(57)【要約】  骨髄細胞の前駆細胞（progenitor）分画に脳移行性細胞が存在することを見出した。さらに、該脳移行性細胞の種々の特徴を明らかにした。該細胞は、血流に注入した後、血液循環し血流から直接脳実質内へ移行する。また、骨髄もしくは骨髄細胞から効率的に脳移行性細胞を調製し得る方法の開発に成功した。自己細胞を使った低侵襲な脳の標的化再生医療へ応用可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
未分化な細胞であって、脳移行活性を有することを特徴とする骨髄前駆細胞。
【請求項２】
未分化な細胞が、（ａ）ER-MP12陽性、および／または（ｂ）Lin陰性であることを特徴とする細胞である、請求項１に記載の骨髄前駆細胞。
【請求項３】
さらに、（ｃ）EpoR陽性であることを特徴とする、請求項２に記載の骨髄前駆細胞。
【請求項４】
前記細胞をレシピエントへ投与した際に、該細胞がレシピエント骨髄を経由せずに脳へ移行することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の骨髄前駆細胞。
【請求項５】
細胞が、脳実質内でG0/G1期で増殖が停止した状態で存在することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の骨髄前駆細胞。
【請求項６】
細胞が、脳実質内で神経系細胞への分化転換を起こさないことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の骨髄前駆細胞。
【請求項７】
血液脳関門通過能を有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の骨髄前駆細胞。
【請求項８】
骨髄もしくは骨髄細胞から調製される細胞分画であって、脳移行活性を有する細胞を実質的に含む骨髄前駆細胞分画。
【請求項９】
細胞成分が、ER-MP12陽性、および／またはLin陰性であることを特徴とする細胞である、請求項８に記載の細胞分画。
【請求項１０】
細胞成分が、さらにEpoR陽性であることを特徴とする細胞である、請求項９に記載の細胞分画。
【請求項１１】
細胞成分が、該細胞をレシピエントへ投与した際に、該細胞がレシピエント骨髄を経由せずに脳へ移行することを特徴とする細胞である、請求項８〜１０のいずれかに記載の細胞分画。
【請求項１２】
細胞成分が、脳実質内でG0/G1期で増殖が停止した状態で存在することを特徴とする細胞である、請求項８〜１０のいずれかに記載の細胞分画。
【請求項１３】
細胞成分が、脳実質内で神経系細胞への分化転換を起こさないことを特徴とする細胞である、請求項８〜１０のいずれかに記載の細胞分画。
【請求項１４】
細胞成分が血液脳関門通過能を有することを特徴とする細胞である、請求項８〜１０のいずれかに記載の細胞分画。
【請求項１５】
骨髄もしくは骨髄細胞から、骨髄前駆細胞または骨髄前駆細胞分画を分離する工程を含む、脳移行性細胞の取得方法。
【請求項１６】
未分化な細胞、または該細胞を実質的に含む細胞分画を分離する工程を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
未分化な細胞が、ER-MP12陽性、および／またはLin陰性であることを特徴とする細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
抗ER-MP12抗体を用いてER-MP12陽性細胞の分離を行い、および／またはLineage cocktailを用いてLin陰性細胞の分離を行う、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
さらに、EpoR陽性細胞、もしくは該細胞を実質的に含む細胞分画を分離する工程を含む、請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
抗EpoR抗体を用いてEpoR陽性細胞の分離を行う、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
さらに、WEHI-3B細胞の培養上清を添加して細胞を培養する工程を含む、請求項１５〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜７のいずれかに記載の骨髄前駆細胞、請求項８〜１４のいずれかに記載の細胞分画、または、請求項１５〜２１のいずれかに記載の方法によって取得される脳移行性細胞を含有する、脳送達用キャリア。
【請求項２３】
請求項２２に記載の脳送達用キャリアへ生理活性物質を含んで成る、脳移行性薬剤。
【請求項２４】
前記生理活性物質が、脳疾患治療効果を有する物質である、請求項２３に記載の脳移行性薬剤。
【請求項２５】
以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、生理活性物質を含有する脳移行性細胞の製造方法。
（ａ）骨髄もしくは骨髄細胞から、請求項１５〜２１のいずれかに記載の方法により、脳移行性細胞を取得する工程、
（ｂ）工程（ａ）の脳移行性細胞内へ、生理活性物質を導入する工程
【請求項２６】
前記生理活性物質が、脳疾患治療効果を有する物質である、請求項２５に記載の製造方法。
【請求項２７】
前記生理活性物質が核酸である、請求項２５または２６に記載の製造方法。
【請求項２８】
以下の（ａ）〜（ｄ）から少なくとも２以上を構成要素として含む、脳移行性細胞の調製用キット。
（ａ）抗ER-MP12抗体
（ｂ）Lineage cocktail
（ｃ）抗EpoR抗体
（ｄ）骨髄細胞を培養するための培地
【請求項２９】
以下の（ａ）および（ｂ）を構成要素として含む、生理活性物質を含有する脳移行性細胞の製造用キット。
（ａ）請求項１〜７のいずれかに記載の骨髄前駆細胞、または請求項８〜１４のいずれかに記載の細胞分画
（ｂ）請求項１〜７のいずれかに記載の骨髄前駆細胞を培養するための培地
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳移行活性を有する細胞、および該細胞の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高次機能中枢をつかさどる脳は、血液脳関門と呼ばれるバリヤー構造によって物質や細胞の輸送を制限されている。そのため外科的手術を除いては効果的に治療を行い難い部位であった。また、血流中を循環する単球などの白血球を採取し成体動物に移植を行っても、血液脳関門が外的因子によって破綻した場合を除いて脳実質内へ移行しないことが知られている（非特許文献１参照）。一方、脳にはマクロファージ様の細胞としてマイクログリアが存在しているが、新生仔脳より単離したマイクログリアを血液中に注入すると脳特異的な浸潤移行をすることが知られている（非特許文献２参照）。しかしマイクログリアは脳実質内の細胞であり、現在までのところ大量のマイクログリアを得るためには脳を培養する方法でしか得ることができない。【０００３】
近年の研究から、成体造血におけるリザーバーの役割を担う骨髄から骨髄細胞を採取し移植すると、ドナーに由来した細胞の一部が脳実質内に移行することが明らかとなってきた（非特許文献３〜７参照）。これら報告の多くは、あらかじめ放射線照射により宿主骨髄細胞を除いた後、骨髄移植を行うと移植後数ヶ月で宿主骨髄中にドナー骨髄幹細胞が定着し、脳実質内にも数多くのドナー由来細胞が見られるというものである。これらの報告の中には脳へ移行した骨髄細胞の一部が神経細胞やグリア細胞といった本来とは起源の異なる細胞へ分化転換（trans-differentiation）することも報告されてきている（非特許文献４〜６参照）。また、骨髄細胞中に含まれる間葉系細胞の一部に培養下において神経系細胞や肝細胞などに分化転換できる細胞が存在していることが知られている（非特許文献８、９参照）。しかし、放射線照射することにより血液脳関門が破綻することも報告されており（非特許文献１０参照）、骨髄中のどのような分画の細胞が脳実質内へ移行し、また脳移行性細胞が移植後どの時期に脳実質内へ移行するのかは明らかとなっていない。【０００４】
【非特許文献１】Imai, F., Sawada, M., Suzuki, H. et al. Neurosci Lett 237 1 pp.49-52 (1997)
【非特許文献２】Sawada, M., Imai, F., Suzuki, H., et al. FEBS Lett 433 1-2 pp.37-40 (1998)
【非特許文献３】Ono K, Takii T, Onozaki K, et al. Biochem Biophys Res Commun 262 3 pp.610-4 (1999)
【非特許文献４】Mezey, E., Chandross, K. J., Harta, G., et al. Science 290 5497 pp.1779-82 (2000)
【非特許文献５】Brazelton, T. R., Rossi, F. M., Keshet, G. I. et al. Science 290 5497 1775-9 (2000)
【非特許文献６】Jiang, Y., Jahagirdar, B. N., Reinhardt, R. L. et al. Nature 418 6893 pp.41-9 (2002)
【非特許文献７】Nakano, K., Migita, M., Mochizuki, H. et al. Transplantation 71 12 pp.1735-40 (2001)
【非特許文献８】Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J. et al. J Neurosci Res 61 4 pp.364-70 (2000)
【非特許文献９】Schwartz, R. E., Reyes, M., Koodie, L. et al. J Clin Invest 109 10 pp.1291-302 (2002)
【非特許文献１０】Monje, M. L., Mizumatsu, S., Fike, J. R. et al. Nat Med 8 9 pp.955-62 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は脳移行活性を有する細胞を同定し、該細胞を効率的に取得可能な方法の開発である。より詳しくは、脳移行性細胞、および該細胞の調製方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。まず本発明者はマウス骨髄細胞の前駆細胞（progenitor）分画に脳移行性（脳指向性）細胞が存在することを見出した。この細胞は血液脳関門を破綻させないマイルドな条件下で移植を行ったところ、移植後早期から脳実質内へ移行したため、移植後１〜２週間で他臓器に出現が確認できる移植細胞由来の細胞とは異なり、ホスト骨髄を経由せず直接脳に移行したと考えられた。
通常、骨髄移植を行うとドナー由来骨髄細胞がレシピエント骨髄に定着し、定着した骨髄による造血により、様々な末梢組織へ血球系細胞が供給される。そのため組織選択的に細胞を送り出すことは難しく、少なくとも骨髄を経由することによる影響を考える必要性があった。本発明における骨髄に由来する脳移行性細胞を用いれば、血流に注入した後、血液循環し血流から直接脳実質内へ移行しているため、骨髄を経由することによる影響を考える必要性がない。【０００７】
また報告されている骨髄移植後に脳内に見られる細胞の多くは脳内において増殖しているが、本発明の細胞は脳実質内でG0/G1期にarrestし、増殖を停止した状態で存在する。また、比較的未分化な性質を維持し、神経系細胞への分化転換を起こさなかった。数ヶ月にわたり脳実質内で安定に存在することが確認できたが、細胞数は経時的に減少した。例えば、移植後１８週のマウス脳内においてもGFP発現細胞は確認できたが、移植後４週までと比べ極めて細胞数が少ないことから、脳へ移行した細胞は幹細胞ではないため一過性に脳内に存在していると考えられた。薬物治療や遺伝子治療を行う場合に問題となる投与量や発現の制御が比較的行いやすいと考えられる。【０００８】
本発明者はこの細胞を分離・同定する手段について検討を行い、有効な手段を発見した。本発明者によって見出されたこの技術は、自己細胞を使った低侵襲な脳の標的化再生医療へ応用ができると考えられる。【０００９】
本発明者は、骨髄から取得される細胞の中から、上述のように脳移行活性を有する細胞（脳移行性骨髄前駆細胞）を見出し、さらに鋭意研究の結果、該細胞の特徴を見出すことに成功した。そして該特徴を利用することにより、骨髄から効率的に脳移行性細胞を調製し得る方法の開発に成功し、本発明を完成させた。【００１０】
即ち本発明は、脳移行性細胞、より詳しくは、骨髄から取得される脳移行性骨髄前駆細胞、および該細胞の調製方法に関し、より具体的には、
〔１〕  未分化な細胞であって、脳移行活性を有することを特徴とする骨髄前駆細胞、
〔２〕  未分化な細胞が、（ａ）ER-MP12陽性、および／または（ｂ）Lin陰性であることを特徴とする細胞である、〔１〕に記載の骨髄前駆細胞、
〔３〕  さらに、（ｃ）EpoR陽性であることを特徴とする、〔２〕に記載の骨髄前駆細胞、
より好ましい態様としては、
〔３ｂ〕さらに、（ｄ）CD13陽性であることを特徴とする、上記骨髄前駆細胞、
〔４〕  前記細胞をレシピエントへ投与した際に、該細胞がレシピエント骨髄を経由せずに脳へ移行することを特徴とする、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の骨髄前駆細胞、
〔５〕  細胞が、脳実質内でG0/G1期で増殖が停止した状態で存在することを特徴とする、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の骨髄前駆細胞、
〔６〕  細胞が、脳実質内で神経系細胞への分化転換を起こさないことを特徴とする、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の骨髄前駆細胞、
〔７〕  血液脳関門通過能を有することを特徴とする、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の骨髄前駆細胞、
〔８〕  骨髄もしくは骨髄細胞から調製される細胞分画であって、脳移行活性を有する細胞を実質的に含む骨髄前駆細胞分画、
〔９〕  細胞成分が、ER-MP12陽性、および／またはLin陰性であることを特徴とする細胞である、〔８〕に記載の細胞分画、
〔１０〕  細胞成分が、さらにEpoR陽性であることを特徴とする細胞である、〔９〕に記載の細胞分画、
より好ましい態様としては、
〔１０ｂ〕  細胞成分が、さらにCD13陽性であることを特徴とする細胞である、上記細胞分画、
〔１１〕  細胞成分が、該細胞をレシピエントへ投与した際に、該細胞がレシピエント骨髄を経由せずに脳へ移行することを特徴とする細胞である、〔８〕〜〔１０〕のいずれかに記載の細胞分画、
〔１２〕  細胞成分が、脳実質内でG0/G1期で増殖が停止した状態で存在することを特徴とする細胞である、〔８〕〜〔１０〕のいずれかに記載の細胞分画、
〔１３〕  細胞成分が、脳実質内で神経系細胞への分化転換を起こさないことを特徴とする細胞である、〔８〕〜〔１０〕のいずれかに記載の細胞分画、
〔１４〕  細胞成分が血液脳関門通過能を有することを特徴とする細胞である、〔８〕〜〔１０〕のいずれかに記載の細胞分画、
〔１５〕  骨髄もしくは骨髄細胞から、骨髄前駆細胞または骨髄前駆細胞分画を分離する工程を含む、脳移行性細胞の取得方法、
〔１６〕  未分化な細胞、または該細胞を実質的に含む細胞分画を分離する工程を含む、〔１５〕に記載の方法、
〔１７〕  未分化な細胞が、ER-MP12陽性、および／またはLin陰性であることを特徴とする細胞である、〔１６〕に記載の方法、
〔１８〕  抗ER-MP12抗体を用いてER-MP12陽性細胞の分離を行い、および／またはLineage cocktailを用いてLin陰性細胞の分離を行う、〔１７〕に記載の方法、
〔１９〕  さらに、EpoR陽性細胞、もしくは該細胞を実質的に含む細胞分画を分離する工程を含む、〔１６〕〜〔１８〕のいずれかに記載の方法、
〔２０〕  抗EpoR抗体を用いてEpoR陽性細胞の分離を行う、〔１９〕に記載の方法、
より好ましい態様としては、
〔２０ｂ〕  さらに、CD13陽性細胞、もしくは該細胞を実質的に含む細胞分画を分離する工程を含む、上記方法、
〔２０ｃ〕  抗CD13抗体を用いてCD13陽性細胞の分離を行う、上記方法、
〔２１〕  さらに、WEHI-3B細胞の培養上清を添加して細胞を培養する工程を含む、〔１５〕〜〔２０〕のいずれかに記載の方法、
〔２２〕  〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の骨髄前駆細胞、〔８〕〜〔１４〕のいずれかに記載の細胞分画、または、〔１５〕〜〔２１〕のいずれかに記載の方法によって取得される脳移行性細胞を含有する、脳送達用キャリア、
〔２３〕  〔２２〕に記載の脳送達用キャリアへ生理活性物質を含んで成る、脳移行性薬剤、
〔２４〕  前記生理活性物質が、脳疾患治療効果を有する物質である、〔２３〕に記載の脳移行性薬剤、
〔２５〕  以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、生理活性物質を含有する脳移行性細胞の製造方法、
（ａ）骨髄もしくは骨髄細胞から、〔１５〕〜〔２１〕のいずれかに記載の方法により、脳移行性細胞を取得する工程、
（ｂ）工程（ａ）の脳移行性細胞内へ、生理活性物質を導入する工程
〔２６〕  前記生理活性物質が、脳疾患治療効果を有する物質である、〔２５〕に記載の製造方法、
〔２７〕  前記生理活性物質が核酸である、〔２５〕または〔２６〕に記載の製造方法、
〔２８〕  以下の（ａ）〜（ｄ）から少なくとも２以上を構成要素として含む、脳移行性細胞の調製用キット、
（ａ）抗ER-MP12抗体
（ｂ）Lineage cocktail
（ｃ）抗EpoR抗体
（ｄ）骨髄細胞を培養するための培地
上記キットは、さらに（ｅ）抗CD13抗体を含めることができる、
〔２９〕  以下の（ａ）および（ｂ）を構成要素として含む、生理活性物質を含有する脳移行性細胞の製造用キット、
（ａ）〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の骨髄前駆細胞、または〔８〕〜〔１４〕のいずれかに記載の細胞分画
（ｂ）〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の骨髄前駆細胞を培養するための培地
を、提供するものである。
さらに本発明は、以下に関する。
〔３０〕  以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む方法によって調製されることを特徴とする、脳移行活性を有する骨髄前駆細胞、
（ａ）  骨髄もしくは骨髄細胞から、骨髄前駆細胞または骨髄前駆細胞分画を分離する工程
（ｂ）  未分化な細胞、または該細胞を実質的に含む細胞分画を分離する工程
（ｃ）  EpoR陽性および/またはCD13陽性細胞、もしくは該細胞を実質的に含む細胞分画を分離する工程
（ｄ）  WEHI-3B細胞の培養上清を添加して細胞を培養する工程
〔３１〕  前記骨髄前駆細胞、前記脳移行用キャリア、または前記脳移行性薬剤を個体（患者等）へ投与する工程を含む、脳疾患の治療方法、
〔３２〕  前記骨髄前駆細胞または前記脳移行用キャリアの、脳移行性薬剤（脳疾患治療薬）の製造における使用、
〔３３〕  前記骨髄前駆細胞、前記脳移行用キャリア、または前記脳移行性薬剤、および、薬学的に許容された担体を含んでなる組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】マウスの血液脳関門におけるエバンスブルー色素の血管外漏出について示す写真である。正常B6マウス（A）、5-FU処理を行ったB6マウス（B）、注射針にて物理的損傷を作製したB6マウス（C）の大脳皮質の蛍光観察像を示す。A、Bのマウスでは色素の漏出は見られないが、Cのマウスでは顕著な色素の漏出を示した。矢印頭は針跡を示す。スケールバーは40μmを示す。
【図２】骨髄移植後７日目のマウス組織におけるGFP発現細胞を示す写真である。移植後７日目マウスの脳、肝臓、脾臓、肺を蛍光下観察した像（A、C、E、G）と同一切片をヘマトキシリンエオジン染色した染色像（B、D、F、H）を示す。矢印は同一細胞を示し、スケールバーは40μmを示す。
【図３】移植後７日目のマウスにおける骨髄及び組織へ移行したGFP発現細胞の相関性について示すグラフである。肝臓や脾臓などの末梢組織では正の相関が見られたのに対して、脳においては相関が全く見られなかった。
【図４】GFP発現細胞の組織内分布に関する経時的解析の結果を示すグラフである。上段２つのグラフは、骨髄および末梢血液におけるGFP発現細胞分布の経時的変化を示す。下段のグラフは、各組織（脳、肝臓、脾臓、肺、腎臓、胸腺、筋肉）におけるGFP発現細胞分布の経時的変化（4週目、6週目、18週目）を示すグラフである。
【図５】GFP発現細胞の脳移行時期に関する解析結果を示す写真である。（A）移植後１〜５日目にかけてのGFPの組織内分布（脳、肝臓、脾臓、肺、GBMCs）について調べた結果を示す写真である。（B）頸動脈から細胞を移植し、15分、２日、７日後のGFP発現細胞の分布（脳左半球、脳右半球、肝臓、脾臓、肺、GBMCs）について調べた結果を示す写真である。（C）頸動脈移植後１５分後の脳の検鏡像を示す写真である。矢印はGFP発現細胞を示し、写真左はGFPの蛍光像、写真中はER-MP12染色像、写真右はヘマトキシリンエオジン染色像を示す。スケールバーは40μmを示す。
【図６】脳へ移行した細胞の未分化骨髄細胞マーカーの発現について示す写真である。移植後７日目の脳を未分化骨髄細胞マーカーとして知られるER-MP12やEpoRに対する抗体で３重染色を行った。GFP発現細胞の一部はGFP陽性ER-MP12陽性EpoR陽性を示した（左）。矢印はGFP発現細胞を示す。組織へ移行したGFP発現細胞のmRNAについて調べると脳に移行した細胞ではEpoRの発現が見られた（右）。
【図７】移植後７日目の全脳を用いた混合グリア培養（mixed glial culture）の結果を示すグラフである。移植後７日目の脳を酵素処理により細胞を分散させ培養した。培養前と培養後のGFP発現細胞のDNA contentsを調べた（左）。増殖因子添加系にて２８日間培養するとGFP発現細胞は顕著に増加した（右）。
【図８】移植後７日目の脳に見られるGFP発現細胞における神経系細胞マーカーの発現結果を示す写真である。神経幹細胞のマーカーであるNestin、アストロサイトのマーカーであるGFAP、成熟神経細胞のマーカーであるMAP-2について発現を調べた。矢印は同一細胞を示し、スケールバーは40μmを示す。
【図９】移植数ヶ月後の脳内におけるGFP発現細胞を示す写真である。造血系細胞のマーカーであるCD45が陽性であり、未分化細胞のマーカーを発現したものも一部見られた。神経系細胞マーカーを発現したものは見られなかった。
【図１０】Lineage陽性/陰性分画の分離に関する図である。
【図１１】Lineage陽性/陰性分画の移植結果を示すグラフである。Lineage陽性分画と陰性分画とに分離後、移植を行った。移植後３日におけるGFP発現細胞の組織内（脳、肝臓、脾臓、肺、腎臓、胸腺、筋肉）分布を調べた。グラフは、上が分画前細胞を移植したもの、中央がLineage陽性細胞を移植したもの、下がLineage陰性細胞を移植したものである。
【図１２】WEHI-3B細胞培養上清添加系による骨髄細胞の表面抗原発現の変化について示すグラフである。培養後０-７日における表面抗原についてFACSを用いて解析した。ヒストグラムに示した数字は、陽性率を示す。
【図１３】ER-MP12陽性/陰性分画の分離と移植結果を示すグラフおよび写真である。MACSによりER-MP12陽性分画と陰性分画に分離し（上段）、尾静脈より移植を行った。ER-MP12陽性分画では脳へ移行する細胞の割合が増大し、末梢組織へ移行する割合が減少した。
【図１４】GFP発現骨髄細胞からLin陰性分画を分離し、造血系細胞マーカーであるCD45に対する染色を行い、FACSを用いて解析した結果を示す図である。主に左側にシグナルピークを有するヒストグラムは一次抗体なしを、右側にシグナルピークを有するヒストグラムは一次抗体有りを、それぞれ表す。99〜100%の細胞がCD45を示している。
【図１５】Lin陰性分画骨髄細胞の増殖を示す写真および図である。(A)WEHI-CM (IL-3を多く含有)にてLin陰性分画と陽性分画の培養を行った。(B)WEHI-CM添加（一番上の線）およびrmEPO刺激（中間の線）におけるLin陰性分画の増殖についてWSTアッセイを用いて調べた。一番下の線は無刺激を示す。
【図１６】Lin陰性骨髄細胞を抗EpoR抗体および抗ER-MP12抗体にて染色を行った際の、蛍光観察像(A)とFACSの解析結果(B)を示す図および写真である。Hoechst33342により核染色を行った。倍率は400倍。
【図１７】Lin陰性骨髄細胞移植時に脳内移行したGFP発現細胞における未分化骨髄細胞マーカーの発現について解析した結果を示す写真および図である。Aは、GFP陽性Lin陰性骨髄細胞移植時の脳及び肝臓におけるER-MP12抗原の発現を示す写真である。Bは、GFP発現細胞に発現がみられる未分化骨髄細胞マーカーの発現割合を示すグラフである。
【図１８】成熟動物脳由来の混合グリア培養(Mixed Glial Culture)を示す写真である。成熟動物脳由来のmixed glial cultureを作製し、抗CD11b抗体(緑色）とHoechst33342(青色）にて染色したものの微分干渉像を左の上図で示し、蛍光像を左の下図で示す。ラミファイドミクログリアが多く確認できた。また、GFP発現骨髄細胞を成熟動物に静脈より移植し、7日目に同様の手法により混合グリア培養(Mixed glial culture)を作製したものの蛍光像を右図に示す。ラミファイド様の骨髄由来細胞が多数確認できた。
【図１９】混合グリア培養(Mixed glial culture)中のGFP発現細胞における抗原の発現について解析した結果を示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明者は、骨髄細胞から調製される細胞分画に含まれる細胞が、脳移行活性を有することを見出した。【００１３】
本発明は、脳移行活性を有する骨髄細胞、または骨髄もしくは骨髄細胞から調製される脳移行活性を有する細胞もしくは該細胞を実質的に含有する細胞分画を提供する。【００１４】
本発明において骨髄細胞（BMC; bone marrow cell）とは、骨髄に存在する細胞（細胞群、細胞集団）を言う。骨髄細胞とは大きく分けると、造血系細胞とこれらの細胞を支持するストローマ等の間葉系細胞から構成される。「骨髄前駆細胞」を狭義でとらえると造血系細胞における前駆細胞を示すが、広義でとらえると間葉系前駆細胞も含まれるものと解釈される場合がある。本発明の細胞の好ましい態様においては、移植前移植後において造血系細胞のマーカーであるCD45陽性を示すことから、好ましくは、本発明の骨髄前駆細胞には、間葉系細胞が含まれない。また、本発明において「骨髄細胞」は、骨髄系細胞、骨髄性細胞とも呼ばれる場合がある。【００１５】
「骨髄」とは通常、骨組織の内部の破骨細胞によって形成された腔（骨髄腔）に存在する組織であり、主要な造血組織である。骨髄は、血液細胞、ストロマ細胞、脂肪細胞、骨芽および破骨細胞、血液内皮細胞、神経組織等の細胞成分と、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン等の細胞外マトリックス成分より構成される。従って、本発明における「骨髄細胞」とは、通常、骨髄における細胞成分を指すものと換言することができる。【００１６】
本発明の細胞の調製には、骨髄および骨髄細胞の双方を出発材料として用いることができる。【００１７】
また、コラーゲンを含む細胞の凝集塊は、脳移行性細胞調製の前にナイロンメッシュに通して、除いておくことも可能である。ただし、該メッシュを通過するコラーゲンなどのマトリックス成分を予め除いておくことは、必ずしも必須ではない。例えば、骨髄から該骨髄の細胞外成分を除いた骨髄細胞への調製は、以下のような方法によって実施することができるが必ずしも下記の方法に限定されない。
（１）大腿骨を採取し両端を切除する。
（２）片端から注射針付きシリンジを差し込みbufferで細胞を押し出す。
（３）バッファー中の骨髄細胞を遠心により集め、NH4Clバッファーにより赤血球を除く。
（４）二度のバッファーによる洗浄後ナイロンメッシュに通し透過した細胞を骨髄細胞として本発明の脳移行性細胞の調製に用いる。【００１８】
本発明の骨髄細胞は、通常、哺乳類の骨髄から採取される。骨髄細胞を採取する哺乳類としては、骨髄を有する動物であれば特に制限されず、ヒト、サル、マウス、ラット等を例示することができるが、好ましくはヒトである。また、本発明の一つの態様としては、本発明の細胞を投与すべき動物（レシピエント）と、採取される動物（ドナー）とは、同一種であることが好ましい。また、例えば、ヒトに対して本発明の細胞を使用する場合には、本発明の細胞は、対象となるヒト自身の骨髄から採取された細胞（由来）であることが、最も好ましい。【００１９】
本発明における脳移行活性を有する骨髄細胞は、好ましくは、骨髄細胞におけるprogenitor分画（骨髄前駆細胞分画）に含まれる細胞（骨髄前駆細胞、骨髄progenitor細胞）である。（本発明においては、前記細胞を「骨髄前駆細胞」と記載する場合あり）【００２０】
本発明の脳移行活性を有する骨髄前駆細胞の特徴の一つとしては、未分化な細胞であることを挙げることができる。従って本発明は、未分化な細胞であって、脳移行活性を有することを特徴とする骨髄前駆細胞を提供する。【００２１】
骨髄中の血球系細胞は幹細胞、前駆細胞を経て終末分化し、単球やマクロファージなどの血液細胞となることが知られている。前駆細胞は複数の細胞集団に分化できうる能力を持っており、分化段階が進むと細胞の運命付けが行われ、顆粒球や単球などある特定の細胞になることしかできなくなる。本発明の脳移行性細胞は、通常、前記「特定の細胞」に発現する抗原に対する抗体を集めたLineage cocktailに対し陰性(Lin-)である。従って、本発明の脳移行性細胞は、通常、分化段階が進んでいない細胞であり、好ましくは、未分化な細胞である。即ち本発明の好ましい態様においては、前記「特定の細胞」に発現する抗原に対する抗体を集めたLineage cocktailを用いて、分化した細胞を除き、未分化な細胞集団の分離を行う。【００２２】
本発明の未分化な細胞は、例えば、以下のような特徴を有する。
（ａ）ER-MP12陽性 (ER-MP12+)、および／または
（ｂ）Lin陰性 (Lin-)【００２３】
未分化な本発明の細胞は、好ましくは、上記のいずれかの特徴を有するが、さらに好ましくは、上記の（ａ）および（ｂ）の両方の特徴を有する細胞である。【００２４】
また本発明者は、Lin陰性分画とLin陽性分画とをそれぞれ増殖因子存在下にて培養すると、Lin陰性分画は極めて高い増殖性を示すことを見出した。従って、本発明は、必ずしも必須ではないが、Lin陰性細胞分画に対し増殖因子を添加して培養することが、より好ましい。なお、受容体の異なる増殖因子によっても増殖させることが可能である。【００２５】
また、未分化な細胞には、通常、Sca-1、CD133等の細胞マーカーが発現していることから、本発明の未分化な細胞の一つの態様としては、Sca-1陽性、および／またはCD133陽性の特徴を有する細胞を挙げることができる。【００２６】
さらに本発明の脳移行性細胞の好ましい態様としては、（ｃ）EpoR陽性であることを特徴とする細胞である。本発明の脳移行性細胞は、通常、上述の（ａ）〜（ｃ）の中から少なくとも１以上の特徴を有する細胞であり、好ましくは、少なくとも２以上の特徴を有する細胞であり、より好ましくは上述の（ａ）〜（ｃ）の全ての特徴を有する細胞である。
さらに本発明の脳移行性細胞は、CD13陽性であることが好ましい。【００２７】
また、本発明の細胞の一つの態様としては、CD45が発現している細胞である。通常、間葉系細胞には、CD45の細胞マーカーは発現していないことから、本発明の脳移行性細胞の一つの態様としては、未分化な細胞であって、間葉系細胞ではない骨髄細胞である。即ち、本発明の好ましい態様においては、未分化な細胞であって、かつ、（ｄ）CD45陽性であることを特徴とする細胞である。【００２８】
また、本発明の骨髄前駆細胞は、例えば、以下のような特徴（機能）を有する。
(1) 本発明の細胞をレシピエント（ホスト）へ投与した際に、該細胞がホスト骨髄を経由せずに脳へ移行する機能を有する（移行することを特徴とする）
(2) 脳へ移行した際に、脳実質内でG0/G1期で増殖が停止した状態で存在する機能（特徴）を有する
(3) 細胞が、脳実質内で神経系細胞への分化転換を起こさない機能を有する（起こさないことを特徴とする）
(4) 血液脳関門通過能を有する【００２９】
これらの上記の特徴は、本発明者によって見出されたものである。【００３０】
一般に血液から脳組織内への物質の移行は、血液脳関門（blood-brain barrier; BBB）と呼ばれる仕組みによって制限されている。これによって脳は有害物質等から守られている。本発明において「脳移行活性」とは、細胞が生物（哺乳動物）体内へ投与（例えば、静脈投与等）された際に、該細胞が脳組織内へ移行する活性を言う。本発明の細胞は、通常、脳移行活性（脳移行性）を有する細胞であると表現することができるが、例えば、血液脳関門の通可能を有する細胞と表現することも可能である。【００３１】
なお、本発明における脳への移行とは、より具体的には、脳実質あるいは脳組織への移行を意味する。【００３２】
また、上記血液脳関門通過のメカニズムは、トランスマイグレーションによるものと推察することができる。従って、本発明の細胞は、例えば、トランスマイグレーション（トランスサイトーシス）誘導能を有する細胞と表現することも可能であるが、本発明の細胞は、必ずしも、該活性を有する細胞であるものと限定して解釈されない。【００３３】
上記「トランスマイグレーション」とは、ある分子が脳へ侵入する際に、血管内皮細胞の細胞間隙を通過するのではなく、血管内皮細胞内を通過する現象を言う。これは「trans-endothelial cell migration」、「trans cellular pathway」、もしくは「トランスサイトーシス」とも呼ばれ、このメカニズムによって血管内皮細胞を通過する分子（細胞等）は、その表面にシグナル分子を持ち、血管内皮細胞表面上にある受容体を介して血管内皮細胞に上記現象を誘導するものと考えられる。【００３４】
本発明において、細胞が脳移行活性を有するか否かは、例えば、マウス骨髄から細胞を取得した場合、被検細胞へマーカー遺伝子（例えば、GFP等）を導入した後、該細胞を尾静脈から投与し、脳において該マーカーの存在の有無を検出することにより、評価することができる。【００３５】
また本発明は、骨髄または骨髄細胞から、脳移行性細胞もしくは該細胞を実質的に含む細胞分画の調製（取得あるいは濃縮）方法に関する。即ち本発明は、骨髄もしくは骨髄細胞から、骨髄前駆細胞または骨髄前駆細胞分画を分離する工程を含む、脳移行性細胞の取得方法を提供する。また本発明は、該方法によって取得される脳移行性細胞、および脳移行性細胞を実質的に含有する細胞分画を提供する。本発明の細胞分画は、骨髄もしくは骨髄細胞から調製される細胞分画であって、本発明の細胞を実質的に含有する細胞分画（骨髄前駆細胞分画）である。なお、本発明の細胞分画中の細胞成分は、好ましくは、上述の各種特徴を有する。【００３６】
本発明者は、本発明の脳移行性細胞は、骨髄細胞における未分化な骨髄前駆細胞分画に存在することを見出した。従って、本発明の上記方法は、骨髄もしくは骨髄細胞から、未分化な細胞（分画）を調製する工程を含む方法である。【００３７】
未分化な細胞（分画）の調製は、例えば、未分化な細胞が有する特徴（細胞マーカー等）を利用して分離・回収することができる。例えば、分化した細胞に対する抗原を認識する抗体を集めたLineage cocktailを適宜利用することが可能である。【００３８】
また、未分化な骨髄細胞のマーカーであるER-MP12陽性を指標として、上記方法における未分化細胞（分画）を分離・回収することが可能である。例えば、抗ER-MP12抗体を用いてER-MP12陽性細胞の分離を行うことができる。【００３９】
さらに、未分化な細胞のマーカーである、Sca-1、CD133等を用いて、未分化な細胞（分画）を分離することができる。即ち、本発明の方法の好ましい態様においては、Sca-1陽性細胞、および／またはCD133陽性細胞を分離する工程を含む方法である。該工程は、例えば、抗Sca-1抗体、または抗CD133抗体を用いて、抗原・抗体反応を利用した一般的な分子生物学的技術によって実施することができる。【００４０】
また本発明の方法は、好ましくは、EpoR陽性細胞もしくは該細胞を実質的に含む細胞分画を分離する工程を含む方法であり、より好ましくは、該工程に加えて、上述の未分化な細胞もしくは該細胞を実質的に含む細胞分画を分離する工程を含む方法である。EpoR陽性細胞の分離は、例えば、抗EpoR抗体を用いて行うことができる。【００４１】
上述のLineage cocktail、または各種抗体を用いた本発明の方法の具体例としては、後述の実施例に記載の方法を挙げることができる。【００４２】
さらに本発明者は、培養下において骨髄由来ER-MP12陽性細胞を増幅させる条件について検討した結果、WEHI-3B細胞の培養上清添加系で数日間培養すると、ER-MP12陽性細胞が増幅することを見出した。【００４３】
従って、本発明の上記調製方法の好ましい態様においては、上述の工程に加えて、さらに、WEHI-3B細胞の培養上清を添加して細胞を培養する工程、を含む方法である。上記工程は、より詳しくは、ER-MP12陽性細胞もしくは該細胞を実質的に含む細胞分画へ、WEHI-3B細胞の培養上清を添加して、数日間培養する工程である。前記「数日間」とは、通常、３〜１４日間程度を指すが、好ましくは、５〜１０日間、より好ましくは６〜８日間、最も好ましくは７日間である。【００４４】
さらに本発明の方法の好ましい態様においては、上記の工程に加えて、CD45陽性細胞を分離する工程を含む方法である。該工程は、例えば、抗CD45抗体を用いて、抗原・抗体反応を利用した一般的な分子生物学的技術によって実施することができる。
さらに本発明の方法は、上述の工程に加えて、CD13陽性細胞を分離する工程を含む方法である。該工程は、例えば、抗CD13抗体を用いて、抗原・抗体反応を利用した一般的な分子生物学的技術によって実施することができる。【００４５】
また、本発明の方法において陽性細胞（分画）と陰性細胞（分画）との分離は、当業者においては、一般的な細胞分離技術、例えば、MACS、FACS等を用いて実施することができる。【００４６】
また、対象動物がマウス等の非ヒト動物である場合には、例えば、本発明の脳移行性細胞を以下のようにして取得することも可能である。【００４７】
一旦骨髄細胞全体または部分精製した細胞を対象動物へ移植し、１週間程度経過した後の脳から脳移行性細胞を含む細胞培養を作成し、移植によって脳に移行した外来性の脳移行性細胞を、WEHI-CMや骨髄前駆細胞に特異的に作用する種々の増殖因子存在下で培養し（元々脳に存在する未分化ミクログリア以外の神経やグリア細胞はこの条件では増殖しない）濃縮した細胞を調製する。本発明者によって、この細胞も再度移植すると脳移行性を示すことが確認された。なお、この方法の一例においては、移植する骨髄細胞にEGPFトランスジェニックマウス由来の骨髄細胞を使用することにより、外来細胞をEGPFの蛍光によって同定することができる。【００４８】
また本発明の脳移行性細胞を利用することにより、所望の物質（化合物）を、脳へ運搬させることが可能である。即ち、本発明の脳移行性細胞へ、所望の物質を導入する、もしくは該細胞と結合させることにより、該物質を脳へ移行させることが可能である。【００４９】
従って本発明は、本発明の脳移行性細胞（本発明の骨髄前駆細胞）、該細胞を実質的に含む細胞分画、または本発明の方法によって取得される細胞を有効成分として含有する、脳送達用キャリアを提供する。該キャリアは、「担体」あるいは「運搬体」と表現することも可能である。【００５０】
上記キャリアへ担持させる物質としては、特に制限されないが、通常、生理活性物質であることが好ましい。生理活性物質としては、例えば、脳において活性を有する物質であり、好ましくは、脳疾患（例えば、脳神経疾患等）に対して治療もしくは予防効果を有する物質である。該物質の一つの態様としては、DNA（ベクター等を含む）もしくはRNA（アンチセンスRNA、siRNA等を含む）等の核酸を好適に挙げることができる。例えば、脳疾患に対して治療効果を有するタンパク質をコードするDNAは、上記生理活性物質の一例である。【００５１】
本発明のキャリアを利用することにより、所望の薬剤を脳へ移行させることが可能である。例えば、脳疾患に対して治療効果を有する化合物（医薬組成物）を、上記キャリアに担持（内包）させることにより、該化合物を効率的に脳へ送達させ、有効な治療効果を発揮させることが可能である。該化合物（医薬組成物）を担持させたキャリア自体は、脳疾患治療剤として期待される。従って本発明は、本発明の上記脳送達用キャリアに薬物が担持された構造からなる、脳疾患治療剤を提供する。なお、上記「担持された」とは、薬物をキャリアと直接結合させた状態でもよいし、薬物（医薬組成物）をキャリアに内包（導入）させた状態でもよい。【００５２】
本発明の脳移行性細胞（キャリア）によって、脳へ送達させる物質としては、基本的には、脳における疾病、疾患に合わせて種々の物質を挙げることができる。例えば、BDNFやGDNFといった神経栄養因子、IL-10やTGF betaなどの抑制性サイトカインをはじめパーキンソン病治療のためのドーパミンやアルツハイマー病治療のための塩酸ドネペジルといった薬物等が考えられる。薬物の場合、ドーパミンプロドラッグのレボドパなどに示されるように薬物修飾がなされなければほとんど脳へ移行できない（脳へ移行するまでに分解されてしまう）薬物が多いため、in vitroでは効果があるにもかかわらずin vivoにおいて有効性を示さなかった薬物も本発明の細胞を使うことにより、利用することが可能になると考えられる。また、現在よく使用されている薬物、例えばアルツハイマー型痴呆症治療薬の塩酸ドネペジルのような薬物も脳へ直接移行することにより、投与量を減少させることが可能である。【００５３】
本発明の脳移行性細胞を用いた脳疾患の治療に対しての治療戦略としては、例えば、以下の５つの場合に応用することが可能である。【００５４】
（１）  欠損または変異などによって量や活性が低下した酵素や生理活性タンパク質を補う補充療法：
これは遺伝子欠損や遺伝子変異により特定の酵素またはタンパク質が脳内で欠乏することによって生じる様々な脳疾患に対し、欠乏するタンパク質や酵素の遺伝子を導入した細胞を注入することにより行われる。また、特定の神経細胞が変性脱落するパーキンソン病やアルツハイマー病に対し、神経の変性脱落により欠乏する神経伝達物質の合成を促進するような遺伝子、例えばパーキンソン病におけるチロシン水酸化酵素やビオプテリン合成酵素などのドーパミン生合成系の酵素遺伝子が考えられる。【００５５】
（２）  変性などで脱落する神経細胞を保護し機能を強化する保護療法：
変性疾患や脳虚血など色々な原因で生じる神経細胞死を抑制し、神経突起の再生を促す神経栄養因子(NGF, BDNF, GDNF, NT3など。特にパーキンソン病ではBDNFやGNNFが有効であることが知られている。）遺伝子を発現する細胞を注入することが考えられる。また多発性硬化症のように免疫細胞が関与する疾患では免疫抑制作用があるTGFβやIL-10遺伝子を本発明の細胞へ導入することが考えられる。【００５６】
（３）  腫瘍や血栓などを除去するような方法：
抗腫瘍作用を持つ因子を発現させたり抗がん剤を導入した本発明の細胞を脳に移入したりすることが考えられる。血栓除去については線溶系の酵素を発現させることが考えられる。【００５７】
（４）  有効な薬物を脳にだけ導入するような方法：
神経系に作用を持つ薬物は末梢毒性が高かったり、末梢神経系に作用を持つ物、血液脳関門を通過しにくい物など色々あり、脳への特異的なドラッグデリバリーシステムが必要とされていた。本発明の細胞では末梢臓器にあまり影響を与えず脳に特異的に薬物を送達させることができると考えられる。【００５８】
（５）  脳疾患予防システムとしての利用法：
（骨髄前駆細胞はミクログリア様の細胞に分化誘導ができるため）もともとミクログリアはその細胞の性質として変性や炎症部位に集まり死細胞を取り除き損傷修復にも関わったり、抗腫瘍作用や抗ウイルス作用を持つ、いわば脳内防御システムともいうべき細胞であることから、その性質を遺伝子操作などで強化することによって単一疾患の治療だけでなく、脳内防御システムそのものの強化を行うことによってあらゆる疾患に対する予防措置にも応用しうる。【００５９】
本発明の脳移行性細胞を用いて、治療が可能な疾患としては、特に制限されるものではないが、例えば、ザンドホッフ病、ゴーシェー病等を挙げることができる。これら疾患は、リソソーム内にある酵素や蛋白質が欠損し本来代謝されるべき物質がリソソーム内に蓄積し種々の症状を引き起こすことから、リソソーム病とも呼ばれる。この疾病に対する治療法として現在のところ酵素を血流から注入する酵素補充療法により症状を緩解する方法が主だった治療法となっている。本発明の脳移行性細胞をリソソーム病に対して用いることができれば、細胞は酵素を正常に産生することができるので細胞に薬物や遺伝子などを運ばせることなく、酵素欠損した細胞の役割を補うことにより細胞治療を行うことができると考えられる。【００６０】
また、遺伝子や薬物を運ばせる場合においては、脳腫瘍、脳虚血、パーキンソン病、アルツハイマー病など多種多様な疾患に用いることが可能であると考えられる。脳虚血時にはBDNFなどの神経栄養因子やエリスロポエチンなどによって局所での神経保護作用を促したり、慢性疾患であるパーキンソン病にはドーパミンを局所的に補充したりすることが可能になる。また脳腫瘍においては、腫瘍部に薬物が移行しないのみならず抗癌剤の多くが増殖性の細胞に作用するため（癌に対する選択性を持たないため）副作用が大きな問題となっているが、これらの問題も回避することが可能である。【００６１】
上述のように本発明は、本発明の脳移行性細胞（脳送達用キャリア）へ生理活性物質を含んで成る、脳移行性薬剤（脳移行性医薬組成物）を提供する。該生理活性物質は、通常、脳疾患に対して治療もしくは予防効果を有する物質（化合物）である。【００６２】
本発明の上記薬剤は、公知の製剤学的製造法によって、製剤化することもできる。例えば、薬剤として一般的に用いられる適当な担体、または媒体、例えば滅菌水や生理食塩水、植物油（例、ゴマ油、オリーブ油等）、着色剤、乳化剤（例、コレステロール）、懸濁剤（例、アラビアゴム）、界面活性剤（例、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油系界面活性剤）、溶解補助剤（例、リン酸ナトリウム）、安定剤（例、糖、糖アルコール、アルブミン）、または保存剤（例、パラベン）、等と適宜組み合わせて、生体に効果的に投与するのに適した注射剤、経鼻吸収剤、経皮吸収剤、経口剤等の医薬用製剤、好ましくは注射剤に調製することができる。例えば、注射剤の製剤としては、凍結乾燥品や、注射用水剤等で提供できる。【００６３】
また体内への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、または経口的に当業者に公知の方法により行うことができるが、好ましくは動脈内、静脈内投与である。投与量は、患者の年齢、体重、症状、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適宜適当な投与量を選択することができる。【００６４】
さらに本発明は、上記の生理活性物質を含有する脳移行性細胞の製造方法に関する。該製造方法の好ましい態様においては、本発明のキャリアへ、生理活性物質を導入する、もしくは結合させる工程を含む方法である。【００６５】
また、より具体的には、（ａ）骨髄もしくは骨髄細胞から、本発明の方法により、脳移行性細胞を取得する工程、（ｂ）工程（ａ）の脳移行性細胞内へ、生理活性物質を導入する工程、を含む製造方法である。【００６６】
また本発明は、本発明の脳移行性細胞の調製用キット、および、本発明の生理活性物質を含有する脳移行性細胞の製造用キットを提供する。【００６７】
本発明のキットは、例えば、抗ER-MP12抗体、Lineage cocktail、抗EpoR抗体、抗Sca-1抗体、抗CD133抗体、抗CD45抗体、または、骨髄細胞を培養するための培地等を構成要素とすることができる。【００６８】
本発明の脳移行性細胞の調製用キットの好ましい態様においては、以下の（ａ）〜（ｃ）から少なくとも２以上を構成要素として含むキットである。
（ａ）抗ER-MP12抗体
（ｂ）Lineage cocktail
（ｃ）抗EpoR抗体
（ｄ）骨髄細胞を培養するための培地【００６９】
また本発明のキットには、サンプルとして、本発明の脳移行性細胞（分画）を含めることができる。さらに（ｅ）抗CD13抗体を含めることができる。【００７０】
また、本発明の生理活性物質を含有する脳移行性細胞の製造用キットは、本発明の脳移行性細胞（分画）と、細胞の培養のための培地、あるいは該細胞へ生理活性物質を導入するための試薬類等を構成要素とする。該試薬とは、例えば、細胞のトランスフェクションのための各種試薬を挙げることができる。【００７１】
また、本発明の生理活性物質を含有する脳移行性細胞の製造用キットの好ましい態様においては、例えば、以下の（ａ）を少なくとも構成要素として含有するキットであり、より好ましくは、以下の（ａ）および（ｂ）を少なくとも構成要素として含むキットである。
（ａ）本発明の脳移行性細胞（骨髄前駆細胞）、または該細胞を実質的に含有する本発明の細胞分画
（ｂ）本発明の脳移行性細胞（骨髄前駆細胞）を培養するための培地【００７２】
本発明のキットには、上述の構成要素の他に、本発明の細胞へ導入すべき生理活性物質も併せてパッケージングさせることも可能である。【００７３】
なお、本発明において使用される各種抗体の作製は、当業者においては、一般的な抗体作製技術によって、適宜、実施することができる。上記「Lineage cocktail」も、当業者においては、容易に入手することが可能である。上記「培地」としては、一般的に骨髄細胞の培養に使用される培地を利用することができる。当業者においては、上記「培地」の基本的な組成等は、文献あるいはマニュアル等から容易に知ることができる。【００７４】
また本発明のキットには、本発明の細胞を分離するための各種方法、例えば、MACS、FACS等に用いる各種試薬類を含めることができる。また、本発明のキットの仕様書、該方法の指示書等、適宜パッケージングさせることができる。
さらに本発明の骨髄前駆細胞は、該細胞を調製する方法によって特徴付けることができる。即ち、本発明の好ましい態様としては、以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む方法によって調製されることを特徴とする、脳移行活性を有する骨髄前駆細胞に関する。
（ａ）  骨髄もしくは骨髄細胞から、骨髄前駆細胞または骨髄前駆細胞分画を分離する工程
（ｂ）  未分化な細胞、または該細胞を実質的に含む細胞分画を分離する工程
（ｃ）  EpoR陽性および/またはCD13陽性細胞、もしくは該細胞を実質的に含む細胞分画を分離する工程
（ｄ）  WEHI-3B細胞の培養上清を添加して細胞を培養する工程
また、本発明の骨髄前駆細胞、本発明の脳移行用キャリア、または本発明の脳移行性薬剤に加えて、薬学的に許容された担体を含んでなる組成物を提供する。
さらに本発明は、本発明の骨髄前駆細胞、本発明の脳移行用キャリア、または本発明の脳移行性薬剤を個体（患者等）へ投与する工程を含む、脳疾患の治療方法に関する。
個体への投与は、一般的には、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射など当業者に公知の方法により行うことができる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者（医師、獣医師、薬剤師等）であれば適切な投与量を適宜選択することが可能である。
また本発明は、本発明の骨髄前駆細胞または本発明の脳移行用キャリアの、脳移行性薬剤（脳疾患治療薬）の製造における使用に関する。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００７５】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により制限されるものではない。
〔実施例１〕  薬物処理における宿主血液脳関門に及ぼす影響
骨髄移植を行う際に多くの場合、放射線照射により宿主側骨髄細胞の除去を行う。この方法では血液脳関門の部分的な崩壊や神経脱落の可能性が示唆されている。脳に対して低侵襲的な骨髄移植を行うため、薬物5-FUによる宿主骨髄細胞除去を行った。【００７６】
血液脳関門に損傷を与えていないことを確認する目的で、5-FU処理を行ったB6マウス、正常B6マウス、および注射針にて物理的損傷を作製したB6マウスそれぞれにエバンスブルーを尾静脈注入し、血液脳関門に色素漏れが見られるか調べた（図１）。結果、5-FU処理を行ったマウスでは色素の漏れだしは見られず、血液脳関門の損傷は確認できなかった。【００７７】
〔実施例２〕  移植後７日目に脳実質内に見られる外来性細胞と骨髄に見られる外来性細胞との相関
5-FU処理を行ったマウスの尾静脈よりGFPトランスジェニックマウスより採取した骨髄細胞を移植した。移植後７日目において脳、肝臓、脾臓、肺においてGFP発現細胞が確認できた（図２）。骨髄及び組織へ移行するGFP発現細胞の相関性について調べてみると、肝臓や脾臓などの末梢組織では正の相関が見られたのに対し、脳では相関が見られなかった（図３）。【００７８】
〔実施例３〕  細胞の脳移行時期に関する検討
骨髄、血流、組織中におけるGFP発現細胞の推移について調べた（図４）。骨髄、血液ともに移植後7日目にGFP発現細胞の割合が顕著に増加し３-４週目にはGFPの発現は全く失われた。肝臓へ移行したGFP発現細胞は移植後６週目にはほとんど発現が見られなくなり１８週目においては全く見られなくなった。それに対し、脳へ移行したGFP発現細胞は血流からの供給がなくなった後も数は少なくなるものの、発現は１８週目においても見られた。【００７９】
GFP発現細胞がどの時期に脳内へ移行するか調べるために、経時的に移植を行ったマウス脳を採取しRT-PCR法を用いてGFPの発現について調べた（図５）。脳において移植後１-２日からGFPの発現が見られた。尾静脈を介した骨髄移植では、血流に乗った骨髄細胞は全身を循環し拡散した後脳に到達するため、脳におけるGFPの発現が遅延している可能性が考えられた。【００８０】
そこで脳を第一循環するように片側頸動脈から細胞注入し、脳循環後全身循環に移行する系でのGFP発現細胞の組織分布について経時的にRT-PCR法及び凍結組織切片の検鏡により解析した。移植後１５分において脳に移行する細胞が確認でき、２日後７日後においてもGFPの発現は見られた。GFP発現量に左右差が見られたが、これは片側頸動脈より注入しているため第一循環する側の半球に強く発現が見られると考えられた。【００８１】
〔実施例４〕  脳移行性細胞の性質に関する解析
移植後７日目に脳内に見られるGFP発現細胞が末梢組織へ移行する細胞とどのように相違しているかを調べるために、移植後組織切片を免疫組織科学的な解析を行った（図６）。脳へ移行したGFP発現細胞と肝臓へ移行したGFP発現細胞を比較すると、脳においては未分化な骨髄細胞のマーカーであるER-MP12陽性を示し、肝臓ではこの発現は見られなかった。また、ミエロイド系共通前駆細胞や赤血球・多核球前駆細胞に発現が見られるエリスロポイエチン受容体の発現について調べると、脳におけるGFP発現細胞の一部に発現が見られ、肝臓では見られなかった。mRNAの発現においても同様の結果が得られた。脳へ移行した細胞のDNA contentsについて調べてみると、ほとんどすべての細胞がG0/G1期にarrestし、増殖していないことを示した（図７）。移植後の全脳を酵素処理により細胞を分散させ10%血清添加系で培養すると、GFP発現細胞数は約８倍増加した。また、GM-CSFを添加した場合は約２０倍、WEHI-3B 細胞由来培養上清(IL-3のソースとなる)２０％添加系では約７０倍増加した。【００８２】
脳へ移行したGFP発現細胞が、神経系細胞へ分化転換を起こすかどうかを調べるため、移植後７日−１８週に至るまでの組織切片を神経幹細胞のマーカーであるNestin、アストロサイトのマーカーであるGFAP、成熟神経細胞のマーカーであるMAP-2に対する抗体で染色を行った（図８および９、表１）。内在性の細胞においてこれらのマーカーの発現は見られたが、GFP発現細胞においてこれらの発現は確認できなかった。【００８３】
【表１】
2006041088.tif 000002
【００８４】
上記表中、「割合」は、GFP発現細胞数に対する染色された細胞の総数を示す。【００８５】
また、GFP発現骨髄細胞からLin陰性分画を分離し、造血系細胞マーカーであるCD45に対する染色を行い、FACSを用いて解析した（図１４）。その結果、本発明の細胞は、CD45陽性を示すことが分かった。【００８６】
〔実施例５〕  脳移行性細胞の濃縮
脳移行性細胞は未分化な骨髄前駆細胞分画に存在していると想定されたので、分化した細胞に対する抗原を認識する抗体を集めた、Lineage cocktailにより陽性(Lin+)分画と陰性(Lin-)分画に分離し移植を行った（図１０および１１）。図１１で示すように、Lin陰性分画は、Lin陽性分画と比較して、顕著に脳移行活性が高いことが示された。陰性分画は全骨髄細胞中の約５％を占めた。陰性分画を未分化骨髄細胞や幹細胞のマーカーで染色すると、ER-MP12陽性細胞が約８５％見られた。脳へ移行するGFP発現細胞の割合は、分離前骨髄細胞に比べLin陰性細胞を移植したものでは約４倍増加した。Lin陰性細胞分画を分離することは、脳移行性細胞を調製するために、非常に有効であることが示された。【００８７】
脳へ移行したGFP発現細胞はER-MP12抗原を発現していたので、培養下において骨髄由来ER-MP12陽性細胞を増幅させる条件について検討した。WEHI-3B細胞の培養上清添加系で７日間培養すると、約７０％の細胞がER-MP12陽性を示した（図１２、図１５）。Lin陰性分画は、増殖因子添加により高い増殖性を示すことが分かった。【００８８】
MACSを用いてER-MP12陽性分画と陰性分画とに分離し移植を行うと、脳へ移行する細胞の割合は分離前骨髄細胞移植時と比べ約３倍増加した（図１３）。また末梢組織へ移行する割合は、分離前骨髄移植時と比べ減少した。一方、ER-MP12陰性分画を移植したものでは、末梢組織へ移行する割合が増加した。図１３で示すように、ER-MP12陽性細胞分画は、ER-MP12陰性細胞分画と比べて、顕著に脳移行活性が高いことが示された。ER-MP12陽性細胞分画を分離することは、脳移行性細胞を調製するために、非常に有効であることが示された。【００８９】
〔実施例６〕  脳移行性細胞の同定
以上の方法を組み合わせることによって骨髄細胞集団から脳移行性を持ったprogenitor細胞を同定することができた（図１６A（=3 colorの蛍光顕微鏡写真）、B （=FACSヒストグラムでの分画））。【００９０】
本発明の方法の一例を以下に示す。
まずマウス大腿骨より骨髄細胞を採取し、混入している赤血球を赤血球溶解用バッファーにより取り除いた。次にLineage Cell Depletion Kitを用いて分化した細胞を染色し、MACS（Magnetic Activated Cell Sorter）を用いて未分化細胞分画を回収した。分離の可否はFACS（Fluorescent Activated Cell Sorter）を用いて確認した。次に抗ER-MP12抗体、R-PE標識抗ラットIgG抗体にて染色し、抗R-PEマグネチックビーズにて標識した。次にMACSを用いてLin陰性ER-MP12陽性分画を分離した。分離の可否はFACS（Fluorescent Activated Cell Sorter）を用いて確認した。次にビオチン化エリスロポイエチンもしくはビオチン化抗EpoR抗体と反応させ、抗ビオチンマグネチックビーズと反応させた。次にMACSによりLin陰性ER-MP12陽性EpoR陽性分画を分離した。次に蛍光標識したアビジンと反応させ、分離の可否をFACSにより確認した。Lin陰性骨髄細胞を抗EpoR抗体および抗ER-MP12抗体にて染色を行った際の、蛍光観察像（図１６A)とFACSの解析結果（図１６B）を示す。【００９１】
〔実施例７〕  Lin陰性骨髄細胞移植時に脳内移行したGFP発現細胞における未分化骨髄細胞マーカーの発現
Lin陰性骨髄細胞を移植した際の、脳内移行したGFP発現細胞における未分化骨髄細胞マーカーの発現について解析を行った。
その結果を図１７に示す。Lin陰性分画のうち脳に入ったものはER-MP12陽性が増大しほぼ100％陽性となり、また、本文画には1％程度しか存在しないCD13陽性細胞が非常に増大することが分かった。
上述の結果から、脳移行性細胞はLin陰性分画のうち約1.5％をしめるCD13陽性細胞として分画することで濃縮できる可能性が示唆された。従って、本発明の脳移行性骨髄前駆細胞を分画して単離する場合、上述の特徴（例えば、ER-MP12陽性、Lin陰性、Epo陽性等）に加え、CD13陽性の特徴を利用することにより、本発明の細胞を高濃度まで濃縮することが可能である。【００９２】
〔実施例８〕  混合グリア培養
成熟動物脳由来の混合グリア培養(mixed glial culture)を作製し、抗CD11b抗体(緑色）とHoechst33342(青色）にて染色したものの微分干渉像(左上図)と蛍光像(左下図)を図１８に示す。ラミファイドミクログリアが多く確認できた。また、GFP発現骨髄細胞を成熟動物に静脈より移植し、7日目に同様の手法により混合グリア培養(Mixed glial culture)を作製したものの蛍光像を図１８に示す(右図)。ラミファイド様の骨髄由来細胞が多数確認できた。
上記結果から、骨髄移植した脳を取り出して混合グリア培養を行うと、図１８の左図で見られるようなミクログリア様の形態をした細胞として回収できることが分かった。即ち、GFP陽性骨髄細胞のうち脳に移入したものはミクログリアに近い性質になり得ることが判明した。
また、混合グリア培養(Mixed glial culture)中のGFP発現細胞における抗原の発現について解析した。その結果を図１９に示す。
さらに、混合グリア培養(Mixed glial culture)中に見られるGFP発現細胞におけるマーカーの発現について解析を行った。その結果を表２に示す。【００９３】
【表２】
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表中、GFP発現細胞の中でそれぞれのマーカーが発現している細胞の割合を示す。GM-CSFやWEHI-CMを添加して作製した混合グリア培養(mixed glial culture)中に見られるGFP発現骨髄細胞は、EpoRやER-MP12陽性を示す割合が高かった。
上記結果から、脳に移行した骨髄細胞を混合グリア培養で回収するとEPO受容体、ER-MP12、Mac1がそれぞれ20.8、5.6、90.6%程度となるが、前２者はGM-CSFで処理すると増大することが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明のprogenitor由来脳移行性細胞を用いることにより、脳内へ効果的に薬物等を運ぶことが可能になれば、これまで代謝分解により使いにくかった薬物が使用できるようになったり、高濃度で使用しなければならなかった薬物の投与量が削減できるようになったりすると考えられる。骨髄移植は、移植治療の中でも確立された術法の一つであり静脈注射等により比較的容易に行うことが可能であり、脳の様々な疾患に対して自己の骨髄細胞を用いて治療を行うことも可能であると考えられる。【００９５】
脳選択的移行性を示す細胞としてマイクログリアが知られているが、マイクログリアは脳実質内の細胞であるため、脳を培養する方法でしか現在までのところ得ることができない。それに対し、本発明で得られる脳移行性細胞は骨髄という比較的採取しやすい部位から細胞を得ることができる。骨髄細胞は培養下で増殖させることが可能であるので、成体外にて濃縮した後、移植することが可能である。輸血と同様に骨髄幹細胞のストックを作製しておけば、疾患の発病時に必要に応じた数の脳移行性細胞を作製し、薬物もしくは遺伝子修飾した後に静脈にかえすというオーダーメード治療も可能であると考えられる。
【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１３】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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