(57)【要約】  本発明は、骨形成、骨吸収の平衡状態の破綻に起因する疾患の予防、改善、および／または治療薬を提供する。本発明のデコイは、骨代謝に関わる細胞の分化誘導因子を阻害することにより、正常な骨代謝を誘導する。例えば、破骨細胞の分化を調節する転写調節因子であるNF-κBを本発明のデコイによって阻害することにより、骨吸収をコントロールすることができる。この方法は今までの薬剤とは異なるメカニズムを利用しているため、既存の薬剤に効果がなかった場合にも効果を期待できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨形成関連転写調節因子結合配列を有する核酸を有効成分とする骨形成調節剤。
【請求項２】
核酸がデコイ、アンチセンス、リボザイム、アプタマ−、siRNAの群から選択される請求項１に記載の骨形成調節剤。
【請求項３】
核酸が、DNAまたはRNAからなるデコイである請求項１に記載の骨形成調節剤。
【請求項４】
デコイがDNAオリゴヌクレオチドからなる請求項２または３に記載の骨形成調節剤。
【請求項５】
デコイがNF-κB、STAT-1、STAT-3、STAT-6、Ets、AP-1、E2F、Smad1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad5、Smad6、Smad7、Smad8、またはRunx2/Cbfa1のデコイである請求項２ないし４のいずれか一項に記載の骨形成調節剤。
【請求項６】
デコイがNF-κBのデコイである請求項５に記載の骨形成調節剤。
【請求項７】
前記デコイが、NF-κB結合配列GGGRHTYYHC（式中、RはAまたはGを、YはCまたはTを、HはA、CまたはTをそれぞれ意味する）を含む請求項２ないし６のいずれか一項に記載の骨形成調節剤。
【請求項８】
前記デコイが、NF-κB結合配列GGGATTTCCC(配列番号：２３)またはGGGACTTTCC（配列番号：２４）を含む請求項７に記載の骨形成調節剤。
【請求項９】
前記デコイが配列番号：２に示されるデコイである請求項２ないし８のいずれか一項に記載の骨形成調節剤。
【請求項１０】
前記デコイが、STAT-1またはSTAT-3結合配列TTCNNNGAA (式中NはA,G,TまたはCを意味する)を含む請求項２ないし５のいずれか一項に記載の骨形成調節剤。
【請求項１１】
前記デコイが、STAT-1またはSTAT-3結合配列TTCCGGGAAを含む請求項１０に記載の骨形成調節剤。
【請求項１２】
前記デコイが、STAT-6結合配列TTCNNNNGAA (式中NはA,G,TまたはCを意味する)を含む請求項２ないし５のいずれか一項に記載の骨形成調節剤。
【請求項１３】
前記デコイが、STAT-6結合配列TTCCCAAGAAを含む請求項１２に記載の骨形成調節剤。
【請求項１４】
前記デコイが、Ets結合配列MGGAW （式中MはAまたはCを、WはAまたはTをそれぞれ意味する)を含む請求項２ないし５のいずれか一項に記載の骨形成調節剤。
【請求項１５】
前記デコイが、Ets結合配列CGGAAを含む請求項１４に記載の骨形成調節剤。
【請求項１６】
前記デコイが、AP-1結合配列TGASTMA (式中SはGまたはCを、MはAまたはCをそれぞれ意味する)を含む請求項２ないし５のいずれか一項に記載の骨形成調節剤。
【請求項１７】
前記デコイが、AP-1結合配列TGAGTCAを含む請求項１６に記載の骨形成調節剤。
【請求項１８】
前記デコイが、E2F結合配列TTTSSCGS（式中、SはGまたはCを意味する）を含む請求項２ないし５のいずれか一項に記載の骨形成調節剤。
【請求項１９】
前記デコイが、E2F結合配列TTTCCCGCを含む請求項１８に記載の骨形成調節剤。
【請求項２０】
前記デコイが、Smad1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad5、Smad6、Smad7、Smad8結合配列GTCT、CAGAあるいはGCCGを含む請求項２ないし５のいずれか一項に記載の骨形成調節剤。
【請求項２１】
前記デコイが、Smad1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad5、Smad6、Smad7、Smad8結合配列GTCTAGACあるいはCAGACAを含む請求項２０に記載の骨形成調節剤。
【請求項２２】
前記デコイが、Runx2/Cbfa1結合配列ACCACAを含む請求項２ないし５のいずれか一項に記載の骨形成調節剤。
【請求項２３】
前記デコイが、Runx2/Cbfa1結合配列AACCACAを含む請求項２２に記載の骨形成調節剤。
【請求項２４】
前記デコイが、二本鎖DNAからなる請求項２ないし２３のいずれか一項に記載の骨形成調節剤。
【請求項２５】
請求項１ないし２４のいずれか一項に記載の骨形成調節剤を含む、破骨細胞と骨芽細胞の平衡状態の破綻に起因する疾患の予防薬、改善薬、または治療薬。
【請求項２６】
請求項２５記載の疾患が、骨粗鬆症、パジェット病、骨腫瘍、外傷性軟骨欠損症、離断性骨軟骨炎、変形性関節症、関節リウマチ、骨折、脱臼、歯周病、う歯から選ばれた一種である予防薬、改善薬、または治療薬。
【請求項２７】
請求項１ないし２４のいずれか一項に記載の骨形成調節剤を含む、歯列矯正、人工歯インプラント治療の改善薬。
【請求項２８】
骨形成関連転写調節因子結合配列を有する核酸を用いて、骨形成を調節する方法。
【請求項２９】
核酸がデコイ、アンチセンス、リボザイム、アプタマ−、siRNAの群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
核酸が、DNAまたはRNAからなるデコイである請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
デコイがDNAオリゴヌクレオチドからなる請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
デコイがNF-κB、STAT-1、STAT-3、STAT-6、Ets、AP-1、E2F、Smad1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad5、Smad6、Smad7、Smad8、またはRunx2/Cbfa1のデコイである請求項２９ないし３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
デコイがNF-κBのデコイである請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記デコイが、NF-κB結合配列GGGRHTYYHC（式中、RはAまたはGを、YはCまたはTを、HはA、CまたはTをそれぞれ意味する）を含む請求項２９ないし３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記デコイが、NF-κB結合配列GGGATTTCCC(配列番号：２３)またはGGGACTTTCC（配列番号：２４）を含む請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記デコイが配列番号：２に示されるデコイである請求項２９ないし３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記デコイが、STAT-1またはSTAT-3結合配列TTCNNNGAA (式中NはA,G,TまたはCを意味する)を含む請求項２９ないし３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記デコイが、STAT-1またはSTAT-3結合配列TTCCGGGAAを含む請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記デコイが、STAT-6結合配列TTCNNNNGAA (式中NはA,G,TまたはCを意味する)を含む請求項２９ないし３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記デコイが、STAT-6結合配列TTCCCAAGAAを含む請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記デコイが、Ets結合配列MGGAW （式中MはAまたはCを、WはAまたはTをそれぞれ意味する）を含む請求項２９ないし３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記デコイが、Ets結合配列CGGAAを含む請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記デコイが、AP-1結合配列TGASTMA (式中SはGまたはCを、MはAまたはCをそれぞれ意味する)を含む請求項２９ないし３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記デコイが、AP-1結合配列TGAGTCAを含む請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記デコイが、E2F結合配列TTTSSCGS（式中、SはGまたはCを意味する）を含む請求項２９ないし３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記デコイが、E2F結合配列TTTCCCGCを含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記デコイが、Smad1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad5、Smad6、Smad7、Smad8結合配列GTCT、CAGAあるいはGCCGを含む請求項２９ないし３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記デコイが、Smad1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad5、Smad6、Smad7、Smad8結合配列GTCTAGACあるいはCAGACAを含む請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記デコイが、Runx2/Cbfa1結合配列ACCACAを含む請求項２９ないし３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記デコイが、Runx2/Cbfa1結合配列AACCACAを含む請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記デコイが、二本鎖DNAからなる請求項２９ないし５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
破骨細胞と骨芽細胞の平衡状態の破綻に起因する疾患を予防、改善、または治療するための、請求項２８〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
破骨細胞と骨芽細胞の平衡状態の破綻に起因する疾患が、骨粗鬆症、パジェット病、骨腫瘍、外傷性軟骨欠損症、離断性骨軟骨炎、変形性関節症、関節リウマチ、骨折、脱臼、歯周病、う歯からなる群より選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
歯列矯正および人工歯インプラント治療を改善するための、請求項２８〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
骨形成を調節する薬剤を製造するための、骨形成関連転写調節因子結合配列を有する核酸の使用。
【請求項５６】
核酸がデコイ、アンチセンス、リボザイム、アプタマ−、siRNAの群から選択される、請求項５５に記載の使用。
【請求項５７】
核酸が、DNAまたはRNAからなるデコイである請求項５５に記載の使用。
【請求項５８】
デコイがDNAオリゴヌクレオチドからなる請求項５６または５７に記載の使用。
【請求項５９】
デコイがNF-κB、STAT-1、STAT-3、STAT-6、Ets、AP-1、E2F、Smad1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad5、Smad6、Smad7、Smad8、またはRunx2/Cbfa1のデコイである請求項５６ないし５８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６０】
デコイがNF-κBのデコイである請求項５９に記載の使用。
【請求項６１】
前記デコイが、NF-κB結合配列GGGRHTYYHC（式中、RはAまたはGを、YはCまたはTを、HはA、CまたはTをそれぞれ意味する）を含む請求項５６ないし６０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６２】
前記デコイが、NF-κB結合配列GGGATTTCCC(配列番号：２３)またはGGGACTTTCC（配列番号：２４）を含む請求項６１に記載の使用。
【請求項６３】
前記デコイが配列番号：２に示されるデコイである請求項５６ないし６２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６４】
前記デコイが、STAT-1またはSTAT-3結合配列TTCNNNGAA (式中NはA,G,TまたはCを意味する)を含む請求項５６ないし５９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６５】
前記デコイが、STAT-1またはSTAT-3結合配列TTCCGGGAAを含む請求項６４に記載の使用。
【請求項６６】
前記デコイが、STAT-6結合配列TTCNNNNGAA (式中NはA,G,TまたはCを意味する)を含む請求項５６ないし５９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６７】
前記デコイが、STAT-6結合配列TTCCCAAGAAを含む請求項６６に記載の使用。
【請求項６８】
前記デコイが、Ets結合配列MGGAW （式中MはAまたはCを、WはAまたはTをそれぞれ意味する）を含む請求項５６ないし５９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６９】
前記デコイが、Ets結合配列CGGAAを含む請求項６８に記載の使用。
【請求項７０】
前記デコイが、AP-1結合配列TGASTMA (式中SはGまたはCを、MはAまたはCをそれぞれ意味する)を含む請求項５６ないし５９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７１】
前記デコイが、AP-1結合配列TGAGTCAを含む請求項７０に記載の使用。
【請求項７２】
前記デコイが、E2F結合配列TTTSSCGS（式中、SはGまたはCを意味する）を含む請求項５６ないし５９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７３】
前記デコイが、E2F結合配列TTTCCCGCを含む請求項７２に記載の使用。
【請求項７４】
前記デコイが、Smad1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad5、Smad6、Smad7、Smad8結合配列GTCT、CAGAあるいはGCCGを含む請求項５６ないし５９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７５】
前記デコイが、Smad1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad5、Smad6、Smad7、Smad8結合配列GTCTAGACあるいはCAGACAを含む請求項７４に記載の使用。
【請求項７６】
前記デコイが、Runx2/Cbfa1結合配列ACCACAを含む請求項５６ないし５９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７７】
前記デコイが、Runx2/Cbfa1結合配列AACCACAを含む請求項７６に記載の使用。
【請求項７８】
前記デコイが、二本鎖DNAからなる請求項５６ないし７７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７９】
前記骨形成調節剤が、破骨細胞と骨芽細胞の平衡状態の破綻に起因する疾患を予防、改善、または治療する、請求項５５〜７８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８０】
破骨細胞と骨芽細胞の平衡状態の破綻に起因する疾患が、骨粗鬆症、パジェット病、骨腫瘍、外傷性軟骨欠損症、離断性骨軟骨炎、変形性関節症、関節リウマチ、骨折、脱臼、歯周病、う歯からなる群より選択される、請求項７９に記載の使用。
【請求項８１】
前記骨形成調節剤が、歯列矯正および人工歯インプラント治療を改善する、請求項５５〜７８のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨形成に関わる任意の転写調節因子が結合する配列を含む核酸系薬剤からなる医薬およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨は骨芽細胞による形成と破骨細胞による破壊・吸収を繰り返し、その再構築を行っている。通常は骨形成と骨吸収は平衡状態にあり，骨芽細胞と破骨細胞の間には相互応答機構が存在する。しかし、両者の平衡状態が崩れると骨粗鬆症，慢性関節リウマチによる骨破壊などの骨代謝異常を発症する。これらの骨代謝異常症は現代高齢化社会の大きな問題の一つとなっている。【０００３】
例えば、骨粗鬆症は中高年、特に女性に多い病気であり、高齢になるに従って背中や腰が痛くなり、また骨が体重の重みでつぶれてしまうと背中が丸くなったり腰が曲がったりといった症状が表れる。【０００４】
現在、骨粗鬆症には、カルシウム剤（アスパラギン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、乳酸カルシウムなど）、ビタミンＤ製剤（アルファカルシドール、カルシトリオールなど）、女性ホルモン製剤（エストリオール、イプリフラボン）、ビタミンＫ２製剤（メナテトレノン）などが用いられているが、それぞれに副作用（カルシウム剤、ビタミンＤ製剤には高カルシウム血症、カルシウム結石、腎障害、腎結石、嘔気、下痢、便秘、頭痛、不眠、倦怠感、記憶力低下など、女性ホルモン製剤（卵胞ホルモン）には発ガン、血栓性静脈炎、心筋梗塞など、イプリフラボンには消化性潰瘍、消化管出血、めまい、ふらつき、発疹、貧血など、ビタミンＫ２製剤には胃部不快感、悪心、下痢、発疹、頭痛など）がある。従って、依然として安全性が高くかつ有効な薬剤が望まれている。【０００５】
この他にも、破骨細胞と骨芽細胞の平衡状態の破綻に起因する疾患としては、例えばパジェット病などを挙げることができる。パジェット病は、病気の部位の骨の成長が異常になり、肥大して軟らかくなる骨格の慢性の疾患である。パジェット病では、破骨細胞と骨芽細胞が両方とも、骨のどこかの部位で活動が過剰になり、このような部位では代謝回転率は著しく増加する。過剰活動の部位は肥大するが、構造的に異常なために、正常部位より弱くなるものである。【０００６】
さらに破骨細胞と骨芽細胞の平衡状態を調節することは、骨腫瘍、外傷性軟骨欠損症、離断性骨軟骨炎、変形性関節症、関節リウマチ、骨折、脱臼、歯周病、う歯の予防、改善、治療や、歯列矯正、人工歯インプラント治療中、治療後の改善、治療に利用することができる。【０００７】
例えば骨腫瘍においては、様々な組織から発生した腫瘍がやがて骨吸収（骨破壊）を引き起こし、骨折、骨痛、高カルシウム血症を誘導する。骨吸収には、腫瘍細胞が直接骨に転移しそこで破骨細胞を活性化し骨破壊に至る局所的骨吸収と、腫瘍から産生された副甲状腺ホルモン関連タンパク質 (Parathyroid hormone-related Protein; PTH-rP)等の骨吸収促進因子が破骨細胞を活性化し骨破壊に至る全身的骨吸収の2種類がある。いずれにしても破骨細胞を調節することで疾患が予防、改善、治療される可能性がある。【０００８】
また、関節リウマチにおいては、炎症が起こった後に， IL-1、TNF-α、IL-6などの炎症性サイトカインが誘導され、破骨細胞形成および骨吸収が起こるとされている。従って、破骨細胞を調節することで骨吸収を抑え、疾患を予防、改善、治療できる可能性がある。【０００９】
破骨細胞と骨芽細胞によってその平衡が保たれているのは骨に限らず、歯も同様である。【００１０】
例えば、歯周病においては、真性嫌気性細菌の毒素によって、破骨細胞が活性化され、骨が破壊されるが、この場合も破骨細胞を不活性化することが予防、改善、治療につながる可能性がある。【００１１】
歯列矯正は、ある方向から歯に力を加えると、力の加わった部分の骨に出現する破骨細胞が骨を破壊吸収し、破骨細胞が吸収した部分に歯が移動し、移動した後の部分に出現する骨芽細胞が骨を新生していく現象を利用したものである。これについても破骨細胞と骨芽細胞の平衡状態を調節することで治療を改善することができると考えられる。【００１２】
このような背景において、近年では新たな骨形成調節薬、つまり破骨細胞と骨芽細胞の分化を調節する作用を持つ薬剤を開発する試みが行われている。【００１３】
特許文献１においては、ラクタシスチン（lactacystin）、ペプチジルアルデヒド（peptidyl aldehyde）、ペントキシフィリン（pentoxyfilline, PTX）などがプロテアソームやNF-κBを阻害することで骨形成や毛の成長を制御できると報告されている。
しかし、特許文献１の実施例４において発明者らは、インビトロの頭蓋冠アッセイにおいて、ＮＦ−κＢの阻害剤であってプロテアソーム活性を阻害しない化合物は、プロテアソーム阻害剤が示す薬理活性レベルまで骨形成を増強しないことを明らかにしている。【００１４】
特許文献２における発明は、NMDA-受容体アンタゴニストを使用して、望ましくない骨吸収を特徴とする疾患を治療する方法を開示している。また、破骨細胞内のNMDA受容体mRNA翻訳を阻害する能力があるアンチセンス mRNAもその治療に用いることができるとしている。【００１５】
しかし、発明者らは公知のNMDA-受容体アンタゴニストMK-801（メルク）およびフェンサイクリジン（PCP）に関する実施例を挙げているが、核酸医薬であるアンチセンス mRNAについては具体的な例を挙げていない。【００１６】
特許文献３における発明は、ＲＡＮＫＬ（ＯＰＧＬ）、ＲＡＮＫＬ融合タンパク質、アナログ、誘導体もしくは模倣物または骨形成性の化合物のうちの１以上のオリゴマー複合体を有効量投与することにより骨形成を増強する方法に関する。【００１７】
実施例においてＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与することにより、骨芽細胞の増殖を刺激することを開示しているが、この方法で投与されるのはタンパク質であり、本発明の核酸医薬品とは異なるものであった。また一方、ＲＡＮＫＬは骨吸収の強力なインデューサーとして、および破骨細胞発生のポジティブな調節因子として同定されているが、ここではＲＡＮＫＬの骨芽細胞刺激に着目している点において本発明とは異なる。【００１８】
【特許文献１】国際公開第00/02548号パンフレット
【特許文献２】特表2001-513757号公報
【特許文献３】特表2004−526748号公報
【非特許文献１】Garrett I.R. et al., J. Clin. Invest., 2003, 111(11); 1771-1782
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明が解決しようとする課題は、破骨細胞と骨芽細胞の平衡状態の破綻に起因する疾患の予防薬、改善薬、および／または治療薬を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、破骨細胞と骨芽細胞の分化を調節する作用を持つ薬剤を開発した。【００２１】
骨吸収が骨形成を上回ると骨量、骨密度が不足するが、このような場合に骨吸収を阻害すれば、疾患の予防、改善、および／または治療をすることができる。【００２２】
骨吸収において重要な役割を果たす破骨細胞の分化は、種々のホルモン、IL-1やTNF-α等のサイトカインによって制御されている。また、近年では破骨細胞の分化には、細胞間接触を介したRANK（NF-κB活性化受容体、Receptor Activator of NF-κB）―RANKL（NF-κB活性化受容体リガンド、Receptor Activator of NF-κB Ligand）のシグナル伝達が必須であることも明らかとなってきた。【００２３】
そこで、本発明者らは鋭意検討の結果、転写調節因子をデコイにより阻害し、骨細胞分化を調節できることを見いだした。
より具体的には、破骨細胞分化に深く関わるNF-κBをデコイにより阻害し、破骨細胞分化を抑制することを見いだした。【００２４】
したがって、本発明は、骨形成関連転写調節因子結合配列を有する核酸を有効成分とする骨形成調節剤を提供する。具体的には、本発明は、骨形成と骨吸収の平衡状態の破綻を修正するため、骨細胞の分化に関わる転写調節因子を阻害する核酸系薬剤（デコイ）を提供するものである。【００２５】
その要旨は、
（１）骨形成関連転写調節因子結合配列を有する核酸を有効成分とする骨形成調節剤、
（２）核酸がデコイ、アンチセンス、リボザイム、アプタマ−、siRNAの群から選択される（１）に記載の骨形成調節剤、
（３）核酸が、DNAまたはRNAからなるデコイである（１）に記載の骨形成調節剤、
（４）デコイがDNAオリゴヌクレオチドからなる（２）または（３）に記載の骨形成調節剤、
（５）デコイがNF-κB、STAT-1、STAT-3、STAT-6、Ets、AP-1、E2F、Smad1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad5、Smad6、Smad7、Smad8、またはRunx2/Cbfa1のデコイである（２）ないし（４）のいずれか一項に記載の骨形成調節剤、
（６）デコイがNF-κBのデコイである（５）に記載の骨形成調節剤、
（７）前記デコイが、NF-κB結合配列GGGRHTYYHC（式中、RはAまたはGを、YはCまたはTを、HはA、CまたはTをそれぞれ意味する）を含む（２）ないし（６）のいずれか一項に記載の骨形成調節剤、
（８）前記デコイが、NF-κB結合配列GGGATTTCCC(配列番号：２３)またはGGGACTTTCC（配列番号：２４）を含む（７）に記載の骨形成調節剤、
（９）前記デコイが配列番号：２に示されるデコイである（２）ないし（８）のいずれか一項に記載の骨形成調節剤、
（１０）前記デコイが、STAT-1またはSTAT-3結合配列TTCNNNGAA (式中NはA,G,TまたはCを意味する)を含む（２）ないし（５）のいずれか一項に記載の骨形成調節剤、
（１１）前記デコイが、STAT-1またはSTAT-3結合配列TTCCGGGAAを含む（１０）に記載の骨形成調節剤、
（１２）前記デコイが、STAT-6結合配列TTCNNNNGAA (式中NはA,G,TまたはCを意味する)を含む（２）ないし（５）のいずれか一項に記載の骨形成調節剤、
（１３）前記デコイが、STAT-6結合配列TTCCCAAGAAを含む（１２）に記載の骨形成調節剤、
（１４）前記デコイが、Ets結合配列MGGAW （式中MはAまたはCを、WはAまたはTをそれぞれ意味する）を含む（２）ないし（５）のいずれか一項に記載の骨形成調節剤、
（１５）前記デコイが、Ets結合配列CGGAAを含む（１４）に記載の骨形成調節剤、
（１６）前記デコイが、AP-1結合配列TGASTMA (式中SはGまたはCを、MはAまたはCをそれぞれ意味する)を含む（２）ないし（５）のいずれか一項に記載の骨形成調節剤、
（１７）前記デコイが、AP-1結合配列TGAGTCAを含む（１６）に記載の骨形成調節剤、
（１８）前記デコイが、E2F結合配列TTTSSCGS（式中、SはGまたはCを意味する）を含む（２）ないし（５）のいずれか一項に記載の骨形成調節剤、
（１９）前記デコイが、E2F結合配列TTTCCCGCを含む（１８）に記載の骨形成調節剤、
（２０）前記デコイが、Smad1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad5、Smad6、Smad7、Smad8結合配列GTCT、CAGAあるいはGCCGを含む（２）ないし（５）のいずれか一項に記載の骨形成調節剤、
（２１）前記デコイが、Smad1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad5、Smad6、Smad7、Smad8結合配列GTCTAGACあるいはCAGACAを含む（２０）に記載の骨形成調節剤、
（２２）前記デコイが、Runx2/Cbfa1結合配列ACCACAを含む（２）ないし（５）のいずれか一項に記載の骨形成調節剤、
（２３）前記デコイが、Runx2/Cbfa1結合配列AACCACAを含む（２２）に記載の骨形成調節剤、
（２４）前記デコイが、二本鎖DNAからなる（２）ないし（２３）のいずれか一項に記載の骨形成調節剤、
（２５）（１）ないし（２４）のいずれか一項に記載の骨形成調節剤を含む、破骨細胞と骨芽細胞の平衡状態の破綻に起因する疾患の予防薬、改善薬、または治療薬、
（２６）（２５）記載の疾患が、骨粗鬆症、パジェット病、骨腫瘍、外傷性軟骨欠損症、離断性骨軟骨炎、変形性関節症、関節リウマチ、骨折、脱臼、歯周病、う歯から選ばれた一種である予防薬、改善薬、または治療薬、
（２７）（１）ないし（２４）のいずれか一項に記載の骨形成調節剤を含む、歯列矯正、人工歯インプラント治療の改善薬、
（２８）骨形成関連転写調節因子結合配列を有する核酸を用いて、骨形成を調節する方法、
（２９）核酸がデコイ、アンチセンス、リボザイム、アプタマ−、siRNAの群から選択される、（２８）に記載の方法、
（３０）核酸が、DNAまたはRNAからなるデコイである（２８）に記載の方法、
（３１）デコイがDNAオリゴヌクレオチドからなる（２９）または（３０）に記載の方法、
（３２）デコイがNF-κB、STAT-1、STAT-3、STAT-6、Ets、AP-1、E2F、Smad1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad5、Smad6、Smad7、Smad8、またはRunx2/Cbfa1のデコイである（２９）ないし（３１）のいずれか一項に記載の方法、
（３３）デコイがNF-κBのデコイである（３２）に記載の方法、
（３４）前記デコイが、NF-κB結合配列GGGRHTYYHC（式中、RはAまたはGを、YはCまたはTを、HはA、CまたはTをそれぞれ意味する）を含む（２９）ないし（３３）のいずれか一項に記載の方法、
（３５）前記デコイが、NF-κB結合配列GGGATTTCCC(配列番号：２３)またはGGGACTTTCC（配列番号：２４）を含む（３４）に記載の方法、
（３６）前記デコイが配列番号：２に示されるデコイである（２９）ないし（３５）のいずれか一項に記載の方法、
（３７）前記デコイが、STAT-1またはSTAT-3結合配列TTCNNNGAA (式中NはA,G,TまたはCを意味する)を含む（２９）ないし（３２）のいずれか一項に記載の方法、
（３８）前記デコイが、STAT-1またはSTAT-3結合配列TTCCGGGAAを含む（３７）に記載の方法、
（３９）前記デコイが、STAT-6結合配列TTCNNNNGAA (式中NはA,G,TまたはCを意味する)を含む（２９）ないし（３２）のいずれか一項に記載の方法、
（４０）前記デコイが、STAT-6結合配列TTCCCAAGAAを含む（３９）に記載の方法、
（４１）前記デコイが、Ets結合配列MGGAW （式中MはAまたはCを、WはAまたはTをそれぞれ意味する）を含む（２９）ないし（３２）のいずれか一項に記載の方法、
（４２）前記デコイが、Ets結合配列CGGAAを含む（４１）に記載の方法、
（４３）前記デコイが、AP-1結合配列TGASTMA (式中SはGまたはCを、MはAまたはCをそれぞれ意味する)を含む（２９）ないし（３２）のいずれか一項に記載の方法、
（４４）前記デコイが、AP-1結合配列TGAGTCAを含む（４３）に記載の方法、
（４５）前記デコイが、E2F結合配列TTTSSCGS（式中、SはGまたはCを意味する）を含む（２９）ないし（３２）のいずれか一項に記載の方法、
（４６）前記デコイが、E2F結合配列TTTCCCGCを含む（４５）に記載の方法、
（４７）前記デコイが、Smad1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad5、Smad6、Smad7、Smad8結合配列GTCT、CAGAあるいはGCCGを含む（２９）ないし（３２）のいずれか一項に記載の方法、
（４８）前記デコイが、Smad1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad5、Smad6、Smad7、Smad8結合配列GTCTAGACあるいはCAGACAを含む（４７）に記載の方法、
（４９）前記デコイが、Runx2/Cbfa1結合配列ACCACAを含む（２９）ないし（３２）のいずれか一項に記載の方法、
（５０）前記デコイが、Runx2/Cbfa1結合配列AACCACAを含む（４９）に記載の方法、
（５１）前記デコイが、二本鎖DNAからなる（２９）ないし（５０）のいずれか一項に記載の方法、
（５２）破骨細胞と骨芽細胞の平衡状態の破綻に起因する疾患を予防、改善、または治療するための、（２８）〜（５１）のいずれか一項に記載の方法、
（５３）破骨細胞と骨芽細胞の平衡状態の破綻に起因する疾患が、骨粗鬆症、パジェット病、骨腫瘍、外傷性軟骨欠損症、離断性骨軟骨炎、変形性関節症、関節リウマチ、骨折、脱臼、歯周病、う歯からなる群より選択される、（５２）に記載の方法、
（５４）歯列矯正および人工歯インプラント治療を改善するための、（２８）〜（５１）のいずれか一項に記載の方法、
（５５）骨形成を調節する薬剤を製造するための、骨形成関連転写調節因子結合配列を有する核酸の使用、
（５６）核酸がデコイ、アンチセンス、リボザイム、アプタマ−、siRNAの群から選択される、（５５）に記載の使用、
（５７）核酸が、DNAまたはRNAからなるデコイである（５５）に記載の使用、
（５８）デコイがDNAオリゴヌクレオチドからなる（５６）または（５７）に記載の使用、
（５９）デコイがNF-κB、STAT-1、STAT-3、STAT-6、Ets、AP-1、E2F、Smad1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad5、Smad6、Smad7、Smad8、またはRunx2/Cbfa1のデコイである（５６）ないし（５８）のいずれか一項に記載の使用、
（６０）デコイがNF-κBのデコイである（５９）に記載の使用、
（６１）前記デコイが、NF-κB結合配列GGGRHTYYHC（式中、RはAまたはGを、YはCまたはTを、HはA、CまたはTをそれぞれ意味する）を含む（５６）ないし（６０）のいずれか一項に記載の使用、
（６２）前記デコイが、NF-κB結合配列GGGATTTCCC(配列番号：２３)またはGGGACTTTCC（配列番号：２４）を含む（６１）に記載の使用、
（６３）前記デコイが配列番号：２に示されるデコイである（５６）ないし（６２）のいずれか一項に記載の使用、
（６４）前記デコイが、STAT-1またはSTAT-3結合配列TTCNNNGAA (式中NはA,G,TまたはCを意味する)を含む（５６）ないし（５９）のいずれか一項に記載の使用、
（６５）前記デコイが、STAT-1またはSTAT-3結合配列TTCCGGGAAを含む（６４）に記載の使用、
（６６）前記デコイが、STAT-6結合配列TTCNNNNGAA (式中NはA,G,TまたはCを意味する)を含む（５６）ないし（５９）のいずれか一項に記載の使用、
（６７）前記デコイが、STAT-6結合配列TTCCCAAGAAを含む（６６）に記載の使用、
（６８）前記デコイが、Ets結合配列MGGAW （式中MはAまたはCを、WはAまたはTをそれぞれ意味する）を含む（５６）ないし（５９）のいずれか一項に記載の使用、
（６９）前記デコイが、Ets結合配列CGGAAを含む（６８）に記載の使用、
（７０）前記デコイが、AP-1結合配列TGASTMA (式中SはGまたはCを、MはAまたはCをそれぞれ意味する)を含む（５６）ないし（５９）のいずれか一項に記載の使用、
（７１）前記デコイが、AP-1結合配列TGAGTCAを含む（７０）に記載の使用、
（７２）前記デコイが、E2F結合配列TTTSSCGS（式中、SはGまたはCを意味する）を含む（５６）ないし（５９）のいずれか一項に記載の使用、
（７３）前記デコイが、E2F結合配列TTTCCCGCを含む（７２）に記載の使用、
（７４）前記デコイが、Smad1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad5、Smad6、Smad7、Smad8結合配列GTCT、CAGAあるいはGCCGを含む（５６）ないし（５９）のいずれか一項に記載の使用、
（７５）前記デコイが、Smad1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad5、Smad6、Smad7、Smad8結合配列GTCTAGACあるいはCAGACAを含む（７４）に記載の使用、
（７６）前記デコイが、Runx2/Cbfa1結合配列ACCACAを含む（５６）ないし（５９）のいずれか一項に記載の使用、
（７７）前記デコイが、Runx2/Cbfa1結合配列AACCACAを含む（７６）に記載の使用、
（７８）前記デコイが、二本鎖DNAからなる（５６）ないし（７７）のいずれか一項に記載の使用、
（７９）前記骨形成調節剤が、破骨細胞と骨芽細胞の平衡状態の破綻に起因する疾患を予防、改善、または治療する、（５５）〜（７８）のいずれか一項に記載の使用、
（８０）破骨細胞と骨芽細胞の平衡状態の破綻に起因する疾患が、骨粗鬆症、パジェット病、骨腫瘍、外傷性軟骨欠損症、離断性骨軟骨炎、変形性関節症、関節リウマチ、骨折、脱臼、歯周病、う歯からなる群より選択される、（７９）に記載の使用、
（８１）前記骨形成調節剤が、歯列矯正および人工歯インプラント治療を改善する、（５５）〜（７８）のいずれか一項に記載の使用、
に関する。
【発明の効果】
【００２６】
本発明により、骨形成に関わる転写調節因子を阻害することを特徴とする核酸系薬剤であるデコイが提供された。また、このデコイは、破骨細胞と骨芽細胞の平衡状態の破綻に起因する疾患、例えば骨粗鬆症、パジェット病などに用いることができる。他にも骨腫瘍、外傷性軟骨欠損症、離断性骨軟骨炎、変形性関節症、関節リウマチ、骨折、脱臼、歯周病、う歯の予防、改善、治療薬や、歯列矯正、人工歯インプラント治療の改善薬として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】多核細胞は骨髄細胞からの分化の間に形成される。ビタミンD3で7日間処理し、分化誘導された骨髄細胞の（a）位相差顕微鏡像（×40）、（b）ヘキスト33258染色像（×40）、（c）TRAP染色像（×40）。NF-κBデコイで処理した細胞の（d）TRAP染色像（×100）、（e）ヘキスト33258染色像（×100）、（f）TRAPとヘキスト33258染色像のダブルイメージ（×100）。
【図２】ビタミンD3で7日間処理し、分化誘導された骨髄細胞の（a）走査型電子顕微鏡像（Cellは破骨細胞、Pitは吸収窩を表す。バーは5μm。倍率×1000）、（b）吸収窩断面の透過型電子顕微鏡像（Nは核、Czは明帯、Rbは波状縁を示す。矢印は一つの吸収窩の大きさを表す。倍率×1000,000）。明帯（Cz）で骨表面を密封した多核細胞が、波状縁（Rb）によって骨塩を吸収している。破骨細胞は表面に掘削窩を残し、骨表面を移動している。
【図３】骨髄細胞におけるNF-κB結合配列によって制御されるルシフェラーゼ活性に対するビタミンD3（1ｘ10-8M）の効果。(＊P<0.01、N=6)
【図４】FITCラベルNF-κBデコイをトランスフェクトした細胞のビタミンD3処理1、4、7日後の蛍光顕微鏡像（a,b：×40、c：×100）。NF-κBデコイは分化のすべての段階において破骨細胞に取り込まれた。
【図５】FITCラベルNF-κBデコイをトランスフェクトした細胞のビタミンD3処理4日後のルシフェラーゼ活性。(＊コントロールと比較してP<0.01、†ビタミンD3と比較してP<0.01、N=6)
【図６】FITCラベルNF-κBデコイをトランスフェクトした細胞のビタミンD3処理７日後のルシフェラーゼ活性。(＊コントロールと比較してP<0.01、†ビタミンD3と比較してP<0.01、N=6）
【図７】FITCラベルNF-κBデコイまたはスクランブルデコイをトランスフェクトした細胞のビタミンD3処理７日後のTRAP陽性細胞の顕微鏡像（×40）。a)ビタミンD3：ビタミンD3（1×10-8M）のみで処理、b)NF-κBデコイ（0.25μM）：ビタミンD3およびNF-κBデコイ（0.25μM）で処理、c)NF-κBデコイ（0. 5μM）：ビタミンD3およびNF-κBデコイ（0.5μM）で処理、d)NF-κBデコイ（1μM）:ビタミンD3およびNF-κBデコイ（1μM）で処理、e)スクランブルデコイ（1μM）：ビタミンD3およびスクランブルデコイ（1μM）で処理。（＊ビタミンD3のみで処理と比較してP<0.01、N=6）
【図８】TRAP陽性細胞におけるNF-κBデコイの影響。（N=6）
【図９】（a）FITCラベルNF-κBデコイをトランスフェクトした破骨細胞の蛍光顕微鏡像、（b）ヘキスト33258染色像、（c）FITCとヘキスト33258染色像のダブルイメージ（×100）。
【図１０】ビタミンD3またはM-CSFとRANKLによって破骨細胞へと分化した細胞に対するNF-κBデコイの影響。破骨細胞形成減少率（％）は、スクランブルデコイ群と比較して減少したTRAP陽性細胞数の割合として示す。ビタミンD3：ビタミンD3による刺激、M-CSF＋RANKL：RANKLおよびM-CSFによる刺激（*P<0.01、N=6）
【図１１】ビタミンD3処理3日後のNF-κBデコイまたはスクランブルデコイを添加した歯切片の顕微鏡像（×5）。スクランブルデコイ（1μM）：ビタミンD3（1×10-8M）およびスクランブルデコイ（1μM）で処理、NFκBデコイ（0.25μM、0.5μM、1μM）：ビタミンD3（1×10-8M）およびNF-κBデコイ（0.25μM、0.5μM、1μM）で処理。
【図１２】ビタミンD3処理3日後のNF-κBデコイまたはスクランブルデコイを添加した歯切片中の吸収窩数。図11の定量解析。（*スクランブルデコイ群に対してP<0.01）
【図１３】破骨細胞活性化と吸収窩の形成の模式図。
【図１４（ａ）（ｂ）】卵巣切除により誘導された骨粗鬆症のモデルにおけるNF-κBデコイの作用。（a）体重および血清エストラジオールレベル、（b）FITC標識NF-κBデコイ（30μg/kg/時間）の処理後の脛骨近位の凍結切片における、左パネルはヘマトキシリン染色後の顕微鏡像、そして右パネルは蛍光顕微鏡像を示す（×40）。Sham＝擬似手術、OVX＝両側卵巣切除、NF-κB＝両側卵巣切除およびNF-κBデコイ（30μg/kg/時間）で処理、Scb＝スクランブルデコイ（30μg/kg/時間）＝両側卵巣切除およびスクランブルデコイ（30μg/kg/時間）で処理。（＊Shamに対してP<0.05。†scb に対してP<0.05、N＝8）
【図１４（ｃ）（ｄ）】卵巣切除により誘導された骨粗鬆症のモデルにおけるNF-κBデコイの作用。（c）処理後14日目の大腿遠位におけるTRAP染色像（×100）、（d）処理後14日目の4つの群における脛骨近位および大腿遠位でのTRAP活性。Sham＝擬似手術、OVX＝両側卵巣切除、NF-κB＝両側卵巣切除およびNF-κBデコイ（30μg/kg/時間）で処理、Scb＝スクランブルデコイ（30μg/kg/時間）＝両側卵巣切除およびスクランブルデコイ（30μg/kg/時間）で処理。（＊Shamに対してP<0.05。†scb に対してP<0.05、N＝8）
【図１５（ａ）（ｂ）】卵巣切除により誘導された骨粗鬆症のモデルの処理後14日目の4つの群における（a）脛骨近位および大腿遠位におけるカルシウム濃度、（b）脛骨近位および大腿遠位におけるヒドロキシプロリン濃度へのNF-κBデコイの作用。Sham＝擬似手術、OVX＝両側卵巣切除、NF-κB＝両側卵巣切除およびNF-κBデコイ（30μg/kg/時間）で処理、Scb＝スクランブルデコイ（30μg/kg/時間）＝両側卵巣切除およびスクランブルデコイ（30μg/kg/時間）で処理。（＊Shamに対してP<0.05。†scbに対してP<0.05、N＝8）
【図１５（ｃ）】卵巣切除により誘導された骨粗鬆症のモデルの処理後14日目の4つの群における（c）尿中デオキシピリジノリン（これらは尿中クレアチン濃度によって調節される）へのNF-κBデコイの作用。Sham＝擬似手術、OVX＝両側卵巣切除、NF-κB＝両側卵巣切除およびNF-κBデコイ（30μg/kg/時間）で処理、Scb＝スクランブルデコイ（30μg/kg/時間）＝両側卵巣切除およびスクランブルデコイ（30μg/kg/時間）で処理。（＊Shamに対してP<0.05。†scbに対してP<0.05、N＝8）
【図１６】（a）L-アスコルビン酸の投与中止後の体重減少におけるNF-κBデコイODNの効果を示すグラフである。NF-κBデコイODNの処理により、体重減少が抑制された。（b）スクランブルデコイODNで処理したラットおよびNF-κBデコイODNで処理したラットにおける大腿骨の写真である。NF-κBデコイODN処理群でのみ、大腿骨頭（矢印で示した部分）が崩壊されずに温存されている。（c）骨形成異常シオノギラットモデルにおいて処理から28日後に二重エネルギーＸ線吸収測定法によって評価された骨密度におけるNF-κBデコイODNの効果を示すグラフである。  NF-κBデコイ＝骨形成異常シオノギラットにビタミンCを欠乏させた食餌を与え、NF-κBデコイODNを30μg/kg/時間で投与した；スクランブルデコイ＝骨形成異常シオノギラットにビタミンCを欠乏させた食餌を与え、スクランブルデコイODNを30μg/kg/時間で投与した；対照＝同週齢の正常WisterラットにビタミンCを欠乏させた食餌を与えた。＊スクランブルデコイに対してP<0.05、1群当たりN＝6。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明の骨形成調節剤は、骨形成関連転写調節因子結合配列を有する核酸を有効成分とする核酸系薬剤である。本発明の骨形成調節剤は、骨形成関連転写調節因子に作用して、骨形成過程（例えば、破骨細胞と骨芽細胞の平衡状態）を調節することができる。【００２９】
本明細書に記載される「骨形成関連転写調節因子」には、骨形成に関連する様々な因子が含まれる。具体的には、骨形成関連転写調節因子として、NF-κB、STAT-1、STAT-3、STAT-6、Ets、AP-1、E2F、Smad1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad5、Smad6、Smad7、Smad8、および／またはRunx2/Cbfa1が挙げられるが、これらに限定されることはない。本明細書における「骨形成関連転写調節因子結合配列」とは、上記のような骨形成に関わる転写調節因子と結合可能な配列を意味する。【００３０】
本発明で使用される核酸系薬剤は、通常はデコイ、アンチセンス、リボザイム、アプタマ―、siRNAなどが対象となるが、好ましくはデコイである。本明細書において、デコイ、デコイオリゴヌクレオチド、デコイODNは同義に用いられる。【００３１】
デコイは例えばNF-κB、STAT-1、STAT-3、STAT-6、Ets、AP-1、E2F、Smad1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad5、Smad6、Smad7、Smad8、Runx2/Cbfa1等のデコイを用いることが出来るが、NF-κBのデコイがより好ましい。1つの態様において、NF-κBのデコイはNF-κB結合配列を含む。NF-κB結合配列をNF-κB結合配列のコンセンサス配列GGGRHTYYHC  （R(A,G); Y(C,T); H(A,C,T)）（配列番号：１）から選択することができる。NF-κBのデコイとして、例えば配列番号：２に示すデコイが挙げられるが、これに限定されない。【００３２】
他の態様において、STAT-1、STAT-3結合配列のコンセンサス配列TTCNNNGAA (N(A,G,T,C)) （配列番号：３）、STAT-6結合配列のコンセンサス配列TTCNNNNGAA (N(A,G,T,C)) （配列番号：５）、Ets結合配列のコンセンサス配列MGGAW (M(A,C); W(A,T)) （配列番号：７）、AP-1結合配列のコンセンサス配列TGASTMA (S(G,C); M(A,C)) （配列番号：９）、E2F結合配列のコンセンサス配列TTTSSCGS（S(G,C)）（配列番号：１１）、Smad結合配列のコンセンサス配列GTCT（配列番号：１３）、CAGA（配列番号：１５）あるいはGCCG（配列番号：１７）、Runx2/Cbfa1結合配列のコンセンサス配列ACCACA（配列番号：１８）から選択した配列を含むデコイを用いることもできる。【００３３】
例えば具体的には、STAT-1、STAT-3結合配列   TTCCGGGAA（配列番号：４）、STAT-6結合配列   TTCCCAAGAA（配列番号：６）、Ets結合配列   CGGAA（配列番号：８）、AP-1結合配列   TGAGTCA（配列番号：１０）、E2F結合配列  TTTCCCGC （配列番号：１２）、Smad結合配列  GTCTAGAC（配列番号：１４）あるいはCAGACA（配列番号：１６）、Runx2/Cbfa1結合配列AACCACA（配列番号：１９）から選択した配列を含むデコイを用いることができるが、これに限定されない。【００３４】
本発明のデコイはオリゴヌクレオチドで構成されてもよい。オリゴヌクレオチドはDNAでもRNAでもよく、またはそのオリゴヌクレオチド内に核酸修飾体および/または擬核酸を含むものであってもよい。また、オリゴヌクレオチドは一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖である。これらの相補体を含むオリゴヌクレオチド、これらの変異体、またはこれらを分子内に含む化合物も用いることができる。【００３５】
なお、本発明に係るデコイは、DNA合成機（DNA Synthesizer）等の常法により製造することができる。【００３６】
本発明の骨形成調節剤（例えば、デコイ）は、単独または一般的な薬学的キャリアと混合して医薬組成物として、局所投与、全身投与、経口投与または非経口投与され得る。例えば関節リウマチなど炎症が限局されている場合は、局所注入することができる。また、歯槽膿漏などの歯周病には、軟膏を基材として歯肉溝に注入することもできる。【００３７】
本医薬組成物は、溶液、懸濁物、シロップ剤、リポソーム、ローションなどのような液体投与形態や、錠剤、顆粒、散剤、およびカプセル剤などのような固体投与形態で提供され得る。必要な場合は、医薬組成物は、種々のビヒクル、賦形剤、安定化剤、滑面沢剤、および／または他の従来の医薬添加剤を補充され得る。【００３８】
本発明の医薬組成物を、破骨細胞と骨芽細胞の平衡状態の破綻に起因する疾患、例えば骨粗鬆症、パジェット病などの予防、改善および／または治療のために使用することができる。または、骨腫瘍、外傷性軟骨欠損症、離断性骨軟骨炎、変形性関節症、関節リウマチ、骨折、脱臼、歯周病、う歯の予防薬、改善薬および／または治療薬、ならびに歯列矯正、人工歯インプラント治療の改善薬として使用することができる。【００３９】
本発明のデコイの投与量は、年齢、体重、症状、投与方法、投与経路等によって異なるが、関節内投与、脈管内投与、または筋肉内投与のためには、例えば成人一日当たり、10nmol〜10,000nmolを、１または複数箇所に分けて投与することが出来る。【００４０】
続いて本発明を具体的に説明するため、以下に実施例を掲げるが、本発明はこれらに限定されない。
【実施例】
【００４１】
１．骨髄細胞の培養と破骨細胞の分化
生後3日のシロウサギから骨髄細胞を調製した。ウサギ大腿骨と脛骨から骨髄細胞を取り出し、チューブに集め、PBSで二回洗浄した。単核細胞の多い画分を骨髄細胞から分離し、10%ウシ胎児血清添加α-MEM培養液を用いて1×105細胞／ウェルで培養した。培養液交換は3日おきにビタミンD3（1×10-8M）添加α-MEMを用いて行った。加えて、骨髄細胞には、リポフェクタミン2000（LipofectAMINE2000, Invitrogen）を用い、NF-κB結合配列によって調節されるルシフェラーゼ遺伝子（クローンテック）をトランスフェクトした。トランスフェクションから24時間後に、細胞を無血清培養液で6時間培養した。静止状態の細胞を1×10-8MのビタミンD3で4時間または48時間処理し、PBSで洗浄し、200μlの細胞溶解バッファーを用い、4℃、15分間細胞を溶解した。20μlの細胞抽出液を100μlのルシフェラーゼアッセイ試薬と混合し、ルミノメーターを用いて2秒間ずつ測定した。コントロールとして、ビタミンD3で処理しない以外は同様の処理を行った細胞を使用した。【００４２】
NF-κBデコイ、スクランブルデコイは各々以下のものを用いた。
NF-κBデコイ
5’-CCTTGAAGGGATTTCCCTCC-3’（配列番号：２）
3’-GGAACTTCCCTAAAGGGAGG-5’ (配列番号：２１)
スクランブルデコイ
5’-TTGCCGTACCTGACTTAGCC-3’（配列番号：２０）
3’-AACGGCATGGACTGAATCGG-5’ (配列番号：２２)
デコイオリゴヌクレオチドは常法に従い、DNA合成機を用いて調製した。【００４３】
２．酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（TRAP）染色（Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining）
破骨細胞のマーカーと考えられるTRAPを染色することで、破骨細胞を検出した。細胞をビタミンD3（1×10-8M）とスクランブルデコイまたはNF-κBデコイで処理し、培養７日目の細胞を4.0％パラフォルムアルデヒド／PBSを用いて室温にて10分間固定した後、TRAP染色（Code# OP04, Hokudo）を行った。【００４４】
３．ヘキスト（Hoechst）33258による核染色
細胞にビタミンD3（1×10-8M）とスクランブルデコイまたはNF-κBデコイを加え、培養７日目にヘキスト33258（10μl）を用いて10分間染色し、非共焦点顕微鏡（オリンパス BX60）を用い、励起波長360nmで観察した。（ヘキスト33258は、細胞膜の壊れた核全てを染色するため、壊死した細胞は無傷の青い核として、アポトーシスをおこした細胞は断片化した（または凝縮した）核としてそれぞれ観察される。）【００４５】
４．電子顕微鏡による観察
細胞や基質を保存するために、試料を5％グルタールアルデヒド添加0.2Mカコジル酸バッファーを用いて4℃で一晩、2％オスミウムで3時間固定した。その後試料をエタノールで段階的に脱水した（70-100％）。走査型電子顕微鏡（scanning electron microscopy, SEM）に用いるため試料を二酸化炭素を用いて臨界点乾燥した。これをスパッタ法で金をコーティングし、SEM（JOEL,T-200）で観察した。透過型電子顕微鏡（transmission electron microscopy, TEM）に用いるため試料をエタノールで段階的に脱水した（70-100％）後、Epok812に包埋した。ウルトラミクロトーム（MT-7000, RMC）を用いて超薄切片を作成し、コロジオンコートした銅グリッドにのせた。これをタンニン酸、酢酸ウラニル、クエン酸鉛を用いて染色し、TEM（H-7000, 日立製作所）で観察した。【００４６】
結果）細胞をビタミンD3処理した後、TRAP陽性の多核細胞が観察された(図1 a, b, c参照)。また、NF-κBデコイで処理した細胞には核の断片化が見られた(図1 d, e, f参照)。【００４７】
電子顕微鏡観察においても、骨の表面を明帯（Clear Zone:Cz)で覆った多核細胞が、波状縁(Ruffled Borders:Rb)によって骨塩に吸収されたことが認められた。図２（b）において写真上部が破骨細胞、写真下部の黒い部分が骨である。骨が破骨細胞によって侵食され、吸収窩（Pit、写真左下約１/４）を形成しているのが分かる。これらの破骨細胞は小窩を残して骨表面を移動した（図2、13参照）。【００４８】
破骨細胞の分化におけるNF-κBの活性化を確かめるために、NF-κB結合配列によって制御されるルシフェラーゼ遺伝子を新生ウサギの骨髄細胞にトランスフェクトしたところ、ビタミンD3処理した細胞では、処理後48時間においてルシフェラーゼ活性が誘導された。これはNF-κBの活性上昇を意味する（図３、表１参照）。【００４９】
【表１】
2006064886.tif 000002
【００５０】
ビタミンD3により誘導されたNF-κBの活性が破骨細胞の分化と活性化の両方を調節しているかどうかを確かめるために、NF-κBデコイを破骨細胞にトランスフェクトし、その抑制活性を調べた。
FITCラベルデコイ（1μM）をトランスフェクトした細胞では、ビタミンD3処理の1、4、7日後に核内に強い蛍光として観察された（図４参照）。ヘキスト33258核染色によって多核細胞も観察された。蛍光はトランスフェクションの72時間後まで検出された。【００５１】
NF-κB配列によって制御されるルシフェラーゼ遺伝子とNF-κBデコイを同時にトランスフェクトした場合、ビタミンD3処理から4日後には未分化の破骨細胞においてルシフェラーゼ活性が大きく減少した（図5、表２参照, P<0.01）。ビタミンD3処理から7日後には分化した破骨細胞においてルシフェラーゼ活性が大きく減少した（図６、表３参照, P<0.01）。【００５２】
【表２】
2006064886.tif 000003
【００５３】
【表３】
2006064886.tif 000004
【００５４】
ビタミンD3によって骨髄細胞から分化した破骨細胞は、多核細胞としてTRAP染色陽性として検出される。ビタミンD3存在下において、TRAP陽性多核破骨細胞は著しく増加した（図７参照）。しかし、NF-κBデコイをトランスフェクトした場合はスクランブルデコイに比べて、TRAP陽性細胞の数が大きく減少した（図７，８、表４参照、P<0.01）。しかしこれらの処理は、他の間葉骨芽細胞（mesenchymal osteoblastic cell)には影響しなかった。【００５５】
【表４】
2006064886.tif 000005
【００５６】
NF-κBは、細胞死を抑制する因子としてよく知られているので、破骨細胞のアポトーシスにおけるNF-κBデコイの効果について調べた。細胞はアポトーシスとして認識される核の凝縮をおこしていた（図9参照）。アポトーシスを起こした細胞はFITCラベルNF-κBデコイの蛍光と共に局在している。【００５７】
すなわち、ビタミンD3による破骨細胞の誘導は、NF-κBデコイによって抑制された。その一部はアポトーシスを誘導することによって起こった。【００５８】
M-CSFとRANKLによって誘導されたラット破骨細胞のTRAP染色を行った。NF-κBデコイは、M-CSFとRANKLによるラット破骨細胞の分化誘導を弱めた（図１０、表５参照）。これらのことから、NF-κBはビタミンD３による骨髄細胞から破骨細胞への分化誘導と同様に、M-CSFとRANKLによる骨髄細胞から破骨細胞への分化誘導にも関わっていることが分かった。【００５９】
【表５】
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【００６０】
５．破骨細胞形成の観察
破骨細胞はラット破骨細胞形成キット（Hokudo、CAT#CUOC01）を用いて調べた。ラットの破骨前駆細胞を24ウェルプレートに播種し、M-CSFとRANKL添加培養液中でインキュベートした。7日後、TRAP染色を行った。【００６１】
６．吸収窩（pit）形成
NF-κBデコイの吸収窩形成における影響を調べた。ヒト歯を3-4mm厚の歯切片を作成し、24ウェルプレートに入れた。ビタミンD3処理から6日後の骨髄細胞（1×104細胞／ml）を歯切片の上で6時間インキュベートし、PBSで洗浄し、さらにビタミンD3（1×10-8M）とNF-κBデコイまたはスクランブルデコイを加え、3日間培養した。次亜塩素酸ナトリウムを用いて有機物を除去した後、切片をトルイジンブルー（SIGMA）で染色して吸収窩を可視化した。また、切片中の破骨細胞活性と関連すると報告されている円形のドット（破骨細胞吸収窩）を光学顕微鏡下で数えた。【００６２】
結果）ビタミンD3処理7日後にTRAP染色を行い、破骨細胞活性を測定した。NF-κBデコイを投与した歯切片は、スクランブルデコイに比べて、破骨細胞活性が著しく抑えられた（図１１、１２、表６参照）。NF-κBデコイは、ビタミンD3による破骨細胞への分化誘導を抑制することに加えて、ビタミンD3による破骨細胞活性を抑える効果があるといえる。【００６３】
【表６】
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【００６４】
７．卵巣切除によるラット骨粗鬆症モデル
メス成体Wisterラット（10週齢）は、日本SLC（静岡, 日本）より購入した。ラットを腹腔内ケタミン（80mg/kg）およびキシラジン（10mg/kg）で麻酔して、両側卵巣切除または擬似手術（比較対象）を行い、NF-κBまたはスクランブルデコイを含む浸透圧ミニポンプ（Alzet model 2004;Alza Corp）（注入速度30μg/kg/時間）を埋め込んだ。これらのマウスの体重を2週間の間記録した。手術後2週間目にこれらを深く麻酔し、そして、大腿骨、脛骨、血液および尿を生化学的解析のために回収した。脛骨近位および大腿遠位を切断し、そして10mMトリエタノールアミンバッファー（pH7.5）中でホモジナイズし、上清をWalterの方法（Walter K, Schutt C. Acid and alkaline phosphatase in serum. Method of Enzymatic Analysis, Academic Press, New York & London: 1974; 856-870.）を用いてTRAP活性を測定し、そして沈殿物を塩酸（6M）で105℃で24時間にわたって加水分解（hydized）して、Bergmanの方法によってヒドロキシプロリンを測定し、そしてGitelmanのo-クレゾールフタレインコンプレキソン（o-cresol-phthalein complexone：OCPC）法（Gitelman HJ, Kukolj S, Welt LG. Inhibition of parathyroid gland activity by hypermagnesemia. Am J Physiol 1968; 215: 483-485）に基づいてCa含量を測定した。血清中のエストラジオールレベルは、EIA（三菱化学ヤトロン,東京,日本）によって測定し、そして尿中デオキシピリジノリンレベルは、EIAにより実験の14日目に測定した（Metra Biosystems, Mountain View, CA）。【００６５】
結果）ラット卵巣切除モデルの骨粗鬆症におけるNF-κBデコイの作用
破骨細胞の活性化におけるNF-κBの役割をさらに解明するために、筆者らは骨粗鬆症のモデルとしてエストロゲン欠乏のラット卵巣切除モデルを用いた。
両側卵巣切除後14日目に、卵巣切除群における血清エストラジオールレベルが有意に低減した一方で、体重には有意な差異はなかった（図14a、表7）。骨へのトランスフェクションを確認するために、FITC標識オリゴヌクレオチドを浸透圧ミニポンプによって投与した。図14bに示すように、蛍光は脛骨で検出することができた。標的化細胞と同様に、TRAP染色陽性細胞もまた卵巣切除後に検出された（図14c）。実際に、TRAP活性は卵巣切除ラットの脛骨および大腿骨において有意に上昇した（図14d、表8）。【００６６】
対照的に、浸透圧ミニポンプを用いたNF-κBデコイの継続的な処理は、TRAP染色陽性領域の増加ならびに脛骨および大腿骨のTRAP活性を低減させたが、しかしスクランブルデコイはさせなかった（図14cおよび14d、表8）。破骨細胞の活性化の阻害もまた、組織コラーゲンの典型的なマーカーであるカルシウムおよびヒドロキシプロリンの測定によって確認された。図15aおよび15bに示すように、脛骨および大腿骨におけるカルシウムならびにヒドロキシプロリンの濃度は、卵巣切除の後に低下した一方、NF-κBデコイの処理はそれらを有意に軽減した（P<0.01、図15a、表9および15b、表10）。【００６７】
これらの結果は、組織コラーゲンのプロセシングによって骨から放出された尿中デオキシピリジノリンの変化を伴った。NF-κBデコイによる処理は、卵巣切除によって誘導される尿中デオキシピリジノリンの増加を抑制した（P<0.01、図15c、表11）。これらの結果は、NF-κBデコイの処理がエストロゲン欠乏で誘導される骨粗鬆症を改善することを示唆する。【００６８】
【表７】
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【００６９】
【表８】
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【００７０】
【表９】
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【００７１】
【表１０】
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【００７２】
８．ビタミンC欠乏ラットモデル
骨形成異常シオノギ（Osteogenic disorder shionogi：ODS）ラットは、アスコルビン酸を合成するための鍵酵素を欠失しているWistarラットの変異系統であり、プロリンヒドロキシラーゼ等、いくつかのヒドロキシラーゼが減少している（Togari A., Arai M., Nakagawa S., Banno A., Aoki M., Matsumoto S., Alteration of bone status with ascorbic acid deficiency in ODS (osteogenic disorder Shionogi) rat, Jpn J Pharmacol, 1995 Jul; 68(3): 255-261）。このラットに生後9週までビタミンCを補足した食餌を与え、正常に飼育した後、欠乏食を与えると、コラーゲン合成ができずに血管や骨の崩壊を招き、約5週間で死に至る。
雄の骨形成異常シオノギラット（8週齢）をCLEA laboratoryより購入し、体重1kg当たり800mgのL-アスコルビン酸を補足した食餌を与えた。1週間後、食餌をL-アスコルビン酸を欠乏させた食餌に変更し、NF-κBまたはスクランブルデコイODNを含む浸透圧ミニポンプ（注入速度30μg/kg/時間）をラットに埋め込んだ。これらのラットの体重を、L-アスコルビン酸の投与中止前およびL-アスコルビン酸の投与中止後4週間目に記録した。手術後4週間目に脛骨および大腿骨を分析した。【００７３】
９．二重エネルギーＸ線吸収測定法（Dual energy x-ray absorptiometry：DXA）
X線骨密度装置、dual-photon x-ray absorbsiometry (DEXA) bone densitometry（GE-Lunar DPX-IQ, Madison, WI）を用いて、骨密度（BMD）（g/cm2）を測定した。全ての走査は、Venken K. et al., Bone, 2005, 36: 663-670に記載されるように、0.5 mAでハイビームエネルギー 80 kV、ロービームエネルギー 35 kVで行った。【００７４】
結果）ビタミンC欠乏ラットモデルの骨粗鬆症におけるNF-κBデコイODNの作用
骨粗鬆症におけるNF-κBデコイの治療効果をさらに確かめるために、アスコルビン酸を合成するための鍵酵素を欠失している骨形成異常シオノギラットを用いた。
L-アスコルビン酸を補足した食餌を中止した後、骨形成異常シオノギラットの体重は劇的に減少し、骨の長さが短くなった。しかし、NF-κBデコイODNの処理により、体重の減少が抑制された（図16a）。さらに、大腿骨の長さおよび重さもに有意な差異が生じた。（大腿骨の長さ：対照、36.8±0.2mm；NF-κBデコイ、32.6±0.2mm＊；スクランブルデコイ、30.1±0.5mm；＊スクランブルデコイに対してP<0.05。大腿骨の重さ：対照、0.866±0.01g；NF-κBデコイ、0.639±0.019g＊；スクランブルデコイ、0.557±0.010g；＊スクランブルデコイに対してP<0.05。）【００７５】
スクランブルデコイODN処理群の大腿骨近位部において、しばしば骨折が見られたが、NF-κBデコイODN処理群では骨折は見られなかった。図16bに記載されるように、NF-κBデコイODN処理群でのみ、大腿骨頭（矢印で示した部分）が崩壊されずに温存されている。重要なことに、二重エネルギーＸ線吸収測定法による骨密度解析において、大腿骨遠位部（膝関節部）における骨密度は、NF-κBデコイODN処理群において有意に増加した（図16c）。これらの結果から、NF-κBデコイODNの処理は、骨形成異常シオノギラットにおける骨粗鬆症の変化を改善することが示唆される。【００７６】
１０．統計解析
全ての数値は平均値±標準誤差で示した。分散はBonferroni／Dunnet法により求め、複数の比較における有意性を検討した。P<0.05を有意な差があるとした。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明は骨形成、骨吸収の平衡状態の破綻に起因する疾患の予防、改善、および／または治療薬を提供する。
【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５（ａ）（ｂ）】
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【図１５（ｃ）】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図７】
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【図９】
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【図１１】
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【図１４（ａ）（ｂ）】
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【図１４（ｃ）（ｄ）】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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