(57)【要約】  低分子量ＧＴＰ結合蛋白質の１グループであるＲｈｏファミリー蛋白質に対してＧＴＰアーゼ活性化蛋白質（ＧＡＰ）として作用し得る新規な蛋白質および該蛋白質をコードする遺伝子を見出し、該ＧＡＰの機能および／または発現を阻害する化合物の同定方法、該ＧＡＰの機能および／または発現の異常に基づく疾患に用い得る医薬組成物、並びにその疾患の判定方法および試薬キットを提供すること。  配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、該ポリヌクレオチドの相同物、前記ポリヌクレオチドがコードする蛋白質、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターを含む形質転換体、前記蛋白質に対する抗体、これらを使用することを特徴とする前記蛋白質の機能および／または発現を阻害する化合物の同定方法並びに疾患の判定方法、これらを含んでなる医薬組成物および試薬キット。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補的塩基配列で表されるポリヌクレオチド、または配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質をコードするポリヌクレオチド若しくは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表されるポリヌクレオチド。
【請求項２】
下記の群から選ばれるポリヌクレオチドであって、Ｒａｃ１と結合する蛋白質をコードするポリヌクレオチド：
ｉ  ）請求項１に記載のポリヌクレオチドの塩基配列と少なくとも７０％の相同性を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチド、
ｉｉ）請求項１に記載のポリヌクレオチドの塩基配列において、１乃至数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有するポリヌクレオ          チド、および
ｉｉｉ）請求項１に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。
【請求項３】
下記の群から選ばれるポリヌクレオチドであって、Ｒａｃ１のＧＴＰアーゼ活性を促進する機能（ＧＡＰ活性）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド：
ｉ  ）請求項１に記載のポリヌクレオチドの塩基配列と少なくとも７０％の相同性を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチド、
ｉｉ）請求項１に記載のポリヌクレオチドの塩基配列において、１乃至数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有するポリヌクレオチド、および
ｉｉｉ）請求項１に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体。
【請求項６】
請求項４に記載の組換えベクターおよびＲａｃ１をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクターにより形質転換されてなる請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質。
【請求項８】
請求項２または３に記載のポリヌクレオチドがコードする蛋白質。
【請求項９】
請求項５または６に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項７または８に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項１０】
請求項７または８に記載の蛋白質を認識する抗体。
【請求項１１】
請求項７または８に記載の蛋白質の機能および／または請求項１から３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法であって、該化合物と該蛋白質および／または該ポリヌクレオチドとの相互作用を可能にする条件下で、該機能および／または該発現の存在、不存在または変化を検出することにより、該化合物が該蛋白質の機能および／または該ポリヌクレオチドの発現を阻害するか否かを判定することを特徴とする同定方法。
【請求項１２】
蛋白質の機能が、Ｒａｃ１に対するＧＡＰ活性である請求項１１に記載の同定方法。
【請求項１３】
ヒト甲状腺組織由来の被検組織が、ヒト甲状腺の慢性炎症性疾患由来組織であるか否かを判定する方法であって、該被検組織における請求項１から３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする判定方法。
【請求項１４】
被検組織における請求項１から３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの発現量が、対照であるヒト正常甲状腺由来組織における該ポリヌクレオチドの発現量の少なくとも４．５倍以上である場合に、被検組織がヒト甲状腺の慢性炎症性疾患由来組織であると判定することを特徴とする、請求項１３に記載の判定方法。
【請求項１５】
ヒト腎臓組織由来の被検組織が、ヒト腎臓の慢性炎症性疾患由来組織であるか否かを判定する方法であって、該被検組織における請求項１から３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする判定方法。
【請求項１６】
被検組織における請求項１から３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの発現量が、対照であるヒト正常腎臓由来組織における該ポリヌクレオチドの発現量の少なくとも３．５倍以上である場合に、被検組織がヒト腎臓の慢性炎症性疾患由来組織であると判定することを特徴とする、請求項１５に記載の判定方法。
【請求項１７】
請求項７または８に記載の蛋白質の機能を阻害する化合物および／または請求項１から３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物を有効成分として含んでなる甲状腺の慢性炎症性疾患および／または腎臓の慢性炎症性疾患の防止剤および／または治療剤。
【請求項１８】
請求項７または８に記載の蛋白質の機能を阻害する化合物および／または請求項１から３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物を用いることを特徴とする甲状腺の慢性炎症性疾患および／または腎臓の慢性炎症性疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項１９】
請求項７または８に記載の蛋白質、請求項１から３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項４に記載の組換えベクター、請求項５または６に記載の形質転換体および請求項１０に記載の抗体のうち少なくともいずれか１つを含んでなる試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低分子量ＧＴＰ結合蛋白質の１グループであるＲｈｏファミリー蛋白質に対してＧＴＰアーゼ活性化蛋白質として作用し得る蛋白質および該蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する。より詳しくは、Ｒｈｏファミリー低分子量ＧＴＰ結合蛋白質の１つであるＲａｃ１に結合する蛋白質、該蛋白質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体に関する。また、前記蛋白質の製造方法、前記蛋白質に対する抗体に関する。さらに、前記蛋白質の機能および／または前記ポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法に関する。また、前記ポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする慢性炎症性疾患の診断方法に関する。さらに、前記蛋白質の機能阻害剤および／または前記ポリヌクレオチドの発現阻害剤を有効成分として含んでなる慢性炎症性疾患の防止剤および／または治療剤、前記蛋白質の機能阻害剤および／または前記ポリヌクレオチドの発現阻害剤を用いることを特徴とする、慢性炎症性疾患の防止方法および／または治療方法に関する。また、前記蛋白質、前記ポリヌクレオチド、前記組換えベクター、前記形質転換体および前記抗体のうち、少なくともいずれか１つを含んでなる試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｒｈｏファミリー低分子量ＧＴＰ結合蛋白質（以下、単にＲｈｏファミリー蛋白質と称することがある）は低分子量ＧＴＰ結合蛋白質（以下、単に低分子量Ｇ蛋白質と称する）の１グループに属する蛋白質である。低分子量Ｇ蛋白質は、細胞膜受容体と細胞内情報伝達経路に関与する効果器（エフェクター）との間で、シグナルの増幅因子として作用する。また、低分子量Ｇ蛋白質は、グアノシン５´−三リン酸（ＧＴＰ）またはグアノシン５´−二リン酸（ＧＤＰ）と特異的に結合し、結合したＧＴＰをＧＤＰに加水分解する酵素活性をもつ。ＧＴＰをＧＤＰに加水分解する酵素活性をＧＴＰアーゼ活性という。細胞膜受容体に細胞外情報物質が結合すると、そのシグナルが低分子量Ｇ蛋白質に伝達され、低分子量Ｇ蛋白質に結合しているＧＤＰと細胞内に存在するＧＴＰとの交換反応（以下、ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応と略称する）が起きる。その結果、活性型のＧＴＰ結合型低分子量Ｇ蛋白質が生じる。活性型低分子量Ｇ蛋白質は、エフェクターに作用してシグナルを増幅する。その後、ＧＴＰ結合型低分子量Ｇ蛋白質は、そのＧＴＰアーゼ活性により、結合しているＧＴＰをＧＤＰに加水分解して不活性化する。このように、低分子量Ｇ蛋白質は、グアニンヌクレオチドの交換により、細胞内情報伝達経路において分子スイッチとして働く。【０００３】
低分子量Ｇ蛋白質の分子スイッチとしての作用に関与している分子の１つが、ＧＴＰアーゼ活性化蛋白質（ＧＴＰａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ；以下、ＧＡＰと略称する）である。ＧＡＰは、低分子量Ｇ蛋白質のＧＴＰアーゼ活性を促進する機能を有する。ＧＡＰは、この機能により、ＧＴＰ結合型の活性型低分子量Ｇ蛋白質からＧＤＰ結合型の不活性型低分子量Ｇ蛋白質への変化を促進する。ＧＡＰには、ＧＡＰドメインと呼ばれる特徴的ドメイン構造が存在する。ＧＡＰドメインは、ＧＡＰの活性ドメインである。【０００４】
ＧＡＰの中で、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対して作用するものを、Ｒｈｏ−ＧＡＰと呼ぶ。Ｒｈｏファミリー蛋白質としては、Ｃｄｃ４２、Ｒａｃ１およびＲｈｏＡ等が知られている。Ｃｄｃ４２は線維芽細胞でフィロポディアの形成を制御している。Ｒａｃ１は、白血球やマクロファージではスーパーオキシドの産生を、線維芽細胞では細胞膜のラッフリングやラメリポディアの形成をそれぞれ制御している。また、Ｃｄｃ４２とＲａｃ１はｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼシグナル伝達経路を活性化することもできる。このように、Ｒｈｏファミリー蛋白質は、細胞内情報伝達の制御を介して様々な細胞機能に関与している。Ｒｈｏファミリー蛋白質が関与する細胞機能として、例えば細胞骨格の再構成、細胞接着、遺伝子発現等が知られている。Ｒｈｏファミリー蛋白質を介するこのような作用は、発生時の形態形成、白血球等の遊走、神経突起退縮、および癌細胞の転移や浸潤に働くと考えられる。【０００５】
Ｒｈｏ−ＧＡＰは、ＧＴＰアーゼ活性を促進する機能により、Ｒｈｏファミリー蛋白質が関与する細胞内情報伝達の制御に重要な役割を担うと考えられる。Ｒｈｏ−ＧＡＰとして単離された遺伝子には、非特異性のＸ連鎖性精神遅滞（ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｘ−Ｌｉｎｋｅｄ  ｍｅｎｔａｌ  ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ）に関与するＯｌｉｇｏｐｈｒｅｎｉｎ−１（非特許文献１）、ロウ症候群（Ｌｏｗｅ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）に関与するＯＣＲＬ−１（非特許文献２）等がある。【０００６】
【非特許文献１】「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、１９９８年、第３９２巻、第６６７９号、ｐ．９２３−９２６。
【非特許文献２】「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９９５年、第９２巻、第１１号、ｐ．４８５３−４８５６。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、新規なＲｈｏ−ＧＡＰおよび該Ｒｈｏ−ＧＡＰをコードする遺伝子を提供することである。また本発明の課題には、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体を提供することも含まれる。さらに本発明の課題には、該Ｒｈｏ−ＧＡＰの製造方法および該Ｒｈｏ−ＧＡＰを認識する抗体を提供することも含まれる。また本発明の課題には、該Ｒｈｏ−ＧＡＰの機能および／または該遺伝子の発現を阻害する化合物の同定方法を提供することも含まれる。さらに本発明の課題には、該Ｒｈｏ−ＧＡＰの機能の異常および／または該遺伝子の発現の異常に基づく疾患の防止方法および／または治療方法、並びに該疾患の診断方法、試薬キットを提供することも含まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題解決のために鋭意努力し、Ｒｈｏ−ＧＡＰに特徴的なＧＡＰドメインをコードする領域を有する新規遺伝子を見出し、さらに該遺伝子がコードする蛋白質を取得することに成功した。そして、該遺伝子がコードする蛋白質が、Ｒｈｏファミリー蛋白質の１つであるＲａｃ１に結合することを実験的に明らかにした。さらに、該遺伝子の組織発現が、甲状腺の慢性炎症例および腎臓の慢性炎症例においてそれぞれ正常組織の少なくとも４．５倍以上および少なくとも３．５倍以上であることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて達成した。【０００９】
すなわち、本発明は、
１．配列表の配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補的塩基配列で表されるポリヌクレオチド、または配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質をコードするポリヌクレオチド若しくは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表されるポリヌクレオチド、
２．下記の群から選ばれるポリヌクレオチドであって、Ｒａｃ１と結合する蛋白質をコードするポリヌクレオチド：
ｉ  ）前記１．に記載のポリヌクレオチドの塩基配列と少なくとも７０％の相同性を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチド、
ｉｉ ）前記１．に記載のポリヌクレオチドの塩基配列において、１乃至数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有するポリヌクレオチド、および
ｉｉｉ）前記１．に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド、
３．下記の群から選ばれるポリヌクレオチドであって、Ｒａｃ１のＧＴＰアーゼ活性を促進する機能（ＧＡＰ活性）を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド：
ｉ  ）前記１．に記載のポリヌクレオチドの塩基配列と少なくとも７０％の相同性を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチド、
ｉｉ ）前記１．に記載のポリヌクレオチドの塩基配列において、１乃至数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有するポリヌクレオチド、および
ｉｉｉ）前記１．に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド、
４．前記１．から３．のいずれか１に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
５．前記４．に記載の組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体、
６．前記４．に記載の組換えベクターおよびＲａｃ１をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクターにより形質転換されてなる前記５．に記載の形質転換体、
７．配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質、
８．前記２．または３．に記載のポリヌクレオチドがコードする蛋白質、
９．前記５．または６．に記載の形質転換体を培養する工程を含む、前記７．または８．に記載の蛋白質の製造方法、
１０．前記７．または８．に記載の蛋白質を認識する抗体、
１１．前記７．または８．に記載の蛋白質の機能および／または前記１．から３．のいずれか１に記載のポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法であって、該化合物と該蛋白質および／または該ポリヌクレオチドとの相互作用を可能にする条件下で、該機能および／または該発現の存在、不存在または変化を検出することにより、該化合物が該蛋白質の機能および／または該ポリヌクレオチドの発現を阻害するか否かを判定することを特徴とする同定方法、
１２．蛋白質の機能が、Ｒａｃ１に対するＧＡＰ活性である前記１１．に記載の同定方法、
１３．ヒト甲状腺組織由来の被検組織が、ヒト甲状腺の慢性炎症性疾患由来組織であるか否かを判定する方法であって、該被検組織における前記１．から３．のいずれか１に記載のポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする判定方法、
１４．被検組織における前記１．から３．のいずれか１に記載のポリヌクレオチドの発現量が、対照であるヒト正常甲状腺由来組織における該ポリヌクレオチドの発現量の少なくとも４．５倍以上である場合に、被検組織がヒト甲状腺の慢性炎症性疾患由来組織であると判定することを特徴とする、前記１３．に記載の判定方法、
１５．ヒト腎臓組織由来の被検組織が、ヒト腎臓の慢性炎症性疾患由来組織であるか否かを判定する方法であって、該被検組織における前記１．から３．のいずれか１に記載のポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする判定方法、
１６．被検組織における前記１．から３．のいずれか１に記載のポリヌクレオチドの発現量が、対照であるヒト正常腎臓由来組織における該ポリヌクレオチドの発現量の少なくとも３．５倍以上である場合に、被検組織がヒト腎臓の慢性炎症性疾患由来組織であると判定することを特徴とする、前記１５．に記載の判定方法、
１７．前記７．または８．に記載の蛋白質の機能を阻害する化合物および／または前記１．から３．のいずれか１に記載のポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物を有効成分として含んでなる甲状腺の慢性炎症性疾患および／または腎臓の慢性炎症性疾患の防止剤および／または治療剤、
１８．前記７．または８．に記載の蛋白質の機能を阻害する化合物および／または前記１．から３．のいずれか１に記載のポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物を用いることを特徴とする甲状腺の慢性炎症性疾患および／または腎臓の慢性炎症性疾患の防止方法および／または治療方法、
１９．前記７．または８．に記載の蛋白質、前記１．から３．のいずれか１に記載のポリヌクレオチド、前記４．に記載の組換えベクター、前記５．または６．に記載の形質転換体および前記１０．に記載の抗体のうち少なくともいずれか１つを含んでなる試薬キット、
からなる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明においては、Ｒｈｏファミリー蛋白質に結合する新規蛋白質をコードするポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドがコードする蛋白質を提供可能である。本蛋白質は、Ｒｈｏファミリー蛋白質の１つであるＲａｃ１に結合した。また、本蛋白質は、そのアミノ酸配列中に、Ｒｈｏ−ＧＡＰに特徴的なＧＡＰドメインを有する。このことから、本蛋白質は、Ｒｈｏ蛋白質、例えばＲａｃ１に結合して、Ｒｈｏ−ＧＡＰとして作用すると考える。また、本発明においては、前記ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体を提供可能である。さらに、前記蛋白質の製造方法、前記蛋白質に対する抗体を提供可能である。また、前記蛋白質の機能および／または前記ポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法を提供可能である。さらに、前記ポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする慢性炎症性疾患、例えば慢性甲状腺炎および慢性腎炎の診断方法を提供可能である。また、前記蛋白質の機能阻害剤および／または前記ポリヌクレオチドの発現阻害剤を有効成分として含んでなる、慢性炎症性疾患、例えば慢性甲状腺炎および／または慢性腎炎の防止剤および／または治療剤、前記蛋白質の機能阻害剤および／または前記ポリヌクレオチドの発現阻害剤を用いることを特徴とする慢性炎症性疾患、例えば慢性甲状腺炎および／または慢性腎炎の防止方法および／または治療方法を提供可能である。さらに、前記蛋白質、前記ポリヌクレオチド、前記組換えベクター、前記形質転換体および前記抗体のうち、少なくともいずれか１つを含んでなる試薬キットを提供可能である。【００１１】
本発明により、Ｒｈｏファミリー蛋白質、例えばＲａｃ１が関与する情報伝達経路および細胞機能の解明とその調節が可能になる。さらに、本ポリヌクレオチドがコードする蛋白質の機能の異常および／または本ポリヌクレオチドの発現の異常に基づく疾患、例えば慢性炎症性疾患、例えば慢性甲状腺炎および／または慢性腎炎の診断、防止および／または治療が可能になる。
、本発明は基礎科学分野から医薬開発分野まで広く寄与する有用な発明である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】パネルＡは、ｓｊ０４０８５がコードする蛋白質とＲａｃ１との結合を検出した図である。ｓｊ０４０８５発現ベクターと、Ｒａｃ１発現ベクターとをコトランスフェクションした細胞の細胞溶解液において、ｓｊ０４０８５がコードする蛋白質とＲａｃ１との結合を示すバンドが検出された（パネルＡのレーン６）。一方、ｓｊ０４０８５発現ベクターとβ−グルクロニダーゼ（Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）（ＧＵＳ）発現ベクターとをコトランスフェクションした細胞の細胞溶解液では、このようなバンドは検出さなかった（パネルＡのレーン５）。また、以下の細胞の細胞溶解液では、いずれにおいてもこのようなバンドは検出されなかった（パネルＡ）：ｓｊ０４０８５発現ベクターのみをトランスフェクションした細胞（レーン４）；ＧＵＳ発現ベクターまたはＲａｃ１発現ベクターのみをトランスフェクションした細胞（レーン２および３）；および各ベクター導入せずＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００のみを添加した細胞（レーン１）。結合の測定はプルダウン法により行った。具体的には、ｓｊ０４０８５をＦＬＡＧ融合蛋白質としてＲａｃ１およびＧＵＳをＧＳＴ融合蛋白質として細胞に発現させた。各細胞溶解液をグルタチオンセファロースとインキュベーションし、グルタチオンセファロースに結合した蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開した後、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたイムノブロッティングによりｓｊ０４０８５とＲａｃ１の結合を検出した。パネルＢは、各細胞溶解液のサンプルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてｓｊ０４０８５がコードする蛋白質を検出した図である。パネルＣは、各細胞溶解液のサンプルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、抗ＧＳＴ抗体を用いてＧＳＴ融合ＧＵＳを検出した図である。パネルＤは、各細胞溶解液のサンプルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、抗ＧＳＴ抗体を用いてＧＳＴ融合Ｒａｃ１を検出した図である。各細胞溶解液中の、ｓｊ０４０８５がコードする蛋白質はほぼ同量であった（パネルＢのレーン４−６）。また、各細胞溶解液中のＲａｃ１またはＧＵＳの量はほぼ同量であった（パネルＤのレーン３および６またはパネルＣのレーン２および５）。（実施例３）
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明について発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。
本発明において、単離された完全長ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ；合成完全長ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ；単離されたＤＮＡオリゴヌクレオチド類および／またはＲＮＡオリゴヌクレオチド類；あるいは合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド類および／またはＲＮＡオリゴヌクレオチド類を意味する総称的用語として「ポリヌクレオチド」という用語を使用し、ここでそのようなＤＮＡおよび／またはＲＮＡは最小サイズが２ヌクレオチドである。
本発明において、単離された若しくは合成の完全長蛋白質；単離された若しくは合成の完全長ポリペプチド；または単離された若しくは合成の完全長オリゴペプチドを意味する総称的用語として「蛋白質」という用語を使用し、ここで蛋白質、ポリペプチド若しくはオリゴペプチドは最小サイズが２アミノ酸である。以降、アミノ酸を表記する場合、１文字または３文字にて表記することがある。【００１４】
（ポリヌクレオチド）
本発明の一態様は新規ポリヌクレオチドに関する。本ポリヌクレオチドは、ヒト脾臓由来ｃＤＮＡライブラリーから、Ｒｈｏ−ＧＡＰに特徴的なドメインであるＧＡＰドメインをコードする領域を有する遺伝子として同定し単離した。【００１５】
本発明に係るポリヌクレオチドの具体的態様は、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列で表されるポリヌクレオチドであり得る。配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドは、４３９３ｂｐのポリヌクレオチドであり、１１０１アミノ酸残基（配列番号２）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。配列番号１に記載の塩基配列において第４２１番目から第８７９番目までのヌクレオチドからなる領域は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第３４番目のプロリン（Ｐｒｏ）から第１８６番目のセリン（Ｓｅｒ）までの１５３アミノ酸残基からなるＧＡＰドメインをコードする。本発明の範囲には、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表されるポリヌクレオチドも包含される。【００１６】
本発明に係るポリヌクレオチドは、好ましくは、Ｒｈｏファミリー蛋白質に結合する蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表されるポリヌクレオチドである。本発明において「蛋白質間の結合」とは、ある蛋白質（蛋白質Ａ）と別のある蛋白質（蛋白質Ｂ）が複合体を形成するように、水素結合、疎水結合または静電的相互作用等の非共有結合により、蛋白質Ａと蛋白質Ｂが相互作用することを意味する。ここでの結合とは、蛋白質Ａと蛋白質Ｂがそれら分子の一部分において結合すれば足りる。例えば、蛋白質Ａまたは蛋白質Ｂを構成するアミノ酸中に、蛋白質Ａと蛋白質Ｂの結合に関与しないアミノ酸が含まれていてもよい。【００１７】
配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドがコードする蛋白質は、Ｒｈｏファミリー蛋白質の１つであるＲａｃ１に結合した。具体的には、配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドとＲａｃ１をコードする遺伝子とを共に発現させた動物細胞において、該ポリヌクレオチドがコードする蛋白質とＲａｃ１の結合が検出された（実施例３参照）。【００１８】
本発明に係るポリヌクレオチドがコードする蛋白質は、その構造にＧＡＰドメインを有し、Ｒｈｏファミリー蛋白質に結合する。ＧＡＰドメインは、ＧＡＰの活性ドメインである。したがって、本ポリヌクレオチドがコードする蛋白質は、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＡＰ活性を有すると考える。「Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＡＰ活性」とは、該Ｒｈｏファミリー蛋白質のＧＴＰアーゼ活性を促進する活性を意味する。その結果、本ポリヌクレオチドがコードする蛋白質は、Ｒｈｏファミリー蛋白質のＧＴＰアーゼ活性を促進することにより、ＧＴＰ結合型の活性型Ｒｈｏファミリー蛋白質からＧＤＰ結合型の不活性型Ｒｈｏファミリー蛋白質への変化を促進する。すなわち、本ポリヌクレオチドがコードする蛋白質は、Ｒｈｏファミリー蛋白質の不活性化を促進し得る。「Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＡＰ活性」には、Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性型から不活性型への変化を促進する活性およびＲｈｏファミリー蛋白質の不活性化を促進する活性も含まれる。【００１９】
本発明に係るポリヌクレオチドがコードする蛋白質が、ＧＡＰ活性を示し得るＲｈｏファミリー蛋白質として、例えばＲａｃ１が好ましく例示できる。Ｒｈｏファミリー蛋白質はこれに限定されず、本ポリヌクレオチドがコードする蛋白質がＧＡＰ活性を示し得る限りにおいて、例えば結合し得る限りにおいていずれのＲｈｏファミリー蛋白質であってもよい。本発明においてＲｈｏファミリー蛋白質というときは、好ましくはＲａｃ１を指す。本ポリヌクレオチドがコードする蛋白質とＲｈｏファミリー蛋白質の結合は、例えばプルダウン法を使用して測定できる（実施例３参照）。また、本ポリヌクレオチドがコードする蛋白質によるＲｈｏファミリー蛋白質のＧＴＰアーゼ活性の促進やＲｈｏファミリー蛋白質の不活性化の促進は、例えば後述するような［γ−３２Ｐ］ＧＴＰ等を用いた方法により測定できる。このような測定方法は、公知文献〔「ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、１９９８年、第２７３巻、第４４号、ｐ．２９１７２−２９１７７〕記載の方法等を参照して実施可能である。【００２０】
Ｒａｃ１のアミノ酸配列およびＲａｃ１遺伝子の塩基配列を、それぞれ配列表の配列番号６および配列番号５に記載する。Ｒａｃ１およびその遺伝子は、上記各配列で表されるものに限らず、一般的に知られているＲａｃ１の機能を有する限りにおいて、上記各配列において１乃至数個の変異を有する蛋白質および遺伝子であることができる。また、これらの機能を促進するあるいは欠失させるといった所望の目的のために上記各配列に１乃至数個の変異を導入した変異体を用いることもできる。Ｒａｃ１は、例えば、その遺伝子を含有する組換えベクターを自体公知の遺伝子工学的方法により適当な宿主にトランスフェクションして形質転換体を作製し、該形質転換体を培養することにより取得することが可能である。【００２１】
本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明により開示されたその具体例、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドについての配列情報に基づいて、公知の遺伝子工学的手法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；および村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社等を参照）により容易に取得することができる。【００２２】
具体的には、本発明に係るポリヌクレオチドの発現が確認されている適当な起源から、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ｃＤＮＡライブラリーから所望のクローンを選択することにより本ポリヌクレオチドを取得可能である。ｃＤＮＡの起源として、本ポリヌクレオチドの発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞、例えばヒトの脾臓由来の細胞等が例示できる。これら起源からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等はいずれも常法に従って実施可能である。また、ヒト脾臓由来の市販されているｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを構築して用いることもできる。ｃＤＮＡライブラリーから所望のクローンを選択する方法も特に制限されず、慣用の方法を利用できる。例えば、本ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイゼーションするプローブやプライマー等を用いて所望のクローンを選択することができる。具体的には、本ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイゼーションするプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法等やこれらを組合せた方法等を例示できる。ここで用いるプローブとして、本ポリヌクレオチドの配列情報に基づいて化学合成したポリヌクレオチド等が一般的に使用できる。また、既に取得された本ポリヌクレオチドやその部分塩基配列で表されるポリヌクレオチドも好ましく使用できる。さらに、本ポリヌクレオチドの配列情報に基づき設計したセンスプライマー、アンチセンスプライマーをこのようなプローブとして用いることもできる。【００２３】
ｃＤＮＡライブラリーからの所望のクローンの選択は、例えば公知の蛋白質発現系を利用して各クローンについて発現蛋白質の確認を行い、さらに該蛋白質の機能を指標にして実施できる。蛋白質発現系は、自体公知の発現系がいずれも利用可能である。具体的には、無細胞蛋白質発現系が例示できる〔マディン（Ｍａｄｉｎ，Ｋ．）ら、「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、２０００年、第９７巻、ｐ．５５９−５６４〕。【００２４】
本発明に係るポリヌクレオチドがコードする蛋白質の機能、または本発明に係る蛋白質の機能とは、好ましくはＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＡＰ活性、より好ましくはＲｈｏファミリー蛋白質に対して結合した本発明に係る蛋白質が示すＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＡＰ活性を意味する。さらに好ましくは、該機能は、Ｒａｃ１に対するＧＡＰ活性、さらにより好ましくはＲａｃ１に対して結合した本発明に係る蛋白質が示すＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＡＰ活性を意味する。【００２５】
本発明に係るポリヌクレオチドの取得にはその他、ポリメラーゼ連鎖反応〔以下、ＰＣＲと略称する、ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１；エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．）編、「ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用」、１９８９年、ストックトンプレス；およびサイキ（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８５年、第２３０巻、ｐ．１３５０−１３５４〕によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。ｃＤＮＡライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法（「実験医学」、１９９４年、第１２巻、第６号、ｐ．６１５-６１８）、特に５´−ＲＡＣＥ法〔フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．）ら、「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９８８年、第８５巻、第２３号、ｐ．８９９８−９００２〕等の採用が好適である。ＰＣＲに使用するプライマーは、ポリヌクレオチドの塩基配列情報に基づいて適宜設計でき、常法に従って合成により得ることができる。増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離精製は、常法により行うことができる。例えばゲル電気泳動法等により実施可能である。【００２６】
このような方法で得られるポリヌクレオチドの塩基配列の決定は、常法、例えばジデオキシ法〔「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９７７年、第７４巻、ｐ．５４６３−５４６７〕やマキサム−ギルバート法〔「メソッズ  イン  エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、１９８０年、第６５巻、ｐ．４９９−５６０〕等により、また簡便には市販のシーケンスキット等を用いて行うことができる。【００２７】
本発明に係るポリヌクレオチドは上記ポリヌクレオチドに限定されず、上記ポリヌクレオチドと配列相同性を有し、かつＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＡＰ活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表されるポリヌクレオチドを包含する。好ましくは本ポリヌクレオチドと配列相同性を有し、Ｒｈｏファミリー蛋白質に結合する蛋白質をコードするポリヌクレオチドかつ該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表されるポリヌクレオチドである。配列相同性は、通常、塩基配列の全体で５０％以上、好ましくは少なくとも７０％であることが適当である。より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上であることが適当である。また、好ましくは、ＧＡＰドメインコード領域を有するポリヌクレオチドが望ましい。ＧＡＰドメインコード領域における配列相同性は少なくとも７０％であることが好ましい。より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上であることが適当である。また、ＧＡＰドメインがその機能を保持していることがさらに好ましい。【００２８】
本発明に係るポリヌクレオチドには、上記ポリヌクレオチドの塩基配列において１個以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１個乃至数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入といった変異が存する塩基配列またはその相補的塩基配列で表されるポリヌクレオチドが包含される。変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有するポリヌクレオチドが、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＡＰ活性を有する蛋白質、より好ましくはＲｈｏファミリー蛋白質に結合する蛋白質である限り特に制限されない。さらに好ましくはＧＡＰドメインを有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドである。このような変異を有するポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチドであってよく、誘発変異を有するポリヌクレオチドであってよい。また、天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たポリヌクレオチドであってもよい。変異を導入する方法は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはＰＣＲ等を、単独でまたは適宜組合せて用いることができる。例えば成書に記載の方法〔サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；および村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社〕に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、ウルマーの技術〔ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１〕を利用することもできる。【００２９】
本発明に係るポリヌクレオチドとしてはまた、上記ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドを例示できる。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば成書に記載の方法〔サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー〕等に従うことができる。具体的には、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳおよび５０％  ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件をいう。これらポリヌクレオチドは本ポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドであれば相補的配列を有するポリヌクレオチドでなくてもよい。好ましくは、ＧＡＰドメインを有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドであることが望ましい。より好ましくは、コードする蛋白質がＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＡＰ活性を有する蛋白質、さらに好ましくはコードする蛋白質がＲｈｏファミリー蛋白質に結合する蛋白質であることが望ましい。【００３０】
本発明に係るポリヌクレオチドには、上記ポリヌクレオチドの指定された領域に存在する部分塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドが包含される。このようなオリゴヌクレオチドは、その最小単位として好ましくは該領域において連続する５個以上のヌクレオチド、より好ましくは１０個以上、より好ましくは２０個以上のヌクレオチドからなる。具体的には、配列表の配列番号３または４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを好ましく例示できる。これらのオリゴヌクレオチドは、本遺伝子または本遺伝子断片を増幅するためのプライマー、本遺伝子またはその転写産物を検出するためのプローブ等として用いることができる。これらオリゴヌクレオチドは、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列情報に従って、所望の配列を設計し、自体公知の化学合成法により製造することができる。簡便には、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置を用いて取得可能である。【００３１】
本発明に係るポリヌクレオチドは、好ましくはヒト由来のポリヌクレオチドである。しかし、本ポリヌクレオチドと配列相同性を有し、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＡＰ活性を有する蛋白質、好ましくはＲｈｏファミリー蛋白質に結合する蛋白質をコードするポリヌクレオチドである限りにおいて、哺乳動物由来のポリヌクレオチド、例えばマウス、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ラットまたはウサギ等由来のポリヌクレオチドも本発明に包含される。配列相同性は、通常、塩基配列の全体で５０％以上、好ましくは少なくとも７０％であることが適当である。より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上であることが適当である。また、好ましくは、ＧＡＰドメインコード領域を有するポリヌクレオチドが望ましい。ＧＡＰドメインコード領域における配列相同性は少なくとも７０％であることが好ましい。より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上であることが適当である。【００３２】
本発明に係るポリヌクレオチドは、その発現あるいはそれがコードする蛋白質の機能が阻害されない限りにおいて、５´末端側や３´末端側に所望の遺伝子が付加されたポリヌクレオチドであってよい。本ポリヌクレオチドに付加することのできる遺伝子として、具体的にはグルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、ホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）等の酵素類、あるいはＨｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類等の遺伝子が例示できる。これら遺伝子から選択した１種類または複数種類の遺伝子を組合せて付加することができる。これら遺伝子の付加は、慣用の遺伝子工学的手法により行うことができ、遺伝子やｍＲＮＡの検出を容易にするために有用である。【００３３】
（ベクター）
本発明の一態様は、本発明に係るポリヌクレオチドを含有する組換えベクターに関する。本組換えベクターは、本ポリヌクレオチドを適当なベクターＤＮＡに挿入することにより得ることができる。【００３４】
ベクターＤＮＡは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターＤＮＡは、天然に存在するＤＮＡを抽出して得られたベクターＤＮＡの他、複製に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているベクターＤＮＡでもよい。代表的なベクターＤＮＡとして例えば、プラスミド、バクテリオファージおよびウイルス由来のベクターＤＮＡを挙げることができる。プラスミドＤＮＡとして、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド等を例示できる。バクテリオファージＤＮＡとして、λファージ等が挙げられる。ウイルス由来のベクターＤＮＡとして、例えばレトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルス等の動物ウイルス由来のベクター、あるいはバキュロウイルス等の昆虫ウイルス由来のベクターが挙げられる。その他、トランスポゾン由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来のベクターＤＮＡ等を例示できる。あるいは、これらを組合せて作成したベクターＤＮＡ、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメントを組合せて作成したベクターＤＮＡ（コスミドやファージミド等）を例示できる。【００３５】
ベクターＤＮＡは、発現ベクターやクローニングベクター等、目的に応じていずれを用いることもできる。本発明に係るポリヌクレオチドを含有する組換え発現ベクターは、本ポリヌクレオチドがコードする蛋白質の製造に使用可能である。【００３６】
ベクターＤＮＡには、本発明に係るポリヌクレオチドの機能が発揮されるように該ポリヌクレオチドを組込むことが必要であり、少なくとも本ポリヌクレオチドとプロモーターとをその構成要素とする。これら要素に加えて、所望によりさらに、複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列を組合せて自体公知の方法によりベクターＤＮＡに組込むことができる。このような遺伝子配列として、例えば、リボソーム結合配列、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、および選択マーカー（ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等）等を例示できる。これらから選択した１種類または複数種類の遺伝子配列をベクターＤＮＡに組込むことができる。【００３７】
ベクターＤＮＡに本発明に係るポリヌクレオチドを組込む方法は、自体公知の方法を適用できる。例えば、本ポリヌクレオチドを含む遺伝子を適当な制限酵素により処理して特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターＤＮＡと混合し、リガーゼにより再結合する方法が用いられる。あるいは、本ポリヌクレオチドに適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組換えベクターが得られる。【００３８】
（形質転換体）
本発明の一態様は、本発明に係る組換えベクターにより、宿主を形質転換して得られる形質転換体に関する。本発明に係るポリヌクレオチドを含有する組換え発現ベクターを導入した形質転換体は、本ポリヌクレオチドがコードする蛋白質の製造に有用である。本形質転換体には、本ポリヌクレオチド以外の所望の遺伝子を含有するベクターＤＮＡの１種類または複数種類をさらに導入することができる。本ポリヌクレオチド以外の所望の遺伝子を含有するベクターＤＮＡとして、例えば、Ｒａｃ１等のＲｈｏファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含有するベクターＤＮＡが挙げられる。本ポリヌクレオチドを含有する発現ベクターとＲｈｏファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターとにより形質転換して得られる形質転換体は、本ポリヌクレオチドがコードする蛋白質のＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＡＰ活性を阻害する化合物の同定方法に使用できる。具体的には、本蛋白質とＲｈｏファミリー蛋白質の結合、本蛋白質によるＲｈｏファミリー蛋白質のＧＴＰアーゼ活性促進、および／または本蛋白質によるＲｈｏファミリー蛋白質の不活性化促進を阻害する化合物の同定方法に使用できる。このような形質転換体として好ましくは、本発明に係る組換えベクターとＲａｃ１をコードする遺伝子を含有する組換えベクターとにより形質転換して得られる形質転換体が挙げられる。【００３９】
宿主として、原核生物および真核生物のいずれも用いることができる。原核生物として、例えば大腸菌〔エシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）〕等のエシェリヒア属、枯草菌等のバシラス属、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウムメリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられる。真核生物として、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞等の動物細胞を例示できる。酵母は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等が挙げられる。昆虫細胞は、Ｓｆ９細胞やＳｆ２１細胞等を例示できる。哺乳動物細胞は、サル腎由来細胞（ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞等）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒトＦＬ細胞や２９３ＥＢＮＡ細胞等が例示できる。好ましくは哺乳動物細胞を用いる。最も好ましくは、２９３ＥＢＮＡ細胞を用いる。【００４０】
組換えベクターによる宿主細胞の形質転換は、自体公知の手段を応用して実施できる。例えば成書に記載されている標準的な方法〔サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー〕により実施できる。より好ましい方法として、遺伝子の安定性を考慮するならば染色体内へのインテグレート法が挙げられる。簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系を使用できる。具体的には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、バリスティック導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）および感染等が挙げられる。【００４１】
原核生物を宿主とする場合、組換えベクターが該原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明に係るポリヌクレオチド、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。細菌を宿主とする場合、プロモーターとして、大腸菌等の細菌中で発現できるプロモーターであればいずれも利用可能である。例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。ｔａｃプロモーター等の人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、いずれも利用可能である。好ましくは例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等を利用できる。
哺乳動物細胞を宿主とする場合、組換えベクターが該細胞中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、ＲＮＡスプライス部位、本発明に係るポリヌクレオチド、ポリアデニル化部位、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、所望により複製起点が含まれていてもよい。プロモーターとして、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、サイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。哺乳動物細胞への組換えベクターの導入方法は、好ましくは例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を利用できる。最も好ましくは、リポフェクション法を用いる。
酵母を宿主とする場合、プロモーターは、酵母中で発現できるプロモーターであれば特に限定されず、例えば、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、好ましくは例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を利用できる。
昆虫細胞を宿主とする場合、組換えベクターの導入方法は、好ましくは例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等を利用できる。【００４２】
（蛋白質）
本発明の一態様は、本発明に係るポリヌクレオチドがコードする蛋白質に関する。【００４３】
本発明に係る蛋白質の具体的態様は、例えば配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドがコードする蛋白質を挙げることができる。より具体的には、このような蛋白質として配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質を例示できる。本蛋白質において、その第３４番目プロリン（Ｐｒｏ）から第１８６番目セリン（Ｓｅｒ）までのアミノ酸残基がＧＡＰドメインを構成する。【００４４】
本発明に係る蛋白質は、好ましくは、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＡＰ活性を有する蛋白質である。配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドがコードする蛋白質は、Ｒｈｏファミリー蛋白質の１つであるＲａｃ１に結合した。具体的には、配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドとＲａｃ１をコードする遺伝子とを共に発現させた動物細胞において、該ポリヌクレオチドがコードする蛋白質とＲａｃ１の結合が検出された（実施例３参照）。配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質をコードする。したがって、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質が、Ｒａｃ１に結合したと考えられる。【００４５】
本発明に係る蛋白質は、その構造にＧＡＰドメインを有し、Ｒｈｏファミリー蛋白質に結合する。ＧＡＰドメインは、ＧＡＰの活性ドメインである。したがって、本蛋白質は、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＡＰ活性を有すると考える。より具体的には、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質は、Ｒｈｏファミリー蛋白質の１つであるＲａｃ１に対するＧＡＰ活性を有すると考える。【００４６】
本発明に係る蛋白質は上記蛋白質に限定されず、本発明に係るポリヌクレオチドがコードする蛋白質であればいずれも本発明の範囲に包含される。好ましくは、本ポリヌクレオチドがコードする蛋白質であって、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＡＰ活性を有する蛋白質が包含される。より好ましくは、本ポリヌクレオチドがコードする蛋白質であって、Ｒｈｏファミリー蛋白質に結合する蛋白質を包含する。このような蛋白質として、例えば、配列番号１に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表されるポリヌクレオチドより選ばれるいずれか１のポリヌクレオチドの塩基配列と少なくとも７０％の相同性を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチドであって、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＡＰ活性を有する蛋白質またはＲｈｏファミリー蛋白質に結合する蛋白質をコードするポリヌクレオチドがコードする蛋白質が挙げられる。また、例えば、上記ポリヌクレオチド群より選ばれるいずれか１のポリヌクレオチドの塩基配列において１乃至数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加等の変異あるいは誘発変異を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチドであって、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＡＰ活性を有する蛋白質またはＲｈｏファミリー蛋白質に結合する蛋白質をコードするポリヌクレオチドがコードする蛋白質が挙げられる。さらに、上記ポリヌクレオチド群より選ばれるいずれか１のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドであって、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＡＰ活性を有する蛋白質またはＲｈｏファミリー蛋白質に結合する蛋白質をコードするポリヌクレオチドがコードする蛋白質であってもよい。【００４７】
本発明に係るこのような蛋白質として、より具体的には、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質と配列相同性を有し、かつＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＡＰ活性を有する蛋白質が例示できる。より好ましくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質と配列相同性を有し、かつＲｈｏファミリー蛋白質に結合する蛋白質である。配列相同性は、通常、アミノ酸配列の全体で５０％以上、好ましくは少なくとも７０％であることが適当である。より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上であることが適当である。また、好ましくは、ＧＡＰドメインを有するポリペプチドが望ましい。ＧＡＰドメインにおける配列相同性は少なくとも７０％であることが好ましい。より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上であることが適当である。ＧＡＰドメインがその機能を保持していることがさらに好ましい。また、本蛋白質として、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１個以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入といった変異を有するアミノ酸配列で表わされ、かつＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＡＰ活性を有する蛋白質が例示できる。より好ましくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列において上記変異を有するアミノ酸配列で表わされ、かつＲｈｏファミリー蛋白質に結合する蛋白質である。アミノ酸の変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有する蛋白質が、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＡＰ活性を有する蛋白質、より好ましくはＲｈｏファミリー蛋白質に結合する蛋白質である限り特に制限されない。さらに好ましくは、ＧＡＰドメインを有する蛋白質である。このような変異を有する蛋白質は、天然において例えば突然変異や翻訳後の修飾等により生じたものであってよく、また天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たものであってもよい。変異を導入する方法は自体公知であり、例えば、公知の遺伝子工学的技術を利用して実施できる。変異の導入において、当該蛋白質の基本的な性質（物性、機能、生理活性または免疫学的活性等）を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。【００４８】
本発明に係る蛋白質にはさらに、上記蛋白質の部分配列で表される蛋白質が包含される。例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質の部分配列で表される蛋白質も本発明の範囲に包含される。このような蛋白質は、その最小単位として好ましくは５個以上、より好ましくは８個以上、さらに好ましくは１２個以上、特に好ましくは１５個以上の連続するアミノ酸で表される。【００４９】
本発明に係る蛋白質は、好ましくはヒト由来の蛋白質である。しかし、本蛋白質と配列相同性を有し、かつＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＡＰ活性を有する蛋白質、好ましくはＲｈｏファミリー蛋白質に結合する蛋白質である限りにおいて、哺乳動物由来の蛋白質、例えばマウス、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ラットまたはウサギ等由来の蛋白質も本発明に包含される。配列相同性は、通常、アミノ酸配列の全体で５０％以上、好ましくは少なくとも７０％であることが適当である。より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上であることが適当である。また、好ましくは、ＧＡＰドメインを有する蛋白質が望ましい。ＧＡＰドメインにおける配列相同性は少なくとも７０％であることが好ましい。より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上であることが適当である。【００５０】
本発明に係る蛋白質は、該蛋白質をコードする遺伝子を遺伝子工学的手法で発現させた細胞、無細胞系合成産物、化学合成産物、または該細胞や生体由来の生物学的試料から調製したものであってよく、これらからさらに精製されたものであってもよい。【００５１】
本発明に係る蛋白質はさらに、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない限りにおいて改変が可能である。また、Ｎ末端側やＣ末端側に別の蛋白質等を、直接的に、またはリンカーペプチド等を介して間接的に、遺伝子工学的手法等を用いて付加することにより標識化したものであってよい。好ましくは、本蛋白質の機能が阻害されないような標識化が望ましい。標識化に用いる物質（標識物質）として、例えばＧＳＴ、β−Ｇａｌ、ＨＲＰまたはＡＬＰ等の酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）またはフィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）等の蛍光物質類、マルトース結合蛋白質、免疫グロブリンのＦｃ断片あるいはビオチン等が例示できるが、これらに限定されない。また、放射性同位元素による標識化も可能である。標識物質は、１種類または複数種類を組合せて本蛋白質に付加することができる。これら標識物質自体またはその機能の測定により、本蛋白質を容易に検出または精製可能であり、また、例えば本蛋白質と他の蛋白質との結合の検出や本蛋白質の機能の測定が可能である。【００５２】
（蛋白質の製造方法）
本発明の一態様は、本発明に係る蛋白質の製造方法に関する。本蛋白質は、例えば本蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列情報に基づいて一般的遺伝子工学的手法〔サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社；ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１；およびエールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．）編、「ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用」、１９８９年、ストックトンプレス等を参照〕により取得可能である。例えば、本発明に係るポリヌクレオチドの発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞から常法に従ってｃＤＮＡライブラリーをまず調製する。次いで、本蛋白質をコードする遺伝子に選択的にハイブリダイゼーションするプライマーを用いて、該ｃＤＮＡライブラリーから本ポリヌクレオチドを増幅する。得られたポリヌクレオチドの発現誘導を公知の遺伝子工学的手法を利用して行うことにより、本蛋白質を取得できる。【００５３】
具体的には例えば、本発明に係る形質転換体を培養し、次いで得られた培養物から本蛋白質を回収することにより、本蛋白質を製造できる。本形質転換体の培養は、形質転換体の作製に用いた宿主に最適な自体公知の培養条件および培養方法で行うことができる。培養は、形質転換体により発現される本蛋白質自体または本蛋白質の機能を指標にして実施できる。あるいは、宿主中または宿主外に産生された本蛋白質自体またはその蛋白質量を指標にして培養してもよく、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養またはバッチ培養を行ってもよい。【００５４】
本発明に係る蛋白質が形質転換体の細胞内あるいは細胞膜上に発現する場合には、形質転換体を破砕して本蛋白質を抽出する。また、本蛋白質が形質転換体外に分泌される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離処理等により形質転換体を除去した培養液を用いる。【００５５】
本発明に係る蛋白質は、所望により、形質転換体を培養した培養液または形質転換体から、分離および／または精製することができる。分離および／または精製は、本蛋白質の物理的性質や化学的性質等を利用した各種分離操作方法により実施できる。分離操作方法として、具体的には、硫酸アンモニウム沈殿、限外ろ過、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、透析法等を例示できる。また、これら方法を適宜組合せて用いることができる。好ましくは、本蛋白質に対する特異抗体を結合させたカラムを利用するアフィニティクロマトグラフィーを用いることが推奨される。本蛋白質に対する特異抗体は、本蛋白質のアミノ酸配列情報に基づき、自体公知の抗体作成法により取得できる。分離および／または精製を行なうとき、本蛋白質を得るための指標として、本蛋白質の機能を利用することができる。【００５６】
本発明に係る蛋白質はまた、一般的な化学合成法により製造することができる。蛋白質の化学合成方法として、例えば、固相合成方法、液相合成方法等が知られている。いずれの方法も利用可能である。このような蛋白質合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていくいわゆるステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメントコンデンセーション法とを包含する。本蛋白質の合成は、そのいずれによっても行うことができる。上記蛋白質合成法において利用される縮合法も常法に従うことができる。縮合法として、例えば、アジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等）法、ウッドワード法等が例示できる。化学合成により得られる本蛋白質はさらに、上記のような慣用の各種精製方法により適宜精製を行うことができる。【００５７】
本発明に係る蛋白質の部分配列で表される蛋白質は、本蛋白質を適当なペプチダーゼにより切断することによっても得ることができる。【００５８】
（抗体）
本発明の一態様は、本発明に係る蛋白質を認識する抗体に関する。本抗体は、本蛋白質を抗原として用いて作製することができる。抗原は、本蛋白質またはその断片でもよく、少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１２個、さらに好ましくは１５個以上のアミノ酸で構成される。本蛋白質に特異的な抗体を作成するためには、本蛋白質に固有なアミノ酸配列からなる領域を抗原として用いることが好ましい。この領域のアミノ酸配列は、必ずしも本蛋白質またはその断片のアミノ酸配列と同一である必要はない。このようなアミノ酸配列として、蛋白質の立体構造上の外部への露出部位のアミノ酸配列が好ましい。露出部位のアミノ酸配列が一次構造上で不連続であっても、該露出部位について連続的なアミノ酸配列であればよい。本抗体は本蛋白質を特異的に認識する抗体であればいずれであってもよく、特に限定されない。本蛋白質を特異的に認識するとは、本蛋白質を認識する、例えば本蛋白質に結合するが、本蛋白質以外の蛋白質は認識しないか、弱く認識することを意味する。認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応により決定できる。【００５９】
抗体の産生には、自体公知の抗体作製法を利用できる。例えば、抗体の産生は、抗原をアジュバントの存在下または非存在下で、単独でまたは担体に結合して動物に投与し、体液性応答および／または細胞性応答等の免疫誘導を行うことにより実施できる。担体は、それ自体が宿主に対して有害作用を示さずかつ抗原性を増強せしめる限りにおいて、公知の担体をいずれも使用できる。具体的には、セルロース、重合アミノ酸、アルブミンおよびキーホールリンペットヘモシアニン等を例示できる。アジュバントとして、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ）、Ｒｉｂｉ（ＴＤＭ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ）、百日咳ワクチン（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｖａｃｃｉｎｅ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）、およびこれらの組み合わせを例示できる。免疫される動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等が好適に用いられる。【００６０】
ポリクローナル抗体は、免疫手段を施された動物の血清から自体公知の抗体回収法により取得できる。好ましい抗体回収手段として免疫アフィニティクロマトグラフィー法が挙げられる。【００６１】
モノクローナル抗体は、免疫手段が施された動物から採取した抗体産生細胞（例えば、脾臓またはリンパ節由来のリンパ球）と、自体公知の永久増殖性細胞（例えば、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株等のミエローマ株）とを融合させて作製したハイブリドーマを用いて生産できる。例えば、抗体産生細胞と永久増殖性細胞とを自体公知の方法で融合させてハイブリドーマを作成し、次いでクローン化する。クローン化した種々のハイブリドーマから、本発明に係る蛋白質を特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマを選別し、該ハイブリドーマの培養液から抗体を回収する。【００６２】
本発明に係る蛋白質を認識または結合し得るポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、該蛋白質の精製用抗体、試薬または標識マーカー等として利用できる。特に本蛋白質の機能を阻害する抗体は、本蛋白質の機能調節に使用でき、本蛋白質の機能異常や量的異常に起因する各種疾患の解明、防止、改善および／または治療のために有用である。【００６３】
（化合物の同定方法）
本発明の一態様は、本発明に係る蛋白質の機能を阻害する化合物、あるいは本発明に係るポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法に関する。本同定方法は、本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体または抗体のうち少なくともいずれか１種類を用いて、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して実施可能である。本同定方法は、インビトロまたはインビボで実施されるいずれの方法も包含する。本同定方法により、本蛋白質の立体構造に基づくドラッグデザインによる拮抗剤の選別、蛋白質合成系を利用した遺伝子レベルでの発現の阻害剤の選別、または抗体を利用した抗体認識物質の選別等が可能である。【００６４】
本発明に係る蛋白質の機能を阻害する化合物の同定方法は、本蛋白質の機能を測定することのできる実験系において、本蛋白質と調べようとする化合物（被検化合物）の相互作用を可能にする条件下で、本蛋白質と被検化合物とを共存させてその機能を測定し、次いで、被検化合物の存在下における本蛋白質の機能と、被検化合物の非存在下における本蛋白質の機能とを比較し、本蛋白質の機能の存在、不存在または変化、例えば低減、増加、消失、出現を検出することにより実施可能である。被検化合物の非存在下における本蛋白質の機能と比較して、被検化合物の存在下における本蛋白質の機能が低減または消失する場合、該被検化合物は本蛋白質の機能を阻害すると判定できる。機能の測定は、該機能の直接的な検出により、または例えば機能の指標となるシグナルを実験系に導入して該シグナルを検出することにより実施可能である。シグナルとして、ＧＳＴ等の酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類、または蛍光蛋白質等を用いることができる。これら例示した物質以外であっても、一般的に化合物の同定方法に用いられている標識物質であれば、いずれも利用可能である。【００６５】
本発明に係る蛋白質は、Ｒｈｏファミリー蛋白質に結合した。本蛋白質がＧＡＰドメインを有することから、本蛋白質はＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＡＰ活性を有すると考える。すなわち、本蛋白質の機能として、Ｒｈｏファミリー蛋白質のＧＴＰアーゼ活性を促進する活性およびＲｈｏファミリー蛋白質の不活性化を促進する活性が挙げられる。【００６６】
本発明に係る蛋白質のＲｈｏファミリー蛋白質との結合を指標にした同定方法は、例えば、本蛋白質を遺伝子工学的手法により発現させて取得し、被検化合物の存在下または非存在下におけるＲｈｏファミリー蛋白質との結合の検出を行うことにより実施できる。具体的には、例えばＲｈｏファミリー蛋白質を遺伝子工学的手法によりＧＳＴ−ｔａｇ融合蛋白質として発現させ、その後グルタチオンセファロースに結合させ、被検化合物の存在下または非存在下で、本蛋白質と反応させる。グルタチオンセファロースに結合させたＲｈｏファミリー蛋白質に結合する本蛋白質を定量することにより、本蛋白質のＲｈｏファミリー蛋白質との結合を阻害する化合物の同定が可能である。被検化合物の非存在下における両蛋白質の結合と比較して、被検化合物の存在下における両蛋白質の結合が低減または消失する場合、該被検化合物は本蛋白質のＲｈｏファミリー蛋白質との結合を阻害すると判定できる。本蛋白質の定量は、例えば、本発明に係る抗体を用いて実施できる。抗体は、ＨＲＰやＡＬＰ等の酵素、放射性同位元素、蛍光物質またはビオチン等の標識物質で標識した抗体を用いることができる。あるいは、標識した二次抗体を用いてもよい。本蛋白質として、タグペプチドを融合した蛋白質を用いれば、抗タグ抗体を用いて定量を実施できる。または、本蛋白質を上記酵素、放射性同位元素、蛍光物質、ビオチン等の標識物質で直接標識して用いてもよい。このような場合、標識物質を測定することにより、本蛋白質の定量が可能である。【００６７】
より具体的には、本発明に係る蛋白質をコードするポリヌクレオチドとＲｈｏファミリー蛋白質をコードするポリヌクレオチドとを共発現させた適当な細胞を用い、両蛋白質の結合をプルダウン法により検出する実験系を用いて、該結合を阻害する化合物を同定できる（実施例３参照）。【００６８】
また、本発明に係る蛋白質とＲｈｏファミリー蛋白質との結合を阻害する化合物の同定方法は、公知のツーハイブリッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）法を用いて実施可能である。例えば、本発明に係る蛋白質とＤＮＡ結合蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、Ｒｈｏファミリー蛋白質と転写活性化蛋白質を融合蛋白として発現するプラスミド、および適切なプロモーター遺伝子に接続したレポーター遺伝子を含有するプラスミドを、酵母または真核細胞等に導入する。次いで、被検化合物の存在下におけるレポーター遺伝子の発現量と、被検化合物の非存在下におけるレポーター遺伝子の発現量との比較により、本蛋白質とＲｈｏファミリー蛋白質との結合を阻害する化合物の同定を達成できる。被検化合物の非存在下におけるレポーター遺伝子の発現量と比較して、被検化合物の存在下におけるレポーター遺伝子の発現量が減少または消失する場合、該被検化合物は本蛋白質のＲｈｏファミリー蛋白質との結合を阻害すると判定できる。レポーター遺伝子は、レポーターアッセイで一般的に用いられている遺伝子を使用可能である。具体的には、ルシフェラーゼ、β−Ｇａｌまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ等の酵素活性を有する遺伝子が例示できる。レポーター遺伝子の発現の検出は、その遺伝子産物の活性、例えば、上記例示したレポーター遺伝子の場合は酵素活性を検出することにより実施可能である。【００６９】
本発明に係る蛋白質とＲｈｏファミリー蛋白質との結合を阻害する化合物の同定方法はまた、ビアコアシステム（ＢＩＡＣＯＲＥ  ｓｙｓｔｅｍ）等の表面プラズモン共鳴センサーを用いて実施可能である。あるいは、シンチレーションプロキシミティアッセイ法（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ、ＳＰＡ）や蛍光共鳴エネルギー転移（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）を応用した方法を用いて、本同定方法を実施可能である。【００７０】
本発明に係る蛋白質が有するＧＡＰ活性を阻害する化合物の同定方法は、例えば、Ｒｈｏ−ＧＡＰのＧＡＰ活性を測定する一般的な方法を利用して実施できる。Ｒｈｏ−ＧＡＰのＧＡＰ活性の測定方法として、例えば、［γ−３２Ｐ］ＧＴＰを用いた測定方法が例示きる〔「ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、１９９８年、第２７３巻、第４４号、ｐ．２９１７２−２９１７７〕。Ｒｈｏ−ＧＡＰのＧＡＰ活性の測定方法は、具体的には、精製したＲｈｏ蛋白質と［γ−３２Ｐ］ＧＴＰを反応させ、ＧＴＰ結合型Ｒｈｏ蛋白質を形成させる。次いで、［γ−３２Ｐ］ＧＴＰ結合型Ｒｈｏ蛋白質と本発明に係る蛋白質を反応させる。［γ−３２Ｐ］ＧＴＰ結合型Ｒｈｏファミリー蛋白質からＧＤＰ結合型Ｒｈｏファミリー蛋白質への変化の測定により、本蛋白質のＧＡＰ活性を測定できる。［γ−３２Ｐ］ＧＴＰ結合型Ｒｈｏファミリー蛋白質からＧＤＰ結合型Ｒｈｏファミリー蛋白質への変化の測定は、［γ−３２Ｐ］ＧＴＰ結合型Ｒｈｏファミリー蛋白質からＧＤＰ結合型Ｒｈｏファミリー蛋白質への変化に伴って遊離されるγ−３２Ｐを測定すること等により実施できる。具体的には、本蛋白質と［γ−３２Ｐ］ＧＴＰ結合型Ｒｈｏ蛋白質との反応後に、反応溶液をニトロセルロースフィルター等でろ過し、このニトロセルロースフィルターを洗浄・乾燥し、遊離のγ−３２Ｐの測定を、このフィルターの放射活性の減少量で測定できる。ニトロセルロースフィルターには蛋白質が捕捉されるので、Ｒｈｏ蛋白質はこのフィルターに捕捉されるが、遊離した３２Ｐはフィルターを通過する。ＧＴＰ結合型Ｒｈｏ蛋白質からＧＤＰ結合型Ｒｈｏ蛋白質への反応が進めば、遊離の３２Ｐの量が増加し、Ｒｈｏ蛋白質を介してニトロセルロースフィルターに捕捉される３２Ｐ量は減少する。つまり、ニトロセルロースフィルターの放射活性が減少していれば、ＧＴＰ結合型Ｒｈｏ蛋白質からＧＤＰ結合型Ｒｈｏ蛋白質への反応が進行しているといえる。したがって、本発明に係る蛋白質の存在下におけるニトロセルロースフィルターの放射活性が、該蛋白質の非存在下における場合と比較して減少しているとき、該蛋白質は、Ｒｈｏ蛋白質に対するＧＡＰ活性を有すると判定できる。【００７１】
本発明に係る蛋白質が有するＧＡＰ活性を阻害する化合物の同定方法は、例えば、上記のような［γ−３２Ｐ］ＧＴＰを用いたＲｈｏ−ＧＡＰのＧＡＰ活性の測定方法を、被検化合物の存在下または非存在下で行なうことにより実施できる。具体的には、［γ−３２Ｐ］ＧＴＰ結合型Ｒｈｏ蛋白質と本発明に係る蛋白質を、被検化合物の存在下または非存在下において反応させた後、［γ−３２Ｐ］ＧＴＰ結合型Ｒｈｏファミリー蛋白質からＧＤＰ結合型Ｒｈｏファミリー蛋白質への変化を測定する。被検化合物の存在下におけるγ−３２Ｐ］ＧＴＰ結合型Ｒｈｏファミリー蛋白質からＧＤＰ結合型Ｒｈｏファミリー蛋白質への変化が、被検化合物非存在下における変化と比較して低減または消失する場合、該被検化合物は本蛋白質のＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＡＰ活性を阻害すると判定できる。【００７２】
本発明に係る同定方法において用いるＲｈｏファミリー蛋白質は、そのＧＴＰアーゼ活性および該ＧＴＰアーゼ活性に対する本発明に係る蛋白質の作用に影響がない限りにおいて、一部を欠損した蛋白質であってよく、あるいは上記のような標識物質が付加された蛋白質であってよい。【００７３】
本発明に係るポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法は、本ポリヌクレオチドの発現を測定することのできる実験系において、本ポリヌクレオチドと被検化合物の相互作用を可能にする条件下で、本ポリヌクレオチドと被検化合物とを共存させてその発現を測定し、次いで、被検化合物の存在下における本ポリヌクレオチドの発現と、被検化合物の非存在下における本ポリヌクレオチドの発現とを比較し、本ポリヌクレオチドの発現の存在、不存在または変化、例えば低減、増加、消失、出現を検出することにより実施可能である。被検化合物の非存在下における本ポリヌクレオチドの発現と比較して、被検化合物の存在下における本ポリヌクレオチドの発現が減少または消失する場合、該被検化合物は本ポリヌクレオチドの発現を阻害すると判定できる。具体的には例えば、本同定方法は、本発明に係る形質転換体を用いて本ポリヌクレオチドを発現させる実験系において、該形質転換体と被検化合物とを接触させた後に、本ポリヌクレオチドの発現を測定することにより実施可能である。発現の測定は、簡便には発現される蛋白質の量、あるいは該蛋白質の機能を指標にして実施できる。また、例えば発現の指標となるシグナルを実験系に導入して該シグナルを検出することにより、発現の測定が可能である。シグナルとして、ＧＳＴ等の酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類、または蛍光物質等を用いることができる。これらシグナルの検出方法は当業者には周知である。【００７４】
本発明に係るポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法はまた、例えば本ポリヌクレオチドを含む遺伝子のプロモーター領域の下流に、該ポリヌクレオチドの代わりにレポーター遺伝子を連結したベクターを作成し、該ベクターを導入した細胞、例えば真核細胞等と被検化合物とを接触させ、レポーター遺伝子の発現の存在、不存在または変化を測定することにより実施可能である。レポーター遺伝子として、レポーターアッセイで一般的に用いられている遺伝子を使用可能である。具体的には、ルシフェラーゼ、β−Ｇａｌまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ等の酵素活性を有する遺伝子を用いることができる。レポーター遺伝子の発現の検出は、その遺伝子産物の活性、例えば、上記に例示したレポーター遺伝子の場合は酵素活性を検出することにより実施可能である。【００７５】
（化合物）
本発明に係る同定方法により得られた化合物は、本発明に係る蛋白質の機能の阻害剤、拮抗剤等の候補化合物として利用可能である。また、本発明に係るポリヌクレオチドの発現阻害剤の候補化合物としても利用可能である。これら候補化合物は、その有用性と毒性のバランスを考慮して選別することにより医薬として調製可能であり、本蛋白質の機能の異常および／または本ポリヌクレオチドの発現の異常に起因する各種病的症状の防止効果および／または治療効果を期待できる。また、本発明に係る化合物は、本同定方法以外の方法により得られた化合物であって、本蛋白質の機能を阻害するおよび／または本ポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物も含まれる。【００７６】
（医薬組成物）
本発明の一態様は、本発明に係る蛋白質、ポリペプチド、組換えベクター、形質転換体、抗体、または化合物を有効成分として含み、本蛋白質の機能および／または本ポリペプチドの発現を阻害するまたは拮抗することに基づく医薬または医薬組成物に関する。【００７７】
本発明に係る医薬は、本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、抗体、または化合物のうち少なくともいずれか１つを有効成分としてその有効量含む医薬となしてもよい。通常は、１種類または２種類以上の医薬用許容される担体（医薬用担体）を用いて医薬組成物を製造することが好ましい。【００７８】
本発明に係る医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択される。通常約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲とするのが適当である。【００７９】
医薬用担体として、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤等の希釈剤や賦形剤等を例示できる。これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択使用される。【００８０】
例えば水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等が挙げられる。これらは、本発明に係る剤形に応じて適宜１種類または２種類以上を組合せて使用される。【００８１】
所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤等を適宜使用して調製することもできる。【００８２】
安定化剤として、例えばヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体等を例示でき、これらは単独でまたは界面活性剤等と組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。上記Ｌ−アミノ酸は、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸等のいずれでもよい。糖類も特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等およびそれらの誘導体等のいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のいずれでもよい。【００８３】
界面活性剤も特に限定はなく、イオン性および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。これには、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が包含される。【００８４】
緩衝剤として、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）等を例示できる。【００８５】
等張化剤として、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン等を例示できる。【００８６】
キレート剤として、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸等を例示できる。【００８７】
本発明に係る医薬および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる。その他、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生埋的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することも可能である。【００８８】
本発明に係る医薬および医薬組成物は、本発明に係る蛋白質の機能の異常および／または本ポリヌクレオチドの発現の異常に基づく疾患の防止剤および／または治療剤として使用することができる。また、当該疾患の防止方法および／または治療方法に使用することができる。【００８９】
本発明に係る蛋白質の機能および／または本発明に係るポリヌクレオチドの発現の過剰に関連する異常な症状に対しては、例えば本蛋白質の機能および／または本ポリヌクレオチドの発現を阻害する有効量の阻害剤を医薬上許容される医薬用担体とともに対象に投与することにより異常な症状を防止、改善または治療することができる。あるいは、内在性の本ポリヌクレオチドの発現を、発現ブロック法を用いて阻害してもよい。例えば本ポリヌクレオチドの部分配列からなるオリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドとして遺伝子治療に用いて、本ポリヌクレオチドの発現を阻害できる。アンチセンスオリゴヌクレオチオドとして用いるオリゴヌクレオチオドは、本ポリヌクレオチドの翻訳領域のみでなく、非翻訳領域に対応するものであっても有用である。本ポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害するためには、該ポリヌクレオチドに固有な領域の塩基配列を用いることが好ましい。【００９０】
本発明に係るポリヌクレオチドの一態様である配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組織発現は、疾患データベース情報ＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓ（ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ社）を用いて調べたところ、甲状腺の慢性炎症例の甲状腺組織における発現量が正常甲状腺組織と比較して４．６５倍高いことが判明した。また、該ポリヌクレオチドの発現は、ＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓ（ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ社）を用いて調べたところ、腎臓の慢性炎症例の腎臓組織における発現量が正常腎臓組織と比較して３．５５倍高いことが判明した。これらから、本ポリヌクレオチドの高発現は慢性炎症性疾患、例えば、甲状腺や腎臓の慢性炎症性疾患に関連すると考える。甲状腺や腎臓の慢性炎症性疾患として、具体的には、慢性甲状腺炎や慢性腎炎が例示できる。本発明に係る医薬および医薬組成物は、慢性炎症性疾患、例えば慢性甲状腺炎や慢性腎炎の防止剤および／または治療剤として有用である。さらに、慢性炎症性疾患、例えば慢性甲状腺炎や慢性腎炎の防止方法および／または治療方法に使用できる。【００９１】
本発明に係る医薬および医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等に応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ〜１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。上記投与量は１日１〜数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。【００９２】
本発明に係る医薬または医薬組成物を投与するときには、該医薬または医薬組成物を単独で使用してよく、あるいは治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。【００９３】
投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与のほか、皮下、皮内、筋肉内等への投与を挙げることができる。あるいは経口による投与も可能である。さらに、経粘膜投与または経皮投与も可能である。【００９４】
投与形態は、各種の形態が治療目的に応じて適宜選択できる。その代表的な例として、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リポソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらはさらに投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。【００９５】
（診断方法）
本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、抗体または化合物は、それ自体を、診断マーカーや診断試薬等の疾患診断手段として使用できる。
本発明によれば、例えば本発明に係るポリヌクレオチドの一部または全部のポリヌクレオチドを利用することにより、個体または各種組織における該ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む遺伝子の異常の有無あるいは発現の有無を特異的に検出することができる。本発明に係るポリヌクレオチドの検出により、該ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む遺伝子の量的異常および／または機能異常等に基づく疾患の易罹患性、発症、および／または予後の診断が可能である。【００９６】
疾患の診断は、例えば調べようとする試料（被検試料）について、本発明に係るポリヌクレオチドの存在を検出すること、その存在量を決定すること、および／またはその変異を同定することにより実施できる。正常な対照試料との比較において、本ポリヌクレオチドの存在の変化、その量的変化を検出することができる。あるいは、正常遺伝子型との比較において本ポリヌクレオチドを公知の手法により増幅した増幅生成物について、例えばサイズ変化を測定することにより、欠失や挿入といった変異を検出可能である。また、被検試料から増幅したポリヌクレオチドを、例えば標識した本ポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせることにより点突然変異を同定できる。このような変化および変異の検出により、上記診断を実施することが可能である。【００９７】
本発明においては、被検試料中の本発明に係るポリヌクレオチドの定性的または定量的な測定方法、または該ポリヌクレオチドの特定領域における変異の定性的または定量的な測定方法をも提供可能である。【００９８】
配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組織発現は、疾患データベース情報ＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓ（ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ社）を用いて調べたところ、甲状腺の慢性炎症例の甲状腺組織における発現量が正常甲状腺組織と比較して４．６５倍高いことが判明した。また、該ポリヌクレオチドの発現は、疾患データベース情報ＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓ（ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ社）を用いて調べたところ、腎臓の慢性炎症例の腎臓組織における発現量が正常腎臓組織と比較して３．５５倍高いことが判明した。これらから、本ポリヌクレオチドの高発現は慢性炎症性疾患、例えば、甲状腺や腎臓の慢性炎症性疾患に関連すると考える。したがって、被検試料中の該ポリヌクレオチドの発現量の増加を検出することにより、該被検試料が慢性炎症性疾患由来の被検組織であるか否かを判定する方法を実施することが可能である。このような判定方法も本発明の範囲に包含される。本判定方法において該ポリヌクレオチドの発現量の増加は、被検試料と正常な対照試料とを比較することにより検出できる。被検試料として、好ましくはヒト甲状腺組織由来またはヒト腎臓組織由来の被検組織が挙げられる。対照試料として、好ましくはヒト正常甲状腺由来組織またはヒト正常腎臓由来組織が挙げられる。ヒト甲状腺組織由来の試料において、本ポリヌクレオチドの発現量が対照試料と比較して増加している場合、好ましくは少なくとも４．５倍以上、より好ましくは少なくとも５倍以上に増加している場合、被検試料が甲状腺の慢性炎症性疾患由来試料であると判定することができる。また、ヒト腎臓組織由来の試料において、本ポリヌクレオチドの発現量が対照試料と比較して増加している場合、好ましくは少なくとも３．５倍以上、より好ましくは少なくとも４倍以上に増加している場合、被検試料が腎臓の慢性炎症性疾患由来試料であると判定することができる。本発明に係るポリヌクレオチドの発現量とは、該ポリヌクレオチドの転写産物の量を意味する。【００９９】
被検試料は、本発明に係るポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む遺伝子またはその変異遺伝子の核酸を含む限りにおいて特に制限されず、例えば、細胞、血液、尿、唾液、髄液、組織生検または剖検材料等の生体生物由来の試料を例示できる。あるいは所望により試料から核酸を抽出して核酸試料を調製して用いることもできる。核酸は、ゲノムＤＮＡを検出に直接使用してもよく、あるいは分析前にＰＣＲまたはその他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅してもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡを同様に用いてもよい。核酸試料は、また、標的配列の検出を容易にする種々の方法、例えば変性、制限酵素による消化、電気泳動またはドットブロッティング等により調製してもよい。【０１００】
本発明に係るポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む遺伝子の検出には、自体公知の遺伝子検出法がいずれも使用可能である。具体的には、プラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、サザンブロット法、ノザンブロット法、ＮＡＳＢＡ法、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）等が例示できる。また、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲやｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション等を利用した細胞レベルでの測定により検出可能である。このような遺伝子検出法においては、本発明に係るポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む遺伝子またはその変異遺伝子の同定および／またはその増幅の実施に、本ポリヌクレオチドの部分配列からなるオリゴヌクレオチドであってプローブとしての性質を有するものまたはプライマーとしての性質を有するものが有用である。プローブとしての性質を有するオリゴヌクレオチドとは、本ポリヌクレオチドのみに特異的にハイブリダイゼーションできる該ポリヌクレオチド特有の配列からなるものを意味する。プライマーとしての性質を有するものとは本ポリヌクレオチドのみを特異的に増幅できる該ポリヌクレオチド特有の配列からなるものを意味する。また、増幅できる変異遺伝子を検出する場合には、遺伝子内の変異を有する箇所を含む所定の長さの配列を持つプライマーあるいはプローブを作成して用いる。プローブまたはプライマーとしては、塩基配列長が一般的に５〜５０ヌクレオチド程度であるものが好ましく、１０〜３５ヌクレオチド程度であるものがより好ましく、１５〜３０ヌクレオチド程度であるものがさらに好ましい。本発明に係るポリヌクレオチドまたはその断片を増幅するためのプライマー、あるいは本ポリヌクレオチドを検出するためのプローブとして、具体的には、配列番号３または４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを好ましく例示できる。プローブは、通常は標識したプローブを用いる。しかし、非標識のプローブを使用することもできる。また、直接的または間接的に標識したリガンドとの特異的結合により検出してもよい。プローブおよびリガンドを標識する方法は、種々の方法が知られており、例えばニックトランスレーション、ランダムプライミングまたはキナーゼ処理を利用する方法等を例示できる。適当な標識として、放射性同位体、ビオチン、蛍光物質、化学発光物質、酵素、抗体等が挙げられる。【０１０１】
遺伝子検出法は、ＰＣＲが感度の点から好ましい。ＰＣＲは、本発明に係るポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む遺伝子またはその変異遺伝子を特異的に増幅できるプライマーを用いる方法である限り、従来公知の方法のいずれも使用可能である。例えばＲＴ−ＰＣＲが例示できる。その他、当該分野で用いられる種々のＰＣＲの変法を適応することができる。【０１０２】
ＰＣＲにより、遺伝子の検出の他に、本発明に係るポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む遺伝子またはその変異遺伝子のＤＮＡの定量も可能である。このような分析方法として、ＭＳＳＡ法等の競合的定量法、または一本鎖ＤＮＡの高次構造の変化に伴う移動度の変化を利用した突然変異検出法として知られるＰＣＲ−ＳＳＣＰ法を例示できる。【０１０３】
本発明によればまた、例えば本発明に係る蛋白質を利用することにより、個体若しくは各種組織における該蛋白質およびその機能の異常の有無を特異的に検出することができる。本発明に係る蛋白質およびその機能の異常の検出により、該蛋白質の量的異常および／または機能の異常に基づく疾患の易罹患性、発症、および／または予後の診断が可能である。【０１０４】
蛋白質の検出による疾患の診断は、例えば被検試料について、該蛋白質の存在を検出すること、その存在量を決定すること、および／またはその変異を検出することにより実施できる。すなわち、本発明に係る蛋白質および／またはその変異体を定量的あるいは定性的に測定する。正常な対照試料との比較において、本蛋白質の存在の変化、その量的変化を検出することができる。正常蛋白質との比較において、例えばアミノ酸配列を決定することによりその変異を検出することができる。このような変化および変異の検出により、上記診断を実施することが可能である。被検試料は、本蛋白質および／またはその変異体を含むものである限り特に制限されず、例えば、血液、血清、尿、生検組織等の生体生物由来の生物学的試料を例示できる。【０１０５】
本発明に係る蛋白質および変異を有する該蛋白質の測定は、本発明に係る蛋白質、例えば配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質、または該蛋白質のアミノ酸配列において１若しくは数個乃至複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列で表される蛋白質、これらの断片、または該蛋白質やその断片に対する抗体を用いることにより可能である。【０１０６】
蛋白質の定量的あるいは定性的な測定は、この分野における慣用技術による蛋白質検出法あるいは定量法を用いて行うことができる。例えば、本蛋白質のアミノ酸配列分析により変異蛋白質の検出ができる。さらに好ましくは、抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル抗体）を用いることにより、蛋白質の配列の相違、または蛋白質の有無を検出することができる。【０１０７】
本発明においては、被検試料中の本蛋白質の定性的または定量的な測定方法、または該蛋白質の特定領域の変異の定性的または定量的な測定方法をも提供可能である。【０１０８】
具体的には、被検試料について、本蛋白質に対する特異抗体を用いて免疫沈降を行い、ウェスタンブロット法またはイムノブロット法で本蛋白質の解析を行うことにより、上記検出が可能である。また、本蛋白質に対する抗体により、免疫組織化学的技術を用いてパラフィンまたは凍結組織切片中の本蛋白質を検出することができる。【０１０９】
本蛋白質またはその変異体を検出する方法の好ましい具体例として、モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を用いるサンドイッチ法を含む、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）、免疫放射線検定法（ＩＲＭＡ）、および免疫酵素法（ＩＥＭＡ）等が挙げられる。その他、ラジオイムノアッセイや競争結合アッセイ等を利用することもできる。【０１１０】
本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、および抗体はいずれも、それ自体を単独であるいは組合わせて、試薬等として使用できる。試薬は、本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、および抗体のうちの少なくとも１種類の他に、緩衝液、塩、安定化剤、および／または防腐剤等の物質を含むことができる。なお、製剤化にあたっては、各性質に応じた自体公知の製剤化手段を導入すればよい。該試薬は、例えば、本発明に係る判定方法、化合物の同定方法、あるいは本蛋白質または本ポリヌクレオチドの測定方法に使用することができる。該試薬はその他、本発明に係る蛋白質またはポリヌクレオチドが関与する細胞内情報伝達経路の解明、および該蛋白質またはポリヌクレオチドの異常に基づく疾患等に関する基礎的研究等に有用である。【０１１１】
本発明はまた、本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、および抗体のうちの少なくともいずれか１つを含んでなる試薬キットを提供する。試薬キットにはその他、本発明に係る蛋白質やポリヌクレオチドを検出するための標識物質、標識の検出剤、反応希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤および反応停止液等、測定の実施に必要とされる物質を含むことができる。標識物質として、上述の蛋白質や放射性同位元素等が挙げられる。標識物質は、予め本発明に係る蛋白質あるいはポリヌクレオチドに付加されていてもよい。本試薬キットは、本発明に係る判定方法、化合物の同定方法、あるいは本蛋白質または本ポリヌクレオチドの測定方法に使用することができる。さらに、本試薬キットは、前記測定方法を用いる検査方法に、検査剤並びに検査用キットとして使用可能である。また、前記測定方法を用いる診断方法にも、診断剤並びに診断用キットとして使用可能である。【０１１２】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定して解釈されない。
【実施例１】
【０１１３】
（遺伝子のクローニング）
ヒト脾臓由来ｃＤＮＡライブラリーは、小原らの方法［オハラ（Ｏｈａｒａ，Ｏ．）ら、「ディーエヌエー  リサーチ（ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９７年、第４巻、ｐ．５３−５９）に従って構築した。具体的には、ＮｏｔＩ部位を有するオリゴヌクレオチド〔ＧＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＣＧＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣ（Ｔ）１５〕（配列番号９：ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）をプライマーとして、ヒト脾臓ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社：カタログ番号６５４２−１］をテンプレートにＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素キット（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）で２本鎖ｃＤＮＡを合成した。ＳａｌＩ部位を有するアダプター（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）をｃＤＮＡとライゲーションした後、ＮｏｔＩ消化し、１％濃度の低融点アガロース電気泳動により、３ｋｂ以上のＤＮＡ断片を精製した。精製ｃＤＮＡ断片を、ＳａｌＩ−ＮｏｔＩ制限酵素処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋プラスミドとライゲーションした。エレクトロポーレーション法により、大腸菌ＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ  ＤＨ１０Ｂ株（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）に組換えプラスミドを導入した。こうして構築したｃＤＮＡライブラリーから、約１０，０００個の組換え体を選択し、これらのクローンの両末端ＤＮＡ配列を決定した。この中から、新規遺伝子を含む約４２０個のクローンのｃＤＮＡに関しての全塩基配列の決定を行なった。配列決定には、株式会社島津製作所製のＤＮＡシーケンサー（ＲＩＳＡ）とＰＥアプライドバイオシステム社製反応キットを使用した。大部分の配列は、ショットガンクローンをダイターミネーター法（ターミネーター標識法）を用いて決定した。【０１１４】
全塩基配列の決定を行ったｃＤＮＡクローンについて、コンピュータプログラムを用いた汎用解析方法によりＯＲＦを予想した。次いで、ＯＲＦ領域についてモチーフドメイン検索を行い、Ｒｈｏ−ＧＡＰに特徴的なＧＡＰドメインをコードする領域を含むｃＤＮＡを同定した。【０１１５】
その結果、新規な塩基配列を有し、ＧＡＰドメインをコードする領域を含むｃＤＮＡ（以下、ｓｊ０４０８５と称する）が同定された。【０１１６】
シーケンス解析の結果、ｓｊ０４０８５は、配列番号１に示す塩基配列（４３９３ｂｐ）からなり、配列番号２に示すアミノ酸配列（１１０１アミノ酸）をコードすることが判明した。ｓｊ０４０８５において、ＧＡＰドメインは、配列番号１に示す塩基配列の第４２１目から第８７９番目のヌクレオチドからなる領域にコードされている。また、ｓｊ０４０８５がコードする蛋白質において、ＧＡＰドメインは、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第３４番目のプロリン（Ｐｒｏ）から第１８６番目のセリン（Ｓｅｒ）までの１５３アミノ酸残基からなる。
【実施例２】
【０１１７】
（ＤＮＡの発現と精製）
実施例１で得られたｓｊ０４０８５の発現ベクターを、ゲートウェイＴＭクローニングテクノロジー（ＧＡＴＥＷＡＹＴＭ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて作製した。次いで、該発現ベクターを用いて、ｓｊ０４０８５がコードする蛋白質をＦＬＡＧ−ｔａｇ融合蛋白質として２９３ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で発現させた。発現の確認はウエスタンブロット法により行った。【０１１８】
具体的には、実施例１で得られたｓｊ０４０８５（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋のＳａｌＩ−ＮｏｔＩサイトに挿入されている）をテンプレートとし、ｐｆｕ  ｔｕｒｂｏ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）により、ｓｊ０４０８５のＯＲＦ領域（終止コドンを除く）を増幅した。増幅用プライマーには、配列番号３および配列番号４に記載の各塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを用いた。その後、増幅産物をＴＯＰＯ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍを用いた反応にて、ｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯに挿入してエントリーベクターを作製した。作製したエントリーベクターをＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｄｅＩで切断した遺伝子断片および実施例１で得られたｓｊ０４０８５をＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｄｅＩで切断した遺伝子断片をライゲーションした後、コンピテントセル（ＴＯＰ１０：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入した。形質転換した大腸菌より精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＤＮＡを精製した。増幅した領域の配列および制限酵素処理を行なった塩基配列前後の配列が正しい配列であることは、シーケンス解析により確認した。シーケンス反応はＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、泳動および解析はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７を用いて、それぞれ実施した。次に、ｓｊ０４０８５とＢｓｐＥＩで切断したＣ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇ（３×）融合蛋白質発現ベクターとを用いて、ＬＲクロナーゼ酵素による組換え反応により、ｓｊ０４０８５発現プラスミドを作製した。この発現プラスミドを用いることにより、ｓｊ０４０８５がコードする蛋白質は、Ｃ末端にＦＬＡＧ−ｔａｇ（３×）が付加された蛋白質として発現される。【０１１９】
シーケンス解析の結果、発現ベクターに挿入したｓｊ０４０８５と配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドを比較すると、１塩基が異なる可能性があることが判明した。しかし、この１塩基の差異によるアミノ酸置換は認められなかった。具体的には、配列番号１に記載の塩基配列において第４８６番目の塩基はシトシン（Ｃ）である。一方、発現ベクターに挿入したｓｊ０４０８５の塩基配列において、第４８６番目の塩基はアデニン（Ａ）またはシトシン（Ｃ）であった。このことから、発現ベクターに挿入したｓｊ０４０８５と配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドとは、１塩基が異なる可能性があることが明らかになった。配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにおいて、第４８４番目から第４８６番目までの塩基はＣＧＣであり、アルギニン（Ａｒｇ）をコードしている。一方、発現ベクターに挿入したｓｊ０４０８５において、該位置に相当する塩基はＣＧＡまたはＣＧＣであり、いずれもアルギニンをコードしている。すなわち、１塩基の差異によるアミノ酸置換は認められなかった。第４８６番目以外の塩基配列はエラーが無く完全に一致した。したがって、本発現ベクターにより発現される蛋白質のアミノ酸配列と、配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列は同一である。【０１２０】
ｓｊ０４０８５発現ベクターは、２９３ＥＢＮＡ細胞にリポフェクション法によりトランスフェクションした。２９３ＥＢＮＡ細胞は、遺伝子導入の前日に２４ウエルプレートに細胞数６×１０４／ｗｅｌｌで播種し、培養培地（ＩＭＤＭ培地、ＳＩＧＭＡ社製；１０％牛胎仔血清；４ｍＭ  グルタミン；および１０μｇ／ｍｌ  ゲンタマイシン）中で培養した。翌日、リポフェクトアミン２０００（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた手法で遺伝子導入を実施した。具体的には、まず、各発現ベクターを添加した無血清のＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ社製）とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００を添加したＤＭＥＭとを混合し、室温で２０分間インキュベーションした。得られた混合液を、前日播種して３７℃にて５％ＣＯ２存在下で培養した２９３ＥＢＮＡ細胞に添加した。遺伝子導入処理した細胞は３７℃にて５％ＣＯ２存在下でさらに培養を行なった。遺伝子導入２日後、培地を除去してリン酸緩衝化生理食塩水食塩水（ＰＢＳ）にて細胞を洗浄し、プロテアーゼインヒビターカクテル（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ、１／１００濃度、ＳＩＧＭＡ社製）１％を含む溶解バッファー（Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）にて細胞を溶解して細胞溶解液を調製した。溶解バッファーは、次の組成からなる：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１ｍＭ  ＣａＣｌ２；および１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００。【０１２１】
各細胞溶解液は、等量のＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーと混合し、加熱処理（１００℃で５分間）して電気泳動用サンプルを調製した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行い、泳動ゲルをブロッティングバッファーに５分間以上浸して平衡化した後、ＰＶＤＦ膜上に蛋白質をトランスファーした。ブロッティング終了後のＰＶＤＦ膜は、ＴＢＳ−Ｔにブロックエース（大日本製薬株式会社製）を３：１の割合で混合した溶液（ＴＢＳ−Ｔ＋ＢＡ）に４℃で一晩浸してブロッキングした。ブロッキング終了後に、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔにて１０分以上振とうしながら１回洗浄した。上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーは、トリスＳＤＳβＭＥサンプル処理液（第一化学薬品社製）を用いた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いた泳動バッファーは次の組成からなる：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ；１９２ｍＭ  グリシン；０．１％  ＳＤＳ、ｐＨ８．３（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）。上記ブロッティングバッファーは、次の組成からなる：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ；４０ｍＭ  ε−アミノ−ｎ−カプロン酸；２０％メタノール；および０．０５％  ＳＤＳ。ＴＢＳ−Ｔは、次の組成からなる：１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；および０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０。【０１２２】
ＰＶＤＦ膜に、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体（１０００倍希釈、ＳＩＧＭＡ社製）をＴＢＳ−Ｔ＋ＢＡで希釈して添加し、３７℃で１時間以上保温した。その後、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔにて３回洗浄し（１回の洗浄に付き２０分以上の振とう）、ＴＢＳ−Ｔ＋ＢＡで１０００倍に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加して、３７℃で１時間以上保温した。最終的に、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔにて３回洗浄した後（１回の洗浄に付き２０分以上の振とう）、ＥＣＬプラスウエスタンブロッティングディテクションシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）により、抗ＦＬＡＧ抗体に反応する発現蛋白質を検出した。化学発光シグナルは検出装置（Ｌｕｍｉｎｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、東洋紡績株式会社製）にて可視化した。【０１２３】
ＦＬＡＧ−ｔａｇ融合蛋白質として発現させた、ｓｊ０４０８５がコードする蛋白質の予想分子量は、約１２０ＫＤａである。該蛋白質の予想分子量を示す位置に主要バンドが検出された。一方、各ベクターを導入せずＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００のみを添加した細胞ではこのようなバンドは認められなかった。かくして、ｓｊ０４０８５がコードする蛋白質を取得することができた。
【実施例３】
【０１２４】
（ｓｊ０４０８５がコードする蛋白質とＲｈｏファミリー蛋白質との結合の検出）
実施例２で構築したｓｊ０４０８５発現ベクターを用いて、ｓｊ０４０８５がコードする蛋白質とＲｈｏファミリー蛋白質との結合について、プルダウン法により検討した。Ｒｈｏファミリー蛋白質として、Ｒａｃ１を用いた。また、ｓｊ０４０８５に結合するＲｈｏファミリー蛋白質の特異性を確認するため、Ｎ末端側にＧＳＴ−ｔａｇを付加したβ−グルクロニダーゼ（Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）（ＧＵＳ）を陰性コントロールとして用いた。Ｒａｃ１をＮ末端ＧＳＴ−ｔａｇ融合蛋白質として発現させるための発現ベクターは、ゲートウェイＴＭクローニングテクノロジー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて作製した。具体的には、まず、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃＤＮＡ  Ｐａｎｅｌｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）のスプリーンファーストストランドＤＮＡ（ｓｐｌｅｅｎ  ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ）をテンプレートとして、ｐｆｕ  ｔｕｒｂｏを用いてＲａｃ１遺伝子を増幅した。増幅産物を、ＴＯＰＯ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍを用いた反応にてｐＥＮＴＲ／Ｄに挿入してエントリーベクターを作製した。増幅反応にはプライマーとして、配列番号７および８に記載の各塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを使用した。次に、構築したエントリーベクターについて、Ｎ末端ＧＳＴ−ｔａｇ融合蛋白質発現ベクターであるｐＤＥＳＴ２７を用いてＬＲクロナーゼによる組換え反応よりＧＳＴ融合Ｒｈｏ発現プラスミドを作製した。各遺伝子のコード領域の塩基配列が正しく挿入されていることをシーケンスを行って確認した。シーケンス反応はＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を、泳動および解析はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７を用いて行なった。ＧＳＴ融合ＧＵＳ蛋白質は、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製の発現ベクター作製キット（ＣＡＴ＃１１８２６−０２１）に添付の２つのベクターを用いて作製した。具体的には、ＧＵＳ遺伝子が組み込まれているｐＥＮＴＲ−ｇｕｓとＧＳＴ遺伝子が組み込まれているｐＤＥＳＴ２７という２つのベクターをＬＲクロナーゼにより組換え反応させ、ＧＳＴタグの付いたＧＵＳベクター（ｐＤＥＳＴ２７−ＧＵＳ）を構築した。【０１２５】
ｓｊ０４０８５がコードする蛋白質とＲｈｏファミリー蛋白質との結合の検出のために、まず、ｓｊ０４０８５発現ベクターとＲａｃ１遺伝子発現ベクターとを細胞にコトランスフェクションした。具体的には、両ベクターを添加した無血清のＤＭＥＭと、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００を添加した無血清のＤＭＥＭを混合し、室温で２０分間インキュベーションした。得られた混合液を２９３ＥＢＮＡ細胞に添加した。２９３ＥＢＮＡ細胞は、遺伝子導入の前日に細胞数６．０×１０４／ｗｅｌｌを２４ウエルプレートへ播種し、３７℃にて５％ＣＯ２存在下で一晩培養した後に本実施例で用いた。遺伝子導入処理した細胞は３７℃にて５％ＣＯ２存在下で２日間インキュベーションした。培養終了後、ＰＢＳにて細胞を洗浄し、プロテアーゼインヒビターカクテル（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ、１／１００濃度、ＳＩＧＭＡ社製）１％を含む溶解バッファー（組成は実施例２を参照）にて細胞を溶解して細胞溶解液を調製した。陰性コントロールとして、Ｒａｃ１遺伝子発現ベクターのみを遺伝子導入した細胞の細胞溶解液を用いた。【０１２６】
ｓｊ０４０８５がコードする蛋白質とＲａｃ１との結合を、上記細胞溶解液を用いてプルダウン法により検出した。各細胞溶解液３００μｌ、溶解バッファーにけん濁した２０μｌのグルタチオンセファロース４Ｂ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ）および溶解バッファー１００μｌを混合した。各サンプルは、ＭｇＣｌ２およびジチオスレイトール（ＤＴＴ）がそれぞれ最終濃度１ｍＭとなるように調製した。回転盤にて回転させながら４℃で１時間反応させた後に、１ｍｌの冷却した溶解バッファー（ＭｇＣｌ２の最終濃度１ｍＭ）を用いて遠心処理（１，０００ｒｐｍで４℃にて１５秒間）により３回洗浄した。洗浄後に上清を除去したＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂに、溶解バッファーと等量のＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを混合した溶液を４０μｌ添加してミキサーにて撹拌後、加熱処理（１００℃にて５分間）して電気泳動用サンプルを調製した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ブロッティングバッファーに５分間以上浸して平衡化した泳動ゲルから、ＰＶＤＦ膜上に蛋白質をトランスファーした。ブロッティング終了後のＰＶＤＦ膜は、ＴＢＳ−Ｔ＋ＢＡに４℃で一晩浸してブロッキングした。ブロッキング終了後に、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔで洗浄した（２０分以上の振とうを１回）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー、ブロッティングバッファー、ＴＢＳ−ＴおよびＴＢＳ−Ｔ＋ＢＡはいずれも、実施例２で使用した各バッファーと同一組成のバッファーを用いた。【０１２７】
抗ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体（１０００倍希釈、ＳＩＧＭＡ社製）をＴＢＳ−Ｔ＋ＢＡで希釈してＰＶＤＦ膜に添加し、３７℃で１時間以上保温した。その後、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔにて３回洗浄し（１回の洗浄に付き２０分以上の振とう）、ＴＢＳ−Ｔ＋ＢＡで１０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加して、３７℃で１時間以上保温した。最終的に、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔにて３回洗浄した後（１回の洗浄に付き２０分以上の振とう）、ＥＣＬプラスウエスタンブロッティングディテクションシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）により、抗ＦＬＡＧ抗体に反応する発現蛋白質を検出した。化学発光シグナルは検出装置（Ｌｕｍｉｎｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、東洋紡績株式会社製）にて可視化した。【０１２８】
抗ＦＬＡＧ抗体にてバンドが検出された場合、ｓｊ０４０８５がコードする蛋白質はＲａｃ１に結合すると判定した。図１に示したように、ｓｊ０４０８５がコードする蛋白質とＲａｃ１とを共発現させた細胞から調製した試料では該蛋白質を示すバンドが検出された（図１のパネルＡのレーン６）。一方、ｓｊ０４０８５がコードする蛋白質とＧＵＳとを共発現させた細胞から調製した試料では、該蛋白質を示すバンドは検出されなかった（図１のパネルＡのレーン５）。また、ｓｊ０４０８５発現ベクターのみをトランスフェクションした細胞ではこのようなバンドは認められなかった（図１のパネルＡのレーン４）。ＧＵＳ発現ベクターまたはＲａｃ１発現ベクターのみをトランスフェクションした細胞でも、このようなバンドは認められなかった（図１のパネルＡのレーン２および３）。各ベクターを導入せずＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００のみを添加した細胞でも、このようなバンドは認められなかった（図１のパネルＡのレーン１）。また、ｓｊ０４０８５がコードする蛋白質の各細胞における発現が確認できた。各試料に含まれるｓｊ０４０８５がコードする蛋白質の量は、ほぼ同量であった（図１のパネルＢのレーン４−６）。また、各試料に含まれるＲａｃ１またはＧＵＳの量も、ほぼ同量であった（図１のパネルＤのレーン３および６またはパネルＣのレーン２および５）。【０１２９】
このように、ｓｊ０４０８５がコードする蛋白質はＲａｃ１に結合することが判明した。ｓｊ０４０８５がコードする蛋白質は、ＧＡＰの活性ドメインであるＧＡＰドメインを有する。これらから、ｓｊ０４０８５がコードする蛋白質は、Ｒａｃ１等のＲｈｏファミリー蛋白質に結合することにより、Ｒｈｏ−ＧＡＰとして作用すると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１３０】
本発明に係るポリヌクレオチドがコードする蛋白質は、ＧＡＰに特徴的なドメインであるＧＡＰドメインを有し、Ｒａｃ１に結合した。このことから、本蛋白質はＲｈｏ−ＧＡＰの機能を有すると考える。本蛋白質およびポリヌクレオチドの利用により、Ｒｈｏファミリー蛋白質が関与する情報伝達経路および細胞機能の解明とその調節、並びに本蛋白質またはポリヌクレオチドの異常に基づく疾患、例えば慢性炎症性疾患、より具体的には甲状腺や腎臓の慢性炎症性疾患の診断、防止および／または治療が可能になる。したがって
【配列表フリーテキスト】
【０１３１】
配列番号１：（４２１）：（８７９）ＧＡＰドメインをコードする領域。
配列番号３：プライマー用に配列番号１の配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号４：プライマー用に配列番号１の配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号５：Ｒａｃ１をコードするポリヌクレオチド。
配列番号６：Ｒａｃ１のアミノ酸配列。
配列番号７：プライマー用に配列番号５の配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号８：プライマー用に配列番号５の配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号９：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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