(57)【要約】本発明は、再現性が良いＥＰＣコロニーの形成方法、患者体内でのＥＰＣ分化動態の解析方法を提供する。より詳細には、本発明は、血管内皮細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する半固形培地で血液血管芽細胞を培養し、血管内皮前駆細胞コロニー形成の様式を評価することを含む、血管内皮前駆細胞分化動態の解析方法；血管内皮細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する半固形培地で血液血管芽細胞を培養することを含む、血管内皮前駆細胞コロニー形成方法；血管内皮細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する半固形培地；並びに当該半固形培地の作製用キットなどを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管内皮細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する半固形培地で血液血管芽細胞を培養し、血管内皮前駆細胞コロニー形成の様式を評価することを含む、血管内皮前駆細胞分化動態の解析方法。
【請求項２】
血液血管芽細胞が、骨髄、臍帯血又は末梢血由来である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
血液血管芽細胞が単核球である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
血液血管芽細胞が、ＣＤ３４陽性および／またはＣＤ１３３陽性である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
血液血管芽細胞が、血液血管芽細胞を動員可能な物質により動員されたものである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
血液血管芽細胞を動員可能な物質が顆粒球コロニー刺激因子である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
血液血管芽細胞がヒト由来である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
半固形培地が、メチルセルロース培地、マトリゲル、コラーゲンゲル及びメビオールゲルからなる群より選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項９】
該半固形培地が、幹細胞因子、インターロイキン３、インスリン様成長因子および上皮細胞増殖因子からなる群より選ばれる１以上の因子をさらに含有する、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
該半固形培地が、血清および／またはヘパリンをさらに含有する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
血管内皮細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する半固形培地で血液血管芽細胞を培養することを含む、血管内皮前駆細胞コロニー形成方法。
【請求項１２】
血管内皮細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する半固形培地。
【請求項１３】
血管内皮細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子および半固形培地（血管内皮細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子の双方または一方は、半固形培地に添加されていない形態で提供される）を含む、血管内皮細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する半固形培地の作製用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管内皮前駆細胞分化動態の解析方法、その為のキット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病、高血圧症、高脂血症、肥満等の生活習慣病は血管障害の危険因子であり、最終的には閉塞性動脈硬化症（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｏｂｌｉｔｅｒａｎｓ；ＡＳＯ）、心筋梗塞、腎不全などの臓器不全を引き起こす。これらの生活習慣病の患者数は極めて多く、血管治療は現代医療の最重要課題と言っても過言ではない。例えば下肢壊疽を引き起こす閉塞性動脈硬化症では、下腿切断を余儀なくされる例が少なくない。それら虚血状態に陥った組織・臓器の治療法としては、カテーテルによる血管拡張術、静脈グラフトを用いて血行を外科的に再建する方法などが行われてきたが、重度の患者には有効な手段となりえていない。
近年、新しい治療法として血管新生療法が行われつつある。血管新生療法には大きく分けて遺伝子治療と細胞移植法がある。遺伝子治療では血管内皮細胞増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）のプラスミドを虚血病変部位に注入し、血流の改善を図る方法が報告されている。一方、細胞移植法では血管内皮細胞に分化し得る血管内皮前駆細胞（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ；以下、ＥＰＣとも略する）の移植法として、骨髄由来単核球移植療法、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ；Ｇ−ＣＳＦ）投与による末梢血動員ＣＤ３４血管幹細胞移植療法が臨床応用されている。しかしながら、患者病態、治療効果を把握する上で末梢血中のＥＰＣ分化動態を評価する方法は未だ確立されていない。
一般に細胞移植法においては、虚血部位でＥＰＣが効率的に血管形成するように、またインビトロでの細胞増幅を効率的に行うためには、移植に用いる細胞懸濁液（この細胞懸濁液にはＥＰＣへ分化し得る細胞が含まれている）のＥＰＣ形成能を予め知る必要がある。また、細胞移植後の患者体内でのＥＰＣ分化動態を解析することは、患者病態、治療効果を把握する上で重要である。現在のところ、赤血球、Ｔ−リンパ球、Ｂ−リンパ球、単球／マクロファージ、顆粒球、巨核球等へ分化し得る造血幹細胞のコロニー形成能を測定する方法として、メチルセルロース培地を用いた方法が用いられている（Ａｔｓｕｓｈｉ  Ｈｉｒａｏ，Ｙｏｉｃｈｉ  Ｔａｋａｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ１０：１７−２２（１９９９））が、ＥＰＣのコロニー形成能をアッセイする方法は知られていない。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、患者体内でのＥＰＣ分化動態を解析し得る方法並びにその為のキット等の提供を目的とする。
本発明者らは、上記課題に鑑み、ＥＰＣがコロニーを形成し得る培養条件を検討し、特定の生理活性物質を含有する半固形培地を用いることによって、再現性よくＥＰＣのコロニーを形成させることに成功した。さらに、当該コロニー形成において分化度の異なる大小２種類のコロニーが形成され、その発現を追跡することにより患者体内でのＥＰＣ分化動態を解析することができることを見出して本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は下記の通りである：
〔１〕血管内皮細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する半固形培地で血液血管芽細胞を培養し、血管内皮前駆細胞コロニー形成の様式を評価することを含む、血管内皮前駆細胞分化動態の解析方法；
〔２〕血液血管芽細胞が、骨髄、臍帯血又は末梢血由来である、上記〔１〕の方法；
〔３〕血液血管芽細胞が単核球である、上記〔１〕の方法；
〔４〕血液血管芽細胞が、ＣＤ３４陽性および／またはＣＤ１３３陽性である、上記〔１〕の方法；
〔５〕血液血管芽細胞が、血液血管芽細胞を動員可能な物質により動員されたものである、上記〔１〕の方法；
〔６〕血液血管芽細胞を動員可能な物質が顆粒球コロニー刺激因子である、上記〔５〕の方法；
〔７〕血液血管芽細胞がヒト由来である、上記〔１〕の方法；
〔８〕半固形培地が、メチルセルロース培地、マトリゲル、コラーゲンゲル及びメビオールゲルからなる群より選ばれる、上記〔１〕の方法；
〔９〕該半固形培地が、幹細胞因子、インターロイキン３、インスリン様成長因子および上皮細胞増殖因子からなる群より選ばれる１以上の因子をさらに含有する、上記〔１〕の方法；
〔１０〕該半固形培地が、血清および／またはヘパリンをさらに含有する、上記〔９〕の方法；
〔１１〕血管内皮細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する半固形培地で血液血管芽細胞を培養し、血管内皮前駆細胞コロニーの出現を確認することを含む、血管内皮前駆細胞コロニー形成方法；
〔１２〕血管内皮細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する半固形培地；
〔１３〕血管内皮細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子および半固形培地（血管内皮細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子の双方または一方は、半固形培地に添加されていない形態で提供される）を含む、血管内皮細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する半固形培地の作製用キット。
本発明のＥＰＣ分化動態の解析方法は、より効率的なＥＰＣ移植療法を可能にする。すなわち患者に移植する血液血管芽細胞の血液系細胞コロニーアッセイとともにＥＰＣコロニーアッセイが実施でき、それによって治療効果を予想・把握することが可能となる。さらに分化度の異なるＥＰＣのコロニーの発現状況を知ることにより、患者の病態を知ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、メチルセルロース培地を用いたＥＰＣコロニーアッセイ法の概要を示す。試料となる血液血管芽細胞が、臍帯血由来の単核球である場合を一例として示す。
図２は、本発明のＥＰＣコロニーアッセイ過程で出現する内皮細胞様小細胞コロニーと内皮細胞様大細胞コロニーを位相差顕微鏡で観察した結果を示す。試料となる血液血管芽細胞が、臍帯血由来の単核球である場合を一例に示す。臍帯血由来の単核球を本発明のメチルセルロース培地に播種し培養１４〜１８日において細胞サイズの異なる２種類のＥＰＣコロニーが出現した。
図３は、臍帯血ＣＤ１３３陽性細胞由来のＥＰＣコロニーをａｃＬＤＬ−ＤｉＩ及びＵＥＡ−１レクチン−ＦＩＴＣで二重染色した結果を示す。ａ、ｃ、ｅは大細胞コロニーを、ｂ、ｄ、ｆは小細胞コロニーを、ａ及びｂは位相差像、ｃ及びｄはａｃＬＤＬ−ＤｉＩによる染色像を、ｅ及びｆはＵＥＡ−１レクチン−ＦＩＴＣによる染色像を示す。両コロニーともにａｃＬＤＬ−ＤｉＩ及びＵＥＡ−１レクチン−ＦＩＴＣに染色され、ＥＰＣとしての特徴を示した。
図４は、Ｇ−ＣＳＦによる動員ＣＤ３４陽性細胞移植ＡＳＯ患者における末梢血を用いたＥＰＣコロニーアッセイのタイムスケジュールを示す。
図５は、メチルセルロース培地を用いたＥＰＣコロニーアッセイ法の概要を示す。試料となる血液血管芽細胞が、末梢血由来の単核球である場合を一例として示す。
図６は、ＡＳＯ患者（症例１）における、末梢血中のＣＤ３４細胞動員目的のＧ−ＣＳＦ投与時、ならびにＣＤ３４陽性細胞の移植時における末梢血中の単核球数及びＣＤ３４陽性細胞数を示す。  ＭＮＣ：単核球、ＣＤ３４＋：ＣＤ３４陽性
図７は、ＡＳＯ患者（症例１）における、末梢血中のＣＤ３４細胞動員目的のＧ−ＣＳＦ投与時、ならびにＣＤ３４陽性細胞の移植時における末梢血のＥＰＣコロニー形成能（小細胞コロニー、大細胞コロニー）を示す。  ＭＮＣ：単核球、ＣＦＵ：コロニー形成単位、ＣＤ３４＋Ｔｘ：ＣＤ３４＋細胞移植
図８は、ＡＳＯ患者（症例２）における、末梢血中のＣＤ３４細胞動員目的のＧ−ＣＳＦ投与時、ならびにＣＤ３４陽性細胞の移植時における末梢血中の単核球数及びＣＤ３４陽性細胞数を示す。  ＭＮＣ：単核球、ＣＤ３４＋：ＣＤ３４陽性、ＣＤ３４＋Ｔｘ：ＣＤ３４＋細胞移植
図９は、ＡＳＯ患者（症例２）における、末梢血中のＣＤ３４細胞動員目的のＧ−ＣＳＦ投与時、ならびにＣＤ３４陽性細胞の移植時における末梢血のＥＰＣコロニー形成能（小細胞コロニー、大細胞コロニー）を示す。  ＭＮＣ：単核球、ＣＦＵ：コロニー形成単位、ＣＤ３４＋Ｔｘ：ＣＤ３４＋細胞移植
図１０は、ＡＳＯ患者（症例３）における、末梢血中のＣＤ３４細胞動員目的のＧ−ＣＳＦ投与時、ならびにＣＤ３４陽性細胞の移植時における末梢血中の単核球数及びＣＤ３４陽性細胞数を示す。  ＭＮＣ：単核球、ＣＤ３４＋：ＣＤ３４陽性、ＣＤ３４＋Ｔｘ：ＣＤ３４＋細胞移植
図１１は、ＡＳＯ患者（症例３）における、末梢血中のＣＤ３４細胞動員目的のＧ−ＣＳＦ投与時、ならびにＣＤ３４陽性細胞の移植時における末梢血のＥＰＣコロニー形成能（小細胞コロニー、大細胞コロニー）を示す。  ＭＮＣ：単核球、ＣＦＵ：コロニー形成単位、ＣＤ３４＋Ｔｘ：ＣＤ３４＋細胞移植
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明は、血管内皮前駆細胞分化動態の解析方法を提供する。本発明の解析方法は、例えば、血管内皮細胞増殖因子及び／又は塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する半固形培地で血液血管芽細胞を培養し、血管内皮前駆細胞コロニー形成の様式を評価することを含む。
本発明で用いられる「血液血管芽細胞」とは、血液系細胞及び血管内皮細胞両方の前駆細胞であって、血液幹細胞、血液前駆細胞を経て血液系細胞（例えば、赤血球、Ｔ−リンパ球、Ｂ−リンパ球、単球／マクロファージ、顆粒球、巨核球）になり得、また、ＥＰＣを経て血管内皮細胞になり得る未分化な細胞であれば特に限定されない。血液血管芽細胞としては、被験対象の骨髄、臍帯血又は末梢血由来の細胞を使用できる。血液血管芽細胞はまた、単核球であり得る。
血液血管芽細胞はさらに、ＣＤ３４及び／又はＣＤ１３３陽性であり得る。従って、血液血管芽細胞として、ＣＤ３４陽性及び／又はＣＤ１３３陽性細胞のみ予め選別して用いることもまた好ましい。ＣＤ３４陽性及び／又はＣＤ１３３陽性細胞の選別は、当分野で通常行われている細胞選別の手法が用いられ、具体的にはＣＤ３４抗原及び／又はＣＤ１３３抗原に特異的な親和性を有する物質を用いた磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）、蛍光細胞分離法（ＦＡＣＳ）等が挙げられる。
ＣＤ３４抗原あるいはＣＤ１３３抗原に特異的な親和性を有する物質としては例えばこれらの蛋白質に特異的親和性を有する抗体又はその断片が挙げられ、その特異的親和性とは抗原・抗体反応により該蛋白質を特異的に認識し、結合する能力のことである。該抗体又はその断片は、当該蛋白質と特異的に結合可能なものであれば特に限定されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びそれらの機能的断片のいずれであってもよい。これらの抗体あるいはその機能的断片は、通常当分野で行なわれている方法によって製せられる。例えばポリクローナル抗体を用いる場合であれば、該蛋白質をマウスやウサギといった動物の背部皮下あるいは腹腔内あるいは静脈等に注射して免疫し、抗体価が上昇するのを待った後に抗血清を採取する方法が挙げられ、またモノクローナル抗体を用いる場合であれば、常法に従いハイブリドーマを作製して、その分泌液を採取する方法が挙げられる。抗体断片を製造する方法としてはクローニングした抗体遺伝子断片を微生物等に発現させる方法がよく用いられている。当該抗体、抗体断片等の純度は、当該蛋白質との特異的親和性を保持している限り、特に限定されない。これらの抗体又はその断片は、蛍光物質、酵素やラジオアイソトープ等で標識されていてもよい。
血液血管芽細胞はまた、血液血管芽細胞を動員可能な物質により動員されたものであり得る。血液血管芽細胞を動員可能な物質としては、例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＤＦ−１、エストロゲン、ＶＥＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、アンジオポイエチン１及び２、ＨＧＦ、スタチン類（ｓｔａｔｉｎｓ）、エリスロポエチンが挙げられるが、なかでもＧ−ＣＳＦが好ましい。この場合、血液血管芽細胞を動員可能な物質の被験対象への投与により得られる、血液血管芽細胞を動員しておいた体液成分（例えば、末梢血）の形態で、血液血管芽細胞が提供されてもよい。血液血管芽細胞を動員可能な物質の被験対象への投与回数、投与期間、投与量は用いる物質の種類によっても異なり、血液血管芽細胞を動員可能である限り特に限定されないが、Ｇ−ＣＳＦの場合であれば、投与回数については、例えば通常１日１回〜３回、好ましくは２回であり、投与期間については、例えば約３〜７日間、好ましくは約４〜６日間、より好ましくは５日間であり、投与量については、約２〜５０μｇ／ｋｇ／日、好ましくは約５〜２０μｇ／ｋｇ／日、より好ましくは約１０μｇ／ｋｇ／日である。
血液血管芽細胞はさらに、血液血管芽細胞を動員可能な物質により動員された血液血管芽細胞を移植された被験対象から採取されるものであってもよい。
本発明において被験対象は、ＥＰＣ分化動態を解析することが求められている動物であって、ヒトを含む哺乳動物一般を意味するが、臨床応用という本発明の目的に鑑みれば、被験対象は好ましくはヒトである。また、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、サル等の哺乳動物での使用も好ましい。
本発明で用いられる半固形培地は、血管内皮前駆細胞コロニー形成を可能とするものである限り特に限定されないが、例えば、造血幹細胞等の未分化細胞の増殖用培地などとして知られている半固形培地を使用できる。このような半固形培地としては、例えば、メチルセルロース培地、マトリゲル、コラーゲンゲル、メビオールゲルなどが挙げられる。半固形培地としてメチルセルロース培地を用いる場合、培地中のメチルセルロース濃度は特に限定されるものではないが、例えば約０．５〜５％、好ましくは約０．７〜３％、より好ましくは約１％で用いられる。
本発明で用いられる血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、ＥＰＣに特異的に作用する増殖因子であり、主に血管周囲の細胞で産生されることが知られている。選択的スプライシングによってサイズの異なる数種のＶＥＧＦタンパク質が産生されるが、本発明で用いるＶＥＧＦはＥＰＣのコロニー形成を可能にする限りいずれのタイプのＶＥＧＦでもよい。好ましくはＶＥＧＦ１６５である。ＶＥＧＦの由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。半固形培地中のＶＥＧＦの濃度は、用いるＶＥＧＦの種類によっても異なり、血管内皮前駆細胞コロニー形成に適切である限り特に限定されないが、ヒト組換えＶＥＧＦ１６５の場合であれば、例えば約５〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約２０〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
本発明で用いられる塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）は、約１８ｋＤａ、等電点９．０の一本鎖ペプチドであり、血管新生、種々の細胞増殖促進、分化誘導等の機能を有することが知られている。本発明で用いるｂＦＧＦの由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。半固形培地中のｂＦＧＦの濃度は、用いるｂＦＧＦの種類によっても異なり、血管内皮前駆細胞コロニー形成に適切である限り特に限定されないが、ヒト組換えｂＦＧＦを用いる場合であれば、例えば約５〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約２０〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
本発明で用いられる半固形培地は、血管内皮前駆細胞コロニーをより効率的に形成させるという観点から、上記ＶＥＧＦ及び／又はｂＦＧＦに加え、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）及び上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）からなる群より選ばれる１又は２以上の因子、好ましくは３以上の因子、より好ましくは全ての因子をさらに含有することが好ましい。従って、本発明の方法で用いられる半固形培地は、ＶＥＧＦ及び／又はｂＦＧＦに加え、例えば、ａ）ＳＣＦ、ｂ）ＩＬ−３、ｃ）ＩＧＦ、ｄ）ＥＧＦ、ｅ）ＳＣＦとＩＬ−３との組合せ、ｆ）ＳＣＦとＩＧＦとの組合せ、ｇ）ＳＣＦとＥＧＦとの組合せ、ｈ）ＩＬ−３とＩＧＦとの組合せ、ｉ）ＩＬ−３とＥＧＦとの組合せ、ｊ）ＩＧＦとＥＧＦとの組合せ、ｋ）ＳＣＦ、ＩＬ−３及びＩＧＦの組合せ、ｌ）ＳＣＦ、ＩＬ−３及びＥＧＦの組合せ、ｍ）ＳＣＦ、ＩＧＦ及びＥＧＦの組合せ、ｎ）ＩＬ−３、ＩＧＦ及びＥＧＦの組合せ、あるいはｏ）ＳＣＦ、ＩＬ−３、ＩＧＦ及びＥＧＦの組合せを含むものであり得る。
幹細胞因子（ＳＣＦ）は、２４８個のアミノ酸からなる分子量約３０，０００の糖タンパク質である。選択的スプライシングにより可溶型と膜結合型が存在するが、本発明で用いるＳＣＦはＥＰＣのコロニー形成を可能にする限りいずれのタイプのＳＣＦでもよい。好ましくは可溶型である。ＳＣＦの由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。半固形培地中のＳＣＦの濃度は、用いるＳＣＦの種類によっても異なり、血管内皮前駆細胞コロニーをより効率的に形成できる限り特に限定されないが、ヒト組換えＳＣＦの場合であれば、約１０〜１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約５０〜５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
インターロイキン３（ＩＬ−３）は、造血幹細胞や各種血球系列の前駆細胞に作用し、その増殖、分化を促進するサイトカインとして知られている。ヒトで１５２残基、マウスで１６６残基のアミノ酸から成るが、糖鎖の修飾によって見かけ上２８，０００の分子量を有する。本発明で用いるＩＬ−３はコロニー形成を目的とするＥＰＣの由来に応じて適宜選択されるが、ヒトのＥＰＣのコロニー形成に用いる場合には、ヒトＩＬ−３が好ましく、安定した供給が見込まれる組換え体が特に好ましい。商業的に入手可能なものが知られている。半固形培地中のＩＬ−３の濃度は、用いるＩＬ−３の種類によっても異なり、血管内皮前駆細胞コロニーをより効率的に形成できる限り特に限定されないが、ヒト組換えＩＬ−３を用いる場合であれば、約１〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約５〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約２０ｎｇ／ｍＬである。
インスリン様成長因子（ＩＧＦ）は、ソマトメジンとも称される、プロインスリンに類似した一次構造をもつ分子量約７０００のポリペプチドで互いに類似したＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩの２種類が存在することが知られている。ともに類似した作用を有し、インビトロでは様々な細胞の増殖を促進することが知られている。本発明で用いるＩＧＦはＥＰＣのコロニー形成を可能にする限りいずれのタイプのＩＧＦでもよい。好ましくはＩＧＦ−Ｉである。ＩＧＦの由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。半固形培地中のＩＧＦの濃度は、用いるＩＧＦの種類によっても異なり、血管内皮前駆細胞コロニーをより効率的に形成できる限り特に限定されないが、ヒト組換えＩＧＦ−Ｉを用いる場合であれば、約５〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約２０〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）は、上皮細胞の分化・増殖を促進させる作用を有する、アミノ酸５３個のタンパク質であり、糖鎖は結合していないことが知られている。約６ｋＤａで３ヶ所のジスルフィド結合を有する。本発明で用いるＥＧＦの由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。半固形培地中のＥＧＦの濃度は、用いるＥＧＦの種類によっても異なり、血管内皮前駆細胞コロニーをより効率的に形成できる限り特に限定されないが、ヒト組換えＥＧＦを用いる場合であれば、約５〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約２０〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
本発明で用いられる半固形培地は、血管内皮前駆細胞コロニーをさらにより効率的に形成させるという観点から、上記ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦ、並びにＳＣＦ、ＩＬ−３、ＩＧＦ及びＥＧＦからなる群より選ばれる１又は２以上の因子に加え、血清及び／又はヘパリンをさらに含有することが好ましい。
血清が使用される場合、その由来等は特に限定されないが、培地に添加されることから比較的使用量が多いことが予想される。従って、商業的に入手可能なウシ、ウマ、ヒト等の血清（例えば、胎児血清）が用いられる。より好ましくはウシ胎児血清（ＦＣＳ）である。当該血清は非働化して用いることが好ましい。半固形培地中の血清の濃度は、用いる血清の種類によっても異なり、血管内皮前駆細胞コロニーをさらにより効率的に形成できる限り特に限定されないが、ＦＣＳの場合であれば、約１０〜５０％、好ましくは約１５〜４０％、より好ましくは約３０％である。
ヘパリンは、Ｄ−グルクロン酸、あるいはＬ−イズロン酸のいずれかを含むウロン酸残基と、Ｄ−グルコサミンとの二糖体の繰り返し構造を骨格に持つグルコサミノグリカンである。ヘパリンは哺乳類の小腸や肺に多く存在し、市販品はブタの腸由来の抽出物が多く、その分子量は７，０００〜２５，０００程度である。本発明で用いるヘパリンは動物組織由来のものであってもよいし、ＥＰＣのコロニー形成を可能にする限り、化学的、物理的に分解された低分子化ヘパリンであってもよい。例えば、ブタ腸由来ヘパリンが使用される。商業的に入手可能なものが知られている。半固形培地中のヘパリンの濃度は、用いるヘパリンの種類によっても異なり、血管内皮前駆細胞コロニーをさらにより効率的に形成できる限り特に限定されないが、ブタ腸由来ヘパリンの場合であれば、約０．２〜１０Ｕ／ｍＬ、好ましくは約１〜５Ｕ／ｍＬ、より好ましくは約２Ｕ／ｍＬである。
本発明において最も好ましく用いられ得る半固形培地は、約５０ｎｇ／ｍＬの血管内皮細胞増殖因子、約５０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子、並びに約１００ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子、約２０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン３、約５０ｎｇ／ｍＬの上皮細胞増殖因子、約５０ｎｇ／ｍＬのインスリン様成長因子、及び約３０％の血清、約２Ｕ／ｍＬのヘパリンを含有する半固形培地である。
上記した各生理活性物質は半固形培地で所定の濃度に溶解するか、あるいはあらかじめ各生理活性物質の濃縮液（ストック溶液）を調製し、半固形培地で所定の濃度に希釈することによって本発明の、ＥＰＣ分化動態解析用の半固形培地を調製できる。例えば市販の半固形培地に必要な生理活性物質を所定の濃度となるよう溶解した後、濾過滅菌等により滅菌するか、あるいは濾過滅菌等により滅菌したストック溶液を無菌的に市販の半固形培地に添加、希釈することによって本発明の生理活性物質含有半固形培地を調製できる。濾過滅菌は当分野で通常実施されている方法に準じて行うことができ、例えば０．２２μｍや０．４５μｍのミリポアフィルター等を用いて行う。
上述した生理活性物質を含有する半固形培地での血液血管芽細胞の培養は、血液血管芽細胞を含有する細胞懸濁液を、上記の生理活性物質含有半固形培地に添加することにより行われる。細胞懸濁液としてはまた、血液血管芽細胞を含有する体液自体（例えば、骨髄液、臍帯血、末梢血）を用いることもできる。血液血管芽細胞の培養条件は、コロニー形成が可能であれば特に限定されず、通常当分野で実施される条件で実施することができる。通常、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で通常１０日以上、例えば１４〜１８日間又はそれ以上培養する。コロニーの形成は目視で確認することができるが、得られるコロニーが本当にＥＰＣで構成されているか否かは、例えば、アセチル化ＬＤＬ（ａｃＬＤＬ）の取り込み能やＵＥＡ−１レクチンとの結合能、ＶＥ−カドヘリン、ＫＤＲ、ｖＷＦの発現（例えば、ＲＴ−ＰＣＲにより、あるいは蛍光免疫組織化学的方法により）等を確認することによって行われ得る。例えばＤｉＩで標識したアセチル化ＬＤＬ（ａｃＬＤＬ−ＤｉＩ）及びＦＩＴＣ標識したＵＥＡ−１レクチン（ＵＥＡ−１レクチン−ＦＩＴＣ）でコロニーを二重染色した場合に、ＥＰＣであれば共に染色される。
ＥＰＣコロニー形成の様式の評価は、コロニーを形成する細胞サイズに基づいて行われ得る。実施例で後述するが、本発明においてＥＰＣコロニーを形成させる際、細胞サイズの異なる２種類のＥＰＣコロニーが出現する。このような２種類のサイズのＥＰＣコロニーが出現するのは血液血管芽細胞を半固形培地上に播種してから通常１０日以上、例えば１４〜１８日経過した時点であるので、本発明においてＥＰＣのコロニーを形成させるには例えば１４〜１８日間培養される。形成される２種類のコロニーのうち、大きい細胞で構成されるコロニー（以下内皮細胞様大細胞コロニー；ＣＦＵ−Ｌａｒｇｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｋｅ  ＥＣ、大細胞コロニーともいう）は直径約２０〜５０μｍの細胞を主に含み、小さい細胞で構成されるコロニー（以下内皮細胞様小細胞コロニー；ＣＦＵ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｋｅ  ＥＣ、小細胞コロニーともいう）は直径約２０μｍ以下（例えば約１０〜２０μｍ）の細胞を主に含む。ここで「主に」とはコロニーを構成する細胞集団の約３０％、好ましくは約５０％、特に好ましくは約７０％が、直径約２０〜５０μｍの細胞（大細胞コロニーの場合）あるいは直径２０μｍ以下の細胞（小細胞コロニーの場合）であることを意味する。被験対象から経時的に骨髄液、臍帯血あるいは末梢血等を採取し、採取した試料についてＥＰＣコロニーアッセイを行うと、動員後のコロニー出現迄に要する時間が、大細胞コロニーと小細胞コロニーとでは異なっていることが判明している。大細胞コロニーは小細胞コロニーにやや遅れて出現する。即ち、分化段階の異なるＥＰＣが存在することが示唆される。早い段階で出現する内皮細胞様小細胞は早期分化段階のＥＰＣと言え、また遅い段階で出現する内皮細胞様大細胞は晩期分化段階のＥＰＣであると言える。本発明の解析方法では、上述の通りコロニーを形成する細胞サイズの差異に基づき分化度の異なるＥＰＣが区別可能であり、従ってＥＰＣ分化動態を解析することが可能となる。
本発明はまた、血管内皮細胞増殖因子及び／又は塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する半固形培地で血液血管芽細胞を培養することを含む、血管内皮前駆細胞コロニー形成方法を提供する。本発明のコロニー形成方法は、血管内皮前駆細胞コロニーの出現を確認することをさらに含むことができる。
本発明はさらに、上述した因子を含有する半固形培地、及びこの半固形培地を含む血管内皮前駆細胞分化動態の解析用試薬を提供する。
本発明はまた、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦおよび半固形培地を含むキットを提供する。本発明のキットは、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦの双方または一方が、半固形培地から隔離された形態（例えば、異なる容器中に格納された形態）で提供される。このようなキットとしては、例えば、ａ）ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦおよび半固形培地のいずれもが異なる容器中に格納された形態、ｂ）ＶＥＧＦを含む半固形培地およびｂＦＧＦが異なる容器中に格納された形態、ｃ）ｂＦＧＦを含む半固形培地およびＶＥＧＦが異なる容器中に格納された形態が挙げられる。また、ＳＣＦ、ＩＬ−３、ＩＧＦ及びＥＧＦからなる群より選ばれる１又は２以上の因子、並びに血清及び／又はヘパリンが、半固形培地から隔離された形態で、又は半固形培地中に添加された形態で提供されてもよい。本発明のキットは、例えば本発明の半固形培地の作製に有用であり得る。
本発明のキットはさらに、血液血管芽細胞を動員可能な物質、および血液血管芽細胞の細胞表面マーカーに特異的な親和性を有する物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの構成要素を含んでいてもよい。血液血管芽細胞を動員可能な物質、血液血管芽細胞の細胞表面マーカーは、上述の通りである。かかるキットは、本発明の解析方法に好適に用いられ得る。
以下実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、実施例は本発明の説明のために記載するものであり、本発明を何ら限定するものではない。
【実施例】
【０００６】
実施例１：メチルセルロース培地を用いたＥＰＣコロニーアッセイ法（臍帯血）
実験プロトコルを図１に示す。
（１）生理活性物質含有メチルセルロース培地の作製
メチルセルロース培地（Ｈ４２３６，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃ．）を用いて表１に示す組成に基づいて生理活性物質含有メチルセルロース培地を作製した。即ち、表１に示す各成分を所定の濃度となるようにメチルセルロース培地に無菌的に添加した。
【表１】
2006090886.tif 000002
表１中、「ｈ」はヒト由来であることを、「ｒ」は遺伝子工学的に製造された組換え体であることを示す。それ以外の各略語は上述の通りである。
（２）ＥＰＣコロニーアッセイ
血液血管芽細胞を含有する細胞懸濁液としては臍帯血由来の単核球を含有する細胞懸濁液を用いた。先ず、採血した血液をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７上に重層し、密度勾配遠心分離法にて単核球を分離した。分離した単核球をＰＢＳ−ＥＤＴＡで洗浄し、血小板除去後の単核球を採取し、緩衝液中に懸濁して細胞懸濁液を調製した。
次いで、細胞懸濁液を抗ＣＤ１３３抗体を用いたＭＡＣＳに付してＣＤ１３３陽性細胞を回収した。詳細には、ＣＤ１３３陽性細胞単離キット（Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製、カタログＮｏ．１３０−０５０−８０１）を用いて、添付文書のプロトコルに準じて行った。
得られたＣＤ１３３陽性細胞を上記（１）で作製した生理活性物質含有メチルセルロース培地１ｍＬあたり１０００個の濃度で３５ｍｍ径のＰｒｉｍａｒｉａ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて１８日間培養した。その後メチルセルロース培地を除去し、非付着性の細胞をＰＢＳで洗い流した。培養皿に付着した細胞のコロニーを観察したところ個々の細胞サイズの異なる２種類のＥＰＣコロニーが出現していた。小さい細胞のコロニーを内皮細胞小細胞コロニー（ＣＦＵ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｋｅ  ＥＣ）と、大きい細胞のコロニーを内皮細胞大細胞コロニー（ＣＦＵ−ｌａｒｇｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｋｅ  ＥＣ）と便宜上称する。図２は各コロニーの位相差顕微鏡による観察像である。これらのコロニーをａｃＬＤＬ−ＤｉＩ及びＵＥＡ−１レクチン−ＦＩＴＣで二重染色した。詳細には、メチルセルロース除去後、ＥＧＭ−ＭＶ添加ＥＢＭ−２（５％ＦＣＳ培地）（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社，Ｓｉｎｇｌｅ  ｑｕｏｔｓキット）を１ｍＬ加えた。次いで、ａｃＬＤＬ−ＤｉＩを１０μＬ加え、３時間培養した。ＰＢＳにて２回洗浄後、上記培地及びＦＩＴＣ標識−ＵＥＡ１レクチン（Ｓｉｇｍａ社製）を０．２μｇ／ｍＬの濃度になるように培地に加え、３時間培養した。２回洗浄後、培地を交換し、蛍光顕微鏡で観察した。
結果を図３に示す。両コロニーともに、ａｃＬＤＬ−ＤｉＩ及びＵＥＡ−１レクチン−ＦＩＴＣに染色され、ＥＰＣとしての特徴を示した。
メチルセルロース培地にて出現した小細胞ＥＰＣコロニーを採取し、内皮細胞培養用培地（ＥＧＭ−ＭＶ添加ＥＢＭ−２（５％ＦＣＳ培地））を用い３７℃、５％ＣＯ２存在下にて３６時間培養した。培養後、内皮細胞系の細胞表面抗原であるＶＥカドヘリンあるいはＫＤＲ抗原の発現、ならびに血球系の細胞表面抗原であるＣＤ４５抗原の発現について調べた。結果、ＶＥカドヘリンやＫＤＲ抗原を発現している細胞が認められた。
実施例２：メチルセルロース培地を用いたＥＰＣコロニーアッセイ法（末梢血）
Ｇ−ＣＳＦによる動員ＣＤ３４陽性細胞移植ＡＳＯ患者３症例を対象に、本発明のＥＰＣコロニーアッセイ法を用いて、末梢血中のＣＤ３４細胞動員目的のＧ−ＣＳＦ投与や細胞移植時における末梢血中のＥＰＣの動態評価を行った。実験プロトコルを図４及び図５に示す。生理活性物質含有メチルセルロース培地としては実施例１で作製したものと同じ培地を用いた。本実施例では血液血管芽細胞を含有する細胞懸濁液としては、上述の通りＧ−ＣＳＦによる動員ＣＤ３４陽性細胞移植ＡＳＯ患者から採取した末梢血（単核球を含む）を用いた。この末梢血に対しては特にＭＡＣＳによる細胞選別は行わず、細胞懸濁液を直接アッセイにかけた。Ｇ−ＣＳＦによる動員は１日２回、１回あたり患者の体重１ｋｇあたり５μｇのＧ−ＣＳＦ（キリンビール（株）製）を皮下投与した。Ｇ−ＣＳＦ投与は５日間行った（５日目は１回のみ投与）。
経時的に患者から末梢血を採取し単核球を分離した。得られた末梢血由来単核球を生理活性物質含有メチルセルロース培地１ｍＬあたり２×１０５個の濃度で３５ｍｍ径のＰｒｉｍａｒｉａ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて１８日間培養した。その後メチルセルロース培地を除去し、非付着性の細胞をＰＢＳで洗い流した。培養皿に付着した細胞のコロニーを観察したところ実施例１と同様サイズの異なる２種類のＥＰＣコロニーが出現していた。各コロニーについて実施例１と同様にしてａｃＬＤＬ−ＤｉＩ及びＵＥＡ−１レクチン−ＦＩＴＣで二重染色を行ったところいずれも共染色された。
以下、症例毎に、末梢血中のＣＤ３４細胞動員目的のＧ−ＣＳＦ投与時、ならびにＣＤ３４陽性細胞の移植時における末梢血中の単核球数、ＣＤ３４陽性細胞数及びＥＰＣコロニー形成能（小細胞コロニー、大細胞コロニー）についての結果を示す。
単核球数及びＣＤ３４陽性細胞数の測定は、ヘモサイトメーターに細胞懸濁液を入れ、光学顕微鏡にて目算することにより行った。ＥＰＣコロニー形成能については本発明のＥＰＣコロニー形成方法及びコロニーの形成能を評価する為の方法に従って行った。
症例１（７８歳、男性）
末梢血１ｍＬあたりの単核球の数及び末梢血１ｍＬあたりのＣＤ３４陽性細胞の数を図６に、２×１０５個の末梢血単核球を本発明のＥＰＣコロニーアッセイに付した場合に形成されるコロニーの数及び末梢血１ｍＬあたりの形成されるコロニーの数をそれぞれ小細胞コロニー、大細胞コロニー及び全ＥＰＣコロニー別に測定した結果を図７に示す。
症例１において、末梢血単核球及びＣＤ３４陽性細胞はＧ−ＣＳＦの投与により増加した。さらに、ＥＰＣコロニー形成能は、２×１０５個の末梢血単核球あたり、また末梢血１ｍＬあたりＧ−ＣＳＦの投与とともに増加した。
症例２（７２歳、男性）
末梢血１ｍＬあたりの単核球の数及び末梢血１ｍＬあたりのＣＤ３４陽性細胞の数を図８に、２×１０５個の末梢血単核球を本発明のＥＰＣコロニーアッセイに付した場合に形成されるコロニーの数及び末梢血１ｍＬあたりの形成されるコロニーの数をそれぞれ小細胞コロニー、大細胞コロニー及び全ＥＰＣコロニー別に測定した結果を図９に示す。
症例２においても、末梢血単核球及びＣＤ３４陽性細胞はＧ−ＣＳＦの投与により増加した。さらに、ＥＰＣコロニー形成能は、２×１０５個の末梢血単核球あたり、また末梢血１ｍＬあたりＧ−ＣＳＦの投与とともに増加した。
症例３（６８歳、男性）
末梢血１ｍＬあたりの単核球の数及び末梢血１ｍＬあたりのＣＤ３４陽性細胞の数を図１０に、２×１０５個の末梢血単核球を本発明のＥＰＣコロニーアッセイに付した場合に形成されるコロニーの数及び末梢血１ｍＬあたりの形成されるコロニーの数をそれぞれ小細胞コロニー、大細胞コロニー及び全ＥＰＣコロニー別に測定した結果を図１１に示す。
症例３においても、末梢血単核球及びＣＤ３４陽性細胞はＧ−ＣＳＦの投与により増加した。さらに、ＥＰＣコロニー形成能は、２×１０５個の末梢血単核球あたり、また末梢血１ｍＬあたりＧ−ＣＳＦの投与とともに増加した。
以上の結果から、本発明のＥＰＣコロニーアッセイ法が、臨床的に患者末梢血中のＥＰＣ分化動態の把握に有用であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明のＥＰＣ分化動態の解析方法は、より効率的なＥＰＣ移植療法を可能にする。すなわち患者に移植する血液血管芽細胞の血液系細胞コロニーアッセイとともにＥＰＣコロニーアッセイが実施でき、それによって治療効果を予想・把握することが可能となる。さらに分化度の異なるＥＰＣのコロニーの発現状況を知ることにより、患者の病態を知ることができる。
本出願は、日本で出願された特願２００５−０４７４２２（出願日：２００５年２月２３日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
2006090886.tif 000003
【図２】
2006090886.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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