(57)【要約】本発明は、癌細胞に特異的に発現する分子を標的とし、癌細胞の増殖阻害を誘導する安全な薬剤を提供する。より詳細には、本発明は、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する中和抗体、並びに該中和抗体を含有する癌（例えば、乳癌、卵巣癌、大腸癌、肺癌、膵臓癌）などの予防・治療剤、アポトーシス促進剤、癌細胞の増殖抑制剤、ＤＤＲ１に対するアンタゴニストなどを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する中和抗体。
【請求項２】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩とコラーゲンとの結合によりもたらされるアポトーシス抑制刺激を中和する活性を有する抗体である、請求項１記載の中和抗体。
【請求項３】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩とコラーゲンとの結合によりもたらされる癌細胞増殖刺激を中和する活性を有する抗体である、請求項１記載の中和抗体。
【請求項４】
コラーゲンがＩＶ型コラーゲンである、請求項２または３記載の中和抗体。
【請求項５】
中和抗体が、配列番号３で表されるアミノ酸配列の２２番目から４１６番目のアミノ酸からなるポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体である、請求項１記載の中和抗体。
【請求項６】
ＤＮＡ免疫法により作製されるものである、請求項１記載の中和抗体。
【請求項７】
中和抗体がポリクローナル抗体である、請求項１記載の中和抗体。
【請求項８】
中和抗体がモノクローナル抗体である、請求項１記載の中和抗体。
【請求項９】
中和抗体がヒト化抗体である、請求項１記載の中和抗体。
【請求項１０】
中和抗体がヒト型抗体である、請求項１記載の中和抗体。
【請求項１１】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する中和抗体を含有してなる医薬。
【請求項１２】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する中和抗体を含有してなる当該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対するアンタゴニスト。
【請求項１３】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する中和抗体を含有してなるアポトーシス誘導剤。
【請求項１４】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する中和抗体を含有してなる癌細胞の増殖抑制剤。
【請求項１５】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する中和抗体を含有してなる癌の予防・治療剤。
【請求項１６】
癌が、乳癌、卵巣癌、大腸癌、肺癌または膵臓癌である、請求項１５記載の剤。
【請求項１７】
哺乳動物に対して、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する中和抗体の有効量を投与することを特徴とする癌の予防・治療方法。
【請求項１８】
癌の予防・治療剤を製造するための配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する中和抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＤＲ１（Ｄｉｓｃｏｉｄｉｎ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １）の活性を中和する抗体、該抗体を含有するアポトーシス誘導剤又は癌の予防・治療剤、アポトーシス誘導剤又は癌の予防・治療剤のスクリーニングなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌において、遺伝子のマイクロアレイプロファイリングデータでその病態が評価しうることが予見され、実際、白血病においては遺伝子発現プロファイルによる白血病の分類が可能であることが報告されている。また個々の癌組織の遺伝子発現プロファイルを明らかにし、その分類を積み重ねることによって、特定の癌治療法に対する反応性を予測したり特定の癌に対する新たな創薬標的タンパク質を発見したりすることが可能となると考えられる。具体的には、ある種の癌である種のタンパク質の発現亢進が認められる場合には、新たに抗原陽性と診断された患者に対して（ｉ）その発現量を低下させる、（ｉｉ）機能を抑制する、（ｉｉｉ）該タンパク質に対する宿主免疫応答を顕在化させる等の方法によって抗腫瘍活性を導くことが可能となる。これと同時に、抗原陰性と診断された患者に対しては別の治療法への切替が迅速に行えるなど、患者に無用な負担をかける懸念がなくなると予想される。以上のように発現プロファイル解析は、癌の分子診断と分子標的治療薬の開発に多大な貢献をなしうるものと期待されている。
ＤＤＲ１ａ遺伝子（ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１９５４）はヒトケラチノサイト由来のｃＤＮＡ、およびヒト胎児脳由来のｃＤＮＡよりクローニングされた遺伝子であり、８７６アミノ酸からなるタンパク質をコードしている（ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００１９４５）。ＤＤＲ１ｂ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｌ１１３１５）はヒト胎盤由来のｃＤＮＡからクローニングされた遺伝子であり、９１３アミノ酸からなるタンパク質をコードしている（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＡ０２８６６）。ＤＤＲ１ｃ遺伝子（ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０１３９９４）はヒト胎児脳由来のｃＤＮＡからクローニングされた遺伝子であり、９１９アミノ酸からなるタンパク質をコードしている（ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０５４７００）。また、ＤＤＲ１ｄ遺伝子、およびＤＤＲ１ｅ遺伝子は癌細胞株で発現していることが知られている（ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（２００１）１５（７），ｐ１３２１−ｐ１３２３）（以下、ＤＤＲ１ａ、ＤＤＲ１ｂ、ＤＤＲ１ｃ、ＤＤＲ１ｄ、およびＤＤＲ１ｅをまとめてＤＤＲ１と総称することもある）。さらに、ＤＤＲ１ｂ遺伝子に相同性を示すマウス遺伝子（ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００７５８４）がクローニングされており、９１１アミノ酸からなるタンパク質をコードしている（ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０３１６１０）。このマウス遺伝子はＤＤＲ１ｂ遺伝子に対して塩基配列で約８６％、アミノ酸配列で約９３％の相同性を有している。ＤＤＲ１ｂ遺伝子に相同性を示すラット遺伝子（ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０１３１３７）もクローニングされており、９１０アミノ酸からなるタンパク質をコードしている（ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０３７２６９）。このラット遺伝子はＤＤＲ１ｂ遺伝子に対して塩基配列で約８６％、アミノ酸配列で約９３％の相同性を有している。ＤＤＲ１遺伝子はＭＣＫ１０、Ｃａｋ、ＮＥＰ、ｔｒｋＥ、ＰＴＫ３、ＲＴＫ６、ＣＤ１６７などの異名を持つ遺伝子であり、ＤＤＲファミリーに属し、ＤＤＲファミリーはＤＤＲ１、およびＤＤＲ２より構成されている（以下、これらをＤＤＲと総称することもある）。ＤＤＲ１ｂ遺伝子は、ＤＤＲ１ａ遺伝子のスプライシングバリアントであり、ＤＤＲ１ｂ遺伝子によってコードされるタンパク質は、ＤＤＲ１ａ遺伝子によってコードされるタンパク質の５０５番目と５０６番目のアミノ酸の間に３７アミノ酸が付加されている。この３７アミノ酸に含まれる配列であるＬＬＳＮＰＡＹはＳｈｃのＰＴＢドメインに結合する配列であることが知られている（ＵＳ２００３０７０１８４号公報）。ＤＤＲ１ｃ遺伝子によってコードされるタンパク質は、ＤＤＲ１ａ遺伝子によってコードされるタンパク質の５０５番目と５０６番目のアミノ酸の間に３７アミノ酸が付加され、６６５番目と６６６番目のアミノ酸の間に６アミノ酸が付加された配列を有している。ＤＤＲ１ｄ遺伝子は５０８アミノ酸からなるタンパク質をコードしており、ＤＤＲ１ａ遺伝子によってコードされるタンパク質の５０５番目からＣ末端までの配列が４アミノ酸よりなる別のアミノ酸配列に置換されている。ＤＤＲ１ｅ遺伝子は７６７アミノ酸からなるタンパク質をコードしており、ＤＤＲ１ａ遺伝子によってコードされるタンパク質の４５０番目から５８６番目に相当する１３７アミノ酸からなる配列が、２８アミノ酸よりなる別のアミノ酸配列に置換されている。
ＤＤＲ１はコラーゲンをリガンドとする受容体であり、コラーゲンがＤＤＲ１の細胞外領域に結合するとＤＤＲ１は活性化され、細胞内領域が触媒するキナーゼ活性が上昇し自己リン酸化が誘発されることが知られている（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ（１９９７）１（１），ｐ１３−ｐ２３）。また、ＤＤＲ１ｂ遺伝子は癌抑制遺伝子ｐ５３によって発現が誘導される遺伝子であるが、リガンドであるコラーゲンによってＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）のリン酸化が亢進される、Ａｋｔのリン酸化が亢進されるなど、ＤＤＲ１ｂによって癌細胞は増殖促進シグナルを受けていると考えられている（ＥＭＢＯ  Ｊ．（２００３）２２（６），ｐ１２８９−ｐ１３０１）。さらに、ＤＤＲ１ｂに存在するキナーゼドメインを欠失させた不活性化型ＤＤＲ１ｂを用いると癌細胞にアポトーシスが誘導されることも知られている（ＥＭＢＯ  Ｊ．（２００３）２２（６），ｐ１２８９−ｐ１３０１）。ＤＤＲ１遺伝子のｍＲＮＡは卵巣癌細胞での発現が知られているほか（Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．（１９９４）５（１１），ｐ１１７３−ｐ１１８３）、種々の癌細胞において発現していることも知られており（ＵＳ５６７７１４４号公報およびＷＯ  ０３／０８５１２５号公報）、ＤＤＲ１遺伝子は乳癌や肺癌の診断と治療に有用な遺伝子のうちの１つである（ＵＳ２００３１２４１３３号公報）、大腸癌の診断と治療に有用な遺伝子のうちの１つである（ＷＯ  ０１／２２９２０号公報）、膵臓癌の診断と治療に有用な遺伝子のうちの１つである（ＷＯ  ００／５５３２０号公報）、卵巣癌の診断に有用な遺伝子のうちの１つである（ＷＯ  ０４／２２７７８号公報）と報告されている。
【発明の開示】
【０００３】
癌細胞に特異的に発現する分子を標的とし、癌細胞の増殖阻害を誘導する安全な薬剤が切望されている。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＤＤＲ１遺伝子が乳癌、卵巣癌、大腸癌、肺癌および膵臓癌等の癌組織で発現が顕著に亢進していることに注目した。また、ＤＤＲ１遺伝子産物が細胞質膜タンパク質であり抗体標的として好適であることから、ＤＤＲ１タンパク質機能を抑制する活性を有するＤＤＲ１中和抗体が乳癌、卵巣癌、大腸癌、肺癌および膵臓癌等の癌の治療剤等として有用であることを見出した。この知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明者らはＤＤＲ１中和抗体の作製に成功し、以って本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下を提供する：
（１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する中和抗体、
（２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩とコラーゲンとの結合によりもたらされるアポトーシス抑制刺激を中和する活性を有する抗体である、上記（１）記載の中和抗体、
（３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩とコラーゲンとの結合によりもたらされる癌細胞増殖刺激を中和する活性を有する抗体である、上記（１）記載の中和抗体、
（４）コラーゲンがＩＶ型コラーゲンである、上記（２）または（３）記載の中和抗体、
（５）中和抗体が、配列番号３で表されるアミノ酸配列の２２番目から４１６番目のアミノ酸からなるポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体である、上記（１）記載の中和抗体、
（６）ＤＮＡ免疫法により作製されるものである、上記（１）記載の中和抗体、
（７）中和抗体がポリクローナル抗体である、上記（１）記載の中和抗体、
（８）中和抗体がモノクローナル抗体である、上記（１）記載の中和抗体、
（９）中和抗体がヒト化抗体である、上記（１）記載の中和抗体、
（１０）中和抗体がヒト型抗体である、上記（１）記載の中和抗体、
（１１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する中和抗体を含有してなる医薬、
（１２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する中和抗体を含有してなる当該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対するアンタゴニスト、
（１３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する中和抗体を含有してなるアポトーシス誘導剤、
（１４）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する中和抗体を含有してなる癌細胞の増殖抑制剤、
（１５）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する中和抗体を含有してなる癌の予防・治療剤、
（１６）癌が、乳癌、卵巣癌、大腸癌、肺癌または膵臓癌である、上記（１５）記載の剤、
（１７）哺乳動物に対して、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する中和抗体の有効量を投与することを特徴とする癌の予防・治療方法、
（１８）癌の予防・治療剤を製造するための配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する中和抗体の使用。
本発明の中和抗体は、アポトーシスの誘導、所定の癌（例えば、乳癌、卵巣癌、大腸癌、肺癌および膵臓癌）の予防・治療などに有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、血清除去により誘導されたアポトーシスにおけるＩＶ型コラーゲンの効果を示す。
図２は、ＤＤＲ１ｂ強制発現細胞株ＤＤＲ１ＦＬ−＃１１７およびＤＤＲ１ｂＤＮ−＃２０６に対するαＤＤＲ１ｂウサギポリクローナル抗体によるコラーゲン誘導細胞保護作用の阻害を示す。
図３は、癌細胞株ＨＣＴ１１６に対するαＤＤＲ１ｂウサギポリクローナル抗体によるコラーゲン誘導細胞保護作用の阻害を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、本発明で用いられるレセプターと称することもある）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、好ましくは約７０％以上、好ましくは約８０％以上、好ましくは約９０％以上、好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号：３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：３で表されるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、好ましくは約７０％以上、好ましくは約８０％以上、好ましくは約９０％以上、好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号：５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：５で表されるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、好ましくは約７０％以上、好ましくは約８０％以上、好ましくは約９０％以上、好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号：７で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：７で表されるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、好ましくは約７０％以上、好ましくは約８０％以上、好ましくは約９０％以上、好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：７で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：７で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号：９で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：９で表されるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、好ましくは約７０％以上、好ましくは約８０％以上、好ましくは約９０％以上、好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：９で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：９で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。
上記の実質的に同質の活性としては、例えばコラーゲン（例えば、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＶＩＩＩ型コラーゲン）等のリガンド結合活性、リン酸化される活性（例、リガンド刺激によりリン酸化される活性など）などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、上記の活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
上記結合活性の測定は、自体公知の方法、例えばＥＩＡ法、免疫沈降法またはこれらに準じる方法に従って測定することができる。具体的には、例えば、コラーゲン等のリガンドおよび本発明で用いられるレセプターのそれぞれを、タグを付加した組換え型タンパク質として動物細胞で発現させる。該タグとしては、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、Ｖ５、ｍｙｃ、ＨＡなどが用いられ、リガンドに付加するタグ（タグＡ）と、本発明で用いられるレセプターに付加するタグ（タグＢ）とは異なるものを用いる。タグＢに対する抗体で、上記タグＡ付加リガンドおよび上記タグＢ付加レセプターの混合液を免疫沈降し、得られた沈殿物を、タグＡに対する抗体を用いてウェスタンブロッティング操作を行うことにより、本発明で用いられるレセプターに結合したリガンドの量を測定することができる。
リン酸化される活性の測定は、自体公知の方法、例えばＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２００巻、９８頁−１０７頁、１９９１年に記載の方法またはそれに準じた方法に従って測定する。具体的には、例えば、タグ（例、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、Ｖ５、ｍｙｃ、ＨＡなど）をＣ末端に付加した本発明で用いられるレセプターを、組換え型タンパク質として動物細胞に発現させ、コラーゲン等のリガンドと反応させた後、細胞を破砕し、無細胞抽出液を調製し、抗タグ抗体で免疫沈降する。リン酸化された本発明で用いられるレセプターの生成量は、抗リン酸化チロシン抗体などを用いて公知の方法（例、ウエスタンブロット法など）により定量することができる。
本発明で用いられるレセプターとしては、例えば、（ｉ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、とくに限定されない。
本発明で用いられるレセプターの具体例としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などがあげられる。
本明細書におけるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。本発明で用いられるレセプターは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明で用いられるレセプターがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるレセプターに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明で用いられるレセプターには、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明で用いられるレセプターの部分ペプチド（本発明で用いられる部分ペプチド）としては、前記した本発明で用いられるレセプターの部分ペプチドであって、好ましくは、前記した本発明で用いられるレセプターと同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。
例えば、本発明で用いられるレセプターの構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。
本発明で用いられる部分ペプチドの具体例としては、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列の２２番目から４１６番目のアミノ酸からなるポリペプチドまたはその部分ペプチドが挙げられ、なかでも配列番号３で表されるアミノ酸配列の２２番目から４１６番目のアミノ酸からなるポリペプチドまたはその部分ペプチドが好ましく用いられる。
また、上記部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、本発明で用いられる部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
さらに、本発明で用いられる部分ペプチドには、前記した本発明で用いられるレセプターと同様に、Ｃ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有しているもの、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明で用いられる部分ペプチドは抗体作成のための抗原としても用いることができる。
本発明で用いられるレセプターまたは部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明で用いられるレセプター、またはその部分ペプチドまたはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明で用いられるレセプターもしくは部分ペプチドまたはその塩、またはそのアミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができ、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分ペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ペプチドとを製造し、これらのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。この粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得ることができる。
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、所望のタンパク質またはペプチドのエステル体を得ることができる。
本発明で用いられる部分ペプチドまたはそれらの塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明で用いられるタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明で用いられる部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（ｉ）〜（ｖ）に記載された方法が挙げられる。
（ｉ）Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６６年）
（ｉｉ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ・ペプチド（Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６５年）
（ｉｉｉ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）
（ｉｖ）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年）
（ｖ）矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明で用いられる部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明で用いられるレセプターをコードするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明で用いられるレセプターをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
本発明で用いられるレセプターをコードするＤＮＡとしては、例えば、
（ｉ）配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉｉ）配列番号：４で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：４で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉｉｉ）配列番号：６で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：６で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉｖ）配列番号：８で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：８で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｖ）配列番号：１０で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：１０で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどが挙げられる。
配列番号：２で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２で表される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、好ましくは約７０％以上、好ましくは約８０％以上、好ましくは約９０％以上、好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：４で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４で表される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、好ましくは約７０％以上、好ましくは約８０％以上、好ましくは約９０％以上、好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：６で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：６で表される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、好ましくは約７０％以上、好ましくは約８０％以上、好ましくは約９０％以上、好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：８で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：８で表される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、好ましくは約７０％以上、好ましくは約８０％以上、好ましくは約９０％以上、好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：１０で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１０で表される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、好ましくは約７０％以上、好ましくは約８０％以上、好ましくは約９０％以上、好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、（ｉｉ）配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：４で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、（ｉｉｉ）配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：６で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、（ｉｖ）配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：８で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、（ｖ）配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１０で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）としては、前述した本発明で用いられる部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表される塩基配列を含有するＤＮＡの一部分を有するＤＮＡ、または配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、本発明のタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするＤＮＡの具体例としては、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列の２２番目から４１６番目のアミノ酸からなるポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡ、なかでも配列番号３で表されるアミノ酸配列の２２番目から４１６番目のアミノ酸からなるポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡが好ましく用いられる。
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列の２２番目から４１６番目のアミノ酸からなるポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、それぞれ配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列の６４番目から１２４８番目の塩基配列を含有するＤＮＡが用いられる。
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
本発明で用いられるレセプター、部分ペプチド（以下、これらをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲ、公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ  ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。
宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、０ｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）〕、ＪＭ１０３〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）〕、ＪＡ２２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）〕、ＨＢ１０１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９）〕、Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）〕、２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２、ＡＨ２２Ｒ−、ＮＡ８７−１１Ａ、ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３、ＮＣＹＣ２０３６、ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ  ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ  ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｎ細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィボ（Ｉｎ  Ｖｉｖｏ），１３，２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１５巻，５９２（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記）、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、マウスＡＴＤＣ５細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）やＧｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、成長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４３１−４３３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７巻，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ  １６４０培地〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のタンパク質を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウェスタンブロッティングなどにより測定することができる。
「配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩（本発明で用いられるレセプター）に対する中和抗体」としては、本発明で用いられるレセプターとそのリガンドとの結合を阻害し得る抗体であればいずれでもよく、例えば、本発明で用いられるレセプターに特異的に反応する抗体、本発明で用いられるレセプターに特異的に反応する二重特異性抗体、本発明で用いられるレセプターの活性（例、コラーゲン等のリガンド結合活性、リン酸化される活性など）を阻害する抗体（以下、これらをまとめて本発明の抗体と称することもある）などが挙げられる。
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明の抗体はまた、ヒトにおける治療効果と安全性を考慮すると、キメラ抗体、ヒト化又はヒト型抗体であってもよい。
本発明の抗体は好ましくは、コラーゲン（例えば、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＶＩＩＩ型コラーゲン）等のリガンドと本発明で用いられるレセプターとの結合によりもたらされるアポトーシス誘導刺激又は癌細胞増殖刺激を中和する活性を有する抗体（中和抗体）である。
本発明の抗体としては、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列の２２番目から４１６番目のアミノ酸からなるポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体が好ましく、なかでも配列番号３で表されるアミノ酸配列の２２番目から４１６番目のアミノ酸からなるポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体が好ましく用いられる。
以下に、本発明の抗体の抗原の調製法、および該抗体の製造法について説明する。
（１）抗原の調製
本発明の抗体を調製するために使用される抗原としては、例えば、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と同一の抗原決定基を１種あるいは２種以上有する（合成）ペプチドなど何れのものも使用することができる（以下、これらを単に本発明の抗原と称することもある）。抗原として用いられる部分ペプチドは、上記タンパク質の細胞外領域全体、又は当該領域中に含まれる免疫原性ペプチド（エピトープ）であり得る。かかる免疫原性ペプチドの長さは免疫原性を有するような長さである限り特に限定されないが、例えば８個、好ましくは１０個、より好ましくは１２個の連続するアミノ酸残基を有するものであり得る。
上記タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、後述の参考例や公知の方法に準じて製造でき、さらに、（ａ）例えばヒト、サル、ラット、マウスなどの哺乳動物の組織または細胞から公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて調製、（ｂ）ペプチド・シンセサイザー等を使用する公知のペプチド合成方法で化学的に合成、（ｃ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造される。
（ａ）該哺乳動物の組織または細胞から本発明の抗原を調製する場合、その組織または細胞をホモジナイズした後、粗分画物（例、膜画分、可溶性画分）をそのまま抗原として用いることもできる。あるいは酸、界面活性剤またはアルコールなどで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することもできる。
（ｂ）化学的に本発明の抗原を調製する場合、該合成ペプチドとしては、例えば上述の（ａ）の方法を用いて天然材料より精製した本発明の抗原と同一の構造を有するもの、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列において３個以上、好ましくは６個以上のアミノ酸からなる任意の箇所のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を１種あるいは２種以上含有するペプチドなどが用いられる。
（ｃ）ＤＮＡを含有する形質転換体を用いて配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩を製造する場合、該ＤＮＡは、公知のクローニング方法〔例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（２ｎｄ  ｅｄ．；Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法など〕に従って作製することができる。該クローニング方法とは、（１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩のアミノ酸配列に基づきデザインしたＤＮＡプローブまたはＤＮＡプライマーを用い、ｃＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼーション法により配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を得る方法、または（２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のアミノ酸配列に基づきデザインしたＤＮＡプライマーを用い、ＰＣＲ法により配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を得る方法などが挙げられる。
本発明で用いられるレセプターを発現する哺乳動物細胞自体を、本発明の抗原として直接用いることもできる。哺乳動物細胞としては、上記（ａ）項で述べたような天然の細胞、上記（ｃ）項で述べたような方法で形質転換した細胞などを用いることができる。形質転換に用いる宿主としては、ヒト、サル、ラット、マウス、ハムスターなどから採取した細胞であれば何れのものでも良く、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ７、ＣＨＯ−Ｋ１、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｂａ１ｂ３Ｔ３、ＦＭ３Ａ、Ｌ９２９、ＳＰ２／０、Ｐ３Ｕ１、Ｂ１６、またはＰ３８８などが好ましく用いられる。本発明で用いられるレセプターを発現する天然の哺乳動物細胞または形質転換した哺乳動物細胞は、組織培養に用いられる培地（例、ＲＰＭＩ１６４０）または緩衝液（例、Ｈａｎｋｓ’Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に懸濁された状態で免疫動物に注射することができる。免疫方法としては、抗体産生を促すことのできる方法であれば何れの方法でも良く、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射または皮下注射などが好ましく用いられる。
本発明の抗原としてのペプチドは、（１）公知のペプチドの合成法に従って、または（２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することもできる。
該ペプチドの合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、該ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としてはたとえば、以下に記載された方法等が挙げられる。
（ｉ）Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６６年）
（ｉｉ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６５年）
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて該ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
ペプチドのアミド体は、アミド形成に適した市販のペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするペプチドの配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、目的のペプチドを取得する。あるいはクロロトリチル樹脂、オキシム樹脂、４−ヒドロキシ安息香酸系樹脂等を用い、部分的に保護したペプチドを取り出し、更に常套手段で保護基を除去し目的のペプチドを得ることもできる。
上記した保護されたアミノ酸の縮合に関しては、ペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができ、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としてはＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが挙げられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔなど）とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護されたアミノ酸の活性化を行ったのちに樹脂に添加することができる。保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。たとえばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどの三級アミン類、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜約５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常約１．５ないし約４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。
原料アミノ酸のアミノ基の保護基としては、たとえば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが挙げられる。カルボキシル基の保護基としては、たとえばＣ１−６アルキル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ７−１４アラルキル基、２−アダマンチル、４−ニトロベンジル、４−メトキシベンジル、４−クロロベンジル、フェナシルおよびベンジルオキシカルボニルヒドラジド、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド、トリチルヒドラジドなどが挙げられる。
セリンおよびスレオニンの水酸基は、たとえばエステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては例えばアセチル基などの低級（Ｃ１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが挙げられる。また、エーテル化に適する基としては、たとえばベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、たとえばＢｚｌ、Ｃｌ−Ｂｚ１、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが挙げられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、Ｂｏｍ、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが挙げられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、たとえば対応する酸無水物、アジド、活性エステル［アルコール（たとえば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル］などが挙げられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、たとえば対応するリン酸アミドが挙げられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、たとえばＰｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども挙げられる。上記酸処理による脱離反応は一般に−２０℃〜４０℃の温度で行われるが、酸処理においてはアニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、ならびにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手段から適宜選択しうる。
ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、まず、カルボキシル末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除いたペプチド（またはアミノ酸）とを製造し、この両ペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ペプチドを得ることができる。この粗ペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のペプチドのアミド体を得ることができる。
ペプチドのエステル体を得るにはカルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ペプチドのアミド体と同様にして所望のペプチドのエステル体を得ることができる。
本発明の抗原は、不溶化したものを直接免疫することもできる。また、本発明の抗原を適当な担体に結合または吸着させた複合体を免疫してもよい。該担体（キャリアー）と本発明の抗原（ハプテン）との混合比は、担体に結合あるいは吸着させた本発明の抗原に対して抗体が効率よくできれば、どのようなものをどのような比率で結合あるいは吸着させてもよく、通常ハプテン抗原に対する抗体の作製にあたり常用されている天然もしくは合成の高分子担体を重量比でハプテン１に対し０．１〜１００の割合で結合あるいは吸着させたものを使用することができる。天然の高分子担体としては、例えばウシ、ウサギ、ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンや例えばウシ、ウサギなどの哺乳動物のチログロブリン、例えばウシ、ウサギ、ヒト、ヒツジなどの哺乳動物のヘモグロビン、キーホールリンペットヘモシアニンなどが用いられる。合成の高分子担体としては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類などの重合物または供重合物などの各種ラテックスなどを用いることができる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができる。例えば、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架橋するビスジアゾ化ベンジジンなどのジアゾニウム化合物、アミノ基同士を架橋するグルタルアルデビトなどのジアルデヒド化合物、トルエン−２，４−ジイソシアネートなどのジイソシアネート化合物、チオール基同士を架橋するＮ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミドなどのジマレイミド化合物、アミノ基とチオール基を架橋するマレイミド活性エステル化合物、アミノ基とカルボキシル基とを架橋するカルボジイミド化合物などが好都合に用いられる。また、アミノ基同士を架橋する際にも、一方のアミノ基にジチオピリジル基を有する活性エステル試薬（例えば、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）など）を反応させた後還元することによりチオール基を導入し、他方のアミノ基にマレイミド活性エステル試薬によりマレイミド基を導入後、両者を反応させることもできる。
（２）モノクローナル抗体の作製
本発明の抗原は、温血動物に対して、例えば腹腔内注入、静脈内注入、皮下注射などの投与方法によって、抗体産生が可能な部位にそれ自体単独であるいは担体、希釈剤と共に投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。また、本発明のモノクローナル抗体の作製に際しては、ＤＮＡ免疫法を利用してもよい（例えばＮａｔｕｒｅ、３５６巻、１５２項−１５４項参照）。温血動物としては、例えばサル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどがあげられるが、モノクローナル抗体作製にはマウスまたはウサギが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体の作製に際しては、本発明の抗原を免疫された温血動物、たとえばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、本発明の抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。血清中の本発明の抗体の抗体価の測定は、例えば本発明で用いられるレセプターを放射性物質または酵素などで標識し、抗血清と反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することによりなされる。融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法〔Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻、４９５頁（１９７５年）〕に従い実施できる。融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧなどが用いられる。骨髄腫細胞としては、例えばＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などがあげられ、Ｐ３Ｕ１などが好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄細胞数との好ましい比率は、通常１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、通常２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃、通常１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
本発明の抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用でき、例えば配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩あるいはそれらの部分ペプチドを直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合した本発明の抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識した配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを加え、固相に結合した本発明の抗体を検出する方法などがあげられる。本発明の抗体のスクリーニング、育種は、通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎仔血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地、１〜１０％の牛胎仔血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。
本発明の抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡまたはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法など〕に従って行われる。
以上のようにして、ハイブリドーマ細胞を温血動物の生体内又は生体外で培養し、その体液または培養物から抗体を採取することによって、本発明の抗体を製造することができる。
（ａ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質の一部領域と反応する本発明の抗体を産生するハイブリドーマ、および（ｂ）上記タンパク質とは反応するが、その一部領域とは反応しない本発明の抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングは、例えば、その一部領域に相当するペプチドとハイブリドーマが産生する抗体との結合性を測定することにより行うことができる。
本発明で用いられるレセプターに特異的に反応する二重特異性モノクローナル抗体は、公知の方法に準じて製造することができる。
さらに、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト型抗体は、公知の方法に準じて製造することができ、例えばキメラ抗体は、「実験医学（臨時増刊号），Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１０，１９８８」、特公平３−７３２８０号公報等を、ヒト化抗体は、特表平４−５０６４５８号公報、特開昭６２−２９６８９０号公報等を、ヒト抗体は、「Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１５，ｐ．１４６−１５６，１９９７」、「Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．７，ｐ．１３−２１，１９９４」、特表平４−５０４３６５号公報、国際出願公開ＷＯ９４／２５５８５号公報、「日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１９９５年」、「Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３６８，ｐ．８５６−８５９，１９９４」、特表平６−５００２３３号公報等を参考にそれぞれ製造することができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、自体公知またはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原自体、またはそれとキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明の抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアータンパク質とハプテンとの混合比は、キャリアータンパク質に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どのようなものをどのような比率で架橋させてもく、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合で架橋させる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアータンパク質の架橋には、種々の縮合剤を用いることができ、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位に、それ自体または担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
また、本発明のポリクローナル抗体は、ＤＮＡ免疫法により作製できる（例えばＮａｔｕｒｅ、３５６巻、１５２項−１５４項参照）。ＤＮＡ免疫法によれば、非常に力価に優れた抗体が得られる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、例えば上記（２）で述べたハイブリドーマ培養上清の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
以下に、本発明の抗体の用途を説明する。
〔１〕癌の予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス誘導剤、癌細胞の増殖抑制剤
本発明で用いられるレセプターは、乳癌、卵巣癌、大腸癌、肺癌、膵臓癌等の癌細胞で発現が亢進しており、また、コラーゲン等のリガンドが結合することによって癌細胞のアポトーシスが抑制されている。このような癌細胞のアポトーシス抑制現象は、例えば（ｉ）コラーゲン等のリガンドと本発明で用いられるレセプターとの結合、（ｉｉ）本発明で用いられるレセプターの活性化誘導（例、リン酸化される活性誘導・促進など）などを阻害することにより消失し、アポトーシスが誘導される。
従って、本発明の抗体（その塩も含む）を含有する医薬は、低毒性で安全な、例えば、癌（例、乳癌、卵巣癌、大腸癌、肺癌、膵臓癌など）の予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス誘導剤、癌細胞の増殖抑制剤などの医薬として使用することができる。
本発明の抗体または上記物質を含有する上記剤は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、腹腔内投与、皮下投与など）に投与することができる。
本発明の抗体は、それ自体を投与しても良いし、または適当な医薬組成物として投与しても良い。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明の抗体または上記物質と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであっても良い。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤、ワクチン等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、本発明の抗体または上記物質を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｃａｓｔｏｒ  ｏｉｌ）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、本発明の抗体または上記物質を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されても良い。
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
なお前記した各組成物は、上記抗体または物質との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。抗体または物質の含有量としては、投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記抗体または物質が含有されていることが好ましい。
上記の剤の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なり、例えば、成人の乳癌の治療・予防のために使用する場合には、本発明の抗体または物質を１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
さらに、本発明の抗体は、他の薬剤、例えばアルキル化剤（例、サイクロフォスファミド、イフォスファミド等）、代謝拮抗剤（例、メソトレキセート、５−フルオロウラシル等）、抗癌性抗生物質（例、マイトマイシン、アドリアマイシン等）、植物由来抗癌剤（例、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール等）、シスプラチン、カルボプラチン、エトポキシドなどと併用してもよい。本発明の抗体または上記物質および上記薬剤は、同時または異なった時間に、患者に投与すればよい。
〔２〕本発明で用いられるレセプターの定量
本発明の抗体を用いることにより、本発明で用いられるレセプターの測定または組織染色などによる検出を行なうことができる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また抗体分子のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’またはＦａｂ画分などを用いてもよい。
本発明の抗体を用いる測定法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、本発明で用いられるレセプター量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、サンドイッチ法、競合法、イムノメトリック法、ネフロメトリーなどが用いられるが、感度、特異性の点で後述するサンドイッチ法、競合法が、特にサンドイッチ法が好ましい。
（１）サンドイッチ法
サンドイッチ法においては、不溶化した本発明の抗体に被検液を反応（１次反応）させ、さらに標識化された本発明の抗体を反応（２次反応）させた後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明で用いられるレセプターの量を定量することができる。１次反応と２次反応は同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明で用いられるレセプターのＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
（２）競合法
本発明の抗体、被検液および標識化された本発明で用いられるレセプターとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明で用いられるレセプターの割合を測定することにより、被検液中の本発明で用いられるレセプターを定量する。
本反応法は、例えば、固相化法を用いて行う。
具体例としては、抗マウスＩｇＧ抗体（ＩＣＮ／ＣＡＰＰＥＬ社製）を固相化抗体として用い、この固相化抗体の存在するプレートに、（ｉ）本発明の抗体、（ｉｉ）ＨＲＰで標識化された本発明で用いられるレセプター、および（ｉｉｉ）被検液を添加し、反応後、固相に吸着したＨＲＰ活性を測定し、本発明で用いられるレセプターを定量する。
（３）イムノメトリック法
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化された本発明の抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは被検液中の抗原と過剰量の標識化された本発明の抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化された本発明の抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
（４）ネフロメトリー
ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
上記（１）〜（４）において、標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、ランタニド元素などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが、酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが、蛍光物質としては、例えばシアニン蛍光色素（例、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（アマシャムバイオサイエンス社製）など）、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが、発光物質としては、例えばルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどがそれぞれ挙げられる。さらに、抗体と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、例えばアガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、例えばポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコンなどの合成樹脂あるいはガラスなどが挙げられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる［例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ．７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ａ））、同書Ｖｏｌ．７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｂ））、同書Ｖｏｌ．７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｃ））、同書Ｖｏｌ．８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、同書Ｖｏｌ．９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ））、同書Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）など参照］。したがって、本発明のサンドイッチ免疫測定法などよる測定系を構築する場合、その方法は後述する実施例に限定されない。
以上のように、本発明の抗体は、本発明で用いられるレセプターを感度良く定量することができるので、本発明で用いられるレセプターの生理機能のさらなる解明、および本発明で用いられるレセプターの関与する疾患の診断に有用である。具体的には、本発明の抗体を用いて、組織中や体液中（血液、血漿、血清、尿など）に含まれる本発明で用いられるレセプターの量を測定することにより、例えば、癌（例、乳癌、卵巣癌、大腸癌、肺癌、膵臓癌など）などを診断することができる。
〔３〕疾病に対する医薬候補物のスクリーニング
本発明で用いられるレセプターは、乳癌、卵巣癌、大腸癌、肺癌、膵臓癌等の癌細胞で発現が亢進しており、また、コラーゲン等のリガンドが結合することによって癌細胞のアポトーシスが抑制されている。このような癌細胞のアポトーシス抑制現象は、例えば（ｉ）コラーゲン等のリガンドと本発明で用いられるレセプターとの結合、（ｉｉ）本発明で用いられるレセプターの活性化誘導（例、リン酸化される活性誘導・促進など）などを阻害することにより消失し、アポトーシスが誘導される。
従って、本発明で用いられるレセプターの活性を阻害する化合物またはその塩は、例えば癌（例、乳癌、卵巣癌、大腸癌、肺癌、膵臓癌など）の予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス誘導剤、癌細胞の増殖抑制剤などとして使用することができる。
したがって、本発明で用いられるレセプターは、本発明のレセプターの活性を阻害する物質のスクリーニングのための試薬として、有用である。
すなわち、本発明は、本発明で用いられるレセプターを用いることを特徴とする、本発明で用いられるレセプターの活性を阻害する物質のスクリーニング方法を提供する。
本発明で用いられるレセプターの活性（例、リン酸化される活性など）を阻害する物質のスクリーニング方法の具体例としては、例えば、タグ（例、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、Ｖ５、ｍｙｃ、ＨＡなど）をＣ末端に付加した本発明で用いられるレセプターを、組換え型タンパク質として動物細胞に発現させ、（ｉ）コラーゲン（例えば、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＶＩＩＩ型コラーゲン）等のリガンド、または（ｉｉ）リガンドおよび試験化合物と、それぞれ反応させた後、細胞を破砕し、無細胞抽出液を調製し、抗タグ抗体で免疫沈降し、リン酸化された本発明で用いられるレセプターの生成量を、抗リン酸化チロシン抗体などを用いて公知の方法（例、ウェスタンブロット法など）により定量し、上記（ｉ）の場合と（ｉｉ）の場合とで比較する。
例えば、上記（ｉｉ）の場合における本発明で用いられるレセプターの活性を、上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害させる試験化合物を、本発明で用いられるレセプターの活性を阻害する化合物として選択することができる。
上記の本発明で用いられるレセプターを産生する能力を有する細胞としては、例えば、本発明で用いられるレセプターをコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）が用いられる。宿主としては、例えば、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などの動物細胞が好ましく用いられる、該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のタンパク質を細胞膜上に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。本発明のタンパク質を発現し得る細胞の培養方法は、前記した本発明の形質転換体の培養法と同様である。また、本発明で用いられるレセプターを産生する能力を有する細胞として、該レセプターを高発現している癌（例えば、乳癌、卵巣癌、大腸癌、肺癌、膵臓癌など）細胞を用いることもできる。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられる。
さらに、本発明で用いられるレセプターの遺伝子も、癌組織において発現が亢進するので、本発明で用いられるレセプターの遺伝子の発現を阻害する物質も、例えば、癌（例、乳癌、卵巣癌、大腸癌、肺癌、膵臓癌など）の予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス誘導剤、癌細胞の増殖抑制剤などとして使用することができる。
したがって、本発明で用いられるレセプターをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）は、本発明で用いられるレセプターの遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
スクリーニング方法としては、（ｉｉｉ）本発明で用いられるレセプターを産生する能力を有する細胞を培養した場合と、（ｉｖ）試験化合物の存在下、本発明で用いられるレセプターを産生する能力を有する細胞を培養した場合との比較を行うことを特徴とするスクリーニング方法が挙げられる。
上記方法において、（ｉｉｉ）と（ｉｖ）の場合における、前記遺伝子の発現量（具体的には、本発明で用いられるレセプター量または本発明で用いられるレセプターをコードするｍＲＮＡ量）を測定して、比較する。
試験化合物および本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、上記と同様のものが挙げられる。
タンパク質量の測定は、公知の方法、例えば、本発明の抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、ウェスタン解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
ｍＲＮＡ量の測定は、公知の方法、例えば、プローブとして配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表される塩基配列またはその一部を含有する核酸を用いるノーザンハイブリダイゼーション、あるいはプライマーとして配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表される塩基配列またはその一部を含有する核酸を用いるＰＣＲ法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
例えば、上記（ｉｖ）の場合における遺伝子の発現を、上記（ｉｉｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害させる試験化合物を、本発明で用いられるレセプターの遺伝子の発現を阻害する化合物として選択することができる。
本発明のスクリーニング用キットは、本発明で用いられるレセプター、または本発明で用いられるレセプターを産生する能力を有する細胞などを含有する。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる物質は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれる。
該塩としては、前記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用いられる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる物質を上述の剤として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、経口投与または非経口投与のための組成物としては、上記〔１〕で記載した組成物と同様のものが挙げられ、同様に製造でき、同様に使用できる。
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ＤＤＲ１ａのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するＤＤＲ１ａをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
ＤＤＲ１ｂのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するＤＤＲ１ｂをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
ＤＤＲ１ｃのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６〕
配列番号：５で表されるアミノ酸配列を有するＤＤＲ１ｃをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
ＤＤＲ１ｄのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８〕
配列番号：７で表されるアミノ酸配列を有するＤＤＲ１ｄをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕
ＤＤＲ１ｅのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０〕
配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有するＤＤＲ１ｅをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
参考例４および参考例８で用いられたプライマー１の塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
参考例４で用いられたプライマー２の塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕
参考例５で用いられたプライマー３の塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕
参考例５で用いられたプライマー４の塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕
ＤＤＲ１ｂＤＮのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１６〕
配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を有するＤＤＲ１ｂＤＮをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕
参考例１で用いられたプライマー５の塩基配列を示す。
〔配列番号：１８〕
参考例１で用いられたプライマー６の塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
参考例１で用いられたＴａｑＭａｎプローブ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：２０〕
参考例２および参考例３で用いられたプライマー７の塩基配列を示す。
〔配列番号：２１〕
参考例２および参考例３で用いられたプライマー８の塩基配列を示す。
〔配列番号：２２〕
参考例２および参考例３で用いられたＴａｑＭａｎプローブ２の塩基配列を示す。
〔配列番号：２３〕
参考例８で用いられたプライマー９の塩基配列を示す。
〔配列番号：２４〕
ＤＤＲ１ｂＥＤ−Ｆｃのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２５〕
配列番号：２４で表されるアミノ酸配列を有するＤＤＲ１ｂＥＤ−ＦｃをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２６〕
ＤＤＲ１ｂＥＤ−Ｆｌａｇのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２７〕
配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を有するＤＤＲ１ｂＥＤ−ＦｌａｇをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２８〕
参考例８で用いられたプライマー１０の塩基配列を示す。
〔配列番号：２９〕
参考例８で用いられたプライマー１１の塩基配列を示す。
本明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ          ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ        ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ            ：アデニン
Ｔ            ：チミン
Ｇ            ：グアニン
Ｃ            ：シトシン
ＲＮＡ          ：リボ核酸
ｍＲＮＡ        ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ        ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ        ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ        ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ        ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ          ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ        ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ          ：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ          ：グリシン
Ａｌａ          ：アラニン
Ｖａｌ          ：バリン
Ｌｅｕ          ：ロイシン
Ｉｌｅ          ：イソロイシン
Ｓｅｒ          ：セリン
Ｔｈｒ          ：スレオニン
Ｃｙｓ          ：システイン
Ｍｅｔ          ：メチオニン
Ｇｌｕ          ：グルタミン酸
Ａｓｐ          ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ          ：リジン
Ａｒｇ          ：アルギニン
Ｈｉｓ          ：ヒスチジン
Ｐｈｅ          ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ          ：チロシン
Ｔｒｐ          ：トリプトファン
Ｐｒｏ          ：プロリン
Ａｓｎ          ：アスパラギン
Ｇｌｎ          ：グルタミン
ｐＧｌｕ        ：ピログルタミン酸
Ｓｅｃ          ：セレノシステイン（ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｅ）
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｍｅ            ：メチル基
Ｅｔ            ：エチル基
Ｂｕ            ：ブチル基
Ｐｈ            ：フェニル基
ＴＣ            ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｔｏｓ          ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ          ：ホルミル
Ｂｚｌ          ：ベンジル
Ｃｌ２−Ｂｚｌ  ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ          ：ベンジルオキシメチル
Ｚ              ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ        ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ        ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ          ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ          ：ジニトロフェニル
Ｔｒｔ          ：トリチル
Ｂｕｍ          ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ        ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ        ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ      ：３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−  １，２，３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ        ：１−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド
ＤＣＣ          ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
【実施例】
【０００６】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はいかなる意味においてもこれらに限定されない。
［参考例１］  ヒト癌組織におけるＤＤＲ１遺伝子ｍＲＮＡ発現亢進の検討
本参考例においては、ＤＤＲ１ａ遺伝子、ＤＤＲ１ｂ遺伝子、およびＤＤＲ１ｃ遺伝子を総称してＤＤＲ１遺伝子と定義する。ＤＤＲ１遺伝子のｍＲＮＡ発現が癌組織において亢進しているか否かを定量的ＰＣＲ法により検討した。発現量測定にはｃＤＮＡ  ＣｅＨＡＴ−ＳＤ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｔｕｍｏｒ  １（コスモバイオ社）、ｃＤＮＡ  ＣｅＨＡＴ−ＳＤ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｔｕｍｏｒ  ２（コスモバイオ社）、Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｏｎ  Ｍａｔｃｈｅｄ  ｃＤＮＡ  Ｐａｉｒ  Ｐａｎｅｌ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）、Ｈｕｍａｎ  Ｌｕｎｇ  Ｍａｔｃｈｅｄ  ｃＤＮＡ  Ｐａｉｒ  Ｐａｎｅｌ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）、およびＨｕｍａｎ  Ｏｖａｒｙ  Ｍａｔｃｈｅｄ  ｃＤＮＡ  Ｐａｉｒ  Ｐａｎｅｌ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いた。１μＬのｃＤＮＡを鋳型とし、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）７．５μＬ、プライマー５（配列番号：１７）およびプライマー６（配列番号：１８）を各５００ｎＭ、ＦＡＭ標識したＴａｑＭａｎプローブ１（配列番号：１９）を１００ｎＭとなるように加え反応液量１５μＬとした。但し、ｃＤＮＡ  ＣｅＨＡＴ−ＳＤ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｔｕｍｏｒ  １（コスモバイオ社）およびｃＤＮＡ  ＣｅＨＡＴ−ＳＤ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｔｕｍｏｒ  ２（コスモバイオ社）については鋳型量を０．２μＬとした。ＰＣＲ反応は、５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。一方、同量の鋳型ｃＤＮＡ中に含まれるβ−アクチン遺伝子発現量を測定し内部標準とした。その結果、正常組織に対する癌組織でのＤＤＲ１遺伝子発現量は、ｃＤＮＡ  ＣｅＨＡＴ−ＳＤ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｔｕｍｏｒ  １（コスモバイオ社）に含まれる３人のドナーで、各々２倍、５．１倍、２．５倍の増加が、ｃＤＮＡ  ＣｅＨＡＴ−ＳＤ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｔｕｍｏｒ  ２（コスモバイオ社）に含まれる別の３人のドナーで、各々６．９倍、１．１倍、４．３倍の増加が認められた。同様にして、Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｏｎ  Ｍａｔｃｈｅｄ  ｃＤＮＡ  Ｐａｉｒ  Ｐａｎｅｌ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）に含まれる５人のドナーのうち４人で各々６．９倍、２．２倍、１．３倍、１．７倍の増加が、Ｈｕｍａｎ  Ｌｕｎｇ  Ｍａｔｃｈｅｄ  ｃＤＮＡ  Ｐａｉｒ  Ｐａｎｅｌ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）に含まれる５人のドナーのうち４人で各々６．５倍、４．９倍、４．６倍、１０．３倍の増加が、Ｈｕｍａｎ  Ｏｖａｒｙ  Ｍａｔｃｈｅｄ  ｃＤＮＡ  Ｐａｉｒ  Ｐａｎｅｌ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）に含まれる５人のドナーのうち３人で各々５．４倍、１．８倍、１．４倍の増加が確認された。これらの結果より、癌組織におけるＤＤＲ１遺伝子の発現亢進が確認された。
［参考例２］  癌組織におけるＤＤＲ１ｂ遺伝子のｍＲＮＡ発現亢進の検討
ヒト癌組織（乳癌、肺癌、直腸癌、卵巣癌）由来のＭａｔｃｈｅｄ  Ｔｕｍｏｒ／Ｎｏｒｍａｌ  ｃＤＮＡ  Ｐａｉｒ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型として、ＦＡＭ標識したＴａｑＭａｎプローブを用いた定量的ＰＣＲ反応を行うことにより、癌組織と正常組織でのＤＤＲ１ｂ遺伝子の発現量を測定した。
該反応における反応液の組成は、上記ｃＤＮＡを１μＬ、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を１０μＬ、プライマー７（配列番号：２０）およびプライマー８（配列番号：２１）を各２００ｎＭ、ＴａｑＭａｎプローブ２（配列番号：２２）を２００ｎＭとなるよう加え、２０μｌの液量とした。ＰＣＲ反応は、５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。
その結果、周辺正常組織に対する癌組織でのＤＤＲ１ｂ遺伝子発現量は、ヒト乳癌組織６例中２例でそれぞれ約３倍と約５倍、ヒト肺癌組織５例中４例でそれぞれ約７倍、約５倍、約６倍および約１６倍、ヒト直腸癌組織５例中１例で約５倍、ヒト卵巣癌組織５例中２例でそれぞれ約５倍と約２倍の発現亢進が認められた。
［参考例３］  ヒト癌細胞株におけるＤＤＲ１ｂ遺伝子のｍＲＮＡの定量
以下で使用される骨肉種細胞株Ｓａｏｓ−２、脳腫瘍細胞株ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ、ＳＫ−Ｎ−ＤＺ、ＳＫ−Ｎ−ＦＩ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、Ｄ３４１  Ｍｅｄ、Ｄａｏｙ、ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ、Ｕ−１１８  ＭＧ、Ｕ−８７  ＭＧ、ＣＣＦ−ＳＴＴＧ１、ＳＷ  １０８８、乳癌細胞株ＨＣＣ１９３７、ＺＲ−７５−１、ＡＵ５６５、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＫＢＲ−３、ＢＴ４７４、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ、大腸癌細胞株Ｃａｃｏ−２、ＣＯＬＯ  ２０１、ＣＯＬＯ  ２０５、ＣＯＬＯ  ３２０ＤＭ、ＤＬＤ−１、ＨＣＴ−１５、ＨＣＴ−８、ＨＴ−２９、ＬｏＶｏ、ＬＳ１８０、ＬＳ１２３、ＬＳ１７４Ｔ、ＮＣＩ−Ｈ５４８、ＳＮＵ−Ｃ１、ＳＫ−ＣＯ−１、ＳＷ  ４０３、ＳＷ  ４８、ＳＷ  ４８０、ＳＷ  ６２０、ＳＷ  ８３７、ＳＷ  ９４８、ＨＣＴ  １１６、小細胞肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１８７、ＮＣＩ−Ｈ３７８、ＮＣＩ−Ｈ５２６、ＮＣＩ−Ｈ８８９、ＮＣＩ−Ｈ１６７２、ＮＣＩ−Ｈ１８３６、ＮＣＩ−Ｈ２２２７、ＮＣＩ−Ｎ４１７、ＳＨＰ−７７、非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３５８、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５２２、ＮＣＩ−Ｈ６６１、ＮＣＩ−Ｈ８１０、ＮＣＩ−Ｈ１１５５、ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＮＣＩ−Ｈ１３９５、ＮＣＩ−Ｈ１４１７、ＮＣＩ−Ｈ１４３５、ＮＣＩ−Ｈ１５８１、ＮＣＩ−Ｈ１６５１、ＮＣＩ−Ｈ１７０３、ＮＣＩ−Ｈ１７９３、ＮＣＩ−Ｈ１９６３、ＮＣＩ−Ｈ２０７３、ＮＣＩ−Ｈ２０８５、ＮＣＩ−Ｈ２１０６、ＮＣＩ−Ｈ２２２８、ＮＣＩ−Ｈ２３４２、ＮＣＩ−Ｈ２３４７、卵巣癌細胞株ＥＳ−２、Ｃａｏｖ−３、ＭＤＡＨ２７７４、ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ３、ＯＶ−９０、ＳＫ−ＯＶ−３、ＴＯＶ−１１２Ｄ、ＴＯＶ−２１Ｇ、前立腺癌細胞株ＤＵ  １４５、ＬＮＣａＰ、網膜芽腫細胞株ＷＥＲＩ−Ｒｂ−１、Ｙ７９、精巣癌細胞株Ｃａｔｅｓ−１ＢはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より購入した。大腸癌細胞株ＣＯＣＭ１、非小細胞肺癌細胞株ＶＭＲＣ−ＬＣＤおよび前立腺癌細胞株ＰＣ３は、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＪＣＲＢ）より購入した。上記癌細胞株をそれぞれＡＴＣＣあるいはＪＣＲＢが推奨している培養方法に従って培養し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてトータルＲＮＡを調製した。このトータルＲＮＡを鋳型としてランダムプライマーを用いた逆転写反応でｃＤＮＡを調製し、定量的ＰＣＲ反応を行うことにより、ＤＤＲ１ｂ遺伝子発現量の定量を行った。
該反応は上記トータルＲＮＡ５ｎｇより得られたｃＤＮＡを鋳型とし、参考例２に記載の方法に従って行った。並行して上記トータルＲＮＡ  １ｎｇに含まれるβ−アクチン遺伝子のコピー数を算出し内部標準とした。
上記遺伝子全体の発現量を、β−アクチン遺伝子発現量で標準化した相対的発現量を〔表１〕に示す。１６株の癌細胞株がβ−アクチン遺伝子発現量の１０％以上の発現を示し、ＤＤＲ１ｂ遺伝子が高発現している細胞株の存在が明らかとなった。
【表１】
2006098465.tif 000002
［参考例４］  組換え型完全長ＤＤＲ１ａおよびＤＤＲ１ｂタンパク質の動物細胞用発現ベクターの構築
ヒト乳癌細胞ＧＩ−１０１由来のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型とし、制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を付加したプライマー１（配列番号：１１）、および制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を付加したプライマー２（配列番号：１２）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡ  ２μＬを鋳型として使用し、ＰｆｕＵｌｔｒａ  Ｈｏｔｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）２．５Ｕ、プライマー１（配列番号：１１）、およびプライマー２（配列番号：１２）を各０．２μＭ、ｄＮＴＰｓを２００μＭ、および１０ｘ  Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を５μＬ加え、５０μＬの液量とした。ＰＣＲ反応は、９５℃・２分の後、９５℃・３０秒、５５℃・３０秒、７２℃・３分のサイクルを４０回繰り返した後に、７２℃・１０分の反応を行った。次にＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて該ＰＣＲ反応産物を精製した後、制限酵素ＢａｍＨＩ、およびＥｃｏＲＩにて処理した。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）も制限酵素ＢａｍＨＩ、およびＥｃｏＲＩにて処理した。これらをＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて精製し、それぞれのＤＮＡ断片をＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いてライゲーション反応を行った後、大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、ＤＤＲ１ａタンパク質（配列番号：１）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：２）を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＤＤＲ１ａおよびＤＤＲ１ｂタンパク質（配列番号：３）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：４）を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＤＤＲ１ｂを得た。
［参考例５］  組換え型ドミナントネガティブ型ＤＤＲ１ｂタンパク質の動物細胞用発現ベクターの構築
キナーゼ活性を有さないドミナントネガティブ型ＤＤＲ１ｂ（以下、ＤＤＲ１ｂＤＮと称する）タンパク質の動物細胞用発現ベクターを構築した。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＤＤＲ１ｂを鋳型とし、制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を付加したプライマー３（配列番号：１３）およびｐｃＤＮＡ３．１（＋）にハイブリダイズするプライマー４（配列番号：１４）を用いて、ＤＤＲ１ｂ完全長ｃＤＮＡ配列（配列番号：４）の２７１０番目から２７３９番目までの配列とｐｃＤＮＡ３．１（＋）由来の配列を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ反応により増幅した。該反応における反応液の組成は上記ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＤＤＲ１ｂ  １０ｎｇ、ＰｆｕＵｌｔｒａ  Ｈｏｔｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）２．５Ｕ、プライマー３（配列番号：１３）、およびプライマー４（配列番号：１４）を各０．２μＭ、ｄＮＴＰｓを２００μＭ、および１０ｘ  Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を５μＬ加え、５０μＬの液量とした。ＰＣＲ反応は、９５℃・２分の後、９５℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・３０秒のサイクルを３０回繰り返した後に、７２℃・１０分の反応を行った。次にＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて該ＰＣＲ反応産物を精製した後、制限酵素ＸｈｏＩにて処理した。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＤＤＲ１ｂも制限酵素ＸｈｏＩにて処理し、約７ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。これらをＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて精製した。それぞれのＤＮＡ断片をＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いてライゲーション反応を行った後、大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、ＤＤＲ１ｂＤＮタンパク質（配列番号：１５）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：１６）を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＤＤＲ１ｂＤＮを得た。
［参考例６］  組換え型完全長ＤＤＲ１ｂタンパク質の安定発現細胞株の樹立
ＤＤＲ１ｂタンパク質（配列番号：３）を構成的に発現する細胞株の樹立を参考例３に記載したヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６を用いて行った。ＨＣＴ１１６細胞１．２ｘ１０６個を１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）および５０μｇ／ｍｌ  ペニシリン・ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むダルベッコ改変型イーグル最少培地（Ｓｉｇｍａ社）１０ｍｌに懸濁し、１０ｃｍのペトリディッシュに播種した後、５％炭酸ガス気流下、３７℃で一晩培養した。予め室温で２０分間放置しておいたＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬１８μｌ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＤＤＲ１ｂ６μｇおよびＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）６００μｌの混合液を添加し培養を継続した。２日後に１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を含む上記培地（Ｇ４１８選択培地）に交換した。Ｇ４１８選択培地で培養を継続しトリプシン・ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて２回継代培養した後、１ウェルあたり細胞１個となるように９６プレートに播種し、Ｇ４１８選択培地で培養を継続した。コロニーを形成したウェルから１４日後に細胞を回収し、２４穴プレートに播種した。さらに５日後６穴プレートに播種し、Ｇ４１８選択培地で培養を継続した後、１％の２−メルカプトエタノールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）２００μＬに細胞を懸濁した。１００℃で３分間加熱処理した後、２０μｌを１０％アクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。抗ＤＤＲ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）を用いてウェスタンブロッティングを行い、ＤＤＲ１ｂタンパク質を発現する細胞株ＤＤＲ１ｂＦＬ−＃１１７を得た。
［参考例７］  組換え型ＤＤＲ１ｂＤＮタンパク質の安定発現細胞株の樹立
ＤＤＲ１ｂＤＮタンパク質（配列番号：１５）を構成的に発現する細胞株の樹立は、トランスフェクションに用いるプラスミドをｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＤＤＲ１ｂＤＮに変更し、参考例６に記載した方法に従って行った。その結果、ＤＤＲ１ｂＤＮタンパク質を発現する細胞株ＤＤＲ１ｂＤＮ−＃２０６、およびＤＤＲ１ｂＤＮ−＃２１８を得た。
［参考例８］  組換え型ＤＤＲ１ｂ細胞外領域タンパク質の動物細胞用発現ベクターの構築（その１）
（１）ヒトＩｇＧ１・Ｆｃフラグメントのクローニング
ヒト脾臓由来Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型とし、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を付加したプライマー１０（配列番号：２８）、および制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を付加したプライマー１１（配列番号：２９）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡ  １μＬ、ＰｆｕＴｕｒｂｏ  Ｈｏｔｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）１Ｕ、プライマー１０（配列番号：２８）およびプライマー１１（配列番号：２９）を各１μＭ、ｄＮＴＰｓを２００μＭ、および２ｘＧＣ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｉ（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ社）を１０μＬ加え、２０μＬの液量とした。ＰＣＲ反応は、９５℃・１分の後、９５℃・２０秒、６０℃・１５秒、７２℃・２分のサイクルを３０回繰り返した。次にＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて該ＰＣＲ反応産物を精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩ、およびＸｈｏＩにて処理した。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）も制限酵素ＥｃｏＲＩ、およびＸｈｏＩにて処理した。これらをＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて精製し、それぞれのＤＮＡ断片をＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ社）を用いてライゲーション反応を行った後、大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコードするｃＤＮＡ配列を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＩｇＧ１Ｆｃを得た。
（２）ＤＤＲ１ｂ細胞外領域・Ｆｃキメラタンパク質発現ベクターの構築
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＤＤＲ１ｂを鋳型とし、制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を付加したプライマー１（配列番号：１１）および制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を付加したプライマー９（配列番号：２３）を用いてＤＤＲ１ｂ細胞外領域をコードするｃＤＮＡを増幅した。該反応における反応液の組成は上記ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＤＤＲ１ｂ  １０ｎｇ、ＰｆｕＵｌｔｒａ  Ｈｏｔｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）２．５Ｕ、プライマー１（配列番号：１１）、およびプライマー９（配列番号：２３）を各０．２μＭ、ｄＮＴＰｓを２００μＭ、および１０ｘ  Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を５μＬ加え、５０μＬの液量とした。ＰＣＲ反応は、９５℃・２分の後、９５℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・１分１５秒のサイクルを３０回繰り返した後に、７２℃・１０分の反応を行った。次にＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて該ＰＣＲ反応産物を精製した後、制限酵素ＢａｍＨＩ、およびＥｃｏＲＩにて処理した。また、前項（１）で取得したｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＩｇＧ１Ｆｃを制限酵素ＢａｍＨＩ、およびＥｃｏＲＩにて同様に処理した。それぞれのＤＮＡ断片をＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて精製し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いてライゲーション反応を行った後、大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入してアンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、ＤＤＲ１ｂ細胞外領域とＩｇＧ１のＦｃ領域が融合したタンパク質（配列番号：２４）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：２５）を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＤＤＲ１ｂＥＤ−Ｆｃを得た。
［参考例９］  組換え型ＤＤＲ１ｂ細胞外領域タンパク質の動物細胞用発現ベクターの構築（その２）
参考例８−（２）で作製したｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＤＤＲ１ｂＥＤ−ＦｃおよびｐＣＭＶ−Ｔａｇ４（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩにて処理し、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてそれぞれのＤＮＡ断片を精製した後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いてライゲーション反応を行った。得られたプラスミドを大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入し、カナマイシンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、ＤＤＲ１ｂ細胞外領域のＣ末端にＦｌａｇタグが融合したタンパク質（配列番号：２６）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：２７）を有する動物細胞用発現ベクターｐＣＭＶ−Ｔａｇ４−ＤＤＲ１ｂＥＤ−Ｆｌａｇを得た。
［参考例１０］  ＤＤＲ１ｂＦＬ−＃１１７、およびＤＤＲ１ｂＤＮ−＃２０６、＃２１８のアポトーシス感受性の検討（その１）
参考例６にて作製したＤＤＲ１ｂＦＬ−＃１１７、および参考例７にて作製したＤＤＲ１ｂＤＮ−＃２０６、ＤＤＲ１ｂＤＮ−＃２１８のアポトーシス感受性を親株であるＨＣＴ１１６細胞と比較した。
ＨＣＴ１１６細胞、ＤＤＲ１ｂＦＬ−＃１１７、およびＤＤＲ１ｂＤＮ−＃２０６、ＤＤＲ１ｂＤＮ−＃２１８をそれぞれ５ｘ１０５個となるように１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）および５０μｇ／ｍｌペニシリン・ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むダルベッコ改変型イーグル最少培地（Ｓｉｇｍａ社）１．５ｍｌに懸濁し、６穴プレートに播種した後、５％炭酸ガス気流下、３７℃で培養した。翌日ドキソルビシン塩酸塩０．５μｇ／ｍｌ（Ｗａｋｏ社）を含む上記培地に交換した。３６時間後、トリプシン・ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてそれぞれの細胞を回収し、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にて２回洗浄した。さらにＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣ（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社）を加え、４℃にて１５分間静置した後、ＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて細胞に結合したＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣの蛍光強度を解析した。ＨＣＴ１１６細胞ではＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣ結合細胞が約３６％であったのに対し、ＤＤＲ１ｂＦＬ−＃１１７では約２７％、ＤＤＲ１ｂＤＮ−＃２０６、ＤＤＲ１ｂＤＮ−＃２１８ではそれぞれ約７０％、約６６％であった。このことからＤＤＲ１ｂの発現あるいは活性増加により、ドキソルビシン誘導性アポトーシスに耐性を示すことが明らかとなった。
［参考例１１］  ＤＤＲ１ｂＤＮ発現細胞＃２０６、＃２１８のアポトーシス感受性（その２）
ＨＣＴ１１６細胞、およびＤＤＲ１ｂＤＮ−＃２０６、＃２１８をそれぞれ１．５ｘ１０６個となるように５０μｇ／ｍｌペニシリン・ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むダルベッコ改変型イーグル最少培地（Ｓｉｇｍａ社）１．５ｍｌに懸濁し、６穴プレートに播種した。５％炭酸ガス気流下、３７℃で４８時間培養した後、トリプシン・ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてそれぞれの細胞を回収し、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にて２回洗浄した。さらにＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣ（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社）を加え４℃にて１５分間静置した後、ＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて細胞に結合したＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣの蛍光強度を解析した。親株であるＨＣＴ１１６細胞ではＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣ結合細胞が約５２％であったのに対し、ＤＤＲ１ｂＤＮ−＃２０６、ＤＤＲ１ｂＤＮ−＃２１８ではそれぞれ約７７％、約７３％であった。このことからＤＤＲ１ｂの機能抑制によりアポトーシス誘導が促進されることが明らかとなった。
［実施例１］  ＤＮＡ免疫法を用いた抗ヒトＤＤＲ１ｂウサギポリクローナル抗体の作製と精製
ヒトＤＤＲ１ｂに対するウサギポリクローナル抗体の作製は、ＤＮＡ免疫法による抗体作製技術を有するＧｅｎｏｖａｃ社に委託して行った。免疫にはヒトＤＤＲ１ｂ（配列番号：３）の２２番目から４１６番目のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを使用し、Ｇｅｎｏｖａｃ社出願の特許文献（ＷＯ  ００／２９４４２）に記載されている方法に従い、ウサギ２羽に対して抗原感作を行った。識別番号Ｎｏ．１のウサギからは約１５０ｍＬの抗血清（ｒＡＳ１）を、識別番号Ｎｏ．２のウサギからは１２０ｍＬの抗血清（ｒＡＳ２）を得た。
次にそれぞれの抗血清からＩｇＧ画分を調製した。まず、１２．５ｍＬの上記ｒＡＳ１あるいはｒＡＳ２に０．２Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１．２５ｍＬを加え緩やかに攪拌しつつ１３．７５ｍＬの硫酸アンモニウム飽和水溶液を滴下した。氷中で１時間攪拌した後、１０，６００ｘ  ｇで３０分間遠心分離し沈殿画分を回収した。５０％硫酸アンモニウム水溶液１０ｍＬで懸濁し、再び１０，６００ｘ  ｇで２０分間遠心分離し沈殿画分を回収した。２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬを加え沈殿を溶解した後、５Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して４℃で一晩透析し脱塩操作を行った。ポアサイズ０．４５μｍのＭｉｌｌｅｘ−ＨＶフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過した後、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２５ｍＬで平衡化したＨｉＴｒａｐ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＦＦ（カラム容量：５ｍＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）にＩｇＧを吸着させた。２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２５ｍＬで未吸着画分を洗浄除去した後、０．１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）２５ｍＬで溶出した。溶出後直ちに１／１０容量の１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で中和し、０．５μＬ相当分を５−２０％アクリルアミド・グラジエントゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。Ｂｉｏ−Ｓａｆｅ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いてタンパク質を染色しＩｇＧを含有するフラクションを集めた後、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２Ｌに対する透析を４℃で２回繰り返した。排除分子量３０，０００のＶＩＶＡ  ＳＰＩＮ  ６（ザルトリウス社）を用いて濃縮し、終容量１ｍＬに調整した。２８０ｎｍの吸光度を測定し、光路長１ｃｍの時の分子吸光係数を２．２４ｘ１０５Ｍ−１として濃度を算出しＩｇＧの回収量を計算したところ、ｒＡＳ１からは３０ｍｇ、ｒＡＳ２からは７２ｍｇのＩｇＧを回収できたことが判明した。
［実施例２］  抗ヒトＤＤＲ１ｂウサギポリクローナル抗体のアポトーシス誘導活性（１）
（１）血清除去によるアポトーシス誘導とＩＶ型コラーゲンの細胞保護作用
参考例６に記載したＤＤＲ１ＦＬ−＃１１７、および参考例７に記載したＤＤＲ１ｂＤＮ−＃２０６をトリプシン・ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）処理で分散し、１０ｍＬのＰＢＳで１回洗浄した。さらに５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むダルベッコ改変型イーグル最少培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）（以後、無血清ＤＭＥＭと称する）を用いて、１ｘ１０４個／５０μＬとなるように懸濁し、予め８００μｇ／ｍＬのＩＶ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ社）を含む無血清ＤＭＥＭを５０μＬ入れておいた平底９６穴プレートの各ウェルに播種した。陰性対照として、ＩＶ型コラーゲンを含まない無血清ＤＭＥＭを入れておいたウェルにも同様に細胞を播種した。５％炭酸ガス気流下、３７℃で３日間培養した後、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡＰＬＵＳ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いて各々の細胞に誘導されたアポトーシスを検出したところ、ＤＤＲ１ＦＬ−＃１１７ではＩＶ型コラーゲンの添加によりアポトーシスが約５３％抑制されたのに対し、ＤＤＲ１ｂＤＮ−＃２０６では約３４％しか抑制されなかった（図１）。即ち、血清除去により誘導されるアポトーシスはＩＶ型コラーゲン添加で一部回復し、且つその回復にはＤＤＲ１ｂが関与していることが明らかとなった。
（２）抗ヒトＤＤＲ１ｂウサギポリクローナル抗体のアポトーシス誘導活性
実施例１に記載したウサギポリクローナル抗体がＩＶ型コラーゲンの細胞保護作用を抑制するか否か調べた。前項（１）記載のＤＤＲ１ＦＬ−＃１１７をＣｅｌｌ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で分散し１０ｍＬのＰＢＳで１回洗浄した後、８００μｇ／ｍＬのＩＶ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ社）を含む無血清ＤＭＥＭで２ｘ１０４個／５０μＬとなるように懸濁した。非免疫ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社）あるいは実施例１に記載したウサギポリクローナル抗体を種々の濃度になるよう無血清ＤＭＥＭで希釈した溶液を、１ウェルあたり５０μＬずつ予め分注しておいた平底９６穴プレートに上記細胞懸濁液５０μＬを播種した。比較の為に、無血清ＤＭＥＭのみを入れたウェルにも同様に細胞を播種した。５％炭酸ガス気流下、３７℃で３日間培養した後に、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡＰＬＵＳ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いて各々の細胞に誘導されたアポトーシスを検出した。ＩＶ型コラーゲン添加によって回復した吸光度変化（アポトーシス指数）を１００％として、各々のポリクローナル抗体１ｍｇ／ｍＬ添加時の細胞保護阻害活性を算出したところ、非免疫ウサギＩｇＧでは１．７％、ｒＡＳ１から精製したＩｇＧでは５８．６％、またｒＡＳ２から精製したＩｇＧでは４６．３％の阻害活性が得られたことから（図２）、抗ＤＤＲ１ｂウサギポリクローナル抗体はＩＶ型コラーゲンとＤＤＲ１ｂの結合を阻害し、ＩＶ型コラーゲンの細胞保護作用を消失させたことが示された。
［実施例３］  抗ヒトＤＤＲ１ｂウサギポリクローナル抗体のアポトーシス誘導活性（２）
実施例１に記載したウサギポリクローナル抗体がＩＶ型コラーゲンの細胞保護作用を抑制するか否か調べた。ＤＤＲ１ｂを強制発現していない癌細胞株ＨＣＴ１１６をＣｅｌｌ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で分散し１０ｍＬのＰＢＳで１回洗浄した後、１００μｇ／ｍＬのＩＶ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ社）を含む無血清ＤＭＥＭで２ｘ１０４個／５０μＬとなるように懸濁した。非免疫ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社）あるいは実施例１に記載したウサギポリクローナル抗体を種々の濃度になるよう無血清ＤＭＥＭで希釈した溶液を、１ウェルあたり５０μＬずつ予め分注しておいた平底９６穴プレートに上記細胞懸濁液５０μＬを播種した。比較の為に、無血清ＤＭＥＭのみを入れたウェルにも同様に細胞を播種した。５％炭酸ガス気流下、３７℃で３日間培養した後に、Ｃａｓｐａｓｅ−ＧｌｏＴＭ３／７Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて各々の細胞に誘導されたアポトーシスを検出した。ＩＶ型コラーゲン添加によって回復した吸光度変化（アポトーシス指数）を１００％として、各々のポリクローナル抗体３３μｇ／ｍＬ添加時の阻害活性を算出したところ、非免疫ウサギＩｇＧでは０％、ｒＡＳ１から精製したＩｇＧでは２９０％、またｒＡＳ２から精製したＩｇＧでは１３９％の細胞保護阻害活性が得られたことから（図３）、抗ＤＤＲ１ｂウサギポリクローナル抗体はＩＶ型コラーゲンとＤＤＲ１ｂの結合を阻害し、ＩＶ型コラーゲンの細胞保護作用を消失させ、さらには癌細胞株ＨＣＴ１１６のアポトーシスを誘導したことが示された。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明の中和抗体は、例えば、癌（例、乳癌、卵巣癌、大腸癌、肺癌、膵臓癌など）の予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス誘導剤、癌細胞の増殖抑制剤、ＤＤＲ１に対するアンタゴニストなどとして有用である。
本出願は、２００５年３月１５日に日本で出願された特願２００５−７４０６５を基礎としており、その内容は本明細書中に援用される。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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