(57)【要約】特効薬的に心筋弛緩を改善する薬剤、即ち、拡張不全による心不全の治療薬剤の発見を容易にする拡張不全による心不全の治療薬剤の選別方法及び選別用試薬を提供する。トロポニンＩ、トロポニンＣ、アクチン、トロポミオシン及びＡＴＰを含有する水溶液に被験薬を加えて反応させ、この反応液から沈殿物を分別し、上澄み液を除いた液中の沈殿物をポリアクリルアミド電気泳動法で分離し、分離帯域を発色剤で染色して、トロポニンＩの分離帯域の分離物の量を測定することを特徴とするアクチン−トロポミオシン複合体とトロポニンＩとの結合についての薬の活性の測定方法にある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トロポニンＩ、トロポニンＣ、アクチン、トロポミオシン及びＡＴＰを含有する水溶液に被験薬を加えて反応させ、この反応液から沈殿物を分別し、この分別された沈殿物をポリアクリルアミド電気泳動法で分離し、分離帯域を発色剤で染色して、トロポニンＩの分離帯域の分離物の量を測定することを特徴とするアクチン−トロポミオシン複合体とトロポニンＩとの結合についての薬の活性の測定方法。
【請求項２】
トロポニンＩ、トロポニンＣ、アクチン、トロポミオシン及びＡＴＰを含有する水溶液に被験薬を加えて反応させ、この反応液に水溶性カルシウム塩及びＥＧＴＡ溶液を加えて反応させて、この反応液から沈殿物を分別し、この分別された沈殿物をポリアクリルアミド電気泳動法で分離し、分離帯域を銀発色剤で染色して、トロポニンＩの分離帯域の分離物の量を測定することを特徴とするアクチン−トロポミオシン複合体とトロポニンＩとの結合についての薬の活性の測定方法。
【請求項３】
トロポニンＩ、トロポニンＣ、アクチン、トロポミオシン及びＡＴＰを含有する水溶液に被験薬を加えて反応させ、この反応液から沈殿物を分別し、この分別された沈殿物をポリアクリルアミド電気泳動法で分離し、分離帯域を発色剤で染色して、トロポニンＩの分離帯域の分離物の量を測定することを特徴とする心臓又は血管の拡張障害を改善する薬剤の選別方法。
【請求項４】
トロポニンＩ、トロポニンＣ、アクチン、トロポミオシン及びＡＴＰを含有する水溶液に被験薬を加えて反応させ、この反応液に水溶性カルシウム塩及びＥＧＴＡ溶液を加えて反応させて、この反応液から沈殿物を分別し、この分別された沈殿物をポリアクリルアミド電気泳動法で分離し、分離帯域を銀発色剤で染色して、トロポニンＩの分離帯域の分離物の量を測定することを特徴とする心臓又は血管の拡張障害を改善する薬剤の選別方法。
【請求項５】
夫々、超遠心分離法により凝集成分が分離された０．１乃至１．２μｇのトロポニンＩ及び０．２乃至１．６μｇのトロポニンＣを含み、さらに、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のアクチン溶液３．２μｌ、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌ濃度のトロポミオシン溶液２．４μｌ及び４乃至６ｍＭのＡＴＰを含む溶液の混合溶液に、被験薬を加えて反応させ、この反応液から沈殿物を分別し、この分別された沈殿物をポリアクリルアミド電気泳動法で分離し、分離帯域を発色剤で染色して、トロポニンＩの分離帯域の分離物の量を測定することを特徴とするアクチン−トロポミオシン複合体とトロポニンＩとの結合についての薬の活性の測定方法。
【請求項６】
夫々、超遠心分離法により凝集成分が分離された０．１乃至１．２μｇのトロポニンＩ及び０．２乃至１．６μｇのトロポニンＣを含み、さらに、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のアクチン溶液３．２μｌ、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌ濃度のトロポミオシン溶液２．４μｌ及び４乃至６ｍＭのＡＴＰを含む溶液の混合溶液に、被験薬を加えて反応させ、この反応液に水溶性カルシウム塩及びＥＧＴＡ溶液を加えて反応させて、この反応液から沈殿物を分別し、この分別された沈殿物をポリアクリルアミド電気泳動法で分離し、分離帯域を銀発色剤で染色して、トロポニンＩの分離帯域の分離物の量を測定することを特徴とするアクチン−トロポミオシン複合体とトロポニンＩとの結合についての薬の活性の測定方法。
【請求項７】
夫々、超遠心分離法により凝集成分が分離された０．１乃至１．２μｇのトロポニンＩ及び０．２乃至１．６μｇのトロポニンＣを含み、さらに、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のアクチン溶液３．２μｌ、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌ濃度のトロポミオシン溶液２．４μｌ及び４乃至６ｍＭのＡＴＰを含む溶液の混合溶液に、被験薬を加えて反応させ、この反応液から沈殿物を分別し、この分別された沈殿物をポリアクリルアミド電気泳動法で分離し、分離帯域を発色剤で染色して、トロポニンＩの分離帯域の分離物の量を測定することを特徴とする心臓又は血管の拡張障害を改善する薬剤の選別方法。
【請求項８】
夫々、超遠心分離法により凝集成分が分離された０．１乃至１．２μｇのトロポニンＩ及び０．２乃至１．６μｇのトロポニンＣを含み、さらに、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のアクチン溶液３．２μｌ、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌ濃度のトロポミオシン溶液２．４μｌ及び４乃至６ｍＭのＡＴＰを含む溶液の混合溶液に、被験薬を加えて反応させ、この反応液に水溶性カルシウム塩及びＥＧＴＡ溶液を加えて反応させて、この反応液から沈殿物を分別し、この分別された沈殿物をポリアクリルアミド電気泳動法で分離し、分離帯域を銀発色剤で染色して、トロポニンＩの分離帯域の分離物の量を測定することを特徴とする心臓又は血管の拡張障害を改善する薬剤の選別方法。
【請求項９】
トロポニンＩ、トロポニンＣ、アクチン、トロポミオシン及びＡＴＰを含有する溶液であることを特徴とするアクチン−トロポミオシン複合体とトロポニンＩとの結合についての薬の活性の測定用試薬。
【請求項１０】
夫々、超遠心分離法により凝集成分が分離された０．１乃至１．２μｇのトロポニンＩ及び０．２乃至１．６μｇのトロポニンＣを含み、さらに、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のアクチン溶液３．２μｌ、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のトロポミオシン溶液２．４μｌ及び４乃至６ｍＭのＡＴＰを含む溶液の混合溶液であることを特徴とするアクチン−トロポミオシン複合体とトロポニンＩとの結合についての薬の活性の測定用試薬。
【請求項１１】
トロポニンＩ、トロポニンＣ、アクチン、トロポミオシン及びＡＴＰを含有する溶液の被験薬混合用の第一試薬と、水溶性カルシウム塩及びＥＧＴＡを含有する溶液の沈殿物完成用の第二試薬とを備えることを特徴とするアクチン−トロポミオシン複合体とトロポニンＩとの結合についての薬の活性の測定用試薬。
【請求項１２】
夫々、超遠心分離法により凝集成分が分離された０．１乃至１．２μｇのトロポニンＩ及び０．２乃至１．６μｇのトロポニンＣを含み、さらに、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のアクチン溶液３．２μｌ、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のトロポミオシン溶液２．４μｌ及び４乃至６ｍＭのＡＴＰを含む溶液の混合溶液の被験薬混合用の第一試薬と、水溶性カルシウム塩及びＥＧＴＡ溶液を含有する溶液の沈殿物完成用の第二試薬とを備えることを特徴とするアクチン−トロポミオシン複合体とトロポニンＩとの結合についての薬の活性の測定用試薬。
【請求項１３】
トロポニンＩ、トロポニンＣ、アクチン、トロポミオシン及びＡＴＰを含有する溶液であることを特徴とする心臓又は血管の拡張障害を改善する薬剤の選別用試薬。
【請求項１４】
夫々、超遠心分離法により凝集成分が分離された０．１乃至１．２μｇのトロポニンＩ及び０．２乃至１．６μｇのトロポニンＣを含み、さらに、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のアクチン溶液３．２μｌ、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のトロポミオシン溶液２．４μｌ及び４乃至６ｍＭのＡＴＰを含む溶液の混合溶液であることを特徴とする心臓又は血管の拡張障害を改善する薬剤の選別用試薬。
【請求項１５】
トロポニンＩ、トロポニンＣ、アクチン、トロポミオシン及びＡＴＰを含有する溶液の被験薬混合用の第一試薬と、水溶性カルシウム塩及びＥＧＴＡを含有する溶液の沈殿物完成用の第二試薬とを備えることを特徴とする心臓又は血管の拡張障害を改善する薬剤の選別用試薬。
【請求項１６】
夫々、超遠心分離法により凝集成分が分離された０．１乃至１．２μｇのトロポニンＩ及び０．２乃至１．６μｇのトロポニンＣを含み、さらに、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のアクチン溶液３．２μｌ、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のトロポミオシン溶液２．４μｌ及び４乃至６ｍＭのＡＴＰを含む溶液の混合溶液の被験薬混合用の第一試薬と、水溶性カルシウム塩及びＥＧＴＡ溶液を含有する溶液の沈殿物完成用の第二試薬とを備えることを特徴とする心臓又は血管の拡張障害を改善する薬剤の選別用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、薬剤のトロポニンＩとの結合性の判別方法及びその判別用試験薬に関し、特に、筋組織、即ち、骨格筋及び平滑筋の弛緩を促進させる機能を有する化合物の判別方法及びその判別用試験薬に関する。
【背景技術】  例えば、心不全は、これまで、心筋の収縮機能不全に基づいて発症するものと考えられており、そのために、心不全の治療薬としては、心筋の収縮を強める薬剤が使用されている。即ち、このような心不全の治療薬としては、（１）  ジギタリス（ジゴキシン、ジギトキシン、ジギラノーゲンＣなど）、（２）  カテコールアミン（ドパミン、ドブタミン、デノパンなど）、（３）  フォスフォジエステラーゼ阻害薬（ＰＤＥＩＩＩ阻害薬、アムリノン、ミルリノン、ベスナリノンなど）、（４）  カルシウムセンシタイザー（ピモベンダン）などがあるが、これらの中で、前記（１）〜（３）に示す薬剤は、いずれもが細胞内カルシウムイオンを増やすことにより、心筋収縮を促進させるものであり、また、前記（４）の薬剤のカルシウムセンシタイザーは心筋収縮調節蛋白質トロポニンＣのカルシウムイオン感受性を高めて、心筋収縮を促進させるものである。
またこれらの他に、リアノジン受容体機能を改善及び／又は安定化により、筋小胞体からのＣａイオンのリークを抑制する作用を発揮する化合物を有効成分とする、筋肉収縮・弛緩機能障害が発症の原因となる疾患の治療又は予防剤が提案されている（日本国特開２００３−９５９７７号公報参照）。
しかしながら、最近、心不全の症例において、左室の収縮機能が保持されているにもかかわらず、心不全をきたす患者が多く、その数は心不全の患者の４０パーセントにも及ぶことが発見されて、しかも、この場合、必ずしも予後が良好といえないことが分かってきた。このような心不全の患者では左室の拡大が認められないために、このような患者では、左室拡張機能が心不全の原因となっており、これは拡張不全とよばれている。
ところで、筋肉には、心筋、骨格筋及び平滑筋があり、これら筋肉の収縮及び弛緩は、筋肉を備える臓器又は組織若しくは器官の機能を発揮する上で不可欠である。これら筋肉の収縮及び弛緩に係る治療は、血液の拍出の際の筋肉の収縮に大きなエネルギーを要するところから、従来より筋肉の収縮を高める物質が研究されており、筋肉の収縮を高める薬剤は、例えば、心臓の疾病を例にとれば、前記のように心不全の治療薬となり、また、血管の場合では、血管の収縮を強めて血圧の上昇をもたらす薬剤となる。これらとは逆に、例えば、β−遮断薬のように、心収縮力を弱めることにより、筋組織の酸素消費量を少なくする薬剤があるが、この薬剤は、労作狭心症の治療薬に使用されている。
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３１，７３９−７４３（２００２）において、比較的高濃度のアクチン−トロポミオシン複合体と、同じく高濃度のトロポニンＣ−Ｉ複合体を含む混合物を使用して、２５℃で、１２０分間、１００，０００×ｇの超遠心力で処理して生成する沈殿物を分析して、前記沈殿物からアクチン−トロポミオシン複合体及びトロポニンＣ−Ｉ複合体を検出することにより、筋組織内でのアクチン−トロポミオシン複合体に対しトロポニンＣ−Ｉ複合体が結合していることが確認されている。また、比較的高濃度のアクチン−トロポミオシン複合体と、トロポニンＣ−Ｉ複合体を含む混合物をカルシウムキレート剤のＥＧＴＡの存在下で、即ち、カルシウムイオンが存在しない状態で、超遠心力で処理すると、アクチン−トロポミオシン複合体とトロポニンＣ−Ｉ複合体とが結合して一緒に沈殿するが、この沈殿物が、アクチン−トロポミオシン複合体とトロポニンＣ−Ｉ複合体とにより形成された複合体であることは、前記沈殿物からトロポニンＩをＳＤＳ−ゲル電気泳動法により検出することにより確認することができる。このように、アクチン−トロポミオシン複合体とトロポニンＣ−Ｉ複合体が複合体を形成して沈殿することは、アクチン−トロポミオシン複合体にトロポニンＣ−Ｉが結合して、アクチン−トロポミオシン複合体にトロポニンＩの筋抑制作用が働いていることを示すものである。
しかし、カルシウムキレート剤のＥＧＴＡが存在しない場合は、即ち、カルシウムイオンが存在する状態では、超遠心力による共沈殿法で処理しても、トロポニンＩ又はトロポニンＣ−Ｉ複合体は、アクチン−トロポミオシン複合体と沈殿物を形成しない。このようにトロポニンＩ又はトロポニンＣ−Ｉ複合体が、アクチン−トロポミオシン複合体と沈殿物を形成しないことは、アクチン−トロポミオシン複合体に、トロポニンＩ又はトロポニンＣ−Ｉの結合が存在しない場合に相当し、アクチン−トロポミオシン複合体にトロポニンＩの筋抑制作用が働かないことを示すものである。
例えば、拡張不全による心不全は、これまでの収縮不全による心不全とは心不全の発生のメカニズムが異なっており、収縮不全による心不全と拡張不全による心不全は峻別されている。したがって、収縮不全による心不全と拡張不全による心不全の治療法は、自ずと異なり、左室拡張不全の治療には、急性憎悪期における治療薬や慢性期における治療薬の使用が提案されてはいるが、何れも完全ではなく、例えば、最近心不全薬として使用されているβ−遮断薬は、筋収縮に影響を与える点に問題が残り、完全とはいえず、特効薬的に心筋弛緩を改善する薬剤、即ち、拡張不全による心不全の治療薬剤の出現が望まれている。
さらにまた、心筋組織において、トロポニン及びトロポミオシンは、収縮蛋白質のアクチン及びミオシンの相互作用を調節する蛋白質であり、蛋白質のトロポニン及びトロポミオシンが存在しない場合には、この収縮蛋白質のアクチン及びミオシンは、常に活性化された状態にあって、筋組織は収縮した状態となる。この状態においては、トロポミオシンを加えても、この筋組織の収縮した状態は変わらない。しかし、Ｃａ受容蛋白質のトロポニンを加えた場合は、筋組織の収縮反応は、筋組織内のＣａ濃度で制御されるようになる。この蛋白質のトロポニンはトロポニンＩ、トロポニンＣ及びトロポニンＴの３つのサブユニットを有する複合体であって、この中、トロポニンＩは筋組織の収縮抑制蛋白質であり、トロポニンＣはカルシウムイオン結合蛋白質であり、トロポニンＴはトロポミオシンと結合する蛋白質である。トロポニンＣにカルシウムイオンが結合すると、筋組織に対するトロポニンＩの抑制作用が外れて、即ち、脱抑制されてミオシン及びアクチンが互いに滑り合って筋組織の収縮が起こる。そこで、筋組織の弛緩を促進させるためには、筋収縮抑制蛋白質のトロポニンＩのアクチンーミオシン複合体に対する結合機能を如何に増強させるかが問題である。
【発明の開示】
本発明は、従来の心不全の４０％とも言われている心筋弛緩不全、即ち拡張不全による心不全の特効薬又は治療薬の開発のための薬物の選別方法及びその選別用試験薬を提供することを目的としている。
本発明者は、拡張不全による心不全の治療に有効な薬物の存在する場合には、存在しない場合に比べて、トロポニンＩが、アクチン−トロポミオシン複合体と沈殿物を強く形成することを発見した。また、本発明者は、この沈殿形成反応が、ごく微量で可能であることを発見した。また、本発明者ら拡張不全による心不全の治療に有効な薬物の存在する場合には、存在しない場合に比べて、アクチン、トロポミオシン、トロポニンＩ、トロポニンＣの四つの蛋白質の中で、トロポニンＩの沈殿形成の割合が最も多くなることを発見した。さらに、本発明者らは、この沈殿形成がカルシウム濃度が１０−８、１０−７、１０−６、１０−５モル（Ｍ）の下でも起こることを発見し、さらにこの沈殿形成反応が、カルシウム濃度が低いほど強く起こることを発見した。本発明は、これらの発見に基づくものである。
即ち、本発明は、トロポニンＩ、トロポニンＣ、アクチン、トロポミオシン及びＡＴＰを含有する水溶液に被験薬を加えて反応させ、この反応液から沈殿物を分別し、この分別された沈殿物をポリアクリルアミド電気泳動法で分離し、分離帯域を発色剤で染色して、トロポニンＩの分離帯域の分離物の量を測定することを特徴とするアクチン−トロポミオシン複合体とトロポニンＩとの結合についての薬の活性の測定方法にあり、また、本発明は、トロポニンＩ、トロポニンＣ、アクチン、トロポミオシン及びＡＴＰを含有する水溶液に被験薬を加えて反応させ、この反応液に水溶性カルシウム塩及びＥＧＴＡ溶液を加えて反応させて、この反応液から沈殿物を分別し、この分別された沈殿物をポリアクリルアミド電気泳動法で分離し、分離帯域を銀発色剤で染色して、トロポニンＩの分離帯域の分離物の量を測定することを特徴とするアクチン−トロポミオシン複合体とトロポニンＩとの結合についての薬の活性の測定方法にあり、さらに、本発明は、トロポニンＩ、トロポニンＣ、アクチン、トロポミオシン及びＡＴＰを含有する水溶液に被験薬を加えて反応させ、この反応液から沈殿物を分別し、この分別された沈殿物をポリアクリルアミド電気泳動法で分離し、分離帯域を発色剤で染色して、トロポニンＩの分離帯域の分離物の量を測定することを特徴とする心臓又は血管の拡張障害を改善する薬剤の選別方法にある。さらにまた、本発明は、トロポニンＩ、トロポニンＣ、アクチン、トロポミオシン及びＡＴＰを含有する水溶液に被験薬を加えて反応させ、この反応液に水溶性カルシウム塩及びＥＧＴＡ溶液を加えて反応させて、この反応液から沈殿物を分別し、この分別された沈殿物をポリアクリルアミド電気泳動法で分離し、分離帯域を銀発色剤で染色して、トロポニンＩの分離帯域の分離物の量を測定することを特徴とする心臓又は血管の拡張障害を改善する薬剤の選別方法にあり、さらに加えて、本発明は、夫々、超遠心分離法により凝集成分が分離された０．１乃至１．２μｇのトロポニンＩ及び０．２乃至１．６μｇのトロポニンＣを含み、さらに、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のアクチン溶液３．２μｌ、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌ濃度のトロポミオシン溶液２．４μｌ及び４乃至６ｍＭのＡＴＰを含む溶液の混合溶液に、被験薬を加えて反応させ、この反応液から沈殿物を分別し、この分別された沈殿物をポリアクリルアミド電気泳動法で分離し、分離帯域を発色剤で染色して、トロポニンＩの分離帯域の分離物の量を測定することを特徴とするアクチン−トロポミオシン複合体とトロポニンＩとの結合についての薬の活性の測定方法にあり、そして、本発明は、夫々、超遠心分離法により凝集成分が分離された０．１乃至１．２μｇのトロポニンＩ及び０．２乃至１．６μｇのトロポニンＣを含み、さらに、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のアクチン溶液３．２μｌ、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌ濃度のトロポミオシン溶液２．４μｌ及び４乃至６ｍＭのＡＴＰを含む溶液の混合溶液に、被験薬を加えて反応させ、この反応液に水溶性カルシウム塩及びＥＧＴＡ溶液を加えて反応させて、この反応液から沈殿物を分別し、この分別された沈殿物をポリアクリルアミド電気泳動法で分離し、分離帯域を銀発色剤で染��して、トロポニンＩの分離帯域の分離物の量を測定することを特徴とするアクチン−トロポミオシン複合体とトロポニンＩとの結合についての薬の活性の測定方法にあり、そしてまた、本発明は、夫々、超遠心分離法により凝集成分が分離された０．１乃至１．２μｇのトロポニンＩ及び０．２乃至１．６μｇのトロポニンＣを含み、さらに、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のアクチン溶液３．２μｌ、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌ濃度のトロポミオシン溶液２．４μｌ及び４乃至６ｍＭのＡＴＰを含む溶液の混合溶液に、被験薬を加えて反応させ、この反応液から沈殿物を分別し、この分別された沈殿物をポリアクリルアミド電気泳動法で分離し、分離帯域を発色剤で染色して、トロポニンＩの分離帯域の分離物の量を測定することを特徴とする心臓又は血管の拡張障害を改善する薬剤の選別方法にあり、さらに、本発明は、夫々、超遠心分離法により凝集成分が分離された０．１乃至１．２μｇのトロポニンＩ及び０．２乃至１．６μｇのトロポニンＣを含み、さらに、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のアクチン溶液３．２μｌ、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌ濃度のトロポミオシン溶液２．４μｌ及び４乃至６ｍＭのＡＴＰを含む溶液の混合溶液に、被験薬を加えて反応させ、この反応液に水溶性カルシウム塩及びＥＧＴＡ溶液を加えて反応させて、この反応液から沈殿物を分別し、この分別された沈殿物をポリアクリルアミド電気泳動法で分離し、分離帯域を銀発色剤で染色して、トロポニンＩの分離帯域の分離物の量を測定することを特徴とする心臓又は血管の拡張障害を改善する薬剤の選別方法にある。以上の他に、本発明は、トロポニンＩ、トロポニンＣ、アクチン、トロポミオシン及びＡＴＰを含有する溶液であることを特徴とするアクチン−トロポミオシン複合体とトロポニンＩとの結合についての薬の活性の測定用試薬にあり、また、本発明は、夫々、超遠心分離法により凝集成分が分離された０．１乃至１．２μｇのトロポニンＩ及び０．２乃至１．６μｇのトロポニンＣを含み、さらに、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のアクチン溶液３．２μｌ、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のトロポミオシン溶液２．４μｌ及び４乃至６ｍＭのＡＴＰを含む溶液の混合溶液であることを特徴とするアクチン−トロポミオシン複合体とトロポニンＩとの結合についての薬の活性の測定用試薬にあり、さらに本発明は、トロポニンＩ、トロポニンＣ、アクチン、トロポミオシン及びＡＴＰを含有する溶液の被験薬混合用の第一試薬と、水溶性カルシウム塩及びＥＧＴＡを含有する溶液の沈殿物完成用の第二試薬とを備えることを特徴とするアクチン−トロポミオシン複合体とトロポニンＩとの結合についての薬の活性の測定用試薬にあり、さらにまた、本発明は、夫々、超遠心分離法により凝集成分が分離された０．１乃至１．２μｇのトロポニンＩ及び０．２乃至１．６μｇのトロポニンＣを含み、さらに、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のアクチン溶液３．２μｌ、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のトロポミオシン溶液２．４μｌ及び４乃至６ｍＭのＡＴＰを含む溶液の混合溶液の被験薬混合用の第一試薬と、水溶性カルシウム塩及びＥＧＴＡ溶液を含有する溶液の沈殿物完成用の第二試薬とを備えることを特徴とするアクチン−トロポミオシン複合体とトロポニンＩとの結合についての薬の活性の測定用試薬にあり、さらに加えて、本発明は、トロポニンＩ、トロポニンＣ、アクチン、トロポミオシン及びＡＴＰを含有する溶液であることを特徴とする心臓又は血管の拡張障害を改善する薬剤の選別用試薬にあり、さらにこれらの他に、本発明は、夫々、超遠心分離法により凝集成分が分離された０．１乃至１．２μｇのトロポニンＩ及び０．２乃至１．６μｇのトロポニンＣを含み、さらに、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のアクチン溶液３．２μｌ、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のトロポミオシン溶液２．４μｌ及び４乃至６ｍＭのＡＴＰを含む溶液の混合溶液であることを特徴とする心臓又は血管の拡張障害を改善する薬剤の選別用試薬にあり、さらにまた、本発明は、トロポニンＩ、トロポニンＣ、アクチン、トロポミオシン及びＡＴＰを含有する溶液の被験薬混合用の第一試薬と、水溶性カルシウム塩及びＥＧＴＡを含有する溶液の沈殿物完成用の第二試薬とを備えることを特徴とする心臓又は血管の拡張障害を改善する薬剤の選別用試薬にあり、さらにこれらに加えて、本発明は、夫々、超遠心分離法により凝集成分が分離された０．１乃至１．２μｇのトロポニンＩ及び０．２乃至１．６μｇのトロポニンＣを含み、さらに、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のアクチン溶液３．２μｌ、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のトロポミオシン溶液２．４μｌ及び４乃至６ｍＭのＡＴＰを含む溶液の混合溶液の被験薬混合用の第一試薬と、水溶性カルシウム塩及びＥＧＴＡ溶液を含有する溶液の沈殿物完成用の第二試薬とを備えることを特徴とする心臓又は血管の拡張障害を改善する薬剤の選別用試薬にある。
本発明は、ごく微量のトロポニンＩ、トロポニンＣ、アクチン、トロポミオシン及びＡＴＰ（アデノシン５′三燐酸）を含有する水溶液に、被験薬を加えて反応させ、この反応溶液から沈殿物を分離し、この分離された沈殿物をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法で分離し、この分離帯域を発色剤で染色して、２９キロダルトンの分子量の蛋白質の分離帯域の分離物のトロポニンＩの量を測定するので、被験薬により形成された、トロポニンＩとアクチンートロポミオシン複合体を測定することとなる。この測定は、筋組織のアクチン−トロポミオシン複合体に対する筋収縮抑制蛋白質のトロポニンＩの結合機能が、被験薬により増強されることを示すものである。
このように、本発明によると、被験薬が、アクチン−トロポミオシン複合体に対するトロポニンＩの結合性を増強するか否かを判定することができる。
また、本発明によりアクチン−トロポミオシン複合体に対するトロポニンＩの結合性を増強すると判定された被験薬は、心筋、骨格筋及び平滑筋等の筋の弛緩促進作用を有しているので、例えば、心筋弛緩障害に基づく疾患の治療薬及び予防薬とすることができ、さらに、心筋弛緩障害を主とする心不全、例えば、急性又は慢性肺うっ血性心不全の治療薬及び予防薬とすることができる。さらにまた、本発明によると、本発明によりアクチン−トロポミオシン複合体に対するトロポニンＩの結合性を増強すると判定された被験薬は、筋収縮に殆ど影響が殆どない筋弛緩促進作用を有しており、平滑筋を速やかに弛緩させて、末梢血管の弛緩を容易にすることの可能性が大きく、高血圧の治療薬とすることの可能性が大きいものと予測される。
例えば、日本国特許第７０３４０８号に示されている４−［３−（４−ベンジルピペリジンー１−イル）プロピオニル］−７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾチアゼピン又はその薬学的に許容しうる塩（以下、本件化合物という）は、本発明の判別方法により、アクチン−トロポミオシン複合体に対するトロポニンＩの結合性を増強すると判定された。この１，４ベンゾチアゼピン誘導体又はその薬学的に許容しうる塩を有効成分として含有する薬剤は、筋収縮に影響を殆ど与えることなく、筋弛緩障害を伴う多くの疾患などの治療や予防に役立てることできるものである。
【発明を実施するための最良の形態】  筋組織において、ミオシンとアクチンは、夫々が筋収縮蛋白質であり、トロポニン及びトロポミオシンが存在しない場合は、ミオシンとアクチンは、常に活性化された状態にあって、筋組織は収縮した状態となる。この状態の筋組織にトロポミオシンを加えてもこの筋組織の収縮した状態は変わらないが、Ｃａ受容蛋白質のトロポニンを加えると、筋組織の収縮は、筋組織内のＣａ＋＋イオン濃度で制御されることになる。トロポニンＣはＣａ＋＋イオン結合成分であり、トロポニンＴは、筋組織の収縮抑制成分のトロポミオシンに結合する成分であり、トロポニン複合体をアクチンとトロポミオシンに繋げる。トロポニンＣがＣａ＋＋イオンと結合すると、トロポニンＩの筋収縮抑制作用が外れて、アクチンとミオシンによる筋組織の収縮が起こる。
本発明において、被験薬が、拡張不全による心不全の治療に有効な薬物である場合には、該被験薬により、トロポニンＩのアクチン−トロポミオシン複合体に対する結合機能が増強されて、アクチン−トロポミオシン複合体と沈殿物を形成する。本発明により、トロポニンＩの存在下にアクチン−トロポミオシン複合体の沈殿物を形成する薬物は、拡張不全による心不全等の拡張不全の治療に有効な薬物と推定することができる。
本発明においては、夫々、超遠心分離法により凝集成分が分離された０．１乃至１．２μｇのトロポニンＩ及び０．２乃至１．６μｇのトロポニンＣを含み、さらに、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のアクチン溶液３．２μｌ、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のトロポミオシン溶液２．４μｌ及び４乃至６ｍＭのＡＴＰを含む溶液の混合溶液が使用される。この混合溶液は、例えば、反応前に、全量で５００マイクロリットルに調製され、したがって、これらの薬物は、この調製される濃度範囲内の濃度において使用することができる。
【実施例】  以下に、本発明の実施例を示して本発明を説明するが、本発明は、これら実施例により何ら限定されるものではない。
例１
トロポニンＩとアクチン−トロポミオシン複合体の結合性の測定
蒸留水２３μｌにトロポニンＩ〔カルバイオケム（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）社製〕０．４μｇ、トロポニンＣ（アブカム〔ａｂｃａｍ）社〕０．５４μｇを含む溶液を４本の試験管に作成し、１００，０００×ｇ１時間遠心分離（ＨＩＴＡＣＨＩ  ｈｉｍａｃ１２０ＦＣ）後、その上清２０μｌを採取し、４℃で保存した。次に別の試験管４本に蒸留水９９．４μｌの中に反応液として６００ｍＭ濃度のＫＣｌ水溶液５０μｌ、２００ｍＭ濃度のモプス〔ＭＯＰＳ（３−モルホリノプロパンスルホン酸（３−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）同仁堂（ＤＯＪＩＮＤＯ）社製〕水溶液５０μｌ、２０ｍＭ濃度のＭｇＣｌ２水溶液５０μｌ、１０μｇ／ｍｌ濃度のペプスタチンＡ〔ｐｅｐｓｔａｔｉｎ（（シグマ（ＳＩＧＭＡ）社製〕溶液５μｌ、１５０ｍＭ濃度の２−メルカプトメタノール（ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）（シグマ（ＳＩＧＭＡ）社製）５０μｌを加えた。さらに、その後１ｍｇ／ｍｌ濃度のアクチン〔シグマ（ＳＩＧＭＡ）社〕３．２μｌ、１ｍｇ／ｍｌ濃度のトロポミオシン〔シグマ（ＳＩＧＭＡ）社〕２．４μｌを加え混和後、２５℃で２０００×ｇの遠心力で５分間遠心分離機（ＨＩＴＡＣＨＩ  ｈｉｍａｃ  ＣＦ７Ｄ２）により遠心分離した。その上清を各々新しいチューブ４本に移し、さらに５０ｍＭ濃度のＡＴＰ（アデノシン５′−三リン酸）溶液を５０μｌ加え、攪拌しながら２５℃で３０分インキュベートした。次いで、先に準備したトロポニンＩとトロポニンＣの１００，０００×ｇの遠心分離の上清２０μｌを各試験管に加え、さらに２５℃で攪拌しながら、３０分インキュベートした。次に、蒸留水のみあるいは最終濃度が１０−７、１０−６、１０−５Ｍになるように調整した被験液の本件化合物を５０μｌ加えて、攪拌しながら２５℃で３０分インキュベートした。
その後、Ｃａ２＋溶液とＥＧＴＡ溶液を混合して最終濃度が１０−６Ｍになるように調整した溶液５０μｌ加え、最終全液量が５００μｌ／１ｔｕｂｅとなるようにした。この溶液を２５℃で断続攪拌しながら６０分インキュベートした後、２５℃１００，０００×ｇで１２０分間遠心分離機（ＨＩＴＡＣＨＩ  ｈｉｍａｃ  １２０ＦＣ：商品名）により遠心分離した。
遠心分離後、上清を除去し、沈殿物を浮遊させないように上記の反応液（Ｃａ２＋と薬物をのぞく）１ｍｌを静かに加え再度吸引除去し、この操作をさらに２回繰り返して沈殿を合計３回洗浄した。
洗浄した溶液を完全に除去し、沈殿物にポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用のサンプルバッファーを２０μｌ加え、よく混和し沈殿物を懸濁させ、９５℃の温度で５分加熱処理後、ＰＡＧミニ「第一」１０／２０ゲル（第一化学薬品）に注入し、４０ｍＡで約１時間泳動した。泳動後、２Ｄ−銀染色試薬・ＩＩ「第一」（第一化学薬品）で銀染色し、蒸留水で洗浄後乾燥させた。その後スキャナー〔ＥＰＳＯＮ  ＥＳ−８５００（商品名）〕で取り込み、解析ソフトＩｍａｇｅＪ（商品名）により分析した。その結果次の表１に示す。
【表１】
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本例において、試験管のカルシウム濃度を１０−６Ｍとし、本件化合物を含まない時のトロポニンＩ量１．０とした場合、本件化合物を１０−７，１０−６，１０−５Ｍ濃度の共沈殿量は各々１．４、３．４、５．４であり、本件化合物の濃度に依存してトロポニンＩの沈殿量が増えることが明らかとなった。本例において、アクチンは、ブタの骨格筋由来であり、分子量４３キロダルトンであり、シグマ（ＳＩＧＭＡ）社であった。また、トロポミオシンは、ニワトリの砂嚢由来であり、分子量３６キロダルトンであり、シグマ（ＳＩＧＭＡ）社であった。トロポニンＩは、ヒトの心筋由来で分子量２４キロダルトンであり、カルバイオケム（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）社製であった。また、トロポニンＣは、ヒト心筋リコンビナント由来であり、分子量１８キロダルトンであり、アブカム（ａｓｃａｍ）社であった。これらは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離され、各バンドは明確に識別できた。
例２
蒸留水２３μｌにトロポニンＩ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社）０．４μｇ、トロポニンＣ〔アブカム（ａｂｃａｍ）社〕０．５４マイクロｇを含む溶液を４本の試験管に作成し、１００，０００×ｇ  １時間遠心分離機（ＨＩＴＡＣＨＩ  ｈｉｍａｃ  １２０ＦＣ）により遠心分離した後、その上清２０μｌを採取し、４℃で保存した。次に別の試験管４本に蒸留水９９．４μｌの中に反応液として６００ｍＭ  ＫＣｌ  ５０μｌ、２００ｍＭ  ＭＯＰＳ（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）〔同仁堂（ＤＯＪＩＮＤＯ社〕５０μｌ、２０ｍＭ濃度のＭｇＣｌ２  ５０μｌ、１０μｇ／ｍｌ濃度のｐｅｐｓｔａｔｉｎＡ（ＳＩＧＭＡ社製）溶液５μｌ、１５０ｍＭ濃度の２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（ＳＩＧＭＡ社製）５０μｌを加えた。さらに、その後１ｍｇ／ｍｌ濃度のアクチン（ＳＩＧＭＡ社製）３．２μｌ、１ｍｇ／ｍｌ濃度のトロポミオシン〈ＳＩＧＭＡ〉２．４μｌを加え混和後、２５℃２０００×ｇで５分間遠心分離機（ＨＩＴＡＣＨＩ  ｈｉｍａｃ  ＣＦ７Ｄ２）により遠心分離した。その上清を各々新しいチューブ４本に移し、さらに５０ｍＭ濃度のＡＴＰを５０μｌ加え、攪拌しながら２５℃で３０分インキュベートした。
次いで、先に準備したトロポニンＩとトロポニンＣの１００，０００×ｇ上清２０μｌを各試験管に加え、さらに２５℃で攪拌しながら、３０分インキュベートした。次に、最終濃度が１０−５Ｍになるように調整した本件化合物を被験液として各々の試験管に５０μｌ加えて、攪拌しながら２５℃で３０分インキュベートした。
その後、Ｃａ２＋溶液とＥＧＴＡ溶液を混合して最終カルシウム濃度が１０−８、１０−７．１０−６、１０−５Ｍになるように調整した溶液５０μｌ加え、最終全液量が５００μｌ／１ｔｕｂｅとなるようにした。この溶液を２５℃で断続攪拌しながら６０分インキュベートした後、２５℃１００，０００×ｇで１２０分間遠心分離機（ＨＩＴＡＣＨＩ  ｈｉｍａｃ  １２０ＦＣ）により遠心分離した。
遠心分離後、上清を除去し、沈殿物を浮遊させないように上記の反応液（Ｃａ２＋と薬物を除く）１ｍｌを静かに加え再度吸引除去し、この操作をさらに２回繰り返して沈殿を合計３回洗浄した。洗浄した溶液を完全に除去し、沈殿物にポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用のサンプルバッファーを２０μｌ加え、よく混和し沈殿物を懸濁させ、９５℃で５分加熱処理後、ＰＡＧミニ「第一」１０／２０ゲル（第一化学薬品）にアプライし、４０ｍＡで約１時間泳動した。泳動後、２Ｄ−銀染色試薬・ＩＩ「第一」（第一化学薬品）で銀染色し、蒸留水で洗浄後乾燥させた。その後スキャナー（ＥＰＳＯＮ  ＥＳ−８５００）で取り込み、解析ソフトＩｍａｇｅＪにより分析した。その結果を表２に示す。
【表２】
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本例において、試験管の本件化合物濃度を１０−５Ｍとし、カルシウム濃度を１０−８Ｍで沈殿するトロポニンＩ量を１．０とした場合、カルシウム濃度を１０−７、１０−６、１０−５と高くすると、おのおの０．９４、０．８１、０．７８と沈殿量が減少することが明らかとなった。このことは、カルシウム濃度が低いほうが本件化合物によるトロポニンＩ沈殿量が多くなることを示す。すなわち、本例においては、本件化合物によるトロポニンＩの沈殿はカルシウム濃度に影響されることを示す。
【産業上の利用可能性】  本発明によりアクチン−トロポミオシン複合体に対するトロポニンＩの結合性を増強すると判定された被験薬は、心筋、骨格筋及び平滑筋等の筋の弛緩促進作用を有しているので、例えば、心筋弛緩障害に基づく疾患の治療薬及び予防薬を簡単な作業で容易に判別できるので、筋拡張不全に起因する例えば、心筋弛緩障害を主とする心不全、急性又は慢性肺うっ血性心不全の治療薬及び予防薬の開発に役立てることができ、医薬品の開発に寄与するところが大きい。
【手続補正書】
【提出日】平成18年2月28日(2006.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】請求の範囲
【請求項１】（削除）
【請求項２】（削除）
【請求項３】トロポニンＩ、トロポニンＣ、アクチン、トロポミオシン及びＡＴＰを含有する水溶液に被験薬を加えて反応させ、この反応液から沈殿物を分別し、この分別された沈殿物をポリアクリルアミド電気泳動法で分離し、分離帯域を発色剤で染色して、トロポニンＩの分離帯域における分離物中のトロポニンＩの量を測定して求められた被験薬を加えた反応液からの沈殿物のトロポニンＩの含有量が、前記トロポニンＩ、トロポニンＣ、アクチン、トロポミオシン及びＡＴＰを含有する水溶液に被験薬を加えないで反応させて対照となる反応液とし、この対照となる反応液から沈殿物を分別し、この分別された沈殿物をポリアクリルアミド電気泳動法で分離し、分離帯域を発色剤で染色して、トロポニンＩの分離帯域における分離物中のトロポニンＩの量を測定して求められた対照となる反応液からの沈殿物のトロポニンＩの含有量に対して、１．４倍以上であることにより、心臓又は血管の拡張障害を改善する薬剤として有効であるとすることを特徴とする心臓又は血管の拡張障害を改善する薬剤の選別方法。
【請求項４】トロポニンＩ、トロポニンＣ、アクチン、トロポミオシン及びＡＴＰを含有する水溶液に被験薬を加えて反応させ、この反応液に水溶性カルシウム塩及びＥＧＴＡ溶液を加えて反応させて、この反応液から沈殿物を分別し、この分別された沈殿物をポリアクリルアミド電気泳動法で分離し、分離帯域を銀発色剤で染色して、トロポニ
ンＩの分離帯域における分離物中のトロポニンＩの量を測定して求められた被験薬を加えた反応液からの沈殿物のトロポニンＩの含有量が、前記トロポニンＩ、トロポニンＣ、アクチン、トロポミオシン及びＡＴＰを含有する水溶液に被験薬を加えないで反応させて、対照となる反応液とし、この対照となる反応液に水溶性カルシウム塩及びＥＧＴＡ溶液を加えて反応させて、この対照となる反応液から沈殿物を分別し、この分別された沈殿物をポリアクリルアミド電気泳動法で分離し、分離帯域を銀発色剤で染色して、トロポニンＩの分離帯域における分離物中のトロポニンＩの量を測定して求められた対照となる反応液からの沈殿物のトロポニンＩの含有量に対して、１．４倍以上であることにより、心臓又は血管の拡張障害を改善する薬剤として有効であるとすることを特徴とする心臓又は血管の拡張障害を改善する薬剤の選別方法。
【請求項５】（削除）
【請求項６】（削除）
【請求項７】夫々、超遠心分離法により凝集成分が分離された０．１乃至１．２μｇのトロポニンＩ及び０．２乃至１．６μｇのトロポニンＣを含み、さらに、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のアクチン溶液３．２μｌ、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌ濃度のトロポミ
オシン溶液２．４μｌ及び４乃至６ｍＭのＡＴＰを含む溶液の混合溶液に、被験薬を加えて反応させ、この反応液から沈殿物を分別し、この分別された沈殿物をポリアクリルアミド電気泳動法で分離し、分離帯域を発色剤で染色して、トロポニンＩの分離帯域における分離物中のトロポニンＩの量を測定して求められた被験薬を加えた反応液からの沈殿物のトロポニンＩの含有量が、前記超遠心分離法により凝集成分が分離された０．１乃至１．２μｇのトロポニンＩ及び０．２乃至１．６μｇのトロポニンＣを含み、さらに、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のアクチン溶液３．２μｌ、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌ濃度のトロポミオシン溶液２．４μｌ及び４乃至６ｍＭのＡＴＰを含む溶液の混合溶液に被験薬を加えないで反応させた対照となる反応液から沈殿物を分別し、この分別された沈殿物をポリアクリルアミド電気泳動法で分離し、分離帯域を発色剤で染色して、トロポニンＩの分離帯域における分離物中のトロポニンＩの量を測定して求められた対照となる反応液からの沈殿物のトロポニンＩの含有量に対して、１．４倍以上であることにより、心臓又は血管の拡張障害を改善する薬剤として有効であるとすることを特徴とする心臓又は血管の拡張障害を改善する薬剤の選別方法。
【請求項８】夫々、超遠心分離法により凝集成分が分離された０．１乃至１．２μｇのトロポニンＩ及び０．２乃至１．６μｇのトロポニンＣを含み、さらに、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のアクチン溶液３．２μｌ、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌ濃度のトロポミオシン溶液２．４μｌ及び４乃至６ｍＭのＡＴＰを含む溶液の混合溶液に、被験薬を加えて反応させ、この反応液に水溶性カルシウム塩及びＥＧＴＡ溶液を加えて反応させて、この反応液から沈殿物を分別し、この分別された沈殿物をポリアクリルアミド電気泳動法で分離し、分離帯域を銀発色剤で染色して、トロポニンＩの分離帯域における分離物中のトロポニンＩの量を測定して求められた被験薬を加えた反応液からの沈殿物のトロポニンＩの含有量が、前記超遠心分離法により凝集成分が分離された０．１乃至１．２μｇのトロポニンＩ及び０．２乃至１．６μｇのトロポニンＣを含み、さらに、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のアクチン溶液３．２７μｌ、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌ濃度のトロポミオシン溶液２．４μｌ及び４乃至６ｍＭのＡＴＰを含む溶液の混合溶液に、被験薬を加えないで反応させて、対照となる反応液とし、この対照となる反応液に水溶性カルシウム塩及びＥＧＴＡ溶液を加えて反応させて、この対照となる反応液から沈殿物を分別し、この分別された沈殿物をポリアクリルアミド電気泳動法で分離し、分離帯域を銀発色剤で染色して、トロポニンＩの分離帯域における分離物中のトロポニンＩの量を測定して求められた対照となる反応液からの沈殿物のトロポニンＩの含有量に対して、１．４倍以上であることにより、心臓又は血管の拡張障害を改善する薬剤として有効であるとすることを特徴とする心臓又は血管の拡張障害を改善する薬剤の選別方法。
【請求項９】（削除）
【請求項１０】（削除）
【請求項１１】（削除）
【請求項１２】（削除）
【請求項１３】（削除）
【請求項１４】（削除）
【請求項１５】トロポニンＩ、トロポニンＣ、アクチン、トロポミオシン及びＡＴＰを含有する溶液の被験薬混合用の第一試薬と、水溶性カルシウム塩及びＥＧＴＡを含有する溶液の沈殿物完成用の第二試薬とを備えることを特徴とする心臓又は血管の拡張障害を改善する薬剤の選別用試薬。
【請求項１６】夫々、超遠心分離法により凝集成分が分離された０．１乃至１．２μｇのトロポニンＩ及び０．２乃至１．６μｇのトロポニンＣを含み、さらに、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のアクチン溶液３．２μｌ、０．５乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のトロポミオシン溶液２．４μｌ及び４乃至６ｍＭのＡＴＰを含む溶液の混合溶液の被験薬混合用の第一試薬と、カルシウム濃度が１０  ６モル以下の濃度の水溶性カルシウム塩及びＥＧＴＡ溶液を含有する溶液の沈殿物完成用の第二試薬とを備えることを特徴とする心臓又は血管の拡張障害を改善する薬剤の選別用試薬。
２２
【国際調査報告】
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