(57)【要約】  ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を阻害することを特徴とする、プロカスパーゼ１の多量体化の阻害方法および阻害剤、プロカスパーゼ１の活性化の阻害方法および阻害剤、カスパーゼ１の生成の阻害方法および阻害剤、炎症性疾患の防止方法および／または治療方法、炎症性疾患の防止剤および／または治療剤、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を阻害する化合物の同定方法、並びに該同定方法に用いる試薬キットを提供した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の群より選ばれる阻害方法；
（ｉ）ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害することを特徴とするプロカスパーゼ１の多量体化阻害方法、
（ｉｉ）ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害することを特徴とするプロカスパーゼ１の活性化阻害方法、
および
（ｉｉｉ）ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害することを特徴とするカスパーゼ１（ｃａｓｐａｓｅ−１）の生成阻害方法。
【請求項２】
ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害することを特徴とする炎症性疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項３】
ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害する化合物を少なくとも１つ用いることを特徴とする炎症性疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項４】
炎症性疾患が、敗血症、炎症性腸疾患、クローン病またはリウマチである請求項２または３に記載の防止方法および／または治療方法。
【請求項５】
ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害する化合物の同定方法であって、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を可能にする条件下、ＮＯＤ２および／またはプロカスパーゼ１を化合物と接触させ、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を検出することができるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在および／または変化を検出することにより、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を阻害するか否かを決定する方法。
【請求項６】
以下の群より選ばれる阻害剤；
（ｉ）ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害することを特徴とするプロカスパーゼ１の多量体化阻害剤、
（ｉｉ）ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害することを特徴とするプロカスパーゼ１の活性化阻害剤、
および
（ｉｉｉ）ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害することを特徴とするカスパーゼ１（ｃａｓｐａｓｅ−１）の生成阻害剤。
【請求項７】
以下の群より選ばれる阻害剤；
（ｉ）ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害する化合物を少なくとも１つ含有するプロカスパーゼ１の多量体化阻害剤、
（ｉｉ）ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害する化合物を少なくとも１つ含有するプロカスパーゼ１の活性化阻害剤、
および
（ｉｉｉ）ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害する化合物を少なくとも１つ含有するカスパーゼ１（ｃａｓｐａｓｅ−１）の生成阻害剤。
【請求項８】
ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害することを特徴とする炎症性疾患の防止剤および／または治療剤。
【請求項９】
ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害する化合物を少なくとも１つ含有する炎症性疾患の防止剤および／または治療剤。
【請求項１０】
請求項６または７に記載の阻害剤を含有する炎症性疾患の防止剤および／または治療剤。
【請求項１１】
炎症性疾患が、敗血症、炎症性腸疾患、クローン病またはリウマチである請求項８から１０のいずれか１項に記載の防止剤および／または治療剤。
【請求項１２】
ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合阻害によるプロカスパーゼ１の多量体化阻害を特徴とする、炎症性疾患の防止剤および／または治療剤。
【請求項１３】
炎症性疾患が、敗血症、炎症性腸疾患、クローン病またはリウマチである請求項１２に記載の防止剤および／または治療剤。
【請求項１４】
請求項５に記載の同定方法に用いることを特徴とする試薬キットであって、ＮＯＤ２、ＮＯＤ２をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれか１つと、プロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）、プロカスパーゼ１をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれか１つとを含んでなる試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害することを特徴とするプロカスパーゼ１の多量体化阻害方法、プロカスパーゼ１の活性化阻害方法およびカスパーゼ１（ｃａｓｐａｓｅ−１）の生成阻害方法に関する。また、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を阻害することを特徴とする炎症性疾患の防止方法および／または治療方法に関する。さらに、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を阻害する化合物の同定方法に関する。また、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を阻害することを特徴とするプロカスパーゼ１の多量体化阻害剤、プロカスパーゼ１の活性化阻害剤およびカスパーゼ１の生成阻害剤、あるいは炎症性疾患の防止剤および／または治療剤に関する。さらに、ＮＯＤ２、ＮＯＤ２をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれか１つと、プロカスパーゼ１、プロカスパーゼ１をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれか１つとを含んでなる試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
カスパーゼ１は、インターロイキン１β転換酵素（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ；ＩＣＥ）とも呼ばれ、炎症性サイトカインであるインターロイキン１（以下、ＩＬ−１βと略称する）やインターロイキン１８（以下、ＩＬ−１８と略称する）をその前駆体から成熟型へと変換するシステインプロテアーゼである（非特許文献１−４）。カスパーゼ１遺伝子は炎症性刺激、例えばリポポリサッカライド（以下、ＬＰＳと略称する）で誘導され、カスパーゼ１活性も同様の刺激で増加する（非特許文献４−６）。また、種々の炎症性疾患、例えば、敗血症、炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）、リウマチ等において、カスパーゼ１活性の促進が報告されている。【０００３】
カスパーゼ１は、カスパーゼ１前駆体として発現するプロカスパーゼ１が多量体化を起こし、それに伴う自己切断により生成されると考えられている。この過程において、プロカスパーゼ１の多量体化は、ＲＩＰ２またはＮＯＤ１がプロカスパーゼ１と結合することで誘導されることが報告されている（非特許文献７および８）。【０００４】
以下に本明細書において引用した文献を列記する。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ０１／６７２９９号パンフレット。
【非特許文献１】「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、１９９２年、第３５６巻、ｐ．７６８−７７４。
【非特許文献２】「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９２年、第２５６巻、ｐ．９７−１００。
【非特許文献３】「ネイチャー」、１９９７年、第３８６巻、ｐ．６１９−６２３。
【非特許文献４】「サイエンス」、１９９７年、第２７５巻、ｐ．２０６−２０９。
【非特許文献５】「ネイチャー」、１９９４年、第３７０巻、ｐ．２７０−２７５。
【非特許文献６】「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」、１９９８年、第９１巻、ｐ．５７７−５８４。
【非特許文献７】「カレント  バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９９８年、第８巻、ｐ．８８５−８８８。
【非特許文献８】「バイオケミカル  アンド  バイオフィジカル  リサーチ  コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）」、２００２年、第２９９巻、ｐ．６５２−６５８。
【非特許文献９】「ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００２年、第２７７巻、ｐ．４１７０１−４１７０５。
【非特許文献１０】「ガット（Ｇｕｔ）」、２００３年、第５２巻、ｐ．８４０−８４６。
【非特許文献１１】「ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー」、２００１年、第２７６巻、ｐ．４８１２−４８１８。
【非特許文献１２】ウルマー（Ｋ．Ｍ．Ｕｌｍｅｒ）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１。
【非特許文献１３】「ペプチド合成」、丸善株式会社、１９７５年。
【非特許文献１４】「ペプチド  シンテシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、インターサイエンス（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９９６年。
【非特許文献１５】「セル（Ｃｅｌｌ）」、１９９５年、第８０巻、ｐ．４０１−４１１。
【非特許文献１６】「サイエンス」、１９９５年、第２６７巻、ｐ．２０００−２００３。
【非特許文献１７】「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、２００１年、第９８巻、ｐ１３２４９−１３２５４。
【非特許文献１８】「ネイチャー」、２００３年、第４２３巻、ｐ．３５６−３６１。
【非特許文献１９】「バイオケミカル  ファーマコロジー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」、２００２年、第６４巻、ｐ．１−８。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、プロカスパーゼ１と結合してこれの多量体化を促進し、これを活性化する新たな蛋白質を見出し、該蛋白質とプロカスパーゼ１の結合を阻害することにより、プロカスパーゼ１の多量体化阻害、プロカスパーゼ１の活性化阻害およびカスパーゼ１の生成阻害、ひいては炎症性疾患の防止および／または治療を可能にする手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意努力し、プロカスパーゼ１がＮＯＤ２と相互作用することをインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）で予測し、そしてＮＯＤ２とプロカスパーゼ１が結合することにより、プロカスパーゼ１の多量体化が促進され、その結果プロカスパーゼ１からカスパーゼ１への活性化およびカスパーゼ１の生成が引き起こされることを実験的に証明して本発明を完成した。【０００７】
すなわち本発明は、以下の群より選ばれる阻害方法に関する；
（ｉ）ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害することを特徴とするプロカスパーゼ１の多量体化阻害方法、
（ｉｉ）ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害することを特徴とするプロカスパーゼ１の活性化阻害方法、
および
（ｉｉｉ）ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害することを特徴とするカスパーゼ１（ｃａｓｐａｓｅ−１）の生成阻害方法。【０００８】
また本発明は、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害することを特徴とする炎症性疾患の防止方法および／または治療方法に関する。【０００９】
さらに本発明は、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害する化合物を少なくとも１つ用いることを特徴とする炎症性疾患の防止方法および／または治療方法に関する。【００１０】
さらにまた本発明は、炎症性疾患が、敗血症、炎症性腸疾患、クローン病またはリウマチである前記防止方法および／または治療方法に関する。【００１１】
また本発明は、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害する化合物の同定方法であって、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を可能にする条件下、ＮＯＤ２および／またはプロカスパーゼ１を化合物と接触させ、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を検出することができるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在および／または変化を検出することにより、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を阻害するか否かを決定する方法に関する。【００１２】
さらに本発明は、以下の群より選ばれる阻害剤に関する；
（ｉ）ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害することを特徴とするプロカスパーゼ１の多量体化阻害剤、
（ｉｉ）ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害することを特徴とするプロカスパーゼ１の活性化阻害剤、
および
（ｉｉｉ）ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害することを特徴とするカスパーゼ１（ｃａｓｐａｓｅ−１）の生成阻害剤。【００１３】
さらにまた本発明は、以下の群より選ばれる阻害剤に関する；
（ｉ）ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害する化合物を少なくとも１つ含有するプロカスパーゼ１の多量体化阻害剤、
（ｉｉ）ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害する化合物を少なくとも１つ含有するプロカスパーゼ１の活性化阻害剤、
および
（ｉｉｉ）ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害する化合物を少なくとも１つ含有するカスパーゼ１（ｃａｓｐａｓｅ−１）の生成阻害剤。【００１４】
また本発明は、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害することを特徴とする炎症性疾患の防止剤および／または治療剤に関する。【００１５】
さらに本発明は、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害する化合物を少なくとも１つ含有する炎症性疾患の防止剤および／または治療剤に関する。【００１６】
さらにまた本発明は、前記阻害剤を含有する炎症性疾患の防止剤および／または治療剤に関する。【００１７】
また本発明は、炎症性疾患が、敗血症、炎症性腸疾患、クローン病またはリウマチである前記いずれかの防止剤および／または治療剤に関する。【００１８】
さらに本発明は、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合阻害によるプロカスパーゼ１の多量体化阻害を特徴とする、炎症性疾患の防止剤および／または治療剤に関する。【００１９】
また本発明は、炎症性疾患が、敗血症、炎症性腸疾患、クローン病またはリウマチである前記防止剤および／または治療剤に関する。【００２０】
さらに本発明は、前記同定方法に用いることを特徴とする試薬キットであって、ＮＯＤ２、ＮＯＤ２をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれか１つと、プロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）、プロカスパーゼ１をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれか１つとを含んでなる試薬キットに関する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明ではＮＯＤ２がプロカスパーゼ１と結合することを見出した。すなわち、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１が結合することにより、プロカスパーゼ１の多量体化が促進され、その結果プロカスパーゼ１からカスパーゼ１への活性化およびカスパーゼ１の生成が引き起こされることを初めて明らかにした。カスパーゼ１は炎症性反応に関与する因子であり、炎症性疾患においてその活性の促進が報告されている。これらから、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を阻害することを特徴とする本発明は、炎症性疾患の防止および／または治療のために非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１−Ａ】ＦＬＡＧ−ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１（Ｃ２８５Ａ）発現用プラスミドのみ、ＮＯＤ２−ｍｙｃ−Ｈｉｓ発現用プラスミドのみ、または両方を組み合わせてトランスフェクションした細胞から作製した細胞溶解液における各蛋白質の発現量を示す図である。蛋白質の検出はウェスタンブロッティング（ＷＢ）により行った。（実施例２）
【図１−Ｂ】左図は、ＮＯＤ２−ｍｙｃ−ＨｉｓとＦＬＡＧ−ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１（Ｃ２８５Ａ）を共発現させた細胞から作製した細胞溶解液について抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を用いて免疫沈降（ＩＰ）した結果、ＮＯＤ２−ｍｙｃ−Ｈｉｓのバンドが検出されたことを示す図である。右図は、上記細胞溶解液について抗ｍｙｃ抗体で免疫沈降した結果、ＮＯＤ２−ｍｙｃ−ＨｉｓとＦＬＡＧ−ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１（Ｃ２８５Ａ）を共発現させた細胞溶解液でのみ、ＦＬＡＧ−ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１（Ｃ２８５Ａ）のバンドが検出されたことを示す図である。蛋白質の検出はウェスタンブロッティング（ＷＢ）により行った。（実施例２）
【図２−Ａ】ＦＬＡＧ−ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１（Ｃ２８５Ａ）発現用プラスミドおよびＭｙｃ−ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１（Ｃ２８５Ａ）発現用プラスミドと図示した濃度のＮＯＤ２−ｍｙｃ発現用プラスミドとをトランスフェクションした細胞から作製した細胞溶解液を抗ＦＬＡＧ抗体で処理して得た画分において、抗ｍｙｃ抗体で検出されるバンドの量がＮＯＤ２−ｍｙｃ発現用プラスミド量依存的に増加したことを説明する図である。（実施例３）
【図２−Ｂ】ＦＬＡＧ−ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１（Ｃ２８５Ａ）発現用プラスミドおよびＭｙｃ−ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１（Ｃ２８５Ａ）発現用プラスミドと図示した濃度のＮＯＤ２−ｍｙｃ発現用プラスミドとをトランスフェクションした細胞から作製した細胞溶解液における各蛋白質の発現量を示す図である。（実施例３）
【図３】ＦＬＡＧ−ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１発現プラスミドとＮＯＤ２−ｍｙｃ発現プラスミドとを共発現させた細胞において、ＮＯＤ２−ｍｙｃの発現量依存的に細胞内ＩＬ−１β量の増加が認められたことを説明する図である。（実施例４）
【図４】ＦＬＡＧ−ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１発現プラスミド（０．５μｇ）とＮＯＤ２発現プラスミドとを共発現させた細胞において、ＮＯＤ２発現プラスミド量依存的に、細胞外へのＩＬ−１β分泌量が増加したことを説明する図である。図中、ベクターとは、各細胞に導入するＤＮＡ量を一定にするために加えた空ベクターを意味する。（実施例４）
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明について発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。
本明細書においては単離された若しくは合成の完全長蛋白質；単離された若しくは合成の完全長ポリペプチド；または単離された若しくは合成の完全長オリゴペプチドを意味する総称的用語として「ポリペプチド」という用語を使用することがある。ここで蛋白質、ポリペプチド若しくはオリゴペプチドはペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合している２個以上のアミノ酸を含むものである。以降、アミノ酸を表記する場合、１文字または３文字にて表記することがある。【００２４】
本発明においては、ＮＯＤ２がプロカスパーゼ１と相互作用することを、国際公開ＷＯ０１／６７２９９号パンフレット記載の方法に従ってインシリコで予測した。そして実験的に、ＮＯＤ２がプロカスパーゼ１と結合することを明らかにした。さらに、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１が結合することにより、プロカスパーゼ１の多量体化が促進され、その結果プロカスパーゼ１からカスパーゼ１への活性化およびカスパーゼ１の生成が引き起こされ、細胞内でＩＬ−１β前駆体（ｐｒｏＩＬ−１β）のカスパーゼ依存的な切断が誘導されて成熟型ＩＬ−１βの分泌が促進されることを初めて明らかにした。【００２５】
ＮＯＤ２は、ＣＡＲＤ１５とも呼ばれ、単球（非特許文献９）、好中球（非特許文献９）、白血球（非特許文献９）、顆粒球（非特許文献９）、樹状細胞（非特許文献９）、腸上皮細胞（非特許文献９および１０）、およびマクロファージ（非特許文献１０）で発現していること、急性前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ−６０や正常大腸細胞株ＦＨＣではＬＰＳや腫瘍壊死因子α（以下、ＴＮＦ−αと略称する）等の炎症刺激でＮＯＤ２遺伝子が増加することが報告されている（非特許文献９）。ＮＯＤ２の機能としては、ＮＯＤ２遺伝子をＨＬ−６０細胞に一過性発現させることによりＮＦ−κＢが活性化されることが報告されている（非特許文献１１）。しかしながら、ＮＯＤ２がプロカスパーゼ−１と結合して機能するという報告はない。【００２６】
これらから、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を阻害することにより、プロカスパーゼ１の多量体化、プロカスパーゼ１の活性化およびカスパーゼ１の生成を阻害でき、その結果、カスパーゼ１の増加により発症・進展する炎症性疾患の防止および／または治療が可能になる。【００２７】
これら知見に基づいて、本発明においては、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を阻害することを特徴とする、プロカスパーゼ１の多量体化阻害方法、プロカスパーゼ１の活性化阻害方法およびカスパーゼ１の生成阻害方法、並びにカスパーゼ１の増加に基づく疾患、具体的には炎症性疾患の防止方法および／または治療方法を提供する。【００２８】
ＮＯＤ２遺伝子および該遺伝子がコードするポリペプチドは、それぞれ配列表の配列番号１および配列番号２に記載の各配列からなる。プロカスパーゼ１遺伝子および該遺伝子がコードするポリペプチドは、それぞれ配列表の配列番号３および配列番号４に記載の各配列からなる。ＮＯＤ２、プロカスパーゼ１およびこれらの遺伝子は上記各配列からなるものに限らず、一般に知られているＮＯＤ２およびプロカスパーゼ１の機能を有する限りにおいて、上記各配列において１乃至数個の変異を有するポリペプチドおよびポリヌクレオチドであることができる。また、これらの機能を促進するあるいは欠失させるといった所望の目的のために、上記各配列に１乃至数個の変異を導入した変異体であることもできる。【００２９】
「ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合」とは、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１が複合体を形成するように、水素結合、疎水結合および静電的相互作用等の非共有結合により、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１が相互作用することを意味する。ここでの結合とは、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１がそれら分子の一部分において結合すれば足りる。例えば、ＮＯＤ２またはプロカスパーゼ１を構成するアミノ酸の中に、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合に関与しないアミノ酸が含まれていてもよい。【００３０】
ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合は、免疫沈降法による共沈物の確認、ツーハイブリッド法、ウエスタンブロット法および蛍光共鳴エネルギー転移法等の自体公知の方法またはこれらの方法を組合わせることにより検出され得る。【００３１】
例えば、実施例２に示すように、Ｃ末にｍｙｃ−Ｈｉｓ−ｔａｇが付加されたＮＯＤ２とＮ末にＦＬＡＧ−ｔａｇが付加されたプロカスパーゼ１との結合を、両ポリペプチドの共存下において、抗ｍｙｃ抗体または抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を用いて免疫沈降した共沈物を抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体または抗ｍｙｃ抗体を用いてウエスタンブロッティングすることにより検出され得る。【００３２】
「プロカスパーゼ１の多量体化」とは、プロカスパーゼ１同士が結合し、該結合により複合体を形成することを意味する。多量体化は、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１とが結合することにより促進される。また、プロカスパーゼ１が有するカスパーゼリクルートメントドメイン（Ｃａｓｐａｓｅ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｄｏｍａｉｎ；ＣＡＲＤ）が、多量体化に重要な役割を果たしていることが知られている。該複合体を構成するプロカスパーゼ１の分子数は特に制限されず、プロカスパーゼ１が自己を切断し、その結果、カスパーゼ１が生成される程度に、プロカスパーゼ１同士が結合し、複合体を形成すればよい。【００３３】
「プロカスパーゼ１の活性化」とは、プロカスパーゼ１の多量体化に伴い、プロカスパーゼ１が自己切断され、カスパーゼ１が生成されることを意味する。ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１とが結合することによりプロカスパーゼ１の多量体化が促進され、それに伴う自己切断が起こり、その結果、カスパーゼ１が生成される。【００３４】
「カスパーゼ１の生成」とは、プロカスパーゼ１が活性化された結果、カスパーゼ１が生成されることを意味する。【００３５】
プロカスパーゼ１の多量体化阻害、プロカスパーゼ１の活性化阻害およびカスパーゼ１の生成阻害は、例えば、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を阻害する化合物を用いることにより実施できる。ここでは、このような阻害効果を有する化合物（後述する例として競合阻害効果を有するポリペプチド類、抗体および低分子化合物等が挙げられる）を阻害剤と称する。【００３６】
ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を阻害する化合物として、好ましくは当該結合を特異的に阻害する化合物、より好ましくは当該結合を特異的に阻害する低分子量化合物が挙げられる。ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を特異的に阻害するとは、当該結合を強く阻害するが、他の蛋白質間結合は阻害しないか、弱く阻害することを意味する。【００３７】
ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を阻害する化合物として、例えば、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１が結合する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドが例示できる。かかるポリペプチドは、蛋白質間の結合を競合的に阻害し、ひいてはプロカスパーゼ１の多量体化およびプロカスパーゼ１の自己切断を阻害することができる。かかるポリペプチドは、ＮＯＤ２またはプロカスパーゼ１のアミノ酸配列から設計し、自体公知のペプチド合成法により合成したものから、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を阻害するものを選択することにより得ることができる。このように特定されたポリペプチドに、１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入したものも本発明の範囲に包含される。このような変異を導入したポリペプチドは、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を阻害するものが好ましい。変異を有するポリペプチドは天然に存在するものであってよく、また変異を導入したものであってもよい。欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマー（Ｕｌｍｅｒ）の技術（非特許文献１２）を利用できる。このような変異の導入において、当該ポリペプチドの基本的な性質（物性、機能または免疫学的活性等）を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。さらに、これら利用できるポリペプチドは、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。【００３８】
上記ポリペプチドは、ペプチド化学において知られる一般的な方法で製造できる。例えば、成書（非特許文献１３および１４）に記載の方法が例示されるが、これらに限らず公知の方法が広く利用可能である。具体的には、通常の液相法および固相法によるペプチド合成法、例えばＦｍｏｃ法等を挙げることができる。または市販のアミノ酸合成装置を用いて製造可能である。あるいは遺伝子工学的手法により取得することもできる。例えば目的とするポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞中で発現できる組換えＤＮＡ（発現ベクター）を作成し、これを適当な宿主細胞、例えば大腸菌にトランスフェクションして形質転換した後に該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から目的とするポリペプチドを回収することにより製造可能である。【００３９】
ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合の阻害は、ＮＯＤ２またはプロカスパーゼ１を認識する抗体であって、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を阻害する抗体を用いることによっても実施可能である。かかる抗体は、ＮＯＤ２またはプロカスパーゼ１自体、またはこれらの断片ポリペプチド、好ましくはＮＯＤ２とプロカスパーゼ１が結合する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原として自体公知の抗体作製法により得ることができる。【００４０】
ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を阻害する化合物は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して当該化合物の同定方法を構築し、これを使用して取得可能である。例えば、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を可能にする条件を選択し、当該条件下で、調べようとする化合物（被検化合物）とＮＯＤ２および／またはプロカスパーゼ１とを接触させ、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を検出することができるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を阻害する化合物を同定できる。例えばＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合により生じるシグナルまたは該結合のマーカーが、被検化合物をＮＯＤ２および／またはプロカスパーゼ１と接触させたときに消失する、あるいは低減する等の変化を示した場合、当該被検化合物はＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を阻害するものであると判定できる。かかる同定方法において、被検化合物をＮＯＤ２および／またはプロカスパーゼ１と予め接触させ、その後にＮＯＤ２とプロカスパーゼ１を結合させることも可能であり、または被検化合物をこれらの結合の過程に共存させることも可能である。ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を可能にする条件は、インビトロのものであってよく、インビボのものであってもよい。例えば、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１とを共発現させた細胞を用いることもできる。細胞における共発現は、ＮＯＤ２をコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターとプロカスパーゼ１をコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターとを用いて慣用の遺伝子工学的方法でこれらを細胞にトランスフェクションすることにより達成できる。ここでシグナルとは、そのもの自体がその物理的または化学的性質により直接検出され得るものを指し、マーカーとはそのものの物理的または生物学的性質を指標として間接的に検出され得るものを指す。シグナルとしてはルシフェラーゼや放射性同位体等、マーカーとしては、レポーター遺伝子、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等、または検出用のエピトープタグ、例えば６×Ｈｉｓ−ｔａｇ等、公知のものが利用できる。これらシグナルまたはマーカーの検出方法は当業者には周知のものである。ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合は、簡便には、これら蛋白質の存在若しくは不存在の検出および／またはその量の変化の測定により判定可能である。蛋白質の検出あるいは蛋白質量の定量は、自体公知の蛋白質またはペプチドの検出方法、例えばウェスタンブロッティング法等を用いて実施できる。【００４１】
具体的には、例えばＮＯＤ２またはプロカスパーゼ１の一方を固相化し、他方をシグナルで標識化して用いて結合反応を行い、標識シグナルを定量的に測定するといった当業者に知られた一般的なインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）における結合実験系に、被検化合物を加えて評価することにより、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を阻害する化合物を得ることができる。【００４２】
あるいは、実施例２に示したように、ＮＯＤ２遺伝子およびプロカスパーゼ１遺伝子を共発現させた細胞を用いて細胞内における結合反応を検出する試験系に、被検化合物を作用させ、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を免疫沈降法やウェスタンブロッティング等の公知方法で検出することによって、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）においてＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を阻害する化合物を得ることができる。【００４３】
また、公知のツーハイブリッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）法を用いることも可能である。例えば、ＮＯＤ２とＤＮＡ結合蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、プロカスパーゼ１と転写活性化蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、および適切なプロモーター遺伝子に接続したｌａｃＺ等レポーター遺伝子を含有するプラスミドを酵母、真核細胞等に導入し、被検化合物を共存させた場合のレポーター遺伝子の発現量を被検化合物非存在下でのレポーター遺伝子の発現量とを比較することにより達成できる。被検化合物を共存させた場合のレポーター遺伝子の発現量が被検化合物非存在下でのレポーター遺伝子の発現量と比較して減少した場合には、該被検化合物にはＮＯＤ２とプロカスパーゼ１との結合を阻害する作用があると判定できる。【００４４】
ビアコアシステム（ＢＩＡＣＯＲＥ  ｓｙｓｔｅｍ）等の表面プラズモン共鳴センサー、シンチレーションプロキシミティアッセイ法（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ、ＳＰＡ）、あるいは蛍光共鳴エネルギー転移（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）を応用した方法を用いて、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１との結合を阻害する化合物を同定することも可能である。【００４５】
また、ＮＯＤ２によるプロカスパーゼ１の多量体化を可能にする条件を選択し、該条件下でＮＯＤ２および／またはプロカスパーゼ１と被検化合物を接触させ、次いで、ＮＯＤ２によるプロカスパーゼ１の多量体化を検出することのできるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を導入し、このシグナルおよび／またはマーカーの存在、不存在、またはその変化を検出することにより、ＮＯＤ２によるプロカスパーゼ１の多量体化を阻害する化合物を同定可能である。例えば、実施例３に示したように、ＮＯＤ２遺伝子またはプロカスパーゼ１遺伝子を共発現させた細胞を用いて細胞内におけるカスパーゼ１の多量体化を測定する実験系を用いて、ＮＯＤ２によるプロカスパーゼ１の多量体化を阻害する化合物を同定可能である。【００４６】
また、ＮＯＤ２によるプロカスパーゼ１の活性化を可能にする条件を選択し、該条件下でＮＯＤ２および／またはプロカスパーゼ１と被検化合物を接触させ、次いで、ＮＯＤ２によるプロカスパーゼ１の活性化を検出することのできるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を導入し、このシグナルおよび／またはマーカーの存在、不存在、またはその変化を検出することにより、ＮＯＤ２によるプロカスパーゼ１の活性化を阻害する化合物を同定可能である。例えば、実施例４に示したように、ＮＯＤ２遺伝子およびプロカスパーゼ１遺伝子が共発現するＩＬ−１β安定発現細胞外に分泌されるＩＬ−１β量を低減させる、または消滅させる化合物を選択することにより、ＮＯＤ２によるプロカスパーゼ１の活性化を阻害する化合物を同定可能である。ＮＯＤ２によるプロカスパーゼ１の活性化を阻害することにより、プロカスパーゼ１の自己切断によるカスパーゼ１の生成が阻害されるため、該化合物はカスパーゼ１の生成を阻害する化合物としても用い得る。【００４７】
ＮＯＤ２およびプロカスパーゼ１は、これらを遺伝子工学的手法で発現させた細胞、無細胞系合成産物、化学合成産物、または該細胞や生体試料から調製したものであってよく、これらからさらに精製されたものであってもよい。また、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合、およびこれら蛋白質の機能、さらにプロカスパーゼ１からその活性化により生成されるカスパーゼ１の性質等に影響がなければ、Ｎ末側やＣ末側に別の蛋白質やポリペプチド、例えばβ−ガラクトシダーゼ、ＩｇＧ等の免疫グロブリンＦｃ断片、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、またはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のｔａｇペプチド類を、直接的にまたはリンカーペプチド等を介して間接的に、遺伝子工学的手法等を用いて付加したものであってもよい。【００４８】
ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合またはＮＯＤ２によるプロカスパーゼ１の多量体化を阻害する化合物の同定においては、該結合によるプロカスパーゼ１の多量体化に伴うプロカスパーゼ１の自己切断により、該結合または該多量体化の検出が困難になる場合がある。かかる場合は、結合または多量体化を容易に検出するために、ＮＯＤ２と結合して多量体化するが自己切断されないプロカスパーゼ１変異体、例えばそのアミノ酸配列２８５番目のシステインをアラニンに置換した変異体を作製して用いることもできる。【００４９】
被検化合物としては、例えば化学ライブラリーや天然物由来の化合物、またはＮＯＤ２またはプロカスパーゼ１の一次構造や立体構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等が挙げられる。あるいは、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドの構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等も被検化合物として好適である。【００５０】
上記同定方法で得られた化合物は、プロカスパーゼ１の多量体化阻害剤、プロカスパーゼ１の活性化阻害剤およびカスパーゼ１の生成阻害剤として利用可能である。当該化合物は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することにより、医薬組成物として調製可能である。医薬組成物の調製において、これら化合物は、単独で使用することもできるし、複数を組み合わせて使用することも可能である。【００５１】
上記化合物および上記阻害剤はさらに、カスパーゼ１の作用やその増加に基づく疾患の防止剤および／または治療剤、並びに当該疾患の防止方法および／または治療方法に利用可能である。かかる疾患としては、例えば敗血症、炎症性腸疾患、クローン病およびリウマチ等を挙げることができる。【００５２】
敗血症は、細菌や毒素（エンドトキシンやエキソトキシン等）等の刺激によって遊離された炎症性サイトカインによって惹起される生体の過剰な反応、すなわち感染に起因した全身性炎症反応症候群（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）である。カスパーゼ１遺伝子欠損マウスでは、エンドトキシンショックに対する抵抗性が増すことが報告されている（非特許文献１５）。また、カスパーゼ１遺伝子欠損マウスから調製されたマクロファージや単球で、ＬＰＳで誘導されるＩＬ−１βおよびＩＬ−１８の産生がほぼ完全に抑制されることが報告されている（非特許文献４、１５および１６）。これらから、カスパーゼ１の活性を阻害することにより、マクロファージや単球から分泌されるＩＬ−１βおよびＩＬ−１８の産生増加を介して起こるエンドトキシンショックを抑制し得ると考えられる。一方、ＮＯＤ２遺伝子も単球やマクロファージで発現が確認されている（非特許文献９および１０）。したがって、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を阻害し、ひいてはプロカスパーゼ１の多量体化阻害、プロカスパーゼ１の活性化阻害およびカスパーゼ１の生成阻害により敗血症の防止および／または治療が可能になると考える。【００５３】
炎症性腸疾患は、多くは慢性に経過し、難治性の種々の病因（クローン病等）によって生じる大腸や小腸の炎症性疾患を指す。正常マウスにデキストラン硫酸（以下、ＤＳＳと略称する）を慢性投与した場合には大腸炎を発症するが、カスパーゼ１遺伝子欠損マウスにＤＳＳを慢性投与した場合には大腸炎を発症しないこと、ＤＳＳ投与したカスパーゼ１遺伝子欠損マウスから調製した大腸組織培養のＩＬ−１βおよびＩＬ−１８分泌量は、ＤＳＳ投与した正常マウスに比して有意に減少していることが報告されている（非特許文献１７）。これらの結果は、大腸炎の発症・進展にカスパーゼ１活性の増加とそれに伴うＩＬ−１βおよびＩＬ−１８分泌の増加が重要である可能性を示すものである。一方、ＮＯＤ２遺伝子も腸上皮細胞やマクロファージで発現が確認されている（非特許文献１０）。したがって、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を阻害し、ひいてはプロカスパーゼ１の多量体化阻害、プロカスパーゼ１の活性化阻害およびカスパーゼ１の生成阻害により炎症性腸疾患の防止および／または治療が可能になると考える。【００５４】
リウマチは、関節の滑膜に存在するマクロファージから分泌されるサイトカインによって進行し、ＩＬ−１βやＩＬ−１８もリウマチの進行に寄与していることが報告されている（非特許文献１８）。また、コラーゲンで誘導される関節炎モデルマウスにカスパーゼ１阻害剤を投与すると炎症が抑制されることが報告されている（非特許文献１９）。これらの事実は、滑膜のマクロファージにおけるカスパーゼ１活性の増加とそれに伴うＩＬ−１βおよびＩＬ−１８分泌の増加がリウマチの進行に寄与している可能性を示すものである。実際、リウマチ治療薬としてカスパーゼ１阻害剤（Ｐｒａｌｎａｃａｓａｎ、Ｖｅｒｔｅｘ社）が臨床試験第２相の進行中である。ＮＯＤ２が滑膜に存在するマクロファージに発現しているという報告はない。しかしながら、大腸に存在するマクロファージに発現しているという報告がある（非特許文献１０）。したがって、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を阻害し、ひいてはプロカスパーゼ１の多量体化阻害、プロカスパーゼ１の活性化阻害およびカスパーゼ１の生成阻害によりリウマチの防止および／または治療が可能になると考える。【００５５】
本発明に係る疾患の防止剤および／または治療剤として、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１との結合阻害によるプロカスパーゼ１の多量体化阻害、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１との結合阻害によるプロカスパーゼ１の活性化阻害、およびＮＯＤ２とプロカスパーゼ１との結合阻害によるカスパーゼ１生成阻害のうち少なくともいずれか１つの阻害を特徴とする、防止剤および／または治療剤を例示できる。好ましくは、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１との結合阻害によるプロカスパーゼ１の多量体化阻害を特徴とする、防止剤および／または治療剤を挙げられる。かかる疾患として、炎症性疾患、好ましくは、敗血症、炎症性腸疾患、クローン病、リウマチを例示できる。このような防止剤および／または治療剤として、例えば上記プロカスパーゼ１の多量体化阻害剤、上記プロカスパーゼ１の活性化阻害剤、および上記カスパーゼ１の生成阻害剤のうち少なくともいずれか１つを有効成分としてその有効量含む、炎症性疾患の防止剤および／または治療剤を例示することができる。【００５６】
本発明に係る疾患の防止剤および／または治療剤は、上記化合物、上記プロカスパーゼ１の多量体化阻害剤、上記プロカスパーゼ１の活性化阻害剤および上記カスパーゼ１の生成阻害剤のうち少なくともいずれか１つを有効成分としてその有効量含む医薬となしてもよいが、通常は、１種または２種以上の医薬用担体を用いて医薬組成物として製造することが好ましい。【００５７】
本発明に係る医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択されるが、通常約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲とするのが適当である。【００５８】
医薬用担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤や賦形剤等を例示でき、これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択使用される。【００５９】
例えば水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等が挙げられる。これらは、本発明に係る剤形に応じて適宜１種類または２種類以上を組合せて使用される。【００６０】
所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤等を適宜使用して調製することもできる。【００６１】
安定化剤としては、例えばヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体等を例示でき、これらは単独でまたは界面活性剤等と組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。上記Ｌ−アミノ酸は、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸等のいずれでもよい。糖類も特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等およびそれらの誘導体等のいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のいずれでもよい。界面活性剤も特に限定はなく、イオン性および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。これには、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエ−テル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が包含される。【００６２】
緩衝剤としては、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）等を例示できる。【００６３】
等張化剤としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン等を例示できる。【００６４】
キレート剤としては、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸等を例示できる。【００６５】
本発明に係る医薬および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生埋的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することも可能である。【００６６】
医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ乃至１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。上記投与量は１日１〜数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。【００６７】
本発明の医薬組成物を投与するときには、該医薬組成物を単独で使用してもよく、あるいは目的の疾患の防止および／または治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。【００６８】
投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内等への投与を挙げることができる。あるいは経口による投与も可能である。さらに、経粘膜投与または経皮投与も可能である。【００６９】
投与形態としては、各種の形態が目的に応じて選択でき、その代表的なものとしては、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リポソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。【００７０】
さらに本発明は、ＮＯＤ２、ＮＯＤ２をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、および該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれか１つと、プロカスパーゼ１、プロカスパーゼ１をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、および該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれか１つとを含んでなるキットを提供する。当該キットは、例えば本発明に係る同定方法に使用できる。【００７１】
ポリヌクレオチドは、例えばヒトｃＤＮＡライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体は、当該ポリヌクレオチドを適当な発現ＤＮＡベクター、例えば細菌プラスミド由来のベクターに自体公知の遺伝子工学的手法で導入することにより、また得られたベクターを周知の方法で適当な細胞にトランスフェクションすることにより得られる。【００７２】
上記キットは、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を検出するためのシグナルおよび／またはマーカー、緩衝液、並びに塩等、必要とされる物質を含むことができる。さらに、安定化剤および／または防腐剤等の物質を含んでいてもよい。製剤化にあたっては、使用する各物質それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。【００７３】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
【実施例１】
【００７４】
（プロカスパーゼ１と相互作用する機能を有する蛋白質のインシリコでの探索）
プロカスパーゼ１と相互作用する機能を有する蛋白質を、特許文献１に記載の予測方法に従って予測した。すなわち、プロカスパーゼ１のアミノ酸配列をある長さのオリゴペプチドに分解し、各オリゴペプチドのアミノ酸配列あるいはそのアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を持った蛋白質をデータベース中で検索し、得られた蛋白質とプロカスパーゼ１との間でローカルアライメントを行い、ローカルアライメントのスコアの高いものをプロカスパーゼ１と相互作用すると予測した。
解析の結果、プロカスパーゼ１と相互作用する機能を有すると予測される蛋白質として、ＮＯＤ２を見出した。
【実施例２】
【００７５】
（ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合解析）
ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１が結合するか否かを、インビボ  バインディングアッセイにより検討した。【００７６】
＜材料およびその調製＞
本実施例においては、プロカスパーゼ１として、プロカスパーゼ１のアミノ酸配列２８５番目のシステインをアラニンに変換した変異体（Ｃ２８５Ａ）を用いた。プロカスパーゼ１（Ｃ２８５Ａ）は、この１アミノ酸置換により、自己切断が起きない。プロカスパーゼ１（Ｃ２８５Ａ）のオープンリーディングフレーム（以下、ＯＲＦと略称する）をｐＣＭＶ−Ｔａｇ２（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）に挿入し、Ｎ末にＦＬＡＧ−ｔａｇが付加されたプロカスパーゼ１（Ｃ２８５Ａ）〔ＦＬＡＧ−ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１（Ｃ２８５Ａ）〕発現用プラスミドを得た。また、ＮＯＤ２のＯＲＦをｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）に挿入し、Ｃ末にｍｙｃ−Ｈｉｓ−ｔａｇが付加されたＮＯＤ２（ＮＯＤ２−ｍｙｃ−Ｈｉｓ）発現用プラスミドを得た。【００７７】
＜方法＞
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＦＬＡＧ−ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１（Ｃ２８５Ａ）発現用プラスミドのみ、ＮＯＤ２−ｍｙｃ−Ｈｉｓ発現用プラスミドのみ、または両方を組み合わせて、ＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてトランスフェクションした。各発現用プラスミドは、それぞれ２．５μｇずつ用いた。また、ＤＮＡの総量は５μｇとなるようにｐＣＭＶ−Ｔａｇ２またはｐｃＤＮＡ３．１（−）／ｍｙｃ−Ｈｉｓにて調整した。４８時間培養後、０．５ｍｌのリシスバッファー１〔ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ  １：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／０．１％  ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０）〕にて細胞溶解液を作製した。各細胞溶解液にマウスＩｇＧ結合アガロース（ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｇａｒｏｓｅ、Ｓｉｇｍａ社）またはウサギＩｇＧ結合アガロース（Ｓｉｇｍａ社）を添加し、４℃で１時間転倒混和した後、上清を回収した。各上清に抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体結合アガロース（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）または抗ｍｙｃ抗体結合アガロース（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）を添加し、４℃で一晩転倒混和した後、上清を除去して結合画分を回収した。結合画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開後、抗ｍｙｃ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）および抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を用いたウエスタンブロッティングにて各蛋白質を検出した。また、各細胞溶解液についてもウエスタンブロッティングにて各蛋白質を検出した。【００７８】
＜結果＞
図１−Ａに示すように、それぞれの細胞溶解液に目的とする蛋白質が発現していることが確認できた。また、図１−Ｂの左図に示すように、ＮＯＤ２−ｍｙｃ−ＨｉｓとＦＬＡＧ−ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１（Ｃ２８５Ａ）を共発現させた細胞から作製した細胞溶解液について抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を用いて免疫沈降した結果、ＮＯＤ２−ｍｙｃ−Ｈｉｓのバンドが検出された。そのバンド強度は、ＮＯＤ２−ｍｙｃ−Ｈｉｓを単発現させて作製した細胞溶解液を免疫沈降した時に検出されたバンド強度に比して強かったことから、ＮＯＤ２がプロカスパーゼ１と共沈すると考えられた。また同様に、図１−Ｂの右図に示すように抗ｍｙｃ抗体で免疫沈降した結果、ＮＯＤ２−ｍｙｃ−ＨｉｓとＦＬＡＧ−ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１（Ｃ２８５Ａ）を共発現させた細胞溶解液でのみ、ＦＬＡＧ−ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１（Ｃ２８５Ａ）のバンドが検出されたことから、プロカスパーゼ１がＮＯＤ２と共沈すると考えられた。以上の結果から、ＮＯＤ２はプロカスパーゼ１と結合すると結論づけた。
【実施例３】
【００７９】
（ＮＯＤ２によるプロカスパーゼ１の多量体化の促進の検討）
プロカスパーゼ１からカスパーゼ１への活性化は、プロカスパーゼ１の多量体化とそれに伴う自己切断により引き起こされると考えられている。そこで、ＮＯＤ２がプロカスパーゼ１の多量体化にどのような効果を示すか検討を行った【００８０】
＜材料およびその調製＞
各発現用プラスミド
プロカスパーゼ１（Ｃ２８５Ａ）ＯＲＦをｐＣＭＶ−Ｔａｇ３（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）に挿入し、Ｎ末にｍｙｃ−ｔａｇが付加されたプロカスパーゼ１（Ｃ２８５Ａ）〔Ｍｙｃ−ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１（Ｃ２８５Ａ）〕発現用プラスミドを得た。また、ＮＯＤ２  ＯＲＦをｐＣＭＶ−Ｔａｇ５（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）に挿入し、Ｃ末にｍｙｃ−ｔａｇが付加されたＮＯＤ２（ＮＯＤ２−ｍｙｃ）発現用プラスミドを得た。さらに、実施例２と同様の方法で調製したＦＬＡＧ−ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１（Ｃ２８５Ａ）を用いた。【００８１】
＜方法＞
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＦＬＡＧ−ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１（Ｃ２８５Ａ）発現用プラスミド０．５μｇおよびＭｙｃ−ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１（Ｃ２８５Ａ）発現用プラスミド０．５μｇとＮＯＤ２−ｍｙｃ発現用プラスミド０〜１．０μｇとをＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてトランスフェクションした。ＤＮＡの総量は２μｇとなるようにｐＣＭＶ−Ｔａｇ５にて調整した。２４時間培養後、０．２５ｍｌ／ｗｅｌｌのリシスバッファー２〔２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／２ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）／０．５％  ＮＰ−４０〕にて細胞溶解液を作製した。各細胞溶解液０．２ｍｌに抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体結合アガロース１５μｌを添加し、４℃で一晩転倒混和した後、上清を除去してアガロースを回収した。リシスバッファー２を０．５ｍｌ用いてアガロースを２回洗浄後、２×  ＳＤＳサンプルバッファーを１５μｌ加え、１００℃で５分間熱処理した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、抗ｍｙｃ抗体を用いてウエスタンブロッティングを行い、ＦＬＡＧ−ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１（Ｃ２８５Ａ）と結合して共沈するＭｙｃ−ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１（Ｃ２８５Ａ）の量を測定することでプロカスパーゼ１の多量体化の度合いを評価した。また、各細胞溶解液についてウエスタンブロッティングにて各蛋白質の発現量をチェックした。【００８２】
＜結果＞
図２−Ａに示すように、細胞溶解液から抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体により回収された試料において、ＮＯＤ２−ｍｙｃ発現用プラスミド量依存的に抗ｍｙｃ抗体で検出されるバンドの量が増加した。このことは、ＦＬＡＧ−ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１（Ｃ２８５Ａ）と結合するＭｙｃ−ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１（Ｃ２８５Ａ）量が、ＮＯＤ２−ｍｙｃ発現用プラスミド量依存的に増加したことを意味する。また図２−Ｂに示すように、各発現用プラスミドをトランスフェクションした細胞のいずれにおいても、Ｍｙｃ−ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１（Ｃ２８５Ａ）およびＦＬＡＧ−ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１（Ｃ２８５Ａ）がほぼ同量発現していることが確認できた。これらから、ＮＯＤ２がプロカスパーゼ１の多量体化を促進することが明らかになった。
【実施例４】
【００８３】
（細胞内でのカスパーゼ１依存的なｐｒｏＩＬ−１βからＩＬ−１βへの切断とＩＬ−１β分泌に及ぼすＮＯＤ２の効果）
ｐｒｏＩＬ−１β安定発現細胞に、プロカスパーゼ１発現用プラスミドおよび／またはＮＯＤ２発現用プラスミドを導入し、ＮＯＤ２存在下でプロカスパーゼ１からカスパーゼ１への活性化が引き起こされ、細胞内でのｐｒｏＩＬ−１βからＩＬ−１βへの切断および細胞外へのＩＬ−１β分泌量に変化が観察されるか否か検討を行った。【００８４】
＜材料およびその調製＞
１．各発現プラスミドの作成
プロカスパーゼ１  ＯＲＦをｐＣＭＶ−Ｔａｇ２に挿入し、Ｎ末にＦＬＡＧ−ｔａｇが付加されたプロカスパーゼ１（ＦＬＡＧ−ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）発現用プラスミドを得た。また、ＮＯＤ２−ｍｙｃ発現用プラスミドは、実施例３と同様の方法で作製した用いた。ＰｒｏＩＬ−１β  ＯＲＦをｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓに挿入し、Ｃ末にｍｙｃ−Ｈｉｓが付加されたｐｒｏＩＬ−１β発現用プラスミドを得た。【００８５】
２．ｐｒｏＩＬ−１β安定発現細胞の作成
ＨＥＫ２９３細胞に、ｐｒｏＩＬ−１β発現用プラスミドをＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてトランスフェクションした。その後、１ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）含有培地で増殖してくるクローンを選択した。選択したクローンのうち、ｐｒｏＩＬ−１βの発現が認められたクローンを実験に用いた〔ＰｒｏＩＬ−１β安定発現細胞（ＨＥＫ２９３）〕。【００８６】
＜方法＞
１．細胞内でのｐｒｏＩＬ−１βからＩＬ−１βへの切断に及ぼすＮＯＤ２の効果
６ウエルプレートに、ＩＬ−１β安定発現細胞（ＨＥＫ２９３）を５×１０５／ｗｅｌｌ播種して一晩培養後、ＦＬＡＧ−ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１発現用プラスミド０．５μｇおよび／またはＮＯＤ２−ｍｙｃ発現用プラスミド０．１〜２．０μｇをＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてトランスフェクションした。ＤＮＡの総量は２．５μｇとなるようにｐＣＭＶ−Ｔａｇ２またはｐＣＭＶ−Ｔａｇ５にて調整した。２４時間培養後、細胞に０．２５ｍｌ／ｗｅｌｌのリシスバッファー２を加え、細胞溶解液を作製した。【００８７】
各ウエルから調製した細胞溶解液４０μｌに５×  ＳＤＳサンプルバッファー１０μｌを加え、１００℃で５分間熱処理した。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、抗ｍｙｃ抗体を用いてウエスタンブロッティングを行い、ｐｒｏＩＬ−１β、ＩＬ−１βそれぞれの量およびＮＯＤ２量を測定した。また、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてウエスタンブロッティングを行い、プロカスパーゼ−１量を測定した。【００８８】
２．カスパーゼ−１依存的なＩＬ−１β分泌に及ぼすＮＯＤ２の効果
６ウエルプレートに、ＩＬ−１β安定発現細胞（ＨＥＫ２９３）を５×１０５／ｗｅｌｌ播種して一晩培養後、ＦＬＡＧ−ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１発現用プラスミド０．５μｇおよび／またはＮＯＤ２−ｍｙｃ発現用プラスミド０．１〜２．０μｇをＦｕＧｅｎｅ６を用いてトランスフェクションした。ＤＮＡの総量は２．５μｇとなるようにｐＣＭＶ−Ｔａｇ２またはｐＣＭＶ−Ｔａｇ５にて調整した。２４時間培養後、培養上清を回収した。回収した各ウエルの培養上清を１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）含有ＤＭＥＭで２倍希釈し、ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１β  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｂｉｏ  Ｓｏｕｒｃｅ社）を用いて付属のプロトコールに従い、培養上清中のＩＬ−１β量を測定した。【００８９】
＜結果＞
図３に示すように、ＦＬＡＧ−ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１発現プラスミドとＮＯＤ２−ｍｙｃ発現プラスミドとを共発現させた細胞において、ＮＯＤ２−ｍｙｃの発現量依存的に細胞内ＩＬ−１β量の増加が認められた。すなわち、細胞内でのカスパーゼ−１依存的なｐｒｏＩＬ−１βからＩＬ−１βへの切断が、ＮＯＤ２により促進されることが判明した。【００９０】
図４に示すように、ＦＬＡＧ−ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１発現プラスミドとＮＯＤ２−ｍｙｃ発現プラスミドとを共発現させた細胞において、ＮＯＤ２−ｍｙｃ発現プラスミド量依存的に、細胞外へのＩＬ−１β分泌量の増加が認められた。すなわち、カスパーゼ−１依存的なＩＬ−１βの細胞外への分泌が、ＮＯＤ２により促進されることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明は、炎症性疾患、例えば敗血症、炎症性腸疾患、クローン病およびリウマチ等の重篤なあるいは難治性の疾患の防止および／または治療のために利用可能であり、医薬分野において非常に有用性が高い。
【図４】
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【図１−Ａ】
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【図１−Ｂ】
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【図２−Ａ】
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【図２−Ｂ】
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【図３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年6月29日(2005.6.29)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】特許請求の範囲
【請求項１】以下の群より選ばれる阻害方法；
（ｉ）ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害することを特徴とするプロカスパーゼ１の多量体化阻害方法、
（ｉｉ）ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害することを特徴とするプロカスパーゼ１の活性化阻害方法、
および
（ｉｉｉ）ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害することを特徴とするカスパーゼ１（ｃａｓｐａｓｅ−１）の生成阻害方法。
【請求項２】ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害することを特徴とする炎症性疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項３】ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害する化合物を少なくとも１つ用いることを特徴とする炎症性疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項４】炎症性疾患が、敗血症、炎症性腸疾患、クローン病またはリウマチである請求項２または３に記載の防止方法および／または治療方法。
【請求項５】ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害する化合物の同定方法であって、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を可能にする条件下、ＮＯＤ２および／またはプロカスパーゼ１を化合物と接触させ、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を検出することができるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在および／または変化を検出することにより、ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１の結合を阻害するか否かを決定する方法。
【請求項６】以下の群より選ばれる阻害剤；
（ｉ）ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害することを特徴とするプロカスパーゼ１の多量体化阻害剤、
（ｉｉ）ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害することを特徴とするプロカスパーゼ１の活性化阻害剤、
カスパーゼ１（ｃａｓｐａｓｅ−１）の生成阻害剤。
【請求項７】以下の群より選ばれる阻害剤；
（ｉ）ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害する化合物を少なくとも１つ含有するプロカスパーゼ１の多量体化阻害剤、
（ｉｉ）ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害する化合物を少なくとも１つ含有するプロカスパーゼ１の活性化阻害剤、
および
（ｉｉｉ）ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害する化合物を少なくとも１つ含有するカスパーゼ１（ｃａｓｐａｓｅ−１）の生成阻害剤。
【請求項８】ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害することを特徴とする炎症性疾患の防止剤および／または治療剤。
【請求項９】ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合を阻害する化合物を少なくとも１つ含有する炎症性疾患の防止剤および／または治療剤。
【請求項１０】請求項６または７に記載の阻害剤を含有する炎症性疾患の防止剤および／または治療剤。
【請求項１１】炎症性疾患が、敗血症、炎症性腸疾患、クローン病またはリウマチである請求項８から１０のいずれか１項に記載の防止剤および／または治療剤。
【請求項１２】ＮＯＤ２とプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）の結合阻害によるプロカスパーゼ１の多量体化阻害を特徴とする、炎症性疾患の防止剤および／または治療剤。
【請求項１３】炎症性疾患が、敗血症、炎症性腸疾患、クローン病またはリウマチである請求項１２に記載の防止剤および／または治療剤。
【請求項１４】請求項５に記載の同定方法に用いることを特徴とする試薬キットであって、ＮＯＤ２、ＮＯＤ２をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれか１つと、プロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）、プロカスパーゼ１をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれか１つとを含んでなる試薬キット。
【請求項１５】
ＮＯＤ２と配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質のアミノ酸配列第２８５番目がアラニンに置換されているプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−１）変異体の結合を阻害する化合物の同定方法であって、ＮＯＤ２と該変異体の結合を可能にする条件下、ＮＯＤ２および／または該変異体を化合物と接触させ、ＮＯＤ２と該変異体の結合を検出することができるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、該シグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在および／または変化を検出することにより、ＮＯＤ２と該変異体の結合を阻害するか否かを決定する方法。
【国際調査報告】
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