(57)【要約】Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ由来の１，３−特異性リパーゼであって、球状で、水分含量が１０質量％以下であるリパーゼ粉末、該リパーゼ粉末が油脂に浸漬又は浸潤されているリパーゼ組成物、及びｐＨが６〜７．５に調整されてなるリパーゼ含有水溶液を噴霧乾燥することを含むリパーゼ粉末の製造方法。本発明により１，３−選択性が向上したリパーゼ粉末が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ由来の１，３−特異性リパーゼであって、球状で、水分含量が１０質量％以下であることを特徴とするリパーゼ粉末。
【請求項２】
ｐＨが６〜７．５に調整されてなるリパーゼ含有水溶液が噴霧乾燥されて製造されたものである請求項１記載のリパーゼ粉末。
【請求項３】
ｐＨが６．５〜７に調整されてなるリパーゼ含有水溶液が噴霧乾燥されて製造されたものである請求項２記載のリパーゼ粉末。
【請求項４】
リパーゼ含有水溶液が、菌体を除去したリパーゼ培養液またはその精製培養液である請求項２又は３項に記載のリパーゼ粉末。
【請求項５】
リパーゼ含有水溶液が、ＵＦ膜処理されたものである請求項２〜４のいずれか１項記載のリパーゼ粉末。
【請求項６】
リパーゼ粉末の９０質量％以上が粒径１〜１００μｍである請求項１〜５のいずれか１項記載のリパーゼ粉末。
【請求項７】
水分含量が６．５〜８．５質量％である請求項１〜６のいずれか１項記載のリパーゼ粉末。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載のリパーゼ粉末が油脂に浸漬又は浸潤されているリパーゼ組成物。
【請求項９】
前記リパーゼ組成物中の油脂の質量が、リパーゼ粉末に対し０．１〜２０倍である請求項８記載のリパーゼ組成物。
【請求項１０】
ｐＨが６〜７．５に調整されてなるリパーゼ含有水溶液を噴霧乾燥することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項記載のリパーゼ粉末の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項記載のリパーゼ粉末を含有するエステル交換用リパーゼ。
【請求項１２】
請求項１１記載のエステル交換用リパーゼを用いることを特徴とする油脂のエステル交換方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、各種油脂のエステル交換反応などに好適に使用することができる１，３−特異性リパーゼ粉末、その製造方法、１，３−特異性リパーゼ粉末が油脂に浸漬又は浸潤されてなるリパーゼ組成物、該リパーゼ粉末を用いる油脂のエステル交換方法などに関するものである。【０００２】（発明の背景）
リパーゼは、脂肪酸などの各種カルボン酸とモノアルコールや多価アルコールなどのアルコール類とのエステル化反応、複数のカルボン酸エステル間のエステル交換反応などに幅広く使用されている。このうち、エステル交換反応は動植物油脂類の改質をはじめ、各種脂肪酸のエステル、糖エステルやステロイドの製造法として重要な技術である。これらの反応の触媒として、油脂加水分解酵素であるリパーゼを用いると、室温ないし約７０℃程度の温和な条件下でエステル交換反応を行うことができ、従来の化学反応に比べ、副反応の抑制やエネルギーコストが低減化されるだけでなく、触媒としてのリパーゼが天然物であることから安全性も高い。また、その基質特異性や位置特異性により目的物を効率良く生産することができる。ところが、リパーゼ粉末をそのままエステル交換反応に用いても活性が十分に発現しないばかりか、元来が水溶性のリパーゼを油性原料中に均一に分散させることは困難であり、その回収も困難である。このため、従来はリパーゼを何らかの担体、たとえば陰イオン交換樹脂（特許文献１）、フェノール吸着樹脂（特許文献２）、疎水性担体（特許文献３）、陽イオン交換樹脂（特許文献４）、キレート樹脂（特許文献５）等に固定化してエステル化やエステル交換反応などに用いることが一般的である。【０００３】  このように、従来はリパーゼを固定化してエステル交換反応に用いていたが、かかる固定化リパーゼは固定化処理による本来のリパーゼ活性の損失を伴うだけでなく、多孔性担体を用いた場合は細孔に原料や生成物が詰まり、結果としてエステル交換率の低下を招いていた。さらに、従来の固定化リパーゼを用いたエステル交換反応においては、担体が保持する水分が反応系に持ち込まれるため、副反応、たとえば油脂類のエステル交換反応におけるジグリセリドやモノグリセリドの生成等を避けることは困難であった。
このような状況に鑑み、リパーゼ粉末を用いる各種技術が開発されている。例えば、不活性有機溶媒の存在下または非存在下、エステル交換反応時に分散リパーゼ粉末粒子の９０％以上を１〜１００μｍの範囲の粒径に保つように、エステルを含有する原料にリパーゼ粉末を分散させてエステル交換反応を行う方法が提案されている（特許文献６）。又、リン脂質および脂溶性ビタミンを含む酵素溶液を乾燥して得た酵素粉末を用いることが提案されている（特許文献７）。
しかしながら、さらに１，３−特異性リパーゼの１，３−選択性が向上したリパーゼ粉末が求められている。【０００４】
【特許文献１】特開昭６０−９８９８４号公報
【特許文献２】特開昭６１−２０２６８８号公報
【特許文献３】特開平２−１３８９８６号公報
【特許文献４】特開平３−６１４８５号公報
【特許文献５】特開平１−２６２７９５号公報
【特許文献６】特許第２６６８１８７号公報
【特許文献７】特開２０００−１０６８７３号公報
【発明の開示】
【０００５】  本発明は、１，３−特異性リパーゼの１，３−選択性が向上したリパーゼ粉末を提供することを目的とする。
本発明は、又、上記リパーゼ粉末を油脂に浸漬又は浸潤されてなるリパーゼ組成物を提供することを目的とする。
本発明は、又、上記リパーゼ粉末の製造方法を提供することを目的とする。
本発明は、又、上記リパーゼ粉末を用いる油脂のエステル交換方法を提供することを目的とする。
本発明のこれらの目的及び他の目的は、以下の記載から明らかとなるであろう。
【０００６】  Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ由来の１，３−特異性リパーゼは極めて１，３選択性が高いリパーゼであり、陰イオン交換樹脂に固定化されて用いられているが、これを、固定用担体を用いずに、球状で、水分含量が１０質量％以下の粉末状にすると、その１，３選択性がさらに向上するとの知見に基づいて本発明はなされたのである。
すなわち、本発明は、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ由来の１，３−特異性リパーゼであって、球状で、水分含量が１０質量％以下であることを特徴とするリパーゼ粉末を提供する。
本発明は、又、上記リパーゼ粉末が油脂に浸漬又は浸潤されているリパーゼ組成物を提供する。
本発明は、又、ｐＨが６〜７．５に調整されてなるリパーゼ含有水溶液を噴霧乾燥することを特徴とする、上記リパーゼ粉末の製造方法を提供する。
本発明は、又、上記リパーゼ粉末を含有するエステル交換用リパーゼを提供する。
本発明は、又、上記エステル交換用リパーゼを用いることを特徴とする油脂のエステル交換方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】  本発明で対象とする１，３特異性リパーゼは、リゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｓｐ．）に属するリゾムコール  ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）由来の１，３−特異性リパーゼである。尚、従来、リゾムコール  ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）は、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ  ｓｐ．）として扱われていた場合もある。
本発明では、このリパーゼを、形状が球状であって、水分含量が１０質量％以下である粉末として使用する。
水分含量は１０質量％以下とするが、６．５〜８．５質量％であるのが好ましい。
本発明のリパーゼ粉末の粒径は任意とすることができるが、リパーゼ粉末の９０質量％以上が粒径１〜１００μｍであるのが好ましい。又、平均粒径は２０〜８０μｍが好ましく、より好ましくは２０〜５０μｍである。
リパーゼ粉末の粒径は、例えば、ＨＯＲＩＢＡ社の粒度分布測定装置（ＬＡ−５００）を用いて測定することができる。
このようなリパーゼ粉末は、例えば、リパーゼ含有水溶液を噴霧乾燥（スプレードライ）することによって容易に調製することができる。
ここで、リパーゼ含有水溶液としては、菌体を除去したリパーゼ培養液、精製培養液、これらから得たリパーゼ粉末を再度水に溶解・分散させたもの、市販のリパーゼ粉末を再度水に溶解・分散させたもの、市販の液状リパーゼ等が挙げられる。さらに、リパーゼ活性をより高めるために塩類等の低分子成分を除去したものがより好ましく、また、粉末性状をより高めるために糖等の低分子成分を除去したものがより好ましい。
リパーゼ培養液としては、例えば、大豆粉、ペプトン、コーン・ステープ・リカー、Ｋ２ＨＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ等含有する水溶液があげられる。これらの濃度としては、大豆粉０．１〜２０質量％、好ましくは１．０〜１０質量％、ペプトン０．１〜３０質量％、好ましくは０．５〜１０質量％、コーン・ステープ・リカー０．１〜３０質量％、好ましくは０．５〜１０質量％、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．０１〜２０質量％、好ましくは０．１〜５質量％である。又、（ＮＨ４）２ＳＯ４は０．０１〜２０質量％、好ましくは０．０５〜５質量％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏは０．０１〜２０質量％、好ましくは０．０５〜５質量％である。培養条件は、培養温度は１０〜４０℃、好ましくは２０〜３５℃、通気量は０．１〜２．０ＶＶＭ、好ましくは０．１〜１．５ＶＶＭ、攪拌回転数は１００〜８００ｒｐｍ、好ましくは２００〜４００ｒｐｍ、ｐＨは３．０〜１０．０、好ましくは４．０〜９．５に制御するのがよい。【０００８】  菌体の分離は、遠心分離、膜濾過などで行うのが好ましい。また、塩類や糖等の低分子成分の除去は、ＵＦ膜処理により行うことができる。具体的には、ＵＦ膜処理を行い、リパーゼを含有する水溶液を１／２量の体積に濃縮後、濃縮液と同量のリン酸バッファーを添加するという操作を１〜５回繰り返すことにより、低分子成分を除去したリパーゼ含有水溶液を得ることができる。
遠心分離は２００〜２０，０００×ｇ、膜濾過はＭＦ膜、フィルタープレスなどで圧力を３．０ｋｇ／ｍ２以下にコントロールするのが好ましい。菌体内酵素の場合は、ホモジナイザー、ワーリングブレンダー、超音波破砕、フレンチプレス、ボールミル等で細胞破砕し、遠心分離、膜濾過などで細胞残さを除去することが好ましい。ホモジナイザーの攪拌回転数は５００〜３０，０００ｒｐｍ、好ましくは１，０００〜１５，０００ｒｐｍ、ワーリングブレンダーの回転数は５００〜１０，０００ｒｐｍ、好ましくは１，０００〜５，０００ｒｐｍである。攪拌時間は０．５〜１０分、好ましくは１〜５分がよい。超音波破砕は１〜５０ＫＨｚ、好ましくは１０〜２０ＫＨｚの条件で行うのが良い。ボールミルは直径０．１〜０．５ｍｍ程度のガラス製小球を用いるのがよい。
本発明では、リパーゼ含有水溶液としては、固形分として５〜３０質量％含むものを用いるのが好ましい。
ここで、リパーゼ含有水溶液中の固形分濃度は、例えば、糖度計（（株）シー・アイ・エス社製  ＢＲＸ−２４２）を用いてＢｒｉｘ．％として求めることができる。【０００９】  噴霧乾燥（スプレードライ）などの乾燥工程の直前に、リパーゼ含有水溶液のｐＨを６〜７．５に調整するのが好ましい。特にｐＨを７．０以下に、さらにｐＨを６．５〜７．０の範囲となるように調整するのが好ましい。ｐＨ調整は、噴霧乾燥（スプレードライ）などの乾燥工程の前のいずれかの工程において行ってもよく、乾燥工程の直前のｐＨが上記範囲内となるように、予めリパーゼ含有水溶液のｐＨを調整しておいてもよい。ｐＨ調整には、各種アルカリ剤や酸を用いることができるが、水酸化ナトリウムなどのアルカリ金属水酸化物を用いるのが好ましい。
又、乾燥工程前の途中の工程において、リパーゼ含有水溶液を濃縮してもよい。濃縮方法は、特に限定されるものではないが、エバポレーター、フラッシュエバポレーター、ＵＦ膜濃縮、ＭＦ膜濃縮、無機塩類による塩析、溶剤による沈殿法、イオン交換セルロース等による吸着法、吸水性ゲルによる吸水法等があげられる。好ましくはＵＦ膜濃縮、エバポレーターがよい。ＵＦ膜濃縮用モジュールとしては、分画分子量３，０００〜１００，０００、好ましくは６，０００〜５０，０００の平膜または中空糸膜、材質はポリアクリルニトリル系、ポリスルフォン系などが好ましい。【００１０】  噴霧乾燥（スプレードライ）は、例えば、ノズル向流式、デイスク向流式、ノズル並流式、デイスク並流式等の噴霧乾燥機を用いて行うのがよい。好ましくはデイスク並流式が良く、アトマイザー回転数は４，０００〜２０，０００ｒｐｍ、加熱は入口温度１００〜２００℃、出口温度４０〜１００℃で制御して噴霧乾燥（スプレードライ）するのが好ましい。
このようにして調製されたリパーゼ粉末はそのまま使用することができるが、油脂に浸漬又は浸潤させたリパーゼ組成物として用いるのが取り扱い性の点から好ましい。ここで、リパーゼ組成物中の油脂の質量は、リパーゼ粉末に対し０．１〜２０倍であるのが好ましく、１〜２０倍であるのがより好ましい。【００１１】  このリパーゼ組成物は、噴霧乾燥（スプレードライ）などにより製造されたリパーゼ粉末に油脂を添加し、スターラーやスリーワンモーター等で均一に攪拌する方法やスプレードライヤーの粉末回収部に予め油脂を添加しておき、回収後に均一に攪拌し、濾過により過剰の油脂を除去する方法により容易に得ることができる。
リパーゼ粉末に含浸又は浸潤させる油脂としては、特に限定されず、菜種油、大豆油、ハイオレイックヒマワリ油、オリーブ油、サフラワー油、コーン油、ヤシ油、ゴマ油などの植物油、トリオレイン（グリセリン  トリオレエート）、トリカプリリン（グリセリン  トリオクタノエート）、トリアセチン（グリセリン  トリアセテート）、トリブチリン（グリセリン  トリブチレート）などのトリアシルグリセロール、脂肪酸エステル、ステロールエステルなどの１種又は２種以上の混合物があげられる。
このリパーゼ粉末を用い、常法により、油脂などのエステル交換反応を効率的に行うことができる。
本発明によれば、１，３特異性リパーゼの１，３選択性が各段に向上し、原料トリグリセリド２位の脂肪酸残基を極めて高い割合で、エステル交換製品中に保持することができる。
次に本発明を実施例により詳細に説明する。
【実施例】
【００１２】［実施例１］
水溶液にリパーゼが溶解・分散した形態にあるノボザイムズ  ジャパン（株）社製のＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ由来のリパーゼ（商品名Ｐａｌａｔａｓｅ  ２００００Ｌ）を、ＵＦモジュール（旭化成工業（株）社製ＳＩＰ−００１３）を用いて低分子成分を除去してリパーゼ含有水溶液（固形分濃度１０．６質量％）を得た。詳しくは、液状リパーゼ（パラターゼ２００００Ｌ））を氷冷下でＵＦ膜処理を行い、１／２量の体積に濃縮後、濃縮液と同量のｐＨ７の０．０１Ｍリン酸バッファーを添加した。得られた溶液について、同じようにＵＦ膜処理後リン酸バッファーを添加する操作を３回繰り返し、リパーゼ含有水溶液（リパーゼ濃縮液：バッファーの体積比は１：１）を得た。
このリパーゼ含有水溶液のｐＨを水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ６．８〜６．９に調整した。
この液を、スプレードライヤー（ＳＤ−１０００型：東京理化器械（株）社製）を用い、入口温度１３０℃、乾燥空気量０．７〜１．１ｍ３／ｍｉｎ、噴霧圧力１１〜１２ｋｐａの条件下噴霧し、リパーゼ粉末を得た。リパーゼ粉末粒子の形状は球状で、リパーゼ粉末の９０質量％以上が粒径１〜１００μｍの範囲内にあり、平均粒径は８．２μｍであった。粒径は、ＨＯＲＩＢＡ社の粒度分布測定装置（ＬＡ−５００）を用いて測定した。１０５℃、１時間の乾熱乾燥の方法により測定した水分含量は７．９質量％であった。
尚、リパーゼ含有水溶液中の固形分濃度は、糖度計（（株）シー・アイ・エス社製  ＢＲＸ−２４２）を用いてＢｒｉｘ．％として求めた。【００１３】比較例１
Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ由来のリパーゼが陰イオン交換樹脂に固定化されてなるノボザイムズ  ジャパン（株）社製のリポザイムＲＭ  ＩＭを比較例１として用いた。【００１４】比較例２
噴霧乾燥（スプレードライ）を行う代わりに、フリーズドライを行った以外は、実施例１と同様にしてリパーゼ粉末を得た。フリーズドライは、ｐＨが６．８〜６．９に調整されたリパーゼ含有水溶液をナスフラスコに入れ、ドライアイスメタノールで凍結後、東京理化器械（株）社製のフリーズドライヤー（ＦＤＵ−８３０）を用い、０．１５Ｔｏｒｒで１日凍結乾燥を行った。乾燥後、乳鉢で軽く粉砕しリパーゼ粉末を得た。得られたリパーゼ粉末の形状は無定形で、水分含量は１１．３質量％であった。
実施例１、比較例１、及び比較例２のリパーゼ粉末の１，３−選択性を以下の方法で測定した。実施例１及び比較例１の１，３−選択性の測定結果を表１に示す。なお、比較例２で得られたリパーゼ粉末は、エステル交換活性が全くなかった。【００１５】１，３−選択性の測定方法
反応基質としてＧＲＹＣＥＲＹＬ−１，３−ＰＡＬＭＩＴＡＴＥ−２−ＯＬＥＡＴＥ（ＰＯＰ）１ｍｏｌ及びＯＣＴＡＮＯＩＣ  ＥＴＨＹＬ（Ｃ８Ｅｔ）３ｍｏｌを用い、酵素活性に応じて、基質の０．５〜５ｗ％となるようにリパーゼ粉末を添加し、６０℃で反応を行い、経時的にサンプリングしヘキサンで希釈した。このサンプルをＧＣ分析し以下の式により１・３位（Ｃ１６：０Ｅｔ）と２位（Ｃ１８：１Ｅｔ）の反応率を求めた。
Ｃ１６：０Ｅｔ（％）＝｛Ｃ１６：０Ｅｔ  ａｒｉａ／（Ｃ１６Ｅｔ＋Ｃ１８：１Ｅｔ  ａｒｅａ＋Ｃ８Ｅｔ  ａｒｅａ）｝×１００
Ｃ１８：１Ｅｔ（％）＝｛Ｃ１８：１Ｅｔ  ａｒｅａ／（Ｃ１６Ｅｔ＋Ｃ１８：１Ｅｔ  ａｒｅａ＋Ｃ８Ｅｔ  ａｒｅａ）｝×１００
各時間における各々の反応率から解析ソフト（ｏｒｉｊｉｎ  ｖｅｒ．６．１）により反応速度定数Ｋを求めた。この時の最終反応率の値は可変とする。２位の反応性を１とした時の１，３位の反応性を求めた。
＜ＧＣ条件＞
カラム    ：ＤＢ−１ｈｔ  ５ｍ
注入量    ：１μｌ
キャリアガス：ヘリウム
気化室温度：３６０℃
検出器温度：３７０℃
カラム温度：初期５０℃、昇温１５℃／ｍｉｎ、最終３７０℃【００１６】
2005097985.tif 000002
表−１の結果から、本発明によると１，３−特異性リパーゼの１，３−選択性が８７％も向上することがわかった。【００１７】［実施例２］
実施例１で得られたリパーゼ粉末に、５倍量の菜種油を加えて、菜種油にリパーゼ粉末を含浸・浸潤させ、濾過により過剰の油脂を除去し、リパーゼ粉末／菜種油の重量が５５／４５であるリパーゼ組成物を調製した。
【国際調査報告】
2005097985.tif 000003
2005097985.tif 000004
2005097985.tif 000005
2005097985.tif 000006