(57)【要約】  本発明は、拡張型心筋症の一因であるβ１アドレノセプターに対する抗体を選択的に吸着するペプチドを提供する。本発明のペプチドは、副反応が少なく短時間で担体に固定化することができ、β１アドレノセプターに対する抗体の吸着材を効率よく製造することができる。また、本発明は、当該ペプチドを担体に固定化した吸着材、当該吸着材を用いた吸着装置、ならびにβ１アドレノセプターに対する抗体の吸着方法を提供する。本発明の吸着材、吸着装置は、β１アドレノセプターに対する抗体を含む液体、特に体液から、当該抗体を効率的に吸着除去することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式(I)のアミノ酸配列を含むペプチド：
x00−x01−x02−x03−x04−x05−x06−x07−x08−x09−x10−x11−x12−x13       (I)
（式中、
x00＝Cys、Cys誘導体、アセチル基または欠失；
x01＝Asp、Glu、Thr、または欠失；
x02＝Trp、Tyr、またはThr；
x03＝Gly；
x04＝Thr、またはSer：
x05＝Leu、またはPhe；
x06＝Val、またはPhe；
x07＝Thr；
x08＝Gly、Asp、またはGlu、；
x09＝Phe、またはLeu；
x10＝Trp；
x11＝Glu、Gln、Thr、またはLeu：
x12＝Tyr、Thr、またはSer；
x13＝Cys、またはCys誘導体または欠失、を表す。ただし、x00又はX13のうち、一方はCys又はCys誘導体であり、他方は欠失である。）
【請求項２】
下記式(II)のアミノ酸配列を含むペプチド：
y00−y01−y02−y03−y04−y05−y06−y07−y08−y09−y10−y11−y12−y13−y14
−y15−y16−y17−y18−y19−y20            (II)
（式中、
y00＝Ｃys、Ｃys誘導体または欠失；
y01＝His、Glu、またはGln；
y02＝Trp；
y03＝His、Phe、Tyr、またはTrp：
y04＝Arg；
y05＝Ala、またはVal；
y06＝Gly、Thr、Glu、Ser、Asp、またはAsn；
y07＝Ser、His、またはAla；
y08＝Asp、Asn、Gln、またはGlu；
y09＝Gly、Ala、または欠失；
y10＝Glu；
y11＝Ala；
y12＝Arg；
y13＝Asp、Asn、またはArg；
y14＝Ala、；
y15＝His、Phe、Trp、またはTyr；
y16＝Ala、Asp、Asn、またはSer；
y17＝Asp、またはAsn；
y18＝Glu、またはPro；
y19＝Arg、Lys、またはThr；
y20＝Cys、Cys誘導体、または欠失、表す。ただし、ｙ00またはｙ20のうち、一方はCys又はCys誘導体であり、他方は欠失である。）
【請求項３】
下記式(III)のアミノ酸配列を含むペプチド：
z00−z01−z02−z03−z04−z05−z06−z07−z08−z09−z10−z11−z12−z13−z14−z15−z16−z17−z18         (III)
（式中、
z00＝Cys、Cys誘導体または欠失
z01＝Ala；
z02＝Arg；
z03＝Arg、Asp、またはAsn；
z04＝Ser、Ala、Thr、またはMet；
z05＝Tyr、His、Phe、またはTrp；
z06＝Asn、Ala、Asp、またはSer；
z07＝Asp、またはAsn；
z08＝Pro、またはGlu；
z09＝Lys、Thr、またはArg；
z10＝Ser、Ala、Thr、またはMet；
z11＝Ser、Thr、Ala、またはMet；
z12＝Asp、またはAsn；
z13＝Phe、Leu、またはVal；
z14＝Val、またはLeu；
z15＝Thr、またはSer；
z16＝Ser、Asp、Ala、またはAsn；
z17＝Arg、Asp、またはAsn；
z18＝Cys、Cys誘導体または欠失、を表す。ただし、ｚ00またはｚ18のうち、一方はCys又はCys誘導体であり、他方は欠失である。）
【請求項４】
請求項１のペプチド、請求項２のペプチドおよび請求項３のペプチドからなる群より選択される少なくとも１種以上のペプチドを担体に固定した、β１アドレノセプターに対する抗体の吸着材。
【請求項５】
請求項１のペプチドおよび請求項２のペプチドを担体に固定した、β１アドレノセプターに対する抗体の吸着材。
【請求項６】
請求項１のペプチドおよび請求項３のペプチドを担体に固定した、β１アドレノセプターに対する抗体の吸着材。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれかに記載の吸着材が、β１アドレノセプターに対する抗体を含む液体の入口および出口を有する容器内に含まれ、そして該吸着材の容器外への流出防止手段が該容器に備えられている、β１アドレノセプターに対する抗体の吸着装置。
【請求項８】
請求項４〜６のいずれかに記載の吸着材と、β１アドレノセプターに対する抗体を含有する液体とを接触させる工程を包含する、β１アドレノセプターに対する抗体の吸着方法。
【請求項９】
前記β１アドレノセプターに対する抗体を含有する液体が体液である、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体液（例えば血液、血漿、リンパ液など）等の液体中に存在するβ１アドレノセプターに対する抗体を選択的に吸着するペプチド、当該ペプチドを担体に固定したβ１アドレノセプターに対する抗体の吸着材、この吸着材を用いた吸着装置、ならびにβ１アドレノセプターに対する抗体の吸着方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
拡張型心筋症（ＤＣＭ）は心室の筋肉の収縮が極めて悪くなり、心臓が拡張してしまう疾患で肥大型心筋症に比べると極めて予後が悪い。我が国では診断されてから５年生存している人は約５０％とされている。拡張型心筋症の治療は、心臓移植が根治療法として望まれるが待機数に対して提供数が不足しており、心不全に対する対症療法が主体となっている。また、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、β遮断薬の投与により心機能や予後が改善する症例が報告されているが、まだ、有効な治療薬、治療法が望まれていることに変化はない。【０００３】
松井らはβ１アドレノセプターの２番目ループにCysを付加したペプチド：His Trp TrpArg Ala Glu Ser Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro Lys Cys Cys Asp PheVal Thr Asn Arg Cys、又はＭ２ムスカリンレセプターの２番目ループにCysを付加したペプチド：Val Arg Thr Val Glu Asp Gly Glu Cys Tyr Ile Gln Phe Phe Ser Asn Ala Ala Val Thr Phe Gly Thr Ala Ile Cys をウサギに投与すると投与ペプチドに対する抗体が出現し、9ヶ月後に死亡したウサギの心臓には拡張型心筋症の所見が見られることを報告しており、これら抗体が拡張型心筋症の病因として作用していることが示唆されている（非特許文献１）。【０００４】
荻野らはβ１アドレノセプターに対する抗体及び／又はＭ２ムスカリンレセプターに対する抗体に対して吸着活性を有する吸着材を報告している（特許文献１）。また、ＤＣＭを引き起こす自己抗体と結合しうるペプチドが報告されている（特許文献２）。
【特許文献１】特開２００１−２８６５５４
【特許文献２】特表２００３−５１４７７２
【特許文献３】特表２００２−５０４８３１
【非特許文献１】Jpn. Heart J., 1998, 39(3), 261-74
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、従来のペプチドは、担体上へ固定化する反応の時間が長い点で問題がある。また、従来のペプチドは、その長さによっては合成における収率の点で問題がある。ペプチド中のアミノ酸残基によってはペプチドの合成における副反応が多い。本発明は、かかる現状に鑑み、ペプチドの担体上への固定化が容易であり、ペプチド固定化において副反応が少なく、また、体液（例えば血液、血漿、リンパ液など）等の液体中に存在するβ１アドレノセプターに対する抗体を効率よく選択的に吸着できるペプチドを提供するものである。また本発明は、当該ペプチドを担体に固定化した吸着材及びこの吸着材を用いた吸着装置、ならびにβ１アドレノセプターに対する抗体の吸着方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を達成せんとして、鋭意研究を進めてきた。驚くべきことに、本発明のペプチドによって、上記課題が達成されることを見出した。また、本発明の吸着材によって上記課題が達成されることを見出した。【０００７】
即ち、本発明は、β１アドレノセプターに対する抗体に対して高い吸着活性を有するペプチド及び前記のペプチドを担体に固定した吸着材を提供するものである。また、前記吸着材を有する吸着装置、並びに、前記吸着材を用いたβ１アドレノセプターに対する抗体の吸着方法を提供するものである。【０００８】
具体的には、本発明が提供するのは以下の通りである：
[１]  下記式(I)のアミノ酸配列を含むペプチド：
x00−x01−x02−x03−x04−x05−x06−x07−x08−x09−x10−x11−x12−x13       (I)
（式中、
x00＝Cys、Cys誘導体、アセチル基または欠失；
x01＝Asp、Glu、Thr、または欠失；
x02＝Trp、Tyr、またはThr；
x03＝Gly；
x04＝Thr、またはSer：
x05＝Leu、またはPhe；
x06＝Val、またはPhe；
x07＝Thr；
x08＝Gly、Asp、またはGlu、；
x09＝Phe、またはLeu；
x10＝Trp；
x11＝Glu、Gln、Thr、またはLeu：
x12＝Tyr、Thr、またはSer；
x13＝Cys、またはCys誘導体または欠失、を表す。ただし、x00又はX13のうち、一方はCys又はCys誘導体であり、他方は欠失である。）【０００９】
[２]  下記式(II)のアミノ酸配列を含むペプチド：
y00−y01−y02−y03−y04−y05−y06−y07−y08−y09−y10−y11−y12−y13−y14
−y15−y16−y17−y18−y19−y20            (II)
（式中、
y00＝Ｃys、Ｃys誘導体または欠失；
y01＝His、Glu、またはGln；
y02＝Trp；
y03＝His、Phe、Tyr、またはTrp：
y04＝Arg；
y05＝Ala、またはVal；
y06＝Gly、Thr、Glu、Ser、Asp、またはAsn；
y07＝Ser、His、またはAla；
y08＝Asp、Asn、Gln、またはGlu；
y09＝Gly、Ala、または欠失；
y10＝Glu；
y11＝Ala；
y12＝Arg；
y13＝Asp、Asn、またはArg；
y14＝Ala、；
y15＝His、Phe、Trp、またはTyr；
y16＝Ala、Asp、Asn、またはSer；
y17＝Asp、またはAsn；
y18＝Glu、またはPro；
y19＝Arg、Lys、またはThr；
y20＝Cys、Cys誘導体、または欠失、表す。ただし、ｙ00またはｙ20のうち、一方はCys又はCys誘導体であり、他方は欠失である。）【００１０】
[３]  下記式(III)のアミノ酸配列を含むペプチド：
z00−z01−z02−z03−z04−z05−z06−z07−z08−z09−z10−z11−z12−z13−z14−z15−z16−z17−z18         (III)
（式中、
z00＝Cys、Cys誘導体または欠失
z01＝Ala；
z02＝Arg；
z03＝Arg、Asp、またはAsn；
z04＝Ser、Ala、Thr、またはMet；
z05＝Tyr、His、Phe、またはTrp；
z06＝Asn、Ala、Asp、またはSer；
z07＝Asp、またはAsn；
z08＝Pro、またはGlu；
z09＝Lys、Thr、またはArg；
z10＝Ser、Ala、Thr、またはMet；
z11＝Ser、Thr、Ala、またはMet；
z12＝Asp、またはAsn；
z13＝Phe、Leu、またはVal；
z14＝Val、またはLeu；
z15＝Thr、またはSer；
z16＝Ser、Asp、Ala、またはAsn；
z17＝Arg、Asp、またはAsn；
z18＝Cys、Cys誘導体または欠失、を表す。ただし、ｚ00またはｚ18のうち、一方はCys又はCys誘導体であり、他方は欠失である。）【００１１】
[４]  [１]のペプチド、[２]のペプチドおよび[３]のペプチドからなる群より選択される少なくとも１種以上のペプチドを担体に固定した、β１アドレノセプターに対する抗体の吸着材。【００１２】
[５]  [１]のペプチドおよび[２]のペプチドを担体に固定した、β１アドレノセプターに対する抗体の吸着材。【００１３】
[６]  [１]のペプチドおよび[３]のペプチドを担体に固定した、β１アドレノセプターに対する抗体の吸着材。【００１４】
[７]  [４]〜[６]のいずれかに記載の吸着材が、β１アドレノセプターに対する抗体を含む液体の入口および出口を有する容器内に含まれ、そして該吸着材の容器外への流出防止手段が備えられている、β１アドレノセプターに対する抗体の吸着装置。【００１５】
[８]  [４]〜[６]のいずれかに記載の吸着材と、β１アドレノセプターに対する抗体を含有する液体とを接触させる工程を包含する、β１アドレノセプターに対する抗体の吸着方法。【００１６】
[９]  前記β１アドレノセプターに対する抗体を含有する液体が体液である、[７]に記載の方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のペプチドはβ１アドレノセプターに対する抗体を選択的に吸着することができ、当該ペプチドを担体に固定化した本発明の吸着材は、β１アドレノセプターに対する抗体を含む溶液から、該抗体を効率よく吸着除去できる。また、本発明のペプチドは、担体への固定化に際し、反応時間を短縮し副反応を低減することができ、β１アドレノセプターに対する抗体の吸着材を効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、3種類のゲルを用いて流速と圧力損失との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明のβ１アドレノセプターに対する抗体対する抗体の吸着装置の一例の概略断面図である。
【符号の説明】
【００１９】
１  液体の流入口
２  液体の流出口
３  β１アドレノセプターに対する抗体に対する抗体の吸着材
４，５  液体および液体に含まれる成分は通過できるが前記β１アドレノセプターに対する抗体に対する抗体の吸着材は通過できないフィルター
６  カラム
７  吸着器
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下に本発明の実施形態を説明するが、本発明は以下の説明に限定されるものではない。本発明のペプチドは、β１アドレノセプターに対する抗体中の抗原認識部分（すなわちFab）に特異的に結合し得る。好ましくは、該ペプチドは、拡張型心筋症に罹患している患者の該抗体に特異的に結合し得る。ここにいう特異的に結合するとは、成書（アフィニティークロマトグラフィー、笠井献一著、東京化学同人）に述べられているとおり、特定の物質を見分けて結合することであり、よく似た物質があっても結合しない現象である。特異的に結合しているか否かは抗原抗体反応の場合、解離定数（Kd）が少なくとも1.0E-05M以下であることによって判断される。【００２１】
本明細書にいうβ１アドレノセプターとは、ヒト心筋細胞の細胞膜外に出ている３種類のペプチドのうち２種のペプチドを意味する。その配列はTrp Gly Arg Trp Glu Tyr Gly Ser Phe Phe Cys Glu Leu（配列番号４）及び、His Trp Trp Arg Ala Glu Ser Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro Lys Cys Cys Asp Phe Val Thr Asn Arg（配列番号５）である（J. Mol. Cell Cardiol., 27, 397-406 (1995)参照）。【００２２】
本発明のペプチドは、前記式(I)、(II)または(III)で表されるペプチドであり、ペプチドのカルボキシル基末端またはアミノ基末端のどちらか一方のみにCys又はCys誘導体を有することを特徴とする。なかでも、カルボキシル基末端にのみCys又はCys誘導体を有するペプチドがより好ましい。【００２３】
本明細書における「誘導体」は、ある化合物に小部分の構造上の変化があってできる化合物を意味する。化合物中の水素原子あるいは特定の原子団が、他の原子あるいは原子団によって置換された化合物は、該化合物の誘導体であると理解される。ここで言うCys誘導体は、システインのいずれかの官能基、例えばアミノ基またはカルボキシル基が、他の官能基で置換されている化合物を表す。アミノ基の場合、例えば、水酸基、チオール基、アセチル基、エポキシ基、グリシジル基、カルボキシル基、アジド基、アミド基、スルホン酸基およびビオチン基から選ばれる少なくとも１種以上で独立的に置換され得る。カルボキシル基の場合、例えば、チオール基、アセチル基、エポキシ基、グリシジル基、アミノ基、アジド基、アミド基、スルホン酸基およびビオチン基から選ばれる少なくとも１種以上で独立的に置換され得る。特に好ましいのは、無置換のシステインである。【００２４】
前記式(I)で表されるペプチドの好適な一例としては、アミノ酸配列Glu Tyr Gly Ser Phe Phe Thr Glu Leu Trp Thr Ser Cys（配列番号１）を含むペプチドが挙げられる。より好ましくは、上記配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドである。ペプチド合成のために、アミノ基末端のGluのアミノ基はアセチル基で置換されるのが好ましい。【００２５】
前記式(II)で表されるペプチドの好適な一例としては、アミノ酸配列His Trp Trp Arg Ala Glu Ser Asp Glu Ala Arg Arg Ala Tyr Asn Asp Pro Lys Cys（配列番号２）を含むペプチドが挙げられる。より好ましくは、上記配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチドである。【００２６】
前記式(III)で表されるペプチドの好適な一例としては、アミノ酸配列 Ala Arg Arg Ala Tyr Asn Asp Pro Lys Ala Ala Asp Phe Val Thr Asn Arg Cys（配列番号３）を含むペプチドが挙げられる。より好ましくは、上記配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるペプチドである。【００２７】
なお、その機能に影響を及ぼすことなく、ペプチド中のアミノ酸位置を、保存的な手法で交換することが可能なことは、当業者には周知である。本発明の場合、「保存的」交換とは、以下のグループにおいて、グループ内のアミノ酸同士の交換を意味するものである。
グループＩ：Leu、Ile、Val、Met、His、Trp、Tyr、Phe、
グループII：Glu、Gln、Asp、Asn、
グループIII：Ser、Thr、Cys、Gly、Ala、Pro、
グループIV：Lys、Arg
上記ペプチドまたはその誘導体は、自体公知方法にしたがって製造できる。化学的方法として、例えばＦｍｏｃ法またはＢｏｃ法を使用しうる。あるいは、生物学的方法、例えば組み換え体生物例えば微生物を使用し、組み換え体ペプチドまたはその誘導体またはタンパク質を発現させてもよい。【００２８】
本発明においては、上記の本発明のペプチドを担体に固定するにより、β１アドレノセプターに対する抗体を効率よく吸着する、吸着材を得ることができる。担体には上記ペプチド１種だけを固定してもよいが、２種以上を固定するのが好ましい。２種以上のペプチドを固定するとβ１アドレノセプターに対する抗体を含む溶液から一度に２種類以上の抗体を吸着することができる。なかでも、前記式(I)で表されるペプチド及び前記式(II)で表されるペプチドを固定化する、若しくは、前記式(I)で表されるペプチド及び前記式(III)で表されるペプチドを固定化するのが好ましい。【００２９】
本発明に用いる担体は、任意の固体担体を使用できる。担体は、液体と接触させるための吸着材として使用する観点から、水不溶性であるのが好ましい。水不溶性とは、水に溶解しないものをいう。ここにいう固体担体は、常温常圧で固体であるものをいう。具体的には、本発明に用いる担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、ポリビニルアルコール、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリスチレンなどの合成高分子あるいは架橋された合成高分子や結晶性セルロース、セルロース、アガロース、デキストランなどの多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機−有機、あるいは有機−無機などの複合担体などが挙げられる。中でも親水性担体は非特異吸着が比較的少なく、β１アドレノセプターに対する抗体の吸着選択性が良好であるため好ましい。ここでいう親水性担体とは、担体を構成する化合物を平板状にしたときの水との接触角が６０度以下の担体を示す。この様な担体としてはセルロース、キトサン、デキストラン等の多糖類、ポリビニルアルコール、エチレン−酢酸ビニル共重合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸グラフト化ポリエチレン、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレン、ガラスなどからなる担体が代表例として挙げられる。前記ペプチドを固定するための官能基、とりわけエポキシ基の導入が容易な点でセルロース、ポリビニルアルコールが好ましい。【００３０】
本発明に用いる担体としては硬質担体、軟質担体のいずれも用いることができるが、体外循環治療用の吸着材として使用するためには、カラムに充填し、通液する際などに目詰まりを生じないことが重要である。そのために充分な機械的強度が要求される。従って、本発明に用いる担体は硬質担体であることがより好ましい。本明細書中では、硬質担体とは、例えば粒状ゲルの場合、以下の条件でゲルをガラス製円筒状カラム(内径９ｍｍ、カラム長１５０ｍｍ)に均一に充填し、水性流体を流した際の圧力損失ΔPと流量の関係が０．３ｋｇ／ｃｍ2まで直線関係にあるものをいう。【００３１】
例えば、両端に孔径１５μｍのフィルターを装着したガラス製円筒状カラム（内径９ｍｍ、カラム長１５０ｍｍ）にアガロースゲル（Bio-Rad社製のBiogel-A5m、粒径５０〜１００メッシュ）、ビニル系ポリマーゲル（東洋曹達工業（株）製のトヨパールHW-65、粒径５０〜１００μｍ）およびセルロースゲル（チッソ（株）製のセルロファインGC-700m、粒径４５〜１０５μｍ）をそれぞれ均一に充填し、ペリスタティックポンプにより水を流し、流量と圧力損失△Pとの関係を求めた（図１）。縦軸に流速（ｃｍ／分）を横軸に圧力損失（ｋｇ／ｃｍ2）をプロットした。この図から明らかなように硬質担体であるトヨパールHW-65、セルロファインGC-700mは、圧力損失△Pと流量の関係が０．３ｋｇ／ｃｍ2まで直線関係にあるのに対し、Biogel-A5m用は圧密化を引き起こし、圧力を増加させても流量が増加しないことがわかる。【００３２】
上述の担体はそれぞれ単独で用いてもよいし、任意の２種類以上を混合してもよい。又、本発明に用いる担体としては、本吸着材の使用目的および方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する、すなわち、多孔質であることが好ましい。【００３３】
β１アドレノセプターに対する抗体は、その分子量が１４万以上１００万以下の分子である。本発明の吸着材で抗体分子をより効率良く吸着する為には、多孔質担体の排除限界分子量が抗体分子の直径よりも大きいことが好ましい。具体的には、排除分子量が１５万以上、２０万以上、３０万以上、４０万以上、５０万以上、６０万以上、７０万以上、８０万以上、９０万以上が好ましく、特に好ましくは１００万以上である。上限は、担体の強度の観点から、通常１０００万以下、好ましくは５００万以下である。【００３４】
排除限界分子量とは、成書（サイズ排除クロマトグラフィー、森定雄著、共立出版）に述べられているとおり、サイズ排除クロマトグラフィーにおいて種々の分子量を有する試料を流した際に、担体の細孔内に侵入できない（排除される）分子の内、最も小さい分子量をもつものの分子量をいう。【００３５】
次に、担体の多孔構造については、吸着材の単位体積あたりの吸着能から考えて、表面多孔性よりも全多孔性が好ましく、空孔容積が２０％以上であり、比表面積が３ｍ2／ｇ以上であることが好ましい。全多孔性とは、表面から粒子内部まで通じている孔がたくさんあることをいう。全多孔性か否かは、走査型電子顕微鏡によって表面、及び断面の構造を観察して、判断できる。【００３６】
空孔容積は空孔部分にのみ水が充填された吸着体を乾燥させその前後で重量を測定することによって求められる。実際には空孔容積は水に浸漬した担体をグラスフィルターで吸引し空孔部分にのみ水が充填された吸着体とする。それを約３ｇ計り真空乾燥機４０±５℃で重量変化が無くなるまで減圧乾燥させ、乾燥前後の重量から算出される。比表面積は低温窒素ガス吸着（BET法）によって測定される。【００３７】
担体の形態としては、ビーズ状、線維状、膜状(中空糸も含む)など何れの形態も使用可能であり、任意の形態を選ぶことができるが、体外循環時の液体の流通面より、ビーズ状が特に好ましく用いられる。ビーズ状の平均粒径は１０〜２５００μｍのものが使いやすい。平均粒経２５μｍから８００μｍの範囲が好ましく用いられる。平均粒径とはここでは体積平均粒径のことである。【００３８】
本発明において、前記ペプチドの担体への固定は共有結合、イオン結合、疎水結合、水素結合のいずれの方法で行ってもよいが、中でも共有結合であることが好ましい。【００３９】
前記ペプチドの固定、とりわけ、共有結合による固定を行う上で、さらに担体表面には、前記ペプチドのカルボキシ基末端またはアミノ基末端のCysまたはCys誘導体のチオール基と反応しうる反応性官能基が存在していることが好ましい。これらの官能基の代表例としては、エポキシ基、チオール基、水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、シラノール基、アミド基、サクシニルイミド基、酸無水物基などが挙げられる。チオール基との反応性の点でエポキシ基が特に好ましい。【００４０】
前記ペプチドをエポキシ化担体に固定する場合、担体のエポキシ基とペプチドのカルボキシル基末端またはアミノ基末端のCysまたはCys誘導体のチオール基と結合し、
Ｒ−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−Ｏ−Ｒ’
（Ｒ−Ｓ−：本発明のペプチド、Ｒ’：担体）
の結合様式にて固定化しうる。【００４１】
ペプチドの固定化量は担体１ｍｌあたり０．０１ｎｍｏｌから１０μｍｏｌである。好ましくは吸着効率とコストの点から、担体１ｍｌあたり０．０５ｎｍｏｌから５μｍｏｌである。固定化量は、固定化反応直前と直後の反応溶液のペプチド濃度をHPLCにより測定し、反応前後のペプチドの減少率とペプチド及び担体の仕込量とから算出される。【００４２】
上述のように本発明のペプチドを担体に固定化することにより、β１アドレノセプターに対する抗体を吸着しうる、本発明の吸着材を調製できる。本発明の吸着材を、β１アドレノセプターに対する抗体を含む液体と接触させることにより、当該液体からβ１アドレノセプターに対する抗体を選択的に吸着除去しうる。【００４３】
β１アドレノセプターに対する抗体を含む液体は、例えば、当該抗体を含む血液、血漿、血清、リンパ液などの体液が挙げられる。好ましくは、該液体は、拡張型心筋症を罹患する患者の体液である。【００４４】
本発明の吸着材をβ１アドレノセプターに対する抗体を含む液体、例えばβ１アドレノセプターに対する抗体を含む血液、血漿、血清などの体液などの液体と接触させて、該液体中のβ１アドレノセプターに対する抗体を吸着する方法には種々の方法がある。代表的な方法としては、以下の方法等が挙げられる。
（１）β１アドレノセプターに対する抗体を含む液体を取り出してバックなどに貯留し、これを吸着材に混合してβ１アドレノセプターに対する抗体を吸着した後、吸着材を濾別してβ１アドレノセプターに対する抗体の除去された液体を得る方法。
（２）液体の入口と出口を有し、出口に液体は通過するが吸着材は通過しないフィルターを装着した容器に吸着材を充填し、これにβ１アドレノセプターに対する抗体を含む液体を流す方法。【００４５】
いずれの方法を用いてもよいが、後者の方法は操作も簡単であり、また体外循環回路に組み込むことにより患者の液体から効率よくオンラインでβ１アドレノセプターに対する抗体を除去することが可能であり、本発明の吸着材はこの方法に適している。また、本発明の吸着材はβ１アドレノセプターに対する抗体を構成成分として含む免疫複合体も吸着しうる。【００４６】
次に、上記吸着材を用いた本発明のβ１アドレノセプターに対する抗体の吸着装置を、その概略断面図に基づき説明する。【００４７】
図２中に示す容器７は、液体の流入口または流出口１、液体の流出口または流入口２、本発明のβ１アドレノセプターに対する抗体の吸着材３、液体および液体に含まれる成分は通過できるが前記吸着材は通過できない吸着材流出防止手段４および５、ならびにカラム６を有する。この容器の形状および材質に特に限定はないが、好ましくは、例えば、容量２０〜４００ｍｌ程度、直径２〜１０ｃｍ程度の筒状容器が用いられる。
【実施例】
【００４８】
以下実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。なお、本明細書においては、各種アミノ酸残基を次の略号で記載する。Ala：L-アラニン残基、Asp：L-アスパラギン酸残基、Asn：L-アスパラギン残基、Cys：L-システイン残基、Gln：L-グルタミン残基、Glu：L-グルタミン酸残基、Gly：L-グリシン残基、Ile：L-イソロイシン残基、Leu：L-ロイシン残基、Lys：L-リジン残基、Phe：L-フェニルアラニン残基、Thr：L-スレオニン残基、Trp：L-トリプトファン残基、Tyr：L-タイロシン残基、Val：L-バリン残基、Ser：L-セリン残基、His：L-ヒスチジン残基。また本明細書においては、ペプチドのアミノ酸配列を、そのアミノ基末端が左側に位置し、カルボキシル基末端が右側に位置するように、常法に従って記述する。【００４９】
（参考例１）ポリビニルアルコール担体（PVAL265）の調製
酢酸ビニル１００重量部、トリアリルイソシアヌレート（ＴＡＩＣ）２４重量部、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）（Ｖ−６５）５．０重量部、酢酸エチル１３１．５重量部、ヘプタン４８．２重量部、ポリ酢酸ビニル（平均重合度８００）１２．８重量部を含む単量体混合物５０４．４ｇを、水６９５．５重量部、ＰＶＡ  ０．１０４重量部、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウム０．０２３重量部、微粒子状の第三リン酸カルシウム５．１８重量部（固形分）、ＮａＮＯ2  ０．０３９重量部を含む水相１５０１．２ｇがあらかじめ仕込まれた、平板状の撹拌翼と２枚の邪魔板を有する２Ｌセパラブルフラスコ中に室温で添加した。十分な撹拌混合の後、窒素雰囲気下、内容物を６５℃で５時間保持して懸濁重合させた。【００５０】
その後、セパラブルフラスコの内容物を室温まで冷却した。次いでセパラブルフラスコの内容物に塩酸を加えてｐＨを２以下に調整し第三リン酸カルシウムを溶解させ、その後水で良く洗浄した。洗浄液のｐＨが中性付近になったことを確認した後、水をアセトンで置換し、重合物をアセトンで十分に洗浄し、次に水で十分に洗浄し、ポリ酢酸ビニル粒子を得た。【００５１】
得られたポリ酢酸ビニル粒子に、酢酸ビニル単位に対して過剰量となるよう下式の量の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を水溶液として加えた。【００５２】
ＮａＯＨ（固形分重量）＝粒子乾燥重量／８６．０９×４０×１．５
なお水に対するＮａＯＨ濃度が４重量％になるように水量を調整した。これを撹拌下、反応温度４０℃で６時間保持して鹸化を行った。その後、洗浄液のｐＨが中性付近になるまで水洗し、さらに８０℃の温水で十分に洗浄を行った。次いで、水の存在下、１２１℃、２０分間のオートクレーブ処理と水洗を行い、清浄なポリビニルアルコール粒子を得た。目開き７１０μｍと３００μｍのふるいを用いて、粒径が７１０μｍの以上の大粒子、および３００μｍ以下の小粒子や微粒子を除き、ポリビニルアルコール担体（PVAL265）を得た。【００５３】
（参考例２）ポリビニルアルコール担体（PVAK301）の調製
撹拌翼を有する２Ｌセパラブルフラスコと、液滴生成装置、単量体混合物タンク、分散媒タンクから構成される重合装置を用いて、ポリ酢酸ビニル粒子の重合を行った。【００５４】
撹拌翼を有する２Ｌセパラブルフラスコ中に、水４２７．７ｇ、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウムの３重量％水溶液１．７８ｇ、微粒子状の第三リン酸カルシウムの１０重量％スラリー１２２．２ｇを仕込み、穏やかに撹拌させておいた。【００５５】
液滴生成装置として、分散媒を満たしたカラムに単量体混合物を噴出するノズルを挿入し、上端は孔径０．１７ｍｍの小孔のノズルを有するオリフィス板よりなり、下端には振動を伝達する振動板を設置し、振動板を加振器と接続したものを用いた。カラムには分散媒タンクより分散媒を供給する導入管を接続し、ノズルには単量体混合物タンクより単量体混合物を供給する導入管を接続した。単量体混合物の供給には定量性が高く脈動の少ない２連プランジャーポンプを使用した。ノズルの上端は孔径０．１７ｍｍの小孔
単量体混合物タンクより、酢酸ビニル１００重量部、トリアリルイソシアヌレート（ＴＡＩＣ）２４重量部、酢酸エチル１２０重量部、ヘプタン５０重量部、ポリ酢酸ビニル（平均重合度４００）９．６重量部、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）（Ｖ−６５）５．０重量部よりなる単量体混合物５０９ｇを、液滴生成装置を経由してセパラブルフラスコに仕込んだ。それと同時に分散媒タンクより、３重量％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）水溶液２５０．０ｇ、６重量％亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ2）水溶液４．６２ｇ、水２２４５ｇよりなる分散媒の５６３．４ｇをカラムに供給し、液滴生成装置を経由してセパラブルフラスコに仕込んだ。【００５６】
この際、ノズル孔から噴出する単量体混合物の液柱に加振器により機械的振動を加えることにより、単量体混合物は分割されて、カラム内の分散媒中に均一な径の液滴を形成し、該液滴は同時に供給される分散媒とともにセパラブルフラスコ内へ送られた。【００５７】
次いで、セパラブルフラスコの内容物を、窒素雰囲気下、６５℃で５時間保持して、該液滴を重合させた。【００５８】
所定時間の重合の後、セパラブルフラスコの内容物を室温まで冷却した。次いでセパラブルフラスコの内容物に塩酸を加えてｐＨを２以下に調整し第三リン酸カルシウムを溶解させ、その後水で良く洗浄した。洗浄液のｐＨが中性付近になったことを確認した後、水をアセトンで置換し、重合物をアセトンで十分に洗浄し、次に水で十分に洗浄し、ポリ酢酸ビニル粒子を得た。【００５９】
得られたポリ酢酸ビニル粒子に、酢酸ビニル単位に対して過剰量となるよう下式の量の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を水溶液として加えた。【００６０】
ＮａＯＨ（固形分重量）＝粒子乾燥重量／８６．０９×４０×１．５
なお水に対するＮａＯＨ濃度が４重量％になるように水量を調整した。これを撹拌下、反応温度４０℃で６時間保持して鹸化を行った。その後、洗浄液のｐＨが中性付近になるまで水洗し、さらに８０℃の温水で十分に洗浄を行った。次いで、水の存在下、１２１℃、２０分間のオートクレーブ処理と水洗を行い、清浄なポリビニルアルコール粒子を得た。目開き７１０μｍと３００μｍのふるいを用いて、粒径が７１０μｍの以上の大粒子、および３００μｍ以下の小粒子や微粒子を除き、ポリビニルアルコール担体（PVAK301）を得た。【００６１】
（実施例1）吸着材K2004E−Ｌ１２Ｌ２４
1-1. ペプチド（Ｌ１２及びＬ２４）の合成
GluTyrGlySerPhePheThrGluLeuTrpThrSerCys（配列番号１）の末端Gluがアセチル化されたペプチド、すなわちAc-Glu Tyr Gly Ser Phe Phe Thr Glu Leu Trp Thr Ser Cys（配列番号７：以下Ｌ１２と記す、ここでAcはアセチル基を示す）と、His Trp Trp Arg Ala Glu Ser Asp Glu Ala Arg Arg Ala Tyr Asn Asp Pro Lys Cys（配列番号２）のペプチド（以下Ｌ２４と記す）を、それぞれ常法に従いBOC法で合成した。逆相カラム（JUPITER 5u C18）を用いてＨＰＬＣにて精製した。なお、溶離液として０．１％ＴＦＡ／水と０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルを用い、流速１ｍｌ／ｍｉｎで０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルの体積比を５％から５５％に２５分間で上昇させる条件で行った。【００６２】
1-2. 吸着材（K2004E−Ｌ１２Ｌ２４）の合成
1-2-1. エポキシ活性化担体の調製
セルロース系多孔質硬質担体であるK2004E（チッソ株式会社製）１００ｍｌに水を加え全量を１５５ｍｌとしたのち、２Ｎ水酸化ナトリウム３１ｍｌを加え４０℃とした。これにエピクロルヒドリン（和光純薬製、特級）１１ｍｌを加え、４０℃で撹拌下２時間反応させた。反応終了後、逆浸透水（以下、ＲＯ水と記す）にて充分に水洗し、エポキシ活性化担体（エポキシ活性化K2004E）を得た。【００６３】
1-2-2. ペプチド（Ｌ１２及びＬ２４）の固定化
上記1-1で合成したペプチド（Ｌ１２及びＬ２４）各７．５ｍｇを炭酸緩衝液（pH8.5）５．０ｍＬに溶解しペプチド溶液を調製した。上記エポキシ活性化K2004E  ５．０ｍＬにペプチド溶液を加えて３７℃で２時間振盪した後、RO水で充分に洗浄し、ペプチド（Ｌ１２及びＬ２４）を固定化した吸着材（K2004E−Ｌ１２Ｌ２４）を得た。その後、過剰な活性化エポキシ基を開環することで不活性化した。【００６４】
担体に固定化されたペプチドの量は反応前後のペプチドの濃度変化から求めた。ペプチド濃度は、逆相カラム（waters AtlAntis  5um dC18）を用いてＨＰＬＣにより測定した。なお溶離液は、０．１％ＴＦＡ／水（溶離液Ａ）と０．１％ＴＦＡ／８０％アセトニトリル／水（溶離液Ｂ）を用い、流速１ｍｌ／ｍｉｎで溶離液Ａと溶離液Ｂの体積比を５％から６５％に６０分間で上昇させる条件で行った。【００６５】
反応前のペプチド濃度に対する、反応後のペプチド濃度の百分率を求めることにより、ペプチドの残存率（％）が算出される。ペプチドの残存率（％）を１００（％）から引くことによりペプチドの固定化率（％）を求めた。結果を後に掲載する表１に示す。【００６６】
固定化量は、ペプチド及びセルロースの仕込量とペプチドの固定化率（％）から算出した。ペプチドの固定化量は、担体１ｍＬ当たりＬ１２は１．０８ｍｇ、Ｌ２４は１．１０ｍｇであった。【００６７】
1-3. 吸着材の評価
カルボキシル基末端にCysを導入したβ１アドレノセプターの２番目のループのペプチドHis Trp Trp Arg Ala Glu Ser Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro Lys Cys Cys Asp Phe Val Thr Asn Arg Cys（配列番号6：以下、β１ＡＲ２と記す）をBOC法で合成した。β１ＡＲ２を抗原として市販ウサギ血清（コスモバイオ社製）を免疫し、ウサギ抗血清（以下、ＳＲＡＲ２と記す）を得た。【００６８】
1-2.で合成した吸着剤（K2004E−Ｌ１２Ｌ２４）１００μＬをバイアル中に採取し、ウサギ抗血清（ＳＲＡＲ２）を市販ウサギ血清で５０倍に希釈したもの３００μＬを加えて３７℃にて２時間振盪した。上清のβ１ＡＲ２に対する抗体（以下、Ａｂ２Ｒと記す）の吸光度をELISA法により測定した。【００６９】
測定にはモデル680マイクロプレートリーダー(バイオラッド社製、測定波長４９０ｎｍ)を使用し、吸着前のウサギ抗血清の吸光度を吸着能0％、と惹起前の市販ウサギ血清の吸光度を吸着能１００％として、前記上清の吸光度を測定することにより、Ａｂ２Ｒに関して、吸着能を算出した。結果を後に掲載する表2に示す。【００７０】
（実施例2）吸着材PVAL265−Ｌ１２Ｌ２５
2-1. ペプチド（Ｌ２５）の合成
ペプチドAla Arg Arg Ala Tyr Asn Asp Pro Lys Ala Ala Asp Phe Val Thr Asn Arg Cys（配列番号３：以下、Ｌ２５と記す）を実施例１と同様に合成した。【００７１】
2-2. 吸着材（PVAL265−Ｌ１２Ｌ２５）の合成
2-2-1. エポキシ活性化担体の調製
参考例１の方法により、ポリビニルアルコール（PVA）系多孔質硬質ゲルであるPVAL265を取得した。実施例１と同様にエポキシ化を行い、エポキシ活性化PVAL265を得た。【００７２】
2-2-2. ペプチド（Ｌ１２及びＬ２５）の固定化
1-1で合成したペプチド（Ｌ１２）、2-1で合成したペプチド（Ｌ２５）各々１．５ｍｇを炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）５．０ｍＬに溶解しペプチド溶液を調製した。上記エポキシ活性化PVAL265  ５．０ｍＬにペプチド溶液を加えて３７℃で２時間振盪した後、RO水で充分に洗浄し、ペプチド（Ｌ１２及びＬ２５）を固定化した吸着体（VAL265−Ｌ１２Ｌ２５）を得た。その後、過剰な活性化エポキシ基を物エタノールアミン（和光純薬製）で不活性化した。【００７３】
実施例１と同様の方法でペプチドの固定化率、固定化量を求めた。ペプチドの固定化率を後に掲載する表１に示す。ペプチドの固定化量は、担体１ｍＬ当たりＬ１２は０．３０ｍｇ、Ｌ２５は０．２３ｍｇであった。【００７４】
2-3. 吸着材の評価
得られた吸着体PVAL265−Ｌ１２Ｌ２５の吸着能を実施例１と同様の方法にて測定した。結果を後に掲載する表２に示す。【００７５】
（実施例３）吸着材PVAK301−Ｌ１２Ｌ２５
担体をPVAL265に換え、参考例２にて得られたPVAK301を用いた以外、実施例２と同様にして、ペプチド（Ｌ１２及びＬ２５）を固定化した吸着材（PVAK301−Ｌ１２Ｌ２５）を得た。実施例１と同様の方法でペプチドの固定化率、固定化量を求めた。ペプチドの固定化率を後に掲載する表１に示す。ペプチドの固定化量は、担体1mL当たりＬ１２は０．３０ｍｇ、Ｌ２５は０．２１ｍｇであった。【００７６】
得られた吸着体PVAK301−Ｌ１２Ｌ２５の吸着能を実施例１と同様の方法にて測定した。結果を後に掲載する表２に示す。【００７７】
（実施例４）吸着材K2004E−Ｌ１２Ｌ２５
4-1. 吸着材（K2004E−Ｌ１２Ｌ２５）の合成
担体をPVAL265に換え、セルロース系多孔質硬質担体であるK2004E（チッソ株式会社製）を用いた以外、実施例２と同様にして、ペプチド（Ｌ１２及びＬ２４）を固定化した吸着材（K2004E−Ｌ１２Ｌ２５）を得た。実施例１と同様の方法でペプチドの固定化率、固定化量を求めた。ペプチドの固定化率を後に掲載する表１に示す。ペプチドの固定化量は担体１ｍＬ当たりＬ１２は０．２５ｍｇ、Ｌ２５は０．１７ｍｇであった。【００７８】
4-2. 吸着材の評価
前記配列番号４に示されるβ１アドレノセプターの１番目のループの配列に対して、カルボキシル基末端にCysが付加され、アミノ基末端のGluがアセチル化されたペプチド、すなわち、Ac-Glu Tyr Gly Ser Phe Phe Cys Glu Leu Trp Thr Ser Cys（配列番号８：以下、β１ＡＲ１と記す）をBOC法で合成した。β１ＡＲ１を抗原として市販ウサギ血清（コスモバイオ社製）を免疫し、ウサギ抗血清（以下、ＳＲＡＲ１と記す）を得た。【００７９】
合成した吸着材（K2004E−Ｌ１２Ｌ２５）１００μＬをバイアル中に採取し、ウサギ抗血清ＳＲＡＲ１及び実施例１で調製したＳＲＡＲ２を混合し、市販ウサギ血清で５０倍に希釈したもの３００μＬを加えて３７℃にて２時間振盪した。上清のβ１ＡＲ１に対する抗体（以下、Ａｂ１Ｒと記す）、及び、β１ＡＲ２に対する抗体（Ａｂ２Ｒ：実施例１参照）の吸光度をELISA法によりそれぞれ測定した。【００８０】
測定にはモデル680マイクロプレートリーダー（バイオラッド社製、測定波長４９０ｎｍ）を使用し、吸着前のウサギ抗血清の吸光度を吸着能０％、市販ウサギ血清の吸光度を吸着能１００%として、前記上清の吸光度を測定することにより、Ａｂ１Ｒ及びＡｂ２Ｒの吸着能を算出した。結果を後に掲載する表３に示す。【００８１】
（実施例５）吸着材K2004E−Ｌ１２Ｌ２５を用いた体液中の抗体吸着
β１アドレノセプターに対する抗体がELISAにより陽性であるＤＣＭ患者血清（以下、ＳＰＡＲ２と記す）を用いて、実施例４で調製した吸着材の評価を行った。【００８２】
前記吸着材（K2004E−Ｌ１２Ｌ２５）１００μＬをバイアル中に採取し、ＳＰＡＲ２を３００μＬ加えて37℃にて2時間振盪し、患者血清中のβ１ＡＲ２に対する抗体（以下、Ａｂ２Ｐと記す）を吸着させた。【００８３】
吸着材を生理食塩水で洗浄した後、０．２ｍｏｌ／ｌのグリシンバッファー（ｐＨ２．６）（グリシン：ナカライテスク製、試薬特級、塩酸：和光純薬製、試薬特級）を加え室温で５分間静置することにより、吸着されたＡｂ２Ｐを遊離させた。上清を採取し、その上清に１ｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を加え中和した後、PBS（10mmol/phosphate, 150mmol/l NaCl pH7.4）によって透析（透析膜：Spectrum Laboratories 社製、spectra-pore6000-8000Daltion-MWCO）を行ない、その後濃縮を行った。得られた溶液を実施例１と同様にELISAを行なうことにより、Ａｂ２Ｐの吸着率を算出した。結果を後に掲載する表４に示す。
【００８４】
【表１】
2006046589.tif 000002
【００８５】
【表２】
2006046589.tif 000003
【００８６】
【表３】
2006046589.tif 000004
【００８７】
【表４】
2006046589.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明によれば、短時間の反応でペプチドの固定化効率がよく、液体中に存在するβ１アドレノセプターに対する抗体を選択的に吸着する能力を有する新規な吸着材が提供される。また、該吸着材を充填してなる吸着装置を用いることによって、血液、血漿、血清などの非処理液中のβ１アドレノセプターに対する抗体に対する抗体を選択的に除去することが可能である。
【図１】
2006046589.tif 000006
【図２】
2006046589.tif 000007
【配列表】
2006046589000001.app
【国際調査報告】
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2006046589.tif 000009
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