(57)【要約】  新規な神経幹細胞の分化促進活性を有するペプチドならびにその薬学的に許容される塩を与え、神経細胞の変性等の治療に有用なペプチドならびにその薬学的に許容される塩を与えることを目的とする。アミノ酸配列(１)： Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn、アミノ酸配列(２)：Tyr Arg His Ala Trp Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Phe Asn、アミノ酸配列(３)：Ala Arg His Ala Trp Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Phe Asnまたはアミノ酸配列(４)：Tyr Arg His Ala Ala Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Phe Asnの何れかで表される配列からなり神経幹細胞の神経細胞への分化を促進するペプチドならびにその薬学的に許容される塩を与える。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のアミノ酸配列：
Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn (配列番号：１)
Tyr Arg His Ala Trp Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Phe Asn（配列番号：２）
Ala Arg His Ala Trp Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Phe Asn（配列番号：３）
Tyr Arg His Ala Ala Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Phe Asn（配列番号：４）
のいずれか、あるいは該アミノ酸配列において１〜３個の任意のアミノ酸が付加された配列、該アミノ酸配列から１〜３個の任意のアミノ酸が欠失した配列、または該アミノ酸配列において任意のアミノ酸残基が相同性置換された配列からなるペプチドであって、神経幹細胞の神経細胞への分化を促進する該ペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
Lys、Ala、Glu、AspおよびGlyからなる群から任意に１〜３個選択されたアミノ酸が付加されている、請求項１のペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
請求項１および２のペプチドのうちの何れか１つをコードする遺伝子。
【請求項４】
下記のアミノ酸配列：
Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn (配列番号：１)
Tyr Arg His Ala Trp Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Phe Asn（配列番号：２）
Ala Arg His Ala Trp Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Phe Asn（配列番号：３）
Tyr Arg His Ala Ala Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Phe Asn（配列番号：４）
のいずれかのアミノ末端が、アセチル基、メトキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、１〜３残基のペプチドの何れかで置換されたペプチドであって、神経幹細胞の神経細胞への分化を促進する該ペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
下記のアミノ酸配列：
Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn (配列番号：１)
Tyr Arg His Ala Trp Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Phe Asn（配列番号：２）
Ala Arg His Ala Trp Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Phe Asn（配列番号：３）
Tyr Arg His Ala Ala Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Phe Asn（配列番号：４）
のいずれかのカルボキシ末端が、アミド基、メチルエステル基、ブチルエステル基、１〜３残基のペプチドの何れかで置換されたペプチドであって、神経幹細胞の神経細胞への分化を促進する該ペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項６】
酸と共に形成された、請求項１、２、４または５のいずれかに記載の薬学的に許容されるペプチドの塩。
【請求項７】
該酸が、塩酸、硫酸、燐酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマール酸、シュウ酸、リンゴ酸、クエン酸、オレイン酸、またはパルミチン酸である、請求項６に記載の薬学的に許容されるペプチドの塩。
【請求項８】
アルカリ金属またはアルカリ土類金属の水酸化物または炭酸塩と共に形成された、請求項１、２、４または５のいずれかに記載の薬学的に許容されるペプチドの塩。
【請求項９】
該アルカリ金属またはアルカリ土類金属が、ナトリウム、カリウム、またはカルシウムである、請求項８に記載の薬学的に許容されるペプチドの塩。
【請求項１０】
アルミニウムの水酸化物または炭酸塩と共に形成された、請求項１、２、４または５のいずれかに記載の薬学的に許容されるペプチドの塩。
【請求項１１】
トリエチルアミン、ベンジルアミン、ジエタノールアミン、ｔ−ブチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、またはアルギニンと共に形成される、請求項１、２、４または５のいずれかに記載の薬学的に許容されるペプチドの塩。
【請求項１２】
請求項１、２、４から１１のいずれかに記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬。
【請求項１３】
脊髄損傷；脊髄異形成症候群；脳虚血による神経障害；ハンチントン病；パーキンソン病；筋萎縮性側索硬化症；およびアルツハイマーからなる群から選択される疾患の治療のための請求項１２の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な神経幹細胞の分化促進活性を有するペプチドならびにその薬学的に許容される塩に関する。さらに詳しくは、本発明は外傷等による脊髄損傷；脊髄異形成症候群；脳虚血による神経障害、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー等の神経変性疾患の治療に有用なペプチドならびにその薬学的に許容される塩に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞や体性幹細胞を用いる再生医療は、従来回復が不可能と考えられていた神経変性疾患などの治療に希望を与えるものであり、既に先駆的な臨床試験も開始されている。しかし、神経疾患の治療において、移植する神経幹細胞の供給源、数量、神経への分化効率などの多くの問題があり、神経幹細胞の有効な増殖・分化方法が求められている（非特許文献１）。
一方、アポトーシスは生体の恒常性を保つために必要な細胞の自然死であり、その破綻は癌や自己免疫疾患などの重篤な疾患を招く(非特許文献２)。アポトーシスは放射線や薬剤などの外因によっても引き起されるが、内因性の誘導因子としてTNF、TRAIL、FasL等が報告されている(非特許文献３および非特許文献４)。これらは、標的細胞上のそれぞれに特異的な受容体と結合し、アポトーシスを誘導する(非特許文献５)。【０００３】
TNF、TRAIL、FasLの過剰産生は、リウマチ性関節炎(Rheumatoid arthritis)、多発性硬化症(Multiple sclerosis)、AIDS(Acquired immune deficiency syndrome)、癌、敗血症ショック(Septic shock)、うっ血性心不全(Congestive heart failure)、再性不良性貧血(Aplastic anemia)、脊髄異形成症候群(Myelodysplastic syndrome)、クローン病(Crohn's disease)等の疾患の原因となる(非特許文献６)。【０００４】
CD95L（FasL）特異的にその生理活性を中和する抗体が、マウスの脊髄損傷後の神経細胞死を抑制し、神経機能の回復を促進することが報告されている（非特許文献７）。【０００５】
IL-12、GM-CSF等の樹状細胞から分泌される物質、樹状細胞を誘導・増殖させる物質、樹状細胞を活性化する物質、神経組織中の神経栄養因子の発現を誘導する物質、および神経組織中のマイクログリア、マクロファージを誘導・増殖させる物質から選ばれる１種または２種以上の物質；これら物質を発現することができるベクター；あるいは、神経栄養因子NT-3、CNTF、TGFβ1、IL-6、EGFを分泌する樹状細胞サブセット；を有効成分とする、脊髄損傷を含む中枢神経系損傷や脳梗塞などの神経機能不全疾患の治療薬が知られている(特許文献１)。【０００６】
神経栄養因子様作用、神経栄養因子活性増強作用、βアミロイドの細胞毒性抑制作用等の医薬作用を有する新規なベンゼン環縮合５員複素環式化合物が知られている(特許文献２)。【０００７】
優れた幹細胞・神経前駆細胞の増殖・分化促進作用を有する新規なベンゼン環縮合５員複素環式化合物が知られている(特許文献３)。【０００８】
インターロイキンー６レセプターとインターロイキンー６の融合タンパク質を有効成分として含む、神経前駆細胞の神経細胞への分化促進剤が知られている(特許文献４)。【０００９】
トリアゼピンまたはジアゼピンからなる７員環と２乃至４個の窒素原子を含む５員環との縮合環化合物であることを特徴とするアポトーシス抑制剤が知られている(特許文献５)。【００１０】
また、近年カスペースの阻害作用などによりアポトーシスを阻害する薬剤が脳虚血による神経障害（非特許文献８）、ハンチントン病（非特許文献９）、パーキンソン病（非特許文献１０）、筋萎縮性側索硬化症（非特許文献１１）、アルツハイマー等の神経変性疾患の動物モデルにおいて有効な治療効果を示すことが報告されている。【００１１】
上記の抗体やサイトカインなどは、特異性は高いが分子量が大きい蛋白質であるので、抗原性、投与方法、安定性に問題がある。天然のTNF結合蛋白のTNF結合機能部分を探索して得られた合成ペプチドは、天然のTNF結合蛋白との競合による有効性の低下、血液中の滞留時間が短いこと等の問題がある。また、低分子有機化合物のアポトーシス阻害剤は、アポトーシスの基本経路を阻害するので、選択性が低いことによる副作用が問題である。
【特許文献１】特開２００４−２４１２号公報
【特許文献２】特開２００３−８１９５９号公報
【特許文献３】特開２００２−３４８２３９号公報
【特許文献４】特開２０００−２４８０００号公報
【特許文献５】特開平１１−２２８５７６号公報
【非特許文献１】実験医学、Vol.20(9),1276-1279、2002
【非特許文献２】Annu Rev Immunol, 17, 221-253, 1999
【非特許文献３】Pharm Acta Helv, 74, 281-286, 2000
【非特許文献４】Exp Cell Res, 256, 58-66, 2000
【非特許文献５】TIBS, 24 February, 47-53, 1999
【非特許文献６】Microsc Res Tech, 50, 229-235, 2000
【非特許文献７】Nat Med, 10(4), 389-395 (2004)
【非特許文献８】Proc Natl Acad Sci USA, 95, 15769-15774, 1998
【非特許文献９】Nature Medicine, 6, 797-801, 2000
【非特許文献１０】J Neurosci, 22, 1763-1771, 2002
【非特許文献１１】Nature, 417, 74-78, 2002
【発明の開示】
【００１２】
発明の概要
本発明は、新規な神経幹細胞の分化促進活性を有するペプチドならびにその薬学的に許容される塩を与え、さらには、外傷等による脊髄損傷；脊髄異形成症候群；脳虚血による神経障害、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー等の神経変性疾患の治療に有用なペプチドならびにその薬学的に許容される塩を与えることを目的とする。
【００１３】
本発明は、下記のアミノ酸配列：
Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn (配列番号：１)
Tyr Arg His Ala Trp Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Phe Asn（配列番号：２）
Ala Arg His Ala Trp Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Phe Asn（配列番号：３）
Tyr Arg His Ala Ala Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Phe Asn（配列番号：４）
のいずれか、あるいは該アミノ酸配列において１〜３個の任意のアミノ酸が付加された配列、該アミノ酸配列から１〜３個の任意のアミノ酸が欠失した配列、または該アミノ酸配列において任意のアミノ酸残基が相同性置換された配列からなるペプチドであって、神経幹細胞の神経細胞への分化を促進する該ペプチドまたはその薬学的に許容される塩を提供する。
【００１４】
本発明においては各種アミノ酸残基を次の略号で記述する。
Ala ：Ｌ−アラニン
Arg ：Ｌ−アルギニン
Asn ：Ｌ−アスパラギン
Asp ：Ｌ−アスパラギン酸
Cys ：Ｌ−システイン
Gln ：Ｌ−グルタミン
Glu ：Ｌ−グルタミン酸
Gly ：グリシン
His ：Ｌ−ヒスチジン
Ile ：Ｌ−イソロイシン
Leu ：Ｌ−ロイシン
Lys ：Ｌ−リジン
Met ：Ｌ−メチオニン
Phe ：Ｌ−フェニルアラニン
Pro ：Ｌ−プロリン
Ser ：Ｌ−セリン
Thr ：Ｌ−トレオニン
Trp ：Ｌ−トリプトファン
Tyr ：Ｌ−チロシン
Val ：Ｌ−バリン
【００１５】
また、本明細書においては、常法に従ってペプチドのアミノ酸配列を、そのＮ末端のアミノ酸残基が左側に位置し、Ｃ末端のアミノ酸残基が右側に位置するように記述する。
【００１６】
本発明のペプチドは、通常のペプチド合成方法により行われる。例えば固相合成法または液相合成法によって調製されるが、固相合成法が操作上簡便である〔例えば、日本生化学会編「続生化学実験講座２  タンパク質の化学(下)」(昭和６２年５月２０日  株式会社東京化学同人発行)、第６４１−６９４頁参照〕。
【００１７】
本発明のペプチドの固相合成法による調製は、
例えば、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体などの反応溶媒に不溶性である重合体に、目的とするペプチドのＣ末端に対応するアミノ酸をそれが有するα−ＣＯＯＨ基を介して結合させ、
次いで該アミノ酸に目的とするペプチドのＮ末端の方向に向かって、対応するアミノ酸またはペプチド断片を該アミノ酸またはペプチド断片が有するα−ＣＯＯＨ基以外のα−アミノ基などの官能基を保護したうえで縮合させて結合させる操作と、該結合したアミノ酸またはペプチド断片におけるα−アミノ基などのペプチド結合を形成するアミノ基が有する保護基を除去する操作とを順次繰り返すことによってペプチド鎖を伸長させ、目的とするペプチドに対応するペプチド鎖を形成し、
次いで該ペプチド鎖を該重合体から脱離させ、かつ保護されている官能基から保護基を除去することにより目的とするペプチドを得、次いで該ペプチドを精製すること
によって実施される。ここで、ペプチド鎖の重合体からの脱離および保護基の除去は、トリフルオロ酢酸を用いて同時に行うのが副反応を抑制する観点から好ましい。また、得られたペプチドの精製は逆相液体クロマトグラフィ−やゲルパーミエイションクロマトグラフィーで行うのが効果的である。
【００１８】
また、本発明のペプチドの塩は、通常の塩生成反応を利用することにより調製される。
【００１９】
本発明により提供されるペプチドのアミノ酸配列は、
(１) Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn (配列番号：１) 
(２) Tyr Arg His Ala Trp Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Phe Asn（配列番号：２）
(３) Ala Arg His Ala Trp Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Phe Asn（配列番号：３）
(４) Tyr Arg His Ala Ala Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Phe Asn（配列番号：４）で与えられる。
【００２０】
本発明のペプチドとは、前記配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるものまたはこれと同等のアミノ酸配列からなるものであって神経幹細胞の神経細胞への分化を促進するものである。ここで、「前記配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列またはこれと同等のアミノ酸配列」には、
１．前記配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列、
２．前記配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列のアミノ末端がアセチル基、メトキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、１〜３個のアミノ酸残基(好ましくは１もしくは２個のアミノ酸残基、さらに好ましくは１個のアミノ酸残基)のペプチドで置換されたアミノ酸配列、
３．前記配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列のカルボキシ末端がアミド基、メチルエステル基、ブチルエステル基、１〜３個のアミノ酸残基(好ましくは１もしくは２個のアミノ酸残基、さらに好ましくは１個のアミノ酸残基)のペプチドで置換されたアミノ酸配列、
４．前記配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列の各アミノ酸残基が側鎖官能基の性質に基づき相同性置換されたアミノ酸配列、例えば、AspおよびGluの群、Arg、LysおよびHisの群、Asn、Gln、Ser、ThrおよびTyrの群、ならびにAla、Gly、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met、TrpおよびCysの群中の残基はそれぞれ互いに置換可能であり(Molecular Biology of The Cell, Fourth Edition, B. Albert et al, Garland Science, NY, 2002. pp.131-133.参照)、本明細書および特許請求の範囲において「相同性置換」とは上記各群内における置換を意味する、
５．１〜３個の任意のアミノ酸残基(好ましくは１もしくは２個の任意のアミノ酸残基、さらに好ましくは１個の任意のアミノ酸残基)が、前記配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列の任意の位置に付加されたアミノ酸配列、特に、付加されるアミノ酸残基はLys、Ala、Glu、AspおよびGlyからなる群から選択される、ならびに
６．前記配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列の１〜３個の任意のアミノ酸残基(好ましくは１もしくは２個の任意のアミノ酸残基、さらに好ましくは１個の任意のアミノ酸残基)が、欠失されたアミノ酸配列、
が含まれる。
【００２１】
本発明のペプチドの神経幹細胞の神経細胞への分化促進効果は、これらの活性を測定する通常の方法により確認し得る。例えば、(１)ラット胎児海馬由来の神経幹細胞の神経分化促進活性（例えば、Nat. Med. 6:271277; 2000参照）、(２) ラット胎児脊髄由来の神経幹細胞の神経分化促進活性（例えば、J. Neurosci. 16:7599-7609,1996参照）、(３) ラット骨髄間質細胞の神経細胞分化促進活性例えば、Brain Res. 991:46-55, 2003参照）を測定して行われる。また、TNFの活性はマウスＬ９２９細胞やＮＩＨ３Ｔ３細胞に対するアポトーシス誘導で測定できる。TRAILの活性はマウスＬ９２９細胞に対するアポトーシス誘導で測定できる。FasLの活性はFas遺伝子を導入したマウスＬ９２９細胞やＮＩＨ３Ｔ３細胞に対するアポトーシス誘導で測定できる(例えば、EMBO J, 13 , 4587-4596, 1994.参照)。アポトーシス誘導の検出は、ヨウ化プロピディウム(ＰＩ)やヘキスト３３２５８等の核酸染色試薬や、蛍光標識アネキシンＶなどの膜構造の変化を検出する方法が好ましく用いられる。中でもヨウ化プロピディウム(ＰＩ)、ＦＩＴＣ標識アネキシンＶが特に好ましい。
【００２２】
本発明の遺伝子は、上記本発明のペプチドのうちの何れか１つをコードするものである。
【００２３】
本発明のペプチドは、薬学的に許容される塩を形成していても良く、その塩としては、例えば、塩酸、硫酸、燐酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマール酸、シュウ酸、リンゴ酸、クエン酸、オレイン酸、パルミチン酸などの酸と共に形成された塩；ナトリウム、カリウム、カルシウムなどのアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の、またはアルミニウムの水酸化物または炭酸塩と共に形成された塩；トリエチルアミン、ベンジルアミン、ジエタノールアミン、ｔ−ブチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、アルギニンなどと共に形成された塩などが挙げられる。
【００２４】
本発明のペプチドおよび／またはその薬学的に許容される塩は単独で用いても、または２以上を混合して用いてもよい。すなわち、本明細書で開示のペプチドは混合物として用いることも可能である。以下、特に断りのない場合、「ペプチド」という語はペプチドおよび／またはその薬学的に許容される塩を示すものとする。
【００２５】
本発明のペプチドは、神経幹細胞の分化促進活性を有するため、外傷等による脊髄損傷；脊髄異形成症候群；脳虚血による神経障害、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー等の神経変性疾患の治療に有用である。このため、本発明は、外傷等による脊髄損傷；脊髄異形成症候群；脳虚血による神経障害、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー等の神経変性疾患を治療するための方法およびその方法における本発明のペプチドの使用を含む。ここで、「外傷等による脊髄損傷」とは、変性、傷害、機能不全等が原因となる脊髄損傷をいう。
【００２６】
本発明のペプチドを用いる治療法は、例えば静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、経皮投与、経口投与などの全身的投与や、脳内投与や脊髄内投与などのように疾患部位にカテーテルや注射針を用いて本発明のペプチドを注入する方法などが挙げられる。
【００２７】
本発明のペプチドの有効な活性発現のための投与量は、通常０．０１μｇ／ｋｇ〜２ｇ／ｋｇ(成人)であり、好ましくは０．０１μｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ(成人)である。
【００２８】
本発明のペプチドは、５％ブドウ糖液や生理食塩水などの薬学的に許容し得る溶液に溶解させて得られる溶液として投与されるのが好ましい。また該溶液は薬理学的に許容される種々の添加剤(充填剤、希釈剤、または保存料などの製剤補助剤)を含んでいてもよい。さらに本発明のペプチドをカプセル化またはリポソ−ム化することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、試験例２において6-ヒドロキシドーパミン処置し、配列番号２のペプチドを投与したラットの脳(試験例)のチロシンヒドロキシラーゼ免疫染色の結果を示す。
【図２】図２は、試験例２において6-ヒドロキシドーパミン処置し、配列番号２のペプチドは投与していないラットの脳(比較例)のチロシンヒドロキシラーゼ免疫染色の結果を示す。
【図３】図３は、試験例２において6-ヒドロキシドーパミンおよび配列番号２のペプチドの何れも投与していないラットの脳(コントロール)のチロシンヒドロキシラーゼ免疫染色の結果を示す。
【００３０】
実施例
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
(実施例１)
式(１)： Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn (配列番号：１)で示されるアミノ酸配列を含むペプチドTyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn-NH2をペプチド自動合成装置を用いて固相合成法により合成した。すなわち、４−(２’、４’−ジメトキシフェニル−フルオレニルメトキシカルボニル)−アミノメチル)−フェノキシアセトアミド−エチル基を０．６２ミリモル／ｇ(樹脂)の割合で有するスチレン−ジビニルベンゼン共重合体〔スチレンとジビニルベンゼンの構成モル比：９９対１〕からなる粒状樹脂〔米国アプライド・バイオシステムズ社製、Ｆｍｏｃアミドレジン〕０．１ミリモルを用い、目的とするペプチドのカルボキシル末端からアミノ末端に向かって順次対応するアミノ酸を結合させた。結合反応において、アミノ酸として、米国アプライド・バイオシステムズ社製のＮα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｎγ−トリチル−Ｌ−グルタミン〔Ｆｍｏｃグルタミン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−γ−ブチル−Ｌ−グルタミン酸〔Ｆｍｏｃグルタミン酸〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｎβ−トリチル−Ｌ−アスパラギン〔Ｆｍｏｃアスパラギン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−ＮＧ−(２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルフォニル)−Ｌ−アルギニン〔Ｆｍｏｃアルギニン〕、Ｎα−９− (フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｓ−トリチル−Ｌ−システイン〔Ｆｍｏｃシステイン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−セリン〔Ｆｍｏｃセリン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−ロイシン〔Ｆｍｏｃロイシン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−ＮＩｍ−トリチル−Ｌ−ヒスチジン〔Ｆｍｏｃヒスチジン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−フェニルアラニン〔Ｆｍｏｃフェニルアラニン 〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−チロシン〔Ｆｍｏｃチロシン 〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−ＮＩｎｄ−ブトキシ−Ｌ−トリプトファン〔Ｆｍｏｃトリプトファン〕を、各結合ステップについてそれぞれ１ミリモルずつ用いた。【００３１】
得られたペプチド樹脂を、７．５％のフェノールと、２．５％のエタンジチオール、５％の水と５％のチオアニソールを含むトリフルオロ酢酸１０ｍｌで３時間処理した。得られた溶液をジエチルエーテルに加えて生じる沈殿をさらに数回ジエチルエーテルで洗浄して、ペプチドの脱保護と樹脂からの脱離を行った。粗生成物をＰＤ１０カラム(アマシャムファルマシアジャパン)で精製してペプチドを得た。得られた精製ペプチドをファルマシアバイオテク株式会社製ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ１０ＸＴ〔カラム：ミリポアウオーターズ株式会社製ノバパックＣ１８  ３．９ｍｍφ×１５０ｍｍ、移動相：トリフルオロ酢酸を０．０５容量％含有するアセトニトリルと水の混合溶媒(アセトニトリル濃度を３０分間で５容量％から５０容量％に直線的に変化させた)、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ〕に付したところ、２１．５minに単一のピ−クが示された。ＦＡＢ法マススペクトルにより求めた精製ペプチドの分子量は１９０６であった(理論値：１９０６．１)。【００３２】
(実施例２)
式(２)： Tyr Arg His Ala Trp Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Phe Asn (配列番号：２)、式(３)：Ala Arg His Ala Trp Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Phe Asn（配列番号：３）、式(４)：Tyr Arg His Ala Ala Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Phe Asn（配列番号：４）で示されるアミノ酸配列を含むペプチドを実施例１と同様の方法で合成した。ただし、結合反応において、実施例１に示したアミノ酸以外に、米国アプライド・バイオシステムズ社製のＮα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−アラニン〔Ｆｍｏｃアラニン 〕を、各結合ステップについてそれぞれ１ミリモルずつ用いた。【００３３】
Tyr-Arg-His-Ala-Trp-Ser-Glu-Asn-Leu-Ala-Gln-Cys-Phe-Asn-NH2で示される精製ペプチドでは、１７．９minに単一のピ−クが示され、精製ペプチドの分子量は１７３８であった(理論値：１７３７．９)。Ala-Arg-His-Ala-Trp-Ser-Glu-Asn-Leu-Ala-Gln-Cys-Phe-Asn-NH2で示される精製ペプチドでは、１７．５minに単一のピ−クが示され、精製ペプチドの分子量は１６４６であった(理論値：１６４５．８)。Tyr-Arg-His-Ala-Ala-Ser-Glu-Asn-Leu-Ala-Gln-Cys-Phe-Asn-NH2で示される精製ペプチドでは、１５．３minに単一のピ−クが示され、精製ペプチドの分子量は１６２３であった(理論値：１６２２．８)。【００３４】
（比較例）
下記の(試験例１)において対照実験を行うべく、式(５)：Trp Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Phe Asn（配列番号：５）、式(６)：Tyr Arg His Ala Trp Ser Glu Asn Leu Ala（配列番号：６）、式(７)：Tyr Arg His Ala Trp Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Ala Asn（配列番号：７）、式(８)：Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Ala Asn（配列番号：８）（配列番号１−８はTNF 1型受容体(TNF-R1)由来）、式(９)：Tyr Arg His Ser Trp Pro Glu Asn Leu Ala Cys Glu Glu Leu（配列番号：９）、式(１０)：Tyr Arg His Ser Trp Pro Glu Asn Leu Ala（配列番号：１０）、式(１１)：Tyr Arg His Ser Phe Pro Glu Asn Leu Ala Cys Glu Glu Leu（配列番号：１１）（配列番号９−１１はFrizzled-related protein(Frzb-1)由来）で示されるアミノ酸配列を含むペプチドを実施例１と同様の方法で合成した。ただし、結合反応において、実施例１に示したアミノ酸以外に、米国アプライド・バイオシステムズ社製のＮα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−アラニン〔Ｆｍｏｃアラニン 〕とＮα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−プロリン〔Ｆｍｏｃプロリン 〕を、各結合ステップについてそれぞれ１ミリモルずつ用いた。【００３５】
Trp Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Phe Asn-NH2で示される精製ペプチドでは、１８．１minに単一のピ−クが示され、精製ペプチドの分子量は１２１０であった(理論値：１２１０．３)。Tyr Arg His Ala Trp Ser Glu Asn Leu Ala-NH2で示される精製ペプチドでは、１３．６minに単一のピ−クが示され、精製ペプチドの分子量は１２４６であった(理論値：１２４５．４)。Tyr Arg His Ala Trp Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Ala Asn-NH2で示される精製ペプチドでは、１４．４minに単一のピ−クが示され、精製ペプチドの分子量は１６６２であった(理論値：１６６１．８)。Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Ala Asn -NH2で示される精製ペプチドでは、１８．５minに単一のピ−クが示され、精製ペプチドの分子量は１８３１であった(理論値：１８３０．０)。Tyr Arg His Ser Trp Pro Glu Asn Leu Ala Cys Glu Glu Leu -NH2で示される精製ペプチドでは、１７．９minに単一のピ−クが示され、精製ペプチドの分子量は１７４６であった(理論値：１７４５．９)。Tyr Arg His Ser Trp Pro Glu Asn Leu Ala -NH2で示される精製ペプチドでは、１４．９minに単一のピ−クが示され、精製ペプチドの分子量は１２７２であった(理論値：１２７１．４)。Tyr Arg His Ser Phe Pro Glu Asn Leu Ala Cys Glu Glu Leu -NH2で示される精製ペプチドでは、１７．４minに単一のピ−クが示され、精製ペプチドの分子量は１７０７であった(理論値：１７０６．９)。【００３６】
（試験例１）
妊娠１６日目のＷｉｓｔａｒラット胎児（チャールス・リバー・ジャパン）から海馬を摘出した。単一細胞に分散した後、１％Ｎ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（ニッスイ製薬工業）に１００万個／ｍｌになるように懸濁して、２５ｃｍ２フラスコ（ＮＵＮＣ社）中で３７℃、５％ＣＯ２下３日間静置培養した。
スフェアを形成して増殖している海馬由来神経幹細胞を集めて、１％Ｎ２、２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２に懸濁し、２４穴プレート（ＮＵＮＣ社）の各ウエルに５００μｌ／ウエルずつ分注した。各ウエルに、実施例および比較例で得られた配列番号１から１１に示すペプチドを、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように加え、その後５日間３７℃、５％ＣＯ２下静置培養し、形態観察と免疫染色（例えば、V. J. Allan, Ed., "Protein Localization by Fluorescence Microscopy", Oxford University Press, N.Y., 2000.）を行った。
５日後に観察した結果、配列番号１〜４に示すペプチドを添加したウエルでは、スフェアを形成していた海馬由来神経幹細胞がプレート表面に接着して、無数の軸索様神経突起を伸張した。これに対して配列番号８に示すペプチドでは、スフェアを形成していた海馬由来神経幹細胞がプレート表面に接着したが、軸索様神経突起の伸張は観測されなかった。配列番号５〜７、９〜１１に示すペプチドでは、海馬由来神経幹細胞のスフェアがプレートに接着せず、かつ軸索様神経突起の伸張も観測されなかった。
配列番号１〜４に示すペプチドを添加したウエルで観測された軸索様神経突起は、免疫染色の結果約８５％がニューロフィラメント（ケミコン社、NF-M(145 kD)抗体、AB1987）陽性であった。約１０％がＧＦＡＰ（ダコ社、GFAP抗体、Z0334）陽性であった。即ち、配列番号１〜４に示すペプチドが高効率に海馬由来神経幹細胞を神経細胞に分化させることが明らかになった。【００３７】
（試験例２）
参考文献（Kirik, D., et al., Exp. Neurol., 152, 259-277(1998).）に記載の方法に従ってパーキンソン病モデルラットを作成した。6-ヒドロキシドーパミン（Sigma, HBr salt）5.2 mg/mlとアスコルビン酸（和光純薬）20 mg/mlの割合で含む生理食塩液を、８週齢の雄性SDラットの脳の線条体に注入個所あたり2 μlずつ注入した。注入個所は脳定位固定装置を用いて、(1) AP: +1.3, ML: -2.6, DV: -5.0;, (2) AP: +0.4, ML: -3.0, DV: -5.0;  (3) AP: -0.4, ML: -4.2, DV: -5.0;  (4) AP: -1.3, ML: -4.5, DV: -5.0 の４ヶ所とした。これをパーキンソン病モデルラットとした。
得られた各パーキンソン病モデルラットに対し、３週間以上１週間ごとに、腹腔内に1 mgのアポモルヒネを含む生理食塩液1 mlを注入し、その後３０分間の平均の反時計方向への回転速度を計測した。回転速度が７回毎分以上のラットを選択し以下の実験に供した。
6-ヒドロキシドーパミンを注入後４週間目に、配列番号２で示されるペプチドを5 mg/mlの割合で含む５％ブドウ糖液（日本薬局方）を、脳定位固定装置を用いて、(1) AP: +0.4, ML: -3.0, DV: -5.0;  (2) AP: -0.4, ML: -4.2, DV: -5.0の２ヶ所に各2 μlずつ注入した(試験例)。比較例として、6-ヒドロキシドーパミンを同様に注入後、５％ブドウ糖液のみ(配列番号２で示されるペプチドは含まず)を同位置に注入した(比較例)。
その後、８週間後に、アポモルヒネによって誘導される回転運動を評価した。
その結果、アポモルヒネによって誘導される回転運動については、試験例の群において４例中１例にアポモルヒネによって誘導される回転運動の完全な抑制が認められた。しかし、比較例の群においては回転運動の抑制は全く認められなかった。
また、脳組織のドーパミン産生神経細胞のマーカーであるチロシンヒドロキシラーゼを免疫染色して、試験例および比較例のラットの神経細胞の再生の程度を評価した。コントロールとして、6-ヒドロキシドーパミン、配列番号２で示されるペプチド、および５％ブドウ糖液の何れも注入していない側のラットの脳を取り出し、同様に染色した(コントロール)。
その結果、比較例のラットにおいてコントロールと比して神経細胞の減少が認められた(図２)。これに対し、試験例の群では４例中２例が、コントロールと同程度にチロシンヒドロキシラーゼ陽性となり、１例が有意に陽性となり、ドーパミン産生神経細胞の顕著な再生が認められた(例えば、図１および図３；図中、神経細胞の中央部の茶色に染色されている部分が陽性細胞である)。【００３８】
（試験例３）
試験例２と同様の方法で作製したパーキンソン病モデルラットに、配列番号２で示されるペプチドを5 mg/mlの割合で含む５％ブドウ糖液（日本薬局方）を、AP: +0.4, ML: 3.0, DV: 5.0の位置に挿入したカニューレを通して、2 μlずつ週１回で４週間注入した。その後、８週間にわたって、行動の観察と８週間後に脳切片のチロシンヒドロキシラーゼ免疫染色を行った。
その結果、８週間後には４例とも左前後肢の麻痺の軽減が認められた。さらに、４例とも20-30％(面積比)のチロシンヒドロキシラーゼ陽性のドーパミン産生神経細胞の再生が認められた。
これより明らかに、配列番号２で示されるペプチドの投与によって、有意な組織学的および行動学的改善が認められ、パーキンソン病モデルの治療に対する有効性が示された。
【図１】
2006046569.tif 000002
【図２】
2006046569.tif 000003
【図３】
2006046569.tif 000004
【配列表】
2006046569000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年11月24日(2006.11.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】請求の範囲
【請求項１】  下記のアミノ酸配列：
Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ（配列番号：１）
Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ（配列番号：２）
Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ（配列番号：３）
Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ（配列番号：４）
のいずれか、またはその薬学的に許容される塩を含む、パーキンソン病の治療剤。
【請求項２】（削除）
【請求項３】（削除）
【請求項４】  下記のアミノ酸配列：
Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ（配列番号：１）
Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ（配列番号：２）
Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ（配列番号：３）
Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ（配列番号：４）
のいずれかのアミノ末端が、アセチル基、メトキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基の何れかで置換されたペプチドであって、神経幹細胞の神経細胞への分化を促進する該ペプチドまたはその薬学的に許容される塩を含む、パーキンソン病の治療剤。
【請求項５】  下記のアミノ酸配列：
Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ（配列番号：１）
Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ（配列番号：２）
Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ（配列番号：３）
Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ（配列番号：４）
のいずれかのカルボキシ末端が、アミド基、メチルエステル基、ブチルエステル基の何れかで置換されたペプチドであって、神経幹細胞の神経細胞への分化を促進する該ペプチドまたはその薬学的に許容される塩を含む、パーキンソン病の治療剤。
【請求項６】（削除）
【請求項７】（削除）
【請求項８】（削除）
【請求項９】（削除）
【請求項１０】（削除）
【請求項１１】（削除）
【請求項１２】（削除）
【請求項１３】（削除）
【請求項１４】  下記のアミノ酸配列：
Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ（配列番号：１）
Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ（配列番号：２）
Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ（配列番号：３）
Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ（配列番号：４）
のいずれかからなるペプチド、該ペプチドのアミノ末端が、アセチル基、メトキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基の何れかで置換されたペプチド、該ペプチドのカルボキシ末端が、アミド基、メチルエステル基、ブチルエステル基の何れかで置換されたペプチドからなる群から選択されるペプチドであって神経幹細胞の神経細胞への分化を促進するペプチドまたはその薬学的に許容される塩の、パーキンソン病治療剤の製造のための使用。
【請求項１５】  下記のアミノ酸配列：
Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ（配列番号：１）
Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ（配列番号：２）
Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ（配列番号：３）
Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ（配列番号：４）
のいずれかからなるペプチド、該ペプチドのアミノ末端が、アセチル基、メトキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基の何れかで置換されたペプチド、該ペプチドのカルボキシ末端が、アミド基、メチルエステル基、ブチルエステル基の何れかで置換されたペプチドからなる群から選択されるペプチドであって神経幹細胞の神経細胞への分化を促進するペプチドまたはその薬学的に許容される塩を、パーキンソン病患者に投与することを含むパーキンソン病の治療方法。
【請求項１６】  下記のアミノ酸配列：
Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ（配列番号：１）
Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ（配列番号：２）
Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ（配列番号：３）
Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ（配列番号：４）
のいずれか、またはその薬学的に許容される塩を含む、脊髄損傷の治療剤。
【請求項１７】  脊髄損傷が外傷による脊髄損傷である、請求項１６記載の治療剤。
【国際調査報告】
2006046569.tif 000005
2006046569.tif 000006