(57)【要約】  本発明は、フラクトオリゴ糖の製造に適するように反応特性が改善されたβ−フルクトフラノシダーゼ変異体の提供を目的とする。本発明によれば、特定のアミノ酸残基において変異を有する配列番号２に記載のアミノ酸配列またはその相同体からなる、β−フルクトフラノシダーゼ変異体が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記アミノ酸配列からなる、β−フルクトフラノシダーゼ変異体：
（ａ）６２番、１２２番、１２８番、１６５番、２２１番、３９５番、および５５０番のアミノ酸残基において少なくとも１つの変異を有する、配列番号２に記載のアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２の６２番、１２２番、１２８番、１６５番、２２１番、３９５番、および５５０番のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基において少なくとも１つの変異を有する、配列番号２に記載のアミノ酸配列の相同体。
【請求項２】
変異が、置換である、請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
置換が、
６２番のアミノ酸残基の、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択される酸性アミノ酸への置換、
１２２番のアミノ酸残基の、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、およびバリンからなる群から選択されるアミノ酸への置換、
１２８番のアミノ酸残基の、アスパラギンおよびグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸への置換、
１６５番のアミノ酸残基の、トリプトファン、フェニルアラニン、およびチロシンからなる群から選択される芳香族アミノ酸への置換、
２２１番のアミノ酸残基の、トリプトファン、フェニルアラニン、およびチロシンからなる群から選択される芳香族アミノ酸への置換、
３９５番のアミノ酸残基の、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、およびバリンからなる群から選択されるアミノ酸への置換、および
５５０番のアミノ酸残基の、セリンおよびスレオニンからなる群から選択されるヒドロキシアミノ酸への置換
である、請求項２に記載の変異体。
【請求項４】
配列番号２に記載のアミノ酸配列およびその相同体の、１７０番、３００番、３１３番、および３８６番の少なくとも１つのアミノ酸残基において、更に変異を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項５】
変異が置換である、請求項４に記載の変異体。
【請求項６】
置換が、
１７０番のアミノ酸残基の、トリプトファン、フェニルアラニン、およびチロシンからなる群から選択される芳香族アミノ酸への置換、
３００番のアミノ酸残基の、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸への置換、
３１３番のアミノ酸残基の、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択される塩基性アミノ酸への置換、および
３８６番のアミノ酸残基の、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択される塩基性アミノ酸への置換
である、請求項５に記載の変異体。
【請求項７】
１６５番、３００番および３１３番のアミノ酸残基において変異を有する、請求項４〜６のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項８】
変異が置換である、請求項７に記載の変異体。
【請求項９】
置換が、
１６５番のアミノ酸残基の、トリプトファン、フェニルアラニン、およびチロシンからなる群から選択される芳香族アミノ酸への置換、
３００番のアミノ酸残基の、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸への置換、
３１３番のアミノ酸残基の、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択される塩基性アミノ酸への置換
である、請求項８に記載の変異体。
【請求項１０】
下記アミノ酸配列からなる、β−フルクトフラノシダーゼ変異体：
（ｃ）４０番、３７９番、および３８１番のアミノ酸残基において少なくとも１つの変異を有する、配列番号２に記載のアミノ酸配列；または
（ｄ）配列番号２の４０番、３７９番、および３８１番のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基において少なくとも１つの変異を有する、配列番号２に記載のアミノ酸配列の相同体。
【請求項１１】
変異が、置換である、請求項１０に記載の変異体。
【請求項１２】
置換が、
４０番のアミノ酸残基の、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択される酸性アミノ酸への置換、
３７９番のアミノ酸残基の、システインへの置換、および
３８１番のアミノ酸残基の、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、およびバリンからなる群から選択されるアミノ酸への置換
である、請求項１１に記載の変異体。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のβ−フルクトフラノシダーゼ変異体をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、組換えベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組換えベクターを含んでなる、形質転換体。
【請求項１６】
請求項１５に記載の形質転換体または請求項１〜１２のいずれか一項に記載のβ−フルクトフラノシダーゼ変異体とスクロースを接触させる工程を含んでなる、フラクトオリゴ糖の製造法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、ショ糖から特定のフラクトオリゴ糖を選択的かつ効率的に生成するβ−フルクトフラノシダーゼ変異体に関し、より詳細には、１−ケストースを効率的に生産するβ−フルクトフラノシダーゼ変異体およびニストースを効率的に生産するβ−フルクトフラノシダーゼ変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般にフラクトオリゴ糖は、ショ糖のフルクトースに１から３分子のフルクトースがＣ１とＣ２の位置でβ結合しているオリゴ糖であり、難消化性の糖質で、腸内のビフィズス菌増殖促進作用、コレステロールなどの脂質代謝改善作用、難う蝕性、ミネラル吸収促進作用などの優れた生理機能を有することが見出されている。フラクトオリゴ糖は、天然には広く植物に分布しており、例えばタマネギ、アスパラガス、キクイモなどに含まれていることが知られているが、最近では、微生物由来のβ−フルクトフラノシダーゼの転移反応を利用してショ糖から大量に製造する技術が確立され、工業的に生産されている。現在フラクトオリゴ糖の工業的生産に利用されているβ−フルクトフラノシダーゼは、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来の菌体内β−フルクトフラノシダーゼを利用している。【０００３】
当該β−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子は、ＷＯ９７／３４００４号公報に開示されている。しかし、当該β−フルクトフラノシダーゼは、１−ケストース、ニストース、１−フルクトシルニストースの混合物としてフラクトオリゴ糖を生成するため、フラクトオリゴ糖はオリゴ糖混合物のシロップあるいは粉末として製造、提供されている。単一成分として、１−ケストースあるいはニストースを選択的かつ効率的に生産するβ−フルクトフラノシダーゼが得られれば、次のような有用性が存在する。すなわち、１−ケストースあるいはニストースを高純度に精製し、結晶化させることによって、フラクトオリゴ糖の生理機能を保持したまま、物性および加工特性上優れた特性を有する単一成分の結晶フラクトオリゴ糖を製造することが可能となる。【０００４】
一方、ショ糖を原料とした結晶１−ケストースの工業的製造法は、例えば、ＷＯ９７／２１７１８号公報に開示されている。すなわち、β−フルクトフラノシダーゼをショ糖に作用させて１−ケストースに生成させ、クロマト分離法により１−ケストースを純度８０％以上に生成した後、これを結晶化原液として純度９５％以上の結晶１−ケストースを得る方法である。この方法に用いられる酵素の特性として、ショ糖から１−ケストースへの変換率が高いこと、ニストースの生成量が低いことが工業的製造法において求められている。また同様にニストースを単一成分として製造する場合には、ニストースへの変換率が高いこと、１−フルクトシルニストースの生成量が低いことが工業的製造法において求められている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、フラクトオリゴ糖の単一成分、例えば１−ケストースあるいはニストースの製造に適するように反応特性が改善されたβ−フルクトフラノシダーゼ変異体およびその遺伝子の提供をその目的とする。
【０００６】
本発明者らは、配列番号２のアミノ酸配列中の特定位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したβ−フルクトフラノシダーゼ変異体が、１−ケストースあるいはニストースの製造に適する反応特性を有していることを見出した。
【０００７】
すなわち本発明の第一の態様によれば、（ａ）６２番、１２２番、１２８番、１６５番、２２１番、３９５番、および５５０番のアミノ酸残基において少なくとも１つの変異を有する、配列番号２に記載のアミノ酸配列；または（ｂ）配列番号２の６２番、１２２番、１２８番、１６５番、２２１番、３９５番、および５５０番のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基において少なくとも１つの変異を有する、配列番号２に記載のアミノ酸配列の相同体からなる、β−フルクトフラノシダーゼ変異体が提供される。
【０００８】
本発明の第二の態様によれば、（ｃ）４０番、３７９番、および３８１番のアミノ酸残基において少なくとも１つの変異を有する、配列番号２に記載のアミノ酸配列；または（ｄ）配列番号２の４０番、３７９番、および３８１番のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基において少なくとも１つの変異を有する、配列番号２に記載のアミノ酸配列の相同体からなる、β−フルクトフラノシダーゼ変異体が提供される。
【０００９】
本発明によるβ−フルクトフラノシダーゼ変異体を用いれば、フラクトオリゴ糖を製造する際の酵素反応液の糖組成を改善することが可能となり、フラクトオリゴ糖の単一成分の効率的な製造が可能となる。すなわち、本発明によるβ−フルクトフラノシダーゼ変異体によれば、従来と比較して簡便に、かつ安価にフラクトオリゴ糖の単一成分の工業的製造が可能となる点で有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、配列番号２に記載のアミノ酸配列およびその相同体を整列させた例を示した図である。上段はA. niger由来のβ−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）、中段はS. brevicaulis由来のβ−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号６）、下段はP. roqueforiti由来のβ−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号４）を表す。図中の数字はA. nigerのＮ末端を１番目としたときのアミノ酸番号を表す。枠で示した部分は、特定変異部分を表す。
【図２】図２は、図１のアミノ酸配列の続きである。
【発明の具体的説明】
【００１１】
β−フルクトフラノシダーゼ変異体およびその遺伝子
本発明による第一および第二の態様による変異体は、配列番号２に記載のアミノ酸配列およびその相同体の特定のアミノ酸残基の少なくとも１つに変異が導入されてなるものである。
【００１２】
変異が導入されるアミノ酸残基の位置は、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基番号と対応する。
【００１３】
本発明において「変異」とは、置換、欠失、および挿入を意味する。
【００１４】
「置換」とは、特定のアミノ酸残基が取り除かれ、かつ他のアミノ酸残基が同じ位置に挿入されていることをいう。
【００１５】
「欠失」とは、特定のアミノ酸残基が取り除かれていることを意味する。
【００１６】
「挿入」とは、特定のアミノ酸残基の前にあるいは後ろに、１個または複数個のアミノ酸残基が挿入されていることをいい、具体的には、特定のアミノ酸残基のα−カルボキシル基あるいはα−アミノ基に、１個または複数個、好ましくは、１個ないし数個、のアミノ酸残基が結合することをいう。
【００１７】
配列番号２に記載のアミノ酸配列およびその相同体に導入される特定変異の数は特に限定されないが、１個ないし数個、１個ないし３個、あるいは１または２個であることができる。
【００１８】
本発明の第一および第二の態様による変異体において、配列番号２に記載のアミノ酸配列およびその相同体に導入される変異は、好ましくは、置換である。
【００１９】
本発明の第一の態様による変異体において、配列番号２に記載のアミノ酸配列およびその相同体の６２番、１２２番、１２８番、１６５番、２２１番、３９５番、および５５０番のアミノ酸残基に導入される置換は、好ましくは、下記の通りである。
【００２０】
６２番のアミノ酸残基の、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択される酸性アミノ酸、特にグルタミン酸、への置換。
【００２１】
１２２番のアミノ酸残基の、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、およびバリンからなる群から選択されるアミノ酸、特にメチオニン、への置換。
【００２２】
１２８番のアミノ酸残基の、アスパラギンおよびグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸、特にアスパラギン、への置換。
【００２３】
１６５番のアミノ酸残基の、トリプトファン、フェニルアラニン、およびチロシンからなる群から選択される芳香族アミノ酸、特にフェニルアラニン、への置換。
【００２４】
２２１番のアミノ酸残基の、トリプトファン、フェニルアラニン、およびチロシンからなる群から選択される芳香族アミノ酸、特にチロシン、への置換。
【００２５】
３９５番のアミノ酸残基の、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、およびバリンからなる群から選択されるアミノ酸、特にロイシン、への置換。
【００２６】
５５０番のアミノ酸残基の、セリンおよびスレオニンからなる群から選択されるヒドロキシアミノ酸、特にセリン、への置換。
【００２７】
本発明の第一の態様による変異体においては、配列番号２に記載のアミノ酸配列およびその相同体の、１７０番、３００番、３１３番、および３８６番の少なくとも１つのアミノ酸残基において、更に変異、好ましくは、置換、を有していてもよい。これらの変異を有するβ−フルクトフラノシダーゼは、１−ケストースを選択的にかつ効率的に生産できる点で有利である（例えば、ＷＯ９９／１３０５９号公報参照）。
【００２８】
本発明の第一の態様による変異体において、配列番号２に記載のアミノ酸配列およびその相同体の１７０番、３００番、３１３番、および３８６番に導入することができる置換は、好ましくは、下記の通りである。
【００２９】
１７０番のアミノ酸残基の、トリプトファン、フェニルアラニン、およびチロシンからなる群から選択される芳香族アミノ酸、特にトリプトファン、への置換。
【００３０】
３００番のアミノ酸残基の、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸、特にバリン、への置換。
【００３１】
３１３番のアミノ酸残基の、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択される塩基性アミノ酸、特にリジンまたはアルギニン、への置換。
【００３２】
３８６番のアミノ酸残基の、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択される塩基性アミノ酸、特にリジン、への置換。
【００３３】
本発明の第一の態様による変異体において、配列番号２に記載のアミノ酸配列およびその相同体に導入することができる好ましい多重変異としては、１６５番のアミノ酸残基と、３００番のアミノ酸残基と、３１３番のアミノ酸残基の三重変異、より好ましくは三重置換、が挙げられ、特に好ましくは、１６５番のアミノ酸残基の、トリプトファン、フェニルアラニン、およびチロシンからなる群から選択される芳香族アミノ酸への置換（最も好ましくはフェニルアラニンへの置換）と、３００番のアミノ酸残基の、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸への置換（最も好ましくはバリンへの置換）と、および３１３番のアミノ酸残基の、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択される塩基性アミノ酸への置換（最も好ましくはリジンまたはアルギニンへの置換）とからなる三重置換が挙げられる。
【００３４】
本発明の第二の態様による変異体において、配列番号２に記載のアミノ酸配列およびその相同体の４０番、３７９番、および３８１番のアミノ酸残基に導入される置換は、好ましくは、下記の通りである。
【００３５】
４０番のアミノ酸残基の、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択される酸性アミノ酸、特にアスパラギン酸、への置換。
【００３６】
３７９番のアミノ酸残基の、システインへの置換。
【００３７】
３８１番のアミノ酸残基の、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、およびバリンからなる群から選択されるアミノ酸、特にメチオニン、への置換。
【００３８】
本発明による第一および第二の態様による変異体において、「相同体」とは、１個または複数個の変異を有する配列番号２に記載のアミノ酸配列であって、β−フルクトフラノシダーゼ活性を有するもの、を意味する。変異の数は、１個ないし数個、あるいは１、２、３、または４個であることができる。
【００３９】
本発明において、相同体がβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有するか否かは、例えば、そのアミノ酸配列からなるタンパク質を基質に作用させ、反応産物を検出することにより評価することができ、例えば、実施例２に記載の方法に従って評価することができる。
【００４０】
相同体における本発明による特定変異の位置は、配列番号２のアミノ酸配列と当該相同体とを整列し、相同体に対応する配列番号２のアミノ酸残基番号を基に決定する。例えば、相同体における「６２番のアミノ酸残基の変異」とは、その相同体の６２番のアミノ酸残基の変異ではなく、配列番号２のアミノ酸配列の６２番のアミノ酸残基に対応する相同体のアミノ酸残基の変異を意味する。配列番号２のアミノ酸配列とその相同体を整列させた例は図１および図２に示されている。
【００４１】
配列番号２のアミノ酸配列と当該相同体との整列は、配列同一性を調べるための分析用ソフトウエアを用いて行うことができる。このようなソフトウエアは周知であり、当業者であれば適宜選択して使用することができることは言うまでもない。例えば、ＢＬＡＳＴ法（Basic local alignment search tool; Altschul, S.F. et al., J.Mol.Biol.,215,403-410(1990)）を使用して配列番号２のアミノ酸配列と当該相同体とを整列させて、対応するアミノ酸残基を決定することができる。
【００４２】
相同体の例としては、１個または複数個（例えば、１個ないし数個あるいは１、２、３、または４個）のβ−フルクトフラノシダーゼ活性に影響を与えない変異を有する配列番号２に記載のアミノ酸配列が挙げられる。
【００４３】
ここで「活性に影響を与えない変異」の例としては、保存的置換が挙げられる。「保存的置換」とは、タンパク質の活性を実質的に改変しないように１若しくは複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００４４】
「相同体」の例としては、また、Aspergillus属、Penicillium属およびScopulariopsis属に属する微生物から生産されるβ−フルクトフラノシダーゼが挙げられ、例えば、Aspergillus niger由来のβ−フルクトフラノシダーゼ、Penicillium roqueforti由来のβ−フルクトフラノシダーゼ、Scopulariopsis brevicaulis由来のβ−フルクトフラノシダーゼが挙げられる。Penicillium roqueforti由来のβ−フルクトフラノシダーゼとしてはＷＯ９９／１３０５９号公報の配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質（配列番号４）が挙げられる。また、Scopulariopsis brevicaulis由来のβ−フルクトフラノシダーゼとしてはＷＯ９９／１３０５９号公報の配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質（配列番号６）が挙げられる。
【００４５】
本発明によれば、本発明によるβ−フルクトフラノシダーゼ変異体をコードする遺伝子が提供される。
【００４６】
一般に、タンパク質のアミノ酸配列が与えられれば、それをコードするＤＮＡ配列は、いわゆるコドン表を参照して容易に定まる。従って、本発明による特定変異が導入された配列番号１のアミノ酸配列およびその相同体、例えば、本発明による特定変異が導入された配列番号２、４、および６のアミノ酸配列、をコードする種々のＤＮＡ配列を適宜選択することが可能である。よって、本発明による特定変異が導入されたβ−フルクトフラノシダーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列とは、本発明による特定アミノ酸変異に対応するＤＮＡ変異を有するβ−フルクトフラノシダーゼ遺伝子のみならず、その縮重関係にあるコドンが使用されている以外は同一のＤＮＡ配列を有し、かつβ−フルクトフラノシダーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列をも意味する。例えば、本発明による特定変異が導入された配列番号２、４、および６のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列とは、後述する表３に記載の１以上の変異を有する配列番号１、３、および５のＤＮＡ配列のみならず、その縮重関係にあるコドンが使用されている以外は同一のＤＮＡ配列を有し、かつβ−フルクトフラノシダーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列をも意味する。
【００４７】
β−フルクトフラノシダーゼ変異体の作製
β−フルクトフラノシダーゼ変異体は、組換えＤＮＡ技術、ポリペプチド合成技術などによって作製することができる。組換えＤＮＡ技術を用いる場合には、β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ（例えば、配列番号１、３、または５のＤＮＡ配列）を取得し、このＤＮＡに部位特異的変異あるいはランダム変異を発生させてコードするアミノ酸を置換させた後、変異処理を施したＤＮＡを含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、形質転換細胞を培養することによってβ−フルクトフラノシダーゼ変異体を調製することができる。
【００４８】
遺伝子の部位特異的変異を導入するための方法は、Gapped duplex法やKunkel法など当業者に周知の方法を用いることができる。これらの方法は、β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡの特異的部位に突然変異を発生させることに利用することができる。
【００４９】
また、ランダム変異を導入するためには、エラープローンＰＣＲ法など一般的に行われている方法が採用できる。変異処理後のＤＮＡの塩基配列は、マキサム・ギルバートの化学修飾法やジデオキシヌクレオチド鎖終結法などにより確認することができ、β−フルクトフラノシダーゼ変異体のアミノ酸配列は、確認された塩基配列より解読することができる。
【００５０】
β−フルクトフラノシダーゼ変異体の生産
β−フルクトフラノシダーゼ変異体は、それをコードするＤＮＡ断片を、宿主細胞内で複製可能でかつ同遺伝子を発現可能な状態で含むＤＮＡ分子、特にＤＮＡ発現ベクター、に連結してなる組換えベクターを調製し、その組換えベクターを宿主に導入して形質転換体を得て、その形質転換体を適当な培養条件下で培養することにより、調製することができる。
【００５１】
本発明において利用されるベクターは、使用する宿主細胞の種類を勘案して、ウィルス、プラスミド、コスミドベクターなどから適宜選択することができる。例えば、宿主細胞が大腸菌の場合はｐＵＣ、ｐＢＲ系のプラスミド、枯草菌の場合はｐＵＢ系のプラスミド、酵母の場合はＹＥｐ、ＹＲｐ、ＹＣｐ系のプラスミドベクターが挙げられる。
【００５２】
本発明の好ましい態様によれば、組換えベクターとしてプラスミドを使用することができる。プラスミドは形質転換体の選択マーカーを含むのが好ましく、選択マーカーとしては薬剤耐性マーカー、栄養要求マーカーを使用することができる。その好ましい具体例としては、使用する宿主細胞が細菌の場合はアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などであり、酵母の場合はトリプトファン合成遺伝子（ＴＲＰ１）、ウラシル合成遺伝子（ＵＲＡ３）、ロイシン合成遺伝子（ＬＥＵ２）などがあり、カビの場合はハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇ）、ビアラホス耐性遺伝子（Ｂａｒ）、硝酸還元酵素遺伝子（ｎｉａＤ）などが挙げられる。
【００５３】
本発明による発現ベクターとしてのＤＮＡ分子は、変異遺伝子の発現に必要なＤＮＡ配列、例えばプロモーター、転写開始信号、リボゾーム結合部位、翻訳停止シグナル、転写終結シグナルなどの転写調節シグナル、翻訳調節シグナルなどを有しているのが好ましい。
【００５４】
プロモーターとしては、挿入断片に含まれる宿主中において機能することができるプロモーターはもちろんのこと、大腸菌においてはラクトースオペロン（ｌａｃ）、トリプトファンオペロン（ｔｒｐ）などのプロモーター、酵母ではアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＨ）、酸性フォスファターゼ遺伝子（ＰＨＯ）、ガラクトース遺伝子（ＧＡＬ）、グリセロアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＧＰＤ）などのプロモーター、カビではα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ）、セロビオハイドロラーゼＩ遺伝子（ＣＢＨＩ）などのプロモーターを好ましく用いることができる。
【００５５】
宿主としては、宿主−ベクター系が確立されているものであればいずれも利用可能であり、好ましくは、カビ、酵母が挙げられる。宿主細胞の形質転換により得られた形質転換体は、適当な条件で培養し、得られた培養液から一般的な方法によって酵素の分取や精製を行うことによりβ−フルクトフラノシダーゼ変異体を得ることができる。また、宿主が枯草菌、酵母、カビの場合には、分泌型ベクターを使用して、菌体外に組換えβ−フルクトフラノシダーゼを分泌させることも有利である。
【００５６】
形質転換体から生産される本発明による変異体は、次のようにして得ることが出来る。まず前記の宿主細胞を適切な条件下で培養し、得られた培養物から公知の方法、例えば遠心分離により培養上清あるいは菌体を得る。菌体の場合にはこれを適切な緩衝液中に懸濁し、凍結融解、超音波処理、磨砕などにより菌体を破砕し、遠心分離またはろ過により組換え酵素を含有する菌体抽出物を得る。
【００５７】
酵素の精製は、慣用されている分離、精製法を適宜組み合わせて実施することができる。例えば、熱処理のような耐熱性の差を利用する方法、塩沈澱および溶媒沈澱のような溶解性の差を利用する方法、透析、限外ろ過、ゲルろ過およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーのような電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーのような特異的親和性を利用する方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーのような疎水性の差を利用する方法、更に等電点電気泳動のような等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
【００５８】
フラクトオリゴ糖の製造
本発明によれば、本発明による形質転換体または本発明によるβ−フルクトフラノシダーゼ変異体を用いた、フラクトオリゴ糖の製造法が提供される。すなわち、本発明によるフラクトオリゴ糖の製造法は、本発明による形質転換体または本発明によるβ−フルクトフラノシダーゼ変異体と、スクロースとを接触させることによって実施される。
【００５９】
本発明による形質転換体または本発明によるβ−フルクトフラノシダーゼ変異体と、スクロースとの接触態様およびその条件は、変異体がスクロースに作用可能な様態である限り特に限定されない。溶液中で接触させる場合の好ましい態様を示せば次の通りである。すなわち、スクロースの使用濃度は、用いる糖が溶解されうる範囲であれば、本酵素の比活性、反応温度などを考慮して適宜選択してよいが、５〜８０％の範囲とするのが一般的であり、好ましくは３０〜７０％の範囲である。糖と酵素との反応における反応温度およびｐＨ条件は、変異体の最適条件下で行うことが好ましく、例えば、３０〜８０℃程度、ｐＨ４〜１０程度の条件下で行うのが一般的であり、好ましくは４０〜７０℃、ｐＨ５〜７の範囲である。
【００６０】
また、変異体の精製の程度も適宜選択することができ、形質転換体の培養上清あるいは菌体破砕物から粗酵素のまま用いることもでき、また、各種精製工程で得られた精製酵素として利用してもよい。さらには各種精製手段を経て単離精製された酵素として用いてもよい。
【００６１】
更に酵素は、常法に準じて担体に固定化された状態でスクロースと接触させてもよい。
【００６２】
生成したフラクトオリゴ糖は、反応液を公知の方法に従い精製することにより得ることが出来る。例えば、加熱して酵素を失活させた後、活性炭により脱色し、さらに、イオン交換樹脂で脱塩する方法が挙げられる。
【００６３】
本発明の第一の態様の変異体をフラクトオリゴ糖の調製に用いると、１−ケストース生成量が増大し、ニストース生成量が抑制される。従って、本発明によれば１−ケストースの選択的な製造法が提供される。すなわち本発明によれば、第一の態様のβ−フルクトフラノシダーゼ変異体あるいは第一の態様のβ−フルクトフラノシダーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを発現可能な形質転換体と、スクロースを接触させる工程を含んでなる、１−ケストースの製造法が提供される。
【００６４】
本発明の第二の態様の変異体をフラクトオリゴ糖の調製に用いると、ニストースの生成量が増大し、１−ケストース生成量が抑制される。従って、本発明によればニストースの選択的な製造法が提供される。すなわち本発明によれば、第二の態様のβ−フルクトフラノシダーゼ変異体あるいは第二の態様のβ−フルクトフラノシダーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを発現可能な形質転換体と、スクロースを接触させる工程を含んでなる、ニストースの製造法が提供される。
【実施例】
【００６５】
本発明を下記例により詳細に説明するが、本発明がこれらの例に限定されないことは言うまでもない。【００６６】
実施例１：β−フルクトフラノシダーゼ変異体の作製
β−フルクトフラノシダーゼ遺伝子へのランダム変異の導入は、市販のＰＣＲ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ(Gene Morph, Stratagene社)を用いて以下のように行った。鋳型ＤＮＡとして、ＡＴＣＣ２０６１１株（A. niger）由来のβ−フルクトフラノシダーゼ遺伝子を用いた。具体的には、ＷＯ９７/３４００４に記載のプラスミドｐＡＷ２０−Ｈｙｇを使用した。ＰＣＲ反応液は、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、４０ｍＭ  ｄＮＴＰ  １μｌ、１０倍濃度の緩衝液５μｌ、プライマーとして５’−ＧＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＧＣＴＣＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡ−３’（Ｎ末）（配列番号７）および５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＣＧＧＴＣＡＡＴＴＴＣＴＣＴ−３’（Ｃ末）（配列番号８）２５０ｎｇ／ｍｌを各０．５μｌ、Mutazyme １μｌ、ＤＭＳＯ  ５μｌ、滅菌水３６μｌを加えて５０μｌとした。反応は９４℃、２分間の前処理後、９４℃、１分間（変性ステップ）、５０℃、２分間（アニーリングステップ）、７２℃、２．５分間（伸長ステップ）のインキュベーションを３０サイクル行った。最後に７２℃、３分間のインキュベーションを行い反応を終了させた。反応液をフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールで抽出し、その後エタノール沈殿を行った。沈殿をＴＥ緩衝液に溶解後、アガロース電気泳動を行い、特異的に増幅された１．９ｋｂｐのバンドを常法に従って切り出してＤＮＡ断片を回収した。ＷＯ９７／３４００４に記載の方法で、１．９ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＹ２８３１のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入したプラスミドをS. cerevisiae ＭＳ−１６１株に酢酸リチウム法で導入し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をＳＤ−ＧＦ培地（０．６７％  yeast nitrogen base w/o amino acids、２％  スクロース、２％  casamino acids、５０μg／ｍｌ ウラシル）で３０℃、３日間培養し、β−フルクトフラノシダーゼ変異体を得た。【００６７】
実施例２：β−フルクトフラノシダーゼ変異体の反応特性の評価
実施例１で作製したβ−フルクトフラノシダーゼ変異体を用いてスクロースを基質とした酵素反応を基質濃度４８％、ｐＨ７、４０℃の反応条件で行い、反応液の糖組成をＨＰＬＣ分析した。野生型β−フルクトフラノシダーゼの酵素反応液の糖組成と比較して、糖組成が変動したものを反応特性が改変されたβ−フルクトフラノシダーゼ変異体とした。【００６８】
反応特性が改変されたβ−フルクトフラノシダーゼ変異体の変異点を同定するために、ＤＮＡ塩基配列を解析した。ファルマシア社のＤＮＡシークエンスキットを用い、シークエンス反応を行った。反応後のサンプルは、ファルマシア社のＤＮＡシークエンサー（ＡＬＦｒｅｄ）を用いて解析を行い、各ＤＮＡ断片の塩基配列を得た。その後、ＤＮＡ解析ソフト（ＤＮＡＳＩＳ、日立ソフトウエアエンジニアリング社）にて最終的な塩基配列を得て、ランダム変異の導入された変異点を決定した。その結果、表１および表２に示したように、１−ケストースを効率的に生産するβ−フルクトフラノシダーゼ変異体、およびニストースを効率的に生産するβ−フルクトフラノシダーゼ変異体が得られていることが明らかとなった。
【表１】
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【表２】
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【００６９】
得られた変異とそれに対応するＤＮＡ配列は下記の通りであった。下線は変異したＤＮＡを示す。
【表３】
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【００７０】
実施例３：部位指定変異による多重置換体の調製と反応特性の評価
実施例２で得られたＶ１６５ＦとＷＯ９７／３４００４に記載のＧ３００ＶとＨ３１３Ｋを組み合わせた３重置換変異体を部位特異的変異導入により調製した。具体的には、実施例１および２で調製したＶ１６５Ｆの変異が導入されたβ−フルクトフラノシダーゼ遺伝子をｐＵＣ１１８（宝酒造）のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入したプラスミドを調製した。次いで、ＷＯ９７/３４００４号公報の実施例Ｄ８と同様の方法でＧ３００ＶとＨ３１３Ｋの変異を順次導入した。実施例２と同じ方法でＤＮＡ塩基配列を調べた結果、目的の部分の塩基配列のみが置換されていることを確認した。【００７１】
３重置換体Ｖ１６５Ｆ＋Ｇ３００Ｖ＋Ｈ３１３Ｋの反応特性を実施例２の方法に従って調べた結果は表３に記載される通りであった。野生型β−フルクトフラノシダーゼと比較すると、１−ケストースの糖組成％は約１０％増大し、ニストースの生成量は７％減少した。
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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