(57)【要約】本発明はアスペルギルス属に属し、ステンフォン類を生産する能力を有するアスペルギルス  エスピー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＦＫＩ−２１３６（ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−８３）を培地で培養し、培養物中にステンフォン類を蓄積せしめ、該培養物からステンフォン類を採取する。得られたステンフォン類は抗菌剤として利用されているβ−ラクタム抗生物質と併用することによりその効果を増強する作用を有することから、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）感染症やβ−ラクタム抗生物質耐性を含む多剤耐性菌を起因とする感染症の治療薬として期待される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式［Ｉ］
2006095444.tif 000011
で表されるステンフォンＢ物質、および／または下記式［ＩＩ］
2006095444.tif 000012
で表されるステンフォンＣ物質からなるステンフォン類。
【請求項２】
アスペルギルス属に属し、請求の範囲１記載の式［Ｉ］および／または［ＩＩ］で表されるステンフォン類を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養物中にステンフォン類を蓄積せしめ、該培養物からステンフォン類を採取することを特徴とするステンフォン類の製造方法。
【請求項３】
アスペルギルス属に属し、ステンフォン類を生産する能力を有する微生物がアスペルギルス  エスピー（Ａｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＦＫＩ−２１３６（ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−８３）またはその変異株である請求の範囲２記載のステンフォン類の製造方法。
【請求項４】
アスペルギルス  エスピー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＦＫＩ−２１３６（ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−８３）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、抗菌剤として利用されているβ−ラクタム抗生物質と併用することによりその効果を増強せしめ得る新規ステンフォン（ｓｔｅｍｐｈｏｎｅ）類およびそれらの製造方法に関する。
【背景技術】  近年、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は、院内感染の主な原因菌として社会的問題となっている。この病原菌は、β−ラクタム抗生物質など種々の薬剤に対する耐性を有しており、一般にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）感染症の治療には、現時点ではほとんど耐性化が報告されていないグリコペプチド系のバンコマイシンやアミノグリコシド系のアルベカシンといった抗生物質が使用されている。またこの他に、β−ラクタム抗生物質同士、もしくは、β−ラクタム抗生物質と他の作用点の異なる抗生物質の併用療法が行われている（長谷川裕美ら、抗菌薬投与の科学、２６４−２７３、１９９８年）。
バンコマイシンやアルベカシンについてもすでにこれらの薬剤に対する耐性菌が出現している。またこれらの薬剤については、第８脳神経障害による聴力障害などの副作用を有することが知られており問題となている。現在までに、このような状況に対処すべく、β−ラクタム抗生物質の効力を回復させる作用を有する物質が報告されている。例えば、β−ラクタム抗生物質を含む抗菌剤と組み合せて使用することで相乗的効果を示す茶エキスまたはその活性フラクションがこれに相当する（特表平９−５０９６７７号）。新規ステンフォン類は、β−ラクタム抗生物質のうちカルバペネム系に属するイミペネムの抗菌活性を増強する作用を有するとともに、ペナム系であるクロキサシリンやセフェム系であるセファゾリンの抗菌活性を増強する作用を有しているため、β−ラクタム抗生物質を含む抗菌剤との併用療法へも応用できることが期待される。新規ステンフォン類は、茶エキスまたはその活性フラクションの有する活性成分であるポリフェノール化合物とは、分子式および化学構造が明確に区別される。
【発明の開示】
β−ラクタム抗生物質の活性を増強する薬剤は、β−ラクタム抗生物質の投与量を減量させ、投与期間を短縮させることにより耐性菌出現の頻度を低減させることが期待される。また同時に、作用の異なる２つの薬剤を併用することにより、β−ラクタム抗生物質に対する耐性を克服することも期待される。
かかる実情において、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）に対するβ−ラクタム抗生物質の活性増強作用を有する物質を提供することは、メチシリン酎性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）感染症やβ−ラクタム抗生物質耐性を含む多剤耐性菌を起因とする感染症の新しい治療薬を提供するものであり有用なことである。
本発明者らは微生物の生産する代謝産物を対象にβ−ラクタム抗生物質カルバペネム系であるイミペネムの活性増強作用物質を探索した結果、新たに土壌から分離した糸状菌ＦＫＩ−２１３６株の培養物中にイミペネム活性増強作用を有する物質が産生されていることを見出した。次いで、該培養物から２種のイミペネム活性増強物質を分離、精製した結果、このような化学構造を有する物質は従来まったく知られていないことから、本物質をそれぞれステンフォンＢ物質およびステンフォンＣ物質と称し、それらの物質を総称してステンフォン類とした。
本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものであって、下記の式［Ｉ］
2006095444.tif 000002
で表されるステンフォンＢ物質および／または下記式［ＩＩ］
2006095444.tif 000003
で表されるステンフォンＣ物質からなるステンフォン類を提供するものである。
本発明は、アスペルギルス属に属し、前述の式［Ｉ］および［ＩＩ］で表されるステンフォン類を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にステンフォン類を蓄積せしめ、該培養物からステンフォン類を採取するステンフォン類の製造方法を提供するものである。
本発明は、アスペルギルス属に属し、前述の式［Ｉ］および［ＩＩ］で表されるステンフォン類を生産する能力を有するアスペルギルス  エスピー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＦＫＩ−２１３６（ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−８３）またはその変異株であるステンフォン類の製造方法を提供するものである。
本発明はアスペルギルス  エスピー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＦＫＩ−２１３６（ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−８３）を提供するものである。
前記の式［Ｉ］および［ＩＩ］で表される新規ステンフォン類を生産する能力を有する微生物（以下「ＦＫＩ−２１３６物質生産菌」と称する）はアスペルギルスに属するが、本発明のステンフォン類生産能を有するものであればよく、特に制限されることはない。本発明のステンフォン類を生産するために使用される菌株の好適な一例としては、本発明者らによって沖縄県石垣島の土壌より新たに分離されたアスペルギルス  エスピー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＦＫＩ−２１３６株が挙げられる。本菌株の菌学的性状を示すと以下のとおりである。
１．形態的特徴
本菌株は、ツァペック・イーストエキス寒天培地、麦芽汁寒天培地、ショ糖２０％入りツァペック・イーストエキス寒天培地などで良好に生育し、各寒天培地での分生子の着生は良好であった。
ツァペック・イーストエキス寒天培地に生育したコロニーを顕微鏡で観察すると、菌糸は無色で隔壁を有していた。分生子柄は基底菌糸より直生し、その長さは、１７５〜７３０μｍで基部には逆Ｔ字型の足細胞を生じる。分生子柄の先端は、球形から亜球形に肥大し、直径１５〜６０μｍの頂嚢を形成する。アスペルギラは、複列性で、メトレ（６〜１２×３〜６μｍ）とアンプル型のフィアライド（５〜１０×２〜３μｍ）からなる。アスペルギラは頂嚢のほぼ全体を覆う。フィアライドの先端からは分生子が形成され、培養時間の経過とともに連鎖状となる。分生子は、球形から亜球形、薄い黄土色、大きさ２〜４μｍで表面は滑面であった。
２．各種培地上での培養性状
本菌株を各種寒天培地上で、２５℃、７日間培養した場合の肉眼的観察結果を下記に示す。
2006095444.tif 000004
2006095444.tif 000005
なお、本菌株はツァペック・イーストエキス寒天培地で、５℃および３７℃で１４日間培養したが、生育しなかった。
３．生理的性状
１）最適生育条件
本菌株の最適生育条件はｐＨ４〜８、温度１１．５〜２９℃である。
２）生育の範囲
本菌株の生育範囲はｐＨ３〜１０、温度１０〜３０．５℃である。
３）好気性、嫌気性の区別
好気性
４．微生物の国際寄託
上記ＦＫＩ−２１３６株の形態的特徴、培養性状および生理的性状に基づき、既知菌種との比較を試みた結果、本菌株はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する一菌株と同定し、アスペルギルス・エスピーＦＫＩ−２１３６と命名した。本菌株は、アスペルギルス・エスピーＦＫＩ−２１３６（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＦＫＩ−２１３６）として、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づき、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番８号（郵便番号２９２−０８１８）に所在する独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ＮＩＴＥ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ）に寄託してある。受領日は２００５年３月３日、受領番号はＮＩＴＥ  ＡＢＰ−８３である。
本発明で使用されるＦＫＩ−２１３６物質生産菌としては、前述のアスペルギルス・エスピーＦＫＩ−２１３６菌株が好ましい例として挙げられるが、菌の一般的性状として菌学上の性状は極めて変異し易く、一定したものではなく、自然的にあるいは通常行われる紫外線照射、Ｘ線照射または変異誘導体剤、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、２−アミノプリンなどを用いる人工的変異処理により取得できる人工的変異株は勿論、細胞融合株、遺伝子操作株、自然変異株も含め、アスペルギルス・エスピー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）に属し、前記の式［Ｉ］および［ＩＩ］で表されるステンフォン類を生産する能力を有する菌株はすべて本発明に使用することができる。
本発明を実施するに当たっては、先ずアスペルギルス・エスピーに属するＦＫＩ−２１３６物質生産菌を培地に培養することにより行われる。上記ステンフォン類の生産に適した栄養源としては、微生物が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源、さらに必要に応じて無機塩、ビタミン等を含有させた栄養培地が使用される。上記の同化し得る炭素源としては、グルコース、フラクトース、マルトース、ラクトース、ガラクトース、デキストリン、澱粉等の糖類、大豆油等の植物性油脂類が単独または組み合わせて用いられる。
消化し得る窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粉、綿実粉、コーン・スティープ・リカー、麦芽エキス、カゼイン、アミノ酸、尿素、アンモニウム塩類、硝酸塩類が単独または組み合わせて用いられる。その他必要に応じてリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩などの塩類、鉄塩、マンガン塩、銅塩、コバルト塩、亜鉛塩等の重金属塩類やビタミン類、その他本ステンフォン類の生産に好適なものが適宜添加される。
培養するに当たり、発泡が激しいときには、必要に応じて液体パラフイン、動物油、植物油、シリコン等、界面活性剤等の消泡剤を添加してもよい。上記の培養は、上記栄養源を含有すれば、培地は液体でも固体でもよいが、通常は液体培地を用い、培養するのがよい。少量生産の場合にはフラスコを用いる培養が好適である。目的物質を大量に工業生産するには、他の発酵生産物と同様に、通気攪拌培養するのが好ましい。
培養を大きなタンクで行う場合は、生産工程において、菌の生育遅延を防止するため、はじめに比較的少量の培地に生産菌を接種培養した後、次に培養物を大きなタンクに移して、そこで生産培養するのが好ましい。この場合、前培養に使用する培地および生産培養に使用する培地の組成は、両者とも同一であってもよいし、必要があれば両者を変えてもよい。
培養を通気攪拌条件で行う場合は、例えばプロペラやその他機械による攪拌、ファメーターの回転または振とう、ポンプ処理、空気の吹き込み等、既知の方法が適宜使用される。通気用の空気は滅菌したものを使用する。
培養温度は、本ＦＫＩ−２１３６物質生産菌が本ステンフォン類を生産する範囲内で適宜変更し得るが、通常は２０〜３０℃、好ましくは２７℃前後で培養するのがよい。培養ｐＨは通常５〜８、好ましくは７前後で培養するのがよい。培養時間は培養条件によっても異なるが、通常は４〜７日程度である。このようにして得られたステンフォン類は、培養菌体および培養濾液に存在する。培養物から目的とするステンフォン類を採取するには、全培養物をアセトンなどの水混和性有機溶媒で抽出し、抽出液を減圧下有機溶媒で留去後、続いて残渣を酢酸エチル等の水不混和性有機溶媒で抽出することによって行われる。
上記の抽出法に加え、脂溶性物質の採取に用いられる公知の方法、例えば吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、遠心向流分配クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を適宜組み合わせ、あるいは繰り返すことにより、本ステンフォン類を分離、精製することができる。
理化学的性状
本発明のステンフォン類の理化学的性状について説明する。
１．ステンフォンＢ物質
（１）性状    ：黄色針状、
（２）分子式  ：Ｃ３０Ｈ４２Ｏ９、
ＨＲＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋］計算値５４６．２８３５、実測値５４６．２８２９、
（３）分子量  ：５４６、
ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）で［Ｍ＋］５４６を観測、
（４）紫外部吸収スペクトル：メタノール溶液中で測定した紫外部吸収スペクトルは第１図に示すとおりであり、λｍａｘ（ＭｅＯＨ，ε）：２０６ｎｍ（７７４８）、２６７ｎｍ（５１５４）、３８３ｎｍ（５０５）付近に特徴的な吸収極大を示す、
（５）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは、第２図に示すとおりであり、νｍａｘ３４４０、２９３５、１７２７、１６４４、１６０２ｃｍ−１に特徴的な吸収極大を示す、
（６）比旋光度：［α］Ｄ２６＋１４４．０°（ｃ＝０．１、メタノール）、
（７）溶剤に対する溶解性：メタノールやクロロホルムに可溶、水に不溶、
（８）プロトン及びカーボン核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で、バリアン社製３００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトロメータで測定した水素の化学シフト（ｐｐｍ）及び炭素の化学シフト（ｐｐｍ）は下記に示すとおりである。
δＨ：０．９８（３Ｈ）、１．０４（３Ｈ）、１．１４（３Ｈ）、１．２０（３Ｈ）、１．３２（３Ｈ）、１．５８（１Ｈ）、１．６０（１Ｈ）、１．６１（３Ｈ）、１．６２（３Ｈ）、１．８６（１Ｈ）、１．８８（１Ｈ）、１．９４（３Ｈ）、１．９６（１Ｈ）、２．０８（１Ｈ）、２．２３（１Ｈ）、３．３０（１Ｈ）、３．４４（１Ｈ）、３．５７（１Ｈ）、３．６８（１Ｈ）、４．１０（１Ｈ）、４．１５（１Ｈ）、４．９０（１Ｈ）、５．１５（１Ｈ）、５．５６（１Ｈ）、６．４７（１Ｈ）ｐｐｍ、
δｃ：１１．６、１３．１、１３．２、１６．９、２１．２、２１．３、２３．８、２５．０、２６．４、２８．２、３４．２、３７．１、４０．８、４５．４、６２．３、７０．７、７１．７、７６．２、７９．６、８１．４、８３．８、１１７．８、１２５．３、１３１．７、１３２．６、１４８．８、１５１．５、１６９．７、１８１．０、１８８．５ｐｐｍ、
以上のように、ステンフォンＢ物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、ステンフォンＢ物質は下記の式［Ｉ］で表される化学構造であることが決定された。
2006095444.tif 000006
２．ステンフォンＣ物質
（１）性状    ：黄色針状、
（２）分子式  ：Ｃ３０Ｈ４２Ｏ７、
ＨＲＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋］  計算値５１４．２９２６、実測値５１４．２９３１、
（３）分子量  ：５１４、
ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）で［Ｍ＋］  ５１４を観測、
（４）紫外部吸収スペクトル：メタノール溶液中で測定した紫外部吸収スペクトルは第５図に示すとおりであり、λｍａｘ（ＭｅＯＨ，ε）：２０７ｎｍ（７６０４）、２６５ｎｍ（７２３９）、３９８ｎｍ（６１６）付近に特徴的な吸収極大を示す、
（５）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは、第６図に示すとおりであり、νｍａｘ３４４４、２９４４、１７３９、１６４３、１６０４ｃｍ−１等に特徴的な吸収極大を示す、
（６）比旋光度：［α］Ｄ２６＋９４．６°（ｃ＝０．１、メタノール）、
（７）溶剤に対する溶解性：メタノールやクロロホルムに可溶、水に不溶、
（８）プロトン及びカーボン核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で、バリアン社製３００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトロメータで測定した水素の化学シフト（ｐｐｍ）及び炭素の化学シフト（ｐｐｍ）は下記に示すとおりである。
δＨ：０．８８（３Ｈ）、１．０２（３Ｈ）、１．１６（３Ｈ）、１．１８（３Ｈ）、１．２１（１Ｈ）、１．２８（３Ｈ）、１．４３（１Ｈ）、１．４８（１Ｈ）、１．５９（３Ｈ）、１．６２（３Ｈ）、１．６３（１Ｈ）、１．６６（１Ｈ）、１．７９（１Ｈ）、１．８０（１Ｈ）、１．８６（１Ｈ）、１．９３（３Ｈ）、２．１１（１Ｈ）、２．１８（１Ｈ）、２．５２（１Ｈ）、３．１２（１Ｈ）、３．２１（１Ｈ）、３．３４（１Ｈ）、５．１４（１Ｈ）、５．５３（１Ｈ）、６．４８（１Ｈ）ｐｐｍ、
δｃ：１１．６、１２．２、１３．１、１６．４、１７．０、２０．８、２１．１、２１．３、２３．８、２５．２、２６．１、３３．５、３５．５、３６．８、３７．２、４６．６、７１．８、８０．５、８１．５、８４．０、８４．９、１１７．８、１２４．９、１３２．１、１３２．４、１４８．０、１５２．３、１６９．８、１８１．３、１８７．１ｐｐｍ、
以上のように、ステンフォンＣ物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、ステンフォンＣ物質は下記の式［ＩＩ］で表される化学構造であることが決定された。
2006095444.tif 000007
次に、本発明のステンフォン類の生物学的性状について詳細に述べる。
１．ペーパーディスク法によるイミペネム活性増強作用の評価方法
試験菌として、臨床分離されたメチシリン耐性Ｓｔａｐｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｋ２４株を用いた。Ｓｔａｐｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ  ｂｒｏｔｈ（２．１％ｗ／ｖ）（ＤＩＦＣＯ）３７℃、２０時間培養後、同培地で０．５Ｍｃ  ＦＡＲＬＡＮＤ（約１０８ＣＦＵ／ｍＬ）相当に懸濁し、ＭＨＡ培地（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ  ｂｒｏｔｈ  ２．１％（ｗ／ｖ）、Ａｇａｒ  １．５％）および同組成の培地にイミペネム（日本国、萬有製薬株式会社チエナム筋注用力価０．５）を試験菌の生育に影響を与えない濃度、すなわち最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように添加した培地に塗沫した。塗沫は米国臨床検査標準化委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄ，ＮＣＣＬＳ）法に従い、滅菌綿棒（川本産業株式会社、日本国）を用いて行った。試験菌に対する各培地上での抗菌活性は、ペーパーディスク法（薄手、６ｍｍ：ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）にて、３７℃で２０時間後の阻止円径の直径を単位ｍｍで表記した。その結果、５μｇディスク条件下にて、ステンフォンＢ物質およびステンフォンＣ物質ともに、それ自身では阻止円が測定されなかったのに対して、イミペネム存在下では、それぞれ、１５ｍｍおよび２０ｍｍの阻止円が測定され、イミペネム活性増強作用が確認された。
２．微量液体希釈法による各種抗菌剤に対する活性増強作用の評価方法
ペーパーディスク法による評価で強いイミペネム活性増強作用を示したステンフォンＣ物質に関しては、微量液体希釈法に従いイミペネムに加えその他抗菌剤を含む活性増強を評価した。その他薬剤としては、クロキサシリン（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｃｉｃａｌｓ社）、セファゾリン（和光純薬、日本国）、バンコマイシン（和光純薬、日本国）、ストレプトマイシン（明治製菓、日本国）、テトラサイクリン（和光純薬、日本国）、エリスロマイシン（日本国、北里大学北里生命科学研究所保存）およびシプロフロキサシン（和光純薬、日本国）を使用した。評価は、日本化学療法学会標準法（ＣＨＥＭＯＴＨＥＲＡＰＹ  ３８巻、１０３〜１０５頁、１９９０年）を一部改変して行った。
９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、米国）の各ｗｅｌｌに、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ  ｂｒｏｔｈ（２．１％ｗ／ｖ）を８５μｌ添加した後、予め滅菌水で段階希釈しておいたイミペネムを最終濃度４．８×１０−４から２５６μｇ／ｍｌとなるように各ｗｅｌｌに５μｌ添加した。さらに、これら各ｗｅｌｌにステンフォンＣ物質自身では生育に影響を与えない最終濃度１６μｇ／ｍｌとなるようにメタノール溶液５μｌを添加した。よく混合した後、試験菌ＭＲＳＡを上記同様に０．５Ｍｃ  ＦＡＲＬＡＮＤ（約１０８ＣＦＵ／ｍＬ）相当に懸濁し、これを同培地で１０倍に希釈した接種菌液を各ｗｅｌｌに５μｌ接種した。３７℃、１２０時間培養後、菌の発育が肉眼的に認められないｗｅｌｌの中、最小の薬剤濃度をもってＭＩＣとした。各種抗菌剤単独時のＭＩＣおよび各種抗菌剤とステンフォンＣ物質併用時のＭＩＣは下記の第１表に示すとおりであった。
【表１】
2006095444.tif 000008
以上のように、イミペネムでは、単独でＭＩＣ１６μｇ／ｍＬからステンフォンＣ物質（１６μｇ／ｍＬ）存在下ではそのＭＩＣは０．０３μｇ／ｍＬまで低下させ、イミペネムの活性を５１２倍に増強することが確認された。また、クロキサシリンやセファゾリンにおいても、それぞれ、５１２および１６倍の活性増強が確認され、ステンフォン類は広くβ−ラクタム抗生物質の活性増強作用を有していた。
３．各種試験菌に対する抗菌作用
以下に示した１５種の試験菌に対する抗菌活性に関しては、ペーパーディスク法に従い阻止円径（ｍｍ）を測定した。培養温度は、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｘ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．ｏｒｙｚａｅ、Ｐ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｎｉｇｅｒ、Ｍ．ｒａｃｅｍｏｓｕｓ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅについては、２７℃とし、他の試験菌は３７℃とした。培養時間はＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｐ．ｏｒｙｚａｅおよびＡ．ｎｉｇｅｒは４８時間とし、他の試験菌については２４時間とした。各試験菌に対する５μｇ／直径６ｍｍディスクの薬剤濃度条件下の薬剤濃度条件下における阻止円径（ｍｍ）は、下記の第２表に示すとおりであった。
【表２】
2006095444.tif 000009
2006095444.tif 000010
【図面の簡単な説明】  第１図は本発明のステンフォンＢ物質の紫外部吸収スペクトル（メタノール溶液中）を示したものである。
第２図は本発明のステンフォンＢ物質の赤外部吸収スペクトル（臭化カリウム法）を示したものである。
第３図は本発明のステンフォンＢ物質のプロトン核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム中）を示したものである。
第４図は本発明のステンフォンＢ物質のカーボン核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム中）を示したものである。
第５図は本発明のステンフォンＣ物質の紫外部吸収スペクトル（メタノール溶液中）を示したものである。
第６図は本発明のステンフォンＣ物質の赤外部吸収スペクトル（臭化カリウム法）を示したものである。
第７図は本発明のステンフォンＣ物質のプロトン核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム中）を示したものである。
第８図は本発明のステンフォンＣ物質のカーボン核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム中）を示したものである。
【発明を実施するための最良の形態】  次に、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれのみに限定されるものでない。
【実施例】  寒天斜面培地（グリセロール０．１％（関東化学、日本国）、ＫＨ２ＰＯ４  ０．０８％（関東化学）、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．０２％（関東化学）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０２％（和光純薬、日本国）、ＫＣｌ  ０．０２％（関東化学）、ＮａＮＯ３  ０．２％（和光純薬、日本国）、酵母エキス０．０２％（オリエンタル酵母、日本国）、寒天１．５％（清水食品、日本国）、ｐＨ６．０に調製）で培養したＦＫＩ−２１３６株（ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−８３）を、種培地（グルコース２％（和光純薬）、ポリペトン０．５％（和光純薬）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０５％（和光純薬）、酵母エキス０．２％（オリエンタル酵母）、ＫＨ２ＰＯ４  ０．１％（関東化学）、寒天０．１％（清水食品）、ｐＨ６．０に調製）１０ｍＬを分注した大試験管に一白金耳ずつ接種し、２７℃で２日間ロータリーシェイカー（３００ｒｐｍ）で培養した後、生産培地（グルコース１．０％（和光純薬）、可溶性スターチ２．０％（関東化学）、大豆油２．０％（和光純薬）、ファーマメディア１．０％（イワキ社、日本国）、肉エキス０．５％（極東製薬、日本国）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１％（和光純薬）、ＣａＣＯ３  ０．３％（関東化学）、トレース塩溶液１．０％（ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１％（関東化学）、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ０．１％（関東化学）、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１％（関東化学）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．１％（関東化学）、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．１％（和光純薬）、寒天０．１％（清水食品）、ｐＨ６．０に調製）１００ｍＬを分注した５００ｍＬ容三角フラスコ（３０本）に植菌し、２７℃、２１０ｒｐｍで３日間振とう培養した後、さらに５００ｍＬルー氏フラスコ（３０本）にそれぞれ移し、２７℃で１０日間静置培養した。
培養終了後、この培養液（３Ｌ）を遠心分離し、上清と菌体を得た。菌体にアセトン（１．５Ｌ）を加え、３０分攪拌後菌体を濾別して菌体抽出液を得た。菌体抽出液を減圧下でアセトンを留去して得られた水残査より、酢酸エチル（９Ｌ）で活性成分を抽出し、酢酸エチル層を濃縮乾固し活性粗物質（４．４ｇ）を得た。この粗物質をシリカゲルカラム（シリカゲル６０、メルク社製、４０ｇ）にて粗精製を行った。ヘキサン−酢酸エチル（２：１）の溶媒で洗浄した後、クロロホルム−メタノール（１００：０、１００：１、５０：１、１０：１、５：１、１：１）の各混合溶媒を展開溶媒とするクロマトグラフイーを行い、溶出液を各条件で１２０ｍＬに分画した。活性画分（１０：１）を濃縮乾固することで、褐色油状物質７８６ｍｇを得た。再度、この粗物質をシリカゲルカラム（シリカゲル６０、メルク社製、５０ｇ）にて精製を行った。クロロホルム−メタノール（１００：１、５０：１、２０：１、１０：１、５：１）の各混合溶媒を展開溶媒とするクロマトグラフィーを行い、溶出液を各条件で１２ｍｌずつ１０本に分画した。活性画分（１００：１フラクション番号２から５０：１フラクション番号３）を濃縮乾固することで、褐色油状物質２７４ｍｇを得た。
これを少量のメタノールに溶解し、分取ＨＰＬＣ（カラム：ＰＥＧＡＳＩＬ  ＯＤＳ、２０φ×２５０ｍｍ、センシュウー科学、日本国）により最終精製を行った。７０％アセトニトリル水溶液を移動相とし、６ｍＬ／ｍｉｎの流速において、ＵＶ２１０ｎｍの吸収をモニターした。保持時間２８分に活性を示すピークを観察し、このピークを分取して分取液を減圧下濃縮し、残渣水溶液を凍結乾燥することによりステンフォンＣ物質を収量１７４ｍｇで単離した。また、活性画分（５０：１フラクション番号４から２０：１フラクション番号３）を濃縮乾固することで得られた粗物質２６２ｍｇを少量のメタノールに溶解し、分取ＨＰＬＣ（カラム：ＰＥＧＡＳＩＬ  ＯＤＳ  ２０φ×２５０ｍｍ）により最終精製を行った。５５％アセトニトリル水溶液を移動相とし、９ｍＬ／ｍｉｎ．の流速において、ＵＶ２１０ｎｍの吸収をモニターした。保持時間２０分のピークを分取して分取液を減圧下濃縮し、残渣水溶液を凍結乾燥することによりステンフォンＢ物質を収量５８ｍｇで単離した。
【産業上の利用可能性】  以上のことから、新規ステンフォン類を生産する能力を有するアスペルギルス属に属するＦＫＩ−２１３６株を代表とする微生物を培地に培養して、その培養液中から採取したステンフォン類は、抗菌剤として利用されているβ−ラクタム抗生物質と併用することによりその効果を増強する作用を有することから、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）感染症やβ−ラクタム抗生物質耐性を含む多剤耐性菌を起因とする感染症の治療薬として有用であると期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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