(57)【要約】  本発明は化粧料や皮膚科領域の薬剤として期待される高分子量フコイダンの製造方法並びに高分子量フコイダン含有組成物を提供する。  オキナワモズク属（Cladosiphon）のモズクをｐＨ６．０以上の中性〜アルカリ性で熱水抽出し、限外ろ過による低分子化合物除去の操作を経て、最終的なｐＨを６．５以上に調整することにより得られる重量平均分子量１，０００，０００〜２，０００，０００のフコイダン含有物は、化粧料及び皮膚科領域の薬剤として有効であり保存安定性に優れる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オキナワモズク属（Cladosiphon）のモズク藻体からｐＨ６．０以上で熱水抽出する工程と、  ｐＨ６．５以上を維持して低分子化合物を除去する工程と、  最終的なｐＨを６．５以上に調整する工程とを含み、  重量平均分子量が１，０００，０００〜２，０００，０００のフコイダンを得る、フコイダンの製造方法。
【請求項２】
オキナワモズク属（Cladosiphon）のモズク藻体からｐＨ６．０以上で熱水抽出する工程と、  ｐＨ６．５以上を維持して低分子化合物を除去する工程と、  最終的なｐＨを６．５以上に調整する工程とを含む製造方法から得られる重量平均分子量が１，０００，０００〜２，０００，０００のフコイダン。
【請求項３】
重量平均分子量が１，０００，０００〜２，０００，０００であるフコイダン。
【請求項４】
乾燥残渣の重量が１．０〜２．０重量％である水溶液のＣ型粘度計による２０ｒｐｍ、２５℃での粘度が６００〜１５００ｍＰａ・ｓである請求項２または３に記載のフコイダン。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれかに記載のフコイダンを含む、フコイダン含有組成物。
【請求項６】
前記フコイダン含有組成物が化粧料、皮膚細胞賦活剤又は抗アレルギー剤である、請求項５に記載のフコイダン含有組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、海藻から得られる重量平均分子量１，０００，０００〜２，０００，０００の高分子量フコイダンの製造方法、並びに高分子量フコイダン及び高分子量フコイダンを含有するフコイダン含有組成物、特に皮膚科領域用組成物（化粧料、皮膚細胞賦活剤及びアレルギー剤）に関する。
【背景技術】
【０００２】  フコイダンは主要構成糖として硫酸化フコースを含む酸性多糖高分子の一種であり、モズクやコンブなどの褐藻類に含まれる粘性成分である。フコイダンは、抗腫瘍、抗胃潰瘍、抗ウイルス、抗炎症、抗血液凝固、免疫増強など種々の薬理作用を有する。加えて、保湿機能、皮膚細胞賦活作用、抗アレルギー作用、凝集作用、増粘作用、界面活性作用などを有しているため、化粧料や皮膚科薬剤の領域で期待される物質である。  フコイダン又はフコイダン含有物をモズク、コンブ、ワカメ，ヒバマタ等の褐藻類から製造する方法については多くの技術が開示されている。  尚、本明細書における「フコイダン含有物」は、原料藻体からフコイダンを抽出する任意のフコイダン製造方法を用いて得られた固体状又は液体状の物質であってフコイダンを含有するものを称することとする。  一般的なフコイダン製造方法では、酸性条件下でフコイダンが抽出される（特許文献１〜７）。しかしながら、フコイダンは単糖がアセタール結合で繋がっている構造であるため、酸性条件での加熱、あるいは長期間の保存によって分子量が低下するという問題が存在する。【０００３】  フコイダンについては、各種分子量のものが知られている。  例えば、特許文献６には、養殖イトモズクから得られる重量平均分子量５００，０００のフコイダンが記載されている。  また、特許文献７には、養殖オキナワモズクから得られる重量平均分子量５００，０００〜６００，０００のフコイダンが記載されている。  特許文献３には、オキナワモズクからｐＨ２〜８の条件下、オートクレーブにより加圧熱水抽出を行うことで得られる重量平均分子量１０，０００〜５００，０００のフコイダンが記載されている。  特許文献４には、オキナワモズクからの有機酸による抽出によって得られる重量平均分子量１８０，０００のフコイダンが記載されている。  特許文献８にはモズク藻体を熱水抽出して得られる重量平均分子量約１００，０００のフコイダンが記載されている。  さらに、特許文献９には、ホソモズクを中性で熱水抽出して得られる重量平均分子量５０，０００〜５００，０００のフコイダンが記載されている。  しかしながら、天然物を原料として得られるフコイダンについて重量平均分子量１，０００，０００を超えるフコイダンの製造方法はこれまで提示されていない。  非特許文献２には重量平均分子量が９０９，０００のフコイダンが記載されているが、分子量測定の標準品としてプルランを用いている。プルランは直鎖状の多糖であり、一方フコイダンは分岐を多く有する多糖であるため、両者の分子量と分子サイズの関係には大きな隔たりがある。従って、フコイダンなどの分岐状の多糖を、プルランを標準品として分子量を測定した場合、多角度光散乱検出器を用いて測定される重量平均分子量よりかなり大きな数値になる。実際、発明者らによって、プルランを標準品としたフコイダンの分子量の測定を行ったところ、多角度光散乱検出器での重量平均分子量が１，８４５，０００であるのに対して（実施例３参照）、プルランを標準品とした分子量の測定では１７，４００，０００であった（参考例１参照）。【０００４】  一方、化粧料は種々の成分により構成される。それらの成分中の増粘剤は、化��料中の薬剤の粘性を保持し、乳化剤などと共にその組成の安定性に寄与するだけでなく、化粧料の使用感触（滑らかさ、しっとり感、べとつかないなど）に与える影響が大きい（非特許文献１）。  コンブ、アラメ、ワカメから分離精製されるフコイダンについては、その粘性に着目して化粧料へ応用されている（特許文献１１）。特許文献１１には、フコイダンを含む化粧料を皮膚に塗布した場合、滑らかで使用感に優れており、皮膚をしっとりとした滑らかな状態に保つことが記載されている。  特許文献１２には、褐藻類のマツモ属、モズク属、カジメ属、レッソニア属、マクロシスティス属、ヒバマタ属、アスコフィラム属及びダービリア属のフコイダンに生体ヒアルロン酸合成作用、ヒアルロニダーゼ阻害作用、ヒスタミン遊離抑制作用を有することが記載されている。  しかしながら、オキナワモズク属（Cladosiphon）由来のフコイダンを化粧料又は皮膚科領域の薬剤に用いることは提示されていない。  このように、フコイダンは化粧料や抗アレルギー作用など皮膚科領域の薬剤として期待されているが、これまでに、これらの分野で重要な粘性、使用感触又は抗アレルギー作用などのフコイダンの機能とその重量平均分子量との関係について検討された事例はない。【特許文献１】特開平１０−１９１９４０号公報
【特許文献２】特開平１１−３５５９１号公報
【特許文献３】特開平２０００−２３９３０１号公報
【特許文献４】特開平２０００−２３９３０２号公報
【特許文献５】特開平２０００−３５１８０１号公報
【特許文献６】特開平１０−１９５１０６号公報
【特許文献７】特開平１０−２３７１０３号公報
【特許文献８】特開平７−１３８１６６号公報
【特許文献９】特開平１０−７０９７０号公報
【特許文献１０】特公平６−１１７６３号公報
【特許文献１１】特公平７−１４８５０号公報
【特許文献１２】特開平１１−２１２４７号公報
【特許文献１３】特開平２００１−１５１７８８号公報
【非特許文献１】光井武夫編，「新化粧品学」，第１版４刷，南山堂，１９９９，ｐ．５−７，ｐ．１４７−１４８
【非特許文献２】“理研メカブフコイダン”、［ｏｎｌｉｎｅ］、［平成１８年２月２２日検索］、インターネット＜http://www.rike-vita.co.jp/prouse/health/mekabufukoidan.html＞
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  本発明は、化粧料や皮膚科領域の薬剤として期待される高分子量フコイダンを製造する方法及び高分子量フコイダンを含む化粧料等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】  本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、オキナワモズク属（Cladosiphon）のモズクをｐＨ６．０以上の中性〜アルカリ性で熱水抽出し、限外ろ過による低分子化合物除去の操作を経て、最終的なｐＨを６．５以上に調整することにより重量平均分子量１，０００，０００〜２，０００，０００のフコイダンを取得した。さらに、こうして得られたフコイダンが長期間安定に存在することを見出し、本発明を完成した。  即ち、第１の発明は、オキナワモズク属（Cladosiphon）のモズク藻体をｐＨ６．０以上で熱水抽出し、ｐＨ６．５以上を維持して低分子化合物除去の操作を行い、かつ最終的なｐＨを６．５以上に調整して得ることを特徴とする、重量平均分子量が１，０００，０００〜２，０００，０００であり、かつ安定なフコイダンの製造方法である。【０００７】  第２の発明は、上記第１の発明の方法で得られたフコイダンである。【０００８】  第３の発明は、重量平均分子量が１，０００，０００〜２，０００，０００であるフコイダンである。【０００９】  第４の発明は、第２または第３の発明において、乾燥残渣の重量が１．０〜２．０重量％である水溶液のＣ型粘度計による２０ｒｐｍ、２５℃での粘度が６００〜１５００ｍＰａ・ｓであるフコイダンである。【００１０】  第５の発明は、第２〜第４のいずれかの発明のフコイダンを含む、フコイダン含有組成物である。【００１１】  第６の発明は、第５の発明のフコイダン含有組成物を、化粧料、皮膚細胞賦活剤又は抗アレルギー剤としたものである。
【発明の効果】
【００１２】  本発明の製造方法によれば、重量平均分子量１，０００，０００〜２，０００，０００のフコイダンが得られる。これは、従来技術の製造方法では得られなかった高分子量のフコイダンである。斯かるフコイダンは、保湿性等に優れ、化粧料及び皮膚科領域の薬剤等におけるフコイダン含有組成物の成分として有効であるのみならず、保存安定性に優れる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】  本発明の原料としてのモズクは高分子量フコイダンの含有率の高さからオキナワモズク属（Cladosiphon）のモズクが好ましい。また、そのモズクは生の状態であっても乾燥された状態であってもよく、アルコールなどで脱水処理されたものでも良い。【００１４】  本発明の製造方法で得られる重量平均分子量１，０００，０００〜２，０００，０００の高分子量フコイダンは、化粧料（化粧水、ヘアートリートメント等）及び皮膚科領域の薬剤（皮膚細胞賦活剤又は抗アレルギー剤）等の組成物の成分として好適に含有させることができる。  以下、本発明の高分子量フコイダンの製造方法を工程に沿って説明する。＜熱水抽出工程＞  抽出操作は，最初に水道水あるいは精製水にモズクを懸濁させて懸濁液とした上で行われる。これらの水の使用量は効率良くフコイダンを抽出できる量であれば特に限定されないが、例えば乾燥モズクを用いる場合には、乾燥モズク１ｇに対して水５０〜３００ｇ使用することが好ましい。【００１５】  次いで、上記懸濁液を抽出開始時にはアルカリ性水溶液にするために水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属塩や水酸化カルシウム、水酸化バリウムなどのアルカリ土類金属の水酸化物を溶解させるが、食品添加物としても使用できる水酸化カリウムが好ましい。このアルカリ性水溶液の濃度は、０．００５〜０．１ｍｏｌ／Ｌ（リットル）が好ましい。【００１６】  フコイダンの抽出時には、フコイダン含有液体の脱色、脱臭のため濃度３０重量％の過酸化水素水を適宜量（例えば乾燥モズクを使用した場合には乾燥モズクの重量に対して０〜２倍量）使用しても良い。  熱水抽出の抽出温度は７０〜１００℃、抽出時間は０．５〜２時間とすることが好ましい。抽出温度が高すぎ、あるいは時間が長すぎると分子量低下に繋がるためである。ｐＨは６．０以上に保持する。  抽出後の懸濁液は遠心分離機やフィルタープレス等の粘性物質を効率よくろ過できる装置を用いて抽出残渣を除去される。その際、珪藻土等のろ過助剤を加えてもよく、より完全に脱色するためには、ろ過前に活性炭を加えても良い。【００１７】＜低分子化合物除去工程＞  抽出残渣を除いた後の透明なフコイダン含有液体は、限外ろ過又は透析等の方法により、低分子化合物が除去されるが、時間的な効率面から限外ろ過が好ましい。限外ろ過膜としては、分画分子量が６，０００〜１０，０００のものを使用する事が好ましい。なお、酸性条件下での操作は分子量を低下させる傾向があるため、低分子化合物除去の操作が終了するまで、ｐＨを６．５以上、好ましくはｐＨ６．５〜７．５に保持することが必要である。【００１８】＜ｐH調整工程＞  限外ろ過後のフコイダン含有液体は、塩酸、硫酸等の鉱酸によって中和しても良いが、保存安定性及び化粧料などとしての使用を考慮してｐＨ６．５以上、好ましくはｐＨ６．５〜７．５に保持することが必要である。これは、一般に皮膚刺激性等から弱酸性から中性域が好ましいことによる。【００１９】  こうして得られた透明水溶液であるフコイダン含有液体は、そのまま化粧料等の原料として用いても良いが、スプレードライや凍結乾燥の手法で粉末化しても良く、またアルコールを加えて析出した沈殿をろ別し、定法で乾燥��て使用しても良い。但しろ別した沈殿を加熱乾燥する場合には、分子量低下を避けるために７０℃以下で行うことが好ましい。
【実施例】
【００２０】＜実施例１＞  トンガ産モズク（Cladosiphon novae-caledoniae）の生の藻体に濃度５０重量％となるようにエタノールを添加し、３０分間浸漬して脱色した後、エタノール分を遠心ろ過によってできる限り除いて加工モズクを調製した。  水１３５０ｍｌ中に前記加工モズク１５０ｇを入れ、続いて濃度３０重量％の過酸化水素水１３．２ｇと水酸化カリウム０．８４ｇを加え、９０〜９５℃で１時間攪拌した。５０℃まで冷却後、残渣をろ別して除いた。  得られたろ液がｐH＝６．３であったため、１ｍｏｌ／Ｌ（リットル）の水酸化カリウム水溶液でｐH＝７．２とした。  次いで、分画分子量１００００の限外ろ過膜を用いて体積として約１／５量にまで濃縮した。  得られた水溶液を１ｍｏｌ／Ｌ（リットル）の希硫酸でｐＨ＝６．５に調製した。  さらに、この溶液をカタラーゼ処理して過酸化物を分解させて、フコイダン水溶液を得た。  上記フコイダン水溶液の乾燥残渣の重量（７０℃，８時間，常圧）は、元の水溶液に対して１．２重量％であった。  また、このフコイダン水溶液からフコイダンをエタノール沈殿させ（実施例２参照）、多角度光散乱検出器にて重量平均分子量を測定したところ１，８４５，０００であった（実施例３参照）。  以下、このフコイダン水溶液を「高分子量フコイダン水溶液（実施例１）」と称する。【００２１】＜比較例１＞  トンガ産モズク（Cladosiphon novae-caledoniae）の生の藻体に濃度５０重量％となるようにエタノールを添加し、３０分間浸漬して脱色した後、エタノール分を遠心ろ過によってできる限り除いて加工モズクを調製した。  水１３５０ｍｌ中に前記加工モズク１５０ｇを入れ、続いて濃度３０重量％の過酸化水素水１３．２ｇを加えた後、濃度１ｍｏｌ／Ｌ（リットル）の希硫酸でｐＨ＝３に調整し、９０〜９５℃で１時間攪拌した。５０℃まで冷却後、残渣をろ別して除いた。  次いで、分画分子量１００００の限外ろ過膜を用いて体積として約１／５量にまで濃縮した。  得られた水溶液を濃度１ｍｏｌ／Ｌ（リットル）の水酸化カリウムでｐＨ＝６．５に調製した。  さらに、この溶液をカタラーゼ処理して過酸化物を分解させて、フコイダン水溶液を得た。  以下、「酸性抽出フコイダン水溶液」と称する。【００２２】＜実施例２＞エタノール沈殿物の調製  高分子量フコイダンのエタノール沈殿物の調製  実施例１で得られた高分子量フコイダン水溶液１００ｇを、５０℃、減圧下で水を除き、体積を約１／２量に濃縮した。得られた濃縮液の体積の４倍量のエタノールを添加してフコイダンを沈殿させ、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分、４℃）した。その後、得られた残渣をエタノールで２回洗浄し、減圧下（０．００１ＭＰａ）、温度５０℃で乾燥させて高分子量フコイダンのエタノール沈殿物（０．８７６ｇ）を調製した。  以下、「高分子量フコイダン」と称する。【００２３】＜比較例２＞加水分解フコイダン水溶液及びそのエタノール沈殿物の調製  実施例１で得られた高分子量フコイダン水溶液１００ｇを２規定の硫酸でｐＨ５に調整し、それぞれの温度、時間で加熱処理（７０℃で１時間、７０℃で２時間、９０℃で１時間）し、加水分解フコイダン水溶液を得た。  これら加水分解フコイダン水溶液を、以下、それぞれ、加水分解フコイ���ン水溶液（７０℃、１時間）、加水分解フコイダン水溶液（７０℃、２時間）、加水分解フコイダン水溶液（９０℃、１時間）と称す。  これら加水分解フコイダン水溶液１００ｍｌから同様にエタノール沈殿を行って、加水分解フコイダンのエタノール沈殿物を得た。  これら加水分解フコイダンのエタノール沈殿物を、以下、それぞれを「加水分解フコイダン（７０℃、１時間）」、「加水分解フコイダン（７０℃、２時間）」、「加水分解フコイダン（９０℃、１時間）」と称す。【００２４】＜実施例３＞  重量平均分子量の測定    実施例２で得られた高分子量フコイダン及び比較例２で得られた加水分解フコイダンの各エタノール沈殿物を、それぞれ濃度０．１ｍｏｌ／Ｌ（リットル）の塩化ナトリウム水溶液に溶解し、０．０５重量％の溶液とした後、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）（カラム：SB-806HQ（Shodex製）、カラム温度：室温(２５℃)、溶離液：濃度０．１ｍｏｌ／Ｌ（リットル）の塩化ナトリウム水溶液、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出器：ＲＩ検出器)に付し、それぞれのフコイダンの重量平均分子量（Ｍｗ）を多角度光散乱検出器（DAWN EOS（登録商標第4377194号）：Wyatt製）により解析した。  その結果を表１に示す。【００２５】
【表１】
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＜参考例１＞  実施例３で使用した高速液体クロマトグラフィー、カラム、RI検出器を用い、市販のプルラン（分子量１８０〜７８８，０００）を標準として相対的に高分子フコイダンの重量平均分子量を求めたところ、１７，４００，０００であった。
【００２６】＜実施例４−１＞  粘度の測定  実施例１で調製した高分子量フコイダン水溶液（乾燥残渣の重量：１．２重量％）、実施例２で調製した各加水分解フコイダン水溶液および比較例１で調製した酸性抽出フコイダン水溶液について、C型粘度計により２０ｒｐｍ、２５℃で粘度を測定した。  その結果を表２に示す。【表２】
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【００２７】  実施例１で調製した高分子量のフコイダン水溶液は高い粘性を示すのに対し、比較例２で調製した加水分解フコイダン水溶液及び比較例１で調製した酸抽出フコイダン水溶液の粘性は低いことが明らかとなった。【００２８】＜実施例４−２＞  トンガ産モズク（Cladosiphon novae-caledoniae）の生の藻体に濃度５０重量％となるようにエタノールを添加し、３０分間浸漬して脱色した後、エタノール分を遠心ろ過によってできる限り除いて加工モズクを調製した。  水１３５０ｍｌ中に前記加工モズク１５０ｇを入れ、続いて濃度３０重量％の過酸化水素水１３．２ｇと水酸化カリウム０．８４ｇを加え、９０〜９５℃で１時間攪拌した。５０℃まで冷却後、残渣をろ別して除いた。  得られたろ液がｐH＝６．４であったため、１ｍｏｌ／Ｌ（リットル）の水酸化カリウム水溶液でｐH＝６．８とした。  次いで、分画分子量１００００の限外ろ過膜を用いて体積として約１／５量にまで濃縮した。  得られた水溶液を１ｍｏｌ／Ｌ（リットル）の希硫酸でｐＨ＝６．６に調製した。  さらに、この溶液をカタラーゼ処理して過酸化物を分解させて、フコイダン水溶液を得た。  上記フコイダン水溶液の乾燥残渣の重量（７０℃，８時間，常圧）は、元の水溶液に対して１．８８重量％であった。  また、このフコイダン水溶液から実施例２と同様にして、フコイダンをエタノール沈殿させ、多角度光散乱検出器にて重量平均分子量を測定したところ１３．０×１０５であった。  また、実施例４−１と同様に粘度を測定したところ、粘度は１０７０ｍＰａ・ｓであった。【００２９】＜実施例４−３＞  トンガ産モズク（Cladosiphon novae-caledoniae）の生の藻体に濃度５０重量％となるようにエタノールを添加し、３０分間浸漬して脱色した後、エタノール分を遠心ろ過によってできる限り除いて加工モズクを調製した。  水１３５０ｍｌ中に前記加工モズク１５０ｇを入れ、続いて濃度３０重量％の過酸化水素水１３．２ｇと水酸化カリウム０．８４ｇを加え、９０〜９５℃で１時間攪拌した。５０℃まで冷却後、残渣をろ別して除いた。  得られたろ液がｐH＝６．４であったため、１ｍｏｌ／Ｌ（リットル）の水酸化カリウム水溶液でｐH＝７．５とした。  次いで、分画分子量１００００の限外ろ過膜を用いて体積として約１／５量にまで濃縮した。  得られた水溶液を１ｍｏｌ／Ｌ（リットル）の希硫酸でｐＨ＝６．７に調製した。  さらに、この溶液をカタラーゼ処理して過酸化物を分解させて、フコイダン水溶液を得た。  上記フコイダン水溶液の乾燥残渣の重量（７０℃，８時間，常圧）は、元の水溶液に対して１．５１重量％であった。  また、このフコイダン水溶液から実施例２と同様にして、フコイダンをエタノール沈殿させ、多角度光散乱検出器にて重量平均分子量を測定したところ１３．２×１０５であった。  また、実施例４−１と同様に粘度を測定したところ、粘度は１０５０ｍＰａ・ｓであった。【００３０】＜実施例４−４＞  トンガ産モズク（Cladosiphon novae-caledoniae）の生の藻体に濃度５０重量％となるようにエタノールを添加し、３０分間浸漬して脱色した後、エタノール分を遠心ろ過によってできる限り除いて得た加工モズク５ロットについて、実施例１にしたがって高分子量フコイダン水溶液を調整し、それぞれの乾燥残渣の重量と粘度とを調べた。なお、乾燥残渣の重量は７０℃、８時間、常圧下で乾燥したものの、元の水溶液の重量に対する重量比（重量％）であり、粘度はC型粘度計を用い、２５℃で測定した。【表３】
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【００３１】＜実施例５＞化粧水の調製（１）高分子量フコイダンの化粧水の調製  実施例１で調製した高分子量フコイダン水溶液（乾燥残渣の重量：１．２％）９．９５ｇにフェノキシエタノールを０．０５ｇ加え、高分子量フコイダンの化粧水を調製した。  以下、「高分子量フコイダンの化粧水」と称する。（２）加水分解フコイダンの化粧水の調製  実施例２で得られた加水分解フコイダン（90℃，1時間）エタノール沈殿物０．６ｇを精製水に溶解（乾燥残渣の重量：１．２重量％）して４９．７５gとし、フェノキシエタノール０．２５ｇを添加し、加水分解フコイダンの化粧水を調製した。  以下、「加水分解フコイダンの化粧水」と称する。【００３２】＜実施例６＞官能効果の評価  実施例５で調製した各化粧水について，パネラー７名（３６歳から５９歳）の手の甲に化粧水又は精製水を１滴塗布し，使用感触の好み，肌の滑らかさ，しっとり感について評価を行った．評価は，使用感触が好き（１）、普通（０）、嫌い（−１）、滑らかさやしっとり感の有り（１）、無し（０）で行い、それらの合計を集計した。  その結果を表４に示す。【００３３】
【表４】
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【００３４】  高分子量フコイダンの化粧水は、加水分解フコイダンの化粧水に比べ使用感触が良く、滑らかさやしっとり感を与えることが確認された。【００３５】＜実施例７＞保湿性の評価  実施例１で調製した高分子量フコイダン水溶液について、パネラー５名（２６歳から５８歳の男性３名及び女性２名）による即時的な保湿性の評価を行った。すなわち、前腕内側部に高分子量フコイダン水溶液又は精製水を１０ｍｇ／ｃｍ２塗布し、１５分、３０分及び４５分後に皮表角層水分量測定装置（SKICON200：I.B.S.Co.Ltd.）を用いて皮膚表面水分量を測定した。  その結果を表５に示す。【００３６】
【表５】
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【００３７】  １５、３０及び４５分後のいずれの場合にも高分子量フコイダン水溶液は精製水に比べ保湿性を有することが示された。【００３８】＜実施例８＞ヒアルロニダーゼ阻害活性の測定  特許文献１３に記載の方法に準じて、牛睾丸由来のヒアルロニダーゼ（Sigma,Type IV-S）を用いてコンパウンド４８／８０による不活性型ヒアルロニダーゼの活性化段階の阻害活性を測定した。すなわち、実施例２で得られた高分子量フコイダンのエタノール沈殿物と比較例２の加水分解フコイダン（90℃，1時間）のエタノール沈殿物（加水分解フコイダン（90℃，1時間））を、それぞれ濃度０．１ｍｏｌ／Ｌ（リットル）の酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）０．２ｍｌに溶かして試験管に取り、同緩衝液０．１ｍｌに溶かしたヒアルロニダーゼ（１００ｕｎｉｔｓ）を加え、３７℃で２０分間インキュベートした。  その後、同緩衝液０．２ｍｌに溶かしたコンパウンド４８／８０（０．１ｍｇ）を加え、さらに３７℃で２０分間インキュベートした。  これに同緩衝液０．５ｍｌに溶かしたヒアルロン酸ナトリウム塩（０．４ｍｇ）を加えて３７℃で４０分間インキュベートした後、濃度０．４ｍｏｌ／Ｌ（リットル）の水酸化ナトリウム水溶液０．２ｍｌを加えて氷冷し、ほう酸溶液（四ホウ酸カリウム４水和物４．５ｇを水に溶かし全量を１００ｍｌとしたもの）（ｐＨ９．１）０．２ｍｌを加えて３分間煮沸した。  氷冷後，ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド試薬６ｍｌを加えて、３７℃で２０分間インキュベートした後、５８５ｎｍにおける吸光度を測定した。  阻害率は以下の式により算出した。５０％阻害濃度（IC50）は、各濃度の阻害率から作成したヒアルロニダーゼの阻害曲線から求めた。【００３９】（数１）阻害率＝（Ａ−Ｂ）／Ａ×１００  （％）【００４０】Ａ：対照（フコイダンの代わりに酢酸緩衝液を用いた）の吸光度Ｂ：フコイダン溶液の吸光度【００４１】  測定結果を表６に示す。【００４２】
【表６】
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【００４３】  この結果から、高分子量フコイダンのヒアルロニダーゼ阻害活性は、加水分解フコイダンよりも１．６倍強いことが認められた。【００４４】＜実施例９＞保存安定性試験（加速試験）  実施例５で調製した高分子量フコイダンの化粧水について、温度４０℃、２０００Lｕｘ（ルクス）の照明下、４週間保存し安定性を評価した。粘度はＥ型粘度計（EHD型）を用い、コーン３°、回転数２０ｒｐｍで測定した。外観は目視により評価した。  その結果を表７に示す。【００４５】
【表７】
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【００４６】  ４０℃、４週間保存後も粘度の低下や外観の変化は認められず、保存安定性に優れていることが明らかとなった。【００４７】＜実施例１０＞  保湿性の評価（２）  （実施例７とは別実験）  被験者の前腕内側部を石鹸により洗浄した。乾燥後、２１℃、相対湿度５０％でコンディショニングした後、直径２ｃｍの円を1試験区につき４つずつ（２試験区／腕）両腕に描き、円の内側に蒸留水、高分子量フコイダン水溶液（実施例１）、加水分解フコイダン水溶液（７０℃，１時間）、加水分解フコイダン水溶液（７０℃，２時間）、加水分解フコイダン水溶液（９０℃，１時間）のそれぞれのエタノール沈殿物を精製水に溶解して調製した１重量％の水溶液を10μLずつ塗布した。処理後２００分間上記環境下で安静にし、CORNEOMETER CM825(CK electronic GmbH)を用いて皮膚水分を計測し、４区の平均値を算出した。精製水塗布区の数値を１として、相対皮膚水分を計算した。  その結果を表８に示す。【００４８】
【表８】
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【００４９】  高分子量フコイダンは精製水、加水分解フコイダンに比べ、有意に高い保湿性を示した。【００５０】＜実施例１１＞  保水性評価  精製水、高分子量フコイダン、加水分解フコイダン（７０℃，１時間、７０℃，２時間９０℃，１時間）加水分解フコイダン水溶液（７０℃，２時間）、加水分解フコイダン水溶液（９０℃，１時間）のそれぞれのエタノール沈殿物を精製水に溶解して調整した０．５重量％水溶液を１０μＬずつろ紙に処理し、２１℃、相対湿度５０％の環境下で電子天秤により1分ごとに重量を測定し、水分蒸発量を求めた。１０分後までの計測により水分蒸発速度を算出し、精製水の蒸発速度を1としたときの相対蒸発速度を求めた。  その結果を表９に示す。【００５１】
【表９】
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【００５２】＜実施例１２＞  ヘアトリートメント溶液の調製  実施例１で調製した高分子量フコイダン水溶液（乾燥残渣の重量：１．２％）、実施例２で調製した加水分解フコイダン水溶液（９０℃，１時間）、精製水、エタノールを用いてヘアトリートメント溶液を調製した。  各ヘアトリートメント溶液の組成を表１０に示す。【００５３】
【表１０】
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注：表中の数値は、フコイダン水溶液、精製水及びエタノールの重量比を表す。ヘアトリートメント溶液Ａにおいて、フコイダン水溶液は、高分子量フコイダン水溶液（実施例１）を使用し、ヘアトリートメント溶液Ｂにおいて、フコイダン水溶液は、加水分解フコイダン水溶液（９０℃，１時間）を用いた。
【００５４】＜実施例１３＞  損傷人毛を用いた官能評価  人毛黒髪（ビューラックス製，１０ｇ）を市販のブリーチ剤で５回処理して損傷人毛を調製した。洗浄、乾燥後、実施例１２のヘアトリートメント溶液Ａ２ｍｌをスプレー処理して乾燥させた。乾燥後、指先でのすべり、しっとり感、柔軟感をヘアトリートメント溶液Ｂと比較した。その結果を表１１に示す。なお、比較例２に比べ優れている場合は○、同等の場合は△、劣る場合は×とした。【００５５】
【表１１】
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【００５６】＜実施例１４＞  細胞賦活評価  ヒト表皮繊維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ株）を５．０×１０３  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６穴プレートにシーディング(seeding)し、ＤＭＥＭ培地（牛血清１％）で４８時間前培養した。培地を実施例１で調製した高分子量フコイダン水溶液（乾燥残渣の重量：１．２％）、実施例２で調製した加水分解フコイダン水溶液（７０℃，１時間）、加水分解フコイダン水溶液（７０℃，２時間）のそれぞれのエタノール沈殿物を所定濃度で含むＤＭＥＭ培地に交換した後、さらに４８時間培養し、ＷＳＴ−１アッセイに供した。陰性対照（ＤＭＥＭ培地（牛血清１％）フコイダン無添加）の値を１００％とした相対値で細胞賦活活性を示した。いずれも２連で実施した。その結果を表１２に示す。【００５７】
【表１２】
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【００５８】  表中の数値は、陰性対照（ＤＭＥＭ培地（牛血清１％））の値を１００％とした細胞賦活活性の相対値を示す。【００５９】＜実施例１５＞フコイダンの構成成分  実施例２で得られた高分子量フコイダン沈殿物をギ酸（135℃、6時間）、引き続き２Mトリフルオロ酢酸（120℃、6時間）にて加水分解を行い、HPLC（カラム：Cosmosil Sugar-D，ナカライテスク製、溶媒：アセトニトリル：10mMりん酸緩衝溶液＝75:25、流速：1.0mL/min、RI検出器）で分析した。その結果、主な構成糖はフコースであり、グルクロン酸も含有することがわかった。また、高分子量フコイダン沈殿物をロジソン酸法により分析して、硫酸基含量を、重水中に溶解して60℃でNMR（500MHz、日本電子製）測定し、1.3ppm付近のフコースのメチル基ピークと2.2ppmのアセチル基ピークの面積比からアセチル基含有比を求めた。フコースを1.0とした場合のグルクロン酸、及びアセチル基の含有比を表１３に示す。【００６０】
【表１３】
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【００６１】  硫酸基は沈殿に対し、16.9重量%含有していることがわかった。
【国際調査報告】
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