(57)【要約】本発明は、所望のタンパク質をコードしているｍＲＮＡを固相に固定してなる固相固定化ｍＲＮＡと、翻訳系とを接触させることを含む、タンパク質をその機能が発揮されるように正しくフォールディングされた状態となるように効率よく合成するタンパク質合成法、タンパク合成装置などを提供する。本発明のタンパク質合成法、タンパク質合成装置などは、有用タンパク質の大量合成などに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望のタンパク質をその機能が発揮されるように正しくフォールディングされた状態となるように合成するタンパク質合成法であって、そのタンパク質をコードしているｍＲＮＡの３’末端をビオチン等で固相に固定してなる固相固定化ｍＲＮＡと、翻訳系とを接触させることを含む、タンパク質合成法。
【請求項２】
前記翻訳系が無細胞翻訳系である請求項１記載のタンパク質合成法。
【請求項３】
前記固相固定化ｍＲＮＡが、ｍＲＮＡの３’末端にリンカーを介して固相に固定化されたものである請求項１又は２に記載のタンパク質合成法。
【請求項４】
前記固相固定化ｍＲＮＡが、前記リンカーに設けた固相結合部位を介して固相に結合されている、請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質合成方法。
【請求項５】
前記リンカーが、ポリヌクレオチド、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、ペプチド核酸又はこれらの組合せを主骨格として含むものである、請求項３又は４に記載のタンパク質合成方法。
【請求項６】
前記固相固定化ｍＲＮＡの終止コドンとｍＲＮＡ固定化位置の距離が１０ｎｍ以下である、請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質合成方法。
【請求項７】
前記固相が、スチレンビーズ、ガラスビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、磁性体ビーズ、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板、ガラス容器、プラスチック容器及びメンブレンから選択される、請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質合成方法。
【請求項８】
前記固相の表面が親水性である、請求項１〜７のいずれかに記載のタンパク質合成方法。
【請求項９】
所望のタンパク質をその機能が発揮されるように正しくフォールディングされた状態となるように合成するための固相固定化ｍＲＮＡであって、所望のタンパク質をコードしているｍＲＮＡをリンカーを介して固相に固定してなることを特徴とする、固相固定化ｍＲＮＡ。
【請求項１０】
前記固相固定化ｍＲＮＡが、ｍＲＮＡの３’末端にリンカーを介して固相に固定化されたものである請求項９に記載の固相固定化ｍＲＮＡ。
【請求項１１】
前記固相固定化ｍＲＮＡが、前記リンカーに設けた固相結合部位を介して固相に結合されている、請求項９又は１０に記載の固相固定化ｍＲＮＡ。
【請求項１２】
前記リンカーが、ポリヌクレオチド、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、ペプチド核酸又はこれらの組合せを主骨格として含むものである、請求項９〜１１のいずれかに記載の固相固定化ｍＲＮＡ。
【請求項１３】
前記固相固定化ｍＲＮＡの終止コドンとｍＲＮＡ固定化位置の距離が１０ｎｍ以下である、請求項９〜１２のいずれかに記載の固相固定化ｍＲＮＡ。
【請求項１４】
前記固相が、スチレンビーズ、ガラスビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、磁性体ビーズ、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板、ガラス容器、プラスチック容器及びメンブレンから選択される、請求項９〜１３のいずれかに記載の固相固定化ｍＲＮＡ。
【請求項１５】
前記固相の表面が親水性である、請求項９〜１４のいずれかに記載の固相固定化ｍＲＮＡ。
【請求項１６】
所望のタンパク質をその機能が発揮されるように正しくフォールディングされた状態となるように合成するタンパク質合成装置であって、所望のタンパク質をコードしているｍＲＮＡをリンカーを介して固相に固定してなる固相固定化ｍＲＮＡを含むことを特徴とする、タンパク質合成装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、所望のタンパク質をその機能が発揮されるように正しくフォールディングされた状態となるように合成するタンパク質合成法、この合成法に用いる固相固定化ｍＲＮＡ及びタンパク質合成装置等に関する。
【背景技術】  １９８８年のＳｐｉｒｉｎらによる無細胞翻訳系の連続合成（Ａ．Ｓ．Ｓｐｉｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４参照）、それに続く遠藤らの小麦胚芽系の改良（特開２００２−３３８５９７号公報等参照）等により無細胞翻訳系はタンパク質を大量に合成する実用的手段になってきた。最近、大手製薬企業やベンチャー企業もこの分野に参入し、様々な応用に向けて研究開発がなされている。
一方、タンパク質は合成されただけでは機能せず、正しく畳み込まれる（フォールディング）ことが不可欠である。これに関する研究も精力的に行われているが、技術的にはシャペロンと呼ばれるフォールディングを促進するタンパク質を加えるなどでフォールディングの効率を高める方法が一般的である。無細胞翻訳系で用いられる材料、条件等の研究は種々行われているものの（特開平６−９８７９０号公報、特開平６−２２５７８３号公報、特開平７−１９４号公報、特開平９−２９１号公報、特開平７−１４７９９２号公報等参照）、現在のところフォールディング効率を高める技術的手法は開発されていない。このため、現在では、所望のタンパク質を合成する場合は、従来の無細胞翻訳系にてそのタンパク質を正しくフォールディングしているものとそうでないものを大量に合成し、結果として正しくフォールディングしたタンパク質を含むタンパク質混合物として所望のタンパク質を得ている。つまり、従来法による場合は、無駄なタンパク質を大量に合成しているのが現状である。
【発明の開示】
上記したように、無細胞翻訳系は、各種実験材料として用いるタンパク質の合成法として画期的なものであったが、さらに効率良く、その機能を発揮するようにフォールディングされたタンパク質を効率良く合成する方法の開発が望まれていた。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、ｍＲＮＡを固相に固定化した後に翻訳系を加え合成した場合に、合成されるタンパク質が効率良く正しくフォールディングされ、合成されたタンパク質の活性が全体として顕著に上昇することを見出し、本発明を完成させたものである。したがって、本発明は、次のようなタンパク質合成方法、これに用いる固相固定化ｍＲＮＡ、タンパク質合成装置等を提供する。
（１）所望のタンパク質をその機能が発揮されるように正しくフォールディングされた状態となるように合成するタンパク質合成法であって、そのタンパク質をコードしているｍＲＮＡの３’末端をビオチン等で固相に固定してなる固相固定化ｍＲＮＡと、翻訳系とを接触させることを含む、タンパク質合成法。
（１ａ）所望のタンパク質をその機能が発揮されるように正しくフォールディングされた状態となるように合成するタンパク質合成法であって、そのタンパク質をコードしているｍＲＮＡを固相に固定してなる固相固定化ｍＲＮＡと、翻訳系とを接触させることを含む、タンパク質合成法。
（２）前記翻訳系が無細胞翻訳系である前記請求項１記載のタンパク質合成法。
（３）前記固相固定化ｍＲＮＡが、ｍＲＮＡの３’末端にリンカーを介して固相に固定化されたものである前記（１）又は（２）に記載のタンパク質合成法。
（４）前記固相固定化ｍＲＮＡが、前記リンカーに設けた固相結合部位を介して固相に結合されている、前記（１）〜（３）のいずれかに記載のタンパク質合成方法。
（５）前記リンカーが、ポリヌクレオチド、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、ペプチド核酸又はこれらの組合せを主骨格として含むものである、前記（３）又は（４）に記載のタンパク質合成方法。
（６）前記固相固定化ｍＲＮＡの終止コドンとｍＲＮＡ固定化位置の距離が１０ｎｍ以下である、前記（１）〜（５）のいずれかに記載のタンパク質合成方法。
（７）前記固相が、スチレンビーズ、ガラスビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、磁性体ビーズ、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板、ガラス容器、プラスチック容器及びメンブレンから選択される、前記（１）〜（６）のいずれかに記載のタンパク質合成方法。
（８）前記固相の表面が親水性である、前記（１）〜（７）のいずれかに記載のタンパク質合成方法。
（９）所望のタンパク質をその機能が発揮されるように正しくフォールディングされた状態となるように合成するための固相固定化ｍＲＮＡであって、所望のタンパク質をコードしているｍＲＮＡをリンカーを介して固相に固定してなることを特徴とする、固相固定化ｍＲＮＡ。
（１０）前記固相固定化ｍＲＮＡが、ｍＲＮＡの３’末端にリンカーを介して固相に固定化されたものである前記（９）に記載の固相固定化ｍＲＮＡ。
（１１）前記固相固定化ｍＲＮＡが、前記リンカーに設けた固相結合部位を介して固相に結合されている、前記（９）又は（１０）に記載の固相固定化ｍＲＮＡ。
（１２）前記リンカーが、ポリヌクレオチド、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、ペプチド核酸又はこれらの組合せを主骨格として含むものである、前記（９）〜（１１）のいずれかに記載の固相固定化ｍＲＮＡ。
（１３）前記固相固定化ｍＲＮＡの終止コドンとｍＲＮＡ固定化位置の距離が１０ｎｍ以下である、前記（９）〜（１２）のいずれかに記載の固相固定化ｍＲＮＡ。
（１４）前記固相が、スチレンビーズ、ガラスビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、磁性体ビーズ、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板、ガラス容器、プラスチック容器及びメンブレンから選択される、前記（９）〜（１３）のいずれかに記載の固相固定化ｍＲＮＡ。
（１５）前記固相の表面が親水性である、前記（９）〜（１４）のいずれかに記載の固相固定化ｍＲＮＡ。
（１６）所望のタンパク質をその機能が発揮されるように正しくフォールディングされた状態となるように合成するタンパク質合成装置であって、所望のタンパク質をコードしているｍＲＮＡをリンカーを介して固相に固定してなる、固相固定化ｍＲＮＡを含むことを特徴とする、タンパク質合成装置。
上記構成からなる本発明のタンパク質合成法等は、例えば、次のような効果を奏する。
（１）ｍＲＮＡの３’末端を固定化するだけで、特に高価なシャペロン等のタンパク質を加えずに機能性タンパク質を取得できる。
（２）原核細胞と真核細胞では利用できるシャペロンが異なるが、本発明の方法では翻訳系の種類を問わないという利点がある。
（３）ｍＲＮＡの３’末端を固定化するためにエクソヌクレアーゼに対して耐性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、実施例１で得られたアルデヒド還元酵素（ＡＬＲ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
図２は、実施例１で得られたアルデヒド還元酵素（ＡＬＲ）の酵素活性を示すグラフである。
図３は、従来の液相タンパク質合成法と本発明の固相タンパク質合成を比較する概略図である。
図４、実施例２で合成されたＧＦＰのＤＮＡコンストラクトの構造を示す概略図である。
図５は、実施例２で行われた液相合成と固相合成によって得られたＧＦＰの合成量を示すグラフである。
図６は、実施例２で行われた液相合成と固相合成によって得られたＧＦＰの活性（蛍光強度）を示すグラフである。
図７は、実施例２で行われた液相合成と固相合成によって得られたＧＦＰのフォールディング効率を示すグラフである。
図８は、実施例３で行われた親水性および疎水性の固相を用いた固相合成によって得られたＧＦＰの活性（蛍光強度）を示すグラフである。
図９は、実施例３で行われた親水性および疎水性の固相を用いた固相合成によって得られたＡＫＲおよび液相合成で得られたＡＫＲの活性を示すグラフである。
図１０は、実施例４で用いられた、固定化ＧＦＰ−ｍＲＮＡの終止コドンと固定化位置の距離ｄの関係を示す図である。
図１１は、実施例４で行われたｍＲＮＡの固定化位置と終止コドン間の距離（ｄ）が異なる固定化ｍＲＮＡを用いた固相合成で得られたＧＦＰの活性（蛍光強度）を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明をその実施態様に基づいて詳細に説明する。
本発明は、所望のタンパク質をその機能が発揮されるように正しくフォールディングされた状態となるように合成するタンパク質合成法に関する。本発明のタンパク質合成法においては、所望のタンパク質をコードしているｍＲＮＡを固相に固定してなる固相固定化ｍＲＮＡと、翻訳系とを接触させることを含むことを特徴としている。本発明は、所望のタンパク質を翻訳する際にそれをコードするｍＲＮＡの一端が固相に固定していた場合に、合成されるタンパク質のフォールディングが効率良く行われるという着想に基づいている。ここで、「所望のタンパク質」とは、合成の対象とする特定のタンパク質のことをいう。所望のタンパク質としては、特に限定されるものではないが、例えば、その機能解析が必要なタンパク質、その立体構造を解析するためのタンパク質など実験材料として必要なタンパク質も含むし、また、機能が確認済みの有用タンパク質（例えば、医薬として用いられるタンパク質）も含む。
本発明の対象となる有用タンパク質としては、例えば、インターフェロン、インターロイキン等のサイトカイン；インスリン、グルカゴン、セクレチン、ガストリン、コレシストキニン、オキシトシン、バソプレッシン、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、プロラクチン、黄体形成ホルモン、濾胞刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ソマトスタチン等のホルモン；エンドルフィン、エンケファリン、ダイノルフィン等のオピオイドペプチド；フィブリノーゲン、プロトロンビン等の血液凝固因子；ジヒドロ葉酸還元酵素、アミログリコシダーゼ、アミラーゼ、インベルターゼ、イソアミラーゼ、プロテアーゼ、パパイン、ペプシン、レンニン、セルラーゼ、ペクチナーゼ、リパーゼ、ラクターゼ、グルコースオキシダーゼ、リゾチーム、グルコースイソメラーゼ、キモトリプシン、トリプシン、チトクローム、セアプローゼ、セラチオペプチダーゼ、ヒアルロニダーゼ、ブロメライン、ウロキナーゼ、ヘモコアグラーゼ、サーモライシン、ウレアーゼ等の酵素；ＳＳＩ等のプロテアーゼインヒビター；さらに、アルブミン、グロブリン、グロビン、ケラチン、コラーゲン等のタンパク質や各種ペプチドが挙げられる。このように、本発明によれば、医薬として有用なタンパク質や、実験材料として有用なタンパク質を、そのタンパク質が本来の機能を果たすように正しくフォールディングされた状態で効率良く合成することができるという利点がある。このため、医薬として用いるタンパク質であれば、その後に必要な単離、精製工程を省略あるいは簡略化することができるという利点もある。
なお、本明細書中、「その機能が発揮されるように正しくフォールディングされた状態」とは、例えば、そのタンパク質が酵素であれば、その酵素活性を発揮するような立体構造をとるように折り畳まれた状態を意味する。
（固相固定化ｍＲＮＡ）
本発明の第２の態様は、所望のタンパク質をその機能が発揮されるように正しくフォールディングされた状態となるように固相タンパク質合成を達成するために用いられる固相固定化ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ−固相連結体）に関する。本発明の固相固定化ｍＲＮＡは、所望のタンパク質をコードしているｍＲＮＡをリンカーを介して固相に固定してなることを特徴とする。本発明で用いられる固相固定化ｍＲＮＡは、通常、ｍＲＮＡの３’末端にリンカーを介して固相に固定されている。
本発明の固相固定化ｍＲＮＡは、通常、このリンカーに設けられた固相結合部位を介して固相に固定化される。ここで、「リンカー」とは、翻訳がされ易いように、固相とｍＲＮＡとに所定の距離を設けるためにあり、そのような機能を達成する限り特に限定されないが、柔軟性があり、親水性で、側鎖の少ない単純な構造を有する骨格を有するものが好ましい。具体的には、ここで用いられるリンカーとして、これらに限定されないが、ポリヌクレオチド（１本鎖もしくは２本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ含む）、ポリエチレンなどのポリアルキレン、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ポリスチレン等の直鎖状物質又はこれらの組合せを主骨格として含むものが好ましく用いられる。なお、本明細書で、「主骨格として含む」とは、例えば、リンカーの骨格全長に対して、その骨格を６０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上含むことをいう。上記直鎖上物質を組み合わせて用いる際は、適宜、それらを適当な連結基（−ＮＨ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［ｎは例えば１〜１０、好ましくは１〜３］、−Ｓ−、−ＳＯ−など）で化学的に連結することができる。本発明で用いるリンカーは、翻訳効率などを考慮して、好ましくは２〜１００ｍｅｒ、より好ましくは５〜５０ｍｅｒ、さらに好ましくは１０〜３０ｍｅｒの長さを有する。なお、本発明のリンカーは、公知の化学合成の手法を用いて作成することができる。
ｍＲＮＡとリンカーとの連結は、公知の手法を用いて直接的又は間接的に、化学的又は物理的に行うことができる。例えば、ＤＮＡをリンカーとして用いる場合は、ｍＲＮＡの３’末端にそのＤＮＡリンカーの末端と相補的な配列を設けておくことにより、両者を連結することができる。
タンパク質を、そのタンパク質が本来の機能を果たすように正しくフォールディングされた状態で合成するためには、固相固定化ｍＲＮＡの終止コドンと固相表面への固定化位置の距離は、好ましくは２０ｎｍ以下、より好ましくは１５ｎｍ以下、さらに好ましくは１０ｎｍ以下、特に好ましくは５ｎｍ以下である。
（ｍＲＮＡの固相固定化）
本発明で用いられる固相としては、生体分子を固定する担体となるものを用いることができ、例えば、スチレンビーズ、ガラスビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、磁性体ビーズ等のビーズ；ガラス基板、シリコン（石英）基板、プラスチック基板、金属基板（例えば、金箔基板）等の基板；ガラス容器、プラスチック容器等の容器；ニトロセルロース、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）等の材料からなるメンブレンなどが挙げられる。本発明において好ましく用いられる固相はビーズである。
固相表面は親水性であるのが、タンパク質をその機能が発揮されるように正しくフォールディングされた状態で合成するために好ましい。親水性の固相表面としては、その固相にｍＲＮＡを固定化してタンパク質を固相合成した場合に、タンパク質が正しくフォールディングされるものであればよく、例えば、固相表面に親水基を有するものが挙げられる。親水基としては、例えば、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、アミド基、スルホン酸ナトリウム、糖鎖、などが挙げられる。表面が親水性である固相としては、例えば、表面に水酸基、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基などの親水基を有するポリマービーズ（例えば、スチレンビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズなど）；ガラスビーズなどが挙げられる。
本発明の固相固定化ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡが翻訳系と接触する際に、その翻訳の障害とならないように固相に固定されれば、その固定化手段は特に限定されない。通常は、ｍＲＮＡに連結するリンカーに固相結合部位を設け、その固相結合部位を、固相に結合させた「固相結合部位認識部位」を介して、ｍＲＮＡを固相に固定する。固相結合部位は、ｍＲＮＡを所望の固相に結合し得るものであれば特に限定されない。例えば、このような固相結合部位として、特定のポリペプチドに特異的に結合する分子（例えば、リガンド、抗体など）が用いられ、この場合は、固相表面には固相結合部位認識部位として、その分子と結合する特定のポリペプチドを結合させておく。固相結合部位認識部位／固相結合部位の組合せの例としては、例えば、アビジン及びストレプトアビジン等のビオチン結合タンパク質／ビオチン、マルトース結合タンパク質／マルトース、Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、ＤＮＡ結合タンパク質／ＤＮＡ、抗体／抗原分子（エピトープ）、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ、あるいはエストラジオール受容体タンパク質／エストラジオールなどの、各種受容体タンパク質／そのリガンドなどが挙げられる。これらの中で、固相結合部位認識部位／固相結合部位の組合せとしては、アビジン及びストレプトアビジンなどのビオチン結合タンパク質／ビオチン、マルトース結合タンパク質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、抗体／抗原分子（エピトープ）などが好ましく、特にストレプトアビジン／ビオチンの組合せが最も好ましい。
上記タンパク質の固相表面への結合は、公知の方法を用いることができる。そのような公知の方法としては、例えば、タンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジゾン、トルエン−２，４−ジイソシアネート、アミノ基、カルボキシル基、又は水酸基あるいはアミノ基などを利用する方法を挙げることができる（Ｐ．Ｍ．Ａｂｄｅｌｌａ，Ｐ．Ｋ．Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．Ｒｏｙｅｒ，Ａ  Ｎｅｗ  Ｃｌｅａｖａｂｌｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，８７，７３４（１９７９）等参照）。
なお、上記組合せは、固相結合部位と固相結合部位認識部位とを逆転させて用いることもできる。上記の固定化手段は、２つの相互に親和性を有する物質を利用した固定化方法であるが、固相がスチレンビース、スチレン基板などのプラスチック材料であれば、必要に応じて、公知の手法を用いてリンカーの一部を直接それらの固相に共有結合させることもできる（Ｑｉａｇｅｎ社、ＬｉｑｕｉＣｈｉｐ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ等参照）。なお、本発明においては、固定手段については上記の方法に限定されることなく、当業者に公知である如何なる固定手段をも利用することができる。
（タンパク質の固相合成）
本発明の方法によれば、上記のようにして作製された固相固定化ｍＲＮＡと、翻訳系とを接触させることにより（例えば、該固相固定化ｍＲＮＡに翻訳系を投入、あるいは該固相固定化ｍＲＮＡを翻訳系に投入）、タンパク質を合成する。ここで用いることができる翻訳系としては、無細胞翻訳系又は生細胞翻訳系などが挙げられる。無細胞翻訳系としては、原核又は真核生物の抽出物により構成される無細胞翻訳系、例えば大腸菌、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽抽出物などが使用できる（Ｌａｍｆｒｏｍ  Ｈ，Ｇｒｕｎｂｅｒｇ−Ｍａｎａｇｏ  Ｍ．Ａｍｂｉｇｕｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙ  Ｕ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｂｂｉｔ  ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９６７  ２７（１）：１−６等参照）。生細胞翻訳系としては、原核又は真核生物、例えば大腸菌の細胞などが使用できる。
本発明においては、取り扱いの容易さから、無細胞翻訳系を使用することが好ましい。ここで、「無細胞翻訳系」とは、宿主生物の細胞の構造を機械的に破壊して得た懸濁液に、翻訳に必要なアミノ酸などの材料を加え、生細胞を用いないｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系のことをいう。無細胞翻訳系としては、既に使用可能なキットが市販されている。例えば、小麦胚芽抽出物を含む無細胞翻訳系キットがプロメガ社から市販されている。そのようなキットを用いる場合は、そのキットに添付のマニュアルにしたがって、効率良くタンパク質合成を行うことができる。また、無細胞翻訳系については、種々の文献が発行されており、本発明の実施に際してもそのような文献を参照することができる（例えば、上述の文献、特開平６−９８７９０号公報、特開平６−２２５７８３号公報、特開平７−１９４号公報、特開平９−２９１号公報、特開平７−１４７９９２号公報、特開平７−２０３９８４号公報、特開２０００−２３６８９６号公報、特開２００２−３３８５９７号公報等参照）。
無細胞翻訳系を用いるタンパク質合成は、公知のバッチ法であってもよいし、アミノ酸、エネルギー源等が連続供給される連続法（Ａ．Ｓ．Ｓｐｉｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４参照）であってもよい、アミノ酸としては、例えば、２０種類のＬ型アミノ酸が挙げられ、エネルギー源としては、例えば、アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン５’−三リン酸（ＧＴＰ）、クレアチンリン酸等が挙げられる。有用タンパク質を大量合成する場合は、連続法が好ましい。また、連続法の場合には、透析法を使用することもできる。透析法においては、透析膜を介してエネルギー源やアミノ酸などの合成基質が透析内液に供給され、反応副生物等を透析外液へ排除する。
本発明の方法により製造されたタンパク質は、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、培養物中（細胞破砕液、培養液、又はそれらの上清中）あるいは無細胞翻訳系の溶液中から単離精製することができる。
なお、本発明の第３の態様によれば、所望のタンパク質をその機能が発揮されるように正しくフォールディングされた状態となるように合成するタンパク質合成装置であって、所望のタンパク質をコードしているｍＲＮＡをリンカーを介して固相に固定してなる固相固定化ｍＲＮＡを含むことを特徴とする、タンパク質合成装置が提供される。このような装置は、例えば、複数の固相固定化ｍＲＮＡを固定した固定基盤と、その固定化基盤を収容し、上記のような無細胞翻訳系を導入して、翻訳を行う翻訳部、その翻訳部を所定の温度にコントロールする温度コントロール部、その翻訳部に上記のようなエネルギー源やアミノ酸源を供給するエネルギー源・アミノ酸源供給部、そのエネルギー源・アミノ酸源供給部から翻訳部にエネルギー源・アミノ酸源を供給する供給路、合成されたタンパク質を導出するタンパク質導出路などを備えることができる。
【実施例】  以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実験例１：ｍＲＮＡ固定化ビーズを用いたアルデヒド還元酵素（ＡＬＲ）の合成
（１）Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓ（ＩＶＶ）用リンカーＬｏｎｇ−Ｂｉｏｔｉｎ−ピューロマイシン  リンカー（ＬＢＰリンカー）の合成
まず、次のＤＮＡをＢＥＸ社から入手した。
（ｉ）Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓ［５’−（Ｓ）−ＴＣ（Ｆ）−（Ｓｐａｃｅｒ１８）−（Ｓｐａｃｅｒ１８）−（Ｓｐａｃｅｒ１８）−（Ｓｐａｃｅｒ１８）−ＣＣ−（Ｐｕｒｏ）−３’］
ここで、（Ｓ）は５’−Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６、（Ｐｕｒｏ）はピューロマイシンＣＰＧ、（Ｓｐａｃｅｒ１８）は商品名「Ｓｐａｃｅｒ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ１８」で化学名は（１８−０−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ，１−［（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）で次の化学構造を有する（以上すべてＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）。
2006052016.tif 000002
2006052016.tif 000003
なお、（Ｔ）はＡｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６  ｄＴ、（Ｔ−Ｂ）はＢｉｏｔｉｎ−ｄＴで、すべてＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅａｒｃｈ社製である。アンダーライン部分は制限酵素ＰｖｕＩＩのサイトを示す。
ＬＢＰリンカーは（ｉ）Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓと（ｉｉ）Ｂｉｏｔｉｎ−ｌｏｏｐを以下の方法に従って架橋し、その後精製した。
Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓ  １０ｎｍｏｌを、１００μｌの５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に溶かし、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ［２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ］ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ（ＴＣＥＰ、Ｐｉｅｒｃｅ社）を１μｌ加え（ｆｉｎａｌ  １ｍＭ）、室温で６時間放置し、Ｐｕｒｏ−Ｆ−ＳのＴｈｉｏｌを還元する。架橋反応を行う直前に５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で平衡化したＮＡＰ５（アマシャム、１７−０８５３−０２）を用いてＴＣＥＰを除いた。
０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）１００μｌに、５００ｐｍｏｌ／μｌのＢｉｏｔｉｎ−ｌｏｏｐ  ２０μｌ、１００ｍＭ架橋剤ＥＭＣＳ（３４４−０５０５１；６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ）、Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）２０μｌ、を加え、良く攪拌した後、３７℃で３０分放置した後に、未反応のＥＭＣＳを取り除いた。沈殿を減圧下で乾燥させた後、０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）１０μｌに溶かし、上記の還元したＰｕｒｏ−Ｆ−Ｓ（〜１０ｎｍｏｌ）を加えて４℃で一晩放置した。サンプルに最終で４ｍＭになるようにＴＣＥＰを加え室温で１５分放置した後、未反応のＰｕｒｏ−Ｆ−Ｓをエタノール沈殿で取り除き、未反応のＢｉｏｔｉｎ−ｌｏｏｐを取り除くために以下の条件でＨＰＬＣ精製を行った。
カラム；ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ  ＣＳＯＭＯＳＩＬ  ３７９１８−３１  １０ｘ２５０ｍｍ  Ｃ１８−ＡＲ−３００（Ｗａｔｅｒｓ）
ＢｕｆｆｅｒＡ；０．１Ｍ  ＴＥＡＡ、ＢｕｆｆｅｒＢ；８０％アセトニトリル（超純水で希釈したもの）
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ（Ｂ％：１５−３５％  ３３ｍｉｎ）
ＨＰＬＣの分画は１８％アクリルアミドゲル（８Ｍ尿素、６２℃）で解析し、目的の分画を減圧下で乾燥させた後、ＤＥＰＣ処理水で溶かして、１０ｐｍｏｌ／μｌにした。
（２）Ｔ４ＲＮＡリガーゼを用いたライゲーション酵素反応
ライゲーション反応はアルデヒド還元酵素（ＡＬＲ）ｍＲＮＡ１０ｐｍｏｌに対しリンカー１５ｐｍｏｌを加え２０μｌのＴ４  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ  ＤＴＴ；１ｍＭ  ＡＴＰ）でおこなった。酵素を加える前にアニーリングするため、７０℃で５分間ヒートブロックで温めた後、１０分間室温で冷やし氷上に置いた。ここに１μｌのＴ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（１０Ｕ／μｌ；Ｔａｋａｒａ），  １．５μｌのＴ４  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（４０Ｕ／μｌ；Ｔａｋａｒａ）と２μｌのＳＵＰＥＲａｓｅ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（２０Ｕ／μｌ；Ａｍｂｉｏｎ）を加え２５℃で２時間インキュベーションした。
（３）ｍＲＮＡ−リンカーの精製
上記（２）において連結されなかったリンカーを除去するためにＱＩＡＧＥＮ社のＲＮｅａｓｙキットを用いて添付のプロトコールに従い、上記（２）の最終産物を精製した。さらにこの精製したｍＲＮＡ−リンカー（３０−５０μｌ）は核酸共沈剤Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍによって添付のプロトコールに従い、翻訳の鋳型に適した濃度に濃縮した。
（４）ｍＲＮＡ−リンカーのストレプトアビジン（ＳｔＡＶ）ビーズへの固定
１ｐｍｏｌのＡＬＲ  ｍＲＮＡに対し４μｌのＴａｋａｒａ社ストレプトアビジンビーズ（Ｍａｇｎｏｔｅｘ−ＳＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに取り、マグネチックスタンドで１分間静置した後、上清を捨てた。残ったビーズを添付の１×Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで最初の体積の１０倍容量（４０μｌ）で洗浄後、さらに０．０１％ＢＳＡ溶液で洗浄した。この際、マグネチックスタンドを用いてビーズを保持して注意深く上清を分取した。ＡＬＲ  ｍＲＮＡ−リンカーと同体積の２×Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを混合し、ビーズの入ったチューブに加えた。ビーズを懸濁し、室温で１５分間ゆっくりチューブを回転させてインキュベーションした。結合後、ビーズを１０倍容の１×ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄後、０．０１％ＢＳＡ溶液で１回洗浄した。これを固定化ｍＲＮＡとして翻訳用に用いた。
（５）翻訳によるｍＲＮＡ−ピューロマイシンータンパク質連結体（ＩＶＶ）の合成
すべての試薬を混合攪拌し、遠心後、氷上に静置した。１００μｌ反応スケールの場合、以下のように調整した。
―メチオニンＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ２．５μｌ，―ロイシンＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ２．５μｌ，１Ｍ  Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ５μｌ，ＳＵＰＥＲａｓｅ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ８μｌを混合し、さらにＲｅｔｉｃｌｙｓａｔｅ６８μｌを泡が出ないようにゆっくりピペッティングした（試薬はすべてＡｍｂｉｏｎ社製）。
このように混合したものをＡＬＲｍＲＮＡ固定化ビーズの入ったチューブに移し、混合後、３０℃で３０分間インキュベートした。その後、１００ｍＭのＭｇＣｌ２と７００ｍＭのＫＣｌを加えて３７℃、９０分インキュベートした。次に、マグネティックスタンドで磁性ビーズをチューブ側面に集め、注意深く上清を捨てた。次に１×ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで２回ほど洗浄し、０．０１％ＢＳＡ溶液で１回洗浄した。さらに、１×ＰｖｕＩＩバッファーで洗浄した。
（６）ＩＶＶのＳｔＡＶビーズからの切り離しとＩＶＶのｍＲＮＡ部分の切り離し
上記（５）で合成したビーズ上で合成されたＩＶＶをビーズから切り離すために、ビーズの入ったチューブに最終体積が２０μｌになるようにＰｖｕＩＩ  ２０ユニット（東洋紡）と反応バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）を加え、３７℃で１時間、チューブをゆっくり回転させながら反応させた。次にマグネックスタンドでビーズを側面に集めて、上清を採取し新しいチューブに移した。
合成されたタンパク質を確認するためにｍＲＮＡ部分を切り離した。残された部分であるＡＬＲタンパク質―リンカーは、リンカーにＦＩＴＣ（蛍光分子）が付加されているため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認できる。具体的には、リンカーとｍＲＮＡの連結部分にＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリダイズ領域があることから、上述の上清にＴｔｈ−ＲＮａｓｅ−Ｈ（東洋紡）を１０ユニット加え、４０℃で２０分インキュベートした。これを１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、その結果を図１に示す。図１中、レーン１は、通常のｍＲＮＡを用いて合成したＡＬＲ（ＦＩＴＣ蛍光で標識）、レーン２はｍＲＮＡ−リンカーを液相中で合成した場合、レーン３はｍＲＮＡ−リンカーを固相上で合成した場合のタンパク質を示す。
（７）酵素活性アッセイ
アルデヒド還元酵素（ＡＬＲ）はＮＡＤＰＨ依存酵素でアルデヒドを含む基質を還元する際にＮＡＤＰＨをＮＡＤＰに変換する。この変化を吸光度や蛍光強度で定量的に測定した。
今回のＡＬＲの酵素活性は、３６０ｎｍの励起波長と４６５ｎｍの放射波長を持つＮＡＤＰＨの酵素依存的な減少を指標に蛍光分光的に解析した。蛍光は蛍光プレートリーダー（ＦｌｕＰｏｌｏ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ，Ｔａｋａｒａ）を用いて３０℃で測定した。上記（６）のＡＬＲ−ＩＶＶのＳｔＡＶビーズから切り離した上清、及び、ビーズに固定化したＡＬＲｍＲＮＡ−リンカーと等量のものをビーズに固定せずに液相中で合成した。その後、これをＳｔＡＶビーズに結合し、上記（６）に従い切り離した上清に基質として１０ｍＭグルクロネート（ｇｌｕｃｕｒｏｎａｔｅ）を加え、５０ｍＭカリウムリン酸バッファー（ｐＨ６．５）で１００μｌにした。次に０．２ｍＭ  ＮＡＤＰＨを加え、３０℃で１０分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーによってＮＡＤＰＨの蛍光強度の減少を測定した。具体的には、ＡＬＲによるＮＡＤＰＨの減少を４４０ｎｍの蛍光強度で測定した。この結果を、図２に示す。
（実験結果及び考察）
図１において、レーン２（ｍＲＮＡ−リンカーを液相中で合成した場合）と、レーン３（ｍＲＮＡ−リンカーを固相上で合成した場合）を比較すると、固相上で合成した場合より液相中で合成した場合の方が合成効率が高いことが確認された。しかし、酵素活性を検討すると、図２に示されるように、固定化されていない場合より固定化した場合の方が、ＮＡＤＰＨの減少が大きいことから酵素活性が高いことがわかった。
実施例２：固定化ｍＲＮＡを用いた緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の合成
（１）実験の概要
ｍＲＮＡを固相に固定化して合成した場合と液相で合成した場合では、合成したタンパク質のフォールディングまたは機能にどのような違いがあるかを確かめるために以下のような実験をした。ＧＦＰはフォールディングの程度が蛍光強度に比例すると考えられる。このためＧＦＰをコードしたｍＲＮＡを準備し、図３のようにｍＲＮＡを固相に固定化した場合と従来通り液相中で合成した場合で合成されたタンパク質の合成量、及び蛍光強度による機能発現量を比較した。
（２）ＤＮＡコンストラクトの作製
ＧＦＰを発現するために、図４に示すように、Ｔ７プロモーター領域、翻訳に必要な５’ＵＴＲ（Ｏｍｅｇａ）、また、３’側においてはリンカー領域（Ｓｐｃ）、ｍＲＮＡ固定化のためにビオチン付ＤＮＡと相補な配列（Ｌｉｎ−ｔａｇ）を有するコンストラクトを合成した。このために、下記に示す鋳型ＤＮＡ（ａ）、プライマー（ｂ）及び（ｃ）をＤＮＡ合成機を用いて合成した。
2006052016.tif 000004
次いで、上記鋳型ＤＮＡ（ａ）を鋳型として、プライマー（ｂ）及び（ｃ）を用いて、（１）アニーリング温度６９℃  ３０秒、（２）伸長温度  ７２℃  ４０秒、（３）変性温度９５℃  ３０秒を３０回繰り返し、という条件でＰＣＲを行った。
また、ＧＦＰの変異体ＧＦＰｗｔ５（阪大工学部  伊藤洋一郎氏より許可を得て使用）をコードしたプラスミドｐＥＴ−２１ａ（＋）（配列番号５）を鋳型として下記をプライマー（ｄ）及び（ｅ）を用いてＰＣＲを行った。
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ＰＣＲは、（１）アニーリング温度６９℃  ３０秒、（２）伸長温度  ７２℃  ４０秒、（３）変性温度  ９５℃  ３０秒を３０回繰り返し、という条件で行った。
次に、これによってできたＰＣＲ産物に、さらにＬｉｎ−ｔａｇ部分の配列をつなげた。このため、上記工程で得たＰＣＲ産物を鋳型として上記プライマー（ｄ）及び下記プライマー（ｆ）を用いてＰＣＲを行った。
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ＰＣＲは、（１）アニーリング温度６９℃  ３０秒、（２）伸長温度  ７２℃  ４０秒、（３）変性温度  ９５℃  ３０秒を３０回繰り返し、という条件で行った。
このようにして得られたＰＣＲ産物と上記（ａ）〜（ｃ）を用いて合成したＰＣＲ産物をプライマーなしで１０サイクルほど、アニーリング温度５５℃でＰＣＲを行った後に、（ｂ）と（ｆ）を用いてアニーリング温度６９℃  ３０秒、伸長温度  ７２℃  ４０秒、  変性温度  ９５℃  ３０秒を３０回繰り返した。
（３）転写
上記（２）で調整したＰＣＲ産物をフェノール抽出、エタノール沈殿で精製したのち、ＲｉｂｏＭａｘ転写キット（プロメガ社）を用いて添付のプロトコールに従いＲＮＡを合成した。
（４）ｍＲＮＡ固定化のためのリンカーＤＮＡ
上記（３）で合成したｍＲＮＡを３’末端で固相に結合するために下記のようにビオチンを含む塩基を導入したＤＮＡを合成した。
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ここで、（Ｔ−Ｂ）はビオチン付きチミン塩基である。
マイクロチューブに２ｐｍｏｌの上記（２）で調整したＧＦＰ−ｍＲＮＡと３ｐｍｏｌの（ｇ）のＤＮＡを加え、さらにタカラ社のＴ４  ＲＮＡリガーゼ添付バッファー  １０×Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ  バッファー２μｌ、０．１％  ＢＳＡ  １．２μｌを加え、さらに滅菌水を加えて２０μｌにした。よく混合後、８０℃で５分インキュベートしてから３０分かけて１０℃になるまでゆっくり冷却した。次にＴ４  ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ社）１μｌ（１０ｕｎｉｔ／μｌ）とＴ４  ＲＮＡリガーゼ（４０Ｕ／μｌ）を１．５μｌと２μｌのＳＵＰＥＲＲａｓｅ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（２０Ｕ／μｌ）加え、２５℃で１時間インキュベートした。
（５）ｍＲＮＡのストレプトアビジン（ＳｔＡＶ）ビーズへの固定化
翻訳の前に上記（４）のリンカー付ｍＲＮＡをビオチンーアビジンの結合によりストレプトアビジン付磁性体ビーズに以下に示すように結合させた。
（ｉ）タカラ社のＭａｇｎｏｔｅｘ−ＳＡビーズ２０μｌを１．５ｍｌに加えた。
（ｉｉ）マグネティックスタンドで１分間静置させた後、上清を捨てた。
（ｉｉｉ）元の体積の１０倍容の１×ｂｉｎｄｉｎｇバッファーでビーズを洗浄後、マグネティックスタンドを用いて注意深くバッファーを取り除いた。
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）で洗浄したビーズの入ったチューブに上記（４）の連結物とこれと同量の２×ｂｉｎｄｉｎｇバッファーを混合して加えた。
（ｖ）ビーズを懸濁させ、室温で１５分間、ローターを用いてインキュベーションした。
（ｖｉ）マグネティックスタンドで上清を捨てた後、０．０１％  ＢＳＡを加えた１０倍容の１×ｂｉｎｄｉｎｇバッファーで２回洗浄。  これを翻訳の鋳型として用いた。
（６）小麦胚芽無細胞翻訳系を用いた翻訳
無細胞翻訳系として小麦胚芽無細胞翻訳系（製品番号Ｌ４３８０；Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いた。添付のプロトコールに従い以下の要領で翻訳を行った。尚、比較のために（ａ）固定化ｍＲＮＡで翻訳をした場合、（ｂ）液相で翻訳した場合の二通りで行った。
（ａ）固定化ｍＲＮＡで翻訳をした場合
アミノ酸Ｍｉｘｔｕｒｅ  ４μｌ、１Ｍ  Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ  ５μｌ、ＳＵＰＥＲａｓｅ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ３μｌに２５μｌのＷｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ｌｙｓａｔｅを加えよく混合した上で、上記（５）で調整したｍＲＮＡ付ビーズに加えた。最終体積が５０μｌになるように滅菌水を加えた。次に２５℃で１５分、ローターで常にビーズが懸濁するようにして反応させた。
（ｂ）液相で翻訳した場合
組成は上記（ａ）と同じであるが、ビーズに固定化したｍＲＮＡではなく、ＧＦＰをコードしたリンカーなしのｍＲＮＡを２ｐｍｏｌ加え、ローターを用いずに通常のインキュベーターで２５℃、１５分反応させた。
（７）ＧＦＰの合成量の比較
発現量を調べるために、上記（６）の組成に無細胞翻訳系中で合成されたタンパク質の蛍光ラベル剤として０．５μｌのＦｌｕｏｒｏＴｅｃｔ（プロメガ社）を加えた。合成されたサンプル６μｌに２×ＳＤＳサンプルバッファー（４％ＳＤＳ，８Ｍ尿素）を１０μｌ加えた。次にＧＦＰタンパク質を完全に変性させるために７０℃、５分インキュベートした。１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動後、ラベル化されたＧＦＰタンパク質のバンド強度を測定するために、蛍光ゲルイメージャー（Ｔｙｏｈｏｏｎ，Ａｍｅｒｓｈａｍ社）によって読み取り、添付の画像解析ソフトを用いて強度を求めた。その結果を図５に示す。
図５に示されるように、蛍光強度の強度から、固相上でのＧＦＰの合成量は、液相に比べ０．１５（±０．０５）であることがわかった。また、固定化されたｍＲＮＡではビーズ同士が非特異的に集合してしまい、うまく懸濁されないことから効率よく翻訳されないことがわかった。ただし、これは今回、ＧＦＰの蛍光強度を測定するために（透明な）小麦胚芽系の無細胞翻訳系を用いているためで、ウサギ網状赤血球を用いるとこのようなことは起こりにくいと考えられる。
（８）ＧＦＰの機能発現量の比較
ＧＦＰのフォールディングを確認するために、上記（６）で合成したそれぞれの合成産物の蛍光を蛍光マイクロリーダーで測定した。それぞれのＧＦＰ翻訳産物４０μｌに対し１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）６０μｌを加え、４８５ｎｍで励起し、５３５ｎｍの放出波長をマイクロプレートリーダーで測定した。ネガティブコントロールとしてｍＲＮＡを加えないで反応させたものも測定した。それらの結果を図６に示す。
図６に示されるように、固相上のＧＦＰの相対強度は、液相で合成したＧＦＰの０．５２倍であることが分かった。
（９）ＧＦＰのフォールディング効率の比較
上記（７）及び（８）の結果に基づいてＧＦＰのフォールディング効率を計算し、その結果を図７に示す。この結果、固相上でのタンパク質のフォールディング効率は液相に比べ３．４７倍高いことが分かった。
実施例３：固定化ｍＲＮＡを用いた翻訳におけるビーズ表面の効果
固定化したｍＲＮＡを用いて無細胞翻訳系を行う際に合成されたタンパク質の機能がｍＲＮＡを固定化したビーズ表面の性質（疎水性、親水性）によって異なるかどうかを調べた。ｍＲＮＡの調整、翻訳、等の実験条件は実施例１と同条件で行った。
（１）固定化ｍＲＮＡによる固相表面でのＧＦＰ発現
終止コドンをもったＧＦＰをコードするｍＲＮＡ２ｐｍｏｌを３ｐｍｏｌのｍＲＮＡ固定化リンカーと連結した後にリンカーについたビオチンを介してストレプトアビジンコートした磁性体ビーズ（親水性：Ｍ−２７０、疎水性：Ｍ−２８０、いずれもＤｙｎａｌ社）に固定化した。これらを２５℃で１０分、４０μｌの小麦胚芽の無細胞翻訳系を用いて合成する際に、ローターで回してビーズが沈殿しないように注意した。反応後、５分間、氷上に静置して反応を停止させる。次に測定のためサンプルと等量のＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水を加え、マイクロプレートリーダー（ＦｌｕＰｏｌｏ，Ｔａｋａｒａ）でＧＦＰの蛍光強度を測定した。それらの結果を図８に示す。
（結果）
図８に示されるように、親水性のビーズ上で合成したＧＦＰの方が疎水性ビーズに比べ約１．５倍ＧＦＰの強度が高まった。固相上での合成において親水性ビーズの方がＧＦＰのフォールディング、等において有利であることがわかった。
（２）アルデヒド還元酵素（ＡＫＲ）の固相表面でのＩｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓ合成
実施例１に従い１０ｐｍｏｌのＡＫＲ  ｍＲＮＡ（終止コドンなし）を１５ｐｍｏｌピューロマイシン・リンカーと連結した後、磁性体ビーズ（親水性：Ｍ−２７０，疎水性：Ｍ−２８０、いずれもＤｙｎａｌ社）１ｍｇに固定化した。次に小麦胚芽無細胞翻訳系を２５分、３０℃で８０μｌの反応系でローターを用いてビーズが沈殿しないように反応させた。次にこの反応液に最終濃度９０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，６３０ｍＭ  ＫＣｌになるようにを加え、さらに２時間、３７℃で反応させｍＲＮＡ−タンパク質形成を促進させた。ビーズ上に固定されたＡＫＲをＲＮａｓｅ  Ｔ１によってビーズより切り離し、実施例１と同じようにマイクロプレートリーダーで未反応のＮＡＤＰＨの濃度を測定することでＡＫＲの酵素活性を測定した（ＡＫＲの活性が高いほどＮＡＤＰＨ量が少ない）。それらの結果を図９に示す。
（結果）図９に示されるように、液相合成した場合に比べビーズ上で合成したＡＫＲの方が活性は高いものの、疎水性ビーズと親水性ビーズで活性を比較したところ、疎水性ビーズ上で合成したＡＫＲの活性は液相合成に比べ約２．５倍、親水性ビーズ上で合成したＡＫＲの活性は液相合成に比べ約３．５倍活性が高かった。
実施例４：固定化ｍＲＮＡの固定化位置と終止コドン間の距離の違いによる合成タンパク質の活性への影響
表１に示されるように終止コドンとｍＲＮＡ固定化位置（ビーズ表面）からの長さ（ｄ）が異なるようにデザインしたＤＮＡリンカーを用意した。固定化ｍＲＮＡ（ＧＰＦ−ｍＲＮＡ）の終止コドンと固定化位置の距離（ｄ）の関係を図１０に示す。
【表１】
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ＧＦＰをコードしたｍＲＮＡ５ｐｍｏｌと表１に示される３種類のＤＮＡリンカーそれぞれ７．５ｐｍｏｌを実施例１に従って連結し、ストレプトアビジン・磁性体ビーズ（Ｄｙｎａｌ−２７０、Ｄｙｎａｌ社）４００μｇに固定化した。そして小麦胚芽無細胞翻訳系（４０μｌ）で２５℃、９０分ローターで回転させながら反応させた。反応液を５分間、氷上に静置させて反応を止めて、滅菌水で２倍に希釈し、マイクロプレートリーダーでＧＦＰの蛍光を測定した。それらの結果を図１１に示す。
（結果）
図１１に示されるようにｍＲＮＡの固定化位置と終止コドン間の距離（ｄ）は短いほどＧＦＰの蛍光強度が強いことがわかる。具体的には、ｄの長さが２３．５ｎｍの場合に比べ、４．１ｎｍと短くした場合、活性が２倍程度向上することがわかった。
このことより、ｍＲＮＡの終止コドンは親水性の固相表面近傍に存在した方がタンパク質のホールディングに効果的であることを見出した。
【産業上の利用可能性】  以上述べたように、本発明のタンパク質合成法によれば、所望のタンパク質をその機能が発揮されるように正しくフォールディングされた状態となるように効率良く合成することができる。このような本発明のタンパク質合成法は、バイオ医薬品を始めとする有用タンパク質の大量合成に有効である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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