(57)【要約】本発明の目的は、幹細胞から骨芽細胞への分化促進剤、骨芽細胞の製造方法、該製造方法により製造される骨芽細胞、または骨治療材を提供することにある。  本発明は、カルシウム拮抗薬を有効成分として含有する幹細胞から骨芽細胞への分化促進剤、該分化促進剤を使用することを特徴とする骨芽細胞の製造方法、該製造方法により製造される骨芽細胞、または該分化促進剤を含有することを特徴とする骨治療材を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシウム拮抗薬を有効成分として含有する、幹細胞に対する骨芽細胞への分化促進剤。
【請求項２】
カルシウム拮抗薬が、ジヒドロピリジン系カルシウム拮抗薬、フェニルアルキルアミン系カルシウム拮抗薬、およびベンゾチアゼピン系カルシウム拮抗薬からなる群から選ばれる少なくとも一つのカルシウム拮抗薬である、請求項１に記載の分化促進剤。
【請求項３】
幹細胞が、骨芽細胞への分化能を有する幹細胞である、請求項１〜２のいずれか１項に記載の分化促進剤。
【請求項４】
骨芽細胞への分化能を有する幹細胞が、胚性幹細胞、成体多能性幹細胞、および末梢血単球由来細胞からなる群から選ばれる少なくとも一つの幹細胞である、請求項３に記載の分化促進剤。
【請求項５】
成体多能性幹細胞がＣＤ４５陰性かつＣＸＣＲ４陽性細胞である、請求項４に記載の分化促進剤。
【請求項６】
骨芽細胞への分化能を有する幹細胞が間葉系幹細胞である、請求項３に記載の分化促進剤。
【請求項７】
間葉系幹細胞が骨髄、脂肪組織、臍帯、歯周辺組織、子宮内膜組織および筋組織から選ばれる組織由来である、請求項６に記載の分化促進剤。
【請求項８】
骨芽細胞への分化能を有する幹細胞が哺乳動物由来である、請求項３〜７のいずれか１項に記載の分化促進剤。
【請求項９】
哺乳動物がヒトである、請求項８に記載の分化促進剤。
【請求項１０】
幹細胞を骨芽細胞へ分化誘導させる条件下、請求項１〜９のいずれか１項に記載の分化促進剤を添加して幹細胞を培養し、幹細胞を骨芽細胞へ分化させ、該培養物中より骨芽細胞を採取することを特徴とする骨芽細胞の製造方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の製造方法により得られる骨芽細胞。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の幹細胞に対する骨芽細胞への分化促進剤と幹細胞の足場とを含有する骨治療材。
【請求項１３】
幹細胞の足場が、生体吸収性材料または生体非吸収性材料である請求項１２に記載の骨治療材。
【請求項１４】
生体吸収性材料が、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ−Ｌ−乳酸、ポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸、乳酸とグリコール酸の共重合体、ポリε−カプロラクトン、ポリシアノアクリレート、ポリ酸無水物、ポリオルソエステル、ポリカーボネート、ポリフォスファゼン、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、セルロース、アルギン酸、デンプン、およびデキストラン、ペプチド、およびその誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つの物質である、請求項１３に記載の骨治療材。
【請求項１５】
生体非吸収性材料がチタンまたはセラミックである請求項１３または１４に記載の骨治療材。
【請求項１６】
幹細胞の足場が、繊維性および／または多孔性形態である請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の骨治療材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、幹細胞に対する骨芽細胞への分化促進剤、骨芽細胞の製造方法、該製造方法により製造される骨芽細胞、および骨治療材に関する。
【背景技術】
【０００２】  変形性関節症や慢性関節リウマチ、難治性骨折、骨形成不全症、歯周病等、種々の骨疾患に対する根治療法として、損傷または疾病に冒された骨組織を修復させることが提唱されている。具体的には、従来、腸骨より採取した自家骨片の移植による治療や、金属またはセラミック製等の人工骨の移植による治療等が行われてきた。しかし、自家骨片の移植においては、採骨量に限界があり、採骨部に痛みが残存し出血を伴うという問題がある。また、人工骨による治療では、使用するに従い、すり減ったり緩んだりするという問題があり、人工骨周辺の免疫力が落ちることによる感染症や、人体にとって異物である人工物への拒絶反応が生ずることもあり、耐用年数は平均１０年から２０年である。こうした状況から、これらに替わる治療法が求められてきた。【０００３】  そこで、患者自身の新鮮な骨髄細胞を採取して傷害部位に骨髄細胞を注入する治療が試みられている。これは骨髄には血球系細胞へ分化する造血幹細胞以外に、骨組織を形成する能力のある骨芽細胞へ分化可能な幹細胞が含まれているからである。すなわち、新鮮骨髄に含まれる幹細胞が移植部位において骨芽細胞へ分化し、更にその分化した細胞による骨形成が期待できるからである。しかし、この新鮮な骨髄細胞に含まれる幹細胞は数が少なく、その治療効果もまだ明確ではない。【０００４】  近年、骨髄細胞を採取し生体外で培養して幹細胞を増殖させることが可能になってきた。少量の成体骨髄から取得した幹細胞は増殖可能で、この増幅された幹細胞を骨芽細胞や軟骨細胞に分化させて移植するという治療法も試みられている。
一般に幹細胞とは、様々な組織を構成する細胞へ分化する多分化能と、自己複製能を有する細胞であり、成体骨髄以外にも、成体の様々な組織、胚、胎児等からも取得することができる。胚性幹細胞は、受精卵より取得され、成体を構成する全ての組織に分化できる能力を持つ。一方、成体組織には、成体の全ての組織ではないが、当該組織の機能性細胞を供給する幹細胞が存在し、その例として、造血幹細胞や神経幹細胞等が知られている。特に、骨芽細胞や脂肪細胞等への分化能を有する幹細胞は、間葉系幹細胞と呼ばれ、成体骨髄や臍帯血等から取得できる。最近では、成体の組織中に、当該組織の機能性細胞だけでなく、胚性幹細胞のように成体のほとんど全ての細胞に分化できる能力を有する、成体多能性幹細胞が存在することも報告されている（非特許文献１参照）。【０００５】  これらの幹細胞は、薬剤やサイトカイン等の添加により、特定の細胞へｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させることができる。例えば、間葉系幹細胞から骨芽細胞へはデキサメタゾン、β−グリセロフォスフェート、およびアスコルビン酸を作用させることにより誘導できることが報告されている（非特許文献２参照）。また、骨形成因子（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ；ＢＭＰｓ）や塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ｂＦＧＦ）等の増殖因子も骨芽細胞への分化を誘導させる作用があることが知られている。一般に、蛋白質の場合、低分子化合物と比べて、安定性、生産コスト、生理作用の多様性等の点で実用に供する場合に問題がある。低分子化合物としては、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の阻害剤であるスタチン系の薬剤に骨形成促進作用が報告されている（非特許文献３参照）が、臨床上の有用性については明確ではない（非特許文献４、５参照）。また、別の低分子化合物として、パーモルファミン（ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ骨芽細胞誘導活性が報告されている（非特許文献６参照）が、臨床上の有用性については明確ではない。【０００６】  一方、ある種のジヒドロピリジン、フェニルアルキルアミン、ベンゾチアゼピン等は血管平滑筋のＬ型カルシウムチャンネルに拮抗的に作用し、降圧作用を示すことが報告されており（非特許文献７参照）、これらの化合物がｉｎ  ｖｉｔｒｏで骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の成熟を促進させること（非特許文献８、９参照）、塩酸ベニジピンを雄性高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ）に投与すると骨重量、骨強度が増加すること（非特許文献１０参照）が報告されている。しかし、これらの化合物の骨芽細胞への分化が決定されていない幹細胞に対する作用は不明である。しかも、幹細胞は骨芽細胞以外の細胞へも分化する多様な分化能を有しており、例えば、成体骨髄由来の間葉系幹細胞は脂肪細胞、骨格筋細胞、線維芽細胞、軟骨細胞等への分化能を有することから、これらの化合物の骨芽細胞以外の細胞への分化に対する影響については全く不明であり、これまでの知見を基に幹細胞に対する作用を予測することは困難である。
【非特許文献１】「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、２００２年、４１８巻、ｐ．４１−４９
【非特許文献２】「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９９年、２８４巻、ｐ．１４３−１４７
【非特許文献３】「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９９年、２８６巻、ｐ．１９４６−１９４９
【非特許文献４】「アールスライティス・リサーチ（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２００２年、４巻、ｐ．１５１−１５３
【非特許文献５】「ジャーナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・メタボリズム（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）」、２００２年、８７巻、ｐ．１４５１−１４５８
【非特許文献６】「ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）」、１２００２年、１２４巻、ｐ．１４５２０−１４５２１
【非特許文献７】「クリニカル・カルシウム（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｌｃｉｕｍ）」、１９９７年、７巻、ｐ．７−１０
【非特許文献８】「バイオロジカル・アンド・ファーマシューティカル・ブリタン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ＆  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）」、２００１年、２４巻、ｐ．６２８−６３３
【非特許文献９】「カルシファイド・ティッシュ・インターナショナル（Ｃａｌｃｉｆｉｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）」、２００２年、７０巻、ｐ．３０−３９
【非特許文献１０】「新薬と臨床」、１９９３年、４２巻、ｐ．２２９８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  幹細胞を生体外で骨芽細胞へ分化させて移植するという治療法や、生体内の幹細胞に対して直接、骨芽細胞への分化を促進させる治療法等において、幹細胞から骨芽細胞への分化を促進させる活性を有する低分子化合物があれば、移植に必要とされる細胞数を減らすことや、分化誘導にかかる時間の短縮等の効果が期待できる。
本発明の目的は、幹細胞に対する骨芽細胞への分化促進剤、骨芽細胞の製造方法、該製造方法により製造される骨芽細胞、または骨治療材を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  本発明は以下の（１）〜（１６）に関する。
（１）カルシウム拮抗薬を有効成分として含有する、幹細胞に対する骨芽細胞への分化促進剤。
（２）カルシウム拮抗薬が、ジヒドロピリジン系カルシウム拮抗薬、フェニルアルキルアミン系カルシウム拮抗薬、およびベンゾチアゼピン系カルシウム拮抗薬からなる群から選ばれる少なくとも一つのカルシウム拮抗薬である、上記（１）に記載の分化促進剤。
（３）幹細胞が、骨芽細胞への分化能を有する幹細胞である、上記（１）〜（２）のいずれか１項に記載の分化促進剤。
（４）骨芽細胞への分化能を有する幹細胞が、胚性幹細胞、成体多能性幹細胞、および末梢血単球由来細胞からなる群から選ばれる少なくとも一つの幹細胞である、上記（３）に記載の分化促進剤。
（５）成体多能性幹細胞がＣＤ４５陰性かつＣＸＣＲ４陽性細胞である、上記（４）に記載の分化促進剤。
（６）骨芽細胞への分化能を有する幹細胞が間葉系幹細胞である、上記（３）に記載の分化促進剤。
（７）間葉系幹細胞が骨髄、脂肪組織、臍帯、歯周辺組織、子宮内膜組織および筋組織から選ばれる組織由来である、上記（６）に記載の分化促進剤。
（８）骨芽細胞への分化能を有する幹細胞が哺乳動物由来である、上記（３）〜（７）のいずれか１項に記載の分化促進剤。
（９）哺乳動物がヒトである、上記（８）に記載の分化促進剤。
（１０）幹細胞を骨芽細胞へ分化誘導させる条件下、上記（１）〜（９）のいずれか１項に記載の分化促進剤を添加して幹細胞を培養し、幹細胞を骨芽細胞へ分化させ、該培養物中より骨芽細胞を採取することを特徴とする骨芽細胞の製造方法。
（１１）上記（１０）に記載の製造方法により得られる骨芽細胞。
（１２）上記（１）〜（９）のいずれか１項に記載の幹細胞に対する骨芽細胞への分化促進剤と幹細胞の足場とを含有する骨治療材。
（１３）幹細胞の足場が、生体吸収性材料または生体非吸収性材料である上記（１２）に記載の骨治療材。
（１４）生体吸収性材料が、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ−Ｌ−乳酸、ポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸、乳酸とグリコール酸の共重合体、ポリε−カプロラクトン、ポリシアノアクリレート、ポリ酸無水物、ポリオルソエステル、ポリカーボネート、ポリフォスファゼン、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、セルロース、アルギン酸、デンプン、およびデキストラン、ペプチド、およびその誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つの物質である、上記（１３）に記載の骨治療材。
（１５）生体非吸収性材料がチタンまたはセラミックである上記（１３）または（１４）に記載の骨治療材。
（１６）幹細胞の足場が、繊維性および／または多孔性形態である上記（１２）〜（１５）のいずれか１項に記載の骨治療材。
【発明の効果】
【０００９】  本発明により、カルシウム拮抗薬を有効成分として含有する、幹細胞に対する骨芽細胞への分化促進剤、骨芽細胞の製造方法、該製造方法により製造される骨芽細胞、または骨治療材を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、塩酸ベニジピンの種々の濃度における、ｈＭＳＣの骨芽細胞への分化に対する効果を表すグラフである。縦軸は単位面積あたりのフォンコッサ染色陽性部分の割合（％）を、横軸は塩酸ベニジピンの濃度（ｍｏｌ／ｌ）を表す。縦軸の値は３回の実験の平均値±ＳＥＭを示す。
【図２】図２は、塩酸ベニジピンの種々の濃度における、ｈＭＳＣの脂肪細胞への分化に対する効果を表すグラフである。縦軸は４９０ｎｍにおける吸光度を、横軸は塩酸ベニジピンの濃度（ｍｏｌ／ｌ）を表す。縦軸の値は３回の実験の平均値±ＳＥＭを示す。
【図３】図３は、ｈＭＳＣに対する種々の濃度のアムロジピンまたはニフェジピンの、骨芽細胞分化への効果を表すグラフである。縦軸は単位面積あたりのフォンコッサ染色陽性部分の割合（％）を、横軸はアムロジピン（●）またはニフェジピン（○）の濃度（ｍｏｌ／ｌ）を表す。縦軸の値は３回の実験の平均値±ＳＥＭを示す。
【図４】図４は、ｍＡｄＳＣに対する塩酸ベニジピンの骨芽細胞への分化に対する効果を表すグラフである。縦軸は単位面積あたりのフォンコッサ染色陽性部分の割合（％）を表す。縦軸の値は３回の実験の平均値±ＳＥＭを示す。
【図５】図５は、ｍＡｄＳＣに対する塩酸ベニジピンの骨芽細胞への分化に対する効果を表すグラフである。縦軸はＤＮＡ含量あたりのＡＬＰ活性の相対値（％）を表す。縦軸の値は３回の実験の平均値±ＳＥＭを示す。
【図６】図６は、ｍＡｄＳＣに対する各種カルシウム拮抗薬の骨芽細胞への分化に対する効果を表すグラフである。縦軸はＤＮＡ含量あたりのＡＬＰ活性の相対値（％）を、横軸は対照群（１）、塩酸ベラパミル１０−８ｍｏｌ／Ｌ（２）、塩酸ベラパミル１０−６ｍｏｌ／Ｌ（３）、または塩酸ジルチアゼム１０−８ｍｏｌ／Ｌ（４）を表す。縦軸の値は３回の実験の平均値±ＳＥＭを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】１．カルシウム拮抗薬
本発明の幹細胞に対する骨芽細胞への分化促進剤に含有されるカルシウム拮抗薬としては、カルシウム拮抗作用を有する物質であればいずれでもよく、例えばジヒドロピリジン系カルシウム拮抗薬、フェニルアルキルアミン系カルシウム拮抗薬、ベンゾチアゼピン系カルシウム拮抗薬、ゾニサミド、ファスジル、ロメリジン、プレガバリン、シクランデレート、イデベノン、ブフロメジル、アトシバン、およびそれらの薬理学的に許容される塩等があげられる。他に、特公昭６０−０３３１１４号公報、特公平０４−０８１９８６号公報、特公平０５−００３８５１号公報、特公平０３−０１３２３２号公報、特開２００４−２３８３９８号公報、Ｎａｎｊｉｎｇ  Ｙａｏｘｕｅｙｕａｎ  Ｘｕｅｂａｏ，２，１９−２６（１９８３）、特公昭５９−０１９９３０号公報、特公昭５１−０２３４９２号公報、特公平０３−０６４５１６号公報のそれぞれに記載の化合物、およびそれらの薬理学的に許容される塩等があげられるが、ジヒドロピリジン系カルシウム拮抗薬、フェニルアルキルアミン系カルシウム拮抗薬、ベンゾチアゼピン系カルシウム拮抗薬、ゾニサミド、ファスジル、ロメリジン、プレガバリン、シクランデレート、イデベノン、ブフロメジル、アトシバン、およびそれらの薬理学的に許容される塩が好ましく、ジヒドロピリジン系カルシウム拮抗薬がより好ましい。【００１２】  ジヒドロピリジン系カルシウム拮抗薬としては、ベニジピン、ニフェジピン、アムロジピン、シルニジピン、ニトレンジピン、ニモジピン、イスラジピン、ニカルジピン、フェロジピン、マニジピン、ニルバジピン、ニソルジピン、バルニジピン、アラニジピン、エホニジピン、レルカニジピン、ラシジピン、アゼルジニピン、およびそれらの薬理学的に許容される塩等があげられる。他に、特公平０２−０００３４８号公報、Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ，２９，２２６−２２９（１９７９）、特公昭６２−００６７０３号公報、特公平０３−０１４３０７号公報、特公平０５−０２１１０５号公報、特公平０５−０５３７７４号公報、Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ，３３，１０６−１１２（１９８３）、特公平０３−０６９９１０号公報、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，２７，１４２６−１４４０（１９７９）、特公昭６１−０２１５５０号公報、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，３３，３７８７−３７９７（１９８５）、特公昭６１−０２５７１１号公報、特公平０５−０５３７７４号公報、特公昭５７−０３０１１１号公報、特公昭６１−００１０６６号公報、特公昭６１−０２１６２７号公報、特公平０６−０５５７５１号公報、特公平０６−０９９４５８号公報、特公平０５−０１７９０８号公報、特公平０５−０５０５０６号公報、特公平０６−０８６４３０号公報、特公平０３−０３１７１５号公報のそれぞれに記載の化合物、およびそれらの薬理学的に許容される塩等があげられるが、ベニジピン、ニフェジピン、アムロジピン、およびそれらの薬理学的に許容される塩が好ましい。【００１３】  フェニルアルキルアミン系カルシウム拮抗薬としては、ベラパミル、ガロパミル、ベプリジル���他、特公昭５１−０１８９４０号公報、特公昭６１−００６８１５号公報、特公昭５４−０２９４９３号公報のそれぞれに記載の化合物、およびそれらの薬理学的に許容される塩等があげられるが、ベラパミル、ガロパミル、ベプリジル、およびそれらの薬理学的に許容される塩が好ましい。【００１４】  ベンゾチアゼピン系カルシウム拮抗薬としては、ジルチアゼムの他、特公昭６３−０１７８３１号公報、特開昭５７−１６９４７６号公報のそれぞれに記載の化合物、およびそれらの薬理学的に許容される塩等があげられるが、ジルチアゼムおよびその薬理学的に許容される塩が好ましい。
薬理学的に許容される塩としては、酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等があげられる。【００１５】  酸付加塩としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩等の有機酸塩があげられる。
金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等があげられる。
アンモニウム塩としては、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩があげられる。【００１６】  有機アミン付加塩としては、モルホリン、ピペリジン等の塩があげられる。
アミノ酸付加塩としては、グリシン、フェニルアラニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸等の塩があげられる。
上記の薬理学的に許容される塩のうち、塩酸塩が好ましく用いられるが、他の塩、または２以上の塩を適宜組み合わせて用いてもよい。【００１７】  カルシウム拮抗薬の製造方法としては特に限定されないが、ベニジピンは例えば特公平０２−０００３４８号公報、特開平０５−０７８３１９号公報、特開平０５−１４８２３１号公報等に記載の方法またはそれらに準じた方法により得ることができる。ニフェジピンは例えばＡｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ，２９，２２６−２２９（１９７９）等に記載の方法またはそれに準じた方法により得ることができる。アムロジピンは例えば特公昭６２−００６７０３号公報等に記載の方法またはそれに準じた方法により得ることができる。シルニジピンは例えば特公平０３−０１４３０７号公報等に記載の方法またはそれに準じた方法により得ることができる。ニトレンジピンは例えば特公平０５−０２１１０５号公報、特公平０５−０５３７７４号公報等に記載の方法またはそれに準じた方法により得ることができる。ニモジピンは例えばＡｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ，３３，１０６−１１２（１９８３）等に記載の方法またはそれに準じた方法により得ることができる。イスラジピンは例えば特公平０３−０６９９１０号公報等に記載の方法またはそれに準じた方法により得ることができる。ニカルジピンは例えばＣｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，２７，１４２６−１４４０（１９７９）等に記載の方法またはそれに準じた方法により得ることができる。フェロジピンは例えば特公昭６１−０２１５５０号公報等に記載の方法またはそれに準じた方法により得ることができる。マニジピンは例えばＣｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，３３，３７８７−３７９７（１９８５）等に記載の方法またはそれに準じた方法により得ることができる。ニルバジピンは例えば特公昭６１−０２５７１１号公報等に記載の方法またはそれに準じた方法により得ることができる。ニソルジピンは例えば特公平０５−０５３７７４号公報等に記載の方法またはそれに準じた方法により得ることができる。バルニジピンは例えば特公昭５７−０３０１１１号公報等に記載の方法またはそれに準じた方法により得ることができる。アラニジピンは例えば特公昭６１−００１０６６号公報、特公昭６１−０２１６２７号公報等に記載の方法またはそれに準じた方法により得ることができる。エホニジピンは例えば特公平０６−０５５７５１号公報、特公平０６−０９９４５８号公報等に記載の方法またはそれらに準じた方法により得ることができる。レルカニジピンは例えば特公平０５−０１７９０８号公報等に記載の方法またはそれに準じた方法により得ることができる。ラシジピンは例えば特公平０５−０５０５０６号公報、特公平０６−０８６４３０号公報等に記載の方法またはそれらに準じた方法により得ることができる。アゼルジニピンは例えば特公平０３−０３１７１５号公報等に記載の方法またはそれに準じた方法により得ることができる。ベラパミルは例えば特公昭５１−０１８９４０号公報等に記載の方法またはそれに準じた方法により得ることができる。ガロパミルは���えば特公昭６１−００６８１５号公報等に記載の方法またはそれに準じた方法により得ることができる。ベプリジルは例えば特公昭５４−０２９４９３号公報等に記載の方法またはそれらに準じた方法により得ることができる。ジルチアゼムは例えば特公昭６３−０１７８３１号公報、特開昭５７−１６９４７６号公報等に記載の方法またはそれらに準じた方法により得ることができる。ゾニサミドは例えば特公昭６０−０３３１１４号公報等に記載の方法またはそれに準じた方法により得ることができる。ファスジルは例えば特公平０４−０８１９８６号公報、特公平０５−００３８５１号公報等に記載の方法またはそれらに準じた方法により得ることができる。ロメリジンは例えば特公平０３−０１３２３２号公報等に記載の方法またはそれに準じた方法により得ることができる。プレガバリンは例えば特開２００４−２３８３９８号公報等に記載の方法またはそれに準じた方法により得ることができる。シクランデレートは例えばＮａｎｊｉｎｇ  Ｙａｏｘｕｅｙｕａｎ  Ｘｕｅｂａｏ，２，１９−２６（１９８３）等に記載の方法またはそれに準じた方法により得ることができる。イデベノンは例えば特公昭５９−０１９９３０号公報等に記載の方法またはそれに準じた方法により得ることができる。ブフロメジルは例えば特公昭５１−０２３４９２号公報等に記載の方法またはそれに準じた方法により得ることができる。アトシバンは例えば特公平０３−０６４５１６号公報等に記載の方法またはそれに準じた方法により得ることができる。【００１８】  本発明に用いられるカルシウム拮抗薬としては、上記製造方法で得られる物質の他、市販されている薬剤等を用いることもできる。
公報記載のカルシウム拮抗薬については、各々の公報に記載の製造方法またはそれに準じた製造方法により得ることができる。
カルシウム拮抗薬の製造における中間体および目的化合物は、有機合成化学で常用される分離精製法、例えば、濾過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、再結晶、各種クロマトグラフィーなどに付して単離精製することができる。また、中間体においては特に精製することなく次の反応に供することもできる。【００１９】  薬理学的に許容される塩を取得したいとき、それらが塩の形で得られるときはそのまま精製すればよく、また、遊離の形で得られるときは、それらを適当な溶媒に溶解または懸濁し、酸または塩基を加えて単離、精製すればよい。
また、本発明に用いられるカルシウム拮抗薬は、水または各種溶媒との付加物の形で存在することもあるが、これらの付加物も本発明で用いられるカルシウム拮抗薬に包含される。【００２０】２．幹細胞に対する骨芽細胞への分化促進剤
本発明の幹細胞に対する骨芽細胞への分化促進剤（以下「本発明の分化促進剤」という。）は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて幹細胞と接触させたとき、該幹細胞に対して作用し、該幹細胞から骨芽細胞への分化を促進させることができる。【００２１】  本発明の分化促進剤は種々の骨疾患治療に使用することができる。該疾患としては、治癒過程で骨形成が生ずる疾患であれば特に限定されないが、例えば、変形性関節症、慢性関節リウマチ、難治性骨折、腫瘍の骨転移に伴う溶骨、骨形成不全症、歯周病、開頭術後の骨欠損等の手術に伴う骨欠損、骨粗鬆症に伴う骨欠損等があげられる。
本発明の分化促進剤は、活性成分としてカルシウム拮抗薬を単独で、または任意の他の治療のための有効成分と混合して医薬製剤として提供される。また、それら医薬製剤は、活性成分を薬理学的に許容される一種またはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。また、それら医薬製剤は、動物およびヒトに使用されるものである。【００２２】  他の治療のための有効成分としては、例えば、骨粗鬆症治療剤、骨形成を促進するサイトカインや転写因子およびその発現プラスミド、骨吸収を促進するサイトカインに対する抗体やｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ＲＮＡ）等の阻害剤、ＢＭＰ−２の骨形成促進効果を増強することが報告されているＲｏｃｋ（Ｒｈｏ−ｋｉｎａｓｅ）阻害剤であるＹ−２７６３２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）、抗リウマチ薬であるＴ−６１４（富山化学社）、骨芽細胞誘導活性を有するパーモルファミンおよびＧＳＫ−３（ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３）阻害剤、例えばリチウム等があげられる。【００２３】  骨粗鬆症治療剤としては、カルシトリオール、アルファカルシドール等の活性型ビタミンＤ３、エルカトニン、サケカルシトニン等のカルシトニン、オステン等のイブリフラボン、アレンドロネート、エチドロネート、リセドロネート等のビスフォスフェート、エストロゲン、エストラジオール、エストリオール、塩酸ラロキシフェン等の選択的エストロゲン受容体モジュレーター、メナテトレノン等のビタミンＫ２、経口カルシウム剤、パラサイロイドホルモン等があげられる。【００２４】  骨形成を促進するサイトカインとしては、ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＢＭＰ−２（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２）、ＴＧＦ−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β）、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ／ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）等があげられ、骨形成を促進する転写因子としては、Ｒｕｎｘ２（ｒｕｎｔ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ２）等があげられる。【００２５】  骨吸収を促進するサイトカインとしては、ＩＬ−１（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１）、ＩＬ−６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）、ＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α）等があげられる。
本発明の分化促進剤の投与経路としては、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口または、例えば静脈内等の非経口をあげることができる。
投与形態としては、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、注射剤等があげられる。【００２６】  経口投与に適当な、例えばシロップ剤のような液体調製物は、水、蔗糖、ソルビット、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を使用して製造できる。
また、錠剤、散剤および顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニット等の賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダ等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いて製造できる。このような錠剤の好適な例として、例えばコニール錠（協和醗酵工業株式会社）、ノバルスク錠（ファイザー株式会社）が製造販売されており、入手可能となっている。【００２７】  非経口投与に適当な製剤は、好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物を含む滅菌水性剤からなる。例えば注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体等を用いて注射用の溶液を調製する。
また、これら非経口剤においても、経口剤で例示した希釈剤、防腐剤、フレーバー類、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤等から選択される１種またはそれ以上の補助成分を添加することもできる。【００２８】  本発明の分化促進剤の投与量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質または重篤度により異なるが、経口投与の場合、カルシウム拮抗薬として、通常成人一人当り０．０１ｍｇ〜１ｇ、好ましくは０．０５〜５０ｍｇを一日一回ないし数回投与する。静脈内投与等の非経口投与の場合、成人一人当り０．００１〜１００ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇを一日一回ないし数回投与する。【００２９】３．ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの幹細胞から骨芽細胞への分化促進方法
幹細胞を骨芽細胞へ分化誘導させる条件下、本発明の分化促進剤を添加して幹細胞を培養し、幹細胞を骨芽細胞へ分化させ、該培養物中より骨芽細胞を採取することができる。【００３０】 ｉｎ  ｖｉｔｒｏで本発明の分化促進剤を用いる場合、水、エタノール、ＤＭＳＯ等の溶媒に溶解して用いることが好ましい。
幹細胞としては、いずれの動物の幹細胞であってもよいが、例えばヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、フェレット、モルモット等の哺乳類、爬虫類、両生類、鳥類等の幹細胞があげられ、好ましくはヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、フェレット、モルモット等の哺乳類の幹細胞、より好ましくはヒトの幹細胞があげられる。【００３１】  また、幹細胞は、少なくとも骨芽細胞への分化能を有する幹細胞であれば特に限定されず、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、生殖性幹細胞［ＥＧ（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ）細胞；Ｃｅｌｌ，７０，８４１−８４７（１９９２），Ｎａｔｕｒｅ，３５９，５５０−５５１（１９９２）］、成体多能性幹細胞、間葉系幹細胞、末梢血単球由来細胞、神経幹細胞、心筋由来幹細胞、筋由来幹細胞、肝幹細胞、角膜周辺の輪部由来幹細胞、毛包中の幹細胞、小腸由来幹細胞、膵臓由来幹細胞、肺由来幹細胞、精巣由来多能性幹細胞［ｍＧＳ（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｇｅｒｍｌｉｎｅｓｔｅｍ）細胞；Ｃｅｌｌ，１１９，１００１−１０１２（２００４）、ｍａＧＳＣｓ（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ａｄｕｌｔ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）；Ｎａｔｕｒｅ，４４０，１１９９−１２０３（２００６）］、ＥＳ細胞と機能性細胞の融合細胞［Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１３６９−１３７３（２００５）］、核移植したＥＳ細胞［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２，７４０−７４３（２００１）］、ＥＳ細胞等の細胞抽出液で初期化した細胞［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，１６，５７１９−５７３５（２００５）］等があげられるが、胚性幹細胞、成体多能性幹細胞、間葉系幹細胞、末梢血単球由来細胞、筋由来幹細胞が好ましく、間葉系幹細胞が特に好ましい。【００３２】  胚性幹細胞とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養が可能で、かつ他の個体の着床以前の胚、例えば胚盤胞の胞腔中に注入すると、生殖細胞をも含む全ての細胞に分化できる細胞であり、ＥＳ細胞とも呼ばれている。
着床以前の初期胚を、文献（マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル）に記載された方法に従って培養することで、該初期胚より胚性幹細胞を取得することができる。【００３３】  得られた胚性幹細胞の培養方法としては、文献（マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  ２２５，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３；ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製等）に記載の方法があげられる。胚性幹細胞は無血清培養することも可能であり、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地に１５〜２０％のＫＮＯＣＫＯＵＴＴＭ  ＳＲ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、２ｍｍｏｌ／ｌグルタミン、１００μｍｏｌ／ｌ  ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ）溶液、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０Ｕ／ｍｌストレプトマイシン、１００μｍｏｌ／ｌ  ２−メルカプトエタノール、および１，０００Ｕ／ｍｌ白血病阻害因子（ＬＩＦ）を加えた培地で培養することにより、未分化な胚性幹細胞としての形質を保ったまま幹細胞を継代培養することができる［Ｆｏｃｕｓ，２０，８，（１９９８）］。【００３４】  成体多能性幹細胞とは成体のほとんどすべての細胞に分化する能力を持つ多分化能幹細胞であり、例えばＷＯ０１／１１０１１、ＷＯ０１／２１７６７、ＷＯ０１／４８１４９、ＷＯ０６／２８７２３等に記載の細胞の他、ＷＯ０４／１０１７７５記載のＣＤ４５陰性かつＣＸＣＲ４陽性を示す幹細胞があげられる。
末梢血単球由来細胞としては、例えばＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，７４，８３３−８４５（２００３）に記載の単球由来間葉系前駆細胞、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００，２４２６−２４３１（２００３）に記載のｆ−マクロファージ等があげられる。
筋由来幹細胞としては、例えばＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２９，２９８７−２９９５（２００２）に記載の筋サテライト細胞由来のもの、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１５７，５７１−５７７（２００２）に記載の骨格筋間質由来のもの、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，１４４８２−１４４８６（１９９９）およびＮａｔｕｒｅ  ４０１，３９０−３９４（１９９９）に記載のＳｉｄｅ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ細胞、Ｃｅｌｌ  １０２，７７７−７８６（２０００）に記載の細胞、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１５７，８５１−８６４（２００２）に記載の細胞、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１５０，１０８５−１０９９（２０００）に記載の細胞、ＵＳ２００６／１４２８７に記載の細胞等があげられる。
筋由来幹細胞を取得する方法としては、特に限定されないが、例えば以下の方法で取得することができる。
ヒトの上腕二頭筋の外側頭や下腿の縫工筋などの筋肉を含む結合組織を切皮して摘出後、縫合する。取得した全筋は、はさみあるいはメスを利用してミンチ状にした後、０．０６％コラゲナーゼおよび１０％ＦＢＳ含有高濃度グルコース培地に懸濁し、３７℃で２時間インキュベーションする。ミンチ状の筋肉より分離してきた細胞を回収後、遠心分離法により細胞を回収し、１０％ＦＢＳ含有高濃度グルコース培地に懸濁する。該懸濁液をまず半径４０μｍのマイクロフィルターに通過させた後、半径２０μｍのマイクロフィルターを通すことによりヒト筋由来幹細胞を得ることができる。
ラットやマウスから取得する方法も、特に限定されないが、例えば以下の手順で取得することができる。
ラットまたはマウスを頚椎脱臼により致死させ、７０％エタノールで十分消毒した後、皮膚を切除して大腿四頭筋を取得する。大腿四頭筋は、はさみあるいはメスを利用してミンチ状にした後、０．０６％コラゲナーゼおよび１０％ＦＢＳ含有高濃度グルコース培地に懸濁し、３７℃で２時間インキュベーションする。ミンチ状の筋肉より分離してきた細胞を回収後、遠心分離法により細胞を回収し、１０％ＦＢＳ含有高濃度グルコース培地に懸濁する。該懸濁液をまず半径４０μｍのマイクロフィルターに通過させた後、半径２０μｍのマイクロフィルターを通すことによりラットおよびマウスの筋細胞幹細胞を得ることができる。【００３５】  間葉系幹細胞とは、骨髄、脂肪組織、臍帯血、子宮内膜、真皮、骨格筋、骨膜、歯小嚢、歯根膜、歯髄、歯胚等の間葉系組織に存在し、少なくとも骨芽細胞、脂肪細胞、筋肉細胞等の間葉系細胞への分化能を有する細胞をいう。以下、種々の組織から間葉系幹細胞を単離する方法を具体的に述べる。【００３６】（１）骨髄から間葉系幹細胞を単離する方法
ヒトの骨髄から間葉系幹細胞を取得する方法としては、安全かつ効率的に取得される方法であれば特に限定されないが、例えば以下に示すＳ．Ｅ．Ｈａｙｎｅｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｏｎｅ，１３，８１（１９９２）に記載の方法があげられる。【００３７】  胸骨または腸骨において、骨髄穿刺を行う場所の皮膚を消毒し、特に骨膜下を十分に局所麻酔する。骨髄穿刺針の内筒を抜き、５，０００ｕｎｉｔｓのヘパリンを入れた１０ｍｌ注射器を装着して必要量、平均的には１０ｍｌ〜２０ｍｌの骨髄液を吸引する。骨髄穿刺針を取り外し、１０分間程度圧迫止血する。取得した骨髄液を１，０００×ｇで遠心分離して骨髄細胞を回収した後、該骨髄細胞をリン酸緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）で洗浄する。遠心分離および洗浄を２回繰り返した後、骨髄細胞を１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むα−ＭＥＭ（α−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＭＥＭ）、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＭＥＭ）、ＩＭＤＭ（Ｉｓｏｃｏｖｅ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）等の細胞培養用培地に浮遊させることにより骨髄細胞液を得る。【００３８】  骨髄細胞液から間葉系幹細胞を単離する方法としては、骨髄細胞液中に混在する他の細胞、例えば血球系細胞、造血幹細胞、血管幹細胞、線維芽細胞等を除去することができれば特に限定されないが、例えば以下に示すＭ．Ｆ．Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４，１４３−１４７（１９９９）に記載の方法があげられる。
骨髄細胞液を密度１．０７３ｇ／ｍｌのＰｅｒｃｏｌｌに重層した後、１，１００×ｇで３０分間遠心分離し、界面の細胞を間葉系幹細胞として単離することができる。また、骨髄細胞液に１０×ＰＢＳを加えて９／１０に希釈したＰｅｒｃｏｌｌを同容量加えて混合した後に、２０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、密度１．０７５〜１．０６０の画分の細胞を間葉系幹細胞として単離することもできる。【００３９】  また、ヒトの骨髄に由来する間葉系幹細胞は、Ｃａｍｂｒｅｘ社、タカラバイオ社より購入することもできる。
ラットまたはマウスの骨髄から間葉系幹細胞を取得する方法としては、特に限定されないが、例えば以下の手順で取得することができる。
ラットまたはマウスを頚椎脱臼により致死させ、７０％エタノールで充分消毒した後、大腿骨の皮膚および大腿四頭筋を切除する。膝関節の部分にハサミをいれて関節をはずし、大腿骨背面の筋肉を除去する。股関節の部分にハサミを入れて関節を外し、大腿骨を取り出す。大腿骨に付着している筋肉をハサミでできるだけ除去した後、大腿骨の両端をハサミで切断する。骨の太さに応じた適当なサイズの注射針を２．５ｍｌの注射器に装着し、１０％のＦＢＳを含むα−ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ等の培地約１．５ｍｌを注射器に充填した後、注射針の先端を大腿骨の膝関節側の断端に差し込む。注射器内の培養液を骨髄内に注入することで、股関節側の断端から骨髄細胞が押し出される。得られた骨髄細胞はピペッティングにより培養液中に浮遊させる。得られた骨髄細胞液からは、上記のヒト骨髄細胞液の場合と同様の方法により、間葉系幹細胞を単離することができる。【００４０】（２）臍帯から間葉系幹細胞を単離する方法
ヒトの臍帯から間葉系幹細胞を取得する方法としては、効率的に取得される方法であれば特に限定されないが、例えば以下に示すＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２１，１０５−１１０（２００３）に記載の方法があげられる。【００４１】  臍帯静脈の両端にカニューレを挿入し、適当な緩衝液、例えば、ＥＢＳＳ（Ｅａｒｌｅ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で洗浄する。タンパク質分解酵素、例えば、０．１％コラゲナーゼを含む１９９培地に抗生物質を添加して血管に注入し、４〜４０℃、好ましくは３７℃で、１〜６０分間インキュベートする。血管をＥＢＳＳで洗浄し、臍帯を軽くマッサージした後、内皮細胞および内皮下層細胞の懸濁液を回収する。該懸濁液を６００×ｇで１０分間遠心分離し、得られた細胞を、例えば、低濃度のグルコースを含むＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ−ＬＧ、Ｇｉｂｃｏ）に、２０ｍｍｏｌ／ｌ  ＨＥＰＥＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍｍｏｌ／ｌＬ−グルタミン、１ｍｍｏｌ／ｌピルビン酸ナトリウムおよび１０％ＦＢＳを加えた培地に懸濁する。細胞密度を、１０２〜１０６個／ｃｍ２として培養フラスコに接種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養する。培地を１〜７日毎に交換し、１〜３週間培養を継続することにより、間葉系幹細胞を取得することができる。【００４２】（３）子宮内膜から間葉系幹細胞を単離する方法
ヒトの子宮内膜から間葉系幹細胞を取得する方法としては、安全かつ効率的に取得される方法であれば特に限定されないが、例えば以下に示すＡｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１６３，２２５９−２２６９（２００３）に記載の方法があげられる。【００４３】  外科手術により摘出されたヒト子宮内膜組織を細切し、細胞を培養可能な培地、好ましくはα−ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ等に１〜２０％の動物由来の血清、好ましくは５〜１０％のＦＢＳを加えた培地で培養する。培地にはペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質を加えても良い。さらに、細胞の分離を良くするために、３型コラゲナーゼ等のコラーゲン分解酵素およびデオキシリボヌクレアーゼＩ等のＤＮＡ分解酵素を培地に添加し、２０〜４０℃、好ましくは３７℃の条件で、１０分間〜５時間、好ましくは１時間、緩やかに振盪する。個々の子宮内膜腺を顕微鏡で観察しながら分離し、適当な培養容器、例えば２４−ウェル培養皿を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養することにより、間葉系幹細胞を取得することができる。【００４４】  マウスの子宮内膜から間葉系幹細胞を取得する方法としては特に限定されないが、例えば以下に示すＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１０６，１６３４−１６４９（１９８０）に記載の方法があげられる。
子宮を細切後、タンパク質分解酵素、例えば５ｍｇ／ｍｌのトリプシン、および２５ｍｇ／ｍｌのパンクレアチンを含むＰＢＳに浸し、０〜３７℃で１０分間〜３時間、好ましくは０℃で３０分間〜１時間、さらに室温にて１０分〜３時間、好ましくは３０分間〜１時間反応させる。ＰＢＳ溶液を注意深く除去した後、１〜２０％の動物由来の血清、好ましくは５〜１０％のＦＢＳを含む適当な培地、例えばＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（ＤＭＥＭとＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２  ｍｅｄｉｕｍを１：１に混合したもの）を加えることによりトリプシンを失活させる。培地をＰＢＳに置換し、組織を１０秒間〜３０分間、好ましくは３０秒間ゆっくり振盪する。子宮組織を注意深く除き、細胞懸濁液をフィルター、例えば７０μｍのメッシュフィルターに通す。濾過液を１０００×ｇで５分間遠心分離することにより、細胞を沈殿画分に回収する。得られた細胞は、ＰＢＳに再懸濁して遠心分離することにより、洗浄しても良い。遠心分離により沈殿した細胞を、１〜２０％の動物由来の血清、好ましくは５〜１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に懸濁する。培地には抗生物質、例えば１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを加えても良い。また、非必須アミノ酸溶液を、例えば１％添加しても良い。このような培地で培養することにより間葉系幹細胞を取得することができる。【００４５】（４）脂肪組織または大網から間葉系幹細胞を単離する方法
動物の脂肪組織または大網から幹細胞を取得する方法としては、特に限定されないが、例えば以下に示すＴｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７，２１１−２２８（２００１）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，１３，４２７９−４２９５（２００２）に記載の方法があげられる。【００４６】  動物の脂肪組織としては、皮下脂肪、内臓脂肪等、いずれの組織を使用してもよい。例えば外科手術、脂肪吸引等で採取した脂肪組織を、ＰＢＳ、ＤＭＥＭ培地等で洗浄し、血液等を除去する。さらに、コラゲナーゼ、トリプシン、プロナーゼ、エラスターゼ、ディスパーゼ、ヒアルロニダーゼ等の蛋白分解酵素を用いて、Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．（２０００）に記載の方法で消化し、細胞を分散させる。消化反応は、例えば１〜２０％の血清を含む培地を添加することにより停止する。５００〜１５００ｒｐｍで１〜１０分間遠心分離し、得られた沈殿を動物血清、例えばＦＢＳを１〜２０％含むＤＭＥＭ培地等の培地に懸濁後、組織残渣をストレイナー、メッシュ、フィルター等を用いて除去する。濾過液を５００〜１５００ｒｐｍで１〜１０分間遠心することにより間葉系幹細胞を単離することができる。【００４７】（５）歯周辺組織から間葉系幹細胞を単離する方法
ヒトの歯、歯胚、歯周辺組織から間葉系幹細胞を取得する方法としては、安全かつ効率的に取得される方法であれば特に限定されないが、例えば以下に示すＬａｎｃｅｔ，３６４，１４９−１５５（２００４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，１３６２５−１３６３０（２０００）に記載の方法があげられる。【００４８】  ヒトの歯としては、乳歯、または切歯、犬歯、小臼歯、大臼歯等の永久歯のいずれでも良い。例えば、抜歯した第三大臼歯（親知らず）の歯根の表面から歯周靭帯（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）を慎重に分離し、コラゲナーゼ、トリプシン、プロナーゼ、エラスターゼ、ディスパーゼ、ヒアルロニダーゼ等の蛋白分解酵素を用いて、３７℃で１時間消化反応を行う。ストレイナー、メッシュ、フィルター等を用いて、組織残渣を除くことにより間葉系幹細胞を取得することができる。【００４９】  また、抜歯した第三大臼歯（親知らず）の表面をＰＢＳ等で洗浄した後、セメント質とエナメル質の結合部を切断して髄質を露出させ、歯冠および歯根から歯髄組織を慎重に分離し、上記と同様の方法で蛋白分解酵素処理した後、組織残渣を除くことにより間葉系幹細胞を取得することもできる。【００５０】  また、上記以外に、ＳＨ２陽性，ＳＨ４陽性，ＣＤ２９陽性，ＣＤ４４陽性，ＣＤ７１陽性，ＣＤ９０陽性，ＣＤ１０６陽性，ＣＤ１２０ａ陽性，ＣＤ１２４陽性，ＣＤ１４陰性，ＣＤ３４陰性，およびＣＤ４５陰性の細胞を間葉系幹細胞として、ＦＡＣＳや磁気ビーズを用いて分離する方法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４，１４３−１４７（１９９９）］を用いることもできる。【００５１】  幹細胞の培養に用いる培地としては、例えば組織培養の技術基礎編  第三版、朝倉書店（１９９６）等に記載された細胞培養用培地があげられるが、ウシやヒト等の血清を１〜２０％添加したα−ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ等の細胞培養用培地が好ましい。培養条件は、幹細胞が培養可能であればいかなる条件でもよいが、培養温度は３３〜３７℃が好ましく、５〜１０％のＣＯ２ガスで満たしたインキュベーターで培養することが好ましい。【００５２】  幹細胞は、通常の組織培養用のプラスチック製培養皿に接着させて増殖させることが好ましい。細胞が培養皿一面に増殖する頃、培地を除去して、トリプシンＥＤＴＡ溶液を加えることで細胞を浮遊させる。浮遊させた細胞は、ＰＢＳまたは細胞培養用の培地で洗浄後、細胞培養用の培地で２倍から２０倍に希釈して新しい培養皿に播種することで、さらに継代培養することができる。【００５３】  幹細胞を骨芽細胞へ分化誘導させる方法としては、幹細胞を骨芽細胞へ分化誘導させることができる方法であればいかなる方法でもよいが、例えば以下に示す方法があげられる。
間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化を誘導させる方法としては、例えばＳｃｉｅｎｃｅ，２８４，１４３−１４７（１９９９）に記載の方法があげられる。すなわち、間葉系幹細胞を培養器に播種した後、デキサメサゾン、アスコルビン酸−２リン酸、およびβ−グリセロフォスフェートを含む細胞培養用培地で１〜４週間培養し続けることにより、間葉系幹細胞の一部を骨芽細胞へ分化させることができる。【００５４】  また、胚性幹細胞から骨芽細胞への分化を誘導させる方法としては、例えばＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，７１，１８−２７（２００３）に記載の方法があげられる。すなわち、胚性幹細胞を培養器に播種した後、β−グリセロフォスフェート、アスコルビン酸、および１α，２５−ＯＨ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ３を含む細胞培養用培地で２〜４週間培養し続けることにより、胚性幹細胞の一部を骨芽細胞へ分化させることができる。【００５５】  幹細胞から骨芽細胞への分化誘導時に使用する培養器としては、通常の組織培養用のプラスチック製培養皿の他、下記４記載の幹細胞の足場となる材料を用いてもよい。
上記のような幹細胞から骨芽細胞へ分化誘導させる条件下において、本発明の分化促進剤を添加することで、幹細胞から骨芽細胞への分化を促進させることができる。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させた骨芽細胞は、例えばヘモネティックス社のヘモライト２プラス等を用いて生理食塩水により洗浄し、培養に用いたサイトカイン等の物質をできる限り除去した後、上記２記載の骨疾患患者に投与することにより、該疾患の治療に使用することができる。骨芽細胞の投与方法としては、通常の点滴法で静脈中に注入するか、患部に直接注入することが好ましい。【００５６】４．骨治療材
本発明の分化促進剤は、幹細胞の足場となる材料に含有、結合、被覆等させることにより、骨治療材として提供することができる。【００５７】  該骨治療材を上記２記載の骨疾患における傷害部に移植することにより、骨形成を促進させることができる。
足場の材料としては、生体非吸収性材料および生体吸収性材料があげられる。
生体非吸収性材料としては、チタン等の金属、ハイドロキシアパタイト等のセラミックがあげられ、生体非吸収性材料を使用した足場の具体例としては、ネオボーン（東芝セラミックス社）等があげられる。【００５８】  生体吸収性材料としては、リン酸カルシウムや炭酸カルシウム等の無機材料、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ−Ｌ−乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸（ＰＤＬＬＡ）、乳酸とグリコール酸との共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリε−カプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリシアノアクリレート、ポリ酸無水物、ポリオルソエステル、ポリカーボネート、ポリフォスファゼン等の生体吸収性合成高分子、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン等のタンパク質、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、セルロース、アルギン酸、デンプン、デキストラン等の多糖等の生体吸収性天然高分子、ペプチドおよびその誘導体等があげられる。ペプチドとして、例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅがあげられ、ペプチド誘導体としては、例えば、Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−誘導体［Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１８，６１１−６１４（２００６）］があげられる。また、これらを混合して用いることもできる。生体吸収性材料を使用した足場の具体例としては、オスフェリオン（オリンパスバイオマテリアル社）等があげられる。【００５９】  生体非吸収性材料は、移植初期に強い強度が得られる利点があり、生体吸収性材料は、足場が役割を終えた後に生体組織に吸収・置換される利点がある。
初期強度が強く至適な分解速度を有する生体吸収性材料として、ＰＧＡとＰＬＬＡの重合体［Ａｒｔｈｒｏｓｃｏｐｙ，１５，６９１−７０８（１９９９）］、アテロコラーゲンの架橋形成によるスポンジ、ハイドロキシアパタイトとコラーゲンの複合体［Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２５，６３−６９（２００４）］、ＰＬＬＡやＰＬＧＡ等の生体吸収性合成高分子材料でできた骨格構造体の内部にコラーゲン等の生体吸収性天然高分子のマイクロスポンジを形成し両方の高分子の欠点を補完した担体等が開発されており、これらの材料を幹細胞の足場として使用しても良い。【００６０】  また、幹細胞が容易に接着するとともに内部に浸透し、骨組織の再生を促進させるようにするため、上記の足場材料は繊維性または多孔性の構造を有していることが好ましい。
また、上記の足場材料は、単独で使用してもよいし、２以上を組み合わせて使用してもよい。
骨治療材における本発明の分化促進剤は、徐放性形態で提供される。徐放性形態の剤型は、本発明において使用され得る限り、当該分野で公知の任意の形態で用いられる。また、徐放性形態を調製する方法は、当該分野において公知であり、例えば日本薬局方、米国または他の国の薬局方等に記載された方法があげられる。【００６１】  骨治療材を骨疾患における傷害部に移植する方法としては、骨折、先天的な骨の欠陥、外科的に生じた骨の欠損、補遺を必要とする骨の構造、歯周の欠陥等の、生体の硬組織の欠損部に対して骨片を移植する際に用いられる、整形外科、獣医等の医師によく知られた標準的な外科的手術等があげられる。
骨治療材移植後における骨形成は、Ｘ線撮影装置、超音波装置等を用いて、Ｄｕａｌ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｘ−ｒａｙ  ａｂｓｏｐｔｉｏｍｅｔｒｙ（ＤＸＡ）法、Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ａｂｓｏｔｉｏｍｅｔｒｙ（ＳＰＡ）法、Ｄｕａｌ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ａｂｓｏｔｉｏｍｅｔｒｙ（ＤＰＡ）法、Ｍｉｃｒｏｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ（ＭＤ）法、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＣＴ（ＱＣＴ）法、超音波法等により骨密度または骨塩量を測定することにより確認することができる。【００６２】  また、骨治療材移植後における骨形成は、酵素免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＥＩＡ）、放射性免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＲＩＡ）、免疫放射定量測定（ｉｍｍｕｎｏｒａｄｉｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ、ＩＲＭＡ）、酵素結合免疫反応吸着測定法（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）、化学発光免疫測定法（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＣＬＩＡ）等を用いて、骨型アルカリフォスファターゼ、オステオカルシン等の骨形成マーカーの血中濃度または尿中濃度を測定することにより確認することもできる。【００６３】５．本発明の分化促進剤の評価方法
本発明の分化促進剤が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて幹細胞から骨芽細胞への分化を促進することができることは、以下のようにして確認することができる。すなわち、Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）を構成的に発現するトランスジェニック・マウスより上記３記載の方法に従って単離した幹細胞、または通常のマウスより上記３記載の方法に従って単離し、レトロウイルスベクターを用いてＧＦＰ遺伝子を導入した幹細胞を、同系統のマウスの静脈内または骨欠損部に注入する。本発明の分化促進剤を該マウスに対して一日一回ないし数回投与して１０〜２０日間飼育した後、骨組織を摘出する。常法により作製した組織切片を蛍光顕微鏡で観察し、単位面積当たりのＧＦＰ陽性骨芽細胞数を陰性対照と比較する。なお、組織切片中の骨芽細胞はヘマトキシリン・エオジン染色等により形態的に同定することができる。【００６４】  本発明の分化促進剤が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて幹細胞から骨芽細胞への分化を促進することができることは、以下のようにして確認することができる。すなわち、幹細胞から骨芽細胞へ分化を誘導する条件下で、本発明の分化促進剤を添加して幹細胞を培養し、骨芽細胞への分化に伴い発現が上昇する遺伝子またはタンパク質を定量的に解析し、陰性対照と比較する。【００６５】  骨芽細胞への分化に伴い発現が上昇する遺伝子の定量的な解析法としては、ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ノーザンブロット解析、ドットブロットハイブリダイゼーション法、ＤＮＡマイクロアレイ等があげられる。
骨芽細胞への分化に伴い発現が上昇するタンパク質の定量的な解析法としては、ウェスタンブロット解析、該タンパク質に特異的に反応する抗体を用いた免疫組織染色、ＥＬＩＳＡ等があげられる。【００６６】  骨芽細胞への分化に伴い発現が上昇する遺伝子またはタンパク質としては、Ｉ型コラーゲン、オステオカルシン、オステオネクチン、オステオポンチン、ボーンシアロプロテイン（ｂｏｎｅ  ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｒｕｎｘ２（ｒｕｎｔ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ２）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）等があげられる。
また、骨芽細胞中のＡＬＰ酵素活性を測定することにより、骨芽細胞への分化を確認することができる。ＡＬＰ酵素活性の測定キットとしては、例えばアルカリ性ホスファＢ−テストワコー（和光純薬株式会社製）等があげられる。【００６７】  また、骨芽細胞が産生した石灰化成分を検出することによっても骨芽細胞への分化を確認することもできる。石灰化成分を検出する方法としては、フォンコッサ（ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ）染色、アリザリンレッド（Ａｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄ）染色等の染色法があげられる。
フォンコッサ染色は、硝酸銀を用いて石灰化成分であるリン酸カルシウムを検出する方法である。具体的には、パラフィン等で固定した細胞に対し１〜５％の硝酸銀水溶液を反応させ光に当てると、リン酸カルシウムが存在する部分が黒く呈色することから、例えば該呈色面積を計測することで骨芽細胞への分化を評価することができる。【００６８】  アリザリンレッド染色は、アリザリン赤Ｓがカルシウムに対して特異的な結合を示しレーキを形成することを利用した方法である。具体的には、パラフィン等で固定した細胞に対し０．０１〜５％アリザリン赤Ｓ溶液を反応させると、赤紫色〜橙赤色に呈色することから、例えば該呈色面積を計測することで骨芽細胞への分化を評価することができる。
以下、本発明の分化促進剤の、骨芽細胞分化促進作用に関する試験例を示す。【００６９】試験例１  ヒト間葉系幹細胞に対する塩酸ベニジピンによる骨芽細胞分化促進効果（１）
ヒト間葉系幹細胞（以下、ｈＭＳＣと称す）に対する塩酸ベニジピンによる骨芽細胞分化促進効果をフォンコッサ染色で評価した。ｈＭＳＣはＣａｍｂｒｅｘ社製のものを用いた。【００７０】  ｈＭＳＣを１ウェルあたり１．２ｘ１０４個の細胞数で１２ウェルプレートに播種し、２０％ＰＢＳ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を含むＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で一晩培養した。翌日、エタノールに溶解した塩酸ベニジピン（協和発酵工業社製：製品名コニール）を、終濃度が１０−８ｍｏｌ／Ｌ〜１０−１２ｍｏｌ／Ｌとなるように添加した分化誘導培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。分化誘導培地は、２０％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地中に、０．１μｍｏｌ／Ｌデキサメサゾン、５０μｍｏｌ／Ｌアスコルビン酸−２リン酸（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  β−グリセロフォスフェート（Ｓｉｇｍａ社製）を添加したものを用いた。該分化誘導培地で培養することにより、ヒト間葉系幹細胞は、骨芽細胞の他、一部は脂肪細胞へも分化誘導される。培養期間中は３〜４日に１回、塩酸ベニジピンを添加した分化誘導培地で培地交換した。【００７１】  培養一ヶ月後、フォンコッサ染色により石灰化した骨芽細胞を検出した。細胞をＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で１回洗浄し、固定液（１０％  ｆｏｒｍａｌｉｎ／ＰＢＳ）で５分間固定した。蒸留水で３回洗浄した後、暗所で５％硝酸銀水溶液（ナカライテスク社製）と１０分間反応させた。更に蒸留水で５回洗浄して光に１５分間当て呈色させた。その後、５％チオ硫酸ナトリウム水溶液（ナカライテスク社製）にて定着させた。【００７２】  ウェルを位相差顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ社製）下で観察し、それぞれのウェルについて任意の４ヶ所をデジタルカメラで記録した。画像データをＴＩＦＦフォーマットに変換し、染色された部分の面積を画像解析ソフト「Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ」（Ｓｃｉｏｎ社製）を用いて計測し、フォンコッサ染色陽性面積割合を算出した。
その結果を図１に示す。図１から明らかなように、塩酸ベニジピンは濃度依存的にｈＭＳＣから骨芽細胞への分化を促進させた。【００７３】  一方、終濃度が１０−６〜１０−１０ｍｏｌ／Ｌとなるように塩酸ベニジピンを添加して培養した１２日後にオイルレッド（Ｏｉｌ  Ｒｅｄ）染色により脂肪細胞を検出した。具体的には、細胞を１回ＰＢＳで洗浄し、固定液で５分間反応させた。蒸留水で３回洗浄した後、オイルレッド（ナカライテスク社製）溶液を添加して５分間反応させた。更に蒸留水で３回洗浄した後、２−プロパノール（国産化学社製）で色素を抽出し、プレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ社製）で、４９０ｎｍの吸光度を測定した。【００７４】  その結果を図２に示す。図２から明らかなように、塩酸ベニジピンはｈＭＳＣから脂肪細胞への分化を抑制した。
以上の結果から、塩酸ベニジピンは、骨芽細胞および脂肪細胞へ分化誘導され得るｈＭＳＣに対して作用し、骨芽細胞への分化を選択的に促進させる活性を有していることが示された。【００７５】試験例２  ヒト間葉系幹細胞に対する塩酸ベニジピンによる骨芽細胞分化促進効果（２）
ｈＭＳＣに対する塩酸ベニジピンによる骨芽細胞分化促進効果を遺伝子発現解析で評価した。【００７６】  ｈＭＳＣを６ｃｍディッシュに８．７ｘ１０４個播種し、２０％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地で一晩培養した。翌日、エタノールに溶解した塩酸ベニジピンを終濃度１０−８ｍｏｌ／Ｌとなるよう添加した分化誘導培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。３〜４日に１回、塩酸ベニジピンを添加した分化誘導培地で培地交換した。
分化誘導培地で培養後１２日目の細胞からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＲＮＡを回収し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩファーストストランドシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。具体的な操作方法はキット、システムの添付文書に従った。このｃＤＮＡに対し、配列番号１および２に示される塩基配列を有するヒトアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）遺伝子特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。対照として、配列番号３および４で示される塩基配列を有するグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（Ｇ３ＰＤＨ）遺伝子特異的プライマーを用いてＧ３ＰＤＨ遺伝子の発現を測定した。【００７７】  その結果、１０−８ｍｏｌ／Ｌ塩酸ベニジピンを添加した群におけるＡＬＰ遺伝子の発現が、添加していない群と比較して上昇していることが示された。このことにより、塩酸ベニジピンによりｈＭＳＣから骨芽細胞への分化が促進されたことが明らかとなった。
なお、対照としたＧ３ＰＤＨ遺伝子の発現は、塩酸ベニジピンの添加の有無で変化が見られなかった。【００７８】試験例３  ヒト間葉系幹細胞に対するアムロジピンまたはニフェジピンによる骨芽細胞分化促進効果
ｈＭＳＣに対するアムロジピンまたはニフェジピンによる骨芽細胞分化促進効果をフォンコッサ染色で評価した。塩酸ベニジピンの代りに、アムロジピン（Ｓｉｇｍａ社製）またはニフェジピン（Ｓｉｇｍａ社製）をエタノールに溶解させて、終濃度が１０−７ｍｏｌ／Ｌ〜１０−１０ｍｏｌ／Ｌとなるよう培地に添加したことを除き、試験例１と同様の方法を用いた。【００７９】  アムロジピンまたはニフェジピンによる分化誘導１ヵ月後のフォンコッサ染色陽性面積の割合を算出した結果を図３に示す。図３から明らかなように、アムロジピン、ニフェジピンともに、濃度依存的にｈＭＳＣから骨芽細胞への分化を促進させた。【００８０】試験例４  マウス脂肪組織由来間葉系幹細胞に対する塩酸ベニジピンによる骨芽細胞分化促進効果（１）
マウス脂肪組織由来間葉系幹細胞（以下、ｍＡｄＳＣと称す）は、ＷＯ２００６／００６６９２に記載されているヒト脂肪組織からの間葉系幹細胞の分離・培養方法と同様の方法で、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス（雄、チャールズ・リバーより購入）より調製した。ｍＡｄＳＣに対する塩酸ベニジピンによる骨芽細胞分化促進効果をフォンコッサ染色で評価した。【００８１】  ｍＡｄＳＣを１ウェルあたり１．０ｘ１０４個の細胞数で１２ウェルプレートに播種し、２０％ＦＢＳ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を含むＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で一晩培養した。４日後、エタノールに溶解した塩酸ベニジピン（協和発酵工業社製：製品名コニール）を、終濃度が１０−８ｍｏｌ／Ｌとなるように添加した分化誘導培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。分化誘導培地は、２０％ＰＢＳを含むＩＭＤＭ培地中に、０．１μｍｏｌ／Ｌデキサメサゾン、５０μｍｏｌ／Ｌアスコルビン酸−２リン酸（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  β−グリセロフォスフェート（Ｓｉｇｍａ社製）を添加したものを用いた。該分化誘導培地で培養することにより、ｍＡｄＳＣは、骨芽細胞の他、一部は脂肪細胞へも分化誘導される。培養期間中は３〜４日に１回、塩酸ベニジピンを添加した分化誘導培地で培地交換した。【００８２】  培養一ヶ月後、フォンコッサ染色により石灰化した骨芽細胞を検出した。細胞をＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で１回洗浄し、固定液（１０％  ｆｏｒｍａｌｉｎ／ＰＢＳ）で５分間固定した。蒸留水で３回洗浄した後、暗所で５％硝酸銀水溶液（ナカライテスク社製）と１０分間反応させた。更に蒸留水で５回洗浄して光に１５分間当て呈色させた。その後、５％チオ硫酸ナトリウム水溶液（ナカライテスク社製）にて定着させた。【００８３】  ウェルを位相差顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ社製）下で観察し、それぞれのウェルについて任意の４ヶ所をデジタルカメラで記録した。画像データをＴＩＦＦフォーマットに変換し、染色された部分の面積を画像解析ソフト「Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ」（Ｓｃｉｏｎ社製）を用いて計測し、フォンコッサ染色陽性面積割合を算出した。
その結果を図４に示す。図４から明らかなように、１０−８ｍｏｌ／Ｌの塩酸ベニジピンはｍＡｄＳＣから骨芽細胞への分化を促進させた。【００８４】試験例５  マウス脂肪組織由来間葉系幹細胞に対する塩酸ベニジピンによる骨芽細胞分化促進効果（２）
ｍＡｄＳＣに対する塩酸ベニジピンによる骨芽細胞分化促進効果をＡＬＰ酵素活性で評価した。【００８５】  ｍＡｄＳＣを１ウェルあたり１．０ｘ１０３個の細胞数で９６ウェルプレートに播種し、２０％ＦＢＳ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を含むＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で一晩培養した（１検体につき２枚ずつ作製した）。４日後、エタノールに溶解した塩酸ベニジピン（協和発酵工業社製：製品名コニール）を、終濃度が１０−８ｍｏｌ／Ｌとなるように添加した分化誘導培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。分化誘導培地は、２０％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地中に、０．１μｍｏｌ／Ｌデキサメサゾン、５０μｍｏｌ／Ｌアスコルビン酸−２リン酸（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  β−グリセロフォスフェート（Ｓｉｇｍａ社製）を添加したものを用いた。該分化誘導培地で培養することにより、ｍＡｄＳＣは、骨芽細胞の他、一部は脂肪細胞へも分化誘導される。培養期間中は３〜４日に１回、塩酸ベニジピンを添加した分化誘導培地で培地交換した。【００８６】  １枚は、分化誘導培地で培養後１４日目の細胞からアルカリ性フォスファＢ−テストワコー（和光純薬株式会社製）を用いて基質緩衝液を回収し、溶液中のＡＬＰ活性の定量に使用した。具体的な操作方法はキット、システムの添付文書に従った。【００８７】  もう１枚は、分化誘導培地で培養後１４日目の細胞からＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ＤＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてＤＮＡ溶液を回収し、溶液中のＤＮＡ含量の定量に使用した。具体的な操作方法はキット、システムの添付文書に従った。【００８８】  ＡＬＰ活性をＤＮＡ量当りの活性で算出し、対照群（溶媒としてエタノールを添加した群）のＡＬＰ活性を１００％として相対値で表した結果を図５に示す。図５から明らかなように、塩酸ベニジピンを添加した群におけるＡＬＰ活性が、添加していない群と比較して上昇していることが示された。このことにより、塩酸ベニジピンによりｍＡｄＳＣから骨芽細胞への分化が促進されたことが明らかとなった。【００８９】試験例６  マウス脂肪組織由来間葉系幹細胞に対する各種カルシウム拮抗薬による骨芽細胞分化促進効果
ｍＡｄＳＣに対する各種カルシウム拮抗薬による骨芽細胞分化促進効果をＡＬＰ酵素活性で評価した。【００９０】  ｍＡｄＳＣを１ウェルあたり１．０ｘ１０３個の細胞数で９６ウェルプレートに播種し、２０％ＦＢＳ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を含むＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で一晩培養した（１検体につき２枚ずつ作製した）。４日後、エタノールに溶解した塩酸ベラパミル（Ｓｉｇｍａ社製）を終濃度が１０−６、または１０−８ｍｏｌ／Ｌとなるように、塩酸ジルチアゼム（Ｓｉｇｍａ社製）を、終濃度が１０−８ｍｏｌ／Ｌとなるように添加した分化誘導培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。分化誘導培地は、２０％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地中に、０．１μｍｏｌ／Ｌデキサメサゾン、５０μｍｏｌ／Ｌアスコルビン酸−２リン酸（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  β−グリセロフォスフェート（Ｓｉｇｍａ社製）を添加したものを用いた。該分化誘導培地で培養することにより、ｍＡｄＳＣは、骨芽細胞の他、一部は脂肪細胞へも分化誘導される。培養期間中は３〜４日に１回、各種薬剤を添加した分化誘導培地で培地交換した。【００９１】  １枚は、分化誘導培地で培養後１４日目の細胞からアルカリ性フォスファＢ−テストワコー（和光純薬株式会社製）を用いて基質緩衝液を回収し、溶液中のＡＬＰ活性定量に使用した。具体的な操作方法はキット、システムの添付文書に従った。【００９２】  もう１枚は、分化誘導培地で培養後１４日目の細胞からＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ＤＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてＤＮＡ溶液を回収し、溶液中のＤＮＡ含量定量に使用した。具体的な操作方法はキット、システムの添付文書に従った。【００９３】  ＡＬＰ活性をＤＮＡ量当りの活性で算出し、対照群（溶媒としてエタノールを添加した群）のＡＬＰ活性を１００％として相対値で表した結果を図６に示す。図６から明らかなように、塩酸ベラパミル、塩酸ジルチアゼムを添加した群におけるＡＬＰ活性が、添加していない群と比較して上昇していることが示された。このことにより、各種カルシウム拮抗薬によりｍＡｄＳＣから骨芽細胞への分化が促進されたことが明らかとなった。
以下に、本発明の実施例を示す。
【実施例１】
【００９４】  錠剤
常法により、次の組成からなる錠剤を調製する。
成分                            量          
塩酸ベニジピン                ５ｍｇ
乳糖                        ６２ｍｇ
馬鈴薯デンプン              ３０ｍｇ
ポリビニルアルコール          ２ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム      １ｍｇ
【実施例２】
【００９５】  幹細胞から骨芽細胞への分化促進剤
常法により、塩酸ベニジピン、塩酸ベラパミル、塩酸ジルチアゼムを０．１ｍｍｏｌ／Ｌになるようにエタノールに溶解し、塩酸ベニジピン、塩酸ベラパミル、塩酸ジルチアゼムを含む本発明の分化促進剤を調製した。
【産業上の利用可能性】
【００９６】  本発明によれば、幹細胞に対する骨芽細胞への分化促進剤、骨芽細胞の製造方法、該製造方法により製造される骨芽細胞、または骨治療材を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００９７】配列番号１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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