(57)【要約】  子宮内膜または月経血から得られた子宮膜由来の、または月経血、臍帯血若しくは胎児付属臓器から単離された間葉系幹細胞由来の心筋細胞に分化する能力を有する細胞が開示されている。本発明による細胞は、その入手が比較的容易であり、かつ例えば多数のＨＬＡタイプを供給可能な月経血、臍帯血、または出産後に廃棄される胎児付属臓器から得ることが出来る。この細胞は、心筋細胞との共培養により、高頻度で心筋細胞に分化する。さらに心筋細胞への分化は、不死化細胞を脱メチル化処理（例えば、５−アザシチジン処理）しなくとも高頻度で生じる。本発明による細胞によれば、心臓再生薬または心臓疾患治療薬を提供できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
子宮内膜組織または月経血から単離された子宮膜由来の、または月経血、臍帯血若しくは胎児付属臓器から単離された間葉系幹細胞由来の、心筋細胞に分化する能力を有する細胞。
【請求項２】
自己または他人の心筋細胞再生のために単離された、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
不死化された、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
前記不死化が、テロメラーゼまたはBmi-1の細胞内発現によりなされた、請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
前記不死化が、ヒトパピローマウイルスのE6またはE7遺伝子の細胞内発現によりなされた、請求項３に記載の細胞。
【請求項６】
心室筋細胞または洞結節細胞に分化する能力を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７】
心筋由来の細胞と共培養することにより心筋細胞に分化する能力を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８】
前記心筋由来の細胞が、哺乳類由来の細胞である、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
前記哺乳類由来の細胞が、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、サルおよびヒトからなる群から選択されるものである、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
CD140a陰性である、請求項５に記載の細胞。
【請求項１１】
CD13、CD29、CD44、CD54、CD55、CD59、CD90、およびCD166の少なくとも一つに陽性である、請求項５に記載の細胞。
【請求項１２】
CD14、CD24、CD31、CD34、CD45、CD50、およびFlk-1の少なくとも一つに陰性である、請求項５に記載の細胞。
【請求項１３】
ｈＥＰＣ１００細胞（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０３６８）またはｈＥＰＣ２１４細胞（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０３６９）である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４】
前記胎児付属臓器が、胎盤、臍帯、または羊膜である、請求項１に記載の細胞。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の細胞から分化誘導された、心筋細胞またはその前駆細胞。
【請求項１６】
心筋細胞の調製法であって、
子宮内膜組織または月経血から子宮内膜由来の細胞、または月経血、臍帯血若しくは胎児付属臓器から単離された間葉系幹細胞を得て、
前記細胞を心筋細胞へ分化誘導すること
を少なくとも含んでなる、方法。
【請求項１７】
前記分化誘導が、心筋細胞との共培養、ＤＮＡの脱メチル化処理による分化誘導、胎児の心臓発生領域で発現している因子または胎児の心臓発生段階において心筋細胞への分化に働く因子による分化誘導、および心筋細胞への分化能を有する細胞または該細胞から分化した心筋細胞の培養上清による分化誘導からなる群から選択される少なくとも一つのにより行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記分化誘導が、心筋細胞との共培養により行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記分化誘導が、心筋細胞との共培養と、ＤＮＡの脱メチル化処理による分化誘導、胎児の心臓発生領域で発現している因子または胎児の心臓発生段階において心筋細胞への分化に働く因子による分化誘導、および心筋細胞への分化能を有する細胞または該細胞から分化した心筋細胞の培養上清による分化誘導からなる群から選択される少なくとも一つとの組み合わせにより行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＤＮＡの脱メチル化処理が、デメチラーゼ、５−アザシチジンおよびジメチルスルフォキシド（DMSO）からなる群から選択される少なくとも一種によるものである、請求項１７または１９に記載の方法。
【請求項２１】
子宮内膜由来の細胞を、心筋細胞へ分化誘導する前に、不死化することを含んでなる、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記不死化が、テロメラーゼまたはBmi-1の細胞内発現によりなされる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記不死化が、ヒトパピローマウイルスのE6またはE7遺伝子の細胞内発現によりなされる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記共培養される心筋由来の細胞が、哺乳動物由来のものである、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記哺乳動物が、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、サルおよびヒトからなる群から選択されるものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の細胞を有効成分として含んでなる、医薬。
【請求項２７】
心臓再生薬として用いられる、請求項２６に記載の医薬。
【請求項２８】
心臓疾患治療薬として用いられる、請求項２６に記載の医薬。
【請求項２９】
心筋梗塞、虚血性心疾患、うっ血性心不全、不整脈、肥大型心筋症、拡張型心筋症、心筋炎、または弁膜症の治療のための、請求項２６に記載の医薬。
【請求項３０】
心臓の先天性遺伝子疾患についての変異遺伝子に対する野生型遺伝子を導入した、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の細胞を有効成分として含んでなる、先天性心臓疾患治療薬。
【請求項３１】
心臓の先天性遺伝子疾患の患者より単離された心筋細胞への分化能を有する細胞に、正常な遺伝子を導入したのち、この細胞を前記患者に移植するために培養することを含んでなる、心筋細胞への分化能を有する細胞の調製方法。
【請求項３２】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の細胞に発現する抗原を特異的に認識する、抗体。
【請求項３３】
請求項３２に記載の抗体を用いて、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の細胞を単離する方法。
【請求項３４】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の細胞を用いることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の細胞に特異的な表面抗原を取得する方法。
【請求項３５】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の細胞を用いることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の細胞を増殖する因子をスクリーニングする方法。
【請求項３６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の細胞を用いることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の細胞の心筋細胞への分化を誘導する因子をスクリーニングする方法。
【請求項３７】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の細胞を含んだ、培養上清。
【請求項３８】
請求項３７記載の培養上清を用いることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の細胞を心筋細胞に分化誘導する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、子宮内膜または月経血から得た子宮膜由来の、または月経血、臍帯血若しくは胎児付属臓器から得た間葉系幹細胞由来の、心筋細胞への分化能を有する細胞に関し、更に詳しくは、心筋細胞への分化能を有する細胞の増殖方法および心筋細胞への分化誘導、ならびにこれら細胞を用いた心臓疾患の治療薬に関する。
【０００２】
背景技術
心筋細胞は、出生前は自律拍動しながら活発に細胞分裂を行っている。しかし、出生と同時にその分裂能は喪失し、肝細胞のように再び細胞分裂能を獲得することはなく、また骨格筋細胞とも異なり衛星細胞といった未分化な前駆細胞を持つこともない。従って、心筋梗塞、心筋炎または老化等に伴い心筋細胞が壊死すると、生体内では残存心筋細胞の細胞分裂ではなく細胞の肥大がおきる。心肥大は初期においては生理的適応であるが、また共存する心線維芽細胞の増殖による間質の線維化と相まって心臓自体の拡張機能の低下、さらには収縮機能の低下へと結びつき心不全を呈するようになる。心筋梗塞等による心不全のこれまでの治療は心収縮力の増強、血管拡張薬による心臓の圧負荷・容量負荷の軽減、利尿薬による血流量の減少等の対症療法を中心に行われてきた。これに対し、心臓移植は重症心不全に対する根本的な治療法であるが、臓器提供者の不足、脳死判定の難しさ、拒絶反応、医療費の高騰等の問題から心臓移植が一般的な医療に普及するのは簡単ではない。実際、心臓病は我が国の死亡原因の第３位となっており（厚生白書平成１０年）、失われた心筋細胞を再生することができれば医療福祉の大きな前進につながると考えられる。
【０００３】
現在までに、心筋細胞の性質を保存した細胞株としては、心房性ナトリウム利尿ホルモンのプロモーターにSV40のlarge T抗原を組み換えて作製したトランスジェニックマウスの心房に生じた腫瘍から株化されたAT-1細胞が挙げられる[Science, 239; 1029-1038 (1988)]。しかしながら、該細胞はin vivoに移植すると腫瘍を形成するため、細胞移植には適さないという問題がある。そこで、このような背景のもと、心筋を再構築するため以下の方法が考えられた。
【０００４】
１つ目の方法は、心筋細胞以外の細胞を心筋細胞に変換する方法である。これは、線維芽細胞にMyoDを導入すると骨格筋細胞に変換できることから類推された。これまでに、マウスの胎児性癌細胞であるＰ１９細胞での成功例は示されているものの[Cell Struc. &Func., 21: 101-110 (1996)]、非ガン細胞での成功例は報告されていない。
【０００５】
２つ目の方法は、心筋細胞に再び分裂能を付与する方法である。これは、胎児期に心筋が拍動しながら分裂できる現象に基づいている。しかしながら、これまでに成功例は報告されていない。
【０００６】
３つ目の方法は、未分化な幹細胞から心筋細胞を誘導する方法である。すでに、胚性幹細胞（ES細胞）から心筋細胞を誘導できることが示されているが、胚性幹細胞自身を成体に移植するとカルシノーマを形成すること、抗原性などの問題が存在する[Nature Biotechnology, 17, 139-142 (1999)]。
【０００７】
従って、胚性幹細胞を現実の医療へと応用するためには、少なくとも心筋前駆細胞あるいは、心筋細胞を純粋に精製する技術が不可欠である。抗原性の問題はクローン化の技術により解決できる可能性は示唆されているが、煩雑な操作を必要とすることから一般的な医療への応用は容易ではない。
【０００８】
中絶胎児から未分化な細胞である心筋前駆細胞を取得して移植に用いる方法も考えられており、動物を用いた実験では心筋細胞として有効に機能することが知られている[Science, 264, 98-101 (1994)]。しかしながら、この方法で大量の心筋前駆細胞を取得することは困難であり、倫理の観点からも一般的な医療への応用は容易ではない。
【０００９】
成体骨髄には造血系幹細胞および血管幹細胞以外に間葉系幹細胞が存在し、間葉系幹細胞からは骨細胞、軟骨細胞、腱細胞、靱帯細胞、骨格筋細胞、脂肪細胞、ストローマ細胞、肝臓oval細胞が分化誘導できることが報告されている[Science, 284, 143-147 (1999); Science, 284, 1168-1170 (1999)]。一方、最近、マウス成体の骨髄から取得した細胞から、心筋細胞が分化誘導できることが報告された[J. Clinical Investigation, 103, 10-18 (1999)]。マウスの骨髄細胞から樹立された不死化細胞は、最大で50％程度筋管様細胞に分化することが報告されている（US2002/0142457）。最近、ヒトの骨髄細胞についても、マウスの骨髄細胞と同様に、心筋細胞への分化誘導が可能であることが報告された[The Journal of Gene Medicine, 6, 833-845 (2004);  Exp. Biol. Med., 229, 623-631 (2004)]が、分化誘導効率はマウス細胞と比較して低頻度である。また、骨髄から骨髄細胞を採取するためには全身麻酔が必要であり、採取できる幹細胞数が少ない。
【００１０】
一方、子宮内膜は、周期的に組織の剥離と再構築が行われており、組織幹細胞の存在が示唆されている。実際、ヒト子宮内膜にある種の幹細胞のマーカー[CD117(c-kit)、CD34]が発現していることが見出され［Fertility and Sterility, 81, 403-407 (2004)］、子宮内膜から組織幹細胞を分離同定する試みも報告されている［Australian and New Zealand Journal of Obstetrics and Gynaecology, 44, 380-386 (2004)］。しかし、子宮内膜に存在することが示唆されている組織幹細胞の分化能等の性質については十分解明されておらず、子宮内膜由来組織幹細胞が心筋細胞に分化する能力を有するかどうかについての報告はない。また、子宮内膜から心筋細胞への分化能力を有する幹細胞を分離同定するための有用なマーカーも報告されていない。
【００１１】
生体内の組織から目的の細胞を取得する方法として、各種表面抗原を認識する抗体が用いられている。例えば、未熟な造血幹細胞ではCD34+/CD38-/HLA-DR-/CD90  (Thy-1)+の特性を有していること、また、造血幹細胞が分化するに従い、CD38が発現しCD90(Thy-1)が消失することが知られている[蛋白質核酸酵素Vol．45，No13，2056-2062(2000)]。血管内皮細胞では、CD34、CD31、Flk-1、Tie-2、Ｅ−セレクチン等のマーカーを発現しており[分子心血管病Vol.1,No.3,294-302(2000)]、骨髄の間葉系幹細胞ではCD90、CD105、CD140a等のマーカーを発現している[Science, 284, 143-147 (1999); Science, 284, 1168-1170 (1999)]。マウス骨髄細胞由来の心筋に分化する細胞は、CD117(c-kit)、CD140ａ等のマーカーを発現しており（US2002/0142457）、ヒト骨髄細胞由来の心筋に分化する細胞は、CD13、CD29、CD44、CD55、CD59、CD90、CD105、CD166等のマーカーが発現していることが報告されている[The Journal of Gene Medicine, 6, 833-845 (2004)]。
【発明の概要】
【００１２】
本発明者は、今般、子宮内膜または月経血から得たヒト子宮内膜組織由来の細胞、または月経血、臍帯血若しくは胎児付属臓器から得た間葉系幹細胞が、心筋細胞との共培養により、高頻度で心筋細胞に分化する、との知見を得た。この心筋細胞への分化は、細胞を脱メチル化処理（例えば、５−アザシチジン処理）しなくとも高頻度で生じるとの知見を得た。本発明はかかる知見に基づくものである。
【００１３】
よって、本発明は、心筋細胞に分化する能力を有する細胞の提供をその目的としている。
【００１４】
また、本発明は、子宮内膜または月経血から得られた子宮膜由来の、または月経血、臍帯血若しくは胎児付属臓器から単離された間葉系幹細胞由来の、心筋細胞に分化する能力を有する細胞からの心筋細胞の調製法の提供をその目的としている。
【００１５】
また、本発明は、医薬、とりわけ心臓再生薬または心臓疾患治療薬の提供をその目的としている。
【００１６】
そして、本発明による細胞は、子宮内膜組織または月経血から単離された子宮膜由来の、または月経血、臍帯血若しくは胎児付属臓器から単離された間葉系幹細胞由来の、心筋細胞に分化する能力を有する細胞である。
【００１７】
本発明による細胞は、月経血、臍帯血、または出産後に廃棄される胎児付属臓器から得ることが出来ることから、その採取にあたり、新たな苦痛を与えることなく、繰り返し、比較的多量の試料を採取することができ、また、例えば多数のＨＬＡタイプを供給できる点で、従来の心筋細胞に分化する能力を有する細胞に比較して極めて有利である。
【００１８】
本発明による細胞は不死化されてもよく、その不死化は例えば、テロメラーゼまたはBmi-1の細胞内発現またはヒトパピローマウイルスのE6またはE7遺伝子の細胞内発現によりなされてよい。
【００１９】
また、本発明による心筋細胞の調製法は、子宮内膜組織または月経血から子宮内膜由来の細胞、または月経血、臍帯血若しくは胎児付属臓器から単離された間葉系幹細胞を得て、前記細胞を心筋細胞へ分化誘導することを少なくとも含んでなる。
【００２０】
本発明の好ましい態様によれば、この方法において、分化誘導は、心筋細胞との共培養、ＤＮＡの脱メチル化処理による分化誘導、胎児の心臓発生領域で発現している因子または胎児の心臓発生段階において心筋細胞への分化に働く因子による分化誘導、および心筋細胞への分化能を有する細胞または該細胞から分化した心筋細胞の培養上清による分化誘導からなる群から選択される少なくとも一つにより行われる。
【００２１】
本発明による心筋細胞の調製法において、子宮内膜由来の細胞を、心筋細胞へ分化誘導する前に、不死化されていてもよく、この不死化は、テロメラーゼまたはBmi-1の細胞内発現によりなされるか、またはヒトパピローマウイルスのE6またはE7遺伝子の細胞内発現によりなされる。
【００２２】
また、本発明による医薬は、上記の本発明による細胞を有効成分として含んでなるものであり、具体的には、心臓再生薬または心臓疾患治療薬として用いられる。
【００２３】
また、本発明の別の態様によれば、上記の本発明による細胞に、心臓の先天性遺伝子疾患についての変異遺伝子に対する野生型遺伝子を導入し、これを有効成分として含んでなる先天性心臓疾患治療薬が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】は、実施例１（３）における、不死化細胞から、Troponin I発現細胞が分化誘導された割合（心筋誘導率）と、共培養の有無、５−アザシチジン（5-azaＣ）処理の有無との関係を表す図である。
【図２】は、本発明によるE-MSC細胞の表面抗原の解析を、種々の抗体を用い、フローサイトメーターで測定した結果のグラフである。
【図３】は、図２と同様に、本発明によるE-MSC細胞の表面抗原の解析を、種々の抗体を用い、フローサイトメーターで測定した結果のグラフである。
【図４】は、図２と同様に、本発明によるE-MSC細胞の表面抗原の解析を、種々の抗体を用い、フローサイトメーターで測定した結果のグラフである。
【図５】は、図２と同様に、本発明によるE-MSC細胞の表面抗原の解析を、種々の抗体を用い、フローサイトメーターで測定した結果のグラフである。
【発明の具体的説明】
【００２５】
細胞の寄託
本発明による心筋細胞への分化能を有する細胞の具体例である、後記するＥ−ＭＳＣ（ｈＥＰＣ１００）細胞およびＥ−ＭＳＣ（ｈＥＰＣ２１４）細胞は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、平成１７年１月１９日（原寄託日）に寄託され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４６７およびＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４６８の受託番号を得ている。
【００２６】
１．心筋細胞への分化能を有する細胞の単離
本発明による心筋細胞への分化能を有する子宮内膜由来の細胞は、子宮内膜または月経血から単離することができる。以下に、心筋細胞への分化能を有する細胞を単離する方法を説明する。
ヒトの子宮内膜より心筋細胞への分化能を有する子宮内膜細胞を取得する方法としては、安全かつ効率的に取得される方法であれば特に限定されないが、Am.J.Pathol., 163, 2259-2269 (2003)に記載された方法に基づき行うことができる。
【００２７】
すなわち、外科手術により摘出されたヒト子宮内膜組織を、細かく切り、細胞を培養可能な培地に入れる。該培地としては、細胞が培養可能なものであれば特に限定されないが、好適にはα-MEM（α-minimnum essential medium）、DMEM（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）、IMDM(Isocove’s modified Dulbecco’s medium)等に1〜20％の動物由来の血清、好ましくは5〜10％のウシ胎児血清(FCS)を加えた培地で培養する。ペニシリンやストレプトマイシンなどの抗生物質を加えても良い。さらに、細胞の分離を良くするために、type3などのコラゲナーゼおよびdeoxyribonuclease IなどのDNA分解酵素を培地に添加し、20〜40℃、好ましくは37℃の条件で、例えば10分間〜5時間、好ましくは１時間、緩やかに振盪する。個々の子宮内膜腺を顕微鏡で観察しながら分離し、適当な培養容器、例えば、24-ウェル培養皿を用いて37℃、5％CO2の条件下で孵卵器にて培養することにより、心筋細胞への分化能を有する子宮内膜細胞を取得することができる。
【００２８】
マウスの子宮内膜細胞の単離は、特に限定されないが、McCormack SA and Glasser  SR [Endocrinology, 106, 1634-1649 (1980) ]に記載されている方法に基づき行うことができる。
【００２９】
すなわち、子宮を切片に切断し、タンパク質分解酵素、例えば、5mg/mlのトリプシンと25mg/mlのパンクレアチンを含むPBS（phosphate-buffed saline）に浸し、0〜37℃で、10分間〜３時間、好ましくは0℃で30分間〜１時間、さらに、室温にて10分〜3時間、好ましくは30分間〜１時間反応させる。酵素を含むPBS溶液を注意深く除去した後、１〜20％の動物由来の血清、好ましくは5〜10％のFCSを含む適当な培地、例えば、DMEM/F-12（DMEMとHam’s F-12 mediumを１：１に混合したもの）培地を加えることにより、トリプシンを失活させる。培地をPBSに置換し、組織を10秒間〜30分間、好ましくは30秒間ゆっくり振盪する。子宮組織を注意深く除き、細胞懸濁液をフィルター、例えば、70-μmのメッシュフィルターに通す。濾過液を例えば、1000×gで5分間遠心することにより、細胞を沈殿画分に回収する。細胞は、PBSに再懸濁して遠心することにより、洗浄しても良い。遠心操作により沈殿した細胞を、増殖可能な培地ならいずれの培地を使用することもできるが、1〜20％の動物由来の血清、好適には5〜10％のFCSを含むDMEM/F-12培地に懸濁する。培地に抗生物質、例えば、100units/mｌのペニシリン、100mg/mlのストレプトマイシンを加えても良い。また、非必須アミノ酸溶液を例えば、1％添加しても良い。このような方法を用いることにより、心筋細胞への分化能を有する子宮内膜細胞を取得することができる。
【００３０】
さらに、月経血からの単離は以下のとおり行うことができる。まず、月経１日目の月経血からの方が獲得される細胞数が多いことから、好ましくは月経１日目（生理が始まった１日目）の月経血を、生理用品ないしは直接、外陰部より採取する。採取した月経血を、好ましくは1%牛胎仔血清入りのDMEM (Dulbecco's modified MEM)培地（ペニシリン・ストレプトマイシンの抗生物質を添加]）に入れ、遠心分離により月経血に含まれる細胞を回収する。この細胞を、10%のFBS（牛胎仔血清）を含むα-MEM (α-modified MEM)、DMEM (Dulbecco's modified MEM)またはIMDM (Isocove's modified Dulbecco's medium)等の細胞培養用培地に再浮遊させることにより、月経血に由来する細胞液を得ることができる。
【００３１】
月経血、臍帯血若しくは胎児付属臓器（例えば、胎盤、臍帯、または羊膜）からの間葉系幹細胞の単離は以下のとおり行うことができる。すなわち、DMEM内で、摘出した組織を眼科用鋏で細断し(約1-5mm3大)、数分間静置した後、血液細胞が含まれる上清を廃棄し、再び、DMEMにて組織を洗浄する。この操作を３−４回繰り返す。その後、100Gで30秒程度の遠心分離を行ってもよい。
【００３２】
２．心筋細胞への分化能を有する細胞の培養
上記１の方法により単離した、心筋細胞への分化能を有する細胞を培養するために用いる培地としては、公知の細胞培養用培地（例えば、組織培養の技術基礎編  第三版、朝倉書店1996）を用いることができるが、好ましくはウシ等の血清を5〜20％添加した、α-MEM、DMEM、DMEM/F-12またはIMDM等の細胞培養用培地などが用いられる。培養条件は、細胞が培養可能であれば特に限定されないが、培養温度は33〜37℃が好ましく、さらに5〜10％の二酸化炭素ガスで満たした孵卵器で培養することが好ましい。心筋細胞への分化能を有する子宮内膜由来細胞は、通常の組織培養用のプラスチック製培養皿に接着して増殖することが好ましい。細胞が培養皿一面に増殖する頃、培地を除去して、トリプシン EDTA（ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid）溶液を加えることで細胞を浮遊させる。浮遊した細胞は、PBSあるいは該細胞培養用の培地で洗浄後、該細胞培養用の培地で5倍から20倍希釈して新しい培養皿に添加することで、さらに継代培養することができる。
【００３３】
３．心筋細胞への分化能を有する細胞からの心筋細胞の誘導方法
心筋細胞への分化能を有する細胞を心筋細胞に分化誘導する方法としては、
（１）心筋由来細胞との共培養、
（２）DNAの脱メチル化剤処理による分化誘導、
（３）胎児の心臓発生領域で発現している因子または胎児の心臓発生段階において心筋細胞への分化に働く因子による分化誘導、
（４）心筋細胞への分化能を有する細胞または該細胞から分化した心筋細胞の培養上清による分化誘導などの方法を挙げることができる。
【００３４】
本発明の好ましい態様によれば、上記（１）の方法を単独で、または上記（１）の方法に上記（２）〜（４）から選ばれる１つ以上の方法を組み合わせることにより、心筋細胞への分化能を有する細胞から心筋細胞を高率に誘導することができる。例えば、（１）の方法単独の場合では８０％以上、（１）と（２）とを組み合わせた場合には９５％以上の誘導率を得ることができる。
【００３５】
（１）心筋由来細胞との共培養
心筋由来細胞としては、心筋への分化能を有する細胞と共培養して、心筋細胞への分化誘導を促進することができる細胞であれば特に限定されない。本発明の好ましい態様によれば、心筋由来の細胞は哺乳類由来の細胞であり、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、サルおよびヒトからなる群から選択される。
【００３６】
本発明の好ましい態様によれば、心筋由来細胞として、マウスの胎児心筋細胞を用いることができる。マウス胎児心筋細胞としては、特に限定されないが、例えば、[The Journal of Gene Medicine, 6, 833-845 (2004)]に記載されている方法で調製することができる。この方法において、妊娠したマウスの系統及び妊娠期間は特に限定されないが、具体的には妊娠14〜16日のBALB/cAJclマウスを用いる。母マウスをエーテルで浅麻酔後、致死量のペントバルビタール腹腔内投与を行うことにより安楽死させる。安楽死確認後、切開開腹する。その際腹部をイソジン等で消毒し無菌的に操作することが望ましい。子宮を切開し胎児マウスを取り出す。同マウスをさらにイソジン消毒あるいは70％エタノール消毒を行い、胸部を眼科用ハサミで切開、胸壁を圧排することによって心臓を胸腔外へ突出させることができる。
【００３７】
その心臓を眼科用ハサミにて切除し、培地に浮遊させる。培地は特に限定されないが、５〜10％のウシ等の血清を含むDMEM培地、DMEM/F-12培地などが好ましい。胎児マウスの匹数については特に指定は無いが、好ましくは30〜50匹の胎児マウスから心臓を取り出し、同培地に浮遊させる。浮遊させた心臓は、眼科用ハサミにて鈍的に切断する。後の酵素反応が十分行われれば問題は無いが、心臓の原型を肉眼的に判別できない程度に、50〜100回程度ハサミにて細切することが望ましい。同組織から蛋白分解酵素を用いて心筋細胞を単離するが、該酵素としては、心筋を破壊せず、組織間質のみを消化する酵素であれば特に限定されない。具体的には、0.05％トリプシン及び0.25mmol/LのEDTAを含むPBSに心筋組織を投入し、20〜40℃にて5〜60分間、好ましくは37℃で5分間酵素反応させる。その後、１〜20％の動物由来の血清、好ましくは５〜10％のFCS入りのDMEMを用いて酵素反応を停止する。組織消化液は遠心器によって500〜2000回転/分、3分から１０分かけて遠心分離を行い、その沈殿物を5〜10％の血清を含むDMEM培地中に入れ、細胞を浮遊させる。細胞浮遊液を30分から3時間程度の間、通常の組織培養用皿上で培養し、接着性の低い細胞が含まれる上清のみを採取することにより、心筋細胞以外の細胞を除外する。上清に含まれる心筋細胞はどのような条件で培養してもかまわないが、同細胞を1x103〜1x107/cm2、好ましくは5x104〜5x105/cm2の細胞密度にて通常の組織培養用皿上で、33〜37℃の培養温度で、5〜10％の二酸化炭素ガスで満たした孵卵器にて培養することが好ましい。
【００３８】
上記初代心筋細胞の培養開始直後〜10日後、好ましくは1〜2日後に、その培養細胞上に心筋細胞への分化能を有する細胞を1x101〜1x105/cm2、好ましくは5x103/cm2の密度で添加する。心筋細胞への分化能を有する細胞の心筋への分化を確認するために、心筋細胞への分化能を有する細胞を共培養前に標識しておくことが望ましい。該標識としては、細胞障害性の無い色素で培養中に培養液中に溶出しない材質で有ればどのようなものでもかなわない。具体的には、[The Journal of Gene Medicine, 6, 833-845 (2004)]に記載されているように、green fluorescent protein (GFP)遺伝子をアデノウイルスによって心筋細胞への分化能を有する細胞に導入し、該細胞を緑色の蛍光を発する細胞として観察することができる。
【００３９】
数日後には、同期して収縮する初代マウス培養心筋細胞とは異なった動きをする緑色蛍光を示す細胞が観察でき、心筋細胞への分化能を有する細胞が心筋へ分化したことが確認できる。心筋の活動電位は、例えば、倒立顕微鏡と蛍光フィルターを用いて測定することにより、心筋特異的な電位波形を観察することができる。また、心筋のマーカータンパク質は、mRNAの発現を、RT-PCR、Northernブロット解析、DNAマイクロアレイ解析等にて検出することができるし、該タンパク質の発現を、該タンパク質に特異的な抗体を用いた免疫組織染色やWesternブロット解析等により検出することができる。好適なマーカー遺伝子/タンパク質としては、例えば、心筋特異的転写因子Nkx2.5/Csx、GATA4、TEF-1、MEF-2C、MEF-2D、MEF-2A、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（BNP）、α-ミオシン重鎖（α-MHC）、β-ミオシン重鎖（β-MHC）、ミオシン軽鎖-2a（MLC-2a）、ミオシン軽鎖-2v（MLC-2v）、α-心筋アクチン、心筋Troponin T、connexin43（Cnx43）等を挙げることができる[J. Clin. Invest., 103, 697-705 (1999)]。
【００４０】
（２）DNAの脱メチル化剤処理による分化誘導
DNAの脱メチル化剤としては、DNAに対して脱メチル化を引き起こす化合物であれば特に限定されないが、脱メチル化剤としては、染色体DNA中のCpG配列中のシトシン残基のメチル化を特異的に阻害する酵素であるデメチラーゼ、5-アザシチジン（以下、5-aza-Cと略す）、DMSO（dimethyl sulfoxide）などが挙げられる。デメチラーゼとしては、Nature, 397, 579-583 (1999)記載のデメチラーゼが挙げられる。DNAの脱メチル化剤処理による分化誘導の具体例を以下に示す。
3μmol/lから10μmol/lの間の濃度になるように5-aza-Cを心筋細胞への分化能を有する細胞を含む培地中に添加し、24時間上記培養条件下でインキュベーションする。培地を交換することで5-aza-Cを除去し、さらに２〜３週間培養することで心筋細胞を取得することができる。この方法により、好ましくは、例えば、洞結節細胞および心室型心筋細胞を分化誘導することができる。
【００４１】
（３）胎児の心臓発生領域で発現している因子または胎児の心臓発生段階において心筋細胞への分化に働く因子による分化誘導
胎児の心臓発生領域で発現している因子または胎児の心臓発生段階において心筋細胞への分化に働く因子としては、サイトカイン、ビタミン、接着分子、転写因子などを挙げることができる。
【００４２】
サイトカインとしては、心筋細胞への分化能を有する細胞に、心臓の発生段階で心筋細胞への分化を促進するものであれば特に限定されない。具体的には、血小板由来増殖因子（以下、PDGFと略記する）、線維芽細胞増殖因子８(FGF8)、エンドセリン１(ET1)、ミドカイン(midkine)、骨形成因子４(BMP4)などを挙げることができる。PDGFとしてはPDGF A、PDGF B、PDGFＣなどがあげられる。サイトカインは、例えば10〜40ng/mlの濃度で用いられる。
また、心筋細胞への分化を抑制するサイトカインに対する阻害剤を用いることにより、心筋細胞への分化能を有する細胞に、心臓の発生段階で心筋細胞への分化を促進することも可能である。心筋細胞への分化を抑制するサイトカインとしては、線維芽細胞増殖因子−２（以下、FGF-2と略記する。）、具体的には、配列番号７または８で表されるFGF-2などを挙げることができる。心筋細胞への分化を抑制するサイトカンに対する阻害剤としては、サイトカインの情報伝達を阻害する物質、例えばサイトカインを中和する抗体、低分子化合物などを挙げることができる。
【００４３】
ビタミンとしては、レチノイン酸など心筋細胞への分化能を有する細胞に、心臓の発生段階で心筋細胞への分化を促進するものであれば特に限定されない。レチノイン酸は、例えば、10-9 mol/lの濃度で用いられる。
【００４４】
接着分子としては、心臓の発生段階で心臓発生領域で発現していれば特に限定されないが、好ましい具体的としては、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンなどの細胞外マトリックス蛋白質等が挙げられる。例えば、フィブロネクチンをコートした培養皿で該心筋細胞への分化能を有する細胞を培養することにより心筋細胞への分化を促進することができる。
【００４５】
転写因子としては、ホメオボックス型転写因子Nkx2.5/Csx、GATAファミリーに属するZinc finger型転写因子GATA4、myocyte enhancer factor-2(MEF-2)ファミリーに属する転写因子MEF-2A、MEF-2B、MEF-2CおよびMEF-2D、basic helix loop helix型転写因子に属するdHAND、eHANDおよびMesP1、TEA-DNA結合型転写因子ファミリーに属するTEF-1、TEF-3およびTEF-5どを挙げることができる。
【００４６】
上述した転写因子は、該因子をコードするDNAを心筋細胞への分化能を有する細胞中に導入し、DNAを発現させることにより心筋細胞への分化を誘導させることができる。
また、心筋細胞への分化を誘導する因子（以下、心筋分化誘導因子という）を用いて、心筋細胞への分化能を有する細胞を心筋細胞に分化誘導することができる。このような心筋分化誘導因子の取得方法としては、自律拍動する細胞の培養上清に各種プロテアーゼ阻害剤を添加して、透析、塩析ならびにクロマトグラフィーなどを組み合わせることにより取得することができる。
【００４７】
さらにマイクロシーケンサーを用いて、上記の心筋分化誘導因子の部分アミノ酸配列を決定し、該アミノ酸配列に基づき設計したDNAプローブを用いて該自律拍動する細胞より作製したcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、心筋分化誘導因子の遺伝子を取得することができる。
こうして得られた心筋分化誘導因子の遺伝子を、以下のように心筋形成剤として調製して用いる。
【００４８】
（ａ）心筋分化誘導因子をコードする遺伝子を有効成分とする心筋形成剤
まず、心筋分化誘導因子の遺伝子DNA断片、あるいは全長cDNAをウイルスベクタープラスミド内のプロモーターの下流に挿入することにより、組換えウイルスベクタープラスミドを造成する。
この組換えウイルスベクタープラスミドを、このウイルスベクタープラスミドに適合したパッケージング細胞に導入する。
【００４９】
パッケージング細胞としては、ウイルスのパッケージングに必要なタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つを欠損している組換えウイルスベクタープラスミドの該欠損する蛋白質を補給できる細胞であれば特に限定されない。例えばヒト腎臓由来のHEK293細胞、マウス線維芽細胞NIH3T3などを用いることができる。
【００５０】
パッケージング細胞で補給する蛋白質としては、レトロウイルスベクターの場合はマウスレトロウイルス由来のgag、pol、envなどの蛋白質、レンチウイルスベクターの場合はHIVウイルス由来のgag、pol、env、vpr、vpu、vif、tat、rev、nefなどの蛋白質、アデノウイルスベクターの場合はアデノウイルス由来のE1A、E1Bなどの蛋白質、アデノ随伴ウイルスの場合はRep(p5,p19,p40)、Vp(Cap)などの蛋白質を用いることができる。
【００５１】
ウイルスベクタープラスミドとしては上記パッケージング細胞において組換えウイルスが生産でき、心臓先天性遺伝子疾患の原因遺伝子に対する野生型の遺伝子を心筋細胞で転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【００５２】
ウイルスベクタープラスミドとしてはMFG [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 6733-6737 (1995)]、pBabePuro [Nucleic Acids Research, 18, 3587-3596 (1990)]，LL-CG、CL-CG、CS-CG、CLG [Journal of Virology, 72, 8150-8157 (1998)]、pAdex1 [Nucleic Acids Res., 23, 3816-3821 (1995)]等が用いられる。
【００５３】
プロモーターとしては、ヒト組織中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトCMV）のIE(immediate early)遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、SRαプロモーター等を挙げることができる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。また、Nkx2.5/Csx遺伝子のような心筋細胞特異的な遺伝子のプロモーターを用いることで、心筋細胞で特異的に目的の遺伝子を発現させることができる。
【００５４】
上記組換えウイルスベクタープラスミドを上記パッケージング細胞に導入することで組換えウイルスベクターを生産することができる。上記パッケージング細胞への上記ウイルスベクタープラスミドの導入法としては、例えば、リン酸カルシウム法［特開平2-227075］、リポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)］等を挙げることができる。
上述した組換えウイルスベクターを心筋細胞への分化能を有する細胞に感染させることにより、心筋細胞へ誘導することができる。
【００５５】
（ｂ）蛋白質を有効成分とする心筋形成剤
心筋分化誘導因子蛋白質の完全長cDNAをもとに、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのDNA断片を調製する。
該DNA断片、あるいは完全長cDNAを発現ベクター内のプロモーターの下流に挿入することにより、該蛋白質の組換発現ベクターを造成する。
該組換発現ベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞内に導入する。
【００５６】
宿主細胞としては、目的とするDNAを発現できるものは全て用いることができ、例えば、エシェリヒア(Escherichia)属、セラチア（Serratia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、バチルス（Bacillus）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属等に属する細菌、クルイベロミセス（Kluyveromyces）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、シゾサッカロマイセス（Shizosaccharomyces）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、シワニオミセス（Schwanniomyces）属等に属する酵母や動物細胞、昆虫細胞等を用いることができる。
【００５７】
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、心筋分化誘導因子蛋白質の遺伝子DNAを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌を宿主細胞として用いる場合は、心筋分化誘導因子蛋白質の組換え発現ベクターは該細菌中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、心筋分化誘導因子蛋白質をコードするDNAおよび転写終結配列より構成された組換え発現ベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００５８】
発現ベクターとしては、例えば、pBTrp2、pBTac1、pBTac2（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、pKK233-2（Amersham Pharmacia Biotech社製）、pSE280（Invitrogen社製）、pGEMEX-1（Promega社製）、pQE-8（QIAGEN社製）、pKYP10［特開昭58-110600］、pKYP200［Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)］、pLSA1［Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)］、pGEL1［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)］、pBluescript II SK(-)（Stratagene社製）、pGEX（Amersham Pharmacia Biotech社製）、pET-3（Novagen社製）、pTerm2(USP4686191、USP4939094、USP5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400［J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)］等を例示することができる。
【００５９】
発現ベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したものを用いることが好ましい。
【００６０】
プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであれば特に限定されず、具体例としては、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、PLプロモーター、PRプロモーター、T7プロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター等を挙げることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター（Ｐtrpｘ２）、tacプロモーター、letIプロモーター［Gene, 44, 29 (1986）］、lacT7プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００６１】
心筋分化誘導因子蛋白質の遺伝子DNAの蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、目的とする蛋白質の生産率を向上させることができる。
心筋分化誘導因子蛋白質の遺伝子DNAの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
【００６２】
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、ミクロバクテリウム属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Brevibacterium ammoniagenes、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14067、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonas sp. D-0110等を挙げることができる。
【００６３】
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)］、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、またはGene, 17, 107 (1982)やMolecular & General Genetics, 168, 111 (1979)に記載の方法等を挙げることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEp13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS19、pHS15等を例示することができる。
【００６４】
プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、MFα1プロモーター、CUP 1プロモーター等を挙げることができる。
【００６５】
宿主細胞としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クリュイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、トリコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulans）、シュワニオミセス・アルビウス（Schwanniomyces alluvius）等を挙げることができる。
【００６６】
組換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Methods in Enzymol., 194, 182 (1990)］、スフェロプラスト法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)］、酢酸リチウム法[J. Bacteriol., 153, 163 (1983)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)]等を挙げることができる。
【００６７】
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pCDNAI(Invitrogen社製)、pCDM8（Invitrogen社製）、pAGE107［特開平3-22979；Cytotechnology, 3, 133 (1990)］、pAS3-3（特開平2-227075）、pCDM8［Nature, 329, 840 (1987)］、pCDNAI/Amp（Invitrogen社製）、pREP4（Invitrogen社製）、pAGE103［J. Biochem., 101, 1307 (1987)］、pAGE210等を例示することができる。
【００６８】
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトCMV）のIE(immediate early)遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、SRαプロモーター等を挙げることができる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【００６９】
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa）細胞、サルの細胞であるCOS細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるCHO細胞、HBT5637［特開昭63-299］等を挙げることができる。
【００７０】
組換えベクターの導入法としては、動物細胞にDNAを導入できるものであれば、特に限定されず、例えば、エレクトロポーレーション法［Cytotechnology, 3, 133 (1990)］、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)、Virology, 52, 456 (1973)］等を用いることができる。形質転換体の取得および培養は、特開平2-227075号公報あるいは特開平2-257891号公報に記載されている方法に準じて行なうことができる。
【００７１】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばバキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ，ア・ラボラトリー・マニュアル[Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company, New York (1992)]、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー サプルメント1-38(1987-1997)、 Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、蛋白質を発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる。
【００７２】
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII（ともにInvitrogen社製）等を挙げることができる。
【００７３】
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
【００７４】
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるSf9、Sf21［Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual、W.H.Freeman and Company，New York，(1992)］、Trichoplusia niの卵巣細胞であるHigh 5（Invitrogen社製）等を用いることができる。
【００７５】
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法［特開平2-227075］、リポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)］等を挙げることができる。
【００７６】
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング  第２版 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行うことができる。
酵母、動物細胞または昆虫細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
【００７７】
心筋分化誘導因子をコードするDNAを組み込んだ組換え体DNAを保有する形質転換体を培地に培養し、培養物中に心筋分化誘導因子蛋白質を生成蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取することにより、心筋分化誘導因子蛋白質を製造することができる。
心筋分化誘導因子蛋白質を製造する形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【００７８】
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該宿主が資化し得る炭素源、窒素源、無機物等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００７９】
炭素源としては、それぞれの宿主が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類を用いることができる。
【００８０】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等が用いられる。
【００８１】
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
【００８２】
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常16時間〜７日間である。培養中pHは、3.0〜9.0に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００８３】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG）等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（IAA）等を培地に添加してもよい。
【００８４】
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地［The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)］、EagleのMEM培地［Science, 122, 501 (1952)］、ダルベッコ改変MEM培地［Virology, 8, 396 (1959)］、１９９培地［Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)］またはこれら培地にウシ胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常pH6〜8、30〜40℃、5％CO2存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００８５】
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているTNM-FH培地（Pharmingen社製）、Sf-900 II SFM培地（Life Technologies社製）、ExCell400、ExCell405（いずれもJRH Biosciences社製）、Grace's Insect Medium［Grace, T.C.C., Nature, 195, 788 (1962)］等を用いることができる。
培養は、通常pH6〜7、25〜30℃等の条件下で、1〜5日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上述の形質転換体の培養物から、心筋分化誘導因子蛋白質を単離精製するには、通常の蛋白質の単離、精製法を用いればよい。
【００８６】
例えば、心筋分化誘導因子蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（DEAE）−セファロース、DIAION HPA-75（三菱化学社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(Amersham Pharmacia Biotech社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００８７】
また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、細胞を回収後破砕し、遠心分離することにより、沈殿画分として蛋白質の不溶体を回収する。
回収した該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。
【００８８】
該可溶化液を、希釈あるいは透析により、該可溶化液中の蛋白質変性剤の濃度を下げることにより、該蛋白質の構造を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法により該蛋白質の精製標品を得る。
【００８９】
心筋分化誘導因子蛋白質またはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清から、該蛋白質またはその糖鎖付加体等の誘導体を回収することができる。即ち、培養物から遠心分離等の手法により培養上清を回収し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【００９０】
また、上記方法により発現させた蛋白質を、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t-ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法によっても製造することができる。また、米国Advanced ChemTech社製、Perkin-Elmer社製、Amersham Pharmacia Biotech社製、米国Protein Technology Instrument社製、米国Synthecell-Vega社製、米国PerSeptive社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して合成することもできる。
【００９１】
（４）心筋細胞への分化能を有する細胞または該細胞から分化した心筋細胞の培養上清による分化誘導
また、自律拍動する心筋細胞から取得した細胞外基質をコートした培養皿を用いて培養すること、自律拍動する心筋細胞の培養上清を添加することで、心筋細胞への分化能を有する細胞を心筋細胞へ分化誘導させることができる。
【００９２】
なお、本発明による細胞の精製方法は特に限定されないが、例えば、後述する心筋細胞への分化能を有する細胞を特異的に認識する抗体を用いたパニング法[J. Immunol., 141(8), 2797-2800 (1988)]、FACS法[Int. Immunol., 10(3), 275-283 (1998)]、または心筋細胞への分化能を有する細胞に特異的な遺伝子のプロモーターを用いたレポーター系を構築する方法により行うことができる。
【００９３】
４．心筋細胞への分化能を有する細胞の不死化
後記する心臓再生薬または心臓疾患治療薬の場合はその要否ついて別途考慮が必要となるが、本発明による細胞の研究のための実験にあっては、子宮内膜由来の細胞の分裂回数は通常有限であることから、本発明による心筋細胞への分化能を有する細胞を心筋細胞に分化誘導する前に不死化し、細胞分裂の回数を増やすことが好ましい。
【００９４】
細胞をガン化させずに細胞分裂の回数を増やす、不死化方法としては、テロメラーゼやBmi-1を心筋細胞への分化能を有する細胞に発現させる方法を挙げることができる。
【００９５】
テロメラーゼを心筋細胞への分化能を有する細胞に発現させる方法としては、テロメラーゼの触媒サブユニットであるTERT遺伝子を、レトロウイルスベクターに導入し、該ベクターを心筋細胞への分化能を有する細胞に導入する方法、心筋細胞への分化能を有する細胞に内在するTERT遺伝子を誘導発現させる因子を心筋細胞への分化能を有する細胞に投与する方法、TERT遺伝子を誘導発現させる因子をコードするDNAを含むベクターを心筋細胞への分化能を有する細胞に導入する方法などを挙げることができる。
【００９６】
上述のTERT遺伝子を誘導発現させる因子は、TERT遺伝子プロモーターとGFP、ルシフェラーゼ、あるいはβーガラクトシダーゼなどのレポーター遺伝子とを組み込んだベクターDNAを心筋細胞への分化能を有する細胞に導入することにより、TERT遺伝子を誘導発現させる因子を選別することができる。
【００９７】
造血系幹細胞や神経幹細胞の自己複製（self-renewal）に必須であることが報告されているBmi-1遺伝子を本発明による心筋細胞への分化能を有する細胞に発現させる方法としては、Bmi-1遺伝子を、レトロウイルスベクターに導入し、該ベクターを心筋細胞への分化能を有する細胞に導入する方法、心筋細胞への分化能を有する細胞に内在するBmi-1遺伝子を誘導発現させる因子を心筋細胞への分化能を有する細胞に投与する方法、Bmi-1遺伝子を誘導発現させる因子をコードするDNAを含むベクターを心筋細胞への分化能を有する細胞に導入する方法などを挙げることができる。
【００９８】
上述のBmi-1遺伝子を誘導発現させる因子は、Bmi-1遺伝子プロモーターとGFP、ルシフェラーゼ、あるいはβーガラクトシダーゼなどのレポーター遺伝子とを組み込んだベクターDNAを心筋細胞への分化能を有する細胞に導入することにより、Bmi-1遺伝子を誘導発現させる因子を選別することができる。
【００９９】
また、ウイルス由来の不死化遺伝子を用いることにより、細胞分裂の回数を増加させることもできる。例えば、ヒトパピローマウイルス（HPV）のE6遺伝子およびE7遺伝子を用いることができる。E6遺伝子としては、細胞に対する形質転換活性を消失した変異体、例えば、151番目のアミノ酸であるロイシンを欠失した変異体を用いることが好ましい。該遺伝子を本発明による心筋細胞への分化能を有する細胞に発現させる方法としては、該遺伝子を、レトロウイルスベクターに導入し、該ベクターを心筋細胞への分化能を有する細胞に導入する方法、通常のプラスミドベクターに導入し、該ベクターを心筋細胞への分化能を有する細胞に導入する方法、あるいは、該遺伝子を発現可能な構造、例えば該遺伝子の上流に動物細胞で発現可能なプロモーター、該遺伝子の下流にポリAシグナルを付加し、さらに必要に応じて、所望の細胞で特異的に発現するためのエンハンサーやスプライシングシグナルを付加したものを心筋細胞への分化能を有する細胞に導入する方法および、HPVウイルスあるいは、欠失、置換、他の配列の付加などを有する該ウイルスを心筋細胞への分化能を有する細胞に感染または導入する方法などを挙げることができる。
【０１００】
５．心筋細胞への分化能を有する細胞を含む心臓再生薬または心臓疾患治療薬
本発明による細胞は、心筋細胞への分化能を有するものであるから、本発明の別の態様によれば、本発明による細胞を含んでなる、医薬、具体的には心臓再生薬または心臓疾患治療薬が提供される。
【０１０１】
本発明による心臓再生薬または心臓疾患治療薬が治療の対象とする心臓疾患としては、心筋梗塞、虚血性心疾患、うっ血性心不全、不整脈、肥大型心筋症、拡張型心筋症、心筋炎、弁膜症などを挙げることができる。
【０１０２】
本発明による医薬が含む細胞は、場合により不死化されたものであってもよく、また、心筋細胞または心筋前駆細胞へ分化誘導された細胞であってもよい。本発明の好ましい態様によれば、心臓の障害部位に応じて、心筋内皮細胞(Endocardial endothelial cell)、クッション細胞(Cushion cell)、心室型心筋細胞、心房型心筋細胞、洞結節細胞等の心臓を形成する様々な細胞へ分化誘導できる細胞またはそれら細胞若しくはその前駆細胞に分化誘導された細胞が用いられる。
【０１０３】
本発明による医薬を障害部位に輸送する方法としては、カテーテルを利用する方法等が用いられる。以下虚血性心疾患を例に具体的な方法を示す。虚血性心疾患で障害を受けた心筋細胞は、血管狭窄部位の下流に存在することから、上記の細胞を注入する前に、冠動脈造影法（図説病態内科講座  循環器―１、MEDICAL VIEW, 1993）により血管の狭窄部位を同定しておく必要がある。器質的狭窄病変は狭窄病態に応じて求心性狭窄、偏心性狭窄、多発性壁不整に分類され、特に偏心性狭窄はタイプIおよびタイプIIの２つのタイプに細分類される。狭窄形態は狭心症の経過、予後に関連することが知られており、タイプIIの偏心性狭窄や多発性壁不整は不安定狭心症例に多く、心筋梗塞に移行する可能性が高い。血管が完全に狭窄している場合には、注入する細胞が障害部位に到達しない可能性があるので、事前に経皮的冠動脈形成術(PTCA)あるいは血栓溶解療法などにより狭窄部位を再開することが必要である。障害を受けた心筋細胞の部位に応じて、注入する細胞を心室型や心房型のように区別することができる。カテーテルの挿入法は右上腕動脈より挿入するSones法（図説病態内科講座  循環器―１、MEDICAL VIEW,１９９３）あるいは大腿動脈より挿入するJundkins法（図説病態内科講座  循環器―１、MEDICAL VIEW,1993）を利用することができる。
【０１０４】
６．先天性遺伝子疾患の治療への利用
本発明の別の態様によれば、心臓関連の先天性遺伝子疾患の治療方法および治療薬が提供される。
心不全をおこす疾患の中には、一部であるが単一遺伝子の変異により、本来心臓の分化または維持に必要な蛋白質の一部が欠損するために心不全となる一群がある。このような疾患としては、家族性肥大型心筋症、Fabri病、QT延長症候群、マルファン症候群、大動脈弁狭窄症、ミトコンドリア心筋症、Duchenne型筋ジストロフィー症等が挙げられる。これらの疾患は、ミオシン、トロポニン、トロポミオシン、電位依存性Naチャンネル、Kチャンネル、フィブリン、エラステイン、ミトコンドリア、ジストロフィンなどの遺伝子異常が原因であることが知られている［治療学, 30,1302-1306(1996)］。
【０１０５】
本発明によれば、上記疾患の治療方法が提供され、その方法は、患者より心筋細胞への分化能を有する細胞を取得し、この細胞に正常な遺伝子を導入したのち、この細胞を、例えば前記した本発明による医薬と同様の手法により、心臓に移植することを含んでなる。ここで、正常な遺伝子は、上記３（３）（ｂ）において記載した遺伝子治療用のベクターに挿入したのちに、本発明による心筋細胞への分化能を有する細胞に導入することができる。
【０１０６】
７.  心筋細胞への分化能を有する細胞特異的な表面抗原を特異的に認識する抗体の取得
本発明による心筋細胞への分化能を有する細胞で発現している表面抗原を特異的に認識する抗体の調製法について以下説明する。
【０１０７】
本発明による心筋細胞への分化能を有する細胞において特異的に発現している表面抗原を認識する抗体は、心筋梗塞などの心臓病の細胞治療を実施する上で必要な心筋細胞への分化能を有する細胞の純度検定や精製に用いることができる。
【０１０８】
この抗体を取得する方法として、本発明による心筋細胞への分化能を有する細胞3〜5×105cells／匹、またはこの細胞から調製した細胞膜画分1〜10mg／匹を抗原として、ウサギ、ヤギまたは3〜20週令のラット、マウスもしくはハムスター等の非ヒトほ乳動物の皮下、静脈内または腹腔内に、適当なアジュバント[例えば、フロインドの完全アジュバント(Complete Freund's Adjuvant)または、水酸化アルミニウムゲル、百日咳菌ワクチンなど]とともに投与する。
【０１０９】
抗原の投与は、1回目の投与の後１〜２週間おきに3〜10回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応するか否かを酵素免疫測定法［酵素免疫測定法（ELISA法）：医学書院刊  1976年、Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988］などで調べる。
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒトほ乳動物を、血清または抗体産生細胞の供給源とする。
ポリクローナル抗体は、該血清を分離、精製することにより調製することができる。
モノクローナル抗体は、該抗体産生細胞と非ヒトほ乳動物由来の骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマを培養するか、動物に投与して該動物を腹水癌化させ、該培養液または腹水を分離、精製することにより調製することができる。
【０１１０】
抗体産生細胞としては、脾細胞、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞、特に脾細胞が好適に用いられる。
【０１１１】
骨髄腫細胞としては、８−アザグアニン耐性マウス（BALB/c由来）骨髄腫細胞株であるP3-X63Ag8-U1(P3-U1)株［Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1 (1978)］、P3-NS1/1-Ag41(NS-1)株［European J. Immunology, 6, 511 (1976)］、SP2/O-Ag14(SP-2)株［Nature, 276, 269 (1978)］、P3-X63-Ag8653(653)株［J. Immunology, 123, 1548 (1979)］、P3-X63-Ag8(X63)株［Nature, 256, 495 (1975)］等、マウス由来の株化細胞が好適に用いられる。
ハイブリドーマ細胞は、以下の方法により作製できる。
【０１１２】
抗体産生細胞と骨髄腫細胞を混合し、HAT培地［RPMI-1640培地にグルタミン（1.5mmol/l）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５ mol/l）、ジェンタマイシン（10μｇ／ml）および10％ FCSを加えた培地に、ヒポキサンチン（１０−４ mol/l）、チミジン（１．５×１０−５ mol/l）およびアミノプテリン（４×１０−７ mol/l）を加えた培地］に懸濁した後、７〜１４日間培養する。培養後、培養上清の一部をとり酵素免疫測定法などにより、抗原に反応し、抗原を含まない蛋白質には反応しないものを選択する。ついで、限界希釈法によりクローニングを行い、酵素免疫測定法により安定して高い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞として選択する。
【０１１３】
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を分離、精製する方法としては、遠心分離、硫安沈殿、カプリル酸沈殿、またはDEAE−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインAまたはG−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて処理する方法が挙げられる。
【０１１４】
上記方法で取得した、心筋細胞への分化能を有する細胞で発現している表面抗原を特異的に認識する抗体を用いて、検体細胞に対する反応性と造血系幹細胞、神経系幹細胞などの対照となる細胞に対する反応性とを比較することで、検体細胞が上記特異的表面抗原を発現しているかどうかを容易に検定することができる。
【０１１５】
８．心筋細胞への分化能を有する細胞で発現している表面抗原および該表面抗原をコードする遺伝子の取得
本発明による心筋細胞への分化能を有する細胞において特異的に発現している表面抗原遺伝子の取得方法としては、二つの由来の異なるサンプル間で異なる発現形態を取る遺伝子を取得する方法であるサブトラクション法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5738-5742 (1988)]やRepresentational difference analysis [Nucleic Acids Research, 22, 5640-5648 (1994)]による方法を挙げることができる。
【０１１６】
まず、心筋細胞への分化能を有する細胞より作製したcDNAライブラリーを、造血系幹細胞や神経系幹細胞などの心筋細胞への分化能を有する細胞以外の対照細胞より取得したmRNAを用いてサブトラクションを行う。心筋細胞への分化能を有する細胞特異的な遺伝子を濃縮した差分化cDNAライブラリーを調製した後、該差分化cDNAライブラリーの挿入cDNA配列を5’末端側よりランダムに塩基配列解析を行い、分泌シグナル配列を持つものだけを選択する（ランダム配列解析）。このようにして得られたcDNAの全長塩基配列を決定することにより、該cDNAがコードする蛋白質が分泌蛋白質か膜蛋白質かを区別することができる。
【０１１７】
上記の方法において、ランダム配列解析の代わりに、シグナルシーケンストラップ法も用いることもできる［Science, 261, 600-603 (1993); Nature Biotechnology, 17, 487-490 (1999)]。シグナルシーケンストラップ法とは、分泌シグナル配列をもつ遺伝子を選択的にスクリーニングする方法である。
【０１１８】
効率よく特異的な表面抗原を取得するためには、シグナルシーケンストラップライブラリーをサブトラクションが行えるベクターを用いて作製し、心筋細胞への分化能を有する細胞から作製したシグナルシーケンストラップライブラリーを造血系幹細胞や神経系幹細胞などの対照となる細胞より取得したmRNAを用いてサブトラクションを行う方法が望ましい。このようにして取得された分泌シグナル配列を含むDNA断片は全長cDNAをクローン化するためのプローブとして用いることができる。
全長cDNAはその全長塩基配列を解析することで、該cDNAがコードする蛋白質が分泌蛋白質か膜蛋白質かを区別することができる。
【０１１９】
ランダム配列解析あるいはシグナルシーケンストラップ法を用いた場合でも、得られたクローンが膜蛋白質をコードする場合は、塩基配列から類推されるアミノ酸配列に基づき合成ペプチドを作製し、該合成ペプチドを抗原として上記方法により特異的な抗体を取得することができる。
【０１２０】
また、膜蛋白質の場合は、受容体をコードしているものがある。このような受容体は心筋細胞への分化能を有する細胞の特異的な増殖、または心筋細胞への分化の調節に働いている可能性があり、当該受容体のリガンドの探索に用いることができる。分泌蛋白質の場合は、直接心筋細胞への分化能を有する細胞を増殖あるいは分化させるために用いることができる。
【０１２１】
９．心筋細胞への分化能を有する細胞の増殖因子および心筋細胞への分化誘導因子のスクリーニング
心筋細胞への分化能を有する細胞の増殖因子および心筋細胞への分化誘導因子のスクリーニングは、心筋細胞への分化能を有する細胞を無血清培地中で培養する際に、検体となる種々の物質を添加し、該細胞が増殖するか、または心筋細胞へ分化誘導されるかを調べることにより行うことができる。
【０１２２】
検体となる物質としては、各種サイトカインや増殖因子などの分泌蛋白質、細胞接着分子などの膜結合蛋白質、組織抽出液、合成ペプチド、合成化合物、微生物培養液等、特に限定されない。
増殖能力はコロニー形成能やBrdUの取り込みなどで調べることができる。
コロニー形成能は、本発明による心筋細胞への分化能を有する細胞を低密度で播種することにより調べることができる。
BrdUの取り込みは、BrdUを特異的に認識する抗体を用いた免疫染色により調べることができる。
【０１２３】
心筋細胞への分化を評価する方法としては、細胞の自律拍動を指標とする方法、細胞内に導入したレポーター遺伝子の発現を指標とする方法などが挙げられる。
【０１２４】
レポーター遺伝子の発現を指標とする方法は、心筋細胞で特異的に発現する遺伝子のプロモーターとレポーター遺伝子とを組み込んだベクターDNAを心筋細胞への分化能を有する細胞に導入し、該細胞を用いてレポーター遺伝子の発現を調べる方法である。
【０１２５】
レポーター遺伝子としては、GFP、ルシフェラーゼ、βーガラクトシダーゼをコードする遺伝子などが挙げられる。
【０１２６】
心筋細胞で特異的に発現する遺伝子のプロモーターとしては、cardiac Troponin I等のプロモーターが挙げられる[J. Biological Chemistry, 273, 25371-25380 (1998)]。
【０１２７】
１０．心筋細胞への分化能を有する細胞を抗体を用いて分離する方法
本発明の別の態様によれば、子宮内膜または月経血から目的の表面抗原を発現している細胞を取得する方法が提供される。この方法としては、ソーテイング機能を有したフローサイトメーターを用いる方法、磁気ビーズを用いる方法が挙げられる。
【０１２８】
フローサイトメーターのソーテイングの方式としては、水滴荷電方式、セルキャプチャー方式などが挙げられる（フローサイトメーター自由自在、ｐ１４−２３、秀潤社、１９９９年）。どちらの方法も、細胞の表面に発現している分子に結合した抗体から発せられる蛍光強度を電気信号に変換することにより抗原の発現量を定量することができる。また、使用する蛍光の種類を組み合わせることで、複数の表面抗原を利用して分離することも可能である。蛍光としては、FITC(fluorescein isothiocyanate)、PE(phycoerythrin)、APC(Allo-phycocyanin)、TR(TexasRed)、Cy3、CyChrome、Red613、Red670、PerCP、TRI-Color、QuantumRedなどが挙げられる（フローサイトメーター自由自在、ｐ３−１３、秀潤社、１９９９年）。
【０１２９】
染色方法としては、子宮内膜または月経血から、上記方法で細胞を分離したのち、直接抗体で染色する方法、一度適当な培地中で培養・増殖を行った後に抗体で染色する方法が挙げられる。
【０１３０】
細胞の染色はまず、表面抗原を認識する一次抗体と目的の細胞サンプルを混合し、氷上で30分間〜１時間、インキュベーションする。一次抗体が蛍光で標識されている場合には、洗浄後フローサイトメーターで分離を行う。一次抗体が蛍光標識されていない場合には、洗浄後一次抗体に対して結合活性を有する蛍光標識された二次抗体と一次抗体が反応した細胞とを混合し、再び氷上で30分間〜１時間、インキュベーションする。洗浄後、一次抗体と二次抗体で染色された細胞をフローサイトメーターで分離を行う。
【０１３１】
磁気ビーズを用いる方法では、目的の表面抗原を発現している細胞を大量に分離することができる。分離の純度は上述のフローサイトメーターを用いる方法には及ばないが、精製を繰り返すことにより、十分高い細胞純度を確保することができる。
【０１３２】
細胞に一次抗体を反応させた後、細胞と反応しなかった一次抗体を除去し、一次抗体と特異的に結合する、磁気ビーズを結合させた二次抗体を結合させる。残存する二次抗体を洗浄除去した細胞は磁石を設置したスタンドで分離することができる。これらの操作に必要な材料および装置はDYNAL社から入手することができる。
【０１３３】
磁気ビーズを用いる方法は、細胞サンプル中より不要な細胞を除去するのにも同様に利用することができる。不要な細胞をより効率的に除去するにはStem Cell Technologies Inc(Vancouver,Canada)より販売されているStemSep法を用いることができる。
【０１３４】
上述の方法で用いられる抗体としては、前記８で取得された抗体、または血管内皮細胞の表面抗原として知られているFlk-1、CD31、造血系細胞の表面抗原として知られているCD13、CD14、CD34、CD45、CD90、間葉系細胞の表面抗原として知られているCD140a（PDGFRα）、インテグリンCD29、マトリックス受容体CD44、CD50、CD54、B細胞や顆粒球のマーカーであるCD24、血液細胞に広く発現しているCD55、CD59、免疫グロブリンスーパーファミリーの一員である接着分子CD166を認識する抗体が挙げられる。これらの抗体を組み合わせることで、より高い純度で目的の細胞を取得することができる。
【０１３５】
具体的には、CD34陰性、CD29陽性、CD140a陰性細胞およびCD44陽性の性質を有する細胞を取得するには、ヒト子宮内膜または月経血由来細胞からCD34陽性細胞とCD140a陽性細胞を上述した免疫磁気ビーズの方法などを利用して除去した後、CD29陽性およびCD44陽性の細胞画分を分取することで目的の細胞を分離することができる。
【０１３６】
１１．心筋特異的な遺伝子のプロモーターレポーターベクターを用いた心筋前駆細胞の分離
心筋細胞への分化能を有する細胞から誘導した心筋細胞または心筋細胞の前駆細胞を効率的に分離するために、発光オワンクラゲの緑色蛍光蛋白質(green fluorescent protein; GFP)を細胞分離の指標として用いることができる。
【０１３７】
具体的には、心筋細胞で特異的に発現している遺伝子または前記９項で取得した心筋細胞への分化能を有する細胞で特異的に発現している遺伝子のプロモーターの下流にGFP遺伝子をつないだベクターを作製し、心筋細胞への分化能を有する細胞に導入する。このようなレポーターベクターを導入された細胞を薬剤耐性などの指標で分離後、心筋細胞へと分化誘導する。分化誘導した細胞はGFPを発現し、蛍光を発生する。蛍光を発生した心筋細胞ならびに心筋前駆細胞はフローサイトメーターを用いて容易に分離することができる（フローサイトメーター自由自在、ｐ４４−５２、秀潤社、１９９９年）。
【０１３８】
心筋細胞で特異的に発現している遺伝子のプロモーターとしてはMLC2vやTroponin Ｉを用いることができる。
【０１３９】
ベクターとしては、上述した動物細胞用のプラスミドベクター、アデノウイルスベクターなどを用いることができる。
【実施例】
【０１４０】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【０１４１】
実施例１
ヒト月経血らの心筋細胞への分化能を有する子宮内膜由来細胞の取得と培養
（１）ヒト月経血からの細胞の分離と培養
月経１日目（生理が始まった１日目）の月経血を生理用品ないしは直接、外陰部より、10mlの無菌的なプラスティック・ディッシュに移行させた。プラスティック・ディッシュに採取された月経血を、20mlの培養液 [1%牛胎仔血清入りのDMEM (Dulbecco's modified MEM)培地、ペニシリン・ストレプトマイシンの抗生物質を添加] を入れた50 mlプラスティック・チューブに移動させた。取得した月経血が含まれる培養液を1,000×gの遠心分離により月経血に含まれる細胞を回収した後、月経血細胞を10%のFBS（牛胎仔血清）を含むα-MEM (α-modified MEM)培地に再浮遊させることにより月経血に由来する細胞液を得た。【０１４２】
単離した、月経血に含まれる細胞を、牛等の血清を10〜20%添加した、α-MEM培地に分散し、組織培養用のプラスチック製培養皿に入れ、培養温度33〜37℃で、5〜10%の二酸化炭素ガスで満たした孵卵器で培養した。培養開始後2日目に、赤血球を除去するために、培地交換を行った。細胞が培養皿一面に増殖する頃、培地を除去して、トリプシン EDTA溶液を加えることで細胞を浮遊させた。【０１４３】
（２）ヒト子宮内膜由来細胞への遺伝子導入と不死化細胞の樹立
上記（１）で得られた、ヒト子宮内膜由来細胞にレトロウイルベクターを用いて不死化遺伝子を導入し、ヒト子宮内膜由来不死化細胞株を樹立した。
即ち、ウイルスを感染させる前日に５×106の細胞を10%ウシ胎児血清(FCS)を含むDMEM（Dulbecco’s modified MEM）培地を用いて6cm培養皿に植え、37℃、5% CO2濃度の孵卵器で一晩培養した。文献[J.Gene Med., 6,833-845 (2004)]に記載されている方法で調製したヒトパピローマウイルス(HPV)16由来のE7を発現するレトロウイルスベクターLXSN-16E7を含む溶液に、終濃度8μg/mlとなるようにhexadimethrine bromide(polybrene)(Sigma社製)を添加し、ヒト子宮内膜由来細胞の培養上清2mlをウイルス液2mlと置換し、37℃、5% CO2濃度の孵卵器で一晩培養した。100μg/mlのG418を含む同培地に交換して更に同様の条件で培養し、レトロウイルスベクターLXSN-16E7の組み込まれた細胞株を得た。【０１４４】
上記で得られた細胞株に、さらにヒトTERT（hTERT）を含むレトロウイルスベクターLXSH-hTERTを感染させた。即ち、得られた細胞株を100μg/mlのG418を含む同培地で増殖させ、５×106の細胞をウイルスを感染させる前日に、6cm培養皿に植え、37℃、5% CO2濃度の孵卵器で一晩培養した。文献[J.Gene Med., 6,833-845 (2004)]に記載されている方法で調製したhTERTを発現するレトロウイルスベクターLXSH-hTERT を含む溶液に、終濃度8μg/mlとなるようにpolybreneを添加し、HPV16由来のE7遺伝子を導入したヒト子宮内膜由来細胞株の培養上清2mlをウイルス液2mlと置換し、37℃、5% CO2濃度の孵卵器で一晩培養した。100μg/mlのG418と50μg/mlのハイグロマイシン Bを含む同培地に交換して更に同様の条件で培養し、レトロウイルスベクターLXSN-16E7およびLXSH-hTERTの組み込まれた細胞株を得た。【０１４５】
得られた細胞株にさらにHPV16由来のE6遺伝子の形質転換活性を消失した欠失変異体である16E6SDD151遺伝子を含むレトロウイルスベクターMSCVpuro-16E6SDD151を感染させた。即ち、得られた細胞株を100μg/mlのG418および50μg/mlのハイグロマイシン Bを含む同培地で増殖させ、５×106の細胞をウイルスを感染させる前日に、6cm培養皿に植え、37℃、5% CO2濃度の孵卵器で一晩培養した。文献[J.Gene Med., 6,833-845 (2004)]に記載されている方法で調製した16E6SDD151遺伝子を発現するレトロウイルスベクターMSCVpuro-16E6SDD151を含む溶液に、終濃度8μg/mlとなるようにpolybreneを添加し、HPV16由来のE7遺伝子およびhTERTを導入したヒト子宮内膜由来細胞株の培養上清2mlをウイルス液2mlと置換し、37℃、5% CO2濃度の孵卵器で一晩培養した。100μg/mlのG418、50μg/mlのハイグロマイシンBおよび1μg/mlのピューロマイシンを含む同培地に交換して更に同様の条件で培養し、レトロウイルスベクターLXSN-16E7、LXSH-hTERTおよびMSCVpuro-16E6SDD151の組み込まれた細胞株を得た。
約４ヶ月上記条件で培養し、不死化した細胞を選択した後、希釈により独立した単一細胞（single cell）由来の細胞株を２種、樹立した。【０１４６】
（３）ヒト子宮内膜由来不死化細胞株からの心筋細胞の誘導
ヒト子宮内膜由来不死化細胞株の心筋細胞への分化能について、以下の通り検討した。
上記（２）で得られた２種のヒト子宮内膜由来不死化細胞株について、文献に記載された方法[J.Gene Med., 6, 833-845 (04)]に従い、緑色蛍光タンパク質（以下、GFPと略記する）を発現するアデノウイルスを感染させた。即ち、５×10４/cm2の密度でヒト子宮内膜由来不死化細胞株を10% FCSを含むDMEM培地で6cm培養皿に植え込み、GFPを発現するアデノウイルスを翌日感染させた。上清を除き同培地で37℃、5%CO2濃度の孵卵機にて更に培養した。GFPの発現は、蛍光共焦点顕微鏡にて確認した。【０１４７】
GFPで標識したヒト子宮内膜由来不死化細胞株は、5-アザシチジン（Sigma社製、以下、5-aza-Cと略記する）処理群としては、3μmol/lの濃度になるように5-aza-Cを添加した10% FCSを含むDMEM培地を用いて、5%CO2濃度の孵卵機にて24時間、37℃で培養することにより脱メチル処理を行った。培地を交換することで5-aza-Cを除去し、１日後に細胞を回収して、単独で培養するものとマウス胎児由来心筋細胞と共培養するものに分けた。一方、5-aza-C未処理群としては、5-aza-Cを含まない培地を用いて全く同様の培養を行い、細胞を回収して単独で培養するものとマウス胎児由来心筋細胞と共培養するものに分けた。【０１４８】
マウス胎児由来心筋細胞との共培養は、文献[J.Gene Med., 6, 833-845 (04)]に記載された条件で行った。即ち、5-aza-C処理したヒト子宮内膜由来不死化細胞株および、5-aza-C処理しなかったヒト子宮内膜由来不死化細胞株を、0.05%トリプシン(GIBCO社製)および0.25mmol/l EDTA（ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid）を含むPBS  (phosphate-buffered saline)により、培養皿からはがし、予め５×103/cm2の密度で植え込んだ、マウス胎児由来心筋細胞の上に重層した。培地は、10% FCSを含むDMEM培地を用い、5%CO2濃度の孵卵機にて、37℃で培養することによりヒト子宮内膜由来不死化細胞株の心筋細胞への誘導を行った。共培養を行わないヒト子宮内膜由来不死化細胞株は、同様に0.05%トリプシンおよび 0.25mmol/l EDTAを含むPBS  により培養皿からはがした後、10% FCSを含むDMEM培地を用いて5%CO2濃度の孵卵機にて、37℃で培養した。【０１４９】
１週間マウス胎児由来心筋細胞と共培養を行った２種のヒト子宮内膜由来不死化細胞株の培養皿は、目視でほぼ100％自己拍動を生じ、GFP蛍光を示す細胞同士が同期して収縮しているものが観察された。しかし、すべての細胞が同期してしまうため、正確に心筋誘導を生じている細胞の割合を評価することは困難であった。そこで、この２種のヒト子宮内膜由来不死化細胞株について１週間マウス胎児由来心筋細胞と共培養したサンプル及び、共培養せず単独で培養したサンプルを準備した。培養液中の血清を除去するためPBSで一回洗浄し、その後0.05%トリプシン及び、0.25mmol/lのEDTAを含有するPBSを加えて37℃の加湿した孵卵器の中で５分間酵素反応を行った。細胞はペトリ培養皿より一塊となって剥離した。剥離した組織を0.5% コラゲナーゼ (TypeII、Worthington社製)と2,3-butanedione monoxime（以下、BDMと略記する）10mmol/lを含有するPBS内に投入し、37℃の恒温槽内でさらに20分間反応させ、細胞を単離した。これらの細胞には、マウス由来細胞が混入しているため、ヒト子宮内膜由来不死化細胞株に発現している抗原に対する抗体である、抗ヒトCD59抗体（BD-555764、Becton Dickinson Bioscience 社製）を用いて磁気マイクロビーズ（BD IMagnet Cell Separation Magnet、BD-552311、Becton Dickinson Bioscience社製）を用いて細胞単離を行った。抗ヒトCD59抗体を用いて細胞を分離すると、GFP陰性の細胞は混入せず、ほぼヒト由来の細胞のみが回収された。【０１５０】
この細胞について、細胞内抗原でヒト心筋特異的なタンパク質であるTroponin Iに対する抗体(Monoclonal mouse anti-cardiac Troponin I for human Catalogue # 4T21、HyTest社製)を用いて染色を行った。まずスライドガラスをPoly-L-Lysine (P8920、Sigma社製)にて表面をコートした。スライドガラスは前もって1%のHClを含有した70%エタノールにて洗浄し、同部に純水で10倍希釈したPoly-L-Lysineを加えて室温で5分間放置した。Poly-L-Lysineをその後除去し、60℃で１時間かけ十分乾燥させた。このLysineでコートされたスライドグラス上にヒト子宮内膜由来不死化細胞株の浮遊液を１時間乗せ、スライドガラス上に強固に接着させた。その後細胞は4%パラフォルムアルデヒドにて固定し、0.02% Triton-Xを含有したPBS液に20分間浸して、細胞膜を破壊した。その後、一次抗体として抗ヒト心筋 Troponin I抗体 をPBSで400倍に希釈したものを加え、一日、保湿しながら冷蔵庫内で反応させた。その後、PBSで10回洗浄して残留抗体を除去し、2次抗体(Anti Mouse TRITC、Sigma社製)溶液を加えて、保湿しながら室温で30分間反応させた。共焦点レーザー顕微鏡（FV1000、Olympus社製）を用いて同サンプルを観察すると、ヒト心筋Troponin Iが中心の核を避けてドーナツ上に染色される像が観察された。これを陽性と判断し、GFP陽性細胞中のTroponin I発現細胞の割合を心筋誘導率として算出した。その結果は、図１に示されるとおりであった。【０１５１】
その結果、5-aza-C処理の有無に関らず、マウス胎児由来心筋細胞との共培養を行わず、単独で培養した２種のヒト子宮内膜由来不死化細胞株では、Troponin I陽性細胞の比率は極めて低かった（GFP陽性細胞の5%以下）。一方、マウス胎児由来心筋細胞と共培養した条件では、5-aza-C処理した２種のヒト子宮内膜由来不死化細胞株は、ほぼ100%、従来心筋誘導に不可欠と考えられていた5-aza-Cの処理をしなかった２種のヒト子宮内膜由来不死化細胞株においても約80%のTroponin I陽性率を示した。従来のヒト心筋細胞への誘導率(一般的には1%以下)と比較して、ヒト子宮内膜由来不死化細胞株は、心筋細胞との共培養を行うことにより、5-aza-C処理の有無に関らず、極めて高率に自己拍動し、培養皿上ですでに生理的な機能を有した心筋になることが明らかになった。【０１５２】
以上のようにして得られた２種の細胞を、Ｅ−ＭＳＣ（ｈＥＰＣ１００）細胞およびＥ−ＭＳＣ（ｈＥＰＣ２１４）細胞と呼ぶこととし、また両者を以下において一括して呼ぶときには、これをヒト子宮内膜由来不死化細胞株またはＥ−ＭＳＣと呼ぶこととする。【０１５３】
（４）コラーゲンゲルフィルムによる分離条件での共培養
（３）で示した高い心筋誘導率が、マウス胎児由来心筋細胞とヒト子宮内膜由来不死化細胞株との細胞融合の結果である可能性を否定するため以下の実験を行った。即ち、組織培養用コラーゲン膜(CM-6、Koken社製)を用いて、そのコラーゲン膜の上面にマウス胎児由来心筋細胞を培養し、下面にE-MSCを培養して観察した。細胞密度、培養条件などは基本的に前述の方法と同様に行った。すなわち、マウス胎児由来心筋細胞を組織培養コラーゲン膜上面に1x105/cm2細胞播種し、培地は、10% FCSを含むDMEM培地を用い、5%CO2濃度の孵卵機にて、37℃で２４時間培養した。 一方、 ５×10４/cm2の密度でヒト子宮内膜由来不死化細胞株を10% FCSを含むDMEM培地で6cm培養皿に植え込み、GFPを発現するアデノウイルスを翌日感染させた。上清を除き同培地で37℃、5%CO2濃度の孵卵機にて更に培養した。GFPの発現は、蛍光共焦点顕微鏡にて確認した。感染１日後に回収したGFPで標識したヒト子宮内膜由来不死化細胞株を、上面にマウス胎児由来心筋細胞が培養されているコラーゲン膜を上下逆転し、コラーゲン膜底面を上向きにし、５×10４/cm2の密度でヒト子宮内膜由来不死化細胞株を５×10３/cm2の密度でコラーゲン膜底面に播種し、さらに10% FCSを含むDMEM培地を用い、5%CO2濃度の孵卵機にて、37℃で２４時間培養した。 細胞が十分付着した頃に、同コラーゲン膜を別の培養皿に移し、再度、マウス胎児由来心筋細胞を上面にして培養を続けた。本培養条件では、E-MSCはコラーゲン膜で物理的に初代マウス培養心筋細胞と隔絶しており、物理的に接触していないため細胞融合が生じることは無い。本培養条件ではE-MSCが、培養１週間後より自己拍動を開始した。同細胞を共焦点レーザー顕微鏡にて観察することにより、明瞭なヒトTroponin Iの発現を認めた。本方法により、E-MSCの心筋誘導が細胞融合によるものではないことが証明された。【０１５４】
実施例２
E-MSCから誘導される心筋細胞の特性
E-MSCはマウス胎児由来心筋細胞との共培養後2日目より自己拍動を開始し、3〜4日でE-MSC同士が同期して収縮し始めた。肉眼的にはGFPの蛍光を発している細胞の100%が収縮していることを観察でき、この状態で約一ヶ月間培養が可能であった。E-MSCを5-aza-C処理せず、マウス胎児由来心筋細胞との共培養のみで心筋に誘導した。このような条件で心筋に誘導したE-MSCに発現している、心筋特異的なタンパク質のmRNAをRT-PCR法により測定した。共培養開始７日後に培養液中の血清を除去するためPBSで一回洗浄し、その後0.05%トリプシンおよび0.25mmol/lのEDTAを含有するPBSを加えて37℃の加湿した孵卵器の中で５分間酵素反応を行った。細胞はペトリ培養皿より一塊となって剥離した。剥離した組織を0.5% コラゲナーゼとBDM 10mmol/lを含有するPBS内に投入し、37℃の恒温槽内でさらに20分間反応させ、細胞を単離した。単離した細胞は、抗ヒトCD59抗体を用いた磁気ビーズ細胞分離法を用いてヒト由来細胞を濃縮した。濃縮した細胞から文献[J.Gene Med., 6, 833-845 (04)]に基づき全RNAを抽出し、First-strand ｃDNAを合成した。即ち、Isogen（日本ジーン社製）を用いて、細胞から全RNAを抽出し、First-strand cDNA synthesis kit (Amersham Pharmacia Biotec社製)を用いて、cDNAを合成した。また、ヒト心筋由来RNAは市販（Clontech社製）のものを購入し、上記と同様の方法を用いてcDNAに変換した。【０１５５】
次に、心筋細胞特異的な遺伝子の発現を検討するために、First strand cDNAを基質として、配列番号１〜３６に示した塩基配列を有する合成DNAを用いて定量的PCRを行った。心筋細胞特異的な遺伝子としては、ナトリウム利尿ペプチドであるANPおよびBNP、筋肉収縮を調節するタンパク質であるTroponin TおよびTroponin I、アクチンであるcardiac actin、ミオシン軽鎖であるMLC-2a、心筋細胞特異的転写因子であるNkx2.5/Csx、GATA4を用いた。これらの配列は、ヒト特異的なプライマーとして設定したので、マウス心筋細胞由来cDNAがサンプルに混入していても、測定結果には影響を与えない。【０１５６】
ANPの増幅には配列番号１、２の塩基配列を有する合成DNAを、BNPの増幅には配列番号３、４の塩基配列を有する合成DNAを、Troponin Tの増幅には配列番号５、６の塩基配列を有する合成DNAを、Troponin Iの増幅には配列番号７、８の塩基配列を有する合成DNAを、cardiac actinの増幅には配列番号９、１０の塩基配列を有する合成DNAを、MLC-2aの増幅には配列番号１１、１２の塩基配列を有する合成DNAを、心筋細胞特異的転写因子であるNkx2.5/Csxの増幅には配列番号13、14の塩基配列を有する合成DNAを、GATA4の増幅には配列番号15、16の塩基配列を有する合成DNA用いた。【０１５７】
RT-PCR解析の結果、マウス胎児由来心筋細胞と共培養したE-MSCには、ヒト心筋細胞と同様、心筋細胞特異的な遺伝子として、ナトリウム利尿ペプチドであるANPおよびBNP、筋肉収縮を調節するタンパク質であるTroponin TおよびTroponin I、アクチンであるcardiac actin、ミオシン軽鎖であるMLC-2a、心筋細胞特異的転写因子であるNkx2.5/Csx、GATA4のmRNAが発現していることが観察された。【０１５８】
E-MSCには、これらの心筋細胞特異的遺伝子mRNAが、共培養する前から発現していることが観察された。不死化による遺伝子導入によって、間葉系細胞の性質自体が変化しないことから考えて[J.Gene Med., 6, 833-845 (04)]、このような心筋先祖細胞と呼べるような間葉系幹細胞が子宮内膜には多量に存在している可能性が示唆された。【０１５９】
共焦点レーザー顕微鏡による観察では、心筋細胞に分化したE-MSCはヒト心筋細胞特異的なTroponin Iを強発現しており、強い収縮を生じる細胞に特徴的な繊維状構造を観察することができた。緑色のGFP蛍光を発するE-MSCにのみ、心筋Troponin Iの反応が検出された。【０１６０】
共焦点レーザー顕微鏡を用いて、心筋細胞に分化したE-MSCのαアクチニン染色と、心筋同士が電気的に結合し心筋が共同して収縮するのに必須なconnexin 43（以下、Cx43と略記する）タンパク質の免疫染色について検討した。αアクチニン染色によって明瞭で、ある一定の配向構造を持つ発達した横紋構造を観察することができた。このことは本細胞が非常に強く収縮していたことを意味し、顕微鏡で肉眼的に観察していた状況と合致する結果である。【０１６１】
また、核を中心に細胞質の辺縁を取り囲むように、非常に強いCx43の染色像が観察された。本細胞が周辺の細胞と強固に電気的に結合していたことを示し、本細胞の自動能による収縮時に観察された同期現象を極めて良く説明できる。【０１６２】
自発的な興奮収縮を起こす細胞は心筋だけとは限らない。骨格筋も平滑筋も自発的興奮を生じることがあるため、本細胞が心筋細胞であることを証明するためには、活動電位の測定が必要である。心筋細胞の活動電位は心筋特異的な、L型Ca電流によって生じる特異的なプラトー相を有しており、そのため活動電位持続時間は200-300m秒程度の幅を有している。【０１６３】
２種のE-MSCを5-aza-C処理を行わないでマウス胎児由来心筋細胞との共培養のみで心筋に誘導し、心筋に誘導したE-MSCから活動電位を記録した。E-MSCはマウス胎児由来心筋細胞の上に存在しているため、E-MSC細胞に記録電極を刺入した場合、その直下のマウス心筋細胞に電極が挿入されている可能性が否定できない。そこで、文献[J.Gene Med., 6, 833-845 (04)]の方法に基づき、活動電位を測定した。即ち、0.5mmol/lのAlexa-568を2mol/lのKCｌ電極内液に溶解し、記録ガラス電極内に封入して記録した。すなわち、ガラス管(WPI社 CG-150-100TF)からSutter社電極プラーP-97を用いて、2mol/lのKClを封入した状態で10-20 MΩ程度の抵抗値を有する細胞内電位記録用微小電極を作製した。細胞を除震台（明立 AZI-0806HS）上に設置した着磁仕様ジブラルタルプラットフォーム(Gibraltar XX-1ss)上のノイズレスヒートプレート(Olympus社製 U-PHP)上で３７℃に保温し保持した。同細胞を、倒立落射蛍光顕微鏡（Olympus社製IX-70-23FL/DIC）ノマルスキー微分干渉顕微鏡にて観察下に実験を行った。細胞は蛍光顕微鏡によって、自己拍動する緑色の蛍光を発する細胞を目視で同定し、同細胞に対してピエゾ駆動式パッチクランプマイクロマニピュレーター(PCS-5400、Narishige社製)を用いてガラス電極を接近させ刺入した。すなわち、細胞を貫かないように、電極先端を細胞膜表面に接着させた後、Buzz systemを用いて細胞膜に穴をあけ、電極を細胞内に刺入した。記録は安定して５−１０分間記録できた。電極先端が小さいため電位記録中はほとんど細胞内に赤色の色素は観察できないが、電位記録終了後、10nA程度の電流を電極を介して細胞内に流すことによって、荷電したAlexa-568は細胞内にイオノフォレーシスによって浸透し、細胞全体が速やかに染色された。緑色の蛍光を示す細胞の形態と電位記録後に赤色に見られる染色パターンを比較することによって、電位を記録した細胞がGFP陽性のE-MSC細胞であることが確認できた。電位は、ガラス電極内に挿入したプラチナ電極を介してパッチクランプ用アンプ(Axopatch
200B、Axon社製)を用いて細胞内電位を増幅し、コンピューター上にデータ取り込み装置(pClamp8)を用いて波形を取り込んだ。【０１６４】
記録した活動電位は自動能を有する細胞に特徴的なペースメーカー電位を有しており、１つのE-MSCは比較的活動電位の短い、洞調律型の活動電位を示し、別のE-MSCは、活動電位幅が広く、静止膜電位の深い、作業心筋型の活動電位を呈した。いずれも心筋特異的な電位波形を有していた。【０１６５】
以上の結果より、E-MSCは、マウス胎児由来心筋細胞と共培養することにより、作業心筋型の心筋細胞および、洞結節細胞型の心筋細胞に分化することが示された。【０１６６】
実施例３
E-MSCの表面抗原の解析
ヒト子宮内膜から効率的に心筋形成能を有する細胞を単離・精製するために、フローサイトメーター（BD FACSort、Becton Dickinson Bioscience社製）を用いてE-MSC細胞の表面抗原の解析を行った。
解析に用いたのは、血管内皮細胞の表面抗原として知られているFlk-1、CD31、造血系細胞の表面抗原として知られているCD13、CD14、CD34、CD45、CD90、間葉系細胞の表面抗原として知られているCD140a（PDGF受容体α、以下、PDGFRαと略記する）、インテグリンCD29、マトリックス受容体CD44、CD50、CD54、B細胞や顆粒球のマーカーであるCD24、血液細胞に広く発現しているCD55、CD59、免疫グロブリンスーパーファミリーの一員である接着分子CD166の16種類である。【０１６７】
FACS用緩衝液（1% FCS-PBS）に懸濁した子宮内膜細胞に各抗体を2μg/5x105cells/0.2mlの濃度で加えて氷中で30分間反応させた。【０１６８】
ネガティブコントロールとしては、抗マウスIgTRITC標識抗体（AP160R 、Chemicon社製）とのみ反応させた細胞を用いた。
FITC標識あるいはPE標識抗体で処理した細胞は、緩衝液で３回洗浄後0.5mlに懸濁した。
未標識の１次抗体で処理した細胞は、緩衝液で洗浄後、2ug/5x105cells/0.2mlの濃度の抗マウスIgTRITC標識抗体と氷中で30分間反応させ、緩衝液で３回洗浄後0.5mlに懸濁した。
フローサイトメーター（BD FACSort、Becton Dickinson Bioscience社製）で蛍光強度を測定し、蛍光強度が増加するか否かで抗原分子の発現の有無を調べた。
CD140a抗原の発現については未標識の抗ヒトCD140a（PDGFRα）抗体（556001、PharMingen社製）を用いて抗体反応を行い、抗マウスIgTRITC標識抗体処理後、フローサイトメーターで測定した。【０１６９】
Flk-1抗原の発現については、未標識の抗ヒトFlk-1抗体（sc-6251、Santa Cruz社製）を用いて抗体反応を行い、抗マウスIgTRITC標識抗体処理後、フローサイトメーターで測定した。【０１７０】
CD31抗原の発現については、FITC標識された抗ヒトCD31抗体（IM1431、Beckman Coulter社製）を用いて抗体反応を行い、フローサイトメーターで測定した。【０１７１】
CD13抗原の発現については、FITC標識された抗ヒトCD13抗体（IM0778、Beckman Coulter社製）を用いて抗体反応を行い、フローサイトメーターで測定した。【０１７２】
CD14抗原の発現については、FITC標識された抗ヒトCD14抗体（PN6604110、Beckman Coulter社製）を用いて抗体反応を行い、フローサイトメーターで測定した。【０１７３】
CD34抗原の発現については、PE標識された抗ヒトCD34抗体（IM1250、Beckman Coulter社製）を用いて抗体反応を行い、フローサイトメーターで測定した。【０１７４】
CD45抗原の発現については、FITC標識した抗ヒトCD45抗体（PM31254X、PharMingen,社製）を用いて抗体反応を行い、フローサイトメーターで測定した。【０１７５】
CD90抗原の発現については、PE標識した抗ヒトCD90抗体（HD7403、Beckman Coulter社製）を用いて抗体反応を行い、フローサイトメーターで測定した。【０１７６】
CD29抗原の発現については、FITC標識したヒトCD29抗体（PN6604105、Beckman Coulter社製）を用いて抗体反応を行い、フローサイトメーターで測定した。【０１７７】
CD44抗原の発現については、FITC標識したヒトCD44抗体（IM1219、Beckman Coulter社製）を用いて抗体反応を行い、フローサイトメーターで測定した。【０１７８】
CD50抗原の発現については、PE標識した抗ヒトCD50抗体（IM1601、Beckman Coulter社製）を用いて抗体反応を行い、フローサイトメーターで測定した。【０１７９】
CD54抗原の発現については、未標識のヒトCD54抗体（IM0544、Beckman Coulter社製）を用いて抗体反応を行い、抗マウスIgTRITC標識抗体処理後、フローサイトメーターで測定した。【０１８０】
CD24抗原の発現については、未標識のヒトCD24抗体（IM0118、Beckman Coulter社製）を用いて抗体反応を行い、抗マウスIgTRITC標識抗体処理後、フローサイトメーターで測定した。【０１８１】
CD55抗原の発現については、FITC標識した抗ヒトCD55抗体（IM2725、Beckman Coulter社製）を用いて抗体反応を行い、フローサイトメーターで測定した。【０１８２】
CD59抗原の発現については、FITC標識した抗ヒトCD59抗体（IM3457、Beckman Coulter社製）を用いて抗体反応を行い、フローサイトメーターで測定した。【０１８３】
CD166抗原の発現については、未標識の抗ヒトCD166抗体（RDI-CD166-aA6、RDI社製）を用いて抗体反応を行い、フローサイトメーターで測定した。【０１８４】
フローサイトメーター測定結果は図２〜図５に示されるとおりであり、その解析結果をまとめると、以下の表のとおりであった。
【表１】
2006078034.tif 000002
【０１８５】
実施例４
in vivo移植実験
上記実施例２（４）と同様にして、E-GFP染色されたシート状の移植グラフトを得た。得られたシートを培養液中で２−３層に重ね、コラーゲンフィルム膜(CM-6, Kohken社製)に乗せた。コラーゲン膜を接子で持ち、拒絶免疫の無いNude Rat心臓表面に移植し閉胸した。２週間後に再開胸し。、心臓を固定し、免疫染色を行った。心臓を、抗Cardiac Troponin-I抗体、Sarcomeric alpha actinin抗体、Connexin 43抗体で染色し、共焦点レーザーコンフォーカル顕微鏡を用いる事によって移植グラフトが心筋へ誘導されているかを確認したところ、心筋特異的な明瞭な横紋と、Cardiac troponin-Iの明瞭な染色、Connexin43蛋白の発現が認められた。移植されたグラフトが移植先で心筋に高率に誘導され全層性に心筋となっているのが確認された。【０１８６】
実施例５
（１）ヒト月経血からの細胞の分離と培養
月経１日目（生理が始まった１日目）の月経血を生理用品ないしは直接、外陰部より、10mlの無菌的なプラスティック・ディッシュに移行させた。プラスティック・ディッシュに採取された月経血を、20mlの培養液 [1%牛胎仔血清入りのDMEM (Dulbecco's modified MEM)培地、ペニシリン・ストレプトマイシンの抗生物質を添加] を入れた50 mlプラスティック・チューブに移動させた。取得した月経血が含まれる培養液を1,000×gの遠心分離により月経血に含まれる細胞を回収した後、月経血細胞を10%のFBS（牛胎仔血清）を含むα-MEM (α-modified MEM)培地に再浮遊させることにより月経血に由来する細胞液を得た。【０１８７】
単離した、月経血に含まれる細胞を、牛等の血清を10〜20%添加した、α-MEM培地に分散し、組織培養用のプラスチック製培養皿に入れ、培養温度33〜37℃で、5〜10%の二酸化炭素ガスで満たした孵卵器で培養した。培養開始後2日目に、赤血球を除去するために、培地交換を行った。細胞が培養皿一面に増殖する頃、培地を除去して、トリプシン EDTA溶液を加えることで細胞を浮遊させた。【０１８８】
（２）ヒト月経血間葉系幹細胞からの心筋誘導
上記（１）で得られたヒト月経血間葉系幹細胞の心筋細胞への分化能について、以下の通り検討した。すなわち、ヒト月経血間葉系幹細胞について、文献に記載された方法[J.Gene Med., 6, 833-845 (04)]に従い、GFPを発現するアデノウイルスを感染させた。即ち、５×10４/cm2の密度でヒト月経血間葉系幹細胞を10% FCSを含むDMEM培地で6cm培養皿に植え込み、GFPを発現するアデノウイルスを翌日感染させた。上清を除き同培地で37℃、5%CO2濃度の孵卵機にて更に培養した。GFPの発現は、蛍光共焦点顕微鏡にて確認した。【０１８９】
マウス胎児由来心筋細胞との共培養は、文献[J.Gene Med., 6, 833-845 (04)]に記載された条件で行った。5-aza-C処理しなかったヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞を、0.05%トリプシン(GIBCO社製)および0.25mmol/l EDTA（ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid）を含むPBS(phosphate-buffered saline)により、培養皿からはがし、予め５×103/cm2の密度で植え込んだ、マウス胎児由来心筋細胞の上に重層した。培地は、10% FCSを含むDMEM培地を用い、5%CO2濃度の孵卵機にて、37℃で培養することによりヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞の心筋細胞への誘導を行った。共培養を行わないヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞は、同様に0.05%トリプシンおよび 0.25mmol/l EDTAを含むPBS  により培養皿からはがした後、10% FCSを含むDMEM培地を用いて5%CO2濃度の孵卵機にて、37℃で培養した。【０１９０】
（３）ヒト月経血間葉系幹細胞の心筋誘導率
１週間マウス胎児由来心筋細胞と共培養を行ったヒト月経血間葉系幹細胞の培養皿は、目視でほぼ50％自己拍動を生じ、GFP蛍光を示す細胞同士が同期して収縮しているものが観察された。しかし、すべての細胞が同期してしまうため、正確に心筋誘導を生じている細胞の割合を評価することは困難であった。そこで、このヒト月経血間葉系幹細胞について１週間マウス胎児由来心筋細胞と共培養したサンプル及び、共培養せず単独で培養したサンプルを準備した。培養液中の血清を除去するためPBSで一回洗浄し、その後0.05%トリプシン及び、0.25mmol/lのEDTAを含有するPBSを加えて37℃の加湿した孵卵器の中で５分間酵素反応を行った。細胞はペトリ培養皿より一塊となって剥離した。剥離した組織を0.5% コラゲナーゼ (TypeII、Worthington社製)と2,3-butanedione monoxime（以下、BDMと略記する）10mmol/lを含有するPBS内に投入し、37℃の恒温槽内でさらに20分間反応させ、細胞を単離した。【０１９１】
この細胞について、細胞内抗原でヒト心筋特異的なタンパク質であるTroponin Iに対する抗体(Monoclonal mouse anti-cardiac Troponin I for human Catalogue # 4T21、HyTest社製)を用いて染色を行った。まずスライドガラスをPoly-L-Lysine (P8920、Sigma社製)にて表面をコートした。スライドガラスは前もって1%のHClを含有した70%エタノールにて洗浄し、同部に純水で10倍希釈したPoly-L-Lysineを加えて室温で5分間放置した。Poly-L-Lysineをその後除去し、60℃で１時間かけ十分乾燥させた。このLysineでコートされたスライドグラス上にヒト月経血間葉系幹細胞の浮遊液を１時間乗せ、スライドガラス上に強固に接着させた。その後細胞は4%パラフォルムアルデヒドにて固定し、0.02% Triton-Xを含有したPBS液に20分間浸して、細胞膜を破壊した。その後、一次抗体として抗ヒト心筋 Troponin I抗体 をPBSで400倍に希釈したものを加え、一日、保湿しながら冷蔵庫内で反応させた。その後、PBSで10回洗浄して残留抗体を除去し、2次抗体(Anti Mouse TRITC、Sigma社製)溶液を加えて、保湿しながら室温で30分間反応させた。共焦点レーザー顕微鏡（FV1000、Olympus社製）を用いて同サンプルを観察すると、ヒト心筋Troponin Iが中心の核を避けてドーナツ上に染色される像が観察された。これを陽性と判断し、GFP陽性細胞中のTroponin I発現細胞の割合を心筋誘導率として算出した。その結果は、約30%のヒト月経血間葉系幹細胞にTroponin-Iが発現していた。【０１９２】
その結果、5-aza-C処理の有無に関らず、マウス胎児由来心筋細胞との共培養を行わず、単独で培養したヒト月経血間葉系幹細胞では、Troponin I陽性細胞の比率は極めて低かった（GFP陽性細胞の１%以下）。一方、マウス胎児由来心筋細胞と共培養した条件では、心筋誘導に不可欠と考えられていた5-aza-Cの処理をしなかったヒト月経血間葉系幹細胞においても約30%のTroponin I陽性率を示した。従来のヒト心筋細胞への誘導率(一般的には1%以下)と比較して、ヒト月経血間葉系幹細胞は、心筋細胞との共培養を行うことにより、5-aza-C処理の有無に関らず、極めて高率に自己拍動し、培養皿上ですでに生理的な機能を有した心筋になることが明らかになった。【０１９３】
（４）ヒト月経血間葉系細胞から得られた心筋特異的活動電位
実施例２と同様に、文献[J.Gene Med., 6, 833-845 (04)]の方法に基づき、活動電位を測定した。その結果、記録できた活動電位は、幅300 msec近くある心筋特有の活動電位を呈し、拡張期緩徐脱分極（ペースメーカー電位）を有していた。【０１９４】
実施例６
（１）ヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞からの心筋誘導
ヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞の心筋細胞への分化能について、以下の通り検討した。
出産時に子宮から脱落した胎盤、臍帯を採取し、20mlの培養液 [1%牛胎仔血清入りのDMEM (Dulbecco's modified MEM)培地、ペニシリン・ストレプトマイシンの抗生物質、およびheparin 100Uを添加] を入れた50 mlプラスティック・チューブに移動させた。チューブ内で軽く洗浄した後、組織を10mlの無菌的なプラスティック・ディッシュに移行させた。組織はプラスティック・ディッシュ内で眼科用鋏で細断し(約1-5mm3大)、数分間静置した後、血液細胞が含まれる上清を廃棄し、再び、DMEMにて組織を洗浄した。この操作を３−４回繰り返した。組織を10%のFBS（牛胎仔血清）を含むα-MEM (α-modified MEM)培地に再浮遊させた。【０１９５】
胎盤、臍帯組織の含まれる液体を、牛等の血清を10〜20%添加したα-MEM培地に分散し、これを組織培養用のプラスチック製培養皿に入れ、培養温度33〜37℃で、5〜10%の二酸化炭素ガスで満たした孵卵器で培養した。培養開始後2日目に、赤血球を除去するために、培地交換を行った。細胞が培養皿一面に増殖する頃、培地を除去して、トリプシン EDTA溶液を加えることで細胞を浮遊させた。
こうして得られたヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞について、文献に記載された方法[J.Gene Med., 6, 833-845 (04)]に従い、GFPを発現するアデノウイルスを感染させた。即ち、５×10４/cm2の密度でヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞を10% FCSを含むDMEM培地で6cm培養皿に植え込み、GFPを発現するアデノウイルスを翌日感染させた。上清を除き同培地で37℃、5%CO2濃度の孵卵機にて更に培養した。GFPの発現は、蛍光共焦点顕微鏡にて確認した。【０１９６】
マウス胎児由来心筋細胞との共培養は、文献[J.Gene Med., 6, 833-845 (04)]に記載された条件で行った。5-aza-C処理しなかったヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞を、0.05%トリプシン(GIBCO社製)および0.25mmol/l EDTA（ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid）を含むPBS(phosphate-buffered saline)により、培養皿からはがし、予め５×103/cm2の密度で植え込んだ、マウス胎児由来心筋細胞の上に重層した。培地は、10% FCSを含むDMEM培地を用い、5%CO2濃度の孵卵機にて、37℃で培養することによりヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞の心筋細胞への誘導を行った。共培養を行わないヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞は、同様に0.05%トリプシンおよび 0.25mmol/l EDTAを含むPBS  により培養皿からはがした後、10% FCSを含むDMEM培地を用いて5%CO2濃度の孵卵機にて、37℃で培養した。【０１９７】
（２）ヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞の心筋誘導率
１週間マウス胎児由来心筋細胞と共培養を行ったヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞の培養皿は、目視でほぼ30％自己拍動を生じ、GFP蛍光を示す細胞同士が同期して収縮しているものが観察された。しかし、すべての細胞が同期してしまうため、正確に心筋誘導を生じている細胞の割合を評価することは困難であった。そこで、このヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞について１週間マウス胎児由来心筋細胞と共培養したサンプル及び、共培養せず単独で培養したサンプルを準備した。培養液中の血清を除去するためPBSで一回洗浄し、その後0.05%トリプシン及び、0.25mmol/lのEDTAを含有するPBSを加えて37℃の加湿した孵卵器の中で５分間酵素反応を行った。細胞はペトリ培養皿より一塊となって剥離した。剥離した組織を0.5% コラゲナーゼ (TypeII、Worthington社製)と2,3-butanedione monoxime（以下、BDMと略記する）10mmol/lを含有するPBS内に投入し、37℃の恒温槽内でさらに20分間反応させ、細胞を単離した。【０１９８】
この細胞について、細胞内抗原でヒト心筋特異的なタンパク質であるTroponin Iに対する抗体(Monoclonal mouse anti-cardiac Troponin I for human Catalogue # 4T21、HyTest社製)を用いて染色を行った。まずスライドガラスをPoly-L-Lysine (P8920、Sigma社製)にて表面をコートした。スライドガラスは前もって1%のHClを含有した70%エタノールにて洗浄し、同部に純水で10倍希釈したPoly-L-Lysineを加えて室温で5分間放置した。Poly-L-Lysineをその後除去し、60℃で１時間かけ十分乾燥させた。このLysineでコートされたスライドグラス上にヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞の浮遊液を１時間乗せ、スライドガラス上に強固に接着させた。その後細胞は4%パラフォルムアルデヒドにて固定し、0.02% Triton-Xを含有したPBS液に20分間浸して、細胞膜を破壊した。その後、一次抗体として抗ヒト心筋 Troponin I抗体 をPBSで400倍に希釈したものを加え、一日、保湿しながら冷蔵庫内で反応させた。その後、PBSで10回洗浄して残留抗体を除去し、2次抗体(Anti Mouse TRITC、Sigma社製)溶液を加えて、保湿しながら室温で30分間反応させた。共焦点レーザー顕微鏡（FV1000、Olympus社製）を用いて同サンプルを観察すると、ヒト心筋Troponin Iが中心の核を避けてドーナツ上に染色される像が観察された。これを陽性と判断し、GFP陽性細胞中のTroponin I発現細胞の割合を心筋誘導率として算出した。その結果は、約２０%のヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞にTroponin-Iが発現していた。【０１９９】
その結果、5-aza-C処理の有無に関らず、マウス胎児由来心筋細胞との共培養を行わず、単独で培養したヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞では、Troponin I陽性細胞の比率は極めて低かった（GFP陽性細胞の１%以下）。一方、マウス胎児由来心筋細胞と共培養した条件では、心筋誘導に不可欠と考えられていた5-aza-Cの処理をしなかったヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞においても約２0%のTroponin I陽性率を示した。従来のヒト心筋細胞への誘導率(一般的には1%以下)と比較して、ヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞は、心筋細胞との共培養を行うことにより、5-aza-C処理の有無に関らず、極めて高率に自己拍動し、培養皿上ですでに生理的な機能を有した心筋になることが明らかになった。【０２００】
（２）ヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞から得られた心筋特異的活動電位
実施例２と同様に、文献[J.Gene Med., 6, 833-845 (04)]の方法に基づき、活動電位を測定した。その結果、記録できた活動電位は、幅300 msec近くある心筋特有の活動電位を呈し、拡張期緩徐脱分極（ペースメーカー電位）を有しているものもあった。【０２０１】
実施例７
ヒト羊膜間葉系幹細胞からの心筋誘導
ヒト羊膜間葉系幹細胞の心筋細胞への分化能について、以下の通り検討した。
上記実施例６（１）に記載の方法に準じて得られた、ヒト羊膜間葉系幹細胞について、文献に記載された方法[J.Gene Med., 6, 833-845 (04)]に従い、GFPを発現するアデノウイルスを感染させた。即ち、５×10４/cm2の密度でヒト羊膜間葉系幹細胞を10% FCSを含むDMEM培地で6cm培養皿に植え込み、GFPを発現するアデノウイルスを翌日感染させた。上清を除き同培地で37℃、5%CO2濃度の孵卵機にて更に培養した。GFPの発現は、蛍光共焦点顕微鏡にて確認した。【０２０２】
マウス胎児由来心筋細胞との共培養は、文献[J.Gene Med., 6, 833-845 (04)]に記載された条件で行った。5-aza-C処理しなかったヒト羊膜間葉系幹細胞を、0.05%トリプシン(GIBCO社製)および0.25mmol/l EDTA（ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid）を含むPBS  (phosphate-buffered saline)により、培養皿からはがし、予め５×103/cm2の密度で植え込んだ、マウス胎児由来心筋細胞の上に重層した。培地は、10% FCSを含むDMEM培地を用い、5%CO2濃度の孵卵機にて、37℃で培養することによりヒト羊膜間葉系幹細胞の心筋細胞への誘導を行った。共培養を行わないヒト羊膜間葉系幹細胞は、同様に0.05%トリプシンおよび 0.25mmol/l EDTAを含むPBS  により培養皿からはがした後、10% FCSを含むDMEM培地を用いて5%CO2濃度の孵卵機にて、37℃で培養した。
（２）ヒト羊膜間葉系幹細胞の心筋誘導率【０２０３】
１週間マウス胎児由来心筋細胞と共培養を行ったヒト羊膜間葉系幹細胞の培養皿は、目視でほぼ20％自己拍動を生じ、GFP蛍光を示す細胞同士が同期して収縮しているものが観察された。【０２０４】
（３）ヒト羊膜間葉系幹細胞から得られた心筋特異的活動電位
実施例２と同様に、文献[J.Gene Med., 6, 833-845 (04)]の方法に基づき、活動電位を測定した。その結果、記録できた活動電位は、幅300 msec近くある心筋特有の活動電位を呈し、拡張期緩徐脱分極（ペースメーカー電位）を有していた。【０２０５】
実施例８
（１）ヒト臍帯血間葉系幹細胞からの心筋誘導
ヒト臍帯血間葉系幹細胞の心筋細胞への分化能について、以下の通り検討した。
文献[Molecular Biology of the Cell., 16, 1491-1499 (05)]に記載のヒト臍帯血間葉系幹細胞を用いて、文献に記載された方法[J.Gene Med., 6, 833-845 (04)]に従い、GFPを発現するアデノウイルスを感染させた。即ち、５×10４/cm2の密度でヒト臍帯血間葉系幹細胞を10% FCSを含むDMEM培地で6cm培養皿に植え込み、GFPを発現するアデノウイルスを翌日感染させた。上清を除き同培地で37℃、5%CO2濃度の孵卵機にて更に培養した。GFPの発現は、蛍光共焦点顕微鏡にて確認した。【０２０６】
マウス胎児由来心筋細胞との共培養は、文献[J.Gene Med., 6, 833-845 (04)]に記載された条件で行った。5-aza-C処理しなかったヒト臍帯血間葉系幹細胞を、0.05%トリプシン(GIBCO社製)および0.25mmol/l EDTA（ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid）を含むPBS  (phosphate-buffered saline)により、培養皿からはがし、予め５×103/cm2の密度で植え込んだ、マウス胎児由来心筋細胞の上に重層した。培地は、10% FCSを含むDMEM培地を用い、5%CO2濃度の孵卵機にて、37℃で培養することによりヒト臍帯血間葉系幹細胞の心筋細胞への誘導を行った。共培養を行わないヒト臍帯血間葉系幹細胞は、同様に0.05%トリプシンおよび 0.25mmol/l EDTAを含むPBS  により培養皿からはがした後、10% FCSを含むDMEM培地を用いて5%CO2濃度の孵卵機にて、37℃で培養した。【０２０７】
（２）ヒト臍帯血間葉系幹細胞の心筋誘導率
１週間マウス胎児由来心筋細胞と共培養を行ったヒト臍帯血間葉系幹細胞の培養皿は、目視でほぼ80％自己拍動を生じ、GFP蛍光を示す細胞同士が同期して収縮しているものが観察された。しかし、すべての細胞が同期してしまうため、正確に心筋誘導を生じている細胞の割合を評価することは困難であった。そこで、このヒト臍帯血間葉系幹細胞について１週間マウス胎児由来心筋細胞と共培養したサンプル及び、共培養せず単独で培養したサンプルを準備した。培養液中の血清を除去するためPBSで一回洗浄し、その後0.05%トリプシン及び、0.25mmol/lのEDTAを含有するPBSを加えて37℃の加湿した孵卵器の中で５分間酵素反応を行った。細胞はペトリ培養皿より一塊となって剥離した。剥離した組織を0.5% コラゲナーゼ (TypeII、Worthington社製)と2,3-butanedione monoxime（以下、BDMと略記する）10mmol/lを含有するPBS内に投入し、37℃の恒温槽内でさらに20分間反応させ、細胞を単離した。【０２０８】
この細胞について、細胞内抗原でヒト心筋特異的なタンパク質であるTroponin Iに対する抗体(Monoclonal mouse anti-cardiac Troponin I for human Catalogue # 4T21、HyTest社製)を用いて染色を行った。まずスライドガラスをPoly-L-Lysine (P8920、Sigma社製)にて表面をコートした。スライドガラスは前もって1%のHClを含有した70%エタノールにて洗浄し、同部に純水で10倍希釈したPoly-L-Lysineを加えて室温で5分間放置した。Poly-L-Lysineをその後除去し、60℃で１時間かけ十分乾燥させた。このLysineでコートされたスライドグラス上にヒト臍帯血間葉系幹細胞の浮遊液を１時間乗せ、スライドガラス上に強固に接着させた。その後細胞は4%パラフォルムアルデヒドにて固定し、0.02% Triton-Xを含有したPBS液に20分間浸して、細胞膜を破壊した。その後、一次抗体として抗ヒト心筋 Troponin I抗体 をPBSで400倍に希釈したものを加え、一日、保湿しながら冷蔵庫内で反応させた。その後、PBSで10回洗浄して残留抗体を除去し、2次抗体(Anti Mouse TRITC、Sigma社製)溶液を加えて、保湿しながら室温で30分間反応させた。共焦点レーザー顕微鏡（FV1000、Olympus社製）を用いて同サンプルを観察すると、ヒト心筋Troponin Iが中心の核を避けてドーナツ上に染色される像が観察された。これを陽性と判断し、GFP陽性細胞中のTroponin I発現細胞の割合を心筋誘導率として算出した。その結果は、約４５%のヒト臍帯血間葉系幹細胞にTroponin-Iが発現していた。【０２０９】
その結果、5-aza-C処理の有無に関らず、マウス胎児由来心筋細胞との共培養を行わず、単独で培養したヒト臍帯血間葉系幹細胞では、Troponin I陽性細胞の比率は極めて低かった（GFP陽性細胞の１%以下）。一方、マウス胎児由来心筋細胞と共培養した条件では、心筋誘導に不可欠と考えられていた5-aza-Cの処理をしなかったヒト臍帯血間葉系幹細胞においても約４５%のTroponin I陽性率を示した。従来のヒト心筋細胞への誘導率(一般的には1%以下)と比較して、ヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞は、心筋細胞との共培養を行うことにより、5-aza-C処理の有無に関らず、極めて高率に自己拍動し、培養皿上ですでに生理的な機能を有した心筋になることが明らかになった。【０２１０】
（２）ヒト臍帯血間葉系幹細胞から得られた心筋特異的活動電位
実施例２と同様に、文献[J.Gene Med., 6, 833-845 (04)]の方法に基づき、活動電位を測定した。その結果、記録できた活動電位は、幅200 msec近くある心筋特有の活動電位を呈し、拡張期緩徐脱分極（ペースメーカー電位）はこの細胞からは記録できなかった。
【図１】
2006078034.tif 000003
【図２】
2006078034.tif 000004
【図３】
2006078034.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【配列表】
2006078034000001.app
【国際調査報告】
2006078034.tif 000008
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