(57)【要約】  DIs株ウイルスベクターに外来遺伝子としてSARS-CoVタンパク質の全部もしくは一部のタンパク質をコードするDNAを挿入し、この組換えDIsをマウスに感染させたところ、マウス血中にSARS-CoVの細胞への結合を阻止する抗体が誘導されることが分かった。本発明の組換えウイルスは、SARSに対する効果的な生ワクチンとなるものと期待される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
SARS-コロナウイルスタンパク質の全部もしくは一部のタンパク質をコードするDNAをゲノムDNA上に保有し、該タンパク質を発現し得る組換えワクチニアウイルスDIs株。
【請求項２】
前記SARS-コロナウイルスタンパク質が構造タンパク質である、請求項１に記載の組換えワクチニアウイルスDIs株。
【請求項３】
前記構造タンパク質が、Ｅ、Ｍ、Ｎ、およびＳタンパク質からなる群より選択される1もしくは複数のタンパク質である、請求項２に記載の組換えワクチニアウイルスDIs株。
【請求項４】
発現可能な状態で前記タンパク質をコードするDNAがゲノムDNAの非必須領域上に配置された構造のゲノムを有する、請求項１〜３のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株。
【請求項５】
非必須領域が対DI株欠損領域もしくは該領域の近傍領域である、請求項４に記載の組換えワクチニアウイルスDIs株。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株のゲノムDNA。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株を有効成分として含む、SARS-コロナウイルスワクチン。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株を有効成分として含む、ウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答誘導剤。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株を有効成分として含む、SARS-コロナウイルス中和抗体誘導剤。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株を有効成分として含む、呼吸器表面におけるSARS-コロナウイルスに対する粘膜免疫誘導剤。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株の、請求項７に記載のワクチンの製造における使用。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株の、請求項８〜１０のいずれかに記載の薬剤の製造における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、SARS-コロナウイルス構造タンパク質の全部もしくは一部のタンパク質をコードするDNAをゲノムDNA上に保有し、該タンパク質を発現し得る組換えワクチニアウイルスDIs株に関する。
【背景技術】
【０００２】
2002年11月に、中国で発熱と呼吸器症状を主訴とする原因不明の重症急性呼吸器症候群（Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS）が出現し、近年の飛行機を利用した旅行を介して世界各国に広まった。この世界的なSARSアウトブレイクに対し、WHOを中心とする全世界的な協力体制が敷かれ、原因ウイルスが新種のコロナウイルス（SARS-coronavirus, SARS-CoV）であることが明らかにされた（非特許文献１および２参照）。さらに、SARS-CoVの完全な遺伝子配列が決定された結果、SARS-CoVは既知のコロナウイルスとは全く異なるグループに分類され（非特許文献３および４参照）、おそらく動物のコロナウイルスからヒトに感染して病原性を獲得したと推測されている（非特許文献５参照）。【０００３】
WHOの報告によると、これまでに8098人の感染者と774人の死者が確認されている。現在流行は収束しているが、SARS-CoVの自然宿主は未だ明らかではなく、今後再流行する可能性は高い。ウイルス感染後の潜伏期間は平均４〜６日、ウイルスは感染者の咳や唾液、尿糞便中に特に病極期に大量に排泄され、このような重篤な感染者に濃厚に接触する病院関係者に飛沫を介して高率に感染伝搬すると考えられている。SARS感染患者に対しては、一般の肺炎と同じ抗生物質投与や抗ウイルス剤の投与が行われているが、現在までに有効な治療法はまだ確立されておらず、感染予防や感染後の発症抑制、ウイルス排除のための特異的なワクチン開発が強く望まれている。【０００４】
【非特許文献１】Ksiazek, G.T.ら著、「A novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome.」、N. Eng. J. Med.、2003年、Vol.348、p.1953
【非特許文献２】Drosten, C.ら著、「Identification of a novel coronavirus in patients with severe acute respiratory syndrome.」、N. Eng. J. Med.、2003年、Vol.348、p.1967
【非特許文献３】Rota, A.P.ら著、「Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome.」、Science、2003年、Vol.300、p.1394
【非特許文献４】Marra, A.M.ら著、「The genome sequence of the SARS-associated coronavirus.」、Science、2003年、Vol.300、p.1399
【非特許文献５】Holme, V.K. および Enjuanes, L.著、「The SARS Coronavirus: A postgenetic era.」、Science、2003年、Vol.300、p.1377
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は上記状況に鑑みて為されたものであり、その目的は、SARSに対して感染予防もしくはウイルス排除のための効果的なワクチンの提供を課題とする。より具体的には、SARS-CoVタンパク質の全部もしくは一部のタンパク質をコードするDNAをゲノムDNA上に保有し、該タンパク質を発現し得る組換えワクチニアウイルスDIs株の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。まず、本発明者らは、DIs株の遺伝子構造の解析を行い、DIs株のゲノムDNAの左端に１箇所の大きな欠損があることを見出した。そして、該欠損部位を挟む領域の中央に挿入されるトランスファーベクターを構築し、相同組換えによって目的とする外来遺伝子と大腸菌由来の薬剤耐性遺伝子XGPRTが挿入されるようなウイルスベクターを設計した。【０００７】
このようにして設計されたDIs株のウイルスベクターとしての有用性を確認するため、外来遺伝子としてT7 polymeraseを組み込んだウイルスを細胞に感染させ、T7 promoterの下流にルシフェラーゼ遺伝子をつないだプラスミドをトランスフェクトしたところ、強いルシフェラーゼ活性が観察された。またいずれの細胞でもCPE（cytopathic effects）は観察されず、さらに感染細胞で増殖せず、細胞傷害性も殆ど見られないことから、ウイルスベクターとして極めて有用であることが示唆された。【０００８】
またDIs株に外来遺伝子としてSARSコロナウイルス(SARS-CoV)タンパク質の全部もしくは一部のタンパク質をコードするDNAを挿入したところ、CTLが誘導されることが分かった。この組換えウイルスを投与することによって、SARS-CoVがコードする蛋白に対する強いCTL応答を誘導することができると考えられる。【０００９】
またDIs株に外来遺伝子としてSARS-CoVタンパク質の全部もしくは一部のタンパク質をコードするDNAを挿入し、この組換えDIsをマウスに感染させたところ、マウス血中にSARS-CoVの細胞への結合を阻止する抗体が誘導されることが分かった。従って本発明の組換えウイルスは、SARSに対する効果的な生ワクチンとなる可能性が考えられる。【００１０】
また本発明者らは、上記組換えDIs株をマウスへ投与することにより、呼吸器官における粘膜免疫を誘導し得る効果を見出した。SARSの感染ルートを勘案すると、呼吸器表面における免疫誘導が可能なワクチンは、感染防御に対して非常に有用であり、実効性の高いものと期待される。【００１１】
さらに本発明者らは、両末端の一部の配列を除くDIsの全塩基配列を決定することに成功した。これにより、より効率的な組換えDIsの作製が可能となった。
また本発明者らは、マウスへ本発明の組換えDIs株を皮下または経鼻投与することにより、該マウスがSARS-CoVの感染から完全に防御されることを実証した。【００１２】
即ち本発明は、SARS-CoVタンパク質の全部もしくは一部のタンパク質をコードするDNAをゲノムDNA上に保有し、該タンパク質を発現し得る組換えワクチニアウイルスDIs株に関し、より詳しくは、
〔１〕  SARS-コロナウイルスタンパク質の全部もしくは一部のタンパク質をコードするDNAをゲノムDNA上に保有し、該タンパク質を発現し得る組換えワクチニアウイルスDIs株、
〔２〕  前記SARS-コロナウイルスタンパク質が構造タンパク質である、〔１〕に記載の組換えワクチニアウイルスDIs株、
〔３〕  前記構造タンパク質が、Ｅ、Ｍ、Ｎ、およびＳタンパク質からなる群より選択される1もしくは複数のタンパク質である、〔２〕に記載の組換えワクチニアウイルスDIs株、
〔４〕  発現可能な状態で前記タンパク質をコードするDNAがゲノムDNAの非必須領域上に配置された構造のゲノムを有する、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株、
〔５〕  非必須領域が対DI株欠損領域もしくは該領域の近傍領域である、〔４〕に記載の組換えワクチニアウイルスDIs株、
〔６〕  〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株のゲノムDNA、
〔７〕  〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株を有効成分として含む、SARS-コロナウイルスワクチン、
〔８〕  〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株を有効成分として含む、ウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答誘導剤、
〔９〕  〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株を有効成分として含む、SARS-コロナウイルス中和抗体誘導剤、
〔１０〕  〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株を有効成分として含む、呼吸器表面におけるSARS-コロナウイルスに対する粘膜免疫誘導剤、
を提供するものである。
さらに本発明は、以下の〔１１〕〜〔２０〕を提供するものである。
〔１１〕  前記組換えワクチニアウイルスDIs株の、SARS-コロナウイルスワクチンの製造における使用、
〔１２〕  前記組換えワクチニアウイルスDIs株の、ウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答誘導剤の製造における使用、
〔１３〕  前記組換えワクチニアウイルスDIs株の、SARS-コロナウイルス中和抗体誘導剤の製造における使用、
〔１４〕  前記組換えワクチニアウイルスDIs株の、呼吸器表面におけるSARS-コロナウイルスに対する粘膜免疫誘導剤の製造における使用、
〔１５〕  前記組換えワクチニアウイルスDIs株を個体（対象者、被検者、患者等）へ投与する工程を含む、ウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導する方法、
〔１６〕  前記組換えワクチニアウイルスDIs株を個体（対象者、被検者、患者等）へ投与する工程を含む、SARS-コロナウイルス中和抗体を誘導する方法、
〔１７〕  前記組換えワクチニアウイルスDIs株を個体（対象者、被検者、患者等）へ投与する工程を含む、呼吸器表面におけるSARS-コロナウイルスに対する粘膜免疫を誘導する方法、
〔１８〕  前記組換えワクチニアウイルスDIs株を個体（対象者、被検者、患者等）へ投与する工程を含む、SARSウイルスの感染を防御、またはSARSウイルスを排除する方法、
〔１９〕前記組換えワクチニアウイルスDIs株を個体（対象者、被検者、患者等）へ投与する工程を含む、SARS(重症急性呼吸器症候群)を予防もしくは治療する方法、
〔２０〕  前記組換えワクチニアウイルスDIs株、および薬学的に許容された担体を含んでなる組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ワクチニアウイルスDIs株のゲノムの解析と同定された欠損部位を模式的に示す図である。ゲノムの左端に近い部位15.4kbpが欠損していた。欠損部分を挟む1.9kbpのフラグメントを増幅し、トランスファーベクターの相同組換え領域として使用した。
【図２】図２は、DIsトランスファーベクターpDIsmH5の構造を示す図である。mH5プロモーターの下流のマルチクローニングサイト(MCS)に目的の外来遺伝子を挿入する。
【図３】図３は、相同組換えによる組換えDIs作成の一例を模式的に示す図である。DIsをCEFに感染させた後トランスファーベクターを感染細胞内にトランスフェクションすると、低い確率ではあるがウイルス複製の過程でウイルスのDNAポリメラーゼがベクター側に組み込まれたDIsの領域を複製するため、目的遺伝子が組み込まれたDIsが生成する。この際に薬剤耐性遺伝子XGPRTも同時に組み込まれるため、MPA存在下でプラークアッセイを行うと目的とするDIsのみが増幅する。
【図４】図４は、構築したトランスファーベクターの構造を示す図である。図中のmH5は、ワクチニアH5Rタンパク質の改変プロモーター（modified promoter of vaccinia H5R protein）を示す。
【図５】図５は、構築したトランスファーベクターの構造を示す図である。
【図６】図６は、CEF細胞におけるSARS-CoV N タンパク質の発現確認について示す写真である。左側は、蛍光抗体法による確認結果を示す写真である。右側は、ウエスタンブロット法による確認結果を示す写真である。図中、ポジティブコントロール（P.C.）は、SARS-CoV感染細胞上清、ネガティブコントロール（N.C.）は 非感染細胞上清を示す。
【図７】図７は、CEF細胞におけるSARS-CoV S タンパク質の発現確認について示す写真である。左側は、蛍光抗体法による確認結果を示す写真である。右側は、ウエスタンブロット法による確認結果を示す写真である。図中、ポジティブコントロール（P.C.）はSARS-CoV感染細胞上清、ネガティブコントロール（N.C.）は 非感染細胞上清を示す。
【図８】図８は、CEF細胞におけるSARS-CoV M タンパク質の発現を、蛍光抗体法により確認した結果を示す写真である。
【図９】図９は、組換えDIsを投与したマウスの鼻腔洗浄液から検出されたIgA抗体に関するグラフである。横軸の数字は以下のことを示す。1：Sd: Sを発現するDIs 106 pfu を皮下に3回投与、2：Sn: Sを発現するDIs 106 pfuを経鼻で3回投与、3：Nd: Nを発現するDIs 106 pfu を皮下に3回投与、4：Nn: Nを発現するDIs 106 pfuを経鼻で3回投与、5：正常マウス、6：陽性対照（positive control）。
【図１０】図１０は、ELISPOT assayの結果を示すグラフおよび図である。左側がSタンパク質（1255アミノ酸）を発現する組換えDIsを皮下投与および経鼻投与した結果を示すグラフおよびSタンパク質の構造を示す図であり、右側がNタンパク質（422アミノ酸）を発現する組換えDIsを皮下投与および経鼻投与した結果を示すグラフおよびNタンパク質の構造を示す図である。
【図１１】図１１は、組換えDIsを皮下または経鼻で投与したマウスにおける感染防御効果の結果を示すグラフである。縦軸はSARS-CoVのウイルス価の対数を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、SARS-コロナウイルス（本明細書においては、「SARS-CoV」または単に「SARSウイルス」と記載する場合あり）タンパク質の全部もしくは一部のタンパク質をコードするDNAをゲノムDNA上に保有し、該タンパク質を発現し得る組換えワクチニアウイルスDIs株を提供する。【００１５】
本発明の組換えウイルス株は、その特徴として、ワクチニアウイルスDIs株ゲノム上へSARS-CoVタンパク質をコードするDNAが挿入された（組み込まれた）ゲノム構造を有するワクチニアウイルスDIs株である。【００１６】
本発明において用いられる、SARS-CoVタンパク質とは、SARS-CoVゲノム上に存在する遺伝子によってコードされるタンパク質（本明細書において「SARS-CoVタンパク質」と記載する場合あり）、もしくは該タンパク質の部分ペプチドを指す。本発明のDIs株に保有されるSARS-CoVタンパク質の数は特に制限されず、少なくとも１以上のタンパク質もしくは該タンパク質の部分ペプチドを保有していればよい。また、本発明の上記タンパク質には、例えば、構造タンパク質、調節タンパク質、およびアクセサリータンパク質等が含まれる。【００１７】
本発明において、DIs株ゲノムDNA上に保有されるSARS-CoVタンパク質をコードするDNAとしては、CTL活性を有するSARS-CoV由来のタンパク質をコードするDNAであることが好ましい。上記DNAとしては、例えば、キャプシドタンパク質Nを発現する領域、構造タンパク質全体（キャプシドタンパク質Nおよび３つのエンベロープタンパク質E、M、S）を発現する領域、プロテアーゼやポリメラーゼタンパク質（非構造タンパク質）を発現する領域に含まれるDNAを挙げることができる。上記Eタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：１に、該タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号：２に、Mタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：３に、該タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号：４に、Sタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：５に、該タンパク質をコードする塩基配列を配列番号：６に、Nタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：７に、該アミノ酸配列によってコードされる塩基配列を配列番号：８にそれぞれ示す。【００１８】
本発明の好ましい態様においては、これらのDNAもしくは該DNAの断片をゲノムDNA上に保有し、該タンパク質を発現し得る組換えワクチニアウイルスDIs株である。即ち、本発明のDIs株において保有されるSARS-CoVタンパク質としては、好ましくは構造タンパク質を例示することができる。より具体的には、本発明におけるSARS-CoVタンパク質として、好ましくはE、M、N、もしくはSタンパク質、または、E、M、N、およびSタンパク質からなる群より選択される１もしくは複数のタンパク質である。本発明におけるSARS-CoVタンパク質としては、例えば、３種の膜タンパク質(EMS)が好ましく、さらに４種のタンパク質(EMNS)であればより好ましい。【００１９】
本発明の構造タンパク質、および非構造タンパク質に分類される各タンパク質のアミノ酸配列および該アミノ酸配列をコードする塩基配列に関する情報は、当業者においては、それぞれのタンパク質の名称を基に、公知の文献あるいは公共のデータベースから容易に取得することができる。これら情報を基に上記タンパク質もしくは該タンパク質の部分ペプチドをコードするDNAについて、適宜クローニングし、本発明のDIs株の作製に用いることは可能である。【００２０】
DIsウイルス株ゲノムDNAにおける、SARS-CoVタンパク質をコードするDNAを挿入する領域としては、特に制限されないが、例えば、DIs株と親株のワクチニアウイルス株とのゲノムを比較した際に、DIs株において欠損しているゲノム領域を好適に挙げることができる（該領域を「対DI株欠損領域」と記載する場合あり）。本発明における「対DI株欠損領域」は、例えば、DIs株のゲノムDNAの制限酵素切断パターンを親株のDI株と比較することにより、ゲノム上のどの領域が上記領域であるかを調べることができる。該領域は通常、DIs株の複製には不必要である。なお、DIsウイルス株ゲノムDNAとしては、より具体的には、配列番号：９に記載された塩基配列を好適に示すことができる。ワクチニアウイルスのコペンハーゲン株のゲノムDNA（GenBankアクセッション番号：M35027）における該「欠損領域」は判明している。該「欠損領域」は、具体的には、コペンハーゲン株のゲノムDNAにおいて、5’側から数えて17145-32562位に相当する領域（配列番号：１４）である。当業者においては、本明細書において開示された情報を基に、上記「欠損領域」が親株（大連株）のゲノムDNA上のどの領域に相当するかについて、適宜知ることが可能である。【００２１】
本発明の好ましい態様においては、SARS-CoV DNAが、上記の対DI株欠損領域もしくは該領域の近傍領域上に保存された（挿入された）組換えワクチニアウイルスDIs株を提供する。【００２２】
本発明における「欠損」領域の一例としては、例えば、図１において黒線で示された15.4 kbpの領域を挙げることができる。この「欠損」領域には、ウイルス増殖に必須と考えられている遺伝子は存在せず、宿主域遺伝子(host range genes)と呼ばれるもののうち2つ(K1LとC7L)が存在している。例えば、K1Lを欠損させると、この欠損ウイルスは例えばRK13等の細胞における増殖能を失う。【００２３】
また、上記「欠損」領域は、図１で示される15.4kbpの領域に、厳格に制限されるものではない。例えば、この「欠損」領域を含むさらに広い領域の「欠損」、あるいは、上記15.4kbp未満の「欠損」であっても、本発明の上記「欠損」に含まれる。なお、この15.4kbpに及ぶ欠損領域は、通常のワクチニアウイルスには存在するが、配列番号：９に記載されたDIs株のゲノムDNAには存在しない領域である。【００２４】
本発明において上記「欠損」領域へのDNAの「挿入」とは、上記「欠損」領域に対応するDNAが、本発明のSARS-CoV DNAによって置換された状態であってもよく、また、「欠損」領域に対応するDNA上へSARS-CoV DNAが挿入（付加）された状態であってもよい。【００２５】
本発明における「組換えワクチニアウイルス」とは、通常、組換え弱毒化ワクチニアウイルスを指す。組換え弱毒化ウイルスとは、例えば、遺伝子の改変がなされる（特定の遺伝子を欠失する）ことによって、もしくは、長期に継代することによって、野生型より毒性が弱められたウイルスを指す。本発明においては、ワクチニアウイルス大連株（DI株）を高度に弱毒化したDIs株が好適に用いられる。【００２６】
また、DIs株以外にも、弱毒株として例えば、MVA弱毒株が知られている。DIs株は、該MVA弱毒株と比較して、例えば、以下の点で優れているものと考えられる。
（１）MVAは一部の哺乳類細胞で増殖するが、DIsは殆ど増殖しない。
（２）MVAには複数の領域の欠損および重複があるため、野生株には存在しない新たなタンパク質が複数生成しており、これらの因子が何らかの未知の影響を宿主に与える可能性が否定できないが、DIsでは欠損は1箇所のみであり、このような影響を考慮する必要がない。【００２７】
また本発明において、SARS-CoVタンパク質の全部もしくは一部のタンパク質をコードするDNA（「SARS-CoV DNA」と記載する場合あり）を、DIs株ゲノム上へ挿入する（組み込む）際の該ゲノム上の部位は、特に制限されないが、該ゲノム上の「非保存領域」であることが好ましい。即ち、本発明の好ましい態様においては、SARS-CoV DNAが、ゲノムDNAの非保存領域上に保存された（挿入された）組換えワクチニアウイルスDIs株（発現可能な状態でSARS-CoV DNAがゲノムDNAの非必須領域上に配置された構造のゲノムを有する、組換えワクチニアウイルスDIs株）を提供する。【００２８】
上記「非保存領域」とは、ウイルスの増殖に必須と考えられている遺伝子が存在しない領域を指す。前述のように、ワクチニアウイルスは、ゲノムの全長が約200 kbpであり、コードする遺伝子のかなりの部分はウイルス複製には必須ではなく、欠損させてもウイルスは増殖することができる。本発明者らは、DIs株の全塩基配列を決定し、DIs株ゲノムの左端に１ヶ所大きな15.4 kbpに及ぶ欠損（単に「DIs株欠損領域」と記載する場合あり）があることを明らかにした。【００２９】
本発明において「非保存領域」とは、例えば、DIs株ゲノム上の上記「欠損」領域（例えば、上記15.4 kbpの欠損領域、もしくは該領域の近傍領域）を好適に示すことができる。尚、本発明において「該領域の近傍領域」とは、通常、該領域の近傍の染色体上の領域を指す。本発明において「近傍」とは特に制限されるものではないが、通常、当該領域の末端から、5 kbp以内の領域、より好ましくは1 kbp以内の領域を指す。【００３０】
本発明の組換えウイルスは、例えば、以下のような方法で作製することができる。本発明の組換えウイルスの作製の際には、例えば、配列番号：９に記載のDIsのゲノム配列に関する情報を適宜利用することができる。DIs株ゲノムの非保存領域もしくは該領域の近傍DNA領域からなるDNA断片へ、「プロモーターの下流に配置されたSARS-CoV DNA」が挿入された構造を含むベクター（トランスファーベクター）を作製する。次いで、該ベクターをDIs株へ導入し、相同組換え機構を利用し、該ウイルスDNAをDIsゲノム上へ挿入させる。上記方法においては、適宜、選択マーカーを保有させたトランスファーベクターを用いることができる。選択マーカーとしては、公知の種々のマーカーを利用することができる。例えば、選択マーカーの一例として、XGPRT遺伝子、LacZ遺伝子等が挙げられる。これらマーカー遺伝子を利用した組換えウイルス(DNA)体の選択方法もまた公知である。また、ウイルスの相同組換え体の選択には、DIs株が唯一増殖可能なCEFを好適に使用することにより効率よく行うことができる。【００３１】
本発明においてSARS-CoV DNAは、通常、プロモーターの下流に該DNAが転写し得るように配置される。プロモーターは、本発明のDNAが転写し得るものであれば、特に制限されない。当業者においては、公知のプロモーターを適宜、使用することができる。利用可能なプロモーターの一例としては、ワクチニアウイルスプロモーターp7.5、mH5（ワクチニアH5Rタンパク質の改変プロモーター(modified promoter of vaccinia H5R protein)／配列番号：１０）等を挙げることができる。【００３２】
また、所望の遺伝子DNAについて、プロモーターの下流に転写し得るように配置させることは、当業者においては、公知の遺伝子工学技術を用いて適宜実施することが可能である。【００３３】
SARS-CoV DNA（SARS-CoV遺伝子）の塩基配列および該遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は既に公知であり、当業者においては、該配列に関する情報について、例えば、文献データベース、または公共の遺伝子（ゲノム）データベースを利用して容易に取得することができる。SARS-CoVのゲノムDNAの塩基配列は、NCBIの提供するデータベースから、アクセッション番号：AY278491 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=30023963)によって適宜取得することができる。【００３４】
また、所望のゲノム上の領域に対して、外来DNAを挿入させる方法は、これまでに種々の方法が知られている。当業者においては、これらの方法を利用して、組換えウイルスを適宜作製することができる。本発明の組換えDIs株の作製方法の一例として、より具体的には、後述の実施例に記載された方法を例示することができる。【００３５】
本発明の組換えワクチニアウイルスDIs株のゲノムDNAの構造の好ましい態様の一つとして、例えば、DIs株ゲノム（配列番号：９）における上記「欠損」領域へ以下の構造のDNAが挿入した構造からなるDNAを例示することができる。
(1) プロモーターmH5（配列番号：１０）の下流に発現可能な状態でEタンパク質をコードするDNA（配列番号：２）が連結した構造のDNA（図４；rDIsSARS-E）
(2) プロモーターmH5（配列番号：１０）の下流に発現可能な状態でMタンパク質をコードするDNA（配列番号：４）が連結した構造のDNA（図４；rDIsSARS-M）
(3) プロモーターmH5（配列番号：１０）の下流に発現可能な状態でSタンパク質をコードするDNA（配列番号：６）が連結した構造のDNA（図４；rDIsSARS-S）
(4) プロモーターmH5（配列番号：１０）の下流に発現可能な状態でNタンパク質をコードするDNA（配列番号：８）が連結した構造のDNA（図４；rDIsSARS-N）
(5) 上記(1)のDNAと上記(2)のDNAがタンデムに連結した構造のDNA（図５；rDIsSARS-E/M）
(6) 上記(1)のDNAと上記(2)のDNAと上記(3)のDNAがタンデムに連結した構造のDNA（図５；rDIsSARS-E/M/S）
(7) 上記(4)のDNAと上記(3)のDNAがタンデムに連結した構造のDNA（図５；rDIsSARS-N/S）【００３６】
また本発明によって提供される組換えワクチニアウイルスDIs株のゲノムDNAまたは該ゲノムDNAの部分断片DNAもまた、本発明に含まれる。該部分断片DNAとは、好ましくは、SARS-CoV DNAが挿入されたDNA領域を含む部分断片DNAである。【００３７】
さらに本発明は、本発明の組換えワクチニアウイルスDIs株を有効成分として含む、SARSワクチンを提供する。
本発明におけるワクチンは、通常、SARS-CoVの感染防御、ウイルス排除またはSARSの治療のために使用される。ワクチンは抗原を含んでいるか、または抗原を発現可能であり、これにより抗原に対する免疫応答を誘導することができる。SARS-CoVの感染防御、ウイルス排除またはSARSの治療のために、本発明のワクチンは、所望の形態で用いることができる。【００３８】
本発明のワクチンには、有効成分である本発明の組換えワクチニアウイルスDIs株以外に、例えば、担体等が含まれていてもよい。担体の種類は、通常、投与の形態に応じて決めることができる。本発明のワクチンは、例えば、局所、経口、鼻腔内、静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内投与を含む、投与に適当な方法で製剤化することができる。皮下注射のような非経口投与については、担体として、好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックス又は緩衝液等を挙げることができる。経口投与のためには、前述の担体又は固形担体、例えばマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウム等を、適宜使用することができる。【００３９】
また本発明のワクチンを、本発明の組換えワクチニアウイルスDIs株、およびアジュバントを含む組成物として製剤化することも可能である。アジュバントとしては、例えば、アルミニウム塩、菌体内毒素、カルメット-ゲラン杆菌（BCG）、リポソーム、ミクロスフィア（例えば、経口投与ワクチンに使用されるマイクロカプセル化ポリマー等）、およびフロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバント等が挙げられるが、これらに限定されない。「アジュバント」とは、抗原の免疫原性を上昇させる物質を指す。【００４０】
本発明のワクチンの個体への投与は、特に制限されるものではないが、例えば、局所、経口、鼻腔内、静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内投与で行うことができる。投与量は、個体（患者）の年齢、体重、症状等を考慮して、当業者（医師・獣医師等）においては、適宜、決定することができる。【００４１】
本発明のワクチンが接種可能な動物としては、免疫系を有し、かつSARS-CoVに感染し得るあらゆる宿主生物が挙げられ、例えば、ヒトおよび一部の霊長類（マウス等）を挙げることができる。【００４２】
また、本発明の組換えワクチニアウイルスDIs株は、個体へ導入されると、ウイルス特異的細胞傷害性T細胞(CTL)の応答を誘導する作用を有する。従って本発明は、本発明の組換えワクチニアウイルスDIs株を有効成分として含む、ウイルス特異的細胞傷害性T細胞(CTL)応答誘導剤を提供する。【００４３】
細胞傷害性T細胞（CTL；cytotoxic T lymphocyte）とは、細胞溶解性（キラー）T細胞、細胞傷害性Tリンパ球ともいわれ、標的細胞を破壊する能力をもち、ウイルス感染細胞や腫瘍細胞の排除に役立っていると考えられている。【００４４】
また、本発明の組換えワクチニアウイルスDIs株は、個体へ導入されると、血中でのSARS-CoVに対する中和抗体を誘導する作用を有する。従って本発明は、本発明の組換えワクチニアウイルスDIs株を有効成分として含む、SARS-CoV中和抗体誘導剤を提供する。【００４５】
さらに、本発明の組換えワクチニアウイルスDIs株は、個体へ導入されると、呼吸器官（特に呼吸器表面）での粘膜免疫を誘導する作用を有する。従って本発明は、本発明の組換えワクチニアウイルスDIs株を有効成分として含む、呼吸器表面におけるSARS-CoVに対する粘膜免疫誘導剤を提供する。【００４６】
本発明の上記誘導剤も、有効成分である本発明の組換えDIs株以外に、上述の担体等を適宜、含有させることが可能である。
また本発明は、本発明の組換えワクチニアウイルスDIs株、もしくは本発明の薬剤を個体（例えば、患者等）へ投与する工程を含む、ウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導する方法、SARS-コロナウイルス中和抗体を誘導する方法、呼吸器表面におけるSARS-コロナウイルスに対する粘膜免疫を誘導する方法、SARSウイルスの感染を防御、もしくはSARSウイルスを排除する方法、または、SARS(重症急性呼吸器症候群)を予防もしくは治療する方法に関する。
本発明の方法における個体とは、好ましくはヒトであるが、特に制限されず、免疫系を有する非ヒト動物であってもよい。
個体への投与は、一般的には、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射など当業者に公知の方法により行うことができる。投与量は、対象者（患者等）の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
さらに本発明は、本発明の組換えワクチニアウイルスDIs株のSARS-コロナウイルスワクチンの製造における使用、並びに、本発明の上記薬剤の製造における使用に関する。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により制限されるものではない。
〔実施例１〕DIs株の遺伝子構造の解析
ワクチニアウイルスDIs株を用いて組換えウイルスを作成するため、DIs株のゲノム上に存在する変異の同定を行った。親株のDIE株およびDIs株よりゲノムDNAを精製し、HindIIIで消化してできる断片をアガロースゲル電気泳動で比較した結果、ゲノムの5'端付近に約15kbpの欠損が存在することが明らかとなった。この欠損の付近を増幅するため、２本のPCRプライマー
Vac H-C [5’-ATAATGTAGCTCCTTCATCAATCATACATT]／配列番号：１１
Vac H-F [5’-AGGAGGTGGTGTAATAGACGAAGATTATAG]／配列番号：１２
を合成した。DIsのゲノムDNAをテンプレートとしてPCR増幅を行い、プラスミドpUC19のEcoRI部位に挿入して増幅されたフラグメントの配列決定を行い、親株と比較して5'端より17.1kbpと32.5kbpの間の部分が欠損していることを明らかにした（Ishii K., Ueda Y., Matsuo K., Matsuura Y., Kitamura T., Kato K., Izumi Y., Someya K., Ohsu T., Honda M. and Miyamura T. (2002) Structural analysis of vaccinia virus DIs strain: Application as a new replication-deficient viral vector. Virology in press)（図１）。なお、ここで作成したベクターをpUc/DIsと呼ぶ。【００４８】
この15.4kbpの欠損領域には、ウイルス増殖に必須と考えられている遺伝子は存在しないが、host range genes（宿主域遺伝子）と呼ばれるもののうち２つ（K1LとC7L）が存在している。宿主域遺伝子は、その機能は未だ明らかではないが、ワクチニアウイルスが感染、増殖できる培養細胞の範囲を規定していることが明らかとなっている(Perkus, M. E., Goebel, S. J., Davis, S. W., Johnson, G. P., Limbach, K., Norton, E. K., and Paoletti, E. (1990). Vaccinia virus host range genes. Virology 179, 276-286.)。例えば、K1Lを欠損させると、この欠損ウイルスはRK13細胞での増殖能を失う。従って、これらの宿主域遺伝子の欠損が、DIs株がほとんどの哺乳類細胞で増殖できない理由であると考えられる。実際、後に述べる組換えウイルス作成の手法を用いてこれらの宿主域遺伝子をDIs株に組み込んだところ、組換えウイルスはHeLa、RK13、CV-1細胞など、調べた哺乳類細胞のいずれでも増殖能を回復していた(Ishii K., Ueda Y., Matsuo K., Matsuura Y., Kitamura T., Kato K., Izumi Y., Someya K., Ohsu T., Honda M. and Miyamura T. (2002) Structural analysis of vaccinia virus DIs strain: Application as a new replication-deficient viral vector. Virology 302 (2002) 433-444)。【００４９】
〔実施例２〕組換えDIs株作成手法の確立
DIs株をウイルスベクターとして、あるいは組換え生ワクチンとして用いるためには、同ウイルスへ外来遺伝子を組み込む手法を確立することが必須である。ワクチニアウイルスはゲノムのみでは感染性がなく、またゲノムサイズが約200kbpあり、外来遺伝子をゲノム中に直接挿入することは現在の遺伝子工学技術では非常に困難である。そのため、トランスファーベクターを使用し、感染細胞内で相同組換えをおこさせることにより外来遺伝子を挿入する方法が一般に用いられる（ウイルスゲノムの一部と同じ配列を持つプラスミドが感染細胞内に存在する場合、ゲノム複製の際に一定の頻度で、プラスミド上の配列と、それに対応するゲノム上の配列の交換がおこる。この現象が相同組換えである。）。従って、DIsゲノムの一部をプラスミドにサブクローニングし、このDIs配列内に目的の外来遺伝子を挿入することで、このプラスミドをDIsに外来遺伝子を挿入するトランスファーベクターとして用いることができる。【００５０】
DIsに外来遺伝子を挿入する場合には、挿入することによりDIsの感染、増殖に影響の出ない場所を選択する必要がある。そのためには、先に決定した欠損部位に外来遺伝子を挿入する方法が、DIsに影響を及ぼさない部位として好適であると考えられる。以上の理由から上記のpUc/DIsをトランスファーベクターとして用いることとした。pUc/DIs中のDIs由来の配列の内部に、ワクチニアウイルス由来のプロモーターとその下流に目的の外来遺伝子を挿入することにより、この外来遺伝子をDIsに組み込むトランスファーベクターとして使用することができる。そのため、ワクチニアウイルスのプロモーター配列のpUc/DIsのDIs由来配列への挿入を行った。pBluescript SK(-)ベクターのHindIII〜SmaI部位に、ワクチニアH5Rタンパク質の改変プロモーター配列mH5[5’-AAAAATTGAAAATAAAATACAAAGGTTCTTGAGGGTTGTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATA／配列番号：１０]を合成して挿入し、生成したベクターをBssHIIで切断した。【００５１】
240bpのフラグメントを精製した後に末端をHindIIIに変換し、pUC19に挿入したDIs由来配列中に存在するHindIII部位に挿入した。このワクチニアウイルスプロモーターmH5の下流に存在するSmaI、BamHI、NotI、SacI、SacIIを外来遺伝子の挿入部位（マルチクローニングサイト）として使用できる。【００５２】
上記のプラスミドに薬剤選択マーカーを挿入するため、E.coli由来の酵素XGPRT（hypoxantine-guanine phosphoribosyl transferase）遺伝子の上流にワクチニアウイルスプロモーターp7.5を付加し、pUC19に挿入したDIsフラグメント中に存在するMluI部位に挿入した。挿入した配列を配列番号：１３に示す。この手法は、プリン合成の阻害剤であるMPA（mycophenolic acid）存在下ではGMP合成が阻害され、ワクチニアウイルスのDNA合成も阻害されるためにウイルス増殖ができないが、培地中にMPA（micophenoic acid）、xantine、hypoxantineをそれぞれ25μg/ml、250μg/ml、15μg/ml添加してある場合、XGPRT遺伝子をゲノム内に持つウイルスのみが増殖するため、この３種の薬剤を含有する培地でウイルスを培養することにより目的の組換えウイルスを取得することができる(小島朝人,「ワクシニアウイルスベクター」,ウイルス実験プロトコール,(1995),343-353,メジカルビュー社)。ウイルスの相同組換えおよび組換えウイルスの選択には、DIsが唯一増殖することができるCEFを用いる点が肝心である。【００５３】
本発明者らは、ワクチニアウイルスのp7.5プロモーターの下流にXGPRT遺伝子を挿入し、更にmH5プロモーターの下流にマルチクローニングサイトをつないで外来遺伝子を容易に挿入できるようにしたユニットを作成した。このユニットを、DIsの遺伝子が欠損している部分を挟む領域の中央に挿入したトランスファーベクターを構築し、相同組換えをおこすと、目的とする外来遺伝子と共にXGPRT遺伝子が挿入されるように設計した（図２）。完成したトランスファーベクターを、pDIsgptmH5と名付けた。【００５４】
目的の外来遺伝子を有する組換えDIs株は、例えば、以下のように選択することができる。
ワクチニアウイルスDIs株約106pfu（plaque forming unit）を含む500μlのウイルス液を、CEF（chick embryo fibroblast）細胞約107個が播かれた80 mmシャーレに接種し、15分ごとに8回震盪することによりウイルスを細胞に感染させた。その後、1 mlの10% FCS（fetal calf serum）を含むDMEM（Dalbecco-modified Eagle培地）を加え、37℃、5% CO2条件下にて2時間培養した。培地を取り除き、PBS（phosphate-buffered serine）で洗浄してから0.05% トリプシン溶液0.5 mlを加え、細胞を遊離させた後、細胞懸濁液を2000 rpmで3分遠心して細胞を回収し、400μlのPBSに懸濁した。この細胞懸濁液にトランスファーベクター10μgを溶解し、Gene Pulser II（Bio Rad社）を用いて0.4 cmキュベット中、250 v、500μFDで１回電圧をかけ電気穿孔法を行った。細胞を10% FCSを含むDMEM 2 mlに懸濁し、35 mmシャーレに播いて37℃、5% CO2条件下にて７日間培養した。感染細胞を培地とともに回収し、凍結乾燥３回、超音波処理２分行った後、同じ培地で10、100、1000倍希釈した。35 mmシャーレに106個の細胞を播き、培地（10% FCSを含むDMEM）にMPA、xantine、hypoxantineをそれぞれ25μg/ml、250μg/ml、15μg/ml添加して一晩培養した後、上記の希釈細胞液を接種した。15分ごとに8回震盪することによりウイルスを細胞に感染させ、希釈細胞液を除いてから、１％軟寒天添加培地（10% FCSを含むDMEM。MPA、xantine、hypoxantineを含む）2 mlを加え、固化させてから37℃、5% CO2条件下にて７日間培養した。形成されたプラーク部分をパスツールピペットでピックアップし、200μlの10% FCSを含むDMEMに懸濁し、２分間超音波処理を行ってウイルスを寒天より放出させた。この培養液を同じ培地で10、100、1000倍希釈し、上記と同様のプラークアッセイ操作をさらに２回繰り返して組換えウイルスを純化した後、CEF細胞に感染させてスケールアップを行った。このウイルスには外来遺伝子も同時に組み込まれているため、目的とする組換えウイルスを効率良く選別することができる（図３）。【００５５】
〔実施例３〕培養細胞
CEF（chick embryo fibroblast）細胞及びVero E6細胞は、10％ FCSと抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン）を添加したDMEM培地（GIBCO社）で培養した。【００５６】
〔実施例４〕SARS-コロナウイルスの精製
SARS-CoV（HKU39849株）をmoi=1.0にてVero E6細胞に感染させ、２日間培養の後、培養上清を回収した。この培養上清を3000 rpm、10分間遠心し、その上清をさらに8000 rpm、30分間遠心して細胞及び細胞破砕物を除いた後、８％ポリエチレングリコール/0.5 M 塩化ナトリウムでウイルスを沈殿させた。この沈殿を生理食塩水で懸濁した後、不連続蔗糖密度勾配遠心法（20% / 60%）によりウイルス粒子を精製した。この精製ウイルス分画を紫外線照射で不活化し、不活化SARS-CoV全粒子分画とした。【００５７】
〔実施例５〕組換えDIsの取得
SARS-CoVよりゲノムRNAを抽出し、常法によりcDNAを作成し、PCR法により構造蛋白をコードするopen reading flame（ORF）に相当する領域を増幅した。増幅した各フラグメントを制限酵素BamHI（ただしEのみ制限酵素BglIIを使用した）で切断し、弱毒化ワクチニアウイルスDIsへのトランスファーベクターであるpDIsgptmH5（図２）のBamHI部位に、TakaraのLigation kitを用いて挿入した（それぞれをpDIsSARS-E、pDIsSARS-M、pDIsSARS-N、pDIsSARS-S、pDIsSARS-EM、pDIsSARS-EMSと名付けた）。上記のプラスミドには弱毒化ワクチニアウイルスの配列が挿入してあるため、本ウイルスが増殖する細胞であるCEF細胞に感染させ、上記プラスミドを感染細胞内に導入すると、一定の頻度でプラスミドとウイルスゲノムとの間で相同組換えが起こる。【００５８】
また、同プラスミドには薬剤選択マーカーとして大腸菌由来の酵素xgprt（hypoxantine-guanine phosphoribosyl transferase）遺伝子を、ワクチニアウイルスプロモーターp7.5を上流に付加した形で挿入してある。そのため培地中にMPA（micophenolic acid）、xantine、hypoxantineをそれぞれ25μg/ml、250μg/ml、15μg/ml添加してある場合、xgprt遺伝子をゲノム内に持つウイルスのみが増殖するため、この３種の薬剤を含有する培地でウイルスを培養することにより、相同組換えをおこした目的の組換えウイルスを取得することができる。今回トランスファーベクターを作成して取得した組換えDIsの構造を、図４および５に示した。【００５９】
ワクチニアウイルスDIs株約106 pfu（plaque forming unit）を含む500μlのウイルス液を、CEF細胞約107個が播かれた80 mmシャーレに接種し、15分ごとに8回震盪することによりウイルスを細胞に感染させた。その後、1 mlの10％ FCS（fetal calf serum）を含むDMEM（Dalbecco-modified Eagle培地）を加え、37℃、5％ CO2条件下にて２時間培養した。培地を取り除き、PBS（phosphate-buffered serine）で洗浄してから0.05％トリプシン溶液0.5 mlを加え、細胞を遊離させた後、細胞懸濁液を2,000 rpmで３分遠心して細胞を回収し、400μlのPBSに懸濁した。この細胞懸濁液に各トランスファーベクター10μgを溶解し、Gene Pulser II（Bio Rad社）を用いて0.4 cmキュベット中、250 v、500μFDで１回電圧をかけ電気穿孔法を行った。細胞を10％ FCSを含むDMEM 2 mlに懸濁し、35 mmシャーレに播いて37℃、5％ CO2条件下にて７日間培養した。感染細胞を培地とともに回収し、凍結融解３回、超音波処理２分行った後、同じ培地で10、100、1000倍希釈した。35 mmシャーレに106 個の細胞を播き、培地（10％ FCSを含むDMEM）にMPA、xantine、hypoxantineをそれぞれ25μg/ml、250μg/ml、15μg/ml添加して一晩培養した後、上記の希釈細胞液を接種した。15分ごとに8回震盪することによりウイルスを細胞に感染させ、希釈細胞液を除いてから、1％ 軟寒天添加培地（10％ FCSを含むDMEM。MPA、xantine、hypoxantineを含む）2 mlを加え、固化させてから37℃、5％ CO2条件下にて７日間培養した。形成されたプラーク部分をパスツールピペットでピックアップし、200μlの10% FCSを含むDMEMに懸濁し、２分間超音波処理を行ってウイルスを寒天より放出させた。この培養液を同じ培地で10、100、1000倍希釈し、上記と同様のプラークアッセイ操作をさらに２回繰り返して組換えウイルスを純化した後、CEF細胞に感染させてスケールアップを行った。【００６０】
得られた組換えウイルスは、単一のクローンまで純化した後、PCR法により目的の外来遺伝子の挿入を確認した。目的のSARS構造蛋白の発現は、組換えウイルスを感染させた細胞を溶解し、SARS患者血清や、SARS構造蛋白のアミノ酸配列を基に化学合成したペプチドに対する抗体を用いたウエスタンブロット法や免疫蛍光染色法により確認した（図６〜８）。【００６１】
〔実施例６〕マウスへの組換えDIsの投与
５週令、メスのBalb/cマウスに、106 pfuの組換えDIsを皮下または経鼻で投与した。２週後と６週後に同量の同じ組換えウイルスを同じ経路で投与し、７週目に採血、鼻腔洗浄液の採取及び脾臓の摘出を行って免疫誘導能の測定に用いた。【００６２】
〔実施例７〕ELISA
SARS-CoVを感染させたVero E6細胞の細胞溶解液を、0.05 M 炭酸緩衝液（pH 9.6)で1000倍希釈し、マイクロプレート（immulon 2, Dynatech, Chantilly, VA）に1ウェルあたり100μlづつ添加した。４℃で一晩コートした後、1％ 卵白アルブミンでブロッキングした。試料（血清または鼻腔洗浄液の希釈液100μl）を各ウェルに添加し、結合した抗体をペルオキシダーゼ標識マウスIgG抗体またはIgA抗体（Zymed, San Francisco, CA）及びo-フェニレンジアミン基質溶液（Zymed）により検出した。
その結果、Nを発現する組換えDIsを投与されたマウス、Sを発現する組換えDIsを投与されたマウスのいずれも、ELISA法によりSARS-CoVに対する抗体を産生していた。投与経路は皮下、経鼻どちらも有効であった。（表１）。【００６３】
【表１】
2006022215.tif 000002
【００６４】
〔実施例８〕中和活性の測定
96ウェルプレート（住友ベークライト）にコンフルエントになるようにVero E6細胞をまいておき、培地を５％ FCS / DMEM 50μlに交換した。1x105 pfu/mlのSARS-CoV 80μlと、PBSで20倍より段階希釈したマウス血清 80μlを混合し、37℃で1時間反応させた後、100μlを上記の細胞プレートに添加し、37℃で48時間培養した。10％ ホルマリン溶液で細胞を固定した後、クリスタルバイオレットで細胞を染色し、細胞傷害効果を観察した。細胞傷害を中和し得た最高希釈度の逆数を中和抗体価とした。
その結果、Sを発現する組換えDIsを皮下投与した群では、いずれのマウスの血清もSARS-CoVを中和する活性を持っていた。この組換えDIsを経鼻投与した群でも、一部は同様に中和活性を持っていた。Nを発現する組換えDIsを投与した群は、皮下、経鼻いずれの投与法でも中和活性は誘導されなかった（表１）。【００６５】
また、Sを発現する組換えDIsを経鼻投与した群では、鼻腔洗浄液中からSARS-CoVに対するIgA抗体が検出され、粘膜免疫が誘導されていることが明らかとなった。Nを発現する組換えDIsを投与した群、組換えDIsを皮下投与した群では、鼻腔洗浄液中のIgA抗体の有意な上昇は見られなかった（図９）。【００６６】
〔実施例９〕ELISPOT assayによる細胞性免疫の測定
ELISPOT assayは、Diaclone社のγ-Interferon検出ELI-spotキット（Besancon, France）を用いて行った。96ウェルプレート（MaxiSorp, Nunc, Rochester, NY）にELI-spotキットのcapture antibodyを加え、37℃で1時間結合させた後、洗浄後に2％ 卵白アルブミンを加え、４℃で一晩ブロッキングした。組換えDIsを投与されたマウスの脾臓及び後頚部リンパ節を摘出してT細胞を調製した。T 細胞を5x105 個、抗原提示細胞として3000 rad γ線照射したA20.2J細胞を1x104 個ウェルに加え、抗原はSARS-CoVのSまたはNの部分ペプチド（20mer）を合成して5μM加えた。37℃で16時間培養した後プレートを洗浄し、ELI-spotキットのbiotinylated detection antibodyを加え、37℃で1時間インキュベートした。洗浄後にAlkaline phosphatase-streptavidinを加え、37℃で1時間インキュベートした。洗浄後にBCIP/NBTを添加した軟寒天を加えて固化させ、37℃で３時間インキュベートした。γ-Interferonを分泌する特異的cytotoxic T lymphocyte (CTL)の数を、KS ELISPOT compact system（Carl Zeiss, Jena, Germany）を用いて測定した。【００６７】
その結果、Sを発現する組換えDIsを皮下投与及び経鼻投与した群では、合成ペプチドの中で、ACE2（SARS-CoVの細胞側のレセプター分子）に結合するドメインの一部をエピトープとする特異的T細胞が誘導されていた。また、Nを発現する組換えDIsを皮下投与及び経鼻投与した群では、N端100アミノ酸部分をエピトープとする特異的T細胞が誘導されていた（図１０）。【００６８】
〔実施例１０〕組換えDIsの投与によるSARS-CoV感染からの防御
５週令、メスのBalb/cマウスに、106pfuの組換えDIsを皮下または経鼻で投与した。２週後と６週後に同量の同じ組換えウイルスを同じ経路で投与し、７週目に104pfu/mlのSARS-CoVを鼻から吸入させることにより感染させ、３日後に肺洗浄液を採取してSARS-CoVのウイルス価を測定した。その結果、４種の構造タンパク質(EMNS)すべてを発現する組換えDIsを投与された群は、経鼻、皮下いずれのルートでもSARS-CoVの感染から完全に防御された。３種の膜タンパク質(EMS)を発現する組換えDIsを投与された群では、皮下投与の場合はSARS-CoVの感染から完全に防御され、経鼻投与の場合もウイルス価はコントロール群(DIs投与群)と比べ著名に減少した。キャプシドタンパク質(N)のみを投与された群では、コントロール群との差は見られなかったことから、本発明においてNタンパク質を利用する場合には、該タンパク質に加えて、３種のタンパク質EMSと併せて用いることが好ましいことが示唆された（図１１）。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
ワクチニアウイルスには、強い免疫誘導能という利点と、神経病原性という欠点が共存していたが、DIs株の病原性は親株のワクチニアウイルス（DI株）と比べ非常に低い。また、DIs株が弱毒化されている理由は、15kbp以上にも及ぶ大きなゲノムの欠損であるため、培養細胞におけるウイルス増殖あるいはワクチンとして接種後に欠損を回復し毒性が復帰した株が出現する可能性はまず考えられない。【００７０】
また本発明の組換えワクチニアウイルスDIs株は、マウスにおいてSARS-CoVタンパク質に対する抗体を誘導し、その血清は培養細胞へのウイルスの侵入を阻止することから、組換えワクチンとして非常に有用である。【００７１】
SARSは21世紀最初に出現した新興ウイルス感染症であり、致死率は10％を超えるとも考えられており、日本でもSARSを、最も危険性が高く緊急かつ徹底した対応を必要とする一類感染症に加えている。しかしながらSARSに対する特異的な治療法や診断法は開発されていない。従って効果的なSARSワクチンの必要性は高く、一刻も早い開発と実用化が切に望まれている。弱毒化ワクチニアウイルスを用いた本ワクチンは、そうした産業上の要望にかなったものであり、人類に多大な貢献をするものと期待される。特に本ワクチンの場合は、血中でのSARS-CoVに対する中和抗体の誘導、呼吸器表面での粘膜免疫の誘導、ウイルス蛋白に対する特異的細胞性免疫の誘導を行うことができるため、呼吸器からの感染の防御、体内でのウイルスの細胞への侵入阻止、感染細胞の生体からの排除のいずれも行うことが可能であり、SARSの感染防御及びウイルス排除に非常に効果的であることが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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