(57)【要約】  本発明は、広範囲の全層皮膚欠損においても上皮形成を誘導できる唯一の手段である自家皮膚移植において、自家皮膚移植片を簡便に固定化することができ、上皮化の効率を上げて皮膚再生を促すことのできる医療用組成物を提供する。本発明は、光架橋性キトサン誘導体と、アミノ酸及び／又は糖類とを含有することを特徴とする医療用組成物に関する。当該アミノ酸は必須アミノ酸であるのが好ましく、糖類はグルコース、ガラクトース、マンノース、フコースから選択される中性糖であるのが好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材と、アミノ酸及び／又は糖類とを含有することを特徴とする医療用組成物。
【請求項２】
基材が、ハイドロゲル、ハイドロコロイド、コラーゲン、ゼラチン製剤から選択される
ことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
基材が、光架橋性キトサン誘導体から形成されたものであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記糖類が、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコースから選択される中性糖であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記アミノ酸が必須アミノ酸であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記光架橋性キトサン誘導体が、下記式（１）及び（２）：
【化１】
2006121156.tif 000016
で表される構成単位を含んでなるキチン・キトサン類のグルコサミン単位（１）の２位アミノ基の少なくとも一部に還元性末端を有する糖鎖を導入し、他の少なくとも一部に光反応性基を導入してなる高分子であることを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
光架橋性キトサン誘導体を、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ含有することを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
創傷治癒促進薬をさらに含有することを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光架橋性キトサン誘導体とグルコース等の糖類及び/又はグリシン等のアミノ酸を含有する、皮膚再生を促進することのできる医療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚には元来自己修復機能が備わっており、単純外傷等の軽度の創傷であれば自己修復機能によって皮膚が再生されるが、重度熱傷、放射線被曝複合創傷、褥創等の難治性創傷においては完全な修復は困難である（非特許文献１）。
創傷治癒の機序は、（１）炎症性細胞、次いで結合組織の細胞、表皮細胞による損傷部の認識、（２）創傷部の収縮、そして（３）肉芽形成及び上皮化という順序で進行するとされており、各段階において関与する細胞、各種因子、サイトカイン、分泌物などが解明されてきている。【０００３】
皮膚の修復を人工的に行う皮膚創傷治癒の研究も、創面の一時的保護を目的とする創傷被覆剤の材料改質に始まり、創傷治癒に係わるサイトカインや増殖因子などの薬剤利用による積極的な治癒を誘導する試みにまで及んだ。しかし、単純創傷から難治性創傷に至る様々な程度の皮膚創傷に有効な被覆剤や単一成分の薬剤は未だ存在せず、特に重度熱傷や広範囲外傷にとって重要な上皮形成までを促進・誘導できる技術は皆無である。【０００４】
このような状況にあって、全層皮膚欠損した患者の治療に皮膚代替物が用いられるようになった。表皮細胞を組み込んだ皮膚代替物は培養表皮、真皮の線維芽細胞を組み込んだ皮膚代替物は培養真皮、それらの両方を組み込んだ物は培養皮膚と呼ばれている。
例えば、深達性ＩＩ度熱傷の治療には凍結培養表皮が利用されており、同種培養表皮から自己細胞に置き換わっていく。しかし、小さな全層欠損である場合、全層皮膚腿潰瘍やＩＩＩ度熱傷においても肉芽形成の促進から上皮化することもあるが、広範囲全層欠損では培養表皮の生着が悪く、最終的には自家皮膚移植に頼らざるを得ない。【０００５】
現在、培養真皮としては、線維芽細胞が組み込まれるマトリックス素材が異なるTransCyteやDermagraft等の製品がSmith & Nephew社から販売されている。しかし、培養真皮も培養表皮と同様に広範囲の創傷で上皮化を誘導する能力はなく、機能的創傷被覆剤の範疇から逸脱しないものと言える。
一方、表皮細胞と線維芽細胞が組み込まれた培養皮膚として、Apligraf（NOVARTIS社）やVivoDerm（Convatec社）等が市販されている。しかし、現実には、培養上皮層と真皮層との親和性の問題や感染創での臨床効果が得られないといった問題があり、自家皮膚に置換可能な皮膚代替物の完成までにはほど遠いものがある。【０００６】
また、従来の皮膚代替物は動物性コラーゲンやヒト血漿成分の利用依存度が高く、その安全性も懸念されている。
さらに、重症熱傷に対し人工真皮も使用されるようになっているが、最終的に上皮化させるためには、再度の自家皮膚移植が必要となる。また、培養皮膚単独の重度熱傷への移植は有効性に乏しく、無細胞性の真皮と合わせたハイブリッド型の培養皮膚を研究している施設もあるが、その臨床評価は未だ定まっていない。【０００７】
即ち、最も機能的な皮膚再生・治療技術を必要とするのは、広範囲重度熱傷などに代表される皮膚付属器の残っていない全層皮膚欠損で、その治癒の鍵は、速やかな真皮形成と上皮形成が握っている。しかしながら、従来の皮膚代替物では、上皮形成に至らしめる程の能力を有するものは得られていない。よって、唯一、上皮化誘導が期待できるのは自家皮膚移植のみということになる。しかし、広範囲に熱傷を受けた場合、自家皮膚移植のために採取できる皮膚の範囲が限られ、創面全体の上皮化に必要な量を確保することは困難である。さらに、移植組織を皮下組織に強固に固着するための縫合あるいはステイプラー等による処置は時間を要するのみならず、術後包帯交換処置の疼痛や再障害の危険を伴い、患者及び医師への負担が大きいものとなっている。
【非特許文献１】高柳健二、熊谷憲夫、「蛋白質  核酸  酵素」第45巻、第13号、2283-2287頁、2000年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
よって本発明における課題は、重度熱傷などの広範囲全層皮膚欠損における唯一の上皮再生法である自家皮膚移植において、自家皮膚移植片を簡便に固定化することができ、上皮化の効率を上げて皮膚再生を促すことのできる医療用組成物を提供することにある。特に、重症熱傷の治療においては、早期に肉芽の形成を促進させることが自家皮膚移植舳片の定着に大きく関与することが知られており、肉芽形成を促す単純高分子皮膚製剤の開発は、これまで多くの熱傷専門医に期待されてきた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
かかる課題を解決するため、本発明は、基材と、糖類及び／又はアミノ酸とを含有することを特徴とする医療用組成物を提供する。前記基材としては、創傷などに使用され、傷の修復や組織治癒・再生をサポートする、いわゆる被覆材料が好ましく用いられる。例えば、各種ハイドロゲル、ハイドロコロイド、コラーゲン、ゼラチン製剤などを挙げることができる。特に、後述する光架橋性キトサン誘導体から形成されるハイドロゲルを用いるのが好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明で使用される光架橋性キトサン誘導体（ＰＲＣ：Photo-Crosslinkable Chitosan）は、例えば、WO00/27889パンフレットに記載されているものから選択され、400nm付近の安全な紫外線で接着性のハイドロゲルになる機能性ポリマーであり、医療用接着剤として好適に用いられるものである。従って、当該ＰＲＣを含有する本発明の組成物は、簡便な操作によって自家移植片等の移植組織を固定・密閉しながら患部の感染を予防し、生体が有する活発な肉芽形成能を保全するというＰＲＣが有する基本的特徴に加え、なおかつ早期分解することにより交換時の再障害の心配がないという熱傷治癒を含む本願発明の用途に特に適した特性を有している。【００１１】
さらに、驚くべき事に、ＰＲＣを溶解させる媒体に、アミノ酸及び／又は糖類を共存させることにより、好中球を中心とする多核球が速やかにキトサン層に浸潤し、多核球によるＶＥＧＦ発現亢進、それに伴う新生血管形成、肉芽形成及び上皮形成の促進が、組織の傷害部位のみならずサポート素材としてのキトサンゲル内でも（ＰＲＣの分解を伴って）観察された。
ＰＲＣに細胞増殖因子等の創傷治癒促進剤を含有せしめることにより、その創傷治癒活性を高めることができるが（WO03/090765パンフレット参照）、本発明の組成物は、増殖因子等を含有しなくても、自家皮膚移植片や他の皮膚代替物を創傷部位に生着させることができ、重度熱傷等の皮膚創傷において皮膚移植片をサポートする素材として使用できるばかりではなく、皮膚移植片や皮膚代替物が存在しなくても上皮化を促し治癒を促進させる効果があり、皮膚創傷治療薬として使用することもできる。
また、本発明の組成物は、従来の接着剤であるフィブリン糊やコラーゲン製剤等ようにヒト組織由来の製剤でないことから感染の危険が無いという利点も有している。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例における自家皮膚移植実験の手法の概略を示す説明図である。
【図２】実施例２において本発明の組成物（Ａ）を用いたときの創傷部位の組織変化を示す顕微鏡写真である。
【図３】実施例２においてアミノ酸及び糖類を含まない組成物（Ｂ）を用いたときの創傷部位の組織変化を示す顕微鏡写真である。
【図４】実施例３において本発明の組成物（Ａ）を用いたときに、創傷部位組織の抗-ＶＥＧＦ染色した断面を示す顕微鏡写真である。
【図５】実施例３において本発明の組成物（Ａ）を用いたときに、創傷部位組織の抗-ＶＥＧＦ染色した断面を示す顕微鏡写真である。
【図６】実施例６において、人為的熱傷の形成及び処置方法を示す写真である。
【図７】実施例６において、熱傷部位の肉芽組織の厚み変化を示すグラフである。
【図８】実施例６において、熱傷部位の毛細血管数の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の医療用組成物で使用される光架橋性キトサン誘導体（ＰＲＣ）は、一般にキチン・キトサン類と呼ばれている高分子骨格に光反応性置換基と糖鎖構造とを導入した構造を有しており、中でも、少なくとも一部が脱アセチル化されたキチン・キトサン類を構成するグルコサミン単位の２位アミノ基の少なくとも一部に還元性末端を有する糖類を導入し、他の少なくとも一部に光反応性官能基を導入してなるものであるのが好ましい。【００１４】
通常、キチン・キトサン類は、エビ殻やカニ殻などの甲殻類由来のキチン質（ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン）をアルカリ処理することによって得られる脱アセチル化した酸可溶性画分であって、一般に下記式（１）、（２）で示される構成単位を有するものである。その他、イカ軟骨、昆虫や植物由来の原料であっても何ら問題はない。
2006121156.tif 000002
【００１５】
これらのキチン・キトサン類のうち脱アセチル化度の低いもの（通常４０％未満のもの）を「キチン」、そして脱アセチル化度の高いもの（通常４０％以上のもの）を「キトサン」と呼ぶこともあるが、以下、本明細書では、少なくとも一部が脱アセチル化されたキチン・キトサン類を総称して「キトサン」という。なお、本発明におけるキトサンは天然由来のものに限らず、化学的、酵素的、または発酵工学的に合成された類似構造を有する化学修飾糖鎖であってもよい。
ここで、「脱アセチル化度」とは、キトサン（あるいは、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン）を構成する糖単位の２位のアセチルアミノ基が脱アセチル化によって遊離アミノ基に変換されている割合である。本明細書では、脱アセチル化度は、「健康食品規格規準集（その４）」財団法人日本健康・栄養食品協会（1996年）第55頁に記載の「コロイド滴定法」によって定量される。【００１６】
本発明のキトサン誘導体は、このキトサンをさらに化学的に修飾することにより機能化したものであり、原料として使用されるキトサンとしては、脱アセチル化度が少なくとも４０％、特に６０〜１００％、さらに特に６５〜９５％の範囲にあるものが好適である。なお、脱アセチル化度が１００％のキトサンは、上記式（１）の構成単位のみからなり、式（２）の構成単位は含まない。
また、該キトサンの分子量には特に制限はなく、最終のキトサン誘導体の使用目的に応じて広い範囲で変えることができるが、一般には、数平均分子量が５,０００〜２,０００,０００、好ましくは１０,０００〜から１,８００,０００、より好ましくは４０,０００〜１,５００,０００の範囲のものが適している。【００１７】
本発明で好ましいキトサン誘導体は、上記キトサンを構成する式（１）のグルコサミン単位の２位のアミノ基の少なくとも一部に還元性末端を有する糖類を導入し、他の一部に光反応性官能基を導入したものである。このようなキトサン誘導体の詳細については、ＷＯ００／２７８８９号パンフレットを参照されたい。【００１８】
キトサン誘導体に導入される還元性末端を有する糖類としては、アルドース類、ケトース類が包含され、中でも、構成糖単位の数が２０個以下、特に１〜７個のものが好適に使用される。具体的には、例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、フコース、マンノース、アラビノース、キシロース、エリトロース、ヘプツロース、ヘキシロースなどのペンタオースやヘキサオース；グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクサミンなどのアミノ糖類；ウロン酸類やデオキシ糖類などの糖誘導体；これらの単糖類を組み合わせた糖鎖からなる、マルトース、イソマルトース、ラクトース、メリビオース、マルトトリオースなどの二もしくは三糖類；各種オリゴ糖類などが挙げられるが、中でもマルトース、ラクトース、メリビオースなどの中性二糖類が好適である。特にグルコースが好ましい。
上記糖類に換えて、ポリエーテル、多価アルコールなどの有機化合物をキトサンに誘導することもできるが、生体適合性などの面で天然の糖鎖を利用するのが好ましい。【００１９】
キトサンの前記式（１）のグルコサミン単位の２位アミノ基への上記の糖類の導入は、それ自体既知の方法を用いて行うことができ、例えば、糖類の還元性末端をカルボキシル化した後、該２位アミノ基にアミド結合により結合させる方法（例えば、特開平１０−１２０７０５号公報参照）や、糖類の還元性末端をアルデヒド化またはカルボニル化した後、グルコサミン単位の２位アミノ基に、シッフ塩基を経由する還元アルキル化法により結合させる方法（例えば、キチン・キトサン研究会編「キチン・キトサンの応用」53-56頁、1990年2月20日、技法堂出版(株)発行参照）などが含まれる。
本発明でキトサンに導入される糖類は１種のみに限定されるものではなく、２種以上を組み合わせて使用することもできる。【００２０】
本発明のキトサン誘導体を構成する糖側鎖の具体例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
(i) ラクトースから誘導される糖鎖：
2006121156.tif 000003
(ii) マルトースから誘導される糖鎖：
2006121156.tif 000004
(iii) メリビオースから誘導される糖鎖：
2006121156.tif 000005
(iv) セロビオースから誘導される糖鎖：
2006121156.tif 000006
(v) ラミナリビオースから誘導される糖鎖：
2006121156.tif 000007
(vi) マンノビオースから誘導される糖鎖：
2006121156.tif 000008
(vii) Ｎ-アセチルキトビオースから誘導される糖鎖：
2006121156.tif 000009
【００２１】
上記(i)〜(vii)の糖側鎖のうち、左側に記載したものが、糖のカルボキシル基とキトサンの２位アミノ基との縮合によって導入される残基を表し、右側に記載したものが、シッフ塩基を介して結合させた残基を表す。
このようにして、キトサンのグルコサミン単位の２位アミノ基を糖類で置換することにより、キトサンの酸依存的溶解性が緩和され、中性領域での可溶化が達成される。
キトサンのグルコサミン単位の２位アミノ基の糖側鎖による置換度は、最終のキトサン誘導体に望まれる物性などに応じて変えることができるが、置換度が、一般的には０．１〜８０％、特に０．５〜６０％、さらに特に１〜４０％の範囲内にあるのが好適である。ここで、糖側鎖の「置換度」は、キトサンを構成する糖単位の２位のアミノ基が糖側鎖で置換されている程度であり、キトサンを構成する糖単位の２位の遊離アミノ基と置換アミノ基の合計に対する置換アミノ基の割合として示す。本明細書では、糖側鎖の置換度は、硫酸中で糖鎖がフェノールと反応することに基づく特徴的な発色を４９０ｎｍの吸光度で検知する「フェノール−硫酸法」によって測定される（J.E.Hodge, B.T.Hofreiter, "Methods in Carbohydrate Chemistry", ed. by R.L.Whistler, M.L.Wolfrom, vol.1, p388, Academic Press, New York(1962)参照）。【００２２】
また、本発明のキトサン誘導体は、キトサンを構成する前記式（１）のグルコサミン単位の２位アミノ基の少なくとも一部に光反応性官能基を導入することにより、光照射による自己架橋性が付与されている。
本発明に従ってキトサンの化学修飾に使用される光反応性官能基は、紫外線、特に約２００〜３８０ｎｍの近紫外領域を含む紫外線の照射によって該光反応性官能基同士で及び/又はキトサン中に存在するアミノ基あるいは水酸基などと反応して架橋結合を形成するような基を含み、例えば、ベンゾフェノン類、ケイ皮酸類、アジド類、ジオレフィン類、ビスアントラセンのような環状不飽和化合物などから誘導されるものが包含され、特に、カルボニルアジド基、スルホニルアジド基、芳香族アジド基を有するものが好適である。
また、光反応性官能基は、約４００〜５００ｎｍ程度の可視光の照射で反応する置換基であってもよい。このような官能基としては、例えば、下記式であらわされるような、Journal of Polymer Science: Polymer Chemistry Edition, Vol.20, 1419-1432 (1982)に記載されたホルミルスチリル化合物等が挙げられる。
2006121156.tif 000010
（上記式中、Ａｒは、ピリジン、アルキルピリジニウム塩、キノリン、アルキルキノリニウム塩等の複素環を表す。）【００２３】
キトサンのグルコサミン単位の２位のアミノ基へのかかる光反応性官能基の導入は、それ自体既知の方法により行うことができ、例えば、カルボキシル基を有するアジド化合物を縮合剤の存在下に該２位のアミノ基に結合させる方法（特開平１０−１２０７０５号公報参照）；酸クロリド基、アルデヒド基、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル基又はエポキシ基を介してアジド化合物を該２位のアミノ基と反応させる方法（キチン・キトサン研究会編「キチン、キトサンの応用」第45〜65頁、1990年2月20日、技報堂出版(株)発行、参照）等の方法により行うことができきる。上記のホルミルスチリル化合物のホルミル基をキトサンのアミノ基とカップリングさせることによっても好適に導入できる。
なお、従来、アジド基の架橋反応において、ビスアジド以上の多官能性化合物が有効であるとされているが（特開平９−１０３４８１号公報参照）、本発明ではその必要はなく、モノアジド化合物の導入によっても、十分に自己架橋性を有するキトサン誘導体が得られる。【００２４】
しかして、本発明のキトサン誘導体（ＰＲＣ）を構成する光反応性官能基の具体例としては、例えば、紫外線の場合は、下記式（Ａ）から（Ｄ）で表されるものが挙げられる。式（Ａ）の基は、ｐ−アジド安息香酸から誘導されるものであり、式（Ｂ）の基は、ｐ−アジドベンズアルデヒドから誘導されるものであり、式（Ｃ）の基は、ｐ−ベンゾイル安息香酸から誘導されるものであり、式（Ｄ）の基は、ケイ皮酸から誘導されるものであり、そして式（Ｅ）は、１-メチル-４-[２-(ホルミルフェニル)エテニル]ピリジニウムから誘導されるものである。
2006121156.tif 000011
【００２５】
これらの光反応性官能基の導入の程度は、最終のキトサン誘導体に望まれる架橋反応に基づくゲル化（不溶化）の程度等に応じて変えることができるが、光反応性官能基の置換度が０.１％〜８０％、特に０.５〜５０％、さらに特に１〜３０％の範囲内にすることが望ましい。ここで、光反応性官能基の「置換度」は、キトサンを構成する糖単位の２位のアミノ基が光反応性感応基で置換されている程度であり、キトサンを構成する糖単位の２位の遊離アミノ基と置換アミノ基の合計に対する置換アミノ基の割合である。本明細書では、光反応性官能基、例えばアジド基の置換度は、４−アジド安息香酸の２７０ｎｍにおける特性吸収から得られる検量線に基づいて決定することができる。
本発明のキトサン誘導体における糖側鎖と光反応性官能基の合計の置換度は、特に制限されるものではなく、広い範囲にわたり変えることができるが、一般には０．２〜８０％、好ましくは１．５〜６５％、さらに好ましくは３〜５０％の範囲内とすることができる。【００２６】
また、本発明のキトサン誘導体では、キトサンを構成する前記式（１）の糖単位の２位のアミノ基や、式（１）又は（２）の糖単位の３位あるいは６位の水酸基の少なくとも一部に、両親媒性基を導入してもよく、それにより架橋後のマトリクスに飛躍的に向上した含水性を付加することができる。この両親媒性基は、疎水性基を具備する疎水ブロックと親水基を具備する親水ブロックとを有する基であり、一般に界面活性剤機能を有する場合が多い。中でも、疎水ブロック（Ｘ）と親水ブロック（Ｙ）の分子量の割合が、Ｘ：Ｙ=１：５〜５：１のものが好適に用いられ、解離性のイオン基を持たない非イオン性の基がより好適に使用できる。特に、疎水性のアルキルブロックと親水性のポリオキシアルキレンブロックから構成される分子量が少なくとも９０以上、より好ましくは５００〜１０,０００のポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。疎水ブロックを持たないポリエーテル類も使用できるが、疎水ブロックと親水ブロックの両方を有するポリオキシアルキレンアルキルエーテルが含水性向上の点から好ましい。
かかる両親媒性基のキトサンへの導入は、例えば、両親媒性基の親水ブロック又は疎水ブロックのいずれか一方の末端に、アミノ基と反応して共有結合を形成しうる基、例えば、アルデヒド基やエポキシ基などを持つ化合物を導入した後、キトサンのグルコサミンの２位アミノ基と反応させる方法や、カルボキシル基を有するポリオキシアルキレンアルキルエーテル誘導体とキトサンを縮合剤の存在下で反応させる方法、さらには酸クロリド基を有するポリオキシアルキレンアルキルエーテル誘導体とキトサンの水酸基やアミノ基と反応させる方法などを用いて行うことができる。【００２７】
例えば、末端にエポキシ基を誘導したポリオキシアルキレンアルキルエーテル基あるいは末端にアルデヒド基を誘導したポリオキシアルキレンアルキルエーテル基をキトサンのアミノ基に導入した場合、キトサン骨格に結合した側鎖は下記式（ａ）あるいは（ｂ）で表される。また、末端に酸クロリド基を誘導したポリオキシアルキレンアルキルエーテル基をキトサンの３位または６位の水酸基に結合させた場合、キトサン骨格に結合した側鎖は、下記式（ｃ）で表される。ただし、下記式（ａ）〜（ｃ）におけるｎ及びｍは１以上の繰返し単位数である。
2006121156.tif 000012
本発明のキトサン誘導体における両親媒性基の導入の程度は、特に制限されるものではないが、導入後のキトサン誘導体の重量変化に基づいて、通常５〜７０％、好ましくは１５〜５５％の範囲内とすることができる。【００２８】
以上詳細に述べたように、本発明の医療用組成物に使用される光架橋性キトサン誘導体にあっては、キトサン骨格に還元性末端を有する糖類及び光反応性官能基が導入され、任意に両親媒性基が導入されていてもよい。糖類を導入することにより、キトサン誘導体は中性領域での可溶性に優れており、生理的緩衝液や培地などで溶液化することができ、蛋白質等の酸やアルカリで変性する可能性のある薬物の活性を失うことなく混合できる。さらに、光反応性官能基を導入することにより、任意の部位に適用した後に光照射することによって即時に不溶性ゲル体を形成するので、皮膚代替物等の移植片を組織に固着させるとともに、上皮化を促進して皮膚を再生させることができる。【００２９】
なお、本発明の光架橋性キトサン誘導体の骨格をなす高分子として、キトサンに代えてヒアルロン酸等の多糖類やコラーゲン等のタンパク質、その他の合成高分子などいかなるものを使用してもよいが、創傷や組織を密閉することができて薬物保持性や適度な生分解性を有し、速すぎない速度で薬物のコントロールドリリースができる糖類が好適であり、中でも、それ自体が生体の高い創傷治癒活性を保全しながら抗菌性を有するキトサン、あるいはヒアルロン酸等の糖類、特に原材料の供給やコストなどの点からキトサンが好ましい。
また、光反応性官能基に代えて化学的架橋性を有する官能基を導入してもよいが、速やかな分子内架橋が可能でそのスイッチングが容易なものであるのが好ましく、スイッチングが容易で反応性も高く未反応の活性部位が残ることも少ないことから、光反応性官能基が好適に使用されうる。また、２位にアミノ基を有するキトサンは、光反応性官能基の導入反応にとっても有利であるため、この点からも好適に使用されうる。【００３０】
本発明の組成物は、前記の光架橋性キトサン誘導体（ＰＲＣ）に加えて、糖類及び/又はアミノ酸を含有することを特徴としている。
本発明で用いられる糖類は、特にグルコース、ガラクトース、マンノース又はフコース等の中性の単糖類、二糖類、オリゴ糖類などの比較的低分子量の糖類が好ましい。特にグルコースが好ましい。アニオン性の糖類を使用した場合、キトサン誘導体との間でポリイオンコンプレックスを形成して光照射しなくてもゲル化してしまうことがある。【００３１】
一方、本発明で用いられるアミノ酸は、グルタミン、アラニン、セリン等の一般に知られたアミノ酸であってよく、特に限定されないが、特に必須アミノ酸（フェニルアラニン、ロイシン、バリン、ヒスチジン、メチオニン、イソロイシン、リジン、スレオニン、トリプトファン、アルギニン、グリシン）を用いるのが好ましい。【００３２】
本発明の医療用組成物は、光架橋性キトサン誘導体（ＰＲＣ）及びアミノ酸及び／又は糖類、並びに他の任意成分を、溶媒、好ましくは水性媒体に、好ましくは中性のｐＨで溶解せしめることにより調製することができる。例えば、ＰＲＣの蒸留水又はリン酸緩衝液（ＰＢＳ）溶液に、アミノ酸又は糖類を添加してもよいし、ＰＲＣ溶液をアミノ酸及び／又は糖類を含有する細胞培養液と混合して調製してもよい。本発明において特に好ましく用いられる細胞培養液は、ダルベッコの変性イーグル培地（D-MEM）とハムのF12培地との混合培地（DMEM/F12)であるが、機能性ペプチド研究所や日水製薬で市販されているものや理研セルバンクなどで用いられているヒト細胞株の培養用培地などであっても、所望の分解特性（多核球浸潤特性）を得ることができる。その他の培地としては、例えばhttp://func-p.co.jp/hitoseihin.html及びhttp://www.brc.riken.jp/lab/cell/distribution/med_table.shtmlを参照されたい。【００３３】
本発明の医療用組成物における光架橋性キトサン誘導体（ＰＲＣ）の含有量は、皮膚移植片周辺部への注入性を確保し、架橋後のゲルによる皮膚移植片の担持を確実にするために、一般的には０．０１〜１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも１〜５０ｍｇ／ｍｌ、更に好ましくは５〜３０ｍｇ／ｍｌ、特に２０ｍｇ／ｍｌ程度とされる。
一方、アミノ酸及び／又は糖類の含有量は特に限られないが、アミノ酸としては約０.０１〜５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約０.１〜２５ｍｇ／ｍｌ、更に好ましくは約０.２〜２００ｍｇ／ｍｌで所望の分解性が得られ、また、糖類としては約０.１〜２５０ｍｇ／ｍｌで、より好ましくは約１.０〜２００ｍｇ／ｍｌ、更に好ましくは約１.５〜１５０ｍｇ／ｍｌで所望の分解性が得られる。これらのアミノ酸類や糖類の添加効果は、ＰＲＣ溶液として光照射前に不溶化しない限り、単独添加でも混合添加でも同様に得られる。【００３４】
このようにして調製された本発明の医療用組成物は、光架橋性キトサン誘導体（ＰＲＣ）を含有しているため、所定強度の光（紫外線及び可視光など）を所定時間照射することにより、短時間で架橋して不溶性のゲルを形成し、皮膚移植片を固定化することができる。
光による架橋条件は、使用する光架橋性キトサン誘導体に導入した光反応性官能基の種類や置換度、組成物に含有されるキトサン誘導体の量や、使用する組成物の量に応じて変化しうるが、400nm以下の波長の紫外線による所定の積算光量が得られれば架橋反応が速やかに達成され、実用的なキトサンハイドロゲル体が得られる。
例えば、365nm検出タイプの市販の照度計（UIT-150、ウシオ電機）による光量測定において、50-300mj/cm2の積算光量で当該組成物は良好な架橋ハイドロゲル形成を達成する。当該組成物は400nm以下の波長のUV-LED、エキシマレーザー、水銀ランプなどによる紫外線で架橋反応し、照射時間は照射強度を高くすれば必要な積算光量を得るまでの時間を短縮でき、1秒以下の照射時間で所望のハイドロゲル体を得ることも可能である。【００３５】
キトサンマトリクスの光反応性基の架橋反応度は特に限られないが、本発明の架橋キトサンマトリクスは、少なくとも３０％、好ましくは４０〜１００％、より好ましくは５０〜１００％、より好ましくは６０〜１００％、さらに好ましくは７０〜１００％の架橋反応度を有する。ここで、本発明でいう「架橋反応度（又は架橋度）」は、光架橋性キトサン誘導体に存在する光反応性官能基の中で他の官能基等と結合したものの割合を指すものとする。【００３６】
本発明の医療用組成物を用いた場合、キトサンゲル層にグルコースやアミノ酸が添加されていることにより、光架橋反応後のキトサン分子の分子間距離が広がって、細胞の浸潤が容易になっているものと考えられる。
また、アミノ酸の添加によって細胞の浸潤が促進されたのは、アミノ酸のコーティング効果であると推察される。すなわち、シアル酸で覆われた酸性粒子である細胞の進入を妨げていたキトサンのアミノ基を、アミノ酸類が中和したことによって、細胞のモビリティが容易になったものと考えられる。このような、キトサンゲル内への細胞浸潤を容易にする添加物効果は、糖類やアミノ酸類を単独で使用しても複合して使用しても有効であり、その効果を減ずることはない。【００３７】
グルコースとグルタミン酸は白血球細胞の増殖を刺激することが知られている。本願発明者等は、本発明で観察された効果の主要な原因が、糖類又はアミノ酸による細胞のエネルギー効果であると考えている。即ち、下記の実施例においては、基材として光架橋性キトサンゲルを使用しているが、当該キトサンゲルを他のハイドロゲルやコラーゲン、あるいはゼラチン製剤等の基材に置換しても、グルコース等の糖類又はアミノ酸とを併用することにより本発明の効果が得られ、そのような基材と糖類及び/又はアミノ酸とを含有する医療用組成物も本発明の範囲内にある。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を具体例を用いて更に詳細に説明するが、これらの具体例は本発明の範囲を限定するものではない。
（合成例１）
光架橋性キトサン誘導体（ＰＲＣ）の合成
キトサン骨格に紫外線反応性官能基及び糖鎖を導入したＰＲＣを、ＷＯ００／２７８８９に記載された方法に準じて合成した。具体的には、エビ由来の８００〜１０００ｋＤａの分子量及び８５の脱アセチル化度を持つキトサン（焼津水産工業（株）製）のアミノ基に、アジド(ｐ-アジド安息香酸)及びラクトース（ラクトビオン酸）を縮合反応により導入した。ラクトースの導入により中性領域のｐＨで可溶性であり、ｐ-アジド安息香酸及びラクトビオン酸の置換度が、各々約２．５％及び５.０％であることが確認された。
また、カニ殻及びイカ軟骨由来のキトサン素材を使用した場合も、同様の誘導体が合成できた。【００３９】
（合成例２）
光（可視光）硬化性キトサン誘導体（ＶＬ-ＲＣ）の合成
下記式で表されるメチル-４-［２-(４-ホルミルフェニル)エテニル］ピリジンメトスルホネート（ＦＰＰ）を、Journal of Polymer Science: Polymer Chemistry Edition, Vol.20, 1419-1432 (1982)記載の方法に準じて合成した。
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具体的には、γ-ピコリン(3.07g,33mmol)のメタノール(8.3ml)溶液を氷冷下、硫酸ジメチル(4.16g,33mmol)に加えた。溶液を室温で1時間放置した後、テレフタルアルデヒド(13.4g,100mmol)を加え、加熱して溶解させた。続いてピペリジン(0.47ml)を加え、5時間還流した。析出物を熱時ロ過により除いた。温濾液はエタノール(50ml)とアセトン(16.7ml)の混合溶媒と合わせ、室温で一晩放置した。黄色析出物をろ過により分取し、エタノール及びアセトンで洗浄後、減圧乾燥をしてＦＰＰを得た。収量4.81g(46%)、融点210〜213℃であった。【００４０】
（実施例１）
ラットの背に3cm×3cmの大きさの皮膚全層欠損を人為的に作成した。その際、切除した皮膚を自家皮膚移植片とし、当該移植片に直径5mmの孔を12個形成した。
次いで、前記皮膚全層欠損部位に孔を形成した移植片を静置し、（Ａ）そのまま放置した場合、（Ｂ）移植片を縫合した場合、（Ｃ）孔に従来の医療用接着剤（シアノアクリルアミド系、商品名：ダーマボンド（Ｊ＆Ｊ社製））を充填した場合、及び（Ｄ）孔に本発明の組成物を充填し、紫外線を照射した場合（波長330nm×15秒間）について、以下の項目について評価した。結果を表１に示す。【００４１】
【表１】
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【００４２】
表１から明らかなように、未処理の移植片（Ａ）では生着率が格段に低く、移植片を縫合した場合（Ｂ）には生着率は向上するものの、処理に１０分以上の時間を要する。一方、シアノアクリルアミド系接着剤を用いた場合（Ｃ）には、処理時間及び生着率の点で優れているが、移植片周辺における肉芽形成が見られなかった。しかしながら、本発明の組成物を用いた場合（Ｄ）には、処理時間、生着率、及び肉芽形成の全ての点で優れていた。【００４３】
（実施例２）
ＰＲＣの4%水溶液（蒸留水）を調製し、等量の培地（DMEM/F12、Invitrogen社製）と混合して本実施例の組成物（Ａ）とした。また、前記培地の代わりに等量のＰＢＳと混合して比較組成物（Ｂ）を調製した。組成物（Ａ）で使用した培地（DMEM/F12）は、各種アミノ酸、グルコース、及びその他の成分を含有する無血清組織培養培地である。
実施例１と同様に、マウスの皮膚全層欠損部位に自家皮膚移植片を静置し、前記組成物（Ａ）及び（Ｂ）を充填して紫外線照射した。その後、移植部位の断面組織を観察した結果を図２及び３に示す。【００４４】
図２に示されるように、本発明に係る組成物（Ａ）を用いた場合には、キトサン層に好中球が高密度に浸潤し（２日目）、引き続きキトサン層が消失するとともに血管新生、肉芽形成が見られ（４日目）、さらに上皮化が観察された（８日目）。それに対して、図３に示すアミノ酸やグルコースを含まない組成物（Ｂ）を用いた場合は、キトサン層への細胞の浸潤が見られず、８日目になってキトサン層の収縮が認められるが、キトサン層直下の組織における浸潤は著しく（２日目）、線維芽細胞などによる肉芽の形成は活発であった。【００４５】
（実施例３）
実施例２と同様の実験を行い、所定時間（４日）の後、ＰＲＣゲル層を含む組織を取り出し、抗-ＶＥＧＦ抗体で免疫染色した。アミノ酸、グルコース等を含む培地を用いた実施例（Ａ）及びＰＢＳを用いた比較例（Ｂ）で得られた結果を各々図４及び５に示す。
図４に示すように、本発明の組成物を用いた実施例（Ａ）では、ＰＲＣゲル層内部に強い染色が認められた（図４（Ａ））。特に、ゲル層の上層部に多くの好中球を含む線維化した層が存在し、強いＶＥＧＦ染色が観察された（図４（Ｂ））。
一方、ＰＢＳに溶解した比較例（Ｂ）では、ＰＲＣゲル層の分解は見られず、ＰＲＣゲル層が皮下組織と接する最下層に強い染色が認められた（図５（Ａ））。当該界面領域ではＰＲＣゲルが線維状に変性し、ＶＥＧＦの強い染色が観察された。【００４６】
（実施例４）
ＰＲＣをＰＢＳに溶解した組成物（Ａ）、（Ａ）に５０ｍｇ/ｍｌのＤ-グルコースを添加した組成物（Ｂ）、及び（Ａ）に５ｍｇ/ｍｌのグルタミンを添加した組成物（Ｃ）を調製した。また、組成物ＢおよびＣと同じ濃度のグルコースとアミノ酸を添加した組成物（Ｄ）を調製した。
実施例２及び３と同様にマウスの背部に皮膚全層欠損部位を作製し、当該部位に自家皮膚移植片を静置して、前記組成物（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）を充填して紫外線照射により硬化させた。処理後５日目に組織を採取し、顕微鏡観察によってキトサンゲル層への顆粒球の浸潤程度を比較した。結果を表２に示す。【００４７】
【表２】
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実施例２および３で認められた培地による添加物効果は、グルコースやアミノ酸単独でも観察されることが明らかである。また、添加するアミノ酸を必須アミノ酸混合物としても、同様に有効な顆粒球浸潤が観察できた（データは示さない）。【００４８】
（実施例５）
マウス背部に２cmの皮膚全層欠損を形成し、本発明の組成物又は市販の人工真皮であるコラーゲン膜（テルダーミス；テルモ社製）で処理した（自家皮膚移植はしていない）。
処理後６日目には、本発明の組成物で処理した創傷（Ａ）では、キトサンゲルが既に消失し、肉芽形成が早く周辺組織からの上皮化が進行していた。一方、コラーゲン膜で処理した創傷（Ｂ）では、創傷周辺組織からの上皮化は観察されるものの、コラーゲン膜が残存していた。また、（Ａ）では、紫外線硬化させたキトサンゲルをガーゼ等の被覆材で覆う必要はないが、（Ｂ）ではコラーゲン膜の固定に縫合が必要であり、抜糸を行う際に再度創傷が生じるという問題が伴った。【００４９】
（実施例６）
ラットの背部に人為的にＩＩＩ度熱傷を形成させ、壊死組織を切除した（図６Ａ）。次いで、当該部位をサポート材としての本発明の組成物（図６Ａ）又はコラーゲンスポンジ（テルダーミス；テルモ社製）（図６Ｃ）で処理した。即ち、本発明の組成物（DMEM/F12含有ＰＲＣ水溶液）を創傷部分に充填して光硬化させた例と、コラーゲンスポンジを用いて処理した例とを比較した。【００５０】
本発明の組成物で処理した場合では、移植後６日目頃から新生血管の発現が認められた。それに対して、コラーゲンスポンジを用いた場合には、６日目では血流量が少なく、新生血管の発現は移植後１２日以降にピークに達した。創傷部位における肉芽組織の厚み及び顕微鏡観察したときの毛細血管数の変化を図７及び８に示す。本発明の組成物により、肉芽形成及び血管新生が著しく促進されたことがわかる。【００５１】
移植後３２日における上皮の厚さは、本発明の組成物で処理した例では平均６７．１μｍに達したのに対し、コラーゲンスポンジで処理した例では５５．８μｍであった。
即ち、本実施例の結果から、本発明の医療用組成物を用いることにより、自家皮膚移植片を使用しなくても、キトサンゲル層への顆粒球の浸潤に続いて新生血管の増加、さらには上皮形成が誘導されるという驚くべき結果が得られた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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