(57)【要約】免疫賦活作用、抗アレルギー作用等の免疫調節作用を発揮する新規組成物を提供する。乳酸菌で発酵させた昆布を単独で、または当該昆布を、乳酸菌で発酵させた胡麻、大豆と組み合わせて含む組成物が提供される。この組成物は、バランス良く栄養素を吸収することを可能とし、安全性が高く、優れた免疫調節作用を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌で発酵させた昆布を含有する、免疫調節作用を有する組成物。
【請求項２】
免疫調節作用が免疫賦活作用及び／または抗アレルギー作用である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
乳酸菌が植物性乳酸菌である請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
乳酸菌で発酵させた昆布と、乳酸菌で発酵させた胡麻と、乳酸菌で発酵させた大豆とを含有する組成物。
【請求項５】
乳酸菌が植物性乳酸菌である請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
免疫調節作用を有する請求項４または５に記載の組成物。
【請求項７】
免疫調節作用が免疫賦活作用及び／または抗アレルギー作用である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
飲食物、食品添加物、健康食品または医薬組成物である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
丸剤の形態である、請求項１〜８のいずれか１項記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌で発酵させた昆布を含有する免疫調節作用を有する組成物、より具体的には免疫賦活作用を有する組成物及び／または抗アレルギー作用を有する組成物に関する。また、本発明は、乳酸菌で発酵させた昆布と、乳酸菌で発酵させた胡麻と、乳酸菌で発酵させた大豆とを含む免疫調節作用を有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、アレルギーに関する問題が急激に顕在化している。アレルギーには様々な疾患があり、花粉症を筆頭にアトピー性皮膚炎、食品アレルギー、アレルギー性鼻炎、アレルギー性喘息などの患者数が特に多いことが知られ、中でも花粉症の患者数は飛躍的に増大していることが報告されている。この様な現状に対して、医薬品メーカーを中心にアレルギー克服のための研究が精力的に行われ、数々の製品が開発された。その代表的なものは、抗アレルギー剤や抗ヒスタミン剤であるが、これらの薬剤はアレルギー発症機序の末端に位置するマスト細胞と呼ばれる顆粒球からの炎症性物質の放出やレセプターへの作用を特徴としており、一過性の症状緩和をもたらす反面、アレルギー発症の根本には影響しない。また、特に重い症状を有する患者に対してはステロイド剤などが投与されることがあるが、この類の薬剤においてはその副作用が問題となっている。このような状況の中、アレルギーの根本的な治療法及び予防法が熱望されている。一方、日本は高齢化社会を迎え、加齢による免疫力低下に起因する高齢者の感染症による死亡が増加している。また、多忙な現代社会及びストレス環境での生活によっても免疫力が低下することが知られており、その対策が強く望まれている。【０００３】
このような問題に対処するため、免疫調節機能を高めることによって、免疫力を向上させて感染症を防止しうる、またはアレルギーを予防または治療しうる手段として、身近な食品素材から製造される、穏やかな免疫調節作用を長期間に亙って発揮し、ストレス環境下の人々の健康を維持できる、安全な経口摂取組成物を開発することが急務とされている。【０００４】
日本においては古くから海藻を食する習慣が根付いており、特に昆布は強運食、長寿食とされ、精進料理にも含まれる伝統食材である。海藻は、不足しがちなカルシウム、ナトリウム、マグネシウム、リン、鉄、ヨードなどのミネラルや、各種ビタミン、フコイダンなどの食物繊維を豊富に含有する食品であり、免疫調節作用を有することも明らかになっている。また、乳酸発酵食品に関しては、これを食することが健康に良いとする認識が、科学的知見の集積とともにますます高まりつつあり、種々の乳酸菌及び／乳酸発酵食品の免疫調節作用も明らかになってきている。しかしながら、海藻も、乳酸発酵食品も、いずれも単独で十分な免疫調節作用を有するとは言いがたい。したがって、これら二つの要素を併せ持つ海藻由来の乳酸発酵素材が、健康機能の向上を期待させる魅力的な素材と考えられる。しかし、昆布等の海藻には発酵菌株が着床、成長するのに必要な栄養素が少ない。また、その培養には多くの手間と労力と費用を要する。従って、海藻発酵食品及びその生理活性については、十分な検討がなされていない。【０００５】
海藻発酵物に関して、特許文献１は、海藻の糖化、即ち発酵基質となる糖の供給のために海藻類をセルラーゼ等で分解処理して単細胞化し、次いで乳酸菌及び／または酵母を用いて発酵させる方法により得られる海藻発酵食品を開示している。この文献は、当該方法でマコンブ及びワカメが発酵されたことを記載しており、また、当該方法で製造された海藻発酵食品、具体的にはワカメにセルラーゼ及び３菌種（１種類の乳酸菌：Lactobacillus brevis NRIFS B5201 株と、２種類の酵母：Debaryomyces hansenii NRIFSY5201株及びCandida zeylanoides NRIF SY5206 株）を接種させて発酵させた食品が、血中中性脂質低減作用及び肝臓脂質低減作用を有することも記載している。【０００６】
また、特許文献２は、大豆及び昆布の混合物にクモノスカビ属の菌を摂取して発酵させた後に未発酵の胡麻を混合することにより得られる発酵食品であって、簡便に摂取することができ、栄養性・吸収性に優れた美味な食品を開示している。
【特許文献１】特開２００３−２０１号公報
【特許文献２】特許第２８４６５４７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、身近な食品素材を使用して、当該素材に免疫調節機能を付与しまたは当該素材の免疫調節機能を高めることにより、安全性の高い優れた免疫調節作用を有する組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、植物性の乳酸菌を用いて、通常は発酵が困難といわれている昆布を発酵してその乳酸菌発酵物を得ることに成功した。そして、本発明者らは、この昆布の乳酸菌発酵物を経口摂取したときの生理活性について検討を重ねた結果、当該発酵物が昆布単体及び／または乳酸菌単体を摂取した場合と比べて顕著に向上した免疫調節作用（免疫賦活作用、免疫バランス調整作用）を示すことを見出した。また、本発明者らは、この昆布の乳酸菌発酵物の免疫調節機能をより効率的に発揮させることができ、かつ優れた栄養価を有する食品素材の開発に向けて鋭意検討したところ、乳酸菌で発酵させた昆布と、乳酸菌で発酵させた胡麻及び乳酸菌で発酵させた大豆とを組み合わせて含む組成物が、驚くべきことに、経口摂取されたときに予測に反するほど高い免疫賦活作用、抗アレルギー作用等の免疫調節作用を示すことが判明した。この免疫調節作用は、乳酸菌単独や未発酵の発酵原料単独の作用より著しく大きいことも判明した。しかも、この免疫調節作用は本発明の組成物を加熱滅菌した後でも維持された。【０００９】
本発明はこれらの驚くべき知見に基づいて完成したものである。【００１０】
本発明は、
１．乳酸菌で発酵させた昆布を含有する、免疫調節作用を有する組成物；
２．免疫調節作用が免疫賦活作用及び／または抗アレルギー作用である、１に記載の組成物；
３．乳酸菌が植物性乳酸菌である１または２に記載の組成物；
４．一回摂取量として、乳酸菌で発酵させた昆布を５ｍｇ以上含有する、１〜３のいずれかに記載の組成物；
５．乳酸菌で発酵させた昆布と、乳酸菌で発酵させた胡麻と、乳酸菌で発酵させた大豆とを含有する組成物；
６．乳酸菌が植物性乳酸菌である、５に記載の組成物；
７．免疫調節作用を有する５または６に記載の組成物；
８．免疫調節作用が免疫賦活作用及び／または抗アレルギー作用である、７に記載の組成物；
９．一回摂取量として、乳酸菌で発酵させた昆布と乳酸菌で発酵させた胡麻と乳酸菌で発酵させた大豆とを合計で１〜１００００ｍｇ、好ましくは１０〜１００００ｍｇ含有する、５〜９のいずれか１つに記載の組成物；
１０．飲食物、食品添加物、健康食品または医薬組成物である、１〜９のいずれか１つに記載の組成物；
１１．丸剤の形態である、１〜１０のいずれか１つに記載の組成物；
１２．乳酸菌で発酵させた昆布を有効成分として含有し、免疫調節作用を有する旨の表示を付した飲食物
である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の組成物は、食品素材から製造されているため、安全性が高く、短期ないし長期間にわたり、日常的にまたは適当な日数間隔で継続的に摂取することができる。したがって飲食物もしくは健康食品として摂取した場合、長期間にわたって免疫機能を調節することにより、さまざまな要因で起こる免疫機能低下を防止することができる。また、免疫機能のバランスを調節することにより、生体に悪影響を及ぼす免疫機能の過度の亢進を防止することができる。【００１２】
また、本発明の組成物は、医薬品として投与した場合、免疫機能の低下または免疫機能の過度の亢進に起因する各種の症状を、穏やかな効き目で緩和ないし治癒することができる。【００１３】
さらに、本発明の組成物は、昆布、大豆及び胡麻の優れた栄養価及び機能性を効率的に利用することも可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、マウス由来マクロファージをＳ−ＰＴ８４株、未発酵昆布、発酵昆布、または発酵胡豆昆で処理して当該マクロファージのＩＬ−１２の産生量を測定して得られた結果を示すグラフである。
【図２】図２は、未発酵昆布、発酵昆布、未発酵胡豆昆、または発酵胡豆昆を摂取させたマウスに由来するマクロファージのＩＬ−１２産生量を示すグラフである。
【図３】図３は、Ｓ−ＰＴ８４、未発酵昆布、または発酵昆布を摂取させたマウスに由来する脾臓リンパ球のＮＫ活性を示すグラフである。
【図４】図４は、Ｓ−ＰＴ８４、未発酵昆布、または発酵昆布を摂取させたマウスに由来する脾臓リンパ球のＩＦＮ−γまたはＩＬ−４産生量を示すグラフである。
【図５】図５は、Ｓ−ＰＴ８４、未発酵昆布、または発酵昆布を摂取させたマウスに由来する脾臓リンパ球のＴｈ１／Ｔｈ２バランスを示すグラフである。
【図６】図６は、Ｓ−ＰＴ８４、発酵組成物をそれぞれ経口摂取させたマウスに由来する脾リンパ球のＮＫ活性を測定して得られた結果を示すグラフである。
【図７】図７は、Ｓ−ＰＴ８４、発酵組成物をそれぞれ経口摂取させたマウスに由来する脾細胞からのＩＬ−４産生を測定して得られた結果を示すグラフである。
【図８】図８は、Ｓ−ＰＴ８４、発酵組成物をそれぞれ経口摂取させたマウスに由来する脾細胞からのＩＦＮ−γ産生を測定して得られた結果を示すグラフである。
【図９】図９は、ストレス負荷時にＳ−ＰＴ８４、発酵組成物をそれぞれ経口摂取させたマウスに由来する脾細胞のＮＫ活性を測定した結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ストレス負荷時にＳ−ＰＴ８４、発酵組成物をそれぞれ経口摂取させたマウスに由来する脾細胞からのＩＬ−４産生を測定して得られた結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ストレス負荷時にＳ−ＰＴ８４、発酵組成物をそれぞれ経口摂取させたマウスに由来する脾細胞からのＩＦＮ−γ産生を測定して得られた結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、Ｓ−ＰＴ８４、未発酵組成物、Ｓ−ＰＴ８４＋未発酵組成物、発酵組成物をそれぞれ経口摂取させたＯＶＡ誘発アレルギーマウスの総ＩｇＥ濃度を測定して得られた結果を示すグラフである。
【図１３】図１３は、Ｓ−ＰＴ８４＋未発酵組成物、発酵組成物をそれぞれ経口摂取させたＯＶＡ誘発アレルギーマウスに由来する脾細胞からのＩＬ−４産生を測定して得られた結果を示すグラフである。
【図１４】図１４は、Ｓ−ＰＴ８４＋未発酵組成物、発酵組成物をそれぞれ経口摂取させたＯＶＡ誘発アレルギーマウスに由来する脾細胞からのＩＦＮ−γ産生を測定して得られた結果を示すグラフである。
【図１５】図１５は、Ｓ−ＰＴ８４、発酵組成物をそれぞれ経口摂取させたマウスの腸管腔における総ＩｇＡ量を測定して得られた結果を示す。
【図１６】図１６は、Ｓ−ＰＴ８４、発酵組成物をそれぞれ経口摂取させたマウスに由来するパイエル板細胞からのＩＬ−４産生を測定して得られた結果を示すグラフである。
【図１７】図１７は、Ｓ−ＰＴ８４、発酵組成物をそれぞれ経口摂取させたマウスに由来するパイエル板細胞からのＩＦＮ-γ産生を測定して得られた結果を示すグラフである。
【図１８】図１８は、未発酵昆布又は発酵昆布をそれぞれ経口摂取させたマウスのＳａｌｃｏｍａ１８０腫瘍サイズを測定して得られた結果である。
【図１９】図１９は、発酵粒を摂取させたヒトのＮＫ活性を測定して得られた結果を示すグラフである。
【図２０】図２０は、発酵粒を摂取させたヒトのＮＫ活性の変化量を示すグラフである。
【図２１】図２１は、発酵粒を摂取させたヒトのＴｈ１／Ｔｈ２比の変化量を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
乳酸菌発酵昆布
本発明でいう昆布とは、褐藻類コンブ科コンブ属（Laminaria spp.）及びその近縁種の総称をいい、例えば、マコンブ（L.japonica）、リシリコンブ（L.japonica var.ochotensis）、ミツイシコンブ（L.angustata）、ナガコンブ（L.angustata var.longissima）、ホソメコンブ（L.religiosa）、ネコアシコンブ（Arthrothamnus bifidus）、トロロコンブ（Kjellmaniella gyrata）、カゴメ（Kjellmaniella crassifolia）が含まれるが、これらに限定されるものではない。【００１６】
本発明の乳酸菌で発酵された昆布（乳酸菌発酵昆布）の原料となる昆布には、上記した昆布の原藻もしくはその乾燥品で砂等の異物を取り除いたものを用いる。発酵のしやすさから、切断または粉末化した昆布を用いるのが好ましく、また塩、糖、アミノ酸、有機酸、核酸等で調味されているものを用いてもよい。このような昆布は一般に市販されており、商品名「昆布パウダー」（焼津水産化学工業株式会社）や、商品名「昆布パウダー」（有限会社惣万水産）等を例示できる。【００１７】
原料昆布を発酵させる乳酸菌は、昆布を発酵させることができるものであれば特に限定されず、通常の方法により凍結乾燥して調製したもの、あるいは冷蔵保存したものを用いることができる。乳酸菌としては、例えば、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、ストレプトコッカス属（Streptcoccus）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）、ロイコノストック属（Leuconostoc）などを挙げることができ、これらのうち一または二以上の乳酸菌を選択し、同時または逐次的に使用できる。中でも、植物成分を資化して生存する単離された乳酸菌（植物性乳酸菌）は、昆布等の栄養が豊富でない植物性原料でも発酵できること、酸やアルカリに強く、高濃度の食塩の存在下でも生息できるために食品として利用しやすいこと、ヒトに有用とされる腸管系で耐性があること等の理由から好適に用いられる。このような植物性乳酸菌としては、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ペントーサス（Lactobacillus pentosus）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Tetragenococcus halophilus）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）等が挙げられる。なお、本出願人は、しば漬けから免疫調節作用を有する種々の植物性乳酸菌を単離した（特開２００５−３３３９１９号公報参照）。本発明では、これらの乳酸菌も好適に用いることができる。【００１８】
また、本発明の乳酸菌には、ホモ乳酸発酵とヘテロ乳酸発酵のいずれの発酵形式の乳酸菌を用いてもよく、ヘテロ乳酸発酵で発生する酢酸、炭酸ガス、アルコール等を香味付与の目的で利用することもできるが、炭酸ガスが大量に発生する場合には、発酵タンク等を用いる製造工程におけるハンドリングが悪くなる場合もある。一方、ホモ乳酸発酵は、乳酸を多く生成するため、昆布由来の腐敗菌等の影響により発酵過程で腐敗を生じる危険性が少なく、本発明に好適に用いることができる。【００１９】
本発明の乳酸菌発酵昆布は、通常、原料昆布に加水して上記乳酸菌を接種して発酵させ、その後、加熱または照射（好ましくは加熱）して発酵物を殺菌する。この殺菌された発酵物をろ過または遠心分離（好ましくはろ過）して、ほとんどの死滅した菌類を除去することにより、乳酸菌発酵昆布を得ることができる。【００２０】
発酵を行う際には、予め滅菌処理を行っておくことが好ましい。滅菌処理の温度及び時間は適宜設定すればよく、例えば、１０分間９０℃に保持される滅菌処理が例示できる。また、昆布の発酵時には、昆布由来多糖類により、発酵液が著しく増粘する場合があるので、アルギン酸リアーゼ等の酵素等を加えて作業性を向上させてもよい。【００２１】
発酵処理は、上記の滅菌処理物に乳酸菌を含むスターターを加えることにより行う。この際、発酵促進添加物としてグルコースのような糖類や大豆ペプチドのような窒素源を添加することが好ましい。発酵処理の温度及び時間は、用いる乳酸菌の性質により、適宜設定すればよい。発酵の度合いは、発酵処理物のｐＨを測定することにより判断でき、本発明の乳酸菌発酵昆布の場合、ｐＨが５．０以下になるまで発酵を行うのがよい。【００２２】
このようにして得られた乳酸菌発酵昆布は、液体状のまま使用してもよいが、作業性・保存性の点から、噴霧乾燥または凍結乾燥により粉末化することが好ましい。【００２３】
乳酸菌発酵胡豆昆（乳酸菌で発酵させた昆布、胡麻及び大豆）
本発明は、上記の乳酸菌発酵昆布に、さらに乳酸菌で発酵させた胡麻と乳酸菌で発酵させた大豆とを組み合わせることにより、免疫調節作用が増強されることを特徴とする。【００２４】
ここで、本発明でいう胡麻とは、Sesamun indicum の植物の種子をいい、例えば白胡麻、黒胡麻、黄胡麻、茶胡麻などが含まれるが、これらに限定されない。また、これらを単独で使用しても、複数種類を混合して使用してもよい。本発明の乳酸菌で発酵された胡麻（乳酸菌発酵胡麻）の原料となる胡麻の形態は限定されず、粒、粉砕物、ペースト等いずれも用いることができるが、発酵のしやすさから、胡麻の粉砕物やペーストを用いるのが好ましい。胡麻のペーストは多数市販されており、例えば、商品名「純練り胡麻黒」（竹本油脂株式会社）等を例示できる。なお、脂肪分の少ない乳酸菌発酵胡麻を得ることを目的として、原料に脱脂胡麻を用いてもよいが、胡麻の有する栄養価・機能性の観点から脱脂されていない油分を含む胡麻を用いるのが好ましい。【００２５】
本発明でいう大豆とは、Glycine max の植物の種子をいい、これには生育期間、産地により異なる多数の品種が含まれる。本発明では特に限定されることなく、いずれの品種も使用できる。本発明の乳酸菌で発酵された大豆（乳酸菌発酵大豆）の原料となる大豆には、固形大豆、大豆粉、大豆カス（soybean oil cake）、脱脂大豆、きな粉、これらの加水分解物等、いずれも特に限定なく使用することができるが、発酵のしやすさから粉末化したものを用いるのが好ましい。このような大豆粉末は市販されており、商品名「黒大豆きなこ」（小林桂株式会社）、商品名「プロライフＪ」（理研農産化工株式会社）等を例示できる。なお、脂肪分の少ない乳酸菌発酵大豆を得る目的として脱脂大豆を用いてもよい。【００２６】
本発明は、乳酸菌発酵昆布と乳酸菌発酵胡麻と乳酸菌大豆を含む組成物（本明細書中、「乳酸菌発酵胡豆昆」や「発酵胡豆昆」と表記することもある）に関する。該組成物は、昆布、胡麻及び大豆原料をそれぞれ別個に乳酸菌発酵させた後に混合することにより調製してもよいし、原料となる昆布、胡麻及び大豆を混合して乳酸菌を接種させることにより調製してもよい。【００２７】
別個に発酵させた後に混合して調製する場合、すなわち乳酸菌発酵昆布、乳酸菌発酵胡麻及び乳酸菌発酵大豆を混合する場合、乳酸菌発酵昆布としては、上記の製造法等により調製された乳酸菌発酵昆布を好適に使用できる。乳酸菌発酵胡麻としては、上記の乳酸菌発酵昆布と同様にして調製した乳酸菌発酵胡麻や特開２００４−１７３６９２号公報に記載されたもの等を使用できる。乳酸菌発酵大豆としては、上記の乳酸菌発酵昆布と同様にして調製した乳酸菌発酵大豆や特開２００３−３３５６９５号公報に記載されたもの等を使用できる。【００２８】
原料となる昆布、胡麻及び大豆を混合して乳酸菌を接種させることにより調製する方法として次の方法を例示できるが、これに限定されるものではない。【００２９】
まず、発酵原料である昆布、大豆、胡麻を準備する。これら原料は、場合により加工して粉末またはペースト状にされる。或いは、市販の粉末またはペースト状材料を購入して発酵原料として用いてもよい。次に、原料である昆布（例えば、昆布粉末）、大豆（例えば、大豆粉末）、胡麻（例えば、胡麻ペースト）を所定の割合で混合し、加水して滅菌処理を行う。滅菌処理の温度及び時間は適宜設定すればよく、１０分間９０℃の滅菌処理を例示できる。次いで、得られた滅菌処理物へ乳酸菌を加えて（例えば、乳酸菌を含むスターター等を加える）発酵処理を行う。発酵処理を行う際は、発酵促進添加物として、グルコースのような糖類や大豆ペプチドのようなの窒素源を添加することが好ましい。発酵処理の温度及び時間は、用いる乳酸菌の性質により適宜設定すればよい。発酵の度合いは、発酵処理物のｐＨを測定することにより判断できる。本発明の組成物の場合は、ｐＨが５．０以下になるまで発酵を行うのがよい。なお、滅菌処理工程及び／または発酵処理工程において、原料混合加水物または滅菌処理物の粘度が高い場合には、アルギン酸リアーゼ等の酵素を加えることにより混合物の粘度を低減させ、作業性を向上させることができる。【００３０】
発酵が終了したら、加熱殺菌を行い、冷却し、必要に応じて濾過する。加熱殺菌温度は適宜設定すればよい。このようにして得られた液体状の発酵組成物を使用してもよいが、作業性・保存性の点から、かかる液体状の発酵組成物を噴霧乾燥し、粉末体とすることが好ましい。この粉末は、茶褐色のきめ細かな粉体で、原料由来の香ばしい香りと乳酸菌由来の酸味を有するものである。【００３１】
なお、いずれの製造方法においても、用いる乳酸菌としては乳酸菌発酵昆布の場合と同様に選択することができ、植物性乳酸菌を使用することが好ましい。本発明者らはしば漬けより単離した乳酸菌を用いた予備試験より、ラクトバチルス・ペントーサス（Lactobacillus pentosus）及びラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）は、昆布、大豆及び胡麻のいずれも良好に発酵できることが見出した。したがって、植物性乳酸菌の中でも、これらの乳酸菌（ラクトバチルス・ペントーサス（Lactobacillus pentosus）及びラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum））を好適に用いることができる。昆布、胡麻及び大豆を混合して乳酸菌を接種させる製造方法においては、乳酸菌として、上記のラクトバチルス・ペントーサス（Lactobacillus pentosus）及びラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）のように昆布と胡麻と大豆のいずれをも発酵させることが可能な乳酸菌を用いるか、またはそれぞれの素材を発酵させることが可能な乳酸菌を複数種類同時に用いればよい。【００３２】
免疫調節作用
本発明の組成物、すなわち乳酸菌発酵昆布または乳酸菌発酵胡豆昆は、免疫調節作用を有することを特徴としている。【００３３】
免疫とは、無数にある病原体や様々な有害物質から体を守ることにより各種疾病を予防する機能、すなわち生体の恒常性を保つ機能であり、免疫機能が過剰に働くかまたは破綻すると、アレルギー疾患や自己免疫疾患が起こる。本発明でいう免疫調節作用とは、加齢、ストレス、疲労、睡眠不足等により、免疫機能の一部が破綻するかまたは免疫機能が低下した場合に免疫反応を活性化させる作用（免疫賦活作用）や、免疫機能が過剰に働いた場合に免疫反応を抑制させる作用（免疫抑制作用）を意味し、本発明組成物は、この免疫賦活作用と免疫抑制作用とを適切に機能させることによって、免疫バランスの最適化を図るものである。【００３４】
生体内免疫系には、抗原を認識するリンパ球であるＴ細胞が存在し、産生するサイトカインによってＴｈ１細胞とＴｈ２細胞とに分けられている。このＴｈ１とＴｈ２のバランス（Ｔｈ１／Ｔｈ２バランス）が、生体内の免疫反応に影響を与えており、例えば、アレルギーでは、Ｔｈ１が優位になると遅延型過敏症（臓器移植の際に起こる拒絶反応などのIV型アレルギー）を引き起こし、また、Ｔｈ２が優位になると抗原特異的なＩｇＥ抗体が産生され即時性過敏症（喘息、アレルギー性鼻炎、花粉症、アトピー性皮膚炎などなどのＩ型アレルギー）を引き起こすことが知られている。Ｔｈ１細胞はＩＦＮ−γを産生し、Ｔｈ２細胞はＩＬ−４を産生するので、免疫バランスの指標には、このＩＬ−４とＩＦＮ−γの比（ＩＦＮ−γ／ＩＬ−４）を用いることができる。【００３５】
本発明の組成物（乳酸菌発酵昆布及び乳酸菌発酵胡豆昆）は、生体のＴｈ１／Ｔｈ２のバランスをＴｈ１優位な状態に導くという特徴がある。上記したように、喘息、花粉症、アトピー性皮膚炎などのＩ型アレルギーでは、Ｔｈ２が優位な状態になっていることが知られている。また、ＨＩＶの感染においてもＴｈ２が優位になることが報告されている。さらに、Ｔｈ１が優位になると、マクロファージ、ＮＫ細胞や細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の活性を促進し、ガンに対する抵抗性が上昇することが知られている。したがって、本発明の組成物をそれ自体でまたは食品や医薬品などとして摂取してＴｈ１が優位な状態にすることにより、Ｉ型アレルギーの治療や予防ばかりか、ＨＩＶ、ガンや細菌感染への抵抗性を高め、その予防や治療を行うこともできる。【００３６】
本発明の組成物は、腸管の免疫力を向上させるという特徴をも有している。腸管免疫とは、腸管に侵入する病原因子を鼻や喉からまたは飲食物等とともに排除するために腸管粘膜面に存在する防御システムである。小腸の粘膜に分布するパイエル板がその司令塔的な役割を果たしており、パイエル板の出す抗体（ＩｇＡ）が病原菌やウイルスをはじめとする異物を攻撃することが知られている。【００３７】
このように、本発明の組成物（乳酸菌発酵昆布または乳酸菌発酵胡豆昆）は、免疫調節用、免疫賦活用、免疫抑制用、または抗アレルギー用の組成物として有用である。【００３８】
飲食物・医薬品等
本発明に係る組成物は、飲食物や医薬品等として用いることができるが、この組成物は、身近にある栄養価の高い食品素材に免疫調節機能を付与しまたは免疫調節機能を高めたものであり、安全性の高いものであるから、日常的に摂取できる飲食物として用いることが好ましい。飲食物に用いる場合には、免疫調節作用を有する健康食品として実施することが好適である。ここでいう健康食品には、免疫機能調節作用、免疫賦活作用及び／または抗アレルギー作用を有する旨の表示を容器や説明書に付した飲食物（例えば、特定保健用食品や条件付き特定保健用食品のような機能性食品）も含まれる。表示場所（容器またはそれに添付した指示書など）、容器形態（瓶、缶、ペットボトル、プラスチックボトル、紙パックなど）、及び表示の方法（印刷、刻印、シールなど）は、何ら限定されない。なお、食品としての使用の態様には、本発明の組成物を食品添加剤として用いる場合も含まれるものとする。【００３９】
本発明の組成物を飲食物として用いる場合、組成物をそのまま使用してもよく、また、公知の基剤、助剤、甘味料、酸味料、ビタミン等の各種成分と混合してユーザーの嗜好に合う製品としてもよく、例えば、本発明組成物は、錠剤、カプセル剤、丸剤、粉末剤、顆粒剤、キャンデー、ドロップ、トローチ、ガム、粉末ジュース、ドリンク剤、調味料、加工食品、デザート類または菓子類等の形態で提供することが可能である。また、本発明の乳酸菌発酵昆布または乳酸菌発酵胡豆昆は、まろやかな呈味を有するものであるから、好適な形態の１つは、飲食品を咀嚼して味わうことを可能とする形態である。具体的には、丸剤のような形態やビスケットのような形態を例示できる。丸剤は、通常、油分が１％以下に調整されている。これは、保存中に生じる油分の滲出による丸剤の酸化劣化や丸剤どおしのくっつきを防止するためである。本発明の乳酸菌発酵胡豆昆では、脱脂大豆、脱脂胡麻を用いれば丸剤の油分は１％以下に調整可能であるが、素材（特に、胡麻）の栄養価を考えると脱脂したものを用いることが必ずしも適切ではない。脱脂したものを用いない場合には４〜１５％程度の油分が組成物に含まれ、上記した油分の滲出が生じうることになる。本発明者らはこの油分の滲出を防ぐ丸剤の製造方法を検討した結果、見栄えをよくすることを目的として通常施されている生地磨き（素丸の表面を磨く処理）の工程において油分の滲出が著しく発生することを見出し、この生地磨きの工程を行わず、シェラックまたは糖で素丸をコーティングすることで、油分の滲出を防止できること確認した。【００４０】
本発明の飲食品は、免疫機能の調節（免疫賦活化、抗アレルギー等）のためにヒト以外の動物にも使用することもできる。対象となる動物としては、犬、猫等のペット類、豚、牛等の家畜類、ニワトリ等の家禽類、マウス、モルモット等の実験動物の他、養殖水産動物等が挙げられる。飲食品の形態としては、それ自体で使用することも可能であるが、動物または魚介類用の飼料（ペットフード）に添加しての供与や、サプリメントのような形態での供与を行うことができる。【００４１】
医薬品としての用途は、例えば、免疫賦活剤や抗アレルギー剤のような免疫調節剤を挙げることができる。また、本発明組成物は、主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤等の医薬の製剤技術分野において通常使用する公知の補助剤を用いて製剤化することができる。剤型としては、丸剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、座剤、注射剤等を挙げることができるが、特にこれらに限定されるものではない。投与期間は、特に限定されるものではないが、１週間〜１０日以上の連続投与がよく、好ましくは恒常的な連続投与がよい。【００４２】
本発明の飲食品または医薬品における本発明の組成物（乳酸菌発酵昆布または乳酸菌発酵胡豆昆）の含有量は特に制限されないが、一般的には０．１〜１００重量％、好ましくは１〜９０重量％、さらに好ましくは１〜５０重量％程度である。【００４３】
本発明の組成物からなる、または本発明の組成物を含有する食品または医薬品は、一回投与分として乳酸菌発酵昆布、または乳酸菌発酵胡豆昆を、乾燥重量換算で１〜１００００ｍｇ、好ましくは１０〜１００００ｍｇ含有するが、本発明の組成物は安全性が高いため、その含有量の上限は実質的に存在しない。
【実施例】
【００４４】
以下に、本発明の組成物について実施例を挙げて詳細に説明する。但し、本発明は実施例に限定されるものではない。【００４５】
試験例１  乳酸菌発酵試験（１）
乳酸菌による昆布の発酵の可能性を調べた。昆布には、粉末状の昆布（焼津水産化学工業株式会社製の商品名「昆布パウダー」）を用いた。これに、昆布：水＝５：９５（重量比）となるように蒸留水を添加して混合し、この混合液を１１０℃で１分間滅菌し、その後、スターターとして表１に示す８種類の乳酸菌（Ａ〜Ｆ）（特開２００５−３３３９１９号公報参照）のうちの一種を０．５％になるように植菌した。得られた混合物を３７℃で４８時間発酵させ、発酵前後におけるｐＨを測定し、乳酸菌Ａ〜Ｄについては発酵後の菌数を測定した。なお、表中の乳酸菌Ａ（Ｓ−ＰＴ８４）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１００２８として寄託されている。【００４６】
【表１】
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【００４７】
発酵後の菌数、及び発酵前後におけるｐＨについての結果を表２に示す。８種の乳酸菌の内のいずれを用いても乳酸菌数の増加及び／またはｐＨの低下が確認でき、乳酸菌により昆布の発酵が進むことが明らかとなった。【００４８】
【表２】
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【００４９】
試験例２  乳酸菌発酵試験（２）
試験例１で使用した乳酸菌による胡麻及び大豆の発酵の可能性を調べた。胡麻には、竹本油脂株式会社製のペースト状の胡麻（商品名「純練り胡麻・黒」）を、大豆には、小林桂株式会社の粉末状大豆（商品名「黒大豆きな粉」）を用いた。これに、胡麻：水＝２５：７５（重量比）、大豆：水＝１５：８５（重量比）となるように蒸留水を添加して混合し、試験例１と同様にして滅菌、発酵処理を行い、発酵前後におけるｐＨを測定し、発酵後の菌数を測定した。なお、発酵後の菌数は、胡麻は８種の乳酸菌について、大豆は乳酸菌Ａ〜Ｄについてカウントした。【００５０】
発酵後の菌数、及び発酵前後のｐＨについての結果を表３に示す。８種の乳酸菌のいずれを用いても乳酸菌数の増加及び／またはｐＨの低下が確認でき、乳酸菌により胡麻及び大豆の発酵が進むことが明らかとなった。【００５１】
【表３】
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【００５２】
実施例１  昆布の乳酸菌発酵物の調製
昆布には、焼津水産化学工業株式会社製の粉末状昆布（商品名「昆布パウダー」）を用いた（以下、これを「未発酵昆布」と表記する）。未発酵昆布に、アルギン酸リアーゼ（ナガセケムテックス社製）を分散させた滅菌水を添加し、９０℃で２０分間加熱滅菌した。スターターとして、乳酸菌（ラクトバシラス・ペントーサスＳ−ＰＴ８４株）を、２％グルコース、１％酵母エキス（三菱化学フーズ株式会社）、１％大豆ペプチド（不二製油株式会社製）の栄養条件下で２０時間培養させて得られたバルクスターターを用いた。このスターターを、滅菌処理を行った昆布混合液に添加し、温度約３７℃で約１４時間発酵を行った。発酵終了後、発酵液を９０℃、１０分で加熱殺菌し、冷却して２０メッシュで濾過し、得られたろ液を噴霧乾燥機（日本ビュッヒ株式会社製  ミニスプレードライヤーB-290型）により乾燥させて、昆布の乳酸菌発酵組成物（以下、これを「発酵昆布」と表記する）を得た。【００５３】
実施例２  胡麻・大豆・昆布混合物（胡豆昆）の乳酸菌発酵物の調製
胡麻には、竹本油脂株式会社製の「純練り胡麻・黒」を、大豆には、小林桂株式会社の「黒大豆きな粉」を、昆布には、実施例１同様アルギン酸リアーゼ（ナガセケムテックス社製）で処理した焼津水産化学工業株式会社製の「昆布パウダー」を用いた。胡麻：大豆：昆布が１：３：１（重量比）となるように混合し（以下、これを「未発酵胡豆昆」または「未発酵組成物」とも表記する）、この混合物に黒砂糖（胡麻に対して重量比で１／３）、大豆ペプチド（胡麻に対して重量比で１／１５）を発酵促進添加物として添加した。この胡麻・大豆・昆布混合物を実施例１と同様にして発酵させた後、発酵物を９０℃、１０分で加熱殺菌し、冷却して２０メッシュで濾過し、得られたろ液を噴霧乾燥機（日本ビュッヒ株式会社製  ミニスプレードライヤーB-290型）により乾燥させて、胡麻・大豆・昆布混合物の乳酸菌発酵組成物（以下、これを「発酵胡豆昆」または「発酵組成物」とも表記する）を得た。【００５４】
実施例３  マクロファージからのＩＬ−１２産生に対する促進作用（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験）
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７週齢・雄、１０匹、清水実験材料）の腹腔内に、一匹あたり５ｍＬのＰＢＳ（Phosphate-Buffer Salines）を投与し、無菌的に腹腔内細胞を回収した。回収した細胞を細胞培養用培地（１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬株式会社））にて洗浄し、溶血バッファーを用いて赤血球を溶血除去した。すなわち、回収した細胞に１ｍＬの溶血バッファー（１５５ｍＭ  ＮＨ4Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ3、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加えて、室温で２〜３分静置し、細胞培養用培地を９ｍＬ加えた。攪拌した後、遠心分離（２０℃、１５００ｒｐｍ、３分間）し、沈殿物を細胞培養用培地にて１回洗浄した。血球計算板を用いて細胞数を計測し、１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度の液を細胞培養用培地で調製し、この液を４８穴カルチャープレート（組織培養プレート）に、一穴あたり５００μＬを播種した。これを５％ＣＯ2、３７℃にて３時間培養した後、培地を除くことにより非接着性細胞を除去し、再度細胞培養用培地を添加した。【００５５】
実施例１及び２で得た未発酵昆布、発酵昆布、及び発酵胡豆昆を一定量秤量して乳鉢で粉砕し、細胞培養用培地に懸濁した液（未発酵昆布懸濁液、発酵昆布懸濁液、発酵胡豆昆懸濁液）を試料として得て、これら試料を上記の細胞プレートに、最終濃度がそれぞれ、１μｇ／ｍＬ及び１０μｇ／ｍＬになるようにプレートに添加して、５％ＣＯ2、３７℃にて１８時間培養した。また、比較としてＳ−ＰＴ８４（乾燥死菌）を細胞培養用培地に懸濁した液を、最終濃度が１．５ｎｇ／ｍＬ及び１５ｎｇ／ｍＬになるように添加して、５％ＣＯ2、３７℃にて１８時間培養した。なお、Ｓ−ＰＴ８４株の最終濃度は、１μｇ／ｍＬ及び１０μｇ／ｍＬの発酵胡豆昆懸濁液中のＳ−ＰＴ８４株量に相当する濃度である。培養上清中に含まれるサイトカイン（インターロイキン１２；ＩＬ−１２）量をＥＬＩＳＡキット（ＯｐｔＥＩＡ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）により測定した。また、何も添加しない培養液をＣｏｎｔｒｏｌ（Ｃｏｎｔ）として同様に測定を行った。【００５６】
培養上清中ＩＬ−１２濃度の試験結果（Ｎ＝２の平均値）を図１に示した。未発酵昆布、発酵昆布、発酵胡豆昆の高濃度の添加により、培養液中ＩＬ−１２濃度の上昇が認められた。また、未発酵昆布を添加した場合よりも発酵昆布の添加によりＩＬ−１２濃度が増加すること、さらに発酵昆布を添加した場合よりも発酵胡豆昆の添加によりＩＬ−１２濃度が増加することが示唆された。以上の結果から、未発酵昆布よりも発酵昆布で、また発酵昆布よりも発酵胡豆昆で免疫賦活作用が高いことが明らかとなった。【００５７】
実施例４  マクロファージからのＩＬ−１２産生に対する促進作用（Ｅｘ  ｖｉｖｏ試験）
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７週齢・雄、１５匹）を各群の平均体重がほぼ同じになるように３匹ずつ５群に分けた。群構成は無処置群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、未発酵昆布投与群（１０ｍｇ／マウス）、発酵昆布投与群（１０ｍｇ／マウス）、未発酵胡豆昆投与群（１０ｍｇ／マウス）、発酵胡豆昆投与群（１０ｍｇ／マウス）とした。Ｃｏｎｔｒｏｌを除く各投与群では、実施例１及び２で得た未発酵昆布、発酵昆布、未発酵胡豆昆及び発酵胡豆昆を、２０ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳを添加して懸濁液を得て、得られた液をそれぞれ０．５ｍＬずつ腹腔内投与した。投与１８時間後に腹腔内に５ｍＬのＰＢＳを投与し、無菌的に腹腔内細胞を回収した。回収した細胞を細胞培養用培地で洗浄し、実施例３のように、溶血バッファーを用いて赤血球を除去した。血球計算板を用いて細胞数を計測し、２×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度の液を細胞培養用培地を用いて調製し、この液を４８穴カルチャープレート（組織培養プレート）に、一穴あたり５００μＬを播種した。これを５％ＣＯ2、３７℃にて３時間培養した後、非接着性細胞を除去し、最終濃度が１００ｎｇ／ｍＬになるようにＬＰＳ（リポポリサッカライド）を添加して５％ＣＯ2、３７℃にて２４時間培養した。培養上清中に含まれるＩＬ−１２量をＥＬＩＳＡキット（ＯｐｔＥＩＡ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）により測定した。【００５８】
培養上清中ＩＬ−１２濃度の測定結果（Ｎ＝２〜３の平均値）を図２に示した。この結果から明らかなように、未発酵昆布投与群及び未発酵胡豆昆投与群ではＩＬ−１２濃度の増加は認められなかったが、発酵昆布投与群及び発酵胡豆昆投与群では高いＩＬ−１２産生増加が認められ、特に発酵胡豆昆投与群でＩＬ−１２産生量が有意に上昇した。以上の結果から、未発酵昆布、未発酵胡豆昆にはＬＰＳ刺激によるマクロファージ活性化を増強する効果はなく、その効果は発酵昆布、発酵胡豆昆にあること、また発酵昆布よりも発酵胡豆昆でその効果がさらに高いことが明らかとなった。【００５９】
実施例３および４の結果は、本発明の組成物が、その発酵原料から予測できないほど優れた免疫調節作用を有することを示している。【００６０】
実施例５  昆布発酵物のＮＫ活性及びＴｈ１細胞とＴｈ２細胞のバランス（Ｔｈ１／Ｔｈ２比）に対する効果
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６週齢・雄）１２匹を各群の平均体重がほぼ同じになるように３匹ずつ４群に分けた。群構成は、無添加群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、Ｓ−ＰＴ８４投与群、未発酵昆布投与群及び発酵昆布投与群とした。無添加群を除く各投与群では、Ｓ−ＰＴ８４（乾燥死菌）を一匹あたり０．７５ｍｇ／ｋｇ（Ｓ−ＰＴ８４投与群）、実施例１の未発酵昆布（未発酵昆布投与群）及び発酵昆布（発酵昆布投与群）を一匹あたり５００ｍｇ／ｋｇ、連日強制経口投与した。なお、Ｓ−ＰＴ８４投与群におけるＳ−ＰＴ８４の量は、発酵胡豆昆中のＳ−ＰＴ８４の量に相当する。投与開始７日目に脾臓を無菌的に摘出後、細胞培養用培地（１０％ウシ胎児血清、０．２％抗生物質−抗真菌剤混合溶液（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地）中セルストレーナー（７０μｍ、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社製）上で軽く圧迫することにより、細胞を取り出した。pipettingにより細胞を分散させた後、遠心分離（１５００ｒｐｍ、３分間、４℃）した。実施例３のように、赤血球を溶血除去した後、脾リンパ球を調製した。この脾リンパ球のＮＫ活性をＰＩＮＫ法（ＰＩＮＫ法とは、標的細胞であるＹａｃ−１を疎水性膜系蛍光色素３，３´−ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｏｘａｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ  ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ（Ｄｉｏ）で標識し、さらに、死細胞の核を膜不透過性核酸結合蛍光色素ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）により二重染色し、傷害されなかったＹａｃ-1はＤｉｏ単染色、傷害されたＹａｃ−１は二重染色でフローサイトメトリーで検出することにより、マウス脾細胞の細胞障害活性を算出する方法である）により測定した。また、この脾リンパ球をコンカナバリンＡ（２.５μｇ／ｍＬ）刺激下で２４時間培養し、培養上清中に産生されたＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の量をＯｐｔＥＩＡ(ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社)を用いたＥＬＩＳＡ法にて測定した。【００６１】
ＮＫ活性の結果を図３に示した。図３中、ＮＫ  ａｃｔｉｖｉｔｙ(％)はマウス脾リンパ球のＹａｃ−１（これはマウスリンパ腫由来細胞であり、マウスＮＫ細胞に感受性の細胞として標準的に使用されている。結果はマウス脾リンパ球：Ｙａｃ−１＝２０：１及び１０：１のデータを示している。）に対する細胞傷害性を表している。図３から明らかなように、対照群に比較してＳ−ＰＴ８４投与群、未発酵昆布投与群、昆布発酵物投与群の順にＮＫ活性は増加した。【００６２】
ＩＦＮ−γ濃度及びＩＬ−４濃度、バランスの指標であるＴｈ１／Ｔｈ２（ＩＦＮ−γ／ＩＬ−４）の結果をそれぞれ図４、５に示した。図４から明らかなように、ＩＦＮ−γ濃度量は対照群に比較してＳ−ＰＴ８４投与群では変化がなかったが、未発酵昆布投与群で増加し、発酵昆布投与群で有意に増加した。一方、ＩＬ−４濃度については対照群に比較していずれの投与群でもわずかに産生が高かったが、４０〜７０％の増加に留まった。これら結果をもとに作成された図５によると、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスに関しては、Ｓ−ＰＴ８４投与群、未発酵昆布投与群では対象群と比較して変化がなく、発酵昆布投与群でのみＴｈ１優位となった。以上の結果から、発酵昆布には定常状態の免疫機能を増強させる効果があること、またＴｈ１／Ｔｈ２バランスをＴｈ１優位な状態に調節する作用を有することが明らかとなった。【００６３】
実施例６  発酵胡豆昆のＮＫ活性及びＴｈ１細胞とＴｈ２細胞のバランス（Ｔｈ１／Ｔｈ２比）に対する効果
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６週齢・雄）１８匹を各群の平均体重がほぼ同じになるように６匹ずつ３群に分けた。群構成は、無添加群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、Ｓ−ＰＴ８４摂取群（Ｓ−ＰＴ８４）及び実施例２で得た発酵胡豆昆摂取群（発酵組成物）とした。各摂取群では、Ｓ−ＰＴ８４（乾燥死菌）を０.００７５重量％となるように添加した固形飼料、発酵胡豆昆を５重量％となるように添加した固形飼料を１週間自由摂取させた。なお、Ｓ−ＰＴ８４摂取群におけるＳ−ＰＴ８４の量は、発酵胡豆昆中のＳ−ＰＴ８４の量に相当する。摂取開始８日目に脾臓を摘出し、実施例５と同様にして脾リンパ球を調製した。得られた脾リンパ球のＮＫ活性（ＰＩＮＫ法）、並びにコンカナバリンＡ（２.５μｇ／ｍＬ、２４時間）刺激後のＩＬ−４及びＩＦＮ−γ濃度を実施例５と同様に測定した。【００６４】
ＮＫ活性の結果を図６に示した。図６中、ＮＫ  ａｃｔｉｖｉｔｙ(％)はマウス脾リンパ球のＹａｃ−１（マウスリンパ腫由来細胞で、マウスＮＫ細胞に感受性の細胞として標準的に使用されている。結果はマウス脾リンパ球：Ｙａｃ−１＝８０：１のデータを示している。）に対する細胞傷害性を表している。図６から明らかなように、無添加群に比較してＳ−ＰＴ８４摂取群はＮＫ活性が上昇し、発酵胡豆昆摂取群でその上昇はさらに顕著となった。従って、本発明組成物は免疫賦活作用を有することが示された。【００６５】
ＩＬ−４濃度、ＩＦＮ−γ濃度の結果をそれぞれ図７、８に示した。図７から明らかなように、ＩＬ−４濃度についてはＳ−ＰＴ８４摂取及び発酵胡豆昆摂取による変化は認められなかった。一方、図８によると、ＩＦＮ−γ濃度に関しては、無添加群に比較してＳ−ＰＴ８４摂取群で上昇し、発酵胡豆昆摂取群ではその上昇はさらに顕著となった。【００６６】
即ち、この実施例から、本発明組成物は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスをＴｈ１優位な状態にすることが明らかとなった。【００６７】
実施例７  発酵胡豆昆のストレス誘発免疫低下及びＴｈ１細胞とＴｈ２細胞のバランス（Ｔｈ１／Ｔｈ２比）に対する効果
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６週齢・雄）２４匹を各群の平均体重がほぼ同じになるように６匹ずつ４群に分けた。群構成は、無処置群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、ストレス負荷群(Ｓｔｒｅｓｓ)、ストレス負荷＋Ｓ−ＰＴ８４摂取群（Ｓ−ＰＴ８４）及びストレス負荷＋実施例２で得た発酵胡豆昆摂取群（発酵組成物）とした。各摂取群では、Ｓ−ＰＴ８４（乾燥死菌）を０.００７５重量％となるように添加した固形飼料、発酵胡豆昆を５重量％となるように添加した固形飼料を１週間自由摂取させた。なお、Ｓ−ＰＴ８４摂取群におけるＳ−ＰＴ８４の量は、発酵胡豆昆中のＳ−ＰＴ８４の量に相当する。摂取開始８日目に、ストレス負荷群１８匹を１度水浸（submerge）させた後、先端に空気穴を施した５０ｍＬのポリエチレンチューブに入れ、２４時間拘束した。無処置群は２４時間、絶水、絶食とした。その後、実施例５と同様に脾臓を摘出して脾リンパ球を調製し、ＮＫ活性（ＰＩＮＫ法）を測定した。またコンカナバリンＡ（２.５μｇ／ｍＬ、２４時間）刺激後のＩＬ−４及びＩＦＮ−γ濃度を測定した。【００６８】
ＮＫ活性の結果を図９に示した。図９中、ＮＫ  ａｃｔｉｖｉｔｙ(％)はマウス脾リンパ球のＹａｃ−１に対する細胞傷害性を表している。図９から明らかなように、無処理群に比較してストレス負荷群（Ｓｔｒｅｓｓ）ではＮＫ活性が低下した。Ｓ−ＰＴ８４摂取群ではストレスによるＮＫ活性の低下が抑制され、発酵胡豆昆摂取群では無処置群レベルにＮＫ活性が維持された。ＩＬ−４濃度、及びＩＦＮ−γ濃度の結果を図１０、１１に示した。図１０、１１から明らかなように、ストレス負荷によりＩＬ−４及びＩＦＮ−γ濃度がともに顕著に低下した（Ｓｔｒｅｓｓ）。この群においてはＩＦＮ−γ濃度の低下がＩＬ−４濃度の低下より顕著であったため、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスはＴｈ２優位な状態となったと理解される。ストレス下におけるＩＬ−４濃度についてはＳ−ＰＴ８４摂取及び発酵胡豆昆摂取による変化は認められなかった。一方ＩＦＮ−γ濃度はストレス負荷群に比較してＳ−ＰＴ８４摂取群で上昇し、発酵胡豆昆摂取群ではその上昇はさらに顕著となった。【００６９】
以上の結果から、胡麻・大豆・昆布の乳酸菌発酵物（発酵胡豆昆）は定常状態の免疫機能を増強させるだけでなく、ストレス時の免疫低下を抑制することが明らかとなった。またこの効果は乳酸菌単独ではなく、発酵胡豆昆で顕著に認められた。【００７０】
実施例８  発酵胡豆昆の抗アレルギー作用
ＢＡＬＢ／Ｃマウス（７週齢・雄）を６群に分けた。群構成は、i）無処置群（Ｎｏｒｍａｌ）（３匹）、ii）対照群(Ｃｏｎｔｒｏｌ)（９匹）、iii）Ｓ−ＰＴ８４（乾燥死菌０.００７５％混餌）摂取群（１２匹）、iv）実施例２で得た未発酵胡豆昆（５％混餌）摂取群（未発酵組成物）（９匹）、v）Ｓ−ＰＴ８４（０.００７５％混餌）＋未発酵胡豆昆（５％混餌）摂取群（１０匹）、vi）実施例２で得た発酵胡豆昆（５％混餌）摂取群（発酵組成物）（８匹）とした。なお、Ｓ−ＰＴ８４群及びＳ−ＰＴ８４＋未発酵胡豆昆摂取群には発酵胡豆昆に含まれる菌数に相当する菌数のＳ−ＰＴ８４を飼料に添加した。無処置群、対照群にはＡＩＮ−９３Ｍ（オリエンタルバイオサービス株式会社製）基本飼料を、その他の群には、ＡＩＮ−９３Ｍに上記に特定した成分を混餌させて調製した特別飼料を、それぞれ自由摂取させた。摂取開始から１週間後及び２週間後に、２０μｇの卵白アルブミン（ＯＶＡ）と２ｍｇの水酸化アルミニウムゲルを混和して、無処置群を除く５群のマウスに腹腔内投与した。摂取開始から４週間後に心臓採血を行い、血清飼料を調製し、血清中の総ＩｇＥ濃度を測定した。また、このとき脾細胞も分離・培養し、コンカナバリンＡ（２.５μｇ／ｍＬ）刺激下で２４時間培養し、培養上清中に産生されたＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の量を測定した。総ＩｇＥ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４の測定はＯｐｔＥＩＡ(ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製)を用いたＥＬＩＳＡ法にて測定した。なお、それぞれの群における飼料の総摂取量は、いずれも約３．０ｇであった。【００７１】
総ＩｇＥ濃度の試験結果を図１２に示した。図１２から明らかなように、本発明の発酵胡豆昆摂取群のみ有意にＩｇＥの上昇を抑制した。【００７２】
それぞれの脾細胞をコンカナバリンＡで刺激した後のＩＬ−４産生量を図１３に示した。ＯＶＡ投与を行うことで無処置群と比較してＩＬ−４の産生量が低下した（対照群）。ＩＬ−４産生量は、Ｓ−ＰＴ８４＋未発酵胡豆昆摂取群においてさらに低下した。しかしながら、発酵胡豆昆摂取群では、ＩＬ−４の産生量が対照群と比較して上昇した。【００７３】
それぞれの脾細胞をコンカナバリンＡ刺激した後のＩＦＮ−γ産生量を図１４に示した。ＯＶＡ投与を行うことでＩＦＮ−γの産生量が無処置群と比較して低下した（対照群）。しかしながら、Ｓ−ＰＴ８４＋未発酵胡豆昆摂取群、発酵胡豆昆摂取群では、ＩＦＮ−γの産生量が対照群と比較して上昇した。この効果は、特に発酵胡豆昆摂取群が強く示した。【００７４】
この実施例の結果から、本発明の発酵胡豆昆は抗アレルギー作用を有することが明らかとなった。また、未発酵胡豆昆、未発酵胡豆昆＋乳酸菌の摂取では抗アレルギー作用が認められなかった。したがって、抗アレルギー作用を発揮させるためには、胡麻・大豆・昆布を乳酸菌発酵させることが重要であることが明らかとなった。【００７５】
実施例９  発酵胡豆昆の経口摂取によるＩｇＡ分泌増強作用
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７週齢・雄）を平均体重がほぼ同じになるように３群に分けた。群構成は、対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）（７匹）、Ｓ−ＰＴ８４（乾燥死菌０.００７５％混餌）摂取群（９匹）、及び実施例２で得た発酵胡豆昆（５％混餌）摂取群（発酵組成物）（９匹）とした。なお、Ｓ−ＰＴ８４群は、発酵胡豆昆に含まれる菌数に相当する菌数のＳ−ＰＴ８４を用いた。対照群には、ＡＩＮ-９３Ｍ基本飼料を、その他の群には、ＡＩＮ−９３Ｍ基本飼料に上記に特定した成分を混餌させて調製した特別飼料を、それぞれ自由摂取させた。摂取開始１週間後に、小腸を摘出し、内部をＰＢＳで洗浄後、４倍量の０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを添加し、ポリトロンホモジナイザーにて均質化した。遠心分離後の上清を回収し、小腸壁抽出物を得た。小腸壁抽出物中のＩｇＡ量は、ＥＬＩＳＡ法（一次抗体はＰｕｒｉｆｉｅｄ  ＩｇＡ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、  二次抗体はＢｉｏｔｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ＩｇＡ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ともにＳｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を使用し、発色にはＡｖｉｄｉｎ−Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅを用いた）で測定した。【００７６】
ＩｇＡ量を図１５に示した。図１５から明らかなように、発酵胡豆昆摂取群では対照群と比較して小腸壁抽出物中のＩｇＡ量が有意に上昇した。本発明の発酵胡豆昆のこの作用は、Ｓ−ＰＴ８４を単独で摂取した場合より強かった。【００７７】
実施例１０  発酵胡豆昆の経口摂取による腸管免疫担当細胞からのサイトカイン産生促進作用
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７週齢・雄）を平均体重がほぼ同じになるように３群に分けた。群構成は、対照群（７匹）、Ｓ−ＰＴ８４摂取群（乾燥死菌０.００７５％混餌）（９匹）及び実施例２で得た発酵胡豆昆（５％混餌）摂取群（９匹：発酵組成物）とした。対照群にはＡＩＮ-９３Ｍ基本飼料を、その他の群には、ＡＩＮ−９３Ｍ基本飼料に上記に特定した成分を混餌させて調製した特別飼料を、それぞれ自由摂取させた。１週間後にパイエル板を摘出し、細胞培養用培地（１０％ウシ胎児血清、０．２％抗生物質−抗真菌剤混合溶液（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地）中のセルストレーナー（７０μｍ、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社製）上で軽く圧迫することにより、細胞を取り出し、パイエル板細胞試料を調製した。１０%ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ培地中で細胞５×１０6個にコンカナバリンＡ２．５μg／ｍＬを２４時間作用させ、上清中に産生されるＩＬ−４及びＩＦＮ−γ量をＯｐｔＥＩＡ(ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社)を用いたＥＬＩＳＡ法で測定した。ＩＬ−４産生量の試験結果を図１６、ＩＦＮ−γ産生量の試験結果を図１７に示した。【００７８】
図１６及び図１７から明らかなように、発酵胡豆昆摂取マウスから調製したパイエル板細胞では対照群と比較してＩＦＮ−γ及びＩＬ−４産生量が有意に上昇した。一方、乳酸菌摂取群（Ｓ−ＰＴ８４）においては、このような作用は認められなかった。【００７９】
実施例９及び１０の結果から、乳酸菌単独ではなく、発酵胡豆昆を経口摂取した場合のみ、腸管免疫賦活作用が認められることが明らかとなった。本発明の発酵組成物のこのような効果は、発酵原料の作用からは到底予測できるものではない。【００８０】
実施例１１  昆布発酵物の抗腫瘍効果
ｄｄｙマウス（日本ＳＬＣ（株））を４群（１群につき１０匹）に分け、水（０．６ｍＬ）または５０ｍｇ／ｋｇ未発酵昆布（５００ｍｇ／ｋｇ）または発酵昆布（５００ｍｇ／ｋｇ）を連日強制経口投与した。強制経口投与開始２日目にマウス胸部にＳａｒｃｏｍａ１８０肉腫細胞を１×１０6ｃｅｌｌｓずつ皮下接種し、Ｓａｒｃｏｍａ１８０担癌マウスを調製した。Ｓａｒｃｏｍａ１８０担癌マウスには継続して１８日間経口投与を行った。試験期間中、腫瘍径を測定し、下記の（I）式に従い腫瘍サイズを求めた（図１８）。その結果、未発酵昆布投与群と発酵昆布投与群での腫瘍サイズはそれぞれ水を投与していた対照群に比較して低く推移し、発酵昆布投与群では腫瘍接種１１、１５および１９日後の腫瘍サイズが有意に小さかった。つまり、発酵昆布のほうが高い抗腫瘍効果があることがわかった。
（Ｉ）腫瘍サイズ（ｍｍ2）＝最大径（ｍｍ）×最小径×３．１４
実施例１２
実施例２で調製した胡麻と大豆と昆布の乳酸菌発酵組成物（発酵胡豆昆）を用い、表４に示す配合で発酵胡豆昆含有の丸剤（以下、発酵粒と称する。）（一粒の重量：３５０ｍｇ）を製造した。具体的には発酵胡豆昆に加え、賦形剤、味調整のための甘味剤などの原料を混ぜ合わせ、練合機にて練合した後、製丸機にて丸剤として成型した。その後適度に乾燥させた後、粒表面をシェラックでコートした。なお、発酵胡豆昆の性質上、丸剤製造において一般的に行われる素丸表面の磨き工程は行わなかった。また、併せて発酵胡豆昆が含まれていない丸剤（発酵粒と同様の形態）をプラセボとして製造した。表4にそれぞれの配合を示した。【００８１】
【表４】
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【００８２】
この丸剤を社内健常人ボランティア４０名に１日あたり３０粒（発酵胡豆昆として４．７ｇ／日）摂取させ、免疫調節作用について検討を行った。摂取試験は、クロスオーバー試験で行った。すなわち、被験者を、ＮＫ活性、年齢、性別を基準に統計学的に差がないように二群に分け、摂取サンプルとして、発酵粒または同じ形態のプラセボを各群に４週間摂取させ（摂取期間Ｉ）、６週間のウォッシュアウト期間を設けた。その後、各群の摂取サンプルを入れ替えて、さらに１ヶ月間プラセボまたは発酵粒を摂取させた（摂取期間ＩＩ）。摂取期間の前後に採血を行い、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ比重遠沈法（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ社）により、白血球を調製し、ＮＫ活性を測定した。ＮＫ活性に関しては、Ｋ５６２をターゲット細胞とした細胞傷害活性を、白血球：Ｋ５６２＝２０：１で、ＰＩＮＫ法を用いて測定した。また、白血球をＰＨＡ（phytohemagglutinin）存在下で２２時間培養し、培養上清中のＩＦＮ−γ、ＩＬ−４産生量を測定し、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを解析した。【００８３】
ＮＫ活性の試験結果を図１９に示す。摂取期間Ｉ、ＩＩともに発酵粒を摂取することにより有意にＮＫ活性が上昇した。図１９における摂取期間Ｉ、ＩＩおけるＮＫ活性の変化量（摂取前後での差：ΔＮＫ活性）を求め、その平均値を算出した。結果を図２０に示す。発酵粒摂取群はプラセボ摂取群と比較して、有意にＮＫ活性の変化量が大きかった。【００８４】
次に、ＰＨＡ刺激後の白血球からのＩＦＮ−γとＩＬ−４の産生量を測定し、摂取期間Ｉ、ＩＩおけるＴｈ１／Ｔｈ２比（ＩＦＮ−γの産生量／ＩＬ−４の産生量）の変化量（摂取前後での差：ΔＴｈ１／Ｔｈ２）を求め、その平均値を算出した。結果を図２１に示す。発酵粒摂取群は、プラセボ群と比較して有意にＴｈ１／Ｔｈ２比の変化量が大きく、発酵粒摂取によってＴｈ１優位な状態となることが示唆された。【００８５】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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