(57)【要約】  本発明は、悪性リンパ腫において複雑な遺伝子コピー数の変化をより正確に解析し、より詳細に重要なゲノム異常領域を同定して、病型の診断や予後診断に利用することを目的とし、ゲノムワイドなアレイＣＧＨを実施して、ヒト１番染色体ｐ３６．２３〜ｐ３６．３２、ヒト１番染色体ｑ４２．２〜ｑ４３、ヒト２番染色体ｐ１１．２、ヒト２番染色体ｑ１３、ヒト１７番染色体ｐ１１．２〜ｐ１３．３及びヒト１９番染色体ｐ１３．２〜ｐ１３．３を同定した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト１番染色体ｐ３６．２３〜ｐ３６．３２、ヒト１番染色体ｑ４２．２〜ｑ４３、ヒト２番染色体ｐ１１．２、ヒト２番染色体ｑ１３、ヒト１７番染色体ｐ１１．２〜ｐ１３．３及びヒト１９番染色体ｐ１３．２〜ｐ１３．３から選択される１種又は２種以上における欠損又は変異を検出する工程を備える、悪性腫瘍の診断方法。
【請求項２】
前記悪性腫瘍は悪性リンパ腫である、請求項１に記載の診断方法。
【請求項３】
前記検出工程の検出結果に基づいて前記悪性リンパ腫の病型を判定する病型判定工程を備える、請求項１又は２に記載の診断方法。
【請求項４】
前記病型判定工程における前記病型はマントル細胞リンパ腫である、請求項３に記載の診断方法。
【請求項５】
ヒト２番染色体ｑ１３の塩基配列における欠損又は変異を検出する検出工程を備える、
請求項１〜４のいずれかに記載の悪性腫瘍の診断方法。
【請求項６】
前記検出工程は、ＢＩＭ遺伝子の欠損又は変異を検出する工程である、請求項５に記載の診断方法。
【請求項７】
前記検出工程における検出結果に基づいて前記悪性腫瘍の治療反応性を判定する治療反応性判定工程を備える、請求項５又は６に記載の診断方法。
【請求項８】
前記検出工程は、ＢＡＣ ＲＰ１１−４３８Ｋ１９の３５０２７ｂｐから４９９２０ｂｐ、配列番号１に記載の塩基配列の３９４位〜５９７位及び配列番号２に記載の塩基配列の２１４位〜４１７位のいずれかにおける欠損又は変異を検出する工程である、請求項５〜７のいずれかに記載の診断方法。
【請求項９】
前記検出工程は、検体中のＢＩＭ遺伝子、ＢＩＭ遺伝子から発現するｍＲＮＡ及びｃＤＮＡのいずれかを利用する工程である、請求項５〜８のいずれかに記載の診断方法。
【請求項１０】
前記検出工程は、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、核酸ハイブリダイゼーションを実施する工程を含んでいる、請求項９に記載の診断方法。
【請求項１１】
前記検出工程は、ＢＩＭ遺伝子の少なくとも一部に相補的な１種又は２種以上のプローブを備えるアレイ上において該プローブと検体から得られる核酸試料とをハイブリダイズする工程を含んでいる、請求項９に記載の診断方法。
【請求項１２】
前記検出工程は、アレイＣＧＨ法を実施する工程である、請求項１〜１１のいずれかに記載の診断方法。
【請求項１３】
前記検出工程は、ＢＩＭ遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の有無、発現量又は変異を検出する工程である、請求項５〜８のいずれかに記載の診断方法。
【請求項１４】
ＢＩＭ遺伝子若しくはその一部又はこれらに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドである、悪性腫瘍診断用マーカー。
【請求項１５】
前記ＢＩＭ遺伝子のタンパク質翻訳領域は配列番号１又は配列番号２に記載の塩基配列を有する、請求項１４に記載の診断用マーカー。
【請求項１６】
配列番号１に記載の塩基配列の３９４位〜５９７位若しくは配列番号２に記載の塩基配列の２１４位〜４１７位の少なくとも一部又はこれに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドである、請求項１４に記載の診断用マーカー。
【請求項１７】
プローブ又はプライマーとして使用される請求項１４〜１６のいずれかに記載の診断用マーカー。
【請求項１８】
ＢＩＭ遺伝子によってコードされるタンパク質若しくはその一部又はこれらに対する抗体である、悪性腫瘍診断用マーカー。
【請求項１９】
悪性腫瘍の診断用アレイであって、
ヒト２番染色体ｑ１３における欠損又は変異を検出するための核酸プローブを固定したアレイ。
【請求項２０】
前記核酸プローブは、ＢＩＭ遺伝子の欠損又は変異を検出するための核酸プローブである、請求項１９に記載の診断用アレイ。
【請求項２１】
前記核酸プローブは、配列番号１に記載の塩基配列の３９４位〜５９７位若しくは配列番号２に記載の塩基配列の２１４位〜４１７位の少なくとも一部又はこれらに相補的な塩基配列を有している、請求項１９に記載の診断用アレイ。
【請求項２２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の診断方法のための診断用キットであって、
ＢＩＭ遺伝子の欠損又は変異を検出するための核酸プローブを含む、
診断用キット。
【請求項２３】
マントル細胞リンパ腫の治療用医薬組成物であって、
ＢＩＭ遺伝子のコード領域又は該ＢＩＭ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を有するホモログタンパク質のコード領域を有するＤＮＡ構築物を含有する医薬組成物。
【請求項２４】
マントル細胞リンパ腫の治療用医薬組成物であって、
ＢＩＭ遺伝子によってコードされるタンパク質又はＢＩＭ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を有するホモログタンパク質を含有する医薬組成物。
【請求項２５】
マントル細胞リンパ腫の患者の予後の診断方法であって、
前記患者から採取した試料について、ヒト６番染色体ｑ１６．２〜ｑ２７における欠損若しくは変異、ヒト８番染色体ｐ１２〜ｐ２３．２における欠損若しくは変異及びヒト８番染色体ｑ１３．２〜ｑ２４．２２における増幅若しくは変異を検出する工程を実施する、方法。
【請求項２６】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの判定工程を実施する、請求項２５に記載の方法。
（ａ）ヒト６番染色体ｑ１６．２〜ｑ２７に欠損があるとき、予後が良好である。
（ｂ）ヒト８番染色体ｐ１２〜ｐ２３．２に欠損あるとき予後が不良である。
（ｃ）ヒト８番染色体ｑ１３．２〜ｑ２４．２２に増幅があるとき、予後が不良である。
【請求項２７】
前記検出工程は、前記染色体上の領域を含むプローブと前記患者から採取した前記患者の核酸試料とをハイブリダイゼーションにより前記欠損又は増幅を検出する工程を備える、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記プローブは、ＢＡＣクローン及び／又はＰＡＣクローンである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＢＡＣクローン（ＲＰ１１−６０Ｏ１９）、ＢＡＣクローン（ＲＰ１１−２４０Ａ１７）及びＢＡＣクローン（ＲＰ１１−１１３６Ｌ８）又はＰＡＣクローン（ＲＰ１−８０Ｋ２２）から選択されるいずれかを用いる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記検出工程は、ｃ−ＭＹＣ遺伝子の増幅又は変異を検出する工程である、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記検出工程は、ｃ−ＭＹＣ遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の有無、発現量又は変異を検出する工程である、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記検出工程は、固相担体上において行う、請求項２５〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
マントル細胞リンパ腫の予後診断用アレイであって、
ヒト６番染色体ｑ１６．２〜ｑ２７、ヒト８番染色体ｐ１２〜ｐ２３．２及びヒト８番染色体ｑ１３．２〜ｑ２４．２２を検出するためのプローブのいずれかを固定したアレイ。
【請求項３４】
ヒト６番染色体ｑ１６．２〜ｑ２７、ヒト８番染色体ｐ１２〜ｐ２３．２及びヒト８番染色体ｑ１３．２〜ｑ２４．２２を検出するためのポリヌクレオチドである、マントル細胞リンパ腫の予後診断用マーカー。
【請求項３５】
前記ポリヌクレオチドは、ｃ−ＭＹＣ遺伝子若しくはその一部又はこれらに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドである、請求項３４に記載のマーカー。
【請求項３６】
ｃ−ＭＹＣ遺伝子によってコードされるタンパク質若しくはその一部又はこれらに対する抗体である、マントル細胞リンパ腫の予後診断用マーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性腫瘍、特に悪性リンパ腫の診断及び予後診断の方法に関し、詳しくは、マントル細胞リンパ腫の診断及び予後診断に方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）は、ＣＣＤＮ１の過剰発現に帰結するＢＣＬ１遺伝子における転座（１１：４）（ｑ１３：ｑ３２）により特徴付けられており、ナイーブ前胚中心（naive pre-germinal center）ＣＤ５＋細胞に由来していると推定されている(Seto et al., 1992; Jaffe et al., 2001)。このＣＣＤＮ１の過剰発現を伴うＭＣＬの実質的に全てに見出される転座の同定は、この遺伝子転座が腫瘍化に重要な役割を担っていることを示している (Jaffe et al., 2001)。こうした共通のマーカーの存在に関わらず、ＣＣＮＤ１を過剰発現するトランスジェニックマウスを用いた実験によれば、このタンパク質のみではリンパ腫を発症しないことがわかっている(Hinds et al., 1994; Lovec et al., 1994)。したがって、１１ｑ１３以外の遺伝子上の変異がＭＣＬの発症と進行に関与していると考えられる。そこで、他の変異を同定するために、ＣＧＨ法及び染色体バンド解析が行われてきている(Monni et al., 1998; Bea et al., 1999; Cuneo et al., 1999; Bentz et al., 2000; Martinez-Climent et al., 2001; Bigoni et al., 2001; Allen et al., 2003)。これらの研究によれば、ＭＣＬにおいては、３ｑ，６ｐ，７ｐ，８ｑ，１０ｐ，１２ｑ及び１８ｑなどのゲノムのゲイン／増幅や１ｐ，６ｑ，８ｐ，９ｐ，１１ｑ及び１３ｑなどのゲノムのロス／欠損などのゲノム不均衡がしばしば存在することを示している。このようなゲノム不均衡を伴ういくつかの遺伝子における脱制御もいくつか検出されている。例えば、１０ｐ１２．２の増幅からＢＭＩ−１遺伝子、９ｐ２１．３の欠損からｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子、１１ｑ２２．３の欠損からＡＴＭ遺伝子における脱制御が見出されている(Dreyling et al., 1997; Pinyol et al., 1997; Stilgenbauer et al., 1999; Schaffner et al., 2000; Bea et al., 2001; Rosenwald et al., 2003)。しかしながら、増幅又は欠損する部位を含む標的遺伝子は不明である。こうした現状は、１０〜２０メガベース以上のＤＮＡのコピー数異常しか検出できないという染色体バンド解析や従来のＣＧＨの解析解像度の限界にも一つの理由がある。【０００３】
近年、アレイＣＧＨ法という、高解像度でかつ高精度なチップを用いたＣＧＨ手法が開発されてきている(Pinkel et al., 1998)。本発明者らは、２３４８種のバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）とｐ−１由来人工染色体（ＰＡＣ）を１．３Ｍｂの平均解析解像度でガラススライド上にそれぞれ二連でスポットした独自のアレイＣＧＨを作製した。また、このアレイＣＧＨは、Ｂリンパ腫の１３ｑ３１．３に新規な腫瘍関連遺伝子であるＣ１３ｏｒｆ２５を同定した(Ota et al., 2004)。これらの結果は、アレイＣＧＨによるＤＮＡコピー数の定量的計測は、ゲノム不均衡の生じている部位をより正確に特定できるものであり、腫瘍関連遺伝子を同定するための有用なツールであることを示している。
【発明の開示】
【０００４】
本発明者らは、複雑な遺伝子コピー数の変化をより正確に解析し、より詳細に重要な増幅／欠損領域を同定するために、２９人の個体サンプルと７種のマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）の細胞株に対してゲノムワイドなアレイを用いるＣＧＨを実施した。
【０００５】
マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）ではＢＣＬ１遺伝子座位（１１ｑ１３）の染色体転座が腫瘍化に重要な役割を担っているが、染色体転座単独では腫瘍化しないことも知られている。しかし、ＭＣＬの病型や病態に関与する転座以外の遺伝子異常について、詳細には検討されていない。そこで、２９症例のＭＣＬ患者検体と７種類のＭＣＬ細胞株を、近年我々が確立したアレイＣＧＨを使用して、全ゲノム領域に渡ってゲノム異常を検討した。その結果、ＭＣＬに特徴的なゲノム異常が見出された。今回、初めて明らかになったこととして、ＢＩＭ遺伝子座位領域の欠失がある。検索の結果、ＢＩＭ遺伝子座位領域の欠失が５症例の患者検体に認められ、また、７細胞株のうち５細胞株に欠失が認められた。共通欠失領域を詳細に調べ、欠失領域の責任遺伝子はＢＩＭ遺伝子であることを明らかにした。また、遺伝子欠失に対応してその発現が強く抑えられていることを明らかにした。悪性腫瘍に関連付けられてＢＩＭ遺伝子異常が明らかになったのは、本報告が初めてである。また、ＢＩＭ遺伝子は抗アポトーシス作用をもつＢＣＬ２遺伝子の拮抗物質であり、その欠失は細胞にＢＣＬ２遺伝子による抗アポトーシス機能をより高めることが想像されるので、腫瘍化やその病態に重要な役割を担うことが推測される。現在までの解析ではＢＩＭ遺伝子異常はＢ細胞性悪性リンパ腫のうちＭＣＬに特徴的に認められる遺伝子異常であるが、ＢＣＬ２は多くの腫瘍細胞に発現されているので、ＢＩＭ遺伝子の発現抑制は他の固形癌においても、腫瘍化や病態の形成に重要な役割を担う可能性がある。すなわち、ＢＩＭ遺伝子は腫瘍化や病態の形成において、がん抑制遺伝子として機能する可能性が高く、治療反応性の指標となりうる。また、将来、治療の標的分子として重要な意義が明らかになる可能性がある。
【０００６】
本発明によれば、以下の手段が提供される。
本発明の一つの形態によれば、ヒト１番染色体ｐ３６．２３〜ｐ３６．３２、ヒト１番染色体ｑ４２．２〜ｑ４３、ヒト２番染色体ｐ１１．２、ヒト２番染色体ｑ１３、ヒト１７番染色体ｐ１１．２〜ｐ１３．３及びヒト１９番染色体ｐ１３．２〜ｐ１３．３から選択される１種又は２種以上における欠損又は変異を検出する工程を備える、悪性腫瘍の診断方法が提供される。
【０００７】
この方法においては、前記悪性腫瘍は悪性リンパ腫であってもよい。さらに、前記検出工程の検出結果に基づいて前記悪性リンパ腫の病型を判定する病型判定工程を備えることもできる。また、この病型判定工程における前記病型はマントル細胞リンパ腫とすることができる。
【０００８】
また、この方法においては、前記検出工程は、ヒト２番染色体ｑ１３の塩基配列における欠損又は変異を検出する検出工程を備えることができる。前記検出工程は、ヒト２番染色体ｑ１３の領域若しくはＢＩＭ遺伝子の欠損を検出する工程とすることもできる。さらに、前記検出工程における検出結果に基づいて前記悪性腫瘍の治療反応性を判定する治療反応性判定工程を備えることもできる。すなわち、ヒト２番染色体ｑ１３の領域若しくはＢＩＭ遺伝子の欠損があるときには、治療反応性が低いと診断することができる。
【０００９】
さらに、この方法においては、前記検出工程は、ＢＡＣ ＲＰ１１−４３８Ｋ１９の３５０２７ｂｐから４９９２０ｂｐ、配列番号：１に記載の塩基配列の３９４位〜５９７位及び配列番号：２に記載の塩基配列の２１４位〜４１７位のいずれかにおける欠損又は変異を検出する工程とすることができる。
【００１０】
また、前記検出工程は、検体中のＢＩＭ遺伝子、ＢＩＭ遺伝子から発現するｍＲＮＡ及びｃＤＮＡのいずれかを利用する工程とすることもできる。この検出工程は、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、核酸ハイブリダイゼーションを実施する工程を含むことができる。さらに、この検出工程は、ＢＩＭ遺伝子の少なくとも一部に相補的な１種又は２種以上のプローブを備えるアレイ上において該プローブと検体から得られる核酸試料とをハイブリダイズする工程を含むことができる。
【００１１】
さらにまた、この方法においては、前記検出工程は、アレイＣＧＨ法を実施する工程とすることもできる。
【００１２】
また、この方法においては、前記検出工程は、前記ＢＩＭ遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の有無、発現量又は変異を検出する工程であるとすることもできる。
【００１３】
本発明の他の一つの形態によれば、ＢＩＭ遺伝子若しくはその一部又はこれらに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドである、悪性腫瘍診断用マーカーが提供される。なお、本明細書において、診断用マーカーとは、診断の指標となる化合物及び診断の指標となる化合物をマーキングして当該化合物を検出できる化合物の双方を包含している。例えば、ＢＩＭ遺伝子は診断の指標となる化合物とし、これに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドは、ＢＩＭ遺伝子をマーキングできる化合物とすることができる。
【００１４】
このマーカーは、前記ＢＩＭ遺伝子のタンパク質翻訳領域である配列番号：１又は配列番号：２に記載の塩基配列を有することができる。また、このマーカーは、配列番号１に記載の塩基配列の３９４位〜５９７位若しくは配列番号２に記載の塩基配列の２１４位〜４１７位の少なくとも一部又はこれに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。さらに、こうしたポリヌクレオチドは、プローブ又はプライマーとして使用されるものであってもよい。
【００１５】
本発明の他の一つの形態によれば、ＢＩＭ遺伝子によってコードされるタンパク質若しくはその一部又はこれらに対する抗体である、悪性腫瘍診断用マーカーが提供される。
【００１６】
本発明の他の一つの形態によれば、悪性腫瘍の診断用アレイであって、ヒト２番染色体ｑ１３における欠損又は変異を検出するための核酸プローブを固定したアレイが提供される。
【００１７】
このアレイにおいては、前記プローブは、ＢＩＭ遺伝子の欠損又は変異を検出するための核酸プローブとすることができる。また、前記核酸プローブは、配列番号１に記載の塩基配列の３９４位〜５９７位若しくは配列番号２に記載の塩基配列の２１４位〜４１７位の少なくとも一部又はこれらに相補的な塩基配列を有していてもよい。
【００１８】
本発明の他の一つの形態によれば、上記いずれかに記載の診断方法のための診断用キットであって、ＢＩＭ遺伝子の欠損又は変異を検出するための核酸プローブを含む、診断用キットが提供される。なお、この診断用キットには、上記染色体上の各種領域の欠損を検出するためのプローブを含んでいてもよい。
【００１９】
本発明の他の一つの形態によれば、マントル細胞リンパ腫の治療用医薬組成物であって、ＢＩＭ遺伝子のコード領域又は該ＢＩＭ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を有するホモログタンパク質のコード領域を有するＤＮＡ構築物を含有する医薬組成物が提供される。
【００２０】
本発明の他の一つの形態によれば、マントル細胞リンパ腫の治療用医薬組成物であって、ＢＩＭ遺伝子によってコードされるタンパク質又はＢＩＭ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を有するホモログタンパク質を含有する医薬組成物が提供される。
【００２１】
本発明の他の一つの形態によれば、マントル細胞リンパ腫の患者の予後の診断方法であって、前記患者から採取した試料について、ヒト６番染色体ｑ１６．２〜ｑ２７における欠損若しくは変異、ヒト８番染色体ｐ１２〜ｐ２３．２における欠損若しくは変異及びヒト８番染色体ｑ１３．２〜ｑ２４．２２における増幅若しくは変異を検出する工程を実施する、方法が提供される。
【００２２】
この方法において、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの判定工程を実施することができる。
（ａ）ヒト６番染色体ｑ１６．２〜ｑ２７に欠損があるとき、予後が良好である。
（ｂ）ヒト８番染色体ｐ１２〜ｐ２３．２に欠損があるとき予後が不良である。
（ｃ）ヒト８番染色体ｑ１３．２〜ｑ２４．２２に増幅があるとき、予後が不良である。
【００２３】
この方法においては、前記検出工程は、前記染色体上の領域を含むプローブと前記患者から採取した前記患者の核酸試料とをハイブリダイゼーションにより前記欠損又は増幅を検出する工程とすることができる。この工程においては、前記プローブは、ＢＡＣクローン及び／又はＰＡＣクローンとすることできる。さらに、前記（ａ）においては、ＢＡＣクローン（ＲＰ１１−６０Ｏ１９）を用い、前記（ｂ）においては、ＢＡＣクローン（ＲＰ１１−２４０Ａ１７）を用い、前記（ｃ）においては、ＢＡＣクローン（ＲＰ１１−１１３６Ｌ８）又はＰＡＣクローン（ＲＰ１−８０Ｋ２２）を用いることができる。さらにまた、前記検出工程は、固相担体上において行うことができる。この方法においては、前記検出工程は、アレイＣＧＨ法を実施する工程とすることもできる。
【００２４】
また、この方法においては、前記検出工程は、ｃ−ＭＹＣ遺伝子の増幅、発現増強又は変異を検出する工程とすることもできる。また、前記検出工程は、検体中のｃ−ＭＹＣ遺伝子、ｃ−ＭＹＣ遺伝子から発現するｍＲＮＡ及びｃＤＮＡのいずれかを利用する工程とすることもできる。この検出工程は、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、核酸ハイブリダイゼーションを実施する工程を含むことができる。さらに、この検出工程は、ｃ−ＭＹＣ遺伝子の少なくとも一部に相補的な１種又は２種以上のプローブを備えるアレイ上において該プローブと検体から得られる核酸試料とをハイブリダイズする工程を含むことができる。
【００２５】
また、この方法においては、前記検出工程は、ｃ−ＭＹＣ遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の有無、発現量又は変異を検出する工程とすることもできる。
【００２６】
本発明の他の一つの形態によれば、マントル細胞リンパ腫の予後診断用アレイであって、ヒト６番染色体ｑ１６．２〜ｑ２７、ヒト８番染色体ｐ１２〜ｐ２３．２及びヒト８番染色体ｑ１３．２〜ｑ２４．２２を検出するためのプローブのいずれかを固定したアレイが提供される。ヒト８番染色体ｑ１３．２〜ｑ２４．２２を検出するためのプローブは、ｃ−ＭＹＣ遺伝子を検出できるプローブであってもよい。
【００２７】
本発明の他の一つの形態によれば、ヒト６番染色体ｑ１６．２〜ｑ２７、ヒト８番染色体ｐ１２〜ｐ２３．２及びヒト８番染色体ｑ１３．２〜ｑ２４．２２を検出するためのプローブやプライマー（セット）などのポリヌクレオチドである、マントル細胞リンパ腫の予後診断用マーカーが提供される。また、前記ポリヌクレオチドは、ｃ−ＭＹＣ遺伝子若しくはその一部又はこれらに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。
【００２８】
本発明の他の一つの形態によれば、ｃ−ＭＹＣ遺伝子によってコードされるタンパク質若しくはその一部又はこれらに対する抗体である、マントル細胞リンパ腫の予後診断用マーカーが提供される。
【００２９】
本発明の他の一つの形態によれば、上記マントル細胞リンパ腫の予後診断方法のための診断用キットであって、上記したマントル細胞リンパ種の予後診断用マーカーの少なくとも一種を含む診断用キットが提供される。
【００３０】
また、本発明の他の一つの形態によれば、マントル細胞リンパ腫の治療用の医薬組成物であって、ｃ−ＭＹＣ遺伝子の発現を抑制する核酸構築物を含有する、医薬組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】個々の腫瘍患者についての典型的なゲノムプロファイルを示す。（ａ）代表的患者サンプル及び（ｂ）ＳＰ−５３細胞株の全ゲノムプロファイルが示されている。Ｌｏｇ２比は、染色体上の位置に基づいて全てのクローンについてプロットされ、染色体の分離を示す縦線とともに。ＢＡＣ及びＰＡＣはそのゲノム上の位置に基づいて、左側の１ｐテロメアから右側のＸｑテロメアまで配列されている。（ａ）コピー数ゲイン領域：５ｐ，７ｐ２１．３，１３ｑ２１．３３，１７ｑ２１．３１〜ｑ２４．３及びＸ。コピー数ロス領域：１ｐ３２，２ｐ１１．２，２ｑ１３，８ｐ１２〜ｐ２３．３，８ｑ１２．３〜ｑ１３．１，９ｐ２４．３〜ｑ３１．２，１１ｑ２２．３〜ｑ２３．２，１３ｑ１４．３〜ｑ２１．１及び１５。（ｂ）コピー数ゲイン領域：７ｐ１１．２〜ｐ２２．３。コピー数ロス領域：１ｐ３６．２３〜ｐ３６．３２，１ｐ１３．３〜ｐ３１．２，１ｑ１３．２〜ｑ４４，２ｐ１１．２〜ｑ１４．３，４ｐ１５．１〜ｐ１６．１，６ｑ１４．１〜ｑ２１，６ｑ２３．２〜ｑ２６，７ｑ２２．１〜ｑ３２．３，９ｐ２１．３〜ｐ２２．１，１１ｑ２２．３〜ｑ２３．２，１８ｑ２２．１及び２０ｑ１３．１３〜ｑ１３．２。
【図２】２９例の患者におけるゲノムワイドのコピー数変化の頻度を示す。（ａ）コピー数ゲインの頻度。（ｂ）コピー数ロスの頻度。クローンは、染色体１〜２２の順に、かつ各染色体内においては、それらのSanger Center mapping position, May 2004 version.に基づいて配列された。
【図３】患者サンプル（Ｇ４６８）及び３種のＭＣＬ細胞株（ＳＰ−５３，Ｚ−１３８及びＪｅｋｏ−１）の第２染色体におけるゲノムプロファイルを示す。Ｌｏｇ２比が＋０．２以上は、ゲノムコピー数ゲインとし、Ｌｏｇ２  比が−０．２以下は、ゲノムコピー数ロスとした。２ｑセントロメアからの物理的距離（Ｍｂ）が示されている。縦線は、ＢＩＭ遺伝子を含むＢＡＣ４３８Ｋ１９の第２染色体上の最も大きな欠損部位を示す。ＢＡＣ４３８Ｋ１９においてＬｏｇ２比は、−０．５９（Ｇ４６８），−２．７５（ＳＰ−５３），−１．７１（Ｚ−１３８）及び−１．７６（Ｊｅｋｏ−１）であり、ＢＩＭ遺伝子座におけるホモ接合性欠損を示唆している。
【図４】２ｑ１３におけるホモ接合性欠損の最小限共通領域とＢＩＭ遺伝子の発現を示す。（ａ）ＢＡＣ４３８Ｋ１９、ＢＩＭ遺伝子のエクソンと３種の細胞株（ＳＰ−５３，Ｚ−１３８ ａｎｄ Ｊｅｋｏ−１）の欠損パターンの概略図。グレーボックス：エクソン（ＢＩＭ ＥＬ遺伝子及びＢＩＭ Ｌ遺伝子のオープンリーディングフレーム）。ＢＩＭ ＥＬ遺伝子のオープンリーディングフレーム（５９７ｂｐ）は、３つのエクソン、エクソン１：７５，０８２−７５，４７５ｂｐ（３９４ｂｐ）（開始コドン（ＡＴＧ）を含む）、エクソン２：４９，０７４−４９，１７７ｂｐ（１０４ｂｐ）及びエクソン３：３４，９９０−３５，０８８ｂｐ（９９ｂｐ）（終止コドン（ＴＧＡ）を含む）を含み、全てＢＡＣ４３８Ｋ１９上にある。黒と白のサークル：サザンブロットに用いたプローブ。白いサークルのある点線：ホモ接合性欠損（バンド陰性）。黒いサークルのある太線：非ホモ接合性欠損（バンド陽性）。細線：ホモ接合性欠損の有無が確認されていない。プローブ２とプローブ３の間の太い点線矢印は、２ｑ１３のホモ接合性欠損の最小限共通領域を示す。（ｂ）ＭＣＬ細胞株のゲノムＤＮＡに対するプローブ１〜６を用いたサザンブロット解析。レーン１、ヒトプラセンタ、レーン２、ｓｐ−５３、レーン３、Ｇｒａｎｔａ５１９（Ｇ５１９）、レーン４、Ｚ−１３８、レーン５、ＲＥＣ−１、レーン６、ＮＣＥＢ−１、レーン７、Ｊｅｋｏ−１、レーン８、ＪＶＭ２。プローブ１のバンド：ヒトプラセンタ（＋）、ＳＰ−５３（−）、Ｇｒａｎｔａ５１９（＋）、Ｚ−１３８（＋）、ＲＥＣ−１（＋）、ＮＣＥＢ−１（＋）、Ｊｅｋｏ−１（−）及びＪＶＭ２（＋）。プローブ４のバンド：ヒトプラセンタ（＋）、ＳＰ−５３（−）、Ｇｒａｎｔａ５１９（＋）、Ｚ−１３８（−）、ＲＥＣ−１（＋）、ＮＣＥＢ−１（＋）、Ｊｅｋｏ−１（＋／−）及びＪＶＭ２（＋）。プローブ５−６のバンド：ヒトプラセンタ（＋）、ＳＰ−５３（−）、Ｇｒａｎｔａ５１９（＋）、Ｚ−１３８（−）、ＲＥＣ−１（＋）、ＮＣＥＢ−１（＋）、Ｊｅｋｏ−１（＋）及びＪＶＭ２（＋）。「コントロール」は、プローブ６のバンド下にあるプローブ３（ＴＣＲ βプローブ）の代表的なコントロールバンドを示す。（ｃ）７種のＭＣＬ細胞株のＢＩＭ遺伝子のノザンブロット解析、Ｂリンパ腫（Ｋａｒｐａｓ２３１）及びバーキットリンパ腫（Ｒａｊｉ）細胞株。コントロールはβ−ａｃｔｉｎである。
【図５】患者サンプル（Ｇ４６８）のサザンブロット及びＦＩＳＨ解析結果を示す。（ａ）サザンブロットレーン１：ヒトプラセンタ、レーン２、３，５：２ｑ１３欠損を伴わない患者サンプル、レーン４：アレイＣＧＨによって２ｑ１３の欠損を示した患者サンプルＧ４６８（図３参照）、レーン６：ＢＩＭ遺伝子座にホモ接合性欠損を有するｊｅｋｏ−１細胞株、ＢＩＭエクソンを含むプローブ２をこの実験に用いた。（ｂ）Ｇ４６８についてのプローブＡ及びプローブＢを用いた二色ＦＩＳＨ解析。プローブＡ：ＢＡＣ４３８Ｋ１９、プローブＢ：ＢＡＣ３６８Ａ１７。プローブＢは、プローブＡに対して１．５５Ｍｂテロメリックであり、ＢＡＣ４３８Ｋ１９はＢＩＭ遺伝子を含む。間期の染色体は、二対の赤いシグナル（プローブＢ、赤）と一対の緑のシグナル（プローブＡ、緑）を有しており、プローブＡについてのヘテロ接合性欠損を示した。
【図６】（ａ）は、６ｑ２１における欠損、８ｐ２３における増幅及び８ｑ２４における増幅を有する場合と有しない場合におけるマントル細胞リンパ腫のカプラン−マイヤー生存曲線を示す。横軸は生存日数であり、縦軸は生存確率を示す。また、図６（ｂ）は、１ｑ２２における欠損及び９ｐ２２における欠損を有する場合と有しない場合におけるマントル細胞リンパ腫のカプラン−マイヤー生存曲線を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
（悪性腫瘍の診断方法）
本発明の悪性腫瘍の診断方法は、ヒト１番染色体ｐ３６．２３〜ｐ３６．３２、ヒト１番染色体ｑ４２．２〜ｑ４３、ヒト２番染色体ｐ１１．２、ヒト２番染色体ｑ１３、ヒト１７番染色体ｐ１１．２〜ｐ１３．３及びヒト１９番染色体ｐ１３．２〜ｐ１３．３から選択される１種又は２種以上における欠損又は変異を検出する工程を備えることを特徴としている。【００３３】
本診断方法によれば、悪性腫瘍の患者試料について、こうした検出工程を実施して、上記染色体領域においてホモ接合性あるいはヘテロ接合性の欠損が見出された場合、悪性腫瘍であると診断することができる。これらの染色体上の各種領域のなかでも、ヒト２番染色体ｑ１３における欠損又は変異を検出することは有用である。この領域は、ＭＣＬ症例検体のほか、ＭＣＬ細胞株において高頻度に欠損している。当該変異は、悪性リンパ腫、特にＢ細胞性悪性リンパ腫において特長的である。また、一般に、ＭＣＬ細胞株は、ＭＣＬ症例検体よりもより高い悪性度を示す。したがって、２ｑ１３における欠損又は変異を検出することは、悪性腫瘍、なかでも、Ｂ細胞性悪性リンパ腫においてＭＣＬなど悪性度の高い病型であると診断するのに有用である。【００３４】
ヒト１７番染色体ｐ１１．２〜ｐ１３．３においては、ヒト１７番染色体ｐ１３．３及び同ｐ１３．１の欠損又は変異を検出するのが好ましく、ヒト１９番染色体ｐ１３．２〜ｐ１３．３においてはヒト１９番染色体ｐ１３．２の欠損又は変異を検出するのが好ましい。これらの領域はより高頻度であるからである。【００３５】
これらの染色体上の各種領域における欠損又は変異を検出するには、各種方法を採用することができる。たとえば、患者から採取される核酸試料とこれらの染色体上の各種領域とハイブリダイズするプローブを用いたハイブリダイゼーションにより検出することができる。症例等からの核酸試料としては、患者のリンパ腫標本などから標準的なＤＮＡ抽出法等により取得することができる。一方、プローブとしては、こうした染色体上の領域の少なくとも一部をハイブリダイズするものであればよい。ＤＮＡプローブとしては、染色体領域に対応したＢＡＣクローン及び／又はＰＡＣクローンを用いることができる。こうした染色体上の各種領域及びクローンの例は、表１及び表２に示されている。【００３６】
ハイブリダイゼーションの形態は特に限定しない。液相反応であってもビーズや基板などの固相担体を用いた方法であってもよい。好ましくは、クローンなどのＤＮＡプローブをチップなどの固相担体に固定したものを用いることができる。上記のようなＤＮＡプローブを固定化した固相担体としては、ＤＮＡアレイが挙げられる。プローブの固定形態は特に限定しないで、共有結合性及び／又は静電的、疎水性相互作用等の非共有結合性の各種の結合による固定形態が包含される。なお、こうしたプローブを固定したアレイは、例えばアレイＣＧＨに用いられるアレイを用いることができる。【００３７】
以上のことから、この態様によれば、こうしたプローブを固定化した固相担体も提供される。典型的には、固相担体は、スライドガラスなど平坦な基板状体であり、プローブ固定化担体としては、ＤＮＡマイクロアレイが挙げられる。【００３８】
本発明者らによれば、２ｑ１３の欠損の責任遺伝子はＢＩＭ遺伝子であると同定されている。このため、２ｑ１３の欠損又は変異の検出には、ＢＩＭ遺伝子の欠損又は変異を検出してもよい。この場合、ＢＩＭ遺伝子の欠損や変異は、検体中のＢＩＭ遺伝子の欠損自体のほか、ＢＩＭ遺伝子の発現量の多少によって検出することができる。すなわち、検体試料中のＢＩＭ遺伝子の発現量が健常者の試料と比較して少ない場合には、悪性腫瘍において例えば、ＭＣＬなど悪性度が高い病型であると診断することができる。なお、検体試料中のＢＩＭ遺伝子の発現量が健常者の試料に比較して少ない場合とは、例えば、健常者の発現量の６０％以下であることが好ましく、より好ましくは５０％以下、さらに好ましくは２０％以下、一層好ましくは１０％以下である。【００３９】
こうしたＢＩＭ遺伝子における欠損又は変異の検出は、具体的には、検体試料中のＢＩＭ遺伝子、ＢＩＭ遺伝子から発現するｍＲＮＡ及びｃＤＮＡのいずれかを利用することができる。これらの核酸材料は、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法等の公知の核酸試料の取得あるいは増幅方法によって得ることができる。ＢＩＭ遺伝子又はその一部を増幅できるＰＣＲ法に用いるプライマーは、ＢＩＭ遺伝子の配列に基づいて設計することができる。好ましくは、ＢＩＭ遺伝子のタンパク質翻訳領域である配列番号１や配列番号２に記載の配列あるいは配列番号１に記載の塩基配列の３９４位〜５９７位及び配列番号２に記載の塩基配列の２１４位〜４１７位に基づいて設計することができる。なお、プライマーの塩基長は、好ましくは、１５−４０塩基、望ましくは１５−３０塩基である。ただし、ＬＡ（ｌｏｎｇ ａｃｃｕｒａｔｅ）ＰＣＲを行う場合には、少なくとも３０塩基とすることが好ましい。なそ、センス鎖とアンチセンス鎖が互いにアニールしないように、また、ヘアピン状構造の形成を回避できるような塩基配列を選択することが好ましい。【００４０】
これらの核酸試料を用いてＢＩＭ遺伝子における欠損又は変異を検出するには、こうしたプライマー（セット）によるＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲなどの定量的ＰＣＲによっても行うことができる。【００４１】
また、これらの核酸試料を用いてＢＩＭ遺伝子における欠損又は変異を検出するには、ＢＩＭ遺伝子を増幅できる適切なプライマーによるReal-Time ＰＣＲなどによる定量的ＰＣＲによって行うことができる。【００４２】
また、ＢＩＭ遺伝子の欠損や変異は、ＢＩＭ遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブによるハイブリダイゼーションを用いることが好ましい。こうしたプローブとしては、ＢＩＭ遺伝子の少なくとも一部に相補的なプローブを用いることができる。プローブは、ＢＩＭ遺伝子由来の核酸試料に対して特異的にハイブリダイズすればよく、遺伝子に対して完全に相補的である必要はない。このような多少変異したポリヌクレオチドは、部位特異的変異（Current protocols in Molecular Biology,Ausubelら編,(1987)John Wiley&Sons,第8.1-8.5章）、ＰＣＲ（Current protocols in Molecular Biology,Ausubelら編,(1987)John Wiley&Sons,第6.1-6.4章）、通常のハイブリダイゼーション（Current protocols in Molecular Biology,Ausubelら編,(1987)John Wiley&Sons,第6.3-6.4章）等により得ることができる。プローブはストリンジェント（stringent）な条件下でＢＩＭ遺伝子由来の核酸試料とハイブリダイゼーションする。ここで、ストリンジェントな条件とは、プローブと前記核酸試料との選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、およびその他公知の条件によって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）は増加する。例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、ＮａＣｌ約７５０ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約７５ｍＭ以下、より好ましくはＮａＣｌ約５００ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約５０ｍＭ以下、最も好ましくはＮａＣｌ約２５０ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約２５ｍＭ以下である。ストリンジェントな有機溶媒濃度は、ホルムアミド約３５％以上、最も好ましくは約５０％以上である。ストリンジェントな温度条件は、約３０℃以上、より好ましくは約３７℃以上、最も好ましくは約４２℃以上である。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）の濃度、およびキャリアーＤＮＡの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。なお、上記のハイブリダイゼーション条件は単なる例示であり、当業者であれば、プローブのヌクレオチド配列、濃度、及び長さ、反応時間、反応温度、試薬濃度等の条件を考慮して、適当なハイブリダイゼーション条件を設定することができる。【００４３】
なお、プローブは、必要に応じて適宜標識されていてもよい。標識は、ラジオアイソトープ（ＲＩ）法または非ＲＩ法によって行うことができるが、非ＲＩ法を用いることが好ましい。非ＲＩ法としては、蛍光標識法、ビオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法が挙げられる。【００４４】
ＢＩＭ遺伝子の欠損又は変異を検出するには、例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノザンブロット、ドットブロット、ＤＮＡアレイなどを用いて解析することができる。なお、こうした手法におけるハイブリダイゼーションの形態は特に限定しない。既に説明したように、液相反応であってもビーズや基板などの固相担体を用いた方法であってもよい。ハイブリダイゼーションによる検出手法としては、好ましくは、ＤＮＡプローブをチップやビーズなどの固相担体に固定したものを用いることができる。ＤＮＡプローブを固定化した固相担体としては、ＤＮＡアレイ（ＤＮＡチップ）が挙げられる。プローブの固定形態は特に限定しないで、共有結合性及び／又は静電的、疎水性相互作用等の非共有結合性の各種の結合による固定形態が包含されるまた、プローブは、その場合成によって固相担体に固定化されたものであってもよい。【００４５】
なお、上記した２ｑ１３における欠損又は変異の検出は、ＢＡＣ ＲＰ１１−４３８Ｋ１９の３５０２７ｂｐから４９９２０ｂｐ、配列番号１に記載の塩基配列の３９４位〜５９７位及び配列番号２に記載の塩基配列の２１４位〜４１７位における欠損又は変異の検出工程としても実施できる。すなわち、これらの領域は、ノザンブロット（実施例参照）においてＭＣＬ細胞株において２ｑ１３の欠損及びＢＩＭ遺伝子の発現低下が認められている細胞株において欠損されているＤＮＡ領域である。配列番号１及び配列番号２における上記所定範囲の塩基配列は、ＢＩＭタンパク質のコード領域の一部である。したがって、これらの塩基配列あるいはその一部をプローブあるいはプライマーとして用いて、上記各種方法により、これらの領域の欠損又は変異を検出することにより、２ｑ１３における欠損又は変異やＢＩＭ遺伝子の欠損等を容易に検出することができる。【００４６】
以上説明したことから、この態様によれば、２ｑ１３等の各種染色体上の領域あるいはＢＩＭ遺伝子若しくはその一部あるいはこれらに相補的な塩基配列を有する悪性腫瘍診断用マーカーが提供される。これらのマーカーの欠損や変異が検出されることにより、悪性腫瘍についての悪性度や病型の診断が可能となる。こうしたマーカーとしては、好ましくは、これら各種領域やＢＩＭ遺伝子の欠損や変異を検出することができるポリヌクレオチドなどの核酸分子であることが好ましい。こうした核酸分子は、上記各種染色体上の領域若しくはその一部あるいはこれらに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド、ＢＩＭ遺伝子若しくはその一部又はこれらに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドが挙げられる。ポリヌクレオチドは、好ましくはＤＮＡである。なかでも、各種染色体上の領域又はその一部あるいはＢＩＭ遺伝子又はその一部に相補的な塩基配列等を有するプローブやプライマーなどの核酸分子は、診断用試薬として好ましく用いることができる。【００４７】
また、この態様によれば、プローブあるいはプローブを固定化したＤＮＡマイクロアレイも提供される。また、こうしたプライマーセットを含む診断用キットも提供される。【００４８】
本診断方法の他の態様として、ＢＩＭ遺伝子の欠損又は変異を検出するには、ＢＩＭ遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の有無、発現量又は変異を検出することによってもよい。このためには、例えば、こうしたタンパク質に対して特異的な抗体を用いることができる。抗体としては、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を用いることができる。抗体分子又はその一部であってもよい。このような抗体は、例えばポリクローナル抗体の場合には、タンパク質やその一部断片を免疫原として動物を免役した後、血清から得ることができる。あるいは、上記の真核細胞用発現ベクターを注射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによって作製することができる。動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどが用いられる。また、モノクローナル抗体は、公知のモノクローナル抗体作製法（「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、1990年；"Monoclonal Antibody" James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996）に従い作製することができる。【００４９】
抗体は、適宜標識物質によって標識化されていてもよい。標識物質は、酵素、放射性同位体または蛍光色素を使用することができる。酵素としては、例えば、特に限定しないで、通常のＥＩＡに用いられる酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。蛍光色素としては、フルオレッセンスイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。【００５０】
こうした抗体を用いてＢＩＭタンパク質の発現量等を検出するには、組織あるいは細胞染色などの免疫染色、競合型又は非競合型による放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ルミネッセント免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）等の各種検出方法による測定方法を用いることができる。なお、こうした測定方法における抗原抗体反応は、液相で行っても固相で行ってもよい。検出には、抗原抗体反応産物が分離されていることが好ましい。このためには、例えば、クロマトグラフィーやビーズやプレートなどの固相担体を用いてもよい。また、ウエスタンブロッティングの手法を用いてもよい。さらに、ＥＬＩＳＡ法などを用いることができる。さらには、抗体を基板などの固相担体に固定化したアレイを用いることでもできる。【００５１】
この態様によれば、ＢＩＭタンパク質若しくはその一部又はこれらに対する抗体を含む悪性腫瘍の診断用のマーカーが提供される。特に、抗体は、こうしたタンパク質を検出するための検出試薬として好ましい。また、この態様によれば、こうした抗体を含む悪性腫瘍の診断用キットが提供される。本発明の診断キットは、抗体や標識化抗体を液相中に含むものであってもよく、あるいは抗体や標識化抗体を固相担体に結合したものであってもよい。また、固定化された抗原又はその一部を含んでいてもよい。診断用キットは、抗体が酵素で標識されている場合には、その基質を含んでいてもよい。さらに、固相担体を含むものの場合には、固相への非結合分子を洗浄除去するための洗浄液を含んでいてもよい。このほか、一般に抗体を含む診断用キットに含まれることのできる要素を含むことができる。【００５２】
本発明のＭＣＬの治療用医薬組成物は、ＢＩＭ遺伝子のコード領域又は該ＢＩＭ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を有するホモログタンパク質のコード領域を有するＤＮＡ構築物を含有する医薬組成物である。本発明者らによれば、ＢＩＭ遺伝子が欠損することにより悪性腫瘍の悪性度が高まっている。したがって、ＭＣＬ患者においてＢＩＭタンパク質を補うことによりＭＣＬの進行の抑制が期待される。このためには、上記ＤＮＡ構築物をベクター等により患者に導入してＢＩＭ遺伝子を発現させることが好ましい。したがって、公知のベクターに上記コード領域を保持させることにより、当該ベクターを医薬組成物として用いることができる。さらに、こうしたベクターによりあるいは他のトランスフェクション法により、上記コード領域を発現可能に保持する細胞を作製することで、この細胞を医薬組成物として用いることも可能である。【００５３】
また、他の態様としては、ＢＩＭ遺伝子によってコードされるタンパク質等をそのまま医薬組成物として用いることもできる。【００５４】
こうした医薬組成物の製剤化や投与については当業者であれば適宜適切な剤型を選択して用量を選択することにより製造することができる。また、この医薬組成物は、例えば、該DNAを、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター等のウイルスベクター、またはリポソーム等を用いて直接に導入することができる。目的とするDNA等は、これらを利用して、ex vivo法及びin vivo法により患者に投与することができる。【００５５】
（マントル細胞リンパ腫の患者の予後の診断方法）
本発明のマントル細胞リンパ腫の患者の予後の診断方法は、前記患者から採取した試料について、ヒト６番染色体ｑ１６．２〜ｑ２７における欠損、ヒト８番染色体ｐ１２〜ｐ２３．２における欠損及びヒト８番染色体ｑ１３．２〜ｑ２４．２２に増幅のいずれかを検出する工程を有することを特徴としている。そして、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの判定工程を実施することができるものである。
（ａ）ヒト６番染色体ｑ１６．２〜ｑ２７に欠損があるとき、予後が良好である。
（ｂ）ヒト８番染色体ｐ１２〜ｐ２３．２に欠損あるとき予後が不良である。
（ｃ）ヒト８番染色体ｑ１３．２〜ｑ２４．２２に増幅があるとき、予後が不良である。【００５６】
こうした染色体上の領域はいずれも有意にＭＣＬの予後と関連しているが、変異の頻度からは、ヒト６番染色体ｑ１６．２〜ｑ２７においては、同６ｑ２１〜ｑ２４．１を検査対象とすることが好ましく、より好ましくは同６ｑ２３．２〜ｑ２４．１である。また、同様の観点からヒト８番染色体ｐ１２〜ｐ２３．２においては、同ｐ２３．１〜ｐ２３．２を検査対象とすることが好ましい。さらに、ヒト８番染色体ｑ１３．１〜ｑ２４．２２においては、同ｑ２１．３〜ｑ２４．２１を検査対象とすることが好ましい。【００５７】
また、上記ヒト８番染色体ｐ１２〜ｐ２３．２の欠損がある場合に予後との関係において有意性が高く、次いで、ヒト８番染色体ｑ１３．１〜ｑ２４．２２の増幅があることが有意性が高く、さらにヒト６番染色体ｑ１６．２〜ｑ２７の欠損がないことの順になっている。【００５８】
この方法においては、前記染色体上の領域を含むプローブと前記患者から採取した前記患者の核酸試料とをハイブリダイゼーションにより前記欠損又は増幅を検出する工程を備えることができる。こうしたプローブとしてはＢＡＣクローン及び／又はＰＡＣクローンとすることでき、具体的には、ＢＡＣクローン（ＲＰ１１−６０Ｏ１９）を用いることができ、ＢＡＣクローン（ＲＰ１１−２４０Ａ１７）を用いることができ、ＢＡＣクローン（ＲＰ１１−１１３６Ｌ８）又はＰＡＣクローン（ＲＰ１−８０Ｋ２２を用いることができる。【００５９】
この態様によれば、これらプローブのいずれかが固定化されたＭＣＬ患者の予後診断用のプローブ固定化固相担体も提供される。典型的には、ＤＮＡマイクロアレイが挙げられる。また、こうした染色体上の領域を増幅することができるプライマー（セット）やこれらの領域とハイブリダイズするプローブも提供される。【００６０】
また、８ｑ２４における増幅領域の責任遺伝子は、ｃ−ＭＹＣ遺伝子であることが強く示唆されている。したがって、既に説明したＢＩＭ遺伝子と同様、ｃ−ＭＹＣ遺伝子の発現量を検出することにより、予後を診断することもできる。すなわち、患者においてこの遺伝子の発現量が健常人に比べて多いとき、予後が不良であるということができる。具体的には、健常人の発現量に比較して１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは７０％以上、一層好ましくは１００％以上である。【００６１】
ｃ−ＭＹＣ遺伝子の発現量を検出するには、例えば、既に述べたＢＩＭ遺伝子の発現量の検出方法と同様の態様をｃ−ＭＹＣ遺伝子又はｃ−ＭＹＣタンパク質に対して採ることができる。すなわち、前記検出工程は、ｃ−ＭＹＣ遺伝子の増幅、発現増強又は変異を検出する工程とすることもできる。また、前記検出工程は、検体中のｃ−ＭＹＣ遺伝子、ｃ−ＭＹＣ遺伝子から発現するｍＲＮＡ及びｃＤＮＡのいずれかを利用する工程とすることもできる。また、前記検出工程は、ｃ−ＭＹＣ遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の有無、発現量又は変異を検出する工程とすることもできる。【００６２】
さらに、これらの態様に用いることのできるアレイ、プライマー、プローブ、抗体等の予後診断用マーカー、予後診断用キットも本発明に包含される。すなわち、ｃ−ＭＹＣ遺伝子を検出できるプローブを備えるＭＣＬの予後診断用アレイ、ｃ−ＭＹＣ遺伝子若しくはその一部又はこれらに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドであるプローブやプライマー（セット）であるＭＣＬの予後診断用マーカーであってもよい。診断用マーカーは、ｃ−ＭＹＣ遺伝子によってコードされるタンパク質若しくはその一部又はこれらに対する抗体であってもよい。さらに、こうした予後診断用マーカーの少なくとも一種を含む診断用キットも包含される。【００６３】
本発明のＭＣＬの治療用医薬組成物は、ｃ−ＭＹＣ遺伝子の発現を抑制する核酸構築物を含有することを特徴としている。本発明者らによれば、ｃ−ＭＹＣ遺伝子が増幅していることによりＭＣＬの予後が不良となっている。したがって、ＭＣＬ患者においてｃ−ＭＹＣタンパク質の発現を抑制することによりＭＣＬの進行の抑制が期待される。このためには、ｃ−ＭＹＣ遺伝子の発現を抑制することのできる核酸構築物をベクター等によりあるいはそのまま患者に導入してｃ−ＭＹＣ遺伝子の発現を抑制させることが好ましい。こうした核酸構築物としては、アンチセンスやＲＮＡ干渉によってｃ−ＭＹＣ遺伝子の発現を抑制することができる核酸構築物を用いることができる。こうした核酸構築物としては、遺伝子等をコードするＤＮＡとのハイブリダイズなどの相互作用により転写を阻害するアンチジーン核酸法、ｍＲＮＡなどのＲＮＡとのハイブリダイズなどの相互作用により転写又は翻訳を阻害するアンチセンス核酸法、ｍＲＮＡなどの転写物とのハイブリダイズ等の相互作用に基づいて転写物を分解又は翻訳を阻害するＲＮＡ干渉法、デコイ核酸法、リボザイム法等による核酸構築物が挙げられる。なお、遺伝子発現を抑制するものではないがアプタマーをエレクトロポレーションにより導入することもできる。なお、遺伝子の発現を抑制する核酸構築物における「核酸」とは、デオキシリボ核酸及びリボ核酸のようなポリヌクレオチドを意味している。また、この用語には、一本鎖（ＤＮＡ又はＲＮＡ、センス又はアンチセンス）又は二本鎖ポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）が包含される。また、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド（二本鎖）やＤＮＡ−ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチド（一本鎖）、ペプチド核酸、モルホリノオリゴヌクレオチドも包含される。さらにまた、ポリヌクレオチドには天然あるいは人工的な修飾が施されていてもよい。【００６４】
例えば、ＲＮＡ干渉を発現可能な核酸コンストラクトは、こうした標的遺伝子のｍＲＮＡ等の転写産物の少なくとも一部を標的としてこれら標的遺伝子の発現を抑制可能に構築されている。こうした核酸コンストラクトの一つの態様は、互いにハイブリダイズするオリゴリボヌクレオチドの二本鎖構造を有するＲＮＡコンストラクトである。具体的には、突出した３'末端をそれぞれ有するあるいは有しない比較的短い二本鎖オリゴリボヌクレオチド（small interfering RNA ：ｓｉＲＮＡ）及びヘアピン構造を形成する（又は有する）単一のオリゴリボヌクレオチド（short hairpin RNA : ｓｈＲＮＡ）が挙げられる。これらのＲＮＡコンストラクトは、直接ＲＮＡ干渉を引き起こすことができる点において好ましい。また、ヘアピン構造を形成しない一本鎖オリゴヌリボヌクレオチドのＲＮＡコンストラクトもＲＮＡ干渉を発現することができる。【００６５】
核酸コンストラクトのもう一つの態様は、上記の態様のＲＮＡコンストラクト、すなわち、sｉＲＮＡやｓｈＲＮＡを発現可能にコードするベクターの態様である。こうした態様の核酸コンストラクトは、継続性のあるＲＮＡ干渉を実現できる点において好ましい。この態様において、ｓｈＲＮＡ発現ベクターは、アンチセンス配列及びセンス配列の他ループ配列を、細胞内転写によりｓｈＲＮＡを構築可能な連続した一本鎖ＲＮＡが転写されるように構成することができる。また、ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、所定のセンス配列及びアンチセンス配列を有するＲＮＡが転写されるように構成すればよい。ｓｉＲＮＡ発現ベクターにおいては、センス配列及びアンチセンス配列は単一のベクターによって発現されるようにしてもよいし、また、それぞれ異なるベクターから発現されるようにしてもよい。【００６６】
こうした医薬組成物の製剤化や投与については当業者であれば適宜適切な剤型を選択して用量を選択することにより製造することができる。また、この医薬組成物は、例えば、該DNAを、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター等のウイルスベクター、またはリポソーム等を用いて直接に導入することができる。目的とするDNA等は、これらを利用して、ex vivo法及びin vivo法により患者に投与することができる。【００６７】
以下、開示された方法、及び請求の範囲に記載された方法の実施可能性を説明するために実施例を示すが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではなく、本発明の範囲は、請求の範囲の記載された内容に基づき、その均等物も含むより包括的なものとして判断される。
【実施例】
【００６８】
[実施例１]
１．材料及び方法
１−１．ＭＣＬ患者及び試料
男性１６名及び女性１３名（全て愛知県がんセンター及び関連病院から、患者によりインフォームドコンセントを得た上で取得され、愛知県がんセンターの倫理審査委員会の審査を受け承認されている。）の２９例のＭＣＬ患者からの腫瘍試料を用いた。２４例は一般型に、５例は芽球性変異型に分類された。患者の年齢中央値は、６７歳であった（４９歳〜９２歳）。２７例中１８例（６７％）は、白血病であり（２７例のデータが利用可能であった。）、２９例中２７例（９３％）が進行期（ＩＩＩ〜ＩＶ）にあり、２７例中８例（３０％）がＬＤＨが増加しており（２７例のデータが利用可能であった）、２８例中５例（３０％）は全身状態の不良であり（２８例のデータが利用可能であった）、２７例中２１例（７８％）が一つ以上のリンパ節以外への転移を有していた（２７例のデータが利用可能であった）。腫瘍の免疫学的表現型は、組織片の免疫組織化学及び／又は細胞懸濁液のフローサイトメトリーにより決定された。これらの研究は、Ｉｇ軽鎖及び重鎖と、いくつかのＢ細胞（ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ７９ａ）及びＴ細胞（ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ４３マーカー、ＣＤ１０及びＣＤ２３を用いた。また、ＣＣＮＤ１発現は、全ての検体においてノザンブロット分析及び／又は免疫組織化学 (Suzuki et al.,1999) により分析した。本実施例に用いた全ての試料はＢ細胞表現型を有しているとともにＣＤ５を発現し、ＣＣＮＤ１の過剰発現を示していた。【００６９】
１−２．ＭＣＬ細胞株
７種のＭＣＬ由来細胞株、ＳＰ−５３、Ｇｒａｎｔａ５１９、Ｚ−１３８、ＲＥＣ−１、ＮＣＥＢ−１、ｊｅｋｏ−１及びＪＶＭ２を用いた。これらの全てのＭＣＬ細胞株は、モルホロジー、免疫学的表現型及び／又は間期細胞遺伝学（ｔ（１：４）（ｑ１３；ｑ３２）の検出）(Saltman et al., 1988; Amin et al., 2003; Jeon et al., 1998)の全てにおいて特徴付けを行った。前リンパ球性白血病由来でありｔ（１１；４）（ｑ１３；ｑ３２）の遺伝子転座を保持するＪＶＭ２細胞株も実施例で用いた。Ｚ−１３８、ＮＣＥＢ−１、Ｇｒａｎｔａ５１９、ＲＥＣ−１及びＪＶＭ２はマーチン・ダイヤー博士（Ｄｒ．ＭａｒｔｉｎＤｙｅｒ ｏｆ Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＵＫ）の好意により提供されたものである。濾胞性リンパ腫（ＦＣＬ）由来であってｔ（１４；１８）（ｑ３２；ｑ２１）遺伝子転座を保持するＫａｒｐａｓ２３１細胞株は、アブラハム・カルパス博士（Dr. Abraham Karpas of Medical Research Council Center, Hills Road, Cambridge, UK (Nachva et al., 1993)の好意により提供されたものである。また、Ｒａｊｉ細胞株は、バーキットリンパ腫に由来するものである。【００７０】
１−３．ＤＮＡ及びＲＮＡサンプル
高分子量のＤＮＡを２９例の患者のリンパ節から標準プロテインナーゼＫ／ＲＮＡｓｅ処理とフェノール・クロロホルム抽出により抽出した。正常なＤＮＡは、男性の健常な献血者から取得した。ＲＮＡは、グアニジニウムチオシアネート中でホモジナイズし、さらに塩化セシウムによって遠心分離することによって細胞株から調製した。【００７１】
１−４．アレイＣＧＨ
実施例で用いたアレイは、２３４８個のＢＡＣ及びＰＡＣクローンを含んでおり、約１．３Ｍｂの解像度でヒトゲノムをカバーしており、ＢＡＣクローンについてＲＰ１１及びＲＰ１３ライブラリ、ＰＡＣクローンについては、ＲＰ１、ＲＰ３、ＲＰ４及びＲＰ５ライブラリに基づいている。ＢＡＣ及びＰＡＣクローンは、ＮＣＢＩ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), Ensembl Genome Data Resources (http://www.ensembl.org/) 及びUCSC genome Bioinfomatics (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) における情報に基づいて選択し、BACPAC Resource Center at the Children’s Hospital (Oakland Research Institute, Oakland, CA)から入手した。クローンは、Ensembl Genome Data Resources from the Sanger Center Institute, February 2004 versionに基づいて１番染色体から２２番染色体までとＸ染色体の順に各染色体の範囲内に配列された。アレイＣＧＨに用いた全てのクローンの位置の確認は、蛍光インサイトウハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により行った。クローンの名称と染色体位置は要求により提供される。【００７２】
変性オリゴヌクレオチドプライマー使用ＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）のための鋳型は、１０ｎｇのＢＡＣ（又はＰＡＣ）ＤＮＡを含んでいた。ＤＯＰ−ＰＣＲ産物は、エタノールで沈殿させた後、ＤＮＡスポット溶液ＤＳＰ００５０（松浪ガラス株式会社製、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）に溶解し、機械的にＣｏｄｅＬｉｎｋ（商標）活性化スライド（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）上にセラミックアクチュエーターを用いたインクジェット法（ＮＧＫ、Ｎａｇｏｙａ、Ｊａｐａｎ）により二連でスポットした。【００７３】
アレイの作製とその評価、ハイブリダイゼーション方法並びに分析手法については、既に詳細な記述がある（Ｏｔａ ｅｔ ａｌ．，２００４）。すなわち、試料（腫瘍又は正常）及び対照（正常）ＤＮＡのそれぞれ１μｇを、ＤｐｎＩＩにより処理し、ＢｉｏＰｒｉｍｅＤＮＡラベリングシステム(Invitrogen Life Technologies, Inc., Tokyo, Japan) により、Cy3-dUTP及びCy5-dUTP(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) を用いて標識した。試料及び対照ＤＮＡは、その後、１００μｇのＣｏｔ−１ ＤＮＡ(Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD)と混合し沈殿させて 、４５μｌのハイブリダイゼーション溶液（５０ｖｏｌ％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、２ｘ ＳＣＣ、４％ＳＤＳ及び１００μｇｔＲＮＡ）に再懸濁させ、ガラススライド上でハイブリダイゼーションさせた。４８〜６６時間のハイブリダイゼーション後、スライドを洗浄してアジレントマイクロアレイスキャナー(Agilent Technologies, Palo Alto, CA) によりスキャンし、得られたアレイイメージをGenepix Pro 4.1 (Axon Instruments, Inc., Foster City, CA)により解析した。すなわち、ＤＮＡスポットを自動的に分割し、局所的なバックグラウンドを減算して、シグナル強度を決定した。引き続き、２種の色素（Ｃｙ３強度／Ｃｙ５強度）のシグナル強度の比を各スポットについて計算し、エクセルシート上において染色体における位置の順でｌｏｇ２比に変換した。【００７４】
このアレイにおいては、正常男性に対する正常男性の同時ハイブリダイゼーションを６回実施し、ｌｏｇ２比の正常変動を定義した。本実施例では、蛍光強度の中央値の１０％以下であり、究極的な平均化テストにより対照の偏差が１．０からとなり、そして正常対照群において最大の標準偏差（ＳＤ）となるような１１３クローン全てを以後の分析から排除した。したがって、２２３５クローン（１．３Ｍｂの解像度で２９８８Ｍｂをカバーしている）をさらなる分析の対象とした。２２３５クローン中２１７６クローン（２８３４Ｍｂ）は１番染色体のｐ腕テロメアから２２番染色体のｑ腕テロメアに相当していた。２２３５クローン中５９クローンはＸ染色体に相当していた。各スポット（２×２２３５クローン）について計測された蛍光ｌｏｇ２比の９６％以上が＋０．２から−０．２の範囲であったので、増幅と欠損のためのｌｏｇ２比の閾値をそれぞれ＋０．２と−０．２とした。低レベルのゲイン／増幅をｌｏｇ２比が＋０．２から＋１．０とし、ヘテロなロス／欠損を含んでいるものと推測されるもののｌｏｇ２比を−１．０から−０．２とし、高レベルのゲイン／増幅をｌｏｇ２比＞＋１．０とし、ホモのロス／欠損を含んでいるものをｌｏｇ２比＜−１．０とした。【００７５】
１−５．サザンブロット分析
２ｑ１３の標的遺伝子を検出するためにプローブ１−６をＢＡＣ４３８Ｋ１９のゲノムＤＮＡに基づいてデザインした。ＢＡＣ４３８Ｋ１９（アクセッションＮｏ．ＡＣ０９６６７０）の長さは、１７９４９７ｂｐである。プローブ７及び８は、それぞれＢＡＣ３６８Ａ１７（ＢＡＣ４３８Ｋ１９に対して１．５５Ｍｂテロメリック）及びＢＡＣ５３７Ｅ１８（ＢＡＣ４３８Ｋ１９に対して１．８５Ｍｂセントロメリック）のゲノムＤＮＡに基づいてデザインした。サザンブロットに用いたプローブ１〜８は、ヒトプラセンタＤＮＡに基づく８種類のプライマーペアを用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲに用いたプライマーペアは、以下のとおりであった。プローブ１〜６を配列番号３〜８に示し、プローブ１〜８のためのプライマーペアを配列番号：９〜２４に示す。【００７６】
プローブ１（８５０ｂｐ）：
sense (BAC438K19: 30,851-30,874 bp), 5’-ttgcacaagtaaagtggcaattac-3’
antisense (BAC438K19: 31,700-31,677 bp), 5’-atccctgacaactcagcgtttaga-3’
プローブ２（８３７ｂｐ）：
sense (BAC438K19: 34,214-34,237 bp), 5’-acgaatggttatcttacgactgtt-3’
antisense (BAC438K19: 35,050-35,027 bp), 5’-atctatgcatctgagtccagactg-3’
プローブ３（８５０ｂｐ）：
sense (BAC438K19: 49,071-49,094 bp), 5’-taccctccttgcatagtaagcgtt-3’
antisense (BAC438K19: 49,920-49,897 bp), 5’-tagtgacagcttaatgaaagggca-3’
プローブ４（８１１ｂｐ）：
sense (BAC438K19: 75,127-75,150 bp), 5’-gggtttgtgttgatttgtcacaac-3’
antisense (BAC438K19: 75,937-75,914 bp), 5’-tgctgccctcagcattttcggcaa-3’
プローブ５（１，０９５ｂｐ）：
sense (BAC438K19: 80,501-80,524 bp), 5’-gggtttgtgttgatttgtcacaac-3’
antisense (BAC438K19: 81,595-81,572 bp), 5’-ccgcgctggagttacaaactctat-3’
プローブ６（８９０ｂｐ）：
sense (BAC438K19: 177,361-177,384 bp), 5’-cattccccagaaacagatctcgtt-3’ antisense (BAC438K19: 178,250-178,227 bp), 5’-catagcattatcaatgccatcgat-3’
プローブ７（８２０ｂｐ）：
sense (BAC368A17: 34,301-34,320 bp), 5’-ccatagttaatgtacacagc-3’ 
antisense (BAC368A17: 35,101-35,120 bp), 5’-tcgcaaaccattaggaactg-3’
プローブ８（５００ｂｐ）：
sense (BAC537E18: 191,071-191,094 bp), 5’-ttggagccaaggtaggattaaaca-3’ antisense (BAC537E18: 191,487-191,570 bp), 5’-ctggaggaatagtgcttccagatg-3’【００７７】
プローブ２〜４はＢＩＭのオープンリーディングフレームを含んでいた。ＢＩＭ（ＢＩＭ ＥＬ）は、ＢＩＭ Ｌ、ＢＩＭ ａｌｐｈａ、ＢＩＭ ｂｅｔａ及びＢＩＭ ｇａｎｎｍａなどのいくつかのスプライシングバリアントを有しており(O’Connor et al., 1998; U et al., 2001; Liu et al., 2002)、ＢＩＭ ＥＬのオープンリーディングフレーム（５９７ｂｐ）は、これらのバリアントのエクソンを含んでいる。プローブ４は、ＢＩＭ（ＢＩＭ ＥＬ及びＢＩＭ Ｌ）の開始コドン（ＡＴＧ）を含み、プローブ２はＢＩＭの終止コドン（ＴＧＡ）を含んでいる。【００７８】
増幅は、サーマルサイクラー(Perkin-Elmer Corporation, Norwalk, CT)で行った。ＰＣＲはタッチダウンＰＣＲ法(Motegi et al., 2000)に従って行った。すなわち、変性（９４℃、０．５分）、アニール（６３℃、０．５分、２サイクルごとに１℃低下）及び伸長（７２℃、２．５分）を１０サイクル行い、続いて、変性（９４℃、０．５分）、アニール（５８℃、０．５分）及び伸長（７２℃、２．５分）を２５サイクル行い、さらに７２℃、５分で最終伸長を行った。反応の基本的なアニール温度は６３℃から５８℃であった。全てのＰＣＲ産物は、電気泳動で分離し、ＱＩＡ Ｑｕｉｃｋ（商標）ゲルエクストラクションキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。精製したＰＣＲ産物に対するＴＡクローニングをpBluescriptII SK (-)を用いて実施して、ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, VA)によりシークエンスした。ゲノムＤＮＡサンプル１０μｇをＢａｍＨ１（プローブ１及び６）又はＨｉｎｄＩＩＩ（プローブ２〜４）で１６時間消化し、その後、０．８％アガロースゲル（１ｘＴＢＥ）で電気泳動した。ゲルは、０．２５ＭＨＣｌに３０分間、１．５Ｍ ＮａＣｌ／０．５Ｍ ＮａＯＨに３０分間、さらに、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）／１．５Ｍ ＮａＣｌに３０分間、順次浸漬した。電気泳動したＤＮＡは、その後、ＨｙｂｏｎｄＮ＋メンブラン(Amersham Pharmacia Biotech, Tokyo, Japan)に移し洗浄し、６５℃で[α−３２Ｐ]ｄＣＴＰで標識したプローブ１〜８と一晩ハイブリダイゼーションさせた。その後、２ｘＳＳＣ、次いで６５℃で濃度低下させたＳＳＣ−０．１％ Ｎ−ラウリルサクロシンで洗浄し、最後に、BioMax（商標）MS フィルム(EKC, Rochester, NY)に曝した。【００７９】
１−６．ノザンブロット分析
ノザンブロットは、７種のＭＣＬ細胞株、Ｋａｒｐａｓ２３１（ＦＣＬ）及びＲａｊｉ（バーキットリンパ腫）に対してＢＩＭ ＥＬｃＤＮＡを用いて実施した。ノザンブロットに用いたプローブは、ＲＴ−ＰＣＲ法により以下のプライマーペア（配列番号：２５、２６）を用いて行った。
Sense： 5’-atggcaaagcaaccttctgatgta-3’
Antisense：5’-tcaatgcattctccacaccaggcg-3’【００８０】
ＢＩＭ ＥＬのｃＤＮＡ（オープンリーディングフレーム、５９７ｂｐ）は胎児脳ｃＤＮＡから調製した。全細胞ＲＮＡ（１０μｇ）を１％アガロース／０．６６Ｍホルムアルデヒドゲルでサイズ分画し、Ｈｙｂｏｎｄ＋ナイロンメンブラン(Amersham Pharmacia Biotech, Tokyo, Japan)に移した。メンブランは４２℃で[α−３２Ｐ]ｄＣＴＰで標識したプローブと一晩ハイブリダイゼーションさせた後、洗浄し、最後に、BioMax（商標）MS フィルム(EKC, Rochester, NY)に曝した。【００８１】
１−７．蛍光インサイトゥハイブリダイゼーション
間期染色体をパラフィン包埋サンプル（Ｇ４６８）及び細胞株から調製した。二色ＦＩＳＨ分析を既報（Ｎｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， ２００３； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００４）に従って行った。プローブはプローブＡ：ＢＡＣ４３８Ｋ１９（緑）とプローブＢ：ＢＡＣ３６８Ａ１７（赤）を用いた。【００８２】
２．結果
２−１．ＭＣＬ患者サンプル及び細胞株のゲノムプロファイル
患者サンプル（Ｇ４６８）とＳＰ−５３細胞株の高解像度解析の代表例を図１ａ及び図１ｂにそれぞれ示す。アレイＣＧＨは、増幅及び欠損について小さい領域も染色体全体の領域も検出することができたほか、増幅と欠損との境界領域の輪郭も検出することができた。公知の腫瘍遺伝子を含むクローンに起因する小さい単位複製配列は、それが小さいホモ接合性欠損であるかのように容易に検出された。【００８３】
２−２．ＭＣＬ患者サンプルにおけるゲノム不均衡
２９例の患者サンプルの全てによって示された遺伝子材料の増幅又は欠損についてデータ解析した。全ての腫瘍セットは、平均でゲノム中１３０．６Ｍｂ、すなわち、その４．６％においてコピー数の増加が生じており、平均で２５０．６Ｍｂ、すなわち、その８．８％でコピー数の減少が生じていた。こうした変化は、増幅については平均して３．８領域、欠損については平均して７．３領域であった。コピー数変化、すなわち、増幅と欠損についてのゲノム全体での頻度を図２に示す。【００８４】
増幅が頻発性（recurrent gain）（５例以上）の領域は、染色体の３ｑ１３．１１〜ｑ２９，６ｐ２１．３２〜ｐ２５．３，７ｐ１４．３〜ｐ２２．３，８ｑ１３．２〜ｑ２４．２２，１０ｐ１２．１〜ｐ１２．２及び１７ｑ２３．２〜ｑ２４．１であり、欠損が頻発性（５例以上）の領域は、１ｐ３６．２３〜ｐ３６．３２，１ｐ１１．２〜ｐ３１．３，１ｑ４２．２〜ｑ４３，２ｐ１１．２，２ｑ１３，５ｑ２１．１〜ｑ２３．１，６ｑ１６．２〜ｑ２７，８ｐ１２〜ｐ２３，９ｐ２４．３〜ｑ３１．１，１０ｐ１２．３１〜ｐ１５．３，１１ｑ１４．３〜ｑ２３．２，１３ｑ１３．２〜ｑ３４，１５ｑ１３〜ｑ２１．１，１７ｐ１１．２〜ｐ１３．３，１９ｐ１３．２〜ｐ１３．３及び２２ｑ１２．１〜ｑ１３．１にあった。また、最も頻度の高い不均衡は、増幅については、染色体の３ｑ２６．１（４８％），７ｐ２１．１〜ｐ２１．２（３４％），６ｐ２５．３（２４％），８ｑ２１．３〜ｑ２４．２１（２４％），１０ｐ１２．１〜ｐ１２．２（２１％）及び１７ｑ２３．２〜ｑ２４．１（１７％）であり、欠損については、２ｐ１１．２（８３％），１１ｑ２２．３〜ｑ２３．１（５９％），１３ｑ１４．３〜ｑ２１．１（５５％），１ｐ２１．３〜ｐ２２．１（５２％），１３ｑ３４（５２％），９ｑ２２．３３〜ｑ３１．１（４５％），１７ｐ１３．３（４５％），９ｐ２１．３〜ｐ２２．１（４１％），９ｐ２４．２〜ｐ２４．３（４１％），６ｑ２３．２〜ｑ２４．１（３８％），１ｐ３６．２３〜ｐ３６．３２（３１％），８ｐ２３．１〜ｐ２３．３（３４％），１０ｐ１４〜ｐ１５．３（３１％），１９ｐ１３．２（２８％），５ｑ２２．１〜ｑ２２．３（２１％），２２ｑ１２．２（２１％），１ｑ４２．２〜ｑ４３（１７％）及び２ｑ１３（１７％）であった（表１）。頻発性の欠損である１ｐ３６．２３〜ｐ３６．３２，１ｑ４２．２〜ｑ４３，２ｐ１１．２，２ｑ１３，１７ｐ１３．３及び１９ｐ１３．２〜ｐ１３．３はこの研究においてはじめて同定されたものであるが、他の増幅領域は、既にＭＣＬについてＣＧＨを用いた報告に掲載されたものであった。【００８５】
表１
2006059769.tif 000002
【００８６】
表１  ゲノム上のゲイン及びロスの頻発性領域及び最高頻度の領域。ゲイン又はロスの領域は、ゲイン又はロスを示すクローンが少なくとも３つ連続するか又は連続していなくとも高コピー数（ｌｏｇ２比＞＋１．０）又はホモ接合性ロスを示すクローンと定義した。ａ：頻発性領域は５例以上において認められた領域と定義されている。ｂ：ゲイン又はロスの最高頻度領域は、頻発性領域中最も高頻度な領域と定義された。ｃ：領域は、染色体上の位置に基づいて配列されている。ｄ： Sanger Center Institute, February 2004 versionに基づく。ｅ：最高頻度領域における最高頻度のゲイン又はロスを示したクローンの例である。最高頻度のゲイン又はロスを示したクローンが最高頻度領域内で同率のゲノム異常のときには、腫瘍関連遺伝子を含むクローンをそうでないクローンよりも上に示す。ｆ：代表的クローンに含まれる遺伝子。【００８７】
高いレベルの増幅が頻発性である領域（ｌｏｇ２比＞＋１．０）が１０ｐ１２．２（２例、ＢＭＩ−１遺伝子座）にあり、ホモ接合性欠損のある頻発性領域（ｌｏｇ２比＜−１．０）は、２ｐ１１．２（３例、Ｉｇκ遺伝子座）及び９ｐ２１．１〜ｐ２４．１にあった。表２に示すように、９ｐ２１〜ｐ２４における最も頻発性のホモ接合性欠損クローンは、ＲＰ１１−１４９Ｉ２（５例）であり、このクローンは、ｐ１６ＩＮＫ４ａ腫瘍抑制遺伝子を含んでいた。
表２
2006059769.tif 000003
【００８８】
表２  ホモ接合性欠損（ｌｏｇ２比＜−１．０）を示すＢＡＣクローンを示すリスト。ａ：染色体上の位置に基づいて配列されている。ｂ：２例以上のホモ接合性欠損を示す患者数。ｃ：２例以上のホモ接合性欠損を示す細胞株数。ｄ：ホモ接合性及びへテロ接合性欠損（ｌｏｇ２比＜−０．２）を示す数。【００８９】
Ｘ染色体上の５９クローンの全ては、性差のために別個に分析したが、１７例の男性患者についてのみゲノム変化を分析した。２例がＸｑ２８において低頻発性のコピー数増加があり、Ｘｐ２１．３〜Ｘｐ２２．３、特には、Ｘｐ２２．３１〜Ｘｐ２２．３２において、ヘテロ接合性（２例）又はホモ接合性（５例）の欠損があった。【００９０】
２−３．ＭＣＬ細胞株におけるゲノム不均衡
ゲノム不均衡は、一般に患者においてよりもＭＣＬ細胞株においてより頻繁に生じる。例えば、７ｐ２１及び８ｑ２４（いずれもｎ＝３、４３％）の増幅及び９ｐ２１及び１１ｑ２２（いずれもｎ＝６、８６％）、１ｐ２２（ｎ＝５、７１％）及び６ｑ、８ｐ２３及び１３ｑ２１（全てｎ＝３、４３％）の欠損は患者サンプルよりもＭＣＬ細胞株においてより高頻度に検出された。【００９１】
高レベルの増幅のある頻発性領域は、１３ｑ３１．３（ｎ＝２、Ｃ１３ｏｒｆ２５遺伝子座）及び１８ｑ２１（ｎ＝２、ＢＣＬ遺伝子座）に検出された。表２に示すように、ホモ接合性欠損のある頻発性領域は、９ｐ２１．１〜ｐ２４．１、２ｐ１１．１及び２ｑ１３において見出された。表２は、患者サンプル及び細胞株におけるホモ接合性欠損クローンをリストしている。３つの細胞株（ＳＰ−５３、Ｚ−１３８及びＪｅｋｏ−１）は、２ｑ１３のホモ接合性の欠損（ｌｏｇ２比＜−１．０）を示す一方、２つの細胞株（ＲＥＣ−１、ＮＣＥＢ−１）は、２ｑ１３においてヘテロ接合性欠損２ｑ１３（−１＜ｌｏｇ２比＜−０．２）を示した。２ｑ１３の欠損を伴う５例の患者サンプルは、同様にヘテロ接合性欠損を示した。患者サンプル（Ｇ４６８）及び細胞株ＳＰ−５３、Ｚ−１３８及びｊｅｋｏ―１の各第２染色体の部分的なゲノムプロファイルを図３に示す。２ｑにおいて最も欠損の大きい座は、ＢＡＣ ＲＰ１１−４３８Ｋ１９（ＢＡＣ４３８Ｋ１９）にあり、このＢＡＣは二つの遺伝子ＢＩＭ及びＡＣＯＸＬ（Ａｃｙｌ−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子）を含んでいる。前者は、ＢＨ３−ｏｎｌｙ、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバータンパク質であって、アポトーシスを促進する(O’Conner et al., 1998) が、後者の機能は知られていない。ホモ接合性欠損を有する２ｑ１３における標的遺伝子について何ら情報がないため、次に、２ｑ１３の欠損の最小限共通領域を探索して標的遺伝子候補を検出する手がかりを得ることとした。【００９２】
２−４．サザンブロット分析
２ｑ１３における欠損の標的遺伝子を検出するため、７種のＭＣＬ細胞株について６種のゲノムプローブを用いてサザンブロットを実施した。ゲノムプローブは、ＢＡＣ４３８Ｋ１９のゲノムＤＮＡに基づいてデザインした（図４ａ）。プローブ１〜６を用いた分析は、ＢＩＭの一部のエクソンが３つの細胞株ＳＰ−５３、Ｚ−１３８及びＪｅｋｏ−１において共通して欠損していることを示し、ホモ接合性欠損の最小限共通領域はＢＩＭ遺伝子座にあってＡＣＯＸＬ遺伝子座でないことを示した（図４ｂ）。なお、最小限共通領域とは、ある領域に異常を有するＭＣＬ細胞株における異常である領域を意味している。これらの細胞株の２ｑ１３のホモ接合性欠損の最小限共通領域は、少なくともプローブ２から３（１５ｋｂ）にわたっており、多くてプローブ１からプローブ４（４５ｋｂ）にわたっている。【００９３】
ＮＩＢＣ、Ensembl Genome Data Resources及び UCSC Genome Bioinfomaticsによれば、この領域は、ＢＩＭ遺伝子のオープンリーディングフレームを含んでいるが、他の遺伝子を含んでいない。サザンブロット分析をＢＡＣ、ＲＰ１１−３６８Ａ１７（プローブ７）由来のプローブ及びＢＡＣ、ＲＰ１１−５３７Ｅ１８（プローブ８）を用いて７種のＭＣＬ細胞株について行った。ＢＡＣ、ＲＰ１１−３６８Ａ１７（ＢＡＣ３６８Ａ１７）は、ＢＡＣ４３８Ｋ１９に対して１．５５Ｍｂテロメリックなクローンであり、ＢＡＣ、ＲＰ１１−５３７Ｅ１８（ＢＡＣ５３７Ｅ１８）は、ＢＡＣ４３８Ｋ１０に対して１．８５Ｍｂセントロメリックなクローンである。プローブ７及び８のバンドは、全てのＭＣＬ細胞株において陽性であり（データ示さず。）、各細胞株（ＳＰ−５３、Ｚ−１３８及びＪｅｋｏ−１）のホモ接合性欠損領域は、最大でも３．４Ｍｂであることがわかった。さらに、使用可能な患者サンプルについてもサザンブロット分析を行ったところ（図５ａ）、２ｑ１３においてヘテロ接合性の欠損パターンを見出した。【００９４】
２−５．ノザンブロット分析
ＭＣＬ細胞株でＢＩＭ遺伝子の発現を確認するために、７種のＭＣＬ細胞株、ＦＣＬ細胞株（Ｋａｒｐａｓ２３１）及びバーキット細胞種株（Ｒａｊｉ）についてノザンブロット分析を行った。図４ｃに示すように、ＢＩＭ遺伝子の３種の転写物である一つの強力なバンド（５．７ｋｂ）及び二つの弱いバンド（３．８ｋｂ、１．３５ｋｂ）が、Ｇｒａｎｔａ５１９、ＪＶＭ２、Ｋａｒｐａｓ２３１及びＲａｊｉに観察され、一方、全く発現のないあるいは非常に弱い発現がＳＰ−５３、Ｚ−１３８、Ｊｅｋｏ−１、ＲＥＣ−１及びＮＣＥＢ−１細胞株で観察された。ＲＥＣ−１及びＮＣＥＢ−１について、アレイＣＧＨでは２ｑ１３においてヘテロ接合性のパターンを示しているが、ノザンブロット分析では、遺伝子量的効果によってこれらの２種の細胞株におけるＢＩＭ遺伝子のｍＲＮＡでは明らかに抑制されていることを示した。ＢＩＭ遺伝子は、２ｑ１３における遺伝子欠損を全く認めなかったＧｒａｎｔａ５１９及びＪＶＭ２においては、ＢＩＭ遺伝子は、通常通り発現されていた。【００９５】
２−６．蛍光インサイトゥハイブリダイゼーション
ＢＡＣ４３８Ｋ１９及びＢＡＣ３６８Ａ１７（ＢＡＣ４３８Ｋ１９に対して１．５５Ｍｂテロメリック）の組み合わせ及びＢＡＣ４３８Ｋ１９及びＢＡＣ５３７Ｅ１８（ＢＡＣ４３８Ｋ１０に対して１．８５Ｍｂセントロメリック）の組み合わせで３種のＭＣＬ細胞株（ＳＰ−５３、Ｚ−１３８及びｊｅｋｏ−１）及び患者サンプル（Ｇ４６８）に対して二色ＦＩＳＨを実施した。これら３種のクローンは隣接してアレイＣＧＨのガラススライド上においた。患者サンプル（Ｇ４６８）に対するＢＡＣ４３８Ｋ１９及びＢＡＣ３６８Ａ１７の二色ＦＩＳＨの結果を図５ｂに示す。これら３種の細胞株のＦＩＳＨの結果（データ示さず。）は、アレイＣＧＨデータとよく整合していた。すなわち、ｉ）ＳＰ−５３細胞株においては、ＢＡＣ４３８Ｋ１９について何らのシグナルも検出されなかったがＢＡＣ３６８Ａ１７のシグナルが二対、ＢＡＣ５３７Ｅ１８シグナルが一対観察され、ＢＡＣ４３８Ｋ１９クローン（ｌｏｇ２比＝−２．７４）のホモ接合性欠損を示していた。ｉｉ）Ｚ−１３８細胞株では、弱いＢＡＣ４３８Ｋ１９シグナルが一対観察されたが、正常なＢＡＣ３６８Ａ１７シグナルが二対又は正常なＢＡＣ５３７Ｅ１８シグナルが一対観察され、この細胞株でのＢＡＣ４３８Ｋ１９内部欠損（ｌｏｇ２比＝−１．７１）を示唆していた。ｉｉｉ）ｊｅｋｏ−１細胞株では、弱いＢＡＣ４３８Ｋ１９シグナルが一対観察されたが、正常なＢＡＣ３６８Ａ１７シグナルが二対又は正常なＢＡＣ５３７Ｅ１８シグナルが一対観察され、この細胞株でのＢＡＣ４３８Ｋ１９内部欠損（ｌｏｇ２比＝−１．７６）を示唆していた。これらの結果は、ＳＰ−５３細胞株における全体的なＢＡＣ４３８Ｋ１９欠損とＺ−１３８細胞株及びｊｅｋｏ−１細胞株におけるＢＡＣ４３８Ｋ１９の部分的なホモ接合性欠損と整合する。【００９６】
３．考察
ここに報告する研究において、ＭＣＬの全ゲノムにおいて高解析解像度のコピー数変化のマッピングが達成された。増幅及び欠損の頻度は、アレイ分析によって高解析解像度で同定され、ゲノム異常の正確なマッピングが可能となった。ＭＣＬのゲノム上の多数の変化はアレイＣＧＨによって同定されたが、その多くは、染色体ＣＧＨ（従来型ＣＧＨともいう。）によるものと同一であった。幾人かの著者ら(Monni et al., 1998; Bea et al., 1999; Bentz et al., 2000; Martinez-Climent et al., 2001; Allen et al., 2003)は、増幅頻発性領域として、３ｑ（４０−７０％），６ｐ（２０％），７ｐ（２７％），８ｑ（２０−３０％），１０ｐ（２０％），１２ｑ（２０−３０％），１８ｑ２１（２０％）を報告し、そして、欠損頻発性領域として、１ｐ（２４−３３％），６ｑ（２７−３７％），８ｐ（２０−３０％），９ｐ（１６−３０％），１１ｑ（２２−３０％）及び１３ｑ（４０−６０％）を報告している。しかしながら、アレイＣＧＨによって同定されるゲノム異常の発生率は一般的に染色体ＣＧＨにより同定されるものよりも高いとされている。例えば、本実施例では、１ｐ２１〜ｐ２２（５２％）及び９ｐ２１（４１％，ＩＮＫ４／ＡＲＦｌｏｃｕｓ）のほか１１ｑ２２（５５％，ＡＴＭｌｏｃｕｓ）において、染色体ＣＧＨによって過去に検出されていた対応する欠損よりも高頻度となっている。こうした高頻度な欠損のなかでも、ｌｐ２２の標的遺伝子候補は同定されていないが、我々のアレイＣＧＨ分析は、１ｐ２１．３〜ｐ２２．１の５．８Ｍｂ内に最も高頻度な欠損があることを示した。【００９７】
近年、コールハマー（Kohlhammer ）とその共同研究者らが、ガラススライド上に８１２の人工染色体をスポットしたアレイを用いた（マトリックス）ＣＧＨによる４９例の患者についての結果を報告したが(Kohlhammer et al., 2004)、染色体ＣＧＨデータに比べてより高頻度なＭＣＬのゲノム変化を見出した。かれらの患者の特徴（例えば、ステージIII／IVのパーセンテージ、全身状態の不良、高いＬＤＨレベル、白血病性ＭＣＬ及びリンパ節外への転移）はほとんど我々の患者のそれと同一であるほか、ゲノム上の変化の頻度も同様であった。しかしながら、彼らは、我々が検出したいくつかの欠損領域、例えば、１ｐ３６，１ｑ４２．２−ｑ４３，２ｐ１１．２，２ｑ１３，１７ｐ１３．３及び１９ｐ１３．２−ｐ１３．３を検出できなかった。これは、彼らのクローンが全ゲノムにわたって選択されていなかったからである。したがって、我々の研究成果における高解析解像度は、ゲノム全体から無作為に人工染色体クローンを選択したことによるものであろう。【００９８】
我々の研究によって見出されたる新規な６箇所の欠損領域のなかでも、１７ｐ１３．３の欠損は、興味深いことにも１７ｐのアレイＣＧＨ解析において最も高頻度な欠損を示したという点において特筆すべきである。このことは、TＰ５３遺伝子から離れた部位に他の腫瘍抑制遺伝子が存在することを示唆している。TＰ５３遺伝子座とは独立した１７ｐ１３．３における頻発性のアレル欠損は、肺癌、胸部癌、卵巣癌、肝細胞癌のほか神経腫瘍など様々なヒト悪性腫瘍において見出されてきている(Fujimori et al., 1991; Cogen et al., 1992; Saxena et al., 1992; Phillips et al., 1996; Schults et al., 1996; Konishi et al., 2002)。ＭＣＬにおけるTＰ５３変異がよく知られたゲノム変化であり、様々な細胞変異や悪い予後と関連していたとしても (Greiner et al., 1996; Hernandez et al., 1996)、我々の知見は、１７ｐ１３．３における他の腫瘍抑制遺伝子がリンパ腫の発症に関連しているかもしれないことを示した。【００９９】
アレイＣＧＨの高解析解像度の生物学的価値は、特定の発ガン遺伝子や腫瘍抑制遺伝子を含んでいるかもしれない少ないレベルや高レベルの増幅コピー数、ホモ接合性欠損を検出できるところにある。高度にコピー数が高い頻発性領域は１０ｐ１２．２（ＢＭＩ−１），１３ｑ３１．３（Ｃ１３ｏｒｆ２５）及び１８ｑ２１（ＢＣＬ２）として同定されてきている(Bea et al., 2001; Ota et al., 2004; Hofmann et al., 2001; Martinez et al., 2003)。両アレル（ホモ接合性）欠損は、腫瘍抑制遺伝子を含むかもしれない染色体上の領域であることの特徴であるため(Kundson 1971), ２ｐ１１や２ｑ１３及び９ｐ２１−２４におけるホモ接合性の欠損領域を検知することは重要である。２ｐ１１における欠損はイムノグロブリン遺伝子の再配列に起因するが、９ｐ２１−ｐ２４の欠損は、おおよそ１５Ｍｂにもわたっており、この領域が最も高頻度なホモ接合性の欠損クローンＲＰ１１−１４９Ｉ２を含んでいたとしても責任遺伝子を同定するのは困難である。このクローンは、ＭＣＬのこのホモ接合性欠損領域の候補遺伝子であるｐ１６ＩＮＫ４  遺伝子を含んでいる(Dreyling et al., 1997; Pinyol et al., 1997)。【０１００】
これら３つのホモ接合性欠損領域のうち２ｑ１３の標的遺伝子についてはこれまで何らの報告もされていないが、我々の結果は、２ｑ１３の欠損の最小限共通領域は、ＢＩＭ遺伝子のエクソンの一部を含むが他の遺伝子やＥＳＴｓを含んでいないことを示した。このことは、ＢＩＭ遺伝子がこの欠損領域の責任遺伝子である可能性が高いことを示唆している。近年、アポトーシスに関連する代謝経路の障害もＭＣＬの発症に寄与することが知られるようになってきている(Hofmann et al., 2001; Martinez et al., 2003)。他の研究は、ＢＩＭ遺伝子がプロアポトーシス作用のあるBCL2ファミリーのメンバーであり、特に造血システムにおいてＢＣＬ２の主要な生理学的なアンタゴニストであるとしているし (Bouillet et al., 2002), エンダーら（ Enders et al.）は最近、ＢＩＭ遺伝子を欠損するＢリンパ球は、試験管内でＢ細胞レセプターとの結合によって誘導されるアポトーシスに抵抗性であることを報告している (Enders et al., 2003)。最後に、エグレら（ Egle et al.）は、Ｂｉｍ−／−及びＢｉｍ＋／−Ｅμ−Ｍｙｃ ｍｉｃｅを用いて、ＢＩＭ遺伝子の欠損は、腫瘍形成の始まりであるとしている(Egle et al., 2004). これらの知見はいずれも強くＢＩＭ遺伝子が腫瘍抑制遺伝子であることを示唆している。【０１０１】
我々は、ＭＣＬ細胞株における２ｑ１３の最小限共通領域がＢＩＭ遺伝子座に存在していることを示した。さらに、我々は、７種のＭＣＬ細胞株中の５種の細胞株においてＢＩＭ遺伝子の発現が抑制されているが、２ｑ１３の欠損のない２種類のＭＣＬ細胞株ではＢＩＭ遺伝子が正常に発現していることを確認した。これらの結果は、ＢＩＭ遺伝子が２ｑ１３の欠損の責任遺伝子の最も適切な候補でありその発現抑制がＭＣＬの腫瘍形成に寄与しているであることの強力な根拠となる。【０１０２】
要約すると、ＭＣＬの詳細な研究のための高解像度なアレイＣＧＨの利用によれば、ゲノム異常を正確に同定できるとともに、ＭＣＬにおける新規な腫瘍サプレッサーとしてのＢＩＭ遺伝子を同定することができる。【０１０３】
[実施例２]
（ＭＣＬゲノム異常と予後との関係）
実施例１と同様の２９症例のＭＣＬ検体に対して予後との関連を調べた。特定クローンのゲイン又はロスについての予後曲線を図６に示す。すなわち、２９症例について特定のゲイン又はロスと予後（生存状況）との関係をカプラン−マイヤー生存曲線とログランク検定を用いて調べた。図６に、カプラン−マイヤー生存曲線を示す。横軸は生存日数、縦軸は生存率を示す。図６に示すように、６ｐ２１（ＢＡＣ，ＲＰ１１−６０Ｏ１９）ロスを有する症例（６症例）は、有しない症例（２３症例）よりも予後が有意に良好（Ｐ＝０．０１５２）であった。また、８ｐ２３（ＢＡＣ、ＲＰ１１−２４０Ａ１７）ロスを有する症例（９症例）は有しない症例（２０症例）よりも予後が有意に不良（Ｐ＝０．０００１）であり、８ｑ２４（ＲＰ１１−１１３６Ｌ８）ゲインを有する症例（５症例）は有しない症例（２４症例）よりも有意に予後が不良（Ｐ＝０．００８４）であった。６ｑ２１及び８ｐ２３の原因遺伝子は不明であるが、本実施例によれば、８ｑ２４の原因遺伝子が、Ｃ−ＭＹＣであると強く示唆される。なお、１ｐ２２、９ｐ２１、１１ｑ２１、１３ｑ２１などの高頻度に欠損がある領域におけるゲノム異常と予後との関連では有意差がなかった。【０１０４】
以下の参考文献に記載の全内容は、引用により本明細書の一部に組み込まれる。
参考文献
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また、本発明は２００４年１２月３日に米国に出願された米国仮出願番号６０／６３２７０８、および２００５年９月３０日に米国に出願された米国仮出願番号６０／７２２００７を優先権主張の基礎としており、引用によりその内容のすべてが編入される。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明は、悪性腫瘍、特に悪性リンパ腫の診断や予後診断に利用できる。
【配列の説明】
【０１０７】
配列番号：３〜８  ヒト２番染色体ｑ１３における欠損を検出するためのプローブ
配列番号：９  プローブ１のためのセンスプライマー
配列番号：１０  プローブ１のためのアンチセンスプライマー
配列番号：１１  プローブ２のためのセンスプライマー
配列番号：１２  プローブ２のためのアンチセンスプライマー
配列番号：１３  プローブ３のためのセンスプライマー
配列番号：１４  プローブ３のためのアンチセンスプライマー
配列番号：１５  プローブ４のためのセンスプライマー
配列番号：１６  プローブ４のためのアンチセンスプライマー
配列番号：１７  プローブ５のためのセンスプライマー
配列番号：１８  プローブ５のためのアンチセンスプライマー
配列番号：１９  プローブ６のためのセンスプライマー
配列番号：２０  プローブ６のためのアンチセンスプライマー
配列番号：２１  プローブ７のためのセンスプライマー
配列番号：２２  プローブ７のためのアンチセンスプライマー
配列番号：２３  プローブ８のためのセンスプライマー
配列番号：２４  プローブ８のためのアンチセンスプライマー
配列番号：２５  ＲＴ−ＰＣＲのためのセンスプライマー
配列番号：２６  ＲＴ−ＰＣＲのアンチセンスプライマー
【図１】
2006059769.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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