(57)【要約】  本発明は、0〜30℃から選択される一定の環境下で、野生型酵素に比べて優れた酵素活性を発揮しうる変異型サチライシン(subtilisin)を提供することを課題とする。かかる課題は、配列番号１に表されたアミノ酸配列からなる野生型サチライシン（野生型酵素）の、N末から数えて第205番目のアミノ酸が少なくとも変異した変異型サチライシンにより、解決される。さらに、第107番目及び／又は第131番目のアミノ酸が改変された変異型サチライシンも優れた酵素活性を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２に表されたアミノ酸配列のN末から数えて第205番目のアミノ酸の変異を含み、0〜30℃から選択される一定の環境下で、野生型酵素と比較して1.2倍以上の活性を有することを特徴とする変異型サチライシン。
【請求項２】
前記第205番目のアミノ酸の変異が、野生型酵素のイソロイシンから、アラニン、バリン、又はトレオニンのいずれかへの変異である請求の範囲第１項に記載の変異型サチライシン。
【請求項３】
さらに、配列表の配列番号２に表されたアミノ酸配列の第107番目のアミノ酸の変異を含む請求の範囲第１項又は第２項に記載の変異型サチライシン。
【請求項４】
前記第107番目のアミノ酸の変異が、野生型酵素のイソロイシンから、バリンへの変異である請求の範囲第３項に記載の変異型サチライシン。
【請求項５】
さらに、配列表の配列番号２に表されたアミノ酸配列の第131番目のアミノ酸が、野生型酵素のグリシンから、フェニルアラニン、アスパラギン酸、トリプトファン、メチオニン又はアルギニンへの変異を含む請求の範囲第１項〜第４項のいずれか一に記載の変異型サチライシン。
【請求項６】
請求の範囲第１項〜第５項のいずれか一に記載の変異型サチライシンをコードするDNA。
【請求項７】
請求の範囲第６項に記載のDNAを含有する変異型組換えサチライシン発現ベクター。
【請求項８】
請求の範囲第７項に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低温環境下で野生型酵素に比べて優れた酵素活性を発揮しうる変異型酵素及びその製造方法に関する。【０００２】
本出願は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願特願２００４−３５９３３６号からの優先権を請求する。
【背景技術】
【０００３】
酵素活性は、温度、pH、イオン強度、金属イオンの存在等に依存する。特に温度については、一般の化学反応と同様、温度を上げれば反応速度が増すこと、及び酵素がタンパク質であることにより、通常37℃付近で高活性を有する酵素が多い。しかし、酵素が使用される環境によって、高温度環境下で活性を維持する酵素が望まれる場合もあるし、またエネルギー節減や環境保持のために、低温でも活性を維持する酵素が望まれる場合もある。【０００４】
特定の生物活性を有するタンパク質は、生物の属間で多様性を示し、しかも同種生物間においても差異が存在することが知られている。この多様性は、ゲノムレベルでは一層顕著である。同じ生物活性を有するタンパク質をコードする遺伝子間について生物間でみられる多様性は、ある環境下で生物が生存してゆく上で、進化の過程において遺伝子の最適化を反映しているものと考えられる。【０００５】
しかし、天然の生物活性分子は、人工的な環境、特に工業目的で使用される環境に対しては必ずしも最適化されているとはいえない。目的とする使用状況に対して最適な生物活性を有するタンパク質を同定することは、工業上興味深い。例えば、洗剤中に用いる酵素の技術分野では、天然のタンパク質分解酵素、脂質分解酵素、アミラーゼ及びセルラーゼ等の酵素を、人工的な環境下で使用しやすいように有意に改良され、実用化されている。【０００６】
遺伝的多様性を創作する多数の方法、例えば、部位特異的又はランダム変異導入による方法が、文献及び特許出願において提唱及び記載されている（非特許文献１）。【０００７】
サチライシン（subtilisin:枯草菌 Bacillus amiloliquefaciens 由来のアルカリセリンプロテアーゼ）は、工業的にも広く利用されている非常に高活性な微生物菌体外酵素である。サチライシンは275個のアミノ酸からなるタンパク質であり、酵素の安定性に関連する変異については数多く報告されている（非特許文献２）。また、上述のランダム変異導入による方法によりスクリーニングを行い、第131番目のグリシンが変異した変異型サチライシンが、低温環境下でも活性を有することが既に開示されている（非特許文献３、４）。しかしながら、さらに高活性を有するサチライシンの開発が望まれている。【０００８】
【非特許文献１】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, p.5618 (1993)
【非特許文献２】Biochemica et Biophysica Acta 1543, p.203-222 (2000)
【非特許文献３】Applied and Enviromental Microbiology, p.492-495 (1998)
【非特許文献４】Applied and Enviromental Microbiology, p.1410-1415 (2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、低温環境下で野生型酵素に比べて優れた酵素活性を発揮しうる変異型サチライシン(subtilisin)を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、配列番号１に表された塩基配列に基づくアミノ酸配列（配列番号２）からなる野生型サチライシン（野生型酵素）をランダム変異導入により変異させたところ、N末から数えて第205番目のアミノ酸が変異した変異型サチライシンが、0〜30℃から選択される一定の環境下で野生型酵素と比較して1.2倍以上の活性を有することを見出し、本発明を完成した。【００１１】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
１．配列表の配列番号２に表されたアミノ酸配列のN末から数えて第205番目のアミノ酸の変異を含み、0〜30℃から選択される一定の環境下で、野生型酵素と比較して1.2倍以上の活性を有することを特徴とする変異型サチライシン。
２．前記第205番目のアミノ酸の変異が、野生型酵素のイソロイシンから、アラニン、バリン、又はトレオニンのいずれかへの変異である前項１に記載の変異型サチライシン。
３．さらに、配列表の配列番号２に表されたアミノ酸配列の第107番目のアミノ酸の変異を含む前項１又は２に記載の変異型サチライシン。
４．前記第107番目のアミノ酸の変異が、野生型酵素のイソロイシンから、バリンへの変異である前項３に記載の変異型サチライシン。
５．さらに、配列表の配列番号２に表されたアミノ酸配列の第131番目のアミノ酸が、野生型酵素のグリシンから、フェニルアラニン、アスパラギン酸、トリプトファン、メチオニン又はアルギニンへの変異を含む前項１〜４のいずれか一に記載の変異型サチライシン。
６．前項１〜５のいずれか一に記載の変異型サチライシンをコードするDNA。
７．前項６に記載のDNAを含有する変異型組換えサチライシン発現ベクター。
８．前項７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の少なくとも第205番目のアミノ酸が変異した変異型サチライシンは、0〜30℃から選択される一定の環境下で、野生型サチライシンと比較して優れた酵素活性を有する。特に、本発明のN末から数えて第205番目のアミノ酸の変異の他、第107番目及び／又は第131番目のアミノ酸が変異した変異型サチライシンは、4℃での野生型サチライシンに比べて4倍程度高い酵素活性を有する。又、25℃での野生型サチライシンに比べて4.6倍程度高い酵素活性を有する。特筆すべきことは、4℃で１番活性の高い変異型サチライシンは、25℃での野生型サチライシンよりも1.2倍程度高い酵素活性を有する点である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】サチライシン前駆体遺伝子の構成と制限酵素部位を示す図である。
【図２】変異導入の流れの概略を示す図である。
【図３】活性低下体（negative mutant）の作製を示す図である。
【図４】ランダム変異体の作製の流れを示す図である。（実施例１）
【図５ａ】スクリーニングの方法（プレート上でのスクリーニング）を示す図である。
【図５ｂ】スクリーニングの方法（メンブレンフィルターアッセイ）を示す図である。
【図６】活性上昇体（positive mutant）の作製（アミノ酸変異１個を鋳型にして出発した場合）を示す図である。（実施例１）
【図７】変異型サチライシンの枯草菌での発現を示す図である。（実施例２）
【図８】活性測定の結果（低温：４℃）を示す図である。（実施例３）
【図９】活性測定の結果（低温：２５℃）を示す図である。（実施例３）
【図１０】活性温度相関を示す図である。（実施例３）
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の変異型サチライシンの野生型酵素はサチライシン(subtilisin) BPN'である。サチライシンBPN'は、枯草菌体内で前駆体として合成され、プレペプチドの働きにより枯草菌体外へ分泌され、さらにプロペプチドの介助により成熟型となる。これらに対応する遺伝子の構成と制限酵素部位を示す（図１）。実験に用いた遺伝子領域は2050bpの塩基からなり、野生型サチライシ遺伝子のプレペプチド・プロペプチド・成熟領域(mature)は合わせて1152bpの塩基からなり、成熟領域は828bpの塩基からなる。成熟型サチライシンBPN'は、配列表の配列番号２に表されるアミノ酸配列からなり、アミノ酸数が275個よりなるタンパク質である。本明細書において、野生型酵素とは該成熟型のサチライシンBPN'（以下、単に「サチライシン」ともいう。）をいう。【００１５】
本発明の変異型サチライシンは、配列番号２に表されたアミノ酸配列のN末から数えて第205番目のアミノ酸の変異を含み、0〜30℃の一定の環境下で野生型酵素と比較して1.2倍以上の活性を有することを特徴とする。0〜30℃から選択される一定の環境下で野生型酵素と比較して1.2倍以上の活性を有するとは、例えば4℃又は25℃の環境下で測定した場合に、野生型酵素と比較して1.2倍以上の活性を有することである。また、野生型酵素と比較して1.2倍以上の活性とは、サチライシン活性を測定しうる合成基質を用いて測定した活性が1.2倍以上であることをいい、例えばシグマ社のAAPF-pNA試薬を用いて通常行われる条件にて測定した場合をいう。また、1.2倍以上の活性とは、同じ条件下で測定した場合の野生型酵素の酵素活性と比較した場合をいい、2.5倍以上、より好適には3倍以上の活性を有するものをいう。このような性質を有するサチライシンであれば、その他の部位で変異を含むものであっても良いし、またどのような製法で生産された変異型サチライシンであっても良い。【００１６】
前記第205番目のアミノ酸の変異は、上記条件下で野生型サチライシンと比較して1.2倍以上の活性を有するものであれば、どのようなアミノ酸の変異でも良いが、具体的にはイソロイシンから、アラニン、バリン、トレオニンへの変異であるのが好適である。【００１７】
さらに、本発明の変異型サチライシンは、上記条件下で野生型サチライシンと比較して1.2倍以上の活性を有するものであれば、前記第205番目のアミノ酸の変異の他のいずれの部位でアミノ酸が変異しているものであっても良い。特に第107番目及び／又は第131番目のアミノ酸が変異しているものが好適である。本発明の条件を満たすものであれば、これらの変異は、どのようなアミノ酸の変異であっても良い。具体的には、第107番目のアミノ酸の変異が、野生型サチライシンのイソロイシンから、バリンへの変異であるのが好適である。また、第131番目のアミノ酸が、野生型サチライシンのグリシンから、フェニルアラニン、アスパラギン酸、トリプトファン、メチオニン又はアルギニンへの変異であるのが好適である。【００１８】
本発明は、これらの変異型サチライシンをコードするDNAにも及ぶ。本明細書における野生型サチライシンをコードするDNAは、配列表の配列番号１に表された塩基配列からなる。本発明において、変異型サチライシンをコードするDNAとは、上記変異型サチライシンのアミノ酸の変異に伴う塩基配列からなるDNAのほか、上記条件下で野生型サチライシンと比較して1.2倍以上の活性を有する変異型サチライシンを構成しうるあらゆるDNAも包含される。具体的には、次の塩基配列も含まれる。
１）上記変異型サチライシンのアミノ酸の変異に伴う塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイスし、かつ野生型サチライシンと比較して1.2倍以上の活性を有するタンパク質をコードするDNA。ここにおいてストリンジェントな条件とは、60℃、6×SSC緩衝液、5×デンハート溶液、100mMリン酸緩衝液、50mMPIPES、100mMリン酸緩衝液の条件をいう。
２）遺伝子コドン縮重による塩基の相違を含み、上記変異型サチライシン又は上記１）に示されるタンパク質をコードするDNA。【００１９】
本発明の変異型サチライシンは、上述の如くどのような製法で生産された変異型サチライシンであっても良い。例えば、進化分子工学的手法を用いて、常温に最適温度を持つサチライシンを低温適応化させる方法を用いて、スクリーニングしたものであっても良い。例えば、ランダム変異導入法により野生型サチライシンに変異導入し、変異型サチライシンをスクリーニングする工程を２回繰り返す方法が挙げられる。ランダム変異導入法として、DNA ポリメラーゼのDNA複製効率を人為的に低下させたエラープローン(error prone) PCR法（非特許文献１） を用いることができる。例えば、１回目は野生型のサチライシン遺伝子を鋳型として変異導入を行い、野生型よりも活性の低い活性低下変異体(negative mutant)をスクリーニングし、２回目は、１回目に得られた活性低下体遺伝子を鋳型として変異導入を行い、野生型よりも活性の高い活性上昇変異体(positive mutant)をスクリーニングにより選択し、得ることができる（図２）。例えば、活性低下ライブラリーは、サチライシンBPN'本体のみに変異を有するよう作製し、活性上昇ライブラリーは、プロペプチドとサチライシン本体に変異を有するよう作製することができる（図２）。
本発明の変異型サチライシンは、上記スクリーニングにより得られた変異型サチライシンのDNAを遺伝子工学的手法により発現させて得た組換変異型サチライシンであっても良い。さらに、タンパク質工学の手法により、人為的にアミノ酸を変異させて得た変異型サチライシンであっても良い。これらの変異型サチライシンの製造方法は、公知の手段を用いて生産することができる。【００２０】
さらに本発明は、本発明の変異型サチライシンを遺伝子工学的手法により発現させて得る場合の変異型サチライシン発現ベクター及び該発現ベクターを含む宿主細胞にも及ぶ。
【実施例】
【００２１】
以下に、本発明の理解をより確実にするために、変異型サチライシンのスクリーニング方法及びタンパク質工学的手法による作製方法を実施例を示して説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではないことはいうまでもない。【００２２】
（実施例１）変異型サチライシンのスクリーニング
１）活性低下変異体(negative mutant)の獲得 （図３）
転写制御配列・30残基のプレペプチド・77残基のプロペプチド・275残基の成熟領域を含む野生型サチライシン遺伝子をpUC18のマルチクローニングサイトに組み込んだものを野生型サチライシンプラスミド（pUΔS）とした。
野生型サチライシン遺伝子内に制限酵素サイトが含まれているもの（J. Biochem., 114, 906 (1993)を改変）を１回目の変異導入（エラープローンPCR）を行う際の鋳型とした。鋳型プラスミドの抽出は、Mag Extracter Kit（東洋紡社製）を用いた。
PCR用プライマーは以下を用いた。
M13 RVセンスプライマー      ：5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'（配列番号３）
M13 M4アンチセンスプライマー：5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'（配列番号４）【００２３】
１回目のエラープローンPCRは次の溶液条件で行った。
(1)  10×LA PCR バッファー２ (Mg2+ フリー) (タカラ製)            10μL
(2)  25mM MgCl2  (タカラ製)                                      30μL
(3)  5mM MnCl2                                                    1μL
(4)  100mM dATP, dGTP                                           0.2μL
(5)  100mM dTTP, dCTP                                             1μL
(6)  20μM M13 RV センスプライマー (配列番号３)                 2.5μL
(7)  20μM M13 M4 アンチセンスプライマー (配列番号４)           2.5μL
(8)  25ng/μL 野生型サチライシン遺伝子(pUΔS)                   0.4μL
(9)  Nuclease-Free Water (プロメガ社製)                          51μL
(10) LA TaqTM (5U/μL)(Mg2+ フリー) (タカラ製)                    1μL
(1)〜(10)  計100.8μL【００２４】
上記(1)〜(9)を混合した溶液を90℃で4分間加熱後、(10)を1μL添加し、94℃で30秒間・55℃で30秒間・72℃で2分間を40サイクルPCR反応させた。その後、72℃で10分間、15℃で10分間反応を行い、PCR反応を終了させた。本明細書の実施例では、PCR反応はPROGRAM TEMP CONTROL SYSTEM PC701 (ASTEC社製)を用いて行った。
上記条件により、平均アミノ酸変異数が1.6個になるように設定した。得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動（1%アガロース）に流して回収し、WizardTM SV Gel and PCR Clean-UP Systemで精製した。【００２５】
その後、精製して得た増幅産物を、制限酵素Sph I（タカラ製）及びBgl II（東洋紡社製）で切断し、再びアガロースゲル電気泳動（1%アガロース）に流し、制限酵素処理後の変異型サチライシンの遺伝子断片を回収した。このDNA断片はサチライシン遺伝子の本体（成熟領域）である。ゆえに、活性低下体作製の際のエラープローンPCRは、サチライシン遺伝子の本体（成熟領域）のみにかけたことになる（図２）。【００２６】
２）活性低下体のスクリーニング（図３）
野生型サチライシンプラスミドを制限酵素Sph I（タカラ製）及びBgl II（東洋紡製）で切断し、上記エラープローンPCR法により得られた変異サチライシンの断片を挿入し、ライゲーションキット（ニッポンジーン社製）を用いて連結させた。その変異型サチライシンプラスミドライブラリーを用いて、大腸菌JM109を3%スキムミルクプレート（アンピシリン50μg/mL含有のスキムミルク固体培地(Difco社製)、1%ラクトース、1%酵母抽出液、1% 寒天）（以下単に「スキムミルクプレート」といい、特記しない場合は、アンピシリン50μg/mLを含む） (Appl. Microbiol. Biotechnol., 41, 239 (1994))上で形質転換させた。大腸菌の培養は、Terrific broth（A液900ml：ポリペプトン12g, 酵母抽出液24g, グリセロール4mL＋α, B液100mL:0.17M KH2PO4,0.72M K2HPO4）を用いた（図４）。【００２７】
その後、37℃で16時間インキュベートすることでコロニーを形成させ、さらに4℃で１週間インキュベートすることで変異型サチライシン群を発現させた（1232クローン）。大腸菌で発現したサチライシンのスキムミルク分解活性により、3%スキムミルクプレート上で、コロニー周辺のスキムミルクが分解されて透明領域（クリアゾーン）が形成された（図５ａ）。【００２８】
１回目の変異導入で得られた変異型サチライシン群からクリアゾーンを形成しない、若しくはクリアゾーン形成が小さい活性の低下した変異体を選択した（99クローン）。その後、PVDF（Polyvinylidene difluoride）メンブレンフィルター (ImmobilonTM) （以下、単に「フィルター」という。）と3%スキムミルクプレートを用いてさらにスクリーニングを行った（図５ｂ）。菌体は膜を通りぬけられないが、サチライシンは通り抜けが可能である。まず、3%スキムミルクプレート上に上述のフィルターを置き、菌体をストリークしてフィルター上に植菌し、37℃で16時間インキュベートした。その後フィルターをはずし、別の3%スキムミルクプレート上に移し、4℃で１週間静置した。その後、フィルター越しにクリアゾーンが僅かにしか認められなかった変異体、すなわち、さらに活性低下を生じたクローンを選択し、活性低下変異体とした（72クローン）。【００２９】
得られたクローンのDNA塩基配列を、ABI PRISMTM を用いてジデオキシ法に基づき調べた。得られたDNA塩基配列をもとに、アミノ酸変異数が１個、２個及び３個以上のグループに分類した。【００３０】
３）活性上昇変異体(positive mutant)の獲得（図６）
上記２）の工程で得た活性低下変異体のうち、アミノ酸変異数が１個のクローン（23クローン）及び２個のクローン（25クローン）を２回目の変異導入（エラープローンPCR）を行う際の鋳型とした。各クローンが等モルずつ存在するように鋳型プラスミドを調整した。
２回目のエラープローンPCRは、以下の溶液を用いて行った。【００３１】
A:アミノ酸変異数が１個のクローンの場合
(1)  10×LA PCR バッファー２ (Mg2+ フリー) (タカラ製)                 10μL
(2)  25mM MgCl2  (タカラ製)                                           30μL
(3)  5mM MnCl2                                                       0.5μL
(4)  100mM dATP, dGTP, dTTP, dCTP                                      1μL
(5)  20μM M13 RV プライマー（センス）（配列番号３）                 2.5μL
(6)  20μM M13 M4 プライマー（アンチセンス）（配列番号４）           2.5μL
(7)  189.88ng/μL  アミノ酸変異１個サチライシン遺伝子（100ng）      0.53μL
(8)  Nuclease-Free Water  (プロメガ社製)                           49.77μL
(9)  LA TaqTM （5U/μL）(Mg2+ フリー) (タカラ製)                       1μL
(1)〜(9)  計100.8μL【００３２】
B:アミノ酸変異が２個のクローンの場合
(1)  10×LA PCR バッファー２ (Mg2+ フリー) (タカラ製)                 10μL
(2)  25mM MgCl2 (タカラ製)                                            30μL
(3)  5mM MnCl2                                                       0.5μL
(4)  100mM dATP, dGTP, dTTP, dCTP                                      1μL
(5)  20μM M13 RV  センスプライマー  （配列番号３）                  2.5μL
(6)  20μM M13 M4  アンチセンスプライマー  （配列番号４）            2.5μL
(7)  167.11ng/μL アミノ酸変異２個サチライシン遺伝子（100ng）       0.60μL
(8)  Nuclease-Free Water  (プロメガ製)                             49.70μL
(9)  LA TaqTM （5U/μL）(Mg2+ フリー) (タカラ製)                       1μL
(1)〜(9)  計100.8μL【００３３】
各々について、上記(1)〜(8)を混合した溶液を90℃で4分間加熱後、(9)を1μL添加し、94℃で30秒間・47℃で30秒間・72℃で2分30秒間を40サイクルPCR反応させた。その後、72℃で10分間、15℃で10分間反応を行い、PCR反応を終了させた。
上記条件により、平均アミノ酸変異数が２個になるように設定した。得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動（1％アガロース）に流して回収し、WizardTM SV Gel and PCR Clean-UP Systemで精製した。
その後、精製して得た増幅産物を、制限酵素Sac I（東洋紡社製）及びHind III（東洋紡社製）を用いて切断し、再びアガロースゲル電気泳動（1％アガロース）に流して、制限酵素処理後の変異型サチライシン遺伝子断片を回収した。このDNA断片はサチライシン遺伝子のプロペプチドとサチライシン本体（成熟領域）である。ゆえに、活性上昇体作製の際のエラープローンPCRは、プロペプチドとサチライシン本体（成熟領域）のみにかけたことになる（図２）。【００３４】
４）活性上昇体のスクリーニング（図６）
A:アミノ酸変異１個を鋳型にした場合
プロペプチドとサチライシン本体（成熟領域）に、エラープローンPCR処理をして得た変異型サチライシン遺伝子断片をインサートとし、野生型サチライシンPUC18プラスミドを制限酵素Sac I（東洋紡製）及びHind III（東洋紡製）で切断したものをベクターとし、ライゲーションキットを用いて連結させたものを変異型サチライシンプラスミドライブラリー（「pUΔS変異体ライブラリー」）とした。該変異型サチライシンプラスミドライブラリーを用いて5%スキムミルクプレート上で大腸菌JM109を形質転換させた。【００３５】
上記形質転換した大腸菌を、37℃で16時間インキュベートすることでコロニーを形成させ、さらに4℃で１週間インキュベートすることで変異型サチライシン群を発現させた（9696クローン）。大腸菌で発現したサチライシンのスキムミルク分解活性により、プレート上でコロニー周辺のスキムミルクが分解されてクリアゾーンが形成された。２回目の変異導入で得られた変異型サチライシン群からクリアゾーンを形成し、活性が向上（復元）したクローン（A群・B群・C群・D群）をスクリーニングし、変異型サチライシンを得た（439クローン）。【００３６】
その後、フィルターと7%スキムミルクプレートを用い、得られたクローンのうちフィルター越しにクリアゾーンが見られるクローンを選択した（90クローン）。さらに、これらのクローンについて7%スキムミルクプレートとフィルターでスクリーニングし、コントロールとした野生型サチライシンのクリアゾーンより大きいクリアゾーンが得られた11クローンを選択し、活性上昇変異体とした。この11クローンについて、ABI PRISMTM を用いてDNA塩基配列を調べた。【００３７】
B:アミノ酸変異２個を鋳型にした場合
アミノ酸変異１個を鋳型にした場合と同様の操作により、最終的に野生型サチライシンのクリアゾーンより大きいクローン（E群・F群）を34選択した。【００３８】
（実施例２）変異型サチライシンの発現（枯草菌(Bacillus subtilis)での発現）
実施例１の活性上昇変異体からなる変異型サチライシンを大腸菌で発現させたが、これらの変異型サチライシンが枯草菌でも発現可能か否かを確認した。枯草菌で発現させるために、大腸菌及び枯草菌用のシャトルベクターpHY300PLK (Jpn. J. Genet., 60, 235 (1985))を用いた（図７）。【００３９】
実施例１の活性上昇変異体11クローンをテトラサイクリンを含むTerrific brothで培養し、その後ミニプレップ法（Mag Extracter Kit：東洋紡製）によりプラスミドを抽出した。抽出したpHY300PLKプラスミドベクター（4.87kb）を制限酵素Eco RI(東洋紡製)及びHind III(東洋紡製)で切断し、回収した変異型サチライシン遺伝子断片（高活性サチライシンBPN'遺伝子）をインサートとし、pHY300PLKプラスミドベクターを制限酵素Eco RI(東洋紡社製)及びHind III(東洋紡社製)で切断し、ライゲーションキットを用いて連結させた。該プラスミドを用いて大腸菌JM109を形質転換させ、得られたコロニーからミニプレップ法によりプラスミド（「pHΔS」という）を得た。【００４０】
枯草菌のプラスミドによる形質転換効率は、ダイマー化したプラスミドの含有量に大きく依存するため (Jpn. J. Genet., 60, 235 (1985))、プラスミドをダイマー化させるrecA+株である大腸菌JM101を用いて形質転換を行った。その後、大腸菌JM101から得られたプラスミド（「pHΔΔS」という）を用いて枯草菌UOT0999株を形質転換させた。【００４１】
枯草菌形質転換体を得るための溶液条件は以下の通りである (１Sample分)。
（Ｃ１溶液） 
(1)  10×SP                                             500μL
（K2HPO4 8.4g, KH2PO4 3.6g, (NH4)SO4 1.2g, 
クエン酸ソーダ・二水和物 0.6g, H2O 46.2mL ）
(2)  1M MgSO4                                            25μL 
(3)  1M グルコース                                      125μL
(4)  5％  カザミノ酸(Casamino Acid)                      20μL
(5)  10mg/mL  His（ヒスチジン）                          25μL
(6)  10mg/mL  Trp（トリプトファン）                      25μL
(7)  10mg/mL  Leu（ロイシン）                           250μL
(8)  滅菌水                                            4030μL
(1)〜(8)   計 5000μL【００４２】
（Ｃ２溶液）
(1)  10×SP                                              50μL
（K2HPO4  8.4g, KH2PO4  3.6g, (NH4)SO4  1.2g, 
クエン酸ソーダ・二水和物 0.6g, H2O 46.2mL ）
(2)  1M MgSO4                                            2.5μL
(3)  1M グルコース                                      12.5μL
(4)  5％  カザミノ酸(Casamino Acid)                        1μL 
(5)  10mg/mL  His（ヒスチジン）                         0.25μL
(6)  10mg/mL  Trp（トリプトファン）                     0.25μL
(7)  10mg/mL  Leu（ロイシン）                            2.5μL
(8)  滅菌水                                              431μL
(1)〜(8)   計 500μL【００４３】
Ｃ１溶液5mLに100μLの枯草菌UOT0999株の培養液を加え、37℃で６時間振盪培養した。その後、超遠心分離により菌体を回収し、菌体懸濁液とした。該菌体懸濁液に、500μLのＣ２溶液と大腸菌JM101から得られたプラスミド（pHΔΔS）を約1μg加え、37℃で１時間振盪培養した。
次に500μLのLB溶液培地（1Lあたり：ポリペプトン10g、酵母抽出液5g、NaCl 10g）を加え、37℃で１時間振盪培養した。最後に超遠心分離により菌体の回収を行い、テトラサイクリン (12.5μg/mL)を含む5％スキムミルクプレートに播種し、37℃で１晩インキュベートした。クリアゾーンを形成したものをサチライシンが発現したものとして選択した。【００４４】
その結果、アミノ酸変異１個を鋳型にした場合、11クローン中6クローンでクリアゾーンを形成した。アミノ酸変異２個を鋳型にした場合は、34クローン中27クローンがクリアゾーンを形成した。前記6クローン及び27クローンについて、96穴プレート (BECTON DICKINSON社製) を用いて、テトラサイクリン(12.5μg/mL) を含むLB液体培地で、37℃、24時間、BIO-SHAKER (TAITEC社製) で振盪培養し、クローンを過剰発現させた。その後、超遠心分離により培養上清を得、培養上清中の枯草菌から分泌された未精製のサチライシンを得た。この培養上清を用いて活性測定を行った。【００４５】
（実施例３）変異型サチライシンの配列の確認
実施例２で得られた変異型サチライシンのDNA塩基配列は、ABI PRISMTMを用いて確認した。
反応溶液条件は以下の通りである。
(1)  Big-Dye terminator premix (Applied Biosystems社)                     2μL
(2)  5×Buffer(1M MgCl2 0.1mL, 1M Tris-HCl(pH=8.0) 4.0mL, 滅菌水 45.9mL)
6μL
(3)  鋳型 DNA*                                                           10μL
(4)  プライマー (5pmol/μL) （配列番号５〜１０）**                      0.5μL
(5)  5% ジメチルスルフォキシド (DMSO)                                   0.5μL
(6)  Nuclease-Free Water  (Promega社製)                                   1μL
(1)〜(6)                      計  20μL
注)*アミノ酸変異１個を鋳型にした場合では、枯草菌で発現した６クローンを、アミノ酸変異２個を鋳型にした場合では、活性測定の結果、活性が上昇した２クローンを鋳型DNA (Template DNA)として用いた。
注)**サチライシンのDNA塩基配列を３つに分けてDNA塩基配列を読んだ。この際、基本的にはセンス鎖を読むことにし、Sub1-RV（配列番号５）・Sub2-RV（配列番号６）・Sub3-RV（配列番号７）の３つのプライマ−を用いた（図１）。このセンスプライマ−では読めない場合に、Sub1-FW（配列番号８）、Sub2-FW（配列番号９）、Sub3-FW（配列番号１０）の３つのプライマー（図１）でアンチセンス鎖を読んだ。【００４６】
以下の６種類のプライマーを使用した。各々RVプライマーはセンスプライマーであり、FWプライマーはアンチセンスプライマーである。
Sub1-RV ：5'-CTGTCTATTGGTTATTCTGC-3'    （配列番号５）
Sub2-RV ：5'-TTACGGCGTATCACAAATTA-3'    （配列番号６）
Sub3-RV ：5'-GTTGATAAAGCCGTTGCATC-3'    （配列番号７）
Sub1-FW ：5'-ATTGAACATGCGGAGGAAGA-3'    （配列番号８）
Sub2-FW ：5'-ATGACAGAAGGGTATTTACC-3'    （配列番号９）
Sub3-FW ：5'-ATACCGCTGTCGATAACCGC-3'    （配列番号１０）【００４７】
(1)〜(6)を混合した溶液を96℃で1分間加熱後、96℃で10秒間・50℃で5秒間・60℃で4分間を30サイクルPCR反応させた。その後、4℃で10分間、15度で1分間反応を行い、PCR反応を終了させた。得られたPCR産物をイソプロパノ−ル沈殿により精製した。その後、真空乾燥したPCR産物に20μLのTSR（Template Suppression Reagent）(Applied Biosystems社製) を加え、90℃で2分間加熱し、氷上で急冷した。
そのPCR産物をABI PRISMTM にかけ、DNA塩基配列の決定を行った。DNA塩基配列決定後に、その配列をもとにしてアミノ酸配列に翻訳した。各アミノ酸は、成熟型サチライシンのN末端方向から数えて1番目のアミノ酸からC末端方向へ正の番号をつけた。プレペプチド、プロペプチドには、成熟型サチライシンの1つ前のアミノ酸からN末端方向へ負の番号をつけた。例えば、S221Cとは、成熟型サチライシン（サチライシン本体）の221番目のアミノ酸がセリンからシステインに置き換わった変異体であることを示す。
結果を表１及び表２に示す。表１は、アミノ酸変異１個を鋳型にした場合の活性上昇変異体（プレートスクリーニングで高活性体として選択され、枯草菌で発現した６クローン）のDNA塩基配列決定後判明したアミノ酸変異部位の結果を示す。なお、これら６クローンの活性測定の結果、活性が上昇した変異体はC-19であった。表２は、アミノ酸変異２個を鋳型にした場合の活性上昇変異体（枯草菌で発現し、活性測定の結果、活性が上昇した２クローン）のDNA塩基配列決定後判明したアミノ酸変異部位の結果を示す。
【表１】
2006064721.tif 000002
【表２】
2006064721.tif 000003
【００４８】
（実験例１）活性測定
得られた変異型サチライシンの活性測定は低温（4℃）と常温（25℃）で行った。
サチライシン活性測定用の基質として、合成基質N-succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilide (AAPF-pNA)（SIGMA社製）を用いた。酵素反応の測定機器は、可視紫外吸光光度計であるプレートリーダー（Molecular Devices社製）を用いた。AAPF-pNAの加水分解により生じた p-ニトロアニリン(pNA)による吸光変化を405nmの吸収波長で追跡し、酵素反応初速度を求めた。AAPF-pNA(25μM、50μM, 100μM, 200μM, 300μMの計5点) は、測定用緩衝液 (0.1M Tris-HCl(pH 8.6)、2mM無水CaCl2、0.0005% Tween 20(10%) (PIERCE社製)) (J. Biotechnol., 66, 157(1998))に溶かして調製した。測定用緩衝液は、0.1M Tris-HCl(pH 8.6)、2mM無水CaCl2 を含む溶液をストックとして準備し、96穴プレート(SUMILON社製) にタンパク質が非特異的に吸着することを防ぐ目的としてTween 20 (10%)を加え、用時調製した。サチライシン溶液やAAPF-pNA溶液の希釈にはすべて測定用緩衝液を用いた。【００４９】
測定用緩衝液10μL、サチライシン溶液30μLを96穴プレートに加え、最後にAAPF-pNA溶液160μLを加えて酵素反応を開始させた。その後、該96穴プレートをすぐにプレートリーダーにセットし、10秒間攪拌を行った後に吸光度測定を開始した。測定時間は10分間で、9秒おきに吸光度を測定し、測定するごとに2秒間攪拌を行った。縦軸に吸光度（OD）・横軸に時間（秒）をとると比例関係が得られ、傾きが最大になるものをこの反応の初速度（mOD/sec）とした（測定・解析ソフト：SOFT max PRO ver.3.1 (Molecular Devices社製) ）。一方、この酵素反応の測定と同時に、[E]0（初期酵素濃度）を求めた。この際、サチライシンに特異的な阻害剤であるStreptomyces subtilisin inhibitor (SSI) (J. Biochem., 114, 906 (1993))を用いて活性部位滴定を行った（SSI は２量体なので実行濃度は[SSI]×2である。SSIの濃度は pH 7.0 で吸光度A280 (1mg.ml) = 0.796 より換算した）。SSI溶液の調製には、測定用緩衝溶液を用いた。サチライシンとSSIを反応させる時間として、低温（4℃）で1時間、常温（25℃）で40分を要した。【００５０】
（データ解析）
活性測定後、以下の酵素反応のスキームに従い、得られた初速度をもとにMichaelis-Menten式を描き、Hanes plotで直線回帰を行い、基質解離定数Kmと最大速度Vmaxを求めた。
【数１】
2006064721.tif 000004
【数２】
2006064721.tif 000005
【数３】
2006064721.tif 000006
また代謝回転数kcatは、次式により求めた。
【数４】
2006064721.tif 000007
これにより各変異体の酵素活性の指標となるkcat/Kmが求められ、野生型と比較した。本研究では、野生型のkcat/Kmに対する変異体のkcat/Kmの相対比をkcat/Kmの比活性と定義した。「活性が高い」とは、kcat/Kmの比活性が高いことを言う。つまり、kcatが大きく（代謝回転数が大きく）、Kmが小さい（基質解離定数が小さい）ほど活性が上昇しているといえる。【００５１】
ランダム変異導入により得られた変異体の活性測定の結果を示す（表３、表４、図８、図９）。
アミノ酸変異１個を鋳型にした場合、変異体C-19が野生型に比べて4℃で1.86倍、25℃で1.86倍の活性上昇を示した。この変異体のアミノ酸変異はI205Tであった。一方、アミノ酸変異２個を鋳型にした場合、変異体E-2と変異体E-8が野生型に比べて4℃で1.27倍、25℃で1.48倍の活性上昇を示した。この変異体のアミノ酸変異はともにI107Vであった。【００５２】
（実施例４）変異型サチライシンの構築（部位指定変異導入の方法）
１）１アミノ酸変異の導入
アミノ酸変異１個を鋳型とした場合に活性上昇を示した205番目の部位に注目し、イソロイシンからランダムにアミノ酸置換（１アミノ酸変異の導入）を行った。その結果、I205G 、I205A 、I205V、I205S、I205P、I205D、I205Hを作製する事ができた。また、アミノ酸変異２個を鋳型にした場合に活性上昇を示した107番目の部位に注目し、文献（Protein Eng.1.319.(1987)）（Biochemistry.33.221.(1994)）(Biochemistry.32.8994.(1993)を参考にして、活性上昇に効くと思われるI107G、I107Aを作製した。【００５３】
まず、変異導入箇所を含む２つのDNA断片（A鎖（5'末端から変異部位まで）、B鎖（変異部位から3'末端まで））を増幅するために１回目のPCR反応を行った。
アミノ酸変異導入用に以下のプライマーを設計し、使用した。各々UPPERプライマーはセンスプライマーであり、LOWERプライマーはアンチセンスプライマーである。ランダム置換用のプライマ−（配列番号２５）（配列番号２６）には、205番目のアミノ酸に対応する部位の塩基をNNS（N:A,T,G,Cのいずれか）(S:C,Gのいずれか)とし、ランダム置換が起こるようにした。このプライマ−を用いてランダム置換がうまくできなかった変異体（I205G 、I205A 、I205V）は、各１アミノ酸変異を含むプライマ−を用意して個別に作製した。【００５４】
M13 RV（センスプライマー）      ：5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'（配列番号３）
M13 M4（アンチセンスプライマー）：5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'
（配列番号４）
SUB-I107V-UPPER：5'-AGCTGGGTCATTAACGGAATC-3'      （配列番号１１）
SUB-I107V-LOWER：5'-GTTAATGACCCAGCTGTATTG-3'      （配列番号１２）
SUB-I107A-UPPER：5'-AGCTGGGCCATTAACGGAATC-3'      （配列番号１３）
SUB-I107A-LOWER：5'-GTTAATGGCCCAGCTGTATTG-3'      （配列番号１４）
SUB-G131F-UPPER：5'-CCTTCTTTTTCTGCTGCTTTA-3'      （配列番号１５）
SUB-G131F-LOWER：5'-AGCAGAAAAAGAAGGTCCGCC-3'  （配列番号１６）
SUB-I205G-UPPER：5'-GTATCTGGCCAAAGCACGCTT-3'      （配列番号１７）
SUB-I205G-LOWER：5'-GCTTTGGCCAGATACGCCAGG-3'  （配列番号１８）
SUB-I205A-UPPER：5'-GTATCTGCCCAAAGCACGCTT-3'      （配列番号１９）
SUB-I205A-LOWER：5'-GCTTTGGGCAGATACGCCAGG-3'  （配列番号２０）
SUB-I205V-UPPER：5'-GTATCTGTCCAAAGCACGCTT-3'      （配列番号２１）
SUB-I205V-LOWER：5'-GCTTTGGACAGATACGCCAGG-3'  （配列番号２２）
SUB-I205T-UPPER：5'-GTATCTACCCAAAGCACGCTT-3'      （配列番号２３）
SUB-I205T-LOWER：5'-GCTTTGGGTAGATACGCCAGG-3'      （配列番号２４）
SUB-I205ALL-UPPER：5'-GTATCTNNSCAAAGCACGCTT-3'    （配列番号２５）
SUB-I205ALL-LOWER：5'-GCTTTGSNNAGATACGCCAGG-3'  （配列番号２６）【００５５】
（A鎖の作製）（5'末端から変異部位まで）
１回目のPCR反応の溶液条件は以下の通りである。
(1)  10×LA PCR Buffer2 (Mg2+ フリー)（タカラ製）                 5μL
(2)  dNTP 混合液 (各2.5mM) （タカラ製）                           8μL
(3)  25mM MgCl2 (最終 2.5mM) （タカラ製）                         5μL
(4)  野生型サチライシン遺伝子（pUΔS）（90ng）                    XμL***
(5)  100μM M13 RVプライマー（配列番号３）                      0.5μL
(6)  100μM SUB-I107X、I205X又はG131F-LOWERプライマー           0.5μL
（配列番号１２、１４、２０、２２、２４、２６又は１６）
(7)  Nuclease-Free Water (Promega社製)                       (30.5-X)μL
(8)  LA TaqTM （5U/μL） (Mg2+ フリー)（タカラ製）              0.5μL
注)***  野生型サチライシン遺伝子が90ngになる量をXμLとした。【００５６】
（B鎖の作製）（変異部位から3'末端まで）
以下に示す(5)(6)以外は、上記A鎖作製の溶液条件と同様とした。
(5)  100μM SUB-I107X、I205X又はG131F-UPPERプライマー            0.5μL
（配列番号１１、１３、１９、２１、２３、２５又は１５）
(6)  100μM M13 M4 （アンチセンスプライマー）（配列番号４）        0.5μL【００５７】
各々(1)〜(7)を混合した溶液を94℃で4分間加熱後、(8)を0.5μL添加し、94℃で30秒間・55℃で30秒間・72℃で30秒から2分間を30サイクルPCR反応させた。その後、72℃で10分間、15℃で1分間反応を行い、PCR反応を終了させた。
得られたPCR産物（A鎖、B鎖）をアガロースゲル電気泳動（1％アガロース）に流して回収し、WizardTM SV Gel and PCR Clean-UP Systemで精製した。
次に、１回目のPCR反応によって得られたDNA断片（A鎖、B鎖）を再会合させ、それを鋳型とし、アミノ酸変異を含む変異型サチライシンの遺伝子を増幅させるために２回目のPCRを行った。【００５８】
２回目のPCRの溶液条件は以下の通りである。
(1)  10×LA PCR Buffer2 (Mg2+ フリー) (タカラ製)                  5μL
(2)  dNTP  混合液 (各2.5mM) (タカラ製)                            8μL
(3)  25mM MgCl2   (最終 2.5mM) (タカラ製)                         5μL
(4)  １回目のPCR反応によって得られたDNA断片（A鎖）              2.5μL
(5)  １回目のPCR反応によって得られたDNA断片（B鎖）              2.5μL
(6)  Nuclease-Free Water (Promega社製)                         26.5μL
(7)  LA TaqTM （5U/μL） (Mg2+ フリー) (タカラ製)               0.5μL【００５９】
(1)〜(6)を混合した溶液を94℃で3分間加熱後、(7)を0.5μL添加し、94℃で30秒間・50℃で30秒間・72℃で2分間を7サイクルPCR反応させた。引き続きアミノ酸変異を含む変異型サチライシンの遺伝子をさらに増幅させるために３回目のPCR反応を行った。２回目のPCR反応溶液を25℃で10秒間置いた後、M13 RV プライマー（配列番号３） (100μM)とM13 M4 プライマー（配列番号４） (100μM)とを1.25μLずつ加えた。そして、94℃で1分間加熱し、94℃で30秒間・55℃で30秒間・72℃で2分間を25サイクルPCR反応させた。その後、72℃で10分間、15℃で10秒間反応を行い、PCR反応を終了させた。
得られたPCR産物をインサートとし、この後の操作は、サチライシンの発現の欄と同様に操作した。また、ABI PRISMTMによりDNA塩基配列を調べ、１アミノ酸変異導入がされていることを確認した。【００６０】
１アミノ酸変異の導入により得られた変異体の活性測定の結果を示す（表３、表４、図８、図９）。
205番目の部位に注目したランダムアミノ酸置換（１アミノ酸変異の導入）において、野生型に比べて活性が上昇した変異体は、I205A 、I205V、I205Sであった。それぞれ４℃で、1.24倍、1.20倍、1.12倍、25℃で1.26倍、1.22倍、1.08倍の活性上昇を示した。I205G、I205H 、I205P、I205Dに関しては、サチライシンの発現量が少なく、うまく活性測定を行うことができなかった。この変異体に関して、スキムミルクプレートを用いたクリアゾーン形成を試みたが、野生型に比べると極端に小さいクリアゾーンだった。このことより、I205G、I205H 、I205P、I205Dの変異体は野生型より活性が低いと考えられた。一方、107番目の部位に注目してI107G、I107Aを作製した。しかし、I107Gはスキムミルクプレート上でのクリアゾーン形成が全く見られず、活性測定を行うことができなかった。また、I107Aについては、スキムミルクプレート上でのクリアゾーン形成がわずかに見られたものの、活性測定を行うと野生型に比べて著しく活性が低かった。
以上の結果より、今回作製した１アミノ酸置換体の中では、ランダム変異により獲得したI205T、I107Vがそれぞれ最適であった。【００６１】
２）２アミノ酸変異の導入
205番目と既に報告例のある131番目（非特許文献４）に注目し、I205TにG131Fを組み合わせたG131F/I205Tの二重変異体を作製した。さらに、１アミノ酸変異の導入の際に得られた1.2倍以上の活性を有するI205A及びI205VにG131Fを組み合わせたG131F/I205A、G131F/I205Vの二重変異体を作製した。また、I205T とI107V の２つのアミノ酸変異に注目してI107V/I205Tの二重変異体を作製した（ランダム変異導入により得られたI205TのpUΔSを鋳型にして、I107Vを１アミノ酸部位指定変異導入で作製した）。【００６２】
まず、変異導入箇所を含む３つのDNA断片（C鎖：5'末端から131番目の変異部位まで、D鎖：131番目の変異部位から205番目の変異部位まで、E鎖：205番目の変異部位から3'末端まで）を増幅するために１回目のPCR反応を行った。【００６３】
（C鎖の作製）（5'末端から131番目の変異部位まで）
１回目のPCR反応の溶液条件は以下の通りである。PCR 反応は、１アミノ酸変異の導入時と同様に行った。
(1)  10×LA PCR Buffer2 (Mg2+ フリー)（タカラ製）                   5μL
(2)  dNTP  混合液 (各2.5mM) （タカラ製）                            8μL
(3)  25mM MgCl2 (最終 2.5mM) （タカラ製）                           5μL
(4)  野生型サチライシン遺伝子（pUΔS）（90ng）                      XμL***
(5)  100μM M13 RVプライマー（配列番号３）                         0.5μL
(6)  100μM SUB-G131F LOWERプライマー（配列番号１６）              0.5μL
(7)  Nuclease-Free Water（Promega社製）                          (30.5-X)μL
(8)  LA TaqTM （5U/μL） (Mg2+ フリー)（タカラ製）                 0.5μL
注)***  野生型サチライシン遺伝子が90ngになる量をXμLとした。【００６４】
（D鎖の作製）（131番目の変異部位から205番目の変異部位まで）
以下に示す(5)(6)以外は、上記C鎖の作製の溶液条件と同様とした。
(5)  100μM SUB-G131F-UPPERプライマー（配列番号１５）              0.5μL
(6)  100μM SUB-I205X-LOWERプライマー                              0.5μL
（配列番号１８、２０、２２又は２４）                      【００６５】
（E鎖の作製）（205番目の変異部位から3'末端まで）
以下に示す(5)(6)以外は、上記C鎖の作製の溶液条件と同様とした。
(5)  100μM SUB-I205X-UPPERプライマー                              0.5μL
（配列番号１７、１９、２１又は２３）
(6)  100μM M13 M4 （配列番号４）                                  0.5μL【００６６】
２回目のPCRの溶液条件は以下の通りである。PCR反応は、１アミノ酸変異導入時と同様に行った。
(1)  10×LA PCR Buffer2  (Mg2+ フリー)（タカラ製）                   5μL
(2)  dNTP  混合液 (各2.5mM) （タカラ製）                             8μL
(3)  25mM MgCl2 (最終 2.5mM) （タカラ製）                            5μL
(4)  １回目のPCR反応によって得られたDNA断片（C鎖）                 2.5μL
(5)  １回目のPCR反応によって得られたDNA断片（D鎖）                 2.5μL
(6)  １回目のPCR反応によって得られたDNA断片（E鎖）                 2.5μL
(7)  Nuclease-Free Water（Promega社製）                             24μL
(8)  LA TaqTM （5U/μL） (Mg2+ フリー)  （タカラ製）               0.5μL【００６７】
２アミノ酸変異の導入により得られた変異体の活性測定の結果を示す（表３、表４、図８、図９）。
G131F/I205A、G131F/I205V、G131F/I205T、I107V/I205Tの二重変異体は、野生型に比べてそれぞれ4℃で2.92倍、2.38倍、3.39倍、2.73倍、25℃で2.66倍、2.59倍、3.61倍、2.46倍の活性上昇を示した。G131F、I205Tと単独で活性の良かったアミノ酸変異の組み合わせが、１番最適であることが確認された。また、131番目、205番目の部位は独立に活性上昇に寄与していると考えられた。【００６８】
３）３アミノ酸変異の導入
さらに活性の上昇を目指し、２アミノ酸変異の導入で得られたG131F/I205A、G131F/I205V、G131F/I205TのpUΔSを鋳型として、I107Vの１アミノ酸変異導入を行い、３アミノ酸変異の変異体I107V/G131F/I205A、I107V/G131F/I205V、I107V/G131F/I205Tを作製した。【００６９】
３アミノ酸変異の導入により得られた変異体の活性測定の結果を示す（表３、表４、図８、図９）。
I107V/G131F/I205A、I107V/G131F/I205V、I107V/G131F/I205Tの三重変異体は、野生型に比べてそれぞれ４℃で3.27倍、2.99倍、3.94倍、25℃で2.95倍、3.51倍、4.57倍の活性上昇を示した。I107V 、G131F、I205Tと単独で活性の良かったアミノ酸変異の組み合わせが、１番最適であることが確認された。また、107番目、131番目、205番目の部位は独立に活性上昇に寄与していると考えられた。
以上の結果より、4℃及び25℃において野生型よりも１番活性が上昇した変異体は、I107V/G131F/I205Tであった。又、温度依存性に差異が生じていることが確認された（表５、図１０）。【００７０】
【表３】
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【００７１】
【表４】
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【００７２】
【表５】
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【産業上の利用可能性】
【００７３】
以上説明したように、本発明の変異型サチライシンは、0〜30℃から選択される一定の環境下で、野生型サチライシンと比較して優れた酵素活性を有する。該変異型サチライシンは、食品、洗剤、皮なめし等の分野で有効活用される。酵素反応の環境を室温以上に維持する必要なければ、エネルギーの節減や環境面において優れた効果を有する。また、食品加工の際、低温環境下で行う方が好ましい場合があるが、このような場合にも有効活用することができる。
【図８】
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【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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