(57)【要約】本発明は、  正確かつ簡便で安全なセンチネルリンパ節の検出剤および検出方法を提供する。本発明によれば、着色成分とヒアルロン酸成分との混合成分により、正確かつ簡便で安全にセンチネルリンパ節を検出することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
着色成分とヒアルロン酸成分との混合成分を主成分とするセンチネルリンパ節の検出剤。
【請求項２】
水溶液状である、請求項１記載のセンチネルリンパ節の検出剤。
【請求項３】
注射用製剤である、請求項１記載のセンチネルリンパ節の検出剤。
【請求項４】
着色成分が濃い色彩を持つ、請求項１記載のセンチネルリンパ節の検出剤。
【請求項５】
着色成分が微粒子状である、請求項１記載のセンチネルリンパ節の検出剤。
【請求項６】
着色成分が、青色色素、緑色色素、鉄磁性体、鉄コロイドまたは着色微粒子である、請求項１記載のセンチネルリンパ節の検出剤。
【請求項７】
ヒアルロン酸成分がヒアルロン酸ナトリウムである、請求項１記載のセンチネルリンパ節の検出剤。
【請求項８】
ヒアルロン酸成分の重量平均分子量が６０万ダルトン〜６００万ダルトンである、請求項１記載のセンチネルリンパ節の検出剤。
【請求項９】
ヒアルロン酸成分の重量平均分子量が１９０万ダルトン〜６００万ダルトンである、請求項１記載のセンチネルリンパ節の検出剤。
【請求項１０】
着色成分とヒアルロン酸成分との混合成分を、癌患者の癌原発巣周辺に投与してなる、センチネルリンパ節の検出方法。
【請求項１１】
着色成分とヒアルロン酸成分との混合成分が水溶液状である、請求項１０記載のセンチネルリンパ節の検出方法。
【請求項１２】
着色成分とヒアルロン酸成分との混合成分が注射用製剤に製剤化されている、請求項１０記載のセンチネルリンパ節の検出方法。
【請求項１３】
着色成分が濃い色彩を持つ、請求項１０記載のセンチネルリンパ節の検出方法。
【請求項１４】
着色成分が微粒子状である、請求項１０記載のセンチネルリンパ節の検出方法。
【請求項１５】
着色成分が、青色色素、緑色色素、鉄磁性体、鉄コロイドまたは着色微粒子である、請求項１０記載のセンチネルリンパ節の検出方法。
【請求項１６】
ヒアルロン酸成分がヒアルロン酸ナトリウムである、請求項１０記載のセンチネルリンパ節の検出方法。
【請求項１７】
ヒアルロン酸成分の重量平均分子量が６０万ダルトン〜６００万ダルトンである、請求項１０記載のセンチネルリンパ節の検出方法。
【請求項１８】
ヒアルロン酸成分の重量平均分子量が１９０万ダルトン〜６００万ダルトンである、請求項１０記載のセンチネルリンパ節の検出方法。
【請求項１９】
着色成分とヒアルロン酸成分との混合成分を主成分とするセンチネルリンパ節の検出剤を製造するためのヒアルロン酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、着色成分とヒアルロン酸成分との混合成分を主成分とするセンチネルリンパ節の検出剤、およびそれを用いたセンチネルリンパ節の検出方法に関する。
【背景技術】  悪性腫瘍の転移は血行性転移とリンパ性転移がある。血行性転移では、癌細胞が血流により様々な臓器に運ばれ転移巣を形成する。一方、リンパ行性転移は、侵入したリンパ管の流域に生じるが、転移があるリンパ節を、術前、術中に正確に把握することは不可能であり、もし転移のあるリンパ節が体内に残れば、癌の再発は避けられない。したがって、癌に対する外科的治療は原発巣と所属リンパ節郭清が原則とされてきた。しかし、所属リンパ節を一塊として切除する手術操作は、時として患者さんのＱＯＬを低下させる場合があり、特にリンパ節転移頻度の低い早期癌などのケースに対するリンパ節郭清の意義が疑問視されてきた。しかし、切除前にリンパ節転移の確定診断が不可能なこと、転移リンパ節の遺残は癌患者にとっては致命的な結果になることが予想されることから、癌の根治性を追求する目的でのリンパ節郭清は、現時点では省略できないと考えられている。
さて、癌病巣からのリンパ流を正確に把握できれば、どのリンパ節に最初に転移が生ずるかの予測が可能である。リンパ節とは、リンパ管網の途中に存在する結節状のリンパ組織で、局所の免疫応答を制御することによって、体内に進入した細菌や有害物質を効率的に排除する機能を果たしている器官である。センチネルリンパ節（Ｓｅｎｔｉｎｅｌ  Ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ：ＳＬＮ）とは、悪性腫瘍の原発巣からのリンパ流を最初にうけるリンパ節のことで、見張りリンパ節または歩哨リンパ節と和訳されている。癌細胞もリンパ管に侵入した後、リンパ流にのってこのリンパ節に到達するが、そこで免疫反応を惹起されるため、このリンパ節を素通りすることは極めて難しく、癌のリンパ行性の転移はＳＬＮに始まると考えられる。そこで、術中にＳＬＮを同定、そのリンパ節だけを生検、ＳＬＮに癌転移が認められば従来通りリンパ節郭清を施行するが、ＳＬＮに転移がなければそれ以外のリンパ節には転移はきたしていないことが予想され従来のリンパ節郭清は省略してよいという治療方針が理論的には成立し、患者さんのＱＯＬを保持したより優れた治療法となりうる。これがセンチネルリンパ節隔清術（ｓｅｎｔｉｎｅｌ  ｎｏｄｅ  ｎａｖｉｇａｔｉｏｎ  ｓｕｒｇｅｒｙ）の概念で、近年、乳癌、悪性黒色腫などで臨床応用されてきつつある。
このｓｅｎｔｉｎｅｌ  ｎｏｄｅ  ｎａｖｉｇａｔｉｏｎ  ｓｕｒｇｅｒｙの臨床応用における最大の問題点は、信頼性の高い術中ＳＬＮの同定法の確立である。この目的で、主としてｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅ  ｃｏｌｌｏｉｄ（ＲＩ）を用いたＲＩ法と色素法とが試行されている。
ＲＩ法はｃｏｌｌｏｉｄ粒子が比較的大きいためリンパ節に留まり易い利点がある。しかしながら、ＲＩ法では特殊な設備、検出用のガンマプローブなどが必要で、一般に普及しにくく、またｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅを用いるため放射線被曝があるという欠点がある。ＲＩ法でのＳＬＮの検出率は、同定率９０−９５％と比較的高いが、完全に満足できる数値には達していない。
一方、色素法はインジゴカルミンやパテントブルーなどの青色色素を癌原発巣周辺に注入し、リンパの流れと最初に染色されるリンパ節を色彩で追うという簡便な方法であり、またｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅを用いないので放射線被曝がないという利点がある。しかしながら、色素はリンパ管から流出する速度が速いため、極めて短時間（約１５分以内）にＳＬＮを同定する必要があり、同定率は概ね７５−８５％と低い傾向がある。これは、対象とする早期癌が、従来のリンパ節郭清によってほぼ１００％完治することを考慮すると、致命的な欠点であるといえる。
したがって、特に解剖学的に複雑なリンパ系を有する臓器の癌に対しては、より正確かつ簡便で安全なＳＬＮの同定法の開発が必要とされている。
一方、ヒアルロン酸は、１９３４年、Ｋ．Ｍｅｙｅｒによって牛の眼の硝子体から単離された生体材料（多糖）であり、細胞外マトリックスの主成分として古くから知られている。ヒアルロン酸は、その化学的、物理的構造に種差が無く、ヒトも代謝系を持っており、免疫性、毒性といった面でも最も安全な生体材料（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ）ということができる。ヒアルロン酸は関節疾患治療薬などの医薬として既に臨床応用されている（アルツ（商品名）、製造  生化学工業株式会社、販売  科研製薬株式会社、スベニール（商品名）：製造販売  中外製薬株式会社）。また、ヒアルロン酸はリンパ系への移行性が高く、局所のリンパ節が主な代謝部位の一つであることが知られている。しかしながら、ヒアルロン酸をセンチネルリンパ節隔清術に応用できるという報告はなされていなかった。
【発明の開示】
発明が解決しようとする課題は、正確かつ簡便なセンチネルリンパ節の検出剤、および正確かつ簡便で安全なセンチネルリンパ節の検出方法を提供することにある。
本発明者は、かかる問題点を解決する為に鋭意研究を進めたところ、着色成分とヒアルロン酸成分との混合成分により、正確かつ簡便で安全にセンチネルリンパ節を検出できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、着色成分とヒアルロン酸成分との混合成分を主成分とするセンチネルリンパ節の検出剤に関する。また、本発明は、着色成分とヒアルロン酸成分との混合成分を、癌患者の癌原発巣周辺に投与してなる、センチネルリンパ節の検出方法にも関する。ここで用いるヒアルロン酸成分としては、特にヒアルロン酸ナトリウムが好ましい。ヒアルロン酸成分の重量平均分子量は、好ましくは６０万ダルトン〜６００万ダルトン、より好ましくは１９０万ダルトン〜６００万ダルトンの範囲にあることが望ましい。本発明の検出剤は、好ましくは水溶液状であり、注射用製剤であることが好ましい。本発明のセンチネルリンパ節の検出剤において用いられる着色成分としては、その該当部位の視認性を良くするために、濃い色彩を持つものが好ましい。また、着色成分は、センチネルリンパ節でのより長い滞留時間を達成するために、微粒子状であることが好ましい。ゆえに、着色成分は、青色色素、緑色色素、鉄磁性体、鉄コロイドまたは着色微粒子から好ましく選択される。
本発明のセンチネルリンパ節の検出剤を用いることで、正確かつ簡便で安全にセンチネルリンパ節を検出することが可能である。
【図面の簡単な説明】  図１は、パテントブルー及びヒアルロン酸を含有する検出剤を適用してから２０分後の所属リンパ管からセンチネルリンパ節までの着色結果を示す図である。
図２は、フェルモキシデス注射液及びヒアルロン酸注入後３時間後のセンチネルリンパ節を示す図である。左図はセンチネルリンパ節を摘出する前の状態を示し、右図は摘出後のセンチネルリンパ節を示す。
図３は、フェルモキシデス注射液及びヒアルロン酸注入後２日後のセンチネルリンパ節を示す図である。左図はセンチネルリンパ節を摘出する前の状態を示し、右図はセンチネルリンパ節切除後の顕微鏡写真を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を更に具体的に説明する。
本発明のセンチネルリンパ節の検出剤は、着色成分とヒアルロン酸成分との混合成分を主成分とするものである。本発明の特徴は、着色成分にヒアルロン酸成分を加えることによって、対象となるセンチネルリンパ節での着色成分の滞留時間が長くなるようにしたことにある。本発明の検出剤においては、好ましくは１時間以上、より好ましくは２時間以上、更に好ましくは２４時間以上着色成分がセンチネルリンパ節を他のリンパ節と肉眼的に区別することができる状態で着色することができる。
本発明において「ヒアルロン酸成分」とは、一般にヒアルロン酸と称されている物質、例えばグルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとを繰り返し単位として含む高分子多糖であればよく、ヒアルロン酸の一部を誘導体化したヒアルロン酸誘導体や、それらの塩なども含まれる。特に限定はされない。例えば平均分子量５万ダルトン〜１０００万ダルトンを有する、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとから成る二糖の重合体である。ヒアルロン酸の塩には、特に限定はされないが、例えばナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、鉄塩、アンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩などが含まれる。ヒアルロン酸およびその塩、並びにそれらの混合物の具体例には、例えば、商品名  スベニール（商標：製造販売  中外製薬株式会社）；商品名  アルツ（商標：製造  生化学工業株式会社、販売  科研製薬株式会社）；商品名  オペガン（商標：製造  生化学工業株式会社、販売  参天製薬株式会社）などが含まれる。本発明において「ヒアルロン酸誘導体」とは、ヒアルロン酸から誘導されるヒアルロン酸骨格を有する物質を意味する。ヒアルロン酸誘導体としては、特に限定はされないが、例えば、ヒアルロン酸中の一つ以上のカルボキシル基がエステル化されている物質（例えば、ベンジルエステル化ヒアルロン酸（商品名  Ｈｙａｆｆ（商標）、Ｆｉｄｉａ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ））、ヒアルロン酸をホルムアルデヒドで架橋しさらに高分子化した物質（例えば、商品名  Ｓｙｎｖｉｓｃ（商標）、Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ））、ヒアルロン酸中の一つ以上の水酸基がアセチル化されているアセチル化ヒアルロン酸、などを包含する。これらのうち、医薬品として繁用されているヒアルロン酸ナトリウムが好ましい。この中でも重量平均分子量６０万ダルトン〜６００万ダルトンのものがより好ましく、重量平均分子量１９０万ダルトン〜６００万ダルトンのものが特に好ましい。
ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は、鶏冠や豚皮下等の生物由来のものを抽出する方法や生物発酵法等の各種公知の方法を用いて製造することができ、或いは市販のものを購入して（例えば、電気化学工業株式会社、株式会社資生堂、生化学工業株式会社等から）入手することも可能である。
着色成分としては、生体に安全で且つ視認性の良いものであれば、如何なる成分でも利用可能である。
バックグラウンドとなる生体の色が黄色であるので、視認性の面からは、着色成分は濃い色彩を持つもの（例えば、緑色、濃緑色などの緑色系統の色；赤褐色、濃褐色、濃赤褐色、暗褐色などの褐色系統の色；青色、紺色、濃紺色などの青色系統の色；黒色、など）が好ましい。この中でも、バックグラウンドと明確に区別できる青色系統の色であることが特に好ましい。
また、滞留性の面からは、着色成分は微粒子状であることが好ましい。微粒子の最大径は、１０ｎｍ〜１００００ｎｍであることが好ましい。
このような色素成分の具体例としては、次のものが挙げられる。既にＳＬＮの同定法（色素法）で利用されている、メチレンブルー、インジゴカルミン、パテントブルー、イソサルファンブルー、パテントブルーなどの青色色素；  インドシアニングリーンなどの緑色色素；  ＭＲＩ用肝臓造影剤として利用されている、フェルモキシデス（商品名  フェリデックス（商標：製造販売  栄研化学株式会社、販売  田辺製薬株式会社）、フェルカルボトラン（商品名  リゾビスト注（商標：製造販売  日本シェーリング株式会社）などの鉄磁性体；  静注用鉄剤として利用されている、コンドロイチン硫酸・鉄コロイド（商品名  ブルタール（商標：製造販売  大日本製薬株式会社、販売  中外製薬株式会社）、コンドロイチン硫酸・鉄コロイド（商品名  アトフェン注（商標：製造販売  宇治製薬株式会社）、シデフェロン（商品名  フェリコン（商標：製造販売  日本臓器製薬株式会社）などの鉄コロイド；  インクジェットプリンタのトナーなどに用いられている、顔料インクなどの着色微粒子。
本発明で用いられる着色成分として、着色材料に、例えば、分散楳及び樹脂を混合することにより適度な粒径を有する微粒子状として分散させたものを使用することができる。このような微粒子分散着色成分を用いることによってセンチネルリンパ節での滞留時間を長期化するこができる。分散媒として用いられる担体液としては、例えば、シクロヘキサン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−ノナン、ｎ−オクタン、イソオクタン、イソドデカン、リグロイン及びそれらの混合物等を使用することができる。樹脂としては、例えば、ポリスチレン樹脂、ポリアクリル樹脂、ポリエステル樹脂、ポリウレタン樹脂、エポキシ樹脂、ポリビニルブチラール樹脂、ポリオレフィン樹脂、シリコーン樹脂、ポリカーボネート樹脂等を用いることができる。このような微粒子分散着色成分に含有させる着色材料としては、前記色素に加え、プリンテックスＶ、プリンテックスＵ、プリンテックスＧ、スペシャルブラック１５、スペシャルブラック４、スペシャルブラック４−Ｂ、（以上デクサ社製）、三菱＃４４、三菱＃３０、三菱ＭＲ−１１、三菱ＭＡ＝１００（以上三菱化成社製）、ラーベン１０３５、ラーベン１２５２、ニュースペクトラＩＩ（以上コロンビアカーボン社製）、リーガル４００、リーガル６００、ブラックパール９００、ブラックパール１１００、ブラックパール１３００、（以上キャボット社製）などのカーボンブラック、酸化亜鉛、酸化チタンのような無機顔料及びフタロシアニンブルー、フタロシアニングリーン、スカイブルー、ローダミンレーキ、マラカイトグリーンレーキ、メチルバイオレットレーキ、ピーコックブルーレーキ、ナフトールグリーンＢ、ナフトールグリーンＹ、ナフトールイエローＳ、ナフトールレッド、リソールファーストイエロー２Ｇ、パーマネントレッド４Ｒ、ブリリアントファストスカーレット、ハンザイエロー、ベンジジンイエロー、リソールレッド、レーキレッドＣ、レーキレッドＤ、ブリリアントカーミン６Ｂ、パーマネントレッドＦ５Ｒ、ピグメントスカーレット３Ｂ、インジゴ、チオインジゴ、オイルピンク及びボルドー１０Ｂなどの有機顔料が用いられる。このような樹脂含有着色成分は、例えば、分散楳５０〜９８重量部、着色材料４０〜０．５重量部、樹脂０．５〜４５重量部に必要に応じて極性制御剤、分散剤等を加え、アトライター、ボールミル、ピンミルなどで粒径０．０１〜５μｍ程度迄分散させて調製することができる。
着色成分とヒアルロン酸成分との混合方法に関しては、均一且つ充分に混合（または分散）できる方法であれば、如何なる方法を用いてもよい。例えば、着色成分として青色色素または緑色色素を用いる場合は、１％ｗ／ｖのヒアルロン酸成分の水溶液と、５％ｗ／ｖの着色成分の水溶液とを準備し、この両者を所望の比率で混合すればよい。着色成分として鉄磁性体または鉄コロイドを用いる場合は、１％ｗ／ｖのヒアルロン酸成分の水溶液と、鉄としての濃度が０．４％ｗ／ｖ〜３％ｗ／ｖである着色成分の水溶液とを準備し、この両者を所望の比率で混合すればよい。着色成分として着色微粒子を用いる場合は、１％ｗ／ｖのヒアルロン酸成分の水溶液と、インクジェットプリンタのトナーなどとして市販されている液状の顔料インクとを準備し、この両者を所望の比率で混合すればよい。混合比としては、何れの場合でもヒアルロン酸成分の水溶液：着色成分の水溶液の容量比で、１：１〜１：１６、好ましくは１：２〜１：８、特に好ましくは１：４である。
本発明のセンチネルリンパ節の検出剤は、水溶液状に製剤化することが好ましく、注射用製剤として製剤化することが特に好ましい。注射用製剤として製剤化するためには、例えば、生理食塩水やリン酸生理食塩水等に所望の濃度に溶解させればよい。この際、必要に応じて、酸又は塩基を加えることにより、溶液を所望のｐＨに調製してもよい。また、ナトリウム塩、カリウム塩等の１価の金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、マンガン塩等の２価の金属塩等の無機塩等を加えることにより、溶液を所望の塩濃度に調製してもよい。更に、所望に応じて、安定化剤等が加えられていてもよい。このようにして調製された、本発明のセンチネルリンパ節の検出剤を溶解させた溶液を、ディスポーザブル注射筒等の注射器に予め充填させた形で流通させてもよい。
本発明のセンチネルリンパ節の検出剤を注射用製剤として投与するに際しては、ヒアルロン酸濃度を０．０１％ｗ／ｖ〜２％ｗ／ｖ、好ましくは０．０５％ｗ／ｖ〜１％ｗ／ｖ、特に好ましくは０．１％ｗ／ｖ〜０．５％ｗ／ｖに調整する。色素成分濃度は、着色成分として青色色素または緑色色素を用いる場合は２．５％ｗ／ｖ〜５％ｗ／ｖ、着色成分として鉄磁性体または鉄コロイドを用いる場合は、鉄としての濃度が０．２％ｗ／ｖ〜３％ｗ／ｖに調整する。この注射用製剤を、１回あたり０．５ｍＬ〜３ｍＬ、センチネルリンパ節の同定前に癌原発巣周辺に投与すればよい。尚、この投与は複数回に分けてもよく、投与量は、医師の指示、対象となる患者、投与部位、原料となるヒアルロン酸の分子量、色素成分の種類等により、それぞれ最適な投与量に適宜増減してもよい。
【実施例】  以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
以下の実施例においては、ヒアルロン酸成分として、平均分子量１９０万〜２５０万のヒアルロン酸ナトリウム（中外製薬株式会社製）を用いた。
〔実施例１〕青色色素とヒアルロン酸成分との混合成分によるセンチネルリンパ節の検出
（１）青色色素とヒアルロン酸成分との混合成分の調製
１％ｗ／ｖのヒアルロン酸ナトリウム水溶液と、パテントブルー（和光純薬工業株式会社製）を注射用水に溶解させて調整した５％ｗ／ｖのパテントブルー水溶液を、１：１、容量比１：２、１：４、１：８または１：１６の割合で混合したものを作成した。
（２）青色色素とヒアルロン酸成分との混合成分によるセンチネルリンパ節の検出
ブタを全身麻酔下に開腹し、上記（１）で作成したヒアルロン酸ナトリウムとパテントブルーの混合物および対照としてパテントブルーのみを、それぞれ胃および小腸の組織内（粘膜下）に０．５ｍＬづつ２ヵ所に注入し、開腹のまま注入後３時間までのリンパ管からリンパ節への移行を色の変化で追及した。さらに、一度、閉腹、１〜２日後、再開腹し、その時点での組織移動を観察した。また、３時間後、および２４時間後のリンパ節の形態を組織学的に検討した。
パテントブルー単独では、注入後数分で胃壁、小腸壁のリンパ管が染まり、直ぐにリンパ節に到達することが確認できたが、２時間以内で、ほとんど所属のリンパ系から消失した。これに対し、ヒアルロン酸を対パテントブルー容量比で１：４以上で混合すると、リンパ系が染色されるのまでの時間には大きな変化はなかったが、注入後２時間でも、所属のリンパ管および最初のリンパ節（ＳＬＮ）内にのみ留まっており、より広範囲への染色は見られなかった。ＳＬＮは、輸入リンパ管の流入部の周辺より染まり始め、２０分後では、一部分のみが染まったセンチネルリンパ節として同定された（図１）。その後ＳＬＮの色調は次第に退色してきたが、閉腹時、および再開腹時（注入後２４時間）でも、ＳＬＮとして他のリンパ節との肉眼的区別が可能であった。
〔実施例２〕鉄磁性体とヒアルロン酸成分との混合物によるセンチネルリンパ節の検出
（１）鉄磁性体とヒアルロン酸成分との混合物の調製
１％ｗ／ｖのヒアルロン酸ナトリウム水溶液と、鉄として１．１２％ｗ／ｖの濃度を有するフェルモキシデス注射液（栄研化学株式会社製）を、容量比１：１、１：２、１：４、１：８または１：１６の割合で混合したものを作成した。
（２）鉄磁性体とヒアルロン酸成分との混合物によるセンチネルリンパ節の検出
ブタを全身麻酔下に開腹し、上記（１）で作成したヒアルロン酸ナトリウムとフェルモキシデス注射液の混合物および対照としてフェルモキシデス注射液のみを、それぞれ胃および小腸の組織内（粘膜下）に０．５ｍＬづつ２ヵ所に注入し、開腹のまま注入後３時間までのリンパ管からリンパ節への移行を色の変化で追及した。さらに、一度、閉腹、１〜２日後、再開腹し、その時点での組織移動を観察した。また、３時間後、および２４時間後のリンパ節の形態を組織学的に検討した。
フェルモキシデス注射液単独では、パテントブルー単独とほぼ同様の時間経過でリンパ管からＳＬＮが周辺部分より黒褐色に染まり始め、３時間後もＳＬＮとして同定されたが、一日後は他のリンパ節も黒色調に染色されており、ＳＬＮと他のリンパ節との区別は不可能であった。しかし、ヒアルロン酸ナトリウムとフェルモキシデス注射液を容量比１：８以上で混合すると、リンパ管からＳＬＮの染色までの時間には大差は認められなかったが、ＳＬＮ内での色調変化のスピードが明らかに遅延し、３時間後でも、ＳＬＮの一部分のみが明瞭に染色されていた（図２）。さらに、２４、４８時間後でも、ＳＬＮのみが黒褐色のリンパ節として他のリンパ節と明瞭に識別できた（図３左）。
上記したリンパ系拡散遅延現象は、ヒアルロン酸ナトリウムとフェルモキシデス注射液を容量比１：１、１：２、または１：４の割合で混合したものの間では、その時間経過には有意な差は認められなかった。しかし、ヒアルロン酸ナトリウムとフェルモキシデス注射液を容量比１：１６以下の割合で混合したものでは、リンパ系拡散遅延現象が明確には認められなかった。但し、ヒアルロン酸ナトリウムとフェルモキシデス注射液を容量比１：２以上の割合で混合したものは、注入時の抵抗が強く粘膜内への注入がやや困難であった。
また、リンパ節の切片の鉄染色を行うと、辺縁洞および髄質のリンパ洞内のマクロファージなどの貪食細胞に活発に取り込まれた鉄磁性体（フェルモキシデス）が確認された。これらの細胞内鉄粒子は、貪食細胞が移動しない限り局所に留まり続けるため、これが長時間にわたるリンパ節の染色性の維持の原因と考えられた（図３右）。
〔実施例３〕鉄磁性体とヒアルロン酸成分との混合物によるセンチネルリンパ節の検出
（１）鉄磁性体とヒアルロン酸成分との混合物の調製
１％ｗ／ｖのヒアルロン酸ナトリウム水溶液と、鉄として２．７９％ｗ／ｖの濃度を有するフェルカルボトラン注射液（日本シェーリング株式会社製）を、容量比１：１、１：２、１：４、１：８または１：１６の割合で混合したものを作成した。
（２）鉄磁性体とヒアルロン酸成分との混合物によるセンチネルリンパ節の検出
ブタを全身麻酔下に開腹し、上記（１）で作成したヒアルロン酸ナトリウムとフェルカルボトラン注射液の混合物および対照としてフェルカルボトラン注射液のみを、それぞれ胃および小腸の組織内（粘膜下）に０．５ｍＬづつ２ヵ所に注入し、開腹のまま注入後３時間までのリンパ管からリンパ節への移行を色の変化で追及した。さらに、一度、閉腹、１〜２日後、再開腹し、その時点での組織移動を観察した。また、３時間後、および２４時間後のリンパ節の形態を組織学的に検討した。
リンパ系への移行経過は実施例２のフェルモキシデスを用いた場合とほぼ同様で、２４時間後も単一のリンパ節に留まっていることが確認された。
〔実施例４〕着色微粒子とヒアルロン酸成分の混合成分によるセンチネルリンパ節の検出
（１）着色微粒子とヒアルロン酸成分の混合成分の調製
１％ｗ／ｖのヒアルロン酸ナトリウム水溶液と、インクジェットプリンタ  商品名「カレイダ（Ｋａｌｅｉｄａ）」（商標：富士フイルムビジネスサプライ株式会社製）シリーズのトナーとして市販されている液状のシアン色顔料インク（富士フイルムビジネスサプライ株式会社製）を、１：４の割合で混合したものを作成した。
（２）着色微粒子とヒアルロン酸成分の混合成分によるセンチネルリンパ節の検出
ブタを全身麻酔下に開腹し、上記（１）で作成したヒアルロン酸ナトリウムと液状のシアン色顔料インクの混合物を、胃および小腸の組織内（粘膜下）に０．５ｍＬづつ２ヵ所に注入し、開腹のまま注入後３時間までのリンパ管からリンパ節への移行を色の変化で追及した。さらに、一度、閉腹、１〜２日後、再開腹し、その時点での組織移動を観察した。また、３時間後、および２４時間後のリンパ節の形態を組織学的に検討した。
その結果、強い染色性が得られ、２４時間後でも明暸にＳＬＮが同定できた。
以上に示したとおり、着色成分とヒアルロン酸成分との混合成分を主成分とする本願のセンチネルリンパ節の検出剤は、色素成分単独の場合と比べて、所属のリンパ管の染色までの時間はそれほど遅延しないが、リンパ系での色素移行速度は著しく低下し、少なくとも注入後１〜２時間の間は、最初に染まるリンパ節は他のリンパ節と十分に判別可能であった。この経過は、術中のＳＬＮ同定には十分な時間的余裕をもたらすと考えられる。
【産業上の利用可能性】  着色成分とヒアルロン酸成分との混合成分を主成分とすることにより、正確かつ簡便で安全なセンチネルリンパ節の検出剤を提供することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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