(57)【要約】種々の増殖因子との結合作用、神経突起伸長促進作用および抗凝血作用を有する、新規コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖を提供し、さらに神経性疾患治療用組成物を提供する。  新規コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖を硬骨魚類以外の魚類体より分離・精製した。サメ皮を用いた場合、該ハイブリッド鎖の平均分子量は６５〜７５ｋＤａで、硫酸化度が二糖１分子当たり０．７以上１．２０未満の範囲内であり、かつＧｌｃＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）の二糖を含む。該ハイブリッド鎖が、種々の増殖因子と結合可能であり、さらに神経突起伸長促進作用および抗凝血作用を有している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧｌｃＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（Ｂユニット）の二糖を含むコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖。
【請求項２】
ＧｌｃＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（Ｂユニット）を含み、さらに、ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（Ａユニット）、ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（Ｃユニット）、ＧｌｃＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（Ｄユニット）、ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（Ｅユニット）および硫酸化されていないＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（Ｏ［オー］ユニット）からなる群から選択される少なくとも１つのユニット、ならびにＩｄｏＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（ｉＡユニット）、ＩｄｏＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（ｉＢユニット）、ＩｄｏＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（ｉＣユニット）、ＩｄｏＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（ｉＤユニット）およびＩｄｏＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（ｉＥユニット）からなる群から選択される少なくとも１つのユニットを含む、請求項１に記載のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖。
【請求項３】
平均分子量が６５〜７５ｋＤａである、請求項１または２に記載のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖。
【請求項４】
二糖１分子当たりの硫酸化度が０．７０以上１．２未満の範囲内である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖。
【請求項５】
サメ皮由来である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖を含む、グリコサミノグリカン。
【請求項７】
請求項６記載のグリコサミノグリカンを活性成分として含む、増殖因子結合剤。
【請求項８】
請求項６記載のグリコサミノグリカンを活性成分として含む、神経突起伸長促進剤。
【請求項９】
請求項６記載のグリコサミノグリカンを活性成分として含む、抗凝血剤。
【請求項１０】
請求項６記載のグリコサミノグリカンを活性成分として含む、医薬組成物。
【請求項１１】
請求項６記載のグリコサミノグリカンを活性成分として含む、神経変性疾患を予防または治療するための医薬組成物。
【請求項１２】
増殖因子結合剤、神経突起伸長促進剤、抗凝血剤または神経変性疾患治療用組成物を製造するための請求項６記載のグリコサミノグリカンの使用。
【請求項１３】
硬骨魚類を除く魚類由来であるコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖を含むグリコサミノグリカン。
【請求項１４】
ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（Ａユニット）、ＧｌｃＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（Ｂユニット）、ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（Ｃユニット）、ＧｌｃＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（Ｄユニット）、ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（Ｅユニット）、ＧｌｃＵＡ（２Ｓ）β１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（Ｔユニット）および硫酸化されていないＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（Ｏ［オー］ユニット）からなる群から選択される少なくとも１つのユニット、ならびにＩｄｏＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（ｉＡユニット）、ＩｄｏＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（ｉＢユニット）、ＩｄｏＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（ｉＣユニット）、ＩｄｏＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（ｉＤユニット）、ＩｄｏＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（ｉＥユニット）およびＩｄｏＵＡ（２Ｓ）α１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（ｉＴユニット）からなる群から選択される少なくとも１つのユニットを含む、請求項１３に記載のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖を含むグリコサミノグリカン。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載のグリコサミノグリカンを活性成分として含む、増殖因子結合剤。
【請求項１６】
請求項１３または１４に記載のグリコサミノグリカンを活性成分として含む、神経突起伸長促進剤。
【請求項１７】
請求項１３または１４に記載のグリコサミノグリカンを活性成分として含む、神経変性疾患治療用組成物。
【請求項１８】
請求項１３または１４に記載のグリコサミノグリカンを活性成分として含む、医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１３または１４に記載のグリコサミノグリカンを活性成分として含む、神経変性疾患を予防または治療するための医薬組成物。ならびに
【請求項２０】
増殖因子結合剤、神経突起伸長促進剤、または神経変性疾患治療用組成物を製造するための請求項１３または１４に記載のグリコサミノグリカンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、魚類由来、特にサメ皮またはヌタウナギ脊索由来のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖に関する。
【背景技術】  動物組織にはグリコサミノグリカンと呼ばれる一群の硫酸化糖鎖が存在しており、タンパク質に共有結合したプロテオグリカン分子として存在し、細胞の増殖および分化、組織の形態形成などに必須の役割を演じている（Ｌｅｗａｎｄｏｗｓｋａ，Ｋ．，Ｃｈｏｉ，Ｈ．Ｕ．，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．Ｃ．，Ｚａｒｄｉ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｃｕｌｐ，Ｌ．Ａ．（１９８７）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０５，１４４３−１４５４、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｙ．，Ｍａｎｎ，Ｄ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４６，２８１−２８４、Ｌｙｏｎ，Ｍ．，Ｄｅａｋｉｎ，Ｊ．Ａ．，Ｒａｈｍｏｕｎｅ，Ｈ．，Ｆｅｒｎｉｇ，Ｄ．Ｇ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ｊ．Ｔ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２７１−２７８、Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇａｌｌｏ，Ｒ．Ｌ．（２００２）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２，１１７Ｒ−１２５Ｒ）。
グリコサミノグリカンの中で、コンドロイチン硫酸はＤ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンの２糖と硫酸残基で構成されている。なお、コンドロイチン硫酸は硫酸基の結合位置によって、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋなどのタイプに分類されている。コンドロイチン硫酸ＢはＤ−グルクロン酸の代わりにＬ−イズロン酸が構成糖であり、デルマタン硫酸と呼ばれている。
コンドロイチン硫酸とデルマタン硫酸には、異なるパターンの硫酸化を受けた二糖ユニットで構築される多数の重複配列が含まれ、ヘパラン硫酸に匹敵する巨大な構造上の多様性を示す。
本発明者は、神経発達において種々の多硫酸化コンドロイチン硫酸およびデルマタン硫酸鎖が関与していることの解明を手がけてきた。そして、さまざまな生体機能を有するコンドロイチン硫酸およびデルマタン硫酸における、多硫酸化された二糖ユニットである「Ｄ」ユニット［ＧｌｃＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）］、「ｉＤ」ユニット［ＩｄｏＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）］、「Ｅ」ユニット［ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）］と「ｉＥ」ユニット［ＩｄｏＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）］の重要性に注目した（ここで、ＩｄｏＵＡはＬ−イズロン酸を、ＧｌｃＵＡはＤ−グルクロン酸を、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを表す。また２Ｓ、４Ｓ、６Ｓは硫酸基の結合部位がＣ−２位、Ｃ−４位、Ｃ−６位に結合していることを表す）。
神経回路の形成過程において、各神経細胞は特徴的な形態を発達させると共に、その軸索を特異的な経路に沿って伸長させることにより、正しい標的細胞を見出し、シナプスを形成する。これまで多くの研究者が、発達期脳組織をコンドロイチナーゼＡＢＣで処理し、組織中に含まれるコンドロイチン硫酸を分解除去すると、神経細胞の形態形成および軸索走行に大きな異常が生じることを見出している。このような観察から、コンドロイチン硫酸は、神経突起の軸索誘導に関与する、あるいは神経細胞の形態分化に関与すると考えられてきた。
本発明者は、マウス１６日目胚より調製した海馬神経細胞を、各種コンドロイチン硫酸（デルマタン硫酸）標品を塗布した基質上で培養することにより、特定の構造を有する糖鎖が神経突起伸長促進作用を示すことを見出した。なかでもＤまたはｉＤユニットを多く含むものは樹状突起様の突起を伸展させ、ＥまたはｉＥユニットに富むものは、長い軸索様の突起を伸長させることを見出した（Ｈｉｋｉｎｏ，Ｍ．，Ｍｉｋａｍｉ，Ｔ．，Ｆａｉｓｓｎｅｒ，Ａ．，Ｖｉｌｅｌａ−Ｓｉｌｖａ，Ａ．Ｃ．，Ｐａｖａｏ，Ｍ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｓｕｇａｈａｒａ，Ｋ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，４３７４４−４３７５４、Ｓｕｇａｈａｒａ，Ｋ  ａｎｄ  Ｙａｍａｄａ，Ｓ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｎｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１２  Ｎｏ．６７  ｐｐ．３２１−３４９を参照のこと）。
このような、多硫酸化されたコンドロイチン硫酸およびデルマタン硫酸は、多くのヘパリン結合性成長因子と結合することが知られており、これらの情報伝達が海馬神経細胞の形態形成に関与することが示唆されている。
以上のような事実から、神経性疾患の治療薬としての使用に有用な、ユニークな構造と顕著な活性を有するグリコサミノグリカンの供給源を探索することが期待されている。海洋生物、例えばサメなどの皮から、ムコ多糖が精製されたことは既に報告されている（Ｓｅｎｏ，Ｎ．ａｎｄ  Ｍｅｙｅｒ，Ｋ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．７８（１９６３）２５８−２６４）。
【非特許文献１】Ｈｉｋｉｎｏ，Ｍ．，Ｍｉｋａｍｉ，Ｔ．，Ｆａｉｓｓｎｅｒ，Ａ．，Ｖｉｌｅｌａ−Ｓｉｌｖａ，Ａ．Ｃ．，Ｐａｖａｏ，Ｍ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｓｕｇａｈａｒａ，Ｋ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，４３７４４−４３７５４
【非特許文献２】Ｓｅｎｏ，Ｎ．ａｎｄ  Ｍｅｙｅｒ，Ｋ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．７８（１９６３）２５８−２６４
【非特許文献３】Ｓｕｇａｈａｒａ，Ｋ  ａｎｄ  Ｙａｍａｄａ，Ｓ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｎｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１２  Ｎｏ．６７  ｐｐ．３２１−３４９
【発明の開示】
種々の増殖因子との結合作用、神経突起伸長促進作用および抗凝血作用を有する、魚類、例えば硬骨魚類を除く魚類、特にサメ皮またはヌタウナギ脊索由来のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖を提供し、さらに神経性疾患治療用組成物を提供することが、本発明の課題である。
新規コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖を、サメ皮等の硬骨魚類を除く魚類の体の一部より分離・精製し、該画分が、種々の増殖因子と結合すること、さらに神経突起伸長促進作用および抗凝血作用を有していることを見出し、さらに神経性疾患治療用組成物としての効果が期待できる。したがって、本発明は以下の態様：
１．ＧｌｃＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（Ｂユニット）の二糖を含むコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖；
２．ＧｌｃＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（Ｂユニット）を含み、さらに、ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（Ａユニット）、ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（Ｃユニット）、ＧｌｃＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（Ｄユニット）、ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（Ｅユニット）および硫酸化されていないＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（Ｏ［オー］ユニット）からなる群から選択される少なくとも１つのユニット、ならびにＩｄｏＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（ｉＡユニット）、ＩｄｏＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（ｉＢユニット）、ＩｄｏＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（ｉＣユニット）、ＩｄｏＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（ｉＤユニット）およびＩｄｏＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（ｉＥユニット）からなる群から選択される少なくとも１つのユニットを含む、上記１に記載のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド；
３．平均分子量が６５〜７５ｋＤａである、上記１、２記載のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖；
４．二糖１分子当たりの硫酸化度が０．７０以上１．２未満の範囲内である、上記１〜３記載のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖；
５．サメ皮由来である、上記１〜４のいずれかに記載のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖；
６．上記１〜５のいずれかに記載のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖を含む、グリコサミノグリカン；
７．上記６記載のグリコサミノグリカンを活性成分として含む、増殖因子結合剤；
８．上記６記載のグリコサミノグリカンを活性成分として含む、神経突起伸長促進剤；
９．上記６記載のグリコサミノグリカンを活性成分として含む、抗凝血剤；
１０．上記６記載のグリコサミノグリカンを活性成分として含む、医薬組成物；
１１．上記６記載のグリコサミノグリカンを活性成分として含む、神経変性疾患を予防または治療するための医薬組成物；
１２．増殖因子結合剤、神経突起伸長促進剤、抗凝血剤または神経変性疾患治療用組成物を製造するための上記６記載のグリコサミノグリカンの使用；
１３．硬骨魚類を除く魚類由来であるコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖を含むグリコサミノグリカン；
１４．ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（Ａユニット）、ＧｌｃＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（Ｂユニット）、ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（Ｃユニット）、ＧｌｃＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（Ｄユニット）、ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（Ｅユニット）、ＧｌｃＵＡ（２Ｓ）β１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（Ｔユニット）および硫酸化されていないＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（Ｏ［オー］ユニット）からなる群から選択される少なくとも１つのユニット、ならびにＩｄｏＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（ｉＡユニット）、ＩｄｏＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（ｉＢユニット）、ＩｄｏＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（ｉＣユニット）、ＩｄｏＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（ｉＤユニット）、ＩｄｏＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（ｉＥユニット）およびＩｄｏＵＡ（２Ｓ）α１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（ｉＴユニット）からなる群から選択される少なくとも１つのユニットを含む、上記１３記載のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖を含むグリコサミノグリカン；
１５．上記１３または１４に記載のグリコサミノグリカンを活性成分として含む、増殖因子結合剤；
１６．上記１３または１４に記載のグリコサミノグリカンを活性成分として含む、神経突起伸長促進剤；
１７．上記１３または１４に記載のグリコサミノグリカンを活性成分として含む、神経変性疾患治療用組成物；
１８．上記１３または１４に記載のグリコサミノグリカンを活性成分として含む、医薬組成物；
１９．上記１３または１４に記載のグリコサミノグリカンを活性成分として含む、神経変性疾患を予防または治療するための医薬組成物；ならびに
２０．増殖因子結合剤、神経突起伸長促進剤、または神経変性疾患治療用組成物を製造するための上記１３または１４に記載のグリコサミノグリカンの使用；に関する。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００４−３０８５８４および米国仮出願６０／５６５，５１１の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１は、サメ皮由来コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖（ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ）（Ｎａｔｉｖｅ）のコンドロイチン分解酵素消化物の、陰イオン交換ＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（Ｎａｔｉｖｅ）をコンドロイチナーゼＡＢＣ（Ａ）、コンドロイチナーゼＢ（Ｂ）またはコンドロイチナーゼＡＣ−Ｉ（Ｃ）で消化し、消化物を２ＡＢ標識し、これを、６０分にわたって１６から５３０ｍＭでＮａＨ２ＰＯ４の直線濃度勾配（破線）によるシリカＰＡ−０３カラムＨＰＬＣによって分析した。１０分より前に得られるピークは、試薬に起因する。矢印は、２ＡＢ標識された不飽和ＣＳ二糖の溶出ピークを示す：１（ΔＨｅｘＵＡα１−３ＧｌｃＮＡ）；２（ΔＨｅｘＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ）（ΔＤｉ−０ＳまたはΔＯ［オー］と略す）；３（ΔＨｅｘＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ））（ΔＤｉ−６ＳまたはΔＣと略す）；４（ΔＨｅｘＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ））（ΔＤｉ−４ＳまたはΔＡと略す）；５ΔＨｅｘＵＡ（２Ｓ）α１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（ΔＤｉ−ｄｉＳＤまたはΔＤと略す）；６ΔＨｅｘＵＡ（２Ｓ）α１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（ΔＤｉ−ｄｉＳＢまたはΔＢと略す）；７（ΔＨｅｘＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ））（ΔＤｉ−ｄｉＳＥまたはΔＥと略す）；８、ΔＨｅｘＵＡ（２Ｓ）α１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（ΔＤｉ−ｔｒｉＳまたはΔＴと略す）。
図２は、単離ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（Ｎａｔｉｖｅ）の各種のコンドロイチナーゼによる消化物のゲル濾過分析の結果を示す図である。ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（Ｎａｔｉｖｅ）（１μｇ）をコンドロイチナーゼＡＣ−Ｉ（Ａ）、コンドロイチナーゼＢ（Ｂ）、またはコンドロイチナーゼＢに続いてコンドロイチナーゼＡＣ−Ｉ（Ｃ）で消化後、消化物を２ＡＢで標識し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅのカラムの上で分析した。スタンダードの二糖およびオリゴ糖の溶出位置を矢印で示す：１（ＣＳ−１０糖）；２（ＣＳ−８糖）；３（ＣＳ−６糖）；４（ＣＳ−４糖）；５（二硫化されたＣＳ−２糖）；６（一硫化されたＣＳ−２糖）；７（硫化されていないＣＳ−２糖）。このオリゴ糖の溶出位置は、予め測定しておいた（Ｂａｏ，Ｘら（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．７９，９７６５−９７７６）。Ｖ０はボイド容量を表す、そして、総容積（Ｖｔ）は２４ｍｌであった。コンドロイチナーゼＡＣ−Ｉ（Ａ）とコンドロイチナーゼＢ（Ｂ）消化物から得られた二硫酸化二糖画分（バーで示す画分）は、ＰＡ−０３カラムで陰イオン交換ＨＰＬＣに供し、その結果をパネルＡとＢのインサートで示している。アスタリスクとブラケットで示されるピークは、試薬に起因するものである。アルファベットと矢印で示される二糖の溶出位置は、以下の通りである：ａ（ΔＨｅｘＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ）（ΔＯ［オー］）；ｂ（ΔＨｅｘＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ））（ΔＣ）；ｃ（ΔＨｅｘＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ））（ΔＡ）；ｄ（ΔＨｅｘＵＡ（２Ｓ）α１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ））（ΔＤ）；ｅ（ΔＨｅｘＵＡ（２Ｓ）α１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ））（ΔＢ）；ｆ（ΔＨｅｘＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ））（ΔＥ）；ｇ（ΔＨｅｘＵＡ（２Ｓ）α１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ））（ΔＴ）。
図３は、分子サイズ決定のための、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（Ｎａｔｉｖｅ）（◆）、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ１．０ＭＮａＣｌ溶出画分（１．０Ｍ）（▲）、およびＳＳ−ＣＳ／ＤＳ１．５Ｍ  ＮａＣｌ溶出画分（１．５Ｍ）（■）について行ったＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００でのゲルろ過カラムクロマトグラフィーの結果を示す図である。
図４は、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．０Ｍ、１．５Ｍ）に対するさまざまな増殖因子の結合を示す図である。Ａ：ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．０Ｍ）（白抜きのバー）と、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．５Ｍ）（黒塗りのバー）に対する応答の結果を示す。Ｂ：対照実験としてヘパリンに対する応答の結果を示す。
図５−１は、増殖因子の濃度に依存したＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．５Ｍ）の結合センサーグラムを示す図である。試験した増殖因子は、ＦＧＦ−２（Ａ）およびＦＧＦ−１０（Ｂ）である。
図５−２は、増殖因子の濃度に依存したＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．５Ｍ）の結合センサーグラムを示す図である。試験した増殖因子は、ＦＧＦ−１８（Ｃ）およびＨＢ  ＥＧＦ（Ｄ）である。
図５−３は、増殖因子の濃度に依存したＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．５Ｍ）の結合センサーグラムを示す図である。試験した増殖因子は、ＭＫ（Ｅ）およびＰＴＮ（Ｆ）である。
図６は、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．５Ｍ）とＢＤＮＦまたはＧＤＮＦとの結合をＢＩＡｃｏｒｅ  Ｊシステムで解析した結果を示す図である。黒塗りのバーはＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．５Ｍ）、白抜きのバーはヌタウナギ由来のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖（ＨＮ−ＣＳ／ＤＳ）を示す（Ａ）。種々の濃度のＢＤＮＦとＧＤＮＦで得られたセンサーグラム（Ｂ：ＢＤＮＦおよびＣ：ＧＤＮＦ）をＢおよびＣに示す。矢印は、会合相および解離相それぞれの開始を示す。
図７−１は、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳの３標品（Ｎａｔｉｖｅ、１．０Ｍ、１．５Ｍ）の神経突起伸長促進作用を示す図である。ＳＳ−ＣＳ／ＤＳの３標品（Ｎａｔｉｖｅ、１．０Ｍ、１．５Ｍ）（ウロン酸としての０．６７のμｇ）はＰ−ＯＲＮでプレコートされたカバーガラスの上にコートされ、Ｅ１６マウス胚由来の海馬ニューロン初代培養細胞をその上で２４時間の間イーグル最小必須培地で培養した。Ａにおいて、最も長い軸索突起の平均の長さは、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳの３標品（Ｎａｔｉｖｅ、１．０Ｍ、１．５Ｍ）の上で培養される、ランダムに選択された１００個のニューロンについて計量した。イカ軟骨由来のコンドロイチン硫酸鎖（ＣＳ−Ｅ）をポジティブコントロール、Ｐ−ＯＲＮのみのコートをネガティブコントロール（Ｐ−ＯＲＮ）とした（★★：ｐ＜０．００１、★：ｐ＜０．００５）。Ｂは、各種コンドロイチナーゼで消化したＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（Ｎａｔｉｖｅ）について同様に調べた結果である（ｎ．ｓ．：有意差なし、★★★：ｐ＜０．００１、★：ｐ＜０．０５）。Ｃは、酵素消化してない各画分により誘導される神経突起の数をグラフにしたものである（ｎ．ｓ．：有意差なし、★★：ｐ＜０．００１）。２つの別々の実験から得られる値を、平均±ＳＥとして表す。
図７−２は、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳの３標品（Ｎａｔｉｖｅ、１．０Ｍ、１．５Ｍ）の神経突起伸長促進作用を示す写真である。（Ｄ）は、ＳＳ−ＤＳ上で培養したニューロンの形態、（Ｅ）は、Ｐ−ＯＲＮのみをコートしたカバーガラス上で培養したニューロンの形態である。
図８は、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳの３標品（Ｎａｔｉｖｅ、１．０Ｍ、１．５Ｍ）の抗ファクターＩＩａ活性測定結果である。ヘパリン（●）およびブタ肌由来のＤＳ（■）はポジティブコントロールである。ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（Ｎａｔｉｖｅ）（◆）、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．０Ｍ）（▲）、およびＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．５Ｍ）（×）について試験した。
図９−１は、増殖因子の濃度に依存した固定化ＨＮ−ＣＳ／ＤＳのセンサーグラムを示す。試験した増殖因子は、ＦＧＦ−２（Ａ）およびＦＧＦ−１０（Ｂ）である。
図９−２は、増殖因子の濃度に依存した固定化ＨＮ−ＣＳ／ＤＳのセンサーグラムを示す図である。試験した増殖因子は、ＦＧＦ−１６（Ｃ）およびＦＧＦ−１８（Ｄ）である。
図９−３は、増殖因子の濃度に依存した固定化ＨＮ−ＣＳ／ＤＳのセンサーグラムを示す図である。試験した増殖因子は、ＭＫ（Ｅ）およびＰＴＮ（Ｆ）である。
図９−４は、増殖因子の濃度に依存した固定化ＨＮ−ＣＳ／ＤＳのセンサーグラムを示す図である。試験した増殖因子は、ＨＢ−ＥＧＦ（Ｇ）およびＶＥＧＦ（Ｈ）である。
図１０は、ＨＮ−ＣＳ／ＤＳをセンサ・チップ上に固定しＢＤＮＦとＧＤＮＦをそれぞれ種々の濃度で、センサ・チップ上に流した際の重ね合わせたセンサーグラムを示す図である。
図１１−１は、ＨＮ−ＣＳ／ＤＳ消化物の神経突起伸長促進作用を示す写真である。ＡはＨＮ−ＣＳ／ＤＳをコートしたカバーガラス上で培養したニューロンであり、ＢはＰ−ＯＲＮコートのみをカバーガラス上で培養した細胞である。
図１１−２は、ＨＮ−ＣＳ／ＤＳ消化物の神経突起伸長促進作用を示す図である。Ｃは神経突起の長さを示し、Ｄは神経突起の数を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明は、コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖、およびこれを含むグリコサミノグリカンに関する。さらに、ＧｌｃＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）の二糖を含むコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖、およびこれを含むグリコサミノグリカンに関する。かかるグリコサミノグリカンは、上記ハイブリッド鎖を、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上（全てｗ／ｗ）、最も好ましくは他の糖鎖成分は全く検出されず、実質的に上記ハイブリッド鎖のみからなるグリコサミノグリカンである。ただし、本発明におけるコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖およびこれを含むグリコサミノグリカンは、その糖鎖に共有結合したペプチドを、３重量％以下、好ましくは、２重量％以下、さらに好ましくは１．２重量％以下（例えば、０．６〜１．２重量％程度）含み得る。
本発明において、コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖とはコンドロイチン硫酸が有する２糖ユニットとデルマタン硫酸が有する２糖ユニットの両方を含む、２糖ユニット構造を有する多糖鎖をいう。コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖の含む２糖ユニットの種類や含量には限定はない。例えば、コンドロイチン硫酸からは次のような構造が単離されている。
ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）β１−４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）β１−４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）β１−４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）
一方、デルマタン硫酸からは次のような構造が単離されている。
ＩｄｏＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）β１−４ＩｄｏＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）β１−４ＩｄｏＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）β１−４ＩｄｏＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）
ＩｄｏＵＡとＧｌｃＵＡが同じ糖鎖中に存在している構造があれば、ハイブリッド型といえる。例えば次のような構造が挙げられる。
１）  ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）β１−４ＩｄｏＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）β１−４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）β１−４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）
２）  ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）β１−４ＩｄｏＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）β１−４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）β１−４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）
３）  ＩｄｏＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）β１−４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）β１−４ＩｄｏＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）β１−４ＩｄｏＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）
かかるコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖は、硬骨魚類以外の魚類体、から分離・精製することができる。硬骨魚類以外の魚類としては、軟骨魚類、や円口類に属する魚類が挙げられる。魚類体は限定されないが、魚類の種類により、コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖の含量、分離・精製処理のし易さにより適宜選択することができる。例えばサメ皮やヌタウナギの脊索を用いることができる。試料より、アセトン抽出、プロテアーゼ処理、トリクロロ酢酸抽出により得られたグリコサミノグリカン画分を、さらにＣＰＣ沈殿、ヒアルロニダーゼ消化、亜硝酸処理、脱塩の工程を経て、コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖画分が得られる。さらに、最終的に得られたコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖画分を陰イオン交換樹脂を用いて、樹脂に吸着したコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖をＮａＣｌ含有溶出剤により溶出することによりさらに分画することができる。約１．０ＭＮａＣｌで溶出されてくる画分と、約１．５Ｍ  ＮａＣｌで溶出されてくる画分と２つのコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖画分が得られる。いずれの画分も、実質的に純粋なコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖である。いずれの画分に含まれるものも、ほぼ等しい分子量を有しており、その平均分子量は、例えばサメ皮由来コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖の場合、約６５〜７５ｋＤａ、好ましくは約６８〜７２ｋＤａ、最も好ましくは約７０ｋＤａであり、ヌタウナギ脊索由来コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖の場合、約１８ｋＤａである。本発明中のサメ皮由来コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖の二糖１分子当たりの硫酸化度は、１．２未満、すなわち、好ましくは約０．７０以上１．２０未満、より好ましくは約０．８０以上約１．２０未満、特に好ましくは約０．８７〜１．１７の範囲内である。
サメ皮やヌタウナギ脊索等の硬骨魚類以外の魚類からのコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖の分離・精製の各工程は当業者に公知の方法にて実施すればよい。例として、一連の工程の実施態様を実施例の欄に後述するが、記載の方法に限定されるわけではない。
本明細書中、コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖をＣＳ／ＤＳと称することもある。また、サメ皮由来のものをＳＳ（ｓｈａｒｋ  ｓｋｉｎ）という接頭語を付し、ヌタウナギ脊索由来のものをＨＮ（ｈａｇｆｉｓｈ  ｎｏｔｏｃｈｏｒｄ）という接頭語を付することがある。例えば、サメ皮試料より上記のヒアルロニダーゼ消化、亜硝酸処理、脱塩後に得られた画分を、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（Ｎａｔｉｖｅ）と、さらにそれを陰イオン交換樹脂に供し、約１．０Ｍ  ＮａＣｌで溶出されてくる画分および約１．５Ｍ  ＮａＣｌで溶出されてくる画分をそれぞれ、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．０Ｍ）およびＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．５Ｍ）と称する。
これらのサメ皮由来コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖の各画分の組成分析を、コンドロイチナーゼＡＢＣ、ＢまたはＡＣ−Ｉにて消化することにより実施した。その結果、いずれのＳＳ−ＣＳ／ＤＳ画分も主要構成成分はＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（Ａユニット）もしくはＩｄｏＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（ｉＡユニット）ならびにＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（Ｃユニット）もしくはＩｄｏＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（ｉＣユニット）であった。また、ＧｌｃＵＡ（２Ｓ）β１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（Ｄユニット）、ＩｄｏＵＡ（２Ｓ）α１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（ｉＤユニット）、ＧｌｃＵＡ（２Ｓ）β１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（Ｂユニット）、ＩｄｏＵＡ（２Ｓ）α１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（ｉＢユニット）、ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（Ｅユニット）およびＩｄｏＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（ｉＥユニット）の全部または一部の二硫酸化二糖を含んでいることも明らかになった。また、これらの画分のコンドロイチン硫酸およびデルマタン硫酸は、非常に多様な二糖分子からなっており、特にＧｌｃＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）の構造を持つ二糖分子が検出された。かかるＧｌｃＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）の構造を持つ二糖分子を含むコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖は、本発明において初めて見つけられたものであり、サメ皮由来のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖特有の性質であると考えられる。
以上のように、サメ皮由来のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖は、ＧｌｃＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（Ｂユニット）を必ず含み、さらにＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（Ａユニット）、ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（Ｃユニット）、ＧｌｃＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（Ｄユニット）、ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（Ｅユニット）および硫酸化されていないＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（Ｏ［オー］ユニット）からなる群から選択される少なくとも１つのユニット（すなわち、１つ、２つ、３つ、４つもしくは４つのユニット）、ならびにＩｄｏＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（ｉＡユニット）、ＩｄｏＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（ｉＢユニット）、ＩｄｏＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（ｉＣユニット）、ＩｄｏＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（ｉＤユニット）およびＩｄｏＵＡ  ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（ｉＥユニット）からなる群から選択される少なくとも１つのユニット（すなわち、１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのユニット）を含む。なお、コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖であるので、ＧｌｃＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（Ｂユニット）、ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（Ａユニット）、ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（Ｃユニット）、ＧｌｃＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（Ｄユニット）、ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（Ｅユニット）および硫酸化されていないＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（Ｏ［オー］ユニット）からなるコンドロイチン硫酸ユニット群中の少なくとも一つとＩｄｏＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（ｉＡユニット）、ＩｄｏＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（ｉＢユニット）、ＩｄｏＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（ｉＣユニット）、ＩｄｏＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（ｉＤユニット）およびＩｄｏＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（ｉＥユニット）からなるデルマタン硫酸ユニット群中の少なくとも一つを必ず同時に含んでいる。
また、ヌタウナギ脊索由来コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖の組成分析の結果、主要構成成分はＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（Ｅユニット）もしくはＩｄｏＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（ｉＥユニット）、ならびにＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（Ａユニット）もしくはＩｄｏＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（ｉＡユニット）であった。また、ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（Ｏ［オー］ユニット）、ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（Ｃユニット）、ＩｄｏＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（ｉＣユニット）、ＧｌｃＵＡ（２Ｓ）β１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（Ｔユニット）およびＩｄｏＵＡ（２Ｓ）α１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（ｉＴユニット）の全部または一部も含まれていた。すなわち、ヌタウナギ脊索由来コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖は、ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（Ａユニット）、ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（Ｃユニット）、ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（Ｅユニット）、ＧｌｃＵＡ（２Ｓ）β１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（Ｔユニット）および硫酸化されていないＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（Ｏ［オー］ユニット）からなる群から選択される少なくとも１つのユニット（すなわち、１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのユニット）、ならびにＩｄｏＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（ｉＡユニット）、ＩｄｏＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（ｉＣユニット）、ＩｄｏＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（ｉＥユニット）およびＩｄｏＵＡ（２Ｓ）α１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（ｉＴユニット）からなる群から選択される少なくとも１つのユニット（すなわち、１つ、２つ、３つもしくは４つのユニット）を含む。
以上より、サメおよびヌタウナギを含む硬骨魚類を除く魚類由来のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖は、ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（Ａユニット）、ＧｌｃＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（Ｂユニット）、ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（Ｃユニット）、ＧｌｃＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（Ｄユニット）、ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（Ｅユニット）、ＧｌｃＵＡ（２Ｓ）β１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（Ｔユニット）および硫酸化されていないＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（Ｏ［オー］ユニット）からなる群から選択される少なくとも１つのユニット、ならびにＩｄｏＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（ｉＡユニット）、ＩｄｏＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（ｉＢユニット）、ＩｄｏＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（ｉＣユニット）、ＩｄｏＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（ｉＤユニット）、ＩｄｏＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（ｉＥユニット）およびＩｄｏＵＡ（２Ｓ）α１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（ｉＴユニット）からなる群から選択される少なくとも１つのユニットを含む。
本発明のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖は種々の増殖因子（繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−２、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１８、ヘパリン結合性上皮細胞増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、ミッドカイン（ＭＫ）、プレイオトロピン（ＰＴＮ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）および神経膠細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ））と高い親和性をもって結合した。
さらに、本発明のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖は、神経突起伸長促進作用および抗凝血作用を示す。
かかる特性より、サメ皮由来、ヌタウナギ脊索由来等の硬骨魚類以外の魚類由来のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖は、神経変性疾患、神経系発達の促進に対する治療または予防薬として有用である。さらにまた、抗凝血剤として有用である。
したがって、本発明は、上記のサメ皮由来、ヌタウナギ脊索由来の画分に含まれるコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖等の硬骨魚類以外の魚類由来のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖からなるグリコサミノグリカンを含む、増殖因子（ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１８、ＨＢ−ＥＧＦ、ＭＫ、ＰＴＮ、ＢＤＮＦおよびＧＤＮＦ）結合剤、神経突起伸長促進剤、および抗凝血剤をも包含する。これらの剤の製造方法は当業者であれば、容易に想到し得る。例えば、サメ皮から上述の通りコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖を含むグリコサミノグリカンを完全にまたは部分的に精製し、得られた画分を必要に応じて、これを適切な担体および／または溶媒と混合するとよい。
上記グリコサミノグリカンは医薬組成物として利用され得る。
特に、上記グリコサミノグリカンの神経突起伸長促進作用により、該グリコサミノグリカンは神経変性疾患の予防または治療用の医薬組成物となり得る。神経変性疾患は、神経細胞の神経突起の変性・脱落を伴うため、該グリコサミノグリカンは、これを予防し得るか、または新規神経突起の伸長を促進し得るために疾患による症状の進行もしくは症状の軽減をもたらし得る。
これらの製剤または医薬組成物は、上記グリコサミノグリカンを、最終的に１〜２０μｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは１〜５μｇ／ｍｌの濃度で、作用させることが好ましい。
例えば、上記コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖を含むグリコサミノグリカンまたはそれを含む画分を、神経突起伸長促進剤として適用する場合は、サメ皮から上述の通りコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖を含むグリコサミノグリカンを完全にまたは部分的に精製して得られた画分を、これが神経突起の伸長を促進する必要のある対象とする個体の神経細胞と接触することが可能な方法で投与することができる。投与方法は適切な方法を当業者が選択することができるが、突起伸長が望ましい神経細胞またはその細胞の周辺に送達し得るように、局所投与するとよい。送達される際の濃度が、１〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは１〜５μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは２μｇ／ｍｌ程度になるよう、投与することが好ましい。また、ヌタウナギ脊索由来コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖を含むグリコサミノグリカン等の他の硬骨魚類以外の魚類の場合も同様である。
例えば、上記グリコサミノグリカンまたはそれを含む画分を、増殖因子結合剤として適用する場合、目的に応じて適切な量（対象とする増殖因子に応じて異なる）の上記グリコサミノグリカンまたはそれを含む画分を増殖因子と混合し、接触させるとよい。
さらにまた、上記グリコサミノグリカンまたはそれを含む画分を、抗凝血剤として適用する場合、目的に応じて適切な量の上記グリコサミノグリカンまたはそれを含む画分を増殖因子と混合し、接触させるとよい。
上記グリコサミノグリカンを、０．１μｇ以上、好ましくは１〜１０μｇ／ｍｌの濃度で血液と混合し、接触させることにより、抗凝血活性が発揮される。
これらの適用の対象となるのは任意の哺乳動物であってよい。
本発明の硬骨魚類以外の魚類由来のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖画分の分離方法およびその特性解析について、以下の実施例にサメ皮およびヌタウナギ脊索を例として詳述するが、本発明は実施例の記載に限定されるわけではない。
【実施例１】実施例１  サメ皮からのコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖画分の分離
＜方法＞
グリコサミノグリカンの単離
ヨシキリザメＰｒｉｏｎａｃｅ  ｇｌａｕｃａの皮膚（乾燥重量８５ｇ）を、アセトン抽出によって３回脱脂し、完全に風乾した。水に懸濁後、タンパク質分解酵素を失活させるために３０分間、沸騰水中に保持した。
懸濁液に、ホウ酸塩−ＮａＯＨバッファーと塩化カルシウムを、それぞれ０．１Ｍと１０ｍＭの終濃度となるように加え、２４時間の間６０℃でプロテアーゼ（アクチナーゼ：サンプルの２重量％）で消化した。そして２４時間および４８時間後に、新たにアクチナーゼ（サンプルの１重量％）を加え消化後、５０％のトリクロロ酢酸を５％終濃度になるように加えて遠心分離し、タンパク質を沈殿させ、５％のトリクロロ酢酸で再懸濁して再度遠心分離により、それぞれの上清を回収した。
上清中の過剰なトリクロロ酢酸はジエチルエーテル抽出によって除去し、４倍容量の５％酢酸ナトリウム含有８０％エタノールを加えて一晩４℃に放置して、グリコサミノグリカンを沈殿させ、さらに遠心によって回収し乾燥させた。
グリコサミノグリカンの精製
上記のグリコサミノグリカン含有沈殿物を、０．０２ＭのＮａ２ＳＯ４で可溶化し、１０％（ｗ／ｖ）塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）／０．０２ＭＮａ２ＳＯ４を添加して室温で一晩放置した。得られた綿状沈降物は、１００：１５（ｖ／ｖ）２Ｍ  ＮａＣｌ／エタノール溶液で再溶解させて、３倍容量の９９．５％のエタノールを加え再度沈殿させた。上記のステップを３度繰り返して、最後に水中で沈殿させて乾燥させた。同様のＣＰＣ沈殿工程を、臨界電解質濃度を０．５ＭのＮａＣｌに保ちつつ実施し、ヒアルロン酸を除去して、グリコサミノグリカンを濃縮した。
ヒアルロニダーゼ消化
上記で得られたＣＰＣ沈殿物を０．１５Ｍ  ＮａＣｌ含有０．０２Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ６）に溶解し、６０℃で振盪しなが５０ＴＲＵ（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ）のストレプトマイセス属ヒアルロニダーゼで５時間消化した。５０ＴＲＵのヒアルロニダーゼを更に添加し、１２時間消化させた。セルロースアセテート膜電気泳動法によって、ヒアルロン酸の消化を確認した後に、タンパク質を除去するために消化物をＴＣＡで処理し、エタノールを６４％になるように添加してグリコサミノグリカンを沈殿させた。
亜硝酸処理
ヒアルロニダーゼ消化後得られた沈殿物は、同量の０．５ｍｍｏｌｅ硫酸と０．５ｍｍｏｌｅ亜硝酸バリウムとを混合して得られる亜硝酸で４０分間室温静置して処理した。新たに調製した亜硝酸のアリコートを再び添加し、更に４０分間静置した。処理したサンプルを、０．５ＭのＮａ２ＣＯ３で中和して、セファデックスＧ−５０カラム（１ｘ５６ｃｍ）で脱塩した（溶出剤：０．２Ｍの重炭酸アンモニウム、流速０．６ｍｌ／分）。溶出は２１０ｎｍでモニターし、溶出画分を回収して、凍結乾燥しては水で戻す作業を繰り返した。
Ｃ１８および陰イオン交換カラムによるコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖の精製
脱塩したグリコサミノグリカンを、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジカラムに通して、水で溶出した後、１００％のメタノールで溶出した。ここで溶出された遊離のペプチド不含コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖は、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（Ｎａｔｉｖｅ）と称した。この標品は糖鎖に共有結合したペプチドをわずかに含む（０．６〜１．２重量％程度）。
ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（Ｎａｔｉｖｅ）は、陰イオン交換体カートリッジに通して、０．１５、０．５、１．０、１．５または２．０Ｍ  ＮａＣｌ含有３００ｍＭリン酸塩緩衝液にてステップワイズに溶出後、ＰＤ−１０カラムを用い５０ｍＭピリジン酢酸塩バッファー（ｐＨ５．０；溶出剤）で脱塩した。
＜結果＞
精製の結果、ＮａＣｌを含む１．０と１．５Ｍのバッファーで溶出された画分に、それぞれ２０％および８０％のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖が含まれており、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．０Ｍ）とＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．５Ｍ）と称した。精製の収率を表１に示す。
【表１】
2005103089.tif 000002
2005103089.tif 000003
【実施例２】実施例２  二糖組成分析
＜方法＞
酵素消化
二糖組成分析は、コンドロイチナーゼＡＢＣ、ＢまたはＡＣ−Ｉの消化物を分析することにより行なった。
１μｇまたは３．６μｇのＳＳ−ＣＳ／ＤＳの３標品（Ｎａｔｉｖｅ、１．０Ｍ、１．５Ｍ）を、１０ｍＩＵのコンドロイチナーゼＡＢＣ、５ｍＩＵのコンドロイチナーゼＡＣ−Ｉ、または２ｍＩＵのコンドロイチナーゼＢのいずれかで消化し、各々の消化物を既報（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，Ａ．，Ｓｕｇａｈａｒａ，Ｋ（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９，３６７−３７８）に従って２−アミノベンズアミド（２ＡＢ）で標識した（過剰な２ＡＢは水：クロロホルム１：１（ｖ／ｖ）混合物で除去した）。
２ＡＢで標識した二糖は、１６ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４４００μｌで希釈し、陰イオン交換ＨＰＬＣ（１６ｍＭおよび５３０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４の溶媒を使用したＰＡ−０３シリカカラム）によって分析した。
また、１．６μｇのＳＳ−ＣＳ／ＤＳの３標品（Ｎａｔｉｖｅ、１．０Ｍ、１．５Ｍ）を１０ｍＩＵコンドロイチナーゼＡＢＣ（１０μｌの総容積）で消化し、その３分の１ずつを１０ｍＩＵのコンドロ４−またはコンドロ６−スルファターゼ消化に供し、この消化物を２ＡＢ標識してＨＰＬＣにて上記と同様に分析した。
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ＰｅｐｔｉｄｅカラムのＳＳ−ＤＳコンドロイチナーゼ消化物のゲルろ過分析
ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（Ｎａｔｉｖｅ）（１．０μｇ）を、コンドロイチナーゼＡＣ−ＩまたはＢで消化した。
コンドロイチナーゼＡＣ−Ｉの後にはコンドロイチナーゼＢで、またはコンドロイチナーゼＢの後にはコンドロイチナーゼＡＣ−Ｉで消化した。全ての消化物を２ＡＢで標識し、７％１−プロパノール含有０．２Ｍ重炭酸アンモニウムにて溶解し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅカラムを使い、蛍光検出にて分析した（流速０．４ｍｌ／分）。
＜結果＞
コンドロイチナーゼＡＢＣ消化による組成分析
ＳＳ−ＣＳ／ＤＳの３標品（Ｎａｔｉｖｅ、１．０Ｍ、１．５Ｍ）を酵素消化し、分析した結果を表２に示す。
ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（Ｎａｔｉｖｅ）、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．０Ｍ）およびＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．５Ｍ）の３標品全ては、様々な比率でΔＨｅｘＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（ΔＤｉ−０Ｓ）、ΔＨｅｘＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（ΔＤｉ−６Ｓ）、ΔＨｅｘＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（ΔＤｉ−４Ｓ）、ΔＤｉ−ｄｉＳＤ、ΔＤｉ−ｄｉＳＢおよびΔＤｉ−ｄｉＳＥを含有していることが明らかとなった。
ＳＳ−ＣＳ／ＤＳの３標品（Ｎａｔｉｖｅ、１．０Ｍ、１．５Ｍ）の主要構成成分はΔＤｉ−４ＳとΔＤｉ−６Ｓであり、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（Ｎａｔｉｖｅ）、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．０Ｍ）およびＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．５Ｍ）におけるΔＤｉ−４ＳとΔＤｉ−６Ｓの全二糖に対する比率は、それぞれ、４８．９％と２１．３％、４３．５％と２１．３％、５５．０％および１６．６％であった（表２）。ΔＤｉ−０Ｓの比率はＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．０Ｍ）が２３．８％であり、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（Ｎａｔｉｖｅ）（１０．５％）およびＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．５Ｍ）（５．８％）と比較して高かった。対照的に、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．５Ｍ）は、二硫酸化二糖（ΔＤｉ−ｄｉＳＤ、ΔＤｉ−ｄｉＳＢおよびΔＤｉ−ｄｉＳＥ）の比率が２２．６％であり、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（Ｎａｔｉｖｅ）（１９．３％）およびＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．０Ｍ）（１１．４％）に比べて高かった。
以上より、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（Ｎａｔｉｖｅ）は、異なった硫酸化度をもった多種多様なＣＳ／ＤＳ鎖を含んでいることが分かった。
今までに単離された、サメ軟骨、イカ軟骨、ホヤ、ウニとヌタウナギを含む海洋生物由来のコンドロイチン硫酸やデルマタン硫酸のほとんどは、「Ｅ」ユニット、「ｉＥ」ユニット、「Ｄ」ユニット、「ｉＤ」ユニットまたは「ｉＢ」（ＩｄｏＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ））ユニットの二硫酸化二糖が大部分を占める高硫酸化物であったが（ｓｕｌｆａｔｅ  ｔｏ  ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｍｏｌｅｒ  ｒａｔｉｏ（Ｓ／Ｕｎｉｔ）＝１．２〜１．９）、本発明のＳＳ−ＣＳ／ＤＳの３標品（Ｎａｔｉｖｅ、１．０Ｍ、１．５Ｍ）は、Ｓ／Ｕｎｉｔが０．８７〜１．１７と低いにもかかわらず（表２）、かなりの量の複数の二硫酸化二糖ユニットを含み、しかも硫酸化されていない二糖ユニット（Ｏ［オー］ユニット）をも含むという点でユニークである。
コンドロイチナーゼＢ消化による組成分析
コンドロイチナーゼＢの消化により、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳの３標品（Ｎａｔｉｖｅ、１．０Ｍ、１．５Ｍ）からはΔＤｉ−４ＳとΔＤｉ−ｄｉＳＢが生成された（表２）。コンドロイチナーゼＢの消化により得られる二糖の総量は、コンドロイチナーゼＡＢＣ消化によって得られる二糖の総量の２％程度に過ぎなかった。
コンドロイチナーゼＢ処理によりΔＤｉ−４ＳとΔＤｉ−ｄｉＳＢがわずかしか遊離してこなかったことは、それらの由来するユニットのほとんどが、ＩｄｏＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（ｉＡユニット）またはＩｄｏＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（ｉＢユニット）としてではなく、むしろＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（Ａユニット）またはＧｌｃＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（Ｂユニット）として存在することを示唆する。また、大多数のｉＡユニットまたはｉＢユニットがクラスターを形成しておらず、それ故、コンドロイチナーゼＢ消化に抵抗性を有していると考えられる。
コンドロイチナーゼＢではΔＤｉ−６Ｓは遊離してこなかった。コンドロイチナーゼＡＣ−Ｉ消化後にはある程度検出されたことから、その全６−０硫酸化ユニットがＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（Ｃユニット）として存在するか、または、ＩｄｏＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（ｉＣユニット）として存在することを示唆する。これらは、酵素に対して抵抗性を有するか、または抵抗性のある配列に含まれている可能性がある。
コンドロイチナーゼＡＣ−Ｉ消化による組成分析
ＳＳ−ＣＳ／ＤＳの３標品（Ｎａｔｉｖｅ、１．０Ｍ、１．５Ｍ）のコンドロイチナーゼＡＣ−Ｉによる消化では、二硫酸化二糖がほとんど検出されず、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ標品中の二糖全量の１０％に過ぎない程度の、ΔＤｉ−０Ｓ、ΔＤｉ−６ＳとΔＤｉ−４Ｓを含む非硫酸化およびモノ硫酸化二糖が検出された（表２）。この結果は、４−０硫酸化ユニットと６−０硫酸化ユニットとの少なくとも一部が、「Ａ」および「Ｃ」ユニットとして存在することを示唆する。
コンドロイチナーゼＡＣ−ＩとＢ消化物のゲル濾過分析
ＩｄｏＵＡ含有ユニットとＧｌｃＵＡ含有ユニットとの分布を調べるために、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（Ｎａｔｉｖｅ）（１．０μｇ）を、コンドロイチナーゼＡＣ−ＩまたはＢで消化し、各々の消化物をＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅカラムでのゲル濾過クロマトグラフィによって分析した。６、８、および１０糖のオリゴ糖は両消化物で観察された。このことは、多糖鎖中にＧｌｃＵＡ含有ユニットとＩｄｏＵＡ含有ユニットとが混在し、ＣＳ／ＤＳ複合型構造が形成されていることを示唆する（図２、ＡとＢ）。
コンドロイチナーゼＡＣ−ＩまたはコンドロイチナーゼＢの消化物を、それぞれ他方のコンドロイチナーゼで消化すると、４および６糖に相当する消化抵抗性断片の他は、主に二糖が生成された。これは、隣接するＩｄｏＵＡ含有二糖ユニットまたはＧｌｃＵＡ含有二糖ユニットを有するオリゴ糖が存在することを示唆した（図２Ｃ）。
１０糖またはこれより大きなオリゴ糖は、コンドロイチナーゼＢ消化物（図２Ｂ）よりコンドロイチナーゼＡＣ−Ｉ消化物（図２Ａ）の方が少なかった。これは、ＩｄｏＵＡよりＧｌｃＵＡが幾分高比率であることを支持する結果であった。
いずれかのコンドロイチナーゼ消化により得られた二糖（図２、ＡおよびＢ中５、６、７）は、恐らくＧｌｃＵＡ含有ユニット（１０％）とＩｄｏＵＡ含有ユニット（２％）から成る隣接する配列の存在を意味する。陰イオン交換クロマトグラフィーによると、コンドロイチナーゼＡＣ−Ｉ消化物の二硫酸化二糖に相当する画分は、それぞれ主要成分としてΔＤｉ−ｄｉＳＥが、少量成分としてΔＤｉ−ｄｉＳＢが存在することを示す。一方、コンドロイチナーゼＢ消化物の二硫酸化二糖は、主要成分としてΔＤｉ−ｄｉＳＢが、少量成分としてΔＤｉ−ｄｉＳＥが存在することを示す。陰イオン交換ＨＰＬＣ（図１Ｃ）によってＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（Ｎａｔｉｖｅ）の二硫酸化二糖がコンドロイチナーゼＡＣ−Ｉ消化物で検出されなかったのは、他の二糖に比べてほとんど検出不可能な量しか存在しないためであろうが（表２）、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅカラムで最初に分画した後、陰イオン交換カラムで分画すると、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（Ｎａｔｉｖｅ）の二硫酸化二糖が検出された。これらの結果は、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ標品中のΔＤｉ−ｄｉＳＢとΔＤｉ−ｄｉＳＥが、ＧｌｃＵＡ含有二糖ユニットとＩｄｏＵＡ含有二糖ユニット、すなわちＧｌｃＵＡ（２Ｓ）／ＩｄｏＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）とＧｌｃＵＡ／ＩｄｏＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）に由来することを示す。本実験により、ＧｌｃＵＡを含有する「Ｂ」ユニット（ＧｌｃＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ））が初めて検出された。表２に示すこれらのユニットの値は非常に少ないが、これらは切断可能なユニットのみであって、他にＢユニットが高頻度で含まれていること可能性は高い。このＢユニットがＳＳ−ＣＳ／ＤＳの機能に関与している可能性がある。
対照的に、ΔＤｉ−ｄｉＳＤが、コンドロイチナーゼＡＣ−ＩまたはＢの消化物で検出されなかった（図１ＢおよびＣ、表２）。これは、以前に報告されている（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｋ．ら（１９９３）Ｄｅｒｍａｔａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｅ．，Ｅｄ．）ｐｐ  ５５−８０，Ｐｏｒｔｌａｎｄ  Ｐｒｅｓｓ）ように、Ｄ［ＧｌｃＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）］または、ｉＤ［ＩｄｏＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）］ユニットを含有する配列がコンドロイチナーゼＡＣ−ＩまたはＢに対して非消化性であることを示す。「Ｄ」および／または「ｉＤ」ユニットはかなりの比率（３％）で存在し、コンドロイチナーゼＡＣ−ＩＩは効率的にＣＳオリゴ糖からＤユニットを解離させるにもかかわらず（Ｎａｄａｎａｋａ，Ｓ．ら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，３３７２８−３３７３４）、コンドロイチナーゼＡＣ−ＩＩ消化でも検出されなかった。これは、コンドロイチナーゼＡＢＣにより生成したΔＤｉ−ｄｉＳＤがｉＤユニットに由来し、それがコンドロイチナーゼＡＢＣには感受性を有するがコンドロイチナーゼＢには感受性を有していないという可能性がある。しかしながら、ｉＤユニットおよびＤユニットが実際ＳＳ−ＣＳ／ＤＳの３標品でそれぞれどのくらいの割合で存在するのかは明らかではない。
【表２】
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【実施例３】実施例３  分子量決定
＜方法＞
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（１０×３００ｍｍ）のゲル濾過でコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖の分子サイズを測定した。ＳＳ−ＣＳ／ＤＳの３標品（Ｎａｔｉｖｅ、１．０Ｍ、１．５Ｍ）（４０μｇ）をカラムにロードし、０．３ｍｌ／分の流速で０．２Ｍの酢酸アンモニウムで溶出した。３分間の溶出分を１画分に回収し、蒸発乾燥して、１００μｌ水で溶解した。測定は既報に従った（Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ（１９８７）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６１，１０３−１０８）。
＜結果＞
ＳＳ−ＣＳ／ＤＳの分子をゲルろ過カラムクロマトグラフィーにて調べたところ、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（Ｎａｔｉｖｅ）、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．０Ｍ）とＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．５Ｍ）のいずれの標品も、その平均分子量は７０ｋＤａであった（図３）。
この分子量は、ヌタウナギ脊索（１８ｋＤａ）、ブタの皮膚（１９ｋＤａ）、ウナギ皮膚（１４ｋＤａ）、内皮細胞（３０ｋＤａ）、ブタ脳（４０ｋＤａ）由来のそれぞれのＣＳ／ＤＳと比較して非常に大きかった。サメ軟骨からのコンドロイチン硫酸Ｃ鎖の分子量は、かなり大きい（４３〜７０ｋＤａ）ので、本発明のＳＳ−ＣＳ／ＤＳの分子量はサメに特徴的である可能性がある。
【実施例４】実施例４  種々の増殖因子によるＳＳ−ＣＳ／ＤＳ標品（１．０Ｍ、１．５Ｍ）の相互作用分析
＜方法＞
ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ標品（１．０Ｍ、１．５Ｍ）と種々の増殖因子（ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１６、ＨＢ−ＥＧＦ、ＰＴＮ、ＭＫ）との相互作用分析は、既報に従って、Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＡｓｙｓ；Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｓｅｎｓｏｒｓ社、ケンブリッジ、英国）を使用して実施した（Ｄｅｅｐａ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ．ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，４３７０７−４３７１６）。
親和性パラメータである解離定数ｋｄ、結合定数ｋａをＦＡＳＴｆｉｔソフトウェア（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｓｅｎｓｏｒｓ社、ケンブリッジ、英国）を使って求め、解離平衡定数（Ｋｄ＝解離定数ｋｄ／結合定数ｋａ）を算出して評価した。
＜結果＞
過剰量（１，５００〜３，５００倍量）の各々の増殖因子を灌流して接触させることにより試験した結果、いずれのＳＳ−ＣＳ／ＤＳ標品（１．０Ｍ、１．５Ｍ）も、ＦＧＦ−１以外の全ての増殖因子と高い相互作用応答を示したが、その応答は、増殖因子によって異なっていた。結合程度も、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ標品（１．０Ｍ、１．５Ｍ）により異なり、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．５Ｍ）の方がＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．０Ｍ）より高い応答性を誘発した（図４）。
試験した種々の増殖因子の中で、ＦＧＦ−１８は５．０ｆｍｏｌの固定化ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．５Ｍ）に対して最も高い応答（１８０ａｒｃ  ｓｅｃｏｎｄｓ）を示し、これは増殖因子１．２ｎｇ（４３ｆｍｏｌ）に匹敵した。このことは、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ鎖１つが、平均８．６分子のＦＧＦ−１８に結合したことを示す。同様に、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．５Ｍ）への各増殖因子の結合最大量を計算し、全ての増殖因子に対する結合能を評価し、既報のＣＳ−Ｈ（ヌタウナギ由来のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖）およびヘパリン（Ｈｅｐ）の結合能と比較して表３にまとめた。
【表３】
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以上の結果は、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ鎖がＣＳ−Ｈ鎖より、多くのＨｅｐ結合性増殖因子に結合することを示した。Ｈｅｐと比較しても、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．５Ｍ）は、大部分の増殖因子に対して１多糖鎖につき、より多くの増殖因子と結合した。
同じ長さのグリコサミノグリカン鎖に結合する増殖因子の数として、その結合能を表した場合もＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．５Ｍ）の方が、ＣＳ−Ｈより数倍結合能が高かった（表３右欄）。Ｈｅｐと比較すると数倍低いにもかかわらず、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．５Ｍ）の硫酸化度（Ｓ／Ｕｎｉｔ＝１．１７）がＨｅｐの硫酸化度（Ｓ／Ｕｎｉｔ＝２．５５）より低いことを考慮すると配列特異性が高いことを示していると考えられる。
結合親和性を決定するために、様々な濃度の増殖因子を、固定化ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．５Ｍ）標品と相互作用させた。図５−１〜５−３に、ＦＧＦ−２（Ａ）、ＦＧＦ−１０（Ｂ）、ＦＧＦ−１８（Ｃ）、ＨＢ−ＥＧＦ（Ｄ）、ＭＫ（Ｅ）、ＰＴＮ（Ｆ）でのセンサーグラムを示した。全ての増殖因子は、増殖因子の典型的な結合するパターンを示した。
ＩＡｓｙｓシステムで得られたＫｄにより、全ての増殖因子は、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．５Ｍ）と高親和性であることが明らかとなった（表４）。ＦＧＦ−１８（Ｋｄ＝４．４ｎＭ）とＨＢ−ＥＧＦ（Ｋｄ＝４．５ｎＭ）が最も高い親和性を示し、ＰＴＮ（Ｋｄ＝７．６ｎＭ）とＦＧＦ−１０（Ｋｄ＝８．６ｎＭ）が次いで高い親和性を示した。
ＰＴＮとＤＳ（ブタ皮膚由来：ＩｄｏＵＡだけを含む）との相互作用はすでに報告されており、５１ｎＭのＫｄがＩＡｓｙｓシステム（Ｖａｃｈｅｒｏｔ，Ｆら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，７７４１−７７４７）で得られているが、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．５Ｍ）のＫｄは７．６ｎＭであった（表４）。
【表４】
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この相違は使用されるＳＳ−ＣＳ／ＤＳ標品の構造上の相違によるかも知れず、ＰＴＮの結合に対するＳＳ−ＣＳ／ＤＳのハイブリッド構造の重要性が示唆され、ブタ胚脳由来のＣＳ／ＤＳ鎖についての最近の知見と一致する（Ｂａｏ，Ｘら（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．７９，９７６５−９７７６）。
面白いことに、種々の増殖因子に対するＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．５Ｍ）によって示された親和性は、ＦＧＦ−２とＨＢ−ＥＧＦを除いて、Ｈｅｐの増殖因子への親和性より高かった（表４）。これらの増殖因子へのＳＳ−ＣＳ／ＤＳの高結合能、親和性および特異性は、ＣＳ／ＤＳハイブリッド構造の重要性を示唆するものである。
＜方法＞
【実施例５】実施例５  ＢＤＮＦとＧＤＮＦとＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．５Ｍ）の相互作用
ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．５Ｍ）とＢＤＮＦとＧＤＮＦの相互作用の分析は、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｊ  ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＡｃｏｒｅ  ＡＢ社、ウプサラ、スウェーデン）を用いて行なった。ビオチン標識されたＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．５Ｍ）をストレプトアビジンでコートしたセンサ・チップ上に固定し、ＢＤＮＦとＧＤＮＦをそれぞれ種々の濃度で、センサ・チップ上に流した（高流速（６０μｌ／分））。結合相２分間、解離相３分間とした。カイネティックパラメータｋａ、ｋｄおよびＫｄは、ＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．１ソフトウェアを使用して算出した。
＜結果＞
過剰量のＢＤＮＦとＧＤＮＦで試験した結果、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．５Ｍ）ではＧＤＮＦへの結合の方がＢＤＮＦへの結合より高かった（図６Ａ）。
ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．５Ｍ）のＧＤＮＦへの結合反応がＣＳ−Ｈ（コントロール）に比べて１．５〜２．２倍程度であったにもかかわらず、ＢＤＮＦまたはＧＤＮＦへのＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．５Ｍ）の結合能は、ＣＳ−Ｈに比べて顕著に高かった（それぞれ７．９と１９．０倍）。結果を表５に示す。
【表５】
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【実施例６】実施例６  精製ＳＳ−ＣＳ／ＤＳの３標品（Ｎａｔｉｖｅ、１．０Ｍ、１．５Ｍ）の神経突起成長促進作用の検討
＜方法＞
既述（Ｈｉｋｉｎｏ，Ｍら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，４３７４４−４３７５４，Ｆａｓｓｉｎｅｒ，Ａら（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２６，７８３−７９９）の通り実施した。カバーガラスを３７℃で２時間、１．５μｇ／ｍｌポリＤＬ−オルニチン（Ｐ−ＯＲＮ）６００μｌでコートし、２μｇのＳＳ−ＣＳ／ＤＳの３標品（Ｎａｔｉｖｅ、１．０Ｍ、１．５Ｍ）またはこれと等量のコンドロイチナーゼＡＢＣ、ＡＣ−ＩまたはＢで消化したＳＳ−ＣＳ／ＤＳ消化物を各ウェルに入れ、一晩３７℃でインキュベートした。イカ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ｅをポジティブコントロールとした。
Ｅ１６マウス胚から単離した海馬ニューロンを１０，０００細胞／ｍｍ２の密度で該カバーガラス上に分散させ、イーグル最小必須培地中にてＣＯ２５％下で３７℃、２４時間培養した。その後、細胞を固定化してニューロフィラメント（ＮＦ）と微小管関連タンパク質（ＭＡＰ２）に対するモノクローナル抗体を用いて免疫染色を行なった。
各々のカバーガラスの免疫染色された細胞を顕微鏡下でカウントした。無作為に選択した細胞の最も長い神経突起の長さと神経突起の数は、画像分析ソフトウェア（ＭａｃＳＣＯＰＥ；三谷商事（株）、福井、日本）を使用して測定した。
＜結果＞
神経突起伸長促進活性を、伸長した最長の神経突起の長さで示すと、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳの３標品（Ｎａｔｉｖｅ、１．０Ｍ、１．５Ｍ）で神経突起伸長促進が認められ、いずれもＣＳ−Ｅより上回っていた（図７−１Ａ）。
また、神経突起伸長促進活性は、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（Ｎａｔｉｖｅ）、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．５Ｍ）、次いでＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．０Ｍ）の順で高かった。
ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（Ｎａｔｉｖｅ）をコートしたカバーガラス上で培養したニューロンは、コントロールとしたＰ−ＯＲＮコートのみのカバーガラス上で培養した細胞（図７−２Ｅ）に比べて、神経突起が伸長している様子が観察された（図７−２Ｄ）。
また、ＳＳ−ＣＳ／ＤＳの３標品（Ｎａｔｉｖｅ、１．０Ｍ、１．５Ｍ）上で培養した細胞では、１細胞あたり平均３本以上の神経突起があった（図７−１Ｃ）。
ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（Ｎａｔｉｖｅ）の構造と神経突起伸長促進活性の関係を調べるために、コンドロイチナーゼＡＢＣ、ＡＣ−ＩまたはＢで消化物について神経突起伸長促進活性を評価した。その結果全ての消化物で、神経突起伸長促進活性が消失した（図７−１Ｂ）。従って、ＣＳ様構造とＤＳ様構造が共に活性に関与していると考えられる。
【実施例７】実施例７  抗ファクターＩＩａ活性測定
＜方法＞
抗ファクターＩＩａ活性は、１〜１０μｇ／ｍｌのＳＳ−ＣＳ／ＤＳの３標品（Ｎａｔｉｖｅ、１．０Ｍ、１．５Ｍ）を含む２２７ｍＭ  ＮａＣｌ含有５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー１００μｌ（ｐＨ８．３）と、正常ヒト血漿６０μｌとヒトトロンビン（１．２ＮＩＨ単位／ｍｌ）４０μｌとを、１分間２５℃でインキュベートすることによって測定した（Ｓａｋａｉ，Ｓら（２００３）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３３８，２６３−２６９）。トロンビンのアミドリティック（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ）活性は、１．９μｍｏｌ／ｍｌ  ｃｈｒｏｍｏｚｙｍ  ＴＨを１００μｌを添加後、１００秒間４０５ｎｍで、吸光度の変化を測定することにより決定した。吸光度の変化率は、残存トロンビン活性と比例していた。ブタの皮膚由来のヘパリンおよびデルマタン硫酸をポジティブコントロールとした。
＜結果＞
ＳＳ−ＣＳ／ＤＳの３標品（Ｎａｔｉｖｅ、１．０Ｍ、１．５Ｍ）で、ポジティブコントロールと同等のトロンビン活性阻害を示した。ＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（Ｎａｔｉｖｅ）は、他の２つのＳＳ−ＣＳ／ＤＳ（１．０Ｍ、１．５Ｍ）よりわずかに高い抗ファクターＩＩａ活性を示した（図８）。
【実施例８】実施例８  ヌタウナギ脊索からのコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖画分の分離
＜方法＞
ヌタウナギ（ｈａｇｆｉｓｈ）Ｅｐｔａｔｒｅｔｕｓ ｂｕｒｇｅｒｉの脊索（ｎｏｔｏｃｈｏｒｄ）をアセトンで処理し、懸濁液にプロナーゼを添加し消化した。２０％のトリクロロ酢酸を加えて遠心分離し、タンパク質を沈殿させ、上清を回収した。２倍量の２．５％酢酸カルシウム含有のエタノールを加えてグリコサミノグリカンを沈殿させた。グリコサミノグリカン混合物はＤｏｗｅｘ１−Ｃ１−カラムを通して、ＮａＣｌ溶液にてステップワイズに溶出し、２．０Ｍ画分についてＳｈｉｖｅｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｒｎａｄの方法に従いヘパラン硫酸を除去した。亜硝酸処理後、０．５ＭのＮａ２ＣＯ３で中和して、セファデックスＧ−５０カラム（１ｘ５６ｃｍ）で脱塩した。脱塩したグリコサミノグリカン画分から遊離のペプチドを除去するために、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジカラムに通して、水で溶出した。
＜結果＞
精製の結果、２．０Ｍ  ＮａＣｌで溶出された画分にコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖（ＣＳ／ＤＳ鎖）が含まれていた。ヌタウナギ（ｈａｇｆｉｓｈ）Ｅｐｔａｔｒｅｔｕｓ ｂｕｒｇｅｒｉの脊索（ｎｏｔｏｃｈｏｒｄ）からこのように単離したＣＳ／ＤＳ鎖を、ここではＨＮ−ＣＳ／ＤＳと呼ぶことにする。
【実施例９】実施例９  分子量決定
＜方法＞
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（１０×３００ｍｍ）のゲル濾過でコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッドＣＳ／ＤＳ鎖の分子サイズを測定した。ＨＮ−ＣＳ／ＤＳをカラムにロードし、０．３ｍｌ／分の流速で０．２Ｍの酢酸アンモニウムで溶出した。３分間の溶出分を１画分に回収し、蒸発乾燥して、１００μｌ水で溶解した。測定は既報（Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ（１９８７）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６１，１０３−１０８）に従った。
＜結果＞
ＨＮ−ＣＳ／ＤＳの分子をゲルろ過カラムクロマトグラフィーにて調べたところ、ＨＮ−ＣＳ／ＤＳの平均分子量は１８ｋＤａでブタの皮膚由来デルマタン硫酸（１９ｋＤａ）やウナギ皮膚由来デルマタン硫酸（１４ｋＤａ）に近いものであった。
【実施例１０】実施例１０  二糖組成分析
＜方法＞
酵素消化
二糖組成分析は、コンドロイチナーゼＡＢＣ、ＢまたはＡＣ−Ｉの消化物を分析することにより行なった。
０．５μｇのＨＮ−ＣＳ／ＤＳを、１０ｍＩＵのコンドロイチナーゼＡＢＣ、５ｍＩＵのコンドロイチナーゼＡＣ−Ｉ、または１ｍＩＵのコンドロイチナーゼＢのいずれかで消化し、各々の消化物を既報（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，Ａ．，Ｓｕｇａｈａｒａ，Ｋ（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９，３６７−３７８）に従って２−アミノベンズアミド（２ＡＢ）で標識した（過剰な２ＡＢは水：クロロホルム１：１（ｖ／ｖ）混合物で除去した）。
２ＡＢで標識した二糖は、１６ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４４００μｌで希釈し、陰イオン交換ＨＰＬＣ（１６ｍＭおよび５３０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４の溶媒を使用したＰＡ−０３シリカカラム）によって分析した。
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅカラムを用いたＨＮ−ＣＳ／ＤＳのコンドロイチナーゼ消化物のゲルろ過分析
ＨＮ−ＣＳ／ＤＳを、コンドロイチナーゼＡＢＣ、ＡＣ−ＩあるいはＢで消化した。
それぞれの消化物を２ＡＢで標識し、７％１−プロパノール含有０．２Ｍ重炭酸アンモニウムにて溶解し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅカラムを使い、蛍光検出にて分析した（流速０．４ｍｌ／分）。
＜結果＞
ＨＮ−ＣＳ／ＤＳの主要構成成分は、ΔＨｅｘＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（ΔＤｉ−ｄｉＳＥ）、ΔＨｅｘＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）（ΔＤｉ−４Ｓ）であった。また、ΔＨｅｘＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）（ΔＤｉ−６Ｓ）、ΔＨｅｘＵＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（ΔＤｉ−０Ｓ）、ΔＨｅｘＵＡ（２Ｓ）α１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）（ΔＤｉ−ｔｒｉＳ）も含まれていた（表６）。
【表６】
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【実施例１１】実施例１１  種々の増殖因子との相互作用分析
＜方法＞
ＨＮ−ＣＳ／ＤＳと種々の増殖因子（ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１８、ＰＴＮ、ＭＫ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＶＥＧＦ）との相互作用分析は、ＢＩＡｃｏｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＡｃｏｒｅ社、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて行なった。カイネティックパラメータｋａ、ｋｄおよびＫｄは、ＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．１ソフトウェアを使用して算出した。
＜結果＞
結合親和性を決定するために、様々な濃度の増殖因子を、固定化したＨＮ−ＣＳ／ＤＳと相互作用させた。図９−１から図９−４に、ＨＮ−ＣＳ／ＤＳのＦＧＦ−２（Ａ）、ＦＧＦ−１０（Ｂ）（図９−１）、ＦＧＦ−１６（Ｃ）、ＦＧＦ−１８（Ｄ）（図９−２）、ＭＫ（Ｅ）、ＰＴＮ（Ｆ）（図９−３）、ＨＢ−ＥＧＦ（Ｇ）、ＶＥＧＦ（Ｈ）（図９−４）でのセンサーグラムを示した。
調べた全ての増殖因子は、増殖因子の典型的な結合パターンを示した。
調べた全ての増殖因子は、ＨＮ−ＣＳ／ＤＳと高親和性であることが明らかとなった（表７）。特にＦＧＦ−１８（Ｋｄ＝０．２ｎＭ）、ＦＧＦ−１０（Ｋｄ＝０．４ｎＭ）とＰＴＮ（Ｋｄ＝０．１７ｎＭ）で高い親和性を示した。
【表７】
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【実施例１２】実施例１２  神経栄養因子とＨＮ−ＣＳ／ＤＳの相互作用
＜方法＞
ＨＮ−ＣＳ／ＤＳとＢＤＮＦとＧＤＮＦの相互作用の分析は、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｊ  ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＡｃｏｒｅ社、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて行なった。ビオチン標識されたＨＮ−ＣＳ／ＤＳをストレプトアビジンでコートしたセンサ・チップ上に固定し、ＢＤＮＦとＧＤＮＦをそれぞれ種々の濃度で、センサ・チップ上に流した（高流速（６０μｌ／分））。結合相２分間、解離相３分間とした。カイネティックパラメータｋａ、ｋｄおよびＫｄは、ＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．１ソフトウェアを使用して算出した（表８）。
＜結果＞
【表８】
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ＨＮ−ＣＳ／ＤＳをセンサ・チップ上に固定し、ＢＤＮＦとＧＤＮＦをそれぞれ種々の濃度で、センサ・チップ上に流した際のセンサーグラムを図１０に示す。
ＨＮ−ＣＳ／ＤＳのＧＤＮＦへのアフィニティーはヘパラン硫酸（ＨＳ）とＧＤＮＦとのアフィニティーに比べて１０倍程度高く、ＢＤＮＦへのアフィニティーは３６０倍と顕著に高かった。これらの高い結合親和性はコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸あるいはＣＳ／ＤＳハイブリッド鎖構造が結合に重要ことを示唆している。
この神経栄養因子との高い結合親和性は初めて報告されたもので、ＨＳに比べて効率的な結合を示していることから、ＨＳとは異なる結合様式で働き、神経栄養因子の活性を調節していると推測される。
【実施例１３】実施例１３  神経突起成長促進作用の検討
＜方法＞
既述（Ｈｉｋｉｎｏ，Ｍら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，４３７４４−４３７５４，Ｆａｓｓｉｎｅｒ，Ａら（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２６，７８３−７９９）の通り実施した。カバーガラスを３７℃で２時間、１．５μｇ／ｍｌポリＤＬ−オルニチン（Ｐ−ＯＲＮ）６００μｌでコートし、０．７μｇのＨＮ−ＣＳ／ＤＳまたはコンドロイチナーゼＡＢＣ、ＡＣ−ＩまたはＢで消化したこれと等量の消化物を各ウェルに入れ、一晩３７℃でインキュベートした。イカ軟骨由来のＣＳ−Ｅをポジティブコントロールとした。
Ｅ１６マウス胚から単離した海馬ニューロンを１０，０００細胞／ｍｍ２の密度で該カバーガラス上に分散させ、イーグル最小必須培地中にてＣＯ２５％下で３７℃、２４時間培養した。その後、細胞を固定化してニューロフィラメント（ＮＦ）と微小管関連タンパク質（ＭＡＰ２）に対するモノクローナル抗体を用いて免疫染色を行なった。
各々のカバーガラスの免疫染色された細胞を顕微鏡下でカウントした。無作為に選択した細胞の最も長い神経突起の長さと神経突起の数は、画像分析ソフトウェア（Ｍａｃ  ＳＣＯＰＥ；Ｍｉｔａｎｉ  Ｃｏｒｐ．、東京、日本）を使用して測定した。
＜結果＞
神経突起伸長促進活性を、伸長した最長の神経突起の長さで示すと、コントロールに比べ神経突起伸長促進が認められた（図１１−２Ｃ）。
ＨＮ−ＣＳ／ＤＳをコートしたカバーガラス上で培養したニューロンは、コントロールとしたＰ−ＯＲＮのみをコートしたカバーガラス上で培養した細胞（図１１−１Ｂ）に比べて、神経突起が伸長している様子が観察された（図１１−１Ａ）。
ＨＮ−ＣＳ／ＤＳの構造と神経突起伸長促進活性の関係を調べるために、コンドロイチナーゼＡＢＣ、ＡＣ−ＩまたはＢで処理した消化物について神経突起伸長促進活性を評価した。その結果コンドロイチナーゼＡＢＣ消化物で、神経突起伸長促進活性が消失した。一方、コンドロイチナーゼＡＣ−ＩまたはＢによる分解でも、コンドロイチナーゼＡＢＣで消化したときよりは活性低下の程度は低かったが、はっきりと活性の低下が認められた（図１１−２Ｃ）。このことは、グルクロン酸を含むＣＳ様の構造とイズロン酸を含むＤＳ様の構造からなるＣＳ／ＤＳハイブリッド構造が神経突起伸長促進活性に関与していることを示している。
【産業上の利用可能性】  本発明により、種々の増殖因子に結合し、神経突起伸長促進作用および抗凝血作用を示す、新規コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖およびそれを含む画分が提供され、さらに、それを含んだ神経性治療用組成物を提供される。また、本発明のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖はサメ皮、ヌタウナギ等の硬骨魚類を除く魚類由来であり、魚類の有用な用途が本発明により見出された。
本明細書に引用されたすべての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【国際調査報告】
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