(57)【要約】  副作用が少なく且つ薬物相互作用の少ないインスリン抵抗性改善のためのGLP-1受容体アゴニストの新しい投与形態及び当該投与のためのインスリン抵抗性改善剤の提供であり、GLP-1受容体アゴニストを、持続的に作用させるのではなく、少なくとも食物摂取の前に投与すること、望ましくは非侵襲的に投与することを一定期間繰り返し、内因性のGLP-1受容体アゴニストが毎食後に一過性に分泌されるのと同じような状況を作り出して、健康な個体における内因性GLP-1受容体アゴニストの日内変動を模倣又は強調した血漿中濃度推移を得ることからなる投与方法及び当該投与のためのGLP-1受容体アゴニストを有効成分とする医薬組成物を得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
GLP-1受容体アゴニストまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物であって、インスリン抵抗性の症状を呈する個体に対して、１投与単位あたり0.5〜5000μgのGLP-1受容体アゴニスト、またはその薬理学的に許容される塩を、１日１回以上食物摂取の前に投与し、当該投与を２週間以上行うことからなる連続スケジュールに従う投与に用いるための、インスリン抵抗性の改善またはインスリン抵抗性を伴う疾患を予防若しくは治療する医薬組成物。
【請求項２】
投与が食物摂取の後にも行う投与である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
GLP-1受容体アゴニストがGLP-1(7-36)アミドである請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項４】
投与が皮下投与、経鼻投与または経肺投与である請求項１〜３記載の医薬組成物。
【請求項５】
インスリン抵抗性を伴う疾患が高インスリン血症、糖尿病、肥満症、高脂血症、動脈硬化症、高血圧症または循環器疾患である請求項１〜４記載の医薬品組成物。
【請求項６】
インスリン抵抗性を伴う疾患が糖尿病である請求項７記載の医薬品組成物。
【請求項７】
食物摂取前の経鼻投与によりGLP-1(7-36)アミドを投与するための請求項１記載の医薬組成物。
【請求項８】
インスリン抵抗性の症状を呈する個体に対して、１投与単位あたり0.5〜5000μgのGLP-1受容体アゴニスト、またはその薬理学的に許容される塩を、１日１回以上食物摂取の前に投与し、当該投与を２週間以上行うことからなる連続スケジュールに従う投与からなるインスリン抵抗性の改善またはインスリン抵抗性を伴う疾患を予防若しくは治療する方法。
【請求項９】
投与が食物摂取の後にも行う投与である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
GLP-1受容体アゴニストがGLP-1(7-36)アミドである請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】
投与が皮下投与、経鼻投与または経肺投与である請求項８〜１０のいずれか記載の方法。
【請求項１２】
インスリン抵抗性を伴う疾患が高インスリン血症、糖尿病、肥満症、高脂血症、動脈硬化症、高血圧症または循環器疾患である請求項８〜１１のいずれか記載の方法。
【請求項１３】
インスリン抵抗性を伴う疾患が糖尿病である請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
食物摂取前の経鼻投与によりGLP-1(7-36)アミドを投与するための請求項８記載の方法。
【請求項１５】
インスリン抵抗性の症状を呈する個体に対して、１投与単位あたり0.5〜5000μgのGLP-1受容体アゴニストまたはその薬理学的に許容される塩を、１日１回以上食物摂取の前に投与し、当該投与を２週間以上行うことからなる連続スケジュールに従う投与からなるインスリン抵抗性の改善またはインスリン抵抗性を伴う疾患を予防若しくは治療する医薬組成物の製造のためのGLP-1受容体アゴニストの使用。
【請求項１６】
投与が食物摂取の後にも行う投与である請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
GLP-1受容体アゴニストがGLP-1(7-36)アミドである請求項１５または１６記載の使用。
【請求項１８】
投与が皮下投与、経鼻投与または経肺投与である請求項１５〜１７のいずれか記載の使用。
【請求項１９】
インスリン抵抗性を伴う疾患が高インスリン血症、糖尿病、肥満症、高脂血症、動脈硬化症、高血圧症または循環器疾患である請求項１５〜１８のいずれか記載の使用。
【請求項２０】
インスリン抵抗性を伴う疾患が糖尿病である請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
食物摂取前の経鼻投与によりGLP-1(7-36)アミドを投与するための請求項１５記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はインスリン抵抗性改善剤及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インスリン抵抗性とは、インスリンに対する筋肉、肝臓、脂肪等の全身組織の感受性が低下した状態を表す。インスリン抵抗性が発症した状態では、組織のインスリン感受性が低下し、インスリン依存性の糖取り込み能力が低下する。その結果、インスリンによる血糖低下効果が減弱する。そのため、代償性の高インスリン血症を発症するか、或いはインスリン分泌能力が不十分の場合には高血糖症状が引き起こされる（非特許文献１）。【０００３】
特に２型糖尿病患者においては、インスリン分泌能の低下とインスリン抵抗性のために、相対的にインスリンが不足した状態になっており、それが病態の本質であると理解されている。そのため、２型糖尿病の薬物による治療にはインスリン抵抗性改善剤を使用して組織でのインスリン依存性の糖取り込み能力を高めることが有用とされており、実際に多数の薬剤が開発されて臨床に用いられている（非特許文献２）。【０００４】
しかしながら、現在使用されているインスリン抵抗性改善薬の中には、治療の継続が困難になるような重篤な副作用を引き起こす可能性のあるものも少なくない。実際に、肝機能障害、浮腫、体重増加、脂肪組織重量増加等の副作用が発生し、治療中止や販売中止を余儀なくされたケースが複数例報告されており、そのことが、インスリン抵抗性改善薬の応用範囲に制限を与えている一因となっている（非特許文献２）。【０００５】
他方、２型糖尿病の新しい治療戦略として、GLP-1（Glucagon-Like Peptide-1）受容体アゴニストのひとつであるGLP-1(7-36)アミドの作用を利用する方法が注目されている（特許文献１〜７；非特許文献４、５、６）。GLP-1(7-36)アミドは、小腸下部に存在するＬ細胞から分泌されるポリペプチドホルモンであり、毎食後に一過性に分泌され、直接あるいは間接的に、膵臓やその他の全身組織に作用する。また、血糖値依存性のインスリン分泌促進作用、グルカゴン分泌抑制作用、食欲抑制作用、消化管運動抑制作用を有していることが知られており（非特許文献７）、生体内で食事性の糖吸収と血糖調節作用を発揮すると同時に、次の食物摂取への備えを準備するという役割を担っているものと理解されている（非特許文献８）。【０００６】
また、２型糖尿病患者では血漿中でのGLP-1(7-36)アミド濃度が低下しているが、その状態においても膵臓β細胞はGLP-1(7-36)アミドに対する感受性を保持しており（非特許文献９）、低下した内因性のGLP-1(7-36)アミドを外部から補充することで２型糖尿病の症状が改善できると考えられている。【０００７】
しかしながら、ペプチドであるGLP-1(7-36)アミドを外部から投与しても、生体内に存在する分解酵素ジペプチジルペプチダーゼ-IV（dipeptidyl peptidase（DPP）-IV）により、速やかに不活性な代謝物（GLP-1(9-36)アミド）に分解されてしまう（非特許文献１０）。更に、ペプチドとしての化学的特性のために、投与方法は注射またはそれに準じた侵襲的投与方法に限られており、GLP-1(7-36)アミドを２型糖尿病のような慢性疾患に対する治療薬とすることには、非常に困難を伴っているのが現状である。【０００８】
このような背景から、GLP-1(7-36)アミドの生物活性を２型糖尿病の新しい治療法として利用する方法として、以下の手法が選択されてきた（非特許文献４、５、６）。
（１）DPP-IVに耐性があり、GLP-1(7-36)アミドと同じ作用を持つ長時間作用型GLP-1受容体アゴニストを注射またはそれに準じた侵襲的投与方法で投与する。
（２）GLP-1(7-36)アミドを灌流ポンプのような特殊なデバイスを用いて、持続的に経静脈投与、あるいは持続的に皮下投与する。
（３）GLP-1(7-36)アミドを分解する酵素であるDPP-IVの活性阻害剤を投与して、食後に分泌された内因性のGLP-1(7-36)アミドが不活性な代謝物（GLP-1(9-36)アミド）に代謝されることを抑制することで、血漿中GLP-1(7-36)アミド濃度を確保することにより治療する。【０００９】
しかしながら、上記（１）にかかる長時間作用型GLP-1受容体アゴニストを用いた治療（非特許文献１１、１２、１３）、及び上記（２）にかかるGLP-1(7-36)アミドの持続投与（特許文献８、９）では、総じて内因性レベルと比較して、極めて高濃度のGLP-1受容体アゴニストを長時間持続して作用させるために、却ってGLP-1(7-36)アミドが持っている多彩な生物活性の一部を犠牲にしている可能性がある。即ち、その際の血漿中GLP-1受容体アゴニスト濃度の変動パターンは、毎食後に一過性に上昇するといわれる内因性のGLP-1受容体アゴニスト濃度のそれとは全く異なるために、脱感作等の理由で作用減弱がおこり、GLP-1(7-36)アミドが持っている生物活性を充分に引き出せない状態に陥っているものと考えられる。【００１０】
また、上記（３）にかかるDPP-IV阻害剤を用いた治療（非特許文献１４、１５）では、DPP-IVの選択性に関する問題が危惧される。DPP-IVはGLP-1(7-36)アミドのみならず、GLP-2、GIP、GHRH、PYY等の多くのホルモン代謝にも関与していることが知られている（非特許文献１６）。そのため、DPP-IV阻害剤を糖尿病患者や糖尿病モデル動物に投与した後に発現する薬理作用は、必ずしも全てがGLP-1(7-36)アミドの分解抑制によるものとは考えられていない（非特許文献１７、１８、１９）。また、DPP-IV阻害剤により当該酵素の活性を非選択的に長期間に渡って抑制することで、動物試験では想定されなかった副作用が発現する可能性が危惧される。【００１１】
また、DPP-IVはCD26とも呼ばれて、免疫細胞の活性制御に深く関わっており、特にＴ細胞の活性と密接な関係が知られている（非特許文献２０）ことから考えて、DPP-IV阻害剤の投与による生体の免疫機能低下の危険性が指摘されている。更に、DPP-IV阻害剤を反復投与すると、代償性に生体内のDPP-IV活性が上昇するため、活性が減弱するという報告がある（非特許文献１８）。
また、上記のような従来の治療方法では、GLP-1受容体アゴニストが直接的に患者のインスリン抵抗性を改善する作用、またはインスリン感受性を増強する作用を有するか否かについては明らかになっていない。【００１２】
GLP-1受容体アゴニストを糖尿病モデル動物に投与することにより、高血糖状態を改善することで２次的にインスリン抵抗性が改善した試験（非特許文献２１）、及び糖尿病状態を改善または進行を止めることで、血管の反応性を改善または悪化を抑制した試験について報告されているが（非特許文献２２）、これらの試験の結果は、いずれもGLP-1受容体アゴニストの生物活性として従来から知られているインスリン分泌亢進作用や食欲抑制作用などに基づく２次的な影響によるものとして位置づけられており、血漿中のGLP-1受容体アゴニスト濃度を長時間、比較的高濃度に維持することにより血糖値を低下させ、それに伴い２次的にインスリン抵抗性あるいは血管の反応性が改善されたものと考察されている。そのため、GLP-1受容体アゴニストを長時間、高濃度で作用することで、より強く作用が発現すると考えられている。【００１３】
以上のことから、現在の糖尿病の治療においては、GLP-1受容体アゴニスト、特にGLP-1(7-36)アミドが有する特性は有用なものであると知られているにも拘らず、実際に当該特性を充分に生かした臨床応用方法は、必ずしも確立しているとはいえないのが現状であり、更なる治療法の開発が望まれている。【００１４】
【特許文献１】特表平１−５０２７４６号公報
【特許文献２】アメリカ特許第５１１８６６６号
【特許文献３】アメリカ特許第５１２０７１２号
【特許文献４】アメリカ特許第５６１４４９２号
【特許文献５】特表平１０−５００１１４号公報
【特許文献６】アメリカ特許公開２００２−０１１９１４６
【特許文献７】アメリカ特許公開２００２−０１６０００８
【特許文献８】特開平７−２６９５号公報
【特許文献９】アメリカ特許公開２００３−００５０２３７
【００１５】
【非特許文献１】糖尿病学2001、第1版、p64-74、平成14年4月25日発行、株式会社診断と治療社
【非特許文献２】日本臨床増刊号  新時代の糖尿病学３、株式会社日本臨床社、422-8、平成14年9月28日発行）
【非特許文献３】最新医学、2005、60巻：36-42
【非特許文献４】Diabetes, 2004, 53:2181-2189
【非特許文献５】Curr. Opin. Investig. Drugs, 2004, 5:402-410
【非特許文献６】Eur. J. Clin. Invest., 1997, 27:533-536
【非特許文献７】Diabetes Care, 2003, 26:2929-2940
【非特許文献８】J Physiol., 2004, 558:369-380
【非特許文献９】J Clin. Invest., 1993、91:301-307
【非特許文献１０】Endocrinology, 1995, 136:3585-3596
【非特許文献１１】Diabetes, 2002, 51:424-429
【非特許文献１２】Diabetes Care, 2004, 27:1335-1342
【非特許文献１３】Diabetes Care, 2004, 27:2628-2635
【００１６】
【非特許文献１４】Diabetes Care, 2002, 25:869-875
【非特許文献１５】Diabetes Care, 2004, 27:2874-2880
【非特許文献１６】Regul. Pept., 1999, 85:9-24
【非特許文献１７】Diabetologia, 2005, 48:616-620
【非特許文献１８】DIABETES, 2002, 51:2677-2682
【非特許文献１９】DIABETES, 2002, 51:943-950
【非特許文献２０】Proc. Natl. Acad. Sci., 2001, 98:12138-12143
【非特許文献２１】Diabetes, 1999, 48:1026-1034
【非特許文献２２】Pharmacology, 2005, 74:112-119
【非特許文献２３】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, 80:5458-5489
【非特許文献２４】J. Clin. Invest., 1987, 79:616-619
【非特許文献２５】New England Medicine, 1992, 326:1316-1322
【非特許文献２６】Diabetes Care, 1992, 15:270-275
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
したがって、本発明の課題は、副作用が少なく、且つ薬物相互作用の少ない、インスリン抵抗性改善のためのGLP-1受容体アゴニストの新しい投与形態、及び当該投与のためのインスリン抵抗性改善剤を提供することである。【００１８】
より詳細には、既存のインスリン抵抗性改善薬の投与及び既存のGLP-1受容体アゴニストの生物活性を利用した糖尿病の治療により生じる問題を生じることなく、インスリン抵抗性の改善、並びにそれに起因する疾患、例えば高血糖症、糖尿病及び肥満症等の予防及び治療する方法と、当該方法に用いるGLP-1受容体アゴニストを有効成分として含有するインスリン抵抗性改善剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、上記の状況から、GLP-1受容体アゴニスト、即ち、GLP-1及びGLP-1誘導体、並びにそれらの薬理上許容される塩を投与することにより、健康な個体における内因性GLP-1受容体アゴニストの日内変動を模倣、または強調した状態を作り出すことができれば、当該アゴニストの生物活性をもっと有効に利用することができ、糖尿病治療に関する新規な臨床適用を見出すことが可能ではないかと考え、その検証を試みた。【００２０】
その結果、GLP-1受容体アゴニストを糖尿病治療に用いる際の最も適切な投与方法としては、GLP-1受容体アゴニストを持続的に高濃度で作用させることを目的とした投与方法ではなく、内因性のGLP-1受容体アゴニストが毎食後に一過性に分泌されるのと同じような状況を、GLP-1受容体アゴニストを外部から投与、望ましくは非侵襲的に投与することにより作り出すことであり、当該投与方法によって個体のインスリン抵抗性が安全、且つ効率的に改善されることを、新規に見出したのである。【００２１】
したがって本発明は、その一つの態様として、以下のものである。
（１）GLP-1受容体アゴニストまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物であって、インスリン抵抗性の症状を呈する個体に対して、１投与単位あたり0.5〜5000μgのGLP-1受容体アゴニスト、またはその薬理学的に許容される塩を、１日１回以上食物摂取の前に投与し、当該投与を２週間以上行うことからなる連続スケジュールに従う投与に用いるための、インスリン抵抗性の改善またはインスリン抵抗性を伴う疾患を予防、若しくは治療する医薬組成物；
（２）投与が食物摂取の後にも行う投与である上記（１）記載の医薬組成物；
（３）GLP-1受容体アゴニストがGLP-1(7-36)アミドである上記（１）または（２）記載の医薬組成物；
（４）投与が皮下投与、経鼻投与または経肺投与である上記（１）〜（３）のいずれか記載の医薬組成物；
（５）インスリン抵抗性を伴う疾患が高インスリン血症、糖尿病、肥満症、高脂血症、動脈硬化症、高血圧症または循環器疾患である上記（１）〜（４）のいずれか記載の医薬品組成物；
（６）インスリン抵抗性を伴う疾患が糖尿病である上記（７）記載の医薬品組成物；
（７）食物摂取前の経鼻投与によりGLP-1(7-36)アミドを投与するための上記（１）記載の医薬組成物；
である。【００２２】
また本発明は、別の態様として、
（８）インスリン抵抗性の症状を呈する個体に対して、１投与単位あたり0.5〜5000μgのGLP-1受容体アゴニスト、またはその薬理学的に許容される塩を、１日１回以上食物摂取の前に投与し、当該投与を２週間以上行うことからなる連続スケジュールに従う投与からなるインスリン抵抗性の改善またはインスリン抵抗性を伴う疾患を予防、若しくは治療する方法；
（９）投与が食物摂取の後にも行う投与である上記（８）記載の方法；
（１０）GLP-1受容体アゴニストがGLP-1(7-36)アミドである上記（８）または（９）記載の方法；
（１１）投与が皮下投与、経鼻投与または経肺投与である上記（８）〜（１０）のいずれか記載の方法；
（１２）インスリン抵抗性を伴う疾患が高インスリン血症、糖尿病、肥満症、高脂血症、動脈硬化症、高血圧症または循環器疾患である上記（８）〜（１１）のいずれか記載の方法；
（１３）インスリン抵抗性を伴う疾患が糖尿病である上記（１２）記載の方法；
（１４）食物摂取前の経鼻投与によりGLP-1(7-36)アミドを投与するための上記（８）記載の方法；
である。【００２３】
更にまた、本発明は更に別の態様として、
（１５）インスリン抵抗性の症状を呈する個体に対して、１投与単位あたり0.5〜5000μgのGLP-1受容体アゴニスト、またはその薬理学的に許容される塩を、１日１回以上食物摂取の前に投与し、当該投与を２週間以上行うことからなる連続スケジュールに従う投与からなるインスリン抵抗性の改善またはインスリン抵抗性を伴う疾患を予防若しくは治療する医薬組成物の製造のためのGLP-1受容体アゴニストの使用；
（１６）投与が食物摂取の後にも行う投与である上記（１５）記載の使用；
（１７）GLP-1受容体アゴニストがGLP-1(7-36)アミドである上記（１５）または（１６）記載の使用；
（１８）投与が皮下投与、経鼻投与または経肺投与である上記（１５）〜（１７）のいずれか記載の使用；
（１９）インスリン抵抗性を伴う疾患が高インスリン血症、糖尿病、肥満症、高脂血症、動脈硬化症、高血圧症または循環器疾患である上記（１５）〜（１８）のいずれか記載の使用；
（２０）インスリン抵抗性を伴う疾患が糖尿病である上記（１９）記載の使用；
（２１）食物摂取前の経鼻投与によりGLP-1(7-36)アミドを投与するための上記（１５）記載の使用；
である。【００２４】
上記により提供される本発明は、GLP-1受容体アゴニストを持続的に作用させるのではなく、血漿中GLP-1受容体アゴニスト濃度を一過性に上昇させることを間歇的に繰り返すことにより、内因性のGLP-1受容体アゴニストの日内変動を模倣し、それによって直接的にインスリン抵抗性を改善するものであり、その結果、高血糖症状、糖尿病及び肥満症等のインスリン抵抗性に起因する疾患の症状改善または治療に有効であることを初めて見出したのである。【００２５】
当該知見は、過食、肥満及び高インスリン血症を伴うインスリン抵抗性モデルマウス（KK-Ay/Taマウス）にGLP-1受容体アゴニストを、血漿中GLP-1受容体アゴニスト濃度を一過性に上昇させることを間歇的に繰り返すことによって、初めて確認できたものである。体内半減期の短いGLP-1受容体アゴニストを低用量で１回のみ投与しても、ほとんど血糖低下作用は認められないが、持続的に作用させるのではなく、血漿中GLP-1受容体アゴニスト濃度を一過性に上昇させることを間歇的に繰り返すことにより、血糖値の上昇抑制、または低下が認められる。【００２６】
当該投与における血糖値の低下にはインスリンの分泌量増加は必ずしも必要ではなく、当該作用はインスリン感受性の増強、即ちインスリン抵抗性の改善により血糖値が低下したものであることを、外部からインスリンを腹腔内投与したときの血糖値低下作用と比較することで確認することができる。当該作用は、GLP-1受容体アゴニストを投与したのちに充分に時間が経過し、外部から投与されたがGLP-1受容体アゴニストが体内より消失したと考えられる条件で確認されたものであり、従来法における持続的に作用させなくても、目的の効果が得られることを意味する。【００２７】
以上のことから、GLP-1受容体アゴニストを持続的に作用させるのではなく、血漿中GLP-1受容体アゴニスト濃度を一過性に上昇させることを間歇的に繰り返し投与すことにより、個体におけるインスリン抵抗性が改善することが示され、インスリン抵抗性の改善を介して高血糖症状を改善することが示された。【００２８】
更に、近年、インスリン抵抗性により血液中のインスリン値及び血糖値が高い状態が持続すると、「代謝症候群」（所謂、メタボリックシンドローム）という状態に陥り、高血圧、高脂血症または心循環系障害等が引き起こされることが判明していることから（非特許文献１）、インスリン抵抗性改善剤は、２型糖尿病の治療のみならず、高脂血症、高血圧、虚血性心疾患等の様々な疾患の予防、及び治療への応用が期待できる。【００２９】
また、本発明にかかるインスリン抵抗性改善作用は、高血糖症状の改善またはインスリンの分泌促進に伴う２次的な作用ではないと考えられることから、全身的にインスリンの作用不足が生じている２型糖尿病患者のみでなく、局所的なインスリン感受性低下とそれに伴う疾患の治療にも応用が可能である。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の特徴は、GLP-1受容体アゴニストを一定期間反復投与することにより、血漿中濃度を一過性に上昇させることを間歇的に繰り返すことにより、インスリン抵抗性が改善することを示したことにある。当該作用はGLP-1を投与した後に充分な時間が経過し、血液中に投与したGLP-1が検出されない状態になった後においても消失しない。したがって本作用は、既に報告されているGLP-1作用（インスリン分泌促進作用、GLP-1共存下でのインスリンの血糖低下作用増強、インスリン非依存的な糖取り込み作用等）とは本質的に異なったものである。【００３１】
また、GLP-1には、既存のインスリン抵抗性改善薬で報告されているような肝機能障害、浮腫、体重増加、脂肪組織重量増加等の副作用がない。したがって、肥満や心不全を併発した患者に投与することが可能であり、既存のインスリン抵抗性改善薬を用いた治療法と比べて有用であると考えられる。【００３２】
以上の各点より、本発明の効果として、以下のものが期待される。
（１）高血糖症状の糖尿病を発症する前のインスリン抵抗性患者に、一定期間反復投与することにより、血漿中GLP-1受容体アゴニスト濃度を一過性に上昇させることを間歇的に繰り返すことにより、糖尿病の発症を予防する。
（２）インスリン抵抗性が認められる糖尿病患者に、一定期間反復投与することにより、血漿中GLP-1受容体アゴニスト濃度を一過性に上昇させることを間歇的に繰り返すことにより、インスリン抵抗性を改善する。
（３）インスリン抵抗性が認められる糖尿病患者に、一定期間反復投与することにより、血漿中GLP-1受容体アゴニスト濃度を一過性に上昇させることを間歇的に繰り返してインスリン抵抗性を改善することにより、膵臓の疲弊を防止し、糖尿病態の進行を抑制する。
（４）血糖値の上昇を必ずしも伴わない、インスリン抵抗性を呈した病態に、一定期間反復投与することにより、血漿中GLP-1受容体アゴニスト濃度を一過性に上昇させることを間歇的に繰り返すことによりインスリン抵抗性を改善する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、KK-Ay/Ta JclマウスにGLP-1(7-36)アミド（500μg/kg、s.c.）またはトログリタゾン（30mg/kg、i.p.）を、１日１回反復投与した期間中の飽食時血糖値変化を示した結果である。
【図２】図２は、KK-Ay/Ta JclマウスにGLP-1(7-36)アミド（500μg/kg、s.c.）またはトログリタゾン（30mg/kg、i.p.）を１日１回１３日間反復投与した後の、空腹時血糖値比較を示した結果である。
【図３】図３は、GLP-1(7-36)アミド（500μg/kg、s.c.）またはトログリタゾン（30mg/kg、i.p.）を１日１回１４日間反復投与したKK-Ay/Ta Jclマウスに、グルコース／３Ｈ−デオキシグルコース混液を経口負荷したときの血清中放射能（糖負荷３０分後に測定）を示した結果である。
【図４】図４は、GLP-1(7-36)アミド（500μg/kg、s.c.）またはトログリタゾン（30mg/kg、i.p.）を１日１回１４日間反復投与したKK-Ay/Ta Jclマウスに、グルコース／３Ｈ−デオキシグルコース混液を経口負荷したときの血清中グルコース濃度（糖負荷３０分後に測定）を示した結果である。
【００３４】
【図５】図５は、GLP-1(7-36)アミド（500μg/kg、s.c.）またはトログリタゾン（30mg/kg、i.p.）を１日１回１４日間反復投与したKK-Ay/Ta Jclマウスに、グルコース／３Ｈ−デオキシグルコース混液を経口負荷したときの放射射能の組織移行率（糖負荷３０分後に測定）を示した結果である。
【図６】図６は、マウスにGLP-1(7-36)アミド溶液（媒体：25%デキストラン70溶液、500μg/kg）を皮下投与したときの血漿中活性型GLP-1濃度推移を示した結果である。
【図７】図７は、GLP-1(7-36)アミド（15、50、150μg/kg）を１日３回反復皮下投与したときの基礎血糖値（９時）を示した結果である。
【図８】図８は、GLP-1(7-36)アミド（15、50、150μg/kg）を１日３回反復皮下投与したときの基礎血糖値（１７時）を示した結果である。
【００３５】
【図９】図９は、GLP-1(7-36)アミド（15, 50, 150μg/kg）を１日３回反復皮下投与したときの糖化ヘモグロビン（HbA1c、９時）の変化を示した図である。
【図１０】図１０は、GLP-1(7-36)アミド（15, 50, 150μg/kg）を１日３回反復皮下投与したときの血漿中インスリン濃度（９時）の変化を示した図である。
【００３６】
【図１１】図１１は、GLP-1(7-36)アミド（15、50、150μg/kg）を１日３回約８週間反復皮下投与したKK-Ay/Ta Jclマウスに、インスリン（0.75U/kg）を皮下投与したときの血糖値低下活性の確認を示した結果である。
【図１２】図１２は、マウスにGLP-1(7-36)アミド溶液（媒体：生理食塩水、50μg/kg）を皮下投与したときの血漿中の活性型GLP-1濃度推移を示した結果である。
【図１３】図１３は、GLP-1(7-36)アミドの30μgまたは100μgを含有した30mg重量の薬剤粉末をカニクイザルに経鼻投与したときの血漿中の活性型GLP-1濃度推移を示した結果である。
【００３７】
【図１４．１】図１４．１は、通常食または高脂肪食を負荷したKK/Ta JclマウスにGLP-1(7-36)アミドを１日３回、１５週間反復皮下投与したときの、投与期間中の体重の変化を示した図である。
【図１４．２】図１４．２は、通常食または高脂肪食を負荷したKK/Ta JclマウスにGLP-1(7-36)アミドを１日３回、１５週間反復皮下投与したときの、摂餌量の変化を示した図である。
【図１４．３】図１４．３は、通常食または高脂肪食を負荷したKK/Ta JclマウスにGLP-1(7-36)アミドを１日３回、１５週間反復皮下投与したときの、随時血糖値（９時の投与前）の変化を示した図である。
【図１４．４】図１４．４は、通常食または高脂肪食を負荷したKK/Ta JclマウスにGLP-1(7-36)アミドを１日３回、１５週間反復皮下投与したときの、糖化ヘモグロビン（HbA1c）の変化を示した図である。
【図１４．５】図１４．５は、通常食または高脂肪食を負荷したKK/Ta JclマウスにGLP-1(7-36)アミドを１日３回、１５週間反復皮下投与したときの、血漿中インスリン濃度（９時の投与前）の変化を示した図である。  図１４．１〜１４．５において、１群は通常食群（媒体投与）、２群は通常食群（GLP-1(7-36)アミド投与）、３群は高脂肪食群（媒体投与）、及び４群は高脂肪食群（GLP-1(7-36)アミド投与）であり、１群vs３群：＊p<0.05、＊＊p<0.01；３群vs４群：＃p<0.05、＃＃p<0.01である。
【００３８】
【図１５】図１５は、通常食または高脂肪食を負荷したKK/Ta JclマウスにGLP-1(7-36)アミドを１日３回、１５週間反復皮下投与したときのアセト酢酸濃度を示す図である。
【図１６．１】図１６．１は、通常食または高脂肪食を負荷したKK/Ta JclマウスにGLP-1(7-36)アミドを１日３回、２２〜２４週間反復投与後の動物から採取した肝臓の重量を示す図である。
【図１６．２】図１６．２は、高脂肪食を負荷したKK/Ta JclマウスにGLP-1(7-36)アミドを１日３回、２２〜２４週間反復投与後の動物から採取した肝臓の組織標本顕微鏡写真である。  図１６．１及び１６．２において、１群は通常食群（媒体投与）、２群は通常食群（GLP-1(7-36)アミド投与）、３群は高脂肪食群（媒体投与）、及び４群は高脂肪食群（GLP-1(7-36)アミド投与）であり、１群vs３群：＊p<0.05；３群vs４群：＃p<0.05である。
【図１７．１】図１７．１は、２２〜２４週間反復投与後の高脂肪食（媒体投与）負荷した動物（３群）から心臓を摘出し、ランゲンドルフ灌流にて心機能を評価した結果を示した図である。
【図１７．２】図１７．２は、２２〜２４週間反復投与後の高脂肪食（GLP-1(7-36)アミド投与）負荷した動物（４群）から心臓を摘出し、ランゲンドルフ灌流にて心機能を評価した結果を示した図である。
【図１８】図１８は、ICR系マウスにGLP-1(7-36)アミドを１日３回、１５週間反復投与後、餌を変更した時の血糖推移及びGLP-1投与休止時の血糖推移を観察した結果を示した図である。
【図１９】図１９は、CRj：CD1(ICR)系マウスを通常食または高脂肪食で飼育したときのコントロール群及びGLP-1(7-36)アミド投与群の体重推移を示した図である。
【００３９】
【図２０．１】図２０．１は、CRj：CD1(ICR)系マウスを通常食または高脂肪食で飼育したときのコントロール群及びGLP-1投与群の摂餌重量（１群１ケージで飼育し、消費した餌の量を動物数で割った平均摂餌量）の変化を示した図である。
【図２０．２】図２０．２は、CRj：CD1(ICR)系マウスを通常食または高脂肪食で飼育したときのコントロール群及びGLP-1(7-36)アミド投与群の摂餌カロリー（摂餌重量に餌の重量当たりのカロリー数を掛け合わせたもの）の変化を示した図である。
【図２１】図２１は、CRj：CD1(ICR)系マウスを通常食または高脂肪食で飼育したときのコントロール群及びGLP-1(7-36)アミド投与群の、投与期間中の血糖値の変化を示した図である。
【図２２．１】図２２．１は、CRj：CD1(ICR)系マウスに媒体または、GLP-1(7-36)アミドを一日１または２回、約５週間反復皮下投与し、最終投与後に一晩絶食させたマウスに1.5g/kgの用量でグルコースを皮下投与し、投与後３０分の血漿中グルコースを測定した結果を示した図である。
【図２２．２】図２２．２は、CRj：CD1(ICR)系マウスに媒体または、GLP-1(7-36)アミドを一日１または２回、約５週間反復皮下投与し、最終投与後に一晩絶食させたマウスに1.5g/kgの用量でグルコースを皮下投与し、投与後３０分のインスリン濃度を測定した結果を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
本発明において、GLP-1受容体アゴニストとは、GLP-1（非特許文献２３、配列番号１）及びGLP-1受容体に結合して、インシュリン放出促進活性を有する当該GLP-1の誘導体を意味する。【００４１】
GLP-1はプレプログルカゴン由来の37アミノ酸残基からなるペプチドであり、更に、プレプログルカゴンがプロセシングされ、GLP-1のＮ末端側における６個のアミノ酸が欠失したGLP-1(7-37)や、更にGLP-1(7-36)のＣ末端がアミド体に修飾されたGLP-1(7-36)アミドが生合成される（非特許文献２４）。これらのペプチドホルモン（即ち、GLP-1やGLP-1誘導体）は、膵臓のベータ細胞に作用し、インシュリンの分泌を促進する作用などを有するため、近年、その薬理作用から糖尿病治療薬の可能性が示唆されている（非特許文献２５、２６）。【００４２】
また、GLP-1誘導体としては、上記のGLP-1(7-37)や、GLP-1(7-36)アミドの他に、GLP-1の３７個のアミノ酸残基よりなるペプチドから、１個または数個のアミノ酸残基が置換、付加、欠失されたインシュリン放出促進活性を有するペプチド、当該ペプチドにかかるアミノ酸が更に修飾された、インシュリン放出促進活性を有するペプチド（例えばアミド体）、及びこれらの組み合わせにより得られる、インシュリン放出促進活性を有するペプチドを挙げることができる。【００４３】
GLP-1誘導体の具体例としては、本発明の実施例に記載した以外に、以下のものを例示として挙げることができる。
（１）GLP-1(7-34)、GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)、GLP-1(7-34)アミド、GLP-1(7-35)アミド、及びGLP-1(7-37)アミド；
（２）GLP-1(7-37)-Arg、GLP-1(7-37)-Arg-Arg、GLP-1(7-37)-Lys、GLP-1(7-37)-Lys-Lys、GLP-1(7-37)-Lys-Arg、及びGLP-1(7-37)-Arg-Lys、並びにこれらのＣ末端アミド体；
（３）GLP-1の８位のアミノ酸であるAlaをThr、GlyまたはSerに置換したGLP-1(7-37)、及びGLP-1(7-36)アミド；
（４）GLP-1の２６位のアミノ酸であるLysをArgに置換したGLP-1(7-37)、及びGLP-1(7-36)アミド；
（５）GLP-1の３４位のアミノ酸であるLysをArgに置換したGLP-1(7-37)、及びGLP-1(7-36)アミド；
（６）GLP-1の３６位のアミノ酸であるArgをLysに置換したGLP-1(7-37)、及びGLP-1(7-36)アミド；
（７）GLP-1の８位のアミノ酸であるAlaをThr、GlyまたはSerに置換し、更に２６位のアミノ酸であるLysをArgに置換したGLP-1(7-37)、及びGLP-1(7-36)アミド；
（８）GLP-1の８位のアミノ酸であるAlaをThr、GlyまたはSerに置換し、更に３４位のアミノ酸であるLysをArgに置換したGLP-1(7-37)、及びGLP-1(7-36)アミド；
（９）GLP-1の８位のアミノ酸であるAlaをThr、GlyまたはSerに置換し、更に３６位のアミノ酸であるArgをLysに置換したGLP-1(7-37)、及びGLP-1(7-36)アミド；
（１０）GLP-1の２６位のアミノ酸であるLysをArgに置換し、更に３４位のアミノ酸であるLysをArgに置換したGLP-1(7-37)、及びGLP-1(7-36)アミド；
（１１）GLP-1の２６位のアミノ酸であるLysをArgに置換し、更に３６位のアミノ酸であるArgをLysに置換したGLP-1(7-37)、及びGLP-1(7-36)アミド；
（１２）GLP-1の３４位のアミノ酸であるLysをArgに置換し、更に３６位のアミノ酸であるArgをLysに置換したGLP-1(7-37)、及びGLP-1(7-36)アミド；
（１３）GLP-1の８位のアミノ酸であるAlaをThr、GlyまたはSerに置換し、更に２６位のアミノ酸であるLysをArgに置換し、更に３４位のアミノ酸であるLysをArgに置換したGLP-1(7-37)、及びGLP-1(7-36)アミド；
（１４）GLP-1の８位のアミノ酸であるAlaをThr、GlyまたはSerに置換し、更に２６位のアミノ酸であるLysをArgに置換し、更に３６位のアミノ酸であるArgをLysに置換したGLP-1(7-37)、及びGLP-1(7-36)アミド；
（１５）GLP-1の８位のアミノ酸であるAlaをThr、GlyまたはSerに置換し、更に３４位のアミノ酸であるLysをArgに置換し、更に３６位のアミノ酸であるArgをLysに置換したGLP-1(7-37)、及びGLP-1(7-36)アミド；
（１６）GLP-1の２６位のアミノ酸であるLysをArgに置換し、更に３４位のアミノ酸であるLysをArgに置換し、更に３６位のアミノ酸であるArgをLysに置換したGLP-1(7-37)、及びGLP-1(7-36)アミド；
（１７）GLP-1の８位のアミノ酸であるAlaをThr、GlyまたはSerに置換し、更に２６位のアミノ酸であるLysをArgに置換し、更に３４位のアミノ酸であるLysをArgに置換し、更に３６位のアミノ酸であるArgをLysに置換したGLP-1(7-37)、及びGLP-1(7-36)アミド。【００４４】
本発明において好ましいGLP-1受容体アゴニストは、GLP-1(7-37)やGLP-1(7-36)アミド等のGLP-1誘導体であり、特にGLP-1(7-36)アミドが好ましい。【００４５】
本発明にかかるGLP-1受容体アゴニストは、公知の方法、例えば化学合成法や遺伝子組換え技術、更にはそれらの組み合わせにより得ることができる。【００４６】
本願発明に用いることができるGLP-1受容体アゴニストにかかる塩としては、薬学的に許容される塩が好ましく、例えば無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。【００４７】
無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。【００４８】
有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。
また、無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。【００４９】
有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。【００５０】
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
以上の塩の中でも、特にナトリウム塩、カリウム塩が最も好ましい。【００５１】
GLP-1受容体アゴニストまたはそれらの薬理学的に許容しうる塩を有効成分として含む本発明の医薬は、薬理学的に許容しうる担体、賦形剤、増量剤などと混合して個体（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル等）に対して用いることができる。【００５２】
本発明におけるGLP-1受容体アゴニストの投与量は特に限定されず、本発明の医薬の使用目的や個体の年齢、体重、個体の種類などに応じて適宜選択可能であるが、正常状態の個体が摂食した際に誘導される内因性GLP-1受容体アゴニスト濃度上昇相当を、外部から個体にGLP-1受容体アゴニストを投与することによって再現できる投与量が好ましい。即ち、投与対象の個体における血漿中のGLP-1受容体アゴニスト（本願において活性型GLP-1とも称する）濃度が、一過性に20pg/mL以上となる有効量であればよい。
ここで、「一過性に」とは、血漿中GLP-1受容体アゴニスト濃度を投与直後から約１−３時間の間、20pg/mL以上の濃度に上昇させることを意味する。【００５３】
投与量にかかるGLP-1受容体アゴニストの重量としては、好ましくは0.5μg〜5000μg、更に好ましくは5.0μg〜5000μgを投与できるように製剤中に含有されればよい。これらを１日１回以上投与し、当該投与を２週間以上行うことからなる連続スケジュールに従って、投与を行う。【００５４】
例えば、GLP-1受容体アゴニストとしてGLP-1(7-36)アミドをヒト成人に経鼻投与する場合は、製剤中のGLP-1(7-36)アミドは300μg〜5000μgとすればよい。この用量は、実施例１及び２において、マウスのインスリン抵抗性を改善したときの血漿中濃度をヒトで実現するのに必要と推定される量である。即ち、300μgの用量は、マウスにGLP-1(7-36)アミドを15μg/kgの用量で皮下投与したときとほぼ同じレベルまで血漿中のGLP-1受容体アゴニスト濃度を上昇させることが予想される投与量であり、5000μgの用量は、マウスにGLP-1(7-36)アミドを500μg/kgの用量で皮下投与したときとほぼ同じレベルまで血漿中のGLP-1受容体アゴニスト濃度を上昇させることが予想される投与量である。【００５５】
これらを１日１回以上、食物摂取の前に投与し、当該投与を２週間以上行うことからなる連続スケジュールに従って、投与を行う。【００５６】
投与時期としては、食物摂取の前のみならず、更に食物摂取の後にも行ってもよい。特にヒトにおいては、好ましくは、毎食事前後、例えば１日３回の投与を行うことが好ましい。
更に、毎回の投与の間隔として、血漿中のGLP-1受容体アゴニスト（活性型GLP-1）濃度が20pg/mL以下まで低下した状態を１時間以上継続させることが好ましい。【００５７】
なお、実施例３で使用したGLP-1(7-36)アミドの粉末点鼻剤と同種の製剤を２週間反復経鼻投与して、カニクイザルで安全性を評価したところ、3600μgを１日６回投与しても、毒性変化、並びに鼻粘膜の刺激性は認められなかった。【００５８】
GLP-1受容体アゴニストまたはそれらの薬理学的に許容しうる塩は、薬学的に許容される担体と配合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等の固形製剤；またはシロップ剤、注射剤等の液状製剤として経口または非経口的に投与することができる。【００５９】
薬学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などを一緒に配合することができる。
また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。【００６０】
賦形剤の好適な例としては、例えば乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸などが挙げられる。滑沢剤の好適な例としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。【００６１】
結合剤の好適な例としては、例えば結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。【００６２】
崩壊剤の好適な例としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウムなどが挙げられる。【００６３】
溶剤の好適な例としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などが挙げられる。【００６４】
溶解補助剤の好適な例としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。【００６５】
懸濁化剤の好適な例としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子などが挙げられる。【００６６】
等張化剤の好適な例としては、例えば塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールなどが挙げられる。【００６７】
緩衝剤の好適な例としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。【００６８】
無痛化剤の好適な例としては、例えばベンジルアルコールなどが挙げられる。
また、防腐剤の好適な例としては、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
抗酸化剤の好適な例としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。【００６９】
非経口投与に適する製剤形態としては、例えば、経鼻投与、経肺投与、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、または筋肉内投与用等の点鼻剤、注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、または吸入剤等を挙げることができる。経口投与に適する製剤形態としては、例えば、カプセル剤、錠剤、シロップ剤などを挙げることができる。そのなかでも、本発明にかかる製剤形態としては、非経口投与に適する製剤形態が好ましく、例えば、点鼻剤、注射剤、点滴剤、経粘膜吸収剤または吸入剤等の製剤形態が好ましい。【００７０】
これらの製剤形態は当業者に種々知られており、当業者は所望の投与経路に適する製剤形態を適宜選択し、必要に応じて当業界で利用可能な１または２以上の製剤用添加物を用いて、医薬用組成物の形態の製剤を製造することが可能である。【００７１】
例えば、注射剤または点滴剤の形態の医薬は、有効成分であるGLP-1受容体アゴニストと共に等張化剤、ｐＨ調節剤、無痛化剤、防腐剤などの１または２以上の製剤用添加物を注射用蒸留水に溶解して、滅菌することにより調製できる。また、注射剤または点滴剤の形態の医薬は、凍結乾燥形態の医薬として提供することもできる。このような製剤は、用時に注射用蒸留水や生理食塩水などを添加して溶解することにより、注射剤または点滴剤として使用できる。また、例えば経粘膜投与には、点鼻剤や鼻腔内スプレー剤等の鼻腔内投与剤、舌下剤などの口腔内投与剤または経肺投与用吸入剤等も好適である。【００７２】
投与方法は特に限定されるものではないが、経鼻投与、経肺投与、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、または筋肉内投与用等の非経口的に投与することが好ましく、更に非侵襲的投与であることが好ましい。非侵襲的投与としては、経鼻投与または経肺投与が好ましい。
【実施例】
【００７３】
以下に本発明を、実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１：インスリン抵抗性モデルマウス(KK-Ay/Ta Jclマウス)にGLP-1(7-36)アミドを２週間反復皮下投与したときの活性評価
GLP-1(7-36)アミドを25%デキストラン70溶液に溶解し、500μg/kg/dayの投与量で雄性KK-Ay/Ta Jclマウスに１日１回１４日間反復皮下投与し、投与期間中の血糖値及び各組織への糖取り込み活性を測定した。その際、明暗サイクルは１２時間（明期：７時〜１９時）とし、給餌は通常食（固形（CRF-1）、オリエンタル酵母工業株式会社）を反復投与期間中与えた。【００７４】
（１）群構成
コントロール群として薬物非投与群（Ｎ＝４）をおいた。被験物質投与群（Ｎ＝４）にはGLP-1(7-36)アミドの500μg/kgを１日１回夕方（１６時頃）に皮下投与した。陽性対照群（Ｎ＝４）には既存のインスリン抵抗性改善薬であるトログリタゾンの30mg/kgを１日１回夕方（１６時頃）に腹腔内投与した。【００７５】
（２）評価項目及び結果
（ア）被験物質或いは陽性対照物質を投与開始前、反復投与後７日目及び１３日目における血糖値（薬物投与前の飽食時血糖値）を、簡易型血糖測定器（アントセンスII、バイエル−三共（株））を用いて測定し、その結果を図１に示した。
コントロール群と比較してGLP-1(7-36)アミド投与群では、投与期間中の飽食時血糖値が低下した。この作用はトログリタゾン投与群よりも強かった。
（イ）被験物質或いは陽性対照物質を１３日間反復投与した後に約２０時間絶食させ、空腹時血糖値を、簡易型血糖測定器（アントセンスII、バイエル−三共（株））を用いて測定し、その結果を図２に示した。
GLP-1(7-36)アミド投与群では空腹時血糖値が低下した。この作用はトログリタゾンを投与したときとほぼ同程度であった。【００７６】
（ウ）被験物質或いは陽性対照物質を１４日間反復投与し、最終投与３０分後に0.15g/mLグルコース−0.123μg/0.83MBq/mL ３Ｈ−デオキシグルコース混液（10mL/kg）を経口投与した。なお、１３日目の投与後は約２０時間絶食させた。糖負荷３０分後の血清中放射能濃度を液体シンチレーションカウンター（TRICARB2200、Packard社）で、また、血清中グルコース濃度をムターゼ・GOD法にてそれぞれ測定し、その結果を各々図３及び図４に示した。
また、肝臓、白色脂肪及び骨格筋中の放射能濃度を、液体シンチレーションカウンター（TRICARB2200、Packard社）にて測定し、その結果を図５に示した。
コントロール群と比較して、GLP-1(7-36)アミド投与群では血清中の放射能及びグルコース濃度が低下し、肝臓での放射能の取り込み活性（KP値）が上昇した。トログリタゾン投与群ではいずれの項目もコントロール群と差が認められなかった。【００７７】
（エ）GLP-1(7-36)アミドを25%デキストラン70溶液に溶解し、500μg/kgの用量で正常マウス（C57BLマウス）に皮下投与したときの血漿中の活性型GLP-1濃度推移を確認した（図６参照）。
血漿中の活性型GLP-1濃度は、投与１５分後に約2ng/mLまで上昇し、投与１時間後には0.4ng/mLまで低下した。【００７８】
（３）結論
KK-Ay/Ta Jclマウスは、過食とインスリン抵抗性により高インスリン血症及び高血糖状態を呈した２型糖尿病モデルマウスであり、血糖低下剤であるスルフォニルウレア剤を投与しても無効であることが知られている。
KK-Ay/Ta Jclマウスに、GLP-1(7-36)アミドの500μg/kgを１日１回１３日間反復皮下投与することで、投与期間中の飽食時及び空腹時血糖値が低下した。このことより、GLP-1(7-36)アミドにはインスリン抵抗性を改善させる作用があることが示唆された。また、１４日目の投与３０分後にグルコース／３Ｈ−デオキシグルコース混液を経口負荷したとき、血清中グルコース及び放射能濃度が低下し、肝臓及び筋肉への放射能の移行性が上昇した。【００７９】
本実施例で確認された末梢組織での糖取り込み促進作用は、直前に投与したGLP-1(7-36)アミドが存在する状態で確認されているものであるが、GLP-1受容体アゴニストによりインスリン抵抗性が改善されていれば、投与直後のみならず投与後充分に時間が経過して血漿中に活性型GLP-1が殆ど存在しないような条件でも、末梢組織での糖取り込み活性が増強しているのではないかと推定し、更に以下の実験を行った。【００８０】
実施例２：インスリン抵抗性モデルマウス(KK-Ay/Ta Jclマウス)にGLP-1(7-36)アミドを８週間反復皮下投与したときの活性評価
GLP-1(7-36)アミドを生理食塩水に溶解し、雄性KK-Ay/Ta Jclマウスに１日３回、８週間反復皮下投与し、基礎血糖値、糖化ヘモグロビン（HbA1c）及び血漿中インスリン濃度に対する影響について検討した。また、最終投与終了後の動物にインスリンの0.75U/kgを腹腔内投与し、血糖値を経時的に測定した。その際、明暗サイクルは１２時間（明期：８時〜２０時）とし、給餌は通常食（固形（CRF-1）、オリエンタル酵母工業株式会社）を反復投与期間中与えた。【００８１】
（１）群構成
コントロール群として媒体（生理的食塩水）投与群（Ｎ＝１０）をおいた。被験物質投与群にはGLP-1(7-36)アミドの15、50及び150μg/kgを１日３回（９時頃、１３時頃及び１７時頃）、８週間反復皮下投与した。【００８２】
（２）評価項目及び結果
（ア）GLP-1(7-36)アミドを１日３回（９時頃、１３時頃及び１７時頃）、８週間反復皮下投与し、投与期間中の投与前の血糖値（９時及び１７時）、糖化ヘモグロビン（HbA1c、９時）及び９時の投与前の血漿中インスリン濃度（９時）を測定した。その結果を各々図７〜１０に示した。
投与期間中の血糖値（９時）及びHbA1c（９時）の上昇をわずかに抑制する傾向が認められた。夕方１７時の投与前に測定した血糖値（９時）は、差が認められなかった。投与期間中のインスリン濃度（９時）の上昇は、15〜150μg/kgの投与量で抑制された。更に、８週間反復皮下投与後の動物では、１６時間以上絶食した後の血糖値（空腹時血糖値）に差が認められなかったにも拘わらず、インスリン（0.75U/kg）腹腔内投与時の血糖値低下作用が増強していた。なお、血糖値及び血漿中インスリン濃度の測定を行った９時には、前回の投与から約１６時間が経過しており、投与したGLP-1(7-36)アミドはすでに体内から消失しているものと考えられる。本試験期間を通じて、各群の体重及び摂餌量には差が認められなかった。【００８３】
（イ）KK-Ay/Ta JclマウスにGLP-1(7-36)アミドを１日３回（９時頃、１３時頃及び１７時頃）約８週間反復皮下投与した後に最終投与（１７時頃）後、１６時間以上絶食させた。その後、インスリンの0.75U/kgを腹腔内投与したときの血糖値を経時的に測定し、その結果を図１１に示した。
６時間以上絶食した後の血糖値（空腹時血糖値）には、群間で差が認められなかったにも拘わらず、GLP-1(7-36)アミド投与群ではコントロール群と比較してインスリンの血糖値低下作用が増強した。【００８４】
（ウ）GLP-1(7-36)アミドを生理食塩水に溶解し、50μg/kgの用量で正常マウス（C57BLマウス）に皮下投与したときの血漿中の活性型GLP-1濃度推移を確認した。血漿中の活性型GLP-1濃度は投与後５分に1.14ng/mLまで上昇し、投与後３０分以内には定量限界未満（0.1ng/mL未満）に低下した（図１２参照）。【００８５】
（３）結論
本試験の結果から、KK-Ay/Ta JclマウスにGLP-1(7-36)アミドを反復皮下投与し、一過性に血漿中の活性型GLP-1濃度の上昇を引き起こすことにより、インスリン抵抗性の悪化を抑制し、インスリン感受性を増強するものと考えられた。この作用は、15〜150μg/kgを１日３回皮下投与した群でほぼ同程度の強さで認められたことより、15μg/kgの投与量ですでに作用が飽和しているものと考えられる。また、投与期間中の動物の体重、摂餌量及び反復投与終了後の空腹時血糖には群間で差が認められず、GLP-1(7-36)アミドを投与したことによる飽食時血糖値の上昇抑制作用はわずかであったことより、本試験で認められたGLP-1(7-36)アミドのインスリン感受性を増強は、血糖値低下作用や、摂餌量抑制作用に伴う２次的な作用ではなく、直接的に末梢組織のインスリン抵抗性を改善したことによるものであると考えられる。【００８６】
実施例３：雄性カニクイザルにGLP-1(7-36)アミドの粉末点鼻剤を経鼻投与したときの血漿中の活性型GLP-1濃度推移の評価
GLP-1(7-36)アミドの粉末点鼻剤１カプセルを専用デバイスに装着して、カプセルに充填された薬剤粉末をデバイスのノズルを通して鼻腔内に噴霧投与したときの血漿中の活性型GLP-1濃度推移を検討した。【００８７】
（１）群構成
GLP-1(7-36)アミドの30μgまたは100μgを含有した30mg重量の薬剤粉末を各４匹の雄性カニクイザルの鼻腔内に噴霧投与した。【００８８】
（２）評価項目及び結果
GLP-1(7-36)アミドの粉末点鼻剤を投与した後の血漿中の活性型GLP-1濃度を、市販のELISA Kitを用いて測定した。血漿中の活性型GLP-1濃度は、投与直後に約0.15または約1.0ng/mLまで上昇し、投与１８０分（３時間）後にはほぼ投与前値まで低下した（図１３参照）。【００８９】
（３）結論
カニクイザルを用いてGLP-1(7-36)アミドの粉末点鼻剤の薬物動態を検討した。この結果から、ヒトにおいても本製剤を間歇的に一定期間繰り返し経鼻投与することで、健常人における内因性GLP-1(7-36)アミドの日内変動を模倣した血漿中濃度推移を再現することが可能であると考えられた。このことより、ヒトにGLP-1受容体アゴニストを非侵襲的に投与する方法が確立した。【００９０】
以上の実施例から、GLP-1受容体アゴニストの血漿中濃度を一過性に上昇させる事を間歇的に繰り返すことは、KK-Ay/Ta Jclマウスのインスリン抵抗性の悪化を抑制し、高インスリン血症及びインスリン抵抗性に伴う相対的なインスリン不足によって生じた高血糖状態を改善することが確認された。
また、GLP-1(7-36)アミドの粉末点鼻剤をカニクイザルに経鼻投与することにより、一過性に血漿中の活性型GLP-1濃度を上昇させることが確認された。GLP-1(7-36)アミドの粉末点鼻剤を用いれば、天然型のGLP-1(7-36)アミドを非侵襲的にヒトに毎食時に繰り返し投与することが可能になると考えられた。【００９１】
実施例４：高脂肪食負荷したKK/Ta JclマウスにGLP-1(7-36)アミドを反復皮下投与したときの活性評価
GLP-1(7-36)アミドを生理食塩水に溶解し、雄性KK/Ta Jclマウス（日本クレア株式会社）に１日３回、１５週間反復皮下投与したときの投与期間中の体重、摂餌量、基礎血糖値、糖化ヘモグロビン（HbA1c）及び血漿中インスリン濃度に対する影響について検討した。１５週間投与終了後に、高脂肪食を普通食に変更し、再び高脂肪食に戻したときの血糖推移、及び、GLP-1(7-36)アミドの投薬を２週間休止したときの血糖推移を観察した。全ての投与終了後（投与開始時より２２〜２４週目）に動物の肝臓及び心臓を採取し、肝重量と脂肪肝の程度を観察するとともに、ランゲンドルフ灌流にて心機能を評価した。なお、飼育期間中の明暗サイクルは１２時間（明期８時〜２０時）とし、給餌は通常食（固形（CRF-1）、オリエンタル酵母工業株式会社）または高脂肪食（固形（Quick Fat）、日本クレア株式会社）を反復投与期間中与えた。【００９２】
（１）群構成
通常食群及び高脂肪食群の両方に媒体（生理的食塩水）投与のコントロール群と被験物質投与群を設定した（N=8〜9）。被験物質投与群にはGLP-1(7-36)アミドの150μg/kgを１日３回（９時頃、１３時頃及び１７時頃）、２２〜２４週間（２週間の休薬期間を含む）反復皮下投与した。【００９３】
（２）評価項目及び結果
（ア）GLP-1(7-36)アミドを１日３回、１５週間反復皮下投与し、投与期間中の体重、摂餌量、随時血糖値（９時及び１７時）、糖化ヘモグロビン（HbA1c、Day1及びDay73の９時）及び血漿中インスリン濃度（９時）を測定した（図１４参照）。高脂肪食群において、GLP-1(7-36)アミドの投与は随時血糖値（９時）、HbA1c及び血漿中インスリン濃度（９時）の上昇を有意に抑制した。通常食群においては、媒体投与とGLP-1(7-36)アミド投与の間で血糖値（９時及び１７時）及びHbA1c値に、差は認められなかった。通常食群及び高脂肪食群のいずれも、媒体投与群とGLP-1(7-36)アミド投与群との間に摂餌量の差は認められなかったが、体重増加を抑制する傾向が認められた。【００９４】
（イ）GLP-1(7-36)アミドを１日３回、１５週間反復皮下投与したときのアセト酢酸濃度（投与85日目の９時の投与前）を測定した（図１５参照）。通常食群と比べて高脂肪食群ではアセト酢酸濃度が有意に上昇し、GLP-1(7-36)アミド投与により、上昇が抑制される傾向が認められた。【００９５】
（ウ）２２〜２４週間反復皮下投与終了後から一晩絶食させた動物より肝臓を採取した。通常食群と比べて高脂肪食群の肝臓重量は有意に増加し、脂肪沈着が確認された。他方、通常食群ではGLP-1(7-36)アミド投与によって肝臓重量の変化は認められず、高脂肪食群ではGLP-1投与によって肝臓重量の増加が有意に抑制され、肝臓への脂肪沈着はほとんど認められなかった（図１６参照）。【００９６】
（エ）２２〜２４週間反復皮下投与終了後に高脂肪食群の動物より心臓を採取し、ランゲンドルフ灌流にて心機能を評価した。媒体投与群と比べてGLP-1(7-36)アミド投与群では、虚血再灌流後の心拍出能の回復が早く、収縮能力の指標となる最大・最低灌流圧差が拡大した（図１７参照）。【００９７】
（オ）１５週間反復投与終了後、高脂肪食群の餌を普通食に変更したところ、高脂肪食によって誘引された高血糖は直ちに低下したが、再び高脂肪食に変更すると、血糖値はすぐに餌変更前と同程度まで上昇した。GLP-1(7-36)アミド投与群では、餌の種類による血糖値の変動は認められず、GLP-1(7-36)アミド投与を2週間休止しても急激に血糖値が上昇することはなかった（図１８参照）。【００９８】
（３）結論
本試験の結果から、KK/Ta JclマウスにGLP-1(7-36)アミドを反復皮下投与して血漿中の活性型GLP-1濃度を一過性に上昇させることを間歇的に繰り返すことにより、高脂肪食負荷によって誘引された高血糖及び高インスリン血症が改善された。それと同時にケトン体であるアセト酢酸の生成や脂肪肝の発症を抑制した。高血糖及び高インスリン血症の是正作用は、GLP-1(7-36)アミドの投与を休止しても継続した（図１８）ことから、GLP-1には肝臓における糖脂質代謝のバランスを整えることでインスリン抵抗性を改善し、糖尿病発症を抑制する作用があるものと推定される。また、高脂肪食のみを摂取していた群と比較して、GLP-1(7-36)アミド投与群では虚血再灌流後の心機能が改善していた。この作用は、GLP-1(7-36)アミド投与終了後１２時間以上経過した条件で実施されたおり、灌流液中にもGLP-1を添加していないことから、従来から知られているようなGLP-1持続投与時の心臓保護作用とは異なる作用であり、血漿中の活性型GLP-1濃度を一過性に上昇させることを間歇的に繰り返すことで心臓組織におけるインスリン抵抗性が改善し、心筋が虚血ストレスに対する耐性を獲得したものと推定される。【００９９】
実施例５：高脂肪食で飼育したマウスに反復皮下投与したときの活性評価
雄性CRj：CD1(ICR)系マウス（チャールズリバー・ジャパン）に媒体（生理食塩水）または、GLP-1(7-36)アミドの150μg/kgを１日２回（休日は１日１回）、約５週間反復皮下投与し、投与期間中の体重、摂餌量、基礎血糖値、糖負荷後の血漿中グルコース及びインスリン濃度に対する影響について検討した。その際、明暗サイクルは１２時間（明期２１時〜９時）とし、給餌は通常食（固形（CRF-1）、オリエンタル酵母工業株式会社）または高脂肪食（固形（Quick Fat）、日本クレア株式会社）を反復投与期間中与えた。【０１００】
（１）群構成
コントロール群として通常食で飼育した媒体投与群（N=6〜7）及び高脂肪食で飼育した媒体投与群（N=6〜7）をおいた。被験物質投与群（N=6）にはGLP-1(7-36)アミドの150μg/kgを１日２回（９時頃及び１７時頃、休日は１日１回）、約５週間反復皮下投与した。【０１０１】
（２）評価項目及び結果
飼育期間中の体重、摂餌量、随時血糖値（９時の投与前に測定）及び最終投与後に一晩絶食した後に1.5g/kgの用量でグルコースを皮下投与し、投与後30分の血漿中グルコース及びインスリン濃度を測定した。【０１０２】
（ア）体重、摂取エネルギー量
高脂肪食群の体重は、飼育期間を通じて通常食群に比べて大きく、GLP-1(7-36)アミド投与により体重増加は抑制された（図１９参照）。摂餌重量（各群の平均値）は群間で明らかな差が認められなかった。摂餌量を摂取エネルギーに換算すると高脂肪食群のほうが通常食群よりも１０〜２０％高かった（図２０参照）。【０１０３】
（イ）血糖値
反復投与期間中の随時血糖値は群間で明らかな差は認められなかった（図２１参照）。最終投与後に一晩絶食した後に測定した空腹時血糖値は通常食群に比べて高脂肪食群で有意な高値を示し、GLP-1(7-36)アミド投与により抑制される傾向が認められた（図２１参照）。1.5g/kgグルコースを皮下投与後３０分の血漿中グルコース及びインスリン濃度は通常食群に比べて高脂肪食群で有意に上昇した。GLP-1(7-36)アミド投与により、インスリン濃度が上昇は抑制される傾向にあったものの有意差は認められず、高脂肪食群での血漿中グルコース濃度の上昇は抑制されなかった（図２２参照）。【０１０４】
（３）結論
高脂肪食を摂取したマウスにGLP-1(7-36)アミドを反復投与すると、摂餌量を変化させることなく高脂肪食を摂取に伴う体重の増加を抑制した。また、GLP-1(7-36)アミド投与により、長期間高脂肪食を摂取したことによって惹起された空腹時血糖値の上昇が通常食摂取群と同程度まで抑制され、高脂肪食摂取によって惹起された血漿中インスリン濃度の高値も抑制された。この結果はKK/Ta Jclマウスでの成績とよく相関したものであり、KK/Ta Jclマウスのように遺伝的に糖尿病を発症させやすい体質を保持していない動物において高脂肪食の長期間摂取によってインスリン抵抗性と肥満が誘導され、それを、血漿中の活性型GLP-1濃度を一過性に上昇させることを間歇的に繰り返すことで改善させることが可能であることが実験的に確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
本発明により、副作用が少なく且つ薬物相互作用の少ない、GLP-1受容体アゴニストを用いた新たなインスリン抵抗性を改善するための投与方法及び当該投与のためのインスリン抵抗性改善剤が提供される。即ち、新たなインスリン抵抗性を改善する方法並びにインスリン抵抗性に起因する疾患、例えば高血糖症、糖尿病及び肥満症等の予防及び治療する方法と、当該方法に用いるGLP-1受容体アゴニストを有効成分として含有するインスリン抵抗性改善剤が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４．１】
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【図１４．２】
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【図１４．３】
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【図１４．４】
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【図１４．５】
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【図１５】
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【図１６．１】
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【図１６．２】
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【図１７．１】
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【図１７．２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０．１】
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【図２０．２】
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【図２１】
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【図２２．１】
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【図２２．２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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