(57)【要約】本発明は、マイコプラズマＡ．ｌａｉｄｌａｗｉｉ（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ ｌａｉｄｌａｗｉｉ）を感度よく、かつ、特異的に検出できるプライマーの提供を目的とする。  前記目的を達成するために、本発明のプライマーは、Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉを検出するためのプライマーであって、下記（Ａ）及び（Ｂ）のヌクレオチド配列又はその部分配列を含むポリヌクレオチドの少なくとも一方を増幅するためのプライマーである。（Ａ）配列番号１の第５８９番目〜第９８７番目のヌクレオチド配列又はその相補配列（Ｂ）配列番号１の第６０４番目〜第９７５番目のヌクレオチド配列又はその相補配列  まず、前記（Ａ）の領域を増幅し、次に、（Ａ）の増幅産物に対して前記（Ｂ）の領域を増幅することで、より感度よく、特異的にＡ．ｌａｉｄｌａｗｉｉを検出できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）及び（Ｂ）のヌクレオチド配列又はその部分配列を含むポリヌクレオチドの少なくとも一方を増幅するためのプライマー。
（Ａ）配列番号１の第５８９番目〜第９８７番目のヌクレオチド配列又はその相補配列
（Ｂ）配列番号１の第６０４番目〜第９７５番目のヌクレオチド配列又はその相補配列
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列（Ａ）を含むポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーであって、下記ヌクレオチド配列（Ｕ１）及び（Ｄ１）のポリヌクレオチドの少なくとも一方とハイブリダイズ可能な請求項１記載のプライマー。
（Ｕ１）配列番号１の第５７１番目〜第５８８番目のヌクレオチド配列の相補配列
（Ｄ１）配列番号１の第９８８番目〜第１００４番目のヌクレオチド配列
【請求項３】
前記ヌクレオチド配列（Ｕ１）のポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なプライマーであって、配列番号２のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号２において１つ若しくは数個の塩基が置換、付加若しくは欠失したヌクレオチド配列からなるプライマー、及び、配列番号２と６０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなるプライマーからなる群から選択される少なくとも一つのプライマーである請求項２記載のプライマー。
【請求項４】
前記ヌクレオチド配列（Ｄ１）のポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なプライマーであって、配列番号４のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号４において１つ若しくは数個の塩基が置換、付加若しくは欠失したヌクレオチド配列からなるプライマー、及び、配列番号４と６０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなるプライマーからなる群から選択される少なくとも一つのプライマーである請求項２記載のプライマー。
【請求項５】
前記ヌクレオチド配列（Ｂ）を含むポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーであって、下記ヌクレオチド配列（Ｕ２）及び（Ｄ２）のポリヌクレオチドの少なくとも一方とハイブリダイズ可能な請求項１記載のプライマー。
（Ｕ２）配列番号１の第５８７番目〜第６０３番目のヌクレオチド配列の相補配列
（Ｄ２）配列番号１の第９７６番目〜第９９５番目のヌクレオチド配列
【請求項６】
前記ヌクレオチド配列（Ｕ２）のポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なプライマーであって、配列番号３のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号３において１つ若しくは数個の塩基が置換、付加若しくは欠失したヌクレオチド配列からなるプライマー、及び、配列番号３と６０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなるプライマーからなる群から選択される少なくとも一つのプライマーである請求項５記載のプライマー。
【請求項７】
前記ヌクレオチド配列（Ｄ２）のポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なプライマーであって、配列番号５のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号５において１つ若しくは数個の塩基が置換、付加若しくは欠失したヌクレオチド配列からなるプライマー、及び、配列番号５と６０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなるプライマーからなる群から選択される少なくとも一つのプライマーである請求項５記載のプライマー。
【請求項８】
２種類以上のプライマーを含むマイコプラズマＡ．ｌａｉｄｌａｗｉｉを検出するためのプライマーセットであって、少なくとも２種類の請求項１記載のプライマーを含むプライマーセット。
【請求項９】
ネステッド（Ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ法に使用するプライマーセットであって、第一段階のＰＣＲ用のプライマーとして、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）のプライマーを含み、第二段階のＰＣＲ用のプライマーとして、以下の（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）のプライマーを含む請求項８記載のプライマーセット。
（ｉ）  配列番号１の第５７１番目〜第５８８番目のヌクレオチド配列の相補配列を含むポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なプライマー
（ｉｉ）  配列番号１の第９８８番目〜第１００４番目のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なプライマー
（ｉｉｉ）配列番号１の第５８７番目〜第６０３番目のヌクレオチド配列の相補配列を含むポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なプライマー
（ｉｖ）  配列番号１の第９７６番目〜第９９５番目のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なプライマー
【請求項１０】
マイコプラズマを遺伝子増幅により検出するマイコプラズマ検出用キットであって、マイコプラズマＡ．ｌａｉｄｌａｗｉｉの検出のための前記遺伝子増幅に使用するプライマーとして、請求項１記載のプライマーを含むマイコプラズマ検出用キット。
【請求項１１】
さらに、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｏｒａｌｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａａｒｇｉｎｉｎｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ及びＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓからなる群から選択される少なくとも一つのマイコプラズマの検出のための前記遺伝子増幅に使用する一つ以上のプライマーを含む請求項１０記載のマイコプラズマ検出用キット。
【請求項１２】
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｏｒａｌｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａａｒｇｉｎｉｎｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ及びＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓからなる群から選択される少なくとも一つのマイコプラズマの検出のための前記遺伝子増幅に使用するプライマーとして、配列番号６のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号７のヌクレオチド配列からなるプライマー、配列番号８のヌクレオチド配列からなるプライマー及び配列番号９のヌクレオチド配列からなるプライマーからなる群から選択される少なくとも一つのプライマーを含む請求項１１記載のマイコプラズマ検出用キット。
【請求項１３】
マイコプラズマＡｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ ｌａｉｄｌａｗｉｉの検出方法であって、下記（Ａ）及び（Ｂ）のヌクレオチド配列又はその部分配列を含むポリヌクレオチドの少なくとも一方を増幅し、これを検出する検出方法。
（Ａ）配列番号１の第５８９番目〜第９８７番目のヌクレオチド配列又はその相補配列
（Ｂ）配列番号１の第６０４番目〜第９７５番目のヌクレオチド配列又はその相補配列
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドの増幅において、請求項１記載のプライマーを使用する請求項１３記載の検出方法。
【請求項１５】
医薬組成物の製造方法であって、製造した医薬組成物のマイコプラズマ検査工程を含み、この検査工程が、請求項１３又は１４記載の検出方法によって実施される製造方法。
【請求項１６】
医薬組成物の製造方法であって、前記医薬組成物が、ポリペプチドを含み、かつ下記（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を含む製造方法。
（ｉ）前記医薬組成物に含まれるポリペプチドをコードする遺伝子を含む宿主細胞を培養する工程。
（ｉｉ）前記（ｉ）の宿主細胞内で発現したポリペプチドを回収する工程。
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）で回収したポリペプチドから検査用サンプルを得る工程。
（ｉｖ）前記（ｉｉｉ）で得たサンプル中にマイコプラズマが存在しないことを請求項１３又は１４記載の検出方法により検査する工程。
【請求項１７】
医薬組成物の製造方法であって、前記医薬組成物が、ポリペプチドを含み、かつ下記（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を含む製造方法。
（ｉ）前記医薬組成物に含まれるポリペプチドをコードする遺伝子を含む宿主細胞を培養する工程。
（ｉｉ）前記（ｉ）の宿主細胞内で発現したポリペプチドを回収する工程。
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）で回収したポリペプチドから検査用サンプルを得る工程。
（ｉｖ）前記（ｉｉｉ）で得たサンプル中にマイコプラズマが存在しないことを請求項１から７のいずれかに記載のプライマー、請求項８若しくは９記載のプライマーセット、又は請求項１０乃至１２のいずれか一項に記載の検出用キットを用いて検査する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、マイコプラズマ検出用のプライマー、プライマーセット、キット、及び、マイコプラズマの検出方法、並びに、これらを用いた医薬組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  マイコプラズマは、細胞壁を持たない原核生物である。マイコプラズマにより培養細胞が汚染された場合、細胞本来の機能や性質が様々な影響を受けることが知られている。この汚染細胞を用いて医薬品が製造されると重大な事態へとつながることが懸念される。培養細胞から検出される主なマイコプラズマとして、以下の６種が挙げられる。
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ    （以下、Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓという。）
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｏｒａｌｅ            （以下、Ｍ．ｏｒａｌｅという。）
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ      （以下、Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉという。）
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ      （以下、Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓという。）
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ            （以下、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓという。）
Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ ｌａｉｄｌａｗｉｉ  （以下、Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉという。）
したがって、医薬品製造工程においては、培養細胞へのマイコプラズマ汚染がないことを確認する必要がある。その確認のためには、上記６種類のマイコプラズマの全てを検出できる方法が必要である。【０００３】  マイコプラズマ検出のためのガイドラインとしては、第十四改正  日本薬局方（２００１）があり、この中にマイコプラズマ検出のためのプライマーが記載されている（非特許文献１、配列番号６〜９）。しかしながら、これらのプライマーは、上記６種類のマイコプラズマのうち、Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉの検出感度が悪いという欠点がある。また、Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉの検出のためのプライマーも文献に開示されているが（例えば、特許文献１参照）、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ等のＤＮＡを増幅することがあるという欠点がある。【０００４】  従って、Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉを感度よく、かつ、できるだけ特異的に検出できるプライマーが望まれている。
【特許文献１】特開２００４−３０５２０７号公報
【非特許文献１】第十四改正  日本薬局方（２００１）、参考情報、「９．バイオテクノロジー応用医薬品／生物起源由来医薬品の製造に用いる細胞基材に対するマイコプラズマ否定試験」、ｐｐ．１２３８−１２４１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  そこで、本発明は、Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉを感度よく、かつ、特異的に検出できるプライマーの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】  前記目的を達成するために、本発明のプライマーは、Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉを検出するためのプライマーであって、下記（Ａ）及び（Ｂ）のヌクレオチド配列又はその部分配列を含むポリヌクレオチドの少なくとも一方を増幅するためのプライマーである。
（Ａ）配列番号１の第５８９番目〜第９８７番目のヌクレオチド配列
（Ｂ）配列番号１の第６０４番目〜第９７５番目のヌクレオチド配列
【発明の効果】
【０００７】  本発明のプライマーを用いれば、Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉを感度よく、かつ、特異的に検出できる。本発明のプライマーは、例えば、ネステッドＰＣＲにも使用できるから、より高感度かつ特異的なＡ．ｌａｉｄｌａｗｉｉの検出が可能となる。さらに、本発明のプライマーと、従来の上記５種類のマイコプラズマを検出できるプライマーとを併用すれば、上記６種類のマイコプラズマを一度に、それぞれマイコプラズマに対し十分な感度で検出することが可能となる。【０００８】  また、本発明のプライマーにより、例えば、Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉ検出用プライマーセット、Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉ検出用キット、Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉ又はマイコプラズマの検出方法、及び、マイコプラズマ検査工程を含む医薬組成物の製造方法の提供が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１Ａ及びＢは、ＣＳＦ産生細胞培養液中のマイコプラズマを検出した結果の一例を示す電気泳動写真である。
【図２】図２Ａ及びＢは、抗ＩＬ−６レセプター抗体産生細胞培養液中のマイコプラズマを検出した結果の一例を示す電気泳動写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】  前記ヌクレオチド配列（Ａ）又はその部分配列を含むポリヌクレオチドを増幅するための本発明のプライマーとしては、例えば、下記ヌクレオチド配列（Ｕ１）及び（Ｄ１）のポリヌクレオチドの少なくとも一方とハイブリダイズ可能なプライマー等が挙げられる。
（Ｕ１）配列番号１の第５７１番目〜第５８８番目のヌクレオチド配列の相補配列
（Ｄ１）配列番号１の第９８８番目〜第１００４番目のヌクレオチド配列
以下、前記ヌクレオチド配列（Ｕ１）のポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なプライマーを、本発明のフォワードプライマーＵ１といい、前記ヌクレオチド配列（Ｄ１）のポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なプライマーを、本発明のリバースプライマーＤ１という。【００１１】  本発明のフォワードプライマーＵ１としては、例えば、配列番号２のヌクレオチド配列からなるプライマー（以下、ＡＦ１−３ともいう）、配列番号２において１つ若しくは数個の塩基が置換、付加若しくは欠失したヌクレオチド配列からなるプライマー、及び、配列番号２と６０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなるプライマー等が挙げられる。【００１２】  本発明のリバースプライマーＤ１としては、例えば、配列番号４のヌクレオチド配列からなるプライマー（以下、ＡＲ１−３ともいう）、配列番号４において１つ若しくは数個の塩基が置換、付加若しくは欠失したヌクレオチド配列からなるプライマー及び配列番号４と６０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなるプライマー等が挙げられる。【００１３】  前記（Ｂ）ヌクレオチド配列又はその部分配列を含むポリヌクレオチドを増幅するための本発明のプライマーとしては、例えば、下記ヌクレオチド配列（Ｕ２）及び（Ｄ２）のポリヌクレオチドの少なくとも一方とハイブリダイズ可能なプライマー等が挙げられる。
（Ｕ２）配列番号１の第５８７番目〜第６０３番目のヌクレオチド配列の相補配列
（Ｄ２）配列番号１の第９７６番目〜第９９５番目のヌクレオチド配列
以下、前記ヌクレオチド配列（Ｕ２）のポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なプライマーを、本発明のフォワードプライマーＵ２といい、前記ヌクレオチド配列（Ｄ２）のポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なプライマーを、本発明のリバースプライマーＤ２という。【００１４】  本発明のフォワードプライマーＵ２としては、例えば、配列番号３のヌクレオチド配列からなるプライマー（以下、ＡＦ２−３ともいう）、配列番号３において１つ若しくは数個の塩基が置換、付加若しくは欠失したヌクレオチド配列からなるプライマー及び配列番号３と６０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなるプライマー等が挙げられる。【００１５】  本発明のリバースプライマーＤ２としては、例えば、配列番号５のヌクレオチド配列からなるプライマー（以下、ＡＲ２−３ともいう）、配列番号５において１つ若しくは数個の塩基が置換、付加若しくは欠失したヌクレオチド配列からなるプライマー及び配列番号５と６０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなるプライマー等が挙げられる。【００１６】  本発明のプライマーセットは、２種類以上のプライマーを含むマイコプラズマＡ．ｌａｉｄｌａｗｉｉを検出するためのプライマーセットであって、本発明のプライマーを少なくとも２種類含むプライマーセットである。【００１７】  本発明のプライマーセットは、ネステッド（Ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ法に使用できることが好ましい。その場合、本発明のプライマーセットは、第一段階のＰＣＲ用のプライマーセットとして、例えば、本発明のフォワードプライマーＵ１およびリバースプライマーＤ１を含み、第二段階のＰＣＲ用のプライマーセットとして、例えば、本発明のフォワードプライマーＵ２及びリバースプライマーＤ２を含むことが好ましい。【００１８】  本発明の検出用キットは、マイコプラズマを遺伝子増幅により検出するマイコプラズマ検出用キットであって、マイコプラズマＡ．ｌａｉｄｌａｗｉｉの検出のための前記遺伝子増幅に使用するプライマー若しくはプライマーセットとして、本発明のプライマー又は本発明のプライマーセットを含むマイコプラズマ検出用キットである。【００１９】  本発明の検出用キットは、さらなる態様として、さらに、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｏｒａｌｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ及びＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓからなる群から選択される少なくとも一つのマイコプラズマの検出のための遺伝子増幅に使用する一つ以上のプライマーを含む。本発明の検出用キットは、Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍ．ｏｒａｌｅ、Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ及びＭ．ｈｏｍｉｎｉｓからなる群から選択される少なくとも一つのマイコプラズマを検出するための前記遺伝子増幅に使用するプライマーとして、例えば、配列番号６のヌクレオチド配列からなるプライマー（以下、Ｆ１ともいう）、配列番号７のヌクレオチド配列からなるプライマー（以下、Ｆ２ともいう）、配列番号８のヌクレオチド配列から��るプライマー（以下、Ｒ１ともいう）及び配列番号９のヌクレオチド配列からなるプライマー（以下、Ｒ２ともいう）の少なくとも一つを含むことが好ましい。【００２０】  本発明の検出方法は、Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉの検出方法であって、下記（Ａ）及び（Ｂ）のヌクレオチド配列又はその部分配列を含むポリヌクレオチドの少なくとも一方を増幅し、これを検出する検出方法である。
（Ａ）配列番号１の第５８９番目〜第９８７番目のヌクレオチド配列又はその相補配列
（Ｂ）配列番号１の第６０４番目〜第９７５番目のヌクレオチド配列又はその相補配列
本発明の検出方法において、前記（Ａ）及び（Ｂ）のヌクレオチド配列又はその部分配列を含むポリヌクレオチドの増幅は、本発明のプライマー、本発明のプライマーセット又は本発明のキットを使用することが好ましい。【００２１】  本発明の製造方法は、医薬組成物の製造方法であって、製造した医薬組成物のマイコプラズマ検査工程を含み、この検査工程が、本発明の検出方法によって実施される製造方法である。【００２２】  前記医薬組成物が、ポリペプチドを含む場合、本発明の製造方法は、例えば、下記（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を含むことが好ましい。
（ｉ）  前記医薬組成物に含まれるポリペプチドをコードする遺伝子を含む宿主細胞を培養する工程。
（ｉｉ）  前記（ｉ）の宿主細胞内で発現したポリペプチドを回収する工程。
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）で回収したポリペプチドから検査用サンプルを得る工程。
（ｉｖ）  前記（ｉｉｉ）で得たサンプル中にマイコプラズマが存在しないことを本発明の検出方法により検査する工程。【００２３】 マイコプラズマ
マイコプラズマは、Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ網に分類される細菌であって、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ科のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ属、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ科のＵｒｅａｐｌａｓｍａ属、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ科のＡｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ属、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ科のＳｐｉｒｏｐｌａｓｍａ属等の細菌を含む。本発明のプライマーによれば、Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉを感度よく、特異的に検出できる。また、本発明のプライマーセットの一例によれば、例えば、Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍ．ｏｒａｌｅ、Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ及びＡ．ｌａｉｄｌａｗｉｉの６種類のマイコプラズマをそれぞれに対し同程度の感度で検出することが可能である。なお、前記６種類のマイコプラズマの配列は既に公知であって、例えば、それらの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列のＤＮＡデータバンクアクセッション番号（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＩＤ）は、それぞれ、Ｍ２４６５８、Ｍ２４６５９、Ｕ１５７９４、Ｍ２４２８９、ＡＪ００２２６９及びＭ２３９３２（配列番号１）である。【００２４】 プライマー
本発明のプライマーを用いた遺伝子増幅法によりＡ．ｌａｉｄｌａｗｉｉを検出する場合、増幅されるポリヌクレオチドは、例えば、前記（Ａ）：配列番号１の第５８９番目〜第９８７番目のヌクレオチド配列若しくはその相補配列、前記（Ｂ）：配列番号１の第６０４番目〜第９７５番目のヌクレオチド配列若しくはその相補配列、又は、これらの部分配列を含むポリヌクレオチドである。また、前記ヌクレオチド配列（Ａ）を含むポリヌクレオチドの増幅を本発明のプライマーＵ１及びＤ１（上記参照）を用いて行った場合、プライマーの長さを含めるとその増幅産物は、例えば、配列番号１の第５７１番目〜第１００４番目のヌクレオチド配列又はその相補配列を含むポリヌクレオチドとなる。前記ヌクレオチド配列（Ｂ）を本発明のプライマーＵ２及びＤ２（上記参照）を用いて行った場合、プライマーの長さを含めるとその増幅産物は、例えば、配列番号１の第５８７番目〜第９９５番目のヌクレオチド配列又はその相補配列を含むポリヌクレオチドとなる。なお、配列番号１は、Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列（Ｍ２３９３２）である。なお、遺伝子増幅方法は、後述のとおり、特に制限されず、例えば、従来公知の核酸増幅方法を採用できるが、好ましくは、ＰＣＲ法である。【００２５】  本発明のフォワードプライマーとしては、例えば、配列番号１の第５３５番目〜第６０３番目、好ましくは配列番号１の第５４８〜６０３番目、さらに好ましくは配列番号１の第５５８番目〜６０３番目のヌクレオチド配列の相補配列のポリヌクレオチドにハイブリダイズが可能なプライマーが挙げられ、とりわけ、前記フォワードプライマーＵ１及びＵ２である。また、本発明のリバースプライマーとしては、例えば、配列番号１の第９７６番目〜第１０１９番目、さらに好ましくは配列番号１の第９７６番目〜第１０１２番目のヌクレオチド配列のポリヌクレオチドにハイブリダイズが可能なプライマーが挙げられ、とりわけ、前記リバースプライマーＤ１及びＤ２である。これらのプライマーは、前記のポリヌクレオチド全体にハイブリダイズする必要はなく、その一部分の領域にでもハイブリダイズすればよい。【００２６】  前記ハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば、４２℃、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば、６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳである。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては、温度や塩濃度等、複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで、同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。なお、本発明において、ハイブリダイゼーションにはアニーリングの意味も含まれる。【００２７】  本発明のフォワードプライマーは、好ましくは、フォワードプライマーＵ１及びＵ２であり、より好ましくは、配列番号２のヌクレオチド配列からなるプライマーＡＦ１−３及び配列番号３のヌクレオチド配列からなるプライマーＡＦ２−３である。また、本発明のリバースプライマーは、好ましくは、リバースプライマーＤ１及びＤ２であり、より好ましくは、配列番号４のヌクレオチド配列からなるプライマーＡＲ１−３及び配列番号５のヌクレオチド配列からなるプライマーＡＲ２−３である。【００２８】  本発明のプライマーは、前記プライマーＡＦ１−３、ＡＦ２−３、ＡＲ１−３及びＡＲ２−３のいずれかのヌクレオチド配列において、１つ若しくは数個の塩基が置換、付加若しくは欠失したヌクレオチド配列からなるプライマーであってもよく、または、前記プライマーＡＦ１−３、ＡＦ２−３、ＡＲ１−３及びＡＲ２−３のいずれかのヌクレオチド配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８８％以上の同一性を持つヌクレオチド配列からなるプライマーであってもよい。前記アニーリングの条件は特に限定されず、当業者であれば適宜選択することができるが、具体的な条件としては、例えば、後述する実施例に記載の条件を用いることができる。【００２９】  前記の置換、付加若しくは欠失される塩基の数は、特に制限されず、プライマーの長さ等によって異なるが、例えば、１個〜５個であり、好ましくは、１個〜３個、より好ましくは、１個〜２個であり、さらにより好ましくは、１個である。ここで、塩基の付加には、塩基の挿入が含まれる。【００３０】  前記のヌクレオチド配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによってヌクレオチド配列を解析する場合には、パラメーターは、例えば、ｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。本発明のプライマーにおいて、前記同一性として、６０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８８％以上であって、より好ましくは、９４％以上である。【００３１】  本発明のプライマーは、上述した条件を満たすヌクレオチド配列であれば、特に制限されず、例えば、ＤＮＡプライマー、ＲＮＡプライマー、又はＤＮＡやＲＮＡの類縁体を用いたプライマー等、いかなるプライマーであってもよい。また、プライマーを構成する主鎖は、ホスホジエステル結合によるものに限定されず、例えば、リン（Ｐ）ではなく、硫黄（Ｓ）をバックボーンとしたホスホチオエート体や、ペプチド結合に基づくペプチド核酸からなるものであってもよい。さらに、塩基も、相補的な塩基対結合を可能とするものであればよい。天然においては、アデニン、グアニン、シトシン、チミン及びウラシルの５種類により構成されるが、例えば、ブロモデオキシ���リジン（ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）等のような類似体であってもよい。【００３２】  プライマーの長さは、通常、７ｍｅｒ〜１００ｍｅｒであり、好ましくは、１５ｍｅｒ〜４０ｍｅｒであり、さらに好ましくは、１８ｍｅｒ〜３０ｍｅｒである。本発明のプライマーの鋳型ＤＮＡへのハイブリダイゼーションは、当業者に公知の条件で行うことができ、例えば、後述する実施例に記載の条件で行うことができる。【００３３】  本発明のプライマーは、当該技術分野で公知の方法によって、製造することができる。例えば、ホスホトリエチル法、ホスホジエステル法又はこれらの自動化された方法等を利用したり、自動合成機等を利用したりする方法が挙げられる。【００３４】 プライマーセット
本発明においてプライマーセットとは、２種類以上のプライマーのセットのことをいう。例えば、ＰＣＲ法においては、特定の領域を増幅する場合には、増幅領域を挟み込むように設計された２つのプライマー（フォワードプライマーとリバースプライマー）が必要となる。したがって、本発明のプライマーセットは、２種類以上の本発明のプライマーを含むことが好ましく、さらに好ましくは、前記（Ａ）及び／又は（Ｂ）ヌクレオチド配列又はその部分配列を含むポリヌクレオチドを増幅することが可能な本発明のフォワードプライマーと本発明のリバースプライマーのセットを含む。また、本発明のプライマーセットは、さらに、異なる領域を同時に増幅するためのプライマーを含むプライマーセットや、ネステッド（Ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲに用いるためのプライマーを含むプライマーセットであってもよい。【００３５】  前記ネステッドＰＣＲとは、１つ目のプライマーセットを用いてＰＣＲを行って遺伝子を増幅し、その後、増幅された遺伝子（ＰＣＲ産物）の内側の領域を２つ目のプライマーセットを用いて増幅する方法である。前記２つ目のプライマーセットは、１つ目のプライマーセットよりも内側になるように設計されるが、両方とも内側であってもよいし、片方のプライマーのみが内側となってもよい。ネステッドＰＣＲは、非特異的増幅を抑える有効な方法である。【００３６】  本発明のプライマーセットは、ネステッドＰＣＲを用いてＡ．ｌａｉｄｌａｗｉｉを検出できるプライマーセットであることが好ましい。その場合、第一段階のＰＣＲにより前記（Ａ）ヌクレオチド配列又はその部分配列を含むポリヌクレオチドを増幅し、第二段階のＰＣＲにより前記（Ｂ）ヌクレオチド配列又はその部分配列を含むポリヌクレオチドを増幅することが好ましい。したがって、本発明のプライマーセットは、第一段階ＰＣＲ用フォワードプライマーとして、例えば、フォワードプライマーＵ１、好ましくは、ＡＦ１−３を含み、第一段階ＰＣＲ用リバースプライマーとして、例えば、リバースプライマーＤ１、好ましくは、ＡＲ１−３を含み、第二段階ＰＣＲ用フォワードプライマーとして、例えば、フォワードプライマーＵ２、好ましくは、ＡＦ２−３を含み、第二段階ＰＣＲ用リバースプライマーとして、リバースプライマーＤ２、好ましくは、ＡＲ２−３を含むことが好ましい。【００３７】  また、本発明のプライマーセットは、Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉを検出するための本発明のプライマーに加え、さらに、５種類のマイコプラズマ、Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍ．ｏｒａｌｅ、Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ及びＭ．ｈｏｍｉｎｉｓを検出可能なプライマーを含んでもよい。前記の５種類のマイコプラズマを検出可能なプライマーとしては、例えば、第十四改正  日本薬局方（２００１）に記載されたネステッドＰＣＲ用プライマーＦ１、Ｆ２、Ｒ１及びＲ２（配列番号６、７、８及び９）が挙げられる。【００３８】 キット
本発明の検出用キットは、マイコプラズマを遺伝子増幅により検出するマイコプラズマ検出用キットであり、マイコプラズマＡ．ｌａｉｄｌａｗｉｉ検出用の本発明のプライマーを含むキットである。本発明の検出用キットで検出するＡ．ｌａｉｄｌａｗｉｉ以外のマイコプラズマの種類は特に制限されないが、例えば、前記５種類のマイコプラズマ、Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍ．ｏｒａｌｅ、Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ及びＭ．ｈｏｍｉｎｉｓの少なくとも一種が挙げられる。その場合、本発明の検出用キットには、前記プライマーＦ１、Ｆ２、Ｒ１及びＲ２が含まれることが好ましい。前記プライマー以外に本発明の検出用キットに含まれるものとしては、特に制限されないが、例えば、ポリメラーゼ等の酵素や、バッファー、ｄＮＴＰ等の各種試薬が挙げられる。【００３９】 検出方法
本発明のマイコプラズマＡ．ｌａｉｄｌａｗｉｉの検出方法は、前記（Ａ）及び（Ｂ）のヌクレオチド配列の少なくとも一方のヌクレオチド配列又はその部分配列を含むポリヌクレオチドを遺伝子増幅法により増幅し、これを検出する方法であり、例えば、本発明のプライマー、プライマーセット又は検出用キットを用いて行うことが好ましい。前記ポリヌクレオチドの増幅方法は、特に制限されず、従来公知の方法が使用できるが、例えば、ＰＣＲ法、ネステッドＰＣＲ法等を使用できる。ＰＣＲ法は、当業者によく知られた技術である。また、検出の精度を上げるには、ネステッドＰＣＲ法を用いることが好ましい。ＰＣＲの条件は、当業者であれば適宜決定できるが、例えば、本発明の実施例に記載の条件を用いてＰＣＲを行うことができる。ＰＣＲの増幅産物の検出方法としては、特に制限されず、例えば、アガロースゲル等を用いた電気泳動や、ＤＮＡチップを用いた方法等が挙げられる。【００４０】 Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍ．ｏｒａｌｅ、Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ及びＡ．ｌａｉｄｌａｗｉｉの６種類のマイコプラズマを同時にネスデットＰＣＲ法で検出する方法としては、例えば、被検サンプルに対して第一段階ＰＣＲをフォワードプライマーとして、Ｕ１（好ましくはＡＦ１−３）及びＦ１を、リバースプライマーとして、Ｄ１（好ましくはＡＲ１−３）及びＲ１を用いて行い、その増幅産物に対して第二段階ＰＣＲをフォワードプライマーとして、Ｕ２（好ましくはＡＦ２−３）及びＦ２を、リバースプライマーとして、Ｄ２（好ましくはＡＲ２−３）及びＲ２を用いて行う方法が挙げられる。【００４１】 医薬組成物
本発明において、医薬組成物とは、治療又は予防目的等で、ヒトに投与されることを前提に製造された組成物のことをいう。そして、本発明の医薬組成物の製造方法は、前記医薬組成物の検査サンプルのマイコプラズマ検査工程を含む製造方法であって、この検査工程が、本発明のプライマー、プライマーセット、検出用キット又は検出方法によって行われる製造方法である。前記マイコプラズマ検査工程は、いかなる医薬組成物の製造においても重要であるが、前記医薬組成物の製造過程において、細胞を培養する工程が含まれる場合には特に重要である。【００４２】 検査サンプル
本発明において検査サンプルとは、通常、製造された医薬組成物の中から取り出された試料のことをいい、上述の培養細胞等に由来の組成物の中から一部を取り出した試料であることが好ましい。前記試料の量は特に限定されず、マイコプラズマの検出を行うことができればよい。【００４３】 医薬組成物に含まれるポリペプチド
本発明の医薬組成物に含まれる有効成分は低分子化合物、ポリペプチド、ヌクレオチドなど、如何なる物質でもよいが、ポリペプチドであることが好ましい。本発明においてポリペプチドは、特に制限されず、いかなるポリペプチドであってもよい。前記ポリペプチドとしては、例えば、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子等の生理活性物質、抗体、受容体等のあらゆるタンパク質が挙げられる。前記ポリペプチドをコードする遺伝子は、通常、ベクターに組み込まれ、宿主に形質転換される。【００４４】  前記ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合、大腸菌で増幅されるための「ｏｒｉ」を有し、さらに、選択遺伝子、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を有すれば、特に制限されない。このようなベクターとしては、例えば、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ等が挙げられる。また、ｃＤＮＡのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、前記ベクターとしては、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７等が挙げられる。また、宿主の大腸菌としては、例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ等が挙げられる。前記ポリペプチドの産生を目的とする場合、前記ベクターは、宿主である大腸菌で効率よく発現できるプロモーターを有することが好ましい。前記プロモーターとしては、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）、又はＴ７プロモーター等が挙げられる。また、発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１（ファルマシア社製）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｓｙｓｔｅｍ」のベクター（キアゲン社製）、ｐＥＧＦＰ、ｐＥＴ等が挙げられる。なお、前記ｐＥＴを使用する場合、宿主大腸菌はＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現しているＢＬ２１が好ましい。また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポーレーション法を用いて行うことができる。【００４５】  前記大腸菌を宿主とするベクターの他、前記ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン社製）、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８等の哺乳動物由来の発現ベクター、例えば、「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ  ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ」のベクター（ギブコＢＲＬ社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８等の昆虫細胞由来の発現ベクター、例えば、ｐＭＨ１、ｐＭＨ２等の植物由来の発現ベクター、例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ等の動物ウィルス由来の発現ベクター、例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ等のレトロウィルス由来の発現ベクター、例えば、「ＰｉｃｈｉａＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ」のベクター（インビトロゲン社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１等の酵母由来の発現ベクター、例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０等の枯草菌由来の発現ベクター等が挙げられる。【００４６】  ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えば、ＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ＡｃｉｄｓＲｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、ＣＭＶプロモーター等を有することが好ましい。細胞への形質転換を選択するための遺伝子、例えば、ネオマイシンやＧ４１８等に対する薬剤耐性遺伝子を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３等が挙げられる。さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するＤＨＦＲ遺伝子を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩ等）を導入し、メトトレキセート（ＭＴＸ）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製起点を持つベクター（ｐｃＤ等）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。【００４７】  ベクターが導入される宿主としては特に制限はなく、上述のとおり、大腸菌や種々の動物細胞等を用いることができる。ポリペプチド製造のための産生系は、ｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。前記動物細胞としては、例えば、ＣＨＯ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１０８，９４５）、ＣＯＳ、３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ細胞等の哺乳類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９１，３５８−３４０）等の両生類細胞、あるいは、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５等の昆虫細胞が知られている。前記ＣＨＯ細胞としては、特に、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞であるｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ���．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，４２１６−４２２０）やＣＨＯ  Ｋ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９６８）６０，１２７５）を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には、特にＣＨＯ細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクション等の方法で行うことが可能である。植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が、ポリペプチド生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、例えば、酵母、サッカロミセス属のサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、アスペルギルス属のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）等が知られている。原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１等の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。これらの細胞を目的とするＤＮＡにより形質転換し、形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することによりポリペプチドが得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができる。その際、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のｐＨは、約６〜８であるのが好ましい。培養は、通常、約３０〜４０℃で約１５〜２００時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。【００４８】  一方、ｉｎ  ｖｉｖｏでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするＤＮＡを導入し、動物又は植物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（ＶｉｃｋｉＧｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。例えば、目的とするＤＮＡを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的のポリペプチドを得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるポリペプチドを含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。また、昆虫としては、例えば、カイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的のポリペプチドを得ることができる（Ｓｕｓｕｍｕ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−５９４）。さらに、植物を使用する場合、例えば、タバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とするポリペプチドをコードするＤＮＡを植物発現用ベクター、例えば、ｐＭＯＮ５３０に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）に感染させ、このタバコの葉より所望のポリペプチドを得ることができる（ＪｕｌｉａｎＫ．−Ｃ．Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。これにより得られたポリペプチドは、宿主細胞内又は細胞外（培地等）から単離し、実質的に純粋で均一なポリペプチドとして精製することができる。
【実施例１】
【００４９】  以下に、本発明の実施例について説明する。【００５０】 Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉ検出用プライマーを作製し、その検出感度と特異性を確認した。検出用プライマーは、下記の４本作製し、ネステッドＰＣＲの第１段階ＰＣＲには、ＡＦ１−３及びＡＲ１−３のプライマーセットを使用し、第２段階ＰＣＲには、ＡＦ２−３及びＡＲ２−３のプライマーセットを使用した。なお、使用したプライマーは、定法により化学合成した。
プライマーＡＦ１−３：５’−ｔｔｇｔｇｇｔｇｔａ  ａｇｔｇｃａｇｔ−３’    配列番号２
プライマーＡＦ２−３：５’−ｇｔｇｃｔｔａａｃｇ  ｃｔｇｔｇａｇ−３’    配列番号３
プライマーＡＲ１−３：５’−ａｔｃｔｇｔｔａｇｃ  ｃｔｃｃｇａａ−３’    配列番号４
プライマーＡＲ２−３：５’−ｃｃｔｃｃｇａａｃｔ  ｔａｔｔｔｃｔａａｇ−３’  配列番合５
また、他の５種類のマイコプラズマ（Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍ．ｏｒａｌｅ、Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ及びＭ．ｈｏｍｉｎｉｓ）の検出用プライマーとして、第１段階ＰＣＲには、下記Ｆ１及びＲ１のプライマーセットを使用し、第２段階ＰＣＲには、下記Ｆ２及びＲ２のプライマーセットを使用した（第十四改正  日本薬局方（２００１）、参考情報、９．参照）。
プライマーＦ１：５’−ａｃａｃｃａｔｇｇｇ  ａｇｙｔｇｇｔａａｔ−３’      配列番号６
プライマーＦ２：５’−ｇｔｇｓｇｇｍｔｇｇ  ａｔｃａｃｃｔｃｃｔ−３’      配列番号７
プライマーＲ１：５’−ｃｔｔｃｗｔｃｇａｃ  ｔｔｙｃａｇａｃｃｃ  ａａｇｇｃａｔ−３’  配列番号８
プライマーＲ２：５’−ｇｃａｔｃｃａｃｃａ  ｗａｗａｃｙｃｔｔ−３’        配列番号９
検出感度の確認
下記組成の第一段階ＰＣＲ及び第二段階ＰＣＲ反応溶液を作製し、下記ＰＣＲ反応条件で、６種のマイコプラズマ：Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍ．ｏｒａｌｅ、Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ及びＡ．ｌａｉｄｌａｗｉｉのそれぞれについて検出感度の確認を行った。各マイコプラズマＤＮＡのサンプル溶液の濃度は、１ｐｇ、１００ｆｇ及び１０ｆｇ／１０μＬとなるように稀釈して調整した。なお、各マイコプラズマＤＮＡは、約１０ｍｌのマイコプラズマ培養液からＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ社製）を用いて調製した。ＰＣＲ反応に用いたＴａｑポリメラーゼは、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ  ＨＳ（ＴａＫａＲａ社製）を使用した。また、ＰＣＲ反応においては、ホットスタートを採用した。【００５１】
【表１】
2006104031.tif 000002
【００５２】
【表２】
2006104031.tif 000003
【００５３】  第二段階ＰＣＲ反応終了後、反応溶液１０μＬに６×ローディングバッファーを混合した溶液を、１×ＴＢＥアガロースゲル電気泳動（１．０％）し、ＰＣＲによる増幅産物を確認した。【００５４】  その結果を下記表３に示す。同表に示すとおり、いずれのマイコプラズマＤＮＡをサンプルとした場合でも、１０ｆｇまで検出することができた。したがって、Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉが、他の５種類のマイコプラズマと同等の感度で検出できることが示された。また、１０ｆｇのＤＮＡ量は、マイコプラズマ数個〜数十個程度に相当するから、この検出方法は、十分な感度を有するといえる。【００５５】
【表３】
2006104031.tif 000004
【００５６】 特異性の確認
サンプル溶液のＤＮＡを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ及びＰｓｅｕｄｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの４種類の細菌ＤＮＡ（１ｎｇ、１ｐｇ及び１００ｆｇ／１０μＬ）とした以外は、上記「検出感度の確認」で行ったネステッドＰＣＲと同様にして、反応を行い、前記Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉ検出用プライマーの特異性を確認した。その結果、いずれの細菌ＤＮＡサンプルに対しても、ＤＮＡの増幅は認められなかった。したがって、この検出方法の特異性が十分であることが確認された。さらにサンプル溶液のＤＮＡを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの５種類の細菌ＤＮＡ（１００ｎｇ／１０μＬ）として、上記と同様にして反応を行い、前記Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉ検出用プライマーの特異性を確認した。その結果、いずれの細菌ＤＮＡサンプルに対しても、ＤＮＡの増幅は認められなかった。したがって、この検出方法の特異性が十分であることが確認された。【００５７】  （比較例１）
市販のマイコプラズマ検出キット（ＡＴＣＣ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いて、試料溶液（培養液）非存在下で、６種のマイコプラズマ：Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍ．ｏｒａｌｅ、Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ及びＡ．ｌａｉｄｌａｗｉｉのそれぞれについて検出感度の確認を行った。マイコプラズマＤＮＡのサンプル溶液の濃度は、実施例１と同様に、１ｐｇ、１００ｆｇ及び１０ｆｇ／１０μＬであった。そのうちの５μＬを用いて、下記組成の第一段階ＰＣＲ及び第二段階ＰＣＲ反応溶液を作製し、下記ＰＣＲ反応条件で反応を行い、検出感度を確認した。【００５８】
【表４】
2006104031.tif 000005
【００５９】
【表５】
2006104031.tif 000006
【００６０】  反応後のＤＮＡの増幅の確認は、実施例１と同様に、アガロース電気泳動を用いて行った。その結果を下記表６に示す。下記表に示すとおり、試料溶液非存在下において、Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉ以外の５種類については、１０ｆｇであったのに対し、Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉの検出感度は、１００ｆｇであった。【００６１】
【表６】
2006104031.tif 000007
【実施例２】
【００６２】 試料共存下における検出感度の確認
ＣＳＦ産生細胞の培養液及び抗ＩＬ−６レセプター抗体産生細胞の培養液中のマイコプラズマに対する検出感度の確認を行った。前記ＣＳＦ培養液は、特開昭６４−８５０９８号公報記載の細胞を培養して得られた培養液であり、前記抗ＩＬ−６レセプター抗体培養液は、特開平８−９９９０２号公報の参考例２に記載された方法に準じて作成したヒト型化ＰＭ−１抗体（抗ヒトＩＬ−６レセプター抗体）を産生するＣＨＯ細胞株を培養して得られた培養液である。【００６３】  ６００μＬの前記ＣＳＦ培養液又は抗ＩＬ−６レセプター抗体培養液に、１００ｃｆｕ又は１０ｃｆｕのマイコプラズマを添加し、細胞培養液とマイコプラズマを共存させた。この混合物を、毎分１５０００回転で１５分遠心分離し、上清を取り除いた後、ペレットを２００μＬのＰＢＳに懸濁し、これをサンプル溶液とした。そして、このサンプル溶液から、実施例１と同様にしてＤＮｅａｓｙＴｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔを用いてマイコプラズマＤＮＡを調製し、ＰＣＲ反応により前記サンプル溶液中のマイコプラズマを検出した。この検出は、前記６種類のマイコプラズマそれぞれについて行った。なお、反応条件は、上記表１及び２のとおりとした。【００６４】  その結果を、下記表７並びに図１及び２に示す。図１Ａ及び図２Ａは、ぞれぞれ、ＣＳＦ培養液及び抗ＩＬ−６レセプター抗体培養液の結果であって、レーン１及び７は、分子量マーカーであり、レーン２は、陰性対照（蒸留水）であり、レーン３及び４は、ＣＳＦ／抗ＩＬ−６レセプター抗体培養液であり、レーン５及び６は、それぞれ、Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ：１００ｃｆｕ及び１０ｃｆｕである。また、図１Ｂ及び図２Ｂは、ぞれぞれ、ＣＳＦ培養液及び抗ＩＬ−６レセプター抗体培養液の結果であって、レーン１及び１３は、分子量マーカーであり、レーン２は、陰性対照（蒸留水）であり、レーン３及び４は、それぞれ、Ｍ．ｏｒａｌｅ：１００ｃｆｕ及び１０ｃｆｕであり、レーン５及び６は、それぞれ、Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ：１００ｃｆｕ及び１０ｃｆｕであり、レーン７及び８は、それぞれ、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ：１００ｃｆｕ及び１０ｃｆｕであり、レーン９及び１０は、それぞれ、Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ：１００ｃｆｕ及び１０ｃｆｕであり、レーン１１及び１２は、それぞれ、Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉ：１００ｃｆｕ及び１０ｃｆｕである。【００６５】
【表７】
2006104031.tif 000008
【００６６】  上記表７及び図１及び２に示すとおり、ＣＳＦ培養液及び抗ＩＬ−６レセプター抗体培養液のいずれにおいても、Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉについて１０ｃｆｕまで検出することができた。【００６７】  培養細胞にマイコプラズマ汚染が起こった場合、マイコプラズマは、１０４〜１０９ｃｆｕ／ｍＬ程度まで増殖することが知られている。よって、上記の検出感度を有していれば、汚染を十分に検出できることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００６８】  以上、説明したとおり、本発明のプライマーは、マイコプラズマＡ．ｌａｉｄｌａｗｉｉを感度よく特異的に検出できる。また、本発明のプライマーを用いれば、培養細胞への感染率が高いことで知られる６種類のマイコプラズマ、Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍ．ｏｒａｌｅ、Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ及びＡ．ｌａｉｄｌａｗｉｉを同時に検出できるようになる。したがって、本発明は、医療分野及び製薬分野において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００６９】配列番号２：プライマー  ＡＦ１−３
配列番号３：プライマー  ＡＦ２−３
配列番号４：プライマー  ＡＲ１−３
配列番合５：プライマー  ＡＲ２−３
配列番号６：プライマー  Ｆ１
配列番号７：プライマー  Ｆ２
配列番号８：プライマー  Ｒ１
配列番号９：プライマー  Ｒ２
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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2006104031.tif 000012
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