(57)【要約】本発明は、タクリン化合物、または配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質とタクリン化合物との結合を促進する化合物などを含有する癌の予防・治療剤などを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩および（ｂ）タクリン化合物を用いることを特徴とする、該蛋白質またはその塩とタクリン化合物との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項２】
タクリン化合物が、下式
2006095897.tif 000013
〔式中、環Ａは、置換基を有していてもよいベンゼン環、
Ｒ１は、置換基を有していてもよいアミノ、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ置換基を有していてもよい炭化水素基、置換基を有していてもよい複素環基またはアシルを示し、あるいは
Ｒ２およびＲ３は、互いに結合して隣接する炭素原子と共に、置換基を有していてもよい３ないし１０員同素または複素環を形成していてもよい〕で表される化合物またはその塩である請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩および（ｂ）タクリンを用いる請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４で表されるアミノ酸配列である請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
（ａ）タクリン化合物を、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、（ｂ）タクリン化合物および試験化合物を、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、タクリン化合物の該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する結合量を測定し、比較する、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
（ａ）タクリン化合物を、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、（ｂ）タクリン化合物および試験化合物を、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、タクリン化合物の該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較する、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩が、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である請求項６記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
タクリン化合物が、標識したタクリン化合物である請求項５〜請求項７記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
（ａ）タクリン化合物を、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、（ｂ）タクリン化合物および試験化合物を、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を介した細胞刺激活性を測定し、比較する、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
（ａ）タクリン化合物を、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、（ｂ）タクリン化合物および試験化合物を、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を介した細胞刺激活性を測定し、比較する、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩が、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である請求項１０記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩および（ｂ）タクリン化合物を含有することを特徴とする、該蛋白質またはその塩とタクリン化合物との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット
【請求項１３】
タクリン化合物を含有してなる癌の予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤または（および）癌細胞の増殖抑制剤。
【請求項１４】
タクリン化合物の活性を促進することを特徴とする癌の予防・治療法、癌細胞のアポトーシス促進法または（および）癌細胞の増殖抑制法。
【請求項１５】
タクリン化合物の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする癌の予防・治療法、癌細胞のアポトーシス促進法または（および）癌細胞の増殖抑制法。
【請求項１６】
癌の予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤または癌細胞の増殖抑制剤の製造のための、タクリン化合物の使用。
【請求項１７】
タクリン化合物の活性を阻害することを特徴とする心疾患の予防・治療法または（および）心筋細胞のアポトーシスの予防・治療法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＰＲ３０受容体とタクリン化合物とを用いる医薬のスクリーニング方法およびスクリーニング用キット、該スクリーニング方法またはキットによって得られうる化合物などに関する。詳細には、癌、心疾患などの予防・治療剤などのスクリーニング方法およびスクリーニング用キットなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＧＰＣＲ）は、７回膜貫通型受容体で、ホルモン、神経伝達物質、サイトカインや他の分子のシグナルを細胞膜内へ伝える働きを行っている。ＧＰＣＲの一つとして知られているヒトＧＰＲ３０（ｈＧＰＲ３０）（Ｏｗｍａｎ，Ｃ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２２８巻、２８５−２９２頁、１９９６年）については、以下のような報告がある。
ヒト臍帯静脈内皮細胞をＳｈｅａｒ  ＳｔｒｅｓｓにさらすとｈＧＰＲ３０の発現量が増加する（Ｔａｋａｄａ，Ｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２４０巻、７３４−７４１頁、１９９７年）。心筋由来細胞におけるラットＧＰＲ３０（ｒＧＰＲ３０、ＧＰＲ４１とも呼ばれる）の発現量は低酸素刺激後に通常の培養に戻すことにより誘導される（Ｋｉｍｕｒａ，Ｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６巻、２６４５３−２６４６０頁、２００１年）。
ｈＧＰＲ３０は、エストロジェン・レセプター（ＥＲ）が発現している乳癌組織、乳癌由来細胞株および胎盤に発現している（Ｃａｒｍｅｃｉ，Ｃ．ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４５巻、６０７−６１７頁、１９９７年）。乳癌由来細胞ＭＣＦ７に対して、エストロゲン存在下でプロゲスチン刺激を行うと、ＧＰＲ３０の発現量は増加する（Ａｈｏｌａ，Ｔ．Ｍ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２６９巻、２４８５−２４９０頁、２００２年）。性ホルモンは多くの生殖機能の調節を行うことが知られ、例えば、子宮ではプロゲステロンはエストロゲンが誘導する子宮内膜上皮細胞の増殖を阻害する。一方、乳腺でのプロゲステロンの働きはまだ解明されていないことが多い。プロゲスチンは、乳癌細胞、正常な乳腺上皮細胞の増殖を阻害する。プロゲスチンによるＭＣＦ７細胞の増殖阻害はＧＰＲ３０の発現量が増加することにより引き起こされることをａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡを用いた実験により示し、ＧＰＲ３０が乳癌由来細胞の増殖の抑制に関わっている可能性が示された（Ａｈｏｌａ，Ｔ．Ｍ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４３巻、３３７６−３３８４頁、２００２年）。さらに、プロゲスチンとＧＰＲ３０による乳癌由来細胞の増殖阻害はＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）の活性化の阻害によることも示されている（Ａｈｏｌａ，Ｔ．Ｍ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４３巻、４６２０−４６２６頁、２００２年）。一方、ＭＣＦ７などの乳癌由来細胞においてＧＰＲ３０を介したエストロゲンによるＭＡＰＫの活性化が報告されている（Ｆｉｌａｒｄ，Ｅ．Ｊ．ら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１４巻、１４６９−１６６０頁、２０００年）。これは、ＭＣＦ７などの乳癌由来細胞の細胞表面に存在する膜結合型ＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）がＧＰＲ３０活性化によって可溶化し、ＥＧＦ受容体が活性化されるためであることが示唆された（Ｆｉｌａｒｄ，Ｅ．Ｊ．ら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１４巻、１４６９−１６６０頁、２０００年）。しかし、同時にエストロゲン刺激によってＧＰＲ３０を介した細胞内ｃＡＭＰ濃度が上昇し、ＰＫＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ａ）活性化によってＲａｆが抑制されてＭＡＰＫの活性化が減弱されることも示された（Ｆｉｌａｒｄ，Ｅ．Ｊ．ら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１６巻、７０−８４頁、２００２年）。これらの事実は、ＧＰＲ３０がエストロゲンの細胞膜型受容体であることを示しており、最近、薬理学的な解析が報告された（Ｔｈｏｍａｓ，Ｔ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４６巻、６２４−６３２頁、２００５年）。
タクリン（１，２，３，４−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−９−ａｃｒｉｄｉｎａｍｉｎｅ）はアセチルコリンエステラーゼ阻害物質であり、アルツハイマー病治療薬として使用されているものの、エストロゲンの核内受容体に作用することは報告されていない。
【発明の開示】
【０００３】
安全で優れた癌や心疾患の予防・治療剤が求められている。
本発明者たちは、上記の課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、タクリンによる刺激で、ＧＰＲ３０発現ＣＨＯ細胞の細胞内カルシウムを特異的に上昇させること、さらにはタクリンがＧＰＲ３０のリガンドであることを見出した。ＧＰＲ３０はエストロゲンの膜結合型受容体であることが示唆されており、乳癌由来細胞においてＭＡＰＫの活性化を抑制することが知られている。エストロゲンは、核内受容体を介して多様な生理作用を示すことが知られており、ＧＰＲ３０の作用を明らかにするためには核内受容体に作用しないＧＰＲ３０特異的なリガンドが必要とされていたため、ＧＰＲ３０とタクリンまたはその関連化合物を用いて、癌などに有効な医薬の探索が可能となる。これらの知見に基づき、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
〔１〕（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩および（ｂ）タクリン化合物を用いることを特徴とする、該蛋白質またはその塩とタクリン化合物との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
〔２〕タクリン化合物が、下式
2006095897.tif 000002
〔式中、環Ａは、置換基を有していてもよいベンゼン環、
Ｒ１は、置換基を有していてもよいアミノ、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ置換基を有していてもよい炭化水素基、置換基を有していてもよい複素環基またはアシルを示し、あるいは
Ｒ２およびＲ３は、互いに結合して隣接する炭素原子と共に、置換基を有していてもよい３ないし１０員同素または複素環を形成していてもよい〕で表される化合物またはその塩〔以下、化合物（Ｉ）と略記することもある〕である上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔３〕（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩および（ｂ）タクリンを用いる上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔４〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４で表されるアミノ酸配列である上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔５〕（ａ）タクリン化合物を、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、（ｂ）タクリン化合物および試験化合物を、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、タクリン化合物の該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する結合量を測定し、比較する、上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔６〕（ａ）タクリン化合物を、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、（ｂ）タクリン化合物および試験化合物を、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、タクリン化合物の該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較する、上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔７〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩が、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である上記〔６〕記載のスクリーニング方法、
〔８〕タクリン化合物が、標識したタクリン化合物である上記〔５〕〜〔７〕記載のスクリーニング方法、
〔９〕（ａ）タクリン化合物を、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、（ｂ）タクリン化合物および試験化合物を、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を介した細胞刺激活性を測定し、比較する、上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔１０〕（ａ）タクリン化合物を、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、（ｂ）タクリン化合物および試験化合物を、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を介した細胞刺激活性を測定し、比較する、上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔１１〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩が、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である上記〔１０〕記載のスクリーニング方法、
〔１２〕（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩および（ｂ）タクリン化合物を含有することを特徴とする、該蛋白質またはその塩とタクリン化合物との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
〔１２ａ〕上記〔１〕記載のスクリーニング方法または上記〔１２〕記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩、
〔１２ｂ〕化合物が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩とタクリン化合物との結合を阻害する化合物またはその塩である上記〔１２ａ〕記載の化合物またはその塩、
〔１２ｃ〕アゴニストである上記〔１２ｂ〕記載の化合物またはその塩、
〔１２ｄ〕アンタゴニストである上記〔１２ｂ〕記載の化合物またはその塩、
〔１２ｅ〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩とタクリン化合物との結合を阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬、
〔１２ｆ〕上記〔１２ｃ〕記載の化合物またはその塩を含有してなる癌の予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤または（および）癌細胞の増殖抑制剤、
〔１２ｇ〕上記〔１２ｄ〕記載の化合物またはその塩を含有してなる心疾患の予防・治療剤または（および）心筋細胞のアポトーシスの予防・治療剤、
〔１３〕タクリン化合物を含有してなる癌の予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤または（および）癌細胞の増殖抑制剤、
〔１４〕タクリン化合物の活性を促進することを特徴とする癌の予防・治療法、癌細胞のアポトーシス促進法または（および）癌細胞の増殖抑制法、
〔１５〕タクリン化合物の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする癌の予防・治療法、癌細胞のアポトーシス促進法または（および）癌細胞の増殖抑制法、
〔１６〕癌の予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤または癌細胞の増殖抑制剤の製造のための、タクリン化合物の使用、
〔１７〕タクリン化合物の活性を阻害することを特徴とする心疾患の予防・治療法または（および）心筋細胞のアポトーシスの予防・治療法などを提供する。
以下、「配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドもしくはその塩」を「本発明の受容体」または「本発明の蛋白質」と略記する場合がある。
さらに、本発明は、
（ｉ）標識したＧＴＰγＳの存在下、タクリン化合物を本発明の受容体細胞膜画分に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を本発明の受容体細胞膜画分に接触させた場合における、本発明の受容体細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を測定し、比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｉｉ）細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる物質の存在下、タクリン化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、該細胞の細胞内ｃＡＭＰの産生抑制活性を測定し、比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｉｉｉ）細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる物質の存在下、タクリン化合物を、ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを導入した本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを導入した本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｉｖ）タクリン化合物を、ＳＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを導入した本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、ＳＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを導入した本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｖ）タクリン化合物を、標識したアラキドン酸を含有する本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、標識したアラキドン酸を含有する本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、アラキドン酸代謝物の放出活性を測定し、比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｖｉ）タクリン化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、細胞内カルシウム濃度上昇活性を測定し、比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｖｉｉ）標識したイノシトールの存在下、タクリン化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、イノシトール三リン酸産生活性を測定し、比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｖｉｉｉ）タクリン化合物を、ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを導入した本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを導入した本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｉｘ）タクリン化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、細胞増殖を測定し、比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｘ）標識したルビジウムの存在下、タクリン化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、標識したルビジウムの流出活性を測定し、比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｘｉ）タクリン化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、細胞外のｐＨ変化を測定し、比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｘｉｉ）ヒスチジン合成遺伝子を導入した本発明の受容体発現酵母を、ヒスチジン欠乏培地で培養し、タクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物を接触させ、該酵母の生育を測定し、比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｘｉｉｉ）タクリン化合物を、本発明の受容体遺伝子ＲＮＡ導入アフリカツメガエル卵母細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、本発明の受容体遺伝子ＲＮＡ導入アフリカツメガエル卵母細胞に接触させた場合における、細胞膜電位の変化を測定し、比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法なども提供する。
タクリン化合物（例、化合物（Ｉ））、タクリン化合物の活性を促進する化合物またはその塩、本発明の受容体（例、ＧＰＲ３０など）とタクリン化合物との結合を促進する化合物またはその塩などは、例えば、癌（例、脳腫瘍、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、肝細胞癌、膵癌、膵内分泌腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、陰茎癌、腎臓癌、腎盂癌、尿管癌、腎細胞癌、精巣腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、外陰癌、子宮癌、子宮頚部癌、子宮体部癌、子宮肉腫、絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、菌状息肉症、基底細胞腫、軟部肉腫、悪性リンパ腫、ホジキン病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、成人Ｔ細胞白血病、慢性骨髄増殖性疾患、膵内分泌腫瘍、原発不明癌など）などの予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖抑制剤などとして有用である。
タクリン化合物の活性を阻害する化合物またはその塩などは、例えば、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）の予防・治療剤、心筋細胞のアポトーシスの予防・治療剤などとして有用である。
また、本発明の受容体（例、ＧＰＲ３０など）およびタクリン化合物は、例えば、癌（例、脳腫瘍、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、肝細胞癌、膵癌、膵内分泌腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、陰茎癌、腎臓癌、腎盂癌、尿管癌、腎細胞癌、精巣腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、外陰癌、子宮癌、子宮頚部癌、子宮体部癌、子宮肉腫、絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、菌状息肉症、基底細胞腫、軟部肉腫、悪性リンパ腫、ホジキン病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、成人Ｔ細胞白血病、慢性骨髄増殖性疾患、膵内分泌腫瘍、原発不明癌など）などの予防・治療作用、癌細胞のアポトーシス促進作用、癌細胞の増殖抑制作用、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）の予防・治療作用、心筋細胞のアポトーシスの予防・治療作用を有する化合物またはその塩のスクリーニングに有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、タクリンに対するヒトＧＰＲ３０細胞の蛍光強度の継時的変化を表す。図中、□はタクリン６７μＭ、△はタクリン２０μＭ、○はタクリン６．７μＭ、■はタクリン２μＭ、●はタクリン０．６７μＭの場合をそれぞれ表す。
図２は、タクリンに対するラットＧＰＲ３０細胞の蛍光強度の継時的変化を表す。図中、□はタクリン６７μＭ、△はタクリン２０μＭ、○はタクリン６．７μＭ、■はタクリン２μＭ、●はタクリン０．６７μＭの場合をそれぞれ表す。
図３は、タクリンに対するＧＰＲ３０を発現させないＣＨＯ細胞株の蛍光強度の継時的変化を表す。図中、□はタクリン６７μＭ、△はタクリン２０μＭ、○はタクリン６．７μＭ、■はタクリン２μＭ、●はタクリン０．６７μＭの場合をそれぞれ表す。
図４は、種々の濃度のタクリンに対するヒトＧＰＲ３０細胞、ラットＧＰＲ３０細胞、ＧＰＲ３０を発現させないＣＨＯ細胞株のＦＬＩＰＲにおける蛍光強度の最高値を表す。図中、○はヒトＧＰＲ３０細胞、□はラットＧＰＲ３０細胞、△はＧＰＲ３０を発現させないＣＨＯ細胞株をそれぞれ表す。
図５は、種々の濃度のタクリンに対するヒトＧＰＲ３０を発現するＨｅＬａ細胞およびＧＰＲ３０を発現させないＨｅＬａ細胞のルシフェラーゼ活性を表す。図中、■はヒトＧＰＲ３０を発現するＨｅＬａ細胞、□はＧＰＲ３０を発現させないＨｅＬａ細胞のルシフェラーゼ活性の相対値をそれぞれ表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、網膜細胞、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、網膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例、ＭＥＬ，Ｍ１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，ＷＥＨＩ−３，ＨＬ−６０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，ＭＬ−１，ＭＯＬＴ−３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１０，ＣＣＲＦ−ＣＥＭ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵＴ−７８，ＨＵＴ−１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−１，ＨＥＬ，ＪＫ−１，ＣＭＫ，ＫＯ−８１２，ＭＥＧ−０１など）に由来する蛋白質であってもよく、合成蛋白質であってもよい。
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列、配列番号：４で表されるアミノ酸配列などが挙げられる。
実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性やシグナル情報伝逹作用などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、後に記載するリガンドの決定方法やスクリーニング方法に従って測定することができる。
また、本発明の受容体としては、（ｉ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。
本発明の受容体の具体例としては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質（ヒトＧＰＲ３０）、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質（ラットＧＰＲ３０）、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質（マウスＧＰＲ３０）、配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質（ヒトＧＰＲ３０）などが挙げられる。
本発明の受容体の部分ペプチド（以下、本発明の部分ペプチドと称する場合がある）としては、後述の医薬等のスクリーニング方法に用いることのできる部分ペプチドであれば、いかなるものであってもよく、例えば、本発明の蛋白質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位であって、実質的に同質のリガンド結合活性などを有するものなどが用いられる。
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質の部分ペプチドとしては、疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）部位）であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでもよい。
本発明の部分ペプチドのアミノ酸の数は、本発明の蛋白質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
ここで、「実質的に同質の活性」とは、上記と同意義を示す。「実質的に同質の活性」の測定は上記と同様に行なうことができる。
また、本発明の部分ペプチドは、（ｉ）上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失し、（ｉｉ）上記アミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加し、または（ｉｉｉ）上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
具体例としては、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４で表されるアミノ酸配列の第５９〜１０２番目、第１６７〜１９８番目、第２０３〜２２４番目または第３１５〜３３８番目のアミノ酸配列を含む部分ペプチドなどが用いられる。
本発明の受容体および本発明の部分ペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。Ｃ末端はカルボキシ（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキルもしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキルなどのＣ７−１４アラルキルのほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチルなどが用いられる。
本発明の受容体および本発明の部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシ（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシがアミド化またはエステル化されているものも本発明の受容体および本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明の受容体および本発明の部分ペプチドには、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル、アセチルなどのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシルなど）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル、アセチルなどのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシルなど）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
本発明の受容体または本発明の部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
タクリン化合物としては、本発明の受容体と特異的に結合するタクリンまたはその関連化合物であればよく、例えば、本発明の受容体との結合の解離定数が１０μＭ以下、好ましくは２μＭ以下、さらに好ましくは１μＭ以下、特に好ましくは２００ｎＭ以下、最も好ましくは１００ｎＭ以下である化合物などが挙げられる。
タクリン化合物としては、例えば化合物（Ｉ）などが挙げられる。
式（Ｉ）中、環Ａで示される「置換基を有していてもよいベンゼン環」の「置換基」としては、例えば、ハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）、Ｃ１−３アルキレンジオキシ（例、メチレンジオキシ、エチレンジオキシなど）、ニトロ、シアノ、ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキル、ハロゲン化されていてもよいＣ２−６アルケニル、カルボキシＣ２−６アルケニル（例、２−カルボキシエテニル、２−カルボキシ−２−メチルエテニルなど）、ハロゲン化されていてもよいＣ２−６アルキニル、ハロゲン化されていてもよく、縮合していてもよいＣ３−８シクロアルキル、Ｃ６−１４アリール（例、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、２−ビフェニリル、３−ビフェニリル、４−ビフェニリル、２−アンスリルなど）、ハロゲン化されていてもよいＣ１−８アルコキシ、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル−Ｃ１−６アルコキシ（例、エトキシカルボニルメチルオキシなど）、Ｃ３−８シクロアルキル−オキシ（例、シクロプロピルオキシ、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシなど）、ヒドロキシ、Ｃ６−１４アリールオキシ（例、フェニルオキシ、１−ナフチルオキシ、２−ナフチルオキシなど）、Ｃ７−１６アラルキルオキシ（例、ベンジルオキシ、フェネチルオキシなど）、メルカプ卜、ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキルチオ、Ｃ６−１４アリールチオ（例、フェニルチオ、１−ナフチルチオ、２−ナフチルチオなど）、Ｃ７−１６アラルキルチオ（例、ベンジルチオ、フェネチルチオなど）、アミノ、ヒドロキシアミノ、モノ−Ｃ１−６アルキルアミノ（例、メチルアミノ、エチルアミノなど）、モノ−Ｃ６−１４アリールアミノ（例、フェニルアミノ、１−ナフチルアミノ、２−ナフチルアミノなど）、ジ−Ｃ１−６アルキルアミノ（例、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノなど）、ジ−Ｃ６−１４アリールアミノ（例、ジフェニルアミノなど）、ニトロ、ニトリル、ホルミル、カルボキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボニル（例、アセチル、プロピオニルなど）、Ｃ３−８シクロアルキル−カルボニル（例、シクロプロピルカルボニル、シクロペンチルカルボニル、シクロヘキシルカルボニルなど）、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル（例、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルなど）、Ｃ６−１４アリール−カルボニル（例、ベンゾイル、１−ナフトイル、２−ナフトイルなど）、Ｃ７−１６アラルキル−カルボニル（例、フェニルアセチル、３−フェニルプロピオニルなど）、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル（例、フェノキシカルボニルなど）、Ｃ７−ｌ６アラルキルオキシ−カルボニル（例、ベンジルオキシカルボニル、フェネチルオキシカルボニルなど）、５または６員複素環カルボニル（例、ニコチノイル、イソニコチノイル、テノイル、フロイル、モルホリノカルボニル、チオモルホリノカルボニル、ピペラジン−１−イルカルボニル、ピロリジン−１−イルカルボニルなど）、カルバモイル、モノ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル（例、メチルカルバモイル、エチルカルバモイルなど）、ジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル（例、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、エチルメチルカルバモイルなど）、Ｃ６−１４アリール−カルバモイル（例、フェニルカルバモイル、１−ナフチルカルバモイル、２−ナフチルカルバモイルなど）、Ｃ１−６アルコキシ−カルバモイル（例、メトキシカルバモイル、エトキシカルバモイルなど）、５または６員複素環カルバモイル（例、２−ピリジルカルバモイル、３−ピリジルカルバモイル、４−ピリジルカルバモイル、２−チエニルカルバモイル、３−チエニルカルバモイルなど）、スルホ、Ｃ１−６アルキルスルホニル（例、メチルスルホニル、エチルスルホニルなど）、Ｃ６−１４アリールスルホニル（例、フェニルスルホニル、１−ナフチルスルホニル、２−ナフチルスルホニルなど）、ホルミルアミノ、Ｃ１−６アルキル−カルボニルアミノ（例、アセチルアミノなど）、Ｃ６−１４アリール−カルボニルアミノ（例、ベンゾイルアミノ、ナフトイルアミノなど）、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニルアミノ（例、メトキシカルボニルアミノ、エトキシカルボニルアミノ、プロポキシカルボニルアミノ、ブトキシカルボニルアミノなど）、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノ（例、メチルスルホニルアミノ、エチルスルホニルアミノなど）、Ｃ６−１４アリールスルホニルアミノ（例、フェニルスルホニルアミノ、２−ナフチルスルホニルアミノ、１−ナフチルスルホニルアミノなど）、Ｃ１−６アルキル−カルボニルオキシ（例、アセトキシ、プロピオニルオキシなど）、Ｃ６−１４アリール−カルボニルオキシ（例、ベンゾイルオキシ、ナフチルカルボニルオキシなど）、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニルオキシ（例、メトキシカルボニルオキシ、エトキシカルボニルオキシ、プロポキシカルボニルオキシ、ブトキシカルボニルオキシなど）、モノ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイルオキシ（例、メチルカルバモイルオキシ、エチルカルバモイルオキシなど）、ジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイルオキシ（例、ジメチルカルバモイルオキシ、ジエチルカルバモイルオキシなど）、Ｃ６−１４アリール−カルバモイルオキシ（例、フェニルカルバモイルオキシ、ナフチルカルバモイルオキシなど）、５または６員複素環カルボニルオキシ（例、ニコチノイルオキシ、イソニコチノイルオキシなど）、５ないし７員飽和環状アミノ（例、ピロリジン−１−イル、ピペリジノ、ピペラジン−１−イル、モルホリノ、チオモルホリノ、テトラヒドロアゼピン−１−イル、ホモピペラジン−１−イルなど）、５ないし１０員芳香族複素環基（例、２−チエニル、３−チエニル、２−フリル、３−フリル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−キノリル、３−キノリル、４−キノリル、５−キノリル、８−キノリル、１−イソキノリル、３−イソキノリル、４−イソキノリル、５−イソキノリル、１−インドリル、２−インドリル、３−インドリル、２−ベンゾチアゾリル、２−ベンゾ〔ｂ〕チエニル、３−ベンゾ〔ｂ〕チエニル、２−ベンゾ〔ｂ〕フラニル、３−ベンゾ〔ｂ〕フラニルなど）、３ないし１０員非芳香族複素環基（例、１−アゼチジニル、２−アゼチジニル、３−アゼチジニル、１−ピロリジニル、２−ピロリジニル、３−ピロリジニル、２−イミダゾリニル、４−イミダゾリニル、２−ピラゾリジニル、３−ピラゾリジニル、４−ピラゾリジニル、２−ピペリジル、３−ピペリジル、４−ピペリジル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル、モルホリノ、チオモルホリノ、２−オキシラニル、２−オキセタニル、３−オキセタニル、２−テトラヒドロフラニル、４−テトラヒドロピラニルなど）、オキソなどが挙げられる。
環Ａは、例えば上記置換基を、置換可能な位置に１ないし４個、好ましくは１ないし２個有していてもよく、置換基数が２個以上の場合、各置換基は同一または異なっていてもよい。
前記「ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキル」としては、例えば１ないし５個、好ましくは１ないし３個のハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）を有していてもよいアルキル（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルなどのＣ１−６アルキルなど）などが挙げられる。具体例としては、メチル、クロロメチル、ジフルオロメチル、トリクロロメチル、トリフルオロメチル、エチル、２−ブロモエチル、２，２，２−トリフルオロエチル、ペンタフルオロエチル、プロピル、３，３，３−トリフルオロプロピル、イソプロピル、ブチル、４，４，４−トリフルオロブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、５，５，５−トリフルオロペンチル、ヘキシル、６，６，６−トリフルオロヘキシルなどが挙げられる。
前記「ハロゲン化されていてもよいＣ２−６アルケニル」としては、例えば１ないし５個、好ましくは１ないし３個のハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）を有していてもよいＣ２−６アルケニル（例、ビニル、プロペニル、イソプロペニル、２−ブテン−１−イル、４−ペンテン−１−イル、５−ヘキセン−１−イルなど）などが挙げられる。
前記「ハロゲン化されていてもよいＣ２−６アルキニル」としては、例えば１ないし５個、好ましくは１ないし３個のハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）を有していてもよいＣ２−６アルキニル（例、プロパルギル、２−ブチン−１−イル、４−ペンチン−１−イル、５−ヘキシン−１−イルなど）などが挙げられる。
前記「ハロゲン化されていてもよく、縮合していてもよいＣ３−８シクロアルキル」の「ハロゲン化されていてもよいＣ３−８シクロアルキル」としては、例えば１ないし５個、好ましくは１ないし３個のハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）を有していてもよいＣ３−６シクロアルキル（例、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなど）などが挙げられる。具体例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、４，４−ジクロロシクロヘキシル、２，２，３，３−テトラフルオロシクロペンチル、４−クロロシクロヘキシルなどが挙げられる。
前記「ハロゲン化されていてもよく、縮合していてもよいＣ３−８シクロアルキル」の「縮合したＣ３−８シクロアルキル」としては、例えば、８ないし１４員の二環または三環性Ｃ３−８シクロアルキル（例、１−アダマンチル、２−アダマンチル、デカリン−１−イル、テトラリン−１−イル、９−フルオレニル、１−インダニル、１，２，３，４−テトラヒドロ−１−ナフチルなど）などが挙げられる。また、該「縮合したＣ３−８シクロアルキル」は、ハロゲン化されていてもよい。
前記「ハロゲン化されていてもよいＣ１−８アルコキシ」としては、例えば１ないし５個、好ましくは１ないし３個のハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）を有していてもよいＣ１−８アルコキシ（例、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシなど）などが挙げられる。具体例としては、例えばメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、エトキシ、２，２，２−トリフルオロエトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、４，４，４−トリフルオロブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシなどが挙げられる。
前記「ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキルチオ」としては、例えば１ないし５個、好ましくは１ないし３個のハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）を有していてもよいＣ１−６アルキルチオ（例、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、ブチルチオ、ｓｅｃ−ブチルチオ、ｔｅｒｔ−ブチルチオなど）などが挙げられる。具体例としては、メチルチオ、ジフルオロメチルチオ、トリフルオロメチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、ブチルチオ、４，４，４−トリフルオロブチルチオ、ペンチルチオ、ヘキシルチオなどが挙げられる。
Ｒ１で示される「置換基を有していてもよいアミノ」の「置換基」としては、例えば、置換基を有していてもよい炭化水素基、置換基を有していてもよい複素環基、アシルなどが挙げられる。上記「アミノ」は「置換基」を１または２個有していてもよい。
上記「置換基を有していてもよい炭化水素基」の「炭化水素基」としては、例えば、鎖状または環状炭化水素基（例、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、アラルキル、多環式炭化水素基など）などが挙げられる。このうち、炭素数１ないし１９個の鎖状または環状炭化水素基などが好ましい。
上記「アルキル」としては、例えばＣ１−６アルキル（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシルなど）などが挙げられる。
上記「アルケニル」としては、例えばＣ２−６アルケニル（例、ビニル、アリル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、２−メチル−２−プロペニル、１−メチル−２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニルなど）などが挙げられる。
上記「アルキニル」としては、例えばＣ２−６アルキニル（例、エチニル、プロパルギル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ヘキシニルなど）などが挙げられる。
上記「シクロアルキル」としては、例えばＣ３−６シクロアルキル（例、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなど）などが挙げられる。
上記「シクロアルケニル」としては、例えばＣ５−６シクロアルケニル（例、１−シクロペンテニル、３−シクロペンテニル、４−シクロペンテニル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、４−シクロヘキセニルなど）などが挙げられる。
上記「アリール」としては、例えばＣ６−１４アリール（例、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、２−ビフェニリル、３−ビフェニリル、４−ビフェニリル、２−アンスリル、３−インデニルなど）などが挙げられる。
上記「アラルキル」としては、例えばＣ７−１９アラルキル（例、ベンジル、フェネチル、ジフェニルメチル、トリチル、１−ナフチルメチル、２−ナフチルメチル、２，２−ジフェニルエチル、３−フェニルプロピル、４−フェニルブチル、５−フェニルペンチル、９−フルオレニルなど）などが挙げられる。
上記「多環式炭化水素基」としては、例えば２ないし４環性非芳香族炭化水素基（例、１−アダマンチル、２−アダマンチル、デカリン−１−イル、テトラリン−１−イル、インダン−１−イル、アンドロスタン−３−イル、５−アンドロステン−３−イルなど）などが挙げられる。
上記「置換基を有していてもよい炭化水素基」の「置換基」としては、例えば、前記環Ａで示される「置換基を有していてもよいベンゼン環」の「置換基」と同様のものなどが挙げられる。「炭化水素基」は、例えば上記置換基を、置換可能な位置に１ないし５個、好ましくは１ないし３個有していてもよく、置換基数が２個以上の場合、各置換基は同一または異なっていてもよい。
上記「置換基を有していてもよい複素環基」の「複素環基」としては、例えば、炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１または２種、１ないし４個のヘテロ原子を含む５ないし１４員（単環、２環または３環式）複素環、好ましくは（ｉ）５ないし１４員（好ましくは５ないし１０員）芳香族複素環、（ｉｉ）３ないし１４員非芳香族複素環または（ｉｉｉ）７ないし１０員複素架橋環から任意の１個の水素原子を除いてできる１価基などが挙げられる。
上記「５ないし１４員（好ましくは５ないし１０員）の芳香族複素環」としては、例えば、チオフェン、ベンゾ〔ｂ〕チオフェン、ベンゾ〔ｂ〕フラン、ベンズイミダゾール、ベンズオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンズイソチアゾール、１Ｈ−ベンゾトリアゾール、ナフト〔２，３−ｂ〕チオフェン、フラン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、１，２，３−トリアゾール、１，２，４−トリアゾール、テトラゾール、１，３，４−チアジアゾール、１，３，４−オキサジアゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドール、イソインドール、１Ｈ−インダゾール、プリン、４Ｈ−キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、カルバゾール、β−カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナジン、チアゾール、イソチアゾール、フェノチアジン、イソオキサゾール、フラザン、フェノキサジンなどの芳香族複素環、またはこれらの環（好ましくは単環）が１ないし複数個（好ましくは１または２個）の芳香環（例、ベンゼン環、ピリジン環、イミダゾール環等）と縮合して形成された環などが挙げられる。
上記「３ないし１４員非芳香族複素環」としては、例えば、オキシラン、オキセタン、テトラヒドロフラン、ジヒドロフラン、ピラン、ジオキソラン、ジオキサン、アゼチジン、ピロリジン、イミダゾリン、ピラゾリジン、ピラゾリン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、チアゾリジン、オキサゾリジン、オキサジアゾリン、チアジアゾリン、トリアゾリン、１，４−ジアゼパン、１，４−オキサゼパン、１，４−チアゼパン、および上記芳香族複素環の還元体または部分還元体（例、１，２，３，４−テトラヒドロキノリン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン、インドリンなど）などが挙げられる。
上記「７ないし１０員複素架橋環」としては、例えば、キヌクリジン、７−アザビシクロ〔２．２．１〕ヘプタンなどが挙げられる。
該「複素環基」として好ましくは、炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１または２種、好ましくは、１ないし４個のヘテロ原子を含む５ないし１４員（好ましくは５ないし１０員）の（単環または２環式）複素環基である。具体的には、例えば２−チエニル、３−チエニル、２−フリル、３−フリル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−キノリル、３−キノリル、４−キノリル、５−キノリル、８−キノリル、１−イソキノリル、３−イソキノリル、４−イソキノリル、５−イソキノリル、ピラジニル、２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、１−ピロリル、３−ピロリル、１−イミダゾリル、２−イミダゾリル、３−ピリダジニル、２−チアゾリル、２−オキサゾリル、３−イソチアゾリル、３−イソオキサゾリル、１−インドリル、２−インドリル、３−インドリル、２−ベンゾチアゾリル、２−ベンゾ〔ｂ〕チエニル、３−ベンゾ〔ｂ〕チエニル、２−ベンゾ〔ｂ〕フラニル、３−ベンゾ〔ｂ〕フラニルなどの芳香族複素環基、例えば１−ピロリジニル、２−ピロリジニル、３−ピロリジニル、２−イミダゾリニル、４−イミダゾリニル、２−ピラゾリジニル、３−ピラゾリジニル、４−ピラゾリジニル、ピペリジノ、２−ピペリジル、３−ピペリジル、４−ピペリジル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル、モルホリノ、チオモルホリノなどの非芳香族複素環基などである。
上記「置換基を有していてもよい複素環基」の「置換基」としては、例えば、前記環Ａで示される「置換基を有していてもよいベンゼン環」の「置換基」と同様のものなどが挙げられる。「複素環基」は、例えば上記置換基を、置換可能な位置に１ないし５個、好ましくは１ないし３個有していてもよく、置換基数が２個以上の場合、各置換基は同一または異なっていてもよい。
上記「アシル」としては、例えば、式−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＲ４、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ５、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲ５Ｒ６、−（Ｃ＝Ｓ）−ＮＲ５Ｒ６、−ＳＯ−Ｒ４、−ＳＯ２−Ｒ４または−ＳＯ２−ＮＲ５Ｒ６〔式中、Ｒ４は置換基を有していてもよい炭化水素基、または置換基を有していてもよい複素環基；Ｒ５は水素原子、置換基を有していてもよい炭化水素基、または置換基を有していてもよい複素環基；Ｒ６は水素原子、置換基を有していてもよい炭化水素基または置換基を有していてもよい複素環基を示し、ＮＲ５Ｒ６は環状アミノであってもよい〕で表される基などが挙げられる。
Ｒ４、Ｒ５またはＲ６で示される「置換基を有していてもよい炭化水素基」としては、上記Ｒ１で示される「置換基を有していてもよいアミノ」の「置換基」として例示された「置換基を有していてもよい炭化水素基」などが挙げられる。
Ｒ４、Ｒ５またはＲ６で示される「置換基を有していてもよい複素環基」としては、上記Ｒ１で示される「置換基を有していてもよいアミノ」の「置換基」として例示された「置換基を有していてもよい複素環基」などが挙げられる。
ＮＲ５Ｒ６で示される「環状アミノ」としては、例えば、１個の窒素原子と炭素原子以外に、窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１または２種、１ないし４個のヘテロ原子を含んでいてもよい５ないし７員飽和環状アミノが挙げられ、具体例としては、ピロリジン−１−イル、ピペリジノ、ピペラジン−１−イル、モルホリノ、チオモルホリノ、テトラヒドロアゼピン−１−イル、ホモピペラジン−１−イルなどが挙げられる。
Ｒ２またはＲ３で示される「置換基を有していてもよい炭化水素基」としては、上記Ｒ１で示される「置換基を有していてもよいアミノ」の「置換基」として例示された「置換基を有していてもよい炭化水素基」などが挙げられる。
Ｒ２またはＲ３で示される「置換基を有していてもよい複素環基」としては、上記Ｒ１で示される「置換基を有していてもよいアミノ」の「置換基」として例示された「置換基を有していてもよい複素環基」などが挙げられる。
Ｒ２またはＲ３で示される「アシル」としては、例えば、上記式−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＲ４、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ５、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲ５Ｒ６、−（Ｃ＝Ｓ）−ＮＲ５Ｒ６、−ＳＯ−Ｒ４、−ＳＯ２−Ｒ４または−ＳＯ２−ＮＲ５Ｒ６〔式中の各記号は上記と同意義を示す〕で表される基などが挙げられる。
Ｒ２およびＲ３が、互いに結合して隣接する炭素原子と共に形成する「置換基を有していてもよい３ないし１０員同素または複素環」の「３ないし１０員同素環」としては、例えば、３ないし１０員不飽和炭化水素、３ないし１０員飽和炭化水素などが挙げられる。
「３ないし１０員不飽和炭化水素」としては、例えばＣ３−１０シクロアルカン（例、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタン、シクロオクタン、シクロノナン、シクロデカンなど）、Ｃ５−７シクロアルケン（例、シクロペンテン、シクロペンタジエン、シクロヘキセン、１，３−シクロヘキサジエン、１，４−シクロヘキサジエン、シクロヘプテン、１，３−シクロヘプタジエンなど）などが挙げられる。
「３ないし１０員飽和炭化水素」としては、例えばベンゼン、ナフタレンなどが挙げられる。
Ｒ２およびＲ３が、互いに結合して隣接する炭素原子と共に形成する「置換基を有していてもよい３ないし１０員同素または複素環」の「３ないし１０員複素環」としては、例えば、炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１または２種、１ないし４個のへテロ原子を含む５ないし１０員（単環または２環式）複素環、好ましくは（ｉ）５ないし１０員芳香族複素環、（ｉｉ）３ないし１０員非芳香族複素環または（ｉｉｉ）７ないし１０員複素架橋環などが挙げられる。
上記「５ないし１０員芳香族複素環」としては、例えば、チオフェン、ベンゾ〔ｂ〕チオフェン、ベンゾ〔ｂ〕フラン、ベンズイミダゾール、ベンズオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンズイソチアゾール、ナフト〔２，３−ｂ〕チオフェン、フラン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドール、イソインドール、１Ｈ−インダゾール、プリン、４Ｈ−キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、カルバゾール、β−カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナジン、チアゾール、イソチアゾール、オキサゾール、１，２，３−トリアゾール、１，２，４−トリアゾール、テトラゾール、１，３，４−チアジアゾール、１，３，４−オキサジアゾール、１Ｈ−ベンゾトリアゾール、フェノチアジン、イソオキサゾール、フラザン、フェノキサジンなどの芳香族複素環、またはこれらの環（好ましくは単環）が１ないし複数個（好ましくは１または２個）の芳香環（例、ベンゼン環等）と縮合して形成された環などが挙げられる。
上記「３ないし１０員非芳香族複素環」としては、例えば、オキシラン、オキセタン、テトラヒドロフラン、ジヒドロフラン、ピラン、ジオキソラン、ジオキサン、アゼチジン、ピロリジン、イミダゾリン、ピラゾリジン、ピラゾリン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、チアゾリジン、オキサゾリジン、オキサジアゾリン、チアジアゾリン、トリアゾリン、１，４−ジアゼパン、１，４−オキサゼパン、１，４−チアゼパン、および上記芳香族複素環の還元体または部分還元体（例、１，２，３，４−テトラヒドロキノリン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン、インドリンなど）などが挙げられる。
上記「７ないし１０員複素架橋環」としては、例えば、キヌクリジン、７−アザビシクロ〔２．２．１〕ヘプタンなどが挙げられる。
上記「複素環」として好ましくは、炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１または２種、好ましくは、１ないし４個のヘテロ原子を含む５ないし１０員（単環または２環式）複素環などである。さらに好ましくは、炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１ないし３個のヘテロ原子を含む５または６員複素環（例、チオフェン、フラン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジンなど）などが挙げられる。
Ｒ２およびＲ３が、互いに結合して隣接する炭素原子と共に形成する「置換基を有していてもよい３ないし１０員同素または複素環」の「置換基」としては、前記環Ａで示される「置換基を有していてもよいベンゼン環」の「置換基」と同様のものなどが挙げられる。「３ないし１０員同素または複素環」は、例えば上記置換基を、置換可能な位置に１ないし５個、好ましくは１ないし３個有していてもよく、置換基数が２個以上の場合、各置換基は同一または異なっていてもよい。
環Ａは、無置換ベンゼン環が好ましい。
Ｒ１は、アミノが好ましい。
Ｒ２およびＲ３は、互いに結合して隣接する炭素原子と共に、Ｃ５−７シクロアルケン（好ましくは、シクロヘキセンなど）を形成するのが好ましい。
化合物（Ｉ）の好ましい具体例としては、タクリンなどが挙げられる。
式（Ｉ）で表される化合物の塩としては、例えば金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。金属塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
このうち、薬学的に許容し得る塩が好ましい。例えば、化合物内に酸性官能基を有する場合にはアルカリ金属塩（例、ナトリウム塩，カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例、カルシウム塩，マグネシウム塩，バリウム塩など）などの無機塩、アンモニウム塩など、また、化合物内に塩基性官能基を有する場合には、例えば臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸など無機酸との塩、または酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。
標識された化合物（Ｉ）も、タクリン化合物として、本発明のスクリーニングに用いることができる。
標識物質としては、放射性同位元素（例、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕、〔３２Ｐ〕、〔３３Ｐ〕、〔３５Ｓ〕など）、蛍光物質〔例、シアニン蛍光色素（例、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（アマシャムバイオサイエンス社製）など）、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート、ＮＢＤ（７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚ−２−ｏｘａ−１，３−ｄｉａｚｏｌ）など〕、酵素（例、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素など）、発光物質（例、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなど）、ビオチン、ランタニド元素などがあげられる。中でも、放射性同位元素〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕、〔１２５Ｉ〕が好ましい。
本発明の受容体および本発明の部分ペプチドは、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のポリペプチドの精製方法によって製造することもできるし、ポリペプチドをコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、ペプチド合成法に準じて製造することもできる。例えば、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、５６巻、１２−２１頁、１９９９年、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１４４６巻、５７−７０頁、１９９９年などに記載の方法またはこれに準じた方法により、製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明の受容体または部分ペプチドもしくはそれらの塩の合成には、通常、市販のポリペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などをあげることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするポリペプチドの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からポリペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のポリペプチド、受容体、部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、ポリペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ポリペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はポリペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
本発明の受容体または部分ペプチドを得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（ポリペプチド）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたポリペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したポリペプチドとを製造し、この両ポリペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ポリペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ポリペプチドを得ることができる。この粗ポリペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の受容体またはその部分ペプチドのアミド体を得ることができる。
本発明の受容体または部分ペプチドもしくはそれらの塩のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、受容体またはその部分ペプチドのアミド体と同様にして、所望の受容体またはその部分ペプチドのエステル体を得ることができる。
本発明の受容体または部分ペプチドは、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは受容体の部分ペプチドについては、受容体を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明受容体または部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（ｉ）〜（ｖ）に記載された方法があげられる。
（ｉ）Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６６年）
（ｉｉ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６５年）
（ｉｉｉ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）
（ｉｖ）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年）
（ｖ）矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて本発明の受容体または部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる受容体または部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明の受容体または部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明の受容体または部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。このうちＤＮＡが好ましく、該ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌ  ＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
本発明の受容体をコードするＤＮＡとしては、例えば配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する受容体をコードするＤＮＡなどであれば何れのものでもよい。
配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有する受容体をコードするＤＮＡとしては、配列番号：５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を含有する受容体をコードするＤＮＡとしては、配列番号：６で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有する受容体をコードするＤＮＡとしては、配列番号：７で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：４で表わされるアミノ酸配列を含有する受容体をコードするＤＮＡとしては、配列番号：８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、本発明の受容体の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。具体的には、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する受容体をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
本発明の受容体または部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）は、自体公知の方法で標識化されていてもよい。標識物質としては、放射性同位元素、蛍光物質（例、フルオレセインなど）、発光物質、酵素、ビオチン、ランタニド元素などがあげられる。
本発明の受容体または部分ペプチドを完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明の受容体または部分ペプチドの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて自体公知のＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明の受容体または部分ペプチドの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
ＤＮＡの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ  ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化された受容体をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明の受容体または部分ペプチドの発現ベクターは、例えば、（ａ）本発明の受容体または部分ペプチドをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ｂ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウィルス，ワクシニアウィルス，バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＩＶ・ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどがあげられる。
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウィルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等があげられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明の受容体のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明の受容体または部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウィルスがＡｃＮＰＶの場合は、ヨトウガの幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ  ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ  ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウィルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｎ細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｉｎ  Ｖｉｖｏ，１３，２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、Ｎａｔｕｒｅ，３１５巻，５９２（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７（ＣＯＳ７），Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）やＧｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、受容体または部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４３１−４３３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｋ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７巻，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ，Ｇ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１巻，５３３０（１９８４）〕があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ  １６４０培地〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  １９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外などに本発明の受容体または部分ペプチドを生成せしめることができる。
上記培養物から本発明の受容体または部分ペプチドを分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
本発明の受容体または部分ペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりポリペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にポリペプチドが分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる受容体または部分ペプチドの精製は、自体公知の分離・精製法を適宜組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られる受容体または部分ペプチドが遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生する受容体または部分ペプチドを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
タクリン化合物（例、化合物（Ｉ））は、市販されている場合には市販品をそのまま用いることもでき、自体公知の方法またはこれらに準じた方法に従って製造または抽出することもできる。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体（以下、単に本発明の抗体と称する場合がある）は、本発明の受容体に対する抗体を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明の受容体に対する抗体としては、受容体のシグナル伝達を不活性化する抗体、受容体のシグナル伝達を活性化する抗体などが挙げられる。
本発明の受容体に対する抗体は、本発明の受容体を抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）としては、該ポリヌクレオチドに相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、該ポリヌクレオチドの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのポリヌクレオチド（アンチセンスポリヌクレオチド）であってもよい。
具体的には、本発明の受容体をコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）（以下、これらのＤＮＡを本発明のＤＮＡと略記する場合がある）に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスＤＮＡ（以下、これらのＤＮＡをアンチセンスＤＮＡと略記する場合がある）が挙げられ、本発明のＤＮＡに相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。
本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などがあげられる。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、本発明の受容体のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスＤＮＡが好適である。これらのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
具体的には、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチドなどが挙げられる。好ましくは例えば、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチドなどが挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、１０〜４０個程度、好ましくは１５〜３０個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスＤＮＡを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾りん酸残基に置換されていてもよい。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
以下に、本発明の受容体、タクリン化合物などの用途を説明する。
〔１〕疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明の受容体は、Ｓｈｅａｒ  Ｓｔｒｅｓｓにさらすことによってヒト臍帯静脈内皮細胞において発現量が増加し（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２４０巻、７３４−７４１頁、１９９７年）、また、ラット心筋由来細胞において低酸素刺激後に通常の培養に戻すことにより発現が誘導される（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６巻、２６４５３−２６４６０頁、２００１年）。さらに、本発明の受容体は、乳癌由来細胞株に発現しているが、受容体の発現亢進またはリガンドによる活性化により、これらの細胞内のＭＡＰキナーゼの活性化が抑制され、アポトーシスが誘導される（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４３巻、３３７６−３３８４頁、２００２年、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１６巻、７０−８４頁、２００２年）。
本発明の受容体を用い、または組換え型本発明の受容体の発現系を用いたリガンドレセプターアッセイ系を用いることにより、本発明の受容体とタクリン化合物との結合性を変化させる化合物（例、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など）またはその塩を効率よくスクリーニングすることができる。
該化合物またはその塩には、（ｉ）本発明の受容体を介して細胞刺激活性（例、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ産生抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、リン脂質依存性プロテインキナーゼの活性化、マイトジェン活性化蛋白質リン酸化酵素（ＭＡＰキナーゼ）の活性化などを促進する活性など）を有する化合物（アゴニスト）、（ｉｉ）上記細胞刺激活性を有しない化合物（アンタゴニスト）、（ｉｉｉ）本発明の受容体とタクリン化合物との結合力を促進する化合物、（ｉｖ）本発明の受容体とタクリン化合物との結合力を阻害する化合物などが含まれる。
具体的には、（ｉ）本発明の受容体に、タクリン化合物を接触させた場合と（ｉｉ）本発明の受容体に、タクリン化合物および試験化合物を接触させた場合との比較を行なう。比較は、例えば、本発明の受容体に対するタクリン化合物の結合量、細胞刺激活性などを測定して行う。
本発明のスクリーニング方法としての具体例としては、例えば、
（ａ）タクリン化合物を本発明の受容体に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を本発明の受容体に接触させた場合における、タクリン化合物の本発明の受容体に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（ｂ）タクリン化合物を、本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、タクリン化合物の該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
（ｃ）本発明の受容体が、本発明の受容体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の受容体である上記（ｂ）記載のスクリーニング方法、
（ｄ）タクリン化合物が、標識したタクリン化合物である上記（ａ）〜（ｃ）のスクリーニング方法などのレセプター結合アッセイ系、
（ｅ）タクリン化合物を本発明の受容体に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を本発明の受容体に接触させた場合における、本発明の受容体を介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（ｆ）タクリン化合物を本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、本発明の受容体を介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
（ｇ）本発明の受容体が、本発明の受容体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の受容体である上記（ｆ）のスクリーニング方法などの細胞刺激アッセイ系などが挙げられる。
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
本発明の受容体としては、ヒトや温血動物の臓器の膜画分などが好適に用いられる。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させた本発明の受容体などが適している。
本発明の受容体を製造するには、前述の本発明の受容体の製造方法などが用いられる。
本発明のスクリーニング方法において、本発明の受容体を含有する細胞あるいは該細胞膜画分などを用いる場合、後述の調製法に従えばよい。
本発明の受容体を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行うことができる。
本発明の受容体を含有する細胞としては、本発明の受容体を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、前述の大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。製造方法は前述と同様である。
膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などがあげられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現した本発明の受容体と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該本発明の受容体を含有する細胞や膜画分中の本発明の受容体の量は、１細胞当たり１０３〜１０８分子であるのが好ましく、１０５〜１０７分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
前記のレセプター結合アッセイ系や細胞刺激アッセイ系などのスクリーニング方法を実施するためには、例えば、本発明の受容体画分と、タクリン化合物（例、標識したタクリン化合物など）などが用いられる。本発明の受容体画分としては、天然型の本発明の受容体画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型本発明の受容体画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性などを示す。標識したタクリン化合物としては、例えば、放射性同位元素（例、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕、〔３２Ｐ〕、〔３３Ｐ〕、〔３５Ｓ〕など）、蛍光物質〔例、シアニン蛍光色素（例、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（アマシャムバイオサイエンス社製）など）、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート、ＮＢＤ（７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚ−２−ｏｘａ−１，３−ｄｉａｚｏｌ）など〕、酵素（例、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素など）、発光物質（例、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなど）、ビオチン、ランタニド元素などで標識されたタクリン化合物などを用いることができる。
具体的には、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行うには、本発明の受容体を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセプター標品を調製する。バッファーとしては、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのタクリン化合物と受容体との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０ＴＭ（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによる本発明の受容体の分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０．０１〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５０００〜５０００００ｃｐｍ）の標識したタクリン化合物を添加し、同時に１０−１０〜１０−７Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識のタクリン化合物を加えた反応チューブも用意する。反応は０℃〜５０℃、望ましくは４℃〜３７℃で２０分〜２４時間、望ましくは３０分〜３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント（Ｂ０）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ０−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が例えば５０％以下になる試験化合物を、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を低下させる化合物として選択することができる。
さらに、表面プラズモンセンサー技術を利用することによって、本発明の受容体に結合する化合物をスクリーニングすることもできる。
具体的には、ビアコア３０００（ビアコア社）のセンサーチップ表面に、本発明の受容体を固定化後、チップ表面にリン酸緩衝液（ＰＢＳ）などに溶解した試験化合物を流したときの表面プラズモンの変化を測定することにより、本発明の受容体に結合する試験化合物を選択する。例えば、表面プラズモンの変化の測定値が５レゾナンスユニット以上与える試験化合物を本発明の受容体に結合性を有する物質として選択する。
前記の細胞刺激アッセイ系のスクリーニング方法を実施するためには、本発明の受容体を介する細胞刺激活性（例、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ産生抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、リン脂質依存性プロテインキナーゼの活性化、マイトジェン活性化蛋白質リン酸化酵素（ＭＡＰキナーゼ）の活性化などを促進する活性または抑制する活性、受容体細胞内移行活性など）を、自体公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、本発明の受容体を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行うにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当な本発明の受容体を発現した細胞が必要である。本発明の受容体を発現した細胞としては、前述の本発明の受容体発現細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられる。
上記細胞刺激アッセイ系のスクリーニング方法について、さらに具体的に以下（１）〜（１３）に記載する。
（１）受容体発現細胞が受容体アゴニストによって刺激されると細胞内のＧ蛋白質が活性化されてＧＴＰが結合する。この現象は受容体発現細胞の膜画分においても観察される。通常、ＧＴＰは加水分解されてＧＤＰへと変化するが、このとき反応液中にＧＴＰγＳを添加しておくと、ＧＴＰγＳはＧＴＰと同様にＧ蛋白質に結合するが、加水分解されずにＧ蛋白質を含む細胞膜に結合した状態が維持される。標識したＧＴＰγＳを用いると細胞膜に残存した標識されたＧＴＰγＳを測定することにより、受容体アゴニストの受容体発現細胞刺激活性を測定することができる。
この反応を利用して、タクリン化合物の本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
この方法は、本発明の受容体を含む膜画分を用いて行う。本測定法において本発明の受容体膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を示す物質はアゴニストである。
具体的には、標識したＧＴＰγＳの存在下、タクリン化合物を本発明の受容体細胞膜画分に接触させた場合とタクリン化合物および試験化合物を本発明の受容体細胞膜画分に接触させた場合における、本発明の受容体細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を測定し、比較することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
本方法において、タクリン化合物による本発明の受容体細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を抑制する活性を示す試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体細胞膜画分に接触させ、本発明の受容体細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を測定することにより、アゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
公知の方法に従って調製した本発明の受容体を含む細胞膜画分を、膜希釈緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１μＭ  ＧＤＰ、０．１％  ＢＳＡ；ｐＨ７．４）で希釈する。希釈率は、受容体の発現量により異なる。これをＦａｌｃｏｎ２０５３に０．２ｍｌずつ分注し、タクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物を加え、さらに終濃度２００ｐＭとなるように［３５Ｓ］ＧＴＰγＳを加える。２５℃で１時間保温した後、氷冷した洗浄用緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  ＢＳＡ，０．０５％  ＣＨＡＰＳ；ｐＨ７．４）１．５ｍｌを加えて、ガラス繊維ろ紙ＧＦ／Ｆでろ過する。６５℃、３０分保温して乾燥後、液体シンチレーションカウンターでろ紙上に残った膜画分に結合した［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの放射活性を測定する。タクリン化合物のみを加えた実験区の放射活性を１００％、タクリン化合物を加えなかった実験区の放射活性を０％とし、タクリン化合物によるＧＴＰγＳ結合促進活性に対する試験化合物の影響を算出する。ＧＴＰγＳ結合促進活性が例えば５０％以下になる試験化合物をアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
（２）本発明の受容体発現細胞は、タクリン化合物の刺激により、細胞内ｃＡＭＰの産生が抑制される。この反応を利用して、タクリン化合物の本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる物質の存在下、タクリン化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、該細胞の細胞内ｃＡＭＰの産生抑制活性を測定し、比較することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる物質としては、例えば、フォルスコリン、カルシトニンなどが用いられる。
本発明の受容体発現細胞内のｃＡＭＰ産生量は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウシなどを免疫して得られた抗ｃＡＭＰ抗体と〔１２５Ｉ〕標識ｃＡＭＰ（ともに市販品）を使用することによるＲＩＡ系、または抗ｃＡＭＰ抗体と標識ｃＡＭＰとを組み合わせたＥＩＡ系で測定することができる。また、抗ｃＡＭＰ抗体を、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａまたは抗ｃＡＭＰ抗体産生に用いた動物のＩｇＧなどに対する抗体などを使用して固定したシンチラントを含むビーズと〔１２５Ｉ〕標識ｃＡＭＰとを使用するＳＰＡ（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ａｓｓａｙ）法による定量、化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティーホモジニアスアッセイ系であるＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を応用した競合法ｃＡＭＰ検出キット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）による定量も可能である。
本方法において、タクリン化合物による本発明の受容体発現細胞のｃＡＭＰ産生抑制活性を阻害する活性を示す試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させて、ｃＡＭＰ産生抑制活性を調べることによりアゴニスト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうことができる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞（例、ＣＨＯ細胞などの動物細胞）を２４穴プレートに５ｘ１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、４８時間培養する。細胞を０．２ｍＭ  ３−イソブチル−メチルキサンチン、０．０５％  ＢＳＡおよび２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄する（以下、反応用バッファーと略記する）。その後、０．５ｍｌの反応用バッファーを加えて３０分間培養器で保温する。反応用バッファーを除き、新たに０．２５ｍｌの反応用バッファーを細胞に加えた後、２０μＭのタクリン化合物または２０μＭのタクリン化合物および試験化合物を添加した２μＭフォルスコリンを含む０．２５ｍｌの反応用バッファーを、細胞に加え、３７℃で２４分間反応させる。１００μｌの２０％過塩素酸を加えて反応を停止させ、その後氷上で１時間置くことにより細胞内ｃＡＭＰを抽出する。抽出液中のｃＡＭＰ量を、ｃＡＭＰ  ＥＩＡキット（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて測定する。フォルスコリンの刺激によって産生されたｃＡＭＰ量を１００％とし、２０μＭのタクリン化合物の添加によって抑制されたｃＡＭＰ量を０％として、タクリン化合物によるｃＡＭＰ産生抑制活性に対する試験化合物の影響を算出する。タクリン化合物の活性を阻害して、ｃＡＭＰ産生活性が例えば５０％以上になる試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
また、タクリン化合物の刺激により、細胞内ｃＡＭＰ量が増加する性質を示す本発明の受容体発現細胞を使用する場合、タクリン化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、該細胞の細胞内ｃＡＭＰの産生促進活性を測定し、比較することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
本方法において、タクリン化合物による本発明の受容体発現細胞のｃＡＭＰ産生促進活性を阻害する活性を示す試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させてｃＡＭＰ産生促進活性を調べることによりアゴニスト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうことができる。
ｃＡＭＰ産生促進活性は、上記のスクリーニング法においてフォルスコリンを添加せずに本発明の受容体発現細胞（例、ＣＨＯ細胞などの動物細胞）にタクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物を添加して産生されたｃＡＭＰを上記の方法で定量して測定する。
（３）ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを用いて、タクリン化合物の本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
ＣＲＥ（ｃＡＭＰ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を含むＤＮＡを、ベクターのレポーター遺伝子上流に挿入し、ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを得る。ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを導入した本発明の受容体発現細胞において、ｃＡＭＰの上昇を伴う刺激は、ＣＲＥを介したレポーター遺伝子発現と、それに引き続くレポーター遺伝子の遺伝子産物（蛋白質）の産生を誘導する。つまり、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定することにより、ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入細胞内のｃＡＭＰ量の変動を検出することができる。
具体的には、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる物質の存在下、タクリン化合物を、ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、比較することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる物質としては、例えば、フォルスコリン、カルシトニンなどが用いられる。
ベクターとしては、例えば、ピッカジーン  ベイシックベクター、ピッカジーン  エンハンサーベクター（東洋インキ製造（株））などが用いられる。ＣＲＥを含むＤＮＡを、上記ベクターのレポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイトに挿入し、ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクターとする。
本方法において、タクリン化合物によるレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性抑制を回復させる試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させて、フォルスコリン刺激によって上昇した発光量のタクリン化合物と同様な抑制を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼを利用する例を用いて、このスクリーニング方法の具体例を以下に述べる。
ＣＲＥ−レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）を導入した本発明の受容体発現細胞を、２４穴プレートに５ｘ１０３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、４８時間培養する。細胞を０．２ｍＭ  ３−イソブチル−メチルキサンチン、０．０５％  ＢＳＡおよび２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄する（以下、反応用バッファーと略記する）。その後０．５ｍｌの反応用バッファーを加えて３０分間培養器で保温する。反応用バッファーを除き、新たに０．２５ｍｌの反応用バッファーを細胞に加えた後、１００μＭのタクリン化合物または１００μＭのタクリン化合物および試験化合物を添加した２μＭフォルスコリンを含む０．２５ｍｌの反応用バッファーを、細胞に加え、３７℃で２４分間反応させる。細胞をピッカジーン用細胞溶解剤（東洋インキ製造（株））で溶かし、溶解液に発光基質（東洋インキ製造（株））を添加する。ルシフェラーゼによる発光は、ルミノメーター、液体シンチレーションカウンターまたはトップカウンターにより測定する。タクリン化合物単独を添加した場合と、１００μＭのタクリン化合物および試験化合物を添加した場合のルシフェラーゼによる発光量を測定して、比較する。
タクリン化合物は、フォルスコリン刺激に基づくルシフェラーゼによる発光量の増加を抑制する。該抑制を回復させる化合物をアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
レポーター遺伝子として、例えば、アルカリフォスファターゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、β−ガラクトシダーゼなどの遺伝子を用いてもよい。これらのレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性は、公知の方法に従い、または市販の測定キットを用いて測定する。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば和光純薬製Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ５３０を用いて、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ活性は、例えば和光純薬製ＦＡＳＴ  ＣＡＴ  ｃｈｒｏｌａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  ＫｉＴを用いて、β−ガラクトシダーゼ活性は、例えば和光純薬製Ａｕｒｏｒａ  Ｇａｌ−ＸＥを用いて測定する。
（４）ＳＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを用いて、タクリン化合物の本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
ＳＲＥ（ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を含むＤＮＡを、ベクターのレポーター遺伝子上流に挿入し、ＳＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを得る。ＳＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを導入した本発明の受容体発現細胞において、血清刺激によるＭＡＰキナーゼ活性化などの増殖シグナルの活性化は、ＳＲＥを介したレポーター遺伝子発現と、それに引き続くレポーター遺伝子の遺伝子産物（蛋白質）の産生を誘導する。つまり、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定することにより、ＳＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入細胞内の増殖シグナルの活性化を検出することができる。
具体的には、タクリン化合物を、ＳＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、ＳＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、比較することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
ベクターとしては、例えば、ピッカジーン  ベイシックベクター、ピッカジーン  エンハンサーベクター（東洋インキ製造（株））などが用いられる。ＳＲＥを含むＤＮＡを、上記ベクターのレポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイトに挿入し、ＳＲＥ−レポーター遺伝子ベクターとする。
本方法において、タクリン化合物によるレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性化を抑制させる試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させて、タクリン化合物と同様な発光量の上昇を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼを利用する例を用いて、このスクリーニング方法の具体例を以下に述べる。
ＳＲＥ−レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）を導入した本発明の受容体発現細胞を、２４穴プレートに５ｘ１０３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、４８時間培養する。細胞を０．０５％  ＢＳＡおよび２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄する（以下、反応用バッファーと略記する）。その後０．５ｍｌの反応用バッファーを加えて３０分間培養器で保温する。反応用バッファーを除き、新たに０．２５ｍｌの反応用バッファーを細胞に加えた後、１００μＭのタクリン化合物または１００μＭのタクリン化合物および試験化合物を添加した０．２５ｍｌの反応用バッファーを、細胞に加え、３７℃で２４分間反応させる。細胞をピッカジーン用細胞溶解剤（東洋インキ製造（株））で溶かし、溶解液に発光基質（東洋インキ製造（株））を添加する。ルシフェラーゼによる発光は、ルミノメーター、液体シンチレーションカウンターまたはトップカウンターにより測定する。タクリン化合物単独を添加した場合と、１００μＭのタクリン化合物および試験化合物を添加した場合のルシフェラーゼによる発光量を測定して、比較する。
タクリン化合物は、ルシフェラーゼによる発光量を増加させる。該増加を抑制させる化合物をアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
レポーター遺伝子として、例えば、アルカリフォスファターゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、β−ガラクトシダーゼなどの遺伝子を用いてもよい。これらのレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性は、公知の方法に従い、または市販の測定キットを用いて測定する。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば和光純薬製Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ５３０を用いて、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ活性は、例えば和光純薬製ＦＡＳＴ  ＣＡＴ  ｃｈｒｏｌａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  ＫｉＴを用いて、β−ガラクトシダーゼ活性は、例えば和光純薬製Ａｕｒｏｒａ  Ｇａｌ−ＸＥを用いて測定する。
（５）本発明の受容体発現細胞は、タクリン化合物の刺激により、アラキドン酸代謝物を細胞外に放出する。この反応を利用して、タクリン化合物の本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
あらかじめ、標識したアラキドン酸を、本発明の受容体発現細胞に取り込ませておくことによって、アラキドン酸代謝物放出活性を、細胞外に放出された標識されたアラキドン酸代謝物を測定することによって測定することができる。
具体的には、タクリン化合物を、標識したアラキドン酸を含有する本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、標識したアラキドン酸を含有する本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、アラキドン酸代謝物の放出活性を測定し、比較することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
本方法において、タクリン化合物によるアラキドン酸代謝物放出活性を阻害する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
また、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、本発明の受容体発現細胞のアラキドン酸代謝物放出活性を公知の方法で調べることによりアゴニスト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を２４穴プレートに５ｘ１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、２４時間培養後、［３Ｈ］アラキドン酸を０．２５μＣｉ／ｗｅｌｌとなるよう添加し、１６時間後、細胞を０．０５％  ＢＳＡおよび２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．４）（以下、反応用バッファーと略記する）で洗浄する。終濃度２０μＭのタクリン化合物または終濃度２０μＭのタクリン化合物および試験化合物を含む反応用バッファー５００μｌを、各ｗｅｌｌに添加する。３７℃で６０分間インキュベートした後、反応液４００μｌをシンチレーターに加え、反応液中に遊離した［３Ｈ］アラキドン酸代謝物の量をシンチレーションカウンターにより測定する。
反応用バッファー５００μｌのみを添加した場合（タクリン化合物非添加・試験化合物非添加）の遊離［３Ｈ］アラキドン酸代謝物の量を０％、２０μＭのタクリン化合物を含む反応用バッファーを添加した場合（試験化合物非添加）の遊離［３Ｈ］アラキドン酸代謝物の量を１００％として、試験化合物を添加した場合の遊離［３Ｈ］アラキドン酸代謝物の量を算出する。
アラキドン酸代謝物放出活性が、例えば５０％以下になる試験化合物をアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
（６）本発明の受容体発現細胞は、タクリン化合物の刺激により、細胞内のＣａ濃度が上昇する。この反応を利用して、タクリン化合物の本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、タクリン化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、細胞内カルシウム濃度上昇活性を測定し、比較することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。測定は公知の方法に従って行う。
本方法において、タクリン化合物による細胞内カルシウム濃度の上昇を抑制する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
一方、試験化合物のみの添加による蛍光強度の上昇を測定することによってアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を、滅菌した顕微鏡用カバーグラス上に播き、２日後、培養液を、４ｍＭ  Ｆｕｒａ−２  ＡＭ（同仁化学研究所）を縣濁したＨＢＳＳに置換し、室温で２時間３０分おく。ＨＢＳＳで洗浄した後、キュベットにカバーグラスをセットし、タクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物を添加し、励起波長３４０ｎｍおよび３８０ｎｍでの、５０５ｎｍの蛍光強度の比の上昇を蛍光測定器で測定し、比較する。
また、ＦＬＩＰＲ（モレキュラーデバイス社製）を使って行ってもよい。本発明の受容体発現細胞縣濁液にＦｌｕｏ−３  ＡＭ（同仁化学研究所製）を添加し、細胞に取り込ませた後、上清を遠心により数度洗浄後、９６穴プレートに細胞を播く。ＦＬＩＰＲ装置にセットし、Ｆｕｒａ−２の場合と同様に、タクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物を添加し、蛍光強度の比の上昇を蛍光測定器で測定し、比較する。
さらに、本発明の受容体発現細胞に、細胞内Ｃａイオンの上昇によって発光するような蛋白質の遺伝子（例、ａｅｑｕｏｒｉｎなど）を共発現させておき、細胞内Ｃａイオン濃度の上昇によって、該遺伝子蛋白質（例、ａｅｑｕｏｒｉｎなど）がＣａ結合型となり発光することを利用して、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることもできる。
細胞内Ｃａイオンの上昇によって発光するような蛋白質の遺伝子を共発現させた本発明の受容体発現細胞を、９６穴プレートに播き、上記と同様に、タクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物を添加し、蛍光強度の比の上昇を蛍光測定器で測定し、比較する。
タクリン化合物による蛍光強度の上昇を、抑制する試験化合物をアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
（７）受容体を発現する細胞に、受容体アゴニストを添加すると、細胞内イノシトール三リン酸濃度は上昇する。タクリン化合物の、本発明の受容体発現細胞における細胞内イノシトール三リン酸産生活性を利用することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、標識したイノシトールの存在下、タクリン化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、イノシトール三リン酸産生活性を測定し、比較することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。測定は公知の方法に従って行う。
本方法において、イノシトール三リン酸産生活性を抑制する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、イノシトール三リン酸産生上昇を測定することによってアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を２４穴プレートに播き、１日間培養する。その後、ｍｙｏ−［２−３Ｈ］ｉｎｏｓｉｔｏｌ（２．５μＣｉ／ｗｅｌｌ）を添加した培地で１日間培養し、細胞を放射活性を有するイノシトールを無添加の培地でよく洗浄する。タクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物を添加後、１０％過塩素酸を加え、反応を止める。１．５Ｍ水酸化カリウムおよび６０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ溶液で中和し、０．５ｍｌのＡＧ１ｘ８樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を詰めたカラムに通し、５ｍＭ四ホウ酸ナトリウム（Ｎａ２Ｂ４Ｏ７）および６０ｍＭギ酸アンモニウムで洗浄した後、１Ｍギ酸アンモニウムおよび０．１Ｍギ酸で溶出した放射活性を、液体シンチレーションカウンターで測定する。タクリン化合物を添加しない場合の放射活性を０％、タクリン化合物を添加した場合の放射活性を１００％とし、試験化合物の、タクリン化合物と本発明の受容体の結合に対する影響を算出する。
イノシトール三リン酸産生活性が、例えば５０％以下になる試験化合物をアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
（８）ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを用いて、タクリン化合物の本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
ＴＲＥ（ＴＰＡ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を含むＤＮＡを、ベクターのレポーター遺伝子上流に挿入し、ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを得る。ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを導入した本発明の受容体発現細胞において、細胞内カルシウム濃度の上昇を伴う刺激は、ＴＲＥを介したレポーター遺伝子発現と、それに引き続くレポーター遺伝子の遺伝子産物（蛋白質）の産生を誘導する。つまり、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定することにより、ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入細胞内のカルシウム量の変動を検出することができる。
具体的には、タクリン化合物を、ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、比較することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
ベクターとしては、例えば、ピッカジーン  ベイシックベクター、ピッカジーン  エンハンサーベクター（東洋インキ製造（株））などが用いられる。ＴＲＥを含むＤＮＡを、上記ベクターのレポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイトに挿入し、ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクターとする。
本方法において、タクリン化合物によるレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を抑制する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
一方、試験化合物のみをＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させ、タクリン化合物と同様な発光量の増加を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼを利用する例を用いて、このスクリーニング方法の具体例を以下に述べる。
ＴＲＥ−レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）を導入した本発明の受容体発現細胞を、２４穴プレートに５ｘ１０３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、４８時間培養する。細胞を０．０５％  ＢＳＡおよび２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄した後、１００μＭのタクリン化合物または１００μＭのタクリン化合物および試験化合物を添加し、３７℃で６０分間反応させる。細胞をピッカジーン用細胞溶解剤（東洋インキ製造（株））で溶かし、溶解液に発光基質（東洋インキ製造（株））を添加する。ルシフェラーゼによる発光は、ルミノメーター、液体シンチレーションカウンターまたはトップカウンターにより測定する。タクリン化合物を添加した場合と、１００μＭのタクリン化合物および試験化合物を添加した場合のルシフェラーゼによる発光量を測定して、比較する。
タクリン化合物による細胞内カルシウムの上昇によって、ルシフェラーゼによる発光量が増加する。この増加を抑制する化合物をアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
レポーター遺伝子として、例えば、アルカリフォスファターゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、β−ガラクトシダーゼなどの遺伝子を用いてもよい。これらのレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性は、公知の方法に従い、または市販の測定キットを用いて測定する。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば和光純薬製Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ５３０を用いて、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ活性は、例えば和光純薬製ＦＡＳＴ  ＣＡＴ  ｃｈｒｏｌａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  ＫｉＴを用いて、β−ガラクトシダーゼ活性は、例えば和光純薬製Ａｕｒｏｒａ  Ｇａｌ−ＸＥを用いて測定する。
（９）本発明の受容体発現細胞は、タクリン化合物の刺激により、ＭＡＰキナーゼが活性化され、増殖する。この反応を利用して、タクリン化合物の本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、タクリン化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、細胞増殖を測定し、比較することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
本発明の受容体発現細胞の増殖は、例えば、ＭＡＰキナーゼ活性、チミジン取り込み活性、ＡＴＰ量、細胞数などを測定すればよい。
具体例としては、ＭＡＰキナーゼ活性については、タクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に添加した後、細胞溶解液から抗ＭＡＰキナーゼ抗体を用いた免疫沈降によりＭＡＰキナーゼ分画を得た後、公知の方法、例えば和光純薬製ＭＡＰ  Ｋｉｎａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔおよびγ−［３２Ｐ］−ＡＴＰを使用してＭＡＰキナーゼ活性を測定し、比較する。
チミジン取り込み活性については、本発明の受容体発現細胞を２４穴プレートに播種し、培養し、タクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物を添加した後、放射活性により標識したチミジン（例、［ｍｅｔｈｙｌ−３Ｈ］−チミジンなど）を加え、その後、細胞を溶解し、細胞内に取り込まれたチミジンの放射活性を、液体シンチレーションカウンターで計数することにより、チミジン取り込み活性を測定し、比較する。
ＡＴＰ量の測定については、本発明の受容体発現細胞を９６穴プレートに播種し、培養し、タクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物を添加した後、例えばＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞内のＡＴＰ量を測定し、比較する。
細胞数の測定については、本発明の受容体発現細胞を２４穴プレートに播種し、培養し、タクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物を添加した後、ＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）を添加する。細胞内に取り込まれてＭＴＴが変化したＭＴＴホルマザンを、塩酸にて酸性としたイソプロパノール水溶液で細胞を溶解した後、５７０ｎｍの吸収によって測定し、比較する。
本方法において、本発明の受容体発現細胞の増殖を抑制する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、タクリン化合物と同様な細胞増殖活性を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
チミジン取り込み活性を利用するスクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を２４穴プレートに５０００個／ウェル播き、１日間培養する。次に血清を含まない培地で２日間培養し、細胞を飢餓状態にする。タクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物を、細胞に添加して２４時間培養した後、［ｍｅｔｈｙｌ−３Ｈ］−チミジンをウェル当たり０．０１５ＭＢｑ添加し、６時間培養する。細胞をＰＢＳで洗った後、メタノールを添加して１０分間放置する。次に５％トリクロロ酢酸を添加して１５分間放置後、固定された細胞を蒸留水で４回洗う。０．３Ｎ水酸化ナトリウム溶液で細胞を溶解し、溶解液中の放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定する。
タクリン化合物を添加した場合の放射活性の増加を抑制する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
（１０）本発明の受容体発現細胞は、タクリン化合物の刺激により、カリウムチャネルが活性化し、細胞内にあるＫイオンが、細胞外に流出する。この反応を利用して、タクリン化合物の本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
Ｋイオンと同族元素であるＲｂイオン（ルビジウムイオン）は、Ｋイオンと区別無く、カリウムチャネルを通って細胞外に流出する。よって、本発明の受容体発現細胞に、放射活性同位体であるＲｂ（［８６Ｒｂ］）を取り込ませておいた後、タクリン化合物の刺激によって流出する８６Ｒｂの流れ（流出活性）を測定することにより、タクリン化合物の本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定する。
具体的には、８６Ｒｂの存在下、タクリン化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、８６Ｒｂの流出活性を測定し、比較することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
本方法において、タクリン化合物刺激による８６Ｒｂの流出活性の上昇を抑制する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、タクリン化合物と同様な８６Ｒｂの流出活性の上昇を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を２４穴プレートに播き、２日間培養する。その後、１ｍＣｉ／ｍｌの８６ＲｂＣｌを含む培地中で２時間保温する。細胞を培地でよく洗浄し、外液中の８６ＲｂＣｌを完全に除く。タクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物を細胞に添加し、３０分後外液を回収し、γカウンターで放射活性を測定し、比較する。
タクリン化合物刺激による８６Ｒｂの流出活性の上昇を抑制する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
（１１）本発明の受容体発現細胞がタクリン化合物に反応し、細胞外のｐＨが変化する。この反応を利用して、タクリン化合物の本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、タクリン化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、細胞外のｐＨ変化を測定し、比較することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
細胞外ｐＨ変化は、例えば、Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ装置（モレキュラーデバイス社）を使用して測定する。
本方法において、タクリン化合物による細胞外ｐＨ変化を抑制する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、タクリン化合物と同様な細胞外ｐＨ変化を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞をＣｙｔｏｓｅｎｓｏｒ装置用のカプセル内で終夜培養し、装置のチャンバーにセットして細胞外ｐＨが安定するまで約２時間、０．１％  ＢＳＡを含むＲＰＭＩ１６４０培地（モレキュラーデバイス社製）を灌流させる。ｐＨが安定した後、タクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物を含む培地を細胞上に灌流させる。灌流によって生じた培地のｐＨ変化を測定し、比較する。
タクリン化合物による細胞外ｐＨ変化を抑制する化合物をアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
（１２）酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のｈａｐｌｏｉｄ  α−ｍａｔｉｎｇ  ｔｙｐｅ（ＭＡＴα）の性フェロモン受容体Ｓｔｅ２は、Ｇ蛋白質Ｇｐａ１と共役しており、性フェロモンα−ｍａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒに応答してＭＡＰキナーゼを活性化し、これに引き続き、Ｆａｒ１（ｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔ）および転写活性化因子Ｓｔｅ１２が活性化される。Ｓｔｅ１２は、種々の蛋白質（例えば、接合に関与するＦＵＳ１）の発現を誘導する。一方、制御因子Ｓｓｔ２は上記の過程に抑制的に機能する。この系において、受容体遺伝子を導入した酵母を作製し、受容体アゴニストの刺激により酵母細胞内のシグナル伝達系を活性化し、その結果生じる増殖などを指標として用いる、受容体アゴニストと受容体との反応の測定系の試みが行なわれている（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５巻，４８７−４９４頁，１９９７年）。上記の受容体遺伝子導入酵母の系を利用して、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体例を以下に示す。
ＭＡＴα酵母のＳｔｅ２およびＧｐａ１をコードする遺伝子を除去し、代わりに、本発明の受容体遺伝子およびＧｐａ１−Ｇａｉ２融合蛋白質をコードする遺伝子を導入する。Ｆａｒ１をコードする遺伝子を除去してｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔが生じないようにし、また、Ｓｓｔ２をコードする遺伝子を除去してタクリン化合物に対する応答の感度を向上させておく。さらに、ＦＵＳ１にヒスチジン生合成遺伝子ＨＩＳ３を結合したＦＵＳ１−ＨＩＳ３遺伝子を導入する。この遺伝子組換え操作は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１５巻，６１８８−６１９５頁，１９９５年に記載の方法において、ソマトスタチン受容体タイプ２（ＳＳＴＲ２）遺伝子を、本発明の受容体に置き換えて実施することができる。
このように構築された形質変換酵母は、タクリン化合物に高感度で反応し、その結果、ＭＡＰキナーゼの活性化が起き、ヒスチジン生合成酵素が合成されるようになり、ヒスチジン欠乏培地で生育可能になる。
従って、上記の本発明の受容体発現酵母（Ｓｔｅ２遺伝子およびＧｐａ１遺伝子が除去され、本発明の受容体遺伝子およびＧｐａ１−Ｇａｉ２融合蛋白質コード遺伝子が導入され、Ｆａｒ遺伝子およびＳｓｔ２遺伝子が除去され、ＦＵＳ１−ＨＩＳ３遺伝子が導入されたＭＡＴα酵母）を、ヒスチジン欠乏培地で培養し、タクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物を接触させ、該酵母の生育を測定し、比較することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
本方法において、該酵母の生育を抑制する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
一方、試験化合物のみを上記の本発明の受容体発現酵母に接触させ、タクリン化合物と同様な酵母の生育を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
上記の本発明の受容体発現酵母を完全合成培地の液体培地で終夜培養し、その後、ヒスチジンを除去した溶解寒天培地に、２ｘ１０４ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度になるように加える。ついで、９ｘ９ｃｍの角形シャーレに播く。寒天が固化した後、タクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物をしみこませた滅菌濾紙を寒天表面におき、３０℃で３日間培養する。試験化合物の影響は、濾紙の周囲の酵母の生育を、タクリン化合物のみをしみこませた滅菌濾紙を用いた場合と比較する。また、あらかじめ、ヒスチジンを除去した寒天培地にタクリン化合物を添加しておき、滅菌濾紙に試験化合物のみをしみこませて酵母を培養し、シャーレ全面での酵母の生育が濾紙の周囲で影響を受けることを観察してもよい。
酵母の生育を抑制する化合物をアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
（１３）本発明の受容体遺伝子ＲＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞に注入し、タクリン化合物によって刺激すると細胞カルシウム濃度が上昇して、ｃａｌｃｉｕｍ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｃｕｒｒｅｎｔが生じる。これは、膜電位の変化としてとらえることができる（Ｋイオン濃度勾配に変化がある場合も同様）。タクリン化合物によって生じる本発明の受容体導入アフリカツメガエル卵母細胞における上記反応を利用して、タクリン化合物の本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、タクリン化合物を、本発明の受容体遺伝子ＲＮＡ導入アフリカツメガエル卵母細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、本発明の受容体遺伝子ＲＮＡ導入アフリカツメガエル卵母細胞に接触させた場合における、細胞膜電位の変化を測定し、比較することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
本方法において、細胞膜電位変化を抑制する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体遺伝子ＲＮＡ導入アフリカツメガエル卵母細胞に接触させ、タクリン化合物と同様な細胞膜電位変化を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
氷冷して動けなくなった雌のアフリカツメガエルから取り出した卵母細胞塊を、ＭＢＳ液（８８ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＫＣｌ，０．４１ｍＭ  ＣａＣｌ２，０．３３ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ３）２，０．８２ｍＭ  ＭｇＳＯ４，２．４ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ；ｐＨ７．４）に溶かしたコラーゲナーゼ（０．５ｍｇ／ｍｌ）で卵塊がほぐれるまで１９℃、１〜６時間、１５０ｒｐｍで処理する。外液をＭＢＳ液に置換することで３度洗浄し、マイクロマニピュレーターで本発明の受容体遺伝子ｐｏｌｙ  Ａ付加ｃＲＮＡ（５０ｎｇ／５０ｎｌ）を卵母細胞にマイクロインジェクションする。
本発明の受容体遺伝子ｍＲＮＡは、組織や細胞から調製してもよく、プラスミドからｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写してもよい。本発明の受容体遺伝子ｍＲＮＡをＭＢＳ液中で２０℃で３日培養し、これをＲｉｎｇｅｒ液を流しているｖｏｌｔａｇｅ  ｃｌａｍｐ装置のくぼみに置き、電位固定用ガラス微小電極および電位測定用ガラス微小電極を細胞内に刺入し、（−）極は細胞外に置く。電位が安定したら、タクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物を含むＲｉｎｇｅｒ液を流して電位変化を記録する。試験化合物の影響は、本発明の受容体遺伝子ＲＮＡ導入アフリカツメガエル卵母細胞の細胞膜電位変化を、タクリン化合物のみ含むＲｉｎｇｅｒ液を流した場合と比較することによって測定することができる。
細胞膜電位変化を抑制する化合物をアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
上記の系において、電位の変化量を増大させると、測定しやすくなるため、各種のＧ蛋白質遺伝子のｐｏｌｙ  Ａ付加ＲＮＡを導入してもよい。また、カルシウム存在下で発光を生じるような蛋白質（例、ａｅｑｕｏｒｉｎなど）の遺伝子のｐｏｌｙ  Ａ付加ＲＮＡを共インジェクションすることにより、膜電位変化ではなく発光量を測定することもできる。
タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、本発明の受容体または本発明の受容体を含有する細胞もしくは細胞の膜画分、およびタクリン化合物を含有する。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
１．スクリーニング用試薬
（ｉ）測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Ｈａｎｋｓ’Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（インビトロジェン社製）に、０．０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、または用時調製しても良い。
（ｉｉ）本発明の受容体標品
本発明の受容体を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０５個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ２、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
（ｉｉｉ）標識リガンド
〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３２Ｐ〕、〔３３Ｐ〕、〔３６Ｓ〕などの放射性同位元素で標識したタクリン化合物を適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを、４℃または−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。
（ｉｖ）リガンド標準液
タクリン化合物を０．１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
２．測定法
（ｉ）１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明の受容体を発現させた細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
（ｉｉ）１０−３〜１０−１０Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、標識したタクリン化合物を５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに１０−３Ｍのタクリン化合物を５μｌ加えておく。
（ｉｉｉ）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識されたタクリン化合物を０．２Ｎ  ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
（ｉｖ）液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Ｐｅｒｃｅｎｔ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｂｉｎｄｉｎｇ（ＰＭＢ）を次式で求める。
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ０−ＮＳＢ）］×１００
ＰＭＢ：Ｐｅｒｃｅｎｔ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｂｉｎｄｉｎｇ
Ｂ    ：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｂｉｎｄｉｎｇ（非特異的結合量）
Ｂ０  ：最大結合量
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩は、タクリン化合物と本発明の受容体との結合を変化させる化合物あるいは本発明の受容体の活性を促進または阻害する化合物であり、具体的には、（ｉ）本発明の受容体を介して細胞刺激活性を有する化合物またはその塩（本発明の受容体アゴニスト）、（ｉｉ）該刺激活性を有しない化合物（本発明の受容体アンタゴニスト）、（ｉｉｉ）本発明の受容体とタクリン化合物との結合力を促進する化合物、（ｉｖ）本発明の受容体とタクリン化合物との結合力を阻害する化合物などである。該化合物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
該化合物の塩としては、前記した本発明の受容体の塩と同様のものが用いられる。
上記本発明の受容体アゴニストであるか、またはアンタゴニストであるかの評価方法は、例えば、以下の（ｉ）または（ｉｉ）に従えばよい。
（ｉ）前記（ａ）〜（ｃ）のスクリーニング方法で示されるバインディング・アッセイを行い、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる（特に、結合を阻害する）化合物を得た後、該化合物が上記した本発明の受容体を介する細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は本発明の受容体アゴニスト（アゴニスト）であり、該活性を有しない化合物またはその塩は本発明の受容体アンタゴニスト（アンタゴニスト）である。
（ｉｉ）（ａ）試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞に接触させ、本発明の受容体を介した細胞刺激活性を測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は本発明の受容体アゴニストである。
（ｂ）タクリン化合物を本発明の受容体を含有する細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞に接触させた場合における、本発明の受容体を介した細胞刺激活性を測定し、比較する。本発明の受容体を活性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る化合物またはその塩は本発明の受容体アンタゴニストである。
前述したように、本発明の受容体は、乳癌由来細胞株に発現しているが、受容体の発現亢進またはリガンドによる活性化により、これらの細胞内のＭＡＰキナーゼの活性化を抑制され、アポトーシスが誘導される（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４３巻、３３７６−３３８４頁、２００２年、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１６巻、７０−８４頁、２００２年）。
従って、本発明の受容体アゴニストおよびタクリン化合物は、安全で低毒性な医薬、例えば、癌（例、脳腫瘍、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、肝細胞癌、膵癌、膵内分泌腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、陰茎癌、腎臓癌、腎盂癌、尿管癌、腎細胞癌、精巣腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、外陰癌、子宮癌、子宮頚部癌、子宮体部癌、子宮肉腫、絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、菌状息肉症、基底細胞腫、軟部肉腫、悪性リンパ腫、ホジキン病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、成人Ｔ細胞白血病、慢性骨髄増殖性疾患、膵内分泌腫瘍、原発不明癌など）などの予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖抑制剤などとして有用である。
本発明の受容体アンタゴニストは、本発明の受容体が有する生理作用（例、虚血再かん流後の心筋細胞のアポトーシスなど）を抑制することができるので、安全で低毒性な医薬、例えば、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）などの予防・治療剤、心筋細胞のアポトーシスの予防・治療剤などとして有用である。
本発明の受容体とタクリン化合物との結合力を促進する化合物は、安全で低毒性な医薬、例えば、癌（例、脳腫瘍、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、肝細胞癌、膵癌、膵内分泌腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、陰茎癌、腎臓癌、腎盂癌、尿管癌、腎細胞癌、精巣腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、外陰癌、子宮癌、子宮頚部癌、子宮体部癌、子宮肉腫、絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、菌状息肉症、基底細胞腫、軟部肉腫、悪性リンパ腫、ホジキン病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、成人Ｔ細胞白血病、慢性骨髄増殖性疾患、膵内分泌腫瘍、原発不明癌など）などの予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖抑制剤などとして有用である。
本発明の受容体とタクリン化合物との結合力を阻害する化合物は、安全で低毒性な医薬、例えば、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）などの予防・治療剤、心筋細胞のアポトーシスの予防・治療剤などとして有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、例えば、ペプチド、蛋白、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物であり、本発明の受容体とタクリン化合物との結合性を変化させる化合物、本発明の受容体の活性または機能を促進または阻害する化合物、本発明の受容体の遺伝子の発現を促進または阻害（発現量を増加または減少）する化合物などである。
該化合物の塩としては、前記した本発明の受容体の塩と同様のものが用いられる。
上記化合物またはその塩を上記の医薬（予防・治療剤など）として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。
該化合物またはその塩は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、該化合物またはその塩を、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどにより差異はある。
例えば、乳癌患者（体重６０ｋｇ当たり）に、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ経口投与する。非経口的に投与する場合、例えば、該化合物を注射剤の形で乳癌患者（体重６０ｋｇ当たり）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
上記医薬は、他の薬剤、例えばアルキル化剤（例、シクロフォスファミド、ブスルファン、メルファランなど）、代謝拮抗剤（例、シタラビン、６−メルカプトプリン、メソトレキサート、５−フルオロウラシルなど）、抗癌性抗生物質（例、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、マイトマイシン、アドリアマイシンなど）、植物由来抗癌剤（例、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール、エトポシドなど）、酵素製剤（例、Ｌ−アスパラギナーゼなど）、副腎皮質ホルモン薬（例、プレドニゾロン、プレドニゾン、デキサメタゾン、酢酸コルチゾンなど）、エストロゲン薬（例、エストラジオール、エチニルエストラジオール、ホスフェストロール、クロロトリアニセンなど）、抗エストロゲン薬（例、エピチオスタノール、メピチオスタン、タモキシフェン、クロミフェンなど）、黄体ホルモン薬（例、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、ジドロゲステロン、メドロキシプロゲステロン、ノルエチステロン、ノルエチンドロンなど）、ＬＨＲＨ誘導体（例、酢酸リュープロレリンなど）、シスプラチン、カルボプラチン、トランスレチノイン酸、インターフェロンα、イマチニブなどと併用してもよい。併用により、予防および（または）治療に必要な抗癌作用を低下させることなく上記医薬、および（または）上記薬物の投与量を減らすことができるため、予防および（または）治療効果を減少させることなく副作用（例、正常細胞に対する障害作用など）を軽減することができる。この際、投与時期は限定されず、これらを投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。投与量は、臨床上用いられている用量を基準として適宜選択することができる。また、上記化合物とこれら薬剤の配合比は、投与対象、投与ルート、対象疾患、症状、組み合わせ等に応じて適宜選択することができる。
〔２〕タクリン化合物を含有する癌の予防・治療剤
タクリン化合物は、乳癌由来細胞株に発現し、受容体の発現亢進またはリガンドによる活性化により、これら細胞内のＭＡＰキナーゼの活性化が抑制され、アポトーシスが誘導される本発明の受容体のリガンドである。
従って、タクリン化合物は、安全で低毒性な医薬、例えば、癌（例、脳腫瘍、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、肝細胞癌、膵癌、膵内分泌腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、陰茎癌、腎臓癌、腎盂癌、尿管癌、腎細胞癌、精巣腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、外陰癌、子宮癌、子宮頚部癌、子宮体部癌、子宮肉腫、絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、菌状息肉症、基底細胞腫、軟部肉腫、悪性リンパ腫、ホジキン病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、成人Ｔ細胞白血病、慢性骨髄増殖性疾患、膵内分泌腫瘍、原発不明癌など）などの予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖抑制剤などとして有用である。
タクリン化合物を上記の医薬（予防・治療剤など）として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。
該化合物は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、該化合物またはその塩を、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどにより差異はある。
例えば、乳癌患者（体重６０ｋｇ当たり）に、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ経口投与する。非経口的に投与する場合、例えば、該化合物を注射剤の形で乳癌患者（体重６０ｋｇ当たり）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
上記医薬は、他の薬剤、例えばアルキル化剤（例、シクロフォスファミド、ブスルファン、メルファランなど）、代謝拮抗剤（例、シタラビン、６−メルカプトプリン、メソトレキサート、５−フルオロウラシルなど）、抗癌性抗生物質（例、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、マイトマイシン、アドリアマイシンなど）、植物由来抗癌剤（例、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール、エトポシドなど）、酵素製剤（例、Ｌ−アスパラギナーゼなど）、副腎皮質ホルモン薬（例、プレドニゾロン、プレドニゾン、デキサメタゾン、酢酸コルチゾンなど）、エストロゲン薬（例、エストラジオール、エチニルエストラジオール、ホスフェストロール、クロロトリアニセンなど）、抗エストロゲン薬（例、エピチオスタノール、メピチオスタン、タモキシフェン、クロミフェンなど）、黄体ホルモン薬（例、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、ジドロゲステロン、メドロキシプロゲステロン、ノルエチステロン、ノルエチンドロンなど）、ＬＨＲＨ誘導体（例、酢酸リュープロレリンなど）、シスプラチン、カルボプラチン、トランスレチノイン酸、インターフェロンα、イマチニブなどと併用してもよい。併用により、予防および（または）治療に必要な抗癌作用を低下させることなく上記医薬、および（または）上記薬物の投与量を減らすことができるため、予防および（または）治療効果を減少させることなく副作用（例、正常細胞に対する障害作用など）を軽減することができる。この際、投与時期は限定されず、これらを投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。投与量は、臨床上用いられている用量を基準として適宜選択することができる。また、上記化合物とこれら薬剤の配合比は、投与対象、投与ルート、対象疾患、症状、組み合わせ等に応じて適宜選択することができる。
本明細書および配列表において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ          ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ        ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ            ：アデニン
Ｔ            ：チミン
Ｇ            ：グアニン
Ｃ            ：シトシン
ＲＮＡ          ：リボ核酸
ｍＲＮＡ        ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ        ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ        ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ        ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ        ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ          ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ        ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ          ：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ          ：グリシン
Ａｌａ          ：アラニン
Ｖａｌ          ：バリン
Ｌｅｕ          ：ロイシン
Ｉｌｅ          ：イソロイシン
Ｓｅｒ          ：セリン
Ｔｈｒ          ：スレオニン
Ｃｙｓ          ：システイン
Ｍｅｔ          ：メチオニン
Ｇｌｕ          ：グルタミン酸
Ａｓｐ          ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ          ：リジン
Ａｒｇ          ：アルギニン
Ｈｉｓ          ：ヒスチジン
Ｐｈｅ          ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ          ：チロシン
Ｔｒｐ          ：トリプトファン
Ｐｒｏ          ：プロリン
Ａｓｎ          ：アスパラギン
Ｇｌｎ          ：グルタミン
ｐＧｌｕ        ：ピログルタミン酸
Ｓｅｃ          ：セレノシステイン（ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｅ）
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｍｅ            ：メチル基
Ｅｔ            ：エチル基
Ｂｕ            ：ブチル基
Ｐｈ            ：フェニル基
ＴＣ            ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｔｏｓ          ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ          ：ホルミル
Ｂｚｌ          ：ベンジル
Ｃｌ２−Ｂｚｌ  ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ          ：ベンジルオキシメチル
Ｚ              ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ        ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ        ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ          ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ          ：ジニトロフェニル
Ｔｒｔ          ：トリチル
Ｂｕｍ          ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ        ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ        ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ      ：３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ        ：１−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド
ＤＣＣ          ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ヒトＧＰＲ３０のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
ラットＧＰＲ３０のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３〕
マウスＧＰＲ３０のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
ヒトＧＰＲ３０のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５〕
配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ３０をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
ラットＧＰＲ３０をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
マウスＧＰＲ３０をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
配列番号：４で表されるアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ３０をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
【実施例】
【０００６】
以下に、参考例および実施例により本発明をより具体的にするが、本発明はこれらに限定されるものではない。
参考例１
ヒトＧＰＲ３０発現ＣＨＯ細胞の作製
ヒトＧＰＲ３０のｃＤＮＡ（配列番号：５）を公知のＰＣＲ法によりクローニングし、ｐＡＫＫＯ１．１１Ｈ発現ベクター（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １２１９（１９９４）２５１−２５９）に組み込んだ。プラスミドの構造を、制限酵素処理および配列解析で確認し、正しい構築のものをＣＨＯ細胞発現用プラスミドｐＡＫ−ｈＧＰＲ３０として使用した。
このプラスミドｐＡＫ−ｈＧＰＲ３０をＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）にエレクトロポレーション法で形質導入した。まず、プラスミドｐＡＫ−ｈＧＰＲ３０を制限酵素Ａｈｄ  Ｉで処理した。エレクトロポレーション用のキュベットに、ＰＢＳ  ５００μｌに懸濁した５ｘ１０６個のＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞と、ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ  １０μｌに溶解したプラスミドＤＮＡ  ５μｇを添加し、５分間氷上で静置後、０．２５Ｖ、９６０μＦの条件でエレクトロポレーションを行った。５分間氷上で静置後、全量のＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞をＴ７５フラスコに播き、１０％のウシ胎児血清（ＢＩＯ  ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ社）を含む、核酸含有ＭＥＭａｌｐｈａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で３７℃、５％炭酸ガス中で１日間培養した。該細胞をトリプシン処理により分散させてフラスコから回収し、２００個または５００個ずつ９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに植え込み、透析済み１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ社）、５０μｇ／ｍｌ  ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎを含む核酸不含ＭＥＭａｌｐｈａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中にて３７℃、５％炭酸ガス中にて培養を開始した。プラスミドの導入された形質転換ＣＨＯ細胞は該培地中で生育するが、非導入細胞は次第に死滅していく。培養開始８〜１０日後に、９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅの一個のｗｅｌｌの中に一個のコロニーが生育してきたｗｅｌｌを選択し、形質転換ＣＨＯ細胞のコロニーを約４８個選んだ。それぞれ選択された細胞からＲＮＡを市販のＲＮＡ単離用キットを用いて回収し、以降、公知のＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ＰＣＲ法によりヒトＧＰＲ３０を高発現する形質転換ＣＨＯ細胞（以後、ヒトＧＰＲ３０細胞と略称する）を選別した。
参考例２
ラットＧＰＲ３０発現ＣＨＯ細胞の作製
ラットＧＰＲ３０は、ＧＰＲ４１としてＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２３４巻、１９０−１９３頁、１９９７年に報告されている。
ラットＧＰＲ３０レセプターｃＤＮＡ（配列番号：６）を公知のＰＣＲ法によりクローニングし、ｐＡＫＫＯ１．１１Ｈ発現ベクター（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １２１９巻、２５１−２５９頁、１９９４年）に組み込んだ。プラスミドの構造を、制限酵素処理ならびに配列解析で確認し、正しい構築のものをＣＨＯ細胞発現用プラスミドｐＡＫ−ｒＧＰＲ３０として使用した。
このプラスミドｐＡＫ−ｒＧＰＲ３０を参考例１に記載した方法に従い、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）にエレクトロポレーション法で形質導入し、ラットＧＰＲ３０を高発現する形質転換ＣＨＯ細胞（以後、ラットＧＰＲ３０細胞と略称する）を選別した。
実施例１
（１）ＦＬＩＰＲによるヒトＧＰＲ３０およびラットＧＰＲ３０アゴニスト活性の測定
上記参考例で得られたヒトＧＰＲ３０細胞およびラットＧＰＲ３０細胞を、それぞれ１５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように培地（１０％  ｄ  ＦＢＳ−ＤＭＥＭ）に懸濁し、ＦＬＩＰＲ用９６穴プレート（Ｂｌａｃｋ  ｐｌａｔｅ  ｃｌｅａｒ  ｂｏｔｔｏｍ、Ｃｏｓｔｅｒ社）に８連ピペットを用いて各ウェルに２００μｌずつ植え込み（３．０×１０４ｃｅｌｌｓ／２００μｌ／ウェル）、５％ＣＯ２インキュベーター中にて３７℃で一晩培養した後用いた（以後、細胞プレートとする）。Ｈ／ＨＢＳＳ  ２０ｍｌ、２５０ｍＭ  Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ  ２００μｌ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）２００μｌを混合した。また、Ｆｌｕｏ  ３−ＡＭ（同仁化学研究所）２バイアル（５０μｇ）をジメチルスルフォキサイド４０μｌ、２０％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）４０μｌに溶解し、これを上記Ｈ／ＨＢＳＳ−Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ−ＦＢＳに加え、混和後、８連ピペットを用いて培養液を除いた細胞プレートに各ウェル１００μｌずつ分注し、５％  ＣＯ２インキュベーター中にて３７℃で１時間インキュベートした（色素ローディング）。種々の濃度のタクリン（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）溶液８μｌを２．５ｍＭ  Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ、０．１％  ＣＨＡＰＳ、０．１％  ＢＳＡを含Ｈ／ＨＢＳＳ  ２５９μｌに加えて希釈し、ＦＬＩＰＲ用９６穴プレート（Ｖ−Ｂｏｔｔｏｍプレート、Ｃｏｓｔｅｒ社）へ移した（以後、サンプルプレートとする）。細胞プレートの色素ローディング終了後、Ｈ／ＨＢＳＳに２．５ｍＭ  Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄを加えた洗浄バッファーでプレートウォッシャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて細胞プレートを５回洗浄し、洗浄後１００μｌの洗浄バッファーを残した。この細胞プレートとサンプルプレートをＦＬＩＰＲにセットし（ＦＬＩＰＲにより、サンプルプレートから５０μｌのサンプルが細胞プレートへと移される）、蛍光強度変化を継時的に測定することにより、細胞内カルシウムイオン濃度上昇活性を測定した。
結果を図１〜図４に示す。
これより、タクリンによる刺激によって、ヒトＧＰＲ３０細胞およびラットＧＰＲ３０細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇が濃度依存的に惹起されることが明らかとなった。
（２）ＦＬＩＰＲを用いた試験化合物の活性の検討法
上記参考例で得られたヒトＧＰＲ３０細胞を、１５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように培地（１０％  ｄ  ＦＢＳ−ＤＭＥＭ）に懸濁し、ＦＬＩＰＲ用９６穴プレート（Ｂｌａｃｋ  ｐｌａｔｅ  ｃｌｅａｒ  ｂｏｔｔｏｍ、Ｃｏｓｔｅｒ社）に８連ピペットを用いて各ウェルに２００μｌずつ植え込み（３．０×１０４ｃｅｌｌｓ／２００μｌ／ウェル）、５％  ＣＯ２インキュベーター中にて３７℃で一晩培養した後にアッセイに用いる（以後、細胞プレートとする）。Ｈ／ＨＢＳＳ  ２０ｍｌ、２５０ｍＭ  Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ  ２００μｌ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）２００μｌを混合する。また、Ｆｌｕｏ  ３−ＡＭ（同仁化学研究所）２バイアル（５０μｇ）をジメチルスルフォキサイド４０μｌ、２０％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）４０μｌに溶解し、これを上記Ｈ／ＨＢＳＳ−Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ−ＦＢＳに加え、混和後、８連ピペットを用いて培養液を除いた細胞プレートに各ウェル１００μｌずつ分注し、５％  ＣＯ２インキュベーター中にて３７℃で１時間インキュベートする（色素ローディング）。
試験化合物を含有する溶液を２．５ｍＭ  Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ、０．１％  ＣＨＡＰＳを含むＨ／ＨＢＳＳに加えて希釈し、ＦＬＩＰＲ用９６穴プレート（Ｖ−Ｂｏｔｔｏｍプレート、Ｃｏｓｔｅｒ社）へ移す（以後、サンプルプレートとする）。細胞プレートの色素ローディング終了後、Ｈ／ＨＢＳＳに２．５ｍＭ  Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄを加えた洗浄バッファーでプレートウォッシャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて細胞プレートを５回洗浄し、洗浄後１００μｌの洗浄バッファーを残す。この細胞プレートとサンプルプレートをＦＬＩＰＲにセットし（ＦＬＩＰＲにより、サンプルプレートから５０μｌのサンプルが細胞プレートへと移される）、蛍光強度変化を継時的に測定することにより、細胞内カルシウムイオン濃度上昇活性を測定する。ＧＰＲ３０を発現させないＣＨＯ細胞株を用いて上記と同様の試験を実施し、ＧＰＲ３０発現ＣＨＯ細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を特異的に上昇させる化合物を探索する。
実施例２
（１）Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質発現プラスミドおよびレポータープラスミドの宿主細胞（ＨｅＬａ）での一過性発現
参考例１記載のプラスミドｐＡＫ−ｈＧＰＲ３０を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、得られたコロニーを単離・培養後、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてプラスミドの大量調製を行なった。また、血清応答配列（ＳＲＥ）の下流にレポーターとしてルシフェラーゼ遺伝子が連結されたｐＳＲＥ−Ｌｕｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のレポータープラスミドおよびＧタンパク質の一種であるヒトＧαｏＡ、ヒトＧβ１、ヒトＧγ２の発現ベクタープラスミドを同様にして調製した。
Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質発現プラスミドｐＡＫ−ｈＧＰＲ３０およびレポータープラスミドを導入する宿主細胞としては、ＨｅＬａ細胞を用い、３８４穴アッセイプレート（ＣＯＳＴＡＲ  ３７０４）に４，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、培養液量２５μｌで播種し、一晩培養した。培地はＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に１０％のウシ胎児血清と１％  ＭＥＭ  ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加したもの（ＤＭＥＭ／ＮＥＡＡ）を用いた。
各プラスミドを２４０ｎｇ／μｌの濃度に希釈し、ｐＡＫ−ｈＧＰＲ３０または対照実験としてレセプターの発現プラスミドの代りにレセプタータンパク質をコードするＤＮＡを含まない発現ベクターｐＡＫＫＯ−１．１１Ｈのプラスミドを１μｌとレポータープラスミド９μｌおよびＧαｏＡ、Ｇβ１、Ｇγ２のＧタンパク質発現プラスミド各１μｌの割合で２５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ−Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に添加した。これを、同じく２５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ−Ｉに１０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したものと等量混合して、添付のマニュアル記載の方法に従ってリポソームとプラスミドの複合体を形成させた。これらを５μｌ／ｗｅｌｌずつＨｅＬａ細胞の培養液に添加し、プラスミドの導入を行った後、３７℃、５％ＣＯ２下で一晩培養した。
（２）レポーターアッセイによるリガンド活性の検出
上記（１）で準備したＨｅＬａ細胞を、ウシ胎児血清を含まないＤＭＥＭ／ＮＥＡＡ（アッセイ用培地）で２回洗浄後、３７℃、５％  ＣＯ２下で２時間培養した。さらにアッセイ用培地で１回洗浄後、０．０５％  ＣＨＡＰＳを含むアッセイ用培地に溶解したタクリン（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を各穴の細胞に添加した。サンプル添加後に３７℃、５％ＣＯ２下で４時間のインキュベーションを行ない、レセプターを介したリガンドのアゴニスト活性によって惹起される細胞内シグナル伝達に由来するレポーター遺伝子の転写・翻訳の促進を誘導した。インキュベーション終了後に各穴の培地を除去し、ルシフェラーゼ活性測定用の基質であるピッカジーンＬＴ２．０（東洋インキ社）を８μｌずつ加えた。細胞が溶解し、基質と充分に混合した後、各穴のレポーター遺伝子の発現誘導量に由来する化学発光量をプレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎＴＭ、パーキンエルマー）にて測定した。
その結果、図５に示すようにＧＰＲ３０発現細胞で、タクリン（１００μＭ）添加によって顕著なルシフェラーゼ活性亢進が認められた。一方、対照のｐＡＫＫＯ−１．１１Ｈ導入細胞では、タクリン（１００μＭ）を添加しても有意な活性の亢進は検出されなかった。
以上よりタクリンによる刺激によってヒトＧＰＲ３０を発現する細胞に特異的に血清応答因子によって制御される遺伝子の転写が促進されることが明らかとなった。
タクリンの代わりに試験化合物を添加して同様の測定を実施することにより、ＧＰＲ３０を活性化して血清応答因子によって制御されるルシフェラーゼ遺伝子転写活性の促進を示す化合物を探索することができる。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
タクリン化合物（例、化合物（Ｉ））、タクリン化合物の活性を促進する化合物またはその塩、本発明の受容体（例、ＧＰＲ３０など）とタクリン化合物との結合を促進する化合物またはその塩などは、例えば、癌（例、脳腫瘍、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、肝細胞癌、膵癌、膵内分泌腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、陰茎癌、腎臓癌、腎盂癌、尿管癌、腎細胞癌、精巣腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、外陰癌、子宮癌、子宮頚部癌、子宮体部癌、子宮肉腫、絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、菌状息肉症、基底細胞腫、軟部肉腫、悪性リンパ腫、ホジキン病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、成人Ｔ細胞白血病、慢性骨髄増殖性疾患、膵内分泌腫瘍、原発不明癌など）などの予防・治療剤、癌の転移抑制剤、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖抑制剤などとして有用である。
タクリン化合物の活性を阻害する化合物またはその塩などは、例えば、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）の予防・治療剤、心筋細胞のアポトーシスの予防・治療剤などとして有用である。
また、本発明の受容体（例、ＧＰＲ３０など）およびタクリン化合物は、例えば、癌（例、脳腫瘍、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、肝細胞癌、膵癌、膵内分泌腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、陰茎癌、腎臓癌、腎盂癌、尿管癌、腎細胞癌、精巣腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、外陰癌、子宮癌、子宮頚部癌、子宮体部癌、子宮肉腫、絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、菌状息肉症、基底細胞腫、軟部肉腫、悪性リンパ腫、ホジキン病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、成人Ｔ細胞白血病、慢性骨髄増殖性疾患、膵内分泌腫瘍、原発不明癌など）などの予防・治療作用、癌細胞のアポトーシス促進作用、癌細胞の増殖抑制作用、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）の予防・治療作用、心筋細胞のアポトーシスの予防・治療作用を有する化合物またはその塩のスクリーニングに有用である。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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