(57)【要約】本発明は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症（Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）または肺高血圧症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）の予防・治療・改善剤を提供する。詳しくは、（１）ＮＦ−κＢデコイを有効成分とする慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症（Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）または肺高血圧症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）の予防・治療・改善剤。（２）ＮＦ−κＢデコイが結合配列ＧＧＧＲＨＴＹＹＨＣ（式中、ＲはＡまたはＧを、ＹはＣまたはＴを、ＨはＡ、ＣまたはＴをそれぞれ意味する）を有するオリゴヌクレオチド。（３）ＮＦ−κＢ結合配列がＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣまたはＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣであるオリゴヌクレオチド。（４）ＮＦ−κＢデコイが配列番号３で表されるオリゴヌクレオチド。（５）ＮＦ−κＢデコイが二本鎖オリゴヌクレオチド。（６）ＮＦ−κＢデコイが微粉末で投与される。（７）ＮＦ−κＢデコイ微粉末がドライパウダーである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＦ−κＢデコイを有効成分とする、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症（Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）または肺高血圧症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）の予防・治療・改善剤。
【請求項２】
ＮＦ−κＢデコイが結合配列ＧＧＧＲＨＴＹＹＨＣ（式中、ＲはＡまたはＧを、ＹはＣまたはＴを、ＨはＡ、ＣまたはＴをそれぞれ意味する。）を含有するオリゴヌクレオチドである、請求項１記載の予防・治療・改善剤。
【請求項３】
前記ＮＦ−κＢ結合配列がＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣまたはＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣである、請求項１または２記載の予防・治療・改善剤。
【請求項４】
ＮＦ−κＢデコイが配列番号３で表されるオリゴヌクレオチドである、請求項１ないし３のいずれかに記載の予防・治療・改善剤。
【請求項５】
ＮＦ−κＢデコイが二本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１ないし４のいずれかに記載の予防・治療・改善剤。
【請求項６】
ＮＦ−κＢデコイが配列番号３で表されるオリゴヌクレオチドとそれに完全に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドからなる、請求項１ないし５のいずれかに記載の予防・治療・改善剤。
【請求項７】
一部または全部のリン酸基部分がホスホロチオエート化されているオリゴヌクレオチドからなるＮＦ−κＢデコイを有効成分とする、請求項１ないし６いずれかに記載の、予防・治療・改善剤。
【請求項８】
ＮＦ−κＢデコイが微粉末であることを特徴とする、請求項１ないし７のいずれかに記載の予防・治療・改善剤。
【請求項９】
ＮＦ−κＢデコイ微粉末がドライパウダーであることを特徴とする、請求項１ないし８のいずれかに記載の予防・治療・改善剤。
【請求項１０】
ＮＦ−κＢデコイ微粉末の空力学的平均粒子径が約０．０１〜５０μｍであることを特徴とする、請求項１ないし９のいずれかに記載の予防・治療・改善剤。
【請求項１１】
ＮＦ−κＢデコイ微粉末の空力学的平均粒子径が約０．０５〜３０μｍであることを特徴とする、請求項１ないし１０のいずれかに記載の予防・治療・改善剤。
【請求項１２】
ＮＦ−κＢデコイ微粉末の空力学的平均粒子径が約０．１〜１０μｍであることを特徴とする、請求項１ないし１１のいずれかに記載の予防・治療・改善剤。
【請求項１３】
請求項１に記載したＮＦ−κＢデコイの薬理学上有効量を患者に投与することにより、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症（Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）または肺高血圧症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）を予防・治療・改善する方法。
【請求項１４】
請求項１ないし１２のいずれかに記載したＮＦ−κＢデコイを、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症（Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）または肺高血圧症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）を予防・治療・改善剤の製造の為に用いる用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＦ−κＢデコイを有効成分とする慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症（Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）または肺高血圧症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）の予防・治療・改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＯＰＤは肺の閉塞性換気障害を特徴とする疾患である。慢性的な喫煙などにより気管支の上皮細胞が傷害を受け、それが引き金となり炎症性の細胞が浸潤し気管支や肺胞に炎症が起こる。粘液の分泌が増加し、せき、喀痰がＣＯＰＤの初期の症状として現れる。さらに進行すると、気道壁の肥厚と炎症による肺胞支持組織の破壊が進み、閉塞性の肺機能傷害と肺の弾性収縮力の損失によって、１秒率（ＦＥＶ１）の低下が起きる。一般に長い経過をたどる予後不良の疾患である。日本においては潜在的なＣＯＰＤ患者が５００万人以上と推定されおり、人口の高齢化にともない今後患者数は増加すると考えられる。現在、ＣＯＰＤの管理には気管支拡張剤やグルココルチコイドが用いられているが（文献４）、根本的な治療法は存在しない。又、吸入ステロイドによって骨粗鬆症のリスクが高まることが指摘されている（文献１３）。
一方、Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ（ＣＦ）は原因遺伝子がＣＦＴＲ（Ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）であることが判明している遺伝病であり、世界中で５万人以上の患者が存在する。ＣＦＴＲは塩素イオンチャンネルを形成しており、この遺伝子の変異により、塩素イオンの細胞外への輸送が損なわれ、結果的に気管支内腔の脱水により気管支および肺胞上皮細胞の障害が起きると考えられている（文献４）。ＣＯＰＤと同様に炎症性の細胞の侵入による炎症像が見られ、濃厚な粘液による肺胞及び細気管支の閉塞が起き換気障害が進む。両疾患とも感染が起き易く感染と伴に病気の増悪を起こす。
肺高血圧症はＣＯＰＤの後期（ステージＩＩＩ：重症ＣＯＰＤ）に発症し、通常は重度の低酸素血症（ＰａＯ２＜８．０ｋＰａあるいは６０ｍｍＨｇ）が発症した後に生じ、しばしば高ＣＯ２血症を伴う。肺高血圧症はＣＯＰＤの主な心血管系合併症であり、肺性心の発症につながり予後は不良である。しかし、重症ＣＯＰＤ患者であっても肺動脈圧は通常安静時には若干上昇する程度であるが、労作により顕著に上昇する。ＣＯＰＤにおける肺高血圧症は末治療であっても進行は遅い。
ＣＯＰＤおよびＣＦとも粘液を分泌する杯細胞（ｇｏｂｌｅｔ  ｃｅｌｌ）の化生（ｍｅｔａｐｌａｓｉａ）、粘液による粘液栓が見られる炎症を伴う閉塞性肺疾患であり、それに関与する炎症性細胞も単球／マクロファージならびに好中球が主体となっている点も共通している（文献５，８，１０）。破壊された気管支、肺胞上皮細胞の修復は困難であるので、これらの疾患の治療に当たっては細胞のさらなる破壊を防ぐため炎症反応の効果的な抑制が重要である。
ＮＦ−κＢは各種のサイトカイン、ケモカイン、細胞接着因子の遺伝子発現の制御因子であり、ＮＦ−κＢの作用を抑制すると種々の炎症反応、並びに免疫学的反応が抑えられることは、すでにアトピーや関節リウマチモデルで知られている。閉塞性の肺疾患に関しても、タバコの煙によるマウスモデルでＮＦ−κＢの活性化が起きることが報告されていている（文献６）。
関連技術の文献リスト
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７）Ｄｅｓｍｅｔ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ＮＦ−ｋＢ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ａｉｒ  ｗａｙ  
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９）Ｓｉｎ  ＤＤ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｍ，Ｇａｎ  ＷＱ，Ｍａｎ  ＳＦ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｉｎｈａｌｅｄ  
ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｌｏｎｇ−ａｃｔｉｎｇ  ｂｅｔａ２−ａｄｅｒｅｎｅｒｇｉｃｓ  ｉｎ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  
ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ．１０：
（２８）３５４７−３５６０（２００４）．
１０）Ｈｕｂｂａｒｄ  ＲＣ，Ｆｅｌｌｓ  Ｇ，Ｇａｄｅｋ  Ｊ，Ｐａｃｈｏｌｏｋ  Ｓ，Ｈｕｍｅｓ  Ｊ，Ｃｒｙｓｔａｌ  ＲＧ．
Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇ  ｉｎ  ａｌｐｈａ  ｌ−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．
Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ  Ｂ４  ｂｙ  ａｌｖｅｏｌａｒ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  
Ｉｎｖｅｓｔ．８８：  （３）８９１−８９７（１９９１）．
１１）Ｄａｈｌ  Ｍ，Ｔｙｂｊａｅｒｇ−Ｈａｎｓｅｎ  Ａ，Ｌａｎｇｅ  Ｐ，Ｎｏｒｄｅｓｔｇａａｒｄ  ＢＧ．ＤｅｌｔａＦ５０８  
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１９９８  Ｊｕｎ  ２７；３５１（９１２０）：１９１１−３．
１２）Ｓｉｎ  ＤＤ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｍ，Ｇａｎ  ＷＱ，Ｍａｎ  ＳＦ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｉｎｈａｌｅｄ  
ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｌｏｎｇ−ａｃｔｉｎｇ  ｂｅｔａ２−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃｓ  ｉｎ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  
ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ  
１０：３５４７−３５６０（２００４）．
１３）Ｓｃａｎｌｏｎ  ＰＤ，Ｃｏｎｎｅｔｔ  ＪＥ，Ｗｉｓｅ  ＲＡ，Ｔａｓｈｋｉｎ  ＤＰ，Ｍａｄｈｏｋ  Ｔ，Ｓｋｅａｎｓ  Ｍ，
Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ＰＣ，Ｂａｉｌｅｙ  ＷＣ，Ｂｕｉｓｔ  ＡＳ，Ｅｉｃｈｅｎｈｏｒｎ  Ｍ，Ｋａｎｎｅｒ  ＲＥ，Ｗｅｉｎｍａｎｎ  Ｇ．
Ｌｏｓｓ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｈａｌｅｄ  Ｔｒｉａｍｃｉｎｏｌｏｎｅ  ｉｎ  Ｌｕｎｇ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔｕｄｙ  ＩＩ．
Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｇｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，１７０（１２）：１３０２−１３０９（２００４）．
ＷＯ−Ａ  ０３／１０５７８０は、アンチセンス・ドライパウダーを各種疾患に投与する方法を開示している。
【発明の開示】
【０００３】
ＷＯ−Ａ  ０３／１０５７８０は、ＮＦ−κＢデコイの使用に関しては何ら開示していない。
また、ＮＦ−κＢの作用の抑制がどのような効果をもたらすかについては十分知られていなかった。本発明者らは、モルモットを用いた閉塞性肺疾患のモデルで、ＮＦ−κＢが遺伝子発現の制御をする際に結合するＤＮＡ配列（コンセンサス配列）を含む、２０塩基前後の塩基対を有するＤＮＡ誘導体（ＮＦ−κＢデコイ）が低投与量で有効であること証明し、本発明を完成した。
なお、デコイ（ｄｅｃｏｙ）とは、英語で「おとり」の意味であり、ある物質が本来結合あるいは作用すべきものと似せた構造を有するものをデコイと呼んでいる。ゲノム遺伝子上の結合領域に結合する転写因子のデコイとしては、主として該結合領域と同じ塩基配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチドが用いられる。このようなオリゴヌクレオチドから成るデコイの共存下では、転写因子の分子のうちの一部は、本来結合すべきゲノム遺伝子上の結合領域に結合せずに、オリゴヌクレオチドデコイに結合する。このため、本来結合すべきゲノム遺伝子上の結合領域に結合する転写因子の分子数が減少し、その結果、転写因子の活性が低下することになる。この場合、オリゴヌクレオチドは、本物のゲノム遺伝子上の結合領域の偽物（おとり）として機能して転写因子を結合するため、デコイと呼ばれる。
また、コンセンサス配列とは、任意の転写因子が結合する共通の遺伝子配列のことをいう。例えばＮＦ−κＢが結合するコンセンサス配列は、ＧＧＧＲＨＴＹＹＨＣ（式中、ＲはＡまたはＧを、ＹはＣまたはＴを、ＨはＡ、ＣまたはＴをそれぞれ意味する）（配列番号１）である。ＮＦ−κＢの場合は、このコンセンサス配列を基に、ｇｇｇａｔｔｔｃｃｃ（配列番号２）又はｇｇｇａｃｔｔｔｃｃ（配列番号４）などの配列を導き出すことができる。
本発明は、（１）ＮＦ−κＢデコイを有効成分とする、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症（Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）または肺高血圧症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）の予防・治療・改善剤である。
本発明は、上記ＮＦ−κＢデコイの薬理学上有効量を患者に投与することにより、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症（Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）または肺高血圧症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）を予防・治療・改善する方法である。
本発明は、上記ＮＦ−κＢデコイを、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症（Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）または肺高血圧症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）を予防・治療・改善剤の製造の為に用いる用途である。
発明の詳細な説明
本発明は好ましい形態として次を含む。
（２）ＮＦ−κＢデコイが結合配列ＧＧＧＲＨＴＹＹＨＣ（式中、ＲはＡまたはＧを、ＹはＣまたはＴを、ＨはＡ、ＣまたはＴをそれぞれ意味する。）を含有するオリゴヌクレオチドである、（１）記載の予防・治療・改善剤。
（３）前記ＮＦ−κＢ結合配列がＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣまたはＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣである、（１）または（２）記載の予防・治療・改善剤。
（４）ＮＦ−κＢデコイが配列番号３で表されるオリゴヌクレオチドである、（１）ないし（３）のいずれかに記載の予防・治療・改善剤。
（５）ＮＦ−κＢデコイが二本鎖オリゴヌクレオチドである、（１）ないし（４）のいずれかに記載の予防・治療・改善剤。
（６）ＮＦ−κＢデコイが配列番号３で表されるオリゴヌクレオチドとそれに完全に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドからなる、（１）ないし（５）のいずれかに記載の予防・治療・改善剤。
（７）一部または全部のリン酸基部分がホスホロチオエート化されているオリゴヌクレオチドからなるＮＦ−κＢデコイを有効成分とする、（１）ないし（６）のいずれかに記載の、予防・治療・改善剤。
（８）ＮＦ−κＢデコイが微粉末で投与されることを特徴とする、（１）ないし（７）のいずれかに記載の予防・治療・改善剤。
（９）ＮＦ−κＢデコイ微粉末がドライパウダーであることを特徴とする、（１）ないし（８）のいずれかに記載の予防・治療・改善剤。
（１０）ＮＦ−κＢデコイ微粉末の空力学的平均粒子径が約０．０１〜５０μｍであることを特徴とする、（１）ないし（９）のいずれかに記載の予防・治療・改善剤。
（１１）ＮＦ−κＢデコイ微粉末の空力学的平均粒子径が約０．０５〜３０μｍであることを特徴とする、（１）ないし（１０）のいずれかに記載の予防・治療・改善剤。
（１２）ＮＦ−κＢデコイ微粉末の空力学的平均粒子径が約０．１〜１０μｍであることを特徴とする、（１）ないし（１１）のいずれかに記載の予防・治療・改善剤。
ここで本発明にかかるＮＦ−κＢデコイとして、具体的には例えばＵＳ６２６２０３３号公報に記載されている、配列番号３で表されるオリゴヌクレオチドとこれに完全に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる二本鎖オリゴヌクレオチドを挙げることができる。
ＮＦ−κＢデコイ・オリゴヌクレオチドは一本鎖でも二本鎖でもよいが、二本鎖がより好ましい。またリン酸基部分がホスホロチオエート化等により修飾されていてもよい。
ＮＦ−κＢデコイの投与方法は限定されないが、微粉末、特にドライパウダーの形態で投与されることが好ましい。微粉末化の手段も限定されないが、通常は例えばボールミル、ビーズミル、ジェットミル、アルティマイザー（ｕｌｔｉｍａｉｚｅｒ）、乳鉢、石臼、噴霧乾燥、超臨界流体等の手段を利用して製造することができる。
微粉末の粒径も限定されないが、通常は約０．０１〜５０μｍであり、好ましくは０．０５〜３０μｍであり、より好ましくは約０．１〜１０μｍである。
微粉末として投与する際には、通常は薬学的に許容されるキャリアを加えた組成物として製剤化する。キャリアも医薬添加物として利用されているものであれば限定されないが、具体的には例えばグルコース、乳糖、トレハロース、ショ糖、マンニトールまたはキシリトール等を挙げることができる。
投与方法も限定されないが、具体的には例えば定量噴霧式吸入器（ＭＤＩ）、ドライパウダー吸入器（ＤＰＩ）、ネブライザー（ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ）等のデバイスを用いて投与する。
投与量も限定されないが、通常は成人１回あたり約１０μｇ〜１００ｍｇを、好ましくは約５０μｇ〜５０ｍｇを、より好ましくは約１００μｇ〜１０ｍｇを投与する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、タバコ煙曝露４週目における、ＮＦ−κＢデコイ１０μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇおよび２５０μｇ／ｋｇ投与群および対照（媒体）群の気道抵抗を比較したグラフである。
図２は、気管支肺胞洗浄液中炎症性細胞数を示した図である。
【実施例】
【０００５】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
［実施例１］  タバコの煙によるモルモットの慢性閉塞性肺疾患モデルに対するＮＦ−κＫＢデコイの効果
動物モデル：
モルモット（Ｈａｒｔｌｅｙ、日本エスエルシー）を曝露ホルダー（ＲＭＨ−ＴＵＢＥＳ，Ｍｕｅｎｓｔｅｒ  Ｌｔｄ．）に入れて曝露チャンバー（Ｆｌｏｗ−ｐａｓｔ  ｔｙｐｅ  ｎｏｓｅ−ｏｎｌｙ  ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  ｃｈａｍｂｅｒ，Ｍｕｅｎｓｔｅｒ  Ｌｔｄ．）に固定し，喫煙曝露装置（Ｈａｍｂｕｒｇ  ＩＩ，Ｂｏｒｇｗａｌｄｔ  Ｔｅｃｈｎｉｋ）を用いてタバコ（ハイライト，日本たばこ産業株式会社）の煙を１日６０分間，１週間に５日間，４週間吸入させ、肺の障害を惹起した。
投与製剤：
（１）微紛化ＮＦ−κＢデコイ・オリゴヌクレオチドの調製
配列番号３で表されるオリゴヌクレオチドとその相補鎖からなるオリゴヌクレオチドであって、そのリン酸結合がホスホロチオエート化されている二本鎖オリゴヌクレオチドからなるＮＦ−κＢデコイ・オリゴヌクレオチド約２００ｍｇを量り、マルチビーズショッカー用サンプルチューブに入れ、メタルコーンを入れた後栓をした。次にマルチビーズショッカーにサンプルチューブをセットし以下の条件で粉砕を行った。
振動数：２０００ｒｐｍ
運転時間：５分×１２回（１時間）（サンプルホルダーを５分毎にドライアイスを用いて冷却して行った。）
（２）微紛化Ｄ−マンニトールの調製
マルチビーズショッカー用サンプルチューブを２個用意し、Ｄ−マンニトール約２ｇずつを量り、メタルコーンを入れた後栓をした。次にマルチビーズショッカーにサンプルチューブをセットし以下の条件で粉砕を行った。
振動数：２０００ｒｐｍ
運転時間：５分×１２回（１時間）（サンプルホルダーを５分毎にドライアイスを用いて冷却して行った。）
上記方法で微粉末化したＮＦ−κＢデコイ粉末とマンニトールを精密に測り取りマルチビーズショッカー用サンプルチューブに入れ、メタルコーンを入れた後栓上記と同条件で再び粉砕し微細粉末を調整した（平均粒度５μｍ以下）。
投与：
投与は粉末気管内投与器具（ＤＰ−４）を用いて、モルモット気管内に週１回投与した。
呼吸機能の測定：
総合呼吸機能解析システム（Ｐｕｌｍｏｓ−Ｉ，株式会社Ｍ・Ｉ・Ｐ・Ｓ）を用い、ｄｏｕｂｌｅ  ｆｌｏｗ  ｐｌｅｔｈｙｓｍｏｇｒａｐｈ法でモルモットの呼吸機能（特殊気道抵抗，一回換気量，分時換気量）を覚醒下で測定した。測定は曝露前、曝露２，３および４週目終了の翌日に行った。それぞれ１００呼吸分の呼吸機能を１匹ずつ測定し、その平均値を測定値とした。各測定週の呼吸機能の変化量は以下の計算式で算出した。
各測定週の呼吸機能の変化量＝各週の呼吸機能測定値−タバコ煙曝露前の呼吸機能測定値
気管支肺胞洗浄液中炎症性細胞の検討：
肺機能の測定後，動物を放血致死させて開胸した。左気管支分岐部を結紮した後、肺機能測定時に固定したカニューレを介して生理食塩液２．５ｍＬを右肺内に注入、吸引する操作を２回繰り返し（全５ｍＬ）、その回収液を気管支肺胞洗浄液（Ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ  ｌａｖａｇｅ  ｆｌｕｉｄ，ＢＡＬＦ）とした。ＢＡＬＦを２３０×ｇ（回転数：１１００ｒｐｍ，回転半径：１７ｃｍ）、４℃、１０分間遠心分離し、沈殿物（ペレット）を得た。ペレットを０．５ｍＬの生理食塩液に懸濁した。あらかじめ９６穴マイクロプレートにチュルク液を加えたものにマイクロピペットで懸濁したペレットを加え１０倍に希釈し、血球計算板（ビュルケルチュルク式計算板：Ｓ７６４）の大区画を４室測定後１μＬ当たりの細胞数を算出した。
試験成績：
図１に示すごとく、タバコ煙曝露４週目における対照（媒体）群の気道抵抗の変化量は、平均０．５６９ｍＨ２Ｏ×ｍＬ／（ｍＬ／ｓｅｃ）を示し、気道抵抗は経時的に上昇した。（ＡＭＧ−１０、ＡＭＧ−５０およびＡＭＧ−２５０はそれぞれＮＦ−κＢデコイ投与量の１０μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇおよび２５０μｇ／ｋｇを表す。）
ＡＭＧ−１０，５０および２５０投与群の変化量は、タバコ煙曝露４週目でそれぞれ平均０．７４１，０．４７５および０．３６０ｃｍＨ２Ｏ×ｍＬ／（ｍＬ／ｓｅｃ）を示し、ＮＦ−κＢ投与群は用量依存的に気道抵抗上昇を抑制した。
気管支肺胞洗浄液中炎症性細胞数の結果を図２および下表に示した。
2006075776.tif 000002
タバコ煙を４週間曝露させた対照（媒体）群の気管支肺胞洗浄液中の総細胞数は平均５３６５個／μＬ、組織球、マクロファージ、好中球、好酸球およびリンパ球の細胞数はそれぞれ平均２１７９，１０９７，７８１，１１９８および１１１個／μＬを示した。
ＡＭＧ−１０投与群の総細胞数は、それぞれ平均４６０５個／μＬ、組織球、マクロファージ、好中球、好酸球およびリンパ球の細胞数はそれぞれ平均２０８８，３７３，１５５４，４７８および１１２個／μＬ、ＡＭＧ−５０投与群はそれぞれ、平均で３５８０，１５７５，６４４，７０５，５１８および１３９個／μＬ、ＡＭＧ−２５０投与群はそれぞれ、平均で２３８０，１２２９，２０３，７８５，９６および６８個／μＬであった。ＮＦ−κＢデコイ投与群では気管支肺胞洗浄液中の総細胞数、組織球の減少が見られ、特にマクロファージでは対照（媒体）群と比較してＡＭＧ−１０および２５０投与群で有意な抑制が見られた。ＣＯＰＤに関与する炎症性細胞の内でマクロファージも重要な地位を占めており、ＮＦ−κＢデコイがＣＯＰＤの症状改善に有効であることを示唆している。
［配列表］
2006075776.tif 000003
【図１】
2006075776.tif 000004
【図２】
2006075776.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成19年8月21日(2007.8.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
NF-κBデコイを有効成分とする、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、嚢胞性線維症(Cystic Fibrosis)または肺高血圧症(pulmonary hypertension)の予防・治療・改善剤。
【請求項２】
NF-κBデコイが結合配列GGGRHTYYHC(式中、RはAまたはGを、YはCまたはTを、HはA、CまたはTをそれぞれ意味する。)を含有するオリゴヌクレオチドである、請求項１記載の予防・治療・改善剤。
【請求項３】
前記NF-κB結合配列がGGGATTTCCCまたはGGGACTTTCCである、請求項１または２記載の予防・治療・改善剤。
【請求項４】
NF-κBデコイが配列番号３で表されるオリゴヌクレオチドである、請求項１ないし３のいずれかに記載の予防・治療・改善剤。
【請求項５】
NF-κBデコイが二本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１ないし４のいずれかに記載の予防・治療・改善剤。
【請求項６】
NF-κBデコイが配列番号３で表されるオリゴヌクレオチドとそれに完全に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドからなる、請求項１ないし５のいずれかに記載の予防・治療・改善剤。
【請求項７】
一部または全部のリン酸基部分がホスホロチオエート化されているオリゴヌクレオチドからなるNF-κBデコイを有効成分とする、請求項１ないし６いずれかに記載の、予防・治療・改善剤。
【請求項８】
NF-κBデコイが微粉末であることを特徴とする、請求項１ないし７のいずれかに記載の予防・治療・改善剤。
【請求項９】
NF-κBデコイ微粉末がドライパウダーであることを特徴とする、請求項１ないし８のいずれかに記載の予防・治療・改善剤。
【請求項１０】
NF-κBデコイ微粉末の空力学的平均粒子径が約0.01〜50μmであることを特徴とする、請求項１ないし９のいずれかに記載の予防・治療・改善剤。
【請求項１１】
NF-κBデコイ微粉末の空力学的平均粒子径が約0.05〜30μmであることを特徴とする、請求項１ないし１０のいずれかに記載の予防・治療・改善剤。
【請求項１２】
NF-κBデコイ微粉末の空力学的平均粒子径が約0.1〜10μmであることを特徴とする、請求項１ないし１１のいずれかに記載の予防・治療・改善剤。
【請求項１３】
請求項１に記載したNF-κBデコイの薬理学上有効量を患者に投与することにより、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、嚢胞性線維症(Cystic Fibrosis)または肺高血圧症(pulmonary hypertension)を予防・治療・改善する方法。
【請求項１４】
請求項１ないし１２のいずれかに記載したNF-κBデコイを、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、嚢胞性線維症(Cystic Fibrosis)または肺高血圧症(pulmonary hypertension)を予防・治療・改善剤の製造の為に用いる用途。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、NF-κBデコイを有効成分とする慢性閉塞性肺疾患(COPD)、嚢胞性線維症(Cystic Fibrosis)または肺高血圧症(pulmonary hypertension)の予防・治療・改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
COPDは肺の閉塞性換気障害を特徴とする疾患である。慢性的な喫煙などにより気管支の上皮細胞が傷害を受け、それが引き金となり炎症性の細胞が浸潤し気管支や肺胞に炎症が起こる。粘液の分泌が増加し、せき、喀痰がCOPDの初期の症状として現れる。さらに進行すると、気道壁の肥厚と炎症による肺胞支持組織の破壊が進み、閉塞性の肺機能傷害と肺の弾性収縮力の損失によって、1秒率(FEV1)の低下が起きる。一般に長い経過をたどる予後不良の疾患である。日本においては潜在的なCOPD患者が500万人以上と推定されおり、人口の高齢化にともない今後患者数は増加すると考えられる。現在、COPDの管理には気管支拡張剤やグルココルチコイドが用いられているが(文献4)、根本的な治療法は存在しない。又、吸入ステロイドによって骨粗鬆症のリスクが高まることが指摘されている(文献12)。
【０００３】
一方、Cystic Fibrosis（CF）は原因遺伝子がCFTR（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator）であることが判明している遺伝病であり、世界中で5万人以上の患者が存在する。CFTRは塩素イオンチャンネルを形成しており、この遺伝子の変異により、塩素イオンの細胞外への輸送が損なわれ、結果的に気管支内腔の脱水により気管支および肺胞上皮細胞の障害が起きると考えられている（文献4）。COPDと同様に炎症性の細胞の侵入による炎症像が見られ、濃厚な粘液による肺胞及び細気管支の閉塞が起き換気障害が進む。両疾患とも感染が起き易く感染と伴に病気の増悪を起こす。
【０００４】
肺高血圧症はCOPDの後期（ステージIII：重症COPD）に発症し、通常は重度の低酸素血症（PaO2<8.0kPaあるいは60mmHg）が発症した後に生じ、しばしば高CO2血症を伴う。肺高血圧症はCOPDの主な心血管系合併症であり、肺性心の発症につながり予後は不良である。しかし、重症COPD患者であっても肺動脈圧は通常安静時には若干上昇する程度であるが、労作により顕著に上昇する。COPDにおける肺高血圧症は末治療であっても進行は遅い。
【０００５】
COPDおよびCFとも粘液を分泌する杯細胞（goblet cell）の化生（metaplasia）、粘液による粘液栓が見られる炎症を伴う閉塞性肺疾患であり、それに関与する炎症性細胞も単球／マクロファージならびに好中球が主体となっている点も共通している(文献5,8,10)。破壊された気管支、肺胞上皮細胞の修復は困難であるので、これらの疾患の治療に当たっては細胞のさらなる破壊を防ぐため炎症反応の効果的な抑制が重要である。
【０００６】
NF-κBは各種のサイトカイン、ケモカイン、細胞接着因子の遺伝子発現の制御因子であり、NF-κBの作用を抑制すると種々の炎症反応、並びに免疫学的反応が抑えられることは、すでにアトピーや関節リウマチモデルで知られている。閉塞性の肺疾患に関しても、タバコの煙によるマウスモデルでNF-κBの活性化が起きることが報告されていている(文献6)。
関連技術の文献リスト
1) Marcus Mall et al. Increased airway epithelial Na+ absorption produces cystic fibrosis-like lung disease in mice. Nature Medicine 10: (5) 487-493 (2004).
2) Shao MX, Nakanaga T, Nadel JA. Cigarette smoke induces MUC5AC mucin overproduction via tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme in human airway epithelial (NCI-H292) cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287 (2): L420-427 (2004).
3) Takeyama K, Birgit J, et al. Activation of epidermal growth factors is responsible for mucin synthesis induced by cigarette smoke. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 280: L165-L172, (2001).
4) Matsui H. et al. Evidence for periciliary liquid layer depletion, not abnormal ion composition, in the pathogenesis of cystic fibrosis airways disease. Cell 95: 1005-1015 (1998).
5) Chung KF. Cytokines in chronic obstructive pulmonary disease. Eur Respir J Suppl 34:50s-59s. Review (2001).
6) Churg A, Wang RD, Tai H, Wang X, Xie C, Dai J, Shapiro SD, Wright JL. Macrophage metalloelastase mediates acute cigarette smoke-induced inflammation via tumor necrosis factor-alpha release. Am J Respir Crit Care Med. 167 (8): 1083-1089 (2003).
7) Desmet C, et al. Selective blockade of NF-kB activity in air way immune cells inhibits the effector phase of experimental asthma. J. Immunology 173; 5766-5775 (2004).
8) Singh S, Syme CA, Singh AK, Devor DC, Bridges RJ. Benzimidazolone activators of chloride secretion: potential therapeutics for cystic fibrosis and chronic obstructive pulmonary disease. J Pharmacol Exp Ther. 296(2):600-611 (2001).
9) Sin DD, Johnson M, Gan WQ, Man SF. Combination therapy of inhaled corticosteroids and long-acting beta2-aderenergics in management of patients with chronic obstructive pulmonary disease. Curr Pharm Des. 10: (28) 3547-3560 (2004).
10) Hubbard RC, Fells G, Gadek J, Pacholok S, Humes J, Crystal RG. Neutrophil accumulation in the lung in alpha 1-antitrypsin deficiency. Spontaneous release of leukotriene B4 by alveolar macrophages. J Clin Invest. 88: (3):891-897 (1991).
11) Dahl M, Tybjaerg-Hansen A, Lange P, Nordestgaard BG. DeltaF508 heterozygosity in cystic fibrosis and susceptibility to asthma. Lancet. 1998 Jun 27;351(9120):1911-3.
12) Scanlon PD, Connett JE, Wise RA, Tashkin DP, Madhok T, Skeans M, Carpenter PC, Bailey WC, Buist AS, Eichenhorn M, Kanner RE, Weinmann G. Loss of Bone Density with Inhaled Triamcinolone in Lung Health Study II. Am J Respir Crit Care Med. 170(12):1302-1309 (2004).
WO-A 03/105780は、アンチセンス・ドライパウダーを各種疾患に投与する方法を開示している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
WO-A 03/105780は、NF-κBデコイの使用に関しては何ら開示していない。
【０００８】
また、NF-κBの作用の抑制がどのような効果をもたらすかについては十分知られていなかった。本発明者らは、モルモットを用いた閉塞性肺疾患のモデルで、NF-κBが遺伝子発現の制御をする際に結合するDNA配列（コンセンサス配列）を含む、20塩基前後の塩基対を有するDNA誘導体（NF-κBデコイ）が低投与量で有効であること証明し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
なお、デコイ(decoy)とは、英語で「おとり」の意味であり、ある物質が本来結合あるいは作用すべきものと似せた構造を有するものをデコイと呼んでいる。ゲノム遺伝子上の結合領域に結合する転写因子のデコイとしては、主として該結合領域と同じ塩基配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチドが用いられる。このようなオリゴヌクレオチドから成るデコイの共存下では、転写因子の分子のうちの一部は、本来結合すべきゲノム遺伝子上の結合領域に結合せずに、オリゴヌクレオチドデコイに結合する。このため、本来結合すべきゲノム遺伝子上の結合領域に結合する転写因子の分子数が減少し、その結果、転写因子の活性が低下することになる。この場合、オリゴヌクレオチドは、本物のゲノム遺伝子上の結合領域の偽物（おとり）として機能して転写因子を結合するため、デコイと呼ばれる。
【００１０】
また、コンセンサス配列とは、任意の転写因子が結合する共通の遺伝子配列のことをいう。例えばNF-κBが結合するコンセンサス配列は、GGGRHTYYHC(式中、RはAまたはGを、YはCまたはTを、HはA、CまたはTをそれぞれ意味する)(配列番号１)である。NF-κBの場合は、このコンセンサス配列を基に、gggatttccc（配列番号２）又はgggactttcc（配列番号４）などの配列を導き出すことができる。
【００１１】
本発明は、(1) NF-κBデコイを有効成分とする、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、嚢胞性線維症(Cystic Fibrosis)または肺高血圧症(pulmonary hypertension)の予防・治療・改善剤である。
【００１２】
本発明は、上記NF-κBデコイの薬理学上有効量を患者に投与することにより、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、嚢胞性線維症(Cystic Fibrosis)または肺高血圧症(pulmonary hypertension)を予防・治療・改善する方法である。
【００１３】
本発明は、上記NF-κBデコイを、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、嚢胞性線維症(Cystic Fibrosis)または肺高血圧症(pulmonary hypertension)を予防・治療・改善剤の製造の為に用いる用途である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は好ましい形態として次を含む。
(2) NF-κBデコイが結合配列GGGRHTYYHC(式中、RはAまたはGを、YはCまたはTを、HはA、CまたはTをそれぞれ意味する。)を含有するオリゴヌクレオチドである、(1)記載の予防・治療・改善剤。
(3) 前記NF-κB結合配列がGGGATTTCCCまたはGGGACTTTCCである、(1)または(2)記載の予防・治療・改善剤。
(4) NF-κBデコイが配列番号３で表されるオリゴヌクレオチドである、(1)ないし(3)のいずれかに記載の予防・治療・改善剤。
(5) NF-κBデコイが二本鎖オリゴヌクレオチドである、(1)ないし(4)のいずれかに記載の予防・治療・改善剤。
(6) NF-κBデコイが配列番号３で表されるオリゴヌクレオチドとそれに完全に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドからなる、(1)ないし(5)のいずれかに記載の予防・治療・改善剤。
(7) 一部または全部のリン酸基部分がホスホロチオエート化されているオリゴヌクレオチドからなるNF-κBデコイを有効成分とする、(1)ないし(6)のいずれかに記載の、予防・治療・改善剤。
(8) NF-κBデコイが微粉末で投与されることを特徴とする、(1)ないし(7)のいずれかに記載の予防・治療・改善剤。
(9) NF-κBデコイ微粉末がドライパウダーであることを特徴とする、(1)ないし(8)のいずれかに記載の予防・治療・改善剤。
(10) NF-κBデコイ微粉末の空力学的平均粒子径が約0.01〜50μmであることを特徴とする、(1)ないし(9)のいずれかに記載の予防・治療・改善剤。
(11) NF-κBデコイ微粉末の空力学的平均粒子径が約0.05〜30μmであることを特徴とする、(1)ないし(10)のいずれかに記載の予防・治療・改善剤。
(12) NF-κBデコイ微粉末の空力学的平均粒子径が約0.1〜10μmであることを特徴とする、(1)ないし(11)のいずれかに記載の予防・治療・改善剤。
【００１５】
ここで本発明にかかるNF-κBデコイとして、具体的には例えばUS6262033号公報に記載されている、配列番号３で表されるオリゴヌクレオチドとこれに完全に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる二本鎖オリゴヌクレオチドを挙げることができる。
【００１６】
NF-κBデコイ・オリゴヌクレオチドは一本鎖でも二本鎖でもよいが、二本鎖がより好ましい。またリン酸基部分がホスホロチオエート化等により修飾されていてもよい。
【００１７】
NF-κBデコイの投与方法は限定されないが、微粉末、特にドライパウダーの形態で投与されることが好ましい。微粉末化の手段も限定されないが、通常は例えばボールミル、ビーズミル、ジェットミル、アルティマイザー(ultimaizer)、乳鉢、石臼、噴霧乾燥、超臨界流体等の手段を利用して製造することができる。
【００１８】
微粉末の粒径も限定されないが、通常は約0.01〜50μmであり、好ましくは0.05〜30μmであり、より好ましくは約0.1〜10μmである。
【００１９】
微粉末として投与する際には、通常は薬学的に許容されるキャリアを加えた組成物として製剤化する。キャリアも医薬添加物として利用されているものであれば限定されないが、具体的には例えばグルコース、乳糖、トレハロース、ショ糖、マンニトールまたはキシリトール等を挙げることができる。
【００２０】
投与方法も限定されないが、具体的には例えば定量噴霧式吸入器(MDI)、ドライパウダー吸入器(DPI)、ネブライザー(nebulizer)等のデバイスを用いて投与する。
【００２１】
投与量も限定されないが、通常は成人１回あたり約10μg〜100mgを、好ましくは約50μg〜50mgを、より好ましくは約100μg〜10mgを投与する。
【実施例】
【００２２】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
【００２３】
実施例１  タバコの煙によるモルモットの慢性閉塞性肺疾患モデルに対するNF-κBデコイの効果
動物モデル：
モルモット（Hartley、日本エスエルシー）を曝露ホルダー（RMH-TUBES，Muenster Ltd.）に入れて曝露チャンバー（Flow-past type nose-only inhalation chamber，Muenster Ltd.）に固定し，喫煙曝露装置（Hamburg II， Borgwaldt Technik）を用いてタバコ（ハイライト，日本たばこ産業株式会社）の煙を1日60分間，1週間に5日間，4週間吸入させ、肺の障害を惹起した。
【００２４】
投与製剤：
(1)微紛化NF-κBデコイ・オリゴヌクレオチドの調製
配列番号３で表されるオリゴヌクレオチドとその相補鎖からなるオリゴヌクレオチドであって、そのリン酸結合がホスホロチオエート化されている二本鎖オリゴヌクレオチドからなるNF-κBデコイ・オリゴヌクレオチド約200mgを量り、マルチビーズショッカー用サンプルチューブに入れ、メタルコーンを入れた後栓をした。次にマルチビーズショッカーにサンプルチューブをセットし以下の条件で粉砕を行った。
【００２５】
振動数：2000rpm
運転時間：5分×12回（1時間）（サンプルホルダーを5分毎にドライアイスを用いて冷却して行った。）
(2)微紛化D-マンニトールの調製
マルチビーズショッカー用サンプルチューブを2個用意し、D-マンニトール約2gずつを量り、メタルコーンを入れた後栓をした。次にマルチビーズショッカーにサンプルチューブをセットし以下の条件で粉砕を行った。
【００２６】
振動数：2000rpm
運転時間：5分×12回（1時間）（サンプルホルダーを5分毎にドライアイスを用いて冷却して行った。）
上記方法で微粉末化したNF-κBデコイ粉末とマンニトールを精密に測り取りマルチビーズショッカー用サンプルチューブに入れ、メタルコーンを入れた後栓上記と同条件で再び粉砕し微細粉末を調整した（平均粒度5μm以下）。
【００２７】
投与：
投与は粉末気管内投与器具（DP-4）を用いて、モルモット気管内に週1回投与した。
【００２８】
呼吸機能の測定：
総合呼吸機能解析システム（Pulmos-I，株式会社M・I・P・S）を用い、double flow plethysmograph法でモルモットの呼吸機能（特殊気道抵抗，一回換気量，分時換気量）を覚醒下で測定した。測定は曝露前、曝露2，3および4週目終了の翌日に行った。それぞれ100呼吸分の呼吸機能を1匹ずつ測定し、その平均値を測定値とした。各測定週の呼吸機能の変化量は以下の計算式で算出した。
各測定週の呼吸機能の変化量＝各週の呼吸機能測定値−タバコ煙曝露前の呼吸機能測定値
気管支肺胞洗浄液中炎症性細胞の検討：
肺機能の測定後，動物を放血致死させて開胸した。左気管支分岐部を結紮した後、肺機能測定時に固定したカニューレを介して生理食塩液2.5mLを右肺内に注入、吸引する操作を2回繰り返し（全5mL）、その回収液を気管支肺胞洗浄液（Bronchoalveolar lavage fluid，BALF）とした。BALFを230×g（回転数：1100rpm，回転半径：17cm）、4℃、10分間遠心分離し、沈殿物（ペレット）を得た。ペレットを0.5mLの生理食塩液に懸濁した。あらかじめ96穴マイクロプレートにチュルク液を加えたものにマイクロピペットで懸濁したペレットを加え10倍に希釈し、血球計算板（ビュルケルチュルク式計算板：S764）の大区画を4室測定後1μL当たりの細胞数を算出した。
【００２９】
試験成績：
図１に示すごとく、タバコ煙曝露4週目における対照（媒体）群の気道抵抗の変化量は、平均0.569 mH2O×mL/(mL/sec)を示し、気道抵抗は経時的に上昇した。（AMG-10、AMG-50およびAMG-250はそれぞれNF-κBデコイ投与量の10μg/kg、50μg/kgおよび250μg/kgを表す。）
AMG-10，50および250投与群の変化量は、タバコ煙曝露4週目でそれぞれ平均0.741，0.475および0.360 cmH2O×mL/(mL/sec)を示し、NF-κB投与群は用量依存的に気道抵抗上昇を抑制した。
【００３０】
気管支肺胞洗浄液中炎症性細胞数の結果を図2および下表に示した。
【００３１】
【表１】
2006075776.tif 000006
【００３２】
タバコ煙を4週間曝露させた対照（媒体）群の気管支肺胞洗浄液中の総細胞数は平均5365個/μL、組織球、マクロファージ、好中球、好酸球およびリンパ球の細胞数はそれぞれ平均2179，1097，781，1198および111個/μLを示した。
【００３３】
AMG-10投与群の総細胞数は、それぞれ平均4605個/μL、組織球、マクロファージ、好中球、好酸球およびリンパ球の細胞数はそれぞれ平均2088，373，1554，478および112個/μL、AMG-50投与群はそれぞれ、平均で3580，1575，644，705，518および139個/μL、AMG-250投与群はそれぞれ、平均で2380，1229，203，785，96および68個/μLであった。NF-κBデコイ投与群では気管支肺胞洗浄液中の総細胞数、組織球の減少が見られ、特にマクロファージでは対照（媒体）群と比較してAMG-10および250投与群で有意な抑制が見られた。COPDに関与する炎症性細胞の内でマクロファージも重要な地位を占めており、NF-κBデコイがCOPDの症状改善に有効であることを示唆している。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、タバコ煙曝露4週目における、NF-κBデコイ10μg/kg、50μg/kgおよび250μg/kg投与群および対照(媒体)群の気道抵抗を比較したグラフである。
【図２】図２は、気管支肺胞洗浄液中炎症性細胞数を示した図である。
【国際調査報告】
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