(57)【要約】  簡便な操作によって、骨組織形成能を有する細胞を効率的且つ安定的に調製する方法を提供する。また、簡便な操作によって、安全性が高く、治療効果に優れた骨組織形成用組成物を調製する方法を提供する。(1)生体から分離された骨髄を所定希釈率で希釈して培養容器に播種した後、培養し、(2)浮遊成分を除去した後、残存した接着性細胞を培養し、(3)増殖した細胞を骨系細胞へと分化誘導し、(4)細胞を回収する、ことによって骨組織形成用細胞を得る。このようにして得られた細胞と、トロンビン溶液と、多血小板血漿と、及び空気とをカルシウムイオン存在下において所定の混合比（体積基準）で混合してゲル化させることによってゲル状の組成物を得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ(1)〜(4)を含む、骨組織形成用細胞の調製方法、
(1)生体から分離された骨髄を2倍希釈〜2000倍希釈となるように培養容器に播種し、培養するステップ、
(2)浮遊成分を除去した後、残存した接着性細胞を培養するステップ、
(3)増殖した細胞を骨系細胞へと分化誘導するステップ、
(4)細胞を回収するステップ。
【請求項２】
以下の(i)〜(iii)のステップを含む、骨組織形成用組成物の調製方法、
(i)トロンビンを100U／ml〜10000U／ml含有するトロンビン溶液を用意するステップ、
(ii)生体から分離された血液から多血小板血漿（PRP）を調製するステップ、
(iii)ステップ(i)で用意したトロンビン溶液と、ステップ(ii)で調製した多血小板血漿と、請求項１に記載の方法で調製した骨組織形成用細胞と、及び空気とを、カルシウムイオン存在下において以下の混合比（体積基準）で混合し、ゲル化させるステップ、
トロンビン溶液：多血小板血漿と骨組織形成用細胞の総量：空気＝１：３〜７：０．１〜５．０。
【請求項３】
トロンビン溶液が、トロンビンを100U／ml〜10000U／mlで含有する5%〜25%塩化カルシウム溶液であることを特徴とする、請求項２に記載の調製方法。
【請求項４】
前記多血小板血漿の血小板濃縮率が約150%〜約1500%の範囲にあることを特徴とする、請求項２又は３に記載の調製方法。
【請求項５】
前記骨組織形成用組成物が、骨組織形成用細胞を約1.0×105〜約1.0×108個／ml含有することを特徴とする、請求項２〜４のいずれかに記載の調製方法。
【請求項６】
請求項２〜５のいずれかの調製方法で得られる骨組織形成用組成物。
【請求項７】
請求項２〜５のいずれかの調製方法で得られる骨組織形成用組成物を骨組織欠損部に注入、埋入、填入、又は塗布することを特徴とする、骨組織の再建方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨組織の修復又は再生（再建）に利用できる細胞の調製方法、当該細胞を用いた骨組織形成用組成物の調製方法、及び当該骨組織形成用組成物を用いた術式に関する。
【背景技術】
【０００２】
頭蓋顎顔面外科、形成外科、及び整形外科領域において、骨欠損の再建・修復を目的として数多くの研究が行われてきた。しかし、軟組織及び硬組織の両者に関して、生体適合性材料の使用及び調製には臨床上解決すべき問題が残っている。これまで、骨片、脂肪、筋膜を含む切除自己組織が頻用されてきた。しかしながら、これまでの治療法は個別の問題を抱えるものであった。例えば適切な自己材料はその供給量が限られ、ドナーサイトの罹患性があり、時折、組織質が低いため又は移植片として成形することが困難なために目的の再建術に十分ではない。他家材料であってもドナー不足からその供給量が限られる。一方、人工修復物の使用は感染に対する感受性を増大させ、周囲への侵襲、及び宿主生理機能との長期的な相互作用が不明であるという問題も伴う。
器官臓器移植におけるこれらの問題を解決する手段として、Vacantiら（非特許文献１〜３）は、単離された細胞に生体適合性スキャフォールドと成長因子を組み合わせて形成される構築物を使用して新生組織の形態形成を伴う“組織工学”と呼ばれる新たな技術を提唱した。この技術では通常、細胞−スキャフォールド構築物の観血的移植を要する。この技術を骨芽細胞に適用し、細胞−スキャフォールド構築物を低侵襲性で移植することができるシステムが開発されれば、組織工学の適用範囲は、例えば頭蓋顎顔面再建、形成外科、及び整形外科領域など、多くの領域へと広がる。【０００３】
間葉系幹細胞（MSCs）は未分化の細胞として複製することができ、且つ骨、軟骨、脂肪、腱、筋、骨髄間質を含む間葉系組織系列への分化能を有する多能性細胞と考えられており（非特許文献４、５）、組織工学分野における潜在的有用性の高さから広く注目を集めている。
これまでに、MSCsの単独の使用によって骨組織が修復され得ることが示されている（非特許文献５、６）。しかし、欠損部をMSCsのみで充たそうとすれば、非常に多くのMSCsを必要とし、また、骨欠損部にMSCsを維持することは難しい。このような理由から、最近では多くの研究者がスキャフォールドとしてのセラミックスなどの人工材料の使用を試みている（非特許文献７）。
先行する研究において我々は、MSCsと組み合わせた新規な生体吸収性β三リン酸（β-TCP）のスキャフォールドとしての骨形成能を検討し、ヒドロキシアパタイト（HA）と比較した（非特許文献８）。この研究の結果、このスキャフォールドは骨形成能を有するものの脆弱であり、また、貫通孔の不足、セラミックスの低吸収性、及び骨誘導特性の不在のために新生骨が骨欠損部へ進入することが妨げられてしまうことが判明した。次に我々は、骨粗鬆症、歯周炎、腫瘍切除による骨欠損を治療又は再建するために自己骨を送達することに使用可能な、低侵襲性で且つゼリー状の柔軟性材料を用いた手法を試みた。まず、注入可能なスキャフォールドとしてフィブリン糊を使用した。注入可能なMSCs／β-TCP−フィブリン糊混合物によって、骨芽細胞の良好な移植及び生着に必要な三次元的スキャフォールドを形成することが可能であった（非特許文献９）。骨誘導材料、移植片の凝集剤、及び移植材料としてフィブリンを使用した例が報告されている（非特許文献１０、１１）。また、自己フィブリン粘着剤内に見出される成長因子の重要性が指摘されている（非特許文献１２〜１４）。そこで我々は、成長因子と修正自己フィブリン糊の混合物からなる、多血小板血漿（PRP）ゲルを使用することを考えた。PRPゲルは、自己全血を複数の異なる条件で遠心処理して得られる、多血小板血漿とトロンビン及び塩化カルシウムを混合することによって得られる。PRPゲルがフィブリン糊と決定的に相違する点は、血小板が高濃度で存在すること、及び本来のフィブリノーゲン濃度があることである。血小板は、トロンビンの存在下でひとたび活性化されれば、無数の因子を放出し、フィブリン塊を形成することによってスキャフォールドを形成し機能するのである。PRPを使用することには、骨再生の増強及び促進、より迅速で且つ予測可能な軟組織治癒等、いくつかの利点がある。モノクローナル技術の使用によって、トランスフォーミング成長因子β１（TGF-β１）、トランスフォーミング成長因子β２（TGF-β２）及び血小板由来成長因子（PDGF）の受容体が髄様骨内に見つかっている（非特許文献１２〜１４）。モノクローナル抗体を使用した研究によって、高濃度のPDGF及びTGF-βが血漿中に存在することが示され、これによってこれらの因子が、自己フィブリンを得ることに使用した元の血漿中に存在することが証明された。
尚、本出願に関連する技術が国際公開第０２／１７９８３号パンフレット及び国際公開第０２／４００７１号パンフレットに開示される（特許文献１、２）。【０００４】
【特許文献１】国際公開第０２／１７９８３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０２／４００７１号パンフレット
【非特許文献１】Langer, R., and Vacanti, J.P. Tissue engineering. Science 260, 920, 1993.
【非特許文献２】Vacanti, J.P., Morse, M.A., Saltzman, W.M., Domb, A.J., Perez-Atayde, A., and Langer, R. Selective cell transplantation using bioabsorbable artificial polymers as matrices. J Pediatr Surg 23, 3, 1988.
【非特許文献３】Vacanti, J.P. Beyond transplantation. Arch. Surg 123, 545, 1998.
【非特許文献４】Pittenger, M.F., Mackay, A.M., Beck, C.B., Jaiswal, R.K., Douglas, R., Mosca, J.D., Moorman, M.A., Simonetti, D.W., Craig, S., and Marshak, D.R. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284, 143, 1999.
【非特許文献５】Owen, M., and Friedenstein, A.J. Stromal stem cells: Marrow derived osteogenic precursors. Ciba Found Symp 136, 42, 1998.
【非特許文献６】Kadiyala, S., Young, R.G., Thiede, M.A., and Bruder, S.P. Culture expanded canine mesenchymal stem cells possess osteochondrogenic potential in vivo and in vitro. Cell Transplant 6, 125, 1997.
【非特許文献７】Bruder, S.P., Kurth, A.A., Shea, M., Hayes, W.C., Jaiswal, N., and Kadiyala, S. Bone regeneration by implantation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells. J Orthop Res 16, 155, 1998.
【非特許文献８】Boo, J.S., Yamada, Y., Hibino, Y., Okazaki, Y., Okada, K., Hata, K., Yoshikawa, T., Sugiura, Y., and Ueda, M. Tissue-engineered bone using mesenchymal stem cells and a biodegradable scaffold. J Craniofac Sug 13, 231, 2002.
【非特許文献９】Yamada, Y., Boo, J.S., Ozawa, R., Nagasaka, T., Okazaki, Y., Hata, K., and Ueda, M. Bone regeneration following injection of mesenchymal stem cells and fibrin glue with a biodegradable scaffold. J Cranio-Maxill Sug 31, 27, 2003.
【非特許文献１０】Rosenberg, M., and Mortenson, W. Considerations in the corticosteroid treatment of bone cysts. J Pediatr Orthop 9, 240, 1989.
【非特許文献１１】Schlag, G., and Redl, H. The influence of fibrin sealant on demineralized bone matrix-dependent osteoinduction: A quantitative and qualitative study in rats. Clin Orthop 238, 282, 1989.
【非特許文献１２】Bowen-Pope, D.F., Vogel, A., and Ross, R. Production of platelet-derived growth factor-like molecules and reduced expression of platelet-derived growth factor receptors accompany transformation by a wide spectrum of agents. Pnas 81, 2396, 1984.
【非特許文献１３】Roberts, A.B., and Spron, M.B. Physiological actions and clinical applications of transforming growth factor-beta (TGF-beta). Growth factors 8, 1, 1993.
【非特許文献１４】Antonaides, H.N., and Williams, L.H. Human platelet-derived growth factors: Structure and functions. Federation Proc 42, 2630, 1983.
【非特許文献１５】Yamada, Y. et al., Autogeneous Injectable Bone for Regeneration with Mesenchimal Stem Cells and Platelete-Rich Plasma:Tissu-Engineeered Bone Regeneration, TISSUE ENGINEERING, Volum 10, Number 5/6, 2004, pp955-964
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
以上のように様々な手法による骨組織の再生が試みられているが、臨床応用ないし実用化のためには、(1)治療効果の高い骨組織形成用組成物を簡便な操作で提供すること、(2)安定した治療効果を得ることができる骨組織形成用組成物を提供すること、(3)安全性の一層高い骨組織形成用組成物を提供すること、などが今後の課題と考えられる。
骨組織形成用組成物には一般に骨組織形成能を有する細胞が使用される。骨組織形成能を有する細胞は間葉系幹細胞を分化誘導することによって得られる。そこで、骨組織形成能を有する細胞を効率的且つ安定して調製するためには、骨髄などの生体試料から間葉系幹細胞を効率的かつ再現性よく回収する必要がある。これまでに間葉系幹細胞の回収方法として、FACSを利用して回収する方法（例えば非特許文献４をを参照）をはじめとしていくつかの方法が提案されている。中でもFACSを利用して間葉系幹細胞を回収する方法は、夾雑細胞の少ない状態で間葉系幹細胞を回収することができることから多くの研究者が採用している。しかしながら、回収された細胞の増殖率が低いこと、操作が煩雑などの問題点が指摘されている。FACSを利用した方法以外の方法についても複雑な操作を伴うことや、効率的な回収が困難であることなど改善すべき点が多い。
本発明は以上の背景に鑑み、簡便な操作によって、骨組織形成能を有する細胞を効率的且つ安定的に調製する方法を提供することを目的の一つとする。本発明はまた、簡便な操作によって、安全性が高く、治療効果に優れた骨組織形成用組成物を調製する方法を提供することを目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らはまず、骨組織形成能を有する細胞を効率的且つ安定的に調製する方法の確立を目指して検討を重ねた。その結果、骨髄を希釈して培養することによって、後に骨組織形成用細胞として利用される間葉系幹細胞を効率的に且つ再現性よく増殖させることができることが明かとなった。また、常識からすれば初代培養する際の骨髄の希釈率は低い方がよいと考えられるが、驚くべきことに希釈率を高めても効率的な細胞増殖が認められた。このように本発明者らは、骨組織形成能を有する細胞を非常に簡便な操作によって効率的且つ安定的に供給する手法を見出すに至った。
以上の成果を得た後、本発明者らは上記課題を解決すべく、新たな骨組織形成用組成物の調製方法の確立を目指し更に研究を重ねた。まず、安全性や骨組織再生効果などを考慮し、細胞に組み合わせる成分として多血小板血漿、並びに多血小板血漿のゲル化に必要なトロンビン及びカルシウムイオンを採用した。続いて、ゲル化の状態と治療効果とが密接に関連していると考え、各成分の混合比とゲル化の状態、及びゲル化の状態と治療効果との関係を詳細に検討した。その結果、各成分を所定の混合比で混合するとともに、空気を所定割合で混合することによって、治療効果が高く操作性もよいゲル化状態の組成物を得られることが明らかになった。
本発明は以上の成果に基づき完成されたものであって、以下の構成を提供する。即ち本発明は、以下のステップ(1)〜(4)を含む、骨組織形成用細胞の調製方法である。
(1)生体から分離された骨髄を2倍希釈〜2000倍希釈となるように培養容器に播種し、培養するステップ、
(2)浮遊成分を除去した後、残存した接着性細胞を培養するステップ、
(3)増殖した細胞を骨系細胞へと分化誘導するステップ、
(4)細胞を回収するステップ。
本発明は更に骨組織形成用組成物の調製方法を提供する。本発明の調製方法は以下の(i)〜(iii)のステップを含むことを特徴とする。
(i)トロンビンを100U／ml〜1000U／ml含有するトロンビン溶液を用意するステップ、
(ii)生体から分離された血液から多血小板血漿（PRP）を調製するステップ、
(iii)ステップ(i)で用意したトロンビン溶液と、ステップ(ii)で調製した多血小板血漿と、本発明の方法で調製した骨組織形成用細胞と、及び空気とを、カルシウムイオン存在下において以下の混合比（体積基準）で混合し、ゲル化させるステップ、
トロンビン溶液：多血小板血漿と骨組織形成用細胞の総量：空気＝１：３〜７：０．１〜５．０。
本発明の一態様では、トロンビン溶液が、トロンビンを100U／ml〜10000U／mlで含有する5%〜25%塩化カルシウム溶液である。
本発明の好ましい一態様では、血小板濃縮率が約150%〜約1500%の範囲にある多血小板血漿が用いられる。
本発明の一態様では、骨組織形成用組成物が骨組織形成用細胞を約1.0×105〜約1.0×108個／ml含有する。
本発明は他の局面として、本発明の調製方法で得られる骨組織形成用組成物を骨組織欠損部に注入、埋入、填入、又は塗布することを特徴とする、骨組織の再建方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】骨組織形成用細胞の調製方法のフローチャートである。
【図２】各成分（トロンビン溶液、骨組織形成用細胞と多血小板血漿、空気）を様々な混合比で混合して得られる組成物の状態を比較した図である。図中の数値は混合比（トロンビン溶液：細胞懸濁液（骨組織形成用細胞と多血小板血漿の総量）：空気）を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の第１の局面は骨組織形成用細胞の調製方法に関する。本明細書において「骨組織形成用細胞」とは、骨組織の再建（再生）に利用される細胞をいい、骨組織形成能を有することによって特徴付けられる。本発明では、骨髄中に存在する間葉系幹細胞（未分化間葉系幹細胞）から骨組織形成用細胞を得る。尚、骨系細胞への分化能を獲得した間葉系幹細胞（即ち、骨組織形成用細胞）のことを「骨系分化能獲得細胞」とも呼称する。
また、本明細書における用語「骨組織」は広義の意味で使用され、様々な部位の骨組織（例えば歯周組織）を包含する。【０００９】
本発明の調製方法は、(1)骨髄を希釈して播種するステップ、(2)接着性細胞を選択培養するステップ、(3)骨系細胞へと分化誘導するステップ、及び(4)細胞を回収するステップを含む。以下、ステップ毎に説明する。【００１０】
(1)骨髄を希釈して播種するステップ
このステップでは、生体から分離された骨髄を2倍希釈〜2000倍希釈となるように培養容器に播種し、その後培養する。後述の実施例に示すように、骨髄を2倍〜500倍希釈した後に初期培養すれば良好な細胞増殖が認められた。また、常識からすれば骨髄の希釈率は低い方が好ましいと考えられるが、驚くべきことに希釈率が高くても良好な細胞増殖を示し、500倍希釈の条件でも非常に高い細胞増殖率であった。この結果から、初期培養時の希釈倍率として上記範囲が有効であることが明らかになるとともに、同様に有効な条件として更に高い希釈率も採用し得ることが予想された。尚、初期培養前の骨髄の希釈率が高ければ、所望の数の細胞を得るために必要な継代数が少なくなり、また培養時間も少なくなる等、培養効率の点で有利である。
骨髄（間葉系幹細胞）はドナーの腸骨、顎骨、臍帯血、脂肪、末梢血等から例えばシリンジを用いて採取することができる。但し、採取が比較的容易なこと、ドナーへの負担が少ないこと等の理由から、腸骨を骨髄の採取源とすることが特に好ましい。
毒性ないし免疫拒絶の観点から、レシピエント自身（即ち、本発明の方法によって得られる骨組織形成用細胞を適用する対象）から採取（分離）した骨髄を用いることが好ましいが、同種由来の骨髄を利用することも可能である。
凝固を防止するために通常、採取した骨髄を抗凝固剤（ヘパリン、クエン酸ナトリウム等）に接触させる。例えば、ヘパリンコートしたシリンジを用いて骨髄を採取することによってこのような接触を達成できる。また、採取した骨髄に対して抗凝固剤を添加することにしてもよい。
希釈には通常、培養液を使用する。培養液として例えばMSCBM（Mesenchymal Stem Cell Basal Medium）又はこれに間葉系幹細胞増殖用添加因子（MSCGM）を添加したもの、又はDMEMを好適に使用することができる。MSCBM、MSCGMはタカラバイオ株式会社（大津、日本）や三光純薬株式会社（東京、日本）などから入手できる。同様にDMEMはGIBCOなどから入手できる。培養液中に間葉系幹細胞の成長を促す成分（成長補助剤）を添加することが好ましい。成長補助剤としては、血清（例えばFBS、自己血清）、L-グルタミン、ペニシリン−ストレプトマイシン混合物等が通常用いられる。
骨髄の希釈を数回に分けて実施することもできる。この場合、最終的な希釈率が上記の範囲内となるように各回の希釈率を調整する。例えば、最終的に１０倍希釈となるように、生体から分離した骨髄をまず２倍希釈し、続いて５倍希釈する。各希釈操作における希釈率は特に限定されないが、この例のように後の希釈操作における希釈率を大きくすることが好ましい。各希釈操作に同一の希釈用溶液（通常は培養液）を使用することは必須でない。例えば、第１回目の希釈をMSCBM（又はDMEM、α-MEM、β-MEMなど）で行い、第２回目の希釈を、10%FBS（ウシ胎仔血清）を含有するMSCBMで行うことができる。希釈の際に抗凝固剤を添加することにしてもよい。複数回に分けて希釈を実施する場合には一部の希釈操作においてのみ抗凝固剤を添加することにしてもよい。尚、抗凝固剤を含有する溶液で希釈することにすれば、希釈と同時に抗凝固剤の添加を行うことができる。
培養容器として例えば三角フラスコ、シャーレなどを好適に使用することができる。【００１１】
以上のように希釈された骨髄を常法に従い培養する。間葉系幹細胞の成長・増殖に適切な条件は当業者に公知である。例えば、以下の条件で培養することができる。即ち、10%FBS含有MSCBM培地を使用し、5%CO2存在下、湿潤雰囲気中、37℃で培養する条件である。【００１２】
(2)接着性細胞を選択培養するステップ
このステップではまず接着性細胞を選択する。浮遊成分を除去することによって接着性細胞を選択することができる。浮遊細胞の除去は、培地の交換によって容易に行うことができる。具体的には一部又は実質的に全部の培地を吸引除去し、続いて新しい培地を培養容器に注ぐことによって培地の一部又は全部を交換する。この培地交換操作を複数回繰り返し実施してもよい。浮遊成分を十分に洗浄除去するために、培地交換を３回〜４回／週で実施することが好ましい。
浮遊成分を除去することによって残存した、接着性を有する接着性細胞（培養容器に接着した状態の細胞）は更なる培養に供される。ここでの培養はステップ(1)での培養と同条件で行うことができる。培養中は適宜培地交換を行う。例えば３日に一度の頻度で培地交換を行う。
細胞がある程度増殖した段階で、継代培養（拡大培養）を実施してもよい。例えば、肉眼で観察してサブコンフルエント（培養容器の表面の約７０％を細胞が占める状態）になったときに細胞を培養容器から剥離して回収し、再度、培養液を満たした培養容器に播種する。継代培養を繰り返し行ってもよい。例えば継代培養を１〜３回行い、必要な細胞数（例えば約1×107個/ml）まで増殖させる。尚、培養容器からの細胞の剥離は、トリプシン処理など常法で実施することができる。【００１３】
(3)骨系細胞へと分化誘導するステップ
このステップでは、増殖した細胞に対して、骨系細胞へと分化するよう誘導処理を施す。未分化間葉系幹細胞を骨系細胞へと分化させるための誘導方法は広く知られている。典型的な手法では、培養液中に３種類の添加剤、即ちデキサメタゾン（Dex）、β−グリセロリン酸ナトリウム（β−GP）、及びL−アスコルビン酸二リン酸塩（AsAP）を添加することによって（又はこれらの添加剤を含有する培地（骨誘導培地）に交換することによって）、骨系細胞への分化を促す。これらの添加剤の添加量は例えば、デキサメタゾンについては約10 mM、β−グリセロリン酸ナトリウムについては約10-8 M、L−アスコルビン酸二リン酸塩については約0.05mMとする。分化誘導中は適宜培地交換を行う。例えば３日に一度の頻度で培地交換を行う。分化誘導のための培養は例えば１日間〜１４日間継続する。【００１４】
(4)細胞を回収するステップ
このステップでは、ステップ(3)の結果として骨系細胞への分化能を獲得した間葉系幹細胞（本明細書において「骨系分化能獲得細胞」又は「骨組織形成能を有する細胞」という）を回収する。トリプシン処理等で培養容器から細胞を剥離した後、遠心処理を施すことによって細胞を回収することができる。【００１５】
次に本発明の他の局面を説明する。この局面は上記本発明の方法で調製される骨組織形成用細胞の一利用形態に関する。即ち、当該局面では骨組織形成用組成物の調製方法が提供される。本発明の調製方法は、(i)トロンビン溶液を用意するステップ、(ii)多血小板血漿（PRP）を調製するステップ、(iii)各成分を混合してゲル化させるステップを含む。以下、ステップ毎に説明する。【００１６】
(i)トロンビン溶液を用意するステップ
このステップではトロンビンを所定量含有する溶液を用意する。トロンビン溶液におけるトロンビン濃度は特に限定されないが、後述のステップ(iii)において適切なゲル化を達成できる濃度とする。例えばトロンビン濃度を100U／ml〜10000U／ml含有するトロンビン溶液とする。好ましくはトロンビン濃度を約1000 U／mlとする。安全性や免疫拒絶の観点からヒトトロンビンを使用することが好ましい。ヒトトロンビンとして例えばトロンビン−ヨシトミ（登録商標）を使用することができる。或いは自己血液から調製したヒトトロンビンを使用してもよい。カルシウムイオンの存在下でトロンビンを作用させることによって多血小板血漿（PRP）中のフィブリノーゲンからフィブリンが生成し、凝固（ゲル化）する。従って、カルシウムイオンを含有するトロンビン溶液を用意すれば、トロンビン溶液とPRPとを混合する際（ステップ(iii)）別途カルシウムイオンを添加する必要がない。例えば、トロンビン溶液を5%〜25%塩化カルシウム溶液として調製することが好ましい。更に好ましくは約10%塩化カルシウム溶液として調製したトロンビン溶液を使用する。【００１７】
(ii)多血小板血漿（PRP）を調製するステップ
このステップでは、生体から分離された血液から多血小板血漿（PRP）を調製する。ここで「多血小板血漿」即ちPRP（Platelet-rich Plasma）とは、血小板を豊富に含む血漿である。換言すれば、血小板が濃縮された血漿のことをいう。PRPは例えば、Whitmanらの方法（Dean H. Whitman et al.:J Oral Maxillofac Surg,55,1294-1299 (1997)）に準じて、採取した血液を遠心分離処理に供することにより調製することができる。PRPはPlatelet-derived Growth Factor（PDGF）、Transforming growth factor β１（TGF−β１）、Transforming growth factor β２（TGF−β２）等の成長因子を豊富に含むことが知られている（Jarry J. Peterson:Oral surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod,85,638-646(1998)）。
PRPは日赤PC（濃厚血小板）採取法に準じて調製することができる。PRPの調製方法の具体例を以下に示す。まず、採取した血液にクエン酸ナトリウム等の凝固防止剤を添加し、室温で所定時間放置する。その後、血球及び軟膜が分離する条件（例えば約1,100rpmで約10分間）で遠心処理する。これにより２層に分離される。上層を採取した後、更に約2,500rpmで約10分間、遠心処理する。その結果得られた画分（Platelet-rich Plasma：PRP）を採取する。PRPの調製方法は当該方法に限定されるものではなく、必要に応じて修正を加えた方法により調製することができる。
毒性ないし免疫拒絶の観点からレシピエント自身（即ち、本発明の方法によって得られる骨組織形成用組成物を適用する対象）の血液を用いてPRPを調製することが好ましいが、同種由来の血液からPRPを調製することにしてもよい。【００１８】
PRPに含まれる血小板の数（血小板濃縮率）についての一般的な定義はないが、採取した血液に比較して約150倍〜約1500倍の血小板を含有する血漿を本発明におけるPRPとすることができる。
本発明においてPRPの「血小板濃縮率」は、次の式で表される。
血小板濃縮率（％）＝（PRP中の平均血小板数／出発材料である全血中の平均血小板数）×100
従って、例えばPRP中の平均血小板数が1,000,000であって、全血中の平均血小板数が300,000であるときの血小板濃縮率は約333％となる。本発明者らの検討の結果、PRPの血小板濃縮率が骨（又は歯周）組織の再生効果と関連性を有することが明らかとなった。そこで、一層高い再生効果を得るべく、血小板濃縮率が約150％〜約1500％（平均血小板数に換算した場合には通常、約240,000個／μL〜約6,150,000個／μLに相当する）の範囲にあるPRPを用いることが好ましく。更に好ましくは血小板濃縮率が約300％〜約700％（平均血小板数に換算した場合には通常、約480,000個／μL〜約2,870,000個／μLに相当する）の範囲にあるPRPを用いる。
PRPを調製する際の遠心処理の条件を適宜調節することによって、所望の血小板濃縮率のPRPを得ることができる。例えば、上記の如き二段階の遠心処理を実施することとし、最初の遠心処理を約500rpm〜約1500rpm（例えば1,100rpm）、約5分間〜約15分間（例えば約5分）の条件で実施し、２段階目の遠心処理を約2000rpm〜約5000rpm（例えば約2,500rpm）、約5分間〜約15分間（例えば約5分）の条件で実施することで、血小板濃縮率が約300％〜約700％の範囲にあるPRPを得ることができる。出発材料である血液や使用する器具の相違によって、同条件で処理したとしても最終的に得られるPRPの血小板濃縮率が変動することが予想されるが、当業者であれば通常、上記条件を考慮しつつ、得られたPRPの血小板濃縮率に基づいて条件の修正を施すことによって、所望の血小板濃縮率のPRPを調製する条件を見出すことができる。
尚、PRPの血小板濃縮率の計測は常法（例えば、実施例に示すように市販のSysmex XE-2100（Sysmex、東京、日本）を使用）を利用して行うことができる。【００１９】
本発明の組成物を構築するために使用するPRPの血小板濃縮率は上記の通りであるが、一方で最終的な組成物（本発明の組成物）の血小板濃度は、PRPの血小板濃縮率、PRPとそれに組み合わせる他の成分（即ち、骨組織形成能を有する細胞等）の使用比率等によって変動するが、例えば約240,000個／μL〜約6,150,000個／μL、好ましくは約480,000個／μL〜約2,870,000個／μLである。このような濃度で血小板を含有することによって、良好な骨（又は歯周組織）再生効果が得られる。尚、例えば血小板濃縮率が約300％〜約700％の範囲にあるPRPを使用すれば、最終的な組成物の血小板濃度を約480,000個／μL〜約2,870,000個／μLの範囲に調整することが可能である。【００２０】
(iii)各成分を混合してゲル化させるステップ
このステップでは、ステップ(i)で用意したトロンビン溶液と、ステップ(ii)で調製した多血小板血漿と、上記本発明の方法で調製した骨組織形成用細胞とをカルシウムイオン存在下で混合してゲル化させる。本発明ではこれらの成分を混合する際に空気を所定割合で混合する。空気を混合することによってゲル化の状態の調整（流動性の調整）が行える。また、空気を混合して得られる骨組織形成用組成物では、それを生体に移植した際、適量の空気が周囲に存在することによって、組成物中の骨組織形成能を有する細胞が生存・増殖するのに適した環境を作り出すことができ、もって良好な組織再生効果を期待できる。
本発明では各成分を次の混合比（体積基準）で混合し、ゲル化させる。
(a)トロンビン溶液：多血小板血漿と骨組織形成用細胞の総量：空気＝１：３〜７：０．１〜５．０
当該混合比で混合することによって、操作性、及び移植後の定着性の観点から適度な流動性を有するとともに、良好な再生効果（治療効果）を発揮するゲル状の組成物が得られる。
ここで、多血小板血漿と骨組織形成用細胞の総量の混合率が大きくなるにつれて、及び／又は空気の混合率が大きくなるにつれて、得られるゲル状組成物の流動性は低くなる。つまり(a)の混合比を操作することによって、得られるゲル状組成物の流動性を調節することができる。具体的には、流動性が比較的低い組成物が必要であれば、上記混合比の範囲内において、多血小板血漿と骨組織形成用細胞の総量の混合率が小さい（及び／又は空気の混合率が小さい）混合比を採用し、流動性が比較的高い組成物が必要であれば、上記混合比の範囲内において、多血小板血漿と骨組織形成用細胞の総量の混合率が大きい（及び／又は空気の混合率が大きい）混合比を採用すればよい。
尚、トロンビン溶液、多血小板血漿、及び骨組織形成用細胞は生体由来の成分であるため、採取源の相違などに起因して性状に多少の変動があり、これがゲル化状態へ影響することが考えられるが、本発明者らのこれまでの検討結果によれば、上記混合比の範囲内で各成分を混合すれば通常、上記の如き優れた特性を有するゲル化状態の骨組織形成用組成物が得られることが確認されている。【００２１】
本発明の好ましい一態様では、各成分の混合比を次の通りとする。
(a1)トロンビン溶液：多血小板血漿と骨組織形成用細胞の総量：空気＝１：４〜６：０．３〜３．０
当該混合比を採用することによって、所望の流動性を有するゲル化状態の骨再生用組成物をより確実に調製することが可能となる。
各成分の混合比の具体例を以下に示す。
トロンビン溶液：多血小板血漿と骨組織形成用細胞の総量：空気＝１：４：１．０
トロンビン溶液：多血小板血漿と骨組織形成用細胞の総量：空気＝１：５：１．０
トロンビン溶液：多血小板血漿と骨組織形成用細胞の総量：空気＝１：６：１．０【００２２】
上記の比率で各成分を混合することによって、典型的には、骨組織形成用細胞を約1.0×105〜約1.0×108個／ml含有する組成物を得ることができる。このような組成物によれば、骨組織欠損部に適用した際、良好な組織再生効果を期待できる。【００２３】
以上説明したように本発明の方法では、トロンビン溶液、多血小板血漿、骨組織形成用細胞、及び空気を混合して骨組織形成用組成物を得る。しかしながら、得られる骨組織再生用組成物の効果（骨組織再生効果）が保持されることを条件として、他の成分を追加的に使用することを妨げない。本発明の方法において追加的に使用され得る成分を以下に列挙する。【００２４】
（無機系生体吸収性材料及び有機系生体吸収性材料）
無機系生体吸収性材料の種類は特に限定されないが、β―リン酸三カルシウム（「β―ＴＣＰ）、α−リン酸三カルシウム（α−ＴＣＰ）、リン酸四カルシウム、リン酸八カルシウム、及び非結晶質リン酸カルシウムからなる群から選択される材料を用いることができる。これらの材料は単独で用いることができることはもちろんのこと、任意に選択した２種以上を組み合わせて用いても良い。好ましくは、β−ＴＣＰ又はα−ＴＣＰのいずれか、又はこれらを任意の割合で組み合わせて用いる。さらに好ましくはβ−ＴＣＰを無機系生体吸収性材料として用いる。
無機系生体吸収性材料は公知の方法により得ることができる。また、市販される無機系生体吸収性材料を用いることもできる。β―ＴＣＰとしては、例えば、オリンパス光学工業株式会社製のものを利用できる。【００２５】
無機系生体吸収性材料は、本発明の組成物が使用時において流動性となるような粒子径を有する粉末状であることが好ましい。
粉末状の無機系生体吸収性材料は、適当な大きさに加工された無機系生体吸収性材料を、所望の粒子径となるまで破砕、粉砕することにより調製することができる。無機系生体吸収性材料の平均粒子径を、０．５μｍ〜５０μｍとすることが好ましい。さらに好ましくは、平均粒子径０．５μｍ〜１０μｍの無機系生体吸収性材料を用いる。さらにさらに好ましくは、平均粒子径１μｍ〜５μｍの無機系生体吸収性材料を用いる。粒子径の異なる複数種類の無機系生体吸収性材料を組み合わせて用いることも可能である。
無機系生体吸収性材料は本発明の組成物全体に対して３０重量％〜７５重量％含有することが好ましい。
尚、本発明の組成物の流動性は、無機系生体吸収性材料の粒子径、及び含有率で調製することができ、両者を適宜調整することにより所望の流動性を得ることができる。また、後述の増粘剤を添加する場合には、増粘剤の添加量によっても流動性の調整を行うことができる。【００２６】
有機系生体吸収性材料としては、コラーゲン、フィブリノーゲン（例えばボルヒール（登録商標））等を使用することができる。【００２７】
（ゲル化材料）
例えば、トロンビンと塩化カルシウムを添加して本発明の組成物を構成することができる。これらを添加することにより、トロンビンがPRP中のフィブリノーゲンに作用しフィブリンが生ずる。そして、フィブリンの凝集作用により粘性が増加する。ゲル化剤の種類は特に限定されず、上記のようにPRP中の成分に作用して粘性を増加させるもの、又はそれ自身により増粘効果を奏するものを適宜選択して用いることができる。
また、上記のゲル化材料に加えて、適用後（移植後）に作用して本発明の組成物の流動性（粘度）を変化させる第２のゲル化材料を併用することもできる。このような構成とすれば、使用時には適度な流動性を有するために移植が容易であり、かつ、適用後にはより粘度が増すことにより適用部位における定着性が向上し、骨又は歯周組織の修復又は再生を効果的に行うことができる。また、予め適用部位の形状に成型する必要がなく、汎用性が高い。
ゲル化材料は、生体親和性が高いものを用いることが好ましく、上記の例の他、コラーゲン又はフィブリン糊等を用いることができる。コラーゲンとしては種々のものを選択して用いることができるが、本発明の組成物の適用目的（適用組織）に適したものを採用することが好ましい。骨組織の再生を目的とする場合には、例えば、I型コラーゲンを用いることができる。用いるコラーゲンは可溶性（酸可溶性コラーゲン、アルカリ可溶性コラーゲン、酵素可溶性コラーゲン等）であることが好ましい。【００２８】
（増粘剤）
増粘剤を添加することにより、本発明の組成物の流動性を調整することもできる。増粘剤としては、アルギン酸ナトリウム等の増粘多糖類、グリセリン、ワセリン等を用いることができるが、安全性及び／又は骨形成能の観点から、生体親和性が高く、かつ生体吸収性又は生体分解性のものを用いることが好ましい。グリセリン等を添加することにより、凍害防止の効果も得られる。【００２９】
（溶媒）
本発明の組成物は、水系の溶媒を含むものであってもよい。水系の溶媒としては、滅菌水、生理食塩水、リン酸塩溶液等の緩衝液等を用いることができる。【００３０】
（その他）
本発明の組成物は、上記の成分の他、安定化剤、保存剤、ｐＨ調整剤等を含んでいても良い。また、成長因子、特に骨誘導因子（ＢＭＰ）を含ませることもできる。【００３１】
本発明の調製方法で得られる骨組織形成用組成物は、骨組織の修復又は再生（再建）に利用される。即ち、上顎洞底挙上術、歯周病治療、骨増生術などにおいて従来使用されている自家骨やセラミックス材料（β−TCPやハイドロキシアパタイト）、Bio-Oss（登録商標）などに代わる骨再生用材料として本発明の骨組織形成用組成物を利用できる。本発明の骨組織形成用組成物は、骨組織の修復等が必要な部位（即ち骨組織欠損部）に注入、埋入、填入、塗布等されて使用される。特に適応症例としては、歯周病、インプラントのための骨増生、顎裂部、骨延長部、抜歯か、のう胞摘出部、腫瘍切除部、人工関節部、骨粗鬆症などがあげられる。
【実施例】
【００３２】
１．骨組織形成能を有する細胞の分離方法の検討
骨髄を出発材料とした、骨組織形成能を有する細胞を効率的且つ安定的に調製する方法の確立を目指して以下の実験を行った。まず、可能な限り簡便な手法であることが必要と考え、骨組織形成能を有する細胞の調製を、(1)骨髄液の採取（分離）、(2)骨髄液の播種・培養、(3)接着性細胞の選択、(4)骨系細胞への分化誘導、(5)細胞の回収からなる一連の操作で実施することにした。そして、(2)の操作において骨髄液を播種する際の希釈率に注目し、希釈率と最終的に得られる細胞数との関係を調べた。尚、各ステップの操作手順は次の通りとした（図１）。【００３３】
＜操作手順＞
(1)骨髄液の採取（図１のステップ１）
ヘパリン（1000Ｕ/ml、持田製薬株式会社）0.5mLをコートした10mlシリンジ（テルモ株式会社）に、患者の腸骨より骨髄穿刺針を用いて腸骨骨髄液を採取した（5〜50ml）。
(2)骨髄液の播種・培養（図１のステップ２）
ヘパリン（1000Ｕ/ml、持田製薬株式会社）0.5mLと増殖培地（MSCBM（又はDMEM、α-MEM、β-MEMなど）に10%FBS又は自己血清、L-グルタミン酸、ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した培地、cambrex社社）10mLを入れた遠沈管に、採取した骨髄液を移した（第１回目の希釈：2倍希釈）。骨髄液を所定の希釈率（第２回目の希釈：1〜250倍希釈）になるように培地（MSCBM＋10%FBS）で希釈した後、フラスコ（80cm2、Greiner labortechnik Germany）に播種した。フラスコをインキュベータ内に移し、5％CO2、湿潤雰囲気中、37℃の条件で培養した。
(3)接着性細胞の選択（図１のステップ３〜５）
培養液中に含まれる血球系の細胞を除去し、接着性の細胞を選択して培養するために、骨髄細胞の播種から24時間後に培地交換を行った。その後、培養液中でサブコンフルエントになるまで約7〜14日間培養を続けた。その間、培地交換を３日に１回の頻度で行った。続いて、0.05%トリプシンを用いて細胞を剥離し、面積比にして２〜４倍となるように播種して継代培養（拡大培養）した。
(4)骨系細胞への分化誘導（図１のステップ６）
まず、継代から約6日間培養し、サブコンフルエントに達したのを確認し、培養液にβ−グリセロリン酸ナトリウム（Sigma Chemical Co., St Louis, US）、デキサメタゾン（Sigma Chemical Co., St Louis, USA）、及びL−アスコルビン酸二リン酸塩(Sigma Chemical Co., St Louis, USA)をそれぞれ10 mM、10-8 M、及び0.05mMとなるように添加して（骨誘導培地）培養を続けた。培地交換は３日毎に行い、その都度上記と同様にβ−グリセロリン酸ナトリウム、デキサメタゾン、及びL−アスコルビン酸二リン酸塩を培養液に添加した。
(5)細胞の回収（図１のステップ７）
少量の培地を残して、培地をフラスコ内から除去した。そして、トリプシン/EDTAを用いて細胞をフラスコから剥離した。剥離した細胞を培地とともに遠沈管に移し、遠沈処理(1500rpm, 5min)に供した。上清を吸引し、細胞成分を回収した。【００３４】
＜結果＞
第２回目の希釈を希釈率1倍〜250倍（第１回目の希釈と合わせた希釈率は2倍〜500倍）で実施した群では、(3)の操作の結果得られる接着性細胞の数が顕著に増加することが判明した。尚、(1)〜(5)の一連の操作の結果として得られる細胞についてはそれぞれ、p−ニトロフェニルホスファターゼを用いたアルカリフォスファターゼによるアルカリフォスファターゼ（ALP）染色法によって骨系細胞へと分化していることを確認した。
以上の結果から、2倍〜500倍希釈した後に骨髄液を播種・培養し、そして接着性細胞の選択操作を実施すれば、接着性細胞（間葉系幹細胞）を効率的かつ高い回収率で選択することができ、最終的に得られる細胞（骨組織形成能を有する細胞）の数が増大することが判明した。
このように明かになった有効な希釈率を採用し、他の患者から採取した骨髄を用いて追試を複数回実施したところ、いずれの場合も最終的に得られる細胞（骨組織形成能を有する細胞）の数に大差はなく、効率的な調製が可能であった。この結果から、上記の希釈率の範囲を採用すれば、骨組織形成能を有する細胞を安定して供給できることを確認できた。【００３５】
２．骨組織形成用組成物のゲル化方法の検討
操作性がよく、治療効果にも優れた骨組織形成用組成物を調製する方法の確立を目指して以下の実験を行った。まず、これまでの報告及び本発明者らの経験を考慮して、組成物に含有させる成分として骨組織形成能を有する細胞と多血小板血漿（PRP）を選択した。そしてゲル化のためにトロンビンを用いることにした。このように大別して細胞、PRP、トロンビンの三成分を用いて骨組織形成用組成物を調製することにし、各成分の混合比とゲル化状態との関係を以下の方法で検討した。
＜材料と方法＞
(1)各成分の用意・調製
ヒトトロンビン（ヨシトミ社）を10％塩化カルシウム溶液に溶解し、1000U／mlのトロンビン溶液を用意した。
骨組織形成能を有する細胞は、上記実施例の＜操作手順＞と同様の手順で調製した。但し、骨髄の希釈率（第２回目の希釈率）を５倍希釈とした。
一方、患者より約50mL〜200mLの全血を採血し、保存剤非含有のヘパリン（250U/mL）とともに献血バッグに入れた。1100rpm、５分間の条件で遠心処理した後、黄色の血漿（血小板と白血球を含んだ軟膜を含む）をカニューレで採取した。血小板をペレットにするために、2500rpm、５分の条件で２回目の遠心処理を行った。そして、乏血小板血漿（PPP）であって、細胞含有量の比較的少ない血漿上清を除去した。得られた血小板ペレット、即ち軟膜／血漿フラクションを残りの血漿5mLに懸濁し、PRPとした。PRPとPPP内の血小板数はSysmex XE-2100（Sysmex、東京、日本）で測定した。その結果、全血小板数は平均値219,000（約16万〜約41万の範囲）であった。一方、PRPの血小板数は平均値1,136,000（約490,000〜約2,130,000の範囲）であった。これらの測定結果によって、血小板を分離できていることが確認できるとともに、PRPにおける濃縮の度合いは485%（対全血血小板数（100%））であることが判明した。PRPは、使用時まで一般的な振盪機内において室温で保存した。
(2)各成分の混合・ゲル化
骨組織形成能を有する細胞をPRPに懸濁し、細胞懸濁液（約1.0×106〜約1.0×108cells/mL）とした。尚、細胞数は約1.0×107cells/mLが好ましい。この細胞懸濁液と、トロンビン溶液及び空気とを以下に示す混合比（体積基準）及び方法で混合し、ゲル化状態を比較した。【００３６】
（混合比）
トロンビン溶液：細胞懸濁液：空気
条件１  １：１：１
条件２  １：２：１
条件３  １：３：１
条件４  １：４：１
条件５  １：５：１
条件６  １：６：１
条件７  １：７：１
条件８  １：８：１
条件９  １：１０：１
条件１０  １：１２：１
条件１１  １：２０：１
条件１２  １：５０：１
条件１３  １：１００：１【００３７】
（混合方法）
注射器に所定量の細胞懸濁液及び空気を吸引する。別に用意した注射器に所定量のトロンビン溶液及び空気を吸引する。このようにして用意した二つの注射器を三方活栓で連結した後、両注射器のピストンを交互に押し込むことによって内容物が両注射器内を行き来するようにして混合し、ゲル化させた。【００３８】
(3)移植実験
TISSUE ENGINEERING, Volum 10, Number 5/6, 2004, pp955-964（Yamada, Y. et al., Autogeneous Injectable Bone for Regeneration with Mesenchimal Stem Cells and Platelete-Rich Plasma:Tissu-Engineeered Bone Regeneration）等に記載される方法に準じて、犬下顎骨を抜歯後、10mmのトレフィンバーにて骨欠損モデルを作製し、ゲル化した骨組織形成用組成物を骨欠損部に填入し、骨形成能（組織再建効果）を組織学的、組織形態学的に検討した。比較対象として、欠損のみの試験群と、自家骨を填入した試験群とを用意した。【００３９】
＜結果＞
(1)各条件で混合して得られた組成物の状態を図２に示す。混合比が１：３：１〜１：７：１（条件３〜７）の範囲において、注射器で患部（例えば歯周組織欠損部）に注入することに適し、かつ注入後に患部において良好に保持される適度な流動性を有するゲル状の組成物が得られることが判明した。特に、混合比が１：４：１〜１：７：１の範囲で得られるゲル状の組成物は、注射器での吸引及び注入が容易であって、しかも注入後の患部での保持状態も極めてよい。また、この範囲内に混合比を設定すれば、各成分の状態に多少変動があったとしても、適度な流動性を有するゲル状の組成物を確実に得ることができると考えられる。
(2)良好にゲル化した組成物を骨欠損部にそれぞれ移植して再生効果を検証したところ、いずれの場合も良好な再生効果が認められた（自家骨を移植した群と同等の再生効果であった）。尚、ゲル化が不良であった組成物、即ち例えば条件１１を採用して得られた組成物では流動性が低いがために注射器で患部に注入することは難しく、また患部への生着性も悪い。一方、条件１や２を採用して得られた組成物では流動性が高すぎて患部への生着性及び患部での保持性が悪い。
(3)空気の混合量によってゲル化状態が変化すると予想されたため、空気の混合量とゲル化状態との関係を調べた。その結果、上記の実験で明かとなったトロンビン溶液と細胞懸濁液との適切な混合比（条件３〜７における両者の混合比）においては、トロンビン溶液１に対して空気の混合率を０．１〜５．０としたときに良好なゲル化状態を作り出せることが判明した。特に、空気の混合量が０．３〜３．０の範囲ではほぼ同等の流動性の組成物が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明の方法で調製される骨組織形成用細胞又は骨組織形成用組成物は、骨組織（歯周組織を含む）の修復、再生が必要とされる各種の分野に適用することができるものである。例えば、高度な骨吸収が認められる顎堤に人工歯根の植立を行う場合の骨増生に適用することができる。また、外傷、各種骨疾患により生ずる骨欠損部における骨組織の再生、骨の補強又は補填に適用することができる。また、歯周病等による歯槽骨の欠損部における歯槽骨、歯周組織の再生に適用することができるものである。適用方法としては、骨組織形成用細胞であれば単独で又は他の成分との併用で適用部位に移植することができる。また、骨組織形成用組成物であれば、適度な流動性を有するゲル状であるから、填入、注入、又は塗布等することによって適用部位に簡便に適用することができる。【００４１】
本発明の方法で調製される骨組織形成用組成物には、骨形成系の細胞の増殖或いは分化を促進させる能力をもつ成長因子が数多く含まれる。従って、適用部（移植部）において、骨形成系の細胞を効率的に増殖或いは分化させ、骨組織又は歯周組織の形成を促進することができる。自家のPRPを用いることにより、毒性がなく、しかも免疫非活性である上記の成長因子により、骨組織又は歯周組織の再生は、質、量ともに向上するものと考えられる。また、ゲル状であるため、注射針等を用いて適用部位に容易に填入でき（創部を開放することなく適用することも可能である）、また、骨欠損部の形状に合わせて予め成型することを要せず、その汎用性が高い。このように、本発明の方法によって調製される骨組織形成用組成物を用いることにより、自家骨を採取して移植に供する必要がなくなり、容易に骨又は歯周組織の増生を図ることが可能となる。【００４２】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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