(57)【要約】特定の配列を有する遺伝子を高感度に検出する遺伝子検出方法、及び遺伝子検出装置を提供する。  検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブが固定化された電極と、一本鎖に変性された遺伝子サンプルとを反応させ、該核酸プローブと遺伝子サンプルとがハイブリダイズした二本鎖核酸を形成する二本鎖核酸形成工程と、二本鎖核酸と共有結合する挿入剤を添加する挿入剤添加工程と、光照射を行うことにより、二本鎖核酸と挿入剤とを共有結合させる光照射工程と、二本鎖核酸に結合した挿入剤に電気化学的に活性である物質を添加し、化学結合させる反応工程と、二本鎖核酸と共有結合した挿入剤に結合した、電気化学的に活性である物質を電気化学的に測定することにより、二本鎖核酸を検出する検出工程、とを含むことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体試料中の特定の配列を有する遺伝子を検出する遺伝子検出方法であって、
前記検体試料中の検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製工程と、
前記検出すべき遺伝子の特定の配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを電極に固定化させる固定化工程と、
前記一本鎖の遺伝子サンプルを、前記一本鎖の核酸プローブが固定化された電極に添加し、前記核酸プローブと前記遺伝子サンプルとがハイブリダイズした二本鎖核酸を形成する二本鎖核酸形成工程と、
前記二本鎖核酸が形成された電極に、光照射により該二本鎖核酸と共有結合する挿入剤を添加する挿入剤添加工程と、
光照射を行うことにより、前記二本鎖核酸と前記添加された挿入剤とを共有結合させる光照射工程と、
前記二本鎖核酸に結合した挿入剤に、電気化学的に活性である物質を添加し、前記挿入剤と該電気化学的に活性である物質とを化学結合させる反応工程と、
前記二本鎖核酸と共有結合した挿入剤に結合した、前記電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出する検出工程、とを含む、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項２】
請求項１に記載の遺伝子検出法において、
前記挿入剤が、電気的に中性か陰性である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項３】
検体試料中の特定の配列を有する遺伝子を検出する遺伝子検出方法であって、
前記検体試料中の検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製工程と、
前記一本鎖に変性された遺伝子サンプルに、光照射により該遺伝子サンプルと共有結合する挿入剤を添加する挿入剤添加工程と、
光照射を行うことにより、前記遺伝子サンプルと前記添加された挿入剤とを共有結合させる光照射工程と、
前記検出すべき遺伝子の特定の配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを電極に固定化させる固定化工程と、
前記挿入剤と共有結合した一本鎖の遺伝子サンプルを、前記一本鎖の核酸プローブが固定化された電極に添加し、前記核酸プローブと前記遺伝子サンプルとがハイブリダイズした二本鎖核酸を形成する二本鎖核酸形成工程と、
前記二本鎖核酸に結合した挿入剤に、電気化学的に活性である物質を添加し、前記挿入剤と該電気化学的に活性な物質とを化学結合させる反応工程と、
前記二本鎖核酸と共有結合した挿入剤に結合した、前記電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出する検出工程、とを含む、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項４】
請求項２に記載の遺伝子検出法において、
前記挿入剤が、電気的に中性か陽性である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項５】
請求項１または請求項３に記載の遺伝子検出方法において、
前記電気化学的な測定は、前記電極に対して電圧を印加し、前記電気化学的に活性である物質からの電気化学発光量を測定するものである、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項６】
請求項１に記載の遺伝子検出法において、
前記挿入剤は、下記一般式（１）で表される、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【化３２】
2006038686.tif 000036
（但し、式中、Ｉａは二本鎖核酸に特異的に挿入され、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合を形成する二本鎖核酸結合部位、Ｓａは前記電気化学的に活性である物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｉａと前記Ｓａとを連結する連結部位、Ｒ１は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉａ、前記Ｓａ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【請求項７】
請求項１に記載の遺伝子検出法において、
前記挿入剤は、下記一般式（２）で表される、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【化３３】
2006038686.tif 000037
（但し、式中、Ｉａは二本鎖核酸に特異的に挿入され、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合を形成する二本鎖核酸結合部位、Ｓａは前記電気化学的に活性である物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｉａと前記Ｓａとを連結する連結部位、Ｒ１及びＲ２は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉａ、前記Ｓａ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【請求項８】
請求項１に記載の遺伝子検出法において、
前記挿入剤は、下記一般式（３）で表される、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【化３４】
2006038686.tif 000038
（但し、式中、Ｉａは二本鎖核酸に特異的に挿入され、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合を形成する二本鎖核酸結合部位、Ｓａは前記電気化学的に活性である物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｉａと前記Ｓａとを連結する連結部位、Ｒ１及びＲ２は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉａ、前記Ｓａ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【請求項９】
請求項３に記載の遺伝子検出法において、
前記挿入剤は、下記一般式（４）で表される、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【化３５】
2006038686.tif 000039
（但し、式中、Ｉｂは光照射により遺伝子サンプルと共有結合を形成する遺伝子サンプル結合部位、Ｓａは前記電気化学的に活性である物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｉｂと前記Ｓａとを連結する連結部位、Ｒ３は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉｂ、前記Ｓａ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【請求項１０】
請求項３に記載の遺伝子検出法において、
前記挿入剤は、下記一般式（５）で表される、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【化３６】
2006038686.tif 000040
（但し、式中、Ｉｂは光照射により遺伝子サンプルと共有結合を形成する遺伝子サンプル結合部位、Ｓａは前記電気化学的に活性である物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｉｂと前記Ｓａとを連結する連結部位、Ｒ３及びＲ４は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉｂ、前記Ｓａ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【請求項１１】
は請求項３に記載の遺伝子検出法において、
前記挿入剤は、下記一般式（６）で表される、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【化３７】
2006038686.tif 000041
（但し、式中、Ｉｂは光照射により遺伝子サンプルと共有結合を形成する遺伝子サンプル結合部位、Ｓａは前記電気化学的に活性である物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｉｂと前記Ｓａとを連結する連結部位、Ｒ３及びＲ４は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉｂ、前記Ｓａ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【請求項１２】
請求項１または請求項３に記載の遺伝子検出法において、
前記電気化学的に活性である物質は、下記一般式（７）で表される、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【化３８】
2006038686.tif 000042
（但し、式中、Ｓｂは前記挿入剤と化学結合する置換基、Ｅは電気化学活性部位、Ｌｂは前記Ｓｂと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ５は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｓｂ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【請求項１３】
請求項１または請求項３に記載の遺伝子検出法において、
前記電気化学的に活性である物質は、下記一般式（８）で表される、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【化３９】
2006038686.tif 000043
（但し、式中、Ｓｂは前記挿入剤と化学結合する置換基、Ｅは電気化学活性部位、Ｌｂは前記Ｓｂと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ５及びＲ６は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｓｂ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【請求項１４】
請求項１または請求項３に記載の遺伝子検出法において、
前記電気化学的に活性である物質は、下記一般式（９）で表される、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【化４０】
2006038686.tif 000044
（但し、式中、Ｓｂは前記挿入剤と化学結合する置換基、Ｅは電気化学活性部位、Ｌｂは前記Ｓｂと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ３及びＲ４は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｓｂ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【請求項１５】
請求項１または請求項３に記載の遺伝子検出法において、
前記電気化学的に活性である物質が、下記一般式（１０）で表される、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【化４１】
2006038686.tif 000045
（但し、式中、Ｓｂは前記挿入剤と化学結合する置換基、Ｅは電気化学活性部位、Ｌｂは前記Ｓｂと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ３及びＲ４は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｓｂ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【請求項１６】
請求項１または請求項３に記載の遺伝子検出方法において、
前記挿入剤と前記電気化学的に活性である物質との化学結合は、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、抗体−抗原結合である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項１７】
請求項６から請求項８のいずれかに記載の遺伝子検出方法において、
前記Ｌａと、前記Ｓａ，前記Ｉａとの結合が、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、抗体−抗原結合である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項１８】
請求項９から請求項１１のいずれかに記載の遺伝子検出方法において、
前記Ｌａと、前記Ｓａ，前記Ｉｂとの結合が、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、抗体−抗原結合である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項１９】
請求項１２から請求項１５のいずれかに記載の遺伝子検出方法において、
前記Ｌｂと、前記Ｓｂ，前記Ｅとの結合が、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、抗体−抗原結合である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項２０】
請求項６から請求項８のいずれかに記載の遺伝子検出方法において、
前記ｍは、１〜１００００の整数である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項２１】
請求項９から請求項１１のいずれかに記載の遺伝子検出方法において、
前記ｎは、１〜１００００の整数である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項２２】
請求項１２から請求項１５のいずれかに記載の遺伝子検出方法において、
前記ｏは、１〜１０００００の整数である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項２３】
請求項６から請求項１１のいずれかに記載の遺伝子検出法において、
前記Ｌａが、天然高分子または、合成高分子のいずれかである、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項２４】
請求項１２から請求項１５のいずれかに記載の遺伝子検出法において、
前記Ｌｂが、天然高分子または、合成高分子のいずれかである、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項２５】
請求項２３に記載の遺伝子検出方法において、
前記Ｌａが、糖、リン酸、ピリジン、アミノ酸、タンパク、メタクリル酸、アルコール、アミド、イソプレン、ウレタン、ウロン酸、エステル、エチレン、カーボネート、ビニル、スチレン、アルキル、エーテル、ケトン、エステルの組み合わせから構成される、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項２６】
請求項２４に記載の遺伝子検出方法において、
前記Ｌｂが、糖、リン酸、ピリジン、アミノ酸、タンパク、メタクリル酸、アルコール、アミド、イソプレン、ウレタン、ウロン酸、エステル、エチレン、カーボネート、ビニル、スチレン、アルキル、エーテル、ケトン、エステルの組み合わせから構成される、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項２７】
請求項６から請求項８のいずれかに記載の遺伝子検出法において、
前記挿入剤中に、前記Ｉａが１〜１０００個含まれている、
ことを特徴とする遺伝子検出法。
【請求項２８】
請求項９から請求項１１のいずれかに記載の遺伝子検出方法において、
前記挿入剤中に、前記Ｉｂが１〜１０００個含まれている、
ことを特徴とする遺伝子検出法。
【請求項２９】
請求項６から請求項８のいずれかに記載の遺伝子検出方法において、
前記Ｉａが、感光性挿入剤である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項３０】
請求項９から請求項１１のいずれかに記載の遺伝子検出方法において、
前記Ｉｂが、感光性挿入剤である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項３１】
請求項２９または請求項３０に記載の遺伝子検出方法において、
前記感光性挿入剤が、フロクマリン誘導体である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の遺伝子検出方法において、
前記フロクマリン誘導体が、ソラレン誘導体である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項３３】
請求項１２ないし請求項１５のいずれかに記載の遺伝子検出法において、
前記電気化学的に活性な物質中に、前記Ｅが１〜１０００個含まれている、
ことを特徴とする遺伝子検出法。
【請求項３４】
請求項１２ないし請求項１５のいずれかに記載の遺伝子検出法において、
前記Ｅが、酸化還元性を有する化合物である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の遺伝子検出方法において、
前記酸化還元性を有する化合物が、電気化学発光を示す化合物である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の遺伝子検出方法において、
前記電気化学発光を示す化合物が、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンのいずれかである、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の遺伝子検出方法において、
前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体が、配位子にピリジン部位を有する金属錯体である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項３８】
請求項３６に記載の遺伝子検出方法において、
前記配位子にピリジン部位を有する金属錯体が、金属ビピリジン錯体、金属フェナントロリン錯体のいずれかである、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の遺伝子検出方法において、
前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属が、ルテニウム、オスニウムのいずれかである、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項４０】
検体試料中の特定の配列を有する遺伝子検出装置であって、
前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを固定化してなる電極と、
前記電極に固定化した核酸プローブと、前記検体試料中の前記検出すべき遺伝子を一本鎖に変性した遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせて二本鎖核酸を形成する二本鎖核酸形成槽と、
前記電極あるいは前記二本鎖核酸に非特異的に吸着している、余分な遺伝子サンプル及びミスマッチの遺伝子サンプルを、遺伝子サンプル洗浄液により除去する遺伝子サンプル洗浄槽と、
光照射により前記二本鎖核酸と共有結合する挿入剤を、前記電極に添加して光照射し、前記二本鎖核酸と前記挿入剤とを共有結合させる挿入剤添加槽と、
前記二本鎖核酸と未反応の挿入剤を挿入剤洗浄液により除去する挿入剤洗浄槽と、
前記二本鎖核酸に結合した挿入剤に電気化学的に活性である物質を添加し、前記挿入剤と前記電気化学的に活性である物質とを化学結合させる電気化学活性物質添加槽と、
前記挿入剤と結合しなかった未反応の電気化学的に活性である物質を、電気化学活性物質洗浄液により除去する電気化学活性物質洗浄槽と、
前記二本鎖核酸と共有結合した挿入剤に結合した、前記電気化学的に活性である物質を電気化学的な測定により検出する検出槽と、
前記電極を、前記二本鎖核酸形成槽、前記遺伝子サンプル洗浄槽、前記挿入剤添加槽、前記挿入剤洗浄槽、前記電気化学活性物質添加槽、前記電気化学活性物質洗浄槽、及び前記検出槽の各槽内に、順に移動させる電極移動部と、を備える、
ことを特徴とする遺伝子検出装置。
【請求項４１】
検体試料中の特定の配列を有する遺伝子検出装置であって、
前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを固定化してなる電極と、
前記検体試料中の前記検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製部と、
前記電極あるいは前記二本鎖核酸に非特異に結合している、余分な遺伝子サンプル及びミスマッチの遺伝子サンプルを除去する、遺伝子サンプル洗浄液を保持する遺伝子サンプル洗浄液タンクと、
光照射により前記二本鎖核酸と共有結合する挿入剤を保持する挿入剤タンクと、
前記二本鎖核酸と未反応の挿入剤を除去する、挿入剤洗浄剤を保持する挿入剤洗浄液タンクと、
前記挿入剤と化学結合する電気化学的に活性である物質を保持する電気化学活性物質タンクと、
前記挿入剤と結合しなかった未反応の電気化学的に活性である物質を除去する、電気化学活性物質洗浄液を保持する電気化学活性物質洗浄液タンクと、
前記二本鎖核酸と共有結合した挿入剤に結合した、前記電気化学的に活性である物質を検出するための電解液を保持する電解液タンクと、
前記遺伝子サンプル作製部、前記遺伝子サンプル洗浄液タンク、前記挿入剤タンク、前記挿入剤洗浄液タンク、前記電気化学活性物質タンク、前記電気化学活性物質洗浄タンク、及び前記電解液タンクと接続され、前記電極に固定した核酸プローブと前記遺伝子サンプルとにより二本鎖核酸を形成させた後、前記余分な遺伝子サンプル及びミスマッチの遺伝子サンプルを前記遺伝子サンプル洗浄液により除去させ、該二本鎖核酸と前記挿入剤とを光照射により共有結合させ、前記二本鎖核酸と未反応の挿入剤を前記挿入剤洗浄液で洗浄し、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤に前記電気化学的に活性である物質を添加し、前記挿入剤と前記電気化学的に活性である物質とを化学結合させ、前記挿入剤と未反応の電気化学的に活性である物質を、前記電気化学活性物質洗浄液で洗浄し、前記二本鎖核酸に結合した前記挿入剤に結合した前記電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出する処理槽と、を備える、
ことを特徴とする遺伝子検出装置。
【請求項４２】
検体試料中の特定の配列を有する遺伝子検出装置であって、
前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを固定化してなる電極と、
光照射により、検体試料中の前記検出すべき遺伝子を一本鎖に変性した遺伝子サンプルと共有結合する挿入剤を、前記電極に添加して光照射し、該遺伝子サンプルと前記挿入剤とを共有結合させる挿入剤添加槽と、
前記遺伝子サンプルと未反応の挿入剤を挿入剤洗浄液により除去する挿入剤洗浄槽と、
前記電極に固定化した核酸プローブと、前記挿入剤が結合された遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせて二本鎖核酸を形成する二本鎖核酸形成槽と、
前記電極あるいは前記二本鎖核酸に非特異的に吸着している、余分な遺伝子サンプル及びミスマッチの遺伝子サンプルを、遺伝子サンプル洗浄液により除去する遺伝子サンプル洗浄槽と、
前記二本鎖核酸に結合した挿入剤に電気化学的に活性である物質を添加し、前記挿入剤と前記電気化学的に活性である物質とを化学結合させる電気化学活性物質添加槽と、
前記挿入剤と結合しなかった未反応の電気化学的に活性である物質を、電気化学活性物質洗浄液により除去する電気化学活性物質洗浄槽と、
前記遺伝子サンプルと共有結合した挿入剤に結合した、前記電気化学的に活性である物質を電気化学的な測定により検出する検出槽と、
前記電極を、前記二本鎖核酸形成槽、前記遺伝子サンプル洗浄槽、前記挿入剤添加槽、前記挿入剤洗浄槽、前記電気化学活性物質添加槽、前記電気化学活性物質洗浄槽、及び前記検出槽の各槽内に、順に移動させる電極移動部と、を備える、
ことを特徴とする遺伝子検出装置。
【請求項４３】
検体試料中の特定の配列を有する遺伝子検出装置であって、
前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを固定化してなる電極と、
前記検体試料中の前記検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製部と、
光照射により前記遺伝子サンプルと共有結合する挿入剤を保持する挿入剤タンクと、
前記遺伝子サンプルと未反応の挿入剤を除去する、挿入剤洗浄剤を保持する挿入剤洗浄液タンクと、
前記電極あるいは前記二本鎖核酸に非特異に結合している、余分な遺伝子サンプル及びミスマッチの遺伝子サンプルを除去する、遺伝子サンプル洗浄液を保持する遺伝子サンプル洗浄液タンクと、
前記挿入剤と化学結合する電気化学的に活性である物質を保持する電気化学活性物質タンクと、
前記挿入剤と結合しなかった未反応の電気化学的に活性である物質を除去する、電気化学活性物質洗浄液を保持する電気化学活性物質洗浄液タンクと、
前記遺伝子サンプルと共有結合した挿入剤に結合した前記電気化学的に活性である物質を検出する電解液を保持する電解液タンクと、
前記遺伝子サンプル作製部、前記遺伝子サンプル洗浄液タンク、前記挿入剤タンク、前記挿入剤洗浄液タンク、前記電気化学活性物質タンク、前記電気化学活性物質洗浄タンク、及び前記電解液タンクと接続され、前記遺伝子サンプルと前記挿入剤とを光照射により共有結合させ、前記遺伝子サンプルと未反応の挿入剤を前記挿入剤洗浄液で洗浄し、該挿入剤と結合した遺伝子サンプルと、前記固定化した核酸プローブとにより二本鎖核酸を形成させ、前記余分な遺伝子サンプル及びミスマッチの遺伝子サンプルを前記遺伝子サンプル洗浄液により除去させた後、前記遺伝子サンプルに結合した挿入剤に前記電気化学的に活性である物質を添加し、前記挿入剤と前記電気化学的に活性である物質とを化学結合させ、前記挿入剤と未反応の電気化学的に活性である物質を、前記電気化学活性物質洗浄液で洗浄し、前記遺伝子サンプルに結合した前記挿入剤に結合した前記電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出する処理槽と、を備える、
ことを特徴とする遺伝子検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、試料中に存在する特定の遺伝子配列を、高感度に検出するための遺伝子検出方法、及び遺伝子検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】  従来の、特定の遺伝子配列を電気化学的に検出する方法は、検出すべき特定の遺伝子配列を有する目的遺伝子に対して、相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを電極表面に固定化し、該核酸プローブと、一本鎖に変性された目的遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせた後、該核酸プローブと目的遺伝子サンプルとの二本鎖核酸に特異的に結合し、且つ電気化学的に活性な挿入剤を、該核酸プローブと遺伝子サンプルとの反応系に添加する。そして、前記挿入剤が添加された反応系中に電圧を印加して電気化学的な測定を行い、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤を検出することにより、前記目的遺伝子サンプルとハイブリダイズした前記核酸プローブを検出し、前記目的遺伝子の存在を確認する（例えば、特許文献１及び特許文献２参照）。【０００３】  ここで、前記挿入剤とは、前記二本鎖の核酸を認識して、該二本鎖核酸と特異的に結合する物質を指す。前記挿入剤は、何れも分子中にフェニル基等の平板状挿入基を有し、該挿入基が二本鎖核酸の塩基対と塩基対との間に介入することによって、二本鎖核酸と結合する。この挿入剤と二本鎖核酸との結合は、静電気的相互作用あるいは疎水的相互作用での結合であって、前記挿入剤の前記二本鎖核酸の塩基対間への挿入、及びその塩基対間からの離脱が一定の速度で繰り返される平衡反応による結合である。【０００４】  さらに、前述した挿入剤の中には、電気的に可逆な酸化還元反応を起こす物質があるため、該電気化学的に可逆である酸化還元反応を起こす物質を挿入剤として用いるようにすれば、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤の存在を、電気化学的変化の測定によって検出することができる。なお、この電気化学的変化は、酸化還元時に発生する電流や発光等で検出することができる。【０００５】  つまり、従来の遺伝子検出方法においては、前記挿入剤が二本鎖核酸にのみ特異的に結合すること、また、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤の量を正確に検出することが重要であった。【０００６】  しかし、従来の遺伝子検出に用いられる挿入剤は、一本鎖の核酸プローブや、該核酸プローブが固定される電極表面にも、非特異的に吸着してしまう。そして、このように一本鎖の核酸プローブや、該核酸プローブが固定される電極表面に非特異的に吸着した挿入剤は、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤の量の検出時に、バックグランドノイズとなり、検出感度を低下させる原因となる。【０００７】  これを解消するため、従来方法においては、前記核酸プローブと遺伝子サンプルとの反応系に前記挿入剤を添加した後に、前述したバックグラウンドノイズとなる、一本鎖の核酸プローブ、あるいは電極表面に非特異的な吸着をしている挿入剤を除去する洗浄処理が行われている（例えば、特許文献２参照）。
【特許文献１】特許第２５７３４４３号公報
【特許文献２】特許第３２３３８５１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】  しかし、従来の挿入剤と二本鎖核酸とは、静電気的相互作用あるいは疎水的相互作用によって結合されているものであるため、それらの結合力は弱い。従って、前述したように、二本鎖核酸に非特異的に吸着した挿入剤を洗浄処理する洗浄工程の際に、二本鎖核酸に結合した挿入剤も解離してしまい、洗浄処理を行なうことによって逆に検出感度を低下させてしまう、という課題があった。【０００９】  そこで、前記洗浄処理において、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤が解離しないように考慮すると、前記一本鎖の核酸プローブや、電極表面に非特異的な吸着をしている挿入剤の除去が不十分となるため、バックグランドノイズを十分に除去できず、結局、検出感度が低下してしまう。【００１０】  また、検出感度を向上させるために、従来の、電気化学的活性部位を含む挿入剤を、二本鎖核酸にできるだけ多く挿入させる必要があるのであるが、前述したように、従来の挿入剤と二本鎖核酸との挿入反応は平衡反応であるため、挿入剤を多量に使用しないと、該挿入剤は二本鎖核酸に挿入されにくい。そこで、挿入剤を多量に加えてしまうと、電極表面に非特異吸着する量が増大して、バックグラウンドノイズが増加してしまい、検出感度が低下してしまう。【００１１】  さらに、従来の挿入剤は、前記二本核酸と結合する部位と、電気化学的に活性である部位とを有する構成となっているが、挿入剤が二本鎖核酸に挿入される際、該電気化学的に活性である部位が立体障害となって、挿入剤が二本鎖核酸に挿入されにくくなっている。すなわち、従来の挿入剤の構成自体が、検出感度が低下する原因の一つとなっている。【００１２】  本発明は、前記課題を解決するためになされたものであって、検体試料中の遺伝子を高感度に検出可能な遺伝子検出方法、及び遺伝子検出装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】  前記従来の課題を解決するため、本発明の遺伝子検出方法は、検体試料中の特定の配列を有する遺伝子を検出する遺伝子検出方法であって、前記検体試料中の検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製工程と、前記検出すべき遺伝子の特定の配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを電極に固定化させる固定化工程と、前記一本鎖の遺伝子サンプルを、前記一本鎖の核酸プローブが固定化された電極に添加し、前記核酸プローブと前記遺伝子サンプルとがハイブリダイズした二本鎖核酸を形成する二本鎖核酸形成工程と、前記二本鎖核酸が形成された電極に、光照射により該二本鎖核酸と共有結合する挿入剤を添加する挿入剤添加工程と、光照射を行うことにより、前記二本鎖核酸と前記添加された挿入剤とを共有結合させる光照射工程と、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤に、電気化学的に活性である物質を添加し、前記挿入剤と該電気化学的に活性である物質とを化学結合させる反応工程と、前記二本鎖核酸と共有結合した挿入剤に結合した、前記電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出する検出工程、とを含むものである。【００１４】  これにより、検出対象の遺伝子と相補的な配列を有する核酸プローブとをハイブリダイズして得た二本鎖核酸に挿入剤を挿入後、該二本鎖核酸に挿入された挿入剤と、電気化学的に活性である物質とを置換基を介して化学結合させるようにしたので、電気化学的に活性である物質の立体障害が解消し、二本鎖核酸への挿入剤の挿入量を大幅に改善することができると共に、電気化学的に活性である物質を、複数連鎖させることも可能となり、遺伝子サンプルをさらに高感度に検出することができる。【００１５】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記挿入剤が、電気的に中性か陰性であるものである。【００１６】  これにより、前記挿入剤が一本鎖の核酸プローブに非特異吸着しにくくなる。【００１７】  また、本発明の遺伝子検出方法は、検体試料中の特定の配列を有する遺伝子を検出する遺伝子検出方法であって、前記検体試料中の検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製工程と、前記一本鎖に変性された遺伝子サンプルに、光照射により該遺伝子サンプルと共有結合する挿入剤を添加する挿入剤添加工程と、光照射を行うことにより、前記遺伝子サンプルと前記添加された挿入剤とを共有結合させる光照射工程と、前記検出すべき遺伝子の特定の配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを電極に固定化させる固定化工程と、前記挿入剤と共有結合した一本鎖の遺伝子サンプルを、前記一本鎖の核酸プローブが固定化された電極に添加し、前記核酸プローブと前記遺伝子サンプルとがハイブリダイズした二本鎖核酸を形成する二本鎖核酸形成工程と、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤に、電気化学的に活性である物質を添加し、前記挿入剤と該電気化学的に活性な物質とを化学結合させる反応工程と、前記二本鎖核酸と共有結合した挿入剤に結合した、前記電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出する検出工程、とを含むものである。【００１８】  これにより、検出対象の遺伝子サンプルに挿入剤を結合させた後、該遺伝子サンプルと相補的な配列を有する核酸プローブと、前記挿入剤が結合した遺伝子サンプルとをハイブリダイズして二本鎖核酸を形成し、該二本鎖核酸に挿入された挿入剤と、電気化学的に活性である物質とを置換基を介して化学結合させるようにしたので、電気化学的に活性である物質の立体障害が解消し、二本鎖核酸への挿入剤の挿入量を大幅に改善することができると共に、前記電気化学的に活性である物質を、複数連鎖させることも可能となり、遺伝子サンプルをさらに高感度に検出することができる。【００１９】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記挿入剤が、電気的に中性か陽性であるものである。【００２０】  これにより、前記挿入剤を、一本鎖の遺伝子サンプルにより多く結合させることができる。【００２１】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記電気化学的な測定は、前記電極に対して電圧を印加し、前記電気化学的に活性である物質からの電気化学発光量を測定するものである。【００２２】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記挿入剤は、下記一般式（１）で表されるものである。【００２３】
【化１】
2006038686.tif 000002
【００２４】  （但し、式中、Ｉａは二本鎖核酸に特異的に挿入され、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合を形成する二本鎖核酸結合部位、Ｓａは前記電気化学的に活性である物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｉａと前記Ｓａとを連結する連結部位、Ｒ１は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉａ、前記Ｓａ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）【００２５】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記挿入剤は、下記一般式（２）で表されるものである。【００２６】
【化２】
2006038686.tif 000003
【００２７】  （但し、式中、Ｉａは二本鎖核酸に特異的に挿入され、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合を形成する二本鎖核酸結合部位、Ｓａは前記電気化学的に活性である物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｉａと前記Ｓａとを連結する連結部位、Ｒ１及びＲ２は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉａ、前記Ｓａ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）【００２８】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記挿入剤は、下記一般式（３）で表されるものである。【００２９】
【化３】
2006038686.tif 000004
【００３０】  （但し、式中、Ｉａは二本鎖核酸に特異的に挿入され、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合を形成する二本鎖核酸結合部位、Ｓａは前記電気化学的に活性である物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｉａと前記Ｓａとを連結する連結部位、Ｒ１及びＲ２は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉａ、前記Ｓａ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）【００３１】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記挿入剤は、下記一般式（４）で表されるものである。【００３２】
【化４】
2006038686.tif 000005
【００３３】  （但し、式中、Ｉｂは光照射により遺伝子サンプルと共有結合を形成する遺伝子サンプル結合部位、Ｓａは前記電気化学的に活性である物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｉｂと前記Ｓａとを連結する連結部位、Ｒ３は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉｂ、前記Ｓａ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）【００３４】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記挿入剤は、下記一般式（５）で表されるものである。【００３５】
【化５】
2006038686.tif 000006
【００３６】  （但し、式中、Ｉｂは光照射により遺伝子サンプルと共有結合を形成する遺伝子サンプル結合部位、Ｓａは前記電気化学的に活性である物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｉｂと前記Ｓａとを連結する連結部位、Ｒ３及びＲ４は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉｂ、前記Ｓａ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）【００３７】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記挿入剤は、下記一般式（６）で表されるものである。【００３８】
【化６】
2006038686.tif 000007
【００３９】  （但し、式中、Ｉｂは光照射により遺伝子サンプルと共有結合を形成する遺伝子サンプル結合部位、Ｓａは前記電気化学的に活性である物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｉｂと前記Ｓａとを連結する連結部位、Ｒ３及びＲ４は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉｂ、前記Ｓａ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）【００４０】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記電気化学的に活性である物質は、下記一般式（７）で表されるものである。【００４１】
【化７】
2006038686.tif 000008
【００４２】  （但し、式中、Ｓｂは前記挿入剤と化学結合する置換基、Ｅは電気化学活性部位、Ｌｂは前記Ｓｂと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ５は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｓｂ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）【００４３】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記電気化学的に活性である物質は、下記一般式（８）で表されるものである。【００４４】
【化８】
2006038686.tif 000009
【００４５】  （但し、式中、Ｓｂは前記挿入剤と化学結合する置換基、Ｅは電気化学活性部位、Ｌｂは前記Ｓｂと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ５及びＲ６は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｓｂ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）【００４６】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記電気化学的に活性である物質は、下記一般式（９）で表されるものである。【００４７】
【化９】
2006038686.tif 000010
【００４８】  （但し、式中、Ｓｂは前記挿入剤と化学結合する置換基、Ｅは電気化学活性部位、Ｌｂは前記Ｓｂと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ５及びＲ６は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｓｂ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）【００４９】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記電気化学的に活性である物質は、下記一般式（１０）で表されるものである。【００５０】
【化１０】
2006038686.tif 000011
【００５１】  （但し、式中、Ｓｂは前記挿入剤と化学結合する置換基、Ｅは電気化学活性部位、Ｌｂは前記Ｓｂと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ５及びＲ６は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｓｂ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）【００５２】  さらに、前記挿入剤と前記電気化学的に活性である物質との化学結合は、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、抗体−抗原結合であるものである。【００５３】  これにより、挿入剤と電気化学的に活性である物質とを強固に結合させることができる。【００５４】  さらに、前記Ｌａと、前記Ｓａ，前記Ｉａとの結合が、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、抗体−抗原結合であるものである。【００５５】  さらに、前記Ｌａと、前記Ｓａ，前記Ｉｂとの結合が、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、抗体−抗原結合であるものである。【００５６】  これにより、挿入剤中の前記Ｌａと、前記Ｉａ及び前記Ｓａ、あるいは前記Ｌａと、前記Ｓａ及び前記Ｉｂとを、強固に結合させることができる。【００５７】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記Ｌｂと、前記Ｓｂ，前記Ｅとの結合が、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、抗体−抗原結合であるものである。【００５８】  これにより、電気化学的に活性な物質中の前記Ｌｂ、前記Ｅ及び前記Ｓｂを、強固に結合させることができる。【００５９】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記ｍは、１〜１００００の整数であるものである。【００６０】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記ｎは、１〜１００００の整数であるものである。【００６１】  これにより、二本鎖核酸と挿入剤とを結合させる際に、挿入剤の構造が立体障害を起こさないようにでき、該二本鎖核酸への挿入剤の挿入量をより多くすることができる。【００６２】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記ｏは、１〜１０００００の整数であるものである。【００６３】  これにより、挿入剤と電気化学的に活性な物質とを結合させる際に、該添加する電気化学的に活性な物質の量をコントロールすることができる。【００６４】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記Ｌａが、天然高分子または、合成高分子のいずれかであるものである。【００６５】  これにより、前記Ｌａに、前記ＳａあるいはＩａ，Ｉｂを多く結合させることができる。【００６６】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記Ｌｂが、天然高分子または、合成高分子のいずれかであるものである。【００６７】  これにより、前記Ｌｂに、前記ＳｂあるいはＥを多く結合させることができる。【００６８】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記Ｌａが、糖、リン酸、ピリジン、アミノ酸、タンパク、メタクリル酸、アルコール、アミド、イソプレン、ウレタン、ウロン酸、エステル、エチレン、カーボネート、ビニル、スチレン、アルキル、エーテル、ケトン、エステルの組み合わせから構成されるものである。【００６９】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記Ｌｂが、糖、リン酸、ピリジン、アミノ酸、タンパク、メタクリル酸、アルコール、アミド、イソプレン、ウレタン、ウロン酸、エステル、エチレン、カーボネート、ビニル、スチレン、アルキル、エーテル、ケトン、エステルの組み合わせから構成されるものである。【００７０】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記挿入剤中に、前記Ｉａが１〜１０００個含まれているものである。【００７１】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記挿入剤中に、前記Ｉｂが１〜１０００個含まれているものである。【００７２】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記Ｉａが、感光性挿入剤であるものである。【００７３】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記Ｉｂが、感光性挿入剤であるものである。【００７４】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記感光性挿入剤が、フロクマリン誘導体であるものである。【００７５】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記フロクマリン誘導体が、ソラレン誘導体であるものである。【００７６】  これにより、感光性挿入剤が二本鎖核酸と非共有的相互作用を起こし、さらに該感光性挿入剤が挿入された二本鎖核酸に光照射すると、安定な共有結合が形成されるため、前記一本鎖の核酸プローブ及び電極表面に非特異吸着した挿入剤に対して、強い洗浄を行って除去することができる。【００７７】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記電気化学的に活性な物質中に、前記Ｅが１〜１０００個含まれているものである。【００７８】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記Ｅが、酸化還元性を有する化合物であるものである。【００７９】  これにより、可逆な酸化還元反応時に生じる酸化還元を測定することで、遺伝子サンプルの検出が可能となる。【００８０】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記酸化還元性を有する化合物が、電気化学発光を示す化合物である。【００８１】  これにより、電気化学発光を測定することで、遺伝子サンプルの検出を行うことができる。【００８２】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記電気化学発光を示す化合物が、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンのいずれかであるものである。【００８３】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体が、配位子にピリジン部位を有する金属錯体であるものである。【００８４】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記配位子にピリジン部位を有する金属錯体が、金属ビピリジン錯体、金属フェナントロリン錯体のいずれかであるものである。【００８５】  さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属が、ルテニウム、オスニウムのいずれかであるものである。【００８６】  また、本発明の遺伝子検出装置は、検体試料中の特定の配列を有する遺伝子検出装置であって、前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを固定化してなる電極と、前記電極に固定化した核酸プローブと、前記検体試料中の前記検出すべき遺伝子を一本鎖に変性した遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせて二本鎖核酸を形成する二本鎖核酸形成槽と、前記電極あるいは前記二本鎖核酸に非特異的に吸着している、余分な遺伝子サンプル及びミスマッチの遺伝子サンプルを、遺伝子サンプル洗浄液により除去する遺伝子サンプル洗浄槽と、光照射により前記二本鎖核酸と共有結合する挿入剤を、前記電極に添加して光照射し、前記二本鎖核酸と前記挿入剤とを共有結合させる挿入剤添加槽と、前記二本鎖核酸と未反応の挿入剤を挿入剤洗浄液により除去する挿入剤洗浄槽と、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤に電気化学的に活性である物質を添加し、前記挿入剤と前記電気化学的に活性である物質とを化学結合させる電気化学活性物質添加槽と、前記挿入剤と結合しなかった未反応の電気化学的に活性である物質を、電気化学活性物質洗浄液により除去する電気化学活性物質洗浄槽と、前記二本鎖核酸と共有結合した挿入剤に結合した、前記電気化学的に活性である物質を電気化学的な測定により検出する検出槽と、前記電極を、前記二本鎖核酸形成槽、前記遺伝子サンプル洗浄槽、前記挿入剤添加槽、前記挿入剤洗浄槽、前記電気化学活性物質添加槽、前記電気化学活性物質洗浄槽、及び前記検出槽の各槽内に、順に移動させる電極移動部と、を備えるものである。【００８７】  これにより、前記遺伝子サンプルと核酸プローブとをハイブリダイズさせた二本鎖核酸と、不可逆的、且つ強固に結合させた挿入剤に化学結合した、電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出することで、前記遺伝子サンプルを検出することが可能となるので、前記検体試料中の遺伝子を高感度に検出できる遺伝子検出装置を提供できる。【００８８】  また、本発明の遺伝子検出装置は、検体試料中の特定の配列を有する遺伝子検出装置であって、前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを固定化してなる電極と、前記検体試料中の前記検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製部と、前記電極あるいは前記二本鎖核酸に非特異に結合している、余分な遺伝子サンプル及びミスマッチの遺伝子サンプルを除去する、遺伝子サンプル洗浄液を保持する遺伝子サンプル洗浄液タンクと、光照射により前記二本鎖核酸と共有結合する挿入剤を保持する挿入剤タンクと、前記二本鎖核酸と未反応の挿入剤を除去する、挿入剤洗浄剤を保持する挿入剤洗浄液タンクと、前記挿入剤と化学結合する電気化学的に活性である物質を保持する電気化学活性物質タンクと、前記挿入剤と結合しなかった未反応の電気化学的に活性である物質を除去する、電気化学活性物質洗浄液を保持する電気化学活性物質洗浄液タンクと、前記二本鎖核酸と共有結合した挿入剤に結合した、前記電気化学的に活性である物質を検出するための電解液を保持する電解液タンクと、前記遺伝子サンプル作製部、前記遺伝子サンプル洗浄液タンク、前記挿入剤タンク、前記挿入剤洗浄液タンク、前記電気化学活性物質タンク、前記電気化学活性物質洗浄タンク、及び前記電解液タンクと接続され、前記電極に固定した核��プローブと前記遺伝子サンプルとにより二本鎖核酸を形成させた後、前記余分な遺伝子サンプル及びミスマッチの遺伝子サンプルを前記遺伝子サンプル洗浄液により除去させ、該二本鎖核酸と前記挿入剤とを光照射により共有結合させ、前記二本鎖核酸と未反応の挿入剤を前記挿入剤洗浄液で洗浄し、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤に前記電気化学的に活性である物質を添加し、前記挿入剤と前記電気化学的に活性である物質とを化学結合させ、前記挿入剤と未反応の電気化学的に活性である物質を、前記電気化学活性物質洗浄液で洗浄し、前記二本鎖核酸に結合した前記挿入剤に結合した前記電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出する処理槽と、を備えるものである。【００８９】  これにより、前記遺伝子サンプルと核酸プローブとをハイブリダイズさせた二本鎖核酸と、不可逆的、且つ強固に結合させた挿入剤に化学結合した、電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出することで、前記遺伝子サンプルを検出することが可能となるので、前記検体試料中の遺伝子を高感度に検出できる遺伝子検出装置を提供できる。また、当該装置の処理槽を一つとしたので、装置の小型化が実現できる。【００９０】  また、本発明の遺伝子検出装置は、検体試料中の特定の配列を有する遺伝子検出装置であって、前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを固定化してなる電極と、光照射により、検体試料中の前記検出すべき遺伝子を一本鎖に変性した遺伝子サンプルと共有結合する挿入剤を、前記電極に添加して光照射し、該遺伝子サンプルと前記挿入剤とを共有結合させる挿入剤添加槽と、前記遺伝子サンプルと未反応の挿入剤を挿入剤洗浄液により除去する挿入剤洗浄槽と、前記電極に固定化した核酸プローブと、前記挿入剤が結合された遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせて二本鎖核酸を形成する二本鎖核酸形成槽と、前記電極あるいは前記二本鎖核酸に非特異的に吸着している、余分な遺伝子サンプル及びミスマッチの遺伝子サンプルを、遺伝子サンプル洗浄液により除去する遺伝子サンプル洗浄槽と、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤に電気化学的に活性である物質を添加し、前記挿入剤と前記電気化学的に活性である物質とを化学結合させる電気化学活性物質添加槽と、前記挿入剤と結合しなかった未反応の電気化学的に活性である物質を、電気化学活性物質洗浄液により除去する電気化学活性物質洗浄槽と、前記遺伝子サンプルと共有結合した挿入剤に結合した、前記電気化学的に活性である物質を電気化学的な測定により検出する検出槽と、前記電極を、前記二本鎖核酸形成槽、前記遺伝子サンプル洗浄槽、前記挿入剤添加槽、前記挿入剤洗浄槽、前記電気化学活性物質添加槽、前記電気化学活性物質洗浄槽、及び前記検出槽の各槽内に、順に移動させる電極移動部と、を備えるものである。【００９１】  これにより、前記遺伝子サンプルと挿入剤とを、不可逆的、且つ強固に結合させ、該挿入剤が結合した遺伝子サンプルと固定化された捕捉プローブとで二本鎖核酸を形成し、該二本鎖核酸中の遺伝子サンプルに結合した挿入剤に化学結合した、電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出することで、��記遺伝子サンプルを検出することが可能となるので、前記検体試料中の遺伝子を高感度に検出できる遺伝子検出装置を提供できる。【００９２】  また、本発明の遺伝子検出装置は、検体試料中の特定の配列を有する遺伝子検出装置であって、前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを固定化してなる電極と、前記検体試料中の前記検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製部と、光照射により前記遺伝子サンプルと共有結合する挿入剤を保持する挿入剤タンクと、前記遺伝子サンプルと未反応の挿入剤を除去する、挿入剤洗浄剤を保持する挿入剤洗浄液タンクと、前記電極あるいは前記二本鎖核酸に非特異に結合している、余分な遺伝子サンプル及びミスマッチの遺伝子サンプルを除去する、遺伝子サンプル洗浄液を保持する遺伝子サンプル洗浄液タンクと、前記挿入剤と化学結合する電気化学的に活性である物質を保持する電気化学活性物質タンクと、前記挿入剤と結合しなかった未反応の電気化学的に活性である物質を除去する、電気化学活性物質洗浄液を保持する電気化学活性物質洗浄液タンクと、前記遺伝子サンプルと共有結合した挿入剤に結合した前記電気化学的に活性である物質を検出する電解液を保持する電解液タンクと、前記遺伝子サンプル作製部、前記遺伝子サンプル洗浄液タンク、前記挿入剤タンク、前記挿入剤洗浄液タンク、前記電気化学活性物質タンク、前記電気化学活性物質洗浄タンク、及び前記電解液タンクと接続され、前記遺伝子サンプルと前記挿入剤とを光照射により共有結合させ、前記遺伝子サンプルと未反応の挿入剤を前記挿入剤洗浄液で洗浄し、該挿入剤と結合した遺伝子サンプルと、前記固定化した核酸プローブとにより二本鎖核酸を形成させ、前記余分な遺伝子サンプル及びミスマッチの遺伝子サンプルを前記遺伝子サンプル洗浄液により除去させた後、前記遺伝子サンプルに結合した挿入剤に前記電気化学的に活性である物質を添加し、前記挿入剤と前記電気化学的に活性である物質とを化学結合させ、前記挿入剤と未反応の電気化学的に活性である物質を、前記電気化学活性物質洗浄液で洗浄し、前記遺伝子サンプルに結合した前記挿入剤に結合した前記電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出する処理槽と、を備えるものである。【００９３】  これにより、前記遺伝子サンプルと挿入剤とを、不可逆的、且つ強固に結合させ、該挿入剤が結合した遺伝子サンプルと固定化された捕捉プローブとで二本鎖核酸を形成し、該二本鎖核酸中の遺伝子サンプルに結合した挿入剤に化学結合した、電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出することで、前記遺伝子サンプルを検出することが可能となるので、前記検体試料中の遺伝子を高感度に検出できる遺伝子検出装置を提供できる。また、当該装置の処理槽を一つとしたので、装置の小型化が実現できる。
【発明の効果】
【００９４】  本発明の遺伝子検出方法及び装置によれば、特定の配列を有する遺伝子を検出する際に、光照射により、前記二本鎖核酸と前記挿入剤とを共有結合させて、該二本鎖核酸と挿入剤とを、不可逆的、且つ強固に結合させた後、電気化学的に活性である物質と前記二本鎖核酸と結合した挿入剤とを共有結合により、強固に結合させるようにしたので、前記挿入剤を洗浄処理により除去する際に、強い洗浄を行っても、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤が解離されることがなくなるため、前記遺伝子サンプルを高感度に検出できる。【００９５】  また、挿入剤として、光照射により二本鎖核酸あるいは遺伝子サンプルと共有結合を形成する物質を用いるようにして、挿入剤中から電気化学的に活性である物質を分離させたことから、該挿入剤を二本鎖核酸に添加して、該二本鎖核酸の塩基間に挿入させる際に、前記電気化学的に活性である物質が立体障害となることがなくなり、前記挿入剤の挿入量が大幅に改善されることに加え、該分離させた前記電気化学的に活性な物質中に、電気化学的に活性である部位を複数連鎖させて存在させることも可能となる。【００９６】  また、前述したように、電気化学的に活性である物質中に、電気化学的に活性である部位を複数連鎖させて存在させるようにしたので、遺伝子サンプルをさらに高感度に検出することができる。また、前記挿入剤に添加する電気化学的に活性である物質の量をコントロールすることも可能となるため、該電気化学的に活性である物質が一本鎖の核酸プローブに非特異吸着しやすい物質であったとしても、必要最小限の電気化学的に活性である物質を添加すれば良いので、バックグラウンドを低下させることもできる。【００９７】  さらに、本発明の遺伝子検出方法及び装置によれば、特定の配列を有する遺伝子を検出する際に、光照射により、前記遺伝子サンプルと前記挿入剤とを共有結合させて、該遺伝子サンプルと挿入剤とを、不可逆的、且つ強固に結合させた後、該挿入剤が結合した遺伝子サンプルと前記固定化された核酸プローブとで二本鎖核酸を形成し、電気化学的に活性である物質と前記遺伝子サンプルと結合した挿入剤とを共有結合により、強固に結合させるようにしたので、前記挿入剤を洗浄処理により除去する際に、強い洗浄を行っても、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤が解離されることがなくなるため、前記遺伝子サンプルを高感度に検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】図１は、本発明の実施の形態１における遺伝子検出装置の構成を示す図である。
【図２】図２は、本発明の実施の形態２における遺伝子検出装置の構成を示す図である。
【図３】図３は、本発明の実施例１の工程により得られた、二本鎖核酸が形成されていない電極ｘ、及び二本鎖核酸が形成された電極ｙそれぞれにおいて検出された最大電気化学発光量を示す図である。
【図４】図４は、本発明の実施例２の工程により得られた、二本鎖核酸が形成されていない電極ｘ、及び二本鎖核酸が形成された電極ｙそれぞれにおいて検出された最大電気化学発光量を示す図である。
【符号の説明】
【００９９】  １  遺伝子サンプル作製部
２  電極
３  二本鎖核酸形成反応槽
４，１０，１６  温度コントローラ
５，２５  電極移動部
５ａ  電極保持アーム
５ｂ  アーム駆動部
６  遺伝子サンプル洗浄液タンク
７  遺伝子サンプル洗浄槽
８  挿入剤タンク
９  挿入剤反応槽
１１  ＵＶランプ
１２  挿入剤洗浄液タンク
１３  挿入剤洗浄槽
１４  電気化学活性物質溶液タンク
１５  電気化学活性物質反応槽
１７  電気化学活性物質洗浄液タンク
１８  電気化学活性物質洗浄槽
１９  電解液タンク
２０  検出槽
２１  フォトマル
２２  ポテンショスタット
２３  制御部
２４  処理槽
２５  電極移動部
２６  廃液タンク
１００，２００  遺伝子検出装置
【発明を実施するための最良の形態】
【０１００】  以下に、本発明の遺伝子検出方法について詳細に説明する。【０１０１】  なお、以下の実施の形態における遺伝子サンプルとは、例えば、血液、白血球、血清、尿、糞便、精液、唾液、培養細胞、各種臓器細胞のような組織細胞、その他遺伝子を含有する任意の試料から、該試料中の細胞を破壊して二本鎖核酸を遊離させ、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖の核酸に解離させたものである。また、本実施の形態における遺伝子サンプルは、制限酵素で切断して電気泳動による分離等で精製した核酸断片でもよい。【０１０２】  （実施の形態１）
以下、実施の形態１における遺伝子検出方法について説明する。【０１０３】  （ステップ１）まず、検査対象となる遺伝子サンプルを作成する。この遺伝子サンプルは、前述したように、任意の試料中の細胞を破壊して二本鎖核酸を遊離させ、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖に変性させる。【０１０４】  このとき、前記試料中の細胞の破壊は、常法により行うことができ、例えば、振とう、超音波等の物理的作用を外部から加えて行うことができる。また、核酸抽出溶液（例えば、ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、Ｔｗｅｅｎ−２０等の界面活性剤、又はサポニン、ＥＤＴＡ、プロテア−ゼ等を含む溶液等）を用いて、細胞から核酸を遊離させることもできる。【０１０５】  （ステップ２）次に、検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを生成し、電極に固定する。【０１０６】  この核酸プローブは、化学合成で得られた一本鎖の核酸あるいは、生物試料から抽出した核酸を制限酵素で切断し、電気泳動による分離等で精製した核酸を用いることができる。生物試料から抽出した核酸の場合には、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖の核酸に解離させておくことが好ましい。【０１０７】  本発明で用いる電極は、電極として使用可能であればどのようなものであってもよく、例えば、金、白金、白金黒、パラジウム、ロジウムのような貴金属電極や、グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバーのような炭素電極や、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛のような酸化物電極や、Ｓｉ、Ｇｅ、ＺｎＯ、ＣｄＳ、ＴｉＯ、ＧａＡｓのような半導体電極等が挙げられる。これらの電極は、導電性高分子によって被覆しても良く、このように前記電極を導電高分子によって被覆すれば、より安定なプローブ固定化電極を調製することができる。【０１０８】  なお、前記核酸プローブを前記電極に固定化する方法としては、公知の方法が用いられる。【０１０９】  例えば、前記電極が金である場合、該電極に固定する核酸プローブの５’−末端、もしくは３’−末端（好ましくは、５’−末端）にチオール基を導入して、金とイオウとの共有結合を介して、該核酸プローブを金電極に固定する。さらに、前記核酸プローブにチオール基を導入する方法は、文献（Ｍ．Ｍａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１８０５〜１８０８（１９９４）及びＢ．Ａ．Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３，４４８４（１９８５））に記載されているものが挙げられる。【０１１０】  即ち、一例を挙げると、前述の方法によってチオール基を核酸プローブに導入した後、該チオール基が導入された核酸プローブを、金電極に滴下し、低温下で数時間放置することで、前記核酸プローブを金電極に固定化する。【０１１１】  また別の例をあげると、前記電極がグラシーカーボンである場合、まずグラシーカーボンを過マンガン酸カリウムで酸化することによって、電極表面にカルボン酸基を導入し、アミド結合により、該核酸プローブを前記グラシーカーボン電極表面に固定する。なお、このグラシーカーボン電極に核酸プローブを固定する、実際の固定化方法については���文献（Ｋ．Ｍ．Ｍｉｌｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６５，２３１７〜２３２３（１９９３））に詳細が記載されている。【０１１２】  （ステップ３）そして、以上のようにして得られた、核酸プローブが固定化された電極を、検出すべき遺伝子配列を有する目的遺伝子サンプルを含む溶液に接触させる。これにより、前記核酸プローブと相補的な配列を有する目的遺伝子サンプルとがハイブリダイズし、二本鎖核酸を形成する。なお、この核酸プローブと前記目的遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせる方法は周知であるため、ここでは説明を省略する。【０１１３】  このように、電極に固定化された核酸プローブと、前記目的遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせて、二本鎖核酸を形成した後、洗浄液で洗浄する。これにより、二本鎖核酸を形成しなかった目的遺伝子サンプル等が洗い流される。【０１１４】  （ステップ４）この後、前記二本鎖核酸に挿入剤を添加して、該挿入剤を挿入させた前記二本鎖核酸に光照射を行い、前記二本鎖核酸と挿入剤との間で共有結合を形成させる。【０１１５】  以下、前記二本鎖核酸に挿入する挿入剤について説明する。【０１１６】  本実施の形態１における挿入剤は、前記二本鎖核酸に特異的に挿入し、光照射により二本鎖核酸と共有結合する特徴をもつ。これにより、前記挿入剤は、二本鎖核酸と、強固且つ不可逆的に結合するため、この後の工程である洗浄工程の際に、二本鎖核酸に結合した挿入剤が解離することがない。【０１１７】  また、本実施の形態１の挿入剤は、前述した二本鎖核酸に特異的に挿入し、光照射により二本鎖核酸と共有結合する二本鎖核酸結合部位が、複数個存在する特徴をもつ。これにより、挿入剤が、二本鎖核酸に挿入する割合がより高くなる。【０１１８】  さらに、本実施の形態１の挿入剤は、電気化学的に活性な物質（以下、単に「電気化学活性物質」とも言う。）と結合するための置換基をもち、該挿入剤中には、電気化学活性物質が含まれない特徴を持つ。【０１１９】  このように、前記挿入剤を、該挿入剤中に電気化学活性物質を含むことなく、該電気化学活性物質と結合する置換基のみを備える構成とすれば、前記電気化学活性物質が立体障害となることがなくなるため、二本鎖核酸に挿入される挿入剤量を大幅に増やすことができる。【０１２０】  また、挿入剤を前述したような構成とすれば、前記挿入剤に添加する電気化学活性物質の量もコントロールすることも可能となるため、該挿入剤に結合させる電気化学活性物質の量を必要最小限にすることが可能となる。これにより、一本鎖の遺伝子サンプル等に非特異的に吸着した電気化学活性物質によるバックグラウンドノイズを低下させることができ、この結果、遺伝子サンプルを高感度に検出することが可能となる。この効果は、電気化学活性物質が非特異吸着しやすい物質であればあるほど、顕著なものとなる。【０１２１】  また、前述したように本実施の形態１の挿入剤は、置換基を介して電気化学活性物質と結合する構成を有するので、前記電気化学活性物質の構成が、前記挿入剤と二本鎖核酸との結合に影響を及ぼさない、という効果もある。よって、前記挿入剤中に、電気化学活性物質と結合する置換基を複数個設��るようにすれば、二本鎖核酸に挿入され結合した挿入剤に前記電気化学活性物質を結合する際に、該挿入剤と電気化学活性物質との結合割合が高くなるため、遺伝子サンプルをより高い感度で検出することが可能となる。【０１２２】  以上のような特徴を有する本実施の形態１の挿入剤は、例えば、下記一般式（１）〜（３）で表すことができる。【０１２３】
【化１１】
2006038686.tif 000012
【０１２４】  （但し、Ｉａは二本鎖核酸に特異的に挿入し、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合を形成できる二本鎖核酸結合部位、Ｓａは前記電気化学的に活性である物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｓａと前記Ｉａとを連結する連結部位、Ｒ１は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉａ、前記Ｓａ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）【０１２５】
【化１２】
2006038686.tif 000013
【０１２６】  （但し、Ｉａは二本鎖核酸に特異的に挿入し、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合を形成できる二本鎖核酸結合部位、Ｓａは前記電気化学的に活性である物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｓａと前記Ｉａとを連結する連結部位、Ｒ１及びＲ２は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉａ、前記Ｓａ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）【０１２７】
【化１３】
2006038686.tif 000014
【０１２８】  （但し、Ｉａは二本鎖核酸に特異的に挿入し、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合を形成できる二本鎖核酸結合部位、Ｓａは前記電気化学的に活性である物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｓａと前記Ｉａとを連結する連結部位、Ｒ１は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉａ、前記Ｓａ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）【０１２９】  ここで、前述した一般式（１）〜（３）中に示される前記Ｌａは、アルキル基、アミド、エーテル、ケトン、エステルの組み合わせから構成される連結部位、もしくは、糖、リン酸、ピリジン、アミノ酸、メタクリル酸、アルコール、アミド、イソプレン、ウレタン、ウロン酸、エステル、エチレン、カーボネート、ビニル、スチレン等を組み合わせてなる、天然高分子、あるいは合成高分子で構成される連結部位である。なお、前記Ｌａは単体でもよいが、天然高分子あるいは合成高分子であるほうが好ましい。これは、高分子のほうが、前記ＳａあるいはＩａを多く結合させることができるためである。【０１３０】  そして、前記Ｌａと、前記ＳａあるいはＩａとは、化学結合により連結され、その化学結合は、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、抗体−抗原結合などが挙げられる。【０１３１】  また、前述した一般式（１）〜（３）中に示される前記Ｉａは、二本鎖核酸に特異的に挿入し、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合できる物質であり、例えば、感光性をもつ挿入剤が例に挙げられる。【０１３２】  そして、このような感光性をもつ挿入剤としては、例えば、フロクマリン誘導体が挙げられ、特に、ソラレン誘導体が好ましい。ソラレン誘導体は、二本鎖核酸に挿入すると、二本鎖核酸と非共有的相互作用を起こし、さらにこれに長波長紫外線（３００〜４００ｎｍ）を３〜５ｍＷ／ｃｍ２で１５分間照射することにより、二本鎖核酸と安定な共有結合を形成する。なお、前記ソラレン誘導体の具体的な例としては、ソラレン、メトキシソラレン、トリメチルソラレン等が挙げられる。【０１３３】  このように、挿入剤として感光性のもの（例えば、ソラレン誘導体）を用いるようにすれば、可逆的に二本鎖核酸に挿入されたソラレン誘導体部分が、光照射によって強固に且つ不可逆的に二本鎖核酸と共有結合するようになり、前記一本鎖の核酸プローブや、該核酸プローブが固定される電極表面に非特異吸着した挿入剤を洗浄等する操作によって、二本鎖核酸に結合させた挿入剤が抜け落ちることがなくなる。これにより、前記一本鎖の核酸プローブ及び電極表面に非特異吸着した前記挿入剤に対して、強い洗浄を行って除去することができるようになる。【０１３４】  また、前述した一般式（１）〜（３）中に示される前記ｍの値は、電極上に固定された核酸プローブの間隔や、遺伝子サンプル及び該核酸プローブの長さにより変わってくるが、１〜１００００個が望ましく、特に、挿入剤中に前記Ｉａが１〜１０００個含まれているものが望ましい。これは、前記���が１００００個以上になると、その部分が立体障害となり、二本鎖核酸に挿入されにくく、且つ結合しにくくなるためである。【０１３５】  なお、前記一般式（１）〜（３）中の、Ｉａ若しくはＳａは、全てのＬａと連結しなければならないわけではなく、例えば、ｍが２〜３個につき、１個のＩａ若しくはＳａがＬａと連結している、というように、複数個のＬａにＩａ及びＳａが１個連結するものであってもよい。また、ｍが１のときは、Ｒ１及びＲ２は無くても良い。【０１３６】  さらに、本実施の形態１では、電気的に中性もしくは陰性の挿入剤を使用するのが好ましい。この理由は、前記一本鎖の核酸プローブが電気的に陰性であるため、もし電気的に陽性である挿入剤を二本鎖核酸に添加した場合、該挿入剤が、二本鎖核酸に挿入されるだけでなく、二本鎖核酸を形成しなかった一本鎖の核酸プローブにも非特異に吸着してしまい、該一本鎖の核酸プローブに非特異に吸着した挿入剤にＵＶ照射すると、該一本鎖の核酸プローブと該挿入剤とが共有結合してしまうため、遺伝子サンプルの検出感度が低下してしまうからである。【０１３７】  上記理由により、前記挿入剤として、電気的に中性もしくは陰性のものを使用すれば、前記挿入剤が一本鎖の核酸プローブに非特異吸着しにくくなるので、二本鎖核酸に挿入剤を効率良く挿入させることができる。なお、通常、挿入剤は、電気的に中性であるが、該挿入剤の側鎖にスルホニル基などを付加させることにより、電気的に陰性の挿入剤をつくることができる。【０１３８】  （ステップ５）以上に説明した本実施の形態１の挿入剤を、電極に形成された二本鎖核酸に添加し、且つ光照射により共有結合させた後、該電極に対してリン酸バッファー等の洗浄液を用いて洗浄処理を行い、該電極面上に非特異的に結合した挿入剤を除去する。この結果、前記ハイブリダイズした二本鎖核酸に、特異的に共有結合した挿入剤のみが残る。【０１３９】  そしてこの後、該二本鎖核酸に結合した挿入剤に、さらに電気化学活性物質を添加し、該挿入剤と電気化学活性物質とを化学結合させる。【０１４０】  以下、電気化学活性物質について説明する。【０１４１】  本実施の形態１の電気化学活性物質は、例えば、下記一般式（７）〜（１０）で表すことができる。【０１４２】
【化１４】
2006038686.tif 000015
【０１４３】  （但し、Ｓｂは挿入剤中の置換基Ｓａと化学結合する置換基、Ｅは電気化学活性部位、Ｌｂは前記Ｓｂと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ５は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｓｂまたはこれらの組み合わせからなる基である。）【０１４４】
【化１５】
2006038686.tif 000016
【０１４５】  （但し、Ｓｂは挿入剤のＳａと化学結合する置換基、Ｅは電気化学活性部位、Ｌｂは前記Ｓｂと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ５及びＲ６は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｓｂまたはこれらの組み合わせからなる基である。）【０１４６】
【化１６】
2006038686.tif 000017
【０１４７】  （但し、Ｓｂは挿入剤中の置換基Ｓａと化学結合する置換基、Ｅは電気化学活性部位、Ｌｂは前記Ｓｂと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ５及びＲ６は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｓｂまたはこれらの組み合わせからなる基である。）【０１４８】
【化１７】
2006038686.tif 000018
【０１４９】  （但し、Ｓｂは挿入剤中の置換基Ｓａと化学結合する置換基、Ｅは電気化学活性部位、Ｌｂは前記Ｓｂと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ５及びＲ６は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｓｂまたはこれらの組み合わせからなる基である。）【０１５０】  ここで、前述した一般式（７）〜（１０）中に示される前記Ｓｂは、前記挿入剤中の置換基Ｓａと化学結合により連結され、その化学結合は、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、抗体−抗原結合などが挙げられる。【０１５１】  また、前述した一般式（７）〜（１０）中に示される前記Ｌｂは、アルキル基、アミド、エーテル、ケトン、エステルの組み合わせから構成される連結部位、もしくは、糖、リン酸、ピリジン、アミノ酸、メタクリル酸、アルコール、アミド、イソプレン、ウレタン、ウロン酸、エステル、エチレン、カーボネート、ビニル、スチレン等を組み合わせてなる、天然高分子あるいは合成高分子で構成される連結部位である。なお、前記Ｌｂは単体でもよいが、天然高分子あるいは合成高分子であるほうが好ましい。これは、高分子のほうが、前記ＳｂあるいはＥを多く結合させることができるためである。【０１５２】  さらに、前記Ｌｂと、前記ＳｂあるいはＥとは、化学結合により連結され、その結合は、例えば、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、抗体−抗原結合などが挙げられる。【０１５３】  なお、電気化学活性部位であるＥは、電気化学的に検出可能な物質であれば、特に制限されずに用いられ、例えば、可逆な酸化還元反応時に生じる酸化還元電流を測定することで物質の検出が可能な、酸化還元性を有する化合物を挙げることができる。【０１５４】  そして、このような酸化還元性を有する化合物としては、例えば、フェロセン、カテコールアミン、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンもしくはビオローゲン等がある。【０１５５】  さらに、前記Ｅの例として挙げられた物質のうち、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンには、酸化還元反応時に電気化学発光を生じるものもあり、それらを用いれば、その発光を測定することで検出を行うこともできる。【０１５６】  また、前述した、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体としては、酸素や窒素等を含む複素環系化合物、例えば、ピリジン部位、ピラン部位等を配位子に有する金属錯体があり、特にピリジン部位を配位子に有する金属錯体が好ましい。【０１５７】  そして、前記ピリジン部位を配位子に有する金属錯体としては、例えば、金属ビピリジン錯体、金属フェナントロリン錯体等があり、また、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属としては、例えば、ルテニウム、オスニウム、亜鉛、コバルト、白金、クロム、モリブデン、タングステン、テクネチウム、レニウム、ロジウム、イリジウム、パラジウム、銅、インジウム、ランタン、プラセオジム、ネオジム、サマリウム等を挙げることができる。【０１５８】  そして特に、前記中心金属がルテニウム、オスニウムである錯体は、良好な電気化学発光特性を有し、このような良好な電気化学発光特性を有する物質としては、例えば、ルテニウムビピリジン錯体、ルテニウムフェナントロリン錯体、オスニウムビピリジン錯体、オスニウムフェナントロリン錯体等を挙げることができる。【０１５９】  また、前述した一般式（７）〜（１０）中に示される前記ｏの値は、電極上に固定された該核酸プローブの間隔や、遺伝子サンプル及び該核酸プローブの長さにより、その値は変わってくるが、１〜１０００００個であることが望ましく、特に、前記電気化学活性物質中に前記Ｅが１〜１０００個含まれているものが望ましい。これは、ｏが１０００００個以上になると、その部分が立体障害となり、前記挿入剤と結合しにくくなるためである。なお、前記一般式（７）〜（１０）中の、Ｅ若しくはＳｂは、全てのＬｂと連結しなければならないわけではなく、例えば、ｏが２〜３個につき、１個のＥ若しくはＳｂがＬｂと連結している、というように、複数個のＬｂにＥ及びＳｂが１個連結する構成をとってもよい。また、ｏが１のときは、Ｒ５及びＲ６は無くても良い。【０１６０】  このように、電気化学活性物質をポリマーにすれば、電気化学的な出力信号を増幅できるため、前記遺伝子サンプルをより高感度に検出することができる。【０１６１】  前述したようにして、電気化学活性物質を、前記挿入剤と二本鎖核酸とを共有結合させた後に、該挿入剤と結合させるようにしたので、一本鎖プローブや電極表面への非特異吸着を抑制させることができることに加え、前記電気化学活性物質が高分子であることにより、遺伝子サンプルの検出のさらなる高感度化が期待できる。なお、前記挿入剤の置換基Ｓａと、前記電気化学活性物質の置換基Ｓｂは、化学結合により結合することができ、その種類としては、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、抗体−抗原結合などが挙げられる。【０１６２】  以下、前述した本実施の形態１の挿入剤の具体例を下記式（１１）〜（１３）に、また電気化学活性物質の具体例を下記式（１４）〜（１７）に示す。ここでは、挿入剤の具体例として、電気的に中性であるものを例に挙げる。【０１６３】
【化１８】
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【０１６４】
【化１９】
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【０１６５】
【化２０】
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【０１６６】
【化２１】
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【０１６７】
【化２２】
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【０１６８】
【化２３】
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【０１６９】
【化２４】
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【０１７０】  なお、式（１２）中のｍは１〜１００００の整数であり、式（１３）中のｐ，ｑは、（ｐ＋ｑ）／２が１〜１００００、且つｐ≧０，ｑ≧０の整数である。また、式（１５）〜（１７）中のｏは１〜１０００００の整数である。【０１７１】  （ステップ６）そして、前述したように、前記挿入剤に置換基を介して電気化学活性物質を化学結合させた後、界面活性剤などにより洗浄処理を行い、前記一本鎖の核酸プローブや、該核酸プローブが固定される電極表面に非特異的に吸着した電気化学活性物質を除去する。【０１７２】  この結果、前記ハイブリダイズした二本鎖核酸に、特異的に共有結合した挿入剤のみが残るようになり、この挿入剤と化学結合した電気化学活性物質由来の電気化学的な信号を測定することにより、二本鎖核酸の存在を高感度に検出することができる。そして、前述したように電気化学活性物質に由来する電気化学的な信号を測定することにより、二本鎖核酸の存在を高感度に検出し、ついては、前記遺伝子サンプルの存在を高感度に検出する【０１７３】  前記電気化学活性物質由来の電気化学的な信号は、添加する種類により異なるが、酸化還元電流を生じる電気化学的に活性である物質を用いた場合には、ポテンショスタット、ファンクションジェネレータ等からなる計測系で測定できる。一方、電気化学発光を生じる挿入剤を用いた場合には、フォトマルチプライヤー等を用いて計測が可能である。【０１７４】  以下、本実施の形態１における遺伝子検出装置について、図１を用いて説明する。図１は、本実施の形態１における遺伝子検出装置の構成を示す図である。【０１７５】  図１において、遺伝子検出装置１００は、二本鎖核酸形成槽３、遺伝子サンプル洗浄槽７、挿入剤反応槽９、挿入剤洗浄槽１３、電気化学活性物質反応槽１５、電気化学活性物質洗浄槽１８、検出槽２０の７種類の槽を有している。【０１７６】  １は試料中の細胞より検出対象となる遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製部であり、２は該検出対象の遺伝子サンプルと相補的配列を有する１本鎖の核酸プローブが固定された電極である。５は前記電極２を保持する電極保持アーム５ａと、該電極保持アーム５ａを駆動するアーム駆動部５ｂとからなる、前述した７つの槽３，７，９，１３，１５，１８，２０の内部に、前記電極２を順に移動させる電極移動部であり、例えば、搬送アームや、ベルトコンベアのようなローダが例に挙げられる。【０１７７】  ６は電極２表面の未反応の遺伝子サンプルを洗浄する洗浄液を保持する遺伝子サンプル洗浄液タンクであり、８は挿入剤を保持する挿入剤タンクであり、１２は電極２表面の未反応の挿入剤を洗浄する洗浄液を保持する挿入剤洗浄液タンクであり、１４は電気化学活性物質を保持する電気化学活性物質タンクであり、１７は電極２の表面の未反応の電気化学活性物質を洗浄する洗浄液を保持する電気化学活性物質洗浄液タンクであり、１９は電解液を保持する電解液タンクである。【０１７８】  そして、前記遺伝子サンプル作製部１は前記二本鎖核酸反応槽３に、前記遺伝子核酸サンプル洗浄液タンク６は前記遺伝子サンプル洗浄槽７に、前記挿入剤タンク８は前記挿入剤反応槽９に、前記挿入剤洗浄液タンク１２は前記挿入剤洗浄槽１３に、前記電気化学活性物質タンク１４は前記電気化学活性物質反応槽１５に、前記電気化学活性物質洗浄液タンク１７は前記電気化学活性物質洗浄槽１８に、前記電解液タンク１９は前記検出槽２０に、それぞれ接続されている。また、前記挿入剤反応槽９には、電極２に光を照射するＵＶランプ１１が、前記検出槽２０には、電極２に電圧を印加するポテンショスタット２２と前記電極２の電気化学発光を測定するフォトマル２１と前記電極２に印加する印加電圧を制御するとともに、前記フォトマル２１から測定結果を取得して解析する制御部２３と、が設けられている。【０１７９】  また、前記二本鎖核酸形成槽３、挿入剤反応槽９は、それぞれ温度コントローラ４，１０，１６により嵌合されている。【０１８０】  次に、本実施の形態１における遺伝子検出装置１００の動作について説明する。【０１８１】  まず、検出しようとする遺伝子を含む被検査細胞を遺伝子サンプル作製部１に入れ、検査対象となる遺伝子を一本鎖に変性した遺伝子サンプルを含有する試料溶液を作製する。そして、前記遺伝子サンプルを含有する試料溶液を二本鎖核酸形成槽３に送り、該二本鎖核酸反応槽３内にセットされた、核酸プローブが固定された電極２に、前記試料溶液を滴下する。このとき二本鎖核酸形成槽３では、温度コントローラ４により、槽内温度を適温に制御しておく。【０１８２】  前記試料溶液が滴下された電極２の表面では、該電極２に固定された核酸プローブと相補的な配列を有する遺伝子サンプルがハイブリダイズし、二本鎖核酸が形成される。【０１８３】  反応終了後、該電極２を電極移動部５により、遺伝子サンプル洗浄槽７に移動させる。【０１８４】  遺伝子サンプル洗浄槽７では、前記遺伝子サンプル洗浄液タンク６に保持された洗浄液を前記電極２に滴下し、該洗浄液で前記電極２表面の未反応の遺伝子サンプルを除去する。【０１８５】  洗浄終了後、電極２を電極移動部５により、挿入剤反応槽９に移動させる。【０１８６】  挿入剤反応槽９では、前記挿入剤タンク８に保持された挿入剤を前記電極２に滴下し、該挿入剤を前記二本鎖核酸に挿入反応させる。このとき挿入反応槽９では、温度コントローラ１０により、槽内温度を適温に制御しておく。【０１８７】  さらにその後、前記挿入剤反応槽９で、前記ＵＶランプ１１により、前記挿入剤を滴下した電極２に光照射することで、前記挿入剤と二本鎖核酸を形成させる。【０１８８】  反応終了後、該電極２を電極移動部５により、挿入剤洗浄槽１３に移動させる。【０１８９】  挿入剤洗浄槽１３では、前記挿入剤洗浄液タンク１２に保持された洗浄液を前記電極２に滴下して、該洗浄液で前記電極２表面の未反応の挿入剤を除去する。【０１９０】  洗浄終了後、電極２を電極移動部５により、電気化学活性物質反応槽１５に移動させる。【０１９１】  電気化学活性物質反応槽１５では、前記電気化学活性物質溶液タンク１４に保持された電気化学活性物質を前記電極２に滴下し、前記二本鎖核酸に挿入した挿入剤と化学結合させる。このとき、電気化学活性物質反応槽１５では、温度コントローラ１６により、槽内温度を適温に制御しておく。【０１９２】  反応終了後、該電極２を電極移動部５により、電気化学活性物��洗浄槽１８に移動させる。【０１９３】  電気化学活性物質洗浄槽１８では、前記電気化学活性物質洗浄タンク１７に保持された洗浄液を前記電極２に滴下して、該洗浄液で前記電極２表面の未反応の電気化学活性物質を除去する。【０１９４】  洗浄終了後、電極２を電極移動部５により検出槽２０に移動させる。【０１９５】  検出槽２０では、前記電極２をポテンショスタット２２に接続し、前記電解液タンク１９に保持された電解液を前記電極２に滴下する。【０１９６】  前記ポテンショスタット２２は制御部２３の制御の下、電極２に対して電圧を印加し、電気化学発光させる。そして、前記フォトマル２１により、該電気化学発光を測定し、該測定値は制御部２３に入力され、解析される。【０１９７】  以上のように、本実施の形態１によれば、検出対象の遺伝子と相補的な配列を有する核酸プローブとをハイブリダイズして得た二本鎖核酸に挿入剤を挿入後、該二本鎖核酸に挿入された挿入剤と、電気化学的に活性である電気化学活性物質とを置換基を介して化学結合させるようにしたので、電気化学活性物質の立体障害が解消し、二本鎖核酸への挿入剤の挿入量を大幅に改善することができる。またこのようにしたので、電気化学活性物質を、複数連鎖させることも可能となり、遺伝子サンプルをさらに高感度に検出することができるだけでなく、電気化学活性物質が非特異吸着しやすい物質の場合、該挿入剤に、必要最小限の電気化学活性物質を添加すれば良いので、バックグラウンドを低下させることもできる。【０１９８】  なお、本実施の形態１では、洗浄槽として、二本鎖核酸形成工程後の未反応の遺伝子サンプルを洗浄する遺伝子サンプル洗浄槽７と、挿入剤添加工程後の未反応の挿入剤を洗浄する挿入剤洗浄槽１３と、電気化学活性物質添加工程後の未反応の電気化学活性物質を洗浄する電気化学活性物質洗浄槽１８とを設ける構成としたが、洗浄槽を一つにして、これらの洗浄処理を同一の洗浄槽で行う構成としてもよいし、或いは、前記３つの洗浄処理のうち、前記未反応の電気化学活性物質の洗浄処理のみを行い、前記未反応の遺伝子サンプル洗浄処理、前記未反応の挿入剤洗浄処理を行わないものとしてもよい。【０１９９】  さらに、前述した遺伝子装置１００では、電極２に対する処理毎に、その処理をするための槽を設ける構成としたが、全ての処理を一つの槽で実現することも可能である。以下、その一例を実施の形態２で示す。【０２００】（実施の形態２）
本実施の形態２は、処理槽を１つとし、電極に対する処理を、該１つの処理槽で行うようにしたものである。なお、本実施の形態２で用いる、遺伝サンプル、核酸プローブ、電極、挿入剤、及び電気化学活性物質は、前記実施の形態１と同じである。【０２０１】  図２は、本実施の形態２にかかる遺伝子検出装置の構成を示す図である。図２において、遺伝子検出装置２００は、電極２に対して処理を行う処理槽２４を有している。２５は前記処理槽２４内部で、前記電極を水平方向に移動させる電極移動部であり、例えば、ステージを平行移動させる機構などが例に挙げられる。そして、２６は前記処理槽２３内部にたまった液を排出する廃液タンクである。前記処理槽２４には、槽内部に、核酸プローブが固定された電極２と、該電極２を水平方向に移動させる電極移動部２５とが設けられ、さらに、槽上部に、前記遺伝子サンプル作製部１、遺伝子サンプル洗浄液タンク６、挿入剤タンク８、挿入剤洗浄液タンク１２、電気化学活性物質タンク１４、電気化学活性物質洗浄液タンク１７、電解液タンク１９、及び廃液タンク２６が接続されている。【０２０２】  また、前記処理槽２４には、電極２に光を照射するＵＶランプ１１と、該電極２の電気化学発光を測定するフォトマル２１とが設けられ、温度コントローラ４に嵌合されているものである。【０２０３】  さらに、当該装置２００には、電極２に電圧を印加するポテンショスタット２２と、前記電極２に印加する印加電圧を制御するとともに、前記フォトマル２１から測定結果を取得して解析する制御部２３とが設けられている。【０２０４】  次に、当該装置２００の動作を説明する。【０２０５】  まず検出しようとする遺伝子を含む被検査細胞を遺伝子サンプル作製部１に入れ、検査対象となる一本鎖に変性された遺伝子サンプルを含有する試料溶液を作製する。そして、前記遺伝子サンプルを含有する試料溶液を処理槽２４に送り、該処理槽２４内にセットされた、核酸プローブが固定された電極２に、前記試料溶液を滴下する。このとき処理槽２４では、温度コントローラ４により、槽内温度を適温に制御しておく。【０２０６】  前記試料溶液が滴下された電極２表面では、該電極２に固定された核酸プローブと相補的な配列を有する遺伝子サンプルがハイブリダイズし、二本鎖核酸が形成される。【０２０７】  反応終了後、前記遺伝子サンプル洗浄液タンク６に保持された洗浄液を前記電極２に滴下し、該洗浄液で前記電極２表面の未反応の遺伝子サンプルを除去する。このとき、電極移動部２５は、遺伝子サンプル洗浄液タンク６から送られる洗浄液が前記電極２に対して適切に滴下されるよう、該電極２を所定位置に水平方向に移動させる。また、前記電極２に滴下された洗浄液は、廃液タンク２６に回収される。【０２０８】  洗浄終了後、前記挿入剤タンク８に保持された挿入剤を前記電極２に滴下して、該挿入剤を前記二本鎖核酸に挿入反応させる。このとき、電極移動部２５は、挿入剤タンク８から送られる挿入剤が前記電極２に対して適切に滴下されるよう、該電極２を所定位置に水平方向に移動させる。また、処理槽２４では、温度コントローラ４により、槽内温度を適温に制御しておく。【０２０９】  反応終了後、前記挿入剤洗浄液タンク１２に保持された洗浄液を前記電極２に滴下して、該洗浄液で前記電極２表面の未反応の挿入剤を除去する。このとき、電極移動部２５は、挿入剤洗浄タンク１２から送られる洗浄液が前記電極２に対して適切に滴下されるよう、該電極２を所定位置に水平方向に移動させる。また、前記電極２に滴下された洗浄液は、廃液タンク２６に回収される。【０２１０】  洗浄終了後、前記電気化学活性物質タンク１４に保持された電気化学活性物質を前記電極２に滴下して、該挿入剤と化学結合させる。このとき、電極移動部２５は、電気化学活性物質タンク１４から送られる電気化学活性物質が前記電極２に対して適切に滴下されるよう、該電極２を所定位置に水平方向に移動させる。また、処理槽２４では、温度コントローラ４により、槽内温度を適温に制御しておく。【０２１１】  反応終了後、前記電気化学活性物質洗浄液タンク１７に保持された洗浄液を前記電極２に滴下して、該洗浄液で前記電極２表面の未反応の電気化学活性物質を除去する。このとき、電極移動部２５は、電気化学活性物質洗浄タンク１７から送られる洗浄液が前記電極２に対して適切に滴下されるよう、該電極２を所定位置に水平方向に移動させる。また、前記電極２に滴下された洗浄液は、廃液タンク２６に回収される。【０２１２】  洗浄終了後、前記電極２をポテンショスタット２２に接続し、前記電解液タンク１９に保持された電解液を前記電極２に滴下する。このとき、電極移動部２５は、電解液タンク１９から送られる電解液が前記電極２に対して適切に滴下されるよう、該電極２を所定位置に水平方向に移動させる。【０２１３】  前記ポテンショスタット２２は制御部２３の制御の下、電極２に対して電圧を印加し、電気化学発光させる。そして、前記フォトマル２１により、該電気化学発光を測定し、該測定値は制御部２３に入力され解析される。【０２１４】  以上のように、本実施の形態２によれば、検出対象の遺伝子と相補的な配列を有する核酸プローブとをハイブリダイズして得た二本鎖核酸に挿入剤を挿入後、電気化学的に活性である電気化学活性物質と挿入剤を化学結合させるようにしたので、該電気化学活性物質の立体障害が解消し、挿入量を大幅に改善することができる。またこのようにしたので、電気化学活性物質の量を複数連鎖させることも可能となり、さらに高感度検出することができるだけでなく、電気化学活性物質が非特異吸着しやすい物質の場合、必要最小限の電気化学活性物質を添加すれば良いので、バックグラウンドを低下させることもできる。【０２１５】  なお、本実施の形態２では、二本鎖核酸形成工程後の未反応の遺伝子サンプルを洗浄する遺伝子サンプル洗浄液タンク６と、挿入剤添加工程後の未反応の挿入剤を洗浄する挿入剤洗浄液タンク１２と、電気化学活性物質添加工程後の未反応の電気化学活性物質を洗浄する電気化学活性物質洗浄液タンク１７とを設ける構成としたが、処理槽２４に設ける洗浄液タンクを１つにして、二本鎖核酸形成工程後の未反応の遺伝子サンプルを洗浄する処理と、挿入剤添加工程後の未反応の挿入剤を洗浄する処理、及び電気化学活性物質添加工程後の未反応の電気化学活性物質を洗浄する処理を同一の洗浄液を用いて行うようにしても良いし、前記３つの洗浄処理のうち、前記電気化学活性物質洗浄処理のみを行い、前記遺伝子サンプルと前記挿入剤洗浄処理は行わないものとしてもよい。【０２１６】  さらに、前記実施の形態では、挿入剤を二本鎖核酸に挿入するタイミングとして、遺伝子サンプルと電極に固定化された核酸プローブとで形成された二本鎖核酸に、挿入剤を添加する場合を説明したが、予め遺伝子サンプルに挿入剤を添加しておき、該挿入剤が添加された遺伝子サンプルと電極に固定化された核酸プローブとで二本鎖核酸を形成させるようにしてもよい。以下、そのケースについて説明する。【０２１７】（実施の形態３）
本実施の形態３では、遺伝子サンプルに挿入剤を添加した後、該挿入剤が結合した遺伝子サンプルと電極に固定化された核酸プローブとをハイブリダイズさせる方法について説明する。なお、本実施の形態３で用いる、遺伝サンプル、核酸プローブ、電極、及び電気化学活性物質、及びそれら作製方法は、前記実施の形態と同じであるため、本実施の形態では詳述しない。【０２１８】  （ステップ１１）まず、検査対象となる遺伝子サンプルを作製する。【０２１９】  （ステップ１２）次に、前記遺伝子サンプルを含む水溶液に、挿入剤を添加した後、長波長紫外線（３００〜４００ｎｍ）を１０ｍＷ／ｃｍ２以上で３０分間照射することにより、該遺伝子サンプルと挿入剤とで安定な共有結合を形成させる。【０２２０】  以下、本実施の形態３における挿入剤について説明する。【０２２１】  本実施の形態３の挿入剤は、光照射により核酸プローブと共有結合する特徴をもつ物質を用いる。これにより、前記挿入剤は、前記核酸プローブと、強固に結合するため、この後の工程である洗浄工程の際に、核酸プローブに結合した挿入剤が解離することがない。【０２２２】  また、本実施の形態３の挿入剤は、光照射により核酸プローブと共有結合する遺伝子サンプル結合部位が、挿入剤中に複数個存在する特徴をもつ。これにより、挿入剤が遺伝子サンプルと結合する割合が高くなる。【０２２３】  さらに、本実施の形態３の挿入剤は、電気化学活性物質と結合するための置換基をもち、該挿入剤中には電気化学活性物質を含まない特徴をもつ。このように、挿入剤を、該挿入剤中に電気化学活性物質を含むことなく、該電気化学活性物質と結合する置換基をのみを備える構成とすることで、遺伝子サンプルと結合する挿入剤の量を大幅に改善することができる。【０２２４】  また、前述したように本実施の形態３の挿入剤は、置換基を介して前記電気化学活性物質と結合する構成を有するので、前記電気化学活性物質の構成が、前記挿入剤と遺伝子サンプルとの結合に影響を及ぼさない、という効果もある。よって、挿入剤中に、電気化学活性物質と結合する置換基を複数個設けるようにすれば、すでに遺伝子サンプルと結合した挿入剤に前記電気化学活性物質を結合させる際、該挿入剤と電気化学活性物質との結合割合を高めることができ、遺伝子サンプルをより高い感度で検出することができる。【０２２５】  以上のような特徴を有する本実施の形態３の挿入剤は、例えば、下記一般式（４）〜（６）で表すことができる。【０２２６】
【化２５】
2006038686.tif 000026
【０２２７】  （但し、Ｉｂは光照射を行うことにより前記遺伝子サンプルと共有結合を形成できる遺伝子サンプル結合部位、Ｓａは前記電気化学活性物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｓａと前記Ｉｂとを連結する連結部位、Ｒ３は、水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉｂ、前記Ｓａまたはこれらの組み合わせからなる基である。）【０２２８】
【化２６】
2006038686.tif 000027
【０２２９】  （但し、Ｉｂは光照射を行うことにより前記遺伝子サンプルと共有結合を形成できる遺伝子サンプル結合部位、Ｓａは前記電気化学活性物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｓａと前記Ｉｂとを連結する連結部位、Ｒ３及びＲ４は、水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉｂ、前記Ｓａまたはこれらの組み合わせからなる基である。）【０２３０】
【化２７】
2006038686.tif 000028
【０２３１】  （但し、Ｉｂは光照射を行うことにより前記遺伝子サンプルと共有結合を形成できる遺伝子サンプル結合部位、Ｓａは前記電気化学活性物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｓａと前記Ｉｂとを連結する連結部位、Ｒ３及びＲ４は、水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉｂ、前記Ｓａ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）【０２３２】  ここで、前述した一般式（４）〜（６）中に示される前記Ｌａは、アルキル基、アミド、エーテル、ケトン、エステル、あるいはこれらの組み合わせから構成される連結部位、もしくは、糖、リン酸、ピリジン、アミノ酸、メタクリル酸、アルコール、アミド、イソプレン、ウレタン、ウロン酸、エステル、エチレン、カーボネート、ビニル、スチレンなどの組み合わせからなる、天然高分子及び合成高分子で構成される連結部位である。なお、前記Ｌａは、単体でもよいが、天然高分子あるいは合成高分子であるほうが好ましい。これは、高分子のほうが、前記ＳａあるいはＩｂを多く結合させることができるためである。【０２３３】  そして、前記Ｌａと、前記Ｓａあるいは前記Ｉｂとは、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、抗体−抗原結合などで結合している。【０２３４】  また、前述した一般式（４）〜（６）中に示される前記Ｉｂは、光照射により遺伝子サンプルと共有結合できる物質であり、例えば、感光性をもつ挿入剤が挙げられる。【０２３５】  そして、このような感光性をもつ挿入剤としては、例えば、フロクマリン誘導体が挙げられ、特に、ソラレン誘導体が好ましい。ソラレン誘導体は、長波長紫外線（３００〜４００ｎｍ）を１０ｍＷ／ｃｍ２で３０分間照射することにより、遺伝子サンプルと安定な共有結合を形成する。なお、前記ソラレン誘導体の具体的な例としては、ソラレン、メトキシソラレン、トリメチルソラレン等が挙げられる。【０２３６】  このように、挿入剤として感光性のもの（例えば、ソラレン誘導体）を用いるようにすれば、可逆的に遺伝子サンプルと結合したソラレン誘導体部分が、光照射によって強固に且つ不可逆的に遺伝子サンプルと共有結合するようになり、一本鎖の核酸プローブとハイブリダイズさせた後の洗浄処理や、電気化学活性物質を添加した後の洗浄処理で、該遺伝子サンプルに結合させた挿入剤が解離することがなくなる。これにより、前記一本鎖の核酸プローブ及び電極表面に非特異吸着した前記挿入剤に対して、強い洗浄を行って除去することができるようになる。【０２３７】  また、前述した一般式（４）〜（６）中に示される前記ｎの値は、電極上に固定された該核酸プローブの間隔や、遺伝子サンプル及び該核酸プローブの長さにより変わってくるが、前述したように１〜１００００個が望ましく、さらに、挿入剤中に前記Ｉｂが１〜１０００個含まれているものが好ましい。これは、前記ｎが１００００個以上になると、その部分が立体障害となり、ＤＮＡと結合しにくくなるためである。【０２３８】  なお、前��一般式（４）〜（６）中の、ＩｂもしくはＳａは、全てのＬａと連結しなければならないわけではなく、例えば、ｎが２〜３個につき、１個のＩｂ若しくはＳａがＬａと連結している、というように、複数個のＬａにＩｂ及びＳａが１個連結するかたちでも良い。また、ｎが１の時は、Ｒ３及びＲ４は無くてもよい。【０２３９】  さらに、本実施の形態３では、電気的に陽性である挿入剤を使用するのが望ましい。このように挿入剤として電気的に陽性である挿入剤を使用すれば、より一本鎖の遺伝子サンプルに結合できる。電気的に陽性である挿入剤は、側鎖に第４級アミンなどを付加させることで合成できる。【０２４０】  以下、前述した本実施の形態３の挿入剤の具体例を、下記式（１８）〜（２０）に示す。ここでは、前記挿入剤の具体例として、電気的に陽性であるものを例に挙げる。【０２４１】
【化２８】
2006038686.tif 000029
【０２４２】
【化２９】
2006038686.tif 000030
【０２４３】
【化３０】
2006038686.tif 000031
【０２４４】  なお、式（１９）中のｎは１〜１００００の整数であり、式（２０）中のｒ，ｓは、（ｒ＋ｓ）／２が１〜１００００、且つｒ≧０，ｓ≧０の整数である。【０２４５】  そしてこの後、前記挿入剤と結合させた遺伝子サンプルに対して、ＮＡＰ５カラムなどで、未結合の挿入剤を除去する洗浄処理を行う。なお、この洗浄処理については、後述するハイブリダイゼーション後の洗浄処理時において、前記未結合の挿入剤を十分除去することができるため、省略してもよい。【０２４６】  （ステップ１３）そして、検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを生成し、電極に固定する。【０２４７】  （ステップ１４）この後、前記電極上に固定した核酸プローブ上に、挿入剤が結合された遺伝子サンプルを滴下し、ハイブリダイズさせて、二本鎖核酸を形成し、リン酸バッファーなどで洗浄処理して、未反応の遺伝子サンプル、あるいは挿入剤を除去する。【０２４８】  （ステップ１５）そして、前記洗浄処理がなされた二本鎖核酸に、電気化学活性物質を添加し、該二本鎖核酸中の遺伝子サンプルに結合した挿入剤と、前記電気化学活性物質とを、置換基を介して化学結合させる。【０２４９】  （ステップ１６）結合後、界面活性剤などで洗浄した後、前記実地の形態１で記載したような手法で、前記電気化学活性物質を計測する。【０２５０】  以上のように、本実施の形態３によれば、検出対象の遺伝子サンプルに挿入剤を結合させた後、該遺伝子サンプルと相補的な配列を有する核酸プローブと、該挿入剤が結合された遺伝子サンプルとをハイブリダイズして二本鎖核酸を形成し、該二本鎖核酸に挿入された挿入剤と、電気化学的に活性である電気化学活性物質とを置換基を介して化学結合させるようにしたので、電気化学活性物質の立体障害が解消し、二本鎖核酸への挿入剤の挿入量を大幅に改善することができる。またこれにより、電気化学活性物質を、複数連鎖させることも可能となり、遺伝子サンプルをさらに高感度に検出することができるだけでなく、電気化学活性物質が非特異吸着しやすい物質の場合、該挿入剤に、必要最小限の電気化学活性物質を添加すれば良いので、バックグラウンドを低下させることもできる。【０２５１】  なお、本実施の形態３の遺伝子検出装置の構成については、前記実施の形態１あるいは実施の形態２と略同じである。ただし、本実施の形態３の場合、光照射して遺伝子サンプルと挿入剤とを可逆的、且つ強固に結合させた後、該挿入剤が結合した遺伝子サンプルと前記核酸プローブとで二本鎖核酸を形成し、該二本鎖核酸中の遺伝子サンプルと結合した挿入剤と電気化学活性物質とを結合させるものであるため、前記実施の形態１で説明した図１の装置では、前記挿入剤添加槽で、光照射により遺伝子サンプルと共有結合する挿入剤と該遺伝子サンプルと反応させ、前記二本鎖核酸形成槽で、前記挿入剤が結合された遺伝子サンプルと前記電極に固定化した核酸プローブとをハイブリダイズさせて二本鎖核酸を形成する構成にするようにし、また、前記実施の形態２で説明した図２の装置では、前記挿入剤タンクに、光照射により前記遺伝子サンプルと共有結合する挿入剤を保持し、前記処理槽において、前記遺伝子サ��プルと前記挿入剤とを光照射により共有結合させ、前記遺伝子サンプルと未反応の挿入剤を前記挿入剤洗浄液で洗浄し、該挿入剤と結合した遺伝子サンプルと、前記固定化した核酸プローブとにより二本鎖核酸を形成させ、前記余分な遺伝子サンプル及びミスマッチの遺伝子サンプルを前記遺伝子サンプル洗浄液により除去させた後、前記遺伝子サンプルに結合した挿入剤に前記電気化学的に活性である物質を添加し、前記挿入剤と前記電気化学的に活性である物質とを化学結合させ、前記挿入剤と未反応の電気化学的に活性である物質を、前記電気化学活性物質洗浄液で洗浄し、前記遺伝子サンプルに結合した前記挿入剤に結合した前記電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出する構成にするようにする。
【実施例１】
【０２５２】  以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。【０２５３】  （１）金電極表面への核酸プローブの固定化
ガラス基板上にスパッタ装置（アルバック製ＳＨ−３５０）によりチタン１０ｎｍを下地に金２００ｎｍを形成し、フォトリソグラフィ工程により電極パターンを形成することで、金電極を準備した。電極表面をピラニア溶液（過酸化水素：濃硫酸＝１：３）で１分間洗浄し、純水ですすいだ後、窒素ブローで乾燥させた。【０２５４】  核酸プローブには、ヒト由来Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ−４５０の遺伝子配列の５’末端より６２９−６６８番目に位置するＣＣＣＣＣＴＧＧＡＴ  ＣＣＡＧＡＴＡＴＧＣ  ＡＡＴＡＡＴＴＴＴＣ  ＣＣＡＣＴＡＴＣＡＴの配列を有する、５’末端のリン酸基を介してチオール基を修飾した４０塩基のオリゴデオキシヌクレオチド（タカラバイオ製）を使用した。そして、該核酸プローブを１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４のリン酸ナトリウム緩衝液）に溶解させ、１０μＭに調整した。【０２５５】  この調整した核酸プローブの溶液を前記金電極上に滴下し、飽和湿潤下、室温で４時間放置することで、チオール基と金とを結合させて、核酸プローブを金電極に固定した。【０２５６】  （２）ハイブリダイゼーション
遺伝子サンプルには、前記核酸プローブと相補的な５’末端からＡＴＧＡＴＡＧＴＧＧ  ＧＡＡＡＡＴＴＡＴＴ  ＧＣＡＴＡＴＣＴＧＧ  ＡＴＣＣＡＧＧＧＧＧの配列を有する、４０塩基のオリゴデオキシヌクレオチド（タカラバイオ製）を使用した。そして、該遺伝子サンプルを、１０ｍＭのＰＢＳ及び２ＸＳＳＣを混合したハイブリダイゼーション溶液に溶解させ、２０μＭに調整した。【０２５７】  この調整した、遺伝子サンプルが溶解したハイブリダイゼーション溶液を、前記核酸プローブを固定した金電極上に滴下し、６０℃の恒温槽内で１時間反応させ、二本鎖核酸を形成させた。これにより、二本鎖核酸が形成された金電極ｙを得た。【０２５８】  さらに、本実施例１においては、比較対象として、二本鎖核酸が形成されていない金電極ｘを作成する。この二本鎖核酸が形成されない金電極ｘは、前記核酸プローブと非相補的な配列を有する遺伝子サンプル（以下、「比較遺伝子サンプル」と称す。）を使用して、前記二本鎖核酸が形成された金電極ｙを得る時と同様の処理をする。なお、ここでは、前記比較遺伝子サンプルとして、４０ｍｅｒのＰｏｌｙ−Ａ（タカラバイオ製）、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ  ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ  ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ  ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡの配列を有する遺伝子サンプルを使用した。【０２５９】  （３）挿入剤の添加
挿入剤には、前述した式（１１）に示す挿入剤を使用した。【０２６０】  前記挿入剤の合成は、以下手順により行うことができる。【０２６１】  窒素雰囲気にした容器に、公知の方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１６，Ｎｏ６，１９７７）により合成した４’−クロロメチル−４，５，８−トリメチルソラレン（０．７ｇ、２．６ｍｍｏｌ）を加え、乾燥ジメチルホルムアミド２０ｍＬで溶解させた。【０２６２】  次に、フタルイミドカリウム０．５６ｇ（３．０ｍｍｏｌ）を加え、３時間還流した。反応溶液は、クロロホルムから抽出した後、０．２Ｍ水酸化ナトリウム１００ｍＬで洗浄した。洗浄後、溶媒を留去し、ジエチルエーテル，クロロホルムで再結晶を行い、生成物Ａを得た（収率７７．５％）。【０２６３】  生成物Ａ０．７９ｇ（２．０４ｍｍｏｌ）をエタノール３０ｍＬに溶解させた後、ヒドラジン一水和物０．４１ｍＬ（８．１６ｍｍｏｌ）を加え、３時間還流を行った。その後、蒸留水４０ｍＬ、塩酸８．１ｍＬ加え、さらに２時間加熱還流した。【０２６４】  エタノールを留去し、１時間氷冷して析出した後、ろ過で生成物の塩酸塩を採取した。この生成物の塩酸塩をメタノールで溶解させ、１．０Ｍ水酸化ナトリウムを３ｍＬ加えた後、メタノールを留去した。クロロホルムで抽出し、溶媒を留去して生成物Ｂを得た（収率９２．６％）【０２６５】  クロロホルム１５ｍＬに溶解した生成物Ｂ０．３０ｇ（１．２ｍｍｏｌ）に、トリエチルアミン０．５０ｍＬ（３．５ｍｍｏｌ）、グルタル酸無水物１．３３ｇ（１１．７ｍｍｏｌ）を加えて５時間室温で撹拌した。反応後、ろ過により式（１１）に示す挿入剤を得た（収率９３．６％）。【０２６６】  表１は、前述のようにして得た式（１１）に示す挿入剤の１Ｈ−ＮＭＲ結果である。【０２６７】
【表１】
2006038686.tif 000032
【０２６８】  このようにして得られた挿入剤をＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドによりカルボキシル基を活性化させた後、１０ｍＭのＰＢＳで１００μＭに調整した。この調整した溶液を、二本鎖核酸が形成された金電極ｙ、及び二本鎖核酸が形成されていない金電極ｘにそれぞれ１０μＬ添加し、３０分間４℃の冷蔵庫内で暗反応を行った。【０２６９】  （４）二本鎖核酸と挿入剤との共有結合
３０分後、ＵＶクロスリンカー（フナコシ製ＵＶＰＣＬ１０００Ｌ型）を用いて波長３６５ｎｍ、５ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１５分間照射し、挿入剤と二本鎖核酸とを共有結合させた。共有結合後、金電極を１０ｍＭのＰＢＳで１０分間揺動洗浄し、未反応の挿入剤を取り除いた。【０２７０】  （５）挿入剤と電気化学的に活性である物質との共有結合
電気化学的に活性である物質は、前述の式（１６）に示す挿入剤を使用した。【０２７１】  ＴＨＦ６０．０ｍＬに溶解させた４，４‘−ジメチル−２，２’ビピリジン２．５０ｇ（１３．５ｍｍｏｌ）溶液を窒素雰囲気の容器に注入した後、リチウムジイソプロピルアミド２Ｍ溶液１６．９ｍＬ（２７．０ｍｍｏｌ）を滴下し、冷却しながら３０分撹拌した。【０２７２】  一方、同様に窒素気流中で乾燥させた容器に、１，３−ジブロモプロパン４．２ｍＬ（４１．１ｍｍｏｌ）とＴＨＦ１０ｍＬを加え、冷却しながら撹拌させた。この容器に、先【０２７３】程の反応液をゆっくり滴下させて２．５時間反応させた。反応溶液は２Ｎの塩酸で中和し、ＴＨＦを留去した後、クロロホルムで抽出した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Ｃを得た（収率４７％）。【０２７４】  窒素雰囲気の容器に生成物Ｃ１．０ｇ（３．２８ｍｍｏｌ），フタルイミドカリウム０．６７ｇ（３．６１ｍｍｏｌ）ジメチルホルムアミド（脱水）３０．０ｍＬを加え、オイルバスで１８時間還流した。反応後、クロロホルムで抽出し、０．２Ｎ水酸化ナトリウム５０ｍＬで蒸留水洗浄した。溶媒を留去して酢酸エチルとヘキサンから再結晶を行い、生成物Ｄを得た（収率６１・５％）。【０２７５】  塩化ルテニウム（ＩＩＩ）（２．９８ｇ、０．０１ｍｏｌ）、及び２，２‘−ビピリジン（３．４４ｇ、０．０２２ｍｏｌ）を、ジメチルホルムアミド（８０．０ｍＬ）中で６時間還流した後、溶媒を留去した。その後、アセトンを加え、一晩冷却することで得られた黒色沈殿物を採取し、エタノール水溶液１７０ｍＬ（エタノール：水＝１：１）を加え、１時間加熱還流を行った。ろ過後塩化リチウムを２０ｇ加え、エタノールを留去し、さらに一晩冷却した。析出した黒色物質は吸引ろ過で採取し、生成物Ｅを得た（収率６８．２％）。【０２７６】  窒素置換した容器に、生成物Ｄ０．５０ｇ（１．３５ｍｍｏｌ），生成物Ｇ０．７８ｇ（１．６１ｍｍｏｌ），エタノール５０ｍＬを加えた。９時間窒素雰囲気で還流した後、溶媒を留去し、蒸留水で溶解させ、１．０Ｍの過塩素酸水溶液で沈殿させた。この沈殿物を採取し、メタノールで再結晶を行い、生成物Ｆを得た（収率８１．６％）。【０２７７】  生成物Ｆ１．０ｇ（１．０２ｍｍｏｌ），メタノール７０．０ｍＬを１時間還流した。室温まで冷却した後、ヒドラジン一水和物０．２１ｍＬ（４．２１ｍｍｏｌ）を加え、再び１３時間還流した。反応後、蒸留水を１５ｍＬ加え、メタノールを留去した。【０２７８】  次に、濃塩酸を５．０ｍＬ加え、２時間還流して得られた反応液を一晩冷蔵し、不純物を自然ろ過で除去した。炭酸水素ナトリウムで中和した後、水を留去し、無機物をアセトニトリルで除去した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Ｇを得た（収率７１．４％）。【０２７９】  アルミホイルで遮光した容器に、生成物Ｇ０．６５ｇ（０．７６ｍｍｏｌ）を加え、アセトニトリル１０ｍＬに溶解させた。【０２８０】  次に、アセトニトリル５ｍＬに溶解させたトリエチルアミン０．２３ｇ（２．２９ｍｍｏｌ）を加えた後、アセトニトリル１０ｍＬに溶解したグルタル酸無水物０．８７ｇ（７．６２ｍｍｏｌ）を滴下した。９時間室温で撹拌させた後、溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、下記に示す式（２１）を得た（収率２８．５％）【０２８１】
【化３１】
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【０２８２】  表２は、前述のようにして得た式（２１）で示される物質の１Ｈ−ＮＭＲ結果である。【０２８３】
【表２】
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【０２８４】  前記式（２１）に示される物質８３ｍｇを、蒸留水５ｍＬに溶解させ、ＷＳＣ０．８２ｇ（４．２８ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド５０ｍｇ（０．４３ｍｍｏｌ）を加えた。この水溶液に、ポリ−Ｌ−リジン塩酸塩（分子量５０００〜１５０００）１０ｍｇを添加し、３日間、室温で撹拌させた。この反応液にアセトンを６０ｍＬ加えて、生成物を析出させた。その後、遠心分離機により生成物を沈殿させ、アセトニトリルで３回洗浄することにより、電気化学的に活性である物質を採取した。【０２８５】  このようにして得られた、電気化学的に活性である物質を、平均分子量１００００として、１０ｍＭＰＢＳで１０μＭに調製した。この溶液１０μＬを電極に滴下し、３０分間静置させて、挿入剤と化学結合させた後、界面活性剤を含む洗浄液で未反応物を除去した。【０２８６】  （５）電気化学測定
以上の工程の後、二本鎖核酸が形成されていない電極ｘ、及び二本鎖核酸が形成された電極ｙのそれぞれに、０．１ＭのＰＢＳ、及び０．１Ｍのトリエチルアミンを混合した電解液を８０μＬ滴下した。その後、それぞれの電極ｘ，ｙに電圧を印加し、この時に生じた挿入剤由来の電気化学発光の測定を行った。なお、電圧の印加は、０Ｖから１．３Ｖまで走査し、３秒間電気化学測定を行った。【０２８７】  電気化学発光量の測定は、光電子増倍管（浜松ホトニクス製Ｈ７３６０−０１）を用いて行い、電圧走査中における最大発光量を測定した。【０２８８】  図３は、本実施例１における、二本鎖核酸が形成されていない電極ｘ、及び二本鎖核酸が形成された電極ｙにおいて検出された最大電気化学発光量を示したものである。【０２８９】  図３から明らかなように、二本鎖核酸が形成された電極ｙでの最大電気化学発光量は、二本鎖核酸が形成されていない電極ｘでの最大電気化学発光量と比較して著しく高い値となっており、本実施例１の挿入剤を用いれば、高感度に二本鎖核酸の検出が可能であることが分かる。
【実施例２】
【０２９０】  （１）金電極表面への核酸プローブの固定化
前記実施例１と同様な手法で核酸プローブを固定した。【０２９１】  （２）挿入剤と遺伝子サンプルとの共有結合
遺伝子サンプルには、前記核酸プローブと相補的な５’末端からＡＴＧＡＴＡＧＴＧＧ  ＧＡＡＡＡＴＴＡＴＴ  ＧＣＡＴＡＴＣＴＧＧ  ＡＴＣＣＡＧＧＧＧＧの配列を有するオリゴデオキシヌクレオチド（タカラバイオ製）を使用し、挿入剤には、前述した式（１４）に示されるものを使用した。挿入剤の合成は、以下の手順により得ることができる。【０２９２】  窒素雰囲気にした容器に、公知の方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１６，Ｎｏ６，１９７７）により合成した４’−クロロメチル−４，５，８−トリメチルソラレン（０．７ｇ、２．６ｍｍｏｌ）を加え、乾燥ジメチルホルムアミド２０ｍＬで溶解させた。【０２９３】  次に、テトラメチル１，４−ジアミノブタン０．９４ｇ（６．５ｍｍｏｌ）を加え、５時間還流した。反応溶液は、クロロホルムから抽出した後、シリカゲルカラムで精製して生成物Ｊを得た（収率５６．８％）。【０２９４】  窒素雰囲気にした容器に、生成物Ｊ０．４８ｇ（１．１８ｍｍｏｌ）、乾燥ジメチルホルムアミド２０ｍＬ、３−クロロプロピオン酸０．２８ｇ（２．５８ｍｍｏｌ）を添加し、６時間１２０℃前後で反応させた。その後、クロロホルムで抽出し、溶媒を留去して、式（１４）に示す挿入剤を得た（収率７８．５％）。【０２９５】  表３は、前述のようにして得た式（１４）に示す挿入剤の１Ｈ−ＮＭＲ結果である。【０２９６】
【表３】
2006038686.tif 000035
【０２９７】  このようにして得られた式（１４）に示す挿入剤７２ｍｇ（０．１４ｍｍｏｌ）を、２ｍＬＤＭＳＯに溶解させ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド７８ｍｇ（０．６８ｍｍｏｌ）、ＷＳＣ２７８ｍｇ（１．４５ｍｍｏｌ）を加えて一晩室温で撹拌させることにより、該挿入剤のカルボキシル基を活性化させた。この挿入剤を１０ｍＭのＰＢＳで１００μＭに調整した。【０２９８】  次に、遺伝子サンプルを１０ｍＭのＰＢＳで２０μＭに調製した溶液４０μＬに、前述の挿入剤を５０μＬ添加し、ＵＶランプ（ＵＶＰ製Ｂ−１００ＡＰ型）を用いて波長３６５ｎｍ、１５ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を氷冷しながら４０分間照射し、挿入剤と遺伝子サンプルとを共有結合させた。【０２９９】（３）ハイブリダイゼーション
前記挿入剤が結合した遺伝子サンプルに、２０ＸＳＳＣを１０μＬ滴下し、２ＸＳＳＣ溶液に調製した。【０３００】  この調整した、遺伝子サンプルが溶解したハイブリダイゼーション溶液を、前記核酸プローブを固定した金電極上に１０μＬ滴下し、６０℃の恒温槽内で１時間反応させ、二本鎖核酸を形成させた。これにより、二本鎖核酸が形成された金電極ｙを得た。【０３０１】  さらに、本実施例においては、比較対象として、二本鎖核酸が形成されていない金電極ｘを作成する。この二本鎖核酸が形成されない金電極ｘは、前記核酸プローブと非相補的な配列を有する遺伝子サンプル（以下、「比較遺伝子サンプル」と称す。）を使用して、前記二本鎖核酸が形成された金電極ｙを得る時と同様の処理をする。なお、ここでは、前記比較遺伝子サンプルとして、４０ｍｅｒのＰｏｌｙ−Ａ（タカラバイオ製）、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ  ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ  ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ  ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡの配列を有する遺伝子サンプルを使用した。【０３０２】  （４）挿入剤と電気化学的に活性である物質の共有結合
電気化学的に活性である物質は、前述した式（１６）に示す物質を使用した。【０３０３】  これは、前記実施例１に記述した電気化学的に活性である物質を合成する過程で生成する生成物Ｇと同様であるので、説明は省略する。【０３０４】  この電気化学的に活性である物質を、１０ｍＭＰＢＳで５μＭに調製した。この溶液１０μＬを電極に滴下し、数回ピペッティングした後、３０分間静置させて、挿入剤と化学結合させ、その後、界面活性剤を含む洗浄液で未反応物を除去した。【０３０５】  （５）電気化学測定
以上の工程の後、二本鎖核酸が形成されていない電極ｘ、及び二本鎖核酸が形成された電極ｙのそれぞれに、０．１ＭのＰＢＳおよび０．１Ｍのトリエチルアミンを混合した電解液を８０μＬ滴下した。その後、それぞれの電極ｘ，ｙに電圧を印加し、この時に生じた挿入剤由来の電気化学発光の測定を行った。なお、電圧の印加は、０Ｖから１．３Ｖまで走査し、３秒間電気化学測定を行った。【０３０６】  電気化学発光量の測定は、光電子増倍管（浜松ホトニクス製Ｈ７３６０−０１）を用いて行い、電圧走査中における最大発光量を測定した。【０３０７】  図４は、本実施例２における、二本鎖核酸が形成されていない電極ｘ、及び二本鎖核酸が形成された電極ｙにおいて検出された最大電気化学発光量を示したものである。【０３０８】  図４から明らかなように、二本鎖核酸が形成された電極ｙでの最大電気化学発光量は、二本鎖核酸が形成されていない電極ｘでの最大電気化学発光量と比較して著しく高い値となっており、本実施例の挿入剤を用いれば、高感度に二本鎖核酸の検出が可能であることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０３０９】  本発明にかかる遺伝子検出方法は、特定の配列を有する遺伝子を高感度に検出することができ、遺伝子診断、感染症診断、ゲノム創薬等の用途に適用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2006038686.tif 000049
【手続補正書】
【提出日】平成19年4月5日(2007.4.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体試料中の特定の配列を有する遺伝子を検出する遺伝子検出方法であって、
前記検体試料中の検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製工程と、
前記検出すべき遺伝子の特定の配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを電極に固定化させる固定化工程と、
前記一本鎖の遺伝子サンプルを、前記一本鎖の核酸プローブが固定化された電極に添加し、前記核酸プローブと前記遺伝子サンプルとがハイブリダイズした二本鎖核酸を形成する二本鎖核酸形成工程と、
前記二本鎖核酸が形成された電極に、光照射により該二本鎖核酸と共有結合する挿入剤を添加する挿入剤添加工程と、
光照射を行うことにより、前記二本鎖核酸と前記添加された挿入剤とを共有結合させる光照射工程と、
前記二本鎖核酸に結合した挿入剤に、電気化学的に活性である物質を添加し、前記挿入剤と該電気化学的に活性である物質とを化学結合させる反応工程と、
前記二本鎖核酸と共有結合した挿入剤に結合した、前記電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出する検出工程、とを含む、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項２】
請求項１に記載の遺伝子検出法において、
前記挿入剤が、電気的に中性か陰性である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項３】
検体試料中の特定の配列を有する遺伝子を検出する遺伝子検出方法であって、
前記検体試料中の検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製工程と、
前記一本鎖に変性された遺伝子サンプルに、光照射により該遺伝子サンプルと共有結合する挿入剤を添加する挿入剤添加工程と、
光照射を行うことにより、前記遺伝子サンプルと前記添加された挿入剤とを共有結合させる光照射工程と、
前記検出すべき遺伝子の特定の配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを電極に固定化させる固定化工程と、
前記挿入剤と共有結合した一本鎖の遺伝子サンプルを、前記一本鎖の核酸プローブが固定化された電極に添加し、前記核酸プローブと前記遺伝子サンプルとがハイブリダイズした二本鎖核酸を形成する二本鎖核酸形成工程と、
前記二本鎖核酸に結合した挿入剤に、電気化学的に活性である物質を添加し、前記挿入剤と該電気化学的に活性な物質とを化学結合させる反応工程と、
前記二本鎖核酸と共有結合した挿入剤に結合した、前記電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出する検出工程、とを含む、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項４】
請求項２に記載の遺伝子検出法において、
前記挿入剤が、電気的に中性か陽性である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項５】
請求項１または請求項３に記載の遺伝子検出方法において、
前記電気化学的な測定は、前記電極に対して電圧を印加し、前記電気化学的に活性である物質からの電気化学発光量を測定するものである、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項６】
請求項１に記載の遺伝子検出法において、
前記挿入剤は、下記一般式（１）で表される、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【化１】
2006038686.tif 000050
（但し、式中、Ｉａは二本鎖核酸に特異的に挿入され、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合を形成する二本鎖核酸結合部位、Ｓａは前記電気化学的に活性である物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｉａと前記Ｓａとを連結する連結部位、Ｒ１は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉａ、前記Ｓａ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【請求項７】
請求項１に記載の遺伝子検出法において、
前記挿入剤は、下記一般式（２）で表される、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【化２】
2006038686.tif 000051
（但し、式中、Ｉａは二本鎖核酸に特異的に挿入され、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合を形成する二本鎖核酸結合部位、Ｓａは前記電気化学的に活性である物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｉａと前記Ｓａとを連結する連結部位、Ｒ１及びＲ２は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉａ、前記Ｓａ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【請求項８】
請求項１に記載の遺伝子検出法において、
前記挿入剤は、下記一般式（３）で表される、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【化３】
2006038686.tif 000052
（但し、式中、Ｉａは二本鎖核酸に特異的に挿入され、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合を形成する二本鎖核酸結合部位、Ｓａは前記電気化学的に活性である物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｉａと前記Ｓａとを連結する連結部位、Ｒ１及びＲ２は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉａ、前記Ｓａ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【請求項９】
請求項３に記載の遺伝子検出法において、
前記挿入剤は、下記一般式（４）で表される、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【化４】
2006038686.tif 000053
（但し、式中、Ｉｂは光照射により遺伝子サンプルと共有結合を形成する遺伝子サンプル結合部位、Ｓａは前記電気化学的に活性である物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｉｂと前記Ｓａとを連結する連結部位、Ｒ３は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉｂ、前記Ｓａ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【請求項１０】
請求項３に記載の遺伝子検出法において、
前記挿入剤は、下記一般式（５）で表される、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【化５】
2006038686.tif 000054
（但し、式中、Ｉｂは光照射により遺伝子サンプルと共有結合を形成する遺伝子サンプル結合部位、Ｓａは前記電気化学的に活性である物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｉｂと前記Ｓａとを連結する連結部位、Ｒ３及びＲ４は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉｂ、前記Ｓａ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【請求項１１】
請求項３に記載の遺伝子検出法において、
前記挿入剤は、下記一般式（６）で表される、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【化６】
2006038686.tif 000055
（但し、式中、Ｉｂは光照射により遺伝子サンプルと共有結合を形成する遺伝子サンプル結合部位、Ｓａは前記電気化学的に活性である物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｉｂと前記Ｓａとを連結する連結部位、Ｒ３及びＲ４は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉｂ、前記Ｓａ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【請求項１２】
請求項１または請求項３に記載の遺伝子検出法において、
前記電気化学的に活性である物質は、下記一般式（７）で表される、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【化７】
2006038686.tif 000056
（但し、式中、Ｓｂは前記挿入剤と化学結合する置換基、Ｅは電気化学活性部位、Ｌｂは前記Ｓｂと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ５は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｓｂ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【請求項１３】
請求項１または請求項３に記載の遺伝子検出法において、
前記電気化学的に活性である物質は、下記一般式（８）で表される、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【化８】
2006038686.tif 000057
（但し、式中、Ｓｂは前記挿入剤と化学結合する置換基、Ｅは電気化学活性部位、Ｌｂは前記Ｓｂと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ５及びＲ６は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｓｂ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【請求項１４】
請求項１または請求項３に記載の遺伝子検出法において、
前記電気化学的に活性である物質は、下記一般式（９）で表される、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【化９】
2006038686.tif 000058
（但し、式中、Ｓｂは前記挿入剤と化学結合する置換基、Ｅは電気化学活性部位、Ｌｂは前記Ｓｂと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ３及びＲ４は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｓｂ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【請求項１５】
請求項１または請求項３に記載の遺伝子検出法において、
前記電気化学的に活性である物質が、下記一般式（１０）で表される、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【化１０】
2006038686.tif 000059
（但し、式中、Ｓｂは前記挿入剤と化学結合する置換基、Ｅは電気化学活性部位、Ｌｂは前記Ｓｂと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ３及びＲ４は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｓｂ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【請求項１６】
請求項１または請求項３に記載の遺伝子検出方法において、
前記挿入剤と前記電気化学的に活性である物質との化学結合は、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、抗体−抗原結合である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項１７】
請求項６から請求項８のいずれかに記載の遺伝子検出方法において、
前記Ｌａと、前記Ｓａ，前記Ｉａとの結合が、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、抗体−抗原結合である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項１８】
請求項９から請求項１１のいずれかに記載の遺伝子検出方法において、
前記Ｌａと、前記Ｓａ，前記Ｉｂとの結合が、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、抗体−抗原結合である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項１９】
請求項１２から請求項１５のいずれかに記載の遺伝子検出方法において、
前記Ｌｂと、前記Ｓｂ，前記Ｅとの結合が、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、抗体−抗原結合である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項２０】
請求項６から請求項８のいずれかに記載の遺伝子検出方法において、
前記ｍは、１〜１００００の整数である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項２１】
請求項９から請求項１１のいずれかに記載の遺伝子検出方法において、
前記ｎは、１〜１００００の整数である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項２２】
請求項１２から請求項１５のいずれかに記載の遺伝子検出方法において、
前記ｏは、１〜１０００００の整数である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項２３】
請求項６から請求項１１のいずれかに記載の遺伝子検出法において、
前記Ｌａが、天然高分子または、合成高分子のいずれかである、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項２４】
請求項１２から請求項１５のいずれかに記載の遺伝子検出法において、
前記Ｌｂが、天然高分子または、合成高分子のいずれかである、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項２５】
請求項２３に記載の遺伝子検出方法において、
前記Ｌａが、糖、リン酸、ピリジン、アミノ酸、タンパク、メタクリル酸、アルコール、アミド、イソプレン、ウレタン、ウロン酸、エステル、エチレン、カーボネート、ビニル、スチレン、アルキル、エーテル、ケトン、エステルの組み合わせから構成される、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項２６】
請求項２４に記載の遺伝子検出方法において、
前記Ｌｂが、糖、リン酸、ピリジン、アミノ酸、タンパク、メタクリル酸、アルコール、アミド、イソプレン、ウレタン、ウロン酸、エステル、エチレン、カーボネート、ビニル、スチレン、アルキル、エーテル、ケトン、エステルの組み合わせから構成される、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項２７】
請求項６から請求項８のいずれかに記載の遺伝子検出法において、
前記挿入剤中に、前記Ｉａが１〜１０００個含まれている、
ことを特徴とする遺伝子検出法。
【請求項２８】
請求項９から請求項１１のいずれかに記載の遺伝子検出方法において、
前記挿入剤中に、前記Ｉｂが１〜１０００個含まれている、
ことを特徴とする遺伝子検出法。
【請求項２９】
請求項６から請求項８のいずれかに記載の遺伝子検出方法において、
前記Ｉａが、感光性挿入剤である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項３０】
請求項９から請求項１１のいずれかに記載の遺伝子検出方法において、
前記Ｉｂが、感光性挿入剤である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項３１】
請求項２９または請求項３０に記載の遺伝子検出方法において、
前記感光性挿入剤が、フロクマリン誘導体である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の遺伝子検出方法において、
前記フロクマリン誘導体が、ソラレン誘導体である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項３３】
請求項１２ないし請求項１５のいずれかに記載の遺伝子検出法において、
前記電気化学的に活性な物質中に、前記Ｅが１〜１０００個含まれている、
ことを特徴とする遺伝子検出法。
【請求項３４】
請求項１２ないし請求項１５のいずれかに記載の遺伝子検出法において、
前記Ｅが、酸化還元性を有する化合物である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の遺伝子検出方法において、
前記酸化還元性を有する化合物が、電気化学発光を示す化合物である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の遺伝子検出方法において、
前記電気化学発光を示す化合物が、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンのいずれかである、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の遺伝子検出方法において、
前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体が、配位子にピリジン部位を有する金属錯体である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項３８】
請求項３６に記載の遺伝子検出方法において、
前記配位子にピリジン部位を有する金属錯体が、金属ビピリジン錯体、金属フェナントロリン錯体のいずれかである、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の遺伝子検出方法において、
前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属が、ルテニウム、オスニウムのいずれかである、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項４０】
検体試料中の特定の配列を有する遺伝子検出装置であって、
前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを固定化してなる電極と、
前記電極に固定化した核酸プローブと、前記検体試料中の前記検出すべき遺伝子を一本鎖に変性した遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせて二本鎖核酸を形成する二本鎖核酸形成槽と、
前記電極あるいは前記二本鎖核酸に非特異的に吸着している、余分な遺伝子サンプル及びミスマッチの遺伝子サンプルを、遺伝子サンプル洗浄液により除去する遺伝子サンプル洗浄槽と、
光照射により前記二本鎖核酸と共有結合する挿入剤を、前記電極に添加して光照射し、前記二本鎖核酸と前記挿入剤とを共有結合させる挿入剤添加槽と、
前記二本鎖核酸と未反応の挿入剤を挿入剤洗浄液により除去する挿入剤洗浄槽と、
前記二本鎖核酸に結合した挿入剤に電気化学的に活性である物質を添加し、前記挿入剤と前記電気化学的に活性である物質とを化学結合させる電気化学活性物質添加槽と、
前記挿入剤と結合しなかった未反応の電気化学的に活性である物質を、電気化学活性物質洗浄液により除去する電気化学活性物質洗浄槽と、
前記二本鎖核酸と共有結合した挿入剤に結合した、前記電気化学的に活性である物質を電気化学的な測定により検出する検出槽と、
前記電極を、前記二本鎖核酸形成槽、前記遺伝子サンプル洗浄槽、前記挿入剤添加槽、前記挿入剤洗浄槽、前記電気化学活性物質添加槽、前記電気化学活性物質洗浄槽、及び前記検出槽の各槽内に、順に移動させる電極移動部と、を備える、
ことを特徴とする遺伝子検出装置。
【請求項４１】
検体試料中の特定の配列を有する遺伝子検出装置であって、
前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを固定化してなる電極と、
前記検体試料中の前記検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製部と、
前記電極あるいは前記二本鎖核酸に非特異に結合している、余分な遺伝子サンプル及びミスマッチの遺伝子サンプルを除去する、遺伝子サンプル洗浄液を保持する遺伝子サンプル洗浄液タンクと、
光照射により前記二本鎖核酸と共有結合する挿入剤を保持する挿入剤タンクと、
前記二本鎖核酸と未反応の挿入剤を除去する、挿入剤洗浄剤を保持する挿入剤洗浄液タンクと、
前記挿入剤と化学結合する電気化学的に活性である物質を保持する電気化学活性物質タンクと、
前記挿入剤と結合しなかった未反応の電気化学的に活性である物質を除去する、電気化学活性物質洗浄液を保持する電気化学活性物質洗浄液タンクと、
前記二本鎖核酸と共有結合した挿入剤に結合した、前記電気化学的に活性である物質を検出するための電解液を保持する電解液タンクと、
前記遺伝子サンプル作製部、前記遺伝子サンプル洗浄液タンク、前記挿入剤タンク、前記挿入剤洗浄液タンク、前記電気化学活性物質タンク、前記電気化学活性物質洗浄タンク、及び前記電解液タンクと接続され、前記電極に固定した核酸プローブと前記遺伝子サンプルとにより二本鎖核酸を形成させた後、前記余分な遺伝子サンプル及びミスマッチの遺伝子サンプルを前記遺伝子サンプル洗浄液により除去させ、該二本鎖核酸と前記挿入剤とを光照射により共有結合させ、前記二本鎖核酸と未反応の挿入剤を前記挿入剤洗浄液で洗浄し、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤に前記電気化学的に活性である物質を添加し、前記挿入剤と前記電気化学的に活性である物質とを化学結合させ、前記挿入剤と未反応の電気化学的に活性である物質を、前記電気化学活性物質洗浄液で洗浄し、前記二本鎖核酸に結合した前記挿入剤に結合した前記電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出する処理槽と、を備える、
ことを特徴とする遺伝子検出装置。
【請求項４２】
検体試料中の特定の配列を有する遺伝子検出装置であって、
前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを固定化してなる電極と、
光照射により、検体試料中の前記検出すべき遺伝子を一本鎖に変性した遺伝子サンプルと共有結合する挿入剤を、前記電極に添加して光照射し、該遺伝子サンプルと前記挿入剤とを共有結合させる挿入剤添加槽と、
前記遺伝子サンプルと未反応の挿入剤を挿入剤洗浄液により除去する挿入剤洗浄槽と、
前記電極に固定化した核酸プローブと、前記挿入剤が結合された遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせて二本鎖核酸を形成する二本鎖核酸形成槽と、
前記電極あるいは前記二本鎖核酸に非特異的に吸着している、余分な遺伝子サンプル及びミスマッチの遺伝子サンプルを、遺伝子サンプル洗浄液により除去する遺伝子サンプル洗浄槽と、
前記二本鎖核酸に結合した挿入剤に電気化学的に活性である物質を添加し、前記挿入剤と前記電気化学的に活性である物質とを化学結合させる電気化学活性物質添加槽と、
前記挿入剤と結合しなかった未反応の電気化学的に活性である物質を、電気化学活性物質洗浄液により除去する電気化学活性物質洗浄槽と、
前記遺伝子サンプルと共有結合した挿入剤に結合した、前記電気化学的に活性である物質を電気化学的な測定により検出する検出槽と、
前記電極を、前記二本鎖核酸形成槽、前記遺伝子サンプル洗浄槽、前記挿入剤添加槽、前記挿入剤洗浄槽、前記電気化学活性物質添加槽、前記電気化学活性物質洗浄槽、及び前記検出槽の各槽内に、順に移動させる電極移動部と、を備える、
ことを特徴とする遺伝子検出装置。
【請求項４３】
検体試料中の特定の配列を有する遺伝子検出装置であって、
前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを固定化してなる電極と、
前記検体試料中の前記検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製部と、
光照射により前記遺伝子サンプルと共有結合する挿入剤を保持する挿入剤タンクと、
前記遺伝子サンプルと未反応の挿入剤を除去する、挿入剤洗浄剤を保持する挿入剤洗浄液タンクと、
前記電極あるいは前記二本鎖核酸に非特異に結合している、余分な遺伝子サンプル及びミスマッチの遺伝子サンプルを除去する、遺伝子サンプル洗浄液を保持する遺伝子サンプル洗浄液タンクと、
前記挿入剤と化学結合する電気化学的に活性である物質を保持する電気化学活性物質タンクと、
前記挿入剤と結合しなかった未反応の電気化学的に活性である物質を除去する、電気化学活性物質洗浄液を保持する電気化学活性物質洗浄液タンクと、
前記遺伝子サンプルと共有結合した挿入剤に結合した前記電気化学的に活性である物質を検出する電解液を保持する電解液タンクと、
前記遺伝子サンプル作製部、前記遺伝子サンプル洗浄液タンク、前記挿入剤タンク、前記挿入剤洗浄液タンク、前記電気化学活性物質タンク、前記電気化学活性物質洗浄タンク、及び前記電解液タンクと接続され、前記遺伝子サンプルと前記挿入剤とを光照射により共有結合させ、前記遺伝子サンプルと未反応の挿入剤を前記挿入剤洗浄液で洗浄し、該挿入剤と結合した遺伝子サンプルと、前記固定化した核酸プローブとにより二本鎖核酸を形成させ、前記余分な遺伝子サンプル及びミスマッチの遺伝子サンプルを前記遺伝子サンプル洗浄液により除去させた後、前記遺伝子サンプルに結合した挿入剤に前記電気化学的に活性である物質を添加し、前記挿入剤と前記電気化学的に活性である物質とを化学結合させ、前記挿入剤と未反応の電気化学的に活性である物質を、前記電気化学活性物質洗浄液で洗浄し、前記遺伝子サンプルに結合した前記挿入剤に結合した前記電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出する処理槽と、を備える、
ことを特徴とする遺伝子検出装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に存在する特定の遺伝子配列を、高感度に検出するための遺伝子検出方法、及び遺伝子検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の、特定の遺伝子配列を電気化学的に検出する方法は、検出すべき特定の遺伝子配列を有する目的遺伝子に対して、相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを電極表面に固定化し、該核酸プローブと、一本鎖に変性された目的遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせた後、該核酸プローブと目的遺伝子サンプルとの二本鎖核酸に特異的に結合し、且つ電気化学的に活性な挿入剤を、該核酸プローブと遺伝子サンプルとの反応系に添加する。そして、前記挿入剤が添加された反応系中に電圧を印加して電気化学的な測定を行い、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤を検出することにより、前記目的遺伝子サンプルとハイブリダイズした前記核酸プローブを検出し、前記目的遺伝子の存在を確認する（例えば、特許文献１及び特許文献２参照）。
【０００３】
ここで、前記挿入剤とは、前記二本鎖の核酸を認識して、該二本鎖核酸と特異的に結合する物質を指す。前記挿入剤は、何れも分子中にフェニル基等の平板状挿入基を有し、該挿入基が二本鎖核酸の塩基対と塩基対との間に介入することによって、二本鎖核酸と結合する。この挿入剤と二本鎖核酸との結合は、静電気的相互作用あるいは疎水的相互作用での結合であって、前記挿入剤の前記二本鎖核酸の塩基対間への挿入、及びその塩基対間からの離脱が一定の速度で繰り返される平衡反応による結合である。
【０００４】
さらに、前述した挿入剤の中には、電気的に可逆な酸化還元反応を起こす物質があるため、該電気化学的に可逆である酸化還元反応を起こす物質を挿入剤として用いるようにすれば、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤の存在を、電気化学的変化の測定によって検出することができる。なお、この電気化学的変化は、酸化還元時に発生する電流や発光等で検出することができる。
【０００５】
つまり、従来の遺伝子検出方法においては、前記挿入剤が二本鎖核酸にのみ特異的に結合すること、また、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤の量を正確に検出することが重要であった。
【０００６】
しかし、従来の遺伝子検出に用いられる挿入剤は、一本鎖の核酸プローブや、該核酸プローブが固定される電極表面にも、非特異的に吸着してしまう。そして、このように一本鎖の核酸プローブや、該核酸プローブが固定される電極表面に非特異的に吸着した挿入剤は、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤の量の検出時に、バックグランドノイズとなり、検出感度を低下させる原因となる。
【０００７】
これを解消するため、従来方法においては、前記核酸プローブと遺伝子サンプルとの反応系に前記挿入剤を添加した後に、前述したバックグラウンドノイズとなる、一本鎖の核酸プローブ、あるいは電極表面に非特異的な吸着をしている挿入剤を除去する洗浄処理が行われている（例えば、特許文献２参照）。
【特許文献１】特許第２５７３４４３号公報
【特許文献２】特許第３２３３８５１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、従来の挿入剤と二本鎖核酸とは、静電気的相互作用あるいは疎水的相互作用によって結合されているものであるため、それらの結合力は弱い。従って、前述したように、二本鎖核酸に非特異的に吸着した挿入剤を洗浄処理する洗浄工程の際に、二本鎖核酸に結合した挿入剤も解離してしまい、洗浄処理を行なうことによって逆に検出感度を低下させてしまう、という課題があった。
【０００９】
そこで、前記洗浄処理において、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤が解離しないように考慮すると、前記一本鎖の核酸プローブや、電極表面に非特異的な吸着をしている挿入剤の除去が不十分となるため、バックグランドノイズを十分に除去できず、結局、検出感度が低下してしまう。
【００１０】
また、検出感度を向上させるために、従来の、電気化学的活性部位を含む挿入剤を、二本鎖核酸にできるだけ多く挿入させる必要があるのであるが、前述したように、従来の挿入剤と二本鎖核酸との挿入反応は平衡反応であるため、挿入剤を多量に使用しないと、該挿入剤は二本鎖核酸に挿入されにくい。そこで、挿入剤を多量に加えてしまうと、電極表面に非特異吸着する量が増大して、バックグラウンドノイズが増加してしまい、検出感度が低下してしまう。
【００１１】
さらに、従来の挿入剤は、前記二本核酸と結合する部位と、電気化学的に活性である部位とを有する構成となっているが、挿入剤が二本鎖核酸に挿入される際、該電気化学的に活性である部位が立体障害となって、挿入剤が二本鎖核酸に挿入されにくくなっている。すなわち、従来の挿入剤の構成自体が、検出感度が低下する原因の一つとなっている。
【００１２】
本発明は、前記課題を解決するためになされたものであって、検体試料中の遺伝子を高感度に検出可能な遺伝子検出方法、及び遺伝子検出装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記従来の課題を解決するため、本発明の遺伝子検出方法は、検体試料中の特定の配列を有する遺伝子を検出する遺伝子検出方法であって、前記検体試料中の検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製工程と、前記検出すべき遺伝子の特定の配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを電極に固定化させる固定化工程と、前記一本鎖の遺伝子サンプルを、前記一本鎖の核酸プローブが固定化された電極に添加し、前記核酸プローブと前記遺伝子サンプルとがハイブリダイズした二本鎖核酸を形成する二本鎖核酸形成工程と、前記二本鎖核酸が形成された電極に、光照射により該二本鎖核酸と共有結合する挿入剤を添加する挿入剤添加工程と、光照射を行うことにより、前記二本鎖核酸と前記添加された挿入剤とを共有結合させる光照射工程と、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤に、電気化学的に活性である物質を添加し、前記挿入剤と該電気化学的に活性である物質とを化学結合させる反応工程と、前記二本鎖核酸と共有結合した挿入剤に結合した、前記電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出する検出工程、とを含むものである。
【００１４】
これにより、検出対象の遺伝子と相補的な配列を有する核酸プローブとをハイブリダイズして得た二本鎖核酸に挿入剤を挿入後、該二本鎖核酸に挿入された挿入剤と、電気化学的に活性である物質とを置換基を介して化学結合させるようにしたので、電気化学的に活性である物質の立体障害が解消し、二本鎖核酸への挿入剤の挿入量を大幅に改善することができると共に、電気化学的に活性である物質を、複数連鎖させることも可能となり、遺伝子サンプルをさらに高感度に検出することができる。
【００１５】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記挿入剤が、電気的に中性か陰性であるものである。
【００１６】
これにより、前記挿入剤が一本鎖の核酸プローブに非特異吸着しにくくなる。
【００１７】
また、本発明の遺伝子検出方法は、検体試料中の特定の配列を有する遺伝子を検出する遺伝子検出方法であって、前記検体試料中の検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製工程と、前記一本鎖に変性された遺伝子サンプルに、光照射により該遺伝子サンプルと共有結合する挿入剤を添加する挿入剤添加工程と、光照射を行うことにより、前記遺伝子サンプルと前記添加された挿入剤とを共有結合させる光照射工程と、前記検出すべき遺伝子の特定の配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを電極に固定化させる固定化工程と、前記挿入剤と共有結合した一本鎖の遺伝子サンプルを、前記一本鎖の核酸プローブが固定化された電極に添加し、前記核酸プローブと前記遺伝子サンプルとがハイブリダイズした二本鎖核酸を形成する二本鎖核酸形成工程と、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤に、電気化学的に活性である物質を添加し、前記挿入剤と該電気化学的に活性な物質とを化学結合させる反応工程と、前記二本鎖核酸と共有結合した挿入剤に結合した、前記電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出する検出工程、とを含むものである。
【００１８】
これにより、検出対象の遺伝子サンプルに挿入剤を結合させた後、該遺伝子サンプルと相補的な配列を有する核酸プローブと、前記挿入剤が結合した遺伝子サンプルとをハイブリダイズして二本鎖核酸を形成し、該二本鎖核酸に挿入された挿入剤と、電気化学的に活性である物質とを置換基を介して化学結合させるようにしたので、電気化学的に活性である物質の立体障害が解消し、二本鎖核酸への挿入剤の挿入量を大幅に改善することができると共に、前記電気化学的に活性である物質を、複数連鎖させることも可能となり、遺伝子サンプルをさらに高感度に検出することができる。
【００１９】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記挿入剤が、電気的に中性か陽性であるものである。
【００２０】
これにより、前記挿入剤を、一本鎖の遺伝子サンプルにより多く結合させることができる。
【００２１】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記電気化学的な測定は、前記電極に対して電圧を印加し、前記電気化学的に活性である物質からの電気化学発光量を測定するものである。
【００２２】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記挿入剤は、下記一般式（１）で表されるものである。
【００２３】
【化１１】
2006038686.tif 000060
【００２４】
（但し、式中、Ｉａは二本鎖核酸に特異的に挿入され、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合を形成する二本鎖核酸結合部位、Ｓａは前記電気化学的に活性である物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｉａと前記Ｓａとを連結する連結部位、Ｒ１は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉａ、前記Ｓａ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【００２５】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記挿入剤は、下記一般式（２）で表されるものである。
【００２６】
【化１２】
2006038686.tif 000061
【００２７】
（但し、式中、Ｉａは二本鎖核酸に特異的に挿入され、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合を形成する二本鎖核酸結合部位、Ｓａは前記電気化学的に活性である物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｉａと前記Ｓａとを連結する連結部位、Ｒ１及びＲ２は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉａ、前記Ｓａ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【００２８】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記挿入剤は、下記一般式（３）で表されるものである。
【００２９】
【化１３】
2006038686.tif 000062
【００３０】
（但し、式中、Ｉａは二本鎖核酸に特異的に挿入され、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合を形成する二本鎖核酸結合部位、Ｓａは前記電気化学的に活性である物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｉａと前記Ｓａとを連結する連結部位、Ｒ１及びＲ２は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉａ、前記Ｓａ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【００３１】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記挿入剤は、下記一般式（４）で表されるものである。
【００３２】
【化１４】
2006038686.tif 000063
【００３３】
（但し、式中、Ｉｂは光照射により遺伝子サンプルと共有結合を形成する遺伝子サンプル結合部位、Ｓａは前記電気化学的に活性である物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｉｂと前記Ｓａとを連結する連結部位、Ｒ３は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉｂ、前記Ｓａ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【００３４】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記挿入剤は、下記一般式（５）で表されるものである。
【００３５】
【化１５】
2006038686.tif 000064
【００３６】
（但し、式中、Ｉｂは光照射により遺伝子サンプルと共有結合を形成する遺伝子サンプル結合部位、Ｓａは前記電気化学的に活性である物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｉｂと前記Ｓａとを連結する連結部位、Ｒ３及びＲ４は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉｂ、前記Ｓａ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【００３７】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記挿入剤は、下記一般式（６）で表されるものである。
【００３８】
【化１６】
2006038686.tif 000065
【００３９】
（但し、式中、Ｉｂは光照射により遺伝子サンプルと共有結合を形成する遺伝子サンプル結合部位、Ｓａは前記電気化学的に活性である物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｉｂと前記Ｓａとを連結する連結部位、Ｒ３及びＲ４は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉｂ、前記Ｓａ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【００４０】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記電気化学的に活性である物質は、下記一般式（７）で表されるものである。
【００４１】
【化１７】
2006038686.tif 000066
【００４２】
（但し、式中、Ｓｂは前記挿入剤と化学結合する置換基、Ｅは電気化学活性部位、Ｌｂは前記Ｓｂと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ５は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｓｂ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【００４３】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記電気化学的に活性である物質は、下記一般式（８）で表されるものである。
【００４４】
【化１８】
2006038686.tif 000067
【００４５】
（但し、式中、Ｓｂは前記挿入剤と化学結合する置換基、Ｅは電気化学活性部位、Ｌｂは前記Ｓｂと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ５及びＲ６は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｓｂ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【００４６】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記電気化学的に活性である物質は、下記一般式（９）で表されるものである。
【００４７】
【化１９】
2006038686.tif 000068
【００４８】
（但し、式中、Ｓｂは前記挿入剤と化学結合する置換基、Ｅは電気化学活性部位、Ｌｂは前記Ｓｂと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ５及びＲ６は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｓｂ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【００４９】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記電気化学的に活性である物質は、下記一般式（１０）で表されるものである。
【００５０】
【化２０】
2006038686.tif 000069
【００５１】
（但し、式中、Ｓｂは前記挿入剤と化学結合する置換基、Ｅは電気化学活性部位、Ｌｂは前記Ｓｂと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ５及びＲ６は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｓｂ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【００５２】
さらに、前記挿入剤と前記電気化学的に活性である物質との化学結合は、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、抗体−抗原結合であるものである。
【００５３】
これにより、挿入剤と電気化学的に活性である物質とを強固に結合させることができる。
【００５４】
さらに、前記Ｌａと、前記Ｓａ，前記Ｉａとの結合が、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、抗体−抗原結合であるものである。
【００５５】
さらに、前記Ｌａと、前記Ｓａ，前記Ｉｂとの結合が、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、抗体−抗原結合であるものである。
【００５６】
これにより、挿入剤中の前記Ｌａと、前記Ｉａ及び前記Ｓａ、あるいは前記Ｌａと、前記Ｓａ及び前記Ｉｂとを、強固に結合させることができる。
【００５７】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記Ｌｂと、前記Ｓｂ，前記Ｅとの結合が、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、抗体−抗原結合であるものである。
【００５８】
これにより、電気化学的に活性な物質中の前記Ｌｂ、前記Ｅ及び前記Ｓｂを、強固に結合させることができる。
【００５９】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記ｍは、１〜１００００の整数であるものである。
【００６０】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記ｎは、１〜１００００の整数であるものである。
【００６１】
これにより、二本鎖核酸と挿入剤とを結合させる際に、挿入剤の構造が立体障害を起こさないようにでき、該二本鎖核酸への挿入剤の挿入量をより多くすることができる。
【００６２】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記ｏは、１〜１０００００の整数であるものである。
【００６３】
これにより、挿入剤と電気化学的に活性な物質とを結合させる際に、該添加する電気化学的に活性な物質の量をコントロールすることができる。
【００６４】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記Ｌａが、天然高分子または、合成高分子のいずれかであるものである。
【００６５】
これにより、前記Ｌａに、前記ＳａあるいはＩａ，Ｉｂを多く結合させることができる。
【００６６】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記Ｌｂが、天然高分子または、合成高分子のいずれかであるものである。
【００６７】
これにより、前記Ｌｂに、前記ＳｂあるいはＥを多く結合させることができる。
【００６８】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記Ｌａが、糖、リン酸、ピリジン、アミノ酸、タンパク、メタクリル酸、アルコール、アミド、イソプレン、ウレタン、ウロン酸、エステル、エチレン、カーボネート、ビニル、スチレン、アルキル、エーテル、ケトン、エステルの組み合わせから構成されるものである。
【００６９】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記Ｌｂが、糖、リン酸、ピリジン、アミノ酸、タンパク、メタクリル酸、アルコール、アミド、イソプレン、ウレタン、ウロン酸、エステル、エチレン、カーボネート、ビニル、スチレン、アルキル、エーテル、ケトン、エステルの組み合わせから構成されるものである。
【００７０】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記挿入剤中に、前記Ｉａが１〜１０００個含まれているものである。
【００７１】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記挿入剤中に、前記Ｉｂが１〜１０００個含まれているものである。
【００７２】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記Ｉａが、感光性挿入剤であるものである。
【００７３】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記Ｉｂが、感光性挿入剤であるものである。
【００７４】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記感光性挿入剤が、フロクマリン誘導体であるものである。
【００７５】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記フロクマリン誘導体が、ソラレン誘導体であるものである。
【００７６】
これにより、感光性挿入剤が二本鎖核酸と非共有的相互作用を起こし、さらに該感光性挿入剤が挿入された二本鎖核酸に光照射すると、安定な共有結合が形成されるため、前記一本鎖の核酸プローブ及び電極表面に非特異吸着した挿入剤に対して、強い洗浄を行って除去することができる。
【００７７】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記電気化学的に活性な物質中に、前記Ｅが１〜１０００個含まれているものである。
【００７８】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記Ｅが、酸化還元性を有する化合物であるものである。
【００７９】
これにより、可逆な酸化還元反応時に生じる酸化還元を測定することで、遺伝子サンプルの検出が可能となる。
【００８０】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記酸化還元性を有する化合物が、電気化学発光を示す化合物である。
【００８１】
これにより、電気化学発光を測定することで、遺伝子サンプルの検出を行うことができる。
【００８２】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記電気化学発光を示す化合物が、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンのいずれかであるものである。
【００８３】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体が、配位子にピリジン部位を有する金属錯体であるものである。
【００８４】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記配位子にピリジン部位を有する金属錯体が、金属ビピリジン錯体、金属フェナントロリン錯体のいずれかであるものである。
【００８５】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属が、ルテニウム、オスニウムのいずれかであるものである。
【００８６】
また、本発明の遺伝子検出装置は、検体試料中の特定の配列を有する遺伝子検出装置であって、前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを固定化してなる電極と、前記電極に固定化した核酸プローブと、前記検体試料中の前記検出すべき遺伝子を一本鎖に変性した遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせて二本鎖核酸を形成する二本鎖核酸形成槽と、前記電極あるいは前記二本鎖核酸に非特異的に吸着している、余分な遺伝子サンプル及びミスマッチの遺伝子サンプルを、遺伝子サンプル洗浄液により除去する遺伝子サンプル洗浄槽と、光照射により前記二本鎖核酸と共有結合する挿入剤を、前記電極に添加して光照射し、前記二本鎖核酸と前記挿入剤とを共有結合させる挿入剤添加槽と、前記二本鎖核酸と未反応の挿入剤を挿入剤洗浄液により除去する挿入剤洗浄槽と、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤に電気化学的に活性である物質を添加し、前記挿入剤と前記電気化学的に活性である物質とを化学結合させる電気化学活性物質添加槽と、前記挿入剤と結合しなかった未反応の電気化学的に活性である物質を、電気化学活性物質洗浄液により除去する電気化学活性物質洗浄槽と、前記二本鎖核酸と共有結合した挿入剤に結合した、前記電気化学的に活性である物質を電気化学的な測定により検出する検出槽と、前記電極を、前記二本鎖核酸形成槽、前記遺伝子サンプル洗浄槽、前記挿入剤添加槽、前記挿入剤洗浄槽、前記電気化学活性物質添加槽、前記電気化学活性物質洗浄槽、及び前記検出槽の各槽内に、順に移動させる電極移動部と、を備えるものである。
【００８７】
これにより、前記遺伝子サンプルと核酸プローブとをハイブリダイズさせた二本鎖核酸と、不可逆的、且つ強固に結合させた挿入剤に化学結合した、電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出することで、前記遺伝子サンプルを検出することが可能となるので、前記検体試料中の遺伝子を高感度に検出できる遺伝子検出装置を提供できる。
【００８８】
また、本発明の遺伝子検出装置は、検体試料中の特定の配列を有する遺伝子検出装置であって、前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを固定化してなる電極と、前記検体試料中の前記検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製部と、前記電極あるいは前記二本鎖核酸に非特異に結合している、余分な遺伝子サンプル及びミスマッチの遺伝子サンプルを除去する、遺伝子サンプル洗浄液を保持する遺伝子サンプル洗浄液タンクと、光照射により前記二本鎖核酸と共有結合する挿入剤を保持する挿入剤タンクと、前記二本鎖核酸と未反応の挿入剤を除去する、挿入剤洗浄剤を保持する挿入剤洗浄液タンクと、前記挿入剤と化学結合する電気化学的に活性である物質を保持する電気化学活性物質タンクと、前記挿入剤と結合しなかった未反応の電気化学的に活性である物質を除去する、電気化学活性物質洗浄液を保持する電気化学活性物質洗浄液タンクと、前記二本鎖核酸と共有結合した挿入剤に結合した、前記電気化学的に活性である物質を検出するための電解液を保持する電解液タンクと、前記遺伝子サンプル作製部、前記遺伝子サンプル洗浄液タンク、前記挿入剤タンク、前記挿入剤洗浄液タンク、前記電気化学活性物質タンク、前記電気化学活性物質洗浄タンク、及び前記電解液タンクと接続され、前記電極に固定した核酸プローブと前記遺伝子サンプルとにより二本鎖核酸を形成させた後、前記余分な遺伝子サンプル及びミスマッチの遺伝子サンプルを前記遺伝子サンプル洗浄液により除去させ、該二本鎖核酸と前記挿入剤とを光照射により共有結合させ、前記二本鎖核酸と未反応の挿入剤を前記挿入剤洗浄液で洗浄し、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤に前記電気化学的に活性である物質を添加し、前記挿入剤と前記電気化学的に活性である物質とを化学結合させ、前記挿入剤と未反応の電気化学的に活性である物質を、前記電気化学活性物質洗浄液で洗浄し、前記二本鎖核酸に結合した前記挿入剤に結合した前記電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出する処理槽と、を備えるものである。
【００８９】
これにより、前記遺伝子サンプルと核酸プローブとをハイブリダイズさせた二本鎖核酸と、不可逆的、且つ強固に結合させた挿入剤に化学結合した、電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出することで、前記遺伝子サンプルを検出することが可能となるので、前記検体試料中の遺伝子を高感度に検出できる遺伝子検出装置を提供できる。また、当該装置の処理槽を一つとしたので、装置の小型化が実現できる。
【００９０】
また、本発明の遺伝子検出装置は、検体試料中の特定の配列を有する遺伝子検出装置であって、前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを固定化してなる電極と、光照射により、検体試料中の前記検出すべき遺伝子を一本鎖に変性した遺伝子サンプルと共有結合する挿入剤を、前記電極に添加して光照射し、該遺伝子サンプルと前記挿入剤とを共有結合させる挿入剤添加槽と、前記遺伝子サンプルと未反応の挿入剤を挿入剤洗浄液により除去する挿入剤洗浄槽と、前記電極に固定化した核酸プローブと、前記挿入剤が結合された遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせて二本鎖核酸を形成する二本鎖核酸形成槽と、前記電極あるいは前記二本鎖核酸に非特異的に吸着している、余分な遺伝子サンプル及びミスマッチの遺伝子サンプルを、遺伝子サンプル洗浄液により除去する遺伝子サンプル洗浄槽と、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤に電気化学的に活性である物質を添加し、前記挿入剤と前記電気化学的に活性である物質とを化学結合させる電気化学活性物質添加槽と、前記挿入剤と結合しなかった未反応の電気化学的に活性である物質を、電気化学活性物質洗浄液により除去する電気化学活性物質洗浄槽と、前記遺伝子サンプルと共有結合した挿入剤に結合した、前記電気化学的に活性である物質を電気化学的な測定により検出する検出槽と、前記電極を、前記二本鎖核酸形成槽、前記遺伝子サンプル洗浄槽、前記挿入剤添加槽、前記挿入剤洗浄槽、前記電気化学活性物質添加槽、前記電気化学活性物質洗浄槽、及び前記検出槽の各槽内に、順に移動させる電極移動部と、を備えるものである。
【００９１】
これにより、前記遺伝子サンプルと挿入剤とを、不可逆的、且つ強固に結合させ、該挿入剤が結合した遺伝子サンプルと固定化された捕捉プローブとで二本鎖核酸を形成し、該二本鎖核酸中の遺伝子サンプルに結合した挿入剤に化学結合した、電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出することで、前記遺伝子サンプルを検出することが可能となるので、前記検体試料中の遺伝子を高感度に検出できる遺伝子検出装置を提供できる。
【００９２】
また、本発明の遺伝子検出装置は、検体試料中の特定の配列を有する遺伝子検出装置であって、前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを固定化してなる電極と、前記検体試料中の前記検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製部と、光照射により前記遺伝子サンプルと共有結合する挿入剤を保持する挿入剤タンクと、前記遺伝子サンプルと未反応の挿入剤を除去する、挿入剤洗浄剤を保持する挿入剤洗浄液タンクと、前記電極あるいは前記二本鎖核酸に非特異に結合している、余分な遺伝子サンプル及びミスマッチの遺伝子サンプルを除去する、遺伝子サンプル洗浄液を保持する遺伝子サンプル洗浄液タンクと、前記挿入剤と化学結合する電気化学的に活性である物質を保持する電気化学活性物質タンクと、前記挿入剤と結合しなかった未反応の電気化学的に活性である物質を除去する、電気化学活性物質洗浄液を保持する電気化学活性物質洗浄液タンクと、前記遺伝子サンプルと共有結合した挿入剤に結合した前記電気化学的に活性である物質を検出する電解液を保持する電解液タンクと、前記遺伝子サンプル作製部、前記遺伝子サンプル洗浄液タンク、前記挿入剤タンク、前記挿入剤洗浄液タンク、前記電気化学活性物質タンク、前記電気化学活性物質洗浄タンク、及び前記電解液タンクと接続され、前記遺伝子サンプルと前記挿入剤とを光照射により共有結合させ、前記遺伝子サンプルと未反応の挿入剤を前記挿入剤洗浄液で洗浄し、該挿入剤と結合した遺伝子サンプルと、前記固定化した核酸プローブとにより二本鎖核酸を形成させ、前記余分な遺伝子サンプル及びミスマッチの遺伝子サンプルを前記遺伝子サンプル洗浄液により除去させた後、前記遺伝子サンプルに結合した挿入剤に前記電気化学的に活性である物質を添加し、前記挿入剤と前記電気化学的に活性である物質とを化学結合させ、前記挿入剤と未反応の電気化学的に活性である物質を、前記電気化学活性物質洗浄液で洗浄し、前記遺伝子サンプルに結合した前記挿入剤に結合した前記電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出する処理槽と、を備えるものである。
【００９３】
これにより、前記遺伝子サンプルと挿入剤とを、不可逆的、且つ強固に結合させ、該挿入剤が結合した遺伝子サンプルと固定化された捕捉プローブとで二本鎖核酸を形成し、該二本鎖核酸中の遺伝子サンプルに結合した挿入剤に化学結合した、電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出することで、前記遺伝子サンプルを検出することが可能となるので、前記検体試料中の遺伝子を高感度に検出できる遺伝子検出装置を提供できる。また、当該装置の処理槽を一つとしたので、装置の小型化が実現できる。
【発明の効果】
【００９４】
本発明の遺伝子検出方法及び装置によれば、特定の配列を有する遺伝子を検出する際に、光照射により、前記二本鎖核酸と前記挿入剤とを共有結合させて、該二本鎖核酸と挿入剤とを、不可逆的、且つ強固に結合させた後、電気化学的に活性である物質と前記二本鎖核酸と結合した挿入剤とを共有結合により、強固に結合させるようにしたので、前記挿入剤を洗浄処理により除去する際に、強い洗浄を行っても、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤が解離されることがなくなるため、前記遺伝子サンプルを高感度に検出できる。
【００９５】
また、挿入剤として、光照射により二本鎖核酸あるいは遺伝子サンプルと共有結合を形成する物質を用いるようにして、挿入剤中から電気化学的に活性である物質を分離させたことから、該挿入剤を二本鎖核酸に添加して、該二本鎖核酸の塩基間に挿入させる際に、前記電気化学的に活性である物質が立体障害となることがなくなり、前記挿入剤の挿入量が大幅に改善されることに加え、該分離させた前記電気化学的に活性な物質中に、電気化学的に活性である部位を複数連鎖させて存在させることも可能となる。
【００９６】
また、前述したように、電気化学的に活性である物質中に、電気化学的に活性である部位を複数連鎖させて存在させるようにしたので、遺伝子サンプルをさらに高感度に検出することができる。また、前記挿入剤に添加する電気化学的に活性である物質の量をコントロールすることも可能となるため、該電気化学的に活性である物質が一本鎖の核酸プローブに非特異吸着しやすい物質であったとしても、必要最小限の電気化学的に活性である物質を添加すれば良いので、バックグラウンドを低下させることもできる。
【００９７】
さらに、本発明の遺伝子検出方法及び装置によれば、特定の配列を有する遺伝子を検出する際に、光照射により、前記遺伝子サンプルと前記挿入剤とを共有結合させて、該遺伝子サンプルと挿入剤とを、不可逆的、且つ強固に結合させた後、該挿入剤が結合した遺伝子サンプルと前記固定化された核酸プローブとで二本鎖核酸を形成し、電気化学的に活性である物質と前記遺伝子サンプルと結合した挿入剤とを共有結合により、強固に結合させるようにしたので、前記挿入剤を洗浄処理により除去する際に、強い洗浄を行っても、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤が解離されることがなくなるため、前記遺伝子サンプルを高感度に検出できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９８】
以下に、本発明の遺伝子検出方法について詳細に説明する。
【００９９】
なお、以下の実施の形態における遺伝子サンプルとは、例えば、血液、白血球、血清、尿、糞便、精液、唾液、培養細胞、各種臓器細胞のような組織細胞、その他遺伝子を含有する任意の試料から、該試料中の細胞を破壊して二本鎖核酸を遊離させ、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖の核酸に解離させたものである。また、本実施の形態における遺伝子サンプルは、制限酵素で切断して電気泳動による分離等で精製した核酸断片でもよい。
【０１００】
（実施の形態１）
以下、実施の形態１における遺伝子検出方法について説明する。
【０１０１】
（ステップ１）まず、検査対象となる遺伝子サンプルを作成する。この遺伝子サンプルは、前述したように、任意の試料中の細胞を破壊して二本鎖核酸を遊離させ、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖に変性させる。
【０１０２】
このとき、前記試料中の細胞の破壊は、常法により行うことができ、例えば、振とう、超音波等の物理的作用を外部から加えて行うことができる。また、核酸抽出溶液（例えば、ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、Ｔｗｅｅｎ−２０等の界面活性剤、又はサポニン、ＥＤＴＡ、プロテア−ゼ等を含む溶液等）を用いて、細胞から核酸を遊離させることもできる。
【０１０３】
（ステップ２）次に、検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを生成し、電極に固定する。
【０１０４】
この核酸プローブは、化学合成で得られた一本鎖の核酸あるいは、生物試料から抽出した核酸を制限酵素で切断し、電気泳動による分離等で精製した核酸を用いることができる。生物試料から抽出した核酸の場合には、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖の核酸に解離させておくことが好ましい。
【０１０５】
本発明で用いる電極は、電極として使用可能であればどのようなものであってもよく、例えば、金、白金、白金黒、パラジウム、ロジウムのような貴金属電極や、グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバーのような炭素電極や、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛のような酸化物電極や、Ｓｉ、Ｇｅ、 ＺｎＯ、 ＣｄＳ、ＴｉＯ、ＧａＡｓのような半導体電極等が挙げられる。これらの電極は、導電性高分子によって被覆しても良く、このように前記電極を導電高分子によって被覆すれば、より安定なプローブ固定化電極を調製することができる。
【０１０６】
なお、前記核酸プローブを前記電極に固定化する方法としては、公知の方法が用いられる。
【０１０７】
例えば、前記電極が金である場合、該電極に固定する核酸プローブの５’−末端、もしくは３’−末端（好ましくは、５’−末端）にチオール基を導入して、金とイオウとの共有結合を介して、該核酸プローブを金電極に固定する。さらに、前記核酸プローブにチオール基を導入する方法は、文献（Ｍ．Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１８０５〜１８０８（１９９４）及びＢ．Ａ．Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３，４４８４（１９８５））に記載されているものが挙げられる。
【０１０８】
即ち、一例を挙げると、前述の方法によってチオール基を核酸プローブに導入した後、該チオール基が導入された核酸プローブを、金電極に滴下し、低温下で数時間放置することで、前記核酸プローブを金電極に固定化する。
【０１０９】
また別の例をあげると、前記電極がグラシーカーボンである場合、まずグラシーカーボンを過マンガン酸カリウムで酸化することによって、電極表面にカルボン酸基を導入し、アミド結合により、該核酸プローブを前記グラシーカーボン電極表面に固定する。なお、このグラシーカーボン電極に核酸プローブを固定する、実際の固定化方法については、文献（Ｋ．Ｍ．Ｍｉｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６５，２３１７〜２３２３（１９９３））に詳細が記載されている。
【０１１０】
（ステップ３）そして、以上のようにして得られた、核酸プローブが固定化された電極を、検出すべき遺伝子配列を有する目的遺伝子サンプルを含む溶液に接触させる。これにより、前記核酸プローブと相補的な配列を有する目的遺伝子サンプルとがハイブリダイズし、二本鎖核酸を形成する。なお、この核酸プローブと前記目的遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせる方法は周知であるため、ここでは説明を省略する。
【０１１１】
このように、電極に固定化された核酸プローブと、前記目的遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせて、二本鎖核酸を形成した後、洗浄液で洗浄する。これにより、二本鎖核酸を形成しなかった目的遺伝子サンプル等が洗い流される。
【０１１２】
（ステップ４）この後、前記二本鎖核酸に挿入剤を添加して、該挿入剤を挿入させた前記二本鎖核酸に光照射を行い、前記二本鎖核酸と挿入剤との間で共有結合を形成させる。
【０１１３】
以下、前記二本鎖核酸に挿入する挿入剤について説明する。
【０１１４】
本実施の形態１における挿入剤は、前記二本鎖核酸に特異的に挿入し、光照射により二本鎖核酸と共有結合する特徴をもつ。これにより、前記挿入剤は、二本鎖核酸と、強固且つ不可逆的に結合するため、この後の工程である洗浄工程の際に、二本鎖核酸に結合した挿入剤が解離することがない。
【０１１５】
また、本実施の形態１の挿入剤は、前述した二本鎖核酸に特異的に挿入し、光照射により二本鎖核酸と共有結合する二本鎖核酸結合部位が、複数個存在する特徴をもつ。これにより、挿入剤が、二本鎖核酸に挿入する割合がより高くなる。
【０１１６】
さらに、本実施の形態１の挿入剤は、電気化学的に活性な物質（以下、単に「電気化学活性物質」とも言う。）と結合するための置換基をもち、該挿入剤中には、電気化学活性物質が含まれない特徴を持つ。
【０１１７】
このように、前記挿入剤を、該挿入剤中に電気化学活性物質を含むことなく、該電気化学活性物質と結合する置換基のみを備える構成とすれば、前記電気化学活性物質が立体障害となることがなくなるため、二本鎖核酸に挿入される挿入剤量を大幅に増やすことができる。
【０１１８】
また、挿入剤を前述したような構成とすれば、前記挿入剤に添加する電気化学活性物質の量もコントロールすることも可能となるため、該挿入剤に結合させる電気化学活性物質の量を必要最小限にすることが可能となる。これにより、一本鎖の遺伝子サンプル等に非特異的に吸着した電気化学活性物質によるバックグラウンドノイズを低下させることができ、この結果、遺伝子サンプルを高感度に検出することが可能となる。この効果は、電気化学活性物質が非特異吸着しやすい物質であればあるほど、顕著なものとなる。
【０１１９】
また、前述したように本実施の形態１の挿入剤は、置換基を介して電気化学活性物質と結合する構成を有するので、前記電気化学活性物質の構成が、前記挿入剤と二本鎖核酸との結合に影響を及ぼさない、という効果もある。よって、前記挿入剤中に、電気化学活性物質と結合する置換基を複数個設けるようにすれば、二本鎖核酸に挿入され結合した挿入剤に前記電気化学活性物質を結合する際に、該挿入剤と電気化学活性物質との結合割合が高くなるため、遺伝子サンプルをより高い感度で検出することが可能となる。
【０１２０】
以上のような特徴を有する本実施の形態１の挿入剤は、例えば、下記一般式（１）〜（３）で表すことができる。
【０１２１】
【化２１】
2006038686.tif 000070
【０１２２】
（但し、Ｉａは二本鎖核酸に特異的に挿入し、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合を形成できる二本鎖核酸結合部位、Ｓａは前記電気化学的に活性である物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｓａと前記Ｉａとを連結する連結部位、Ｒ１は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉａ、前記Ｓａ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【０１２３】
【化２２】
2006038686.tif 000071
【０１２４】
（但し、Ｉａは二本鎖核酸に特異的に挿入し、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合を形成できる二本鎖核酸結合部位、Ｓａは前記電気化学的に活性である物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｓａと前記Ｉａとを連結する連結部位、Ｒ１及びＲ２は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉａ、前記Ｓａ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【０１２５】
【化２３】
2006038686.tif 000072
【０１２６】
（但し、Ｉａは二本鎖核酸に特異的に挿入し、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合を形成できる二本鎖核酸結合部位、Ｓａは前記電気化学的に活性である物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｓａと前記Ｉａとを連結する連結部位、Ｒ１は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉａ、前記Ｓａ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【０１２７】
ここで、前述した一般式（１）〜（３）中に示される前記Ｌａは、アルキル基、アミド、エーテル、ケトン、エステルの組み合わせから構成される連結部位、もしくは、糖、リン酸、ピリジン、アミノ酸、メタクリル酸、アルコール、アミド、イソプレン、ウレタン、ウロン酸、エステル、エチレン、カーボネート、ビニル、スチレン等を組み合わせてなる、天然高分子、あるいは合成高分子で構成される連結部位である。なお、前記Ｌａは単体でもよいが、天然高分子あるいは合成高分子であるほうが好ましい。これは、高分子のほうが、前記ＳａあるいはＩａを多く結合させることができるためである。
【０１２８】
そして、前記Ｌａと、前記ＳａあるいはＩａとは、化学結合により連結され、その化学結合は、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、抗体−抗原結合などが挙げられる。
【０１２９】
また、前述した一般式（１）〜（３）中に示される前記Ｉａは、二本鎖核酸に特異的に挿入し、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合できる物質であり、例えば、感光性をもつ挿入剤が例に挙げられる。
【０１３０】
そして、このような感光性をもつ挿入剤としては、例えば、フロクマリン誘導体が挙げられ、特に、ソラレン誘導体が好ましい。ソラレン誘導体は、二本鎖核酸に挿入すると、二本鎖核酸と非共有的相互作用を起こし、さらにこれに長波長紫外線（３００〜４００ｎｍ）を３〜５ｍＷ／ｃｍ2で１５分間照射することにより、二本鎖核酸と安定な共有結合を形成する。なお、前記ソラレン誘導体の具体的な例としては、ソラレン、メトキシソラレン、トリメチルソラレン等が挙げられる。
【０１３１】
このように、挿入剤として感光性のもの（例えば、ソラレン誘導体）を用いるようにすれば、可逆的に二本鎖核酸に挿入されたソラレン誘導体部分が、光照射によって強固に且つ不可逆的に二本鎖核酸と共有結合するようになり、前記一本鎖の核酸プローブや、該核酸プローブが固定される電極表面に非特異吸着した挿入剤を洗浄等する操作によって、二本鎖核酸に結合させた挿入剤が抜け落ちることがなくなる。これにより、前記一本鎖の核酸プローブ及び電極表面に非特異吸着した前記挿入剤に対して、強い洗浄を行って除去することができるようになる。
【０１３２】
また、前述した一般式（１）〜（３）中に示される前記ｍの値は、電極上に固定された核酸プローブの間隔や、遺伝子サンプル及び該核酸プローブの長さにより変わってくるが、１〜１００００個が望ましく、特に、挿入剤中に前記Ｉａが１〜１０００個含まれているものが望ましい。これは、前記ｍが１００００個以上になると、その部分が立体障害となり、二本鎖核酸に挿入されにくく、且つ結合しにくくなるためである。
【０１３３】
なお、前記一般式（１）〜（３）中の、Ｉａ若しくはＳａは、全てのＬａと連結しなければならないわけではなく、例えば、ｍが２〜３個につき、１個のＩａ若しくはＳａがＬａと連結している、というように、複数個のＬａにＩａ及びＳａが１個連結するものであってもよい。また、ｍが１のときは、Ｒ１及びＲ２は無くても良い。
【０１３４】
さらに、本実施の形態１では、電気的に中性もしくは陰性の挿入剤を使用するのが好ましい。この理由は、前記一本鎖の核酸プローブが電気的に陰性であるため、もし電気的に陽性である挿入剤を二本鎖核酸に添加した場合、該挿入剤が、二本鎖核酸に挿入されるだけでなく、二本鎖核酸を形成しなかった一本鎖の核酸プローブにも非特異に吸着してしまい、該一本鎖の核酸プローブに非特異に吸着した挿入剤にＵＶ照射すると、該一本鎖の核酸プローブと該挿入剤とが共有結合してしまうため、遺伝子サンプルの検出感度が低下してしまうからである。
【０１３５】
上記理由により、前記挿入剤として、電気的に中性もしくは陰性のものを使用すれば、前記挿入剤が一本鎖の核酸プローブに非特異吸着しにくくなるので、二本鎖核酸に挿入剤を効率良く挿入させることができる。なお、通常、挿入剤は、電気的に中性であるが、該挿入剤の側鎖にスルホニル基などを付加させることにより、電気的に陰性の挿入剤をつくることができる。
【０１３６】
（ステップ５）以上に説明した本実施の形態１の挿入剤を、電極に形成された二本鎖核酸に添加し、且つ光照射により共有結合させた後、該電極に対してリン酸バッファー等の洗浄液を用いて洗浄処理を行い、該電極面上に非特異的に結合した挿入剤を除去する。この結果、前記ハイブリダイズした二本鎖核酸に、特異的に共有結合した挿入剤のみが残る。
【０１３７】
そしてこの後、該二本鎖核酸に結合した挿入剤に、さらに電気化学活性物質を添加し、該挿入剤と電気化学活性物質とを化学結合させる。
【０１３８】
以下、電気化学活性物質について説明する。
【０１３９】
本実施の形態１の電気化学活性物質は、例えば、下記一般式（７）〜（１０）で表すことができる。
【０１４０】
【化２４】
2006038686.tif 000073
【０１４１】
（但し、Ｓｂは挿入剤中の置換基Ｓａと化学結合する置換基、Ｅは電気化学活性部位、Ｌｂは前記Ｓｂと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ５は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｓｂまたはこれらの組み合わせからなる基である。）
【０１４２】
【化２５】
2006038686.tif 000074
【０１４３】
（但し、Ｓｂは挿入剤のＳａと化学結合する置換基、Ｅは電気化学活性部位、Ｌｂは前記Ｓｂと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ５及びＲ６は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｓｂまたはこれらの組み合わせからなる基である。）
【０１４４】
【化２６】
2006038686.tif 000075
【０１４５】
（但し、Ｓｂは挿入剤中の置換基Ｓａと化学結合する置換基、Ｅは電気化学活性部位、Ｌｂは前記Ｓｂと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ５及びＲ６は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｓｂまたはこれらの組み合わせからなる基である。）
【０１４６】
【化２７】
2006038686.tif 000076
【０１４７】
（但し、Ｓｂは挿入剤中の置換基Ｓａと化学結合する置換基、Ｅは電気化学活性部位、Ｌｂは前記Ｓｂと前記Ｅとを連結する連結部位、Ｒ５及びＲ６は水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｅ、前記Ｓｂまたはこれらの組み合わせからなる基である。）
【０１４８】
ここで、前述した一般式（７）〜（１０）中に示される前記Ｓｂは、前記挿入剤中の置換基Ｓａと化学結合により連結され、その化学結合は、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、抗体−抗原結合などが挙げられる。
【０１４９】
また、前述した一般式（７）〜（１０）中に示される前記Ｌｂは、アルキル基、アミド、エーテル、ケトン、エステルの組み合わせから構成される連結部位、もしくは、糖、リン酸、ピリジン、アミノ酸、メタクリル酸、アルコール、アミド、イソプレン、ウレタン、ウロン酸、エステル、エチレン、カーボネート、ビニル、スチレン等を組み合わせてなる、天然高分子あるいは合成高分子で構成される連結部位である。なお、前記Ｌｂは単体でもよいが、天然高分子あるいは合成高分子であるほうが好ましい。これは、高分子のほうが、前記ＳｂあるいはＥを多く結合させることができるためである。
【０１５０】
さらに、前記Ｌｂと、前記ＳｂあるいはＥとは、化学結合により連結され、その結合は、例えば、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、抗体−抗原結合などが挙げられる。
【０１５１】
なお、電気化学活性部位であるＥは、電気化学的に検出可能な物質であれば、特に制限されずに用いられ、例えば、可逆な酸化還元反応時に生じる酸化還元電流を測定することで物質の検出が可能な、酸化還元性を有する化合物を挙げることができる。
【０１５２】
そして、このような酸化還元性を有する化合物としては、例えば、フェロセン、カテコールアミン、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンもしくはビオローゲン等がある。
【０１５３】
さらに、前記Ｅの例として挙げられた物質のうち、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンには、酸化還元反応時に電気化学発光を生じるものもあり、それらを用いれば、その発光を測定することで検出を行うこともできる。
【０１５４】
また、前述した、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体としては、酸素や窒素等を含む複素環系化合物、例えば、ピリジン部位、ピラン部位等を配位子に有する金属錯体があり、特にピリジン部位を配位子に有する金属錯体が好ましい。
【０１５５】
そして、前記ピリジン部位を配位子に有する金属錯体としては、例えば、金属ビピリジン錯体、金属フェナントロリン錯体等があり、また、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属としては、例えば、ルテニウム、オスニウム、亜鉛、コバルト、白金、クロム、モリブデン、タングステン、テクネチウム、レニウム、ロジウム、イリジウム、パラジウム、銅、インジウム、ランタン、プラセオジム、ネオジム、サマリウム等を挙げることができる。
【０１５６】
そして特に、前記中心金属がルテニウム、オスニウムである錯体は、良好な電気化学発光特性を有し、このような良好な電気化学発光特性を有する物質としては、例えば、ルテニウムビピリジン錯体、ルテニウムフェナントロリン錯体、オスニウムビピリジン錯体、オスニウムフェナントロリン錯体等を挙げることができる。
【０１５７】
また、前述した一般式（７）〜（１０）中に示される前記ｏの値は、電極上に固定された該核酸プローブの間隔や、遺伝子サンプル及び該核酸プローブの長さにより、その値は変わってくるが、１〜１０００００個であることが望ましく、特に、前記電気化学活性物質中に前記Ｅが１〜１０００個含まれているものが望ましい。これは、ｏが１０００００個以上になると、その部分が立体障害となり、前記挿入剤と結合しにくくなるためである。なお、前記一般式（７）〜（１０）中の、Ｅ若しくはＳｂは、全てのＬｂと連結しなければならないわけではなく、例えば、ｏが２〜３個につき、１個のＥ若しくはＳｂがＬｂと連結している、というように、複数個のＬｂにＥ及びＳｂが１個連結する構成をとってもよい。また、ｏが１のときは、Ｒ５及びＲ６は無くても良い。
【０１５８】
このように、電気化学活性物質をポリマーにすれば、電気化学的な出力信号を増幅できるため、前記遺伝子サンプルをより高感度に検出することができる。
【０１５９】
前述したようにして、電気化学活性物質を、前記挿入剤と二本鎖核酸とを共有結合させた後に、該挿入剤と結合させるようにしたので、一本鎖プローブや電極表面への非特異吸着を抑制させることができることに加え、前記電気化学活性物質が高分子であることにより、遺伝子サンプルの検出のさらなる高感度化が期待できる。なお、前記挿入剤の置換基Ｓａと、前記電気化学活性物質の置換基Ｓｂは、化学結合により結合することができ、その種類としては、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、抗体−抗原結合などが挙げられる。
【０１６０】
以下、前述した本実施の形態１の挿入剤の具体例を下記式（１１）〜（１３）に、また電気化学活性物質の具体例を下記式（１４）〜（１７）に示す。ここでは、挿入剤の具体例として、電気的に中性であるものを例に挙げる。
【０１６１】
【化２８】
2006038686.tif 000077
【０１６２】
【化２９】
2006038686.tif 000078
【０１６３】
【化３０】
2006038686.tif 000079
【０１６４】
【化３１】
2006038686.tif 000080
【０１６５】
【化３２】
2006038686.tif 000081
【０１６６】
【化３３】
2006038686.tif 000082
【０１６７】
【化３４】
2006038686.tif 000083
【０１６８】
なお、式（１２）中のｍは１〜１００００の整数であり、式（１３）中のｐ，ｑは、（ｐ＋ｑ）／２が１〜１００００、且つｐ≧０，ｑ≧０の整数である。また、式（１５）〜（１７）中のｏは１〜１０００００の整数である。
【０１６９】
（ステップ６）そして、前述したように、前記挿入剤に置換基を介して電気化学活性物質を化学結合させた後、界面活性剤などにより洗浄処理を行い、前記一本鎖の核酸プローブや、該核酸プローブが固定される電極表面に非特異的に吸着した電気化学活性物質を除去する。
【０１７０】
この結果、前記ハイブリダイズした二本鎖核酸に、特異的に共有結合した挿入剤のみが残るようになり、この挿入剤と化学結合した電気化学活性物質由来の電気化学的な信号を測定することにより、二本鎖核酸の存在を高感度に検出することができる。そして、前述したように電気化学活性物質に由来する電気化学的な信号を測定することにより、二本鎖核酸の存在を高感度に検出し、ついては、前記遺伝子サンプルの存在を高感度に検出する
【０１７１】
前記電気化学活性物質由来の電気化学的な信号は、添加する種類により異なるが、酸化還元電流を生じる電気化学的に活性である物質を用いた場合には、ポテンショスタット、ファンクションジェネレータ等からなる計測系で測定できる。一方、電気化学発光を生じる挿入剤を用いた場合には、フォトマルチプライヤー等を用いて計測が可能である。
【０１７２】
以下、本実施の形態１における遺伝子検出装置について、図１を用いて説明する。図１は、本実施の形態１における遺伝子検出装置の構成を示す図である。
【０１７３】
図１において、遺伝子検出装置１００は、二本鎖核酸形成槽３、遺伝子サンプル洗浄槽７、挿入剤反応槽９、挿入剤洗浄槽１３、電気化学活性物質反応槽１５、電気化学活性物質洗浄槽１８、検出槽２０の７種類の槽を有している。
【０１７４】
１は試料中の細胞より検出対象となる遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製部であり、２は該検出対象の遺伝子サンプルと相補的配列を有する１本鎖の核酸プローブが固定された電極である。５は前記電極２を保持する電極保持アーム５ａと、該電極保持アーム５ａを駆動するアーム駆動部５ｂとからなる、前述した７つの槽３，７，９，１３，１５，１８，２０の内部に、前記電極２を順に移動させる電極移動部であり、例えば、搬送アームや、ベルトコンベアのようなローダが例に挙げられる。
【０１７５】
６は電極２表面の未反応の遺伝子サンプルを洗浄する洗浄液を保持する遺伝子サンプル洗浄液タンクであり、８は挿入剤を保持する挿入剤タンクであり、１２は電極２表面の未反応の挿入剤を洗浄する洗浄液を保持する挿入剤洗浄液タンクであり、１４は電気化学活性物質を保持する電気化学活性物質タンクであり、１７は電極２の表面の未反応の電気化学活性物質を洗浄する洗浄液を保持する電気化学活性物質洗浄液タンクであり、１９は電解液を保持する電解液タンクである。
【０１７６】
そして、前記遺伝子サンプル作製部１は前記二本鎖核酸反応槽３に、前記遺伝子核酸サンプル洗浄液タンク６は前記遺伝子サンプル洗浄槽７に、前記挿入剤タンク８は前記挿入剤反応槽９に、前記挿入剤洗浄液タンク１２は前記挿入剤洗浄槽１３に、前記電気化学活性物質タンク１４は前記電気化学活性物質反応槽１５に、前記電気化学活性物質洗浄液タンク１７は前記電気化学活性物質洗浄槽１８に、前記電解液タンク１９は前記検出槽２０に、それぞれ接続されている。また、前記挿入剤反応槽９には、電極２に光を照射するＵＶランプ１１が、前記検出槽２０には、電極２に電圧を印加するポテンショスタット２２と前記電極２の電気化学発光を測定するフォトマル２１と前記電極２に印加する印加電圧を制御するとともに、前記フォトマル２１から測定結果を取得して解析する制御部２３と、が設けられている。
【０１７７】
また、前記二本鎖核酸形成槽３、挿入剤反応槽９は、それぞれ温度コントローラ４，１０，１６により嵌合されている。
【０１７８】
次に、本実施の形態１における遺伝子検出装置１００の動作について説明する。
【０１７９】
まず、検出しようとする遺伝子を含む被検査細胞を遺伝子サンプル作製部１に入れ、検査対象となる遺伝子を一本鎖に変性した遺伝子サンプルを含有する試料溶液を作製する。そして、前記遺伝子サンプルを含有する試料溶液を二本鎖核酸形成槽３に送り、該二本鎖核酸反応槽３内にセットされた、核酸プローブが固定された電極２に、前記試料溶液を滴下する。このとき二本鎖核酸形成槽３では、温度コントローラ４により、槽内温度を適温に制御しておく。
【０１８０】
前記試料溶液が滴下された電極２の表面では、該電極２に固定された核酸プローブと相補的な配列を有する遺伝子サンプルがハイブリダイズし、二本鎖核酸が形成される。
【０１８１】
反応終了後、該電極２を電極移動部５により、遺伝子サンプル洗浄槽７に移動させる。
【０１８２】
遺伝子サンプル洗浄槽７では、前記遺伝子サンプル洗浄液タンク６に保持された洗浄液を前記電極２に滴下し、該洗浄液で前記電極２表面の未反応の遺伝子サンプルを除去する。
【０１８３】
洗浄終了後、電極２を電極移動部５により、挿入剤反応槽９に移動させる。
【０１８４】
挿入剤反応槽９では、前記挿入剤タンク８に保持された挿入剤を前記電極２に滴下し、該挿入剤を前記二本鎖核酸に挿入反応させる。このとき挿入反応槽９では、温度コントローラ１０により、槽内温度を適温に制御しておく。
【０１８５】
さらにその後、前記挿入剤反応槽９で、前記ＵＶランプ１１により、前記挿入剤を滴下した電極２に光照射することで、前記挿入剤と二本鎖核酸を形成させる。
【０１８６】
反応終了後、該電極２を電極移動部５により、挿入剤洗浄槽１３に移動させる。
【０１８７】
挿入剤洗浄槽１３では、前記挿入剤洗浄液タンク１２に保持された洗浄液を前記電極２に滴下して、該洗浄液で前記電極２表面の未反応の挿入剤を除去する。
【０１８８】
洗浄終了後、電極２を電極移動部５により、電気化学活性物質反応槽１５に移動させる。
【０１８９】
電気化学活性物質反応槽１５では、前記電気化学活性物質溶液タンク１４に保持された電気化学活性物質を前記電極２に滴下し、前記二本鎖核酸に挿入した挿入剤と化学結合させる。このとき、電気化学活性物質反応槽１５では、温度コントローラ１６により、槽内温度を適温に制御しておく。
【０１９０】
反応終了後、該電極２を電極移動部５により、電気化学活性物質洗浄槽１８に移動させる。
【０１９１】
電気化学活性物質洗浄槽１８では、前記電気化学活性物質洗浄タンク１７に保持された洗浄液を前記電極２に滴下して、該洗浄液で前記電極２表面の未反応の電気化学活性物質を除去する。
【０１９２】
洗浄終了後、電極２を電極移動部５により検出槽２０に移動させる。
【０１９３】
検出槽２０では、前記電極２をポテンショスタット２２に接続し、前記電解液タンク１９に保持された電解液を前記電極２に滴下する。
【０１９４】
前記ポテンショスタット２２は制御部２３の制御の下、電極２に対して電圧を印加し、電気化学発光させる。そして、前記フォトマル２１により、該電気化学発光を測定し、該測定値は制御部２３に入力され、解析される。
【０１９５】
以上のように、本実施の形態１によれば、検出対象の遺伝子と相補的な配列を有する核酸プローブとをハイブリダイズして得た二本鎖核酸に挿入剤を挿入後、該二本鎖核酸に挿入された挿入剤と、電気化学的に活性である電気化学活性物質とを置換基を介して化学結合させるようにしたので、電気化学活性物質の立体障害が解消し、二本鎖核酸への挿入剤の挿入量を大幅に改善することができる。またこのようにしたので、電気化学活性物質を、複数連鎖させることも可能となり、遺伝子サンプルをさらに高感度に検出することができるだけでなく、電気化学活性物質が非特異吸着しやすい物質の場合、該挿入剤に、必要最小限の電気化学活性物質を添加すれば良いので、バックグラウンドを低下させることもできる。
【０１９６】
なお、本実施の形態１では、洗浄槽として、二本鎖核酸形成工程後の未反応の遺伝子サンプルを洗浄する遺伝子サンプル洗浄槽７と、挿入剤添加工程後の未反応の挿入剤を洗浄する挿入剤洗浄槽１３と、電気化学活性物質添加工程後の未反応の電気化学活性物質を洗浄する電気化学活性物質洗浄槽１８とを設ける構成としたが、洗浄槽を一つにして、これらの洗浄処理を同一の洗浄槽で行う構成としてもよいし、或いは、前記３つの洗浄処理のうち、前記未反応の電気化学活性物質の洗浄処理のみを行い、前記未反応の遺伝子サンプル洗浄処理、前記未反応の挿入剤洗浄処理を行わないものとしてもよい。
【０１９７】
さらに、前述した遺伝子装置１００では、電極２に対する処理毎に、その処理をするための槽を設ける構成としたが、全ての処理を一つの槽で実現することも可能である。以下、その一例を実施の形態２で示す。
【０１９８】
（実施の形態２）
本実施の形態２は、処理槽を１つとし、電極に対する処理を、該１つの処理槽で行うようにしたものである。なお、本実施の形態２で用いる、遺伝サンプル、核酸プローブ、電極、挿入剤、及び電気化学活性物質は、前記実施の形態１と同じである。
【０１９９】
図２は、本実施の形態２にかかる遺伝子検出装置の構成を示す図である。図２において、遺伝子検出装置２００は、電極２に対して処理を行う処理槽２４を有している。２５は前記処理槽２４内部で、前記電極を水平方向に移動させる電極移動部であり、例えば、ステージを平行移動させる機構などが例に挙げられる。そして、２６は前記処理槽２３内部にたまった液を排出する廃液タンクである。前記処理槽２４には、槽内部に、核酸プローブが固定された電極２と、該電極２を水平方向に移動させる電極移動部２５とが設けられ、さらに、槽上部に、前記遺伝子サンプル作製部１、遺伝子サンプル洗浄液タンク６、挿入剤タンク８、挿入剤洗浄液タンク１２、電気化学活性物質タンク１４、電気化学活性物質洗浄液タンク１７、電解液タンク１９、及び廃液タンク２６が接続されている。
【０２００】
また、前記処理槽２４には、電極２に光を照射するＵＶランプ１１と、該電極２の電気化学発光を測定するフォトマル２１とが設けられ、温度コントローラ４に嵌合されているものである。
【０２０１】
さらに、当該装置２００には、電極２に電圧を印加するポテンショスタット２２と、前記電極２に印加する印加電圧を制御するとともに、前記フォトマル２１から測定結果を取得して解析する制御部２３とが設けられている。
【０２０２】
次に、当該装置２００の動作を説明する。
【０２０３】
まず検出しようとする遺伝子を含む被検査細胞を遺伝子サンプル作製部１に入れ、検査対象となる一本鎖に変性された遺伝子サンプルを含有する試料溶液を作製する。そして、前記遺伝子サンプルを含有する試料溶液を処理槽２４に送り、該処理槽２４内にセットされた、核酸プローブが固定された電極２に、前記試料溶液を滴下する。このとき処理槽２４では、温度コントローラ４により、槽内温度を適温に制御しておく。
【０２０４】
前記試料溶液が滴下された電極２表面では、該電極２に固定された核酸プローブと相補的な配列を有する遺伝子サンプルがハイブリダイズし、二本鎖核酸が形成される。
【０２０５】
反応終了後、前記遺伝子サンプル洗浄液タンク６に保持された洗浄液を前記電極２に滴下し、該洗浄液で前記電極２表面の未反応の遺伝子サンプルを除去する。このとき、電極移動部２５は、遺伝子サンプル洗浄液タンク６から送られる洗浄液が前記電極２に対して適切に滴下されるよう、該電極２を所定位置に水平方向に移動させる。また、前記電極２に滴下された洗浄液は、廃液タンク２６に回収される。
【０２０６】
洗浄終了後、前記挿入剤タンク８に保持された挿入剤を前記電極２に滴下して、該挿入剤を前記二本鎖核酸に挿入反応させる。このとき、電極移動部２５は、挿入剤タンク８から送られる挿入剤が前記電極２に対して適切に滴下されるよう、該電極２を所定位置に水平方向に移動させる。また、処理槽２４では、温度コントローラ４により、槽内温度を適温に制御しておく。
【０２０７】
反応終了後、前記挿入剤洗浄液タンク１２に保持された洗浄液を前記電極２に滴下して、該洗浄液で前記電極２表面の未反応の挿入剤を除去する。このとき、電極移動部２５は、挿入剤洗浄タンク１２から送られる洗浄液が前記電極２に対して適切に滴下されるよう、該電極２を所定位置に水平方向に移動させる。また、前記電極２に滴下された洗浄液は、廃液タンク２６に回収される。
【０２０８】
洗浄終了後、前記電気化学活性物質タンク１４に保持された電気化学活性物質を前記電極２に滴下して、該挿入剤と化学結合させる。このとき、電極移動部２５は、電気化学活性物質タンク１４から送られる電気化学活性物質が前記電極２に対して適切に滴下されるよう、該電極２を所定位置に水平方向に移動させる。また、処理槽２４では、温度コントローラ４により、槽内温度を適温に制御しておく。
【０２０９】
反応終了後、前記電気化学活性物質洗浄液タンク１７に保持された洗浄液を前記電極２に滴下して、該洗浄液で前記電極２表面の未反応の電気化学活性物質を除去する。このとき、電極移動部２５は、電気化学活性物質洗浄タンク１７から送られる洗浄液が前記電極２に対して適切に滴下されるよう、該電極２を所定位置に水平方向に移動させる。また、前記電極２に滴下された洗浄液は、廃液タンク２６に回収される。
【０２１０】
洗浄終了後、前記電極２をポテンショスタット２２に接続し、前記電解液タンク１９に保持された電解液を前記電極２に滴下する。このとき、電極移動部２５は、電解液タンク１９から送られる電解液が前記電極２に対して適切に滴下されるよう、該電極２を所定位置に水平方向に移動させる。
【０２１１】
前記ポテンショスタット２２は制御部２３の制御の下、電極２に対して電圧を印加し、電気化学発光させる。そして、前記フォトマル２１により、該電気化学発光を測定し、該測定値は制御部２３に入力され解析される。
【０２１２】
以上のように、本実施の形態２によれば、検出対象の遺伝子と相補的な配列を有する核酸プローブとをハイブリダイズして得た二本鎖核酸に挿入剤を挿入後、電気化学的に活性である電気化学活性物質と挿入剤を化学結合させるようにしたので、該電気化学活性物質の立体障害が解消し、挿入量を大幅に改善することができる。またこのようにしたので、電気化学活性物質の量を複数連鎖させることも可能となり、さらに高感度検出することができるだけでなく、電気化学活性物質が非特異吸着しやすい物質の場合、必要最小限の電気化学活性物質を添加すれば良いので、バックグラウンドを低下させることもできる。
【０２１３】
なお、本実施の形態２では、二本鎖核酸形成工程後の未反応の遺伝子サンプルを洗浄する遺伝子サンプル洗浄液タンク６と、挿入剤添加工程後の未反応の挿入剤を洗浄する挿入剤洗浄液タンク１２と、電気化学活性物質添加工程後の未反応の電気化学活性物質を洗浄する電気化学活性物質洗浄液タンク１７とを設ける構成としたが、処理槽２４に設ける洗浄液タンクを１つにして、二本鎖核酸形成工程後の未反応の遺伝子サンプルを洗浄する処理と、挿入剤添加工程後の未反応の挿入剤を洗浄する処理、及び電気化学活性物質添加工程後の未反応の電気化学活性物質を洗浄する処理を同一の洗浄液を用いて行うようにしても良いし、前記３つの洗浄処理のうち、前記電気化学活性物質洗浄処理のみを行い、前記遺伝子サンプルと前記挿入剤洗浄処理は行わないものとしてもよい。
【０２１４】
さらに、前記実施の形態では、挿入剤を二本鎖核酸に挿入するタイミングとして、遺伝子サンプルと電極に固定化された核酸プローブとで形成された二本鎖核酸に、挿入剤を添加する場合を説明したが、予め遺伝子サンプルに挿入剤を添加しておき、該挿入剤が添加された遺伝子サンプルと電極に固定化された核酸プローブとで二本鎖核酸を形成させるようにしてもよい。以下、そのケースについて説明する。
【０２１５】
（実施の形態３）
本実施の形態３では、遺伝子サンプルに挿入剤を添加した後、該挿入剤が結合した遺伝子サンプルと電極に固定化された核酸プローブとをハイブリダイズさせる方法について説明する。なお、本実施の形態３で用いる、遺伝サンプル、核酸プローブ、電極、及び電気化学活性物質、及びそれら作製方法は、前記実施の形態と同じであるため、本実施の形態では詳述しない。
【０２１６】
（ステップ１１）まず、検査対象となる遺伝子サンプルを作製する。
【０２１７】
（ステップ１２）次に、前記遺伝子サンプルを含む水溶液に、挿入剤を添加した後、長波長紫外線（３００〜４００ｎｍ）を１０ｍＷ／ｃｍ2以上で３０分間照射することにより、該遺伝子サンプルと挿入剤とで安定な共有結合を形成させる。
【０２１８】
以下、本実施の形態３における挿入剤について説明する。
【０２１９】
本実施の形態３の挿入剤は、光照射により核酸プローブと共有結合する特徴をもつ物質を用いる。これにより、前記挿入剤は、前記核酸プローブと、強固に結合するため、この後の工程である洗浄工程の際に、核酸プローブに結合した挿入剤が解離することがない。
【０２２０】
また、本実施の形態３の挿入剤は、光照射により核酸プローブと共有結合する遺伝子サンプル結合部位が、挿入剤中に複数個存在する特徴をもつ。これにより、挿入剤が遺伝子サンプルと結合する割合が高くなる。
【０２２１】
さらに、本実施の形態３の挿入剤は、電気化学活性物質と結合するための置換基をもち、該挿入剤中には電気化学活性物質を含まない特徴をもつ。このように、挿入剤を、該挿入剤中に電気化学活性物質を含むことなく、該電気化学活性物質と結合する置換基をのみを備える構成とすることで、遺伝子サンプルと結合する挿入剤の量を大幅に改善することができる。
【０２２２】
また、前述したように本実施の形態３の挿入剤は、置換基を介して前記電気化学活性物質と結合する構成を有するので、前記電気化学活性物質の構成が、前記挿入剤と遺伝子サンプルとの結合に影響を及ぼさない、という効果もある。よって、挿入剤中に、電気化学活性物質と結合する置換基を複数個設けるようにすれば、すでに遺伝子サンプルと結合した挿入剤に前記電気化学活性物質を結合させる際、該挿入剤と電気化学活性物質との結合割合を高めることができ、遺伝子サンプルをより高い感度で検出することができる。
【０２２３】
以上のような特徴を有する本実施の形態３の挿入剤は、例えば、下記一般式（４）〜（６）で表すことができる。
【０２２４】
【化３５】
2006038686.tif 000084
【０２２５】
（但し、Ｉｂは光照射を行うことにより前記遺伝子サンプルと共有結合を形成できる遺伝子サンプル結合部位、Ｓａは前記電気化学活性物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｓａと前記Ｉｂとを連結する連結部位、Ｒ３は、水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉｂ、前記Ｓａまたはこれらの組み合わせからなる基である。）
【０２２６】
【化３６】
2006038686.tif 000085
【０２２７】
（但し、Ｉｂは光照射を行うことにより前記遺伝子サンプルと共有結合を形成できる遺伝子サンプル結合部位、Ｓａは前記電気化学活性物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｓａと前記Ｉｂとを連結する連結部位、Ｒ３及びＲ４は、水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉｂ、前記Ｓａまたはこれらの組み合わせからなる基である。）
【０２２８】
【化３７】
2006038686.tif 000086
【０２２９】
（但し、Ｉｂは光照射を行うことにより前記遺伝子サンプルと共有結合を形成できる遺伝子サンプル結合部位、Ｓａは前記電気化学活性物質と化学結合する置換基、Ｌａは前記Ｓａと前記Ｉｂとを連結する連結部位、Ｒ３及びＲ４は、水素、アルキル、アルコール、フェノール、カルボン酸、カルボン酸誘導体、スルホン酸、スルホン酸誘導体、スクシンイミド、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、ハロゲン化合物、前記Ｉｂ、前記Ｓａ、またはこれらの組み合わせからなる基である。）
【０２３０】
ここで、前述した一般式（４）〜（６）中に示される前記Ｌａは、アルキル基、アミド、エーテル、ケトン、エステル、あるいはこれらの組み合わせから構成される連結部位、もしくは、糖、リン酸、ピリジン、アミノ酸、メタクリル酸、アルコール、アミド、イソプレン、ウレタン、ウロン酸、エステル、エチレン、カーボネート、ビニル、スチレンなどの組み合わせからなる、天然高分子及び合成高分子で構成される連結部位である。なお、前記Ｌａは、単体でもよいが、天然高分子あるいは合成高分子であるほうが好ましい。これは、高分子のほうが、前記ＳａあるいはＩｂを多く結合させることができるためである。
【０２３１】
そして、前記Ｌａと、前記Ｓａあるいは前記Ｉｂとは、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、抗体−抗原結合などで結合している。
【０２３２】
また、前述した一般式（４）〜（６）中に示される前記Ｉｂは、光照射により遺伝子サンプルと共有結合できる物質であり、例えば、感光性をもつ挿入剤が挙げられる。
【０２３３】
そして、このような感光性をもつ挿入剤としては、例えば、フロクマリン誘導体が挙げられ、特に、ソラレン誘導体が好ましい。ソラレン誘導体は、長波長紫外線（３００〜４００ｎｍ）を１０ｍＷ／ｃｍ2で３０分間照射することにより、遺伝子サンプルと安定な共有結合を形成する。なお、前記ソラレン誘導体の具体的な例としては、ソラレン、メトキシソラレン、トリメチルソラレン等が挙げられる。
【０２３４】
このように、挿入剤として感光性のもの（例えば、ソラレン誘導体）を用いるようにすれば、可逆的に遺伝子サンプルと結合したソラレン誘導体部分が、光照射によって強固に且つ不可逆的に遺伝子サンプルと共有結合するようになり、一本鎖の核酸プローブとハイブリダイズさせた後の洗浄処理や、電気化学活性物質を添加した後の洗浄処理で、該遺伝子サンプルに結合させた挿入剤が解離することがなくなる。これにより、前記一本鎖の核酸プローブ及び電極表面に非特異吸着した前記挿入剤に対して、強い洗浄を行って除去することができるようになる。
【０２３５】
また、前述した一般式（４）〜（６）中に示される前記ｎの値は、電極上に固定された該核酸プローブの間隔や、遺伝子サンプル及び該核酸プローブの長さにより変わってくるが、前述したように１〜１００００個が望ましく、さらに、挿入剤中に前記Ｉｂが１〜１０００個含まれているものが好ましい。これは、前記ｎが１００００個以上になると、その部分が立体障害となり、ＤＮＡと結合しにくくなるためである。
【０２３６】
なお、前記一般式（４）〜（６）中の、ＩｂもしくはＳａは、全てのＬａと連結しなければならないわけではなく、例えば、ｎが２〜３個につき、１個のＩｂ若しくはＳａがＬａと連結している、というように、複数個のＬａにＩｂ及びＳａが１個連結するかたちでも良い。また、ｎが１の時は、Ｒ３及びＲ４は無くてもよい。
【０２３７】
さらに、本実施の形態３では、電気的に陽性である挿入剤を使用するのが望ましい。このように挿入剤として電気的に陽性である挿入剤を使用すれば、より一本鎖の遺伝子サンプルに結合できる。電気的に陽性である挿入剤は、側鎖に第４級アミンなどを付加させることで合成できる。
【０２３８】
以下、前述した本実施の形態３の挿入剤の具体例を、下記式（１８）〜（２０）に示す。ここでは、前記挿入剤の具体例として、電気的に陽性であるものを例に挙げる。
【０２３９】
【化３８】
2006038686.tif 000087
【０２４０】
【化３９】
2006038686.tif 000088
【０２４１】
【化４０】
2006038686.tif 000089
【０２４２】
なお、式（１９）中のｎは１〜１００００の整数であり、式（２０）中のｒ，ｓは、（ｒ+ｓ）／２が１〜１００００、且つｒ≧０，ｓ≧０の整数である。
【０２４３】
そしてこの後、前記挿入剤と結合させた遺伝子サンプルに対して、ＮＡＰ５カラムなどで、未結合の挿入剤を除去する洗浄処理を行う。なお、この洗浄処理については、後述するハイブリダイゼーション後の洗浄処理時において、前記未結合の挿入剤を十分除去することができるため、省略してもよい。
【０２４４】
（ステップ１３）そして、検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを生成し、電極に固定する。
【０２４５】
（ステップ１４）この後、前記電極上に固定した核酸プローブ上に、挿入剤が結合された遺伝子サンプルを滴下し、ハイブリダイズさせて、二本鎖核酸を形成し、リン酸バッファーなどで洗浄処理して、未反応の遺伝子サンプル、あるいは挿入剤を除去する。
【０２４６】
（ステップ１５）そして、前記洗浄処理がなされた二本鎖核酸に、電気化学活性物質を添加し、該二本鎖核酸中の遺伝子サンプルに結合した挿入剤と、前記電気化学活性物質とを、置換基を介して化学結合させる。
【０２４７】
（ステップ１６）結合後、界面活性剤などで洗浄した後、前記実地の形態１で記載したような手法で、前記電気化学活性物質を計測する。
【０２４８】
以上のように、本実施の形態３によれば、検出対象の遺伝子サンプルに挿入剤を結合させた後、該遺伝子サンプルと相補的な配列を有する核酸プローブと、該挿入剤が結合された遺伝子サンプルとをハイブリダイズして二本鎖核酸を形成し、該二本鎖核酸に挿入された挿入剤と、電気化学的に活性である電気化学活性物質とを置換基を介して化学結合させるようにしたので、電気化学活性物質の立体障害が解消し、二本鎖核酸への挿入剤の挿入量を大幅に改善することができる。またこれにより、電気化学活性物質を、複数連鎖させることも可能となり、遺伝子サンプルをさらに高感度に検出することができるだけでなく、電気化学活性物質が非特異吸着しやすい物質の場合、該挿入剤に、必要最小限の電気化学活性物質を添加すれば良いので、バックグラウンドを低下させることもできる。
【０２４９】
なお、本実施の形態３の遺伝子検出装置の構成については、前記実施の形態１あるいは実施の形態２と略同じである。ただし、本実施の形態３の場合、光照射して遺伝子サンプルと挿入剤とを可逆的、且つ強固に結合させた後、該挿入剤が結合した遺伝子サンプルと前記核酸プローブとで二本鎖核酸を形成し、該二本鎖核酸中の遺伝子サンプルと結合した挿入剤と電気化学活性物質とを結合させるものであるため、前記実施の形態１で説明した図１の装置では、前記挿入剤添加槽で、光照射により遺伝子サンプルと共有結合する挿入剤と該遺伝子サンプルと反応させ、前記二本鎖核酸形成槽で、前記挿入剤が結合された遺伝子サンプルと前記電極に固定化した核酸プローブとをハイブリダイズさせて二本鎖核酸を形成する構成にするようにし、また、前記実施の形態２で説明した図２の装置では、前記挿入剤タンクに、光照射により前記遺伝子サンプルと共有結合する挿入剤を保持し、前記処理槽において、前記遺伝子サンプルと前記挿入剤とを光照射により共有結合させ、前記遺伝子サンプルと未反応の挿入剤を前記挿入剤洗浄液で洗浄し、該挿入剤と結合した遺伝子サンプルと、前記固定化した核酸プローブとにより二本鎖核酸を形成させ、前記余分な遺伝子サンプル及びミスマッチの遺伝子サンプルを前記遺伝子サンプル洗浄液により除去させた後、前記遺伝子サンプルに結合した挿入剤に前記電気化学的に活性である物質を添加し、前記挿入剤と前記電気化学的に活性である物質とを化学結合させ、前記挿入剤と未反応の電気化学的に活性である物質を、前記電気化学活性物質洗浄液で洗浄し、前記遺伝子サンプルに結合した前記挿入剤に結合した前記電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出する構成にするようにする。
【実施例１】
【０２５０】
以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【０２５１】
（１）金電極表面への核酸プローブの固定化
ガラス基板上にスパッタ装置（アルバック製ＳＨ−３５０）によりチタン１０ｎｍを下地に金２００ｎｍを形成し、フォトリソグラフィ工程により電極パターンを形成することで、金電極を準備した。電極表面をピラニア溶液（過酸化水素：濃硫酸＝１：３）で１分間洗浄し、純水ですすいだ後、窒素ブローで乾燥させた。
【０２５２】
核酸プローブには、ヒト由来Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ−４５０の遺伝子配列の５’末端より６２９−６６８番目に位置するＣＣＣＣＣＴＧＧＡＴ  ＣＣＡＧＡＴＡＴＧＣ  ＡＡＴＡＡＴＴＴＴＣ  ＣＣＡＣＴＡＴＣＡＴの配列を有する、５’末端のリン酸基を介してチオール基を修飾した４０塩基のオリゴデオキシヌクレオチド（タカラバイオ製）を使用した。そして、該核酸プローブを１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４のリン酸ナトリウム緩衝液）に溶解させ、１０μＭに調整した。
【０２５３】
この調整した核酸プローブの溶液を前記金電極上に滴下し、飽和湿潤下、室温で４時間放置することで、チオール基と金とを結合させて、核酸プローブを金電極に固定した。
【０２５４】
（２）ハイブリダイゼーション
遺伝子サンプルには、前記核酸プローブと相補的な５’末端からＡＴＧＡＴＡＧＴＧＧ    ＧＡＡＡＡＴＴＡＴＴ  ＧＣＡＴＡＴＣＴＧＧ  ＡＴＣＣＡＧＧＧＧＧの配列を有する、４０塩基のオリゴデオキシヌクレオチド（タカラバイオ製）を使用した。そして、該遺伝子サンプルを、１０ｍＭのＰＢＳ及び２ＸＳＳＣを混合したハイブリダイゼーション溶液に溶解させ、２０μＭに調整した。
【０２５５】
この調整した、遺伝子サンプルが溶解したハイブリダイゼーション溶液を、前記核酸プローブを固定した金電極上に滴下し、６０℃の恒温槽内で１時間反応させ、二本鎖核酸を形成させた。これにより、二本鎖核酸が形成された金電極ｙを得た。
【０２５６】
さらに、本実施例１においては、比較対象として、二本鎖核酸が形成されていない金電極ｘを作成する。この二本鎖核酸が形成されない金電極ｘは、前記核酸プローブと非相補的な配列を有する遺伝子サンプル（以下、「比較遺伝子サンプル」と称す。）を使用して、前記二本鎖核酸が形成された金電極ｙを得る時と同様の処理をする。なお、ここでは、前記比較遺伝子サンプルとして、４０ｍｅｒのＰｏｌｙ−Ａ（タカラバイオ製）、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ  ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ  ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ  ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡの配列を有する遺伝子サンプルを使用した。
【０２５７】
（３）挿入剤の添加
挿入剤には、前述した式（１１）に示す挿入剤を使用した。
【０２５８】
前記挿入剤の合成は、以下手順により行うことができる。
【０２５９】
窒素雰囲気にした容器に、公知の方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１６，Ｎｏ６，１９７７）により合成した４’−クロロメチル−４，５，８−トリメチルソラレン（０．７ｇ、２．６ｍｍｏｌ）を加え、乾燥ジメチルホルムアミド２０ｍＬで溶解させた。
【０２６０】
次に、フタルイミドカリウム０．５６ｇ（３．０ｍｍｏｌ）を加え、３時間還流した。反応溶液は、クロロホルムから抽出した後、０．２Ｍ水酸化ナトリウム１００ｍＬで洗浄した。洗浄後、溶媒を留去し、ジエチルエーテル，クロロホルムで再結晶を行い、生成物Ａを得た（収率７７．５％）。
【０２６１】
生成物Ａ０．７９ｇ（２．０４ｍｍｏｌ）をエタノール３０ｍＬに溶解させた後、ヒドラジン一水和物０．４１ｍＬ（８．１６ｍｍｏｌ）を加え、３時間還流を行った。その後、蒸留水４０ｍＬ、塩酸８．１ｍＬ加え、さらに２時間加熱還流した。
【０２６２】
エタノールを留去し、１時間氷冷して析出した後、ろ過で生成物の塩酸塩を採取した。この生成物の塩酸塩をメタノールで溶解させ、１．０Ｍ水酸化ナトリウムを３ｍＬ加えた後、メタノールを留去した。クロロホルムで抽出し、溶媒を留去して生成物Ｂを得た（収率９２.６％）
【０２６３】
クロロホルム１５ｍＬに溶解した生成物Ｂ０．３０ｇ（１．２ｍｍｏｌ）に、トリエチルアミン０．５０ｍＬ（３．５ｍｍｏｌ）、グルタル酸無水物１．３３ｇ（１１．７ｍｍｏｌ）を加えて５時間室温で撹拌した。反応後、ろ過により式（１１）に示す挿入剤を得た（収率９３．６％）。
【０２６４】
表１は、前述のようにして得た式（１１）に示す挿入剤の1Ｈ−ＮＭＲ結果である。
【０２６５】
（表１）
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ  ｄ−６、Ｄ2Ｏ添加）
σ：
１．７６        （２Ｈ，ｍ）
２．１３        （４Ｈ，ｍ）
２．４１        （９Ｈ，ｍ）
４．２８        （２Ｈ，ｓ）
６．１７        （１Ｈ，ｓ）
７．５２        （１Ｈ，ｓ）
【０２６６】
このようにして得られた挿入剤をＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドによりカルボキシル基を活性化させた後、１０ｍＭのＰＢＳで１００μＭに調整した。この調整した溶液を、二本鎖核酸が形成された金電極ｙ、及び二本鎖核酸が形成されていない金電極ｘにそれぞれ１０μＬ添加し、３０分間４℃の冷蔵庫内で暗反応を行った。
【０２６７】
（４）二本鎖核酸と挿入剤との共有結合
３０分後、ＵＶクロスリンカー（フナコシ製ＵＶＰＣＬ１０００Ｌ型）を用いて波長３６５ｎｍ、５ｍＷ/ｃｍ2の紫外線を１５分間照射し、挿入剤と二本鎖核酸とを共有結合させた。共有結合後、金電極を１０ｍＭのＰＢＳで１０分間揺動洗浄し、未反応の挿入剤を取り除いた。
【０２６８】
（５）挿入剤と電気化学的に活性である物質との共有結合
電気化学的に活性である物質は、前述の式（１６）に示す挿入剤を使用した。
【０２６９】
ＴＨＦ６０．０ｍＬに溶解させた４，４‘−ジメチル−２，２’ビピリジン２．５０ｇ（１３.５ｍｍｏｌ）溶液を窒素雰囲気の容器に注入した後、リチウムジイソプロピルアミド２Ｍ溶液１６．９ｍＬ（２７.０ｍｍｏｌ）を滴下し、冷却しながら３０分撹拌した。
【０２７０】
一方、同様に窒素気流中で乾燥させた容器に、１，３−ジブロモプロパン４．２ｍＬ（４１.１ｍｍｏｌ）とＴＨＦ１０ｍＬを加え、冷却しながら撹拌させた。この容器に、先
【０２７１】
程の反応液をゆっくり滴下させて２．５時間反応させた。反応溶液は２Ｎの塩酸で中和し、ＴＨＦを留去した後、クロロホルムで抽出した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Ｃを得た（収率４７％）。
【０２７２】
窒素雰囲気の容器に生成物Ｃ１．０ｇ（３．２８ｍｍｏｌ），フタルイミドカリウム０．６７ｇ（３．６１ｍｍｏｌ）ジメチルホルムアミド（脱水）３０．０ｍＬを加え、オイルバスで１８時間還流した。反応後、クロロホルムで抽出し、０．２Ｎ水酸化ナトリウム５０ｍＬで蒸留水洗浄した。溶媒を留去して酢酸エチルとヘキサンから再結晶を行い、生成物Ｄを得た（収率６１・５％） 。
【０２７３】
塩化ルテニウム（ＩＩＩ）（２．９８ｇ、０．０１ｍｏｌ）、及び２，２‘−ビピリジン（３．４４ｇ、０．０２２ｍｏｌ）を、ジメチルホルムアミド（８０．０ｍＬ）中で６時間還流した後、溶媒を留去した。その後、アセトンを加え、一晩冷却することで得られた黒色沈殿物を採取し、エタノール水溶液１７０ｍＬ（エタノール：水＝１：１）を加え、１時間加熱還流を行った。ろ過後塩化リチウムを２０ｇ加え、エタノールを留去し、さらに一晩冷却した。析出した黒色物質は吸引ろ過で採取し、生成物Ｅを得た（収率６８．２％）。
【０２７４】
窒素置換した容器に、生成物Ｄ０．５０ｇ（１．３５ｍｍｏｌ）， 生成物Ｇ０．７８ｇ（１．６１ｍｍｏｌ），エタノール５０ｍＬを加えた。９時間窒素雰囲気で還流した後、溶媒を留去し、蒸留水で溶解させ、１．０Ｍの過塩素酸水溶液で沈殿させた。この沈殿物を採取し、メタノールで再結晶を行い、生成物Ｆを得た（収率８１.６％）。
【０２７５】
生成物Ｆ１．０ｇ（１．０２ｍｍｏｌ），メタノール７０．０ｍＬを１時間還流した。室温まで冷却した後、ヒドラジン一水和物０．２１ｍＬ（４．２１ｍｍｏｌ）を加え、再び１３時間還流した。反応後、蒸留水を１５ｍＬ加え、メタノールを留去した。
【０２７６】
次に、濃塩酸を５．０ｍＬ加え、２時間還流して得られた反応液を一晩冷蔵し、不純物を自然ろ過で除去した。炭酸水素ナトリウムで中和した後、水を留去し、無機物をアセトニトリルで除去した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Ｇを得た （収率７１．４％）。
【０２７７】
アルミホイルで遮光した容器に、生成物Ｇ０．６５ｇ（０．７６ｍｍｏｌ）を加え、アセトニトリル１０ｍＬに溶解させた。
【０２７８】
次に、アセトニトリル５ｍＬに溶解させたトリエチルアミン０．２３ｇ（２．２９ｍｍｏｌ）を加えた後、アセトニトリル１０ｍＬに溶解したグルタル酸無水物０．８７ｇ（７．６２ｍｍｏｌ）を滴下した。９時間室温で撹拌させた後、溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、下記に示す式（２１）を得た（収率２８．５％）
【０２７９】
【化４１】
2006038686.tif 000090
【０２８０】
表２は、前述のようにして得た式（２１）で示される物質の1Ｈ−ＮＭＲ結果である。
【０２８１】
（表２）
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ  ｄ−６）
σ：
１．４６      （２Ｈ，ｍ）
１．６９      （４Ｈ，ｍ）
２．１０      （４Ｈ，ｍ）
２．５４      （３Ｈ，ｓ）
２．８１      （２Ｈ，ｔ）
３．０８      （２Ｈ，ｍ）
７．４１      （２Ｈ，ｔ）
７．５７      （６Ｈ，ｍ）
７．７７      （４Ｈ，ｍ）
８．１９      （１Ｈ，ｔ）
８．７９      （４Ｈ，ｔ）
８．８８      （６Ｈ，ｍ）
【０２８２】
前記式（２１）に示される物質８３ｍｇを、蒸留水５ｍＬに溶解させ、ＷＳＣ０．８２ｇ（４．２８ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド５０ｍｇ（０.４３ｍｍｏｌ）を加えた。この水溶液に、ポリ−Ｌ−リジン塩酸塩（分子量５０００〜１５０００）１０ｍｇを添加し、３日間、室温で撹拌させた。この反応液にアセトンを６０ｍＬ加えて、生成物を析出させた。その後、遠心分離機により生成物を沈殿させ、アセトニトリルで３回洗浄することにより、電気化学的に活性である物質を採取した。
【０２８３】
このようにして得られた、電気化学的に活性である物質を、平均分子量１００００として、１０ｍＭＰＢＳで１０μＭに調製した。この溶液１０μＬを電極に滴下し、３０分間静置させて、挿入剤と化学結合させた後、界面活性剤を含む洗浄液で未反応物を除去した。
【０２８４】
（５）電気化学測定
以上の工程の後、二本鎖核酸が形成されていない電極ｘ、及び二本鎖核酸が形成された電極ｙのそれぞれに、０．１ＭのＰＢＳ、及び０．１Ｍのトリエチルアミンを混合した電解液を８０μＬ滴下した。その後、それぞれの電極ｘ，ｙに電圧を印加し、この時に生じた挿入剤由来の電気化学発光の測定を行った。なお、電圧の印加は、０Ｖから１．３Ｖまで走査し、３秒間電気化学測定を行った。
【０２８５】
電気化学発光量の測定は、光電子増倍管（浜松ホトニクス製Ｈ７３６０−０１）を用いて行い、電圧走査中における最大発光量を測定した。
【０２８６】
図３は、本実施例１における、二本鎖核酸が形成されていない電極ｘ、及び二本鎖核酸が形成された電極ｙにおいて検出された最大電気化学発光量を示したものである。
【０２８７】
図３から明らかなように、二本鎖核酸が形成された電極ｙでの最大電気化学発光量は、二本鎖核酸が形成されていない電極ｘでの最大電気化学発光量と比較して著しく高い値となっており、本実施例１の挿入剤を用いれば、高感度に二本鎖核酸の検出が可能であることが分かる。
【実施例２】
【０２８８】
（１）金電極表面への核酸プローブの固定化
前記実施例１と同様な手法で核酸プローブを固定した。
【０２８９】
（２）挿入剤と遺伝子サンプルとの共有結合
遺伝子サンプルには、前記核酸プローブと相補的な５’末端からＡＴＧＡＴＡＧＴＧＧ  ＧＡＡＡＡＴＴＡＴＴ  ＧＣＡＴＡＴＣＴＧＧ  ＡＴＣＣＡＧＧＧＧＧの配列を有するオリゴデオキシヌクレオチド（タカラバイオ製）を使用し、挿入剤には、前述した式（１４）に示されるものを使用した。挿入剤の合成は、以下の手順により得ることができる。
【０２９０】
窒素雰囲気にした容器に、公知の方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１６，Ｎｏ６，１９７７）により合成した４’−クロロメチル−４，５，８−トリメチルソラレン（０．７ｇ、２．６ｍｍｏｌ）を加え、乾燥ジメチルホルムアミド２０ｍＬで溶解させた。
【０２９１】
次に、テトラメチル１，４−ジアミノブタン０．９４ｇ（６．５ｍｍｏｌ）を加え、５時間還流した。反応溶液は、クロロホルムから抽出した後、シリカゲルカラムで精製して生成物Ｊを得た（収率５６．８％）。
【０２９２】
窒素雰囲気にした容器に、生成物Ｊ０．４８ｇ（１．１８ｍｍｏｌ）、乾燥ジメチルホルムアミド２０ｍＬ、３−クロロプロピオン酸０．２８ｇ（２．５８ｍｍｏｌ）を添加し、６時間１２０℃前後で反応させた。その後、クロロホルムで抽出し、溶媒を留去して、式（１４）に示す挿入剤を得た（収率７８．５％）。
【０２９３】
表３は、前述のようにして得た式（１４）に示す挿入剤の1Ｈ−ＮＭＲ結果である。
【０２９４】
（表３）
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ  ｄ−６）
σ：
１．６９          （４Ｈ，ｍ）
２．０１          （３Ｈ，ｓ）
２．４７          （３Ｈ，ｓ）
２．５７          （１２Ｈ，ｓ）
２．６３〜２．６６（９Ｈ，ｍ）
２．９３          （２Ｈ，ｔ）
３．９２          （２Ｈ，ｓ）
６．２０          （１Ｈ，ｓ）
７．６１          （１Ｈ，ｓ）
【０２９５】
このようにして得られた式（１４）に示す挿入剤７２ｍｇ（０．１４ｍｍｏｌ）を、２ｍＬＤＭＳＯに溶解させ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド７８ｍｇ（０．６８ｍｍｏｌ）、ＷＳＣ２７８ｍｇ（１．４５ｍｍｏｌ）を加えて一晩室温で撹拌させることにより、該挿入剤のカルボキシル基を活性化させた。この挿入剤を１０ｍＭのＰＢＳで１００μＭに調整した。
【０２９６】
次に、遺伝子サンプルを１０ｍＭのＰＢＳで２０μＭに調製した溶液４０μＬに、前述の挿入剤を５０μＬ添加し、ＵＶランプ（ＵＶＰ製Ｂ−１００ＡＰ型）を用いて波長３６５ｎｍ、１５ｍＷ/ｃｍ2の紫外線を氷冷しながら４０分間照射し、挿入剤と遺伝子サンプルとを共有結合させた。
【０２９７】
（３）ハイブリダイゼーション
前記挿入剤が結合した遺伝子サンプルに、２０ＸＳＳＣを１０μＬ滴下し、２ＸＳＳＣ溶液に調製した。
【０２９８】
この調整した、遺伝子サンプルが溶解したハイブリダイゼーション溶液を、前記核酸プローブを固定した金電極上に１０μＬ滴下し、６０℃の恒温槽内で１時間反応させ、二本鎖核酸を形成させた。これにより、二本鎖核酸が形成された金電極ｙを得た。
【０２９９】
さらに、本実施例においては、比較対象として、二本鎖核酸が形成されていない金電極ｘを作成する。この二本鎖核酸が形成されない金電極ｘは、前記核酸プローブと非相補的な配列を有する遺伝子サンプル（以下、「比較遺伝子サンプル」と称す。）を使用して、前記二本鎖核酸が形成された金電極ｙを得る時と同様の処理をする。なお、ここでは、前記比較遺伝子サンプルとして、４０ｍｅｒのＰｏｌｙ−Ａ（タカラバイオ製）、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ  ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ  ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ  ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡの配列を有する遺伝子サンプルを使用した。
【０３００】
（４）挿入剤と電気化学的に活性である物質の共有結合
電気化学的に活性である物質は、前述した式（１６）に示す物質を使用した。
【０３０１】
これは、前記実施例１に記述した電気化学的に活性である物質を合成する過程で生成する生成物Ｇと同様であるので、説明は省略する。
【０３０２】
この電気化学的に活性である物質を、１０ｍＭＰＢＳで５μＭに調製した。この溶液１０μＬを電極に滴下し、数回ピペッティングした後、３０分間静置させて、挿入剤と化学結合させ、その後、界面活性剤を含む洗浄液で未反応物を除去した。
【０３０３】
（５）電気化学測定
以上の工程の後、二本鎖核酸が形成されていない電極ｘ、及び二本鎖核酸が形成された電極ｙのそれぞれに、０.１ＭのＰＢＳおよび０．１Ｍのトリエチルアミンを混合した電解液を８０μＬ滴下した。その後、それぞれの電極ｘ，ｙに電圧を印加し、この時に生じた挿入剤由来の電気化学発光の測定を行った。なお、電圧の印加は、０Ｖから１．３Ｖまで走査し、３秒間電気化学測定を行った。
【０３０４】
電気化学発光量の測定は、光電子増倍管（浜松ホトニクス製Ｈ７３６０−０１）を用いて行い、電圧走査中における最大発光量を測定した。
【０３０５】
図４は、本実施例２における、二本鎖核酸が形成されていない電極ｘ、及び二本鎖核酸が形成された電極ｙにおいて検出された最大電気化学発光量を示したものである。
【０３０６】
図４から明らかなように、二本鎖核酸が形成された電極ｙでの最大電気化学発光量は、二本鎖核酸が形成されていない電極ｘでの最大電気化学発光量と比較して著しく高い値となっており、本実施例の挿入剤を用いれば、高感度に二本鎖核酸の検出が可能であることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０３０７】
本発明にかかる遺伝子検出方法は、特定の配列を有する遺伝子を高感度に検出することができ、遺伝子診断、感染症診断、ゲノム創薬等の用途に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【０３０８】
【図１】図１は、本発明の実施の形態１における遺伝子検出装置の構成を示す図である。
【図２】図２は、本発明の実施の形態２における遺伝子検出装置の構成を示す図である。
【図３】図３は、本発明の実施例１の工程により得られた、二本鎖核酸が形成されていない電極ｘ、及び二本鎖核酸が形成された電極ｙそれぞれにおいて検出された最大電気化学発光量を示す図である。
【図４】図４は、本発明の実施例２の工程により得られた、二本鎖核酸が形成されていない電極ｘ、及び二本鎖核酸が形成された電極ｙそれぞれにおいて検出された最大電気化学発光量を示す図である。
【符号の説明】
【０３０９】
１  遺伝子サンプル作製部
２  電極
３  二本鎖核酸形成反応槽
４，１０，１６  温度コントローラ
５，２５  電極移動部
５ａ  電極保持アーム
５ｂ  アーム駆動部
６  遺伝子サンプル洗浄液タンク
７  遺伝子サンプル洗浄槽
８  挿入剤タンク
９  挿入剤反応槽
１１  ＵＶランプ
１２  挿入剤洗浄液タンク
１３  挿入剤洗浄槽
１４  電気化学活性物質溶液タンク
１５  電気化学活性物質反応槽
１７  電気化学活性物質洗浄液タンク
１８  電気化学活性物質洗浄槽
１９  電解液タンク
２０  検出槽
２１  フォトマル
２２  ポテンショスタット
２３  制御部
２４  処理槽
２５  電極移動部
２６  廃液タンク
１００，２００  遺伝子検出装置
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2006038686.tif 000091
【図２】
2006038686.tif 000092
【図３】
2006038686.tif 000093
【図４】
2006038686.tif 000094
【国際調査報告】
2006038686.tif 000095
2006038686.tif 000096
2006038686.tif 000097
2006038686.tif 000098