(57)【要約】タンパク質における特異的なＣＴＬ誘導能を迅速かつ簡便に評価できる方法の提供を目的とする。  前記目的を達成するために、本発明のタンパク質特異的なＣＴＬ誘導能評価方法は、被検タンパク質をコードする遺伝子を、抗原提示細胞に、前記タンパク質が発現可能に導入する工程と、前記遺伝子が導入された前記抗原提示細胞をリンパ球と共培養する工程と、前記リンパ球におけるＣＴＬの誘導効率を調べる工程とを含み、前記抗原提示細胞として、Ｔ細胞共刺激因子及びＭＨＣクラスＩ分子を発現し、かつ、細胞内で発現される前記タンパク質の全部若しくは一部を前記ＭＨＣクラスＩ分子上に抗原提示できる確立された細胞株に由来する細胞を使用する評価方法である。本発明によれば、特異的なＣＴＬ誘導能を有する抗原タンパク質や抗原エピトープペプチドを迅速かつ簡便にスクリーニングでき、新規な抗原エピトープペプチドの探索が容易となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質における特異的なＣＴＬ誘導能の評価方法であって、
被検タンパク質をコードする遺伝子を、抗原提示細胞に、前記タンパク質が発現可能に導入する工程と、
前記遺伝子が導入された前記抗原提示細胞をリンパ球と共培養する工程と、
前記リンパ球におけるＣＴＬの誘導効率を調べる工程とを含み、
前記抗原提示細胞として、Ｔ細胞共刺激因子及びＭＨＣクラスＩ分子を発現し、かつ、細胞内で発現される前記タンパク質の全部若しくは一部を前記ＭＨＣクラスＩ分子上に抗原提示できる確立された細胞株に由来する細胞を使用する評価方法。
【請求項２】
前記Ｔ細胞共刺激因子が、ＣＤ８０である請求項１記載の評価方法。
【請求項３】
前記遺伝子を導入する工程において、前記タンパク質に加え、ユビキチンをコードする遺伝子を発現可能に導入する請求項１記載の評価方法。
【請求項４】
前記遺伝子を導入する工程において、前記タンパク質をコードする遺伝子に代えて、前記タンパク質とユビキチンとの融合タンパク質をコードする遺伝子を発現可能に導入する請求項１記載の評価方法。
【請求項５】
前記遺伝子の導入が、一過性の遺伝子導入である請求項１記載の評価方法。
【請求項６】
前記タンパク質が、がん細胞由来又はウイルス由来である請求項１記載の評価方法。
【請求項７】
前記抗原提示細胞が、付着性細胞である請求項１記載の評価方法。
【請求項８】
前記抗原提示細胞が、腫瘍細胞由来細胞株に由来する細胞である請求項１記載の評価方法。
【請求項９】
前記腫瘍細胞由来細胞株が、乳がん由来細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１である請求項８記載の評価方法。
【請求項１０】
ＣＴＬを特異的に誘導可能なタンパク質のスクリーニング方法であって、請求項１記載の評価方法により、被検タンパク質の特異的なＣＴＬ誘導能を評価し、特異的なＣＴＬ誘導能を有するタンパク質を同定する工程を含むスクリーニング方法。
【請求項１１】
ＣＴＬを特異的に誘導可能なタンパク質中の抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法であって、下記（Ａ）及び（Ｂ）の少なくとも一方の工程を含むスクリーニング方法。
（Ａ）被検タンパク質をコードする遺伝子を前記抗原提示細胞に前記タンパク質が発現可能に導入する工程に代えて、前記タンパク質の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを前記抗原提示細胞に発現可能に導入する工程を有する請求項１記載の評価方法により、前記部分ペプチドのＣＴＬ誘導能を評価し、特異的なＣＴＬ誘導能を有する抗原エピトープペプチドを同定する工程。
（Ｂ）被検タンパク質をコードする遺伝子を前記抗原提示細胞に前記タンパク質が発現可能に導入する工程及び前記遺伝子が導入された前記抗原提示細胞をリンパ球と共培養する工程の前記両工程に代えて、前記タンパク質の部分ペプチドを、前記抗原提示細胞と接触させた後、又は接触させながらリンパ球と共培養する工程を有する請求項１記載の評価方法により、前記部分ペプチドのＣＴＬ誘導能を評価し、特異的なＣＴＬ誘導能を有する抗原エピトープペプチドを同定する工程。
【請求項１２】
前記被検タンパク質として、請求項１０記載の方法により同定されたタンパク質を使用する請求項１１記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
前記部分ペプチドが、アミノ酸残基数９〜１１からなるペプチドである請求項１１記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
請求項１記載のタンパク質における特異的なＣＴＬ誘導能の評価方法に用いる抗原提示細胞であって、Ｔ細胞共刺激因子及びＭＨＣクラスＩ分子を発現し、かつ、細胞内で発現される前記タンパク質の全部若しくは一部を前記ＭＨＣクラスＩ分子上に抗原提示できる確立された細胞株に由来する抗原提示細胞。
【請求項１５】
請求項１０記載のＣＴＬを特異的に誘導可能なタンパク質のスクリーニング方法に用いる抗原提示細胞であって、Ｔ細胞共刺激因子及びＭＨＣクラスＩ分子を発現し、かつ、細胞内で発現される前記タンパク質の全部若しくは一部を前記ＭＨＣクラスＩ分子上に抗原提示できる確立された細胞株に由来する抗原提示細胞。
【請求項１６】
請求項１１記載のＣＴＬを特異的に誘導可能なタンパク質中の抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法に用いる抗原提示細胞であって、Ｔ細胞共刺激因子及びＭＨＣクラスＩ分子を発現し、かつ、細胞内で発現される前記タンパク質の全部若しくは一部を前記ＭＨＣクラスＩ分子上に抗原提示できる確立された細胞株に由来する抗原提示細胞。
【請求項１７】
請求項１記載のタンパク質における特異的なＣＴＬ誘導能の評価方法に用いる評価キットであって、請求項１４記載の抗原提示細胞を含むキット。
【請求項１８】
請求項１０記載のＣＴＬを特異的に誘導可能なタンパク質のスクリーニング方法に用いるスクリーニングキットであって、請求項１５記載の抗原提示細胞を含むキット。
【請求項１９】
請求項１１記載のＣＴＬを特異的に誘導可能なタンパク質中の抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法に用いるスクリーニングキットであって、請求項１６記載の抗原提示細胞を含むキット。
【請求項２０】
特異的なＣＴＬ誘導能を有する抗原エピトープペプチドの製造方法であって、請求項１１記載のＣＴＬを特異的に誘導可能なタンパク質中の抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法により、前記タンパク質の抗原エピトープペプチドを同定する工程を含む製造方法。
【請求項２１】
さらに、前記タンパク質から同定された抗原エピトープペプチドを分離する工程及び前記同定された抗原エピトープペプチドを合成する工程の少なくとも一方の工程を含む請求項２０記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ＣＴＬ誘導能評価方法及びそれを用いたスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  免疫は、生体内で異物（抗原）と認識されたものに対して働く一連の生体防御システムと自他の認識システムである。このシステムにより、生物は様々な疾患から防御されている。【０００３】  例えば、健常人の体内においては、常にがん細胞が発生しているが、その大部分は免疫応答により抑え込まれ、病気にまで至らずに消滅していると考えられている。しかし、何かのきっかけによりがんの力が免疫による抑止力を上回った場合には、がん細胞が増殖を続け、やがて病気としてのがんが成立するということになる。【０００４】  近年、人工的に細胞性免疫を強化し、様々な疾患（特にがんやウイルス性感染症）を治療する免疫細胞療法が注目されている。免疫細胞療法の特に優れている点は、副作用が非常に少なく、現れたとしても軽度な発熱程度で済むことである。【０００５】  免疫細胞療法の中で特に効果が高いと言われているものに、細胞傷害性Ｔ細胞療法（ＣＴＬ療法）がある。細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、以下、ＣＴＬともいう。）は、腫瘍（がん細胞）やウイルス等を認識して排除する生体防御反応の中心的な役割を担っている。ＣＴＬ療法とは、がんや感染症に対する治療や予防を目的として、このような抗原に特異的なＣＴＬを誘導する治療・予防方法であって、がんやウイルスに対する免疫応答の中心を担うＣＴＬを誘導し、がん細胞やウイルス感染細胞を排除することを目的とした治療・予防方法である。【０００６】  ＣＴＬが認識するのは、がん細胞やウイルス感染細胞の表面上あるいは細胞内に特異的に発現しているタンパク質の一部で抗原エピトープペプチドと呼ばれる部位である。抗原エピトープペプチドは、通常、９〜１１アミノ酸残基からなる。この抗原エピトープペプチドが、主要組織適合抗原複合体（Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｔｉｇｅｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ、以下、ＭＨＣともいう。）クラスＩと結合し、抗原提示細胞上に提示される。リンパ球は、提示された抗原エピトープペプチドを認識し、同様の抗原エピトープペプチドを持つがん細胞やウイルス感染細胞等を特異的に攻撃するＣＴＬとなる（例えば、非特許文献１参照）。【０００７】  そのため、ＣＴＬを誘導するには、ＣＴＬが認識する抗原エピトープペプチドの同定が重要となる。同定された抗原エピトープペプチドのアミノ酸配列の情報に基づけば、例えば、エピトープペプチドを合成し、直接ペプチドワクチンとして投与してＣＴＬを誘導したり、また、前記エピトープペプチドを樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ、以下、ＤＣともいう。）にパルスしてより強力なＤＣワクチンを作製することが可能となる（例えば、非特許文献２参照）。そのため、現在まで様々な方法によりエピトープペプチドの同定が試みられている。【０００８】  しかしながら、今までのがん抗原エピトープペプチド検索法においては、例えば、下記のような問題点がある。
１．腫瘍特異的なＣＴＬ細胞株を樹立しなければならない。
２．モチーフ構造を持った多数のペプチドを抗原エピトープペプチドの候補として合成し、スクリーニングしなければならない。
３．抗原提示細胞としてＤＣを毎回分化誘導して培養しなければならない。
４．ＤＣへの遺伝子（ＤＮＡ）導入が、非常に効率が悪く困難である。
【非特許文献１】Ｔｈｉｅｒｒｙ  Ｂｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ，″Ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ″Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｔｏｄａｙ  ２６７−２６８  Ｖｏｌ．１８，１９９７
【非特許文献２】Ｊｏａｃｈｉｍ  Ｌ．Ｓｃｈｕｌｔｚｅａｎｄ  ｅｔ  ａｌ，″Ｆｒｏｍ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ｔｏｗａｒｄ  ｓｅｃｏｎｄ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎｓ″Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２２  Ｎｏ．９：５１６−５２３，２００１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】  本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、抗原提示細胞としてＤＣを使用することなく、迅速かつ簡便な抗原エピトープペプチドのスクリーニングを可能とする特異的なＣＴＬ誘導能の評価方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】  上記課題を解決するために、本発明のタンパク質における特異的なＣＴＬ誘導能の評価方法（以下、本発明の評価方法ともいう。）は、
被検タンパク質をコードする遺伝子を、抗原提示細胞に、前記タンパク質が発現可能に導入する工程と、
前記遺伝子が導入された前記抗原提示細胞をリンパ球と共培養する工程と、
前記リンパ球におけるＣＴＬの誘導効率を調べる工程とを含み、
前記抗原提示細胞として、Ｔ細胞共刺激因子及びＭＨＣクラスＩ分子を発現し、かつ、細胞内で発現される前記タンパク質の全部若しくは一部を前記ＭＨＣクラスＩ分子上に抗原提示できる確立した細胞株に由来する細胞を使用する評価方法である。
【発明の効果】
【００１１】  本発明者らは、抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法のなかでも、抗原エピトープペプチドに特異的に誘導されるＣＴＬを指標とするスクリーニング方法について、従来から抗原提示細胞として使用されているＤＣに代えて、増殖能に優れ、分化誘導の必要が無い確立された細胞株を使用することを着想し、鋭意研究を重ねた。その結果、前記抗原提示細胞が、Ｔ細胞共刺激因子及びＭＨＣクラスＩ分子を発現する又は発現するように改変された細胞株由来のものであれば、抗原エピトープペプチドを含むタンパク質をコードする遺伝子を前記抗原提示細胞内に発現可能に導入した場合に、前記抗原エピトープペプチドがＭＨＣクラスＩ分子上に抗原提示され、特異的なＣＴＬを誘導できることを見出した。さらに、本発明者らは、前記抗原提示細胞への遺伝子導入効率が、従来のＤＣのそれに比べて優れるため、前記抗原提示細胞を用いれば、導入したタンパク質の特異的なＣＴＬ誘導能を従来よりも迅速・簡便に評価でき、この評価方法を用いれば、迅速・簡便な抗原エピトープペプチドのスクリーニングが可能となることを見出し、本発明に到達した。【００１２】  ここで、「特異的なＣＴＬ誘導能」とは、タンパク質又はペプチドが、その一部又は全部がエピトープペプチドとして抗原提示された場合に、前記エピトープペプチドに特異的なＣＴＬを活性化し、増殖を促すことができる能力を意味する。また、「確立された細胞株」とは、増殖能を有し、同一の性質・特性を示すクローン細胞を産生できる細胞株を意味する。【００１３】  本発明の評価方法は、抗原提示細胞として、ＤＣの代わりに、増殖しやすく、分化誘導の必要もない確立された細胞株に由来する本発明の抗原提示細胞を使用するから、短時間で効率よく行うことができる。また、本発明の抗原提示細胞は、遺伝子導入効率が優れるから、必要となる準備作業がさらに短時間で効率よく行える。したがって、本発明によれば、迅速かつ簡便なＣＴＬ誘導能評価方法の提供が可能である。また、本発明の評価方法における前記遺伝子導入は、一過性の導入であってもよく、本発明の評価方法をさらに迅速・簡便なものとすることができる。【００１４】  また、本発明の評価方法によれば、タンパク質の大きさによらず、前記タンパク質全体をコードする遺伝子を導入しても、前記タンパク質に含まれる抗原エピトープペプチドに特異的なＣＴＬ誘導能を評価できるから、特異的なＣＴＬを誘導する抗原エピトープペプチドを含むタンパク質のスクリーニング方法が可能である。また、導入する遺伝子を、前記タンパク質の一部をコードする遺伝子であって、前記タンパク質における部位や長さを変化させた遺伝子とすれば、本発明の評価方法により、抗原エピトープペプチドのスクリーニングが可能である。すなわち、本発明の評価方法によれば、例えば、抗原特異的なＣＴＬ細胞株の樹立や、抗原エピトープ候補のペプチド合成等を行うことなく、特異的にＣＴＬを誘導するタンパク質や抗原エピトープペプチドのスクリーニングを迅速かつ簡便に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＭＤＡ−ＣＤ８０細胞株のフローサイトメーター解析図の一例の図である。
【図２】図２は、ＭＤＡ−ＣＤ８０細胞株のＲＴ−ＰＣＲの結果の一例の図である。
【図３Ａ】図３Ａは、ＭＤＡ−ＣＤ８０細胞株にｐＴｒａｃｅｒを導入して抗原提示を行わせ、リンパ球と共培養し、特異的なＣＴＬ誘導能をＦＡＣＳにて測定した一例の図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＭＤＡ−ＣＤ８０細胞株にｐＴｒａｃｅｒ−ＢＭＬＦ１を導入して抗原提示を行わせ、リンパ球と共培養し、特異的なＣＴＬ誘導能をＦＡＣＳにて測定した一例の図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＭＤＡ−ＣＤ８０細胞株にｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂ−ＢＭＬＦ１を導入して抗原提示を行わせ、リンパ球と共培養し、特異的なＣＴＬ誘導能をＦＡＣＳにて測定した一例の図である。
【図４Ａ】図４Ａは、ＭＤＡ−ＣＤ８０細胞株にｐＴｒａｃｅｒを導入して抗原提示を行わせ、リンパ球と共培養し、特異的なＣＴＬ誘導能をＦＡＣＳにて測定した一例の図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＭＤＡ−ＣＤ８０細胞株にｐＴｒａｃｅｒ−Ｍａｒｔ１を導入して抗原提示を行わせ、リンパ球と共培養し、特異的なＣＴＬ誘導能をＦＡＣＳにて測定した一例の図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＭＤＡ−ＣＤ８０細胞株にｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂ−Ｍａｒｔ１を導入して抗原提示を行わせ、リンパ球と共培養し、特異的なＣＴＬ誘導能をＦＡＣＳにて測定した一例の図である。
【図５Ａ】図５Ａは、ＭＤＡ−ＣＤ８０細胞株にｐＴｒａｃｅｒを導入して抗原提示を行わせ、リンパ球と共培養し、ＩＮＦ−γを指標の一つとして特異的なＣＴＬ誘導能をＦＡＣＳにて測定した一例の図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＭＤＡ−ＣＤ８０細胞株にｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂ−ＢＭＬＦ１を導入して抗原提示を行わせ、リンパ球と共培養し、ＩＮＦ−γを指標の一つとして特異的なＣＴＬ誘導能をＦＡＣＳにて測定した一例の図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】  本発明の評価方法において、前記Ｔ細胞共刺激因子は、ＣＤ８０であることが好ましい。また、前記遺伝子を導入する工程において、前記タンパク質に加え、ユビキチンをコードする遺伝子を発現可能に導入することが好ましく、より好ましくは、前記タンパク質とユビキチンとの融合タンパク質をコードする遺伝子を発現可能に導入する。前記遺伝子導入は、一過性の遺伝子導入であってもよい。前記タンパク質は、がん細胞由来のものであってもよく、ウイルス由来のものであってもよい。前記抗原提示細胞は、付着性であることが好ましく、また、腫瘍細胞由来細胞株に由来する細胞であることが好ましい。前記腫瘍細胞由来細胞株としては、乳がん由来細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１であることが好ましい。【００１７】  本発明のスクリーニング方法は、ＣＴＬを特異的に誘導可能なタンパク質のスクリーニング方法（以下、本発明の抗原タンパク質のスクリーニング方法ともいう。）であって、本発明の評価方法により、被検タンパク質の特異的なＣＴＬ誘導能を評価し、特異的なＣＴＬ誘導能を有するタンパク質を同定する工程を含むスクリーニング方法である。【００１８】  その他の態様として、本発明のスクリーニング方法は、ＣＴＬを特異的に誘導可能なタンパク質中の抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法（以下、本発明の抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法ともいう。）であって、下記（Ａ）及び（Ｂ）の少なくとも一方の工程を含むスクリーニング方法である。
（Ａ）被検タンパク質をコードする遺伝子を前記抗原提示細胞に前記タンパク質が発現可能に導入する工程に代えて、前記タンパク質の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを前記抗原提示細胞に発現可能に導入する工程を有する本発明の評価方法により、前記部分ペプチドのＣＴＬ誘導能を評価し、特異的なＣＴＬ誘導能を有するペプチドを同定する工程。
（Ｂ）被検タンパク質をコードする遺伝子を抗原提示細胞に前記タンパク質が発現可能に導入する工程及び前記遺伝子が導入された前記抗原提示細胞をリンパ球と共培養する工程の前記両工程に代えて、前記タンパク質の部分ペプチドを、前記抗原提示細胞と接触させた後、又は接触させながらリンパ球と共培養する工程を有する本発明の評価方法により、前記部分ペプチドのＣＴＬ誘導能を評価し、特異的なＣＴＬ誘導能を有するペプチドを同定する工程。【００１９】  本発明の抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法において、前記被検タンパク質は、本発明の抗原タンパク質のスクリーニング方法で同定されたタンパク質であることが好ましい。本発明の抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法において、前記部分ペプチドは、アミノ酸残基数が９〜１１残基であるペプチドであってもよい。【００２０】  本発明の抗原提示細胞は、本発明の評価方法に用いられる抗原提示細胞であって、Ｔ細胞共刺激因子及びＭＨＣクラスＩ分子を発現し、かつ、細胞内で発現される前記タンパク質の全部若しくは一部を前記ＭＨＣクラスＩ分子上に抗原提示できる確立された細胞株に由来する抗原提示細胞である。また、本発明の抗原提示細胞は、その他の態様として、本発明の抗原タンパク質のスクリーニング方法に用いられる前記抗原提示細胞であり、さらにその他の態様として、本発明の抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法に用いられる前記抗原提示細胞である。【００２１】  本発明のキットは、本発明の評価方法に用いられる評価キットであって、本発明の抗原提示細胞を含む。また、本発明のキットは、その他の態様として、本発明の抗原タンパク質のスクリーニング方法に用いられるスクリーニングキットであって、本発明の抗原提示細胞を含む。本発明のキットは、さらなるその他の態様として、本発明の抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法に用いられるスクリーニングキットであって、本発明の抗原提示細胞を含む。【００２２】  本発明の製造方法は、特異的なＣＴＬ誘導能を有する抗原エピトープペプチドの製造方法であって、本発明の抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法により、前記タンパク質の抗原エピトープペプチドを同定する工程を含む製造方法である。本発明の製造方法は、さらに、前記タンパク質から同定された抗原エピトープペプチドを分離する工程及び同定された抗原エピトープペプチドを合成する工程の少なくとも一方の工程を含むことが好ましい。【００２３】  本発明の評価方法は、前述のとおり、Ｔ細胞共刺激因子及びＭＨＣクラスＩ分子を発現する細胞株である本発明の抗原提示細胞を使用し、前記抗原提示細胞に被検タンパク質をコードする遺伝子を導入して抗原提示させることを技術的特徴の一つとする。【００２４】  抗原提示細胞内では、導入された遺伝子の転写・翻訳が行われ、被検タンパク質が合成される。合成された被検タンパク質は、細胞内のタンパク質分解酵素（以下、プロテアソームともいう。）によりいくつかの断片に分解される。被検タンパク質にエピトープ部位が含まれる場合には、ＭＨＣクラスＩ分子と結合し、細胞表面に提示される。【００２５】  Ｔリンパ球表面に存在するＴ細胞レセプター（Ｔ  ｃｅｌ��  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下、ＴＣＲともいう。）は、抗原提示細胞表面に提示されたＭＨＣクラスＩ分子とエピトープペプチドとの複合体を認識する。エピトープと結合するＴＣＲを持つＴリンパ球は、活性化されＣＴＬとなる。【００２６】  すなわち、本発明の評価方法によれば、特異的なＣＴＬ誘導能を確認することで、被検タンパク質中に、ＭＨＣクラスＩ分子に結合でき、かつ、ＴＣＲにより認識される抗原エピトープペプチドが存在することを容易に確認することが可能となる。【００２７】  以下に、本発明の評価方法の一例を具体的に説明する。【００２８】  （１．遺伝子導入工程）
まず、特異的なＣＴＬ誘導能の評価を行う被検タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだベクターを作製し、本発明の抗原提示細胞に導入する。【００２９】  前記被検タンパク質は、特に制限されず、アミノ酸がペプチド結合で直鎖状につながったものをいい、アミノ酸のみからなる単純タンパク質であってもよく、アミノ酸以外の構成成分を含む複合タンパク質（例えば、糖タンパク質、核タンパク質、リポタンパク質、ヘムタンパク質、金属タンパク質等）であってもよい。また、アミノ酸残基数も特に制限されず、例えば、オリゴペプチドやポリペプチド等であってもよい。【００３０】  前記遺伝子が組み込まれたベクターの作製方法としては、特に制限されず、従来公知の方法が適用でき、例えば、発現させたい遺伝子のｃＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ；相補的デオキシリボ核酸）を得た後、ＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ法；ポリメラーゼ連鎖反応法）によりｃＤＮＡを増幅させ、適当な発現ベクターに組み込むという方法等があげられる。前記発現ベクターとしては、特に制限されず、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター等があげられる。【００３１】  前記遺伝子の大きさには、特に制限はない。例えば、被検タンパク質の全長をコードした遺伝子を用いた場合であっても、細胞内でタンパク質分解を受け、エピトープ部位が抗原提示されるため、操作が非常に簡便である。また、前記遺伝子は、被検タンパク質の一部をコードするポリヌクレオチドであってもよい。【００３２】  被検タンパク質としては、例えば、がん細胞由来のものを用いることができる。ここで、ターゲットとするがん細胞としては、例えば、肝がん、胃がん、大腸がん、肺がん、乳がん、子宮がん、脳腫瘍等があげられる。本発明の評価方法によれば、後述のとおり、例えば、抗原エピトープペプチドを同定してそのペプチドを合成し、その合成ペプチドをペプチドワクチンとしてがん患者に投与して患者の体内でＣＴＬを誘導することや、その合成ペプチドを樹状細胞（ＤＣ）にパルスすることによりＤＣワクチンを製造してそのＤＣワクチンを患者に投与することが可能となる。また、抗原エピトープペプチドを含むタンパク質又はペプチド配列をコードする遺伝子をＤＮＡ等のポリヌクレオチドの形でワクチンとして患者に投与することも可能である（例えば、ＤＮＡワクチン等）。【００３３】  前記被検タンパク質としては、また、例えば、ウイルス由来のものを用いることができる。前記ウイルスとしては、例えば、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ；ヒト免疫不全ウイルス）、ＨＢＶ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ；Ｂ型肝炎ウイルス）、ＨＣＶ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ；Ｃ型肝炎ウイルス）、ＳＡＲＳ（Ｓｅｖｅｒ  Ａｃｕｔｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ；重症急性呼吸器症候群）の原因ウイルス等があげられる。本発明の評価方法によれば、後述のとおり、例えば、抗原エピトープペプチドを同定してそのペプチドを合成し、その合成ペプチドをウイルス感染症に対するワクチンとして利用することが可能である。よって、本発明の評価方法は、ウイルス感染症に対するワクチ��開発システムとして利用することができる。【００３４】  作製した前記ベクターを、抗原提示能を有する本発明の抗原提示細胞に導入する。【００３５】  本発明の抗原提示細胞は、Ｔ細胞共刺激因子及びＭＨＣクラスＩ分子を発現し、かつ、細胞内で発現される前記タンパク質の全部若しくは一部を前記ＭＨＣクラスＩ分子上に抗原提示できる確立された細胞株由来の細胞である。【００３６】  抗原提示細胞は、従来、ＤＣ等が用いられているが、末梢血から得られるＤＣは数が少なく、増殖させることができないため、抗原提示細胞として使用するための数の確保が困難な場合が多い。また、末梢血等からＤＣの前駆細胞を分離する場合には、サイトカインを用いて分化誘導を行わなければならない。対照的に、本発明の抗原提示細胞であれば、例えば、増殖が容易であり、分化誘導を行う必要もないため、抗原提示細胞の調製が容易である等の利点がある。【００３７】  また、従来のＤＣを用いるＣＴＬ誘導能の検査の場合では、検査のたびにドナーから細胞を採取しなければならない。さらに、ドナーにより細胞の性質が異なるため、一定の結果が得られにくい。対照的に、本発明の抗原提示細胞であれば、例えば、継代培養により均一の細胞が得られるため、条件を適宜設定することにより一定の結果が得られ、それにより、本発明の評価方法の再現性も向上する等の利点がある。【００３８】  本発明の抗原提示細胞は、付着性細胞であることが好ましい。ＤＣを抗原提示細胞として用いる場合、被検遺伝子の導入効率が非常に低いという問題がある。抗原提示細胞が付着性細胞であると、例えば、リポフェクション法等によるベクター導入効率が向上する利点がある。また、リンパ球と共培養する際にも、抗原提示細胞がシャーレ等の底面に付着しているほうが、リンパ球へのパルス効率が高くなる利点がある。【００３９】  本発明の抗原提示細胞は、腫瘍細胞由来細胞株に由来することが好ましい。腫瘍由来の細胞は、株の樹立が容易ではないが、常に半永久的に増殖が可能であり、さらに、その性質が安定しているからである。また、腫瘍細胞由来細胞株をＭＨＣクラスＩ分子やＴ細胞共刺激因子を発現するように改変した細胞株を、本発明の抗原提示細胞としてもよい。そのような本発明の抗原提示細胞は、従来公知の方法を適宜用いて作製することができる。例えば、文献［Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９３  Ｆｅｂ  １；２０８（２）：３５２−６．Ｍａｘｉｍａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃＤＮＡｓ  ＩＮ  ＣＯＳ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ＩＮ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｋｌｕｘｅｎ  ＦＷ，Ｌｕｂｂｅｒｔ  Ｈ．］を参照できる。【００４０】  具体的には、例えば、以下のような手順を用いて本発明の抗原提示細胞を作製できる。
１）ＭＨＣクラスＩ分子やＴ細胞共刺激因子等の発現させたい分子の遺伝子を増幅してｃＤＮＡを得た後、ＰＣＲ法で増幅し、適当な発現ベクターに組み込む。
２）使用する細胞株に前記発現ベクターを導入し、培地中で培養した後、抗生物質を含む培地でセレクションを行う。
３）さらに、抗体結合ビーズを用いて、組み換えタンパク質（前記発現させたい分子の遺伝子の遺伝子産物）を発現している細胞を濃縮する。
４）前記ビーズにより濃縮された細胞を選択し、前記細胞を限界希釈法等によってクローニングを行い、安定している細胞株を選択する。【００４１】  本発明の抗原提示細胞の具体例として、ＭＤＡ−ＣＤ８０細胞株等があげられる。ここで、ＭＤＡ−ＣＤ８０細胞株とは、ＭＨＣクラスＩ分子を発現している乳がん由来の腫瘍細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に、ＣＤ８０（Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ８０）をコードする遺伝子を導入し、ＣＤ８０分子を細胞表面で高発現するように改変した細胞株をいう。前記ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株は、例えば、ＡＴＣＣ等から入手することができる。そのほか、本発明の抗原提示細胞に使用できる腫瘍細胞由来細胞株としては、例えば、腎がん由来のＴＵＨＲ１０ＴＫＢ細胞株、胃がん由来のＪＲ−ｓｔ細胞株等があげられる。【００４２】  前記Ｔ細胞共刺激因子としては、例えば、ＣＤ８０（Ｂ７．１）分子やＣＤ８６（Ｂ７．２）分子等があげられる。これらの分子は、リンパ球の免疫機能を活性化するシグナルを伝達する分子の一つであり、リンパ球表面にあるＣＤ２８分子と結合することにより、リンパ球が活性化し、ＣＴＬが誘導される。本発明の抗原提示細胞では、ＣＤ８０分子及びＣＤ８６分子のいずれかが発現していればよく、好ましくは、ＣＤ８０分子である。ＣＤ８０分子とＣＤ８６分子とが同時に発現していてもよい。【００４３】  前記被検タンパク質をコードする遺伝子をベクターにより前記抗原提示細胞に導入する場合、被検タンパク質をコードする遺伝子に加え、ユビキチンをコードする遺伝子を発現可能に導入することが好ましく、より好ましくは、前記被検タンパク質とユビキチンとの融合タンパク質をコードする遺伝子を発現可能に導入することが好ましい。こうすることで抗原提示経路への移行が促進され、抗原提示能が向上し、それに伴いＣＴＬの誘導能が向上する。その結果、高感度にＣＴＬの誘導能を評価すること、すなわち、高感度なエピトープペプチドの存在の検出が可能となる。【００４４】  ここで、ユビキチンとは、７６アミノ酸残基からなるタンパク質であって、標的タンパク質に結合して分解の目印となるものである。ユビキチンが結合したタンパク質には、さらにユビキチンの付加が起こり、ポリユビキチン鎖が付加された標的タンパク質となる。これが分解のシグナルとなり、前記標的タンパク質は、細胞内のプロテアソームによって速やかに分解される。【００４５】  前記ベクターを前記抗原提示細胞に導入する方法としては、特に制限されず、一般的な手法を用いることができる。例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）デキストラン法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法等があげられるが、導入効率の高さの点からは、リポフェクション法が好ましい。リポフェクション法とは、脂質二重膜の小胞であるリポソームと導入するＤＮＡとの複合体を形成させ、貪食や膜融合により目的の遺伝子を細胞内に導入する方法である。【００４６】  （２．共培養工程）
次に、被検タンパク質をコードする遺伝子が導入された抗原提示細胞と、リンパ球とを共培養する。【００４７】  前記ベクターを導入した後、抗原提示細胞を培養し、抗原提示を行わせる。培養期間としては、例えば、２４時間〜４８時間が好ましい。それより長時間の培養の場合、ＣＴＬの誘導能が低下する場合があるからである。以下、抗原提示させた抗原提示細胞を、ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞（刺激細胞）ともいう。【００４８】  本発明の評価方法では、導入した遺伝子を安定して発現する細胞株を得ずとも一過性の遺伝子導入による発現によりＣＴＬの誘導を検出することができるため、ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞の準備期間の大幅な短縮が可能となる。一過性の発現株では抗原タンパク質の発現量が少ないことが問題となる場合があるが、例えば、前述のとおり、ユビキチンとの融合タンパク質とする等すれば、前記問題を解決できる。【００４９】  前記リンパ球としては、種々のものを使用できるが、ヒトリンパ球を用いることが好ましい。また、前記リンパ球としては、本発明の抗原提示細胞と少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ分子を共有するリンパ球が好ましく、より好ましくは、ＭＨＣクラスＩ分子が一致するリンパ球である。リンパ球を採取する方法としては、特に制限されず、例えば、血液から密度遠心勾配法により末梢血単核球（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌ、以下、ＰＢＭＣともいう。）を回収方法等があげられる。以下、前記ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞との共培養に使用するリンパ球を、ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞（反応細胞）ともいう。【００５０】  前記共培養において、前記ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞と前記ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞とを混合して培養する。その混合する比率は、特に制限されないが、例えば、ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞：ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞＝１：４程度が好ましい。【００５１】  混合した細胞を培養する培養条件としては、温度条件は、例えば、３４℃〜３８℃であって、好ましくは、３７℃であり、ＣＯ２条件は、例えば、２〜１０％ＣＯ２存在下であって、好ましくは、５％ＣＯ２存在下である。【００５２】  前記共培養の培養期間としては、５日間〜７日間程度の培養が好ましい。５日間以上の培養であれば、ＣＴＬの誘導が可能となり、また、新たな刺激を加えずに長期間培養すると細胞が死んでしまう場合があるからである。【００５３】  前記共培養の培地としては、ＡＩＭ−Ｖ培地（インビトロジェン社製）、ＲＰＭＩ−１６４０培地（インビトロジェン社製）、ダルベッコ改変イーグル培地（インビトロジェン社製）、ＴＩＬ（株式会社免疫生物研究所製）、表皮角化細胞培地（コージンバイオ株式会社製）、イスコフ培地（インビトロジェン社製）等、細胞培養に使用される市販の培地を使用できる。また、必要に応じて、５〜２０％のウシ血清、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ、以下、ＦＣＳともいう。）、ヒト血漿等を添加してもよい。また、必要に応じて、種々のサイトカインを添加してもよい。【００５４】  （３．ＣＴＬ誘導効率測定工程）
最後に、細胞を回収し、特異的なＣＴＬ誘導能の有無を確認する。確認する方法としては、特に制限されず、従来公知の方法を適用できるが、例えば、抗原エピトープペプチド配列が分かっている場合は、ＭＨＣクラスＩ／抗原ペプチド複合体の４量体であるテトラマーを用いたＣＴＬの定量法を適用できる。また、抗原エピトープペプチド配列が分かっていない場合には、ＥＬＩＳＰＯＴ法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  Ａｓｓａｙ）や、細胞内サイトカイン（インターフェロンγ）を測定する方法等を適用できる。【００５５】  以上のようにして本発明の評価方法を行うことで、被検タンパク質中に特異的なＣＴＬ誘導能を有する抗原エピトープペプチドが存在するか否かを確認でき、また、その誘導能を評価できる。【００５６】  本発明の抗原タンパク質のスクリーニング方法は、被検タンパク質の中から、本発明の評価方法により、ＣＴＬを特異的に誘導する抗原エピトープペプチドを含むタンパク質（以下、抗原タンパク質ともいう。）を同定する工程を含むスクリーニング方法である。このような方法であれば、例えば、様々ながん細胞由来タンパク質やウイルスタンパク質の中から、抗原エピトープペプチドを含むタンパク質を容易に探索できる。また、同定された前記タンパク質は、例えば、後述のように、新たな抗原エピトープペプチド同定のための絞込み対象とすることができる。【００５７】  本発明の抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法は、前記（Ａ）工程及び前記（Ｂ）工程の少なくとも一方を含むスクリーニング方法である。本発明の抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法において、前記被検タンパク質としては、公知の抗原タンパク質であってもよく、本発明の抗原タンパク質のスクリーニング方法により同定された新規な抗原タンパク質であってもよい。前記被検タンパク質としては、後者の抗原タンパク質が好ましい。【００５８】  前記（Ａ）工程は、例えば、本発明の抗原タンパク質のスクリーニング方法により同定された抗原タンパク質、又は抗原エピトープペプチドが未知である公知の抗原タンパク質の一部からなる様々な部分ペプチドを被検タンパク質（以下、被検部分ペプチドともいう。）として本発明の評価方法を行い、前記被検部分ペプチドから抗原エピトープペプチドを含む部分ペプチドを同定する工程である。このような方法を、前記抗原提示細胞に導入する前記被検部分ペプチドの長さや切断箇所を変えて行うことで、前記抗原エピトープペプチドの絞込みが可能となり、最終的に、前記抗原エピトープペプチドが同定できる。抗原エピトープペプチドのアミノ酸残基数は、一般的には、９〜１１残基である。【００５９】  前記（Ｂ）工程は、例えば、本発明の抗原タンパク質のスクリーニング方法により同定された抗原タンパク質に基づき、様々な被検部分ペプチドを合成し、この合成した被検部分ペプチドを本発明の抗原提示細胞と接触させた後、又は接触させながら、リンパ球と共培養し、前記リンパ球における特異的なＣＴＬの誘導効率を調べ、前記被検部分ペプチドから抗原エピトープペプチドを同定する工程である。被検部分ペプチドの長さや切断箇所を変えて行うことで、前記抗原エピトープペプチドの絞込��が可能となり、最終的に、前記抗原エピトープペプチドが同定できる。抗原エピトープペプチドのアミノ酸残基数は、一般的には、９〜１１残基である。【００６０】  本発明のキットは、本発明のＣＴＬ誘導能評価方法に用いる評価キットであって、本発明の抗原提示細胞を含むことを特徴とする。また、本発明のキットは、別の態様として、本発明の抗原タンパク質及び／又は抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法に用いるスクリーニングキットであって、本発明の抗原提示細胞を含むことを特徴とする。従来、ＣＴＬの誘導能を評価するためには、その度、抗原提示細胞を調製する必要があり、このようなキット化は困難である。しかし、本発明の抗原提示細胞を用いれば、キット化が可能となり、これにより、簡便で精度が優れたＣＴＬの誘導能評価方法並びに抗原タンパク質及び／又は抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法が可能となる。また、本発明のキットは、前記本発明の抗原提示細胞の他に、培養用の培地や試薬等、適宜必要なものを含めることができる。【００６１】  本発明のＣＴＬ誘導能を有する抗原エピトープペプチドの製造方法は、本発明の抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法により抗原エピトープペプチドを同定する工程を含み、その他の工程については、特に制限されない。本発明の製造方法は、さらに、前記タンパク質から同定された抗原エピトープペプチドを分離する工程や、前記同定された抗原エピトープペプチドを合成する工程を含むことが好ましい。
【実施例】
【００６２】  以下に、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明する。ただし、本発明がこれらに限定されないことは、言うまでもない。
実施例１【００６３】  ＜ＭＤＡ−ＣＤ８０細胞株の樹立＞
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株をヒトＣＤ８０分子を恒常的に発現するように改変した細胞株であるＭＤＡ−ＣＤ８０細胞株の樹立は、下記方法で行った。【００６４】  ＣＤ８０分子を発現している細胞から抽出したＲＮＡを使用してＲＴ−ＰＣＲ法により鋳型となるｃＤＮＡ断片を調製し、下記２種類の合成オリゴＤＮＡからなるプライマーＣＤ８０：Ｆ及びｈＢ７−１：Ｒを使用して、ＰＣＲ法によりＣＤ８０遺伝子断片を増幅した。下記プライマー塩基配列における下線部は、ベクターに挿入するための制限酵素サイトの配列（ＨｉｎｄＩＩＩ；ＣＤ８０：Ｆ、ＸｂａＩ；ｈＢ７−１：Ｒ）を示す。【００６５】
【化１】
2006040920.tif 000002
【００６６】  ＰＣＲは、ＬＡＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて、最初に９４℃で３分間反応し、次に、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒を１サイクルとして３０サイクル反応し、最後に、７２℃で５分間反応するという反応条件で行った。前記ＰＣＲ法で特異的に増幅されたＤＮＡ断片を、１．５％アガロースゲル電気泳動により切り出し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで処理し、プラスミドｐＲＣ／ＣＭＶ（インビトロジェン社製）のＨｉｎｄＩＩＩ部位とＸｂａＩ部位との間に挿入し、ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＣＤ８０を得た。挿入されたヒトＣＤ８０ｃＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシーケンサーで確認したところ、文献［Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｇ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１４３  ２７１４−２７２２（１９８９）］で報告されたヒトＣＤ８０のｃＤＮＡ塩基配列と完全に一致した。【００６７】  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、直径３５ｍｍのシャーレを用い、１０％ＦＣＳ（ＣＥＬＬｅｃｔ  Ｇｏｌｄ  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ、ＩＣｓＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ製）含有ＲＰＭＩ１６４０培地で、４〜６時間培養した。この細胞に６μｇの前記ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＣＤ８０をリポフェクション法で導入した。導入４８時間後、一過的にＣＤ８０分子を発現していることをフローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ  ＸＬ／ＭＣＬ、ベックマン・コールター社製）を用いたフローサイトメトリー（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ、以下、ＦＡＣＳともいう。）で確認した。同時に、培地を前記培地に抗生物質Ｇ４１８を添加した培地に換えて、プラスミドが染色体に組み込まれた細胞を選択した。さらに、選択された細胞を限界希釈法によって単一細胞からクローニングし、ヒトＣＤ８０分子を安定に発現する細胞株ＭＤＡ−ＣＤ８０を得た。【００６８】  前記ＭＤＡ−ＣＤ８０が、ＣＤ８０分子を発現していることを、抗ＣＤ８０抗体を用いたＦＡＣＳ及び前記ＭＤＡ−ＣＤ８０から抽出したｍＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ法により確認した。その結果の一例を、図１及び図２に示す。図１において、縦軸が細胞数、横軸が１つの細胞における蛍光の強さ（ＣＤ８０分子の発現頻度）を表す。また、白い山は、コントロール（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）の細胞、黒い山は、ＭＤＡ−ＣＤ８０の細胞の結果を表す。同図に示すとおり、ＦＡＣＳにより、前記ＭＤＡ−ＣＤ８０上にＣＤ８０分子が発現していることが確認された。また、図２において、レーンａは、マーカーであり、レーンｂは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１であり、レーンｃは、ＭＤＡ−ＣＤ８０である。同図に示すとおり、前記ＭＤＡ−ＣＤ８０（レーンｃ）では、その親細胞であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１（レーンｂ）よりもＣＤ８０のｍＲＮＡが高発現していることが確認された。【００６９】  ＜ＢＭＬＦ１遺伝子導入によるＣＴＬの誘導＞
ＢＭＬＦ１を発現している細胞から抽出したＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ法を行い、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。前記ＢＭＬＦ１とは、ＥＢＶ（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ）由来のタンパク質である。作製したｃＤＮＡライブラリーからＢＭＬＦ１遺伝子断片を選択し、取得したＢＭＬＦ１断片をＰＣＲ法により増幅した。増幅された遺伝子断片は、１，３１７ｂｐであった。【００７０】  ｐＴｒａｃｅｒＴＭ−ＳＶ４０（商品名、インビトロジェン社製、以下、ｐＴｒａｃｅｒともいう。）と、ユビキチン遺伝子（以下、Ｕｂともいう。）とを、制限酵素ＡｆｌＩＩ及びＫｐｎＩで切断し、ｐＴｒａｃｅｒの制限酵素切断部位の間に、Ｕｂを挿入して、ｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂを作製した。【００７１】  前記ｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂと、前記ＢＭＬＦ１断片とを、制限酵素ＫｐｎＩ及びＮｏｔＩで切断し、ｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂの制限酵素切断部位の間に、ＢＭＬＦ１を挿入し、ｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂ−ＢＭＬＦ１を作製した。【００７２】  Ｕｂを導入しない場合のため、前記ｐＴｒａｃｅｒと、前記ＢＭＬＦ１断片とを、制限酵素ＫｐｎＩ及びＮｏｔＩで切断し、ｐＴｒａｃｅｒの制限酵素切断部位の間に、ＢＭＬＦ１を挿入し、ｐＴｒａｃｅｒ−ＢＭＬＦ１を作製した。【００７３】  １×１０６細胞のＭＤＡ−ＣＤ８０細胞株を、６ウェルプレート（住友ベークライト社製）にて、４〜１２時間培養した後、ｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂ−ＢＭＬＦ１（４μｇ）をリポフェクション法により前記ＭＤＡ−ＣＤ８０細胞に導入した。【００７４】  ２４時間後、ＦＡＣＳによりＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；緑色蛍光タンパク質）の発現量を測定することで導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ；トランスフェクション）効率を確認した。【００７５】  ｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂ−ＢＭＬＦ１を導入したＭＤＡ−ＣＤ８０細胞を、１×１０６細胞あたり１００μｇのマイトマイシン（マイトマイシン注用２ｍｇ、協和発酵工業株式会社製）を使用して３０分間処理し、ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞とした。【００７６】  他方、血液から血球遠心分離剤（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、ＡＸＩＳ−ＳＨＩＥＬＤ  ＰｏＣ  ＡＳ製）を用いた遠心分離法により、ＰＢＭＣを調製し、ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞とした。【００７７】  前記ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞（５×１０５細胞）と、前記ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞（２×１０６細胞）とを混合して３７℃、５％ＣＯ２条件下で、７日間培養した。この際、ＩＬ−２（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ、ＣＨＩＲＯＮ（カイロン）社製）を１００Ｕ／ｍｌとなるように添加した。培地は、１０％ＦＣＳ添加ＡＩＭ−Ｖ培地を使用した。【００７８】  ７日間の培養後、細胞を回収し、１００μｌあたり５×１０５細胞となるようにＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、リン酸バッファー、ダルベッコＰＢＳ（−）、日水製薬株式会社製）に懸濁した。【００７９】  前記細胞懸濁液に、５μｌのａｎｔｉ−ＣＤ８０−ＦＩＴＣ（ＣＤ８α、ＩＭＭＵＮＯＴＥＣＨ社製）と、５μｌのＢＭＬＦ１特異的Ｔ−ｓｅｌｅｃｔ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩ  ｔｅｔｒａｍｅｒ−ＰＥ（Ｔ−ｓｅｌｅｃｔ  ＨＬＡ−Ａ＊０２０１  ＥＢＶ  Ｔｅｔｒａｍｅｒ−ＧＬＣＴＬ���ＡＭＬ−ＰＥ、株式会社医学生物学研究所製）とを添加し、室温にて１５分間反応させた。【００８０】  細胞をＰＢＳで洗浄し、再びＰＢＳで懸濁した後、ＣＤ８を発現し（ＣＤ８−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）かつＢＭＬＦ１を認識することができる（ｔｅｔｒａｍｅｒ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）細胞集団をＦＡＣＳで測定した。ＣＤ８を発現し、かつ、テトラマーに結合できるものが、ＢＭＬＦ１に対する特異的なＣＴＬである。【００８１】  前記ＦＡＣＳ測定の結果の一例を図３Ａ〜Ｃに示す。図３Ａは、ＭＤＡ−ＣＤ８０にｐＴｒａｃｅｒのみを導入したＭｏｃｋ処理の結果の一例であり、図３Ｂは、ＭＤＡ−ＣＤ８０にｐＴｒａｃｅｒ−ＢＭＬＦ１を導入した結果の一例であり、図３Ｃは、ＭＤＡ−ＣＤ８０にｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂ−ＢＭＬＦ１を導入した結果の一例である。図３Ａ〜Ｃの右図において、横軸が、ＦＩＴＣ−ＣＤ８のシグナルを示し、縦軸が、ＰＥ−Ｔｅｔｒａｍｅｒのシグナルを示す。図３Ａ及び図３Ｂに示すとおり、ＭＤＡ−ＣＤ８０にウイルス由来の全長タンパク質をコードした遺伝子を導入することで抗原提示させ、特異的なＣＴＬを誘導できることが確認された。また、図３Ｃに示すとおり、ユビキチンと抗原ペプチドとの融合遺伝子を導入した場合には、導入しなかった場合（図３Ｂ）と比較して、特異的なＣＴＬ誘導・検出効率が、３倍以上向上することが確認された。
実施例２【００８２】  ＜Ｍａｒｔ１遺伝子導入によるＣＴＬの誘導＞
１×１０６細胞のＭＤＡ−ＣＤ８０細胞株（実施例１で作製したもの）を６ウェルプレートにて４〜１２時間培養した。【００８３】  Ｍａｒｔ１を発現している細胞から抽出したＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲ法を行い、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。前記Ｍａｒｔ１とは、メラノーマ（悪性黒色腫）の抗原タンパク質である。【００８４】  作製した前記ｃＤＮＡライブラリーからＭａｒｔ１遺伝子断片を選択し、取得したＭａｒｔ１遺伝子断片をＰＣＲ法により増幅した。増幅された遺伝子断片は、３５７ｂｐであった。【００８５】  前記ｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂと、前記Ｍａｒｔ１遺伝子断片とを、制限酵素ＫｐｎＩ及びＳｐｅＩで切断し、ｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂの制限酵素切断部位の間にＭａｒｔ１を挿入し、ｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂ−Ｍａｒｔ１を作製した。【００８６】  Ｕｂを導入しない場合のため、前記ｐＴｒａｃｅｒと、前記Ｍａｒｔ１遺伝子断片とを、制限酵素ＫｐｎＩ及びＳｐｅＩで切断し、ｐＴｒａｃｅｒの制限酵素切断部位の間にＭａｒｔ１を挿入し、ｐＴｒａｃｅｒ−Ｍａｒｔ１を作製した。【００８７】  前記ｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂ−Ｍａｒｔ１を、実施例１と同様のリポフェクション法により、ＭＤＡ−ＣＤ８０細胞に導入し、２４時間後、ＦＡＣＳによりＧＦＰの発現量を測定することでトランスフェクション効率を確認した。【００８８】  ｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂ−Ｍａｒｔ１を導入したＭＤＡ−ＣＤ８０細胞を、１×１０６細胞あたり１００μｇのマイトマイシンを使用して３０分間処理し、ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞とした。【００８９】  他方、血液から血球遠心分離剤（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、ＡＸＩＳ−ＳＨＩＥＬＤ  ＰｏＣ  ＡＳ製）を用いた遠心分離法により、ＰＢＭＣを調製し、ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞とした。【００９０】  前記ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞（５×１０５細胞）と、前記ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞（２×１０６細胞）とを混合して３７℃、５％ＣＯ２条件下で、７日間培養した。この際、ＩＬ−２を１００Ｕ／ｍｌとなるように添加した。培地は、１０％ＦＣＳ添加ＡＩＭ−Ｖ培地を使用した。【００９１】  ７日間の培養後、細胞を回収し、１００μｌあたり５×１０５細胞となるようにＰＢＳに懸濁した。【００９２】  前記細胞懸濁液に、５μｌのａｎｔｉ−ＣＤ８０−ＦＩＴＣと、５μｌのＭａｒｔ１特異的Ｔ−ｓｅｌｅｃｔ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩ  ｔｅｔｒａｍｅｒ−ＰＥ（Ｔ−ｓｅｌｅｃｔ  ＨＬＡ−Ａ＊０２０１  Ｍａｒｔ１  Ｔｅｔｒａｍｅｒ−ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ−ＰＥ、株式会社医学生物学研究所製）とを添加し、室温にて１５分間反応させた。【００９３】  細胞をＰＢＳで洗浄し、再びＰＢＳで懸濁した後、ＣＤ８を発現し（ＣＤ８−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）かつＭａｒｔ１を認識することができる（ｔｅｔｒａｍｅｒ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）細胞集団をＦＡＣＳで測定した。ＣＤ８を発現し、かつ、テトラマーに結合できるものが、Ｍａｒｔ１に対する特異的なＣＴＬである。【００９４】  前記ＦＡＣＳ測定の結果の一例を図４Ａ〜Ｃに示す。図４Ａは、ＭＤＡ−ＣＤ８０にｐＴｒａｃｅｒのみを導入したＭｏｃｋ処理の結果の一例であり、図４Ｂは、ＭＤＡ−ＣＤ８０にｐＴｒａｃｅｒ−Ｍａｒｔ１を導入した結果の一例であり、図４Ｃは、ＭＤＡ��ＣＤ８０にｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂ−Ｍａｒｔ１を導入した結果の一例である。図４Ａ〜Ｃの右図において、横軸が、ＦＩＴＣ−ＣＤ８のシグナルを示し、縦軸が、ＰＥ−Ｔｅｔｒａｍｅｒのシグナルを示す。図４Ａ及び図４Ｂに示すとおり、ＭＤＡ−ＣＤ８０に腫瘍細胞由来の全長タンパク質をコードした遺伝子を導入することで抗原提示させ、特異的なＣＴＬを誘導できることが確認された。また、図４Ｃに示すとおり、ユビキチンと抗原ペプチドとの融合遺伝子を導入した場合には、導入しなかった場合（図４Ｂ）と比較して、特異的なＣＴＬ誘導・検出効率が、２．７倍向上することが確認された。
実施例３【００９５】  ＜細胞内サイトカイン（インターフェロンγ）の測定によるＣＴＬ誘導能評価＞
ＢＭＬＦ１遺伝子をＭＤＡ−ＣＤ８０細胞に導入してＣＴＬを誘導し、誘導されたＣＴＬが産生するインターフェロンγ（以下、ＩＦＮ−γともいう。）を測定することで、ＢＭＬＦ１のＣＴＬ誘導能を評価した。【００９６】  実施例１と同様にしてｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂ−ＢＭＬＦ１及びｐＴｒａｃｅｒをＭＤＡ−ＣＤ８０に導入してｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞を調製し、また、実施例１と同様にしてｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞を調製した。【００９７】  前記ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞（５×１０５細胞）と、前記ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞（２×１０６細胞）とを混合して３７℃、５％ＣＯ２条件下で、７日間培養した。この際、ＩＬ−２を１００Ｕ／ｍｌとなるように添加した。培地は、１０％ＦＣＳ添加ＡＩＭ−Ｖ培地を使用した。ここで、前記ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞は、ｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂ−ＢＭＬＦ１を導入したＭＤＡ−ＣＤ８０及びｐＴｒａｃｅｒを導入したＭＤＡ−ＣＤ８０である。【００９８】  ７日間の培養後、ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞を回収し、ＰＢＳ（−）で洗浄した。ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞は、前述のとおり、事前にマイトマイシン処理してあるため、７日間の培養後には、回収した細胞群には、ほぼｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞のみが残っていることになる。【００９９】  前記１回目のｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞の刺激により誘導されたＣＴＬは、ＩＦＮ−γを誘導するが、７日間の培養の間にＩＦＮ−γ産生量が減少してしまう。ＩＦＮ−γの産生量を検出しやすくするため、２回目の刺激を行った。１回目の刺激ですでにＣＴＬの誘導が行われているため２回目の刺激は短時間でもよい。また、下記の２回目刺激には、エピトープペプチドをパルスしたＭＤＡ−ＣＤ８０を使用しているが、エピトープペプチドが未知である場合には、ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞として、例えば、ユビキチン−抗原タンパク質の融合タンパク質をｐＴｒａｃｅｒ等により導入したＭＤＡ−ＣＤ８０を用いることができる。【０１００】  回収したｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞（２×１０５細胞）を、１００μｌの１０％ＦＣＳ添加ＡＩＭ−Ｖ培地に懸濁した。また、２回目のｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞として、エピトープペプチドをパルスしたＭＤＡ−ＣＤ８０（１×１０５細胞）を１００μｌの１０％ＦＣＳ添加ＡＩＭ−Ｖ培地に懸濁して調製した。【０１０１】  前記ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞と前記ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞とを、９６ウェル丸底プレート（住友ベークライト社製）において混合し、５０Ｕｎｉｔ／ｍｌのＩＬ−２と、４０μｇ／ｍｌのＢｅｆｅｌｄｉｎＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）とを添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で、４〜６時間培養した。前記ＢｅｆｅｌｄｉｎＡは、サイトカインの細胞外への放出を阻害する試薬である。そのため、細胞内で産生されたＩＦＮ−γは、細胞内に蓄積されることとなる。【０１０２】  細胞を回収し、ＰＢＳ（−）で洗浄し、１００μｌのＰＢＳ（−）に懸濁し、５μｌのＡｎｔｉ−ＣＤ８ＦＩＴＣと５μｌのＡｎｔｉ−ＣＤ３−ＰＣ５とをそれぞれ加え、室温で１５分間反応させた。【０１０３】  １００μｌのＩｎｔｒａＰｒｅｐ  Ｒｅａｇｅｎｔ１（細胞膜透過処理試薬、ベックマン・コールター社製）を添加した。前記ＩｎｔｒａＰｒｅｐ  ���ｅａｇｅｎｔ１は、細胞を固定するための薬品である。サンプルをボルテックスにかけてよく混合し、室温・暗所で１５分間静置した。細胞を回収し、ＰＢＳ（−）で洗浄し、１００μｌのＰＢＳ（−）に懸濁した。その後、１００μｌのＩｎｔｒａＰｒｅｐ  Ｒｅａｇｅｎｔ２（細胞膜透過処理試薬、ベックマン・コールター社製）を添加し、室温・暗所で５分間静置した。前記ＩｎｔｒａＰｒｅｐ  Ｒｅａｇｅｎｔ２は、固定された細胞表面に穴をあけ、抗体が細胞内のＩＦＮ−γと反応できるようにするための試薬である。【０１０４】  ５μｌのＡｎｔｉ−ＩＦＮ−γ−ＦＩＴＣ（ＩＭＭＵＮＯＴＥＣＨ社製）を添加し、室温・暗所で１５分間反応させた。細胞を回収し、ＰＢＳ（−）で洗浄し、ＦＡＣＳによりＣＤ３陽性かつＣＤ８陽性かつＩＦＮ−γ陽性細胞を測定した。【０１０５】  その結果の一例を図５Ａ〜Ｂに示す。図５Ａは、ＭＤＡ−ＣＤ８０にｐＴｒａｃｅｒのみを導入したＭｏｃｋ処理の結果の一例であり、図５Ｂは、ＭＤＡ−ＣＤ８０にｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂ−ＢＭＬＦ１を導入した結果の一例である。図５Ａ〜Ｂにおいて、横軸が、ＦＩＴＣ−ＣＤ８のシグナルを示し、縦軸が、ＩＦＮ−γのシグナルを示す。図５Ａ及び図５Ｂに示すとおり、ｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂ−ＢＭＬＦ１を導入したＭＤＡ−ＣＤ８０を１回目の刺激に用いた場合、産生されるＩＦＮ−γ量が、ｐＴｒａｃｅｒのみを導入した場合と比較して高くなっていることが確認された。すなわち、ＢＭＬＦ１遺伝子を導入したことにより、抗原提示が行われ、特異的なＣＴＬが誘導されたことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】  以上説明したように、本発明によれば、迅速かつ簡便に特異的なＣＴＬ誘導能評価が可能であるから、抗原タンパク質及び抗原エピトープペプチドのスクリーニングが迅速かつ簡便にできる。したがって、本発明は、例えば、新規抗原エピトープペプチド探索の分野であり、また、がんや感染症等の治療／予防に関する免疫細胞療法を含む医療分野に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１０７】配列番号１  プライマー  ＣＤ８０：Ｆ
配列番号２  プライマー  ｈＢ７−１：Ｒ
【図１】
2006040920.tif 000003
【図２】
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【図３Ａ】
2006040920.tif 000005
【図３Ｂ】
2006040920.tif 000006
【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
2006040920.tif 000008
【図４Ｂ】
2006040920.tif 000009
【図４Ｃ】
2006040920.tif 000010
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【国際調査報告】
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