(57)【要約】  本発明は、GPC3N端部位を認識する抗体を用いてGPC3を測定することを特徴とする肝炎の重篤化をモニターする方法に関する。本発明によれば、肝炎の重篤化、すなわち、肝炎または肝硬変から肝癌への移行が予測できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗GPC3抗体を含有する肝炎重篤化のモニター薬。
【請求項２】
抗GPC3抗体が、GPC3N端部位を認識する抗体である請求項１記載のモニター薬。
【請求項３】
肝炎または肝硬変から肝癌への移行を予測するものである請求項１または２記載のモニター薬。
【請求項４】
支持体に固定した抗GPC3抗体と標識物質で標識された抗GPC3抗体を用いる請求項１〜３のいずれか１項記載のモニター薬。
【請求項５】
抗GPC3抗体を用いて被検試料中のGPC3を測定することを特徴とする肝炎重篤化のモニター方法。
【請求項６】
抗GPC3抗体が、GPC3N端部位を認識する抗体である請求項５記載のモニター方法。
【請求項７】
被検試料が、血液、血清または血漿である請求項５または６記載のモニター方法。
【請求項８】
肝炎または肝硬変から肝癌への移行を予測するものである請求項５〜７のいずれか１項記載のモニター方法。
【請求項９】
支持体に固定した抗GPC3抗体と標識物質で標識された抗GPC3抗体を用いる請求項５〜８のいずれか１項記載のモニター方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝炎重篤化のモニター方法および当該モニター薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
原発性肝細胞癌（以下、肝癌という）は、多くはB型およびC型肝炎ウイルス感染患者であり、慢性肝炎から肝硬変に進行した後に発症することが知られている。ウイルス感染者の中でも特にC型肝炎ウイルス感染患者は肝癌への移行率が高く、発症も近年増加傾向にある。肝癌の治療手段としては肝切除、経皮的局所療法（ラジオ波焼灼療法・エタノール注入療法など）、肝動脈塞栓療法（TAE）、持続動注化学療法、放射線療法等が行われているが、完全治癒に至らない場合も多々ある。従って、肝癌移行段階である慢性肝炎および肝硬変時にウイルス除去と免疫力増強を目的に、近年各種抗ウイルス剤および各種インターフェロンの開発・臨床応用により肝癌への移行を防ぐ治療がなされている。【０００３】
現在、肝臓異常の検査としてAST（GOT）、ALT（GPT）およびγ-GTP（γ-グルタミルトランスペプチダーゼ）が汎用されているが、その他にTP（血清総蛋白）、A/G比（アルブミン/グロブリン比）、UA（尿酸）、T-Cho（総コレステロール）、TTT（チモール混濁試験）、ZTT（硫酸亜鉛混濁試験）、LDH（乳酸脱水酵素）、ALP（アルカリンフォスファターゼ）、chE（コリンエステラーゼ）も肝臓異常の指標として使われている。このように多くの検査により、肝臓異常が診断されるが、さらにウイルス検査ならびにバイオプシーにより炎症、線維化および癌化への進行の程度が診断されている。【０００４】
ウイルス感染、肝炎、慢性肝炎、肝硬変そして肝癌への移行は、各種マーカーによる検査およびバイオプシーによる検査にて炎症、線維化および癌化への移行を診断しているのが現状である。この措置は患者への負担が大きく、医療経済の上からも問題であるだけでなく、的確な医療指針を得るためにも簡便に肝癌発症を予測できる方法の開発が望まれている。【０００５】
細胞表面上に存在するヘパラン硫酸プロテオグリカンの新しいファミリーとしてグリピカンファミリーの存在が報告されている。現在までのところ、グリピカンファミリーのメンバーとして、６種類のグリピカン（グリピカン１、グリピカン２、グリピカン３、グリピカン４、グリピカン５およびグリピカン６）が存在することが報告されている。このファミリーのメンバーは、均一なサイズ（約60kDa）のコアタンパク質を持ち、特異的でよく保持されたシステインの配列を共有しており、グリコシルフォスファチジルイノシトール（GPI）アンカーにより細胞膜に結合している。【０００６】
グリピカン３（GPC3）は、発生における細胞分裂やそのパターンの制御に深く関わっていることが知られている。GPC3は血中に分泌されることが知られており、非特許文献１より、358番目のアミノ酸と359番目のアミノ酸の間で解裂を受けることが示唆されており、還元条件でSDS-PAGEを行うと、１〜358番目の断片（N端）と、ヘパラン硫酸鎖が付加して巨大分子化した359〜580番目の断片（C端）に分かれる。【０００７】
一方、GPC3遺伝子が肝癌細胞において高発現しており、GPC3遺伝子が肝細胞癌マーカーとして利用できる可能性があることが知られている。さらに、GPC3を測定することによる肝癌を診断する方法として、既に特許文献１〜３および非特許文献２が知られている。【０００８】
従来のGPC3測定薬のうちGPC3のC端部位を認識する抗体を用いた特許文献１では肝癌の陽性率が53％、健常者および慢性肝炎で検出限界以下、肝硬変で５％との記載があり、N端C端解裂近傍部位を認識する抗体を用いた特許文献２においても肝癌の陽性率が40％、健常者および慢性肝炎および肝硬変では０％との記載がある。一方で、N端部位を認識する抗体を用いた非特許文献２では肝癌TAE後の陽性率が73％、肝癌手術例で53％であり、肝硬変と有意差がつくことから肝癌の診断薬として有用であると記載されている。しかし、GPC3が肝癌発症前にどのように変化するかは全く知られていなかった。
【特許文献１】WO 03/10042
【特許文献２】WO 2004/018667
【特許文献３】WO 2004/038420
【非特許文献１】J. Cell. Biol., 163(3):625-35. 2003
【非特許文献２】CANCER RESEARCH 64, 1-6, April 1, 2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、肝炎の重篤化をモニターする手段を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、C端部位およびN端C端解裂近傍部位を認識する抗体ではなく、N端部位を認識する新たな抗体を開発し、肝癌発症前段階である肝炎および肝硬変患者血清中のGPC3濃度を測定した。その測定系による肝臓疾患患者血清中GPC3濃度を測定した結果、カットオフ値0.4での陽性率は健常者で1.5％であったが、慢性肝炎で36％、肝硬変で51.4％の高い値を示した。一方、肝癌患者では51％の陽性率であった。さらに、慢性肝炎患者および肝硬変患者の肝臓組織について免疫染色を検討した結果、増殖肝細胞で陽性を示した。このことは、新たな本GPC3測定系は肝癌の診断薬ではなく、肝炎および肝硬変から肝癌への移行の予測薬、すなわち肝炎重篤化のモニター薬として有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明は、抗GPC3抗体を含有する肝炎重篤化のモニター薬を提供するものである。
また、本発明は、抗GPC3抗体を用いて被検試料中のGPC3を測定することを特徴とする肝炎重篤化のモニター方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、従来の単一の肝臓異常検出薬では予測が困難であった肝炎重篤化のモニターが簡便な方法で可能となり、早急に新たな治療計画の策定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】GPC3抗体の認識部位の確認のためのウエスタンブロッティングの図である。
【図２】C端部位およびN端部位を認識する抗体により得られた標準曲線である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、抗GPC3抗体を用いて被検試料中のGPC3を測定することにより肝炎重篤化をモニターする方法である。【００１５】
測定とは、定量的または非定量的な測定を含み、例えば、非定量的な測定としては、単にGPC3が存在するか否かの測定、GPC3が一定の量以上存在するか否かの測定、GPC3の量を他の試料（例えば、コントロール試料など）と比較する測定などを挙げることができ、定量的な測定としては、GPC3の濃度の測定、GPC3の量の測定などを挙げることができる。【００１６】
被検試料とは、GPC3が含まれる可能性のある試料であれば特に制限されないが、哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましく、さらに好ましくはヒトから採取された試料である。被検試料の具体的な例としては、例えば、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿などを挙げることができるが、好ましいのは血液、血清、血漿である。さらに好ましくは肝炎、特に慢性肝炎または肝硬変患者から採取された血液、血清、血漿である。又、生物の体から採取された細胞の培養液などの、被検試料から得られる試料も本発明の被検試料に含まれる。【００１７】
本発明に用いられる抗GPC3抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでもよい。また、抗GPC3抗体としては、血液、血清、血漿を被検試料とする点から、分泌型GPC3に対する抗体、すなわち抗可溶性GPC3抗体が好ましい。ポリクローナル抗体としては、抗血清を用いるのが好ましい。さらに好ましくは、N端部位を認識する抗可溶性GPC3モノクローナル抗体を用いるのが特に好ましい。以下抗GPC3モノクローナル抗体を用いた場合について詳細に説明する。【００１８】
１．抗GPC3モノクローナル抗体の作製
本発明で用いられる抗GPC3モノクローナル抗体はGPC3タンパク質に特異的に結合すればよく、その由来および形状を問わない。具体的には、トリ抗体、マウス抗体、ラット抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体などの公知のモノクローナル抗体を用いることができる。
又、支持体に固定される抗GPC3モノクローナル抗体と標識物質で標識される抗GPC3モノクローナル抗体はGPC3分子の異なるエピトープを認識することが好ましい。認識部位は特に制限されないが、N端を認識する抗体が好ましい。【００１９】
本発明で使用される抗GPC3モノクローナル抗体は、公知の手段を用いて製造することができる。本発明で使用される抗GPC3モノクローナル抗体として、哺乳動物および鳥類由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物および鳥類由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。【００２０】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、GPC3または可溶性GPC3ならびにその断片ペプチドを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。【００２１】
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
まず、抗体取得の感作抗原として使用されるGPC3は、HuH6、HepG2細胞株等を培養してその上清に含まれる天然のGPC3を精製して得ることができる。さらに、Lage, H. et al.,Gene 188（1997）, 151-156に開示されたGPC3（MXR7）遺伝子／アミノ酸配列を発現することによっても得ることができる。すなわち、GPC3をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のリコンビナントGPC3タンパク質を公知の方法で精製する。
次に、この精製GPC3を感作抗原として用いるが、GPC3の部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、部分ペプチドはヒトGPC3のアミノ酸配列より化学合成により得ることもできるし、GPC遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで得ることもでき、さらに天然のGPC3をタンパク質分解酵素により分解することによっても得ることができる。部分ペプチドとして用いるGPC3の部分および大きさは限られない。本発明においては、感作抗原として天然のGPC3を用いるのが好ましい。【００２２】
感作抗原で免疫される哺乳動物および鳥類としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットあるいはウサギ、サル、鶏等が使用される。【００２３】
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をPBS（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、動物に４〜21日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。特に分子量の小さい部分ペプチドを感作抗原として用いる場合には、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。【００２４】
このように動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。【００２５】
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、P3（P3×63Ag8.653）（J. Immnol.（1979）123, 1548-1550）、P3x63Ag8U.1（Current Topics in Microbiology and Immunology（1978）81, 1-7）、NS-1（Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.（1976）6,511-519）、MPC-11（Margulies. D.H. et al., Cell（1976）8, 405-415）、SP2/0（Shulman, M. et al., Nature（1978）276, 269-270）、FO（de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods（1980）35, 1-21）、S194（Trowbridge, I. S. J. Exp. Med.（1978）148, 313-323）、R210（Galfre, G. et al., Nature（1979）277, 131-133）等が適宜使用される。【００２６】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C.、Methods Enzymol.（1981）73, 3-46）等に準じて行うことができる。【００２７】
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（PEG）、センダイウイルス（HVJ）等が使用され、さらに所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加することもできる。【００２８】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。【００２９】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め37℃程度に加温したPEG溶液（例えば平均分子量1000〜6000程度）を通常30〜60％（w/v）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。【００３０】
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばHAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記HAT培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。【００３１】
目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法で行えばよい。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の96ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させ、担体を洗浄した後に酵素標識第２次抗体等を反応させることにより、培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれるかどうか決定できる。目的とする抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることができる。この際、抗原としては免疫に用いたものを用いればよい。【００３２】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をin vitroでGPC3に感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、GPC3への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−59878号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるGPC3を投与して抗GPC3モノクローナル抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からGPC3に対するヒト抗体を取得してもよい（WO 94/25585、WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602参照）。【００３３】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。【００３４】
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。【００３５】
本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる（例えば、Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem.（1990）192, 767-775, 1990参照）。具体的には、抗GPC3モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから、抗GPC3モノクローナル抗体の可変（V）領域をコードするmRNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry(1979)18, 5294-5299）、AGPC法（Chomczynski, P.et al., Anal. Biochem.(1987)162, 156-159）等により行って全RNAを調製し、mRNA Purification Kit（Pharmacia製）等を使用して目的のmRNAを調製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit（Pharmacia製）を用いることによりmRNAを直接調製することもできる。【００３６】
得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のcDNAを合成する。cDNAの合成は、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit（生化学工業社製）等を用いて行う。また、cDNAの合成および増幅を行うには、5'-Ampli FINDER RACE Kit（Clontech製）およびPCRを用いた5'-RACE法（Frohman, M. A.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988)85, 8998-9002、Belyavsky, A.et al., Nucleic Acids Res.(1989)17, 2919-2932）等を使用することができる。【００３７】
得られたPCR産物から目的とするDNA断片を精製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするDNAの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認する。【００３８】
目的とする抗GPC3モノクローナル抗体のＶ領域をコードするDNAを得たのち、これを、所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNAを含有する発現ベクターへ組み込む。【００３９】
本発明で使用される抗GPC3モノクローナル抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。【００４０】
抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（H鎖）または軽鎖（L鎖）をコードするDNAを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはH鎖およびL鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（WO 94/11523参照）。【００４１】
また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、トランスジェニック動物を使用することができる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生されるタンパク質（ヤギβカゼインなど）をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology（1994）12, 699-702）。【００４２】
本発明では、上記抗体のほかに、人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト型化（Humanized）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。【００４３】
キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体V領域をコードするDNAをヒト抗体C領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。【００４４】
ヒト型化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（EP 125023、WO 96/02576参照）。【００４５】
具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region；FR）とを連結するように設計したDNA配列を、CDRおよびFR両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてPCR法により合成する(WO98/13388に記載の方法を参照)。【００４６】
CDRを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.et al., Cancer Res.(1993)53, 851-856）。【００４７】
キメラ抗体およびヒト型化抗体のC領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばH鎖では、Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4を、Ｌ鎖ではCκ、Cλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体C領域を修飾してもよい。【００４８】
キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト型化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域およびC領域とからなる。【００４９】
本発明で使用される抗体は、抗体の全体分子に限られず、GPC3に結合する限り、抗体の断片またはその修飾物であってもよく、二価抗体も一価抗体も含まれる。例えば、抗体の断片としては、Fab、F（ab′）2、Fv、１個のFabと完全なFcを有するFab/c、またはH鎖若しくはL鎖のFvを適当なリンカーで連結させたシングルチェインFv（scFv）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Co, M.S. et al., J. Immunol.（1994）152, 2968-2976、Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496, Academic Press, Inc.、Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496, Academic Press, Inc.、Lamoyi, E., Methods in Enzymology（1989）121, 652-663、Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology（1989）121, 663-669、Bird, R. E. et al., TIBTECH（1991）9, 132-137参照）。【００５０】
scFvは、抗体のH鎖V領域とL鎖V領域とを連結することにより得られる。このscFvにおいて、H鎖V領域とL鎖V領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Huston, J. S. et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.（1988）85, 5879-5883）。scFvにおけるH鎖V領域およびL鎖V領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。V領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸12〜19残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。【００５１】
scFvをコードするDNAは、前記抗体のH鎖またはH鎖V領域をコードするDNA、およびL鎖またはL鎖V領域をコードするDNAのうち、それらの配列のうちの全部または所望のアミノ酸配列をコードするDNA部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてPCR法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするDNA、およびその両端が各々H鎖、L鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。【００５２】
また、一旦scFvをコードするDNAが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってscFvを得ることができる。【００５３】
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。【００５４】
抗体の修飾物として、標識物質等の各種分子と結合した抗GPC3抗体を使用することもできる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。【００５５】
さらに、本発明で使用される抗体は、二重特異性抗体（bispecific antibody）であってもよい。二重特異性抗体はGPC3分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有する二重特異性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位がGPC3を認識し、他方の抗原結合部位が標識物質等を認識してもよい。二重特異性抗体は２種類の抗体のHL対を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。【００５６】
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer）を挙げることができる。【００５７】
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス40（SV40）等のウイルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター1a（HEF1a）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。【００５８】
SV40プロモーター／エンハンサーを使用する場合はMulliganらの方法（Nature（1979）277, 108）により、また、HEF1aプロモーター／エンハンサーを使用する場合はMizushimaらの方法（Nucleic Acids Res.（1990）18, 5322）により、容易に遺伝子発現を行うことができる。【００５９】
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列および発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることができる。プロモーターとしては、例えばlaczプロモーター、araBプロモーターを挙げることができる。laczプロモーターを使用する場合はWardらの方法（Nature（1098）341, 544-546 ; FASEB J.（1992）6, 2422-2427）により、あるいはaraBプロモーターを使用する場合はBetterらの方法（Science（1988）240, 1041-1043）により発現することができる。【００６０】
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol.（1987）169, 4379）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直して（refold）使用する。【００６１】
複製起源としては、SV40、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（BPV）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。【００６２】
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の発現系、例えば真核細胞または原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。【００６３】
好ましくは、本発明で使用される抗体は、哺乳類細胞、例えばCHO、COS、ミエローマ、BHK、Vero、HeLa細胞中で発現される。
次に、形質転換された宿主細胞をin vitroまたはin vivoで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができ、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。【００６４】
前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Hyper D、POROS、Sepharose F.F.（Pharmacia製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。【００６５】
本発明に使用される抗体のエピトープは、全長GPC3またはそのペプチド断片を認識すれば良いが、好ましくはGPC3のN端部位を認識する抗体が望まれる。【００６６】
２．GPC3の測定
本発明において測定するGPC3は、ヘパラン硫酸などが付加されたGPC3タンパク質でも、GPC3コアタンパク質でもよい。
被検試料に含まれるGPC3の測定は、抗GPC3抗体を用いた免疫学的方法により測定される。免疫学的方法としては、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウエスタンブロット、免疫染色、免疫拡散法などを挙げることができるが、好ましくはエンザイムイムノアッセイであり、特に好ましいのは酵素結合免疫吸着定量法(enzyme-linked immunosorbent assay：ELISA)（例えば、sandwich ELISA）である。ELISAなどの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことが可能である。【００６７】
抗GPC3抗体を用いた一般的な測定方法としては、例えば、抗GPC3抗体を支持体に固定し、ここに被検試料を加え、インキュベートを行い抗GPC3抗体とGPC3タンパク質を結合させた後に洗浄して、抗GPC3抗体を介して支持体に結合したGPC3タンパク質を測定することにより、被検試料中のGPC3タンパク質の測定を行う方法を挙げることができる。【００６８】
本発明において用いられる支持体としては、例えば、アガロース、セルロースなどの不溶性の多糖類、シリコン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ナイロン樹脂、ポリカーボネイト樹脂などの合成樹脂や、ガラスなどの不溶性の支持体を挙げることができる。これらの支持体は、ビーズやプレートなどの形状で用いることが可能である。ビーズの場合、これらが充填されたカラムなどを用いることができる。プレートの場合、マルチウェルプレート（96穴マルチウェルプレート等）やバイオセンサーチップなどを用いることができる。抗GPC3抗体と支持体との結合は、化学結合や物理的な吸着などの通常用いられる方法により結合することができる。これらの支持体はすべて市販のものを用いることができる。【００６９】
抗GPC3抗体とGPC3タンパク質との結合は、通常、緩衝液中で行われる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、Tris緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液などが使用される。また、インキュベーションの条件としては、すでによく用いられている条件、例えば、４℃〜室温にて１時間〜24時間のインキュベーションが行われる。インキュベート後の洗浄は、GPC3タンパク質と抗GPC3抗体の結合を妨げないものであれば何でもよく、例えば、Tween20等の界面活性剤を含む緩衝液などが使用される。【００７０】
本発明のGPC3タンパク質測定方法においては、GPC3タンパク質を測定したい被検試料の他に、コントロール試料を設置してもよい。コントロール試料としては、GPC3タンパク質を含まない陰性コントロール試料やGPC3タンパク質を含む陽性コントロール試料などがある。この場合、GPC3タンパク質を含まない陰性コントロール試料で得られた結果、GPC3タンパク質を含む陽性コントロール試料で得られた結果と比較することにより、被検試料中のGPC3タンパク質を測定することが可能である。また、濃度を段階的に変化させた一連のコントロール試料を調製し、各コントロール試料に対する測定結果を数値として得て、標準曲線を作成し、被検試料の数値から標準曲線に基づいて、被検試料に含まれるGPC3タンパク質を定量的に測定することも可能である。【００７１】
抗GPC3抗体を介して支持体に結合したGPC3タンパク質の測定の好ましい態様として、標識物質で標識された抗GPC3抗体を用いる方法を挙げることができる。【００７２】
例えば、支持体に固定された抗GPC3抗体に被検試料を接触させ、洗浄後に、GPC3タンパク質を特異的に認識する標識抗体を用いて測定する。【００７３】
抗GPC3抗体の標識は通常知られている方法により行うことが可能である。標識物質としては、蛍光色素、酵素、補酵素、化学発光物質、放射性物質などの当業者に公知の標識物質を用いることが可能であり、具体的な例としては、ラジオアイソトープ(32P、14C、125I、3H、131Iなど)、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ビオチンなどを挙げることができる。標識物質としてビオチンを用いる場合には、ビオチン標識抗体を添加後に、アルカリホスファターゼなどの酵素を結合させたアビジンをさらに添加することが好ましい。標識物質と抗GPC3抗体との結合には、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、過ヨウ素酸法、などの公知の方法を用いることができる。【００７４】
具体的には、抗GPC3抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗GPC3抗体を支持体に固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばBSA、ゼラチン、アルブミンなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、標識抗GPC3抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、プレートに残った標識抗GPC3抗体を測定する。測定は当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、放射性物質による標識の場合には液体シンチレーションやRIA法により測定することができる。酵素による標識の場合には基質を加え、基質の酵素的変化、例えば発色を吸光度計により測定することができる。基質の具体的な例としては、２，２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ABTS）、１，２−フェニレンジアミン（オルソ−フェニレンジアミン）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（TME）などを挙げることができる。
蛍光物質の場合には蛍光光度計により測定することができる。【００７５】
本発明のGPC3タンパク質測定方法の特に好ましい態様として、ビオチンで標識された抗GPC3抗体およびアビジンを用いる方法を挙げることができる。【００７６】
具体的には、抗GPC3抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗GPC3抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばBSAなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、ビオチン標識抗GPC3抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素と結合したアビジンを加える。インキュベーション後、プレートを洗浄し、アビジンに結合している酵素に対応した基質を加え、基質の酵素的変化などを指標にGPC3タンパク質を測定する。【００７７】
本発明のGPC3タンパク質測定方法の他の態様として、GPC3タンパク質を特異的に認識する一次抗体を一種類以上、および該一次抗体を特異的に認識する二次抗体を一種類以上用いる方法を挙げることができる。【００７８】
例えば、支持体に固定された一種類以上の抗GPC3抗体に被検試料を接触させ、インキュベーションした後、洗浄し、洗浄後に結合しているGPC3タンパク質を、一次抗GPC3抗体および該一次抗体を特異的に認識する一種類以上の二次抗体により測定する。この場合、二次抗体は好ましくは標識物質により標識されている。【００７９】
本発明のGPC3タンパク質の測定方法の他の態様としては、凝集反応を利用した測定方法を挙げることができる。該方法においては、抗GPC3抗体を感作した担体を用いてGPC3を測定することができる。抗体を感作する担体としては、不溶性で、非特異的な反応を起こさず、かつ安定である限り、いかなる担体を使用してもよい。例えば、ラテックス粒子、ベントナイト、コロジオン、カオリン、固定羊赤血球等を使用することができるが、ラテックス粒子を使用するのが好ましい。ラテックス粒子としては、例えば、ポリスチレンラテックス粒子、スチレン−ブタジエン共重合体ラテックス粒子、ポリビニルトルエンラテックス粒子等を使用することができるが、ポリスチレンラテックス粒子を使用するのが好ましい。感作した粒子を試料と混合し、一定時間攪拌する。試料中に抗GPC3抗体が高濃度で含まれるほど粒子の凝集度が大きくなるので、凝集を肉眼でみることによりGPC3を測定することができる。また、凝集による濁度を分光光度計等により測定することによってもGPC3を測定可能である。【００８０】
本発明のGPC3タンパク質の測定方法の他の態様としては、例えば、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを用いた方法を挙げることができる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーはタンパク質−タンパク質間の相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である。例えば、BIAcore（Pharmacia製）等のバイオセンサーを用いることによりGPC3タンパク質と抗GPC3抗体の結合を測定することが可能である。具体的には、抗GPC3抗体を固定化したセンサーチップに、被検試料を接触させ、抗GPC3抗体に結合するGPC3タンパク質を共鳴シグナルの変化として測定することができる。【００８１】
本発明の測定方法は、種々の自動検査装置を用いて自動化することもでき、一度に大量の試料について検査を行うことも可能である。【００８２】
本発明は、肝炎重篤化のモニター薬、例えば肝炎および肝硬変から肝癌への移行の予測判定薬の提供を目的とするが、該モニター薬は少なくとも抗GPC3抗体を含む。該モニター薬がELISA法に基づく場合は、抗体を固相化する担体を含んでいてもよく、抗体があらかじめ担体に結合していてもよい。該モニター薬がラテックス等の担体を用いた凝集法に基づく場合は抗体が吸着した担体を含んでいてもよい。また、該モニター薬は、適宜、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液、試料を処理するための試薬等を含むキットとしてもよい。【００８３】
肝炎および肝硬変から肝癌への移行を予測するには、それら患者の血清中のGPC濃度を測定すればよい。血清中GPC3濃度が高ければ高いほど肝癌への移行の確立が上がる。例えば、慢性肝炎および肝硬変患者血清中GPC3濃度が0.4ng/mL以上の場合には、肝癌への移行の可能性が高く、0.4ng/mL未満の場合には、肝癌への移行の可能性が低いと予測できる。
【実施例】
【００８４】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００８５】
本願明細書記載の実施例において、以下の材料を用いた。
天然のGPC3の産生細胞として、肝芽腫由来細胞株であるHuH-6を理研細胞バンクより購入し、10% FBS /ダルベッコの改変イーグル培地(Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM) (SIGMA CAT# D6429)/ penicillin・streptomycin（GIBCO BRL CAT# 15140-122）で培養を行った。
ハイブリドーマは10％FBS / RPMI1640 / (SIGMA CAT# R-8578)/gentacin（Scheling-plough）で培養した。【００８６】
実施例１  天然型GPC3の取得
直径150mmのディッシュを用い、HuH６細胞の大量培養を行い、培養上清を回収し精製を行った。培養上清をDEAE Sepharose Fast Flow (Amersham CAT# 17-0709-01)にチャージし、洗浄後、500mM NaClを含むバッファーにより溶出した。次に、Centriprep-10(Millipore CAT#4304)で濃縮後、Superdex 200 HR 10/30(Amersham CAT# 17-1088-01)によるゲルろ過にて精製することにより粗精製GPC3を得た。【００８７】
高純度のGPC3の取得には、粗精製GPC3を抗原として作製したモノクローナル抗体を用いてアフィニティーカラムを作成し、それにHuH-6粗精製GPC3をチャージした後、pH3.5、0.1Mグリシン塩酸にて洗浄後、4MのMgCl2・６H2Oにて溶出し、ついで、50 mM Tris-HCl (pH7.5), 150 mM NaClに対して透析を行った。【００８８】
実施例２  リコンビナントGPC3の取得
完全長ヒトGPC3 cDNAを含むプラスミドDNAを用い、flag付加可溶型GPC3、すなわちリコンビナントGPC3 cDNA発現プラスミドDNAを構築した。Ｃ末端側の疎水領域（564-580アミノ酸）を除くように設計した下流プライマー（5'- ATA GAA TTC CAC CAT GGC CGG GAC CGT GCG C -3'（配列番号１））とEcoRI認識配列、Kozak配列を加えた上流プライマー（5'-ATA GGA TCC CTT CAG CGG GGA ATG AAC GTT C -3'（配列番号２）を用いてPCRを行った。得られたPCR断片(1711bp)をpCXND2-Flagにクローニングした。作製された発現プラスミドDNAをCHO細胞DXB11株へ導入し、500μg/mL Geneticin での選抜により、可溶型GPC3高発現CHO株を得た。【００８９】
1700 cm2ローラーボトルを用いflag付加可溶型GPC3高発現CHO株の大量培養を行い、培養上清を回収し精製を行った。培養上清をDEAE Sepharose Fast Flow (Amersham CAT# 17-0709-01)にチャージし、洗浄後、500mM NaClを含むバッファーにより溶出した。次に、Anti-Flag M2 agarose affinity gel（SIGMA CAT#A-2220）を用いてアフィニティー精製を行った。溶出は200μg/mLのFLAGペプチドにより行った。Centriprep-10(Millipore CAT#4304)による濃縮後、Superdex 200 HR 10/30(Amersham CAT# 17-1088-01)によるゲルろ過を行いFLAGペプチドを除去した。最後にDEAE Sepharose Fast Flowカラムを用いて濃縮し、同時にTween20を含まないPBS（500mMのNaClを含む）で溶出を行うことによりバッファー置換を行った。【００９０】
実施例３  抗GPC3モノクローナル抗体の作製
Balb/Cマウス (CRL)５匹にリコンビナントGPC3あるいは天然型GPC3を免疫した。リコンビナントGPC3の場合、初回免疫には免疫タンパク質を100μg/匹、天然型GPCの場合は10μg/匹となるように調製し、FCA（フロイント完全アジュバント（H37 Ra）、Difco（3113-60）、ベクトンディッキンソン（cat#231131））を用いてエマルジョン化したものを皮下に投与した。追加免疫として、２週間後にリコンビナントGPC3の場合50μg/匹、天然型GPC3の場合は５μg/匹となるように調製したものをFIA（フロイント不完全アジュバント、Difco（0639-60）、ベクトンディッキンソン（cat#263910））でエマルジョン化したものを皮下に投与した。以降１週間間隔で追加免疫を合計５回行った。最終免疫については追加免疫と同量を尾静脈内に投与した。GPC3コアタンパク質をコートしたイムノプレートを用いたELISAによりGPC3に対する血清中の抗体価が飽和しているのを確認後、マウスミエローマ細胞P3U1とマウス脾臓細胞を混合し、PEG1500（ロシュ・ダイアグノスティック、cat#783 641）により細胞融合を行った。96穴培養プレートに播種し、翌日よりHAT培地で選択後培養上清をELISAでスクリーニングした。陽性クローンについては限界希釈法によりモノクローン化した後、拡大培養における培養上清を回収した。ELISAによるスクリーニングは、GPC3コアタンパク質との結合活性を指標に行い、強い結合能を有する抗GPC3モノクローナル抗体を得た。【００９１】
抗体の精製はHi Trap ProteinG HP(Amersham CAT#17-0404-01)を用いて行った。ハイブリドーマ培養上清を直接カラムにチャージし、結合バッファー（20mM リン酸ナトリウム (pH7.0)）にて洗浄後、溶出バッファー（0.1M グリシン-HCl (pH2.7)）で溶出した。溶出は中和バッファー（1M Tris-HCl(pH9.0)）を加えたチューブに行い直ちに中和した。抗体画分をプールした後、0.05％Tween20／PBSで一昼夜透析を行いバッファー置換した。精製された抗体は0.02%となるようにNaN3を添加した後、４℃で保管した。【００９２】
実施例４  抗GPC3モノクローナル抗体のアイソタイピング
抗体濃度はヤギ抗マウス IgG (gamma) (ZYMED CAT# 62-6600)とアルカリフォスファターゼ−ヤギ抗マウス IgG (gamma)(ZYMED CAT# 62-6622)を用いたマウスIgGサンドイッチELISAを行い、市販の精製マウスIgG1抗体（ZYMED CAT#02-6100）をスタンダードとして定量した。
抗可溶性GPC3モノクローナル抗体のアイソタイピングは、ImmunoPure Monoclonal Antibody Isotyping Kit II (PIERCE CAT# 37502)を用い、方法は添付のマニュアルに従った。アイソタイピングの結果、全てIgG1タイプであった。【００９３】
実施例５  抗GPC3モノクローナル抗体の認識部位の確認
ウエスタンブロットの概略は、肝癌細胞株であるHuH-6を、DMEM＋10％FBSで５日間培養し、その培養上清を、5μl/laneとなるようにアプライして、還元および非還元条件でSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。次に、Hybond P膜（アマシャムバイオサイエンス社製）にタンパク質を転写し、転写膜をブロッキング後、各抗体を反応させた。次にHRP標識抗マウス抗体を反応させ、ECL検出試薬（アマシャムバイオサイエンス社）を添加後に得られた化学発光について、X線フィルムを感光させて検出した。図１に示すウェスタンの結果より、PPMX018がN末端を認識する抗体であり、PPMX001がC末端を認識する抗体であると判定できる。尚、同様の手法にて検討した結果、N端部位を認識する抗体としてPPMX013、M18D04 (FERM BP-10325)が挙げられる。
ここで、M18D04を産生するハイブリドーマは、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。【００９４】
実施例６  抗GPC3ポリクローナル抗体の作製
リコンビナントGPC3あるいは天然型GPC3を用いて、モルモットポリクローナル抗体の作製を行った。作製には、公知の方法を用いた。GPC3を、アジュバントを用いてエマルジョン化したものを皮下に投与し、免疫を行った。これを数回繰り返し、抗体価が上昇したのを確認した後、採血を行い、血清を得た後、硫安沈殿によりポリクローナル抗体を取得した。【００９５】
実施例７  サンドイッチELISA系の構築
血中の可溶性GPC3を測定するため、GPC3のサンドイッチELISA系を多数構築し、感度および特異性に優れた測定系を選択した。尚、発色には高い測定感度を達成するためScytek社のTMBを用いた。【００９６】
96ウェルイムノプレートに10μg/mLとなるように抗GPC3モノクローナル抗体あるいはポリローナル抗体をPBS（−）で希釈したものをコートし、４℃で一晩インキュベートした。翌日300μL/wellのPBSで3回洗浄後、ABI社のイムノアッセイスタビライザー（ABI #10-601-001）を150μL加え、ブロッキングを行った。室温で数時間後、あるいは４℃で一晩保管後、精製タンパク質、ヒト血清などを、動物血清などを含む希釈バッファー（50mM Tris-Cl pH 8.0, 0.15M NaCl）で適当に希釈したものを加え２時間室温でインキュベートした。次いで、動物血清などを含むPBS（−）で20μg/mLとなるように希釈したビオチン標識したC端部位あるいはN端部位を認識する抗体を加え２時間室温でインキュベートした。反応液を捨てた後、動物血清を適当量含んだCygnus社のStab-ELISA-r (Cygnus #I-030)を用いて、Vector社のストレプトアビジン-HRPO (Vector #SA-5004) を3 μg/mLに希釈したものを加え、0.5時間室温でインキュベートした。300μL/wellの洗浄バッファーで5回洗浄した後、Scytek社添付のプロトコールに従い、TMB (Cat#TM4999)を用いて発色させ、マイクロプレートリーダーで吸光度を測定した。【００９７】
抗体のビオチン化にはPierce社のSulfo-NHS-LC-Biotin (CAT# 21335)を用いた。また、サンプル中のGPC3濃度の換算には、表計算ソフトGlaphPad PRISM(GlaphPad software Inc. ver.3.0)を用いて解析した。図２はC端部位を認識する抗体であるPPMX001とPPMX013およびN端部位を認識するPPMX018とPPMX013で作製したELISA測定系によるリコンビナントGPC3を用いたスタンダードカーブである。C端部位認識測定系においてはN端部位認識測定系よりも高い吸光度を得る事が出来た。尚、前者測定系においては全長GPC3およびC端ペプチドを、後者測定系においては全長GPC3およびN端ペプチドを認識することが予測される。【００９８】
実施例８  C端部位およびN端部位を認識する抗体を用いた測定系によるHuH６培養液および肝硬変患者血清中GPC3の測定
上記スタンダードカーブ作製に用いた２つのELISA測定系を用い、HuH-6の培養上清より精製したGPC3および20例の肝ガン患者血清中のGPC3濃度を測定した。その結果、スタンダード曲線の結果からは予測できない結果（表１）が得られた。すなわち、GPC3の認識部位が異なる測定系を用いた場合、リコンビナントGPC3、HuH６由来天然型GPC3および患者血清GPC3において測定値が大きく異なる結果となった。C端部位を認識する測定系において、リコンビナントGPC3と患者血清GPC3との間に大きな乖離がみられる原因として、GPC3のC端部位に付加しているヘパラン硫酸含量の差異に基づくものと推察された。【００９９】
【表１】
2006038588.tif 000002
【０１００】
実施例９  N端部位を認識する測定系を用いた健常者、慢性肝炎、肝硬変および肝癌患者の血清中GPC3濃度の測定【０１０１】
N端部位を認識する各種ELISA測定系のうち、感度に優れたM18D04(FERM BP-10325)モノクローナル抗体とモルモットポリクローナル抗体を用いた測定系にて健常者、慢性肝炎、肝硬変および肝癌患者の血清中GPC3濃度の測定をした。その結果、カットオフ値0.4での健常者血清中GPC3の陽性率は1.5％、慢性肝炎で36%、肝硬変で51.4%および肝癌患者で51%であった。次に肝癌で入院した３例の肝癌患者において、肝癌発症以前の８年間定期的にサンプリングした血清中のGPC濃度を測定したところ、肝疾患の進行とともに、GPC3の血中濃度が上昇していく傾向が見られた。以上のことから、本測定系は肝癌の診断薬というよりは肝炎の重症化のモニターに有用であることが示された。【０１０２】
【表２】
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【０１０３】
実施例１０  健常者、慢性肝炎、肝硬変の組織の免疫染色
慢性肝炎および肝硬変患者からバイオプシーにより得た病理組織標本を用いて、抗GPC3モノクローナル抗体による免疫染色を行った。
各検体は、固定パラフィン包埋標本を４μｍに薄切した切片をスライドガラスに張り付け、37℃で16時間置くことで十分乾燥させた。100％キシレンに５分間で３回漬けることで脱パラフィンし、100％アルコールに５分間を３回、70％エタノールで５分間漬けることで親水化を行った。その後、50mM TBSで５分間、３回洗浄した後、クエン酸バッファー（10mM, pH6.0）中で120℃10分間の抗原の賦活化を行った。抗原の賦活化後、TBSによる５分間で３回の洗浄を行った後、１μｇ／mLに希釈された抗GPC3抗体と室温で１時間反応させた。内在性のペルオキシダーゼを失活させるために、0.3％の過酸化水素で１５分間、室温で作用させた。さらにTBSで３回洗浄した後、二次抗体であるENVISION＋キット／HRP(DAKO)を１時間作用させた。TBSによる５分間で３回の洗浄後、発色基質にはDAB(3,3'-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride)を用いた。また、核の対比染色にはヘマトキシリンを用いた。【０１０４】
慢性肝炎および肝硬変における免疫組織化学の結果、いずれの疾患においてもGPC3が陽性であり、その染色像は細胞膜に認められた。一方、正常肝臓組織では、GPC3の染色が認められなかった。
従って、GPC3濃度測定は肝炎重篤化のモニターに有用であることが判明した。
【図１】
2006038588.tif 000004
【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2006038588.tif 000007