(57)【要約】クラスＡ型β−ラクタマーゼに対する特異的阻害剤、クラスＢ型β−ラクタマーゼに対する特異的阻害剤及びクラスＣ型β−ラクタマーゼに対する特異的阻害剤のいずれか２つを含有する３つの試験系を用意し、各試験系において被検体である菌株を培養し、培養後、各試験系における被検体の産生するβ−ラクタマーゼの活性を色調の変化により検定することを含むβ−ラクタマーゼのクラスを識別する方法。被検体が、クラス A型、B型、C型の３つのグループ、またはクラス A型、B型、C型、D型の４つのグループの内の、どの型のβ−ラクタマーゼを産生する菌であるかを短時間に一括して判定できる方法を提供する。【選択図】図２【特許請求の範囲】
【請求項１】
クラスＡ型β−ラクタマーゼに対する特異的阻害剤、クラスＢ型β−ラクタマーゼに対する特異的阻害剤及びクラスＣ型β−ラクタマーゼに対する特異的阻害剤のいずれか２つを含有する３つの試験系を用意し、
各試験系において被検体である菌株を培養し、培養後、被検体が産生するβ−ラクタマーゼの活性を各試験系の色調の変化により検定することを含む、被検体が産生するβ−ラクタマーゼのクラスを識別する方法。
【請求項２】
クラスＡ〜Ｃ型のβ−ラクタマーゼに対する３つの特異的阻害剤を含有する試験系を、前記３つの試験系と併用する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
クラスＡ〜Ｃ型のβ−ラクタマーゼに対する３つの特異的阻害剤を含有しない試験系を、前記３つの試験系と併用する請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
特異的阻害剤を含有する試験系が、ディスクである請求項１〜３いずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
特異的阻害剤を含有する試験系が、ウェルである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
発色法が、ヨード還元反応法、アシドメトリー法または発色基質を用いる方法である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌が産生するβ−ラクタマーゼのクラスを識別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
β−ラクタマーゼ（セリン−β−ラクタマーゼ、メタロ−β−ラクタマーゼを含む）産生は、腸内細菌をはじめとするグラム陰性菌のβ−ラクタム剤に対する主要な耐性機序である。即ち、β−ラクタマーゼはβ−ラクタム系抗菌薬のβ−ラクタム環を加水分解し抗菌力を失わせる細菌産生酵素の一つである。【０００３】
β−ラクタム薬（β−ラクタム系抗菌薬）は、その分子構造母核中にβ−ラクタム環を持つ抗菌薬の総称でペニシリンの発見以来、セファロスポリン、モノバクタム、カルバペネムなど多くの種類が発見、開発されている。これらのβ−ラクタム薬の開発に伴い、その分子構造中のβ−ラクタム環を加水分解して、その抗菌作用を無効化する酵素β−ラクタマーゼを産生する産生菌（β−ラクタマーゼ産生菌）が出現した。【０００４】
β−ラクタマーゼには、その構造上の特徴からクラス A型、B型、C型、D型の４つのグループがある。本発明者らは、これまでに臨床上大きな問題となっているクラス A 型の基質拡張型β−ラクタマーゼ(ESBL)の検出法としてTwin testを、さらに、クラス B型のβ−ラクタマーゼの検出法としてSMA法（特開２０００−２２４９９８号公報（特許文献１）、特開２００１−２９９３８８号公報（特許文献２））を開発し、広く普及されるに至っている。【０００５】
上述のようにβ−ラクタマーゼには、その構造上の特徴からクラス A型、B型、C型、D型の４つのグループがあるが、これらのクラスを一度に見分ける方法はこれまでに知られていない。上記従来の方法は、いずれも、ペニシリナーゼかセファロスポリナーゼかなど、ある特定のクラスに属するか否かを個別に判定する方法であって、被検体が、どのクラスのβ−ラクタマーゼ産生菌であるか、を一括して判定する方法は知られていない。【０００６】
また、上記特許文献１に記載の方法は、クラスB型β−ラクタマーゼの検出法としては優れた方法であるが、検出法のための培養に一晩必要であり、迅速な判定には不向きであった。【０００７】
そこで本発明の目的は、被検体が、クラス A型、B型、C型の３つのグループ、またはクラス A型、B型、C型、D型の４つのグループの内の、どの型のβ−ラクタマーゼを産生する菌であるかを短時間に一括して判定できる方法を提供することにある。
【発明の開示】
【０００８】
上記課題を解決する本発明は以下のとおりである。
［1］クラスＡ型β−ラクタマーゼに対する特異的阻害剤、クラスＢ型β−ラクタマーゼに対する特異的阻害剤及びクラスＣ型β−ラクタマーゼに対する特異的阻害剤のいずれか２つを含有する３つの試験系を用意し、
各試験系において被検体である菌株を培養し、培養後、被検体が産生するβ−ラクタマーゼの活性を各試験系の色調の変化により検定することを含む、被検体が産生するβ−ラクタマーゼのクラスを識別する方法。
［２］クラスＡ〜Ｃ型のβ−ラクタマーゼに対する３つの特異的阻害剤を含有する試験系を、前記３つの試験系と併用する［１］に記載の方法。
［３］クラスＡ〜Ｃ型のβ−ラクタマーゼに対する３つの特異的阻害剤を含有しない試験系を、前記３つの試験系と併用する［１］または［２］に記載の方法。
［４］特異的阻害剤を含有する試験系が、ディスクである［１］〜［３］いずれかに記載の方法。
［５］特異的阻害剤を含有する試験系が、ウェルである［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［６］発色法が、ヨード還元反応法、アシドメトリー法または発色基質を用いる方法である、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
【０００９】
本発明によれば、被検体が、クラス A型、B型、C型の３つのグループ、またはクラス A型、B型、C型、D型の４つのグループの内の、どの型のβ−ラクタマーゼを産生する菌であるかを短時間にかつ一括して判定できる方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
［クラスＡ〜Ｃ型の識別方法］
この方法では、クラスＡ型β−ラクタマーゼに対する特異的阻害剤、クラスＢ型β−ラクタマーゼに対する特異的阻害剤及びクラスＣ型β−ラクタマーゼに対する特異的阻害剤のいずれか２つを含有する３つの試験系を用意する。【００１１】
クラスA型β−ラクタマーゼに対する特異的阻害剤としては、例えば、クラブラン酸、スルバクタム、タゾバクタム等のβ−ラクタム系阻害剤、およびモノ4-ニトロフェニルエステルフォスフォネート(mono 4-nitrophenyl ester phosphonate)や架橋型 ビサイクリコ[3.2.1]ジアザビシクロ-オクタノン類 (bicyclico[3.2.1]diazabicyclo-octanones)など、クラスA型β−ラクタマーゼを特異的に阻害する全ての非β−ラクタム系阻害剤を挙げる事ができる。【００１２】
クラスB型β−ラクタマーゼに対する特異的阻害剤としては、例えば、メルカプト化合物、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)、ジピコリン酸、および、その他クラスB型β−ラクタマーゼを特異的に阻害する全ての阻害剤を挙げる事ができる。【００１３】
クラスＣ型β−ラクタマーゼに対する特異的阻害剤としては、クラスC型β−ラクタマーゼに対して阻害効果を有する薬剤から適宜選択することができる。クラスC型β−ラクタマーゼに対して阻害効果を有する薬剤としては、例えば、ボロン酸化合物、ホウ酸、モノバクタム誘導体、フェニルアセチルグリシル異項環誘導体等を挙げることができる。さらに、ボロン酸化合物としては、例えば、３-アミノフェニルボロン酸、３-ニトロフェニルボロン酸、２-チオフェンボロン酸、ベンゾ[b]チオフェン-２-ボロン酸等を挙げることができる。
また、上記ボロン酸化合物は、塩酸(hydrochloride)やヘミ硫酸(hemysulfate)などの塩の形で50 mg/ml程度の濃度で水によく溶解する為、実際の試験では、それらを用いる事ができる。【００１４】
これら３種類の特異的阻害剤のいずれか２つを含有する３つの試験系を用意する。ここで、特異的阻害剤を含有する試験系は、例えば、ディスクや適当な形状の濾紙片であることができる。ディスクは、例えば、適当な寸法及び形状の濾紙に、所定のβ-ラクタマーゼ阻害剤の混合液と発色剤を含浸させることで作成することができる。ディスクへのβ−ラクタマーゼ阻害剤等の含有量は、β−ラクタマーゼ阻害剤の種類や被検体の種類に応じて適宜決定できる。【００１５】
特異的阻害剤を含有する試験系は、ウェルであることもできる。ここで、ウェルには、バッファー溶液に加え、特異的阻害剤、pH指示薬、発色試薬、発色基質等を適宜含めることができる。ウェルのバッファー溶液へのβ−ラクタマーゼ阻害剤等の含有量は、β−ラクタマーゼ阻害剤の種類や被検体の種類に応じて適宜決定できる。【００１６】
各試験系において被検菌体を適当な培地を用いて培養する。次に、試験系がディスクである場合、例えば、各種の阻害剤等を含有させたディスクに、菌体または菌抽出物などの被検体を含有する溶液を所定量滴下し、次いで所定時間、所定温度で反応させる。また、試験系がウェルである場合、各種の阻害剤を含有させたウェルに直接、菌体または菌抽出物などの被検体を添加するか、または被検体を含有する溶液をウェルに滴下し、次いで所定時間、所定温度で反応させる。反応時間は、被検体の種類の種類等に応じて適宜選択できるが、一般には、例えば、５〜３０分程度の範囲とすることができる。また、反応温度は、被検体の種類の種類等に応じて適宜選択できるが、一般には、例えば、２５〜３７℃の範囲とすることができる。【００１７】
反応後、各試験系における被検体の活性を発色法により検定する。発色法としては、例えば、ヨード還元反応法、アシドメトリー法、発色試薬、または発色基質を用いる方法を用いることができる。【００１８】
ヨード還元反応法
ペニシリンやセファロスポリンなどのβ−ラクタム薬は、β−ラクタマーゼにより、β−ラクタム環が分解されると、（-COO- ）基とH+が生成し、その溶液は還元力を示す。そこで、その還元力により、ヨードが還元され、ヨード特有の赤褐色の色調が消退し黄色または白色に変化する事によりβ−ラクタマーゼの活性を検出する。【００１９】
アシドメトリー法
ペニシリンやセファロスポリンなどのβ-ラクタム薬は、β−ラクタマーゼにより、β−ラクタム環が分解されると、（-COO- ）基とH+が生成し、その溶液は酸性に変化する。そこでその変化を、適当なpH指示薬などの色調の変化を指標としβ−ラクタマーゼの活性を検出する。【００２０】
発色基質を用いる方法
ニトロセフィンなどの発色基質は、β−ラクタマーゼにより分解されると、黄色から赤褐色に色調が変化する。この性質を利用してβ−ラクタマーゼの活性を検出または測定する事ができる。【００２１】
β−ラクタマーゼ産生菌のクラス識別の原理
３つの試験系における発色を観察することで、被検体がどの特異的阻害剤により阻害され、あるいは阻害されないβ−ラクタマーゼを産生または含有するかを判別することができる。
クラスＡ型β−ラクタマーゼに対する特異的阻害剤（以下、クラスＡ阻害剤という）、クラスＢ型β−ラクタマーゼに対する特異的阻害剤（以下、クラスＢ阻害剤という）及びクラスＣ型β−ラクタマーゼに対する特異的阻害剤（以下、クラスＣ阻害剤という）のいずれか２つを含有する３つの試験系を用意する。即ち、試験系ＡとしてクラスＢ阻害剤＋クラスＣ阻害剤を含有する試験系（試験系Ａとする）、クラスＡ阻害剤＋クラスＣ阻害剤を含有する試験系試験系（試験系Ｂとする）、クラスＡ阻害剤＋クラスＢ阻害剤を含有する試験系（試験系Ｃとする）を用意する。【００２２】
試験系Ａには、クラスＢ阻害剤及びクラスＣ阻害剤が含まれているので、試験系Ａは、被検体が少なくともクラスＡ型β−ラクタマーゼ産生菌あるいはその抽出物を含む場合、色調の変化が発生する。
試験系Ｂには、クラスＡ阻害剤及びクラスＣ阻害剤が含まれているので、試験系Ｂは、被検体が少なくともクラスＢ型β−ラクタマーゼ産生菌あるいはその抽出物を含む場合、色調の変化が発生する。
試験系Ｃには、クラスＡ阻害剤及びクラスＢ阻害剤が含まれているので、試験系Ｃは、被検体が少なくともクラスＣ型β−ラクタマーゼ産生菌あるいはその抽出物を含む場合、色調の変化が発生する。【００２３】
さらに、上記３つの試験系に加えて、クラスＡ、Ｂ及びＣ型の３つのβ−ラクタマーゼのそれぞれに対する特異的阻害剤（３種類）を含有する試験系（試験系Ｎという）を併用することができる。この試験系Ｎには、クラスＡ阻害剤、クラスＢ阻害剤及びクラスＣ阻害剤が全て含まれているので、試験系Ｎは、被検体が適量な場合、クラスＡ〜Ｃ型のいずれのβ−ラクタマーゼ産生菌あるいはその抽出物を含んでいても色調の変化は発生しない。このような３つの特異的阻害剤を含有する試験系Ｎを併用することで、被検体の添加量が過剰か否か等、試験の信頼性を検証するための陰性対照として用いる事ができるという利点がある。【００２４】
さらに、上記３つの試験系（試験系Ａ〜Ｃ）または４つの試験系（試験系Ａ〜Ｃ＋Ｎ）に加えて、クラスＡ〜Ｃ型のβ−ラクタマーゼに対する特異的阻害剤のいずれも含有しない試験系（試験系＋という）を、併用することができる。この試験系＋には、クラスＡ阻害剤、クラスＢ阻害剤及びクラスＣ阻害剤のいずれも含まれていないので、試験系＋は、被検体がクラスＡ〜Ｃ型のいずれか少なくとも１つ以上のβ−ラクタマーゼを含む菌株またはその抽出物の場合に色調の変化が発生する。つまり、３つの特異的阻害剤のいずれも含有しない試験系＋を併用することで、被検体が何らかのβ−ラクタマーゼを産生しているか否か、あるいは被検体の添加量が十分か否かなどを検証するための、陽性対照とする事ができ、添加する被検体の量を適宜増減させる事により、試験の精度、信頼度を向上させる事が可能となるという利点がある。【００２５】
上記試験系Ａ〜Ｃ、Ｎ、＋の５つの試験系を用いた場合に予想される各試験系の発色状態と被検体に含まれるβ−ラクタマーゼ産生菌または抽出物中に含まれるβ−ラクタマーゼのクラスとの関係を図１に示す。図１の左側の上から下向きの順に、被検体にβ−ラクタマーゼ産生菌またはβ−ラクタマーゼが全く含まれない場合、被検体に含まれるβ−ラクタマーゼ産生菌またはβ−ラクタマーゼが、クラスＡ型の場合、クラスＢ型の場合、クラスＣ型の場合である。また、図１の右側の上から、被検体に含まれるβ−ラクタマーゼ産生菌またはβ−ラクタマーゼが、クラスＡ型及びＢ型の場合、クラスＡ型及びクラスＣ型の場合、クラスＢ型及びクラスＣ型の場合、およびクラスＡ型、Ｂ型及びＣ型の場合である。【００２６】
図１においては、例えば、クラスＡ阻害剤としてＣＶＡ（クラブラン酸）、クラスＢ阻害剤としてＤＰＡ（ジピコリン酸）及びクラスＣ阻害剤としてＡＰＢ（3-アミノフェニルボロン酸）が用いられている。【００２７】
図１の右側に示すように、検体に含まれるβ−ラクタマーゼ産生菌が複数のクラスのβ−ラクタマーゼを産生する場合、試験系Ａ〜Ｃのいずれか２つまたは３つ全部に色調の変化が発生することで、判別できる。この状態を図２によりさらに説明する。【００２８】
図２の左上は、被検体に含まれるβ−ラクタマーゼ産生菌あるいはその抽出物がクラスＡ及びＢ型の双方のβ−ラクタマーゼを含む場合である。一方、阻害剤は、図１と同様に、クラスＡ阻害剤としてＣＶＡ、クラスＢ阻害剤としてＤＰＡ及びクラスＣ阻害剤としてＡＰＢが用いられている。そして、クラスＡ阻害剤（ＣＶＡ）とクラスＢ阻害剤（ＤＰＡ）含む試験系Ｃでは、クラスＡ及びＢ型の双方のβ−ラクタマーゼを産生する菌は、双方の活性が阻害されるので色調の変化が発生しない。それに対して、クラスＡ阻害剤（ＣＶＡ）とクラスＣ阻害剤（ＡＰＢ）含む試験系Ｂでは、クラスＢ型のβ−ラクタマーゼの活性は阻害されないので色調の変化が発生し、クラスＢ阻害剤（ＤＰＡ）とクラスＣ阻害剤（ＡＰＢ）含む試験系Ｃでは、クラスＣ型のβ−ラクタマーゼの活性は阻害されないので色調の変化が発生する。即ち、クラスＡ阻害剤（ＣＶＡ）を含まない試験系ＡとクラスＢ阻害剤（ＤＰＡ）を含まない試験系Ｂで色調の変化が発生することで、被検体にはクラスＡ及びＢ型の双方のβ−ラクタマーゼを産生する菌あるいはその抽出物が含まれると判定できる。【００２９】
図２の左下は、同様に、検体に含まれる菌がクラスＡ及びＣ型のβ−ラクタマーゼを産生する場合であり、この場合には、クラスＡ阻害剤（ＣＶＡ）を含まない試験系ＡとクラスＣ阻害剤（ＡＰＢ）を含まない試験系Ｃで色調の変化が発生することで、被検体に含まれる菌がクラスＡ及びＣ型の双方のβ−ラクタマーゼを産生することを判定できる。右上は、被検体に含まれる菌がクラスＢ及びＣ型の双方のβ−ラクタマーゼを産生する場合であり、この場合には、クラスＢ阻害剤（ＤＰＡ）を含まない試験系ＢとクラスＣ阻害剤（ＡＰＢ）を含まない試験系Ｃで色調の変化が発生することで、被検体に含まれる菌は、クラスＢ及びＣ型の双方のβ−ラクタマーゼを産生すると判定できる。さらに、右下は、被検体に含まれる菌がクラスＡ、Ｂ及びＣ型の３種類のβ−ラクタマーゼを同時に産生する場合であり、この場合には、クラスＡ阻害剤（ＣＶＡ）を含まない試験系ＡとクラスＢ阻害剤（ＤＰＡ）を含まない試験系ＢとクラスＣ阻害剤（ＡＰＢ）を含まない試験系Ｃの全てにおいて色調の変化が発生することで、被検体に含まれる菌あるいはその抽出物がクラスＡ、Ｂ及びＣ型の３種類のβ−ラクタマーゼを同時に含有すると判定できる。【００３０】
［クラスＤ型の識別方法］
クラスD型のβ−ラクタマーゼを産生する株の分離は、現時点では、臨床現場ではそれ程多くは無いが、既に多数の亜型が報告されており、無視できない状況に至っている。そこでクラスA, B, Cの３種類の特異的阻害剤を用いてクラスDのβ−ラクタマーゼの産生性の判定を行う事は重要であり、それは以下のようにして達成する事ができる。【００３１】
クラスD型β−ラクタマーゼはクラスAとクラスCの双方のβ−ラクタマーゼに類似した共通の性格を示す為、クラスＡ阻害剤（例えば、クラブラン酸（ＣＶＡ））とクラスＣ阻害剤（例えば、3-アミノフェニルボロン酸（ＡＰＢ））の双方により阻害される。従って、クラスD型β−ラクタマーゼを単独で産生する株の場合は、＋のディスクあるいはウェルが陽性になるにもかかわらず、理論上、A, B, C, Nの全てのディスクあるいはウェルが陰性となる事で判別可能である。
尚、将来クラスD型β−ラクタマーゼの特異的阻害剤が発見された場合には、既に記載した方法と同様に、三種類の阻害剤を含む４つの反応系と四種類の全ての阻害剤を含む一つの反応系、および、いずれの阻害剤をも含まない一つの反応系の計６種類の反応系を用意する事により、クラスA、B、C、Dの型別を判別する事が可能となる。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例１
2種類の阻害剤を含む３種類のディスクの組を用意した。各ディスクには、予めあるいは、試験直前にβ−ラクタマーゼにより分解されると赤褐色に変色するニトロセフィンを5〜20μg添加した。
阻害剤の組み合わせは以下のとおりである。
A. DPA(200μg/disk)+APB(500μg/disk)
B. APB(500μg/disk)+CVA(200μg/disk)
C. DPA(200μg/disk)+CVA(200μg/disk)
CVA（クラブラン酸）: class A β−ラクタマーゼ特異的阻害剤
DPA（ジピコリン酸）: class B β−ラクタマーゼ特異的阻害剤
APB（3-アミノフェニルボロン酸）: class C β-ラクタマーゼ特異的阻害剤
APBを含むボロン酸化合物は、一般的に、水に難容性であるが、それらの塩酸塩やヘミ硫酸塩などの塩を選択すると、それらは水に容易に溶解するため、実際の試験では、それらを用いる事ができる。【００３３】
寒天平板より菌のコロニーを１〜数白金耳かき取り、0.01Mのリン酸バッファー100 μlに懸濁し、各ディスクに各々10 μlづつ加え、５分間室温に放置し、阻害剤とニトロセフィンを含有したディスクの分解による色調の変化（黄色→褐色）を観察し、判定した。【００３４】
反応させた後の発色（色調の変化）の状態を図3に示す。
図3の(1)は、被検体が、クラスＡ型のβ−ラクタマーゼであるCTX-M-2を産生する菌株菌液であり、ディスクAのみ発色した。
図3の(2)は、被検体が、クラスＢ型のβ−ラクタマーゼであるIMP-1を主に産生する菌株の菌液である。従って、ディスクBが発色した。但し、この株はクラスA 及びC型のβ−ラクタマーゼも同時に若干量産生しており、ディスクA 及びCも発色した。【００３５】
図3の(3)は、被検体が、クラスC型のβ−ラクタマーゼであるAmpCを主に産生する菌株の菌液である。従って、ディスクCが発色した。但し、クラスA型のβ−ラクタマーゼも少し産生しており、ディスクAも発色した。
図3の(4)は、被検体が、クラスA型のβ−ラクタマーゼであるCTX-M-2及びクラスＢ型のβ−ラクタマーゼであるIMP-1を産生する菌株の菌液である。従って、ディスクA及びBが発色した。【００３６】
図3の(5)は、被検体が、クラスＢ型のβ−ラクタマーゼであるIMP-1及びクラスC型のβ−ラクタマーゼであるAmpCを同時に産生する菌株の菌液である。従って、ディスクB及びCが発色した。但し、クラスAのβ−ラクタマーゼも同時に少量産生しており、ディスクA も弱く発色した。
図3の(6)は、被検体が、クラスC型のβ−ラクタマーゼであるCMY-8を単独産生する菌株の菌液である。従って、ディスクCのみが発色した。
図3の(7)は、被検体が、クラスA型のβ−ラクタマーゼであるCTX-M-2、クラスＢ型のβ−ラクタマーゼであるIMP-1及びクラスC型のβ−ラクタマーゼであるAmpCを同時に産生する菌株の菌液である。従って、ディスクA、B及びCがともに発色した。【００３７】
実施例2
以下に示す、2種類以上の阻害剤を含む5つのディスクを用意し、図4の(1)に示すように配置した。但し、各ディスクには、ニトロセフィンを5〜20μg添加した。阻害剤の組み合わせは以下のとおりである。【００３８】
+. 阻害剤未添加
A. DPA+APB
B. APB+CVA
C. DPA+CVA
N. APB+CVA+DPA
阻害剤の内訳は以下のとおりである。
DPA=200μg/disk
APB=500μg/disk
CVA=200μg/disk【００３９】
寒天平板より菌のコロニーを１白金耳かき取り、0.01Mのリン酸バッファー100μlに懸濁し、５つのティスクに各々10μlづつ加え、５分間室温に放置し、ニトロセフィンの分解による色調の変化（黄色→褐色）を観察し、判定した。【００４０】
培養した後の発色状態を図4の(2)〜(5)に示す。
図4の(2)は、被検体が、クラスＢ型のβ−ラクタマーゼであるIMP-1を主に産生し、かつクラスC型のβ−ラクタマーゼであるAmpCを少量産生する菌株Enterobacter  cloacae 02-324株の菌液であり、ディスクB及びCが発色した。また、阻害剤未添加ディスク+も発色した。しかし、３種類の阻害剤を全て含むため、本来発色してはならないNのdiskも発色した事から、この試験については、添加した被検体が阻害剤の量に比較して過剰である事を示しており、このような場合、再度、被検体の量を減量して再試験する必要がある。【００４１】
図4の(3)は、被検体が、クラスＢ型のβ−ラクタマーゼであるIMP-1を主に産生し、かつクラスC型のβ−ラクタマーゼであるAmpCを少量産生する菌株Escherichia coli 02-156株の菌液であり、ディスクBが発色し、ディスクCも少し発色した。また、阻害剤未添加ディスク+も発色した。しかし、ディスクA及びNは発色しなかった。したがって、この試験では、添加された被検体は適量であり、本被検体に含まれる菌株あるいはその抽出物には、クラスBであるIMP-1とともにクラスC型の染色体性AmpC型β−ラクタマーゼが少量存在すると判定される。【００４２】
図4の(4)は、被検体が、クラスＢ型のβ−ラクタマーゼであるIMP-1を主に産生し、かつクラスC型のβ−ラクタマーゼであるAmpCを極少量産生する菌株Pseudomonas aeruginosa 02-64株の菌液であり、ディスクBが発色し、ディスクCもほんの少し発色した。また、阻害剤未添加ディスク+も発色した。しかし、ディスクA及びNは発色しなかった。したがって、この試験では、添加された被検体は適量であり、本被検体に含まれる菌株あるいはその抽物には、クラスBであるIMP-1とともにクラスC型の染色体性AmpC型β−ラクタマーゼが微量存在すると判定される。【００４３】
図4の(5)は、被検体が、クラスA型のβ−ラクタマーゼであるCTX-M-2を主に産生し、かつ、かつクラスC型のβ−ラクタマーゼであるAmpCを極少量産生する菌株Citrobacter  freundii  03-113株の菌液であり、ディスクAが発色し、ディスクCもほんの少し発色した。また、阻害剤未添加ディスク+も発色した。しかし、ディスクB及びNは発色しなかった。したがって、この試験では、添加された被検体は適量であり、本被検体に含まれる菌株あるいはその抽出物には、クラスAであるCTX-M-2とともにクラスC型の染色体性AmpC型β−ラクタマーゼが微量存在すると判定される。【００４４】
実施例3
2種類以上の阻害剤を含む5つのウェルを用意し、図5の(1)に示すように配置した。但し、各ウェルには、ニトロセフィンを5〜20μg添加した。阻害剤の組み合わせは実施例2と同様である。【００４５】
寒天平板より菌のコロニーを１白金耳かき取り、0.01Mのリン酸バッファー100μlに懸濁し、５つのウェルに各々10μlづつ加え、５分間室温に放置し、ニトロセフィンの分解による色調の変化（黄色→褐色）を観察し、判定した。
培養した後の発色状態を図5〜7に示す。図5及び6には、左側に発色前のウェルを示し、右側に発色後のウェルを示す。図7には発色後のウェルのみを示す。また図7にいては、発色基質としてのニトロセフィンの代わりに、基質としてセファロチンまたはABPC(アンピシリン)を 300〜500μg用い、発色剤として例えば、pH指示薬であるフェノールレッド 10〜30 μg/mlを用いた。【００４６】
図5の(1)は、被検体が、クラスＢ型のβ−ラクタマーゼであるIMP-1を主に産生し、かつクラスC型のβ−ラクタマーゼであるAmpCを極少量産生する菌株P. aeruginosa 02-64株の菌液であり、ウェルBが発色した。また、阻害剤未添加ウェル+も発色した。しかし、ウェルA、C及びNは発色しなかったため、試験条件は適切であったと判断される。【００４７】
図5の(2)は、被検体が、クラスＢ型のβ−ラクタマーゼであるIMP-1を主に産生し、クラスA型のβ−ラクタマーゼであるTEMを少量産生し、かつクラスC型のβ−ラクタマーゼであるAmpCを少量産生する菌株E. cloacae 02-324株であり、ウェルBが発色し、ウェルAとCもほんの少し発色した。また、阻害剤未添加ウェル+も発色した。しかし、ウェルNは発色せず、この事は、試験条件は適切であった事を示している。【００４８】
図5の(3)は、被検体が、クラスA型のβ−ラクタマーゼであるCTX-M-2を主に産生し、かつ、かつクラスC型のβ−ラクタマーゼであるAmpCを極少量産生する菌株C. freundii 03-113株の菌液であり、ウェルAが発色し、ウェルCも極弱く発色した。また、阻害剤未添加ウェル+も発色した。しかし、ウェルB及びNは発色せず、この事は、試験条件は適切であった事を示している。【００４９】
図5の(4)は、被検体が、クラスＢ型のβ−ラクタマーゼであるIMP-1を主に産生し、かつクラスC型のβ−ラクタマーゼであるAmpCを少量産生する菌株E. coli 02-156 株の菌液であり、ウェルBが発色し、ウェルCも弱く発色した。また、阻害剤未添加ウェル+も発色した。しかし、ウェルA及びNは発色せず、この事は、試験条件は適切であった事を示している。【００５０】
図6の(1)は、被検体が、クラスＢ型のβ−ラクタマーゼであるIMP-1を主に産生する菌株Klebsiella pneumoniaeの菌液であり、ウェルBが発色した。また、阻害剤未添加ウェル+も発色した。しかし、ウェルA、C及びNは発色しなかった。【００５１】
図6の(2)は、被検体が、クラスC型のβ−ラクタマーゼであるCMY-8を主に産生する菌株Escherichia coli 04-399株の菌液であり、ウェルCが発色した。また、阻害剤未添加ウェル+も発色した。しかし、ウェルAとB及びウェルNは発色しなかった。【００５２】
図6の(3)は、被検体が、クラスC型のβ−ラクタマーゼであるSHV-5a とともにクラスC型β−ラクタマーゼである DHA-1を同時に産生する、Klebsiella  oxytoca 03-284株の菌液であり、ウェルA, Cが発色した。また、阻害剤未添加ウェル+も発色した。しかし、ウェルB及びNは発色しなかった。【００５３】
図6の(4)は、被検体が、クラスA型のβ−ラクタマーゼ産生菌であるCTX-M-2を主に産生し、かつ、かつクラスC型のβ−ラクタマーゼ産生菌であるAmpCを極少量産生する菌株A. baumannii 03-259株の菌液であり、ウェルA及びCが発色した。また、阻害剤未添加ウェル+も発色した。しかし、ウェルB及びNは発色しなかった。【００５４】
図7は、アシドメトリー法の原理と阻害剤を組み合わせた、β−ラクタマーゼの型別の実施例である。判定の原理は、これまでと同様であるが、pH指示薬として用いたフェノールレッドは、中性(pH 7)付近では赤色であり、pHが下がる（酸性化）に従い黄色に変色する。（１）は、ウェルBとCが、黄色に変化しているため、このウェルに加えた被検体は、クラスBとクラスCの双方のβ−ラクタマーゼを同時に産生していると判定される。（２）は、同様に、クラスA, B, Cの三種類のβ−ラクタマーゼを産生していると判定される。（３）は（１）と同様にクラスBとクラスCの双方のβ−ラクタマーゼを産生していると判定される。（４）は、クラスAとクラスCの双方のβ-ラクタマーゼを産生していると判定される。【００５５】
+のウェルが赤いままの場合は、被検体の添加量が少ない事を意味し、一方、Nのウェルが黄色くなる場合は、被検体の添加量が多い事を示すため、+とNのウェルを各々陽性対照、陰性対照として用いる事により、添加する菌液の量を増減するなどにより、試験条件を適正な条件に調整する事が可能である。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の方法は、分子構造母核中にβ−ラクタム環を持つ抗菌薬を投与する際に、患者から分離された菌株がどのクラスのβ−ラクタマーゼ産生菌であるかの判定を行う事が必要とされる医療現場において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】予想される試験結果を示す。試験系Ａ〜Ｃ、Ｎ、＋の５つの試験系を用いた場合に予想される各試験系の発色状態と被検体に含まれるβ−ラクタマーゼ産生菌または抽出物中に含まれるβ−ラクタマーゼのクラスとの関係を示す。
【図２】二種以上のβ−ラクタマーゼを産生する株の判定の原理を示す。検体に含まれるβ−ラクタマーゼ産生菌が複数のクラスのβ−ラクタマーゼを産生する場合、試験系Ａ〜Ｃのいずれか２つまたは３つ全部に色調の変化が発生することで判別できることの説明図。
【図３】実施例１の結果を示す。
【図４】実施例２の結果を示す。
【図５】実施例３の結果を示す。
【図６】実施例３の結果を示す。
【図７】実施例３の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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