(57)【要約】  アンジオポエチン関連増殖因子（ＡＧＦ）又はそれをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含有する抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬を開示する。ＡＧＦを有効成分とする肥満、糖尿病、及び／又は高脂血症の改善の機能を付与した機能性食品又は健康食品を開示する。更に、ＡＧＦ又はそれをコードするポリヌクレオチドを投与することを含む肥満、糖尿病、及び／又は高脂血症を治療又は予防する方法を開示する。加えて、ＡＧＦ又はそれをコードするポリヌクレオチドの抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬を製造するための使用を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選んだポリペプチド、又は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有効成分とする、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬：
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番〜４５０番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番〜４５０番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列において、１〜１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番〜４５０番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、並びに
（ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番〜４５０番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列との同一性が９５％以上であるアミノ酸配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドを有効成分とする、肥満、糖尿病、及び／又は高脂血症の改善の機能を付与した機能性食品又は健康食品。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチド、又は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、肥満、糖尿病、及び／又は高脂血症の治療又は予防が必要な対象に、有効量で投与することを含む、肥満、糖尿病、及び／又は高脂血症を治療又は予防する方法。
【請求項４】
請求項１に記載のポリペプチド、又は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬を製造するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンジオポエチン関連増殖因子（Angiopoietin-Related Growth Factor；以下、ＡＧＦと称する）若しくはその誘導体又はそれをコードするポリヌクレオチドを有効成分とする抗肥満薬に関する。本発明の抗肥満薬は、医薬品として投与することができるだけでなく、種々の形態、例えば、健康食品（好ましくは機能性食品）又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。
【背景技術】
【０００２】
肥満の有害性は広く知られているにもかかわらず、近年肥満が顕著に増加している。肥満つまり脂肪組織の過剰蓄積が多彩な疾患の原因となっていることは周知の事実であり、疾患としての肥満症を治療対象にすることが提唱されている。肥満を原因の一つとして発症する疾患として、例えば、腰痛、膝関節痛、及び変形性関節症がある。これらの整形外科学的疾患は肥満による体重増加が直接の原因となりうる。肥満に伴う脂肪の過剰蓄積は、糖尿病、高脂血症、高血圧、又は動脈硬化性疾患の原因となっている。特に内臓脂肪の蓄積がこれらの疾患の発症に関与していることが明らかにされている（非特許文献１）。【０００３】
基本的な肥満改善方法としては、運動療法と食事療法があるが、どちらも継続的な実施が困難である。また、運動又は食事療法以外の改善方法としては医薬品の使用があり、現時点では、世界的に見ると、シブトラミンとオルリスタットが主に使用されている。しかし、それらの効果は弱く、どちらも副作用の問題がある。日本ではマジンドールのみが認可されているが、適用が高度肥満者に限定されており、投与期間も限定されている（非特許文献２）。【０００４】
社会の近代化に伴い、日本のみならず世界的に糖尿病患者は急増している。特に、患者数の多いII型糖尿病は、肥満や脂肪の過剰蓄積が発症に関与していることが知られている。II型糖尿病の治療としては、肥満症と同様に運動療法と食事療法があるが、継続的な実施が困難であり、医薬品が使用されている。重度の糖尿病患者ではインスリン療法が行なわれている。しかし、インスリン療法には低血糖の副作用の危険性が常にある。経口血糖降下薬として、チアゾリジン系薬剤又はスルホニルウレア（ＳＵ）薬等が多く使用されている。しかしながら、チアゾリジン系薬剤には、肝障害・浮腫・心不全という副作用があり、ＳＵ薬には肥満を助長する副作用が危惧され、安全で、体重増加を伴わないインスリン抵抗性改善薬が強く求められている（非特許文献３）。【０００５】
肥満の糖尿病患者の内臓脂肪では脂肪細胞の肥大化が観察される。この肥大化した脂肪細胞からは、インスリン抵抗性を惹起するようなアディポサイトカイン類が産生及び分泌され、近傍の脂肪細胞、筋細胞、及び／又は肝細胞に作用して、インスリン抵抗性を引き起こしていると考えられる。このように、脂肪組織は、糖尿病病態において、インスリン抵抗性を増強する方向に関わる組織へと変化する（非特許文献４及び５）。【０００６】
肥満や糖尿病の原因となる脂肪組織の蓄積に関与する因子としてはレプチンがよく知られている。レプチンは、体重増加抑制ホルモンであり、レプチンを欠失することで食欲が亢進し、エネルギー消費が減弱し肥満となることが知られている。このような脂肪組織の蓄積、及び脂肪細胞の肥大化に関与する因子の発見は、肥満症、糖尿病、又は高脂血症等の疾患の治療薬開発に非常に有用である（非特許文献６）。【０００７】
アンジオポエチン関連増殖因子（ＡＧＦ）は、Ｎ末端側にコイルドコイル（Coiled-coil）ドメインを、Ｃ末端側にフィブリノーゲン様（Fibrinogen-like）ドメインを持つ分泌タンパク質である。ＡＧＦは特許文献１で報告されたＮＬ８と同一であり、ＮＬ８をＣＨＯ細胞に安定発現させて、ヌードマウスに皮下移植すると、ＣＨＯが腫瘍形成能を持つようになることが報告されている。また、ＡＧＦをＫ１４プロモーターを用いて表皮細胞に強制発現させたトランスジェニックマウス等を用いて、ＡＧＦに、血管新生活性、表皮細胞増殖活性、軟骨細胞増殖活性、創傷治癒促進活性、及び組織再生活性があることが示されている（特許文献１、非特許文献７）。しかし、前記以外のＡＧＦの生理機能に関しては何ら知見がなかった。【０００８】
【非特許文献１】「メタボリズム（Metabolism）」，(米国)，１９８７年，３６巻，ｐ.５４−５９
【非特許文献２】「日本臨床」，２００３年，６１巻，増刊号６，肥満症，ｐ.６４９−６５４
【非特許文献３】「日本臨床」，２００２年，６０巻，増刊号９，新時代の糖尿病学３，ｐ.３１０−３３１
【非特許文献４】「医学のあゆみ」,２０００年，１９２巻，ｐ.５１３−５１８
【非特許文献５】「医学のあゆみ」,２０００年，１９２巻，ｐ.５４１−５４５
【非特許文献６】「トレンズ・イン・モレキュラー・メディスン（Trends in Molecular Medicine）」，（オランダ），２００２年，８巻，９号，ｐ．４４２−４４７
【非特許文献７】「プロシディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイティッド・ステート・オブ・アメリカ（Proceedings of the national academy of sciences of the United Statesof America）」，（米国），２００３年，１００巻，ｐ．９４９４−９４９９
【特許文献１】国際公開ＷＯ９９／１５６５３号パンフレット
【特許文献２】国際公開ＷＯ０３／０８３１１４号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、新規の抗肥満薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは鋭意検討した結果、ＡＧＦノックアウト（ＫＯ）マウス及びＡＧＦトランスジェニック（Ｔｇ）マウスの作製及び解析により、ＡＧＦが抗肥満、抗糖尿、及び抗高脂血症の作用を有することを明らかにした。すなわち、ＡＧＦノックアウトマウスが顕著な肥満を示すことを見出した（実施例３）。更に、ＡＧＦノックアウトマウスは、肥満に伴う脂肪組織の重量が増加しており（実施例４）、脂肪細胞が肥大化（実施例５）、肥満で増加することが知られている骨格筋及び肝臓組織中のトリグリセリド量が増加することを見出した（実施例６）。一方、ＡＧＦトランスジェニックマウス（ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス；全身にＡＧＦを強制発現したマウス）は体重増加が抑制されており（実施例３）、脂肪組織の重量増加が抑制され（実施例４）、脂肪細胞の肥大化は抑制され（実施例５）、骨格筋及び肝臓組織中トリグリセリド量は減少（実施例６）されること、更には、インスリン感受性の向上、並びに脂質代謝及び耐糖能が改善されること（実施例１６及び実施例１７）を見出した。更に、ＡＧＦノックアウトマウスは高インスリン血症となり、耐糖能が悪化することが示された（参考例２）。更に、ＡＧＦ発現アデノウイルス投与マウスにおいて、体重増加が抑制され、且つ耐糖能が改善されたこと（実施例１５及び実施例２０）、別のＡＧＦトランスジェニックマウス（Ｋ１４−ＡＧＦ  Ｔｇマウス；表皮にＡＧＦを強制発現したマウス）において、抗肥満作用、脂肪組織減少作用、インスリン感受性亢進作用を有すること（実施例１８及び実施例１９）を見出した。
これらの知見から、ＡＧＦは抗肥満、糖尿、及び／又は高脂血症治療薬の有効成分となることを明らかにし、本発明を完成させた。【００１１】
すなわち、本発明は、
［１］下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選んだポリペプチド、又は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有効成分とする、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬：
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番〜４５０番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番〜４５０番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列において、１〜１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番〜４５０番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、並びに
（ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番〜４５０番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列との同一性が９５％以上であるアミノ酸配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、
［２］前記ポリペプチドを有効成分とする、肥満、糖尿病、及び／又は高脂血症の改善の機能を付与した機能性食品又は健康食品、
［３］前記ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを、肥満、糖尿病、及び／又は高脂血症の治療又は予防が必要な対象に、有効量で投与することを含む、肥満、糖尿病、及び／又は高脂血症を治療又は予防する方法、並びに
［４］前記ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドの、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬を製造するための使用
に関する。【００１２】
本明細書において、用語「トランスジェニック動物」は、プロモーター及び遺伝子を染色体に導入して、遺伝子を所望の個所で強制発現させた動物を意味し、用語「ノックアウト動物」は、染色体に遺伝子操作することで特定の遺伝子の発現を欠失させた動物を意味するものとして使用する。
【発明の効果】
【００１３】
ＡＧＦは、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬の有効成分として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】プラスミドｐＢＳ−ｌｏｘＰ−ｌｏｘ７１−ｍＡＧＦ−βｇｅｏの構造を模式的に示す図面である。記号「ｐｒｏ．」及び「ｐｒｉ．」は、それぞれ、プロモーター及びプライマーを意味する。
【図２】ＡＧＦ  ＫＯマウスの体重変化を示すグラフである。横軸は週齢（週）を、縦軸は体重（ｇ）を示す。また、記号「ＷＴ」、「ＨＴＲ」、及び「ＨＭ」は、それぞれ、ＷＴマウス、ヘテロＫＯマウス、及びホモＫＯマウスを意味する。
【図３】ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス（標準食）の生殖器脂肪（白色脂肪組織）重量変化を示すグラフである。縦軸は、白色脂肪組織重量（ｇ）／体重（ｇ）を示す。また、記号「ＷＴ」及び「Ｔｇ」は、それぞれ、ＷＴマウス及びＴｇマウスを意味する。
【図４】ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス（高脂肪食負荷）の生殖器脂肪（白色脂肪組織）重量変化を示すグラフである。縦軸は、白色脂肪組織重量（ｇ）／体重（ｇ）を示す。また、記号「ＷＴ」及び「Ｔｇ」は、それぞれ、ＷＴマウス及びＴｇマウスを意味する。
【図５】ＡＧＦ  ＫＯマウスの生殖器脂肪（白色脂肪組織）重量変化（白色脂肪組織重量）を示すグラフである。縦軸は、白色脂肪組織重量（ｇ）を示す。また、記号「ＷＴ」、「ＨＴＲ」、及び「ＨＭ」は、それぞれ、ＷＴマウス、ＡＧＦヘテロＫＯマウス、及びＡＧＦホモＫＯマウスを意味する。
【図６】ＡＧＦ  ＫＯマウスの生殖器脂肪（白色脂肪組織）重量変化（白色脂肪組織重量／体重）を示すグラフである。縦軸は、白色脂肪組織重量（ｇ）／体重（ｇ）を示す。また、記号「ＷＴ」、「ＨＴＲ」、及び「ＨＭ」は、それぞれ、ＷＴマウス、ＡＧＦヘテロＫＯマウス、及びＡＧＦホモＫＯマウスを意味する。
【図７】ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの脂肪細胞の形態を示す図面である。また、記号「ＴＧ」及び「ＮＴＧ」は、それぞれ、Ｔｇマウス及びＷＴマウスを意味する。
【図８】ＡＧＦホモＫＯマウスの脂肪細胞の形態を示す図面である。
【図９】リターメイトＷＴマウスの脂肪細胞の形態を示す図面である。
【図１０】ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの組織（肝臓）中ＴＧ含量を示すグラフである。横軸は高脂肪食負荷（箇月間）を、縦軸はＴＧ含量（ｍｇ／ｇ組織）を示す。また、記号「ＷＴ」及び「Ｔｇ」は、それぞれ、ＷＴマウス及びＴｇマウスを意味する。
【図１１】ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの組織（骨格筋）中ＴＧ含量を示すグラフである。横軸は高脂肪食負荷（箇月間）を、縦軸はＴＧ含量（ｍｇ／ｇ組織）を示す。また、記号「ＷＴ」及び「Ｔｇ」は、それぞれ、ＷＴマウス及びＴｇマウスを意味する。
【図１２】ＡＧＦ  ＫＯマウスの組織中ＴＧ含量を示すグラフである。縦軸はＴＧ含量（ｍｇ／ｇ組織）を示す。また、横軸の記号「Ｌ」及び「ＳＭ」は、それぞれ、肝臓及び骨格筋を意味し、記号「ＷＴ」、「ＨＴＲ」、及び「ＨＭ」は、それぞれ、ＷＴマウス、ヘテロＫＯマウス、及びホモＫＯマウスを意味する。
【図１３】ＡＧＦ  ＫＯマウスの糖負荷試験の結果（血糖値）を示すグラフである。横軸は時間（分）を、縦軸は血糖値（ｍｇ／ｄＬ）を示す。また、記号「ＷＴ」及び「ＨＭ」は、それぞれ、ＷＴマウス及びホモＫＯマウスを意味する。
【図１４】ＡＧＦ  ＫＯマウスの糖負荷試験の結果（血漿インスリン）を示すグラフである。横軸は時間（分）を、縦軸は血漿インスリン（ｎｇ／ｍＬ）を示す。また、記号「ＷＴ」及び「ＨＭ」は、それぞれ、ＷＴマウス及びホモＫＯマウスを意味する。
【図１５】ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの酸素消費量を示すグラフである。横軸において、レーン１は「明期」、レーン２は「暗期」、レーン３は「２４時間」であり、縦軸はＶＯ２（ｍＬ／ｋｇ／ｍｉｎ）を示す。また、記号「ＷＴ」及び「Ｔｇ」は、それぞれ、ＷＴマウス及びＴｇマウスを意味する。
【図１６】マウスＡＧＦ発現アデノウイルス投与マウスの糖代謝試験の結果を示すグラフである。黒丸は、ｍＡＧＦ−Ａｄｅｎｏ投与マウスの結果であり、白丸は、Ｃｏｎｔ−Ａｄｅｎｏ投与マウスの結果である。また、横軸は経過時間（分）であり、縦軸は血糖値（ｍｇ／ｄＬ）である。
【図１７】高脂肪食で飼育したＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスの血漿中インスリン濃度（縦軸；ｎｇ／ｍＬ）を示すグラフである。記号「ＴＧ」及び「ＮＴＧ」は、それぞれ、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスを意味する。
【図１８】高脂肪食で飼育したＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスの血清コレステロール濃度（縦軸；ｍｇ／ｄＬ）を示すグラフである。記号「ＴＧ」及び「ＮＴＧ」は、それぞれ、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスを意味する。
【図１９】高脂肪食で飼育したＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスの血清遊離脂肪酸濃度（縦軸；μＥｑ／Ｌ）を示すグラフである。記号「ＴＧ」及び「ＮＴＧ」は、それぞれ、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスを意味する。
【図２０】ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスの糖代謝試験の結果を示すグラフである。記号「ＴＧ」及び「ＮＴＧ」は、それぞれ、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスを意味する。また、横軸は経過時間（分）であり、縦軸は血糖値（ｍｇ／ｄＬ）である。
【図２１】ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスのインスリン感受性試験の結果を示すグラフである。記号「ＴＧ」及び「ＮＴＧ」は、それぞれ、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスを意味する。また、横軸は経過時間（分）であり、縦軸は、インスリン投与前の血糖値に対する、投与後の血糖値の割合（％）である。
【図２２】Ｋ１４−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスにおける内臓脂肪組織重量を示すグラフである。記号「Ｋ１４−ＡＧＦ」及び「ＮＴＧ」は、それぞれ、Ｋ１４−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスを意味する。また、縦軸は、体重当たりの内蔵脂肪組織重量の百分率（％）である。
【図２３】Ｋ１４−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスにおける皮下脂肪組織重量を示すグラフである。記号「Ｋ１４−ＡＧＦ」及び「ＮＴＧ」は、それぞれ、Ｋ１４−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスを意味する。また、縦軸は、体重当たりの皮下脂肪組織重量の百分率（％）である。
【図２４】Ｋ１４−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスのインスリン感受性試験の結果を示すグラフである。記号「Ｋ１４−ＡＧＦ」及び「ＮＴＧ」は、それぞれ、Ｋ１４−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスを意味する。また、横軸は経過時間（分）であり、縦軸は、インスリン投与前の血糖値に対する、投与後の血糖値の割合（％）である。
【図２５】ヒトＡＧＦ発現アデノウイルス投与マウスの糖代謝試験の結果を示すグラフである。黒丸は、ｈＡＧＦ−Ａｄｅｎｏ投与マウスの結果であり、白丸は、Ｃｏｎｔ−Ａｄｅｎｏ投与マウスの結果である。また、横軸は経過時間（分）であり、縦軸は血糖値（ｍｇ／ｄＬ）である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
［１］本発明の医薬
本発明の抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬（以下、総称して、本発明の医薬と称する）は、下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選んだポリペプチド、又は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも１つを有効成分として含有することができる：
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番〜４５０番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番〜４５０番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列において、１〜１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番〜４５０番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、並びに
（ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番〜４５０番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列との同一性が９５％以上であるアミノ酸配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド。【００１６】
なお、本明細書における「抗肥満薬」には、肥満患者の治療のために使用する薬剤と、肥満傾向にある対象に予防的に使用する薬剤との両方が含まれる。また、本明細書における「糖尿病治療薬」には、糖尿病である患者の治療のために使用する薬剤と、糖尿病傾向にある対象に予防的に使用する薬剤との両方が含まれる。更に、本明細書における「高脂血症治療薬」には、高脂血症である患者の治療のために使用する薬剤と、高脂血症傾向にある対象に予防的に使用する薬剤との両方が含まれる。【００１７】
本発明の医薬の有効成分であるポリペプチドとしては、配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番〜４５０番のアミノ酸からなる配列からなるヒトＡＧＦ、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列からなるマウスＡＧＦが好ましい。【００１８】
配列番号３で表されるアミノ酸配列は、ヒトＡＧＦ前駆体のアミノ酸配列である。ヒトＡＧＦは、Ｎ末端にシグナル配列（−２０〜−１）を持ち、細胞外に分泌発現される際にシグナル配列が切断される。シグナル配列が切断された配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番〜４５０番のアミノ酸からなる配列からなるヒト成熟ＡＧＦが、生理活性を有する。
同様に、配列番号５で表されるアミノ酸配列は、マウスＡＧＦ前駆体のアミノ酸配列である。マウスＡＧＦは、Ｎ末端にシグナル配列（−２４〜−１）を持ち、細胞外に分泌発現される際にシグナル配列が切断される。シグナル配列が切断された配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列からなるマウス成熟ＡＧＦが、生理活性を有する。【００１９】
本発明の医薬の有効成分として用いることのできる前記ポリペプチド（ｂ）、すなわち、配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番〜４５０番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列において、１〜１０個（例えば、１〜数個）のアミノ酸残基が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチドとしては、前記各配列において、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチドを挙げることができる。【００２０】
ポリペプチドの機能を維持するために、置換されるアミノ酸は、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、以下に示すような各グループに属するアミノ酸は、そのグループ内で互いに似た性質を有するアミノ酸である。これらのアミノ酸をグループ内の他のアミノ酸に置換しても、タンパク質の本質的な機能は損なわれないことが多い。このようなアミノ酸の置換は、保存的置換と呼ばれ、ポリペプチドの機能を保持しつつアミノ酸配列を変換するための手法として公知である。
非極性アミノ酸：Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、及びTrp
非荷電性アミノ酸：Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、及びGln
酸性アミノ酸：Asp及びGlu
塩基性アミノ酸：Lys、Arg、及びHis【００２１】
或るポリペプチドが体重増加抑制活性を有するか否かの判定方法は、特に限定されるものではないが、例えば、実施例３に記載の方法によって確認することができる。すなわち、前記ポリペプチドをコードする遺伝子を用いて作製したトランスジェニック動物を、標準食又は高脂肪食で飼育し、その体重変動を野生型動物と比較することによって確認することができる。また、実施例１５又は実施例２０に記載の方法によって確認することができる。すなわち、前記ポリペプチドを発現するアデノウイルスを、標準食又は高脂肪食で飼育したマウスに投与し、その体重変動をコントロールアデノウイルスを投与した場合と比較することによって確認することができる。【００２２】
本発明の医薬の有効成分として用いることのできる前記ポリペプチド（ｃ）における「ストリンジェントな条件」としては、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５ｘＳＳＰＥ、５ｘデンハート（Denhard's）液、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、４０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、３７℃オーバーナイト」程度の条件であり、より厳しい条件としては「５ｘＳＳＰＥ、５ｘデンハート液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」程度の条件である。また、洗浄のための条件として、緩い条件としては「５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、４２℃」であり、通常の条件として「０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の条件である。なお、５ＸＳＳＰＥの組成は、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、０．７５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、及び５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡであり、５ＸＳＳＣの組成は、０．７５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ及び７５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）である。【００２３】
本発明の医薬の有効成分として用いることのできる前記ポリペプチド（ｄ）における前記同一性は、少なくとも９５％以上であるが、９７％以上の同一性を示すことが好ましい。なお、アミノ酸配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを用いて決定することができる。具体的には、ＢＬＡＳＴパッケージ（sgi32bit版、バージョン2.0.12；NCBIより入手）のｂｌ２ｓｅｑプログラム［Tatiana A. Tatusova,
Thomas L. Madden, FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250 (1999)］を用い、デフォルトパラメーターに従って算出することができる。ペアワイズ  アラインメント  パラメーターとして、プログラム名ｂｌａｓｔｐ、Ｇａｐ挿入Ｃｏｓｔ値を０、Ｇａｐ伸長Ｃｏｓｔ値を０、Ｑｕｅｒｙ配列のフィルターとしてＳＥＧ、ＭａｔｒｉｘとしてＢＬＯＳＵＭ６２を使用することができる。【００２４】
本発明の医薬の有効成分として用いることのできるポリペプチドとしては、前記ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）のＮ末端側にシグナル配列を含むものが好ましい。シグナル配列としては、ポリペプチドの膜通過を先導する配列であれば限定されず、例えば、Biochemistry, 28(3), 923-930, 1989に記載のシグナル配列を用いることができる。より好ましくは、前記ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）のＮ末端側に、配列番号３で表されるアミノ酸配列におけるシグナル配列（−２０〜−１）又は配列番号５で表されるアミノ酸配列におけるシグナル配列（−２４〜−１）を含むものが好ましく、配列番号３で表されるアミノ酸配列又は配列番号５で表されるアミノ酸配列が最も好ましい。【００２５】
本発明の医薬の有効成分として用いることのできるポリペプチドの起源は、ヒト又はマウスに限定されない。前記ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）のいずれかに該当する限り、例えば、ヒト又はマウス以外の生物由来のポリペプチドも、また、配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番〜４５０番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列を基にして、遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドも、本発明の医薬の有効成分として用いることができる。
また、前記ポリペプチドは、組換え体であることが好ましい。【００２６】
前記ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）をコードするポリヌクレオチド、すなわち、本発明の医薬の有効成分として用いることのできるポリヌクレオチドには、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれ、ＤＮＡであることが好ましい。前記ポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号２で表される塩基配列における６１番〜１４１０番の塩基からなる配列、又は配列番号４で表される塩基配列における７３番〜１３７１番の塩基からなる配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。好ましくは、配列番号２で表される塩基配列又は配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、あるいは、配列番号２で表される塩基配列における６１番〜１４１０番の塩基からなる配列、又は配列番号４で表される塩基配列における７３番〜１３７１番の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチドである。【００２７】
本発明には、前記ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）、又は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも１つを、肥満、糖尿病、及び／又は高脂血症の治療又は予防が必要な対象に、有効量で投与することを含む、肥満、糖尿病、及び／又は高脂血症を治療又は予防する方法が含まれる。また、本発明には、前記ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）、又は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬を製造するための使用が含まれる。【００２８】
本発明の医薬であるポリペプチドの投与方法としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注若しくは筋注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に酵素の影響を受けるポリペプチドにあっては、経皮投与や静注等の非経口投与とするか、あるいは、消化酵素の影響の少ない消化管の下部（例えば、空腸、回腸、結腸、又は大腸）に前記ポリペプチドが分解されずに送達される製剤技術を用いることが好ましい。【００２９】
前記ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）を有効成分とする製剤は、ポリペプチドの製剤化に通常用いられる薬理学上許容される担体や賦形剤、その他の添加剤を用いて医薬組成物として調製されうる。【００３０】
非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含む。水溶性の溶液剤や懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などが含まれる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、又はポリソルベート８０等を含む。前記組成物はさらに湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含んでいてもよい。組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、または照射によって無菌化される。また、無菌の固体組成物を製造し、使用に際し無菌水その他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。【００３１】
本発明の医薬には、肥満、糖尿病、及び／又は高脂血症の治療又は予防において意図される効果を生じるのに充分な、すなわち、治療的有効量又は薬理学的有効量の前記ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）が含まれる。実際の投与における有効量の確認は、例えば、標的疾患の回復の程度を測定することにより行うことができる。実際に投与されるべき量は、処置される個体の症状、年齢、体重等の種々の要因に依存し、好ましくは所望の効果が顕著な副作用を伴うことなく発揮される量が決定され、投与される。このような有効量、また毒性等については、当業者であれば、公知のモデル動物を用いて容易に決定することができる。例えば、通常成人において有効成分の量が１日１μｇ〜２ｇが好ましい。更に好ましくは１日１μｇ〜２００ｍｇである。【００３２】
また、前記ポリペプチドに代えて、それをコードするポリヌクレオチドを遺伝子治療において抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は高脂血症治療薬として投与することもできる。一般に遺伝子治療における投与形態は大きく、非ウイルスベクターを用いる方法とウイルスベクターを用いる方法に分類される［『別冊実験医学
遺伝子治療の基礎技術』羊土
社(1996);『別冊実験医学 遺伝子導入＆発現解析実験法』羊土社(1997);日本遺伝子治療
学会編『遺伝子治療開発研究ハンドブック』NTS(1999)］。【００３３】
非ウイルスベクターによる方法としては、例えば、内包型リポソームによる方法、静電気型リポソームによる方法、ＨＶＪ−リポソーム［J.Clin.Invest. 93: 1458-1464 (1994)等］を利用する方法、レセプター介在性導入法、パーティクルガンで金属粒子などの担体と共に細胞へ導入する方法、プラスミドの直接導入法、あるいは、正電荷ポリマーによる導入法等が組織への遺伝子導入法として挙げられる。細胞への遺伝子導入法としては、例えば、リポフェクション、リン酸-カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、又は微小ガラス管を用いたＤＮＡの直接注入法等が公知である。【００３４】
ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルスベクターが知られている。具体的には、例えば、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、ＳＶ４０、ＨＩＶ、又はセンダイウイルス等のＤＮＡ又はＲＮＡウイルスに、前記ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）をコードするポリヌクレオチドを導入し、細胞をウイルス感染させることにより細胞内に遺伝子を導入することができる。【００３５】
前記ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）をコードするポリヌクレオチドを含む抗肥満薬、糖尿病治療薬、又は高脂血症治療薬は、直接体内への遺伝子の導入を行うインビボ（in vivo）法、及び、体外へ取り出された細胞へ遺伝子導入し、遺伝子が導入された細胞を体内へ戻すエクスビボ（ex vivo）法のどちらによって投与してもよい。【００３６】
インビボ投与のための製剤形態としては、注射や点滴に用いることができる液剤を挙げることができる。液剤の調製は、具体的には、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の緩衝液、生理食塩水、又は滅菌水等の溶剤に溶解した後、必要に応じフィルター濾過などにより滅菌し、無菌的な容器に充填する。必要に応じ、懸濁剤、凍結剤、又は遠心分離濃縮凍結剤等の形態とすることもできる。また、前記ポリヌクレオチドは、例えば、脂肪、脂肪油、ラノリン、ワセリン、ロウ、流動パラフィン、硬膏剤、プラスチック、グルコール類、高級アルコール、樹脂、グリセリン、乳化剤、又は懸濁剤を含む半固形の軟膏として患部へ局所投与することができる。このような軟膏は必要に応じ親水性ポリマーと混合してシート状に成形し、患部に対して接着して用いることもできる。【００３７】
前記ポリヌクレオチドを含む抗肥満薬、糖尿病治療薬、又は高脂血症治療薬の投与は、疾患の種類、症状に応じた適当な方法・部位を選択して行われる。投与方法としては非経口投与が好ましい。具体的には、例えば、皮下、皮内、血管内、筋肉内、及び軟膏などによる表層への投与が可能である。皮下、皮内、血管、筋肉などへの投与は注射やカテーテル等により行い得る。【００３８】
本発明の医薬には、肥満、糖尿病、及び／又は高脂血症の治療又は予防において意図される効果を生じるのに充分な、すなわち、治療的有効量又は薬理学的有効量の前記ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）をコードするポリヌクレオチドが含まれる。実際の投与における有効量の確認は、例えば、標的疾患の回復の程度を測定することにより行うことができる。実際に投与されるべき量は、処置される個体の症状、年齢、体重等の種々の要因に依存し、好ましくは所望の効果が顕著な副作用を伴うことなく発揮される量が決定され、投与される。このような有効量、また毒性等については、当業者であれば、公知のモデル動物を用いて容易に決定することができる。例えば、通常成人において有効成分の量が１日０．１μｇ〜２００ｍｇが好ましい。更に好ましくは１日０．１μｇ〜２０ｍｇである。【００３９】
［２］本発明の健康食品
本発明における有効成分である、前記ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）は、医薬品として投与することができるだけでなく、種々の形態、例えば、健康食品（好ましくは機能性食品）又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。なお、前記食品には飲料が含まれる。【００４０】
本明細書において「健康食品」とは、健康に何らかの効果を与えるか、あるいは、効果を期待することができる食品を意味し、「機能性食品」とは、前記「健康食品」の中でも、種々の生体調節機能（例えば、消化器系、循環器系、内分泌系、免疫系、又は神経系などの生理系統の調節機能）を充分に発現することができるように設計及び加工された食品を意味する。
本発明の健康食品としては、肥満、糖尿病、及び／又は高脂血症の治療機能を有するものが好ましい。
「肥満、糖尿病、及び／又は高脂血症の改善効果を有することを特徴とする前記ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）のポリペプチド含有食品用組成物」及び「肥満、糖尿病、及び／又は高脂血症の改善効果を有することを特徴とする前記ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）のポリペプチド含有機能性食品素材」も本発明に含まれる。前記ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）のポリペプチド含有食品用組成物は、食品に使用可能な担体、その他の添加剤を含むことができる。【００４１】
本発明の健康食品は、有効成分として、前記ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）を含有すること以外は、一般的な健康食品と同様に調製することができる。例えば、食品として摂取可能な物質に、有効量の前記有効成分を含有させることにより、本発明の健康食品を調製することができる。前記有効量は、食品の形状若しくは種類、又はそれを摂取する個体の症状、年齢、体重等の種々の要因に応じて適宜決定することができる。例えば、通常成人において有効成分の量が１日１μｇ〜２ｇが好ましい。更に好ましくは１日１μｇ〜２００ｍｇである。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法（「Molecular Cloning」, Sambrook, J.ら, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1989年など）に従って実施可能である。また、市販の試薬やキットを用いる場合には、市販品の指示書に従って実施可能である。【００４３】
ノックアウト動物及びトランスジェニック動物の作製については、特に断りがない場合は、Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual. 2nd Edition, B.
Hogan, R. Beddington, F. Costantini, E. Lacy, Cold Spring Harbor, New York,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994に従って、ＥＳ細胞を用いたキメラマウス作製については、AL Joyner:
Gene Targeting, A Practical Approach, OXFORD UNIVERSITY PRESS, 1993又はバイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲッティング  ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，相沢慎一／著，羊土社，1994に従って実施可能である。【００４４】
《参考例１：ＡＧＦ  ＫＯマウスの作製》
（１）ターゲッティングベクターの作製
マウスＡＧＦ遺伝子の５’側のゲノム配列（5’long arm）、ｐｇｋプロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子、マウスＡＧＦ遺伝子のエクソン（exon）２の一部とエクソン３を含むゲノム配列（3’short
arm）、及びＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を順にもつターゲッティングベクターを以下の方法で作製した。【００４５】
すなわち、WO03/083114号公報の実施例１と同様に作製したマウスＡＧＦのタンパク質
コード領域全長に対応するｃＤＮＡをプローブとして、添付マニュアルに従ってマウスゲノミックライブラリー（Mouse Genomic, 129 SVJ Library；ストラタジーン社）のスクリーニングを行い、約１７．９ｋｂｐの配列（ＡＧＦ遺伝子を含む、mouse-pub-genome配列ACO73775.2の90644〜108544）を持つファージクローンを単離し、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン社）にサブクローニングした。このプラスミドクローン（ｐＢＮ２）を制限酵素ＳａｌＩ及びＭｆｅＩで切断することで、約６．２ｋｂｐの５’ロングアーム（mouse-pub-genome配列ACO73775.2の90664〜96900を含む）を切り出した。また、前記プラスミドｐＢＮ２を鋳型にして、配列番号６（CTAGACTAGTTGCAAAGGCGTGCGGCGG人工配列）及び配列番号７（CTAGACTAGTGGATCCGCAGGCTTGCTTTGACTTAC人工配列）で表される塩基配列からなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、約２．０ｋｂｐの３’ショートアーム（mouse-pub-genome配列ACO73775.2の105903〜107914を含む）を得た。５’ロングアーム及び３’ショートアームを、それぞれ、プラスミドｐＰＮＴ（Cell,
1991, 65(7), 1153-1163）のＸｈｏＩサイト及びＸｂａＩサイトへ挿入してターゲッティングベクターを完成した。【００４６】
（２）相同組み換えＥＳ細胞の取得
得られたターゲッティングベクターを制限酵素ＮｏｔＩで切断し、ＥＳ細胞株Ｒ１（Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol 90, 8424-8428,
1993）へ電気穿孔法で導入した。Ｇ４１８を含んだ培地でＥＳ細胞を培養し、耐性株を得た。ＥＳ細胞からＤＮＡを抽出し、相同組み換えのみが起きているクローンをサザンブロット解析によって同定した。具体的には、ＡＧＦのエクソン４とエクソン５を含む、配列番号８（GCCCATGGAGGGATTGTGCAGAGGCTCACGGGGCAGGTCACTGGCAGAGTGGAGTGTATGACCTGCGGCTGGGCCGTCGTGTAGTAGCCGTGTGGTGTGAACAGCAGCAGGAAGTGGAGGCTGGACTGTCATCCAGAGACGGCAGGACGGCTCTGTCAACTTCTTCACCAACTGGCAGCACTACAAGGTGTGTGCTTGTGGTGGGGGTGTCAGAGACTGCTGGGCAGAGAGGACGCCCCCACCCTCTTCCTCCTACCCTTCCAGGCGGGCTTTGGGCGTCCAGAAGGAGAATACTGGCTGGGCCTGGAACCTGTGCATCAGGTGACAAGCCGTGGGGACCACGAGCTGCTGATACTCCTAGAGGACTGGGGGGGCCGTGCAGCACGCGCCCACTACGACAGCTTCTCCTTGGAGCCTGAGAGTGACCACTACCGTCTGCGGCTTGGCCAGTACCACGGCGATGCCGGAGACTCCCTCTCTTGGCACAATGACAAAACCTTTCAGCACTGTGGATAGGGACAGAGACTCATATTCTGマウス）で表される塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断したＤＮＡを用いてサザンブロット解析を行った。その結果、野生型の４．６Ｋｂに対して相同組換えでは６．５ＫｂのＤＮＡ断片を検出することができた。【００４７】
（３）ＡＧＦ  ＫＯマウスの作製
得られたＥＳ細胞株を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとＤＢＡ／２マウス交雑第２代であるＢＤＦ２マウスより得た胚盤胞へマイクロインジェクションし、操作胚を子宮へ移植した。操作胚を移植し妊娠したマウスより、キメラマウスを出産させた。キメラマウスをＣ５７ＢＬ／６マウスと交配することによって、ＡＧＦの開始コドンを欠失した変異アレルを持つヘテロ接合体マウス（以下、ＡＧＦヘテロＫＯマウスと称する）を得た。ＡＧＦヘテロＫＯマウス同士の交配によってホモ接合体マウス（以下、ＡＧＦホモＫＯマウスと称する）を得た。仔マウスの尻尾より単離したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、マウスの遺伝子型を、ＰＣＲによって生じるＤＮＡ断片のサイズによって確かめた。すなわち、尻尾をプロテイナーゼＫで処理し、ＤＮＡをフェノール・クロロホルム抽出した。抽出したＤＮＡは、イソプロパノール沈殿及びエタノール沈殿によって回収し、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液（以下、ＴＥ溶液と称する）に溶解した。ネオマイシン耐性遺伝子配列及びターゲッティングによって欠失するゲノム配列に基づいて次の塩基配列からなるプライマーをデザインした。
（ネオマイシン耐性遺伝子）
フォワードプライマー：配列番号９（5'-agaggctattcggctatgac-3'人工配列）
リバースプライマー：配列番号１０（5'-caccatgatattcggcaagc-3'人工配列）
（ゲノムDNA）
フォワードプライマー：配列番号１１（5'-tggcctctgttatcatgctc-3'マウス）
リバースプライマー：配列番号１２（5'-ctacctacatccactcctac-3'マウス）【００４８】
得られた仔マウス由来ゲノムＤＮＡについて、前記プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼ（ExTaq；Takara社）を用いて、９５℃（５分間）の熱変性を行った後、９５℃（１分間）、６０℃（１分間）、及び７２℃（１分間）からなるサイクルを３０サイクル実施し、更に７２℃（７分間）の伸長反応を行い、増幅される断片のサイズを調べた。変異アレルがある場合は、ネオマイシン耐性遺伝子を検出するＰＣＲにおいて５４５ｂｐのバンドが検出され、野生型アレルがある場合は、マウスＡＧＦエクソン１を含むゲノムＤＮＡを検出するＰＣＲにおいて３２２ｂｐのバンドが検出される。これらの結果より、マウスの遺伝子型を判定した。その結果、ＡＧＦホモＫＯマウスでは、変異アレルのバンドが検出され、野生型アレルのバンドが検出されず、ＡＧＦヘテロＫＯマウスでは、変異アレルのバントと野生型アレルのバンドが共に検出され、野生型マウス［以下、リターメイト（Littermate）ＷＴマウスと称する］では変異アレルのバンドが検出されず、野生型アレルのバンドが検出された。【００４９】
また、前記参考例１（２）のサザンブロット解析を行なうことでも、マウスの遺伝子型を調べた。その結果、ＡＧＦホモＫＯマウスでは、変異アレルの６．５ｋｂｐのバンドが検出され、ＡＧＦヘテロＫＯマウスでは、変異アレルの６．５ｋｂｐのバントと野生型アレルの４．６ｋｂｐのバンドが共に検出され、リターメイトＷＴマウスでは野生型アレルの４．６ｋｂｐのバンドが検出された。【００５０】
更に、ＡＧＦ  ＫＯマウスから採血した血液を３７℃に３０分間静置後、遠心し、その上清から血清を得た。血清をリシス（lysis）バッファー［0.5mol/L HEPES (pH7.2), 1% TritonX-100, 10%グリセロール,
10mmol/L Na4P2O7, 0.1mol/L NaF, 0.1mmol/L Na3VO4,
4mmol/L EDTA (pH8) , 0.05mg/mL アプロチニン, 1mmol/L PMSF, 0.1mmol/L ロイペプチ
ン, 0.025mmol/L ペプスタインA］で２０倍希釈したものを２×ＳＤＳサンプルバッファーで倍量希釈した。１レーン当たり２０μＬを１０％アクリルアミドゲルにて電気泳動を行い、ウエスタンブロッティングを行なった。ウエスタンブロッティングは、ブロッキング剤として５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＴＢＳ−Ｔ［20mmol/L
Tris-HCl (pH 7.5), 150mmol/L NaCl, 0.05%(w/v) Tween20］を、１次抗体として抗マウスＡＧＦ抗体（WO03/083114号公報）を、２次抗体として抗ラビット抗体（ALI3404；BIO
SourCE社）を３％ＢＳＡ含有ＴＢＳ−Ｔで５０００倍に希釈したものを各々使用した。ＡＧＦホモＫＯマウスでは、ＡＧＦのバンドが欠失していることよりＡＧＦの欠損を確認した。【００５１】
《実施例１：ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの作製》
本実施例では、ＣＡＧ（modified chicken beta-actin promoter with CMV-IE enhancer）プロモーター［GENE,
108(1991) 193-200］制御下に全身にマウスＡＧＦを強制発現させたＡＧＦトランスジェニックマウス（以下、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスと称する）を作製した。プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII  ＫＳ（＋）（ストラタジーン社）のマルチクローニングサイトに、ＣＡＧプロモーター（１．７ｋｂ）、ｌｏｘ７１配列、ブラストサイジン遺伝子（ｂｓｒ）、ポリＡシグナル配列（０．５ｋｂ）、ｌｏｘ  Ｐ配列、マウスＡＧＦ  ｃＤＮＡ配列、及びＩＲＥＳ（internal
ribosomal entry site）−β−ｇｅｏ−ポリＡ配列（４．５ｋｂ）を順に挿入したプラスミドを以下の方法で作製した。【００５２】
マウスＡＧＦ全長ｃＤＮＡ（WO03/083114号公報）を鋳型に、配列番号１３（AGAAGCTTCACCATGGGGACCGCCAGGCTAC人工配列）及び配列番号１４（CCGTCGACATTAGATCTTCACAAGCGCAAGCCGGGTC人工配列）で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲ（９５℃で１０分間の反応後、９４℃で１５秒間、６０℃で３０秒間、及び７２℃で２分間からなる反応を４５サイクル実施）を行い、得られたＰＣＲ産物をｐＺＥｒＯ−２クローニングベクター（インビトロジェン社）にサブクローニングした。得られたプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄIIIとＳａｌＩで切断し、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII  ＳＫ（ストラタジーン社）のＨｉｎｄIIIとＳａｌＩサイトへ挿入してマウスＡＧＦ全長遺伝子をもつプラスミドｐＢＳ−ｍＡＧＦを作製した。次に、プラスミドｐＢＳ−ｍＡＧＦにＩＲＥＳ−β−ｇｅｏ−ポリＡ遺伝子を導入するために、この遺伝子を持つプラスミドｐＵ−Ｓａｎ（Hum
Mol Genet 8:387-396 1999）を制限酵素ＳａｌＩとＢｇｌIIで切断してＩＲＥＳ−β−ｇｅｏ−ポリＡ遺伝子を切り出し、ｐＢＳ−ｍＡＧＦのＢｇｌIIとＳａｌＩサイトへ挿入し、マウスＡＧＦ  ｃＤＮＡ配列及びＩＲＥＳ−β−ｇｅｏ−ポリＡ配列を持つプラスミドｐＢＳ−ｍＡＧＦ−βｇｅｏを作製した。【００５３】
ＣＡＧプロモーター、ｌｏｘ７１配列、ｂｓｒ、及びポリＡシグナル配列を持つプラスミドｐＣＡＧｌｏｘ７１ｂｓｒ（Nucleic Acids Res. 1997;25(4):868-872）の、ポリＡシグナルの３’側に、ｌｏｘＰ配列を挿入して、ｂｓｒとｐｏｌｙＡシグナルをｌｏｘ７１配列とｌｏｘＰ配列で挟んだ構造を持つプラスミドを作製した。すなわち、ｌｏｘＰを含むリン酸化（kination）処理した８１ｂｐの断片（配列番号１５：GATCCGGAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCCCTCGACCTGCAGCCCGGGGGATC：人工配列）を、制限酵素ＳｍａＩでの切断後ＢＡＰ（bacterial
alkaline phosphatase）処理したプラスミドｐＣＡＧｌｏｘ７１ｂｓｒへ挿入し、プラスミドｌｏｘＰ−ｌｏｘ７１を作製した。プラスミドｌｏｘＰ−ｌｐｘ７１に挿入されたｌｏｘＰ配列を確認するために、Ｔ３プライマー（配列番号１６：AATTAACCCTCACTAAAGGG）を用いてシークエンシングを行い、挿入したｌｏｘＰ配列を含む領域の塩基配列を調べた。その結果、Ｔ３プライマーで読んだ塩基配列が、前記配列番号１５で表される塩基配列と一致し、ｌｏｘＰとｌｏｘ７１が同じ方向であることを確認した。プラスミドｌｏｘＰ−ｌｏｘ７１を制限酵素ＳｐｅＩで切断し、得られたＣＡＧプロモーター、ｌｏｘ７１配列、ｂｓｒ、ポリＡシグナル配列、及びｌｏｘＰ配列を含む断片を、プラスミドｐＢＳ−ｍＡＧＦ−βｇｅｏのＳｐｅＩサイトへ挿入し、目的のプラスミドｐＢＳ−ｌｏｘＰ−ｌｏｘ７１−ｍＡＧＦ−βｇｅｏを作製した。得られたプラスミドｐＢＳ−ｌｏｘＰ−ｌｏｘ７１−ｍＡＧＦ−βｇｅｏの構造を図１に示す。このプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩで切断し、直鎖ＤＮＡ断片［ＣＡＧプロモーター（promoter）、ｌｏｘ７１配列、ｂｓｒ、ポリＡシグナル配列（ｐＡ）、ｌｏｘ  Ｐ配列、マウスＡＧＦ  ｃＤＮＡ配列、及びＩＲＥＳ−β−ｇｅｏ−ポリＡ配列（ｐＡ）を含む］を得た。【００５４】
ＴＴ２  ＥＳ細胞［Anal. Biochem., 1993, 214(1): 70-76］に電気穿孔法で前記直鎖ＤＮＡ断片を導入した（０．８Ｖ，３μＦ）。４μｇ／ｍＬブラストサイジン存在下でＥＳ細胞を培養して、遺伝子が導入された細胞を選択し、２０クローンを樹立した。これらの細胞にＣＡＧ−Ｃｒｅベクター（Blood,
1326-1333, Vol100, 2002）をサークルのまま電気穿孔法で導入した（０．８Ｖ，３μＦ）。【００５５】
ＣＡＧプロモーターによって発現したＣｒｅリコンビナーゼが、ｌｏｘ７１−ｌｏｘＰ間の遺伝子を除去すれば、ＡＧＦ及びβ−ｇｅｏがＣＡＧプロモーター活性によって発現する。そこで、β−ｇｅｏ発現クローンを選択するために、Ｇ４１８（２００μｇ／ｍＬ）存在下でＥＳ細胞を培養し、ｌｏｘ７１−ｌｏｘＰ間が除去された遺伝子構造を持つ細胞を選択した。この段階で選ばれた１５クローンの細胞は、ＣＡＧプロモーター（１．７ｋｂ）、ｌｏｘ７１配列、マウスＡＧＦ  ｃＤＮＡ配列、及びＩＲＥＳ−β−ｇｅｏ−ポリＡ配列（４．５ｋｂ）をもち、ＣＡＧプロモーターの制御下にＡＧＦが恒常的に発現しているＥＳ細胞となる。ＣＡＧ−Ｃｒｅベクターを導入する前のｌｏｘ７１−ｌｏｘＰ間が除去されていない各クローンのＥＳ細胞をネガティブコントロールとして、選ばれた１５クローンのＥＳ細胞でＡＧＦが発現していることを、参考例１（３）と同様の抗ＡＧＦ抗体を用いたウエスタンブロッティングで確認した。すなわち、ＥＳ細胞をリシスバッファー及び２×ＳＤＳサンプルバッファーで２倍希釈したものをサンプルとしてウエスタンブロッティングを行い、ＡＧＦが発現していることを確認した。ＡＧＦの発現を確認したＥＳ細胞の中から、８−１、８−２、及び９−１の３ラインを選び、これを各々胚盤胞へマイクロインジェクションし、操作胚を子宮へ移植した。操作胚を移植し妊娠したマウスより、キメラマウスを出産させた。キメラマウスをＣ５７ＢＬ／６マウスと交配することによってＣＡＧプロモーターの制御下にＡＧＦが恒常的に発現しているトランスジェニックマウスを得た。トランスジェニックマウスを同定するため、仔マウスの尻尾より単離したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。尻尾をプロテイナーゼＫで処理し、ＤＮＡをフェノール・クロロホルム抽出した。抽出したＤＮＡは、イソプロパノール沈殿及びエタノール沈殿によって回収し、ＴＥ溶液に溶解した。【００５６】
マウスＡＧＦ  ｃＤＮＡ配列及びＬａｃＺ配列に基づいて次の塩基配列からなるプライマーをデザインした。
（ＡＧＦ）
フォワードプライマー：配列番号１７（5'-cccactacgacagcttctcc-3'マウス）
リバースプライマー：配列番号１８（5'-agccgggtcaacataacagc-3'マウス）
（ＬａｃＺ）
フォワードプライマー：配列番号１９（5'-gcgttacccaacttaatcg-3'人工配列）
リバースプライマー：配列番号２０（5'-tgtgagcgagtaacaacc-3'人工配列）
このプライマーを用いてＰＣＲを行うと、導入遺伝子からは、ＡＧＦ  ｃＤＮＡを検出するＰＣＲにおいて３２５ｂｐ断片が増幅され、ＬａｃＺを検出するＰＣＲにおいては３２０ｂｐ断片が増幅され、マウスゲノムＤＮＡからはこれらのサイズの断片は増幅されないはずである。前記プライマーを用いて、得られた仔マウス由来ゲノムＤＮＡについてＰＣＲを行った。ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼ（ExTaq；Takara社）を用いて、９４℃（５分間）熱変性を行った後、９４℃（１分間）、６２℃（１分３０秒間）、及び７２℃（１分３０秒間）からなるサイクルを２８サイクル実施し、更に７２℃（７分間）の伸長反応を行い、増幅される断片のサイズを調べた。その結果、３ラインとも、ＡＧＦ  ｃＤＮＡを検出するＰＣＲ及びＬａｃＺを検出するＰＣＲ共にバンドが確認された。すなわち、３ラインともジャームライントランスミッションを確認し、それぞれＣＡＧプロモーターの制御下にＡＧＦが恒常的に発現しているトランスジェニックマウスであることが確認された。【００５７】
《実施例２：ＣＡＧ−ＡＧＦ  ＴｇマウスのＡＧＦ遺伝子発現》
実施例１で作製したＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスで、ＡＧＦ遺伝子がどの程度発現しているかを調べた。ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及び同腹の野生型マウス（リターメイトＷＴマウス）の白色脂肪（ＷＡＴ）、褐色脂肪（ＢＡＴ）、大脳、小脳、視床下部、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、骨格筋、及び膵臓の各組織よりトリゾール試薬（Invitrogen社）を用いて総ＲＮＡを調製した。市販のＲＮＡ精製試薬（RNeasy；キアゲン社）及びＤＮアーゼ（キアゲン社）を用いて総ＲＮＡをＤＮアーゼ処理及びクリーンアップした。ＤＮアーゼ処理した総ＲＮＡ０．５μｇを、スーパースクリプト・ファーストストランドシステム（ＲＴ−ＰＣＲ用）（LIFE
TECHNOLOGIES社）を用いてｃＤＮＡに変換した。【００５８】
ＡＧＦ及び内部標準の１８ＳリボゾーマルＲＮＡ（18SrRNA）の発現量は定量ＰＣＲ法で行なった。定量ＰＣＲは、シークエンスディテクションシステム（ABI PRISM 7900HT
Sequence Detection System；Applied Biosystems社）を用いて、リアルタイムの蛍光量を計測することで測定した。鋳型としてｃＤＮＡを、プライマーとして各遺伝子毎にデザインしたプライマー及びタックマンプローブ（Taq
Man probe）を使用した。ＡＧＦ遺伝子の発現量測定には、プライマーとして配列番号２１（TCGTGTAGTAGCCGTGTGGTGTマウス）と配列番号２２（CACCTGATGCACAGGTTCCAマウス）を用い、ＰＣＲ試薬として市販の試薬（SYBR
Green PCR Master Mix；アプライドバイオシステムズ社）を用いてＰＣＲを行った。１８ＳｒＲＮＡの発現量測定には、プライマーとして配列番号２３（TGGTTGATCCTGCCAGTAGマウス）と配列番号２４（CGACCAAAGGAACCATAACTマウス）を、タックマンプローブとして配列番号２５（CCGGTACAGTGAAACTGCGAATGマウス）を用い、ＰＣＲ試薬として市販の試薬（TaqMan
Universal PCR Master Mix；アプライドバイオシステムズ社）を使用してＰＣＲを行った。【００５９】
ＰＣＲの反応は、９５℃（１０分間）の初期変性反応を実施した後、９４℃（１５秒間）と６０℃（６０秒間）からなるサイクル反応を４５回繰り返すことにより実施した。遺伝子発現量算出の標準曲線は、上記ｃＤＮＡ又はマウスゲノムＤＮＡを鋳型として用いて同様の反応を行ない、遺伝子の発現量はサンプル間の相対値で算出した。
その結果、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの組織では、ＷＴマウスの組織に比べてＡＧＦ遺伝子の発現量が上昇していることが判った。特に、骨格筋、ＢＡＴ、心臓での発現上昇が顕著であった。【００６０】
《実施例３：遺伝子改変マウスの体重変化》
（１）ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの体重変化
ＣＡＧ−ＡＧＦ  ＴｇマウスをＣ５７ＢＬ／６に２世代戻し交配し、Ｆ２のＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスを得た。ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスを標準食（CE-2；クレア社）で通常に飼育した。６週齢の雌マウスの体重を比較したところ、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスは１５．７ｇ±０．８ｇ（ＳＤ）、ＷＴマウスは１７．８ｇ±０．５ｇ  （ＳＤ）であり、１２週齢の雌マウスの体重を比較したところ、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスは１９．５ｇ±０．７ｇ（ＳＤ）、ＷＴマウスは２３．５ｇ±２．５  ｇ  （ＳＤ）であり、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの方が体重が少ないことが判った。【００６１】
次に、同じマウスを引き続き高脂肪食負荷して体重の変動を調べた。高脂肪食（high fat diet 32；クレア社）で通常に１２週間飼育し、体重の変動を調べた。その結果、１２週間での体重増加量が、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスは、７．１ｇ±１ｇ（ＳＤ）であったのに対して、ＷＴマウスは２１．８ｇ±４ｇ（ＳＤ）であった。これらのことより、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスでは、標準食での体重増加抑制、高脂肪食での顕著な体重増加抑制があることが判り、ＡＧＦに体重増加抑制作用があることが判った。【００６２】
（２）ＡＧＦ  ＫＯマウスの体重変化
ＡＧＦホモＫＯマウス、ＡＧＦヘテロＫＯマウス、及びリターメイトＷＴマウスを標準食で通常に飼育した。１週間毎に２４週齢まで各マウスの体重を測定した。結果を図２に示す。図２に示すように、ＡＧＦホモＫＯマウスでは、約１２週齢より、ＷＴマウスに比べて体重が重くなり始め、その後も体重増加が続き、顕著な肥満となることが判った。ＡＧＦヘテロＫＯマウスでは、ＡＧＦホモＫＯマウスとリターメイトＷＴマウスの中間的な表現型となった。【００６３】
《実施例４：遺伝子改変マウスの臓器重量変化》
（１）ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの臓器重量変化
ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスでは体重増加が抑制されていることが判ったが、その原因を明らかにするために、臓器の重量を測定した。ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスの、生殖器脂肪（ＷＡＴ）、褐色脂肪（ＢＡＴ）、肝臓、心臓、腎臓、及び脾臓の各組織を採取し、体重当たりの組織重量を計測した。標準食で飼育した１２週齢のマウスと、高脂肪食で１２週齢〜２４週齢の１２週間飼育したマウスで調べた。その結果、褐色脂肪、肝臓、心臓、腎臓、及び脾臓では、標準食飼育及び高脂肪食飼育共に、ＣＡＧ−ＡＧＦ  ＴｇマウスとＷＴマウスで組織重量の変化はなかった。一方、生殖器脂肪（白色脂肪組織）は、標準食飼育及び高脂肪食飼育共に、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの方が、ＷＴマウスよりも体重当たりの組織重量が減少していた。すなわち、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスで体重増加が抑制されていたのは、白色脂肪組織の重量増加が抑制されていたためであることが示された。すなわち、ＡＧＦは、他の臓器重量には何ら影響を与えず、肥満などに伴う脂肪組織重量の増加を抑制する作用があることが判った。白色脂肪組織に関する結果を図３（標準食）及び図４（高脂肪食負荷）に示す。【００６４】
（２）ＡＧＦ  ＫＯマウスの臓器重量変化
ＡＧＦ  ＫＯマウスでは体重が増加していることが判ったが、その原因を明らかにするために、臓器の重量を測定した。標準食で飼育した２０週齢雌のＡＧＦホモＫＯマウス、ＡＧＦヘテロＫＯマウス、及びリターメイトＷＴマウスの、生殖器脂肪（ＷＡＴ）、褐色脂肪（ＢＡＴ）、肝臓、心臓、腎臓、及び脾臓の各組織を採取し、体重当たりの組織重量を計測した。その結果、褐色脂肪、肝臓、心臓、腎臓、及び脾臓は、ＡＧＦホモＫＯマウス、ＡＧＦヘテロＫＯマウス、及びＷＴマウスで組織重量の変化はなかった。一方、生殖器脂肪は、ＡＧＦホモＫＯマウスの方が、ＷＴマウスよりも、マウス個体当たり及び体重当たりの組織重量が増加していた。ＡＧＦヘテロＫＯマウスは、ＡＧＦホモＫＯマウスとＷＴマウスの中間的な組織重量となった。すなわち、ＡＧＦ  ＫＯマウスで体重が増加していたのは、生殖器脂肪組織等の白色脂肪組織の重量が増加していたためであることが示された。このことより、ＡＧＦ  ＫＯマウスは、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスと逆の表現型となることが明らかとなり、ＡＧＦの生理活性として他の臓器重量には影響を与えずに脂肪組織の重量増加抑制作用があることが明らかとなった。生殖器脂肪組織（白色脂肪組織）に関する結果を図５（白色脂肪組織重量）及び図６（白色脂肪組織重量／体重）に示す。【００６５】
《実施例５：遺伝子改変マウスの脂肪細胞形態変化》
（１）ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの脂肪細胞形態変化
高脂肪食負荷することで白色脂肪組織の重量が増大し、更に脂肪細胞が肥大化することが知られている。脂肪細胞の肥大化は糖尿病の悪性化と関連があることが知られている（医学のあゆみ，１９２，５１３−５１８，２０００；医学のあゆみ，１９２，５４１−５４５，２０００）ため、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの脂肪細胞の形態を調べた。高脂肪食で１２週齢〜２４週齢の１２週間飼育したＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスの生殖器脂肪組織を採取し、１０％中性緩衝ホルマリン液（Wako）で固定し、パラフィン包埋後、薄切切片の作製及びヘマトキシレンーエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を行なった。結果を図７に示す。リターメイトＷＴマウス（ＮＴＧ）では、脂肪細胞が肥大化していたが、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス（ＴＧ）では、脂肪細胞の肥大化が抑制されて、ほぼ正常の大きさに維持されていた。【００６６】
（２）ＡＧＦ  ＫＯマウスの脂肪細胞形態変化
糖尿病モデルマウスや肥満モデルマウスでは、脂肪組織の重量増大に伴って脂肪細胞が肥大化していることが知られている［Diabetologia, 14(3), 141-148, 1978］。脂肪細胞の肥大化は糖尿病の悪性化と関連があることが知られているため、ＡＧＦ  ＫＯマウスの脂肪細胞の形態を調べた。ＡＧＦホモＫＯマウス及びリターメイトＷＴマウスの生殖器脂肪組織（ＷＡＴ）及び褐色脂肪組織（ＢＡＴ）を採取し、１０％中性緩衝ホルマリン液で固定し、パラフィン包埋後、薄切切片の作製及びヘマトキシレンーエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を行なった。結果を図８（ＡＧＦホモＫＯマウス）及び図９（リターメイトＷＴマウス）に示す。リターメイトＷＴマウスのＷＡＴは、脂肪細胞が正常の大きさであったが、ＡＧＦホモＫＯマウスのＷＡＴは、脂肪細胞が肥大化していることが判った。更に、ＡＧＦホモＫＯマウスではリターメイトＷＴマウスに比べてＢＡＴでの脂肪の蓄積が観察された。【００６７】
《実施例６：遺伝子改変マウスの組織中トリグリセリド含量変化》
（１）ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの組織中トリグリセリド含量変化
肥満では、脂肪組織の増大に加えて、骨格筋や肝臓中でのトリグリセリド（ＴＧ）含量の増加が起きることが知られている（日本臨床、1995年、53巻、1995年特別号、肥満症、p354-p358）。そこでＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの骨格筋（腓腹筋）及び肝臓組織中のＴＧ含量を調べた。ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス（Ｔｇ）及びリターメイトＷＴマウス（ＷＴ）を高脂肪食（high
fat diet 32；クレア社）で１箇月間及び３箇月間飼育し、各マウスの骨格筋及び肝臓組織から、クロロホルム−メタノール溶液を用いて、組織中のＴＧを抽出した（生化学実験講座３、脂質の化学、東京化学同人）。抽出したＴＧの濃度をキット（トリグリセライドＥテストワコー；和光純薬工業社）を用いて測定し、組織中のＴＧ含量を求めた。結果を図１０（肝臓）及び図１１（骨格筋）に示す。骨格筋と肝臓共にＣＡＧ−ＡＧＦ  ＴｇマウスはＷＴマウスに比べて、組織中のＴＧ含量が減少していることが判った。このことより、肥満によって増加することが知られている骨格筋や肝臓中のＴＧ含量を、ＡＧＦが減少させる活性があることが明らかとなった。【００６８】
（２）ＡＧＦ  ＫＯマウスの組織中ＴＧ含量
ＡＧＦ  ＫＯマウスの骨格筋（腓腹筋）及び肝臓組織中のＴＧ含量を調べた。ＡＧＦ  ＫＯマウス及びリターメイトＷＴマウスの骨格筋及び肝臓組織から前記（１）の方法で、組織中のＴＧを抽出した。抽出したＴＧの濃度をキット（トリグリセライドＥテストワコー；和光純薬工業社）を用いて測定し、組織中のＴＧ含量を求めた。結果を図１２に示す。ＡＧＦ  ＫＯマウスはＷＴマウスに比べて、骨格筋及び肝臓組織中のＴＧ含量が顕著に増加していることが判った。ＡＧＦ  ＫＯマウスはＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスと逆の表現型となることが判り、ＡＧＦの生理活性として、骨格筋や肝臓中のＴＧ含量を減少させる活性があることが明らかとなった。【００６９】
《参考例２：ＡＧＦ  ＫＯマウスの血糖値及び血中インスリン濃度変化》
ＡＧＦホモＫＯマウス及びリターメイトＷＴマウスの糖負荷試験を行い、血糖値及び血中インスリン濃度を調べた。マウスを１６時間絶食後、１ｇ／ｋｇのＤ−グルコースを腹腔内注射（ｉｐ）による投与し、投与前、並びに投与後１５、３０、６０、及び１２０分後に眼静脈より採血した。グルテストエース（三和化学研究所）を用いて血糖値を、ＲＩＡ２抗体法（ＳＲＬ社）を用いて血中インスリン濃度を測定した。結果を図１３（血糖値）及び図１４（血漿インスリン）に示す。【００７０】
ＷＴマウスは、糖負荷により上昇した血糖値が投与後３０分後から減少し始めるのに対して、ＡＧＦホモＫＯマウスは、糖負荷によって血糖値がより大きく上昇し、投与後６０分後でも血糖値は減少し始めなかった。これらのことより、ＡＧＦホモＫＯマウスでは耐糖能異常が起きていることが判った。血中インスリン濃度は、ＷＴマウスでは、糖負荷によりインスリン濃度が上昇したが、ＡＧＦホモＫＯマウスでは、糖負荷前から血中インスリン濃度が顕著に高値であり、高インスリン血症の状態にあることが判った。これらのことより、ＡＧＦ遺伝子を欠失したＡＧＦホモＫＯマウスでは、糖尿病が惹起されることが判り、ＡＧＦに抗糖尿病作用があることが明らかとなった。【００７１】
《実施例７：ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの酸素消費量》
ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスの酸素消費量を測定した。酸素消費量測定装置（OXYMAX；Columbus Instruments社）を用いて、絶食下で、マウスの酸素消費量を２４時間に渡り計測した。計測方法は酸素消費量測定装置に添付の取扱説明書に従った。ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウス各１４匹の、酸素消費量を計測し、明期の１２時間（７：００〜１９：００）、暗期の１２時間（１９：００〜７：００）、及び２４時間の酸素消費量を求め、ＣＡＧ−ＡＧＦ  ＴｇマウスとＷＴマウス間で比較した。結果を図１５に示す。何れの時間帯においても、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの酸素消費量（ＶＯ２）がＷＴマウスに比較して多いことが判った。この結果、ＡＧＦには酸素消費量を亢進する活性があることがわかった。酸素消費量とエネルギー消費量は相関するので、酸素消費量が亢進することで、抗肥満の作用がある［FEBS
Letters, 491(1-2): 154-158, 2001］。ＡＧＦには酸素消費量を亢進する活性があることが判ったので、ＡＧＦには抗肥満作用があることが裏付けられた。【００７２】
《実施例８：ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの組織中の遺伝子発現変動》
ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの褐色脂肪組織（ＢＡＴ）及び骨格筋での、ＵＣＰ（Uncoupling Protein）遺伝子及びＰＰＡＲ（Peroxisome Proliferator-Activated
Receptor）遺伝子の発現変動を調べた。ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスのＢＡＴ及び骨格筋組織から、実施例２と同様の方法で、総ＲＮＡを調製し、ＤＮアーゼ処理後、ｃＤＮＡ合成した。ＵＣＰ１、ＵＣＰ３、ＰＰＡＲ−α、ＰＰＡＲ−δ、及びβ−アクチンの発現量は定量ＰＣＲ法で行なった。定量ＰＣＲは、実施例２に記載の方法と同様の方法で実施した。各遺伝子の定量ＰＣＲで用いたプライマーとしては表１に記載のプライマーを用いた。また、市販のＰＣＲ試薬として、β−アクチンについてはSYBR
Green PCR Master Mix（アプライドバイオシステムズ）を、ＵＣＰ１、ＵＣＰ３、ＰＰＡＲ−α、及びＰＰＡＲ−δについては、TaqMan
Universal PCR Master Mix（アプライドバイオシステムズ）を使用した。【００７３】
【表１】
2005097171.tif 000002
【００７４】
その結果、ＣＡＧ−ＡＧＦ  ＴｇマウスのＢＡＴではＵＣＰ１が発現誘導していること、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの骨格筋ではＵＣＰ３、ＰＰＡＲ−α、及びＰＰＡＲ−δが発現誘導していることが判った。すなわち、ＡＧＦは、ＢＡＴではＵＣＰ１を発現誘導させ、骨格筋ではＵＣＰ３、ＰＰＡＲ−α、及びＰＰＡＲ−δを発現誘導させることが判った。このことより、ＡＧＦによる熱消費を亢進させるＵＣＰの発現亢進、熱消費や脂質代謝を亢進させるＰＰＡＲの発現亢進が、ＡＧＦによる酸素消費量の亢進、体重増加抑制、及び脂肪組織重量増加抑制等の作用のメカニズムの一つであることが明らかとなった。【００７５】
《実施例９：マウスＡＧＦとヒトＡＧＦの発現及び精製》
ヒトＡＧＦ及びマウスＡＧＦをWO03/083114号公報（実施例１９）に記載の方法に従って発現し、精製した。すなわち、ＰＣＲにより得られた約１．４ｋｂｐ（ヒト）又は約１．３ｋｂｐ（マウス）のＤＮＡ断片をプラスミドｐｃＤＮＡ−Ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧに挿入して得られた発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞に導入した。ヒトＡＧＦ及びマウスＡＧＦの発現細胞株の培養上清を、抗ＦＬＡＧ−Ｍ２モノクローナル抗体アガロースアフィニティーゲル（ANTI-FLAG
M2 Monoclonal Antibody Agarose Affinity Gel；Sigma社）を用いてアフィニティー精製してヒト及びマウスのリコンビナントＡＧＦタンパク質を得た。【００７６】
《実施例１０：マウスＡＧＦ発現アデノウイルスの作製》
マウスＡＧＦの全長ｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＣＲ２．１−ｍＮｅｗ（WO03/083114号公報の実施例１で作製）を鋳型として、フォワードプライマー（AATCTAGACACCATGGGGACCGCCAGGCTACG；配列番号４０）とリバースプライマー（AAGCGGCCGCCAAGCGCACAAGCCGGGTCAA；配列番号４１）を使用してＰＣＲ（ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを用い、９５℃１０分間の後、９４℃１５秒、６０℃３０秒、７２℃２分のサイクルを４５回）を実施した。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社製）にサブクローニング後、制限酵素ＸｂａＩとＮｏｔＩで切断し、ＸｂａＩとＮｏｔＩで切断したＣ末端ＦＬＡＧ付加型発現ベクターｐＣＥＰ４ｄＥ２−ＦＬＡＧ（WO02/42448号公報の実施例２と同様に作製）に挿入して、ｐＣＥＰｄＥ２−ｍＡＧＦ−ＦＬＡＧを得た。ｐＣＥＰｄＥ２−ｍＡＧＦ−ＦＬＡＧを鋳型として、フォワードプライマー（GAAGATCTACCATGGGGACCGCCAGGCTACGC；配列番号４２）とリバースプライマー（CCGCTCGAGTGATGGGACAGTCACAAGCGC；配列番号４３）を使用してＰＣＲ（ＰｙｒｏＢｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを用い、９５℃２分間の後、９８℃２０秒、６０℃３０秒、７２℃１分３０秒のサイクルを２０回、続いて７２℃７分）を実施した。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社製）にサブクローニング後、制限酵素ＢｇｌIIとＸｈｏＩで切断し生じた約１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を、アデノウイルス作製用シャトルベクターｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶ（Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 95:2509-2514, 1998）のＢｇｌII、ＸｈｏＩ部位に挿入して、ｐＡｄＴｒａｃＫ−ＣＭＶ−ｍＡＧＦを完成させた。このプラスミド又はコントロールとしてｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶ（空ベクター）を用い、ウイルス粒子を調製した。具体的には、以下の方法により調製した。【００７７】
大腸菌ＢＪ５１８３（stratagene社製）を、プラスミドｐＡｄＥａｓｙ−１（He T.-C.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
95, 2509-2514, 1998）でトランスフォームして、プラスミドｐＡｄＥａｓｙ−１を含む大腸菌ＢＪ５１８３［以下、大腸菌ＢＪ５１８３（ｐＡｄＥａｓｙ−１）と称する］を作製した。先に調製したプラスミドｐＡｄＴｒａｃＫ−ＣＭＶ−ｍＡＧＦ又はｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶを制限酵素ＰｍｅＩで切断し、これを用いて大腸菌ＢＪ５１８３（ｐＡｄＥａｓｙ−１）をトランスフォームした。プラスミドｐＡｄＥａｓｙ−１とプラスミドｐＡｄＴｒａｃＫ−ＣＭＶ−ｍＡＧＦ又はｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶとがリコンビネーションしたクローンを選択するために、得られたトランスフォーマントのクローンからプラスミドを調製して、制限酵素ＰａｃＩによる切断パターンを調べた。３ｋｂ又は４．５ｋｂのエキストラバンド（extra
band）が出現するクローンを選択することにより、プラスミドのアーム部位で、デザインどおりにリコンビネーションを起こしたクローンを得た。
得られたウイルス粒子濃度は、WO02/42448号公報の実施例１５と同様の方法で求めた。【００７８】
《実施例１１：アデノウイルスを用いたマウスＡＧＦタンパク質の発現》
実施例１０にて調製したマウスＡＧＦタンパク質発現アデノウイルス及びｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶコントロールアデノウイルスをヒト胎児腎臓細胞株２９３（ATCC番号：CRL-1573）に、細胞１個当たりおよそ１００個のウイルス粒子になるように感染させた。具体的には、Ｉ型コラーゲンでコートした６穴プレート（旭テクノグラス）に３×１０５で２９３細胞を蒔き、２ｍＬの１０％ＦＢＳ／ペニシリン１００ＩＵ／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ／ＤＭＥＭ培地で１晩培養した後、アデノウイルス６×１０７粒子を添加し、１晩培養し、２ｍＬのペニシリン１００ＩＵ／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ／ＤＭＥＭ培地に置換した。感染後２日目に培養上清を回収し、３，０００回転／分で５分間の遠心分離を行い、上清をゲル濃度４−２０％のグラジェントゲル（第一化学薬品）でＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を実施した。一次抗体として抗マウスＡＧＦ抗体（WO03/083114号公報の実施例５で作製）、二次抗体として西洋わさびパーオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（Biosource社製）を用いたウエスタンブロッティングを行った。コントロールアデノウイルスにより感染させた上清をサンプルとした場合には検出されず、マウスＡＧＦタンパク質発現アデノウイルスにより感染させた上清をサンプルとした場合にのみ、予想されるマウスＡＧＦ分子量にバンドが検出され、実施例１０で作製したマウスＡＧＦタンパク質発現アデノウイルスにより、実施例１１の方法でマウスＡＧＦタンパク質が発現されることがわかった。【００７９】
《実施例１２：ヒトＡＧＦ発現アデノウイルスの作製》
ヒトＡＧＦの全長ｃＤＮＡを含有するプラスミド（WO03/083114号公報の実施例１８で作製；以下、ｐＣＲ２．１−ｈＮｅｗ）を鋳型として、フォワードプライマー（CCAAGCTTACCATGGGGAAGCCCTGGCTGCGTGCGCTACAG；配列番号４４）とリバースプライマー（AACTCGAGCAGCTTCAGGGGCCGAATGAGCATGGC；配列番号１）を使用してＰＣＲ（ＰｙｒｏＢｅｓｔＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）を用い５％ホルムアミド存在下で９８℃２０秒、６４℃３０秒、７４℃３分のサイクルを３５回繰り返した）を実施した。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社製）にサブクローニング後、制限酵素ＨｉｎｄIIIとＸｈｏＩで切断し、ＨｉｎｄIIIとＸｈｏＩで切断したｐＣＥＰ４（Invitrogen）に挿入して、ｐＣＥＰ−ｈＡＧＦを得た。ｐＣＥＰ−ｈＡＧＦを制限酵素ＫｐｎＩ及びＭｌｕＩで切断し生じた約０．４３ｋｂｐのＤＮＡ断片、全長ヒトＡＧＦ  ｃＤＮＡを含む発現プラスミド（WO03/083114号公報の実施例１９で作製；以下、ｐｃＤＮＡ−ＳＦ−ｈＡＧＦ）を制限酵素ＭｌｕＩ及びＸｈｏＩで切断し生じた約０．９８ｋｂｐのＤＮＡ断片を、アデノウイルス作製用シャトルベクターｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶ（Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 95:2509-2514, 1998）のＫｐｎＩ、ＸｈｏＩ部位に挿入して、ｐＡｄＴｒａｃＫ−ＣＭＶ−ｈＡＧＦを完成させた。このプラスミド又はコントロールとしてｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶを用い、WO02/42448号公報の実施例１４及び実施例１５と同様の方法でｐＡｄＥａｓｙシステム（Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 95:2509-2514, 1998）を利用して、ウイルス粒子を調製した。得られたウイルス粒子濃度は、WO02/42448号公報の実施例１５と同様の方法で求めた。【００８０】
《実施例１３：抗ヒトＡＧＦ抗体の作製》
全長ヒトＡＧＦ精製タンパク質（WO03/083114号公報の実施例１９）を、ウサギに免疫して抗体を得た。初回免疫に５００μｇ、２回目〜４回目の免疫に２５０μｇを使用して２週間毎に免疫した。最終免疫後２週間目に、全採血により抗血清を得た。抗血清をプロテインＡカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて精製し、ＩｇＧ抗体（以下、抗ＳＦ−ＹＰ−０３０  ＩｇＧ）を得た。【００８１】
《実施例１４：アデノウイルスを用いたヒトＡＧＦタンパク質の発現》
実施例１０及び実施例１２にて調製したヒトＡＧＦタンパク質発現アデノウイルス及びｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶコントロールアデノウイルスをヒト胎児腎臓細胞株２９３に、実施例１１と同様の方法で感染させ培養上清を得た。一次抗体として実施例１３で作製した抗ＳＦ−ＹＰ−０３０  ＩｇＧを使用すること以外は実施例１１と同じ方法を用いて、培養上清中のヒトＡＧＦタンパク質発現を検出した。その結果、コントロールアデノウイルスにより感染させた上清をサンプルとした場合には検出されず、ヒトＡＧＦタンパク質発現アデノウイルスにより感染させた上清をサンプルとした場合にのみ、予想されるヒトＡＧＦ分子量にバンドが検出され、実施例１２で作製したヒトＡＧＦタンパク質発現アデノウイルスにより、実施例１４の方法でヒトＡＧＦタンパク質が発現されることがわかった。【００８２】
《実施例１５：高脂肪食負荷マウスへのマウスＡＧＦ発現アデノウイルス投与》
雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（クレア社）に８週齢から高脂肪食（high fat diet 32；クレア社）を与えた。高脂肪食負荷マウスは体重が増加し、本試験のウイルス投与時である３８週齢時で約５４ｇと、肥満となった。これらのマウス各４匹に、実施例１０で作製した、マウスＡＧＦ発現アデノウイルス（ｍＡＧＦ−Ａｄｅｎｏ）又はコントロールアデノウイルス（Ｃｏｎｔ−Ａｄｅｎｏ）を、５×１０９ＰＦＵ／マウス／週ずつ、尾静脈注射にて投与した。最初にアデノウイルスを投与してから１２日後の体重が、ｍＡＧＦ−Ａｄｅｎｏ投与マウスで、平均７．３ｇ減少し、Ｃｏｎｔ−Ａｄｅｎｏ投与マウスで１．４ｇ減少した。ｍＡＧＦ−Ａｄｅｎｏ投与マウスでは、ＡＧＦ遺伝子を持つウイルスを投与することで生体内でＡＧＦタンパク質が発現して、このＡＧＦタンパク質が体重減少を引き起こしたことが判った。【００８３】
更にこれらのマウスを用いて、糖代謝試験を実施した。これらのマウスを１６時間絶食後、０．４ｇ／ｋｇのＤ−グルコースを腹腔内注射（ｉｐ）により投与し、投与前、並びに投与後１５、３０、６０、及び１２０分後に眼静脈より採血した。グルテストエース（三和化学研究所）を用いて血糖値を測定した。その結果を図１６に示す。
ｍＡＧＦ−Ａｄｅｎｏ投与マウスは、グルコース投与後のすべての時間においてＣｏｎｔ−Ａｄｅｎｏ投与マウスよりも血糖値が低く、耐糖能が改善していることが明らかとなった。すなわち、ｍＡＧＦ−Ａｄｅｎｏ投与マウスで高発現されたＡＧＦタンパク質の作用により、耐糖能が改善されたことが明らかとなった。【００８４】
《実施例１６：高脂肪食負荷によるＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの血中インスリン及び脂質濃度》
６週齢のＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス（実施例１）及びリターメイトＷＴマウス（雌）を、高脂肪食で１２週間飼育した。眼静脈より採血し、インスリンイムノアッセイ（栄研化学）を用いて血漿中インスリン濃度を、Ｌタイプワコー  コレステロール（和光純薬）を用いて血清コレステロール濃度を、及びＮＥＦＡ  Ｃ−テストワコー（和光純薬）を用いて血清遊離脂肪酸濃度を、各キットに添付のプロトコールに従って測定した。結果を図１７（血漿中インスリン濃度、ｎｇ／ｍＬ）、図１８（血清コレステロール濃度、ｍｇ／ｄＬ）、図１９（血清遊離脂肪酸濃度、μＥｑ／Ｌ）に示す。
その結果、インスリン濃度、コレステロール濃度、遊離脂肪酸濃度の何れも、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス（ＴＧ）の方が、リターメイトＷＴマウス（ＮＴＧ）よりも低いことがわかった。このことより、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスで高発現されたＡＧＦタンパク質の作用により、インスリン感受性が亢進したこと、脂質代謝が改善したことが明らかとなった。【００８５】
《実施例１７：ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの糖代謝試験》
ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス（実施例１）の糖負荷試験を行い、ＡＧＦによる耐糖能改善効果を調べた。４ヶ月齢の雌のＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスを１６時間絶食後、１ｇ／ｋｇのＤ−グルコースを腹腔内注射（ｉｐ）により投与し、投与前、並びに投与後１５、３０、６０、及び１２０分後に眼静脈より採血した。グルテストエース（三和化学研究所）を用いて血糖値を測定した。結果を図２０に示す。
ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスは、グルコース投与後のすべての時間においてリターメイトＷＴマウスよりも血糖値が低く、耐糖能が改善していることが明らかとなった。すなわち、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスで高発現されたＡＧＦタンパク質の作用により、耐糖能が改善されたことが明らかとなった。【００８６】
次に、４ヶ月齢の雌のＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスに、０．７５単位／ｋｇのインスリンを腹腔内投与した。インスリン投与後、２０、４０、及び６０分後に眼静脈より採血し、グルテストエース（三和化学研究所）を用いて血糖値を測定した。インスリン投与前の血糖値に対する、投与後の血糖値の割合を図２１に示す。
ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスはインスリン投与後すべての時間においてリターメイトＷＴマウスよりも血糖値の低下が大きく、インスリン感受性が亢進していたことが判った。すなわち、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスで高発現されたＡＧＦタンパク質の作用により、インスリン感受性が亢進したことが明らかとなった。【００８７】
《実施例１８：Ｋ１４−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの体重及び脂肪重量変化》
Ｋ１４プロモーター制御下にＡＧＦを強制発現させたトランスジェニックマウス（WO03/083114号公報の実施例８）を作製した。
このマウスは、表皮細胞からＡＧＦタンパク質を高発現し、発現したＡＧＦの作用により血管新生、組織再生が引き起こされることが判っている。全身にＡＧＦを高発現したマウスを用いて実施例３、実施例４、及び実施例１７で示したのと同様に、表皮細胞で高発現されたＡＧＦが抗肥満、及び抗糖尿病の作用を示すことを確認した。【００８８】
８ヶ月齢雌のＫ１４−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウス各５匹の体重を測定したところ、Ｋ１４−ＡＧＦ  Ｔｇマウスは平均約２１ｇであり、リターメイトＷＴマウスの平均約３１ｇと比べて、体重が減少していることが明らかとなった。次に、Ｋ１４−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスの横隔膜から腹腔の最下部までの領域を２ｍｍ間隔で、実験動物用Ｘ線ＣＴ（アロカ社製）で撮影し、内臓脂肪組織重量及び皮下脂肪組織重量を計測した。結果を図２２（内臓脂肪組織重量）及び図２３（皮下脂肪組織重量）に示す。
内臓脂肪及び皮下脂肪共にＫ１４−ＡＧＦ  ＴｇマウスのほうがリターメイトＷＴマウスに比べて、顕著に脂肪組織重量が減少していることが明らかとなった。すなわち、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの場合と同様に、発現したＡＧＦに抗肥満作用、及び脂肪組織を減少する作用があることが判った。【００８９】
《実施例１９：Ｋ１４−ＡＧＦ  Ｔｇマウスのインスリン感受性試験》
Ｋ１４−ＡＧＦ  Ｔｇマウスのインスリン感受性を調べた。８ヶ月齢雌のＫ１４−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスに、０．７５単位／ｋｇのインスリンを腹腔内投与した。インスリン投与後、２０、４０、６０、８０、及び１００分後に眼静脈より採血し、グルテストエース（三和化学研究所）を用いて血糖値を測定した。インスリン投与前の血糖値に対する、投与後の血糖値の割合を図２４に示す。
Ｋ１４−ＡＧＦ  Ｔｇマウスはインスリン投与後すべての時間においてリターメイトＷＴマウスよりも血糖値の低下が大きく、インスリン感受性が亢進していたことが判った。すなわち、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスで高発現されたＡＧＦタンパク質の作用により、インスリン感受性が亢進したことが明らかとなった。【００９０】
《実施例２０：高脂肪食負荷マウスへのヒトＡＧＦ発現アデノウイルス投与》
実施例１５では、マウスＡＧＦの体重減少抑制作用及び耐糖能改善作用を示した。そこで、ヒトＡＧＦに同様の作用があることを以下の試験を実施することで確認した。実施例１２で作製したヒトＡＧＦ発現アデノウイルス（ｈＡＧＦ−Ａｄｅｎｏ）及びコントロールアデノウイルス（Ｃｏｎｔ−Ａｄｅｎｏ）を各３匹のマウスに、実施例１５と同様に投与したところ、１３日後の体重が、ｈＡＧＦ−Ａｄｅｎｏ投与マウスで平均４．６ｇ減少し、Ｃｏｎｔ−Ａｄｅｎｏ投与マウスで平均０．１ｇ増加した。更に、腹腔内注射したＤ−グルコースが０．５ｇ／ｋｇ、投与後の採血を３０、６０、９０、及び１２０分後に行ったこと以外は、実施例１５と同様に糖代謝試験を実施したところ、図２５に示すように、ｈＡＧＦ−Ａｄｅｎｏ投与マウスは、グルコース投与後の全ての時間においてＣｏｎｔ−Ａｄｅｎｏ投与マウスよりも血糖値が低く、耐糖能が改善していることが明らかになった。すなわち、ｈＡＧＦ−Ａｄｅｎｏ投与マウスで高発現されたｈＡＧＦタンパク質の作用により、体重減少が引き起こされたこと、及び耐糖能が改善されたことが明らかとなった。【００９１】
《実施例２１：ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの血中ＡＧＦタンパク質量》
ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス（実施例１）において、ＡＧＦタンパク質が血中にどの程度発現しているかを調べた。４ヶ月齢の雌のＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスから眼底採血し、定法に従って血清を得た。得られた血清を、参考例１（３）と同様の方法でウエスタンブロッティングを行い、ＡＧＦタンパク質を検出した。スキャナーでウエスタンブロッティングの結果を取り込み、画像解析ソフト（ＮＩＨ  ｉｍａｇｅ  １．６２ｆ）を用いてＡＧＦタンパク質のバンドの濃度を数値化した。その結果、リターメイトＷＴマウスと比較して、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスで血清中のＡＧＦタンパク質濃度が２．４倍に亢進していることが判った。【００９２】
《実施例２２：マウスＡＧＦ発現アデノウイルス投与したマウスの血中ＡＧＦタンパク質量》
実施例１５で、マウスＡＧＦ発現アデノウイルスをマウスに投与した際の、血中のＡＧＦタンパク質量を調べた。マウスＡＧＦ発現アデノウイルス及びコントロールアデノウイルス投与前（０日目）及び投与後１〜７日目のマウスから眼底採血し、定法に従って血清を得た。参考例１（３）と同様の方法でウエスタンブロッティングを行い、ＡＧＦタンパク質を検出した。その結果、コントロールアデノウイルス投与では、ＡＧＦタンパク質濃度は変化しないが、マウスＡＧＦ発現アデノウイルス投与では、４日目をピークにして経時的にＡＧＦタンパク質濃度が上昇していることが判った。実施例２１と同様の方法で、マウスＡＧＦ発現アデノウイルスを投与したマウスの０日目と４日目のＡＧＦタンパク質のバンドの濃度を数値化した。その結果、マウスＡＧＦアデノウイルスを投与することでＡＧＦタンパク質濃度が２．５倍に亢進していることが判った。【００９３】
《実施例２３：Ｋ１４−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの血中ＡＧＦタンパク質量》
実施例１８及び実施例１９で使用したＫ１４−ＡＧＦ  ＴｇマウスでＡＧＦタンパク質が血中にどの程度発現しているかを調べた。８ヶ月齢の雌のＫ１４−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスから眼底採血し、定法に従って血清を得た。参考例１（３）と同様の方法でウエスタンブロッティングを行い、ＡＧＦタンパク質を検出、数値化した。その結果、リターメイトＷＴマウスと比較して、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスで血清中のＡＧＦタンパク質濃度が１．８倍に亢進していることが判った。【００９４】
《実施例２４：抗ヒトＡＧＦ抗体作製》
ヒトＡＧＦの部分配列であるペプチド（SRMLDPAPEPQRDQTQR；配列番号４５）のＮ末端にＣｙｓ残基を付加したペプチド（CSRMLDPAPEPQRDQTQR；配列番号４６）（以下、ペプチドＡ）を合成及び精製した。ペプチドＡをキャリアタンパク質のウシサイログロブリン（SIGMA）に結合して抗原を作製し、１００μｇのペプチドを２週間毎に、合計８回ウサギに免疫した。最終免疫後１週間目に全採血を行い、血清を得た。ペプチドＡでアフィニティーカラムを作製した。アフィニティーカラムを用いて血清をアフィニティー精製し、ペプチドＡに結合するＩｇＧ抗体（以下、抗ＹＰ−０３０−Ａ  ＩｇＧ）を得た。抗体の濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定して、分子吸光係数を１．３８として求めた。【００９５】
《実施例２５：抗ＳＦ−ＹＰ−０３０  ＩｇＧのＨＲＰ標識》
０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液に透析した抗ＳＦ−ＹＰ−０３０  ＩｇＧ（実施例１３で作製）に、攪拌しながら、ペプシン（シグマ）を添加し、３７℃で１時間反応して抗体を部分切断した。反応液を０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １６／６０ＨＲカラム（アマシャムバイオサイエンス）を用いたゲルろ過によりＦ（ａｂ’）２を採取した。得られたＦ（ａｂ’）２に２−メルカプトエチルアミン塩酸塩（ナカライテスク）を添加後３７℃で９０分間反応して還元し、ＵＬＴＲＯＧＥＬ  ＡＣＡ５４カラム（BIOSEPRA社）を用いたゲルろ過によりＦａｂ’を採取した。架橋剤ＥＭＣＳ［N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimide；DOJINDO社］と西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ；東洋紡）を混合し、３７℃６０分間反応させ、０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＰ６−ＤＧカラム（BIORAD社）を用いたゲルろ過によりＥＭＣＳとＨＲＰのコンジュゲート画分（以下、ＥＭＣＳ−ＨＲＰ）を採取した。続いて、Ｆａｂ’とＥＭＣＳ−ＨＲＰを混合し４℃１６時間反応させた後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １６／６０ＨＲカラムを用いたゲルろ過にてＦａｂ’とＨＲＰとの結合画分を採取し、ＨＲＰ標識抗ヒトＡＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント（ＨＲＰ−抗ＳＦ−ＹＰ−０３０  Ｆａｂ’）を得た。抗体の濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定して、分子吸光係数を１．３８として求めた。【００９６】
《実施例２６：ヒトＡＧＦ検出ＥＬＩＳＡ系構築》
実施例２４で作製した抗ＹＰ−０３０−Ａ  ＩｇＧを２０μｇ／ｍＬで、ＥＬＩＳＡ用マイクロプレート（NUNC社）に１００μＬ／ウェル入れ、４℃で一晩静置した。ウェル内の溶液を吸引除去し、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）で２回洗浄後、ブロッキング液（１％ＢＳＡ、０．０５％ＮａＮ３、ＰＢＳ）を３００μＬ／ウェル添加し、４℃で一晩静置し、ブロッキングした。洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０添加１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液）で２回洗浄後、標準ヒトＡＧＦ精製タンパク質を希釈液（１％ＢＳＡ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で１００〜０．３９ｎｇ／ｍＬまで２倍連続希釈し、１００μＬ／ウェルずつ添加し、３７℃で１時間反応した。洗浄液で７回洗浄後、実施例２５で作製したＨＲＰ標識抗体（ＨＲＰ−抗ＳＦ−ＹＰ−０３０  Ｆａｂ’）を希釈液で１μｇ／ｍＬに調製し、１００μＬ／ウェルずつ添加後、３７℃で０．５時間反応した。洗浄液で９回洗浄後、ＴＭＢＺ基質液（IBL社製）を１００μＬ／ウェルずつ添加後、室温で３０分間反応した。反応停止液（１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）を１００μＬ／ウェル添加し、発色反応を停止した。吸光光度計（スペクトラマックス）を用いてＡ４５０ｎｍでの吸光度を測定した。スペクトラマックスに添付のプログラムを用いて解析したところ、直線性が得られる濃度領域があり、検量線を作成することができた。以上のようにしてヒトＡＧＦを検出するＥＬＩＳＡ系を構築することができた。【００９７】
《実施例２７：ヒトＡＧＦ発現アデノウイルス投与したマウスの血中ヒトＡＧＦタンパク質量》
ヒトＡＧＦ発現アデノウイルスをマウスに投与した際の、血中のＡＧＦタンパク質量を調べた。各６匹の高脂肪食負荷マウスに実施例１２で作製したヒトＡＧＦ発現アデノウイルス（ｈＡＧＦ−Ａｄｅｎｏ）及びコントロールアデノウイルス（Ｃｏｎｔ−Ａｄｅｎｏ）を、実施例２０と同様に投与した。その結果、実施例２０に記載した場合と同様に、ｈＡＧＦ−Ａｄｅｎｏ投与マウスで体重減少、耐糖能改善が同様に観察された。アデノウイルス投与４日目に、眼底採血を行い常法に従って血清を得た。血清中のヒトＡＧＦタンパク質量を実施例２６で構築したＥＬＩＳＡ系を用いて測定した。その結果、Ｃｏｎｔ−Ａｄｅｎｏを投与したマウスの血清からはヒトＡＧＦタンパク質は検出されず、ｈＡＧＦ−Ａｄｅｎｏを投与したマウスの血清からは、０．７〜１．２μｇ／ｍＬの濃度でヒトＡＧＦタンパク質が検出された。この結果、血中のＡＧＦタンパク質濃度が０．７〜１．２μｇ／ｍＬあれば、期待される体重減少及び耐糖能改善の作用が得られることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明の医薬は、肥満、糖尿病、及び／又は高脂血症の治療及び／又は予防の用途に適用することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表フリーテキスト】
【００９９】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Artificial Sequence」の説明を記載する。配列番号１、６、７、９、１０、１３、１４、１６、１９、２０、及び４０〜４４の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列であり、配列番号１５の配列で表される塩基配列は、ｌｏｘＰを含む配列である。配列番号４６の配列で表されるアミノ酸配列は、ペプチドＡの配列である。
【図１】
2005097171.tif 000003
【図２】
2005097171.tif 000004
【図３】
2005097171.tif 000005
【図４】
2005097171.tif 000006
【図５】
2005097171.tif 000007
【図６】
2005097171.tif 000008
【図７】
2005097171.tif 000009
【図８】
2005097171.tif 000010
【図９】
2005097171.tif 000011
【図１０】
2005097171.tif 000012
【図１１】
2005097171.tif 000013
【図１２】
2005097171.tif 000014
【図１３】
2005097171.tif 000015
【図１４】
2005097171.tif 000016
【図１５】
2005097171.tif 000017
【図１６】
2005097171.tif 000018
【図１７】
2005097171.tif 000019
【図１８】
2005097171.tif 000020
【図１９】
2005097171.tif 000021
【図２０】
2005097171.tif 000022
【図２１】
2005097171.tif 000023
【図２２】
2005097171.tif 000024
【図２３】
2005097171.tif 000025
【図２４】
2005097171.tif 000026
【図２５】
2005097171.tif 000027
【配列表】
2005097171000001.app
【国際調査報告】
2005097171.tif 000028
2005097171.tif 000029
2005097171.tif 000030
2005097171.tif 000031