(57)【要約】【課題】  希少糖D-プシコースを用いて動脈硬化症発症の抑制性組成物および抑制方法を提供すること。【解決手段】  D-プシコースの抗動脈硬化作用の有効成分とすることを特徴とする動脈硬化症発症の抑制性組成物。上記の抗動脈硬化作用が、生体の動脈硬化症に関係するケモカインまたはサイトカインの発現抑制または軽減作用、および動脈硬化惹起因子の発現に影響を及ぼさず、動脈硬化の改善に関与する受容体の発現を促進する作用、である。D-プシコースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物を有効成分として配合した甘味料、調味料、食品添加物、食品素材、飲食品、健康飲食品、医薬品・医薬部外品および飼料からなる群から選ばれる形態で用いる。前記組成物を用いた動脈硬化症発症の抑制方法。【選択図】        図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
希少糖であるD-プシコースを抗動脈硬化作用の有効成分とすることを特徴とする動脈硬化症発症の抑制性組成物。
【請求項２】
上記の抗動脈硬化作用が、生体の動脈硬化症に関係するケモカインまたはサイトカインの発現抑制または軽減作用、および動脈硬化惹起因子の発現に影響を及ぼさず動脈硬化の改善に関与する受容体の発現を促進する作用、である請求項１の動脈硬化症発症の抑制性組成物。
【請求項３】
上記の発現を促進する作用が、D-プシコースによる生体の動脈硬化症に関係する、サイトカインによるケモカイン発現誘導を抑制し、動脈硬化惹起因子であるスカベンジャー受容体CD36発現への影響を及ぼさず、動脈硬化の改善に関与する受容体の発現を促進する作用である請求項２の動脈硬化症発症の抑制性組成物。
【請求項４】
D-プシコースをD-プシコースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物を配合した組成物の形態で用いる請求項１、２または３の動脈硬化症発症の抑制性組成物。
【請求項５】
上記組成物が、D-プシコースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物を有効成分として配合した甘味料、調味料、食品添加物、食品素材、飲食品、健康飲食品、医薬品・医薬部外品および飼料からなる群から選ばれる形態のものである請求項４の動脈硬化症発症の抑制性組成物。
【請求項６】
希少糖であるD-プシコースを、生体の動脈硬化症に関係するケモカインまたはサイトカインの発現抑制または軽減作用、および動脈硬化惹起因子の発現に影響を及ぼさず
動脈硬化の改善に関与する受容体の発現を促進する作用、である抗動脈硬化作用の有効成分として用いることを特徴とする動脈硬化症発症の抑制方法。
【請求項７】
上記の発現を促進する作用が、生体の動脈硬化症に関係する、サイトカインによるケモカイン発現誘導を抑制し、動脈硬化惹起因子であるスカベンジャー受容体CD36発現への影響を及ぼさず、動脈硬化の改善に関与する受容体の発現を促進する作用である請求項６の動脈硬化症発症の抑制方法。
【請求項８】
D-プシコースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物を配合した組成物の形態で用いる請求項６または７の動脈硬化症発症の抑制方法。
【請求項９】
上記組成物が、D-プシコースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物を有効成分として配合した甘味料、調味料、食品添加物、食品素材、飲食品、健康飲食品、医薬品・医薬部外品および飼料からなる群から選ばれる形態のものである請求項８の動脈硬化症発症の抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、希少糖による、動脈硬化症の増悪に関係するサイトカインによるケモカイン発現誘導を抑制し、動脈硬化惹起因子であるスカベンジャー受容体CD36発現への影響を及ぼさず、動脈硬化の改善に関与する受容体の発現促進の技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化症に起因する死亡は、死因の第一位である。動脈硬化症の危険因子としては、糖尿病、高脂血症、高血圧などが指摘されている。最近の報告によれば、これら危険因子と動脈硬化症発症の機序について、分子レベルでの解析が進んでいる。動脈硬化症発症の契機は、単球の血管壁への遊走およびマクロファージに発現するスカベンジャー受容体によるコレステロール蓄積それにともなう泡沫細胞化である(図７、非特許文献：13, 18)。
すでに動脈硬化病変の血管内皮細胞から分泌され単球の遊走に関係する因子であるケモカイン、MCP-1の分泌が、D-プシコースにより抑制されること、およびサイトカインによるMCP-1の分泌促進を抑制することを報告し、D-プシコースの抗動脈硬化作用について報告している（特許文献１、非特許文献: 6,9-11, 17）。
一方、動脈硬化惹起因子である酸化LDLの受容体、スカベンジャー受容体は動脈硬化病変においてマクロファージに発現誘導され、動脈硬化病変形成の主役を演じている（図９、特許文献: 5, 13, 19）。【０００３】
さて、糖尿病の主体は血管障害であり、その死因は動脈硬化症によるものである。糖尿病による動脈硬化発症のメカニズムについての詳細は不明である。最近、高血糖状態において、スカベンジャー受容体CD36の発現誘導がおこることが報告され注目されている（非特許文献: 1, 20）。
逆に、生体には抗動脈硬化作用としてHigh density lipoprotein (HDL)を介したコレステロール逆転送系が知られている（図１０，非特許文献: 14, 16）。
我々はヒト遺伝子CLA-1が、HDL受容体であることを同定してきた（非特許文献:2, 3, 8, 12, 15）。
遺伝子導入の研究からCLA-1は肝臓においてHDLからのコレステロールの取り込みを介して、抗動脈硬化作用を示すことが知られている（非特許文献: 4, 7, 14, 15 ）。【０００４】
【特許文献１】ＷＯ  ０３／０９７８２０
【非特許文献１】Yu X, Murao K, Sayo Y, Imachi H, Cao WM, Ohtsuka S, Niimi M, Tokumitsu H, Inuzuka H, Wong NC, Kobayashi R, Ishida T “The Role of Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase Cascade in Glucose Upregulation of Insulin Gene Expression” Diabetes (in press)
【非特許文献２】Cao WM, Murao K, Imachi H, Yu X, Abe H, Yamauchi A, Wong NC, Ishida T “A Mutant HDL Receptor Inhibits Proliferation of Human Breast Cancer Cells.” Cancer Res  64, 1515-1521, 2004
【非特許文献３】Cao WM, Murao K, Imachi H, Hiramine C, Yu X, Wong NC, Takahara J, Ishida T “Phosphatidylserine Receptor Cooperates with High Density Lipoprotein Receptor on Recognition of Apoptotic Cells by Thymic Nurse Cells.” J Mol Endocrinol 32, 497-505, 2004
【非特許文献４】Imachi H, Murao K, Cao WM, Tada S, Taminato T, Wong NC, Takahara J, Ishida T “Expression of human scavenger receptor B1 on and in human platelets” Arterioscler Thromb Vasc Biol 23:898-904, 2003
【非特許文献５】Cao WM, Murao K, Imachi H, Nakano T, Kodama T, Wong NC, Takahara J, Ishida T “PI3 kinase-Akt/PKB pathway mediates Gas6 induction of SRA in vascular smooth muscle cell.” Arterioscler Thromb Vasc Biol 21:1592-1597, 2001
【非特許文献６】Momoi A, Murao K, Imachi H, Ishida T, Cao WM, Sato M, Takahara J “Inhibition of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) expression in cytokine-treated human lung epithelial cells by thiazolidinedione” CHEST 120:1293-1300, 2001
【非特許文献７】Imachi H, Murao K, Cao WM, Ohyama T, Sato M, Sasaguri Y, Ishida T, Takahara J  “Expression of HDL receptor, CLA-1 in human smooth-muscle cells and effect of interferon-gamma on its regulation. ” Horm Metab Res 33:389-393; 2001
【非特許文献８】Imachi H, Murao K, Hiramine C, Sayo Y, Sato M, Hosokawa H, Ishida T, Kodama T, Quehenberger O, Steinberg D, Takahara J “Human scavenger receptor B1 is involved in recognition of apoptotic thymocytes by nurse cells. ” Lab Invest 80:263-70 ; 2000
【非特許文献９】Murao K, Ohyama T, Imachi H, Ishida T, Cao WM, Sato M, Wong NC, Takahara J “TNF-alpha stimulation of MCP-1 expression is mediated by the Akt/PKB signal transduction pathway in vascular endothelial cells.” Biochem Biophys Res Commun 276:791-796 ;2000
【非特許文献１０】Momoi A, Murao K, Imachi H, Sayo Y, Nakamura H, Hosokawa H, Sato M, Fujita J, Okada H, Ishida T, Takahara J “Thiazolidinedione inhibits production of RANTES in a cytokine-treated human lung epithelial cell line.” FEBS Lett 452:301-304 ;1999
【非特許文献１１】Murao K, Imachi H, Momoi A, Sayo Y, Hosokawa H, Sato M, Ishida T, Takahara J “Thiazolidinedione inhibits the production of monocyte chemoattractant protein-1 in cytokine-treated human vascular endothelial cells. ” FEBS Lett 454:27-30 ;1999
【非特許文献１２】Imachi H, Murao K, Sato M, Hosokawa H, Ishida T, Takahara J “CD36 LIMPII analogous-1, a human homolog of the rodent scavenger receptor B1,provides the cholesterol ester for steroidogenesis in adrenocortical cells.” Metabolism 48:627-30 ;1999
【非特許文献１３】Murao K, Imachi H, Sayo Y, Hosokawa H, Sato M, Ishida T, Nakano T, Kodama T, Sasaguri Y, Takahara J “A product of growth arrest-specific gene 6 modulates scavenger receptor expression in human vascular smooth muscle cells.” FEBS Lett 459:363-6 ;1999
【非特許文献１４】Murao K, Wada Y, Nakamura T, Taylor AH, Mooradian AD, Wong NC “Effects of glucose and insulin on rat apolipoprotein A-I gene expression.” J. Biol. Chem. 273:18959-65, 1998
【非特許文献１５】Murao K, Teraptca V, Green SR, Kondratenko K, Steinberg D, Quenquenberger O. “Characterization of CLA-1, Human Homologue of Rodent Scavenger Receptor B1 as Receptor for HDL and apototic thymocyte.” J Biol Chem 272, 17551-17557, 1997
【非特許文献１６】Murao K, Bassyouni H, Taylor AH, Wanke IE, Wong NCW “Hepatocyte Nuclear Factor 4 Inhibits Activity of Site A from the Rat Apolipoprotein A1 gene. ” Biochemistry. 36, 301-306, 1997
【非特許文献１７】Tangirara R, Murao K, Quenquenberger O. “Regulation of the monocyte chemotactic protein-1 receptor expression by cytokines.” J Biol Chem  272, 8050-8056, 1997
【非特許文献１８】Tall AR “Plasma high density lipoproteins. Metabolism and relationship to atherogenesis.”J Clin Invest 86:379-384; 1990
【非特許文献１９】Steinberg D. “Low density lipoprotein oxidation and its pathobiological significance.”J Biol Chem 272:20963-20966; 1997
【非特許文献２０】Griffin E, Re A, Hamel N, Fu C, Bush H, McCaffrey T, Asch AS. “A link between diabetes and atherosclerosis: Glucose regulates expression of CD36 at the level of translation.” Nat Med   7:840-846; 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
Monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1) はC-C familyに属するケモカインであり、血管内皮細胞を含めた種々の細胞より分泌され、単球の遊走活性を有している。
動脈硬化病変では、障害された血管内皮細胞よりMCP-1が放出され、単球の血管壁への遊走、マクロファージへの分化を促進し、動脈硬化病変の初期巣形成をおこなっている。
MCP-1の分泌刺激としては炎症性サイトカインのTNF-α、IL-1βが知られており（図８）、細胞内情報伝達系としてPI3-K/PKB(AKT)が関与し（図８）、逆にPPAR-γは抑制的に働いている。
以前の報告によれば高濃度のグルコースはMCP-1の分泌を刺激し、臨床的にも糖尿病患者ではMCP-1が高値を示すことが指摘されている。
したがって、血管内皮細胞からのMCP-1の分泌を抑制する化合物、および炎症性サイトカインIL-1βによるMCP-1の分泌を抑制する化合物は、動脈硬化症の優れた予防・治療剤となり、それらに関連する技術の開発が望まれるところである。【０００６】
そこで、本発明者らは、希少糖D-プシコースのスカベンジャー受容体群、HDL受容体への影響について検討し、希少糖の動脈硬化症における有用性および臨床応用の可能性を見いだすことを目的とした。そこで、本発明は、D-プシコースによる動脈硬化症の増悪に関係するサイトカインによるケモカイン発現誘導を抑制し、動脈硬化惹起因子であるスカベンジャー受容体CD36発現への影響を及ぼさず、動脈硬化の改善に関与する受容体の発現促進の作用を実験的に裏付け、該作用に係わる動脈硬化症発症の抑制性組成物および抑制方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の（１）〜（５）の動脈硬化症発症の抑制性組成物を要旨とする。
（１）希少糖、好ましくはD-プシコースを、抗動脈硬化作用の有効成分とすることを特徴とする動脈硬化症発症の抑制性組成物。
（２）上記の抗動脈硬化作用が、生体の動脈硬化症に関係するケモカインまたはサイトカインの発現抑制または軽減作用、および動脈硬化惹起因子の発現に影響を及ぼさず動脈硬化の改善に関与する受容体の発現を促進する作用、である上記（１）の動脈硬化症発症の抑制性組成物。
（３）上記の発現を促進する作用が、D-プシコースによる生体の動脈硬化症に関係する、サイトカインによるケモカイン発現誘導を抑制し、動脈硬化惹起因子であるスカベンジャー受容体CD36発現への影響を及ぼさず、動脈硬化の改善に関与する受容体の発現を促進する作用である上記（２）の動脈硬化症発症の抑制性組成物。
（４）D-プシコースをD-プシコースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物を配合した組成物の形態で用いる上記（１）、（２）または（３）の動脈硬化症発症の抑制性組成物。
（５）上記組成物が、D-プシコースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物を有効成分として配合した甘味料、調味料、食品添加物、食品素材、飲食品、健康飲食品、医薬品・医薬部外品および飼料からなる群から選ばれる形態のものである上記（４）の動脈硬化症発症の抑制性組成物。【０００８】
本発明は、以下の（６）〜（９）の動脈硬化症発症の抑制方法を要旨とする。
（６）希少糖、好ましくはD-プシコースを、生体の動脈硬化症に関係するケモカインまたはサイトカインの発現抑制または軽減作用、および動脈硬化惹起因子の発現に影響を及ぼさず動脈硬化の改善に関与する受容体の発現を促進する作用、である抗動脈硬化作用の有効成分として用いることを特徴とする動脈硬化症発症の抑制方法。
（７）上記の発現を促進する作用が、生体の動脈硬化症に関係する、サイトカインによるケモカイン発現誘導を抑制し、動脈硬化惹起因子であるスカベンジャー受容体CD36発現への影響を及ぼさず、動脈硬化の改善に関与する受容体の発現を促進する作用である上記    （６）の動脈硬化症発症の抑制方法。
（８）D-プシコースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物を配合した組成物の形態で用いる上記（６）または（７）の動脈硬化症発症の抑制方法。
（９）上記組成物が、D-プシコースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物を有効成分として配合した甘味料、調味料、食品添加物、食品素材、飲食品、健康飲食品、医薬品・医薬部外品および飼料からなる群から選ばれる形態のものである上記（８）の動脈硬化症発症の抑制方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、希少糖を用いた、動脈硬化症発症の抑制性組成物（甘味料、調味料、食品添加物、食品素材、飲食品、健康飲食品、医薬品・医薬部外品および飼料）およびそれを用いた抑制方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、希少糖、好ましくはD-プシコースの、生体の動脈硬化症に関係する、サイトカインによるケモカイン発現誘導を抑制し（たとえばMCP-1の分泌を抑制することである。）、動脈硬化惹起因子であるスカベンジャー受容体CD36発現への影響を及ぼさず（高血糖で発現が高まることが動脈硬化を惹起することなど。）、動脈硬化の改善に関与する受容体（たとえばHDL受容体CLA-1）の発現促進する作用を利用する技術に関する。そこで、本発明で用いた希少糖D-プシコースについて説明する。
「希少糖」とは、自然界に微量にしか存在しない単糖と定義づけることができる。自然界に多量に存在する単糖は、D-グルコース、D-フラクトース、D-ガラクトース、D-マンノース、D-リボース、D-キシロース、Ｌ−アラビノースの７種類あり、それ以外の単糖は、自然界における存在量が少なく希少糖に分類することができる。また、糖アルコールは単糖を還元してできるが、自然界にはD-ソルビトールおよびD-マンニトールが比較的多いが、それ以外のものは量的には少ないので、これらも本発明に従う希少糖と定義される。これらの希少糖は、これまで入手が困難であったが、自然界に多量に存在する単糖から希少糖を生産する方法が開発されつつあり、その技術を利用して製造することができる。
以下、これらの単糖の関係を一層容易に理解するために提案されたイズモリング（Izumoring、登録商標、以下省略）に基づき説明を加える（ＷＯ  ０３／０９７８２０参照）。
図１１で示される生産過程と分子構造（D型、L型）により、炭素数４から６の単糖全てをつないだ連携図がイズモリング(Izumoring)の全体図である。すなわち、図１１から理解できることは、単糖は、炭素数4、5、6全てがつながっているということである。全体図は、イズモリングC6の中でのつながりと、イズモリングC5の中でのつながりと、イズモリングC4の中でのつながりと、C4、C5、C6が全てつながっていることである。この考え方は重要である。炭素数を減少させるには主に発酵法を用いる。炭素数の異なる単糖全てをつなぐという大きな連携図であることも特徴である。【００１１】
炭素数が6つの単糖（ヘキソース）のイズモリングは、図１１の下段および図１２に示すように、炭素数が6つの単糖（ヘキソース）は全部で34種類あり、アルドースが16種類、ケトースが8種類、糖アルコールが10種類ある。これらの糖は、酸化還元酵素の反応、アルドース異性化酵素の反応、アルドース還元酵素の反応で変換できることは、本発明者らの研究を含めた研究で知られている。
しかしながら、これまでの研究では上のグループ、真ん中のグループ、下のグループは酵素反応でつながっていなかった。つまり、上のグループに属しているD-グルコース（ブドウ糖）やD-フラクトースは自然界に多量に存在する糖であり安価であるが、これらから希少糖を合成することができなかった。ところが、本発明者らの研究の過程で、これを結ぶ酵素が発見された。それはガラクチトールからD-タガトースを合成する酵素を持つ菌の培養液中に、全く予期しなかったD-ソルボースが発見されたことに端を発する。その原因を調べた結果、この菌がD-タガトース3エピメラーゼ（DTE）という酵素を産生していることを発見した。
図１１の下段および図１２に示すように、このDTEはこれまで切れていたD-タガトースとD-ソルボースの間をつなぐ酵素であることがわかる。そしてさらに驚くことに、このDTEは全てのケトースの3位をエピ化する酵素であり、これまで合成接続できなかったD-フラクトースとD-プシコース、Ｌ−ソルボースとＬ−タガトース、D-タガトースとD-ソルボース、Ｌ−プシコースとＬ−フラクトース、に作用するという非常に幅広い基質特異性を有するユニークな酵素であることが分かった。このDTEの発見によって、すべての単糖がリング状につながり、単糖の知識の構造化が完成し、イズモリング（Izumoring）と名付けた。
この図１２をよく見てみると、左側にL型、右側にD型、真ん中にDL型があり、しかもリングの中央（星印）を中心としてL型とD型が点対称になっていることもわかる。例えば、D-グルコースとＬ−グルコースは、中央の点を基準として点対称になっている。しかもイズモリング(Izumoring)の価値は、全ての単糖の生産の設計図にもなっていることである。先の例で、D-グルコースを出発点としてＬ−グルコースを生産しようと思えば、D-グルコースを異性化→エピ化→還元→酸化→エピ化→異性化するとＬ−グルコースが作れることを示している。
炭素数が6つの単糖(ヘキソース)のイズモリング(Izumoring)を使って、自然界に多量に存在する糖と微量にしか存在しない希少糖との関係が示されている。D-グルコース、D-フラクトース、D-マンノースと、牛乳中の乳糖から生産できるD-ガラクトースは、自然界に多く存在し、それ以外のものは微量にしか存在しない希少糖と分類される。DTEの発見によって、D-グルコースからD-フラクトース、D-プシコースを製造し、さらにD-アロース、アリトール、D-タリトールを製造することができるようになった。
炭素数が6つの単糖(ヘキソース)のイズモリング(Izumoring)の意義をまとめると、生産過程と分子構造(D型、L型)により、すべての単糖が構造的に整理され(知識の構造化)、単糖の全体像が把握できること、研究の効果的、効率的なアプローチが選択できること、最適な生産経路が設計できること、欠落部分について予見できること、が挙げられる。【００１２】
D-プシコースは、希少糖のうち、現在大量生産ができている糖である。プシコースは、単糖類の中で、ケトン基を持つ六炭糖の一つである。このプシコースには光学異性体としてD体とL体とが有ることが知られている。ここで、D-プシコースは既知物質であるが自然界に希にしか存在しないので、国際希少糖学会の定義によれば「希少糖」と定義されている。D-プシコースは、ケトースに分類されるプシコースのD体であり六炭糖（C6H12O6）である。このようなD-プシコースは、自然界から抽出されたもの、化学的またはバイオ的な合成法により合成されたもの等を含めて、どのような手段により入手してもよい。比較的容易には、例えば、エピメラーゼを用いた手法（例えば、特開平6-125776号公報参照）により調製されたものでもよい。得られたD-プシコース液は、必要により、例えば、除蛋白、脱色、脱塩などの方法で精製され、濃縮してシラップ状のD-プシコース製品を採取することができ、更に、カラムクロマトグラフィーで分画、精製することにより99％以上の高純度の標品も容易に得ることができる。このようなD-プシコースは単糖としてそのまま利用できるほか、必要に応じて各種の誘導体として用いることも期待される。【００１３】
本発明は、糖尿病、高脂血症、高血圧などの危険因子に基づく動脈硬化症などの疾患の予防および治療に用いることができる甘味料、調味料、食品添加物、食品素材、飲食品、健康飲食品、医薬品・医薬部外品および飼料に関するものである。予防剤または治療剤は、これらのみで用いるほか、一般的賦形剤、安定剤、保存剤、結合剤、崩壊剤等の適当な添加剤を配合し、液剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、散剤、錠剤等の適宜な剤型を選んで製剤し、経口的あるいは経腸的に投与することができる。投与量は、経口投与の場合、成人に対しD-プシコースとして、１日量0.3〜50ｇを内服するのが好ましいが、年令、症状により適宜増減することも可能である。
本発明の製剤（医薬品）は、例えば、ケモカインやサイトカインの発現を効率良く抑制することができ、かつ毒性が低い。ケモカインやサイトカインの発現抑制には、ケモカインやサイトカインのｍＲＮＡの発現抑制、ケモカインやサイトカインの産生抑制、ケモカインやサイトカインのＤＮＡの発現抑制、ケモカインやサイトカインの発現プロモーター抑制、ケモカインやサイトカインの分泌抑制、ケモカインやサイトカインのｍＲＮＡの翻訳抑制などが含まれる。【００１４】
本発明の飼料は、家畜、家禽、その他蜜蜂、蚕、魚などの飼育動物のための飼料であって、D-プシコースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物を配合した組成物がD-プシコースとして飲食品中の炭水化物量（糖質量）に対して０．１〜５０重量％となるように配合されていることを特徴とする。このような飼料を家畜、家禽、その他蜜蜂、蚕、魚などの飼育動物のための飼料動物に投与した場合、肥満傾向が緩和される。したがって、本発明の飼料は、ペットの肥満防止、糖尿病防止や、脂肪付の少ない肉を持つ食用獣肉を得るために有用な飼料である。【００１５】
以上述べたような甘味料、調味料、食品添加物、食品素材、飲食品、健康飲食品、医薬品・医薬部外品および飼料にD-プシコースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物を配合した組成物の形態で含有せしめる方法は、その製品が完成するまでの工程でD-プシコースとして０．１重量％以上、望ましくは０．５重量％以上含有せしめればよく、例えば、混和、混捏、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、晶析、固化などの公知の方法が適宜選ばれる。
本発明のD-プシコースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物を配合した組成物において、D-プシコースは、組成物中に0.1〜50重量％含まれるように配合されている。好ましくは0.5〜30重量％、より好ましくは1〜10重量％である。組成物中において、D-プシコースが0.1重量％未満だと、サイトカインによるケモカイン発現抑制および、ケモカインの分泌（mRNAおよびプロモーター）の抑制の作用が充分ではない。また、組成物中において、D-プシコースが50重量％を越えると、経済的な意味で好ましくない。【００１６】
希少糖D-プシコースを食品の一成分として使用した場合、日常の食生活のなかで、希少糖D-プシコースの有効量を安全に摂取することができる。その根拠として希少糖D-プシコースは、ケトヘキソースであり、その面からヒトに投与できる安全性の高い化合物である。
医薬品・医薬部外品や食品等の開発において最も重要で大きなハードルは新規物質としての希少糖の安全性の検証である。変異原性、生分解度試験および３種類の急性毒性試験（経口急性毒性試験、皮膚一次刺激試験、眼一次刺激試験）が最も基本的な安全性試験として定められている。希少糖は微量ながらも自然界に存在する単糖であるので、安全であろうとの予想はできるものの、きちんとした検証が必要である。我々は希少糖のうちD-プシコース、D-アロース、アリトールの３種に対し、基本部分の安全性試験を指定機関に依頼し実施した。その結果、どの希少糖もその安全性において問題がないことが確認された。【００１７】
本発明の希少糖D-プシコース、誘導体あるいはその薬理的に許容される塩、または／および水和物（以下、本発明の化合物と略す。）の製剤についてさらに詳細に説明する。
本発明の血管新生抑制剤の剤型としては、有効成分を医学的に許容される担体、賦形剤、滑沢剤、結合剤等の添加物を含有する種々の形態、例えば水または各種の輸液用製剤に溶解させた液剤、散剤、顆粒剤、錠剤、注射剤、坐剤、または外用製剤等が、公知の製剤技術により製造できる。【００１８】
本発明の希少な糖を注射で投与する場合、水性注射剤、水性懸濁注射剤、脂肪乳剤、またはリポソーム注射剤等が好ましい。水性注射剤、または水性懸濁注射剤においては、本発明に係る希少な糖、その誘導体あるいはその薬理的に許容される塩を、精製水と混合し、必要に応じて水溶性あるいは水膨潤性高分子、ｐＨ調整剤、界面活性剤、浸透圧調整剤、防腐剤、または保存剤などを加え、混合して、必要に応じて加熱しながら溶解乃至懸濁させ、滅菌して注射剤容器に充填密封し、水性注射剤、または水性懸濁注射剤とする。水性注射剤は、静脈内、皮下、筋肉内、皮内、または関節腔内等に投与することができる。また、水性懸濁注射剤は皮下、筋肉内、皮内、または関節腔内等に服用することができる。また経口でも投与することができる。【００１９】
水溶性あるいは水膨潤性高分子としては、ゼラチン、セルロース誘導体、アクリル酸誘導体、ポビドン、マクロゴール、ポリアミノ酸誘導体、または多糖体類が好ましく、ゼラチン類では精製ゼラチンが好ましく、セルロース誘導体では、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース２９１０、ヒドロキシプロピルメチルセルロース２２０８、ヒドロキシプロピルメチルセルロース２９０６、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロースナトリウム、アクリル酸誘導体として、アミノアクリルメタアクリレートコポリマー、メタアクリル酸コポリマー、ポリアミノ酸誘導体としては、ポリリジン、ポリグルタミン酸が好ましい。多糖体としては、ヒアルロン酸、デキストラン、またはデキストリンが特に好ましい。水溶性あるいは水膨潤性高分子の添加量は、エスクレチン、その誘導体、あるいはその薬理的に許容される塩の性質、量、並びに水溶性あるいは水膨潤性高分子の性質、分子量、適用部位によって異なるが概ね製剤全量に対し、０．０１％乃至１０％の範囲で使用可能である。【００２０】
ｐＨ調整剤には、人体に無害な酸あるいはアルカリが用いられ、界面活性剤には、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤が用いられる。また、浸透圧調整剤には、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が、防腐剤にはパラベン類が、保存剤にはアスコルビン酸や亜硫酸塩類が例示される。これらの使用量は、特に限定はないが、その作用がそれぞれ発揮できる範囲で用いることができる。また、必要に応じ塩酸プロカイン等の局所麻酔剤、ベンジルアルコール等の無痛化剤、キレート剤、緩衝剤、あるいは水溶性有機溶剤等を加えてもよい。【００２１】
脂肪乳剤は適当な油脂に乳化剤と希少糖、その誘導体、あるいはその薬理的に許容される塩を配合し、精製水を加えて、必要に応じて水溶性あるいは水膨潤性高分子、ｐＨ調整剤、界面活性剤、浸透圧調整剤、防腐剤、または保存剤などを加え、適当な乳化装置で乳化し、滅菌して注射剤容器に充填密封することによって調製される。【００２２】
本発明化合物からなる経口用製剤としては本発明化合物を主剤とする剤型としては例えば錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤や、溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤、または油性ないし水性の懸濁液等を投与法に応じ適当な製剤を選択し、通常の賦形剤、滑沢剤、結合剤等の添加物と共に、公知の製剤技術により製造できる。
固形製剤としては活性化合物とともに製剤学上許容されている添加物を含み、例えば充填剤類や増量剤類、結合剤類、崩壊剤類、溶解促進剤類、湿潤剤類、または潤滑剤類等を必要に応じて選択して混合し、製剤化することができる。
また外用製剤として溶液剤、懸濁液、乳濁液、軟膏、ゲル、クリーム、ローション、およびスプレー等を例示できる。【００２３】
本発明の詳細を実施例で説明する。本発明はこれらの実施例によって何ら限定されることはない。
【実施例１】
【００２４】
D-プシコースのスカベンジャー受容体群、HDL受容体への影響について検討し、D-プシコースの抗動脈硬化作用について、以下の通り、新たな研究結果がえられた。
〈方法〉
細胞培養：ヒト肝臓由来細胞株(Hep G2)、ヒト単球由来細胞株(THP-1)およびヒト血管平滑筋細胞株（ISS10）を、既報の報告（13-15）に従い、培養液DMEM＋10%FBSまたはRPMI1640+10%FBSの条件下で培養をおこなった。
HepG2, THP-1, ISS10細胞を約70%の密度で培養ディッシュに分注し以下の実験に供与した。
１．  ISS10細胞およびTHP-1細胞をcontrol(5.6 mM D-グルコース)、 高グルコース（22.4 mM D-グルコース）、 D-プシコース (22.4 mM)で３日間培養し、ISS10細胞では、Scavenger receptor A (SRA)、THP-1細胞ではscavenger receptor, CD36の発現を市販のSRA, CD36に対する抗体にて既報（15）のWestern blot analysis法にて検討した。
ISS10細胞では、SRAの発現誘導positive controlとしてPMA処理をおこなった。
またコントロール蛋白としてcyclophilin Aを用いた。
２．  Hep G2細胞をさまざまな濃度のD-グルコース、 D-プシコース存在下にて培養し、HDL受容体CLA-1の発現を既報（15）のWestern blot analysis法にて検討した。
検出用の抗体は、CLA-1の細胞外ドメイン185−300アミノ酸残基をGST-fusion vectorに組み込み、モルモットに免疫してえられた抗体を使用した。
またCLA-1遺伝子のpromoter領域1200 bpをluciferase reporter geneに組み込み、細胞内に遺伝子導入し、luciferase活性を測定することにより、CLA-1の転写活性とした。【００２５】
〈結果〉
１．  血管平滑筋細胞株ISS10をD-グルコース5.6 mM (control)、 22.4 mM (グルコース)、D-プシコース22.4 mM (D-プシコース)、 PMA 100 nM (PMA)で72時間処理し、SRAの発現をWestern blot analysis法にて検討した。
図１に示すように、PMAではSRAが発現誘導されるが、D-グルコース、 D-プシコースでは、影響を認めなかった。
２．  一方、CD36に関しては、単球由来細胞株THP-1を用いて検討した。
従来の報告と同様に高濃度のD-グルコースにより、CD36の発現が誘導されるが、D-プシコースではCD36の発現を増強しなかった（図２）。
３．  ヒト肝臓細胞由来細胞株HepG2をD-グルコース2.8(lane 1)、 5.6(lane 2)、11.2(lane 3)、22.4(lane 4) mMで72時間培養し、CLA-1の発現をWestern blot analysis法にて検討した。図３に示すようにD-グルコース11.2(lane 3)、22.4(lane 4) mMではCLA-1の発現が低下した。
４．  次にHepG2をD-プシコース 0, 2.8, 5.6, 11.2 mMで72時間培養し、CLA-1の発現をWestern blotで検討した。図４に示すようにD-プシコースではCLA-1の低下は認められなかった。
５．  HepG2をD-グルコース 2.8, 5.6, 11.2 mMおよびD-グルコース 11.2 mMにD-プシコース 2.8, 5.6, 11.2 mMを添加して72時間培養し、CLA-1の発現をWestern blot analysis法にて検討した。図５に示すようにD-グルコース 11.2 mMでCLA-1が低下するが、D-プシコースを添加することにより、濃度依存的にCLA-1の抑制が解除された。
６．  CLA-1の転写活性についても検討した。CLA-1 promoterを含んだluciferase reporter geneをHepG2細胞に遺伝子導入し、そのHepG2をD-グルコース 2.8(lane 1)、 5.6(lane 2)、 11.2(lane 3)、 22.4(lane 4) mM、およびD-プシコース22.4 mMで24時間培養し、luciferase活性を測定した。高濃度のD-グルコースはCLA-1のpromoter活性を抑制した。一方、D-プシコースはCLA-1のpromoter活性には影響を与えなかった（図６）。【００２６】
〈考察〉
動脈硬化症発症の契機は、単球の血管壁への遊走およびScavenger Receptorsによるコレステロール蓄積とマクロファージの泡沫細胞化である(図７)。現在までに酸化LDLの受容体（Scavenger Receptors）としてSRA, CD36, CD68, LOX, SRC, SR-B1などがクローニングされている（図９）。今回はD-プシコースのScavenger Receptors発現への影響を検討した。SRAに関しては、血管平滑筋細胞をD-プシコースとD-グルコースで培養し、SRAの発現をWestern blot analysis法にて検討したが、明らかな差異を認めなかった。
CD36に関しては、単球由来細胞株THP-1を用いて検討した。報告では高濃度のグルコースにより、発現が誘導されるが、D-プシコースはCD36の発現を増強しなかった（図２）。糖尿病と動脈硬化の関連として、高血糖によるscavenger receptorの発現誘導が指摘されているが、D-プシコースはscavenger receptor誘導作用はないと考えられる。臨床的には、糖尿病患者における食事療法に関して、グルコースの代用糖としてD-プシコースを使用できれば合併症予防に有益であると考えられる。【００２７】
生体には抗動脈硬化作用としてHDLを介したコレステロール逆転送系が知られている（図１０）。我々が同定したヒト遺伝子CLA-1はHDLの受容体として、肝臓におけるコレステロールの取り込みを仲介している。そこでヒト肝臓由来細胞株HepG2細胞を種々の濃度のグルコースまたはD-プシコースで処理し、CLA-1の発現を検討した。高濃度のグルコースはCLA-1の発現を抑制したが、D-プシコースはグルコースによるCLA-1発現抑制を解除した。臨床的には糖尿病患者においては、コレステロール逆転送系が低下していることが指摘されている。現在のところ生体内のコレステロール逆転送系を賦活する薬剤は知られていない。D-プシコースによるCLA-1低下抑制機序は糖尿病患者における動脈硬化症発症の抑制を目的とした治療に有用であると考えられた。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】PMAではSRAが発現誘導されるが、D-グルコース、 D-プシコースでは、影響を認めなかったことを示す図面である。
【図２】高濃度のD-グルコースにより、CD36の発現が誘導されるが、D-プシコースではCD36の発現を増強しなかったことを示す図面である。
【図３】D-グルコース11.2(lane 3)、22.4(lane 4) mMではCLA-1の発現が低下したことを示す図面である。
【図４】D-プシコースではCLA-1の低下は認められなかったことを示す図面である。
【図５】D-グルコース 11.2 mMでCLA-1が低下するが、D-プシコースを添加することにより、濃度依存的にCLA-1の抑制が解除されたことを示す図面である。
【図６】高濃度のD-グルコースはCLA-1のpromoter活性を抑制した。一方、D-プシコースはCLA-1のpromoter活性には影響を与えなかったことを示す図面である。
【図７】動脈硬化症発症の契機は、単球の血管壁への遊走およびScavenger Receptorsによるコレステロール蓄積とマクロファージの泡沫細胞化であることを示す図面である。
【図８】MCP-1の分泌刺激としては炎症性サイトカインのTNF-α、IL-1βが知られていることを示す図面である。
【図９】動脈硬化惹起因子である酸化LDLの受容体、スカベンジャー受容体は動脈硬化病変においてマクロファージに発現誘導され、動脈硬化病変形成の主役を演じていることを示す図面である。
【図１０】生体には抗動脈硬化作用としてHigh density lipoprotein (HDL)を介したコレステロール逆転送系が知られていることを示す図面である。
【図１１】イズモリング（Izumoring）連携図である。
【図１２】図１１の下段のイズモリングC6の説明図である。
【図６】
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【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年3月23日(2006.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】請求の範囲
【請求項１】  希少糖であるＤ−プシコースを抗動脈硬化作用の有効成分とすることを特徴とする動脈硬化症発症の抑制性組成物。
【請求項２】  上記の抗動脈硬化作用が、生体の動脈硬化症に関係するケモカインまたはサイトカインの発現抑制または軽減作用、および動脈硬化惹起因子の発現に影響を及ぼさず動脈硬化の改善に関与する受容体の発現を促進する作用、である請求項１の動脈硬化症発症の抑制性組成物。
【請求項３】  上記の発現を促進する作用が、Ｄ−プシコースによる生体の動脈硬化症に関係する、サイトカインによるケモカイン発現誘導を抑制し、動脈硬化惹起因子であるスカベンジャー受容体ＣＤ３６発現への影響を及ぼさず、動脈硬化の改善に関与する受容体の発現を促進する作用である請求項２の動脈硬化症発症の抑制性組成物。
【請求項４】  Ｄ−プシコースをＤ−プシコースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物を配合した組成物の形態で用いる請求項１、２または３の動脈硬化症発症の抑制性組成物。
【請求項５】  上記組成物が、Ｄ−プシコースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物を有効成分として配合した甘味料、調味料、食品添加物、食品素材、飲食品、健康飲食品、医薬品・医薬部外品および飼料からなる群から選ばれる形態のものである請求項４の動脈硬化症発症の抑制性組成物。
【請求項６】  希少糖であるＤ−プシコースを含む、その予防または治療のために、生体の動脈硬化症に関係するケモカインまたはサイトカインの発現抑制または軽減作用、および動脈硬化惹起因子の発現に影響を及ぼさず動脈硬化の改善に関与する受容体の発現を促進する作用、である抗動脈硬化作用が要求される患者群に経口で摂取させる動脈硬化症の予防または治療剤。
【請求項７】  上記の発現を促進する作用が、生体の動脈硬化症に関係する、サイトカインによるケモカイン発現誘導を抑制し、動脈硬化惹起因子であるスカベンジャー受容体ＣＤ３６発現への影響を及ぼさず、動脈硬化の改善に関与する受容体の発現を促進する作用である請求項６の動脈硬化症の予防または治療剤。
【請求項８】  Ｄ−プシコースが、Ｄ−プシコースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物を配合した組成物の形態である請求項６または７の動脈硬化症の予防または治療剤。
【請求項９】  上記組成物が、Ｄ−プシコースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物を有効成分として配合した甘味料、調味料、食品添加物、食品素材、飲食品、健康飲食品、医薬品・医薬部外品および飼料からなる群から選ばれる形態のものである請求項８の動脈硬化症の予防または治療剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
の抑制性組成物。
（５）上記組成物が、Ｄ−プシコースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物を有効成分として配合した甘味料、調味料、食品添加物、食品素材、飲食品、健康飲食品、医薬品・医薬部外品および飼料からなる群から選ばれる形態のものである上記（４）の動脈硬化症発症の抑制性組成物。
［０００８］  本発明は、以下の（６）〜（９）の動脈硬化症の予防または治療剤を要旨とする。
（６）希少糖、好ましくはＤ−プシコースを含む、その予防または治療のために、生体の動脈硬化症に関係するケモカインまたはサイトカインの発現抑制または軽減作用、および動脈硬化惹起因子の発現に影響を及ぼさず動脈硬化の改善に関与する受容体の発現を促進する作用、である抗動脈硬化作用が要求される患者群に経口で摂取させる動脈硬化症の予防または治療剤。
（７）上記の発現を促進する作用が、生体の動脈硬化症に関係する、サイトカインによるケモカイン発現誘導を抑制し、動脈硬化惹起因子であるスカベンジャー受容体ＣＤ３６発現への影響を及ぼさず、動脈硬化の改善に関与する受容体の発現を促進する作用である上記（６）の動脈硬化症の予防または治療剤。
（８）Ｄ−プシコースが、Ｄ−プシコースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物を配合した組成物の形態である上記（６）または（７）の動脈硬化症の予防または治療剤。
（９）上記組成物が、Ｄ−プシコースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物を有効成分として配合した甘味料、調味料、食品添加物、食品素材、飲食品、健康飲食品、医薬品・医薬部外品および飼料からなる群から選ばれる形態のものである上記（８）の動脈硬化症の予防または治療剤。
【発明の効果】
［０００９］  本発明は、希少糖を用いた、動脈硬化症発症の抑制性組成物、（甘味料、調味料、食品添加物、食品素材、飲食品、健康飲食品、医薬品・医薬部外品および飼料）およびそれを用いた抑制方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
［００１０］  本発明は、希少糖、好ましくはＤ−プシコースの、生体の動脈硬化症に関係する、サイトカインによるケモカイン発現誘導を抑制し（たとえばＭＣＰ−１の分泌を抑制すること
【国際調査報告】
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2005115409.tif 000016
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