(57)【要約】本発明は種々の有用なポリペプチドなどを提供するもので、特に、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、上記ポリペプチドの活性を促進する化合物またはその塩などは、腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群、高血圧などの予防・治療剤などとして利用することができる。また、上記ポリペプチドの活性を阻害する化合物またはその塩は、例えば蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング症候群などの予防・治療剤などとして有用である。さらに、配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどは、拒食症などの予防・治療剤、摂食（食欲）促進剤などとして利用することもできる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド（但し、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを除く）、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項２】
配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなる請求項１記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項３】
配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列からなる請求項１記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項４】
請求項１記載のポリペプチドの部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項５】
配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド（但し、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを除く）、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項６】
配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなる請求項５記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項７】
配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列からなる請求項５記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項８】
請求項５記載のポリペプチドの部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項９】
請求項１記載のポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項１０】
ＤＮＡである請求項９記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号：１２または配列番号：１３で表される塩基配列を含有する請求項１０記載のＤＮＡ。
【請求項１２】
配列番号：１２または配列番号：１３で表される塩基配列からなる請求項１０記載のＤＮＡ。
【請求項１３】
請求項５記載のポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項１４】
ＤＮＡである請求項１３記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号：１４または配列番号：１５で表される塩基配列を含有する請求項１４記載のＤＮＡ。
【請求項１６】
配列番号：１４または配列番号：１５で表される塩基配列からなる請求項１４記載のＤＮＡ。
【請求項１７】
請求項９または１３記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項１８】
請求項１７記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１９】
請求項１８記載の形質転換体を培養し、請求項１または５記載のポリペプチドまたはその部分ペプチドを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする請求項１または５記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩の製造法。
【請求項２０】
請求項１記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体。
【請求項２１】
請求項２０記載の抗体を用いることを特徴とする請求項１記載のポリペプチドの定量方法。
【請求項２２】
請求項２１記載の定量方法を用いることを特徴とする請求項１記載のポリペプチドの機能が関連する疾患の診断法。
【請求項２３】
請求項５記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体。
【請求項２４】
請求項２３記載の抗体を用いることを特徴とする請求項５記載のポリペプチドの定量方法。
【請求項２５】
請求項２４記載の定量方法を用いることを特徴とする請求項５記載のポリペプチドの機能が関連する疾患の診断法。
【請求項２６】
請求項９記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド。
【請求項２７】
請求項１３記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項１記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする、該ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項２９】
請求項１記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有することを特徴とする、該ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項３０】
請求項５記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする、該ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項３１】
請求項５記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有することを特徴とする、該ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項３２】
請求項１記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる医薬。
【請求項３３】
請求項９記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
【請求項３４】
請求項１記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる医薬。
【請求項３５】
腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群または高血圧の予防・治療剤である請求項３２〜３４のいずれかに記載の医薬。
【請求項３６】
請求項１記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬。
【請求項３７】
請求項２０記載の抗体を含有してなる医薬。
【請求項３８】
請求項２６記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
【請求項３９】
蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症またはクッシング症候群の予防・治療剤である請求項３６〜３８のいずれかに記載の医薬。
【請求項４０】
請求項５記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる医薬。
【請求項４１】
請求項１３記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
【請求項４２】
請求項５記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる医薬。
【請求項４３】
腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群、高血圧もしくは拒食症の予防・治療剤または摂食促進剤である請求項４０〜４２のいずれかに記載の医薬。
【請求項４４】
請求項５記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬。
【請求項４５】
請求項２３記載の抗体を含有してなる医薬。
【請求項４６】
請求項２７記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
【請求項４７】
蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング症候群、肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤である請求項４４〜４６のいずれかに記載の医薬。
【請求項４８】
外来性の、請求項９または請求項１３記載のポリヌクレオチドを有する非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項４９】
請求項１記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進することを特徴とする腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群または高血圧の予防・治療方法。
【請求項５０】
請求項１記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、請求項９記載のポリヌクレオチド、または該ポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に対して投与することを特徴とする腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群または高血圧の予防・治療方法。
【請求項５１】
腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群または高血圧の予防・治療剤の製造のための請求項１記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、請求項９記載のポリヌクレオチド、または該ポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の使用。
【請求項５２】
請求項１記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害することを特徴とする蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症またはクッシング症候群の予防・治療方法。
【請求項５３】
請求項１記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、請求項２０記載の抗体または請求項２６記載のアンチセンスポリヌクレオチドの有効量を哺乳動物に対して投与することを特徴とする蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症またはクッシング症候群の予防・治療方法。
【請求項５４】
蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症またはクッシング症候群の予防・治療剤を製造するための、請求項１記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、請求項２０記載の抗体または請求項２６記載のアンチセンスポリヌクレオチドの使用。
【請求項５５】
請求項５記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進することを特徴とする腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群、高血圧もしくは拒食症の予防・治療方法または摂食促進方法。
【請求項５６】
請求項５記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、請求項１３記載のポリヌクレオチド、または該ポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に対して投与することを特徴とする腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群、高血圧もしくは拒食症の予防・治療方法または摂食促進方法。
【請求項５７】
腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群、高血圧もしくは拒食症の予防・治療剤または摂食促進剤の製造のための請求項５記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、請求項１３記載のポリヌクレオチド、または該ポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の使用。
【請求項５８】
請求項５記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害することを特徴とする蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング症候群、肥満症または摂食亢進症の予防・治療方法。
【請求項５９】
請求項５記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、請求項２３記載の抗体または請求項２７記載のアンチセンスポリヌクレオチドの有効量を哺乳動物に対して投与することを特徴とする蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング症候群、肥満症または摂食亢進症の予防・治療方法。
【請求項６０】
蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング症候群、肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤を製造するための、請求項５記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、請求項２３記載の抗体または請求項２７記載のアンチセンスポリヌクレオチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ポリペプチドまたはその塩、これをコードするポリヌクレオチド、これらの用途等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＶＧＦはニューロンおよび内分泌細胞に見られる分泌ポリペプチドである。ｖｇｆ遺伝子は、元来、ＮＧＦ処理時、ラットの褐色細胞腫ＰＣ１２細胞株に速やかに誘導される遺伝子として単離された（Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２，７０３−７０８（２０００））。ＶＧＦは、神経細胞および神経内分泌細胞の中で合成され、有芯小胞（ｄｅｎｓｅ  ｃｏｒｅ  ｖｅｓｉｃｌｅ）に輸送され、調節された分泌経路を介して分泌される（ＥＭＢＯ  Ｊ．８，２２１７−２２２３（１９８９））。ＶＧＦの特異的除去（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｂｌａｔｉｏｎ）により、ＶＧＦがエネルギー恒常性に関与することが報告されている（Ｎｅｕｒｏｎ  ２３，５３７−５４８（１９９９））、（Ｍｔ．Ｓｉｎａｉ  Ｊ．Ｍｅｄ．７０，９３−１００（２００３））。さらに、ヒトおよびラットＶＧＦのヌクレオチドおよびアミノ酸配列、ならびにＶＧＦは代謝、長期記憶への関与などの生理活性を有することが報告されている（国際公開第２００１／０７０７４号パンフレット、国際公開第２００１／０７４７７号パンフレット、国際公開第２０００／７００４２号パンフレット、国際公開第２００１／２２９２０号パンフレット、国際公開第２００１／６４８３５号パンフレット、国際公開第２００１／７４２９８号パンフレット、国際公開第２００３／０６２３９５号パンフレット、国際公開第２００４／０３０６１５号パンフレットおよび国際公開第２００４／０４８９３８号パンフレット）。
また、ラットＰＣ１２細胞においてＮＧＦ刺激によってＶＧＦ遺伝子のｍＲＮＡ発現量が上昇すること（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９（４７１１），３９３−３９５（１９８５））、ＶＧＦタンパク質がラットの視交叉上核において強く発現していること（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．９（１２），４１２２−４１３７（１９８９））、ゴールデンハムスターの視交叉上核において照明点灯後３−９時間のＶＧＦ遺伝子のｍＲＮＡ発現量が亢進することおよびＶＧＦが概日リズムの制御に関与していること（Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．３７８（２），２２９−２３８（１９９７））、ＶＧＦ遺伝子のホモ欠失体は体型が小さくなり、代謝が亢進し、過活動で不稔であることおよび野生型マウスにおいて絶食によって視床下部の弓状核におけるＶＧＦ遺伝子のｍＲＮＡの発現が亢進されることおよびＶＧＦが摂食およびエネルギー代謝に関与する可能性があること（Ｎｅｕｒｏｎ  ２３（３），５３７−５４８（１９９９））が報告されている。
さらに、ウシ下垂体後葉からＶＧＦの部分ペプチドを単離したこと（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３５（６），２７４２−２７４８（１９９４））、ラット脳抽出物からＶＧＦの部分ペプチドを単離したこと（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．８１（３），５６５−５７４（２００２））が報告されている。また、ＶＧＦのＣ末側の部分ペプチドが、雄性ラットの視床下部室傍核への投与によって濃度依存的に勃起を促進したこと（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０（１１），３０３５−３０４０（２００４））が報告されている。
【発明の開示】
【０００３】
現在、尿排出障害、高血圧、拒食症、蓄尿障害、尿崩症、肥満症などの予防・治療剤は種々知られているが、より優れたこれら疾患の予防・治療剤が望まれている。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドがバソプレシン分泌抑制活性を有することを見出した。さらに、本発明者らは、配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドがバソプレシン分泌抑制活性に加え、摂食促進活性を有することを見出した。これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
（１）配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド（但し、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを除く）、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩；
（２）配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなる上記（１）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩；
（３）配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列からなる上記（１）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩；
（３ａ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなる上記（１）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩；
（３ｂ）配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列からなる上記（１）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩；
（４）上記（１）記載のポリペプチドの部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩；
（５）配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド（但し、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを除く）、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩；
（６）配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなる上記（５）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩；
（７）配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列からなる上記（５）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩；
（７ａ）配列番号：７で表されるアミノ酸配列からなる上記（５）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩；
（７ｂ）配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列からなる上記（５）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩；
（８）上記（５）記載のポリペプチドの部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩；
（９）上記（１）記載のポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（１０）ＤＮＡである上記（９）記載のポリヌクレオチド；
（１１）配列番号：１２または配列番号：１３で表される塩基配列を含有する上記（１０）記載のＤＮＡ；
（１１ａ）配列番号：１２、配列番号：１３または配列番号：１７で表される塩基配列を含有する上記（１０）記載のＤＮＡ；
（１１ｂ）配列番号：１２で表される塩基配列を含有する上記（１０）記載のＤＮＡ；
（１１ｃ）配列番号：１３または配列番号：１７で表される塩基配列を含有する上記（１０）記載のＤＮＡ；
（１２）配列番号：１２または配列番号：１３で表される塩基配列からなる上記（１０）記載のＤＮＡ；
（１２ａ）配列番号：１２、配列番号：１３または配列番号：１７で表される塩基配列からなる上記（１０）記載のＤＮＡ；
（１２ｂ）配列番号：１２で表される塩基配列からなる上記（１０）記載のＤＮＡ；
（１２ｃ）配列番号：１３または配列番号：１７で表される塩基配列からなる上記（１０）記載のＤＮＡ；
（１３）上記（５）記載のポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（１４）ＤＮＡである上記（１３）記載のポリヌクレオチド；
（１５）配列番号：１４または配列番号：１５で表される塩基配列を含有する上記（１４）記載のＤＮＡ；
（１５ａ）配列番号：１４、配列番号：１５または配列番号：１８で表される塩基配列を含有する上記（１４）記載のＤＮＡ；
（１５ｂ）配列番号：１４で表される塩基配列を含有する上記（１４）記載のＤＮＡ；
（１５ｃ）配列番号：１５または配列番号：１８で表される塩基配列を含有する上記（１４）記載のＤＮＡ；
（１６）配列番号：１４または配列番号：１５で表される塩基配列からなる上記（１４）記載のＤＮＡ；
（１６ａ）配列番号：１４、配列番号：１５または配列番号：１８で表される塩基配列からなる上記（１４）記載のＤＮＡ；
（１６ｂ）配列番号：１４で表される塩基配列からなる上記（１４）記載のＤＮＡ；
（１６ｃ）配列番号：１５または配列番号：１８で表される塩基配列からなる上記（１４）記載のＤＮＡ；
（１７）上記（９）または（１３）記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター；
（１８）上記（１７）記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体；
（１９）上記（１８）記載の形質転換体を培養し、上記（１）または（５）記載のポリペプチドまたはその部分ペプチドを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする上記（１）または（５）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩の製造法；
（２０）上記（１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体；
（２１）上記（２０）記載の抗体を用いることを特徴とする上記（１）記載のポリペプチドの定量方法；
（２２）上記（２１）記載の定量方法を用いることを特徴とする上記（１）記載のポリペプチドの機能が関連する疾患の診断法；
（２３）上記（５）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体；
（２４）上記（２３）記載の抗体を用いることを特徴とする上記（５）記載のポリペプチドの定量方法；
（２５）上記（２４）記載の定量方法を用いることを特徴とする上記（５）記載のポリペプチドの機能が関連する疾患の診断法；
（２６）上記（９）記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド；
（２７）上記（１３）記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド；
（２８）上記（１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする、該ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法；
（２９）上記（１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有することを特徴とする、該ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット；
（３０）上記（５）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする、該ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法；
（３１）上記（５）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有することを特徴とする、該ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット；
（３２）上記（１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる医薬；
（３３）上記（９）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬；
（３４）上記（１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる医薬；
（３５）腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群または高血圧の予防・治療剤である上記（３２）〜（３４）のいずれかに記載の医薬；
（３６）上記（１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬；
（３７）上記（２０）記載の抗体を含有してなる医薬；
（３８）上記（２６）記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬；
（３９）蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症またはクッシング症候群の予防・治療剤である上記（３６）〜（３８）のいずれかに記載の医薬；
（４０）上記（５）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる医薬；
（４１）上記（１３）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬；
（４２）上記（５）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる医薬；
（４３）腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群、高血圧もしくは拒食症の予防・治療剤または摂食促進剤である上記（４０）〜（４２）のいずれかに記載の医薬；
（４４）上記（５）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬；
（４５）上記（２３）記載の抗体を含有してなる医薬；
（４６）上記（２７）記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬；
（４７）蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング症候群、肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤である上記（４４）〜（４６）のいずれかに記載の医薬；
（４８）外来性の、上記（９）または上記（１３）記載のポリヌクレオチドを有する非ヒトトランスジェニック動物；
（４９）上記（１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進することを特徴とする腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群または高血圧の予防・治療方法；
（５０）上記（１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、上記（９）記載のポリヌクレオチド、または該ポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に対して投与することを特徴とする腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群または高血圧の予防・治療方法；
（５１）腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群または高血圧の予防・治療剤の製造のための上記（１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、上記（９）記載のポリヌクレオチド、または該ポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の使用；
（５２）上記（１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害することを特徴とする蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症またはクッシング症候群の予防・治療方法；
（５３）上記（１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、上記（２０）記載の抗体または上記（２６）記載のアンチセンスポリヌクレオチドの有効量を哺乳動物に対して投与することを特徴とする蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症またはクッシング症候群の予防・治療方法；
（５４）蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症またはクッシング症候群の予防・治療剤を製造するための、上記（１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、上記（２０）記載の抗体または上記（２６）記載のアンチセンスポリヌクレオチドの使用；
（５５）上記（５）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進することを特徴とする腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群、高血圧もしくは拒食症の予防・治療方法または摂食促進方法；
（５６）上記（５）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、上記（１３）記載のポリヌクレオチド、または該ポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に対して投与することを特徴とする腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群、高血圧もしくは拒食症の予防・治療方法または摂食促進方法；
（５７）腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群、高血圧もしくは拒食症の予防・治療剤または摂食促進剤の製造のための上記（５）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、上記（１３）記載のポリヌクレオチド、または該ポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の使用；
（５８）上記（５）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害することを特徴とする蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング症候群、肥満症または摂食亢進症の予防・治療方法；
（５９）上記（５）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、上記（２３）記載の抗体または上記（２７）記載のアンチセンスポリヌクレオチドの有効量を哺乳動物に対して投与することを特徴とする蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング症候群、肥満症または摂食亢進症の予防・治療方法；
（６０）蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング症候群、肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤を製造するための、上記（５）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、上記（２３）記載の抗体または上記（２７）記載のアンチセンスポリヌクレオチドの使用
等を提供する。
さらに、本発明は、
（Ｉ）配列番号：４、配列番号：５、または配列番号：６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列である上記（１）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩；
（ＩＩ）配列番号：４、配列番号：５、または配列番号：６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、（ｉ）配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１５個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１５個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１５個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１５個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列である上記（１）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩；
（ＩＩＩ）上記（９）記載のポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
（ＩＶ）配列番号：７、配列番号：８、または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列である上記（５）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩；
（ｖ）配列番号：７、配列番号：８、または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、（ｉ）配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１５個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１５個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１５個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１５個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列である上記（５）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩；および
（ＶＩ）上記（１３）記載のポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドから選択されるポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルもしくはその塩またはポリヌクレオチドであって、かつ、バソプレシン分泌抑制活性もしくは摂食促進活性など本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルもしくはその塩またはポリヌクレオチドなども提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＮＥＲＰの内因的存在を示す図である。図中、ａからｄは、それぞれヒト血漿（ａ）、ラット視床下部（ｂ）、ラット下垂体前葉（ｃ）およびラット下垂体後葉（ｄ）における免疫反応性ＮＥＲＰ−１（白丸）およびＮＥＲＰ−２（黒丸）のＲＰ−ＨＰＬＣによる解析結果を示す。矢印１と矢印２は、それぞれ合成ＮＥＲＰ−１および合成ＮＥＲＰ−２の溶出位置を示す。
図２は、ラット内分泌組織におけるＮＥＲＰ免疫反応性細胞の局在を示す図である。
図３は、ＳＯＮにおけるＮＥＲＰ１（赤）およびＮＥＲＰ−２（赤）とＡＶＰ（緑）およびオキシトシン（緑）との共局在を示す図である。目盛は５０μｍを示す。挿入された図は、ラットＳＯＮニューロンにおけるＮＥＲＰの代表的な免疫電子顕微鏡写真であり、ＳＯＮにおけるＮＥＲＰ（１０ｎｍの金粒子、赤の矢印）とＡＶＰおよびオキシトニン（５ｎｍ金粒子、緑の矢印）の共局在を示す。目盛は１μｍを示す。
図４は、ＰＶＮ（矢印）およびＳＯＮ（矢先印）における４８時間絶水によるＶＧＦ遺伝子発現の増加を示す図である。
図５は、ＰＶＮおよびＳＯＮにおけるフィルムオートラジオグラフィー（図４）のデンシトメトリーによる定量的密度解析の結果を示す図である。＊はＰ＜０．００１（対照群と比較）を示す。
図６は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＮＥＲＰのＡＶＰ分泌に対する作用を示す図である。＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１を示す。
図７は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰＶＮおよびＳＯＮの静的培養からのＡＶＰ分泌に対するＮＥＲＰの作用を示す図である。黒、白および斜線は、各々ＮＥＲＰ−１、ＡＴ−ＩＩおよびＫＣｌの投与期間を示す。＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１を示す。
図８は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの下垂体後葉の静的培養からのＡＶＰ分泌に対するＮＥＲＰ−１の作用を示す図である。黒、白および斜線は、各々ＮＥＲＰ−１、ＡＴ−ＩＩおよびＫＣｌの投与期間を示す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を示す。
図９は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの切片試料における、ＮＥＲＰ−１に反応したＩＰＳＣ周波数の増加を示す図である。時間１、２、３から得られる、ＮＥＲＰ−２を適用する前、適用している間および適用した後における典型的な自然発生するＩＰＳＣを時間軸において拡大したものを四角に囲んで示す。
図１０は、ＳＯＮニューロンにおけるＩＰＳＣおよびＥＰＳＣの周波数に対するＮＥＲＰ−１の作用を示す図である。＊はＰ＜０．０５（対照群と比較）を示す。
図１１は、ＮＥＲＰ−１で誘導されたＩＰＳＣの増強に対するテトロドトキシン（ＴＴＸ、１０−６Ｍ）の作用を示す図である。ＴＴＸは、ＮＥＲＰ−１投与５分後に添加された。
図１２は、ＮＥＲＰ−１で誘導されたＩＰＳＣの増強に対するヘモグロビン（Ｈｂ、１０−６Ｍ）の作用を示す図である。ＨｂはＮＥＲＰ−１投与の５分後に添加された。
図１３は、ＮＥＲＰ−１（グレー）、ＮＥＲＰ−２（黒）、およびＮＥＲＰ−２−Ｇｌｙ（網掛け）のＩＣＶ投与を受けた自由摂食ラットの摂食を示す図である。＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．００１を示す。
図１４は、視床下部外側野におけるＮＥＲＰ−２（赤）およびオレキシン（緑）またはＭＣＨ（緑）の免疫組織化学的二重染色の結果を示す図である。ｆｘは、脳弓（ｆｏｒｎｉｘ）を示す。棒は、１００μｍを示す。ＮＥＲＰ−２とオレキシンの共染色は黄色で示されている（中央）。
図１５は、ＮＥＲＰ−２で誘導されたラットの摂食に対する抗オレキシン−Ａ  ＩｇＧ（０．２５μｇ）と抗オレキシン−Ｂ  ＩｇＧ（０．２５μｇ／１０μｌ）または抗ＭＣＨ  ＩｇＧ（０．５μｇ／１０μｌ）の作用を示す図である。＊はＰ＜０．０１を示す。
図１６は、ＮＥＲＰ−２（１ｎｍｏｌ／２μｌ）またはＭＣＨ（１ｎｍｏｌ／２μｌ）のＩＣＶ投与を受けたオレキシン・ノックアウトマウスおよび野生型の同腹子の１時間の摂食を示す図である。＊はＰ＜０．０５を示す。
図１７は、ＮＥＲＰ−２（１ｎｍｏｌ）のＩＣＶ投与を受けたオレキシン・ノックアウトマウスおよび野生型の同腹子の自発運動を示す図である。＊はＰ＜０．０１を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本明細書中、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を、「ＮＥＲＰ−１」と略称することがある。また、配列番号：７、配列番号：８、または配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有するポリペチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を、「ＮＥＲＰ−２」と略称することがある。
配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド（以下、「本発明のポリペプチドＡ」と略称する場合がある）および配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド（以下、「本発明のポリペプチドＢ」と略称する場合がある）は、例えば、ヒト、哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル、イヌ）などのあらゆる細胞（例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、膵臓ランゲルハンス島、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）や血球系の細胞、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するポリペプチドであってもよく、合成ペプチドであってもよい。
配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用いて計算することができる。
配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとしては、例えば、前記の配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドなどが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、本発明のポリペプチドの有する活性、例えば、バソプレシン分泌抑制活性、レセプターとの結合活性、レセプター発現細胞に対する細胞刺激活性（例、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ生成抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、リン脂質依存性プロテインキナーゼの活性化、またはマイトジェン活性化タンパク質リン酸化酵素（ＭＡＰキナーゼ）の活性化などを促進する活性など）、前述の疾患の予防・治療活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的（例、生理学的に、または薬理学的に）に同質であることを示す。したがって、バソプレシン分泌抑制活性、レセプターとの結合活性、レセプター発現細胞に対する細胞刺激活性または疾患の予防・治療活性などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度やポリペプチドの分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
バソプレシン分泌抑制活性、レセプターとの結合活性、レセプター発現細胞に対する細胞刺激活性または疾患の予防・治療活性などの活性の測定は、公知の方法に準じて行なうことができる。例えば、バソプレシン分泌抑制活性については、後述の実施例３に記載の方法などに従って測定することができる。
また、本発明のポリペプチドＡとしては、（ｉ）配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１５個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１５個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１５個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１５個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するポリペプチドなども用いられる。
本発明のポリペプチドＡの具体例としては、配列番号：４で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、配列番号：５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、配列番号：６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩などがあげられる。
本発明のポリペプチドＡの部分ペプチドとしては、本発明のポリペプチドＡと実質的に同質の活性を有していればよく、特に制限されない。該部分ペプチドのアミノ酸の数は、本発明のポリペプチドＡの構成アミノ酸配列のうち少なくとも５個以上、好ましくは１０個以上、好ましくは１５個以上、好ましくは２０個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどがあげられる。
ここで、「実質的に同質の活性」とは、上記と同意義を示す。「実質的に同質の活性」の測定は上記と同様に行なうことができる。
該部分ペプチドとしては、（ｉ）上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは数個（１〜４個））のアミノ酸が欠失し、（ｉｉ）上記アミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜１５個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加し、または（ｉｉｉ）上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは数個（１〜４個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
該部分ペプチドの具体例としては、配列番号：４で表されるアミノ酸配列において、例えば第１０番目〜第２６番目のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：５で表されるアミノ酸配列において、例えば第１０番目〜第２５番目のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：６で表されるアミノ酸配列において、例えば第１０番目〜第２５番目のアミノ酸配列を有するペプチドなどがあげられる。なかでも、好ましくは、配列番号：４で表されるアミノ酸配列において、第１２番目〜第２６番目、第１３番目〜第２６番目、第１４番目〜第２６番目、第１５番目〜第２６番目、第１６番目〜第２６番目、第１７番目〜第２６番目、第１８番目〜第２６番目、第１９番目〜第２６番目、第２０番目〜第２６番目、第２１番目〜第２６番目のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列において、第１１番目〜第２５番目、第１２番目〜第２５番目、第１３番目〜第２５番目、第１４番目〜第２５番目、第１５番目〜第２５番目、第１６番目〜第２５番目、第１７番目〜第２５番目、第１８番目〜第２５番目、第１９番目〜第２５番目、第２０番目〜第２５番目のアミノ酸配列を有するペプチドなどがあげられる。
以下、本発明のポリペプチドＡとその部分ペプチドとをまとめて「本発明のポリペプチドＡ」と称することもある。
配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用いて計算することができる。
配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとしては、例えば、前記の配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドなどが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、本発明のポリペプチドの有する活性、例えば、バソプレシン分泌抑制活性、摂食促進活性、レセプターとの結合活性、レセプター発現細胞に対する細胞刺激活性（例、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ生成抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、リン脂質依存性プロテインキナーゼの活性化、またはマイトジェン活性化タンパク質リン酸化酵素（ＭＡＰキナーゼ）の活性化などを促進する活性など）、前述の疾患の予防・治療活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的（例、生理学的に、または薬理学的に）に同質であることを示す。したがって、バソプレシン分泌抑制活性、摂食促進活性、レセプターとの結合活性、レセプター発現細胞に対する細胞刺激活性、疾患の予防・治療活性などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度やポリペプチドの分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
バソプレシン分泌抑制活性、摂食促進活性、レセプターとの結合活性、レセプター発現細胞に対する細胞刺激活性、疾患の予防・治療活性などの活性の測定は、公知の方法に準じて行なうことができる。例えば、バソプレシン分泌抑制活性は、後述の実施例３に記載の方法などに従って測定することができ、摂食促進活性は、後述の実施例５に記載の方法などに従って測定することができる。
また、本発明のポリペプチドＢとしては、（ｉ）配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１５個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１５個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１５個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１５個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するポリペプチドなども用いられる。
本発明のポリペプチドＢの具体例としては、配列番号：７で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどがあげられる。
本発明のポリペプチドＢの部分ペプチドとしては、本発明のポリペプチドＢと実質的に同質の活性を有していればよく、特に制限されない。該部分ペプチドのアミノ酸の数は、本発明のポリペプチドＢの構成アミノ酸配列のうち少なくとも５個以上、好ましくは１０個以上、好ましくは１５個以上、好ましくは２０個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどがあげられる。
ここで、「実質的に同質の活性」とは、上記と同意義を示す。「実質的に同質の活性」の測定は上記と同様に行なうことができる。
該部分ペプチドとしては、（ｉ）上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは数個（１〜４個））のアミノ酸が欠失し、（ｉｉ）上記アミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜１５個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加し、または（ｉｉｉ）上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは数個（１〜４個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
該部分ペプチドの具体例としては、配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列において、例えば第２０番目〜第３８番目のアミノ酸配列を有するペプチドなどがあげられる。なかでも、好ましくは、第２４番目〜第３８番目、第２５番目〜第３８番目、第２６番目〜第３８番目、第２７番目〜第３８番目、第２８番目〜第３８番目、第２９番目〜第３８番目、第３０番目〜第３８番目、第３１番目〜第３８番目、第３２番目〜第３８番目、第３３番目〜第３８番目のアミノ酸配列を有するペプチドなどがあげられる。
以下、本発明のポリペプチドＢとその部分ペプチドとをまとめて本発明のポリペプチドＢと称することがある。
さらに、「本発明のポリペプチドＡ」と「本発明のポリペプチドＢ」とを、まとめて「本発明のポリペプチド」と称することもある。
本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば無機酸（例、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本明細書におけるポリペプチドおよびタンパク質はペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列などを含有するポリペプチドはＣ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。エステルのＲとしては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、ベンジル、フェネチル、ベンズヒドリルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル、もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキルなどのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などがあげられる。
本発明のポリペプチドとしてはＣ末端のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）がアミド（−ＣＯＮＨ２）であるものが好ましい。
具体的には、例えば、Ｃ末端のアミノ酸残基がアミド化されている配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドなどが好ましく用いられる。
本発明のポリペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のポリペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のポリペプチドには、上記したポリペプチドにおいて、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明のポリペプチドＢとしては、Ｎ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したものが好ましく、この場合、さらに上記したようにＣ末端のアミノ酸残基がアミドまたはエステルであってもよく、アミドであるのがより好ましい。
具体的には、例えば、Ｎ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化されている配列番号：７、配列番号：８もしくは配列番号：９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、Ｃ末端のアミノ酸残基がアミド化されており、かつＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化されている配列番号：７、配列番号：８もしくは配列番号：９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドなどが好ましく用いられる。また、本発明の部分ペプチドはＣ末端が、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。本発明の部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
本発明の部分ペプチドとしてはＣ末端のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）がアミド（−ＣＯＮＨ２）であるものが好ましい。
さらに、本発明の部分ペプチドには、前記した本発明のポリペプチドと同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明のポリペプチドまたはその塩は、前述したヒトや哺乳動物の細胞または組織から自体公知のペプチド・タンパク質の精製方法によって製造することもできるし、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド・タンパク質合成法またはこれに準じて製造することもできる。
本発明のポリペプチドまたはその塩をヒト、哺乳動物などの組織または細胞から製造する場合、ヒト、哺乳動物などの組織または細胞をホモジナイズした後、酸、有機溶媒などで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
上記したように本発明のポリペプチドは、公知のポリペプチドの合成法に従って、あるいは本発明のポリペプチドを含有するポリペプチドを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ポリペプチドの合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のポリペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のポリペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては例えば、以下の（１）〜（５）に記載された方法があげられる。
（１）Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド  シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６６年）；
（２）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ  ペプチド（Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６５年）；
（３）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）；
（４）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年）；
（５）矢島治明監修、続医薬品の開発  第１４巻  ペプチド合成  広川書店。
また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明のポリペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる本発明のポリペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
本発明のポリペプチドのアミド体は、アミド形成に適した市販のペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などをあげることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするペプチドの配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からポリペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、必要に応じて高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のポリペプチドを取得する。
上記した保護されたアミノ酸の縮合に関しては、ポリペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としてはＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどがあげられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢＴ、ＨＯＯＢＴなど）とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢＴエステルあるいはＨＯＯＢＴエステルとしてあらかじめ保護されたアミノ酸の活性化を行ったのちに樹脂に添加することができる。保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ポリペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。たとえばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどの三級アミン類、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５ないし４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。
原料アミノ酸のアミノ基の保護基としては、たとえば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどがあげられる。カルボキシル基の保護基としては、たとえばＲとして上記したＣ１−６アルキル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ７−１４アラルキル基の他、２−アダマンチル、４−ニトロベンジル、４−メトキシベンジル、４−クロロベンジル、フェナシル基およびベンジルオキシカルボニルヒドラジド、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド、トリチルヒドラジドなどがあげられる。
セリンおよびスレオニンの水酸基は、たとえばエステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては例えばアセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭素から誘導される基などがあげられる。また、エーテル化に適する基としては、たとえばベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ターシャリーブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、たとえばＢｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどがあげられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどがあげられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、たとえば対応する酸無水物、アジド、活性エステル［アルコール（たとえば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢＴ）とのエステル］などがあげられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、たとえば対応するリン酸アミドなどがあげられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、たとえばＰｄ黒あるいはＰｄ炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元などもあげられる。上記酸処理による脱離反応は一般に−２０℃〜４０℃の温度で行われるが、酸処理においてはアニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、ならびにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手段から適宜選択しうる。
本発明のポリペプチドのアミド体を得る別の方法としては、まず、カルボキシル末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除いたペプチド（またはアミノ酸）とを製造し、この両ペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ポリペプチドを得ることができる。この粗ポリペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のポリペプチドのアミド体を得ることができる。
本発明のポリペプチドのエステル体を得るにはカルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ポリペプチドのアミド体と同様にして所望のポリペプチドのエステル体を得ることができる。
本発明のポリペプチドの部分ペプチドは、本発明のポリペプチドを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができるし、上記のポリペプチドの合成法に従って製造することができる。本発明のポリペプチドの部分ペプチドのアミドまたはエステルも上述のアミド体またはエステル体の製造方法に準じて製造することができる。さらに本発明のポリペプチドの部分ペプチドの塩としては、上記の本発明のポリペプチドの塩と同様のものなどがあげられる。
該アミノ酸配列中のアミノ酸の実質的に同一な置換物としては、たとえばそのアミノ酸が属するクラスの他のアミノ酸類から選ぶことができる。非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンなどがあげられる。極性（中性）アミノ酸としてはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンなどがあげられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としてはアルギニン、リジン、ヒスチジンなどがあげられる。負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などがあげられる。
本発明のポリペプチドまたは部分ペプチドが標識化されたものとしては、公知の方法で、アイソトープラベル化されたもの、蛍光標識されたもの（例えば、フルオレセインなどによる蛍光標識）、ビオチン化されたもの、酵素標識されたものなどがあげられる。
具体的には、例えば公知の方法によって、〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕などで標識された本発明のポリペプチドなどを利用することができる。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明のポリペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡとしては、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した組織・細胞由来のｃＤＮＡ、前記した組織・細胞由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターはバクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した組織・細胞よりＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１２、配列番号：１３もしくは配列番号：１７で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：１２、配列番号：１３もしくは配列番号：１７で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号：４、配列番号：５もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドと実質的に同質の性質を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、または配列番号：１４、配列番号：１５もしくは配列番号：１８で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：１４、配列番号：１５もしくは配列番号：１８で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号：７、配列番号：８もしくは配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドと実質的に同質の性質を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１７または配列番号：１８で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１７または配列番号：１８で表される塩基配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、好ましくは約９５％以上、好ましくは約９８％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。より具体的には、配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１３で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：６で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１７で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１４で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：８で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１５で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１８で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本発明の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）としては、前述した本発明の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１７もしくは配列番号：１８で表される塩基配列を含有するＤＮＡの一部分を含有するＤＮＡ、または配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１７もしくは配列番号：１８で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、本発明のポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの一部分を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１７もしくは配列番号：１８で表される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
（ＤＮＡのクローニング）
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは以下の遺伝子工学的手法によっても製造することができる。
本発明のポリペプチドを完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のポリペプチドの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて公知のＰＣＲ法によって前記ＤＮＡライブラリー等から目的とするＤＮＡを増幅する方法、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のポリペプチドをコードする塩基配列の一部あるいは全領域を有するＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別する方法があげられる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（２ｎｄ  ｅｄ．；Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行われる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行う。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。該ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
ＤＮＡの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ  ＰＣＲ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化された本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
（発現ベクター）
本発明のポリペプチドの発現ベクターは、例えば、（ｉ）本発明のポリペプチドまたは本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ｉｉ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
形質転換する際の宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが利用できる。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、Ｔｒｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等があげられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞を用いてＤＨＦＲ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、ポリペプチドまたはその部分ペプチドのＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｐｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、メイテイングファクターα（ＭＦα）・シグナル配列、インベルターゼ・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、例えばインシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
（形質転換体）
このようにして構築された本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、たとえばエシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫または昆虫細胞、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）〕，１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、たとえばサッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２などが用いられる。
昆虫としては、例えばカイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１５巻，５９２（１９８５）〕。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ  ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ  ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｎ；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞〔以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィトロ（ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ），１３巻，２１３−２１７頁（１９７７年）〕などが用いられる。
動物細胞としては、たとえばサルＣＯＳ−７細胞，Ｖｅｒｏ細胞，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，ＤＨＦＲ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−  ＣＨＯ細胞），マウスＬ細胞，マウス３Ｔ３細胞、マウスミエローマ細胞，ヒトＨＥＫ２９３細胞、ヒトＦＬ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ３Ｔ３細胞、Ｓｐ−２／Ｏ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），６９巻，２１１０（１９７２）やジーン（Ｇｅｎｅ），１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なわれる。
バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行われる。
酵母を形質転換するには、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）に記載の方法に従って行なわれる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、たとえばバイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６巻，４７−５５頁（１９８８年）などに記載の方法に従って行なわれる。
動物細胞を形質転換するには、たとえばヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なわれる。
発現ベクターの細胞への導入方法としては、例えば、リポフェクション法〔Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ），８４巻，７４１３頁（１９８７年）〕、リン酸カルシウム法〔Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ａ．Ｊ．ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），５２巻，４５６−４６７頁（１９７３年）〕、電気穿孔法〔Ｎｕｅｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊ．），１巻，８４１−８４５頁（１９８２年）〕等があげられる。
このようにして、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
なお、動物細胞を用いて、本発明のポリペプチドを安定に発現させる方法としては、上記の動物細胞に導入された発現ベクターが染色体に組み込まれた細胞をクローン選択によって選択する方法がある。具体的には、上記の選択マーカーを指標にして形質転換体を選択する。さらに、このように選択マーカーを用いて得られた動物細胞に対して、繰り返しクローン選択を行なうことにより本発明のポリペプチドの高発現能を有する安定な動物細胞株を得ることができる。また、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして用いた場合、ＭＴＸ濃度を徐々に上げて培養し、耐性株を選択することにより、ｄｈｆｒ遺伝子とともに、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを細胞内で増幅させて、さらに高発現の動物細胞株を得ることもできる。
上記の形質転換体を本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡが発現可能な条件下で培養し、本発明のポリペプチドを生成、蓄積せしめることによって、本発明のポリペプチドを製造することができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としてはたとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），４３１−４３３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、たとえば３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえばバークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｋ．Ｌ．ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７７巻，４５０５（１９８０）」や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ，Ｇ．Ａ．ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２））に非働化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ  １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
特にＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞およびｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして用いる場合には、チミジンをほとんど含まない透析ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いるのが好ましい。
（本発明のポリペプチドの分離精製）
上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、例えば下記の方法により行なうことができる。
本発明のポリペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により本発明のポリペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク変性剤や、トリトン（登録商標）Ｘ−１００などの界面活性剤が含まれていてもよい。
培養液中に本発明のポリペプチドが分泌される場合には、培養終了後、自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明のポリペプチドの精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法やクロマトフォーカシングなどの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
このようにして得られる本発明のポリペプチドが遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生する本発明のポリペプチドを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、（ポリ）ペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。またＮ末端アミノ酸を欠失させるためには、エドマン（Ｅｄｍａｎ）試薬（フェニルイソチオシアネート）を用いた公知のエドマン法を用いることが可能である。
このようにして生成する本発明のポリペプチドの存在は特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
（抗体）
本発明は、さらに本発明のポリペプチドに対する抗体を提供する。
本発明のポリペプチドに対する抗体は、本発明のポリペプチドを認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のポリペプチドに対する抗体は、本発明のポリペプチドを抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のポリペプチドは、哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギがあげられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化本発明のポリペプチドと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６巻、４９５頁（１９７５年）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、本発明のポリペプチドの抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識した本発明のポリペプチドを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（本発明のポリペプチド抗原）とキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のポリペプチドに対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
上記の本発明の抗体は、本発明のポリペプチドを特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のポリペプチドの定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。すなわち、本発明は、例えば、（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化本発明のポリペプチドとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化本発明のポリペプチドの割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のポリペプチドの定量法、
（ｉｉ）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のポリペプチドの定量法を提供する。
上記（ｉｉ）においては、一方の抗体が本発明のポリペプチドのＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のポリペプチドのＣ端部に反応する抗体であることが好ましい。
本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称する場合がある）を用いて本発明のポリペプチドの測定を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明のポリペプチドに対する抗体を用いる測定法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、本発明のポリペプチド量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常、タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、例えば、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が用いられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のポリペプチド量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行なっても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は上記のそれらに準じることができる。
また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のポリペプチドの測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は本発明のポリペプチドの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。即ち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のポリペプチドのＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原と（Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、上記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果、生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のポリペプチドの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「メソッズ・イン・エンジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ）」Ｖｏｌ．７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ａ））、同書  Ｖｏｌ．７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｂ））、同書  Ｖｏｌ．７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｃ））、同書  Ｖｏｌ．８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、同書  Ｖｏｌ．９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ））、同書  Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）など参照〕。
以上のように、本発明の抗体を用いることによって、本発明のポリペプチドを感度良く定量することができる。
さらに、本発明の抗体を用いて、生体内での本発明のポリペプチドを定量することによって、本発明のポリペプチドの機能不全に関連する各種疾患の診断をすることができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のポリペプチドを特異的に検出するために使用することができる。また、本発明のポリペプチドを精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のポリペプチドの検出、被検細胞内における本発明のポリペプチドの挙動の分析などのために使用することができる。
（アンチセンスポリヌクレオチド）
本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ（以下、アンチセンスポリヌクレオチドの説明においては、これらのＤＮＡを本発明のＤＮＡと略記する場合がある））の塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を含有するアンチセンスポリヌクレオチドとしては、本発明のＤＮＡの塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を含有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスポリヌクレオチドであってもよいが、アンチセンスＤＮＡが好ましい。
本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、本発明のポリペプチドのＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドが好適である。
具体的には、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１７または配列番号：１８で表される塩基配列を含有するＤＮＡの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチドなどが挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、１０〜４０個程度、好ましくは１５〜３０個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスＤＮＡを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換されていてもよい。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
本発明に従えば、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンスポリヌクレオチドを、クローン化した、あるいは決定されたポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。このようなポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいは本発明のポリペプチド関連ＲＮＡとの相互作用を介して本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を調節・制御することができる。本発明のポリペプチド関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、および本発明のポリペプチド関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外で本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。
用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とポリペプチドとの間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される指令にあるポリペプチドのアミノ酸を通常指している。ポリペプチドをコードする遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、ポリペプチドコード領域、翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、ポリペプチドをコードする遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係は、「アンチセンス」であるということができる。アンチセンスポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマまたは特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレート化合物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは次のような方針：（１）細胞内でのアンチセンスポリヌクレオチドをより安定なものにする、（２）アンチセンスポリヌクレオチドの細胞透過性をより高める、（３）目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、（４）もし毒性があるならアンチセンスポリヌクレオチドの毒性をより小さなものにする、で好ましく設計されうる。
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えばＪ．Ｋａｗａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｔｅｃｈ  Ｊａｐａｎ，Ｖｏｌ．８，ｐｐ．２４７，１９９２；Ｖｏｌ．８，ｐｐ．３９５，１９９２；Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３などに開示がある。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンスポリヌクレオチドの阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいは本発明のポリペプチドの生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸は公知の各種の方法で細胞に適用できる。
以下に、（ａ）本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩（以下、本発明のポリペプチドと略記する場合がある）、（ｂ）本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩、（ｃ）本発明のポリペプチドに対する抗体、（ｄ）本発明のポリヌクレオチド、（ｅ）本発明のアンチセンスポリヌクレオチドなどの用途を説明する。
本発明のポリペプチドＡもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩（以下、本発明のポリペプチドＡと略記する場合がある）はバソプレシン分泌抑制活性を有していることから、本発明のポリペプチドＡ、本発明のポリペプチドＡの活性を促進する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドＡまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドなどは、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害（例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など）、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群（ＳＩＡＤＨ）、高血圧などの予防・治療剤として用いることができる。
また、本発明のポリペプチドＡの活性を阻害する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドＡに対する抗体、本発明のポリペプチドＡをコードする遺伝子のアンチセンスポリヌクレオチド、本発明のポリペプチドＡをコードする遺伝子に対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、本発明のポリペプチドＡをコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイム、本発明のポリペプチドＡに対するアプタマーなどは、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁（例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など）など〕、多尿症、尿崩症（例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など）、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング（Ｃｕｓｈｉｎｇ）症候群などの予防・治療剤などとして使用することができる。
本発明のポリペプチドＢもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩（以下、本発明のポリペプチドＢと略記する場合がある）はバソプレシン分泌抑制活性および摂食促進活性を有していることから、本発明のポリペプチドＢ、本発明のポリペプチドＢの活性を促進する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドＢまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドなどは、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害（例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など）、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群（ＳＩＡＤＨ）、高血圧などの予防・治療剤、拒食症などの予防・治療剤、摂食（食欲）促進剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害（例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群（時差ボケ）など）〕などの予防・治療剤などとして用いることができる。
また、本発明のポリペプチドＢの活性を阻害する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドＢに対する抗体、本発明のポリペプチドＢをコードする遺伝子のアンチセンスポリヌクレオチド、本発明のポリペプチドＢをコードする遺伝子に対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、本発明のポリペプチドＢをコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイム、本発明のポリペプチドＢに対するアプタマーなどは、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁（例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など）など〕、多尿症、尿崩症（例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など）、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング（Ｃｕｓｈｉｎｇ）症候群などの予防・治療剤、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症などの予防・治療剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害（例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群（時差ボケ）など）〕などの予防・治療剤などとして使用することができる。
また、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング用試薬としても有用である。
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド遺伝子の発現を促進または阻害する化合物のスクリーニング用試薬としても有用である。
（１）本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有する医薬
本発明のポリペプチドＡもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩はバソプレシン分泌抑制活性を有していることから、本発明のポリペプチドＡもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩は、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害（例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など）、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群（ＳＩＡＤＨ）、高血圧などの予防・治療剤として用いることができる。
本発明のポリペプチドＢもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩はバソプレシン分泌抑制活性および摂食促進活性を有しているので、本発明のポリペプチドＢもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩は、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害（例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など）、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群（ＳＩＡＤＨ）、高血圧などの予防・治療剤、拒食症などの予防・治療剤、摂食（食欲）促進剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害（例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群（時差ボケ）など）〕などの予防・治療剤などとして用いることができる。
本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルの塩としては、例えば、薬学的に許容可能な塩などが用いられる。例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などがあげられる。
無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩などがあげられる。
有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩あげられる。
無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などとの塩があげられる。
有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸などとの塩があげられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルチニンなどとの塩があげられ、酸性アミノ酸との好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩があげられる。
本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を上述の医薬として使用する場合には、常套手段に従って実施することができる。具体的には、以下に記載するとおりに使用することができる。
例えば、必要に応じて糖衣や腸溶性被膜を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール（たとえばエタノール）、ポリアルコール（たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（たとえばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば温血動物（例えば、ヒト、モルモット、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル、イヌ、ニワトリ）などに対して投与することができる。
本発明のポリペプチドＡもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えば、腎性浮腫患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは約１．０〜３００ｍｇ、より好ましくは約３．０〜５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に、例えば、腎性浮腫患者（体重６０ｋｇとして）への投与においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチドＢもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えば、腎性浮腫患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは約１．０〜３００ｍｇ、より好ましくは約３．０〜５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に、例えば、腎性浮腫患者（体重６０ｋｇとして）への投与においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（２）本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩を含有する医薬
本発明のポリペプチドＡもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩はバソプレシン分泌抑制活性を有していることから、本発明のポリペプチドＡもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩は、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害（例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など）、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群（ＳＩＡＤＨ）、高血圧などの予防・治療剤として用いることができる。
また、本発明のポリペプチドＡもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩は、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁（例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など）など〕、多尿症、尿崩症（例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など）、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング（Ｃｕｓｈｉｎｇ）症候群などの予防・治療剤として有用である。
本発明のポリペプチドＢもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩はバソプレシン分泌抑制活性および摂食促進活性を有しているので、本発明のポリペプチドＢもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩は、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害（例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など）、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群（ＳＩＡＤＨ）、高血圧などの予防・治療剤、拒食症などの予防・治療剤、摂食（食欲）促進剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害（例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群（時差ボケ）など）〕などの予防・治療剤などとして用いることができる。
また、本発明のポリペプチドＢもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩は、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁（例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など）など〕、多尿症、尿崩症（例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など）、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング（Ｃｕｓｈｉｎｇ）症候群などの予防・治療剤、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症などの予防・治療剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害（例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群（時差ボケ）など）〕などの予防・治療剤などとして有用である。
本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物の塩としては、例えば、薬学的に許容可能な塩などが用いられる。例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などがあげられる。
無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩などがあげられる。
有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩あげられる。
無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などとの塩があげられる。
有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸などとの塩があげられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルチニンなどとの塩があげられ、酸性アミノ酸との好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩があげられる。
本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、該ポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を上述の医薬として使用する場合には、常套手段に従って実施することができる。具体的には、以下に記載するとおりに使用することができる。
例えば、必要に応じて糖衣や腸溶性被膜を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール（たとえばエタノール）、ポリアルコール（たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（たとえばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば温血動物（例えば、ヒト、モルモット、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル、イヌ、ニワトリ）などに対して投与することができる。
本発明のポリペプチドＡもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、腎性浮腫患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは約１．０〜３００ｍｇ、より好ましくは約３．０〜５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に例えば、腎性浮腫患者（体重６０ｋｇとして）への投与においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチドＡもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、尿崩症患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは約１．０〜３００ｍｇ、より好ましくは約３．０〜５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に例えば、尿崩症患者（体重６０ｋｇとして）への投与においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチドＢもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、腎性浮腫患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは約１．０〜３００ｍｇ、より好ましくは約３．０〜５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に例えば、腎性浮腫患者（体重６０ｋｇとして）への投与においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチドＢもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、尿崩症患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは約１．０〜３００ｍｇ、より好ましくは約３．０〜５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に例えば、尿崩症患者（体重６０ｋｇとして）への投与においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（３）本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体を含有する医薬
本発明のポリペプチドＡもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩はバソプレシン分泌抑制活性を有していることから、本発明のポリペプチドＡもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体は、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁（例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など）など〕、多尿症、尿崩症（例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など）、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング（Ｃｕｓｈｉｎｇ）症候群などの予防・治療剤などとして有用である。
本発明のポリペプチドＢもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩はバソプレシン分泌抑制活性および摂食促進活性を有しているので、本発明のポリペプチドＢもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体は、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁（例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など）など〕、多尿症、尿崩症（例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など）、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング（Ｃｕｓｈｉｎｇ）症候群などの予防・治療剤、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症などの予防・治療剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害（例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群（時差ボケ）など）〕などの予防・治療剤などとして有用である。
本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体を上述の医薬として使用する場合には、常套手段に従って実施することができる。具体的には、以下に記載するとおりに使用することができる。
例えば、必要に応じて糖衣や腸溶性被膜を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール（たとえばエタノール）、ポリアルコール（たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（たとえばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば温血動物（例えば、ヒト、モルモット、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル、イヌ、ニワトリ）などに対して投与することができる。
本発明のポリペプチドＡもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、尿崩症患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは約１．０〜３００ｍｇ、より好ましくは約３．０〜５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に例えば、尿崩症患者（体重６０ｋｇとして）への投与においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチドＢもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、尿崩症患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは約１．０〜３００ｍｇ、より好ましくは約３．０〜５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に例えば、尿崩症患者（体重６０ｋｇとして）への投与においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（４）本発明のポリヌクレオチドを含有する医薬
本発明のポリペプチドＡもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩はバソプレシン分泌抑制活性を有していることから、本発明のポリペプチドＡまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドは、例えばバソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害（例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など）、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群（ＳＩＡＤＨ）、高血圧などの予防・治療剤として用いることができる。
本発明のポリペプチドＢもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩はバソプレシン分泌抑制活性および摂食促進活性を有しているので、本発明のポリペプチドＢまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドは、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害（例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など）、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群（ＳＩＡＤＨ）、高血圧などの予防・治療剤、拒食症などの予防・治療剤、摂食（食欲）促進剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害（例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群（時差ボケ）など）〕などの予防・治療剤などとして用いることができる。
本発明のポリヌクレオチドを上記の予防・治療剤として使用する場合、公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。
例えば、該ポリヌクレオチドを用いる場合、該ポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたはその他の哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。該ポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
本発明のポリペプチドＡまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドの投与量は、症状などにより差異はあるが、一般的に例えば、腎性浮腫患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇである。
本発明のポリペプチドＢまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドの投与量は、症状などにより差異はあるが、一般的に例えば、腎性浮腫患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇである。
（５）本発明のアンチセンスポリヌクレオチド、二重鎖ＲＮＡ、リボザイムなどを含有する医薬および診断薬
本発明のポリペプチドＡをコードするＤＮＡ（以下「本発明のＤＮＡ（Ａ）」という）に相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑制することができる本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、生体内における本発明のポリペプチドＡまたは本発明のＤＮＡ（Ａ）の機能を抑制することができるので、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁（例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など）など〕、多尿症、尿崩症（例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など）、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング（Ｃｕｓｈｉｎｇ）症候群などの予防・治療剤などとして使用できる。
本発明のポリペプチドＢをコードするＤＮＡ（以下「本発明のＤＮＡ（Ｂ）」という）に相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑制することができる本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、生体内における本発明のポリペプチドＢまたは本発明のＤＮＡ（Ｂ）の機能を抑制することができるので、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁（例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など）など〕、多尿症、尿崩症（例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など）、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング（Ｃｕｓｈｉｎｇ）症候群などの予防・治療剤、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症などの予防・治療剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害（例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群（時差ボケ）など）〕などの予防・治療剤などとして使用できる。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを上記の予防・治療剤として使用する場合、公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。
例えば、該アンチセンスポリヌクレオチドを用いる場合、該アンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたはその他の哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。該アンチセンスポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
該アンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、尿崩症の治療の目的で本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ）においては、一日につき該アンチセンスポリヌクレオチドを約０．１〜１００ｍｇ投与する。
さらに、該アンチセンスポリヌクレオチドは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
本発明は、さらに
（１）本発明のポリペプチドＡをコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡ；
（２）前記（１）記載の二重鎖ＲＮＡを含有してなる医薬；
（３）本発明のポリペプチドＡをコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイム；
（４）前記（３）記載のリボザイムを含有してなる医薬；
（５）本発明のポリペプチドＢをコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡ；
（６）前記（５）記載の二重鎖ＲＮＡを含有してなる医薬；
（７）本発明のポリペプチドＢをコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイム；
（８）前記（７）記載のリボザイムを含有してなる医薬なども提供する。
これらの二重鎖ＲＮＡ（本発明のポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ（ｓｈｏｒｔ）ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ（ｓｈｏｒｔ）ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）など）、リボザイムなどは、上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）の発現を抑制することができ、生体内における本発明のポリペプチドまたは本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）の活性や機能を阻害することができる。
前記（１）記載の二重鎖ＲＮＡおよび前記（３）記載のリボザイムは、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁（例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など）など〕、多尿症、尿崩症（例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など）、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング（Ｃｕｓｈｉｎｇ）症候群などの予防・治療剤などとして使用できる。
前記（５）記載の二重鎖ＲＮＡおよび前記（７）記載のリボザイムは、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁（例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など）など〕、多尿症、尿崩症（例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など）、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング（Ｃｕｓｈｉｎｇ）症候群などの予防・治療剤、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症などの予防・治療剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害（例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群（時差ボケ）など）〕などの予防・治療剤などとして使用できる。
二重鎖ＲＮＡは、公知の方法（例、Ｎａｔｕｒｅ，４１１巻，４９４頁，２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
リボザイムは、公知の方法（例、ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７巻，２２１頁，２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、本発明のペプチドをコードするＲＮＡの一部に公知のリボザイムを連結することによって製造することができる。本発明のペプチドをコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得る本発明のＲＮＡ上の切断部位に近接した部分（ＲＮＡ断片）が挙げられる。
上記の二重鎖ＲＮＡまたはリボザイムを上記予防・治療剤として使用する場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、本発明のポリペプチドに対するアプタマーなども、本発明で用いられるタンパク質の活性や機能を抑制することができる。よって、本発明のポリペプチドＡに対するアプタマーなどは、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁（例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など）など〕、多尿症、尿崩症（例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など）、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング（Ｃｕｓｈｉｎｇ）症候群などの予防・治療剤などの医薬として使用することができる。
本発明のポリペプチドＢに対するアプタマーなどは、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁（例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など）など〕、多尿症、尿崩症（例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など）、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング（Ｃｕｓｈｉｎｇ）症候群などの予防・治療剤、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症などの予防・治療剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害（例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群（時差ボケ）など）〕などの予防・治療剤などの医薬として使用することができる。
アプタマーは、公知の方法、例えばＳＥＬＥＸ（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法（Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５６巻，５５５−５８３頁，２００５年）を用いて取得する。アプタマーの構造は、公知の方法を用いて決定することができ、その構造を基に、公知の方法に従いアプタマーを製造する。
上記のアプタマーを医薬として使用する場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。
（６）医薬候補化合物のスクリーニング方法及びスクリーニングキット
本発明のポリペプチドを用いることを特徴とする医薬候補化合物のスクリーニング方法および本発明のポリペプチドを含有することを特徴とする医薬候補化合物のスクリーニング用キット（以下、「本発明のスクリーニング方法」および「本発明のスクリーニング用キット」とそれぞれ略記する場合がある）について以下に説明する。
〔本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング〕
本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドの機能を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。すなわち、本発明は、（１）本発明のポリペプチドを用いることを特徴とする本発明のポリペプチドの活性（機能）を促進または阻害する化合物またはその塩（以下、促進剤または阻害剤と略記する場合がある）のスクリーニング方法を提供する。具体的には、例えば、（２）（ｉ）本発明のポリペプチドを細胞に接触させた場合と、（ｉｉ）本発明のポリペプチドおよび試験化合物を細胞に接触させた場合との、該細胞のバソプレシン分泌抑制活性など本発明のポリペプチドの活性の比較を行うことを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。具体的には、上記スクリーニング方法においては、例えば、（ｉ）と（ｉｉ）の場合において、上記細胞を培養し、そのバソプレシン分泌量を測定する。上記細胞としては、バソプレシン分泌が誘発されるものなどが好ましく用いられる。例えば、ラット視索上核組織（例、後述の実施例に記載のラット視索上核の静的培養など）、ラット室傍核組織（例、後述の実施例に記載のラット室傍核の静的培養など）、ラット視索上核神経細胞（ニューロン）、ラット室傍核神経細胞（ニューロン）などが用いられる。培地は、本発明のポリペプチドの有するバソプレシン分泌抑制作用などの活性を阻害しない培地であればいずれのものでもよく、例えばＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）などが用いられる。バソプレシン分泌量は、公知の方法、例えば、ＡＶＰ  ＲＩＡ（放射免疫測定）キット（三菱化学ヤトロン製など）を用いた放射免疫測定法などにより測定することができる。試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、生理学的に許容される金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。金属塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、安息香酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸���の塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
例えば、上記（ｉｉ）の場合における本発明のポリペプチドの活性（例、バソプレシン分泌抑制活性）を、上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を、本発明のポリペプチドの活性を促進する化合物またはその塩として選択することができる。例えば、上記（ｉｉ）の場合における本発明のポリペプチドの活性（例、バソプレシン分泌抑制活性）を、上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を、本発明のポリペプチドの活性を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。本発明は、（３）本発明のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする本発明のポリペプチド遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩（以下、それぞれ促進剤、阻害剤と略記する場合がある）のスクリーニング方法を提供し、より具体的には、例えば、（４）（ｉｉｉ）本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞を培養した場合と（ｉｖ）本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を培養した場合との比較を行うことを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。上記スクリーニング方法においては、例えば、（ｉｉｉ）と（ｉｖ）の場合における、本発明のポリペプチド遺伝子の発現量（例、本発明のポリペプチド遺伝子のプロモーター下流に挿入したアルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼなどの酵素活性、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ量など）を測定して、比較する。本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）が用いられる。宿主としては、例えば、ＣＨＯ細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のポリペプチドを細胞内または培養上清中に産生する形質転換体が好ましく用いられる。さらに好ましくは、本発明のポリペプチド遺伝子のプロモーター下流に、分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼなどの遺伝子を挿入した形質転換体などが用いられる。試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、前記と同様のものなどが挙げられる。上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適した培地で培養して調製する。培地は、本発明のポリペプチドの産生を阻害しない培地であればいずれのものでもよく、例えばＤＭＥＭ培地などが用いられる。本発明のポリペプチド遺伝子の発現量は、本発明のポリペプチド遺伝子のプロモーター下流に挿入したアルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼなどの酵素活性を、公知の方法に従い、測定することができる。本発明のポリペプチド遺伝子の発現量は、さらに、公知の方法、例えば、ノーザンブロッティングやＲｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ解析システム（ＡＢＩ社製、ＴａｑＭａｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）などの方法あるいはそれに準じる方法にしたがって測定することもできる。例えば、上記（ｉｖ）の場合における本発明のポリペプチド遺伝子の発現を、上記（ｉｉｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を本発明のポリペプチド遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩として選択することができる。例えば、上記（ｉｖ）の場合における本発明のポリペプチド遺伝子の発現を、上記（ｉｉｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を本発明のポリペプチド遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬としても有用である。すなわち、本発明は、（５）本発明のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩（以下、促進剤または阻害剤と略記する場合がある）のスクリーニング方法を提供する。具体的には、例えば、（６）（ｖ）本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞を、別の細胞に接触させて培養した場合と（ｖｉ）本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を、別の細胞に接触させて培養した場合との、該別の細胞の本発明のポリペプチドの活性（例、バソプレシン分泌抑制活性）の比較を行うことを特徴とする本発明のポリペプチドの有する活性の促進剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。具体的には、上記スクリーニング方法においては、例えば、（ｖ）と（ｖｉ）の場合において、上記細胞（および組織）を培養し、そのバソプレシン分泌量を測定する。本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞としては、上記（４）に記載の細胞が用いられる。別の細胞としては、上記（２）に記載の細胞が用いられる。試験化合物、培養法、バソプレシン分泌抑制活性の測定法などは、上記（２）に準じる。例えば、上記（ｖｉ）の場合における本発明のポリペプチドの活性（例、バソプレシン分泌抑制活性）を、上記（ｖ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を、本発明のポリペプチドの活性を促進する化合物またはその塩として選択することができる。例えば、上記（ｖｉ）の場合における本発明のポリペプチドの活性（例、バソプレシン分泌抑制活性）を、上記（ｖ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を、本発明のポリペプチドの活性を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
本発明は、（７）本発明の抗体を用いることを特徴とする本発明のポリペプチドの発現（産生）を促進または阻害する化合物またはその塩（以下、それぞれ促進剤、阻害剤と略記する場合がある）のスクリーニング方法を提供する。具体的には、例えば、（８）（ｖｉｉ）本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞を培養した場合と（ｖｉｉｉ）本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を培養した場合との比較を、本発明の抗体を用いて行うことを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。上記スクリーニング方法においては、例えば、本発明の抗体を用いて（ｖｉｉ）と（ｖｉｉｉ）の場合における、本発明のポリペプチドの産生量（具体的には、本発明のポリペプチド量）を測定して、比較する。
上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適した培地で培養して行う。培地は、本発明のポリペプチドの産生を阻害しない培地であればいずれのものでもよく、例えばＤＭＥＭ培地などが用いられる。本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）が用いられる。宿主としては、例えば、ＣＨＯ細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のポリペプチドを細胞内または培養上清中に産生する形質転換体が好ましく用いられる。本発明のポリペプチド量の測定は、公知の方法、例えば、本発明のポリペプチドを認識する抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する前記ポリペプチドを、ウェスタン解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。例えば、上記（ｖｉｉｉ）の場合における本発明のポリペプチドの産生量（発現量）を、上記（ｖｉｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を本発明のポリペプチドの発現を促進する化合物またはその塩として選択することができる。例えば、上記（ｖｉｉｉ）の場合における本発明のポリペプチドの産生量（発現量）を、上記（ｖｉｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を本発明のポリペプチドの発現を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。本発明のスクリーニング用キットは、本発明のポリペプチドまたはその塩を含有するものである。
上記各スクリーニングで用いられる試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、前記と同様のものなどが挙げられる。
（７）本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を含有する医薬など
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿等から選ばれた化合物であり、本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物、本発明のポリペプチド遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドの発現を促進または阻害する化合物またはその塩である。該化合物の塩としては、前記した本発明のポリペプチドの塩と同様のものが用いられる。本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる、本発明のポリペプチドＡの活性を促進する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドＡの遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドＡの発現を促進する化合物またはその塩は、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害（例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など）、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群（ＳＩＡＤＨ）、高血圧などの予防・治療剤などとして、低毒性で安全な医薬として使用できる。一方、本発明のポリペプチドＡの活性を阻害する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドＡの遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドＡの発現を阻害する化合物またはその塩は、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁（例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など）など〕、多尿症、尿崩症（例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など）、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング（Ｃｕｓｈｉｎｇ）症候群などの予防・治療剤等の医薬として使用できる。
さらに、本発明のポリペプチドＢの活性を促進する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドＢの遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドＢの発現を促進する化合物またはその塩は、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害（例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など）、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群（ＳＩＡＤＨ）、高血圧などの予防・治療剤、拒食症などの予防・治療剤、摂食（食欲）促進剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害（例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群（時差ボケ）など）〕などの予防・治療剤などとして、低毒性で安全な医薬として使用できる。一方、本発明のポリペプチドＢの活性を阻害する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドＢの遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドＢの発現を阻害する化合物またはその塩は、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁（例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など）など〕、多尿症、尿崩症（例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など）、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング（Ｃｕｓｈｉｎｇ）症候群などの予防・治療剤、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症など）の予防・治療剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害（例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群（時差ボケ）など）〕などの予防・治療剤等の医薬として使用できる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上述の予防・治療剤として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、前記した本発明のポリペプチドを含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤等とすることができる。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル等）に対して投与することができる。
本発明のポリペプチドＡの活性を促進する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドＡの遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩、および本発明のポリペプチドＡの発現を促進する化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルート等により差異はあるが、例えば、経口投与の場合、一般的に例えば腎性浮腫患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、該化合物の投与量は投与対象、対象疾患等によっても異なるが、例えば、注射剤の形では、−般的に例えば腎性浮腫患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチドＡの活性を阻害する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドＡの遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、および本発明のポリペプチドＡの発現を阻害する化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルート等により差異はあるが、例えば、経口投与の場合、一般的に例えば尿崩症患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、該化合物の投与量は投与対象、対象疾患等によっても異なるが、例えば、注射剤の形では、一般的に例えば尿崩症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチドＢの活性を促進する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドＢの遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩、および本発明のポリペプチドＢの発現を促進する化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルート等により差異はあるが、例えば、経口投与の場合、一般的に例えば腎性浮腫患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、該化合物の投与量は投与対象、対象疾患等によっても異なるが、例えば、注射剤の形では、一般的に例えば腎性浮腫患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチドＢの活性を阻害する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドＢの遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、および本発明のポリペプチドＢの発現を阻害する化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルート等により差異はあるが、例えば、経口投与の場合、一般的に例えば尿崩症患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、該化合物の投与量は投与対象、対象疾患等によっても異なるが、例えば、注射剤の形では、一般的に例えば尿崩症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（８）本発明の抗体を用いる診断方法
本発明のポリペプチドに対する抗体（以下、「本発明の抗体」という）は、本発明のポリペプチドを特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のポリペプチドの検出や中和に使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明のポリペプチドとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のポリペプチドの割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のポリペプチドの定量法、および
（ｉｉ）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のポリペプチドの定量法を提供する。
上記（ｉｉ）の定量法においては、一方の抗体が本発明のポリペプチドのＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のポリペプチドのＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
また、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を用いて本発明のポリペプチドの定量を行うことができるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のポリペプチドの定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、本発明のポリペプチド量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常本発明のポリペプチドあるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のポリペプチド量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のポリペプチドの測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のポリペプチドのＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のポリペプチドの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ．７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ａ））、同書  Ｖｏｌ．７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｂ））、同書  Ｖｏｌ．７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｃ））、同書  Ｖｏｌ．８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、同書  Ｖｏｌ．９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ））、同書  Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明のポリペプチドを感度良く定量することができる。
さらには、本発明の抗体を用いて本発明のポリペプチドの濃度を定量することによって、本発明のポリペプチドの濃度の変化が検出された場合、それらのポリペプチドが関与する上記疾患に罹患している、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
（９）本発明のＤＮＡ導入動物の作製
本発明は、外来性の本発明のＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
〔１〕本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
〔２〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔１〕記載の動物、
〔３〕ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第〔２〕記載の動物、および
〔４〕本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明の非ヒトトランスジェニック動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融合法により融合させることにより本発明の非ヒトトランスジェニック動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のポリペプチドを発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明のポリペプチドの機能を抑制するポリペプチドを発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例えば、ベクター）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
本発明のポリペプチドの発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、（ｉ）ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、（ｉｉ）各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン三リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ペプチド鎖延長囚子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするｍＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネーターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネーターなどが用いられる。
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のポリペプチドの翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なポリペプチドの翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のポリペプチドの機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常非ヒトトランスジェニック動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能亢進症や、本発明のポリペプチドが関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、本発明のポリペプチドの増加症状を有することから、本発明のポリペプチドに関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原料として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラクトは、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常非ヒトトランスジェニック動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症における本発明の異常ポリペプチドによる正常ポリペプチドの機能阻害（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、本発明のポリペプチドの増加症状を有することから、本発明のポリペプチドまたはの機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明の非ヒトトランスジェニック動物のその他の利用可能性として、例えば、
（ｉ）組織培養のための細胞源としての使用、
（ｉｉ）本発明の非ヒトトランスジェニック動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたポリペプチド組織を分析することによる、本発明のポリペプチドにより特異的に発現あるいは活性化するポリペプチドとの関連性についての解析、
（ｉｉｉ）ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
（ｖ）本発明の変異ポリペプチドを単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明の非ヒトトランスジェニック動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症などを含む、本発明のポリペプチドに関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のポリペプチドに関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明の非ヒトトランスジェニック動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のポリペプチド産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のポリペプチドおよびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明の非ヒトトランスジェニック動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症を含む、本発明のポリペプチドに関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明の非ヒトトランスジェニック動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のポリペプチドが関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
（１０）ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
１）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第１）項記載の胚幹細胞、
３）ネオマイシン耐性である第１）項記載の胚幹細胞、
４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第１）項記載の胚幹細胞、
５）ゲッ歯動物がマウスである第４）項記載の胚幹細胞、
６）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第６）項記載の非ヒト哺乳動物、
８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第６）項記載の非ヒト哺乳動物、
９）ゲッ歯動物がマウスである第８）項記載の非ヒト哺乳動物、および
１０）第７）項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法などを提供する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしている本発明のポリペプチドの活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のポリペプチドの発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエクソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエクソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエクソンの機能を破壊するか、あるいはエクソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なｍＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知のＥｖａｎｓとＫａｕｆｍａｎの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３．５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１−１００００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０．００１−０．５％トリプシン／０．１−５ｍＭ  ＥＤＴＡ、好ましくは約０．１％トリプシン／１ｍＭ  ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１−３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ及びＭ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２９２巻、１５４頁、１９８１年；Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ  プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）第７８巻、７６３４頁、１９８１年；Ｔ．Ｃ．Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第８７巻、２７頁、１９８５年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおけ本発明のポリペプチドの細胞生物学的検討において有用である。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のポリペプチドのヘテロ発現不全個体であり、本発明のポリペプチドのヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のポリペプチドのホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のポリペプチドにより誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のポリペプチドの生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
（ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、前記した医薬候補化合物のスクリーニング方法などで用いられる試験化合物の塩と同様の物が用いられる。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のポリペプチドの欠損や損傷などによって引き起こされる疾患に対して治療・予防効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、前記した試験化合物の塩と同様の物が用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のポリペプチドを含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたはその他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の腎性浮腫患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の腎性浮腫患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、前記した医薬候補化合物のスクリーニング方法などで用いられる試験化合物の塩と同様の物が用いられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明のポリペプチドの発現する組織で、本発明のポリペプチドの代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のポリペプチドの動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のポリペプチド欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、前記した試験化合物の塩と同様の物が用いられる。
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドの発現を促進し、該ポリペプチドの機能を促進することができるので、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害（例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など）、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群（ＳＩＡＤＨ）、高血圧などの予防・治療剤、拒食症などの予防・治療剤、摂食（食欲）促進剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害（例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群（時差ボケ）など）〕などの予防・治療剤などの医薬として有用である。
また、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドの発現を阻害し、該ポリペプチドの機能を阻害することができるので、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁（例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など）など〕、多尿症、尿崩症（例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など）、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング（Ｃｕｓｈｉｎｇ）症候群などの予防・治療剤、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症などの予防・治療剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害（例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群（時差ボケ）など）〕などの予防・治療剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のポリペプチドまたはその塩などを含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたはその他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の腎性浮腫患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の腎性浮腫患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
一方、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の尿崩症患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の尿崩症患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療剤の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のポリペプチドのプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子導入動物）を作成すれば、特異的にそのポリペプチドを合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のポリペプチドそのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ              ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ            ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ                ：アデニン
Ｔ                ：チミン
Ｇ                ：グアニン
Ｃ                ：シトシン
Ｙ                ：チミンまたはシトシン
Ｎ                ：チミン、シトシン、アデニンまたはグアニン
Ｒ                ：アデニンまたはグアニン
Ｍ                ：シトシンまたはアデニン
Ｗ                ：チミンまたはアデニン
Ｓ                ：シトシンまたはグアニン
ＲＮＡ              ：リボ核酸
ｍＲＮＡ            ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ            ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ            ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ            ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ            ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ              ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ            ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ              ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＴＦＡ              ：トリフルオロ酢酸
ＥＩＡ              ：エンザイムイムノアッセイ
ＧｌｙまたはＧ      ：グリシン
ＡｌａまたはＡ      ：アラニン
ＶａｌまたはＶ      ：バリン
ＬｅｕまたはＬ      ：ロイシン
ＩｌｅまたはＩ      ：イソロイシン
ＳｅｒまたはＳ      ：セリン
ＴｈｒまたはＴ      ：スレオニン
ＣｙｓまたはＣ      ：システイン
ＭｅｔまたはＭ      ：メチオニン
ＧｌｕまたはＥ      ：グルタミン酸
ＡｓｐまたはＤ      ：アスパラギン酸
ＬｙｓまたはＫ      ：リジン
ＡｒｇまたはＲ      ：アルギニン
ＨｉｓまたはＨ      ：ヒスチジン
ＰｈｅまたはＦ      ：フェニルアラニン
ＴｙｒまたはＹ      ：チロシン
ＴｒｐまたはＷ      ：トリプトファン
ＰｒｏまたはＰ      ：プロリン
ＡｓｎまたはＮ      ：アスパラギン
ＧｌｎまたはＱ      ：グルタミン
ｐＧｌｕまたはｐＥ  ：ピログルタミン酸
Ｍｅ                ：メチル基
Ｅｔ                ：エチル基
Ｂｕ                ：ブチル基
Ｐｈ                ：フェニル基
ＴＣ                ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｂｏｍ              ：ベンジルオキシメチル
ＮＭＰ              ：Ｎ−メチルピロリドン
ＰＡＭ              ：フェニルアセトアミドメチル
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｔｏｓ            ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＨＯＮＢ          ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネンー２，３−ジカルボキシイミド
Ｂｚｌ            ：ベンジル
Ｚ                ：ベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ          ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ          ：２−クロルベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ            ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＨＯＢｔ          ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＤＣＣ            ：Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＴＦＡ            ：トリフルオロ酢酸
Ｆｍｏｃ          ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＤＮＰ            ：ジニトロフェニル
Ｂｕｍ            ：ターシャリーブトキシメチル
Ｔｒｔ            ：トリチル
ＢＳＡ            ：ウシ血清アルブミン
ＣＨＡＰＳ        ：３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート
ＰＭＳＦ          ：フェニルメチルスルホニルフルオリド
Ｅ６４            ：（Ｌ−３−ｔｒａｎｓ−カルボキオキシラン−２−カルボニル）Ｌ−ロイシル−アグマチン
ＧＤＰ            ：グアノシン−５’−二リン酸
ＭＥＭα          ：ミニマムエッセンシャルメジウムアルファ
Ｆｕｒａ−２ＡＭ  ：１−［６−アミノ−２−（５−カルボキシ−２−オキサゾリル）−５−ベンゾフラニロキシ］−２−（２−アミノ−５メチルフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸ペンタアセトキシメチルエステル
ＨＢＳＳ          ：ハンクス平衡塩液
Ｆｌｕｏ−３ＡＭ  ：１−［２−アミノ−５−（２，７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−３−オキシ−９−キサンテニル）フェノキシ］−２−（２−アミノ−５−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸ペンタアセトキシメチルエステル
ＨＥＰＥＳ        ：２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸
ＭｅＢｚｌ        ：４−メチルベンジル
ＮＭＰ            ：Ｎ−メチルピロリドン
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ヒトＶＧＦのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
ラットＶＧＦのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３〕
マウスＶＧＦのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
ヒトＮＥＲＰ−１のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５〕
ラットＮＥＲＰ−１のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６〕
マウスＮＥＲＰ−１のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７〕
ヒトＮＥＲＰ−２のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８〕
ラットＮＥＲＰ−２のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９〕
マウスＮＥＲＰ−２のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０〕
ヒトＶＧＦをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
ラットＶＧＦをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
ヒトＮＥＲＰ−１をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕
ラットＮＥＲＰ−１をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕
ヒトＮＥＲＰ−２をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕
ラットＮＥＲＰ−２をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１６〕
マウスＶＧＦをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕
マウスＮＥＲＰ−１をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１８〕
マウスＮＥＲＰ−２をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
以下の実施例２における抗原として用いられたポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２０〕
以下の実施例２における抗原として用いられたポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２１〕
以下の実施例２における抗原として用いられたポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２２〕
以下の実施例２におけるＲＩＡに用いられた１２５Ｉで放射性標識したポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２３〕
以下の実施例２におけるＲＩＡに用いられた１２５Ｉで放射性標識したポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２４〕
以下の実施例２におけるＲＩＡに用いられた１２５Ｉで放射性標識したポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【実施例】
【０００６】
以下の実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
［実施例１］
ヒト甲状腺髄質腫瘍由来細胞株ＴＴの培養上清からのＮＥＲＰペプチドの単離および構造決定
無血清培養したヒト甲状腺髄質腫瘍由来細胞株ＴＴ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１，１４３８６−１４３９１（１９８６））の培養上清からペプチド画分を調製し、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって５０分画に分離した。これらの分画をタンデム質量分析計によって分析し、２８２個のペプチドの配列を同定した。これらのペプチドの配列はすべて既知の分泌タンパク質または生理活性ペプチド前駆体の配列に帰属されたことから、用いられた培養上清には分泌タンパク質あるいはペプチドが豊富に含まれていることが示唆された。同定されたペプチドのうち２０個はＣ末端がアミド化されていた。この細胞株はカルシトニン遺伝子関連ペプチドαおよびカルシトニンを産生し、アミド化ペプチドのうち１６個はこれらのペプチドの全長あるいはフラグメントペプチドであったが、それら以外にさらに２つの新規ペプチドが同定された。質量分析においてこれらのペプチドのそれぞれについて、２６７７．４および４０６２．２、およびそれらのフラグメントである２５２２．２および３４０６．７にモノイソトピックマスが検出され、神経分泌タンパク質であるＶＧＦ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００３３６９、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２，７０３−７０８（２０００））に由来するペプチドであると同定された。これらのＶＧＦ由来ペプチドの配列はヒトと齧歯類において高い保存性を示した。これらのペプチドを本明細書に示す生理作用に基づいて神経内分泌調節ペプチド−１および−２〔ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１（ＮＥＲＰ−１）およびｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ−２（ＮＥＲＰ−２）〕と命名した。ヒト、ラットおよびマウスのＮＥＲＰ−１のアミノ酸配列を配列番号：４、配列番号：５および配列番号：６に、ヒト、ラットおよびマウスのＮＥＲＰ−２のアミノ酸配列を配列番号：７、配列番号：８および配列番号：９にそれぞれ示す。
［実施例２］
（１）抗ＮＥＲＰ抗血清の調製および得られた抗血清を用いた組織及び血漿中のＮＥＲＰの同定
まず、ラットのＮＥＲＰ−１、ＮＥＲＰ−２およびヒトのＮＥＲＰ−２のＣ末端に対する抗体を取得した。具体的には、無処理（ラットＮＥＲＰ−１）またはマレイミドによって活性化されたｍａｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  ＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ；Ｓｉｇｍａ  ａｎｄ  Ｐｉｅｒｃｅ）と結合させた合成のＱＧＬＡＱＶＥＡ−ＮＨ２（配列番号：１９）、Ｃ＋ＱＧＧＡＲＱＲＤＬＧ−ＮＨ２（配列番号：２０）およびＧＣ＋ＹＬＬＱＧＧＡＲＱＲＧＬＧ−ＮＨ２（配列番号：２１）をウサギに免疫することによって上記ポリクローナル抗体を産生させた。ラットＮＥＲＰ−１に対する抗体は、そのＣ末端配列が一致することから、ヒトＮＥＲＰ−１と１００％の交差反応を示した。リガンドとして、ＮＥＲＰ−１には１２５Ｉで放射性標識したＹＬＬＱＱＧＬＡＱＶＥＡ−ＮＨ２（配列番号：２２）、ＮＥＲＰ−２にはＹＬＬＱＧＧＡＲＱＲＤＬＧ−ＮＨ２（配列番号：２３）またはＹＬＬＱＧＧＡＲＱＲＧＬＧ−ＮＨ２（配列番号：２４）を用いて、ＲＩＡ（放射免疫測定）を実施した。雄ウィスターラットのさまざまな組織内のペプチドを抽出した後、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ−１８カートリッジに負荷した。カートリッジ溶出液の一部を、ＮＥＲＰの組織含有量を決定するためにＲＩＡに供した。溶出液の残りの部分を、ＮＥＲＰペプチドを同定するためにＲＩＡと連結されたＲＰ−ＨＰＬＣによって分離した。なお、ここでは「ＮＥＲＰ」はアミド体を示す。
ヒト血漿およびラット組織の中の免疫反応性をもつＮＥＲＰはすべて、ＲＰ−ＨＰＬＣで得られる標準のＮＥＲＰペプチドと一致し（図１ａ〜図１ｄ）、ＮＥＲＰは、ヒトとラットに内因的に存在することが示された。ヒトにおける免疫反応性を有すＮＥＲＰ−１およびＮＥＲＰ−２の血漿濃度は、各々９．８±１．１ｆｍｏｌ／ｍｌおよび１０．８±１．０ｆｍｏｌ／ｍｌであった。ラット脳におけるＮＥＲＰの主な内因的形態は、ＮＥＲＰ−１とＮＥＲＰ−２それぞれに対応するアミド化された２５−および３８−アミノ酸ペプチド（それぞれ、配列番号：５および配列番号：８）であることを、脳の全抽出物（ｗｈｏｌｅ  ｂｒａｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔ）から得られた免疫沈降物のマススペクトロメトリー分析によって確認した。ＮＥＲＰ−１およびＮＥＲＰ−２は、いずれも視床下部および下垂体においてもっとも多く、脳および胃においても多く存在し、測定された全臓器において検出された（表１および図２）。
（２）免疫組織化学によるＮＥＲＰの内因的存在および局在の確認
免疫蛍光顕微鏡法用に２％パラホルムアルデヒドまたは電子顕微鏡法用に０．１％グルタルアルデヒド含有の４％パラホルムアルデヒドで灌流したコルヒチン（２００μｇ）で処理されたラットから脳を採取した。他の臓器は、４％パラホルムアルデヒドで灌流されたラットから採取した。ＮＥＲＰ−１（希釈率１：２，５００）、ＮＥＲＰ−２（希釈率１：５，０００）、オキシトキシン（ケミコン（ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、１：１５，０００）、バソプレシン（ペニンスラ・ラボラトリーズ（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１：８０，０００）、ＭＣＨ（ケミコン（ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、１：２，０００）およびオレキシン−Ａ（サンタ・クルース（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、１：１，０００）に対する抗体を用い、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１４４，１５０６−１５１２（２００３）に記載の方法に従って、二重免疫蛍光染色法を実施した。画像は、オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ）ＡＸ−７０蛍光顕微鏡により撮影した。二重標識された金コロイド抗体電子顕微鏡法用の超薄切片（１００ｎｍ）は、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４４，１５０６−１５１２（２００３）記載の方法に従い、ＮＥＲＰ−１（１：１，０００）、ＮＥＲＰ−２（１：３，０００）、オキシトシン（１：３００）に対する抗体またはバソプレシン抗血清（１：３００）と共にインキュベートした後、５ｎｍまたは１０ｎｍの金コロイドを結合させたＩｇＧ（ブリティッシュ・バイオセル（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｂｉｏｃｅｌｌ））と共にインキュベートして調製した。この超薄切片の観察は、日立Ｈ−７０００電子顕微鏡によって行った。
ＮＥＲＰ−１およびＮＥＲＰ−２の免疫反応性細胞体は、ラット視床下部の視索上核（ｓｕｐｒａｏｐｔｉｃ  ｎｕｃｌｅｕｓ）（ＳＯＮ）に存在した（図３）。また、ＮＥＲＰは、室傍核（ｐａｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｎｕｃｌｅｕｓ）（ＰＶＮ）の大細胞部（ｍａｇｎｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ）にも存在した。コロイド金免疫染色（ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）は、ＳＯＮおよびＰＶＮにおいて、ＮＥＲＰと、常在するホルモンであるアルギニン・バソプレシン（ＡＶＰ）およびオキシトニンとの共局在を示した。
【表１】
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［実施例３］
Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるＶＧＦのｍＲＮＡレベルの変化の測定
ＰＶＮおよびＳＯＮを含む１２μｍの切片を、６匹の対照ラットと４８時間絶水された６匹のラットから調製した。ＶＧＦをコードする転写産物に相補的な２つの３３Ｐで３’末端標識されたデオキシオリゴヌクレオチド・プローブ（１７４１−１７８５および１８２５−１８７０；ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ７４２２３）を、等モル比で使用した。ＡＶＰのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．７７２，１６１−６（１９９７）記載の方法に従って行った。得られた画像は、ＭＣＩＤ画像解析装置で解析した（Ｎａｔｕｒｅ  ４０９，１９４−１９８（２００１））。
定量ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション組織化学によってＮＥＲＰの前駆体であるＶＧＦのｍＲＮＡレベルの変化について評価したところ、ＰＶＮおよびＳＯＮにおけるＶＧＦ  ｍＲＮＡレベルが絶水（ｗａｔｅｒ  ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ）に対応して増加していた（図４および図５）。
［実施例４］
Ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＡＶＰ分泌の測定
ラットに、ＮＥＲＰ−１、ＮＥＲＰ−１−Ｇｌｙ、ＮＥＲＰ−２またはＮＥＲＰ−２−ＧｌｙをＩＣＶ投与し、５分後に高張食塩水（８５０ｍＭ  ＮａＣｌ／１０μｌ）またはアンジオテンシンＩＩ  （ＡＴ−ＩＩ）（１ｎｍｏｌ／１０μｌ）のＩＣＶ（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射を行った。
血液サンプルは、ＮＥＲＰの注射の１５分後に採取した。血漿ＡＶＰは、ＲＩＡキット（三菱製）により測定した。ＰＶＮおよびＳＯＮの６つの断片を、ラットの視床下部から採取した。それぞれの核は、９５％  Ｏ２で平衡化された培地１９９（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファｐＨ７．４、２．５％ウシ胎仔血清、２．５％ウシ血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシン）内で１時間３７℃でプレインキュベートした（１群当たりｎ＝４ウェル）。これらの核を、ＮＥＲＰ−１（１０−６Ｍ）、ＮＥＲＰ−１（１０−６Ｍ）＋ＡＴ−ＩＩ（１０−６Ｍ）またはＡＴ−ＩＩ（１０−６Ｍ）のいずれか１つを用いて、３回、各５分間刺激した。これらの刺激期間の間に、５分間の回復期間をおいた。同様に、これらの核を、ＮＥＲＰ−２（１０−６Ｍ）、ＮＥＲＰ−２（１０−６Ｍ）＋ＡＴ−ＩＩ（１０−６Ｍ）、ＮＥＲＰ−１−Ｇｌｙ（１０−６Ｍ）、またはＮＥＲＰ−２−Ｇｌｙ（１０−６Ｍ）のいずれかを用いて刺激した。脱分極によって誘発された分泌を確認するために、これらの刺激を加えた後、６×１０−２Ｍ  ＫＣｌを用いてインキュベーションした。ラット下垂体後葉の２つの断片は、上記記載と同様の条件下で、ＮＥＲＰおよびＡＴ−ＩＩで刺激した。培地の一部分は、ＡＶＰの測定用にＲＩＡに供した。本実験は、５回繰り返した。
ＮＥＲＰ−１の脳室内ＩＣＶ投与は、高塩分投与で誘導されたＡＶＰ分泌を用量依存的に抑制した（図６）。ＮＥＲＰ−１の事前投与は、ＡＴ−ＩＩで誘導されたＡＶＰ分泌を抑制した（図６）。また、ＮＥＲＰ−２のＩＣＶ投与も、高塩分とＡＴ−ＩＩで誘導されたＡＶＰ分泌を抑制した。ＰＶＮとＳＯＮのｉｎ  ｖｉｔｒｏ静的培養において、ＮＥＲＰ−１およびＮＥＲＰ−２双方とも、基底およびＡＴ−ＩＩで誘導されたＡＶＰ分泌を抑制した（図７）。また、ＮＥＲＰ−１は、下垂体後葉からのＡＶＰ分泌も抑制した（図８）。
以上の結果から、ＮＥＲＰはＡＶＰ分泌の調節に関与していることが示された。
［実施例５］
電気生理学によるＮＥＲＰの作用機序の確認
雄ウィスター若年ラットのＳＯＮを含む薄片試料を、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５０４，１１３−１２６（１９９７）記載の方法に従って記録室内に固定した。灌流速度は、１．４ｍｌ／分とした。ＳＯＮ内の大細胞神経内分泌ニューロンは、正立顕微鏡（ｕｐｒｉｇｈｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（ＢＸ５０、オリンパス）によって同定した。物質の測定期間は、別段の記載のない限り５分とした。電極は、ガラス毛細管からプラー（Ｐ−８７、Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．）で３重に引いて作成した。後シナプス電流の記録は、膜を破って５分後、電流が安定状態に達した時に開始された。電流と電圧は、ＥＰＣ−１０増幅器（ＨＥＫＡ）によって記録した。信号は、アナログ・デジタル・コンバータ（ＭａｃＬａｂ／ｖ．３．５）を用いて、３ｋＨｚでフィルタ処理し、１ｋＨｚでデジタル化した。シナプス電流を定量的に分析するために、ソフトウェア（ＡｘｏＧｒａｐｈ  ｖ．３．６．１、アクソン・インスツルメンツ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））とともに１Ｈｚのハイパスフィルタを用いたＡＣ部品のみを使用した。
ＡＶＰ分泌に関するＮＥＲＰの抑制機序を明らかにするために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏスライス標本上でのパッチクランプ法（Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５０４，１１３−１２６（１９９７））を用いてＳＯＮにおけるＡＶＰニューロンへの求心性入力（ａｆｆｅｒｅｎｔ  ｉｎｐｕｔ）について検討した。バソプレシンニューロンの神経活動は、興奮性グルタミン入力および抑制性ＧＡＢＡ作動性入力によって調節される。バソプレシンニューロンからの自発性の興奮性および抑制性後シナプス電流（ＥＰＳＣおよびＩＰＳＣ）は、各々−７０ｍＶおよび−２０ｍＶに保持電位を設定することで選択的に記録した。ＮＥＲＰ−１は、ＳＯＮニューロンにおいて、ＧＡＢＡ作動性ＩＰＳＣを増大させたが、ＥＰＳＣを増大させなかった（図９、図１０）。また、ＮＥＲＰ−２も、ＩＰＳＣを増大させた。ＮＥＲＰ−１は、ＩＰＳＣの周波数を増大させたが振幅を増大させなかった（図９）。このことはＮＥＲＰが前シナプスＧＡＢＡ作動性電流を活性化（ａｃｔｉｖａｔｅ）したことを示している。ＮＥＲＰ−１によって誘導される前シナプスＧＡＢＡ作動性電流は、Ｎａ＋チャンネル阻害剤であるテトロドトキシンによって変化しなかった。このことは、介在ニューロンがＳＯＮニューロンに対するＮＥＲＰの抑制作用に関与しなかったことを示している（図１１）。ＩＰＳＣに対するＮＥＲＰ−１の興奮性作用が酸化窒素（ＮＯ）の同作用に類似していたため、ＮＥＲＰ−１がＮＯを介してＳＯＮニューロンの前シナプスＧＡＢＡ作動性電流に影響を及ぼすかどうかについて調べた。ＮＯスカベンジャーであるヘモグロビン（Ｈｂ）の適用によって、ＮＥＲＰ−１に誘導されるＩＰＳＣは影響を受けなかった（図１２）。上記の結果は、ＮＥＲＰは、ＳＯＮニューロンにおけるＧＡＢＡ作動性活動の局所調節因子であり、ＮＯが介在する経路とは独立して作用をもたらすことを示している。以上の結果から、ＮＥＲＰは、ＮＯのようなＧＡＢＡ作動性入力を誘導する新規の生物活性ペプチドであることが確認された。
［実施例６］
給餌実験による摂食促進活性の測定
ＮＥＲＰ−１、ＮＥＲＰ−２またはＮＥＲＰ−２−Ｇｌｙ（０．１〜５ｎｍｏｌ／１０μｌ）を、摂食の評価のために０９：３０にラット（１群当たりｎ＝１５）にＩＣＶ注射した。抗オレキシンＡ  ＩｇＧ（０．２５μｇ／１０μｌ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）および抗オレキシンＢ  ＩｇＧ（０．２５μｇ／１０μｌ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）または抗ＭＣＨ  ＩｇＧ（０．５μｇ／１０μｌ、Ｐｈｏｅｎｉｘ）は、０９：００にラット（１群当たりｎ＝１２）にＩＣＶ注射した。すべての場合において、ＩｇＧは、ＮＥＲＰ−２投与３時間前に注射した。摂食は、１時間モニターした。マウス実験では、ＮＥＲＰ−２（１ｎｍｏｌ／２μｌ生理食塩水）またはＭＣＨ（１ｎｍｏｌ／２μｌ生理食塩水）をオレキシン・ノックアウトマウス（Ｃｅｌｌ  ９２，５７３−５８５（１９９８））および野生型同腹子（１群当たりｎ＝５、４ヶ月雄）にＩＣＶ注射によって投与してから、１時間摂食を測定した。オレキシン・ノックアウトマウスは、ＥＳ細胞の標的変異によって作成した（Ｃｅｌｌ  ９２，５７３−５８５（１９９８））
自由給餌ラットへのＮＥＲＰ−２のＩＣＶ注射は、最低有効用量０．１ｎｍｏｌで用量依存的に明期中の摂食を増大させた（図１３）。ＮＥＲＰ−２の食欲促進作用は、ＩＣＶ注射後１時間を超えては持続しなかった。ＮＥＲＰ−２のＩＣＶ注射を受けるラットは、敏捷な（ａｌｅｒｔ）点は変わりなく、対照群と比較して通常と異なる行動は一切示さなかった。ＮＥＲＰ−２免疫反応性細胞は、摂食行動やエネルギー代謝の調節に重要な部位である視床下部外側野（ｌａｔｅｒａｌ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ）（Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５０４，１１３−１２６（１９９７））に存在していた（図１４）。二重免疫染色により、ＮＥＲＰ−２は、摂食および自発運動を刺激する神経ペプチドであるオレキシンと共局在する一方（図１４）、ＮＥＲＰ−２は、視床下部外側野において産生される別の食欲促進作用をもつペプチドであるメラニン凝集ホルモン（ｍｅｌａｎｉｎ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）（ＭＣＨ）とは共局在していないことが明らかになった（図１４）。
ＮＥＲＰ−２を投与する３時間前に、脳室内に抗オレキシン−Ａ  ＩｇＧおよび抗オレキシン−Ｂ  ＩｇＧまたは抗ＭＣＨ  ＩｇＧを注射した。オレキシン抗体は、ＮＥＲＰ−２に誘導される摂食を無効にしたが、ＭＣＨ抗体は無効にしなかった（図１５）。また、野生型の対照マウスではＮＥＲＰ−２のＩＣＶ注射は摂食を刺激したが、オレキシン・ノックアウトマウスでは刺激しなかった（図１６）。
［実施例７］
自発運動促進活性の測定
ＮＥＲＰ−２（５ｎｍｏｌ／２μｌ生理食塩水）または溶媒（ｖｅｈｉｃｌｅ）のＩＣＶ投与が施されたマウスの運動は、前述したような赤外線検出器（Ｍｕｒｏｍａｃｈｉ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．、東京、日本）を備えた耐音性、耐光性があるかごの中で、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４４，４７２９−４７３３（２００３）記載の方法に従って測定した。自発運動数は、１５分ごとに測定し、投与後３０分から１２０分の間合計した。
ＮＥＲＰ−２のＩＣＶ投与は、野生型マウスでは全自発運動（ｔｏｔａｌ  ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を促進したが、オレキシン・ノックアウトマウスでは促進しなかった（図１７）。
以上の結果は、ＮＥＲＰ−２がオレキシン系と相互作用して摂食および自発運動を促進することを示している。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明においては、例えば、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、該ポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、該ポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドなどは、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群（ＳＩＡＤＨ）、高血圧などの予防・治療剤などとして利用することができる。
また、例えば、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、該ポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体、該ポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチドなどは、例えば、蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング（Ｃｕｓｈｉｎｇ）症候群などの予防・治療剤などとして利用することができる。
さらに、例えば、配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、該ポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、該ポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドなどは、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群（ＳＩＡＤＨ）、高血圧などの予防・治療剤、拒食症などの予防・治療剤、摂食（食欲）促進剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害（例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群（時差ボケ）など）〕などの予防・治療剤などとして利用することができる。
また、例えば、配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、該ポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体、該ポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチドなどは、例えば、蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング症候群、肥満症、摂食亢進症、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害（例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群（時差ボケ）など）〕などの予防・治療剤などの予防・治療剤などとして利用することができる。
さらに、例えば、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩などは、上記したそれらのポリペプチドなどが関与する疾患の予防・治療剤のスクリーニングなどに有用である。
また、例えば、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体などは、上記疾患の診断などに有用である。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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