(57)【要約】  本発明は、生細胞系タンパク質合成に用いる宿主細胞や、無細胞系タンパク質に用いる抽出物の由来生物の種による制限を受けず、ｍＲＮＡの翻訳活性を高め、かつ、温度制御可能であり、特に低温（２０℃未満）における翻訳活性を高める翻訳制御ポリヌクレオチドを提供することを目的とする。このため、（Ａ）アミノ酸配列をコードするｍＲＮＡの３´側に組み込まれ、組み込まれる前に比べて、該ｍＲＮＡの翻訳活性を高め、かつ、組み込まれた後の前記ｍＲＮＡの翻訳活性を、２０℃未満の温度条件下における翻訳活性Ｘと、２０℃以上の温度条件下における翻訳活性Ｙとが、Ｘ／Ｙ≧１の関係を満たすように制御するポリヌクレオチド（ＲＮＡ）、及び（Ｂ）アミノ酸配列をコードする塩基配列の３´側に組み込まれ、組み込まれる前に比べて、該塩基配列の翻訳活性を高め、かつ、組み込まれた後の前記塩基配列の翻訳活性を、２０℃未満の温度条件下における翻訳活性Ｘと、２０℃以上の温度条件下における翻訳活性Ｙとが、Ｘ／Ｙ≧１の関係を満たすように制御するポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を提供する。前記（Ａ）の翻訳制御ポリヌクレオチドは、配列番号１５又は７に示されるポリヌクレオチドであり、前記（Ｂ）の翻訳制御ポリヌクレオチドは、配列番号１２又は１３に示されるポリヌクレオチドである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号１５に示されるＲＮＡ配列、（２）配列番号１５に示されるＲＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（３）配列番号１５に示されるＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかを含み、アミノ酸配列をコードするｍＲＮＡの３´側に組み込まれ、
組み込まれる前に比べて、該ｍＲＮＡの翻訳活性を高め、かつ、
組み込まれた後の前記ｍＲＮＡの翻訳活性を、２０℃未満の温度条件下における翻訳活性Ｘと、２０℃以上の温度条件下における翻訳活性Ｙとが、Ｘ／Ｙ≧１の関係を満たすように制御することを特徴とする翻訳制御ポリヌクレオチド。
（配列番号１５）
uugguucuuu  uaaguguagc  cuccacccga  guugcaagag  gggaacacgc  agucucgccg    60
acccuguugg  caaacaguaa  aauugcaaaa  aauagagugc  uaggaguagu  ucccguaccc    120
gcgggagcaa  gacccuacua  caguagacga  accggcaucg  gacccuggga  aacagguacc    180
uagcguauua  auaggucgcu  agaaaucggg  cgggcuucac  cuucggguaa  cccgccgucg    240
agagggaaaa  ccucugugug  guugugcgca  cgucguuguc  ggaagacucu  cacuguugua    300
guuauuuccu  uuuucuuuua  gguaggagca  cuugcucaga  gggcgcauac  cucugguaaa    360
acaaaauugg  ccccugagag  uagaaaacuc  agguuaauaa  aacaggagaa  uauuuaccua    420
gucguauaac  ggcuagguac  ccc                                              443
【請求項２】
（１）配列番号７に示されるＲＮＡ配列、（２）配列番号７に示されるＲＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（３）配列番号７に示されるＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかを含み、アミノ酸配列をコードするｍＲＮＡの３´側に組み込まれ、
組み込まれる前に比べて、該ｍＲＮＡの翻訳活性を高め、かつ、
組み込まれた後の前記ｍＲＮＡの翻訳活性を、２０℃未満の温度条件下における翻訳活性Ｘと、２０℃以上の温度条件下における翻訳活性Ｙとが、Ｘ／Ｙ≧１の関係を満たすように制御することを特徴とする翻訳制御ポリヌクレオチド。
（配列番号７）
uugguuaauu  gguuagcgca  gccuccaucc  gaguugcaag  agaggaagac  gcagucucgc    60
cgacccuguu  ggcaaacagu  aaaauugcaa  aaaauagagu  guuaggagua  guucccauac    120
ccuuggggac  aagaaccuau  uauggagaaa  cgaacuggca  ucggacccug  ggaaacaggc    180
aucuagcgua  uuaauagguc  gcuagaagac  gggcaggcuu  caccacuagg  uaaccugccg    240
ccgagaggga  aaaccucugu  gugguugugc  gcacgucguu  gucggaagaa  guucaccaua    300
guaguuauuu  ccuuuucuuu  uagguagaag  cacuugcucc  agagggcgca  uaccucuggu    360
uaaacaaaau  uguccccuga  gaguagaaaa  cucagguuaa  uaaaacagga  gaauauuuac    420
cuaguuguau  aacggcuagg  uacccc                                            446
【請求項３】
１７℃における翻訳活性が、２５℃における翻訳活性よりも高くなるように制御する請求項１から２のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
【請求項４】
（１）配列番号３９に示されるＲＮＡ配列、（２）配列番号３９に示されるＲＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（３）配列番号３９に示されるＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む請求項１から３のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
（配列番号３９）
ccugggaaac  agg                                                            13
【請求項５】
（１）配列番号１に示されるＲＮＡ配列、（２）配列番号１に示されるＲＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（３）配列番号１に示されるＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む請求項１から３のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
（配列番号１）
agagggaaaa  ccucu                                                            15
【請求項６】
（１）配列番号３に示されるＲＮＡ配列、（２）配列番号３に示されるＲＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（３）配列番号３に示されるＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む請求項１から３のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
（配列番号３）
gugugguugu  gcgcac                                                          16
【請求項７】
（１）配列番号１３に示されるＲＮＡ配列、（２）配列番号１３に示されるＲＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（３）配列番号１３に示されるＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む請求項１及び３のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
（配列番号１３）
gaaccggcau  cggacccugg  gaaacaggua  ccuagcguau  uaauaggucg  cuagaaaucg    60
ggcgggcuuc  accuucgggu  aacccgccgu  cgagagggaa  aaccucugug  ugguugugcg    120
cacgucguug  ucggaaga                                                      138
【請求項８】
（１）配列番号５に示されるＲＮＡ配列、（２）配列番号５に示されるＲＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（３）配列番号５に示されるＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む請求項２及び３のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
（配列番号５）
gaacuggcau  cggacccugg  gaaacaggca  ucuagcguau  uaauaggucg  cuagaagacg  60
ggcaggcuuc  accacuaggu  aaccugccgc  cgagagggaa  aaccucugug  ugguugugcg  120
cacgucguug  ucggaag                                                      137
【請求項９】
アミノ酸配列をコードするｍＲＮＡの５´側に（１）配列番号１７に示されるＲＮＡ配列、（２）配列番号１７に示されるＲＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（３）配列番号１７に示されるＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかが組み込まれたポリヌクレオチドに組み込まれる請求項１から８のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
（配列番号１７）
gacaaacguu  uuaccgguuu  guaaauagga  gcacacaagc  ucgcuagucg  cccccuucgu    60
aucggggauc  uagagauuaa  acgguauacc  ugucauuuua  aauuucuacu  uuucguacca    120
guc                                                                      123
【請求項１０】
アミノ酸配列をコードするｍＲＮＡの５´側に（１）配列番号９に示されるＲＮＡ配列、（２）配列番号９に示されるＲＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（３）配列番号９に示されるＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかが組み込まれたポリヌクレオチドに組み込まれる請求項１から８のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
（配列番号９）
gaacaaacgu  uuuaccgguu  uguaaauugg  aauucucgaa  uucgccaguc  gccuucuucg    60
uaucaaggau  cuggaauuug  aacgguaucu  uuaucauuuu  aauuucuacu  uuucguacca    120
guc                                                                      123
【請求項１１】
レッドクローバー・ネクロティック・モザイクウィルス（Ｒｅｄ  ｃｌｏｖｅｒ  ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ：ＲＣＮＭＶ）のＲＮＡ１由来の配列である請求項１から１０のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
（１）配列番号１６に示されるＤＮＡ配列、（２）配列番号１６に示されるＤＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（３）配列番号１６に示されるＤＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかを含み、アミノ酸配列をコードする塩基配列の３´側に組み込まれ、
組み込まれる前に比べて、該塩基配列の翻訳活性を高め、かつ、
組み込まれた後の前記塩基配列の翻訳活性を、２０℃未満の温度条件下における翻訳活性Ｘと、２０℃以上の温度条件下における翻訳活性Ｙとが、Ｘ／Ｙ≧１の関係を満たすように制御することを特徴とする翻訳制御ポリヌクレオチド。
（配列番号１６）
ggggtaccta  gccgttatac  gactaggtaa  atattctcct  gttttattaa  cctgagtttt        60
ctactctcag  gggccaattt  tgttttacca  gaggtatgcg  ccctctgagc  aagtgctcct      120
acctaaaaga  aaaaggaaat  aactacaaca  gtgagagtct  tccgacaacg  acgtgcgcac      180
aaccacacag  aggttttccc  tctcgacggc  gggttacccg  aaggtgaagc  ccgcccgatt      240
tctagcgacc  tattaatacg  ctaggtacct  gtttcccagg  gtccgatgcc  ggttcgtcta      300
ctgtagtagg  gtcttgctcc  cgcgggtacg  ggaactactc  ctagcactct  attttttgca      360
attttactgt  ttgccaacag  ggtcggcgag  actgcgtgtt  cccctcttgc  aactcgggtg      420
gaggctacac  ttaaaagaac  caa                                                443
【請求項１３】
（１）配列番号８に示されるＤＮＡ配列、（２）配列番号８に示されるＤＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（３）配列番号８に示されるＤＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかを含み、アミノ酸配列をコードする塩基配列の３´側に組み込まれ、
組み込まれる前に比べて、該塩基配列の翻訳活性を高め、かつ、
組み込まれた後の前記塩基配列の翻訳活性を、２０℃未満の温度条件下における翻訳活性Ｘと、２０℃以上の温度条件下における翻訳活性Ｙとが、Ｘ／Ｙ≧１の関係を満たすように制御することを特徴とする翻訳制御ポリヌクレオチド。
（配列番号８）
ggggtaccta  gccgttatac  aactaggtaa  atattctcct  gttttattaa  cctgagtttt      60
ctactctcag  gggacaattt  tgtttaacca  gaggtatgcg  ccctctggag  caagtgcttc      120
tacctaaaag  aaaaggaaat  aactactatg  gtgaacttct  tccgacaacg  acgtgcgcac      180
aaccacacag  aggttttccc  tctcggcggc  aggttaccta  gtggtgaagc  ctgcccgtct      240
tctagcgacc  tattaatacg  ctagatgcct  gtttcccagg  gtccgatgcc  agttcgtttc      300
tccataatag  gttcttgtcc  ccaagggtat  gggaactact  cctaacactc  tattttttgc      360
aattttactg  tttgccaaca  gggtcggcga  gactgcgtct  tcctctcttg  caactcggat      420
ggaggctgcg  ctaaccaatt  aaccaa                                              446
【請求項１４】
１７℃における翻訳活性が、２５℃における翻訳活性よりも高くなるように制御する請求項１２から１３に記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
（１）配列番号４０に示されるＤＮＡ配列、（２）配列番号４０に示されるＤＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（３）配列番号４０に示されるＤＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む請求項１２から１４のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
（配列番号４０）
cctgtttccc  agg                                                            13
【請求項１６】
（１）配列番号２に示されるＤＮＡ配列、（２）配列番号２に示されるＤＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（３）配列番号２に示されるＤＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む請求項１２から１４のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
（配列番号２）
agaggttttc  cctct                                                          15
【請求項１７】
（１）配列番号４に示されるＤＮＡ配列、（２）配列番号４に示されるＤＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（３）配列番号４に示されるＤＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む請求項１２から１４のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
（配列番号４）
gtgcgcacaa  ccacac                                                          16
【請求項１８】
（１）配列番号１４に示されるＤＮＡ配列、（２）配列番号１４に示されるＤＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（３）配列番号１４に示されるＤＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む請求項１２及び１４のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
（配列番号１４）
tcttccgaca  acgacgtgcg  cacaaccaca  cagaggtttt  ccctctcgac  ggcgggttac      60
ccgaaggtga  agcccgcccg  atttctagcg  acctattaat  acgctaggta  cctgtttccc      120
agggtccgat  gccggttc                                                        138
【請求項１９】
（１）配列番号６に示されるＤＮＡ配列、（２）配列番号６に示されるＤＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（３）配列番号６に示されるＤＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む請求項１３及び１４のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
（配列番号６）
cttccgacaa  cgacgtgcgc  acaaccacac  agaggttttc  cctctcggcg  gcaggttacc      60
tagtggtgaa  gcctgcccgt  cttctagcga  cctattaata  cgctagatgc  ctgtttccca      120
gggtccgatg  ccagttc                                                          137
【請求項２０】
アミノ酸配列をコードする塩基配列の５´側に（１）配列番号１８に示されるＤＮＡ配列、（２）配列番号１８に示されるＤＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（３）配列番号１８に示されるＤＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかが組み込まれたポリヌクレオチドに組み込まれる請求項１２から１９のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
（配列番号１８）
gactggtacg  aaaagtagaa  atttaaaatg  acaggtatac  cgtttaatct  ctagatcccc      60
gatacgaagg  gggcgactag  cgagcttgtg  tgctcctatt  tacaaaccgg  taaaacgttt      120
gtc                                                                          123
【請求項２１】
アミノ酸配列をコードする塩基配列の５´側に（１）配列番号１０に示されるＤＮＡ配列、（２）配列番号１０に示されるＤＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（３）配列番号１０に示されるＤＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかが組み込まれたポリヌクレオチドに組み込まれる請求項１２から１９のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
（配列番号１０）
gactggtacg  aaaagtagaa  attaaaatga  taaagatacc  gttcaaattc  cagatccttg      60
atacgaagaa  ggcgactggc  gaattcgaga  attccaattt  acaaaccggt  aaaacgtttg      120
ttc                                                                          123
【請求項２２】
レッドクローバー・ネクロティック・モザイクウィルス（Ｒｅｄ  ｃｌｏｖｅｒ  ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ：ＲＣＮＭＶ）のＲＮＡ１由来の配列に対するｃＤＮＡである請求項１２から２１のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
【請求項２３】
１７℃以下の温度条件下において翻訳活性が最大となるように翻訳制御する請求項１から２２のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
【請求項２４】
アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドの非翻訳領域に組み込まれる請求項１から２３のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
【請求項２５】
請求項１から２４のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドを含むことを特徴とする組換えベクター。
【請求項２６】
請求項１から２４のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド、及び請求項２５に記載の組換えベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とする形質転換体。
【請求項２７】
動物細胞、植物細胞、菌類、及び酵母から選択される請求項２６に記載の形質転換体。
【請求項２８】
請求項１から２４のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドを用いることを特徴とするタンパク質合成方法。
【請求項２９】
請求項２５に記載の組換えベクターを用いることを特徴とするタンパク質合成方法。
【請求項３０】
無細胞タンパク質合成系で行われる請求項２８から２９のいずれかに記載のタンパク質合成方法。
【請求項３１】
コムギ胚芽抽出物を用いて行われる請求項３０に記載のタンパク質合成方法。
【請求項３２】
真核生物の細胞を用いて行われる請求項２８から２９のいずれかに記載のタンパク質合成方法。
【請求項３３】
大腸菌を用いて行われる請求項２８から２９のいずれかに記載のタンパク質合成方法。
【請求項３４】
１７℃以下の温度条件下で行われる請求項２８から３３のいずれかに記載のタンパク質合成方法。
【請求項３５】
請求項１から２４のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドを少なくとも含むことを特徴とするｉｎ  ｖｉｔｒｏ系翻訳キット。
【請求項３６】
コムギ胚芽抽出物を含む請求項３５に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ系翻訳キット。
【請求項３７】
請求項１から２４のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドを用い、アミノ酸を合成させる合成手段を少なくとも有することを特徴とするタンパク質合成装置。
【請求項３８】
合成手段がコムギ胚芽抽出物を使用する請求項３７に記載のタンパク質合成装置。
【請求項３９】
温度制御手段を有する請求項３７から３８のいずれかに記載のタンパク質合成装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、温度に依存して翻訳活性を制御する翻訳制御ポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、及び該組換えベクターを含む形質転換体、並びに、タンパク質合成方法、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系翻訳キット、タンパク質合成装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、遺伝子組換え技術を用いた有用タンパク質の合成や、植物の品種改良等が広く行われている。
遺伝子組換え技術におけるタンパク質の合成方法としては、例えば、生細胞である宿主細胞に、目的のタンパク質をコードする塩基配列を含む発現ベクター等を導入し、前記宿主細胞を形質転換させ、前記目的のタンパク質を発現させる方法等が挙げられる。
前記宿主細胞に前記目的のタンパク質を効率よく生産させるために、例えば、前記目的のタンパク質をコードする塩基配列を含む遺伝子のプロモーターを改良し、さらに宿主細胞を培養する培地の成分の濃度を調整することによりｍＲＮＡの転写活性を制御する方法（例えば、特許文献１参照）や、特定のＲＮＡ配列を利用してタンパク質の翻訳を促進させる方法（例えば、特許文献２参照）等の手法がとられてきた。【０００３】
一方、近年では、宿主細胞内で行われるタンパク質合成を、生体外で行わせる方法として、無細胞系タンパク質合成が研究され、実用化に向けた改良が行われている。前記無細胞系タンパク質合成の方法としては、例えば、大腸菌やコムギ胚芽等から、リボソーム、ｔＲＮＡ合成酵素、翻訳開始因子等を含む抽出物を調製し、該抽出物に鋳型となるＲＮＡやエネルギー源を加え、試験管内でタンパク質合成を行わせる方法が挙げられ、効率よくタンパク質を合成する方法が提案されている（例えば、特許文献３参照）。
前記無細胞系タンパク質合成は、宿主細胞の形質転換や、細胞の破砕等の工程が不要であることに加え、宿主細胞を用いた系に比べ、合成させることが困難なタンパク質の種類が少ない等の利点がある。【０００４】
これらのタンパク質合成方法において、活性のあるタンパク質を効率よく大量に得ることは容易ではなく、改良技術が求められている。そのための手法として、例えば、温度制御が挙げられる。タンパク質合成を温度により制御する方法は、特別な試薬などが不要であり、環境の影響を直接受けるような屋外で生育する動植物にも応用可能であることから、極めて有効である。【０００５】
真核生物由来の目的タンパク質を合成する場合、これらのタンパク質は、一般的な宿主細胞の培養温度の範囲内に活性を有するため、宿主細胞内で発現させることにより、該宿主細胞の生育を阻害し、その結果、十分な量のタンパク質が得られないことがあるため、低温条件下で合成を行うことが望まれる。無細胞系タンパク質合成においても、同様に、合成された活性を有する目的タンパク質が、翻訳に関与する因子やタンパク質に悪影響を与えることがある。
また、大腸菌を使用した場合、一般的な培養温度である３７℃よりも低い温度で培養を行うと、活性型タンパク質の発現量が増加することが知られており、さらに、この他にも、好適生育温度範囲が２０℃未満の動植物由来のタンパク質を合成する場合にも、低温条件下で行うことにより、効率よく活性のあるタンパク質が合成できると考えられる。このように、タンパク質合成における温度制御としては、例えば、低温条件下において合成を促進させる技術が有効であると考えられる。【０００６】
低温条件下でタンパク質合成を行う方法として、例えば、低温でタンパク質を発現させるベクターや、プロモーター配列等が提案されているが、宿主細胞や、無細胞系タンパク質に用いる抽出物の由来生物の種による制限を受けず、ｍＲＮＡの翻訳活性を温度制御可能な因子は未だ満足なものは提供されていないのが現状である。【０００７】
ところで、本発明の発明者らは、レッド・クローバー・ネクロティック・モザイク・ウイルス（Ｒｅｄ  Ｃｌｏｖｅｒ  Ｎｅｃｒｏｔｉｃ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓ、以下「ＲＣＮＭＶ」と略称することがある）の遺伝子の複製に、温度依存性があることを見出し、発表している（非特許文献１参照）。具体的には、ＲＣＮＭＶの遺伝子であるＲＮＡ１を植物プロトプラストに接種した場合、ＲＣＮＭＶのオーストラリア株ＲＮＡ１は、１７℃及び２５℃のいずれでも自己複製できるのに対し、ＲＣＮＭＶのカナダ株のＲＮＡ１は、１７℃で自己複製できるが、２５℃では自己複製できないことを見出したのである。【０００８】
本発明者らは、ＲＣＮＭＶの遺伝子の「複製」に温度依存性があることを見出し、発表したが、前記非特許文献１において、ＲＣＮＭＶの遺伝子の「翻訳」の温度依存性については開示していない。一般に、遺伝子の「複製」と「翻訳」とは、以下に示す通り、まったく異なるものである。
ＲＮＡウイルスの遺伝子（ゲノムＲＮＡ）の「複製」過程は、
１）細胞に侵入したゲノムＲＮＡからのウイルスＲＮＡ複製酵素タンパク質の翻訳、
２）ウイルスＲＮＡ複製酵素タンパク質のゲノムＲＮＡ（特に３´−ＵＴＲ）の認識、
３）ゲノムＲＮＡからのマイナス鎖ＲＮＡ（ゲノムＲＮＡに相補的配列を持つＲＮＡ）の合成、
４）マイナス鎖ＲＮＡを鋳型としたゲノムＲＮＡの合成
という、４つに大別され、これらの中でいずれかの過程が進行しない場合には、ウイルスの遺伝子であるＲＮＡは「複製」されない。
本発明者らは、２５℃で複製できない前記カナダ株のＲＮＡ１における５´−ＵＴＲ及び３´−ＵＴＲを有するｌｕｃ  ｍＲＮＡが、１７℃よりは程度は劣るものの２５℃でもキャップ非依存性の翻訳活性を示す結果を得た。この翻訳活性は、キャップ及びポリ(Ａ)を有する通常のｍＲＮＡの翻訳活性に比べても約１０倍も高く、２５℃でも十分な量のウイルスタンパク質が翻訳されることを示唆している。このことからＲＮＡ１のウイルスタンパク質の翻訳が、「複製」と同様の温度依存性を示すものではないことは明らかである。
また、ＲＣＮＭＶのＲＮＡ１の合成活性（上記４）の過程）は、１７℃よりも２５℃の方が高いことから、ＲＮＡ１の「複製」の温度感受性は、上記２）ウイルスＲＮＡ複製酵素タンパク質のゲノムＲＮＡ（特に３´−ＵＴＲ）の認識の過程、又は上記３）ゲノムＲＮＡからのマイナス鎖ＲＮＡの合成の過程、のいずれかに関与するものと考えられる。
一般的に、翻訳の過程は、ｍＲＮＡにリボソームが結合し、ｔＲＮＡにより誘導されたアミノ酸が連結されてペプチド乃至タンパク質が合成される過程からなり、これらは「複製」の過程と異なるものである。また、該翻訳におけるメカニズム、必要とされる因子や物質も、前記「複製」とは異なるのものである。【０００９】
【特許文献１】特開２００２−３２０４９５号公報
【特許文献２】特許第２８１４４３３号公報
【特許文献３】特開２００２−３３８５９７号公報
【非特許文献１】Hiroyuki  Mizumoto,  Yasufumi  Hikichi,  and  Tetsuro  Okuno,  Viology  293(2002),  p320-327
【発明の開示】
【００１０】
本発明は従来における前記問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、生細胞系タンパク質合成に用いる宿主細胞や、無細胞系タンパク質に用いる抽出物の由来生物の種による制限を受けず、ｍＲＮＡの翻訳活性を高め、かつ、温度制御可能であり、特に低温（２０℃未満）における翻訳活性を高める翻訳制御ポリヌクレオチドを提供することを目的とする。
また、該翻訳制御ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、前記翻訳制御ポリヌクレオチド及び該組換えベクターのいずれかが導入された形質転換体、前記翻訳制御ポリヌクレオチドを用いたタンパク質合成方法、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系翻訳キット、並びにタンパク質合成装置を提供することを目的とする。
【００１１】
前記課題を解決するため、本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、ゲノムＲＮＡの複製において温度依存性を示したレッド・クローバー・ネクロティック・モザイク・ウイルス（Ｒｅｄ  Ｃｌｏｖｅｒ  Ｎｅｃｒｏｔｉｃ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓ、ＲＣＮＭＶ）のＲＮＡ１が、その非翻訳領域に、翻訳活性を高め、特に、２０℃未満の温度条件下における翻訳活性を高める領域を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  （１）配列番号１５に示されるＲＮＡ配列、（２）配列番号１５に示されるＲＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（３）配列番号１５に示されるＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかを含み、アミノ酸配列をコードするｍＲＮＡの３´側に組み込まれ、
組み込まれる前に比べて、該ｍＲＮＡの翻訳活性を高め、かつ、
組み込まれた後の前記ｍＲＮＡの翻訳活性を、２０℃未満の温度条件下における翻訳活性Ｘと、２０℃以上の温度条件下における翻訳活性Ｙとが、Ｘ／Ｙ≧１の関係を満たすように制御することを特徴とする翻訳制御ポリヌクレオチドである。
（配列番号１５）
uugguucuuu  uaaguguagc  cuccacccga  guugcaagag  gggaacacgc  agucucgccg  60
acccuguugg  caaacaguaa  aauugcaaaa  aauagagugc  uaggaguagu  ucccguaccc  120
gcgggagcaa  gacccuacua  caguagacga  accggcaucg  gacccuggga  aacagguacc  180
uagcguauua  auaggucgcu  agaaaucggg  cgggcuucac  cuucggguaa  cccgccgucg  240
agagggaaaa  ccucugugug  guugugcgca  cgucguuguc  ggaagacucu  cacuguugua  300
guuauuuccu  uuuucuuuua  gguaggagca  cuugcucaga  gggcgcauac  cucugguaaa  360
acaaaauugg  ccccugagag  uagaaaacuc  agguuaauaa  aacaggagaa  uauuuaccua  420
gucguauaac  ggcuagguac  ccc                             443
＜２＞  （１）配列番号７に示されるＲＮＡ配列、（２）配列番号７に示されるＲＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（３）配列番号７に示されるＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかを含み、アミノ酸配列をコードするｍＲＮＡの３´側に組み込まれ、
組み込まれる前に比べて、該ｍＲＮＡの翻訳活性を高め、かつ、
組み込まれた後の前記ｍＲＮＡの翻訳活性を、２０℃未満の温度条件下における翻訳活性Ｘと、２０℃以上の温度条件下における翻訳活性Ｙとが、Ｘ／Ｙ≧１の関係を満たすように制御することを特徴とする翻訳制御ポリヌクレオチドである。
（配列番号７）
uugguuaauu  gguuagcgca  gccuccaucc  gaguugcaag  agaggaagac  gcagucucgc  60
cgacccuguu  ggcaaacagu  aaaauugcaa  aaaauagagu  guuaggagua  guucccauac  120
ccuuggggac  aagaaccuau  uauggagaaa  cgaacuggca  ucggacccug  ggaaacaggc  180
aucuagcgua  uuaauagguc  gcuagaagac  gggcaggcuu  caccacuagg  uaaccugccg  240
ccgagaggga  aaaccucugu  gugguugugc  gcacgucguu  gucggaagaa  guucaccaua  300
guaguuauuu  ccuuuucuuu  uagguagaag  cacuugcucc  agagggcgca  uaccucuggu  360
uaaacaaaau  uguccccuga  gaguagaaaa  cucagguuaa  uaaaacagga  gaauauuuac  420
cuaguuguau  aacggcuagg  uacccc                                          446
＜３＞  １７℃における翻訳活性が、２５℃における翻訳活性よりも高くなるように制御する前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
＜４＞  （１）配列番号３９に示されるＲＮＡ配列、（２）配列番号３９に示されるＲＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（３）配列番号３９に示されるＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
（配列番号３９）
ccugggaaac  agg                                                            13
＜５＞  （１）配列番号１に示されるＲＮＡ配列、（２）配列番号１に示されるＲＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（３）配列番号１に示されるＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
（配列番号１）
agagggaaaa  ccucu                                                            15
＜６＞  （１）配列番号３に示されるＲＮＡ配列、（２）配列番号３に示されるＲＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（３）配列番号３に示されるＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
（配列番号３）
gugugguugu  gcgcac                                                          16
＜７＞  （１）配列番号１３に示されるＲＮＡ配列、（２）配列番号１３に示されるＲＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（３）配列番号１３に示されるＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む前記＜１＞及び＜３＞のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
（配列番号１３）
gaaccggcau  cggacccugg  gaaacaggua  ccuagcguau  uaauaggucg  cuagaaaucg    60
ggcgggcuuc  accuucgggu  aacccgccgu  cgagagggaa  aaccucugug  ugguugugcg    120
cacgucguug  ucggaaga                                                      138
＜８＞  （１）配列番号５に示されるＲＮＡ配列、（２）配列番号５に示されるＲＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（３）配列番号５に示されるＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む前記＜２＞及び＜３＞のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
（配列番号５）
gaacuggcau  cggacccugg  gaaacaggca  ucuagcguau  uaauaggucg  cuagaagacg    60
ggcaggcuuc  accacuaggu  aaccugccgc  cgagagggaa  aaccucugug  ugguugugcg    120
cacgucguug  ucggaag                                                        137
＜９＞  アミノ酸配列をコードするｍＲＮＡの５´側に（１）配列番号１７に示されるＲＮＡ配列、（２）配列番号１７に示されるＲＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（３）配列番号１７に示されるＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかが組み込まれたポリヌクレオチドに組み込まれる前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
（配列番号１７）
gacaaacguu  uuaccgguuu  guaaauagga  gcacacaagc  ucgcuagucg  cccccuucgu    60
aucggggauc  uagagauuaa  acgguauacc  ugucauuuua  aauuucuacu  uuucguacca    120
guc                                                                      123
＜１０＞  アミノ酸配列をコードするｍＲＮＡの５´側に（１）配列番号９に示されるＲＮＡ配列、（２）配列番号９に示されるＲＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（３）配列番号９に示されるＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかが組み込まれたポリヌクレオチドに組み込まれる前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
（配列番号９）
gaacaaacgu  uuuaccgguu  uguaaauugg  aauucucgaa  uucgccaguc  gccuucuucg  60
uaucaaggau  cuggaauuug  aacgguaucu  uuaucauuuu  aauuucuacu  uuucguacca  120
guc                                                                     123
＜１１＞  レッドクローバー・ネクロティック・モザイクウィルス（Ｒｅｄ  ｃｌｏｖｅｒ  ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ：ＲＣＮＭＶ）のＲＮＡ１由来の配列である前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
【００１３】
＜１２＞  （１）配列番号１６に示されるＤＮＡ配列、（２）配列番号１６に示されるＤＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（３）配列番号１６に示されるＤＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかを含み、アミノ酸配列をコードする塩基配列の３´側に組み込まれ、
組み込まれる前に比べて、該塩基配列の翻訳活性を高め、かつ、
組み込まれた後の前記塩基配列の翻訳活性を、２０℃未満の温度条件下における翻訳活性Ｘと、２０℃以上の温度条件下における翻訳活性Ｙとが、Ｘ／Ｙ≧１の関係を満たすように制御することを特徴とする翻訳制御ポリヌクレオチドである。
（配列番号１６）
ggggtaccta  gccgttatac  gactaggtaa  atattctcct  gttttattaa  cctgagtttt      60
ctactctcag  gggccaattt  tgttttacca  gaggtatgcg  ccctctgagc  aagtgctcct      120
acctaaaaga  aaaaggaaat  aactacaaca  gtgagagtct  tccgacaacg  acgtgcgcac      180
aaccacacag  aggttttccc  tctcgacggc  gggttacccg  aaggtgaagc  ccgcccgatt      240
tctagcgacc  tattaatacg  ctaggtacct  gtttcccagg  gtccgatgcc  ggttcgtcta      300
ctgtagtagg  gtcttgctcc  cgcgggtacg  ggaactactc  ctagcactct  attttttgca      360
attttactgt  ttgccaacag  ggtcggcgag  actgcgtgtt  cccctcttgc  aactcgggtg      420
gaggctacac  ttaaaagaac  caa                                                443
＜１３＞  （１）配列番号８に示されるＤＮＡ配列、（２）配列番号８に示されるＤＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（３）配列番号８に示されるＤＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかを含み、アミノ酸配列をコードする塩基配列の３´側に組み込まれ、
組み込まれる前に比べて、該塩基配列の翻訳活性を高め、かつ、
組み込まれた後の前記塩基配列の翻訳活性を、２０℃未満の温度条件下における翻訳活性Ｘと、２０℃以上の温度条件下における翻訳活性Ｙとが、Ｘ／Ｙ≧１の関係を満たすように制御することを特徴とする翻訳制御ポリヌクレオチドである。
（配列番号８）
ggggtaccta  gccgttatac  aactaggtaa  atattctcct  gttttattaa  cctgagtttt      60
ctactctcag  gggacaattt  tgtttaacca  gaggtatgcg  ccctctggag  caagtgcttc      120
tacctaaaag  aaaaggaaat  aactactatg  gtgaacttct  tccgacaacg  acgtgcgcac      180
aaccacacag  aggttttccc  tctcggcggc  aggttaccta  gtggtgaagc  ctgcccgtct      240
tctagcgacc  tattaatacg  ctagatgcct  gtttcccagg  gtccgatgcc  agttcgtttc      300
tccataatag  gttcttgtcc  ccaagggtat  gggaactact  cctaacactc  tattttttgc      360
aattttactg  tttgccaaca  gggtcggcga  gactgcgtct  tcctctcttg  caactcggat      420
ggaggctgcg  ctaaccaatt  aaccaa                                              446
＜１４＞  １７℃における翻訳活性が、２５℃における翻訳活性よりも高くなるように制御する前記＜１２＞から＜１３＞に記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
＜１５＞  （１）配列番号４０に示されるＤＮＡ配列、（２）配列番号４０に示されるＤＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（３）配列番号４０に示されるＤＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む前記＜１２＞から＜１４＞のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
（配列番号４０）
cctgtttccc  agg                                                            13
＜１６＞  （１）配列番号２に示されるＤＮＡ配列、（２）配列番号２に示されるＤＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（３）配列番号２に示されるＤＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む前記＜１２＞から＜１４＞のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
（配列番号２）
agaggttttc  cctct                                                          15
＜１７＞  （１）配列番号４に示されるＤＮＡ配列、（２）配列番号４に示されるＤＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（３）配列番号４に示されるＤＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む前記＜１２＞から＜１４＞のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
（配列番号４）
gtgcgcacaa  ccacac                                                          16
＜１８＞  （１）配列番号１４に示されるＤＮＡ配列、（２）配列番号１４に示されるＤＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（３）配列番号１４に示されるＤＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む前記＜１２＞及び＜１４＞のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
（配列番号１４）
tcttccgaca  acgacgtgcg  cacaaccaca  cagaggtttt  ccctctcgac  ggcgggttac      60
ccgaaggtga  agcccgcccg  atttctagcg  acctattaat  acgctaggta  cctgtttccc      120
agggtccgat  gccggttc                                                        138
＜１９＞  （１）配列番号６に示されるＤＮＡ配列、（２）配列番号６に示されるＤＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（３）配列番号６に示されるＤＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む前記＜１３＞及び＜１４＞のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
（配列番号６）
cttccgacaa  cgacgtgcgc  acaaccacac  agaggttttc  cctctcggcg  gcaggttacc      60
tagtggtgaa  gcctgcccgt  cttctagcga  cctattaata  cgctagatgc  ctgtttccca      120
gggtccgatg  ccagttc                                                          137
＜２０＞  アミノ酸配列をコードする塩基配列の５´側に（１）配列番号１８に示されるＤＮＡ配列、（２）配列番号１８に示されるＤＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（３）配列番号１８に示されるＤＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかが組み込まれたポリヌクレオチドに組み込まれる前記＜１２＞から＜１９＞のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
（配列番号１８）
gactggtacg  aaaagtagaa  atttaaaatg  acaggtatac  cgtttaatct  ctagatcccc      60
gatacgaagg  gggcgactag  cgagcttgtg  tgctcctatt  tacaaaccgg  taaaacgttt      120
gtc                                                                          123
＜２１＞  アミノ酸配列をコードする塩基配列の５´側に（１）配列番号１０に示されるＤＮＡ配列、（２）配列番号１０に示されるＤＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（３）配列番号１０に示されるＤＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかが組み込まれたポリヌクレオチドに組み込まれる前記＜１２＞から＜１９＞のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
（配列番号１０）
gactggtacg  aaaagtagaa  attaaaatga  taaagatacc  gttcaaattc  cagatccttg      60
atacgaagaa  ggcgactggc  gaattcgaga  attccaattt  acaaaccggt  aaaacgtttg      120
ttc                                                                          123
＜２２＞  レッドクローバー・ネクロティック・モザイクウィルス（Ｒｅｄ  ｃｌｏｖｅｒ  ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ：ＲＣＮＭＶ）のＲＮＡ１由来の配列に対するｃＤＮＡである前記＜１２＞から＜２１＞のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
【００１４】
＜２３＞  １７℃以下の温度条件下において翻訳活性が最大となるように翻訳制御する前記＜１＞から＜２２＞のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
＜２４＞  アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドの非翻訳領域に組み込まれる前記＜１＞から＜２３＞のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
【００１５】
＜２５＞  前記＜１＞から＜２４＞のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドを含むことを特徴とする組換えベクターである。
【００１６】
＜２６＞  前記＜１＞から＜２４＞のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド、及び前記＜２５＞のいずれかに記載の組換えベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とする形質転換体である。
＜２７＞  動物細胞、植物細胞、菌類、及び酵母から選択される前記＜２６＞に記載の形質転換体である。
【００１７】
＜２８＞  前記＜１＞から＜２４＞のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドを用いることを特徴とするタンパク質合成方法である。
＜２９＞  前記＜２５＞に記載の組換えベクターを用いることを特徴とするタンパク質合成方法である。
＜３０＞  無細胞タンパク質合成系で行われる前記＜２８＞から＜２９＞のいずれかに記載のタンパク質合成方法である。
＜３１＞  コムギ胚芽抽出物を用いて行われる前記＜３０＞に記載のタンパク質合成方法である。
＜３２＞  真核生物の細胞を用いて行われる前記＜２８＞から＜２９＞のいずれかに記載のタンパク質合成方法である。
＜３３＞  大腸菌を用いて行われる前記＜２８＞から＜２９＞のいずれかに記載のタンパク質合成方法である。
＜３４＞  １７℃以下の温度条件下で行われる前記＜２８＞から＜３３＞のいずれかに記載のタンパク質合成方法である。
【００１８】
＜３５＞  前記＜１＞から＜２４＞のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドを少なくとも含むことを特徴とするｉｎ  ｖｉｔｒｏ系翻訳キットである。
＜３６＞  コムギ胚芽抽出物を含む前記＜３５＞に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ系翻訳キット。
【００１９】
＜３７＞  前記＜１＞から＜２４＞のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドを用い、アミノ酸を合成させる合成手段を少なくとも有することを特徴とするタンパク質合成装置である。
＜３８＞  合成手段がコムギ胚芽抽出物を使用する前記＜３７＞に記載のタンパク質合成装置である。
＜３９＞  温度制御手段を有する前記＜３７＞から＜３８＞のいずれかに記載のタンパク質合成装置である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ＲＣＮＭＶのオーストラリア株のＲＮＡ１を示す構造図であり、本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドである３´ＴＥ−ＤＲ１領域が形成する２次構造（ステムループ構造）を示した模式図である。
【図２】図２は、ＲＣＮＭＶのカナダ株のＲＮＡ１を示す構造図であり、本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドである３´ＴＥ−ＤＲ１領域が形成する２次構造（ステムループ構造）を示した模式図である。
【図３】図３は、実施例１で翻訳活性を評価した各ｍＲＮＡの構造図であり、破線は欠失を導入した部分、細線はｐＵＣ１１８の配列部分を示す。
【図４】図４は、実施例２、実施例３、実施例６、及び実施例７において、３´ＴＥ−ＤＲ１領域中の各ステムループ構造に導入した変異を表す模式図である。
【図５】図５は、実施例６において、宿主細胞としてタバコ培養細胞プロトプラストを用い、翻訳制御ポリヌクレオチド（配列番号１５、配列番号１６）を含む組換えベクター（Ｒ１−５´−ＸｂＳ）、及び、ステムループを構成する領域に変異を導入した組換えベクター（３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ１、３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ２、３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ３、３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ４、３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ５）を用いてタンパク質合成を行った結果を示すグラフである。
【図６】図６は、実施例６において、宿主細胞としてササゲプロトプラストを用い、翻訳制御ポリヌクレオチド（配列番号１５、配列番号１６）を含む組換えベクター（Ｒ１−５´−ＸｂＳ）、及び、ステムループを構成する領域に変異を導入した組換えベクター（３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ１、３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ２、３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ３、３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ４、３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ５）を用いてタンパク質合成を行った結果を示すグラフである。
【図７】図７は、実施例７において、タバコ培養細胞（ＢＹ２）抽出物を使用した無細胞タンパク合成系でタンパク質合成を行った結果を示すグラフである。
【図８】図８は、実施例８において、ＲＣＮＭＶ由来の本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドを含む組換えベクター（Ｒ１−５´−ＸｂＳ）と、サンヘンプモザイクウィルス（ＳＨＭＶ）の非翻訳領域を含む組換えベクター（ＳＨ−ｌｕｃ−ＳＨ）の翻訳活性を比較した結果を示すグラフである。
【図９】図９は、実施例９において、本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ系翻訳キットを用いたタンパク質合成と、他の組換えベクターを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ系翻訳キットを用いたタンパク質合成とを比較した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（翻訳制御ポリヌクレオチド）
本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドは、
（Ａ）アミノ酸配列をコードするｍＲＮＡの３´側に組み込まれ、組み込まれる前に比べて、該ｍＲＮＡの翻訳活性を高め、かつ、組み込まれた後の前記ｍＲＮＡの翻訳活性を、２０℃未満の温度条件下における翻訳活性Ｘと、２０℃以上の温度条件下における翻訳活性Ｙとが、Ｘ／Ｙ≧１の関係を満たすように制御するポリヌクレオチド（ＲＮＡ）、及び
（Ｂ）アミノ酸配列をコードする塩基配列の３´側に組み込まれ、組み込まれる前に比べて、該塩基配列の翻訳活性を高め、かつ、組み込まれた後の前記塩基配列の翻訳活性を、２０℃未満の温度条件下における翻訳活性Ｘと、２０℃以上の温度条件下における翻訳活性Ｙとが、Ｘ／Ｙ≧１の関係を満たすように制御するポリヌクレオチド（ＤＮＡ）である。【００２２】
前記翻訳活性は、前記ｍＲＮＡがコードする目的のアミノ酸配列（以下、「タンパク質」ということがある）の合成量で表すことができ、「翻訳活性を高める」とは、タンパク質合成量Ｐが、該翻訳制御ポリヌクレオチドが組み込まれる前の合成量Ｑに対し、Ｐ＞Ｑの関係を満たすことを表す。
前記合成量の定量方法としては、例えば、回収した前記目的のタンパク質濃度を分光高度計を用いて測定する方法、放射線同位元素をとりこませて前記目的のタンパク質を合成させて、該タンパク質の放射活性を測定する方法、更に、活性を評価する目的で発光タンパク質を合成させて、該発光タンパク質の発光量を測定する方法等が挙げられる。【００２３】
−（Ａ）翻訳制御ポリヌクレオチド（ＲＮＡ）−
前記（Ａ）の翻訳制御ポリヌクレオチド（ＲＮＡ）としては、
（Ｉ）（１）配列番号１５に示されるＲＮＡ配列、（２）配列番号１５に示されるＲＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（３）配列番号１５に示されるＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかを含む翻訳制御ポリヌクレオチドと、
（II）（１）配列番号７に示されるＲＮＡ配列、（２）配列番号７に示されるＲＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（３）配列番号７に示されるＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかを含む翻訳制御ポリヌクレオチドとが挙げられる。【００２４】
本発明において、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、特定されたポリヌクレオチド（例えば、前記（Ｉ）においては、配列番号１５に示されるＲＮＡ配列）と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上の相同性が存在するときにのみ、ハイブリダイゼーションが起こるポリヌクレオチドを意味し、完全ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より約５℃〜約３０℃、好ましくは約１０℃〜約２５℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こるポリヌクレオチドをいう。
なお、前記ストリンジェントな条件としては、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９），特に11.45節“Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ”に記載された条件を適用することができる。【００２５】
また、本発明において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチドとは、特定されたポリヌクレオチド（例えば、前記（Ｉ）においては、配列番号１５に示されるＲＮＡ配列）に、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個の塩基の欠失、置換、若しくは付加といった変異を有するポリヌクレオチドをいう。前記塩基の欠失、置換、若しくは付加の手段としては、特に制限はなく、公知の方法から適宜選択することができる。【００２６】
（配列番号１５）
uugguucuuu  uaaguguagc  cuccacccga  guugcaagag  gggaacacgc  agucucgccg    60
acccuguugg  caaacaguaa  aauugcaaaa  aauagagugc  uaggaguagu  ucccguaccc    120
gcgggagcaa  gacccuacua  caguagacga  accggcaucg  gacccuggga  aacagguacc    180
uagcguauua  auaggucgcu  agaaaucggg  cgggcuucac  cuucggguaa  cccgccgucg    240
agagggaaaa  ccucugugug  guugugcgca  cgucguuguc  ggaagacucu  cacuguugua    300
guuauuuccu  uuuucuuuua  gguaggagca  cuugcucaga  gggcgcauac  cucugguaaa    360
acaaaauugg  ccccugagag  uagaaaacuc  agguuaauaa  aacaggagaa  uauuuaccua    420
gucguauaac  ggcuagguac  ccc                                                443【００２７】
（配列番号７）
uugguuaauu  gguuagcgca  gccuccaucc  gaguugcaag  agaggaagac  gcagucucgc    60
cgacccuguu  ggcaaacagu  aaaauugcaa  aaaauagagu  guuaggagua  guucccauac    120
ccuuggggac  aagaaccuau  uauggagaaa  cgaacuggca  ucggacccug  ggaaacaggc    180
aucuagcgua  uuaauagguc  gcuagaagac  gggcaggcuu  caccacuagg  uaaccugccg    240
ccgagaggga  aaaccucugu  gugguugugc  gcacgucguu  gucggaagaa  guucaccaua    300
guaguuauuu  ccuuuucuuu  uagguagaag  cacuugcucc  agagggcgca  uaccucuggu    360
uaaacaaaau  uguccccuga  gaguagaaaa  cucagguuaa  uaaaacagga  gaauauuuac    420
cuaguuguau  aacggcuagg  uacccc                                            446【００２８】
ここで、前記（Ａ）の翻訳制御ポリヌクレオチドとしては、該（Ａ）の翻訳制御ポリヌクレオチドのｃＤＮＡである前記（Ｂ）の翻訳制御ポリヌクレオチドが、任意のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの前記塩基配列の３´側に組み込まれた結果、前記塩基配列とともに転写されてｍＲＮＡの３´側に存在するＲＮＡ配列であってもよい。【００２９】
前記翻訳制御ポリヌクレオチドの翻訳制御の態様としては、例えば、前記ｍＲＮＡの１７℃における翻訳活性が、２５℃における翻訳活性よりも高くなるように制御する態様であることが好ましく、１７℃における翻訳活性が最大となるように制御する態様であることがより好ましい。この結果、前記翻訳制御ポリヌクレオチドは、高温（例えば、２５℃以上）条件下で不安定なタンパク質の合成や、低温（例えば、１７℃以下）条件下で産生量が少ないタンパク質の合成に好適に使用される。【００３０】
前記（Ａ）の翻訳制御ポリヌクレオチドとしては、例えば、
前記（Ｉ）の翻訳制御ポリヌクレオチドの部分配列である配列番号１３の翻訳制御ポリヌクレオチド、
前記（II）の翻訳制御ポリヌクレオチドの部分配列である配列番号５の翻訳制御ポリヌクレオチド、並びに、
前記（Ｉ）及び（II）の翻訳制御ポリヌクレオチドに共通な配列である配列番号３９、配列番号１、及び配列番号３の翻訳制御ポリヌクレオチド、などが好適に挙げられる。
さらに、これらの翻訳制御ポリヌクレオチドの１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及びこれらの翻訳制御ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする翻訳制御ポリヌクレオチドが挙げられる。
また、これらの翻訳制御ポリヌクレオチドは単独であってもよく、複数の組合せからなるものであってもよい。【００３１】
（配列番号１３）
gaaccggcau  cggacccugg  gaaacaggua  ccuagcguau  uaauaggucg  cuagaaaucg    60
ggcgggcuuc  accuucgggu  aacccgccgu  cgagagggaa  aaccucugug  ugguugugcg    120
cacgucguug  ucggaaga                                                      138【００３２】
（配列番号５）
gaacuggcau  cggacccugg  gaaacaggca  ucuagcguau  uaauaggucg  cuagaagacg    60
ggcaggcuuc  accacuaggu  aaccugccgc  cgagagggaa  aaccucugug  ugguugugcg    120
cacgucguug  ucggaag                                                        137【００３３】
（配列番号３９）
ccugggaaac  agg                                                            13【００３４】
（配列番号１）
agagggaaaa  ccucu                                                          15【００３５】
（配列番号３）
gugugguugu  gcgcac                                                        16【００３６】
前記（Ａ）の翻訳制御ポリヌクレオチドが組み込まれるポリヌクレオチドとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、アミノ酸配列をコードするｍＲＮＡの５´側に、
（１）配列番号１７に示されるＲＮＡ配列、（２）配列番号１７に示されるＲＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（３）配列番号１７に示されるＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかが組み込まれたポリヌクレオチド、及び
（１）配列番号９に示されるＲＮＡ配列、（２）配列番号９に示されるＲＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（３）配列番号９に示されるＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかが組み込まれたポリヌクレオチドに組み込まれることが好ましい。【００３７】
（配列番号１７）
gacaaacguu  uuaccgguuu  guaaauagga  gcacacaagc  ucgcuagucg  cccccuucgu    60
aucggggauc  uagagauuaa  acgguauacc  ugucauuuua  aauuucuacu  uuucguacca    120
guc                                                                      123【００３８】
（配列番号９）
gaacaaacgu  uuuaccgguu  uguaaauugg  aauucucgaa  uucgccaguc  gccuucuucg      60
uaucaaggau  cuggaauuug  aacgguaucu  uuaucauuuu  aauuucuacu  uuucguacca    120
guc                                                                        123【００３９】
また、前記（Ａ）の翻訳制御ポリヌクレオチドが組み込まれるｍＲＮＡ（ポリヌクレオチド）としては、３´末端のポリＡ構造、及び５´末端のＣａｐ構造の少なくともいずれかを有していてもよく、いずれも有していなくてもよい。３´末端のポリＡ構造、及び５´末端のＣａｐ構造を有するポリヌクレオチドに組み込まれた場合には、該ｍＲＮＡの翻訳活性をより高めることができる。【００４０】
前記（Ａ）の翻訳制御ポリヌクレオチドが組み込まれるポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、タンパク質、ポリペプチド鎖のいずれであってもよいが、タンパク質であることが好ましい。
また、前記タンパク質としては、低温条件下で発現量が少ないタンパク質や、高温条件下で不安定なタンパク質等が好適に挙げられる。【００４１】
また、前記（Ａ）の翻訳制御ポリヌクレオチドが組み込まれるｍＲＮＡ（ポリヌクレオチド）の領域としては、前記アミノ酸配列をコードする領域の３´側であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、非翻訳領域であることが好ましい。【００４２】
前記（Ａ）の翻訳制御ポリヌクレオチドとしては、レッドクローバー・ネクロティック・モザイクウィルス（Ｒｅｄ  ｃｌｏｖｅｒ  ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ：ＲＣＮＭＶ）のＲＮＡ１由来の配列であることが好ましく、具体的には、配列番号１９に示すオーストラリア株のＲＮＡ１由来の配列、及び、配列番号１１に示すカナダ株のＲＮＡ１由来の配列のいずれかであることが好ましい。【００４３】
（配列番号１９）
gacaaacguu  uuaccgguuu  guaaauagga  gcacacaagc  ucgcuagucg  cccccuucgu  60
aucggggauc  uagagauuaa  acgguauacc  ugucauuuua  aauuucuacu  uuucguacca  120
gucauggguu  uuauaaaucu  uucgcuuuuu  gauguggaua  aauuaauggu  gugggugagu  180
aaauucaauc  caggcaaaau  ccugucugca  aucugcaacu  uggguauaga  cuguuggaau  240
cgcuuucgca  agugguucuu  uggucucaac  uuugaugcac  auaugugggc  gguggaugcc  300
uucauuccac  ucaugccaca  uuacacggag  cagauggaac  guguagucga  cgacuucugc  360
agcgaaaccc  cagaauccaa  auuagaagac  ugucuggaac  uggacaccuc  aguaaaugaa  420
uucuucgaug  aagaggugua  caagaaggau  gaggaaggcg  ugaugaaacu  ccaaaggagc  480
gcugccagga  aacacauuaa  acgugugcgc  ccaggcauga  ugcaagcggc  cauuaaggcu  540
guagaaacga  ggaucagaaa  ucgccauacc  aucuuuggag  augacauggg  aaagguagac  600
gaagcugcag  uuagagcaac  ugccagugac  auauguggug  aguucaagau  caacgaacac  660
cacaccaaug  cauuggugua  ugccgcagca  uaccuugcca  ugacaccaga  ccagaggucu  720
aucgacagcg  ucaagcucgc  cuacaauccu  aagagucaag  ccagaaggac  uuugguuuca  780
gccauucgug  agaacaaggc  uguugccggg  uucaaauccc  uugaggauuu  uuaggcggcc  840
cacucagcuu  uccgguugaa  gaugccccau  auccuauuuu  aggcaucccg  gaaaucaggg  900
uagcugagaa  gcgggccagu  agagucauga  aaaguaagag  agucguaggg  uuaccugcug  960
uuagugcagg  uuugaagguu  ugcguccauc  aaaccucccu  acauaauaug  auaguuaguc  1020
ucgaacgcag  gguuuuucgu  gugaagaacu  cugcaggaga  guuaguagua  ccucccaaac  1080
cuauccaaaa  ugcauuugac  uccauuuccu  auuuccguga  agaaugguug  aggaaauugu  1140
cucacaaggg  ucaaauucuc  aaguccucuu  uggcggaugu  uguggcgugu  uacucuucug  1200
aaaagaggaa  guuauaccaa  aaagcagcag  acuccuuaga  gaagaaaccu  gugcaaugga  1260
gagacuccaa  gguacaagca  uucaucaaag  uugaaaagcu  ugagugugac  accaaggauc  1320
ccguaccucg  uacgauucaa  ccucgaucca  agagguacaa  ccuagcaaua  ggccaguauc  1380
ucagauuaaa  ugaaaagaag  auguuggauu  ccauagacga  cguuuucaaa  gagaagacug  1440
ucuuaucagg  uuuggacaac  agggcucaag  ggagagccau  cgcccacaag  uggcguaaau  1500
accagaaccc  aauagggauc  gggcuggaug  caucgagauu  cgaucaacau  ugcagcgucg  1560
augcccucaa  auucgagcaa  acuuucuaua  aagcgugcuu  uccuggggau  caacaguugg  1620
aaacauuauu  gaaauggcaa  uuauccaaua  cuggaucggc  uuuguuacca  acuggagaac  1680
ugguuagaua  ucguaccaaa  gggugucgca  ugagcggcga  uauaaacaca  ggccuuggga  1740
acaaaauucu  caugugcagc  augguacacg  cauucuugaa  agagacggga  gugcgagcuu  1800
cguuggccaa  caauggugac  gauugugucc  ucuucuguga  gaagggagau  uaugagcaga  1860
uaaaccgcaa  ucuugagcaa  ugguuccugu  gcagggguuu  cgaaaugacc  gucgaaaaac  1920
cugucgaugu  acucgagaag  guggcguuuu  gucguaguca  accgguuugc  auugccacgc  1980
aaugggcuau  gguaaggcaa  uugggaaguu  ugucgagaga  cugcuuuuca  acacaggauu  2040
gguuaaaccc  aaagacauuc  aaagaugcaa  ugaaugcgcu  aggucaaugu  aacgggauca  2100
ucaaugaugg  aguuccaaua  cauauggcac  aagcaaaacu  aaugcauaga  aucgguggaa  2160
accguaaguu  caaucuagau  gcgcuucaua  aacaaaugga  guacagcugg  agagaucguc  2220
ucgguaagag  aacgaaucuu  uuguggagug  agguagagga  ugcuacaaga  uugucguacu  2280
uuagagcauu  cggaauagaa  ccuuacauuc  aaagaauagu  ggaggaguac  uucucacagg  2340
uggaaaucac  uugugagggg  cgaucaacaa  acguauuacc  uacacacuac  ucuagaaucc  2400
acaaagaucu  aaucaaagcc  cgauaaaaug  ucuucaaaag  cucccaagaa  auccaaacaa  2460
cggucccagc  ccaggaaccg  gaccccaaau  accaguguaa  agacuguagc  cauccccuuu  2520
gccaagacgc  aaauaaucaa  gacugugaau  ccuccaccga  aaccagcaag  agguauauug  2580
cauacccagu  uaguuaugag  ugugguugga  ucaguucaaa  ugcguacaaa  uaauggcaaa  2640
uccaaccaaa  gguucagauu  aaacccuagc  aauccugcuc  uuuuccccac  ucuagcauau  2700
gaagcugcaa  auuaugacau  guaucgcuua  aagaagcuga  cacuccguua  cgucccacuc  2760
guuaccgugc  aaaauuccgg  gcgaguugca  augaucuggg  aucccgacuc  gcaagacucg  2820
gccccacaau  ccagacagga  gauaucagcc  uauucccgau  cagucucgac  ugccguguac  2880
gagaaaugcu  cguugacgau  uccggcggau  aaucaauggc  gcuucguugc  agauaacacc  2940
acaguggaca  gaaagcucgu  cgauuuuggc  cagcuuuugu  ucguuacaca  cucugguagu  3000
gauggaauag  aaacagggga  cauauucuua  gauugugaag  ucgaguucaa  aggaccccaa  3060
ccaaccgcaa  gcaucguaca  gaaaacugua  auugaucucg  gugggacacu  cacuucuuuc  3120
gaagggccau  cuuaucugau  gccuccggau  gccuuuauua  ccaguucuag  uuucggccug  3180
uuuguugacg  ucgcagggac  cuaucugcuu  acacuagugg  ugacuuguuc  gaccacuggu  3240
agcgucacag  uaggaggaaa  uucaacucug  guuggcgacg  guagggcggc  auacgguagu  3300
agcaauuaca  uugcuucuau  aguauucacu  aguucgggug  uguuaucgac  caccccuagu  3360
gugcaguuuu  cagguuccuc  uggaguauca  cgcgugcaaa  ugaacaucug  cagauguaaa  3420
caggggaaca  cuuucauacu  ugguuaauug  guucuuuuaa  guguagccuc  cacccgaguu  3480
gcaagagggg  aacacgcagu  cucgccgacc  cuguuggcaa  acaguaaaau  ugcaaaaaau  3540
agagugcuag  gaguaguucc  cguacccgcg  ggagcaagac  ccuacuacag  uagacgaacc  3600
ggcaucggac  ccugggaaac  agguaccuag  cguauuaaua  ggucgcuaga  aaucgggcgg  3660
gcuucaccuu  cggguaaccc  gccgucgaga  gggaaaaccu  cugugugguu  gugcgcacgu  3720
cguugucgga  agacucucac  uguuguaguu  auuuccuuuu  ucuuuuaggu  aggagcacuu  3780
gcucagaggg  cgcauaccuc  ugguaaaaca  aaauuggccc  cugagaguag  aaaacucagg  3840
uuaauaaaac  aggagaauau  uuaccuaguc  guauaacggc  uagguacccc              3890【００４４】
（配列番号１１）
gaacaaacgu  uuuaccgguu  uguaaauugg  aauucucgaa  uucgccaguc  gccuucuucg  60
uaucaaggau  cuggaauuug  aacgguaucu  uuaucauuuu  aauuucuacu  uuucguacca  120
gucauggguu  uugucaacuu  uucgcuuuuu  gauguggaca  aauugauggu  augggugagc  180
aaauucaauc  caggcaagau  auuguccgcu  auuugcaacu  uggguauaga  cugcuggaac  240
cguuuucgca  aaugguacuu  cggucucaac  uuugaugcac  auaugugggc  ugucgaugcc  300
uuuaugccac  ucaugccaca  uuacacggag  cagauggaac  gcguagucgg  cgaccucugc  360
agcgaaaccc  uagaauccaa  auuagaagac  ugucuggaau  uggacacuuc  cgucaaccag  420
uauuuugacg  aagaagugua  caaagaggau  gacaagggcg  ugaugaaacu  ccaaaggagu  480
gcugccagga  agcacauuaa  acgugugcga  ccagguauga  ugacagcagc  cauaaaagcu  540
guugagacga  ggaucagaaa  ccgccaugcc  auuuucggag  auaacauggg  auugauagac  600
gaagcugcag  uuagagcaac  ugccagugau  aucuguggag  aguucaaaau  aaaugaacac  660
cacacgagga  cauugguaua  caccgcagca  uaucuuucca  ugacaccuga  ccagaagucc  720
cuagacagug  ucaagcucgc  cuauaaucca  aagagucaag  ccagaaggac  uuuagugaca  780
gccguucgug  agaacaaagc  uguugcuggg  uucaaauccc  uugaggauuu  uuaggcgguc  840
cacucagcuu  uccgguugaa  gaugccccau  auccuauuuu  aggcaucccg  gaaaucaggg  900
uagcugagaa  gcgggccagu  agagucauga  gaaguaagag  agucguaggu  uuaccugcug  960
uuagugcggg  ucuaaagguu  ugcguccauc  aaaccucccu  acauaauaug  auaguuaguc  1020
ucgaacgcag  aguguuccgu  guaaagaacg  cugcgggaga  guuaguagug  ccucccaaac  1080
caauccaaaa  ugcauuugac  uccauuuccu  acuuccgcga  agagugguug  aggaaauugu  1140
cucauaaggg  ucaagugcuc  aaauccucca  uagaugacgu  uguugcuugc  uauucuucug  1200
aaaagaggaa  auuguaucaa  aaagcggcug  acucucugga  gaagaaaccu  guccaaugga  1260
gagauuccaa  ggugcaagca  uucaucaagg  uagaaaaacu  ugaaugugac  acuaaggauc  1320
ccgugccccg  cacgauucaa  ccucgaucca  agagauauaa  ucuuugcaua  ggacaauauc  1380
ucagguugaa  ugaaaagaag  auguuggauu  ccauagacga  ugucuucaaa  gagaagaccg  1440
ucuugucagg  uuuggauaac  agggcucaag  ggagagccau  cgcccacaag  uggcgcaaau  1500
accagaaccc  cauagggauc  gggcuagaug  cgaguagauu  cgaucagcau  uguagcgugg  1560
augcccucaa  auuugaacac  accuuuuaua  aagcguguuu  uccuggggau  caacaguugg  1620
aacaacuauu  gaaauggcaa  uuauccaaca  cuggaucggc  ccuauuacca  acuggagaac  1680
ugguuagaua  ccguaccaaa  gggugucgca  ugagcggcga  uauaaacaca  ggccuuggga  1740
acaagauucu  caugugcagc  augguacacg  cauuccugaa  agaggcggga  gugcgggcuu  1800
cguuagccaa  uaauggugac  gauugugucc  uuuucuguga  gaagggagac  uaugaugaga  1860
uaaaccgcaa  ucuugagcaa  ugguuccugu  gcagggguuu  cgaaaugacc  gucgaaaaac  1920
cugucgaugu  acucgagaag  guggcguucu  gucguaguca  accaguuugc  auugccacgc  1980
aaugggcuau  gguaaggcaa  uugggaaguu  ugucuagaga  cuguuuuuca  acacaggauu  2040
gguuaaaccc  aaagacauuc  aaagaugcaa  ugaacgcguu  ggggcaaugu  aacggaauca  2100
ucaaugaugg  aguuccaaua  cauauggcuc  aggcgaaauu  aaugcauaaa  aucgguggaa  2160
accggaaguu  caaucuagau  gcacuccaca  agcaaaugga  guacaguugg  agagaucguc  2220
ucgguaaaag  aacgaaucuu  uuguggagug  agguagagga  ugcuacgaga  uugucauacu  2280
uuaaagcauu  cggcauagaa  ccuuacauuc  agaaaauagu  ggaggaguac  uucucacaag  2340
uggaaaucac  uugugagggg  cgaucaacaa  acguauuacc  ugcacacuau  ucuagaaucc  2400
acaaagauuu  aaucaaaucc  cgauaguaug  ucuucgaaag  cucccaagaa  auccaaauca  2460
cggucccagc  ccaggaaccg  gaucccaaac  accaguauca  aaacuguagc  caucccauuu  2520
gccaagacgc  aaaucaucaa  gaccgugaac  ccuccacaaa  ggccagcuaa  agcuuuaaug  2580
cacacccagc  ugguacuaag  uguuguugga  acgacucaac  ugcgugugaa  caacggcaag  2640
uccauucaga  gguucagauu  gaacccaagu  aacccagcuc  uauuccccac  cauagccuau  2700
gaagccgcaa  auuaugacau  guaucgucug  aagaaaauga  cacuccguua  ugucccgauc  2760
gugaccgugc  aaaauuccgg  acgcguauca  augguuuggg  augccgacuc  ucgggauucg  2820
gcuccccaau  cacgacagga  gacaucugcu  uauucucgau  cugucucgac  ugccguguac  2880
gagaaaugcu  cguugacgau  uccggcugau  aaucaauggc  gauucauagc  ugacaacaca  2940
gccguugaua  gaaaacugau  cgacuuuggc  caguuguugu  uugucaccca  cuccgggagu  3000
gagggaguag  aaauugguga  uguguucuuc  gagugugaag  uagaauuuaa  aggaccccaa  3060
cccaccgcaa  cagucaucca  gaagggugua  gcugacguug  gcggggcacu  cuccucagaa  3120
ggaccgucuu  acuuaauguc  cucggacuua  gucgucaccc  cgucggguuu  cgguaugaac  3180
uuggauguag  cagggacuua  ucugcuaacg  uuggugguug  cagcaacugc  uagcggaaac  3240
aucacaguag  ccggcaauuc  aacauuggug  ggugaggcaa  gggcagcaua  cagcagcggc  3300
aacuacaucg  ccacucuggu  auuuacuagu  accggcgucu  ugucggcgac  accuaguaua  3360
caguuuacag  gauccuccgg  aguuacacgg  guucaauuga  accucgccag  auguaaaccg  3420
gcgaauaccu  acgucacugg  uuaguugguu  aauugguuag  cgcagccucc  auccgaguug  3480
caagagagga  agacgcaguc  ucgccgaccc  uguuggcaaa  caguaaaauu  gcaaaaaaua  3540
gaguguuagg  aguaguuccc  auacccuugg  ggacaagaac  cuauuaugga  gaaacgaacu  3600
ggcaucggac  ccugggaaac  aggcaucuag  cguauuaaua  ggucgcuaga  agacgggcag  3660
gcuucaccac  uagguaaccu  gccgccgaga  gggaaaaccu  cugugugguu  gugcgcacgu  3720
cguugucgga  agaaguucac  cauaguaguu  auuuccuuuu  cuuuuaggua  gaagcacuug  3780
cuccagaggg  cgcauaccuc  ugguuaaaca  aaauuguccc  cugagaguag  aaaacucagg  3840
uuaauaaaac  aggagaauau  uuaccuaguu  guauaacggc  uagguacccc              3890【００４５】
前記オーストラリア株のＲＮＡ１の構造を図１に、前記カナダ株のＲＮＡ１の構造を図２に示す。【００４６】
図１に示す前記ＲＣＮＭＶオーストラリア株のＲＮＡ１において、前記（Ａ）の翻訳制御ポリヌクレオチドは、３´側の非翻訳領域（以下、「３´−ＵＴＲ」と表すことがある）に由来するＲＮＡ配列である。
前記オーストラリア株の３´−ＵＴＲは、前記配列番号１５で示される前記（Ｉ）の翻訳制御ポリヌクレオチドに相当する。
図１中、５つのステムループ構造を形成する３５９５番目から３７３２番目の塩基配列（以下、「３´ＴＥ−ＤＲ１」と表すことがある）は、前記配列番号１３で示される前記（Ｉ）の翻訳制御ポリヌクレオチドに相当する。【００４７】
図２に示す前記ＲＣＮＭＶカナダ株のＲＮＡ１において、前記（Ａ）の翻訳制御ポリヌクレオチドは、３´−ＵＴＲに由来するＲＮＡ配列である。
前記カナダ株の３´−ＵＴＲは、前記配列番号７で示される前記（Ｉ）の翻訳制御ポリヌクレオチドに相当する。
図２中、５つのステムループ構造を形成する３５９５番目から３７３２番目の塩基配列である３´ＴＥ−ＤＲ１は、前記配列番号５で示されるの前記（Ｉ）の翻訳制御ポリヌクレオチドに相当する。【００４８】
前記オーストラリア株及び前記カナダ株の３´ＴＥ−ＤＲ１中、ＳＬ１、ＳＬ４、及びＳＬ５は共通の塩基配列であり、ＳＬ１で示されるステムループ構造を形成する塩基配列は、前記配列番号３９の翻訳制御ポリヌクレオチドに相当し、ＳＬ４で示されるステムループ構造を形成する塩基配列は、前記配列番号１の翻訳制御ポリヌクレオチドに相当し、ＳＬ５で示されるステムループ構造を形成する塩基配列は、前記配列番号３の翻訳制御ポリヌクレオチドに相当する。
前記ステムループ構造は、該ステムループ構造を形成する配列中に相補的な配列が存在することにより、対応する塩基が相補的結合（水素結合）を生じて形成されるヘアピン形の２次構造である。【００４９】
ここで、本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドにおいて、前記ステムループ構造を形成する塩基配列を含むことにより、３´末端のポリＡ構造、及び５´末端のＣａｐ構造のいずれかが存在しないポリヌクレオチド、又は、３´末端のポリＡ構造、及び５´末端のＣａｐ構造のいずれも存在しないポリヌクレオチドのアミノ酸配列を翻訳が可能であることについては、本発明者らの知見であり、文献の内容を参照することができる（Hiroyuki  Mizumoto,  Masahiro  Tatsuta,  Masanori  Kaido,  Kazuyuki  Mise,  and  Tetsuro  Okuno,  JOURNAL  OF  VIOLOGY  (2003),  p12113-p12121）。【００５０】
また、前記（Ａ）の翻訳制御ポリヌクレオチドが組み込まれるポリヌクレオチドにおいて、アミノ酸配列をコードするｍＲＮＡの５´側に組み込まれることがある前記配列番号１７に示されるＲＮＡ配列、及び前記配列番号９に示されるＲＮＡ配列も、前記ＲＣＮＭＶのＲＮＡ１由来の配列であることが好ましい。
具体的には、前記配列番号１７に示されるＲＮＡ配列は、前記ＲＣＮＭＶオーストラリア株のＲＮＡ１の５´−ＵＴＲに由来する配列であり、前記配列番号９に示されるＲＮＡ配列は、前記ＲＣＮＭＶカナダ株のＲＮＡ１の５´−ＵＴＲに由来する配列である。【００５１】
前記ＲＣＮＭＶのＲＮＡ１から、前記翻訳制御ポリヌクレオチドを調製する方法としては、特に制限はなく、公知の方法から適宜選択することができ、例えば、ＲＣＮＭＶのウィルス粒子からＲＮＡ１を抽出し、該ＲＮＡ１のｃＤＮＡを逆転写反応により調製した後、これを増幅し、該ｃＤＮＡの転写産物のうち、ＲＮＡ２とともに混合して感染性を示すものを選択する方法等が挙げられる。【００５２】
−（Ｂ）の翻訳制御ポリヌクレオチド（ＤＮＡ）−
前記（Ｂ）の翻訳制御ポリヌクレオチド（ＤＮＡ）としては、
（III）（１）配列番号１６に示されるＤＮＡ配列、（２）配列番号１６に示されるＤＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（３）配列番号１６に示されるＤＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかを含む翻訳制御ポリヌクレオチドと、
（IV）（１）配列番号８に示されるＤＮＡ配列、（２）配列番号８に示されるＤＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（３）配列番号８に示されるＤＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかを含む翻訳制御ポリヌクレオチドとが挙げられる。【００５３】
（配列番号１６）
ggggtaccta  gccgttatac  gactaggtaa  atattctcct  gttttattaa  cctgagtttt        60
ctactctcag  gggccaattt  tgttttacca  gaggtatgcg  ccctctgagc  aagtgctcct      120
acctaaaaga  aaaaggaaat  aactacaaca  gtgagagtct  tccgacaacg  acgtgcgcac      180
aaccacacag  aggttttccc  tctcgacggc  gggttacccg  aaggtgaagc  ccgcccgatt      240
tctagcgacc  tattaatacg  ctaggtacct  gtttcccagg  gtccgatgcc  ggttcgtcta      300
ctgtagtagg  gtcttgctcc  cgcgggtacg  ggaactactc  ctagcactct  attttttgca      360
attttactgt  ttgccaacag  ggtcggcgag  actgcgtgtt  cccctcttgc  aactcgggtg      420
gaggctacac  ttaaaagaac  caa                                                443【００５４】
（配列番号８）
ggggtaccta  gccgttatac  aactaggtaa  atattctcct  gttttattaa  cctgagtttt      60
ctactctcag  gggacaattt  tgtttaacca  gaggtatgcg  ccctctggag  caagtgcttc      120
tacctaaaag  aaaaggaaat  aactactatg  gtgaacttct  tccgacaacg  acgtgcgcac      180
aaccacacag  aggttttccc  tctcggcggc  aggttaccta  gtggtgaagc  ctgcccgtct      240
tctagcgacc  tattaatacg  ctagatgcct  gtttcccagg  gtccgatgcc  agttcgtttc      300
tccataatag  gttcttgtcc  ccaagggtat  gggaactact  cctaacactc  tattttttgc      360
aattttactg  tttgccaaca  gggtcggcga  gactgcgtct  tcctctcttg  caactcggat      420
ggaggctgcg  ctaaccaatt  aaccaa                                              446【００５５】
ここで、前記（Ｂ）の翻訳制御ポリヌクレオチドとしては、前記（Ａ）の翻訳制御ポリヌクレオチドのｃＤＮＡであり、任意のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの３´側に組み込まれた結果、前記塩基配列とともに転写されてｍＲＮＡの３´側に前記（Ａ）の翻訳制御ポリヌクレオチドを発現するものが挙げられる。【００５６】
前記翻訳制御ポリヌクレオチドの翻訳制御の態様としては、例えば、前記塩基配列の１７℃における翻訳活性が、２５℃における翻訳活性よりも高くなるように制御する態様であることが好ましく、１７℃における翻訳活性が最大となるように制御する態様であることがより好ましい。この結果、前記翻訳制御ポリヌクレオチドは、高温（例えば、２５℃以上）条件下で不安定なタンパク質の合成や、低温（例えば、１７℃以下）条件下で産生量が少ないタンパク質の合成に好適に使用される。【００５７】
前記（Ｂ）の翻訳制御ポリヌクレオチドとしては、例えば、
前記（III）の翻訳制御ポリヌクレオチドの部分配列である配列番号１４の翻訳制御ポリヌクレオチド、
前記（IV）の翻訳制御ポリヌクレオチドの部分配列である配列番号６の翻訳制御ポリヌクレオチド、並びに、
前記（Ｉ）及び（II）の翻訳制御ポリヌクレオチドに共通な配列である配列番号４０、配列番号２、及び配列番号４の翻訳制御ポリヌクレオチド、などが好適に挙げられる。
さらに、これらの翻訳制御ポリヌクレオチドの１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及びこれらの翻訳制御ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする翻訳制御ポリヌクレオチドが挙げられる。
また、これらの翻訳制御ポリヌクレオチドは単独であってもよく、複数の組合せからなるものであってもよい。【００５８】
（配列番号１４）
tcttccgaca  acgacgtgcg  cacaaccaca  cagaggtttt  ccctctcgac  ggcgggttac      60
ccgaaggtga  agcccgcccg  atttctagcg  acctattaat  acgctaggta  cctgtttccc      120
agggtccgat  gccggttc                                                        138【００５９】
（配列番号６）
cttccgacaa  cgacgtgcgc  acaaccacac  agaggttttc  cctctcggcg  gcaggttacc      60
tagtggtgaa  gcctgcccgt  cttctagcga  cctattaata  cgctagatgc  ctgtttccca      120
gggtccgatg  ccagttc                                                          137【００６０】
（配列番号４０）
cctgtttccc  agg                                                            13【００６１】
（配列番号２）
agaggttttc  cctct                                                          15【００６２】
（配列番号４）
gtgcgcacaa  ccacac                                                          16【００６３】
前記（Ｂ）の翻訳制御ポリヌクレオチドが組み込まれるポリヌクレオチドとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、アミノ酸配列をコードする塩基配列の５´側に、
（１）配列番号１８に示されるＤＮＡ配列、（２）配列番号１８に示されるＤＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（３）配列番号１８に示されるＤＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかが組み込まれたポリヌクレオチド、及び
（１）配列番号１０に示されるＤＮＡ配列、（２）配列番号１０に示されるＤＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（３）配列番号１０に示されるＤＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかが組み込まれたポリヌクレオチドに組み込まれることが好ましい。【００６４】
（配列番号１８）
gactggtacg  aaaagtagaa  atttaaaatg  acaggtatac  cgtttaatct  ctagatcccc      60
gatacgaagg  gggcgactag  cgagcttgtg  tgctcctatt  tacaaaccgg  taaaacgttt      120
gtc                                                                          123【００６５】
（配列番号１０）
gactggtacg  aaaagtagaa  attaaaatga  taaagatacc  gttcaaattc  cagatccttg      60
atacgaagaa  ggcgactggc  gaattcgaga  attccaattt  acaaaccggt  aaaacgtttg      120
ttc                                                                          123【００６６】
前記（Ｂ）の翻訳制御ポリヌクレオチドが組み込まれるポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、タンパク質、ポリペプチド鎖のいずれであってもよいが、タンパク質であることが好ましい。
前記タンパク質としては、低温条件下で発現量が少ないタンパク質や、高温条件下で不安定なタンパク質等が好適に挙げられる。【００６７】
また、前記（Ｂ）の翻訳制御ポリヌクレオチドが組み込まれるポリヌクレオチドの領域としては、前記アミノ酸配列をコードする塩基配列の３´側であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、非翻訳領域であることが好ましい。【００６８】
前記（Ｂ）の翻訳制御ポリヌクレオチドとしては、レッドクローバー・ネクロティック・モザイクウィルス（Ｒｅｄ  ｃｌｏｖｅｒ  ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ：ＲＣＮＭＶ）のＲＮＡ１由来の配列のｃＤＮＡであることが好ましく、具体的には、配列番号２０に示すオーストラリア株のＲＮＡ１のｃＤＮＡ、及び、配列番号１２に示すカナダ株のＲＮＡ１のｃＤＮＡのいずれかに由来する配列であることが好ましい。【００６９】
（配列番号２０）
ggggtaccta  gccgttatac  gactaggtaa  atattctcct  gttttattaa  cctgagtttt      60
ctactctcag  gggccaattt  tgttttacca  gaggtatgcg  ccctctgagc  aagtgctcct      120
acctaaaaga  aaaaggaaat  aactacaaca  gtgagagtct  tccgacaacg  acgtgcgcac      180
aaccacacag  aggttttccc  tctcgacggc  gggttacccg  aaggtgaagc  ccgcccgatt      240
tctagcgacc  tattaatacg  ctaggtacct  gtttcccagg  gtccgatgcc  ggttcgtcta      300
ctgtagtagg  gtcttgctcc  cgcgggtacg  ggaactactc  ctagcactct  attttttgca      360
attttactgt  ttgccaacag  ggtcggcgag  actgcgtgtt  cccctcttgc  aactcgggtg      420
gaggctacac  ttaaaagaac  caattaacca  agtatgaaag  tgttcccctg  tttacatctg      480
cagatgttca  tttgcacgcg  tgatactcca  gaggaacctg  aaaactgcac  actaggggtg      540
gtcgataaca  cacccgaact  agtgaatact  atagaagcaa  tgtaattgct  actaccgtat      600
gccgccctac  cgtcgccaac  cagagttgaa  tttcctccta  ctgtgacgct  accagtggtc      660
gaacaagtca  ccactagtgt  aagcagatag  gtccctgcga  cgtcaacaaa  caggccgaaa      720
ctagaactgg  taataaaggc  atccggaggc  atcagataag  atggcccttc  gaaagaagtg      780
agtgtcccac  cgagatcaat  tacagttttc  tgtacgatgc  ttgcggttgg  ttggggtcct      840
ttgaactcga  cttcacaatc  taagaatatg  tcccctgttt  ctattccatc  actaccagag      900
tgtgtaacga  acaaaagctg  gccaaaatcg  acgagctttc  tgtccactgt  ggtgttatct      960
gcaacgaagc  gccattgatt  atccgccgga  atcgtcaacg  agcatttctc  gtacacggca    1020
gtcgagactg  atcgggaata  ggctgatatc  tcctgtctgg  attgtggggc  cgagtcttgc    1080
gagtcgggat  cccagatcat  tgcaactcgc  ccggaatttt  gcacggtaac  gagtgggacg    1140
taacggagtg  tcagcttctt  taagcgatac  atgtcataat  ttgcagcttc  atatgctaga    1200
gtggggaaaa  gagcaggatt  gctagggttt  aatctgaacc  tttggttgga  tttgccatta    1260
tttgtacgca  tttgaactga  tccaaccaca  ctcataacta  actgggtatg  caatatacct    1320
cttgctggtt  tcggtggagg  attcacagtc  ttgattattt  gcgtcttggc  aaaggggatg    1380
gctacagtct  ttacactggt  atttggggtc  cggttcctgg  gctgggaccg  ttgtttggat    1440
ttcttgggag  cttttgaaga  cattttatcg  ggctttgatt  agatctttgt  ggattctaga    1500
gtagtgtgta  ggtaatacgt  ttgttgatcg  cccctcacaa  gtgatttcca  cctgtgagaa    1560
gtactcctcc  actattcttt  gaatgtaagg  ttctattccg  aatgctctaa  agtacgacaa    1620
tcttgtagca  tcctctacct  cactccacaa  aagattcgtt  ctcttaccga  gacgatctct    1680
ccagctgtac  tccatttgtt  tatgaagcgc  atctagattg  aacttacggt  ttccaccgat    1740
tctatgcatt  agttttgctt  gtgccatatg  tattggaact  ccatcattga  tgatcccgtt    1800
acattgacct  agcgcattca  ttgcatcttt  gaatgtcttt  gggtttaacc  aatcctgtgt    1860
tgaaaagcag  tctctcgaca  aacttcccaa  ttgccttacc  atagcccatt  gcgtggcaat    1920
gcaaaccggt  tgactacgac  aaaacgccac  cttctcgagt  acatcgacag  gtttttcgac    1980
ggtcatttcg  aaacccctgc  acaggaacca  ttgctcaaga  ttgcggttta  tctgctcata    2040
atctcccttc  tcacagaaga  ggacacaatc  gtcaccattg  ttggccaacg  aagctcgcac    2100
tcccgtctct  ttcaagaatg  cgtgtaccat  gctgcacatg  agaattttgt  tcccaaggcc    2160
tgtgtttata  tcgccgctca  tgcgacaccc  tttggtacga  tatctaacca  gttctccagt    2220
tggtaacaaa  gccgatccag  tattggataa  ttgccatttc  aataatgttt  ccaactgttg    2280
atccccagga  aagcacgctt  tatagaaagt  ttgctcgaat  ttgagggcat  cgacgctgca    2340
atgttgatcg  aatctcgatg  catccagccc  gatccctatt  gggttctggt  atttacgcca    2400
cttgtgggcg  atggctctcc  cttgagccct  gttgtccaaa  cctgataaga  cagtcttctc    2460
tttgaaaacg  tcgtctatgg  aatccaacat  cttcttttca  tttaatctga  gatactggcc    2520
tattgctagg  ttgtacctct  tggatcgagg  ttgaatcgta  cgaggtacgg  gatccttggt    2580
gtcacactca  agcttttcaa  ctttgatgaa  tgcttgtacc  ttggagtctc  tccattgcac    2640
aggtttcttc  tctaaggagt  ctgctgcttt  ttggtataac  ttcctctttt  cagaagagta    2700
acacgccaca  acatccgcca  aagaggactt  gagaatttga  cccttgtgag  acaatttcct    2760
caaccattct  tcacggaaat  aggaaatgga  gtcaaatgca  ttttggatag  gtttgggagg    2820
tactactaac  tctcctgcag  agttcttcac  acgaaaaacc  ctgcgttcga  gactaactat    2880
catattatgt  agggaggttt  gatggacgca  aaccttcaaa  cctgcactaa  cagcaggtaa    2940
ccctacgact  ctcttacttt  tcatgactct  actggcccgc  ttctcagcta  ccctgatttc    3000
cgggatgcct  aaaataggat  atggggcatc  ttcaaccgga  aagctgagtg  ggccgcctaa    3060
aaatcctcaa  gggatttgaa  cccggcaaca  gccttgttct  cacgaatggc  tgaaaccaaa    3120
gtccttctgg  cttgactctt  aggattgtag  gcgagcttga  cgctgtcgat  agacctctgg    3180
tctggtgtca  tggcaaggta  tgctgcggca  tacaccaatg  cattggtgtg  gtgttcgttg    3240
atcttgaact  caccacatat  gtcactggca  gttgctctaa  ctgcagcttc  gtctaccttt    3300
cccatgtcat  ctccaaagat  ggtatggcga  tttctgatcc  tcgtttctac  agccttaatg    3360
gccgcttgca  tcatgcctgg  gcgcacacgt  ttaatgtgtt  tcctggcagc  gctcctttgg    3420
agtttcatca  cgccttcctc  atccttcttg  tacacctctt  catcgaagaa  ttcatttact    3480
gaggtgtcca  gttccagaca  gtcttctaat  ttggattctg  gggtttcgct  gcagaagtcg    3540
tcgactacac  gttccatctg  ctccgtgtaa  tgtggcatga  gtggaatgaa  ggcatccacc    3600
gcccacatat  gtgcatcaaa  gttgagacca  aagaaccact  tgcgaaagcg  attccaacag    3660
tctataccca  agttgcagat  tgcagacagg  attttgcctg  gattgaattt  actcacccac    3720
accattaatt  tatccacatc  aaaaagcgaa  agatttataa  aacccatgac  tggtacgaaa    3780
agtagaaatt  taaaatgaca  ggtataccgt  ttaatctcta  gatccccgat  acgaaggggg    3840
cgactagcga  gcttgtgtgc  tcctatttac  aaaccggtaa  aacgtttgtc                3890【００７０】
（配列番号１２）
ggggtaccta  gccgttatac  aactaggtaa  atattctcct  gttttattaa  cctgagtttt        60
ctactctcag  gggacaattt  tgtttaacca  gaggtatgcg  ccctctggag  caagtgcttc      120
tacctaaaag  aaaaggaaat  aactactatg  gtgaacttct  tccgacaacg  acgtgcgcac      180
aaccacacag  aggttttccc  tctcggcggc  aggttaccta  gtggtgaagc  ctgcccgtct      240
tctagcgacc  tattaatacg  ctagatgcct  gtttcccagg  gtccgatgcc  agttcgtttc      300
tccataatag  gttcttgtcc  ccaagggtat  gggaactact  cctaacactc  tattttttgc      360
aattttactg  tttgccaaca  gggtcggcga  gactgcgtct  tcctctcttg  caactcggat      420
ggaggctgcg  ctaaccaatt  aaccaactaa  ccagtgacgt  aggtattcgc  cggtttacat      480
ctggcgaggt  tcaattgaac  ccgtgtaact  ccggaggatc  ctgtaaactg  tatactaggt      540
gtcgccgaca  agacgccggt  actagtaaat  accagagtgg  cgatgtagtt  gccgctgctg      600
tatgctgccc  ttgcctcacc  caccaatgtt  gaattgccgg  ctactgtgat  gtttccgcta      660
gcagttgctg  caaccaccaa  cgttagcaga  taagtccctg  ctacatccaa  gttcataccg      720
aaacccgacg  gggtgacgac  taagtccgag  gacattaagt  aagacggtcc  ttctgaggag      780
agtgccccgc  caacgtcagc  tacacccttc  tggatgactg  ttgcggtggg  ttggggtcct      840
ttaaattcta  cttcacactc  gaagaacaca  tcaccaattt  ctactccctc  actcccggag      900
tgggtgacaa  acaacaactg  gccaaagtcg  atcagttttc  tatcaacggc  tgtgttgtca      960
gctatgaatc  gccattgatt  atcagccgga  atcgtcaacg  agcatttctc  gtacacggca    1020
gtcgagacag  atcgagaata  agcagatgtc  tcctgtcgtg  attggggagc  cgaatcccga    1080
gagtcggcat  cccaaaccat  tgatacgcgt  ccggaatttt  gcacggtcac  gatcgggaca    1140
taacggagtg  tcattttctt  cagacgatac  atgtcataat  ttgcggcttc  ataggctatg    1200
gtggggaata  gagctgggtt  acttgggttc  aatctgaacc  tctgaatgga  cttgccgttg    1260
ttcacacgca  gttgagtcgt  tccaacaaca  cttagtacca  gctgggtgtg  cattaaagct    1320
ttagctggcc  tttgtggagg  gttcacggtc  ttgatgattt  gcgtcttggc  aaatgggatg    1380
gctacagttt  tgatactggt  gtttgggatc  cggttcctgg  gctgggaccg  tgatttggat    1440
ttcttgggag  ctttcgaaga  catactatcg  ggatttgatt  aaatctttgt  ggattctaga    1500
atagtgtgca  ggtaatacgt  ttgttgatcg  cccctcacaa  gtgatttcca  cttgtgagaa    1560
gtactcctcc  actattttct  gaatgtaagg  ttctatgccg  aatgctttaa  agtatgacaa    1620
tctcgtagca  tcctctacct  cactccacaa  aagattcgtt  cttttaccga  gacgatctct    1680
ccaactgtac  tccatttgct  tgtggagtgc  atctagattg  aacttccggt  ttccaccgat    1740
tttatgcatt  aatttcgcct  gagccatatg  tattggaact  ccatcattga  tgattccgtt    1800
acattgcccc  aacgcgttca  ttgcatcttt  gaatgtcttt  gggtttaacc  aatcctgtgt    1860
tgaaaaacag  tctctagaca  aacttcccaa  ttgccttacc  atagcccatt  gcgtggcaat    1920
gcaaactggt  tgactacgac  agaacgccac  cttctcgagt  acatcgacag  gtttttcgac    1980
ggtcatttcg  aaacccctgc  acaggaacca  ttgctcaaga  ttgcggttta  tctcatcata    2040
gtctcccttc  tcacagaaaa  ggacacaatc  gtcaccatta  ttggctaacg  aagcccgcac    2100
tcccgcctct  ttcaggaatg  cgtgtaccat  gctgcacatg  agaatcttgt  tcccaaggcc    2160
tgtgtttata  tcgccgctca  tgcgacaccc  tttggtacgg  tatctaacca  gttctccagt    2220
tggtaatagg  gccgatccag  tgttggataa  ttgccatttc  aatagttgtt  ccaactgttg    2280
atccccagga  aaacacgctt  tataaaaggt  gtgttcaaat  ttgagggcat  ccacgctaca    2340
atgctgatcg  aatctactcg  catctagccc  gatccctatg  gggttctggt  atttgcgcca    2400
cttgtgggcg  atggctctcc  cttgagccct  gttatccaaa  cctgacaaga  cggtcttctc    2460
tttgaagaca  tcgtctatgg  aatccaacat  cttcttttca  ttcaacctga  gatattgtcc    2520
tatgcaaaga  ttatatctct  tggatcgagg  ttgaatcgtg  cggggcacgg  gatccttagt    2580
gtcacattca  agtttttcta  ccttgatgaa  tgcttgcacc  ttggaatctc  tccattggac    2640
aggtttcttc  tccagagagt  cagccgcttt  ttgatacaat  ttcctctttt  cagaagaata    2700
gcaagcaaca  acgtcatcta  tggaggattt  gagcacttga  cccttatgag  acaatttcct    2760
caaccactct  tcgcggaagt  aggaaatgga  gtcaaatgca  ttttggattg  gtttgggagg    2820
cactactaac  tctcccgcag  cgttctttac  acggaacact  ctgcgttcga  gactaactat    2880
catattatgt  agggaggttt  gatggacgca  aacctttaga  cccgcactaa  cagcaggtaa    2940
acctacgact  ctcttacttc  tcatgactct  actggcccgc  ttctcagcta  ccctgatttc    3000
cgggatgcct  aaaataggat  atggggcatc  ttcaaccgga  aagctgagtg  gaccgcctaa    3060
aaatcctcaa  gggatttgaa  cccagcaaca  gctttgttct  cacgaacggc  tgtcactaaa    3120
gtccttctgg  cttgactctt  tggattatag  gcgagcttga  cactgtctag  ggacttctgg    3180
tcaggtgtca  tggaaagata  tgctgcggtg  tataccaatg  tcctcgtgtg  gtgttcattt    3240
attttgaact  ctccacagat  atcactggca  gttgctctaa  ctgcagcttc  gtctatcaat    3300
cccatgttat  ctccgaaaat  ggcatggcgg  tttctgatcc  tcgtctcaac  agcttttatg    3360
gctgctgtca  tcatacctgg  tcgcacacgt  ttaatgtgct  tcctggcagc  actcctttgg    3420
agtttcatca  cgcccttgtc  atcctctttg  tacacttctt  cgtcaaaata  ctggttgacg    3480
gaagtgtcca  attccagaca  gtcttctaat  ttggattcta  gggtttcgct  gcagaggtcg    3540
ccgactacgc  gttccatctg  ctccgtgtaa  tgtggcatga  gtggcataaa  ggcatcgaca    3600
gcccacatat  gtgcatcaaa  gttgagaccg  aagtaccatt  tgcgaaaacg  gttccagcag    3660
tctataccca  agttgcaaat  agcggacaat  atcttgcctg  gattgaattt  gctcacccat    3720
accatcaatt  tgtccacatc  aaaaagcgaa  aagttgacaa  aacccatgac  tggtacgaaa    3780
agtagaaatt  aaaatgataa  agataccgtt  caaattccag  atccttgata  cgaagaaggc    3840
gactggcgaa  ttcgagaatt  ccaatttaca  aaccggtaaa  acgtttgttc                3890【００７１】
図１に示す前記ＲＣＮＭＶオーストラリア株のＲＮＡ１において、３´−ＵＴＲのｃＤＮＡは、前記配列番号１６で示される前記（III）の翻訳制御ポリヌクレオチドに相当する。
図１中、５つのステムループ構造を形成する３５９６番目から３７３２番目の塩基配列である３´ＴＥ−ＤＲ１のｃＤＮＡは、前記配列番号１４で示される前記（III）の翻訳制御ポリヌクレオチドに相当する。【００７２】
図２に示す前記ＲＣＮＭＶカナダ株のＲＮＡ１において、３´−ＵＴＲのｃＤＮＡは、前記配列番号８で示される前記（IV）の翻訳制御ポリヌクレオチドに相当する。
図２中、５つのステムループ構造を形成する３５９５番目から３７３２番目の塩基配列である３´ＴＥ−ＤＲ１のｃＤＮＡは、前記配列番号６で示されるの前記（IV）の翻訳制御ポリヌクレオチドに相当する。【００７３】
前記オーストラリア株及び前記カナダ株の３´ＴＥ−ＤＲ１中、ＳＬ１、ＳＬ４、及びＳＬ５は共通の塩基配列であり、ＳＬ１で示されるステムループ構造を形成する塩基配列のｃＤＮＡは、前記配列番号４０の翻訳制御ポリヌクレオチドに相当し、ＳＬ４で示されるステムループ構造を形成する塩基配列のｃＤＮＡは、前記配列番号２の翻訳制御ポリヌクレオチドに相当し、ＳＬ５で示されるステムループ構造を形成する塩基配列のｃＤＮＡは、前記配列番号４の翻訳制御ポリヌクレオチドに相当する。【００７４】
また、前記（Ｂ）の翻訳制御ポリヌクレオチドが組み込まれるポリヌクレオチドにおいて、アミノ酸配列をコードする塩基配列の５´側に組み込まれることがある前記配列番号１８に示されるＤＮＡ配列、及び前記配列番号１０に示されるＤＮＡ配列も前記ＲＣＮＭＶのＲＮＡ１由来配列のｃＤＮＡであることが好ましい。
具体的には、前記配列番号１８に示されるＤＮＡ配列は、前記ＲＣＮＭＶオーストラリア株のＲＮＡ１の５´−ＵＴＲに由来する配列のｃＤＮＡであり、前記配列番号１０に示されるＤＮＡ配列は、前記ＲＣＮＭＶカナダ株のＲＮＡ１の５´−ＵＴＲに由来する配列のｃＤＮＡである。【００７５】
前記ＲＣＮＭＶのＲＮＡ１から、前記翻訳制御ポリヌクレオチドを調製する方法としては、特に制限はなく、公知の方法から適宜選択することができ、例えば、ＲＣＮＭＶのウィルス粒子からＲＮＡ１を抽出し、該ＲＮＡ１のｃＤＮＡを逆転写反応により調製した後、これを増幅し、該ｃＤＮＡの転写産物が、ＲＮＡ２とともに混合して感染性を示すものを選択する方法等が挙げられる。【００７６】
（組換えベクター）
本発明の組換えベクターとしては、少なくとも前記翻訳制御ポリヌクレオチドを含むベクターであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記組換えベクターとしては、前記翻訳制御ポリヌクレオチドと目的のアミノ酸配列（タンパク質）をコードする塩基配列とを含むタンパク質発現用組換えベクターの他、前記翻訳制御ポリヌクレオチドを増幅させるための組換えベクターが含まれる。
前記タンパク質発現用組換えベクターとしては、目的のアミノ酸配列をコードする領域の３´側の非翻訳領域に、前記翻訳制御ポリヌクレオチドが挿入されてなることが好ましい。また、目的のアミノ酸配列をコードする領域の５´側の非翻訳領域には、前記配列番号９、１０、１７、及び１８のいずれかに示されるポリヌクレオチドが挿入されていてもよく、その他の翻訳活性を高める配列が挿入されていてもよい。【００７７】
前記組換えベクターを調製するために使用されるベクター（レプリコン）としては、宿主細胞において複製可能である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プラスミドベクター、ウィルスベクター、コスミド、バクテリオファージ、及びアグロバクテリウムなどが挙げられ、具体的には、細菌プラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＫＣ３０、ｐＣＦＭ５３６等）、ファージＤＮＡ（例えば、ラムダファージ等）、酵母プラスミド（例えば、ｐＧ−１等）、哺乳類細胞用のベクターとしてのバキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等のウイルスＤＮＡ、ＳＶ４０とその誘導体などが挙げられる。
また、前記ベクターとしては、例えば、複製開始点、選択マーカー、プロモーター、エンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。
また、前記ベクターは、種々の制限部位をその内部にもつポリリンカーを含んでいるか、又は単一の制限部位を含んでいることが好ましい。前記ベクター中の特定の制限部位を、特定の制限エンドヌクレアーゼによって切断し、その切断した部位に前記翻訳制御ポリヌクレオチドを挿入することができる。【００７８】
前記プラスミドベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＴ１５３、ｐＵＣ８、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＳＰ−ＲＬＵＣ等が挙げられる。また、商業的に入手可能なものとしては、例えば、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴ−１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ  ＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等が挙げられる。【００７９】
前記ウィルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス等が挙げられる。
前記バクテリオファージとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｔ４ファージ、Ｔ５ファージ、Ｔ７ファージ、λファージ、Ｍ１３等が挙げられる。【００８０】
前記組換えベクターとしては、目的の細胞に導入されて使用される。前記組換えベクターのうち、前記翻訳制御ポリヌクレオチドと目的のアミノ酸をコードする塩基配列とを含むタンパク質発現用組換えベクターは、例えば、後述する本発明の形質転換体の調製に好適に使用される。
前記組換えベクターの使用方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウィルスベクターからなる前記組換えベクターを目的の細胞に感染させ、該細胞内に導入する方法、バクテリオファージからなる前記組換えベクターを目的の細胞に感染させ、該細菌内に導入する方法、及びプラスミドベクターからなる前記組換えベクターを目的の細胞に導入する方法などが挙げられる。【００８１】
（形質転換体）
本発明の形質転換体としては、本発明の翻訳制御ポリヌクレオチド、及び本発明の組換えベクターのいずれかを含む細胞であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、前記翻訳制御ポリヌクレオチドの翻訳活性が最大となる温度条件下において、少なくとも生存可能であり、タンパク質を合成可能な細胞からなるものが好ましい。【００８２】
前記形質転換体を調製する方法としては、細胞等に、前記翻訳制御ポリヌクレオチド及び前記組換えベクターが導入される限り、特に制限はなく、公知の方法から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリエチレングリコール法（ＰＥＧ法）、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法、リポソーム法、及びアグロバクテリウム法などが挙げられる。【００８３】
前記形質転換体としては、単一の細胞であってもよく、複数の細胞からなる組織、器官、又は個体であってもよい。
前記細胞としては、例えば、動物細胞、植物細胞、菌類、及び酵母などが挙げられる。【００８４】
前記動物細胞としては、特に制限なく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、受精卵、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞、ＥＣ細胞等の胚性幹細胞、胚性癌細胞、造血幹細胞、癌化し、不死化した癌細胞株、各臓器の細胞株などが挙げられる。なお、前記動物細胞には、発生時から前記翻訳制御ポリヌクレオチドが導入されて形質転換されたトランスジェニック動物の細胞も含まれる。
前記動物細胞の由来としては、特に制限なく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、哺乳類、爬虫類、鳥類、両生類、魚類、昆虫類等の動物が挙げられる。【００８５】
前記動物細胞への前記翻訳制御ポリヌクレオチド、又は前記組換えベクターの導入方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、リポソーム法、マイクロインジェクション法、及びインビトロにおいて前記組換えベクターを、前記動物細胞（又は組織）に直接接触させることにより投与する方法などが挙げられる。また、動物個体の筋肉内、皮下、腹腔内等へ、注射等により投与してもよい。【００８６】
前記植物細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、栽培植物の器官(例えば、葉、花弁、茎、根、根茎、種子等)、組織(例えば、表皮、師部、柔組織、木部、維管束等)由来の切片、プロトプラストなどが挙げられる。なお、前記植物細胞には、発生時から前記翻訳制御ポリヌクレオチドが導入されて形質転換された植物体の細胞も含まれる。
前記植物細胞の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、種子植物、シダ類、蘚苔類、藻類等の植物が挙げられる。【００８７】
前記植物細胞への前記翻訳制御ポリヌクレオチド又は前記組換えベクターの導入方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アグロバクテリウムのバイナリーベクター法、パーティクルボンバードメント法、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。【００８８】
また、前記翻訳制御ポリヌクレオチド又は前記組換えベクターが導入された細胞は、細胞培養、組織培養、及び器官培養に供することができ、さらに、公知の植物組織培養法を用い、植物ホルモン等を投与し、植物体に再生させることができる。
具体的には、収穫量増加作用のあるタンパク質、寒さ等の環境ストレスに対する耐性を高めるタンパク質等をコードする塩基配列の３´側非翻訳領域に、本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドを導入してなる組換えベクターを、イネ、ムギ、トウモロコシ、ジャガイモ等の植物に導入することによって、耐寒性に優れ、収穫量の多い植物を作出することができる。【００８９】
前記菌類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｉｎ ｒｕｂｒｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｐａｎａｘ、Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ ｂｒｉｚａｅ等の糸状菌；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｂｕｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｔｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｉｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｓｅｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓｅ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｏｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｉｓ等の細菌等が挙げられる。
これらの中でも低温で増殖可能な菌類が好ましい。低温で増殖可能な菌類としては、例えば、Vibrio属微生物（Vibrio marinas等）、Pseudomonas属微生物（Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas syringae等）、Rhodococcus属微生物（Rhodococcus erythropolis等）、Shewanella属微生物（Shewanella violacea等）、Pseudoalteromonas属微生物（Pseudoalteromonas haloplanktis等）、Sphingomonas属微生物（Sphingomonas paucimobilis等）、Psychrobacter属微生物（Psychrobacter immobilis等）、Arthrobacter属微生物（Arthrobacter sp.  TAD20株等）、Cytophaga属微生物（Cytophaga sp.  KUC-1株等）、Moraxella属微生物（Moraxella sp.  TAE123株等）等が挙げられる。【００９０】
前記酵母としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ． ｇｌａｂｒａｄａ、Ｃ． ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ． ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ． ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等が挙げられる。【００９１】
前記形質転換体が得られたことを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬剤耐性遺伝子等をマーカーとして組み込み、該組換えベクターを導入した細胞を薬剤含有培地で培養し、増殖した細胞を選抜する方法等が挙げられる。
前記薬剤耐性遺伝子等としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、デストマイシン耐性遺伝子、オーレオバシジンＡ耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、フレオマイシン耐性遺伝子、及びチオストレプトン耐性遺伝子等が挙げられる。【００９２】
また、前記形質転換体が目的のアミノ酸配列（ポリペプチド、タンパク質）を発現したことを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光タンパク法、酵素活性測定法、免疫組織化学法等が挙げられる。
前記蛍光タンパク法としては、例えば、前記組換えベクター中に、蛍光タンパク質遺伝子を組み込み、該組換えベクターを導入した細胞を培養した後、紫外線を照射して前記タンパクによる蛍光を測定する方法が挙げられる。
前記酵素活性測定法としては、例えば、前記組換えベクター中に、酵素タンパク質の遺伝子を組み込み、酵素反応により発色する培養液中で培養した後、該培養液の発色を分光光度計により測定し、酵素活性を定量する方法が挙げられる。酵素タンパク質以外のタンパク質については、過酸化水素等を発生させてキノン体等発色物質を形成させ、それを分光光度計にて測定することにより定量する方法も挙げられる。
前記免疫組織化学法としては、例えば、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法等が挙げられる。【００９３】
（タンパク質合成方法）
本発明のタンパク質合成方法は、前記翻訳制御ポリヌクレオチド、及び前記組換えベクターを用いる方法であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、宿主細胞を用いた方法、及び無細胞タンパク質合成系で行われる方法（以下、「in  vitro系」ということがある）などが挙げられる。
また、前記タンパク質合成方法は、２０℃未満で行われることが好ましく、１７℃以下で行われることがより好ましい。【００９４】
前記宿主細胞を用いた方法としては、特に制限はなく、公知の方法から適宜選択することができ、例えば、目的のタンパク質をコードする塩基配列、及び前記翻訳制御ポリヌクレオチドを含む前記組換えベクターが導入された宿主細胞（例えば、前記形質転換体）を成長乃至増殖させ、２０℃未満の温度条件下で前記宿主細胞を培養することにより、前記目的のタンパク質を発現させる方法が挙げられる。【００９５】
前記宿主細胞としては、タンパク質を合成可能な細胞（例えば、真核細胞、大腸菌など）であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２０℃未満でタンパク質合成を行う細胞であることが好ましい。【００９６】
前記目的のタンパク質は、宿主細胞外に分泌される場合には、培地から回収することができ、宿主細胞内に存在する場合には、該宿主細胞を破砕又は溶解して得た抽出液から回収することができる。
回収された前記目的のタンパク質は、前記培地又は前記抽出液に対し、硫酸アンモニウム沈殿、エタノール沈殿、酸抽出、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、電気泳動、クロマトフォーカシングなどの公知の方法により精製することができる。【００９７】
−無細胞タンパク質合成系−
前記無細胞タンパク質合成系で行われる前記タンパク質合成方法としては、目的のタンパク質をコードする塩基配列、及び前記翻訳制御ポリヌクレオチドを含む前記組換えベクターを、宿主細胞に導入することなくタンパク質を合成させる方法であり、具体的には、リボソーム等を含む細胞抽出物に、前記組換えベクター、アミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液等を加え、細胞外でタンパク質合成を行う方法である。
前記無細胞タンパク質合成系としては、ｍＲＮＡを鋳型として、該ｍＲＮＡの情報に基づきリボゾーム上でタンパク質を合成する翻訳のみからなる方法であってもよく、ＤＮＡを鋳型としてｍＲＮＡを合成する転写及び翻訳からなる方法であってもよい。【００９８】
前記無細胞タンパク質合成系に用いられる反応液としては、目的のタンパク質の種類等に応じて適宜選択することができるが、例えば、細胞抽出液、鋳型となるポリヌクレオチド（例えば、本発明の翻訳制御ポリヌクレオチド及び目的のタンパク質をコードした塩基配列を含む組換えベクター）、アミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液、ＡＴＰ再生系、核酸分解酵素阻害剤、ｔＲＮＡ、還元剤、ポリエチレングリコール、葉酸塩、抗菌剤、また鋳型としてＤＮＡを用いる場合、ＲＮＡ合成の基質、及びＲＮＡポリメラーゼ等を含むものが挙げられる。【００９９】
前記細胞抽出液としては、例えば、大腸菌、植物種子胚芽（例えば、コムギ胚芽、オオムギ胚芽、イネ胚芽、コーン胚芽等）、ウサギ網状赤血球等の細胞抽出物が挙げられるが、これらの中でも２０℃未満の温度条件下で増殖可能な細胞の抽出物が好ましく、コムギ胚芽抽出物が好ましい。
前記細胞抽出液の調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、翻訳阻害因子、核酸分解酵素等を除去する処理、翻訳阻害因子の活性化を抑制する処理を行うことが好ましい。【０１００】
前記アミノ酸としては、例えば、タンパク質を構成するアミノ酸が挙げられる。
前記エネルギー源としては、例えば、ＡＴＰ、及びＧＴＰのいずれかが挙げられる。
各種イオンとしては、例えば、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、酢酸アンモニウム等の酢酸塩、グルタミン酸塩等が挙げられる。
前記緩衝液としては、例えば、Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＯＡＣ等が挙げられる。
前記ＡＴＰ再生系としては、例えば、ホスホエノールピルベートとピルビン酸キナーゼの組合せ、またはクレアチンリン酸（クレアチンホスフェート）とクレアチンキナーゼの組合せが挙げられる。
前記核酸分解酵素阻害剤としては、例えば、リボヌクレアーゼインヒビターや、ヌクレアーゼインヒビター等が挙げられる。
前記還元剤としては、例えば、ジチオスレイトール等が挙げられる。
前記抗菌剤としては、例えば、アジ化ナトリウム、アンピシリン等が挙げられる。
前記ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えば、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。【０１０１】
前記前記無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質の合成方法としては、特に制限はなく、公知の方法から適宜選択することができ、例えば、前記反応液を一の反応容器中に混合して行う方法、及び、タンパク質を合成する反応部と、タンパク質合成に必要な物質を供給する供給部とを、半透膜等により分割した反応容器を使用する方法（透析法）、反応部と供給部を半透膜で区切る代わりに、供給する液にグリセリン等の比重の大きい物質を混合し、反応液に対する比重を大きくし供給し、その上に比重の小さい反応液を重層する方法（重層法）等が挙げられる。【０１０２】
前記無細胞タンパク質合成系により合成された目的のタンパク質は、前記反応液からゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー等の公知のタンパク質精製法を適宜組合せることにより、単離精製される。【０１０３】
（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系翻訳キット）
本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ系翻訳キットは、本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドを少なくとも含んでなり、前記タンパク質合成方法に好適に使用される。
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系翻訳キットとしては、具体的には、前記翻訳制御ポリヌクレオチドが組込まれ、目的タンパク質をコードする塩基配列を組込むための前記組換えベクターを少なくとも含み、さらに、細胞抽出液、ＡＴＰ再生系試薬を含み、必要に応じて、前記無細胞タンパク合成系にに必要な試薬類の全部または一部を含む。
本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ系翻訳キットは、さらに、反応用容器を含んでいてもよい。【０１０４】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳キットの具体的な構成としては、公知のｉｎ  ｖｉｔｒｏ系翻訳キットの構成を採用することができ、例えば、特開２００３−１０２４９５号公報、Current  Opinion  Biotechnology  9:  534-548  (1998)  、J.  Biotechnology  41:  81-90  (1995)、などの文献を参照することができる。【０１０５】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系翻訳キットに使用される細胞抽出液としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、大腸菌、植物種子胚芽（例えば、コムギ胚芽、オオムギ胚芽、イネ胚芽、コーン胚芽等）、植物由来培養細胞（例えば、タバコ培養細胞等）、ウサギ網状赤血球等の細胞抽出物が挙げられるが、これらの中でも２０℃未満の温度条件下で増殖可能な細胞の抽出物が好ましく、コムギ胚芽抽出物が好ましい。【０１０６】
（タンパク質合成装置）
本発明のタンパク質合成装置は、前記翻訳制御ポリヌクレオチドを用い、アミノ酸を合成させる合成手段を少なくとも有してなり、前記タンパク質合成方法に好適に使用される。
また、本発明のタンパク質合成装置としては、温度制御手段を有することが好ましく、該温度制御手段により、タンパク質合成を２０℃未満で行うように制御することが好ましく、１７℃以下で行うように制御することがより好ましい。
前記温度制御手段としては、特に制限はなく、目的に応じて公知の装置等の中から適宜選択することができ、例えば、前記タンパク質合成装置と一体に構成されたサーモモジュールであってもよく、前記タンパク質合成装置に外付けされる恒温槽、ＣＯ２インキュベーターなどであってもよい。【０１０７】
前記宿主細胞を用いたタンパク質合成方法に使用される前記合成手段としては、例えば、バイオリアクター等が挙げられる。【０１０８】
前記無細胞系タンパク質合成に使用される前記合成手段としては、例えば、前記細胞抽出物、前記組換えベクター、アミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液等を供給する供給手段と、目的のタンパク質の合成反応を行うための容器と、及び生成物を排出する排出手段とを備えるものなどが挙げられる。前記容器は、半透膜等で、反応槽と供給槽に仕切られていてもよい。
前記細胞抽出物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、コムギ胚芽抽出物、大腸菌抽出物、タバコ培養細胞抽出物等が好ましく、これらの中でもコムギ胚芽抽出物がより好ましい。【０１０９】
前記タンパク質合成装置の好ましい具体例としては、例えば、前記反応槽を備えた反応温度勾配恒温器や、前記容器を半透膜で仕切り、前記供給槽と前記反応槽とが形成され、転写と翻訳とを連続的に行うことができるようにした装置などが挙げられる。該タンパク質合成装置を用い、例えば、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳キットを用いたタンパク質合成方法としては、反応に必要な基質とエネルギーとを半透膜を介して連続的に供給でき、前記細胞抽出物を用いて、タンパク質合成を最長２４時間まで行うことができる。前記反応槽においては、Ｔ７ＲＮＡ  ポリメラーゼによって高レベルの転写が行われ、その後、前記細胞抽出物中の成分（ｔＲＮＡ、リボソーム、酵素、因子等）を用いて翻訳が行われる。前記供給槽には、イオン、エネルギー源や基質となるヌクレオチド、アミノ酸が含まれており、半透膜を介してこれらの物質を前記反応槽に供給する。同様に前記反応槽から前記供給槽へ対流させることにより、前記反応槽中の反応によって形成された阻害要因となる低分子が効果的に希釈される。【０１１０】
本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドは、宿主細胞や、無細胞系タンパク質に用いる抽出物の由来生物の種による制限を受けず、ｍＲＮＡの翻訳活性を高め、かつ、温度制御可能であり、特に低温（２０℃未満）における翻訳活性を高めるため、高温条件下で不安定なタンパク質の合成や、低温条件下で産生量が少ないタンパク質の合成に好適に使用される。また、前記翻訳制御ポリヌクレオチドによる形質転換体としての植物体は、寒冷地農業等に好適であるため、前記翻訳制御ポリヌクレオチドは、寒冷地農業用の品種改良に好適に使用される。
【実施例】
【０１１１】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。【０１１２】
（実施例１）
＜翻訳制御ポリヌクレオチド、及び組換えベクターの調製＞
ＲＣＮＭＶオーストラリア株から、公知の方法により、ＲＮＡ１を抽出した。
下記の方法により、該ＲＮＡ１の全長ｃＤＮＡを合成し、該ｃＤＮＡから翻訳制御ポリヌクレオチドを切り出し、ルシフェラーゼをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドに組み込み、組換えベクターを調製した。【０１１３】
＜ＲＮＡ１の配列解析＞
−３´ＲＡＣＥ法による３´末端塩基配列の決定−
ＲＮＡ１（３０μｇ）に対し、１Ｕのポリ（Ａ）ポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製）、４０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５０ｍＭのＮａＣｌ２、２．５ｍＭのＭｎＣｌ２、２５０μＭのＡＴＰ、５０ｎｇ／μＬのＢＳＡ、及び１ｍＭのＤＴＴを用い、３７℃で３０分間で反応を行い、前記ＲＮＡ１の３´末端にポリＡを付加した。次いでフェノール／クロロホルム抽出を２回行い、クロロホルム抽出を１回行った後、エタノール沈澱を行い、３´末端にポリＡが付加されたＲＮＡ１を回収した。【０１１４】
次いで、スーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）II（インビトロジェン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製）と、プライマーとして２０ｐｍｏｌのポリ（Ｔ）アダプター（配列番号２１：５´−ＣＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３´）とを用いてＲＮＡの逆転写反応を行った。この逆転写反応は、４２℃で６０分間、５１℃で３０分間、６７℃で１５分間の条件で行った。
前記逆転写反応により得られたｃＤＮＡを、ＰＣＲ反応により増幅した。前記ＰＣＲ反応は、Ｅｘ  タグ  ポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製）と、プライマーとして１０ｐｍｏｌのアダプター（配列番号２２：５´−ＣＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡ−３´）と、Ｓ／Ｒ１ｉｎｔ５´（配列番号２３：５´−ＴＧＡＧＣＡＧＡＴＡＡＡＣＣＧＣＡＡＴＣ−３´）とを用い、９４℃で４分間を１サイクル、次に９４℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で１分間を２サイクル、続いて９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間を２７サイクル、さらに９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１０分間を１サイクルの条件で行った。
前記ｃＤＮＡを回収し、１％低融点アガロースゲル（ＦＭＣ  バイオプロダクツ社製）を用いて電気泳動を行って長さを確認したところ、前記ｃＤＮＡの長さは１．９ｋｂであることがわかった。【０１１５】
回収した前記ｃＤＮＡを、制限酵素ＸｈｏＩで切断後、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔII（ＫＳ）（ストラタジーン社製）の対応するサイトにＤＮＡ  ライゲ−ション  キット  Ｖｅｒ．１（タカラバイオ株式会社製）を用いてライゲーションし、これをオートシークエンサー（アプライド  バイオシステムズ社製）に供し、前記ＲＮＡ１の３´末端の配列を決定した。【０１１６】
−５´ＲＡＣＥ法を用いた５´末端塩基配列の決定−
前記ＲＮＡ１（１μｇ）と、スーパースクリプトII（インビトロジェン社製）と、プライマーとして２０ｐｍｏｌの３´Ｒ／Ｃ１（配列番号２４：５´−ＴＡＣＣＣＧＧＧＧＴＡＣＣＴＡＧＣＣＧＴＴＡＴＡＣ−３´）とを用い、前記ＲＮＡ１の逆転写反応を行った。該逆転写反応は、４２℃で６０分間、５１℃で３０分間、６７℃で１５分間の条件で行った。
前記逆転写反応の反応液から、ＳＵＰＲＥＣ−０２（タカラバイオ株式会社製）を用い、余分なｄＮＴＰとプライマーとを除去した。前記反応液中のアデニル残基の重合反応は、ターミナル  デオキシヌクレオチジル  トランスフェラーゼ（タカラバイオ株式会社製）を用いて３７℃で３０分間行い、さらに６５℃で３分間不活化処理を行った。
得られた前記反応液５μＬをＰＣＲ反応に供した。前記ＰＣＲ反応は、Ｅｘ  タグ  ポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製）、プライマーとして２ｐｍｏｌのポリ（Ｔ）−アダプター、２４ｐｍｏｌのアダプター、及び２４ｐｍｏｌのＳ／Ｒ１ｉｎｔ３´（配列番号２５：５´−ＴＴＧＣＧＴＧＧＣＡＡＴＧＣＡＡＡＣＣＧ−３´）を用い、９５℃で５分間、４２℃で２分間、７２℃で４分間を１サイクル行い、９４℃で４５秒間、５８℃で４５秒間、７２℃で３分間を３０サイクル行い、９４℃で４５秒間、５８℃で４５秒間、７２℃で１０分間を１サイクル行った。【０１１７】
さらに前記ＰＣＲの反応液１μＬをセカンドＰＣＲに供した。このセカンドＰＣＲは、２０ｐｍｏｌのアダプター及びプライマー（Ｓ／Ｒ１ｉｎｔ３´）を用い、９４℃で４分間を１サイクル行い、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で２分間を３０サイクル行った。
得られたＤＮＡを回収し、１％低融点アガロースゲル（ＦＭＣ  バイオプロダクツ社製）を用いて電気泳動により長さを確認したところ、１．９ｋｂであった。
得られたｃＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩで切断後、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（ＫＳ）（ストラタジーン社製）の対応するサイトに、ＤＮＡ  ライゲーション  キット  Ｖｅｒ．１（タカラバイオ株式会社製）を用いてライゲーションした。
以上により得られたＲＮＡ１の５´末端を含むｃＤＮＡを、オートシークエンサー（アプライド  バイオシステムズ社製）に供し、ＲＮＡ１の５´末端の配列を決定した。【０１１８】
＜ｃＤＮＡクローンの作製＞
上記（１）において決定した前記ＲＮＡ１の塩基配列に基づいて調製したプライマー、Ｔ７Ｃａｎ１５´（配列番号２６：５´−ＧＣＧＡＧＣＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＡＡＡＣＧＴＴＴＴＡＣＣＧＧ−３´）と、前記３´Ｒ／Ｃ１とを用い、分離したＲＣＮＭＶオーストラリア株、及びカナダ株それぞれのＲＮＡ１について逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。【０１１９】
得られたｃＤＮＡのうち、オーストラリア株のｃＤＮＡをＰＣＲ反応により増幅した。
前記ＰＣＲ反応は、Ｅｘ  タグ  ポリメラーゼ（タカラバイオ株式会製）を用い、９４℃で４分間、５０℃で１分間、７２℃で５分間を１サイクル行い、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で４分間を２８サイクル行い、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１０分間を１サイクル行った。
ＰＣＲにより増幅した前記ｃＤＮＡを回収し、１％アガロースゲル（ＦＭＣ  バイオプロダクツ社製）を用いて電気泳動を行い、長さを確認したところ、４．０ｋｂであった。このｃＤＮＡを、制限酵素ＳａｃＩとＳｍａＩとで切断後、ｐＵＣ１１８（タカラバイオ株式会社製）の対応する領域にライゲーションし、ｃＤＮＡクローンを得た。【０１２０】
前記ｃＤＮＡクローンをＳｍａＩでリニアライズした後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応を行った。この転写反応により得られたＲＮＡ１の転写産物を、ＲＮＡ２と等量混合してＣ．ｑｕｉｎｏａに接種し、感染性を示した転写産物の由来であるｃＤＮＡを選抜した。【０１２１】
＜組換えベクターの作製＞
前記ＲＣＮＭＶのオーストラリア株のＲＮＡ１（ｐＲＣ１｜Ｇ）のｃＤＮＡ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ（フェルメンタス社製）、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によってポリ（Ａ）３０テールの付加されたｍＲＮＡ転写物を作ることができるＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃ遺伝子をもつプラスミド（ｐＳＰ６４−ＲＬＵＣ）を用いて、下記の方法により、前記組換えベクターを調製した。【０１２２】
前記ＲＣＮＭＶのオーストラリア株のＲＮＡ１のｃＤＮＡ断片における配列番号（ｎｔ）１〜１３１は、プライマー５´ＲＳ１Ｔ７（配列番号２７：５´-ＧＣＧＡＧＣＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＣＡＡＡＣＧＴＴＴＴＡＣＣＧＧＴＴＴＧ-３´）と、ＡＣ５´ＵＴＲ／Ｎｃｏ−（配列番号２８：５´−ＡＡＡＡＣＣＣＡＴＧＧＡＣＴＧＧＴＡＣＧＡＡＡＡＧＴＡＧ−３´）とを使用し（下線部は、制限酵素領域を示す）、ｐＲＣ１｜ＧからＰＣＲで増幅した。
前記ＲＣＮＭＶのオーストラリア株のＲＮＡ１のｃＤＮＡ断片における配列番号（ｎｔ）：１１３〜３８９０は、プライマーＡＣ５´ＵＴＲ／Ｎｃｏ＋（配列番号２９：５´-ＣＧＴＡＣＣＡＧＴＣＣＡＴＧＧＧＴＴＴＴＡＴＡＡＡＴＣ-３´）と、３´Ｒ／Ｃ１（配列番号３０：５´-ＴＡＣＣＣＧＧＧＧＴＡＣＣＴＡＧＣＣＧＴＴＡＴＡＣ-３´）とを用いて、ｐＲＣ１｜ＧからＰＣＲで増幅した。
これらのｃＤＮＡ断片を混合し、変性し、冷却して得られた混合物は、ＰＣＲの鋳型として用い、ＰＣＲを行い、ＤＮＡを合成した。【０１２３】
新たに合成されたＤＮＡは、前記５´ＲＳ１Ｔ７プライマー、及び前記３Ｒ／Ｃ１プライマーを使って増幅した。増幅された３．９ｋｂのｃＤＮＡは、制限酵素ＳａｃＩとＳｍａＩとで処理し、、ｐＵＣ１１８（タカラバイオ株式会社）の一致した領域にライゲーションさせて、プラスミドｐＵＲＣ１／Ｎｃｏを得た。【０１２４】
＜＜ＲＮＡ１全長を含む組換えベクター（ｐＲ１−５´−ＮＳ）＞＞
前記プラスミドｐＵＲＣ１／Ｎｃｏを制限酵素ＮｃｏＩ／ＳｐｈＩを用いて切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによる末端平活化を行った。得られたＤＮＡ小断片を、１％低融点アガロースゲル（ＦＭＣ  バイオプロダクツ社製）にて電気泳動して回収した。回収したＤＮＡ小断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、制限酵素ＸｂａＩとＨｐａＩとで切断されたｐＳＰ−Ｌｕｃ＋（プロメガ社製）に導入し、ＲＮＡ１全長を含む組換えベクター（ｐＲ１−５´−ＮＳ）を作製した。【０１２５】
＜＜ＲＮＡ１の３´−ＵＴＲを含む組換えベクター（ｐＲ１−ＸｂＳ）＞＞
ＲＣＮＭＶのオーストラリア株のＲＮＡ１のｃＤＮＡ断片の配列番号（ｎｔ）：３４４６〜３８９０を、プライマーＡｕｓ１−３´／Ｘｂａ（配列番号３１：５´−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＧＧＴＴＣＴＴＴＴＡＡＧＴＧＴＡＧＣＣ−３´）と、Ｍ４（配列番号３２：５´−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３´）とを用い（下線部は制限酵素領域を示す）、ｐＵＲＣ１／Ｎｃｏから増幅し、増幅したｃＤＮＡ断片（０．５ｋｂ）をＸｂａＩ／ＳｐｈＩで切断し、ｐＳＰ−Ｌｕｃ＋のＸｂａＩ／ＨｐａＩ領域に導入し、ＲＮＡ１の３´−ＵＴＲを含む組換えベクター（ｐＲ１−ＸｂＳ）を作製した。該組換えベクターは、本発明の翻訳制御ポリヌクレオチド（配列番号１４）を含む。【０１２６】
＜＜ＲＮＡ１の５´−ＵＴＲと３´−ＵＴＲとを含む組換えベクター（ｐＲ１−５´−ＸｂＳ）＞＞
ｐＲ１−ＸｂＳのＮｄｅＩ／ＮｃｏＩ領域に、ｐＵＲＣ１／ＮｃｏをＳａｃＩ／ＮｃｏＩで切断したＤＮＡ断片を挿入し、ＲＮＡ１の５´−ＵＴＲと３´−ＵＴＲとを含む組換えベクター（ｐＲ１−５´−ＸｂＳ）を作製した。該組換えベクターは、本発明の翻訳制御ポリヌクレオチド（配列番号１４）を含む。【０１２７】
＜＜比較用ベクターの調製＞＞
６０-ｎｔのポリＡ領域を持っているプラスミドｐ３´−８を、ＨｉｎｄIII／ＡｃｃＩで切断し、ｐＬＵＣｐＡ３０をＨｉｎｄIII／ＳａｃＩで切断したＤＮＡ断片を挿入し、ポリＡを有する比較用ベクター（ｐＬＵＣＡ３０）を作製した。
なお、プラスミドｐＬＵＣｐＡ３０は、ｐＳＰ６４−ＲＬＵＣのＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃ遺伝子をホタルＬｕｃ遺伝子と組み換えることで作製した。
なお、得られた各組換えベクターの塩基配列は、ＡＢＩ３１０自動シークエンサーを用いて解析した。【０１２８】
前記各組換えベクターを直鎖状にし、転写反応を行った。
前記ＲＮＡ１の全長を含む組換えベクター（ｐＲ１−５´−ＮＳ）、及び前記ＲＮＡ１の５´−ＵＴＲと３´−ＵＴＲとを含む組換えベクター（ｐＲ１−５´−ＸｂＳ）は、ＳｍａＩで切断し、直鎖状にした後、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写を行い、Ｒ１−５´−ＮＳ、及びＲ１−５´−ＸｂＳを調製した。
前記ＲＮＡ１の３´−ＵＴＲを含む組換えベクター（ｐＲ１−Ｘｂｓ）は、ＳｍａＩで切断し、直鎖にした後、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ（フェルメンタス社製）を用いて転写を行い、Ｒ１−Ｘｂｓを調製した。
また、前記ｐＡ６０は、ＥｃｏＲＩで切断して、直鎖にした後、前記Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写を行い、Ａ４０を調製した。
それぞれの構造図を、図３に示した。【０１２９】
前記転写反応において、ニュー  イングランド  バイオラブズ社製のキャップ構造アナログ（ｍ７ＧｐｐｐＧ）を用い、５´末端にＣａｐ構造を持つｍＲＮＡと、Ｃａｐ構造を持たないｍＲＮＡとを以下の方法によりそれぞれ作製した。【０１３０】
Ｃａｐ構造を持つ前記ｍＲＮＡは、１×Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼバッファーと、１０ｍＭのＤＴＴと、１ｍＭのＡＴＰと、１ｍＭのＵＴＰと、１ｍＭのＣＴＰと、０．２ｍＭのＧＴＰと、２ｍＭのＲＮＡ  キャップ  ストラクチャー  アナログ（ｍ７ＧｐｐｐＧ）と、６０ｎｇ／μＬのｌｉｎｅａｌｉｚｅｄ  ＤＮＡと、１０Ｕ／１０μＬのＴ７ＲＮＡポリメラーゼとを含む反応液を用い、３７℃で２時間転写反応を行った後、ＲＱ１ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅＤＮａｓｅ（プロメガ社製）を用い、３７℃で３０分の反応条件で前記各プラスミドのＤＮＡを分解して調製した。【０１３１】
Ｃａｐ構造を持たない前記ｍＲＮＡは、１×Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼバッファーと、１０ｍＭのＤＴＴと、１ｍＭのＡＴＰと、１ｍＭのＵＴＰと、１ｍＭのＣＴＰと、１ｍＭのＧＴＰと、６０ｎｇ／μＬのリニアライズド  ＤＮＡと、１０Ｕ／１０μＬのＴ７ＲＮＡポリメラーゼとを含む反応液を用い、３７℃で２時間転写反応を行った後、ＲＱ１ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅＤＮａｓｅ（プロメガ社製）を用い、３７℃で３０分の反応条件で前記各プラスミドのＤＮＡを分解して調製した。【０１３２】
その後、前記各反応液を蒸留水で飽和させた後、アマシャム社製Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０  ｆｉｎｅ  担体を充填した１ｍＬシリンジ（株式会社テルモ製）に添加し、１２００×ｇで５分間、スイングローターを用いて遠心分離した。
前記反応液をカラムを通過させた後エタノール沈澱し、蒸留水に溶解し、濃度をＡ２６０で測定し、さらに電気泳動で行うことにより転写産物を確認した。【０１３３】
＜形質転換体の調製＞
−プロトプラストの調製−
１０〜１６日間培養したササゲ（Ｖｉｇｎａ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ  ｃｖ．Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｂｌａｃｋｅｙｅ）の第１葉の裏表皮をピンセットで剥ぎ取り、酵素液（０．５Ｍのマンニトール、５ｍＭのＣａＣｌ２、１％（Ｗ／Ｖ）のセルラーゼ  オノズカ  Ｒ-１０（株式会社ヤクルト製）、０．０５％（Ｗ／Ｖ）のマセロザイム  Ｒ−１０（株式会社ヤクルト製）を含む）上に、剥ぎ取った面を下にして浮かべ、２５℃で４時間、４０ｒｐｍで振とうし、プロトプラストを得た。
該プロトプラストを４層のガーゼでろ過し、遠心分離（５０×ｇ、室温、３分間）により回収した後、０．５Ｍのマンニトール及び５ｍＭのＣａＣｌ２による洗浄を３回繰り返し、ヘマトメーターで、細胞数をカウントした。
前記プロトプラストを４ｍＬのプラスチックチューブに３．０×１０５個ずつ分注し、遠心分離した後、上清を除去した。【０１３４】
−組換えベクターの導入−
前記各組換えベクター（Ｒ１−５´−ＮＳ、Ｒ１−５´−ＸｂＳ、Ｒ１−ＸｂＳ、及びｐＡ６０）を前記プラスチックチューブの壁面に付け、２００μＬのＰＥＧ溶液（４０％Ｗ／Ｖポリエチレングリコール、３ｍＭＣａＣｌ２、ｐＨ５．５）でプロトプラストに向けて流し込み、２０秒間穏やかに混ぜた。その後、直ちに０．５Ｍマンニトール及び５ｍＭのＣａＣｌ２を２ｍＬ加え、穏やかに混ぜ、氷中に１５分間静置した。この間、５分間ごとにプロトプラストを穏やかに攪拌した。得られたプロトプラスト（形質転換体）は、遠心分離（５０×ｇ、室温、３分間）で集めた後、０．５％マンニトール及び５ｍＭのＣａＣｌ２で２回洗浄した。【０１３５】
＜タンパク質合成＞
前記プロトプラスト（形質転換体）を、培養液（０．２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１ｍＭのＫＮＯ３、１ｍＭのＭｇＳＯ４、１０ｍＭのＣａＣｌ２、１μＭのＫＩ、０．０１μＭのＣｕＳＯ４、０．５Ｍのマンニトール、０．０２％（Ｗ／Ｖ）のクロラムフェニコール、ｐＨ６．５）１ｍＬ中に加え、１．５ｍＬエッペンチューブに移し、弱光下（１０００ｌｕｘ以下）で温度勾配恒温器（日本医科機器製作所製、ＴＧ−１００−ＡＤＣＴ）を用い、１７℃と２５℃とで、それぞれ６時間培養した。
培養液２０μＬをルシフェラーゼ定量システム（スタンダードタイプ）（プロメガ社製）を利用し、ルシフェラーゼ活性（ＬＵＣ活性）を測定した。ｐＡ６０を導入したプロトプラストの２５℃における活性を１とし、相対値を求めた。結果を表１に示す。【０１３６】
【表１】
2005100561.tif 000002
各組換えベクター中、ｐＡ６０のみが、Ｃａｐ構造を有する。各組換えベクターの構造は図３に示すとおりである。【０１３７】
表１の結果から、前記ＲＣＮＭＶのＲＮＡ１由来の配列を含まないｐＡ６０に比べて、本発明の翻訳制御ポリヌクレオチド（配列番号１５、配列番号１６）を含む前記Ｒ１−５´−ＸｂＳ、及びＲ１−ＸｂＳは、導入したプロトプラストにおけるタンパク質翻訳活性を高めることがわかった。また、２５℃の翻訳活性よりも１７℃における翻訳活性を高めることから、低温域における翻訳活性を高めることがわかった。
なお、前記ＲＣＮＭＶのＲＮＡ１全長を含むＲ１−５´−ＮＳでは、翻訳活性を高める作用は弱かった。【０１３８】
（実施例２）
前記ＲＣＮＭＶのＲＮＡ１中、ステムループ構造を形成する配列であり、前記配列番号３９（ｃＤＮＡとして配列番号４０）、及び前記配列番号１（ｃＤＮＡとして配列番号２）で示される本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドの配列中に、下記の方法により変異を導入した組換えベクター（ｐ３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ１、及びｐ３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ４）を調製した。【０１３９】
−ｐ３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ４の調製−
前記ｐＲ１−５´−ＸｂＳを鋳型として、プライマーＬｕｃ＋３´ＦＷ（配列番号３３：５´−ＴＧＴＧＧＡＣＧＡＡＧＴＡＣＣＧＡＡＡＧＧＴＣＴＴＡＣＣＧＧ−３´）と、ＳＬ４−Ｌｍ１／−（配列番号３４：５´−ＧＡＧＧＡＡＡＡＧＣＣＴＣＴＣＧＡＣＧＧＣＧＧＧＴＴＡＣ−３´）の組合せと、ＳＬ４−Ｌｍ１／＋（配列番号３５：５´−ＧＡＧＧＣＴＴＴＴＣＣＴＣＴＧＴＧＴＧＧＴＴＧＣＧ−３´）と、Ｌｕｃ＋３´ＲＶ（配列番号３６：５´−ＧＣＡＧＣＣＧＡＡＣＧＡＣＣＧＡＧＣＧＣＡＧＣＧＡＧＴＣＡＧ−３´）の組合わせとを用いて、９４℃で４５秒、５５℃で４５秒間、７２℃で１分間を３０サイクルの条件でＰＣＲを行い、目的の２つの断片が増幅しているのを確認し、５０μＬのうち、１μＬをプライマーＬｕｃ＋３´ＦＷとＬｕｃ＋３´ＲＶを用いたリコンビナントＰＣＲ反応に供した。ＰＣＲ反応は、９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃で１分間を３０サイクル行った。ＰＣＲで増幅したＤＮＡを制限酵素ＳａｃIIと、ＳｍａＩとで切断後、ｐＲ１−５´−ＸｂＳの対応する領域にライゲーションした。得られたｃＤＮＡは、オートシークエンサー（アプライド  バイオシステムズ社製）に供し、変異が挿入されたことを確認した。【０１４０】
−ｐ３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ１の調製−
前記ｐＲ１−５´−ＸｂＳを鋳型として、プライマーに、前記Ｌｕｃ＋３´ＦＷ、及びＳＬ１−Ｌｍ１／−（配列番号４１：５´−ＧＧＴＡＣＣＴＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＴＧＣＣＧＧ−３´の組合せと、前記Ｌｕｃ＋３´ＲＶ、及びＳＬ１−Ｌｍ１／＋（配列番号４２：５´−ＧＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＡＣＣＴＡＧＣＧＴＡＴＴＡＡＴＡＧＧ−３´）の組合せとを用いた以外は、上記ｐ３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ４と同様にして変異をＳＬ１に挿入した。【０１４１】
変異が挿入された後の配列を、図４の各枠中に示す。図４中、Ｌｍ４に示す変異が導入された組換えベクターを、ｐ３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ４と表し、Ｌｍ１に示す変異が導入された組換えベクターを、ｐ３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ１と表す。【０１４２】
前記ｐＲ１−５´−ＸｂＳ、前記ｐ３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ４、前記ｐ３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ１及び前記ｐＡ６０を、実施例１と同様にして直鎖にした後、転写を行い、それぞれ５´末端にＣａｐ構造を持つｍＲＮＡと、Ｃａｐ構造を持たないｍＲＮＡとを作製した。【０１４３】
得られた各ｍＲＮＡを実施例１と同様にしてプロトプラストへ導入し、実施例１と同様にしてルシフェラーゼ活性（ＬＵＣ活性）を測定した。ｐＡ６０（Ｃａｐ構造あり）を導入したプロトプラストの２５℃における活性を１とし、相対値を求めた。結果を表２に示す。【０１４４】
【表２】
2005100561.tif 000003
なお、表２中、
「Ｒ１−５´−ＸｂＳ」は、実施例１と同様、配列番号１５（ｃＤＮＡとして配列番号１６）で示される翻訳制御ポリヌクレオチドと、前記ＲＮＡ１の５´−ＵＴＲとを含む組換えベクターであり、
「３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ４」は、前記「Ｒ１−５´−ＸｂＳ」中、配列番号１（ｃＤＮＡとして配列番号２）で示される本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドの領域に、塩基置換を行ったものであり、
「３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ１」は、前記「Ｒ１−５´−ＸｂＳ」中、配列番号３９（ｃＤＮＡとして配列番号４０）で示される本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドの領域に、塩基置換を行ったものである。【０１４５】
表２の結果から、本発明の翻訳制御ポリヌクレオチド（配列番号１５、配列番号１６）において、ステムループ形成可能なＳＬ１領域、及びＳＬ４領域が、翻訳活性、特に低温域における翻訳活性を高める作用において重要なポリヌクレオチドであることがわかった。【０１４６】
（実施例３）
前記ＲＣＮＭＶのＲＮＡ１中、ステムループ構造を形成する配列であり、前記配列番号３（ｃＤＮＡとして配列番号４）で示される本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドの配列中に、下記の方法により変異を導入した組換えベクター（ｐ３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ５）を調製した。【０１４７】
前記ｐＲ１−５´−ＸｂＳを鋳型として、プライマーに、前記Ｌｕｃ＋３´ＦＷ、及びＳＬ５−Ｌｍ１／−（配列番号３７：５´−ＣＧＴＧＣＧＧＴＧＴＴＣＣＡＣＡＣＡＧＡＧＧＴＴＴＴＣＣＣ−３´の組合せと、前記Ｌｕｃ＋３´ＲＶ、及びＳＬ５−Ｌｍ１／＋（配列番号３８：５´−ＧＴＧＴＧＧＡＡＣＡＣＣＧＣＡＣＧＴＣＧＴＴＧＴＣＧＧＡＡＧ−３´）の組合せとを用いた以外は、実施例２と同様にして変異をＳＬ５に挿入した。
変異が挿入された後の配列を、図４の各枠中に示す。図４中、Ｌｍ５に示す変異が導入された組換えベクターを、ｐ３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ５と表す。【０１４８】
前記ｐＲ１−５´−ＸｂＳ、前記ｐ３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ４、前記ｐ３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ１、前記ｐ３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ５、及び前記ｐＡ６０を、実施例１と同様にして直鎖にした後、転写を行い、それぞれ５´末端にＣａｐ構造を持つｍＲＮＡと、Ｃａｐ構造を持たないｍＲＮＡとを作製した。【０１４９】
得られた各ｍＲＮＡを実施例１と同様にしてプロトプラストへ導入し、実施例１と同様にしてルシフェラーゼ活性（ＬＵＣ活性）を測定した。ｐＡ６０（Ｃａｐ構造あり）を導入したプロトプラストの２５℃における活性を１とし、相対値を求めた。結果を表２に示す。【０１５０】
【表３】
2005100561.tif 000004
なお、表２中、
「Ｒ１−５´−ＸｂＳ」は、実施例１と同様、配列番号１５（ｃＤＮＡとして配列番号１６）で示される翻訳制御ポリヌクレオチドと、前記ＲＮＡ１の５´−ＵＴＲとを含む組換えベクターであり、
「３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ４」は、前記「Ｒ１−５´−ＸｂＳ」中、配列番号１（ｃＤＮＡとして配列番号２）で示される本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドの領域に、塩基置換を行ったものであり、
「３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ１」は、前記「Ｒ１−５´−ＸｂＳ」中、配列番号３９（ｃＤＮＡとして配列番号４０）で示される本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドの領域に、塩基置換を行ったものであり、
「３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ５」は、前記「Ｒ１−５´−ＸｂＳ」中、配列番号３（ｃＤＮＡとして配列番号４）で示される本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドの領域に、塩基置換を行ったものである。【０１５１】
表３の結果から、本発明の翻訳制御ポリヌクレオチド（配列番号１５、配列番号１６）において、ステムループ形成可能なＳＬ５領域は、ＳＬ１領域、及びＳＬ４領域と同様、翻訳活性、特に低温域における翻訳活性を高める作用において重要なポリヌクレオチドであることがわかった。【０１５２】
（実施例４）
＜無細胞タンパク質合成系＞
前記翻訳制御ポリヌクレオチドを含む組換えベクターとして、実施例１と同様にして調製したＲ１−５´−ＸｂＳ（Ｃａｐ構造なし）を含む前記Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系のキットを用い、無細胞タンパク質合成系でタンパク質合成を行った。
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系のキットを構成する前記細胞抽出物としては、コムギ胚芽抽出物（Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｔｒａｃｔ、以下「ＷＧＥ」と略す。）(プロメガ社製)及び、ウサギ網状赤血球抽出物（Ｒａｂｂｉｔ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ、以下「ＲＲＬ」と略す。）(プロメガ社製)を用いた。
なお、前記組換えベクターの比較対照としては、実施例１と同様にして調製した前記ｐＡ６０（Ｃａｐ構造あり）を用いた。【０１５３】
前記ｐＡ６０、及び前記Ｒ１−５´−ＸｂＳに対して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０  ｆｉｎｅ担体(アマシャム社製)を充填した１ｍＬシリンジカラムで処理することにより、これらのＲＮＡを精製し，２．５ｎｇ／μＬの濃度に調製した。
前記ＷＧＥのを含む反応液２５μＬは、前記ＷＧＥ１２．５μＬと、１ｍＭアミノ酸混合液（Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｍｉｘｔｕｒｅ）(プロメガ社製)２μＬと、１Ｍ酢酸カリウム３．２５μＬと、４０Ｕ／μＬルナシンリボヌクレアーゼインヒビター（Ｒｎａｓｉｎ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）(プロメガ社製)０．５μＬと、蒸留水６．７５μＬとを含むように調製した。
前記ＲＲＬを含む反応液２５μＬは，前記ＲＲＬ１７．５μＬと、１ｍＭアミノ酸混合液（Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｍｉｘｔｕｒｅ）(プロメガ社製)０．５μＬと、４０Ｕ／μｌルナシンリボヌクレアーゼインヒビター（Ｒｎａｓｉｎ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）(プロメガ社製)０．５μＬと、蒸留水６．５μＬとを含むように調製した。【０１５４】
１μＬの前記Ｒ１−５´−ＸｂＳ、及び前記ｐＡ６０を、それぞれ前記反応液５μＬ中に添加し、温度勾配恒温器（日本医科機器製作所製、ＴＧ−１００−ＡＤＣＴ）を用いて、１０℃、１７℃、２５℃、３２℃の条件により２時間反応させた。
反応後、前記ルシフェラーゼ定量システム（スタンダードタイプ）（プロメガ社製）を用い、実施例１と同様にして定量した。結果を表４に示す。【０１５５】
【表４】
2005100561.tif 000005
表４中、「ＷＧＥ」は、コムギ胚芽抽出物を表し、「ＲＲＬ」は、ウサギの網状赤血球抽出物を表す。【０１５６】
表４の結果から、本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドは、無細胞タンパク合成系において、動物細胞由来の抽出物、植物細胞由来の抽出物いずれを用いた場合でも、翻訳活性を高め、また、低温において翻訳活性を高めることが明らかになった。【０１５７】
（実施例５）
＜タバコ培養細胞（ＢＹ２）プロトプラストにおけるタンパク質合成＞
実施例１と同様にして調製した前記Ｒ１−５´−ＸｂＳ、前記Ｒ１−ＸｂＳ、及びｐＡ６０を用い、それぞれＣａｐ構造を付加したｍＲＮＡ、Ｃａｐ構造を付加しないｍＲＮＡを調製し、これらを、下記の方法により調製したタバコ培養細胞（ＢＹ２）のプロトプラストに、実施例１と同様にして導入し、得られた形質転換体を１７℃で６時間培養し、実施例１と同様にしてルシフェラーゼ活性を測定した。結果を表５に示す。【０１５８】
−タバコ培養細胞（ＢＹ２）プロトプラストの調製−
タバコ（Nicotiana  tabacum  L.cv.Bright.Yellow-2）由来培養細胞（以下、「ＢＹ２培養細胞」と表す）は、７日ごとに、培養液（30g/Ｌ  スクロース、0.2g/Ｌ  KH2PO4、4.6g/Ｌ  ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類（日本製薬社製）、0.1g/Ｌ  myo-イノシトール、0.001g/Ｌ  ビタミンB1塩酸塩、0.2×10-3g/Ｌ  2.4-ジクロロフェノキシ酢酸、pH5.8）１００ｍＬに、１．５ｍＬのＢＹ２細胞液を無菌状態で植え継ぎ、２５℃、暗黒条件で振盪培養して継代培養して得た。
植え継ぎ３日目に、前記ＢＹ２培養細胞の培養液を、５０ｍＬのスクリューチューブ２本に分注し、前記ＢＹ２培養細胞を自然落下させ、前記培養液の上澄みをアスピレーターで取り除き、０．４Ｍマンニトール液(０．４Ｍマンニトール、２０ｍＭ  MgCl2・6H20)で２回洗浄した。洗浄した前記ＢＹ２培養細胞に、酵素液（１．０％セルラーゼオノズカＲＳ、０．１％ペクトリアーゼＹ−２３、０．４Ｍ  マンニトールpH5.5）を細胞沈殿量の５倍量加え、２００ｍＬ三角フラスコに移し、これをアルミホイルで包み、３０℃で３時間インキュベートした。インキュベート中は、１５分ごとにピペットで静かに細胞を撹拌した。
インキュベート後、細胞の状態を顕微鏡で確認し、プロトプラストを酵素液と共にオートクレーブしたガラス遠沈管に移し５０×ｇで３分間遠心した。上澄みをアスピレーターで取り除き、０．４Ｍマンニトール液を遠沈管の半分程度まで加えてプロトプラストを懸濁し、さらに５０×ｇで３分間遠心した。この洗浄作業を５回繰り返した後、沈殿したプロトプラストを０．４Ｍマンニトール液に懸濁し、５０ｍＬスクリューチューブに移した。  再び５０×ｇで３分間遠心した後、アスピレーターでマンニトール液を充分取り除き、前記ＢＹ２培養細胞のプロトプラストを得た。【０１５９】
【表５】
2005100561.tif 000006
【０１６０】
表５の結果から、タバコ培養細胞（ＢＹ２）のプロトプラストにおいて、前記ＲＣＮＭＶ  ＲＮＡ１の５´−ＵＴＲを有する前記Ｒ１−５´−ＸｂＳと、５´−ＵＴＲを持たない前記Ｒ１−ＸｂＳとを比較すると、５´−ＵＴＲを有する前記Ｒ１−５´−ＸｂＳが、著しく高い翻訳制御効果を示すことがわかった。このことから、前記ＲＣＮＭＶ  ＲＮＡ１の５´−ＵＴＲが、３´−ＵＴＲの翻訳制御効果をより高めることがわかった。【０１６１】
（実施例６）
前記ＲＣＮＭＶのＲＮＡ１中、ステムループ構造を形成する配列のうち、図１に示すＳＬ２、及びＳＬ３に、下記の方法により変異を導入した組換えベクター（ｐ３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ２、及びｐ３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ３）を調製した。【０１６２】
前記ｐＲ１−５´−ＸｂＳを鋳型として、プライマーに、前記Ｌｕｃ＋３´ＦＷ、及びＳＬ２−Ｌｍ１／−（配列番号４３：５´−ＧＣＧＡＣＣＡＴＡＡＡＡＴＡＣＧＣＴＡＧＧＴＡＣＣＴＧ−３´）の組合せと、前記Ｌｕｃ＋３´ＲＶ、及びＳＬ２−Ｌｍ１／＋（配列番号４４：５´−ＣＧＴＡＴＴＴＴＡＴＧＧＴＣＧＣＴＡＧＡＡＡＴＣＧＧＧＣ−３´）の組合せとを用いた以外は、実施例２と同様にして変異をＳＬ２に挿入し、ｐ３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ２を調製した。
また、前記ｐＲ１−５´−ＸｂＳを鋳型として、プライマーに、前記Ｌｕｃ＋３´ＦＷ、及びＳＬ３−Ｌｍ３／−（配列番号４５：５´−ＧＧＴＴＡＣＣＧＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＣＧＣＣＣＧ−３´）の組合せと、前記Ｌｕｃ＋３´ＲＶ、及びＳＬ３−Ｌｍ３／＋（配列番号４６：５´−ＣＴＴＣＡＣＣＡＡＧＣＧＧＴＡＡＣＣＣＧＣＣＧＴＣＧＡＧ−３´）の組合せとを用いた以外は、実施例２と同様にして変異をＳＬ３に挿入し、ｐ３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ３を調製した。【０１６３】
実施例２及び３と同様にして調製した、ステムループ構造領域に変異を導入した各組換えベクター（ｐ３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ４、ｐ３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ１、ｐ３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ５）、前記ｐ３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ２、前記ｐ３´ＴＥ−ＤＲ１／Ｌｍ１、並びに実施例１と同様にして調製した前記ｐＲ１−５´−ＸｂＳ、及びｐＡ６０を用い、これらを直鎖状にした後、転写を行い、それぞれ５´末端にＣａｐ構造を持たないｍＲＮＡを作製した。
得られた各ｍＲＮＡを、実施例１と同様にして調製したササゲプロトプラストと、実施例５と同様にして調製したタバコ培養細胞（ＢＹ２）プロトプラストにそれぞれ導入し、１７℃で１６時間培養した後、実施例１と同様にしてルシフェラーゼ活性を測定した。
タバコ培養細胞（ＢＹ２）プロトプラストにおける結果を図５に、ササゲプロトプラストにおける結果を図６にそれぞれ示す。【０１６４】
図５及び図６の結果から、本発明の翻訳制御ポリヌクレオチド（配列番号１５、配列番号１６）において、ステムループ形成可能なＳＬ５領域は、ＳＬ１領域、及びＳＬ４領域と同様、翻訳活性、特に低温域における翻訳活性を高める作用において重要なポリヌクレオチドであることがわかった。【０１６５】
（実施例７）
＜無細胞タンパク質合成系＞
前記翻訳制御ポリヌクレオチドを含む組換えベクターとして、実施例１と同様にして調製したＲ１−５´−ＸｂＳ（Ｃａｐ構造なし）を含む前記Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系のキットを用い、無細胞タンパク質合成系でタンパク質合成を行った。
前記Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系のキットを構成する前記細胞抽出物として、下記の方法により調製したタバコ培養細胞（ＢＹ２）抽出物を用いた以外は、実施例４と同様にして合成を行った。なお、前記組換えベクターの比較対照としては、実施例１と同様にして調製した前記ｐＡ６０（Ｃａｐ構造あり）を用いた。前記Ｒ１−５´−ＸｂＳの結果を、図７に示す。【０１６６】
＜＜ＢＹ２抽出物の調製方法＞＞
実施例５と同様にして調製したＢＹ２プロトプラストを用い、重量の５倍量の３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）パーコール(Amersham社製)液を該ＢＹ２プロトプラストに加え懸濁した。
得られた懸濁液を、オートクレーブを行った遠心管に６ｍＬ入れ、この下に４０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）パーコール液７ｍＬを重層し、さらにその下に２ｍＬの７０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）パーコール液を重層した。なお、全てのパーコール液には０．７Ｍマンニトール、２０ｍＭ  MgCl2  及び５ｍＭ  Pipes-KOH(pH7.4)が含まれている。
パーコール液を重層した前記懸濁液を、２５℃、１０，０００×ｇで６５分間遠心した。この時アクセルとブレーキは最小にした。遠心後、４０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）と７０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のパーコール液の境界に存在する脱液胞化したプロトプラストのフラクションを、先端を切ったｐ１０００チップで、２５ｍＬの０．４Ｍマンニトール液が入ったスクリューチューブに回収した。
これを、さらに５０×ｇで３分間遠心して、アスピレーターで上澄みを除去し、０．４Ｍマンニトール液で２回洗浄した後、マンニトール液を充分取り除いてスクリューチューブの重さを差し引いて重量を測定し、その重量の４倍量のＴＲバッファー(３０ｍＭ  Hepes-KOH,pH7.4、１００ｍＭ  酢酸カリウム、２ｍＭ  ＤＴＴ、500μg/ｍＬ  ベントナイト、1  tablet  per  10ml  Complete  Mini  protease  mixture(Roche  Diagnostics社製)を加えて脱液胞化プロトプラストを得た。該脱液胞化プロトプラストを、オートクレーブを行ったダウンスホモジェナイザー(tight社製)を用い、氷上で５０回破砕し、得られた破砕液を、氷上に立てておいたエッペンドルフチューブに移し、４℃、５００×ｇで１０分間遠心した。得られた破砕液の上澄みを、無細胞タンパク合成系の細胞抽出物として使用し、タンパク質合成を行った。【０１６７】
ＬＵＣ活性を測定したところ、ｐＡ６０（Ｃａｐ構造あり）の翻訳活性は、２５℃及び３０℃における活性が最も高かった（図示せず）。
図７の結果から、本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドは、無細胞タンパク質合成系においても、低温における翻訳活性を高めることがわかった。【０１６８】
（実施例８）
実施例１において、ＲＣＮＭＶのＲＮＡ１から組換えベクターを調製したのと同様の方法で、サンヘンプモザイクウィルス（以下、「ＳＨＭＶ」と表す）から、３´−ＵＴＲ領域と、５´−ＵＴＲ領域のｃＤＮＡを調製し、これらを用いて、実施例１と同様にして組換えベクターを作製した。
前記ＳＨＭＶの３´−ＵＴＲ及び５´−ＵＴＲを含む組換えベクター（ＳＨ−ｌｕｃ−ＳＨ）と、前記ＲＣＮＭＶの３´−ＵＴＲ及び５´−ＵＴＲを含む組換えベクター（ｐＲ１−５´−ＸｂＳ）と、前記ｐＡ６０とを、それぞれ実施例１と同様にして直鎖にした後、転写を行い、それぞれ５´末端にＣａｐ構造を持つｍＲＮＡを作製した。得られたｍＲＮＡを、実施例１と同様にしてササゲプロトプラストに導入し、１０℃、１７℃、２５℃、３２℃の温度条件下で６時間培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図８に示す。【０１６９】
図８の結果から、ＲＣＮＭＶのＲＮＡ１由来の本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドを含む組換えベクターは、翻訳活性を高めることが知られているトバモウィルスの５´−ＵＴＲを有するＳＨＭＶから調製した組換えベクターよりも、翻訳活性を高め、特に低温域における翻訳活性を高めることがわかった。【０１７０】
（実施例９）
前記翻訳制御ポリヌクレオチドを含む組換えベクターとして、実施例１と同様にして調製したＲ１−５´−ＸｂＳ（Ｃａｐ構造なし）を含む前記Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系のキットを用い、無細胞タンパク質合成系でタンパク質合成を行った。
前記Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系キットを構成する前記細胞抽出物、及び他の成分として、ＰＲＯＴＥＩＯＳ（和研薬（株）製）を使用し、前記組換えベクターの比較対照としては、ｐＥＵ３−ＮIIを用いて調製したものを使用した。これらのベクターを、直鎖にした後、転写を行い、それぞれ５´末端にＣａｐ構造を持たないｍＲＮＡを作製した。得られたｍＲＮＡを用い、１７℃、及び２６℃の温度条件下でタンパク質合成を行い、実施例１と同様にしてルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図９に示す。【０１７１】
本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドは、生細胞系タンパク質合成に用いる宿主細胞や、無細胞系タンパク質に用いる抽出物の由来生物の種による制限を受けず、ｍＲＮＡの翻訳活性を高め、かつ、温度制御可能であり、特に低温（２０℃未満）における翻訳活性を高めるため、該翻訳制御ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、前記翻訳制御ポリヌクレオチド及び該組換えベクターのいずれかが導入された形質転換体、前記翻訳制御ポリヌクレオチドを用いたタンパク質合成方法、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系翻訳キット、並びにタンパク質合成装置は、高い温度領域（例えば、２０℃以上）において不安定なタンパク質の合成や、低い温度領域（例えば、２０℃未満）において従来の方法では十分な合成量が得られなかったタンパク質の合成に好適に使用することができる。【０１７２】
また、前記翻訳制御ポリヌクレオチドは、寒冷地農業等に好適な農作物の品種改良、具体的には、農作物等の生産可能な北限をより北方に移し、寒冷地での農作物生産を可能とし、ハウス栽培等の温室栽培を不要とし、稲等の穀類の二期作等を可能とする等、農業に革命をもたらし得る品種改良に好適に使用することができる。
【図１】
2005100561.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年8月11日(2005.8.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】請求の範囲
【請求項１】  （１）配列番号１５に示されるＲＮＡ配列、（２）配列番号１５に示されるＲＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（３）配列番号１５に示されるＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかを含み、アミノ酸配列をコードするｍＲＮＡの３´側に組み込まれて使用され、
組み込まれる前に比べて、該ｍＲＮＡの翻訳活性を高め、かつ、
組み込まれた後の前記ｍＲＮＡの翻訳活性を、２０℃未満の温度条件下における翻訳活性Ｘと、２０℃以上の温度条件下における翻訳活性Ｙとが、Ｘ／Ｙ≧１の関係を満たすように制御することを特徴とする翻訳制御ポリヌクレオチド。
2005100561.tif 000016
【請求項２】  （１）配列番号７に示されるＲＮＡ配列、（２）配列番号７に示されるＲＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（３）配列番号７に示されるＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかを含み、アミノ酸配列をコードするｍＲＮＡの３´側に組み込まれて使用され、
組み込まれる前に比べて、該ｍＲＮＡの翻訳活性を高め、かつ、
組み込まれた後の前記ｍＲＮＡの翻訳活性を、２０℃未満の温度条件下における翻訳活性Ｘと、２０℃以上の温度条件下における翻訳活性Ｙとが、Ｘ／Ｙ≧１の関係を満たすように制御することを特徴とする翻訳制御ポリヌクレオチド。
2005100561.tif 000017
【請求項３】  １７℃における翻訳活性が、２５℃における翻訳活性よりも高くなるように制御する請求項１から２のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
【請求項４】  （１）配列番号３９に示されるＲＮＡ配列、（２）配列番号３９に示されるＲＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（３）配列番号３９に示されるＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む請求項１から３のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
2005100561.tif 000018
【請求項５】  （１）配列番号１に示されるＲＮＡ配列、（２）配列番号１に示されるＲＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（３）配列番号１に示されるＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む請求項１から３のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
2005100561.tif 000019
【請求項６】  （１）配列番号３に示されるＲＮＡ配列、（２）配列番号３に示されるＲＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（３）配列番号３に示されるＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む請求項１から３のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
2005100561.tif 000020
【請求項７】  （１）配列番号１３に示されるＲＮＡ配列、（２）配列番号１３に示されるＲＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（３）配列番号１３に示されるＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む請求項１及び３のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
2005100561.tif 000021
【請求項８】  （１）配列番号５に示されるＲＮＡ配列、（２）配列番号５に示されるＲＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（３）配列番号５に示されるＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む請求項２及び３のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
2005100561.tif 000022
【請求項９】  アミノ酸配列をコードするｍＲＮＡの５´側に（１）配列番号１７に示されるＲＮＡ配列、（２）配列番号１７に示されるＲＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（３）配列番号１７に示されるＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかが組み込まれたポリヌクレオチドに組み込まれる請求項１から８のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
2005100561.tif 000023
【請求項１０】  アミノ酸配列をコードするｍＲＮＡの５´側に（１）配列番号９に示されるＲＮＡ配列、（２）配列番号９に示されるＲＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（３）配列番号９に示されるＲＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかが組み込まれたポリヌクレオチドに組み込まれる請求項１から８のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
2005100561.tif 000024
【請求項１１】  レッドクローバー・ネクロティック・モザイクウィルス（Ｒｅｄ  ｃｌｏｖｅｒ  ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ：ＲＣＮＭＶ）のＲＮＡ１由来の配列である請求項１から１０のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
【請求項１２】  （１）配列番号１６に示されるＤＮＡ配列、（２）配列番号１６に示されるＤＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（３）配列番号１６に示されるＤＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかを含み、アミノ酸配列をコードする塩基配列の５´側に組み込まれて使用され、
組み込まれる前に比べて、該塩基配列の翻訳活性を高め、かつ、
組み込まれた後の前記塩基配列の翻訳活性を、２０℃未満の温度条件下における翻訳活性Ｘと、２０℃以上の温度条件下における翻訳活性Ｙとが、Ｘ／Ｙ≧１の関係を満たすように制御することを特徴とする翻訳制御ポリヌクレオチド。
2005100561.tif 000025
【請求項１３】  （１）配列番号８に示されるＤＮＡ配列、（２）配列番号８に示されるＤＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（３）配列番号８に示されるＤＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかを含み、アミノ酸配列をコードする塩基配列の５´側に組み込まれて使用され、
組み込まれる前に比べて、該塩基配列の翻訳活性を高め、かつ、
組み込まれた後の前記塩基配列の翻訳活性を、２０℃未満の温度条件下における翻訳活性Ｘと、２０℃以上の温度条件下における翻訳活性Ｙとが、Ｘ／Ｙ≧１の関係を満たすように制御することを特徴とする翻訳制御ポリヌクレオチド。
2005100561.tif 000026
2005100561.tif 000027
【請求項１４】  １７℃における翻訳活性が、２５℃における翻訳活性よりも高くなるように制御する請求項１２から１３に記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
【請求項１５】  （１）配列番号４０に示されるＤＮＡ配列、（２）配列番号４０に示されるＤＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（３）配列番号４０に示されるＤＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む請求項１２から１４のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
2005100561.tif 000028
【請求項１６】  （１）配列番号２に示されるＤＮＡ配列、（２）配列番号２に示されるＤＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（３）配列番号２に示されるＤＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む請求項１２から１４のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
2005100561.tif 000029
【請求項１７】  （１）配列番号４に示されるＤＮＡ配列、（２）配列番号４に示されるＤＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（３）配列番号４に示されるＤＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む請求項１２から１４のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
2005100561.tif 000030
【請求項１８】  （１）配列番号１４に示されるＤＮＡ配列、（２）配列番号１４に示されるＤＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（３）配列番号１４に示されるＤＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む請求項１２及び１４のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
2005100561.tif 000031
【請求項１９】  （１）配列番号６に示されるＤＮＡ配列、（２）配列番号６に示されるＤＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（３）配列番号６に示されるＤＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む請求項１３及び１４のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
2005100561.tif 000032
【請求項２０】  アミノ酸配列をコードする塩基配列の５´側に（１）配列番号１８に示されるＤＮＡ配列、（２）配列番号１８に示されるＤＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（３）配列番号１８に示されるＤＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかが組み込まれたポリヌクレオチドに組み込まれる請求項１２から１９のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
2005100561.tif 000033
【請求項２１】  アミノ酸配列をコードする塩基配列の５´側に（１）配列番号１０に示されるＤＮＡ配列、（２）配列番号１０に示されるＤＮＡ配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（３）配列番号１０に示されるＤＮＡ配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び（４）前記（１）から（３）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかが組み込まれたポリヌクレオチドに組み込まれる請求項１２から１９のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
2005100561.tif 000034
【請求項２２】  レッドクローバー・ネクロティック・モザイクウィルス（Ｒｅｄ  ｃｌｏｖｅｒ  ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ：ＲＣＮＭＶ）のＲＮＡ１由来の配列に対するｃＤＮＡである請求項１２から２１のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
【請求項２３】  １７℃以下の温度条件下において翻訳活性が最大となるように翻訳制御する請求項１から２２のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
【請求項２４】  アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドの非翻訳領域に組み込まれる請求項１から２３のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
【請求項２５】  請求項１から２４のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドを含むことを特徴とする組換えベクター。
【請求項２６】  請求項１から２４のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド、及び請求項２５に記載の組換えベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とする形質転換体。
【請求項２７】  動物細胞、植物細胞、菌類、及び酵母から選択される請求項２６に記載の形質転換体。
【請求項２８】  請求項１から２４のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドを用いることを特徴とするタンパク質合成方法。
【請求項２９】  請求項２５に記載の組換えベクターを用いることを特徴とするタンパク質合成方法。
【請求項３０】  無細胞タンパク質合成系で行われる請求項２８から２９のいずれかに記載のタンパク質合成方法５
【請求項３１】  コムギ胚芽抽出物を用いて行われる請求項３０に記載のタンパク質合成方法。
【請求項３２】  真核生物の細胞を用いて行われる請求項２８から２９のいずれかに記載のタンパク質合成方法。
【請求項３３】  大腸菌を用いて行われる請求項２８から２９のいずれかに記載のタンパク質合成方法。
【請求項３４】  １７℃以下の温度条件下で行われる請求項２８から３３のいずれかに記載のタンパク質合成方法。
【請求項３５】  請求項１から２４のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドを少なくとも含むことを特徴とするｉｎ  ｖｉｔｒｏ系翻訳キット。
【請求項３６】  コムギ胚芽抽出物を含む請求項３５に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ系翻訳キット。
【請求項３７】  請求項１から２４のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドを用い、アミノ酸を合成させる合成手段を少なくとも有することを特徴とするタンパク質合成装置。
【請求項３８】  合成手段がコムギ胚芽抽出物を使用する請求項３７に記載のタンパク質合成装置。
【請求項３９】  温度制御手段を有する請求項３７から３８のいずれかに記載のタンパク質合成装置。
【国際調査報告】
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2005100561.tif 000037
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