(57)【要約】  汎用性および高感度が確保され、ディスポーサブルタイプとする低コスト性を実現し、シンプルな構成で精度の高い検出が可能であると共に、効率良く且つ迅速に、検体に対して増幅反応に適した前処理を行うことができる菌体検出のための遺伝子検査用マイクロリアクタを提供する。  溶菌試薬収容部３に収容された溶菌試薬により検体中の菌体を溶菌し、菌体遺伝子を担体充填部４内に充填された担体に吸着させた後、洗浄および菌体遺伝子の抽出を行う前処理を行う。さらに、担体充填部４に送液された菌体遺伝子を含む液体の送液方向を切り替えて繰り返し前後動させる制御手段、逆止弁、増幅試薬収容部７および試薬混合部を冷却するペルチェ素子等の冷却手段を設けた。【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体または前記検体を前処理した処理液と溶菌試薬とが混合されて、前記溶菌試薬により溶菌された菌体遺伝子を含む液体から、前記菌体遺伝子を吸着する微粒状の担体が充填された担体充填部、
前記担体充填部の上流に連通し、双方向に液体の送液を行うマイクロポンプを接続するマイクロポンプ接続部、および
前記担体充填部に送液された前記菌体遺伝子を含む液体の送液方向を切り替えて、前記液体を前記担体充填部で繰り返し前後動させるようにマイクロポンプを制御する制御手段を備えたことを特徴とする遺伝子検査用マイクロリアクタ。
【請求項２】
増幅試薬を収容する増幅試薬収容部、
注入された検体または前記検体を前処理した処理液中の菌体を溶菌する溶菌試薬を収容する溶菌試薬収容部、
前記担体充填部の上流に連通し、前記担体に吸着した前記遺伝子を抽出する遺伝子抽出試薬が収容される抽出試薬収容部、
前記担体充填部の下流に連通し、遺伝子増幅を行う増幅試薬を収容する増幅試薬収納部、
前記担体充填部の下流に設けられ、前記抽出試薬収容部から送液された前記遺伝子抽出試薬により前記担体から抽出された遺伝子と、前記増幅試薬容部から送液された前記増幅試薬とが混合された液体を反応させて遺伝子増幅を行う反応部、および
前記反応部の下流に設けられ、前記遺伝子増幅が行われた前記増幅試薬が送液され遺伝子を検出が行われる第１の検出部を有し、
前記担体充填部は、前記溶菌試薬収容部の下流に設けられ、前記注入された検体または前記検体を前処理した処理液と、前記溶菌試薬収容部に収容された溶菌試薬とが混合されて、前記溶菌試薬により溶菌された菌体遺伝子を含む液体が送液されることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の遺伝子検査用マイクロリアクタ。
【請求項３】
前記反応部の上流に連通した双方向に送液を行うマイクロポンプを接続するマイクロポンプ接続部と、
前記反応部の上流に連通したマイクロポンプを制御し送液方向を切り替えて、前記遺伝子と前記増幅試薬容部から送液された前記増幅試薬とが混合された液体を、前記反応部で繰り返し前後動させる制御手段を備えたことを特徴とする請求の範囲第２項に記載の遺伝子検査用マイクロリアクタ。
【請求項４】
前記マイクロポンプは、流路抵抗が差圧に応じて変化する第１流路と、差圧の変化に対する流路抵抗の変化割合が第１流路よりも小さい第２流路と、第１流路および第２流路に接続された加圧室と、該加圧室の内部圧力を変化させるアクチュエータと、
該アクチュエータを駆動する駆動装置とを備えていることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の遺伝子検査用マイクロリアクタ。
【請求項５】
前記マイクロポンプは、流路抵抗が差圧に応じて変化する第１流路と、差圧の変化に対する流路抵抗の変化割合が第１流路よりも小さい第２流路と、第１流路および第２流路に接続された加圧室と、該加圧室の内部圧力を変化させるアクチュエータと、
該アクチュエータを駆動する駆動装置とを備えていることを特徴とする請求の範囲第３項に記載の遺伝子検査用マイクロリアクタ。
【請求項６】
前記増幅試薬収容部、溶菌試薬収容部、担体充填部、抽出試薬収容部、反応部、第１の検出部、およびマイクロポンプ接続部の間に少なくとも１つの、液体の逆流を阻止する逆止弁が設けられていることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の遺伝子検査用マイクロリアクタ。
【請求項７】
前記増幅試薬収容部が混合される試薬混合部を冷却する冷却手段が設けられていることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の遺伝子検査用マイクロリアクタ。
【請求項８】
前記冷却手段がペルチェ素子であることを特徴とする請求の範囲第７項に記載の遺伝子検査用マイクロリアクタ。
【請求項９】
液を２つの流路に分割する送液分割手段および
遺伝子の検出が行われる第２の検出部を有し、
前記２つの流路のそれぞれの下流に前記第１の検出部および第２の検出部を設け、
前記反応部で同時に増幅された前記菌体遺伝子とインターナルコントロールとを含む増幅試薬を、前記送液分割手段で２つに分割して第１及び第２の検出部に送液し、それぞれ検出部において前記菌体遺伝子とインターナルコントロールを検出することを特徴とする請求の範囲第２項に記載の遺伝子検査用マイクロリアクタ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体収容部から注入された検体もしくは該検体を前処理した処理液と、増幅試薬収容部に収容された試薬とを反応部に送液して遺伝子増幅反応を行った後、この遺伝子増幅反応を検出部で検出する操作を、前記各部が微細流路を介して連通したチップ内で行うようにした遺伝子検査用マイクロリアクタに関し、特に、検体からの菌体検出に好適なマイクロリアクタに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、マイクロマシン技術および超微細加工技術を駆使することにより、従来の試料調製、化学分析、化学合成などを行うための装置、手段(例えばポンプ、バルブ、流路、センサーなど)を微細化して１チップ上に集積化したシステムが開発されている（特許文献１）。これは、μ−ＴＡＳ（Micro total Analysis System）、バイオリアクタ、ラブ・オン・チップ（Lab-on-chips）、バイオチップとも呼ばれ、医療検査・診断分野、環境測定分野、農産製造分野でその応用が期待されている。とりわけ遺伝子検査に見られるように、煩雑な工程、熟練した手技、機器類の操作が必要とされる場合には、自動化、高速化および簡便化されたミクロ化分析システムは、コスト、必要試料量、所要時間のみならず、時間および場所を選ばない分析を可能とすることによる恩恵は多大と言える。【０００３】
例えばヒト、家畜に見られる新型感染症の突発的流行にあっては、原因となるウィルス、細菌の特定が、一刻を争う予防対策における最初の障壁となる。菌の培養が律速となりがちな従来の検出法に対し、場所を選ばず迅速に結果を出す遺伝子検査技術は、こうした急務の要請に応えるものである。さらには遺伝子による病気の診断、生活習慣病などの発症リスク予測、遺伝子医療においてもニーズが高い。【０００４】
臨床検査ではこれらの分析用チップにおける分析の定量性、解析の精度、経済性などが重要視される。そのためにはシンプルな構成で、高い信頼性の送液システムを確立することが課題である。精度が高く、信頼性に優れるマイクロ流体制御素子が求められている。これに好適なマイクロポンプシステムを本発明者らはすでに提案している（特許文献２および３）。【０００５】
また、大量の臨床検体を対象とするチップに対しては、ディスポーサブルであることが望まれ、さらに多用途対応性、製造コストなどの問題点を克服する必要がある。【０００６】
多数のＤＮＡ断片を高密度で固定化したＤＮＡチップでは、搭載する情報の内容、かさむ作製コスト、さらに検出精度、再現性などが未だ充分でないといった問題点が存在する。しかしながら、遺伝子検査の目的と種類によっては、チップ基板上に多数のＤＮＡプローブを網羅的に配置する方式よりも、適宜変更できるプライマーを使用してＤＮＡ増幅反応の効率をリアルタイムで追跡する方が、簡便かつ迅速な検査法を提供する可能性もある。
【特許文献１】特開2004-28589号公報
【特許文献２】特開2001-322099号公報
【特許文献３】特開2004-108285号公報
【非特許文献１】「ＤＮＡチップ技術とその応用」、「蛋白質  核酸  酵素」43巻、13号（1998年）君塚房夫、加藤郁之進、共立出版（株）発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はこれらの実状に鑑みてなされたものであり、遺伝子増幅反応による検体からの菌体検出に好適な遺伝子検査用マイクロリアクタを提供することを目的とする。【０００８】
即ち、汎用性および高感度が確保され、用いるプライマー、バイオプローブを適宜変更する方式のＤＮＡ増幅を行うことができ、ディスポーサブルタイプとする低コスト性を実現し、しかも検出に際してはシンプルな構成で精度の高い検出を可能とする菌体検出のための遺伝子検査用マイクロリアクタの提供を行うことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の遺伝子検査用マイクロリアクタは、検体収容部から注入された検体もしくは該検体を前処理した処理液と、増幅試薬収容部に収容された試薬とを反応部に送液して遺伝子増幅反応を行った後、この遺伝子増幅反応を検出部で検出する操作を、前記各部が微細流路を介して連通したチップ内で行うようにした遺伝子検査用マイクロリアクタであって、
前記検体中の菌体を溶菌する溶菌試薬が収容された溶菌試薬収容部と、
前記溶菌試薬により溶菌された菌体遺伝子を吸着する微粒状の担体が微細流路内に充填された担体充填部と、
前記菌体遺伝子を前記担体に吸着した後に前記担体充填部へ送液する洗浄液が収容された洗浄液収容部と、
前記担体に吸着した前記菌体遺伝子を抽出する遺伝子抽出試薬が収容された抽出試薬収容部とが前記チップ内に設けられるとともに、
前記担体充填部に送液された前記菌体遺伝子を含む液体の送液方向を切り替えて、前記液体を前記担体充填部で繰り返し前後動させる制御手段が設けられていることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
上記の発明では、検体の前処理として、検体中の菌体を溶菌し、その遺伝子を微粒状担体（ビーズ等）に吸着させた状態で洗浄を行い、次いで抽出試薬で吸着遺伝子を溶離した後に反応部へ送液して遺伝子増幅反応を行うようにしているので、効率良く且つ迅速に増幅反応に適した前処理液を得ることができる。【００１１】
特に、溶菌された菌体遺伝子を含む液体の送液方向を流路前後方向に切り替えるようにしたので、菌体遺伝子と微粒状担体とが出会う確率が高められ、効率よく多くの菌体遺伝子を微粒状担体に吸着させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明の遺伝子検査用マイクロリアクタの実施形態におけるチップの概略構成を示した平面図である。
【図２】図２（ａ）は、ピエゾポンプの一例を示した断面図、図２（ｂ）は、その上面図である。図２（ｃ）は、ピエゾポンプの他の例を示した断面図である。
【図３】図３は、ピエゾポンプをチップとは別体とした場合におけるチップのポンプ接続部周辺の構成を示した図である。
【図４】図４は、担体充填部の担体へ検体からの溶菌で出た菌体遺伝子を吸着させる構成を説明する図である。
【図５】図５は、担体充填部の担体へ検体からの溶菌で出た菌体遺伝子を吸着させる他の構成を説明する図である。
【図６】図６は、担体充填部内の菌体遺伝子を含む液体の送液を前後方向に繰り返し切り替える制御系統を説明する図である。
【図７】図７は、検体処理液と試薬との混合および反応を行う流路構成の一例を示した図である。
【図８】図８は、微細流路内に導入された検体処理液と試薬との合流液の送液を前後方向に繰り返し切り替える制御系統を説明する図である。
【図９】図９は、増幅試薬収容部および試薬混合部の構成の一例を示した図である。
【図１０】図１０は、増幅試薬収容部および試薬混合部におけるチップ下面にペルチェ素子を設けた状態を示した断面図である。
【図１１】図１１は、ＩＣＡＮ法による増幅反応を上述した方法で検出する反応部および検出部周辺の流路構成を示した図である。
【図１２】図１２は、マイクロリアクタの流路に使用される逆止弁の一例を示した断面図である。
【図１３】図１３は、逆止弁を利用した定量送液機構を説明する図である。
【図１４】図１４は、疎水性バルブの構造を説明する図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の遺伝子検査用マイクロリアクタは、前記反応部が、前記検体を前処理した処理液と、前記増幅試薬収容部に収容された試薬とが合流する合流部から先の微細流路からなり、
前記反応部に送液された前記各液の合流液の送液方向を切り替えて、前記合流液を前記反応部で繰り返し前後動させる制御手段を備えることを特徴とする。【００１４】
上記の発明では、担体充填部で前処理した処理液と試薬との合流液を、反応部内で送液方向を切り替えて前後動させながら増幅反応を行うようにしたので、菌体遺伝子と試薬とが出会う確率が高められ、反応速度が向上する。特に、反応部を微細流路とすると、流路中央部から流路内壁側へ粘性により流速勾配が生じるので、この条件下では、流路前後方向への切り替え送液による試薬の拡散は２次元的になり、菌体遺伝子と試薬とが出会う確率が高くなる。【００１５】
なお、担体充填部もしくは反応部における送液方向の切り替えは、
流路抵抗が差圧に応じて変化する第１流路と、
差圧の変化に対する流路抵抗の変化割合が第１流路よりも小さい第２流路と、
第１流路および第２流路に接続された加圧室と、
該加圧室の内部圧力を変化させるアクチュエータと、
該アクチュエータを駆動する駆動装置とを備えるマイクロポンプを用いて行うことが好ましい。【００１６】
本発明の遺伝子検査用マイクロリアクタは、検体収容部から注入された検体もしくは該検体を前処理した処理液と、増幅試薬収容部に収容された試薬とを反応部に送液して遺伝子増幅反応を行った後、この遺伝子増幅反応を検出部で検出する操作を、前記各部が微細流路を介して連通したチップ内で行うようにした遺伝子検査用マイクロリアクタであって、
前記検体中の菌体を溶菌する溶菌試薬が収容された溶菌試薬収容部と、
前記溶菌試薬により溶菌された菌体遺伝子を吸着する微粒状の担体が微細流路内に充填された担体充填部と、
前記菌体遺伝子を前記担体に吸着した後に前記担体充填部へ送液する洗浄液が収容された洗浄液収容部と、
前記担体に吸着した前記菌体遺伝子を抽出する遺伝子抽出試薬が収容された抽出試薬収容部とが前記チップ内に設けられるとともに、
前記各部を連通する微細流路のうち少なくとも一つの微細流路に逆止弁が設けられていることを特徴とする。【００１７】
上記の発明では、検体の前処理として、検体中の菌体を溶菌し、その遺伝子を微粒状担体に吸着させた状態で洗浄を行い、次いで抽出液で吸着遺伝子を溶離して反応部へ送液して遺伝子増幅反応を行うようにしているので、効率良く且つ迅速に増幅反応に適した前処理液を得ることができる。【００１８】
さらに、前記各収容部および担体充填部の間の流路における適宜の位置に、逆止弁を設けているので、当該位置における液体の逆流を防止して正確に所定の送液を行うことができる。【００１９】
逆止弁を設ける好ましい位置としては、試薬もしくは検体の処理液を定量する後述の機構を設けた場合には当該位置、また、ＰＣＲ法ではクロスコンタミネーションといった汚染による影響が著しく深刻となるため、これらの汚染を防止するための適切な部位、その他、マイクロポンプとチップとの接続部に対する下流側の近傍位置を挙げることができる。【００２０】
本発明の遺伝子検査用マイクロリアクタは、検体収容部から注入された検体もしくは該検体を前処理した処理液と、増幅試薬収容部に収容された試薬とを反応部に送液して遺伝子増幅反応を行った後、この遺伝子増幅反応を検出部で検出する操作を、前記各部が微細流路を介して連通したチップ内で行うようにした遺伝子検査用マイクロリアクタであって、
前記検体中の菌体を溶菌する溶菌試薬が収容された溶菌試薬収容部と、
前記溶菌試薬により溶菌された菌体遺伝子を吸着する微粒状の担体が微細流路内に充填された担体充填部と、
前記菌体遺伝子を前記担体に吸着した後に前記担体充填部へ送液する洗浄液が収容された洗浄液収容部と、
前記担体に吸着した前記菌体遺伝子を抽出する遺伝子抽出試薬が収容された抽出試薬収容部とが前記チップ内に設けられるとともに、
前記増幅試薬収容部、および／または複数の前記増幅試薬収容部からの各試薬が混合される試薬混合部を冷却する冷却手段が設けられていることを特徴とする。【００２１】
前記冷却手段としては、ペルチェ素子が好ましい。【００２２】
上記の発明では、検体の前処理として、検体中の菌体を溶菌し、その遺伝子を微粒状担体に吸着させた状態で洗浄を行い、次いで抽出液で吸着遺伝子を溶離して反応部へ送液して遺伝子増幅反応を行うようにしているので、効率良く且つ迅速に増幅反応に適した前処理液を得ることができる。【００２３】
さらに、増幅試薬収容部と試薬混合部をペルチェ素子などの冷却手段により冷却するようにしたので、温度による試薬の変質を防止できる。特に、ＰＣＲ増幅では３つの温度間で昇降させる温度管理が必要になり、遺伝子増幅にICAN（Isothermal chimera primer initiated nucleic acid amplification ）法を適用する構成とした場合でも、反応部を５０〜６５℃とする必要があるため、反応部の昇温過程、試薬混合時等に試薬が加温されて変質し易くなるが、増幅試薬収容部と試薬混合部のチップ上面もしくは下面、あるいは上下両面にペルチェ素子等を設けて冷却することによりこれを防止することができる。【００２４】
本発明の遺伝子検査用マイクロリアクタは、検体収容部から注入された検体もしくは該検体を前処理した処理液と、増幅試薬収容部に収容された試薬とを反応部に送液して遺伝子増幅反応を行った後、この遺伝子増幅反応を検出部で検出する操作を、前記各部が微細流路を介して連通したチップ内で行うようにした遺伝子検査用マイクロリアクタであって、
前記検体中の菌体を溶菌する溶菌試薬が収容された溶菌試薬収容部と、
前記溶菌試薬により溶菌された菌体遺伝子を吸着する微粒状の担体が微細流路内に充填された担体充填部と、
前記菌体遺伝子を前記担体に吸着した後に前記担体充填部へ送液する洗浄液が収容された洗浄液収容部と、
前記担体に吸着した前記菌体遺伝子を抽出する遺伝子抽出試薬が収容された抽出試薬収容部とが前記チップ内に設けられるとともに、
前記菌体遺伝子とインターナルコントロールとを前記反応部で同時に増幅し、これらを別途の検出部でそれぞれ検出するようにしたことを特徴とする。【００２５】
上記の発明では、検体の前処理として、検体中の菌体を溶菌し、その遺伝子を微粒状担体に吸着させた状態で洗浄を行い、次いで抽出液で吸着遺伝子を溶離して反応部へ送液して遺伝子増幅反応を行うようにしているので、効率良く且つ迅速に増幅反応に適した前処理液を得ることができる。【００２６】
さらに、阻害物質等による遺伝子増幅反応の偽陰性を判別するためのインターナルコントロールを検体の前処理液と共に増幅反応させ、反応後の溶液を、必要に応じて適宜の処理を行った後に分割して別途の検出部に送液し、一方の検出部で菌体遺伝子の増幅を検出し、他方の検出部でインターナルコントロールの増幅を検出するようにしたので、簡易な構成で、迅速に信頼性の高い検査を行うことができる。【００２７】
本発明によれば、汎用性および高感度性が確保され、ディスポーサブルタイプとする低コスト性を実現し、シンプルな構成で精度の高い検出が可能であると共に、効率良く且つ迅速に、検体に対して増幅反応に適した前処理を行うことができる細菌またはウィルス検出に好適である遺伝子検査用マイクロリアクタが提供される。【００２８】
本明細書において、「遺伝子」とは、何らかの機能を発現する遺伝情報を担うＤＮＡまたはＲＮＡをいうが、単に化学的実体であるＤＮＡ、ＲＮＡと言及することもある。【００２９】
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。図１は、本発明の遺伝子検査用マイクロリアクタの実施形態におけるチップの概略構成を示した平面図である。本実施形態の遺伝子検査用マイクロリアクタは、図示したチップ１と、送液用のマイクロポンプと、その送液、温度、反応の各制御に関わる制御系と、光学検出系と、データの収集および処理を受け持つ処理系とを備えている装置本体とから構成されていてもよい。【００３０】
チップ１以外の構成要素は、これらを一体化した装置本体としてチップ１をこの装置本体に着脱するように構成することができる。マイクロポンプは、チップ１に設けてもよいが、装置本体に組み込んで、チップ１を装置本体に装着することによりチップ１のポンプ接続部を装置本体のマイクロポンプに接続するようにすることも可能である。【００３１】
チップ１は、例えば樹脂、ガラス、シリコン、セラミックスなどを材料として微細加工技術により流路等を形成したものであり、例えば、その縦横が数十ｍｍ、高さが数ｍｍ程度のサイズを有している。チップ１に形成された微細流路は、例えば、その幅および高さが約１０μｍ〜数百μｍのサイズを有している。【００３２】
溶菌試薬収容部３、洗浄液収容部５、抽出試薬収容部６、増幅試薬収容部７、検出試薬収容部８などの各収容部内の液体は、これらの各収容部に連通されたマイクロポンプ１１で送液される。マイクロポンプ１１は、例えば、単数もしくは複数のマイクロポンプがフォトリソグラフィー技術などにより形成されたチップ状のポンプユニットと、図示したような前処理、反応および検出用の流路が形成されたチップとを面同士で重ね合わせることにより各収容部に接続することができる。【００３３】
マイクロポンプ１１としては、アクチュエータを設けた弁室の流出入孔に逆止弁を設けた逆止弁型のポンプなど各種のものが使用できるが、ピエゾポンプを用いることが好適である。図２（ａ）は、ピエゾポンプの一例を示した断面図、図２（ｂ）は、その上面図である。このマイクロポンプには、第１液室４８、第１流路４６、加圧室４５、第２流路４７、および第２液室４９が形成された基板４２と、基板４２上に積層された上側基板４１と、上側基板４１上に積層された振動板４３と、振動板４３の加圧室４５と対向する側に積層された圧電素子４４と、圧電素子４４を駆動するための駆動部（図示せず）とが設けられている。【００３４】
この例では、基板４２として、厚さ５００μｍの感光性ガラス基板を用い、深さ１００μｍに達するまでエッチングを行なうことにより、第１液室４８、第１流路４６、加圧室４５、第２流路４７および第２液室４９を形成している。第１流路４６はその幅を２５μｍ、長さを２０μｍとしている。また、第２流路４７は、その幅を２５μｍ、長さを１５０μｍとしている。【００３５】
ガラス基板である上側基板４１を、基板４２上に積層することにより、第１液室４８、第１流路４６、第２液室４９および第２流路４７の上面が形成される。上側基板４１の加圧室４５の上面に当たる部分は、エッチングなどにより加工されて貫通している。【００３６】
上側基板４１の上面には、厚さ５０μｍの薄板ガラスからなる振動板４３が積層され、その上に、例えば厚さ５０μｍのチタン酸ジルコン酸鉛（ＰＺＴ）セラミックスなどからなる圧電素子４４が積層されている。【００３７】
駆動部からの駆動電圧により、圧電素子４４とこれに貼付された振動板４３が振動し、これにより加圧室４５の体積が増減する。第１流路４６と第２流路４７とは、幅および深さが同じで、長さが第１流路よりも第２流路の方が長くなっており、第１流路４６では、差圧が大きくなると、流路内で渦を巻くように乱流が発生し、流路抵抗が増加する。一方、第２流路４７では、流路幅が長いので差圧が大きくなっても層流になり易く、第１流路に比べて差圧の変化に対する流路抵抗の変化割合が小さくなる。【００３８】
例えば、圧電素子４４に対する駆動電圧により、加圧室４５の内方向へ素早く振動板４３を変位させて大きい差圧を与えながら加圧室４５の体積を減少させ、次いで加圧室４５から外方向へゆっくり振動板４３を変位させて小さい差圧を与えながら加圧室４５の体積を増加させると、液体は同図のＢ方向へ送液される。逆に、加圧室４５の外方向へ素早く振動板４３を変位させて大きい差圧を与えながら加圧室４５の体積を増加させ、次いで加圧室４５から内方向へゆっくり振動板４３を変位させて小さい差圧を与えながら加圧室４５の体積を減少させると、液体は同図のＡ方向へ送液される。【００３９】
なお、第１流路と第２流路における、差圧の変化に対する流路抵抗の変化割合の相違は、必ずしも流路の長さの違いによる必要はなく、他の形状的な相違に基づくものであってもよい。【００４０】
上記のように構成されたピエゾポンプによれば、ポンプの駆動電圧および周波数を変えることによって、液体の送液方向、送液速度を制御できるようになっている。図２（ｃ）に、このポンプの他の例を示した。この例では、ポンプをシリコン基板７１、圧電素子４４、および図示しないフレキシブル配線から構成している。シリコン基板７１は、シリコンウエハをフォトリソグラフィー技術により所定の形状に加工したものであり、エッチングにより加圧室４５、ダイヤフラム４３、第１流路４６、第１液室４８、第２流路４７、および第２液室４９が形成されている。第１液室４８にはポート７２が、第２液室４９にはポート７３がそれぞれ設けられており、例えばこのピエゾポンプを図１のチップ１とは別体とする場合には、このポート７２、７３を介してチップ１のポンプ接続部と連通する。例えば、ポート７２、７３が穿孔された基板７４と、マイクロリアクタのポンプ接続部近傍とを上下に重ね合わせることによって、ポンプをチップ１に接続することができる。また、前述したように、１枚のシリコン基板に複数のポンプを形成することも可能である。この場合、チップ１と接続したポートの反対側のポートには、駆動液タンクが接続されていることが望ましい。ポンプが複数個ある場合、それらのポートは共通の駆動液タンクに接続されていてもよい。【００４１】
ピエゾポンプを図１のチップ１とは別体とした場合におけるチップ１のポンプ接続部周辺の構成を図３に示した。同図（ａ）は駆動液を送液するポンプ部の構成を示し、同図（ｂ）は増幅試薬を送液するポンプ部の構成を示している。ここで、２４は駆動液の収容部であり、駆動液は鉱物油などのオイル系、あるいは水系のいずれであってもよい。２５は、予め収容された増幅試薬を封止する封止液の収容部である。この封止液は、微細流路への漏出により試薬が反応してしまうこと等を防止するためのものであり、使用前に、マイクロリアクタ（μ−ＴＡＳ）チップが保管される冷蔵条件下では、固化もしくはゲル化しており、使用時、室温にすると融解し流動状態となる。封止液と増幅試薬との間には空気が介在しても差し支えないが、定量送液の観点から介在する空気の量は（試薬量に対して）充分に少ないことが望ましい。また、封止液は、微細流路中に充填してもよく、あるいは封止液用に設けられた貯留部に充填してもよい。【００４２】
ポンプ接続部１２と、増幅試薬収容部７との間の流路には、空気抜き用の流路２６が設けられている。この空気抜き用の流路２６は、ポンプ接続部１２と増幅試薬収容部７との間の流路から分岐し、その末端が開放されている。この空気抜き用の流路２６から、例えばポンプ接続時などに流路内に存在する気泡を除去するようにしている。【００４３】
この空気抜き用の流路２６は、例えば水などの水性液体が漏出することを防止する点から、流路径が１０μｍ以下であり、且つ流路内面の水との接触角が３０°以上であることが好ましい。【００４４】
１３は、図１４に示した構造を有する疎水性バルブであり、この疎水性バルブ１３は、正方向への送液圧力が所定圧に達するまで液体の通過を遮断し、所定圧以上の送液圧力を加えることにより液体の通過を許容する。図示したように、疎水性バルブ１３は、流路径を絞った部分からなり、これにより、一端側からこの絞り流路５１に達した図１４（ｂ）の液体２７が、他端側へ通過することを規制している。この絞り流路５１は、例えば、両側に直列に連結された縦横が２００μｍ×２００μｍの流路に対して、縦横が２００μｍ×３０μｍ程度となるように形成される。【００４５】
液体２７を、細径の絞り流路５１の端部から太径の流路５０へ押し出すには、表面張力のために所定の送液圧力を要する。したがって、マイクロポンプからのポンプ圧により、液体の停止と通過を制御することができるので、例えば流路の所定箇所において液体の移動を一時止めておき、所望のタイミングでこの箇所から先の流路へ送液を再開することができる。【００４６】
必要に応じて、絞り流路５１の内面には、撥水性のコーティング、例えばフッ素系のコーティングを施してもよい。＜検体の前処理＞
検体収容部２から、例えば全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、唾液、喀痰その他の体液等の検体が注入される。これら検体に含まれる、またはその可能性がある検出可能な細菌、ウィルスとしては特に限定されない。細菌、ウィルスの遺伝子、好ましくは固有のＤＮＡ配列が既知であれば、そのためのＰＣＲプライマーは、公知技術によって作製できるため、いずれも検出可能である。具体例として、結核菌、ＭＲＳＡ、インフルエンザウィルス、新型感染病原菌などを挙げることができる。必要とされる検体量は、例えば、ＤＮＡとして0.001〜100ｎｇである。【００４７】
図４に示したように、検体収容部２に注入された検体は、溶菌試薬収容部３に接続されたピエゾポンプ１１により送液される、例えばリゾチーム(lysozyme)を含む水溶液のような溶菌試薬と混合され、検体中の菌体は溶菌される。溶菌試薬としては、任意の公知のものを使用することができる。溶菌されて菌体外へ出た菌体遺伝子は、担体充填部４の微細流路４ａ内に充填された微粒状の担体５５に吸着される。【００４８】
担体５５としては、例えばガラス、シリカゲル、ハイドロキシアパタイト、セライトなどからなるビーズ、粉末等を使用できる。一例としては、粒子径０．０５〜１０００μｍのガラスビーズが０．０５ｇ／ｍｌ〜１．３ｇ／ｍｌの密度で微細流路４ａ内に充填される。【００４９】
好ましくは、担体充填部４に送液された菌体遺伝子を含む液体は、同図の矢印で示したようにその送液方向が前後に切り替えられ、液体が担体充填部４内で流路方向へ繰り返し前後動するようにマイクロポンプ１１を駆動する。これにより、菌体遺伝子５６と微粒状担体５５とが出会う確率が高められ、菌体遺伝子５６の多数を短時間で微粒状担体５５に吸着させる効率を高めることができる。場合によるが、例えば、振幅５ｍｍ、周期５秒程度の往復動をさせればよい。【００５０】
図６は、担体充填部４内の菌体遺伝子を含む液体を前後動させる送液用のマイクロポンプ１１の制御系統を示した図である。図示したように、送液用マイクロポンプ１１は増幅器３２、Ｄ／Ａ変換器３３を介してマイクロコンピュータ３４に接続されている。マイクロコンピュータ３４はタイマー３５を搭載しており、予めプログラムされたタイミングで送液用マイクロポンプ１１の送液を制御する。なお、マイクロポンプ１１を制御する３２〜３５系統は、チップ内にあってもよいが、マイクロリアクタ装置本体に組み込んで、チップ１を装置本体に装着することにより、チップ１のポンプ接続部を装置本体のマイクロポンプに接続するようにして、作動制御させることも可能である。【００５１】
図５は、検体収容部、溶菌試薬収容部および担体充填部における送液系の他の例を示した図である。図示したように、検体収容部２にもマイクロポンプ１１を接続し、検体収容部２からの検体送液と、溶菌試薬収容部３からの溶菌試薬の送液とを別制御としてもよい。この場合、例えば検体収容部２側の微細流路に逆止弁などの弁５７を設け、担体充填部４内に導入された菌体遺伝子を含む液体を前後動させる際には、弁５７を閉止して溶菌試薬収容部３に接続されたマイクロポンプ１１により送液の切り替えを行う。【００５２】
担体充填部４の微粒状担体に菌体遺伝子を吸着させた後、図１の洗浄液収容部５から、例えばTris-EDTA-NaCl／エタノール混合液などの洗浄液を送液して担体充填部４を通過させ、充分に洗浄を行う。次いで、分岐部３１の近傍に設けられた能動弁などの弁（図示せず）を切り替えて、抽出試薬収容部６から、例えばTris-EDTA緩衝液などの抽出試薬を担体充填部４へ送液し、微粒状担体に吸着された菌体遺伝子を溶離して反応部９へ前処理液として送液する。【００５３】
なお、菌体遺伝子がＲＮＡである場合には、適当な逆転写酵素を利用してｃＤＮＡに変換してから遺伝子増幅反応を行う。＜遺伝子増幅反応および検出＞
検体を前処理した検体処理液と、増幅試薬収容部７からの増幅試薬とを反応部９へ送液し、遺伝子増幅反応を行う。反応部９は、場合に応じて広幅の液溜め状であってもよく、微細流路であってもよい。【００５４】
増幅試薬収容部７は、複数の試薬に対応して複数設けられており、試薬と試薬との混合、および検体処理液と試薬との混合は、単一の混合部で所望の比率で混合してもよく、あるいは何れかもしくは両方を分割して複数の合流部を設け、最終的に所望の混合比率となるように混合してもよい。【００５５】
増幅試薬収容部および試薬混合部の構成の一例を図９に示した。このように、各増幅試薬収容部７ａ、７ｂ、７ｃにはマイクロポンプ（この例ではピエゾポンプ）１１が接続され、これらの各収容部からの流路が合流した先に試薬混合部１４が設けられている。そして、これらの各部は、ペルチェ素子によって冷却されるようになっている。即ち、図９において増幅試薬収容部７ａ、７ｂ、７ｃが設けられた領域Ａ１には、図１０（ａ）に示したようにチップ下面にペルチェ素子５９が設けられ、図９において試薬混合部１４が設けられた領域Ａ２にも、図１０（ｂ）に示したようにチップ下面にペルチェ素子５９が設けられている。【００５６】
ペルチェ素子５９は、これらの各部のチップ上面に、あるいは上下両面に設けてもよい。このように、増幅試薬収容部７と試薬混合部１４を冷却することにより、加温による試薬の変質を防止できる。特に、ＰＣＲ増幅では３つの温度間で昇降させる温度管理が必要になる。また遺伝子増幅にICAN（Isothermal chimera primer initiated nucleic acid amplification ）法を適用する構成とした場合でも、増幅反応部を５０〜６５℃とする必要があるため、反応部の昇温過程、試薬混合時等に試薬が加温されて変質し易くなるが、図１０のようにペルチェ素子を設けて冷却することによりこれを防止することができる。通常は、増幅試薬収容部７と試薬混合部１４を４℃以下程度に保てば試料の変質を充分に防止できる。【００５７】
増幅試薬収容部７には、場所や時間を問わず迅速に検査ができるように、予め試薬が収容されていることが望ましい。チップ内に内蔵される試薬類などは、蒸発、漏失、気泡の混入、汚染、変性などを防止するため、その試薬部の表面が密封処理され、封止材（封止液）により封入されている。これらの封止材（図３では封止液収容部２５に収容される）は、使用前、マイクロリアクタ（μ−ＴＡＳ）チップが保管される冷蔵条件下では、固化もしくはゲル化しており、使用時、室温にすると融解し流動状態となるものである。このような封止材としては、水に対して難溶性の可塑性物質を使用することができ、好ましくは、水に対する溶解度が１％以下であり且つ融点が８℃〜室温（２５℃）である油脂、およびゼラチンの水溶液が挙げられる。ゼラチンの水溶液は、ゼラチンの濃度を変えることによりゲル化温度を調整することができ、例えば10℃前後でゲル化させるためには、約１％の水溶液とするとよい。【００５８】
以下、反応部９で行われる遺伝子増幅反応について説明する。
・増幅法
本発明のマイクロリアクタでは、増幅方法を限定されない。例えばＤＮＡ増幅技術として、多方面で盛んに利用されているＰＣＲ増幅法を使用することができる。その増幅技術を実施するための諸条件が詳細に検討され、各種の変法、改良点も含めて各種文献などに記載されている。ＰＣＲ増幅においては、３つの温度間で昇降させる温度管理が必要になるが、マイクロチップに好適な温度制御を可能とする流路デバイスが、すでに本発明者らにより提案されている（特開2004−108285号）。このデバイスシステムを本発明のチップの増幅用流路に適用すればよい。これにより、熱サイクルが高速に切り替えられ、微細流路を熱容量の小さいマイクロ反応セルとしているため、ＤＮＡ増幅は、手作業によりマイクロチューブ、マイクロバイアルなどで行なう従来の方式よりはるかに短時間で行うことができる。【００５９】
ＰＣＲ反応のように複雑な温度管理を必要としない、最近開発されたＩＣＡＮ（Isothermal chimera primer initiated nucleic acid amplification ）法は、５０〜６５℃における任意の一定温度の下にＤＮＡ増幅を短時間で実施できる特徴を有する（特許第3433929号）。したがって、ＩＣＡＮ法は、本発明のマイクロリアクタでは、簡便な温度管理で済むために好適な増幅技術である。手作業では、１時間かかる本法は、本発明のバイオリアクタにおいては、10〜20分、好ましくは、15分で解析まで終わる。【００６０】
ＤＮＡ増幅反応は、その他のＰＣＲ変法であってもよく、本発明のマイクロリアクタは、流路の設計変更などによりいずれにも対応できる柔軟性がある。いずれのＤＮＡ増幅反応を使用する場合にも、その技術の詳細は開示されており、当業者は容易に導入することができる。
・試薬類
(i)  プライマー
ＰＣＲプライマーは、増幅したい特定部位のＤＮＡ鎖の両端に相補的な２種のオリゴヌクレオチドである。その設計は、すでに専用のアプリケーションが開発されており、当業者であればＤＮＡシンセザイザー、化学合成などにより容易に作成できる。ＩＣＡＮ法用のプライマーは、ＤＮＡおよびＲＮＡのキメラプライマーであるが、このものの調製法もすでに技術的に確立されている（特許第3433929号）。プライマーの設計、選択は、増幅反応の成否、効率を左右するため最も適切なものを使用することが重要である。【００６１】
また、ＰＣＲプライマーにビオチンを結合させておくと、増幅産物のＤＮＡを、チップ基板上のストレプトアビジンとの結合を介して基板上に固定化でき、増幅産物の定量に供し得る。その他のプライマー標識物質としてジゴキシゲニン、各種蛍光色素などが例示される。
(ii)  増幅反応用試薬類
増幅反応に使用する酵素をはじめとする試薬類は、ＰＣＲ用、ＩＣＡＮ法のいずれも容易に入手できる。【００６２】
ＰＣＲ法における試薬類として、少なくとも２'−デオキシヌクレオシド５'−三リン酸のほか、Taq ＤＮＡポリメラーゼ、Vent ＤＮＡポリメラーゼまたはPfu ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。【００６３】
ＩＣＡＮ法における試薬類は、少なくとも２'−デオキシヌクレオシド５'−三リン酸、検出したい遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションできるキメラプライマー、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼのＲＮaseを含む。
(iii)  コントロール
インターナルコントロールは、標的核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）について、増幅のモニタリング、あるいは定量の際の内部標準物質として使用される。インターナルコントロールの配列は、検体とは異なる配列の両側に、検体用プライマーと同じプライマーがハイブリダイズできる配列を有するために検体と同様に増幅できるものである。【００６４】
ポジティブコントロールの配列は、検体を検出する特異的な配列で、プライマーがハイブリダイズする部分とその間の配列が検体と同じものである。コントロールに使用する核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）は、公知技術文献に記載されているものを使用すればよい。ネガティブコントロールは、核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）以外の試薬などをすべて含み、コンタミネーションの有無のチェック、バックグラウンド補正用に用いる。
(iv)  逆転写用試薬
ＲＮＡの試料の場合、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成するための逆転写酵素、逆転写プライマーなどであり、これらも市販され容易に入手できる。【００６５】
図７は、検体処理液と試薬との混合および反応を行う流路構成の一例を示した図である。図示したように、検体処理液側流路５４からマイクロポンプ（図示せず）により送液される検体処理液と、試薬収容部７からマイクロポンプ１１により送液される試薬は、Ｙ字流路の合流部５８で合流され、後続する微細流路９ａに送液される。【００６６】
微細流路９ａは、例えば、幅が０．２ｍｍ、深さが０．２ｍｍとされ、この微細流路９ａ内でＩＣＡＮ反応が行われる。【００６７】
検体処理液と試薬とを微細流路９ａ内に充填した後、試薬を送液するマイクロポンプ１１を、送液方向を繰り返し切り替えるように駆動し、微細流路９ａ内の合流液を微細流路９ａ内で前後動させ、ＩＣＡＮ反応を行う。例えば微細流路９ａの幅が０．２ｍｍ、深さが０．２ｍｍ、液量が２５μｌである場合、振幅２５ｍｍ、周期５秒程度の往復動をさせればよい。【００６８】
この前後動により、微細流路９ａ内の試薬と検体とがアクティブに拡散混合されるとともに、流路の中心部分と壁面近傍との液体の流速勾配によって、ＤＮＡと試薬とが出会う確率が高くなり、反応速度が向上する。【００６９】
また、検体処理液側の流路５４に逆止弁、能動弁などの弁５７を設けて、混合時にはそれを閉止するとともに、試薬を送液するマイクロポンプ１１によって微細流路９ａ内の合流液を前後動させると、混合用の別途のマイクロポンプを流路に配置する必要が無い。このマイクロポンプ１１には、図２に示したようなピエゾポンプが好適である。【００７０】
図７では一方のマイクロポンプ１１だけで合流液を往復動させているが、弁５７を設けずに、検体処理液側のマイクロポンプと試薬収容部７側のマイクロポンプ１１とを駆動することにより微細流路９ａ内の合流液を往復動させるようにしてもよい。【００７１】
図８は、送液用のマイクロポンプ１１および弁５７の制御系統を示した図である。図示したように、送液用マイクロポンプ１１は増幅器３２、Ｄ／Ａ変換器３３を介してマイクロコンピュータ３４に接続されている。【００７２】
さらに、弁５７を開閉するためのエアシリンダ３６が、Ｄ／Ａ変換器３３を介してマイクロコンピュータ３４に接続されている。【００７３】
マイクロコンピュータ３４はタイマー３５を搭載しており、予めプログラムされたタイミングで送液用マイクロポンプ１１の送液および弁５７の開閉を制御する。これらの制御部についても、上述のようにマイクロリアクタ装置本体に組み込んで、チップ１のポンプ接続部を装置本体のマイクロポンプに接続させた場合に作動制御させるようにしてもよい。【００７４】
反応部９で遺伝子増幅反応を行った後、検出部１０で増幅反応を検出する。この検出部１０は、場合によっては反応部９を兼ねてもよいが、後述する金コロイドによる検出では、ストレプトアビジンを吸着させた別途の検出部で検出する。また、インターナルコントロールを菌体遺伝子と同時に増幅反応させた後、増幅反応液を分割して、菌体遺伝子の増幅検出と、インターナルコントロールの増幅検出を別途の検出部で行うようにすることが好ましい。検出部１０、もしくは反応部９と検出部１０との間の流路へ、検出試薬収容部８からの検出試薬（例えば金コロイド溶液、発光試薬など）が送液され、反応増幅液もしくはその処理物と混合もしくは接触させる。【００７５】
本発明において、増幅された目的遺伝子のＤＮＡを検出する方法は特に限定されず、必要に応じて好適な方法が使用される。そうした方法としては、可視分光測光法、蛍光測定法、発光ルミネッセンス法といった検出方法が主流である。さらに、電気化学的方法、表面プラズモン共鳴、水晶発振子マイクロバランスなどの手法も挙げられる。増幅反応の検出は、最終的に可視光により、高感度で測定できる方式が好ましい。蛍光測光より、機器が汎用的であり、妨害因子が少なく、かつ簡便に測定できてデータ処理も容易である。【００７６】
本発明に適用される好適な反応、検出方法としては、
（１）検体からの菌体遺伝子のＤＮＡと、ビオチン修飾したプライマーとを、反応部９で反応させ、遺伝子を増幅する工程、
（２）増幅された遺伝子を含む増幅反応液と変性液とを混合し、増幅された遺伝子を一本鎖に変性処理する工程、
（３）増幅された遺伝子を一本鎖に変性処理した処理液を、ストレプトアビジンを吸着させた微細流路内に送液し、前記の増幅された遺伝子を固定化する工程、
（４）増幅された遺伝子を固定化した微細流路内に、末端をＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）で蛍光標識したプローブＤＮＡを流し、これを固定化した遺伝子にハイブリダイズさせる工程、
（５）上記微細流路内に、好ましくはＦＩＴＣに特異的に結合する抗ＦＩＴＣ抗体で表面を修飾した金コロイド液を流し、これにより固定化した遺伝子にハイブリダイズしたＦＩＴＣ修飾プローブに、その金コロイドを吸着させる工程、
（６）上記微細流路の金コロイドの濃度を光学的に測定する工程、とを含む方法が挙げられる。【００７７】
上記方法において、ビオチン化ＤＮＡ、ビオチン−ストレプトアビジン結合による固定化、ＦＩＴＣ蛍光標識、ＦＩＴＣ抗体などは公知技術である。また、増幅遺伝子にＦＩＴＣ標識プローブＤＮＡをハイブリダイズさせた後に、ストレプトアビジンを吸着させた微細流路に固定化させる順序の方式も可能である。本発明では、上記（３）次いで（４）の順序の構成が好ましい。【００７８】
好ましくは、前記各工程の間に、必要に応じてストレプトアビジンを吸着させた前記流路内に洗浄液を送液する工程を含む。そのような洗浄液としては、例えば各種の緩衝液、塩類水溶液、有機溶媒などが好適である。【００７９】
上記工程において、変性液は、遺伝子ＤＮＡを１本鎖にするための試薬で、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどが挙げられる。プローブは、オリゴデオキシヌクレオチドなどが挙げられる。またＦＩＴＣの他に、ＲＩＴＣ（ローダミンイソチオシアネート）などの蛍光物質が挙げられる。【００８０】
上記の前処理、増幅および検出は、予め送液順序、容量、タイミングなどに関して設定された諸条件を、マイクロポンプおよび温度の制御とともにプログラムの内容として有するソフトウェア、前記マイクロポンプ、検出装置および温度制御装置とが一体化された装置本体に、チップを装着した状態で開始される。試料を注入した後、分析が開始され、試料および試薬類の送液、前処理、混合に基づく遺伝子増幅反応、遺伝子検出反応および光学的測定が、一連の連続的工程として自動的に実施され、測定データが、必要な条件、記録事項とともにファイル内に格納される。【００８１】
図１１は、ＩＣＡＮ法による増幅反応を上述した方法で検出する反応部および検出部周辺の流路構成を示した図である。検出対象である遺伝子に特異的にハイブリダイズするビオチン修飾したキメラプライマー、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、およびエンドヌクレアーゼなどの試薬は、図９の増幅試薬収容部７ａ、７ｂ、７ｃに収容され、各試薬収容部の上流側のピエゾポンプ１１により、各試薬収容部から下流側の流路１４へ試薬が送液され混合される。【００８２】
各試薬収容部７ａ、７ｂ、７ｃには、例えば、合計で７．５μｌ超の試薬が収容され、先端を切り捨てた計７．５μｌの試薬混合液が、２．５μｌずつ３本に分岐した流路へ送液される。そのうち一つの流路は、図１１のＢの位置に連通し、検体処理液との反応およびその検出のための系統へ繋がっている。図示しないが、他の一つの流路はポジティブコントロールとの反応およびその検出のための系統へ連通し、残りの一つの流路はネガティブコントロールとの反応およびその検出のための系統へ連通している。【００８３】
図１１のＢの位置から送液された混合試薬は、貯留部１７ａに充填される。検体処理液は、図１１のＡの位置から送液され、貯留部１７ｂに定量に充填され（２．５μｌ）、後続する流路へ定量送液される。各貯留部１７ａ、１７ｂに充填された検体処理液と試薬混合液は、Ｙ字流路を介して流路１５ａ（容積５μｌ）に送液され、この流路１５ａ内で混合およびＩＣＡＮ−ＰＣＲ反応が行われる。【００８４】
増幅反応は、５μｌの反応液と、停止液収容部２１ａに収容された１μｌの反応停止液とを容積６μｌの流路１５ｂに送液してこれらを混合することにより停止される。次いで、変性液収容部２１ｂに収容された変性液（１μｌ）と、反応液と停止液との混合液（０．５μｌ）とを、容積１．５μｌの流路１５ｃへ送液して混合し、増幅された遺伝子を１本鎖に変性する。【００８５】
この処理液を、流路内にストレプトアビジンを吸着させたストレプトアビジン吸着部１０ａ、１０ｂに送液して増幅遺伝子をこの流路内に固定化し、次に洗浄液収容部２１ｄからストレプトアビジン吸着部１０ａ、１０ｂへ洗浄液を流して洗浄する。【００８６】
次に、ハイブリダイゼーションバッファー収容部２１ｃに収容されたハイブリダイゼーションバッファーを、ストレプトアビジン吸着部１０ａ、１０ｂに収容する。次に流路１０ａ内へ、単一のポンプ１１により、各収容部２１ｆ、２１ｄ、２１ｅ、２１ｄに収容された、末端をＦＩＴＣで蛍光標識した菌体遺伝子のプローブＤＮＡ溶液、洗浄液および、ＦＩＴＣ抗体で標識した金コロイドの溶液を、同図に示した順序で送液する。同様に、増幅遺伝子が固定化された流路１０ｂ内へ、単一のポンプ１１により、各収容部２１ｇ、２１ｄ、２１ｅ、２１ｄに収容された、インターナルコントロール用プローブＤＮＡ溶液、洗浄液および、ＦＩＴＣ抗体で標識した金コロイドの溶液を、同図に示した順序で送液する。【００８７】
なお、１本鎖の増幅遺伝子をストレプトアビジン吸着部１０ａ、１０ｂに固定化する前の段階で１本鎖の増幅遺伝子にプローブＤＮＡをハイブリダイズさせるように流路を構成してもよい。【００８８】
金コロイド溶液を送液することにより、固定化された増幅遺伝子にＦＩＴＣを介して金コロイドが結合され、固定化される。この固定化された金コロイドを光学的に検出することにより、増幅の有無または増幅効率を測定する。【００８９】
このように、インターナルコントロールを検体の前処理液と共に増幅反応させ、増幅反応液を分割して別異の検出部１０ａ、１０ｂに送液し、一方の検出部１０ａで菌体遺伝子の増幅を検出し、他方の検出部１０ｂでインターナルコントロールの増幅を検出するようにしたので、簡易な構成で、迅速に信頼性の高い検査を行うことができる。【００９０】
図１１に示したように、試薬収容部、反応部および検出部の間の流路における適宜の位置には、逆止弁１６が設けられている。これ以外にも、上記のようにクロスコンタミネーションといった汚染を防止するための適切な位置（例えば、図１１におけるポンプ接続部１２の下流側の近傍位置）にも逆止弁を設けることが好ましい。【００９１】
図１２（ａ）、（ｂ）は、本実施形態のマイクロリアクタの流路に使用される逆止弁の一例を示した断面図である。図１２（ａ）の逆止弁では、微小球６７を弁体として、基板６２に形成した開口６８をこの微小球６７の移動により開閉させることによって、液体の通過を許容および遮断している。すなわち、Ａ方向から液体が送液される際には、液圧によって微小球６７が基板６２から離反して開口６８が開放されるので、液体の通過が許容される。一方、Ｂ方向から液体が逆流した場合には、微小球６７が基板６２に着座して開口６８が閉止されるので、液体の通過が遮断される。【００９２】
図１２（ｂ）の逆止弁では、基板６２上に積層され、その端部が開口６８の上側に延び出した可撓性基板６９が、液圧により開口６８の上側を上下動することにより開口６８を開閉している。すなわち、Ａ方向から液体が送液される際には、液圧によって可撓性基板６９の端部が基板６２から離反して開口６８が開放されるので、液体の通過が許容される。一方、Ｂ方向から液体が逆流した場合には、可撓性基板６９が基板６２に密着して開口６８が閉止されるので、液体の通過が遮断される。【００９３】
このように、液体の逆流を防止して正確に所定の送液を行うために逆止弁を配設することが望ましいが、逆止弁を利用した好適な機構として、図１３に示した定量送液機構を挙げることができる。この機構では、図示したように逆止弁１６と、疎水性バルブ１３ａとの間の流路（試薬充填流路１５Ａ）には、所定量の試薬が充填される。また、この試薬充填流路１５Ａから分岐し、駆動液を送液するマイクロポンプ１１に連通する分岐流路１５Ｂが設けられている。【００９４】
試薬の定量送液は、次のように行われる。最初に、逆止弁１６側から、疎水性バルブ１３ａから先へ試薬液６０が通過しない送液圧力で試薬充填流路１５Ａに試薬液６０を供給することにより試薬液６０を充填する。次いで、疎水性バルブ１３ａから先へ試薬液６０が通過することを許容する送液圧力で、マイクロポンプ１１により分岐流路１５Ｂから試薬充填流路１５Ａに向かう方向へ、疎水性バルブ１３ｂを介して駆動液７０を送液することにより、試薬充填流路１５Ａ内に充填された試薬液６０を送液制御部１５Ａから先へ押し出し、これにより試薬液６０を定量的に送液する。分岐流路１５Ｂには、空気、封止液などが存在していることがあるが、この場合でもマイクロポンプ１１で駆動液７０を送液してこの空気、封止液などを試薬充填流路１５Ａに送り込むことによって試薬を押し出すことができる。なお、試薬充填流路１５Ａに、大容積の貯留部１７ａを設けることによって、定量のバラツキが小さくなる。【００９５】
なお、この定量送液機構を、図１１における試薬混合液の定量（同図のＸ２の位置）、および検体処理液の定量（同図のＸ１の位置）に使用している。【００９６】
以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明はこれらの実施形態に限定されることはなく、その要旨を逸脱しない範囲内において種々の変形、変更が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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