(57)【要約】ヒトＰＬＫ−１遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡを内包してなるリポソームは、膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物として有用である。特に、配列番号１の塩基配列を含むｓｉＲＮＡ及び配列番号２の塩基配列を含むｓｉＲＮＡが好ましい。この膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物は、膀胱表在性癌又は膀胱の前癌病変を有するヒトの膀胱内に、経尿道的に投与することにより、癌細胞の増殖を抑制し、又は癌への進行を抑制することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のｓｉＲＮＡ
（ａ）  配列番号１の塩基配列を含むｓｉＲＮＡ
（ｂ）  配列番号１において１〜３個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列を含み、かつヒトＰＬＫ−１遺伝子の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡ。
【請求項２】
以下の（ｃ）又は（ｄ）のｓｉＲＮＡ
（ｃ）  配列番号２の塩基配列を含むｓｉＲＮＡ
（ｄ）  配列番号２において１〜３個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列を含み、かつヒトＰＬＫ−１遺伝子の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡ。
【請求項３】
請求項１に記載のｓｉＲＮＡが内包されたリポソーム。
【請求項４】
請求項２に記載のｓｉＲＮＡが内包されたリポソーム。
【請求項５】
請求項３に記載のリポソームを含む医薬組成物。
【請求項６】
請求項４に記載のリポソームを含む医薬組成物。
【請求項７】
請求項３に記載のリポソームを含む膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物。
【請求項８】
請求項４に記載のリポソームを含む膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物。
【請求項９】
ヒトＰＬＫ−１の発現を阻害するｓｉＲＮＡが内包されたリポソームを含む膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物。
【請求項１０】
ｓｉＲＮＡ濃度が１００ｎＭ〜１ｍＭである請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
リポソームの８０重量％以上が５０〜３００μｍの粒径を有するものである請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
膀胱表在性癌又は膀胱の前癌病変を有するヒトの膀胱内に、経尿道的に、請求項３に記載のリポソームを投与する膀胱表在性癌の治療又は予防方法。
【請求項１３】
膀胱表在性癌又は膀胱の前癌病変を有するヒトの膀胱内に、経尿道的に、請求項４に記載のリポソームを投与する膀胱表在性癌の治療又は予防方法。
【請求項１４】
膀胱表在性癌又は膀胱の前癌病変を有するヒトの膀胱内に、経尿道的に、ヒトＰＬＫ−１の発現を阻害するｓｉＲＮＡが内包されたリポソームを投与する膀胱表在性癌の治療又は予防方法。
【請求項１５】
膀胱表在性癌の治療又は予防剤の１回投与量が、ｓｉＲＮＡを１２μｇ〜１２０ｍｇ投与できる量である請求項１４に記載の治療又は予防方法。
【請求項１６】
膀胱表在性癌の治療又は予防剤を１〜７日間間隔で５〜１０回投与する請求項１４に記載の治療又は予防方法。
【請求項１７】
膀胱表在性癌を切除後に微小残存癌病変を有するヒトに対して行われるものである請求項１４に記載の治療又は予防方法。
【請求項１８】
請求項３に記載のリポソームの膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物としての使用。
【請求項１９】
請求項４に記載のリポソームの膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物としての使用。
【請求項２０】
ヒトＰＬＫ−１の発現を阻害するｓｉＲＮＡが内包されたリポソームの膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物としての使用。
【請求項２１】
ｓｉＲＮＡの濃度が１００ｎＭ〜１ｍＭである請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
リポソームの８０重量％以上が５０〜３００μｍの粒径を有するものである請求項２０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、膀胱表在性癌の治療、特に膀胱表在性癌の摘出後に残存する微小癌病変の治療や、膀胱組織の前癌病変の癌への進行の予防などに有効なｓｉＲＮＡ、このｓｉＲＮＡを用いた膀胱表在性癌の治療又は予用医薬組成物、及び、この医薬組成物を用いた膀胱表在性癌の治療又は予防方法に関する。
【背景技術】  膀胱癌の初診断時にはその７０％を膀胱表在性癌が占める。膀胱表在性癌は経尿道的に切除可能であるが、術後に癌細胞が僅かに残存する場合がある。また、周囲に前癌状態の細胞が存在する場合もある。このような細胞の増殖により膀胱癌が再発することを予防するために、現在の臨床では、結核菌であるＢａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）や抗癌剤のマイトマイシンＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ）、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）などの膀胱内注入療法がされており、この治療法は１９８０年代からほとんど改善されていない。
しかし、これらの薬剤は再発予防効果は認めるものの十分とは言いがたく約半数は再発し、その内２０％−３０％は浸潤癌となる。このような進行期膀胱癌では膀胱全摘手術を施行せざるをえず、術後に排尿および性機能に関しＱＯＬを著しく損なう。また、ＢＣＧは生細菌であるため、ＢＣＧの使用により膀胱炎や菌血症になる恐れがある。また、マイトマイシンＣやアドリアマイシン等の抗癌剤は、癌細胞に対する選択性が十分ではなく正常細胞にも傷害を与える恐れがある。
【発明の開示】
本発明は、癌細胞に対する選択性が高い表在性膀胱癌の治療又は予防剤、及び治療又は予防方法を提供することを課題とする。
上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ね、以下の知見を得た。
（ｉ）  細胞の分裂及び増殖に重要な役割を担っているＰＬＫ−１（ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ−１）は、癌細胞の中でも膀胱癌細胞において特に強く発現している。
（ｉｉ）  ＰＬＫ−１の発現を特異的に阻害するｓｉＲＮＡを封入したリポソームを表在性膀胱癌モデルマウスに経尿道的に投与すると癌細胞に浸透し、癌細胞の増殖が効果的に抑制される。
（ｉｉｉ）  配列番号１及び２の塩基配列からなる各ｓｉＲＮＡを封入したリポソームは、膀胱癌細胞の増殖を特に効果的に抑制できる。
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下のｓｉＲＮＡ、表在性膀胱癌治療又は予防用医薬組成物、及び表在性膀胱癌の治療又は予防方法を提供する。
項１．  以下の（ａ）又は（ｂ）のｓｉＲＮＡ
（ａ）  配列番号１の塩基配列を含むｓｉＲＮＡ
（ｂ）  配列番号１において１〜３個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列を含み、かつヒトＰＬＫ−１遺伝子の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡ。
項２．  以下の（ｃ）又は（ｄ）のｓｉＲＮＡ
（ｃ）  配列番号２の塩基配列を含むｓｉＲＮＡ
（ｄ）  配列番号２において１〜３個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列を含み、かつヒトＰＬＫ−１遺伝子の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡ。
項３．  項１に記載のｓｉＲＮＡが内包されたリポソーム。
項４．  項２に記載のｓｉＲＮＡが内包されたリポソーム。
項５．  項３に記載のリポソームを含む医薬組成物。
項６．  項４に記載のリポソームを含む医薬組成物。
項７．  項３に記載のリポソームを含む膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物。
項８．  項４に記載のリポソームを含む膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物。
項９．  ヒトＰＬＫ−１の発現を阻害するｓｉＲＮＡが内包されたリポソームを含む膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物。
項１０．  ｓｉＲＮＡ濃度が１００ｎＭ〜１ｍＭである項９に記載の組成物。
項１１．  リポソームの８０重量％以上が５０〜３００μｍの粒径を有するものである項９に記載の組成物。
項１２．  膀胱表在性癌又は膀胱の前癌病変を有するヒトの膀胱内に、経尿道的に、項３に記載のリポソームを投与する膀胱表在性癌の治療又は予防方法。
項１３．  膀胱表在性癌又は膀胱の前癌病変を有するヒトの膀胱内に、経尿道的に、項４に記載のリポソームを投与する膀胱表在性癌の治療又は予防方法。
項１４．  膀胱表在性癌又は膀胱の前癌病変を有するヒトの膀胱内に、経尿道的に、ヒトＰＬＫ−１の発現を阻害するｓｉＲＮＡが内包されたリポソームを投与する膀胱表在性癌の治療又は予防方法。
項１５．  膀胱表在性癌の治療又は予防剤の１回投与量が、ｓｉＲＮＡを１２μｇ〜１２０ｍｇ投与できる量である項１４に記載の治療又は予防方法。
項１６．  膀胱表在性癌の治療又は予防剤を１〜７日間間隔で５〜１０回投与する項１４に記載の治療又は予防方法。
項１７．  膀胱表在性癌を切除後に微小残存癌病変を有するヒトに対して行われるものである項１４に記載の治療又は予防方法。
項１８．  項３に記載のリポソームの膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物としての使用。
項１９．  項４に記載のリポソームの膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物としての使用。
項２０．  ヒトＰＬＫ−１の発現を阻害するｓｉＲＮＡが内包されたリポソームの膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物としての使用。
項２１．  ｓｉＲＮＡの濃度が１００ｎＭ〜１ｍＭである項２０に記載の使用。
項２２．  リポソームの８０重量％以上が５０〜３００μｍの粒径を有するものである項２０に記載の使用。
本発明の治療又は予防方法によれば、ＰＬＫ−１遺伝子の発現を抑制できるｓｉＲＮＡを封入したリポソームを尿道を経由して膀胱内に投与することにより、膀胱表在性癌細胞や膀胱の前癌組織に浸透し、膀胱癌細胞の増殖を効果的に抑制する。
ｓｉＲＮＡを始めとする各種治療剤を封入したリポソームの投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与などの方法が試みられているが、膀胱内へのリポソームの投与により内包された治療剤を膀胱表在性の細胞に導入できるか否かは全く予測できないことである。
また、本発明によれば、ＰＬＫ−１遺伝子の発現を特に効果的に抑制する配列番号１及び２の塩基配列からなる各ｓｉＲＮＡが提供された。設計したｓｉＲＮＡが実際に標的遺伝子の発現を抑制する確率は低く、このように効果的なｓｉＲＮＡを見出すことは一般に困難である。このような状況の下で、配列番号１及び２のｓｉＲＮＡはリポソームに封入して膀胱内に投与することにより実際に膀胱癌細胞におけるＰＬＫ−１遺伝子の発現を抑制し、膀胱癌細胞の増殖を効果的に抑制した。
また、従来膀胱癌の治療に使用されている抗癌剤（マイトマイシンＣ、アドリアマイシン等）は活発に増殖する癌細胞に選択性を示すが、その作用機序はタンパク質合成や核酸合成の阻害であることから、ある程度正常細胞に対しても作用し、副作用を引き起こす。これに対して本発明の膀胱表在性癌の治療又は予防用組成物は、癌細胞、中でも膀胱癌細胞に特異的に強く発現しているＰＬＫ−１遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡを有効成分とするため、癌細胞に対する選択性が極めて高い。
また、上記の公知の膀胱癌治療剤は、有効投与量と最大耐容量との差がせいぜい１０倍程度と小さく、使用可能な用量範囲が狭い。これに対して本発明の膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物は、副作用が認められない又は殆ど認められないため、有効投与量と最大耐容量との差が大きく、使用し易い。
【図面の簡単な説明】  図１は、膀胱癌患者から摘除された癌組織におけるＰＬＫ−１発現量を示す免疫組織染色図である。
図２は、膀胱癌細胞株におけるＰＬＫ−１タンパク質の発現量を示すウェスタンブロッティングの結果である。
図３は、（Ａ）は、癌細胞株において本発明のｓｉＲＮＡがＰＬＫ−１の発現を抑制することを示すウェスタンブロティングの結果である。（Ｂ）は、本発明のｓｉＲＮＡが経時的にＰＬＫ−１の発現を抑制することを示すウェスタンブロッティングの結果である。（Ｃ）は、本発明のｓｉＲＮＡが用量依存的にＰＬＫ−１の発現を抑制することを示すウェスタンブロッティングの結果である。
図４は、本発明のｓｉＲＮＡが膀胱癌細胞において紡錐体形成を抑制することを示す図である。
図５は、（Ａ）及び（Ｂ）は、本発明のｓｉＲＮＡ内包リポソームの接触により膀胱癌細胞のアポトーシスが誘導されることを示す図である。（Ｃ）は、１００ｎＭの本発明のｓｉＲＮＡを内包するリポソームの接触により膀胱癌細胞の生存数が減少することを示す図である。
図６は、（Ａ）は膀胱癌細胞株がマウスの膀胱に生着し、増殖することを示す図である。（Ｂ）及び（Ｃ）は、マウスの膀胱内に経尿道的に本発明のｓｉＲＮＡを投与した場合に癌細胞に浸透することを示す図である。（Ｄ）は、に本発明のｓｉＲＮＡを経尿道的に膀胱内投与した膀胱癌細胞移植マウスにおいて、膀胱癌細胞の増殖が抑制されることを示す図である。
発明の詳細な記述
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物
本発明の膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物は、ヒトＰＬＫ−１の発現を特異的に阻害ないしは抑制するｓｉＲＮＡがリポソームに内包されたものを含む。
ｓｉＲＮＡ
このｓｉＲＮＡは、ヒトＰＬＫ−１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＮＭ＿００５０３０）の連続する１５〜３０塩基程度、特に１９〜２３塩基程度にハイブリダイズできる塩基配列を含むことが好ましい。ヒトＰＬＫ−１遺伝子にハイブリダイズできる塩基配列には、ヒトＰＬＫ−１遺伝子にハイブリダイズしない塩基領域が３塩基程度までなら含まれていてもよい。中でも、ヒトＰＬＫ−１遺伝子の連続する１５〜３０塩基程度、特に１９〜２３塩基程度にハイブリダイズできる塩基配列からなるｓｉＲＮＡが好ましい。このようなｓｉＲＮＡの設計は、例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２００４）Ｊｕｎ  １８，３１９（１），２６４−２７４に記載の方法により行うことができる。選択した配列がＰＬＫ−１のｍＲＮＡのみ発現阻害するか否かは、例えばＢＬＡＳＴサーチで確認すればよい。
このようなｓｉＲＮＡとして、例えば配列番号１〜４のいずれかの塩基配列を含むｓｉＲＮＡが挙げられる。本発明において、配列番号１〜４の各塩基配列を含むｓｉＲＮＡとは、この塩基配列のＲＮＡとそれに相補的又は略相補的な塩基配列のＲＮＡとが対になった２本鎖ＲＮＡを含む２本鎖ＲＮＡを指す。
配列番号１〜４の各塩基配列を含むｓｉＲＮＡは、配列番号１〜４の各塩基配列を含み、最大５０塩基程度のものである。特に、ヒトＰＬＫ−１遺伝子の発現阻害作用が強い点で、配列番号１〜４の各塩基配列を含むｓｉＲＮＡが好ましい。
ＰＬＫ−１の発現を抑制又は阻害するｓｉＲＮＡの中でも、特に配列番号１の塩基配列を含むｓｉＲＮＡ（好ましくは、配列番号１の塩基配列からなるｓｉＲＮＡ）、及び配列番号２の塩基配列を含むｓｉＲＮＡ（好ましくは、配列番号２の塩基配列からなるｓｉＲＮＡ）は、膀胱癌細胞又は膀胱の前癌状態の細胞に効率よく取り込まれて、ＰＬＫ−１遺伝子の発現を効率的に抑制ないしは阻害する。
また、配列番号１の塩基配列、及び配列番号２の塩基配列において、ぞれぞれ１〜３個程、特に１〜２個程度のヌクレオチドが付加、欠失、又は置換された塩基配列を含むｓｉＲＮＡであっても、ヒトＰＬＫ−１遺伝子の発現を特異的に阻害又は抑制する限り使用することができる。
また、本発明のｓｉＲＮＡは、ＰＬＫ−１の発現を阻害する限り、これらのヌクレオチドの誘導体であってもよい。
配列番号１及び２の各塩基配列において、１〜３個のヌクレオチドが欠失、付加、又は置換された塩基配列を含むｓｉＲＮＡがＰＬＫ−１遺伝子の発現を抑制するか否かは、例えば後述する実施例３で説明するように、抗ＰＬＫ−１ポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングなどにより確かめればよい。
本発明のｓｉＲＮＡは、公知の化学合成法により製造できる。
リポソーム
リポソームの構成は特に限定されず、癌の遺伝子治療に使用される公知のリポソーム材料からなるものを使用すればよい。このような公知のリポソームとしては、例えば、カチオン化されたリポソームが挙げられる。カチオン化されたリポソームを用いることにより、細胞内での浸透性を向上させることができる。
リポソームを構成する脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、カルジオリビン等の天然または合成のリン脂質、又はこれらを常法に従って水素添加したものが挙げられる。また、これらのリン脂質にはステロールを併用してもよい。脂質は、１種を単独で又は２種以上を混合して使用できる。
リポソームは、例えば、脂質をｔ−ブチルアルコールなどの溶媒に溶解させ、冷却後、凍結乾燥することにより作製することができる。また、作製したリポソームとｓｉＲＮＡ溶液とを接触させるだけでもｓｉＲＮＡを内包したリポソームが得られる。さらに、例えば、脂質にｓｉＲＮＡを溶解させた液体を加えて膨潤させ、超音波で分散させた後、分散体にポリエチレングリコール−フォスファチジルエタノールアミンを添加することにより直接ｓｉＲＮＡが封入されたリポソームを得ることができる。
リポソームの大きさは、その８０重量％以上が、粒径５０〜３００μｍ程度であることが好ましく、粒径７０〜２００μｍ程度の範囲であることがより好ましく、粒径７０〜１００μｍ程度の範囲であることがさらにより好ましい。上記の粒径範囲であれば、十分量のｓｉＲＮＡを封入できるとともに、リポソームによる毒性が生じない。
また、リポソーム内には、その形態及び機能を維持するために、通常、ｓｉＲＮＡの他にリン酸緩衝液−生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ＝７〜７．４程度）のような緩衝液、生理食塩水、ＲＰＭＩのような細胞用培養液、糖溶液などの液体成分が含まれていればよい。
リポソーム内のｓｉＲＮＡの濃度は、１００ｎＭ〜１ｍＭ程度であることが好ましく、１００ｎＭ〜６μＭ程度であることがより好ましい。上記のｓｉＲＮＡの封入量の範囲であれば治療効率が良い。また、現実にｓｉＲＮＡを封入できる範囲の量である。なお、ｓｉＲＮＡを内包するリポソームは、ｓｉＲＮＡを懸濁した溶液とリポソームとの接触により行うことから、本発明に規定する「リポソーム内ｓｉＲＮＡ濃度」は、リポソーム作製の際にリポソームと接触させる溶液中のｓｉＲＮＡ濃度である。本発明においては、この濃度をリポソーム内ｓｉＲＮＡ濃度とみなす。
（ＩＩ）膀胱表在性癌の治療又は予防方法
本発明の膀胱表在性癌の治療又は予防方法は、膀胱表在性癌又は膀胱の前癌病変を有するヒトの膀胱内に、経尿道的に、上記説明した本発明のｓｉＲＮＡ内包リポソーム（本発明の膀胱癌の治療又は予防用医薬組成物）を投与する方法である。
本発明方法の対象となる患者は、未処置の膀胱表在性癌を有するヒト、膀胱表在性癌を摘除後のヒト、抗癌剤を投与したことにより膀胱癌が小さくなったヒト、膀胱内表面に前癌状態の病変を有するヒトなどである。膀胱癌細胞は複数層重なっているため、膀胱表在性癌を摘除しても、通常はわずかに癌細胞が残存する。このような微小残存病変を有するヒトも本発明方法の対象となる。このような状態の患者に本発明のｓｉＲＮＡ内包リポソームを投与することにより、癌細胞の増殖を抑制することができ、また前癌組織の癌への進行を抑制することができる。最も高い治療効果を期待できる対象は、膀胱癌を摘除後に、膀胱内表面に微小残存癌病変を有するヒトである。
ｓｉＲＮＡ内包リポソームは、例えばＰＢＳ、生理食塩水、細胞用培養液、糖溶液等に懸濁した状態で、尿道口から、通常カテーテルを用いて尿道を通して膀胱内に投与すればよい。これにより、膀胱癌細胞内にｓｉＲＮＡが導入される。
ｓｉＲＮＡ内包リポソームの１回投与量は、ｓｉＲＮＡ量に換算して１２μｇ〜１２０ｍｇ程度が好ましく、５０μｇ〜１０ｍｇ程度がより好ましい。上記の投与量の範囲であれば、十分に治療又は予防効果が得られるとともに、非特異的な作用が生じることもない。
また、この量を、３〜１０回程度に分けて投与することが好ましい。上記投与回数の範囲であれば、副作用の出るような１回投与量になることがなく、かつ患者の負担が小さい。
また、投与間隔は１〜７日間程度が好ましい。上記投与間隔であれば、感染症を誘発せず、患者の負担が小さい。また、上記投与間隔であれば、患者体内で有効ｓｉＲＮＡ濃度を保つことができる。
（ＩＩＩ）膀胱表在性癌の予防又は治療用医薬組成物としての使用
上記説明した本発明のｓｉＲＮＡ内包リポソームは、膀胱表在性癌の予防又は治療用医薬組成物として使用できる。使用の好ましい態様は、前述した通りである。
【実施例】  以下、本発明を実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
膀胱癌細胞におけるＰＬＫ−１の発現
滋賀医科大学にて根治的膀胱全摘が施行されＨｅｌｓｉｎｋｉ宣言に基づいてインフォームドコンセントを得た５８例の膀胱癌患者から摘除された癌組織の標本を用意した。一次抗体として、１００倍希釈の抗ヒトＰＬＫ−１モノクローナル抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹ）を用い、周知のアビジン−ビオチン−パーオキシダーゼ複合体法（  ＡＢＣ−Ｅｌｉｔｅ，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ；Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９３，５２３−５３１）により免疫組織染色を行った。
結果を図１に示す。図１のＡ，Ｂ，Ｃは、グレードの高い未分化な筋層浸潤を認める膀胱癌である。Ｅ，Ｆはグレードの低い高分化で表在性の膀胱癌である。グレードの高い癌組織の方が、ＰＬＫ−１が高発現していることが分かる。また、Ｄはリンパ管浸潤が認められる組織であるが、この組織にもＰＬＫ−１は高発現していることが分かる。
また、５８標本について、膀胱癌の臨床病理学的特徴とＰＬＫ−１発現レベルとの関係を以下の表１に示す。
【表１】
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表１から、腫瘍の筋層浸潤の有無、リンパ管浸潤の有無、及び悪性度とＰＬＫ−１の発現との間には正の相関性が認められた。即ち、グレードの高い膀胱癌組織ではグレードの低い膀胱癌組織よりＰＬＫ−１が高発現している。また、表在性の癌より侵襲性の癌の方がＰＬＫ−１が高発現している。さらに、リンパ管浸潤が認められる癌ではＰＬＫ−１が高発現している。
このように、ＰＬＫ−１は膀胱癌において特に高発現していることが分かる。
実施例２
膀胱癌細胞株におけるＰＬＫ−１の発現
次に、膀胱癌の樹立細胞株におけるＰＬＫ−１の発現量を検討した。ヒト膀胱癌細胞株の２５３Ｊ，５６３７，ＨＴ１１９７，ＨＴ１３７６，Ｊ８２，ＲＴ４，ＲＴ１１２，ＳＣａＢＥＲ，ＴＣＣＳＵＰ，ＫＵ−７，及びＵＭ−ＵＣ−３；マウス膀胱癌細胞株のＭＢＴ−２；ヒト正常肝細胞Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ；並びにヒト正常線維芽細胞ＨＦ，ＮＨＤＦをＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。これらの細胞から調製したタンパク質について、抗ヒトＰＬＫ−１ポリクローナル抗体（ｒａｂｂｉｔ；Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いてウエスタン・ブロッティングを行った。
結果を図２に示す。図２から、膀胱癌細胞株では正常細胞に比べてＰＬＫ−１が非常に強く発現していることが分かる。
実施例１及び２より、膀胱癌の浸潤・悪性化にＰＬＫ−１が重要な役割を果たしていることが示唆された。また、ＰＬＫ−１が膀胱癌の分子治療の標的として好適であることが分かる。
実施例３
本発明のｓｉＲＮＡ内包リポソームを用いた膀胱癌細胞株におけるＰＬＫ−１発現の抑制
（Ａ）  ＰＬＫ−１に対する配列番号１〜４の４種類のｓｉＲＮＡを化学合成した（Ｎｉｐｐｏｎ−Ｓｈｉｎｙａｋｕ  Ｃｏ．，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）。これらのｓｉＲＮＡの塩基配列は以下の通りである。
ＰＬＫ−１  ｓｉＲＮＡ  １３４５：５’−ＧＡＣＡＧＣＣＵＧＣＡＧＵＡＣＡＵＡＧｄＴｄＴ−３’（配列番号１）
ＰＬＫ−１  ｓｉＲＮＡ  １４１２：５’−ＣＣＵＵＧＡＵＧＡＡＧＡ  ＡＧＡＵＣＡＣｄＴｄＴ−３’（配列番号２）
ＰＬＫ−１  ｓｉＲＮＡ  １８３：５’−ＧＧＧＣＧＧＣＵＵＵＧＣＣＡＡＧＵＧＣｄＴｄＴ−３’（配列番号３）
ＰＬＫ−１  ｓｉＲＮＡ  １４１８：５’−ＧＡＡＧＡＡＧＡＵＣＡＣ  ＣＣＵＣＣＵＵｄＴｄＴ−３’（配列番号４）
カチオン性脂質アナログを含むカチオン製リポソーム（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９９  Ｓｅｐ  １；５９（１７）：４３２５−３３．に記載のリポソーム）に、それぞれ上記４種のｓｉＲＮＡを接触により封入した。このリポソームは、その８０重量％以上が粒径７０〜８０μｍである。これらのリポソーム内には、１０％マルトース水溶液が満たされており、ｓｉＲＮＡが１００ｎＭ含まれている。このｓｉＲＮＡ濃度は、ｓｉＲＮＡ封入リポソームの作製時に使用したｓｉＲＮＡ溶液中のｓｉＲＮＡ濃度である。
ヒト膀胱癌細胞株ＨＴ１３７６、マウス膀胱癌細胞株ＭＢＴ−２、及びヒト子宮頚癌細胞株ＨｅＬａにおけるＰＬＫ−１タンパク質の発現に与える上記４種のｓｉＲＮＡ内包リポソームの影響を以下のようにして調べた。即ち、上記各細胞培養に対して上記ｓｉＲＮＡ封入リポソームを添加することにより細胞にｓｉＲＮＡを導入した。ｓｉＲＮＡ導入後の細胞からタンパク質を調製し、実施例２と同様にして、抗ヒトＰＬＫ−１ポリクローナル抗体を用いたウエスタン・ブロッティングを行った。
結果を図３（Ａ）に示す。図３（Ａ）中、非処理はｓｉＲＮＡ内包リポソームを作用させない細胞を示し、コントロールは、ナンセンス配列（５’−ＵＵＣＵＣＣＧＡＡＣＧＵＧＵＣＡＣＧＵｄＴｄＴ−３’（配列番号５））を有するｓｉＲＮＡを作用させた細胞を示す。図３から、４種のｓｉＲＮＡは癌細胞におけるＰＬＫ−１の発現を抑制しているが、中でもＰＬＫ−１  １４１２及びＰＬＫ−１  １４１８がＰＬＫ−１の発現を強く抑制し、特にＰＬＫ−１  １４１２が最も効果的にＰＬＫ−１の発現を抑制していることが分かる。
（Ｂ）  また、ＰＬＫ−１  １４１２の膀胱癌細胞株ＵＭ−ＵＣ−３におけるｓｉＲＮＡ発現抑制を経時的に観察した。即ち、ｓｉＲＮＡ内包リポソームと細胞との接触時間を０、２、及び４時間として、各場合のＵＭ−ＵＣ−３細胞におけるＰＬＫ−１タンパク質の発現量を、実施例２と同様にして、抗ヒトＰＬＫ−１ポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングで調べた。結果を図３（Ｂ）に示す。図３（Ｂ）より、ＰＬＫ−１  １４１２はＰＬＫ−１の発現を時間依存的に抑制することが分かる。
（Ｃ）  また、ＰＬＫ−１  １４１２の使用量と膀胱癌細胞株ＵＭ−ＵＣ−３及びＨＴ１３７６におけるｓｉＲＮＡ発現抑制効果との関係を同様にして調べた。即ち、膀胱癌細胞株ＵＭ−ＵＣ−３については、リポソーム内のＰＬＫ−１  １４１２濃度（リポソームと接触させるｓｉＲＮＡ溶液中のｓｉＲＮＡ濃度）を１ｎＭ、１０ｎＭ、及び１００ｎＭに変化させ、膀胱癌細胞株ＨＴ１３７６については、リポソーム内ｓｉＲＮＡ濃度（リポソームと接触させるｓｉＲＮＡ溶液中のｓｉＲＮＡ濃度）を３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭに変化させて、各場合の膀胱癌細胞におけるＰＬＫ−１タンパク質の発現量を、実施例２と同様にして、抗ヒトＰＬＫ−１ポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングにより調べた。
結果を図３（Ｃ）に示す。いずれの膀胱癌細胞を用いた場合も、ＰＬＫ−１１４１２は用量依存的にＰＬＫ−１の発現を抑制している。
以上より、本発明のｓｉＲＮＡを内包するリポソームは、膀胱癌細胞に作用してＰＬＫ−１の発現を抑制することが分かる。
（Ｄ）  ＰＬＫ−１タンパク質は細胞周期の制御に重要な役割を果たしており、サイクリンＢ１の分解に関与するとされている。サイクリンＢ１の分解に及ぼすＰＬＫ−１  １４１２の影響を調べるために、上記各濃度のｓｉＲＮＡを内包するリポソームを導入した膀胱癌細胞株ＵＭ−ＵＣ−３及びＨＴ１３７６について、サイクリンＢ１タンパク質の発現量を、ウサギ抗サイクリンＢ１ポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を用いたウェスタンブロッティングにより調べた。
結果を図３（Ｃ）に示す。図３（Ｃ）から、ＰＬＫ−１  １４１２は濃度依存的にサイクリンＢ１の分解を抑制していることが分かる。
実施例４
本発明のｓｉＲＮＡによる紡錐体形成の抑制
ＰＬＫ−１タンパク質の重要な役割とされている紡錐体形成に及ぼすｓｉＲＮＡの影響を以下のようにして調べた。
膀胱癌細胞株ＵＭ−ＵＣ−３（ＡＴＣＣ；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に、ＰＬＫ−１  ｓｉＲＮＡ  １４１２内包リポソームを実施例３と同様にして上記細胞に作用させた。ｓｉＲＮＡを導入したが膀胱癌細胞及び導入しないコントロールの膀胱癌細胞について、β−チューブリン及びγ−チューブリンに特異的な抗体（Ｓｉｇｍａ，ＳＴ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２  ＤＮＡ染色（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いた免疫細胞染色を、これらに添付されたマニュアルに従って行った。
結果を図４に示す。β−チューブリン及びγ−チューブリン染色により、ＰＬＫ−１  ｓｉＲＮＡ  １４１２を導入しないコントロール細胞では、正常に形成されたＭ−期の双極性の紡錐体が観察された。また、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２  ＤＮＡ染色により、染色体ＤＮＡが細胞の中心に整列しているのが観察された。これに対して、ＰＬＫ−１  ｓｉＲＮＡ  １４１２を導入した膀胱癌細胞では、Ｍ−期の円形の細胞が増加し、双極性の紡錐体の形成が強く抑制されている。  サイクリンＢ１の分解が抑制され、また紡錐体形成が抑制されることから、本発明のｓｉＲＮＡを内包するリポソームは、膀胱癌細胞に作用してＰＬＫ−１の機能を効果的に抑制することが分かる。
実施例５
本発明のｓｉＲＮＡ内包リポソームのアポトーシス誘導に対する影響
ＰＬＫ−１  ｓｉＲＮＡ  １４１２を内包するリポソームが膀胱癌細胞の細胞周期に及ぼす影響を以下のようにして調べた。
（Ａ）  ＵＭ−ＵＣ−３膀胱癌細胞株についてｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）の単染色を行い、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）で細胞周期を調べた。また、実施例３と同様にして１００ｎＭ濃度のＰＬＫ−１  ｓｉＲＮＡ  １４１２を内包するリポソームをＵＭ−ＵＣ−３細胞に作用させて２４時間培養した細胞についても、同様にしてＰＩの単染色を行い、ＦＡＣＳにより細胞周期を調べた。
結果を図５（Ａ）に示す。図５（Ａ）より、ＰＬＫ−１  ｓｉＲＮＡ  １４１２を導入しないコントロール膀胱癌細胞ではアポトーシスは誘導されていないが、ＰＬＫ−１  ｓｉＲＮＡ  １４１２を導入した膀胱癌細胞では、Ｇ２／Ｍ期にて細胞周期が停止され、アポトーシスが誘導されていることが分かる。
（Ｂ）  同様に、ＰＬＫ−１  ｓｉＲＮＡ  １４１２を導入しないＵＭ−ＵＣ−３膀胱癌細胞株、コントロールｓｉＲＮＡ（配列番号５）を導入したＵＭ−ＵＣ−３膀胱癌細胞、及びＰＬＫ−１  ｓｉＲＮＡ  １４１２を導入したＵＭ−ＵＣ−３膀胱癌細胞について、ＭＥＢＳＴＡＩＮ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ＭＢＬ，Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）を用いてＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ染色を行った。この場合、リポソーム内ｓｉＲＮＡ濃度は１００ｎＭ、細胞との接触時間は３６時間とした。
結果を図３（Ｂ）に示す。図３（Ｂ）のＡは染色写真であり、Ｂは生存細胞数である。図３（Ｂ）から、ＰＬＫ−１  ｓｉＲＮＡ  １４１２を作用させたＵＭ−ＵＣ−３膀胱癌細胞ではＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖポジティブである細胞の比率が高く、アポトーシスの誘導が確認された。
（Ｃ）  さらに、実施例３と同様にして、膀胱癌細胞株ＵＭ−ＵＣ−３，２５３Ｊ，及びＫＵ−７に、１００ｎＭのＰＬＫ−１  ｓｉＲＮＡ  １４１２を内包するリポソームを１，３，６，及び７２時間作用させた後の生存細胞数をカウントした。ＰＬＫ−１  ｓｉＲＮＡ  １４１２による上記各細胞に対する増殖抑制効果のＩＣ５０はそれぞれ、４６．１ｎＭ，９４．５ｎＭ，及び６０．４μＭであった。
後述する実施例６において、ＰＬＫ−１  ｓｉＲＮＡ  １４１２を内包するリポソームは、ｉｎ  ｖｉｖｏで１５０ｎＭ〜６μＭの濃度範囲でがん細胞増殖抑制効果が認められたことから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＩＣ５０の３〜１２０倍の濃度でｉｎ  ｖｉｖｏ効果が認められたことになる。
なお、Ａ４３１膀胱癌細胞株（ＡＴＣＣ）を用い、ｓｉＲＮＡ内包リポソームとしてそれぞれＰＬＫ−１  ｓｉＲＮＡ  ２４６，１３４５，１４１２，及び２４６を内包するリポソームを用い、同様にしてＩＣ５０を求めたところ、それぞれ２２１ｎＭ、３５７ｎＭ、２ｎＭ、１３ｎＭであった。
また、膀胱癌細胞株ＵＭ−ＵＣ−３，２５３Ｊ，及びＫＵ−７について、実施例３と同様にして、濃度１００ｎＭのＰＬＫ−１  ｓｉＲＮＡ  １４１２を内包するリポソームを作用させ、０時間、１時間、２時間、及び３時間後の生存細胞数をカウントした。ＰＬＫ−１  ｓｉＲＮＡ  １４１２を作用させた各細胞の相対細胞生存数は、コントロール細胞の当初生存細胞数を１．０とした場合、ＵＭ−ＵＣ−３細胞では０．１８７±０．０１９１及び０．０８９１±０．０２９０であり、２５３Ｊ細胞では０．７０５±０．０３４２及び０．３９９±０．０６９３であり、ＫＵ−７細胞では０．４６６±０．１０８及び０．２４３±０．０７１７であった。
結果を図５（Ｃ）に示す。図５（Ｃ）より、１００ｎＭという比較的高濃度のＰＬＫ−１  ｓｉＲＮＡ  １４１２を内包するリポソームで膀胱癌細胞を処理した場合は、１〜３時間という短時間で生存細胞数が減少したことが分かる。
これは、ＰＬＫ−１  ｓｉＲＮＡ  １４１２によってＰＬＫ−１タンパク質の発現が阻害された結果、膀胱癌細胞の増殖が抑制されたものと考えられる。
実施例６
マウス正所性モデルを用いた膀胱癌増殖抑制効果
（Ａ）  ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて膀胱癌に対するＰＬＫ−１  ｓｉＲＮＡ  １４１２の抗腫瘍効果を観察するために、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した膀胱癌細胞株を用いた正所性膀胱癌マウスモデルを確立した。
リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、マウス膀胱癌細胞株ＵＭ−ＵＣ−３にｐＧＬ３（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）及びｐＳＶ２ネオベクター（ＡＴＣＣ）を導入した。このようにして得られたＬＵＣ−ラベルされた膀胱癌細胞１×１０６個を、マウス膀胱へ２４Ｇのアンギオ・カテーテルを用いて移植した。移植して１０分後、１日後、１週間後、３週間後、及び４週間後に、Ｘｅｎｏｇｅｎ社のｉｎ  ｖｉｖｏイメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を用いてマウスを観察した。
結果を図６（Ａ）に示す。Ａは１０分後、Ｂは１日後、Ｃは１週間後、Ｄは３週間後、Ｅは４週間後の様子を示す。膀胱癌細胞がマウス膀胱で増殖していることが観察される。
このことから、上記システムにより、非観血的に反復的に、さらに定量的に膀胱癌細胞の増殖を観察できることが分かる。
（Ｂ）  次いで、実施例３と同様にして、濃度１００ｎＭのｓｉＲＮＡを内包するリポソームを作製した。さらに、このリポソームをＦＩＴＣ（ピーク波長５３０ｎｍの蛍光を発する）でラベルした。ＬＵＣ−ラベルされた膀胱癌細胞を移植したマウスの膀胱からカテーテルを用いて排尿させた後、カテーテルを用いて尿道口から膀胱内に上記リポソームを２００μｌ注入した。
リポソーム注入の２４時間後に、マウスの膀胱を摘出し、蛍光顕微鏡を用いて観察した。結果を図６（Ｂ）に示す。図６（Ｂ）のＡ，Ｂはリポソームを投与した場合、Ｃ，Ｄはリポソームを投与しない場合、Ａ，Ｃは蛍光顕微鏡で観察した場合、Ｂ，Ｄは連続切片をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色した結果を示す。図６（Ｂ）Ａに示すように、リポソームを投与した場合は、膀胱部分に蛍光が観察される。このことから、経尿道的にｓｉＲＮＡ内包リポソームを投与することにより、膀胱癌組織に浸透することが分かる。
（Ｃ）  次いで、リポソームを投与したマウス及びリポソームを投与しないコントロールのマウスの膀胱癌組織を摘出し、実施例２と同様にして、但し、抗ＰＬＫ−１ポリクローナル抗体に代えて抗ＰＬＫ−１モノクローナル抗体を用いてウェスタンブロッティングによりＰＬＫ−１の発現量を調べた。
また、摘出した膀胱癌組織について、ＨＥ染色も行った。
結果を図６（Ｃ）に示す。図６（Ｃ）のＡ，ＢはｓｉＲＮＡ内包リポソームで治療したマウスの組織であり、Ｃ，Ｄはこの治療を行わないマウスの組織である。また、Ａ，Ｃは抗ＰＬＫ−１モノクローナル抗体を用いた場合であり、Ｂ，ＤはＨＥ染色による場合である。図６（Ｃ）から、ｓｉＲＮＡ内包リポソームを経尿道的に投与することにより、ＰＬＫ−１の発現が抑制されていることが分かる。
（Ｄ）  次いで、ルシフェラーゼ遺伝子を導入したＵＭ−ＵＣ−３細胞株を膀胱内に移植したマウスを４群（１群７匹）に分けて、２１日間にわたり飼育し、ＰＬＫ−１  ｓｉＲＮＡ  １４１２内包リポソーム又はコントロールｓｉＲＮＡ（配列番号５）を５日目から９日目にわたって投与した。投与は、１日に１回一度に膀胱内にリポソームを投与して尿道口を手術用糸で縛り、４時間後に開放する方法で行った。これら４群は、それぞれ非投与群、濃度６μｍのコントロールｓｉＲＮＡを内包するリポソームを投与した群、濃度２００ｎＭのＰＬＫ−１  ｓｉＲＮＡ  １４１２を投与した群、濃度６μｍ（７）ＰＬＫ−１  ｓｉＲＮＡ  １４１２を投与した群である。
各群のマウスについて、膀胱癌細胞の増殖を測定した。結果を図６（Ｄ）に示す。図６（Ｄ）のグラフの横軸は飼育期間を示し、縦軸は光子のカウントを示す。
図６（Ｄ）中、・は濃度２００ｎＭのＰＬＫ−１  ｓｉＲＮＡ  １４１２を投与した群、○は濃度６μｍのＰＬＫ−１  ｓｉＲＮＡ  １４１２を投与した群、□は無投与群、■はコントロールｓｉＲＮＡ投与群である。ＰＬＫ−１  ｓｉＲＮＡ  １４１２内包リポソームを投与することにより、膀胱癌細胞の増殖が効果的に抑制されたことが分かる。
この４群間の末梢血中赤血球数、白血球数、血小板数および血清ａｓｐａｒｔａｔｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＳＴ），血清ａｌａｎｉｎｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＬＴ），血清ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＬＤＨ），血清ｔｏｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＰ），血清ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ（Ｃｒｅ），及び血清ｂｌｏｏｄ  ｕｒｅａ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ（ＢＵＮ）を測定したところ、４群間に有意差を認めなかった。調べた範囲では、ＰＬＫ−１  ｓｉＲＮＡ  １４１２には副作用は認められなかった。
以上のことからＰＬＫ−１  ｓｉＲＮＡ  １４１２は膀胱内に経尿道的に注入することで表在性膀胱癌の微小再発巣、微小残存病変の治療効果の可能性が示され、即ち再発予防的投与の理論的根拠となる十分な実験結果が得られた。
【産業上の利用可能性】  本発明の膀胱表在性癌の予防又は治療用医薬組成物は、膀胱内に投与することにより、膀胱表在性癌細胞や前癌組織に浸透し、膀胱癌細胞の増殖を効果的に抑制する。特に、膀胱癌を切除後に微小残存癌病変を有するヒトの治療用医薬組成物として好適に使用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年8月25日(2006.8.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】請求の範囲
【請求項１】  以下の（ａ）又は（ｂ）のｓｉＲＮＡ
（ａ）  配列番号４の塩基配列を含むｓｉＲＮＡ
（ｂ）  配列番号４において１〜３個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列を含み、かつヒトＰＬＫ−１遺伝子の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡ。
【請求項２】  以下の（ｃ）又は（ｄ）のｓｉＲＮＡ
（ｃ）  配列番号２の塩基配列を含むｓｉＲＮＡ
（ｄ）  配列番号２において１〜３個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列を含み、かつヒトＰＬＫ−１遺伝子の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡ。
【請求項３】  請求項１に記載のｓｉＲＮＡが内包されたリポソーム。
【請求項４】  請求項２に記載のｓｉＲＮＡが内包されたリポソーム。
【請求項５】  請求項３に記載のリポソームを含む医薬組成物。
【請求項６】  請求項４に記載のリポソームを含む医薬組成物。
【請求項７】  請求項３に記載のリポソームを含む膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物。
【請求項８】  請求項４に記載のリポソームを含む膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物。
【請求項９】  ヒトＰＬＫ−１の発現を阻害するｓｉＲＮＡが内包されたリポソームを含む膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物。
【請求項１０】  ｓｉＲＮＡ濃度が１００ｎＭ〜１ｍＭである請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】  リポソームの８０重量％以上が５０〜３００μｍの粒径を有するものである請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】  膀胱表在性癌又は膀胱の前癌病変を有するヒトの膀胱内に、経尿道的に、請求項３に記載のリポソームを投与する膀胱表在性癌の治療又は予防方法。
【請求項１３】  膀胱表在性癌又は膀胱の前癌病変を有するヒトの膀胱内に、経尿道的に、請求項４に記載のリポソームを投与する膀胱表在性癌の治療又は予防方法。
【請求項１４】  膀胱表在性癌又は膀胱の前癌病変を有するヒトの膀胱内に、経尿道的に、ヒトＰＬＫ−１の発現を阻害するｓｉＲＮＡが内包されたリポソームを投与する膀胱表在性癌の治療又は予防方法。
【請求項１５】  膀胱表在性癌の治療又は予防剤の１回投与量が、ｓｉＲＮＡを１２μｇ〜１２０ｍｇ投与できる量である請求項１４に記載の治療又は予防方法。
【請求項１６】  膀胱表在性癌の治療又は予防剤を１〜７日間間隔で５〜１０回投与する請求項１４に記載の治療又は予防方法。
【請求項１７】  膀胱表在性癌を切除後に微小残存癌病変を有するヒトに対して行われるものである請求項１４に記載の治療又は予防方法。
【請求項１８】  請求項３に記載のリポソームの膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物としての使用。
【請求項１９】  請求項４に記載のリポソームの膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物としての使用。
【請求項２０】  ヒトＰＬＫ−１の発現を阻害するｓｉＲＮＡが内包されたリポソームの膀胱表在性癌の治療又は予防用医薬組成物としての使用。
【請求項２１】  ｓｉＲＮＡの濃度が１００ｎＭ〜１ｍＭである請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】  リポソームの８０重量％以上が５０〜３００μｍの粒径を有するものである請求項２０に記載の使用。
【国際調査報告】
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