(57)【要約】  本発明は、アリールアシルアミダーゼの効率的な製造方法を提供する。本発明の一つの特徴は、（ａ）配列表の配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、（ｂ）配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アリールアシルアミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。本発明の別の特徴は、前記ＤＮＡにコードされアリールアシルアミダーゼ活性を有するポリペプチド、前記ＤＮＡを含有するベクター、前記ＤＮＡ又はベクターで形質転換された形質転換体、並びに、当該形質転換体を培養し、培養液からアリールアシルアミダーゼを取得するアリールアシルアミダーゼの製造方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アリールアシルアミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項２】
配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１に記載のＤＮＡにコードされ、かつ、アリールアシルアミダーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項４】
配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項５】
請求項１又は２に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項６】
プラスミドｐＮＴＮＧである請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
請求項１又は２に記載のＤＮＡ、又は、請求項５又は６に記載のベクターにより、宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項８】
前記宿主細胞が大腸菌である、請求項７記載の形質転換体。
【請求項９】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＮＧ）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４１６である、請求項８記載の形質転換体。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれかに記載の形質転換体を栄養培地中で培養し、得られた培養液からアリールアシルアミダーゼを取得することを特徴とする、アリールアシルアミダーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アリールアシルアミダーゼをコードするＤＮＡ、および、当該ＤＮＡを利用したアリールアシルアミダーゼの製造方法に関する。
【関連出願の相互参照】
【０００２】
日本国特許２００４−２９１９１６号（２００４年１０月４日出願）の明細書、請求の範囲、図面および要約を含む全開示内容は、これら全開示内容を参照することによって本出願に合体される。
【背景技術】
【０００３】
アリールアシルアミダーゼは、インターナショナル・ユニオン・オブ・バイオケミストリー（International union of biochemistry）により規定されており（酵素命名法（Enzyme Nomenclature），１９７８，アカデミー出版，ニューヨーク）、アニリドをアニリンおよび脂肪酸陰イオンに加水分解する触媒活性を有することが示されている。アリールアシルアミダーゼは、アセトアミノフェン等のアニリド類の定量に利用可能な、産業上有用な酵素である（特許文献１）。【０００４】
アリールアシルアミダーゼは、哺乳類、高等植物、および、微生物中に存在することが知られている。しかし、哺乳類および高等植物由来の酵素は、１）酵素源となる動植物の入手が困難である、２）動植物からの単離操作が煩雑である、３）遺伝子組換え技術を用いた微生物宿主による生産が困難である等の理由により、一般に工業的生産には不向きである。一方、微生物由来の酵素ではこのような問題が少なく、工業的生産に有利な場合が多い。【０００５】
微生物より単離されたアリールアシルアミダーゼとしては、キャンディダ・ウティリス（Candida utilis）由来のもの（非特許文献１）、バシラス・スファエリカス（Bacillus sphaericus）由来のもの（非特許文献２）、シュードモナス・アシドボランス（Pseudomonas acidovorans）由来のもの（非特許文献３）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）由来のもの（非特許文献４）、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）由来のもの（特許文献２）、コリネフォーム・バクテリウム（Coryneform bacterium）由来のもの（非特許文献５）、シュードモナス・スピーシズ（Pseudomonas sp.）由来のもの（非特許文献６）、および、ノカルディア・グロベルーラ（Nocardia globerula）由来のもの（特許文献３、非特許文献７）が報告されている。
【非特許文献１】J. Gen. Microbiol., 59, 47-55 (1969)
【非特許文献２】Appl. Microbiol., 26, 709-718 (1973)
【非特許文献３】Eur. J. Biochem., 53, 357-369 (1975)
【非特許文献４】Eur. J. Biochem., 132, 651-655 (1983)
【非特許文献５】Journal of Pesticide Science, 18, 211-216 (1993)
【非特許文献６】Sanop Misaengmul Hakhoechi, 26, 413-419 (1998)
【非特許文献７】Eur. J. Biochem., 199, 17-24 (1991)
【特許文献１】米国特許第４９９９２８８
【特許文献２】特開昭６３−７４４８４号公報
【特許文献３】特開平３−２７７２８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記文献に開示されているアリールアシルアミダーゼはいずれも、由来する微生物の培養液から単離することが可能である。しかし、それらのアリールアシルアミダーゼの製造方法は、培養液量あたりの生産性が低く、実用的とは言い難い。また、これらのアリールアシルアミダーゼをコードするＤＮＡに関する情報は開示されておらず、従って、遺伝子組換え技術を利用して、これらのアリールアシルアミダーゼの生産性を向上させることもできない。このような状況の中、より効率の良いアリールアシルアミダーゼの製造方法が必要とされていた。【０００７】
本発明の課題は、アリールアシルアミダーゼをコードするＤＮＡを単離し、それを利用して、効率の良いアリールアシルアミダーゼの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、アリールアシルアミダーゼ活性を有する微生物から、アリールアシルアミダーゼをコードするＤＮＡを単離し、その塩基配列を明らかにした。さらに、該ＤＮＡを用いてアリールアシルアミダーゼを産生する形質転換体を育種し、該形質転換体を用いた、効率の良いアリールアシルアミダーゼの製造方法を確立した。【０００９】
即ち、本発明の一つの特徴は、アリールアシルアミダーゼ活性を有する微生物から単離された、アリールアシルアミダーゼをコードするＤＮＡである。また、本発明の別の特徴は、当該ＤＮＡによってコードされ、かつ、アリールアシルアミダーゼ活性を有するポリペプチドである。また、本発明の別の特徴は、当該ＤＮＡを含むベクターである。また、本発明の別の特徴は、当該ベクターを含む形質転換体である。さらに、本発明の別の特徴は、当該形質転換体を用いた、アリールアシルアミダーゼの製造方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、アリールアシルアミダーゼの実用的な製造方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本明細書において記述されている、ＤＮＡの単離、ベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Molecular Cloning 2nd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）等の成書に記載されている方法により行うことができる。また、本明細書の記述に用いられる％は、特に断りのない限り、％（ｗ／ｖ）を意味する。【００１２】
１．ＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、アリールアシルアミダーゼをコードするＤＮＡであり、後述する方法に従って導入された宿主細胞内でアリールアシルアミダーゼを発現し得るものであれば、任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。このようなＤＮＡは、アリールアシルアミダーゼ活性を有する微生物から単離できる。本発明のＤＮＡの起源となる微生物は特に限定されないが、例えばノカルディア・グロベルーラ（Nocardia globerula）ＮＢＲＣ１３５１０株から、当該ＤＮＡを単離できる。当該微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ：〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）より入手できる。【００１３】
２．ＤＮＡの単離
本発明のＤＮＡは、例えば、以下に示した方法で、当該ＤＮＡの起源となる微生物から単離できる。【００１４】
第一に、本発明のＤＮＡの起源となる微生物を、適当な培地を用いて培養する。当該微生物を培養するための培地としては、その微生物が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いることができる。【００１５】
第二に、通常公知の蛋白質精製法を適当に組み合わせて用いることにより、当該微生物からアリールアシルアミダーゼを単離する。例えば、当該微生物の培養液から遠心分離、あるいは、濾過により菌体を集め、得られた菌体を、超音波破砕機あるいはグラスビーズ等を用いた物理的手法で破砕した後、遠心分離にて菌体残さを除いて無細胞抽出液を調製し、これを、分別沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等に供することにより、アリールアシルアミダーゼを単離できる。【００１６】
アリールアシルアミダーゼの活性は、例えば、１０ｍＭの２−メチルアセトアニリド（反応基質）を含有する１００ｍＭのグリシン緩衝液（ｐＨ９．５）９９０μｌに被験液１０μｌを加え、これを３５℃で２０分間反応させた後、１Ｍの塩酸０．２ｍｌを添加して反応を停止し、反応液中に生成した２−メチルアニリンをＨＰＬＣ（カラム：Ｍ＆ＳパックＣ１８（φ４．６×１５０ｍｍ；エムエス機器株式会社製）、移動相：アセトニトリル／１％リン酸二水素カリウム水溶液＝３／７、検出：２４０ｎｍ、流速：１ｍｌ／分）で定量することにより、測定できる。【００１７】
第三に、単離されたアリールアシルアミダーゼのアミノ酸配列の一部を決定する。例えば、単離されたアリールアシルアミダーゼを適当なエンドペプチダーゼを用いて消化した後、生じたペプチド断片を逆相ＨＰＬＣにより分取し、これをＡＢＩ４９２型プロテインシークエンサー（Applied Biosystems社製）等を用いて解析することにより、アリールアシルアミダーゼのアミノ酸配列の一部を決定できる。【００１８】
第四に、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）によりアリールアシルアミダーゼをコードするＤＮＡの一部を増幅し、その塩基配列を決定する。この工程は、例えば、以下のように実施できる。まず、上記で得られたアミノ酸配列情報をもとにして、アリールアシルアミダーゼをコードするＤＮＡの一部を増幅するためのＰＣＲプライマーを合成する。次に、通常のＤＮＡ単離法、例えば、Ｖｉｓｓｅｒ等の方法（Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 415 (2000)）により、当該ＤＮＡの起源となる微生物の染色体ＤＮＡを調製する。そして、この染色体ＤＮＡを鋳型として、先述のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、アリールアシルアミダーゼをコードするＤＮＡの一部を増幅する。さらに、ＡＢＩ３７３Ａ型  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Applied Biosystems社製）等を用いて、増幅された当該ＤＮＡの塩基配列を決定する。【００１９】
第五に、上記で明らかとなったアリールアシルアミダーゼをコードするＤＮＡの一部の塩基配列を基に、例えば、ｉ−ＰＣＲ法（Nucl. Acids Res., 16,8186 (1988)）により、その全体の配列を決定する。【００２０】
このようにして得られる本発明のＤＮＡの例としては、配列表の配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡを挙げることができる。また、配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、アリールアシルアミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも、本発明のＤＮＡに包含される。【００２１】
配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を実施した際、配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡが、特異的にハイブリッドを形成するＤＮＡを言う。【００２２】
ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、および、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ  ４００（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）の組成からなる水溶液中、６５℃でハイブリダイゼーションを実施した後に、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６０℃で洗浄が行われる条件を言う。好ましくは、上記条件でハイブリダイゼーションを実施した後に、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６５℃で洗浄が行われる条件であり、より好ましくは、上記条件でハイブリダイゼーションを実施した後に、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６５℃で洗浄が行われる条件である。【００２３】
３．ポリペプチド
本発明のポリペプチドは、上述の本発明のＤＮＡによってコードされ、かつ、アリールアシルアミダーゼ活性を有するポリペプチドである。本発明のポリペプチドの例としては、配列表の配列番号１に示す塩基配列によってコードされる、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。しかし、本発明のポリペプチドはこれに限定されず、配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、かつ、アリールアシルアミダーゼ活性を有するポリペプチドは、本発明に包含される。【００２４】
このようなポリペプチドは、例えば、先述の、配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを、適当なベクターに連結した後、適当な宿主細胞に導入して発現させることにより得られる。また、例えば、Current Protocols in Molecular Biology（John Wiley and Sons, Inc., 1989）等に記載の公知の方法に従い、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに、アミノ酸の置換、挿入、欠失または付加を生じさせることによっても取得できる。アリールアシルアミダーゼ活性が失われない限り、ポリペプチドにおいて、置換、挿入、欠失または付加するアミノ酸の個数は限定されないが、例えば、２０アミノ酸以下、好ましくは、５個以下、さらに好ましくは２または１個である。【００２５】
４．ベクター
本発明のベクターは、本発明のＤＮＡを含むベクターである。本発明のＤＮＡを宿主微生物内に導入し、導入された宿主微生物内で発現させるために用いられるベクターは、適当な宿主微生物内で当該ＤＮＡがコードする遺伝子を発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。このようなベクターは、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、ｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号公報）が好適に使用できる。【００２６】
本明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。【００２７】
本明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。【００２８】
本発明のベクターの例としては、後述するｐＮＴＮＧを挙げることができる。ｐＮＴＮＧは、上述の発現ベクターｐＵＣＮＴに配列番号１に示すＤＮＡを挿入することにより得られる。【００２９】
５．形質転換体
本発明の形質転換体は、本発明のベクターを宿主細胞に導入して得られる。本発明のベクターを導入する宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などが挙げられるが、大腸菌が特に好ましい。本発明のベクターは、公知の方法により宿主細胞に導入できる。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、例えば、市販のＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入できる。【００３０】
本発明の形質転換体としては、後述する、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＮＧ）  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４１６が挙げられる。この形質転換体は、前記の受託番号にて、２００５年９月１５日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566  茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に寄託されている（原寄託日２００３年１０月２３日の国内寄託株を、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管）。【００３１】
本発明の形質転換体を培養することにより、アリールアシルアミダーゼを効率良く製造することができる。本発明の形質転換体の培養は、それが増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いて実施できる。また、必要に応じて、培地中に種々の誘導剤を添加することにより、培養液量あたりのアリールアシルアミダーゼの生成量を向上させる事もできる。本発明の形質転換体の培養液中に蓄積したアリールアシルアミダーゼは、当該培養液のままアリールアシルアミダーゼ含有物として使用することも可能であるが、通常公知の蛋白質精製手法を用いて、精製もしくは部分精製した後に使用することもできる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。【００３３】
（実施例１）  アリールアシルアミダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列の決定
（ＰＣＲプライマーの作製）
Eur. J. Biochem., 199, 17-24 (1991)において開示されている、ノカルディア・グロベルーラ（Nocardia globerula）ＮＢＲＣ１３５１０株由来のアリールアシルアミダーゼ（ＨＮＧ）の部分アミノ酸配列情報を基に、アリールアシルアミダーゼをコードするＤＮＡの一部をＰＣＲにより増幅するためのプライマー１：５’−atggaygtngcngartaygc−３’（配列表の配列番号３）、および、プライマー２：５’−acytcrcangcrctnacytg−３’（配列表の配列番号４）を合成した。【００３４】
（アリールアシルアミダーゼをコードするＤＮＡの増幅）
Eur. J. Biochem., 199, 17-24 (1991)において開示されている方法に従って培養した、ノカルディア・グロベルーラＮＢＲＣ１３５１０株の菌体から、Ｖｉｓｓｅｒ等の方法（Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 415 (2000)）に従って染色体ＤＮＡを抽出した。次に、上記で調製したＤＮＡプライマー１および２を用い、得られた染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ったところ、目的遺伝子の一部と考えられる約８０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとしてＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。このＤＮＡ断片を、プラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にクローニングし、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）およびＡＢＩ  ３７３Ａ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いてその塩基配列を決定した。その塩基配列を、配列表の配列番号５に示した。【００３５】
（ｉ−ＰＣＲ法によるＨＮＧ遺伝子の全長配列の決定）
ノカルディア・グロベルーラＮＢＲＣ１３５１０株の染色体ＤＮＡを制限酵素ＡｐａＬＩ、ＥｃｏＲＩ、またはＳｐｈＩを用いて完全消化し、得られた消化物をＴ４ＤＮＡリガーゼ（タカラバイオ社製）を用いて各々分子内環化させた。これを鋳型として用い、上記で判明したアリールアシルアミダーゼをコードするＤＮＡの部分塩基配列情報をもとに、ｉ−ＰＣＲ法（Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988)）により、アリールアシルアミダーゼをコードするＤＮＡの全塩基配列を決定した。ｉ−ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとしてＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。塩基配列の決定は上記と同様に行った。判明した塩基配列を配列表の配列番号１に示した。また、該塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示した。【００３６】
（実施例２）  発現ベクターの構築
プライマー３：５’−gtgcatatggatgtcgccgaatacgc−３’（配列表の配列番号６）と、プライマー４：５’−gacggatccttactaccggcccacgtgcacgg−３’（配列表の配列番号７）を用い、実施例１で得たノカルディア・グロベルーラＮＢＲＣ１３５１０株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡの開始コドン部分にＮｄｅＩ認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後にＢａｍＨＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡを得た。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとしてＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。このＤＮＡをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号公報）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＢａｍＨＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＴＮＧを構築した。【００３７】
（実施例３）  形質転換体の作製
実施例２で構築した組換えベクターｐＮＴＮＧ用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＮＧ）を得た。この形質転換体は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４１６として、２００５年９月１５日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている（原寄託日２００３年１０月２３日の国内寄託株を、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管）。【００３８】
（実施例４）  形質転換体によるアリールアシルアミダーゼの生産
実施例３で得た形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＮＧ）を２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）に接種し、３７℃で２４時間培養した。この培養液１ｍｌから遠心分離により菌体を集め、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍｌに懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を調製した。この無細胞抽出液のアリールアシルアミダーゼ活性とタンパク質濃度を測定した結果、蛋白質１ｍｇあたり０．４３Ｕの当該活性を示した。一方、アリールアシルアミダーゼをコードするＤＮＡを含まないベクタープラスミドを導入した形質転換体であるＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）の無細胞抽出液について、同様に測定したところ、蛋白質１ｍｇあたりの当該活性は０．０１Ｕ未満であった。【００３９】
アリールアシルアミダーゼの活性は、１０ｍＭの２−メチルアセトアニリド（反応基質）を含有する１００ｍＭのグリシン緩衝液（ｐＨ９．５）９９０μｌに被験液１０μｌを加え、これを３５℃で２０分間反応させた後、１Ｍの塩酸０．２ｍｌを添加して反応を停止し、反応液中に生成した２−メチルアニリンをＨＰＬＣ（カラム：Ｍ＆ＳパックＣ１８（φ４．６×１５０ｍｍ；エムエス機器株式会社製）、移動相：アセトニトリル／１％リン酸二水素カリウム水溶液＝３／７、検出：２４０ｎｍ、流速：１ｍｌ／分）で定量することにより、測定した。この活性測定条件において、１分間に１μｍｏｌの２−メチルアニリンを生成する活性を、１Ｕと定義した。また、タンパク質濃度は、プロテインアッセイキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて測定した。
【配列表】
2006038479000001.app
【国際調査報告】
2006038479.tif 000002
2006038479.tif 000003
2006038479.tif 000004
2006038479.tif 000005