(57)【要約】  本発明は、非侵襲性イメージングによって、哺乳類動物対象中での生物学的過程を解析や測定をより効果的に行う方法に関する。さらに詳しくは、組織透過性の高い長波長側の発光活性を示し、かつpHによる発光スペクトルの変動がほとんどない発光酵素を用いてより効果的な光学性非侵襲製イメージングを行う方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
発光の最大発光波長が600 nm以上であるルシフェラーゼ及びルシフェリンを哺乳類動物中に投与し、発光を検出することからなる、非侵襲的イメージング方法。
【請求項２】
発光の最大発光波長が600 nm以上であるルシフェラーゼ遺伝子を特定プロモーター制御下で発現する哺乳類動物中において、前記ルシフェラーゼの発光を検出することを特徴とする非侵襲的イメージング方法。
【請求項３】
発光の最大発光波長が600 nm以上であるルシフェラーゼ遺伝子を特定プロモーター制御下で発現する哺乳類細胞を哺乳類動物個体に移植し、哺乳類動物個体中における前記ルシフェラーゼの発光を検出することを特徴とする非侵襲的イメージング方法。
【請求項４】
ルシフェラーゼの最大発光波長が620 nm以上である、請求項1〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記ルシフェラーゼ遺伝子が、最大発光波長が620 nm以上であって、発光性甲虫由来のルシフェラーゼ遺伝子である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ルシフェラーゼ遺伝子がコードするルシフェラーゼが、pH５〜９付近で発光スペクトルがpHに実質的に影響されないルシフェラーゼである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ルシフェラーゼがホタルモドキ科、ヒカリコメツキ科、コメツキ科またはイリオモテボタル科由来のルシフェラーゼである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ルシフェラーゼが鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
特定組織におけるATP濃度の変化を調べるためにルシフェラーゼの発光を検出することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
特定プロモーターが構成発現プロモーターであって、発光の検出によって移植された細胞の数をモニターすることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
細胞が腫瘍細胞、正常細胞、ES細胞及び幹細胞からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非侵襲性イメージングによって、哺乳類動物対象中での生物学的過程の解析や測定をより効果的に行う方法に関する。さらに詳しくは、組織透過性の高い長波長側の発光活性を示し、かつpHによる発光スペクトルの変動が実質的にない発光酵素を用いてより効果的な光学性非侵襲性イメージングを行う方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生物学的諸過程を調べるin vivoアッセイ系として、培養細胞系が広く用いられてきた。しかしながら、生体内とは異なる単純化された系では上手く調べる系を構築できなかったり、あるいはそのような環境下で調べられた結果は、必ずしも生体内の現象を反映したものでないことがある。そのため、生きた哺乳動物個体において観察（非侵襲性イメージング）することが望ましく、近年種々の蛍光性プローブ、すなわちフルオレセインのような低分子の蛍光性化合物や緑色蛍光タンパク質（非特許文献：１、２）のような蛍光タンパク質、などの開発が進み、さまざまな研究領域で応用されつつある。しかしながら、蛍光タンパク質の検出には励起光を照射する必要があるため、動物組織中の自家蛍光によるバックグラウンドシグナルが高い他、励起光自体も個体内部へと組織透過しなければならず、個体深部における検出には向かない。
【非特許文献１】Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W.W., and Prasher, D.C. ; Green fluorescent protein as a marker for gene expression, Science. 1994, Feb 11;263(5148):802-805.
【非特許文献２】Morin, J.G. and Hastings, J.W.;Biochemistry of the bioluminescence of colonial hydroids and other coelenterates, J. Cell. Physiol.1971 Jun;77(3):305-12.
【０００３】
一方、生物発光分子は光を放射するための励起光の照射を必要とせず、蛍光検出に比べバックグラウンドとなるシグナルはほとんど存在しない。このような生物発光分子としてはルシフェラーゼファミリーが挙げられ、種々の原核生物、真核生物で同定されてきた。原核生物型ルシフェラーゼ（lux）としては、Vibrio属やPhotobacterium属の海洋性細菌、Xenorhabdus属の陸生細菌由来の酵素などが知られている。また、真核生物型ルシフェラーゼ(luc)として、甲虫のPhotinus pyralis、Pyrophorus plagiophthalamusなど、あるいは海洋生物のRenilla reniformis (Sea pansy)などに由来するルシフェラーゼなどが知られている。【０００４】
原核生物型ルシフェラーゼ（lux）はヘテロ2量体ルシフェラーゼからなるため、取扱いが煩雑となるのに対し、真核生物型ルシフェラーゼは1つのタンパク質からなるため、より広く用いられている。真核生物型ルシフェラーゼのうち、Photinus pyralis、Pyrophorus plagiophthalamusなどの発光性甲虫に由来するルシフェラーゼは甲虫ルシフェリン（D-luciferin）を基質としATP依存的にoxyluciferinに変換する一方、Renilla由来ルシフェラーゼ(Rluc)はcoelenterazineを基質とし、ATP非依存的にcoelenteramideに変換する。後者については不安定で自家発光性が高く、そのためバックグラウンドシグナルが高い。さらに、最近、coelenterazineがATP-binding cassette transporterファミリー、その中でも特にmultidrug resistance MDR1 P-glycoprotein (ABCA1; Pgp)の基質として認識され、細胞内より排出されてしまうため、Pgpが発現する細胞、組織ではRlucの発光を検出することができず、利用の範囲が制限されるとの報告がある（非特許文献3）。一方、D-luciferinはPgpに認識されないため細胞から排出されない。
【非特許文献３】Andrea P., Julie L.P., and David P.W,; Imaging reversal of multidrug resistance in living mice with bioluminescence: MDR1 P-glycoprotein transports coelenterazine, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004 Feb; 101(6):1702-1707
【０００５】
一方、D-luciferinを基質とするルシフェラーゼとして、現在最も広く用いられるPhotinus pyralis由来のルシフェラーゼは562 nmに発光波長ピークを持つといわれるが、pHにより発光スペクトルが変動してしまうという特徴がある。検出感度としては、ルシフェラーゼ発現細胞数103個程度は必要で、より少ない細胞数の検出は難しい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、非侵襲性イメージングによって、哺乳類動物中での生物学的過程の解析や測定をより効果的に行う方法を提供することである。さらには、組織透過性の高い長波長側の発光活性を示し、かつpHによって、その発光スペクトルの影響の実質的にない発光酵素を用いてより効果的に、精度の高い光学性非侵襲性イメージングを行う方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、現在までに見つかっているルシフェラーゼにおいて最も長波長側に最大発光波長を有するルシフェラーゼとして、鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼのクローニングに成功している（特許文献１）。その後、鉄道虫発光タンパク質遺伝子の構造を改変することで哺乳類細胞において発現させることを可能にした例もあるが（特許文献２）、生きた哺乳類動物対象を用いて非侵襲性イメージングを行うにはいたっていない。本発明者らは、以前に、この鉄道虫赤色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の緑、橙色発光ルシフェラーゼの哺乳類細胞における発現、さらにこれらを用いて3つのプロモーター活性を同時に測定する方法を開示している（特許文献３）。本発明者らは、さらに鋭意研究を重ねた結果、鉄道虫赤色発光ルシフェラーゼなどの最大発光波長が600 nm以上であるルシフェラーゼを用いてより効率的に生きた哺乳動物個体内のプローブを検出すること、すなわち生きた哺乳類動物を対象としてより効率的な非侵襲性イメージング方法を見出し、本発明を完成するに到った。
【特許文献１】US2002/0119542-A1
【特許文献２】WO2003-016839
【特許文献３】WO2004/099421
【０００８】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
１．  発光の最大発光波長が600 nm以上であるルシフェラーゼ及びルシフェリンを哺乳類動物中に投与し、発光を検出することからなる、非侵襲的イメージング方法。
２．  発光の最大発光波長が600 nm以上であるルシフェラーゼ遺伝子を特定プロモーター制御下で発現する哺乳類動物中において、前記ルシフェラーゼの発光を検出することを特徴とする非侵襲的イメージング方法。
３．  発光の最大発光波長が600 nm以上であるルシフェラーゼ遺伝子を特定プロモーター制御下で発現する哺乳類細胞を哺乳類動物個体に移植し、哺乳類動物個体中における前記ルシフェラーゼの発光を検出することを特徴とする非侵襲的イメージング方法。
４．  ルシフェラーゼの最大発光波長が620 nm以上である、項1〜３のいずれかに記載の方法。
５．  前記ルシフェラーゼ遺伝子が、最大発光波長が620 nm以上であって、発光性甲虫由来のルシフェラーゼ遺伝子である項４に記載の方法。
６．  前記ルシフェラーゼ遺伝子がコードするルシフェラーゼが、pH５〜９付近で発光スペクトルがpHに実質的に影響されないルシフェラーゼである、項５に記載の方法。
７．  ルシフェラーゼがホタルモドキ科、ヒカリコメツキ科、コメツキ科またはイリオモテボタル科由来のルシフェラーゼである、項６記載の方法。
８．  ルシフェラーゼが鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼである、項７に記載の方法。
９．  特定組織におけるATP濃度の変化を調べるためにルシフェラーゼの発光を検出することを含む、項１または２に記載の方法。
１０．  特定プロモーターが構成発現プロモーターであって、発光の検出によって移植された細胞の数をモニターすることを特徴とする、項３に記載の方法。
１１．  細胞が腫瘍細胞、正常細胞、ES細胞及び幹細胞からなる群より選択される、項１０に記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法により、生きた動物個体内の特定の生物学的過程のレポーターであるルシフェラーゼの発光が組織吸収される割合が減少するため、周囲の組織の種類あるいは深さに影響を受けることなくより直接的、かつより効果的に検出することが可能となった。さらに、本法は発光スペクトルがｐＨの影響を受けないルシフェラーゼを用いることによって、発光の組織透過効率を一定に維持できるため、より精度の高い検出が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Photinus pyralis由来ルシフェラーゼ（ffLuc、最大発光波長約560 nm）、Ragophthalmus ohbai 由来ルシフェラーゼ（Rol、最大発光波長約550nm）、Ragophthalmus ohbai 由来変異型ルシフェラーゼ(Rol T226N、最大発光波長約580 nm)、Phrixothrix hirtus由来ルシフェラーゼ(PhRE、最大発光波長約630 nm)を発現したHeLa S3細胞の破砕液を用いて、種々ルシフェラーゼの発光の中で、特にPhrixothrix hirtus 由来ルシフェラーゼ(PhRE)が組織透過性のよい長波長領域（600 nm以上）の発光割合が高いことを示すデータ及びグラフである。
【図２】Ragophthalmus ohbai 由来ルシフェラーゼ（Rol）、Ragophthalmus ohbai 由来変異型ルシフェラーゼ(Rol T226N)、Phrixothrix hirtus 由来ルシフェラーゼ(PhRE)を発現させた生細胞において、高感度CCDカメラによる良好な発光検出が認められることを示すイメージ、計測値、グラフである。
【図３】Ragophthalmus ohbai 由来ルシフェラーゼ（Rol）、Ragophthalmus ohbai 由来変異型ルシフェラーゼ(Rol T226N)、Phrixothrix hirtus 由来ルシフェラーゼ(PhRE)を発現させた生細胞をD-luciferinと皮下注射し、Phrixothrix hirtus 由来ルシフェラーゼ(PhRE)の発光が非常に強く検出されることを示すイメージ、計測値、グラフである。
【図４】Phrixothrix hirtus 由来ルシフェラーゼ(PhRE)の発光が他のルシフェラーゼに比べ、動物対象から非常に高効率で検出されていることを示唆するグラフである。
【図５】実施例4で構築したG1HRD-PhREトランスジーンの構造を示す。
【図６】PHZ(phenylhydrazine)で貧血を誘導後、ネガティブコントロール（G1HRD-PhRE非導入マウス、左）に対して、G1HRD-PhRE TGマウスの造血組織である脾臓においてPhRE由来する発光シグナルが有意に観察されたことを示す画像イメージである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に本発明を詳細に説明する。【００１２】
本発明における「非侵襲的イメージング方法」とは、生きた哺乳類動物を用いて、当該動物個体内における特定の生物学的過程のレポーターであるルシフェラーゼの発光を検出、測定し、発光の位置、相対強度を調べ、当該動物個体内における当該生物学的過程を解析、測定する方法である。当該方法は、転写制御、シグナル伝達経路、タンパク質−タンパク質相互作用、細胞トラフィックのような基礎科学的な解析から、疾患の検出、治療のモニタリングなどの応用科学分野まで利用される。代表的な検出（イメージング）方法としては、Xenogen社IVIS Imaging System、BERTHOL TECHNOLOGIES社NightOWL LB981システムなど、高感度CCD（charge-coupled device）カメラを搭載したシステムを用いて撮像する方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。CCDカメラはシリコンウェファーに当たった光子を電子に変換し、投射光子密度を空間的に電荷パターンに暗号化し、イメージを生成する。生物発光のイメージングに対しては、CCDカメラを冷却することによって熱によるノイズを低減し、さらに暗箱内に設置することによって、微弱光である生物発光を検出するカメラの感度を高めることができる。非侵襲的方法としては、生物発光を用いた光学イメージングの他、PET (positoron emission tomography)やMRI（magnetic resonance imaging）などの系が知られ、他系に比べイメージの三次元性に乏しいといった短所もあったが、この点についても現在改善されつつあり、放射性化合物を用いる必要がないため、より簡便な系として注目されている。特に、PET系で必要な放射性化合物は安全性が問われる他、この化合物の半減期が数分程度と短く、サイクロトロンや標識化合物合成のための自動合成装置を備えた施設内で標識化合物の合成を行い、すぐに検出に用いる必要がある。一方、ルシフェラーゼの発光反応は前記動物個体中にルシフェラーゼの基質となるD-luciferinを静脈注射、腹腔内注射、あるいは標的部位への注射、D-luciferinを持続的に放出する徐放性製剤などによって投与することによって検出することができる。甲虫ルシフェリン（D-luciferin）としては、ホタル由来の天然型ルシフェリンの他、Cytochrome P450あるいはCaspaseなどの生体内分子の基質となるように修飾され、前記活性型分子によってD-luciferinに変換されるD-luciferin誘導体などが挙げられる。【００１３】
D-luciferinは多数のメーカーから市販され、容易に入手可能である。また、急性毒性などの危険性の報告もない。【００１４】
検出対象となるルシフェラーゼとしては、インジェクションにより標準品として哺乳類動物に投与されたもの、トランスジェニック哺乳類動物として当該動物DNA内に組み込まれ発現されたもの、哺乳類細胞に導入され発現されたものであって当該細胞が哺乳類動物個体へ移植されたもの、などが挙げられる。ルシフェラーゼによるルシフェリンの反応においてはATPが必要である。ルシフェラーゼの標準品のインジェクションは、十分量のルシフェラーゼ標準品とルシフェリンを投与することによって発光は当該部位に存在するATP量に比例することになるから、投与領域の相対的なATP濃度の測定法として利用が可能である。なお、ATP量は、ルシフェラーゼを発現する哺乳類細胞や、例えば臓器ないし組織特異的に発現されるプロモーター、時期特異的あるいは低温誘導性等の誘導性プロモーターに連結されたルシフェラーゼで形質転換されたトランスジェニック哺乳動物でも検出可能である。【００１５】
ATP濃度をモニターすることによって、当該部位の活動状態のモニターが可能である。例えば、アルツハイマーにより活動が低下した脳において、改善薬をATP濃度をモニターすることによってスクリーニングすることが可能である。また、心筋・脳神経細胞では虚血時の細胞内ATP濃度によってATP感受性Kチャネルが開口して自己防御する働きを持っており、ATP濃度と並行したATP感受性Kチャネルの開口薬のスクリーニングは、虚血性心疾患・脳血管障害への応用が期待できる。また、細胞内のATP濃度については、膵臓β細胞ではインスリン分泌調節に働き、糖尿病薬のスクリーニング時に有効な指標である。【００１６】
一方、ルシフェラーゼ遺伝子が当該動物DNA内に組み込まれた場合、その上流域の転写制御配列が、ある組織内において、どのような転写制御を与えているかを解析することが可能である。このような当該動物を用いて生体における薬理効果の評価が可能である。例えば、Peroxisome proliferators-activated receptorγ (PPARγ)やGlucose Transporter 4 (GLUT4)、lipoprotein lipase、アディポネクチン、TNF-αなど、肥満に連動して発現変動する遺伝子のプロモーターに連結されたルシフェラーゼ遺伝子を、正常動物、さらには肥満モデルや糖尿病モデル動物と組み合わせることによって、発現したルシフェラーゼの発光を指標に糖尿病や肥満の改善薬の評価が可能である。あるいは炎症性サイトカイン（例えば、IL-1、IL-6、IL-11やTNF-αなど）の遺伝子プロモーターとルシフェラーゼ遺伝子を連結することによって、抗炎症剤の評価が可能である。その他、PCNA、cdc2 kinase、c-myc, c-mybなどの細胞周期調節遺伝子プロモーターをルシフェラーゼ遺伝子に連結し、細胞増殖抑制の阻害効果を評価することによって、心筋治療の障害となっている血管再狭窄の抑制剤、抗がん剤評価系としての利用が可能であるが、これらに限られるものではない。一方、ルシフェラーゼ遺伝子が導入された哺乳類細胞を哺乳類動物個体へ移植させた場合、単に培養細胞系によるアッセイと比較し、より生体内の現象を反映した解析が可能となる。さらに構成発現型プロモーター制御下のルシフェラーゼ遺伝子を導入された哺乳類細胞を同一または異なる種類の哺乳類動物個体へ移植させた場合には、その発光は主として細胞の増殖状態を反映するものとなるから、例えばルシフェラーゼ遺伝子を導入された腫瘍細胞を用いれば腫瘍細胞の増殖、転移等をモニターする系として有効である。また、ルシフェラーゼ遺伝子を導入された正常細胞、ES細胞、幹細胞（間葉系幹細胞、造血幹細胞、脂肪幹細胞など）の増殖をモニターすれば、移植の評価系としても十分利用することが可能である。【００１７】
ルシフェラーゼ（タンパク質）を哺乳類動物に投与する場合、100〜10000mg/体重kg程度の量を投与すればよい。また、ルシフェラーゼを発現する哺乳類細胞を動物に移植する場合、102〜1010個程度の細胞を移植することができる。本発明では、最大発光波長が600 nm以上であるルシフェラーゼを使用しているので、ルシフェラーゼ量が非常に少なくてもイメージングが可能である。例えばルシフェラーゼを発現する腫瘍細胞では、１×１０３個程度の細胞でも十分にイメージングによる検出が可能である。従って、従来のように動物を犠牲にし、組織切片を作成する作業は必要ない。また、肉眼では認識できない程度の少数の腫瘍細胞（例えば１０００個以下、好ましくは１００個以下）でもイメージング可能であり、候補化合物のスクリーニングに非常に適している。【００１８】
なお、ルシフェリンは、10〜1000mg/体重kg程度の量を哺乳動物に投与してイメージングすることができる。【００１９】
用いられるルシフェラーゼの検出性として重要な特性は、発光強度、発光部位の体表面からの深さ、波長、発光スペクトルの安定性が挙げられる。発光強度としてはルシフェラーゼの存在量が寄与する割合が高く、導入遺伝子の発現の検出の際には哺乳類細胞で発現が高いものが好ましい。この例としては、哺乳類細胞で利用の高いコドンユーセージを持つように改良されたルシフェラーゼ遺伝子、翻訳効率を上げるためにKozak配列などの配列が付加されたルシフェラーゼ遺伝子、構成発現型プロモーターとしてCAGプロモーター、CMVプロモーターなどの高い発現活性を有するプロモーターに連結されたルシフェラーゼ遺伝子などが挙げられるが、これに限られるものではない。【００２０】
波長は、光の組織透過性と関係する。ほとんどの動物組織には多くの水が含まれ、水が長波長光（赤色領域光）を短波長光よりよく透過することが知られる。そのため、600 nm以上の波長の発光割合の高いルシフェラーゼ遺伝子が好ましい。すなわち、好ましくは最大発光波長が600 nm以上、さらに好ましくは620 nm以上のルシフェラーゼ遺伝子が好ましい。ルシフェラーゼの最大発光波長の上限は特に限定されないが、通常650nm程度、特に640nm程度である。【００２１】
また、本発明者らは。ある種のルシフェラーゼはpHの上昇により短波長側へシフトすることを確認している。例えば、Photinus pyralisではpH 6では最大発光波長が617 nmであるのに対し、pH 8では565 nmとなるとの報告がある。つまりpHが上昇すると短波長側へ発光スペクトルがシフトし、検出効率が低下することが予想される。この種の発光性甲虫ルシフェラーゼとしてはホタル科のものがあり、pHに影響を受けないルシフェラーゼ、より具体的にはホタルモドキ科、ヒカリコメツキ科、イリオモテボオタル科由来のルシフェラーゼが好ましい。【００２２】
なお、本明細書において、最大発光波長が600 nm以上であるルシフェラーゼとは、生理的pHの全範囲(pH5〜9)において最大発光波長が600 nm以上であるルシフェラーゼを意味し、Photinus pyralis由来のルシフェラーゼは、「最大発光波長が600 nm以上であるルシフェラーゼ」には含まれない。また、「pH５〜９付近で発光スペクトルがpHに実質的に影響されないルシフェラーゼ」とは、このpH範囲における最大発光波長の変化が10nm以下、好ましくは5nm以下、より好ましくは3nm以下である。【００２３】
このような波長、発光スペクトルの安定性の特性から、最も好ましいルシフェラーゼとしてはホタルモドキ科鉄道虫、とりわけPhrixothrix hirtus由来の赤色発光ルシフェラーゼ及びその変異体が挙げられる。前記ルシフェラーゼは630 nm付近（測定設備により若干相違が出る可能性がある）に最大発光波長を有し、また発光スペクトルはpH5〜9の領域においてpHに対して安定である（非特許文献４）。【００２４】
赤色発光ルシフェラーゼの変異体としては、コドンユーセージなどのアミノ酸の変更を伴わない塩基置換体、620 nm以上の最大発光波長及び発光スペクトルのpH非感受性の酵素特性を保持したアミノ酸置換体、さらにはmycタグ、histidineタグ、GSTタグなどのタンパク質性タグ配列の付加体等を含むが、これに限られるものではない。
【非特許文献４】Viviani V., Uchida, A., Suenaga, N., Ryufuku, M., and Ohmiya, Y.;Thr226 Is a Key Residue for Bioluminescence Spectra Determination in Beetle Luciferase.; Biochemical and Biophysical Research Communications. 2001; 280, 1286-1291  哺乳類としては、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、ブタ、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌが挙げられ、好ましくはマウス、ラットである。マウス、ラットにおいてはヌード系、白毛系が好ましく、有色毛系においては所望の検出部位に当たる部分の毛を剃ることが好ましい。なお、哺乳類動物に導入されるルシフェラーゼを発現する哺乳類細胞としては、マウス、ラットの他にヒト、サル等の細胞（特に腫瘍細胞）が挙げられる。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明の実施例を例示することによって、本発明の効果をより一層明確なものとする。【００２６】
実施例１  哺乳類細胞破壊系における種々ルシフェラーゼ発光の測定
HeLa S3細胞1×105 cellsずつを12ウェルプレートへ播種し、10% FCSを含むダルベッコ変法イーグル培地（日水製薬）中で培養した。翌日、pGL3-control（プロメガ、Photinus pyralis由来ルシフェラーゼ（ffLuc）、最大発光波長約560 nm）、pSLG-SV40 control（東洋紡績、Ragophthalmus ohbai 由来ルシフェラーゼ（Rol）、最大発光波長約550nm）、pSLO-SV40 control（東洋紡績、Ragophthalmus ohbai 由来変異型ルシフェラーゼ(Rol T226N)、最大発光波長約580 nm）、pSLR-SV40 control（東洋紡績、Phrixothrix hirtus 由来ルシフェラーゼ(PhRE)、最大発光波長約630 nm）の各プラスミド1μgを100μl Opti-MEM(GIBCO)で希釈し、100μl Opti-MEM(GIBCO)で希釈した2.5μl Lipofectamine 2000（インビトロジェン）と混合し、HeLa S3細胞へトランスフェクションした。24時間後に、細胞をPBS(-)でリンスし、ピッカジーン細胞溶解剤Lcβ（東洋インキ）で細胞を溶解し、発光基質（東洋インキ）を加え、緑色、橙色、赤色発光ルシフェラーゼの相対発光量を光分離機能付きルミノメーター、AB-2250型ルミネッセンサーMCA（アトー社）を用いて、全光量（フィルターなし）、600 nm LPフィルター透過光量、540 nm LPフィルター透過光量を20秒間の積算値として計測した。図1に各条件における計測値と、全光計測値に対する600 nm LPフィルター透過光計測値の割合を示す。【００２７】
実施例２  哺乳類細胞非破壊系における種々ルシフェラーゼ発光の検出
COS細胞4.0×104 cellsずつを24ウェルプレートへ播種し培養した。翌日、pSLG-SV40 control、pSLO-SV40 control、pSLR-SV40 controlの各プラスミド0.5μgをトランスフェクションした。その際、D-luciferinを1 mM、0.5 mM加え、翌日IVIS Imaging System （Xenogen）で10秒間露光した。図2に画像イメージと、各ウェルについて定量された相対的発光強度値及びグラフを示す。【００２８】
実施例３  ルシフェラーゼ発現細胞の皮下注射による発光の検出
実施例２の各ルシフェラーゼ発現細胞を2ウェル分スクレーパーではがして回収し、遠心分離により100μl（D-luciferinを含む培地中）に濃縮した。この細胞液をマウス四肢付近に皮下注射し、IVIS Imaging Systemで10秒間露光した。図3に画像イメージと、各ウェルについて定量された相対的発光強度値及びグラフを示す。図4に各ルシフェラーゼについて実施例2における細胞検出時の計測値に対する皮下注射時検出の計測値の割合及びそのグラフを示す。【００２９】
実施例４  トランスジェニックマウス作製用ベクターの調製
赤血球に発現する転写因子GATA-1の、血球特異的第1エクソンIEの上流3.9 kbから第2エクソンまでの制御領域(G1HRD; GATA-1Hematopoietic Regulatory Domain)(非特許文献5 、6)下流に、pSLR-test（東洋紡績）のSLR遺伝子(PhRE)を挿入した。方法は、非特許文献7に記載のように、IE3.9int plasmid vectorを制限酵素NotI（東洋紡績）で消化してIE3.9int plasmid vectorを開列した。また、オリゴヌクレオチド1（配列番号1）、オリゴヌクレオチド2（配列番号2）を用いてpSLR-testより制限酵素NotIを5’サイトを付加した形でSLR遺伝子(PhRE)を増幅し、Not Iで消化してPhRE遺伝子断片を取得し、IE3.9int plasmid vectorに挿入した（G1HRD-PhRE）。図5に、構築したG1HRD-PhREトランスジーンの構造を示す。
【非特許文献５】Onodera, K., Takahashi, S., Nishimura, S., Ohta, J., Motohashi, H., Yomogida, K., Hayashi, N., Engel, J.D., Yamamoto, M. GATA-1 transcription is controlled by distinct regulatory mechanisms during primitive and definitive erythropiesis.:Proceedings of the Natitonal Academy of Sciences of the United States of America. 1997; 94, 4487-4492
【非特許文献６】Nishimura, S., Takahashi, S., Kuroha, T., Suwabe, N., Nagasawa, T., Trainor, C., Yamamoto, M. A GATA Box in the Network of GATA Factors and Sites That Regulate This Gene.: Molecular and Cellular Biology. 2000; 20, 713-723
【非特許文献７】Shimizu, R. Takahashi, S., Ohneda, K., Engel, J.D., Yamamoto, M. In vivo requirements functional domains during primitive and definitive erythropoiesis.: The EMBO Journal. 2001; 20, 5250-5260
【００３０】
実施例５  トランスジェニックマウスの作成
トランスジェニックマウス作成のためのDNAは、G1HRD-PhREを制限酵素Sal I（東洋紡績）で消化し、アガロースゲル電気泳動によって分離しベクターDNAを除去し、G1HRD-PhREトランスジーンを精製した。精製したDNA断片を、マウス受精卵に標準的手法（非特許文献8）に従って注入した。作成したG1HRD-PhRE TGマウスは、D-ルシフェリンを投与後、発光をIVIS systemで観察し、発光強度の高い個体を選択した。図6は、PHZ(phenylhydrazine)で貧血を誘導後、ネガティブコントロール（G1HRD-PhRE非導入マウス、左）に対して、G1HRD-PhRE TGマウスの造血組織である脾臓においてPhRE由来する発光シグナルが有意に観察されたことを示す画像イメージである。
【非特許文献８】Hogan, B., R. Beddington, F. Constantini, E. Lacy. Manipulating the mouse embryo. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. 1994.
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明における600 nm以上であるルシフェラーゼを用いた哺乳類動物個体における非侵襲性検出方法は、より効果的に哺乳類動物個体中における生物学的過程をモニターする系として、薬剤スクリーニング系、腫瘍や感染症の解析系、移植評価系として利用することができ、創薬・医療などの産業界に寄与することが大である。
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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