(57)【要約】ピグメンティファーガ属に属し、テレフタル酸を特異的に分解する能力を有する微生物、バシラス属に属し、芳香族ポリエステル付着能を有する菌体外多糖類を生成する能力を有する微生物、シュードモナス属に属し、ビスヒドロキシエチルテレフタレートを特異的に分解する能力を有する微生物、アルファプロテオバクテリア綱に属し、芳香族ポリエステル分解能を加速させる能力を有する微生物およびリゾビウムｓｐ．ＯＫＨ−３の芳香族系ポリエステル分解能の活性を高める微生物ならびにこれらの微生物群を用いた芳香族ポリエステルの分解方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピグメンティファーガ属に属し、そしてリゾビウムｓｐ．ＯＫＨ−０３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４８３）の芳香族ポリエステル分解能力を向上させうる能力とテレフタル酸を分解する能力を有する微生物。
【請求項２】
ピグメンティファーガ属に属する微生物が、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−６５として寄託されたものである、請求項１記載の微生物。
【請求項３】
バシラス属に属し、そしてリゾビウムｓｐ．ＯＫＨ−０３の芳香族ポリエステル分解能力を向上させうる能力を有する微生物。
【請求項４】
バシラス属に属する微生物が、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−６７として寄託されたものである、請求項３記載の微生物。
【請求項５】
シュードモナス属に属し、そしてリゾビウムｓｐ．ＯＫＨ−０３の芳香族ポリエステル分解能力を向上させうる能力を有する微生物。
【請求項６】
シュードモナス属に属する微生物が、受領番号ＮＩＴＥ  Ｐ−６４として奇託されたものである、請求項５記載の微生物。
【請求項７】
アルファプロテオバクテリア綱に属し、リゾビウムｓｐ．ＯＫＨ−０３の芳香族ポリエステル分解能力を向上させうる微生物。
【請求項８】
アルファプロテオバクテリア綱に属する微生物が、受領番号ＮＩＴＥ  Ｐ−６６として寄託されたものである、請求項７記載の微生物。
【請求項９】
リゾビウムｓｐ．ＯＫＨ−０３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４８３）、及び請求項１〜８に記載の微生物よりなる群から選ばれる少なくとも１つの微生物を芳香族ポリエステルに接触させて該芳香族ポリエステルを分解させることを特徴とする、芳香族ポリエステルの分解方法。
【請求項１０】
芳香族ポリエステルが、エチレンテレフタレート繰り返し単位を９５重量％以上含むポリエステルである、請求項９記載の分解方法。
【請求項１１】
微生物と芳香族ポリエステルとの接触をＬＥ培地中で行う、請求項９記載の分解方法。
【請求項１２】
微生物と芳香族ポリエステルとの接触を２０℃〜３７℃の範囲で行う、請求項９記載の分解方法。
【請求項１３】
微生物と芳香族ポリエステルとの接触をｐＨ５〜９の範囲で行う、請求項９記載の分解方法。
【請求項１４】
微生物と芳香族ポリエステルとの接触を、微生物を芳香族ポリエステルに吸着させ、バイオフィルムを形成させることにより行う、請求項９記載の分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いた芳香族ポリエステルの分解方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、脂肪族ポリエステルは一般的な土壌微生物やリパーゼ等の既知酵素によって分解されることから、生分解性のポリマーとして研究開発が行われている。
また、テレフタル酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸等の芳香族成分を有するポリエステルであっても、含有される芳香族成分が少量であったり、耐熱性が著しく低下していたりする場合には、一般土壌中や活性汚泥中の微生物や既知酵素により生分解可能であることが知られている。しかしながら、ポリエチレンテレフタレート（以下、ＰＥＴと略記することがある。）のように芳香族成分を主成分とする芳香族ポリエステルを分解する微生物及び酵素はほとんど知られておらず、わずかに、ＰＥＴ繊維やＰＥＴ織布を酵素で処理することにより、親水性の向上などの表面改質を行うことが提案されているが（特表２０００−５０２４１２号公報および特表２００１−５０２０１４号公報参照）、ＰＥＴが分解されていることを明確に示すデータはない。
このようなことから、ＰＥＴを分解する際には高濃度の水酸化ナトリウム水溶液に代表される強塩基性下で加熱処理する方法が一般的である。
【発明の開示】
【０００３】
本発明の目的は、芳香族ポリエステルを分解する能力を有する微生物をより活性化させる微生物と、該微生物群を用いた芳香族ポリエステルの分解方法を提供することにある。
本発明者らは、上記の目的を達成すべく、生物機能によって芳香族ポリエステルを分解する方法について鋭意検討した結果、リゾビウムｓｐ．ＯＫＨ−０３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４８３）と共存させることにより、同リゾビウムｓｐ．ＯＫＨ−０３の分解能力を飛躍的に高め、高速度で芳香族ポリエステルの分解を実現できる菌の単離、同定に成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明によれば、本発明の上記目的は、
ピグメンティファーガ属に属する微生物および、バシラス属に属する微生物および、シュードモナス属にする微生物および、アルファプロテオバクテリア綱に属する微生物であり、リゾビウムｓｐ．ＯＫＨ−０３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４８３）の芳香族ポリエステル分解能を加速させる能力を有する微生物およびその微生物群によって達成される。
さらに本発明によれば、本発明の上記目的は、
リゾビウムｓｐ．ＯＫＨ−０３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４８３）、ピグメンティファーガｓｐ．（ＮＩＴＥ  Ｐ−６５）、バシラス  メガテリューム（ＮＩＴＥＰ−６７）、シュードモナスｓｐ．（ＮＩＴＥ  Ｐ−６４）、アルファプロテオバクテリア綱（ＮＩＴＥ  Ｐ−６６）よりなる群から選ばれる少なくとも１種の微生物を芳香族ポリエステルに接触させて該芳香族ポリエステルを分解させることを特徴とする、芳香族ポリエステルの分解方法によって達成される。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は実施例１による分解実験後のフィルムの全体写真である。
図２は比較例１の操作によって最終的に得られたＰＥＴフィルムの表面を走査型電子顕微鏡（株式会社日立製作所製「ＳＥＭ−２４００」）により撮影した写真図（倍率５００倍）である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、分解の対象となる芳香族ポリエステルとは、芳香族ジカルボン酸と脂肪族ジオール成分からなる繰り返し単位を５０重量％以上含むポリエステルである。特にエチレンテレフタレート繰り返し単位を８５重量％以上含む芳香族ポリエステルが好ましい。この時に、共重合してよい成分としては、例えばテレフタル酸以外のジカルボン酸成分としてフタル酸、イソフタル酸、ジフェニルジカルボン酸、ジフェノキシエタンジカルボン酸、２，６−ナフタレンジカルボン酸等の芳香族ジカルボン酸及びその誘導体、コハク酸、アジピン酸、アゼライン酸、セバチン酸、デカンジカルボン酸等の脂肪族ジカルボン酸及びその誘導体が挙げられる。
また、エチレングリコール以外のジオール成分としては、例えばジエチレングリコール、トリメチレングリコール、テトラメチレングリコール、プロピレングリコール、ペンタメチレングリコール、ヘキサメチレングリコール、デカメチレングリコール等が例示される。
この芳香族ポリエステルは、分解時において、例えば繊維状、フィルム状、塊状、これらの混合体など、どのような形態をもっていてもよい。
本発明の微生物は、ピグメンティファーガ属、バシラス属、シュードモナス属、アルファプロテオバクテリア綱に属し、リゾビウムｓｐ．ＯＫＨ−０３の芳香族ポリエステル分解能力を向上させる能力を有する微生物であればどのようなものでも良い。特に、ピグメンティファーガｓｐ．（ＮＩＴＥ  Ｐ−６５）、バシラスメガテリューム（ＮＩＴＥ  Ｐ−６７）、シュードモナスｓｐ．（ＮＩＴＥ  Ｐ−６４）、アルファプロテオバクテリア綱（ＮＩＴＥ  Ｐ−６６）であることが好ましい。
上記の菌株群は、本発明者らが日本国内の土壌から新たに分離した菌株であり、以下の菌学的性質を有する。
【表１】
2006090913.tif 000002
また、化学分類学的性質・リポソーマルＤＮＡの配列は別添の配列番号１、２、３、４に示すとおりである。
なお、リゾビウムｓｐ．ＯＫＨ−０３の菌学的性質を表２に、また、その化学分類学的性質・リボソーマルＤＮＡの配列は別添の配列番号５に示すとおりである。
【表２】
2006090913.tif 000003
表１に示す性質に基づき、バージェイズ・マニュアル・オブ・システマティックバクテリオロジー等と照らし合わせた結果、それぞれ、バシラス属、ピグメンティファーガ属、シュードモナス属、アルファプロテオバクテリア綱に属する微生物であることが確認されたが、同属に属する公知の菌株に該当しなかったので、これらの菌株を新規な菌株として、平成１７年１月１４日付けで、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託し、受領された（受託番号はそれぞれ、ＮＩＴＥ  Ｐ−６５、ＮＩＴＥ  Ｐ−６７、ＮＩＴＥ  Ｐ−６４、ＮＩＴＥ  Ｐ−６６である。）。これらの微生物はバイオセーフティーレベルＩであり病原性が無いことから、この菌株を用いることにより、生物学的にも安全に作業を行うことが可能である。
また、リゾビウムｓｐ．ＯＫＨ−０３については、平成１５年８月１１日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に寄託している（受託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−１９４８３である）。
本発明の菌類はそれぞれ、リゾビウムｓｐ．ＯＫＨ−０３の芳香族ポリエステル分解能力を補完することによってその分解性を高めることが出来るが、例えば、ピグメンティファーガｓｐ．（ＮＩＴＥ  Ｐ−６５）は、特に分解時に発生するオリゴマーやモノマー、特にテレフタル酸を分解する能力を有するのでポリエステルの分解能を高めることが出来る。
次に本発明の、リゾビウムｓｐ．ＯＫＨ−０３の芳香族ポリエステルを特異的に分解する能力を著しく向上させる微生物の単離方法について説明する。
芳香族ポリエステルを特異的に分解する微生物は、土壌、雨水等をサンプリングし、これを公知の方法で適宜選別することで単離される。このとき用いる土壌、雨水などは特に、芳香族ポリエステル廃棄物集積所やゴミ箱などからサンプリングすることが好ましい。
ついで、培地としては芳香族ポリエステルを唯一の炭素源として含有するものを用いる（以下、この培地を芳香族ポリエステル培地と記載することがある。）。
他の窒素源、ミネラル源等としては、例えば、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、硫酸鉄、硫酸銅、硫酸亜鉛、硫酸マンガン、硫酸マグネシウム等の金属塩及びその水和物を用いることができる。
培養の方法としては、例えば振盪培養、静置培養等が挙げられるが、微生物の混合系から特定の微生物を取得するには振盪培養が好ましく、なかでも栄養源を限定して培養を行う集積培養法を併用するのが特に好ましい。
土壌等からサンプリングしたサンプルを、前記培地で培養し、所定期間毎に培地を交換して有用細菌を集積させる。
培養期間に特に制限はないが、例えば１〜２ヶ月程度が好ましい。次いで集積培養液中の芳香族ポリエステルを採取し、微生物の芳香族ポリエステル分解活性を評価する。評価方法としては特に制限はないが、例えば走査型電子顕微鏡による表面観察は簡便で確実性も高いため好ましい。
上記芳香族ポリエステル分解能力を有するサンプルを適宜希釈し、ＬＥ寒天培地（ＬＥ培地に更に寒天を添加した培地）等に塗末し、コロニーを形成して単離を行う（一次選別）。
次いで、一次選別された菌株から、リゾビウムｓｐ．ＯＫＨ−０３の芳香族ポリエステル分解能に関与する菌株を選別する（二次選別）。リゾビウムｓｐ．ＯＫＨ−０３が芳香族ポリエステルを分解するためには、１）芳香族ポリエステルへの菌の付着、２）芳香族ポリエステル鎖の分解、３）芳香族ポリエステルオリゴマーおよびモノマーの分解、という過程を経ると推測される。これらの各段階においてリゾビウムｓｐ．ＯＫＨ−０３の分解能力を補佐する菌株を二次選別により得ることが出来る。
本発明の菌株であるピグメンティファーガｓｐ．（ＮＩＴＥ  Ｐ−６５）は、一次選別した菌株を対数増殖期まで増殖させ、集菌した大量の菌体をビスヒドロキシエチルテレフタレート培地中、またはテレフタル酸培地中に植菌する等の方法で培養した後、これらのビスヒドロキシテレフタレート分解能または、テレフタル酸分解能を確認することにより、得ることが出来る。
本発明の菌株であるバシラス  メガテリューム（ＮＩＴＥ  Ｐ−６７）、シュードモナスｓｐ．（ＮＩＴＥ  Ｐ−６４）、アルファプロテオバクテリア綱（ＮＩＴＥ  Ｐ−６６）は、一次選別した菌株を対数増殖期まで増殖させ、集菌した大量の菌体を芳香族ポリエステル培地中にリゾビウムｓｐ．ＯＫＨ−０３とともに植菌する等の方法で培養した後、これらのバイオフィルム生成能を確認することにより、リゾビウムｓｐ．ＯＫＨ−０３の芳香族ポリエステル分解能力を向上させる菌株を得ることができる。
本発明の分解方法は、芳香族系ポリエステル分解能を有する菌株に対して、本発明の菌株１種以上とを組み合わせてなる微生物群を用いることで、芳香族ポリエステルを安全にかつ二酸化炭素までより高速度で確実に分解することが出来る。
本発明の分解方法では、前記微生物群と芳香族ポリエステルが確実に接触し、且つ、微生物群が維持される状態が形成されればよいが、特に、本発明の微生物群が存在する水溶液中に分解対象とする芳香族ポリエステルを浸漬させることにより行うことが好ましい。
該水溶液としては、芳香族ポリエステルのみが実質的に唯一の有機栄養源となるような培地を用いることが好ましく、特段制限を設けるものではない。芳香族ポリエステル以外の有機栄養源の存在量が０．２重量％以下であるＬＥ培地を用いることが好ましく、このＬＥ培地に無機化合物を添加した培地を用いることがより好ましい。ここでいうＬＥ培地とはレタスと卵の黄味の抽出液からなる培地であり、次の方法で作成することができる。１１０℃で５時間乾燥させたレタスの葉３ｇと、ゆで卵の卵黄３ｇを別々にイオン交換水１Ｌで１０分間煎じ、室温まで冷却した後に、濾紙で濾過する。これらの濾液を混合したものをＬＥ培地とする。
ここで添加する無機化合物としては、例えば硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、硫酸鉄、硫酸銅、硫酸亜鉛、硫酸マンガン、硫酸マグネシウム等の金属塩及びその水和物が挙げられる。
また、微生物と芳香族ポリエステルとを接触させる温度としては、２０〜３７℃の範囲が好ましく、更に好ましくは２５〜３５℃、特に好ましくは３０℃である。
また、接触させるときのｐＨは５〜９の範囲が好ましい。ｐＨをこの範囲に調整するためには、例えば水溶液に芳香族ポリエステルを浸漬させて接触させる場合には、該水溶液中に、塩酸、硫酸等の無機酸、水酸化ナトリウ厶、水酸化カリウム等の無機塩基及びその水溶液を用いるのが好ましく、また、りん酸緩衝液等の各種緩衝液を用いるのも好ましい。
最も好ましいのは、２０〜３７℃、ｐＨが５〜９の範囲にあるＬＥ培地中で本発明の微生物を芳香族ポリエステルとを接触させることである。しかし、その他の方法であっても微生物と芳香族ポリエステルとが接触し、芳香族ポリエステルが分解されうる方法であれば採用することができる。
また、本発明の微生物と芳香族ポリエステルとの接触の際に、微生物を芳香族ポリエステルに吸着させ、芳香族ポリエステル表面にバイオフィルムを形成させることが好ましい。ここでいうバイオフィル厶とは微生物とその排出物からなる層状物質のことであり、これによって本微生物が芳香族ポリエステルに強固に接着し、目つ、芳香族ポリエステルを分解する場を形成することになる。
また、本発明の微生物と芳香族ポリエステルとを接触させる期間は少なくとも２４時間あればよいが、目標とする芳香族ポリエステルの分解量に応じて、任意の期間を設定することができる。なお、接触期間が２週間以上に及ぶ場合には２週間ごとに水溶液を新しいものに交換することが望ましい。
このような方法により、自然界においてはほとんど分解することの無い芳香族ポリエステルの分解を０．５〜４ケ月程度の短期間で行うことができる。
以上のとおり、本発明の芳香族ポリエステルを特異的に分解する能力を有する微生物を用いれば、安全かつ安価で比較的速やかに、芳香族ポリエステルを温和な条件で分解することができる。
【実施例】
【０００６】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれにより何等限定を受けるものではない。
実施例１
ＰＥＴフィルムを、０．１規定の塩酸水溶液に３時間浸漬した後、７０重量％エタノール水溶液に１２時間以上浸漬し、そして無菌状態下で乾燥させた。このようにして滅菌処理した寸法１．４ｃｍ×２．０ｃｍ、重量６８．６ｍｇのＰＥＴフィルムを準備した。表３に記載の成分よりなるｐＨ７．０の水溶液培地１０ｍｌと、リゾビウムｓｐ．ＯＫＨ−０３（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４８３）、ピグメンティファーガｓｐ．（ＮＩＴＥ  Ｐ−６５）、バシラス  メガテリューム（ＮＩＴＥ  Ｐ−６７）、シュードモナスｓｐ．（ＮＩＴＥ  Ｐ−６４）、アルファプロテオバクテリア綱（ＮＩＴＥ  Ｐ−６６）を含む培養液１ｍｌとを併せて、シリコン栓をつけた内径１８ｍｍの試験管に封入した。
好気条件を保った状態で、横振り振盪培養機を用いて３０℃、３００ストローク／分の条件で振盪し、２週間毎に試験管内の溶液を新規なものと交換しながら、延べ３５日間振盪培養を行った。
試験管内からＰＥＴフィルムを取り出し、７０重量％エタノール水溶液中で２０分間超音波処理することにより、フィルム表面に付着した菌体及び菌体排出物を除去した。
次いで、このＰＥＴフィルムを室温、真空下で２４時間以上乾燥させた後に、重量を測定したところ、分解処理後のＰＥＴフィルムの重量は３５．７ｍｇであり、減量率は４８．０％、フィルムの片面の面積を基準とした場合の分解速度は０．３４ｍｇ／ｃｍ２・日であった。
【表３】
2006090913.tif 000004
実施例２
イソフタル酸共重合ＰＥＴフィルムを、０．１規定の塩酸水溶液に３時間浸漬した後、７０重量％エタノール水溶液に１２時間以上浸漬し、無菌状態下で乾燥させた。このようにして滅菌処理した寸法１．２ｃｍ×１．５ｃｍ、重量６６．３ｍｇの１０％イソフタル酸共重合ＰＥＴフィルムを準備した。表２に記載の成分よりなるｐＨ７．０の水溶液培地１０ｍｌと、リゾビウムｓｐ．ＯＫＨ−０３（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４８３）、ピグメンティファーガｓｐ．（ＮＩＴＥＰ−６５）、バシラス  メガテリューム（ＮＩＴＥ  Ｐ−６７）、シュードモナスｓｐ．（ＮＩＴＥ  Ｐ−６４）、アルファプロテオバクテリア綱（ＮＩＴＥ  Ｐ−６６）を含む培養液１ｍｌとを併せて、シリコン栓をつけた内径１８ｍｍの試験管に封入した。
好気条件を保った状態で、横振り振盪培養機を用いて３０℃、３００ストローク／分の条件で振盪し、２週間毎に試験管内の溶液を新規なものと交換しながら、延べ３０日間振盪培養を行った。
試験管内からイソフタル酸共重合ＰＥＴフィルムを取り出し、７０重量％エタノール水溶液中で２０分間超音波処理することにより、フィルム表面に付着した菌体及び菌体排出物を除去した。
次いで、このイソフタル酸共重合ＰＥＴフィルムを室温、真空下で２４時間以上乾燥させた後に、重量を測定したところ、分解処理後のフィルムの重量は４０．６ｍｇであり、減量率は３９％、フィルムの片面の面積を基準とした場合の分解速度は０．４８ｍｇ／ｃｍ２・日であった。
実施例３
テレフタル酸二ナトリウム塩を４．８ｍＭ含む表２記載の培地１０ｍｌにピグメンティファーガｓｐ．（ＮＩＴＥ  Ｐ−６５）を含む培養液１ｍｌを併せて、シリコン栓をつけた内径１８ｍｍの試験管に封入した。好気条件を保った状態で、横振り振盪培養機を用いて３０℃、３００ストローク／分の条件で振盪し、２日間培養を行った。
試験管から培養液を取り出し、ＴＬＣを用いてテレフタル酸の検出を行ったところ、テレフタル酸を示すスポットは確認されなかった。
比較例１
実施例１において、寸法が１．４ｃｍ×２．０ｃｍであり、初期重量６０．７ｍｇのＰＥＴフィルムを用い、リゾビウムｓｐ．ＯＫＨ−０３（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４８３）のみを含む培養液１ｍｌを添加した以外は、同様の操作を行ったところ、５５日間でＰＥＴフィルムの重量は５６．２ｍｇであり、減量率は７．４％、フィルムの片面の面積を基準とした場合の分解速度は０．０２９ｍｇ／ｃｍ２・日であった。
比較例２
実施例１において、寸法が１．４ｃｍ×２．０ｃｍであり、初期重量６０．７ｍｇのＰＥＴフィルムを用い、菌を含む培養液を添加しなかったこと以外は、同様の操作を行ったところ、ＰＥＴフィルムの重量は６０．７ｍｇであり、有意な重量減少は認められなかった。また、図２に示すとおり、電子顕微鏡による目視観察でも表面は分解されていないことが確認された。
比較例３
実施例３において、ピグメンティファーガを含まないこと以外は同様の操作を行ったところ、ＴＬＣによって、培養初期と同濃度のテレフタル酸が検出された。
［配列表］
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2006090913.tif 000006
2006090913.tif 000007
2006090913.tif 000008
【図１】
2006090913.tif 000009
【図２】
2006090913.tif 000010
【国際調査報告】
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2006090913.tif 000012
2006090913.tif 000013
2006090913.tif 000014
2006090913.tif 000015
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