(57)【要約】  ＨＣＶ関連疾患を有する患者を治療する方法であって，前記患者に，患者のＨＬＡと適合したＨＬＡ結合モチーフを配列中に含み，かつ，Ｃ型肝炎ウイルス患者で検出される抗体により認識されるＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドと，インターフェロンまたは肝庇護剤の少なくとも一種類以上、好ましくはインターフェロンとを組み合わせて投与することを含む方法が開示される。本発明の方法は、特にインターフェロン，リバビリン不応症例，肝細胞癌発生治療後症例に対して適用することができる，慢性肝炎に対する新しい治療法である。また，患者のＨＬＡと適合したＨＬＡ結合モチーフを配列中に含み，かつ，Ｃ型肝炎ウイルス患者で検出される抗体により認識されるＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドを含む，インターフェロンまたは肝庇護剤の少なくとも一種類以上、好ましくはインターフェロンと併用してＨＣＶ関連疾患を有する患者を治療するための医薬組成物も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＣＶ関連疾患を有する患者を治療する方法であって，前記患者に，患者のＨＬＡと適合したＨＬＡ結合モチーフを配列中に含み，かつ，Ｃ型肝炎ウイルス患者で検出される抗体により認識されるＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドと，インターフェロンまたは肝庇護剤の少なくとも1種類以上とを組み合わせて投与することを含む方法。
【請求項２】
前記Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドが，前記患者の血液中に存在する抗ＨＣＶ抗体のペプチド反応性に基づいて選択される，請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドが，配列番号１−８，１６，２０および３８のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする，請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドが，ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による認識性を有することを特徴とする，請求項１−３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
インターフェロンが，１回投与あたり３００万ＩＵ―１０００万ＩＵの用量で投与される，請求項１−４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記患者が，インターフェロンによる治療またはインターフェロンとリバビリンとの併用による治療に応答しない患者である，請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
患者のＨＬＡと適合したＨＬＡ結合モチーフを配列中に含み，かつ，Ｃ型肝炎ウイルス患者で検出される抗体により認識されるＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドを含む，インターフェロンまたは肝庇護剤の少なくとも1種類以上と併用してＨＣＶ関連疾患を有する患者を治療するための医薬組成物。
【請求項８】
前記Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドが，前記患者の血液中に存在する抗ＨＣＶ抗体のペプチド反応性に基づいて選択される，請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドが，配列番号１−８，１６，２０および３８のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項７または８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドが，ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による認識性を有することを特徴とする請求項７−９のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，Ｃ型肝炎の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス性肝炎には，主としてウイルスが経口感染するＡ型肝炎と血液を介して感染するＢ型肝炎やＣ型肝炎がある。このＣ型肝炎は，慢性化して肝硬変や肝癌に移行する割合が非常に高い疾患の１つである。【０００３】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は，フラビウイルス科に属する１本鎖ＲＮＡウイルスであり，日本に２００万人以上，世界中では約１億７０００万人のＣ型肝炎ウイルス感染者がいると言われている。【０００４】
慢性Ｃ型肝炎患者の肝臓では，慢性の炎症が継続している。この炎症の継続こそが肝硬変への移行，強いては肝細胞癌発生の素地となるものである。肝硬変患者では年率７−８％という高率で肝細胞癌の発生を認め，慢性肝炎患者でもその発生率は年率２％に達する（Tsubota  A,  et  al,  Hepatology  19  :  1088-1094,  1994）。また，患者血清ＡＬＴ値が高いほど肝癌の発生リスクが高いことは広く知られている。このことから，肝細胞癌を予防するためには，肝細胞の慢性の炎症を収束させることが重要であると考えられる。【０００５】
現在，Ｃ型慢性肝炎に対する抗ウイルス療法は，インターフェロン単独もしくはリバビリンとの併用療法が広く行われている。インターフェロン・リバビリン併用療法における著効率は，２４週投与で約３０％，４８週投与で約４０％である（McHutchison  JG  et  sl,  N  Engl  J  Med  339;  1485,  1998）。しかし，その効果は，ウイルスの遺伝子型〔ジェノタイプ〕やウイルス量によって異なり，ジェノタイプ１や高ウイルス量では，効果が低いとされている。ジェノタイプ１での効果は，２４週投与で約１５％，４８週で約３０％であり，高ウイルス量（＞２×１０６copies/ml）では，２４週で約２５％，４８週で約３５〜４０％である（McHutchison  JG  et  sl,  N  Engl  J  Med  339;  1485,  1998,  Manns  MP  et  al,  Lancet  358;  958,  2001）。【０００６】
最近，長期作用型のペグ・インターフェロンが開発され，各施設で大規模なトライアルが行われている。その効果は，全体では単独療法で約３０％，リバビリンとの併用療法では約５５％であり，難治性のジェノタイプ１では単独療法で約２０％，リバビリン併用療法で約４５％である。高ウイルス量（＞２×１０６copies/ml）では，単独療法で約２０％，リバビリン併用療法で，約５０％である。ジェノタイプ１かつ高ウイルス量での効果に至っては，単独療法で約１５％，リバビリン併用療法で約４０％となっている(Fried  MW  et  al,  N  Engl  J  Med  347;  975,  2002)。実際の臨床現場では，ウイルス量は＞５００ＫＩＵのことが多く，その効果は２０％程度とされている（Sjogen  MH,  et  al:  AASLD,  2001）。この様に，治療効果が最大でも，約半数の患者にしか効果がなく，インターフェロン（ペグ・インターフェロンを含む）とリバビリンとの併用療法に不応であった症例に対しては現在のところ新たなる治療法がない。【０００７】
また，慢性Ｃ型肝炎またはＣ型肝硬変に肝細胞癌が合併した症例では，肝細胞癌に対する根治治療が優先される。しかし，肝細胞癌の特徴として多中心性の発育をするため，肝細胞の炎症が継続する限り肝細胞癌は再発し，その再発率は１年で２０％，３年で５０％と極めて高い。【０００８】
【非特許文献１】Tsubota  A,  et  al,  Hepastology  19  :  1088-1094,  1994
【非特許文献２】McHutchison  JG  et  sl,  N  Engl  J  Med  339;  1485,  1998
【非特許文献３】Manns  MP  et  al,  Lancet  358;  958,  2001
【非特許文献４】Fried  MW  et  al,  N  Engl  J  Med  347;  975,  2002
【非特許文献５】Sjogen  MH,  et  al:  AASLD,  2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって，本発明は，ＨＣＶ関連疾患の新しい治療法を提供することを目的とする。特に，本発明は，インターフェロン／リバビリン不応症例，肝細胞癌発生治療後症例に対して，慢性肝炎に対する新しい治療法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は，ＨＣＶ関連疾患を有する患者を治療する方法であって，前記患者に，患者のＨＬＡと適合したＨＬＡ結合モチーフを配列中に含み，かつ，Ｃ型肝炎ウイルス患者で検出される抗体により認識されるＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドと，インターフェロンまたは肝庇護剤(hepatoprotector)の少なくとも1種類以上とを組み合わせて投与することを含む方法を提供する。好ましくは、Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドとインターフェロンとを組み合わせて投与する。【００１１】
本明細書において用いる場合，「ＨＣＶ関連疾患」とは，Ｃ型肝炎ウイルスの感染によって引き起こされる疾患を意味し，例えば，急性および慢性の肝炎，肝硬変，および肝細胞癌が含まれる。「組み合わせて投与する」とは，ＨＣＶ関連疾患の治療のために設計される投与計画において，C型肝炎ウイルス由来ペプチドとインターフェロンまたは肝庇護剤の少なくとも1種類以上とを同時にまたは別々に投与することを意味する。例えば，ペプチドとインターフェロンとをそれぞれ１ヶ月に１回から数回ずつ，同日にまたは別々の日に投与してもよく，あるいはペプチドを一定期間投与した後に，インターフェロンを一定期間投与してもよい。好ましくは，ペプチドを一定期間投与して患者の血漿中の投与ペプチドにたいする抗体上昇，もしくは，細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の増加が認められた後に，ペプチドとインターフェロンとをそれぞれ１ヶ月に１回から数回ずつ，同日にまたは別々の日に投与する。更に好ましくは，ペプチドを一定期間投与して患者の血漿中の投与ペプチドにたいする抗体価の上昇と細胞傷害性Ｔ細胞の増加が認められた後に，ペプチドとインターフェロンとをそれぞれ１ヶ月に１回から数回ずつ，同日にまたは別々の日に投与する。なお，本発明における組み合わせ投与には，インターフェロンを一定期間投与する治療に応答しなかった患者に，別の投与計画としてペプチドを単独で投与することは含まれない。【００１２】
別の観点においては，本発明は，患者のＨＬＡと適合したＨＬＡ結合モチーフを配列中に含み，かつ，Ｃ型肝炎ウイルス患者で検出される抗体により認識されるＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドを含む，インターフェロンまたは肝庇護剤の少なくとも1種類以上と併用してＨＣＶ関連疾患を有する患者を治療するための医薬組成物を提供する。【００１３】
好ましくは，投与されるＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドは，患者の血液中に存在する抗ＨＣＶ抗体のペプチド反応性もしくは細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の存在に基づいて選択される。更に好ましくは抗ＨＣＶ抗体のペプチド反応性と細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の両方の存在に基づいて選択される。【００１４】
また好ましくは，Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドは，配列番号１−８，１６，２０および３８のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有する。また好ましくは，Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドは，ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による認識性を有する。【００１５】
インターフェロンの好ましい投与量は，インターフェロンの種類，ジェノタイプ，ウイルス量等により異なるが，一般に３００万ＩＵ―１０００万ＩＵである。例えば，ペグ・インターフェロンの場合は，ペガシス（中外製薬株式会社）は，９０もしくは１８０μｇ，ペグ・イントロン（シェーリングプラウ）は１．５／ｋｇ体重で投与することができる。【００１６】
本発明において好ましくは，患者は，インターフェロンによる治療またはインターフェロンとリバビリンとの併用による治療に応答しない患者である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のC型肝炎ウイルス由来ペプチドとインターフェロンまたは肝庇護剤の少なくとも１種類以上とを併用して投与することによって、HCV関連疾患を有する患者を治療し得、特に、C型肝炎ウイルス由来ペプチドとインターフェロンとを併用することによって、インターフェロン単独またはインターフェロンとリバビリンとの併用による治療に応答しない患者に対しても優れた改善効果を得ることができる。このような中でも、本発明の、C型肝炎ウイルス由来ペプチドと併用する薬剤としては、インターフェロンとの併用が好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は，Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドとインターフェロンの併用によるＣ型肝炎の治療の経過を示す。
【図２】図２は，Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドとインターフェロンの併用によるＣ型肝炎の治療の経過を示す。
【図３】図３は，Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドとインターフェロンの併用によるＣ型肝炎の治療の経過を示す。
【図４】図４は，Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドとインターフェロンの併用によるＣ型肝炎の治療の経過を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明者らは，先に，ＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識されるいくつかのペプチドと反応性を有するＩｇＧが，異なるＨＬＡクラスＩタイプや異なるＨＣＶゲノタイプには関係なく，ＨＣＶ感染患者の大多数に検出されることを見出した。さらに，これらのペプチドが対応するＨＬＡのＨＣＶ患者のＰＢＭＣからペプチド特異的ＣＴＬを誘導しうることを見出した。【００２０】
これらの結果に基づいて，ＨＬＡ−Ａ２４の患者８症例と−Ａ２患者３症例の標準治療（ＩＦＮ療法もしくはリバビリン併用療法）無効症例に対し，ＨＣＶ１ｂ由来ペプチドを投与したところ，ペプチドによる免疫賦活作用は大多数の症例にて，またウイルス量の低下は半数以上の症例で認められた。中間評価では副作用としては投与部位の軽度炎症反応が認められたが，それ以外の副作用は認められなかった。【００２１】
本発明らはさらに，２クール以上の０．３ｍｇペプチド投与によって免疫賦活作用が確認された４症例に対して，低用量もしく通常量のペグ・インターフェロンを併用したところ，低用量ペグ・インターフェロン投与の2症例にウイルス量が著明低下（検出限界以下）すること，および，通常量を投与した残りの2例のうち1例においてもウイルス量が低下することを見出した。すなわち，本発明は，ペプチドと低用量もしくは通常量のインターフェロンとを組み合わせて投与することによりＨＣＶ関連疾患を有する患者を治療する方法を提供する。【００２２】
本発明に係るＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド（ＨＣＶペプチド）は，Ｃ型肝炎ウイルス由来の蛋白質の部分アミノ酸配列を含み，かつ，患者のＨＬＡと適合するＨＬＡ結合モチーフを配列中に含む。このペプチドは，Ｃ型肝炎ウイルス感染患者の血中抗体により認識されることができる。【００２３】
好ましくは，本発明に係るＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドは，細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができ，このようにして誘導されたＣＴＬは，ＨＣＶ感染細胞を標的にしてこの細胞を攻撃する。【００２４】
Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドとしては，例えば，ＨＬＡ−Ａ２結合モチーフを有するペプチドとしては下記の表２のＮｏ４０−５７，ＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフを有するペプチドとしては下記の表１のＮｏ３−３９および表２のＮｏ６０−６６として表されるペプチドが含まれる。【００２５】
【表１】
2006080340.tif 000002
【００２６】
【表２】
2006080340.tif 000003
【００２７】
好ましいペプチドとしては，例えば，Ｎｏ３のＮＳ５Ａ−２１３２（ＨＣＶのＮＳ５Ａタンパクの２１３２番から２１４０番に相当，以下同様に省略する），Ｎｏ１１（ＮＳ３−１２６６），Ｎｏ１２（Ｅ２−４８８），Ｎｏ１３（Ｅ１−２１３），Ｎｏ２２（ＮＳ２−９４７），Ｎｏ２５（ＮＳ３−１０８１），Ｎｏ３２（Ｃ−１７６），Ｎｏ３８（Ｃ−１７３），Ｎｏ４０（Ｃ−３５），Ｎｏ６２（ＮＳ５Ｂ−２９９０），Ｎｏ４（Ｅ２−７１７），Ｎｏ１４（ＮＳ４Ｂ−１７１６），Ｎｏ１８（ＮＳ２−８８５），Ｎｏ３９（Ｅ２−７１１）などが挙げられる。【００２８】
本発明において特に好ましいＨＣＶペプチドの１つは，以下のアミノ酸配列を有するＨＬＡ−Ａ２結合性モチーフを有するペプチド：
Ｃ−３５：ＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬ（配列番号１）
である。ＨＣＶ感染患者においては，このペプチドに対するペプチド反応性ＩｇＧ抗体の検出率およびＨＣＶ感染症特異性が，それぞれ９３％と１００％と非常に高い。【００２９】
また本発明において特に好ましい別のＨＣＶペプチドは，以下のアミノ酸配列を有するＨＬＡ−Ａ２４結合性モチーフを有するペプチド：
ＮＳ５Ａ−２１３２：ＲＹＡＰＡＣＫＰＬ（配列番号２）
Ｅ２−４８８：ＨＹＡＰＲＰＣＧＩ（配列番号３）
Ｅ１−２１３：ＶＹＥＡＡＤＭＩＭ（配列番号４）
ＮＳ３−１０８１：ＶＹＨＧＡＧＳＫＴＬ（配列番号５）
Ｃ−１７６：ＩＦＬＬＡＬＬＳＣＬ（配列番号６）
Ｃ−１７３：ＳＦＳＩＦＬＬＡＬＬ（配列番号７）
Ｅ２−７１７：ＥＹＶＬＬＬＦＬＬ（配列番号８）
ＮＳ４Ｂ−１７１６：ＰＹＩＥＱＧＭＱＬ（配列番号１６）
ＮＳ２−８８５：ＩＦＴＩＴＫＩＬＬ（配列番号２０）
Ｅ２−７１１：ＳＦＡＩＫＷＥＹＶＬ（配列番号３８）
である。特に，ＮＳ５Ａ−２１３２は，ＨＬＡ−Ａ２４陽性の多くの患者において，細胞性免疫および液性免疫の両方を誘導することができる。【００３０】
また，本発明に係るＨＣＶペプチドは，ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による認識性を有するペプチドをさらに含んでいてもよい。細胞内で製造された抗原タンパクが細胞内で分解されたペプチドからなる，このＨＬＡに結合可能な抗原ペプチドには，ＨＬＡのタイプごとにその配列にモチーフがあり，細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）はこの抗原ペプチドとＨＬＡとの複合体を認識してＨＣＶ感染細胞を傷害する。【００３１】
本発明に係るＨＣＶペプチドは，通常の化学的合成法，タンパク分子の酵素的分解法，目的のアミノ酸配列をコードする塩基配列を発現するように形質転換した宿主を用いた遺伝子組換え技術などにより製造することができる。【００３２】
目的とするペプチドを化学的合成法で製造する場合には，通常のペプチド化学においてそれ自体公知の慣用されている手法によって製造することができ，例えば，ペプチド合成機を使用して，固相合成法により合成することができる。このようにして得られた粗ペプチドは，タンパク質化学において通常使用されている精製方法，例えば，塩析法，限外ろ過法，逆相クロマトグラフィー法，イオン交換クロマトグラフィー法，アフィニティークロマトグラフィー法などによって精製することができる。【００３３】
一方，所望のペプチドを遺伝子組換え技術で生産する場合には，例えば，合成またはクローニングした目的のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を適当な発現ベクターに組込み，この発現ベクターを用いて微生物や動物細胞を形質転換して，得られた形質転換体を培養することによって，所望のペプチドを得ることができる。使用できる発現ベクターとしては，当該技術分野において公知であるプラスミド，ウイルスベクターなどを用いることができる。【００３４】
このペプチド生産技術における発現ベクターを用いた宿主細胞の形質転換方法としては，それ自体公知の方法，例えば，塩化カルシウム法，リン酸カルシウム共沈殿法，ＤＥＡＥデキストラン法，リポフェクチン法，エレクトロポレーション法などが使用でき，使用する宿主細胞に基づいて適宜選択するのがよい。得られたペプチドの精製は，培養した培地から回収した細胞抽出液もしくは培養上清から上記精製法により行うことができる。【００３５】
Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドからなるワクチンは，上記のようにして製造したペプチドを，医薬的に許容される補助剤および／または担体と適宜混合することにより調製する。補助剤としては，免疫応答を強化し得るアジュバント，例えばフロイントの不完全アジュバント，水酸化アルミニウムゲルなどを使用することができる。また，担体としては，例えば，ＰＢＳ，蒸留水などの希釈剤，生理食塩水などを使用することができる。【００３６】
ペプチドワクチンは，その使用形態に応じて，例えば，経口または静脈投与や皮下投与など経皮経路で投与することができる。その剤形としては，例えば，錠剤，顆粒剤，ソフトカプセル剤，ハードカプセル剤，液剤，油剤，乳化剤などが挙げられる。かかる医薬組成物の投与量は，投与する患者の症状などにより，適宜変動し得るが，一般的には，成人に対して１日当たり，ペプチド量として０．１−１０ｍｇが好ましく，投与間隔としては数日ないし数ヶ月に１回投与することが好ましい。【００３７】
好ましくは，投与されるＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドは，患者の血液中に存在する抗ＨＣＶ抗体のペプチド反応性もしくは細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の存在に基づいて選択される。更に好ましくは抗ＨＣＶ抗体のペプチド反応性と細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の両方の存在に基づいて選択される。ここで，「抗ＨＣＶ抗体のペプチド反応性」とは，投与すべきペプチドのいずれかが，患者の血液中に存在する抗ＨＣＶ抗体により認識されることをいう。それぞれの患者における抗ＨＣＶ抗体のペプチド反応性を検査して，各人に適するペプチドのみを投与する，いわゆるテーラーメイド型の投与により，より高い治療効果を期待することができる。がんペプチドワクチン臨床試験における経験により，テーラーメイド型投与により二次免疫の賦活が速やかに誘導されるため，より安全により良い臨床効果が発現することが立証されている（Mine  et  al.,  Clin.Can.Res.  929-937,2004）。【００３８】
本発明の方法において用いられるインターフェロンとしては，市販のインターフェロン製剤のいずれを使用してもよい。インターフェロンは，例えば，皮下注射または筋肉注射により投与することができる。インターフェロンの好ましい投与量は，３００万ＩＵ―１０００万ＩＵ（インターフェロンの種類，ジェノタイプ，ウイルス量により変化），ペグ・インターフェロンの好ましい投与量は，ペガシス（中外製薬株式会社）は，９０もしくは１８０μｇ，ペグ・イントロンは１．５／ｋｇ体重である。本発明にしたがってペプチドワクチンと併用することにより，Ｃ型肝炎を治療するために通常用いられる用量より少ない用量のインターフェロンで治療効果を得ることができる。特に好ましくは，インターフェロンはペプチドワクチンにより患者の抗体価が上昇した後に投与を開始する。このことにより，インターフェロンによる治療効果を上げることができる。【００３９】
さらに本発明においては、インターフェロンの代わりに、またはインターフェロンに加えて、１種類またはそれ以上の肝庇護剤(hepatoprotector)をＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドと併用してもよい。肝庇護剤とは、肝臓の炎症を抑制する機能を有する薬剤であり、例えば、抗炎症剤や肝機能改善剤、肝臓製剤、漢方製剤等が挙げられる。坑炎症剤としては、例えば、グリチルリチン製剤（強力ネオミノファーゲンC等）、副腎皮質ホルモン（コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、ベタメタゾン、プレドニゾロン及びこれらの誘導体等）等が挙げられる。肝機能改善剤としては、例えば、ウルソデオキシコール酸、アミノエチルスルホン酸、グルクロン酸アミド、グルクロン酸ナトリウム、グルクロノララクトン、プロポルフィリン二ナトリウム、ジクロロ酢酸ジイソポロピルアミン、チオプロニン、ポリエンホスファチジルコリン、グルタチオン、メチルメチオニンスルホニウムクロライド、マロチラートなどが挙げられる。肝臓製剤としては、肝臓加水分解物、肝臓抽出物などが挙げられる。漢方製剤としては、ショウサイコトウ、ダイサイコトウ等が挙げられる。【００４０】
ＨＣＶ関連疾患の治療効果の確認は，ＨＣＶ関連疾患に罹患している被験者の血中抗体価，すなわちペプチドに対する反応性を有する抗体の血中濃度を，ＥＬＩＳＡ等の慣用の方法によりモニターすることによって行うことができる。また，ＨＣＶ  ＲＮＡの量をＲＴ−ＰＣＲ等の慣用の方法により測定することにより，ウイルス量をモニターすることができる。【００４１】
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００５−０２０９８２号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
【実施例】
【００４２】
本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。ただし，これらの実施例は本発明をより具体的に説明するために例示的に示したものであり，本発明は以下の実施例により限定されるものではない。【００４３】
ペプチドに反応性を有する抗体の測定
患者血液中のペプチド特異的抗体のレベルは，酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。簡単には，各ペプチドをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し，−２０℃で保存した。化学架橋剤であるジサクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）（ＰＩＥＲＣＥ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を含む０．１Ｍ炭酸バッファで希釈したペプチド（２０μｇ／ウェル）をＥＬＩＳＡプレートに結合させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）でウェルを３回洗浄した。プレートをＢｌｏｃｋ  Ａｃｅ（Ｙｕｋｉｊｉｒｕｓｈｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）により４℃で一晩ブロッキングした。血清サンプルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＢｌｏｃｋＡｃｅで１００倍，２００倍，４００倍に希釈し，１００μｌ／ウェルのサンプルを各ウェルに加えた。３７℃で２時間インキュベートした後，プレートをＰＢＳＴで９回洗浄し，１００μｌ／ウェルの１０００倍希釈ウサギ抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的）（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）とともに３７℃で２時間インキュベートした。９回洗浄した後，１００μｌ／ウェルの１：１００希釈抗ウサギＩｇＧ結合西洋ワサビパーオキシダーゼ・デキストランポリマー（Ｅｎ  Ｖｉｓｉｏｎ，ＤＡＫＯ）を各ウェルに加え，プレートを室温で４０分間インキュベートした。洗浄した後，１００μｌ／ウェルのテトラメチルベンチジン基質溶液（ＫＰＬ，Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ，ＵＫ）を加え，１．０Ｍのリン酸を加えることにより反応を停止させた。【００４４】
ペプチドワクチンの投与
ＨＬＡ−Ａ２陽性またはＨＬＡ−Ａ２４陽性のＨＣＶ感染者において，本発明のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドを用いたワクチンの抗ウイルス効果を調べた。被験者はいずれも，ＨＣＶ１ｂに感染しており，インターフェロン＋リバビリンもしくはインターフェロン単独による治療に応答しなかった患者である。【００４５】
Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドＣ−３５，ＮＳ５Ａ−２１３２，Ｅ２−４８８，Ｅ１−２１３およびＮＳ３−１０８１はＧＭＰ適合下に合成し，精製し，凍結乾燥粉末として保存した。投与直前に０．３ｍｇのペプチドを少量のＤＭＳＯに溶解し，生理食塩水０．３ｍｌを加え，さらに不完全フロイントアジュバント０．３ｍｌを加えてディスポ・シリンジ（Ｂ・ｂｒｏｕｎ社）で混合し，エマルジョン化した。各ペプチドのエマルジョン（合計０．６ｍｌ／ペプチド）を大腿部や側背部，腹部などの皮下組織内に各々別々に注射した。【００４６】
まず，患者のリンパ球と血漿中のペプチドに対するＣＴＬ及び抗体の有無を検査して，個々の患者ごとにいずれもが陽性（優先選択），もしくはいずれかが陽性であるペプチドのみを投与した。投与は，２週間ごとに，１回あたり０．３ｍｇのペプチドを含むエマルジョンを側胸部，もしくは大腿部や腹部に注射することにより行った。投与は，６回投与を１クールとし，１クール終了後の有害事象，血液検査による免疫賦活の有無，ウイルス安定度など総合的に判定した。次に，第２クールを開始し，合計１２回投与した。なお，投与前に，個々のペプチド皮内反応溶液（１０μｇ／０．０５ｍｌ）による皮内反応にてアレルギー反応陰性を確認し，アレルギー反応陽性を示したペプチドは投与しなかった。【００４７】
ＨＣＶ  ＲＮＡの量およびＧＯＴ，ＧＰＴ，ＡＦＰの値を継続的にモニターした。ＨＣＶ  ＲＮＡの測定は，測定キット（アンプリコア  ＨＣＶ  モニター  ｖ２．０  シリーズ（ロッシュ社））を用いてＲＴ−ＰＣＲにより行った。感度は，定性法で０．０５ＫＩＵ／ｍｌ以上，定量法で０．０５−５０００ＫＩＵ／ｍｌである。ＨＣＶの陰性化とは，定性法によりＨＣＶ  ＲＮＡが検出されないことを表す。【００４８】
インターフェロンの投与
さらに，２クール以上の０．３ｍｇペプチド投与によって免疫賦活作用が確認された４症例に対して，インターフェロン併用療法を行った。インターフェロン投与は，ＰＥＧ−ＩＦＮ９０μｇ（商品名ペガシス）を週１回皮下注射することにより行った。この投与量は常用量の約１／２である。【００４９】
結果を図１−４に示す。４例のうち２例において，インターフェロン併用療法の開始から８週間（８回投与）までにＨＣＶの陰性化が認められた。これらの症例のうち一例はＩＦＮ単独，もう一例はＩＦＮ／リバビリン併用で無効であった症例である。また，これまでの中間評価では特筆すべき副作用はなかった。【００５０】
すなわち，本発明にしたがって，ペプチドワクチンとインターフェロンとを組み合わせて投与することにより，慢性Ｃ型肝炎の治療が可能であることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明によれば、C型肝炎ウイルス由来ペプチドとインターフェロンまたは肝庇護剤の少なくとも１種類以上とを併用して投与することによって、HCV関連疾患を有する患者を治療しえるため、有用である。特に、C型肝炎ウイルス由来ペプチドとインターフェロンとを併用することによって、インターフェロン単独またはインターフェロンとリバビリンとの併用による治療に応答しない患者に対しても優れた改善効果を得ることができるため、有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年6月21日(2007.6.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者のＨＬＡと適合したＨＬＡ結合モチーフを配列中に含み，かつ，Ｃ型肝炎ウイルス患者で検出される抗体により認識されるＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドを含む，インターフェロンまたは肝庇護剤の少なくとも1種類以上と併用してＨＣＶ関連疾患を有する患者を治療するための医薬組成物。
【請求項２】
前記Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドが，前記患者の血液中に存在する抗ＨＣＶ抗体のペプチド反応性に基づいて選択される，請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドが，配列番号１−８，１６，２０および３８のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドが，ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による認識性を有することを特徴とする請求項１−３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記患者が，インターフェロンによる治療またはインターフェロンとリバビリンとの併用による治療に応答しない患者である，請求項１−４のいずれかに記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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