(57)【要約】 本発明の目的は、二種類以上の細胞のゲノム上の非メチル化領域を同時に多数検出し、網羅的に比較し解析することができる方法を提供することである。本発明は、第一の制限酵素Ｘ及び第二の制限酵素Ｙの少なくともいずれか一方はメチル化センシティブな酵素を使用して、非メチル化領域に由来するDNA 断片のみから構成された集団を調製し、次いで、ＨｉＣＥＰの原理を用いてゲノム上の非メチル化領域を検出する方法、及び、該方法によって、二種類以上の細胞由来のゲノム上の非メチル化領域を検出し、その結果（例えば、非メチル化領域の量に相当する各ピークの大きさの変化等）を比較することにより非メチル化領域の差異を解析するから成る、ゲノム上の転写活性領域の変化を解析する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム上の非メチル化領域を検出する方法であって、
（ａ）ゲノムDNAを第一の制限酵素Ｘで切断する工程、
（ｂ）工程（ａ）で切断されたＤＮＡ断片の第一の制限酵素Ｘによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びＸプライマーに相補的な配列を含み、該切断部位の配列に相補的な配列末端とは反対側の末端にタグ物質が付加されたＸアダプターを結合させて、Ｘアダプターが結合しているＤＮＡ断片を得る工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られたＸアダプターが結合しているＤＮＡ断片を該Ｘプライマーに相補的な配列部分を切断しない第二の制限酵素Ｙで切断する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で切断されたＸアダプターが結合しているＤＮＡ断片を、Ｘアダプターに付加されたタグ物質高親和性を有する物質を用いて分離精製する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で精製されたＸアダプターが結合しているＤＮＡ断片の第二の制限酵素Ｙによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びＹプライマーに相補的な配列を含むＹアダプターを結合させて、両端にＸアダプターとＹアダプターが結合しているＤＮＡ断片を得る工程、
（ｇ）該Ｘプライマーを基準として３’末端に２塩基配列であるＮ１Ｎ２（Ｎ１及びＮ２は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＸ１プライマーと、該Ｙプライマーを基準として３’末端に２塩基配列であるＮ３Ｎ４（Ｎ３及びＮ４は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＹ１プライマーとからなるプライマーセットを用いて、工程（ｅ）で得られた二本鎖配列を鋳型としてＰＣＲ反応を行う工程、及び
（ｈ）得られたＰＣＲ産物をその鎖長に基づき、分離して検出する工程、
から成り、第一の制限酵素Ｘ及び第二の制限酵素Ｙの少なくともいずれか一方はメチル化センシティブな酵素である、前記方法。
【請求項２】
更に、（ｆ）工程（ｅ）で得られた両末端がＸアダプターとＹアダプターで囲まれているＤＮＡ断片を鋳型として、ＸプライマーとＹプライマーとからなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行ないＤＮＡ断片を増幅する工程を、（ｅ）工程と（ｇ）工程の間に含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（ｆ）において、ＰＣＲサイクル数を７〜１０回とすることにより、ＤＮＡ断片の数を１２８〜１０２４倍に増幅する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
更に、（ｉ）検出されたピークを同定する工程を含む、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
第一の制限酵素Ｘがメチル化センシティブな酵素である、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
第一の制限酵素Ｘが、６塩基又は８塩基を認識するメチル化センシティブな酵素である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第一の制限酵素Ｘがメチル化アンセンシティブな酵素であり、且つ、第二の制限酵素Ｙがメチル化センシティブな酵素である、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
第一の制限酵素Ｘが６塩基を認識するメチル化センシティブな酵素SalI であり、第二の制限酵素Ｙがメチル化アンセンシティブな酵素MspI である、請求項１ないし７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＰＣＲ産物の鎖長に基づく分離及び検出を、ＰＣＲ産物の電気泳動における移動距離及びピークに基づき行う、請求項１ないし８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか一項に記載の方法によって、二種類以上の細胞由来のゲノム上の非メチル化領域を検出し、その結果を比較することにより非メチル化領域の差異を解析するから成る、ゲノム上の転写活性領域の変化を解析する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲノム多様性解析を行なう方法、より具体的には、ゲノム上の転写活性領域（非メチル化領域）の網羅的検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトやマウスなどのゲノム塩基配列が決定されたあるいはほぼ決定されつつある現在、ポストゲノム解析の焦点は、個体や疾患間のゲノム塩基配列の違いやその因果関係に移行している。すなわち、患者と健常者の間でゲノムの塩基配列の違いがあるか、その違いと疾患の関連があるか、などが研究され始めている。【０００３】
例えば、多型マーカーとして、SNP（single nucleotide polymorphism：一塩基多型）による研究では、ゲノムの塩基配列中に存在するSNPを網羅的に同定し、それを個体間、疾患間（あるいは、健常者との間）などで比較し関連性を見出す方法、及び、マイクロサテライト（ゲノム中に点在する繰り返し配列であって、個体間で繰り返し単位の長さが異なる）を多型マーカーとして用いて比較する方法等が知られている。【０００４】
こうした試みによって疾患と多型マーカーとの関連性が見出されつつあるが、これら多型マーカーはゲノム塩基配列の単に違いであって、この違いが直接的に疾患に関与しているかどうかは、今後の研究に委ねられている。ゲノム上の塩基配列の違いと疾患の関連性をもっと詳しく解析するためには、疾患関連遺伝子（その遺伝子そのものが異常になって疾患を引き起こす遺伝子群のみを指すのではなく、疾患に直接的又は間接的に関与している遺伝子群も含む。）が、どのように発現しているか、すなわち、網羅的な遺伝子発現頻度解析と関連づけて解析する必要がある。【０００５】
一方で、この様なゲノムの塩基配列の違いのみならず、遺伝子の転写発現機構に関与している要因として、ゲノム上の塩基の修飾がある。現在最もよく知られているのが、塩基配列CGのシチジン塩基のメチル化制御である。即ち、メチル化を受けているシチジン塩基（Met-C）が、ゲノム上で遺伝子の転写制御配列や転写配列に関与する位置で起こっている場合、関与する遺伝子の転写が妨げられる、あるいは、制御されることが知られている（非特許文献１）。ゲノム上のCG配列の内、細胞の状態により、約60-90%がメチル化されていると言われており、このメチル化は遺伝子の転写調節の一端を担っている（非特許文献２）【０００６】
これまでに、ゲノム上の特定部位のメチル化に関する解析方法として、メチル化感受性制限酵素及びメチル化非感受性制限酵素を用いてゲノムの特定部分を切断し、得られた切断断片を増幅して電気泳動等により解析する方法（非特許文献３）、及び、メチル化非感受性制限酵素で付着末端を生じるXmaI に特異的なアダプターを使用してメチル化部位を解析する方法（非特許文献４）が報告されている。【０００７】
更に、特許文献１には、ゲノム中のメチル化部位を検出する方法、及び、それに用いられるバイオチップ等が記載されている。
【非特許文献１】木住野達也、新川詔夫, 実験医学増刊, vol.21, 1442-1447, 2003.
【非特許文献２】Razin A, Riggs AD., Science. 1980 Nov 7;210(4470):604-10.
【非特許文献３】Toshikazu U., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA Vol.94, pp.2284-2289, March 1997
【非特許文献４】Minoru T., et al., Cancer Research 59, 2307-2312 (1999)
【特許文献１】特開２００３−３８１８３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
既に述べたように、疾患関連遺伝子を同定するためには、ゲノム塩基配列の違いを見出すのみならずゲノムの転写活性領域（非メチル化修飾領域）も把握して相関解析する必要がある。即ち、本発明の目的は、二種類以上の細胞のゲノム上の非メチル化領域を同時に多数検出し、網羅的に比較し解析することができる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
即ち、本発明は第一の態様として、ゲノム上の非メチル化領域を検出する方法であって、
（ａ）ゲノムDNAを第一の制限酵素Ｘで切断する工程、
（ｂ）工程（ａ）で切断されたＤＮＡ断片の第一の制限酵素Ｘによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びＸプライマーに相補的な配列を含み、該切断部位の配列に相補的な配列末端とは反対側の末端にタグ物質が付加されたＸアダプターを結合させて、Ｘアダプターが結合しているＤＮＡ断片を得る工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られたＸアダプターが結合しているＤＮＡ断片を該Ｘプライマーに相補的な配列部分を切断しない第二の制限酵素Ｙで切断する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で切断されたＸアダプターが結合しているＤＮＡ断片を、Ｘアダプターに付加されたタグ物質高親和性を有する物質を用いて分離精製する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で精製されたＸアダプターが結合しているＤＮＡ断片の第二の制限酵素Ｙによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びＹプライマーに相補的な配列を含むＹアダプターを結合させて、両端にＸアダプターとＹアダプターが結合しているＤＮＡ断片を得る工程、
（ｇ）該Ｘプライマーを基準として３’末端に２塩基配列であるＮ１Ｎ２（Ｎ１及びＮ２は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＸ１プライマーと、該Ｙプライマーを基準として３’末端に２塩基配列であるＮ３Ｎ４（Ｎ３及びＮ４は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＹ１プライマーとからなるプライマーセットを用いて、工程（ｅ）で得られた二本鎖配列を鋳型としてＰＣＲ反応を行う工程、及び
（ｈ）得られたＰＣＲ産物をその鎖長に基づき、分離して検出する工程、
から成り、第一の制限酵素Ｘ及び第二の制限酵素Ｙの少なくともいずれか一方はメチル化センシティブな酵素である、前記方法に係る。【００１０】
本発明の第二の態様として、上記方法によって、二種類以上の細胞由来のゲノム上の非メチル化領域を検出し、その結果（例えば、非メチル化領域の量に相当する各ピークの大きさの変化等）を比較することにより非メチル化領域の差異を解析するから成る、ゲノム上の転写活性領域の変化を解析する方法に係る。ここで、ゲノムの由来に特に制限はなく、例えば、真核細胞、特にヒト及びマウスなどの哺乳類細胞由来のゲノムを挙げることができる。又、「二種類以上の細胞」とは、細胞の由来する生物種、臓器、組織、発生・分化段階、病態等のような、細胞の任意の性質が互いに異なる場合を広く意味する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のゲノム上の非メチル化領域を検出する方法では、第一の制限酵素Ｘ及び第二の制限酵素Ｙの少なくともいずれか一方に、メチル化修飾シチジンが存在する場合に切断できない制限酵素（メチル化センシティブ制限酵素）を利用することにより、ゲノム上のメチル化領域あるいは、非メチル化領域を含むゲノム領域を断片化（フラグメンテーション）し、このフラグメント集団（フラグメントライブラリー）を網羅的に、且つ、高感度で分離、検出することが出来る。【００１２】
更に、例えば、疾患患者由来細胞と健常者由来細胞、又は、異なる発生・分化段階にある細胞間等のような、何らかの相違点を有する二種類以上の細胞について、本発明の検出方法を実施して得られた結果を比較することにより、ゲノム上の非メチル化領域、すなわち、転写活性領域の差異を容易に見出し、解析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】工程（ｈ）の結果で工程（ｇ）のX-AAとY-AAの組合せの場合を図１に示す。
【図２】工程（ｈ）の結果で工程（ｇ）のX-CAとY-ACの組合せの場合を図２に示す。
【図３】工程（ｈ）の結果で工程（ｇ）のX-CAとY-ACの組合せの場合を図３に示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の検出方法において、出発材料であるゲノムＤＮＡの量が十分にないような場合でも、十分な検出感度が得られるように、更に、工程（ｅ）で得られた両末端がＸアダプターとＹアダプターで囲まれているＤＮＡ断片を鋳型として、ＸプライマーとＹプライマーとからなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行ないＤＮＡ断片を増幅することからなる工程（ｆ）を、（ｅ）工程と（ｇ）工程の間に含むことが好ましい。その結果、ＸプライマーとＹプライマーが付加された二本鎖ＤＮＡ数を増大させることができる。当業者であれば、工程（ｆ）においてＰＣＲの条件を適当に設定することにより、例えば、ＰＣＲサイクル数を７〜１０回とすることにより、ＤＮＡ断片の数を１２８〜１０２４倍に増幅することが出来る。【００１５】
本発明の検出方法において得られたＰＣＲ産物を分離及び検出した後に、更に、検出されたピークを同定する工程（ｉ）を含むことが出来る。このような同定は当業者に公知の任意の方法で行うことが可能である。例えば、検出されたピークを回収し、適当なシーケンシング等の適当な実験的手法によって具体的にその塩基配列を決定することが出来る。或いは、コンピューター上でかかる配列を理論的に求めることも出来る。例えば、GenBank, EMBL 及びDDBJ 等の当業者に公知の任意のデータベースから得られるデータを利用し、本発明方法で使用した制限酵素による切断で得られることが予想されるＤＮＡ断片の理論的に求めることが出来る。従って、これを本発明の検出方法から得られた実測データと比較すれば、当該ＤＮＡ断片がどの遺伝子（ゲノムＤＮＡ）に由来するものであるかを同定することが可能である。【００１６】
本発明方法において、ゲノム上の非メチル化領域を検出するためには、第一の制限酵素Ｘ及び第二の制限酵素Ｙの少なくともいずれか一方はメチル化センシティブな酵素である必要がある。【００１７】
具体的には、好適な態様として、例えば、第一の制限酵素Ｘがメチル化センシティブな酵素であり、且つ、第二の制限酵素Ｙがメチル化センシティブ又はメチル化アンセンシティブな酵素である場合、又は、第一の制限酵素Ｘがメチル化アンセンシティブな酵素であり、且つ、第二の制限酵素Ｙがメチル化センシティブな酵素である場合を挙げることが出来る。尚、第一の制限酵素Ｘ及び第二の制限酵素Ｙは、当業者に公知の任意の酵素を適宜使用することが出来る。【００１８】
しかしながら、ゲノムの位置を特定しやすくするために、第一の制限酵素Ｘとしては、出現頻度が比較的少ない酵素が望ましく、例えば、6塩基認識で且つメチル化センシティブなSalI（タカラバイオ社製、認識配列GTCGAC）、BssHII（タカラバイオ社製、認識配列GCGCGC）、8塩基認識で且つメチル化センシティブなNotI（タカラバイオ社製、認識配列 GCGGCCGC）、AscI（New England BioLabs社製、GGCGCGCC）などを好適例として挙げることが出来る。【００１９】
同様に、第一の制限酵素Ｘとして適している出現頻度が比較的少ないメチル化アンセンシティブ酵素の例として、XmaI（New England BioLabs社製、CCCGGG）、BssSI（New England BioLabs社製、CTCGTG）、BsoBI（New England BioLabs社製、CYCGRG）等を挙げることが出来る。【００２０】
例えば、New England BioLabs社2002-3年版カタログ263頁（或いは、同社ホームページhttp://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/fragment_size_by_cleavage.asp）に記載されている報告では、マウスゲノム中に出現するSalIサイト確立は、平均48kbpに1回の割合であり、マウスゲノムを26.4億塩基対と仮定する（National Center for Biotechnology Information U.S. National Library of Medicine 2004年10月1日現在の記述。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/）と約55,000箇所、NotIは、平均120kbpで22,000箇所、AscIでは、平均280kbpで約9,400箇所存在する。【００２１】
従って、SalIを第一の制限酵素として使用した場合、マウスゲノムでは、約55,000個のDNA断片が得られることになるが、SalIは、メチル化センシティブであるので、ゲノム上のCG配列中70%が、メチル化されていると仮定する（非特許文献１）と、SalIでも、55,000箇所の内、70%にあたる約38,500箇所は切断できないことになるので、切断できる個所は、30%にあたる約16,500個所と成り、16,500個のDNA断片が得られる。しかしながら、ここのDAN 断片の鎖長は、26.4億塩基対割る16,500になるので、平均160kbpと予想される。現実問題として、このような平均160kbpの長いDNA 断片を扱うのは、非常に困難である。【００２２】
このDAN 断片に対して第二の制限酵素Ｙを作用させ、約160kbpを短く切り刻み、扱い易い断片サイズにする。従って、第二の制限酵素Ｙは、第一の制限酵素と違い、出現頻度が豊富な、４塩基認識制限酵素を使うのが望ましく、これにより、扱いやすいDNA断片サイズを得ることができる。その為には、第二の制限酵素Ｙは、メチル化アンセンシティブな酵素にすることが望ましいが、第二の制限酵素Ｙもメチル化センシティブな酵素にするとメチル化が起こっている広範囲な領域の特定に役立つので、解析対象によって使い分けることが可能である。【００２３】
このような第二の制限酵素Ｙとして使用するのに適当な酵素の例として、メチル化アンセンシティブな酵素としては、MspI（タカラバイオ社、認識配列CCGG）、及びTaqI（New England BioLabs社製、TCGA）等を挙げることができ、又、メチル化センシティブな酵素としては、HpaII（New England BioLabs社製、CCGG）及びHhaI（New England BioLabs社製、GCGC）等を挙げることが出来る。【００２４】
こうして作製された第一制限酵素Ｘ及び第二制限酵素Ｙで切断されたDNA 断片集団（DAN 断片ライブラリ）は、非メチル化領域に由来するDNA 断片のみから構成されたものとなる。【００２５】
こうして得られたDNA
断片ライブラリから各要素であるDAN 断片をそれらの鎖長（分子サイズ）に基づき分離、検出する。その具体的な方法は当業者に公知であり、例えば、電気泳動、液体クロマトグラフ（HPLC）、飛行時間型質量分析装置（TOF/MS）を用いることが一般的である。例えば、電気泳動法を用いた場合では、ＰＣＲ産物の電気泳動における移動距離及びピークに基づき、分離検出することができる。【００２６】
具体的には、アクリルアミド系のゲルを用いたゲル電気泳動法では、通常20塩基から1000塩基の鎖長を持つDNA 断片が対象で、この範囲で分離能力が非常によく、1塩基の分解能がある。しかしながら、第一の制限酵素Ｘと第二の制限酵素Ｙ組合せを、夫々SalIとMspI（タカラバイオ社、認識配列CCGG）とした場合、上述のようにメチル化の影響を70%と考えても、第一の制限酵素SalIによる切断約16,500種のDNA 断片が得えられ、これを第二の制限酵素MspIによる切断によって、両末端が、SalI-MspIで囲まれたDNA 断片が約16,500の倍の約33,000種類得られることになる。このような場合、電気泳動の分解能を1baseとしても、約33,000種類以上ものぼるDNA断片を鎖長だけで十分に分離することは困難である。【００２７】
そこで、本発明方法においては、このような多種類のDNA 断片を場合分けする為に、国際公開WO02/48352号パンフレットに開示される高カバー率遺伝子発現プロファイル解析法(HiCEP：High coverage expression profiling analysis)に用いられている方法を利用する。これによって、第一制限酵素Ｘ及び第二制限酵素Ｙで切断されたDNA断片配列の制限酵素認識配列に隣接する2塩基の配列から成る計256通りの組合せでDNA 断片ライブラリを場合分けすることが出来、その結果、約33,000種のDNA断片は、2塩基一つの組合せあたり約129種に分類されることとなる。この約129種は電気泳動にて現実的に分離定量できる数である。又、この方法によれば、仮にCGメチル化率が60%であったとしても、2塩基一つの組合せあたり約172種類に留まり、十分に分離解析が可能である。【００２８】
「アダプター」は、ＰＣＲ反応においてプライマーを結合させるために使用され、使用する制限酵素及びプライマーの構造に種類等に応じて適宜設計することが出来る。安定したＰＣＲ反応を行わせるためには、通常プライマーの長さは３０塩基程度である。【００２９】
「Ｘプライマー」、「Ｘ１プライマー」、「Ｙプライマー」及び「Ｙ１プライマー」は、対象ＲＮＡ配列と出来るだけ一致させないために、１６塩基以上の長さを有することが好ましい。更に、例えば、「バイオラッド実験イラストレイテッド（３）新版  本当にふえるＰＣＲ」中山広樹  著、秀潤社、２００２年、第２版、第４刷に記載されているような、ＰＣＲプライマーとして一般的に要求される条件を満たしている必要がある。また、各プライマーは当業者に公知の一般的なプライマー合成方法（Letsinger et al., Nucleic Acids Research, 20, 1879-1882, 1992; 特開平１１−０８０１８号公報）に従い調製することができる。【００３０】
更に、ＰＣＲ反応後の検出を容易にするために、これらプライマーの少なくともいずれかの末端に、当業者に公知の任意の蛍光物質等の標識物質が結合していることが好ましい。例えば、適当な蛍光物質として、６−カルボキシフルオレッセイン（ＦＡＭ）、４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロー６−カルボキシフルオレッセイン（ＨＥＸ）、ＮＥＤ（アプライドシステムズジャパン社）及び６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（Ｒｏｘ）等を挙げることが出来る。【００３１】
「タグ物質」及び「タグ物質に高親和性を有する物質」とは、互いに高親和性をもって特異的に結合することが可能な結合対を構成する一方の物質を意味する。互いに高親和性をもって特異的に結合するこが可能な結合対であれば使用することが可能である。本発明に使用可能なタグ物質とタグ物質に高親和性を有する物質との組合せの例には、ビオチンとストレプトアビジン、ビオチンとアビジン、FITCとFITC抗体、DIGとanti-DIG及びプロテインAとマウスIgG及びラテックス粒子等が含まれるが、これらに限られるものではない。タグ物質のDNA配列への付加は、当業者に公知の適当な条件により達成することが可能である。タグ物質が付加されている二本鎖ｃＤＮＡ断片を回収する場合には、該タグ物質に高い親和性を有する物質との特異的な反応を利用する。【００３２】
更に、ＨｉＣＥＰ法の実施に際してのＰＣＲ等のその他の条件及び使用する装置等は、当業者に公知の情報、例えば、国際公開WO02/48352号パンフレット中の記載を参照することが出来る。尚、得られた遺伝子発現プロファイルは、当業者に公知の解析ソフトウェア、例えば、ＧｅｎｅＳｃａｎ（登録商標：アプライドバイオシステムズジャパン社）を使用して解析することが出来る。【００３３】
尚、本発明方法でプライマーのミスアニーリングに起因する偽ピークの発生を減少させるためには、Ｘプライマー又はＸ１プライマー、及びＹプライマー又はＹ１プライマーのそれぞれＸアダプター及びＹアダプターへのアニーリングをプライマーのTmMAX+6℃〜TmMAX+14℃の温度で行うことが好ましい。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の技術的範囲を何等限定するものではない。当業者であれば、本明細書の記載に基づき、本発明の技術的範囲を逸脱せずに、多くの変形及び修飾を実施することが可能である。【００３５】
材料として、マウスＥＳ細胞とマウス胸腺細胞からゲノムＤＮＡを抽出、精製した。それぞれ5μｇを用いた。【００３６】
（ａ）ゲノム DNAを認識配列中にCG配列を有し且つメチル化センシティブな第一の制限酵素Ｘで切断する工程：【００３７】
【表１】
2006038416.tif 000002
【００３８】
37℃ 3時間 反応させた。エタノール沈殿法でDNAを濃縮、精製した。乾燥後、20μlのTE溶液でDNAを溶解した。【００３９】
（ｂ）工程（ａ）で切断されたＤＮＡ断片の第一の制限酵素Ｘによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列、Ｘプライマーに相補的な配列を含み、該切断部位の配列に相補的な配列末端とは反対側の末端にタグ物質が付加されたＸアダプターを結合させて、Ｘアダプターが結合しているＤＮＡ断片を得る工程：
Ｘアダプター
１．5’-
Biotin-AAGTATCGTCACGAGGCGTCCTACTGGC - 3’  （配列番号１）
２．5’- TCGAGCCAGTAGGACGCCTCGTGACGATACTT- 3’     （配列番号２）【００４０】
１と２のオリゴマーをアニーリングし、
5’-  Biotin-AAGTATCGTCACGAGGCGTCCTACTGGC -3’
3’- TTCATAGCAGTGCTCCGCAGGATGACCGAGCT -5’
の構造をとる、Ｘアダプター溶液100mMを作製した。【００４１】
【表２】
2006038416.tif 000003
【００４２】
16℃ 6時間 反応させた。エタノール沈殿法でDNAを濃縮、精製した。乾燥後、50μlのTE溶液でDNAを溶解した。【００４３】
（ｃ）工程（ｂ）で得られたＸアダプターが結合しているＤＮＡ断片を該Ｘプライマーに相補的な配列部分を切断しない第二の制限酵素Ｙで切断する工程：【００４４】
【表３】
2006038416.tif 000004
【００４５】
（ｄ）工程（ｃ）で切断されたＸアダプターが結合しているＤＮＡ断片をＸアダプターに付加されたタグ物質を利用して、分離精製する工程：
MspI切断DNA溶液に100μlのストレプトアビジンコート磁気ビーズ溶液（ダイナル社製）を加え懸濁し、Biotinタグ付きＸアダプターＤＮＡ断片を吸着させた。マグネットを利用して、磁気ビーズを集め、上清を捨てた。1xB/W（磁気ビーズ洗浄溶液）500μlを加え、懸濁した。マグネットを利用して、磁気ビーズを集め、上清を捨てた。得られた磁気ビーズを20μlの蒸留水に懸濁させた。【００４６】
（ｅ）工程（ｄ）で精製されたＸアダプターが結合しているＤＮＡ
Ｆｒａｇｍｅｎｔの第二の制限酵素Ｙによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びＹプライマーに相補的な配列を含むＹアダプターを結合させて、両端にＸアダプターとＹアダプターが結合しているＤＮＡ断片を得る工程：
Ｙアダプター
5’-
AATGGCTACACGAACTCGGTTCATGACA - 3’      （配列番号３）
４．5’- CGTGTCATGAACCGAGTTCGTGTAGCCATT- 3’    （配列番号４）【００４７】
３と４のオリゴマーをアニーリングし、
5’-  AATGGCTACACGAACTCGGTTCATGACA -3’
3’-  TTACCGATGTGCTTGAGCCAAGTACTGTGC -5’
の構造をとる、Ｙアダプター溶液、100μMを作製した。【００４８】
【表４】
2006038416.tif 000005
【００４９】
25℃ 6時間 反応させた。マグネットを利用して、磁気ビーズを集め、上清を捨てた。1x B/W（磁気ビーズ洗浄溶液）500μlを加え、懸濁させた。マグネットを利用して、磁気ビーズを集め、上清を捨てた。得られた磁気ビーズを40μlの蒸留水に懸濁させた。【００５０】
（ｆ）工程（ｅ）で得られた両末端がＸアダプターとＹアダプターで囲まれているＤＮＡ断片を鋳型として、ＸプライマーとＹプライマーとからなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行ないＤＮＡ断片を増幅する工程：
Ｘプライマー  （Ｘアダプターに相補的な配列を含む）
５．5’-  AAGTATCGTCACGAGGCGTCCTACTGGCTCGA  -3’      （配列番号５）
Ｙプライマー  （Ｙアダプターに相補的な配列を含む）
６．5’-  AATGGCTACACGAACTCGGTTCATGACACGG  -3’        （配列番号６）
これらＸプライマーとＹプライマーを各100pmol/μl溶液に調整した。【００５１】
【表５】
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【００５２】
【表６】
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【００５３】
ＰＣＲ溶液をＰＣＲ産物精製キットを用いて精製し、未反応Ｘプライマー及びＹプライマーを除去した。回収した、DNA溶液を40μlの蒸留水で溶解した。【００５４】
（ｇ）該Ｘプライマーを基準として３’末端に２塩基配列であるＮ１Ｎ２（Ｎ１及びＮ２は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＸ１プライマーと、該Ｙプライマーを基準として３’末端に２塩基配列であるＮ３Ｎ４（Ｎ３及びＮ４は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＹ１プライマーとからなるプライマーセットを用いて、工程（ｅ）で得られた二本鎖配列を鋳型としてＰＣＲ反応を行う工程：【００５５】
【表７】
2006038416.tif 000008
【００５６】
【表８】
2006038416.tif 000009
【００５７】
以上の合計32本のオリゴマーを合成し、各プライマーを2μM濃度に調整した。各プライマー溶液を2μlずつＸ１プライマーとＹ１プライマーの組合せ表に従ってPCRチューブ256本へそれぞれ分注した。【００５８】
【表９】
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【００５９】
【表１０】
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【００６０】
次いで、ＰＣＲ反応液を各チューブに16μlずつ分注し、PCR装置にセットし、PCRを行なった。【００６１】
【表１１】
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【００６２】
（ｈ）得られたＰＣＲ産物をその鎖長に基づき、分離して検出する工程：
工程（ｇ）で得られたＰＣＲ産物をApplied Biosystems社製ABI PRISM（登録商標） 3100 Genetic Analyzerにて、そのマニュアルに従って、電気泳動と解析を行なった。得られた、各サンプルの各Lotの256チューブを全て解析した結果、全てのサンプルに置いて同じＸプライマーとＹプライマーの組合せに関して、電気泳動波形パターンが異なることを見出した。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明方法により、二種類以上の細胞のゲノム上の非メチル化領域を同時に多数検出し、網羅的に比較し解析することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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