(57)【要約】  タンパク質の生理的条件下でループ構造をとる部位のアミノ酸配列を含み、かつ環状構造を有するペプチドで非ヒト哺乳動物を免疫することによって、タンパク質の生理的条件下でループ構造を形成する部位を特異的に認識する抗体を効率よく取得する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理的条件下でループ構造を形成する部位を有するタンパク質に対する抗体を製造する方法であって、前記ループ構造を形成する部位のアミノ酸配列を含み、かつ環状構造を有するペプチドで非ヒト哺乳動物を免疫するステップと、該非ヒト哺乳動物から抗体を回収するステップを含む方法。
【請求項２】
生理的条件下でループ構造を形成する部位を有するタンパク質に対する抗体を製造する方法であって、前記ループ構造を形成する部位のアミノ酸配列を含み、かつ環状構造を有するペプチドで非ヒト哺乳動物を免疫するステップと、該非ヒト哺乳動物からB細胞を回収しミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを得るステップと、ハイブリドーマの培養上清から抗体を回収するステップを含む方法。
【請求項３】
生理的条件下でループ構造を形成する部位を有するタンパク質に対する抗体を製造する方法であって、前記ループ構造を形成する部位のアミノ酸配列を含み、かつ環状構造を有するペプチドで非ヒト哺乳動物を免疫するステップと、該非ヒト哺乳動物からB細胞を回収しエプスタインバーウイルスを感染させて不死化するステップと、その培養上清から抗体を回収するステップを含む方法。
【請求項４】
前記ペプチドが、前記アミノ酸配列に含まれる２個のシステイン残基のチオール基間のジスルフィド結合を介する環状構造を有するペプチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
タンパク質が抗体であり、ループ構造をとる部位がCDRである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の生理的条件下でループ構造を形成する部位に対する抗体を効率よく製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質に対する抗体は、通常、その部分配列を有する直鎖状ペプチドあるいはwholeのタンパク質で非ヒト哺乳動物を免疫することによって作製される。タンパク質のある特定のドメインに対する抗体を取得したい場合は、通常はそのドメイン内の配列のペプチドを免疫する。しかし、タンパク質は生体内で複雑な３次元構造を形成しているため、直鎖状ペプチドの免疫ではタンパク質を立体的特異的に認識する抗体が得られない場合が多かった。さらに、タンパク質そのものを免疫した場合にはそのタンパク質を立体的に認識する抗体が得られることはあるが、ある特定のドメインのみを認識する抗体を得ることは困難であった。特に、抗体に対する抗体を取得する場合は相補性決定領域（CDR）以外の部分のホモロジーが非常に高いため、同動物種の他の抗体にはまったく反応性を示さず、特定の１種類の抗体のみを認識する抗体を取得することは困難であった。
【発明の開示】
【０００３】
本発明はタンパク質の生理的条件下でループ構造を形成する部位を特異的に認識できる抗体を効率よく取得できる方法を提供することを課題とする。
【０００４】
本発明者は上記課題を解決すべく、鋭意検討を行った。その結果、タンパク質の生理的条件下でループ構造を形成する部位のアミノ酸配列を含み、かつ環状構造を有するペプチドで非ヒト哺乳動物を免疫することにより、生体内で複雑なループ構造を形成する部位を有するタンパク質に対する特異的抗体を効率よく取得できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）生理的条件下でループ構造を形成する部位を有するタンパク質に対する抗体を製造する方法であって、前記ループ構造を形成する部位のアミノ酸配列を含み、環状構造を有するペプチドで非ヒト哺乳動物を免疫するステップと、該非ヒト哺乳動物から抗体を回収するステップを含む方法。
（２）生理的条件下でループ構造を形成する部位を有するタンパク質に対する抗体を製造する方法であって、前記ループ構造を形成する部位のアミノ酸配列を含み、かつ環状構造を有するペプチドで非ヒト哺乳動物を免疫するステップと、該非ヒト哺乳動物からB細胞を回収しミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを得るステップと、ハイブリドーマの培養上清から抗体を回収するステップを含む方法。
（３）生理的条件下でループ構造を形成する部位を有するタンパク質に対する抗体を製造する方法であって、前記ループ構造を形成する部位のアミノ酸配列を含み、かつ環状構造を有するペプチドで非ヒト哺乳動物を免疫するステップと、該非ヒト哺乳動物からB細胞を回収しEBVを感染させて不死化するステップと、その培養上清から抗体を回収するステップを含む方法。
（４）前記ペプチドが、前記アミノ酸配列に含まれる２個のシステイン残基のチオール基間のジスルフィド結合を介する環状構造を有するペプチドである、（１）〜（３）のいずれかの方法。
（５）タンパク質が抗体であり、ループ構造をとる部位がCDRである、（１）〜（４）のいずれかの方法。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】マウス抗血清の力価測定の結果を示すグラフ図。
【図２】マウス抗血清によるwhole Ab 3-3とE2tagのcompetition assayの結果を示すグラフ図。各血清を競合させたときの反応性を吸光度で示した。
【図３】No.61株のサブクラス検定結果を示す図（写真）。
【図４】モノクローナル抗体61-11Fのwhole Ab3-3への反応性の結果を示すグラフ図。
【図５】抗体の立体構造の模式図。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の抗体の製造方法は、生理的条件下でループ構造を形成する部位を有するタンパク質に対する抗体を製造する方法であって、前記部位のアミノ酸配列を含み、かつ環状構造を有するペプチドで非ヒト哺乳動物を免疫するステップと、該非ヒト哺乳動物から抗体を回収するステップを含む方法である。【０００８】
生理的条件下でループ構造をとる部位を有するタンパク質としては特に制限されないが、抗体、増殖因子、酵素、受容体などが挙げられ、その中では抗体が特に好ましい。ループ構造は必ずしも環状になっている必要はなく、ステムアンドループ構造などであってもよい。ループ構造をとる部位の長さは特に制限されないが、１〜５０アミノ酸が好ましく、１〜３６アミノ酸がより好ましく、１〜１８アミノ酸がさらに好ましい。なお、「生理的条件下」とは、細胞内や体液中などの生理的条件下を意味し、生理食塩水などの溶液中も含む。
抗体は可変領域と定常領域からなり、可変領域の中の超過変領域のCDR（相補性決定領域）がループ構造をとっている（図５）。したがって、抗体における生理的条件下でループ構造をとる部位としてはCDRが挙げられる。CDRに対する抗体を作製する場合、CDRのアミノ酸配列を有するペプチドをそのまま抗原として用いてもCDRを特異的に認識する抗体がほとんど得られない。本発明の製造法によれば、環状構造を有するペプチドがCDRのループ構造を模倣するため、CDRを特異的に認識する抗体が効率よく得られる。【０００９】
その他のタンパク質についても、現在、X線結晶構造解析により、数多くのタンパク質について３次元構造が明らかになっており、それを参照することによりループ構造をとる部位を選択することができる。例えば、sbi.imim.es/cgi-bin/archdb/loops.plからアクセスすることができるArcDB（Nucleic Acids Res. 2004 Jan 1;32 Database issue:D185-8.）においてはX線結晶構造解析のされている蛋白質のループ構造を取る部分を検索することが可能である。上記データベースでは蛋白質のループ構造を取っている部分のペプチドの配列、すなわち本発明における免疫すべきペプチドを特定することが可能である。上記データベースをもとにループ状構造を検索すると、ミオシン２重鎖の２６４〜２９５アミノ酸の部分、ペプシンの４８〜７４アミノ酸部分、ヘモグロビンの２１〜７０アミノ酸部分などが検索される。
さらに、X線結晶構造解析のデータベースは種々存在するので（Protein Data Bank Japanなど）、それらを任意に用いて立体構造の推定およびループ構造の決定をすることも可能である。
また、蛋白質の立体構造の結晶解析が分かっていない場合でも立体構造予測データをもとにループ構造を推定しそのペプチド配列を免疫することも可能である。
また、３次元構造が明らかになっていないものでも、X線結晶構造解析などによって３次元構造を決定し、それに基づいて、ループ構造をとる部位を選択することができる。【００１０】
本発明の抗体の製造方法においては、上記ループ構造を形成する部位のアミノ酸配列を含み、かつ環状構造を有するペプチドを用いる。ループ構造を形成する部位のアミノ酸配列としては、ループ全体のアミノ酸配列でもよいが、ループの一部のアミノ酸配列や好ましくはループの先端（折り返し点）のアミノ酸を含むループの一部のアミノ酸配列であってもよい。
本発明で用いるペプチドは上記部位のアミノ酸配列からなるものであってもよいが、上記部位のアミノ酸配列にさらに任意の数のアミノ酸が付加されたものであってもよい。本発明で用いるペプチドの長さは特に制限されないが、１〜５０アミノ酸が好ましく、１〜３６アミノ酸がより好ましく、さらに好ましくは１〜１７アミノ酸がよい。なお、環状構造は本発明で用いるペプチドの一部に含まれていてもよいし、ペプチド全体が環状構造を形成していてもよい。【００１１】
上記アミノ酸配列を含み、かつ環状構造を有するペプチドは、例えば、まず、上記アミノ酸配列を含む直鎖上のペプチドを合成し、以下のような方法で環状化することによって得ることができる。ただし、最初から環状構造を含むペプチドを合成してもよい。
１．ペプチド内に存在する２つのシステイン残基のチオール基間にジスルフィド結合を形成させることにより環状化する。
２．ペプチド内に存在するリジンのε−アミノ基などの側鎖アミノ基と、アスパラギン酸のβ−カルボキシル基、グルタミン酸のγ−カルボキシル基などの側鎖カルボキシル基とをペプチド結合させて環状化する。
３．ホモ二価架橋試薬、ヘテロ二価架橋試薬などの化学的架橋剤を用い、ペプチド内の側鎖間、例えば、アミノ基間、カルボキシル基間、アミノ基−カルボキシル基間、アミノ基−チオール基間等で架橋することにより環状化する。
４．ループ構造をとる部位のアミノ酸配列にシステインなどの架橋可能なアミノ酸を付加した配列を有するペプチドを合成し、付加されたアミノ酸を介して環状化することも可能である。例えばシステインのないペプチドの両末端にシステインを入れて架橋する。【００１２】
以下に、生理的条件下でループ構造をとる部位のアミノ酸配列とそれを含む環状構造含有ペプチドの一例を挙げる。ただし、本発明に用いることのできるペプチドはこの例に限定されない。
Val Leu Arg Gly Tyr Cys Arg Arg Gly Ser Cys Tyr Asp Trp Leu Asp Pro（配列番号１）
この配列は抗HCV（C型肝炎ウイルス）抗体のCDR３の配列である。
この配列を含む環状ペプチドとしては６番目と１１番目のシステインをジスルフィド結合させることによって環状にした下記に示すようなペプチドが挙げられる。【００１３】
【化１】
2006057339.tif 000002
【００１４】
本発明の抗体の製造方法では、上述したような環状構造を有するペプチドで非ヒト哺乳動物を免疫する。非ヒト哺乳動物の種類は特に制限されないが、ウサギ、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、サルなどが好ましい。本発明の方法によって製造される抗体は抗血清、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。
免疫する方法は一般的な方法を採用することができ、たとえば、アジュバントを配合した環状構造含有ペプチドを、好ましくは２〜３回、非ヒト哺乳動物に注射することにより免疫する方法が挙げられる。
ポリクローナル抗体は、免疫された非ヒト哺乳動物の血清から、例えば、プロテインAカラムなどを用いて回収することができる。なお、ポリクローナル抗体は必ずしも精製されたものである必要はなく、ポリクローナル抗体を含む抗血清として回収されてもよい。回収されたポリクローナル抗体またはそれを含む血清が目的タンパク質を特異的に認識するかどうかの評価は、例えば、ウエスタンブロットやELISAによって行うことができる。
モノクローナル抗体は、例えば、環状構造含有ペプチドで免疫された非ヒト哺乳動物から単離されたリンパ球をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、得られたハイブリドーマが産生する抗体の中から、目的タンパク質を特異的に認識する抗体を選択することによって得ることができる。抗体の特異性の評価は、ウエスタンブロットやELISAなどによって確認することができる。
さらに、モノクローナル抗体は、例えば、環状構造含有ペプチドで免疫された非ヒト哺乳動物から単離されたリンパ球をEBV（エプスタインバーウイルス）で感染させて不死化細胞を作製し、得られた細胞が産生する抗体の中から、目的タンパク質を特異的に認識する抗体を選択することによって得ることもできる。抗体の特異性の評価は、ウエスタンブロットやELISAなどによって確認することができる。【００１５】
さらに、本発明においては、抗血清、ポリクローナル抗体やハイブリドーマ細胞やEBV不死化細胞から得られたモノクローナル抗体を、抗体のフラグメント、例えば、Ｆ（ａｂ’）2化抗体、Ｆ（ａｂ’）化抗体、短鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）およびミニボディ（Ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）などにしてもよい。また、ハイブリドーマ細胞によって得られたモノクローナル抗体を、キメラ化又はヒト化してもよい。具体的には、遺伝子組み換えによって抗体の定常領域をヒト由来のものとするキメラ抗体作成技術や、超可変領域以外をヒト由来とするヒト化抗体作成技術などを用いて、モノクローナル抗体をキメラ化又はヒト化することができる。【００１６】
本発明の製造法によって得られる抗体は、抗体医薬、診断薬、研究用試薬などとして使用することができる。また、環状構造を有するペプチドが抗体のCDRに基づくペプチドである場合、抗CDR抗体が得られるが、抗CDR抗体は抗体医薬の薬物動態測定や同動物種由来抗体の識別などに好適に使用することができる。
【実施例】
【００１７】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００１８】
［実施例１］ポリクローナル抗体（抗血清）の作製と評価
＜免疫用ペプチドの調製＞
抗ペプチド抗体作製用として、Ｐｉｏｎｅｅｒ（Applied Biosystems 社）を用いて、F-moc固相合成法によりwhole Ab 3-3（完全抗HCV抗体；WO 03/014728に記載）のCDR3のアミノ酸配列である”ＶＬＲＧＹＣＲＲＧＳ  ＣＹＤＷＬＤＰ”のペプチド（配列番号１）を、８０％の純度で合成し、精製を実施した。
ペプチド合成時に脱保護はTFA(4.5mL)、チオアニソール(0.25mL)、エタンジチオール（EDT）(0.15mL)、アニソール(0.1mL)の混液を用い3.5時間行った。樹脂をろ過で除き、エーテル（無水）を用いて遠沈により2回洗浄後、乾燥をした。水75mLとアセトニトリル5mLの混液に本品を溶解し分取用HPLC(Waters 600E; column u-Bondasphere 150×19mm)を用いて相当部分を分取した。分取部分を凍結乾燥し、精製直鎖状ペプチド（以下、ＶＬＲ１７ＳＨフリーペプチドと呼ぶ）約48mgを得た。本品のうち8mgを分取しこれ以降の操作に使用した。
さらにペプチドを２つのシステインで分子内架橋した環状ペプチド（以下ＶＬＲ１７Ｓ−Ｓ環状ペプチドと呼ぶ）の合成を実施した。上記操作で得られたＶＬＲ１７ＳＨフリーペプチド40mgを脱気した水400mLに溶解しゆっくり撹拌を行った。3日後に溶液のうち10mLを分取し、凍結乾燥を行った。Ellman試薬を用いてSH基の測定を行い、0.005という値を得たので、環状化によりＶＬＲ１７ＳＨフリーペプチド中のフリーのSH基は十分少なくなったと考えた。翌日、溶媒を80mL程度に濃縮しHPLCにより分取を行い、得られた溶液を凍結乾燥した。本工程によりＶＬＲ１７Ｓ−Ｓ環状ペプチドを取得した。【００１９】
＜免疫用F(ab’)2の作製＞
whole Ab 3-3溶液をセントリコン30を用いて、0.1M NaCl, 0.1M Acetate buffer(pH 3.2)に置換した。最終濃度を12.6mg/mLとし、4℃で保存した。
以下の反応組成液を作製し、37℃で3時間インキュベートした。
（組成）
whole Ab 3-3            10.4mg
ペプシン                15μg／1.2mL 0.1M NaCl, 0.1M Acetate buffer(pH 3.2)
反応後、直ちに200μLづつに小分けし、1M Tris baseを25μL加えた後-80℃に保存した。
Gel濾過精製前に1本ずつ融解し、TOSOH TSKgel G3000SWXLにて精製およびPBSへの置換を実施した。Gelろ過により約120(kDa)のwhole Ab 3-3のF(ab’)2のみに精製し免疫用抗原とした。
さらに、ELISAの陰性対照として用いるヒト IgG1/kappaのF(ab’)2を作製した。
ヒト IgG1/kappa(THE BINDING SITE社より購入) 4mgをセントリコン30を用いて、0.1M NaCl, 0.1M Acetate buffer(pH 3.2)に置換する操作を4回行った。最終濃度を9.9mg/mLとし、4℃で保存した。
以下の反応組成液を2本作製し、37℃で3時間インキュベートした。
（組成）
ヒト IgG1/kappa        2mg
ペプシン                2.9μg／231μL 0.1M NaCl, 0.1M Acetate buffer(pH 3.2)
反応後、直ちに1M Tris baseを29μL加えた後-80℃に保存した。
Gel濾過精製前に1本づつ融解し、TOSOH TSKgel G3000SWXLにて精製およびPBSへの置換を実施した。Gelろ過により120(kDa)のヒト IgG1/kappaのF(ab’)2のみに精製した。【００２０】
＜ペプチドのKLHへの架橋＞
（方法）
（１）マレイミド法によるＳＨフリーペプチドとＫＬＨ(keyhole limpet hemocyanin)の架橋
ＶＬＲ１７ＳＨフリーペプチド  １ｍｇ粉末を５００μｌのマレイミドコンジュゲーションバーファー（80mMリン酸緩衝液（pH7）0.1M EDTA  0.15M NaCl）で溶解した。マレイミドＫＬＨ(ピアス社より購入)  １ｍｇ粉末を５００μｌの純水で溶解し、ペプチド溶液と直ちに混合した。室温（２５℃）で３時間反応させた。反応後、１００μｌずつ６本に分注して、残りはひとまとめのまま−２０℃で保存した。【００２１】
（２）ＥＤＣ（1-ethy-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride）法による環状ペプチドとＫＬＨの架橋
ＶＬＲ１７Ｓ−Ｓ環状ペプチド  １ｍｇ粉末を５００μｌのＥＤＣコンジュゲーションバーファー（0.1M MES緩衝液（pH4.7）0.9M NaCl  0.02%NaN3）で溶解した。ＫＬＨ（粉末）（ピアス社より購入）は、純水で１０ｍｇ／ｍｌとして、そのうち１００μｌ（１ｍｇ分）をペプチド溶液に添加した。ＥＤＣ試薬（ピアス社より購入）  ５ｍｇを、５００μｌの純水で溶解し、そのうち５０μｌを、ペプチド・ＫＬＨ混合溶液に添加し、室温（２５℃）で３時間反応させた。反応後、透析チューブ（分子量１００００カット）に移し、２ＬのＰＢＳに対して一晩透析した。翌日、透析チューブよりマイクロチューブ内に取り出し、さらに１００μｌずつ６本に分注して、残りはひとまとめのまま−２０℃で保存した。【００２２】
＜抗原のマウスへの免疫＞
ＫＬＨ架橋ＶＬＲ１７ＳＨフリーペプチド、ＫＬＨ架橋ＶＬＲ１７Ｓ−Ｓ環状ペプチド、whole Ab 3-3 F(ab’)2の3種類の抗原を用いて免疫作業を実施した。【００２３】
一次免疫
マレイミド架橋物抗原（ＶＬＲ１７ＳＨフリー−ＫＬＨ）溶液１００μｌ（ペプチド１００μｇ相当）＋ＰＢＳ４００μｌ＋ＦＣＡ(Difco社より購入)  ５００μｌを混合し、エマルジョン化後、２匹のＢＡＬＢ／ｃマウス♀８週令の腹腔に５００μｌずつ投与した。
ＥＤＣ架橋物抗原（ＶＬＲ１７Ｓ−Ｓ環状−ＫＬＨ）溶液１００μｌ（ペプチド１２５μｇ相当）＋ＰＢＳ４００μｌ＋ＦＣＡ  ５００μｌを混合し、エマルジョン化後、２匹のＢＡＬＢ／ｃマウス♀８週令の腹腔に５００μｌずつ投与した。
whole Ab 3-3 F(ab’)2溶液（０．８６９ｍｇ／ｍｌ）２５０μｌ（８６．９μｇ相当）＋ＰＢＳ７５０μｌ＋ＦＣＡ１．０ｍｌを混合し、エマルジョン化後、４匹のＢＡＬＢ／ｃマウス♀８週令の腹腔に５００μｌずつ投与した。【００２４】
二次免疫から三次免疫
一次免疫から2週間後、二次免疫を行った。
マレイミド架橋物抗原（ＶＬＲ１７ＳＨフリー−ＫＬＨ）溶液１００μｌ（ペプチド１００μｇ相当）＋ＰＢＳ８００μｌ＋リビアジュバント（RIBI/Corixa社より購入）１００μｌを混合し、既免疫２匹のＢＡＬＢ／ｃマウス♀１０週令の腹腔に５００μｌずつ投与した。
ＥＤＣ架橋物抗原（ＶＬＲ１７Ｓ−Ｓ環状−ＫＬＨ）溶液１００μｌ（ペプチド１２５μｇ相当）＋ＰＢＳ８００μｌ＋リビアジュバント１００μｌを混合し、既免疫２匹のＢＡＬＢ／ｃマウス♀１０週令の腹腔に５００μｌずつ投与した。
whole Ab 3-3 F(ab’)2溶液（0.869 mg/ml）２５０μｌ（８６．９μｇ相当）＋ＰＢＳ６５０μｌ＋リビアジュバント（RIBI:67060-121801004）１００μｌを混合し、既免疫４匹のＢＡＬＢ／ｃマウス♀１０週令の腹腔に２５０μｌずつ投与した。
二次免疫より２週間の間隔をあけて三次免疫を行った。【００２５】
＜血清の採取＞
３次免疫の一週間後に、各マウスにナンバリング（耳パンチを施す）を実施し、キャピラリー採血管を用いて、眼窩静脈より４０〜５０μｌ採血する操作を３回実施し血液を集めた。室温１時間放置後、遠心機（１００００ｒｐｍ、５分）により血清を分離した。【００２６】
＜力価測定＞
力価測定のため、環状ペプチド、直鎖ペプチド、whole Ab 3-3、陰性対象用ヒト IgG1/kappa F(ab’)2をそれぞれ固定化したELISAプレートを調製した。【００２７】
（１）ＶＬＲ１７Ｓ−Ｓ環状ペプチド固定化プレート
（i）VLR17S-S環状ぺプチド、６００μｇ粉末を秤量してオートクレーブ滅菌水６００μｌを加えて１ｍｇ／ｍｌのペプチド溶解液とした。
（ii）アミノプレート（住友ベークライド社より購入）を用意し、０．１ＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４．７）により、ぺプチド濃度が５μｇ／ｍｌとなるように希釈し、５０μｌ／ウェルで投入した。
（iii）純水で1mg／mlの濃度に調製したＥＤC試薬（ピアス社より購入）を１０μｌ／ウェルで（ii）で調製したアミノプレートに添加し、４℃一晩架橋反応した。
（iv）翌日、PBSにて各ウェルを３回洗浄後、防腐剤入りブロックエースTM（大日本製薬より購入）を、２００μｌ／ウェルで投入し、使用まで、低温室４℃保管した。【００２８】
（２）VLR17SHフリーペプチド固定化プレート
（i）VLR17 SHフリーぺプチド、６００μｇ粉末を秤量してオートクレーブ滅菌水６００μｌを加えて１ｍｇ／ｍｌのペプチド溶解液とした。
（ii）アミノプレート（住友ベークライド社より購入）を用意し、ＰＢＳで希釈して調製した２％グルタルアルデヒド（ナカライテスクより購入）を５０μｌ／ウェル投入し、室温で１時間反応させ、アルデヒド化した。
（iii）ＰＢＳにて各ウェルを３回洗浄後、０．２Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で５μｇ／ｍｌに希釈したＳＨフリーペプチドを５０μｌ／ウェルで投入し、４℃一晩架橋反応した。
（iv）翌日、PBSにて各ウェルを３回洗浄後、防腐剤入りブロックエースTM（大日本製薬より購入）を、２００μｌ／ウェルで投入し、使用まで４℃保管した。【００２９】
（３）whole Ab 3-3 F(ab’)2自然吸着プレート
（i）whole Ab 3-3 F(ab’)2  ８６９μｇ／ｍｌをＰＢＳにて、５μｇ／ｍｌに希釈し、５０μｌ／ウェルでイムノプレート（ナルジェヌンクより購入）に投入し、４℃一晩放置した。
（ii）翌日、ＰＢＳにて各ウェルを３回洗浄後、防腐剤入りブロックエースTM（大日本製薬より購入）を、２００μｌ／ウェルで投入し、使用まで４℃保管した。【００３０】
（４）ヒト IgG1/kappa／F(ab’)2  自然吸着プレート
（i）ヒト IgG1/kappa F(ab’)2  ７２８μｇ／ｍｌをＰＢＳにて、５μｇ／ｍｌに希釈し、５０μｌ／ウェルでイムノプレート（ナルジェヌンクより購入）に投入し、４℃一晩放置した。
（ii）翌日、ＰＢＳにて各ウェルを３回洗浄後、防腐剤入りブロックエースTM（大日本製薬より購入）を、２００μｌ／ウェルで投入し、使用まで４℃保管した。【００３１】
（５）ブランクプレート
（i）アミノプレートに防腐剤入りブロックエースTM（大日本製薬より購入）を、２００μｌ／ウェルで投入し、使用まで４℃保管した。【００３２】
力価測定は以下の方法で実施した。
作製した５種の抗原固定化プレートのブロッキング液を捨て、キムタオルで液をよく切った。採取したマウス部分血清をそれぞれ、ブロックエースＴＭ原液で１０倍希釈した。各ウェルに４０μｌずつ、希釈した血清を投入し、室温（２０℃）１時間反応させた。ＰＢＳで各ウェル３回洗浄した。キムタオルで液をよく切った。抗マウスＩｇＧ−ＰＯＤ標識抗体（Ｚｙｍｅｄ社より購入）をブロックエースＴＭで５００倍希釈して５０μｌ／ウェルで投入し、室温（２０℃）１時間反応させた。ＰＢＳで各ウェル３回洗浄した。キムタオルで液をよく切った。発色基質：ＡＢＴＳを５０μｌ／ウェルで投入し、室温にて１０分発色反応させた。１５０ｍＭシュウ酸溶液を５０μｌ／ウェルで添加し、反応を停止させ、モレキュラーデバイス社のM-Tmax（機体番号UVT06000）を用いてＡ４０５ｎｍの吸光度を測定した。【００３３】
吸光度測定結果を図１に示す。
VLR17S-S環状ぺプチド免疫マウス血清2例はともに陰性対象であるヒト IgG1/kappaには反応性を示さずwhole Ab 3-3にのみ反応性を示した。
VLR17 SHフリーペプチド免疫マウス血清2例はともにwhole Ab 3-3にもヒト IgG1/kappaにも反応性を示さなかった。
whole Ab 3-3免疫マウス血清4例は2例がwhole Ab 3-3に反応性を示したがそのうちの1例はヒト IgG1/kappaにも反応性を示した。
ゆえに、VLR17S-S環状ペプチドを免疫したマウスではwhole Ab 3-3のみに反応性を示す血清が効率的に取得できた。【００３４】
＜マウス抗血清によるwhole Ab 3-3とE2tagのcompetition assay＞
E2tag溶液（WO 03/014728に作製法を記載）を0.05M Bicarbonate buffer(pH9.6)で3.3μg/mLに希釈し、50μL/wellにて96wellプレートに加え、37℃で1時間インキュベートした。各wellの溶液をデカンテーションで廃棄し、各wellに250μLの5% BSAを含むPBSを加え、4℃で16時間以上保温した。溶液除去後、0.05% Tween20を含むPBSで各wellを5回づつ洗浄した。同時に各免疫マウス血清を5% BSAを含むPBSを用いて50倍、500倍、5000倍希釈した溶液50μLと50ng/mLのwhole Ab 3-3溶液50μLを混合し37℃で1時間インキュベートした。本溶液50μLを各wellにて加え、37℃で1時間インキュベートした。溶液除去、0.05% Tween20を含むPBSで5回洗浄後、5% BSAを含むPBS を用いてHRP標識抗ヒト IgG(Fc)を2000倍希釈した溶液を各wellに50μL加え、室温で1時間保温した。液除去、PBSで5回洗浄後、o-フェニレンジアミン（SIGMAより購入）20mgと30%％H2O2  20μLを加えたPhosphate  Citrate  Buffer（クエン酸（無水）4.7g、Na2HPO4 7.3gをMilliQ水1Lに溶解したbuffer（pH5.0）） 50μLを各wellに加え室温で遮光して約5分間反応させた。等量の10%硫酸を加えて反応を停止させた後、イムノリーダーを用いて各wellの波長1（490nm）における吸光度A1及び波長2（650nm）における吸光度A2を測定し、(A1-A2)を求めた。【００３５】
結果を図2に示す。
VLR17環状ペプチド免疫マウス血清は2例ともにwhole Ab 3-3とE2tagのinteractionを阻害した。
また、whole Ab 3-3免疫マウス血清はwhole Ab 3-3に反応性を示した血清2例ともにwhole Ab 3-3とE2tagのinteractionを阻害した。しかし、そのうち1例はwhole Ab 3-3のみを特異的に認識する抗体ではなかった。
以上の結果より、目的抗体のCDR3を環状化したペプチドを免疫したマウスにおいて効率よく目的抗体に対するイデオタイプ抗血清が取得された。さらに、得られた抗血清は目的抗体と抗原の結合を効率よく阻害した。【００３６】
［実施例２］モノクローナル抗体の作製と評価
さらにCDR3を環状化したペプチドを免疫したマウスから脾臓を摘出しハイブリドーマおよびモノクローナル抗体の作製を試みた。【００３７】
＜抗原のマウスへの免疫II＞
四次免疫から五次免疫
三次免疫から１ヶ月の間隔をあけて四次免疫を実施した。
さらに、脾臓摘出前の追加免疫として四次免疫の二週間後にＥＤＣ架橋物抗原（ＶＬＲ１７環状−ＫＬＨ）溶液１００μｌ（ペプチド１２５μｇ相当）＋ＰＢＳ８００μｌ＋リビアジュバント（RIBI:67060-121801004）１００μｌを混合し、ＥＤＣ架橋物抗原既免疫２匹のＢＡＬＢ／ｃマウス♀１０週令の腹腔に５００μｌずつ投与し五次免疫を実施した。【００３８】
＜ハイブリドーマ作製と抗体の機能解析＞
（１）細胞融合
五次免疫を施し、３日後のマウスより脾臓を摘出し、同時に心臓より採血を実施し、のちほど小型冷却遠心機にて（１００００ｒｐｍ、５分）血清を採取した。摘出した脾臓は、乾熱滅菌した金属メッシュ上で、無血清培地１０ｍｌを加えながら、乾熱滅菌したガラス棒により脾臓をつぶした。５０ｍｌ遠心チューブに入れ、無血清培地でのべ３回の洗浄・遠心を行った。一方、融合パートナーとしてマウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｕ１を９ｃｍシャーレ６枚分培養したものを回収し、同じく無血清培地でのべ３回の洗浄を行い、両者を混合して５０％ＰＥＧ（ナカライテスク：code.28219-55、オートクレーブにて滅菌）／ＲＰＭＩ１６４０（無血清）存在下で、細胞融合を実施した。
融合細胞は、血清培地１００ｍｌに懸濁し、１００μｌ／ウェルずつ９６穴培養プレート（Falcon ：code.3072）、１０枚分にまきこみ、３７℃、５％ＣＯ２で培養を開始した。１０枚目の最終ウェル１つは、陽性コントロールとしての抗血清用に細胞懸濁液は未投入としておいた。【００３９】
（２）ＨＡＴ選択
細胞融合の翌日より、ＨＡＴ培地（ＩＣＮ：16-808-49と三光純薬：CM-B）を１００μｌ／ウェルで添加し、融合した細胞のみの選択培養を開始した。翌日から、培地交換を実施した。
途中、顕微鏡観察によりコロニーの増殖を観察し、細胞融合の成功を確認した。【００４０】
（３）ハイブリドーマスクリーニング
（i）抗原プレートの作製
whole Ab 3-3 F(ab’)2抗体とブランク抗体をそれぞれＰＢＳ溶液により  １０μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェルで、イムノプレート（ナルジェヌンク：code.468667）各１３枚に投入し、抗原プレートを作製した。
（ii）翌日、ブロックエースＴＭ（大日本製薬：code.UK-B25）原液を、２００μｌ／ウェルで投入し、４℃一晩放置しブロッキング操作を実施した。
（iii）翌日、融合細胞９５９株の培養上清を無菌下で、１１０μｌずつ全ウェルについて回収した。回収した上清を、whole Ab 3-3 F(ab’)2抗体とブランク抗体プレートのそれぞれに５０μｌずつ投入し、室温で１時間放置して、一次反応を実施した。
（iv）ＰＢＳで各ウェルを３回洗浄後、抗マウスＩｇＧ−ＰＯＤ標識抗体（Ｚｙｍｅｄ：61-6520）をブロックエースＴＭにて５００倍希釈し、５０μｌ／ウェルで投入し、室温で１時間放置して、二次反応を実施した。
（v）ＰＢＳで各ウェルを４回洗浄後、ＡＢＴＳ（ナカライテスク試薬を使用した自家調製品）を１００μｌ／ウェルで投入し、室温で５〜１０分程度放置して、発色反応を実施した。【００４１】
吸光度測定を行い発色が強かった６３株について二次スクリーニングを実施した。
一次スクリーニングで陽性と思われた６３株について、再度、両抗原とあらたに環状ペプチド抗原に対しての反応を調べた。二次スクリーニングでは二次抗体のバックグラウンドを回避するために環状ペプチド抗原を抗原としたスクリーニングを実施した。環状ペプチドとwhole Ab 3-3 F(ab’)2抗体に反応し、ブランク抗体に反応しないＮｏ．６１を選抜した。【００４２】
（４）陽性株のクローニング
限界希釈法により、陽性株（Ｎｏ．６１）のクローニングを実施した。競合する細胞群と分離するために、顕微鏡下でコロニーをピックアップした。ピックアップにより分離した細胞群の活性を再度確認し、反応陽性の群からクローニングを開始した。クローニングは、あらかじめクローニングメディウム１００μｌを入れた９６穴培養プレートに、１穴あたり２細胞、１細胞、０．５細胞となるように、希釈した細胞液１００μｌを加えて定法どおり行った。【００４３】
（５）サブクラス検定
陽性株（クローニング前のＮｏ．６１）の培養上清を用いて、ＩＤ／ＳＰ  ＫＩＴ（Zymed  93-6550）の説明書にしたがって、検定したところＩｇＧ２ａと判断された。（図３）【００４４】
（６）クローニングアッセイとリクローニング
希釈培養したウェルに対して、ＶＬＲ１７Ｓ−Ｓ環状ペプチドプレートを作製してクローニングアッセイを実施した。
完全なシングルセルになるまで、限界希釈クローニングとアッセイを繰り返した。【００４５】
（７）シングルクローン樹立
シングルクローンを３種独立して取得し、増殖してきた順に  本株１種（６１−１１Ｆ）、亜株２種（６１−１２Ｈ、６１−９Ｇ）と名づけ、拡大培養を実施し凍結保存した。【００４６】
（８）培養上清の精製
６１−１１F株を培養し得られた培養上清をProteinAカラムを用いて精製した。
ProteinAカラム（カラム高 1cm、カラム径 1cm）に線速0.5cm／minで培養上清をapplyした。その後、PBSを線速0.5cm／minで50ml流しカラムを洗浄した。次にElution溶液、0.1M Acetate buffer(pH3.0)を線速0.5cm／minで約30ml流した。Elution溶液を2mlづつフラコレチューブ14本に分注した。分注したElution溶液のAbs280nmを分光光度計（日立製作所製、ダブルビーム分光光度計  U-2001）を用いてを測定した。ピークの範囲で吸光度があったフラコレチューブのElution溶液を１つにまとめて抗体sampleとした。
得られた抗体sampleはセントリコン50を用いて定法により0.1%のアザイドを含むPBSに置換した。【００４７】
（９）モノクローナル抗体の活性測定
whole Ab 3-3 F(ab’)2溶液およびヒト IgG1/kappa F(ab’)2溶液（溶液１で10μg/mlに希釈）を50μL/wellで96wellプレートに加え、３７℃で２時間処理した。その後、wellの溶液をすて、各wellに250μlの溶液２を加え、４℃で１６時間以上保温した。溶液除去後、溶液３で各wellを５回ずつ洗浄し、溶液４で100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125(ng/mL)に希釈した61-11F上清由来のモノクローナル抗体溶液を50μL/wellで加えて、３７℃で１時間保温した。溶液除去、溶液３で５回洗浄後、溶液５を50μL/wellで加え、室温で1時間保温した。液除去、PBSで５回洗浄後、溶液９を100μL/wellで加えて室温で遮光して約５分間反応させた。等量の10%硫酸を加えて反応を停止させた後、イムノリーダー（Inter Med社製、Immuno Reader NJ-2000）を用いて各wellの波長１（490nm）及び波長2（650nm）における吸光度A1及びA2を測定し、（A1-A2）を求めた。その結果、61-11F由来のモノクローナル抗体はwhole Ab 3-3のみに特異的に結合することが示された（図4）。【００４８】
なお、各溶液の組成は以下の通りである。
溶液１：0.1% Sodium Azideを含むPBS
溶液２：1% BSA、0.1% Sodium Azideを含むPBS
溶液３：0.05%のTween20を含むPBS
溶液４：1% BSAを含むPBS
溶液５：HRP標識抗マウス免疫グロブリンヤギ抗体（Zymed社より購入）原液2μLを10mlの溶液４に溶かしたもの（用時調製）
溶液６：リン酸−水素ナトリウム14.2gを取り、水を加えて500mlとする
溶液７：クエン酸１水和物10.5gを取り水を加えて500mlとする
溶液８：溶液５ 257mlに溶液６を243ml加え、水を加えて1000mlとする
溶液９：O-フェニレンジアミン（和光純薬より購入）4.0mgを取り、溶液７を10ml及び３０％(v/v)過酸化水素溶液5マイクロリットルを加えて溶かす（調製後１０分以内に用いた）
【産業上の利用の可能性】
【００４９】
本発明の方法によれば、生体内で複雑なループ構造を形成する部位を有するタンパク質に対する特異的抗体を効率よく製造することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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