(57)【要約】【課題】本発明の目的は、試料中に含まれる複数の塩基多型の種類を、容易に、同時検出するのに優れた核酸配列分析法を提供することにある。【解決手段】複数種類の塩基多型を測定すべき試料と、複数種類の第一オリゴヌクレオチドと、複数種類の第二オリゴヌクレオチドとを、ハイブリダイゼーションさせ、ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガーゼ活性含む酵素とを用いて第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドとを連結し連結オリゴヌクレオチドを生成させ、該連結オリゴヌクレオチドに相補的配列を有する検出用プローブを用いて該連結オリゴヌクレオチドの種類を同定することによって、試料中に含まれる複数種類の塩基多型を同時に同定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれる複数種類の塩基多型を同時に同定する方法であって、複数種類の塩基多型を測定すべき試料と複数種類の第一オリゴヌクレオチドと複数種類の第二オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションさせ、ヌクレアーゼ活性を含む酵素とリガーゼ活性を含む酵素とを用いて第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドとを連結し連結オリゴヌクレオチドを生成させ、該連結オリゴヌクレオチドに相補的配列を有する検出用プローブを用いて該連結オリゴヌクレオチドの種類を同定することを特徴とする複数塩基多型同定方法。
【請求項２】
第一オリゴヌクレオチドに塩基多型の配列部分と相補的な配列が含まれることを特徴とする請求項１記載の複数塩基多型同定方法。
【請求項３】
第二オリゴヌクレオチドに塩基多型の予想される配列部分と相補的でない配列が含まれることを特徴とする請求項１記載の複数塩基多型同定方法。
【請求項４】
第二オリゴヌクレオチドの５’末端に塩基多型の予想される配列部分と相補的でない配列が含まれることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の複数塩基多型同定方法。
【請求項５】
第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドとを、塩基多型の予想される配列部分を含む標的核酸に接触させたときに、塩基多型の予想される配列部分において少なくとも１塩基以上オーバーラップするように設計されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の複数塩基多型同定方法。
【請求項６】
第一オリゴヌクレオチドが、予め標識されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の複数塩基多型同定方法。
【請求項７】
標識が酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射線物質、発光団および特定の核酸配列からなる群から選ばれたいずれかの方法であることを特徴とする請求項６に記載の複数塩基多型同定方法。
【請求項８】
野生型を検出するための第一オリゴヌクレオチドと、多型を検出するための第一オリゴヌクレオチドが、それぞれの異なる蛍光波長を有する蛍光物質で標識されていることを特徴とする請求項６又は７に記載の複数塩基多型同定方法。
【請求項９】
検出用プローブを用いて連結オリゴヌクレオチドを検出する方法が、ハイブリダイゼーションであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の複数塩基多型同定方法。
【請求項１０】
検出用プローブが、少なくとも第二オリゴヌクレオチドの一部に相補的な配列を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の複数塩基多型同定方法。
【請求項１１】
検出用プローブが、少なくとも第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの一部に相補的な配列を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の複数塩基多型同定方法。
【請求項１２】
検出用プローブが多型配列の部分を含んでいることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の複数塩基多型同定方法。
【請求項１３】
検出用プローブの多型配列の部分が、ミックス塩基であることを特徴とする請求項１２記載の複数塩基多型同定方法。
【請求項１４】
１種類以上の検出用プローブが、固相に固定されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の複数塩基多型同定方法。
【請求項１５】
検出用プローブを固定した固相がDNAマイクロアレイであることを特徴とする請求項１４に記載の複数塩基多型同定方法。
【請求項１６】
連結オリゴヌクレオチドを増幅反応により増幅した後、検出することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の複数塩基多型同定方法。
【請求項１７】
増幅方法が、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲおよびＴＭＡよりなる群から選ばれたいずれかの方法であることを特徴とする請求項１６に記載の複数塩基多型同定方法。
【請求項１８】
試料が予め増幅された核酸であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の複数塩基多型同定方法。
【請求項１９】
増幅方法が、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲおよびＴＭＡよりなる群から選ばれたいずれかの方法であることを特徴とする請求項１８に記載の複数塩基多型同定方法。
【請求項２０】
ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガーゼ活性を含む酵素を逐次及び／又は同時に用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の複数塩基多型同定方法。
【請求項２１】
ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガーゼ活性を含む酵素が、同一であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の複数塩基多型同定方法。
【請求項２２】
ヌクレアーゼ活性を含む酵素が、Mung beanヌクレアーゼ、S1 ヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼI〜VIIからなる群から選択される少なくとも１種の酵素であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の複数塩基多型同定方法。
【請求項２３】
リガーゼ活性を含む酵素がT4DNA リガーゼ、Ecoli DNAリガーゼ 、RNA リガーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の複数塩基多型同定方法。
【請求項２４】
ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガーゼ活性を含む酵素が耐熱性酵素であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の複数塩基多型同定方法。
【請求項２５】
耐熱性酵素がTth、Taq、KODまたはPfuに由来することを特徴とする請求項２４に記載の複数塩基多型同定方法。
【請求項２６】
ヌクレアーゼ活性を含む酵素がＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の複数塩基多型同定方法。
【請求項２７】
ＤＮＡポリメラーゼが、Tth由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、Taq由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、KOD由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及びPfu由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼからなる群より選ばれた１種又は２種以上のＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項２６に記載の複数塩基多型同定方法。
【請求項２８】
塩基多型が１塩基多型、挿入、欠失多型のいずれかを含む請求項１〜３のいずれかに記載の複数塩基多型同定方法。
【請求項２９】
試料中に含まれる複数種類の塩基多型を同時に同定する方法であって、
(1)該塩基多型の配列部分を含む複数種類の第一オリゴヌクレオチドを調製し、該第一オリゴヌクレオチドと隣接し該塩基多型の配列部分でハイブリダイズしない配列を含む複数種類の第二オリゴヌクレオチドを調製し、
(2)該第一オリゴヌクレオチド及び該第二オリゴヌクレオチドを、試料中に含まれる染色体又は核酸断片とハイブリダイズさせ、
(3)各々のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした時に、塩基多型の配列部分で該第二オリゴヌクレオチドに生じる塩基対を形成しない塩基配列を、ヌクレアーゼ活性を含む酵素により除去した後、リガーゼ活性を含む酵素を作用させることにより、該オリゴヌクレオチドを連結し連結オリゴヌクレオチドを生成し、
(4)該連結オリゴヌクレオチドを、少なくとも該第二オリゴヌクレオチドの一部に相補的な複数種類の検出用プローブ、および/または、少なくとも該第二オリゴヌクレオチドと該第一オリゴヌクレオチドの一部に相補的な複数種類の検出用プローブを用いて検出することを特徴とする複数塩基多型同定方法。
【請求項３０】
試料中に含まれる複数種類の塩基多型を同時に同定するためのキットであって、少なくとも下記の(i)〜(v)を含むことを特徴とするキット。
(i)塩基多型の配列部分を含む２種類以上の第一オリゴヌクレオチド
(ii) 第一オリゴヌクレオチドと隣接し該塩基多型の配列部分でハイブリダイズしない配列を含む２種類以上の第二オリゴヌクレオチド
(iii) ヌクレアーゼ活性を含む少なくとも一種の酵素
(iv)リガーゼ活性を含む少なくとも一種の酵素
(v)少なくとも第二オリゴヌクレオチドの一部に相補的な検出用プローブ、および/または、少なくとも第二オリゴヌクレオチドと第一オリゴヌクレオチドの一部に相補的な検出用プローブ
【請求項３１】
試料中に含まれる複数種類の塩基多型を同時に同定するためのキットであって、少なくとも下記の(i)〜(vi)を含むことを特徴とするキット。
(i)塩基多型の予想される配列部分において、多型を示す塩基と相補的な配列が含まれる２種類以上の多型第一オリゴヌクレオチド
(ii)塩基多型の予想される配列部分において、野生型を示す塩基と相補的な配列が含まれる２種類以上の野生型第二オリゴヌクレオチド
(iii) 多型型および／または野生型第一オリゴヌクレオチドと隣接し該塩基多型の予想される配列部分でハイブリダイズしない配列を含む２種類以上の第二オリゴヌクレオチド
(iv) ヌクレアーゼ活性を含む少なくとも一種の酵素
(v)リガーゼ活性を含む少なくとも一種の酵素
(vi)少なくとも第二オリゴヌクレオチドの一部に相補的な検出用プローブ、および/または、少なくとも第二オリゴヌクレオチドと第一オリゴヌクレオチドの一部に相補的な検出用プローブ
【請求項３２】
検出用プローブが予め固定されている固相を含む請求項３０または３１に記載のキット。
【請求項３３】
固相がDNAマイクロアレイであることを特徴とする請求項３０または３１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸配列の分析法に関する。さらに詳しくは、試料中に含まれる複数の塩基多型を同時に検出することができる核酸配列分析法に関する。本発明の核酸配列分析法は、遺伝子工学や分子生物学及びこれらに関連する産業分野において有用である。
【背景技術】
【０００２】
本発明において、塩基多型とは野生型とは異なる配列を有する遺伝子型であって、多型遺伝子は薬物代謝において副作用および治療失敗の発生において個体間変動の原因として重要な役割を果たしている。また体質として知られる基礎代謝等の個人差の原因としても知られている。その上、これらは多数の疾患の遺伝マーカーとしての働きもする。それゆえ、これら突然変異の解明は臨床的に重要であり、ルーチンの表現型分類が臨床研究における精神医学患者および自発志願者にとって特に推奨される（例えば、非特許文献１及び２参照）。それゆえ、原因となる多型遺伝子の同定に続くそれぞれの遺伝子型の検出用の核酸配列分析法が所望される。【０００３】
従来の核酸配列分析技術としては、例えば核酸配列決定法（シークエンシング法）がある。核酸配列決定法は核酸配列中に含まれる塩基多型を検出、同定することができるが、鋳型核酸の調製、ポリメラーゼ反応、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、核酸配列の解析等を行うため多大な労力と時間が必要である。また近年の自動シークエンサーを用いることで省力化は行うことができるが、高価な装置が必要であるという問題がある。【０００４】
他の方法として、サザンハイブリダイゼーション法がある（例えば、非特許文献３参照）。この方法によれば、標識されたＤＮＡプローブと相補的な塩基配列を持つＤＮＡの領域を同定することができる。即ち、サザンハイブリダイゼーション法では、核酸断片をアガロースゲルやポリアクリルアミドゲルの平板上で電気泳動させ、断片の大きさ（長さ）によって分離した後、変性させて一本鎖とし、その平板にニトロセルロースやナイロン等のメンブランを張り付け、核酸断片を電気泳動パターンそのままにトランスファーし、固定した後、ＲＩ（放射性同位体）等で標識した塩基多型特異的ＤＮＡプローブとハイブリッドを形成させ、プローブに相補的なメンブラン上の核酸断片をオートラジオグラフィー等により検出する。【０００５】
サザンハイブリダイゼーション法によれば、目的とする核酸断片の電気泳動位置や分子量を決めることができるが、電気泳動やオートラジオグラフィー等の操作に長時間を要し、迅速に分析を行うことができないこと、塩基多型特異的ＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションしたか否かだけで検出するため、プローブの特異性を厳密にしないと、塩基多型の有無を検出するための類似配列を識別することが困難である等の問題があった。【０００６】
他に、酵素を用いた核酸配列の識別方法として、リガーゼを用いた方法（例えば、特許文献１及び２参照）や、ヌクレアーゼを用いた方法（例えば、特許文献３参照）が知られている。リガーゼを用いる方法として良く知られるオリゴヌクレオチド連結アッセイ（“ＯＬＡ”）において、所望の標的領域にまたがる２つのプローブまたはプローブエレメントが標的領域にハイブリダイズされる。プローブエレメントが隣接の標的塩基と塩基対になると、プローブエレメントの向かい合う末端は、連結反応により、例えばリガーゼ処理により結ばれる。連結プローブエレメントは検定されて、標的配列の存在が明らかにされる。【０００７】
近年、標的遺伝子における多数の配列の各々の存在・不存在を検出するのに有用な方法に関して、（例えば、遺伝子スクリーニング分野において）必要性が増大している。例えば４００種もの変異が嚢胞性線維症に関連している。この疾患に対する遺伝子的前処置のためのスクリーニングにおいて、“嚢胞性線維症”の積極的な同定を行うために、対象者のゲノムＤＮＡにおける可能性のある相違する遺伝子配列変異のすべてを検査することが最適である。１回のアッセイで可能性ある変異部位のすべての存在・不存在を検査するのが理想的である。【０００８】
そのような多数の塩基多型解析方法として、複数の検出用オリゴヌクレオチドプローブを固相に結合した、DNAマイクロアレイ（DNAチップ）と呼ばれる固相を用いたハイブリダイゼーションアッセイ方法がある。しかし、固相ハイブリダイゼーションアッセイにおいては、多数の液体処理工程を必要とし、単一ヌクレオチド・ミスマッチ識別に要するストリジェンシィを保持するために、いくつかのインキュベーションおよび洗浄温度を注意深くコントロールしなければならない。最適ハイブリダイゼーション条件がプローブ配列によって大きく変わるので、この方法の多重化は困難である。【０００９】
この問題を、１種の多型配列あたり数十本のオリゴヌクレオチドを用いて、DNAマイクロアレイにより多型を解析可能にした方法も開示されている（例えば、特許文献４参照）。この方法によると、それぞれの多型性形態に基づいて並べられた（ｔｉｌｅｄ）プローブの特殊化されたアレイを用いて分析する。並べ付け（ｔｉｌｉｎｇ）は、関連する固定化プローブの群の使用をいい、そのいくつかが参照配列に対して完全な相補性を示し、そして他のものは参照配列からのミスマッチを示す（例えば、特許文献５参照）。しかしこの方法では、１種の多型に数十本のオリゴヌクレオチドを用いるため、非常にコストがかかる方法である。【００１０】
また、チトクロームＰ４５０の１種の多型を、２４０本ものプローブで検出する手法も知られているが、多くのプローブを作製せねばならず、コストがかかる。また、この方法を用いて複数種類の多型を同定するには、さらに多くのプローブを必要とするので、不慮の非特異的反応も懸念される。非特異的反応を少なくするためには、厳密なプローブ設計が必要となるが、膨大な量の組み合わせを検討せねばならない。【００１１】
複数の多型について、リガーゼにより、多型特的にオリゴヌクレオチドを連結して、DNAマイクロアレイで測定する方法も開示されている（例えば、特許文献６参照）。この方法ではDNAマイクロアレイ上のオリゴヌクレオチドは少なくできるが、オリゴヌクレオチドの連結にリガーゼしか用いていないので、末端にリン酸基を結合したオリゴヌクレオチドが必要でありコストが高く、また、リン酸基のオリゴヌクレオチドと隣接すればどのオリゴヌクレオチドとも連結反応が起こり、非特異的連結が生じやすい。特に解析する多型が増えるほどその危険性は高くなる。【００１２】
【特許文献１】特公平６−４４８８０号
【特許文献２】特許第２６２２２５５号
【特許文献３】特開平３−４３０９８号
【特許文献４】特開２００２−５１４０９１号
【特許文献５】ＥＰ７３０６６３号
【特許文献６】特開２０００−５１１０６０号
【非特許文献１】Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ   ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ，  Ｌｕｘｅｍｂｏｕｒｇ  第８７〜９６頁（１９９０年発行）
【非特許文献２】Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  第３６巻、第５５１〜５５４頁（１９８９年発行）
【非特許文献３】ラボマニュアル遺伝子工学増補版、  第７０〜７５頁（１９９６年発行）
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の反応機序の一部の例を示した図
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従来技術では、塩基多型を解析するために、高価な機器を必要としたり、厳密なプローブの特異性が必要であったり、操作に長時間要したりといった問題があった。また、多数の塩基多型を同時に解析する場合にも、注意深い操作が必要であったり、非特異的連結反応が生じたりといった問題があった。従って、本発明の目的は、試料中に含まれる複数の塩基多型の種類を、容易に、同時検出するのに優れた核酸配列分析法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示すような手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明は、複数の塩基多型を同時に同定する方法に関する。
１．試料中に含まれる複数種類の塩基多型を同時に同定する方法であって、複数種類の塩基多型を測定すべき試料と複数種類の第一オリゴヌクレオチドと複数種類の第二オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションさせ、ヌクレアーゼ活性を含む酵素とリガーゼ活性を含む酵素とを用いて第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドとを連結し連結オリゴヌクレオチドを生成させ、該連結オリゴヌクレオチドに相補的配列を有する検出用プローブを用いて該連結オリゴヌクレオチドの種類を同定することを特徴とする複数塩基多型同定方法。
２．第一オリゴヌクレオチドに塩基多型の配列部分と相補的な配列が含まれることを特徴とする１の複数塩基多型同定方法。
３．第二オリゴヌクレオチドに塩基多型の予想される配列部分と相補的でない配列が含まれることを特徴とする１の複数塩基多型同定方法。
４．第二オリゴヌクレオチドの５’末端に塩基多型の予想される配列部分と相補的でない配列が含まれることを特徴とする１〜３のいずれかの複数塩基多型同定方法。
５．第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドとを、塩基多型の予想される配列部分を含む標的核酸に接触させたときに、塩基多型の予想される配列部分において少なくとも１塩基以上オーバーラップするように設計されていることを特徴とする１〜３のいずれかの複数塩基多型同定方法。
６．第一オリゴヌクレオチドが、予め標識されていることを特徴とする１〜３のいずれかの複数塩基多型同定方法。
７．標識が酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射線物質、発光団および特定の核酸配列からなる群から選ばれたいずれかの方法であることを特徴とする６の複数塩基多型同定方法。
８．野生型を検出するための第一オリゴヌクレオチドと、多型を検出するための第一オリゴヌクレオチドが、それぞれの異なる蛍光波長を有する蛍光物質で標識されていることを特徴とする６又は７の複数塩基多型同定方法。
９．検出用プローブを用いて連結オリゴヌクレオチドを検出する方法が、ハイブリダイゼーションであることを特徴とする１〜３のいずれかの複数塩基多型同定方法。
１０．検出用プローブが、少なくとも第二オリゴヌクレオチドの一部に相補的な配列を含むことを特徴とする１〜３のいずれかの複数塩基多型同定方法。
１１．検出用プローブが、少なくとも第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの一部に相補的な配列を含むことを特徴とする１〜３のいずれかの複数塩基多型同定方法。
１２．検出用プローブが多型配列の部分を含んでいることを特徴とする１〜３のいずれかの複数塩基多型同定方法。
１３．検出用プローブの多型配列の部分が、ミックス塩基であることを特徴とする１２の複数塩基多型同定方法。
１４．１種類以上の検出用プローブが、固相に固定されていることを特徴とする１〜３のいずれかの複数塩基多型同定方法。
１５．検出用プローブを固定した固相がDNAマイクロアレイであることを特徴とする１４の複数塩基多型同定方法。
１６．連結オリゴヌクレオチドを増幅反応により増幅した後、検出することを特徴とする１〜３のいずれかの複数塩基多型同定方法。
１７．増幅方法が、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲおよびＴＭＡよりなる群から選ばれたいずれかの方法であることを特徴とする１６の複数塩基多型同定方法。
１８．試料が予め増幅された核酸であることを特徴とする１〜３のいずれかの複数塩基多型同定方法。
１９．増幅方法が、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲおよびＴＭＡよりなる群から選ばれたいずれかの方法であることを特徴とする１８の複数塩基多型同定方法。
２０．ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガーゼ活性を含む酵素を逐次及び／又は同時に用いることを特徴とする１〜３のいずれかの複数塩基多型同定方法。
２１．ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガーゼ活性を含む酵素が、同一であることを特徴とする１〜３のいずれかの複数塩基多型同定方法。
２２．ヌクレアーゼ活性を含む酵素が、Mung beanヌクレアーゼ、S1 ヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼI〜VIIからなる群から選択される少なくとも１種の酵素であることを特徴とする１〜３のいずれかの複数塩基多型同定方法。
２３．リガーゼ活性を含む酵素がT4DNA リガーゼ、Ecoli DNAリガーゼ 、RNA リガーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素であることを特徴とする１〜３のいずれかの複数塩基多型同定方法。
２４．ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガーゼ活性を含む酵素が耐熱性酵素であることを特徴とする１〜３のいずれかの複数塩基多型同定方法。
２５．耐熱性酵素がTth、Taq、KODまたはPfuに由来することを特徴とする２４の複数塩基多型同定方法。
２６．ヌクレアーゼ活性を含む酵素がＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする１〜３のいずれかの複数塩基多型同定方法。
２７．ＤＮＡポリメラーゼが、Tth由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、Taq由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、KOD由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及びPfu由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼからなる群より選ばれた１種又は２種以上のＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする２６の複数塩基多型同定方法。
２８．塩基多型が１塩基多型、挿入、欠失多型のいずれかを含む１〜３のいずれかの複数塩基多型同定方法。
２９．試料中に含まれる複数種類の塩基多型を同時に同定する方法であって、
(1)該塩基多型の配列部分を含む複数種類の第一オリゴヌクレオチドを調製し、該第一オリゴヌクレオチドと隣接し該塩基多型の配列部分でハイブリダイズしない配列を含む複数種類の第二オリゴヌクレオチドを調製し、
(2)該第一オリゴヌクレオチド及び該第二オリゴヌクレオチドを、試料中に含まれる染色体又は核酸断片とハイブリダイズさせ、
(3)各々のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした時に、塩基多型の配列部分で該第二オリゴヌクレオチドに生じる塩基対を形成しない塩基配列を、ヌクレアーゼ活性を含む酵素により除去した後、リガーゼ活性を含む酵素を作用させることにより、該オリゴヌクレオチドを連結し連結オリゴヌクレオチドを生成し、
(4)該連結オリゴヌクレオチドを、少なくとも該第二オリゴヌクレオチドの一部に相補的な複数種類の検出用プローブ、および/または、少なくとも該第二オリゴヌクレオチドと該第一オリゴヌクレオチドの一部に相補的な複数種類の検出用プローブを用いて検出することを特徴とする複数塩基多型同定方法。
３０．試料中に含まれる複数種類の塩基多型を同時に同定するためのキットであって、少なくとも下記の(i)〜(v)を含むことを特徴とするキット。
(i)塩基多型の配列部分を含む２種類以上の第一オリゴヌクレオチド
(ii) 第一オリゴヌクレオチドと隣接し該塩基多型の配列部分でハイブリダイズしない配列を含む２種類以上の第二オリゴヌクレオチド
(iii) ヌクレアーゼ活性を含む少なくとも一種の酵素
(iv)リガーゼ活性を含む少なくとも一種の酵素
(v)少なくとも第二オリゴヌクレオチドの一部に相補的な検出用プローブ、および/または、少なくとも第二オリゴヌクレオチドと第一オリゴヌクレオチドの一部に相補的な検出用プローブ
３１．試料中に含まれる複数種類の塩基多型を同時に同定するためのキットであって、少なくとも下記の(i)〜(vi)を含むことを特徴とするキット。
(i)塩基多型の予想される配列部分において、多型を示す塩基と相補的な配列が含まれる２種類以上の多型第一オリゴヌクレオチド
(ii)塩基多型の予想される配列部分において、野生型を示す塩基と相補的な配列が含まれる２種類以上の野生型第二オリゴヌクレオチド
(iii) 多型型および／または野生型第一オリゴヌクレオチドと隣接し該塩基多型の予想される配列部分でハイブリダイズしない配列を含む２種類以上の第二オリゴヌクレオチド
(iv) ヌクレアーゼ活性を含む少なくとも一種の酵素
(v)リガーゼ活性を含む少なくとも一種の酵素
(vi)少なくとも第二オリゴヌクレオチドの一部に相補的な検出用プローブ、および/または、少なくとも第二オリゴヌクレオチドと第一オリゴヌクレオチドの一部に相補的な検出用プローブ
３２．検出用プローブが予め固定されている固相を含む３０または３１のキット。
３３．固相がDNAマイクロアレイであることを特徴とする３０または３１のキット。
【発明の効果】
【００１６】
リガーゼ活性を含む酵素と、ヌクレアーゼ活性含む酵素を逐次及び／又は同時に用い、塩基多型特異的に連結されたオリゴヌクレオチドを、遺伝子特異的に検出することで、複数の塩基多型を容易に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片は、目的の遺伝子の情報を担う塩基多型部位を含む標的核酸であれば、特に制限されない。該標的核酸の例としては、Ａｌｕ配列、蛋白質をコードする遺伝子のエキソンやイントロン、プロモーターなどが例示できる。より具体的には、遺伝病を含む各種疾患、薬物代謝、生活習慣病（高血圧、糖尿病等）に関連する遺伝子が挙げられる。例えば、高血圧としてＡＣＥ遺伝子が挙げられる。【００１８】
本発明において、染色体又は核酸断片の多型核酸とは、野生型核酸のうち少なくとも１つのヌクレオチドが点突然変異して他のヌクレオチドに置換されているものや、野生型核酸の一部に挿入、欠失配列等を含む核酸のことである。このような塩基多型により体質等が異なっていることが解明されてきており、本発明の方法は試料中の核酸がこのような予想される多型を有しているか否かを検査する方法である。【００１９】
本発明における塩基多型を検出する方法においては、ヌクレアーゼ活性を含む酵素とリガーゼ活性を含む酵素を逐次及び／又は同時に用いることを特徴とする。該活性は、例えば、酵素によって行うことができ、両活性を備えた酵素を使用することも可能である。【００２０】
具体的には、ヌクレアーゼ活性を含む酵素としては、Mung beanヌクレアーゼ、S1ヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＩ〜ＶＩＩ等を例示することができる。リガーゼ活性を含む酵素としては、T4DNA
リガーゼ、E.coli  DNA リガーゼ、RNA リガーゼ等を例示することができる。ヌクレアーゼ活性を含む酵素とリガーゼ活性を含む酵素は、耐熱性酵素であることが好ましい。例えば、耐熱性酵素がTth、Taq、KOD、Pfuに由来するのがよい。また、ヌクレアーゼ活性を含む酵素がＤＮＡポリメラーゼであってもよい。例えば、Tth、Taq、KOD、Pfu由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いても良い。【００２１】
本発明の塩基多型の検出方法の具体的態様としては、試料中に含まれる複数の塩基多型を同定する方法であって、
(1)塩基多型の配列部分を含む第一オリゴヌクレオチドを調製し、該第一オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするストランド鎖の核酸と相補的で、該第一オリゴヌクレオチドに隣接してハイブリし、該塩基多型の配列部分が多型のどちらの配列とも相補鎖を形成しない配列を含む第二オリゴヌクレオチドを調製し、
(2)該第一オリゴヌクレオチド及び第二オリゴヌクレオチドを、核酸とハイブリダイズさせ、
(3)各々のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした時に生じる塩基多型の配列部分で、第二ヌクレオチドが有する塩基対を形成しない塩基をヌクレアーゼ活性を含む酵素により除去する。この時、リン酸基が残って塩基が除去される。すなわち、ヌクレアーゼ活性を含む酵素により初めてリン酸基が生成されて、リガーゼ活性を含む酵素により第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドが連結される。この連結されたオリゴヌクレオチドを検出することで、試料中に含まれる特定の核酸配列の塩基多型を同定する方法である。【００２２】
具体的には、第一オリゴヌクレオチドは、塩基多型の予想される配列部分と相補的な塩基を含むオリゴヌクレオチドである。好ましくは、該塩基多型が予想される部分は、第一ヌクレオチドの３’末端がよい。【００２３】
第二オリゴヌクレオチドは、第一オリゴヌクレオチドよりも３’側に位置するのが好ましい。第二オリゴヌクレオチドの特徴として、塩基多型の予想される配列部分と相補的でない塩基を含むオリゴヌクレオチドであるのがよい。好ましくは、塩基多型の予想される配列部分と相補的でない塩基は第二オリゴヌクレオチドの５’末端にあるのがよい。【００２４】
さらに詳細に、第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの設計方法を説明すると、塩基多型の予想される配列部分を含む標的核酸に第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドとを接触させたときに、塩基多型の予想される配列部分において少なくとも１塩基以上オーバーラップするように設計するのがよい。オーバーラップさせるためには、第一オリゴヌクレオチドの３’末端は塩基多型の予想される配列部分とハイブリダイズするように設計し、第二オリゴヌクレオチドの５’末端は塩基多型の予想される配列部分とハイブリダイズしないように設計するのがよい。第二オリゴヌクレオチドの５’末端で、塩基多型の予想される配列部分とハイブリダイズしない長さは、少なくとも１塩基上であればよい。この第二オリゴヌクレオチドの５’末端で塩基多型の予想される配列部分とハイブリダイズしない塩基を、ヌクレアーゼ活性により除去したときに、リガーゼ活性を含む酵素により第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドが結合できるように設計すればよい。【００２５】
本発明における第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの長さとしては、１３〜３５塩基、好ましくは、１６〜３０塩基である。例えば、第一オリゴヌクレオチドの３’末端塩基が塩基多型部位の予想されるオリゴヌクレオチドになるように設計し、野生型第一オリゴヌクレオチドは野生型核酸の該塩基と相補的な塩基、及び多型第一オリゴヌクレオチドは多型核酸の該塩基と相補的な塩基を配置させる。さらに、第二オリゴヌクレオチドの５’末端が第一オリゴヌクレオチドと１塩基オーバーラップするよう設計する場合は、該第二オリゴヌクレオチドのオーバーラップする塩基は、野生型、多型とも、相補的な塩基以外のもの選択する。野生型、多型共に相補的でない塩基を選択することによって、第二オリゴヌクレオチドは１種類の塩基多型を測定する場合には１種類調製するのみでよい。【００２６】
このように設計した場合、野生型第一オリゴヌクレオチド／第二オリゴヌクレオチド／野生型核酸、及び多型第一ヌクレオチド／第二オリゴヌクレオチド／多型核酸の組合せにおいてのみ、第二オリゴヌクレオチドのオーバーラップする部分を除いて、完全に一致する為、ヌクレアーゼ活性を含む酵素により第二オリゴヌクレオチドのオーバーラップする塩基が除去される。この時、リン酸基を残して除去されるため、リガーゼ活性を含む酵素を作用させることによって、第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドは連結して１本になるが、野生型第一オリゴヌクレオチド／第二オリゴヌクレオチド／多型核酸、及び多型第一ヌクレオチド／第二オリゴヌクレオチド／野生型核酸の組合せにおいては、第一オリゴヌクレオチドの３‘末端が相補的にならないので、リガーゼ活性を含む酵素による連結が起こらない。【００２７】
ヌクレアーゼ活性を含む酵素及びリガーゼ活性を含む酵素
本発明においては、上記野生型第一オリゴヌクレオチドと多型第一オリゴヌクレオチドを、同時に作用させる。
i)上記第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドとを塩基多型を含む染色体又は核酸断片にハイブリダイズさせる。ハイブリダイズさせる条件は、通常行われる条件でよい。例えば、モレキュラークローニング（１９８９年発行）に記載の方法に従って、行うことができる。
ii)次に第二オリゴヌクレオチドのオーバーラップした部分を、ヌクレアーゼ活性を含む酵素を用いて切断する。使用できる酵素活性としては、上述したとおりである。好ましくは、エキソヌクレアーゼ活性が好ましく、ＤＮＡポリメラーゼ等のエキソヌクレアーゼが好ましい。
第二オリゴヌクレオチドの５‘末端が第一オリゴヌクレオチドとオーバーラップしている場合には、５’エキソヌクレアーゼを用いて、第二オリゴヌクレオチドのオーバーラップしている部分を切断し、リン酸基を突出させる。
iii)同時に、第二オリゴヌクレオチドの５’側に突出したリン酸基と、第一オリゴヌクレオチド３’側とをリガーゼ活性を含む酵素を用いて結合させ、１本のオリゴヌクレオチドにする。【００２８】
本発明において、第一オリゴヌクレオチド中の塩基多型に対応する部位が相補的でないと、エンドヌクレアーゼで切断されても、塩基多型に対応する部位が相補的でないため、リガーゼ活性によって１本のオリゴヌクレオチドに結合することができない。【００２９】
野生型第一オリゴヌクレオチドを用いて試料核酸にヌクレアーゼ活性を含む酵素及びリガーゼ活性を含む酵素を用いた場合、試料核酸が野生型であれば１本鎖となるが、多型では反応が起きない。逆に、多型第一オリゴヌクレオチドを用いて試料核酸にヌクレアーゼ活性を含む酵素及びリガーゼ活性を含む酵素を用いた場合、試料核酸が多型であれば１本鎖となるが、野生型であれば反応は起こらない。特に、ヒトを始め、高等生物は、１種類の遺伝子について、父親由来の遺伝子と母親由来の遺伝子をそれぞれ１つずつ有しているが、この方法によれば、試料遺伝子が野生型のホモか、多型のホモか、ヘテロかを区別することもできる。【００３０】
本発明では、測定したい複数種類の塩基多型を、同一の反応系でヌクレアーゼ活性を含む酵素及びリガーゼ活性を含む酵素を作用させる方法も提供する。本発明で複数種類とは、少なくとも１種類又は２種類以上の塩基多型を測定することを意味する。複数種類の塩基多型を同定する場合、別々の反応系でヌクレアーゼ活性を含む酵素及びリガーゼ活性を含む酵素を作用させる方法も実施しても良いが、同一の反応系で実施すれば更に簡便性が向上し、コスト的にも更に有利となる。複数種類の塩基多型を少なくとも１種類の反応系で同時にヌクレアーゼ活性を含む酵素及びリガーゼ活性を含む酵素を作用させる場合は、野生型用と多型用の第一オリゴヌクレオチドに異なる標識、例えば蛍光波長が区別できる蛍光標識を付与することが好ましい。少なくとも野生型用と多型用の第一オリゴヌクレオチドの標識用の蛍光標識が異なっていれば、複数種類の塩基多型を同定するための第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドが混在していても構わない。【００３１】
標的核酸が検出するのに十分な量が含まれていない場合、上記ハイブリダイゼーションをする前に、前記多型配列を含む核酸断片を以下に示す増幅反応によって、増幅しておくことも可能である。上記増幅法としては特に限定されるものではないが、ＰＣＲ（Polymerase
chain reaction；特公平４−６７９６０号公報、特公平４−６７９５７号公報）、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-based
amplification method；Ｎａｔｕｒｅ  第３５０巻、第９１頁(1991)）、ＬＣＲ（WO89/12696、特開平2-2934号など）、ＳＤＡ（Strand
Displacment Amplification；Nucleic Acids Res.  第二０巻、第一６９１頁(1992)）、ＲＣＲ（WO90/01069  ）、ＴＭＡ（Transcription
Mediated amplification Method；J.Clin.Microbiol.  第３１巻、第３２７０頁(1993)）などが挙げられ、いずれにおいても適用することが可能である。【００３２】
また、ヌクレアーゼ活性を含む酵素及びリガーゼ活性を含む酵素を作用させて、オリゴヌクレオチドを結合させた後、結合産物を上記に示す増幅反応において増幅することで検出可能にすることも可能である。この時、第一オリゴヌクレオチドの５‘末端側と第二オリゴヌクレオチドの３’末端側に、増幅反応に用いるプライマーが作用する配列を付加しておくこともできる。【００３３】
検出
上記反応によって得られる連結したオリゴヌクレオチドを、検出用プローブを用いて以下のようにして検出する。【００３４】
第一オリゴヌクレオチドに予め標識を賦することが好ましい。その場合は、合成時にビオチン、リンカーアーム、蛍光物質等を有するヌクレオチドまたはオリゴｄＧＴＰ、オリゴｄＡＴＰ、オリゴｄＴＴＰ、オリゴｄＣＴＰ等を５’末端に付加し修飾基を導入しても良い。あるいはビオチン、リンカーアーム、蛍光物質等を有するヌクレオチドをオリゴヌクレオチド配列中のヌクレオチドの替わりに置換して合成し修飾基を導入しても良い。あるいは合成したヌクレオチドに後から３２Ｐ、３５Ｓなどの放射性物質、ALP、PODなどの酵素、FITC、HEX、6-FAM、TETなどの蛍光物質など、公知のオリゴヌクレオチドの標識物を導入しても良い。あるいは野生型第一オリゴヌクレオチドと塩基多型第一オリゴヌクレオチドに、それぞれ異なるオリゴヌクレオチド配列を付加しておいてもよい。【００３５】
具体的には、例えば、蛍光物質等で標識した第一オリゴヌクレオチドと、第二オリゴヌクレオチドを用いて特定核酸とハイブリダイズさせ、リガーゼ活性を含む酵素とヌクレアーゼ活性を含む酵素を逐次及び／又は同時に作用させた後、解離させ、固相に結合させた多型に特異的な検出用プローブ及び野生型に特異的な検出用プローブとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしなかった核酸を洗いだし、各検出用プローブとハイブリダイズした核酸の第一オリゴヌクレオチドの標識によりハイブリダイズしたか否かを検出し、各検出用プローブの検出シグナルの比により塩基多型が野生型か多型もしくは混合型であるのかを同定する方法が挙げられる。【００３６】
野生型用と多型用の第一オリゴヌクレオチドに異なる標識、例えば色の異なる蛍光標識を付与することで、野生型及び多型の検出を塩基多型部分の配列にミックス塩基を用いた１つの検出用プローブで行うこともできる。【００３７】
野生型用と多型用の第一オリゴヌクレオチドに異なる標識、例えば蛍光波長が区別できる蛍光標識を付与して、複数種類の塩基多型を少なくとも１種類の反応系で同時にヌクレアーゼ活性を含む酵素及びリガーゼ活性を含む酵素を作用させてもよい。この場合、少なくとも野生型用と多型用の第一オリゴヌクレオチドの標識用の蛍光標識が異なっていれば、複数種類の塩基多型を同定するための第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドが混在していても構わない。野生型用と多型用の第一オリゴヌクレオチドの標識用の蛍光標識は、蛍光波長が区別できればよく、更に好ましくは発色の異なる蛍光色素がよい。特に限定されないが、例えば、野生型用の第一オリゴヌクレオチドの５’末端をＣｙ３、多型用の第一オリゴヌクレオチドの５’末端をＣｙ５で標識すればよく、また、その逆の標識でもよい。【００３８】
図を用いて本発明の反応機序の一部の例を説明するが、これにより本発明が限定されるものではない。図１では、標的核酸を多型核酸とし、５’末端がＣｙ３により修飾された野生型第一オリゴヌクレオチドと５’末端がＣｙ５により修飾された多型第一オリゴヌクレオチドを用いた場合を一例として示している。【００３９】
この例の場合、第２オリゴヌクレオチドにおいてその５’末端に「塩基多型の予想される配列部分」が設定されているとともに「塩基多型の予想される配列部分」と相補的でない塩基が設定されている。なお、この場合、第２オリゴヌクレオチドの５’末端に位置する塩基は、標的核酸が野生型の場合も相補的でない塩基を設定するのがよい。また、この例の場合、多型第一オリゴヌクレオチドの３’末端のＡと、第２オリゴヌクレオチドの５’末端のＧがオーバーラップするよう設計されている。また、野生型第一オリゴヌクレオチドの３’末端のＣと、第２オリゴヌクレオチドの５’末端のＧがオーバーラップするよう設計されている。【００４０】
図１の（１）では、多型核酸に多型第一オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドが作用するケースを示している。この場合、多型第一オリゴヌクレオチドの３’末端のＡは多型部位にハイブリダイズしており、その隣接する部位には第二オリゴヌクレオチドの５’末端から２番目のＴがハイブリダイズしている。なお第二オリゴヌクレオチドの５’末端のＧは、多型部位に非相補なのでハイブリダイズしていない状態である。この場合、ヌクレアーゼ活性を含む酵素の作用により、第二オリゴヌクレオチドの５’末端のＧが切断されるとともに、リン酸基が生成される。ここにリガーゼ活性を含む酵素が作用させ、二つのオリゴヌクレオチドを連結させる。【００４１】
図１の（２）では、多型核酸に野生型第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドが作用するケースを示している。この場合、野生型第一オリゴヌクレオチドの３’末端は多型部位に非相補なのでハイブリダイズしていない。なお第二オリゴヌクレオチドの５’末端のＧは、多型部位に非相補なのでハイブリダイズしていない状態である。この場合、ヌクレアーゼ活性を含む酵素は、第二オリゴヌクレオチドの５’末端のＧ切断できない。従って、リガーゼ活性を含む酵素は作用できず、二つのオリゴヌクレオチドは連結されない。【００４２】
標的核酸が野生型核酸の場合の図は示していないが、図1と反対の結果となり、多型第一オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドが連結されず、野生型第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドが連結される。【００４３】
図１のケースの場合、標的核酸が多型核酸だけのホモの場合は、多型第一オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドの連結物だけが得られ、標的核酸が野生型核酸だけのホモの場合は、野生型第一オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドの連結物だけが得られ、標的核酸が多型核酸と野生型核酸のヘテロの場合は、両者の連結物の比率がほぼ１：１の混合物が得られることになる。【００４４】
図１ではわかりやすく説明するために１種類の塩基多型の場合を説明したが、本願発明では、少なくとも１種類又は２種類以上の塩基多型を測定する方法を提供する。すなわち、少なくとも野生型用と多型用の第一オリゴヌクレオチドの標識用の蛍光標識が異なっていれば、複数種類の塩基多型を同定するための第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドが混在して、同一の反応系でヌクレアーゼ活性を含む酵素及びリガーゼ活性を含む酵素を作用させてもよい。このように、複数種類の塩基多型の検出に係る反応を同一の反応系で行った場合、下記に示す方法で検出するのがよい。【００４５】
複数種類の塩基多型を検出するには、これらの塩基多型を検出するための複数種類の検出用プローブが、１種類毎に交わることなく固定化された固相を用いることで可能となる。複数種類の塩基多型を少なくとも１種類の反応系で同時にヌクレアーゼ活性を含む酵素及びリガーゼ活性を含む酵素を作用させた反応生成物を測定するために、上記検出用オリゴヌクレオチドを固定したDNAマイクロアレイを用いても良い。DNAマイクロアレイを用いるのが、コストや操作の簡便性を考慮しても有利である。【００４６】
本発明では、利便性がよく、コスト的にも有利なDNAマイクロアレイを用いた検出系も提供する。このようなDNAマイクロアレイを作製するため、検出用プローブの設計方法について説明する。本発明で使用される検出用プローブは、塩基多型部分を含み、好ましくは連続した少なくとも１５塩基以上、より好ましくは連続した少なくとも１８塩基以上からなる塩基配列が必要である。また、第二オリゴヌクレオチドの一部に相補的な配列を含むもの、もしくは、第一オリゴヌクレオチドの塩基多型部位を含む一部と第二オリゴヌクレオチドの一部に相補的な配列を含むものがよい。検出用プローブは特定核酸配列と相補鎖を形成すればＤＮＡでもＲＮＡでもＰＮＡでもよく、化学合成または生物学的な方法により調製することができる。例えば、パーキンエルマー社のＤＮＡシンセサイザー３９１型を用いてホスホアミダイト法により合成できる。精製はＦＰＬＣでＭＯＮＯ−Ｑカラムや逆相カラムにて実施しても良い。他の合成方法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスファイト法等がある。【００４７】
検出用プローブの多型配列の部分が、ミックス塩基であっても良い。ミックス塩基とは、野生型と多型のいずれかと相補的な塩基を含む塩基を意味する。具体的に例を挙げると、多型配列の部分が、野生型がＣで多型がＡの場合には、Ｔ又はＧの塩基であればよい。具体的な調整方法を、例を挙げて説明すると、ホスホアミダイト法などにより合成時に、ＴとＧを混合して合成すればよい。混合の合成比率により、検出プローブ中の塩基の存在比率が異なってくるが、所望のシグナルを得たい比率を選択すればよい。好ましくは、１：１がよい。野生型がＣで多型がＡの場合を例にあげて説明したが、多型が複数になる場合には、ミックス塩基が３種類以上になっても差し支えない。【００４８】
本発明で、使用する検出用プローブを用いてＤＮＡマイクロアレイを作製するためには、既存方法を用いても良い。DNAマイクロアレイの作製方法としては、固相担体表面で直接プローブを合成する方法（オン・チップ法）と、予め調製したプローブを固相基体表面に固定する方法とが知られているが、この発明のDNAマイクロアレイは後者の方法で作製することが好ましい。予め調製したプローブを固相基体表面に固定する場合には、官能基を導入したプローブを合成し、表面処理した固相基体表面にプローブを点着し、共有結合させる（例えば、Lamture,
J.B. et al. Nucl. Acids Res. 22:2121-2125, 1994; Guo, Z. et al. Nucl. Acids
Res. 22:5456-5465, 1994）。プローブは、一般的には、表面処理した固相基体にスペーサーやクロスリンカーを介して共有結合させる。ガラス表面にポリアクリルアミドゲルの微小片を整列させ、そこにプローブを共有結合させる方法（Yershov,
G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4913, 1996）、あるいはポリL−リジンを被覆した固相基体にプローブを結合する方法（特開2001−186880号公報）も知られている。また、シリカマイクロアレイ上に微小電極のアレイを作製し、電極上にはストレプトアビジンを含むアガロースの浸透層を設けて反応部位とし、この部位をプラスに荷電させることでビオチン化プローブを固定し、部位の荷電を制御することで、高速で厳密なハイブリダイゼーションを可能にする方法も知られている（Sosnowski,
R.G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1119-1123, 1997）。この発明のDNAマイクロアレイは、以上のいずれの方法によっても作製することができる。また、プローブを固相基体表面に滴下させてスポッティングを行う場合には、ピン方式によって行うこともできるし、特開2001-116750号公報や特開2001-186881号公報に開示されているインクジェット方式を採用する事も可能である。スポッティングの後は、冷却、スポットに対する水分付加（湿度〜80%程度に一定時間保持）、焼成乾燥による固定化処理等を行うことによって、各スポットを固相基体上に固定し、DNAマイクロアレイを完成することができる。なお、DNAマイクロアレイの固相基体は、通常のDNAマイクロアレイに使用されるガラス（スライドガラス）の他、プラスチック、シリコーン、セラミック等を使用することもできる。【００４９】
本発明で提供するDNAマイクロアレイと、リガーゼで連結された第一及び第二オリゴヌクレオチドは、少なくとも２６塩基から７０塩基程度なので、検出プローブとの反応性がよく、DNAマイクロアレイ上において、容易に操作可能であるという特徴を有する。【００５０】
また、従来法の一例に従えば、１塩基の多型を検出するために２４０本ものプローブを作製しなければならなかった。本発明によれば、１塩基の多型を同定するために、異なる蛍光波長を有する蛍光物質で標識された野生型用の第一オリゴヌクレオチドと多型用の第一オリゴヌクレオチドと、第二オリゴヌクレオチドとを、それぞれ１種類ずつ用意すれば、ミックス塩基を含む検出用プローブはすくなくとも１種類作製するだけでよい。従って、本発明は、複数種類の多型を同時に測定において、従来法より遙かに優れている。また、プローブ数が少なくすむので、非特異反応の発生確率を低減できる利点がある。非特異反応は、産業化時の障壁となることが多いので、本発明は、当業者の産業分野において、スピードアップ、効率化などに大いに貢献できる。【００５１】
キット
本発明において、キットとしては、
(i)塩基多型の配列部分を含む２種類以上の第一オリゴヌクレオチド
(ii) 第一オリゴヌクレオチドと隣接し該塩基多型の配列部分でハイブリダイズしない配列を含む２種類以上の第二オリゴヌクレオチド
(iii) ヌクレアーゼ活性を含む少なくとも一種の酵素
(iv)リガーゼ活性を含む少なくとも一種の酵素
(v)少なくとも第二オリゴヌクレオチドの一部に相補的な２種類以上の検出用プローブ、および/または、少なくとも第二オリゴヌクレオチドと第一オリゴヌクレオチドの一部に相補的な２種類以上の検出用プローブ
が含まれていてもよい。【００５２】
また、本発明において、キットとしては、
(i)塩基多型の予想される配列部分において、多型を示す塩基と相補的な配列が含まれる２種類以上の多型第一オリゴヌクレオチド
(ii)塩基多型の予想される配列部分において、野生型を示す塩基と相補的な配列が含まれる２種類以上の野生型第二オリゴヌクレオチド
(iii) 多型型および／または野生型第一オリゴヌクレオチドと隣接し該塩基多型の予想される配列部分でハイブリダイズしない配列を含む２種類以上の第二オリゴヌクレオチド
(iv) ヌクレアーゼ活性を含む少なくとも一種の酵素
(v)リガーゼ活性を含む少なくとも一種の酵素
(vi)少なくとも第二オリゴヌクレオチドの一部に相補的な２種類以上の検出用プローブ、および/または、少なくとも第二オリゴヌクレオチドと第一オリゴヌクレオチドの一部に相補的な２種類以上の検出用プローブ
が含まれていてもよい。【００５３】
検出用DNAマイクロアレイ上の検出プローブは、各々のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした時に塩基多型の配列部分で生じる塩基対を形成しない塩基配列をヌクレアーゼ活性により除去した後、リガーゼ活性を作用させることにより結合される第一オリゴヌクレオチド及び第二オリゴヌクレオチドの結合物を検出し得るものであるという特徴を有する。また、第一及び第二オリゴヌクレオチドは、予め上述したような酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射線物質および発光団などによって標識されていてもよい。
【実施例】
【００５４】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。【００５５】
（１）遺伝子増幅用PCRプライマーおよびプローブの合成
測定する遺伝子とSNP部位を表１に示す。この５種類のＳＮＰの同時解析をおこなうために、配列番号1〜３０（表２参照）に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ1〜３０と略すこともある）をDNA合成受託会社（（株）日本バイオサービス、（株）サワディー、ＧＥＮＳＥＴ
KK、アマシャムファルマシア  バイオテク（株）等）に依頼した。【００５６】
【表１】
2006064745.tif 000002
【００５７】
【表２】
2006064745.tif 000003
【００５８】
（２）Multi-PCRによる遺伝子の増幅
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりMulti-PCRにより、５種類の遺伝子多型部位を含む核酸断片を増幅した。【００５９】
試薬
以下の試薬を含む25μｌ溶液を調製した。
bTaq DNAポリメラーゼ反応液
オリゴ１〜１０                       各々2.5 pmol
×10緩衝液                              2.5 μl
2mM dNTP                                 2.5 μl
bTaq DNAポリメラーゼ（東洋紡績（株）） 1.25 Ｕ
抽出DNA溶液                            20 ng【００６０】
増幅条件
94℃・5分
94℃・30秒、60℃・30秒、72℃、30秒（40サイクル）
72℃・2分【００６１】
（３）ヌクレアーゼ／リガーゼ反応
（２）で増幅した反応液20μｌに、以下の試薬10μlを加え反応混合液とした。
オリゴ１１〜２５                    各々  2.5pmol
×10  bTaq緩衝液                           1μl
200mM  MgCl2                               1.2μｌ
100mM  NAD                                  0.3μl
Tth  DNA  ligase（Epicentre Technology）   5U
rTaq DNAポリメラーゼ（東洋紡績（株））      0.625 Ｕ
アルカリフォスファターゼ（東洋紡績（株）） 3U【００６２】
反応条件
37℃・30分
94℃・5分
94℃・30秒、60℃・2分（１５サイクル）【００６３】
（４）検出
（ａ）DNAマイクロアレイの作成
オリゴ１６−２０を別々に、スポット溶液（松波ガラス工業株式会社：DSP0050）に1：1に混合する。混合したオリゴヌクレオチド溶液を、DNAマイクロアレイ用スライドガラス（松波硝子工業株式会社：SDA0011）にスポットする。湿箱に入れて一晩放置。乾燥した後、軽く水洗し、1%BSA水溶液に一晩放置する。軽く水洗を２回繰り返した後、遠心機で、（2000rpm、２分）遠心し乾燥させる。【００６４】
（ｂ）ハイブリダイゼーション
（３）の反応液2.5μlに0.6N NaOH溶液2.5μｌ加え混合する。混合液にハイブリ溶液（２００ｍＭクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、２％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＮａＮ３）を20μl加え、良く混和し、（ａ）で作成したDNAマイクロアレイにカバーグラスをかけ、その隙間より注入する。55℃で２時間保温する。【００６５】
（ｃ）洗浄
２時間保温した後、55℃に保温した洗浄液１（２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）、１％ＳＤＳ）にいれ20分放置。さらに室温で洗浄液２（２５０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．０２５％  Tween20溶液）に入れ、１５分放置。最後に遠心機で、（2000rpm、２分）遠心し乾燥させる。【００６６】
（ｄ）測定
富士フイルム社製アレイスキャナFLA8000で測定後、アレイゲイジ（富士フイルム社製）ソフトで解析し、スポットの蛍光値を測定した。表３からわかるように、５種類のSNPを同時に解析し、多型が判別できた。【００６７】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明は、第一及び第二オリゴヌクレオチドを特定核酸とハイブリダイズさせ、リガーゼ活性とヌクレアーゼ活性を逐次及び／又は同時に作用させた後、連結した第一及び第二オリゴヌクレオチドの存在の有無を、検出用プローブが結合したアレイで検出することで、塩基多型の配列部分を判定する方法を提供する。ヌクレアーゼ活性により、第二オリゴヌクレオチドの５’末端にリン酸基を突出させるので、オリゴヌクレオチド作製時にリン酸基を結合させる反応を省略できる。また、ヌクレアーゼ活性によって５’末端にリン酸基が突出した第二オリゴヌクレオチドのみしか連結反応が生じないため、非特異的連結反応が軽減される。本発明では、数種類の塩基多型を少なくとも１種類の反応系で同時にヌクレアーゼ活性及びリガーゼ活性を作用させる方法も提供する。さらに、リガーゼで連結された第一及び第二オリゴヌクレオチドは少なくとも２６塩基から７０塩基程度なので、検出プローブとの反応性がよく、アレイ上において、容易に操作可能であるという特徴を有する。本発明により、複数の塩基多型を容易に検出することができることからも、産業界に大きく寄与することが期待される。
【図１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年2月28日(2007.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
【表１】
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【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
【表３】
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【国際調査報告】
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