(57)【要約】  タンパク質合成活性を有する細胞抽出液から、精製や相互作用解析に用いるアフィニティ担体と結合する物質を除去した無細胞タンパク質合成用細胞抽出液を製造し、該無細胞タンパク質合成用細胞抽出液を用いて目的タンパク質を合成する。合成された目的タンパク質は該アフィニティ担体を用いて精製することもできるし、相互作用解析に用いることもできる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
無細胞タンパク質合成用細胞抽出液製造法であって、タンパク質合成活性を有する細胞抽出液を該抽出液を用いて合成されるタンパク質に親和性を有するアフィニティ担体と接触させて、該細胞抽出液から該アフィニティ担体に結合する物質を除去する工程を含み、該アフィニティ担体は、該細胞抽出液に接触させても該細胞抽出液のタンパク質合成能を損なわないアフィニティ担体であることを特徴とする方法。
【請求項２】
細胞抽出液が、コムギ胚芽抽出液であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アフィニティ担体が、請求項１または２に記載の方法で製造された無細胞タンパク質合成用細胞抽出液を用いて合成されるタンパク質が結合し得る物質を担持しているものである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
アフィニティ担体が、金属キレート担体であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
金属キレート担体が、コバルト担体、ニッケル担体、あるいは亜鉛キレート担体のいずれかである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法により製造された無細胞タンパク質合成用細胞抽出液。
【請求項７】
無細胞タンパク質合成用細胞抽出液であって、該抽出液を用いて合成されるタンパク質に親和性を有するアフィニティ担体に結合し、該細胞抽出液のタンパク質合成能に大きく影響しない物質が除去されていることを特徴とする細胞抽出液。
【請求項８】
請求項６または７に記載の無細胞タンパク質合成用細胞抽出液を用いてタンパク質を合成するタンパク質製造方法。
【請求項９】
請求項６または７に記載の無細胞タンパク質合成用細胞抽出液を用いてタンパク質の合成反応を行い、得られた合成反応液を、該細胞抽出液の製造に用いたアフィニティ担体、又はこれと実質的に同一のアフィニティ担体と接触させることにより、該タンパク質を該アフィニティ担体に結合させて回収することを特徴とするタンパク質の精製方法。
【請求項１０】
請求項６または７に記載の無細胞タンパク質合成用細胞抽出液を用いてタンパク質の合成反応を行い、得られた合成反応液を、該細胞抽出液の製造に用いたアフィニティ担体またはこれと実質的に同一のアフィニティ担体であって目的物質が担持されたアフィニティ担体と接触させることにより、該タンパク質と該目的物質の相互作用を解析することを特徴とするタンパク質−物質間相互作用解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無細胞タンパク質合成用細胞抽出液、該細胞抽出液の製造方法、該細胞抽出液を用いた目的タンパク質合成方法、合成された目的タンパク質の精製方法、並びに合成された目的タンパク質と物質間の相互作用解析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の合成方法には、生細胞で行う方法と、無細胞タンパク質合成系で行う方法等が知られている。このような合成系で合成されたタンパク質（以下、これを「組換えタンパク質」と称することがある）は、これを適当な方法を用いて精製して利用される。タンパク質の精製方法には、精製するタンパク質の種類によって様々な方法が用いられる。その中で、合成しようとするタンパク質をタグと呼ばれるペプチドとの融合タンパク質として上記の合成系を用いて合成し、該タグペプチドと特異的に結合する物質を固定化したアフィニティ担体により精製する方法が有効に用いられている。【０００３】
組換えタンパク質の利用法として、例えば立体構造解析に用いる場合等は、該タンパク質の精製度は非常に高いものが要求される（タンパク質・酵素の基礎実験法、南江堂、１９８１年）。また、組換えタンパク質を機能解析に用いる場合には、より精製度の高いものが求められる。しかし、上記のアフィニティ担体を用いたタンパク質の精製方法を行っても、目的タンパク質が高度に精製されることは少なく、さらに複数の精製を組み合わせて行う必要があった。【０００４】
このような複数種類の精製法を組み合わせたタンパク質の精製は、操作が煩雑であるだけでなく、各精製工程における目的タンパク質のロスが増加するために、立体構造解析のように多くのタンパク質量を必要とする目的に用いる場合には問題があった。
そこで、これらの問題を解決するために高度な精製効率を有する精製方法が望まれていた。【０００５】
一方、タンパク質と物質間の相互作用解析を行なう方法が一般に用いられているが、これらの方法で用いられる目的タンパク質溶液に、本来相互作用するものではない非特異的結合をする物質が含まれると、相互作用する物質を保持した担体等と上記タンパク質を接触させて、該物質と結合するタンパク質を取得しようとした場合、擬陽性が多く見られ、解析効率が非常に悪いという問題があった。そこで、これらの問題を解決する高効率なタンパク質−物質間相互作用解析方法が望まれていた。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、高度な精製効率を有するタンパク質の精製や、高効率のタンパク質（ポリペプチド）−物質間相互作用解析方法を提供することを課題とする。さらに詳細には、高度な精製効率を有する精製や高効率なタンパク質−物質間相互作用解析方法に用いるためのタンパク質を合成する無細胞タンパク質合成用細胞抽出液、該細胞抽出液を用いるタンパク質合成方法、並びに該細胞抽出液により合成されたタンパク質を精製する方法や、該細胞抽出液により合成されたタンパク質を用いてタンパク質−物質間相互作用解析を行なう方法の提供を課題とする。
【０００７】
即ち、本発明によれば、
（１）  無細胞タンパク質合成用細胞抽出液製造法であって、タンパク質合成活性を有する細胞抽出液を該抽出液を用いて合成されるタンパク質に親和性を有するアフィニティ担体と接触させて、該細胞抽出液から該アフィニティ担体に結合する物質を除去する工程を含み、該アフィニティ担体は、該細胞抽出液に接触させても該細胞抽出液のタンパク質合成能を損なわないアフィニティ担体であることを特徴とする方法。
（２）  細胞抽出液が、コムギ胚芽抽出液であることを特徴とする（１）の方法。
（３）  アフィニティ担体が、（１）または（２）の方法で製造された無細胞タンパク質合成用細胞抽出液を用いて合成されるタンパク質が結合し得る物質を担持しているものである（１）または（２）の方法。
（４）  アフィニティ担体が、金属キレート担体であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかの方法。
（５）  金属キレート担体が、コバルト担体、ニッケル担体、あるいは亜鉛キレート担体のいずれかである（４）の方法。
（６）  （１）〜（５）のいずれかの方法により製造された無細胞タンパク質合成用細胞抽出液。
（７）  無細胞タンパク質合成用細胞抽出液であって、該抽出液を用いて合成されるタンパク質に親和性を有するアフィニティ担体に結合し、該細胞抽出液のタンパク質合成能に大きく影響しない物質が除去されていることを特徴とする細胞抽出液。
（８）  （６）または（７）の無細胞タンパク質合成用細胞抽出液を用いてタンパク質を合成するタンパク質製造方法。
（９）  （６）または（７）の無細胞タンパク質合成用細胞抽出液を用いてタンパク質の合成反応を行い、得られた合成反応液を、該細胞抽出液の製造に用いたアフィニティ担体またはこれと実質的に同一のアフィニティ担体と接触させることにより、タンパク質を該アフィニティ担体に結合させて回収することを特徴とするタンパク質の精製方法。
（１０）  （６）または（７）の無細胞タンパク質合成用細胞抽出液を用いてタンパク質の合成反応を行い、得られた合成反応液を、該細胞抽出液の製造に用いたアフィニティ担体またはこれと実質的に同一のアフィニティ担体であって目的物質が担持されたアフィニティ担体と接触させることにより、該タンパク質と該目的物質の相互作用を解析することを特徴とするタンパク質−物質間相互作用解析方法、
等が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】Ｔａｌｏｎカラム処理を行ったコムギ胚芽抽出液と未処理のコムギ胚芽抽出液を用いてタンパク質合成反応を行ったときの目的タンパク質合成量を示す電気泳動写真である。図中、レーン１はマーカーを示し、レーン２はコントロールのクレアチンキナーゼ、レーン３は未処理コムギ胚芽抽出液を用いてＮ−Ｈｉｓ−ＪＳＰ−１を合成した反応液、レーン４はＴａｌｏｎカラム処理コムギ胚芽抽出液を用いてＮ−Ｈｉｓ−ＪＳＰ−１を合成した反応液、レーン５は未処理コムギ胚芽抽出液を用いてＧＦＰを合成した反応液、レーン６はＴａｌｏｎカラム処理コムギ胚芽抽出液を用いてＧＦＰを合成した反応液の結果を示す。Ｔａｌｏｎカラムで処理を行ったコムギ胚芽抽出液のタンパク質合成能は、未処理のコムギ胚芽抽出液と比べてほぼ同等である。
【図２】Ｔａｌｏｎカラム処理を行ったコムギ胚芽抽出液と未処理のコムギ胚芽抽出液を用いてタンパク質合成反応を行った後に、同じＴａｌｏｎカラムで精製を行ったタンパク質を示す電気泳動写真である。図中、レーン１は分子量マーカー、レーン２はコントロールのクレアチンキナーゼ、レーン３は未処理コムギ胚芽抽出液を用いてＮ−Ｈｉｓ−ＪＳＰ−１合成を行った後に、同じ金属キレート担体を用いて上記タンパク質の精製を行った結果を示し、レーン４はＴａｌｏｎカラム処理コムギ胚芽抽出液を用いてＮ−Ｈｉｓ−ＪＳＰ−１合成を行った後に、同じ金属キレート担体を用いて上記タンパク質の精製を行った結果を示す。Ｔａｌｏｎカラムで処理を行ったコムギ胚芽抽出液を用いて合成したタンパク質を同じ担体カラムで精製した場合、未処理の場合に比べて目的タンパク質の精製効率が非常に高いことがわかる。
【図３】Ｎｉ−ＮＴＡカラム処理を行ったコムギ胚芽抽出液と未処理のコムギ胚芽抽出液を用いてタンパク質合成反応を行った後に、同じＮｉ−ＮＴＡカラムで精製を行ったタンパク質を示す電気泳動写真である。図中、レーン１は未処理抽出液を用いてＰＫ６５の合成を行った後に、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを用いて精製を行った結果を示し、レーン２はＮｉ−ＮＴＡカラム処理抽出液を用いてＰＫ６５の合成を行った後に、同じＮｉ−ＮＴＡカラムを用いて精製を行った結果を示し、レーン３は未処理抽出液を用いてＰＫ１４２の合成を行った後に、同じＮｉ−ＮＴＡカラムを用いて精製を行った結果を示し、さらにレーン４はＮｉ−ＮＴＡ処理抽出液を用いてＰＫ１４２の合成を行った後に、同じＮｉ−ＮＴＡカラムを用いて精製を行った結果を示す。Ｎｉ−ＮＴＡカラム処理抽出液を用いて合成したタンパク質をＮｉ−ＮＴＡカラムで精製した結果では、溶離液中の目的のタンパク質の純度が高くなっており、未処理抽出液を用いて合成したタンパク質をＮｉ−ＮＴＡカラムで精製した結果では、目的のタンパク質以外にコムギ胚芽抽出液由来のタンパク質が高濃度溶離液中に含まれていることがわかる。つまり、Ｎｉ−ＮＴＡカラム処理抽出液を用いて合成したタンパク質をＮｉ−ＮＴＡカラムで精製することにより、目的タンパク質の非常に高度な精製が可能であることが確認される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を実施するための最良の形態について詳細に説明する。以下に記載する構成要件の説明は、本発明の実施態様の一例（代表例）であり、これらの内容に特定はされない。【００１０】
（１）無細胞タンパク質合成用細胞抽出液の製造
本発明の１つは、無細胞タンパク質合成用細胞抽出液の製造法であって、タンパク質合成活性を有する細胞抽出液を該抽出液を用いて合成されるタンパク質に親和性を有するアフィニティ担体と接触させて、該細胞抽出液から該アフィニティ担体に結合する物質を除去する工程を含み、該アフィニティ担体は、該細胞抽出液に接触させても該細胞抽出液のタンパク質合成能を損なわないアフィニティ担体であることを特徴とする方法である。「タンパク質合成活性を有する細胞抽出液」とは、鋳型核酸、アミノ酸、エネルギー源等を供給することにより無細胞タンパク質合成を行うことができる細胞抽出液を意味し、このような活性があれば何れのものでもよい（以下、これを「細胞抽出液」と称することがある）。具体的には、大腸菌、植物種子の胚芽、ウサギ網状赤血球等の細胞抽出液等が挙げられる。これら無細胞タンパク質合成用細胞抽出液は、市販のものも用いることができるし、それ自体既知の方法、例えば、大腸菌の場合は、Pratt, J. M. et al., Transcription and translation, Hames, 179-209, B. D. & Higgins, S. J., IRL Press, Oxford(1984)等に記載の方法を用いて作製したものでもよい。【００１１】
市販の無細胞タンパク質合成用細胞抽出液としては、大腸菌由来のものは、E. coli S30 extract system(Promega社製）とRTS 500 Rapid Translation System等を用いることができ、ウサギ網状赤血球由来のものは、Rabbit Reticulocyte Lysate system（Promega社製）等、さらにコムギ胚芽由来のものは、PROTEIOSTM（TOYOBO社製）等を用いることができる。
このうち、コムギ胚芽細胞抽出液を用いて合成された目的タンパク質の精製に金属キレート担体を用いる場合には、コムギ胚芽細胞抽出液に金属キレート担体に結合する物質が多く含まれるため、本発明の方法により製造された無細胞タンパク質合成用コムギ胚芽細胞抽出液を用いることが好ましい。【００１２】
本発明の無細胞タンパク質合成用細胞抽出液の製造法において原料として用いることのできるコムギ胚芽細胞抽出液としては、ＷＯ０３／０６４６７１号公報に記載の方法により調製された細胞抽出液等が特に好ましく用いられる。
より、具体的にはコムギ胚芽細胞抽出液は以下のようにして調製することができる。
コムギ種子から無傷の胚芽を主成分とする胚芽画分を取得する。ここで、無傷の胚芽とは、少なくとも発芽能を有する胚芽を意味し、胚芽画分とは、無傷の胚芽を主要成分とするものであり、これを用いて無細胞タンパク質合成に使用しうる細胞抽出物が調製可能なものを意味する。コムギ種子に含まれる胚芽の量は少なく、種子から胚芽を効率的に取得するためには、胚芽以外の部分をできるだけ除去しておくことが好ましい。通常、まず、コムギ種子に機械的な力を加えることにより、胚芽、胚乳破砕物、種皮破砕物を含む混合物を得、該混合物から、胚乳破砕物、種皮破砕物等を取り除いて粗胚芽画分（胚芽を主成分とし、胚乳破砕物、種皮破砕物を含む混合物）を得る。コムギ種子に加える力は、コムギ種子から胚芽を分離することができる程度の強さであればよい。
通常は、公知の粉砕装置を用いて、コムギ種子を粉砕することにより、胚芽、胚乳破砕物、種皮破砕物を含む混合物を得る。コムギ種子の粉砕は、通常公知の粉砕装置を用いて行うことができるが、ピンミル、ハンマーミル等の被粉砕物に対して衝撃力を加えるタイプの粉砕装置を用いることが好ましい。粉砕の程度は、使用するコムギ種子胚芽の大きさに応じて適宜選択すればよい。コムギ種子の場合は、通常、最大長さ４ｍｍ以下、好ましくは最大長さ２ｍｍ以下の大きさに粉砕する。また、粉砕は乾式で行うのが好ましい。
次いで、得られたコムギ種子粉砕物から、通常公知の分級装置、例えば篩を用いて粗胚芽画分を取得する。コムギ種子の場合、通常、メッシュサイズ０．５ｍｍ〜２．０ｍｍ、好ましくは０．７ｍｍ〜１．４ｍｍの粗胚芽画分を取得する。さらに、必要に応じて、得られた粗胚芽画分に含まれる種皮、胚乳、ゴミ等を風力、静電気力を利用して除去してもよい。
また、胚芽と種皮、胚乳の比重の違いを利用する方法、例えば重液選別により、粗胚芽画分を得ることもできる。より多くの胚芽を含有する粗胚芽画分を得るために、上記の方法を複数組み合わせてもよい。胚芽は、胚芽以外の部分よりも硬いために、上記粉砕処理の際も胚芽以外の部分は粉砕されるが、胚芽は粉砕されずその形状を保ったまま分離される。【００１３】
上記のようにして得られた胚芽、胚乳破砕物、種皮破砕物等を含む粗胚芽画分から、目視等により形状の違いに基づいて胚芽を選別する。種子粉砕物から胚芽を選別することもできるが、種子粉砕物は胚芽以外の成分を大量含んでいるため、効率的ではない。このようにして得られた胚芽画分には、胚乳成分が付着している場合があるため、通常、胚芽純化のために更に洗浄処理することが好ましい。
洗浄処理としては、通常１０℃以下、好ましくは４℃以下に冷却した水又は水溶液に胚芽画分を分散・懸濁させ、洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄することが好ましい。また、通常１０℃以下、好ましくは４℃以下で、界面活性剤を含有する水溶液に胚芽画分を分散・懸濁させて、洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄することがより好ましい。界面活性剤としては、非イオン性のものが好ましく、非イオン性界面活性剤であるかぎりは、広く利用ができる。具体的には、例えば、好適なものとして、ポリオキシエチレン誘導体であるブリッジ（Ｂｒｉｊ）、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）等が例示される。なかでも、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０が最適である。これらの非イオン性界面活性剤は、例えば０．５％の濃度で使用することができる。水又は水溶液による洗浄処理及び界面活性剤による洗浄処理は、どちらか一方でもよいし、両方実施してもよい。また、これらの洗浄処理は、超音波処理との組み合わせで実施してもよい。【００１４】
かくして、胚乳成分が除去された胚芽画分を取得することができる。胚芽画分中に胚乳成分が含まれていないことは、リボソームがトリチンによって実質的に脱アデニン化されないことから確認できる。
以上のようにして得られた胚芽を、微粉砕及び抽出処理することにより胚芽抽出物を得る。胚芽抽出物を得る方法は、従来公知の方法で行うことができる。例えば、液体窒素で凍結した胚芽を乳鉢等を用いて微粉砕し、抽出溶媒を加えて攪拌した後、胚芽抽出物含有液を遠心分離等により回収し、ゲルろ過等により精製する。あるいは、胚芽を衝撃または切断により粉砕し、抽出溶媒を加えて撹拌した後、胚芽抽出物含有液を遠心分離により回収し、ゲルろ過等により精製する。
抽出溶媒としては、緩衝液、カリウムイオン、マグネシウムイオン及び／又はチオール基の酸化防止剤を含む水溶液を用いることができる。また、必要に応じて、カルシウムイオン、Ｌ型アミノ酸等をさらに添加してもよい。例えば、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ'−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、Ｌ型アミノ酸及び／又はジチオスレイトールを含む溶液や、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎらの方法を一部改変した溶液（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、塩化カルシウム、Ｌ型アミノ酸及び／又はジチオスレイトールを含む溶液）を抽出溶媒として使用することができる。抽出溶媒中の各成分の組成・濃度はそれ自体既知であり、無細胞タンパク質合成用のコムギ胚芽抽出液の製造法に用いられるものを採用すればよい。
ゲルろ過としては、例えば予め抽出溶媒（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、ジチオスレイトール又はＬ型アミノ酸を含む溶媒）で平衡化しておいたゲルろ過装置を用いて行うことができる。ゲルろ過溶液中の各成分の組成・濃度はそれ自体既知であり、無細胞タンパク合成用のコムギ胚芽抽出液の製造法に用いられるものを採用すればよい。【００１５】
本発明において、「アフィニティ担体」とは、特定のタンパク質と親和性を有し、これらと結合し、これらを吸着する性質を有する物質を保持した担体を意味する。該アフィニティ担体は、特定のタンパク質と結合し、これを吸着することによって、特定のタンパク質、または該タンパク質を介した他タンパク質の精製に用いられ得るものである。また、特定タンパク質と物質間の相互作用の解析に用いられるものとしては、特定タンパク質と相互作用する物質を保持したアフィニティ担体を用いる。本発明の方法では、本発明の無細胞タンパク質合成用細胞抽出液を用いて合成されるタンパク質に親和性を有するアフィニティ担体を用いる。
本発明の方法において、細胞抽出液から除去する「アフィニティ担体に結合する物質」とは、アフィニティ担体に接触させる前の細胞抽出液に含まれる物質であって、上記アフィニティ担体に結合し、タンパク質合成活性を有する細胞抽出液から該物質を除去しても細胞抽出液のタンパク質合成能が損なわれずに保持されるものであれば何れのものでもよい。また、該細胞抽出液の「タンパク質合成能が保持される」とは、該細胞抽出液のタンパク質合成能が、合成される目的タンパク質の利用に充分な量を合成し得る程度に保たれることを意味する。具体的には、未処理の同じ細胞抽出液と比較してそのタンパク質合成能が３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上に保たれるものを意味する。これらには、タンパク質合成活能が未処理の細胞抽出液と比較して上昇するものも含まれる。例えば、タンパク質合成能は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの電気泳動により合成されたタンパク質のバンドの濃さを比較することや、合成反応系に標識アミノ酸を加え、合成タンパク質への標識アミノ酸の取り込み量を比較することによって調べることができる。【００１６】
アフィニティ担体として、一般的にタンパク質の精製に用いられるものの具体例としては、コバルト担体、ニッケル担体等の金属キレート担体、ＨｉＴｒａｐ  ｃｈｅｌｅｔｉｎｇ  ＨＰ（アマシャム社製）、ＩＰＡＣ  Ｍｅｔａｌ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｒｅｓｉｎ（エプロジェン社製）等の金属キレート用担体とニッケルイオン、コバルトイオン、亜鉛イオンなどの金属イオンの組み合わせによる金属キレート担体、抗体結合担体、マルトース結合担体、グルタチオン結合担体、メトトリキセート結合担体、ＰｒｏｔｅｉｎＧ結合担体、ＰｒｏｔｅｉｎＡ結合担体、抗体のＦｃ部位結合担体、４−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｒｓｉｎｅ  ｏｘｉｄｅ結合担体、セルロース結合担体等が挙げられる。また、抗体結合担体としては、例えば、抗ＨＡ抗体結合担体、抗ＦＬＡＧ抗体結合担体、抗ｍｙｃタグ抗体結合担体、抗Ｔ７抗体結合担体、抗Ｖ５抗体結合担体、抗チオレドキシン抗体結合担体、抗ＣＡＴ抗体結合担体、抗ＧＦＰ抗体結合担体、抗β−ｇａｌ抗体結合担体等が挙げられる。【００１７】
上記の細胞抽出液およびアフィニティ担体として、好ましい組み合わせは、コムギ胚芽抽出液と金属キレート担体、あるいはコムギ胚芽抽出液とグルタチオン結合担体等が挙げられる。金属キレート担体として好ましくは、コバルト担体、ニッケル担体などが挙げられる。さらに具体的には、コバルト担体としてはＴａｌｏｎ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｔｙ  Ｒｅｓｉｎ（クローンテック社、BD Bioscience社）等が挙げられ、ニッケル担体としては、Ｎｉ−ＮＴＡ−Ａｇａｒｏｓｅ（キアゲン社製）、Ｎｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（アマシャム社製）等が挙げられる。【００１８】
また、タンパク質と物質間の相互作用の解析に用いるものとしては、特定のタンパク質に結合する物質、例えば医薬活性化合物、酵素阻害物質、ＡＴＰアナログ、核酸、タンパク質、ポリペプチド等を保持した担体が挙げられる。
アフィニティ担体を構成し、タンパク質と親和性を有する物質が保持される担体は、本発明の細胞抽出液製造方法や、タンパク質の精製、あるいはタンパク質−物質間相互作用解析などに用いられるものであれば如何なるものであってもよい。具体的には、アガロース、セルロース、セファロースや、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリアクリレート、テフロン、ポリアセタール等を用いた、ボール又はビーズ、ギヤ、マイクロプレート等が好ましく使用される。固定化の方法は公知の方法を採用できる。【００１９】
本発明の方法で用いられるアフィニティ担体の選択は、アフィニティ担体を細胞抽出液に接触させて細胞抽出液から該アフィニティ担体に結合する物質を除去しても、細胞抽出液のタンパク質合成能が損なわれずに保持されていることを指標として行なうことができる。具体的には、例えば、下述する方法でアフィニティ担体と細胞抽出液を接触させた（以下、この操作を「吸着」と称することがある）後、下述する方法で該細胞抽出液を用いて目的タンパク質を合成する。ここで、合成された目的タンパク質の量を、未処理の細胞抽出液で合成した目的タンパク質の量と適当な方法で比較し、未処理の細胞抽出液で合成したものと比較して３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上の合成量を示すものを選択する方法が挙げられる。【００２０】
本発明の無細胞タンパク質合成用細胞抽出液製造法は、上記細胞抽出液を上記アフィニティ担体と接触させる工程を含むことを特徴としている。「細胞抽出液とアフィニティ担体を接触させる方法」は、アフィニティ担体や細胞抽出液の種類に応じて適宜選択することができる。ただし、該アフィニティ担体を用いて本発明の無細胞タンパク質合成用細胞抽出液により合成されたタンパク質を精製又は相互作用解析する条件と同じ条件で接触させることが好ましい。但し、上記細胞抽出液のタンパク質合成能が保持されるように行うことは重要である。また、接触させるアフィニティ担体と細胞抽出液の体積量は、これらの種類によって適宜選択し得るが、細胞抽出液に対して１／１００以上の体積量のアフィニティ担体を用いることが好ましく、さらに好ましくは１／１０〜１０倍の体積量、最も好ましくは１／５〜２倍の体積量のアフィニティ担体を用いることが好ましい。【００２１】
具体的な細胞抽出液とアフィニティ担体との接触法は、アフィニティ担体と細胞抽出液を適当な容器中で混合するバッチ法、あるいはアフィニティ担体を適当なカラムに詰めた後に、細胞抽出液を該カラムに添加するカラム法等が挙げられる。カラム法を用いる場合、アフィニティ担体は、予め適当な緩衝液で平衡化しておくことが好ましい。適当な緩衝液とは、用いるアフィニティ担体の種類によって適宜選択されるが、細胞抽出液を添加する前には、該細胞抽出液と同様の緩衝液に交換しておくことが好ましい。【００２２】
接触させる温度は、細胞抽出液中のアフィニティ担体に結合すべき物質が結合できて、かつ細胞抽出液のタンパク質合成能が保持される範囲であればよい。具体的には、例えば、０〜５０℃が好ましく、さらには２〜３０℃が好ましい。特に細胞抽出液としてコムギ胚芽抽出液を用いる場合、好ましくは４〜２６℃で接触させることが好ましい。接触させる時間は、細胞抽出液中のアフィニティ担体に結合すべき物質が結合できて、細胞抽出液のタンパク質合成活性が低下しない範囲であればよく、具体的には、例えば、１分以上、好ましくは５〜１００分、さらに好ましくは１０〜６０分である。【００２３】
金属キレート担体を用いる場合には、細胞抽出液中に含まれる還元剤、特にジチオスレイトールの濃度によっては、金属が担体から遊離することがあるが、遊離した金属が、タンパク質合成活性に著しく影響しない限り用いることができる。また、還元剤の濃度を調節したり、他の還元剤を用いること等によってこの金属の遊離を阻害することは有効である。また、金属キレート担体と細胞抽出液を接触させる際に、イミダゾールなどのイミダゾール環を有する化合物またはその誘導体（以下、これを「イミダゾール類」と称することがある）を添加することによれば、上記金属キレート担体に、弱く非特異的に結合している物質の吸着が抑えられるため、本発明の無細胞タンパク質合成用細胞抽出液のタンパク質合成能を保持するために有効である。イミダゾール類の具体的な濃度としては、１ｍＭ以上、好ましくは２〜５０ｍＭ、さらに好ましくは１０〜２０ｍＭが挙げられる。【００２４】
また、細胞抽出液とアフィニティ担体との接触は、公知の細胞抽出液の製造工程の全部を経た後に行ってもよく、また、細胞からタンパク質合成活性を有する抽出液が抽出された後の何れの工程で行ってもよい。【００２５】
かくして製造された本発明の無細胞タンパク質合成用細胞抽出液も本発明の範囲に含まれる。本発明の無細胞タンパク質合成用細胞抽出液は、特定のタンパク質に親和性を有するアフィニティ担体に結合し、該細胞抽出液のタンパク質合成能に大きく影響しない物質が除去されている特徴を有する。
本発明の無細胞タンパク質合成用細胞抽出液にタンパク質合成に必要な翻訳鋳型、核酸分解酵素阻害剤、各種イオン、基質、エネルギー源等（以下、これを「翻訳反応用添加物」と称することがある）を添加して目的タンパク質合成用システム（キット）に付することによりタンパク質合成を行うことができる。また、本発明の無細胞タンパク質合成用細胞抽出液を適当な装置を用いて濃縮した後に、目的タンパク質合成に用いることもできる。本発明の無細胞タンパク質合成用細胞抽出液は、これを凍結させて保存することもできるし、翻訳鋳型及び核酸分解阻害剤以外の翻訳反応用添加物を添加した液（本明細書中ではこれを「レディメイド型細胞抽出液」と称することがある）として保存することもできる。また、特開２０００−３１６５９４号公報、あるいは特開２００２−１２５６９３号公報等に記載の方法等を用いて凍結乾燥して保存することもできる。「細胞抽出液のタンパク質合成能に大きく影響しない」とは、該物質を細胞抽出液から除去した時に、未処理の細胞抽出液と比較して、そのタンパク質合成能が３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上であることを意味する。【００２６】
（２）目的タンパク質の合成
上記（１）に記載の方法で製造した無細胞タンパク質合成用細胞抽出液は、上記の翻訳反応用添加物を添加して目的タンパク質合成用システムに付することによりタンパク質合成を行うことができる。翻訳反応用添加物は、用いる無細胞タンパク質合成用細胞抽出液によって異なるが、公知のものを適宜選択して用いることができる。
具体的には、例えば、コムギ胚芽抽出液を用いる場合、翻訳反応溶液としては、鋳型となる核酸、基質となるアミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液、ＡＴＰ再生系、核酸分解酵素阻害剤、ｔＲＮＡ、還元剤、ポリエチレングリコール、３’，５’−ｃＡＭＰ、葉酸塩、抗菌剤等が含まれる。それぞれ濃度としては、ＡＴＰとしては１００μＭ〜０．５ｍＭ、ＧＴＰは２５μＭ〜１ｍＭ、２０種類のアミノ酸としてはそれぞれ２５μＭ〜０．４ｍＭ含まれるように添加することが好ましい。ここで、細胞抽出液としてＷＯ０３／０６４６７１号公報に記載の方法により調製されたコムギ胚芽抽出液を用いる場合には、通常ｔＲＮＡの添加は必要無い。【００２７】
タンパク質合成のための方法、または装置も、それぞれ選択した無細胞タンパク質合成用細胞抽出液に適した公知の方法や装置を選択することができる。コムギ胚芽抽出液を用いる場合には、バッチ法（Pratt,J.M.et al.,Transcription and Tranlation,Hames,179-209,B.D.&Higgins,S.J.,eds,IRL Press,Oxford(1984)）のように、本発明の無細胞タンパク質合成用細胞抽出液に無細胞タンパク質合成に必要なエネルギー源やアミノ酸、あるいはｔＲＮＡを添加して行う方法や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞タンパク質合成システム（Spirin,A.S.et al.,Science,242,1162-1164(1988））、透析法（木川等、第２１回日本分子生物学会、ＷＩＤ６）、あるいは重層法（Sawasaki, T., et al., FEBS Let. ,514, 102-105(2002)）等が挙げられる。さらには、合成反応系に、鋳型のＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する不連続ゲルろ過法（特開２０００−３３３６７３号公報）等を用いることができる。また、無細胞タンパク質合成に必要なアミノ酸、エネルギー源等を含むゾルまたはゲルの上部に翻訳反応液を重層して行う方法（国際公開2004/050891号パンフレット）を用いることもできる。  【００２８】
鋳型となる核酸は、目的タンパク質をコードするものを用いる。目的タンパク質は、本発明の細胞抽出液で合成され得るものであれば如何なるものであってもよいが、本発明の細胞抽出液を用いる効果は、目的タンパク質の精製や、目的タンパク質−物質間の相互作用解析を行なう場合に発揮されるので、アフィニティ担体に保持されている物質と親和性を有し、これと結合する性質を有する可能性のあるタンパク質が好ましい。目的タンパク質の精製を行なう場合には、アフィニティ担体に保持されている物質と結合することが必要である。ここで、目的タンパク質が本発明の無細胞タンパク質合成用細胞抽出液の製造あるいは後述する目的タンパク質の精製に用いるアフィニティ担体に結合しない場合には、これと結合する能力のあるペプチド（以下、これを「タグ」と称することがある）との融合タンパク質をコードするものを用いることができる。
具体的には、目的タンパク質をコードする塩基配列、または目的タンパク質とタグとの融合タンパク質をコードする塩基配列（以下、これを「ＯＲＦ」と称することがある）を有し、ＯＲＦの上流に、プロモーター配列、翻訳活性増強配列等の転写翻訳制御領域を有し、下流には停止配列とｍＲＮＡの安定性のための非翻訳領域を含むことが好ましい。プロモーター配列は、本発明の無細胞タンパク質合成用細胞抽出液、または転写に用いるＲＮＡ合成酵素により適宜選択することができる。具体的には、転写にＳＰ６  ＲＮＡ合成酵素を用いる場合には、ＳＰ６プロモーターを用いることが好ましい。翻訳活性増強配列として具体的には、真核生物においては、５’キャップ構造（Shatkin, Cell, 9, 645-(1976)）、コザック配列（Kizak, Nucleic Acid. Res., 12, 857-(1984)）等があり、また原核生物においてはシャインダルガーノ配列等が知られている。更にはＲＮＡウィルスの５’−非翻訳リーダー配列にも翻訳促進活性があることが見出されており（特許第２８１４４３３号公報）、これらの配列を用いてタンパク質合成を効率よく行う方法が開発されている（特開平１０−１４６１９７号公報）。【００２９】
目的タンパク質は、本発明の無細胞タンパク質合成用細胞抽出液を用いた上記合成法により合成され得るものであれば如何なるものであってもよい。目的タンパク質としてタグとの融合タンパク質を用いる場合、タグは、上記アフィニティ担体に特定に結合する性質を有するものを用いる。本発明で用いられるアフィニティ担体と、これと特異的に結合するタグとの組み合わせは、例えば、金属キレート担体とポリヒスチジン、マルトース結合担体とマルトース結合タンパク質、グルタチオン結合担体とグルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、メトトリキセート結合担体とジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ＰｒｏｔｅｉｎＧ結合担体、あるいはＰｒｏｔｅｉｎＡ結合担体と抗体のＦｃ部分、抗体のＦｃ部位結合担体とＰｒｏｔｅｉｎＧ、あるいはＰｒｏｔｅｉｎＡ、４−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｒｓｉｎｅ  ｏｘｉｄｅ結合担体とチオレドキシン、セルロース結合担体とセルロースバインディング部位、抗ＨＡ抗体結合担体とＨＡタグ、抗ＦＬＡＧ抗体結合担体とＦＬＡＧタグ、抗ｍｙｃ抗体結合担体とｍｙｃタグ、抗Ｔ７抗体結合担体とＴ７タグ、抗Ｖ５抗体結合担体とＶ５タグ、抗チオレドキシン抗体結合担体とチオレドキシン、抗ＣＡＴ抗体結合担体とＣＡＴタグ、抗ＧＦＰ抗体結合担体とＧＦＰ等が挙げられる。【００３０】
これらのタグは、目的タンパク質のどこに含まれていてもよいが、好ましくは、目的タンパク質のＮ末またはＣ末に位置するものが挙げられる。本発明の無細胞タンパク質合成用細胞抽出液の製造および目的タンパク質の精製等に、上記（１）に挙げた抗体結合担体を用いる場合には、その抗体に対する抗原ポリペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質を用いることができる。ここで、該抗体結合担体の抗原が目的タンパク質自身である場合は、目的タンパク質そのものを用いることができる。タグとして用いる抗原ポリペプチドは、担体に結合している抗体に結合し得る限り、その構造は特に制限はない。【００３１】
また、本発明の無細胞タンパク質合成用細胞抽出液の製造および目的タンパク質の精製にアビジン結合担体やストレプトアビジン結合担体を用いる場合には、目的タンパク質がビオチン修飾されたタンパク質が合成されるような合成方法を用いる。具体的には、例えば、目的タンパク質をコードする鋳型を用い、ビオチン修飾されたアミノ酸を含む上記のタンパク質合成方法等が挙げられる。【００３２】
また、必要であれば、アフィニティ担体による目的タンパク質の精製後に、タグを目的タンパク質から分離するための構造を有する鋳型を用いることができる。具体的には、プロテアーゼ認識配列がタグと目的タンパク質との間に挿入されたタンパク質をコードする鋳型を用いることができる。プロテアーゼ認識配列とは、具体的には、例えば、PreScissionTMProtease（アマシャムバイオサイエンス社）認識配列等が挙げられる。
また、本発明の細胞抽出液を用いて合成したタンパク質を、タンパク質−物質間相互作用解析に用いる場合には、合成されるタンパク質は相互作用解析に適した形態を有するように合成されることが好ましい。具体的には、例えば、タンパク質（ポリペプチド）とそれをコードする核酸が共有結合した形態を有する分子等が挙げられる。この分子の合成法や、これを用いたタンパク質−物質間相互作用解析方法等は、例えば、ＷＯ９８／１６６３６号公報等に記載された方法を用いることができる。【００３３】
（３）目的タンパク質の精製
上記（２）のようにして得られるタンパク質合成反応溶液を、本発明の無細胞タンパク質合成用細胞抽出液を製造する際に用いたアフィニティ担体またはこれと実質的に同一のアフィニティ担体と接触させ、アフィニティ担体に結合したタンパク質を溶離することにより、目的タンパク質を高度に精製することができる。「実質的に同一なアフィニティ担体」とは、本発明の無細胞タンパク質合成用細胞抽出液を製造する際に用いたアフィニティ担体と同様の物質を結合し、合成されたタンパク質を吸着する性質を有するものであれば十分であり、全く同一のものでなくてもよいことを意味する。アフィニティ担体を用いる目的タンパク質の精製は、それ自体既知の各アフィニティ担体に適した方法を用いることができる。ここで、アフィニティ担体の平衡化用緩衝液および溶離用緩衝液に、５〜２０ｍＭのイミダゾール等のイミダゾール環を有する化合物あるいはその誘導体を添加することによれば、アフィニティ担体への非特異的吸着を防止することができ、目的タンパク質の精製効率をさらに上昇させることができる。【００３４】
上記アフィニティ担体に吸着後、適当な方法で溶離された目的タンパク質は、例えば、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動などを用いて分離し、ＣＢＢ染色などにより確認することができる。【００３５】
（４）目的物質とタンパク質の相互作用解析
また、本発明の細胞抽出液を用いて合成したタンパク質は、タンパク質−物質間相互作用解析に用いることもできる。例えば、アフィニティ担体として、タンパク質に結合しうる目的物質を担持させた担体を用い、これに本発明の細胞抽出液を用いて合成したタンパク質を接触させて、該タンパク質と該目的物質の相互作用を解析することができる。この場合、１種類のタンパク質を合成し、そのタンパク質と担体に担持された目的物質の相互作用を解析することもできるし、タンパク質ライブラリーのような複数のタンパク質を合成し、それらのタンパク質の中から目的物質と相互作用するタンパク質を探索することもできる。相互作用の解析法は特に制限されないが、例えば、標識されたタンパク質を合成し、担体に特異的に結合した標識物質の量に基づいて解析してもよい。また、上述したようなタンパク質（ポリペプチド）とそれをコードする核酸が共有結合した形態を有する分子を用いてもよい。この場合、目的物質に結合したタンパク質を容易に同定することができるため、目的物質と相互作用するタンパク質を探索するような研究に適している。
【実施例】
【００３６】
以下に、実施例を挙げ本発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例は本発明の一例を示すものに過ぎず、本発明の範囲は以下の実施例により何ら限定されるものではない。
なお、以下の実施例において、ｍｉｎは分、ｌはリットル、ｍｌはミリリットル、Ｍはモル／リットル、ｍＭはミリモル／リットル、μｇはマイクログラムをそれぞれ表す。【００３７】
実施例１  ワーリングブレンダーによる微粉砕抽出
北海道産のチホク小麦（未消毒）を用い、ＷＯ０２／２９５３７７号公報の実施例に記載の方法に準じて、胚芽を分離し、胚芽の純度（任意のサンプル１ｇ当たりに含まれる胚芽の重量割合）が９８％以上になるまで選別した。得られた小麦胚芽５０ｇを、４℃の蒸留水中に懸濁し、超音波洗浄器を用いて洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄した。次に、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０の０．５容量％溶液に懸濁し、超音波洗浄器を用いて洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄して胚乳分を除去した小麦胚芽を得た。
次いで、以下の操作を４℃で行い、小麦胚芽抽出液を得た。まず洗浄した小麦胚芽を抽出Ｂｕｆｆｅｒ（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）８０ｍＭ、酢酸カリウム２００ｍＭ、酢酸マグネシウム１０ｍＭ、塩化カルシウム４ｍＭ、Ｌ型アミノ酸２０種類各０．６ｍＭ及びジチオスレイトール８ｍＭ）１００ｍｌとともにワーリングブレンダーに入れ、回転数５０００〜２００００ｒｐｍで３０秒粉砕した。ブレンダー内壁に付着した胚芽等をかき落とした後、再び５０００〜２００００ｒｐｍで３０秒粉砕する作業を２回行った。得られた胚芽粉砕物の粒径分布をレーザー散乱方式粒度分布装置（堀場製作所製ＬＡ−９２０）を用いて測定した。【００３８】
得られた抽出液と粉砕胚芽の混合物を遠心管に移し３００００ｇ、３０分間の遠心をかけ上清を採取した。これをさらに３００００ｇ、３０分間の遠心をかけ上清を採取する操作を５回繰り返し、濁りのない上清を得た。これを、あらかじめＢｕｆｆｅｒ（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）４０ｍＭ、酢酸カリウム１００ｍＭ、酢酸マグネシウム５ｍＭ、Ｌ型アミノ酸２０種類各０．３ｍＭ、及びジチオスレイトール４ｍＭ）で平衡化しておいたセファデックスＧ−２５カラムでゲルろ過を行った。得られた液を３００００ｇ、１２分間の遠心をかけ上清を採取し、限外ろ過膜を使用して濃縮を行った。これを小麦胚芽抽出液とした。試料の濃度は、２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ260）が１８０〜２５０（Ａ260／Ａ280＝１．５程度）になるように調製した（以下、これを「未処理抽出液」と称することがある）。【００３９】
実施例２  Ｔａｌｏｎ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎカラムによるコムギ胚芽抽出液処理
（１）Ｔａｌｏｎ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎカラムの平衡化
金属キレート担体カラムであるＴａｌｏｎ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎ５０％溶液（クローンテック、BD Biosciences社製）：１００μｌをスピンカラムに添加して、３０００ｒｐｍ、１ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、カラム担体に含まれる保存Ｂｕｆｆｅｒを除去した。次に、保存Ｂｕｆｆｅｒを除去した担体にコムギ胚芽抽出液を作製する際に使用したＢｕｆｆｅｒ（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）４０ｍＭ、酢酸カリウム１００ｍＭ、酢酸マグネシウム５ｍＭ、Ｌ型アミノ酸２０種類各０．３ｍＭ及びジチオスレイトール４ｍＭ）：５００μｌを添加して、３０００ｒｐｍ、１ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、Ｂｕｆｆｅｒを除去した。これを３回繰り返し、担体の平衡化を行った。【００４０】
（２）カラムによるコムギ胚芽抽出液処理
上記（１）で平衡化を行ったカラム担体に対して実施例１で作製したコムギ胚芽抽出液：５０μｌを添加し、２６℃、３０ｍｉｎインキュベートし、コムギ胚芽抽出液の内在性のＴａｌｏｎ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎに吸着するタンパク質の吸着を行った。その後、３０００ｒｐｍ、１ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、内在性のＴａｌｏｎ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎに吸着するタンパク質を除去したコムギ胚芽抽出液（以下、これを「Ｔａｌｏｎカラム処理抽出液」と称することがある）を作製した。【００４１】
（３）Ｔａｌｏｎカラム処理抽出液と未処理抽出液の液組成調整
上記の条件で処理を行ったＴａｌｏｎカラム処理抽出液と実施例１で作製した未処理抽出液の液組成を最終濃度 ３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．４ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）になるように調整した。その後、液組成を調整したコムギ胚芽抽出液を２６０ｎｍでの吸光度が７５ＡｂｓになるようにＢｕｆｆｅｒ （３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．４ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ））を用いて調節した。【００４２】
実施例３ Ｔａｌｏｎカラム処理抽出液と未処理抽出液のタンパク質合成能の比較
実施例２で調整した２種類のコムギ胚芽抽出液４０μｌに対して（i）ＧＦＰ遺伝子をコードするｍＲＮＡと（ii）アミノ基末端側にヒスチジン１０個の遺伝子配列とその下流にＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎTMＰｒｏｔｅａｓｅ（アマシャム バイオサイエンス社）認識配列とその下流にＪＳＰ−１構造遺伝子の１番目のメチオニンから１６３番目のグルタミン酸までの遺伝子をコードするｍＲＮＡの２種類を用いてタンパク質合成を行った。【００４３】
（１）鋳型の調製
（i）Ｎ−Ｈｉｓ−ＪＳＰ−１（１−１６３）／ｐＥＵ
ＳＰ６プロモーター配列およびリボソーム結合配列を５’→３’の順に含むオリゴＤＮＡ（配列番号１）を化学合成により取得した。また、ＪＳＰ−１（GenBank Accession No.AF424702）を鋳型として、５’センス側のプライマーとして、ヒスチジンタグをコードする配列とＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎTMＰｒｏｔｅａｓｅ（アマシャム バイオサイエンス社）認識配列、さらにその下流にＪＳＰ−１の５’端の配列を含むオリゴＤＮＡ（配列番号２）用い、３’アンチセンス側プライマーとして、５’末端にＳｆｉＩサイトを付加したＪＳＰ−１の１６３番目のグルタミン酸までを増幅することができるオリゴＤＮＡ（配列番号３）を用いてＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片をＳｆｉＩで切断した（以下、これを「ＪＳＰ−１断片」と称することがある）。【００４４】
タンパク質合成用ベクターであるｐＥＵ３ｂ（Sawasaki, T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(23), 14652-14657(2002)）からＳＰ６プロモーター配列、Ω配列およびマルチクローニングサイトを除去して、ＮａｅＩおよびＳｆｉＩサイトを付加した。このベクターをＮａｅＩで切断し、上記で取得した配列番号１で示されるＤＮＡ断片とライゲーションを行った。このプラスミドをｐＥＵｂｌｕｎｔとした。ｐＥＵｂｌｕｎｔをＳｍａＩおよびＳｆｉＩで切断し、上記ＪＳＰ−１断片とライゲーションした。得られたプラスミドをＮ−Ｈｉｓ−ＪＳＰ−１（１−１６３）／ｐＥＵとした。【００４５】
（ii）ＧＦＰ／ｐＥＵ
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＤＮＡ配列が含まれるプラスミド（Plasmid-pCaMV35S-sGFP(S65T)-NOS3'(25)、Haas, J. et al., Curr. Biol., 6(3), 315-324(1996)）を鋳型として、配列番号４および５に記載の塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡ断片をＳｆｉＩで切断し、ｐＥＵｂｌｕｎｔをＳｍａＩおよびＳｆｉＩで切断したものとライゲーションを行った。得られたプラスミドをＧＦＰ／ｐＥＵとした。【００４６】
（２）タンパク質合成
上記（１）で調製したＧＦＰ／ｐＥＵ、Ｎ−Ｈｉｓ−ＪＳＰ−１（１−１６３）／ｐＥＵを鋳型として、ＳＰ６  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて転写を行い、得られたＲＮＡをエタノール沈殿により定法に従い精製して用いた。
実施例２で調整した２種類のコムギ胚芽抽出液４０μｌに対して上記ｍＲＮＡをそれぞれ２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で含む翻訳反応溶液（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．４ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）２０μｌ）を調製した。【００４７】
この翻訳反応溶液を透析膜に入れ、Ｂｕｆｆｅｒ（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）２．５ｍｌ）を透析外液として用い、２６℃で２４時間タンパク質合成反応を行った。【００４８】
反応後のタンパク質合成溶液：１μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＣＢＢ染色して合成物を確認した。この結果を図１に示す。図中レーン１はマーカーを示し、レーン２はコントロールのクレアチンキナーゼ、レーン３は未処理抽出液を用いてＮ−Ｈｉｓ−ＪＳＰ−１を合成した反応液、レーン４はＴａｌｏｎカラム処理抽出液を用いてＮ−Ｈｉｓ−ＪＳＰ−１を合成した反応液、レーン５は未処理抽出液を用いてＧＦＰを合成した反応液、レーン６はＴａｌｏｎカラム処理抽出液を用いてＧＦＰを合成した反応液の結果を示す。図から明かなように、Ｔａｌｏｎ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎカラムで処理を行ったコムギ胚芽抽出液は、未処理のコムギ胚芽抽出液と比べて著しく低い合成能は示さず、ほぼ同等であった。【００４９】
実施例４ Ｔａｌｏｎ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎによる精製比較
（１）Ｔａｌｏｎ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎカラムによるタンパク質合成反応溶の精製
実施例２（１）と同様に平衡化を行ったＴａｌｏｎ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎに対して、実施例３（２）でＮ−Ｈｉｓ−ＪＳＰ−１（１−１６３）のｍＲＮＡを鋳型として、Ｔａｌｏｎカラム処理抽出液と未処理抽出液を用いて合成反応を行った反応溶液を、それぞれ５０μｌ添加し、４℃、６０ｍｉｎインキュベートし、タンパク質合成反応溶液のＴａｌｏｎ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎへの吸着を行った。その後、３０００ｒｐｍ、１ｍｉｎ、４℃で遠心分離した。その後、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）３０ｍＭ、塩化ナトリウム３００ｍＭ、グリセロール１０％、イミダゾール１０ｍＭ及びβメルカプトエタノール２ｍＭ）：５００μｌを添加して、３０００ｒｐｍ、１ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、Ｂｕｆｆｅｒを除去した。これを３回繰り返し、Ｔａｌｏｎ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎへ非特異に吸着しているタンパク質等の洗浄を行った。洗浄を行った上記カラム担体に対してＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）３０ｍＭ、塩化ナトリウム３００ｍＭ、グリセロール１０％、イミダゾール４００ｍＭ及びβメルカプトエタノール２ｍＭ）５０μｌを添加し、４℃、１０ｍｉｎインキュベートし、Ｔａｌｏｎ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎに吸着したタンパク質の溶離を行った。【００５０】
上記溶離液：１μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、これをＣＢＢ染色して、各タンパク質の精製度を確認した。この結果を図２に示す。図中、レーン１は分子量マーカー、レーン２はコントロールのクレアチンキナーゼ、レーン３は未処理抽出液を用いてタンパク質合成を行った後に、Ｔａｌｏｎ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎカラムを用いて精製を行った結果を示し、レーン４はＴａｌｏｎカラム処理抽出液を用いてタンパク質合成を行った後に、同じカラムを用いて精製を行った結果を示す。【００５１】
これらの結果が示すように、Ｔａｌｏｎカラム処理抽出液を用いて合成したタンパク質をＴａｌｏｎ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎカラムで精製した場合には、目的のタンパク質だけの状態になっており、未処理抽出液を用いて合成したタンパク質をＴａｌｏｎ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎカラムで精製した結果では、溶離液中に目的のタンパク質以外にコムギ胚芽抽出液由来のタンパク質が含まれていることがわかった。つまり、Ｔａｌｏｎカラム処理抽出液を用いて合成したタンパク質をＴａｌｏｎ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎカラムで精製することにより、目的タンパク質の非常に高度な精製が可能であることが確認された。【００５２】
実施例５   Ｎｉ−ＮＴＡカラムによるコムギ胚芽抽出液処理
（１）Ｎｉ−ＮＴＡカラムの平衡化
金属キレートカラム担体であるＮｉ−ＮＴＡ  ５０％溶液（ＱＩＡＧＥＮ社製）：１００μｌをスピンカラムに添加して、３０００ｒｐｍ、１ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、カラム担体に含まれる保存Ｂｕｆｆｅｒを除去した。次に保存Ｂｕｆｆｅｒを除去した担体に、コムギ胚芽抽出液を作製する際に使用するＢｕｆｆｅｒ（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）４０ｍＭ、酢酸カリウム１００ｍＭ、酢酸マグネシウム５ｍＭ、Ｌ型アミノ酸２０種類各０．３ｍＭ及びジチオスレイトール１ｍＭ、イミダゾール１０ｍＭ）：５００μｌを添加して、３０００ｒｐｍ、１ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、Ｂｕｆｆｅｒを除去した。これを３回繰り返し、担体の平衡化を行った。【００５３】
（２）Ｎｉ−ＮＴＡカラムによるコムギ胚芽抽出液処理
上記（１）で平衡化を行ったカラム担体に対して、実施例１で作製したコムギ胚芽抽出液：５０μｌにイミダゾール１０ｍＭを添加したものをアプライし、４℃、３０ｍｉｎインキュベートし、コムギ胚芽抽出液に内在性のＮｉ−ＮＴＡカラムに吸着するタンパク質の吸着を行った。その後、３０００ｒｐｍ、１ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、内在性のＮｉ−ＮＴＡカラムに吸着するタンパク質を除去したコムギ胚芽抽出液（以下、これを「Ｎｉ−ＮＴＡカラム処理抽出液」と称することがある）を作製した。【００５４】
（３）Ｎｉ−ＮＴＡカラム処理抽出液と未処理抽出液の液組成調整
上記の条件で処理を行ったＮｉ−ＮＴＡカラム処理抽出液と実施例１で作製した未処理抽出液の液組成を最終濃度 ３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．４ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）になるように調整した。その後液組成を調整したコムギ胚芽抽出液を２６０ｎｍでの吸光度が７５ＡｂｓになるようにＢｕｆｆｅｒ （３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．６ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ））を用いて調節した。【００５５】
実施例６ Ｎｉ−ＮＴＡカラム処理抽出液と未処理抽出液のタンパク質合成能の比較
実施例５で調整した２種類のコムギ胚芽抽出液４０μｌに対して（i）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ ６５の遺伝子（配列番号６）とその下流にとヒスチジン１０個が付加した遺伝子配列をコードするｍＲＮＡ（ii）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ １４２の構造遺伝子（ヘッリクスクローン）とその下流にとヒスチジン１０個が付加した遺伝子配列をコードするｍＲＮＡの２種類を用いてタンパク質合成を行った。【００５６】
（１）鋳型の調製
（i）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ ６５−ＣＨＩＳ／ｐＥＵ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ ６５（配列番号６）を鋳型として、５’センス側のプライマーとして、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ ６５の５’端の配列を含むオリゴＤＮＡ（配列番号７）用い、３’アンチセンス側プライマーとして、５’末端にSfi Iサイトを付加し、ヒスチジンタグをコードする配列を付加し終止コドンを含まないＰｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ ６５を増幅することができるオリゴＤＮＡ（配列番号８）を用いてＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片をSfi Iで切断した（以下、これを「ＰＫ６５断片」と称することがある）。実施例３（１）（i）に記載のｐＥＵｂｌｕｎｔをＳｍａＩおよびＳｆｉ  Ｉで切断し、上記ＰＫ６５断片とライゲーションした。得られたプラスミドをＰｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ ６５−ＣＨＩＳ／ｐＥＵとした。【００５７】
（ii）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ １４２−ＣＨＩＳ／ｐＥＵ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ １４２（配列番号９）を鋳型として、５’センス側のプライマーとして、さらにその下流にＰｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ １４２の５’端の配列を含むオリゴＤＮＡ（配列番号１０）用い、３’アンチセンス側プライマーとして、５’末端にSfi Iサイトを付加し、ヒスチジンタグをコードする配列を付加し終止コドンを含まないＰｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ １４２を増幅することができるオリゴＤＮＡ（配列番号１１）を用いてＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片をSfi Iで切断した（以下、これを「ＰＫ１４２断片」と称することがある）。
実施例３（１）（i）に記載のｐＥＵｂｌｕｎｔをＳｍａＩおよびＳｆｉＩで切断し、上記ＰＫ１４２断片とライゲーションした。得られたプラスミドをＰｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ １４２−ＣＨＩＳ／ｐＥＵとした。【００５８】
（２）タンパク質合成
上記（１）で調製したＰｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ １４２−ＣＨＩＳ／ｐＥＵ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ ６５−ＣＨＩＳ／ｐＥＵを鋳型として、ＳＰ６  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて転写を行い、得られたＲＮＡをエタノール沈殿により定法に従い精製して用いた。
実施例５で調整した２種類のコムギ胚芽抽出液４０μｌに対して、上記ｍＲＮＡをそれぞれ２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で含む翻訳反応溶液（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．６ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）２０μｌ）を調製した。【００５９】
この翻訳反応溶液を透析膜に入れ、Ｂｕｆｆｅｒ（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）２．５ｍｌ）を透析外液として用い、２６℃で２４時間タンパク質合成反応を行った。
これらの各タンパク質合成反応溶液中に含まれる目的タンパク質量を、実施例３（２）に記載の方法で比較したところ、Ｎｉ−ＮＴＡカラム処理抽出液のタンパク質合成能は、未処理抽出液と比べてほぼ同等であった。【００６０】
実施例７ 各タンパク質合成反応溶液のＮｉ−ＮＴＡカラムによる精製比較
（１）Ｎｉ−ＮＴＡカラムによるタンパク質合成反応溶液の精製
実施例５（１）と同様に平衡化を行なったＮｉ−ＮＴＡカラムに対して、実施例６（２）で、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ ６５−ＣＨＩＳ、およびＰｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ １４２−ＣＨＩＳのｍＲＮＡを鋳型として、Ｎｉ−ＮＴＡカラム処理抽出液を用いて合成反応を行った反応溶液、および未処理抽出液を用いて合成反応を行った反応溶液を、それぞれ５０μｌ添加し、４℃、６０ｍｉｎインキュベートし、タンパク質合成反応溶液のＮｉ−ＮＴＡカラムへの吸着を行った。その後、３０００ｒｐｍ、１ｍｉｎ、４℃で遠心分離した。その後、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）３０ｍＭ、塩化ナトリウム３００ｍＭ、グリセロール１０％、イミダゾール１０ｍＭ及びジチオスレイトール１ｍＭ）：５００μｌを添加して、３０００ｒｐｍ、１ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、Ｂｕｆｆｅｒを除去した。これを３回繰り返し、担体への非特異に吸着しているタンパク質等の洗浄を行った。洗浄を行った上記カラム担体に対してＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）３０ｍＭ、塩化ナトリウム３００ｍＭ、グリセロール１０％、イミダゾール２００ｍＭ及びジチオスレイトール１ｍＭ）５０μｌを添加し、４℃、１０ｍｉｎインキュベートし、Ｎｉ−ＮＴＡカラムに吸着したタンパク質の溶離を行った。【００６１】
上記溶離液：１μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、これをＣＢＢ染色して、各タンパク質の精製度を確認した。この結果を図３に示す。図中、レーン１は未処理抽出液を用いてＰＫ６５の合成を行った後に、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを用いて精製を行った結果を示し、レーン２はＮｉ−ＮＴＡカラム処理抽出液を用いてＰＫ６５の合成を行った後に、同じＮｉ−ＮＴＡカラムを用いて精製を行った結果を示し、レーン３は未処理抽出液を用いてＰＫ１４２の合成を行った後に、同じＮｉ−ＮＴＡカラムを用いて精製を行った結果を示し、さらにレーン４はＮｉ−ＮＴＡ処理抽出液を用いてＰＫ１４２の合成を行った後に、同じＮｉ−ＮＴＡカラムを用いて精製を行った結果を示す。【００６２】
これらの結果が示すように、Ｎｉ−ＮＴＡカラム処理抽出液を用いて合成したタンパク質をＮｉ−ＮＴＡカラムで精製した結果では、溶離液中の目的のタンパク質の純度が高くなっており、未処理抽出液を用いて合成したタンパク質をＮｉ−ＮＴＡカラムで精製した結果では、目的のタンパク質以外にコムギ胚芽抽出液由来のタンパク質が高濃度溶離液中に含まれていることがわかった。つまり、Ｎｉ−ＮＴＡカラム処理抽出液を用いて合成したタンパク質をＮｉ−ＮＴＡカラムで精製することにより、目的タンパク質の非常に高度な精製が可能であることが確認された。【００６３】
実施例８ グルタチオン結合担体によるコムギ胚芽抽出液処理
（１） グルタチオン結合担体カラムの平衡化
グルタチオン結合担体であるＭｉｃｒｏＳｐｉｎ ＧＳＴ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅ（アマシャムバイオサイエンス社製）：５０μｌを使用して、３０００ｒｐｍ、１ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、カラム担体に含まれる保存Ｂｕｆｆｅｒを除去した。次に保存Ｂｕｆｆｅｒを除去した担体にコムギ胚芽抽出液を作製する際に使用するＢｕｆｆｅｒ（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）４０ｍＭ、酢酸カリウム１００ｍＭ、酢酸マグネシウム５ｍＭ、Ｌ型アミノ酸２０種類各０．３ｍＭ及びジチオスレイトール２．５ｍＭ）：５００μｌを添加して、３０００ｒｐｍ、１ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、Ｂｕｆｆｅｒを除去した。これを３回繰り返し、担体の平衡化を行った。【００６４】
（２） グルタチオン結合担体カラムによるコムギ胚芽抽出液処理
上記（１）で平衡化を行ったカラム担体に対して実施例１で作製したコムギ胚芽抽出液：５０μｌを添加し、４℃、３０ｍｉｎインキュベートし、コムギ胚芽抽出液に内在性のグルタチオン結合担体カラム吸着するタンパク質の吸着を行った。その後、３０００ｒｐｍ、１ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、内在性のグルタチオン結合担体カラムに吸着するタンパク質除去したコムギ胚芽抽出液（以下、これを「グルタチオン結合担体処理抽出液」と称することがある）を作製した。【００６５】
（３）グルタチオン結合担体処理抽出液と未処理抽出液の液組成調整
上記の条件で処理を行ったグルタチオン結合担体処理抽出液と実施例１で作製した未処理抽出液組成を最終濃度 ３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．４ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）になるように調整した。その後、液組成を調整したコムギ胚芽抽出液を２６０ｎｍでの吸光度が７５ＡｂｓになるようにＢｕｆｆｅｒ （３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．４ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ））を用いて調節した。【００６６】
実施例９ グルタチオン結合担体処理抽出液と未処理抽出液のタンパク質合成能の比較
実施例８で調整した２種類のコムギ胚芽抽出液４０μｌに対して（i）ＧＦＰの構造遺伝子とその上流にとＧＳＴが付加した遺伝子配列をコードするｍＲＮＡを用いてタンパク質合成を行った。
（１）鋳型の調製
（i）ＮＧＳＴ−ＧＦＰ／ｐＥＵ
ＧＳＴ（配列番号１２）を鋳型として、５’センス側のプライマーとして、ＧＳＴの５’端の配列を含むオリゴＤＮＡ（配列番号 １３）用い、３’アンチセンス側プライマーとして、５’末端にＧＦＰの５’末端とアニリングする配列を付加し、終止コドンを含まないＧＳＴを増幅することができるオリゴＤＮＡ（配列番号１４）を用いてＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片と実験例３で作成したＧＦＰ断片を鋳型として５’センス側のプライマーとして、ＧＳＴの５’端の配列を含むオリゴＤＮＡ（配列番号１３）と３’アンチセンス側プライマーとして、５’端ｓｆｉＩの配列を付加した
ＧＦＰの３’端の配列を含むオリゴＤＮＡ（配列番号５）を用いてＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅し、得られたＤＮＡ断片をＳｆｉＩで切断した（以下、これを「ＧＳＴ−ＧＦＰ断片」と称することがある）。実施例３（１）(i)に記載のpEUbluntをSma IおよびSfi Iで切断し、上記ＧＳＴ−ＧＦＰ断片とライゲーションした。得られたプラスミドをＮＧＳＴ−ＧＦＰ／ｐＥＵとした。【００６７】
（２）タンパク質合成
上記（１）で調製したＮＧＳＴ−ＧＦＰ／ｐＥＵを鋳型として、ＳＰ６  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて転写を行い、得られたＲＮＡをエタノール沈殿により定法に従い精製して用いた。
実施例８で調整した２種類のコムギ胚芽抽出液４０μｌに対して、上記ｍＲＮＡをそれぞれ２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で含む翻訳反応溶液（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．４ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）２０μｌ）を調製した。【００６８】
この翻訳反応溶液を透析膜に入れ、Ｂｕｆｆｅｒ（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）２．５ｍｌ）を透析外液として用い、２６℃で２４時間タンパク質合成反応を行った。
これらの各タンパク質合成反応溶液中に含まれる目的タンパク質量を、実施例３（２）に記載の方法で比較したところ、グルタチオン結合担体処理抽出液のタンパク質合成能は、未処理抽出液と比べてほぼ同等であった。【００６９】
実施例１０ タンパク質合成反応溶液のグルタチオン結合担体カラムによる精製比較
（１）  グルタチオン結合担体カラムによるタンパク質合成反応溶液の精製
実施例８（１）と同様に平衡化を行なったグルタチオン結合担体カラムに対して、実施例９（２）で、ＧＳＴ−ＧＦＰのｍＲＮＡを鋳型として、グルタチオン結合担体処理抽出液を用いて合成反応を行った反応溶液、および未処理抽出液を用いて合成反応を行った反応溶液を、それぞれ５０μｌ添加し、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ ＧＳＴ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅ（アマシャムバイオサイエンス社製）のプロトコルに従って担体への吸着を行った。その後、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ ＧＳＴ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅ（アマシャムバイオサイエンス社製）のプロトコルに従って、担体への非特異に吸着しているタンパク質等の洗浄、および溶離を行った。【００７０】
上記溶離液：５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、これをＣＢＢ染色して、目的タンパク質の精製度を確認した。この結果、グルタチオン結合担体処理抽出液を用いて合成したタンパク質を、同じグルタチオン結合担体カラムにより精製した結果では、未処理抽出液を用いて合成した場合と比べて目的のタンパク質の純度が若干高くなっていた。未処理抽出液を用いて合成した目的タンパク質を、同じグルタチオン結合担体カラムにより精製した結果では、目的タンパク質以外にコムギ胚芽抽出液由来のタンパク質が、溶離液中に若干含まれていることがわかった。
【産業上の利用の可能性】
【００７１】
本発明によって改良された無細胞タンパク質合成用細胞抽出液を用いてタンパク質合成を行い、得られたタンパク質を細胞抽出液を製造する際に用いたアフィニティ担体を用いて精製することにより、高度に精製された目的タンパク質を取得することができる。この方法によれば、アフィニティ担体カラムのベッドボリュームを小さくすることができるため、目的タンパク質の濃縮も可能となり、無細胞タンパク質合成系において合成量が少ないタンパク質の回収にも、非常に有益である。さらに、高度に精製されたタンパク質を必要とするタンパク質立体構造解析やタンパク質機能解析等にも高純度の目的タンパク質を大量に供給することが可能となった。
また、本発明によって改良された無細胞タンパク質合成用細胞抽出液を用いてタンパク質合成を行い、得られたタンパク質を、細胞抽出液を製造する際に用いたアフィニティ担体と実質的に同一のものと接触させて、該アフィニティ担体に保持された物質と親和性を有し、結合するタンパク質の選択、つまりタンパク質−物質間相互作用解析を行なう場合、擬陽性の割合を非常に低下させることができ、より高効率な相互作用解析を行なうことができる。
【図３】
2005083104.tif 000002
【図１】
2005083104.tif 000003
【図２】
2005083104.tif 000004
【配列表】
2005083104000001.app
【国際調査報告】
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2005083104.tif 000006