣＤ１４に対する抑制効果もエンドトキシンショックを抑制する効果があることが報告されている。そこでインビボにおける抗ＣＤ１４モノクローナル抗体の効果を明らかにするために、エンドトキシンショックをガラクトサミンとＬＰＳで誘導し、抗体の効果を調べた。マウス一匹あたり抗体１００μｇずつ腹腔内投与し、２時間後にガラクトサミン２５ｍｇとＬＰＳ５００ｎｇを腹腔内投与してエンドトキシンショックを誘導し、マウスの生存数の経時変化により、マウスエンドトキシンショックに対する抗体の効果を調べた。結果を図６に示す。その結果、抗ＣＤ１４モノクローナル抗体は、全くレスキュー効果を認めなかった。【００４６】（ガラクトサミンとＬＰＳ投与一時間後のマウス血清中のＴＮＦ産生）
抗ＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体によるエンドトキシンショック抑制効果の作用機序を明らかにするために、ＬＰＳとガラクトサミン投与後１時間の血中のＴＮＦを測定した。マウスに、Ｓａ１５−２１を腹腔内投与し、２時間後にガラクトサミンとＬＰＳを腹腔内投与し、ＬＰＳとガラクトサミン投与後１時間の血中のＴＮＦをＥＬＩＳＡで測定した結果を図７に示す。インビトロでのＬＰＳ刺激によるマウスマクロファージ細胞におけるＴＮＦ産生の抑制はＳａ１５−２１でもほかの抗体でもほとんど認められなかった（図４）が、インビボにおいてはＳａ１５−２１のみがＴＮＦの産生量を１０倍近く亢進していることがわかった。【００４７】  これらの結果は、ＴＬＲ４−ＭＤ−２に対する抗体Ｓａ１５−２１がエンドトキシンショックをはじめ、ＬＰＳが関与する疾患の治療に有効であることを示している。またその作用機序は単なるＬＰＳ応答の抑制ではなく、まったく新たな機序によることが予想される。【００４８】（抗ＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体の抗原決定基）
抗マウスＴＬＲ４−ＭＤ−２抗体Ｓａ１５−２１及びＭＴＳ５１０の抗原決定基、並びに抗ヒトＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体ＴＦ９０４の抗原決定基のロケーションについて調べた。２９３Ｔ細胞株（ｈｕｍａｎ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌ−ｌｉｎｅ  ｗｉｔｈ  Ｔ−ａｎｔｉｇｅｎ）に、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）によりＴＬＲ４及びＭＤ−２を一過性にトランスフェクションした細胞を用いて各抗体で染色した結果を図８に示す。図８中、最上段は（１）マウスＴＬＲ４全長及びマウスＭＤ−２を、２段目は（２）マウスＴＬＲ４Ｎ末端側・ヒトＴＬＲ４Ｃ末端側キメラｃＤＮＡ（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｅｌｅｔｅｄ）及びマウスＭＤ−２を、３段目は（３）ヒトＴＬＲ４Ｎ末端側・マウスＴＬＲ４Ｃ末端側キメラｃＤＮＡ（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｅｌｅｔｅｄ）及びマウスＭＤ−２を、４段目は（４）ヒトＴＬＲ４全長及びヒトＭＤ−２を、それぞれトランスフェクトした結果を示している。Ｓａ１５−２１及びＭＴＳ５１０はビオチン化抗体で、ＴＦ９０４はハイブリドーマ上清を用いて染色した。【００４９】  図８において、白抜きのヒストグラムは、モノクローナル抗体Ｓａ１５−２１、ＭＴＳ５１０、ＴＦ９０４を加えていないサンプルの結果を示す。抗マウスＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体Ｓａ１５−２１は、上記（１）及び（２）と反応し、（３）及び（４）とは反応しないことから、マウスＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体におけるマウスＴＬＲ４のＮ末端側の抗原決定基を認識することがわかる。これに対して、抗マウスＴＬＲ４−ＭＤ−２モノクローナル抗体ＭＴＳ５１０は、上記（１）及び（３）と反応し、（２）及び（４）とは反応しないことから、マウスＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体におけるマウスＴＬＲ４のＣ末端側の抗原決定基を認識することがわかる。また、抗ヒトＴＬＲ４モノクローナル抗体ＴＦ９０４は、上記（３）及び（４）と反応し、（１）及び（２）とは反応しないことから、ヒトＴＬＲ４のＮ末端側の抗原決定基を認識することがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】  本発明によると、ＴＬＲ４−ＭＤ−２に対するモノクローナル抗体をあらかじめ投与しておくと、ＬＰＳによるエンドトキシンショックを回避できる。ＬＰＳレセプターに対するモノクローナル抗体がエンドトキシンショックを回避できるという知見は抗体による治療法となるとともに、抗体によるエンドトキシンショック回避機構を解析することで、従来考慮されなかった新たなエンドトキシンショック治療の標的分子の同定につながることが期待される。さらには免疫賦活剤であるＬＰＳの認識防御機構の解析が生体内免疫賦活機構の解明に直結することから、免疫監視の基盤とその維持・制御という当領域の研究に資することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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