(57)【要約】  本発明は、優れたペプチド生成タンパク質、および効率の良いペプチドの製造方法等を提供することを課題とする。  すなわち、下記（Ｉ）および（II）に示すタンパク質のうち少なくとも一方の存在下で、アミン成分とカルボキシ成分とを反応させてペプチドを生成させるものである。（Ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対し変異型１から６８、変異型２３９から２９０、および３２４から３７７のうちのいずれか１種または２種以上の変異を含むアミノ酸配列を有する変異型タンパク質（II）配列番号２０８に記載のアミノ酸配列に対し変異型Ｌ１からＬ３３５およびＭ１からＭ６４２のうちのいずれか１種または２種以上の変異を含むアミノ酸配列を有する変異型タンパク質【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に記載のアミノ酸配列に対し下記変異型１から６８のいずれか１種または２種以上の変異を含むアミノ酸配列を有する変異型タンパク質。
変異型１  Ｆ２０７Ｖ
変異型２  Ｑ４４１Ｅ
変異型３  Ｋ８３Ａ
変異型４  Ａ３０１Ｖ
変異型５  Ｖ２５７Ｉ
変異型６  Ａ５３７Ｇ
変異型７  Ａ３２４Ｖ
変異型８  Ｎ６０７Ｋ
変異型９  Ｄ３１３Ｅ
変異型１０  Ｑ２２９Ｈ
変異型１１  Ｍ２０８Ａ
変異型１２  Ｅ５５１Ｋ
変異型１３  Ｆ２０７Ｈ
変異型１４  Ｔ７２Ａ
変異型１５  Ａ１３７Ｓ
変異型１６  Ｌ４３９Ｖ
変異型１７  Ｇ２２６Ｓ
変異型１８  Ｄ６１９Ｅ
変異型１９  Ｙ３３９Ｈ
変異型２０  Ｗ３２７Ｇ
変異型２１  Ｖ１８４Ａ
変異型２２  Ｖ１８４Ｃ
変異型２３  Ｖ１８４Ｇ
変異型２４  Ｖ１８４Ｉ
変異型２５  Ｖ１８４Ｌ
変異型２６  Ｖ１８４Ｍ
変異型２７  Ｖ１８４Ｐ
変異型２８  Ｖ１８４Ｓ
変異型２９  Ｖ１８４Ｔ
変異型３０  Ｑ４４１Ｋ
変異型３１  Ｎ４４２Ｋ
変異型３２  Ｄ２０３Ｎ
変異型３３  Ｄ２０３Ｓ
変異型３４  Ｆ２０７Ａ
変異型３５  Ｆ２０７Ｓ
変異型３６  Ｑ４４１Ｎ
変異型３７  Ｆ２０７Ｔ
変異型３８  Ｆ２０７Ｉ
変異型３９  Ｔ２１０Ｋ
変異型４０  Ｗ１８７Ａ
変異型４１  Ｓ２０９Ａ
変異型４２  Ｆ２１１Ａ
変異型４３  Ｆ２１１Ｖ
変異型４４  Ｖ２５７Ａ
変異型４５  Ｖ２５７Ｇ
変異型４６  Ｖ２５７Ｈ
変異型４７  Ｖ２５７Ｍ
変異型４８  Ｖ２５７Ｎ
変異型４９  Ｖ２５７Ｑ
変異型５０  Ｖ２５７Ｓ
変異型５１  Ｖ２５７Ｔ
変異型５２  Ｖ２５７Ｗ
変異型５３  Ｖ２５７Ｙ
変異型５４  Ｋ４７Ｇ
変異型５５  Ｋ４７Ｅ
変異型５６  Ｎ４４２Ｆ
変異型５７  Ｎ６０７Ｒ
変異型５８  Ｐ２１４Ｔ
変異型５９  Ｑ２０２Ｅ
変異型６０  Ｙ４９４Ｆ
変異型６１  Ｒ１１７Ａ
変異型６２  Ｆ２０７Ｇ
変異型６３  Ｓ２０９Ｄ
変異型６４  Ｓ２０９Ｇ
変異型６５  Ｑ４４１Ｄ
変異型６６  Ｒ４４５Ｄ
変異型６７  Ｒ４４５Ｆ
変異型６８  Ｎ４４２Ｄ
【請求項２】
請求項１に記載の変異型タンパク質において、前記変異型１から６８のいずれか１種または２種以上の変異を含むアミノ酸配列中、変異部位以外の部位に置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を更に含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有する、変異型タンパク質。
【請求項３】
少なくとも変異型２を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の変異型タンパク質。
【請求項４】
少なくとも変異型１４を含むことを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の変異型タンパク質。
【請求項５】
配列番号２に記載のアミノ酸配列に対し下記変異型２３９から２９０、および３２４から３７７のうちのいずれか１種または２種以上の変異を含むアミノ酸配列を有する変異型タンパク質。
変異型２３９  Ｆ２０７Ｖ／Ｑ４４１Ｅ
変異型２４０  Ｆ２０７Ｖ／Ｋ８３Ａ
変異型２４１  Ｆ２０７Ｖ／Ｅ５５１Ｋ
変異型２４２  Ｋ８３Ａ／Ｑ４４１Ｅ
変異型２４３  Ｍ２０８Ａ／Ｅ５５１Ｋ
変異型２４４  Ｖ２５７Ｉ／Ｑ４４１Ｅ
変異型２４５  Ｖ２５７Ｉ／Ａ５３７Ｇ
変異型２４６  Ｆ２０７Ｖ／Ｓ２０９Ａ
変異型２４７  Ｋ８３Ａ／Ｓ２０９Ａ
変異型２４８  Ｋ８３Ａ／Ｆ２０７Ｖ／Ｑ４４１Ｅ
変異型２４９  Ｌ４３９Ｖ／Ｆ２０７Ｖ／Ｑ４４１Ｅ
変異型２５０  Ａ５３７Ｇ／Ｆ２０７Ｖ／Ｑ４４１Ｅ
変異型２５１  Ａ３０１Ｖ／Ｆ２０７Ｖ／Ｑ４４１Ｅ
変異型２５２  Ｇ２２６Ｓ／Ｆ２０７Ｖ／Ｑ４４１Ｅ
変異型２５３  Ｖ２５７Ｉ／Ｆ２０７Ｖ／Ｑ４４１Ｅ
変異型２５４  Ｄ６１９Ｅ／Ｆ２０７Ｖ／Ｑ４４１Ｅ
変異型２５５  Ｙ３３９Ｈ／Ｆ２０７Ｖ／Ｑ４４１Ｅ
変異型２５６  Ｎ６０７Ｋ／Ｆ２０７Ｖ／Ｑ４４１Ｅ
変異型２５７  Ａ３２４Ｖ／Ｆ２０７Ｖ／Ｑ４４１Ｅ
変異型２５８  Ｑ２２９Ｈ／Ｆ２０７Ｖ／Ｑ４４１Ｅ
変異型２５９  Ｗ３２７Ｇ／Ｆ２０７Ｖ／Ｑ４４１Ｅ
変異型２６０  Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２６１  Ｋ８３Ａ／Ｑ２２９Ｈ／Ａ３０１Ｖ／Ｄ３１３Ｅ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２６２  Ｑ２２９Ｈ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２６３  Ｑ２２９Ｈ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２６４  Ｑ２２９Ｈ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ｄ３１３Ｅ／Ａ３２４Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２６５  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２６６  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ａ３０１Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２６７  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｈ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２６８  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｈ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２６９  Ｔ７２Ａ／  Ｑ２２９Ｈ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ｄ３１３Ｅ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２７０  Ｔ７２Ａ／  Ｑ２２９Ｈ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ｄ３１３Ｅ／Ａ３２４Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２７１  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２７２  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｌ／Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２７３  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｇ／Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２７４  Ｔ７２Ａ／Ｑ２２９Ｉ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ｄ３１３Ｅ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２７５  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｉ２２８Ｇ／Ｑ２２９Ｐ／Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２７６  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｉ２２８Ｌ／Ｑ２２９Ｐ／Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２７７  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｉ２２８Ｄ／Ｑ２２９Ｐ／Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２７８  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｉ２３０Ｄ／Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２７９  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｉ２３０Ｖ／Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２８０  Ｔ７２Ａ／Ｉ２２８Ｓ／Ｑ２２９Ｈ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ｄ３１３Ｅ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２８１  Ｔ７２Ａ／Ｑ２２９Ｈ／Ｓ２５６C／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ｄ３１３Ｅ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２８２  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２８３  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２８４  Ｔ７２Ａ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｇ／Ｄ３１３Ｅ／Ａ３２４Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２８５  Ｔ７２Ａ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ｄ３１３Ｅ／Ａ３２４Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２８６  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｖ１８４Ａ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２８７  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｖ１８４Ｇ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２８８  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｖ１８４Ｎ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２８９  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｖ１８４Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２９０  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｖ１８４Ｔ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型３２４  Ｖ１８４Ａ／Ｖ２５７Ｙ
変異型３２５  Ｖ１８４Ａ／Ｗ１８７Ａ
変異型３２６  Ｖ１８４Ａ／Ｎ４４２Ｄ
変異型３２７  Ｖ１８４Ｐ／Ｎ４４２Ｄ
変異型３２８  Ｖ１８４Ａ／Ｎ４４２Ｄ／Ｌ４３９Ｖ
変異型３２９  Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ
変異型３３０  Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ｐ
変異型３３１  Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ２５７Ｙ
変異型３３２  Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｗ１８７Ａ
変異型３３３  Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｆ２１１Ａ
変異型３３４  Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｑ４４１Ｅ
変異型３３５  Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｎ４４２Ｄ
変異型３３６  Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｆ２０７Ｖ
変異型３３７  Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ａ１８２Ｇ
変異型３３８  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｎ４４２Ｄ
変異型３３９  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｎ４４２Ｄ／Ｔ１８５Ｆ
変異型３４０  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｋ８３Ａ
変異型３４１  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｗ１８７Ａ
変異型３４２  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｆ２１１Ａ
変異型３４３  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｖ１７８Ｇ
変異型３４４  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｔ１８５Ａ
変異型３４５  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ａ１８２Ｇ
変異型３４６  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｋ３１４Ｒ
変異型３４７  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ａ５１５Ｖ
変異型３４８  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｌ６６Ｆ
変異型３４９  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｓ３１５Ｒ
変異型３５０  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｋ４８４Ｉ
変異型３５１  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｖ２１３Ａ
変異型３５２  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ａ２４５Ｓ
変異型３５３  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｐ２１４Ｈ
変異型３５４  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ  ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ  ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｌ２６３Ｍ
変異型３５５  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ  ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｐ１８３Ａ
変異型３５６  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｔ１８５Ｋ
変異型３５７  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｔ１８５Ｄ
変異型３５８  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｔ１８５Ｃ
変異型３５９  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｔ１８５Ｓ
変異型３６０  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｔ１８５Ｆ
変異型３６１  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｔ１８５Ｐ
変異型３６２  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｔ１８５Ｎ
変異型３６３  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｐ１８３Ａ／Ａ１８２Ｇ
変異型３６４  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｐ１８３Ａ／Ａ１８２Ｓ
変異型３６５  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ  ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｔ１８５Ｆ／Ｎ４４２Ｄ
変異型３６６  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ  ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｌ６６Ｆ／Ｅ８０Ｋ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８２Ｇ／Ｐ２１４Ｈ／Ｌ２６３Ｍ
変異型３６７  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｌ６６Ｆ／Ｅ８０Ｋ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８２Ｇ／Ｐ２１４Ｈ／Ｌ２６３Ｍ／Ｙ３２８Ｆ
変異型３６８  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ  ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｌ６６Ｆ／Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８２Ｇ／Ｐ２１４Ｈ／Ｌ２６３Ｍ／Ｙ３２８Ｆ
変異型３６９  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｌ６６Ｆ／Ｅ８０Ｋ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８２Ｇ／Ｔ２１０Ｌ／Ｌ２６３Ｍ／Ｙ３２８Ｆ
変異型３７０  Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｑ４４１Ｋ
変異型３７１  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｉ１５７Ｌ
変異型３７２  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｇ１６１Ａ
変異型３７３  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型３７４  Ｆ２０７Ｖ／Ｇ２２６Ｓ
変異型３７５  Ｆ２０７Ｖ／Ｗ３２７Ｇ
変異型３７６  Ｆ２０７Ｖ／Ｙ３３９Ｈ
変異型３７７  Ｆ２０７Ｖ／Ｄ６１９Ｅ
【請求項６】
請求項５に記載の変異型タンパク質において、前記変異型２３９から２９０、および３２４から３７７のうちのいずれか１種または２種以上の変異を含むアミノ酸配列中、変異部位以外の部位に置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を更に含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有する、変異型タンパク質。
【請求項７】
少なくとも変異型２６０を含むことを特徴とする、請求項５または６に記載の変異型タンパク質。
【請求項８】
少なくとも変異型２８６を含むことを特徴とする、請求項５から７のいずれかに記載の変異型タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の変異型タンパク質が有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９に記載のポリヌクレオチドを含む組換えポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組換えポリヌクレオチドを含む形質転換微生物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および／または微生物中に前記変異型タンパク質を蓄積させることを特徴とする、変異型タンパク質の製造方法。
【請求項１３】
請求項１から８のいずれか一項に記載の変異型タンパク質の存在下で、ペプチド生成反応を行うことを特徴とする、ペプチドの製造方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および／または形質転換微生物中に前記変異型タンパク質を蓄積させてペプチド生成反応を行うことを特徴とする、ペプチドの製造方法。
【請求項１５】
請求項１から８のいずれか一項に記載の変異型タンパク質の存在下で、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルとＬ−フェニルアラニンとの反応を行うことを特徴とする、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法。
【請求項１６】
請求項１１に記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および／または形質転換微生物中に前記変異型タンパク質を蓄積させて、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルとＬ−フェニルアラニンとの反応を行うことを特徴とする、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法。
【請求項１７】
配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をＸ線結晶構造解析して得られた立体構造を基にして、当該タンパク質の基質結合部位を推定し、基質結合部位に位置するアミノ酸残基の置換、挿入または削除をすることによりペプチド生成活性を有する変異型タンパク質を設計・作製する方法。
【請求項１８】
配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造のうち、当該配列中６７−７０、７２−８８、１００、１０２、１０３、１０６、１０７、１１３−１１７、１３０、１５５−１６３、１６５、１６６、１８０−１８８、１９０−１９５、２００−２３５、２５９、２７３、２７６、２７８、２９２−２９４、２９６、２９８、２９９、３００−３０４、３２５−３２８、３３０−３４０、及び４３７−４４７のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基が置換、挿入または削除され、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
【請求項１９】
ペプチド生成活性を有するタンパク質の変異型タンパク質であって、当該タンパク質と配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質との３次元構造とが、トレッディング法による判定の結果類似しており、該判定の際に得られるアラインメントにおいて、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中６７−７０、７２−８８、１００、１０２、１０３、１０６、１０７、１１３−１１７、１３０、１５５−１６３、１６５、１６６、１８０−１８８、１９０−１９５、２００−２３５、２５９、２７３、２７６、２７８、２９２−２９４、２９６、２９８、２９９、３００−３０４、３２５−３２８、３３０−３４０、及び４３７−４４７のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一以上のアミノ酸残基が置換、挿入または削除され、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
【請求項２０】
ペプチド生成活性を有するタンパク質の変異型タンパク質であって、当該タンパク質と配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の一次配列とのアラインメントを行ったときに、もしくは当該タンパク質と配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の３次元構造とのアラインメントを行なったときに、一次配列の相同性が２５％以上であるものにおいて、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、６７−７０、７２−８８、１００、１０２、１０３、１０６、１０７、１１３−１１７、１３０、１５５−１６３、１６５、１６６、１８０−１８８、１９０−１９５、２００−２３５、２５９、２７３、２７６、２７８、２９２−２９４、２９６、２９８、２９９、３００−３０４、３２５−３２８、３３０−３４０及び４３７−４４７のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一以上のアミノ酸残基が置換、挿入または削除され、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
【請求項２１】
配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造において、以下の（ａ）〜（ｉ）の中から選ばれる１または２以上の立体構造の変化が生じており、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
（ａ）配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中７９−８２のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｂ）配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中８４、８８、８９及び９２のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｃ）配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中７２、７５及び７７のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｄ）配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中１５９、１６１、１６２、１８４、１８７及び２７６のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｅ）配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中７０、１０６、１１３、１１５、１９３、２０７、２０９−２１２、２１６及び２５９のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｆ）配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中２００、２０２−２０５、２０７及び２２８のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｇ）配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中２３３、２３４、及び４３９のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｈ）配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中３２８、３３９、３４０、４４５、及び４４６のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｉ）配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中８７、１５５、１５７、及び１６０のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
【請求項２２】
ペプチド生成活性を有するタンパク質の変異型タンパク質であって、当該タンパク質と配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質との３次元構造とが、トレッディング法による判定の結果類似しており、かつ、該判定の際に得られるアラインメントにおいて、以下の（ａ´）〜（ｉ´）の中から選ばれる１または２以上の変化が生じている、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
（ａ´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、７９−８２のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｂ´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、８４、８８、８９及び９２のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｃ´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、７２、７５及び７７のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｄ´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、１５９、１６１、１６２、１８４、１８７及び２７６のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｅ´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、７０、１０６、１１３、１１５、１９３、２０７、２０９−２１２、２１６及び２５９のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｆ´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、２００、２０２−２０５、２０７、及び２２８のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｇ´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、２３３、２３４、及び４３９のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｈ´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、３２８、３３９、３４０、４４５、及び４４６のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｉ´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、８７、１５５、１５７、及び１６０のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
【請求項２３】
ペプチド生成活性を有するタンパク質の変異型タンパク質であって、当該タンパク質と配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の一次配列とのアラインメントを行ったときに、もしくは当該タンパク質と配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の３次元構造とのアラインメントを行ったときに、一次配列の相同性が２５％以上であるものにおいて、以下の（ａ´´）〜（ｉ´´）の中から選ばれる１または２以上の変化が生じており、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
（ａ´´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、７９−８２のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｂ´´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、８４、８８、８９及び９２のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｃ´´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、７２、７５及び７７のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｄ´´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、１５９、１６１、１６２、１８４、１８７及び２７６のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｅ´´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、７０、１０６、１１３、１１５、１９３、２０７、２０９−２１２、２１６及び２５９のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｆ´´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、２００、２０２−２０５、２０７、及び２２８のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｇ´´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、２３３、２３４、及び４３９のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｈ´´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、３２８、３３９、３４０、４４５、及び４４６のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｉ´´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、８７、１５５、１５７、及び１６０のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
【請求項２４】
配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造のうち、当該配列中６７、６９、７０、７２−８５、１０３、１０６、１０７、１１３−１１６、１６５、１８２、１８３、１８５、１８７、１８８、１９０、２００、２０２、２０４−２０６、２０９−２１１、２１３−２３５、３０１、３２８、３３８−３４０、４４０−４４２、及び４４６のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基が置換、挿入または削除され、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
【請求項２５】
配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造のうち、当該配列中６７、６９、７０、７２−８４、１０６、１０７、１１４、１１６、１８３、１８５、１８７、１８８、２０２、２０４−２０６、２０９、２１１、２１３−２３３、２３５、３２８、３３８−４４２、及び４４６のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基が置換、挿入または削除され、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
【請求項２６】
配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造のうち、当該配列中６７、７０、７２−７５、７７−７９、８１−８４、１１４、１１６、１８５、１８８、２０２、２０４、２０６、２０９、２１１、２１３−２１５、２１８−２２４、２２６−２３３、２３５、３２８、３３８−４４１、及び４４６のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基が置換、挿入または削除され、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
【請求項２７】
配列番号２０８に記載のアミノ酸配列に対し下記変異型Ｌ１からＬ３３５のいずれか１種または２種以上の変異を含むアミノ酸配列を有する変異型タンパク質。
変異型Ｌ１  Ｎ６７Ｋ
変異型Ｌ２  Ｎ６７Ｌ
変異型Ｌ３  Ｎ６７Ｓ
変異型Ｌ４  Ｔ６９Ｉ
変異型Ｌ５  Ｔ６９Ｍ
変異型Ｌ６  Ｔ６９Ｑ
変異型Ｌ７  Ｔ６９Ｒ
変異型Ｌ８  Ｔ６９Ｖ
変異型Ｌ９  Ｐ７０Ｇ
変異型Ｌ１０  Ｐ７０Ｎ
変異型Ｌ１１  Ｐ７０Ｓ
変異型Ｌ１２  Ｐ７０Ｔ
変異型Ｌ１３  Ｐ７０Ｖ
変異型Ｌ１４  Ａ７２Ｃ
変異型Ｌ１５  Ａ７２Ｄ
変異型Ｌ１６  Ａ７２Ｅ
変異型Ｌ１７  Ａ７２Ｉ
変異型Ｌ１８  Ａ７２Ｌ
変異型Ｌ１９  Ａ７２Ｍ
変異型Ｌ２０  Ａ７２Ｎ
変異型Ｌ２１  Ａ７２Ｑ
変異型Ｌ２２  Ａ７２Ｓ
変異型Ｌ２３  Ａ７２Ｖ
変異型Ｌ２４  Ｖ７３Ａ
変異型Ｌ２５  Ｖ７３Ｉ
変異型Ｌ２６  Ｖ７３Ｌ
変異型Ｌ２７  Ｖ７３Ｍ
変異型Ｌ２８  Ｖ７３Ｎ
変異型Ｌ２９  Ｖ７３Ｓ
変異型Ｌ３０  Ｖ７３Ｔ
変異型Ｌ３１  Ｓ７４Ａ
変異型Ｌ３２  Ｓ７４Ｆ
変異型Ｌ３３  Ｓ７４Ｋ
変異型Ｌ３４  Ｓ７４Ｎ
変異型Ｌ３５  Ｓ７４Ｔ
変異型Ｌ３６  Ｓ７４Ｖ
変異型Ｌ３７  Ｐ７５Ａ
変異型Ｌ３８  Ｐ７５Ｄ
変異型Ｌ３９  Ｐ７５Ｌ
変異型Ｌ４０  Ｐ７５Ｓ
変異型Ｌ４１  Ｙ７６Ｆ
変異型Ｌ４２  Ｙ７６Ｈ
変異型Ｌ４３  Ｙ７６Ｉ
変異型Ｌ４４  Ｙ７６Ｖ
変異型Ｌ４５  Ｙ７６Ｗ
変異型Ｌ４６  Ｇ７７Ａ
変異型Ｌ４７  Ｇ７７Ｆ
変異型Ｌ４８  Ｇ７７Ｋ
変異型Ｌ４９  Ｇ７７Ｍ
変異型Ｌ５０  Ｇ７７Ｎ
変異型Ｌ５１  Ｇ７７Ｐ
変異型Ｌ５２  Ｇ７７Ｓ
変異型Ｌ５３  Ｇ７７Ｔ
変異型Ｌ５４  Ｑ７８Ｆ
変異型Ｌ５５  Ｑ７８Ｌ
変異型Ｌ５６  Ｎ７９Ｄ
変異型Ｌ５７  Ｎ７９Ｌ
変異型Ｌ５８  Ｎ７９Ｒ
変異型Ｌ５９  Ｎ７９Ｓ
変異型Ｌ６０  Ｅ８０Ｄ
変異型Ｌ６１  Ｅ８０Ｆ
変異型Ｌ６２  Ｅ８０Ｌ
変異型Ｌ６３  Ｅ８０Ｐ
変異型Ｌ６４  Ｅ８０Ｓ
変異型Ｌ６５  Ｙ８１Ａ
変異型Ｌ６６  Ｙ８１Ｃ
変異型Ｌ６７  Ｙ８１Ｄ
変異型Ｌ６８  Ｙ８１Ｅ
変異型Ｌ６９  Ｙ８１Ｆ
変異型Ｌ７０  Ｙ８１Ｈ
変異型Ｌ７１  Ｙ８１Ｋ
変異型Ｌ７２  Ｙ８１Ｌ
変異型Ｌ７３  Ｙ８１Ｎ
変異型Ｌ７４  Ｙ８１Ｓ
変異型Ｌ７５  Ｙ８１Ｔ
変異型Ｌ７６  Ｙ８１Ｗ
変異型Ｌ７７  Ｋ８２Ｄ
変異型Ｌ７８  Ｋ８２Ｌ
変異型Ｌ７９  Ｋ８２Ｐ
変異型Ｌ８０  Ｋ８２Ｓ
変異型Ｌ８１  Ｋ８３Ｄ
変異型Ｌ８２  Ｋ８３Ｆ
変異型Ｌ８３  Ｋ８３Ｌ
変異型Ｌ８４  Ｋ８３Ｐ
変異型Ｌ８５  Ｋ８３Ｓ
変異型Ｌ８６  Ｋ８３Ｖ
変異型Ｌ８７  Ｓ８４Ｄ
変異型Ｌ８８  Ｓ８４Ｆ
変異型Ｌ８９  Ｓ８４Ｋ
変異型Ｌ９０  Ｓ８４Ｌ
変異型Ｌ９１  Ｓ８４Ｎ
変異型Ｌ９２  Ｓ８４Ｑ
変異型Ｌ９３  Ｌ８５Ｆ
変異型Ｌ９４  Ｌ８５Ｉ
変異型Ｌ９５  Ｌ８５Ｐ
変異型Ｌ９６  Ｌ８５Ｖ
変異型Ｌ９７  Ｎ８７Ｅ
変異型Ｌ９８  Ｎ８７Ｑ
変異型Ｌ９９  Ｆ８８Ｅ
変異型Ｌ１００  Ｖ１０３Ｉ
変異型Ｌ１０１  Ｖ１０３Ｌ
変異型Ｌ１０２  Ｋ１０６Ａ
変異型Ｌ１０３  Ｋ１０６Ｆ
変異型Ｌ１０４  Ｋ１０６Ｌ
変異型Ｌ１０５  Ｋ１０６Ｑ
変異型Ｌ１０６  Ｋ１０６Ｓ
変異型Ｌ１０７  Ｗ１０７Ａ
変異型Ｌ１０８  Ｗ１０７Ｙ
変異型Ｌ１０９  Ｆ１１３Ａ
変異型Ｌ１１０  Ｆ１１３Ｗ
変異型Ｌ１１１  Ｆ１１３Ｙ
変異型Ｌ１１２  Ｅ１１４Ａ
変異型Ｌ１１３  Ｅ１１４Ｄ
変異型Ｌ１１４  Ｄ１１５Ｅ
変異型Ｌ１１５  Ｄ１１５Ｑ
変異型Ｌ１１６  Ｄ１１５Ｓ
変異型Ｌ１１７  Ｉ１１６Ｆ
変異型Ｌ１１８  Ｉ１１６Ｋ
変異型Ｌ１１９  Ｉ１１６Ｌ
変異型Ｌ１２０  Ｉ１１６Ｍ
変異型Ｌ１２１  Ｉ１１６Ｎ
変異型Ｌ１２２  Ｉ１１６Ｔ
変異型Ｌ１２３  Ｉ１１６Ｖ
変異型Ｌ１２４  Ｉ１５７Ｋ
変異型Ｌ１２５  Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｌ１２６  Ｙ１５９Ｇ
変異型Ｌ１２７  Ｙ１５９Ｎ
変異型Ｌ１２８  Ｙ１５９Ｓ
変異型Ｌ１２９  Ｐ１６０Ｇ
変異型Ｌ１３０  Ｇ１６１Ａ
変異型Ｌ１３１  Ｆ１６２Ｌ
変異型Ｌ１３２  Ｆ１６２Ｙ
変異型Ｌ１３３  Ｙ１６３Ｉ
変異型Ｌ１３４  Ｔ１６５Ｖ
変異型Ｌ１３５  Ｑ１８１Ｆ
変異型Ｌ１３６  Ａ１８２Ｇ
変異型Ｌ１３７  Ａ１８２Ｓ
変異型Ｌ１３８  Ｐ１８３Ａ
変異型Ｌ１３９  Ｐ１８３Ｇ
変異型Ｌ１４０  Ｐ１８３Ｓ
変異型Ｌ１４１  Ｔ１８５Ａ
変異型Ｌ１４２  Ｔ１８５Ｇ
変異型Ｌ１４３  Ｔ１８５Ｖ
変異型Ｌ１４４  Ｗ１８７Ａ
変異型Ｌ１４５  Ｗ１８７Ｆ
変異型Ｌ１４６  Ｗ１８７Ｈ
変異型Ｌ１４７  Ｗ１８７Ｙ
変異型Ｌ１４８  Ｙ１８８Ｆ
変異型Ｌ１４９  Ｙ１８８Ｌ
変異型Ｌ１５０  Ｙ１８８Ｗ
変異型Ｌ１５１  Ｇ１９０Ａ
変異型Ｌ１５２  Ｇ１９０Ｄ
変異型Ｌ１５３  Ｆ１９３Ｗ
変異型Ｌ１５４  Ｈ１９４Ｄ
変異型Ｌ１５５  Ｆ２００Ａ
変異型Ｌ１５６  Ｆ２００Ｌ
変異型Ｌ１５７  Ｆ２００Ｓ
変異型Ｌ１５８  Ｆ２００Ｖ
変異型Ｌ１５９  Ｌ２０１Ｑ
変異型Ｌ１６０  Ｌ２０１Ｓ
変異型Ｌ１６１  Ｑ２０２Ａ
変異型Ｌ１６２  Ｑ２０２Ｄ
変異型Ｌ１６３  Ｑ２０２Ｆ
変異型Ｌ１６４  Ｑ２０２Ｓ
変異型Ｌ１６５  Ｑ２０２Ｔ
変異型Ｌ１６６  Ｑ２０２Ｖ
変異型Ｌ１６７  Ｄ２０３Ｅ
変異型Ｌ１６８  Ａ２０４Ｇ
変異型Ｌ１６９  Ａ２０４Ｌ
変異型Ｌ１７０  Ａ２０４Ｓ
変異型Ｌ１７１  Ａ２０４Ｔ
変異型Ｌ１７２  Ａ２０４Ｖ
変異型Ｌ１７３  Ｆ２０５Ｌ
変異型Ｌ１７４  Ｆ２０５Ｑ
変異型Ｌ１７５  Ｆ２０５Ｖ
変異型Ｌ１７６  Ｆ２０５Ｗ
変異型Ｌ１７７  Ｔ２０６Ｆ
変異型Ｌ１７８  Ｔ２０６Ｋ
変異型Ｌ１７９  Ｔ２０６Ｌ
変異型Ｌ１８０  Ｆ２０７Ｉ
変異型Ｌ１８１  Ｆ２０７Ｗ
変異型Ｌ１８２  Ｆ２０７Ｙ
変異型Ｌ１８３  Ｍ２０８Ａ
変異型Ｌ１８４  Ｍ２０８Ｌ
変異型Ｌ１８５  Ｓ２０９Ｆ
変異型Ｌ１８６  Ｓ２０９Ｋ
変異型Ｌ１８７  Ｓ２０９Ｌ
変異型Ｌ１８８  Ｓ２０９Ｎ
変異型Ｌ１８９  Ｓ２０９Ｖ
変異型Ｌ１９０  Ｔ２１０Ａ
変異型Ｌ１９１  Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｌ１９２  Ｔ２１０Ｑ
変異型Ｌ１９３  Ｔ２１０Ｖ
変異型Ｌ１９４  Ｆ２１１Ａ
変異型Ｌ１９５  Ｆ２１１Ｉ
変異型Ｌ１９６  Ｆ２１１Ｌ
変異型Ｌ１９７  Ｆ２１１Ｍ
変異型Ｌ１９８  Ｆ２１１Ｖ
変異型Ｌ１９９  Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｌ２００  Ｆ２１１Ｙ
変異型Ｌ２０１  Ｇ２１２Ａ
変異型Ｌ２０２  Ｖ２１３Ｄ
変異型Ｌ２０３  Ｖ２１３Ｆ
変異型Ｌ２０４  Ｖ２１３Ｋ
変異型Ｌ２０５  Ｖ２１３Ｓ
変異型Ｌ２０６  Ｐ２１４Ｄ
変異型Ｌ２０７  Ｐ２１４Ｆ
変異型Ｌ２０８  Ｐ２１４Ｋ
変異型Ｌ２０９  Ｐ２１４Ｓ
変異型Ｌ２１０  Ｒ２１５Ａ
変異型Ｌ２１１  Ｒ２１５Ｉ
変異型Ｌ２１２  Ｒ２１５Ｋ
変異型Ｌ２１３  Ｒ２１５Ｑ
変異型Ｌ２１４  Ｒ２１５Ｓ
変異型Ｌ２１５  Ｒ２１５Ｔ
変異型Ｌ２１６  Ｒ２１５Ｙ
変異型Ｌ２１７  Ｐ２１６Ｄ
変異型Ｌ２１８  Ｐ２１６Ｋ
変異型Ｌ２１９  Ｋ２１７Ｄ
変異型Ｌ２２０  Ｐ２１８Ｆ
変異型Ｌ２２１  Ｐ２１８Ｌ
変異型Ｌ２２２  Ｐ２１８Ｑ
変異型Ｌ２２３  Ｐ２１８Ｓ
変異型Ｌ２２４  Ｉ２１９Ｄ
変異型Ｌ２２５  Ｉ２１９Ｆ
変異型Ｌ２２６  Ｉ２１９Ｋ
変異型Ｌ２２７  Ｔ２２０Ａ
変異型Ｌ２２８  Ｔ２２０Ｄ
変異型Ｌ２２９  Ｔ２２０Ｆ
変異型Ｌ２３０  Ｔ２２０Ｋ
変異型Ｌ２３１  Ｔ２２０Ｌ
変異型Ｌ２３２  Ｔ２２０Ｓ
変異型Ｌ２３３  Ｐ２２１Ａ
変異型Ｌ２３４  Ｐ２２１Ｄ
変異型Ｌ２３５  Ｐ２２１Ｆ
変異型Ｌ２３６  Ｐ２２１Ｋ
変異型Ｌ２３７  Ｐ２２１Ｌ
変異型Ｌ２３８  Ｐ２２１Ｓ
変異型Ｌ２３９  Ｄ２２２Ａ
変異型Ｌ２４０  Ｄ２２２Ｆ
変異型Ｌ２４１  Ｄ２２２Ｌ
変異型Ｌ２４２  Ｄ２２２Ｒ
変異型Ｌ２４３  Ｑ２２３Ｆ
変異型Ｌ２４４  Ｑ２２３Ｋ
変異型Ｌ２４５  Ｑ２２３Ｌ
変異型Ｌ２４６  Ｑ２２３Ｓ
変異型Ｌ２４７  Ｆ２２４Ａ
変異型Ｌ２４８  Ｆ２２４Ｄ
変異型Ｌ２４９  Ｆ２２４Ｇ
変異型Ｌ２５０  Ｆ２２４Ｋ
変異型Ｌ２５１  Ｆ２２４Ｌ
変異型Ｌ２５２  Ｋ２２５Ｄ
変異型Ｌ２５３  Ｋ２２５Ｇ
変異型Ｌ２５４  Ｋ２２５Ｓ
変異型Ｌ２５５  Ｇ２２６Ａ
変異型Ｌ２５６  Ｇ２２６Ｆ
変異型Ｌ２５７  Ｇ２２６Ｌ
変異型Ｌ２５８  Ｇ２２６Ｎ
変異型Ｌ２５９  Ｇ２２６Ｓ
変異型Ｌ２６０  Ｋ２２７Ｄ
変異型Ｌ２６１  Ｋ２２７Ｆ
変異型Ｌ２６２  Ｋ２２７Ｓ
変異型Ｌ２６３  Ｉ２２８Ａ
変異型Ｌ２６４  Ｉ２２８Ｆ
変異型Ｌ２６５  Ｉ２２８Ｋ
変異型Ｌ２６６  Ｉ２２８Ｓ
変異型Ｌ２６７  Ｐ２２９Ａ
変異型Ｌ２６８  Ｐ２２９Ｄ
変異型Ｌ２６９  Ｐ２２９Ｋ
変異型Ｌ２７０  Ｐ２２９Ｌ
変異型Ｌ２７１  Ｐ２２９Ｓ
変異型Ｌ２７２  Ｉ２３０Ａ
変異型Ｌ２７３  Ｉ２３０Ｆ
変異型Ｌ２７４  Ｉ２３０Ｋ
変異型Ｌ２７５  Ｉ２３０Ｓ
変異型Ｌ２７６  Ｋ２３１Ｆ
変異型Ｌ２７７  Ｋ２３１Ｌ
変異型Ｌ２７８  Ｋ２３１Ｓ
変異型Ｌ２７９  Ｅ２３２Ｄ
変異型Ｌ２８０  Ｅ２３２Ｆ
変異型Ｌ２８１  Ｅ２３２Ｇ
変異型Ｌ２８２  Ｅ２３２Ｌ
変異型Ｌ２８３  Ｅ２３２Ｓ
変異型Ｌ２８４  Ａ２３３Ｄ
変異型Ｌ２８５  Ａ２３３Ｆ
変異型Ｌ２８６  Ａ２３３Ｈ
変異型Ｌ２８７  Ａ２３３Ｋ
変異型Ｌ２８８  Ａ２３３Ｌ
変異型Ｌ２８９  Ａ２３３Ｎ
変異型Ｌ２９０  Ａ２３３Ｓ
変異型Ｌ２９１  Ｄ２３４Ｌ
変異型Ｌ２９２  Ｄ２３４Ｓ
変異型Ｌ２９３  Ｋ２３５Ｄ
変異型Ｌ２９４  Ｋ２３５Ｆ
変異型Ｌ２９５  Ｋ２３５Ｌ
変異型Ｌ２９６  Ｋ２３５Ｓ
変異型Ｌ２９７  Ｆ２５９Ｙ
変異型Ｌ２９８  Ｒ２７６Ａ
変異型Ｌ２９９  Ｒ２７６Ｑ
変異型Ｌ３００  Ａ２９８Ｓ
変異型Ｌ３０１  Ｄ３００Ｎ
変異型Ｌ３０２  Ｖ３０１Ｍ
変異型Ｌ３０３  Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｌ３０４  Ｙ３２８Ｈ
変異型Ｌ３０５  Ｙ３２８Ｍ
変異型Ｌ３０６  Ｙ３２８Ｗ
変異型Ｌ３０７  Ｗ３３２Ｈ
変異型Ｌ３０８  Ｅ３３６Ａ
変異型Ｌ３０９  Ｎ３３８Ａ
変異型Ｌ３１０  Ｎ３３８Ｆ
変異型Ｌ３１１  Ｙ３３９Ｋ
変異型Ｌ３１２  Ｙ３３９Ｌ
変異型Ｌ３１３  Ｙ３３９Ｔ
変異型Ｌ３１４  Ｌ３４０Ａ
変異型Ｌ３１５  Ｌ３４０Ｉ
変異型Ｌ３１６  Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｌ３１７  Ｖ４３９Ｐ
変異型Ｌ３１８  Ｉ４４０Ｆ
変異型Ｌ３１９  Ｉ４４０Ｖ
変異型Ｌ３２０  Ｅ４４１Ｆ
変異型Ｌ３２１  Ｅ４４１Ｍ
変異型Ｌ３２２  Ｅ４４１Ｎ
変異型Ｌ３２３  Ｎ４４２Ａ
変異型Ｌ３２４  Ｎ４４２Ｌ
変異型Ｌ３２５  Ｒ４４３Ｓ
変異型Ｌ３２６  Ｔ４４４Ｗ
変異型Ｌ３２７  Ｒ４４５Ｇ
変異型Ｌ３２８  Ｒ４４５Ｋ
変異型Ｌ３２９  Ｅ４４６Ａ
変異型Ｌ３３０  Ｅ４４６Ｆ
変異型Ｌ３３１  Ｅ４４６Ｑ
変異型Ｌ３３２  Ｅ４４６Ｓ
変異型Ｌ３３３  Ｅ４４６Ｔ
変異型Ｌ３３４  Ｙ４４７Ｌ
変異型Ｌ３３５  Ｙ４４７Ｓ
【請求項２８】
請求項２０に記載の変異型タンパク質において、前記変異型Ｌ１からＬ３３５のいずれか１種または２種以上の変異を含むアミノ酸配列中、変異部位以外の部位に置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を更に含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有する、変異型タンパク質。
【請求項２９】
少なくとも変異型Ｌ１２４もしくは変異型Ｌ１２５を含むことを特徴とする、請求項２７または２８に記載の変異型タンパク質。
【請求項３０】
少なくとも変異型Ｌ３０３を含むことを特徴とする、請求項２７から２９のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項３１】
少なくとも変異型Ｌ１２を含むことを特徴とする、請求項２７から３０のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項３２】
少なくとも変異型Ｌ１２７を含むことを特徴とする、請求項２７から３１のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項３３】
少なくとも変異型Ｌ１９５もしくはＬ１９９を含むことを特徴とする、請求項２７から３２のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項３４】
少なくとも変異型Ｌ１３０を含むことを特徴とする、請求項２７から３３のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項３５】
少なくとも変異型Ｌ１１５を含むことを特徴とする、請求項２７から３４のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項３６】
少なくとも変異型Ｌ３１６を含むことを特徴とする、請求項２７から３５のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項３７】
少なくとも変異型Ｌ９９を含むことを特徴とする、請求項２７から３６のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項３８】
少なくとも変異型Ｌ１５もしくはＬ１６を含むことを特徴とする、請求項２７から３７のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項３９】
少なくとも変異型Ｌ１３１を含むことを特徴とする、請求項２７から３８のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項４０】
少なくとも変異型Ｌ２８４を含むことを特徴とする、請求項２７から３９のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項４１】
少なくとも変異型Ｌ１９１を含むことを特徴とする、請求項２７から４０のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項４２】
少なくとも変異型Ｌ６５を含むことを特徴とする、請求項２７から４１のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項４３】
少なくとも変異型Ｌ２６５を含むことを特徴とする、請求項２７から４２のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項４４】
少なくとも変異型Ｌ３１７を含むことを特徴とする、請求項２７から４３のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項４５】
少なくとも変異型Ｌ２５５を含むことを特徴とする、請求項２７から４４のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項４６】
少なくとも変異型Ｌ５２を含むことを特徴とする、請求項２７から４５のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項４７】
少なくとも変異型Ｌ１５５を含むことを特徴とする、請求項２７から４６のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項４８】
少なくとも変異型Ｌ２９８を含むことを特徴とする、請求項２７から４７のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項４９】
少なくとも変異型Ｌ２０１を含むことを特徴とする、請求項２７から４８のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項５０】
少なくとも変異型Ｌ１４５を含むことを特徴とする、請求項２７から４９のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項５１】
少なくとも変異型Ｌ１７０を含むことを特徴とする、請求項２７から５０のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項５２】
少なくとも変異型Ｌ８７を含むことを特徴とする、請求項２７から５１のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項５３】
少なくとも変異型Ｌ６０を含むことを特徴とする、請求項２７から５２のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項５４】
少なくとも変異型Ｌ１１０を含むことを特徴とする、請求項２７から５３のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項５５】
配列番号２０８に記載のアミノ酸配列に対し下記の変異型Ｍ１からＭ６４２のいずれか１種または２種以上の変異を含むアミノ酸配列を有する変異型タンパク質。
変異型Ｍ１  Ｔ６９Ｎ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ２  Ｔ６９Ｑ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３  Ｔ６９Ｓ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ４  Ｐ７０Ａ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ５  Ｐ７０Ｇ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ６  Ｐ７０Ｉ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ７  Ｐ７０Ｌ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ８  Ｐ７０Ｎ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ９  Ｐ７０Ｓ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１０  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１１  Ｐ７０Ｔ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ１２  Ｐ７０Ｔ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ１３  Ｐ７０Ｖ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１４  Ａ７２Ｅ／Ｇ７７Ｓ
変異型Ｍ１５  Ａ７２Ｅ／Ｅ８０Ｄ
変異型Ｍ１６  Ａ７２Ｅ／Ｙ８１Ａ
変異型Ｍ１７  Ａ７２Ｅ／Ｓ８４Ｄ
変異型Ｍ１８  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｗ
変異型Ｍ１９  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ２０  Ａ７２Ｅ／Ｇ１６１Ａ
変異型Ｍ２１  Ａ７２Ｅ／Ｆ１６２Ｌ
変異型Ｍ２２  Ａ７２Ｅ／Ａ１８４Ｇ
変異型Ｍ２３  Ａ７２Ｅ／Ｗ１８７Ｆ
変異型Ｍ２４  Ａ７２Ｅ／Ｆ２００Ａ
変異型Ｍ２５  Ａ７２Ｅ／Ａ２０４Ｓ
変異型Ｍ２６  Ａ７２Ｅ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ２７  Ａ７２Ｅ／Ｆ２１１Ｌ
変異型Ｍ２８  Ａ７２Ｅ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ２９  Ａ７２Ｅ／Ｇ２２６Ａ
変異型Ｍ３０  Ａ７２Ｅ／Ｉ２２８Ｋ
変異型Ｍ３１  Ａ７２Ｅ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ３２  Ａ７２Ｅ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３３  Ａ７２Ｓ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３４  Ａ７２Ｖ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３５  Ｖ７３Ａ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３６  Ｖ７３Ｉ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３７  Ｓ７４Ａ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３８  Ｓ７４Ｎ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３９  Ｓ７４Ｔ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ４０  Ｓ７４Ｖ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ４１  Ｇ７７Ａ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ４２  Ｇ７７Ｆ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ４３  Ｇ７７Ｍ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ４４  Ｇ７７Ｐ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ４５  Ｇ７７Ｓ／Ｅ８０Ｄ
変異型Ｍ４６  Ｇ７７Ｓ／Ｙ８１Ａ
変異型Ｍ４７  Ｇ７７Ｓ／Ｓ８４Ｄ
変異型Ｍ４８  Ｇ７７Ｓ／Ｆ１１３Ｗ
変異型Ｍ４９  Ｇ７７Ｓ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ５０  Ｇ７７Ｓ／Ｙ１５９Ｎ
変異型Ｍ５１  Ｇ７７Ｓ／Ｙ１５９Ｓ
変異型Ｍ５２  Ｇ７７Ｓ／Ｇ１６１Ａ
変異型Ｍ５３  Ｇ７７Ｓ／Ｆ１６２Ｌ
変異型Ｍ５４  Ｇ７７Ｓ／Ａ１８４Ｇ
変異型Ｍ５５  Ｇ７７Ｓ／Ｗ１８７Ｆ
変異型Ｍ５６  Ｇ７７Ｓ／Ｆ２００Ａ
変異型Ｍ５７  Ｇ７７Ｓ／Ａ２０４Ｓ
変異型Ｍ５８  Ｇ７７Ｓ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ５９  Ｇ７７Ｓ／Ｆ２１１Ｌ
変異型Ｍ６０  Ｇ７７Ｓ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ６１  Ｇ７７Ｓ／Ｉ２２８Ｋ
変異型Ｍ６２  Ｇ７７Ｓ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ６３  Ｇ７７Ｓ／Ｒ２７６Ａ
変異型Ｍ６４  Ｇ７７Ｓ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６５  Ｅ８０Ｄ／Ｙ８１Ａ
変異型Ｍ６６  Ｅ８０Ｄ／Ｆ１１３Ｗ
変異型Ｍ６７  Ｅ８０Ｄ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ６８  Ｅ８０Ｄ／Ｙ１５９Ｎ
変異型Ｍ６９  Ｅ８０Ｄ／Ｇ１６１Ａ
変異型Ｍ７０  Ｅ８０Ｄ／Ａ１８４Ｇ
変異型Ｍ７１  Ｅ８０Ｄ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ７２  Ｅ８０Ｄ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ７３  Ｅ８０Ｓ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ７４  Ｙ８１Ａ／Ｆ１１３Ｗ
変異型Ｍ７５  Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ７６  Ｙ８１Ａ／Ｙ１５９Ｎ
変異型Ｍ７７  Ｙ８１Ａ／Ｙ１５９Ｓ
変異型Ｍ７８  Ｙ８１Ａ／Ｇ１６１Ａ
変異型Ｍ７９  Ｙ８１Ａ／Ａ１８４Ｇ
変異型Ｍ８０  Ｙ８１Ａ／Ｗ１８７Ｆ
変異型Ｍ８１  Ｙ８１Ａ／Ｆ２００Ａ
変異型Ｍ８２  Ｙ８１Ａ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ８３  Ｙ８１Ａ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ８４  Ｙ８１Ａ／Ｆ２１１Ｙ
変異型Ｍ８５  Ｙ８１Ａ／Ｇ２２６Ａ
変異型Ｍ８６  Ｙ８１Ａ／Ｉ２２８Ｋ
変異型Ｍ８７  Ｙ８１Ａ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ８８  Ｙ８１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ８９  Ｙ８１Ｈ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ９０  Ｙ８１Ｎ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ９１  Ｋ８３Ｐ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ９２  Ｓ８４Ａ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ９３  Ｓ８４Ｄ／Ｆ１１３Ｗ
変異型Ｍ９４  Ｓ８４Ｄ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ９５  Ｓ８４Ｄ／Ｙ１５９Ｎ
変異型Ｍ９６  Ｓ８４Ｄ／Ｇ１６１Ａ
変異型Ｍ９７  Ｓ８４Ｄ／Ａ１８４Ｇ
変異型Ｍ９８  Ｓ８４Ｄ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ９９  Ｓ８４Ｅ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１００  Ｓ８４Ｆ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１０１  Ｓ８４Ｋ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１０２  Ｌ８５Ｆ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１０３  Ｌ８５Ｉ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１０４  Ｌ８５Ｐ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１０５  Ｌ８５Ｖ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１０６  Ｎ８７Ａ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１０７  Ｎ８７Ｄ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１０８  Ｎ８７Ｅ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１０９  Ｎ８７Ｇ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１１０  Ｎ８７Ｑ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１１１  Ｎ８７Ｓ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１１２  Ｆ８８Ａ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１１３  Ｆ８８Ｄ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１１４  Ｆ８８Ｅ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１１５  Ｆ８８Ｅ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ１１６  Ｆ８８Ｌ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１１７  Ｆ８８Ｔ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１１８  Ｆ８８Ｖ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１１９  Ｆ８８Ｙ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１２０  Ｋ１０６Ｈ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１２１  Ｋ１０６Ｌ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１２２  Ｋ１０６Ｍ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１２３  Ｋ１０６Ｑ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１２４  Ｋ１０６Ｒ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１２５  Ｋ１０６Ｓ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１２６  Ｋ１０６Ｖ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１２７  Ｗ１０７Ａ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１２８  Ｗ１０７Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ１２９  Ｗ１０７Ｙ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１３０  Ｗ１０７Ｙ／Ｔ２０６Ｙ
変異型Ｍ１３１  Ｗ１０７Ｙ／Ｋ２１７Ｄ
変異型Ｍ１３２  Ｗ１０７Ｙ／Ｐ２１８Ｌ
変異型Ｍ１３３  Ｗ１０７Ｙ／Ｔ２２０Ｌ
変異型Ｍ１３４  Ｗ１０７Ｙ／Ｐ２２１Ｄ
変異型Ｍ１３５  Ｗ１０７Ｙ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ１３６  Ｆ１１３Ａ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１３７  Ｆ１１３Ｈ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１３８  Ｆ１１３Ｎ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１３９  Ｆ１１３Ｖ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１４０  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１４１  Ｆ１１３Ｗ／Ｙ１５９Ｎ
変異型Ｍ１４２  Ｆ１１３Ｗ／Ｙ１５９Ｓ
変異型Ｍ１４３  Ｆ１１３Ｗ／Ｇ１６１Ａ
変異型Ｍ１４４  Ｆ１１３Ｗ／Ｆ１６２Ｌ
変異型Ｍ１４５  Ｆ１１３Ｗ／Ａ１８４Ｇ
変異型Ｍ１４６  Ｆ１１３Ｗ／Ｗ１８７Ｆ
変異型Ｍ１４７  Ｆ１１３Ｗ／Ｆ２００Ａ
変異型Ｍ１４８  Ｆ１１３Ｗ／Ｔ２０６Ｙ
変異型Ｍ１４９  Ｆ１１３Ｗ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ１５０  Ｆ１１３Ｗ／Ｆ２１１Ｌ
変異型Ｍ１５１  Ｆ１１３Ｗ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ１５２  Ｆ１１３Ｗ／Ｆ２１１Ｙ
変異型Ｍ１５３  Ｆ１１３Ｗ／Ｖ２１３Ｄ
変異型Ｍ１５４  Ｆ１１３Ｗ／Ｋ２１７Ｄ
変異型Ｍ１５５  Ｆ１１３Ｗ／Ｔ２２０Ｌ
変異型Ｍ１５６  Ｆ１１３Ｗ／Ｐ２２１Ｄ
変異型Ｍ１５７  Ｆ１１３Ｗ／Ｇ２２６Ａ
変異型Ｍ１５８  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ２２８Ｋ
変異型Ｍ１５９  Ｆ１１３Ｗ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ１６０  Ｆ１１３Ｗ／Ｒ２７６Ａ
変異型Ｍ１６１  Ｆ１１３Ｙ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１６２  Ｆ１１３Ｙ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ１６３  Ｅ１１４Ｄ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１６４  Ｄ１１５Ａ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１６５  Ｄ１１５Ｅ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１６６  Ｄ１１５Ｍ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１６７  Ｄ１１５Ｎ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１６８  Ｄ１１５Ｑ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１６９  Ｄ１１５Ｓ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１７０  Ｄ１１５Ｖ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１７１  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ１５９Ｉ
変異型Ｍ１７２  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ１５９Ｌ
変異型Ｍ１７３  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ１５９Ｎ
変異型Ｍ１７４  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ１５９Ｓ
変異型Ｍ１７５  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ１５９Ｖ
変異型Ｍ１７６  Ｉ１５７Ｌ／Ｐ１６０Ａ
変異型Ｍ１７７  Ｉ１５７Ｌ／Ｐ１６０Ｓ
変異型Ｍ１７８  Ｉ１５７Ｌ／Ｇ１６１Ａ
変異型Ｍ１７９  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ１６２Ｌ
変異型Ｍ１８０  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ１６２Ｍ
変異型Ｍ１８１  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ１６２Ｎ
変異型Ｍ１８２  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ１６２Ｙ
変異型Ｍ１８３  Ｉ１５７Ｌ／Ｔ１６５Ｌ
変異型Ｍ１８４  Ｉ１５７Ｌ／Ｔ１６５Ｖ
変異型Ｍ１８５  Ｉ１５７Ｌ／Ｑ１８１Ａ
変異型Ｍ１８６  Ｉ１５７Ｌ／Ｑ１８１Ｆ
変異型Ｍ１８７  Ｉ１５７Ｌ／Ｑ１８１Ｎ
変異型Ｍ１８８  Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ
変異型Ｍ１８９  Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｌ
変異型Ｍ１９０  Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｍ
変異型Ｍ１９１  Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｓ
変異型Ｍ１９２  Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｔ
変異型Ｍ１９３  Ｉ１５７Ｌ／Ｗ１８７Ｆ
変異型Ｍ１９４  Ｉ１５７Ｌ／Ｗ１８７Ｙ
変異型Ｍ１９５  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ１９３Ｈ
変異型Ｍ１９６  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ１９３Ｉ
変異型Ｍ１９７  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ１９３Ｗ
変異型Ｍ１９８  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２００Ａ
変異型Ｍ１９９  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２００Ｈ
変異型Ｍ２００  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２００Ｌ
変異型Ｍ２０１  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２００Ｙ
変異型Ｍ２０２  Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｇ
変異型Ｍ２０３  Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｉ
変異型Ｍ２０４  Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｌ
変異型Ｍ２０５  Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｓ
変異型Ｍ２０６  Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｔ
変異型Ｍ２０７  Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｖ
変異型Ｍ２０８  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２０５Ａ
変異型Ｍ２０９  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２０７Ｉ
変異型Ｍ２１０  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２０７Ｍ
変異型Ｍ２１１  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２０７Ｖ
変異型Ｍ２１２  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２０７Ｗ
変異型Ｍ２１３  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２０７Ｙ
変異型Ｍ２１４  Ｉ１５７Ｌ／Ｍ２０８Ａ
変異型Ｍ２１５  Ｉ１５７Ｌ／Ｍ２０８Ｋ
変異型Ｍ２１６  Ｉ１５７Ｌ／Ｍ２０８Ｌ
変異型Ｍ２１７  Ｉ１５７Ｌ／Ｍ２０８Ｔ
変異型Ｍ２１８  Ｉ１５７Ｌ／Ｍ２０８Ｖ
変異型Ｍ２１９  Ｉ１５７Ｌ／Ｓ２０９Ｆ
変異型Ｍ２２０  Ｉ１５７Ｌ／Ｓ２０９Ｎ
変異型Ｍ２２１  Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ａ
変異型Ｍ２２２  Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ２２３  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２１１Ｉ
変異型Ｍ２２４  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２１１Ｌ
変異型Ｍ２２５  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２１１Ｖ
変異型Ｍ２２６  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ２２７  Ｉ１５７Ｌ／Ｇ２１２Ａ
変異型Ｍ２２８  Ｉ１５７Ｌ／Ｇ２１２Ｄ
変異型Ｍ２２９  Ｉ１５７Ｌ／Ｇ２１２Ｓ
変異型Ｍ２３０  Ｉ１５７Ｌ／Ｒ２１５Ｋ
変異型Ｍ２３１  Ｉ１５７Ｌ／Ｒ２１５Ｌ
変異型Ｍ２３２  Ｉ１５７Ｌ／Ｒ２１５Ｔ
変異型Ｍ２３３  Ｉ１５７Ｌ／Ｒ２１５Ｙ
変異型Ｍ２３４  Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２２０Ｌ
変異型Ｍ２３５  Ｉ１５７Ｌ／Ｇ２２６Ａ
変異型Ｍ２３６  Ｉ１５７Ｌ／Ｇ２２６Ｆ
変異型Ｍ２３７  Ｉ１５７Ｌ／Ｉ２２８Ｋ
変異型Ｍ２３８  Ｉ１５７Ｌ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ２３９  Ｉ１５７Ｌ／Ｒ２７６Ａ
変異型Ｍ２４０  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ａ
変異型Ｍ２４１  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ２４２  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｈ
変異型Ｍ２４３  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｉ
変異型Ｍ２４４  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｌ
変異型Ｍ２４５  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｐ
変異型Ｍ２４６  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｖ
変異型Ｍ２４７  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｗ
変異型Ｍ２４８  Ｉ１５７Ｌ／Ｌ３４０Ｆ
変異型Ｍ２４９  Ｉ１５７Ｌ／Ｌ３４０Ｉ
変異型Ｍ２５０  Ｉ１５７Ｌ／Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｍ２５１  Ｉ１５７Ｌ／Ｖ４３９Ａ
変異型Ｍ２５２  Ｉ１５７Ｌ／Ｖ４３９Ｐ
変異型Ｍ２５３  Ｉ１５７Ｌ／Ｒ４４５Ａ
変異型Ｍ２５４  Ｉ１５７Ｌ／Ｒ４４５Ｆ
変異型Ｍ２５５  Ｉ１５７Ｌ／Ｒ４４５Ｇ
変異型Ｍ２５６  Ｉ１５７Ｌ／Ｒ４４５Ｋ
変異型Ｍ２５７  Ｉ１５７Ｌ／Ｒ４４５Ｖ
変異型Ｍ２５８  Ｙ１５９Ｎ／Ｇ１６１Ａ
変異型Ｍ２５９  Ｙ１５９Ｎ／Ａ１８４Ｇ
変異型Ｍ２６０  Ｙ１５９Ｎ／Ａ２０４Ｓ
変異型Ｍ２６１  Ｙ１５９Ｎ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ２６２  Ｙ１５９Ｎ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ２６３  Ｙ１５９Ｎ／Ｆ２１１Ｙ
変異型Ｍ２６４  Ｙ１５９Ｎ／Ｇ２２６Ａ
変異型Ｍ２６５  Ｙ１５９Ｎ／Ｉ２２８Ｋ
変異型Ｍ２６６  Ｙ１５９Ｎ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ２６７  Ｙ１５９Ｎ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ２６８  Ｙ１５９Ｓ／Ｇ１６１Ａ
変異型Ｍ２６９  Ｙ１５９Ｓ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ２７０  Ｇ１６１Ａ／Ｆ１６２Ｌ
変異型Ｍ２７１  Ｇ１６１Ａ／Ａ１８４Ｇ
変異型Ｍ２７２  Ｇ１６１Ａ／Ｗ１８７Ｆ
変異型Ｍ２７３  Ｇ１６１Ａ／Ｆ２００Ａ
変異型Ｍ２７４  Ｇ１６１Ａ／Ａ２０４Ｓ
変異型Ｍ２７５  Ｇ１６１Ａ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ２７６  Ｇ１６１Ａ／Ｆ２１１Ｌ
変異型Ｍ２７７  Ｇ１６１Ａ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ２７８  Ｇ１６１Ａ／Ｇ２２６Ａ
変異型Ｍ２７９  Ｇ１６１Ａ／Ｉ２２８Ｋ
変異型Ｍ２８０  Ｇ１６１Ａ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ２８１  Ｇ１６１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ２８２  Ｆ１６２Ｌ／Ａ１８４Ｇ
変異型Ｍ２８３  Ｆ１６２Ｌ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ２８４  Ｆ１６２Ｌ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ２８５  Ｐ１８３Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ２８６  Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ
変異型Ｍ２８７  Ａ１８４Ｇ／Ｆ２００Ａ
変異型Ｍ２８８  Ａ１８４Ｇ／Ａ２０４Ｓ
変異型Ｍ２８９  Ａ１８４Ｇ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ２９０  Ａ１８４Ｇ／Ｆ２１１Ｌ
変異型Ｍ２９１  Ａ１８４Ｇ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ２９２  Ａ１８４Ｇ／Ｉ２２８Ｋ
変異型Ｍ２９３  Ａ１８４Ｇ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ２９４  Ａ１８４Ｇ／Ｒ２７６Ａ
変異型Ｍ２９５  Ｖ１８４Ｇ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ２９６  Ｔ１８５Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ２９７  Ｔ１８５Ｎ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ２９８  Ｗ１８７Ｆ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ２９９  Ｗ１８７Ｆ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３００  Ｆ１９３Ｗ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ３０１  Ｆ２００Ａ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ３０２  Ｆ２００Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３０３  Ｌ２０１Ｑ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３０４  Ｌ２０１Ｓ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３０５  Ａ２０４Ｓ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ３０６  Ａ２０４Ｓ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３０７  Ｔ２１０Ｌ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ３０８  Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３０９  Ｆ２１１Ｌ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ３１０  Ｆ２１１Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３１１  Ｆ２１１Ｗ／Ｉ２２８Ｋ
変異型Ｍ３１２  Ｆ２１１Ｗ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ３１３  Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３１４  Ｒ２１５Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３１５  Ｒ２１５Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３１６  Ｔ２２０Ｌ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ３１７  Ｔ２２０Ｌ／Ｄ３００Ｎ
変異型Ｍ３１８  Ｐ２２１Ｌ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ３１９  Ｐ２２１Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３２０  Ｆ２２４Ａ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ３２１  Ｇ２２６Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３２２  Ｇ２２６Ｆ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ３２３  Ｇ２２６Ｆ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３２４  Ｉ２２８Ｋ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３２５  Ａ２３３Ｄ／Ｋ２３５Ｄ
変異型Ｍ３２６  Ａ２３３Ｄ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３２７  Ｒ２７６Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３２８  Ｙ３２８Ｆ／Ｙ３３９Ｆ
変異型Ｍ３２９  Ａ２７Ｔ／Ｙ８１Ａ／Ｓ８４Ｄ
変異型Ｍ３３０  Ｐ７０Ｔ／Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３３１  Ｐ７０Ｔ／Ｇ７７Ｓ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３３２  Ｐ７０Ｔ／Ｅ８０Ｄ／Ｆ８８Ｅ
変異型Ｍ３３３  Ｐ７０Ｔ／Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３３４  Ｐ７０Ｔ／Ｓ８４Ｄ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３３５  Ｐ７０Ｔ／Ｆ８８Ｅ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３３６  Ｐ７０Ｔ／Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３３７  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｓ
変異型Ｍ３３８  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ３３９  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ３４０  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３４１  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｖ４３９Ｐ
変異型Ｍ３４２  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｉ４４０Ｆ
変異型Ｍ３４３  Ｐ７０Ｔ／Ｇ１６１Ａ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ３４４  Ｐ７０Ｔ／Ｇ１６１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３４５  Ｐ７０Ｔ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ
変異型Ｍ３４６  Ｐ７０Ｔ／Ａ２０４Ｓ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３４７  Ｐ７０Ｔ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３４８  Ｐ７０Ｖ／Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３４９  Ａ７２Ｅ／Ｓ７４Ｔ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３５０  Ａ７２Ｅ／Ｇ７７Ｓ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３５１  Ａ７２Ｅ／Ｅ８０Ｄ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３５２  Ａ７２Ｅ／Ｙ８１Ｈ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３５３  Ａ７２Ｅ／Ｋ８３Ｐ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３５４  Ａ７２Ｅ／Ｓ８４Ｄ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３５５  Ａ７２Ｅ／Ｌ８５Ｐ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３５６  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３５７  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３５８  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｙ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３５９  Ａ７２Ｅ／Ｄ１１５Ｑ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３６０  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｇ１６１Ａ
変異型Ｍ３６１  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ１６２Ｌ
変異型Ｍ３６２  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ
変異型Ｍ３６３  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２００Ａ
変異型Ｍ３６４  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｓ
変異型Ｍ３６５  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｔ
変異型Ｍ３６６  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ３６７  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ３６８  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｇ２２６Ａ
変異型Ｍ３６９  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ３７０  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３７１  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｍ３７２  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｖ４３９Ｐ
変異型Ｍ３７３  Ａ７２Ｅ／Ｇ１６１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３７４  Ａ７２Ｅ／Ｆ１６２Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３７５  Ａ７２Ｅ／Ａ１８４Ｇ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３７６  Ａ７２Ｅ／Ｗ１８７Ｆ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３７７  Ａ７２Ｅ／Ｆ２００Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３７８  Ａ７２Ｅ／Ａ２０４Ｓ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３７９  Ａ７２Ｅ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３８０  Ａ７２Ｅ／Ｉ２２８Ｋ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３８１  Ａ７２Ｅ／Ａ２３３Ｄ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３８２  Ａ７２Ｅ／Ｙ３２８Ｆ／Ｙ１５９Ｎ
変異型Ｍ３８３  Ａ７２Ｅ／Ｙ３２８Ｆ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ３８４  Ａ７２Ｅ／Ｙ３２８Ｆ／Ｆ２１１Ｙ
変異型Ｍ３８５  Ａ７２Ｅ／Ｙ３２８Ｆ／Ｇ２２６Ａ
変異型Ｍ３８６  Ａ７２Ｖ／Ｙ８１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３８７  Ａ７２Ｖ／Ｇ１６１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３８８  Ｇ７７Ｍ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ３８９  Ｇ７７Ｐ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ１６２Ｌ
変異型Ｍ３９０  Ｇ７７Ｐ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ
変異型Ｍ３９１  Ｇ７７Ｐ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３９２  Ｇ７７Ｓ／Ｙ８１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３９３  Ｇ７７Ｓ／Ｓ８４Ｄ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３９４  Ｇ７７Ｓ／Ｆ８８Ｅ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３９５  Ｇ７７Ｓ／Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３９６  Ｇ７７Ｓ／Ｆ１１３Ｙ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３９７  Ｇ７７Ｓ／Ｄ１１５Ｑ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３９８  Ｇ７７Ｓ／Ｉ１５７Ｌ／Ｇ１６１Ａ
変異型Ｍ３９９  Ｇ７７Ｓ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２００Ａ
変異型Ｍ４００  Ｇ７７Ｓ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｓ
変異型Ｍ４０１  Ｇ７７Ｓ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４０２  Ｇ７７Ｓ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ４０３  Ｇ７７Ｓ／Ｉ１５７Ｌ／Ｇ２２６Ａ
変異型Ｍ４０４  Ｇ７７Ｓ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ４０５  Ｇ７７Ｓ／Ｉ１５７Ｌ／Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｍ４０６  Ｇ７７Ｓ／Ｉ１５７Ｌ／Ｖ４３９Ｐ
変異型Ｍ４０７  Ｇ７７Ｓ／Ｇ１６１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４０８  Ｅ８０Ｄ／Ｙ８１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４０９  Ｙ８１Ａ／Ｓ８４Ｄ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４１０  Ｙ８１Ａ／Ｆ１１３Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４１１  Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４１２  Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４１３  Ｙ８１Ａ／Ｇ１６１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４１４  Ｙ８１Ａ／Ｆ１６２Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４１５  Ｙ８１Ａ／Ａ１８４Ｇ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４１６  Ｙ８１Ａ／Ｗ１８７Ｆ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４１７  Ｙ８１Ａ／Ａ２０４Ｓ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４１８  Ｙ８１Ａ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４１９  Ｙ８１Ａ／Ｉ２２８Ｋ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４２０  Ｙ８１Ａ／Ａ２３３Ｄ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４２１  Ｙ８１Ａ／Ｙ３２８Ｆ／Ｙ１５９Ｎ
変異型Ｍ４２２  Ｙ８１Ａ／Ｙ３２８Ｆ／Ｙ１５９Ｓ
変異型Ｍ４２３  Ｙ８１Ａ／Ｙ３２８Ｆ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ４２４  Ｙ８１Ａ／Ｙ３２８Ｆ／Ｆ２１１Ｙ
変異型Ｍ４２５  Ｙ８１Ａ／Ｙ３２８Ｆ／Ｇ２２６Ａ
変異型Ｍ４２６  Ｙ８１Ａ／Ｙ３２８Ｆ／Ｒ２７６Ａ
変異型Ｍ４２７  Ｋ８３Ｐ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ
変異型Ｍ４２８  Ｋ８３Ｐ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４２９  Ｋ８３Ｐ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４３０  Ｓ８４Ｄ／Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ４３１  Ｓ８４Ｄ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４３２  Ｆ８８Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ１６２Ｌ
変異型Ｍ４３３  Ｆ８８Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ
変異型Ｍ４３４  Ｆ８８Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２００Ａ
変異型Ｍ４３５  Ｆ８８Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４３６  Ｆ８８Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４３７  Ｆ８８Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｑ
変異型Ｍ４３８  Ｆ８８Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｍ４３９  Ｆ８８Ｅ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４４０  Ｆ８８Ｅ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４４１  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ｇ１６１Ａ
変異型Ｍ４４２  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ
変異型Ｍ４４３  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ｗ１８７Ｆ
変異型Ｍ４４４  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２００Ａ
変異型Ｍ４４５  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｓ
変異型Ｍ４４６  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｔ
変異型Ｍ４４７  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４４８  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ４４９  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ｇ２２６Ａ
変異型Ｍ４５０  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ４５１  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４５２  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｍ４５３  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ｖ４３９Ｐ
変異型Ｍ４５４  Ｆ１１３Ｗ／Ｇ１６１Ａ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４５５  Ｆ１１３Ｗ／Ｇ１６１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４５６  Ｆ１１３Ｗ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ
変異型Ｍ４５７  Ｆ１１３Ｙ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４５８  Ｆ１１３Ｙ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４５９  Ｆ１１３Ｙ／Ｇ１６１Ａ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４６０  Ｄ１１５Ｑ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４６１  Ｄ１１５Ｑ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４６２  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ１５９Ｎ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４６３  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ１５９Ｎ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４６４  Ｉ１５７Ｌ／Ｇ１６１Ａ／Ｗ１８７Ｆ
変異型Ｍ４６５  Ｉ１５７Ｌ／Ｇ１６１Ａ／Ｆ２００Ａ
変異型Ｍ４６６  Ｉ１５７Ｌ／Ｇ１６１Ａ／Ａ２０４Ｓ
変異型Ｍ４６７  Ｉ１５７Ｌ／Ｇ１６１Ａ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４６８  Ｉ１５７Ｌ／Ｇ１６１Ａ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ４６９  Ｉ１５７Ｌ／Ｇ１６１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４７０  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ１６２Ｌ／Ａ１８４Ｇ
変異型Ｍ４７１  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ１６２Ｌ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４７２  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ１６２Ｌ／Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｍ４７３  Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ
変異型Ｍ４７４  Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ｆ２００Ａ
変異型Ｍ４７５  Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ａ２０４Ｔ
変異型Ｍ４７６  Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４７７  Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ４７８  Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｍ４７９  Ｉ１５７Ｌ／Ｗ１８７Ｆ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４８０  Ｉ１５７Ｌ／Ｗ１８７Ｆ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４８１  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２００Ａ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４８２  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２００Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４８３  Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｓ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４８４  Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｓ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４８５  Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｔ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４８６  Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｔ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４８７  Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ４８８  Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｇ２１２Ａ
変異型Ｍ４８９  Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｇ２２６Ａ
変異型Ｍ４９０  Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ４９１  Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４９２  Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｍ４９３  Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｖ４３９Ｐ
変異型Ｍ４９４  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４９５  Ｉ１５７Ｌ／Ｇ２２６Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４９６  Ｉ１５７Ｌ／Ａ２３３Ｄ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４９７  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ／Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｍ４９８  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ／Ｖ４３９Ｐ
変異型Ｍ４９９  Ｙ１５９Ｎ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５００  Ｇ１６１Ａ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ
変異型Ｍ５０１  Ｇ１６１Ａ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５０２  Ｇ１６１Ａ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５０３  Ａ１８２Ｇ／Ｐ１８３Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５０４  Ａ１８２Ｓ／Ｐ１８３Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５０５  Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ｆ２００Ａ
変異型Ｍ５０６  Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ａ２０４Ｓ
変異型Ｍ５０７  Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ５０８  Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ｉ２２８Ｋ
変異型Ｍ５０９  Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ５１０  Ｆ２００Ａ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５１１  Ａ２０４Ｓ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５１２  Ａ２０４Ｔ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５１３  Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ／Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｍ５１４  Ｐ７０Ｔ／Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５１５  Ｐ７０Ｔ／Ａ７２Ｅ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５１６  Ｐ７０Ｔ／Ｇ７７Ｍ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５１７  Ｐ７０Ｔ／Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ５１８  Ｐ７０Ｔ／Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５１９  Ｐ７０Ｔ／Ｓ８４Ｄ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５２０  Ｐ７０Ｔ／Ｆ８８Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５２１  Ｐ７０Ｔ／Ｆ８８Ｅ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５２２  Ｐ７０Ｔ／Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ５２３  Ｐ７０Ｔ／Ｆ１１３Ｗ／Ｇ１６１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５２４  Ｐ７０Ｔ／Ｆ１１３Ｙ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５２５  Ｐ７０Ｔ／Ｄ１１５Ｑ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ５２６  Ｐ７０Ｔ／Ｄ１１５Ｑ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５２７  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｇ１６１Ａ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ５２８  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ
変異型Ｍ５２９  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ５３０  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｗ１８７Ｆ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ５３１  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｗ１８７Ｆ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５３２  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｔ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ５３３  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｔ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５３４  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｔ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ５３５  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ５３６  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｇ２２６Ａ
変異型Ｍ５３７  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ５３８  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５３９  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｍ５４０  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｖ４３９Ｐ
変異型Ｍ５４１  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ／Ｖ４３９Ｐ
変異型Ｍ５４２  Ｐ７０Ｔ／Ｇ１６１Ａ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５４３  Ｐ７０Ｔ／Ｇ１６１Ａ／Ａ２３３Ｄ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５４４  Ａ７２Ｅ／Ｓ７４Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５４５  Ａ７２Ｅ／Ｇ７７Ｓ／Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ５４６  Ａ７２Ｅ／Ｙ８１Ｈ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５４７  Ａ７２Ｅ／Ｋ８３Ｐ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５４８  Ａ７２Ｅ／Ｆ８８Ｅ／Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ５４９  Ａ７２Ｅ／Ｆ８８Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５５０  Ａ７２Ｅ／Ｆ８８Ｅ／Ｇ１６１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５５１  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５５２  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｗ／Ｇ１６１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５５３  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｙ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５５４  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｙ／Ｇ１６１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５５５  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｙ／Ｇ２２６Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５５６  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｇ１６１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５５７  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ１６２Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５５８  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５５９  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２００Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５６０  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｔ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５６１  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５６２  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２１１Ｙ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５６３  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２３３Ｄ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５６４  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ／Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｍ５６５  Ａ７２Ｅ／Ｇ１６１Ａ／Ａ２０４Ｔ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５６６  Ａ７２Ｅ／Ｇ１６１Ａ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５６７  Ａ７２Ｅ／Ｇ１６１Ａ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５６８  Ａ７２Ｅ／Ｇ１６１Ａ／Ｆ２１１Ｙ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５６９  Ａ７２Ｅ／Ｇ１６１Ａ／Ａ２３３Ｄ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５７０  Ａ７２Ｅ／Ｇ１６１Ａ／Ｙ３２８Ｆ／Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｍ５７１  Ａ７２Ｅ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５７２  Ａ７２Ｅ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ／Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｍ５７３  Ａ７２Ｖ／Ｉ１５７Ｌ／Ｗ１８７Ｆ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５７４  Ｇ７７Ｐ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５７５  Ｙ８１Ａ／Ｓ８４Ｄ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５７６  Ｙ８１Ａ／Ｆ８８Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５７７  Ｙ８１Ａ／Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５７８  Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ｇ１６１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５７９  Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ｗ１８７Ｆ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５８０  Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｓ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５８１  Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５８２  Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２３３Ｄ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５８３  Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ／Ｖ４３９Ｐ
変異型Ｍ５８４  Ｙ８１Ａ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５８５  Ｆ８８Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５８６  Ｆ８８Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２３３Ｄ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５８７  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｔ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ５８８  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５８９  Ｉ１５７Ｌ／Ｇ１６１Ａ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ
変異型Ｍ５９０  Ｉ１５７Ｌ／Ｇ１６１Ａ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５９１  Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ５９２  Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｓ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５９３  Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｔ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５９４  Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ａ２３３Ｄ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５９５  Ｇ１６１Ａ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５９６  Ｐ７０Ｔ／Ａ７２Ｅ／Ｓ８４Ｄ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５９７  Ｐ７０Ｔ／Ａ７２Ｅ／Ａ２０４Ｓ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５９８  Ｐ７０Ｔ／Ａ７２Ｅ／Ｔ２１０Ｌ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５９９  Ｐ７０Ｔ／Ａ７２Ｅ／Ｇ２２６Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６００  Ｐ７０Ｔ／Ａ７２Ｅ／Ａ２３３Ｄ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６０１  Ｐ７０Ｔ／Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６０２  Ｐ７０Ｔ／Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２３３Ｄ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６０３  Ｐ７０Ｔ／Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６０４  Ｐ７０Ｔ／Ｙ８１Ａ／Ａ２３３Ｄ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６０５  Ｐ７０Ｔ／Ｓ８４Ｄ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６０６  Ｐ７０Ｔ／Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６０７  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ６０８  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｗ１８７Ｆ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６０９  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｓ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６１０  Ｐ７０Ｔ／Ｇ１６１Ａ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６１１  Ｐ７０Ｖ／Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｙ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６１２  Ｐ７０Ｖ／Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６１３  Ａ７２Ｅ／Ｓ７４Ｔ／Ｆ１１３Ｙ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６１４  Ａ７２Ｅ／Ｓ７４Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６１５  Ａ７２Ｅ／Ｙ８１Ｈ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６１６  Ａ７２Ｅ／Ｋ８３Ｐ／Ｆ１１３Ｙ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６１７  Ａ７２Ｅ／Ｗ１７Ｆ／Ｆ１１３Ｙ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６１８  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｙ／Ｄ１１５Ｑ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６１９  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｙ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ／Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｍ６２０  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｙ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ／Ｖ４３９Ｐ
変異型Ｍ６２１  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｙ／Ｇ１６１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６２２  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｙ／Ａ２０４Ｓ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６２３  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｙ／Ａ２０４Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６２４  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｙ／Ｔ２１０Ｌ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６２５  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｙ／Ａ２３３Ｄ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６２６  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｇ１６１Ａ／Ｆ１６２Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６２７  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｗ１８７Ｆ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６２８  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｓ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６２９  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｔ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６３０  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ／Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｍ６３１  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ／Ｖ４３９Ｐ
変異型Ｍ６３２  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｇ２２６Ａ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６３３  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２３３Ｄ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６３４  Ｙ８１Ａ／Ｓ８４Ｄ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６３５  Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６３６  Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ６３７  Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２３３Ｄ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６３８  Ｆ８８Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ６３９  Ｆ１１３Ｙ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ１５９Ｎ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６４０  Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６４１  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６４２  Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
【請求項５６】
請求項５５に記載の変異型タンパク質において、前記変異型Ｍ１からＭ６４２のいずれか１種または２種以上の変異を含むアミノ酸配列中、変異部位以外の部位に置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を更に含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有する、変異型タンパク質。
【請求項５７】
少なくとも変異型Ｍ２４１を含むことを特徴とする、請求項５５から５６のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項５８】
少なくとも変異型Ｍ３４０を含むことを特徴とする、請求項５５から５７のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項５９】
少なくとも変異型Ｍ４１２を含むことを特徴とする、請求項５５から５８のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項６０】
少なくとも変異型Ｍ４９１を含むことを特徴とする、請求項５５から５９のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項６１】
少なくとも変異型Ｍ４９６を含むことを特徴とする、請求項５５から６０のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項６２】
少なくとも変異型Ｍ５８１を含むことを特徴とする、請求項５５から６１のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項６３】
少なくとも変異型Ｍ５８２を含むことを特徴とする、請求項５５から６２のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項６４】
少なくとも変異型Ｍ５９４を含むことを特徴とする、請求項５５から６３のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
【請求項６５】
請求項１８から６４のいずれか一項に記載の変異型タンパク質が有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６６】
請求項６５に記載のポリヌクレオチドを含む組換えポリヌクレオチド。
【請求項６７】
請求項６６に記載の組換えポリヌクレオチドを含む形質転換微生物。
【請求項６８】
請求項６７に記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および／または微生物中に前記変異型タンパク質を蓄積させることを特徴とする、変異型タンパク質の製造方法。
【請求項６９】
請求項１８から６４のいずれか一項に記載の変異型タンパク質の存在下で、ペプチド生成反応を行うことを特徴とする、ペプチドの製造方法。
【請求項７０】
請求項６７に記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および／または形質転換微生物中に前記変異型タンパク質を蓄積させてペプチド生成反応を行うことを特徴とする、ペプチドの製造方法。
【請求項７１】
請求項１８から６４のいずれか一項に記載の変異型タンパク質の存在下で、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルとＬ−フェニルアラニンとの反応を行うことを特徴とする、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法。
【請求項７２】
請求項６７に記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および／または形質転換微生物中に前記変異型タンパク質を蓄積させて、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルとＬ−フェニルアラニンとの反応を行うことを特徴とする、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質に関し、より詳しくは、優れたペプチド生成活性を有する変異型タンパク質およびこのタンパク質を用いたペプチドの製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドは、医薬品、食品等のさまざまな分野で利用されている。例えば、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンはＬ−グルタミンに比べ安定かつ水溶性も高いことから、輸液や無血清培地の成分として広く用いられている。【０００３】
ペプチドの製造法としては従来から化学合成法が知られているが、その製造法は必ずしも簡便さ、効率性の点で満足のいくものではなかった。
他方、酵素を用いたペプチドの製造方法も開発されてきた（例えば特許文献１、２など）。しかしながら、従来の酵素を用いたペプチドの製造方法では、ペプチド生成速度が極めて遅い、ペプチド生成収率が低いなどの点で改善の余地が残されるものであった。このような背景の下、これらペプチドの工業的にも効率の良い製造法の開発が望まれていた。【０００４】
本発明者らは、既にペプチド生成活性に優れた酵素としてスフィンゴバクテリウムに由来する酵素を見出している（特許文献３−６）。【０００５】
【特許文献１】欧州特許出願公開第２７８７８７号明細書
【特許文献２】欧州特許第３５９３９９号明細書
【特許文献３】国際公開第２００４／０１１６５３号パンフレット
【特許文献４】特開２００５−０４００３７号公報
【特許文献５】特開２００５−０５８２１２号公報
【特許文献６】特開２００５−１６８４０５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、より優れたペプチド生成タンパク質、および効率の良いペプチドの製造方法等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは鋭意研究の結果、スフィンゴバクテリウム属に属する細菌に由来するペプチド生成活性を有するタンパク質のアミノ酸配列または塩基配列の特定部位を改変させることにより、さらにペプチド生成活性に優れたタンパク質が得られることを見出し本発明を完成させた。すなわち、本発明は、下記タンパク質およびこのタンパク質を用いたペプチドの製造方法等を提供するものである。【０００８】
〔１〕配列番号２に記載のアミノ酸配列に対し下記変異型１から６８のいずれか１種または２種以上の変異を含むアミノ酸配列を有する変異型タンパク質。
変異型１  Ｆ２０７Ｖ、変異型２  Ｑ４４１Ｅ、変異型３  Ｋ８３Ａ、変異型４  Ａ３０１Ｖ、変異型５  Ｖ２５７Ｉ、変異型６  Ａ５３７Ｇ、変異型７  Ａ３２４Ｖ、変異型８  Ｎ６０７Ｋ、変異型９  Ｄ３１３Ｅ、変異型１０  Ｑ２２９Ｈ、変異型１１  Ｍ２０８Ａ、変異型１２  Ｅ５５１Ｋ、変異型１３  Ｆ２０７Ｈ、変異型１４  Ｔ７２Ａ、変異型１５  Ａ１３７Ｓ、変異型１６  Ｌ４３９Ｖ、変異型１７  Ｇ２２６Ｓ、変異型１８  Ｄ６１９Ｅ、変異型１９  Ｙ３３９Ｈ、変異型２０  Ｗ３２７Ｇ、変異型２１  Ｖ１８４Ａ、変異型２２  Ｖ１８４Ｃ、変異型２３  Ｖ１８４Ｇ、変異型２４  Ｖ１８４Ｉ、変異型２５  Ｖ１８４Ｌ、変異型２６  Ｖ１８４Ｍ、変異型２７  Ｖ１８４Ｐ、変異型２８  Ｖ１８４Ｓ、変異型２９  Ｖ１８４Ｔ、変異型３０  Ｑ４４１Ｋ、変異型３１  Ｎ４４２Ｋ、変異型３２  Ｄ２０３Ｎ、変異型３３  Ｄ２０３Ｓ、変異型３４  Ｆ２０７Ａ、変異型３５  Ｆ２０７Ｓ、変異型３６  Ｑ４４１Ｎ、変異型３７  Ｆ２０７Ｔ、変異型３８  Ｆ２０７Ｉ、変異型３９  Ｔ２１０Ｋ、変異型４０  Ｗ１８７Ａ、変異型４１  Ｓ２０９Ａ、変異型４２  Ｆ２１１Ａ、変異型４３  Ｆ２１１Ｖ、変異型４４  Ｖ２５７Ａ、変異型４５  Ｖ２５７Ｇ、変異型４６  Ｖ２５７Ｈ、変異型４７  Ｖ２５７Ｍ、変異型４８  Ｖ２５７Ｎ、変異型４９  Ｖ２５７Ｑ、変異型５０  Ｖ２５７Ｓ、変異型５１  Ｖ２５７Ｔ、変異型５２  Ｖ２５７Ｗ、変異型５３  Ｖ２５７Ｙ、変異型５４  Ｋ４７Ｇ、変異型５５  Ｋ４７Ｅ、変異型５６  Ｎ４４２Ｆ、変異型５７  Ｎ６０７Ｒ、変異型５８  Ｐ２１４Ｔ、変異型５９  Ｑ２０２Ｅ、変異型６０  Ｙ４９４Ｆ、変異型６１  Ｒ１１７Ａ、変異型６２  Ｆ２０７Ｇ、変異型６３  Ｓ２０９Ｄ、変異型６４  Ｓ２０９Ｇ、変異型６５  Ｑ４４１Ｄ、変異型６６  Ｒ４４５Ｄ、変異型６７  Ｒ４４５Ｆ、変異型６８  Ｎ４４２Ｄ。
〔２〕  上記〔１〕に記載の変異型タンパク質において、前記変異型１から６８のいずれか１種または２種以上の変異を含むアミノ酸配列中、変異部位以外の部位に置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を更に含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有する、変異型タンパク質。
〔３〕  少なくとも変異型２を含むことを特徴とする、上記〔１〕または〔２〕に記載の変異型タンパク質。
〔４〕  少なくとも変異型１４を含むことを特徴とする、上記〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の変異型タンパク質。
〔５〕  配列番号２に記載のアミノ酸配列に対し下記変異型２３９から２９０、および３２４から３７７のうちのいずれか１種または２種以上の変異を含むアミノ酸配列を有する変異型タンパク質。
変異型２３９  Ｆ２０７Ｖ／Ｑ４４１Ｅ
変異型２４０  Ｆ２０７Ｖ／Ｋ８３Ａ
変異型２４１  Ｆ２０７Ｖ／Ｅ５５１Ｋ
変異型２４２  Ｋ８３Ａ／Ｑ４４１Ｅ
変異型２４３  Ｍ２０８Ａ／Ｅ５５１Ｋ
変異型２４４  Ｖ２５７Ｉ／Ｑ４４１Ｅ
変異型２４５  Ｖ２５７Ｉ／Ａ５３７Ｇ
変異型２４６  Ｆ２０７Ｖ／Ｓ２０９Ａ
変異型２４７  Ｋ８３Ａ／Ｓ２０９Ａ
変異型２４８  Ｋ８３Ａ／Ｆ２０７Ｖ／Ｑ４４１Ｅ
変異型２４９  Ｌ４３９Ｖ／Ｆ２０７Ｖ／Ｑ４４１Ｅ
変異型２５０  Ａ５３７Ｇ／Ｆ２０７Ｖ／Ｑ４４１Ｅ
変異型２５１  Ａ３０１Ｖ／Ｆ２０７Ｖ／Ｑ４４１Ｅ
変異型２５２  Ｇ２２６Ｓ／Ｆ２０７Ｖ／Ｑ４４１Ｅ
変異型２５３  Ｖ２５７Ｉ／Ｆ２０７Ｖ／Ｑ４４１Ｅ
変異型２５４  Ｄ６１９Ｅ／Ｆ２０７Ｖ／Ｑ４４１Ｅ
変異型２５５  Ｙ３３９Ｈ／Ｆ２０７Ｖ／Ｑ４４１Ｅ
変異型２５６  Ｎ６０７Ｋ／Ｆ２０７Ｖ／Ｑ４４１Ｅ
変異型２５７  Ａ３２４Ｖ／Ｆ２０７Ｖ／Ｑ４４１Ｅ
変異型２５８  Ｑ２２９Ｈ／Ｆ２０７Ｖ／Ｑ４４１Ｅ
変異型２５９  Ｗ３２７Ｇ／Ｆ２０７Ｖ／Ｑ４４１Ｅ
変異型２６０  Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２６１  Ｋ８３Ａ／Ｑ２２９Ｈ／Ａ３０１Ｖ／Ｄ３１３Ｅ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２６２  Ｑ２２９Ｈ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２６３  Ｑ２２９Ｈ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２６４  Ｑ２２９Ｈ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ｄ３１３Ｅ／Ａ３２４Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２６５  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２６６  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ａ３０１Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２６７  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｈ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２６８  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｈ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２６９  Ｔ７２Ａ／  Ｑ２２９Ｈ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ｄ３１３Ｅ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２７０  Ｔ７２Ａ／  Ｑ２２９Ｈ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ｄ３１３Ｅ／Ａ３２４Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２７１  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２７２  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｌ／Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２７３  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｇ／Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２７４  Ｔ７２Ａ／Ｑ２２９Ｉ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ｄ３１３Ｅ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２７５  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｉ２２８Ｇ／Ｑ２２９Ｐ／Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２７６  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｉ２２８Ｌ／Ｑ２２９Ｐ／Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２７７  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｉ２２８Ｄ／Ｑ２２９Ｐ／Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２７８  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｉ２３０Ｄ／Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２７９  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｉ２３０Ｖ／Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２８０  Ｔ７２Ａ／Ｉ２２８Ｓ／Ｑ２２９Ｈ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ｄ３１３Ｅ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２８１  Ｔ７２Ａ／Ｑ２２９Ｈ／Ｓ２５６C／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ｄ３１３Ｅ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２８２  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２８３  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２８４  Ｔ７２Ａ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｇ／Ｄ３１３Ｅ／Ａ３２４Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２８５  Ｔ７２Ａ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ｄ３１３Ｅ／Ａ３２４Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２８６  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｖ１８４Ａ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２８７  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｖ１８４Ｇ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２８８  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｖ１８４Ｎ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２８９  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｖ１８４Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型２９０  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｖ１８４Ｔ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ
変異型３２４  Ｖ１８４Ａ／Ｖ２５７Ｙ
変異型３２５  Ｖ１８４Ａ／Ｗ１８７Ａ
変異型３２６  Ｖ１８４Ａ／Ｎ４４２Ｄ
変異型３２７  Ｖ１８４Ｐ／Ｎ４４２Ｄ
変異型３２８  Ｖ１８４Ａ／Ｎ４４２Ｄ／Ｌ４３９Ｖ
変異型３２９  Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ
変異型３３０  Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ｐ
変異型３３１  Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ２５７Ｙ
変異型３３２  Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｗ１８７Ａ
変異型３３３  Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｆ２１１Ａ
変異型３３４  Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｑ４４１Ｅ
変異型３３５  Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｎ４４２Ｄ
変異型３３６  Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｆ２０７Ｖ
変異型３３７  Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ａ１８２Ｇ
変異型３３８  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｎ４４２Ｄ
変異型３３９  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｎ４４２Ｄ／Ｔ１８５Ｆ
変異型３４０  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｋ８３Ａ
変異型３４１  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｗ１８７Ａ
変異型３４２  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｆ２１１Ａ
変異型３４３  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｖ１７８Ｇ
変異型３４４  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｔ１８５Ａ
変異型３４５  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ａ１８２Ｇ
変異型３４６  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｋ３１４Ｒ
変異型３４７  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ａ５１５Ｖ
変異型３４８  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｌ６６Ｆ
変異型３４９  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｓ３１５Ｒ
変異型３５０  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｋ４８４Ｉ
変異型３５１  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｖ２１３Ａ
変異型３５２  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ａ２４５Ｓ
変異型３５３  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｐ２１４Ｈ
変異型３５４  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ  ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ  ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｌ２６３Ｍ
変異型３５５  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ  ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｐ１８３Ａ
変異型３５６  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｔ１８５Ｋ
変異型３５７  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｔ１８５Ｄ
変異型３５８  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｔ１８５Ｃ
変異型３５９  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｔ１８５Ｓ
変異型３６０  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｔ１８５Ｆ
変異型３６１  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｔ１８５Ｐ
変異型３６２  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｔ１８５Ｎ
変異型３６３  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｐ１８３Ａ／Ａ１８２Ｇ
変異型３６４  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｐ１８３Ａ／Ａ１８２Ｓ
変異型３６５  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ  ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｔ１８５Ｆ／Ｎ４４２Ｄ
変異型３６６  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ  ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｌ６６Ｆ／Ｅ８０Ｋ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８２Ｇ／Ｐ２１４Ｈ／Ｌ２６３Ｍ
変異型３６７  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｌ６６Ｆ／Ｅ８０Ｋ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８２Ｇ／Ｐ２１４Ｈ／Ｌ２６３Ｍ／Ｙ３２８Ｆ
変異型３６８  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ  ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｌ６６Ｆ／Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８２Ｇ／Ｐ２１４Ｈ／Ｌ２６３Ｍ／Ｙ３２８Ｆ
変異型３６９  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｌ６６Ｆ／Ｅ８０Ｋ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８２Ｇ／Ｔ２１０Ｌ／Ｌ２６３Ｍ／Ｙ３２８Ｆ
変異型３７０  Ａ３０１Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｑ４４１Ｋ
変異型３７１  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｉ１５７Ｌ
変異型３７２  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｇ１６１Ａ
変異型３７３  Ｔ７２Ａ／Ａ１３７Ｓ／Ｑ２２９Ｐ／Ｖ２５７Ｉ／Ａ３０１Ｖ／Ａ３２４Ｖ／Ｌ４３９Ｖ／Ｑ４４１Ｅ／Ａ５３７Ｇ／Ｎ６０７Ｋ／Ｖ１８４Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型３７４  Ｆ２０７Ｖ／Ｇ２２６Ｓ
変異型３７５  Ｆ２０７Ｖ／Ｗ３２７Ｇ
変異型３７６  Ｆ２０７Ｖ／Ｙ３３９Ｈ
変異型３７７  Ｆ２０７Ｖ／Ｄ６１９Ｅ
〔６〕  上記〔５〕に記載の変異型タンパク質において、前記変異型２３９から２９０、および３２４から３７７のうちのいずれか１種または２種以上の変異を含むアミノ酸配列中、変異部位以外の部位に置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を更に含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有する、変異型タンパク質。
〔７〕  少なくとも変異型２６０を含むことを特徴とする、上記〔５〕または〔６〕に記載の変異型タンパク質。
〔８〕  少なくとも変異型２８６を含むことを特徴とする、上記〔５〕から〔７〕のいずれかに記載の変異型タンパク質。
〔９〕  上記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の変異型タンパク質が有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
〔１０〕  上記〔９〕に記載のポリヌクレオチドを含む組換えポリヌクレオチド。
〔１１〕  上記〔１０〕に記載の組換えポリヌクレオチドを含む形質転換微生物。
〔１２〕  上記〔１１〕に記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および／または微生物中に前記変異型タンパク質を蓄積させることを特徴とする、変異型タンパク質の製造方法。
〔１３〕  上記〔１〕から〔８〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質の存在下で、ペプチド生成反応を行うことを特徴とする、ペプチドの製造方法。
〔１４〕  上記〔１１〕に記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および／または形質転換微生物中に前記変異型タンパク質を蓄積させてペプチド生成反応を行うことを特徴とする、ペプチドの製造方法。
〔１５〕  上記〔１〕から〔８〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質の存在下で、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルとＬ−フェニルアラニンとの反応を行うことを特徴とする、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法。
〔１６〕  上記〔１１〕に記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および／または形質転換微生物中に前記変異型タンパク質を蓄積させて、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルとＬ−フェニルアラニンとの反応を行うことを特徴とする、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法。
〔１７〕  配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をＸ線結晶構造解析して得られた立体構造を基にして、当該タンパク質の基質結合部位を推定し、基質結合部位に位置するアミノ酸残基の置換、挿入または削除をすることによりペプチド生成活性を有する変異型タンパク質を設計・作製する方法。
〔１８〕  配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造のうち、当該配列中６７−７０、７２−８８、１００、１０２、１０３、１０６、１０７、１１３−１１７、１３０、１５５−１６３、１６５、１６６、１８０−１８８、１９０−１９５、２００−２３５、２５９、２７３、２７６、２７８、２９２−２９４、２９６、２９８、２９９、３００−３０４、３２５−３２８、３３０−３４０、及び４３７−４４７のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基が置換、挿入または削除され、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
〔１９〕  ペプチド生成活性を有するタンパク質の変異型タンパク質であって、当該タンパク質と配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質との３次元構造とが、トレッディング法による判定の結果類似しており、該判定の際に得られるアラインメントにおいて、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中６７−７０、７２−８８、１００、１０２、１０３、１０６、１０７、１１３−１１７、１３０、１５５−１６３、１６５、１６６、１８０−１８８、１９０−１９５、２００−２３５、２５９、２７３、２７６、２７８、２９２−２９４、２９６、２９８、２９９、３００−３０４、３２５−３２８、３３０−３４０、及び４３７−４４７のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一以上のアミノ酸残基が置換、挿入または削除され、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
〔２０〕  ペプチド生成活性を有するタンパク質の変異型タンパク質であって、当該タンパク質と配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の一次配列とのアラインメントもしくは当該タンパク質と配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の３次元構造とのアラインメントを行なったときに、一次配列の相同性が２５％以上であるものにおいて、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、６７−７０、７２−８８、１００、１０２、１０３、１０６、１０７、１１３−１１７、１３０、１５５−１６３、１６５、１６６、１８０−１８８、１９０−１９５、２００−２３５、２５９、２７３、２７６、２７８、２９２−２９４、２９６、２９８、２９９、３００−３０４、３２５−３２８、３３０−３４０及び４３７−４４７のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一以上のアミノ酸残基が置換、挿入または削除され、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
〔２１〕  配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造において、以下の（ａ）〜（ｉ）の中から選ばれる１または２以上の立体構造の変化が生じており、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
（ａ）配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中７９−８２のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｂ）配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中８４、８８、８９及び９２のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｃ）配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中７２、７５及び７７のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｄ）配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中１５９、１６１、１６２、１８４、１８７及び２７６のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｅ）配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中７０、１０６、１１３、１１５、１９３、２０７、２０９−２１２、２１６及び２５９のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｆ）配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中２００、２０２−２０５、２０７及び２２８のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｇ）配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中２３３、２３４、及び４３９のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｈ）配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中３２８、３３９、３４０、４４５、及び４４６のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｉ）配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中８７、１５５、１５７、及び１６０のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
〔２２〕  ペプチド生成活性を有するタンパク質の変異型タンパク質であって、当該タンパク質と配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質との３次元構造とが、トレッディング法による判定の結果類似しており、かつ、該判定の際に得られるアラインメントにおいて、以下の（ａ´）〜（ｉ´）の中から選ばれる１または２以上の変化が生じている、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
（ａ´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、７９−８２のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｂ´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、８４、８８、８９及び９２のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｃ´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、７２、７５及び７７のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｄ´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、１５９、１６１、１６２、１８４、１８７及び２７６のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｅ´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、７０、１０６、１１３、１１５、１９３、２０７、２０９−２１２、２１６及び２５９のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｆ´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、２００、２０２−２０５、２０７、及び２２８のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｇ´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、２３３、２３４、及び４３９のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｈ´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、３２８、３３９、３４０、４４５、及び４４６のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｉ´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、８７、１５５、１５７、及び１６０のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
〔２３〕  ペプチド生成活性を有するタンパク質の変異型タンパク質であって、当該タンパク質と配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の一次配列とのアラインメントもしくは当該タンパク質と配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の３次元構造とのアラインメントを行ったときに、一次配列の相同性が２５％以上であるものにおいて、以下の（ａ´´）〜（ｉ´´）の中から選ばれる１または２以上の変化が生じており、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
（ａ´´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、７９−８２のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｂ´´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、８４、８８、８９及び９２のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｃ´´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、７２、７５及び７７のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｄ´´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、１５９、１６１、１６２、１８４、１８７及び２７６のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｅ´´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、７０、１０６、１１３、１１５、１９３、２０７、２０９−２１２、２１６及び２５９のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｆ´´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、２００、２０２−２０５、２０７、及び２２８のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｇ´´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、２３３、２３４、及び４３９のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｈ´´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、３２８、３３９、３４０、４４５、及び４４６のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｉ´´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、８７、１５５、１５７、及び１６０のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
〔２４〕  配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造のうち、当該配列中６７、６９、７０、７２−８５、１０３、１０６、１０７、１１３−１１６、１６５、１８２、１８３、１８５、１８７、１８８、１９０、２００、２０２、２０４−２０６、２０９−２１１、２１３−２３５、３０１、３２８、３３８−３４０、４４０−４４２、及び４４６のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基が置換、挿入または削除され、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
〔２５〕  配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造のうち、当該配列中６７、６９、７０、７２−８４、１０６、１０７、１１４、１１６、１８３、１８５、１８７、１８８、２０２、２０４−２０６、２０９、２１１、２１３−２３３、２３５、３２８、３３８−４４２、及び４４６のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基が置換、挿入または削除され、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
〔２６〕  配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造のうち、当該配列中６７、７０、７２−７５、７７−７９、８１−８４、１１４、１１６、１８５、１８８、２０２、２０４、２０６、２０９、２１１、２１３−２１５、２１８−２２４、２２６−２３３、２３５、３２８、３３８−４４１、及び４４６のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基が置換、挿入または削除され、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
〔２７〕  配列番号２０８に記載のアミノ酸配列に対し下記変異型Ｌ１からＬ３３５のいずれか１種または２種以上の変異を含むアミノ酸配列を有する変異型タンパク質。
変異型Ｌ１  Ｎ６７Ｋ
変異型Ｌ２  Ｎ６７Ｌ
変異型Ｌ３  Ｎ６７Ｓ
変異型Ｌ４  Ｔ６９Ｉ
変異型Ｌ５  Ｔ６９Ｍ
変異型Ｌ６  Ｔ６９Ｑ
変異型Ｌ７  Ｔ６９Ｒ
変異型Ｌ８  Ｔ６９Ｖ
変異型Ｌ９  Ｐ７０Ｇ
変異型Ｌ１０  Ｐ７０Ｎ
変異型Ｌ１１  Ｐ７０Ｓ
変異型Ｌ１２  Ｐ７０Ｔ
変異型Ｌ１３  Ｐ７０Ｖ
変異型Ｌ１４  Ａ７２Ｃ
変異型Ｌ１５  Ａ７２Ｄ
変異型Ｌ１６  Ａ７２Ｅ
変異型Ｌ１７  Ａ７２Ｉ
変異型Ｌ１８  Ａ７２Ｌ
変異型Ｌ１９  Ａ７２Ｍ
変異型Ｌ２０  Ａ７２Ｎ
変異型Ｌ２１  Ａ７２Ｑ
変異型Ｌ２２  Ａ７２Ｓ
変異型Ｌ２３  Ａ７２Ｖ
変異型Ｌ２４  Ｖ７３Ａ
変異型Ｌ２５  Ｖ７３Ｉ
変異型Ｌ２６  Ｖ７３Ｌ
変異型Ｌ２７  Ｖ７３Ｍ
変異型Ｌ２８  Ｖ７３Ｎ
変異型Ｌ２９  Ｖ７３Ｓ
変異型Ｌ３０  Ｖ７３Ｔ
変異型Ｌ３１  Ｓ７４Ａ
変異型Ｌ３２  Ｓ７４Ｆ
変異型Ｌ３３  Ｓ７４Ｋ
変異型Ｌ３４  Ｓ７４Ｎ
変異型Ｌ３５  Ｓ７４Ｔ
変異型Ｌ３６  Ｓ７４Ｖ
変異型Ｌ３７  Ｐ７５Ａ
変異型Ｌ３８  Ｐ７５Ｄ
変異型Ｌ３９  Ｐ７５Ｌ
変異型Ｌ４０  Ｐ７５Ｓ
変異型Ｌ４１  Ｙ７６Ｆ
変異型Ｌ４２  Ｙ７６Ｈ
変異型Ｌ４３  Ｙ７６Ｉ
変異型Ｌ４４  Ｙ７６Ｖ
変異型Ｌ４５  Ｙ７６Ｗ
変異型Ｌ４６  Ｇ７７Ａ
変異型Ｌ４７  Ｇ７７Ｆ
変異型Ｌ４８  Ｇ７７Ｋ
変異型Ｌ４９  Ｇ７７Ｍ
変異型Ｌ５０  Ｇ７７Ｎ
変異型Ｌ５１  Ｇ７７Ｐ
変異型Ｌ５２  Ｇ７７Ｓ
変異型Ｌ５３  Ｇ７７Ｔ
変異型Ｌ５４  Ｑ７８Ｆ
変異型Ｌ５５  Ｑ７８Ｌ
変異型Ｌ５６  Ｎ７９Ｄ
変異型Ｌ５７  Ｎ７９Ｌ
変異型Ｌ５８  Ｎ７９Ｒ
変異型Ｌ５９  Ｎ７９Ｓ
変異型Ｌ６０  Ｅ８０Ｄ
変異型Ｌ６１  Ｅ８０Ｆ
変異型Ｌ６２  Ｅ８０Ｌ
変異型Ｌ６３  Ｅ８０Ｐ
変異型Ｌ６４  Ｅ８０Ｓ
変異型Ｌ６５  Ｙ８１Ａ
変異型Ｌ６６  Ｙ８１Ｃ
変異型Ｌ６７  Ｙ８１Ｄ
変異型Ｌ６８  Ｙ８１Ｅ
変異型Ｌ６９  Ｙ８１Ｆ
変異型Ｌ７０  Ｙ８１Ｈ
変異型Ｌ７１  Ｙ８１Ｋ
変異型Ｌ７２  Ｙ８１Ｌ
変異型Ｌ７３  Ｙ８１Ｎ
変異型Ｌ７４  Ｙ８１Ｓ
変異型Ｌ７５  Ｙ８１Ｔ
変異型Ｌ７６  Ｙ８１Ｗ
変異型Ｌ７７  Ｋ８２Ｄ
変異型Ｌ７８  Ｋ８２Ｌ
変異型Ｌ７９  Ｋ８２Ｐ
変異型Ｌ８０  Ｋ８２Ｓ
変異型Ｌ８１  Ｋ８３Ｄ
変異型Ｌ８２  Ｋ８３Ｆ
変異型Ｌ８３  Ｋ８３Ｌ
変異型Ｌ８４  Ｋ８３Ｐ
変異型Ｌ８５  Ｋ８３Ｓ
変異型Ｌ８６  Ｋ８３Ｖ
変異型Ｌ８７  Ｓ８４Ｄ
変異型Ｌ８８  Ｓ８４Ｆ
変異型Ｌ８９  Ｓ８４Ｋ
変異型Ｌ９０  Ｓ８４Ｌ
変異型Ｌ９１  Ｓ８４Ｎ
変異型Ｌ９２  Ｓ８４Ｑ
変異型Ｌ９３  Ｌ８５Ｆ
変異型Ｌ９４  Ｌ８５Ｉ
変異型Ｌ９５  Ｌ８５Ｐ
変異型Ｌ９６  Ｌ８５Ｖ
変異型Ｌ９７  Ｎ８７Ｅ
変異型Ｌ９８  Ｎ８７Ｑ
変異型Ｌ９９  Ｆ８８Ｅ
変異型Ｌ１００  Ｖ１０３Ｉ
変異型Ｌ１０１  Ｖ１０３Ｌ
変異型Ｌ１０２  Ｋ１０６Ａ
変異型Ｌ１０３  Ｋ１０６Ｆ
変異型Ｌ１０４  Ｋ１０６Ｌ
変異型Ｌ１０５  Ｋ１０６Ｑ
変異型Ｌ１０６  Ｋ１０６Ｓ
変異型Ｌ１０７  Ｗ１０７Ａ
変異型Ｌ１０８  Ｗ１０７Ｙ
変異型Ｌ１０９  Ｆ１１３Ａ
変異型Ｌ１１０  Ｆ１１３Ｗ
変異型Ｌ１１１  Ｆ１１３Ｙ
変異型Ｌ１１２  Ｅ１１４Ａ
変異型Ｌ１１３  Ｅ１１４Ｄ
変異型Ｌ１１４  Ｄ１１５Ｅ
変異型Ｌ１１５  Ｄ１１５Ｑ
変異型Ｌ１１６  Ｄ１１５Ｓ
変異型Ｌ１１７  Ｉ１１６Ｆ
変異型Ｌ１１８  Ｉ１１６Ｋ
変異型Ｌ１１９  Ｉ１１６Ｌ
変異型Ｌ１２０  Ｉ１１６Ｍ
変異型Ｌ１２１  Ｉ１１６Ｎ
変異型Ｌ１２２  Ｉ１１６Ｔ
変異型Ｌ１２３  Ｉ１１６Ｖ
変異型Ｌ１２４  Ｉ１５７Ｋ
変異型Ｌ１２５  Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｌ１２６  Ｙ１５９Ｇ
変異型Ｌ１２７  Ｙ１５９Ｎ
変異型Ｌ１２８  Ｙ１５９Ｓ
変異型Ｌ１２９  Ｐ１６０Ｇ
変異型Ｌ１３０  Ｇ１６１Ａ
変異型Ｌ１３１  Ｆ１６２Ｌ
変異型Ｌ１３２  Ｆ１６２Ｙ
変異型Ｌ１３３  Ｙ１６３Ｉ
変異型Ｌ１３４  Ｔ１６５Ｖ
変異型Ｌ１３５  Ｑ１８１Ｆ
変異型Ｌ１３６  Ａ１８２Ｇ
変異型Ｌ１３７  Ａ１８２Ｓ
変異型Ｌ１３８  Ｐ１８３Ａ
変異型Ｌ１３９  Ｐ１８３Ｇ
変異型Ｌ１４０  Ｐ１８３Ｓ
変異型Ｌ１４１  Ｔ１８５Ａ
変異型Ｌ１４２  Ｔ１８５Ｇ
変異型Ｌ１４３  Ｔ１８５Ｖ
変異型Ｌ１４４  Ｗ１８７Ａ
変異型Ｌ１４５  Ｗ１８７Ｆ
変異型Ｌ１４６  Ｗ１８７Ｈ
変異型Ｌ１４７  Ｗ１８７Ｙ
変異型Ｌ１４８  Ｙ１８８Ｆ
変異型Ｌ１４９  Ｙ１８８Ｌ
変異型Ｌ１５０  Ｙ１８８Ｗ
変異型Ｌ１５１  Ｇ１９０Ａ
変異型Ｌ１５２  Ｇ１９０Ｄ
変異型Ｌ１５３  Ｆ１９３Ｗ
変異型Ｌ１５４  Ｈ１９４Ｄ
変異型Ｌ１５５  Ｆ２００Ａ
変異型Ｌ１５６  Ｆ２００Ｌ
変異型Ｌ１５７  Ｆ２００Ｓ
変異型Ｌ１５８  Ｆ２００Ｖ
変異型Ｌ１５９  Ｌ２０１Ｑ
変異型Ｌ１６０  Ｌ２０１Ｓ
変異型Ｌ１６１  Ｑ２０２Ａ
変異型Ｌ１６２  Ｑ２０２Ｄ
変異型Ｌ１６３  Ｑ２０２Ｆ
変異型Ｌ１６４  Ｑ２０２Ｓ
変異型Ｌ１６５  Ｑ２０２Ｔ
変異型Ｌ１６６  Ｑ２０２Ｖ
変異型Ｌ１６７  Ｄ２０３Ｅ
変異型Ｌ１６８  Ａ２０４Ｇ
変異型Ｌ１６９  Ａ２０４Ｌ
変異型Ｌ１７０  Ａ２０４Ｓ
変異型Ｌ１７１  Ａ２０４Ｔ
変異型Ｌ１７２  Ａ２０４Ｖ
変異型Ｌ１７３  Ｆ２０５Ｌ
変異型Ｌ１７４  Ｆ２０５Ｑ
変異型Ｌ１７５  Ｆ２０５Ｖ
変異型Ｌ１７６  Ｆ２０５Ｗ
変異型Ｌ１７７  Ｔ２０６Ｆ
変異型Ｌ１７８  Ｔ２０６Ｋ
変異型Ｌ１７９  Ｔ２０６Ｌ
変異型Ｌ１８０  Ｆ２０７Ｉ
変異型Ｌ１８１  Ｆ２０７Ｗ
変異型Ｌ１８２  Ｆ２０７Ｙ
変異型Ｌ１８３  Ｍ２０８Ａ
変異型Ｌ１８４  Ｍ２０８Ｌ
変異型Ｌ１８５  Ｓ２０９Ｆ
変異型Ｌ１８６  Ｓ２０９Ｋ
変異型Ｌ１８７  Ｓ２０９Ｌ
変異型Ｌ１８８  Ｓ２０９Ｎ
変異型Ｌ１８９  Ｓ２０９Ｖ
変異型Ｌ１９０  Ｔ２１０Ａ
変異型Ｌ１９１  Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｌ１９２  Ｔ２１０Ｑ
変異型Ｌ１９３  Ｔ２１０Ｖ
変異型Ｌ１９４  Ｆ２１１Ａ
変異型Ｌ１９５  Ｆ２１１Ｉ
変異型Ｌ１９６  Ｆ２１１Ｌ
変異型Ｌ１９７  Ｆ２１１Ｍ
変異型Ｌ１９８  Ｆ２１１Ｖ
変異型Ｌ１９９  Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｌ２００  Ｆ２１１Ｙ
変異型Ｌ２０１  Ｇ２１２Ａ
変異型Ｌ２０２  Ｖ２１３Ｄ
変異型Ｌ２０３  Ｖ２１３Ｆ
変異型Ｌ２０４  Ｖ２１３Ｋ
変異型Ｌ２０５  Ｖ２１３Ｓ
変異型Ｌ２０６  Ｐ２１４Ｄ
変異型Ｌ２０７  Ｐ２１４Ｆ
変異型Ｌ２０８  Ｐ２１４Ｋ
変異型Ｌ２０９  Ｐ２１４Ｓ
変異型Ｌ２１０  Ｒ２１５Ａ
変異型Ｌ２１１  Ｒ２１５Ｉ
変異型Ｌ２１２  Ｒ２１５Ｋ
変異型Ｌ２１３  Ｒ２１５Ｑ
変異型Ｌ２１４  Ｒ２１５Ｓ
変異型Ｌ２１５  Ｒ２１５Ｔ
変異型Ｌ２１６  Ｒ２１５Ｙ
変異型Ｌ２１７  Ｐ２１６Ｄ
変異型Ｌ２１８  Ｐ２１６Ｋ
変異型Ｌ２１９  Ｋ２１７Ｄ
変異型Ｌ２２０  Ｐ２１８Ｆ
変異型Ｌ２２１  Ｐ２１８Ｌ
変異型Ｌ２２２  Ｐ２１８Ｑ
変異型Ｌ２２３  Ｐ２１８Ｓ
変異型Ｌ２２４  Ｉ２１９Ｄ
変異型Ｌ２２５  Ｉ２１９Ｆ
変異型Ｌ２２６  Ｉ２１９Ｋ
変異型Ｌ２２７  Ｔ２２０Ａ
変異型Ｌ２２８  Ｔ２２０Ｄ
変異型Ｌ２２９  Ｔ２２０Ｆ
変異型Ｌ２３０  Ｔ２２０Ｋ
変異型Ｌ２３１  Ｔ２２０Ｌ
変異型Ｌ２３２  Ｔ２２０Ｓ
変異型Ｌ２３３  Ｐ２２１Ａ
変異型Ｌ２３４  Ｐ２２１Ｄ
変異型Ｌ２３５  Ｐ２２１Ｆ
変異型Ｌ２３６  Ｐ２２１Ｋ
変異型Ｌ２３７  Ｐ２２１Ｌ
変異型Ｌ２３８  Ｐ２２１Ｓ
変異型Ｌ２３９  Ｄ２２２Ａ
変異型Ｌ２４０  Ｄ２２２Ｆ
変異型Ｌ２４１  Ｄ２２２Ｌ
変異型Ｌ２４２  Ｄ２２２Ｒ
変異型Ｌ２４３  Ｑ２２３Ｆ
変異型Ｌ２４４  Ｑ２２３Ｋ
変異型Ｌ２４５  Ｑ２２３Ｌ
変異型Ｌ２４６  Ｑ２２３Ｓ
変異型Ｌ２４７  Ｆ２２４Ａ
変異型Ｌ２４８  Ｆ２２４Ｄ
変異型Ｌ２４９  Ｆ２２４Ｇ
変異型Ｌ２５０  Ｆ２２４Ｋ
変異型Ｌ２５１  Ｆ２２４Ｌ
変異型Ｌ２５２  Ｋ２２５Ｄ
変異型Ｌ２５３  Ｋ２２５Ｇ
変異型Ｌ２５４  Ｋ２２５Ｓ
変異型Ｌ２５５  Ｇ２２６Ａ
変異型Ｌ２５６  Ｇ２２６Ｆ
変異型Ｌ２５７  Ｇ２２６Ｌ
変異型Ｌ２５８  Ｇ２２６Ｎ
変異型Ｌ２５９  Ｇ２２６Ｓ
変異型Ｌ２６０  Ｋ２２７Ｄ
変異型Ｌ２６１  Ｋ２２７Ｆ
変異型Ｌ２６２  Ｋ２２７Ｓ
変異型Ｌ２６３  Ｉ２２８Ａ
変異型Ｌ２６４  Ｉ２２８Ｆ
変異型Ｌ２６５  Ｉ２２８Ｋ
変異型Ｌ２６６  Ｉ２２８Ｓ
変異型Ｌ２６７  Ｐ２２９Ａ
変異型Ｌ２６８  Ｐ２２９Ｄ
変異型Ｌ２６９  Ｐ２２９Ｋ
変異型Ｌ２７０  Ｐ２２９Ｌ
変異型Ｌ２７１  Ｐ２２９Ｓ
変異型Ｌ２７２  Ｉ２３０Ａ
変異型Ｌ２７３  Ｉ２３０Ｆ
変異型Ｌ２７４  Ｉ２３０Ｋ
変異型Ｌ２７５  Ｉ２３０Ｓ
変異型Ｌ２７６  Ｋ２３１Ｆ
変異型Ｌ２７７  Ｋ２３１Ｌ
変異型Ｌ２７８  Ｋ２３１Ｓ
変異型Ｌ２７９  Ｅ２３２Ｄ
変異型Ｌ２８０  Ｅ２３２Ｆ
変異型Ｌ２８１  Ｅ２３２Ｇ
変異型Ｌ２８２  Ｅ２３２Ｌ
変異型Ｌ２８３  Ｅ２３２Ｓ
変異型Ｌ２８４  Ａ２３３Ｄ
変異型Ｌ２８５  Ａ２３３Ｆ
変異型Ｌ２８６  Ａ２３３Ｈ
変異型Ｌ２８７  Ａ２３３Ｋ
変異型Ｌ２８８  Ａ２３３Ｌ
変異型Ｌ２８９  Ａ２３３Ｎ
変異型Ｌ２９０  Ａ２３３Ｓ
変異型Ｌ２９１  Ｄ２３４Ｌ
変異型Ｌ２９２  Ｄ２３４Ｓ
変異型Ｌ２９３  Ｋ２３５Ｄ
変異型Ｌ２９４  Ｋ２３５Ｆ
変異型Ｌ２９５  Ｋ２３５Ｌ
変異型Ｌ２９６  Ｋ２３５Ｓ
変異型Ｌ２９７  Ｆ２５９Ｙ
変異型Ｌ２９８  Ｒ２７６Ａ
変異型Ｌ２９９  Ｒ２７６Ｑ
変異型Ｌ３００  Ａ２９８Ｓ
変異型Ｌ３０１  Ｄ３００Ｎ
変異型Ｌ３０２  Ｖ３０１Ｍ
変異型Ｌ３０３  Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｌ３０４  Ｙ３２８Ｈ
変異型Ｌ３０５  Ｙ３２８Ｍ
変異型Ｌ３０６  Ｙ３２８Ｗ
変異型Ｌ３０７  Ｗ３３２Ｈ
変異型Ｌ３０８  Ｅ３３６Ａ
変異型Ｌ３０９  Ｎ３３８Ａ
変異型Ｌ３１０  Ｎ３３８Ｆ
変異型Ｌ３１１  Ｙ３３９Ｋ
変異型Ｌ３１２  Ｙ３３９Ｌ
変異型Ｌ３１３  Ｙ３３９Ｔ
変異型Ｌ３１４  Ｌ３４０Ａ
変異型Ｌ３１５  Ｌ３４０Ｉ
変異型Ｌ３１６  Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｌ３１７  Ｖ４３９Ｐ
変異型Ｌ３１８  Ｉ４４０Ｆ
変異型Ｌ３１９  Ｉ４４０Ｖ
変異型Ｌ３２０  Ｅ４４１Ｆ
変異型Ｌ３２１  Ｅ４４１Ｍ
変異型Ｌ３２２  Ｅ４４１Ｎ
変異型Ｌ３２３  Ｎ４４２Ａ
変異型Ｌ３２４  Ｎ４４２Ｌ
変異型Ｌ３２５  Ｒ４４３Ｓ
変異型Ｌ３２６  Ｔ４４４Ｗ
変異型Ｌ３２７  Ｒ４４５Ｇ
変異型Ｌ３２８  Ｒ４４５Ｋ
変異型Ｌ３２９  Ｅ４４６Ａ
変異型Ｌ３３０  Ｅ４４６Ｆ
変異型Ｌ３３１  Ｅ４４６Ｑ
変異型Ｌ３３２  Ｅ４４６Ｓ
変異型Ｌ３３３  Ｅ４４６Ｔ
変異型Ｌ３３４  Ｙ４４７Ｌ
変異型Ｌ３３５  Ｙ４４７Ｓ
〔２８〕  上記〔２０〕に記載の変異型タンパク質において、前記変異型Ｌ１からＬ３３５のいずれか１種または２種以上の変異を含むアミノ酸配列中、変異部位以外の部位に置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を更に含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有する、変異型タンパク質。
〔２９〕  少なくとも変異型Ｌ１２４もしくは変異型Ｌ１２５を含むことを特徴とする、上記〔２７〕または〔２８〕に記載の変異型タンパク質。
〔３０〕  少なくとも変異型Ｌ３０３を含むことを特徴とする、上記〔２７〕から〔２９〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔３１〕  少なくとも変異型Ｌ１２を含むことを特徴とする、上記〔２７〕から〔３０〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔３２〕  少なくとも変異型Ｌ１２７を含むことを特徴とする、上記〔２７〕から〔３１〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔３３〕  少なくとも変異型Ｌ１９５もしくはＬ１９９を含むことを特徴とする、上記〔２７〕から〔３２〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔３４〕  少なくとも変異型Ｌ１３０を含むことを特徴とする、上記〔２７〕から〔３３〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔３５〕  少なくとも変異型Ｌ１１５を含むことを特徴とする、上記〔２７〕から〔３４〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔３６〕  少なくとも変異型Ｌ３１６を含むことを特徴とする、上記〔２７〕から〔３５〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔３７〕  少なくとも変異型Ｌ９９を含むことを特徴とする、上記〔２７〕から〔３６〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔３８〕  少なくとも変異型Ｌ１５もしくはＬ１６を含むことを特徴とする、上記〔２７〕から〔３７〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔３９〕  少なくとも変異型Ｌ１３１を含むことを特徴とする、上記〔２７〕から〔３８〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔４０〕  少なくとも変異型Ｌ２８４を含むことを特徴とする、上記〔２７〕から〔３９〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔４１〕  少なくとも変異型Ｌ１９１を含むことを特徴とする、上記〔２７〕から〔４０〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔４２〕  少なくとも変異型Ｌ６５を含むことを特徴とする、上記〔２７〕から〔４１〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔４３〕  少なくとも変異型Ｌ２６５を含むことを特徴とする、上記〔２７〕から〔４２〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔４４〕  少なくとも変異型Ｌ３１７を含むことを特徴とする、上記〔２７〕から〔４３〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔４５〕  少なくとも変異型Ｌ２５５を含むことを特徴とする、上記〔２７〕から〔４４〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔４６〕  少なくとも変異型Ｌ５２を含むことを特徴とする、上記〔２７〕から〔４５〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔４７〕  少なくとも変異型Ｌ１５５を含むことを特徴とする、上記〔２７〕から〔４６〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔４８〕  少なくとも変異型Ｌ２９８を含むことを特徴とする、上記〔２７〕から〔４７〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔４９〕  少なくとも変異型Ｌ２０１を含むことを特徴とする、上記〔２７〕から〔４８〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔５０〕  少なくとも変異型Ｌ１４５を含むことを特徴とする、上記〔２７〕から〔４９〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔５１〕  少なくとも変異型Ｌ１７０を含むことを特徴とする、上記〔２７〕から〔５０〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔５２〕  少なくとも変異型Ｌ８７を含むことを特徴とする、上記〔２７〕から〔５１〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔５３〕  少なくとも変異型Ｌ６０を含むことを特徴とする、上記〔２７〕から〔５２〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔５４〕  少なくとも変異型Ｌ１１０を含むことを特徴とする、上記〔２７〕から〔５３〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔５５〕  配列番号２０８に記載のアミノ酸配列に対し下記の変異型Ｍ１からＭ６４２のいずれか１種または２種以上の変異を含むアミノ酸配列を有する変異型タンパク質。
変異型Ｍ１  Ｔ６９Ｎ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ２  Ｔ６９Ｑ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３  Ｔ６９Ｓ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ４  Ｐ７０Ａ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ５  Ｐ７０Ｇ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ６  Ｐ７０Ｉ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ７  Ｐ７０Ｌ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ８  Ｐ７０Ｎ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ９  Ｐ７０Ｓ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１０  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１１  Ｐ７０Ｔ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ１２  Ｐ７０Ｔ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ１３  Ｐ７０Ｖ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１４  Ａ７２Ｅ／Ｇ７７Ｓ
変異型Ｍ１５  Ａ７２Ｅ／Ｅ８０Ｄ
変異型Ｍ１６  Ａ７２Ｅ／Ｙ８１Ａ
変異型Ｍ１７  Ａ７２Ｅ／Ｓ８４Ｄ
変異型Ｍ１８  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｗ
変異型Ｍ１９  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ２０  Ａ７２Ｅ／Ｇ１６１Ａ
変異型Ｍ２１  Ａ７２Ｅ／Ｆ１６２Ｌ
変異型Ｍ２２  Ａ７２Ｅ／Ａ１８４Ｇ
変異型Ｍ２３  Ａ７２Ｅ／Ｗ１８７Ｆ
変異型Ｍ２４  Ａ７２Ｅ／Ｆ２００Ａ
変異型Ｍ２５  Ａ７２Ｅ／Ａ２０４Ｓ
変異型Ｍ２６  Ａ７２Ｅ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ２７  Ａ７２Ｅ／Ｆ２１１Ｌ
変異型Ｍ２８  Ａ７２Ｅ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ２９  Ａ７２Ｅ／Ｇ２２６Ａ
変異型Ｍ３０  Ａ７２Ｅ／Ｉ２２８Ｋ
変異型Ｍ３１  Ａ７２Ｅ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ３２  Ａ７２Ｅ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３３  Ａ７２Ｓ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３４  Ａ７２Ｖ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３５  Ｖ７３Ａ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３６  Ｖ７３Ｉ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３７  Ｓ７４Ａ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３８  Ｓ７４Ｎ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３９  Ｓ７４Ｔ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ４０  Ｓ７４Ｖ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ４１  Ｇ７７Ａ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ４２  Ｇ７７Ｆ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ４３  Ｇ７７Ｍ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ４４  Ｇ７７Ｐ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ４５  Ｇ７７Ｓ／Ｅ８０Ｄ
変異型Ｍ４６  Ｇ７７Ｓ／Ｙ８１Ａ
変異型Ｍ４７  Ｇ７７Ｓ／Ｓ８４Ｄ
変異型Ｍ４８  Ｇ７７Ｓ／Ｆ１１３Ｗ
変異型Ｍ４９  Ｇ７７Ｓ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ５０  Ｇ７７Ｓ／Ｙ１５９Ｎ
変異型Ｍ５１  Ｇ７７Ｓ／Ｙ１５９Ｓ
変異型Ｍ５２  Ｇ７７Ｓ／Ｇ１６１Ａ
変異型Ｍ５３  Ｇ７７Ｓ／Ｆ１６２Ｌ
変異型Ｍ５４  Ｇ７７Ｓ／Ａ１８４Ｇ
変異型Ｍ５５  Ｇ７７Ｓ／Ｗ１８７Ｆ
変異型Ｍ５６  Ｇ７７Ｓ／Ｆ２００Ａ
変異型Ｍ５７  Ｇ７７Ｓ／Ａ２０４Ｓ
変異型Ｍ５８  Ｇ７７Ｓ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ５９  Ｇ７７Ｓ／Ｆ２１１Ｌ
変異型Ｍ６０  Ｇ７７Ｓ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ６１  Ｇ７７Ｓ／Ｉ２２８Ｋ
変異型Ｍ６２  Ｇ７７Ｓ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ６３  Ｇ７７Ｓ／Ｒ２７６Ａ
変異型Ｍ６４  Ｇ７７Ｓ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６５  Ｅ８０Ｄ／Ｙ８１Ａ
変異型Ｍ６６  Ｅ８０Ｄ／Ｆ１１３Ｗ
変異型Ｍ６７  Ｅ８０Ｄ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ６８  Ｅ８０Ｄ／Ｙ１５９Ｎ
変異型Ｍ６９  Ｅ８０Ｄ／Ｇ１６１Ａ
変異型Ｍ７０  Ｅ８０Ｄ／Ａ１８４Ｇ
変異型Ｍ７１  Ｅ８０Ｄ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ７２  Ｅ８０Ｄ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ７３  Ｅ８０Ｓ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ７４  Ｙ８１Ａ／Ｆ１１３Ｗ
変異型Ｍ７５  Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ７６  Ｙ８１Ａ／Ｙ１５９Ｎ
変異型Ｍ７７  Ｙ８１Ａ／Ｙ１５９Ｓ
変異型Ｍ７８  Ｙ８１Ａ／Ｇ１６１Ａ
変異型Ｍ７９  Ｙ８１Ａ／Ａ１８４Ｇ
変異型Ｍ８０  Ｙ８１Ａ／Ｗ１８７Ｆ
変異型Ｍ８１  Ｙ８１Ａ／Ｆ２００Ａ
変異型Ｍ８２  Ｙ８１Ａ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ８３  Ｙ８１Ａ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ８４  Ｙ８１Ａ／Ｆ２１１Ｙ
変異型Ｍ８５  Ｙ８１Ａ／Ｇ２２６Ａ
変異型Ｍ８６  Ｙ８１Ａ／Ｉ２２８Ｋ
変異型Ｍ８７  Ｙ８１Ａ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ８８  Ｙ８１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ８９  Ｙ８１Ｈ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ９０  Ｙ８１Ｎ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ９１  Ｋ８３Ｐ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ９２  Ｓ８４Ａ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ９３  Ｓ８４Ｄ／Ｆ１１３Ｗ
変異型Ｍ９４  Ｓ８４Ｄ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ９５  Ｓ８４Ｄ／Ｙ１５９Ｎ
変異型Ｍ９６  Ｓ８４Ｄ／Ｇ１６１Ａ
変異型Ｍ９７  Ｓ８４Ｄ／Ａ１８４Ｇ
変異型Ｍ９８  Ｓ８４Ｄ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ９９  Ｓ８４Ｅ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１００  Ｓ８４Ｆ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１０１  Ｓ８４Ｋ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１０２  Ｌ８５Ｆ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１０３  Ｌ８５Ｉ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１０４  Ｌ８５Ｐ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１０５  Ｌ８５Ｖ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１０６  Ｎ８７Ａ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１０７  Ｎ８７Ｄ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１０８  Ｎ８７Ｅ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１０９  Ｎ８７Ｇ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１１０  Ｎ８７Ｑ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１１１  Ｎ８７Ｓ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１１２  Ｆ８８Ａ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１１３  Ｆ８８Ｄ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１１４  Ｆ８８Ｅ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１１５  Ｆ８８Ｅ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ１１６  Ｆ８８Ｌ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１１７  Ｆ８８Ｔ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１１８  Ｆ８８Ｖ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１１９  Ｆ８８Ｙ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１２０  Ｋ１０６Ｈ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１２１  Ｋ１０６Ｌ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１２２  Ｋ１０６Ｍ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１２３  Ｋ１０６Ｑ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１２４  Ｋ１０６Ｒ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１２５  Ｋ１０６Ｓ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１２６  Ｋ１０６Ｖ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１２７  Ｗ１０７Ａ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１２８  Ｗ１０７Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ１２９  Ｗ１０７Ｙ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１３０  Ｗ１０７Ｙ／Ｔ２０６Ｙ
変異型Ｍ１３１  Ｗ１０７Ｙ／Ｋ２１７Ｄ
変異型Ｍ１３２  Ｗ１０７Ｙ／Ｐ２１８Ｌ
変異型Ｍ１３３  Ｗ１０７Ｙ／Ｔ２２０Ｌ
変異型Ｍ１３４  Ｗ１０７Ｙ／Ｐ２２１Ｄ
変異型Ｍ１３５  Ｗ１０７Ｙ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ１３６  Ｆ１１３Ａ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１３７  Ｆ１１３Ｈ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１３８  Ｆ１１３Ｎ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１３９  Ｆ１１３Ｖ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１４０  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１４１  Ｆ１１３Ｗ／Ｙ１５９Ｎ
変異型Ｍ１４２  Ｆ１１３Ｗ／Ｙ１５９Ｓ
変異型Ｍ１４３  Ｆ１１３Ｗ／Ｇ１６１Ａ
変異型Ｍ１４４  Ｆ１１３Ｗ／Ｆ１６２Ｌ
変異型Ｍ１４５  Ｆ１１３Ｗ／Ａ１８４Ｇ
変異型Ｍ１４６  Ｆ１１３Ｗ／Ｗ１８７Ｆ
変異型Ｍ１４７  Ｆ１１３Ｗ／Ｆ２００Ａ
変異型Ｍ１４８  Ｆ１１３Ｗ／Ｔ２０６Ｙ
変異型Ｍ１４９  Ｆ１１３Ｗ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ１５０  Ｆ１１３Ｗ／Ｆ２１１Ｌ
変異型Ｍ１５１  Ｆ１１３Ｗ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ１５２  Ｆ１１３Ｗ／Ｆ２１１Ｙ
変異型Ｍ１５３  Ｆ１１３Ｗ／Ｖ２１３Ｄ
変異型Ｍ１５４  Ｆ１１３Ｗ／Ｋ２１７Ｄ
変異型Ｍ１５５  Ｆ１１３Ｗ／Ｔ２２０Ｌ
変異型Ｍ１５６  Ｆ１１３Ｗ／Ｐ２２１Ｄ
変異型Ｍ１５７  Ｆ１１３Ｗ／Ｇ２２６Ａ
変異型Ｍ１５８  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ２２８Ｋ
変異型Ｍ１５９  Ｆ１１３Ｗ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ１６０  Ｆ１１３Ｗ／Ｒ２７６Ａ
変異型Ｍ１６１  Ｆ１１３Ｙ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１６２  Ｆ１１３Ｙ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ１６３  Ｅ１１４Ｄ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１６４  Ｄ１１５Ａ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１６５  Ｄ１１５Ｅ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１６６  Ｄ１１５Ｍ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１６７  Ｄ１１５Ｎ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１６８  Ｄ１１５Ｑ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１６９  Ｄ１１５Ｓ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１７０  Ｄ１１５Ｖ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ１７１  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ１５９Ｉ
変異型Ｍ１７２  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ１５９Ｌ
変異型Ｍ１７３  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ１５９Ｎ
変異型Ｍ１７４  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ１５９Ｓ
変異型Ｍ１７５  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ１５９Ｖ
変異型Ｍ１７６  Ｉ１５７Ｌ／Ｐ１６０Ａ
変異型Ｍ１７７  Ｉ１５７Ｌ／Ｐ１６０Ｓ
変異型Ｍ１７８  Ｉ１５７Ｌ／Ｇ１６１Ａ
変異型Ｍ１７９  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ１６２Ｌ
変異型Ｍ１８０  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ１６２Ｍ
変異型Ｍ１８１  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ１６２Ｎ
変異型Ｍ１８２  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ１６２Ｙ
変異型Ｍ１８３  Ｉ１５７Ｌ／Ｔ１６５Ｌ
変異型Ｍ１８４  Ｉ１５７Ｌ／Ｔ１６５Ｖ
変異型Ｍ１８５  Ｉ１５７Ｌ／Ｑ１８１Ａ
変異型Ｍ１８６  Ｉ１５７Ｌ／Ｑ１８１Ｆ
変異型Ｍ１８７  Ｉ１５７Ｌ／Ｑ１８１Ｎ
変異型Ｍ１８８  Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ
変異型Ｍ１８９  Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｌ
変異型Ｍ１９０  Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｍ
変異型Ｍ１９１  Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｓ
変異型Ｍ１９２  Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｔ
変異型Ｍ１９３  Ｉ１５７Ｌ／Ｗ１８７Ｆ
変異型Ｍ１９４  Ｉ１５７Ｌ／Ｗ１８７Ｙ
変異型Ｍ１９５  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ１９３Ｈ
変異型Ｍ１９６  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ１９３Ｉ
変異型Ｍ１９７  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ１９３Ｗ
変異型Ｍ１９８  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２００Ａ
変異型Ｍ１９９  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２００Ｈ
変異型Ｍ２００  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２００Ｌ
変異型Ｍ２０１  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２００Ｙ
変異型Ｍ２０２  Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｇ
変異型Ｍ２０３  Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｉ
変異型Ｍ２０４  Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｌ
変異型Ｍ２０５  Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｓ
変異型Ｍ２０６  Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｔ
変異型Ｍ２０７  Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｖ
変異型Ｍ２０８  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２０５Ａ
変異型Ｍ２０９  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２０７Ｉ
変異型Ｍ２１０  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２０７Ｍ
変異型Ｍ２１１  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２０７Ｖ
変異型Ｍ２１２  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２０７Ｗ
変異型Ｍ２１３  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２０７Ｙ
変異型Ｍ２１４  Ｉ１５７Ｌ／Ｍ２０８Ａ
変異型Ｍ２１５  Ｉ１５７Ｌ／Ｍ２０８Ｋ
変異型Ｍ２１６  Ｉ１５７Ｌ／Ｍ２０８Ｌ
変異型Ｍ２１７  Ｉ１５７Ｌ／Ｍ２０８Ｔ
変異型Ｍ２１８  Ｉ１５７Ｌ／Ｍ２０８Ｖ
変異型Ｍ２１９  Ｉ１５７Ｌ／Ｓ２０９Ｆ
変異型Ｍ２２０  Ｉ１５７Ｌ／Ｓ２０９Ｎ
変異型Ｍ２２１  Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ａ
変異型Ｍ２２２  Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ２２３  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２１１Ｉ
変異型Ｍ２２４  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２１１Ｌ
変異型Ｍ２２５  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２１１Ｖ
変異型Ｍ２２６  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ２２７  Ｉ１５７Ｌ／Ｇ２１２Ａ
変異型Ｍ２２８  Ｉ１５７Ｌ／Ｇ２１２Ｄ
変異型Ｍ２２９  Ｉ１５７Ｌ／Ｇ２１２Ｓ
変異型Ｍ２３０  Ｉ１５７Ｌ／Ｒ２１５Ｋ
変異型Ｍ２３１  Ｉ１５７Ｌ／Ｒ２１５Ｌ
変異型Ｍ２３２  Ｉ１５７Ｌ／Ｒ２１５Ｔ
変異型Ｍ２３３  Ｉ１５７Ｌ／Ｒ２１５Ｙ
変異型Ｍ２３４  Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２２０Ｌ
変異型Ｍ２３５  Ｉ１５７Ｌ／Ｇ２２６Ａ
変異型Ｍ２３６  Ｉ１５７Ｌ／Ｇ２２６Ｆ
変異型Ｍ２３７  Ｉ１５７Ｌ／Ｉ２２８Ｋ
変異型Ｍ２３８  Ｉ１５７Ｌ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ２３９  Ｉ１５７Ｌ／Ｒ２７６Ａ
変異型Ｍ２４０  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ａ
変異型Ｍ２４１  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ２４２  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｈ
変異型Ｍ２４３  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｉ
変異型Ｍ２４４  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｌ
変異型Ｍ２４５  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｐ
変異型Ｍ２４６  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｖ
変異型Ｍ２４７  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｗ
変異型Ｍ２４８  Ｉ１５７Ｌ／Ｌ３４０Ｆ
変異型Ｍ２４９  Ｉ１５７Ｌ／Ｌ３４０Ｉ
変異型Ｍ２５０  Ｉ１５７Ｌ／Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｍ２５１  Ｉ１５７Ｌ／Ｖ４３９Ａ
変異型Ｍ２５２  Ｉ１５７Ｌ／Ｖ４３９Ｐ
変異型Ｍ２５３  Ｉ１５７Ｌ／Ｒ４４５Ａ
変異型Ｍ２５４  Ｉ１５７Ｌ／Ｒ４４５Ｆ
変異型Ｍ２５５  Ｉ１５７Ｌ／Ｒ４４５Ｇ
変異型Ｍ２５６  Ｉ１５７Ｌ／Ｒ４４５Ｋ
変異型Ｍ２５７  Ｉ１５７Ｌ／Ｒ４４５Ｖ
変異型Ｍ２５８  Ｙ１５９Ｎ／Ｇ１６１Ａ
変異型Ｍ２５９  Ｙ１５９Ｎ／Ａ１８４Ｇ
変異型Ｍ２６０  Ｙ１５９Ｎ／Ａ２０４Ｓ
変異型Ｍ２６１  Ｙ１５９Ｎ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ２６２  Ｙ１５９Ｎ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ２６３  Ｙ１５９Ｎ／Ｆ２１１Ｙ
変異型Ｍ２６４  Ｙ１５９Ｎ／Ｇ２２６Ａ
変異型Ｍ２６５  Ｙ１５９Ｎ／Ｉ２２８Ｋ
変異型Ｍ２６６  Ｙ１５９Ｎ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ２６７  Ｙ１５９Ｎ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ２６８  Ｙ１５９Ｓ／Ｇ１６１Ａ
変異型Ｍ２６９  Ｙ１５９Ｓ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ２７０  Ｇ１６１Ａ／Ｆ１６２Ｌ
変異型Ｍ２７１  Ｇ１６１Ａ／Ａ１８４Ｇ
変異型Ｍ２７２  Ｇ１６１Ａ／Ｗ１８７Ｆ
変異型Ｍ２７３  Ｇ１６１Ａ／Ｆ２００Ａ
変異型Ｍ２７４  Ｇ１６１Ａ／Ａ２０４Ｓ
変異型Ｍ２７５  Ｇ１６１Ａ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ２７６  Ｇ１６１Ａ／Ｆ２１１Ｌ
変異型Ｍ２７７  Ｇ１６１Ａ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ２７８  Ｇ１６１Ａ／Ｇ２２６Ａ
変異型Ｍ２７９  Ｇ１６１Ａ／Ｉ２２８Ｋ
変異型Ｍ２８０  Ｇ１６１Ａ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ２８１  Ｇ１６１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ２８２  Ｆ１６２Ｌ／Ａ１８４Ｇ
変異型Ｍ２８３  Ｆ１６２Ｌ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ２８４  Ｆ１６２Ｌ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ２８５  Ｐ１８３Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ２８６  Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ
変異型Ｍ２８７  Ａ１８４Ｇ／Ｆ２００Ａ
変異型Ｍ２８８  Ａ１８４Ｇ／Ａ２０４Ｓ
変異型Ｍ２８９  Ａ１８４Ｇ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ２９０  Ａ１８４Ｇ／Ｆ２１１Ｌ
変異型Ｍ２９１  Ａ１８４Ｇ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ２９２  Ａ１８４Ｇ／Ｉ２２８Ｋ
変異型Ｍ２９３  Ａ１８４Ｇ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ２９４  Ａ１８４Ｇ／Ｒ２７６Ａ
変異型Ｍ２９５  Ｖ１８４Ｇ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ２９６  Ｔ１８５Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ２９７  Ｔ１８５Ｎ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ２９８  Ｗ１８７Ｆ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ２９９  Ｗ１８７Ｆ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３００  Ｆ１９３Ｗ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ３０１  Ｆ２００Ａ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ３０２  Ｆ２００Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３０３  Ｌ２０１Ｑ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３０４  Ｌ２０１Ｓ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３０５  Ａ２０４Ｓ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ３０６  Ａ２０４Ｓ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３０７  Ｔ２１０Ｌ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ３０８  Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３０９  Ｆ２１１Ｌ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ３１０  Ｆ２１１Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３１１  Ｆ２１１Ｗ／Ｉ２２８Ｋ
変異型Ｍ３１２  Ｆ２１１Ｗ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ３１３  Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３１４  Ｒ２１５Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３１５  Ｒ２１５Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３１６  Ｔ２２０Ｌ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ３１７  Ｔ２２０Ｌ／Ｄ３００Ｎ
変異型Ｍ３１８  Ｐ２２１Ｌ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ３１９  Ｐ２２１Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３２０  Ｆ２２４Ａ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ３２１  Ｇ２２６Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３２２  Ｇ２２６Ｆ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ３２３  Ｇ２２６Ｆ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３２４  Ｉ２２８Ｋ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３２５  Ａ２３３Ｄ／Ｋ２３５Ｄ
変異型Ｍ３２６  Ａ２３３Ｄ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３２７  Ｒ２７６Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３２８  Ｙ３２８Ｆ／Ｙ３３９Ｆ
変異型Ｍ３２９  Ａ２７Ｔ／Ｙ８１Ａ／Ｓ８４Ｄ
変異型Ｍ３３０  Ｐ７０Ｔ／Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３３１  Ｐ７０Ｔ／Ｇ７７Ｓ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３３２  Ｐ７０Ｔ／Ｅ８０Ｄ／Ｆ８８Ｅ
変異型Ｍ３３３  Ｐ７０Ｔ／Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３３４  Ｐ７０Ｔ／Ｓ８４Ｄ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３３５  Ｐ７０Ｔ／Ｆ８８Ｅ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３３６  Ｐ７０Ｔ／Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３３７  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｓ
変異型Ｍ３３８  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ３３９  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ３４０  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３４１  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｖ４３９Ｐ
変異型Ｍ３４２  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｉ４４０Ｆ
変異型Ｍ３４３  Ｐ７０Ｔ／Ｇ１６１Ａ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ３４４  Ｐ７０Ｔ／Ｇ１６１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３４５  Ｐ７０Ｔ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ
変異型Ｍ３４６  Ｐ７０Ｔ／Ａ２０４Ｓ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３４７  Ｐ７０Ｔ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３４８  Ｐ７０Ｖ／Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３４９  Ａ７２Ｅ／Ｓ７４Ｔ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３５０  Ａ７２Ｅ／Ｇ７７Ｓ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３５１  Ａ７２Ｅ／Ｅ８０Ｄ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３５２  Ａ７２Ｅ／Ｙ８１Ｈ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３５３  Ａ７２Ｅ／Ｋ８３Ｐ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３５４  Ａ７２Ｅ／Ｓ８４Ｄ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３５５  Ａ７２Ｅ／Ｌ８５Ｐ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３５６  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３５７  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３５８  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｙ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３５９  Ａ７２Ｅ／Ｄ１１５Ｑ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３６０  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｇ１６１Ａ
変異型Ｍ３６１  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ１６２Ｌ
変異型Ｍ３６２  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ
変異型Ｍ３６３  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２００Ａ
変異型Ｍ３６４  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｓ
変異型Ｍ３６５  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｔ
変異型Ｍ３６６  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ３６７  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ３６８  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｇ２２６Ａ
変異型Ｍ３６９  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ３７０  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３７１  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｍ３７２  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｖ４３９Ｐ
変異型Ｍ３７３  Ａ７２Ｅ／Ｇ１６１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３７４  Ａ７２Ｅ／Ｆ１６２Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３７５  Ａ７２Ｅ／Ａ１８４Ｇ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３７６  Ａ７２Ｅ／Ｗ１８７Ｆ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３７７  Ａ７２Ｅ／Ｆ２００Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３７８  Ａ７２Ｅ／Ａ２０４Ｓ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３７９  Ａ７２Ｅ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３８０  Ａ７２Ｅ／Ｉ２２８Ｋ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３８１  Ａ７２Ｅ／Ａ２３３Ｄ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３８２  Ａ７２Ｅ／Ｙ３２８Ｆ／Ｙ１５９Ｎ
変異型Ｍ３８３  Ａ７２Ｅ／Ｙ３２８Ｆ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ３８４  Ａ７２Ｅ／Ｙ３２８Ｆ／Ｆ２１１Ｙ
変異型Ｍ３８５  Ａ７２Ｅ／Ｙ３２８Ｆ／Ｇ２２６Ａ
変異型Ｍ３８６  Ａ７２Ｖ／Ｙ８１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３８７  Ａ７２Ｖ／Ｇ１６１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３８８  Ｇ７７Ｍ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ３８９  Ｇ７７Ｐ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ１６２Ｌ
変異型Ｍ３９０  Ｇ７７Ｐ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ
変異型Ｍ３９１  Ｇ７７Ｐ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３９２  Ｇ７７Ｓ／Ｙ８１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ３９３  Ｇ７７Ｓ／Ｓ８４Ｄ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３９４  Ｇ７７Ｓ／Ｆ８８Ｅ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３９５  Ｇ７７Ｓ／Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３９６  Ｇ７７Ｓ／Ｆ１１３Ｙ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３９７  Ｇ７７Ｓ／Ｄ１１５Ｑ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ３９８  Ｇ７７Ｓ／Ｉ１５７Ｌ／Ｇ１６１Ａ
変異型Ｍ３９９  Ｇ７７Ｓ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２００Ａ
変異型Ｍ４００  Ｇ７７Ｓ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｓ
変異型Ｍ４０１  Ｇ７７Ｓ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４０２  Ｇ７７Ｓ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ４０３  Ｇ７７Ｓ／Ｉ１５７Ｌ／Ｇ２２６Ａ
変異型Ｍ４０４  Ｇ７７Ｓ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ４０５  Ｇ７７Ｓ／Ｉ１５７Ｌ／Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｍ４０６  Ｇ７７Ｓ／Ｉ１５７Ｌ／Ｖ４３９Ｐ
変異型Ｍ４０７  Ｇ７７Ｓ／Ｇ１６１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４０８  Ｅ８０Ｄ／Ｙ８１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４０９  Ｙ８１Ａ／Ｓ８４Ｄ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４１０  Ｙ８１Ａ／Ｆ１１３Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４１１  Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４１２  Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４１３  Ｙ８１Ａ／Ｇ１６１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４１４  Ｙ８１Ａ／Ｆ１６２Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４１５  Ｙ８１Ａ／Ａ１８４Ｇ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４１６  Ｙ８１Ａ／Ｗ１８７Ｆ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４１７  Ｙ８１Ａ／Ａ２０４Ｓ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４１８  Ｙ８１Ａ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４１９  Ｙ８１Ａ／Ｉ２２８Ｋ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４２０  Ｙ８１Ａ／Ａ２３３Ｄ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４２１  Ｙ８１Ａ／Ｙ３２８Ｆ／Ｙ１５９Ｎ
変異型Ｍ４２２  Ｙ８１Ａ／Ｙ３２８Ｆ／Ｙ１５９Ｓ
変異型Ｍ４２３  Ｙ８１Ａ／Ｙ３２８Ｆ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ４２４  Ｙ８１Ａ／Ｙ３２８Ｆ／Ｆ２１１Ｙ
変異型Ｍ４２５  Ｙ８１Ａ／Ｙ３２８Ｆ／Ｇ２２６Ａ
変異型Ｍ４２６  Ｙ８１Ａ／Ｙ３２８Ｆ／Ｒ２７６Ａ
変異型Ｍ４２７  Ｋ８３Ｐ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ
変異型Ｍ４２８  Ｋ８３Ｐ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４２９  Ｋ８３Ｐ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４３０  Ｓ８４Ｄ／Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ４３１  Ｓ８４Ｄ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４３２  Ｆ８８Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ１６２Ｌ
変異型Ｍ４３３  Ｆ８８Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ
変異型Ｍ４３４  Ｆ８８Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２００Ａ
変異型Ｍ４３５  Ｆ８８Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４３６  Ｆ８８Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４３７  Ｆ８８Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｑ
変異型Ｍ４３８  Ｆ８８Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｍ４３９  Ｆ８８Ｅ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４４０  Ｆ８８Ｅ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４４１  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ｇ１６１Ａ
変異型Ｍ４４２  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ
変異型Ｍ４４３  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ｗ１８７Ｆ
変異型Ｍ４４４  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２００Ａ
変異型Ｍ４４５  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｓ
変異型Ｍ４４６  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｔ
変異型Ｍ４４７  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４４８  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ４４９  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ｇ２２６Ａ
変異型Ｍ４５０  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ４５１  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４５２  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｍ４５３  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ｖ４３９Ｐ
変異型Ｍ４５４  Ｆ１１３Ｗ／Ｇ１６１Ａ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４５５  Ｆ１１３Ｗ／Ｇ１６１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４５６  Ｆ１１３Ｗ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ
変異型Ｍ４５７  Ｆ１１３Ｙ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４５８  Ｆ１１３Ｙ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４５９  Ｆ１１３Ｙ／Ｇ１６１Ａ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４６０  Ｄ１１５Ｑ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４６１  Ｄ１１５Ｑ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４６２  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ１５９Ｎ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４６３  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ１５９Ｎ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４６４  Ｉ１５７Ｌ／Ｇ１６１Ａ／Ｗ１８７Ｆ
変異型Ｍ４６５  Ｉ１５７Ｌ／Ｇ１６１Ａ／Ｆ２００Ａ
変異型Ｍ４６６  Ｉ１５７Ｌ／Ｇ１６１Ａ／Ａ２０４Ｓ
変異型Ｍ４６７  Ｉ１５７Ｌ／Ｇ１６１Ａ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４６８  Ｉ１５７Ｌ／Ｇ１６１Ａ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ４６９  Ｉ１５７Ｌ／Ｇ１６１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４７０  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ１６２Ｌ／Ａ１８４Ｇ
変異型Ｍ４７１  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ１６２Ｌ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４７２  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ１６２Ｌ／Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｍ４７３  Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ
変異型Ｍ４７４  Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ｆ２００Ａ
変異型Ｍ４７５  Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ａ２０４Ｔ
変異型Ｍ４７６  Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４７７  Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ４７８  Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｍ４７９  Ｉ１５７Ｌ／Ｗ１８７Ｆ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４８０  Ｉ１５７Ｌ／Ｗ１８７Ｆ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４８１  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２００Ａ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４８２  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２００Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４８３  Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｓ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４８４  Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｓ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４８５  Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｔ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ４８６  Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｔ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４８７  Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ４８８  Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｇ２１２Ａ
変異型Ｍ４８９  Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｇ２２６Ａ
変異型Ｍ４９０  Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ４９１  Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４９２  Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｍ４９３  Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｖ４３９Ｐ
変異型Ｍ４９４  Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４９５  Ｉ１５７Ｌ／Ｇ２２６Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４９６  Ｉ１５７Ｌ／Ａ２３３Ｄ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ４９７  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ／Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｍ４９８  Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ／Ｖ４３９Ｐ
変異型Ｍ４９９  Ｙ１５９Ｎ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５００  Ｇ１６１Ａ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ
変異型Ｍ５０１  Ｇ１６１Ａ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５０２  Ｇ１６１Ａ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５０３  Ａ１８２Ｇ／Ｐ１８３Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５０４  Ａ１８２Ｓ／Ｐ１８３Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５０５  Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ｆ２００Ａ
変異型Ｍ５０６  Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ａ２０４Ｓ
変異型Ｍ５０７  Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ５０８  Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ｉ２２８Ｋ
変異型Ｍ５０９  Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ５１０  Ｆ２００Ａ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５１１  Ａ２０４Ｓ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５１２  Ａ２０４Ｔ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５１３  Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ／Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｍ５１４  Ｐ７０Ｔ／Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５１５  Ｐ７０Ｔ／Ａ７２Ｅ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５１６  Ｐ７０Ｔ／Ｇ７７Ｍ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５１７  Ｐ７０Ｔ／Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ５１８  Ｐ７０Ｔ／Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５１９  Ｐ７０Ｔ／Ｓ８４Ｄ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５２０  Ｐ７０Ｔ／Ｆ８８Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５２１  Ｐ７０Ｔ／Ｆ８８Ｅ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５２２  Ｐ７０Ｔ／Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ５２３  Ｐ７０Ｔ／Ｆ１１３Ｗ／Ｇ１６１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５２４  Ｐ７０Ｔ／Ｆ１１３Ｙ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５２５  Ｐ７０Ｔ／Ｄ１１５Ｑ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ５２６  Ｐ７０Ｔ／Ｄ１１５Ｑ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５２７  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｇ１６１Ａ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ５２８  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ
変異型Ｍ５２９  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ５３０  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｗ１８７Ｆ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ５３１  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｗ１８７Ｆ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５３２  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｔ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ５３３  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｔ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５３４  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｔ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ５３５  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｆ２１１Ｗ
変異型Ｍ５３６  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｇ２２６Ａ
変異型Ｍ５３７  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ５３８  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５３９  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｍ５４０  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｖ４３９Ｐ
変異型Ｍ５４１  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ／Ｖ４３９Ｐ
変異型Ｍ５４２  Ｐ７０Ｔ／Ｇ１６１Ａ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５４３  Ｐ７０Ｔ／Ｇ１６１Ａ／Ａ２３３Ｄ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５４４  Ａ７２Ｅ／Ｓ７４Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５４５  Ａ７２Ｅ／Ｇ７７Ｓ／Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ５４６  Ａ７２Ｅ／Ｙ８１Ｈ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５４７  Ａ７２Ｅ／Ｋ８３Ｐ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５４８  Ａ７２Ｅ／Ｆ８８Ｅ／Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ
変異型Ｍ５４９  Ａ７２Ｅ／Ｆ８８Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５５０  Ａ７２Ｅ／Ｆ８８Ｅ／Ｇ１６１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５５１  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５５２  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｗ／Ｇ１６１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５５３  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｙ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５５４  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｙ／Ｇ１６１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５５５  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｙ／Ｇ２２６Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５５６  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｇ１６１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５５７  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ１６２Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５５８  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５５９  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２００Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５６０  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｔ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５６１  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５６２  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２１１Ｙ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５６３  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２３３Ｄ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５６４  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ／Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｍ５６５  Ａ７２Ｅ／Ｇ１６１Ａ／Ａ２０４Ｔ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５６６  Ａ７２Ｅ／Ｇ１６１Ａ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５６７  Ａ７２Ｅ／Ｇ１６１Ａ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５６８  Ａ７２Ｅ／Ｇ１６１Ａ／Ｆ２１１Ｙ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５６９  Ａ７２Ｅ／Ｇ１６１Ａ／Ａ２３３Ｄ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５７０  Ａ７２Ｅ／Ｇ１６１Ａ／Ｙ３２８Ｆ／Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｍ５７１  Ａ７２Ｅ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５７２  Ａ７２Ｅ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ／Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｍ５７３  Ａ７２Ｖ／Ｉ１５７Ｌ／Ｗ１８７Ｆ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５７４  Ｇ７７Ｐ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５７５  Ｙ８１Ａ／Ｓ８４Ｄ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５７６  Ｙ８１Ａ／Ｆ８８Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５７７  Ｙ８１Ａ／Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５７８  Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ｇ１６１Ａ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５７９  Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ｗ１８７Ｆ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５８０  Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｓ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５８１  Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５８２  Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２３３Ｄ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５８３  Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ／Ｖ４３９Ｐ
変異型Ｍ５８４  Ｙ８１Ａ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５８５  Ｆ８８Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５８６  Ｆ８８Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２３３Ｄ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５８７  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｔ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ５８８  Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５８９  Ｉ１５７Ｌ／Ｇ１６１Ａ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ
変異型Ｍ５９０  Ｉ１５７Ｌ／Ｇ１６１Ａ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５９１  Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ５９２  Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｓ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５９３  Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｔ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５９４  Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ａ２３３Ｄ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５９５  Ｇ１６１Ａ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５９６  Ｐ７０Ｔ／Ａ７２Ｅ／Ｓ８４Ｄ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５９７  Ｐ７０Ｔ／Ａ７２Ｅ／Ａ２０４Ｓ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５９８  Ｐ７０Ｔ／Ａ７２Ｅ／Ｔ２１０Ｌ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ５９９  Ｐ７０Ｔ／Ａ７２Ｅ／Ｇ２２６Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６００  Ｐ７０Ｔ／Ａ７２Ｅ／Ａ２３３Ｄ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６０１  Ｐ７０Ｔ／Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６０２  Ｐ７０Ｔ／Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２３３Ｄ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６０３  Ｐ７０Ｔ／Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６０４  Ｐ７０Ｔ／Ｙ８１Ａ／Ａ２３３Ｄ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６０５  Ｐ７０Ｔ／Ｓ８４Ｄ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６０６  Ｐ７０Ｔ／Ｆ１１３Ｗ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６０７  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ａ２３３Ｄ
変異型Ｍ６０８  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｗ１８７Ｆ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６０９  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｓ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６１０  Ｐ７０Ｔ／Ｇ１６１Ａ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６１１  Ｐ７０Ｖ／Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｙ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６１２  Ｐ７０Ｖ／Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６１３  Ａ７２Ｅ／Ｓ７４Ｔ／Ｆ１１３Ｙ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６１４  Ａ７２Ｅ／Ｓ７４Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６１５  Ａ７２Ｅ／Ｙ８１Ｈ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６１６  Ａ７２Ｅ／Ｋ８３Ｐ／Ｆ１１３Ｙ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６１７  Ａ７２Ｅ／Ｗ１７Ｆ／Ｆ１１３Ｙ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６１８  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｙ／Ｄ１１５Ｑ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６１９  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｙ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ／Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｍ６２０  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｙ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ／Ｖ４３９Ｐ
変異型Ｍ６２１  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｙ／Ｇ１６１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６２２  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｙ／Ａ２０４Ｓ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６２３  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｙ／Ａ２０４Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６２４  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｙ／Ｔ２１０Ｌ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６２５  Ａ７２Ｅ／Ｆ１１３Ｙ／Ａ２３３Ｄ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６２６  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｇ１６１Ａ／Ｆ１６２Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６２７  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｗ１８７Ｆ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６２８  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｓ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６２９  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２０４Ｔ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６３０  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ／Ｌ３４０Ｖ
変異型Ｍ６３１  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ／Ｖ４３９Ｐ
変異型Ｍ６３２  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ｇ２２６Ａ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６３３  Ａ７２Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２３３Ｄ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６３４  Ｙ８１Ａ／Ｓ８４Ｄ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６３５  Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６３６  Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ６３７  Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２３３Ｄ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６３８  Ｆ８８Ｅ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ｔ２１０Ｌ
変異型Ｍ６３９  Ｆ１１３Ｙ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ１５９Ｎ／Ｆ２１１Ｗ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６４０  Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６４１  Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
変異型Ｍ６４２  Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ１８４Ｇ／Ｗ１８７Ｆ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ
〔５６〕  上記〔５５〕に記載の変異型タンパク質において、前記変異型Ｍ１からＭ６４２のいずれか１種または２種以上の変異を含むアミノ酸配列中、変異部位以外の部位に置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を更に含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有する、変異型タンパク質。
〔５７〕  少なくとも変異型Ｍ２４１を含むことを特徴とする、上記〔５５〕から〔５６〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔５８〕  少なくとも変異型Ｍ３４０を含むことを特徴とする、上記〔５５〕から〔５７〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔５９〕  少なくとも変異型Ｍ４１２を含むことを特徴とする、上記〔５５〕から〔５８〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔６０〕  少なくとも変異型Ｍ４９１を含むことを特徴とする、上記〔５５〕から〔５９〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔６１〕  少なくとも変異型Ｍ４９６を含むことを特徴とする、上記〔５５〕から〔６０〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔６２〕  少なくとも変異型Ｍ５８１を含むことを特徴とする、上記〔５５〕から〔６１〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔６３〕  少なくとも変異型Ｍ５８２を含むことを特徴とする、上記〔５５〕から〔６２〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔６４〕  少なくとも変異型Ｍ５９４を含むことを特徴とする、上記〔５５〕から〔６３〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔６５〕  上記〔１８〕から〔６４〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質が有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
〔６６〕  上記〔６５〕に記載のポリヌクレオチドを含む組換えポリヌクレオチド。
〔６７〕  上記〔６６〕に記載の組換えポリヌクレオチドを含む形質転換微生物。
〔６８〕  上記〔６７〕に記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および／または微生物中に前記変異型タンパク質を蓄積させることを特徴とする、変異型タンパク質の製造方法。
〔６９〕  上記〔１８〕から〔６４〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質の存在下で、ペプチド生成反応を行うことを特徴とする、ペプチドの製造方法。
〔７０〕  上記〔６７〕に記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および／または形質転換微生物中に前記変異型タンパク質を蓄積させてペプチド生成反応を行うことを特徴とする、ペプチドの製造方法。
〔７１〕  上記〔１８〕から〔６４〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質の存在下で、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルとＬ−フェニルアラニンとの反応を行うことを特徴とする、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法。
〔７２〕  上記〔６７〕に記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および／または形質転換微生物中に前記変異型タンパク質を蓄積させて、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルとＬ−フェニルアラニンとの反応を行うことを特徴とする、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ペプチド生成活性に優れたタンパク質および効率のよいペプチドの製造方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の実施の形態についてその最良の形態と共に説明する。
なお、以下に挙げる種々の遺伝子工学的な技法については、Molecular  Cloning,  2nd  edition,  Cold  Spring  Harbor  press  (1989)、細胞工学ハンドブック、黒木登志夫ら編、羊土社（1992）、新遺伝子工学ハンドブック改訂第３版、村松ら編、羊土社（1999）など、多くの標準的な実験マニュアルがあり、これらの文献を参考にすることにより当業者であれば実施可能である。【００１１】
本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、核酸、塩基配列などの略号による表示は、IUPAC（International  Union  of  Pure  and  Applied  Chemistry）またはIUBMB（International  Union  of  Biochemistry  and  Molecular  Biology）による規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）および当該分野における慣用記号に従うものとする。また、本明細書において、配列番号を示すものは、特に断りのない限り、配列表中の配列番号を示すものとする。尚、グリシン以外のアミノ酸に関し、Ｄ−アミノ酸またはＬアミノ酸であることを明記しない場合、Ｌ−アミノ酸を示すものとする。【００１２】
１．本発明のペプチド生成活性を有するタンパク質（配列番号２に記載のアミノ酸配列に基づく変異型タンパク質）
本発明のタンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対し下記変異型１から６８のいずれか１種または２種以上の変異が導入されたアミノ酸配列を有する変異型タンパク質であり、ペプチド生成活性を有する（以下、「（Ｉ）の変異型タンパク質」ともいう）。変異型１から６８の各変異型は表１−１及び表１−２に示すとおりである。【００１３】
【表１−１】
2006075486.tif 000002
【００１４】
【表１−２】
2006075486.tif 000003
【００１５】
本明細書において各変異型は、表１−１及び表１−２に示すようにアミノ酸残基の略号および配列番号１または２に示すアミノ酸配列中の部位より特定する。例えば、変異型１の「Ｆ２０７Ｖ」とは、配列番号２の配列の第２０７番目のアミノ酸残基フェニルアラニンをバリンに置換したことを示す。すなわち、変異型の表記は、野生型（配列番号２で特定されるアミノ酸）のアミノ酸残基の種類；配列番号２に記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の位置；変異導入後のアミノ酸残基の種類を示す。他の変異型の表記も同様である。【００１６】
変異型１から６８の変異は１種のみを導入しても、２種以上を組み合わせて導入してもよい。また、変異型１から６８の変異は、そのうちの１種または２種以上を、表１−１及び表１−２以外の変異型、例えば、Ｖ１８４Ｎ、Ｑ２２９Ｐ、Ｑ２２９Ｌ、Ｑ２２９Ｇ、Ｑ２２９Ｉ、Ｉ２２８Ｇ、Ｉ２２８Ｌ，Ｉ２２８Ｄ，Ｉ２２８Ｓ、Ｉ２３０Ｄ、Ｉ２３０Ｖ、Ｉ２３０Ｓ、Ｓ２５６Ｃ、Ａ３０１Ｇ、Ｌ６６Ｆ、Ｅ８０Ｋ、Ｙ８１Ａ、Ｉ１５７Ｌ、Ｖ１７８Ｇ、Ａ１８２Ｇ、Ａ１８２Ｓ、Ｐ１８３Ａ、Ｖ１８４Ｐ、Ｔ１８５Ｆ、Ｔ１８５Ａ、Ｔ１８５Ｋ、Ｔ１８５Ｔ１８５Ｄ、Ｔ１８５Ｃ、Ｔ１８５Ｓ、Ｔ１８５Ｐ、Ｔ１８５Ｎ、Ｔ２１０Ｌ、Ｖ２１３Ａ、Ｐ２１４Ｔ、Ｐ２１４Ｈ、Ａ２４５Ｓ、Ｌ２６３Ｍ、Ｋ３１４Ｒ、Ｓ３１５Ｒ、Ｙ３２８Ｆ、Ｋ４８４Ｉ、及びＡ５１５Ｖの変異から選ばれる１種または２種以上と組み合わせて導入してもよい。具体的には下記表１−３及び表１−４に示すような組み合わせが好適である。また少なくとも変異型２：Ｑ４４１Ｅを含む変異型タンパク質、少なくとも変異型１４：Ｔ７２Ａを含む変異型タンパク質がペプチド生成活性を向上させる上で好適である。更に、Ｍ７−３５、及びＭ３５−４＋Ｖ１８４Ａ（Ａ１）の組み合わせを含む変異型タンパク質も、ペプチド生性活性を向上させる上で好適である。【００１７】
【表１−３】
2006075486.tif 000004
【００１８】
【表１−４】
2006075486.tif 000005
【００１９】
本発明の変異型タンパク質は、優れたペプチド生成活性を有する。すなわち、配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型のタンパク質と比べ、ペプチド生成反応を触媒する能力について優れた性能を有する。より具体的には、本発明の変異型タンパク質はそれぞれ、特定のカルボキシ成分及びアミン成分からペプチドを生成する際の反応速度または収率、あるいは基質特異性、ｐＨ特性、温度安定性など、ペプチド生成反応を行うために求められる何らかの特性について、野生型タンパク質よりも性能が向上している（具体的には下記実施例参照）。そのため本発明の変異型タンパク質は、ペプチドの工業的生産において好適に用い得る。好ましい変異型タンパク質の一形態として、例えば、野生型タンパク質によるペプチド生成濃度を「１」とした場合の変異型タンパク質によるペプチド生成濃度が、好ましくは１．３倍以上、より好ましくは１．５倍以上、さらに好ましくは２倍以上生成させる能力を有するものが例示される。【００２０】
なお、本明細書において、ペプチド生成活性とは、２つ以上の物質から、ペプチド結合を形成させてペプチド結合を有する新たな化合物を生成する活性であり、より具体的には、例えば２つのアミノ酸またはそのエステルなどから、少なくとも１つペプチド結合を増やしたペプチド化合物を生成する活性をいう。【００２１】
変異型１から６８、変異型２３９から２９０および３２４から３７７に示す変異の導入は、例えば部位特異的変異法によって、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子の特定の部位のアミノ酸が置換されるように塩基配列を改変することによって得られる。配列番号２のアミノ酸配列における変異部位に対応する塩基配列は、配列番号１を参照することにより容易に確認できる。また、上記のような改変された塩基配列によりコードされるポリペプチドは、従来知られている突然変異処理によっても取得され得る。突然変異処理としては、例えば（Ａ）のタンパク質をコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲにより変異を導入する方法、及び変異修復系の欠損した宿主中で該ＤＮＡを増幅し、変異の導入されたＤＮＡを回収する方法などが挙げられる。【００２２】
また、本発明により、上記変異型１から６８、並びに変異型２３９から２９０および３２４から３７７に示す１種または２種以上の変異を含む変異型タンパク質と実質的に同じタンパク質も提供される。すなわち、本発明は、変異型１から６８、並びに変異型２３９から２９０および３２４から３７７の変異型を１種または２種以上含む変異型タンパク質において、前記変異部位以外の部位に置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を更に含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質（以下、「（II）の変異型タンパク質」ともいう）も提供するものである。すなわち、本発明の変異型タンパク質は、配列番号２に示すアミノ酸の変異型１から６８、並びに変異型２３９から２９０および３２４から３７７の変異部位以外の部位における変異を許容する。したがって、変異型１から６８、並びに変異型２３９から２９０および３２４から３７７の変異部位以外の部位に欠失、挿入などの変異が導入された場合、変異型１から６８、並びに変異型２３９から２９０および３２４から３７７によって特定される部位からのＮ末端またはＣ末端までのアミノ酸残基数は、変異導入前の状態とは異なることがあり得る。【００２３】
ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜１０個である。ただし、異型１から６８、並びに変異型２３９から２９０および３２４から３７７以外の変異部位を含む変異型タンパク質の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で、変異型１から６８、並びに変異型２３９から２９０および３２４から３７７の１種または２種以上の変異を含むタンパク質（すなわち（Ｉ）の変異型タンパク質）の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上のペプチド生成活性を保持していることが望ましい。【００２４】
変異型１から６８、並びに変異型２３９から２９０および３２４から３７７以外の変異も、例えば部位特異的変異法によって、本タンパク質をコードする遺伝子の特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加、逆位などされるように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変された塩基配列によりコードされるポリペプチドは、従来知られている突然変異処理によっても取得され得る。突然変異処理としては、（Ｉ）の変異型タンパク質をコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及び（Ｉ）の変異型タンパク質をコードするＤＮＡを保持するエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。【００２５】
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、および逆位等の変異には、微生物の種あるいは菌株による差等、天然に生じる変異も含まれる。上記のような変異を有するＤＮＡを適当な細胞で発現させ、発現産物の本酵素活性を調べることにより、配列番号２に記載のタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。【００２６】
２．配列番号２０８に記載のアミノ酸配列に基づく変異型タンパク質の設計・作製
本発明者は、上記した変異型タンパク質に更に変異を加えることにより、ペプチド生成活性に優れる変異型ペプチドを設計、作製することができることを見出した。特に、Ｍ３５−４／Ｖ１８４Ａ変異型（Ａ１）（変異型２８６；表１−３参照）に更に変異を加えることにより、顕著なペプチド生成活性を発揮する変異型ペプチドを得られることを見出した。本発明は、このようなＭ３５−４／Ｖ１８４Ａ変異型（Ａ１）に基づく変異型タンパク質の設計・作製方法についても提供するものである。【００２７】
Ｍ３５−４／Ｖ１８４Ａに対応するアミノ酸配列は、配列表の配列番号２０８に示すとおりである。すなわち、配列番号２０８記載のアミノ酸配列は、配列番号２記載のアミノ酸配列において、Ｍ３５−４／Ｖ１８４Ａ変異型（表１−３参照）に対応する１１箇所のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたものである。【００２８】
変異型タンパク質の設計・作製は、Ｘ線結晶構造解析によるタンパク質の立体構造決定と、決定された構造情報に基づいて行なうことができる。すなわちタンパク質をＸ線結晶構造解析して得られた立体構造を基にして、基質結合部位を推定し、当該タンパク質の基質結合部位の少なくとも一部分に変化を生じさせることにより、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質を設計・作製を行なう。【００２９】
Ｘ線結晶構造解析によるタンパク質の立体構造決定は、例えば、以下の手順に沿って行うことができる。【００３０】
（１）蛋白質を結晶化する。結晶化は、立体構造決定のためには欠かせないが、それ以外にも、蛋白質の高純度の精製法、高密度でプロテアーゼ抵抗性の強い安定な保存法として産業上の有用性もある。【００３１】
（２）作製した結晶にＸ線を照射して回折データを収集する。なお、蛋白質結晶はＸ線照射によりダメージを受け回折能が劣化するケースが多々ある。その場合、結晶を急激に−１７３℃程度に冷却し、その状態で回折データを収集する低温測定技術が最近普及してきた。なお、最終的に、構造決定に利用する高分解能データを収集するために、輝度の高いシンクロトロン放射光が利用される。【００３２】
（３）続いて、結晶構造解析を行なう。結晶構造解析を行うには、回折データに加えて、位相情報が必要になる。例えば、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、類縁の蛋白質の結晶構造としてαアミノ酸エステル加水分解酵素のＳ２０５Ａ変異体（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋのエントリー番号：１ＮＸ９）が公知であるため、分子置換法で構造決定することが可能である。このようにして決定された位相を用いて計算した電子密度図に蛋白質のモデルをフィットさせる。このプロセスは、コンピューターグラフィックス上で、ＭＳＩ社（アメリカ）のＱＵＡＮＴＡ等のプログラムを用いて行われる。この後、ＭＳＩ社のＣＮＸ等のプログラムを用いて、構造精密化を行い、構造解析は完了する。
上述の処理の結果解析された立体構造に基づき、蛋白質の基質結合部位を推定することができる。ここで、基質結合部位とは、タンパク質表面上の基質（例えば、ペプチド生成活性を有する蛋白質の場合、アミノ酸やアミノ酸エステルなど）が相互作用する部位を意味し、一般にタンパク質の活性中心の周囲に存在する。【００３３】
本発明の設計・作成方法においては、結晶構造解析の対象として、配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を用いる。配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質とは、既に述べたように、変異型タンパク質Ｍ３５−４／Ｖ１８４Ａを意味する。すなわち、配列番号２０８記載のアミノ酸配列は、前述の配列番号２に記載のアミノ酸配列中、表１−３に記載されるＭ３５−４／Ｖ１８４Ａに対応する１１箇所のアミノ酸残基が所定のアミノ酸残基に置換されたほかは同様のものである。【００３４】
一方、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列と配列番号２０８に記載のアミノ酸配列の相同性は非常に高く、４個のアミノ酸残基が置換されているにすぎない。従って、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を結晶構造解析し、得られる立体構造を参考にして、配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の基質結合部位を推定することができる。配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の基質結合部位は、上述の配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の構造解析の結果から、活性残基であるセリン（配列番号２０８に記載のアミノ酸配列の１５８番目、以下「Ｓｅｒ１５８」と略記することがある。図５中の「活性部位」参照）から１５Å以内の領域と推定された。【００３５】
本発明の設計・作成方法においては、上述のようにして推定された基質結合部位の少なくとも一部分に変化を生じさせることにより、ペプチド生成活性の向上した変異体をを得ることができる。ここで、基質結合部位の少なくとも一部分に変化を生じさせるとは、変化を生じさせた後の変異型タンパク質がペプチド生成活性を有することを条件として、基質結合部位を構成するアミノ酸残基のうちの一残基以上を改変すること、特に、置換、挿入または削除すること、好ましくは他のアミノ酸残基に置換することを意味する。改変の対象となるアミノ酸の数は、アミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが、得られる変異型タンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない範囲で適宜定めることができる。【００３６】
例えば、配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質から、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質を得るためには、当該タンパク質の活性残基Ｓｅｒ１５８から１５Å以内の少なくとも一部分、すなわち、配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中６７−７０、７２−８８、１００、１０２、１０３、１０６、１０７、１１３−１１７、１３０、１５５−１６３、１６５、１６６、１８０−１８８、１９０−１９５、２００−２３５、２５９、２７３、２７６、２７８、２９２−２９４、２９６、２９８、２９９、３００−３０４、３２５−３２８、３３０−３４０、及び４３７−４４７のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基を置換、挿入または削除させた構造とすることによることができる。具体的には、上述のアミノ酸残基のうちの少なくとも一残基について他のアミノ酸残基に置換することにより、所望の変異型タンパク質を得ることができる。【００３７】
特に、配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中６７、６９、７０、７２−８５、１０３、１０６、１０７、１１３−１１６、１６５、１８２、１８３、１８５、１８７、１８８、１９０、２００、２０２、２０４−２０６、２０９−２１１、２１３−２３５、３０１、３２８、３３８−３４０、４４０−４４２、及び４４６のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基が置換、挿入または削除された変異型タンパク質は、ペプチド生成活性が高く、特にＡＭＰ生成活性が向上している。具体的には、Ａ１変異型タンパク質に対するＡＭＰの収率向上確率で２０％以上である。【００３８】
また、配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中６７、６９、７０、７２−８４、１０６、１０７、１１４、１１６、１８３、１８５、１８７、１８８、２０２、２０４−２０６、２０９、２１１、２１３−２３３、２３５、３２８、３３８−４４２、及び４４６のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基が置換、挿入または削除され、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質は、ペプチド生成活性が高く、特にＡＭＰ生成活性が向上している。具体的には、Ａ１変異型タンパク質に対するＡＭＰの収率向上確率で３０％以上である。【００３９】
更に、配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中６７、７０、７２−７５、７７−７９、８１−８４、１１４、１１６、１８５、１８８、２０２、２０４、２０６、２０９、２１１、２１３−２１５、２１８−２２４、２２６−２３３、２３５、３２８、３３８−４４１、及び４４６のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基が置換、挿入または削除され、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質は、ペプチド生成活性が高く、特にＡＭＰ生成活性が向上している。具体的には、Ａ１変異型タンパク質のＡＭＰの収率向上確率で４０％以上である。【００４０】
尚、設計される変異型タンパク質は、その一次配列（すなわち、アミノ酸配列）において、Ａ１変異型タンパク質とある程度の相同性を有することが好ましい。相同性の程度は、例えば２５％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上とすることができる。【００４１】
上記した範囲のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一部分を変化させること、すなわち、アミノ酸残基の一つを置換することにより、ペプチド生成活性の向上した変異型タンパク質を見出すことができる。また、活性の向上をもたらした個々の変異を組み合わせることにより、それらの相乗効果によって、更に活性の向上した変異型タンパク質を創出することができる。一方で、変異によるペプチド生成活性の向上の程度は、アミノ酸残基の側鎖が１原子分変化しただけでも劇的な変化が生じる場合があり、その最適化には様々な可能性がある。例えば、ある一部位の変異により活性の向上した部位が発見されたならば、立体構造上でその部位に連続する数残基にランダム変異をかけることにより、更に活性の向上した変異体を得ることも可能である。すなわち、ペプチド生成活性の向上をもたらすアミノ酸残基の立体構造上の位置と連続した表面を構成する位置のうちの少なくとも一部分を変化させることにより、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質を得ることができる。【００４２】
タンパク質の表面は、構成各原子をそのｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ半径の球として表したときに、溶媒に露出している部分の包絡面であり、例えば図４に示すような空間充填図によって図示できる。ここで、配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質中、ペプチド生成活性の向上をもたらすアミノ酸残基の立体構造上の位置と連続した表面を構成する位置とは、例えば、配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中６７−７０、７２−８８、１００、１０２、１０３、１０６、１０７、１１３−１１７、１３０、１５５−１６３、１６５、１６６、１８０−１８８、１９０−１９５、２００−２３５、２５９、２７３、２７６、２７８、２９２−２９４、２９６、２９８、２９９、３００−３０４、３２５−３２８、３３０−３４０、及び４３７−４４７のうちのいずれかのアミノ酸残基が存在する位置のうちの２以上の位置のように、上記に説明したタンパク質表面上で連続したパッチを形成する部分である。具体的には例えば、配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中７９−８２のアミノ酸残基が存在する位置は、図４中の灰色で示した部分に相当する。具体的には、以下の（ａ）〜（ｉ）の中から選ばれる１または２以上の立体構造の変化を生じさせることによりペプチド生成活性を有する変異型タンパク質を得ることができる。
（ａ）配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中７９−８２のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｂ）配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中８４、８８、８９及び９２のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｃ）配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中７２、７５及び７７のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｄ）配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中１５９、１６１、１６２、１８４、１８７及び２７６のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｅ）配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中７０、１０６、１１３、１１５、１９３、２０７、２０９−２１２、２１６及び２５９のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｆ）配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中２００、２０２−２０５、２０７及び２２８のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｇ）配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中２３３、２３４、及び４３９のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｈ）配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中３２８、３３９、３４０、４４５、及び４４６のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｉ）配列番号２０８に記載のアミノ酸配列中８７、１５５、１５７、及び１６０のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除【００４３】
３．配列番号２０８記載の変異型タンパク質以外のタンパク質からの変異型タンパク質の設計、作製
上述したＸ線結晶構造解析によって得られた配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造は、配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質以外のタンパク質からの変異型タンパク質の設計、作製にも応用できる。本発明は、このような他のタンパク質に由来する配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と同様またはそれ以上のペプチド生成活性を有する変異型タンパク質をも提供するものである。【００４４】
配列番号２０８記載のアミノ酸配列を有するタンパク質以外のタンパク質からの変異型タンパク質の設計、作製は、トレッディング（Ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）法により、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の３次元構造に対するアラインメントを行ない、配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と同様のアミノ酸変異を施すことによる。尚、既に述べたように、配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、３箇所のアミノ酸残基が異なっているだけであり、その３次元構造は殆ど同一であると考えてよい。【００４５】
トレッディング法を利用した変異導入の対象となるタンパク質は、配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質以外のタンパク質であり、特に、ペプチド生成活性を有するタンパク質であることが好ましい。更に、アミノ酸配列が既知のタンパク質を用いることが好ましい。また、変異導入の対象となるタンパク質は、その立体構造を、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有する変異型タンパク質の立体構造と比較した場合に、類似の立体構造を有するものであることが好ましい。ここで、立体構造が類似するとは、タンパク質の２次元構造、３次元構造が類似していることを意味し、具体的には、アミノ酸残基間の距離、ペプチドを構成する主鎖や側鎖の角度の類似を意味する。【００４６】
配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質以外のタンパク質が、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と類似の立体構造を有するか否かの判定には、トレッディング（Ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）法を利用することができる。トレッディング法とは、あるアミノ酸配列がどのような立体構造をとるかを、データベース中の既知の立体構造との類似性で評価し、予測する方法である（Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５３巻、第１６４〜１７０頁（１９９１））。【００４７】
トレッディング法による立体構造の類似性の判断及び評価は、対象タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造に乗せて、二次構造のとり易さ等に関して、両者の適合度を定量化する目的関数を算出し、その結果を比較検討して行うことができる。ここで、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）のデータ（座標）としては、図６−１〜図６−１３４に記載のデータを用いることができる。【００４８】
トレッディング法は、ＩＮＳＩＧＨＴ  ＩＩ、ＬＩＢＲＡなどのプログラムにより実行が可能である。ＩＮＳＩＧＨＴ  ＩＩは、米国Ａｃｃｅｌｒｙｓ社より購入可能である。ＩＮＳＩＧＨＴ  ＩＩでトレッディング法を実施するには、同プログラム中のＳｅｑＦｏｌｄモジュールを利用することができる。一方、ＬＩＢＲＡは、インターネットを使って、ＤＤＢＪのホームページのアドレス（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈ／ｌｉｂｒａ＿ｉ−ｊ．ｈｔｍｌ）にアクセスして使用することができる。【００４９】
あるタンパク質が配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造と類似性を有するか否かを判定する基準としては、例えばＩＮＳＩＧＨＴ  ＩＩ−ＳｅｑＦｏｌｄを用いる場合には、トレッディング法による評価関数をすべて総合して算出した総合評価値（ＳｅｑＦｏｌｄ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｃｏｒｅ（ｂｉｔｓ））を用いることが好ましい。ＳｅｑＦｏｌｄ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｃｏｒｅ（ｂｉｔｓ）を算出することにより、タンパク質の立体構造が全体的に類似しているかどうかを判定することができる。プログラムＳｅｑＦｏｌｄを用いてトレッディング法を実施すると、ＳｅｑＦｏｌｄ（ＬＩＢ）  Ｐ−Ｖａｌｕｅ、ＳｅｑＦｏｌｄ（ＬＩＢ）  Ｐ−Ｖａｌｕｅ、ＳｅｑＦｏｌｄ（ＬＥＮ）  Ｐ−Ｖａｌｕｅ、ＳｅｑＦｏｌｄ（ＬＯＷ）  Ｐ−Ｖａｌｕｅ、ＳｅｑＦｏｌｄ（Ｈｉｇｈ）  Ｐ−Ｖａｌｕｅ、ＳｅｑＦｏｌｄ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｃｏｒｅ（ｒａｗ）、ＳｅｑＦｏｌｄ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｃｏｒｅ（ｒａｗ）等の各種の評価値が算出されるが、ＳｅｑＦｏｌｄ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｃｏｒｅ（ｂｉｔｓ）は、これらの評価値をすべて総合して算出した総合評価値であり、ＳｅｑＦｏｌｄ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｃｏｒｅ（ｂｉｔｓ）の値が大きいほど、対比している２つのタンパク質の立体構造の類似性が高いことを意味する。例えば、ＩＮＳＩＧＨＴ  ＩＩを用いてトレッディング法を実施した場合、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と類似した立体構造を有するタンパク質であると判断する際の閾値としては、ＳｅｑＦｏｌｄ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｃｏｒｅ（ｂｉｔｓ）の値にして、９０程度が妥当と考えられる。すなわち、ＳｅｑＦｏｌｄ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｃｏｒｅ（ｂｉｔｓ）が９０以上であれば、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造と他のタンパク質の立体構造が類似性を有していると判定できる。より好ましい閾値としては、ＳｅｑＦｏｌｄ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｃｏｒｅの値にして１１０以上、更に好ましくは１３０以上であり、特に好ましくは１５０以上である。【００５０】
他のタンパク質が配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と類似の立体構造を有すると判定された場合、他のタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の活性残基Ｓｅｒ１５８から１５Å以内に存在するアミノ酸残基に対応する、アミノ酸残基を特定する。目的とするアミノ酸残基の特定は、前記したトレッディング法による３次元構造の類似性の判定の過程で得られる、目的のタンパク質と配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の３次元構造に対するアラインメントによって、行なうことができる。【００５１】
本発明の設計・作成方法においては、配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するペプチド以外のペプチドの場合にも同様に、上記のようにして推定された基質結合部位の少なくとも一部分に変化を生じさせることにより、ペプチド合成活性の向上した変異型タンパク質を見出すことができる。活性の向上した個々の変異を組み合わせることにより、その相乗効果によって、更に活性の向上した変異体を創出することができる。ここで、基質結合部位の少なくとも一部分に変化を生じさせるとは、変化を生じさせた後の変異型タンパク質がペプチド生成活性を有することを条件として、基質結合部位を構成するアミノ酸残基のうちの一残基以上を改変すること、特に、置換、挿入または削除すること、好ましくは他のアミノ酸残基に置換することを意味する。改変の対象となるアミノ酸の数は、アミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが、得られる変異型タンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない範囲で適宜定めることができる。【００５２】
例えば、当該タンパク質と配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質との３次元構造とが、トレッディング法による判定の際に得られるアラインメントにおいて、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中６７−７０、７２−８８、１００、１０２、１０３、１０６、１０７、１１３−１１７、１３０、１５５−１６３、１６５、１６６、１８０−１８８、１９０−１９５、２００−２３５、２５９、２７３、２７６、２７８、２９２−２９４、２９６、２９８、２９９、３００−３０４、３２５−３２８、３３０−３４０、及び４３７−４４７のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一以上のアミノ酸残基が置換、挿入または削除された構造とすることによることができる。具体的には、アラインメントの結果上述のアミノ酸残基に対応する（重なり合う）位置のアミノ酸残基のうちの少なくとも一残基について他のアミノ酸残基に置換することにより、所望の変異型タンパク質を得ることができる。【００５３】
尚、設計される変異型タンパク質は、その一次配列において、配列番号２０７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の変異型タンパク質とある程度の相同性を有することが好ましい。相同性の程度は、例えば２５％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上とすることができる。【００５４】
上記した範囲のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一部分を変化させること、すなわち、アミノ酸残基の一つを置換することにより、ペプチド生成活性の向上した変異型タンパク質を見出すことができる。また、活性の向上をもたらした個々の変異を組み合わせることにより、それらの相乗効果によって、更に活性の向上した変異型タンパク質を創出することができる。一方で、変異によるペプチド生成活性の向上の程度は、アミノ酸残基の側鎖が１原子分変化しただけでも劇的な変化が生じる場合があり、その最適化には様々な可能性がある。例えば、ある一部位の変異により活性の向上した部位が発見されたならば、立体構造上でその部位に連続する数残基にランダム変異をかけることにより、更に活性の向上した変異体を得ることも可能である。すなわち、ペプチド生成活性の向上をもたらすアミノ酸残基の立体構造上の位置と連続した表面を構成する位置のうちの少なくとも一部分を変化させることにより、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質を得ることも可能である。【００５５】
ここで、配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質以外のタンパク質における、ペプチド生成活性の向上をもたらすアミノ酸残基の立体構造上の位置と連続した表面を構成する位置とは、当該タンパク質と配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の３次元構造とのアラインメントをトレッディング法により行ったときに、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中６７−７０、７２−８８、１００、１０２、１０３、１０６、１０７、１１３−１１７、１３０、１５５−１６３、１６５、１６６、１８０−１８８、１９０−１９５、２００−２３５、２５９、２７３、２７６、２７８、２９２−２９４、２９６、２９８、２９９、３００−３０４、３２５−３２８、３３０−３４０、及び４３７−４４７のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置同士を基準として、基質結合部位（Ｓｅｒ１５８）方向に向かう表面（平面）を構成する位置を意味する。具体的には、下の（ａ´）〜（ｉ´）の中から選ばれる１または２以上の変化を生じさせることにより、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質を得ることができる。
（ａ´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、７９−８２のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｂ´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、８４、８８、８９及び９２のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｃ´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、７２、７５及び７７のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｄ´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、１５９、１６１、１６２、１８４、１８７及び２７６のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｅ´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、７０、１０６、１１３、１１５、１９３、２０７、２０９−２１２、２１６及び２５９のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｆ´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、２００、２０２−２０５、２０７、及び２２８のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｇ´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、２３３、２３４、及び４３９のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｈ´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、３２８、３３９、３４０、４４５、及び４４６のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｉ´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、８７、１５５、１５７、及び１６０のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除【００５６】
また、当該タンパク質と配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の一次配列とのアラインメントもしくは当該タンパク質と配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の３次元構造とのアラインメントを行ったときに、一次配列の相同性が２５％以上であるものにおいて、以下の（ａ´´）〜（ｉ´´）の中から選ばれる１または２以上の変化を生じさせることによっても、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質を得ることができる。
（ａ´´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、７９−８２のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｂ´´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、８４、８８、８９及び９２のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｃ´´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、７２、７５及び７７のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｄ´´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、１５９、１６１、１６２、１８４、１８７及び２７６のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｅ´´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、７０、１０６、１１３、１１５、１９３、２０７、２０９−２１２、２１６及び２５９のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｆ´´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、２００、２０２−２０５、２０７、及び２２８のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｇ´´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、２３３、２３４、及び４３９のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｈ´´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、３２８、３３９、３４０、４４５、及び４４６のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
（ｉ´´）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列中、８７、１５５、１５７、及び１６０のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除【００５７】
４．本発明のペプチド生成活性を有するタンパク質（配列番号２０８記載のアミノ酸配列に基づく変異型タンパク質）
本発明のタンパク質は、上記項目２，３にて説明した設計・作製方法により設計・作成される変異型タンパク質、具体的には、配列番号２０８に記載のアミノ酸配列に対し下記変異型Ｌ１からＬ３３５のいずれか１種または２種以上の変異、もしくは、下記変異型Ｍ１からＭ６４２が導入されたアミノ酸配列を有する変異型タンパク質であり、ペプチド生成活性を有する（以下、「（Ｉ´）の配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の変異型タンパク質」ともいう）。変異型Ｌ１からＬ３３５、および変異型Ｍ１からＭ６４２の各変異型は表２−１〜２−１９に示すとおりである。【００５８】
【表２−１】
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【００５９】
【表２−２】
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【００６０】
【表２−３】
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【００６１】
【表２−４】
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【００６２】
【表２−５】
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【００６３】
【表２−６】
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【００６４】
【表２−７】
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【００６５】
【表２−８】
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【００６６】
【表２−９】
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【００６７】
【表２−１０】
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【００６８】
【表２−１１】
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【００６９】
【表２−１２】
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【００７０】
【表２−１３】
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【００７１】
【表２−１４】
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【００７２】
【表２−１５】
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【００７３】
【表２−１６】
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【００７４】
【表２−１７】
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【００７５】
【表２−１８】
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【００７６】
【表２−１９】
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【００７７】
本明細書において各変異型は、前述の配列番号２記載のアミノ酸配列に基づく変異型タンパク質と同様に、表２−１〜表２−１９に示すようなアミノ酸残基の略号および配列番号２０８に示すアミノ酸配列中の部位より特定する。例えば、変異型Ｌ１の「Ｎ６７Ｋ」とは、配列番号２０８の配列の第６７番目のアミノ酸残基アスパラギンをリジンに置換したことを示す。すなわち、変異型の表記は、Ｍ３５−４／Ｖ１８４Ａ変異型（配列番号２０８で特定されるアミノ酸）のアミノ酸残基の種類；配列番号２０８に記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の位置；変異導入後のアミノ酸残基の種類を示す。他の変異型の表記も同様である。【００７８】
変異型Ｌ１からＬ３３５の変異は１種のみを導入しても、２種以上を組み合わせて導入してもよい。また、変異型Ｌ１からＬ３３５の変異は、そのうちの１種または２種以上を、表２−１〜２−７以外の変異型、例えば、後述の表３３に示される変異型の中から選ばれる１種または２種以上と組み合わせて導入してもよい。具体的には上述の表２−８〜２−１９に示すような組み合わせＭ１からＭ６４２が好適である。また少なくとも変異型Ｌ１２５：Ｉ１５７Ｌ、少なくとも変異型Ｌ１２４：Ｉ１５７Ｋ、少なくとも変異型Ｌ３０３：Ｙ３２８Ｆ、少なくとも変異型Ｌ１２：Ｐ７０Ｔ、少なくとも変異型Ｌ１２７：Ｙ１５９Ｎ、少なくとも変異型Ｌ１９９：Ｆ２１１Ｗ、少なくとも変異型Ｌ１９５：Ｆ２１１Ｉ、少なくとも変異型Ｌ１３０：Ｇ１６１Ａ、少なくとも変異型Ｌ１１５：Ｄ１１５Ｑ、少なくとも変異型Ｌ３１６：Ｌ３４０Ｖ、少なくとも変異型Ｌ９９：Ｆ８８Ｅ、少なくとも変異型Ｌ１６：Ａ７２Ｅ、少なくとも変異型Ｌ１５：Ａ７２Ｄ、少なくとも変異型Ｌ１３１：Ｆ１６２Ｌ、少なくとも変異型Ｌ２８４：Ａ２３３Ｄ、少なくとも変異型Ｌ１９１：Ｔ２１０Ｌ、少なくとも変異型Ｌ６５：Ｙ８１Ａ、少なくとも変異型Ｌ２６５：Ｉ２２８Ｋ、少なくとも変異型Ｌ３１７：Ｖ４３９Ｐ、少なくとも変異型Ｌ２５５：Ｇ２２６Ａ、少なくとも変異型Ｌ５２：Ｇ７７Ｓ、少なくとも変異型Ｌ１５５：Ｆ２００Ａ、少なくとも変異型Ｌ２９８：Ｒ２７６Ａ、少なくとも変異型Ｌ２０１：Ｇ２１２Ａ、少なくとも変異型Ｌ１４５：Ｗ１８７Ｆ、少なくとも変異型Ｌ１７０：Ａ２０４Ｓ、少なくとも変異型Ｌ８７：Ｓ８４Ｄ、少なくとも変異型Ｌ６０：Ｅ８０Ｄ、少なくとも変異型Ｌ１１０：Ｆ１１３Ｗ、少なくとも変異型Ｍ２４１：Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ、少なくとも変異型Ｍ３４０：Ｐ７０Ｔ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ、少なくとも変異型Ｍ４１２：Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ｙ３２８Ｆ、少なくとも変異型Ｍ４９１：Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ、少なくとも変異型Ｍ４９６：Ｉ１５７Ｌ／Ａ２３３Ｄ／Ｙ３２８Ｆ、少なくとも変異型Ｍ５８１：Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ｙ３２８Ｆ、少なくとも変異型Ｍ５８２：Ｙ８１Ａ／Ｉ１５７Ｌ／Ａ２３３Ｄ／Ｙ３２８Ｆ、少なくとも変異型Ｍ５９４：Ｉ１５７Ｌ／Ｔ２１０Ｌ／Ａ２３３Ｄ／Ｙ３２８Ｆ、を含む変異型タンパク質がペプチド生成活性を向上させる上で好適である。【００７９】
本発明の変異型タンパク質は、優れたペプチド生成活性を有する。すなわち、配列番号２０８のアミノ酸配列を有するタンパク質（Ｍ３５−４／Ｖ１８４変異型タンパク質）と比べ、ペプチド生成反応を触媒する能力について優れた性能を有する。より具体的には、本発明の変異型タンパク質はそれぞれ、特定のカルボキシ成分及びアミノ成分からペプチドを生成する際の反応速度または収率、あるいは基質特異性、ｐＨ特性、温度安定性など、ペプチド生成反応を行うために求められる何らかの特性について、配列番号２０８に示すタンパク質よりも性能が向上している（具体的には下記実施例参照）。そのため本発明の変異型タンパク質は、ペプチドの工業的生産において好適に用い得る。【００８０】
変異型Ｌ１から変異型Ｌ３３５、変異型Ｍ１からＭ６４２に示す変異の導入は、例えば部位特異的変異法によって、配列番号２０８のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子の特定の部位のアミノ酸が置換されるように塩基配列を改変することによって得られる。配列番号２０８のアミノ酸配列における変異部位に対応する塩基配列は、配列番号２０７を参照することにより容易に確認できる。【００８１】
また、本発明により、上記変異型Ｌ１から変異型Ｌ３３５、または、変異型Ｍ１からＭ６４２に示す１種または２種以上の変異を含む変異型タンパク質と実質的に同じタンパク質も提供される。すなわち、本発明は、変異型Ｌ１から変異型Ｌ３３５、または、変異型Ｍ１からＭ６４２の変異型を１種または２種以上含む変異型タンパク質において、前記変異型Ｌ１から変異型Ｌ３３５、変異型Ｍ１からＭ６４２のいずれか１種または２種以上の変異部位以外の部位に置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を更に含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質（以下、「（II´）の配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の変異型タンパク質」ともいう）も提供するものである。すなわち、本発明の変異型タンパク質は、配列番号２０８に示すアミノ酸の変異型Ｌ１から変異型Ｌ３３５、もしくは、変異型Ｍ１からＭ６４２の変異部位以外の部位における変異を許容する。したがって、変異型Ｌ１から変異型Ｌ３３５、もしくは、変異型Ｍ１からＭ６４２の変異部位以外の部位に欠失、挿入などの変異が導入された場合、変異型Ｌ１から変異型Ｌ３３５、変異型Ｍ１からＭ６４２によって特定される部位からのＮ末端またはＣ末端までのアミノ酸残基数は、変異導入前の状態とは異なることがあり得る。【００８２】
ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜１０個である。ただし、変異型Ｌ１から変異型Ｌ３３５、もしくは、変異型Ｍ１からＭ６４２の１種または２種以上の変異を含むタンパク質（すなわち（Ｉ´）の配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の変異型タンパク質）の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上のペプチド生成活性を保持していることが望ましい。【００８３】
変異型Ｌ１から変異型Ｌ３３５、変異型Ｍ１からＭ６４２以外の変異も、例えば部位特異的変異法によって、本タンパク質をコードする遺伝子の特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加、逆異などされるように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変された塩基配列によりコードされるポリペプチドは、従来知られている突然変異処理によっても取得され得る。突然変異処理、塩基の置換、欠失、挿入、付加、および逆位等の変異の意味については、前述の項目１において例示したような方法で行うことができる。上記のような変異を有するＤＮＡを適当な細胞で発現させ、発現産物の本酵素活性を調べることにより、配列番号２０８に記載のタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。【００８４】
４．本発明のポリヌクレオチド
本発明は、上記本発明の変異型タンパク質が有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを提供する。コドンの縮重により、１つのアミノ酸配列を規定する塩基配列は複数あり得る。すなわち、本発明のポリヌクレオチドには、下記ポリヌクレオチドが含まれる。
（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対し前記変異型１から６８、並びに変異型２３９から２９０および３２４から３７７のいずれか１種または２種以上の変異を含むアミノ酸配列を有する変異型タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ii）上記（Ｉ）に記載の変異型タンパク質において、前記変異型１から６８、並びに変異型２３９から２９０および３２４から３７７のいずれか１種または２種以上の変異を含むアミノ酸配列中、変異部位以外の部位に置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を更に含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有する、変異型タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
配列番号２のアミノ酸配列は、例えば配列番号１に記載の塩基配列によってコードされる。【００８５】
また、本発明は、上記本発明の配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の変異型タンパク質が有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを提供する。コドンの縮重により、１つのアミノ酸配列を規定する塩基配列は複数あり得る。すなわち、本発明のポリヌクレオチドには、下記ポリヌクレオチドが含まれる。
（ｉ´）配列番号２０８に記載のアミノ酸配列に対し前記Ｌ１からＬ３３５、および変異型Ｍ１からＭ６４２のいずれか１種または２種以上の変異を含むアミノ酸配列を有する変異型タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ii´）上記（Ｉ´）に記載の変異型タンパク質において、前記Ｌ１からＬ３３５、および変異型Ｍ１からＭ６４２のいずれか１種または２種以上の変異を含むアミノ酸配列中、変異部位以外の部位に置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を更に含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有する、変異型タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
また、配列番号２０８のアミノ酸配列は、例えば配列番号２０７に記載の塩基配列によってコードされる。【００８６】
配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡと実質的に同一のポリヌクレオチドとして次のようなポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはこれを保持する細胞などから、配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドもしくは同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを単離することによって、配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドと実質的に同一のポリヌクレオチドが得られる。
一方、配列番号２０７に示す塩基配列を有するＤＮＡと実質的に同一のポリヌクレオチドも、上記配列番号１に示すＤＮＡの場合と同様に、配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはこれを保持する細胞などから、同様に単離することによって得ることができる。【００８７】
同様に、本発明は、本発明の変異型タンパク質をコードするポリヌクレオチドと実質的に同一である、下記（iii）または（iv）に示すポリヌクレオチドを提供する。
（iii）上記（ｉ）のポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、変異型１から６８、並びに変異型２３９から２９０および３２４から３７７の１種または２種以上の変異が保持され、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（iv）上記（ii）のポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、変異型１から６８、並びに変異型２３９から２９０および３２４から３７７の１種または２種以上の変異が保持され、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。【００８８】
同様に、本発明は、本発明の変異型タンパク質をコードするポリヌクレオチドと実質的に同一である、下記（iii´）または（iv´）に示すポリヌクレオチドを提供する。
（iii´）上記（ｉ´）のポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、前記Ｌ１からＬ３３５、および変異型Ｍ１からＭ６４２の１種または２種以上の変異が保持され、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（iv´）上記（ii´）のポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、前記Ｌ１からＬ３３５、および変異型Ｍ１からＭ６４２の１種または２種以上の変異が保持され、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。【００８９】
実質的に同一のポリヌクレオチドを得るためのプローブは、例えば配列番号１や配列番号２０７に記載の塩基配列、または変異型タンパク質をコードする塩基配列に基づいて定法により作製することができる。また、プローブを用いてこれとハイブリダイズするポリヌクレオチドをつり上げ、目的とするポリヌクレオチドを単離する方法も、定法に従って行えばよい。例えば、ＤＮＡプローブはプラスミドやファージベクターにクローニングされた塩基配列を増幅し、プローブとして用いたい塩基配列を制限酵素により切り出し、抽出して調製することができる。切り出す箇所は、目的とするＤＮＡに応じて調節することができる。【００９０】
ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の発現ベクターにつなぎ、適当な宿主で発現させて、発現産物の酵素活性を後述の方法で測定することによって容易に取り除くことができる。【００９１】
なお、上記のように、上記（ii）、（iii）および（iv）のポリヌクレオチドの場合には、それらによってコードされるタンパク質が、５０℃、ｐＨ８の条件下で、上記（Ｉ）の変異型タンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上のペプチド生成活性を保持していることが望ましい。一方、上記（ii´）、（iii´）および（iv´）のポリヌクレオチドの場合には、それらによってコードされるタンパク質が、２２℃、ｐＨ８．５の条件下で、上記（Ｉ）の変異型タンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上のペプチド生成活性を保持していることが望ましい。【００９２】
５．本発明の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、及び配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
上記のとおり、（Ｉ）の変異型タンパク質及び（Ｉ´）の配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の変異型タンパク質は、それぞれ配列番号２及び配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を改変することにより得ることができる。以下、本発明のタンパク質の元となったタンパク質について説明する。なお、本発明の変異型タンパク質はタンパク質の由来によって限定されるものではない。【００９３】
配列番号１に記載のＤＮＡおよび配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、ならびに配列番号２０７に記載のＤＮＡおよび配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、スフィンゴバクテリウム・マルチボラム  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１６３株（寄託者が付した識別のための表示：Sphingobacterium  multivorum  AJ2458）に由来する。ＦＥＲＭ番号が記載されている菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566））に寄託されており、受託番号を参照して分譲を受けることができる。【００９４】
なお、配列番号２や配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と同種のタンパク質をスフィンゴバクテリウム・エスピー  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２４株から単離することができる。スフィンゴバクテリウム・エスピー  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２４株からは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質における第４３９番目のアミノ酸残基であるロイシンがバリンに置換されたタンパク質が単離される。スフィンゴバクテリウム・エスピー  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２４株（寄託者が付した識別のための表示：Sphingobacterium  sp.  AJ  110003）は、２００２年７月２２日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、受託番号が付与された。ＦＥＲＭ番号が記載されている菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号305-8566））に寄託されており、受託番号を参照して分譲を受けることができる。【００９５】
なお上記スフィンゴバクテリウム・マルチボラムの菌株は、以下の分類実験によってスフィンゴバクテリウム・マルチボラムであると同定されたものである。上記菌株は、桿菌（０．６〜０．７×１．２〜１．５μｍ）、グラム陰性、胞子形成なし、運動性なし、コロニー形態は円形、全縁滑らか、低凸状、光沢あり、黄色、３０℃で生育、カタラーゼ陽性、オキシダーゼ陽性、ＯＦテスト（グルコース）陰性の性質より、スフィンゴバクテリウムに属する細菌と同定された。更に、硝酸塩還元陰性、インドール産生陰性、グルコースからの酸生成陰性、アルギニンジヒドロラーゼ陰性、ウレアーゼ陽性、エスクリン加水分解陽性、ゼラチン加水分解陰性、β−ガラクトシダーゼ陽性、グルコース資化陽性、Ｌ−アラビノース資化陽性、Ｄ−マンノース資化陽性、Ｄ−マンニトール資化陰性、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン資化陽性、マルトース資化陽性、グルコン酸カリウム資化陰性、ｎ−カプリン酸資化陰性、アジピン酸資化陰性、ｄｌ−リンゴ酸資化陰性、クエン酸ナトリウム資化陰性、酢酸フェニル資化陰性、チトクロームオキシダーゼ陽性の性質より、スフィンゴバクテリウム・マルチボラムの性状に類似することが判明した。更に１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列のホモロジー解析の結果、スフィンゴバクテリウム・マルチボラムと最も高いホモロジー（９８．５％）を示し、本菌株をスフィンゴバクテリウム・マルチボラム（Sphingobacterium  multivorum）と同定した。【００９６】
配列番号１に記載の塩基番号６１〜１９１７の塩基配列からなるＤＮＡは、コードシーケンス（ＣＤＳ）部分である。塩基番号６１〜１９１７の塩基配列には、シグナル配列領域と成熟タンパク質領域とが含まれている。シグナル配列領域は塩基番号６１〜１２０の領域であり、成熟タンパク質領域は塩基番号１２１〜１９１７の領域である。すなわち、本発明は、シグナル配列を含むペプチド酵素タンパク質遺伝子と、成熟したタンパク質としてのペプチド酵素タンパク質遺伝子の双方を提供する。配列番号１に記載の配列に含まれるシグナル配列は、リーダー配列の類であり、当該リーダー配列領域にコードされるリーダーペプチドの主たる機能は、細胞膜内から細胞膜外に分泌させることにあると推定される。塩基番号１２１〜１９１７でコードされるタンパク質、すなわちリーダーペプチドを除く部位が成熟タンパク質であり、高いペプチド生成活性を示すと推定される。【００９７】
配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡは、スフィンゴバクテリウム・マルチボラムの染色体ＤＮＡ、もしくはＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲ（polymerase  chain  reaction,  White,  T.  J.  et  al  ;Trends  Genet.,  5,  185(1989)参照）またはハイブリダイゼーションによって取得することができる。ＰＣＲに用いるプライマーは、例えばペプチド生成活性を有する精製タンパク質に基づいて決定された内部アミノ酸配列に基づいて設計することができる。また、配列番号１に記載された塩基配列に基づいてプライマーまたはハイブリダイゼーション用のプローブを設計することもでき、あるいはプローブを使って単離することもできる。ＰＣＲ用のプライマーとして、５'非翻訳領域及び３'非翻訳領域に対応する配列を有するプライマーを用いると、本タンパク質のコード領域全長を増幅することができる。配列番号１に記載された、リーダー配列および成熟タンパク質コード領域の双方を含む領域を増幅する場合を例にとると、具体的には、５'側プライマーとしては配列番号１において塩基番号６１よりも上流の領域の塩基配列を有するプライマーが、３'側プライマーとしては塩基番号１９１７よりも下流の領域の塩基配列に相補的な配列を有するプライマーが挙げられる。【００９８】
プライマーの合成は、例えば、Applied  Biosystems社製ＤＮＡ合成機model  380Bを使用し、ホスホアミダイト法を用いて（Tetrahedron  Letters  (1981),  22,  1859参照）常法に従って合成できる。PCR反応は、例えばGene  Amp  PCR  System  9600（PERKIN  ELMER社製）及びTaKaRa  LA  PCR  in  vitro  Cloning  Kit（宝酒造社製）を用い、各メーカーなど供給者により指定された方法に従って行うことができる。【００９９】
６．本発明の変異型タンパク質の製造方法
次に本発明のタンパク質の製造方法、並びにこれに用いられる組換え体および形質転換体の作製方法について説明する。【０１００】
上記変異型タンパク質を発現する形質転換体は、例えば、配列番号１に示される塩基配列を有する発現ベクターなどの組換えＤＮＡに変異型１から６８、並びに変異型２３９から２９０および３２４から３７７のいずれかに該当する変異を導入し、適切な宿主に導入し、発現させることによってペプチド生成活性を有する変異型タンパク質を生成することができる。一方、配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の変異型タンパク質を発現する形質転換体は、配列番号２０７に示される塩基配列を有する発現ベクターなどの組換えＤＮＡに変異型Ｌ１から変異型Ｌ３３５、変異型Ｍ１からＭ６４２のいずれかに該当する変異を導入し、適切な宿主に導入し、発現させることによってペプチド生成活性を有する変異型タンパク質を生成することができる。配列番号１または配列番号２０７の塩基配列を有するＤＮＡにより特定される変異型タンパク質を発現させるための宿主としては、例えばエシェリヒア・コリ（Escherichia  coli）等のエシェリヒア属細菌、エンペドバクター属細菌、スフィンゴバクテリウム属細菌、フラボバクテリウム属細菌、及びバチルス・ズブチリス（Bacillus  subtilis）をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces  cerevisiae）、ピヒア・スティピティス（Pichia  stipitis）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus  oryzae）をはじめとする種々の真核細胞を用いることができる。【０１０１】
外来ＤＮＡを宿主に導入するために用いる組換えＤＮＡは、発現させようとする宿主の種類に応じたベクターに、所定のＤＮＡを、該ＤＮＡがコードするタンパク質が発現可能な形態で挿入することで調製可能である。タンパク質を発現させるためのプロモータとしては、エンペドバクター・ブレビスのペプチド生成タンパク質をコードする遺伝子固有のプロモータが宿主細胞で機能する場合には、そのプロモータを使用することができる。また、必要に応じて宿主細胞で働く他のプロモータを、変異型タンパク質をコードするＤＮＡに連結し、そのプロモータ制御下で発現させるようにしてもよい。【０１０２】
組換えＤＮＡを宿主細胞に導入するための形質転換法としては、D.  M.  Morrisonの方法（Methods  in  Enzymology  68,  326  (1979)）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.  and  Higa,  A.,  J.  Mol.  Biol.,  53,  159(1970)）等が挙げられる。【０１０３】
タンパク質を組換えＤＮＡ技術を用いて大量生産する場合、該タンパク質を生産する形質転換体内で該タンパク質が会合し、タンパク質の封入体（inclusion  body）を形成させる形態も好ましい一実施形態として挙げられる。この発現生産方法の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼによる消化から保護する点および目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に精製できる点等である。【０１０４】
このようにして得られるタンパク質封入体は、タンパク質変性剤により可溶化され、主にその変性剤を除去することによる活性再生操作を経た後、正しく折り畳まれた生理的に活性なタンパク質に変換される。例えば、ヒトインターロイキン−２の活性再生（特開昭６１−２５７９３１号公報）等多くの例がある。【０１０５】
タンパク質封入体から活性型タンパク質を得るためには、可溶化・活性再生等の一連の操作が必要であり、直接活性型タンパク質を生産する場合よりも操作が複雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすようなタンパク質を菌体内で大量に生産させる場合は、不活性なタンパク質封入体として菌体内に蓄積させることにより、その影響を抑えることができる。【０１０６】
目的タンパク質を封入体として大量生産させる方法として、強力なプロモータの制御下、目的のタンパク質を単独で発現させる方法の他、大量発現することが知られているタンパク質との融合タンパク質として発現させる方法がある。【０１０７】
以下、形質転換された大腸菌を作製し、これを用いて変異型タンパク質を製造する方法を例として、より具体的に説明する。なお、大腸菌などの微生物に変異型タンパク質を作製させる場合、タンパク質のコード配列として、リーダー配列を含む前駆タンパク質をコードするＤＮＡを組み込んでも、リーダー配列を含まない成熟タンパク質領域のＤＮＡのみを組み込んでもよく、作製しようとする酵素の製造条件、形態、使用条件などにより適宜選択することができる。【０１０８】
変異型タンパク質をコードするＤＮＡを発現させるプロモータとしては、通常大腸菌における異種タンパク質生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ラムダファージのＰＲプロモータ、ＰＬプロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。また、ベクターとしては、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８等を用いることができる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。さらに、プロモータを含み、挿入ＤＮＡ配列を発現させることができる発現ベクターを使用することもできる。【０１０９】
変異型タンパク質を融合タンパク質封入体として生産させるためには、変異型タンパク質の上流あるいは下流に、他のタンパク質、好ましくは親水性であるペプチドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質遺伝子とする。このような他のタンパク質をコードする遺伝子としては、融合タンパク質の蓄積量を増加させ、変性・再生工程後に融合タンパク質の溶解性を高めるものであればよく、例えば、Ｔ７ｇｅｎｅ  １０、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、インターフェロンγ遺伝子、インターロイキン−２遺伝子、プロキモシン遺伝子等が候補として挙げられる。【０１１０】
これらの遺伝子と変異型タンパク質をコードする遺伝子とを連結する際には、コドンの読み取りフレームが一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結するか、あるいは適当な配列の合成ＤＮＡを利用すればよい。【０１１１】
また、生産量を増大させるためには、融合タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネータを連結することが好ましい場合がある。このターミネータとしては、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネータ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータ等が挙げられる。【０１１２】
変異型タンパク質または変異型タンパク質と他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。【０１１３】
また、形質転換体を選別するために、該ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモータを持つ発現ベクターが市販されている（ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）ほか）。【０１１４】
プロモータ、変異型タンパク質または変異型タンパク質と他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子、場合によってはターミネータの順に連結したＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを連結して組換えＤＮＡを得る。【０１１５】
得られた組換えＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養すると、変異型タンパク質または変異型タンパク質と他のタンパク質との融合タンパク質が発現生産される。形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通常用いられる株を使用することができるが、大腸菌Ｋ１２株亜種のエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９株などが好ましい。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法はMolecular  Cloning,  2nd  edition,  Cold  Spring  Harbor  Press  (1989)等に記載されている。【０１１６】
融合タンパク質として発現させた場合、血液凝固因子Ｘａ、カリクレインなどの、ペプチド生成酵素内に存在しない配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用いてペプチド生成酵素を切り出せるようにしてもよい。【０１１７】
生産培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択する。【０１１８】
変異型タンパク質または変異型タンパク質と他のタンパク質との融合タンパク質を回収するには、以下の方法などがある。変異型タンパク質あるいはその融合タンパク質が菌体内に可溶化されていれば、菌体を回収した後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、粗酵素液として使用できる。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法により変異型タンパク質あるいはその融合タンパク質を精製して用いることも可能である。この場合、変異型タンパク質あるいは融合タンパク質の抗体を利用した精製法も利用できる。【０１１９】
タンパク質封入体が形成される場合には、変性剤でこれを可溶化する。菌体タンパク質とともに可溶化してもよいが、以降の精製操作を考慮すると、封入体を取り出して、これを可溶化するのが好ましい。封入体を菌体から回収するには、従来公知の方法で行えばよい。例えば、菌体を破壊し、遠心分離操作等によって封入体を回収する。タンパク質封入体を可溶化させる変性剤としては、グアニジン塩酸（例えば、６Ｍ、ｐＨ５〜８）や尿素（例えば８Ｍ）などが挙げられる。【０１２０】
これらの変性剤を透析等により除くと、活性を有するタンパク質として再生される。透析に用いる透析溶液としては、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液などを用いればよく、濃度としては２０ｍＭ〜０．５Ｍ、ｐＨとしては５〜８が挙げられる。【０１２１】
再生工程時のタンパク質濃度は、５００μｇ／ｍｌ程度以下に抑えるのが好ましい。再生したペプチド生成酵素が自己架橋を行うのを抑えるために、透析温度は５℃以下であることが好ましい。また、変性剤除去の方法として、この透析法のほか、希釈法、限外濾過法などがあり、いずれを用いても活性の再生が期待できる。【０１２２】
７．ペプチドの製造方法
本発明のペプチドの製造方法は、上記変異型タンパク質を用いて、ペプチドを生成させるものである。すなわち、本発明のペプチド製造方法では、下記（Ｉ）および（II）に示すタンパク質のうち少なくとも一方の存在下で、アミン成分とカルボキシ成分とを反応させてペプチドを生成せしめる。
（Ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対し前記変異型１から６８、並びに変異型２３９から２９０および３２４から３７７のいずれか１種または２種以上の変異を含むアミノ酸配列を有する変異型タンパク質。
（II）上記（Ｉ）に記載の変異型タンパク質において、前記変異型１から６８、並びに変異型２３９から２９０および３２４から３７７のいずれか１種または２種以上の変異部位以外の部位に置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を更に含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有する、変異型タンパク質。【０１２３】
また、本発明のペプチドの製造方法は、上記配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の変異型タンパク質を用いてペプチドを生成させることもできる。すなわち、本発明のペプチド製造方法では、下記（Ｉ´）および（II´）に示すタンパク質のうち少なくとも一方の存在下で、アミン成分とカルボキシ成分とを反応させてペプチドを生成せしめる。
（Ｉ）配列番号２０８に記載のアミノ酸配列に対し前記変異型Ｌ１からＬ３３５、及び変異型Ｍ１からＭ６４２のいずれか１種または２種以上の変異を含むアミノ酸配列を有する変異型タンパク質。
（II）上記（Ｉ）に記載の変異型タンパク質において、前記変異型Ｌ１からＬ３３５、および変異型Ｍ１からＭ６４２のいずれか１種または２種以上の変異部位以外の部位に置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を更に含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有する、変異型タンパク質。
【０１２４】
本発明のペプチドの製造方法では、ペプチド生成反応系内に変異型タンパク質が存在するようにすればよい。上記変異型タンパク質は、例えば、生化学的に許容される媒体中に（Ｉ）および／または（II）、あるいは（Ｉ´）および／または（II´）のタンパク質を含有する混合物（以下、「変異型タンパク質含有物」という）として供給されてもよい。さらに具体的には、例えば、本発明の変異型タンパク質を発現するように形質転換された微生物の培養物、当該培養物より分離した微生物菌体および当該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる１種または２種以上を用い、アミン成分とカルボキシ成分とからペプチドを生成せしめてもよい。【０１２５】
本明細書において「変異型タンパク質含有物」とは、本発明の変異型タンパク質を含有するものであればよく、具体的形態としては、変異型タンパク質を生産する微生物の培養物、当該培養物から分離された微生物菌体、菌体処理物などが含まれる。微生物の培養物とは、微生物を培養して得られる物のことであり、より具体的には、微生物菌体、その微生物の培養に用いた培地および培養された微生物により生成された物質の混合物などのことをいう。また、微生物菌体は洗浄し、洗浄菌体として用いてもよい。また、菌体処理物には、菌体を破砕、溶菌、凍結乾燥したものなどが含まれ、さらに菌体などを処理して回収される粗精製タンパク質、さらに精製した精製タンパク質なども含まれる。精製処理されたタンパク質としては、各種精製法によって得られる部分精製タンパク質等を使用してもよいし、これらを共有結合法、吸着法、包括法等によって固定化した固定化タンパク質を使用してもよい。また、使用する微生物によっては、培養中に一部、溶菌するものもあるので、この場合には培養液上清も変異型タンパク質含有物として利用できる。【０１２６】
また、本発明の変異型タンパク質を含む微生物としては、変異型タンパク質を発現した遺伝子組換え株を用いてもよいし、アセトン処理菌体、凍結乾燥菌体等の菌体処理物を使用してもよいし、これらを共有結合法、吸着法、包括法等によって固定化した固定化菌体、固定化菌体処理物を使用してもよい。【０１２７】
なお、培養物、培養菌体、洗浄菌体、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物を用いる場合には、ペプチドの生成に関与せずに生成ペプチドを分解する酵素が存在することが多く、この場合には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属プロテアーゼ阻害剤を添加するほうが好ましい場合がある。添加量は、０．１ｍＭから３００ｍＭの範囲で、好ましくは１ｍＭから１００ｍＭである。【０１２８】
変異型タンパク質またはその含有物を、カルボキシ成分とアミン成分に作用せしめる方法としては、当該変異型タンパク質またはその含有物、カルボキシ成分、およびアミン成分を混合すればよい。より具体的には、本発明の変異型タンパク質またはその含有物を、カルボキシ成分とアミン成分を含む溶液中に添加して反応せしめる方法を用いてもよいし、変異型タンパク質を生産する微生物を用いる場合には、変異型タンパク質を生産する微生物を培養し、微生物中または微生物の培養液中に当該酵素を生成・蓄積せしめ、培養液中にカルボキシ成分とアミン成分を添加する方法などを用いてもよい。生成されたペプチドは、定法により回収し、必要に応じて精製することができる。【０１２９】
微生物の菌体（すなわち、微生物の細胞）を得るには、微生物の種類に応じて適当な培地で培養増殖せしめるとよい。このための培地はその微生物が増殖し得るものであれば特に制限はなく、通常の炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、無機イオン、更に必要に応じ有機栄養源を含む通常の培地でよい。【０１３０】
例えば、炭素源としては上記微生物が利用可能であればいずれも使用でき、具体的には、グルコース、フラクトース、マルトース、アミロース等の糖類、ソルビトール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸などの有機酸類及びこれらの塩類、パラフィンなどの炭水化物類あるいはこれらの混合物などを使用することができる。【０１３１】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの有機窒素化合物あるいはこれらの混合物を使用することができる。【０１３２】
他に無機塩類、微量金属塩、ビタミン類等、通常の培地に用いられる栄養源を適宜混合して用いることができる。【０１３３】
培養条件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件下にてｐＨ５〜９、温度約１５〜５５℃の範囲でｐＨおよび温度を適当に制限しつつ１２〜４８時間程度培養を行えばよい。【０１３４】
本発明のペプチド製造方法の好ましい形態としては、上記、形質転換された微生物を培地中で培養し、培地中および／または微生物中に、変異型タンパク質を蓄積させる方法が挙げられる。形質転換体を用いることにより、変異型タンパク質を簡便に大量生成できるため、ペプチドの生成も大量に速く行うことができる。【０１３５】
変異型タンパク質またはその含有物の使用量は、目的とする効果を発揮する量（有効量）であればよく、この有効量は当業者であれば簡単な予備実験により容易に求められるが、例えば酵素を用いる場合には、０．０１から１００ユニット（Ｕ）程度、洗浄菌体を用いる場合は０．１〜５００ｇ／Ｌ程度である。【０１３６】
カルボキシ成分としては、もう一つの基質であるアミン成分と縮合してペプチドを生成できるものであれば、いかなるものを使用してよい。カルボキシ成分としては、例えば、Ｌ−アミノ酸エステル、Ｄ−アミノ酸エステル、Ｌ−アミノ酸アミド、Ｄ−アミノ酸アミド、更にはアミノ基の有さない有機酸エステル等が挙げられる。また、アミノ酸エステルとしては、天然型のアミノ酸に対応するアミノ酸エステルだけでなく、非天然型のアミノ酸もしくはその誘導体に対応するアミノ酸エステルなども例示される。また、アミノ酸エステルとしては、α−アミノ酸エステルの他、アミノ基の結合位置の異なる、β−、γ−、ω−等のアミノ酸のエステルなども例示される。アミノ酸エステルの代表例としては、アミノ酸のメチルエステル、エチルエステル、n-プロピルエステル、iso-プロピルエステル、n-ブチルエステル、iso-ブチルエステル、tert-ブチルエステル等が例示される。【０１３７】
アミン成分としては、もう一つの基質であるカルボキシ成分と縮合してペプチドを生成できるものであれば、いかなるものも使用してよい。アミン成分としては、例えば、Ｌ−アミノ酸、Ｃ保護Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、Ｃ保護Ｄ−アミノ酸、アミン等が挙げられる。また、アミンとしは、天然型アミンだけでなく、非天然型のアミンもしくはその誘導体などが例示される。また、アミノ酸としては、天然型アミノ酸だけではなく非天然型アミノ酸もしくはその誘導体も例示される。α−アミノ酸の他、アミノ基の結合位置の異なる、β−、γ−、ω−等のアミノ酸なども例示される。【０１３８】
出発原料であるカルボキシ成分およびアミン成分の濃度は各々１ｍＭ〜１０Ｍ、好ましくは０．０５Ｍ〜２Ｍであるが、カルボキシ成分に対してアミン成分を等量以上添加したほうが好ましい場合がある。また、基質が高濃度だと反応を阻害するような場合には、反応中にこれらを阻害しない濃度にして逐次添加することができる。【０１３９】
反応温度は０〜６０℃でペプチド合成可能であり、好ましくは５〜４０℃である。また反応ｐＨはｐＨ６．５〜１０．５でペプチド合成可能であり、好ましくはｐＨ７．０〜１０．０である。【０１４０】
本発明のペプチド製造方法は、各種のペプチドの製造方法として好適である。ペプチドとしては、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−メチルエステル（i.e.,  α-L-(β-O-methyl  aspartyl)-L-phenylalanine（略称：α−ＡＭＰ）Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ala-Gln）、Ｌ−アラニル−Ｌ−フェニルアラニン（Ala-Phe）、Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−メチオニン（Phe-Met）、Ｌ−ロイシル−Ｌ−メチオニン（Leu-Met）、Ｌ−イソロイシル−Ｌ−メチオニン（Ile-Met）、Ｌ−メチオニル−Ｌ−メチオニン（Met-Met）、Ｌ−プロリル−Ｌ−メチオニン（Pro-Met）、Ｌ−トリプトファニル−Ｌ−メチオニン（Trp-Met）、Ｌ−バリル−Ｌ−メチオニン（Val-Met）、Ｌ−アスパラギニル−Ｌ−メチオニン（Asn-Met）、Ｌ−システイニル−Ｌ−メチオニン（Cys-Met）、Ｌ−グルタミル−Ｌ−メチオニン（Gln-Met）、グリシル−Ｌ−メチオニン（Gly-Met）、Ｌ−セリル−Ｌ−メチオニン（Ser-Met）、Ｌ−スレオニル−Ｌ−メチオニン（Thr-Met）、Ｌ−チロシニル−Ｌ−メチオニン（Tyr-Met）、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−メチオニン（Asp-Met）、Ｌ−アルギニル−Ｌ−メチオニン（Arg-Met）、Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−メチオニン（His-Met）、Ｌ−リジル−Ｌ−メチオニン（Lys-Met）、Ｌ−アラニル−グリシン（Ala-Gly）、Ｌ−アラニル−Ｌ−スレオニン（Ala-Thr）、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン酸（Ala-Glu）、Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニン（Ala-Ala）、Ｌ−アラニル−Ｌ−アスパラギン酸（Ala-Asp）、Ｌ−アラニル−Ｌ−セリン（Ala-Ser）、Ｌ−アラニル−Ｌ−メチオニン（Ala-Met）、Ｌ−アラニル−Ｌ−バリン（Ala-Val）、Ｌ−アラニル−Ｌ−リジン（Ala-Lys）、Ｌ−アラニル−Ｌ−アスパラギン（Ala-Asn）、Ｌ−アラニル−Ｌ−システイン（Ala-Cys）、Ｌ−アラニル−Ｌ−チロシン（Ala-Tyr）、Ｌ−アラニル−Ｌ−イソロイシン（Ala-Ile）、Ｌ−アルギニル−Ｌ−グルタミン（Arg-Gln）、グリシル−Ｌ−セリン（Gly-Ser）、グリシル−Ｌ−（ｔ−ブチル）セリン（Gly-Ser（tBu））、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシルイソロイシル−フェニルアラニン（HIL-Phe）等のジペプチド、Ｌ−アラニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アラニン（ＡＦＡ）、Ｌ−アラニル−グリシル−Ｌ−アラニン（ＡＧＡ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−アラニン（ＡＨＡ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニン（ＡＬＡ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニン（ＡＡＡ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−グリシン（ＡＡＧ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリン（ＡＡＰ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン（ＡＡＱ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−チロシン（ＡＡＹ）、グリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アラニン（ＧＦＡ）、Ｌ−アラニル−グリシル−グリシン（ＡＧＧ）、Ｌ−トレオニル−グリシル−グリシン（ＴＧＧ）、グリシル−グリシル−グリシン（ＧＧＧ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−フェニルアラニル−グリシン（ＡＦＧ）等のトリペプチド、グリシル−グリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−メチオニン（ＧＧＦＭ）等のテトラペプチド、Ｌ−チロシル−グリシル−グリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−メチオニン（ＹＧＧＦＭ）等のペンタペプチドを挙げることができる。
本発明のペプチド製造方法は、例えば、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−メチルエステル（i.e.,  α-L-(β-O-methyl  aspartyl)-L-phenylalanine（略称：α−ＡＭＰ）の製造方法としても好適である。α−ＡＭＰは、甘味料として大きな需要があるα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステル（製品名：アスパルテーム）製造の重要な中間体である。
【実施例】
【０１４１】
以下、本発明について実施例を示しより詳細に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。【０１４２】
（実施例１）  ペプチド生成酵素遺伝子の大腸菌における発現
スフィンゴバクテリウム・マルチボラム  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１６３株の染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号５，６に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより、ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードする目的遺伝子を増幅した。増幅したＤＮＡ断片をＮｄｅＩ／ＸｂａＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｐＴｒｐＴのＮｄｅＩ／ＸｂａＩ処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液でエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性を指標として目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＴｒｐＴ＿Ｓｍ＿Ａｅｔと命名した。なお、ｐＴｒｐＴ＿Ｓｍ＿Ａｅｔを保有するエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９をｐＴｒｐＴ＿Ｓｍ＿Ａｅｔ／ＪＭ１０９株とも表す。【０１４３】
ｐＴｒｐＴ＿Ｓｍ＿Ａｅｔ／ＪＭ１０９株を３ｍｌの培地（２ｇ／ｌグルコース、１０ｇ／ｌ酵母エキス、１０ｇ／ｌカザミノ酸、５ｇ／ｌ硫酸アンモニウム、３ｇ／ｌリン酸二水素カリウム、１ｇ／ｌリン酸水素二カリウム、０．５ｇ／ｌ硫酸マグネシウム七水和物、１００ｍｇ／ｌアンピシリン）を張り込んだ普通試験管に一白金耳植菌し、２５℃、２０時間の本培養を行った。培養液１ｍｌあたり２．１ＵのＡＭＰ生成活性を有しており、クローニングした遺伝子がエシェリヒア・コリで発現したことを確認した。なお、対照としてｐＴｒｐＴのみを導入した形質転換体には、活性は検出されなかった。【０１４４】
（実施例２）  ｐＫＦベクターを用いたラショナル変異株の構築
（１）  ｐＫＦ＿Ｓｍ＿Ａｅｔの構築
ｐＴｒｐＴ＿Ｓｍ＿Ａｅｔプラスミドを鋳型として配列番号３、４に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子を増幅した。このＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｐＫＦ１８ｋ２（宝酒造社製）のＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液でエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９を形質転換し、カナマイシン耐性を指標として目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＫＦ＿Ｓｍ＿Ａｅｔと命名した。なお、ｐＫＦ＿Ｓｍ＿Ａｅｔを有するエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９をｐＫＦ＿Ｓｍ＿Ａｅｔ／ＪＭ１０９株とも表す。【０１４５】
（２）ｐＫＦ＿Ｓｍ＿Ａｅｔラショナル変異導入
変異型Ａｅｔを構築するために、ｐＫＦ＿Ｓｍ＿Ａｅｔプラスミドを、ＯＤＡ法を用いる部位特異的突然変異誘発法の鋳型として使用した。変異は宝酒造社（日本）の「Site  Directed  Mutagenesis  System  Mutan  Super  Express  Km  Kit」を使用し、製造元のプロトコールに従って、各種変異型酵素に対応するプライマー（配列番号１２〜３３）を用いて導入した。プライマーは、宝酒造社製のＴ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅを用いて５’−末端をリン酸化して用いた。プライマーリン酸化条件は、１００μｍｏｌＤＮＡ（プライマー）及びＴ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ  １０ユニットをＡＴＰ  ０．５ｍＭ、塩化マグネシウム  １０ｍＭ及びＤＴＴ  ５ｍＭを含む５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２０μｌに添加し、３７℃で３０分保温後、７０℃で５分加熱し、リン酸化した。本反応液１μｌ（５ｐｍｏｌ）を変異導入ＰＣＲに用いた。ＰＣＲ条件は、Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｄｓ  ＤＮＡ（ｐＫＦ＿Ｓｍ＿Ａｅｔプラスミド）１０ｎｇ、プライマーとしてＳｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｐｒｉｍｅｒ及び先に示した５’リン酸化済みのＭｕｔａｇｅｎｉｃ  オリゴヌクレオチド  各５ｐｍｏｌ及びＬＡ−Ｔａｑ  ４０ユニットをｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ各２５０μＭを含むＬＡ−Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒII（Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）５０μｌに添加し、９４℃を１分、５５℃を１分、７２℃を３分のサイクルを２５回繰り返すＰＣＲ反応を行った。変異導入ＰＣＲ後、エタノール沈殿によりＤＮＡ断片を回収し、得られたＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリ  ＭＶ１１８４株を形質転換し、カナマイシン耐性を指標として、変異型Ａｅｔ遺伝子を含む目的のプラスミド：ｐＫＦ＿Ｓｍ＿ＡｅｔＭを有する株を選択した。【０１４６】
なお、本明細書において、ｐＫＦ＿Ｓｍ＿ＡｅｔＭを有するエシェリヒア・コリ  ＭＶ１１８４株を、ｐＫＦ＿Ｓｍ＿ＡｅｔＭ／ＭＶ１１８４株とも表す。また、ｐＫＦ＿Ｓｍ＿ＡｅｔＭについてその具体的な変異型を示す場合、ｐＫＦ＿Ｓｍ＿Ｆ２０７Ｖのように、「ＡｅｔＭ」の部分を変異型の内容で置き換えて表示する場合がある。また、２種以上の変異を含む場合変異型を「／」で区切り、列挙する場合がある。例えば、ｐＫＦ＿Ｓｍ＿Ｆ２０７Ｖ／Ｑ４４１Ｅは、ｐＫＦ＿Ｓｍ＿Ａｅｔプラスミドが搭載するＡｅｔ遺伝子にＦ２０７ＶおよびＱ４４１Ｅの変異が導入されたものである。【０１４７】
（３）ｐＨＳＧ＿Ｓｍ＿Ａｅｔの構築
ｐＴｒｐＴ＿Ｓｍ＿Ａｅｔプラスミドを鋳型として配列番号３、４に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子を増幅した。このＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｐＨＳＧ２９８（宝酒造社製）のＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液でエシェリヒア・コリ  ＭＶ１１８４株を形質転換し、カナマイシン耐性を指標として目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＨＳＧ＿Ｓｍ＿Ａｅｔと命名した。なお、ｐＨＳＧ＿Ｓｍ＿Ａｅｔを有するエシェリヒア・コリ  ＭＶ１１８４株を、ｐＨＳＧ＿Ｓｍ＿Ａｅｔ／ＭＶ１１８４株とも表す。【０１４８】
（４）菌体の取得Ａ
ｐＫＦ＿Ｓｍ＿Ａｅｔ／ＪＭ１０９株、ｐＫＦ＿Ｓｍ＿ＡｅｔＭ／ＭＶ１１８４株およびｐＨＳＧ＿Ｓｍ＿Ａｅｔ／ＭＶ１１８４株をそれぞれＬＢ寒天培地（１０ｇ／ｌ酵母エキス、１０ｇ／ｌペプトン、５ｇ／ｌ塩化ナトリウム、２０ｇ／ｌ寒天、ｐＨ７．０））上で３０℃、２４時間前培養した。前培養で得られた各種菌体を、３ｍｌのＬＢ培地（上記培地より寒天を除いた培地に０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ、２０ｍｇ／ｌカナマイシンを含む）を張り込んだ普通試験管に一白金耳植菌し、２５℃、１５０往復／分で２０時間の本培養を行った。【０１４９】
（５）微生物菌体を用いるペプチドの生産  ＜ＡＭＰの生成＞
実施例２（４）で得られた培養液４００μlを遠心して菌体を回収し、１０ｍＭ  ＥＤＴＡと５０ｍＭ  アスパラギン酸ジメチルエステル、１００ｍＭ  フェニルアラニンを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）２００μＬに懸濁し、２５℃にて３０分反応を行った。この反応で野性型酵素発現株（以下、野生株と称する）において生成したα−ＡＭＰの濃度を表３に示した。また、各種変異型酵素発現株（以下、変異株と称する）におけるジペプチド生成については、野生株に対するジペプチドの生成濃度の比率を表３に示した。【０１５０】
（６）微生物菌体を用いるペプチドの生産  ＜Ａｌａ−Ｇｌｎ生成＞
実施例２（４）で得られた培養液１００μlを遠心して菌体を回収し、１０ｍＭ  ＥＤＴＡと１００ｍＭ  Ｌ−アラニンメチルエステル、２００ｍＭグルタミンを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）２００μＬに懸濁し、２５℃にて３０分反応を行った。この反応で野生株において生成したＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（以下、Ａｌａ−Ｇｌｎ）の濃度を表３に示した。また、各種変異株におけるジペプチド生成については、野生株に対するジペプチドの生成濃度の比率を表３に示した。【０１５１】
（７）微生物菌体を用いるペプチドの生産  ＜Ｐｈｅ−Ｍｅｔ、Ｌｅｕ−Ｍｅｔ＞
実施例２（４）で得られた培養液８００μlを遠心して菌体を回収し、１０ｍＭ  ＥＤＴＡと５０ｍＭ  Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩又はＬ−ロイシンメチルエステル塩酸塩、１００ｍＭ  Ｌ−メチオニンを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）４００μＬに懸濁し、２５℃にて２０分反応を行った。この反応で野生株において生成したＬ−フェニルアラニル−Ｌ−メチオニン（以下、Ｐｈｅ−Ｍｅｔ）又はＬ−ロイシル−Ｌ−メチオニン（以下Ｌｅｕ−Ｍｅｔ）の濃度を表３に示した。また、各種変異株におけるジペプチド生成については、野生株に対するジペプチドの生成濃度の比率を表３に示した。【０１５２】
【表３】
2006075486.tif 000025
【０１５３】
（実施例３）ランダムスクリーニング１
（８）ｐＴｒｐＴ＿Ｓｍ＿Ａｅｔランダムライブラリーの作製
変異型Ａｅｔを構築するために、ｐＴｒｐＴ＿Ｓｍ＿Ａｅｔプラスミドを、Ｅｒｒｏｒ
ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ法を用いるランダム変異誘発法の鋳型として使用した。変異はストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社（アメリカ）の「ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＰＣＲ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ」を使用し、製造元のプロトコールに従って行った。【０１５４】
配列表の配列番号５、６に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｄｓ  ＤＮＡ（ｐＴｒｐ＿Ｓｍ＿ＡｅｔまたはｐＴｒｐ＿Ｓｍ＿Ｆ２０７Ｖプラスミド）  ５００ｎｇ、プライマー各１２５ｎｇ及びＭｕｔａｚｙｍｅ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ２．５ユニットをｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ各２００μＭを含むＭｕｔａｚｙｍｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ５０μｌに添加し、９５℃を３０秒、５２℃を３０秒、７２℃を２分のサイクルを３０回繰り返すＰＣＲ反応を行った。【０１５５】
ＰＣＲ反応の生成物をＮｄｅＩ／ＸｂａＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｐＴｒｐＴのＮｄｅＩ／ＸｂａＩ処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液を用いて常法によりエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換した。これを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上にプレーティングし、ランダム変異導入ライブラリーを作製した。【０１５６】
（９）ｐＴｒｐＴ＿Ｓｍ＿ＡｅｔランダムライブラリーからのスクリーニングＡ
それぞれの変異型Ａｅｔ遺伝子を含むプラスミド（ｐＴｒｐＴ＿Ｓｍ＿ＡｅｔＭ）を導入したエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９株及び野生型Ａｅｔを含むプラスミドを導入したエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９株をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む生産培地（２ｇ／ｌ  グルコース、１０ｇ／ｌ  酵母エキス、１０ｇ／ｌ  カザミノ酸、５ｇ／ｌ  硫酸アンモニウム、１ｇ／ｌ  リン酸二水素カリウム、３ｇ／ｌ  リン酸水素二カリウム、０．５ｇ／ｌ  硫酸マグネシウム七水和物、ｐＨ７．５、１００ｍｇ／ｌ  アンピシリン）１５０μｌ（９６穴プレートに分注）に接種し、２５℃で１６時間振とう培養した。培養にはＴＩＴＥＣ社のバイオシェーカー（Ｍ／ＢＲ−１２１２ＦＰ）を用い、１０００回転／分で振とう培養した。【０１５７】
（１０）一次スクリーニング
実施例３（９）で得られた培養液を用いて一次スクリーニングを実施し、次のようにして選抜を行った。まず、得られた培養液５μｌに、１０ｍＭ  Ｐｈｅｎｏｌ、６ｍＭ  ＡＰ、５ｍＭ  Ａｓｐ（ＯＭｅ）２、７．５ｍＭ  Ｐｈｅ、３．６Ｕ／ｍｌ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、０．１６Ｕ／ｍｌ  ａｌｃｈｏｌ  ｏｘｉｄａｓｅ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  Ｂｏｒａｔｅを含む反応液（ｐＨ８．２）を２００μｌ添加し、２５℃にて約２０分反応させた。反応後５００ｎｍの吸光度を測定し、メタノール放出量を算出した。ここではメタノールの放出量が多いものはＡＭＰ生成活性が高い酵素として選抜した。【０１５８】
（１１）菌体の取得
１次スクリーニングにて採取された選抜株を、ＬＢ寒天培地で２５℃、１６時間前培養した。各種酵素発現株を２ｍｌのｔｅｒｒｉｆｉｃ培地（１２ｇ／ｌ  トリプトン  、２４ｇ／ｌ  酵母エキス、２．３ｇ／ｌ  リン酸酸二水素カリウム、１２．５ｇ／ｌ  リン酸水素二カリウム、４ｇ／ｌ  グリセロール、１００ｍｇ／ｌ  アンピシリン）を張り込んだ普通試験管に一白金耳植菌し、２５℃、１５０往復／分で１８時間の本培養を行った。【０１５９】
（１２）二次スクリーニング
得られた培養ブロス２５μｌを、１０ｍＭ  ＥＤＴＡと５０ｍＭ  アスパラギン酸ジメチルエステル、７５ｍＭ  フェニルアラニンを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５又はｐＨ９．０）５００μＬに懸濁し、２０℃又は２５℃にて１０分又は１５分間反応を行い、ＡＭＰ生成量を測定した。２次スクリーニング選抜株より、比活性が向上した上位株について変異点解析を実施し、以下の変異点を特定した。野生株を親株（鋳型）としたライブラリーより、変異型４、５、６、７、８、９、１０、１４、１５、１６を備える変異株、Ｆ２０７Ｖ変異株を親株としたライブラリーより変異型１７、１８、１９、２０を備える変異株を取得した。【０１６０】
（１３）微生物菌体を用いるペプチドの生産
上記反応で野生株において生成したＡＭＰの濃度を表４（反応時間１０分）、Ｆ２０７Ｖ変異株において生成したＡＭＰの濃度を表５（反応時間１５分）に示した。また、各種変異株におけるジペプチド生成については、親株に対するジペプチドの生成濃度の比率を表４、５に示した。ＡＭＰ生成反応の他の条件は上記実施例２（５）と同様とした。【０１６１】
【表４】
2006075486.tif 000026
【０１６２】
【表５】
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【０１６３】
（実施例４）特定した変異点のｐＫＦへの載せかえによる評価
（１４）特定した変異点のｐＫＦへの載せかえ株の構築
実施例３（１２）で得られた変異点を既構築ｐＫＦ＿Ｓｍ＿Ｆ２０７Ｖ／Ｑ４４１Ｅと組合わせ、３重変異株を構築した。変異導入は、鋳型としてｐＫＦ＿Ｓｍ＿Ｆ２０７Ｖ／Ｑ４４１Ｅを用いて実施例２（２）と同様の方法で行い、各種変異型酵素に対応するプライマー（配列表の配列番号３４〜４４および７７）を用いて導入した。得られた株及び既構築株は実施例２（４）と同様の方法で培養した。【０１６４】
（１５）微生物菌体を用いるペプチドの生産  ＜ＡＭＰ＞
実施例４（１４）で得られた培養液５００μｌを遠心して菌体を回収し、１０ｍＭ  ＥＤＴＡと５０ｍＭアスパラギン酸ジメチルエステル、１００ｍＭフェニルアラニンを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５又はｐＨ９．０）５００μＬに懸濁し、２５℃にて３０分反応を行った。この反応で野生株において生成したＡＭＰの濃度を表６に示した。また、各種変異株におけるジペプチド生成については、野生株に対するジペプチドの生成濃度の比率を表６に示した。【０１６５】
（１６）微生物菌体を用いるペプチドの生産  ＜Ａｌａ−Ｇｌｎ＞
実施例４（１４）で得られた培養液１００μｌを遠心して菌体を回収し、１０ｍＭ  ＥＤＴＡと１００ｍＭ  Ｌ−アラニンメチルエステル、２００ｍＭグルタミンを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５又はｐＨ９．０）１０００μＬに懸濁し、２５℃にて１０分反応を行った。この反応で野生株において生成したＡｌａ−Ｇｌｎの濃度を表６に示した。また、各種変異株におけるジペプチド生成については、野生株に対するジペプチドの生成濃度の比率を表６に示した。【０１６６】
（１７）微生物菌体を用いるペプチドの生産  ＜Ｐｈｅ−Ｍｅｔ，Ｌｅｕ−Ｍｅｔ＞
実施例４（１４）で得られた培養液８００μｌを遠心して菌体を回収し、１０ｍＭ  ＥＤＴＡと５０ｍＭ  Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩又はＬ−ロイシンメチルエステル塩酸塩、１００ｍＭ  Ｌ−メチオニンを含む１００ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５又はｐＨ９．０）４００μＬに懸濁し、２５℃にて２０分反応を行った。この反応で野生株において生成したＰｈｅ−Ｍｅｔ、Ｌｅｕ−Ｍｅｔの濃度を表６に示した。また、各種変異株におけるジペプチド生成については、野生株に対するジペプチドの生成濃度の比率を表６に示した。【０１６７】
【表６】
2006075486.tif 000028
【０１６８】
（実施例５）ランダムスクリーニング２
（１８）ｐＳＴＶ＿Ｓｍ＿Ａｅｔランダムライブラリーの作製
変異型Ａｅｔを構築するために、ｐＨＳＧ＿Ｓｍ＿Ａｅｔプラスミドを、Ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ法を用いるランダム変異誘発法の鋳型として使用した。変異はストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社（アメリカ）の「ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＰＣＲ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ」を使用し、製造元のプロトコールに従って行った。【０１６９】
配列表の配列番号３、４に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｄｓ  ＤＮＡ（ｐＨＳＧ＿Ｓｍ＿Ａｅｔ  プラスミド）  １００ｎｇ、プライマー１，２（配列番号３、４参照）各１．２５ｐｍｏｌ及びＭｕｔａｚｙｍｅ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ２．５ユニットをｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ各２００μＭを含むＭｕｔａｚｙｍｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ５０μｌに添加し、９５℃で３０秒加熱後、９５℃を３０秒、５２℃を３０秒、７２℃を２分のサイクルを２５回繰り返すＰＣＲ反応を行った。  【０１７０】
ＰＣＲ反応の生成物をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｐＳＴＶ２８（宝酒造社）のＥｃｏＩ／ＰｓｔＩ処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液を用いて常法によりエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換した。これを５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを含むＭ９寒天培地上（５＊Ｍ９  ２００ｍｌ／ｌ、０．１Ｍ  ＣａＣｌ2  １ｍｌ／ｌ、１Ｍ  ＭｇＳＯ4  １ｍｌ／ｌ、５０％Ｇｌｕｃｏｓｅ  １０ｍｌ／ｌ、カザミノ酸  １０ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ）にプレーティングし、ランダム変異導入ライブラリーを作製した。その際、その後のスクリーニングを簡便にするため、１プレート１００コロニー程度になるように塗布した。なお、上記「５＊Ｍ９」は、Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ  ６４ｇ／Ｌ，ＫＨ2ＰＯ4  １５ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ  ２．５ｇ／Ｌ，ＮＨ4Ｃｌ  ５ｇ／Ｌの溶液である。【０１７１】
（１９）ｐＳＴＶ系ランダムライブラリーからの一次スクリーニング
得られた形質転換体（変異型酵素発現株ライブラリー）から効率的に活性向上株を選抜するため、各形質転換体のＰｈｅ−ｐＮＡ加水分解活性を調べた。実施例５（１８）にて作製した形質転換体生育プレートに、反応液（１０ｍＭ  Ｐｈｅ−ｐＮＡ、１０ｍＭ  ＯＰＴ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）、０．８％ａｇａｒ）５ｍｌを重層し、Ｐｈｅ−ｐＮＡの加水分解により生じるｐＮＡの発色を調べた（ｐＮＡの遊離により菌体が黄色く着色）。強く発色が見られるコロニーを活性上昇株として選抜した。【０１７２】
（２０）菌体の取得
選抜した株はＬＢ寒天培地上で３０℃、２４時間培養した。この各種菌体を、３ｍｌのＬＢ培地（上記培地より寒天を除いた培地に０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ、５０ｍｇ／ｌ  クロラムフェニコールを含む）を張り込んだ普通試験管に一白金耳植菌し、２５℃、１５０往復／分で２０時間の本培養を行った。【０１７３】
（２１）二次スクリーニング
実施例５（２０）で得られた培養ブロス４００μｌを集菌し、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  と５０ｍＭ  Ｐｈｅ−ＯＭｅ、１００ｍＭ  Ｍｅｔを含む１００ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）４００μｌに懸濁し、２５℃にて３０分反応を行い、Ｐｈｅ−Ｍｅｔ生成量を測定し、反応初速度の早い株を選抜した。そこで選抜した活性が向上した株について、変異点解析を実施し、変異点１１、１２を特定した。【０１７４】
（２２）微生物菌体を用いるペプチドの生産  ＜Ｐｈｅ−Ｍｅｔ，Ｌｅｕ−Ｍｅｔ＞
実施例５（２０）で得た培養液８００μlを遠心して菌体を回収し、１０ｍＭ  ＥＤＴＡと２５ｍＭ  Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩又はＬ−ロイシンメチルエステル塩酸塩、５０ｍＭ  Ｌ−メチオニンを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）４００μＬに懸濁し、２５℃にて２０分反応を行った。この反応で野生株において生成したＰｈｅ−Ｍｅｔ又はＬｅｕ−Ｍｅｔの濃度を表７に示した。また、各種変異株におけるジペプチド生成については、野生株に対するジペプチドの生成濃度の比率を表７に示した。【０１７５】
【表７】
2006075486.tif 000029
【０１７６】
（実施例６）ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ａｅｔでのペプチド生成酵素遺伝子の高発現
（２３）高発現プラスミドの構築
ＰＣＲにより、エンテロバクター・アエロゲネス由来酸性フォスファターゼの改変プロモータおよびシグナル配列の下流にスフィンゴバクテリウム属由来の成熟型ペプチド生成酵素遺伝子を連結した発現プラスミドを構築した。【０１７７】
鋳型としてｐＴｒｐＴ＿Ｓｍ＿Ａｅｔプラスミド（実施例１）、プライマーとしてＥｓｐ−Ｓ１（5'-CCG  TAA  GGA  GGA  ATG  TAG  ATG  AAA  AAT  ACA  ATT  TCG  TGC  C；配列番号１２１）及びＳ−ＡＳ１（5'-GGC  TGC  AGT  TTG  CGG  GAT  GGA  AGG  CCG  GC；配列番号１２２）オリゴヌクレオチド各０．４ｍＭ並びにＫＯＤ  ｐｌｕｓ用緩衝液（ＴＯＹＯＢＯ社製）、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ各０．２ｍＭ、硫酸マグネシウム１ｍＭ、及びＫＯＤ  ｐｌｕｓポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）１ユニットを含む５０μｌの反応液で、９４℃、３０秒の熱処理の後、９４℃を１５秒、５５℃を３０秒、６８℃を２分３０秒のサイクルを２５回繰り返すＰＣＲを行い、ペプチド生成酵素遺伝子部分を増幅した。また、鋳型としてｐＥＡＰ１３０プラスミド（下記参考例１参照。関連特許出願；特願２００４−８３４８１）、プライマーとしてＥ−Ｓ１（5'-CCT  CTA  GAA  TTT  TTT  CAA  TGT  GAT  TT；配列番号１２３）及びＥｓｐ−ＡＳ１（5'-GCA  GGA  AAT  TGT  ATT  TTT  CAT  CTA  CAT  TCC  TCC  TTA  CGG  TGT  TAT；配列番号１２４）オリゴヌクレオチドを用い同条件にてＰＣＲを行い、酸性フォスファターゼのプロモータ及びシグナル配列部分を増幅した。反応液をアガロース電気泳動に供し、増幅された各ＤＮＡ断片をＭｉｃｒｏｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いて回収した。【０１７８】
次いで、該増幅断片混合物を鋳型とし、プライマーとしてＥ−Ｓ１及びＳ−ＡＳ１オリゴヌクレオチドを用い、同様の組成の反応液で９４℃を１５秒、５５℃を３０秒、６８℃を２分３０秒のサイクルを２５回繰り返すＰＣＲを行い、キメラ型酵素遺伝子を構築した。増幅された各ＤＮＡ断片をＭｉｃｒｏｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いて回収し、これをＸｂａ  ＩとＰｓｔ  Ｉで消化した。これをｐＵＣ１８プラスミドのＸｂａ  Ｉ−Ｐｓｔ  Ｉサイトに連結した。ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社製）を用いたＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法により、３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ）にて塩基配列を決定し、目的の遺伝子が導入されていることを確認し、本プラスミドをｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ａｅｔプラスミドと命名した。【０１７９】
（２４）ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ａｅｔラショナル変異導入株の構築
変異型Ａｅｔを構築するために、ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ａｅｔを、ＰＣＲを用いる部位特異的突然変異誘発法の鋳型として使用した。変異はストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社（アメリカ）の「クイックチェンジ部位特異的突然変異誘発キット（Ｑｕｉｋ  ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）」を使用し、製造元のプロトコールに従って、各種変異型酵素に対応するプライマー（配列番号４５〜７８）を用いて導入した。ＰＣＲ反応の生成物を用いて、エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性を指標として目的のプラスミドを有する株を選択した。なお、ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ａｅｔを有するエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９株を、ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ａｅｔ／ＪＭ１０９株とも表す。【０１８０】
（２５）菌体の取得
実施例６（２４）で取得した各種変異株をＬＢ寒天培地で２５℃、１６時間前培養した。各種酵素発現株を２ｍｌのｔｅｒｒｉｆｉｃ培地（１２ｇ／ｌトリプトン、２４ｇ／ｌ酵母エキス、２．３ｇ／ｌリン酸酸二水素カリウム、１２．５ｇ／ｌリン酸水素二カリウム、４ｇ／ｌグリセロール、１００ｍｇ／ｌアンピシリン）を張り込んだ普通試験管に一白金耳植菌し、２５℃、１５０往復／分で１８時間の本培養を行った。【０１８１】
（２６）微生物菌体を用いるペプチドの生産  ＜Ａｌａ−Ｇｌｎ＞
（２５）で得られた培養ブロス５μｌを、５０ｍＭのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩（Ａｌａ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）、１００ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む５００μｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５又はｐＨ９．０）に加え、２５℃にて１０分反応した。この反応で野生株において生成したＡｌａ−Ｇｌｎの濃度を表８に示した。また、各種変異株におけるジペプチド生成については、野生株に対するジペプチドの生成濃度の比率を表８に示した。【０１８２】
（２７）微生物菌体を用いるペプチドの生産  ＜ＡＭＰ＞
上記培養ブロス２５μｌを、１０ｍＭ  ＥＤＴＡと５０ｍＭアスパラギン酸ジメチルエステル、７５ｍＭフェニルアラニンを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５又はｐＨ９．０）５００μＬに懸濁し、２０℃又は２５℃にて１５分間反応を行った。この反応で野生株において生成したＡＭＰの濃度を表８に示した。また、各種変異株におけるジペプチド生成については、野生株に対するジペプチドの生成濃度の比率を表８に示した。【０１８３】
（２８）微生物菌体を用いるペプチドの生産  ＜Ｐｈｅ−Ｍｅｔ，Ｌｅｕ−Ｍｅｔ＞
上記培養ブロス２５μｌを、１０ｍＭ  ＥＤＴＡと２５ｍＭ  Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩又はＬ−ロイシンメチルエステル塩酸塩、５０ｍＭ  Ｌ−メチオニンを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５又はｐＨ９．０）５００μＬに懸濁し、２５℃にて１５分反応を行った。この反応で野生株において反応で生成したＰｈｅ−Ｍｅｔ又はＬｅｕ−Ｍｅｔの濃度を表８に示した。また、各種変異株におけるジペプチド生成については、野生株に対するジペプチドの生成濃度の比率を表８に示した。【０１８４】
【表８】
2006075486.tif 000030
【０１８５】
（実施例７）変異の組み合わせにより高活性株の構築
（２９）ランダムスクリーニング変異点組合せ株の構築
様々な変異を組合わせた株を構築するため、ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ａｅｔを、ＰＣＲを用いる部位特異的突然変異誘発法の鋳型として使用した。【０１８６】
変異はストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社（アメリカ）の「Ｑｕｉｋ  ｃｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ」を使用し、製造元のプロトコールに従って、各種変異型酵素に対応するプライマー（配列番号９９〜１２０）を用いて導入した。プライマーは、宝酒造社製のＴ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅを用いて５’−末端をリン酸化して用いた。プライマーリン酸化条件は、１００μｍｏｌＤＮＡ（プライマー）及びＴ４Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ  １０ユニットをＡＴＰ０．５ｍＭ、塩化マグネシウム１０ｍＭ及びＤＴＴ５ｍＭを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２０μｌに添加し、３７℃で３０分保温後、７０℃で５分加熱し、リン酸化した。【０１８７】
ＰＣＲ条件は、Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｄｓ  ＤＮＡ（ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ａｅｔプラスミド）５０ｎｇ、プライマーとして先に示した５’リン酸化済みのＭｕｔａｇｅｎｉｃオリゴヌクレオチド各５０−１００ｎｇ（組合わせるプライマーが３種類までは１００ｎｇ、４種類以上の場合は５０ｎｇを反応系に添加）、Ｑｕｉｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ０．３７５μｌ及びＱｕｉｋ  ｃｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  ｅｎｚｙｍｅ  ｂｌｅｎｄ  １．２５ユニットをｄＮＴＰ  Ｍｉｘ  ０．５μｌを含むＱｕｉｋ  ｃｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  １２．５μｌに添加し、９５℃を１分、５３．５℃を１分、６５℃を１０分のサイクルを３０回繰り返すＰＣＲ反応を行った。【０１８８】
ＰＣＲ産物（全量１２．５μｌ）にＤｐｎＩ  ５ユニット添加し、３７℃で１時間処理した反応液２μｌを用いて、エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９株を形質転換した。形質転換した菌体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地上にプレーティングし、アンピシリン耐性株としてランダムな組み合わせ株ライブラリーを得た。【０１８９】
（３０）組合わせ変異ライブラリーからのスクリーニング
それぞれの変異型Ａｅｔ遺伝子を含むプラスミド（ｐＳＦ＿Ｓｍ＿ＡｅｔＭ）を導入したエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９及び野生型Ａｅｔを含むプラスミドを導入したエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む生産培地１５０μｌ（９６穴プレートに分注）に接種し、２５℃で１６時間振とう培養した。培養にはＴＩＴＥＣ社のバイオシェーカー（Ｍ／ＢＲ−１２１２ＦＰ）を用い、１０００回転／分で振とう培養した。得られた培養液を用いて、スクリーニングを実施し選抜を行った。【０１９０】
（３１）一次スクリーニング
得られた菌液５μｌに、１０ｍＭ  Ｐｈｅｎｏｌ、６ｍＭ  ＡＰ、５ｍＭ  Ａｓｐ（ＯＭｅ）２、７．５ｍＭ  Ｐｈｅ、３．６Ｕ／ｍｌ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、０．１６Ｕ／ｍｌ  ａｌｃｈｏｌ  ｏｘｉｄａｓｅ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  Ｂｏｒａｔｅを含む反応液（ｐＨ８．２）を２００μｌ添加し、２５℃にて約２０分反応後５００ｎｍの吸光度を測定し、メタノール放出量を算出した。メタノールの放出量が多いものはＡＭＰ生成活性が高い酵素として選抜した。【０１９１】
（３２）二次スクリーニング
上記方法で一次スクリーニングしたのち、選抜した株を実施例６（２５）に記載した方法で培養し、その培養ブロス１０μｌ又は５０μｌを１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  と５０ｍＭ  Ａｓｐ（ＯＭｅ）２、７５ｍＭ  Ｐｈｅを含む１００ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍｌに懸濁し、２０℃又は２５℃にて１０分反応を行い、ＡＭＰ生成量を測定し、生成量の多い株を選抜した。選抜株はシーケンスにより変異点の組み合わせを特定した。取得された株と、それを取得するのに用いたプライマーの組み合わせを表９に示した。【０１９２】
【表９】
2006075486.tif 000031
【０１９３】
（３３）微生物菌体を用いるペプチドの生産
上記で得られた組合わせ株の評価を行った。上記培養ブロス２５μｌを、１０ｍＭ  ＥＤＴＡと５０ｍＭ  アスパラギン酸ジメチルエステル、７５ｍＭ  フェニルアラニンを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）５００μＬに懸濁し、２０℃にて１５分間反応を行った。この反応で野生株において生成したＡＭＰの濃度を表１０に示した。また、各種変異株におけるジペプチド生成については、野生株の比活性を１とした場合のジペプチドの生成比活性の比率を表１０に示した。【０１９４】
【表１０】
2006075486.tif 000032
【０１９５】
（実施例８）基質特異性の把握
（３４）変異型酵素を用いた基質特異性の把握
カルボキシ成分に各種のＬ−アミノ酸メチルエステル、アミン成分にＬ−メチオニンを用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例６（２５）に記載した方法で培養した培養ブロス２５μｌを、表１１に示す２５ｍＭのＬ−アミノ酸メチルエステル塩酸塩（Ｘ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）、５０ｍＭのＬ−メチオニン、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む５００μｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）に加え、２５℃にて１５分、３時間反応した。この反応で野生株において反応で生成した各種ペプチドの生産量を表１１−１および表１１−２に示した。表中＋印の示されたジペプチドは、ＨＰＬＣのエリア値８０００を１ｍｇ／Ｌと仮に定め、予想されるピークの参考値を生産量として示したものである。また、各種変異株におけるジペプチド生成については、野生株に対するジペプチドの生成濃度の比率を表１１−１および表１１−２に示した。【０１９６】
【表１１−１】
2006075486.tif 000033
【０１９７】
【表１１−２】
2006075486.tif 000034
【０１９８】
（実施例９）ランダムスクリーニング
（３５）ｐＴｒｐＴ＿Ｓｍ＿ＡｅｔランダムライブラリーからのスクリーニングＢ
実施例３（８）で作製したライブラリーを、実施例３（９）と同様に培養して得られた培養液を用いて、２種類のスクリーニングを実施し、選抜を行った。【０１９９】
（３６）一次スクリーニングＡ
得られた菌液５μｌに、１０ｍＭ  Ｐｈｅｎｏｌ、６ｍＭ  ＡＰ、５ｍＭ  Ａｓｐ（ＯＭｅ）２、５ｍＭ  Ａｌａ−ＯＥｔ、７．５ｍＭ  Ｐｈｅ、３．６Ｕ／ｍｌ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、０．１６Ｕ／ｍｌ  ａｌｃｈｏｌ  ｏｘｉｄａｓｅ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  Ｂｏｒａｔｅを含む反応液（ｐＨ８．２）を２００μｌ添加し、２５℃にて約２０分反応後５００ｎｍの吸光度を測定し、メタノール放出量を算出した。ここではメタノールの放出量が多いものはＡｌａ−ＰｈｅよりもＡＭＰがより生成しやすい酵素として選抜した。【０２００】
（３７）一次スクリーニングＢ
同様に、得られた菌液５μｌに、１０ｍＭ  Ｐｈｅｎｏｌ、６ｍＭ  ＡＰ、５ｍＭ  Ａｓｐ（ＯＭｅ）２、５ｍＭ  Ａ（Ｍ）、３．６Ｕ／ｍｌ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、０．１６Ｕ／ｍｌ  ａｌｃｈｏｌ  ｏｘｉｄａｓｅ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  Ｂｏｒａｔｅを含む反応液（ｐＨ８．２）を２００μｌ添加し、２５℃にて約２０分反応後５００ｎｍの吸光度を測定し、メタノール放出量を算出した。ここではメタノールの放出量が少ないものはＡＭ（ＡＭ）ができにくい酵素として選抜した。【０２０１】
（３８）二次スクリーニング
実施例９（３６）および（３７）にて選抜した株は、実施例６（２５）と同様な方法で培養し、その培養ブロス５０μｌを１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  と５０ｍＭ  Ａｓｐ（ＯＭｅ）２、５０ｍＭ  Ａｌａ−ＯＭｅ、７５ｍＭ  Ｐｈｅを含む１００ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍｌに懸濁し、２０℃にて１０分反応を行い、ＡＭＰ、Ａｌａ−Ｐｈｅ生成量を測定し、反応初速度の早い株を選抜した。又、同様に培養した培養ブロス５０μｌを１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  と５０ｍＭ  Ａｓｐ（ＯＭｅ）２、７５ｍＭ  Ｐｈｅを含む１００ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１ｍｌに懸濁し、２０℃にて１０分反応を行い、ＡＭＰ生成収率を測定し、収率の高い株を選抜した。有効変異点として変異型２１を選抜した。【０２０２】
（実施例１０）特定した変異点のｐＳＦへの載せかえによる評価
（３９）Ｖ１８４への変異導入
（実施例９）で得られた変異点Ｖ１８４ＡをｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ａｅｔに導入した。また、既構築ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ３５−４にも導入した。また、Ｖ１８４を別のアミノ酸に置換したＶ１８４Ｘ株も構築した。変異導入は（２）と同様の方法で行い、鋳型はｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ａｅｔ又はｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ３５−４を用い、各種変異型酵素に対応するプライマー（配列番号７９〜９８）を用いて導入した。得られた株は実施例６（２５）に記載の方法で培養した。【０２０３】
（４０）微生物菌体を用いるペプチドの生産  ＜ＡＭＰ＞
実施例６（２４）に記載した方法で培養した培養ブロス２５μｌを、１０ｍＭ  ＥＤＴＡと５０ｍＭ  アスパラギン酸ジメチルエステル、７５ｍＭ  フェニルアラニンを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５又はｐＨ９．０）５００μＬに懸濁し、２０℃にて１０分間反応を行った。この反応で野生株において生成したＡＭＰの濃度を表１２に示した。また、各種変異株におけるジペプチド生成については、野生株に対するジペプチドの生成濃度の比率を表１２に示した。【０２０４】
【表１２】
2006075486.tif 000035
【０２０５】
（４１）微生物菌体を用いるペプチドの生産  ＜ＡＭＰ＞
実施例６（２５）に記載した方法で培養した培養ブロスを、１０ｍＭ  ＥＤＴＡと５０ｍＭ  アスパラギン酸ジメチルエステル、７５ｍＭ  フェニルアラニンを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５又はｐＨ９．０）に懸濁し（２．２Ｕ／ｍｌ反応液）、２０℃にて反応を行った。この反応で野生株及び各種変異株において生成したＡＭＰ収率を表１３に示した。【０２０６】
【表１３】
2006075486.tif 000036
【０２０７】
（実施例１１）変異型酵素の性質の変化
（４２）酵素のｐＨ安定性
酵素をあるｐＨで一定時間インキュベーション後、Ｌ−アスパラギン酸ジメチルエステル塩酸塩とＬ−フェニルアラニンからＡＭＰを生成する反応を行い、ｐＨ安定性を検討した。実施例６（２５）に記載した方法で培養した培養ブロス１０μlを２０℃にて各ｐＨ（８．５、９．０、９．５）（Ｍ９−９、Ｍ１２−１に関しては８．０も実施）のバッファー１９０μｌと混合し、３０分インキュベーション後、７５ｍＭ  Ｌ−アスパラギン酸ジメチルエステル、１１２．５ｍＭ  Ｌ−フェニルアラニン、１５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む４５０ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）４００μｌに加え、２０℃にて２０分間反応させ、生成したＡＭＰの濃度を図１に示した。【０２０８】
（４３）酵素の至適反応温度
Ｌ−アスパラギン酸ジメチルエステル塩酸塩とＬ−フェニルアラニンからＡＭＰを生成する反応における反応温度の影響を検討した。５０ｍＭ  Ｌ−アスパラギン酸ジメチルエステル、７５ｍＭ  Ｌ−フェニルアラニン、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１００ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）９８０μｌに、実施例６（２５）に記載した方法で培養した培養ブロス２０μｌ加え、各温度（２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０，５５，６０℃）にて５分間反応させ、生成したＡＭＰ濃度を図２に示した。結果、本酵素の至適温度は２４５８：３５℃、Ｍ９−９：４５℃、Ｍ１２−１：５０℃であった。【０２０９】
（４４）酵素の温度安定性
酵素をある温度で一定時間インキュベーション後、Ｌ−アスパラギン酸ジメチルエステル塩酸塩とＬ−フェニルアラニンからＡＭＰを生成する反応を行い、温度安定性を検討した。菌液を各温度（３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃）にて３０分インキュベーション後、５０ｍＭ  Ｌ−アスパラギン酸ジメチルエステル、１００ｍＭ  Ｌ−フェニルアラニン、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１００ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）９８０μｌに実施例６（２５）に記載した方法で培養した培養ブロス２０μｌ加え、２０℃にて５分間反応させた。このとき生成したＡＭＰの濃度を図３に示した。【０２１０】
＜生成物の分析＞
上記実施例において、生成物は以下に示す高速液体クロマトグラフィーにて定量した。カラム：ＩｎｅｒｔｓｉＬ  ＯＤＳ−３（ＧＬサイエンス社製）、溶離液：ｉ）５．０ｍＭ  １−オクタンスルホン酸ナトリウムを含むリン酸水溶液（ｐＨ２．１）：メタノール＝１００：１５〜５０、ｉｉ）５．０ｍＭ  １−オクタンスルホン酸ナトリウムを含むリン酸水溶液（ｐＨ２．１）：アセトニトリル＝１００：１５〜３０、流量：１．０ｍＬ／分、検出  ２１０ｎｍ。【０２１１】
＜参考例１：ｐＥＡＰ１３０プラスミドの作製−エンテロバクター・アエロゲネス由来酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモータ配列の改変＞
Journal  of  Bioscience  and  Bioengineering  (2001)  Vol.  92,  No.1,  50-54記載の通り（もしくは特開平１０−２０１４８１号公報）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）ＩＦＯ  １２０１０菌株の染色体ＤＮＡより、酸性フォスファターゼ遺伝子領域を含む、制限酵素ＳａｌＩと制限酵素ＫｐｎＩで切り出される１．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を単離し、ｐＵＣ１１８に連結したプラスミドＤＮＡを構築し、ｐＥＡＰ１２０と命名した。ｐＥＡＰ１２０は、酸性フォスファターゼのプロモータ及びシグナルペプチドをコードする塩基配列が組み込まれたプラスミドである。なお、ＩＦＯ番号が記載されているものは、財団法人発酵研究所（日本国大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７−８５）に寄託されたものであるが、平成１４年６月３０日以降、その業務は独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）・バイオテクノロジー本部（ＤＯＢ）・生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）に移管され、ＮＢＲＣより上記ＩＦＯ番号を参照して分譲を受けることができる。【０２１２】
続いて、本遺伝子の上流に存在するプロモータ配列を一部改変し、活性向上を試みた。Ｑｕｉｋ  ｃｈａｎｇｅ  ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いて部位特異的変異を導入し、酸性フォスファターゼ遺伝子推定プロモータ配列の−１０領域をＡＡＡＡＡＴからＴＡＴＡＡＴへ置換した。変異導入用にデザインしたＰＣＲ用オリゴヌクレオチプライマーＥＭ１（5'-CTT  ACA  GAT  GAC  TAT  AAT  GTG  ACT  AAA  AAC；配列番号１２５）およびＥＭＲ１（5'-GTT  TTT  AGT  CAC  ATT  ATA  GTC  ATC  TGT  AAG；配列番号１２６）を合成した。説明書の方法に従って、ｐＥＡＰ１２０を鋳型に変異導入を行った。ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社製）を用いたＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法により、３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ）にて塩基配列を決定し、目的の変異が導入されていることを確認し、本プラスミドをｐＥＡＰ１３０と命名した。ｐＥＡＰ１３０は、酸性フォスファターゼのＮ末端領域に由来するシグナルペプチドをコードする塩基配列、および、改変されたプロモータを有するプラスミドである。【０２１３】
（実施例１２）ｐＳＦＮベクターを用いたラショナル変異株の構築
（４５）ｐＳＦＮ＿Ｓｍ＿Ａｅｔ株の構築
Ａｅｔ酵素遺伝子部分のみを制限酵素処理により切り出し可能なプラスミド、ｐＳＦＮ＿Ｓｍ＿Ａｅｔを構築するために、ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ａｅｔ（実施例６）を、ＰＣＲを用いる部位特異的突然変異誘発法の鋳型として使用した。変異はストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社（アメリカ）の「クイックチェンジ部位特異的突然変異誘発キット（Ｑｕｉｋ  ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）」を使用し、製造元のプロトコールに従って、各種プライマーを用いて導入した。まず、配列番号１２７，１２８に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとした変異導入により、ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ａｅｔプラスミド上４５８７番目の塩基を置換し（ａ→ｇ）、ＮｄｅＩサイトを欠失した。次に、配列番号１２９，１３０に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとした変異導入により、ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ａｅｔプラスミド上２３６３番目の塩基を置換し（ｔａｇ→ａｔｇ）、ＮｄｅＩサイトを導入した。ＰＣＲ反応の生成物を用いて、エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性を指標として目的のプラスミド、ｐＳＦＮ＿Ｓｍ＿Ａｅｔを有する株を選択した。【０２１４】
（４６）ｐＫＦ＿Ｓｍ＿Ａｅｔラショナル変異導入
変異型Ａｅｔを構築するために、ｐＫＦ＿Ｓｍ＿Ａｅｔプラスミド（実施例２（１））を、ＯＤＡ法を用いる部位特異的突然変異誘発法の鋳型として使用した。変異は実施例２（２）と同様の方法で、各種変異型酵素に対応するプライマー（配列番号１３１〜１３７）を用いて導入し、変異型Ａｅｔ遺伝子を含む目的のプラスミド：ｐＫＦ＿Ｓｍ＿ＡｅｔＭを有する株を選択した。【０２１５】
（４７）ｐＳＦＮ＿Ｓｍ＿Ａｅｔへの載せ変え
変異型Ａｅｔ遺伝子を含むプラスミド：ｐＫＦ＿Ｓｍ＿ＡｅｔＭを鋳型として配列番号１２９，１２２に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子を増幅した。このＤＮＡ断片をＮｄｅＩ／ＰｓｔＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｐＳＦＮ＿Ｓｍ＿ＡｅｔのＮｄｅＩ／ＰｓｔＩ処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液でエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性を指標として目的のプラスミドを有する株を選択した。得られた株及び既構築株は、実施例６（２５）に記載の方法で培養した。【０２１６】
（４８）微生物菌体を用いるペプチドの生産  ＜Ｘ−Ｍｅｔ＞
（４７）にて得た培養ブロス４０μｌを、１０ｍＭ  ＥＤＴＡと５０ｍＭ  各種アミノ酸メチルエステル、１００ｍＭ  Ｍｅｔを含む１００ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５又は９．０）４００μＬに懸濁し、２０℃にて１時間反応を行った。この反応で野生株において生成した各種ジペプチドの濃度を表１４に示した。また、各種変異型酵素発現株（以下、変異株と称する）におけるジペプチド生成については、野生株に対するジペプチドの生成濃度の比率を表１４に示した。【０２１７】
【表１４】
2006075486.tif 000037
【０２１８】
（実施例１３）各種ラショナル変異株の基質特異性把握
（４９）微生物菌体を用いたジペプチド生産  ＜Ａｌａ−Ｘ＞
カルボキシ成分にアラニンメチルエステル、アミン成分にＬ−アミノ酸を用いた場合のペプチド生産を検討した。変異型酵素は、実施例７（３２）、実施例１０（３９）、実施例１２（４７）で作製した変異株を用いた。実施例６（２５）に記載した方法で培養した培養ブロス２０μｌを、５０ｍＭのアラニンメチルエステル塩酸塩（Ａｌａ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）、１００ｍＭのＬ−アミノ酸、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む４００μｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）に加え、２０℃にて反応した。この反応で野生株において生成した各種ジペプチドの濃度（ｍＭ）を表１５に示した。また、各種変異株におけるジペプチド生成については、野生株に対するジペプチドの生成濃度の比率を表１５に示した。尚、表１５中、Ａｌａ−Ｇｌｙ及びＡｌａ−Ｔｈｒの測定結果は反応時間１０分時のものであり、その他のジペプチドについては反応時間１５分時の結果を示した。【０２１９】
【表１５】
2006075486.tif 000038
【０２２０】
（５０）微生物菌体を用いたジペプチド生産  ＜Ａｌａ−Ｘ＞
実施例１２（４７）にて得た培養ブロス２０μｌを、１０ｍＭ  ＥＤＴＡと５０ｍＭ  アラニンメチルエステル、１００ｍＭ  Ｌ−アミノ酸を含む１００ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）４００μＬに懸濁し、２０℃にて１５分反応を行った。この反応で野生株において生成した各種ジペプチドの濃度（ｍＭ／Ｏ．Ｄ．）を表１６に示した。また、各種変異株におけるジペプチド生成については、野生株に対するジペプチドの生成濃度の比率を表１６に示した。【０２２１】
【表１６】
2006075486.tif 000039
【０２２２】
（実施例１４）変異の組合せによる高活性株の構築Ａ
（５１）ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ａｅｔラショナル変異導入株の構築
変異型Ａｅｔを構築するために、ｐＳＦ＿Ｓｍ＿ＡｅｔをＰＣＲを用いる部位特異的突然変異誘発法の鋳型として使用した。変異導入は実施例１２（４５）と同様の方法で行い、各種変異型酵素に対応するプライマー（配列番号１３８−１５７，１６０−１６７）を用いて導入した。ＰＣＲ反応の生成物を用いて、エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性を指標として目的のプラスミドを有する株を選択した。得られた株及び既構築株（実施例１０（３９））は、実施例６（２５）に記載した方法で培養した。【０２２３】
（５２）微生物菌体を用いるペプチドの生産  ＜Ａｌａ−Ｘ＞
（５１）で得られた培養ブロス２０μｌを、５０ｍＭのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩（Ａｌａ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）、１００ｍＭのＬ−アミノ酸、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む４００μｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）に加え、２０℃にて１５分反応した。この反応で野生株において生成したジペプチド（Ａｌａ−Ｘ）の濃度（ｍＭ／Ｏ．Ｄ．）を表１７に示した。また、各種変異株におけるジペプチド生成については、野生株に対するジペプチドの生成濃度の比率を表１７に示した。【０２２４】
【表１７】
2006075486.tif 000040
【０２２５】
（５３）微生物菌体を用いるペプチドの生産  ＜Ａｌａ−Ｘ＞
（５２）で効果のあった変異点Ｖ１８４Ａ及びＶ１８４ＰをｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ７−３５に導入した。また、Ｖ２５７ＹはｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ７−３５及びｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｖ１８４Ａに導入した。変異導入は（４５）と同様の方法で行い、鋳型はｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ７−３５又はｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｖ１８４Ａを用い、各種変異型酵素に対応するプライマー（配列番号７９，８０、９３，９４、１５６，１５７）を用いて導入した。得られた株は実施例６（２５）に記載の方法で培養した。【０２２６】
（５４）微生物菌体を用いるペプチドの生産  ＜Ａｌａ−Ｘ＞
実施例８（３４）表１１及び実施例１３（５０）表１６で効果のあった変異点Ｗ１８７Ａ，Ｆ２１１Ａ，Ｑ４４１Ｅ，Ｑ４４１Ｋ，Ｎ４４２Ｄを既構築ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ７−３５に導入した。また、ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｖ１８４Ａ／Ｗ１８７Ａ，Ｖ１８４Ａ／Ｎ４４２Ｄ，Ｖ１８４Ａ／Ｎ４４２Ｄ／Ｌ４３９Ｖの二重置換体、三重置換体も構築した。更に、Ｆ２０７ＶをｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ７−３５／Ｖ１８４Ａに導入した変異株も構築した。変異導入は、実施例１２（４５）と同様の方法で、鋳型はｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ７−３５又はｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｖ１８４Ａ、ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ７−３５／Ｖ１８４Ａを用い、各種変異型酵素に対応するプライマー（配列番号１３１，１５８、１３４，１５９、１４，１７０、１６８，１６９等）を用いて行った。得られた株及び既構築株は実施例６（２５）に記載の方法で培養した。【０２２７】
（５５）微生物菌体を用いるペプチドの生産  ＜Ａｌａ−Ｘ＞
（５３）、（５４）で得られた培養ブロス２０μｌを、５０ｍＭのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩（Ａｌａ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）、１００ｍＭのＬ−アミノ酸、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む４００μｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）に加え、２０℃にて１５分反応した。この反応で野生株において生成したジペプチド（Ａｌａ−Ｘ）の濃度（ｍＭ／Ｏ．Ｄ．）を表１８に示した。また、各種変異株におけるジペプチド生成については、野生株に対するジペプチドの生成濃度の比率を表１８に示した。【０２２８】
【表１８】
2006075486.tif 000041
【０２２９】
（５６）微生物菌体を用いるペプチドの生産  ＜Ａｌａ−Ｘ＞
実施例１４（４９）で効果のあった変異点Ｋ８３Ａ，Ｗ１８７Ａ，Ｆ２１１Ａ，Ｎ４４２ＤをｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ３５−４／Ｖ１８４Ａに導入した。また、変異点Ｎ４４２ＤをｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｖ１８４Ｐに導入した二重置換体も構築した。変異導入は（４５）と同様の方法で行い、鋳型はｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ３５−４／Ｖ１８４Ａ又はｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｖ１８４Ｐを用い、各種変異型酵素に対応するプライマーを用いて導入した。得られた株は実施例６（２５）に記載の方法で培養した。【０２３０】
（５７）微生物菌体を用いるペプチドの生産  ＜Ａｌａ−Ｘ＞
（５６）で得られた培養ブロス２０μｌを、５０ｍＭのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩（Ａｌａ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）、１００ｍＭのＬ−アミノ酸、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む４００μｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）に加え、２０℃にて１５分反応した。この反応で野生株において生成したジペプチド（Ａｌａ−Ｘ）の濃度（ｍＭ）を表１９に示した。また、各種変異株におけるジペプチド生成については、野生株に対するジペプチドの生成濃度の比率を表１９に示した。【０２３１】
【表１９】
2006075486.tif 000042
【０２３２】
（実施例１５）ランダムスクリーニング
（５８）ｐＴｒｐＴ＿Ｓｍ＿Ａｅｔランダムライブラリーの作製
変異型Ａｅｔを構築するために、ｐＴｒｐＴ＿Ｓｍ＿ＡｅｔまたはｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ３５−４／Ｖ１８４Ａプラスミドを、Ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ法を用いるランダム変異誘発法の鋳型として使用した。変異導入ライブラリーは実施例３（８）と同様の方法で作製した。【０２３３】
（５９）ｐＳＦＮ＿Ｓｍ＿Ａｅｔランダムライブラリーからのスクリーニング
（５８）で作製したライブラリーを、実施例３（９）と同様に培養して得られた培養液を用いて、以下に示す一次スクリーニング（Ａ）〜（Ｃ）のうちから選択された２種類のスクリーニングを実施し（Ａ／ＢあるいはＡ／Ｃ）、選抜を行った。【０２３４】
（６０）一次スクリーニングＡ
得られた菌液５μｌに、１０ｍＭ  Ｐｈｅｎｏｌ、６ｍＭ  ＡＰ、５ｍＭ  Ａｓｐ（ＯＭｅ）２、５ｍＭ  Ａｌａ−ＯＥｔ、７．５ｍＭ  Ｐｈｅ、３．６Ｕ／ｍｌ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、０．１６Ｕ／ｍｌ  ａｌｃｈｏｌ  ｏｘｉｄａｓｅ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  Ｂｏｒａｔｅを含む反応液（ｐＨ８．２）を２００μｌ添加し、２５℃にて約２０分反応後５００ｎｍの吸光度を測定し、メタノール放出量を算出した。ここではメタノールの放出量が多いものはＡｌａ−ＰｈｅよりもＡＭＰがより生成しやすい酵素として選抜した。【０２３５】
（６１）一次スクリーニングＢ
（６０）と同様に、得られた菌液５μｌに、１０ｍＭ  Ｐｈｅｎｏｌ、６ｍＭ  ＡＰ、５ｍＭ  Ａｓｐ（ＯＭｅ）２、５ｍＭ  Ａ（Ｍ）、３．６Ｕ／ｍｌ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、０．１６Ｕ／ｍｌ  ａｌｃｈｏｌ  ｏｘｉｄａｓｅ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  Ｂｏｒａｔｅを含む反応液（ｐＨ８．２）を２００μｌ添加し、２５℃にて約２０分反応後５００ｎｍの吸光度を測定し、メタノール放出量を算出した。ここではメタノールの放出量が少ないものはＡＭ（ＡＭ）が生成しにくい酵素として選抜した。【０２３６】
（６２）一次スクリーニングＣ
（６０）と同様に、得られた菌液５μｌに、１０ｍＭ  Ｐｈｅｎｏｌ、６ｍＭ  ＡＰ、５ｍＭ  Ａｓｐ（ＯＭｅ）２、３．６Ｕ／ｍｌ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、０．１６Ｕ／ｍｌ  ａｌｃｈｏｌ  ｏｘｉｄａｓｅ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  Ｂｏｒａｔｅを含む反応液（ｐＨ８．２）を２００μｌ添加し、２５℃にて約２０分反応後５００ｎｍの吸光度を測定し、メタノール放出量を算出した。ここではメタノールの放出量が少ないものはＡｓｐ（ＯＭｅ）２を分解しにくい酵素として選抜した。【０２３７】
（６３）二次スクリーニング
（６０）および（６１），（６２）にて選抜した株は、実施例６（２５）と同様な方法で培養し、その培養ブロス５０μｌを１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  と５０ｍＭ  Ａｓｐ（ＯＭｅ）２、５０ｍＭ  Ａｌａ−ＯＭｅ、７５ｍＭ  Ｐｈｅを含む１００ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍｌに懸濁し、２０℃にて１０分反応を行い、ＡＭＰ、Ａｌａ−Ｐｈｅ生成量を測定し、反応初速度の早い株を選抜した。【０２３８】
また、同様に培養した培養ブロスを１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  と５０ｍＭ  Ａｓｐ（ＯＭｅ）２、７５ｍＭ  Ｐｈｅを含む１００ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）に懸濁し（２．２Ｕ／ｍｌ反応液）、２０℃にて反応を行い、ＡＭＰ生成収率を測定し、生成収率上位株について変異点解析を実施し、以下の変異点を特定した。ｐＴｒｐＴ＿Ｓｍ＿Ａｅｔを鋳型としたライブラリーより、変異型２１，２２，２３（Ｐ２１４Ｔ，Ｑ２０２Ｅ，Ｙ４９４Ｆ）を備える変異株、ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ３５−４／Ｖ１８４Ａを鋳型としたライブラリーより、変異型３４５，３４６，３４７，３５０，３５１，３５２，３４３，３５４，３４８，３４９，３５３（Ｍ３５−４／Ｖ１８４Ａに対し、それぞれＡ１８２Ｇ，Ｋ３１４Ｒ，Ａ５１５Ｖ，Ｋ４８４Ｉ，Ｖ２１３Ａ，Ａ２４５Ｓ，Ｖ１７８Ｇ，Ｌ２６３Ｍ，Ｌ６６Ｆ，Ｓ３１５Ｒ，Ｐ２１４Ｈの各変異を組み合わせたもの）を備える変異株を取得した。この反応での、反応開始後２０分、４０分及び７０分後におけるＡＭＰ収率を各変異株について表２０−１及び表２０−２に示した。尚、Ｍ３５−４／Ｖ１８４Ａを、以下「Ａ１」と表すことがあるものとする。【０２３９】
【表２０−１】
2006075486.tif 000043
【０２４０】
【表２０−２】
2006075486.tif 000044
【０２４１】
（実施例１６）ラショナル変異株の構築
（６４）Ａ１８２，Ｐ１８３，Ｔ１８５への変異導入
Ｖ１８４Ａ変異を持つ株において、収率向上効果があったことから、周辺変異株を構築した。変異導入は（４５）と同様の方法で行い、鋳型はｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ３５−４／Ｖ１８４Ａを用い、各種変異型酵素に対応するプライマー（配列番号１７１−１９２）を用いて導入した。【０２４２】
（６５）微生物菌体を用いるペプチドの生産  ＜ＡＭＰ＞
実施例１５（６３）及び上記（６４）で得られた株は実施例６（２５）に記載の方法で培養した。培養ブロスを、４００ｍＭ  Ａｓｐ（ＯＭｅ）２塩酸塩、６００ｍＭ  Ｐｈｅを含む１００ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁し（１０Ｕ／ｍｌ反応液）、ＮａＯＨを用いてｐＨ８．５に維持しながら２５℃にて反応を行い、反応開始後２０分、４０分、８０分後におけるＡＭＰ生成収率を測定した。この反応でのＡＭＰ収率を表２１に示した。【０２４３】
【表２１】
2006075486.tif 000045
【０２４４】
（６６）微生物菌体を用いるペプチドの生産  ＜Ａｌａ−Ｘ＞
実施例１５（６３）及び上記（６４）で得られた株は実施例６（２５）に記載の方法で培養した。培養ブロス２０μｌを、５０ｍＭのＡｌａ−ＯＭｅ・ＨＣｌ、１００ｍＭのＬ−アミノ酸、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む４００μｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）に加え、２０℃にて１５分反応した。この反応でｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ３５−４／Ｖ１８４Ａにおいて生成したジペプチド（Ａｌａ−Ｘ）の濃度（ｍＭ）を表２２に示した。また、各種変異株におけるジペプチド生成については、Ｍ３５−４／Ｖ１８４Ａに対するジペプチドの生成濃度の比率を表２２に示した。【０２４５】
【表２２】
2006075486.tif 000046
【０２４６】
（実施例１７）変異組合せによる高活性株の構築Ｂ
（６７）組合せ変異株の構築
実施例１６（６６）でＭ３５−４／Ｖ１８４Ａ（Ａ１）と組み合わせた場合に効果のあった変異点Ｔ１８５Ｆ，Ａ１８２ＧをｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ３５−４／Ｖ１８４Ａ，ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ７−３５／Ｖ１８４Ａ，ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ３５−４／Ｖ１８４Ａ／Ｎ４４２Ｄに導入した。変異導入は（４５）と同様の方法で行い、各種変異型酵素に対応するプライマー（配列番号１８５，１８６、１９３，１９４、１９９，２００）を用いて導入した。得られた株は実施例６（２５）に記載の方法で培養した。【０２４７】
（６８）微生物菌体を用いるペプチドの生産  ＜Ａｌａ−Ｘ＞
（６７）で得られた培養ブロス２０μｌを、５０ｍＭのＡｌａ−ＯＭｅ・ＨＣｌ、１００ｍＭのＬ−アミノ酸、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む４００μｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）に加え、２０℃にて１５分反応した。この反応で野生株において生成したジペプチド（Ａｌａ−Ｘ）の濃度（ｍＭ）を表２３に示した。また、各種変異株におけるジペプチド生成については、野生株に対するジペプチドの生成濃度の比率を表２３に示した。【０２４８】
【表２３】
2006075486.tif 000047
【０２４９】
（６９）基質増加時のジペプチド生産  ＜Ａｌａ−Ｘ＞
ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ａｅｔ，ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ３５−４／Ｖ１８４Ａ，ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ７−３５／Ｖ１８４Ａ／Ａ１８２Ｇを実施例６（２５）で示した方法で培養した。培養ブロス５又は２０μｌを、５０ｍＭのＡｌａ−ＯＭｅ・ＨＣｌ、１００−４００ｍＭのＬ−アミノ酸、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む４００μｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）に加え、２０℃にて１時間反応した。この反応で生成したジペプチド（Ａｌａ−Ｘ）の濃度（ｍＭ）を表２４に示した。【０２５０】
【表２４】
2006075486.tif 000048
【０２５１】
（実施例１８）基質特異性の把握
（７０）変異型酵素を用いた各種ジペプチド生産
カルボキシ成分に各種のＬ−アミノ酸メチルエステル、アミン成分にＬ−アミノ酸を用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例６（２５）に記載した方法で培養した培養ブロス２０又は４０μｌを、表２５に示す５０ｍＭのＬ−アミノ酸メチルエステル塩酸塩（Ｘ−ＯＭｅ・ＨＣｌ）、１００ｍＭのＬ−アミノ酸、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む４００μｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５又は９．０）に加え、２０℃にて反応した。この反応で生成した各種ジペプチドの生産量を表２５に示した。なお、酵素はｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ａｅｔ，ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ１２−１（実施例７（３２）），ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ３５−４／Ｖ１８４Ａ（実施例１０（３９））を用い、Ｖａｌ−Ｍｅｔ，Ｍｅｔ−Ｍｅｔ生成反応においてはｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｆ２０７Ｖ（実施例６（２４）），ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ３５−４／Ｖ１８４Ａ／Ｆ２０７Ｖも用いた。【０２５２】
【表２５】
2006075486.tif 000049
【０２５３】
（実施例１９）Ａｒｇ−Ｇｌｎ生産
（７１）微生物菌体を用いるペプチドの生産  ＜Ａｒｇ−Ｇｌｎ＞
ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ａｅｔ，ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ３５−４／Ｖ１８４Ａを、実施例６（２５）に記載した方法で培養した。培養ブロス１ｍｌを、１０ｍＭ  ＥＤＴＡと１００，２００ｍＭ  アルギニンメチルエステル、１５０−３００ｍＭ  Ｇｌｎを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）９ｍｌに懸濁し、２０℃にて３時間反応を行った。なお、反応に伴ってｐＨが低下するため、２５％ＮａＯＨ溶液にて、ｐＨ９．０に維持しながら反応した。この反応で生成したＡｒｇ−Ｇｌｎ濃度及び収率を表２６に示した。【０２５４】
【表２６】
2006075486.tif 000050
【０２５５】
（実施例２０）精製酵素を用いたペプチドの生産
（７２）酵素の精製
野生株、ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ３５−４／Ｖ１８４Ａ、ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ７−３５／Ｖ１８４Ａ／Ａ１８２Ｇ株は、ＬＢプレートにてリフレッシュし、ｔｅｒｒｉｆｉｃ  ｂｒｏｔｈ  ５０ｍｌに一白金耳植菌し、２５℃にて１８時間培養した。培養液は集菌し、菌体を１００ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．５）にて懸濁後、ソニケーターにて破砕した（１８０Ｗ／３０分）。溶液を回収し、２００，０００ｇ、２０分、４℃の超遠心分離により、上清を可溶性画分とした。以下の操作は特に明記しない場合には、４℃あるいは氷上で操作を行った。また、下記カラムによる分画操作は、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１００を使用した。【０２５６】
得られた可溶性画分を、あらかじめ１００ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．５）にて平衡化したＣＨＴ５−Ｉ（５ｍｌ、１０×６４ｍｍ）に供し、流速１ｍｌ／分の条件にて１００ｍＭ  ＫＰＢ緩衝液で非吸着タンパク質を溶出した後、カラム容量の２５倍での１００−５００ｍＭ  ＫＰＢ緩衝液の直線的濃度勾配にて吸着タンパクを溶出した。
ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーにて分離した活性画分を、終濃度２Ｍ硫酸アンモニウムとなるように調整し、あらかじめ１００ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．５）、２Ｍ硫酸アンモニウムにて平衡化したＨｉｃ−ｒｅｓｏｕｒｓｅ−Ｐｈｅ（１ｍｌ）に供し、流速１ｍｌ／分の条件にて非吸着タンパク質を溶出した後、カラム容量の６０倍での２Ｍ−０Ｍ硫酸アンモニウムを含むＫＰＢ緩衝液の直線的濃度勾配にて溶出した。【０２５７】
疎水クロマトグラフィーにて分離した画分を、あらかじめ２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ６．５）、５００ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化したＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｄｅｒｄｅｘ−２００ｐｇ（カラム体積１２０ｍｌ、１６ｍｍ×６００ｍｍ）に供した。流速０．７５ｍｌ／分の条件にてタンパク質を溶出させ、活性画分を回収した。活性画分は濃縮後、２０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ６．５）に対して透析した。以下に示すＵｎｉｔは、Ａｌａ−Ｇｌｎ生成反応時のＵｎｉｔを示す。【０２５８】
（７３）精製酵素を用いたペプチドの生産  ＜ＨＩＬ−Ｐｈｅ＞
ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ３５−４／Ｖ１８４Ａ精製酵素０．８４又は４．２Ｕ（１，５μｌ）を、５０ｍＭのＨＩＬ（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−Ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）がラクトン化したもの、１００ｍＭ  Ｐｈｅ、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１５０μｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）に加え、２０℃にて１時間反応した。この反応で生成したＨＩＬ−Ｐｈｅの濃度を表２７に示した。【０２５９】
【表２７】
2006075486.tif 000051
【０２６０】
（７４）精製酵素を用いたペプチドの生産  ＜Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）＞
ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ３５−４／Ｖ１８４Ａ精製酵素０．８４又は４．２Ｕ（１，５μｌ）を、５０ｍＭのＧｌｙ−ＯＭｅ、１００ｍＭ  Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１５０μｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）に加え、２０℃にて反応した。この反応で生成したＧｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）の濃度をＧｌｙ−Ｓｅｒ換算で表２８に示した。【０２６１】
【表２８】
2006075486.tif 000052
【０２６２】
（７５）精製酵素を用いたトリペプチドの生産  ＜Ａｌａ−Ｘ−Ｘ＞
ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ３５−４／Ｖ１８４Ａ又はｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ７−３５／Ｖ１８４Ａ／Ａ１８２Ｇ精製酵素０．８４又は４．２Ｕ（１，５μｌ）を、５０ｍＭのＡｌａ−ＯＭｅ、１００ｍＭ  Ｘ−Ｘ、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１５０μｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）に加え、２０℃にて反応した。この反応で生成したトリペプチド（Ａｌａ−Ｘ−Ｘ）の濃度を表２９に示した。【０２６３】
【表２９】
2006075486.tif 000053
【０２６４】
（７６）精製酵素を用いたトリペプチドの生産
ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ３５−４／Ｖ１８４Ａ精製酵素０．８４又は４．２Ｕ（１，５μｌ）を、５０ｍＭのＡｌａ−ＯＭｅ、５０ｍＭ  Ｘ−Ｘ、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１５０μｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）に加え、２０℃にて反応した。この反応で生成したトリペプチドの濃度を表３０に示した。【０２６５】
【表３０】
2006075486.tif 000054
【０２６６】
（７７）精製酵素を用いたペプチドの生産  ＜Ａｌａ−Ｘ−Ｘ＞
ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ３５−４／Ｖ１８４Ａ精製酵素０．８４又は４．２Ｕ（１，５μｌ）を、１００ｍＭのＡｌａ−ＯＭｅ、１００ｍＭ  Ｘ−Ｘ、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１５０μｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）に加え、２０℃にて反応した。この反応で生成したトリペプチド（Ａｌａ−Ｘ−Ｘ）の濃度を表３１に示した。【０２６７】
【表３１】
2006075486.tif 000055
【０２６８】
（７８）精製酵素を用いたテトラペプチドの生産  ＜ＧＧＦＭ＞
ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ３５−４／Ｖ１８４Ａ精製酵素４．２Ｕ（５μｌ）を、１００ｍＭのＧｌｙ−ＯＭｅ、４０ｍＭ  ＧＦＭ、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１５０μｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）に加え、２０℃にて反応した。この反応で生成したテトラペプチド（ＧＧＦＭ）の濃度を表３２に示した。【０２６９】
【表３２】
2006075486.tif 000056
【０２７０】
（７９）精製酵素を用いたペンタペプチドの生産  ＜Ｍｅｔ−Ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ＞
ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ３５−４／Ｖ１８４Ａ精製酵素４．２Ｕ（５μｌ）を、５０ｍＭのＴｙｒ−ＯＭｅ、５ｍＭ  ＧＧＦＭ、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１５０μｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）に加え、２０℃にて反応した。この反応で生成したペンタペプチド（ＹＧＧＦＭ）の濃度を表３３に示した。【０２７１】
【表３３】
2006075486.tif 000057
【０２７２】
（実施例２１）Ｘ線結晶構造解析
（１）  配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を高発現させたエシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株を１Ｌ培養し、その菌体から、下記の手順で同タンパク質を精製した。【０２７３】
（１−１）  ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー
上記の菌体を「１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）」（バッファーＡ）中で破砕し、その可溶性画分１００ｍｌを、バッファーＡで平衡化したハイドロキシアパタイトカラムＢｉｏ−Ｓｃａｌｅ  ＣＨＴ−Ｉ（バイオラッド製、ＣＶ＝５ｍｌ）に供して担体に吸着させた。リン酸カリウム緩衝液の濃度を１００ｍＭから５００ｍＭまで直線的に変化させて（２５ＣＶ）、吸着したタンパク質の溶出を行った。２８０ｎｍの吸光度により、タンパク質のピークを検出し、その画分を分取した。【０２７４】
（１−２）疎水性クロマトグラフィー
（１−１）で分取した画分を、５倍量の「２Ｍ硫酸アンモニウムを添加した１００ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）」（バッファーＢ）と、混合した。この溶液をバッファーＢで平衡化した疎水性クロマトグラフィーカラムＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＰＨＥ（アマシャム製、ＣＶ＝1ｍｌ）に供した。この操作により目的タンパク質は担体に吸着した。続いて、硫酸アンモニウムの濃度を２Ｍから０Ｍまで直線勾配で減少させ（６０ＣＶ）、タンパク質を溶出させ、その画分を分取した。【０２７５】
（１−３）  陽イオン交換クロマトグラフィー  ：Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｓ
（１−２）で分取した画分を、「２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）」（バッファーＣ）に対して、一晩透析した。この溶液をバッファーＣで平衡化した陽イオン交換カラムＲＥＳＯＵＲＣＥ  Ｓ（アマシャム製、ＣＶ＝１ｍｌ）に供した。塩化ナトリウム濃度を０ｍＭから５００ｍＭまで直線的に変化させて（５０ＣＶ）、吸着したタンパク質の溶出を行った。２８０ｎｍの吸光度により、タンパク質のピークを検出し、その画分を分取した。【０２７６】
精製各段階の画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認したところ、（１−３）の後に得られた精製タンパク質は、約７０ｋＤａの位置にＣＢＢ染色でほぼ単一なバンドとして検出された。取得したタンパク質溶液は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に対して４℃で一晩透析した。上記の操作により、約３０ｍｇの精製タンパク質を取得した。【０２７７】
（２）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の結晶化
（１）で得られた精製タンパク質溶液を、限外ろ過器ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ（ミリポア製、分画分子量１０ｋＤａ）を用いて４℃で４０ｍｇ／ｍｌ程度にまで濃縮した。得られた濃縮タンパク質溶液を用いて、タンパク質濃度、沈殿剤、ｐＨ、温度、添加剤等の様々なパラメータを変化させ、結晶化条件を探索した。その結果、を１２−１８％  ＰＥＧ６０００、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）の組成の沈殿剤溶液に対して、タンパク質溶液１μＬ、０．２％の  Ｏｃｔｙｌ  β  Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅを含む沈殿剤溶液１μＬを混合したドロップレットを、２０℃で平衡化した、ｈａｎｇｉｎｇ  ｄｒｏｐ蒸気拡散法により、１週間程度で０．２ｍｍ×０．２ｍｍ×０．２ｍｍにまで成長する六角柱状晶を取得した。【０２７８】
（３）配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質のＸ線結晶構造解析
タンパク質の結晶は、常温測定では、Ｘ線損傷により結晶が劣化し、徐々に分解能が下がるため、低温条件下でのＸ線回折強度測定を行った。結晶を、２０％  グリセロール、２０％  ＰＥＧ６０００、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）、及び０．４％  Ｏｃｔｙｌ  β  Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅを含む溶液に移した後、−１７３℃の窒素ガスを吹き付け、急速冷却した。大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構（つくば市）放射光研究施設のビームライン５に設置されたＡＤＳＣ社製の３１５型ＣＣＤ検出器を用いて、結晶のＸ線回折データを収集した。Ｘ線の波長は１．０Åに設定し、結晶からＣＣＤ検出器までの距離は４５０ｍｍとした。１フレームの画像データに対しては振動角１．０°で２０秒間露光し、１５０フレーム分のデータを集めた。結晶学的パラメータは、空間群がＰ６５２２、格子定数がａ＝１０４．３２４Å、ｃ＝６１５．９３１Åとなった。非対称単位に２個のタンパク質分子が含まれているとすると、結晶の水分含有率は６５％である。結晶は３．０Å程度まで回折した。プログラムＨＫＬ２０００（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，第２７６巻  第３０７〜３２６頁（１９９７））を用いて、データを処理した。データの質の指標であるＲｍｅｒｇｅの値は，５０．０〜３．０Å分解能で０．１０６、最外郭シェルの３．１１〜３．００Å分解能で０．４５０となった。データの完全率は、５０．０〜３．０Å分解能で９７．２％、最外郭シェルの３．１１〜３．００Å分解能で８１．１％となった。【０２７９】
分子置換法によって構造解析を行った。タンパク質構造解析プログラムパッケージＣＣＰ４（Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  Ｓｅｃｔ．  Ｄ、第５０巻、第７６０〜７６３頁（１９９４））に含まれる分子置換法用プログラムＡＭＯＲＥ（Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  Ｓｅｃｔ．Ａ、第５０巻、第１５７〜１６３頁（１９９４））を用いた。参照構造としては、αアミノ酸エステル加水分解酵素のＳ２０５Ａ変異体（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋのエントリー番号：１ＮＸ９）を利用した。αアミノ酸エステル加水分解酵素は４量体構造をとっているのに対し、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は２量体構造をとっている。αアミノ酸エステル加水分解酵素の単量体構造をモデルとした場合には、有望な解は見い出せなかった。αアミノ酸エステル加水分解酵素４量体からは、３種類の２量体構造を切り出すことが出来る。そこで、この３種の２量体を用いた分子置換法を試みた。その結果、１ＮＸ９坐標データ中のＡ、Ｄ分子からなる２量体をモデルとした場合に、幾つかの観点（第一解のコントラストの良さ、空間群による差が明確、分子間のぶつかりが無い等）から、有望な解が見出された。得られた初期位相に基づき、３．０Å分解能の電子密度図を計算し、Ａｃｃｅｌｒｙｓ社製のコンピュータグラフィクスプログラムＱＵＡＮＴＡ上で、電子密度図を描いた。同グラフィックス上での分子モデルの修正と、Ａｃｃｅｌｒｙｓ社製のプログラムＣＮＸを用いての精密化を繰り返し、構造解析を進めた。【０２８０】
（４）Ｌｙｓ残基を還元ジメチル化した配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の結晶化
タンパク質のＬｙｓ残基を還元ジメチル化すると、結晶性が改善される場合があることが報告されている（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３２巻、第９８５１〜９８５８頁（１９９３））。同法に従い、水素化ホウ素ナトリウム、ホルムアルデヒドを用いて、上記で得られた精製タンパク質溶液のＬｙｓ残基を還元ジメチル化し、結晶化実験に供した。その結果、１５％  ＰＥＧ６０００、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）の組成の沈殿剤溶液に対して、タンパク質溶液１μＬ、０．２％の  Ｏｃｔｙｌ  β  Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅを含む沈殿剤溶液１μLを混合したドロップレットを平衡化した、ｈａｎｇｉｎｇ  ｄｒｏｐ蒸気拡散法により、１週間程度で０．４ｍｍ×０．２ｍｍ×０．１ｍｍにまで成長する板状晶を取得した。【０２８１】
（５）Ｌｙｓ残基を還元ジメチル化した配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質のＸ線結晶構造解析
結晶を、２０％  グリセロール、２０％  ＰＥＧ６０００、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）、及び０．４％  Ｏｃｔｙｌ  β  Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅを含む溶液に移した後、−１７３℃の窒素ガスを吹き付け、急速冷却した。財団法人高輝度光科学研究センター（兵庫県佐用郡）のシンクロトロン放射光施設ＳＰｒｉｎｇ―８のビームライン２４ＸＵに設置されたリガク製のＲ−ＡＸＩＳ  Ｖ型イメージングプレート検出器を用いて、結晶のＸ線回折データを収集した。Ｘ線の波長は０．８２７Åに設定し、結晶からイメージングプレート検出器までの距離は５００ｍｍとした。１フレームの画像データに対しては振動角１．０°で９０秒間露光し、１８０フレーム分のデータを集めた。結晶学的パラメータは、空間群がＰ２１、格子定数がａ＝７４．４７６Å、ｂ＝２１３．８９２Å、ｃ＝９０．４２７Åとなった。非対称単位に４個のタンパク質分子が含まれているとすると、結晶の水分含有率は５３％である。結晶は３．０Å程度まで回折した。リガク製のプログラムＣｒｙｓｔａｌＣｌｅａｒを用いて、データを処理した。データの質の指標であるＲｍｅｒｇｅの値は，４０．０〜３．０Å分解能で０．０９７、最外郭シェルの３．１１〜３．００Å分解能で０．３０９となった。データの完全率は、４０．０〜３．０Å分解能で９６．８％、最外郭シェルの３．１１〜３．００Å分解能で９５．８％となった。【０２８２】
分子置換法によって構造解析を行った。タンパク質構造解析プログラムパッケージＣＣＰ４（Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｄ、第５０巻、第７６０〜７６３頁（１９９４））に含まれる分子置換法用プログラムＡＭＯＲＥ（Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ａ、第５０巻、第１５７〜１６３頁（１９９４））を用いた。参照構造としては、αアミノ酸エステル加水分解酵素のＳ２０５Ａ変異体（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋのエントリー番号：１ＮＸ９）を利用した。αアミノ酸エステル加水分解酵素の単量体構造をモデルとした場合には、有望な解は見い出せなかった。そこで、αアミノ酸エステル加水分解酵素４量体から切り出される３種の２量体を用いて、分子置換法を試みた。その結果、上記と同様、１ＮＸ９座標データ中のＡ、Ｄ分子からなる２量体をモデルとした場合に、解が見出された。この結果は、分子置換法の成功を示すと共に、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の２量体構造が明らかにされたことを意味している。得られた初期位相に基づき、３．０Å分解能の電子密度図を計算し、Ａｃｃｅｌｒｙｓ社製のコンピュータグラフィクスプログラムＱＵＡＮＴＡ上で、電子密度図を描いた。同グラフィックス上での分子モデルの修正と、Ａｃｃｅｌｒｙｓ社製のプログラムＣＮＸを用いての精密化を繰り返し、構造解析を進めた。本結晶構造の原子座標を、図４及び図５に示した。尚、図４中、位置７９−８２の残基を濃い灰色で、その他の残基を薄い灰色で表示し、図５中、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−メチルエステル（i.e.,  α-L-(β-O-methyl  aspartyl)-L-phenylalanine（略称：α−ＡＭＰ）をＡＭＰ（グレー；ball-and-stick表示）、カタリティックトライアドを活性部位（CPK表示）として表示した。【０２８３】
（実施例２２）  立体構造情報を用いたラショナル変異株の作製
配列番号２０８に記載された全アミノ酸配列のうち、活性部位に近接する１３４残基（黒色）に関して、下記の実施例２２に記載したようにラショナル変異にて改変体を作製した。
（１）立体構造情報に基づいたラショナル変異法
ＡＭＰの生成量を向上させるため、立体構造情報に基づいて配列番号２０８に記載のアミノ酸配列（以下ｐＡ１と表記）に対して部位特異的変異を導入することにした。配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の相同性は高く、４個の置換が施されているにすぎない。そこで、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からｐＡ１の発現する変異型ペプチド生成酵素（以下Ａ１と表記）の立体構造情報を推定し、活性中心であるカタリティックトライアドのＳｅｒ１５８から１５Å以内に位置する１３４個のアミノ酸残基（図５の黒色部分）：６７−７０、７２−８８、１００、１０２、１０３、１０６、１０７、１１３−１１７、１３０、１５５−１６３、１６５、１６６、１８０−１８８、１９０−１９５、２００−２３５、２５９、２７３、２７６、２７８、２９２−２９４、２９６、２９８、２９９、３００−３０４、３２５−３２８、３３０−３４０、４３７−４４７をＡＭＰ生成に寄与する残基と予測し、これらの残基に対して部位特異的変異を導入することにした。各残基において置換したアミノ酸の種類については表３４−１及び３４−２に示した。【０２８４】
【表３４−１】
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【０２８５】
【表３４−２】
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【０２８６】
（２）  各シングル変異株の作製
変異型Ａ１を作製するため、ＰＣＲに用いる部位特異的突然変異誘発法の鋳型としてｐＡ１を使用した。変異はストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社（アメリカ）の「クイックチェンジ部位特異的突然変異誘発キット（Ｑｕｉｋ  ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）」を使用し、製造元のプロトコールに従った。各残基における部位特異的変異の導入には、変異コドンを中央に含み、前後に１５ｍｅｒを加えた、合計３３ｍｅｒのプライマーを用いた。各変異点において用いたプライマーを表４６に示した。尚、表４６中の各プライマーを構成する塩基配列は配列表にも示されており、表の上段から下段の方向へ、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの順に、配列番号２１０から４８３に対応する。各プライマーの配列の中央部の変異コドン「ｘｘｘ」（配列番号２１０から４８３の塩基配列中の「ｎｎｎ」部分）には、置換する各アミノ酸残基の種類に対応するコドンが導入される。すなわち、すなわち、導入したいアミノ酸残基の種類に応じて、各プライマー配列中の「ｘｘｘ」の部分に対応するコドンの配列を導入したものを用いた。アミノ酸残基に対応する各コドンは、表４４に示すとおりである。ＰＣＲ反応の生成物を用いて、エシェリヒア・コリＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性を指標として目的のプラスミドを有する株を選択した。【０２８７】
（３）  菌体の取得
各変異株を２ｍｌのｔｅｒｒｉｆｉｃ培地（１２ｇ／ｌトリプトン、２４ｇ／ｌ酵母エキス、２．３ｇ／ｌリン酸酸二水素カリウム、１２．５ｇ／ｌリン酸水素二カリウム、４ｇ／ｌグリセロール、１００ｍｇ／ｌアンピシリン）を張り込んだ普通試験管に一白金耳植菌し、２５℃、１５０往復／分で１８時間の本培養を行った。【０２８８】
（４）  各変異株における比活性の測定  
１ｍＬの低濃度反応液（５０ｍＭアスパラギン酸ジメチルエステル、７５ｍＭフェニルアラニン）に５０μＬの各変異株のブロスを添加し、温度２０℃、初期ｐＨ８．５で反応を行った。反応開始１５分後のＡＭＰ生成量をＨＰＬＣにより定量し、各シングル変異株の比活性（Ｕ／ｍＬ）を算出した。なお、酵素のユニット数（Ｕ）は、１分間に生成物ＡＭＰを１μｍｏｌ作ることができる酵素の量を１Ｕと定義した。【０２８９】
（５）  低濃度反応液における各シングル変異株ＡＭＰ収率の測定
まず、得られた比活性のデータをもとに各変異株を２Ｕにするのに必要なブロス量を算出した。次に、算出したブロス量を１ｍＬの低濃度反応液に添加し、温度２０℃、初期ｐＨ８．５で反応を行った。反応開始２５分および４５分後のＡＭＰ生成量をＨＰＬＣにより定量し、Ａ１よりも収量が高い変異体を表３５−１〜３５−７にまとめた。これらは、ＡＭＰ生成反応に寄与する重要な変異体と判明した。【０２９０】
【表３５−１】
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【０２９１】
【表３５−２】
2006075486.tif 000061
【０２９２】
【表３５−３】
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【０２９３】
【表３５−４】
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【０２９４】
【表３５−５】
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【０２９５】
【表３５−６】
2006075486.tif 000065
【０２９６】
【表３５−７】
2006075486.tif 000066
【０２９７】
（６）収率向上率の算出
シングル変異体１１３７種のうち、Ａ１よりも収率が向上した変異体として３３５種取得した。収率向上率は３３５×１１３７＝０．２９である。一方、各残基ごとに収率向上率を算出した結果を表３６及び表３７にまとめた。収率向上率は各残基ごとに大きく異なり、例えば４０％以上の確率で収率が向上する部位は４７箇所存在した。３０％以上では５９箇所、２０％以上では７１箇所にも達した。収率向上確率として２０％を越える部位に関しては、非常に高い確率で収率を向上させることが可能であり、産業上極めて重要な変異点と判断することができる。【０２９８】
【表３６−１】
2006075486.tif 000067
【０２９９】
【表３６−２】
2006075486.tif 000068
【０３００】
【表３７−１】
2006075486.tif 000069
【０３０１】
【表３７−２】
2006075486.tif 000070
【０３０２】
（７）  ダブル変異株の作製
さらなる収率向上株の取得を目指し、ＡＭＰの収率が向上した変異点を相互に組み合わせてダブル変異株を作製した（表３７）。例えば、ＡＭＰの収率が大きく向上した変異点であるＩ１５７ＬとＹ３２８Ｆを組み合わせる場合、ｐＡ１／Ｉ１５７Ｌに対してＹ３２８Ｆを導入するために使用したプライマーを用いて、実施例２２の（２）に記載した方法によりＰＣＲおよび形質転換を行い、アンピシリン耐性を指標として目的のプラスミドを有する株を選択した。【０３０３】
（８）  各ダブル変異株における比活性の測定
実施例２２の（４）に記載した方法によって、各ダブル変異株の比活性（Ｕ／ｍＬ）を算出し、表３８に示した。【０３０４】
（９）  低濃度反応液における各ダブル変異株ＡＭＰ収率の測定
まず、得られた比活性のデータをもとに各変異株を２Ｕにするのに必要なブロス量を算出した。次に、算出したブロス量を１ｍＬの低濃度反応液に添加し、温度２０℃、初期ｐＨ８．５で反応を行った。反応開始２５分および４５分後のＡＭＰ生成量をＨＰＬＣにより定量し、Ａ１よりも収量が高い変異体を表３８にまとめた。これらは、２残基の変異を組み合わせることによっても収率が向上する変異であると判明した。【０３０５】
（１０）  多重変異株の作製
より一層の収率向上株の取得を目指し、ＡＭＰの収率が向上した組み合わせ可能な変異点を相互に組み合わせて多重変異株を作製した（表３８）。例えば、ＡＭＰの収率が大きく向上した変異点であるＹ８１Ａ／Ｙ３２８Ｆに対してＩ１５７Ｌを組み合わせる場合、ｐＡ１／Ｙ８１Ａ／Ｙ３２８Ｆに対してＩ１５７Ｌを導入するために使用したプライマーを用いて、実施例２２の（２）に記載した方法によりＰＣＲおよび形質転換を行い、アンピシリン耐性を指標として目的のプラスミドを有する株を選択した。同様に、反応開始２５分および４５分後のＡＭＰ生成量をＨＰＬＣにより定量し、Ａ１よりも収量が高い変異体を表３８にまとめた。これらは、３残基以上の変異を組み合わせることによっても収率が向上する変異であると判明した。【０３０６】
【表３８−１】
2006075486.tif 000071
【０３０７】
【表３８−２】
2006075486.tif 000072
【０３０８】
【表３８−３】
2006075486.tif 000073
【０３０９】
【表３８−４】
2006075486.tif 000074
【０３１０】
【表３８−５】
2006075486.tif 000075
【０３１１】
【表３８−６】
2006075486.tif 000076
【０３１２】
【表３８−７】
2006075486.tif 000077
【０３１３】
【表３８−８】
2006075486.tif 000078
【０３１４】
【表３８−９】
2006075486.tif 000079
【０３１５】
【表３８−１０】
2006075486.tif 000080
【０３１６】
【表３８−１１】
2006075486.tif 000081
【０３１７】
【表３８−１２】
2006075486.tif 000082
【０３１８】
（１１）  高濃度反応液における各変異株ＡＭＰ収率の測定
まず、得られた比活性のデータをもとに各変異株を２００Ｕにするのに必要なブロス量を算出した。次に、算出したブロス量を５ｍＬにまで濃縮した。１５ｍＬの高濃度反応液（４００ｍＭアスパラギン酸ジメチルエステル、６００ｍＭフェニルアラニン）に各変異株の濃縮したブロスを添加し、温度２２℃、初期ｐＨ８．５で反応を行った。反応が進むにつれてｐＨが低下するが、６Ｍ  ＮａＯＨを添加することによって、常時ｐＨ８．５を維持した。反応開始４０分、６０分、および８０分後のＡＭＰ生成量をＨＰＬＣにより定量し、Ａ１よりも収率が向上した変異体を表３９及び表４０にまとめた。【０３１９】
【表３９】
2006075486.tif 000083
【０３２０】
【表４０−１】
2006075486.tif 000084
【０３２１】
【表４０−２】
2006075486.tif 000085
【０３２２】
（実施例２３）
（Ｆ１）ラショナル変異を用いたジペプチドの生産
実施例２２にて得られた変異株（Ａ１，Ａ１／Ｉ１５７Ｌ，Ａ１／Ｇ１６１Ａ，Ａ１／Ｙ３２８Ｆ）は、実施例６（２５）に記載の方法で培養した。培養ブロス５又は１０μｌを、５０ｍＭのＡｌａ−ＯＭｅ・ＨＣｌ、１００ｍＭのＬ−アミノ酸、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む２００μｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）に加え、２０℃にて３０分反応した。この反応で、反応開始後５分、１０分、及び３０分の時点で生成したジペプチド（Ａｌａ−Ｘ）の濃度を表４１に示した。【０３２３】
【表４１】
2006075486.tif 000086
【０３２４】
（実施例２４）変異の組合せによる高活性株の構築
（Ｆ２）ランダムスクリーニング変異点組合せ株の構築
様々な変異を組合わせた株を構築するため、ｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ｍ３５−４／Ｖ１８４Ａ／Ｉ１５７Ｌ（Ａ１／Ｉ１５７Ｌ）を、ＰＣＲを用いる部位特異的突然変異誘発法の鋳型として使用した。
変異導入は実施例７（２９）と同様の方法で行い、各種変異型酵素に対応するプライマー（配列番号１９３，１９５−１９８）を用いて導入し、ランダムな組み合わせ株ライブラリーを得た。【０３２５】
（Ｆ３）組合わせ変異ライブラリーからのスクリーニング
（Ｆ２）で作製したライブラリーを、実施例３（９）と同様に培養し、得られた培養液を用いて、２種類のスクリーニングを実施し（下記（Ｆ４）及び（Ｆ５）参照）選抜を行った。【０３２６】
（Ｆ４）一次スクリーニングＡ
得られた菌液５μｌに、１０ｍＭ  Ｐｈｅｎｏｌ、６ｍＭ  ＡＰ、５ｍＭ  Ａｓｐ（ＯＭｅ）２、３０ｍＭ  Ｐｈｅ、６．１２Ｕ／ｍｌ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、０．２１Ｕ／ｍｌ  ａｌｃｈｏｌ  ｏｘｉｄａｓｅ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  Ｂｏｒａｔｅを含む反応液（ｐＨ８．２）を２００μｌ添加し、２５℃にて約２０分反応後５００ｎｍの吸光度を測定し、メタノール放出量を算出した。【０３２７】
（Ｆ５）一次スクリーニングＢ  
得られた菌液５μｌに、１０ｍＭ  Ｐｈｅｎｏｌ、６ｍＭ  ＡＰ、５ｍＭ  Ａｓｐ（ＯＭｅ）２、５ｍＭ  Ａｌａ−ＯＥｔ、３０ｍＭ  Ｐｈｅ、６．１２Ｕ／ｍｌ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、０．２１Ｕ／ｍｌ  ａｌｃｈｏｌ  ｏｘｉｄａｓｅ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  Ｂｏｒａｔｅを含む反応液（ｐＨ８．２）を２００μｌ添加し、２５℃にて約２０分反応後５００ｎｍの吸光度を測定し、メタノール放出量を算出した。
（Ｆ４），（Ｆ５）両方を実施し、（Ｆ４）／（Ｆ５）の値が親株（Ａ１＋Ｉ１５７Ｌ）よりも大きいものは、Ａｌａ−ＰｈｅよりもＡＭＰがより生成しやすい酵素として選抜した。【０３２８】
（Ｆ６）二次スクリーニング  
上記方法で一次スクリーニングしたのち、選抜した株を実施例６（２５）に記載した方法で培養し、その培養ブロス２Ｕ分を１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  と５０ｍＭ  Ａｓｐ（ＯＭｅ）２、７５ｍＭ  Ｐｈｅを含む１００ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）に最終ボリュームが１ｍｌとなるように懸濁し、２０℃にてＡＭＰ生成量を測定した。ＡＭＰ生成量の多い株を選抜とし、選抜株はシーケンスにより変異点の組み合わせを特定し、その変異点を表３４に記載した。以後、本選抜株をＦ２２と記載し、Ｆ２２株のＡＭＰ生成量を表４２に示した。【０３２９】
【表４２】
2006075486.tif 000087
【０３３０】
（Ｆ７）ラショナル変異株との組合せ  
実施例２２において効果のあった変異点Ｙ３２８Ｆ，Ｙ８１Ａ，Ｔ２１０Ｌを、Ｆ２２株へ導入した。変異導入は（４５）と同様の方法で行い、各種変異型酵素に対応するプライマー（配列番号２０１−２０６）を用いて導入した。得られた株は実施例６（２５）に記載の方法で培養した。得られた培養ブロスを、４００ｍＭ  Ａｓｐ（ＯＭｅ）２モノメチル硫酸塩、４００ｍＭ  Ｐｈｅを含む溶液に懸濁し（１８Ｕ／ｍｌ反応液）、ＮＨ４ＯＨを用いてｐＨ８．５に維持しながら２２℃にて反応を行い、ＡＭＰ生成収率を測定した。この反応でのＡＭＰ収率を表４３に示した。【０３３１】
【表４３】
2006075486.tif 000088
【０３３２】
＜略称一覧＞
Asp(OMe)2・ＨＣｌ：Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジメチルエステル塩酸塩
Ala-OEt：Ｌ−アラニン−エチルエステル
Ala-OMe：Ｌ−アラニン−メチルエステル
Tyr-OMe：Ｌ−チロシン−メチルエステル
Gly-OMe：グリシン−メチルエステル
Phe-OMe：Ｌ−フェニルアラニン−メチルエステル
ＡＭＰ：α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステル
Ala-Gln：Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン
Ala-Phe：Ｌ−アラニル−Ｌ−フェニルアラニン
Phe-Met：Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−メチオニン
Leu-Met：Ｌ−ロイシル−Ｌ−メチオニン
Ile-Met：Ｌ−イソロイシル−Ｌ−メチオニン
Met-Met：Ｌ−メチオニル−Ｌ−メチオニン
Pro-Met：Ｌ−プロリル−Ｌ−メチオニン
Trp-Met：Ｌ−トリプトファニル−Ｌ−メチオニン
Val-Met：Ｌ−バリル−Ｌ−メチオニン
Asn-Met：Ｌ−アスパラギニル−Ｌ−メチオニン
Cys-Met：Ｌ−システイニル−Ｌ−メチオニン
Gln-Met：Ｌ−グルタミル−Ｌ−メチオニン
Gly-Met：グリシル−Ｌ−メチオニン
Ser-Met：Ｌ−セリル−Ｌ−メチオニン
Thr-Met：Ｌ−スレオニル−Ｌ−メチオニン
Tyr-Met：Ｌ−チロシニル−Ｌ−メチオニン
Asp-Met：Ｌ−アスパルチル−Ｌ−メチオニン
Arg-Met：Ｌ−アルギニル−Ｌ−メチオニン
His-Met：Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−メチオニン
Lys-Met：Ｌ−リジル−Ｌ−メチオニン
Ala-Gly：Ｌ−アラニル−グリシン
Ala-Thr：Ｌ−アラニル−Ｌ−スレオニン
Ala-Glu：Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン酸
Ala-Ala：Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニン
Ala-Asp：Ｌ−アラニル−Ｌ−アスパラギン酸
Ala-Ser：Ｌ−アラニル−Ｌ−セリン
Ala-Met：Ｌ−アラニル−Ｌ−メチオニン
Ala-Val：Ｌ−アラニル−Ｌ−バリン
Ala-Lys：Ｌ−アラニル−Ｌ−リジン
Ala-Asn：Ｌ−アラニル−Ｌ−アスパラギン
Ala-Cys：Ｌ−アラニル−Ｌ−システイン
Ala-Tyr：Ｌ−アラニル−Ｌ−チロシン
Ala-Ile：Ｌ−アラニル−Ｌ−イソロイシン
Arg-Gln：Ｌ−アルギニル−Ｌ−グルタミン
Gly-Ser：グリシル−Ｌ−セリン
Gly-Ser（tBu）：グリシル−Ｌ−（ｔ−ブチル）セリン
HIL-Phe：（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシルイソロイシル−フェニルアラニン
ＡＦＡ：Ｌ−アラニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アラニン
ＡＧＡ：Ｌ−アラニル−グリシル−Ｌ−アラニン
ＡＨＡ：Ｌ−アラニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−アラニン
ＡＬＡ：Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニン
ＡＡＡ：Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニン
ＡＡＧ：Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−グリシン
ＡＡＰ：Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリン
ＡＡＱ：Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン
ＡＡＹ：Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−チロシン
ＧＦＡ：グリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アラニン
ＡＧＧ：Ｌ−アラニル−グリシル−グリシン
ＴＧＧ：Ｌ−トレオニル−グリシル−グリシン
ＧＧＧ：グリシル−グリシル−グリシン
ＡＦＧ：Ｌ−アラニル−Ｌ−フェニルアラニル−グリシン
ＧＧＦＭ：グリシル−グリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−メチオニン
ＹＧＧＦＭ：Ｌ−チロシル−グリシル−グリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−メチオニン
AM：Ｌ−アスパラギン酸−β−メチルエステル塩酸塩
AM（AM）：Ｌ−アスパルチル−Ｌ−アスパラギン酸−β，β−ジメチルエステル
AP：４−アミノアンチピリン
OPT：1,10-Phenanthoroline  monohydrate【０３３３】
本明細書中における変異部位のアミノ酸の一文字表記、並びに各アミノ酸残基への変異導入に対応する使用コドンは、以下の表４４の通りである。【０３３４】
【表４４】
2006075486.tif 000089
【０３３５】
［配列表フリーテキスト］【０３３６】
プライマー配列一覧【０３３７】
【表４５−１】
2006075486.tif 000090
【０３３８】
【表４５−２】
2006075486.tif 000091
【０３３９】
【表４５−３】
2006075486.tif 000092
【０３４０】
【表４５−４】
2006075486.tif 000093
【０３４１】
【表４５−５】
2006075486.tif 000094
【０３４２】
【表４５−６】
2006075486.tif 000095
【０３４３】
【表４５−７】
2006075486.tif 000096
【０３４４】
【表４５−８】
2006075486.tif 000097
【０３４５】
【表４５−９】
2006075486.tif 000098
【０３４６】
【表４６−１】
2006075486.tif 000099
【０３４７】
【表４６−２】
2006075486.tif 000100
【０３４８】
【表４６−３】
2006075486.tif 000101
【０３４９】
【表４６−４】
2006075486.tif 000102
【図面の簡単な説明】
【０３５０】
【図１】図１は、ｐＨ安定性についての実験結果を示す図である。
【図２】図２は、至適反応温度についての実験結果を示す図である。
【図３】図３は、温度安定性についての実験結果を示す図である。
【図４】図４は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造を示す図である。
【図５】図５は、配列番号２０８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造である。
【図６−１】図６−１は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−２】図６−２は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−３】図６−３は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−４】図６−４は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−５】図６−５は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−６】図６−６は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−７】図６−７は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−８】図６−８は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−９】図６−９は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１０】図６−１０は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１１】図６−１１は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１２】図６−１２は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１３】図６−１３は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１４】図６−１４は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１５】図６−１５は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１６】図６−１６は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１７】図６−１７は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１８】図６−１８は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１９】図６−１９は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−２０】図６−２０は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−２１】図６−２１は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−２２】図６−２２は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−２３】図６−２３は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−２４】図６−２４は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−２５】図６−２５は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−２６】図６−２６は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−２７】図６−２７は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−２８】図６−２８は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−２９】図６−２９は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−３０】図６−３０は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−３１】図６−３１は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−３２】図６−３２は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−３３】図６−３３は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−３４】図６−３４は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−３５】図６−３５は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−３６】図６−３６は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−３７】図６−３７は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−３８】図６−３８は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−３９】図６−３９は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−４０】図６−４０は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−４１】図６−４１は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−４２】図６−４２は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−４３】図６−４３は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−４４】図６−４４は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−４５】図６−４５は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−４６】図６−４６は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−４７】図６−４７は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−４８】図６−４８は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−４９】図６−４９は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−５０】図６−５０は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−５１】図６−５１は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−５２】図６−５２は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−５３】図６−５３は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−５４】図６−５４は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−５５】図６−５５は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−５６】図６−５６は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−５７】図６−５７は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−５８】図６−５８は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−５９】図６−５９は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−６０】図６−６０は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−６１】図６−６１は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−６２】図６−６２は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−６３】図６−６３は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−６４】図６−６４は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−６５】図６−６５は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−６６】図６−６６は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−６７】図６−６７は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−６８】図６−６８は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−６９】図６−６９は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−７０】図６−７０は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−７１】図６−７１は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−７２】図６−７２は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−７３】図６−７３は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−７４】図６−７４は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−７５】図６−７５は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−７６】図６−７６は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−７７】図６−７７は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−７８】図６−７８は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−７９】図６−７９は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−８０】図６−８０は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−８１】図６−８１は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−８２】図６−８２は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−８３】図６−８３は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−８４】図６−８４は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−８５】図６−８５は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−８６】図６−８６は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−８７】図６−８７は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−８８】図６−８８は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−８９】図６−８９は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−９０】図６−９０は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−９１】図６−９１は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−９２】図６−９２は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−９３】図６−９３は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−９４】図６−９４は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−９５】図６−９５は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−９６】図６−９６は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−９７】図６−９７は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−９８】図６−９８は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−９９】図６−９９は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１００】図６−１００は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１０１】図６−１０１は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１０２】図６−１０２は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１０３】図６−１０３は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１０４】図６−１０４は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１０５】図６−１０５は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１０６】図６−１０６は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１０７】図６−１０７は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１０８】図６−１０８は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１０９】図６−１０９は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１１０】図６−１１０は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１１１】図６−１１１は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１１２】図６−１１２は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１１３】図６−１１３は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１１４】図６−１１４は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１１５】図６−１１５は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１１６】図６−１１６は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１１７】図６−１１７は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１１８】図６−１１８は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１１９】図６−１１９は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１２０】図６−１２０は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１２１】図６−１２１は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１２２】図６−１２２は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１２３】図６−１２３は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１２４】図６−１２４は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１２５】図６−１２５は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１２６】図６−１２６は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１２７】図６−１２７は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１２８】図６−１２８は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１２９】図６−１２９は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１３０】図６−１３０は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１３１】図６−１３１は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
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【図６−１３３】図６−１３３は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【図６−１３４】図６−１３４は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（３次元構造）の原子座標を示す図である。
【産業上の利用可能性】
【０３５１】
本発明は、ペプチドの製造法などに関する分野で有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図６−８】
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【図６−９】
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【図６−１２】
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【図６−１４】
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【図６−１５】
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【図６−１６】
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【図６−１７】
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【図６−１８】
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【図６−１９】
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【図６−２０】
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【図６−２１】
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【図６−２７】
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【図６−２８】
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【図６−２９】
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【図６−３０】
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【図６−３１】
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【図６−３２】
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【図６−４０】
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【図６−４２】
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【図６−４３】
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【図６−４４】
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【図６−４５】
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【図６−４６】
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【図６−６６】
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【図６−７８】
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【図６−７９】
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【図６−８１】
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【図６−８２】
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【図６−９４】
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【図６−１１６】
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【図６−１１７】
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【図６−１１８】
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【図６−１１９】
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【図６−１２４】
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【図６−１２９】
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【図６−１３２】
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【図６−１３３】
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【図６−１３４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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