(57)【要約】  本発明のＡＧＥ−２アプタマーは、グリセルアルデヒド由来終末糖化産物（ＡＧＥ−２）に結合するがヒト血清アルブミンには結合せず、少なくとも３５塩基からなり、そして該塩基中のシトシン含有率が少なくとも３５％であるか、または該塩基中のグアニン含有率が少なくとも３２％である。本発明のＡＧＥ−２アプタマーは、ＡＧＥ−２を検出するために使用できるので、ＡＧＥ−２が関与する疾患、例えば、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害などの糖尿病合併症、アルツハイマー病などの神経変性疾患、悪性腫瘍の増殖、転移、浸潤などの検出薬・診断薬および予防・治療剤として利用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリセルアルデヒド由来終末糖化産物（ＡＧＥ−２）に結合するがヒト血清アルブミンには結合しないアプタマーであって、該アプタマーが、少なくとも３５塩基からなり、そして該塩基中のシトシン含有率が少なくとも３５％であるか、または該塩基中のグアニン含有率が少なくとも３２％である、アプタマー。
【請求項２】
前記アプタマーが、一本鎖ＤＮＡである、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項３】
前記アプタマーが少なくとも５０塩基かつ多くとも１２０塩基からなる、請求項１または２に記載のアプタマー。
【請求項４】
前記塩基中のシトシン含有率が少なくとも４０％である、請求項１から３のいずれかの項に記載のアプタマー。
【請求項５】
前記塩基中のシトシン含有率が少なくとも５０％である、請求項４に記載のアプタマー。
【請求項６】
前記塩基中のグアニン含有率が少なくとも３５％である、請求項１から３のいずれかの項に記載のアプタマー。
【請求項７】
前記塩基中のグアニン含有率が少なくとも４０％である、請求項６に記載のアプタマー。
【請求項８】
前記一本鎖ＤＮＡが、配列表の配列番号１から２４のいずれかに記載の塩基配列を含む、請求項２に記載のアプタマー。
【請求項９】
前記一本鎖ＤＮＡが、配列表の配列番号２５から４１のいずれかに記載の塩基配列を含む、請求項２に記載のアプタマー。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかの項に記載のアプタマーを含む、ＡＧＥ−２検出試薬。
【請求項１１】
請求項１０に記載のＡＧＥ−２検出試薬を含む、ＡＧＥ−２検出キット。
【請求項１２】
請求項１から９のいずれかの項に記載のアプタマーを含む、ＡＧＥ−２が関与する疾患の診断試薬。
【請求項１３】
前記ＡＧＥ−２が関与する疾患が糖尿病合併症である、請求項１２に記載の試薬。
【請求項１４】
請求項１２に記載の試薬を含む、ＡＧＥ−２が関与する疾患の診断用キット。
【請求項１５】
前記ＡＧＥ−２が関与する疾患が糖尿病合併症である、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
請求項１から９のいずれかの項に記載のアプタマーを含む、抗ＡＧＥ−２剤。
【請求項１７】
請求項１から９のいずれかの項に記載のアプタマーを含む、ＡＧＥ−２が関与する疾患の予防または治療のための薬剤。
【請求項１８】
前記ＡＧＥ−２が関与する疾患が糖尿病合併症である、請求項１７に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリセルアルデヒド由来終末糖化産物（ＡＧＥ−２）アプタマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＧＥｓ（終末糖化産物）は、グルコースなどの還元糖とタンパク質との間の非酵素的糖化反応により生成する構造体の総称である。ＡＧＥｓは、老化や糖尿病に伴って中枢神経などに蓄積し、あるいは神経・感覚器障害や腎症などの糖尿病による合併症の原因と考えられている。最近では、アルツハイマー病などの神経変性疾患、悪性腫瘍の増殖、転移、浸潤などにも関与することが明らかになっている。
ＡＧＥｓは、グルコースだけではなく、グルコースの自動酸化および分解産物などの種々の糖から生成される。このうち、グリセルアルデヒド由来のＡＧＥであるＡＧＥ−２（図１を参照のこと）は、ＡＧＥレセプター（ＲＡＧＥ）との結合能力が高く、このＲＡＧＥを介して、糖尿病性網膜症や糖尿病性腎症などの糖尿病血管合併症の発症や進展に強く関与していることが知られている（Ｙａｍａｇｉｓｈｉ  Ｓ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００２年，２９０巻，９７３−９７８頁およびＯｋａｍｏｔｏ  Ｔ．ら，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，２００２年，１６巻，１９２８−１９３０頁）。しかし、その診断法や阻害剤は未だほとんど開発されていない。
ＡＧＥｓの測定方法については、これまでに種々検討されている。最も簡単には、ＡＧＥｓが、黄褐色であり蛍光を発するので、その蛍光を測定する方法がある。しかし、ＡＧＥｓに対する特異性や感度が低いため、特に生体試料に対しては適切ではない。特定の構造のＡＧＥｓについては、ＨＰＬＣ法、ＧＣ／ＭＳ法、ＬＣ／ＭＳ法などを用いて定量することができるが、時間がかかり、例えば、診断におけるような、多数の試料の分析には適していない。
現在のところ、ＡＧＥｓのうちで構造が明らかであるカルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）を認識する抗体（抗ＣＭＬ抗体）を用いる免疫学的測定方法が主として行われている。しかし、感度が低く、しかも抗体自体が高価である。さらに、ＣＭＬが生体内では糖化反応ではなく脂質の過酸化によって生じること、およびＣＭＬが酸化ストレスのマーカーと考えられるようになってきたことから、抗ＣＭＬ抗体を抗ＡＧＥｓ抗体として用いることには問題がある。このように、ＡＧＥｓ全体を認識する抗体は、現在のところ得られていない。
近年、一本鎖ＤＮＡや一本鎖ＲＮＡが種々の立体構造をとり、低分子からタンパク質までの種々の化合物を認識して結合して、抗体のような機能を有し得ることが明らかになっている（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  Ａ．Ｄ．およびＳｚｏｓｔａｋ  Ｊ．Ｗ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９０年，３４６巻，８１８−８２２頁およびＴｕｅｒｋ  Ｃ．およびＧｏｌｄ  Ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０年，２４９巻，５０５−５１０頁）。このような分子をアプタマーと称する。アプタマーは、ランダム配列の中からＳＥＬＥＸという選別方法によって得られ得る（Ｔｕｅｒｋ  Ｃ．ら、前出）。
アプタマーは、試験管内で大量に合成できること、抗体よりも結合力が強いものが得られる可能性があること、安定化できることなどの利点を有する。そのため、抗体と同様に、研究、検出、医療などに応用され得る。医療などへの応用が検討されている例としては、ＨＩＶ−１逆転写酵素に対するＲＮＡアプタマー（Ｋｅｎｓｃｈ  Ｏ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００年，２７５巻，１８２７１−１８２７８頁）、補体Ｃ５に対するＲＮＡアプタマー（Ｂｉｅｓｅｃｋｅｒ  Ｇ．ら，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍ．，１９９９年，４２巻，２１９−２３０頁）、ＣＭＶ感染を防止するＲＮＡアプタマー（Ｗａｎｇ  Ｊ．ら，ＲＮＡ，２０００年，６巻，５７１−５８３頁）、老人性黄斑変性症の治療薬として開発中の血管内皮細胞増殖因子に対するＲＮＡアプタマー（Ｒｕｃｋｍａｎ  Ｊ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８８年，２７３巻，２０５５６−２０５６７頁）、糸球体間質増殖性糸球体腎炎モデルラットに静脈内注射すると症状が緩和される血小板由来増殖因子に対するアプタマー（Ｆｌｏｅｇｅ  Ｊ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．，１９９９年，１５４巻，１６９−１７９頁）、ショウジョウバエＢ５２タンパク質の過剰発現による異常を正常に戻すＲＮＡアプタマー（Ｓｈｉ  Ｈ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９９年，９６巻，１００３３−１００３８頁）などが報告されている。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、ＡＧＥ−２に特異的に結合し得るアプタマーを提供することを目的とする。
本発明は、グリセルアルデヒド由来終末糖化産物（ＡＧＥ−２）に結合するがヒト血清アルブミンには結合しないアプタマーを提供し、該アプタマーが、少なくとも３５塩基からなり、そして該塩基中のシトシン含有率が少なくとも３５％であるか、または該塩基中のグアニン含有率が少なくとも３２％である。
１つの実施態様では、上記アプタマーは、一本鎖ＤＮＡである。
他の実施態様では、上記アプタマーは、少なくとも５０塩基かつ多くとも１２０塩基からなる。
さらに他の実施態様では、上記塩基中のシトシン含有率は、少なくとも４０％である。
さらに他の実施態様では、上記塩基中のシトシン含有率は、少なくとも５０％である。
さらに他の実施態様では、上記塩基中のグアニン含有率は、少なくとも３５％である。
さらに他の実施態様では、上記塩基中のグアニン含有率は、少なくとも４０％である。
なおさらに他の実施態様では、上記一本鎖ＤＮＡは、配列表の配列番号１から２４のいずれかに記載の塩基配列を含む。
なおさらに他の実施態様では、上記一本鎖ＤＮＡは、配列表の配列番号２５から４１のいずれかに記載の塩基配列を含む。
本発明はまた、上記のいずれかのアプタマーを含む、ＡＧＥ−２検出試薬を提供する。
本発明はさらに、上記のＡＧＥ−２検出試薬を含む、ＡＧＥ−２検出キットを提供する。
本発明はまた、上記のいずれかのアプタマーを含む、ＡＧＥ−２が関与する疾患の診断試薬を提供する。
本発明はさらに、上記の試薬を含む、ＡＧＥ−２が関与する疾患の診断用キットを提供する。
本発明はまた、上記のいずれかのアプタマーを含む、抗ＡＧＥ−２剤を提供する。
本発明はまた、上記のいずれかのアプタマーを含む、ＡＧＥ−２が関与する疾患の予防または治療のための薬剤を提供する。
１つの実施態様では、上記ＡＧＥ−２が関与する疾患は、糖尿病合併症である。
本発明によれば、ＡＧＥ−２に特異的に結合するＡＧＥ−２アプタマーが提供される。このＡＧＥ−２アプタマーを用いれば、ＡＧＥ−２の定性・定量が可能となり、糖尿病合併症、神経変性疾患、悪性腫瘍などの臨床検査薬として利用され得る。また、ＡＧＥ−２アプタマーは、ＡＧＥ−２阻害活性を有するので、抗ＡＧＥ−２剤としても利用され得る。
さらに、本発明のＡＧＥ−２アプタマーは、化学的に安価に合成することができる。さらに、このアプタマーを修飾することによって安定化させること、あるいはアプタマーに蛍光または発光ドメインを付加して検出効率を上げることも可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、グリセルアルデヒド由来のＡＧＥであるＡＧＥ−２の生成経路を示す図である。
図２は、ＳＥＬＥＸ法の概要を示す工程図である。
図３は、種々の濃度のＡＧＥ−２（Ａ）、ならびに１００μｇ／ｍＬのＡＧＥ−２に種々の濃度のＡＧＥ−２アプタマーを添加した場合（ＢおよびＣ）の蛍光スペクトル図である。
図４は、アポトーシス阻害率の算出方法を説明するための図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
アプタマーとは、上述のように、特定の化合物に特異的に結合し得る一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡである。本発明においては、この特定の化合物がＡＧＥ−２である。すなわち、本発明のＡＧＥ−２アプタマーは、ＡＧＥ−２に結合し、ヒト血清アルブミンには結合しない。一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡのいずれであってもよい。
本発明のＡＧＥ−２アプタマーは、少なくとも３５塩基からなり、好ましくは少なくとも５０塩基かつ多くとも１２０塩基からなる。３４塩基以下の場合は、ＡＧＥ−２と結合しない。
本発明のＡＧＥ−２アプタマーは、該アプタマーを構成する塩基中にシトシンまたはグアニンのいずれか一方を多く含むことが好ましい。シトシンが多い場合は、シトシン含有率は少なくとも３５％、少なくとも４０％あるいは少なくとも５０％であってもよい。グアニンが多い場合は、塩基中のグアニン含有率は、少なくとも３２％、少なくとも３５％あるいは少なくとも４０％であってもよい。このような塩基含有率であることにより、アプタマーはＡＧＥ−２に結合しやすくなる。
具体的な例としては、配列表の配列番号１から２４のいずれかに記載の塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡが挙げられる。これらの一本鎖ＤＮＡは、５４〜５８塩基からなり、塩基中のシトシン含有率は少なくとも３５％である。別の具体的な例としては、配列表の配列番号２５から４１のいずれかに記載の塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡが挙げられる。これらの一本鎖ＤＮＡは、６１〜６６塩基からなり、塩基中のグアニン含有率は少なくとも３２％である。
本発明のＡＧＥ−２アプタマーは、アプタマーを得るための一般的な方法であるＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法によって得られ得る。一本鎖ＤＮＡをライブラリー源とするＳＥＬＥＸ法の概要を図２に基づいて説明する。まず、任意の２つのプライマー配列で挟まれた適当な長さのランダム配列を含むテンプレートＤＮＡを合成する。本発明においては、ランダム配列の長さは、３５塩基〜１２０塩基が適切である。このテンプレートＤＮＡをＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応）で増幅して、ランダムＤＮＡアプタマープールを得る。次いで、このランダムＤＮＡアプタマープールを標的物質と会合させ、結合しなかったＤＮＡを除去し、そして結合したＤＮＡアプタマーを抽出する。得られたＤＮＡアプタマーを、上記プライマー配列を用いるＰＣＲによって増幅する。このとき、５〜８ｍＭのＭｇ２＋存在下でＰＣＲを行って、複製の正確性を低下させて変異を導入しやすくすることにより、標的物質との会合前のＤＮＡアプタマープールに存在しない新たなＤＮＡアプタマーを含むＤＮＡアプタマープールが得られる。新たなＤＮＡアプタマーは、結合力がより強い可能性があり、すなわち、ＤＮＡアプタマーが進化する可能性が生じる。この進化したＤＮＡアプタマープールについて、上記の一連の操作を５〜１５ラウンド繰り返すことによって、標的物質に特異的に結合するＤＮＡアプタマーが得られる。最終ラウンドの後、得られたＤＮＡアプタマープールは、当業者が通常行う操作によってクローニングされ、次いで配列決定される。このＳＥＬＥＸ法における、テンプレートＤＮＡの合成、ＰＣＲなどの操作、ならびにクローニングおよび配列決定は、当業者が通常用いる方法によって行われる。本発明のＡＧＥ−２アプタマーは、このようにして決定された配列に基づいて、当業者が通常用いる方法によって化学合成することができる。
本発明においては、ＳＥＬＥＸ法における標的物質はＡＧＥ−２であり、好ましくはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）との結合体である。ＡＧＥ−２は、培養法、化学合成法などの任意の方法によって合成され得る。培養法では、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を、Ｄ−グルコースと数週間インキュベートするか、あるいはＤ−グリセルアルデヒドまたはＤ−グリコールアルデヒドと数日間インキュベートする。化学合成法は、例えば、Ｔｅｓｓｉｅｒらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２００３年，３６９巻，７０５−７１９頁）に従って行われる。具体的には、アセチル−リジンとグリセルアルデヒドとをリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で混合し、さらにジエチレントリアミンペンタ酢酸および２５％メタノールを加えて、３７℃で数日間反応させることによって得られる。得られたＡＧＥ−２は、ＳＥＬＥＸ法において用いる場合は、適切な固相（例えば、ビーズなど）に固定化されていることが好ましい。
得られたアプタマーのＡＧＥ−２との結合親和性は、ＡＧＥ−２が蛍光を発することを利用して、ＡＧＥ−２にアプタマーを添加したときのＡＧＥ−２の蛍光強度の減弱によって測定できる。このようにして、本発明のアプタマーのうち、親和性の強いアプタマーを選択することができる。
本発明のＡＧＥ−２アプタマーは、ＡＧＥ−２に特異的に結合するので、ＡＧＥ−２を検出するために用いることができる。本発明のＡＧＥ−２アプタマーは、より安定化させる目的で、修飾ヌクレオチド／ヌクレオチドを用いて合成されていてもよい。あるいは、ＡＧＥ−２アプタマー自体の検出効率を上げるために、アプタマーに蛍光または発光ドメインが付加されていてもよい。したがって、本発明のＡＧＥ−２アプタマーは、ＡＧＥ−２検出試薬として用いられ得る。
代表的には、本発明のＡＧＥ−２アプタマーは、例えば、ＥＬＩＳＡ、組織染色などのように、抗体が用いられ得る種々の分析において、抗体と同様に使用することが可能である。ＤＮＡマイクロアレイの技術を利用して、ＡＧＥ−２アプタマーチップを作成することもできる。したがって、本発明のＡＧＥ−２アプタマーは、ＡＧＥ−２検出キットとして提供され得る。
このようなＡＧＥ−２の検出に供する試料としては、代表的には、種々の生体試料（血液、細胞、組織など）およびその処理物が挙げられる。このような試料について、ＡＧＥ−２を検出することにより、ＡＧＥ−２が関与する疾患、例えば、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害などの糖尿病合併症、アルツハイマー病などの神経変性疾患、悪性腫瘍の増殖、転移、浸潤などを検出／診断することができる。したがって、本発明のＡＧＥ−２アプタマーは、上記の疾患の臨床検査薬または診断用キットとして提供され得る。
また、本発明のＡＧＥ−２アプタマーは、ＡＧＥ−２阻害活性を有するので、抗ＡＧＥ−２剤として、あるいはＡＧＥ−２が関与する疾患、例えば、上記の種々の疾患の予防・治療剤として使用され得る。
さらに、本発明のＡＧＥ−２アプタマーは、ＡＧＥ−２が関与する疾患の発症機構の解明などの基礎研究にも用いられ得る。
【実施例】
【０００６】
（実施例１：ＡＧＥ−２アプタマーの作成）
（１−１：一本鎖ランダムオリゴＤＮＡの作成）
３４、５６、または７２塩基のランダム領域およびその両側にプライマー部位（配列番号４２および４３）を含む一本鎖ランダムオリゴＤＮＡの合成を、次のように行った。
まず、３’末端のヌクレオチドが３’水酸基を介して結合されたＣＰＧ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）担体をカラムに詰めた。次いで、リボースの５’位の保護基であるジメトキシトリチル基をトリクロロ酢酸によって除去して、脱トリチル化した。リボースの３’位の水酸基がリン酸シアノエチルアミダイト誘導体である２番目のヌクレオチドを、脱トリチル化された１番目のヌクレオチドの５’水酸基に、塩基触媒（テトラゾール）を用いてカップリングさせ、未反応の５’水酸基を無水酢酸によってアセチル化した。２つのヌクレオチド間の結合を、ヨードを用いて酸化して、３価のリンから５価のリン酸エステルへ変換した。上記の脱トリル化からリン酸エステルへの変換までの操作を目的の鎖長になるまで繰り返した。ランダム部分の配列は、カップリング反応の際に、４種のヌクレオチドアミダイト混合物を使用して行った。反応後、カラムからアンモニア処理によってオリゴＤＮＡを切り出し、逆相カートリッジカラムによって精製した。凍結乾燥後、適量の水に溶解し、ＳＥＬＥＸライブラリーのテンプレートＤＮＡとした。
（１−２：ＡＧＥ−２の合成）
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（Ｓｉｇｍａ社製）を無菌状態で、Ｄ−グリセルアルデヒドと３７℃にて７日間インキュベートした。未反応糖を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の透析によって除去した。使用する前に、Ｅｎｄｏｓｐｅｃｙ  ＥＳ−２０Ｓシステム（生化学工業）を用いて、エンドトキシンがないことを確認した。
（１−３：ＡＧＥ−２のビーズへの結合）
上記１−２で得たＡＧＥ−２を、ＰＩＥＲＣＥ社のＳｕｌｆｏＬｉｎｋ（登録商標）カップリングゲル（カタログ番号２０４０１）を使用して製品の指示書に従って、次のようにビーズに固定化した。
まず、カップリングゲルをカラムにとり、カップリング緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．５）で平衡化した。ＡＧＥ−２をカップリング緩衝液に溶解し、カップリングゲルと混合して、室温で１時間インキュベートした。反応終了後、カップリング緩衝液でカラムを数回洗浄した。Ｌ−システインをカップリング緩衝液に溶解し、カップリングゲルと混合して、室温で３０分間インキュベートした。反応終了後、カップリング緩衝液およびＰＢＳでカラムを数回洗浄した。なお、反応前および反応後の吸光度を測定することによって、ＡＧＥ−２の固定化量を算出した。固定化後のゲル（ビーズ）を小分けし、使用するまで冷暗所に保存した。
（１−４：ＨＳＡのビーズへの結合）
ＨＳＡを、ＰＩＥＲＣＥ社のＳｕｌｆｏＬｉｎｋ（登録商標）カップリングゲル（カタログ番号２０４０１）およびＵｌｔｒａＬｉｎｋ（登録商標）ＥＤＣ／ＤＡＤＰＡ固定化キット（カタログ番号５３１５４）を使用して、ビーズに固定化した。
（１−５：ＳＥＬＥＸ法）
上記１−１で合成したランダムオリゴＤＮＡを鋳型にして、ｆｏｒｗａｒｄプライマー（配列番号４２）とｒｅｖｅｒｓｅプライマー（配列番号４３）によるＰＣＲ（１サイクル：９４℃，１５秒；５５℃，１５秒；７２℃，１５秒×１２サイクル）を行った。増幅後、ｆｏｒｗａｒｄプライマーのみを用いた非対称ＰＣＲによりプラス鎖を増幅した（１サイクル：９４℃，１５秒；５５℃，１５秒；７２℃，１５秒×４５サイクル）。増幅したプラス鎖をアガロースゲル電気泳動によって精製し、ＳＥＬＥＸ用ＤＮＡライブラリーとした。このＳＥＬＥＸ用ＤＮＡライブラリーをＰＢＳに溶かし、９５℃で５分加熱し、室温に戻した。次いで、ＳＥＬＥＸ用ＤＮＡライブラリーと上記１−３で調製したＡＧＥ−２を固定化させたビーズとを混合し、室温で３０分間インキュベートした。インキュベート後、ＰＢＳでビーズを数回洗浄した。適量の水をビーズに加えて混合し、１００℃で５分間加熱し、ＡＧＥ−２ビーズに結合したＤＮＡを解離させて回収した。回収したＤＮＡと上記１−４で調製したＨＳＡを固定化させたビーズとを混合し、室温で１０分間インキュベートした。素通りした（ＨＳＡに結合しなかった）ＤＮＡを回収して、エタノール沈殿法によって濃縮した。濃縮したＤＮＡを鋳型にして、上記の操作を５〜１５ラウンド繰り返した。この時、５〜８ｍＭのＭｇ＋存在下でＰＣＲを行って、変異を導入させた。
（１−６：クローニング）
５〜１５ラウンド後に得られたＤＮＡを、ｆｏｒｗａｒｄプライマー（配列番号４２）およびｒｅｖｅｒｓｅプライマー（配列番号４３）を用いるＰＣＲによって増幅し、アガロースゲル電気泳動によって精製し、そしてＡＧＥ−２特異的ＤＮＡを得た。このＤＮＡをクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社：Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標）ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（カタログ番号Ｋ２８７５Ｊ１０））へ導入し、次のようにして配列を決定した。
まず、ＡＧＥ−２特異的ＤＮＡ（ＰＣＲ産物）とクローニングベクター（ＴＯＰＯベクター）とを混合し、室温で５分間インキュベートした。反応終了後、反応液の一部をコンピテントセルに加え、氷冷下で３０分間インキュベートした。４２℃にて３０秒間ヒートショックした後、氷上で２分間冷却した。冷却した反応液に、キット中に含まれているＳＯＣ培地を加えて３７℃にて１時間培養した。適量を寒天プレート（５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地）に播種し、３７℃にて一晩培養した。無作為に数十個のクローンを選び、アルカリ法によってプラスミドＤＮＡを調製した。
（１−７：配列決定）
上記１−６で得られたプラスミドＤＮＡ中のＡＧＥ−２特異的ＤＮＡの配列を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社のＡＢＩ３７７を用いてＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ法によって行った。
その結果、３４塩基の一本鎖ＤＮＡからは、ＡＧＥ−２に結合するものが得られなかった。５６塩基の一本鎖ＤＮＡからは、配列番号１〜２４に示す５４〜５８塩基の一本鎖ＤＮＡ、すなわちＡＧＥ−２アプタマーが得られた（表１）。なお、７２塩基の一本鎖ＤＮＡについてもＡＧＥ−２に結合するものが得られたが、配列決定は行っていない。
【表１】
2006080262.tif 000002
表１に示すように、得られたＡＧＥ−２アプタマーはいずれも、該アプタマーを構成する塩基中のシトシン含有率が３５％以上であった。
（実施例２：ＡＧＥ−２アプタマーの作成）
６４塩基のランダム領域およびその両側にプライマー部位（配列番号４２および４３）を含む一本鎖ランダムオリゴＤＮＡを鋳型に用いたこと以外は、実施例１と同様にしてＡＧＥ−２アプタマーの作成を行った。
その結果、配列番号２５〜４１に示す６１〜６６塩基の一本鎖ＤＮＡ、すなわちＡＧＥ−２アプタマーが得られた（表２）。
【表２】
2006080262.tif 000003
表２に示すように、得られたＡＧＥ−２アプタマーはいずれも、該アプタマーを構成する塩基中のグアニン含有率が３２％以上であった。
次いで、得られたＡＧＥ−２アプタマーの配列に基づいて、上記１−１と同様にホスホアミダイト法により、各ＡＧＥ−２アプタマーを化学合成した。
（実施例３：ＡＧＥ−２アプタマーによるＡＧＥ−２蛍光阻害実験）
まず、ＡＧＥ−２の蛍光特性を測定するために、蛍光分光光度計（ＦＰ−７７７；日本分光）を用いて、励起波長および消光波長を決定した。その結果、励起は３８０ｎｍおよび消光は４７０ｎｍで最大蛍光を示した。そこで、２５〜１００μｇ／ｍＬのＡＧＥ−２を用いて、励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度を測定して検量線を作成した（図３Ａ）。
次いで、１００μｇ／ｍＬのＡＧＥ−２に対して、最終濃度２５〜１００ｎＭとなるように各アプタマー（配列番号１〜１５）を添加し、蛍光強度を測定した（図３ＢおよびＣを参照）。アプタマーを２５ｎＭ添加したときのＡＧＥ−２の蛍光強度の減弱に基づいて、アプタマー単位モル数（ｎｍｏｌ）あたりに結合するＡＧＥ−２の質量（ｎｇ）を算出した。結果を表３に示す。
【表３】
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（実施例４：ウシ周皮細胞を用いたアポトーシス実験）
ウシ周皮細胞を、屠殺後のウシから取り出して、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）に２０％ウシ胎児血清（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ａｕｒｏｒａ，ＯＨ）を添加した培地中で継代培養した。培養したウシ周皮細胞を、２０μｇ／ｍＬのＡＧＥ−２および１００μｇ／ｍＬのアプタマー（配列番号１〜２２）とともに３７℃にて２日間インキュベートした。コントロールではアプタマーの代わりにＨＳＡを添加して、ならびに陽性コントロールではＡＧＥ−２を添加して、上記と同様にインキュベートした。２日後、細胞をトリプシンで剥がし、［３Ｈ］−チミジンの取込実験を行って、生存細胞の数をカウントした。生存細胞数から、図４に示すようにして、アポトーシス阻害率を算出した。結果を表４に示す。
【表４】
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表４に示すように、ＡＧＥ−２のみの添加によって誘発されるアポトーシスが、ＡＧＥ−２アプタマーを加えることによって阻害されたことがわかる。このことから、ＡＧＥ−２アプタマーがＡＧＥ−２に結合して、その機能を阻害し得ることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明のＡＧＥ−２アプタマーは、ＡＧＥ−２を検出するために使用できるので、ＡＧＥ−２が関与する疾患、例えば、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害などの糖尿病合併症、アルツハイマー病などの神経変性疾患、悪性腫瘍の増殖、転移、浸潤などの検出薬・診断薬として利用され得る。さらに、本発明のＡＧＥ−２アプタマーは、ＡＧＥ−２阻害活性を有するため、ＡＧＥ−２が関与する疾患、例えば、上記の種々の疾患の予防・治療剤として使用され得る。特に、糖尿病患者の増加に伴って糖尿病合併症も増加しているため、早期発見および治療に有用である。また、本発明のＡＧＥ−２アプタマーは、ＡＧＥ−２が関与する疾患の発症機構の解明などの基礎研究にも用いられ得る。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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