(57)【要約】  プローブを安定して担体に固定化する技術を提供する。本発明はこのため、以下の式（２）で表される、リンカー用化合物を用いる。2006095831.tif 000009［式中、Ａは、水素原子、その他の置換基又は糖類その誘導体を表す。］【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブであって、
以下の式（１）で表される１又は２以上のリンカーユニットを備える、プローブ。
2006095831.tif 000008
［式中、Ｘは、水素原子、水酸基、あるいは置換基を表す。］
【請求項２】
前記リンカーユニットは、前記プローブの端末側又は前記プローブの全長の中央側に備えられる、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドプローブ又はポリヌクレオチドプローブである、請求項１又は２に記載のプローブ。
【請求項４】
前記プローブは、前記１又は２以上の前記リンカーユニットと、ハイブリダイゼーション配列と、該ハイブリダイゼーション配列と前記リンカーユニットの間に介在されるスペーサーとを備えている、請求項１〜３のいずれかに記載のプローブ。
【請求項５】
前記リンカーユニットは、ヌクレオチド誘導体である、請求項１〜４のいずれかに記載のプローブ。
【請求項６】
前記プローブは、ヘアピン構造又はループ構造を形成可能な配列を含んでいる、請求項１〜５のいずれかに記載のプローブ。
【請求項７】
ターゲット核酸に対するハイブリダイゼーション配列を有する、請求項１〜６のいずれかに記載のプローブ。
【請求項８】
２以上のハイブリダイゼーション配列、
を備える、請求項１〜７のいずれかに記載のプローブ。
【請求項９】
前記２以上のハイブリダイゼーション配列は、互いに同一である２以上のハイブリダイゼーション配列を含んでいる、請求項８に記載のプローブ。
【請求項１０】
前記２以上のハイブリダイゼーション配列は、互いに異なる２以上のハイブリダイゼーション配列を含んでいる、請求項８に記載のプローブ。
【請求項１１】
前記２以上のハイブリダイゼーション配列のうち一つのハイブリダイゼーション配列を、少なくとも一つの前記リンカーユニットを含む領域の一方の端末側に有し、他の一つのハイブリダイゼーション配列を前記リンカーユニットを含む領域の他方の端末側に有する、請求項８〜１０のいずれかに記載のプローブ。
【請求項１２】
前記プローブは、ターゲット核酸と三重鎖を形成可能に形成されている、請求項１〜１１のいずれかに記載のプローブ。
【請求項１３】
前記プローブは、少なくとも一つの前記リンカーユニットを含む領域の一方の端末側にターゲット核酸の少なくとも一部に相補的な第１のハイブリダイゼーション配列を有し、前記リンカーユニットを含む領域の他方の端末側には、前記第１のハイブリダイゼーション配列の少なくとも一部と前記リンカーユニットを含む領域を介して対称的な第２のハイブリダイゼーション配列を有している、請求項１２に記載のプローブ。
【請求項１４】
１又は２以上のターゲット核酸に対する２以上のハイブリダイゼーション配列を有する、請求項８〜１１のいずれかに記載のプローブ。
【請求項１５】
前記プローブは、前記ターゲット核酸の一部に相補的な第１のハイブリダイゼーション配列と、前記ターゲット核酸の他の一部に相補的な第２のハイブリダイゼーション配列とを有している、請求項１４に記載のプローブ。
【請求項１６】
前記プローブは、第１のターゲット核酸の少なくとも一部に相補的な第１のハイブリダイゼーション配列と、第２のターゲット核酸の少なくとも一部に相補的な第２のハイブリダイゼーション配列を有する、請求項１４に記載のプローブ。
【請求項１７】
前記第１のハイブリダイゼーション配列を前記少なくとも１つのリンカーユニットを含む領域の一方の端末側に有し、前記第２のハイブリダイゼーション配列を前記リンカーユニットを含む領域の他方の端末側に有する、請求項１５又は１６に記載のプローブ。
【請求項１８】
プローブが固定化された担体であって、
前記プローブは、請求項１〜７のいずれかに記載のプローブである、プローブ固定化担体。
【請求項１９】
プローブが固定化された担体であって、
前記プローブは、請求項８〜１７いずれかに記載のプローブである、プローブ固定化担体。
【請求項２０】
前記プローブは、前記担体表面に備えられるアミノ基を介した共有結合により固定化されている、請求項１８又は１９記載のプローブ固定化担体。
【請求項２１】
前記アミノ基はシロキサン結合を介して前記担体に備えられる、請求項２０に記載のプローブ固定化担体。
【請求項２２】
前記プローブは、前記リンカーユニットにおけるカルボジイミドと前記アミノ基との反応により固定化されている、請求項２０又は２１に記載のプローブ固定化担体。
【請求項２３】
前記プローブは、前記担体表面に備えられるチオール基を介した共有結合により固定化されている、請求項１８又は１９に記載のプローブ固定化担体。
【請求項２４】
前記プローブは、前記リンカーユニットにおけるカルボジイミドと前記チオール基との反応により固定化されている、請求項２３に記載のプローブ固定化担体。
【請求項２５】
前記担体は、平板状、粒子状及びキャピラリーの内層である、請求項１８〜２４のいずれかに記載のプローブ固定化担体。
【請求項２６】
前記担体は、平板状であり、前記プローブは、前記固定化担体に対してスポッティングにより供給される、請求項１８〜２５のいずれかに記載のプローブ固定化担体。
【請求項２７】
プローブ固定化担体の製造方法であって、
請求項１〜７のいずれかに記載のプローブを含有する液体を準備する工程と、
前記液体をアミノ基を備える担体の表面に供給して前記プローブを前記担体に固定化させる工程と、
を備える、製造方法。
【請求項２８】
プローブ固定化担体の製造方法であって、
請求項８〜１７のいずれかに記載のプローブを含有する液体を準備する工程と、
前記液体をアミノ基を備える担体の表面に供給して前記プローブを前記担体に固定化させる工程と、
を備える、製造方法。
【請求項２９】
前記液体の前記担体への供給工程は、インクジェット記録方式を用いる工程である、請求項２７又は２８に記載の製造方法。
【請求項３０】
核酸のハイブリダイズ方法であって、
請求項１〜７のいずれかに記載のプローブが担体に固定化されたプローブ固定化担体を準備する工程と、
当該プローブ固定化担体に、ターゲット核酸を供給して前記プローブとターゲット核酸とをハイブリダイズさせる工程と、
を備える、方法。
【請求項３１】
核酸のハイブリダイズ方法であって、
請求項８〜１７のいずれかに記載の前記プローブが担体に固定化されたプローブ固定化担体を準備する工程と、
前記プローブにターゲット核酸を供給して前記プローブとターゲット核酸とをハイブリダイズさせる工程と、
を備える、方法。
【請求項３２】
前記プローブは、ターゲット核酸と三重鎖を形成可能に形成されており、
前記ハイブリダイズ工程は、前記プローブとターゲット核酸との三重鎖を形成させる工程である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記プローブは、第１のターゲット核酸の少なくとも一部に相補的な第１のハイブリダイゼーション配列を有し、第２のターゲット核酸の少なくとも一部に相補的な第２のハイブリダイゼーション配列を有し、
前記第１のターゲット核酸を測定対象核酸とし、前記第２のターゲット核酸を、内部標準核酸として用いる、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸のハイブリダイズ反応のためのプローブに用いるのに適したリンカー用化合物、プローブ、プローブ固定化担体、当該固定化担体の製造方法及び核酸ハイブリダイズ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイなど、オリゴヌクレオチドなどの核酸をプローブとする各種のハイブリダイゼーションアッセイにおいては、基板や粒子などの担体に対してプローブを固定する必要がある。例えば、ＰＣＲ産物等の長鎖ＤＮＡはポリ陽イオンをコーティングしたスライドガラスに静電結合により固定化し、合成オリゴヌクレオチドは予めアミノ基やアルデヒド基などの官能基を末端に導入しておいたうえでアルデヒド基やアミノ基を導入したスライドガラスと共有結合を介して固定化している（蛋白質 核酸 酵素Ｖｏｌ．４３．No.13, 2005頁）【０００３】
また、生体においてＤＮＡがＮＯ等と接触して生成するグアニン損傷塩基としてオキサニン（oxaninie）が知られている（J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 2515-2516）。二重鎖中の特定部位に塩基としてオキサニンを有するＤＮＡはＤＮＡグリコシラーゼとの間で架橋体を形成することが知られている。また、オキサニン塩基を有するデオキシリボヌクレオチドである、デオキシオキサノシンのグリシンとの反応生成物も知られている（Chem. Res. Toxicol. 2000, 13, 227-230）。さらに、ＤＮＡグリコシラーゼの特定アミノ酸残基の側鎖で架橋することも知られている（J. Biol. Chem. Vol.278、 No.27.pp26264-25272,2003）。また、オキサニンを塩基として有するオリゴヌクレオチドをＰＣＲを用いて合成することも知られている（Biochem., 1997, 36, 8013-8019, Biochem., 1998, 37, 11592-11598、）。
【発明の開示】
【０００４】
しかしながら、従来までのプローブの固定化方法では、これらのいずれの方法によっても、ハイブリダイズやその後の工程並び固定化担体の保存工程を通じて、プローブの安定的固定化を実現するのは困難であった。また、共有結合により核酸を基板等に導入する際の反応性や特異性は必ずしも十分ではなく、核酸の基板に対する固定化形態を制御することも困難であった。
【０００５】
そこで、本発明では、プローブを安定して担体に固定化する技術を提供することを一つの目的とする。また、本発明では、プローブの固定化形態を制御できる技術を提供することを他の一つの目的とする。
【０００６】
本発明者らは、上記した課題について検討したところ、生体内においてＤＮＡがＮＯなどにより損傷を受けた際に生成される塩基であるオキサニンとアミノ基との間における不可逆反応に着目した。そして、この塩基をプローブに備えさせ、オキサニンとアミノ基との不可逆反応とその結合形態を利用することで、プローブを安定して担体に固定化できることを見出して、本発明を完成した。すなわち、本発明によれば、以下の手段が提供される。
【０００７】
本発明の一つの態様によれば、以下の式（１）で表される１又は２以上のリンカーユニットをプローブに備える、プローブが提供される。
2006095831.tif 000002
［式中、Ｘは、水素原子、水酸基、あるいは置換基を表す。］
【０００８】
このプローブは、前記リンカーユニットは、前記プローブの端末、端末側又はその全長の中央側に備えることができる。また、このプローブは、オリゴヌクレオチドプローブ又はポリヌクレオチドプローブとすることができる。また、前記リンカーユニットを前記プローブの端末側又はその全長の中央側に備えることができる。さらにまた、前記プローブは、前記１又は２以上の前記リンカーユニットと、ハイブリダイゼーション配列と、該ハイブリダイゼーション配列と前記リンカーユニットの間に介在されるスペーサーとを備えることができる。また、前記リンカーユニットは、ヌクレオチド誘導体とすることができる。
【０００９】
さらに、本発明のプローブは、ヘアピン構造又はループ構造を形成可能な配列を含むことができる。また、本発明のプローブは、ターゲット核酸に対するハイブリダイゼーション配列を有することもできる。
【００１０】
本発明のプローブは、２以上のハイブリダイゼーション配列を有することができる。これらのハイブリダイゼーション配列は、互いに同一である２以上のハイブリダイゼーション配列を含んでいてもよいし、互いに異なる２以上のハイブリダイゼーション配列を含んでいてもよい。さらに、互いに相補的である２以上のハイブリダイゼーション配列を含んでいてもよい。また、これらのハイブリダイゼーション配列のうち一つのハイブリダイゼーション配列を、少なくとも一つの前記リンカーユニットを含む領域の一方の端末側に有し、他の一つのハイブリダイゼーション配列を前記リンカーユニットを含む領域の他方の端末側に有することができる。
【００１１】
前記２以上のハイブリダイゼーション配列を有する前記プローブは、ターゲット核酸と三重鎖を形成可能に形成されていてもよい。この態様において、前記プローブは、少なくとも一つの前記リンカーユニットを含む領域の一方の端末側にターゲット核酸の少なくとも一部に相補的な第１のハイブリダイゼーション配列を有し、前記リンカーユニットを含む領域の他方の端末側には、前記第１のハイブリダイゼーション配列の少なくとも一部と前記リンカーユニットを含む領域を介して対称的な第２のハイブリダイゼーション配列を有することができる。
【００１２】
前記２以上のハイブリダイゼーション配列を有する前記プローブは、１又は２以上のターゲット核酸に対して２以上のハイブリダイゼーション配列を有することができる。この態様において、ターゲット核酸の一部に相補的な第１のハイブリダイゼーション配列と、前記ターゲット核酸の他の一部に相補的な第２のハイブリダイゼーション配列とを有することができる。また、この態様においては、第１のターゲット核酸の少なくとも一部に相補的な第１のハイブリダイゼーション配列と、第２のターゲット核酸の少なくとも一部に相補的な第２のハイブリダイゼーション配列とを有することもできる。これらの第１のハイブリダイゼーション配列を、少なくとも一つの前記リンカーユニットを含む領域の一方の端末側に有し、第２のハイブリダイゼーション配列を前記リンカーユニットを含む領域の他方の端末側に有することが好ましい。
【００１３】
本発明の他の一つの態様によれば、これらのプローブの１種又は２種以上を組み合わせたプローブセットが提供される。
【００１４】
本発明の他の一つの態様によれば、プローブが固定化された担体であって、前記プローブは、上記いずれかの態様のプローブである、プローブ固定化担体が提供される。この固定化担体によれば、前記プローブは、前記担体表面に備えられるアミノ基を介した共有結合により固定化されることができる。前記アミノ基はシロキサン結合を介して前記担体に備えられていてもよい。また、前記プローブは、前記リンカーユニットにおけるカルボジイミドと前記アミノ基との反応により固定化されることができる。さらに、前記プローブは、チオール基を介した共有結合により固定化されていてもよく、この場合、前記プローブは、前記リンカーユニットにおけるカルボジイミドと前記チオール基との反応により固定化されることができる。前記担体は、平板状、粒子状及びキャピラリーの内層とすることができる。さらにまた、前記担体は、平板状であり、前記プローブは、前記固定化担体に対してスポッティングにより供給されていてもよい。また、本発明によれば、前記プローブの１種又は２種以上が組み合わされたプローブセットが固定化された担体も提供される。
【００１５】
本発明の他の一つの態様によれば、プローブ固定化担体の製造方法であって、上記いずれかの態様のプローブを含有する液体を準備する工程と、前記液体をアミノ基を備える担体の表面に供給して前記プローブを前記担体に固定化させる工程と、を備える、製造方法が提供される。前記液体の前記担体への供給工程は、インクジェット記録方式を用いることができる。
【００１６】
また、本発明の他の一つの態様によれば、核酸のハイブリダイズ方法であって、上記いずれかの態様のプローブ固定化担体を準備する工程と、当該プローブ固定化担体に、ターゲット核酸を供給して前記プローブとターゲット核酸とをハイブリダイズさせる工程と、
を備える、方法が提供される。また、この方法において、前記プローブがターゲット核酸と三重鎖を形成可能に形成されており、前記ハイブリダイズ工程は、前記プローブとターゲット核酸との三重鎖を形成させる工程としてもよいし、また、第１のターゲット核酸の少なくとも一部に相補的な第１のハイブリダイゼーション配列と、第２のターゲット核酸の少なくとも一部に相補的な第２のハイブリダイゼーション配列と、を有し、前記第１のターゲット核酸を測定対象核酸とし、前記第２のターゲット核酸を、内部標準核酸として用いてもよい。前記第１のハイブリダイゼーション配列を少なくとも一つの前記リンカーユニットを含む領域を介した一方の端末側に有し、前記第２のハイブリダイゼーション配列を、前記リンカーユニットを含む領域の他方の端末側に有することが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】プローブが同一のハイブリダイゼーション配列を有する一例におけるハイブリダイゼーションを示す図であり、図中の配列Ｓ１はターゲットＤＮＡの配列１に相補的な配列である。
【図２】プローブが異なるハイブリダイゼーション配列を有する一例におけるハイブリダイゼーションを示す図であり、図中の配列Ｓ１，Ｓ２はそれぞれターゲットＤＮＡの配列１，配列２に相補的な配列である。
【図３】プローブが異なるターゲット核酸に対するハイブリダイゼーション配列を有する一例におけるハイブリダイゼーションを示す図であり、図中の配列Ｓ１，Ｓ２はそれぞれターゲットＤＮＡの配列１，配列２に相補的な配列である。ターゲットＤＮＡ１及び２をいずれも測定対象核酸としてもよく、ターゲットＤＮＡ１を測定対象用核酸としターゲットＤＮＡ２を内部標準用核酸としてもよい。
【図４】プロープがターゲット核酸と三重鎖を形成するハイブリダイゼーションを示す図であり、配列Ｓ１，Ｓ２はターゲットＤＮＡ１と三重鎖を形成可能な配列である。
【図５】核酸における三重鎖形成形態を示す図。
【図６】オキサノシン修飾オリゴＤＮＡと担体表面のアミノ基との結合形態を示す図。
【図７】オキサノシン修飾オリゴＤＮＡと担体表面のＳＨ基との結合形態を示す図。
【図８】オキサノシン修飾オリゴＤＮＡの合成スキームの一例を示す図。
【図９】各種基板の保存期間と蛍光シグナル強度との関係を示す図。
【図１０】実施例１０で用いた２種類のスペーサーを示す図。
【図１１】プローブの固定化を確認したときの蛍光シグナル測定結果を示す図。
【図１２】実施例１３におけるハイブリダイゼーション概念と結果とを示す図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、上記式（１）で表される１又は２以上のリンカーユニットをプローブの端末側又はその全長の中央側に備える、プローブに関し、さらに、こうしたプローブが固定化されたプローブ固定化担体、該プローブ固定化担体の製造方法及び該プローブ固定化担体を用いたハイブリダイゼーション方法に関する。【００１９】
本発明のプローブによれば、上記式（１）で表されるリンカーユニットを有するため、本プローブは、図１に示す反応及び結合形態で担体に固定化されると考えられる。すなわち、このリンカーユニットの６員環部分のカルボジイミドにより活性化されたカルボキシル基が固相担体側のアミノ基と反応して、新たなアミド結合を形成することができると考えられる。この反応は平衡反応でなく不可逆反応であるため、この新たなアミド結合が安定的に維持される。したがって、このリンカーユニットを相補的核酸とのハイブリダイゼーションアッセイに用いられるプローブに連結させることで、アミノ基を有する担体やその他の化合物とプローブとを結合させることができる。【００２０】
こうしたリンカーユニットを有する本発明のプローブは、担体に対して安定的に保持されるため、長期間にわたり安定したハイブリダイゼーションによるシグナル強度及びハイブリダイゼーション効率を確保することができる。また、リンカーユニットと担体アミノ基とは容易に反応するため、高い密度でプローブを担体に固定化することができる。また、このために高いシグナル感度を得ることができる。これらの結果、本発明のプローブによれば、優れた検出感度と検出精度のハイブリダイゼーションアッセイを提供することができる。【００２１】
また、本発明のプローブは、ハイブリダイゼーションアッセイに付随する担体表面の前処理工程、ハイブリダイズ工程、洗浄工程等においても安定して担体への固定状態が維持されるため、こうした操作に関わらず再現性の高い結果を容易に得ることができる。【００２２】
また、本発明のプローブは、当該リンカーユニットの連結位置においてアミノ基を備える担体表面と結合する。また、当該リンカー用化合物におけるこの結合反応性をプローブを構成する他の単位であるヌクレオチドは有していないため、プローブに備えられる他の官能基を保護する必要性がないものとなっている。すなわち、担体への連結位置を制御することができるようになっている。また、換言すれば、本発明のプローブは、任意の箇所に備えられるリンカーユニットを介して選択的に担体に固定化されるため、プローブの配向制御が可能となっている。【００２３】
また、本発明のプローブに備えられるリンカーユニットは、ヌクレオチドの形態を採ることができ、かつ当該形態において安定であるため、プローブの所望の位置に容易に導入できる。これにより、リンカーユニットを備える本発明のプローブを容易に作製できる。さらに、本プローブによればこうしたリンカーユニットを備えることで、プローブの担体に対する結合形態を自在に設計でき、ハイブリダイゼーション効率を得やすい固定化形態のプローブを得ることができる。さらに、こうしたプローブは、アミノ基保持担体との安定的な結合を容易に形成できるので、適用する担体形態として、平板状のほか、粒子やキャピラリーの内層などにも有効である。【００２４】
また、本発明のプローブは、２以上のハイブリダイゼーション配列を有することができる。この結果、ハイブリダイゼーション配列の密度を向上させることができる。さらに、これら２以上のハイブリダイゼーション配列を同一のターゲット核酸の同一又は異なる配列を指向させたり、異なるターゲット核酸の異なる配列を指向させたりすることができるため、従来にないハイブリダイゼーション形態を構築可能であるほか、従来にないハイブリダイゼーション効率、解析手法や定量性を実現できるものとなっている。例えば、本発明のプローブが２以上のターゲット核酸のそれぞれに対するハイブリダイゼーション配列を備える場合には、一つのプローブでの２以上のターゲット核酸を検出できるとともに、これら２以上のターゲット核酸の比率を容易に検出できる。さらに、こうした２以上のハイブリダイゼーション配列は、リンカーユニットを含む領域の一方の端末側と他方の端末側とにそれぞれ有することができる。【００２５】
以上のことから、本プローブが固定化された担体は、ターゲット核酸とのハイブリダイゼーションアッセイに適したものとなっている。また、本プローブ固定化担体を用いたハイブリダイズ方法は、検出感度と検出精度の良好なハイブリダイゼーションアッセイを実現することができる。さらに、本プローブ固定化用担体の製造方法によれば、優れた検出感度と検出精度のハイブリダイゼーションアッセイを提供できるプローブ固定化担体を製造することができる。【００２６】
以下、プローブ、それに用いるリンカー用化合物、プローブ固定化担体、その製造方法について説明するとともに、本プローブ固定化担体を用いたハイブリダイゼーションアッセイについて説明する。【００２７】
（プローブ）
プローブは、核酸、すなわち、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションアッセイのために用いられる。したがって、プローブは、各種のＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ等の各種のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの形態を採ることができる。その他、プローブはＰＮＡであってもよい。また、プローブに含まれることのある塩基部分、糖部分及びリン酸エステルを介した連結部分などは、それぞれ修飾されていてもよい。すなわち、修飾塩基、修飾糖及び改変された連結部分の１種又は２種以上を備えることができる。なお、ここで、オリゴヌクレオチドとは、主として、ヌクレオチドが数個から好ましくは百数十以下、より好ましくは百程度以下の重合体を意味しており、主として化学合成等により得られるものを含むことができる。また、ポリヌクレオチドとは、主として、オリゴヌクレオチドよりも長鎖の重合体を意味しており、ＰＣＲ産物などを含むことができる。また、プローブは核酸間のハイブリダイゼーションアッセイのほか、タンパク質などとの相互作用を検出するためのアッセイにも用いられる。【００２８】
本プローブは、好ましくはデオキシリボースを有するオリゴデオキシリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドである。本プローブにおいては、本リンカーユニットはプローブを構成する他のモノマーユニットと同種のヌクレオチド誘導体として含まれていることが好ましい。【００２９】
本発明のプローブは、上記式（１）で表される１又は２以上のリンカーユニットをプローブの任意の箇所に備えることができる。例えば、プローブの端末のほか、前記プローブの端末側又はその全長の中央側等に備えることができる。Ｘは、水素原子、水酸基又は置換基とすることができる。Ｘが水素原子のとき、リンカーユニットは、デオキシリボースを有するヌクレオチド誘導体モノマーとしてプローブ中に含まれていることになる。また、Ｘが水酸基のときには、リンカーユニットは、リボースを有するヌクレオチド誘導体モノマーとしてプローブ中に含まれていることになる。Ｘは置換基であってもよい。置換基は特に限定されないで糖又はリボースに一般的な官能基とすることができる。【００３０】
ヌクレオチド誘導体としてのリンカーユニットを含むオリゴヌクレオチドは、公知のプローブ作製方法を適用して作製することができる。各種のＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ鎖伸長法を用いる場合には、例えば、プローブ中において本リンカーユニットを構成可能なリンカー用化合物（これについては後述する。）としてデオキシオキサノシン三リン酸（ｄＯＴＰ）を準備する。デオキシオキサノシン中の塩基部分であるオキサニンは、シトシンやチミン（好ましくはシトシンである。）とそれぞれ２つの水素結合を形成して安定な塩基対合を形成することと推測される。こうした塩基対合を考慮して、所望のテンプレートと５’末端から本リンカー用化合物を導入しようとする所望の位置までのプライマーとを準備し、ｄＯＴＰのみを含む反応系で第１回目の伸長工程を実施する。その後、残存するｄＯＴＰを除去して、通常どおり必要なｄＮＴＰ（ＮはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧのいずれかあるいは２種類以上である。）の存在下で２回目以降の伸長工程を実施する。その後、必要に応じ、ｄＯＴＰのみの伸張工程を実施すれば、２以上の所望の部位に本リンカー用化合物を導入することができる。【００３１】
また、ホスホアミダイト法による場合には、例えば、既に説明したデオキシオキサノシンのホスホアミダイト化誘導体を準備し、合成中のオリゴデオキシヌクレオチドに対して所望の導入順位において添加して鎖延長反応を行う。こうすることによっても、プローブの１又は２以上の所望の部位に本リンカー用化合物を導入できる。【００３２】
本プローブは、ハイブリダイゼーションにおいては１本鎖核酸の形態で機能するが、取得時若しくは合成時又は固定化時においては、２本鎖の形態であってもよい。また、１本鎖の形態を採るとき、ループやヘアピン部位を有していてもよい。【００３３】
本プローブは、１又は２以上のリンカーユニットを備えることができる。リンカーユニットは、プローブにおいてもっぱら選択される担体固定部位である５’末端に備えることもできるが３’末端等それ以外の部位に備えることもできる。例えば、プローブの全長の中央近傍に備えていてもよい。また、５’末端側あるいは３’末端側にリンカーユニットを備えるようにし、このようなプローブを担体に固定したとき、該リンカー用化合物部位を含むプローブの上流側と下流側で部分的にヘアピン構造やループ構造を採らせるよう設計することもできる。特にリンカーユニットがヌクレオチド誘導体の形態を採ることにより、既に説明したように化学合成によっても酵素的な鎖延長法によっても任意の部位にリンカーを導入することができる。【００３４】
本プローブにおいては、ターゲット核酸とのハイブリダイズ領域は、リンカーユニットを含まないことが好ましい。したがって、プローブの全長の中央近傍や末端近傍にリンカーユニットが導入される場合には、その近傍には、ハイブリダイズに関与しないスペーサー領域を形成することが好ましい。【００３５】
また、こうしたスペーサー領域は、プローブの５’末端などにリンカーユニットが導入される場合であっても同様にハイブリダイズ領域との間に形成することが好ましく、この場合、５’末端側からリンカーユニット−スペーサー領域−ハイブリダイズ領域とすることが好ましい。【００３６】
本発明においてリンカーユニットは任意の個数で任意の箇所に備えることができるが、リンカーユニットを含んで、担体に固定化されるプローブ領域及びその近傍をリンカー領域というものとする。１つのリンカー領域には、リンカーユニットを１個備えていてもよいが、２個から数個程度のリンカーユニットを備えていてもよい。なお、すでに説明したように、こうしたリンカーユニットが導入された領域あるいは導入比率が高い領域に隣接してスペーサー領域を備えていることが好ましい。リンカー領域がプローブの非末端領域にある場合には、スペーサー領域はリンカーユニット部分の両側に有することができるし、リンカー領域がプローブの末端にある場合には、スペーサー領域は、当該末端よりも先端側に有することができる。【００３７】
（２以上のハイブリダイゼーション配列を有するプローブ）
本発明のプローブは、２以上のハイブリダイゼーション配列を有することができる。こうしたプローブを用いることで、担体におけるハイブリダイゼーション配列の密度を向上させることができる。【００３８】
プローブは、それぞれ同一である２以上のハイブリダイゼーション配列を有していてもよいし、互いに異なる２以上のハイブリダイゼーション配列を有していてもよいし、互いに相補的な２以上のハイブリダイゼーション配列を有していてもよい。また、２以上のハイブリダイゼーション配列は、異なるターゲット核酸を指向していてもよく、同一のターゲット核酸の異なる配列や同一配列を指向していてもよい。また、プローブは、例えば、ＲＮＡ等における各種構造（ループ、ステム、ヘアピン、バルジ、インターナルループ、ダングリングエンド等）を形成可能なハイブリダイゼーション配列を有していてもよい。【００３９】
なお、特に、プローブが２以上のハイブリダイゼーション配列を有する場合のハイブリダイゼーション配列とは、後述するように、通常のワトソン−クリック型の水素結合による塩基対形成による対合のほか、フーグスティーン（ＨＧ）型及び逆フーグスティーン（逆ＨＧ）型の水素結合による塩基対形成による対合も包含することができる。【００４０】
プローブが備える２以上のハイブリダイゼーション配列は、１又は２以上のターゲット核酸に対するハイブリダイゼーション配列を含むことができる。こうしたプローブにおいては、これらのハイブリダイゼーション配列の一つを少なくとも一つのリンカー領域の一方の端末側に備え、少なくとも他の一つを前記領域の他方の端末側に備えることが好ましい。例えば、リンカー領域を挟んだ３’末端側に一つのハイブリダイゼーション配列を有し、５’末端側に他の一つのハイブリダイゼーション配列を有することで、一つのプローブに対してそれぞれにおいて容易にターゲット核酸とハイブリダイズ可能にハイブリダイゼーション配列を付与することができる。このとき、リンカー領域は、１個又は数個程度のリンカーユニットを挟んで適当なスペーサーを備えていることが好ましい。こうしたスペーサーを有することで、ハイブリダイゼーション配列に対するターゲット核酸のハイブリダイゼーション効率を確保しひいては向上させることができる。本発明のプローブは、好ましくは、リンカー領域のそれぞれの側に一つずつのハイブリダイゼーション配列を備えている。【００４１】
（１つのターゲット核酸に対して２以上のハイブリダイゼーション配列を有するプローブ）
本発明のプローブは、１つのターゲット核酸に対する２以上のハイブリダイゼーション配列を有することができる。この２以上のハイブリダイゼーション２以上のハイブリダイゼーション配列は、同一であってもよいし、異なっていてもよい。図１に示すように、２以上のハイブリダイゼーション配列が同一である場合、一つのプローブに２以上の同一のターゲット核酸をハイブリダイズさせることができるため、ハイブリダイゼーション効率を向上させ、検出感度を向上させることができるとともに、シグナル強度を向上させることができる。また、図２に示すように、２以上のハイブリダイゼーション配列に異なるハイブリダイゼーション配列を含む場合、すなわち、ターゲット核酸の少なくとも一部に対するハイブリダイゼーション配列とターゲット核酸の他の少なくとも一部に対するハイブリダイゼーション配列とを有する場合には、１つのターゲット核酸の異なる部位を検出できるため、１つのターゲット核酸に対するハイブリダイゼーション効率を向上させることができる。特に、長いターゲット核酸やキメラＤＮＡなどをハイブリダイゼーション効率を向上させ、容易にかつ高い識別性で検出できるようになる。こうしたプローブにおいても、リンカー領域をプローブの中央側、すなわち、非末端側に有しており、２以上のハイブリダイゼーション配列のうち１つをリンカー領域の一方側に有し、他の少なくとも１つをリンカー領域の他方側に有することが好ましい。こうしたプローブによれば、リンカー領域の両側で２以上のターゲット核酸を容易に１つのプローブでハイブリダイゼーションさせることができる。【００４２】
（２以上のターゲット核酸に対する２以上のハイブリダイゼーション配列を有するプローブ）
本発明のプローブは、２以上のターゲット核酸に対して２以上のハイブリダイゼーション配列を有することができる。こうしたプローブによれば、１つのプローブで２以上のターゲット核酸を検出することができ、２個のプローブをスポットする場合に比較して１つのスポット中に含まれるハイブリダイゼーション配列の比率を正確に調整できるようになる。すなわち、本プローブが固定化されれば、確実にそのプローブ中の２以上のハイブリダイゼーション配列が固定化されたことになるからである。従来、等量比で混合した２種類以上のプローブをスポットしても必ずしも、その等量比で固定化されるわけではなかった。【００４３】
図３に示すように、こうしたプローブの１つのハイブリダイゼーション配列が指向するターゲット核酸を測定対象核酸とし、他の１つのハイブリダイゼーション配列が指向するターゲット核酸を内部標準用核酸とすることで、内部標準を利用した定量性に優れるハイブリダイゼーションアッセイが可能となる。例えば、こうしたプローブをセットでスポットして、これらのプローブによって測定対象核酸の標準曲線をハイブリダイゼーションアッセイと同時にあるいは予め作製しておき、サンプル液中にも標準曲線作成用溶液と同濃度で内部標準用核酸を添加することで、内部標準を用いた再現性の良好なハイブリダイゼーションアッセイが可能となる。【００４４】
こうしたプローブにおいても、リンカー領域をプローブの中央側、すなわち、非末端側に有しており、２以上のハイブリダイゼーション配列のうち１つをリンカー領域の一方側に有し、他の少なくとも１つをリンカー領域の他方側に有することが好ましい。こうしたプローブによれば、リンカー領域の両側で２以上のターゲット核酸を容易に１つのプローブでハイブリダイゼーションさせることができる。【００４５】
（ターゲット核酸と三重鎖を形成可能なプローブ）
さらに、本発明のプローブは、図４に示すように、ターゲット核酸の少なくも一部と三重鎖を形成可能な２以上のハイブリダイゼーション配列を有していてもよい。こうしたプローブによれば、ターゲット核酸を二重鎖形成時によりも安定してかつ高い識別性で捕捉することができる。三重鎖は、ワトソン−クリック型二本鎖核酸のメジャーグルーブにおいて、オリゴピリミジン又はオリゴヌクレオチドプリン配列からなる第三鎖が二本鎖核酸のオリゴヌクレオチドプリン配列に対してＨＧ型又は逆ＨＧ型で水素結合により形成されることにより形成される。【００４６】
図５に示すように、三本鎖形成時の第三鎖の配向には２種類（パラレル、アンチパラレル）存在し、図５中の第三鎖がオリゴピリミジン鎖の場合には、二本鎖中のオリゴヌクレオチドプリン鎖に対してパラレルに結合し、図５中の第三鎖がオリゴヌクレオチドプリン鎖の場合には、二本鎖中のオリゴプリン鎖に対してアンチパラレルに結合することが知られている。【００４７】
本発明においては、本発明のプローブとターゲット核酸とがどのような形態で三重鎖を形成してもよく、第三鎖がプローブ中のハイブリダイゼーション配列となるように構成してもよいし、第三鎖がターゲット核酸となるように配列構成してもよい。また、本発明のプローブとターゲット核酸とが形成する三重鎖は、図４に示すような２種類のクランプ型あるいはこれに類似した形状とすることができる。例えば、プローブ中の１つのハイブリダイズ配列（ピリミジン鎖）が第三鎖となるパラレル型のプローブとしては、リンカー領域の一方の端末側にターゲット核酸の少なくとも一部（例えば、プリン鎖）に相補的な第１のハイブリダイゼーション配列（例えば、ピリミジン鎖）を有し、リンカー領域の他方の端末側には、第１のハイブリダイゼーション配列の少なくとも一部と前記リンカーユニットを含む領域を介して対称的な（リンカー領域を介して両配列を対向させたとき、同じ塩基同士が対合すること。例えば、同種のピリミジン塩基同士が対合すること）第２のハイブリダイゼーション配列（例えば、ピリミジン塩基からなる配列）を有することができる。この第２のハイブリダイゼーション配列は、ターゲット核酸のプリン鎖中の塩基との間でＨＧ型水素結合を形成することになる。【００４８】
なお、三重鎖を形成可能な本発明のプローブにおける各ハイブリダイゼーション配列は、オリゴピリミジン領域又はオリゴプリン領域を備えるものであってもよいし、これらの領域を組み合わせて（交互に）備えていてもよい。ターゲット核酸の配列や三重鎖形成形態によって適宜選択すればよい。【００４９】
また、特に、三重鎖形成可能な本発明のプローブには、三重鎖形成に適した修飾核酸を含んでいてもよい。【００５０】
ターゲット核酸と三重鎖形成可能なプローブは、上記クランプ型構造を形成可能に、リンカー領域をプローブの中央側、すなわち、非末端側に有しており、三重鎖中の１本鎖に対応するハイブリダイゼーション配列をリンカー領域の一方側に有し、三重鎖中の他の１本鎖に対応するハイブリダイゼーション配列をリンカー領域の他方側に有していることが好ましい。【００５１】
これらの本発明のプローブは、３以上のハイブリダイゼーション配列を有することもできる。例えば、プローブの非末端側にリンカー領域を有するＵ字状プローブの一方のアームに１つのハイブリダイゼーション配列を有し、他方のアームに２以上のハイブリダイゼーション配列を有することもできる。さらに、双方のアームに２以上のハイブリダイゼーション配列を有することもできる。このように、本発明によれば、従来に比較して容易に２以上のハイブリダイゼーション配列をプローブに保持させることができるため、従来とは異なる捕捉形態でターゲット核酸を捕捉できるようになる。【００５２】
また、本発明のプローブにおいては、さらに、他の態様で３以上のハイブリダイゼーション配列を有していてもよい。本発明のプローブによれば、リンカーユニットの位置において高い選択性を持って担体に固定化することができる。このため、１又は２以上のリンカーユニットによって担体に固定化されたときにおいて、ターゲット核酸とハイブリダイズ可能な箇所を３箇所以上形成し、当該箇所にハイブリダイゼーション配列を備えることができる。【００５３】
（プローブセット）
本発明のプローブセットは、上記した各種の本発明のプローブの１種又は２種以上を含んでいる。本発明のプローブセットによれば、従来のプローブセットに比較して、高いハイブリダイゼーション効率、高い識別性及び高感度な検出のうち少なくとも１つを達成することができる。また、従来のプローブセットと異なる新たな検出形態、例えば、三重鎖形成によるターゲット核酸の検出、１つのターゲット核酸中の２以上の異なるハイブリダイゼーション配列による検出が可能であるため、従来とは異なる形態のターゲット核酸を検出することも可能となる。本発明の他の一つの態様によれば、これらのプローブの１種又は２種以上を組み合わせたプローブセットが提供される。【００５４】
（リンカー用化合物）
本発明のプローブにおけるリンカーユニットは、以下の式（２）で表されるリンカー用化合物を用いてプローブ中に導入される。
2006095831.tif 000003
【００５５】
前記Ａとしては、水素原子、その他の置換基又は糖類もしくはその誘導体とすることができる。Ａが水素であるとき、式（２）で表される化合物は、オキサニン塩基である。本塩基は、グアノシンがＮＯ又はＮＯ2により誘起される酸化的脱アミネーションされて形成される損傷塩基の一つである。なお、以下、本明細書において、オキサニンがリボース又はデオキシリボース（いずれもフラノース型）と結合したヌクレオシド形態をオキサノシンヌクレオシドと称し、特に、糖がデオキシリボースのときはデオキシオキサノシンと称し、糖がリボースのときはオキサノシンと称するものとする。【００５６】
このリンカー用化合物は、前記Ａはリボース、デオキシリボース及びこれらの誘導体から選択されるヌクレオシド誘導体であることが好ましい。また、前記リボース又は前記デオキシリボースにおいて、Ｃ３’位の水酸基にはホスホアミダイド基が導入され、Ｃ５’位の水酸基には、ジメトキシトリチル基が導入されていることも好ましい。さらにまた、このリンカーは、ヌクレオチド誘導体であってもよい。【００５７】
オキサニンは、例えば、デオキシグアノシンをＮＯ及び／又はＮａＮＯ2と反応させることによってデオキシオキサノシンとして得ることができる。例えば、デオキシグアノニンにＮａＮＯ2を酸性下、例えば、酢酸ナトリウム緩衝液（３．０Ｍ、ｐＨ３．７）を用いて、３７℃、４時間反応させることによって得ることができる。こうした反応後、反応液をＮａＯＨで中和し、必要に応じ適宜減圧留去した後、逆相クロマトグラフィー等により精製し、乾燥することでデオキシオキサノシンを白色粉末として得ることができる。移動相としては、リン酸ナトリウム緩衝液（４００μＭ、ｐＨ７．４）等の中性の緩衝液とアセトニトリルなどの有機溶媒との混液（アセトニトリル１０％等）とすることで良好に分離できる。オキサニンは、デオキシオキサノシンを酸加水分解し、この反応液から逆相クロマトグラフィー等によって分取することができる。酸加水分解は、例えば、１Ｍ塩酸などの酸とともに３７℃で２時間という反応条件を採用することができる。【００５８】
なお、前記Ａは、リボースやデオキシリボースなどのペントースを始めとする糖類とすることもできる。糖類の誘導体としては、糖類の炭素原子に結合した水素あるいは水酸基に替えて、アルコキシ、アルコキシアルキルオキシ、ハロゲン等の官能基を備えたものが挙げられる。【００５９】
本リンカー用化合物は、カルボジイミドで活性化されたカルボキシル基においてアミノ基との反応性が確保されていれば、どのような形態でオキサニンを備えていてもよい。好ましくは、リボース又はデオキシリボースなどのペントースと結合した形態で有することが好ましい。また、本塩基とペントースとの結合位置は、好ましくは、３位のＮ原子にペントースのＣ１’位炭素原子が結合する形態であることが好ましい。ペントースが１−β−リボフラノシルリボース又はリボフラノシルデオキシリボースのとき、本リンカー用化合物は、ヌクレオシド誘導体の形態を採ることになる。ヌクレオシド誘導体の形態の本リンカー用化合物は、既に説明したように、デオキシグアニンやデオキシグアノシンから容易に得ることができる。【００６０】
こうしたヌクレオシド誘導体形態の本リンカー用化合物は、化学合成によりオリゴヌクレオチドを取得するのに適した種々の修飾が施されていてもよい。例えば、リボース又はデオキシリボースのＣ３’位の水酸基やＣ５’位の水酸基は適宜修飾される。３’位の水酸基には、ホスホルアミダイト基が導入され、５’位の水酸基には、ジメトキシトリチル基等が導入されていることが好ましい。こうした修飾基としては、核酸の化学合成法において公知の方法を適宜用いることができる。ホスホアミダイト法による核酸の化学合成に適した本リンカー用化合物の例を以下に示す
2006095831.tif 000004
［式中、Ｒ１は２−シアノエチル、４−ニトロフェニルエチル、２−トリメチルシチルエチル、又はメチルを表す］【００６１】
こうした本リンカー用化合物は、公知の核酸化学合成用モノマーの合成方法を適用して取得することができる。例えば、デオキシオキサノシンの懸濁液（溶媒としてはＤＭＦなど）にジメトキシトリチルクロライドを添加して、その後、イミダゾールとジイソプロピルエチルアンモニウムメシレートを添加し、この反応液を攪拌して均質化し、次いで、多量の水に投入し、沈殿を得、乾燥して粗精製物とする。この粗精製物をジクロロメタンなどの適当な溶媒に再溶解後、ヘキサン中で再結晶化することで、ＤＭＴ−デオキシオキサノシンを得ることができる。【００６２】
さらに、ＤＭＴ−デオキシオキサノシンをホスホアミダイト化するには、ＤＭＴ−デオキシオキサノシンを適当な溶媒に溶解し、その後、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ジイソプロピルホスホアミドを添加し、十分に反応させた後、メタノール、ジイソプロピルエチルアミン及び酢酸エチルの添加で反応を終了させ、１０％の炭酸水素ナトリウムで洗浄した後、有機相を脱水し濃縮した。この濃縮物をジクロロメタン等の適当な溶媒に再溶解し順相クロマトグラフィーにて分離した。移動相としては、例えば、酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝６５：３５：０．３３）などを採用することができる。【００６３】
さらに、本リンカー用化合物は、好ましくはリボース又はデオキシリボースの５位の炭素原子に結合した水酸基においてリン酸エステルの形態を採る。この場合、本リンカー化合物は、ヌクレオチド誘導体の形態を採ることができる。リン酸エステルは、１リン酸エステル、ビスリン酸エステル、３リン酸エステル等とすることができる。３リン酸エステル体であるリンカー用化合物は、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅手法により１００塩基以上の長鎖ＤＮＡなどの核酸を取得するのに好ましく用いることができる。ヌクレオチド誘導体としての本リンカー用化合物の例を以下の式に示す。
2006095831.tif 000005
【００６４】
こうしたプローブ用化合物を用いることにより、核酸の公知の固相合成法やＰＣＲ法等により任意の箇所にリンカーユニットを備えるプローブを得ることができる。【００６５】
（プローブ固定化担体）
プローブ固定化担体は、本発明のプローブが固定化された固相担体である。固相担体としては、特に限定しないで、ハイブリダイゼーションアッセイに用いられる従来公知の各種の担体を用いることができる。例えば、ガラス、セラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、短繊維、メンブランフィルター等が挙げられる。好ましくは、ガラス、シリコン、ポリマーである。【００６６】
担体の形態も、本プローブを固定化可能であってかつターゲット核酸が供給可能な表面（内表面を含む）を有していれば特に限定しない。例えば、基板などの平板状、ビーズなどの粒子状、ファイバー状、内表面を固定化表面とするキャピラリー状等を採用することができる。担体は、上記のとおり多孔質であってもよい。【００６７】
本発明における担体は、プローブの固定化のために固定化表面にアミノ基（−ＮＲ1Ｒ2）を備えている。Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立に水素原子、または、置換基である。置換基は、炭素数が１以上１８以下、好ましくは、１以上６以下の直鎖アルキル基である。アミノ基は、リンカー用化合物との反応性を考慮すると１級アミノ基であることが好ましい。【００６８】
アミノ基を備える担体は、例えば、リジン、ヒスチジン及びアルギニンからなる群から選択される１種以上のアミノ酸残基を備えることができる。こうしたアミノ酸残基は、ポリマーの形態でコーティング層として担体表面を構成していてもよい。また、ガラス製担体などシラノール基を備える担体のシラノール基に、アミノ基含有基を備える各種のモノ−、ジ−、トリ−アルコキシシランを導入することにより、シロキサン結合を介してアミノ基を備える担体を得ることもできる。アミノ基は、好ましくは末端に備えられるように設計される。アミノ基含有基は、適当なスペーサー部分を介してアミノ基を備えることができる。スペーサー部分は、炭素数２以上１０以下のアルキル基又は当該アルキル基の一部の炭素原子が窒素原子又はＳ原子により置換された形態が好ましい。アルキル基は、直鎖状あるいは分枝状とすることができるが、好ましくは直鎖状である。【００６９】
また、アルコキシシランにおけるアルコキシル基は、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。また、アルコキシシランにおける残余の基（アルコキシル基及びアミノ基アルキルアミノ基以外にＳｉに結合する基）としては、アルキル基であることが好ましい。当該アルキル基としては、炭素数１〜１０程度のアルキル基が好ましく用いられ、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、シクロヘキシル基、ｎ−オクチル基、ｔｅｒｔ−オクチル基、ｎ−デシル基が挙げられる。なお、シラノール基に導入するアルコキシシランはこれに限定するものではなく、その他各種のシラン化合物を用いることができる。なお、担体に使用することのできるシラン化合物の例を以下に示す。
2006095831.tif 000006
【００７０】
また、本発明における担体は、プローブの固定化のために固定化表面にチオール基（−ＳＨ）を備えることができる。チオール基は、例えば、システインなどのアミノ酸残基など各種官能基や化合物の一部として担体表面に備えられていればよい。したがって、ＳＨ基を有するポリマーやＳＨ基含有化合物のコーティング層として担体表面が構成されていてもよい。また、アミノ基と同様に、ガラス製担体などのシラノール基を備える担体のシラノール基に対してＳＨ基含有基を備える各種のモノ−、ジ−、トリ−アルコキシシランを導入することにより、シロキサン結合を介してＳＨ基を備える担体を得ることもできる。ＳＨ基は好ましくは、末端に備ええられるように設計される。ＳＨ基はシロキサン結合部分から適当なスペーサー部分を介して備えられていることが好ましく、スペーサー部分は、炭素数２以上１０以下のアルキル基又は当該アルキル基の一部の炭素原子が窒素原子又はＳ原子により置換された形態が好ましい。アルキル基は、直鎖状あるいは分枝状とすることができるが、好ましくは直鎖状である。なお、アルコキシシランにおけるアルコキシル基は、上記と同様の各種態様のものが挙げられる。【００７１】
本発明のプローブ固定化担体においては、プローブは、そのリンカー用化合物のオキサニンのカルボジイミドで活性化されたカルボキシル基と担体表面のアミノ基又はＳＨ基とが反応して、アミド結合を形成した状態で固定化されている（図６、図７参照）。【００７２】
プローブの固定化形態は、プローブにおけるリンカー用化合物（リンカーユニット）の導入位置により異なり、５’末端にリンカーユニットを備える場合には、プローブが１本鎖状に固定化されるであろうし、プローブ全長の中央近傍にリンカー用化合物（リンカーユニット）を備える場合には、プローブはＵ字等状に固定化されるであろう。また、リンカー用化合物（リンカーユニット）の導入部位近傍に対向して塩基対合を形成可能な配列等を有する場合には、リンカー用化合物導入部位（リンカーユニット）近傍でヘアピンやループ構造を採るであろう。【００７３】
（プローブ固定化担体の製造方法）
プローブ固定化担体は、プローブを含有する液体を準備し、この液体を上記担体の表面に供給し、前記プローブにおけるリンカー用化合物（リンカーユニット）のオキサニンと担体に備えられるアミノ基又はＳＨ基とを反応させることによって得ることができる。担体にプローブを供給する方法は従来公知のいずれの方法も採用できる。例えば、プローブ固定化担体として、基板等の表面に多数個のプローブスポットを配列されたアレイを作製するには、ピンによる接触型あるいはバブルジェット（登録商標）方式やピエゾジェット等によるインクジェット記録方式等によりプローブ含有液滴をスポット状に供給することができる。また、ビーズ等の粒子にプローブを供給するには、プローブ含有溶液中にビーズをディッピングするかプローブ含有溶液を噴霧するなどによることができる。【００７４】
プローブの担体への固定化は、通常行われるこうしたプローブ溶液のスポッティングやディッピング等の操作において可能である。アミノ基又はＳＨ基を備える担体へプローブ溶液が供給されれば、リンカー用化合物とアミノ基やＳＨ基は速やかに反応することができる。なお、プローブ溶液には、有機溶媒を添加することでもきるし、また、必要に応じて、中性あるいは微酸性に調整することができる。温度やインキュベーション時間は、担体やプローブの種類等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、３０℃〜９０℃の所定温度とし、反応時間は数十分から１時間あるいは数時間程度とすることができる、担体表面にプローブ溶液を供給した後は、リハイドレーション、ブロッキング、変性、洗浄、乾燥等の工程を実施することができる。【００７５】
（ハイブリダイズ方法）
本発明の核酸ハイブリダイズ方法は、本発明のプローブ固定化担体を準備し、このプローブ固定化担体に対して核酸を供給してプローブとターゲット核酸とをハイブリダイズさせるものである。本ハイブリダイズ方法では、本プローブ固定化担体を用いる以外は、従来公知の方法で調製した各種のターゲット核酸を常法に従い供給しハイブリダイズさせればよい。本発明のハイブリダイズ方法においては、上記プローブセットも用いることができる。【００７６】
本発明のハイブリダイズ方法によれば、プローブが上記リンカーユニットを介して担体に固定化されているため、安定してプローブが固定化されているため、安定したハイブリダイゼーションアッセイが可能となっている。さらに、プローブが２以上のハイブリダイゼーション配列を有する場合には、高いハイブリダイゼーション効率が得られやすい方法を容易に構築することができる。例えば、既に説明したように、１つのターゲット配列に対して同一又は異なる２以上のハイブリダイゼーション配列を有するプローブを用いたり、三重鎖を形成可能なプローブなどを用いることで、ハイブリダイゼーション効率を向上させることができる。さらに、三重鎖が形成可能であるなどプローブが従来にない固定化形態で担体に固定されているため、従来にない高い識別性でのハイブリダイゼーションアッセイが可能となっている。さらにまた、２以上のハイブリダイゼーション配列のうち、１つを測定対象核酸に対するハイブリダイゼーション配列とし、他の１つを、内部標準核酸に対するハイブリダイゼーション配列とすることで、内部標準を用いた高い定量性のハイブリダイゼーションアッセイが可能となる。また、２以上のハイブリダイゼーション配列が、２以上の測定対象核酸に対するハイブリダイゼーション配列を含むことで、多数のターゲット核酸を同時に検出し、定量も可能となる。
【実施例１】
【００７７】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。なお、図８に、実施例１〜４におけるオキサノシン修飾オリゴＤＮＡの合成スキームを示す。【００７８】
（２’−デオキシオキサノシンの合成）
デオキシグアニン３ｍｍｏｌを４００ｍｌの１００ｍＭのＮａＮＯ2含有酢酸ナトリウム緩衝液（３．０Ｍ、ｐＨ３．７）で３７℃、４時間インキュベートした。その後、５Ｍ ＮａＯＨで中和し、ロータリーエバポレータで溶媒の半量を減圧留去し、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＳ（０．２２μｍ：ミリポア（ブラッドフォード、ＭＡ）でろ過して、分取用逆相ＨＰＬＣシステム（ＴｏｓｏｈＰＸ−８０１０（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ），ＣＣＰＭ（ｐｕｍｐ）ａｎｄＵＶ−８０１０（ＵＶ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）（Ｔｏｓｏｈ Ｃｏ，Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）、Ｕｌｔｒｏｎ ＶＸ−ＯＤＳ ｃｏｌｕｍｎ （２５０ｘ２０ｍｍ， ５μｍ； 信和化工株式会社製）に導入した。移動相は、１０％アセトニトリル含有リン酸ナトリウム緩衝液（４００μＭ、ｐＨ７．４）でアイソクラティックとし、流量は６ｍｌ／分とした。デオキシオキサノシンのフラクションをさらに精製し凍結乾燥すると、デオキシオキサノシンの白色粉末を得ることができた（０．４ｍｍｏｌ、収率１０％）。【００７９】
２−デオキシオキサノシンのＮＭＲデータ：
1H NMR (600MHz, D2O at 30oC): δ = 7.98 (s, 1H, H-2), 6.26 (dd, 1H, H-1'), 4.61 (ddd, 1H, H-3'), 4.12 (ddd, 1H, H-4'), 3.79 (m, 2H, H-5',5"), 2.77 (ddd, 1H, H-2'), 2.52 (ddd, 1H, H-2"); UV: λmax = 245, 286 (pH 7); MS(FAB) m/z 269 (M+H+)
【実施例２】
【００８０】
（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシオキサノシン（ＤＭＴ−ｄＯｘｏ）の合成）
４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（０．４ｍｍｏｌ）をデオキシオキサノシンの懸濁液（０．４ｍｍｏｌ、脱水したＤＭＦ３ｍｌ）に添加し、その後、イミダゾール（０．８ｍｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアンモニウムメシレート（０．８ｍｍｏｌ）を添加した。【００８１】
室温で６時間この反応混合液を攪拌することで反応溶液は均質化した。次いで、この反応溶液を水９００ｍｌに投入して、得られた沈殿をろ取して室温で２４時間乾燥した。この粗精製物を、ジクロロメタンに再溶解して、ヘキサン中で再結晶化して、ＤＭＴ−デオキシオキサノシンの白色粉末を得た（０．２２ｍｍｏｌ、収率６９％）。【００８２】
ＤＭＴ−ｄＯｘｏのＮＭＲデータ：
1H NMR (600MHz, DMSO-d6 at 30oC): δ = 7.88 (br, 2H, NH2), 7.80 (s, 1H, H-2), 7.31-6.74 (m, 13H, Ar-H), 6.04 (dd, 1H, H-1'), 5.26 (s, 1H, 3'-OH), 4.39 (m, 1H, H-3'), 3.85 (m, 1H, H-4'), 3.75 (s, 6H, Ar-OCH3), 3.06 (m, 2H, H-5',5"), 2.54 (ddd, 1H, H-2'), 2.22 (ddd, 1H, H-2"); (MS(FAB) m/z 571 (M+H+)
【実施例３】
【００８３】
（5’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシオキサノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル ホスホアミダイト（ＤＭＴ−ｄＯｘｏ−アミダイト）の合成）
０．３５ｍｍｏｌＤＭＴ−デオキシオキサノシンを３ｍｌの０．３４ｍｍｏｌテトラゾール含有の無水アセトニトリルに溶解して、その後、０．５２５ｍｍｏｌの２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ジイソプロピルホスホアミドをこの溶液に添加した。この均一な混合物を、室温で４時間攪拌し、最終的に１ｍｌのメタノールを加えた後、０．１５ｍｌのジイソプロピルエチルアミンと３ｍｌの酢酸エチルを加えて反応を終了させ、その後、３ｍｌの１０％ＮＡＨＣＯ3で３回洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した後、粘調なオイルに濃縮した。この粗精製物を、ジクロロメタン２ｍｌに再溶解して、分取用順相ＨＰＬＣに導入した。移動相は、酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝６５：３５：０．３３のアイソクラティックとし、流量は６ｍｌ／分とした。目的化合物のフラクションを減圧下で留去して、ＤＭＴ−ｄＯｘｏ−アミダイトの白色粉末を得た（０．２９ｍｍｏｌ、収率７２．５％）。【００８４】
ＮＭＲデータ：
1H NMR (600MHz, DMSO-d6 at 30oC): δ = 7.88 (br, 2H, NH2), 7.80 (s, 1H, H-2), 7.31-6.74 (m, 13H, Ar-H), 6.04 (dd, 1H, H-1'), 5.26 (s, 1H, 3'-OH), 4.39 (m, 1H, H-3'), 3.85 (m, 1H, H-4'), 3.75 (s, 6H, Ar-OCH3), 3.06 (m, 2H, H-5',5"), 2.54 (ddd, 1H, H-2'), 2.22 (ddd, 1H, H-2"); (MS(FAB) m/z 571 (M+H+)
【実施例４】
【００８５】
（デオキシオキサノシン修飾オリゴＤＮＡプローブの合成及び精製）
オリゴデオキシヌクレオチドプローブの合成は、ホスホアミダイト法によってＣＰＧ支持体（０．２又は１μｍｏｌスケール）に結合された５’−ＤＭＴ−ＤＮＡ塩基から開始した。調製したプローブのハイブリダイゼーション用配列を以下に示す。ＤＭＴ−ｄＯｘｏ−アミダイトは、以下の配列を合成後の最終ステップにおいて５’末端に導入された。
デオキシオキサノシン修飾オリゴＤＮＡプローブ１：５’−agagaaaaccccttcaccaaagcgt−３’（配列番号：１）
デオキシオキサノシン修飾オリゴＤＮＡプローブ２：５’−aagaagctgaacgcttagtgaggcg−３’（配列番号２）
デオキシオキサノシン修飾オリゴＤＮＡプローブ３：５’−gcaggcagataaatcagagtggggg−３’（配列番号３）【００８６】
デオキシヌクレオシドホスホアミダイトの結合には、ＤＮＡシンセサイザー（ＡＢＩ）の通常のプロトコールを使用した。５’末端側のジメトキシトリチル基は、合成装置によっては取り除かれなかった。ＣＰＧ支持体からオリゴマーを分離し、３７℃、２４時間、０．５ＭのＮａＯＨで処理して保護基を外した。本実施例の化学合成においては、ステップ毎において９５％以上のカップリング率であった。【００８７】
２ＭのＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）による中和後、ｐｏｌｙ−Ｐａｋカートリッジ（グレンリサーチカンパニー）で脱塩し、さらに、逆相ＨＰＬＣで精製した。移動相は、５％（０分）−５％（５分）−３０％（２５分）―４０％（３０分）―５％（３７分）アセトニトリル含有１００ｍＭ ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）でグラディエントをかけた。流量は、２ｍｌ／分とした。【００８８】
精製物を、室温で３０分間、８０％酢酸で処理した後、減圧乾燥して、ジエチルエーテルで抽出した。得られた水相を、先と同じグラディエント条件（ただし、流量は１ｍｌ／分）による逆相ＨＰＬＣに供し、最終的な同定を行った。さらに、精製したオリゴＤＮＡを、１００μｌの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．９、０．５ｍＭ塩化亜鉛含有）中でヌクレアーゼＰ１とアルカリホスファターゼで処理した。反応処理液を、直接逆相ＨＰＬＣシステムに導入して、移動相を（０％（０分）−１５％（１５分）アセトニトリル含有１００ｍＭＴＥＡＡとしたリニアグラディエントで溶出させた。流量は１ｍｌ／分とした。得られたクロマトグラムから消化後のヌクレオチドを分析し、合成したオリゴＤＮＡにデオキシオキサノシンが導入されていることを確認した。
【実施例５】
【００８９】
（アミノ基含有ガラス基板の調製）
スライドガラス（２５．４ｍｍ×７６．２ｍｍ×１ｍｍ）をアセトンで洗浄し、ｐｉｒａｎｈａ溶液（濃硫酸／３０％Ｈ2Ｏ2、体積比で７／３）の超音波浴で３０分間処理した。その後、多量の水で洗浄して、１時間減圧吸引しながらデシケータ中で乾燥した。【００９０】
洗浄した基板を、メタノール、メタノールとトルエンとの混液（１：１）及びトルエンにてそれぞれ１０分間洗浄し、各種の２％シラン化合物（３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシシラン、２−（２−アミノエチルチオエチル）トリエトキシシラン、３−アミノプロピルジメチルエトキシシラン）に５時間浸漬し、２５℃で５時間、回転攪拌器（７０ｒｐｍ）で攪拌した。【００９１】
シラン化後、スライドガラスを、トルエン、メタノールとトルエンとの混液（１：１）及びメタノールにてそれぞれ１０分間洗浄し、１１０℃の熱風オーブン中で１時間乾燥した。室温まで冷却後、スライドガラスを、トルエン、メタノールとトルエンとの混液（１：１）及びメタノールにてそれぞれ１０分間洗浄し、減圧吸引したデシケータ中で乾燥した。その後、さらに、この修飾ガラスは、２％シラン化合物溶液に８時間浸漬して２５℃で８時間振とうし、その後熱風乾燥し、同様にして洗浄（ただし、最後はメタノール）して、送風乾燥して、減圧デシケータに保存した。
【実施例６】
【００９２】
（デオキシオキサノシン修飾オリゴＤＮＡプローブの基板への固定化）
担体としての基板（以下、実施例基板という。）には、実施例５で調製したアミノ基修飾スライドガラスのうち、３−アミノプロピルトリエトキシシランで修飾したものを用いた。また、比較例用の基板１としては、アルデヒド修飾スライドガラス（ＴｅｌｅＣｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．社製、アミノ基修飾オリゴＤＮＡ用、以下、比較例基板１という。）を用い、同基板２としては、エポキシ修飾スライドガラス（MWG社製、アミノ基修飾オリゴＤＮＡ用、以下、比較例基板２という。）を用いた。いずれのオリゴＤＮＡも化学合成により取得し、その５’末端にアミノ基が導入された。【００９３】
オキサノシン修飾オリゴＤＮＡとしては、実施例４で合成した３種類のオリゴＤＮＡを用いた。また、比較例基板１及び比較例基板２のそれぞれに用いるアミノ基修飾オリゴＤＮＡは、配列番号１〜３のそれぞれに記載のハイブリダイゼーション配列の５’末端にアミノ基を導入したものを調製した。【００９４】
次に、実施例、比較例１及び比較例２の各オリゴＤＮＡをＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．６）に溶解し、オリゴＤＮＡ濃度５０ｐｍｏｌ／μｌの溶液を調製し、これをプローブ溶液として、ＧＥＮＥＳＨＯＴ（登録商標）スポッターを用いて、それぞれ実施例基板、比較例基板１及び比較例基板２に１スポット当たり約２００ｐＬスポットした。【００９５】
こうして調製した３種類の基板のそれぞれについて以下の操作を行った。
（実施例基板）
オキサノシン修飾オリゴＤＮＡ溶液をスポッティング後、８０℃で１時間ベークし、スライドガラスラックに基板を入れて、無水コハク酸溶液（２．５ｇ無水コハク酸を１６０ｍｌ １−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｎｅに溶解し、０．２Ｍほう酸ナトリウム水溶液 (ｐＨ8.0)を１７．５ｍｌ加えて調製した。）に２０分間浸漬した。その後、滅菌水にスライドラックごと漬け１０回静かに揺動洗浄し、さらに新しい滅菌水にスライドラックごと漬け１０回静かに揺動洗浄した。次いで、沸騰滅菌水中に３分間浸漬した後、余分な水分を吸い取り、素早く冷エタノールに１分間浸漬し、脱水したうえ、余分なエタノールを吸い取り室温で乾燥した。【００９６】
（比較例基板１）
アミノ修飾オリゴＤＮＡ溶液をスポッティング後、８０℃、１時間ベークした後、スライドガラスラックに基板を入れて、ＮaＢＨ4溶液（エタノール４０ｍｌとＰＢＳ１３５ｍｌに１．５gのＮaＢＨ4を溶解し、調製した。）に５分間浸漬した。その後、滅菌水にスライドラックごと漬け１０回静かに揺動洗浄し、さらに新しい滅菌水にスライドラックごと漬け１０回静かに揺動洗浄した。次いで、沸騰滅菌水中に３分間浸漬した後、余分な水分を吸い取り、素早く冷エタノールに１分間浸漬し、脱水したうえ、余分なエタノールを吸い取り室温で乾燥した。【００９７】
（比較例基板２）
アミノ修飾オリゴＤＮＡ溶液をスポッティング後、相対湿度４５％、４２℃で一晩インキュベートした。その後、スライドガラスラックに基板を入れて、０．２％ＳＤＳ水溶液で室温にて２分間振とう洗浄し、さらに滅菌水で室温にて１分間振とう洗浄し、さらに新しい滅菌水で室温にて１分間振とう洗浄した。その後、５０℃の滅菌水中に２０分間浸漬。遠心し乾燥した。【００９８】
（ハイブリダイゼーションサンプルの調製）
オリゴＤＮＡの配列番号１〜３のハイブリダイゼーション配列に対してそれぞれ相補的な配列（配列番号４〜６）を持つとともに、５’末端をＣｙ３で標識したオリゴＤＮＡを滅菌水に溶解して使用した。試料液の終濃度は１００ｎＭとした。
相補鎖オリゴＤＮＡ１：５’−acgctttggtgaaggggttttctct−３’（配列番号４）
相補鎖オリゴＤＮＡ２：５’−cgcctcactaagcgttcagcttctt−３’（配列番号５）
相補鎖オリゴＤＮＡ３：５’−cccccactctgatttatctgcctgc−３’（配列番号６）【００９９】
（ハイブリダイゼーション）
濃度調製したハイブリダイゼーションサンプルに２０×ＳＳＣ、１０％ ＳＤＳを加え、終濃度５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳになるように調製した。このサンプルのそれぞれ２５μｌを基板上に滴下し、その上から静かにカバーガラスをかけ、相対湿度１００％、４２℃で一晩インキュベートした。その後、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ溶液で室温にて５分振とうし、１×ＳＳＣ溶液で室温にて５分振とうし、さらに０．１×ＳＳＣ溶液で室温にて５分振とうした後、１０００ｒｐｍで３分間遠心し乾燥した。【０１００】
（測定及び蛍光シグナル数値化）
ＳｃａｎＡｒｒａｙ４０００（商標）（Ｐａｃｋａｒｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社製）にて、レーザーパワー、ＰＭＴ（フォトマル）を適宜調節し測定した。ＧｅｎｅＰｉｘＰｒｏ（商標）（Ａｘｏｎ社製）を用いて、各スポットの蛍光シグナルを数値化した。【０１０１】
実施例、比較例１及び比較例２について同時に調製したそれぞれ他のオリゴＤＮＡ固定化基板を室温にてデシケータ中に保存し、１ヶ月毎に各基板を取り出して、ハイブリダイゼーションを行い、蛍光シグナルを測定し数値化した。これらの結果を図９に示す。【０１０２】
図３に示すように、実施例の基板にあっては、調製直後の蛍光シグナル強度が高いとともに、その後において蛍光シグナル強度の低下はほとんど観察されなかった。これに対し、比較例基板１及び２においては、当初の蛍光シグナル強度も低く、しかも、保存期間の経過に伴ってシグナル強度も低下した。したがって、本発明のオリゴＤＮＡプローブを固定化した基板によれば、固定化にも優れるとともに、高いハイブリダイゼーション効率でのハイブリダイズが可能であるほか、保存してもそのような能力が安定して維持されることがわかった。
【実施例７】
【０１０３】
（デオキシオキサノシンの合成）
デオキシグアノシン（４ｍｍｏｌ）を亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ2；１００ｍＭ）存在下で４００ｍｌの酢酸ナトリウム緩衝液（３．０Ｍ，ｐＨ３．７）中４５℃で４時間反応させた。反応溶液を水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ；５Ｍ）を用いて中和した後ロータリーエバポレーターにより溶液量を半分まで濃縮した。溶液はＭｉｌｌｅｘ ＧＳ（０．２２μｍ；  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，ＭＡ））を用いてろ過した後ＲＰ−ＨＰＬＣ（アイソクラティック、リン酸ナトリウム緩衝液（４００μＭ，ｐＨ７．４）アセトニトリル（ＣＨ3ＣＮ）１０％（ｖ／ｖ）；流速６ｍｌ／ｍｉｎ）によって精製した。これを凍結乾燥したところ白色の固体としてデオキシオキサノシン（０．６ｍｍｏｌ，１５％収率）を得た。得られたデオキシオキサノシンを、ＮＭＲ、ＵＶ及びＭＳで確認したところ、実施例１と同様の同定ピーク等が得られた。
【実施例８】
【０１０４】
（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシオキサノシン（ＤＭＴ−ｄＯｘｏ）の合成）
４，４’−ジメトキシトリチルクロライド (ＤＭＴ−Ｃｌ，０．６〜０．８ｍｍｏｌ）  を脱水したＤＭＦ（３ｍｌ）にけん濁させたデオキシオキサノシン（０．４ｍｍｏｌ）中へ加えた後、イミダゾール（０．８ｍｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアンモニウムメシレート（ＤＩＥＡ−ＭＥＳ，０．８ｍｍｏｌ）を反応溶液中へ加えた。ＤＩＥＡ−ＭｅｓはＫａｔａｏｋａとＨａｙａｋａｗａらによってされた報告に従って用意した（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．， ６４，６０８７−６０８９）。反応溶液は室温下で３時間攪拌したところ均一溶液となった。反応終了後、反応溶液に対して９００ｍｌのＨ2Ｏを加え、析出した沈殿を吸引ろ過によって集め、これを室温下で２４時間乾燥させた後ジクロロメタン（ＣＨ2Ｃｌ2）に溶解させ硫酸ナトリウム（Ｎａ2ＳＯ4）を用いて乾燥させた。これを濃縮してヘキサン中で再結晶させたところ白色の固体としてＤＭＴ−ｄＯｘｏを得た。得られたデオキシオキサノシンを、ＮＭＲ、ＵＶ及びＭＳで確認したところ、実施例２と同様の同定ピーク等が得られた。
【実施例９】
【０１０５】
（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシオキサノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホアミダイト（ＤＭＴ−ｄＯｘｏ−アミダイト）の合成）
無水ジクロロメタン（３ｍｌ）中へＤＭＴ−ｄＯｘｏ（０．３５ｍｍｏｌ）とテトラゾール（０．３５ｍｍｏｌ）を加え、さらに２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ジイソプロピルホスホアミダイト（０．５２５ｍｍｏｌ）を加えた。この反応溶液を室温下で３時間攪拌させつつ反応させた。反応終了後、反応溶液にメタノール（ＭｅＯＨ；１ｍｌ）を加えてクエンチし、さらにジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ；０．１５ｍｌ）と酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ；３ｍｌ）を加えた後１０％の炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ3；３ｍｌ）で３回洗浄した。有機層をＮａ2ＳＯ4を用いて乾燥した後濃縮したところ粘性のオイル状物質を得た。これをＣＨ2Ｃｌ2（２ｍｌ）中に溶解させ、ＮＰ−ＨＰＬＣ（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ  ｅｌｕｔｉｏｎ，ＥｔＯＡｃ：ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ＝６５：３５：０．３３（ｖ／ｖ／ｖ）；ｆｌｏｗｒａｔｅ，６ｍｌ／ｍｉｎ）により単離した溶液を留去したところ白色の固体としてＤＭＴ−ｄＯｘｏ−ａアミダイト（０．２９ｍｍｏｌ，７２．５％収率）を得た。得られたＤＭＴ−ｄＯｘｏ−ａアミダイトを、ＮＭＲ、ＵＶ及びＭＳで確認したところ、実施例３と同様の同定ピーク等が得られた。
【実施例１０】
【０１０６】
（デオキシオキサノシン修飾オリゴＤＮＡプローブの合成）
オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）は５’−ＤＭＴ−ＤＮＡ ｂａｓｅあるいは６’−蛍光色素結合ＣＰＧ支持体（０．２ｏｒ１μｍｏｌｓｃａｌｅＣＰＧ）からホスホロアミダイト法により合成した。デオキシヌクレオシドのホスホアミダイトのカップリング反応はＤＮＡ合成機（ＡＢＩ ３４００ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）の標準的な手順で行った。なお、合成した実施例及び参考例のオリゴヌクレオチドプローブの配列は表１とした。表１に示すように、実施例プローブは、デオキシオキサノシンを挟んだ両側にそれぞれ異なるターゲットＤＮＡにハイブリダイズするハイブリダイゼーション配列を備え、参考例プローブは、実施例プローブの一方のハイブリダイゼーション配列と同一のハイブリダイゼーション配列を備えている。サンプルオリゴヌクレオチド１は、実施例プローブ及び参考例プローブの双方に備えられるハイブリダイゼーション配列の相補鎖をターゲット配列として備えており、サンプルオリゴヌクレオチド２は、実施例プローブ１の５’側のハイブリダイゼーション配列の相補鎖をターゲット配列として備えている。また、プローブ合成において、デオキシオキサノシンとハイブリダイゼーション配列との間のスペーサーとしては図１０に示したＳｐａｃｅｒ Ｃ１２ＣＥホスホロアミダイトを用いた。５’末端のＤＭＴは合成機を使用しても脱離しなかった。なお、ハイブリダイゼーションサンプルも表１に示すように合成した。なお、それぞれのハイブリダイゼーションサンプルの５’末端はＣｙ３又はＣｙ５で標識した。実施例プローブの２つのハイブリダイゼーション配列及び参考例プローブのハイブリダイゼーション配列並びにサンプルオリゴヌクレオチド１及び２の配列は、それぞれ配列番号７〜１１に示した。【０１０７】
表１
2006095831.tif 000007
【実施例１１】
【０１０８】
（デオキシシオキサノシン修飾オリゴヌクレオチドＤＮＡプローブの精製）
合成したＤＭＴ付きオリゴヌクレオチドは３７℃のＮａＯＨ（０．５Ｍ）溶液で２４時間処理することでＣＰＧ担体から離すと同時に脱保護した。酢酸トリエチルエチル緩衝液（ＴＥＡＡ；２Ｍ，ｐＨ７．０）で処理した後、Ｐｏｌｙ−Ｐａｋカートリッジ（グレンリサーチＣｏ．（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ））を用いてＤＭＴ除去オリゴヌクレオチドを精製した。脱トリチル化オリゴヌクレオチドは、さらにＲＰ−ＨＰＬＣ（グラジエント条件：溶離液Ａ（５％ＣＨ3ＣＮ ｉｎ １００ｍＭ ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０））及び溶離液Ｂ（３０％ＣＨ3ＣＮ ｉｎ １００ｍＭ ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０））を用い、溶離液Ｂを１０％（０ｍｉｎ）−８０％（４０ｍｉｎ）（流速：２ｍｌ／ｍｉｎ））により精製した。得たオリゴヌクレオチドは上述したグラジエント条件（ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：１ｍｌ／ｍｉｎ）を用いてＲＰ−ＨＰＬＣにより再度精製度を確認した。
【実施例１２】
【０１０９】
（デオキシオキサノシン修飾オリゴＤＮＡの基板への固定化）
基板として、実施例５で調製したアミノ基修飾スライドガラスのうち、３−アミノプロピルトリエトキシシランで修飾したものを用いた。実施例１１で精製された６−Ｆｌｕｏｒｅｓｅｉｎで３’末端が修飾されたオリゴヌクレオチドプローブをＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．６）に溶解し、オリゴＤＮＡ濃度５０ｐｍｏｌ／μｌの溶液を調製し、これをプローブ溶液として、ＧＥＮＥＳＨＯＴ（登録商標）スポッターを用いて、基板に１スポット当たり約２００ｐＬスポットした。【０１１０】
デオキシオキサノシン修飾オリゴＤＮＡ溶液をスポッティング後、相対湿度４５％、４２℃で一晩インキュベートし、その後、スライドガラスラックに基板を入れて、無水コハク酸溶液（２．５ｇ無水コハク酸を１６０ｍｌの１−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｎｅに溶解し、０．２Ｍほう酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．０）を１７．５ｍｌ加えて調製した。）に２０分間浸漬した。その後、滅菌水にスライドラックごと漬け１０回静かに揺動洗浄し、さらに新しい滅菌水にスライドラックごと漬け１０回静かに揺動洗浄した。次いで、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ水溶液で室温にて１５分間振とう洗浄し、その後、沸騰させた２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ水溶液中に５分間浸漬した。この後、滅菌水にスライドラックごと漬け１０回静かに揺動洗浄することを３回繰り返し、１０００ｒｐｍ３分間で遠心乾燥した。【０１１１】
得られた基板のフルオレセインの蛍光シグナルはａｒｒａｙＷｏＲｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，ＩＮＣ．）を使用して検出したところ（励起フィルターは４７５ｎｍ±２０ｎｍ（ＸＦ１０７３／２５、ＯＭＥＧＡ ＯＰＴＩＣＡＬ，ＩＮＣ．製）、検出フィルターは５２５±２２．５ｎｍ（ＸＦ１０７４／２５、ＯＭＥＧＡ ＯＰＴＩＣＡＬ，ＩＮＣ．製）を使用）、各種プローブオリゴヌクレオチドスポットにつきほぼ等しい蛍光シグナル強度検出することができた。このことから、実施例１１で取得した各種のプローブはアミノ基修飾ガラス基板に対して固定化されることが確認できた。図１１に、実施例プローブの固定化を確認したときの蛍光シグナル測定結果を示す。
【実施例１３】
【０１１２】
（ハイブリダイゼーションアッセイ：一つのプローブに対する２つのターゲット核酸のハイブリダイゼーション）
次に、ｄＯＸＯ−プローブ１と対照プローブ１とを固定化した基板に、ｄＯＸＯ−プローブ１の２種類のハイブリダイゼーション配列に対する相補鎖であるサンプルオリゴヌクレオチド１及び２の混液を供給してハイブリダイゼーションを行った。混液は、サンプルオリゴヌクレオチド１及び２をそれぞれ滅菌水にて１０ｎＭとなるように混合した溶液に２０×ＳＳＣ、１０％ ＳＤＳを加え、終濃度５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳになるように調製した。基板上にこの混液２５μｌを滴下し、その上から静かにカバーガラスをかけた。相対湿度１００％、４２℃で一晩インキュベートしてハイブリダイズさせた。その後、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ溶液で室温にて５分振とうし、その後、１×ＳＳＣ溶液で室温にて５分振とうし、さらに、０．１×ＳＳＣ溶液で室温にて５分振とうし、１０００ｒｐｍで３分間遠心乾燥した。【０１１３】
Ｃｙ３及びＣｙ５の蛍光シグナルはDNA Microarray Scanner（G2505A、Agilent  Technologies製）を使用し、各スポットの蛍光シグナルはGenePixｘRPro（Axon Instrument製）にて数値化した。これらの基板におけるハイブリダイゼーションの概念図と結果を図１２に示す。【０１１４】
図１２に示すように、デオキシオキサノシンをプローブの中央に導入したｄＯＸＯ−プローブのスポットにおいては、Ｃｙ５で標識したサンプルオリゴヌクレオチド及びＣｙ３で標識したサンプルオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによる蛍光シグナルが観察された。これに対して、末端にｄＯＸＯを導入した対照プローブ１のスポットにおいては、Ｃｙ５で標識したサンプルオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによる蛍光シグナルしか観察されなかった。このことから、ｄｏｘｏ−プローブ１では、ｄＯｘｏをはさんで両側のプローブが機能していることが確認された。以上のことから、例えば、ｄＯｘｏをプローブの中央に導入したＤＮＡプローブを用いることにより、一つのプローブにおける一方のハイブリダイゼーション配列の相補鎖を有する核酸をターゲット核酸（測定対象）とし、もう一方のハイブリダイゼーション配列の相補鎖を有する核酸を内部標準核酸として、予めターゲット核酸の標準曲線などを作製しておくことにより、従来に比してより定量性に優れるハイブリダイゼーションアッセイが可能となることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明は、核酸のハイブリダイズに関わる技術分野に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【０１１６】
配列番号１〜３：オリゴヌクレオチドプローブ
配列番号４〜６：ターゲットサンプル
配列番号７：実施例オリゴヌクレオチドプローブの５’側のハイブリダイゼーション配列
配列番号８：実施例オリゴヌクレオチドプローブの３’側のハイブリダイゼーション配列
配列番号９：参考例オリゴヌクレオチドプローブ
配列番号１０、１１：サンプルオリゴヌクレオチド
【図１】
2006095831.tif 000010
【図２】
2006095831.tif 000011
【図３】
2006095831.tif 000012
【図４】
2006095831.tif 000013
【図５】
2006095831.tif 000014
【図６】
2006095831.tif 000015
【図７】
2006095831.tif 000016
【図８】
2006095831.tif 000017
【図９】
2006095831.tif 000018
【図１０】
2006095831.tif 000019
【図１１】
2006095831.tif 000020
【図１２】
2006095831.tif 000021
【配列表】
2006095831000001.app
【国際調査報告】
2006095831.tif 000022
2006095831.tif 000023
2006095831.tif 000024
2006095831.tif 000025