(57)【要約】【課題】移植用細胞の機能を活性化し、生着および増殖効率を増加させる方法の提供することである。【解決手段】移植用細胞を静電場雰囲気内に置いて保存することによる。静電場雰囲気は、100〜10000Ｖの交流又は直流電圧を電極に印加して形成される。静電場雰囲気での保存温度は-30〜40℃であり、静電場雰囲気でなければ移植用細胞が凍結しうる-10〜-1℃でも凍結させることなく活性化することができる。本発明の方法は、特に、移植領域、再生医療領域、遺伝子治療領域、基礎研究領域等に利用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を静電場雰囲気内に置くことを特徴とする、移植用細胞の機能を活性化する方法。
【請求項２】
静電場雰囲気が100〜10000Ｖの交流または直流電圧を電極に印加して形成される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
移植用細胞を、-30〜40℃で静電場雰囲気内に置くことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
移植用細胞が、骨髄移植用の細胞である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
骨髄移植用の細胞が骨髄細胞、臍帯血細胞、およびそれらの幹細胞から選ばれる請求項４に記載の方法。
【請求項６】
移植用細胞の機能の活性化が、被移植組織における移植用細胞の生着率および増殖率の向上である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法により調製される移植用細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、移植用細胞を活性化する方法に関するものである。さらに詳しくは、移植用細胞を静電場雰囲気内に置くことを特徴とする、移植用細胞を活性化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄移植は、白血病、リンパ腫、ホジキン病並びに固形癌、特に黒色腫および乳癌のような血液学的悪性疾患の患者において施行される治療になりつつある。また、最近IMF（特発性多発性骨髄線維増殖）といった骨髄肥大性疾患の治療において用いられている。さらに、骨髄移植は、エイズ、再生不良性貧血及び自己免疫疾患の治療にも使用することができる。【０００３】
骨髄移植の目的は、化学療法、照射または病気により障害を受けた宿主造血幹細胞（全能及び多分化能）を置換することである。移植された細胞のうち、造血幹細胞がホストの骨髄内に生着、増殖し、繰り返し複製し分化することで、血液中に存在する全ての種類の細胞、すなわち赤血球、リンパ球、単球および好中球を含む白血球が作られる。常在マクロファージ及び破骨細胞も造血全能幹細胞から誘導される。【０００４】
骨髄移植には、骨髄細胞、臍帯血細胞、およびそれら幹細胞が用いられている。ドナーから採取された細胞は、DMSOを添加した溶液中で凍結保存され、必要に応じ解凍し用いられている。近年注目されている臍帯血は、その造血幹細胞量が血液のそれに比べ１０倍程度多く、また採取が簡便なため数多くのHLA（ヒトの組織適合性抗原）に対応し、臓器移植及び骨髄移植に有用である可能性を包含している。しかしながら、成人に対する移植には不十分な量の造血幹細胞しか含まれていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
移植用細胞の機能を活性化し、生着率および増殖率を増加させる方法の提供が、本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために鋭意検討した結果、本発明者らは、移植用細胞を静電場雰囲気内に置くことで移植用細胞の機能を活性化することを見出し、本発明を完成した。
つまり本発明は以下からなる。
１．移植用細胞を静電場雰囲気内に置くことを特徴とする、移植用細胞の機能を活性化する方法。
２．静電場雰囲気が100〜10000Ｖの交流または直流電圧を電極に印加して形成される前項１に記載の方法。
３．移植用細胞を、-30〜40℃で静電場雰囲気内に置くことを特徴とする前項１又は２に記載の方法。
４．移植用細胞が、骨髄移植用の細胞である前項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
５．骨髄移植用の細胞が骨髄細胞、臍帯血細胞、およびそれらの幹細胞から選ばれる前項４に記載の方法。
６．移植用細胞の機能の活性化が、被移植組織における移植用細胞の生着率および増殖率７．前項１〜６のいずれか１項に記載の方法により調製される移植用細胞。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の方法により、移植用細胞を静電場雰囲気に置くことで、移植用細胞の非移植組織における生着率および増殖率を向上し、移植効率を高めることが可能となる。また、本発明の方法においては、０℃以下であっても細胞を凍結させることなく活性化することができ、０℃以上の場合であっても良好な状態で活性化することができる。したがって、本発明の方法は、移植領域、再生医療領域、遺伝子治療領域、基礎実験領域等において非常に有用な手段となりうる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明で使用した装置の横中央断面図である。
【図２】本発明で使用した装置の正面中央断面図である。
【図３】本発明で使用した装置の棚図面である。
【図４】本発明で使用した装置の横断面図である。
【図５】末梢血内蛍光含有血小板量の推移
【図６】末梢血内蛍光含有細胞量の推移
【符号の説明】
【０００９】
１：高電圧発生機
２：高圧ケーブル
３：絶縁部
３：支持部
４：ファン
５：保存棚
６：外側壁
７：内側壁
８：開放
９：外壁
１０：断熱材
１１：冷却機
１２：ドアー
１３：ドアー部
１４：空隙
１５：容器
１６：冷却装置
１６：冷却区画
１７：保存区画
１７：保存装置
１８：アース
１８：棚板留
１９：連通部
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の静電場雰囲気は、例えば閉鎖系又は開放系の容器内を静電場状態にすることにより得られる。静電場雰囲気とするために、種々の手段が公知であるが、例えば容器内の底部に単に電極板を絶縁状態で載置することで達成される。また、通常の家庭用又は業務用の冷蔵庫を簡便に静電場冷蔵庫に変換することができる。例えば絶縁材料（塩ビ板）からなる横板と、この横板の両側にヒンジを介して組立て自在とされた側板と、電場箱の底部を閉塞する底板から形成される。そして、その前面と上面は開放されて冷蔵庫の扉を開いたときに対象物の出入が容易に行い得る。接続線、高電圧発生装置で、高電圧がいずれかの金属棒等に印加され、静電場雰囲気が形成される。【００１１】
本発明の移植用細胞の活性化方法に使用することができる装置として、具体的には、静電場雰囲気を形成させるための電極を備えた容器と、該電極に交流又は直流電圧を印加する静電場発生用電源と、上記容器に、例えば移植用細胞を冷蔵温度に保持できる冷却装置とを備えた装置を例示することができる。【００１２】
更に、冷蔵室内の空気を帯電させるためには、導電性カーテンを設けてもよく、このカーテンは柔軟な布、プラスチック等の表面に導電性塗料を付着させたり、カーテン自体を薄いアルミ板等にすることにより形成してもよい。そして、カーテンは、レール等を介して高電圧発生装置に接続される。【００１３】
本発明で使用する装置は、静電場発生装置と冷却装置を備えている。そして、装置は、少なくとも２区画に分かれており、微生物、動物の臓器、その細切り、又は細胞（以下これらを細胞等という）の保存区画と冷却区画が区別及び／又は分離されている。両区画は少なくとも一部の連通部を有し、この連通部を通じて空気の流通が達成される。連通部の位置は特に限定されないが、好適には下方部にある。空気対流の制御手段を講じれば下方部には限定する必要はない。細胞等の保存区画は少なくとも静電場雰囲気にすることができ、この区画には冷却機能はないように分離される。細胞等の保存区画の冷却は、細胞等の保存区画と冷却区画が区別及び／又は分離されていることにより生じる両者間の温度差による空気の対流によって冷却された空気が、連通部を経て細胞等の保存区画に緩徐に流入することによっておこなわれる。つまり、細胞等が保存区画に保存された際には、保存装置のドア（図中１２及び１３）を開けることから外部の空気が流入し、保存区画（図中１７）の温度が上昇する。一方、冷却区画（図中１６）は冷却機によって冷却されており、保存区画と冷却区画に温度差が生じる。ファン（図中４）等の作用で空気に循環を起こすと、冷えた空気が連通部を経て対流し、少し上昇した空気と混ざり合い、緩徐に保存区画の冷却を達成できる。この結果、細胞等の保存安定性が有意に上昇した。
本発明で使用する装置は、装置内の温度と冷却機の稼動を連動させるためのセンサーを設置する。センサーは、サーモスタットに連動し、冷却機の稼動及び停止を行う。温度は、例えば−５〜−３を所望温度とし、−５以下であればスイッチオフ、−３以上であればスイッチオンとなる。このセンサーの設置位置は好適には、連通部周辺である。あるいは、保存区画全体の温度を感知するためには、保存区画の中央部又は空気流通の最深到達部に設置することもできる。【００１４】
本発明で使用する装置の好ましい態様は、前記対流する空気が、細胞等に直接及ばない構造である。たとえば、実施例に示したものは空気の対流が、細胞等の保存棚の下側のみからおこる構造的設計である。この構造では冷却機によって冷却された空気は、下方部に設置された連通部（１９）を経て、保存区画（図中１７）の下部から例えば細胞等の保存棚の下側のみからおこる。この構造的設計によって、細胞等の保存安定性が有意に上昇した。しかし、空気の対流はこれに限定されるものではなく、上側から或は横側から冷却区画から保存区画に流入してきても、一定の遮蔽板等を使い、空気流入が細胞等に直接あたり細胞等の冷却を急激に行うのでなければ利用できる。このような態様も本発明で使用できる装置である。【００１５】
細胞等保存装置の保存区画に設置される細胞等の保存棚は、複数段に上下に設置される。この保存棚は、空気の通過のために多数の空隙（図中１４）が設けられている。空隙は、好ましくは、直角滑面であって、斜めの切れ目でないことがよい。空隙の直径は、5mm〜30mmである。なお、棚は網構造であってもよい。つまり空隙でなく、網目構造でも同様に目的は達成できる。空瞭部の比率は、２０〜９０％が一般的、好適には３０〜７０％である。棚は、内層部例えば金属壁（図中７）と0〜15mm程の空隙を設ける。例えば、前後が0mmで、左右が15mm程度が例示される。この空隙及び棚の空隙を経て、空気は保存区画内を対流し、緩徐に下から上方向に細胞等の保存棚を冷やし、保存物を静電場雰囲気下で冷却する。この保存棚は、導電性材料例えば金属でつくられている。【００１６】
本発明で使用する装置の細胞等の保存棚の保存区画は、静電場雰囲気にある。保存区画は、細胞等の出し入れ用のドアー部（図中１３）、下部の開放部（図中８）、導電性材料（例えばステンレス、アルミ箔、導電塗料、導電性ゴム、導電性テープ、導電性インク等の公知の導電性材料で被覆された材料でも良いし、自体でも良い。以下本発明で導電性材料は同様の意味。）によって形成された内層部（図中７）、絶縁性材料（例えばポリカーボネート、ＡＢＳ樹脂、セラミック、テフロン（登録商標）、プラスチック、塩化ビニル樹脂、絶縁ガラス、ＰＢＳ、シリコン、木材、紙等の公知の絶縁材料で被覆された材料でも良いし、自体でも良い。以下本発明で絶縁材は同様の意味。）によって形成された外層部（図中６）からなる隔壁等によって構成されている。そして、保存区画と冷却区画は、この内層部（図中７）と外層部（図中６）の隔壁によって、区別及び／又は分離され、連通部（１９）を通じて連通している。さらに、この隔壁と冷却区画との接触部は絶縁体（例えばポリカーボネート、ＡＢＳ樹脂、セラミック、テフロン（登録商標）、プラスチック、塩化ビニル樹脂、絶縁ガラス、ＰＢＳ、シリコン、木材、紙等の公知の絶縁材料で被覆された材料でも良いし、自体でも良い。以下本発明で絶縁材は同様の意味。）（図中３）が設置され、漏電を防ぐ。
保存区画の好ましい態様は、容器内を静電場状態にする。静電場雰囲気とするために、種々の手段が公知であるが、例えば保存区画内の特定部に単に電極板を絶縁状態で載置することで達成される。あるいは、内層部例えば金属壁（図中７）に高電圧発生装置（図中１）を高圧ケーブル（図中２）でつなぐことでも達成できる。【００１７】
本発明で使用する装置の細胞等の保存棚の保存区画は、冷却区画（冷却装置）内に半開放（連通部を通じてのみ開口）的に設置することによってつくることができる。冷却区画は、断熱材によって形成された内層部（図中１０）、保護材によって形成された外壁（図中９）よりなり、ドアー部（図中１２）、空気循環用のファン（図中４）、蒸発機と圧縮機を含む冷却機（図中１１）等を構成要素に含む。通常の家庭用又は業務用の冷凍冷蔵庫を簡便に利用することもできる。この冷凍冷蔵庫内に上記条件を満たす静電場雰囲気の保存区画を設置すればよい。両側に閉塞性の側板と、電場箱の上部を閉塞する上板と電場箱の連通部のみを開放し、多数の空隙をもつ保存棚から形成される。そして、その前面は用事開放されて冷蔵庫の扉を開いたときに対象物の出入が容易に行い得る。高電圧発生装置で、高電圧がいずれかの金属棒等の導電性材料部に印加され、静電場雰囲気が形成される。
なお、空気循環用ファンの強さは、例えば、１〜５ｍ／ｓ程度の強さで十分である。【００１８】
本発明の静電場雰囲気は、100〜10000Ｖ、好ましくは500〜8000Ｖ、より好ましくは1000〜6000Ｖ、さらに好ましくは2000〜4000Ｖの交流又は直流電圧を電極に印加して形成される。印加する電圧は、保存対象物やその保存状態により適宜選択することができる。特に、保存液中で保存する場合や保存容器の材質により、印加する電圧を選択することができる。電流は交流、直流のいずれであってもよい。本発明の方法において移植用細胞を活性化する時間は、1〜4日間、好ましくは2〜3日間、より好ましくは2日間である。【００１９】
本発明の移植用細胞の活性化方法に適用されうる温度は、-30〜40℃、好ましくは-20〜5℃、より好ましくは-10〜-1℃、さらに好ましくは-7〜-3℃である。該温度は、保存対象物やその保存状態により適宜選択することができる。特に例えば0℃以下であっても、過冷却現象により、移植用細胞を凍結させることなく活性化することができる。ここに過冷却現象とは、液体が凍り始める寸前の温度である氷結点を下回る温度であっても物質が凍らない現象をいう。氷結点を下回る温度の場合でも、本発明の静電場雰囲気下では、物質へ温度を伝えると同時に微振動エネルギーが起こり、水溶液は凍結せず、細胞の凍結も起こらないと考えられる。【００２０】
本発明の方法における移植用細胞の活性化は、移植用細胞を水溶液中に浸漬させて実施することができる。浸漬とは、移植用細胞が金属やプラスチック等の容器内の水溶液中に浸っている状態をいう。該水溶液として、一般的に公知のあらゆる細胞等の保存液や今後開発される保存液を利用することができる。保存液の代表的なものとして、例えば今日の移植で用いられているリンゲル液、ユーロコリンズ溶液、ＵＷ溶液、ＳＬＳ溶液、Ｈ−Ｌ溶液、ＨＴＫ溶液等や、市販品、例えばラクテック（大塚製薬製）が挙げられる。【００２１】
また、本発明の方法における移植用細胞の活性化は、移植用細胞を静電場雰囲気内にそのまま存置させて実施することができる。静電場雰囲気内にそのまま存置させるとは、移植用細胞が、水溶液中におかれることなくそのまま静電場雰囲気内におかれることをいい、物質そのものが金属やプラスチック等の容器内に収納されていても良い。  【００２２】
本発明の方法は、移植領域、再生医療領域、遺伝子治療領域、基礎実験領域で用いる移植用細胞に適用することができる。移植領域では、骨髄、心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、腸管、小腸、心臓弁、皮膚、血管、角膜、眼球、硬膜、骨、気管及び耳小骨等由来の細胞、臍帯血細胞等が挙げられる。再生医療領域では、造血幹細胞、ES細胞（胚性幹細胞）、神経幹細胞、等が挙げられる。遺伝子治療領域では、遺伝子及び薬剤を導入した細胞が挙げられる。さらに、基礎実験領域では、各種臓器や摘出生体試料及び検体由来の細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、血液幹細胞などの培養系細胞および再生医療用各種細胞等が挙げられる。また各種アッセイ等に利用可能な細胞にも適用することができる。例えば、市販の株化細胞や、生体から取得した細胞等が挙げられる。【００２３】
本発明の一実施態様は、骨髄移植用細胞の機能の活性化である。骨髄移植用細胞として、骨髄細胞、臍帯血細胞、およびそれらの幹細胞が挙げられる。骨髄細胞は当該分野に公知の方法に従って任意の哺乳動物から得ることができる。例えば、骨髄は髄腔に針を挿入し、骨髄を吸引することによってドナーから得ることができる。【００２４】
本発明に用いられる移植用細胞は、生きたもの（例えば、有核）である必要がある。使用される細胞はそれが戻される哺乳動物から、または同種または異種（ドナー）の別の／異なる哺乳動物から採取することができ、レシピエントに導入される。例えば、該細胞はブタから採取し、ヒトに導入することができる。本発明に用いられる哺乳動物の例として、ヒト及び他の霊長類（サル、チンパンジー等）、げっ歯類（ラット、マウス、モルモット等）及び反芻動物（ウシ、ブタ、ウマ等）が含まれる。【００２５】
ドナーとは、移植用細胞の天然採取源である哺乳動物を意味する。ドナーは健常な哺乳動物が望ましい。また、レシピエントとは、移植用細胞の非移植哺乳動物を意味する。本発明の一実施態様においては、ドナー及びレシピエントは組織適合性について適合することが望ましい。一例として、ドナー及びレシピエントは、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）（ヒト白血球抗原）（HLA）−クラスI及びクラスII抗原について適合することが望ましい。ドナーとレシピエントの間の組織適合性は当該分野に公知の方法により決定される。
【実施例】
【００２６】
＜材料および方法＞
（静電場雰囲気条件）
不凍過冷却インキュベーター（3000V、-5℃）の網棚3段の最下層内にIscove modified Dulbesso medium (IMDM)培地で懸濁した骨髄細胞を入れ、0、1、2、4、7日間保存した。【００２７】
（骨髄細胞）
GFP（Green  Fluorescent  protein）過剰発現マウス（グリーンマウス）を深麻酔後、心臓から脱血死させて後、大腿骨と脛骨、計４本を採取し、IMDM培地内で骨髄細胞を採取した。成マウスの場合は5〜7x107個の細胞を採取し、細胞密度5x107/mlにてIMDM培地中で調整した。    【００２８】
（骨髄移植）
レシピエントのマウスは9週令のオスC57BL/6を用い、移植前日に86.5 mM の5-FU（5-fluorouracil）を750μl腹腔内投与し、骨髄抑制のための前処理を行った。移植当日、ネンブタールを腹腔内投与し、全身麻酔を施したマウスの鎖骨下静脈から1x107/200μl骨髄細胞をヘパリン処理した注射器で緩徐に静注した。【００２９】
（蛍光血小板数および蛍光細胞数の計測）
骨髄移植後の蛍光血小板数および蛍光細胞数は、眼窩採血でヘパリン処理したキャピラリーで75μl採取し、フローサイトメトリィー（FACS）で100,000万個細胞当たりの数で表した。移植後7日目（移植早期）、15日目（移植成立期）の2つの時間ポイントで検討した。【００３０】
＜結果＞
（骨髄移植と移植成立までの一般的動態）
蛍光含有血液細胞は100,000個当たりの細胞をフローサイトメトリィーで検出しその数で表し移植成立の程度を表している。グリーンマウス骨髄細胞を静脈内に投与すると数十個単位の数で末梢血を循環するが、数時間で末梢血から消失する。次に骨髄内で移植された蛍光細胞が末梢血中に出現してくるのは4日目で、7日目（移植早期）まで増加する。その後、拒絶反応が出現する場合、15日目（移植成立期）にはほぼ全蛍光含有細胞は末梢血中から消失するが、拒絶をくぐり抜けて骨髄移植が成立した場合、ほぼその値で移行してゆく。【００３１】
（保存細胞の骨髄移植）
骨髄採取当日（0day）および不凍過冷却インキュベーターで1、2、4、7日間保存した骨髄細胞を前日に5-FUで骨髄抑制したマウスの静脈内に投与した（各1匹）。保存期間が4日間を越えると細胞の凝集が認められ、7日間のものでは一部柔らかなゼリー状になっていた。7日間保存の骨髄を移植すると、直後より呼吸が困難となり死亡したが、他の保存期間のものは全て生存し、実験期間を通し特別な変化はなかった。【００３２】
（末梢血内蛍光含有血小板の出現頻度）
蛍光含有血小板は骨髄で生着したグリーンマウス由来の幹細胞から分化した成熟巨核球の細胞質が細分断化し、末梢血液中に放出される。図１は様々な期間保存した骨髄細胞を移植し、7日目と15日目に末梢血中に出現した蛍光血小板量を表す。いずれの保存期間でも7日目に比べ15日目で増加が見られた。移植成立時期である15日目では、2日間保存が最も多く、当日移植（0日）に比べ約1.5倍増加していた。【００３３】
（末梢血内蛍光含有細胞の出現頻度）
蛍光含有細胞は骨髄で生着したグリーンマウス由来の幹細胞から分化した血液細胞であり、赤血球は蛍光を持たないため白血球系細胞であり、血小板より強い蛍光を持つ。図２は様々な期間保存した骨髄細胞を移植し、7日目と15日目に末梢血中に出現した蛍光血液細胞量を表す。いずれの保存期間でも7日目に比べ15日目で増加（0日：1.2倍、1日：1.9倍、2日：3.5倍、4日：1.1倍）が見られたが、移植成立時期である15日目では、2日間保存が最も多く、当日移植（0日）に比べ約2.4倍増加していた。【００３４】
（装置）
図１は、本発明で使用できる細胞等保存装置の横中央断面図である。図２は本発明で使用できる細胞等保存装置の正面中央断面図である。図１の左側がドアー部である。装置は、冷却区画（１６）と保存区画（１７）と連通部（１９）から構成される。冷却区画（１６）と保存区画（１７）は、連通部（１９）を有する半開放的な壁で区別されている。いわゆる冷却装置（１６）の中に半開放的な壁で区別された静電場雰囲気が達成される細胞等の保存装置（１７）が設置されたのが図１及び図２の例示である。冷却装置は、断熱材（１０）と外壁（９）の壁で全面構成されており、全部には保存物の取り出し用ドアー（１２）が設置されている。ドアー（１２）は、同様に断熱材（１０）と外壁（９）の壁で構成される。冷却機（１１）は、通常の蒸発機と圧縮機を含む。冷却機には、ファン（４）が設置され、冷却機内の空気の循環を起こす。１〜５ｍ／ｓ程度の風力で循環を起こす。アース（１８）は、過剰の通電を放流する。冷却装置内は、−２０〜５℃に設定可能である。
冷却機（１１）内に設置された保存区画（１７）は、通電材料で作られた内側壁（７）と絶縁材料で作られた外側壁（６）からなる２重構造隔壁で上部、周囲はおおわれ、その下部は開放（８）されている。この２重構造隔壁は、冷却装置とは絶縁部（３）で電気の流れは断絶されている。絶縁部は、内部の保存装置（１７）の支持部（３）の意義も有し、下部の４箇所に設置されている。固定を確実にするためには、上部にも支持部として絶縁部を有することは好ましい。なお、絶縁部（３）は、４隅に設置されれば十分であり、実際には横中央断面図及び正面中央横断面図には表示されないが、位置関係を明示するために破線で表示した。保存装置（１７）の前部には、ドアー部（１３）があり、このドアー部も通電材料で作られた内側壁（７）と絶縁材料で作られた外側壁（６）からなる２重構造壁である。保存装置（１７）内には、複数段の保存棚が設置されている。保存棚は導電性材料で構成される。図中では３段の保存棚（５）が設置されている。棚の支持は、既存の棚板留（１８）を使用することで十分である。例えばタキゲン製の棚板用支柱、棚板留が例示される。棚（５）は、前記２重構造隔壁の内側壁と接触していてもよいが、離れていてもよい。その隙間は０〜１５ｍｍである。保存棚は、多数の空隙が設けられており（図３）、この空隙を通じて空気の対流が達成される。保存棚には適宜培養等の容器（１５）が設置される。
高電圧発生機（１）で約１００Ｖ〜５０００Ｖの交流又は直流電圧を高圧ケーブル（２）で電極に印加し、保存装置内（１７）を静電場雰囲気にする。
具体的な事例は、冷却装置（１６）は、例えば−５℃〜−３℃を示摘温度として、−３℃以上で稼動、−５℃以下で停止するように連通部（１９）に設置された温度センサーに連動するサーモスタットで調節されており、保存装置部は約３０００Ｖの交流電圧で静電場雰囲気にされている。培養細胞の保存のために、ドアー（１２）及びドアー（１３）が開けられ、保存装置（１７）の保存棚（５）におかれる。ドアーを開けることで、保存装置（１７）内の室温が数度上昇する。そしてドアーを閉めることで、装置内は、保存区画（１７）と冷却区画（１６）に数度の温度差が生じる。その結果、温度差による緩徐な空気の対流が生じる。保存装置（１７）の隔壁は連通部（１９）のみが開放（８）されており、空気は連通部（１９）を経て緩徐に保存区画（１７）を上昇して、保存区画の冷却を極めて穏やかに達成できる。
図１及び図２に開示の本発明で使用できる装置は、保存装置（１７）を冷却装置（１６）内に設置された形態であるが、本発明で使用できる装置はこれに限らず冷却区画からの冷却空気が温度差に基づく対流によって保存区画の連通部から流入し、保存区画内を静電場雰囲気下で冷却していく限りは本発明の対象となる。例えば、保存装置（１７）と冷却装置（１６）を左右にならべ、保存装置（１７）と冷却装置（１６）の間はその連通部（１９）のみが開放（８）されており、またドアーは保存装置にのみ設置され、保存装置（１７）の導電材料層に高電圧が印加されている（図４）形態が例示される。各壁の２重構造は、図１及び２と同様であるが、図１におけるドアー（１２）とドアー（１３）が一体化されドアー（１２）とドアー（１３）の間の空隙をなくしたものである。
細胞等の出し入れによる保存区画の温度変化を最小にするためには、保存区画は、冷却区画内に設置される構造の図１及び図２に開示の構造がより好ましい。外部温度が、２０数℃の場合、ドアーをあけることで内部の温度上昇は１０数℃にまでなることから、保存区画の温度上昇を最小限にするためにもこのような構造がより好ましい。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
以上説明したように、本発明の静電場雰囲気内では、移植用細胞を活性化し、移植効率を向上させることができる。このことより、本発明の方法は、特に移植領域、再生医療領域、基礎実験領域等に利用することができる。
【図１】
2006085534.tif 000002
【図３】
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【図４】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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2006085534.tif 000009