(57)【要約】【課題】  細胞レベルで、簡易かつ効率よく、インスリンの産生量および／または分泌量を増加させる方法を提供すること。【解決手段】  インビトロでインスリン産生細胞を周波数が５０Ｈｚ±１Ｈｚまたは６０Ｈｚ±１Ｈｚの電磁場に曝露することを特徴とする。【選択図】  図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン産生細胞のインスリンの産生量および／または分泌量を増加させる方法であって、インビトロでインスリン産生細胞を周波数が５０Ｈｚ±１Ｈｚまたは６０Ｈｚ±１Ｈｚの電磁場に曝露することを特徴とする方法。
【請求項２】
Ｄ−グルコースを含む培養液で培養中のインスリン産生細胞を電磁場に曝露することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｄ−グルコースを実質的に含まない培養液で培養中のインスリン産生細胞を電磁場に曝露した後、Ｄ−グルコースを含む培養液で培養することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
磁場強度を０．５ｍＴ〜５０ｍＴとすることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
インビトロで周波数が５０Ｈｚ±１Ｈｚまたは６０Ｈｚ±１Ｈｚの電磁場に曝露することにより、インスリンの産生量および／または分泌量を増加させてなることを特徴とするインスリン産生細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリン産生細胞のインスリンの産生量および／または分泌量を増加させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
周波数が３Ｈｚ〜３００Ｈｚの電磁場（極低周波電磁場：extremely low frequency alternating magnetic field：ELF-MF）が、生物個体に影響を与えることはよく知られた事実である。しかしながら、その作用の全容は十分に明らかにされておらず、その解明に向けて種々の検討が行われているとともに、極低周波電磁場の生物個体への作用を臨床医学に応用する試みが行われている。【０００３】
例えば、特許文献１では、１５Ｈｚの共振周波数の電磁波と、２３Ｈｚ〜２８Ｈｚの非共振周波数の電磁波を、数ｍＴの磁場強度で、高血糖症を伴う患者の肝臓や膵臓に照射することによって、患者の血糖値を制御する方法が提案されている。また、非特許文献１によると、周波数が１０Ｈｚまたは４０Ｈｚの電磁波を、数ｍＴの磁場強度で、ラットに照射した場合、血清中のインスリン濃度が上昇するとのことである。
【特許文献１】米国特許第４８５０９５９号明細書
【非特許文献１】Laitl-Koblerska et al., Influence of Alternating Extremely Low Frequency ELF Magnetic Field on Structure and Function of Pancreas in Rats. Bioelectromagnetics 23:49-58(2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記のいずれの方法も、用いる周波数が特殊なものであるので、電磁波発生装置もまた特殊なものになってしまい、実用化に際しては装置の簡略化や小型化が困難であるといった問題を有する。また、これらの方法によって得られる、血糖値の低下や血清中のインスリン濃度の上昇などの現象は、あくまで電磁波が生物個体に影響を与えた結果であるので、細胞レベルで考えた場合、電磁波がどのように作用したことでこのような現象が引き起こされたのかということは当然のことながら全くわからない。従って、これらの方法は、細胞レベルでの臨床医学への応用のための有益な情報を何らもたらさないといった問題を有する。
そこで本発明は、細胞レベルで、簡易かつ効率よく、インスリンの産生量および／または分泌量を増加させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記の点に鑑みて鋭意検討を重ねた結果、極低周波の中でも５０Ｈｚまたは６０Ｈｚという商用周波数を用いた電磁波を、インビトロでインスリン産生細胞に照射すると、インスリン産生細胞のインスリンの産生量と分泌量が増加することを見出した。【０００６】
本発明は、上記の知見に基づいてなされたものであり、本発明のインスリン産生細胞のインスリンの産生量および／または分泌量を増加させる方法は、請求項１記載の通り、インビトロでインスリン産生細胞を周波数が５０Ｈｚ±１Ｈｚまたは６０Ｈｚ±１Ｈｚの電磁場に曝露することを特徴とする。
また、請求項２記載の方法は、請求項１記載の方法において、Ｄ−グルコースを含む培養液で培養中のインスリン産生細胞を電磁場に曝露することを特徴とする。
また、請求項３記載の方法は、請求項１記載の方法において、Ｄ−グルコースを実質的に含まない培養液で培養中のインスリン産生細胞を電磁場に曝露した後、Ｄ−グルコースを含む培養液で培養することを特徴とする。
また、請求項４記載の方法は、請求項１乃至３のいずれかに記載の方法において、磁場強度を０．５ｍＴ〜５０ｍＴとすることを特徴とする。
また、本発明のインスリン産生細胞は、請求項５記載の通り、インビトロで周波数が５０Ｈｚ±１Ｈｚまたは６０Ｈｚ±１Ｈｚの電磁場に曝露することにより、インスリンの産生量および／または分泌量を増加させてなることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、細胞レベルで、簡易かつ効率よく、インスリンの産生量および／または分泌量を増加させる方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明において好適に用いることができる極低周波電磁場曝露ユニットの概略図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明において、インビトロでインスリン産生細胞を周波数が５０Ｈｚ±１Ｈｚまたは６０Ｈｚ±１Ｈｚの電磁場に曝露する方法は、特段限定されるものではなく、例えば、培養皿中などで培養下にあるインスリン産生細胞に、周波数が５０Ｈｚまたは６０Ｈｚの電磁波を照射することで行えばよい。この操作は、例えば、Miyakoshi et al., J. Radiat. Res., 37:185-191(1996)に記載の、ＣＯ2インキュベーター内に構築した極低周波電磁場曝露ユニット（図１参照）によって行うことができる。【００１０】
この場合、磁場強度は０．５ｍＴ〜５０ｍＴとすることが望ましく、１ｍＴ〜１０ｍＴとすることがより望ましい。磁場強度が０．５ｍＴを下回ると、本発明の効果が十分に得られない恐れがある一方、磁場強度が５０ｍＴを上回ると、装置の複雑化や大型化を招き、その維持・管理が困難になる恐れがある。【００１１】
インスリン産生細胞への電磁波の照射時間は、例えば、１０分間〜５日間である。インスリン産生細胞への電磁波の照射は、持続的に行ってもよいし断続的に行ってもよい。【００１２】
本発明のインスリン産生細胞のインスリンの産生量および／または分泌量を増加させる方法において、好適な方法としては、Ｄ−グルコースを含む培養液（例えばＤ−グルコース濃度が０．１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌ、望ましくは０．５ｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌの培養液）で培養中のインスリン産生細胞を電磁場に曝露する方法や、Ｄ−グルコースを実質的に含まない培養液で培養中のインスリン産生細胞を電磁場に曝露した後、Ｄ−グルコースを含む培養液（例えばＤ−グルコース濃度が０．１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌ、望ましくは０．５ｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌの培養液）で培養する方法が挙げられる。【００１３】
本発明の適用対象となるインスリン産生細胞は、インスリンの産生能および／または分泌能を有する細胞であれば特段制限されるものではなく、例えば、インスリノーマ細胞株、膵島細胞、胚性幹細胞や体性幹細胞のような前駆細胞から分化誘導したインスリンの産生能および／または分泌能を有する細胞、細胞工学的手法によってインスリンの産生能および／または分泌能を付与した形質転換細胞などをその具体例として挙げることができる。これらの細胞は、自体公知の適切な方法で生物個体から取り出されるなどして生体外にある限りは、単離精製の有無やその程度はどのようなものであってもよい。また、インスリン産生細胞が産生および／または分泌するインスリンは、天然のアミノ酸配列を持つものに限定されるものではなく、遺伝子工学的手法によってアミノ酸の置換・欠失・付加のような修飾が施されたアミノ酸配列を持つものであってもよい。【００１４】
本発明によってインスリンの産生量および／または分泌量が増加したインスリン産生細胞は、例えば、近年、Ｉ型糖尿病の新しい治療方法として注目されている膵島移植における移植細胞として用いることで、移植に必要とする細胞数の軽減を図ることができる。従って、本発明は、Ｉ型糖尿病の膵島移植による治療方法の進歩に寄与する。また、本発明は、医薬品としてのインスリンの大量生産に際して、その生産効率を高める方法としても利用することができる。
【実施例】
【００１５】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は、以下の記載に何ら限定して解釈されるものではない。【００１６】
実施例１：
（実験方法）
シリアンハムスター由来インスリノーマ細胞株ＨＩＴ−Ｔ１５を、細胞皿に１．５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2で播種し、１０％牛胎児血清と１ｇ／ＬのＤ−グルコースを含むＲＰＭＩ１６４０培養液中で培養した。３日間培養することで細胞が８０％〜９０％集密的になったところで、培養液を、１０％牛胎児血清と種々の濃度のＤ−グルコースを含むＲＰＭＩ１６４０培養液に交換し、図１に示したＣＯ2インキュベーター内に構築した極低周波電磁場曝露ユニットを用いて、細胞に、周波数が６０Ｈｚの電磁波を、５ｍＴの磁場強度で、連続的に２４時間または４８時間照射しながら、培養した。
照射終了後の培養液中に含まれるインスリン量を、シバヤギ社製のレビス・インスリン測定キットを用いてＥＬＩＳＡ法で測定し、細胞のインスリン分泌量を求めた。細胞のインスリン分泌量は、細胞数で標準化した。細胞数はパーティクルカウンター（ベックマンコールター社製）によって計測した。
また、培養液から細胞を回収し、エタノール：１２規定塩酸：水＝１４０：３：５７の組成からなる溶液を用いて、回収した細胞を−２０℃で４８時間処理することで、細胞内のインスリンを抽出し、ペレットダウン後、抽出液上清のインスリン量を、シバヤギ社製のレビス・インスリン測定キットを用いてＥＬＩＳＡ法で測定し、細胞内インスリン量を求めた。細胞内インスリン量は、抽出液中の総たんぱく質量で標準化した。抽出液中の総たんぱく質量は、バイオ・ラッド社製のバイオラッド・ＤＣタンパクアッセイキットを用いて牛血清アルブミン溶液を標準物質として測定した。【００１７】
（実験結果）
表１に細胞のインスリン分泌量を示し、表２に細胞内インスリン量を示す。また、表１と表２には、細胞を電磁場に曝露せずに培養した場合の結果をあわせて示す（擬曝露下培養群）。表１と表２から明らかなように、この方法によれば、インスリン産生細胞のインスリンの産生量および／または分泌量を増加させることができることがわかった。【００１８】
【表１】
2005123906.tif 000002
【００１９】
【表２】
2005123906.tif 000003
【００２０】
実施例２：
インスリン産生細胞に周波数が５０Ｈｚの電磁波を照射した場合でも、実施例１と同様の効果を得ることができることを確認した。【００２１】
実施例３：
（実験方法）
シリアンハムスター由来インスリノーマ細胞株ＨＩＴ−Ｔ１５を、細胞皿に１．５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2で播種し、１０％牛胎児血清と１ｇ／ＬのＤ−グルコースを含むＲＰＭＩ１６４０培養液中で培養した。３日間培養することで細胞が８０％〜９０％集密的になったところで、培養液を、１０％牛胎児血清を含みＤ−グルコースを含まないＲＰＭＩ１６４０培養液に交換し、図１に示したＣＯ2インキュベーター内に構築した極低周波電磁場曝露ユニットを用いて、細胞に、周波数が６０Ｈｚの電磁波を、５ｍＴの磁場強度で、連続的に３０分間または２時間照射しながら、培養した。
照射終了後、直ちにまたは２時間経過後、培養液を、１０％牛胎児血清と３ｇ／ＬのＤ−グルコースを含むＲＰＭＩ１６４０培養液に交換し、通常のＣＯ2インキュベーター内において２時間培養することで、グルコース刺激を行った。培養終了後の培養液中に含まれるインスリン量を、シバヤギ社製のレビス・インスリン測定キットを用いてＥＬＩＳＡ法で測定し、細胞のインスリン分泌量を求めた。細胞のインスリン分泌量は、細胞数で標準化した。細胞数はパーティクルカウンター（ベックマンコールター社製）によって計測した。【００２２】
（実験結果）
表３に細胞のインスリン分泌量を示す。また、表３には、細胞を電磁場に曝露せずに培養してから、グルコース刺激を行った場合の結果をあわせて示す（擬曝露下培養群）。表３から明らかなように、この方法によれば、インスリン産生細胞のインスリンの産生量および／または分泌量を増加させることができることがわかった。【００２３】
【表３】
2005123906.tif 000004
【００２４】
実施例４：
インスリン産生細胞に周波数が５０Ｈｚの電磁波を照射した場合でも、実施例３と同様の効果を得ることができることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明は、細胞レベルで、簡易かつ効率よく、インスリンの産生量および／または分泌量を増加させる方法を提供することができる点において、産業上の利用可能性を有する。
【図１】
2005123906.tif 000005
【国際調査報告】
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