(57)【要約】〔課題〕  本発明は、アドレノメデュリンを用いて障害組織を再生または修復する方法の提供を課題とする。また、アドレノメデュリンを有効成分とする、障害組織を再生または修復する薬剤の提供も課題とする。〔解決手段〕  上記課題を解決するために、本願発明者らは、C57BL／6マウスに対してアドレノメデュリン（以下AMと表記する）または生理食塩水を投与し、血中の単核細胞およびSca-1陽性細胞の数を算定した所、AMは血中の単核細胞および幹細胞抗原-1陽性細胞の数を増加させることが明らかとなった。また、肺気腫モデルマウスおよび急性心筋梗塞モデルラットに、AMを投与することで、障害組織に遊走・定着する骨髄由来細胞の量が増加し、また、動員された骨髄細胞は病変局所において血管、肺胞、心筋に分化することが明らかとなった。さらに、心筋梗塞・肺気腫モデルにおける梗塞サイズの減少、肺胞径の拡大の抑制、およびそれぞれ臓器の機能の改善が確認された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アドレノメデュリンを対象に投与する工程を含む、対象における障害組織を再生または修復する方法
【請求項２】
アドレノメデュリンを対象に投与する工程を含む、対象における障害組織への骨髄由来細胞の遊走、定着を促進させる方法
【請求項３】
アドレノメデュリンを対象に投与する工程を含む、骨髄由来細胞を対象における障害組織の末梢血中に誘導する方法
【請求項４】
アドレノメデュリンを対象に投与する工程を含む、対象における障害組織の末梢血中に含まれる骨髄由来細胞を増加させる方法
【請求項５】
骨髄由来細胞が幹細胞または前駆細胞を含む細胞である、請求項２〜４のいずれかに記載の方法
【請求項６】
アドレノメデュリンを対象に投与する工程を含む、対象における障害組織の末梢血管や細胞を新生または再生させる方法
【請求項７】
対象における障害組織が、難治性心肺疾患、末梢性血管疾患、腎疾患、肝疾患または脳血管疾患のいずれかにおける障害組織である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法
【請求項８】
対象における障害組織が、肺気腫における障害組織である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法
【請求項９】
対象における障害組織が、肺胞または肺血管における障害組織である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法
【請求項１０】
対象における障害組織が、心筋梗塞、心筋炎、または心筋症のいずれかにおける障害組織である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法
【請求項１１】
アドレノメデュリンを対象に投与する工程を含む、肺容積、静肺コンプライアンス、または平均肺胞径を減少させる方法
【請求項１２】
アドレノメデュリンを有効成分とする、障害組織を再生または修復させる薬剤
【請求項１３】
アドレノメデュリンを有効成分とする、障害組織への骨髄由来細胞の遊走、定着を促進させる薬剤
【請求項１４】
アドレノメデュリンを有効成分とする、骨髄由来細胞を障害組織の末梢血中に誘導する薬剤
【請求項１５】
アドレノメデュリンを有効成分とする、障害組織の末梢血中に含まれる骨髄由来細胞を増加させる薬剤
【請求項１６】
骨髄由来細胞が幹細胞または前駆細胞を含む細胞である、請求項１３〜１５のいずれかに記載の薬剤
【請求項１７】
アドレノメデュリンを有効成分とする、障害組織の末梢血管や細胞を新生または再生させる薬剤
【請求項１８】
障害組織が、難治性心肺疾患、末梢性血管疾患、腎疾患、肝疾患または脳血管疾患のいずれかにおける障害組織である、請求項１２〜１７のいずれかに記載の薬剤
【請求項１９】
障害組織が、肺気腫における障害組織である、請求項１２〜１７のいずれかに記載の薬剤
【請求項２０】
障害組織が、肺胞または肺血管における障害組織である、請求項１２〜１７のいずれかに記載の薬剤
【請求項２１】
障害組織が、心筋梗塞、心筋炎、または心筋症のいずれかにおける障害組織である、請求項１２〜１７のいずれかに記載の薬剤
【請求項２２】
アドレノメデュリンを有効成分とする、肺容積、静肺コンプライアンス、または平均肺胞径を減少させる薬剤
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アドレノメデュリンを用いて障害組織を再生または修復する方法、およびアドレノメデュリンを有効成分とする、障害組織を再生または修復する薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
難治性肺疾患のひとつである肺気腫は、世界的に呼吸機能障害および死の主な原因であり、終末細気管支より末梢部における気腔の異常かつ永続的な拡張であると定義されている（非特許文献１〜３）。肺気腫には作用が部分的に重複する多くのメディエーターが関与しているため、本疾患の進行を予防する有効な治療法は現在存在していない（非特許文献４）。肺気腫における病理学的変化の一つである末梢気道や肺胞壁の破壊はこれまで不可逆的であると考えられてきた。よって現時点では生活の質や運動耐容能の改善を目的とする薬物治療が中心であり、炎症や気道の閉塞性障害の進展抑制に有効な薬剤は存在していない。【０００３】
また、心筋梗塞は冠動脈の閉塞によって心筋が壊死に陥った状態であり、陳旧性心筋梗塞は、慢性心不全の原因として重要である。慢性心不全に対しては不整脈や心筋梗塞の再発、動脈硬化の進展の防止等を目的とした薬物治療が行われるが、壊死した心筋を回復させる友好な治療法は存在しない。近年、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）を用いて骨髄細胞を心筋障害部位に動員し、血管や心筋の再生を促すことで心機能を改善させる試みがなされ始めたが、副作用の問題などから治療薬としては定着していない。
肺気腫や、心筋梗塞などの難治性心肺疾患では障害組織を再生・修復させ、機能回復を図ることが重要であるが、現時点では有効な治療方法が確立されていない。【０００４】
【非特許文献１】Lopez AD, Murray CC. The global burden of disease, 1990-2020. Nat Med 1998;4:1241-1243.
【非特許文献２】Michaud CM, Murray CJ, Bloom BR. Burden of disease--implications for future research. JAMA 2001;285:535-539.
【非特許文献３】American Thoracic Society. Standards for the diagnosis and care of patients with chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med 1995;152:S77-S121.
【非特許文献４】Barnes PJ. Chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med 2000;343:269-280.
【非特許文献５】Ishizawa K, Kubo H, Yamada M, Kobayashi S, Numasaki M, Ueda S, Suzuki T, Sasaki H. Bone marrow-derived cells contribute to lung regeneration after elastase-induced pulmonary emphysema. FEBS Lett 2004;556:249-252.
【非特許文献６】Yamada M, Kubo H, Kobayashi S, Ishizawa K, Numasaki M, Ueda S, Suzuki T, Sasaki H. Bone marrow-derived progenitor cells are important for lung repair after lipopolysaccharide-induced lung injury. J Immunol 2004;172:1266-1272.
【非特許文献７】Kitamura K, Kangawa K, Kawamoto M, Ichiki Y, Nakamura S, Matsuo H, Eto T. Adrenomedullin: a novel hypotensive peptide isolated from human pheochromocytoma. Biochem Biophys Res Commun 1993;192:553-560.
【非特許文献８】Ichiki Y, Kitamura K, Kangawa K, Kawamoto M, Matsuo H, Eto T. Distribution and characterization of immunoreactive adrenomedullin in human tissue and plasma. FEBS Lett 1994;338:6-10.
【非特許文献９】Sakata J, Shimokubo T, Kitamura K, Nishizono M, Iehiki Y, Kangawa K, Matsuo H, Eto T. Distribution and characterization of immunoreactive rat adrenomedullin in tissue and plasma. FEBS Lett 1994;352:105-108.
【非特許文献１０】Martinez A, Miller MJ, Catt KJ, Cuttitta F. Adrenomedullin receptor expression in human lung and in pulmonary tumors. J Histochem Cytochem 1997;45:159-164.
【非特許文献１１】Nishimatsu H, Suzuki E, Nagata D, Moriyama N, Satonaka H, Walsh K, Sata M, Kangawa K, Matsuo H, Goto A, et al. Adrenomedullin induces endothelium-dependent vasorelaxation via the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt-dependent pathway in rat aorta. Circ Res 2001;89 (1):63-70.
【非特許文献１２】Shiojima I, Walsh K. Role of Akt signaling in vascular homeostasis and angiogenesis. Circ Res 2002;90:1243-1250.
【非特許文献１３】Kim W, Moon SO, Sung MJ, Kim SH, Lee S, So JN, Park SK. Angiogenic role of adrenomedullin through activation of Akt, mitogen-activated protein kinase, and focal adhesion kinase in endothelial cells. FASEB J 2003;17:1937-1939.
【非特許文献１４】Tokunaga N, Nagaya N, Shirai M, Tanaka E, Ishibashi-Ueda H, Harada-Shiba M, Kanda M, Ito T, Shimizu W, Tabata Y, et al. Adrenomedullin gene transfer induces therapeutic angiogenesis in a rabbit model of chronic hind limb ischemia: benefits of a novel nonviral vector, gelatin. Circulation 2004;109:526-531
【非特許文献１５】Abe M, Sata M, Nishimatsu H, Nagata D, Suzuki E, Terauchi Y, Kadowaki T, Minamino N, Kangawa K, Matsuo H, Hirata Y, Nagai R. Adrenomedullin augments collateral development in response to acute ischemia, Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003;306(1):10-15
【非特許文献１６】Nagaya N, Kyotani S, Uematsu M, Ueno K, Oya H, Nakanishi N, Shirai M, Mori H, Miyatake K, Kangawa K. Effects of Adrenomedullin Inhalation on Hemodynamics and Exercise Capacity in Patients With Idiopathic Pulmonary Arterial Hypertension. Circulation, 2004;109(3):351-356
【特許文献１】特開平７−１９６６９３
【特許文献２】ＷＯ０１／０２７３１０
【特許文献３】ＷＯ００／０７８３３９
【特許文献４】ＷＯ００／０７８３３８
【特許文献５】特開２００３−３００８９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
アドレノメデュリン（以下「AM」と表記することもある）は強力な血管拡張性ペプチドであり、最初にヒト褐色細胞腫から単離され（非特許文献７）、その後、免疫反応性AMが肺をはじめとする種々の組織で検出された（非特許文献８,９）。AM受容体は気道上皮の基底細胞およびII型肺胞細胞において強く発現しているが、これらの細胞はいずれも肺の上皮再生に関与する（非特許文献１０）。最近の研究において、AMが、細胞増殖における多くの重要な段階を調節すると考えられているホスファチジルイノシトール3-キナーゼ／Akt依存的経路を、血管内皮細胞で活性化することが示されている（非特許文献１１〜１４）。これらの所見からみて、AMは肺のホメオスタシスの調節に重要な役割を果たしている可能性が高い。しかしながら、AMが肺再生に関与しているか否か、すなわちAMが肺胞および肺血管系の再生を促進し、それによって肺の構造および機能を改善させるか否かは未だに不明である。【０００６】
近年、サイトカインやケモカインを用いて骨髄中に含まれる幹細胞・前駆細胞を末梢組織へ動員させ、それらを病変局所で血管や心筋、肺胞に分化させることにより臓器を再生させる試みがなされているが（非特許文献５,６）、未だ治療法としては確立していない。アドレノメデュリンは骨髄細胞を末梢へ動員し、障害組織を再生・修復させることから、難治性心肺疾患を始め、脳、肝、腎疾患などによる様々な臓器障害に対する新たな治療薬となり得る可能性がある。【０００７】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、アドレノメデュリンを用いて障害組織を再生または修復する方法を提供することにある。また、アドレノメデュリンを有効成分とする、障害組織を再生または修復する薬剤の提供も課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、まず、C57BL／6マウスに対してアドレノメデュリンまたは生理食塩水を無作為に5日間投与し、血中の単核細胞およびSca-1陽性細胞の数を算定した。その結果、アドレノメデュリンは血中の単核細胞およびSca-1陽性細胞の数を増加させることが明らかとなった。【０００９】
また、ブタ膵エラスターゼまたは生理食塩水の気管内注射後に、マウスを無作為化してアドレノメデュリンまたは生理食塩水の持続注入を14日間行い、投与から28日後に機能分析および組織学的分析を行った。エラスターゼ注射から28日後の時点で、肺胞壁の破壊を伴う気腔拡大が観察された。しかし、アドレノメデュリン注入により、エラスターゼ処置マウスにおける肺容積、静肺コンプライアンスおよび平均肺胞径の増加は有意に抑制されることがわかった。また、アドレノメデュリンはエラスターゼを投与した肺における骨髄由来細胞の数を有意に増加させ、これらの細胞の一部は、サイトケラチン（上皮細胞マーカー）またはフォンビルブラント因子（内皮細胞マーカー）に関して陽性であることもわかった。【００１０】
さらに、急性心筋梗塞モデルラットにおいて、骨髄由来細胞および血管内皮細胞の動態（分布）、および虚血心筋における血管再生へのアドレノメデュリン投与の影響を検討した。その結果、急性心筋梗塞後に骨髄由来細胞が虚血心筋に到達、集積し血管が形成されることが明らかとなった。また、急性心筋梗塞後のアドレノメデュリン投与は、骨髄細胞による血管再生を有為に増加させることが明らかとなった。また、骨髄由来細胞のごく一部は、虚血心筋内に定着し、心筋細胞のマーカーを発現していることが明らかとなった。【００１１】
以上の結果より、本発明者らは、循環調節ペプチドであるアドレノメデュリンを投与することにより障害組織に遊走・定着する骨髄細胞の量が増加すること、また、動員された骨髄細胞は病変局所において血管、肺胞、または心筋細胞を再生することを見出した。さらに、その結果として、小動物を用いた心筋梗塞・肺気腫モデルにおいて梗塞サイズの減少と肺胞径の拡大の抑制が、またそれぞれの機能の改善が認められた。
即ち、本発明者らは、アドレノメデュリンを対象に投与することにより、対象における障害組織を再生または修復する方法を開発することに成功し、これにより本発明を完成するに至った。【００１２】
本発明は、より具体的には、以下の〔１〕〜〔２２〕を提供する。
〔１〕アドレノメデュリンを対象に投与する工程を含む、対象における障害組織を再生または修復する方法
〔２〕アドレノメデュリンを対象に投与する工程を含む、対象における障害組織への骨髄由来細胞の遊走、定着を促進させる方法
〔３〕アドレノメデュリンを対象に投与する工程を含む、骨髄由来細胞を対象における障害組織の末梢血中に誘導する方法
〔４〕アドレノメデュリンを対象に投与する工程を含む、対象における障害組織の末梢血中に含まれる骨髄由来細胞を増加させる方法
〔５〕骨髄由来細胞が幹細胞または前駆細胞を含む細胞である、〔２〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法
〔６〕アドレノメデュリンを対象に投与する工程を含む、対象における障害組織の末梢血管や細胞を新生または再生させる方法
〔７〕対象における障害組織が、難治性心肺疾患、末梢性血管疾患、腎疾患、肝疾患または脳血管疾患のいずれかにおける障害組織である、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法
〔８〕対象における障害組織が、肺気腫における障害組織である、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法
〔９〕対象における障害組織が、肺胞または肺血管における障害組織である、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法
〔１０〕対象における障害組織が、心筋梗塞、心筋炎、または心筋症のいずれかにおける障害組織である、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法 
〔１１〕アドレノメデュリンを対象に投与する工程を含む、肺容積、静肺コンプライアンス、または平均肺胞径を減少させる方法
〔１２〕アドレノメデュリンを有効成分とする、障害組織を再生または修復させる薬剤
〔１３〕アドレノメデュリンを有効成分とする、障害組織への骨髄由来細胞の遊走、定着を促進させる薬剤
〔１４〕アドレノメデュリンを有効成分とする、骨髄由来細胞を障害組織の末梢血中に誘導する薬剤
〔１５〕アドレノメデュリンを有効成分とする、障害組織の末梢血中に含まれる骨髄由来細胞を増加させる薬剤
〔１６〕骨髄由来細胞が幹細胞または前駆細胞を含む細胞である、〔１３〕〜〔１５〕のいずれかに記載の薬剤
〔１７〕アドレノメデュリンを有効成分とする、障害組織の末梢血管や細胞を新生または再生させる薬剤
〔１８〕障害組織が、難治性心肺疾患、末梢性血管疾患、腎疾患、肝疾患または脳血管疾患のいずれかにおける障害組織である、〔１２〕〜〔１７〕のいずれかに記載の薬剤
〔１９〕障害組織が、肺気腫における障害組織である、〔１２〕〜〔１７〕のいずれかに記載の薬剤
〔２０〕障害組織が、肺胞または肺血管における障害組織である、〔１２〕〜〔１７〕のいずれかに記載の薬剤
〔２１〕障害組織が、心筋梗塞、心筋炎、または心筋症のいずれかにおける障害組織である、〔１２〕〜〔１７〕のいずれかに記載の薬剤
〔２２〕アドレノメデュリンを有効成分とする、肺容積、静肺コンプライアンス、または平均肺胞径を減少させる薬剤
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】（A）末梢血単核細胞の数に対するアドレノメデュリン（AM）ボーラス注射の効果、（B）末梢血単核細胞の数に対するAM連続投与の効果、（C）肺におけるSca-1陽性細胞の数に対するAM連続投与の効果、を示す図である。データは平均±SEMである。*P<0.05、生理食塩水群との比較を示す。
【図２】（A）骨髄細胞の上皮系譜への分化の代表的な例を示す写真である。一番左の写真は、緑色蛍光タンパク質（GFP）の蛍光を表す。真ん中の写真は、上皮細胞のマーカーであるサイトケラチンの蛍光を表す。一番右の写真は、それぞれの蛍光を併せて表示したものであり、緑色蛍光タンパク質および上皮細胞のマーカーであるサイトケラチンのどちらでも蛍光を示した箇所を、矢印で示す。倍率400倍。（B）細胞遊走に関する半定量的分析を示す図である。肺胞壁内のGFP陽性細胞の数は生理食塩水群よりもAM群の方が有意に多い。（C）上皮分化に関する半定量的分析を示す図である。GFP／サイトケラチン二重陽性細胞の数は生理食塩水群よりもAM群の方が有意に多い。
【図３】（A）ヘマトキシリン-エオシンで染色した肺組織の代表的な例を示す写真である。エラスターゼの気管内注射は、マウス肺において肺胞壁の破壊を伴う気腔拡大の発生を誘導した（生理食塩水群）。AM注入により、エラスターゼで誘発される気腫性変化は減弱化した（AM群）。倍率100倍。（B）肺気腫の形態計測パラメーターである平均肺胞径を用いた肺組織の半定量的分析を示す図である。データは平均±SEMである。*P<0.05、偽処置群との比較；†P<0.05、生理食塩水群との比較を示す。
【図４】（A）骨髄細胞の内皮系譜への分化の代表的な例を示す写真である。一番左の写真は、緑色蛍光タンパク質（GFP）の蛍光を表す。真ん中の写真は、内皮細胞のマーカーであるフォンビルブラント因子（vWF）の蛍光を表す。一番右の写真は、それぞれの蛍光を併せて表示したものであり、緑色蛍光タンパク質および内皮細胞のマーカーであるフォンビルブラント因子（vWF）のどちらでも蛍光を示した箇所を、矢印で示す。倍率400倍。（B）内皮分化に関する半定量的分析を示す図である。GFP／vWF二重陽性細胞の数は生理食塩水群よりもAM群の方が有意に多かった。（C）vWFに関する免疫組織化学分析を示す写真である。生理食塩水を投与したエラスターゼ注射マウスの方がvWF陽性血管が観察される頻度は低かったが、AM注入によってこれは増加した。倍率100倍。（D）半定量的分析により、エラスターゼ注射から28日後の時点でvWF陽性血管の数は減少していることが示された（生理食塩水群）。しかし、AM注入により、エラスターゼを投与した肺におけるvWF陽性血管の数は有意に増加した（AM群）。データは平均±SEMである。*P<0.05、偽処置群との比較を示す；†P<0.05、生理食塩水群との比較を示す。
【図５】エラスターゼ注射から28日後のマウスの肺容積（A）および静肺コンプライアンス（B）に対するAMの影響を示す図である。エラスターゼ注射により、マウスの肺容積およびコンプライアンスは有意に増加した（生理食塩水群）。AM注入により、エラスターゼ処置マウスにおける変化は有意に抑制された（AM群）。データは平均±SEMである。*P<0.05、偽処置群との比較；†P<0.05、生理食塩水群との比較を示す。
【図６】急性心筋梗塞後の虚血心筋における骨髄由来細胞および血管内皮細胞の動態を示す写真および図である。（A）急性心筋梗塞後の骨髄由来細胞の分布（GFPの発現確認）および、血管内皮細胞の分布（vWF発現による確認）を示す写真である。（B）AM群および対照群における、骨髄由来細胞および血管内皮細胞の総量を示す図である。データは平均±SEMである。P<0.05、対照群との比較を示す。（C）虚血心筋のある部位における、骨髄由来細胞の分布（GFPの発現確認）および、血管内皮細胞の分布（vWF発現による確認）を示す写真である。
【図７】急性心筋梗塞後の虚血心筋における骨髄由来細胞および心筋細胞の動態を示す写真および図である。（A）急性心筋梗塞後の骨髄由来細胞の分布（GFPの発現確認）および、心筋細胞の分布（デスミン発現による確認）を示す写真である。（B）虚血心筋のある部位における、骨髄由来細胞の分布（GFPの発現確認）および、心筋細胞の分布（デスミン発現による確認）を示す写真である。GFPとデスミンを同時に発現している骨髄由来細胞より再生された、あるいは再生過程にある心筋細胞群が認められる。（C）AM群および対照群における、骨髄由来細胞および心筋細胞の総量を示す図である。データは平均±SEMである。P<0.05、対照群との比較を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、アドレノメデュリンを対象に投与する工程を含む、対象における障害組織を再生または修復する方法に関する。
本発明において「アドレノメデュリン」または「AM」とは、血小板中のcAMPの増加活性を指標にヒト褐色細胞腫組織抽出液より発見された強力な降圧作用を有する生理活性ペプチドである。「アドレノメデュリン」の前駆体のcDNAの塩基配列を配列番号：１に、該DNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。【００１５】
本発明の「アドレノメデュリン」の前駆体としては、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる天然由来のタンパク質であって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を挙げることが出来る。また、配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする天然由来のDNAよりコードされるタンパク質であって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質も、「アドレノメデュリン」の前駆体として挙げることができる。【００１６】
活性型の「アドレノメデュリン」は、該「アドレノメデュリン」前駆体の一部分であり、配列番号：３に示すアミノ酸配列を有する。本発明において用いられるアドレノメデュリンは、好ましくは配列番号：３に示すアミノ酸配列を有するが、それらに限定されず、配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる天然由来のタンパク質であって、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質も挙げることが出来る。また、配列番号：１に記載の塩基配列の447位から602位に相当するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする天然由来のDNAよりコードされるタンパク質であって、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質も、活性型「アドレノメデュリン」として挙げることができる。【００１７】
本発明において、変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、30アミノ酸以内であり、好ましくは15アミノ酸以内であり、さらに好ましくは5アミノ酸以内（例えば、3アミノ酸以内）であると考えられる。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（R、K、H）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。あるアミノ酸配列に対する1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することは当業者に公知な事項である。【００１８】
本発明において「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が、該タンパク質と同等の生物学的機能や生化学的機能を有することを指す。本発明において、該タンパク質の生物学的機能や生化学的機能としては、対象における障害組織を再生または修復する機能、該障害組織への単核細胞の遊走・定着を促進させる機能、単核細胞を対象における障害組織の末梢血中に誘導する機能、該障害組織の末梢血中に含まれる単核細胞を増加させる機能、該障害組織の末梢血管を新生または再生させる機能、または、肺容積、静肺コンプライアンスまたは平均肺胞径を減少させる機能等を挙げることが出来る。このような機能の測定方法としては、実施例に記載の方法が例示できるが、それらの方法に限定されない。生物学的な性質には発現する部位の特異性や、発現量等も含まれる。【００１９】
目的のタンパク質と「機能的に同等なタンパク質」をコードするDNAを調製するために、当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者にとっては、「アドレノメデュリン」の塩基配列（配列番号：１）もしくはその一部をプローブとして、また「アドレノメデュリン」の塩基配列（配列番号：１）に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、「アドレノメデュリン」と高い相同性を有するDNAを単離することは通常行いうることである。このようにハイブリダイズ技術やPCR技術により単離しうる「アドレノメデュリン」と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAもまた本発明のDNAに含まれる。【００２０】
このようなDNAを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、6M尿素、 0.4%SDS、0.5xSSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M尿素、0.4%SDS、0.1xSSCの条件を用いることにより、より相同性の高いDNAの単離を期待することができる。これにより単離されたDNAは、アミノ酸レベルにおいて、目的タンパク質のアミノ酸配列と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で、少なくとも50％以上、さらに好ましくは70％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95%,96%,97%,98%,99%以上）の配列の同一性を指す。アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLASTを用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。【００２１】
本発明において、「対象」とは、本発明の方法によって処置されるべき生物体、該生物体の体内の一部分（例えば脳、肺、心臓、肝臓、腎蔵等の臓器、およびそれらの臓器中の血管または一組織）、または生物体より摘出または排出されたその一部分をいう。生物体は、動物（例えば、ヒト、家畜動物種、野生動物）であれば特に限定されるものではないが、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを含む。本発明において、「対象」とは、障害を受けている組織（障害組織）そのものを示すこともできる。【００２２】
本発明において、「投与する」とは、経口的、あるいは非経口的に投与することが含まれる。
経口的な投与としては、経口剤という形での投与を挙げることができ、経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型を選択することができる。【００２３】
非経口的な投与としては、注射剤という形での投与を挙げることができ、注射剤としては、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を挙げることができる。注射剤を投与する方法としては、対象となる生物体の体内の一部分（臓器等の一組織）を標的として局所的に投与を行っても良いし、血管に投与することにより、生物体全体に本発明のアドレノメデュリンを循環させてもよい。また、複数箇所の標的に同時に投与を行ってもよい。また、投与すべきアドレノメデュリンをコードする遺伝子を遺伝子治療の手法を用いて生体に導入することにより、本発明の方法の効果を達成することができる。本発明の方法の効果をもたらすタンパク質をコードする遺伝子を生体に導入し、発現させる手法は公知である。また、本発明のアドレノメデュリンを、処置を施したい領域に局所的に投与することもできる。例えば、手術中の局所注入、カテーテルの使用、または治療薬をコードする配列の標的化遺伝子送達により投与することも可能である。【００２４】
投与量は、患者の年齢、性別、体重および症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される活性成分の種類などにより異なるが、通常成人一人あたり、一回につき0.1mgから500mgの範囲で、好ましくは0.5 mgから20 mgの範囲で投与することができる。しかし、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量よりも少ない量で充分な場合もあり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もある。【００２５】
また、生物体より摘出または排出された生物体の一部分に投与を行う際には、本発明のアドレノメデュリンを生物体の一部に「接触」させてもよい。
また、本発明において「接触」は、生物体の状態に応じて行う。例えば、生物体の一部への本アドレノメデュリンの散布、あるいは、生物体の一部の破砕物への本アドレノメデュリンの添加等を挙げることができるが、これらの方法に制限されない。【００２６】
本発明の方法を実践する際に、本発明のアドレノメデュリンは、少なくとも1つの既知の化学療法剤と共に薬学的組成物の一部として投与されてもよい。一つの態様において、本発明のアドレノメデュリンおよび既知の化学療法剤は、実質的に同時に投与されてもよい。
また、生物体より摘出または排出された生物体の一部分に本発明のアドレノメデュリンを投与し、摘出または排出を行った生物体または他の生物体に、該生物体の一部分を戻すことも可能である。【００２７】
本発明において注射剤で接種を行う方法としては、公知の種々の方法が使用できる。接種法としては皮下注射、筋肉注射、経皮接種等が好ましいが、これらに限定されるものではない。
どの接種方法が適切かは薬剤の種類、接種する対象の種類等を考慮して決定される。容器はバイアル、プレフィルド シリンジ製品  (pre-filled syringe)  が可能である。必要に応じて、溶液状でも凍結乾燥などによる粉末製品でもよい。一回接種用でも複数回接種用でも良い。投与量は、接種する対象の種類や体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。【００２８】
本発明における「障害組織」とは、何らかの理由により障害を受けた組織を挙げることが出来る。通常、正常細胞に外的または内的刺激が加わった場合には、直ちに細胞障害に至らず適応現象が生じる。しかし、外的または内的刺激が適応範囲を超えると、それらの刺激に伴った形態変化、例えば変性、壊死が起こり、本発明ではこれらの現象を「障害」と定義することにする。【００２９】
本発明において、障害組織における「変性」とは、可逆性細胞障害として普遍的に認められる細胞・組織変化のことを表す。変性の際に蓄積する物質は生体に正常に存在するものと存在しない病的なものがあり、蓄積した物質によって蛋白変性または脂肪変性と呼ばれる。変性状態としては、粘液変性、アミロイド変性、α１アンチトリプシン欠損症における変性、尿酸代謝障害における変性、硝子滴変性、水腫様変性、空胞変性、フィブリノイド変性、または角質変性等を挙げることが出来る。【００３０】
本発明において、「壊死」とは、細胞・組織の不可逆的変化のことを表す。壊死状態としては、凝固壊死（循環障害）、融解壊死、壊疽（壊死に細菌感染が合併した状態）、または枯死（細胞障害による病的死ではなく組織内で生じる生理的な死）等を挙げることが出来る。【００３１】
本発明において「対象における障害組織」としては、循環器、呼吸器、脳神経系、消化器、内分泌系、泌尿器、または皮膚等に発症する疾患における障害組織を挙げることが出来る。
上記の疾患としては、心筋梗塞、不整脈、動脈硬化、血液攣縮、虚血再循環障害、肺炎、感染症、肺線維症（制ガン剤副作用）、ARDS、パラコート中毒、喫煙障害、肺気腫、高酸素療法、インフルエンザ、脳浮腫、脳梗塞、脳出血、てんかん、脳血管攣縮、パーキンソン病、自律神経障害（Reilly現象）、遅発性神経障害、脊髄損傷、神経原性肺浮腫、急性胃粘膜障害、胃潰瘍、潰瘍性大腸炎、クローン病、ベーチェット病、肺炎、肝硬変、薬物性肝障害、肝移植病態、各種の黄疸病態、膵炎、糸球体腎炎、溶血性腎障害、薬物性腎障害、火傷、日光皮膚炎、アトピー性皮膚炎、皮膚漬瘍、網膜変症、白内障、角膜腫瘍等を挙げることができ、好ましくは、難治性心肺疾患、末梢性血管疾患、腎疾患、肝疾患または脳血管疾患、より好ましくは、肺気腫、心筋梗塞、心筋炎、または心筋症を挙げることができる。【００３２】
本発明の「対象における障害組織」として、より具体的には肺胞または肺血管における障害組織を挙げることが出来る。また、心筋または心臓血管における障害組織も、好ましい例として挙げることができる。
本発明において「再生または修復する」とは、上記の障害組織を、変性が起こる以前の状態に再生すること、または壊死してしまった障害組織を、新たに新生することを表す。例えば、対象における障害組織の末梢血管を新生または再生させることも、本発明における「再生または修復」に該当することとして挙げることができる。【００３３】
障害組織の再生または修復が起こる期間は特に限定されないが、一時的な再生または修復であってもよいし、一定期間の再生または修復であってもよい。また、再生または修復が完全に進む、すなわち組織が元の状態に完全に戻ることが好ましいが、組織の部分的な再生または修復であってもよい。【００３４】
「再生または修復」の、より具体的な例としては、肺気腫状態の肺胞または肺血管における、変性した末梢血管の修復、また壊死した末梢血管に置き換わる新たな血管の再生、肺胞上皮の再生を挙げることが出来る。結果として、肺容積、静肺コンプライアンス、または平均肺胞径が減少した場合にも、肺組織の修復・再生が行われたと解釈することが出来る。【００３５】
本発明は、アドレノメデュリンを対象に投与する工程を含む、対象における障害組織への単核細胞の遊走、定着を促進させる方法に関する。
本発明において、「単核細胞」とは円形に近い核を有する白血球という意味で、リンパ球と単球の総称であり、骨髄、臍帯血等に由来する細胞を含む。本発明において「単核細胞」のより好ましい例としては、「骨髄由来細胞」を挙げることができる。本発明において、「骨髄由来細胞」とは、幹細胞や前駆細胞を含む骨髄由来の細胞を意味する。【００３６】
骨髄由来細胞としては、リンパ球（B細胞、ヘルパーT細胞、サプレッサーT細胞、キラーT細胞）およびそれらの前駆体、単球（マクロファージ）およびそれらの前駆体、または血管を形成する細胞の前駆細胞を挙げることが出来るが、本発明においてはより好ましくは、幹細胞またはさまざまな細胞の前駆細胞を挙げることが出来る。本発明において、前駆細胞の好ましい例としては、血管内皮前駆細胞、または心筋前駆細胞を挙げることが出来る。【００３７】
本発明において、「細胞の遊走、定着を促進させる」とは、血管新生などの機序に重要となる細胞の遊走・定着が、より増加することを意味する。細胞の遊走、定着が促進される期間は特に限定されないが、一時的な促進であってもよいし、一定期間の促進であってもよい。一時的に遊走・定着される細胞数が増加する場合や、ある期間中に遊走・定着される細胞数が増減を繰り返し、最終的に遊走・定着される細胞数が増加している場合にも、本発明の「促進させる」の意味に該当する。【００３８】
本発明において、「細胞の遊走、定着を促進させる」とは、アドレノメデュリンが、炎症性サイトカイン、ケモカイン等の接着因子の発現を誘導し、結果として細胞の遊走、定着が促進されるものであってもよい。接着因子の発現の誘導は、接着因子をコードする遺伝子の発現を誘導してもよいし、接着因子の発現を誘導してもよい。【００３９】
本発明において、炎症性サイトカインは免疫反応、炎症反応にかかわるサイトカインであり、インターロイキン1（IL-1）、インターロイキン6（IL-6）、腫瘍壊死因子（TNF）、インターロイキン8（IL-8）、マクロファージ走化性因子（MCF)、インターフェロンγ（IFN-γ）、コロニー刺激因子（CSF)、インターロイキン10（IL-10)などが含まれる。【００４０】
本発明において、ケモカインは白血球の遊走、活性化を制御するサイトカインであり、炎症などでの白血球の浸潤、ホーミングなどに関与している。ケモカインはCXCケモカイン、CCケモカイン、CX3Cケモカイン、Cケモカインに分類される。ケモカインには、MCAF/MCP-1、リンホタクチン、フラクタルカイン、IL-8などが含まれる。【００４１】
本発明において、接着因子は細胞接着に関与するタンパク質を示し、膜貫通型糖タンパク質、細胞外基質タンパク質、プロテオグリカンなどが含まれる。接着因子は、細胞接着分子、接着分子、接着タンパク質とも呼ばれる。接着因子には、免疫グロブリンスーパーファミリー、カドヘリンスーパーファミリー、インテグリンスーパーファミリー、セレクチンファミリー、MAMスーパーファミリー、ヒアルロン酸受容体ファミリー、LRRドメインファミリーなどが含まれる。【００４２】
本発明は、アドレノメデュリンを対象に投与する工程を含む、単核細胞を対象における障害組織の末梢血中に誘導する方法、または、対象における障害組織の末梢血中に含まれる単核細胞を増加させる方法に関する。【００４３】
本発明において、単核細胞を障害組織の末梢血中へ誘導する効果、および対象における障害組織の末梢血中に含まれる単核細胞を増加させる効果は、一時的なものであってもよいし、一定期間における効果であってもよい。また、障害組織への単核細胞の遊走、定着が促進されることで、結果的に、単核細胞が障害組織の末梢血中に誘導され、末梢血中の単核細胞が増加してもよい。【００４４】
本発明は、アドレノメデュリンを対象に投与する工程を含む、肺容積、静肺コンプライアンス、または平均肺胞径を減少させる方法に関する。
肺気腫等の難治性肺疾患によって肺容積は過膨張し、静肺コンプライアンス、または平均肺胞径が増加することが知られている。本発明における、肺容積、静肺コンプライアンス、または平均肺胞径を減少させる効果とは、持続性がある方が好ましいが、一時的なものであってもよいし、一定期間内の効果であってもよい。【００４５】
本発明において「静肺コンプライアンス（static lung compliance, Cst）」とは、 肺圧容量（胸腔内圧 X 肺容量）曲線 (pressure-volume curve, P-V curve) から計測され、P-V curveは各肺容量で気流を遮断し、空気の流れのない状態で測定される。肺は拡張させるともとにもどろうとする力（肺の弾性収縮力）が生じ、コンプライアンスは肺の弾性収縮力の評価法のひとつである。肺容積、静肺コンプライアンス、または平均肺胞径の測定方法として、本発明の実施例に記載の方法を挙げることが出来るが、これらの方法に限定されるわけではなく、当業者に公知の方法で測定を行うことも可能である。【００４６】
本発明は、アドレノメデュリンを有効成分とする、障害組織を再生または修復させる薬剤、障害組織への単核細胞の遊走、定着を促進させる薬剤、単核細胞を障害組織の末梢血中に誘導する薬剤、障害組織の末梢血中に含まれる単核細胞を増加させる薬剤、障害組織の末梢血管を新生または再生させる薬剤、または肺容積、静肺コンプライアンス、または平均肺胞径を減少させる薬剤に関する。【００４７】
本発明の薬剤には、保存剤や安定剤等の製剤上許容しうる担体を添加してもよい。製剤上許容しうるとは、それ自体は上記の活性を有さない材料であって、上記の薬剤とともに投与可能な製剤上許容される材料を意味する。
安定剤としては、0.2%程度のゲラチンやデキストラン、0.1-1.0%のグルタミン酸ナトリウム、あるいは約5%の乳糖や約2%のソルビトールなどを使用することが出来るが、これらに限定されるものではない。保存剤としては、0.01%程度のチメロサールや0.1%程度のベータプロピオノラクトンなどを使用することが出来るが、これらに限定されるものではない。【００４８】
注射剤を調製する場合、必要により、pH 調製剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤等を添加し、常法により、皮下、筋肉内、静脈内注射剤とする。注射剤は、溶液を容器に収納後、凍結乾燥等によって、固形 製剤として、用時調製の製剤としてもよい。また、一投与量を容器に収納してもよく、また、投与量を同一の容器に収納してもよい。【００４９】
どの接種方法が適切かは薬剤の種類、接種する対象の種類等を考慮して決定される。容器はバイアル、プレフィルド シリンジ製品  (pre-filled syringe)  が可能である。必要に応じて、溶液状でも凍結乾燥などによる粉末製品でもよい。一回接種用でも複数回接種用でも良い。投与量は、接種する対象の種類や体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００５０】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。本実施例においては、データはすべて平均±SEMとして表した。群間のパラメーターの比較は、片側ANOVA検定の後にNewman-Keuls検定によって行った。値がP<0.05であれば統計学的に有意であるとみなした。【００５１】
〔実施例１〕アドレノメデュリンの投与による骨髄細胞の動態の評価測定
まず、AMが骨髄細胞の動態に影響を及ぼすか否かを調べるために、動物モデルに対してAMまたは生理食塩水を無作為に投与した。
動物モデルとしては、10週齡の雌性C57BL／6マウス48匹を用いた。緑色蛍光タンパク質（GFP：Green fluorescent protein）を遍在性に発現するトランスジェニックマウス（C57BL／6バックグラウンド）は、岡部勝教授（大阪大学、日本）から提供を受けた（Okabe M, Ikawa M, Kominami K, Nakanishi T, Nishimune Y. 'Green mice' as a source of ubiquitous green cells. FEBS Lett 1997;407:313-319）。
AM（生理食塩水100μl中に1、2または5μg）を、無作為にC57BL／6マウス（それぞれn＝8）に対して腹腔内注射により5日間毎日投与した。対照マウスには生理食塩水100μlを同様に5日間毎日投与した（n＝8）。
さらに、AMまたは生理食塩水を他のマウスに対して（それぞれn＝8）、皮下浸透ミニポンプ（Alzet, Palo Alto, CA）により送出量0.05μg／kg／分で5日間投与した。血液試料を第5日目に採取し、当業者に公知の方法で（Asahara T, Takahashi T, Masuda H, Kalka C, Chen D, Iwaguro H, Inai Y, Silver M, Isner JM. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells. EMBO J 1999;18:3964-3972）、Histopaque-1083（Sigma）を用いて単核細胞を単離した。単核細胞を手作業で計数し、Sca1-FITC（Sca-1陽性細胞：BD Pharmingen, San Diego, CA）の発現に関して分析した。免疫蛍光標識細胞はFACSCaliburフローサイトメーター（BD Biosciences, Mountain View, CA）を用いる定量的フローサイトメトリーによって分析した。アイソタイプが同一な抗体（BD Pharmingen）を対照として用いた。【００５２】
上記の結果、AMの投与により、第5日目時点での末梢血単核細胞の数は用量依存的に増加することがわかった（図1A）。AMの用量が最も低い場合（1μg／匹：生理食塩水群の120％）から、AMの用量が最も高い場合（5μg／匹：生理食塩水群の140％）にかけていずれにおいても有意な変化が検出された。浸透ミニポンプによってAMを持続投与したマウスでも有意な増加が検出された（生理食塩水群の131％、図1B）。さらに、Sca-1陽性細胞の頻度も有意に高いことが確認された（生理食塩水群の200％、図1C）。
これらのことより、AMの注入によって循環血液中の単核細胞およびSca-1陽性細胞の数が増加することが明らかとなった。循環血液中の内皮前駆細胞はSca1陽性単核細胞の画分に存在することが示されている(Asahara T, Murohara T, Sullivan A, Silver M, van der Zee R, Li T, Witzenbichler B, Schatteman G, Isner JM. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science 1997;275:964-967)。このため、AMは骨髄から循環血液中への内皮前駆細胞の放出を誘導するものと考えられる。【００５３】
これまでに、AMはホスファチジルイノシトール3-キナーゼ／Akt依存性経路を介して内皮一酸化窒素シンターゼの活性化を誘導することが示されている(Nishimatsu H, Suzuki E, Nagata D, Moriyama N, Satonaka H, Walsh K, Sata M, Kangawa K, Matsuo H, Goto A, et al. Adrenomedullin induces endothelium-dependent vasorelaxation via the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt-dependent pathway in rat aorta. Circ Res 2001;891:63-70.)。また、骨髄細胞の動員はマトリックスメタロプロテナーゼ-9の局所分泌に依存することが示されており（Heissig B, Hattori K, Dias S, Friedrich M, Ferris B, Hackett NR, Crystal RG, Besmer P, Lyden D, Moore MA, et al. Recruitment of stem and progenitor cells from the bone marrow niche requires MMP-9 mediated release of kit-ligand. Cell 2002;109:625-637）、近年では、一酸化窒素がS-ニトロシル化によってマトリックスメタロプロテナーゼ-9を活性化することが示されている(Gu Z, Kaul M, Yan B, Kridel SJ, Cui J, Strongin A, Smith JW, Liddington RC, Lipton SA. S-nitrosylation of matrix metalloproteinases: signaling pathway to neuronal cell death. Science 2002;297:1186-1190)。さらに、内皮一酸化窒素シンターゼが幹細胞および前駆細胞の動員に必須であることも示されている(Aicher A, Heeschen C, Mildner-Rihm C, Urbich C, Ihling C, Technau-Ihling K, Zeiher AM, Dimmeler S. Essential role of endothelial nitric oxide synthase for mobilization of stem and progenitor cells. Nat Med 2003;9:1370-1376)。
これらのことを総合すると、AMで誘発された一酸化窒素合成によってマトリックスメタロプロテアーゼ-9が調節され、それが次に骨髄細胞の動員を誘導することが示唆される。【００５４】
〔実施例２〕骨髄細胞のホーミングおよび分化の評価
骨髄細胞の動態の評価のためにC57BL／6GFP陽性骨髄キメラマウスを樹立した。
上記の骨髄キメラマウスは当業者に公知の方法で作製した（Sata M, Saiura A, Kunisato A, Tojo A, Okada S, Tokuhisa T, Hirai H, Makuuchi M, Hirata Y, Nagai R. Hematopoietic stem cells differentiate into vascular cells that participate in the pathogenesis of atherosclerosis. Nat Med 2002;8:403-409.）。作成方法について簡潔に述べると、野生型レシピエントC57BL／6マウスに致死量照射（900cGy）を行い、GFPマウス由来の骨髄細胞（3×106個／300μl）を尾静脈から移植した。マウス骨髄の再構成を数量化するために、骨髄移植から4週後に末梢血単核細胞および骨髄細胞をフローサイトメトリーにより分析した。キメラマウスにおけるGFP陽性末梢血単核細胞および骨髄細胞の割合はそれぞれ87〜93％および85〜90％であり、このことは元の幹細胞集団がドナー細胞によって置き換えられたことを示している。【００５５】
骨髄移植から4週後に、キメラマウスに対してブタ膵エラスターゼ（200単位／kg；Sigma, St. Louis, MO）を気管内注射した。これらのマウスを、生理食塩水を投与するエラスターゼ処置マウスと、AMを投与するエラスターゼ処置マウスという2つの群に分けた（それぞれn＝5）。実験動物へのエラスターゼ等のタンパク質分解酵素の気管内注射によって肺気腫が誘導されることはこれまでに十分に実証されている(Snider GL, Lucey EC, Stone PJ. Animal models of emphysema. Am Rev Respir Dis 1986;133:149-169)。【００５６】
このほかの42匹のマウスは、AMがエラスターゼ誘発性肺気腫における肺構造および肺機能を改善するか否かを検討するために用いた。マウスに対してブタ膵エラスターゼ（200単位／kg）または生理食塩水の気管内注射を無作為に行い、AMまたは生理食塩水の持続注入のいずれかに割り当てた。このプロトコールの結果、以下の3つの群が生じた。生理食塩水を投与した偽処置マウス（偽処置群、n＝14）、生理食塩水を投与したエラスターゼ処置マウス（生理食塩水群、n＝14）およびAMを投与したエラスターゼ処置マウス（AM群、n＝14）。上記実施例はいずれも、国立循環器病センター（大阪、日本）の動物管理倫理委員会の指針に準拠して行った。【００５７】
エラスターゼ（n＝5）または食塩水（n＝5）の注射から28日後に、GFP陽性キメラマウスの肺から凍結切片を作製した。肺胞壁内のGFP陽性細胞の数を算定し、肺胞100当たりの数として表した。肺胞上皮細胞は、マウスモノクローナル抗体、抗サイトケラチン5および8（Chemicon, Temecula, CA）ならびにAlexa fluor 633を結合させたヤギ抗マウス抗体（Molecular Probes, Eugene, OR）を用いて同定した（Ishizawa K, Kubo H, Yamada M, Kobayashi S, Numasaki M, Ueda S, Suzuki T, Sasaki H. Bone marrow-derived cells contribute to lung regeneration after elastase-induced pulmonary emphysema. FEBS Lett 2004;556:249-252）。血管内皮細胞は、フォンビルブラント因子（vWF：von Willebrand factor）に対して産生されたウサギポリクローナル抗体（DAKO, Copenhagen, Denmark）およびAlexa fluor 633を結合させたヤギ抗ウサギ抗体（Molecular Probes）を用いて同定した（Itoh T, Nagaya N, Murakami S, Fujii T, Iwase T, Ishibashi-Ueda H, Yutani C, Yamagishi M, Kimura H, Kangawa K. C-Type Natriuretic Peptide Ameliorates Monocrotaline-induced Pulmonary Hypertension in Rats. Am J Respir Crit Care Med 2004;170:1204-1211）。GFP／サイトケラチン二重陽性細胞およびGFP／vWF二重陽性細胞の数を算定し、肺胞100当たりの数として表した。組織学的検査は3人の観察者により盲検方式で行った。【００５８】
上記の結果、エラスターゼ注射から28日後の時点でGFP陽性細胞が肺胞壁内で検出されることが明らかとなった。GFP／サイトケラチン二重陽性細胞も肺胞壁内で検出された（図2A）。半定量的分析により、肺に組み込まれたGFP陽性細胞の数はAM群の方が生理食塩水群と比較して有意に多いことが示された（図2B）。さらに、GFP／サイトケラチン二重陽性細胞の数もAM群の方が生理食塩水群と比較して有意に多かった（図2C）。
これらのことより、AMはエラスターゼを投与した肺に組み込まれる骨髄由来細胞の数を増加させることが明らかとなった。最近の研究により、骨髄前駆細胞は肺胞および血管系の再生に寄与することが示されている(Ishizawa K, Kubo H, Yamada M, Kobayashi S, Numasaki M, Ueda S, Suzuki T, Sasaki H. Bone marrow-derived cells contribute to lung regeneration after elastase-induced pulmonary emphysema. FEBS Lett 2004;556:249-252, Yamada M, Kubo H, Kobayashi S, Ishizawa K, Numasaki M, Ueda S, Suzuki T, Sasaki H. Bone marrow-derived progenitor cells are important for lung repair after lipopolysaccharide-induced lung injury. J Immunol 2004;172:1266-1272)。以上のことから、AMがエラスターゼを投与した肺における骨髄由来の肺胞上皮細胞の数を増加させることによって、肺再生を促進することが示唆される。【００５９】
〔実施例３〕AMを投与したエラスターゼ処置マウスの形態学的分析および機能分析
実験動物へのエラスターゼ等のタンパク質分解酵素の気管内注射によって肺気腫が誘導されることはこれまでに十分に実証されている(Snider GL, Lucey EC, Stone PJ. Animal models of emphysema. Am Rev Respir Dis 1986;133:149-169.)。実際、本発明ではエラスターゼの気管内注射により、肺に肺気腫変化が誘導されたことが、肺機能（肺容積および静肺コンプライアンスの増加）および形態学的所見（平均肺胞径の増加）により確認され、これらの所見は以前の研究の結果と一致していた（Hayes JA, Korthy A, Snider GL. The pathology of elastase-induced panacinar emphysema in hamsters. J Pathol 1975;117:1-14., Kuraki T, Ishibashi M, Takayama M, Shiraishi M, Yoshida M. A novel oral neutrophil elastase inhibitor (ONO-6818) inhibits human neutrophil elastase-induced emphysema in rats. Am J Respir Crit Care Med 2002;166:496-500.）
エラスターゼまたは生理食塩水の注射から28日後に、マウスに麻酔を施し、コンピュータ制御式小動物用ベンチレーター（flexiVent；Scireq, Montreal, PQ, Canada）を用いて静肺コンプライアンスを測定した（それぞれn＝7）。肺を摘出し、肺内外圧較差を25cmH2Oに保った上で24時間固定した（それぞれn＝7）。肺容積はScherleの方法によって測定した（Scherle W. A simple method for volumetry of organs in quantitative stereology. Mikroskopie 1970;26:57-60）。肺気腫の形態計測パラメーターであるmean linear interceptは、当業者に公知の方法で（Thurlbeck WM. Internal surface area and other measurements in emphysema. Thorax 1967;22:483-496）、無作為に選択した20箇所の領域に対して光学顕微鏡により算出した。形態学的検査は3人の観察者により盲検方式で行った。
また、パラフィン切片を肺から入手し（それぞれn＝7）、AMがエラスターゼを投与した肺における血管新生を誘導するか否かについて調べるため、組織切片をvWFに対して染色した。3人の観察者が盲検方式で1mm2当たりのvWF陽性血管の数を算定した。【００６０】
上記の結果、エラスターゼ注射から28日後の時点で、生理食塩水群では肺胞壁の破壊を伴う気腔拡大の発生が観察された（図3A）。しかし、AMの投与により、エラスターゼ注射マウスにおけるこれらの組織学的変化は減弱化することがわかった。生理食塩水群における平均肺胞径は偽処置群と比較して有意に大きかったが（図3B）、この差異の幅はAMにより縮小した。
また、GFP／vWF二重陽性細胞が肺胞壁内に観察され（図4A）、これらの細胞の数は生理食塩水群と比較してAM群の方が多かった（図4B）。全体的には、vWF陽性肺血管の数はエラスターゼ注射から28日後には減少していた（図4CおよびD）。しかし、AM注入により、エラスターゼを投与した肺におけるvWF陽性肺血管の数は有意に増加した。【００６１】
さらに、エラスターゼ注射から28日後の時点で、生理食塩水群における肺容積は偽処置群と比較して有意に大きいことがわかった（図5A）。この肺容積の増加幅はAMによって縮小した。また、静肺コンプライアンスは生理食塩水群の方が有意に大きく、この変化はAMによって有意に縮小していることもわかった（図5B）。
これらのことから、AMが肺胞および肺血管系の再生を促進し、エラスターゼ投与マウスにおける肺構造および肺機能を改善することが明らかとなった。【００６２】
〔実施例４〕AMを投与した心筋梗塞モデルラットにおける骨髄由来細胞の動態分析
GFPキメララット（骨髄細胞においてGFPが発現しているラット）に対して開胸術後に冠動脈前下行枝を結さつして急性心筋梗塞を作成した（Fujii T  et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288(3):H1444-50, 2005）。
結さつして心臓を局所的な虚血状態にした後に、0.05μg/kg/minのAM（AM群）または0.9%生理食塩水（対照群）を浸透圧ポンプで皮下より７日間投与した。
急性心筋梗塞後、心筋梗塞部における骨髄由来細胞の分布（GFPの発現確認）、血管内皮細胞の分布（vWF、血管内皮細胞マーカーによる確認）および心筋細胞の分布（デスミン（Desmin）、心筋細胞マーカーによる確認）を確認した。さらに、AM群および対照群においてGFP発現細胞数、vWF発現細胞数およびデスミン発現細胞数の総和を検討し、各群における血管や心筋再生の状態を確認した。【００６３】
その結果、急性心筋梗塞後に骨髄由来細胞が虚血心筋に到達、集積し血管が形成されることが明らかとなった（図６Ａ、Ｃ）。また、急性心筋梗塞後のAM投与は、骨髄細胞による血管再生を有為に増加させることが明らかとなった（図６Ｂ）。また、骨髄由来細胞の一部は、虚血心筋内に定着し、心筋細胞のマーカーであるデスミンと骨髄由来細胞のマーカーであるGFPを同時に発現していることが明らかとなった(図７Ａ、Ｂ)。また、急性心筋梗塞後のAM投与は、骨髄由来細胞による心筋の再生を有意に増加させることが明らかとなった（図７Ｃ）。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
肺気腫の進行過程では毛細血管網が破壊を余儀なくされるが、これは毛細血管が肺胞壁の体積のかなりの割合を占めるためである。このため、肺気腫性の病理的変化を修復するためには、肺胞だけでなく肺血管系も同時に再生させることが重要である。本発明ではAMの注入によって、GFP／vWF二重陽性細胞の数が増加し、このことからAMが骨髄由来の血管内皮細胞を増加させることが示唆された。さらに、最近の研究において、内皮細胞におけるAkt、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ／細胞外シグナル調節性キナーゼ１／２およびフォーカルアドヒージョンキナーゼの活性化により、AMが血管新生作用を発揮することが示されている。本発明において、AMはエラスターゼ処置マウスにおける肺血管の数を有意に増加させた。このため、AMで誘導される肺での血管新生は、エラスターゼ処置マウスにおける肺再生に寄与するものと考えられる。【００６５】
本発明の方法により、アドレノメデュリンを肺の障害組織に持続注入を行ったところ、エラスターゼ誘発性肺気腫は減弱化した。また、アドレノメデュリンを心筋梗塞における障害組織に注入したところ、骨髄由来細胞の虚血心筋への到達、集積を促進し、血管新生および心筋新生を増加させることが明らかとなった。これらの有益な効果は、骨髄由来細胞の動員ならびに肺胞、心筋細胞および血管系の再生を介すると考えられる。【００６６】
本発明は、アドレノメデュリンを肺気腫の再生、すなわち肺胞および肺血管再生に適用した世界的に初めての試みであり、これらの方法は、陳旧性心筋梗塞や肺気腫等の末梢血管が致命的な障害を受ける疾患の、優れた再生または治療方法となりうる。これらの疾患に対する自然治癒力の促進、新たな治療法の開発、不足機能の再建は患者の生活の質の向上に繋がるのみならず、入院患者を社会復帰させることで医療費の削減効果も期待される。
【図１】
2006095711.tif 000002
【図５】
2006095711.tif 000003
【図２】
2006095711.tif 000004
【図３】
2006095711.tif 000005
【図４】
2006095711.tif 000006
【図６】
2006095711.tif 000007
【図７】
2006095711.tif 000008
【配列表】
2006095711000001.app
【国際調査報告】
2006095711.tif 000009
2006095711.tif 000010
2006095711.tif 000011
2006095711.tif 000012
2006095711.tif 000013
2006095711.tif 000014