(57)【要約】  本発明は、癌細胞又は癌組織に対するターゲッティング遺伝子を提供すべく誠意検討した結果、正常組織に比べて癌細胞又は癌組織で発現が上昇している新規塩基配列を同定した。さらに検討を重ねた結果、創薬ターゲットとして有用な、癌細胞又は癌組織において発現が上昇している遺伝子を見出して、本発明を完成するに至った。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１から配列番号４のいずれかで示される塩基配列からなるＤＮＡに対するアンチセンスＤＮＡを含有する肺癌の予防及び／又は治療剤。
【請求項２】
配列表の配列番号１から配列番号４のいずれかで示される塩基配列からなるＤＮＡがコードするポリペプチドに対する抗体を含有する肺癌の予防及び／又は治療剤。
【請求項３】
抗体がモノクローナル抗体である請求項２に記載の肺癌の予防および／または治療剤。
【請求項４】
抗体がヒトモノクローナル抗体である請求項２に記載の肺癌の予防および／または治療剤。
【請求項５】
配列表の配列番号５で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項６】
請求項５に記載のＤＮＡを含む組換ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の組換ベクターを含む形質転換体。
【請求項８】
請求項５に記載のＤＮＡによってコードされたポリペプチド。
【請求項９】
請求項５に記載のＤＮＡに対するアンチセンスＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項９に記載のアンチセンスＤＮＡを含有する膵癌の予防及び／又は治療剤。
【請求項１１】
請求項５に記載のＤＮＡによってコードされたポリペプチドに対する抗体。
【請求項１２】
抗体が、モノクローナル抗体である請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
抗体が、ヒトモノクローナル抗体である請求項１１に記載の抗体。
【請求項１４】
請求項１１から１３のいずれかに記載の抗体を含有する膵癌の予防及び／又は治療剤。
【請求項１５】
請求項５に記載のＤＮＡの発現を抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項１６】
請求項５に記載のＤＮＡがコードするポリペプチドの機能を抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項１７】
物質が、膵癌の予防及び／又は治療剤である請求項１５又は１６に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な塩基配列、および、癌関連遺伝子の用途に関する。さらに、癌関連遺伝子を用いる薬剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の診断および治療分野においては、十分な治療効果を得るとともに、治療薬による副作用を低減することを目的として、特定の癌細胞を標的としたターゲッティング療法の研究が行われている。具体的には、癌化した細胞の表面に特異的に発現する抗原を同定し、その抗原に対するモノクローナル抗体を取得し、当該モノクローナル抗体を癌治療薬として用いる方法が挙げられる（非特許文献１または非特許文献２）。【０００３】
近年になって、正常組織に比べて癌細胞または癌組織で発現が上昇している遺伝子の特定が可能となった。そこで、癌の診断または治療のターゲットとなる遺伝子を検索することを目的として、バイオチップアレイに代表される遺伝子発現の網羅的測定装置であるマイクロアレイを用いて、正常組織に比べて癌組織で発現が上昇している遺伝子の探索が行われている。例えばBioExpress（GeneLogic社）を用いて、膵癌で高発現している遺伝子６９例の同定を試みた例（特許公報１）や、肺腺癌で発現変動している遺伝子の同定を試みた例（特許公報２）等が挙げられる。【０００４】
しかしながら、これらの既報告例においては、いずれも癌組織と当該癌組織に対応する正常組織（例えば、膵癌組織に対する膵臓正常組織）との比較を行っているのみで、ターゲットとなりうる遺伝子候補として数十から数百以上の遺伝子が挙げられている。そのため、これらの候補遺伝子のなかから、創薬のターゲットとして有用な遺伝子を選択するのは困難であるという問題点があった。
【特許文献１】WO03／030725号公報
【特許文献２】WO02／86443号公報
【非特許文献１】Vogel C, Cobleigh MA, Eur J Cancer. 2001 Jan;37 Suppl 1:25-29
【非特許文献２】J. Baselga, Clinical trials of Herceptin, Eur. J. Cancer 37 Suppl 1 (2001) S18-24.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、創薬ターゲットとして有用な、新規な塩基配列、および、癌関連遺伝子の用途を提供することにある。さらに、癌関連遺伝子を用いる薬剤のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、創薬ターゲットとして有用な新規な塩基配列を提供すべく誠意検討した結果、正常組織に比べて癌細胞または癌組織で発現が上昇している新規塩基配列を同定した。さらに検討を重ねた結果、創薬ターゲットとして有用な、癌細胞または癌組織において発現が上昇している癌関連遺伝子を見出して、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）配列表の配列番号１から配列番号４のいずれかで示される塩基配列からなるＤＮＡに対するアンチセンスＤＮＡを含有する肺癌の予防および／または治療剤。
（２）配列表の配列番号１から配列番号４のいずれかで示される塩基配列からなるＤＮＡがコードするポリペプチドに対する抗体を含有する肺癌の予防および／または治療剤。
（３）抗体がモノクローナル抗体である上記２に記載の肺癌の予防および／または治療剤。
（４）抗体がヒトモノクローナル抗体である上記２に記載の肺癌の予防および／または治療剤。
（５）配列表の配列番号５で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（６）上記５に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
（７）上記６に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（８）上記５に記載のＤＮＡによってコードされたポリペプチド。
（９）上記５に記載のＤＮＡに対するアンチセンスＤＮＡ。
（１０）上記９に記載のアンチセンスＤＮＡを含有する膵癌の予防および／または治療剤。
（１１）上記５に記載のＤＮＡによってコードされたポリペプチドに対する抗体。
（１２）抗体が、モノクローナル抗体である上記１１に記載の抗体。
（１３）抗体が、ヒトモノクローナル抗体である上記１１に記載の抗体。
（１４）上記１１から１３のいずれかに記載の抗体を含有する膵癌の予防および／または治療剤。
（１５）上記５に記載のＤＮＡの発現を抑制する物質のスクリーニング方法。
（１６）上記５に記載のＤＮＡがコードするポリペプチドの機能を抑制する物質のスクリーニング方法。
（１７）物質が、膵癌の予防および／または治療剤である上記１５または１６に記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、新規な塩基配列、および、創薬ターゲットとして有用な癌関連遺伝子の用途を提供することができる。さらに、癌関連遺伝子を用いる薬剤のスクリーニング方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）ターゲットとなる塩基配列の選択
配列番号１から４の塩基配列は、BioExpress発現プロファイルデータベース(GeneLogic社)および解析ソフトGeneExpressTMExplorer version1.4を用いて、次の手順に従い選択した。【００１０】
まず、正常肺組織、肺腺癌組織または肺腺癌で発現亢進していることが知られているhigh-mobility group protein 4 （HMG4）を高発現している肺腺癌をそれぞれ選択して、それぞれのサンプルセットを作成した。fold change解析（GeneExpressTMExplorer version1.4）によりシグナル値の平均値が正常肺組織に比較して肺腺癌組織で３倍以上亢進していて、かつシグナル値の平均値が50以上である80個の候補プローブを見いだした。同様にシグナル値の平均値が正常肺組織に比べてHMG4高発現肺癌組織で3倍以上亢進していて、かつシグナル値の平均値が50以上である307個の候補プローブを見いだした。【００１１】
また、正常肺組織をより限定するために、患者の一次疾病が肺に関わる症例を除いた正常肺組織サンプルセットを新たに作製した。この正常肺組織サンプルセットに比べて、上記の肺腺癌またはHMG4高発現の肺腺癌で３倍以上発現が亢進していて、かつシグナル値の平均値が50以上である464個の候補プローブを得た。【００１２】
さらに、これらの候補プローブについて、肺以外の正常組織における発現量を確認するために、各種正常組織（乳房、十二指腸、食道、心臓、腎臓、肝臓、筋肉、卵巣、膵臓、皮膚、小腸、大腸、直腸、脾臓、胃、胸腺、子宮頚部、子宮内膜、子宮筋、前立腺、リンパ節、リンパ球、白血球）における発現を解析した。候補プローブの中でこれら各種正常組織のうち生殖組織を除いて、少なくとも１つにおける発現が、肺腺癌よりも高値を示すプローブを除外した。これにより上記の80プローブから4プローブ、307プローブから145プローブ、464プローブから23プローブを選択した。【００１３】
さらにこれらの候補のうち、SOSUI(Bioinformatics, 14(4),378-379 (1998))およびTMHMM(Journal of Molecular Biology, 305(3):567-580 (2001))により２次構造予測および膜貫通部位予測を行った。その結果、膜タンパク質の可能性のある候補遺伝子であるsimilar to monocarboxylate transporter 4（Probe  Set ID: 238029_s_at）配列番号１および２並びにhypothetical protein（同: 227804_at）配列番号３を得た。また、アミノ酸配列の未知のESTs（同: 241031_at）配列番号４を得た。さらに、配列番号１、２および３にそれぞれ対応する配列番号６、７および８のアミノ酸配列を得た。【００１４】
配列番号１および２のsimilar to monocarboxylate transporter 4（238029_s_at）に関しては、前立腺癌（WO0160860  Millenium Predictive Medicine社）で発現が上昇するという報告があるが、肺癌細胞または組織において発現が上昇するという報告はこれまでにない。  【００１５】
配列番号３のhypothetical protein（227804_at）に関しては、癌細胞または癌組織において発現が上昇するという報告はこれまでになく、肺癌細胞または組織において発現が上昇するという報告もない。【００１６】
配列番号４のESTs（同: 241031_at）に関しては、癌細胞または癌組織において発現が上昇するという報告はこれまでになく、肺癌細胞または組織において発現が上昇するという報告もない。【００１７】
配列番号５の塩基配列は、次の手順に従い選択した。【００１８】
正常膵組織のうち一次疾病が膵臓に関わる症例を除いたサンプルセットおよび膵管癌のサンプルセットをそれぞれ作成して、signature differential解析により発現陽性率が膵管癌組織で70%以上、かつ正常膵組織で30%以下であるプローブ約2700個を得た。さらに、これらのプローブについて、膵臓以外の正常組織（膀胱、乳房、十二指腸、食道、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、前立腺、唾液腺、皮膚、小腸、大腸、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、子宮内膜、リンパ節、リンパ球、白血球）における発現を解析した。候補プローブの中でこれら正常組織のうち生殖組織を除いて、少なくとも１つにおける発現が、膵管癌よりも高値を示すプローブを除外し42プローブを得た。この中から、機能未知であるESTs（229479_at）を見いだした。【００１９】
このESTs（229479_at）は、これまでに大腸癌（WO0122920号公報）や乳癌（WO0078960 号公報およびWO0259271号公報）において、発現が上昇することが知られているが、膵癌での発現上昇はこれまで報告されていない。
該ＥＳＴ（229479_at）に関して、ＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓデータベース中のアノテーションを用いて、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＰｒｏｂｅＳｅｔ ＩＤ ２２９４７９＿ａｔに対応する遺伝子のＵｎｉＧｅｎｅデータベース（ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３１（１），２８−３３（２００３））の登録番号を調べた。その結果、登録番号Ｈｓ．１５２８１２が、該ＥＳＴ（229479_at）に対応するＥＳＴクラスタの登録番号であることがわかった。ＵｎｉＧｅｎｅデータベースを閲覧し、公共データベースに登録されているＨｓ．１５２８１２クラスタに属するＥＳＴは、ＧｅｎＢａｎｋ登録記号ＡＩ５３８６３２、ＡＡ５１３０９６、ＡＩ７３９１３２、ＡＩ１２３７１７、ＡＩ７４０５１６、ＡＩ４６７８５２、ＡＩ７４１３７６、ＡＷ０４４２１１、ＡＡ６３１２５７、ＡＡ４６４５１０、ＢＱ００２３４１、ＡＷ９７２４６７、ＡＷ２０５５１０、ＡＷ０２８８８９、ＡＷ１９８０３３、ＡＷ０６８９３５、ＡＩ７５４５５１、ＡＩ７５２２４０および ＣＢ０４４９９０であることがわかった。これらのＥＳＴ群の塩基配列中には、ｐｏｌｙＡ配列が付加された塩基配列が含まれていた。  また、ＥＳＴ群の染色体上の位置は、２番染色体の２ｑ３５であることがわかった。【００２０】
ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．， ｅｔ ａｌ．, Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，２１５,４０３−４１０（１９９０））を用いてＧｅｎＢａｎｋ登録記号ＡＩ７４０５１６の示す塩基配列の相同性検索をした結果、特許配列データベース（ＧｅｎｅＳｅｑ）の塩基配列データベース（ｎａｇｅｎｅｓｅｑ）中の登録記号ＡＡＨ３４７３１の示す塩基配列が５９１塩基にわたり１００％の一致度でヒットし、登録記号ＡＢＴ１０４８８の示す塩基配列が５７２塩基にわたり９８％の一致度でヒットした。【００２１】
更に、ＢＬＡＳＴを用いて登録記号ＡＡＨ３４７３１の示す塩基配列について相同性検索した結果、特許配列データベース（ＧｅｎｅＳｅｑ）の塩基配列データベース（ｎａｇｅｎｅｓｅｑ）中の登録記号ＡＡＦ４４９５２の示す塩基配列が２２５塩基にわたり１００％の一致度で、登録記号ＡＢＬ８２４８９の示す塩基配列が３５３塩基にわたり９９％の一致度でヒットした。【００２２】
更に、ＢＬＡＳＴを用いて登録記号ＡＡＦ４４９５２の示す塩基配列について相同性検索をした結果、特許配列データベース（ＧｅｎｅＳｅｑ）の塩基配列データベース（ｎａｇｅｎｅｓｅｑ）中の登録記号ＣＢ０４４９９１の示す塩基配列が８０塩基にわたり１００％の一致度でヒットし、登録記号ＣＢ０４５３６７の示す塩基配列が３１８塩基にわたり１００％の一致度でヒットした。【００２３】
ＧｅｎＢａｎｋ登録記号ＡＩ５３８６３２、ＡＡ５１３０９６、ＡＩ７３９１３２、ＡＩ１２３７１７、ＡＩ７４０５１６、ＡＩ４６７８５２、ＡＩ７４１３７６、ＡＷ０４４２１１、ＡＡ６３１２５７、ＡＡ４６４５１０、ＢＱ００２３４１、ＡＷ９７２４６７、ＡＷ２０５５１０、ＡＷ０２８８８９、ＡＷ１９８０３３、ＡＷ０６８９３５、ＡＩ７５４５５１、ＡＩ７５２２４０、ＣＢ０４４９９０、ＣＢ０４５３６７およびＣＢ０４４９９１と、特許配列データベース（ＧｅｎｅＳｅｑ）の塩基配列データベース（ｎａｇｅｎｅｓｅｑ）中の登録記号ＡＡＨ３４７３１、ＡＢＴ１０４８８およびＡＡＦ４４９５２の塩基配列それぞれを、ｃＤＮＡ塩基配列をゲノム塩基配列へ写像するソフトウェアｓｉｍ４（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，８，９６７−９７４（１９９８））を用いて、ヒトゲノム塩基配列ＮＣＢＩ ｂｕｉｌｄ３１の２番染色体の配列にマッピングした。その結果、２番染色体のＧｅｎＢａｎｋ登録記号ＡＣ０９３８５０のコンティグの塩基配列に上記のすべてのＥＳＴ群の塩基配列がマッピングされた。
ＧｅｎＢａｎｋ登録記号ＣＢ０４４９９１とＣＢ０４４９９０の示す塩基配列は、Ｉ.Ｍ.Ａ.Ｇ.Ｅ.コンソーシアムにおけるクローンの登録記号３２１８１６０の示す塩基配列の５’末端と３’末端からの塩基配列にそれぞれ対応した。登録記号ＣＢ０４４９９１の示す塩基配列は１つのスプライス部位を持ちイントロンを挟んでマッピングされ、ＣＢ０４４９９０の示す塩基配列はスプライス部位を持たない形でマッピングされた。２つの塩基配列にマッピング上の重なりは無く、お互いに１０２７塩基のゲノム上の隔たりをもって２９００塩基にわたってマッピングされた。登録記号ＣＢ０４４９９１の示す塩基配列は、３’末端側において登録記号ＡＡＦ４４９５２の示す塩基配列と重なる領域を持ってマッピングされた。登録記号ＡＡＦ４４９５２の示す塩基配列は、３’末端側において登録記号ＡＡＨ３４７３１と重なる領域を持ってマッピングされた。登録記号ＡＡＨ３４７３１の示す塩基配列は、登録記号ＡＢＴ１０４８８、ＡＢＬ８２４８９、ＣＢ０４５３６７、ＡＩ５３８６３２、ＡＡ５１３０９６、ＡＩ７３９１３２、ＡＩ１２３７１７、ＡＩ７４０５１６、ＡＩ４６７８５２、ＡＩ７４１３７６、ＡＷ０４４２１１、ＡＡ６３１２５７、ＡＡ４６４５１０、ＢＱ００２３４１、ＡＷ９７２４６７、ＡＷ２０５５１０、ＡＷ０２８８８９、ＡＷ１９８０３３、ＡＷ０６８９３５、ＡＩ７５４５５１、ＡＩ７５２２４０およびＣＢ０４４９９０と重なる領域を持ってマッピングされた。これらの中で、ＣＢ０４４９９１が最も５’末端側の塩基配列であることがわかった。【００２４】
更に、ＢＬＡＳＴを用いて登録記号ＣＢ０４４９９１の示す塩基配列の相同性検索を行ったところ、登録記号ＣＢ０４４９９１の示す配列と５’末端側で重なる塩基配列は検出されなかった。したがって、登録記号ＣＢ０４４９９１の示す塩基配列が現在までに、公共データベースおよび特許配列データベースに登録されている該遺伝子の配列の最も５’末端側の塩基配列であると考えられた。【００２５】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＰｒｏｂｅＳｅｔＩＤ ２２９４７９＿ａｔのプローブの塩基配列を、ＮｅｔＡｆｆｙｘデータベース （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３１（１），８２−８６（２００３））を用いて調べた。ｓｉｍ４を用いて該プローブの塩基配列をＡＣ０９３８５０のコンティグ配列に対してマッピングした結果、該プローブの塩基配列は、上記ＥＳＴ群がマッピングされた領域の内の３’末端側の約５００塩基の領域にマッピングされることがわかった。【００２６】
ゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋデータベース登録記号ＡＣ０９３８５０）の塩基番号２００００番から２３１００番の配列とＧｅｎＢａｎｋ登録記号ＡＩ５３８６３２、ＡＡ５１３０９６、ＡＩ７３９１３２、ＡＩ１２３７１７、ＡＩ７４０５１６、ＡＩ４６７８５２、ＡＩ７４１３７６、ＡＷ０４４２１１、ＡＡ６３１２５７、ＡＡ４６４５１０、ＢＱ００２３４１、ＡＷ９７２４６７、ＡＷ２０５５１０、ＡＷ０２８８８９、ＡＷ１９８０３３、ＡＷ０６８９３５、ＡＩ７５４５５１、ＡＩ７５２２４０、ＣＢ０４４９９０、ＣＢ０４５３６７およびＣＢ０４４９９１と、特許配列データベース（ＧｅｎｅＳｅｑ）の塩基配列データベース（ｎａｇｅｎｅｓｅｑ）中の登録記号ＡＡＨ３４７３１、ＡＢＴ１０４８８およびＡＡＦ４４９５２の示す塩基配列をＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ社製ＳｅｑＭａｎプログラムでクラスタリングし、最も長い仮想ＥＳＴの塩基配列をＧｅｎＢａｎｋデータベース登録記号ＡＣ０９３８５０の塩基配列を基にして配列番号５の新規塩基配列を取得した。【００２７】
配列番号５の新規塩基配列が、膵癌細胞または組織において発現が上昇するという報告はない。【００２８】
配列番号５の塩基配列は、全長で２１８４塩基からなり、上記のｓｉｍ４によるマッピングの結果と合わせて考察した結果、２２０番目の塩基と２２１番目の塩基の間がスプライス部位であり、非成熟なｍＲＮＡではこの間にイントロンの塩基配列が存在することが考えられた。【００２９】
ｇｅｎｅｗｉｓｅプログラム（ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｗｉｓｅ２／）を用いて、配列番号５の塩基配列を蛋白質プロファイルデータベースＰｆａｍ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０（１），２７６−２８０（２００２））に対して検索を行ったが、蛋白質機能ドメインのプロファイルは検出されなかった。【００３０】
該配列に関して、オープンリーディングフレームをＮＣＢＩ ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｇｏｒｆ．ｈｔｍｌ）を用いて調査した結果、最大のオープンリーディングフレームの塩基数は１７７塩基であった。３００塩基以上のオープンリーディングフレームが検出されなかった理由として、これまで公共データベースおよび特許配列データベースに登録されているＥＳＴの塩基配列がｍＲＮＡの中の３’末端側非翻訳領域であること、実際の配列に変異やフレームシフト等が生じた配列が登録されていること、該遺伝子が１００アミノ酸残基以下のペプチドをコードする遺伝子またはＲＮＡの形で機能する遺伝子であること等が考えられた。
（２）塩基配列およびＤＮＡ
本発明において、配列表の配列番号１から配列番号５のいずれかで示される塩基配列からなるＤＮＡとは、当該塩基配列で示されるＤＮＡの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡを含有するものである。また、本発明においては、配列表の配列番号１から配列番号５のいずれかで示される塩基配列、または、当該塩基配列で示されるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列について、塩基配列等と略することもある。【００３１】
本発明においてストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列とは、配列番号１から５で表される塩基配列の相補鎖と約８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するものである。ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd (J.  Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)に記載の方法などに従って行うことが出来る。ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９から４０ｍＭ、好ましくは１９から２０ｍＭで、温度が約５０から７０℃、好ましくは約６０℃から６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が６５℃の場合がもっとも好ましい。【００３２】
なお、本発明の塩基配列は、配列番号１から５で表される塩基配列と５０％以上の同一性が認められる配列を含む。好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列を含有するものである。  また、本発明の塩基配列は、配列番号１から５で表される塩基配列に塩基が挿入、欠失若しくは置換した塩基配列を含む。ここで、挿入、欠失若しくは置換した塩基配列の数としては１塩基または２塩基以上が挙げられ、例えば１塩基から３０塩基、好ましくは１塩基から１０塩基、より好ましくは１塩基から５塩基が挙げられる。この場合において、塩基が挿入、欠失若しくは置換していても配列番号１から５のぞれぞれと同等の作用または機能を示す塩基配列である場合が挙げられる。
（３）組換えベクターおよび形質転換体
本発明において使用される組換えベクターとは、大腸菌（Escherichia coli）のような原核細胞において発現可能なベクター（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１１９またはこれらの派生物）であってもよいが、真核生物において発現可能なベクターが好ましく、哺乳動物由来の細胞において発現可能なベクターとしては、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（Invitrogen社）のようなプラスミドベクター、ｐＤＯＮ−ＡＩ ＤＮＡ（宝バイオ社）などのウイルスベクターを挙げることができる。【００３３】
本発明の組換えベクターは、これらの組換えベクターに、常法により、本発明の塩基配列を有するＤＮＡの全部又は一部が組換えられたものである。【００３４】
本発明において形質転換体とは、本発明の組換えベクターを含む形質転換体を示す。形質転換体としては、大腸菌のような原核細胞であってもよいが、真核細胞が好ましく、哺乳動物由来の細胞がより好ましい。哺乳動物由来の細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）などを挙げることができる。
（４）ポリペプチド
本発明においてポリペプチドとは、例えば、配列番号５で表される塩基配列等からなる遺伝子が転写、翻訳されることにより生成するものが挙げられる。  最も好ましくは、配列番号５で表される塩基配列からなる遺伝子が転写、翻訳されることにより生成するポリペプチドが挙げられるが、１個または２個以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはそれらを組合わせたアミノ酸配列を有するポリペプチドなどが含まれる。上記のように、アミノ酸が挿入、欠失または置換されれている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、特に限定されない。
（５）アンチセンスＤＮＡ
本発明においてアンチセンスＤＮＡとは、配列表の配列番号１から５のいずれかで示される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるポリペプチドの機能を抑制することができる塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。本発明におけるアンチセンスＤＮＡは、アンチセンスＤＮＡが本発明のＤＮＡに相補的に結合し、本発明のＤＮＡの発現を抑制することができるので、癌の予防および／または治療剤として使用することができる。
（６）抗体
本発明において抗体とは、各種動物のポリクロ−ナル抗体、および、各種動物のモノクローナル抗体が挙げられる。【００３５】
モノクローナル抗体としては、マウスモノクロ−ナル抗体、ヒト−マウスキメラ抗体またはヒト型モノクロ−ナル抗体およびヒトモノクローナル抗体が挙げられるが、好ましくはヒトモノクロ−ナル抗体が挙げられる。さらに好ましくは癌反応性のヒトモノクロ−ナル抗体が挙げられる。さらに、モノクローナル抗体としては、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体のフラグメント、Ｆ（ａｂ'）2化抗体、Ｆａｂ化抗体、短鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、トライボディ（Ｔｒｉｂｏｄｉｅｓ）およびミニボディ（Ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）を含むものとする。定常領域を含む場合においては、重鎖および軽鎖の定常領域のアミノ酸配列は、Nucleic Acids Research vol.14, p1779, 1986、The Journal of Biological Chemistry vol.257, p1516, 1982 およびCell vol.22, p197, 1980 に記載のものが好ましい。また、本発明において抗体とは、ホール抗体（全長抗体、抗体全体）、抗体断片（抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ’)2、scFv（一本鎖抗体））または抗体誘導体が挙げられ、より好ましくはＦ(ａｂ’)2化抗体が挙げられる。
（７）スクリーニング方法
本発明は、配列表の配列番号１から配列番号４のいずれかで示される塩基配列からなるＤＮＡの発現を抑制する肺癌の予防および／または治療剤のスクリーニング方法を提供することができる。また、本発明は、配列表の配列番号５で示される塩基配列からなるＤＮＡの発現を抑制する物質のスクリーニング方法を提供することができる。ここで、物質としては、癌の予防および／または治療剤が挙げられ、好ましくは膵癌の予防および／または治療剤が挙げられる。スクリーニング方法としては、本発明の塩基配列等と被検物質の結合を基準としてスクリーニングを行うことができる。本発明の塩基配列等と被検物質の結合は、いずれか一方を固相に固定し、他方を標識しておくことによって容易に検出することができる。したがって、例えば支持体上に合成されたコンビナトリアルライブラリーを用いる手法は、本発明のスクリーニングに好適である。この場合、蛍光標識した本発明の塩基配列等を反応させることにより、両者の結合を容易に検出することができる。【００３６】
本発明は、配列表の配列番号１から配列番号４のいずれかで示される塩基配列からなるＤＮＡがコードするポリペプチドの機能を抑制する肺癌の予防および／または治療剤のスクリーニング方法を提供することができる。また、本発明は、配列表の配列番号５で示される塩基配列からなるＤＮＡがコードするポリペプチドの機能を抑制する物質のスクリーニング方法を提供することができる。スクリーニング方法としては、本発明のＤＮＡがコードするポリペプチドと被検物質の結合を基準としてスクリーニングを行うことができる。本発明のＤＮＡがコードするポリペプチドと被検物質の結合は、いずれか一方を固相に固定し、他方を標識しておくことによって容易に検出することができる。したがって、例えば支持体上に合成されたコンビナトリアルライブラリーを用いる手法は、本発明のスクリーニングに好適である。この場合、本発明のＤＮＡがコードするポリペプチドを蛍光標識させ、被検物質と反応させることにより、両者の結合を容易に検出することができる。【００３７】
本発明のスクリーニング方法により得られる肺癌の予防および／または治療剤、および、物質としては、低分子化合物や高分子化合物が挙げられる。【００３８】
高分子化合物としては、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはリガンドなどが挙げられ、好ましくは、リガンドが挙げられる。【００３９】
本発明におけるリガンドとは、ターゲット細胞またはターゲット分子に結合するものが挙げられる。ここで、ターゲット細胞とは、例えば癌細胞、癌組織の血管内皮細胞、癌組織の間質細胞等が挙げられる。また、ターゲット分子とは、ターゲット細胞の細胞質内の分子、核内の分子、あるいは細胞表面の分子等いかなる分子でも良いが、好ましくは細胞表面の分子である。ターゲット分子の別の形態として、細胞から放出された分子が挙げられる。例えば、癌細胞や癌組織の間質細胞の分泌物や構築物が挙げられ、具体的には腫瘍マーカーや細胞間の構造物等が挙げられる。さらに詳しくは、リガンドとは、上記の通りターゲット細胞またはターゲット分子に結合するものであって、例えば、抗体、線維芽細胞成長因子（FGF）、上皮細胞成長因子（EGF）等の成長因子または増殖因子等のタンパク質が挙げられるが、好ましくは抗体が挙げられる。【００４０】
また、リガンドは、本発明のポリペプチドを特異的に認識することができるので、予防および／または治療剤として用いる以外にも、被検液中の本発明のポリペプチドの定量、例えばサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。また、本発明のポリペプチドを生成するために使用する抗体カラムの作成、精製時における各分画中の本発明ポリペプチドの検出、被検細胞内における本発明ポリペプチドの挙動の分析などに使用することもできる。
（８）製剤化および投与量
本発明におけるアンチセンスＤＮＡを癌の予防および／又治療剤として用いる場合には、公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。例えば、該アンチセンスＤＮＡを用いる場合、該アンチセンスＤＮＡをレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、または、該アンチセンスＤＮＡ単独をそれぞれ公知の方法に従い、ヒトまたは哺乳動物(例えば、ラット、ウサギなど)に対して経口的または非経口的に投与することができる。本発明のアンチセンスＤＮＡのヒトに対する投与量は０．０１ｍｇ/ｍｌ〜０．１ｍｇ/ｍｌが挙げられる。【００４１】
本発明における抗体を癌の予防および／または治療剤として用いる場合には、公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。例えば、そのまま液剤としてまたは適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳類に対して経口的または非経口的に投与することができる。本発明における抗体のヒトに対する投与量は０．０１ｍｇ/ｋｇ〜１．０ｍｇ/ｋｇが挙げられる。【００４２】
本発明における低分子化合物を癌の予防および／または治療剤として用いる場合には、公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。例えば、液剤、錠剤、カプセル剤などの適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳類に対して経口的または非経口的に投与することができる。本発明における低分子化合物のヒトに対する投与量は０．５〜３００ｍｇ/ｋｇ体重であり、一日あたり１回あるいはそれ以上投与することができる。【００４３】
投与量は年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与時間、投与方法、排泄速度、薬物の組合せ、患者のその時に治療を行っている病状の程度に応じ、それらあるいはその他の要因を考慮して決められる。【００４４】
経口投与に適した医薬組成物としては、例えば、錠剤、カプセル剤、粉剤、液剤、エリキシル剤等を挙げることができ、非経口投与に適した医薬組成物としては、例えば、液剤あるいは懸濁化剤等の殺菌した液状の形態の医薬組成物を例示することができる。【００４５】
その他、癌の予防および／または治療剤としては、例えば、遺伝子治療キットが挙げられる。本発明において遺伝子治療キットとは、肺癌細胞または膵癌細胞の殺傷に使用するためのキットであり、癌の処置に使用するための治療キットである。該遺伝子治療キットは、適切な容器、動物細胞において配列番号１から５のいずれかの塩基配列等のアンチセンスＤＮＡを発現し得る組換えベクターの薬学的処方物およびＤＮＡ損傷剤の薬学的処方物を含む。ここで、組換えベクターおよびＤＮＡ損傷剤は、単一の容器内に存在し得るか、異なるまたは分かれた容器中に提供され得る。例えば、組換えベクターは、アデノウイルス粒子内に該アンチセンスＤＮＡが存在する組換えアデノウイルスベクターであり、そしてＤＮＡ損傷剤はシスプラチンであることが挙げられる。キットの成分は、好ましくは液体溶液または乾燥粉末として提供される。成分が液体溶液で提供される場合、液体溶液は水溶液であり、滅菌水溶液が特に好ましい。試薬または成分が乾燥粉末として提供される場合、粉末は適切な溶媒の添加により再構成され得る。溶媒もまた別の容器手段において提供され得ることが想像される。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（１）使用細胞株
遺伝子発現解析には、肺癌由来のPC-3（株式会社免疫生物研究所）、NCI-H522（ATCC No.CRL-5810）、A549（ATCC No.CRL-185）、膵癌由来のHPAC（ATCC No. CRL-2119）、PANC-1（ATCC No.CRL1469）、SUIT-2（国立病院九州ガンセンターより入手）、乳癌由来のMCF7（ATCC No.HTB-22）、大腸癌由来のHCT-15（ATCC No.CCL-225）、 HCT-116（ATCC No.CCL-247）、細網肉腫由来のU937（ATCC No. CRL-1593.2）、繊維芽細胞由来のVA-13（ATCC No.CCL-75.1）などの細胞株を使用する。
（２）癌細胞株からのRNA抽出および逆転写反応
各種細胞株からのTotal RNA抽出はトリゾル試薬（インビトロジェン社）を用い、添付マニュアルに従って実施する。RNase-free DNase I（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて、Total RNAを37度で15分間処理する。その後、1/10容量の3M NaOAcおよび2.5倍容のエタノールを用いて、エタノール沈殿によりTotal RNAを濃縮・回収した。Total RNA (200 ng)の逆転写反応は、オリゴdTまたはランダムヘキサマーをプライマーとして、インビトロジェン社のスーパースクリプトII逆転写酵素を用いて、添付マニュアルにしたがって実施する。
（３）PCR法
逆転写反応により合成した各種細胞株由来cDNA 10 ngを鋳型として、PCR反応を実施する。【００４７】
PCR反応条件は、96℃で2分間処理した後、(96℃、 30秒)、(60℃、 30秒)、(72℃、1分) を1サイクルとしたものを35サイクル行い、その後4℃とする。    
PCR解析に供したプライマー配列は、配列番号１および２に対しては配列番号９および１０、配列番号5に対しては配列番号１１および１２をそれぞれ用いる。
（４）ノーザン解析
ノーザン解析には各種細胞株から抽出したTotal RNAまたはpoly-A RNAを用いる。Total RNAからのpoly-A RNAの精製は、タカラバイオ社のOligotex-dT30<Super>mRNA purification kitを用いて行う。【００４８】
ノーザン解析のための一連の操作（アガロース電気泳動法、ナイロンメンブレンへのキャピラリー・トランスファー法、ジゴキシゲニン（DIG）ラベルしたRNAプローブやDNAプローブの作製方法、ハイブリダイゼーション・洗浄方法、化学発光検出法）は、ロッシュ・ダイアグノスティックス社が作成したDIGアプリケーションマニュアルに従って行う。具体的には、各種細胞株由来のTotal RNA 1μgおよびpoly-A RNA 100 ngをMOPSバッファー、脱イオン化フォルムアミド、フォルムアルデヒド、ローディングバッファー、エチジウムブロマイドと混和し、65℃で10分間処理して変性させる。その後、1%アガロースを含む変性ゲルに添加して、RNA分子量マーカーと共に電気泳動（100 V、約１時間）を行う。ゲルを20 x SSCバッファー中で15分間の洗浄を2回行った後、ポジティブチャージのナイロンメンブレン（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）へキャピラリートランスファーする（16時間）。メンブレンをUVクロスリンク（120 mJ）し、風乾させた後、5 mlのハイブリダイゼーションバッファー（DIG Easy Hyb、ロッシュ・ダイアグノスティックス社）中で68℃、1時間のプレハイブリダイゼーションを行い、20-100 ng/ml RNAプローブを用いて68℃で一晩のハイブリダイゼーションを行う。なお、配列番号１（MCT4-like protein）および配列番号５（膵癌Est, 229479_at） のmRNAを検出するためのRNAプローブには、配列番号１の塩基配列のうち5’末端から数えて2715番目から3457番目のantisense RNA (743 bp)、および配列番号５の塩基配列のうち5’末端から数えて1312番目から2036番目のantisense RNA (725 bp)をそれぞれ用いる。【００４９】
ハイブリダイゼーション後、メンブレンを高ストリンジェンシーバッファー（2 x SSC, 0.1% SDS）で室温で5分間の洗浄を2回行う。その後、低ストリンジェンシーバッファー（0.1 x SSC, 0.1% SDS）で68℃で15分間の洗浄を2回行う。ハイブリダイゼーション後のメンブレンのブロッキングや洗浄は、DIG Wash and Block Buffer Setおよび抗DIG-アルカリフォスファタ−ゼ（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて実施する。また、化学発光検出のための基質にはCDP-Star（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）を、検出器にはLAS2000（FUJIFILM社）を用いる。
（５）遺伝子産物に対する抗血清の作成
配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡがコードするアミノ酸配列（以下、「ＭＣＴ１４」と記載することもある）のうち、Ｃ末端側の１８アミノ酸の配列（配列表の配列番号１４）のペプチドをＫｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）に結合させてウサギに免疫し、抗血清を取得した。【００５０】
抗ＭＣＴ１４ペプチド抗体は、当該のペプチドをＣＮＢｒセファロース（アマシャムバイオサイエンス社）に固定化したアフィニティカラムを用いて当該抗血清を精製して取得した。
（６）抗血清を用いた遺伝子産物の検出・ウエスタンブロッティング
６―１）ＭＣＴ14遺伝子発現ベクターの作成
配列表の配列番号１の配列情報からＰＣＲ用プライマーを設計し、ヒト癌細胞株、ＮＣＩ−Ｈ５２２（肺癌株）ＨＣＴ−１５ （大腸癌株）ＭＣＦ−７ （乳癌株）のｃＤＮＡを鋳型として上記記載の方法に従い、ＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ産物をＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）にクローニングして配列を確認し、いずれのクローンも配列表の配列番号１に一致することを確認した。さらにこのベクターからＭＣＴ１４遺伝子産物にｃ−ｍｙｃが付加される発現ベクターを作成した。
６−２）一過性発現細胞の作成および抗ＭＣＴ１４ペプチド抗体の反応性の確認
ＣＯＳ−７細胞にｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（インビトロジェン社）を用いて発現ベクターをトランスフェクトし、２４時間後に細胞を回収した。  その後、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％Ｂｒｉｊ９７、２．５ｍＭヨード酢酸アミド、プロテアーゼインヒビターとしてコンプリート（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を含むバッファーで可溶化した上清を得た。この可溶化上清をアセトン沈殿し、沈殿したタンパクを、８Ｍ ｕｒｅａおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーで溶解し、当該サンプルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロッティング操作を行った。各可溶化上清に含まれるタンパク濃度は予めＢＣＡプロテインアッセイキット（ピアース社）で測定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥへのタンパクアプライ量は一定にした。【００５１】
ブロッティング後、０．１％ゼラチンと０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳでブロッキングした。【００５２】
まずＭＣＴ１４の遺伝子産物が発現されていること確認するために抗ｃ−ｍｙｃモノクローナル抗体（インビトロジェン社）の１０００倍希釈溶液中で室温１時間反応させ、続いてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（ＤＡＫＯ社）の１０００倍希釈溶液中で室温１時間反応させた。また、ＭＣＴ１４遺伝子産物に抗ＭＣＴ１４ペプチド抗体が反応することを確認するために、抗ＭＣＴ１４ペプチド抗体３μｇ／ｍｌで室温１時間反応させた後、１０００倍希釈した抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ標識体（カペル社）中で室温１時間反応させた。【００５３】
バンドの検出はＥＣＬ（アマシャムバイオサイエンス社）を用いて行った。【００５４】
ペプチドによる競合実験は、抗ＭＣＴ１４ペプチド抗体３μｇ／ｍｌの溶液に対して、配列表の配列番号１４のペプチドを、最終濃度が１μｇ／ｍｌまたは５μｇ／ｍｌになるように混合し、４℃にて一晩インキュベーションしたものを１次抗体として用いて反応させ、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧで検出した。【００５５】
レーン１には、MCT14遺伝子を導入した細胞の可溶化上清を泳動した。その後、ノーマルウサギIgGでバンドの有無を検出した。レーン２には、遺伝子導入していない細胞（Mock細胞）の可溶化上清を泳動した。その後、ノーマルウサギIgGでバンドの有無を検出した。レーン３には、MCT14遺伝子を導入した細胞の可溶化上清を泳動した。その後、抗MCT14ペプチド抗体でバンドの有無を検出した。レーン４には、Mock細胞の可溶化上清を泳動した。その後、抗MCT14ペプチド抗体でバンドの有無を検出した。レーン５には、MCT14遺伝子を導入した細胞の可溶化上清を泳動した。その後、抗MCT14ペプチド抗体に配列表の配列番号１４のペプチドを最終濃度１μg/mlの濃度で添加して予めインキュベートしたものでバンドの有無を検出した。レーン６には、Mock細胞の可溶化上清を泳動した。その後、抗MCT14ペプチド抗体に配列表の配列番号１４のペプチドを最終濃度１μg/mlの濃度で添加して予めインキュベートしたものでバンドの有無を検出した。レーン７には、MCT14遺伝子を導入した細胞の可溶化上清を泳動した。その後、抗MCT14ペプチド抗体に配列表の配列番号１４のペプチドを最終濃度５μg/mlの濃度で添加して予めインキュベートしたものでバンドの有無を検出した。レーン８には、Mock細胞の可溶化上清を泳動した。その後、抗MCT14ペプチド抗体に配列表の配列番号１４のペプチドを最終濃度５μg/mlの濃度で添加して予めインキュベートしたものでバンドの有無を検出した。レーン９には、MCT14遺伝子を導入した細胞の可溶化上清を泳動した。その後、抗c-myc抗体でバンドの有無を検出した。【００５６】
その結果、約５０ｋＤａの位置に抗ｃ−ｍｙｃ抗体に反応するバンドが検出され（レーン９）、ＣＯＳ７細胞でＭＣＴ１４が発現されていることを確認した。また、このＭＣＴ１４遺伝子産物に対して抗ＭＣＴ１４ペプチド抗体が反応性を示すことが確認された。(レーン３)  また、この反応はペプチドにより競合されることから(レーン５、７)、ＭＣＴ１４遺伝子産物に対して特異的な反応であることが示された。
６‐３）各種癌細胞株でのＭＣＴ１４タンパク発現
ヒト肺癌細胞株ＢＴ４７４（ＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓシグナル値：１２４３）、肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ４６０（同：１０１５）、前立腺癌細胞株ＬＮＣＡＰ（同：５３５）、肺癌細胞株Ａ５４９（同：４８）それぞれを、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， １ｍＭ ＥＤＴＡ， １％Ｂｒｉｊ９７、２．５ｍＭヨード酢酸アミド、および、プロテアーゼインヒビターとしてコンプリート（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）を含むバッファーで可溶化した上清を調製した。この可溶化上清をアセトン沈殿し、沈殿したタンパクを８Ｍ ｕｒｅａおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーで溶解し、当該サンプルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロッティング操作を行った。各可溶化上清のタンパク濃度は予めＢＣＡプロテインアッセイキット（ピアース社）で測定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのタンパクアプライ量は一定にした。ブロッティング後の膜を０．１％ゼラチンと０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳでブロッキングし、抗ＭＣＴ１４ペプチド抗体３μｇ／ｍｌ中で室温１時間反応させた後、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧの１０００倍希釈溶液中で室温１時間反応させた。バンドの検出はＥＣＬで行った。【００５７】
レーン１には、MCT14遺伝子を導入していないCOS7細胞の可溶化上清を泳動した。レーン２には、MCT14遺伝子を導入したCOS7細胞の可溶化上清を泳動した。レーン３には、BT474細胞の可溶化上清を泳動した。レーン４には、NCI-H460細胞の可溶化上清を泳動した。レーン５には、LNCAP細胞の可溶化上清を泳動した。レーン６には、A549細胞の可溶化上清を泳動した。【００５８】
その結果、ＣＯＳ７で一過性発現させて検出されたバンド位置と同じ位置に、バンドが検出され、本発明にかかる塩基配列からなるＤＮＡが、癌細胞内でポリペプチドとして発現していることが明らかになった。さらに、ＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓでのシグナル値が高いものほど、濃いバンドが検出された。そのため、ＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓでのシグナル値とバンドの濃さは相関しており、本発明にかかる塩基配列からなるＤＮＡは創薬ターゲットとして実際に利用可能であることが明らかになった。
（７）抗血清を用いた遺伝子産物の検出・免疫組織染色
癌および正常組織の凍結、若しくはパラフィン包埋切片の内因性ペルオキシダーゼを阻害するために、3.0%H2O2・MeOH法（30%過酸化水素水15ml＋メタノール135ml）で室温25分間処理する。0.1%Tween20を含む0.05M TBSで5分間ずつ３回洗浄した後、ブロッキングのために5%正常ヤギ血清で室温40分間インキュベートする。１次抗体として各遺伝子産物に対する抗血清を室温で90分反応させて0.1%Tween20を含む0.05M TBSで5分間ずつ３回洗浄する。次に2次抗体反応として、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgGを室温30分反応させ、0.1%Tween20を含む0.05M TBSにより氷上で5分間ずつ３回洗浄、さらに0.05M TBSで氷上5分間ずつ3回洗浄する。DABを用いて発色後、流水水洗し、脱水・透徹・封入して検鏡する。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明によれば、新規な塩基配列、および、創薬ターゲットとして有用な癌関連遺伝子の用途を提供することができる。【００６０】
なお、本出願は、日本特許出願  特願２００４−１０２６８１号を優先権主張して出願されたものである。
【配列表】
2005094900000001.app
【国際調査報告】
2005094900.tif 000002
2005094900.tif 000003
2005094900.tif 000004
2005094900.tif 000005
2005094900.tif 000006
2005094900.tif 000007
2005094900.tif 000008
2005094900.tif 000009