(57)【要約】  被検組織又は被検細胞に於ける、ＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１及びＧＥＦ−Ｈ１からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現量を測定する工程と、該遺伝子の発現量と正常組織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量とを比較する工程と、比較した結果、被検組織又は被検細胞における遺伝子の発現量が正常組織又は正常細胞における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断する工程と、を含む方法により、ｐ５３の機能異常の検出や癌の分子診断を行う。本発明の分子診断方法により、ｐ５３の変異の有無にかかわらず、また、ｐ５３の変異を直接検出することなくｐ５３の機能異常を検出することや、かかる機能異常に起因する癌の診断を行うことが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検組織又は被検細胞における、ＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１及びＧＥＦ−Ｈ１からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現量（Ｅ１）を測定する工程と、
発現量（Ｅ１）と、正常組織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量（Ｅ０）とを比較する工程と、
比較した結果、発現量（Ｅ１）が発現量（Ｅ０）より有意に多いか否かを判断する工程と、を含むｐ５３の機能異常の検出方法。
【請求項２】
前記遺伝子がＣＡＲＳ又はＧＥＦ−Ｈ１である請求項１に記載のｐ５３の機能異常の検出方法。
【請求項３】
被検組織又は被検細胞における、ＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１及びＧＥＦ−Ｈ１からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現量（Ｅ１）を測定する工程と、
発現量（Ｅ１）と、正常組織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量（Ｅ０）とを比較する工程と、
比較した結果、発現量（Ｅ１）が発現量（Ｅ０）より有意に多いか否かを判断することによりｐ５３の機能異常を予測する工程と、を含む癌の分子診断方法。
【請求項４】
前記遺伝子がＣＡＲＳ又はＧＥＦ−Ｈ１である請求項３に記載の癌の分子診断方法。
【請求項５】
被検組織又は被検細胞における、ＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１及びＧＥＦ−Ｈ１からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現量（Ｅ１）を測定する工程と、
発現量（Ｅ１）と、正常組織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量（Ｅ０）とを比較する工程と、
比較した結果、発現量（Ｅ１）が発現量（Ｅ０）より有意に多いか否かを判断することによりｐ５３の機能異常を予測する工程と、を含む薬剤感受性の判定方法。
【請求項６】
前記遺伝子がＣＡＲＳ又はＧＥＦ−Ｈ１である請求項５に記載の薬剤感受性の判定方法。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の薬剤感受性の判定方法によって得られた結果に基づき投与する抗癌剤を選択する抗癌剤の選択方法。
【請求項８】
ＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１及びＧＥＦ−Ｈ１からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を測定する発現測定手段と、
該遺伝子の発現を検出する検出手段と、を含む癌診断キット。
【請求項９】
前記発現測定手段が、マイクロアレイ及びＰＣＲ用プライマーからなる群より選択されるいずれか一つである請求項８に記載の癌診断キット。
【請求項１０】
被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、
該被検動物又は被検細胞中における、ＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１及びＧＥＦ−Ｈ１からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現量を測定する工程と、
該発現量を被検化合物の投与又は接触前と比較する工程と
比較した結果、被検化合物の投与又は接触によって該遺伝子の発現量が有意に変化したことを確認する工程と、を含む癌治療に有効な化合物の評価方法。
【請求項１１】
前記遺伝子がＧＥＦ−Ｈ１である請求項１０に記載の評価方法。
【請求項１２】
被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、
該被検化合物が、ＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１及びＧＥＦ−Ｈ１からなる群より選択される少なくとも一つのタンパク質又は該タンパク質と機能的に等価なタンパク質の活性を測定する工程と、
該活性の値を被検化合物の投与又は接触前と比較する工程と、
比較した結果、投与又は接触前後で該タンパク質の活性が有意に変化しているか否かを確認する工程と、を含む癌治療に有効な化合物の評価方法。
【請求項１３】
前記タンパク質がＧＥＦ−Ｈ１である請求項１２に記載の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所定の遺伝子の発現等を測定することにより癌抑制遺伝子ｐ５３の機能異常の検出や癌の診断を行う方法に関する。また、所定の遺伝子の発現量等に基づいて化合物の評価を行う方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒトゲノム計画の進展により、薬物感受性の個人差を遺伝子レベルで理解し、医薬の開発に応用する薬理ゲノミクス（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）が急速に進展している。薬物感受性の個人差を遺伝子レベルで判断できるようになれば、副作用の強い医薬を真に薬効の期待できる患者だけに投与することや、試行錯誤的な投薬を実施することなく、治療の初期から適切な投薬を実施する、いわゆるオーダーメイド医療が可能となる。その結果、患者に無用の肉体的負担を負わせることもなくなり、また、近年高騰する傾向にある医療費の削減にも寄与することとなる。中でも、抗癌剤は非常に強い副作用を有する場合が多く、オーダーメイド医療が強く望まれている。【０００３】
また、個々人の疾患関連遺伝子の分子レベルでの解析が可能となることによって、同じ疾患であっても原因となるメカニズムが異なる場合に、そのメカニズムに応じた治療や予防を行うことが可能となる。【０００４】
一方、癌抑制遺伝子として知られるｐ５３は、当初、腫瘍ウイルスであるＳＶ４０のＴ抗原と複合体を形成する分子として発見された（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、第３１巻、４６３頁、１９７９年：非特許文献１）。その後、ｐ５３遺伝子が多くの癌で欠失が見られる１７番染色体の短腕（１７ｐ１３）に存在し、対立遺伝子の双方が欠失と変異により不活性化されている癌抑制遺伝子であることが明らかとなった（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、第３１９巻、５２５頁、１９８８年：非特許文献２）。また、その遺伝子産物は３９３アミノ酸からなる転写制御因子で、４量体を形成して機能することが明らかとなっている。さらに、細胞周期に関与するｐ２１、14−3−3、アポトーシスに関与するｂａｘ、ＰＩＧ３、ＧＡＤＤ４５等、非常に多くの遺伝子がｐ５３の標的遺伝子として同定されており、ｐ５３に異常が生じることにより標的遺伝子の転写制御に異常を来たすと考えられる。【０００５】
実際、ｐ５３遺伝子の変異は、肺癌では７０％、胃癌では４５％、乳癌では３０％、大腸癌では６５％、膀胱癌では６１％、膵臓癌では７０％にのぼることが明らかとなっており（実験医学、第１９巻、１３５頁、２００１年：非特許文献３）、他の癌抑制遺伝子と比較しても顕著に高い。すなわち、ｐ５３遺伝子の変異による機能異常が癌の発症に大きな影響を及ぼしているといえる。【０００６】
このような状況の下、ｐ５３遺伝子の変異や機能異常と疾患との関連に関する研究が盛んになされている。例えば、Ｓｏｕｓｓｉらは１５０００例以上にのぼるｐ５３の変異をデータベース化しており（http://p53.curie.fr/：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第２２巻、３５５１頁、１９９４年：非特許文献４）、ｐ５３のＤＮＡ結合ドメイン領域内に位置するコドン１７５、２４５、２４８、２７３等には変異が頻発することを示している。また、ある種の肝細胞癌では、ＤＮＡ結合ドメイン内のコドン２４９にはＡｒｇからＳｅｒへの変異が認められることが明らかにされている（Ｎａｔｕｒｅ、第３５０巻、４２７頁、１９９１年：非特許文献５）。また、紫外線によって生じる皮膚癌においてもｐ５３遺伝子中のＣＣがチミンダイマー化していることが報告されている（ＰＮＡＳ、第８８巻、１０１２４頁、１９９１年：非特許文献６）。【０００７】
【非特許文献１】Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、第３１巻、４６３頁、１９７９年
【非特許文献２】Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、第３１９巻、５２５頁、１９８８年
【非特許文献３】実験医学、第１９巻、１３５頁、２００１年
【非特許文献４】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．,第２２巻、３５５１頁、１９９４年
【非特許文献５】Ｎａｔｕｒｅ、第３５０巻、４２７頁、１９９１年
【非特許文献６】ＰＮＡＳ、第８８巻、１０１２４頁、１９９１年
【非特許文献７】Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、第１９巻、２４３頁、１９９７年
【発明の開示】
【０００８】
しかしながら、ｐ５３の変異が必ずしも機能異常や疾患の原因となるわけではなく、変異が生じていてもｐ５３の機能には何ら影響を及ぼさない場合もある。例えば、Ｌｉ−ＱｕｎＪｉａらは、酵母を用いた実験で、リンパ腫由来のＡ３／ＫＡＷ細胞にはｐ５３のコドン２１３及び２３４にミスセンス変異がありながら、転写活性には異常が認められなかったことを明らかにしている（Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、第１９巻、２４３頁、１９９７年：非特許文献７）。このような場合には、ｐ５３の変異を検出しても機能異常や疾患との関連を推測することができないという問題があった。
【０００９】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、ｐ５３の変異の有無にかかわらず、また、ｐ５３の変異を直接検出することなくｐ５３の機能異常を検出することや、かかる機能異常に起因する癌の診断を行う方法等を提供することを目的とする。
【００１０】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、特定の遺伝子群の発現量がｐ５３の機能異常とリンクして増減することを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明のｐ５３の機能異常の検出方法は、被検組織又は被検細胞に於ける、ＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１及びＧＥＦ−Ｈ１からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現量を測定する工程と、当該遺伝子の発現量と正常組織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量とを比較する工程と、比較した結果、被検組織又は被検細胞における遺伝子の発現量が正常組織又は正常細胞における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断する工程と、を含むことを特徴とする。
【００１２】
ここで、前記遺伝子がＣＡＲＳ又はＧＥＦ−Ｈ１であることが好ましい。かかる遺伝子を用いることにより、より精度高くｐ５３の機能異常を検出することが可能となる。
【００１３】
また、本発明の癌の分子診断方法（癌の評価又は判定方法）は、被検組織又は被検細胞における、ＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１及びＧＥＦ−Ｈ１からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現量を測定する工程と、当該遺伝子の発現量と正常組織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量とを比較する工程と、比較した結果、被検組織又は被検細胞における遺伝子の発現量が正常組織又は正常細胞における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断することによりｐ５３の機能異常を予測する工程と、を含むことを特徴とする。
【００１４】
ここで、前記遺伝子がＣＡＲＳ又はＧＥＦ−Ｈ１であることが好ましい。かかる遺伝子を用いることにより、より精度高く癌の分子診断を行うことが可能となる。
【００１５】
また、本発明の薬剤感受性の判定方法は、被検組織又は被検細胞における、ＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１及びＧＥＦ−Ｈ１からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現量を測定する工程と、当該遺伝子の発現量と正常組織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量とを比較する工程と、比較した結果、被検組織又は被検細胞における遺伝子の発現量が正常組織又は正常細胞における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断することによりｐ５３の機能異常を予測する工程と、を含むことを特徴とする。
【００１６】
ここで、前記遺伝子がＣＡＲＳ又はＧＥＦ−Ｈ１であることが好ましい。かかる遺伝子を用いることにより、より精度高く薬剤感受性の判定をすることが可能となる。
【００１７】
さらに、本発明は、上記薬剤感受性の判定方法によって得られた結果に基づき投与する抗癌剤を選択する抗癌剤の投与方法（抗癌剤の選択方法）をも包含する。
【００１８】
また、本発明の癌診断キット（検出キット、ｐ５３の機能異常の検出キット）は、ＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１及びＧＥＦ−Ｈ１からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を測定する発現測定手段と、当該遺伝子の発現を検出する検出手段と、を含むことを特徴とする。
【００１９】
ここで、前記発現測定手段が、マイクロアレイ、ＰＣＲ用プライマーからなる群より選択されるいずれか一つであることが好ましい。
【００２０】
また、本発明の癌治療に有効な化合物の評価方法は、被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、当該被検動物又は被検細胞中における、ＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１及びＧＥＦ−Ｈ１からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現量を測定する工程と、当該発現量を被検化合物の投与又は接触前と比較する工程と比較した結果、被検化合物の投与又は接触によって当該遺伝子の発現量が有意に変化したことを確認する工程と、を含むことを特徴とする。
【００２１】
ここで、前記遺伝子がＧＥＦ−Ｈ１であることが好ましい。かかる遺伝子を使用することにより、より精度高く化合物の評価を行うことが可能となる。
【００２２】
さらに、本発明の癌治療に有効な化合物の評価方法は、被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、当該被検化合物が、ＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１及びＧＥＦ−Ｈ１からなる群より選択される少なくとも一つのタンパク質又は当該タンパク質と機能的に等価なタンパク質の活性を測定する工程と、当該活性の値を被検化合物の投与又は接触前と比較する工程と、比較した結果、投与又は接触前後で当該タンパク質の活性が有意に変化しているか否かを確認する工程と、を含むことを特徴とする。
【００２３】
ここで、前記タンパク質がＧＥＦ−Ｈ１であることが好ましい。かかる遺伝子を使用することにより、より精度高く化合物の評価を行うことが可能となる。
【００２４】
本発明によれば、ｐ５３の変異を直接検出することなく、また、被験者に負担をかけることなくｐ５３の機能異常を検出することや、かかる機能異常に起因する癌の診断を行うことが可能となる。さらに、本発明によれば、ｐ５３が関与する癌の治療に有効な化合物の評価が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、各種組換えｐ５３変異体の発現をタンパク質レベルで確認した図である。
【図２】図２は、各種組換えｐ５３変異体の発現をｍＲＮＡレベルで確認した図である。
【図３】図３は、各種組換えｐ５３変異体とｐ２１の発現との関係を示す図である。
【図４】図４は、各種ｐ５３変異体の発現とＧＥＦ−Ｈ１の発現量との関係を示す図である。
【図５】図５は、ｐ５３変異体の発現誘導によって活性化されるＧＥＦ−Ｈ１と、ＧＥＦ−Ｈ１の発現によって活性化されるＲｈｏＡとの関係を示す図である。
【図６】図６は、種々の癌細胞におけるＧＥＦ−Ｈ１の発現量を示す図である。図中、□は変異型ｐ５３を発現する癌細胞を示し、△は野生型ｐ５３を発現する癌細胞を示す。
【図７】図７は、野生型ｐ５３を発現するＨＣＴ１１６細胞についてＧＥＦ−Ｈ１の発現を抑制した場合の３日後の生細胞率を示す図である。□は対照（Scramble）を示し、◇はＧＥＦ−Ｈ１ｓｉＲＮＡを導入した場合の生細胞率を示す。
【図８】図８は、野生型ｐ５３を発現するＡ４２７細胞についてＧＥＦ−Ｈ１の発現を抑制した場合の３日後の生細胞率を示す図である。□は対照（Scramble）を示し、◇はＧＥＦ−Ｈ１ｓｉＲＮＡを導入した場合の生細胞率を示す。
【図９】図９は、野生型ｐ５３を発現するＲＴ４細胞についてＧＥＦ−Ｈ１の発現を抑制した場合の３日後の生細胞率を示す図である。□は対照（Scramble）を示し、◇はＧＥＦ−Ｈ１ｓｉＲＮＡを導入した場合の生細胞率を示す。
【図１０】図１０は、変異型ｐ５３を発現するＵＭＣＵ３細胞についてＧＥＦ−Ｈ１の発現を抑制した場合の３日後の生細胞率を示す図である。□は対照（Scramble）を示し、◇はＧＥＦ−Ｈ１ｓｉＲＮＡを導入した場合の生細胞率を示す。
【図１１】図１１は、変異型ｐ５３を発現するＳＫ−ＯＶ３細胞についてＧＥＦ−Ｈ１の発現を抑制した場合の３日後の生細胞率を示す図である。□は対照（Scramble）を示し、◇はＧＥＦ−Ｈ１ｓｉＲＮＡを導入した場合の生細胞率を示す。
【図１２】図１２は、変異型ｐ５３を発現するＥＳ−２細胞についてＧＥＦ−Ｈ１の発現を抑制した場合の３日後の生細胞率を示す図である。□は対照（Scramble）を示し、◇はＧＥＦ−Ｈ１ｓｉＲＮＡを導入した場合の生細胞率を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。【００２７】
先ず、本発明にかかる用語について説明する。
本発明における「被検組織」とは、癌の検査対象となる生体から抽出可能な組織であり、ｐ５３の関与を検討する必要のある癌組織や、癌診断の必要があると認められる組織であればその種類は特に限定されない。かかる組織の例としては、例えば、神経芽腫、網膜芽細胞腫、脳腫瘍、頭頸部癌、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、口腔が癌、咽頭癌、喉頭癌、甲状腺癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、膵内分泌腫瘍、胆道癌、陰茎癌、外陰癌、腎盂尿管癌、腎臓癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮癌、絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵管癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、菌状息肉症、悪性黒色腫、軟部肉腫、骨腫瘍、悪性リンパ腫、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、リンパ浮腫由来の組織が挙げられる。【００２８】
また、本発明における「被検細胞」も同様に、癌の検査対象となる生体から抽出可能な組織であり、ｐ５３の関与を検討する必要のある癌組織由来の細胞や、癌診断の必要があると認められる組織由来の細胞であればその種類は特に限定されない。かかる細胞の例としては、例えば、神経芽腫、網膜芽細胞腫、脳腫瘍、頭頸部癌、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、口腔が癌、咽頭癌、喉頭癌、甲状腺癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、膵内分泌腫瘍、胆道癌、陰茎癌、外陰癌、腎盂尿管癌、腎臓癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮癌、絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵管癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、菌状息肉症、悪性黒色腫、軟部肉腫、骨腫瘍、悪性リンパ腫、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、リンパ浮腫由来の細胞が挙げられる。【００２９】
次に、本発明において被検対象となる遺伝子、ＣＡＲＳ遺伝子、ＭＯＣＯＳ遺伝子、ＴＮＦＲＳＦ９遺伝子、ＬＯＣ５６９０１遺伝子及びＧＥＦ−Ｈ１遺伝子について説明する。
ＣＡＲＳ遺伝子（ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ：ＮＭ＿００１７５１：配列番号１）によりコードされるタンパク質は、細胞質に存在する酵素であり、ｔＲＮＡのアミノアシル化を触媒する。また、ＣＡＲＳ遺伝子は、癌抑制遺伝子の存在部位として知られる染色体の１１ｐ１５．５に存在することが明らかにされている（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、第１５巻、６９２頁、１９９３年）。【００３０】
ＭＯＣＯＳ遺伝子（ｍｏｌｙｂｄｅｎｕｍ  ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｓｕｌｆｕｒａｓｅ：ＮＭ＿０１７９４７：配列番号２）は、キサンチン尿症の原因遺伝子として同定された（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第２８２巻、１１９４頁、２００１）。ＭＯＣＯＳは、コード領域２６６７塩基、８８８アミノ酸からなる分子である。【００３１】
ＴＮＦＲＳＦ９遺伝子（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，  ｍｅｍｂｅｒ  ９：ＮＭ＿００１５６１：配列番号３）によりコードされるタンパク質は、Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）受容体ファミリーに属し、Ｔ細胞の増殖を阻害し、アポトーシスを誘導することが知られている（Ｅｕｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第９巻、２２１９頁、１９９４年）。【００３２】
ＧＥＦ−Ｈ１遺伝子（Ｒｈｏ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｆａｃｔｏｒ−Ｈ１：ＮＭ＿００４７２３：配列番号４）によりコードされるタンパク質は、癌遺伝子と知られるＲｈｏに結合し、不活性型のＲｈｏ−ＧＤＰから活性型のＲｈｏに変換する酵素として知られている(Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、第２７３巻、３４９５４頁、１９９８年)。【００３３】
ＬＯＣ５６９０１遺伝子（ＮＭ＿０２０１４２：配列番号５）によりコードされるタンパク質は、電子をＮＡＤＨから電子伝達系に輸送する酸化還元酵素ＮＤＵＦＡ４のホモログとして知られる（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．、第９９巻、１６８９９頁、２００２年)。【００３４】
本発明において使用されるＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１又はＧＥＦ−Ｈ１は、これらの遺伝子と機能的に等価な遺伝子であってもよい。【００３５】
ここで、「ＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１及びＧＥＦ−Ｈ１からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子と機能的に等価な遺伝子」とは、当該遺伝子と塩基配列は異なるものの、比較的高い相同性を示し、それぞれのタンパク質と同じ又は類似の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を示す。ここで、前記相同性は、機能的に等価であれば特に制限はないが、塩基配列の相同性が７０〜１００％であることが好ましく、８０〜１００％であることがより好ましく、９０〜１００％であることが特に好ましい。相同性が前記下限より低い場合には対応する遺伝子と同じ又は類似の機能を示さない可能性が高い傾向にある。しかしながら、相同性が前記下限未満であっても、対応する遺伝子に特有の機能を有するドメインと、当該ドメインに対応する塩基配列との相同性が高い場合には同じ又は類似の機能を有する場合がある。このような遺伝子は、塩基配列の相同性が前記範囲外であっても好適に使用可能である。また、比較的相同性の高い遺伝子とは、ＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１又はＧＥＦ−Ｈ１における１又は２以上の塩基が自然若しくは人為的に置換、欠失、付加及び／又は挿入した遺伝子であってもよい。【００３６】
次に、本発明のｐ５３の機能異常の検出方法について説明する。
本発明のｐ５３の機能異常の検出方法は、被検組織における、ＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１及びＧＥＦ−Ｈ１からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量を測定する工程と、当該遺伝子の発現量と正常組織における対応遺伝子の発現量とを比較する工程と、比較した結果、被検組織における遺伝子の発現量が正常組織における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断する工程とを含むことを特徴とする。【００３７】
本発明において、先ず、被検組織における、ＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１及びＧＥＦ−Ｈ１からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量を測定する。遺伝子の発現量の測定の方法としては特に制限はないが、例えば、被検組織から抽出したゲノミックＤＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行う方法、前記遺伝子がプロットされたマイクロアレイを用いる方法、ノーザンブロットが挙げられる。ここで、遺伝子の「発現量」とは、遺伝子転写産物の絶対量又は相対量をいい、相対量の場合は、後述する正常組織における発現量との相対的な比較において当該遺伝子の発現量を決定すればよい。【００３８】
また、本工程において、発現量を測定する遺伝子は一種である必要はなく、二種以上の遺伝子の発現を測定した結果よりｐ５３の機能異常を総合的に判断してもよい。【００３９】
次に、上記の方法により測定した遺伝子の発現量と正常組織における対応遺伝子の発現量とを比較する。【００４０】
ここで、「正常組織又は正常細胞」とは、被検組織又は被検細胞と比較の対象となる組織又は細胞であればその由来は特に限定されず、健常人由来であっても癌患者由来であってもよい。また、癌組織の近辺に存在する正常組織又は正常細胞であってもよい。【００４１】
本工程においては、被検組織又は細胞に発現するＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１又はＧＥＦ−Ｈ１遺伝子と正常組織又は細胞に発現するこれらの遺伝子（対応遺伝子）の発現量を比較するが、発現量の絶対量を比較してもよく、また、比較による相対値を算出してもよい。【００４２】
次に、比較した結果、被検組織又は被検細胞における遺伝子の発現量が正常組織又は正常細胞における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断する。【００４３】
前記の有意差の判断手法としては特に制限はないが、当業者に公知の統計学的手法を用いて検定すればよい。【００４４】
被検組織又は被検細胞と、正常組織又は正常細胞における前記遺伝子の発現量の比較の結果、有意差をもって被検組織又は被検細胞において発現が高いと認められた場合には当該被検組織又は被検細胞におけるｐ５３に機能異常が認められると判断できる。この場合のｐ５３の機能異常としては、ｐ５３遺伝子における塩基の欠失（例えばナンセンス変異）、置換（例えば、ミスセンス変異、ポイントミューテーション）、挿入、フレームシフト等が考えられるが、本発明の対象としては、機能異常の原因は特に限定されず、これらのいずれが原因となった機能異常も含まれる。【００４５】
また、ｐ５３の機能異常の具体例としては、ｐ５３タンパク質の転写活性が低下又は活性化する場合や、転写が全く起こらない場合が挙げられるが、活性には異常を認めないがコードされる遺伝子には変異を生じている場合も含まれる。【００４６】
次に、本発明の癌の分子診断方法（癌の評価又は判定方法）について説明する。
本発明の癌の分子診断方法は、被検組織又は被検細胞における、ＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１及びＧＥＦ−Ｈ１からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量を測定する工程と、当該遺伝子の発現量と正常組織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量とを比較する工程と、比較した結果、被検組織又は被検細胞における遺伝子の発現量が正常組織又は正常細胞における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断することによりｐ５３の機能異常を予測する工程と、を含む。【００４７】
本発明の癌の分子診断方法の手順としては、ｐ５３の機能異常を検出するまでは上述したｐ５３の機能異常の検出方法と同様に行う。当該方法によってｐ５３の機能異常が検出された場合、被検組織又は被検細胞がｐ５３の異常によって生じる癌由来の組織又は細胞であると判断できる。すなわち、被検組織又は被検細胞が由来する組織においてｐ５３の異常により生じることが知られている癌種を特定することができる。具体的には、例えば、ｐ５３との関与が示唆されているＬｉ−Ｆｒａｕｍｅｎｉ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ（Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５０巻、１２３３頁、１９９０年）、肝細胞癌（Ｎａｔｕｒｅ、第３５０巻、３７７頁、１９９１年）、骨原性肉腫（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，第８４巻、７７１６頁、１９８７年）、横紋筋肉種（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、第８７巻、５８６３頁、１９９０年）、結腸癌（Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４４巻、２１７頁、１９８９年）、肺癌（Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４６年、４９１頁、１９８９年）、グリア芽細胞腫（Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ.、第４７巻(ｓｕｐｐｌ.)、Ａ４、１９９０年）、食道癌（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、第８７巻、９９５８頁、１９９０年）、膀胱癌（Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５２巻、７０６頁、１９９１年）、扁平上皮癌（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳ、第８８巻、１０１２４頁、１９９１年）、子宮頚癌（Ｌａｎｃｅｔ、第３３９巻、１０７０頁、１９９２年）、肺癌（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、第８９巻、７２６２頁、１９９２年）、白血病・リンパ腫（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．、第９０巻、６５３頁、１９９２年）等と、被検組織又は被検細胞との関係を診断することが可能となる。【００４８】
次に、本発明の薬剤感受性の判定方法について説明する。
本発明の薬剤感受性の判定方法は、被検組織又は被検細胞における、ＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１及びＧＥＦ−Ｈ１からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量を測定する工程と、当該遺伝子の発現量と正常組織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量とを比較する工程と、比較した結果、被検組織又は被検細胞における遺伝子の発現量が正常組織又は正常細胞における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断することによりｐ５３の機能異常を予測する工程と、を含む。【００４９】
本発明の癌の分子診断方法の手順としては、ｐ５３の機能異常を検出するまでは上述したｐ５３の機能異常の検出方法と同様に行う。当該方法によってｐ５３の機能異常が検出された場合、被検組織又は被検細胞がｐ５３の異常によって生じる癌由来の組織又は細胞であると判断できる。すなわち、ｐ５３と薬効との関係が知られている薬剤について、その薬剤を投与した場合にどの程度の薬効が期待できるか、あるいは、どのような副作用が生じるかといった薬剤感受性を予測することができる。その結果、副作用が予想される薬剤の投与は避け、有効であると予想される薬剤を選択的に投与することが可能となる。このようなｐ５３と薬効との関係が知られている薬剤としては、例えば、ドキソルビシンやアントラサイクリン系の抗癌剤が挙げられ、ｐ５３のＤＮＡ結合領域に遺伝子変異が存在することにより生じる肺癌とこれらの抗癌剤の応答性に一定の関係があることが示唆されている（Ｎａｔ  Ｍｅｄ、第２巻、８１１頁、１９９６年）。しかしながら、本発明の薬剤感受性の判定方法において対象となる薬剤は前記抗癌剤に限定されず、あらゆる抗癌剤についてｐ５３との関連を検討あるいは調査したうえで、薬剤感受性の判断をおこなえばよい。【００５０】
すなわち、本発明の薬剤感受性の判定方法により、被検組織又は被検細胞がｐ５３の関与する癌細胞を含むことが明らかとなった場合に、被検体にこれらの抗癌剤の投与が有効かどうか判断できることとなり、投与すべきかどうかの判定が可能となる。また、当該判定によって適切な薬剤を選択し、投与することにより、副作用を抑え、治療効果の高い投薬を行うことが可能となる。【００５１】
また、本発明は、ＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１及びＧＥＦ−Ｈ１からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を測定する発現測定手段と、当該遺伝子の発現を検出する検出手段と、を含む癌診断キットをも提供する。【００５２】
ＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１及びＧＥＦ−Ｈ１からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を測定する発現測定手段としては特に制限はないが、例えば、当該遺伝子を増幅するためのプライマー、当該遺伝子がプロットされたマイクロアレイ、ノーザンブロット用のプローブが挙げられる。また、当該遺伝子の発現を検出する検出手段としても特に制限はないが、例えば、ノーザンブロット用のプローブを可視化するための蛍光標識試薬やラジオアイソトープ標識試薬が挙げられる。【００５３】
このような癌診断キットを使用することにより、被検組織や被検細胞からゲノムＤＮＡを抽出して塩基配列を確認することによりｐ５３の変異を検出するという工程を経ることなく、簡易・迅速にｐ５３が関与する癌の診断をすることが可能となる。【００５４】
次に、本発明の化合物の評価方法について説明する。
本発明の第一の化合物の評価方法は、被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、当該被検動物又は被検細胞中における、ＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１及びＧＥＦ−Ｈ１からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量を測定する工程と、当該遺伝子の発現量と、正常動物又は正常細胞における対応遺伝子の発現量とを比較する工程と、比較した結果、該被検動物又は被検組織における遺伝子の発現量が該正常動物又は正常組織における遺伝子の発現量と有意に差が認められるか否かを確認する工程と、を含むことを特徴とする。【００５５】
具体的には、以下の手順で化合物の評価を行う。
先ず、被検化合物を被検動物又は被検細胞に投与又は接触させる。ここで、被検化合物としては、癌に治療、予防又は診断を目的とする薬剤候補の化合物であれば、その構造や性質は問わず、化合物種も限定されない。【００５６】
また、被検化合物を被検動物に投与する方法としては特に制限はなく、その都度好適な投与方法を選択すればよいが、例えば、経口投与、非経口投与（例えば、経皮投与、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射）が挙げられる。また、被検化合物を被検細胞に接触させる方法としても特に制限はなく、例えば、細胞と被検化合物を培養液や緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）等の溶液中で混合し、両者を接触させる方法が挙げられる。【００５７】
次に、被検動物又は被検細胞中における、ＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１及びＧＥＦ−Ｈ１からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現量を測定する。これらの遺伝子の発現量の測定方法としては、特に制限はなく、投与又は接触前を対照として、当該遺伝子の発現量の変化をＲＴ−ＰＣＲのような遺伝子増幅法、マイクロアレイを用いる方法、ノーザンブロット等によって検出し、比較すればよい。また、発現量の測定には、前記遺伝子の発現調節領域とレポーター遺伝子との融合遺伝子を人為的に導入した動物又は細胞を用いてもよい。この場合、レポーター遺伝子としては、例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子又はグリーンフルオレッセンスプロテイン遺伝子が挙げられる。【００５８】
ここで、「ＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１及びＧＥＦ−Ｈ１からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子と機能的に等価な遺伝子」とは、当該遺伝子と塩基配列は異なるものの、比較的高い相同性を示し、それぞれのタンパク質と同じ又は類似の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を示す。ここで、前記相同性は、機能的に等価であれば特に制限はないが、塩基配列の相同性が７０〜１００％であることが好ましく、８０〜１００％であることがより好ましく、９０〜１００％であることが特に好ましい。相同性が前記下限より低い場合には対応する遺伝子と同じ又は類似の機能を示さない可能性が高い傾向にある。しかしながら、相同性が前記下限未満であっても、対応する遺伝子に特有の機能を有するドメインと、当該ドメインに対応する塩基配列との相同性が高い場合には同じ又は類似の機能を有する場合がある。このような遺伝子は、塩基配列の相同性が前記範囲外であっても好適に使用可能である。また、比較的相同性の高い遺伝子とは、ＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１又はＧＥＦ−Ｈ１における１又は２以上の塩基が自然若しくは人為的に置換、欠失、付加及び／又は挿入した遺伝子であってもよい。【００５９】
次に、前工程で測定した当該遺伝子の発現量を、被検化合物の投与又は接触前と比較する。すなわち、本工程では、測定対象の遺伝子の発現量が被検化合物の投与又は接触前後でどのように変化したかを確認する。比較の結果、発現量の差に有意差が認められるか否かを検討し、被検化合物の投与又は接触後でＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１又はＧＥＦ−Ｈ１の発現が優位に高い場合には化合物の効果が低いと判断し、低い場合には有効と判断する。【００６０】
次に、本発明の第二の化合物の評価方法について説明する。
本発明の第二の化合物の評価方法は、被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、当該被検化合物が、ＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１及びＧＥＦ−Ｈ１からなる群より選択される少なくとも一つのタンパク質又は該タンパク質と機能的に等価なタンパク質の活性を測定する工程と、当該活性の値を被検化合物の投与又は接触前と比較する工程と、比較した結果、投与又は接触前後で該タンパク質の活性が有意に変化しているか否かを確認する工程と、を含むことを特徴とする。【００６１】
具体的には、以下の手順で化合物の評価を行う。
先ず、被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる。ここで、被検化合物としては、癌に治療、予防又は診断を目的とする薬剤候補の化合物であれば、その構造や性質は問わず、化合物種も限定されない。【００６２】
また、被検化合物を被検動物に投与する方法としては特に制限はなく、その都度好適な投与方法を選択すればよいが、例えば、経口投与、非経口投与（例えば、経皮投与、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射）が挙げられる。また、被検化合物を被検細胞に接触させる方法としても特に制限はなく、例えば、細胞と被検化合物を培養液や緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）等の溶液中で混合し、両者を接触させる方法が挙げられる。【００６３】
次に、被検動物又は被検細胞中における、ＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１及びＧＥＦ−Ｈ１からなる群より選択される少なくとも一つのタンパク質又は該タンパク質と機能的に等価なタンパク質の活性を測定する。これらのタンパク質の活性の測定方法としては、特に制限はなく、投与又は接触前を対照として、例えば、ＣＡＲＳであればｔＲＮＡのアミノアシル化活性を測定すればよい。【００６４】
ここで、「ＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１及びＧＥＦ−Ｈ１からなる群より選択される少なくとも一つのタンパク質と機能的に等価なタンパク質」とは、当該タンパク質とアミノ酸配列は異なるものの、比較的高い相同性を示し、それぞれのタンパク質と同じ又は類似の活性を有するタンパク質を示す。ここで、前記相同性は、機能的に等価であれば特に制限はないが、アミノ酸配列の相同性が５０〜１００％であることが好ましく、６０〜１００％であることがより好ましく、７０〜１００％であることが特に好ましい。相同性が前記下限より低い場合には対応するタンパク質と同じ又は類似の活性を示さない可能性が高い傾向にある。しかしながら、相同性が前記下限未満であっても、対応するタンパク質に特有の機能を有するドメインと、当該ドメインに対応するアミノ酸配列との相同性が高い場合には同じ又は類似の活性を有する場合がある。このようなタンパク質は、アミノ酸配列の相同性が前記範囲外であっても好適に使用可能である。また、比較的相同性の高いタンパク質とは、ＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１又はＧＥＦ−Ｈ１における１又は２以上のアミノ酸が自然若しくは人為的に置換、欠失、付加及び／又は挿入したタンパク質であってもよい。【００６５】
次に、前工程で測定した当該タンパク質の活性を、被検化合物の投与又は接触前と比較する。すなわち、本工程では、測定対象の遺伝子の活性が被検化合物の投与又は接触前後でどのように変化したかを確認する。比較の結果、活性の差に有意差が認められるか否かを検討し、被検化合物の投与又は接触後でＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１又はＧＥＦ−Ｈ１の活性が優位に高い場合には効果が低いと判断し、低い場合には有効と判断する。【００６６】
以上説明したような本発明の化合物の評価方法によれば、癌治療や予防に有用な化合物のスクリーニングや、これら薬剤の有効性又は安全性の評価が可能となる。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００６８】
まず、変異型ｐ５３発現ベクタープラスミドを構築した。
野生型及びＶ１５７Ｆ、Ｒ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｑの各変異を持つｐ５３遺伝子をドキソサイクリン誘導型ベクターｐＴＲＥ−ｈｙｇへクローニングした。次に、これらのｐ５３発現ベクターを癌細胞であるＵ２ＯＳへ導入し、誘導性のｐ５３変異体発現細胞株を樹立した。【００６９】
次に、野生型及び各変異型ｐ５３遺伝子を有する細胞株のｐ５３の発現を確認した。タンパク質レベルでの発現をウエスタンブロット法にて（図１）、ｍＲＮＡレベルでの発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法にて測定した(図２)。ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマー及びプローブの配列は下記のとおりである。
フォワードプライマー：5’-TCCCCGGACGATATTGAACA-3’（配列番号６）
リバースプライマー：5’-GCATTCTGGGAGCTTCATCTG-3’（配列番号７）
ＴａｑＭａｎプローブ：5’-TGGTTCACTGAAGACCCA-3’（配列番号８）。【００７０】
その結果、誘導後は１０倍以上の野生型及び変異体ｐ５３の発現誘導があった。【００７１】
次に、これらの細胞株において導入した変異型ｐ５３により内在性のｐ５３の機能が喪失していることを確かめた。【００７２】
まず、ｐ５３の転写活性化能をｐ２１の遺伝子発現誘導を測定することにより調べた。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法に用いたプライマー及びプローブの配列は下記のとおりである。
フォワードプライマー：5’-TGGAGACTCTCAGGGTCGAAA-3’（配列番号９）
リバースプライマー：5’-GGCGTTTGGAGTGGTAGAAATC-3’（配列番号１０）
ＴａｑＭａｎプローブ：5’-CGGCGGCAGACCAGCATGAC-3’（配列番号１１）。【００７３】
調製した細胞株にドキソサイクリンを添加し、野生型及び変異型ｐ５３を誘導したところ、誘導後１０時間において野生型ｐ５３発現細胞ではｐ２１が１０倍以上転写活性化されているのに対して、３種の変異型細胞では、全くｐ２１の転写活性化が見られなかった（図３）。このことにより、変異型ｐ５３では、転写活性化能は失われていることが確認できた。【００７４】
次に、変異型ｐ５３によって発現が誘導される遺伝子を探索するために、野生型、変異型ｐ５３発現細胞株及びコントロールのＵ２ＯＳ細胞株の網羅的遺伝子発現をマイクロアレイを用いて測定した。変異型ｐ５３発現誘導後０、１２、１５時間の各細胞からｍＲＮＡを抽出し、逆転写反応によってｃＤＮＡに変換後、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）でハイブリダイゼーションし、解析を行った。３種類全ての変異型ｐ５３発現細胞株で遺伝子発現が上昇している遺伝子群を次のように抽出した。すなわち、変異型ｐ５３誘導前と誘導１５時間後を比較して、少なくとも一つの変異体細胞で１．５倍以上の発現上昇があり、全ての変異体で有意に発現上昇を示す遺伝子群を抽出した。また、野生型ｐ５３の発現誘導によっては、遺伝子発現は変化をしないことを条件とした。この条件下で以下の１２遺伝子が抽出された。
Ｇｅｎｅ  ｓｙｍｂｏｌ:  Ｃ９ｏｒｆ４８，  ＣＣＮＢ１ＩＰ１，  ＭＲＰＬ４６，  ＺＮＦ２４，  ＣＡＲＳ，  ＭＯＣＯＳ，  ＴＮＦＲＳＦ９，  ＣＡＲＳ，  ＬＯＣ５６９０１，  ＧＥＦ−Ｈ１，  ＳＦＰＱ，  ＣＣＮＬ１【００７５】
これらの遺伝子群の発現亢進の有無は、癌細胞においてｐ５３の状態が野生型か変異型かを判別することに有用と考えられる。さらに、遺伝子抽出の基準値を全ての変異型ｐ５３により１．５倍以上の発現上昇を示す遺伝子群を抽出したところ、ＧＥＦ−Ｈ１(Ｒｈｏ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｆａｃｔｏｒ  Ｈ１)とＣＡＲＳ(ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ)の二つであった。【００７６】
次にＧＥＦ−Ｈ１に注目し、変異型ｐ５３によるＧＥＦ−Ｈ１の誘導をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により確認した。用いたプライマー及びプローブの配列は下記のとおりである。
フォワードプライマー：5’-TGAGATGTACGAGGTGCACACA-3’（配列番号１２）
リバースプライマー：5’-CGCACGCTCTGCTGAATG-3’（配列番号１３）
ＴａｑＭａｎプローブ：5’-CCGGGATGACCGGAGCACCTG-3’（配列番号１４）。【００７７】
ドキシサイクリンによるｐ５３発現誘導後のＧＥＦ−Ｈ１発現の経時変化を調べたところ、２４〜４８時間後には全ての変異ｐ５３細胞株において発現量が５倍以上上昇していた（図４）。さらに、ＧＥＦ−Ｈ１は癌遺伝子のＲｈｏＡを活性化することが知られているので変異型ｐ５３発現誘導後のＲｈｏＡの活性化状態を測定した。変異型及び野生型ｐ５３の発現誘導時間が２４、４８時間の各細胞株から、細胞抽出液を作成し全体のＲｈｏＡの発現量と活性型ＲｈｏＡの量をキット（Ｒｈｏ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ，  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，  Ｉｎｃ．）を用いて次のように測定した。ＧＳＴ−Ｒｈｏｔｅｋｉｎ−ＲＢＤ  （Ｒｈｏ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ) は活性型Ｒｈｏに結合するのでＧＳＴ−Ｒｈｏｔｅｋｉｎ−ＲＢＤを用いてプルダウンした。プルダウンされた活性型ＧＴＰａｓｅはＲｈｏＡ特異抗体を用いたウェスタンブロッティングで検出した。結果として、変異型ｐ５３を発現しＧＥＦ−Ｈ１が誘導されている細胞株では、ＲｈｏＡの活性が５倍以上上昇していることが判明した（図５）。【００７８】
次に様々なガン細胞（２９種類）においてｐ５３の変異とＧＥＦ−Ｈ１遺伝子発現量の相関を調べた。図６に示すようにＧＥＦ−Ｈ１の遺伝子発現は変異細胞株群において有意に上昇していることが判った（Ｐ＜０．０１）。【００７９】
次に、変異型ｐ５３によるＧＥＦ−Ｈ１の発現が癌化の進行を促進しているかどうかを調べるため、野生型及び変異型ｐ５３細胞株においてＧＥＦ−Ｈ１の発現をｓｉＲＮＡにて抑制し、細胞増殖能を調べた。すなわち、ＧＥＦ−Ｈ１のｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社)をＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いて癌細胞へトランスフェクションし、３日後にＭＴＴ法にて生細胞率を測定した。【００８０】
図７〜９（野生型ｐ５３を発現する癌細胞株）及び図１０〜１２（変異型ｐ５３を発現する癌細胞株）に示すように、野生型ｐ５３を発現する細胞群に比して変異型ｐ５３を発現する細胞群ではＧＥＦ−Ｈ１の発現抑制により、有意に細胞増殖能が低下していることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明によれば、ｐ５３の変異を直接検出することなく、また、被験者に負担をかけることなくｐ５３の機能異常を検出することや、かかる機能異常に起因する癌の診断を行うことが可能となる。さらに、本発明によれば、ｐ５３が関与する癌の治療に有効な化合物の評価が可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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