(57)【要約】  胃粘膜に対して安全であり、消化管傷害の副作用が少ない化合物またはその塩、とくに非ステロイド系抗炎症化合物またはその塩を選択するスクリーニング方法を提供することであり、蛍光色素、特にカルセインを内封するとともに、フォスファチジルコリン、フォスファチジルグリセロール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール等のリン脂質で構成された細胞膜モデルを有するリポソームを使用し、当該リポソームと試験化合物を反応させ、リポソームからの蛍光色素の漏出の程度を評価することを特徴とする、胃粘膜に安全な化合物、特に非ステロイド系抗炎症化合物のスクリーニング方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光色素を内封するとともに、リン脂質で構成された細胞膜モデルを有するリポソームを使用し、当該リポソームと試験化合物を反応させ、リポソームからの内封された蛍光色素の漏出の程度を評価することを特徴とする、胃粘膜に安全な化合物のスクリーニング方法。
【請求項２】
細胞膜モデルとして使用するリン脂質が、フォスファチジルコリン、フォスファチジルグリセロール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルエタノールアミンまたはカルジオリピンから選択されるものである請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
蛍光色素の漏出の程度を当該蛍光色素の励起波長の蛍光を測定することにより行う請求項１または２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
蛍光色素がカルセイン、ローダミンまたはフルオレセイン誘導体から選択されるものである請求項１ないし３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
蛍光色素としてカルセインを使用する請求項１ないし３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
カルセインの漏出の程度を、５２０ｎｍの蛍光を測定することにより行う請求項５に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
試験化合物が、抗炎症作用を有する化合物である請求項１ないし６のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
抗炎症作用を有する化合物が、非ステロイド系抗炎症化合物またはステロイド系化合物である請求項７に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
試験化合物が、胃粘膜保護作用を有する化合物である請求項１ないし６のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
請求項７または８に記載のスクリーニング方法で得られる胃粘膜に安全な抗炎症性化合物またはその塩。
【請求項１１】
請求項９に記載のスクリーニング方法で得られる胃粘膜保護作用物質。
【請求項１２】
胃粘膜傷害作用を有する化合物をスクリーニングするために使用する、蛍光色素を内封するとともに、リン脂質で構成された細胞膜モデルを有するリポソーム。
【請求項１３】
蛍光色素がカルセイン、ローダミンまたはフルオレセイン誘導体から選択されるものである請求項１２に記載のリポソーム。
【請求項１４】
細胞膜モデルとして使用するリン脂質が、フォスファチジルコリン、フォスファチジルグリセロール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルエタノールアミンまたはカルジオリピンから選択されるものである請求項１２に記載のリポソーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胃粘膜に対して安全である、いわゆる消化管障害の副作用が少ない化合物またはその塩、特に抗炎症化合物またはその塩、あるいは胃粘膜保護作用物質を評価・選択するスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗炎症薬のなかでも非ステロイド系抗炎症薬（NSAIDs）は、優れた抗炎症作用を発揮する薬物であるが、消化管障害等の副作用が大きく、とくに胃潰瘍を誘発させる副作用が臨床の現場で大きな問題となっている。すなわち、現在において最も主要な胃潰瘍、胃炎の原因としては、非ステロイド系抗炎症薬（NSAIDs）の使用があげられている。【０００３】
しかしながらその一方で、高齢化社会の進展に伴い、NSAIDsの投与を必要とする患者も今後増え続けることが予想される。事実、高齢者の増加とともに、腰痛症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチなどの症状の緩和にNSAIDsの使用が増加傾向にある。
したがって、NSAIDsによる胃潰瘍の誘発を抑えた、胃粘膜傷害の副作用が無いNSAIDs、すなわち胃粘膜に安全なNSAIDsを開発することは、重要なことであるといえる。【０００４】
本発明者は、先にNSAIDsが有する胃潰瘍誘発の副作用の原因が、NSAIDsの直接細胞傷害性作用であることを発見し、直接細胞傷害性のないNSAIDsは、胃粘膜に対し安全で有用な薬になるという考え方を提案してきている（特許文献１）。
【特許文献１】特開２００３−２０７５０７号公報
【０００５】
すなわち、細胞膜におけるシクロオキシゲナーゼの作用を阻害し、胃粘膜防御因子であるプロスタグランジンを減少させること、かつネクローシスおよび／またはアポトーシス誘導阻害活性を有する直接細胞傷害性作用の無いNSAIDsが、胃潰瘍誘発等の副作用を有しない化合物であるとの考え方に基づき、胃粘膜細胞傷害性と、胃粘膜でシクロオキシゲナーゼの作用の阻害性の両者を指標にしたスクリーニング方法を提案してきている。【０００６】
本発明者は、その考え方をベースにさらに研究を重ねた結果、NSAIDsの直接細胞障害性作用の原因がNSAIDsの膜傷害性にあることを新規に見出し、さらに、その膜傷害性を簡便に検出し得る細胞膜モデルの作成に成功した。したがって、かかる細胞膜モデルを用いて、NSAIDsの膜傷害性の有無を判定することにより、胃粘膜に対して安全なNSAIDsを検索することが可能となる。
また、この細胞膜モデルを使用すれば、NSAIDsのみならず、胃粘膜に対して安全な薬物、すなわち胃粘膜保護作用物質を広く検索することが可能となる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかして本発明は、胃粘膜に対して安全であり、消化管障害の副作用が少ない化合物またはその塩、とくに非ステロイド系抗炎症化合物またはその塩を選択するスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
かかる課題を解決するため、本発明の一つの基本的態様は、具体的には；
（１）蛍光色素を内封するとともに、リン脂質で構成された細胞膜モデルを有するリポソームを使用し、当該リポソームと試験化合物を反応させ、リポソームからの内封された蛍光色素の漏出の程度を評価することを特徴とする、胃粘膜に安全な化合物のスクリーニング方法；
（２）細胞膜モデルとして使用するリン脂質が、フォスファチジルコリン、フォスファチジルグリセロール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルエタノールアミンまたはカルジオリピンから選択されるものである上記（１）に記載のスクリーニング方法；
（３）蛍光色素の漏出の程度を当該蛍光色素の励起波長の蛍光を測定することにより行う上記（１）または（２）に記載のスクリーニング方法；
（４）蛍光色素がカルセイン、ローダミンまたはフルオレセイン誘導体から選択されるものである上記（１）ないし（３）に記載のスクリーニング方法；
であり、特に好ましくは、
（５）蛍光色素としてカルセインを使用する上記（１）ないし（３）に記載のスクリーニング方法；
（６）カルセインの漏出の程度を、５２０ｎｍの蛍光を測定することにより行う上記（５）に記載のスクリーニング方法である。【０００９】
本発明はさらに別の態様として、
（７）試験化合物が、抗炎症作用を有する化合物である上記（１）ないし（６）のずれかに記載のスクリーニング方法；
（８）抗炎症作用を有する化合物が、非ステロイド系抗炎症化合物またはステロイド系化合物である上記（７）に記載のスクリーニング方法；
（９）試験化合物が、胃粘膜保護作用を有する化合物である上記（１）ないし（６）のいずれかに記載のスクリーニング方法；
でもある。【００１０】
さらに本発明は、また別の態様として、
（１０）上記した（７）または（８）に記載のスクリーニング方法で得られる胃粘膜に安全な抗炎症性化合物またはその塩；
（１１）上記した（９）に記載のスクリーニング方法で得られる胃粘膜保護作用物質；
である。【００１１】
さらに本発明は、別の態様として上記したスクリーニング方法に使用する細胞膜モデルを有するリポソームを提供するものでもあり、具体的には、
（１２）胃粘膜傷害作用を有する化合物をスクリーニングするために使用する、蛍光色素を内封するとともに、リン脂質で構成された細胞膜モデルを有するリポソーム；
（１３）蛍光色素がカルセイン、ローダミンまたはフルオレセイン誘導体から選択されるものである上記（１２）に記載のリポソーム；
（１４）細胞膜モデルとして使用するリン脂質が、フォスファチジルコリン、フォスファチジルグリセロール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルエタノールアミンまたはカルジオリピンから選択されるものである上記（１２）に記載のリポソーム；
である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明が提供するスクリーニング方法は、簡便な細胞膜モデルを使用することにより、薬物の膜傷害性を検出することが可能となる。したがって、本発明が提供するスクリーニング方法を使用することにより、試験化合物の膜傷害性、特に非ステロイド系抗炎症作用を有する化合物（NSAIDs）の膜傷害性を簡単に測定することができ、その結果、胃粘膜に安全であり、胃粘膜障害の無い、臨床的に極めて有用なNSAIDsを開発し得る利点を有している。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】１０種類のNSAIDsに関して、その細胞生存率の低下で見た細胞傷害性（ネクローシス）と、本発明のリポソームモデルによる膜傷害性の相関関係を示す図である。
【図２】１０種類のNSAIDsに関して、その細胞生存率の低下で見た細胞傷害性（アポトーシス）と、本発明のリポソームモデルによる膜傷害性の相関関係を示す図である。
【図３】本発明の実施例２の結果について、その一部を示す図である。
【図４】本発明の実施例２の結果について、その一部を示す図である。
【図５】本発明の実施例３におけるインドメタシンとテプレノンを併用した場合のカルセインの漏出率を示した図である。
【図６】本発明の実施例３におけるジクロフェナックとテプレノンを併用した場合のカルセインの漏出率を示した図である。
【図７】本発明の実施例３におけるセレコキシブとテプレノンを併用した場合のカルセインの漏出率を示した図である。
【図８】本発明の実施例３におけるイブプロフェンとテプレノンを併用した場合のカルセインの漏出率を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明で使用する細胞膜モデルとしては、細胞膜透過性を有する蛍光色素を内封したリポソームとして、リン脂質で構成されたリポソームを使用するものである。すなわち、NSAIDsの膜傷害性は、細胞膜の脂質部分における膜のバリアー性を破壊することが主な作用であると考えられることから、リン脂質で構成されたリポソームを作成し、そのリポソームに蛍光色素を内封してやり、かかるリポソームとNSAIDsを反応させることにより、リポソームからの蛍光色素の漏出の程度を評価すれば、NSAIDsの膜傷害性の程度が判明できることとなる。【００１５】
そのような蛍光色素としては、カルセイン、ローダミンまたはフルオレセイン誘導体等をあげることができる。そのなかでもカルセイン（calcein）を好ましく使用することができる。カルセインは、細胞傷害活性の測定に汎用されている蛍光色素であり、生細胞を染色し、細胞毒性の無い蛍光色素である。【００１６】
また、リポソーム膜を構成するリン脂質としては、フォスファチジルコリン、フォスファチジルグリセロール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルエタノールアミン、カルジオリピン等を挙げることができる。これらのリン脂質は一種類を用いてリポソーム膜を構成してもよく、また複数種用いてリポソーム膜を構成してもよい。【００１７】
したがって、本発明はリン脂質から構成されるリポソーム膜に対し、試験化合物を反応させた場合におけるそのリポソーム膜の損傷程度の度合を測定することを手段とするものであり、言うなれば、胃粘膜を、リン脂質を使用したリポソーム膜に置き換えて試験しようとするものである。
したがって、胃粘膜とリン脂質を使用したリポソーム膜との間の相関性が存在するかどうかが一つの問題となる。本発明者の検討によれば、例えば、NSAIDsにおけるネクローシス／アポトーシスによる細胞生存率の低下でみた細胞傷害性と、リポソームモデルによる膜傷害性は良く一致していることが確認された。【００１８】
また、本発明者の検討によれば、NSAIDsの直接細胞傷害性の原因が、NSAIDsの膜傷害性にあることは以下の事実から証明された。すなわち、これまでに臨床的に使用されている１０種類のNSAIDsに関して、その細胞生存率の低下で見た細胞傷害性（ネクローシス／アポトーシスによる細胞生存率の低下でみた細胞傷害性）と、上記したリポソームモデルによる膜傷害性の程度を対比した。その結果、図１および２に示すように、その細胞傷害性と膜傷害性は極めて良く対応しており、直接細胞傷害の原因が、NSAIDsの膜傷害性に存在するものであることが確認された。すなわち、細胞傷害性の高いNSAIDsは、膜傷害性も高いものであり、細胞傷害性が弱いNSAIDsは、膜傷害性も弱いという対応が確認された（相関係数：０．９１）。【００１９】
以上のように、本発明が提供する細胞膜モデルであるリポソームを使用する膜傷害性の判定により、NSAIDsの細胞傷害性を判定することができることとなる。ところで、本発明者は先に、胃潰瘍誘発の副作用の原因が、NSAIDsの直接細胞傷害性であることを見出し、直接細胞傷害性のない細胞膜モデルは、胃粘膜に安全であるという考え方を提唱している。そして、上記したように、この直接細胞傷害性の原因が、NSAIDsの膜傷害性にあるという事実からみれば、本発明が提供する細胞膜モデルを用いた膜傷害性の度合を測定することにより、胃粘膜に安全なNSAIDsをスクリーニングすることが可能となるのである。【００２０】
本発明が提供する細胞膜モデルを用いた、胃粘膜に安全なNSAIDsのスクリーニング方法は、具体的には以下のようにして行うことができる。すなわち、蛍光色素である、例えばカルセインを内封するリン脂質から構成されるリポソームと、スクリーニングするべきNSAIDsを種々の濃度で反応させ、リポソームからのカルセインの漏出（すなわちリポソーム膜の傷害による漏出）の程度を、５２０ｎｍの蛍光を測定することにより行うことができる。【００２１】
本発明が提供する細胞膜モデルを用いた、胃粘膜に安全な化合物のスクリーニング方法の妥当性は、蛍光色素を内封するリン脂質から構成されるリポソームと、例えば、膜障害性のあるNSAIDsと共に、粘膜保護作用物質を添加させることにより、リポソームに内封された蛍光色素の漏出が抑制される事実からも、立証された。【００２２】
すなわち後記する実施例から判明するように、例えば、膜障害性のあるNSAIDsとして知られているインドメタシン、ジクロフェナック、セレコキシブあるいはイブプロフェンと、胃粘膜保護作用のある抗潰瘍薬であるテプレノン（商品名：セルベックス（登録商標））を併用して、本発明の蛍光色素であるカルセインを内封したリポソームと反応させると、併用したテプレノンの用量に依存して、リポソームからのカルセインの漏出が抑制された。【００２３】
この事実は、胃粘膜保護作用物質であるテプレノンが細胞膜の傷害性を防止することによってNSAIDsの膜傷害作用を軽減させていることに他ならない。したがって、本発明が提供する細胞膜モデルを用いた膜傷害性の度合を測定することにより、胃粘膜に安全な化合物、特にNSAIDsをスクリーニングすることができることを証明しているのである。【００２４】
なお、上記したスクリーニング方法は、主にNSAIDsのスクリーニング方法であるが、本発明が提供するスクリーニング方法は、NSAIDsにのみ限定されず、胃粘膜に対して安全な薬物、すなわち胃粘膜障害性のない化合物を広くスクリーニングすることができることはいうまでもない。
【実施例】
【００２５】
以下に本発明を、具体的実施例により説明する。
実施例１：カルセイン内封リポソームの作成
卵黄由来のフォスファチジルコリン（１０μｍｏｌ、７．７ｍｇ）を、クロロホルム／メタノール（１：２）混合液に溶解後、乾燥させた。その後１.５ｍＬのジエチルエーテルに溶解させ、１ｍＬの１００ｍＭカルセイン−水酸化ナトリウム含有水溶液（ｐＨ７．４）と混合した。次いでジエチルエーテルを除去し、カルセインを内封したリポソーム溶液を得た。【００２６】
実施例２：種々の公知のNSAIDsとの反応によるリポソームからのカルセインの漏出
NSAIDsとして、臨床的に使用されている公知のインドメタシン、イブプロフェン、ケトプロフェン、ジクロフェナック、フルルビプロフェン、メフェナム酸、フルフェナム酸、セレコキシブ、エトドラクおよびニメスリドを選択し、上記実施例１で得たリポソーム溶液中に種々の濃度で添加し、３０℃にて１０分間反応させた。反応液の５２０ｎｍの蛍光を測定することにより、リポソームからのカルセインの漏出（膜傷害）を測定した。
その結果を、図３（インドメタシン、イブプロフェン、ケトプロフェン、ジクロフェナックおよびフルルビプロフェンにつての結果）および図４（メフェナム酸、フルフェナム酸、セレコキシブ、エトドラクおよびニメスリドについての結果）にまとめて示した。【００２７】
図３に示したNSAIDsであるインドメタシン、イブプロフェン、ケトプロフェン、ジクロフェナックおよびフルルビプロフェンにつては、胃粘膜細胞傷害性の強さは、インドメタシン＞ジクロフェナック＞フルルビプロフェン＞イブプロフェン＞ケトプロフェンの順であるとされている。リポソームからのカルセインの漏出の程度もその順であり、リポソームからのカルセインの漏出（膜傷害性）の程度を評価することにより、胃粘膜に安全な非ステロイド系抗炎症化合物の評価ができていることが良く理解された。【００２８】
また、図４に示したNSAIDsであるメフェナム酸、フルフェナム酸、セレコキシブ、エトドラクおよびニメスリドについては、胃粘膜細胞傷害性の強さは、セレコキシブ＞メフェナム酸＞フルフェナム酸＞ニメスリド＞エトドラクの順であるとされている。リポソームからのカルセインの漏出の程度もその順であり、図３に示した結果と同様に、リポソームからのカルセインの漏出（膜傷害性）の程度を評価することにより、胃粘膜に安全な非ステロイド系抗炎症化合物の評価ができていることが良く理解された。【００２９】
実施例３：種々の公知のNSAIDsと胃粘膜保護作用物質を併用した反応によるリポソームからのカルセインの漏出
NSAIDsとして、臨床的に使用されている公知のインドメタシン、ジクロフェナック、セレコキシブおよびイブプロフェンを選択し、胃粘膜保護作用物質との併用によるリポソームからのカルセインの漏出を検討した。【００３０】
方法：
添加するNSAIDsの濃度としては、細胞膜傷害を顕著に生じさせる濃度とし、インドメタシンについては６ｍＭを、ジクロフェナックについては４ｍＭを、セレコキシブについては０．０８ｍＭを、イブプロフェンについては２０ｍＭを添加した。
胃粘膜保護作用物質としてテプレノン（商品名：セルベックス（登録商標））を用い、無添加（コントロール）、１０−７、１０−６、１０−５、および１０−４Ｍをそれぞれ併用した。
上記実施例１で得たリポソーム溶液中にそれぞれの試験濃度で添加し、３０℃にて１０分間反応させ、反応液の５２０ｎｍの蛍光を測定することにより、リポソームからのカルセインの漏出（膜傷害）を測定した。【００３１】
結果：
図５〜図８にその結果を示した。
図５は、インドメタシン６ｍＭとテプレノンをその用量を変化させて併用した場合のカルセインの漏出率を示したものであるが、併用するテプレノンの用量に依存してカルセインの漏出が抑制されているのが判明する。【００３２】
また、図６は、ジクロフェナック４ｍＭとテプレノンをその用量を変化させて併用した場合のカルセインの漏出率を示したものであり、図７は、セレコキシブ０．０８ｍＭとテプレノンをその用量を変化させて併用した場合のカルセインの漏出率を示したものであり、図８は、イブプロフェン２０ｍＭとテプレノンをその用量を変化させて併用した場合のカルセインの漏出率を示したものであるが、いずれの場合にあっても、併用するテプレノンの用量に依存してカルセインの漏出が抑制されていた。【００３３】
なお、添加する４種類のNSAIDsの濃度について、インドメタシンについては４および８ｍＭ、ジクロフェナックについては２および１０ｍＭ、セレコキシブについては０．０５および０．１ｍＭ、イブプロフェンについては４０および６０ｍＭと変化させて同様の実験を行ったが、テプレノンと併用することでリポソームからのカルセインの漏出（膜傷害）が抑制されていた。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
以上記載のように、本発明により、極めて簡便な細胞膜モデルを使用することにより、試験化合物、特に非ステロイド系抗炎症作用を有する化合物（NSAIDs）の膜傷害性を検出することが可能となる。したがって、本発明のスクリーニング方法を使用することにより、NSAIDsの膜傷害性を簡単に測定することができることから、胃粘膜に安全な、胃粘膜傷害の無い、臨床的に極めて有用なNSAIDsをはじめとする化合物を開発し得る利点を有している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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2005073718.tif 000011
2005073718.tif 000012
2005073718.tif 000013
2005073718.tif 000014