(57)【要約】  本発明の主な目的は、アミノ酸又はオリゴペプチドを有する側鎖が主鎖に結合した構造の化合物を提供することである。  以下の一般式(1)で示される化合物を提供する。 [化１]2006115230.tif 000097［式(1)中、n1〜n3、及びm1〜m6は所定の整数を示し；Yは、水酸基又はアミノ基を示し；Eは、Ｎ又はＣＨを示し；Rは、アミノ酸残基、又は２〜１００個のアミノ酸残基からなるペプチド残基を示し；Lは、水素原子、脂質基を有する基、脂肪酸残基を有する基、又は蛍光性基を有する基を示す。］【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式(1)で示される化合物：
【化１】
2006115230.tif 000079
［式(1)中、n1は０〜１０の整数、n2は１〜５０の整数、及びn3は１〜１０の整数を示し；
m1は０〜１００の整数、m2は０〜１００の整数、m3は０〜１００の整数、m4は０又は１の整数、m5は０〜１００の整数、及びm6は０〜１００の整数を示し；
Yは、水酸基又はアミノ基を示し；
Eは、Ｎ又はＣＨを示し；
Rは、アミノ酸残基、又は２〜１００個のアミノ酸残基からなるペプチド残基を示し；
Lは、水素原子、脂質基を有する基、脂肪酸残基を有する基、又は蛍光性基を有する基を示し；
n1が２以上である場合、繰返単位Aにおけるm1は、それぞれの繰返単位A同士で、同一又は異なっていてもよく；
n2が２以上である場合、繰返単位B中におけるm2〜m5及びRは、それぞれの繰返単位B同士で、同一又は異なっていてもよく；
n3が２以上である場合、繰返単位Cにおけるm6は、それぞれの繰返単位C同士で、同一又は異なっていてもよい。］
【請求項２】
式(1)中、Lがリン脂質基を有する基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
式(1)中、Rが、アルギニン残基、リジン残基、及びセリン残基よりなる群から選択されるアミノ酸残基、或いはこれらのアミノ酸残基の少なくとも１種を含むペプチド残基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
式(1)中、Rが、アルギニン残基、リジン残基、及びセリン残基よりなる群から選択される１種又は２種以上のアミノ酸残基から構成される、アミノ酸残基の総数が２〜２０個のペプチド残基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
式(1)中、Rが、２〜５個のアルギニン残基から構成されるペプチド残基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
式(1)中、n1は０〜２の整数、n2は１〜１０の整数、n3は０〜２の整数である、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
式(1)中、EがＮであり、m2が２であり、m3及びm4が１であり、m5が５である、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
式(1)中、EがＣＨであり、m2、m3及びm4が０であり、m5が４である、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
下記一般式(1a)で示される化合物：
【化２】
2006115230.tif 000080
［n1〜n3、m1〜m6、E及びRは前記と同じであり、
Yは水酸基を示し；
Xは、保護基を示し；
Zは、保護基Xとは異なる保護基Za、又は保護基Xと同一の保護基Zbを示し；
RZとは、前記Rのアミノ酸残基又はペプチド残基の官能基に保護基Zが結合していることを示し；
n1が２以上である場合、繰返単位Aにおけるm1は、それぞれの繰返単位A同士で、同一又は異なっていてもよく；
n2が２以上である場合、繰返単位B中におけるm2〜m5及びRZは、それぞれの繰返単位B同士で、同一又は異なっていてもよく；
n3が２以上である場合、繰返単位Cにおけるm6は、それぞれの繰返単位C同士で、同一又は異なっていてもよい。］
【請求項１０】
式(1a)中、Xが、ターシャリーブトキシカルボニル基、又は９−フルオレニルメトキシカルボニル基である、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
式(1a)中、Rが、アルギニン残基、リジン残基、及びセリン残基よりなる群から選択されるアミノ酸残基、或いはこれらのアミノ酸残基の少なくとも１種を含み、アミノ酸残基の総数が２〜２０個のペプチド残基である、請求項９に記載の化合物。
【請求項１２】
式(1a)中、Rが、アルギニン残基、リジン残基、及びセリン残基よりなる群から選択される１種又は２種以上のアミノ酸残基から構成される、アミノ酸残基の総数が２〜２０個のペプチド残基、請求項９に記載の化合物。
【請求項１３】
式(1a)中、２〜５個のアルギニン残基から構成されるペプチド残基である、請求項９に記載の化合物。
【請求項１４】
式(1a)中、n1は０〜２の整数、n2は１〜１０の整数、n3は０〜２の整数である、請求項９に記載の化合物。
【請求項１５】
式(1a)中、EがＮであり、m2が２であり、m3及びm4が１であり、m5が５である、請求項９に記載の化合物。
【請求項１６】
式(1a)中、EがＣＨであり、m2、m3及びm4が０であり、m5が４である、請求項９に記載の化合物。
【請求項１７】
請求項９に記載の化合物と、アミノ基又は水酸基を有する化合物との縮合反応によって合成される、複合化合物。
【請求項１８】
アミノ基又は水酸基を有する化合物が、PNAモノマー又はPNAオリゴマーである、請求項１７に記載の複合化合物。
【請求項１９】
以下の第1-1工程〜第1-5工程を含む、下記一般式(1)で示される化合物の製造方法：
【化３】
2006115230.tif 000081
［式(1)中、n1は０〜１０の整数、n2は１〜５０の整数、及びn3は１〜１０の整数を示し；
m1は０〜１００の整数、m2は０〜１００の整数、m3は０〜１００の整数、m4は０又は１の整数、m5は０〜１００の整数、及びm6は０〜１００の整数を示し；
Yは、水酸基又はアミノ基を示し；
Eは、Ｎ又はＣＨを示し；
Rは、アミノ酸残基、又は２〜１００個のアミノ酸残基からなるペプチド残基を示し；
Lは、水素原子、脂質を有する基、脂肪酸残基を有する基、又は蛍光性基を有する基を示し；
n1が２以上である場合、繰返単位Aにおけるm1は、それぞれの繰返単位A同士で、同一又は異なっていてもよく；
n2が２以上である場合、繰返単位B中におけるm2〜m5及びRは、それぞれの繰返単位B同士で、同一又は異なっていてもよく；
n3が２以上である場合、繰返単位Cにおけるm6は、それぞれの繰返単位C同士で、同一又は異なっていてもよい。］
第1-1工程：下記一般式(I)で示される化合物
【化４】
2006115230.tif 000082
［式(I)中、m6は前記と同じ。］
を、固相樹脂又は固相化合物に縮合させた後、固相樹脂又は固相化合物に縮合した化合物の保護基Xの脱離、及び一般式(I)で示される化合物の縮合重合を、n3 −１回実施することにより、下記一般式(i)で示される化合物
【化５】
2006115230.tif 000083
［式(i)中、n3、m6及びXは前記と同じ。Solid Phaseは、固相樹脂又は固相化合物を示す。］
を得る工程、
第1-2工程：一般式(i)で示される化合物に対して、下記一般式(II)で示される化合物
【化６】
2006115230.tif 000084
［式(II)中、m2〜m5、及びXは前記と同じであり、ZaはXとは異なる保護基を示す。］
の縮合反応をn2回実施することにより、下記一般式(ii)で示される化合物
【化７】
2006115230.tif 000085
［式(ii)中、n2、n3、m2〜m6、X、Za及びSolid Phaseは前記と同じ。］
を得る工程、
第1-3工程：  般式(ii)で示される化合物に対して、下記一般式(III)で示される化合物
【化８】
2006115230.tif 000086
［式(III)中、m1及びXは前記と同じ。］
の縮合反応をn1回実施することにより、下記一般式(iii)で示される化合物
【化９】
2006115230.tif 000087
［式(iii)中、n1〜n3、m1〜m6、X、Za及びSolid Phaseは前記と同じ。］
を得る工程、
第1-4工程：  一般式(iii)で示される化合物に対して、α位の炭素原子に結合したカルボキシル基以外の官能基に保護基Zaを結合させたアミノ酸の縮合反応を１〜１００回実施することにより、下記一般式(iv)で示される化合物
【化１０】
2006115230.tif 000088
［式(iv)中、n1〜n3、m1〜m6、X、RZa及びSolid Phaseは前記と同じ。］
を得る工程、及び
第1-5工程：  一般式(iv)で示される化合物から、固相樹脂又は固相化合物を切り離して末端に−ＣＯＯＨ又は−ＣＯＮＨ２を形成させると共に、保護基Ｘ及びＺaを脱離させて、一般式(1)で示される化合物を得る工程。
【請求項２０】
以下の第3-1工程〜第3-5工程を含む、下記一般式(1a)で示される化合物の製造方法：
【化１１】
2006115230.tif 000089
［n1〜n3、m1〜m6、E、X及びRZは前記と同じであり；
Yは水酸基であり；
n1が２以上である場合、繰返単位Aにおけるm1は、それぞれの繰返単位A同士で、同一又は異なっていてもよく；
n2が２以上である場合、繰返単位B中におけるm2〜m5及びRZは、それぞれの繰返単位B同士で、同一又は異なっていてもよく；
n3が２以上である場合、繰返単位Cにおけるm6は、それぞれの繰返単位C同士で、同一又は異なっていてもよい。］
第3-1工程：下記一般式(I)で示される化合物
【化１２】
2006115230.tif 000090
［式(I)中、m6は前記と同じ。］
を、アミノ基を有する固相樹脂又は固相化合物に縮合重合させた後、固相樹脂又は固相化合物に縮合重合した化合物の保護基Xの脱離、及び一般式(I)で示される化合物の縮合重合をn3 −１回実施することにより、下記一般式(i)で示される化合物
【化１３】
2006115230.tif 000091
［式(i)中、n3、m6及びXは前記と同じ。Solid Phaseは、固相樹脂又は固相化合物を示す。］
を得る工程、
第3-2工程：一般式(i)で示される化合物に対して、下記一般式(II)で示される化合物
【化１４】
2006115230.tif 000092
［式(II)中、m2〜m5、X及びZaは前記と同じである。］
の縮合反応をn2回実施することにより、下記一般式(ii)で示される化合物
【化１５】
2006115230.tif 000093
［式(ii)中、n2、n3、m2〜m6、X、Za及びSolid Phaseは前記と同じ。］
を得る工程、
第3-3工程：一般式(ii)で示される化合物に対して、下記一般式(III)で示される化合物
【化１６】
2006115230.tif 000094
［式(III)中、m1及びXは前記と同じ。］
の縮合反応をn1回実施することにより、下記一般式(iii)で示される化合物
【化１７】
2006115230.tif 000095
［式(iii)中、n1〜n3、m1〜m6、X、Za及びSolid Phaseは前記と同じ。］
を得る工程、
第3-4工程：  一般式(iii)で示される化合物に対して、アミノ基に保護基Zを結合させたアミノ酸の縮合反応を１〜１００回実施することにより、下記一般式(iv)で示される化合物
【化１８】
2006115230.tif 000096
［式(iv)中、n1〜n3、m1〜m6、X、RZa及びSolid Phaseは前記と同じ。］
を得る工程、及び
第3-5工程：  一般式(iv)で示される化合物の保護基Zaを、必要に応じて保護基Zbに置換して、保護基X及びZを残した状態で、固相樹脂又は固相化合物を切り離し、末端に−ＣＯＯＨを形成させることにより、一般式(1a)で示される化合物を得る工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸残基又はペプチド残基を有し、該残基の機能性を有効に発現可能な化合物に関する。更に、本発明は、前記化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸又はオリゴペプチドには、その種類に応じた様々な有用作用が知られている。例えば、アルギニンやそのオリゴペプチドには、細胞膜を透過する作用があることが知られており、細胞内に目的物質を導入させるための試薬として有用であることが知られている。そして、アミノ酸又はオリゴペプチドを単独で使用するよりも、これらの複数個を結合させた化合物を使用する方が、所望の作用の増強、安全性の向上等の点で有利である場合があることも分かっている。【０００３】
しかしながら、アミノ酸又はオリゴペプチドを含む化合物について、アミノ酸又はオリゴペプチドを有する側鎖が主鎖に結合した構造のものは、これまで提唱されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、アミノ酸又はオリゴペプチドを有する側鎖が主鎖に結合した構造の化合物、保護基で保護されている前記化合物、及びそれらの製造方法を提供することを目的とす る。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下の一般式(1)及び(1a)に示す化合物、及びこれらの製造方法を提供する：
項１．  下記一般式(1)で示される化合物：【０００６】
【化１】
2006115230.tif 000002
【０００７】
［式(1)中、n1は０〜１０の整数、n2は１〜５０の整数、及びn3は１〜１０の整数を示し；
m1は０〜１００の整数、m2は０〜１００の整数、m3は０〜１００の整数、m4は０又は１の整数、m5は０〜１００の整数、及びm6は０〜１００の整数を示し；
Yは、水酸基又はアミノ基を示し；
Eは、Ｎ又はＣＨを示し；
Rは、アミノ酸残基、又は２〜１００個のアミノ酸残基からなるペプチド残基を示し；
Lは、水素原子、脂質基を有する基、脂肪酸残基を有する基、又は蛍光性基を有する基を示し；
n1が２以上である場合、繰返単位Aにおけるm1は、それぞれの繰返単位A同士で、同一又は異なっていてもよく；
n2が２以上である場合、繰返単位B中におけるm2〜m5及びRは、それぞれの繰返単位B同士で、同一又は異なっていてもよく；
n3が２以上である場合、繰返単位Cにおけるm6は、それぞれの繰返単位C同士で、同一又は異なっていてもよい。］
項２．  式(1)中、Lがリン脂質基を有する基である、項１に記載の化合物。
項３．  式(1)中、Rが、アルギニン残基、リジン残基、及びセリン残基よりなる群から選択されるアミノ酸残基、或いはこれらのアミノ酸残基の少なくとも１種を含むペプチド残基である、項１に記載の化合物。
項４．  式(1)中、Rが、アルギニン残基、リジン残基、及びセリン残基よりなる群から選択される１種又は２種以上のアミノ酸残基から構成される、アミノ酸残基の総数が２〜２０個のペプチド残基である、項１に記載の化合物。
項５．  式(1)中、Rが、２〜５個のアルギニン残基から構成されるペプチド残基である、項１に記載の化合物。
項６．  式(1)中、n1は０〜２の整数、n2は１〜１０の整数、n3は０〜２の整数である、項１に記載の化合物。
項７．  式(1)中、EがＮであり、m2が２であり、m3及びm4が１であり、m5が５である、項１に記載の化合物。
項８．  式(1)中、EがＣＨであり、m2、m3及びm4が０であり、m5が４である、項１に記載の化合物。
項９．  下記一般式(1a)で示される化合物：【０００８】
【化２】
2006115230.tif 000003
【０００９】
［n1〜n3、m1〜m6、E及びRは前記と同じであり、
Yは水酸基を示し；
Xは、保護基を示し；
Zは、保護基Xとは異なる保護基Za、又は保護基Xと同一の保護基Zbを示し；
RZとは、前記Rのアミノ酸残基又はペプチド残基の官能基に保護基Zが結合していることを示し；
n1が２以上である場合、繰返単位Aにおけるm1は、それぞれの繰返単位A同士で、同一又は異なっていてもよく；
n2が２以上である場合、繰返単位B中におけるm2〜m5及びRZは、それぞれの繰返単位B同士で、同一又は異なっていてもよく；
n3が２以上である場合、繰返単位Cにおけるm6は、それぞれの繰返単位C同士で、同一又は異なっていてもよい。］
項１０．  式(1a)中、Xが、ターシャリーブトキシカルボニル基、又は９−フルオレニルメトキシカルボニル基である、項９に記載の化合物。
項１１．  式(1a)中、Rが、アルギニン残基、リジン残基、及びセリン残基よりなる群から選択されるアミノ酸残基、或いはこれらのアミノ酸残基の少なくとも１種を含み、アミノ酸残基の総数が２〜２０個のペプチド残基である、項９に記載の化合物。
項１２．  式(1a)中、Rが、アルギニン残基、リジン残基、及びセリン残基よりなる群から選択される１種又は２種以上のアミノ酸残基から構成される、アミノ酸残基の総数が２〜２０個のペプチド残基、項９に記載の化合物。
項１３．  式(1a)中、２〜５個のアルギニン残基から構成されるペプチド残基である、項９に記載の化合物。
項１４．  式(1a)中、n1は０〜２の整数、n2は１〜１０の整数、n3は０〜２の整数である、項９に記載の化合物。
項１５．  式(1a)中、EがＮであり、m2が２であり、m3及びm4が１であり、m5が５である、項９に記載の化合物。
項１６．  式(1a)中、EがＣＨであり、m2、m3及びm4が０であり、m5が４である、項９に記載の化合物。
項１７．  項９に記載の化合物と、アミノ基又は水酸基を有する化合物との縮合反応によって合成される、複合化合物。
項１８．  アミノ基を有する化合物が、PNAモノマー又はPNAオリゴマーである、項１７に記載の複合化合物。
項１９．  以下の第1-1工程〜第1-5工程を含む、下記一般式(1)で示される化合物の製造方法：【００１０】
【化３】
2006115230.tif 000004
【００１１】
［式(1)中、n1は０〜１０の整数、n2は１〜５０の整数、及びn3は１〜１０の整数を示し；
m1は０〜１００の整数、m2は０〜１００の整数、m3は０〜１００の整数、m4は０又は１の整数、m5は０〜１００の整数、及びm6は０〜１００の整数を示し；
Yは、水酸基又はアミノ基を示し；
Eは、Ｎ又はＣＨを示し；
Rは、アミノ酸残基、又は２〜１００個のアミノ酸残基からなるペプチド残基を示し；
Lは、水素原子、脂質を有する基、脂肪酸残基を有する基、又は蛍光性基を有する基を示し；
n1が２以上である場合、繰返単位Aにおけるm1は、それぞれの繰返単位A同士で、同一又は異なっていてもよく；
n2が２以上である場合、繰返単位B中におけるm2〜m5及びRは、それぞれの繰返単位B同士で、同一又は異なっていてもよく；
n3が２以上である場合、繰返単位Cにおけるm6は、それぞれの繰返単位C同士で、同一又は異なっていてもよい。］
第1-1工程：下記一般式(I)で示される化合物【００１２】
【化４】
2006115230.tif 000005
【００１３】
［式(I)中、m6は前記と同じ。］
を、固相樹脂又は固相化合物に縮合させた後、固相樹脂又は固相化合物に縮合した化合物の保護基Xの脱離、及び一般式(I)で示される化合物の縮合重合を、n3 −１回実施することにより、下記一般式(i)で示される化合物【００１４】
【化５】
2006115230.tif 000006
【００１５】
［式(i)中、n3、m6及びXは前記と同じ。Solid Phaseは、固相樹脂又は固相化合物を示す。］
を得る工程、
第1-2工程：一般式(i)で示される化合物に対して、下記一般式(II)で示される化合物【００１６】
【化６】
2006115230.tif 000007
【００１７】
［式(II)中、m2〜m5、及びXは前記と同じであり、ZaはXとは異なる保護基を示す。］
の縮合反応をn2回実施することにより、下記一般式(ii)で示される化合物【００１８】
【化７】
2006115230.tif 000008
【００１９】
［式(ii)中、n2、n3、m2〜m6、X、Za及びSolid Phaseは前記と同じ。］
を得る工程、
第1-3工程：  般式(ii)で示される化合物に対して、下記一般式(III)で示される化合物【００２０】
【化８】
2006115230.tif 000009
【００２１】
［式(III)中、m1及びXは前記と同じ。］
の縮合反応をn1回実施することにより、下記一般式(iii)で示される化合物【００２２】
【化９】
2006115230.tif 000010
【００２３】
［式(iii)中、n1〜n3、m1〜m6、X、Za及びSolid Phaseは前記と同じ。］
を得る工程、
第1-4工程：  一般式(iii)で示される化合物に対して、α位の炭素原子に結合したカルボキシル基以外の官能基に保護基Zaを結合させたアミノ酸の縮合反応を１〜１００回実施することにより、下記一般式(iv)で示される化合物【００２４】
【化１０】
2006115230.tif 000011
【００２５】
［式(iv)中、n1〜n3、m1〜m6、X、RZa及びSolid Phaseは前記と同じ。］
を得る工程、及び
第1-5工程：  一般式(iv)で示される化合物から、固相樹脂又は固相化合物を切り離して末端に−ＣＯＯＨ又は−ＣＯＮＨ２を形成させると共に、保護基Ｘ及びＺaを脱離させて、一般式(1)で示される化合物を得る工程。
項２０．  以下の第3-1工程〜第3-5工程を含む、下記一般式(1a)で示される化合物の製造方法：【００２６】
【化１１】
2006115230.tif 000012
【００２７】
［n1〜n3、m1〜m6、E、X及びRZは前記と同じであり；
Yは水酸基であり；
n1が２以上である場合、繰返単位Aにおけるm1は、それぞれの繰返単位A同士で、同一又は異なっていてもよく；
n2が２以上である場合、繰返単位B中におけるm2〜m5及びRZは、それぞれの繰返単位B同士で、同一又は異なっていてもよく；
n3が２以上である場合、繰返単位Cにおけるm6は、それぞれの繰返単位C同士で、同一又は異なっていてもよい。］
第3-1工程：下記一般式(I)で示される化合物【００２８】
【化１２】
2006115230.tif 000013
【００２９】
［式(I)中、m6は前記と同じ。］
を、アミノ基を有する固相樹脂又は固相化合物に縮合重合させた後、固相樹脂又は固相化合物に縮合重合した化合物の保護基Xの脱離、及び一般式(I)で示される化合物の縮合重合をn3 −１回実施することにより、下記一般式(i)で示される化合物【００３０】
【化１３】
2006115230.tif 000014
【００３１】
［式(i)中、n3、m6及びXは前記と同じ。Solid Phaseは、固相樹脂又は固相化合物を示す。］
を得る工程、
第3-2工程：一般式(i)で示される化合物に対して、下記一般式(II)で示される化合物【００３２】
【化１４】
2006115230.tif 000015
【００３３】
［式(II)中、m2〜m5、X及びZaは前記と同じである。］
の縮合反応をn2回実施することにより、下記一般式(ii)で示される化合物【００３４】
【化１５】
2006115230.tif 000016
【００３５】
［式(ii)中、n2、n3、m2〜m6、X、Za及びSolid Phaseは前記と同じ。］
を得る工程、
第3-3工程：一般式(ii)で示される化合物に対して、下記一般式(III)で示される化合物【００３６】
【化１６】
2006115230.tif 000017
【００３７】
［式(III)中、m1及びXは前記と同じ。］
の縮合反応をn1回実施することにより、下記一般式(iii)で示される化合物【００３８】
【化１７】
2006115230.tif 000018
【００３９】
［式(iii)中、n1〜n3、m1〜m6、X、Za及びSolid Phaseは前記と同じ。］
を得る工程、
第3-4工程：  一般式(iii)で示される化合物に対して、アミノ基に保護基Zを結合させたアミノ酸の縮合反応を１〜１００回実施することにより、下記一般式(iv)で示される化合物【００４０】
【化１８】
2006115230.tif 000019
【００４１】
［式(iv)中、n1〜n3、m1〜m6、X、RZa及びSolid Phaseは前記と同じ。］
を得る工程、及び
第3-5工程：  一般式(iv)で示される化合物の保護基Zaを、必要に応じて保護基Zbに置換して、保護基X及びZを残した状態で、固相樹脂又は固相化合物を切り離し、末端に−ＣＯＯＨを形成させることにより、一般式(1a)で示される化合物を得る工程。【００４２】
以下、本明細書において、「膜透過性」とは、細胞膜を透過する特性のことをさす。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、参考試験例４における試験結果（ウェスタンブロット法により、bcl-2タンパク質発現の検出結果）を示す図である。図中、各レーンは、以下のものに対応する：レーン１：ネガティブコントロールレーン２：bcl-2対応siRNA（添加量45pmpl/well）の導入：XtremeGeneレーン３：bcl-2対応siRNA（添加量90pmpl/well）の導入：XtremeGeneレーン４：GFP対応siRNA（添加量42.5pmpl/well）の導入：参考例３の核酸導入用担体レーン５：bcl-2対応siRNA（添加量13.5pmpl/well）の導入：参考例３の核酸導入用担体レーン６：bcl-2対応siRNA（添加量45pmpl/well）の導入：参考例３の核酸導入用担体レーン７：bcl-2対応siRNA（添加量135pmpl/well）の導入：参考例３の核酸導入用担体レーン８：bcl-2対応siRNA（添加量225pmpl/well）の導入：参考例３の核酸導入用担体レーン９：bcl-2対応siRNA（添加量450pmpl/well）の導入：参考例３の核酸導入用担体
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
１．一般式(1)で示される化合物
アミノ酸又はオリゴペプチドを有する側鎖が主鎖に結合した構造の化合物として、以下の一般式(1)で示される化合物を提供する。【００４５】
【化１９】
2006115230.tif 000020
【００４６】
式(1)中、n1は、繰返単位Aの数を示し、０〜１０の整数、好ましくは０〜５の整数、更に好ましくは０〜２の整数を示す。【００４７】
繰返単位A中、m1は０〜１００の整数、好ましくは０〜３０の整数、更に好ましくは０〜１１の整数を示す。n1が２以上の整数、即ち繰返単位Aが２個以上ある場合、それぞれの繰返単位A同士で、m1は同一であってもよいし、異なっていてもよい。【００４８】
また、式(1)中、n2は、繰返単位Bの数を示し、１〜５０の整数、好ましくは１〜２０の整数、更に好ましくは１〜１０の整数を示す。【００４９】
繰返単位B中、m2は０〜１００の整数、好ましくは０〜２０の整数、更に好ましくは０〜２の整数を示す。m3は０〜１００の整数、好ましくは０〜２０の整数、更に好ましくは０〜２の整数を示す。m4は０又は１の整数を示す。m5は０〜１００の整数、好ましくは０〜３０の整数、更に好ましくは０〜１１の整数を示す。【００５０】
また、繰返単位B中、Eは、Ｎ又はＣＨを示す。繰返単位Bにおいて、EがＮの場合、m2が０〜２、好ましくは２であり；m3が０〜１、好ましくは１であり；m4が１であり；m5が０〜１１、好ましくは５である化合物が好適に例示される。また、繰返単位Bにおいて、EがＣＨの場合、m2が０〜２、好ましくは０であり；m3が０〜１、好ましくは０であり；m4が０であり；m5が０〜１１、好ましくは５である化合物が好適に例示される。【００５１】
繰返単位B中、Rは、アミノ酸残基、又は２〜１００個のアミノ酸残基からなるペプチド残基を示す。Rの内、アミノ酸残基としては、天然アミノ酸残基又は非天然アミノ酸残基のいずれであってもよく、特に制限されるものではない。一般式(1)で示される化合物に膜透過性を備えさせるという観点から、好ましくはアルギニン残基、リジン残基、及びセリン残基であり、更に好ましくはアルギニン残基である。【００５２】
また、Rの内、ペプチド残基についても、２〜１００個のアミノ酸残基からなるものであれば、その構成アミノ酸残基の種類については特に制限されない。該ペプチド残基の一例として、一般式(1)で示される化合物に膜透過性を備えさせるという観点から、アルギニン残基、リジン残基、及びセリン残基よりなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸残基を含むペプチド残基；好ましくはアルギニン残基、リジン残基、及びセリン残基のみを構成アミノ酸残基とするペプチド残基；特に好ましくはアルギニン残基及び／又はリジン残基のみを構成アミノ酸残基とするペプチド残基が例示される。【００５３】
また、該ペプチド残基において、リジン残基を構成アミノ酸残基として含む場合、リジンのα位又はε位のアミノ基の何れか一方、又はその双方のアミノ基が、隣接するアミノ酸のカルボキシル基とペプチド結合を構成することができる。【００５４】
ペプチド残基を構成するアミノ酸残基の数としては、好ましくは２〜５０、更に好ましくは２〜２０、より好ましくは２〜５、特に好ましくは２〜３が挙げられる。【００５５】
Rの好ましい形態の一例として、２〜５つのアルギニン残基からなるペプチド残基、特に好ましい例として、３つのアルギニン残基からなるトリアルギニン残基が例示される。このようなペプチド残基を有することによって、一般式(1)で示される化合物が一層優れた膜透過性を備えることが可能になる。【００５６】
繰返単位Bにおいて、アミノ酸残基又はペプチド残基は、C末端側の構成アミノ酸のカルボキシル基が、繰返単位の側鎖のアミノ基と脱水縮合した形態で結合している。即ち、Rのアミノ酸残基又はペプチド残基は、アミノ酸又はペプチドのC末端側の構成アミノ酸のカルボキシル基のＯＨが除かれている基に相当する。【００５７】
繰返単位B中、m2が２以上の整数、即ち繰返単位Bが２個以上ある場合、それぞれの繰返単位B同士で、m2〜m5及びRは同一であってもよいし、異なっていてもよい。【００５８】
式(1)中、n3は、繰返単位Cの数を示し、０〜１０の整数、好ましくは０〜５の整数、更に好ましくは０〜２の整数を示す。【００５９】
繰返単位C中、m6は０〜１００の整数、好ましくは０〜３０の整数、更に好ましくは０〜１１の整数を示す。n3が２以上の整数、即ち繰返単位Cが２個以上ある場合、それぞれの繰返単位C同士で、m6は同一であってもよいし、異なっていてもよい。【００６０】
式(1)におけるn1〜n3の具体例として、n1が０〜２の整数、n2が１〜１０の整数、且つn3が０〜２の整数、特に好ましくは、n1が１又は２の整数、n2が４〜６の整数、且つn3が１又は２の整数が例示される。【００６１】
式(1)において、Yは、水酸基又はアミノ基を示す。【００６２】
式(1)において、Lは、水素原子、脂質を有する基、脂肪酸残基を有する基、又は蛍光性基を有する基を示す。【００６３】
脂質基を有する基の構成脂質としては、特に制限されないが、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファリジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、スフィンゴシン、セラミド、プラスマロゲン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸等のリン脂質；ガラクトシルジグリセロール、6−スルホキノボシルジアシルグリセロール等のグリセロ糖脂質；ガラクトセレブロシド等のスフィンゴ糖脂質；ステロイド；プロスタグランジン等が挙げられる。これらの中で、好ましくはリン脂質であり、更に好ましくはホスファチジルエタノールアミンを挙げることができる。これらの脂質基を構成する脂肪酸残基としては、特に制限されないが、炭素数４〜３０（好ましくは１２〜２０）の飽和又は不飽和の脂肪酸残基が挙げられる。このような脂肪酸残基として、具体的には、ラウロイル基、ミリストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、オレオイル基、リノレイル基等が例示される。当該脂肪酸残基の内、好適なものとしては、パルミトイル基、及びオレオイル基が例示される。【００６４】
脂質基を有する基は、脂質基自体であってもよいが、脂質基にリンカーが結合している基であってもよい。リンカーとしては、例えば、以下の(a)及び(b)に示す構造のものが使用される。【００６５】
【化２０】
2006115230.tif 000021
【００６６】
iは１〜２０、好ましくは１〜８の整数、ｊは１〜１０００、好ましくは１〜２１の整数を示す。【００６７】
具体的には、脂質基にリンカーが結合している基としては、構成脂質がアミノ基を有している場合、下記式(L1)で示される基が例示され；構成脂質がカルボキシル基を有している場合、下記式(L2)で示される基が例示される。【００６８】
【化２１】
2006115230.tif 000022
【００６９】
式（L1）及び(L2)中、i及びｊは前記と同じである。【００７０】
なお、脂質基を有する基は、以上の脂質基が結合している基であってもよい。【００７１】
また、Lの内、脂肪酸残基を有する基としては、脂肪酸残基自体であってもよいが、脂肪酸残基にリンカーが結合している基であってもよい。ここで、脂肪酸残基とは、脂肪酸のカルボキシル基のＯＨが除かれている基を指す。脂肪酸残基としては、具体的には、炭素数４〜３０（好ましくは１２〜２０）の飽和又は不飽和の脂肪酸残基が挙げられる。このような脂肪酸残基として、具体的には、ラウロイル基、ミリストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、オレオイル基、リノレイル基等が例示される。当該脂肪酸残基の内、好適なものとしては、パルミトイル基、及びオレオイル基が例示される。【００７２】
また、脂肪酸残基にリンカーが結合している基の場合、該リンカーとしては、上記(a)及び(b)に示す構造のものが使用される。具体的には、脂肪酸残基にリンカーが結合している基としては、下記式(L3)で示される基が例示される。【００７３】
【化２２】
2006115230.tif 000023
【００７４】
式(L3)中、ｊは前記と同じ。【００７５】
また、脂肪酸残基を有する基は、２個以上（例えば２〜８個、好ましくは２〜４個）の脂肪酸残基が結合している基であってもよい。２個以上の脂肪酸残基が結合している基としては、具体的には、以下に示す基が例示される。【００７６】
【化２３】
2006115230.tif 000024
【００７７】
また、Lの内、蛍光性基を有する基としては、蛍光性基自体であってもよいが、脂質基にリンカーが結合している基であってもよい。蛍光性基とは、蛍光を発する性質を有する基を指す。蛍光性基としては、公知の蛍光化合物を使用することができる。蛍光性基の一例として、以下の構造のものが挙げられる。【００７８】
【化２４】
2006115230.tif 000025
【００７９】
また、脂肪酸残基にリンカーが結合している基の場合、該リンカーとしては、上記(a)及び(b)に示す構造のものが使用される。【００８０】
式(1)において、Lが、脂質基を有する基又は脂肪酸残基を有する基である場合、一般式(1)で示される化合物の膜透過性を向上させたり、油性成分に対する相溶性を高めることが可能になる。【００８１】
また、式(1)において、Lが、蛍光性基を有する基である場合、一般式(1)で示される化合物を蛍光標識でき、蛍光の有無により該化合物の検出が可能になる。
２．一般式(1a)で示される化合物
アミノ酸又はオリゴペプチドを有する側鎖が主鎖に結合した構造の化合物として、更に、以下の一般式(1a)で示される化合物を提供する。【００８２】
【化２５】
2006115230.tif 000026
【００８３】
式(1a)中、n1〜n3、m1〜m6、E及びRは前記と同様である。【００８４】
式(1a)中、Yは水酸基を示す。【００８５】
式(1a)中、Xは、保護基を示す。また、式(1a)中、保護基Xとは異なる保護基（保護基Zaと表記する）、又は保護基Xと同一の保護基（保護基Zbと表記する）を示す。ここで、保護基とは、一般式(1a)で示される化合物を構成している特定の領域における結合基を、当該化合物の他の構成領域における酸化、還元、加水分解、縮合などによる反応による影響を受けないように保護している基であって、所定の条件下において脱離して水素原子や水酸基に置換可能な基のことを指す。保護基として、具体的には、ターシャリーブトキシカルボニル基（Boc基）又は９−フルオレニルメトキシカルボニル基（Fmoc基）が代表的であるが、これら以外にも以下に示す保護基が例示される。保護基Xとして、好ましくはBoc基又はFmoc基である。保護基Rとして、好ましくは、保護基Xとは異なる保護基（保護基Za）である。【００８６】
【化２６】
2006115230.tif 000027
【００８７】
特に、保護基Xが、Boc基又はFmoc基の場合であれば、保護基Rは以下に示すAloc基であることが望ましい。【００８８】
【化２７】
2006115230.tif 000028
【００８９】
式(1a)中、RZとは、前記Rのアミノ酸残基又はペプチド残基の官能基に保護基Zが結合していることを示す。なお、前記Rのアミノ酸残基又はペプチド残基において、官能基が２以上存在する場合には、それぞれの官能基に結合している保護基Zは、それぞれ同一の保護基であってもよく、異なる種類の保護基であってもよい。アミノ酸残基又はペプチド残基の官能基としては、アミノ基、カルボキシル基、グアニジル基、イミダゾール基、チオール基等が例示される。【００９０】
また、n2が２以上の整数、即ち繰返単位Bが２個以上ある場合、それぞれの繰返単位B同士で、RZは同一であってもよいし、異なっていてもよい。【００９１】
一般式(1a)で示される化合物では、全ての官能基が保護基X及びZで保護されており、且つ繰返単位Cの末端に遊離カルボキシル基が存在している。従って、アミノ基又は水酸基を有する標的化合物と、一般式(1a)で示される化合物は、容易に縮合反応して、一般式(1a)で示される化合物と標的化合物が結合した複合化合物することができる。従って、一般式(1a)で示される化合物を原料として使用することによって、繰返単位A、B及びCを標的化合物に容易に結合させることが可能になる。また、一般式(1a)で示される化合物の保護基を水素原子に置換することにより、上記一般式(1)で示される化合物を製造することもできる。【００９２】
一般式(1a)で示される化合物の結合対象となる標的化合物としては、アミノ基又は水酸基を有している限り特に限定されないが、具体例として、PNA（ペプチド核酸）オリゴマー、PNAモノマー、ペプチド、脂質、脂肪酸等を挙げることができる。【００９３】
例えば、一般式(1a)で示される化合物は、下記の反応式（１５）乃至（１７）、又は反応式（１８）乃至（１９）に示すように、ＰＮＡモノマー又はＰＮＡオリゴマーとの間にて縮合反応を経ることによって、効率的に、繰返単位A、B及びCが付加されたＰＮＡモノマー又はＰＮＡオリゴマーを製造することが可能となる。【００９４】
【化２８】
2006115230.tif 000029
【００９５】
［Fmoc-〔……〕-OHは、一般式(1a)において保護基XがＦｍｏｃである化合物を示し、Ｂはアデニン、グアニン、シトシン、チミン等の核酸塩基を示し、ＢｈｏｃはＦｍｏｃ以外の保護基を示す。ｑは、１以上、好ましくは１〜５０の整数である。］【００９６】
【化２９】
2006115230.tif 000030
【００９７】
［Boc-〔……〕-OHは、一般式(1a)において保護基XがBocである化合物を示し、Ｂはアデニン、グアニン、シトシン、チミン等の核酸塩基を示し、ＣｂｚはBoc以外の保護基を示す。ｑは、１以上、好ましくは１〜５０の整数である。］
３．一般式(1)で示される化合物の製造方法
一般式(1)で示される化合物の第１の製造方法として、以下に示す第1-1工程〜第1-5工程を順次実施する方法が挙げられる。第1-1工程〜第1-5工程について、工程毎に詳述する。【００９８】
第1-1工程
第1-1工程では、下記一般式(I)で示される化合物と、固相樹脂又は固相化合物を用いて、一般式(i)で示される化合物を合成する。【００９９】
【化３０】
2006115230.tif 000031
【０１００】
［式(I)中、m6は前記と同じ。］【０１０１】
【化３１】
2006115230.tif 000032
【０１０２】
［式(i)中、n3、m6及びXは前記と同じ。Solid Phaseは、固相樹脂又は固相化合物を示す。］
一般式(I)で示される化合物は、公知化合物又は公知の製造方法に準じて製造される化合物である。【０１０３】
当該工程で使用される固相樹脂又は固相化合物としては、特に制限されないが、例えば、ＭＢＨＡ（メチルベンジドリルアミン樹脂）、ＰＡＬ（ペプチドアミドリンカー）、Ｏｘｉｍｅ（Ｐ−ニトロベンゾフェノンオキシム）、ＰＡＭ（４−ヒドロキシメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂）、Merrifield樹脂等が例示される。【０１０４】
まず、上記一般式(I)で示される化合物を、固相樹脂又は固相化合物と縮合反応させる。【０１０５】
一般式(I)で示される化合物と、固相樹脂又は固相化合物との縮合反応は、一般式(I)で示される化合物１モルに対して、固相樹脂又は固相化合物を通常0.01〜100モル、好ましくは0.1〜10モル混合して行なわれる。【０１０６】
一般式(I)で示される化合物と、固相樹脂又は固相化合物との縮合反応は、通常、適当な溶媒中で行われる。溶媒としては、反応を阻害しない溶媒であれば公知のものを広く使用できる。このような溶媒としては、例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、N-メチルピロリドン（NMP）等が挙げられる。【０１０７】
一般式(I)で示される化合物と、固相樹脂又は固相化合物との縮合反応は、縮合剤及び反応促進剤を用いて実施することが望ましい。縮合剤としては、例えば、Ｏ-(アザベンゾトリアゾル-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩(HATU)、Ｏ-(ベンゾトリアゾル-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩(HBTU)、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(EDCI)、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）などが挙げられる。縮合剤として、好ましくはHATUが好適に使用される。また、反応促進剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）、トリエチルアミン（TEA）等が挙げられる。反応促進剤として、好ましくはDIEAである。【０１０８】
縮合剤の使用量は、固相樹脂又は固相化合物１モルに対して、縮合剤が総量で通常0.01〜100モル、好ましくは0.1〜10モルとするのがよい。【０１０９】
また、上記反応促進剤の使用量は、固相樹脂又は固相化合物１モルに対して、縮合剤が総量で通常0.01〜100モル、好ましくは0.1〜10モルとするのがよい。【０１１０】
一般式(I)で示される化合物と、固相樹脂又は固相化合物との縮合反応は、通常５〜８０℃、好ましくは１０〜３０℃で、0.1〜48時間、好ましくは0.1〜1時間、必要に応じて撹拌することにより行われる。【０１１１】
斯くして、固相樹脂又は固相化合物に１個の一般式(I)で示される化合物を縮合させた下記構造の化合物を得ることができる。以下、固相樹脂又は固相化合物に結合した状態の化合物を固相結合化合物と表記する。【０１１２】
【化３２】
2006115230.tif 000033
【０１１３】
斯くして得られた固相結合化合物の保護基Xの脱離を行う。固相結合化合物の保護基Xの脱離は、保護基Xの種類に応じた方法を適宜採用して実施される。例えば、保護基XがBoc基である場合、TFA（トリフルオロ酢酸）溶液（95容量％ TFA／5容量％ m−cresol）中で１０〜３０℃で0.1〜１時間処理する方法が例示される。また、保護基XがFmoc基である場合、ピペリジン溶液（20容量％ ピペリジン／80容量％DMF）中で１０〜３０℃で0.01〜0.5時間処理する方法が例示される。更に、保護基XがAllocである場合、Pd(PPh3)4（テトラキスートリフェニルフォスフィン  パラジウム錯体、312 mg）溶液（55容量％クロロホルム／30容量％酢酸／15容量％N-methylmorphorine）中で１０〜３０℃で0.1〜1時間処理する方法が例示される。【０１１４】
次いで、保護基Xを脱離した固相結合化合物と一般式(I)で示される化合物の縮合反応を実施する。当該縮合反応の条件等は、固相樹脂又は固相化合物と固相結合化合物を置き換える以外は、上記の縮合反応と同様である。【０１１５】
上記した固相結合化合物の保護基Xの脱離反応、及び保護基Xを脱離した固相結合化合物と一般式(I)で示される化合物の縮合反応を、n3 −１回繰り返し実施することにより、一般式(i)で示される化合物が得られる。【０１１６】
第1-2工程
第1-2工程では、第1-1工程で得られた一般式(i)で示される化合物と、下記の一般式(II)で示される化合物を用いて、下記の一般式(ii)で示される化合物を合成する。【０１１７】
【化３３】
2006115230.tif 000034
【０１１８】
式(II)中、m2〜m5、X及びZaは前記と同じである。また、一般式(II)で示される化合物は、公知化合物又は公知の製造方法に準じて製造される化合物である。【０１１９】
【化３４】
2006115230.tif 000035
【０１２０】
式(ii)中、n2、n3、m2〜m6、X、Za及びSolid Phaseは前記と同じである。【０１２１】
第２工程では、まず、固相結合化合物の保護基Xの脱離反応を行う。保護基Xの脱離を行う方法は、前記第1-1工程の場合と同様の条件を採用できる。【０１２２】
次いで、保護基Xを脱離した固相結合化合物と一般式(II)で示される化合物の縮合反応を実施する。【０１２３】
保護基Xを脱離した固相結合化合物と下記一般式(II)で示される化合物の縮合反応は、上記第1-1工程の縮合反応と同様の条件が採用できる。具体的には、上記第1-1工程の縮合反応条件において、固相樹脂又は固相化合物を固相結合化合物に置き換え、更に一般式(I)で示される化合物を一般式(II)で示される化合物に置き換えることにより、第1-2工程の縮合反応が実施される。【０１２４】
上記した固相結合化合物の保護基Xの脱離反応、及び保護基Xを脱離した固相結合化合物と一般式(II)で示される化合物の縮合反応を、合計n2回実施することにより、一般式(ii)で示される化合物が得られる。
【０１２５】
第1-3工程
第1-3工程では、第1-2工程で得られた一般式(ii)で示される化合物と、下記の一般式(III)で示される化合物を用いて、下記の一般式(iii)で示される化合物を合成する。【０１２６】
【化３５】
2006115230.tif 000036
【０１２７】
式(III)中、m1及びXは前記と同じである。一般式(III)で示される化合物は、公知化合物又は公知の製造方法に準じて製造される化合物である。【０１２８】
【化３６】
2006115230.tif 000037
【０１２９】
式(iii)中、n1〜n3、m1〜m6、X、Za及びSolid Phaseは前記と同じである。【０１３０】
第1-3工程では、まず、固相結合化合物の保護基Xの脱離反応を行う。保護基Xの脱離を行う方法は、前記第１工程の場合と同様の条件を採用できる。【０１３１】
次いで、保護基Xを脱離した固相結合化合物と下記一般式(III)で示される化合物の縮合反応を実施する。【０１３２】
保護基Xを脱離した固相結合化合物と下記一般式(III)で示される化合物の縮合反応は、上記第1-1工程の縮合反応と同様の条件が採用できる。具体的には、上記第1-1工程の縮合反応条件において、固相樹脂又は固相化合物を固相結合化合物に置き換え、更に一般式(I)で示される化合物を一般式(III)で示される化合物に置き換えることにより、第1-3工程の縮合反応が実施される。【０１３３】
上記した固相結合化合物の保護基Xの脱離反応、及び保護基Xを脱離した固相結合化合物と一般式(III)で示される化合物の縮合反応を、合計n3回実施することにより、一般式(iii)で示される化合物が得られる。【０１３４】
第1-4工程
第1-4工程では、第1-3工程で得られた一般式(iii)で示される化合物と、α位の炭素原子に結合したカルボキシル基以外の官能基に保護基Zaを結合させたアミノ酸を用いて、下記の一般式(iv)で示される化合物を合成する。【０１３５】
【化３７】
2006115230.tif 000038
【０１３６】
式(iv)中、n1〜n3、m1〜m6、X、RZa及びSolid Phaseは前記と同じである。【０１３７】
また、本工程に使用される上記のアミノ酸は、α位の炭素原子に結合したカルボキシル基以外の官能基に保護基Zaが結合していればよい。【０１３８】
例えば、α位の炭素原子に結合したカルボキシル基及びアミノ基以外に官能基がないアミノ酸の場合、α位の炭素原子に結合したアミノ基に保護基Zaが結合していればよい。【０１３９】
また、例えば、リジン、アルギニン、セリン等のように、α位の炭素原子以外に官能基が結合しているアミノ酸の場合、α位の炭素原子に結合したカルボキシル基以外の全ての官能基に保護基Zaが結合していればよい。この場合、α位の炭素原子に結合したアミノ基の保護基Zaと、α位の炭素原子以外の部位に結合した官能基の保護基Zaは、それぞれ異なる種類の保護基であることが望ましい。このように、上記アミノ酸に２以上の保護基Zbがある場合に、それぞれ異なる種類のものを採用することにより、縮合反応に使用するアミノ基に結合した保護基Zaのみを選択的に脱離させ、他の官能基に結合した保護基Zaは残存させた状態にすることが可能になる。【０１４０】
第1-4工程では、まず、固相結合化合物において縮合反応に使用されるアミノ基に結合した保護基Zaの脱離反応を行う。保護基Zaの脱離を行う方法は、前記第1-1工程の場合と同様の条件を採用できる。【０１４１】
次いで、上記のようにして保護基Zaを脱離した固相結合化合物と、上記アミノ酸の縮合反応を実施する。【０１４２】
保護基Zaを脱離した固相結合化合物と上記アミノ酸の縮合反応は、上記第1-1工程の縮合反応と同様の条件が採用できる。具体的には、上記第1-1工程の縮合反応条件において、固相樹脂又は固相化合物を固相結合化合物に置き換え、更に一般式(I)で示される化合物を上記アミノ酸に置き換えることにより、第1-4工程の縮合反応が実施される。【０１４３】
上記した固相結合化合物の保護基Zaの脱離反応、及び保護基Zaを脱離した固相結合化合物と上記アミノ酸の縮合反応を、１〜１００回繰り返し実施することにより、一般式(iv)で示される化合物が得られる。例えば、上記保護基Zaの脱離及び縮合反応を１回実施すると、Rがアミノ酸残基の化合物が合成され、また、例えば、上記保護基Zaの脱離及び縮合反応を３回実施すると、Rが３個のアミノ酸残基からなるペプチド残基の化合物が合成される。
【０１４４】
第1-5工程
次いで、第1-4工程で得られた一般式(iv)で示される化合物から、固相樹脂又は固相化合物を切り離して末端に−ＣＯＯＨ又は−ＣＯＮＨ２を形成させると共に、保護基Ｘ及びＺを脱離させて水素原子と置換する。また、必要に応じて、一般式(1)で示される化合物の繰返単位Aの末端アミノ基に、脂質基を有する基、脂肪酸残基を有する基、又は蛍光性基を有する基を結合させる。斯くして、一般式(1)で示される化合物が合成される。【０１４５】
例えば、固相樹脂又は固相化合物として、Merrifield樹脂を用いている場合には、超強酸性条件下に晒すことにより、Yがカルボキシル基である一般式(1)で示される化合物を得ることができる。また、例えば、固相樹脂又は固相化合物として、MBHA樹脂レジンを用いている場合には、超強酸性条件下に晒すことにより、Yがアミノ基である一般式(1)で示される化合物を得ることができる。
【０１４６】
更に、一般式(1)で示される化合物の第２の製造方法として、以下に示す第2-1工程〜第2-5工程を順次実施する方法が挙げられる。第2-1工程〜第2-5工程について、工程毎に詳述する。【０１４７】
第2-1工程
第2-1工程では、前記一般式(I)で示される化合物固相樹脂又は固相化合物を用いて、一般式(i)で示される化合物を合成する。【０１４８】
まず、前記一般式(I)で示される化合物を、固相樹脂又は固相化合物に縮合させて固相結合化合物を得た後、当該固相結合化合物の保護基Xの脱離反応を行う。保護基Xの脱離は、上記第1-1工程の場合と同様の条件で実施される。【０１４９】
次いで、保護基Xを脱離した固相結合化合物と一般式(I)で示される化合物の縮合反応をn3−１回繰り返し実施する実施する。当該縮合反応は、上記第1-1工程の場合と同様の条件で実施される。斯くして、一般式(i)で示される化合物を得ることができる。
【０１５０】
第2-2工程
第2-2工程では、前記一般式(II)で示される化合物、及びα位の炭素原子に結合したカルボキシル基以外の官能基に保護基Zaを結合させたアミノ酸を用いて、下記一般式(II')で示される化合物を合成する。【０１５１】
【化３８】
2006115230.tif 000039
【０１５２】
式(II')中、m2〜m5、X及びRZaは前記と同じである。【０１５３】
本第2-2工程において、一般式(II)で示される化合物のカルボキシル基は、X及びZbとは異なる保護基で保護しておくことが望ましい。【０１５４】
まず、一般式(II)で示される化合物の保護基Zaの脱離を行う。保護基Zaの脱離は、上記第1-4工程の場合と同様の条件で実施される。【０１５５】
次いで、保護基Zaを脱離した一般式(II)で示される化合物と、上記アミノ酸の縮合反応を実施する。当該縮合反応は、上記第1-4工程の場合と同様の条件で実施される。【０１５６】
上記のように、縮合反応に使用されるアミノ基に結合した保護基Zaの脱離反応、及び縮合反応に使用されるアミノ基に結合した保護基Zaを脱離した化合物と上記アミノ酸との縮合反応を、合計１〜１００回実施することにより、一般式(II')で示される化合物が得られる。【０１５７】
第2-3工程
第2-3工程では、第2-1工程で得られた一般式(i)で示される化合物及び第2-2工程で得られた一般式(II')で示される化合物を用いて、下記一般式(ii')で示される化合物を合成する。【０１５８】
【化３９】
2006115230.tif 000040
【０１５９】
式(ii')中n2、n3、、m2〜m6、RZa、及びSolid Phaseは前記と同じである。【０１６０】
まず、固相結合化合物の保護基Xの脱離を行う。保護基Xの脱離を行う方法は、前記第1-2工程の場合と同様の条件を採用できる。【０１６１】
次いで、保護基Xを脱離した固相結合化合物と一般式(III)で示される化合物の縮合反応を実施する。当該縮合反応は、上記第1-2工程の場合と同様の条件で実施される。【０１６２】
上記した固相結合化合物の保護基Xの脱離反応、及び保護基Xを脱離した固相結合化合物と一般式(II')で示される化合物の縮合反応を、合計n2回実施することにより、以下の一般式(ii')で示される化合物が得られる。
【０１６３】
第2-4工程
第2-4工程では、第2-3工程で得られた一般式(ii')で示される化合物及び一般式(III)で示される化合物を用いて、一般式(iv)で示される化合物を合成する。【０１６４】
まず、固相結合化合物の保護基Xの脱離反応を行う。保護基Xの脱離を行う方法は、前記第1-3工程の場合と同様の条件を採用できる。【０１６５】
次いで、保護基Xを脱離した固相結合化合物と一般式(III)で示される化合物の縮合反応を実施する。当該縮合反応は、上記第1-3工程の場合と同様の条件で実施される。【０１６６】
上記した固相結合化合物の保護基Xの脱離反応、及び保護基Xを脱離した固相結合化合物と一般式(III)で示される化合物の縮合反応を、合計n1回実施することにより、一般式(iv)で示される化合物が得られる。
【０１６７】
第2-5工程
次いで、第2-4工程で得られた一般式(iv)で示される化合物から、固相樹脂又は固相化合物を切り離して末端に−ＣＯＯＨ又は−ＣＯＮＨ２を形成させると共に、保護基Ｘ及びＺaを脱離させる。また、必要に応じて、一般式(1)で示される化合物の繰返単位Aの末端アミノ基に、脂質基を有する基、脂肪酸残基を有する基、蛍光性基を有する基を結合させる。斯くして、一般式(1)で示される化合物が合成される。なお、本第2-5工程は、上記第1-5工程と同様の方法で実施される。
【０１６８】
また、一般式(1)で示される化合物の第３の製造方法として、一般式(1a)で示される化合物における保護基X及びZを脱離させる方法が挙げられる。保護基X及びZの脱離反応は、保護基の種類に応じた条件を適宜設定することにより実施される。
【０１６９】
４．一般式(1a)で示される化合物の製造方法
一般式(1a)で示される化合物の第１の製造方法として、以下に示す第3-1工程〜第3-5工程を順次実施する方法が挙げられる。以下、第3-1工程〜第3-5工程について、工程毎に詳述する。【０１７０】
第3-1工程
第3-1工程では、前記一般式(I)で示される化合物と固相樹脂又は固相化合物を用いて、一般式(i)で示される化合物を合成する。【０１７１】
一般式(1a)で示される化合物の合成に使用される固相樹脂又は固相化合物については、一般式(1a)で示される化合物に含まれる保護基X及びZの種類に応じて適宜選択される。例えば、一般式(1a)で示される化合物に含まれる保護基X及びZの一方又は双方がBoc基である場合、固相樹脂としてOxime樹脂、又は固相化合物としてオキシルベンジルを採用することが望ましい。また、一般式(1a)で示される化合物に含まれる保護基X及びZの一方又は双方がFmoc基である場合、固相樹脂としてPAM樹脂を採用することが望ましい。【０１７２】
まず、一般式(I)で示される化合物を、固相樹脂又は固相化合物に縮合させて固相結合化合物を得た後、当該固相結合化合物の保護基Xの脱離反応を行う。保護基Xの脱離は、上記第1-1工程の場合と同様の条件で実施される。【０１７３】
次いで、保護基Xを脱離した固相結合化合物と一般式(I)で示される化合物の縮合反応をn3 −１回繰り返し実施する実施する。当該縮合反応は、上記第1-1工程の場合と同様の条件で実施される。斯くして、一般式(i)で示される化合物を得ることができる。
【０１７４】
第3-2工程
第3-2工程では、第3-1工程で得られた一般式(i)で示される化合物と、一般式(II)で示される化合物を用いて、一般式(ii)で示される化合物を合成する。【０１７５】
まず、固相結合化合物の保護基Xの脱離反応を行う。保護基Xの脱離を行う方法は、前記第1-2工程の場合と同様の条件を採用できる。【０１７６】
次いで、保護基Xを脱離した固相結合化合物と一般式(II)で示される化合物の縮合反応を実施する。当該縮合反応は、上記第1-2工程の場合と同様の条件で実施される。【０１７７】
上記した固相結合化合物の保護基Xの脱離、及び保護基Xを脱離した固相結合化合物と一般式(II)で示される化合物の縮合反応を、合計n2回実施することにより、一般式(ii)で示される化合物が得られる。
【０１７８】
第3-3工程
第3-3工程では、第3-2工程で得られた一般式(ii)で示される化合物と、一般式(III)で示される化合物を用いて、一般式(iii)で示される化合物を合成する。【０１７９】
まず、固相結合化合物の保護基Xの脱離反応を行う。保護基Xの脱離を行う方法は、前記第1-3工程の場合と同様の条件を採用できる。【０１８０】
次いで、保護基Xを脱離した固相結合化合物と一般式(III)で示される化合物の縮合反応を実施する。当該縮合反応は、上記第1-3工程の場合と同様の条件で実施される。【０１８１】
上記した固相結合化合物の保護基Xの脱離、及び保護基Xを脱離した固相結合化合物と一般式(III)で示される化合物の縮合反応を、合計n1回実施することにより、一般式(iii)で示される化合物が得られる。
【０１８２】
第3-4工程
第3-4工程では、第3-3工程で得られた一般式(iii)で示される化合物と、α位の炭素原子に結合したカルボキシル基以外の官能基に保護基Zaを結合させたアミノ酸を用いて、一般式(iv)で示される化合物を合成する。【０１８３】
第3-4工程で使用されるアミノ酸は、上記第1-4工程で使用されるアミノ酸と同様である。【０１８４】
まず、一般式(iii)で示される化合物の保護基Zaの脱離を行う。保護基Zaの脱離は、上記第1-4工程の場合と同様の条件で実施される。【０１８５】
次いで、保護基Zaを脱離した一般式(iii)で示される化合物と上記アミノ酸の縮合反応を実施する。当該縮合反応は、上記第４工程の場合と同様の条件で実施される。【０１８６】
上記のように、縮合反応に使用されるアミノ基に結合した保護基Zaの脱離反応、及び縮合反応に使用されるアミノ基に結合した保護基Zaを脱離した化合物と上記アミノ酸との縮合反応を、合計１〜１００回実施することにより、一般式(iv)で示される化合物が得られる。
【０１８７】
第3-5工程
上記第3-4工程で得られた一般式(iv)で示される化合物には、保護基としてZaが結合している。従って、必要に応じて、保護基Zaを公知の方法に従って、保護基Xと同じ保護基(保護基Zb)に置き換える。【０１８８】
次いで、第3-4工程で得られた一般式(iv)で示される化合物から、保護基Ｘ及びZを残した状態で、固相樹脂又は固相化合物を切り離して末端に−ＣＯＯＨを形成させる。【０１８９】
例えば、固相樹脂又は固相化合物として、Oxime樹脂を用いている場合には、アルカリ性条件下に晒すことにより、一般式(1-a)で示される化合物を得ることができる。
【０１９０】
更に、一般式(1a)で示される化合物の第２の製造方法として、以下に示す第4-1工程〜第4-5工程を実施する方法が挙げられる。以下、第4-1工程〜第4-5工程について、工程毎に詳述する。【０１９１】
第4-1工程
第4-1工程では、前記一般式(I)で示される化合物と固相樹脂又は固相化合物を用いて、一般式(i)で示される化合物を合成する。本第4-1工程は、上記第3-1工程と同様の条件で実施される。
【０１９２】
第4-2工程
第4-2工程では、前記一般式(II)で示される化合物、及びα位の炭素原子に結合したカルボキシル基以外の官能基に保護基Zaを結合させたアミノ酸を用いて、一般式(II')で示される化合物を合成する。【０１９３】
本第1-2工程において使用されるアミノ酸は、上記第3-4工程で使用されるアミノ酸と同様である。【０１９４】
まず、一般式(II)で示される化合物の保護基Zaの脱離を行う。保護基Zaの脱離は、上記第3-4工程の場合と同様の条件で実施される。【０１９５】
次いで、保護基Zaを脱離した一般式(II)で示される化合物と上記アミノ酸の縮合反応を実施する。当該縮合反応は、上記第3-4工程の場合と同様の条件で実施される。【０１９６】
上記のように、縮合反応に使用されるアミノ基に結合した保護基Zaの脱離反応、及び縮合反応に使用されるアミノ基に結合した保護基Zaを脱離させた化合物と上記アミノ酸との縮合反応を、合計１〜１００回実施することにより、一般式(II')で示される化合物が得られる。
【０１９７】
第4-3工程
第4-3工程では、第4-1工程で得られた一般式(i)で示される化合物及び第4-2工程で得られた一般式(II')で示される化合物を用いて、一般式(ii')で示される化合物を合成する。【０１９８】
まず、固相結合化合物の保護基Xの脱離を行う。保護基Xの脱離を行う方法は、前記第3-2工程の場合と同様の条件を採用できる。【０１９９】
次いで、保護基Xを脱離した固相結合化合物と一般式(III)で示される化合物の縮合反応を実施する。当該縮合反応は、上記第3-2工程の場合と同様の条件で実施される。【０２００】
上記した固相結合化合物の保護基Xの脱離、及び保護基Xを脱離した固相結合化合物と一般式(II')で示される化合物の縮合反応を、合計n2回実施することにより、以下の一般式(ii')で示される化合物が得られる。
【０２０１】
第4-4工程
第4-4工程では、第4-3工程で得られた一般式(ii')で示される化合物及び一般式(III)で示される化合物を用いて、一般式(iv)で示される化合物を合成する。【０２０２】
まず、固相結合化合物の保護基Xの脱離反応を行う。保護基Xの脱離を行う方法は、前記第3-3工程の場合と同様の条件を採用できる。【０２０３】
次いで、保護基Xを脱離した固相結合化合物と一般式(III)で示される化合物の縮合反応を実施する。当該縮合反応は、上記第3-3工程の場合と同様の条件で実施される。【０２０４】
上記した固相結合化合物の保護基Xの脱離、及び保護基Xを脱離した固相結合化合物と一般式(III)で示される化合物の縮合反応を、合計n1回実施することにより、以下の一般式(iv)で示される化合物が得られる。
【０２０５】
第4-5工程
上記第4-4工程で得られた一般式(iv)で示される化合物には、保護基としてZaが結合している。従って、必要に応じて、保護基Zaを公知の方法に従って、保護基Xと同じ保護基(保護基Zb)に置き換える。【０２０６】
次いで、第4-4工程で得られた一般式(iv)で示される化合物から、保護基Ｘ及びＺbを残した状態で、固相樹脂又は固相化合物を切り離して末端に−ＣＯＯＨを形成させる。本第4-5工程は、上記第3-5工程と同様の方法で実施される。
【実施例】
【０２０７】
以下、実施例及び試験例を挙げて本発明をより詳細に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例及び試験例によって限定されることはない。【０２０８】
参考合成例１  一般式(11)で表される化合物の合成
以下に示す一般式(11)で表される化合物（以下、化合物(11)と表記する）を合成した。【０２０９】
【化４０】
2006115230.tif 000041
【０２１０】
具体的には、Alloc（アリルオキシカルボニル）−HN−C5H10−COOH（891 mg, 3.0 mmol）とPfp−OH（ペンタフルオロフェノール）（754 mg, 4.5 mmol）の塩化メチレン溶液（12 mL）にDCC（1,3-ジサイクロヘキシルカルボジイミド）（845 mg, 4.5 mmol）を水冷下加え、この反応液を0℃で30分、次いで室温で15時間撹拌した。反応液を濾過し濾液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマト法(CH2Cl2)により精製した後、ヘキサンで再結晶し白色粉末としてAlloc−HN−C5H10−COO−Pfp (537.5 mg，98%)を得た。1H-NMR(CDCl3)δ5.92 (m, 1 H), 5.26 (m, 2 H), 4.96 (brt, 1 H), 4.57 (brd, 2 H), 3.22 (q, J = 6.2 Hz, 2 H), 2.69 (t, J = 7.2 Hz, 2 H), 2.0 - 1.8 (m, 2 H), 1.75 - 1.1 (m, 8 H); LRMS (FAB+) calcd for C16H17F5NO4 [(M+H)+] 382.3 observed 382.
次いで、アセトン（6.0 mL）と水（1.0 mL）の混合溶液にNaHCO3（67.2 mg, 0.8 mmol）を加え、Alloc−HN−C5H10−O−Pfp（763 mg, 2.0 mmol）と下式(12)で表される化合物（681 mg, 2.0 mmol）を溶解し、室温で6時間撹拌した。【０２１１】
【化４１】
2006115230.tif 000042
【０２１２】
水冷した1 N塩酸で、冷却した反応溶液をpH 3.0とし、さらに1％クエン酸水溶液を加えた後、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄をした。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させて濃縮し、シリカゲルカラムクロマト法（1-5％ MeOH／CH2C12）で精製した。この後、塩化メチレンに溶かし、減圧濃縮しアモルファスパウダーとして化合物(11)（157.3 mg, 80%）を得た。1H-NMR(CDCl3)δ7.75 (d, J = 6.8 Hz, 2 H), 7.59 (d, J = 7.6 Hz, 2 H)，7.35 (m, 4 H), 5.8 (m, 1 H), 5.8 (ma) and 5.6 (mi) (m, 1 H), 5.2 (m, 2 H), 4.6 (mi) and 4.53 (ma) (brd, 2 H), 4.37 (brd, 2 H), 4.22 (mi) and 4.04 (ma) (brd, 2 H), 3.50 (m, 2 H), 3.33 (m, 2 H), 3.16 (m, 2 H), 2.37 (ma) and 2.2 (mi) (brt, 2 H), 1.8 - 1.2 (m, 6 H); LRMS (FAB+) calcd for C29H36N3O7[(M+H)+] 538.6 observed 538。【０２１３】
実施例１  一般式で表される化合物(1-A)の合成
以下の一般式で表される化合物(1-A)（以下、化合物(1-A)と表記する）を合成した。【０２１４】
【化４２】
2006115230.tif 000043
【０２１５】
標準的tBoc法（cf．Koch, T.; Hansen, H.F.; Andersen, P.; Larsen, T.; Batz, H.G.; Otteson, K.; Orum, H. J. Peptide Res. 1997, 49, 80-88.）に従い、まず、固相担体MBHA（4-Methyl-benzhydrylamine）樹脂（120 mg, 73.2 μmol）にBoc−HN−C5H10−COOH（ｔ−ブトキシカルボニル-6-アミノカプロン酸；34.3 mg、109.8 μmol）、縮合剤HATU（2-(1H-9-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3テトラメチルラウニウム ヘキサフルオロホスフェイト）（41.7 mg、109.8 μmol）とDIEA（ジイソプロピルエチルアミン）（50 μL）を用いて縮合反応（室温、30分）を行った（反応工程r1-1）。TFA処理（95％ TFA／5％ m−cresol）によりBoc基を脱保護した後、Boc−HN−C5H10−COOH（34.3 mg、109.8 μmol）、縮合剤HATU（41.7 mg、109.8 μmol）とDIEA（50 μL）を用いて逐次伸長反応（室温、30分）を行った（反応工程r1-2及びr1-3）。【０２１６】
次いで、TFA処理（95％ TFA／5％ m−cresol）によりBoc基を脱保護した後（反応工程r1-4）、下式(13)で表される化合物（58.6 mg、109.8 μmol）を、縮合剤HATU（41.7 mg、109.8 μmol）とDIEA（50 μL）を用いて縮合させた（室温、30分）。この操作を計5回繰り返した（反応工程r1-5及び2-6）。【０２１７】
【化４３】
2006115230.tif 000044
【０２１８】
その後、ピペリジン処理（20％piperidine in DMF、室温5分）してFmoc基を脱保護した（反応工程r1-7）。次いで、Fmoc−Arg(Mts：N- mesitylene- 2- sulfonyl)−OH・IPE（isopropylethylamine）（747 mg、1098 μmol）を縮合剤HATU（417 mg、1098 μmol）とDIEA（192 μL）を用いて縮合させた（室温、30分）。この操作を計3回繰り返した（反応工程r1-8〜r1-10）。【０２１９】
最後にピペリジン処理によりFmoc基を脱保護した後、常法（TFA／TFMSA／p−cresol／thioanisol＝60／25／10／10）により固相担体MBHAからの切り出し、とArgの保護基Mts基の脱保護を行って、目的物（化合物(1-A)）を得た（反応工程r1-11）。MALDI-TOF MS：calcd．3653.53（M＋H＋）, found 3654.57.【０２２０】
【化４４】
2006115230.tif 000045
【０２２１】
実施例２  一般式で表される化合物(1-B)の合成
以下の一般式で表される化合物(1-B)（以下、化合物(1-B)と表記する）を合成した。【０２２２】
【化４５】
2006115230.tif 000046
【０２２３】
具体的には、標準的tBoc法（cf．Koch, T.; Hansen, H.F.; Andersen, P.; Larsen, T.; Batz, H.G.; Otteson, K.; Orum, H. J. Peptide Res. 1997, 49, 80-88.）に従い、まず、固相担体MBHA（120 mg, 73.2 μmol）にリンカー用ω−アミノ酸であるBoc−HN−C5H10−COOH（34.3 mg、109.8 μmol）、縮合剤HATU（41.7 mg、109.8 μmol）とDIEA（50 μL）を用いて縮合反応（室温、30分）を行った（反応工程r2-1）。TFA処理（95％ TFA／5％ m−cresol）によりBoc基を脱保護した後、Boc−HN−C5H10−COOH（34.3 mg、109.8 μmol）、縮合剤HATU（41.7 mg、109.8 μmol）とDIEA（50 μL）を用いて逐次伸長反応（室温、30分）を行った（反応工程r2-2及びr2-3）。【０２２４】
次いで、TFA処理（95％ TFA／5％ m−cresol）によりBoc基を脱保護した後（反応工程r2-4）、Boc−Lys(Fmoc)−OH（53.4 mg、109.8 μmol）を、縮合剤HATU（41.7 mg、109.8 μmol）とDIEA（50 μL）を用いて縮合させた（室温、30分）。この操作を計5回繰り返した（反応工程r2-5及びr2-6）。【０２２５】
その後、ピペリジン処理（20％piperidine in DMF、室温5分）してFmoc基を脱保護した（反応工程r2-7）。次いで、Fmoc−Arg(Mts)−OH・IPE（747 mg、1098 μmol）を縮合剤HATU（417 mg、1098 μmol）とDIEA（192 μL）を用いて縮合させた（室温、30分）。この操作を計3回繰り返した（反応工程r2-8〜r2-10）。【０２２６】
最後にピペリジン処理によりFmoc基を脱保護した後、常法（TFA／TFMSA／p−cresol／thioanisol＝60／25／10／10）により固相担体MBHAからの切り出しと、Argの保護基Mts基の脱保護を行って、目的物（化合物(1-B)）を得た（反応工程r2-11）。MALDI-TOF MS：calcd．3228.00（M＋H＋）, found 3227.91.【０２２７】
【化４６】
2006115230.tif 000047
【０２２８】
実施例３  一般式で表される化合物(1-C)の合成
以下の一般式で表される化合物(1-C)（以下、化合物(１−C)と表記する）を合成した。【０２２９】
【化４７】
2006115230.tif 000048
【０２３０】
具体的には、標準的tBoc法（cf．Koch, T.; Hansen, H.F.; Andersen, P.; Larsen, T.; Batz, H.G.; Otteson, K.; Orum, H. J. Peptide Res. 1997, 49, 80-88.）に従い、まず、固相担体MBHA（120 mg, 73.2 μmol）にリンカー用ω−アミノ酸であるBoc−HN−C5H10−COOH（（34.3 mg、109.8 μmol）、縮合剤HATU（41.7 mg、109.8 μmol）とDIEA（50 μL）を用いて縮合反応（室温、30分）を行った（反応工程r3-1）。TFA処理（95％ TFA／5％ m−cresol）によりBoc基を脱保護した後、Boc−HN−C5H10−COOH（34.3 mg、109.8 μmol）、縮合剤HATU（41.7 mg、109.8 μmol）とDIEA（50 μL）を用いて逐次伸長反応（室温、30分）を行った（反応工程r3-2及びr3-3）。【０２３１】
次いで、TFA処理（95％ TFA／5％ m−cresol）によりBoc基を脱保護した後（反応工程r3-4）、前記式(13)で表される化合物（58.6 mg、109.8 μmol）を、縮合剤HATU（41.7 mg、109.8 μmol）とDIEA（50 μL）を用いて縮合させた（室温、30分）。この操作を計5回繰り返した（反応工程r3-5及びr3-6）。【０２３２】
その後、ピペリジン処理（20％piperidine in DMF、室温5分）してFmoc基を脱保護した（反応工程r3-7）。次いで、Fmoc−Lys(Boc)−OH（534 mg、1098 μmol）を、縮合剤HATU（417 mg、1098 μmol）とDIEA（192 μL）を用いて縮合させた（室温、30分）。この操作を計3回繰り返した（反応工程r3-8〜r3-10）。【０２３３】
最後にピペリジン処理によりFmoc基を脱保護した後、常法（TFA／TFMSA／p−cresol／thioanisol＝60／25／10／10）により固相担体MBHAからの切り出しと、Lysの保護基Boc基の脱保護を行い、目的物（化合物(1-C)）を得た（反応工程r3-11）。MALDI-TOF MS：calcd．3233.32（M＋H＋）, found 3233.60.【０２３４】
【化４８】
2006115230.tif 000049
【０２３５】
実施例４  一般式(1-D)で表される化合物の合成
以下の一般式(1-D)で表される化合物（以下、化合物(1-D)と表記する）を合成した。【０２３６】
【化４９】
2006115230.tif 000050
【０２３７】
具体的には、標準的tBoc法（cf．Koch, T.; Hansen, H.F.; Andersen, P.; Larsen, T.; Batz, H.G.; Otteson, K.; Orum, H. J. Peptide Res. 1997, 49, 80-88.）に従い、まず、固相担体MBHA（120 mg, 73.2 μmol）にリンカー用ω−アミノ酸であるBoc−HN−C5H10−COOH（（34.3 mg、109.8 μmol）、縮合剤HATU（41.7 mg、109.8 μmol）とDIEA（50 μL）を用いて縮合反応（室温、30分）を行った（反応工程r4-1）。TFA処理（95％ TFA／5％ m−cresol）によりBoc基を脱保護した後、Boc−HN−C5H10−COOH（34.3 mg、109.8 μmol）、縮合剤HATU（41.7 mg、109.8 μmol）とDIEA（50 μL）を用いて逐次伸長反応（室温、30分）を行った（反応工程r4-2及びr4-3）。【０２３８】
次いで、TFA処理（95％ TFA／5％ m−cresol）によりBoc基を脱保護した後（反応工程r4-4）、前記式(13)で表される化合物（58.6 mg、109.8 μmol）を、縮合剤HATU（41.7 mg、109.8 μmol）とDIEA（50 μL）を用いて縮合させた（室温、30分）。この操作を計5回繰り返した（反応工程r4-5及びr4-6）。【０２３９】
その後、ピペリジン処理（20％piperidine in DMF、室温5分）してFmoc基を脱保護した（反応工程r4-7）。次いで、Fmoc−Lys(Boc)−OH（534 mg、1098 μmol）を縮合剤HATU（417 mg、1098 μmol）とDIEA（192 μL）を用いて縮合させた（室温、30分）（反応工程r4-8）。次に、ピペリジン処理にてFmoc基を脱保護し、Fmoc−Arg(Mts)−OH・IPE（747 mg、1098 μmol）を、縮合剤HATU（417 mg、1098 μmol）とDIEA（192 μL）を用いて縮合させた（室温、30分）（反応工程r4-9）。更に、ピペリジン処理にてFmoc基を脱保護し、Fmoc−Ser(Trt)−OH（415 mg、1098 μmol）を、縮合剤HATU（417 mg、1098 μmol）とDIEA（192 μL）を用いて縮合させた（室温、30分）（反応工程r4-10）。【０２４０】
最後に、ピペリジン処理によりFmoc基を脱保護した後、常法（TFA／TFMSA／p−cresol／thioanisol＝60／25／10／10）により固相担体MBHAからの切り出しと、Lysの保護基Boc基、Argの保護基Mts基、Serの保護基Trt基の脱保護を行い、目的物（化合物(1-D)）を得た（反応工程r4-11）。MALDI-TOF MS：calcd．3167.92（M＋H＋）, found 3166.89.【０２４１】
【化５０】
2006115230.tif 000051
【０２４２】
実施例５  化合物(1L-A)の合成
以下の一般式で表される化合物(1L-A)を合成した。【０２４３】
【化５１】
2006115230.tif 000052
【０２４４】
具体的には、標準的Fmoc法（cf．Carpino, L.A.; Han, G.Y. J. Org. Chem. 1972, 37, 3404-9.）に従い、まず、固相担体PAL（5-(4'-Aminomethyl-3',5'-dimethoxyphenoxy)-valeric acid）（180 mg, 72 μmol）をピペリジン処理（20％piperidine in DMF、室温5分）してFmoc基を脱保護した。これにリンカー用ω−アミノ酸であるFmoc−HN-C10H20−COOH（305 mg、720 μmol）を、縮合剤HATU（274 mg、720 μmol）とDIEA（126 μL）を用いて縮合（室温、30分）させた（反応工程r5-1）。【０２４５】
次いで、ピペリジン処理してFmoc基を脱保護した後、化合物(11)（193 mg、360 μmol）を、縮合剤HATU（137 mg、360 μmol）とDIEA（63 μL）を用いて縮合させた（室温、30分）。この操作を計5回繰り返した（反応工程r5-2〜r5-4）。【０２４６】
次に、ピペリジン処理してFmoc基を脱保護した後、Fmoc−HN -C10H20−COOH（305 mg、720 μmol）、縮合剤HATU（274 mg、720 μmol）とDIEA（126 μL）を用いて縮合（室温、30分）させた（反応工程r5-5）。【０２４７】
次いで、ピペリジン処理してFmoc基を脱保護した（反応工程r5-6）。その後、リン脂質活性エステル体DOPE-NHS（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン−N-hydroxysuccinimide）（90.5 mg、92.3 μmol）を、DMF / DIEA (1 mL / 50 μL)溶液を用いて縮合させた（反応工程r5-7）。【０２４８】
次いで、Pd(PPh3)4（tetrakis (triphenylphosphine)palladium(0)）のCHCl3 / AcOH / N-methylmorphorine溶液（312 mg, 2.8 mL, 1.5 mL, 0.75 mL、室温30分）にて2度処理し、Alloc基を脱保護した（反応工程r5-8）。次いで、Fmoc−Arg(Pbf)−OH・0.3IPE（733 mg、1080 μmol）を、縮合剤HATU（410 mg、1080 μmol）とDIEA（188 μL）を用いて縮合させた（室温、30分）。この操作を計3回繰り返した（反応工程r5-9〜r5-11）。【０２４９】
最後に、ピペリジン処理後によりFmoc基を脱保護した後、TFA処理（95％ TFA／5％ m−cresol）により、固相担体PALからの切り出しと、Argの保護基Pbf基の脱保護を行い、目的物（化合物(1L-A)）を得た（反応工程r5-12）。MALDI-TOF MS：calcd．4632.90（M＋H＋）, found 4632.63.【０２５０】
【化５２】
2006115230.tif 000053
【０２５１】
2006115230.tif 000054
【０２５２】
実施例６  一般式(1L-B)で表される化合物の合成
以下の一般式(1L-B)で表される化合物（以下、化合物(1L-B)と表記する）を合成した。【０２５３】
【化５３】
2006115230.tif 000055
【０２５４】
具体的には、標準的Fmoc法（cf．Carpino, L.A.; Han, G.Y. J. Org. Chem. 1972, 37, 3404-9.）に従い、まず、固相担体PAL（180 mg, 72 μmol）をピペリジン処理（20％piperidine in DMF、室温5分）してFmoc基を脱保護した。これにリンカー用ω−アミノ酸であるFmoc−HN-C10H20−COOH（305 mg、720 μmol）、縮合剤HATU（274 mg、720 μmol）とDIEA（126 μL）を用いて縮合（室温、30分）させた。（反応工程r6-1）
次いで、ピペリジン処理してFmoc基を脱保護した後、化合物(11)（193 mg、360 μmol）を、縮合剤HATU（137 mg、360 μmol）とDIEA（63 μL）を用いて縮合させた（室温、30分）。この操作を計4回繰り返した（反応工程r6-2〜r6-4）。【０２５５】
次に、ピペリジン処理してFmoc基を脱保護した後、Fmoc−HN-C10H20−COOH（305 mg、720 μmol）、縮合剤HATU（274 mg、720 μmol）とDIEA（126 μL）を用いて縮合（室温、30分）させた（反応工程r6-5）。【０２５６】
次いで、ピペリジン処理してFmoc基を脱保護した（反応工程r6-6）。その後、リン脂質活性エステル体DOPE-NHS（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン−N-hydroxysuccinimide）（90.5 mg、92.3 μmol）を、DMF / DIEA (1 mL / 50 μL)溶液を用いて縮合させた（反応工程r6-7）。【０２５７】
更に、Pd(PPh3)4のCHCl3 / AcOH / N-methylmorphorine溶液（312 mg, 2.8 mL, 1.5 mL, 0.75 mL、室温30分）にて2度処理し、Alloc基を脱保護した（反応工程r6-8）。次いで、Fmoc−Lys(Boc)−OH（525 mg、1080 μmol）を、縮合剤HATU（410 mg、1080 μmol）とDIEA（188 μL）を用いて縮合させた（室温、30分）。この操作を計3回繰り返した（反応工程r6-9〜r6-11）。【０２５８】
最後に、ピペリジン処理によりFmoc基を脱保護した後、TFA処理（95％ TFA／5％ m−cresol）により、固相担体PALからの切り出しと、Lysの保護基Boc基の脱保護を行い、目的物（化合物(1L-B)）を得た（反応工程r6-12）。MALDI-TOF MS：calcd．3614.91（M＋H＋）, found 3611.60.【０２５９】
【化５４】
2006115230.tif 000056
【０２６０】
2006115230.tif 000057
【０２６１】
実施例７  一般式で表される化合物(1L-C)の合成
以下の一般式で表される化合物(1L-C)（以下、化合物(1L-C)と表記する）を合成した。【０２６２】
【化５５】
2006115230.tif 000058
【０２６３】
具体的には、標準的Fmoc法（cf．Carpino, L.A.; Han, G.Y. J. Org. Chem. 1972, 37, 3404-9.）に従い、まず、固相担体PAL（180 mg, 72 μmol）をピペリジン処理（20％piperidine in DMF、室温5分）してFmoc基を脱保護した。これにリンカー用ω−アミノ酸であるFmoc−HN-C10H20−COOH（305 mg、720 μmol）、縮合剤HATU（274 mg、720 μmol）とDIEA（126 μL）を用いて縮合（室温、30分）させた。（反応工程r7-1）
次いで、ピペリジン処理してFmoc基を脱保護した後、化合物(11)（193 mg、360 μmol）を、縮合剤HATU（137 mg、360 μmol）とDIEA（63 μL）を用いて縮合させた（室温、30分）。この操作を計5回繰り返した（反応工程r7-2〜r7-4）。【０２６４】
次に、ピペリジン処理してFmoc基を脱保護した後、Fmoc−HN-C10H20−COOH（305 mg、720 μmol）、縮合剤HATU（274 mg、720 μmol）とDIEA（126 μL）を用いて縮合（室温、30分）させた（反応工程r7-5）。【０２６５】
次いで、ピペリジン処理してFmoc基を脱保護した（反応工程r7-6）。その後、オレイン酸（40 mg、144 μmol）を、縮合剤HATU（54.6 mg、144 μmol）とDIEA（25 μL）を用いて縮合させた（反応工程r7-7）。【０２６６】
更に、Pd(PPh3)4のCHCl3 / AcOH / N-methylmorphorine溶液（312 mg, 2.8 mL, 1.5 mL, 0.75 mL、室温30分）にて2度処理し、Alloc基を脱保護した（反応工程r7-8）。次いで、Fmoc−Arg(Pbf)−OH・0.3IPE（733 mg、1080 μmol）を、縮合剤HATU（410 mg、1080 μmol）とDIEA（188 μL）を用いて縮合させた（室温、30分）。この操作を計3回繰り返した（反応工程r7-9〜r7-11）。【０２６７】
最後に、ピペリジン処理によりFmoc基を脱保護した後、TFA処理（95％ TFA／5％ m−cresol）により、固相担体PALからの切り出しと、Argの保護基Pbf基の脱保護を行い、目的物（化合物(1L-C)）を得た（反応工程r7-12）。【０２６８】
【化５６】
2006115230.tif 000059
【０２６９】
2006115230.tif 000060
【０２７０】
実施例８  一般式(1L-D)で表される化合物の合成
以下の一般式(1L-D)で表される化合物(以下、化合物(1L-D)と表記する)を合成した。【０２７１】
【化５７】
2006115230.tif 000061
【０２７２】
具体的には、標準的Fmoc法（cf．Carpino, L.A.; Han, G.Y. J. Org. Chem. 1972, 37, 3404-9.）に従い、まず、固相担体PAL（180 mg, 72 μmol）をピペリジン処理（20％piperidine in DMF、室温5分）してFmoc基を脱保護した。これにリンカー用ω−アミノ酸であるFmoc−HN-C10H20−COOH（305 mg、720 μmol）、縮合剤HATU（274 mg、720 μmol）とDIEA（126 μL）を用いて縮合（室温、30分）させた。（反応工程r8-1）
次いで、ピペリジン処理してFmoc基を脱保護した後、化合物(11)（193 mg、360 μmol）を、縮合剤HATU（137 mg、360 μmol）とDIEA（63 μL）を用いて縮合させた（室温、30分）。この操作を計5回繰り返した（反応工程r8-2〜r8-4）。【０２７３】
次に、ピペリジン処理してFmoc基を脱保護した後、Fmoc−HN-C10H20−COOH（305 mg、720 μmol）、縮合剤HATU（274 mg、720 μmol）とDIEA（126 μL）を用いて縮合（室温、30分）させた（反応工程r8-5）。【０２７４】
次いで、ピペリジン処理してFmoc基を脱保護した（反応工程r8-6）。その後、リン脂質活性エステル体Ole-PEG-NHS(オレイン酸-ポリエチレングリコール- N-hydroxysuccinimide) （306 mg、144 μmol）を、DMF / DIEA (1 mL / 50 μL)溶液を用いて縮合させた（反応工程r8-7）。【０２７５】
更に、Pd(PPh3)4のCHCl3 / AcOH / N-methylmorphorine溶液（312 mg, 2.8 mL, 1.5 mL, 0.75 mL、室温30分）にて2度処理し、Alloc基を脱保護した（反応工程r8-8）。次いで、Fmoc−Arg(Pbf)−OH・0.3IPE（733 mg、1080 μmol）を、縮合剤HATU（410 mg、1080 μmol）とDIEA（188 μL）を用いて縮合させた（室温、30分）。この操作を計3回繰り返した（反応工程r8-9〜r8-11）。【０２７６】
最後にピペリジン処理によりFmoc基を脱保護した後、TFA処理（95％ TFA／5％ m−cresol）により、固相担体PALからの切り出しと、Argの保護基Pbf基の脱保護を行い、目的物（化合物(1L-D)）を得た（反応工程r8-12）。【０２７７】
【化５８】
2006115230.tif 000062
【０２７８】
2006115230.tif 000063
【０２７９】
実施例９  化合物(1-E)の合成
以下の一般式で表される化合物(1-E)を合成した。【０２８０】
【化５９】
2006115230.tif 000064
【０２８１】
具体的には、標準的tBoc法（cf．Koch, T.; Hansen, H.F.; Andersen, P.; Larsen, T.; Batz, H.G.; Otteson, K.; Orum, H. J. Peptide Res. 1997, 49, 80-88.）に従い、まず、固相担体MBHA（100 mg, 61 μmol）にリンカー用ω−アミノ酸であるBoc−HN−C5H10−COOH（6.93 mg、30 μmol）、縮合剤HATU（11.4 mg、30 μmol）とDIEA（10μL）を用いて縮合反応（室温、120分）を行った（反応工程r9-1）。
次に、TFA処理（95％ TFA／5％ m−cresol）によりBoc基を脱保護した（反応工程r6-6）。その後、下記一般式(91)で表される化合物（19.9 mg、60 μmol）を、縮合剤HATU（13.7 mg、60 μmol）とDIEA（12.5 μL）を用いて縮合させた（室温、30分）。この操作を計5回繰り返した（反応工程r9-7及びr9-8）。【０２８２】
【化６０】
2006115230.tif 000065
【０２８３】
次いで、ピペリジン処理（20％piperidine in DMF、室温5分）してFmoc基を脱保護した（反応工程r9-9）。次いで、Fmoc−Arg(Mts)−OH・IPE（153 mg、225 μmol）を、縮合剤HATU（85 mg、225 μmol）とDIEA（39 μL）を用いて縮合させた（室温、30分）。この操作を計3回繰り返した（反応工程r9-10〜r9-12）。【０２８４】
次いで、TFA処理（95％ TFA／5％ m−cresol）によりBoc基を脱保護した後、Boc−HN−C5H10−COOH（13.9 mg、60 μmol）、縮合剤HATU（22.8 mg、60 μmol）とDIEA（20μL）を用いて縮合反応（室温、30分）を行った（反応工程r9-2及び9-3）。【０２８５】
更に、TFA処理によりBoc基を脱保護した後、FITC（29.2 mg、75 μmol）のDIEA/DMF（26.7 mL/1.5 mL）溶液を室温で14時間攪拌して、蛍光標識化した（反応工程r9-13）。【０２８６】
最後に、ピペリジン処理によりFmoc基を脱保護した後、常法（TFA／TFMSA／p−cresol／thioanisol＝60／25／10／10）により固相担体MBHAからの切り出しと、Argの保護基Mts基の脱保護を行い、目的物（化合物(1-E)）を得た（反応工程r9-14）。MALDI-TOF MS：calcd．4041.40、（M＋H＋）, found 4042.91.【０２８７】
実施例１０  一般式(1a-1)で示される化合物の合成
下記に示す反応工程に従って、以下の一般式で表される化合物(1a-1)を合成した。【０２８８】
【化６１】
2006115230.tif 000066
【０２８９】
具体的には、標準的tBoc法（cf．Koch, T.; Hansen, H.F.; Andersen, P.; Larsen, T.; Batz, H.G.; Otteson, K.; Orum, H. J. Peptide Res. 1997, 49, 80-88.）に従い、まず、固相担体Oxime（100 mg, 120 μmol）にリンカー用ω−アミノ酸であるBoc−HN−C5H10−COOH（181 mg、480 μmol）、縮合剤DCC（124 mg、480 μmol）を用いて縮合反応（室温、15時間）を行った。TFA処理（95％ TFA／5％ m−cresol）によりBoc基を脱保護した後、Boc−HN−C5H10−COOH（68 mg、180 μmol）、縮合剤HATU（68 mg、180 μmol）とDIEA（83 μL）を用いて逐次伸長反応（室温、30分）を行った。【０２９０】
次いで、TFA処理（95％ TFA／5％ m−cresol）によりBoc基を脱保護した。その後、下記一般式(101)で表される化合物（19.9 mg、180 μmol）を、縮合剤HATU（41 mg、180 μmol）とDIEA（37.5 μL）を用いて縮合させた（室温、30分）。この操作を計5回繰り返した。【０２９１】
【化６２】
2006115230.tif 000067
【０２９２】
次いで、TFA処理（95％ TFA／5％ m−cresol）によりBoc基を脱保護した後、Boc−HN−C5H10−COOH（68 mg、180 μmol）、縮合剤HATU（68 mg、180 μmol）とDIEA（83 μL）を用いて逐次伸長反応（室温、30分）を行った。【０２９３】
次いで、TFA処理（95％ TFA／5％ m−cresol）によりBoc基を脱保護した後、Boc−HN−C5H10−COOH（68 mg、180 μmol）、縮合剤HATU（68 mg、180 μmol）とDIEA（83 μL）を用いて逐次伸長反応（室温、30分）を行った。【０２９４】
更に、Pd(PPh3)4のCHCl3/ AcOH / N-methylmorphorine溶液（312 mg, 2.8 mL, 1.5 mL, 0.75 mL、室温30分）にて2度処理し、Alloc基を脱保護した。次いで、Alloc−Arg(Pbf)−OH（459 mg、900 μmol）を、縮合剤HATU（340 mg、900 μmol）とDIEA（157 μL）を用いて縮合させた（室温、30分）。この操作を計2回繰り返した。【０２９５】
更に、Pd(PPh3)4のCHCl3/ AcOH / N-methylmorphorine溶液（312 mg, 2.8 mL, 1.5 mL, 0.75 mL、室温30分）にて2度処理し、Alloc基を脱保護した。次いで、Boc−Arg(Pbf)−OH・IPE（474 mg、900 μmol）を、縮合剤HATU（340 mg、900 μmol）とDIEA（157 μL）を用いて縮合させた（室温、30分）。
最後に、1N NaOHのdioxane水溶液（70％ dioxane／30％ 水）にて、固相担体oximeからの切り出しを行い（室温、5分）、中和後、目的物（一般式(1a-1)で示される化合物）を得た。【０２９６】
【化６３】
2006115230.tif 000068
2006115230.tif 000069
【０２９７】
実施例１１  一般式(1a-2)で示される化合物の合成
下記に示す反応工程に従って、以下の一般式で表される化合物(1a-2)を合成した。【０２９８】
【化６４】
2006115230.tif 000070
【０２９９】
具体的には、標準的tBoc法（cf．Koch, T.; Hansen, H.F.; Andersen, P.; Larsen, T.; Batz, H.G.; Otteson, K.; Orum, H. J. Peptide Res. 1997, 49, 80-88.）に従い、まず、固相担体Oxime（100 mg, 120 μmol）にリンカー用ω−アミノ酸であるBoc−HN−C5H10−COOH（181 mg、480 μmol）、縮合剤DCC（124 mg、480 μmol）を用いて縮合反応（室温、15時間）を行った。TFA処理（95％ TFA／5％ m−cresol）によりBoc基を脱保護した後、Boc−HN−C5H10−COOH（68 mg、180 μmol）、縮合剤HATU（68 mg、180 μmol）とDIEA（83 μL）を用いて逐次伸長反応（室温、30分）を行った。【０３００】
次に、TFA処理（95％ TFA／5％ m−cresol）によりBoc基を脱保護した。その後、下記一般式(111)で表される化合物（19.9 mg、180 μmol）を、縮合剤HATU（41 mg、180 μmol）とDIEA（37.5 μL）を用いて縮合させた（室温、30分）。この操作を計5回繰り返した。【０３０１】
【化６５】
2006115230.tif 000071
【０３０２】
次いで、TFA処理（95％ TFA／5％ m−cresol）によりBoc基を脱保護した後、Boc−HN−C5H10−COOH（68mg、180 μmol）、縮合剤HATU（68 mg、180μmol）とDIEA（83μL）を用いて逐次伸長反応（室温、30分）を行った。
次いで、TFA処理（95％ TFA／5％ m−cresol）によりBoc基を脱保護した後、Fmoc−HN−C5H10−COOH（64mg、180 μmol）、縮合剤HATU（68 mg、180μmol）とDIEA（83μL）を用いて逐次伸長反応（室温、30分）を行った。
更に、Pd(PPh3)4のCHCl3/ AcOH / N-methylmorphorine溶液（312 mg, 2.8 mL, 1.5 mL, 0.75 mL、室温30分）にて2度処理し、Alloc基を脱保護した。次いで、Alloc−Arg(Pbf)−OH（459 mg、900 μmol）を、縮合剤HATU（340 mg、900 μmol）とDIEA（157 μL）を用いて縮合させた（室温、30分）。この操作を計2回繰り返した。【０３０３】
更に、Pd(PPh3)4のCHCl3/ AcOH / N-methylmorphorine溶液（312 mg, 2.8 mL, 1.5 mL, 0.75 mL、室温30分）にて2度処理し、Alloc基を脱保護した。次いで、Boc−Arg(Pbf)−OH・IPE（474 mg、900 μmol）を、縮合剤HATU（340 mg、900 μmol）とDIEA（157 μL）を用いて縮合させた（室温、30分）。【０３０４】
最後に、1N NaOHのdioxane水溶液（70％ dioxane／30％ 水）にて、固相担体oximeからの切り出しを行い（室温、5分）、中和後、目的物（一般式(1a-2)で示される化合物）を得た。【０３０５】
【化６６】
2006115230.tif 000072
【０３０６】
2006115230.tif 000073
【０３０７】
実施例１２  一般式(1a-3)で示される化合物の合成
下記に示す反応工程に従って、以下の一般式で表される化合物(1a-3)を合成した。【０３０８】
【化６７】
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【０３０９】
参考試験例１  核酸導入実験（オリゴDNAレベル）
12ウェルプレートに、PC3 (Human lung adenocarcinoma)細胞、UMUC3 (Human bladder carcinoma)細胞、T24 (Human urinary bladder carcinoma)細胞或いはNIH−3T3 (Mouse embryonic fibroblast)細胞を、10%FBS含有RPMI培地（PC3細胞、NIH-3T3細胞、T24細胞）或いは10%FBS含有DMEM培地（UMUC細胞）で予め培養し、60-70％コンフルエントの状態にした。【０３１０】
表１に示す化合物［化合物（1-A）又は（1-B）を各々
0.37、0.13、0.04mMとした溶液］1 μlを無血清培地50 μLに加え、タッピングにより混合し、室温で5分間インキュベートした。次に、上記で調製した核酸導入用担体含有培地に、FITC標識一本鎖DNA（20 mer）（FITC-TAATACGACTCACTATAGGG : プロリゴ社製）0.3μgを添加し、タッピングにより混合し、37℃で30分間インキュベートした（10分おきにタッピングし混合）。得られた混合液を、細胞培養後の上記のウェルに添加し、軽くゆすって均一化した後で37 ℃で4時間インキュベートした。細胞を回収し、FACSのよりFITC陽性細胞を測定することにより、DNAの細胞内への導入効率（％）を算出した。また、従来の核酸導入用担体（Lipofectamine 2000、TransIt-TKO、Fugene 6）との比較を行うため、導入核酸量0.3μgに対応した各社推奨プロトコルを使用して、上記と同様に、PC3細胞内へのsiRNAの導入効率（％）を求めた。【０３１１】
得られた結果を表１に示す。この結果から、化合物（1-A）又は（1-B）には、細胞内へ核酸を透過させる作用に優れており、核酸導入用担体として有用であることが確認された。【０３１２】
【表１】
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【０３１３】
参考例１−１７  核酸導入用担体の作成
適当な大きさのガラス容器（ナスフラスコやキュベットなど）に有機溶媒に溶かした脂質および前述のカチオニックリポソーム構成ユニットを入れ（構成は表２に示す）、ロータリーエバポレーターで溶媒を留去した（フィルムの作製）。真空条件下（6時間以上）で完全に溶媒を除いた後、リン酸緩衝液（PBS buffer、pH 7.4）で最終濃度が2.0 mMになるように水和し、形成されたフィルムを完全にはがし、脂質サスペンジョンを作製した。このサスペンジョンをドライアイスバスとぬるま湯に交互に付けるという“Freeze-thaw”操作を10回繰り返し行い、多重層リポソーム（MLV：multilamellar vesicle）を作製した。【０３１４】
次いで、MLVは粒径200〜100 nm程度のLUV(large unilamellar vesicle)、又は粒径20nm程度のSUV(small unilamellar vesicle)に調整した。LUVは標準的な作製装置（Avanti社製Mini-Extruder）により作製した。また、SUVはプローブチップ型ソニケーター（TOMY社製UD-220）により作製した。【０３１５】
【表２】
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【０３１６】
参考試験例２  核酸導入実験（siRNAレベル）
PC3 (Human lung adenocarcinoma)細胞、UMUC3 (Human bladder carcinoma)細胞、或いはT24 (Human urinary bladder carcinoma)細胞を、siRNA導入時に50-60％コンフルエントとなるように、導入前日に6ウェルプレートへ播種し37℃、５% CO2インキュベータで培養した。【０３１７】
1.5mlのチューブに100μlのOpti-MEMを加えて、これに参考例３又は８の核酸導入用担体を含有するPBS溶液（各核酸導入用担体の含有量は、化合物(1L-A)が0.067mMとなるように調整）1、3又は10μlを添加し、室温でおよそ10分静置した後に、更にFITC標識siRNA（蛍光標識siRNA（（sense）Fluo-GACCCGCGCCGAGGUGAAGUU/（Antisence）CUUCACCUCGGCGCGGGUCUU：プロリゴ社製）0.5μgを添加し、15分間静置し、siRNAと遺伝子導入用担体との複合体を形成した。【０３１８】
また、別途、1.5mlのチューブに50μlのOpti-MEMを加えて、これに0.6mMの化合物（1-A）又は（1-B）を含有するPBS溶液1 、3、10μlを添加し、タッピングにより混合し、室温で5分間静置した後に、更にFITC標識siRNA（上記と同様）0.5μgを添加し、30分間静置し、siRNAと遺伝子導入用担体との複合体を形成した。【０３１９】
斯くして調製したsiRNAと遺伝子導入用担体の含有液を、細胞が50-60％コンフルエントで存在している各ウェルに添加し、プレートを前後左右に、緩やかに揺らした後、37℃、5%CO2条件下で2時間培養した。培養後、FITC陽性細胞をフローサイトメーターで測定することにより、細胞内へのsiRNAの導入効率（％）を算出した。また、従来の核酸導入用担体（Lipofectamine 2000、TransIt-TKO、Metafectene、oligofectamine）との比較を行うため、導入核酸量0.5μgに対応した各社推奨プロトコルを使用して、上記と同様に、細胞内へのsiRNAの導入効率（％）を求めた。【０３２０】
得られた結果を表３に示す。この結果から、化合物(1L-A)を使用することにより、従来公知の核酸導入用担体に比べて、細胞内へsiRNAを効率的に導入できることが明らかとなった。【０３２１】
【表３】
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【０３２２】
試験例３  核酸導入実験（プラスミドDNAレベル）
PC3 (Human lung adenocarcinoma)細胞がプラスミドDNA導入時に60-70％コンフルエントとなるように、導入前日に6ウェルプレートへ播種し37℃、５% CO2条件下で培養した。各ウェル中の培養液を、導入2時間前に無血清培地（RPMI培地）に置換した。【０３２３】
1.5mlのチューブに250μlのOpti-MEMを加えて、これに参考例３の核酸導入用担体を含有するPBS溶液（各核酸導入用担体の含有量は、化合物(1L-A)が0.133mMとなるように調整）5μlを添加し、室温でおよそ10分静置した後に、更に、これにEGFP組み換えプラスミドDNA（pEGFP-N3）を含むOpti-MEM（pEGFP-N3の濃度：5.0 μg/250ml）250μlを添加し、軽くタッピング後、15分間静置し、プラスミドDNAと核酸導入用担体との複合体を形成した。【０３２４】
斯くして調製したsiRNAと遺伝子導入用担体の含有液を、細胞が60-70％コンフルエントで存在している各ウェルに添加し、プレートを前後左右に、緩やかに揺らした後、37℃、5%CO2条件下で2時間培養した後に、完全培地に置換し、37℃、5 % CO2 条件下で更に45時間培養した（合計47時間）。培養後、GFP（緑色蛍光タンパク質）の陽性細胞をフローサイトメーターで測定することにより、細胞内へのプラスミドDNAの導入効率（％）を算出した。【０３２５】
また、従来の核酸導入用担体（FuGene 6、Lipofectamine 2000、Metafectene）との比較を行うため、各社推奨プロトコルに順じて、細胞内へのプラスミドDNAを導入し、上記と同様に導入効率（％）を求めた。【０３２６】
得られた結果を表４に示す。この結果から、化合物(1L-A)を使用することにより、細胞内へプラスミドDNAを導入できることが明らかとなった。【０３２７】
【表４】
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【０３２８】
参考試験例４  核酸導入実験（siRNAレベル）
PC3(Human lung adenocarcinoma)/Bcl-2細胞（PC3へBcl-2挿入プラスミドを導入した細胞）がsiRNA導入時に50-60％コンフルエントとなるように、導入前日に6ウェルプレートへ播種し37℃、５% CO2インキュベータで培養した。【０３２９】
1.5mlのチューブに、100μlのOpti-MEMを添加し、これに参考例３の核酸導入用担体を含有するPBS溶液（各核酸導入用担体の含有量は、化合物(1L-A)が0.067mMとなるように調整）6μlを添加し、室温で10分間プレインキュベートした。これに、13.5-450pmolのbcl-2対応siRNA（siRNA（（sense）GACCCGCGCCGAGGUGAAGUU/（Antisence）CUUCACCUCGGCGCGGGUCUU：プロリゴ社製）を添加し、15分間静置して、siRNAと遺伝子導入用担体との複合体を形成させた。これを、50-60％コンフルエントの状態で細胞が存在するウェルへ滴下し、37℃で約48時間インキュベートした。培養後、標準的なウェスタンブロット法により、bcl-2タンパク質発現を検出した。【０３３０】
また、従来の核酸導入用担体（Roche社製XtremeGene）との比較を行うため、導入核酸量0.5μgに対応した推奨プロトコルを使用して、上記と同様に、細胞内へbcl-2対応siRNAを導入効率した（lane2,3）。また、標的配列を有さないGFP対応siRNAが複合体で導入された場合でも、bcl-2タンパク質発現の抑制効果を引き起こさないことを証明した（lane4）。各laneの詳細な導入条件に関しては下表に示す。【０３３１】
得られた結果を図１に示す。この結果から、化合物(1L-A)を使用することにより、従来公知の核酸導入用担体に比べて、細胞内へ導入されたsiRNAが効率的にタンパク質発現抑制効果を示すことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０３３２】
本発明の一般式(1)で示される化合物は、側鎖にアミノ酸又はオリゴペプチドを有しており、これらのアミノ酸又はオリゴペプチドに基づく有用活性を一層効果的に発揮できる。特に、一般式(1)で示される化合物において、アルギニン、リジン、及びセリンよりなる群から選択されるアミノ酸又はこれらのアミノ酸を含むオリゴペプチドを備えることによって、膜透過機能を効果的に発揮することができる。【０３３３】
また、本発明の一般式(1a)で示される化合物は、遊離アミノ基が保護基で保護されており、且つ繰返単位Cの末端に遊離カルボキシル基が存在している。従って、一般式(1a)で示される化合物は、アミノ基又は水酸基を有する標的化合物に対して容易に縮合反応できるので、アミノ酸又はオリゴペプチドに基づく有用活性を該標的化合物に付与することができる。
【図１】
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【国際調査報告】
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