(57)【要約】本発明は、被検試料中に混入している細菌、特に有胞子好気性細菌を、簡便な操作で、迅速かつ正確に判定することができる細菌検出器具、細菌検出方法および細菌検出キットを提供する。本発明にかかる細菌検出器具は、対象となる有胞子好気性細菌が属する属または種に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドが、基板に固定されたマイクロアレイ型の器具である。被検試料から調製したプローブと、上記基板に固定されたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの成立の有無により、被検試料中の有胞子好気性細菌を簡便、迅速かつ正確に検出・同定することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出対象となる細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号１〜４０、４３〜５６または５７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの群から選択される１以上のオリゴヌクレオチドが、基板に固定されており、当該オリゴヌクレオチドと被検試料に由来する核酸とのハイブリダイゼーションにより被検試料中の細菌を検出・同定することを特徴とする細菌検出器具。
【請求項２】
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号１、２または３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ以上が、基板に固定されている請求項１に記載の細菌検出器具。
【請求項３】
ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている請求項１に記載の細菌検出器具。
【請求項４】
アリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号５に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている請求項１に記載の細菌検出器具。
【請求項５】
アネウリニバチルス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている請求項１に記載の細菌検出器具。
【請求項６】
ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている請求項１に記載の細菌検出器具。
【請求項７】
パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号３または８に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ以上が、基板に固定されている請求項１に記載の細菌検出器具。
【請求項８】
バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号９、１０または１１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ以上が、基板に固定されている請求項１に記載の細菌検出器具。
【請求項９】
バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号１２、１３または１４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ以上が、基板に固定されている請求項１に記載の細菌検出器具。
【請求項１０】
バチルス・スポロサーモデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｏｒｏｔｈｅｒｍｏｄｕｒａｎｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号１５、４３または４４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている請求項１に記載の細菌検出器具。
【請求項１１】
バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号１６、１７または１８に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ以上が、基板に固定されている請求項１に記載の細菌検出器具。
【請求項１２】
バチルス・リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号１９に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている請求項１に記載の細菌検出器具。
【請求項１３】
バチルス・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号２０または５５に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている請求項１に記載の細菌検出器具。
【請求項１４】
バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号２１ないし２５のいずれかに示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ以上が、基板に固定されている請求項１に記載の細菌検出器具。
【請求項１５】
バチルス・ファルマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号２６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている請求項１に記載の細菌検出器具。
【請求項１６】
バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号２７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている請求項１に記載の細菌検出器具。
【請求項１７】
バチルス・ベンゾエヴォランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｅｎｚｏｅｖｏｒａｎｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号２９または３０に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ以上が、基板に固定されている請求項１に記載の細菌検出器具。
【請求項１８】
バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号３１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている請求項１に記載の細菌検出器具。
【請求項１９】
バチルス・スファエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号３２または３３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ以上が、基板に固定されている請求項１に記載の細菌検出器具。
【請求項２０】
アリシクロバチルス・アシドテレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号３４、３５または３６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ以上が、基板に固定されている請求項１に記載の細菌検出器具。
【請求項２１】
アリシクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号２８または３７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つ以上が、基板に固定されている請求項１に記載の細菌検出器具。
【請求項２２】
パエニバチルス・バリダス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖａｌｉｄｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号３８、３９または４０に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ以上が、基板に固定されている請求項１に記載の細菌検出器具。
【請求項２３】
バチルス・スミシー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号４５または４６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ以上が、基板に固定されている請求項１に記載の細菌検出器具。
【請求項２４】
アリシクロバチルス・アシディフィラス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号４７、４８または４９に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つ以上が、基板に固定されている請求項１に記載の細菌検出器具。
【請求項２５】
アリシクロバチルス・ヘスペリダム（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｉｄｕｍ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号５０または５１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つ以上が、基板に固定されている請求項１に記載の細菌検出器具。
【請求項２６】
バチルス・フマリオリ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｕｍａｒｉｏｌｉ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号５２または５３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ以上が、基板に固定されている請求項１に記載の細菌検出器具。
【請求項２７】
バチルス・アシドジェネシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｇｅｎｅｓｉｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号５４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ以上が、基板に固定されている請求項１に記載の細菌検出器具。
【請求項２８】
バチルス・ソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号５６または５７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ以上が、基板に固定されている請求項１に記載の細菌検出器具。
【請求項２９】
配列番号１〜４０、４３〜５６または５７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの全部が、基板に固定されている請求項１に記載の細菌検出器具。
【請求項３０】
上記被験試料中の細菌が、以下の（ａ）ないし（ｆ）のいずれかに記載の細菌から選ばれる少なくとも１種類以上の細菌であることを特徴とする請求項１ないし２９のいずれか１項に記載の細菌検出器具。
（ａ）バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌。
（ｂ）ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌。
（ｃ）アリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌。
（ｄ）アネウリニバチルス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌。
（ｅ）ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌。
（ｆ）パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌。
【請求項３１】
上記基板にカルボジイミド基またはイソシアネート基を有し、当該カルボジイミド基またはイソシアネート基と上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド末端に付加されたリンカーとの反応により共有結合が形成されることを特徴とする請求項１ないし３０のいずれか１項に記載の細菌検出器具。
【請求項３２】
被検試料中の細菌を検出・同定するための方法であって、
被検試料中の細菌の核酸を調製する核酸調製工程と、
当該核酸を鋳型として標識プローブを調製するプローブ調製工程と、
請求項１ないし３１のいずれか１項に記載の細菌検出器具を用いて、基板に固定されたオリゴヌクレオチドと上記標識プローブとのハイブリダイゼーションを行うハイブリダイゼーション工程と、
ハイブリダイゼーションシグナルを検出するシグナル検出工程とを含むことを特徴とする細菌検出方法。
【請求項３３】
被検試料中の細菌を検出・同定するための方法であって、
被検試料中の細菌の核酸を調製する核酸調製工程と、
当該核酸を鋳型として標識プローブを調製するプローブ調製工程と、
配列番号１ないし４０及び４３〜５７のいずれかに示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを用いて、当該オリゴヌクレオチドと上記標識プローブとのハイブリダイゼーションを行うハイブリダイゼーション工程と、
ハイブリダイゼーションシグナルを検出するシグナル検出工程とを含むことを特徴とする細菌検出方法。
【請求項３４】
上記被検試料が食品であることを特徴とする、請求項３２または３３に記載の細菌検出方法。
【請求項３５】
上記食品が飲料であることを特徴とする、請求項３４に記載の細菌検出方法。
【請求項３６】
上記飲料が清涼飲料水であることを特徴とする、請求項３５に記載の細菌検出方法。
【請求項３７】
請求項３２ないし３６のいずれか１項に記載の細菌検出方法を実施するための細菌検出キット。
【請求項３８】
請求項３２ないし３６のいずれか１項に記載の細菌検出方法を実施するためのキットであって、上記ハイブリダイゼーション工程およびシグナル検出工程で用いる試薬を含むことを特徴とする細菌検出キット。
【請求項３９】
さらに、上記プローブ調製工程および／または上記核酸調製工程で用いる試薬を含む請求項３８に記載の細菌検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、細菌検出器具、細菌検出方法および細菌検出キットに関するものであり、具体的には、有胞子好気性細菌に特異的なオリゴヌクレオチドが基板に固定された細菌検出器具と、これを用いた極めて正確かつ操作性の高い細菌検出方法および細菌検出キットに関するものである。
【背景技術】  従来、食品産業では、製造される食品の安全性を高める点から、衛生管理に関してさまざまな技術が研究開発されてきている。特に近年では、食品の安全性が厳しく問われることもあり、技術の向上について関心が高まっている。
食品の製造現場で衛生管理を行うためには、微生物管理が必須である。そのためには、微生物の検査・同定が必要となる。微生物の検査・同定は専門的な知識と技術とを必要とするため、通常、それを専門とする各種機関や部門に依頼される。依頼を受けた機関等では、生理生化学的性質および遺伝子解析による分類から微生物の検査・同定を行うことになる。
食品の微生物管理において最も重要なことは、正確な検査結果を出来るだけ早く現場に提供することにある。ところが、現在一般的に用いられている検査法や分類同定法では、微生物種の同定に日数がかかり、例えば、微生物の同定は数日〜１週間程度の期間を要する場合がほとんどである。そのため、食品製造現場で行える迅速で正確な微生物検査法の開発が強く望まれている。
中でも、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属をはじめとする有胞子好気性細菌は、土壌や水、空気中など広く自然界に分布しており、有害性のものが多く知られている。例えば、バチルス属の中で、ヒトに病原性を示すものとしては、炭疽病菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）や、食中毒の起因菌となるセレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）などが知られている。
ここで、細菌を分類同定する方法としては、生理生化学的性状に基づく方法、キノン組成、菌体脂肪酸組成、細胞壁成分等に基づく方法、ＤＮＡのＧ＋Ｃ含量に基づく方法、ＤＮＡ相同性に基づく方法、ＤＮＡプローブを用いる方法、および１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列の解析を行う方法等が知られている。特に、近年では、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づく系統分類により得られるグループ（クラスター）を指標として、細菌の分類・識別を行うことが一般的になっている。
さらに、有胞子好気性細菌に属する細菌を同定する技術としては、例えば、特開平９−９４１００号公報（公開日：平成９（１９９７）年４月８日：特許文献１）およびＳｈｉｄａ，Ｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｐｏｓａｌ  ｆｏｒ  Ｔｗｏ  Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａ，Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｅｎ．ｎｏｖ．ａｎｄ  Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｅｎ．ｎｏｖ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，９３９−９４６（１９９６）（非特許文献１）に開示されている方法が知られている。この技術では、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アネウリニバチルス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属等の有胞子好気性細菌に属する細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子に存在する特異的な塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとし、被同定細菌から得た染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法を適用し、特定のＤＮＡの増幅を指標として被同定細菌の属レベルでの同定を行う。
また、１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子を利用したバチルス属細菌の分類技術としては、Ｇｏｔｏ，Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｒｔｉａｌ  １６Ｓ  ｒＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｓ  ａｎ  ｉｎｄｅｘ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｕｓ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４６，１−８（２０００）（非特許文献２）に開示されている方法が知られている。１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子のｈｙｐｅｒｖａｒｉａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ（ＨＶ  ｒｅｇｉｏｎ）と呼ばれる５’側の約２７５ｂｐは種特異的な領域であるため、この技術では、この領域の塩基配列解析を行うことによりバチルス属細菌の分類が可能であるとしている。
【発明の開示】
しかしながら、上述した各技術でも、食品の製造現場で迅速かつ簡便に微生物を同定することは困難となっている。そのため、特に迅速性を要する食品産業の出荷前の検査等に用いることが可能な技術の開発が望まれている。
具体的には、まず、上記特許文献１および非特許文献１に開示されている方法は、そもそも食品産業の出荷前の検査等に用いるための技術ではなく、細菌の同定そのものに重点がおかれた技術である。そのため、この方法では、ＰＣＲ法によって検出するために迅速性は担保できるものの、属特異的な方法であるため、プライマーをそれぞれの属に応じて採用する必要があり操作が煩雑となる。
また、非特許文献２に記載の方法は、迅速性および簡便性については未だ不十分なものとなっている。
迅速かつ簡便な微生物同定法は、食品の製造現場だけでなく、医薬品等の製造や病院、あるいは研究機関等でも利用可能となるため、このような技術の開発が望まれている。しかしながら、このような技術は知られていなかった。
本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、有胞子好気性細菌を属だけでなく種レベルまで同定することができるとともに、迅速かつ簡便な同定を可能とする技術を提供することにある。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、清涼飲料水をはじめとする食品の代表的な汚染細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列において、特定の属または特定の種に特異的な配列を見出し、この塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドを基板に固定した器具を用いて、被検試料に由来する核酸とのハイブリダイゼーションにより、迅速かつ正確に目的の細菌を検出・同定できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は、以下の発明を包含する。
（１）検出対象となる細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号１〜４０、４３〜５６または５７（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６または５７）に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの群から選択される１以上のオリゴヌクレオチドが、基板に固定されており、当該オリゴヌクレオチドと被検試料に由来する核酸とのハイブリダイゼーションにより被検試料中の細菌を検出・同定することを特徴とする細菌検出器具。
（２）バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号１、２または３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ以上が、基板に固定されている上記（１）に記載の細菌検出器具。
（３）ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている上記（１に記載の細菌検出器具。
（４）アリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号５に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている上記（１）に記載の細菌検出器具。
（５）アネウリニバチルス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている上記（１）に記載の細菌検出器具。
（６）ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている上記（１）に記載の細菌検出器具。
（７）パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号３または８に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ以上が、基板に固定されている上記（１）に記載の細菌検出器具。
（８）バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号９、１０または１１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ以上が、基板に固定されている上記（１）に記載の細菌検出器具。
（９）バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号１２、１３または１４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ以上が、基板に固定されている上記（１）に記載の細菌検出器具。
（１０）バチルス・スポロサーモデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｏｒｏｔｈｅｒｍｏｄｕｒａｎｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号１５、４３または４４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている上記（１）に記載の細菌検出器具。
（１１）バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号１６、１７または１８に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ以上が、基板に固定されている上記（１）に記載の細菌検出器具。
（１２）バチルス・リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号１９に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている上記（１）に記載の細菌検出器具。
（１３）バチルス・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号２０または５５に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている上記（１）に記載の細菌検出器具。
（１４）バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号２１ないし２５のいずれかに示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ以上が、基板に固定されている上記（１）に記載の細菌検出器具。
（１５）バチルス・ファルマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号２６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている上記（１）に記載の細菌検出器具。
（１６）バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号２７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている上記（１）に記載の細菌検出器具。
（１７）バチルス・ベンゾエヴォランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｅｎｚｏｅｖｏｒａｎｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号２９または３０に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ以上が、基板に固定されている上記（１）に記載の細菌検出器具。
（１８）バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号３１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、基板に固定されている上記（１）に記載の細菌検出器具。
（１９）バチルス・スファエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号３２または３３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ以上が、基板に固定されている上記（１）に記載の細菌検出器具。
（２０）アリシクロバチルス・アシドテレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号３４、３５または３６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ以上が、基板に固定されている上記（１）に記載の細菌検出器具。
（２１）アリシクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号２８または３７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つ以上が、基板に固定されている上記（１）に記載の細菌検出器具。
（２２）パエニバチルス・バリダス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖａｌｉｄｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号３８、３９または４０に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ以上が、基板に固定されている上記（１）に記載の細菌検出器具。
（２３）バチルス・スミシー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号４５または４６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ以上が、基板に固定されている上記（１）に記載の細菌検出器具。
（２４）アリシクロバチルス・アシディフィラス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号４７、４８または４９に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つ以上が、基板に固定されている上記（１）に記載の細菌検出器具。
（２５）アリシクロバチルス・ヘスペリダム（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｉｄｕｍ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号５０または５１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つ以上が、基板に固定されている上記（１）に記載の細菌検出器具。
（２６）バチルス・フマリオリ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｕｍａｒｉｏｌｉ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号５２または５３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ以上が、基板に固定されている上記（１）に記載の細菌検出器具。
（２７）バチルス・アシドジェネシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｇｅｎｅｓｉｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号５４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ以上が、基板に固定されている上記（１）に記載の細菌検出器具。
（２８）バチルス・ソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号５６または５７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ以上が、基板に固定されている上記（１）に記載の細菌検出器具。
（２９）配列番号１〜４０、４３〜５６または５７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの全部が、基板に固定されている上記（１）に記載の細菌検出器具。
（３０）上記被験試料中の細菌が、以下の（ａ）ないし（ｆ）のいずれかに記載の細菌から選ばれる少なくとも１種類以上の細菌であることを特徴とする上記（１）ないし（２９）のいずれか１項に記載の細菌検出器具。
（ａ）バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌。
（ｂ）ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌。
（ｃ）アリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌。
（ｄ）アネウリニバチルス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌。
（ｅ）ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌。
（ｆ）パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌。
（３１）上記基板にカルボジイミド基またはイソシアネート基を有し、当該カルボジイミド基またはイソシアネート基と上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド末端に付加されたリンカーとの反応により共有結合が形成されることを特徴とする上記（１）ないし（３０）のいずれか１項に記載の細菌検出器具。
（３２）被検試料中の細菌を検出・同定するための方法であって、
被検試料中の細菌の核酸を調製する核酸調製工程と、
当該核酸を鋳型として標識プローブを調製するプローブ調製工程と、
上記（１）ないし（３１）のいずれか１項に記載の細菌検出器具を用いて、基板に固定されたオリゴヌクレオチドと上記標識プローブとのハイブリダイゼーションを行うハイブリダイゼーション工程と、
ハイブリダイゼーションシグナルを検出するシグナル検出工程とを含むことを特徴とする細菌検出方法。
（３３）被検試料中の細菌を検出・同定するための方法であって、
被検試料中の細菌の核酸を調製する核酸調製工程と、
当該核酸を鋳型として標識プローブを調製するプローブ調製工程と、
配列番号１ないし４０及び４３〜５７のいずれかに示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを用いて、当該オリゴヌクレオチドと上記標識プローブとのハイブリダイゼーションを行うハイブリダイゼーション工程と、
ハイブリダイゼーションシグナルを検出するシグナル検出工程とを含むことを特徴とする細菌検出方法。
（３４）上記被検試料が食品であることを特徴とする、上記（３２）または（３３）に記載の細菌検出方法。
（３５）上記食品が飲料であることを特徴とする、上記（３４）に記載の細菌検出方法。
（３６）上記飲料が清涼飲料水であることを特徴とする、上記（３５）に記載の細菌検出方法。
（３７）上記（３２）ないし（３６）のいずれか１項に記載の細菌検出方法を実施するための細菌検出キット。
（３８）上記（３２）ないし（３６）のいずれか１項に記載の細菌検出方法を実施するためのキットであって、上記ハイブリダイゼーション工程およびシグナル検出工程で用いる試薬を含むことを特徴とする細菌検出キット。
（３９）さらに、上記プローブ調製工程および／または上記核酸調製工程で用いる試薬を含む上記（３８）に記載の細菌検出キット。
本発明にかかる細菌検出器具は、対象となる細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板に固定されており、当該オリゴヌクレオチドと被検試料に由来する核酸とのハイブリダイゼーションにより、被検試料中の細菌を検出・同定することが可能となる。それゆえ、本発明によれば、正確かつ簡便に細菌の検出・同定を行うことができるという効果を奏する。
また、基板に複数の細菌種、または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドを固定しておけば、網羅的な検査を行うことができるという効果を奏する。
さらに、本発明にかかる細菌検出キットは、上記細菌検査器具および必要な試薬を含むものであるため、操作性が向上し、一層簡便に細菌の検出・同定を行うことができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
（１）本発明にかかる細菌検出器具
本発明にかかる細菌検出器具は、被検試料中の細菌を検出・同定するための器具であって、対象となる細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板に固定されており、当該オリゴヌクレオチドと被検試料に由来する核酸とのハイブリダイゼーションにより被検試料中の細菌を検出・同定するものである。
〔基板〕
本発明にかかる細菌検出器具に用いる基板の材質としては、オリゴヌクレオチドを安定して固定することができるものであればよい。例えば、ポリカーボネートやプラスティックなどの合成樹脂、ガラス等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。基板の形態も特に限定されるものではないが、例えば、板状、フィルム状等の基板を好適に用いることができる。
〔基板に固定されるオリゴヌクレオチド〕
本発明にかかる細菌検出器具の基板に固定されるオリゴヌクレオチドは、検出対象細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドであればよい。当該オリゴヌクレオチドと被検試料由来の核酸との間にハイブリダイゼーションが成立することにより、被検試料中に含まれている目的の種または属に属する細菌を検出することが可能となる。なお、上記検出対象細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドを、以下適宜「キャプチャーオリゴ」と称する。
上記特異的な塩基配列は、検出対象細菌のゲノムの塩基配列から属または種特異的な塩基配列を見出せばよいが、検出対象細菌のリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列から見出すことが好ましい。なかでも細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子は属または種特異的な塩基配列を多く有していることが知られており、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応するＤＮＡ配列中から属または種特異的な塩基配列を見出すことが特に好ましい。リボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ等のデータベース等から入手することができる。
キャプチャーオリゴは上記属または種特異的な塩基配列に基づいて設計すればよい。したがって、上記属または種特異的な塩基配列そのものであってもよいし、検出対象細菌から調製した核酸と特異的なハイブリダイゼーションが成立する限りにおいて、変異が含まれていてもよい。変異の位置は特に限定されるものではない。
キャプチャーオリゴの長さ（塩基数）は特に限定されるものではないが、短すぎるとハイブリダイゼーションの検出が困難になり、長すぎると非特異的ハイブリダイゼーションを許容してしまう。発明者らは、キャプチャーオリゴの長さの最適化について検討を重ね、標準的な長さを１２〜２４塩基とした。より好ましくは１３〜２２塩基である。ただし、これに限定されるものではない。塩基長は主として配列特性（特定の塩基の含有率，同一塩基のリピート）に依存するものであり、結合性の良いものは短鎖でも特異的ハイブリダイゼーションが可能であることが、発明者らにより確認されている。
キャプチャーオリゴが、被検試料由来の核酸とのハイブリダイゼーションを妨害するヘアピン構造、ループ構造、またはそれ以外の立体構造を持つ場合、キャプチャーオリゴを構成する１またはそれ以上のヌクレオチドをイノシンまたはいずれのヌクレオチドとも対合しない核酸に置換することにより、その立体構造を解除することができる。
キャプチャーオリゴの合成法は特に限定されるものではなく、公知の方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載の方法等）により合成すればよい。一般的には、市販のＤＮＡ合成機を用いて化学合成することができる。
本発明にかかる細菌検出器具において、上記検出対象細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドのみではなく、それらに加えて、いわゆるコントロール・キャプチャーオリゴを基板に固定することが好ましい。コントロール・キャプチャーオリゴには、陽性コントロール・キャプチャーオリゴおよび陰性コントロール・キャプチャーオリゴが含まれる。陽性コントロール・キャプチャーオリゴは、後述するプローブ調製工程において増幅反応がうまくいっており、かつハイブリダイゼーションがうまくいっているかどうかを判定するために用いるものである。陰性コントロール・キャプチャーオリゴは、非特異的ハイブリダイゼーションが生じていないこと、すなわち擬陽性のハイブリダイゼーションシグナルが生じていないことを確認するために用いるものである。これらの陽性コントロール・キャプチャーオリゴおよび陰性コントロール・キャプチャーオリゴが基板に固定された細菌検出器具も本発明に含まれる。
陽性コントロール・キャプチャーオリゴは検出対象細菌から調製するプローブに含まれる塩基配列に基づいて設計されるものであればよい。また、複数の検出対象細菌を同時に同一の細菌検出器具を用いて検出する場合には、各検出対象細菌について陽性コントロール・キャプチャーオリゴを設計してもよいが、複数の検出対象細菌から調製するプローブに共通する塩基配列に基づいて設計してもよい。すべての検出対象細菌から調製するプローブに共通する塩基配列がない場合は、いくつかのグループごとに陽性コントロール・キャプチャーオリゴを設計してもよい。
あるいは、プライマー配列部分が同じで、対象となる細菌の配列とは異なる人工的な配列を設計し、この配列の一部を陽性コントロール・キャプチャーオリゴとすることもできる。上記人工的な配列を鋳型としてプローブを調製し（本明細書では、このようなプローブをコントロールプローブと称する。）、被検試料から調製したプローブに添加することにより、後述するプローブ調製工程において、増幅反応がうまくいっており、かつハイブリダイゼーションがうまくいっているかどうかを検証することが可能となる。
陰性コントロール・キャプチャーオリゴは、陽性コントロール・キャプチャーオリゴの塩基配列において、１塩基以上であり、かつ、当該配列の有する塩基数の２０％未満の範囲内で人為的な塩基の置換を含む塩基配列を有するように設計することが好ましい。塩基置換を行う塩基数は、ハイブリダイゼーションの条件との関係で決定され、検出対象細菌由来のプローブがハイブリダイゼーションを生じないような塩基数を選択すればよい。
検出対象細菌は特に限定されるものではなく、目的とする被検試料中から検出しようとする細菌を適宜選択すればよい。例えば、食品中に混入し当該食品を汚染する可能性のある細菌を挙げることができる。なかでも飲料、特に清涼飲料水に混入・汚染する可能性のある細菌を検出対象細菌とすることが好ましい。食品中に有害な細菌が混入することは、食中毒等の公衆衛生上非常に大きな問題となる。また、食品の濁りや異臭発生や風味劣化などの品質劣化の原因となるため、これらの有害細菌を迅速かつ正確に検出・同定する方法の開発が特に強く望まれている。
上記検出対象菌としては、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌、より具体的には、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・スポロサーモデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｏｒｏｔｈｅｒｍｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ファルマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ベンゾエヴォランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｅｎｚｏｅｖｏｒａｎｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・スファエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、バチルス・スミシー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ）、バチルス・フマリオリ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｕｍａｒｉｏｌｉ）、バチルス・アシドジェネシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｇｅｎｅｓｉｓ）、バチルス・ソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）等を挙げることができる。
また上記の他、アリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌、より具体的には、アリシクロバチルス・アシドテレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、アリシクロバチルス・ヘスペリダム（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｉｄｕｍ）、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｙｃｌｏｈｅｐｔａｎｉｃｕｓ）、アリシクロバチルス・ハーバリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｒｂａｒｉｕｓ）、アリシクロバチルス・アシディフィラス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｓ）等を挙げることができる。
また上記の他、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌、より具体的には、パエニバチルス・バリダス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖａｌｉｄｕｓ）、パエニバチルス・イリノイセンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｌｌｉｎｏｉｓｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・アルベイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｖｅｉ）、パエニバチルス・ポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）等を挙げることができる。
また上記の他、アネウリニバチルス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌、より具体的にはアネウリニバチルス・アネウリノリティカス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）等を挙げることができる。
また上記の他、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌、より具体的にはゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）等を挙げることができる。
また上記の他、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌、より具体的にはブレビバチルス・ブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、ブレビバチルス・アグリ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇｒｉ）、ブレビバチルス・ラテロスポーラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、等を挙げることができる。ただし、検出対象細菌は、上記に限定されるものではない。
上記例示した細菌を検出・同定するためのキャプチャーオリゴとしては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アネウリニバチルス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、各属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドを挙げることができる。
上記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドの具体例としては、以下の配列番号１、２または３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＡＧＡＴＧＧＧＣＣＣＧＣＧＧＣＧＣＡＴＴ（配列番号１）。
ＧＡＣＣＣＧＣＧＧＣＧＣＡＴＴ（配列番号２）。
ＧＧＧＣＡＡＣＣＴＧＣＣＴＧＴＡＡＧＡＣ（配列番号３）。
上記ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドの具体例としては、以下の配列番号４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＡＣＡＴＡＧＧＧＡＡＡＣＴＴＡＴＧＣＴＡＡ（配列番号４）。
上記アリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドの具体例としては、以下の配列番号５に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＧＡＧＧＡＧＣＣＣＧＣＧＧＣＧＣＡＴＴ（配列番号５）。
上記アネウリニバチルス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドの具体例としては、以下の配列番号６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＧＡＡＧＡＡＣＣＧＣＣＧＧＧＡ（配列番号６）。
ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドの具体例としては、以下の配列番号７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＡＣＡＣＣＧＡＡＧＡＣＣＧＣＡＴＧＧＴＣ（配列番号７）。
パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドの具体例としては、以下の配列番号３または８に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＧＧＧＣＡＡＣＣＴＧＣＣＴＧＴＡＡＧＡＣ（配列番号３）。
ＧＡＣＧＧＴＡＣＣＴＧＡＧＡＡＧＡＡ（配列番号８）。
また、上記の他のキャプチャーオリゴとしては、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・スポロサーモデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｏｒｏｔｈｅｒｍｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ファルマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ベンゾエヴォランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｅｎｚｏｅｖｏｒａｎｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・スファエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、バチルス・スミシー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ）、バチルス・フマリオリ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｕｍａｒｉｏｌｉ）、バチルス・アシドジェネシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｇｅｎｅｓｉｓ）、バチルス・ソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、アリシクロバチルス・アシドテレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、アリシクロバチルス・ヘスペリダム（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｉｄｕｍ）、アリシクロバチルス・アシディフィラス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｓ）、パエニバチルス・バリダス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖａｌｉｄｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、各細菌種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドを挙げることができる。
上記バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドの具体例としては、以下の配列番号９、１０または１１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＧＡＴＴＡＡＧＡＧＣＴＴＧＣＴＣＴＴＡＴＧＡＡ（配列番号９）。
ＣＣＧＣＡＴＧＧＴＴＣＧＡＡＡＴ（配列番号１０）。
ＧＣＴＡＧＴＴＧＡＡＴＡＡＧＣＴＧＧＣ（配列番号１１）。
上記バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドの具体例としては、以下の配列番号１２、１３または１４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＴＣＧＴＧＣＧＧＡＣＣＴＴＴＴＡＡＡＡＧ（配列番号１２）。
ＣＣＧＣＡＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＡＧ（配列番号１３）。
ＧＣＣＧＧＧＧＡＡＧＡＡＣＡＡＧ（配列番号１４）。
上記バチルス・スポロサーモデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｏｒｏｔｈｅｒｍｏｄｕｒａｎｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドの具体例としては、以下の配列番号１５、４３または４４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＣＴＣＣＧＣＡＴＧＧＡＧＡＧＡＧＡＴＴ（配列番号１５）。
ＡＡＧＡＧＣＴＴＧＣＴＴＴＴＧＡＴＣＡＧ（配列番号４３）。
ＣＴＴＣＧＣＡＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＴＴＧ（配列番号４４）。
上記バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドの具体例としては、以下の配列番号１６、１７または１８に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＧＣＡＴＧＧＴＴＣＡＡＡＣＡＴＡＡＡＡＧ（配列番号１６）。
ＧＧＣＴＡＣＣＡＣＴＴＡＣＡ（配列番号１７）。
ＧＡＧＣＴＴＧＣＴＣＣＣＴＧＡＴＧＴＴＡ（配列番号１８）。
上記バチルス・リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドの具体例としては、以下の配列番号１９に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＴＧＣＴＣＣＣＴＴＡＧＧＴＣＡＧＣＧＧＣ（配列番号１９）。
上記バチルス・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドの具体例としては、以下の配列番号２０または５５に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＧＧＡＴＧＡＡＡＧＡＣＧＧＴＴＴ（配列番号２０）。
ＣＣＧＧＡＴＡＧＴＴＣＣＴＴＧＡＡＣＣＧ（配列番号５５）。
上記バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドの具体例としては、以下の配列番号２１ないし２５のいずれかに示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＡＧＣＴＴＧ（配列番号２１）。
ＡＧＣＴＴＧＣＴＣＣＣＡＧＡＡＧ（配列番号２２）。
ＴＴＣＴＣＣＴＧＧＡＧＡＡＡＧＧＴＴ（配列番号２３）。
ＡＧＣＴＴＧＣＴＣＣＣＡＧＡＡＧＴＴ（配列番号２４）。
ＣＴＧＧＡＧＡＡＡＧＧＴＴＧＡＡＡＧＡＣ（配列番号２５）。
上記バチルス・ファルマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドの具体例としては、以下の配列番号２６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＧＡＧＧＡＡＡＡＧＣＴＧＡＡＡＧＡＴＧＧ（配列番号２６）。
上記バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドの具体例としては、以下の配列番号２７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＧＡＧＣＧＧＡＣＴＴＴＡＡＡＡＧＣＴＴＧ（配列番号２７）。
上記バチルス・ベンゾエヴォランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｅｎｚｏｅｖｏｒａｎｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドの具体例としては、以下の配列番号２９または３０に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＧＡＧＣＧＧＡＣＴＴＡＡＡＡＡＧＣＴＴＧ（配列番号２９）。
ＧＡＧＣＧＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＡＧ（配列番号３０）。
上記バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドの具体例としては、以下の配列番号３１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＴＡＧＧＡＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＴＧＧＧ（配列番号３１）。
上記バチルス・スファエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドの具体例としては、以下の配列番号３２または３３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＴＣＧＧＣＴＧＴＣＧＣＴＡＴＡＧＧＡＴＧ（配列番号３２）。
ＡＡＧＴＡＣＡＧＴＡＧＴＡＡＣＴＧＧＣＴ（配列番号３３）。
上記アリシクロバチルス・アシドテレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドの具体例としては、以下の配列番号３４、３５または３６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＴＴＴＣＡＧＡＣＴＧＧＡＡＴＡＡＣＡＣＴ（配列番号３４）。
ＡＡＴＡＣＡＣＧＧＧＴＡＧＧＣＡＴＣＴＡ（配列番号３５）。
ＧＧＡＡＡＧＣＴＣＣＴＴＧＴＧＡ（配列番号３６）。
上記アリシクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドの具体例としては、以下の配列番号２８または３７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＴＴＧＧＧＣＣＧＣＴＧＡＧＡＧＡＧ（配列番号２８）。
ＣＧＣＣＣＧＣＧＡＧＧＡＧＧＣＡＴＣＴＴ（配列番号３７）。
上記パエニバチルス・バリダス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖａｌｉｄｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドの具体例としては、以下の配列番号３８、３９または４０に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＧＧＧＧＣＡＡＣＣＴＧＴＧＧＣＴＴＡＣ（配列番号３８）。
ＧＣＴＡＡＧＡＣＣＧＧＡＴＡＧＣＴＧＧＴ（配列番号３９）。
ＣＧＣＣＴＣＧＧＡＧＡＧＴＡＡ（配列番号４０）。
上記バチルス・スミシー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドの具体例としては、以下の配列番号４５または４６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＡＧＣＴＴＧＣＴＴＴＴＴＧＡＡＡＧＴＴＡ（配列番号４５）。
ＧＡＴＡＡＴＡＴＣＴＴＣＣＴＴＣＧＣ（配列番号４６）。
上記アリシクロバチルス・アシディフィラス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドの具体例としては、以下の配列番号４７、４８または４９に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＧＴＴＣＡＡＧＧＧＡＡＧＧＣＡ（配列番号４７）。
ＣＣＧＴＴＧＡＧＧＡＡＡＧＴＴＧＣ（配列番号４８）。
ＡＴＧＣＡＡＣＡＣＴＧＡＴＡＧＡＧ（配列番号４９）。
上記アリシクロバチルス・ヘスペリダム（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｉｄｕｍ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドの具体例としては、以下の配列番号５０または５１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＧＧＴＣＡＣＧＡＧＧＡＧＧＣＡ（配列番号５０）。
ＧＣＡＴＣＴＴＣＴＴＧＴＧＡＧＧＡ（配列番号５１）
上記バチルス・フマリオリ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｕｍａｒｉｏｌｉ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドの具体例としては、以下の配列番号５２または５３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＴＴＧＣＣＣＣＴＴＧＡＧＡＴＴＡＧ（配列番号５２）。
ＴＣＡＴＣＣＴＴＴＣＣＴＴＣＧＣ（配列番号５３）。
上記バチルス・アシドジェネシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｇｅｎｅｓｉｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドの具体例としては、以下の配列番号５４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＣＧＣＡＴＧＧ（配列番号５４）。
上記バチルス・ソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドの具体例としては、以下の配列番号５６または５７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＡＧＣＧＡＡＣＣＧＡＣＧＧＧＡ（配列番号５６）。
ＴＣＣＣＴＴＡＧＧＴＴＡＧＣＧＧＣ（配列番号５７）。  なお上記キャプチャーオリゴは、上記配列番号１〜４０及び４３〜５７に示された、いずれかの塩基配列を含むオリゴヌクレオチドに限定されるものではない。
本発明にかかる細菌検出器具の基板に固定されるキャプチャーオリゴは、対象とする細菌から調製されたプローブとハイブリダイゼーションが成立するものであれば特に限定されるものではない。したがって、上記配列番号１〜４０及び４３〜５７に示されたいずれかの塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１〜４０及び４３〜５７に示されたいずれかの塩基配列のみからなるものであってもよく、配列番号１〜４０及び４３〜５７に示されたいずれかの塩基配列以外の配列を含むものであってもよい。配列番号１〜４０及び４３〜５７に示されたいずれかの塩基配列以外の配列を含むキャプチャーオリゴとしては、配列番号１〜４０及び４３〜５７に示された各塩基配列の５’側もしくは３’側またはその両方に対して、各々の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づいて伸長させた塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができ、このようなオリゴヌクレオチドを基板に固定された細菌検出器具も本発明に含まれる。
１つの基板上に固定するキャプチャーオリゴは、少なくとも１種類以上であればよく、特に上限はない。一般に、試料中に混入した細菌を検出する場合は、被検試料中から検出可能な細菌を１つの基板で網羅的に検出できることが、操作の簡便性および検査の迅速性の観点から好ましいといえる。したがって、本発明にかかる細菌検出器具も、１つの基板上に目的の細菌種または属に対応するキャプチャーオリゴを複数固定した、いわゆるマイクロアレイ型の器具とすることが最も好ましい。
〔オリゴヌクレオチド（キャプチャーオリゴ）の固定〕
オリゴヌクレオチドの基板への固定法は特に限定されるものではなく、公知の方法を適宜選択して用いればよい。例えば、物理的吸着、電気的結合または分子共有結合などの一般的なハイブリダイゼーション法に用いられる手法が利用可能である。本発明にかかる細菌検出器具においては、表面にカルボジイミド基またはイソシアネート基を有する基材を使用し（米国特許：ＵＳ５，９０８，７４６、特開平８−２３９７５号）、固定することが好ましい。
オリゴヌクレオチドをスポッティングする際に、オリゴヌクレオチドのスポット量が少なすぎると、オリゴヌクレオチドとプローブとの間の反応性を十分に確保することができず、判定が困難になることがある。また、高集積度のスポッティングは技術的な問題と同時にコストがかかり、さらにプローブの蛍光標識や化学発色などを用いたハイブリダイゼーションシグナルの検出にもより精密で高額な検出装置（例えば、スキャナー）が必要となる。したがって、オリゴヌクレオチドは、基板の表面に径１０〜１，０００μｍのサイズに固定することが好ましい。オリゴヌクレオチドの基板上へのスポッティング方法は特に限定されるものではない。例えば、スポッティングマシンを使用して基板上にオリゴヌクレオチド溶液をスポッティングすることにより行うことができる。これによりオリゴヌクレオチド溶液は、通常ほぼ円形にスポッティングされる。
（２）本発明にかかる細菌検出方法
本発明にかかる細菌検出方法は、被検試料中の細菌の核酸を調製する核酸調製工程と、当該核酸を鋳型として標識プローブを調製するプローブ調製工程と、対象となる細菌が属する種または属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドと上記標識プローブとのハイブリダイゼーションを行うハイブリダイゼーション工程と、ハイブリダイゼーションシグナルを検出するシグナル検出工程とを含む、被検試料中の細菌を検出・同定するための方法である。本検出方法のハイブリダイゼーション工程においては、上記本発明にかかる細菌検出器具を用いることが好ましい。当該細菌検出器具を用いることにより、簡便、迅速かつ正確に網羅的な検出・同定を行うことが可能となる。また、本検出方法の被検試料としては、食品であることが好ましく、飲料であることがさらに好ましく、清涼飲料水であることが最も好ましい。以下各工程に分けて詳細に説明する。
〔核酸調製工程〕
被検試料中の細菌の核酸を調製する工程である。被検試料からの核酸の調製法は、公知の核酸の調製法を適宜選択して用いることができる。例えば、ＤＮＡの調製は、Ｒ−Ｆ．Ｗａｎｇが紹介する方法に従って抽出することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（２０００）１４，１−５）。この方法は標準的な調製法であるが、多くの代替法があり、いずれを採用して
もよいことは言うまでもない。また、市販のキットを使用してもよい。
〔プローブ調製工程〕
上記核酸調製工程で調製した核酸を鋳型として標識プローブを調製する工程である。プローブは、例えば、キャプチャーオリゴおよび陽性コントロール・キャプチャーオリゴの塩基配列を含む領域を増幅するよう設計されたプライマーを使用して核酸増幅により作製することができる。核酸増幅の方法としては、例えば、ＰＣＲによりＤＮＡとして増幅する方法、あるいはインビトロ・トランスクリプション（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）法によりＲＮＡとして増幅する方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
例えば、ＰＣＲにより標識プローブを調製する場合には、ＰＣＲに用いるプライマーは、プローブがキャプチャーオリゴおよび陽性コントロール・キャプチャーオリゴと相補的な塩基配列を含む領域を増幅するように設計される。なお、ハイブリダイゼーションが可能である限りにおいて、プローブはキャプチャーオリゴまたは陽性コントロール・キャプチャーオリゴよりも長くても短くてもよい。標識プローブを得るために、ＰＣＲに用いるプライマーを予め標識しておくことが可能である。また、ＰＣＲの基質（デオキシヌクレオシド三リン酸）を標識しておくことにより標識プローブを得ることもできる。あるいはＰＣＲ終了後にプローブを標識してもよい。標識物質は特に限定されるものではなく、例えば、蛍光物質、ハプテン、放射性物質等、通常のハイブリダイゼーションに用いるプローブと同様の標識物質を使用することができる。具体的には、蛍光物質としてはフルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ローダミン（Ｒｏｄａｍｉｎｅ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、シアニン系蛍光色素等が、ハプテンとしてはビオチン（ＢＩＯＴＩＮ）、ジゴキシゲニン（Ｄｉｇ）、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、フルオレセイン等を挙げることができる。
〔ハイブリダイゼーション工程〕
ハイブリダイゼーション工程は、対象となる細菌が属する種または属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドと上記標識プローブとのハイブリダイゼーションを行う工程である。ハイブリダイゼーションは上記オリゴヌクレオチドを固定したメンブレン上等で行うことができるが、本発明にかかる細菌検出器具を用いることが好ましい。当該細菌検出器具を用いることにより、簡便、迅速かつ正確に網羅的な検出・同定を行うことが可能となる。ハイブリダイゼーション工程に用いる方法は特に限定されるものではなく、公知の核酸ハイブリダイゼーション方法を適宜選択して用いることができる。以下に、具体的なハイブリダイゼーション方法の一例を示す。
ＳＳＣ（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓａｌｉｎｅ  Ｃｉｔｒａｔｅ）などの塩溶液、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのブロッキング溶液、および融合反応促進のための添加剤からなる融合液に、標識プローブを加える。プローブが２本鎖の場合は熱等による変性を行う。基板上に標識プローブ液を数μＬ添加した後、数時間加熱操作（通常３７〜５０□）を行い、基板上に固定されているオリゴヌクレオチドと標識プローブ間でハイブリッドを形成させる。その後、基板上に５×ＳＳＣまたは３Ｍテトラメチルアンモニウムクロライドを加えて加熱し（通常３７〜５０□）、特異的なハイブリッドを形成していない標識プローブを基板から剥離させ、特異的なハイブリッドのみを選択的に基板上に残す。
〔シグナル検出工程〕
シグナル検出工程は、上記ハイブリダイゼーション工程においてハイブリダイゼーションの成立の有無を判定する工程であり、通常上記ハイブリダイゼーション工程と連続的に行われる。
シグナル検出工程で用いる方法は、上記プローブ調製工程で調製したプローブに導入された標識物質に依存する。すなわち、ハイブリッドの検出には、プローブに導入されている蛍光物質、ハプテン等の標識物質を使用する。したがって、用いたプローブに導入した標識物質を検出するための公知の方法を適宜選択して使用すればよい。
例えば、ハプテンを使用する場合は、ハプテンを認識するタンパクまたはそれに結合するタンパクと、アルカリフォスファターゼまたはホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ等の結合体（酵素コンジュゲート）を含む溶液を基板上に加え、室温で数１０分間反応させる。
ハイブリッドの視覚化には、ハプテンと酵素コンジュゲート結合体のみが存在する場合にのみ不溶化合物が形成されるような化合物を添加する。その不溶性化合物の生成は、酵素反応によって増幅され可視化される。添加される化合物として、酵素コンジュゲート中の酵素がアルカリフォスファターゼの場合には、ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（ＮＢＴ）とＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸−ｐトルイジン塩）が用いられ
、酵素がホースラディッシ・ペルオキシダーゼの場合には、ＴＭＢ（３，３’，５，５’テトラメチルベンチジン）などが用いられる。
キャプチャーオリゴを固定した位置におけるハイブリッドの色素沈着または蛍光発色等のハイブリダイゼーションシグナルを見ることによって、被検試料中に含まれる細菌種の判定を行う。すなわち、ハイブリダイゼーションシグナルが検出された場合には、当該シグナルがある位置にスポットされたオリゴヌクレオチドに対応する細菌が、被検試料中に含まれていることを意味する。なお、陽性コントロール・キャプチャーオリゴの位置にシグナルが認められれば、本試験が正常に機能していることが確認でき、陰性コントロール・キャプチャーオリゴの位置にシグナルが認められなければ、ハイブリダイゼーションが適当な条件で行われたことが確認できる。
（３）本発明にかかる細菌検出キット
本発明にかかる細菌検出キットは、上述の本発明にかかる細菌検出方法を実施するためのキットである。したがって、本発明にかかる細菌検出方法を実施できるものであれば、キットに含まれる構成は特に限定されるものではない。
本細菌検出キットは、本発明にかかる細菌検出器具を含むものであることが好ましい。当該細菌検出器具を含むキットとすることにより、簡便、迅速かつ正確に網羅的な検出・同定を行うことが可能となる。また、本細菌検出キットには、上記ハイブリダイゼーション工程およびシグナル検出工程で使用する試薬を含むことが好ましい。ハイブリダイゼーション工程で用いる試薬としては、例えば、ＳＳＣ（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓａｌｉｎｅ  Ｃｉｔｒａｔｅ）などの塩溶液、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのブロッキング溶液、融合反応促進のための添加剤等を挙げることができる。
また、シグナル検出工程で使用する試薬としては、例えば、ハプテンを認識するタンパクと酵素との結合体（酵素コンジュゲート）や、ＮＢＴ、ＢＣＩＰ、ＴＭＢ等の発色基質等を挙げることができる。
なお、例示したハイブリダイゼーション工程およびシグナル検出工程で使用する試薬は、これらに限定されるものではなく、目的に適合するように適宜適切な試薬を選択してキットの構成とすればよい。
本細菌検出キットには、上記プローブ調製工程で使用する試薬を含むことが好ましく、さらに、上記核酸調製工程で使用する試薬を含むことが好ましい。プローブ調製工程で使用する試薬としては、例えば、ＰＣＲ用緩衝液、耐熱性ＤＮＡ合成酵素、デオキシヌクレオシド三リン酸混合液等を挙げることができ、核酸調製工程で使用する試薬としては、溶菌用緩衝液、ＤＮＡ回収用カラム、ＤＮＡ抽出用緩衝液等を挙げることができる。ただしこれらに限定されるものではなく、目的に適合するように適宜適切な試薬を選択してキットの構成とすればよい。
本発明にかかるキット（本発明にかかる細菌検出器具および各工程に使用する試薬を含むもの）を用いることにより、被検試料受領後約６時間で被検試料中に含まれる細菌の検出・同定を実施することができる。
（４）本発明の用途
本発明にかかる細菌検出器具、細菌検出方法および細菌検出キットの用途は特に限定されるものではなく、細菌の判定が必要な用途全てに用いることができる。具体的には、例えば、細菌による汚染が品質に大きな影響を及ぼす各種工業製品の製造工程で、同工業製品やその製造環境等から分離された細菌を迅速かつ正確に検出・同定する必要がある場合に好適に用いられる。
判定の対象となる被判定細菌の由来となる上記工業製品としては、代表的なものとして、食品、医薬品・試薬・医薬部外品、使い捨ての医療用器具等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。本発明は上記例示した工業製品のなかでの食品に応用することが好ましい。食品としては、より具体的には、飲料（清涼飲料水、アルコール飲料、濃縮還元果汁、天然果汁、果汁飲料、コーヒー飲料）、パン、和洋菓子（冷菓等も含む）、惣菜食品、乳製品、シリアル食品、豆腐・油揚げ類、麺類、弁当類、調味料、小麦粉や食肉等の農産加工品、栄養補助食品（サプリメント等）、長期保存食品（缶詰、冷凍食品、レトルト食品等）等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
本発明は、上記例示した食品のなかでも、特に清涼飲料水に好適に応用することができる。清涼飲料水としては、麦茶・ウーロン茶・緑茶・ほうじ茶等のお茶類等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】  〔オリゴヌクレオチドの合成〕
定法に従い、オリゴヌクレオチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてオリゴヌクレオチドを合成し、脱保護を施した後、乾燥させた。このオリゴヌクレオチド乾燥体を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）・１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液を用いて溶解し、１００ｐｍｏｌ／μｌのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。本実施例に使用したすべてのオリゴヌクレオチドはこの方法で合成した。
合成したオリゴヌクレオチドの塩基配列を配列番号１〜５７に示した。これらのうち、配列番号１〜４０及び４３〜５７がキャプチャーオリゴであり、配列番号４１，４２がプライマーである。キャプチャーオリゴヌクレオチドについては上記合成機を用いて５’末端にアミノ基を結合させ、プライマーは５’末端にビオチンを結合させた。
〔基板へのキャプチャーオリゴヌクレオチドのスポッティング〕
５’末端にアミノ基を有するオリゴヌクレオチド溶液１０μｌに対してマイクロスポッティング溶液（ＴｅｌｅＣｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．製）を１０μｌ混合し、マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｃ．製）上に分注した。スポッティングマシンの所定の位置にカルボジイミド樹脂処理スライドグラスＣａｒｂｏｓｔａｔｉｏｎ（日清紡績株式会社製、登録商標）を配置し、スポッティングマシンを作動させた。
スポッティング終了後、スライドグラスに熱水からの蒸気を数秒間あて、その後紫外線を６００ｍＪ照射した。再度蒸気に数秒間曝露した後、ホットプレート上にスライドグラスを置いて水分を除去した。
スライドグラスを３％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）・１００ｍＭ  ＮａＣｌ・０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に室温で３０分間浸し、ブロッキングした。その後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）・１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液で洗浄した。
スライドグラスを室温で乾燥させ、使用まで乾燥状態で冷暗所にて保存した。
〔核酸調製工程〕
検体として用いた細菌は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属するバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・スポロサーモデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｏｒｏｔｈｅｒｍｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ファルマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ベンゾエヴォランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｅｎｚｏｅｖｏｒａｎｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・スファエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、バチルス・スミシー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ）、バチルス・フマリオリ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｕｍａｒｉｏｌｉ）、バチルス・アシドジェネシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｇｅｎｅｓｉｓ）及びバチルス・ソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）を用いた。
上記に加え、アリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属するアリシクロバチルス・アシドテレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、アリシクロバチルス・アシディフィラス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｓ）及びアリシクロバチルス・ヘスペリダム（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｉｄｕｍ）を検体として用いた。
また上記に加え、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属するパエニバチルス・バリダス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖａｌｉｄｕｓ）、パエニバチルス・イリノイセンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｌｌｉｎｏｉｓｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・アルベイ（Ｐａｅｎｉｂａｅｉｌｌｕｓ  ａｌｖｅｉ）、パエニバチルス・ポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）を検体として用いた。
また上記に加え、アネウリニバチルス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属するアネウリニバチルス・アネウリノリティカス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）を検体として用いた。
また上記に加え、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属するゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）を検体として用いた。
また上記に加え、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属するブレビバチルス・ブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）を検体として用いた。
一方、対照検体として、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・キャピティス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、ラクトバチルス・デルブルッキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）を用いた。
上記各細菌を最適な培養条件で培養した菌液から、Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆ．Ｋｉｔ（ＥｄｇｅＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ製、Ｃａｔ．Ｎｏ．＃８５１７１）を用いて各細菌のゲノムＤＮＡをそれぞれ調製した。
〔プローブ調製工程〕
得られた各細菌のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによりプローブ核酸を調製した。ＰＣＲ反応液の組成は、Ｔａｑポリメラーゼ：２．５ｕｎｉｔ、ビオチン化プライマー（配列番号４１および４２）：各５０ｐｍｏｌ、１０×反応用緩衝液：５μｌ、ｄＮＴＰ：各１０ｎｍｏｌ、鋳型ＤＮＡ：１００ｎｇに
滅菌蒸留水を加えて総量５０μｌとした。サーマルサイクラーを用いて、９５□で３分間保持した後、９５□：３０秒間、５７□：３０秒間、７２□：１分間の反応を４０サイクル行い、７２□で５分間保持して反応を終了した。
〔ハイブリダイゼーション工程およびシグナル検出工程〕
上記プローブ核酸溶液４μｌと、ＡｒｒａｙＩｔ  Ｕｎｉｈｙｂ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴｅｌｅＣｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．製、登録商標）１６μｌとを加えて混合し、９５□で１分間加熱処理を行った後、氷中に１分間浸した。このプローブ核酸溶液を全量とり、キャプチャーオリゴヌクレオチドを固定した基板に載せ、その上にカバーグラスを載せた。これを保湿箱に入れ、３７□に設定した恒温器中に１２０分間静置した。基板を取り出し、すばやく室温下で２×ＳＳＣ溶液（２×ＳＳＣ：０．０３３Ｍ  ＮａＣｌ、０．０３３Ｍ  クエン酸ナトリウム）に浸してカバーグラスを除去し、３７□に保温した２×ＳＳＣ中に５分間浸した。
基板を２×ＳＳＣから取り出し、遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）にセットして、２，０００ｒｐｍで１分間遠心した。次にＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  ｋｉｔ（ＶＥＣＴＯＲ社製）を用いてアビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体を作製し、基板上に１．４ｍｌ滴下して室温で３０分間静置した。
その後、ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、０．９％塩化ナトリウム）中で洗浄した。ＴＭＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｋｉｔ  ｆｏｒ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＶＥＣＴＯＲ社製）を用いて発色溶液を作製し、基板上
に１．４ｍｌ滴下して室温で３０分間静置した。基板を蒸留水で洗浄して発色反応を止めた。
〔判定〕
ＥＰＳＯＮ社製スキャナーＧＴ−８７００Ｆ、およびその透過型ユニットを用いてハイブリダイゼーションを行った領域を６００ｄｐｉにてスキャンし、スキャン画像を目視により発色の有無を確認した。
〔結果〕
検体として用いた２１種類の各細菌についての結果を表１〜２１に示した。
なお各表とも「＋」が発色の確認されたスポットを表し、「−」が発色の確認されなかったスポットを表す。
表１にバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の結果を示す。
【表１】
2006014022.tif 000002
表１によれば、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャー（配列番号２，３）と、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ検出用キャプチャー（配列番号１６，１７，１８）の合計５箇所に発色が確認された。
表２にバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）の結果を示す。
【表２】
2006014022.tif 000003
表２によれば、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャー（配列番号１，３）と、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ検出用キャプチャー（配列番号１２，１３，１４）の合計５箇所に発色が確認された。
表３にバチルス・スファエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）の結果を示す。
【表３】
2006014022.tif 000004
表３によれば、バチルス・スファエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャー（配列番号１）と、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ検出用キャプチャー（配列番号３２，３３）の合計３箇所に発色が確認された。
表４にバチルス・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）の結果を示す。
【表４】
2006014022.tif 000005
表４によれば、バチルス・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャー（配列番号３）と、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ検出用キャプチャー（配列番号２０，５５）の合計３箇所に発色が確認された。
表５にバチルス・スポロサーモデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｏｒｏｔｈｅｒｍｏｄｕｒａｎｓ）の結果を示す。
【表５】
2006014022.tif 000006
表５によれば、バチルス・スポロサーモデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｏｒｏｔｈｅｒｍｏｄｕｒａｎｓ）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャー（配列番号３）と、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｏｒｏｔｈｅｒｍｏｄｕｒａｎｓ検出用キャプチャー（配列番号１５及び４３）の合計３箇所に発色が確認された。
表６にバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）の結果を示す。
【表６】
2006014022.tif 000007
表６によれば、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍはＢａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャー（配列番号１，３）と、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ検出用キャプチャー（配列番号３１）の合計３箇所に発色が確認された。
表７にバチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）の結果を示す。
【表７】
2006014022.tif 000008
表７によれば、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャー（配列番号１，３）と、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ検出用キャプチャー（配列番号２１、２２，２３，２４，２５）の合計７箇所に発色が確認された。
表８にバチルス・ファルマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）の結果を示す。
【表８】
2006014022.tif 000009
表８によれば、バチルス・ファルマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャー（配列番号１，３）と、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ検出用キャプチャー（配列番号２６）の合計３箇所に発色が確認された。
表９にバチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）の結果を示す。
【表９】
2006014022.tif 000010
表９によれば、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャー（配列番号１，３）と、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ検出用キャプチャー（配列番号２７）の合計３箇所に発色が確認された。
表１０にバチルス・ベンゾエヴォランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｅｎｚｏｅｖｏｒａｎｓ）の結果を示す。
【表１０】
2006014022.tif 000011
表１０によれば、バチルス・ベンゾエヴォランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｅｎｚｏｅｖｏｒａｎｓ）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャー（配列番号１，３）と、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｅｎｚｏｅｖｏｒａｎｓ検出用キャプチャー（配列番号３０）の合計３箇所に発色が確認された。
表１１にバチルス・リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の結果を示す。
【表１１】
2006014022.tif 000012
表１１によれば、バチルス・リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャー（配列番号２，３）と、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ検出用キャプチャー（配列番号１９）の合計３箇所に発色が確認された。
表１２にアリシクロバチルス・アシドテレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）の結果を示す。
【表１２】
2006014022.tif 000013
表１２によれば、アリシクロバチルス・アシドテレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）は、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャー（配列番号５）と、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ検出用キャプチャー（配列番号３４，３５，３６）の合計４箇所に発色が確認された。
表１３にアリシクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）の結果を示す。
【表１３】
2006014022.tif 000014
表１３によれば、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）は、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャー（配列番号５）と、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ検出用キャプチャー（配列番号２８，３７）の合計３箇所に発色が確認された。
表１４にアネウリニバチルス・アネウリノリティカス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）の結果を示す。
【表１４】
2006014022.tif 000015
表１４によれば、アネウリニバチルス・アネウリノリティカス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャー（配列番号３）と、Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャー（配列番号６）の合計２箇所に発色が確認された。
表１５にゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の結果を示す。
【表１５】
2006014022.tif 000016
表１５によれば、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャー（配列番号１）とＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャー（配列番号７）の合計２箇所に発色が確認された。
表１６にパエニバチルス・バリダス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖａｌｉｄｕｓ）の結果を示す。
【表１６】
2006014022.tif 000017
表１６によれば、パエニバチルス・バリダス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖａｌｉｄｕｓ）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャー（配列番号３）と、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャー（配列番号８）と、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖａｌｉｄｕｓ検出用キャプチャー（配列番号３８，３９，４０）の合計５箇所に発色が確認された。
表１７にバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）の結果を示す。
【表１７】
2006014022.tif 000018
表１７によれば、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ検出用キャプチャー（配列番号９，１０，１１）の合計３箇所に発色が確認された。
表１８にパエニバチルス・イリノイセンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｌｌｉｎｏｉｓｅｎｓｉｓ）の結果を示す。
【表１８】
2006014022.tif 000019
表１８によれば、パエニバチルス・イリノイセンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｃ  ｉｌｌｉｎｏｉｓｅｎｓｉｓ）は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャー（配列番号８）の１箇所に発色が確認された。
表１９にパエニバチルス・アルベイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｖｅｉ）の結果を示す。
【表１９】
2006014022.tif 000020
表１９によれば、パエニバチルス・アルベイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｖｅｉ）は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャー（配列番号８）の１箇所に発色が確認された。
表２０にパエニバチルス・ポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）の結果を示す。
【表２０】
2006014022.tif 000021
表２０によれば、パエニバチルス・ポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャー（配列番号８）の１箇所に発色が確認された。
表２１にブレビバチルス・ブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）の結果を示す。
【表２１】
2006014022.tif 000022
表２１によれば、ブレビバチルス・ブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）は、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャー（配列番号４）の１箇所に発色が確認された。
表２２にバチルス・スミシー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ）の結果を示す。
【表２２】
2006014022.tif 000023
表２２によれば、バチルス・スミシー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャー（配列番号１及び３）とＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ検出用キャプチャー（配列番号４５及び４６）の合計４箇所に発色が確認された。
表２３にアリシクロバチルス・アシディフィラス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｓ）の結果を示す。
【表２３】
2006014022.tif 000024
表２３によれば、アリシクロバチルス・アシディフィラス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｓ）は、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャー（配列番号５）とＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｓ検出用キャプチャー（配列番号４７〜４９）の合計４箇所に発色が確認された。
表２４にアリシクロバチルス・ヘスペリダム（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｉｄｕｍ）の結果を示す。
【表２４】
2006014022.tif 000025
表２４によれば、アリシクロバチルス・ヘスペリダム（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｉｄｕｍ）は、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャー（配列番号５）とＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｉｄｕｍ検出用キャプチャー（配列番号５０及び５１）の合計３箇所に発色が確認された。
表２５にバチルス・フマリオリ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｕｍａｒｉｏｌｉ）の結果を示す。
【表２５】
2006014022.tif 000026
表２５によれば、バチルス・フマリオリ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｕｍａｒｉｏｌｉ）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャー（配列番号１及び３）とＢａｃｉｌｌｕｓ  ｆｕｍａｒｉｏｌｉ検出用キャプチャー（配列番号５２及び５３）の合計４箇所に発色が確認された。
表２６にバチルス・アシドジェネシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｇｅｎｅｓｉｓ）の結果を示す。
【表２６】
2006014022.tif 000027
表２６によれば、バチルス・アシドジェネシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｇｅｎｅｓｉｓ）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャー（配列番号１〜３）とＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｇｅｎｅｓｉｓ検出用キャプチャー（配列番号５４）の合計４箇所に発色が確認された。
表２７にバチルス・ソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）の結果を示す。
【表２７】
2006014022.tif 000028
表２７によれば、バチルス・ソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャー（配列番号１〜３）とＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ検出用キャプチャー（配列番号５６及び５７）の合計３箇所に発色が確認された。
また、対照菌種としてエシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・キャピティス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、ラクトバチルス・デルブルッキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）からは全てのキャプチャーに対して発色が得られなかった（データ省略）。
これらの結果より、本実施例にかかる細菌検出器具（基板）は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アネウリニバチルス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属を特異的に検出し、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、パエニバチルス・バリダス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖａｌｉｄｕｓ）、バチルス・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・スファエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、アリシクロバチルス・アシドテレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｅｓｔｒｉｓ）、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｒｄａｒｉｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ファルマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ベンゾエヴォランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｅｎｚｏｅｖｏｒａｎｓ）、バチルス・リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・スミシー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ）、バチルス・フマリオリ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｕｍａｒｉｏｌｉ）、バチルス・アシドジェネシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｇｅｎｅｓｉｓ）、バチルス・ソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、アリシクロバチルス・アシディフィラス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｓ）、アリシクロバチルス・ヘスペリダム（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｉｄｕｍ）などを種特異的に分けることが出来る基板であることが確認された。
【産業上の利用可能性】  本発明は、被検試料中に混入している細菌を簡便な操作で迅速かつ正確に判定することができる細菌検出器具、細菌検出方法および細菌検出キットを提供するものである。したがって、本発明は、食品製造業、飲食産業、薬品産業等における衛生管理、工程管理、品質管理に利用することが可能である。
【配列表】
2006014022000001.xml
【国際調査報告】
2006014022.tif 000041
2006014022.tif 000042
2006014022.tif 000043
2006014022.tif 000044