(57)【要約】  NRSF/RESTのmSin3Bとの相互作用領域を特定した。下記のアミノ酸配列：Leu-Ile-Met-Leu-Ala-Asn-Val-Ala    (I)を含む、アミノ酸残基数８〜５０個のペプチド。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のアミノ酸配列：
Leu-Ile-Met-Leu-Ala-Asn-Val-Ala（配列番号１）    (I)
を含む、アミノ酸残基数８〜５０個のペプチド。
【請求項２】
配列(I)のN末端側にGln及び／又はC末端側にLeuをさらに含む、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
配列(I)のN末端側にAla-Pro-Gln及び／又はC末端側にLeu-Thrをさらに含む、請求項１記載のペプチド。
【請求項４】
Sin3のPAH1ドメインと結合することができる、請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド。
【請求項５】
神経選択的サイレンサー結合因子NRSF/RESTの特定の領域と同一のアミノ酸配列からなる、請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド。
【請求項６】
配列番号３、４又は５のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項５記載のペプチド。
【請求項７】
C末端側に塩基性アミノ酸残基を付加した、請求項１〜６のいずれかに記載のペプチド。
【請求項８】
さらに、芳香環を有するアミノ酸残基を付加した、請求項７記載のペプチド。
【請求項９】
配列番号８のアミノ酸配列からなる、請求項８記載のペプチド。
【請求項１０】
下記のアミノ酸配列：
Φ1-X1-X2-Φ2-A1-X3-A2-Ala（配列番号２）    (II)
（配列(II)中、Φ1及びΦ2はそれぞれ独立にかさ高い疎水性アミノ酸残基であり、X1、X2及びX3はそれぞれ独立にPro以外の任意のアミノ酸残基であり、A1及びA2はそれぞれ独立にAla又はValである）
を含む、アミノ酸残基数８〜５０個のペプチド。
【請求項１１】
Sin3のPAH1ドメインと結合することができる、請求項１０記載のペプチド。
【請求項１２】
神経選択的サイレンサー結合因子NRSF/REST又は転写コリプレッサーN-CoRの特定の領域と同一のアミノ酸配列からなる、請求項１０又は１１に記載のペプチド。
【請求項１３】
配列番号３、４、５又は１０のアミノ酸配列からなる、請求項１２記載のペプチド。
【請求項１４】
C末端側に塩基性アミノ酸残基を付加した、請求項１０〜１３のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１５】
さらに、芳香環を有するアミノ酸残基を付加した、請求項１４記載のペプチド。
【請求項１６】
配列番号８のアミノ酸配列からなる、請求項１５記載のペプチド。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載のペプチドとSin3のPAH1ドメインとが形成する複合体。
【請求項１８】
被験物質が、請求項１〜１６のいずれかに記載のペプチドとSin3のPAH1ドメインとの相互作用に影響を与えるか否かを測定することを含む、神経疾患の予防及び／又は治療に効果がある物質をスクリーニングする方法。
【請求項１９】
請求項１〜１６のいずれかに記載のペプチド又はそれに対する抗体を利用して、神経疾患を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経特異的遺伝子発現に必須なアミノ酸配列を含むペプチド及び複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子は、適切な時期に適切な場所において、適切な量だけ発現することによって、生体内で正常な細胞、組織そして器官が形成され、正しい機能が発揮されることになる。 例えば、神経の遺伝子は、神経細胞において正しく発現されなければならず、非神経細胞では発現が起こってはならない。 NRSE/RE1（neural restrictive silencer element/ repressor element 1）は21塩基対からなり、神経特異的遺伝子の近傍に存在し、神経伝達物質合成酵素、イオンチャネル、神経突起伸長関連分子など、約30種類以上の遺伝子の神経細胞特異的な転写制御の中核を担っているサイレンサーである。神経細胞では働かず、非神経細胞で神経特異的遺伝子の発現を抑えることで、神経細胞における神経特異的な遺伝子の発現を保障している。また、神経特異的遺伝子の発現制御に関与するだけでなく、神経細胞の最終分化にも関与していると考えられている。このNRSE/RE1に結合し、非神経細胞での神経特異的遺伝子の発現を抑える転写抑制因子として同定されたものが、神経選択的サイレンサー結合因子NRSF/RESTである。【０００３】
鳴瀬らによって、NRSF/RESTのN末端側転写抑制ドメインは、コリプレッサーmSin3を介してHDACをリクルートし、またC末端側のドメインではCoRESTを介してHDACをリクルートし、クロマチン構造を不活性化することで、転写を抑制することが示唆された（非特許文献１）。【０００４】
【非特許文献１】Naruse Y et al. :Proc.Natl Acad. Sci. USA, 96, 13691-13696 (1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在までにNRSF/RESTのN末端は、mSin3BのPAH1ドメインと相互作用することが本発明者らの研究室によって明らかとなっているが、具体的にN末端のどの残基が転写抑制に必要なのか分かっていない。【０００６】
そこで、本発明は、NRSF/RESTのmSin3Bとの相互作用領域を特定し、さらにNMRを用いた複合体の構造解析によって、原子レベルでの認識機構を明らかにすることを目的とする。【０００７】
また、同じくmSin3Bとの相互作用が知られている転写コリプレッサーN-CoRを用いた実験や、構造既知ながん抑制因子Mad1とmSin3のPAH2ドメインの複合体との構造比較から、転写抑制に関する新たな知見を得ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、NRSF/RESTの相互作用候補領域を数種作成し，各々15N標識されたmSin3BのPAH1水溶液に添加し、1H-15N HSQCを測定することにより、相互作用に必要な領域をおおまかに求めた。その後，NMRフィルター法によるタンパク質−タンパク質間のNOEの帰属結果から、mSin3Bとの相互作用に必要な領域を特定した。本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。【０００９】
本発明の要旨は以下の通りである。【００１０】
（１）  下記のアミノ酸配列：
Leu-Ile-Met-Leu-Ala-Asn-Val-Ala（配列番号１）    (I)
を含む、アミノ酸残基数８〜５０個のペプチド。【００１１】
（２）  配列(I)のN末端側にGln及び／又はC末端側にLeuをさらに含む、（１）記載のペプチド。【００１２】
（３）  配列(I)のN末端側にAla-Pro-Gln及び／又はC末端側にLeu-Thrをさらに含む、（１）記載のペプチド。【００１３】
（４）  Sin3のPAH1ドメインと結合することができる、（１）〜（３）のいずれかに記載のペプチド。【００１４】
（５）  神経選択的サイレンサー結合因子NRSF/RESTの特定の領域と同一のアミノ酸配列からなる、（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチド。【００１５】
（６）  配列番号３、４又は５のいずれかのアミノ酸配列からなる、（５）記載のペプチド。【００１６】
（７）  C末端側に塩基性アミノ酸残基を付加した、（１）〜（６）のいずれかに記載のペプチド。【００１７】
（８）  さらに、芳香環を有するアミノ酸残基を付加した、（７）記載のペプチド。【００１８】
（９）  配列番号８のアミノ酸配列からなる、（８）記載のペプチド。【００１９】
（１０）  下記のアミノ酸配列：
Φ1-X1-X2-Φ2-A1-X3-A2-Ala（配列番号２）    (II)
（配列(II)中、Φ1及びΦ2はそれぞれ独立にかさ高い疎水性アミノ酸残基であり、X1、X2及びX3はそれぞれ独立にPro以外の任意のアミノ酸残基であり、A1及びA2はそれぞれ独立にAla又はValである）
を含む、アミノ酸残基数８〜５０個のペプチド。【００２０】
（１１）  Sin3のPAH1ドメインと結合することができる、（１０）記載のペプチド。【００２１】
（１２）  神経選択的サイレンサー結合因子NRSF/REST又は転写コリプレッサーN-CoRの特定の領域と同一のアミノ酸配列からなる、（１０）又は（１１）に記載のペプチド。【００２２】
（１３）  配列番号３、４、５又は１０のアミノ酸配列からなる、（１２）記載のペプチド。【００２３】
（１４）  C末端側に塩基性アミノ酸残基を付加した、（１０）〜（１３）のいずれかに記載のペプチド。【００２４】
（１５）  さらに、芳香環を有するアミノ酸残基を付加した、（１４）記載のペプチド。【００２５】
（１６）  配列番号８のアミノ酸配列からなる、（１５）記載のペプチド。【００２６】
（１７）  （１）〜（１６）のいずれかに記載のペプチドとSin3のPAH1ドメインとが形成する複合体。
（１８）  被験物質が、（１）〜（１６）のいずれかに記載のペプチドとSin3のPAH1ドメインとの相互作用に影響を与えるか否かを測定することを含む、神経疾患の予防及び／又は治療に効果がある物質をスクリーニングする方法。
（１９）  （１）〜（１６）のいずれかに記載のペプチド又はそれに対する抗体を利用して、神経疾患を検出する方法。【００２７】
本明細書において、「サイレンサー」とは、遺伝子の転写を抑制するためのシスエレメントをいう。サイレンサーは、転写活性化能をもつエンハンサーと同様に、遺伝子本体との位置、距離、そして方向に無関係に働く。サイレンサーにサイレンサー結合因子が結合することによって、転写が抑制される。NRSE/RE1は、神経系で初めて明らかにされた細胞特異的発現制御に関わるサイレンサーである。【００２８】
「mSin3」とは、転写制御機構に関わる哺乳動物由来のスカフォールドタンパク質の一つである。Sin3は組織特異性がなく、広く発現し、酵母からヒトまで高度に保存されている。転写因子やコリプレッサー、メチル化CpG結合タンパク質といった、相互作用の相手が異なる4つのPAH（paired amphipathic helix）ドメインとHDAC相互作用ドメインを有している（Xie AY et al. : J Virol., 76, 11809-11818 (2002)）。PAH1ドメインは、４つのPAHドメインのうち最もN末端側にあるドメインで、転写コリプレッサーN-CoR等と相互作用することが知られている（Heinzel T et al. : Nature, 387, 43-48 (1997), Alland L et al. : Nature, 387, 49-55 (1997)）。本明細書において、「Sin3(又はmSin3)のPAH1ドメイン」という時には、天然由来の配列からなるペプチドのみならず、それに他の配列（例えば、大腸菌大量発現系でペプチドを製造する際に、精製を容易にするために付加する人工配列（例えば、Gly-Ser-His-Metなど）が付加したものも含まれるものとする。mSin3には、mSin3AとmSin3Bの2つのアイソフォームがある（Heinzel T et al. : Nature, 387, 43-48 (1997)）。【００２９】
「N-CoR」（nuclear receptor co-repressor）とは、約270kDaの転写コリプレッサーをいう。リガンドと結合していない状態の核内ホルモンレセプターは、N-CoRを介して、mSin3やHDACと複合体を形成し、転写を抑制している。相同性の高い関連因子にSMRTがある。【００３０】
「1H-15N HSQC」とは、共有結合した1Hと15Nの相関を示したスペクトルをいう。1H-15N HSQC により、ProとN末端を除いた主鎖アミドのNH（および一部の側鎖のNH）を観測することができる。1H-15N HSQC は、安定同位体標識されたタンパク質の立体構造決定や運動性の議論等を行う際、最も基本となるスペクトルである。相互作用解析にも有効な手段となり、近年創薬における薬物候補化合物のスクリーニングにも利用されている。【００３１】
後述の実施例においては、{1H}-15N のNOE を測定しているが、{1H}-15N のNOEの強度変化は、タンパク質内部の15N-1Hベクトルの運動を反映している。観測結果から主鎖のダイナミクスが分り、タンパク質中で運動性の高いランダムな領域なのか、それともある一定の構造を形成した領域なのかを判断することができる。NOEのある状態とない状態のピーク強度比を用いて評価し、内部運動の大きさに応じてその値は小さくなる。【００３２】
本明細書及び図面において、塩基及びアミノ酸を略語で表示する場合、IUPAC-IUB Commision on Biochemical Nomenclatureによる略語あるいは当分野における慣用略語に基づいて記載する。その例を以下に記載する。【００３３】
DNA：デオキシリボ核酸
A：アデニン
T：チミン
G：グアニン
C：シトシン
Ala又はA：アラニン
Val又はV：バリン
Leu又はL：ロイシン
Ile又はI：イソロイシン
Pro又はP：プロリン
Phe又はF：フェニルアラニン
Trp又はW：トリプトファン
Met又はM：メチオニン
Gly又はG：グリシン
Ser又はS：セリン
Thr又はT：トレオニン
Cys又はC：システイン
Gln又はQ：グルタミン
Asn又はN：アスパラギン
Tyr又はY：チロシン
Lys又はK：リシン
Arg又はR：アルギニン
His又はH：ヒスチジン
Asp又はD：アスパラギン酸
Glu又はE：グルタミン酸
特に断りのない限り、塩基配列は5’末端→3’末端の方向で記載し、アミノ酸配列はN末端→C末端の方向で記載する。
【発明の効果】
【００３４】
本発明により、神経の遺伝子発現に関わるタンパク質−タンパク質相互作用に必要なアミノ酸配列が見出された。神経選択的サイレンサー結合因子NRSF/RESTは、神経細胞では働かず、非神経細胞で神経特異的遺伝子の発現を抑えることで、逆に神経細胞における神経特異的な遺伝子の発現を保障している（図１）。この転写抑制機構には，NRSF/RESTとコリプレッサーmSin3との相互作用が関与している。本発明は，NRSF/REST の中でmSin3との相互作用に必要なアミノ酸配列を特定した。【００３５】
ダウン症、アルツハイマー病、ハンチントン病といった神経変性疾患や髄芽腫に、NRSF/RESTやNRSF/RESTがターゲットとする遺伝子の発現異常が関与している。【００３６】
ダウン症は、第21染色体が3本になったトリソミー変異により生ずる病気であるが、ダウン症で死亡した胎児と正常な胎児の神経組織で、遺伝子の違いを調べたところ、神経突起伸長関連分子SCG10をはじめ、NRSF/RESTのターゲット遺伝子の発現が大きく低下していた。一方、NRSF/REST以外の転写因子で制御されているタンパク質は正常に発現していた（Bahn S et al. : Lancet, 359, 310-315 (2002)）。【００３７】
アルツハイマー病は、βアミロイドおよび神経原繊維変化の蓄積と、神経細胞の脱落により生ずる病気であるが、アルツハイマー病脳において、SCG10の発現に変動が見られた（Okazaki T et al. :Neurobiol Aging, 16, 883-894 (1995)）。【００３８】
髄芽腫は最も悪性の小児の脳腫瘍であるが、髄芽腫細胞中では、NRSF/RESTの発現レベルが非常に高い。NRSF/RESTに拮抗し、NRSF/RESTのターゲット遺伝子を活性化する組み換えタンパク質REST-VP16は、神経の遺伝子の発現を促進し、さらにカスパーゼカスケードを活性化することにより、アポトーシスを誘導する。REST-VP16は治療薬になる可能性を秘めている（Lawinger P et al. :Nature Med., 7, 826-831 (2000)）。【００３９】
ハンチントン病は、舞踏運動，痴呆，性格変化を主症状とした進行性の神経変性疾患であるが、グルタミン残基の繰り返し構造を持つ異常なハンチンチン分子が、凝集体を形成することによって、神経細胞の変性をもたらすと考えられている。野生型のハンチンチンは細胞質中でNRSF/RESTと結合し、NRSF/RESTのNRSE/RE1への結合を制御している。一方、ハンチントン病では、このコントロールが失われ、神経の遺伝子の発現が十分に起こらない（Zuccato C et al. :Nature Genetics, 35, 76-83 (2003)）。【００４０】
NRSF/RESTは、神経細胞特異的な転写制御の中核を担っているため、上記以外の神経性疾患にも関わっている可能性がある。【００４１】
神経変性疾患にはまだ根本的な治療法が存在しない。治療法の確立している髄芽腫においても、腫瘍摘出手術後に全脳および全脊髄への放射線照射とともに化学療法を行なうため、患者に対する負担が大きい。【００４２】
ダウン症、アルツハイマー病、ハンチントン病といった神経変性疾患や髄芽腫には、現在のところNRSF/RESTのmSin3との相互作用部位をターゲットにした薬物はないため、新規な作用機序の薬物開発が期待できる。【００４３】
アルツハイマー病は、主原因と考えられているβアミロイドの生成を抑えたり、除去したりする薬の開発が行われているが、NRSF/RESTをターゲットにした薬剤を開発した場合、それらとは異なる作用機序で働くと考えられる、新たな治療法開発の可能性がある。髄芽腫では、NRSF/RESTのmSin3との相互作用部位をターゲットにした薬剤を開発することで、腫瘍摘出手術以外に治療法の選択肢が広がる可能性がある。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願（特願2004‐267770号）の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】神経細胞での神経特異的遺伝子の発現と非神経細胞での神経特異的遺伝子の発現抑制のモデル図。
【図２】15N-mSin3B PAH1単体とNRSF/REST38-57、NRSF/REST43-83、NRSF/REST39-55および NRSF/REST42-56存在下での1H-15N HSQC。
【図３】NRSF/REST42-56を添加した時のmSin3B PAH1の化学シフト変化。左からmSin3B PAH1:NRSF/REST=1:0、1:0.5、1:1、1:2。
【図４】複合体中のmSin3B PAH1の構造情報と{1H}-15N NOE。
【図５】N-CoRの滴定実験の重ね合わせのスペクトル。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
以下、本発明をより詳細に説明する。【００４６】
本願の第１発明は、下記のアミノ酸配列：
Leu-Ile-Met-Leu-Ala-Asn-Val-Ala（配列番号１）    (I)
を含む、アミノ酸残基数８〜５０個のペプチドを提供する。【００４７】
本願の第１発明のペプチドのアミノ酸残基数は、８〜５０個であるが、好ましくは１０〜４０個であり、より好ましくは１５〜３０個である。【００４８】
本願の第１発明のペプチドにおいて、配列(I)のN末端側にGln及び／又はC末端側にLeuをさらに含んでもよい。あるいは、配列(I)のN末端側にAla-Pro-Gln及び／又はC末端側にLeu-Thrをさらに含んでもよい。【００４９】
本願の第１発明のペプチドは、Sin3のPAH1ドメインと結合することができるものであるとよい。Sin3としては、真核生物（例えば、酵母、ショウジョウバエなど）哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウスなど）、両生類（例えば、アフリカツメガエルなど）に由来するものを例示することができる。Sin3のPAH1ドメインとしては、マウス由来mSin3Bの３１〜９８残基の領域（Spronk CA et al. : Nat. Struct. Biol., 7, 1100-1104 (2000)）、ヒト由来Sin3Bの３８〜１０５残基の領域（Spronk CA et al. : Nat. Struct. Biol., 7, 1100-1104 (2000)）、ヒト由来Sin3Aの１１４〜１８９残基の領域（Brubaker K et al. : Cell, 103, 655-665 (2000)）、マウス由来mSin3Aの１２０〜１８７残基の領域（Spronk CA et al. : Nat. Struct. Biol., 7, 1100-1104 (2000)）などが知られており、本願の第１発明のペプチドはこれらのうちのどれと結合することができるものであってもよい。Sin3のPAH1ドメインは、天然由来の配列からなるペプチドであっても、それに他の配列（例えば、大腸菌大量発現系でペプチドを製造する際に、精製を容易にするために付加する人工配列（例えば、Gly-Ser-His-Metなど）が付加したものであってもよい。【００５０】
配列(I)は、mSin3のPAH1ドメインと結合することができるNRSF/RESTの相互作用領域に見出される共通配列である。例えば、配列(I)は、ヒトのNRSF/RESTの46-53残基の領域に見出される。【００５１】
本願の第１発明のペプチドは、神経選択的サイレンサー結合因子NRSF/RESTの特定の領域（例えば、Sin3のPAH1ドメインと相互作用するアミノ酸残基を含む領域など）と同一のアミノ酸配列からなるものであってもよい。例えば、配列番号３、４及び５のアミノ酸配列からなるペプチドは、それぞれ、ヒトのNRSF/RESTの43-83残基、39-55残基及び38-57残基の領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなる。【００５２】
本願の第１発明のペプチドは、C末端側に塩基性アミノ酸残基を付加したものであってもよい。これにより、ペプチドの溶解性を改善することができる。さらに、芳香環を有するアミノ酸残基を付加してもよい。これにより、UVによる濃度の定量を行うことができるようになる。【００５３】
神経選択的サイレンサー結合因子NRSF/RESTの特定の領域（42-56残基の領域）のC末端側に塩基性アミノ酸残基（Lys-Lys-Lys-Lys）を付加し、さらに、芳香環を有するアミノ酸残基(Trp)を付加したペプチドのアミノ酸配列の一例を配列番号８に示す。【００５４】
本願の第２発明は、下記のアミノ酸配列：
Φ1-X1-X2-Φ2-A1-X3-A2-Ala（配列番号２）    (II)
（配列(II)中、Φ1及びΦ2はそれぞれ独立にかさ高い疎水性アミノ酸残基であり、X1、X2及びX3はそれぞれ独立にPro以外の任意のアミノ酸残基であり、A1及びA2はそれぞれ独立にAla又はValである）
を含む、アミノ酸残基数８〜５０個のペプチドを提供する。【００５５】
Φ1及びΦ2の「かさ高い疎水性アミノ酸残基」としては、Leu、Ile、Val、Met、Phe、Trp、Tyrを例示することができる。このうち、Leu、Ileが好ましい。【００５６】
X1、X2及びX3のアミノ酸残基としては、Ala、Met、Leu、Val、Ile、Phe、Trp、Glu、Asp、Arg、Lys、His、Gln、Asn、Ser、Thrを例示することができる。このうち、Ala、Met、Ile、Asp、Asnが好ましい。【００５７】
本願の第２発明のペプチドは、Sin3のPAH1ドメインと結合することができるものであるとよい。Sin3としては、真核生物（例えば、酵母、ショウジョウバエなど）哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウスなど）、両生類（例えば、アフリカツメガエルなど）に由来するものを例示することができる。Sin3のPAH1ドメインとしては、マウス由来mSin3Bの３１〜９８残基の領域（Spronk CA et al. : Nat. Struct. Biol., 7, 1100-1104 (2000)）、ヒト由来Sin3Bの３８〜１０５残基の領域（Spronk CA et al. : Nat. Struct. Biol., 7, 1100-1104 (2000)）、ヒト由来Sin3Aの１１４〜１８９残基の領域（Brubaker K et al. : Cell, 103, 655-665 (2000)）、マウス由来mSin3Aの１２０〜１８７残基の領域（Spronk CA et al. : Nat. Struct. Biol., 7, 1100-1104 (2000)）などが知られており、本願の第２発明のペプチドはこれらのうちのどれと結合することができるものであってもよい。Sin3のPAH1ドメインは、天然由来の配列からなるペプチドであっても、それに他の配列（例えば、大腸菌大量発現系でペプチドを製造する際に、精製を容易にするために付加する人工配列（例えば、Gly-Ser-His-Metなど）が付加したものであってもよい。【００５８】
配列(II)は、mSin3のPAH1ドメインと結合することができるNRSF/RESTの相互作用領域及びN-CoRの相互作用領域に見出されるコンセンサス配列である。例えば、配列(II)は、ヒトのNRSF/RESTの46-53残基の領域、ヒトのN-CoRの1837-1844残基の領域に見出される。【００５９】
本願の第２発明のペプチドは、C末端側に塩基性アミノ酸残基を付加したものであってもよい。これにより、ペプチドの溶解性を改善することができる。さらに、芳香環を有するアミノ酸残基を付加してもよい。これにより、UVによる濃度の定量を行うことができるようになる。【００６０】
神経選択的サイレンサー結合因子NRSF/RESTの特定の領域（42-56残基の領域）のC末端側に塩基性アミノ酸残基（Lys-Lys-Lys-Lys）を付加し、さらに、芳香環を有するアミノ酸残基(Trp)を付加したペプチドのアミノ酸配列の一例を配列番号８に示す。【００６１】
本願の第２発明のペプチドは、神経選択的サイレンサー結合因子NRSF/REST又は転写コリプレッサーN-CoRの特定の領域（例えば、Sin3のPAH1ドメインと相互作用するアミノ酸残基を含む領域など）と同一のアミノ酸配列からなるものであってもよい。例えば、配列番号３、４及び５のアミノ酸配列からなるペプチドは、それぞれ、ヒトのNRSF/RESTの43-83残基、39-55残基及び38-57残基の領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなる。また、配列番号１０のアミノ酸配列からなるペプチドは、ヒトの転写コリプレッサーN-CoRの1834-1847残基の領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなる。【００６２】
本願の第１発明及び第２発明のペプチドは、公知の方法で製造することができる。例えば、市販のペプチド合成機を用いて製造することができるし、慣用の遺伝子組換え手法により製造することもできる。【００６３】
本願の第１発明及び第２発明のペプチドを構成するアミノ酸は、D体、L体、DL体のいずれであってもよいが、天然に存在するアミノ酸はL体であることから、L体が好ましい。【００６４】
本願の第１発明及び第２発明のペプチドは、NRSF/RESTのSin3との相互作用部位をターゲットにした神経性疾患薬剤の開発に利用することができる。例えば、様々な神経変性疾患において、NRSF/RESTやNRSF/RESTがターゲットとする遺伝子の発現異常が見られるが、これらの遺伝子の発現を制御する薬物候補化合物のスクリーニングに利用することができる。【００６５】
本願の第３発明は、本願の第１発明又は第２発明のペプチドとSin3のPAH1ドメインとが形成する複合体を提供する。【００６６】
本願の第１発明及び第２発明のペプチド、並びにSin3のPAH1ドメインは上述した通りである。【００６７】
Sin3のPAH1ドメインは、慣用の遺伝子組換えの手法により製造することができる。マウス由来のmSin3BのPAH1ドメインの塩基配列は、配列番号１５の７番目〜２４６番目の塩基からなる配列である。マウス由来のmSin3BのPAH1ドメインのアミノ酸配列は配列番号１６に示される。【００６８】
本願の第３発明の複合体は、室温で、本願の第１発明又は第２発明のペプチドをSin3のPAH1ドメイン水溶液に添加することにより製造することができる。本願の第１発明又は第２発明のペプチドとSin3のPAH1ドメインとのモル比は約１：１とするとよい。また、Sin3のPAH1ドメイン水溶液濃度は、0.1mM〜2mMとするとよい。複合体の形成はNMRで確認することができる。【００６９】
本願の第３発明の複合体は、NRSF/RESTのSin3との相互作用部位をターゲットにした神経性疾患薬剤の開発に利用することができる。例えば、様々な神経変性疾患において、NRSF/RESTやNRSF/RESTがターゲットとする遺伝子の発現異常が見られるが、これらの遺伝子の発現を制御する薬物候補化合物のスクリーニングに利用することができる。
本願の第４発明は、被験物質が、本願の第１発明又は第２発明のペプチドとSin3のPAH1ドメインとの相互作用に影響を与えるか否かを測定することを含む、神経疾患の予防及び／又は治療に効果がある物質をスクリーニングする方法を提供する。
被験物質は、いかなる物質であってもよく、タンパク質、ペプチド、多糖、オリゴ糖、単糖、低分子化合物、核酸（DNA、RNA、オリゴヌクレオチド、モノヌクレオチド等）などを例示することができる。
本願の第１発明又は第２発明のペプチドとSin3のPAH1ドメインとの相互作用に影響を与えるか否かを測定する方法の一例を以下に説明する。まず、被験物質の存在下又は不存在下で、本願の第１発明又は第２発明のペプチドとSin3のPAH1ドメインとの相互作用を測定する。本願の第１発明又は第２発明のペプチドとSin3のPAH1ドメインとの相互作用は、Ｘ線結晶構造解析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、中性子回折などによる原子レベルでの立体構造解析や電子顕微鏡、原子間力顕微鏡などによる複合体の形状を観察する方法、本願の第１発明又は第２発明のペプチドの立体構造及びSin3のPAH1ドメインの立体構造に対する任意の構造の被験物質との安定な結合様式をコンピュータでシミュレートするドッキングスタディなどの手法を用いることができる。次に、被験物質の存在下における本願の第１発明又は第２発明のペプチドとSin3のPAH1ドメインとの相互作用と、被験物質の不存在下における本願の第１発明又は第２発明のペプチドとSin3のPAH1ドメインとの相互作用とを比較する。前者の相互作用と後者の相互作用に有意差が見られた場合、被験物質は神経疾患の予防及び／又は治療に効果がある物質であると判定することができる。被験物質は、本願の第１発明又は第２発明のペプチドとSin3のPAH1ドメインとの相互作用を強めるかもしれないし、弱めるかもしれない。神経疾患としては、NRSF/RESTが関与する疾患を挙げることができ、具体的には、ダウン症、アルツハイマー病、ハンチントン病などの神経変性疾患、髄芽腫などを挙げることができる。
本願の第５発明は、本願の第１発明若しくは第２発明のペプチド又はそれに対する抗体を利用して、神経疾患を検出する方法を提供する。
例えば、本願の第１発明又は第２発明のペプチドを用いて、被験者から採取した生検試料におけるSin3若しくはSin3のPAH1ドメインの発現を調べることにより、神経疾患を検出することができる。あるいはまた、本願の第１発明又は第２発明のペプチドに対する抗体を用いて、被験者から採取した生検試料におけるNRSF/RESTの発現を調べることにより、神経疾患を検出することができる。
被験者から採取する生検試料としては、神経組織、神経以外の組織、羊水、血液、髄液などを挙げることができる。
神経選択的サイレンサー結合因子NRSF/RESTは、神経細胞特異的な遺伝子の転写制御の中核を担っているNRSE/RE1に結合する、転写制御因子である。様々な神経変性疾患において，NRSF/RESTやNRSF/RESTがターゲットとする遺伝子の発現異常が見られる（上述）。
本願の第１発明又は第２発明のペプチドを用いて、被験者から採取した生検試料におけるSin3若しくはSin3のPAH1ドメインの発現を調べる場合には、色素、放射性元素、酵素などでペプチドを標識するとよい。例えば、ビオチン標識したペプチドを市販のストレプトアビジンを固定したカラムに添加し、ビオチン−アビジン相互作用を利用して、ペプチドをカラムに固定化する。次に神経組織の抽出液をそのカラムに添加し、Sin3をカラムに吸着させる。6 M 塩酸グアニジンによる変性処理を行った後、Sin3の発現量を調べる。発現量に正常値と比べて有意差がある場合は、ダウン症やアルツハイマー病などの神経変性疾患の疑いがある。
本願の第１発明又は第２発明のペプチドに対する抗体を用いて、被験者から採取した生検試料におけるNRSF/RESTの発現を調べる場合には、ウェスタンブロット法、免疫組織化学分析法、ELISA法などの手法を用いるとよい。使用する抗体は、測定の対象となるタンパク質を特異的に認識する抗体であるとよい。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれであってもよい。これらの抗体は公知の方法で製造することができる。
ウェスタンブロット法で測定する場合には、抗体は、125I標識プロテインＡ、ペルオキシダーゼ結合IgGなどを用いて二次的に検出される。免疫組織化学分析法で測定する場合には、抗体は、蛍光色素、フェリチン、酵素などで標識するとよい。ELISA法で測定する場合には、抗体は、ペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼなどの酵素で標識するとよい。
例えば、髄液におけるNRSF/RESTの発現レベルが高ければ、髄芽腫であると判定してもよい。また、神経細胞核内におけるNRSF/RESTの発現レベルが高ければ、ハンチントン病などの神経疾患の疑いがある。
【実施例】
【００７０】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。【００７１】
〔実施例１〕
『実験方法』
1） 試料調製
a） NRSF/REST(a.a.43-83)及びmSin3BのPAH1ドメイン(a.a.28-107)の調製
公表されている配列データをもとにRT-PCR法によってNRSF/REST及びmSin3BのcDNAを得た（Naruse Y et al. :Proc.Natl Acad. Sci. USA, 96, 13691-13696 (1999)）。得られたcDNAをインビトロジェン（株）社製TAクローニングベクターにサブクローニングした。次にアマシャムバイオサイエンス（株）社製GST融合タンパク質発現用ベクター （pGEX-2T）のBamHI-EcoRIサイトにNRSF/REST(a.a.43-83)のフラグメントを挿入し、大腸菌BL21(DE3)株（Novagen 社製）に形質転換した。同様にNovagen 社製Hisタグタンパク質発現用ベクター（pET-28a）のNdeI-BamHIサイトにmSin3BのPAH1ドメイン(a.a.28-107) のフラグメントを挿入し、大腸菌BL21(DE3)株に形質転換した。液体培地中、37℃で培養し、和光純薬工業（株）社製isopropyl-β-D-thiogalactopyranosideにより発現誘導を行った。集菌、菌体破砕処理後、破砕上清に対して順に、アフィニティクロマトグラフィー、トロンビンによるGST及びHisタグ切断、ゲルろ過クロマトグラフィーの各処理を行い、目的試料を得た。試料の同定にはブルカー・ダルトニクス社製質量分析装置BIFLEXまたはAutoFLEXを用いた。NRSF/REST(a.a.43-83)の分子量は4511、mSin3BのPAH1ドメイン(a.a.28-107)の分子量は9585であり、相当するm/zにより確認を行った。また、大腸菌を15NH4Clを唯一の窒素源、13C‐グルコースを唯一の炭素源とするM9最小培地で培養することにより、mSin3BのPAH1ドメイン(a.a.28-107)の13C/15Nもしくは15N標識体を得た。多核多次元NMR法によって矛盾無く帰属が行えることからmSin3BのPAH1ドメイン(a.a.28-107)の確認ができた。【００７２】
pGEX-2TのBamHI-EcoRIサイトに挿入したNRSF/REST(a.a.43-83)のフラグメントのDNA配列を配列番号１４に示す。配列番号１４の１番目〜６番目の塩基からなる配列(GGATCC)はBamHIサイトであり、７番目〜１２９番目の塩基からなる配列はNRSF/REST(a.a.43-83)のDNA配列であり、１３１番目〜１３６番目の塩基からなる配列(GAATTC)はEcoRIサイトである。NRSF/REST(a.a.43-83)のアミノ酸配列は配列番号３に示す。【００７３】
pET-28aのNdeI-BamHIサイトに挿入したmSin3BのPAH1ドメイン(a.a.28-107) のフラグメントのDNA配列を配列番号１５に示す。配列番号１５の１番目〜６番目の塩基からなる配列(CATATG)はNdeIサイトであり、７番目〜２４６番目の塩基からなる配列はmSin3BのPAH1ドメイン(a.a.28-107) のDNA配列であり、２５０番目〜２５５番目の塩基からなる配列(GGATCC)はBamHIサイトである。mSin3BのPAH1ドメイン(a.a.28-107) のアミノ酸配列は配列番号１６に示す。【００７４】
b） 合成ペプチドの調製
NRSF/REST(a.a.39-55)、NRSF/REST(a.a.64-80)、NRSF/REST(a.a.38-57)、NRSF/REST(a.a.68-83)、NRSF/REST(a.a.42-56)およびN-CoR (a.a.1829 -1847)は、常法のペプチド合成法で合成し、精製した。試料の同定にはアプライドバイオシステムズ社製Voyager-DEまたはブルカー・ダルトニクス社製質量分析装置BIFLEXまたはAutoFLEXを用いた。NRSF/REST(a.a.39-55)、NRSF/REST(a.a.64-80)、NRSF/REST(a.a.38-57)、NRSF/REST(a.a.68-83)、NRSF/REST(a.a.42-56)およびN-CoR (a.a.1829 -1847)の分子量は順に、1739、1937、2053、1790、2182、1835であり、相当するm/zにより確認を行った。【００７５】
NRSF/REST(a.a.39-55)、NRSF/REST(a.a.64-80)、NRSF/REST(a.a.38-57)、NRSF/REST(a.a.68-83)、NRSF/REST(a.a.42-56)およびN-CoR (a.a.1829 -1847)のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号４、６、５、７、８および１７に示す。【００７６】
2) 相互作用実験
NRSF/RESTの相互作用候補領域（a.a.43-83、39-55、38-57、64-80、68-83）を各々15N標識されたmSin3BのPAH1水溶液に添加し、1H-15N HSQCを測定することにより、相互作用に必要な領域を求めた。結合比を調べるため、リン酸緩衝液中(pH 6.6)で15N標識されたmSin3BのPAH1ドメインにNRSF/REST (a.a.42-56)を濃度を変えて加え、 1H-15N HSQCによりシグナルの変化を観測した。なお、NRSF/REST(a.a.42-56)は難溶性であるため、C末端側に塩基性残基(KKKK)を付加して溶解性を改善し、更にUVによる濃度の定量を行うために芳香環を有する残基(W)を付ける工夫をした。同様に15N標識されたmSin3BのPAH1ドメインとN-CoR (a.a.1829-1847)との相互作用を1H-15N HSQCにより観測した。NMR測定には全てブルカー社製Avance 700を用いた。【００７７】
NRSF/REST(a.a.42-56)のC末端にKKKK及びWを付加したアミノ酸配列を配列番号８に示す。【００７８】
3) 複合体の構造解析
多核多次元NMR法により、20mMリン酸緩衝液中(pH 7.5)、温度293KでmSin3BのPAH1ドメインとNRSF/REST(a.a.38-57)の構造解析を行った。mSin3BのPAH1ドメインの化学シフト値とランダムコイルの化学シフト値から化学シフトインデックスを作成し、二次構造の傾向を予測した。また、{1H}-15N NOEを測定し、分子内運動から構造に関する情報を得た。【００７９】
『実験結果』
1) NRSF/RESTのmSin3BのPAH1ドメインとの相互作用領域の特定
表１で下線を引いた残基を有する試料は、1H-15N HSQC測定において図2右に示すような複合体のスペクトルを与えた。【００８０】
表1．相互作用実験に用いた配列【００８１】
【表１】
2006030722.tif 000002
【００８２】
2) NRSF/REST(a.a.42-56)の滴定実験
0.1mMの15N標識されたmSin3BのPAH1ドメインに対して、NRSF/REST (a.a.42-56)をモル比で1:0、1:0.5、1:1、1:2になるように添加した時の1H-15N HSQCを測定し、そのスペクトルの一部を図3に示した。NRSF/RESTの濃度が増えるに従って、mSin3B単体のシグナルは消失し、複合体中のmSin3B由来の新たなシグナルが現れた。NMRのタイムスケールに対して遅い交換過程であることが示された。また、mSin3B PAH1:NRSF/REST が1:1の場合と1:2の場合では、差は認められなかった。よって、mSin3BのPAH1ドメインとNRSF/RESTは1:1で複合体を形成することが示された。【００８３】
3) 複合体中のmSin3BのPAH1ドメインの二次構造
図４にスピン−スピン結合定数3JHNHα、隣接残基間および中位の1H-1H NOE、化学シフトインデックス、{1H}-15N NOE、予測された二次構造の結果を示した。PAH1ドメインは4本のαへリックスから構成され、更に{1H}-15N NOE より、C末端側に運動性の低い領域があることが示された。【００８４】
4) コリプレッサーN-CoRとmSin3BのPAH1ドメインの相互作用実験
0.1mMの15N標識されたmSin3BのPAH1ドメインに対して、N-CoRをモル比で1:0、1:0.2、1:0.4、1:0.6、1:0.8、1:1、1:2、1:3になるように添加した時の1H-15N HSQCを測定し、それらの重ね合わせのスペクトルの一部を図5に示した。N-CoRの濃度変化に従って、シグナルの位置がシフトし、NMRのタイムスケールに対して速い交換過程であることが示された。【００８５】
『討論』
NRSF/REST 43-55残基を含む試料は、mSin3BのPAH1ドメインとNMRによる構造解析可能な１：１の安定な複合体を形成することが分かった。また、N-CoR(a.a.1829-1847)はNRSF/RESTよりも弱いながら、PAH1ドメインと相互作用することが判明した。これらの配列およびコンセンサス配列と、Mad1とmSin3のPAH2ドメインの複合体の立体構造を基にVuisterらのグループ(a)とRadhakrishnanらのグループ(b)が提唱している（van Ingen H et al. : Biochemistry, 43, 46-54 (2004)、Swanson KA et al. : Nat. Struct. Mol. Biol., 11, 738-746 (2004)）、PAH2ドメインに結合するSID (Sin3-interaction domain)のコンセンサス配列を表2に示した。Φはかさ高い疎水性残基、Xはプロリン以外の任意の残基を表す。PAH1ドメインに結合するSIDと、PAH2ドメインに結合するSIDは共に特徴的な疎水性アミノ酸から構成されており、類似している。しかし、mSin3BのPAH2ドメインに結合するSIDの配列において、2番目のΦがPAH1ドメインの場合ではA/Vになっており、またPAH1ドメインのC末端側にはΦが無い、という違いがある。【００８６】
表2．mSin3に結合するSIDのコンセンサス配列【００８７】
【表２】
2006030722.tif 000003
【００８８】
NRSF/REST (a.a.43-56)、N-CoR (a.a.1834-1847)、mSin3B PAH1に結合するSID、Mad1 (a.a.6-21)、mSin3B PAH2に結合するSID a)及びmSin3A PAH2に結合するSID b)のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号９、１０、２、１１、１２及び１３に示す。【００８９】
PAH1ドメインは4本のαへリックスから構成されていることが示され、またPAH2ドメインも4本のαへリックスから構成されていることが示されている（van Ingen H et al. : Biochemistry, 43, 46-54 (2004)、Swanson KA et al. : Nat. Struct. Mol. Biol., 11, 738-746 (2004)）。PAH1と2のアミノ酸配列の相同性も非常に高いが、PAH2ドメインにあるへリックス2と3の間のフレキシブルなループはPAH1ドメインにはなく、またPAH1ドメインのC末端には固定されたループ領域が存在することが示された。【００９０】
以上のようにmSin3の各PAHドメインに、選択性の違いや、親和性の違いといった相互作用のバリエーションをもたせることによって、様々なDNA結合性転写制御因子やコリプレッサーと結合し、状況に応じた転写抑制を行うことができるのであろう。【００９１】
『まとめ』
1) NRSF/REST (a.a.38-57)とmSin3BのPAH1ドメインは、1:1で複合体を形成することを確認した。【００９２】
2) 複合体の構造解析から、mSin3BのPAH1ドメインは4つのαへリックスから構成されていることと、C末端にPAH2ドメインにはない、固定されたループ領域が存在することを示した。【００９３】
3) mSin3BのPAH1ドメインに結合するSIDのコンセンサス配列を提示した。PAH1ドメインのSIDはPAH2ドメインのSIDと認識配列が異なっていることが分かった。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明のペプチド及び複合体は、NRSF/RESTのSin3との相互作用部位をターゲットにした神経性疾患薬剤の開発に利用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００９５】
＜配列番号１＞
配列番号１は、NRSF/RESTにおける、mSin3との相互作用に必要なアミノ酸配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、NRSF/REST及びN-CoRにおける、mSin3との相互作用に必要な共通のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、NRSF/RESTの43-83残基のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号４＞
配列番号４は、NRSF/RESTの39-55残基のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号５＞
配列番号５は、NRSF/RESTの38-57残基のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号６＞
配列番号６は、NRSF/RESTの64-80残基のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号７＞
配列番号７は、NRSF/RESTの68-83残基のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号８＞
配列番号８は、NRSF/RESTの42-56残基のC末端側にLys-Lys-Lys-LysとTrpを付加したアミノ酸配列を示す。
＜配列番号９＞
配列番号９は、NRSF/RESTの43-56残基のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１０＞
配列番号１０は、N-CoRの1834-1847残基のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１１＞
配列番号１１は、Mad1の6-21残基のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１２＞
配列番号１２は、mSin3BのPAH2ドメインに結合するSIDのコンセンサス配列を示す。
＜配列番号１３＞
配列番号１３は、mSin3AのPAH2ドメインに結合するSIDのコンセンサス配列を示す。
＜配列番号１４＞
配列番号１４は、pGEX-2TのBamHI-EcoRIサイトに挿入したNRSF/REST(a.a.43-83)のフラグメントのDNA配列を示す。
＜配列番号１５＞
配列番号１５は、pET-28aのNdeI-BamHIサイトに挿入したmSin3BのPAH1ドメイン(a.a.28-107) のフラグメントのDNA配列を示す。
＜配列番号１６＞
配列番号１６は、mSin3BのPAH1ドメイン(a.a.28-107)のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１７＞
配列番号１７は、N-CoRの1829-1847残基のアミノ酸配列を示す。
【図１】
2006030722.tif 000004
【図２】
2006030722.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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