(57)【要約】抗ＨＥＲ２抗体療法および腫瘍特異的温熱療法の併用に用いることができる製剤、医薬組成物及びその製造方法を提供する。抗ＨＥＲ２抗体を結合した、磁性微粒子を含むリポソーム、該リポソームを含む医薬組成物、及び磁性微粒子を含むリポソームを抗ＨＥＲ２抗体と接触させることを含む該リポソームを製造するための方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＨＥＲ２抗体を結合した、磁性微粒子を含むリポソーム。
【請求項２】
請求項１に記載のリポソームを含む、医薬組成物。
【請求項３】
磁性微粒子を含むリポソームを抗ＨＥＲ２抗体と接触させることを含む、請求項１に記載のリポソームを製造するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、抗ＨＥＲ２抗体を結合した、磁性微粒子を含むリポソーム、それを含む医薬組成物、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  温熱療法は、有望ながん療法である（非特許文献１及び２）。しかし、周囲の健康な組織に損害を与えることのない温度にまで、局所の腫瘍領域だけを加熱することが困難であるという技術的な課題があった（非特許文献３及び４）。【０００３】  この課題を克服するために、温熱療法には磁性微粒子が用いられている。磁性微粒子を腫瘍組織のみに蓄積させることができれば、ヒステリシスロスによって交番磁場（ＡＭＦ）において発熱を生じることによって、がんに特異的な温熱療法を達成することができる（非特許文献５）。【０００４】  そこで、細胞内温熱療法のメディエーターとして、マグネタイト陽イオン性リポソーム（ＭＣＬｓ）が開発されている（非特許文献６−８）。これらの陽イオン性リポソームは、腫瘍細胞への吸着および取込みが改善されており、中性に荷電したマグネタイトリポソームに比べて１０倍高い腫瘍細胞に対する親和性を有する（非特許文献６）。【０００５】  ＭＣＬ介在温熱療法は、Ｂ１６マウスメラノーマ（非特許文献９）、Ｔ−９ラット神経膠腫（非特許文献８）、Ｏｓ５１５ハムスター骨肉腫（未発表の結果）およびウサギ舌のＶＸ−７扁平上皮がん（非特許文献１０）を含む、数種類の腫瘍を有する動物において効果を示すことが知られている。【０００６】  しかし、ＭＣＬ介在温熱療法が腫瘍の完全寛解を誘導するために非常に有効性が確認されているにもかかわらず、これらの陽イオン性ＭＣＬｓには、直接腫瘍組織に注入しなければならないという欠点があった。【０００７】  この欠点を克服するために、磁性微粒子を含む抗体コンジュゲートリポソーム（イムノリポソーム）が開発され、すでに、ヒト神経膠腫細胞に対するマウスＧ２２モノクローナル抗体（ＭＡｂ）（非特許文献１１）及びヒト腎細胞がん腫に対するマウスＧ２５０ＭＡｂ（非特許文献１２）を用いるイムノリポソームが構築され、そして、動物モデルを用いてそれらの腫瘍特異的ターゲッティング能力を明らかにした。【０００８】  ヒト上皮成長因子受容体−２（ＨＥＲ２）は、乳がんの２０〜３０％において過剰発現するが、特定の正常組織においては低いレベルで発現する（非特許文献１３）。そして、下記の２つの考察にもとづき、抗体ベース療法の可能な標的であると認められていた。【０００９】  第一に、ＨＥＲ２過剰発現が、腫瘍悪性度に関与することから、抗ＨＥＲ２抗体は、腫瘍増殖の重要なメディエーターを妨害することができる。また、ネズミの抗ＨＥＲ２  ＭＡｂ（ｍｕＭＡｂ４Ｄ５）は、インビトロ（非特許文献１４）及びインビボ（非特許文献１５）でＨＥＲ２を過剰発現する乳がん細胞の増殖を阻害する。この抗体のヒト化修飾物であるハーセプチン（トラスツズマブ）は、免疫原性ポテンシャルを減らす（非特許文献１６）、一方、細胞増殖阻害特性は保持しており、現在臨床で用いられている。【００１０】  第二に、安定的に過剰発現した腫瘍細胞表面上のＨＥＲ２は、理想的な標的抗原として薬剤デリバリーシステム（ＤＤＳ）のために利用することができる。【００１１】  抗ＨＥＲ２イムノリポソームが、腫瘍標的剤形として開発され、それらはＨＥＲ２を過剰発現する腫瘍に特異的に結合し、そして、取り込まれる。抗ＨＥＲ２イム��リポソームは、乳がん療法での二つの役割、すなわち、細胞障害性薬物を運搬するＤＤＳとしての役割と、それ自身が抗腫瘍活性を有するハーセプチンを含むことによる役割とがある。【００１２】  ハーセプチンは、それ自体で投与すると、抗増殖効果を有し、また、化学療法と組み合わせても有効である（非特許文献１７）。実際に、パークらは、ドキソルビシンを含む抗ＨＥＲ２イムノリポソームが、ＨＥＲ２を過剰発現する腫瘍細胞を標的とし、ハーセプチンとドキソルビシンの細胞障害性効果を重ね合わせたことを報告している（非特許文献１８）。しかし、抗ＨＥＲ２抗体療法および腫瘍特異的温熱療法の併用については、いまだ何らの報告もなされていない。【００１３】  したがって、本発明は抗ＨＥＲ２抗体療法および腫瘍特異的温熱療法が同時に施行できる製剤を提供することを目的としている。【００１４】
【非特許文献１】ジェイ・バンダージー（Ｊ．Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｚｅｅ）著、アニュアルズ・オブ・オンコロジー（Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、１３巻、１１７３−１１８４頁、２００２年
【非特許文献２】ピー・モローズら（Ｐ．Ｍｏｒｏｚ  ｅｔ  ａｌ）著、インターナショナル・ジャーナル・オブ・ハイパーサーミア（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ）、１８巻、２６７−２８４頁、２００２年
【非特許文献３】エー・ジョーダンら（Ａ．Ｊｏｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ）著、インターナショナル・ジャーナル・オブ・ハイパーサーミア（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ）、９巻、５１−６８頁、１９９３年
【非特許文献４】ティー・ミナミムラら（Ｔ．Ｍｉｎａｍｉｍｕｒａ）著、アニュアルズ・オブ・オンコロジー（Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、１６巻、１１５３−１１５８頁、２０００年
【非特許文献５】エム・シンカイら（Ｍ．Ｓｈｉｎｋａｉ  ｅｔ  ａｌ）著、日本ハイパーサーミア学会誌、１０巻、１６８−１７７頁、１９９４年
【非特許文献６】エム・シンカイら（Ｍ．Ｓｈｉｎｋａｉ  ｅｔ  ａｌ）著、日本癌学会誌、８７巻、１１７９−１１８３頁、１９９６年
【非特許文献７】エム・ヤナセら（Ｍ．Ｙａｎａｓｅ  ｅｔ  ａｌ）著、日本癌学会誌、８８巻、６３０−６３２頁、１９９７年
【非特許文献８】エム・ヤナセら（Ｍ．Ｙａｎａｓｅ  ｅｔ  ａｌ）著、日本癌学会誌、８９巻、４６３−４６９頁、１９９８年
【非特許文献９】エム・スズキら（Ｍ．Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ）著、メラノーマ・リサーチ（Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１３巻、１２９−１３５頁、２００３年
【非特許文献１０】エイチ・マツノら（Ｈ．Ｍａｔｓｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ）著、日本ハイパーサーミア学会誌、１７巻、１４１−１５０頁、２００１年
【非特許文献１１】ビー・レら（Ｂ．Ｌｅ  ｅｔ  ａｌ）著、化学工学会誌、３４巻、６６−７２頁、２００１年
【非特許文献１２】エム・シンカイら（Ｍ．Ｓｈｉｎｋａｉ  ｅｔ  ａｌ）著、日本癌学会誌、９２巻、１１３８−１１４５頁、２００１年
【非特許文献１３】エム・エフ・プレスら（Ｍ．Ｆ．Ｐｒｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ）著、オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、５巻、９５３−９６２頁、１９９０年
【非特許文献１４】ジー・ディー・ルイスら（Ｇ．Ｄ．Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ）著、キャンサー・イムノロジー、イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）、３７巻、２５５−２６３頁、１９９３年
【非特許文献１５】ジェイ・バセルガら（Ｊ．Ｂａｓｅｌｇａ  ｅｔ  ａｌ）著、ブレスト・キャンサー・リサーチ（Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２９巻、１２７−１３８頁、１９９４年
【非特許文献１６】ピー・カーターら（Ｐ．Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ）著、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）、８９巻、４２８５−４２８９頁、１９９２年
【非特許文献１７】エム・ペグラムら（Ｍ．Ｐｅｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ）著、オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、１８巻、２２４１−２２５１頁、１９９９年
【非特許文献１８】ジェイ・ダブリュー・パークら（Ｊ．Ｗ．Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ）著、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）、９２巻、１３２７−１３３１頁、１９９５年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】  抗ＨＥＲ２抗体療法と腫瘍特異性温熱療法との併用療法のための物及びその製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】  本発明者等は、抗ＨＥＲ２抗体を結合した、磁性微粒子を含むリポソームを構築し、抗ＨＥＲ２抗体療法および腫瘍特異的温熱療法の併用の実現可能性を検討したところ、予想外にも、抗ＨＥＲ２抗体療法および腫瘍特異性温熱療法の組み合わせが強い細胞傷害効果を有するという知見を得て、本発明を完成させるに至った。即ち、本発明は、下記の（１）〜（３）である。
（１）抗ＨＥＲ２抗体を結合した、磁性微粒子を含むリポソーム。
（２）前記（１）に記載のリポソームを含む、医薬組成物。
（３）磁性微粒子を含むリポソームを抗ＨＥＲ２抗体と接触させることを含む、前記（１）に記載のリポソームを製造するための方法。【００１７】  本発明は、抗ＨＥＲ２抗体を結合した、磁性微粒子を含むリポソームに関する。【００１８】  ＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２）タンパク質は、乳がん細胞表面に過剰発現している上皮細胞増殖因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）のレセプターである。チロシンキナーゼ活性を有する分子量１８５ｋＤａの膜受容型タンパクで、上皮細胞の分化や増殖などにかかわる重要な因子である。このＨＥＲ２タンパク過剰発現のある乳がん患者は予後不良であり、ホルモン療法の治療抵抗性、抗ガン剤への感受性が低い。【００１９】  本発明において、抗ＨＥＲ２抗体とは、ＨＥＲ２タンパク質を抗原として作製された抗体をいい、従来公知の任意の方法を用いて調製することができる。抗体は、モノクローン又はポリクローンのいずれも、本発明に用いることができる。【００２０】  本発明に用いる磁性微粒子としては、電磁波を吸収して発熱し、人体に無害なものであれば、使用することができるが、特に人体に吸収されにくい周波数の電磁波を吸収して発熱するものが有利であり、なかでも強磁性微粒子は、電磁波の吸収効率が良好であることから好ましく使用でき、例えば、マグネタイト、フェライトなどのセラミックあるいはパーマロイなどの強磁性金属等を例示できる。
なお、前記磁性微粒子は、１００μｍ以下、特に１μｍ以下の粒径であることが望ましい。【００２１】  また、本発明に用いる抗ＨＥＲ２抗体を結合した、磁性微粒子を含むリポソームとは、表面に抗ＨＥＲ２抗体を結合したリポソームである。抗ＨＥＲ２抗体を結合したリポソームは、ＨＥＲ２をその表面上に発現する細胞、特に乳がん細胞の付近に選択的に集中するので、乳がん細胞以外を加熱することなく温熱療法を行うことができる。【００２２】  したがって、本発明の医薬組成物は、乳がんの処置に適用することができる。【００２３】  また、本発明は、抗ＨＥＲ２抗体を結合した、磁性微粒子を含むリポソームを有効成分として含む医薬組成物にも関する。【００２４】  次に本発明のリポソーム製剤を乳がん治療に用いる際の処方や用法について詳しく説明する。
本発明のリポソーム製剤を分散する溶媒としては、水系溶媒、例えば、蒸留水；生理的食塩水；リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液などを使用することができる。このような水系溶媒のｐＨは５〜１０が挙げられ、好ましくは６〜８である。【００２５】  本発明の薬剤の形態は特に限定されず、経口投与のための製剤としては例えば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤などが挙げられ、非経口投与のための製剤としては例えば、注射剤、点滴剤、座剤、吸入剤、経粘膜吸収剤、経皮吸収剤、点鼻剤、点耳剤などが挙げられる。本発明の薬剤の形態、使用すべき製剤用添加物、製剤の製造方法などは、いずれも当業者が適宜選択可能である。本発明の薬剤の投与量は、患者の性別、年齢または体重、症状の重症度、予防または治療といった投与目的、あるいは他の合併症状の有無などを総合的に考慮して適宜選択することができる。投与量は、一般的には、０．００１μｇ／ｋｇ体重／日〜１０００μｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは０．００１μｇ／ｋｇ体重／日〜１００μｇ／ｋｇ体重／日である。【００２６】  また、本発明は、磁性微粒子を含むリポソームを抗ＨＥＲ２抗体と接触させることを含む、抗ＨＥＲ２抗体を結合した、磁性微粒子を含むリポソームを製造するための方法にも関する。【００２７】  上記のように、本発明のリポソームは、抗ＨＥＲ２抗原を、磁性微粒子を含むリポソームの表面に結合していることが特徴であり、両者を結合させる方法としては、従来公知の方法を用いることができるが、例えば、次の方法を挙げることができる：
抗体をＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）によって処理する。それから、ＳＰＤＰ修飾抗体を１，４−ジチオスレイトールも用いて還元する。還元した抗体を磁性微粒子担荷リポソームに添加する。続いて、ナトリウムリン酸緩衝液中でインキュベーションする。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、磁性微粒子を含むイムノリポソーム上に固定されたハーセプチンによって介在される抗増殖活性である。ＳＫＢｒ３細胞を異なる濃度（０−３μｇ抗体／ｍｌ）の、リツキサンとコンジュゲートした磁性微粒子担荷イムノリポソーム（黒丸）またはハーセプチンとコンジュゲートした磁性微粒子担荷イムノリポソーム（黒三角）で処理した。８日間インキュベーション後、抗増殖効果を相対細胞数パーセントとして評価した。データおよびバーは、３つの独立した実験の平均及びＳＤである。ＨＭＬは０．５μｇ−抗体／ｍｌまでは濃度依存的に抗がん作用を示し、０．５μｇ−抗体／ｍｌ以上では変わらなかった。この効果は固定化しないハーセプチンを添加した場合と同じだったことから、固定化されたハーセプチンが持つ抗腫瘍効果であるといえる。Ｘ軸は抗体濃度［μｇ／ｍｌ］であり、Ｙ軸は相対的な細胞数［％］を表す。
【図２】図２は、ＳＫＢｒ３細胞による抗ＨＥＲ２抗体を結合した、磁性微粒子を含むリポソームの摂取である。２８．６ｐｇマグネタイト／細胞の濃度で、ＳＫＢｒ３細胞を、磁性微粒子担荷リポソーム（ＭＬｓ（黒丸））又はハーセプチン（黒四角）とコンジュゲートしたイムノリポソームで処理した。「材料および方法」にて説明したように、マグネタイト摂取率を判断した。データおよびバーは、３つの独立した実験の平均及びＳＤである。ＨＭＬはＨＥＲ２抗原を過剰発現している悪性乳癌細胞（ＳＫＢｒ３細胞株）に特異的に結合した。Ｘ軸はＨＭＬ添加後の時間［ｈ］であり、Ｙ軸はがん細胞内へのマグネタイト取り込み量［％（添加した量を１００％ととする）］を表す。
【図３】図３は、抗ＨＥＲ２抗体を結合した、磁性微粒子を含むリポソームによって誘導される温熱療法の結果を示す。２８．６ｐｇマグネタイト／細胞の濃度で、ＳＫＢｒ３細胞を磁性微粒子担荷リポソーム（ＭＬｓ（黒丸））、リツキサン（ＲＭＬｓ（黒三角））を有するイムノリポソーム複合化またはハーセプチン（黒四角）で処理した。４時間のインキュベーションの後、細胞を回収し、交番磁場（ＡＭＦ）で３０分照射した。細胞ペレットの温度上昇を測定した（Ａ）。ＡＭＦ照射の後、細胞を再播種した。次いで、ＨＭＬｓで処理した細胞を、２４時間の間隔で、もう一回、ＡＭＦ照射（反復温熱療法（白四角））あるいはもう二回ＡＭＦ照射（黒三角）に付した。所定の日に、生細胞数を、血球計数盤を用いるトリパンブルー排除方法で測定した（Ｂ）。データおよびバーは、３つの独立した実験の平均及びＳＤである。ＨＭＬを添加することで、マグネタイトが細胞に取り込まれ、磁場照射により発熱した（Ａ）。その発熱に伴い、ハーセプチンと温熱療法の併用効果によって、顕著な殺細胞効果が引き起こされた（Ｂ）。Ｘ軸は磁場照射時間［ｍｉｎ］であり、Ｙ軸は温度［℃］を表す（Ａ）。Ｘ軸は磁場照射後の培養時間［ｄａｙ］であり、Ｙ軸は生細胞数［１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ］を表す（Ｂ）。
【実施例】
【００２９】  細胞培養および抗体
ＳＫＢｒ３ヒト乳がん細胞（ＡＴＣＣ）は、１．５ｍＭのＬ−グルタミン、１０％ウシ胎仔血清および抗生物質（１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧおよび０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン）添加マッコイ５ａ培地（ギブコＢＲＬ、ゲーサーズバーグ、メリーランド）中で培養した。細胞を５％ＣＯ２を含む雰囲気中、３７℃で増殖させた。【００３０】  ＳＫＢｒ３細胞を、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡおよび免疫組織化学的アッセイによってＨＥＲ２発現について広範囲に特徴づけた。
臨床用として市販されている抗ＨＥＲ２  ＭＡｂ  ハーセプチンおよび抗ＣＤ２０  ＭＡｂ  リツキサン（ハーセプチンのアイソタイプ照合コントロールＭＡｂ）を日本ロシュ（東京）から入手した。【００３１】  磁性微粒子を含むイムノリポソームの調製
イムノリポソーム及び磁性微粒子を含むリポソーム（抗体なし）の調製方法はすでに記載されている。磁性微粒子（Ｆｅ３Ｏ４；平均粒径、１０ナノメートル）は、戸田工業から供与された。【００３２】  磁性微粒子担荷リポソームをコロイド性マグネタイト、およびホスファチジルコリン／ホスファチジルエタノールアミン（比、２：１）およびＮ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンからなる脂質混合物を用いて調製した。【００３３】  リポソーム上の抗体の固定化のために、抗体（ハーセプチンまたはリツキサン）をＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）によって処理した。それから、ＳＰＤＰ修飾抗体を１，４−ジチオスレイトール（２５ｍＭ））も用いて還元した。還元した抗体を７０μｇ抗体／ｍｇマグネタイトの濃度で磁性微粒子担荷リポソームに添加した。続いて、リン酸ナトリウム緩衝液中で４℃で２０時間インキュベーションした。抗体およびマグネタイト濃度を、タンパク質アッセイ（ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ）によって、そして、チオシアン酸カリウム方法によって、それぞれ、測定した。イムノリポソームのサイズを、動的光散乱分光光度計（ＦＲＡＲ１０００、大塚電子）を使用して測定した。【００３４】  磁性微粒子担荷イムノリポソーム上のハーセプチンの抗増殖活性
ＳＫＢｒ３細胞を、指示濃度で抗体または磁性微粒子担荷イムノリポソームを含む実験的培地を用いて２×１０４細胞／ウェルで、６ウェル細胞培養プレートに播種した。抗増殖活性を、８日間のインキュベーション後に測定した。生細胞数を、血球計数盤を用いるトリパンブルー色素排除法で測定し、そして、相対細胞数を算出した。【００３５】  ＳＫＢｒ３細胞による、抗ＨＥＲ２抗体を結合した磁性微粒子を含むリポソームの取り込み
ＳＫＢｒ３セルを、２８．６ｐｇマグネタイト／セル（０．５μｇ抗体／ｍｌ）の濃度で磁性微粒子担荷イムノリポソームまたはリポソーム（抗体なし）を含む実験的培地を用いて７×１０５細胞／ウェルで６ウェル細胞培養プレートに播種し、往復シェーカー（ＳＨＫ−３２０、旭テクノグラス、７０ｒｐｍ）によって３７℃で穏やかに振盪しながらインキュベーションした。１、４、８または２４時間インキュベーション後に、細胞をＰＢＳで二回洗浄し、ラバーポリスマンを使用して回収し、そして、マグネタイト濃度を測定した。【００３６】  磁性微粒子誘導温熱療法
磁性微粒子を用いるインビトロの温熱療法実験を、先に記載された方法を使用して実行した。概略すると、ＳＫＢｒ３細胞を、磁性微粒子担荷イムノリポソームでの処理の前に、サブコンフルエントまで培養した。次に、細胞を、２８．６ｐｇのマグネタイト／セル（０．５ｍｇ抗体／ｍｌ）の濃度で磁性微粒子担荷イムノリポソームを含む実験的培地で培養した。マグネタイト取込みの４時間後に、細胞をマイクロ遠心チューブに集め、穏やかに遠心分離し、細胞ペレットを形成させた。チューブを、高周波磁場発生器（３６０ｋＨｚ、１２０Ｏｅ、第一高周波）のコイルの中央に配置した。細胞ペレットの温度を光ファイバ・プローブ（安立計器）をその中央に挿入することで測定し、ペレットを手動で磁場強度を調整することによって恒温に維持した。交番磁場（ＡＭＦ）照射時間は、３０分であった。ＡＭＦ照射の間、周囲温度を３７℃に維持した。処理した細胞を２×１０４細胞／ウェルで６ウェル細胞培養プレートに再播種した。生細胞数を、血球計数盤を用いるトリパンブルー排除方法で測定した。【００３７】  磁性微粒子を含むイムノリポソームの調製
磁性微粒子（ハーセプチン−コンジュゲートマグネトリポソーム（ＨＭＬｓ））を組み込んだ抗ＨＥＲ２イムノリポソームを構築し、ＨＭＬｓが抗ＨＥＲ２抗体療法を温熱療法と組合わせることができるかどうか検討した。磁性微粒子を組み込んでいる抗ＣＤ２０イムノリポソーム（リツキサンコンジュゲートマグネトリポソーム（ＲＭＬｓ））をコントロールとして調製した。ＨＭＬｓの固定化密度および平均粒径は、それぞれ、５５．６±６μｇ抗体／ｍｇマグネタイトおよび１３８±７．６ｎｍであった。これらの値は、ＲＭＬｓのそれと同様である（表１）。【００３８】
2005079843.tif 000002
【００３９】  磁性微粒子を含むイムノリポソームの調製方法は、以前より報告されている。マウスＭＡｂｓの場合には、固定化密度は、約４０ｍｇ抗体／ｍｇマグネタイトであった。本研究において、同様の結果が、「ヒト化」抗体について得られた。先の研究において、磁性微粒子を含むＦａｂ’フラグメント−コンジュゲートイムノリポソームが調製され、全体抗体に比べて２．４倍高いモル固定化という結果となった。Ｆａｂ’フラグメント−コンジュゲートイムノリポソームは、ＤＤＳのための有利な効果を有することができる。他方、ハーセプチンのヒト定常（Ｆｃ）ドメインは、ＨＥＲ２を過剰発現するがんに対して、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を示す。本研究において、インビトロでＡＤＣＣを与えることができる磁性微粒子を含む全ハーセプチン−コンジュゲートイムノリポソームが調製された。【００４０】  磁性微粒子を含むイムノリポソームの調製
図１は、異なる濃度でのＳＫＢｒ３細胞に対するＨＭＬｓの抗増殖効果を示す。遊離のハーセプチンのように、ＨＭＬｓは抗増殖効果を有した。用量反応曲線は、最大効果が、０．５μｇ抗体／ｍｌの濃度で達成され、約５０％の乳ガン細胞を殺した。対照的に、遊離のリツキサン又はＲＭＬｓが加えられたときには、抗増殖効果は観察されなかった。これらの結果は、ハーセプチン−コンジュゲートイムノリポソームが、その抗増殖活性を保持していることを示唆する。【００４１】  ＳＫＢｒ３細胞による磁性微粒子のイムノリポソーム介在摂取
その抗増殖効果に加えて、抗ＨＥＲ２イムノリポソームを腫瘍標的製剤として用いることができる。そこで、ＨＭＬｓが、ＳＫＢｒ３セルに取り込まれるかどうかを検討した。ＳＫＢｒ３細胞による磁性微粒子の摂取を図２に示す。ＨＭＬｓについては、磁性微粒子は、急速にＳＫＢｒ３細胞内に取り込まれ、最大摂取は４時間後、総添加磁性微粒子（２８．６ｐｇマグネタイト／細胞（０．５ｍｇ抗体／ｍｌ））の５６．７％（１６．５±０．９ｐｇ−マグネタイト／細胞）であった。他方、少量の抗体のない磁性微粒子担荷リポソーム（マグネトリポソーム（ＭＬｓ））だけが、ＳＫＢｒ３セルに取り込まれた。ＲＭＬｓについては、総添加磁性微粒子の１１．７％のみが、取り込まれた。【００４２】  我々は、以前、Ｇ２２（Ｇ２２ＭＬｓ）およびＧ２５０（Ｇ２５０ＭＬｓ）とコンジュゲートした磁性微粒子担荷イムノリポソームを開発し、それらは、それぞれヒトＵ２５１神経膠腫細胞およびＭＮ抗原提示性マウス腎細胞がん細胞に特異的に取り込まれた。最大摂取量は、それぞれ、Ｇ２２ＭＬｓとＧ２５０ＭＬｓについて、約８０％と６０％であった。他方、これらの細胞による非特異的抗体コンジュゲートイムノリポソームの摂取は、１０〜２０％であった。この摂取実験の結果は、以前の研究と同様であった。ＲＭＬの摂取は、抗体タンパクと標的細胞との間の非特異的相互作用により生じる非特異的摂取であると考えられる。この結果は、ＨＭＬｓの摂取が、抗体依存性であり、ＨＥＲ２を過剰発現するがん細胞に特異的だったことを示す。【００４３】  磁性微粒子を取り込んでいる抗ＨＥＲ２イムノリポソームによって誘導される温熱療法
次に、交番磁場（ＡＭＦ）が、ＨＭＬｓによって処理されたＳＫＢｒ３セルにおいて熱を生じるか否かを検討し、細胞内の温熱療法を観察した。図３Ａは、３６０ｋＨｚおよび１２０ＯｅでのＡＭＦ照射の間の磁性微粒子担荷イムノリポソームで処理された細胞ペレットの温度を示す。熱は、ＨＭＬｓを取り込んでいるＳＫＢｒ３細胞において発生した（１６．５ｐｇマグネタイト／セル；図２）。これらの細胞の温度は急速に上昇し、４２．５℃に達した。そして、それは温熱療法に有効な温度であって、それからＡＭＦの強さを制御することによって３０分の間のその温度に維持された。対照的に、未処理細胞（０ｐｇマグネタイト／細胞）及びＲＭＬｓで処理された細胞（１１．７ｐｇマグネタイト／細胞）においては、ＡＭＦ照射の間の温度は、それぞれ１及び２℃増加したに過ぎなかった。【００４４】  図３Ｂは、ＡＭＦ照射の後の生細胞数を示す。ＳＫＢｒ３細胞がＲＭＬｓによって処理され、ＡＭＦによって照射を受けるとき、未処置のコントロールと比較して、有意な成長阻止は観察されなかった。対照的に、細胞がＨＭＬｓによって処理されるとき、生細胞数はコントロールのそれの約４分の１に減少した。ＨＭＬｓ処理だけの場合には約２分の１に減少したことから、温熱によって抗ＨＥＲ２抗体の抗腫瘍効果が増強された。また、ＨＭＬ処理２４時間後であってもＳＫＢｒ３細胞には温熱療法に充分な量（１５．６±０．２７ｐｇマグネタイト／細胞）の磁性微粒子が残存していたことから反復温熱療法もおこなった（図２）。ＡＭＦ照射を２４時間の間隔で２回繰り返したとき、図３Ａに示すものと同様の温度プロフィールを示し（データは示さず）、生細胞数の激しい減少を引き起こし、そして細胞増殖が少なくとも８日間強く抑制された。そして驚くべきことに、３回ＡＭＦ照射を繰り返すことで、ＳＫＢｒ３細胞は死滅するという格別の効果が見られた。これらの結果は、ＨＭＬｓによって処理されたＨＥＲ２を過剰発現するがん細胞がＡＭＦ照射によって特異的に加熱され、そして、ＨＭＬｓによって介在されるその温熱療法が強い抗がん効果を有することを示唆する。
【図１】
2005079843.tif 000003
【図２】
2005079843.tif 000004
【図３】
2005079843.tif 000005
【国際調査報告】
2005079843.tif 000006
2005079843.tif 000007