(57)【要約】  本発明は、肝炎治療薬ME3738（ソヤサポゲノールＢのメチル誘導体）の原料となるソヤサポニンＢの安価で、かつ大量生産可能な製造方法を確立することを目的とする。  本発明は、以下の工程を含むことを特徴とするグループＢサポニンの製造方法を提供する。（1）ソヤサポニン類の抽出画分に低級脂肪族アルコール又は含水低級脂肪族アルコールを加えて酸性下で沈殿物を形成させる工程、（2）前工程で得られた沈殿物を低級脂肪族アルコール又は含水低級脂肪族アルコールで洗浄後、低級脂肪族アルコールに溶解する工程、（3）前工程で得られた溶液を濃縮し、加水した後、酸性化で沈殿物を形成させ、生ずる沈殿物を担体に吸着・回収する工程、（4）前工程で得られた担体を脂溶性溶剤で洗浄後、低級脂肪族アルコールにより抽出する工程【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含むことを特徴とするグループＢサポニンの製造方法。
（1）ソヤサポニン類の抽出画分に低級脂肪族アルコール又は含水低級脂肪族アルコールを加えて酸性下で沈殿物を形成させる工程、
（2）前工程で得られた沈殿物を含水低級脂肪族アルコールで洗浄後、低級脂肪族アルコールに溶解する工程、
（3）前工程で得られた溶液を濃縮し、加水した後、酸性下で沈殿物を形成させ、生ずる沈殿物を担体に吸着・回収する工程、
（4）前工程で得られた担体を脂溶性溶剤で洗浄後、低級脂肪族アルコールにより抽出する工程
【請求項２】
請求項１記載の（4）工程で得られた抽出液を濃縮し、必要に応じてグループBサポニンを固形物とすることを特徴とする精製されたグループＢサポニンの製造方法。
【請求項３】
ソヤサポニン類の抽出画分が、大豆の脱脂胚軸抽出液から抽出したソヤサポニン類であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
請求項２記載の精製グループBサポニンを含水低級脂肪族アルコールでスラリー洗浄あるいは低級脂肪族アルコールに溶解後に加水し、次いで固−液分離を行う工程を更に含んでなることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
得られるグループＢサポニン固形物の純度が５０％以上であることを特徴とする請求項２〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
以下の工程を含むことを特徴とするグループＢサポニンの製造方法。
（1）ソヤサポニン類の抽出画分に低級脂肪族アルコール又は含水低級脂肪族アルコールを加えて酸性下で沈殿物を形成させる工程、
（2）前工程で得られた沈殿物を含水低級脂肪族アルコールで洗浄後、低級脂肪族アルコールに溶解する工程、
（3）前工程で得られた溶液を濃縮して得た固形物を、必要に応じて酸性下で処理して沈殿物を形成させる工程、
（4）前工程で得られた固形物もしくは沈殿物を脂溶性溶剤で洗浄し、次いで乾燥する工程
【請求項７】
以下の工程を含むことを特徴とするグループＢサポニンの製造方法。
（1）ソヤサポニン類の抽出画分に低級脂肪族アルコール又は含水低級脂肪族アルコールを加えて酸性下で固−液分離を行い、固体部分を回収する工程、
（2）前工程で得られた固体部分を含水低級脂肪族アルコールに溶解し、生じた不溶物を除く工程
【請求項８】
以下の工程を含むことを特徴とするグループＢサポニンの製造方法。
（1）ソヤサポニン類の抽出画分に低級脂肪族アルコール又は含水低級脂肪族アルコールを加えて酸性下で固−液分離を行い、固体部分を回収する工程、
（2）前工程で得られた固体部分を含水低級脂肪族アルコールに溶解し、生じた不溶物を除く工程、
（3）前工程で得られた溶液を濃縮して得た固形物を、必要に応じて酸性下で処理して沈殿物を形成させたる工程、
（4）前工程で得られた固形物もしくは沈殿物を脂溶性溶剤で洗浄し、次いで乾燥する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グループＢサポニンの製造方法に関し、詳しくはグループＡサポニン、グループＢサポニン、イソフラボン及びオリゴ糖類を含有する胚軸抽出液よりグループＢサポニンを分離、回収する方法に関する。より詳しくは、本発明は、胚軸抽出液を加熱、低級脂肪族アルコール含有液存在下の酸沈澱、含水低級脂肪族アルコールによる洗浄、低級脂肪族アルコールへの溶解処理、珪藻土等の吸着剤処理並びに低級脂肪族アルコールによる抽出処理により、胚軸抽出液からのグループＡサポニン含量の極めて低いグループＢサポニンの効率的、かつ大量生産可能な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大豆胚軸には、グループＢサポニン以外に、グループＡサポニンあるいはイソフラボン等が含まれており、イソフラボンとしてはダイゼイン、ゲニステイン、グリシテイン等や、これらの配糖体であるダイジン、ゲニスチン、グリシチン等及びこれら配糖体のマロニルエステル、アセチルエステル等が含まれていることが一般的に知られている（非特許文献1参照）。【０００３】
グループＡサポニンとは、ソヤサポゲノールＡをアグリコンとして有しているソヤサポニンA1〜A6とそのアセチル体の総称であり、グループＢサポニンとは、ソヤサポゲノールＢをアグリコンとして有しているソヤサポニンI〜Vとその22位の水酸基に2,3-dihydro-2,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one（DDMP）を有する化合物の総称である（非特許文献2、非特許文献3参照）。
また、ソヤサポニンIは、ソヤサポニンBb、そしてソヤサポニンVはソヤサポニンBaとも称されている（非特許文献3参照）。【０００４】
ソヤサポニンを得る方法に関しては、例えば特許文献1には、原料の大豆粉末をメタノールで処理して得た抽出液をｎ‐ブタノールと水で分配した後、ブタノール層からの抽出液をカラムクロマトグラフィーにて精製する方法が開示されている。
大豆からの抽出液をODSカラムに吸着させて溶出後、クロマトグラフィーを組み込んでサポニン画分を集め、目的とするソヤサポニンを単離する方法が特許文献2に記載されている。
しかし、これらの方法で得られるソヤサポニンは、純度が低く、他の夾雑物（例えば、大豆イソフラボン）が多く含まれている。下山田ら（非特許文献4参照）は、大豆胚軸を70 ％エタノールで抽出して減圧濃縮した残渣をn-ブタノール−水（1:1）に溶解してｐHをコントロールすることによって、n-ブタノール層へのソヤサポニンIの移行性を高めることを報告している。しかしながら、この方法は、大豆イソフラボンがn-ブタノール層へ移行することとグループＡサポニンのn-ブタノール層と水層への移行性については言及していないことより、グループＢサポニンの高純度な精製法について開示したものではない。【０００５】
【特許文献１】特開昭61-7285号公報
【特許文献２】特開平6-100583号公報
【非特許文献１】S. Kudou, Y. Fleury, D. Welti, D. Magnolato, T. Uchida, K. Kitamura, and K. Okubo, Agric. Biol. Chem., 55, 2227-2233 (1991).
【非特許文献２】M. Shiraiwa, K. Harada, and K. Okubo, Agric. Biol. Chem., 55, 911‐917 (1991).
【非特許文献３】Y. Yoshiki, S. Kudou, and K. Okubo, Biosci. Biotechnol. Biochem., 62, 2291‐2299 (1998).
【非特許文献４】M. Shimoyamada, K. Okubo, M. Yoshikoshi, Y. Yoshiki, and K. Watanabe, Food Sci. Technol., Int., 1, 112-114 (1995).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
肝臓障害抑制効果のあるトリテルペン化合物、ME3738（ソヤサポゲノールＢのメチル誘導体、特許第3,279,574号及びKlein Cら, Eur. J. Immunol., 33, 2251-2261 (2003).を参照）の原料となるソヤサポニンＢの安価で大量生産可能な製造方法を確立することが重要な課題となっている。しかし、前述したクロマトグラフィーによるソヤサポニンＢの分離・精製方法は、使用する各種担体へのソヤサポニンＢの吸着量が少ないため、原料の大豆、大豆胚軸、脱脂大豆より年間数十トンという大量の精製ソヤサポニンＢを製造するためには、多量のクロマトグラフィー用担体が必要となり、操作が煩雑である上に、製造コストが高くなり実用的ではなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、こうした課題背景のもと鋭意検討し、大豆の脱脂胚軸抽出液からのグループAサポニン含量の極めて低いグループＢサポニンを、低コストで、しかも大量生産可能な取得方法を確立し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、請求項１に記載の本発明は、以下の工程を含むことを特徴とするグループＢサポニンの製造方法である。
（1）ソヤサポニン類の抽出画分に低級脂肪族アルコール又は含水低級脂肪族アルコールを加えて酸性下で沈殿物を形成させる工程、
（2）前工程で得られた沈殿物を含水低級脂肪族アルコールで洗浄後、低級脂肪族アルコールに溶解する工程、
（3）前工程で得られた溶液を濃縮し、加水した後、酸性下で沈殿物を形成させ、生ずる沈殿物を担体に吸着・回収する工程、
（4）前工程で得られた担体を脂溶性溶剤で洗浄後、低級脂肪族アルコールにより抽出する工程
また、請求項２に記載の本発明は、請求項１記載の（4）工程で得られた抽出液を濃縮し、必要に応じてグループＢサポニンを固形物とすることを特徴とする精製されたグループＢサポニンの製造方法である。
また、請求項３に記載の本発明は、ソヤサポニン類の抽出画分が、大豆の脱脂胚軸抽出液から抽出したソヤサポニン類であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法である。
請求項４に記載の本発明は、請求項２記載の精製グループＢサポニンを含水低級脂肪族アルコールでスラリー洗浄あるいは低級脂肪族アルコールに溶解後に加水し、次いで固−液分離を行う工程を更に含んでなることを特徴とする請求項２に記載の方法である。
請求項５に記載の本発明は、得られるグループＢサポニン固形物の純度が５０％以上であることを特徴とする請求項２〜４の何れか１項に記載の方法である。【０００９】
請求項６に記載の本発明は、以下の工程を含むことを特徴とするグループＢサポニンの製造方法である。
（1）ソヤサポニン類の抽出画分に低級脂肪族アルコール又は含水低級脂肪族アルコールを加えて酸性下で沈殿物を形成させる工程、
（2）前工程で得られた沈殿物を含水低級脂肪族アルコールで洗浄後、低級脂肪族アルコールに溶解する工程、
（3）前工程で得られた溶液を濃縮して得た固形物を、必要に応じて酸性下で処理して沈殿物を形成させる工程、
（4）前工程で得られた固形物もしくは沈殿物を脂溶性溶剤で洗浄し、次いで乾燥する工程
請求項７に記載の本発明は、以下の工程を含むことを特徴とするグループＢサポニンの製造方法である。
（1）ソヤサポニン類の抽出画分に低級脂肪族アルコール又は含水低級脂肪族アルコールを加えて酸性下で固−液分離を行い、固体部分を回収する工程、
（2）前工程で得られた固体部分を含水低級脂肪族アルコールに溶解し、生じた不溶物を除く工程
請求項８に記載の本発明は、以下の工程を含むことを特徴とするグループＢサポニンの製造方法である。
（1）ソヤサポニン類の抽出画分に低級脂肪族アルコール又は含水低級脂肪族アルコールを加えて酸性下で固−液分離を行い、固体部分を回収する工程、
（2）前工程で得られた固体部分を含水低級脂肪族アルコールに溶解し、生じた不溶物を除く工程、
（3）前工程で得られた溶液を濃縮して得た固形物を、必要に応じて酸性下で処理して沈殿物を形成させる工程、
（4）前工程で得られた固形物もしくは沈殿物を脂溶性溶剤で洗浄し、次いで乾燥する工程
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、胚軸抽出液からグループＡサポニン含量の極めて低いグループＢサポニンを効率的、かつ安定的に供給することが可能な製造方法が提供される。
本発明の方法は、グループＢサポニンを製造するにあたり、各種担体によるカラムクロマトグラフィーを全く使用しない方法であり、該物質を低コストで、大量生産することが可能である。
グループＢサポニンは、肝臓障害抑制効果のあるソヤサポゲノールＢメチル誘導体を商品化するための原料としての利用が期待されるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明による、大豆の脱脂胚軸抽出液からグループＡサポニン含量の極めて低いグループBサポニンの製造方法について、以下に詳しく説明する。
はじめに、請求項１に記載の方法について説明する。まず、大豆の脱脂胚軸抽出液からソヤサポニン類を低級脂肪族アルコール又は含水低級脂肪族アルコールで抽出する。このとき用いる低級脂肪族アルコールの濃度は、特に限定されないが、60〜100％が好ましい。用いる低級脂肪族アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールなどがあり、特に限定されるものではないが、抽出物からソヤサポニン以外に食品等に使用する成分を分離する場合、エタノールが好ましい。
抽出した溶液から低級脂肪族アルコール（例えばエタノール）を留去し、その残渣に加水した後、加熱処理して真正サポニンをソヤサポニンに分解する。その際の加熱温度は80〜100℃が好ましく、特に好ましい温度は90〜95℃である。また、加熱時間は、特に限定されないが、真正サポニンをソヤサポニンに分解するのに必要な時間であればよく、通常は6〜24時間が適当であり、好ましくは20〜24時間である。【００１２】
次に、該加熱処理液に低級脂肪族アルコールもしくは水と低級脂肪族アルコールを加える。ここで使用する低級脂肪族アルコールについては、特に限定されないが、好ましくはメタノール、エタノールであり、その添加量は水を加えた後の溶液の10〜30％である。このように調製した希釈液に酸を加えてｐH調整する。このとき用いる酸についても、限定されないが、好ましいものは、塩酸、硫酸、硝酸、燐酸、酢酸等である。
酸による調整後のｐHは、0.5〜3.5で、好ましくは1.0〜2.5である。ｐH調整後、必要に応じて撹拌する。この処理によって生ずる沈殿物をろ過、デカンテーション或いは遠心分離機等の固−液分離方法により沈殿物（固形物）を取得する。
得られた沈殿物を含水低級脂肪族アルコールで洗浄し、洗浄した沈殿物を低級脂肪族アルコールに溶解すると共に、生ずる不溶物をろ過等により除去する。ここで用いる低級脂肪族アルコールとしては、メタノールやエタノールなどが好ましい。【００１３】
次いで、ろ液を濃縮し、濃縮液に水を加えて、酸によりｐH調整をする。このとき用いる酸は特に限定されないが、塩酸、硫酸、硝酸、燐酸、酢酸等を用いることが好ましい。調整後のｐHは、0.5〜3.5で、好ましくは1.0〜2.5である。
酸性下で生ずる沈殿物を担体（吸着作用のある物質、例えばある種の珪藻土、好ましくはラヂオライト600、800または900等) へ吸着させる。その後、遠心分離或いはろ過等により、好ましくはバスケット遠心機により分離して当該担体を取得する。
次に、この担体を有機溶剤で洗浄する。洗浄用の有機溶剤については限定されないが、通常は脂溶性溶剤が用いられ、好ましくは酢酸エチルを用いる。このとき、必要に応じて水を加える。酢酸エチル等で洗浄後、メタノールなどの低級脂肪族アルコールを加えて抽出する。
得られた抽出液を、請求項２に記載のように、濃縮してグループＢサポニンの精製物（純度５０％以上）である固形物（好ましくは粉末、結晶など）を得る。
このようにして、グループＡサポニン含量の極めて低いグループＢサポニンを得ることができる。更に、得られたグループＢサポニンをより高純度にするために、請求項４に記載したように、含水低級脂肪族アルコール（好ましくはメタノールなど)でスラリー洗浄あるいは低級脂肪族アルコールに溶解後に加水して再沈殿化した後、遠心分離機などによる固−液分離を行うことで、更に純度の高いグループＢサポニンを得ることができる。【００１４】
請求項６に記載の方法は、上記請求項１記載の方法と同様に、ソヤサポニン類の抽出画分から酸性下で沈殿物を形成させた後、該沈殿物を含水低級脂肪族アルコールで洗浄し、洗浄した沈殿物を低級脂肪族アルコールに溶解する。これらの操作に使用する低級脂肪族アルコールなどは、上記したものと同じである。
次いで、沈殿物の低級脂肪族アルコール溶液を、濃縮して固形物を得る。この固形物を、必要に応じて酸性下で処理して沈殿物を形成させる。このとき用いる酸は特に限定されないが、前記と同様に塩酸、硫酸、硝酸、燐酸、酢酸等を用いることが好ましい。調整後のｐHは、0.5〜3.5で、好ましくは1.0〜2.5である。
この固形物もしくは沈殿物を脂溶性溶剤、好ましくは酢酸エチルで１回ないし数回洗浄し、次いで乾燥する。乾燥は、減圧乾燥機等により行うことができる。これにより、高純度のグループＢサポニンを得ることができる。【００１５】
次に、請求項７に記載の方法は、はじめにソヤサポニン類の抽出画分に低級脂肪族アルコール又は含水低級脂肪族アルコールを加え、酸性下で固−液分離を行い、固体部分を回収する。得られた固体部分を含水低級脂肪族アルコールに溶解し、その際に生じた不溶物を除くことによって、目的とするグループＢサポニンを得ることができる。なお、これらの操作に使用する低級脂肪族アルコールなどは、上記したものと同じである。【００１６】
請求項８に記載の方法は、上記請求項７に記載の方法と同様に、ソヤサポニン類の抽出画分から酸性下で固−液分離を行い、固体部分を回収した後、該固体部分を含水低級脂肪族アルコールに溶解し、その際に生じた不溶物を除去する。次に、得られた溶液を濃縮して固形物を得る。この固形物は、必要に応じて酸性下で処理して沈殿を形成させる。この処理は、前記請求項６に記載の方法と同様である。
このようにして得た固形物もしくは沈殿物を脂溶性溶剤、好ましくは酢酸エチルで１回ないし数回洗浄した後、乾燥する。乾燥は、上記と同じく減圧乾燥機等により行うことができる。これにより、高純度のグループＢサポニンを得ることができる。【００１７】
ところで、大豆の脱脂胚軸抽出液に含まれているイソフラボンについて、上記の操作における挙動について述べると、加熱処理液の希釈液に酸を加えてｐH調整し、固−液分離したとき、大部分のイソフラボンは液側に移行する。また、沈殿物を洗浄したとき、残余のイソフラボンは洗液に移る。更に、洗浄した沈殿物を低級脂肪族アルコールに溶解したとき、サポニンと共に、少量のイソフラボンも可溶部に移る。該可溶部を濃縮し、酸によりｐH調整したとき、イソフラボンはサポニンと分かれて可溶部に移行する。次いで、サポニンを吸着した担体を有機溶剤で洗浄した際に、ごく僅かに存在するイソフラボンは可溶部に移り、サポニンから分離する。
【実施例】
【００１８】
以下に、実施例を示して本発明の方法を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
なお、ソヤサポニン、ソヤサポゲノール及びイソフラボンの分析方法は、以下の通りである。また、ソヤサポゲノールＡ含量及びソヤサポゲノールＢ含量は、抽出・精製中の各種サンプルを酸性条件下にメタノリシスすることで得られるグループＡサポニン及びグループＢサポニンのアグリコン部分であるソヤサポゲノールＡ及びソヤサポゲノールＢの重量として表示した。【００１９】
ソヤサポニンの分析方法
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）条件
検出器:UV 210nm
カラム:L-Column ODS、250×4.6 nm、5μm
恒温槽:40℃
移動相:CH3CN : 0.05％TFA水溶液＝40:60
流  速:1.0mL/min
標準品:ソヤサポニンBa及びソヤサポニンBbは、大豆の脱脂胚軸の60％エタノール水溶液による抽出物を減圧乾燥し、その固形分をODSカラムクマトグラフィーにより精製し、HPLC分析で面積％が98％以上のサンプルを標準品とした。【００２０】
ソヤサポゲノール分析方法（一般的にソヤサポニンからその糖部分を除いたアグリコン部分をソヤサポゲノールと称する。)
試料300mgを精秤後、10％塩化水素−メタノール12mL加え、1時間85℃の油浴中で加熱還流し、次にこの反応液に水を10mlとエタノールを45mL加えて、25％NaOHと2.5％NaOHでｐH4〜7に調整し、80％エタノールで100mlにメスアップして試料溶液とする。また、標準品のソヤサポゲノールＡ及びソヤサポゲノールＢは、それぞれ10mg前後を精秤後、エタノールで100mLにメスアップして用いた。試料溶液及び標準溶液は、以下に示したHPLC条件で分析を行った。
ＨＰＬＣ条件
検出器:UV 210nm
カラム:L-Column ODS、250×4.6nm、5μm
恒温槽:40℃
移動相:CH3CN:H2O:MeOH=60:30:10
流  速:1.0mL/min
標準品:ソヤサポゲノールＢ及びソヤサポゲノールＡは、大豆の油粕よりシリカゲルカラムクマトグラフィーにより精製し、HPLC分析で面積％が98％以上のサンプルを標準品とした。【００２１】
イソフラボン分析方法（イソフラボンの分析は、(財)日本健康・栄養食品協会法に従って行い、３種類の大豆イソフラボンをHPLCにて測定した。ダイジンの標品を用いて測定し、ダイジン以外のイソフラボンは、各イソフラボンの定量係数を乗じて、換算した。以下に、HPLC条件及びイソフラボンの定量係数を示す。
HPLC条件
検出器:UV 254nm
カラム:ODSカラム5μm 250×4.6mm Develosil ODS-7
恒温槽:35℃
移動相:0.1％酢酸水溶液／アセトニトリル混液（85:15→65:35，50分直線グラジエント)
流  速:1.0mL/min
注入量:10μL【００２２】
【表１】
2005097815.tif 000002
【００２３】
実施例１
大豆の脱脂胚軸抽出液からソヤサポニン類を60％エタノールで抽出して得た溶液からエタノールを留去し、その残渣に水を加えた後、90〜93℃で16.5時間加熱した。
次に、この加熱処理液2000mL（固形分:36.2％、ソヤサポニンBa:5.53g、ソヤサポニンBb:18.81g、ソヤサポゲノールＡ含量:17.40g、ソヤサポゲノールＢ含量:13.77g、ダイジン:13.76g、グリシチン:8.26g、ゲニスチン:4.50g）に水2000mLとエタノール800mLを加えたのち、6N−塩酸でｐH2.5に調整し、３時間撹拌後、遠心分離して沈殿物を取得した。このとき、ろ液4265mL（固形分:12.8％）には、ソヤサポニンBa:0.28g、ソヤサポニンＢ:2.41g、ソヤサポゲノールＡ含量:13.11g、ソヤサポゲノールＢ含量:1.64g、ダイジン:11.67g、グリシチン:6.77g、ゲニスチン:3.45gが移行した。
この遠心分離により得られた沈殿物を10％メタノール7000mLで洗浄した。洗浄液6910mL（固形分:1.88％）中には、ソヤサポニンBa、ソヤサポニンBb、ソヤサポゲノールＢは無く、ソヤサポゲノールＡ含量:3.81g、ダイジン:1.68g、グリシチン:0.89g、ゲニスチン:0.49gが移行した。【００２４】
次に、洗浄した沈殿物をメタノール2000mLに溶解し、生じた不溶物をろ過して除去した。ろ液2930mL（固形分:2.95％）には、ソヤサポニンBa:5.69g、ソヤサポニンBb:17.30g、ソヤサポゲノールＡ含量:3.71g、ソヤサポゲノールＢ含量:12.35g、ダイジン:0.23g、グリシチン:0.11g、ゲニスチン:0.44gが移行した。
ろ液のメタノール層を濃縮して得た濃縮液900mLに水1500mLを加えて、1N−塩酸によりｐH2.5に調整した。生じた沈殿物を珪藻土（ラヂオライト800）へ吸着させ、遠心分離により珪藻土を取得した。ろ液1820mL（固形分:0.28％）中には、ソヤサポニンBaは無く、ソヤサポニンBb:0.04g、ソヤサポゲノールＡ含量:0.61g、ソヤサポゲノールＢ含量:0.08g、ダイジン:0.15g、グリシチン:0.07g、ゲニスチン:0.16gが移行した。【００２５】
次いで、吸着物を担持した珪藻土を10％メタノール3000mLで洗浄したところ、洗浄液3840mL（固形分:0.06％）には、ソヤサポニンBa、ソヤサポニンBbは無く、ソヤサポゲノールＡ含量:0.11g、ソヤサポゲノールＢ含量:0.05g、ダイジン:0.05g、グリシチン:0.02g、ゲニスチン:0.08gが移行した。
この珪藻土にメタノール2000mLを加えて抽出した。得られた抽出液2480mL（固形分:3.15％)には、ソヤサポニンBa:5.50g、ソヤサポニンBb:16.52g、ソヤサポゲノールＡ含量:2.03g、ソヤサポゲノールＢ含量:13.45gが移行した。このメタノール抽出液2060mLを濃縮し、酢酸エチルおよび水を加えて粉末化することで、精製サポニン15.17gを得た。【００２６】
得られた精製サポニンを高速液体クロマトグラフィーにて分析したところ、ソヤサポニンBｂが45.7％、ソヤサポニンBａが24.8％であり、グループＢサポニンとして純度70.5％であった。
グループＢサポニンとグループAサポニンをそれぞれのアグリコン部分であるソヤサポゲノールＢとソヤサポゲノールAに変換して、グループＢサポニンとグループＡサポニンの含有割合を測定するために、得られた精製サポニンを10％塩酸／メタノールで１時間、加熱還流してソヤサポゲノールとした後、ＨＰＬＣにて分析したところ、ソヤサポゲノールＢの含有割合は34.5％、ソヤサポゲノールＡの含有割合は3.9％であった。
これらの測定結果を、表２に示す。表中のBａはソヤサポニンBa、BｂはソヤサポニンBｂ、Soya AはソヤサポゲノールA、Soya BはソヤサポゲノールＢを、それぞれ表す。【００２７】
【表２】
2005097815.tif 000003
【００２８】
実施例２
実施例１に準じた方法で得られたグループＢサポニン45g（ソヤサポニンＢの純度約60％、ソヤサポゲノールＢの含有割合29.8％、ソヤサポゲノールＡの含有割合4.2％）をメタノール（675mL）と水（675mL）の混合溶液に懸濁して40℃で加熱撹拌した後、遠心分離した。
得られた沈殿物を更にメタノール（225mL）と水（225mL）の混合溶液に懸濁して遠心分離した。更に、同様の操作を繰り返し、より純度の高い精製サポニンを27.5g（ソヤサポニンＢの純度約82％、ソヤサポゲノールＢの含有割合40.8％、ソヤサポゲノールＡの含有割合0.54％）得た。【００２９】
実施例３
実施例１に準じた方法で得られたグループＢサポニン69.9g（ソヤサポニンＢの純度約47％、ソヤサポゲノールＢの含有割合23.5％、ソヤサポゲノールＡの含有割合5.6％）を1050mLのメタノールに溶解し、撹拌下、40℃に保ちながら1050mLの水をゆっくりと滴下した後、遠心分離を行って、より純度の高い精製サポニンを27.5g（ソヤサポニンＢの純度約88％、ソヤサポゲノールＢの含有割合44.0％、ソヤサポゲノールＡの含有割合0.53％）得た。【００３０】
実施例４
大豆の脱脂胚軸抽出液からソヤサポニン類を60％エタノールで抽出して得た溶液からエタノールを留去し、その残渣に水を加えた後、90〜93℃で16.5時間加熱した。
次に、この加熱処理液700mL（固形分:36.2％、ソヤサポニンBa:1.94g、ソヤサポニンBb:6.58g、ソヤサポゲノールＡ含量:6.09g、ソヤサポゲノールＢ含量:4.81g、ダイジン:4.82g、グリシチン:2.89g、ゲニスチン:1.58g）に水700mL、エタノール280mLを加えて、6N−塩酸でｐH2.5に調整し、２時間撹拌後、遠心分離して沈殿物（ソヤサポニンＢ:8.52g）を取得した。一方、ろ液1525mLには、ソヤサポニンBa:85mg、ソヤサポニンBb:729 mgが移行したことを確認した。【００３１】
実施例５
実施例４で得られた沈殿物（ソヤサポニンＢ:4.25g）を10％エタノール1400mLで洗浄した。得られた洗浄液1340mLには、ソヤサポニンBa、ソヤサポニンBb、ソヤサポゲノールＢは移行しなかった。一方、洗浄した沈殿物を70％エタノール695mLに溶解し、生じた不溶物をろ過して除去した。なお、この不溶物にはソヤサポニンＢが136mg（収率3.2％）が移行していた。
ろ液652mL（固形分:15.9％）には、ソヤサポニンBa:0.99g、ソヤサポニンBb:3.13gが移行した（回収率96.9％）。【００３２】
当該ろ液95mL (ソヤサポニンBa:145mg、ソヤサポニンBb:457mg）を24mLまで濃縮し、析出した沈殿物を酢酸エチル5mLと10mLで２回洗浄したのち、沈殿物を遠心分離した。その後、乾燥して精製サポニン487mg（純度72.2％、ソヤサポニンBa:107mg、ソヤサポニンBb:245mg）を得た。
グループＢサポニンとグループＡサポニンの含量を、それぞれのアグリコン部分であるソヤサポゲノールＢとソヤサポゲノールＡに変換して測定した。すなわち、得られた精製サポニンを10％塩酸／メタノールで１時間、加熱還流してソヤサポゲノールとした後、高速液体クロマトグラフィーにて分析したところ、ソヤサポゲノールＢの含有割合は35.7％、ソヤサポゲノールＡの含有割合は1.7％であった。【００３３】
実施例６
大豆の脱脂胚軸抽出液からソヤサポニン類を60％エタノールで抽出した溶液からエタノールを留去し、その残渣に水を加えた後、90〜93℃で16.5時間加熱した。
次に、この加熱処理液2000mL（固形分:36.2％、ソヤサポニンBa:5.53g、ソヤサポニンBb:18.81g、ソヤサポゲノールＡ含量:17.40g、ソヤサポゲノールＢ含量:13.77g、ダイジン:13.76g、グリシチン:8.26g、ゲニスチン:4.50g）に水2000mLとエタノール800mLを加えて、6Ｎ−塩酸でｐＨ2.5に調整し、３時間撹拌後、遠心分離して沈殿物（ソヤサポニンＢ:23.43g）を取得した。一方、ろ液4196mLには、ソヤサポニンBa:90mg、ソヤサポニンBb:821mg、ソヤサポゲノールＡ含量:12.39g、ソヤサポゲノールＢ含量:1.62gが移行したことを確認した。【００３４】
実施例７
実施例６で得られた沈殿物（ソヤサポニンＢ:11.73g）を10％エタノール3500mLで洗浄した。この洗浄液3500mLには、ソヤサポニンBa、ソヤサポニンBbは移行せず、ソヤサポゲノールＢ:55mg、ソヤサポゲノールＡ:681mgが移行した。一方、洗浄した沈殿物を70％エタノール2750mLに溶解し、生じた不溶物をろ過して除去した。なお、この不溶物にはソヤサポニンＢが282mg（収率2.3％）が移行していた。
ろ液2940mLには、ソヤサポニンBa:2.80g、ソヤサポニンBb:8.78g、ソヤサポゲノールＢ:6.45g、ソヤサポゲノールＡ:1.97gが移行した（回収率95.0％)。
該ろ液610 mL (ソヤサポニンBa:581mg、ソヤサポニンBb:1.82g）を100mLまで濃縮し、水100mlを加えて、1N−塩酸でｐH2.5に調整した。これを遠心分離し、得られた沈殿物を酢酸エチル40mLで洗浄したのち、該沈殿物を遠心分離した。その後、乾燥して精製サポニン2.91g（純度63.0％:ソヤサポニンBa:489mg、ソヤサポニンBb:1.34g）を得た。
また、沈殿化の廃母液には、ソヤサポニンBa:9.6mg、ソヤサポニンBb:246mg、ソヤサポゲノールＢ:167mg、ソヤサポゲノールＡ:284mgが移行した。
グループＢサポニンとグループＡサポニンの含量を、それぞれのアグリコン部分であるソヤサポゲノールＢとソヤサポゲノールＡに変換して測定した。すなわち、得られた精製サポニンを10％塩酸／メタノールで１時間、加熱還流してソヤサポゲノールとした後、高速液体クロマトグラフィーにて分析したところ、ソヤサポゲノールＢの含有割合は36.1％、ソヤサポゲノールＡの含有割合は4.5％であった。結果を表３に示す。【００３５】
【表３】
2005097815.tif 000004
【００３６】
実施例８
実施例4で得られた沈殿物（ソヤサポニンＢ:4.27 g）を30％エタノール1400mLで洗浄した。この洗浄液1395mLには、ソヤサポニンBa:21mg、ソヤサポニンBb:150mgが移行した。この洗浄した沈殿物を70％エタノール490mLに溶解し、生じた不溶物をろ過して除去した。ろ液440mL（固形分:19.1％）には、ソヤサポニンBa:0.97g、ソヤサポニンBb:2.91gが移行した（回収率91.0％）。一方、生じた不溶物には、ソヤサポニンＢが249mg（収率5.8％）が移行した。【００３７】
実施例９
実施例８で得られたろ液70mL（ソヤサポニンBa:154mg、ソヤサポニンBb:463g）を24mLまで濃縮し、析出した沈殿物を酢酸エチル5mLと10mLで２回洗浄した。次に、該沈殿物を遠心分離後、乾燥して精製サポニン171mg（純度81.9％:ソヤサポニンBa:51mg、ソヤサポニンBb:90mg、回収率21％）を得た。
グループＢサポニンとグループＡサポニンの含量を、それぞれのアグリコン部分であるソヤサポゲノールＢとソヤサポゲノールＡに変換して測定した。すなわち、得られた精製サポニンを10％塩酸／メタノールで１時間、加熱還流してソヤサポゲノールとした後、高速液体クロマトグラフィーにて分析したところ、ソヤサポゲノールＢの含有割合は39.8％、ソヤサポゲノールＡの含有割合は0.6％であった。【００３８】
実施例１０
実施例６で得られた沈殿物（ソヤサポニンＢ:11.70g）を30％エタノール3500mLで洗浄した。得られた洗浄液3550mLには、ソヤサポニンBa:36mg、ソヤサポニンBb:313mgが移行した。この洗浄した沈殿物を70％エタノール2660mLに溶解し、生じた不溶物をろ過して除去した。ろ液2160mLには、ソヤサポニンBa:2.83g、ソヤサポニンBb:8.65g、ソヤサポゲノールＢ:5.90g、ソヤサポゲノールＡ:0.91gが移行した（回収率94.5％）。一方、生じた不溶物には、ソヤサポニンＢが359mg（収率3.0％）が移行した。
ここで得られたろ液470mL（ソヤサポニンBa:616mg、ソヤサポニンBb:1.88g）を100mLまで濃縮し、水100mLを加えた後、1N−塩酸でｐH2.5に調整した。これを遠心分離し、得られた沈殿物を酢酸エチル40mLで洗浄した。次いで、該沈殿物を遠心分離後、乾燥して精製サポニン2.50g（純度73.5％:ソヤサポニンBa:518mg、ソヤサポニンBb:1.32g、回収率69.5％）を得た。【００３９】
グループＢサポニンとグループＡサポニンの含量を、それぞれのアグリコン部分であるソヤサポゲノールＢとソヤサポゲノールＡに変換して測定した。すなわち、得られた精製サポニンを10％塩酸／メタノールで１時間、加熱還流してソヤサポゲノールとした後、高速液体クロマトグラフィーにて分析したところ、ソヤサポゲノールＢの含有割合は40.6％、ソヤサポゲノールＡの含有割合は2.2％であった。得られた結果を表４に示す。【００４０】
【表４】
2005097815.tif 000005
【００４１】
実施例１１
実施例１に示した加熱処理液2000 mLの一部200 mL に水200 mL、エタノール80 mLを加えて、6 N塩酸でpH 2.5に調整し、2時間撹拌後、遠心分離し沈殿物を取得した。得られた沈殿物を用いて表５で示した洗浄溶媒700mLを用いて洗浄工程を２回行った後、沈殿物を表５で示した抽出溶媒200mLに溶解し、生じた不溶物をろ過して除去した。ろ液を濃縮、乾固してソヤサポニンB含量を測定した。ソヤサポニンB回収率とソヤサポニンB純度を表５に示した。【００４２】
【表５】
2005097815.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明によれば、低コストで、大量生産可能なソヤサポニンＢの製造方法が提供される。このソヤサポニンＢは、ソヤサポゲノールＢの原料として用いられる物質であり、肝臓障害抑制効果のあるソヤサポゲノールＢのメチル誘導体の製造に有用である。
【国際調査報告】
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