(57)【要約】  複数のP450間でアミノ酸配列が高度に保存された領域に基づいて設計したプライマーにより、試料中に含まれるP450遺伝子断片を増幅し、この断片と既知P450遺伝子とによってハイブリッド遺伝子を作製する方法を提供する。これにより培養工程や抽出したDNAの平均化工程を経ることなく、多様な微生物資源から効率よくP450遺伝子を単離することが可能になる。  また、P450本体タンパク質のC末端側に、リンカー部分を介して、ロドコカッス属NCIMB9784株由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼに含まれる還元酵素ドメインと同様の機能を持つペプチドを付加してなる融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼも提供する。これにより多様なP450本体タンパク質に対応し、尚且つ効率の良い電子伝達を行うシステムを構築し、活性のあるP450モノオキシゲナーゼを生産することが可能になる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５１又は５２記載のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配列、又はそれと相補的な塩基配列を含み、かつプライマー又はプローブとして実質的な機能を有するP450遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号５３〜５６記載のいずれかの塩基配列、又はそれと相補的な配列の一部または全部を含み、かつプライマー又はプローブとして実質的な機能を有するP450遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１又は２記載のオリゴヌクレオチドを少なくとも一方のプライマーとして使用することを特徴とするP450遺伝子断片単離法。
【請求項４】
試料から核酸を抽出する工程、及び抽出した核酸を鋳型とし、請求項１又は２記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして核酸増幅反応を行う工程を含むP450遺伝子断片単離法。
【請求項５】
請求項１又は２記載のオリゴヌクレオチドを少なくとも一方のプライマーとして使用してP450遺伝子断片を単離する工程、及び単離されたP450遺伝子断片の5'末端及び3'末端のそれぞれに既知P450遺伝子の5'末端領域及び3'末端領域を付加する工程を含むハイブリッドP450遺伝子の作製方法。
【請求項６】
既知P450遺伝子が、配列番号５７記載のアミノ酸配列をコードするP450遺伝子である請求項５記載のハイブリッドP450遺伝子の作製方法。
【請求項７】
以下の（a）〜（c）を含むことを特徴とするP450遺伝子単離用キット、
（a）請求項１又は２記載のオリゴヌクレオチド、
（b）既知P450遺伝子の5’末端領域を含むDNA断片、
（c）既知P450遺伝子の3’末端領域を含むDNA断片。
【請求項８】
以下の（a）又は（b）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子、
（a）配列番号１〜２５のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質、
（b）配列番号１〜２５のいずれかのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつP450として機能するタンパク質。
【請求項９】
配列番号２６〜５０のいずれかの塩基配列からなり、P450として機能するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１０】
請求項８又は９記載の遺伝子を含有する発現ベクター。
【請求項１１】
以下の（a）または（b）のいずれかのタンパク質、
（a）配列番号１〜２５のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質、
（b）配列番号１〜２５のいずれかのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなりかつ、P450として機能するタンパク質。
【請求項１２】
請求項１０記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培地で培養し、得られる培養物から請求項１１記載のタンパク質を回収することを特徴とするP450として機能するタンパク質の製造法。
【請求項１３】
請求項１１記載のタンパク質を基質と反応させ、酸化化合物を得ることを特徴とする酸化化合物の生産法。
【請求項１４】
P450本体タンパク質のC末端側に、リンカー部分を介して、ロドコカッス属NCIMB9784株由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼに含まれる還元酵素ドメインと同様の機能を持つペプチドを付加してなる融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼ。
【請求項１５】
ロドコカッス属NCIMB9784株由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼに含まれる還元酵素ドメインと同様の機能を持つペプチドが、（ａ）配列番号７０記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｂ）配列番号７０記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるペプチド、又は（ｃ）配列番号６９記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするペプチドであることを特徴とする請求項１４に記載の融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼ。
【請求項１６】
リンカー部分が、（ｄ）配列番号６８記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｅ）配列番号６８記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるペプチド、又は（ｆ）配列番号６７記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするペプチドであることを特徴とする請求項１４又は１５に記載の融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼ。
【請求項１７】
P450本体タンパク質が、細菌由来のP450本体タンパク質であることを特徴とする請求項１４乃至１６のいずれか一項に記載の融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼ。
【請求項１８】
P450本体タンパク質が、請求項１１記載のタンパク質、又は配列番号５７若しくは配列番号８５のアミノ酸配列からなるタンパク質であることを特徴とする請求項１４乃至１６のいずれか一項に記載の融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼ。
【請求項１９】
請求項１４乃至１８のいずれか一項に記載の融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼをコードするDNA。
【請求項２０】
請求項１９記載のDNAを導入した微生物。
【請求項２１】
請求項２０記載の微生物を培養し、培養物又は菌体から融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼを採取することを特徴とする融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼの生産方法。
【請求項２２】
請求項１４乃至１８のいずれか一項に記載の融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼを基質と反応させ、酸化化合物を得ることを特徴とする酸化化合物の生産法。
【請求項２３】
基質が、n-へキサン、n-へプタン、n-オクタン、n-デカン、1-オクテン、シクロヘキサン、n-ブチルベンゼン、4-フェニル-1-ブテン、又は2-n-ブチルベンゾフランであり、生産される酸化化合物がそれぞれ1-ヘキサノール、1-ヘプタノール、1-オクタノール、1-デカノール、1,2-エポキシオクタン、シクロヘキサノール、4-フェニル-1-ブタノール、2-フェネチルオキシラン、又は4-ベンゾフラン-2-イル-ブタン-1-オールであることを特徴とする請求項２２記載の酸化化合物の生産法。
【請求項２４】
以下の（a）又は（b）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子、
（a）配列番号８５のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（b）配列番号８５のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつP450として機能するタンパク質。
【請求項２５】
配列番号８６の塩基配列からなり、P450として機能するタンパク質をコードする遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、P450として機能するタンパク質をコードする遺伝子の単離方法、該方法に有用なオリゴヌクレオチド、該方法によって単離された新規遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質、該タンパク質を含む融合型P450モノオキシゲナーゼ、及び該酵素を用いた酸化化合物の生産法に関するものである。本発明の単離方法は、海水や土壌等の試料から細菌等の微生物の分離・培養する工程や分離・培養した微生物から抽出したDNAの平均化工程を経ずに、酵素遺伝子を単離できる方法であり、自然界の遺伝子資源から、特に当該遺伝資源中に目的の遺伝子を有する微生物の存在量が少ない場合において、新規のP450遺伝子を単離するのに有効である。本発明で得られる遺伝子から合成されるP450は生体触媒として化学工業における有用物質生産に利用することができる。
【背景技術】
【０００２】
シトクロムP450モノオキシゲナーゼは細菌から植物や哺乳動物に至る広範囲の生物種に分布している酸素添加酵素であり、酸素分子を還元して１分子の水を作ると共に、残りの酸素原子を様々な低分子有機化合物に導入して、酸化生成物に変換する反応（１原子酸素添加反応）を触媒する鉄・イオウ酵素である。P450は分子構造や基本的な触媒機構を保ちつつ、基質結合部位の構造を変化させることで炭化水素の水酸化のみならず、脱アルキル化、エポキシ化、C-C結合切断、芳香化、脱水素、還元など様々な酸化反応に対応しており、P450によって触媒される反応は、動物のホルモンや植物の２次代謝産物の生合成から、生体内に取り込まれた異物の活性化や生分解に至るまで、かなり多様で広範囲に及んでいる。このようにP450はあらゆる種類の有機化合物の酸化に関与することから、バイオインダストリー分野において注目を集めている。具体的には、既存の方法では酸化処理が難しい化合物に対してP450の触媒反応を利用することで、新しい有機低分子化合物の合成や環境負荷物質の分解処理を行う検討がなされている。また、最近では産業上の観点からも、バイオコンバージョン技術への応用を目的として、細菌をはじめとする微生物のP450の利用が考案されている（非特許文献1）。細菌でよく研究されているP450としては、P450で初めて結晶構造が解かれたシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のP450camと、P450の酸化反応に必要な還元酵素と融合した構造を持つバチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）由来のP450BM3等が挙げられる。これらの酵素は、分子進化工学的手法で酵素活性や基質特異性を改良する試みもなされている（非特許文献1）。しかしながら、従来知られていた細菌のP450は細菌種の豊富さに比べると非常に少なかった。一方、近年のゲノム解析の進展がP450研究に新局面をもたらした。多くの細菌のゲノム解析が完結し、細菌のP450も多数存在していることが明らかとなった。例えば、結核菌マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）には２０種類のP450配列が存在しており、放線菌ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）には１８種類のP450配列が存在していた。こうして新たに発見されたP450をバイオコンバージョン（生変換）における酸化酵素資源として利用する試みも開始されている。以上のように最近では、微生物から多数のP450が単離され解析が実施され始めているが、これらのP450はすべて、単離・培養の可能な生物種に由来するものである。しかし、単離・培養が可能な微生物は、土壌、海洋等の生息環境を問わず1%以下であるので（非特許文献2)、現在同定されている微生物由来のP450は限定的であり、未だ単離同定が困難なP450が環境中には多数存在することが推定される。こうした未同定のP450の中には有機化合物の種々の酸化反応に関与するものが多数存在することは否定できない。したがって、単離・培養が不可能または困難な微生物（難培養微生物）由来のP450を含め環境中から直接、多数の遺伝子を単離し、迅速に機能解析を行うことは、産業利用の観点からも非常に有意義である。【０００３】
微生物の単離・培養を経ずに環境中から直接、目的遺伝子を単離・回収する例として、カセットPCR法という手法がOkutaらにより開発されている（非特許文献3）。この方法は、目的とする機能を有する既知のタンパク質又はその遺伝子のアミノ酸配列ないし塩基配列から当該遺伝子に特異的なプライマーを設計した上で、土壌や海水等の環境サンプルから直接抽出したDNAを鋳型としてPCR等のDNA増幅反応を行い、増幅されたDNA断片を単離した後、上記プライマーによる増幅反応で増幅されない遺伝子の両端部を既知類似遺伝子の塩基配列で補う手法である。これにより中央部が環境から直接抽出したDNA由来の新規遺伝子配列、両端部が既知遺伝子配列からなるハイブリッド遺伝子が生成され、大腸菌などを宿主とするタンパク質発現系にハイブリッド遺伝子を組み込むことにより、効率的に得られた遺伝子の機能解析を行うことが可能になる。この手法を用いて多様な新規遺伝子配列を獲得するためには、DNA増幅反応に用いるプライマーの配列、さらには、プライマー設計の基礎情報とする既存のタンパク質又は遺伝子配列の相同性が重要である。しかし、P450に関しては１次構造が著しく多様化しており、既知の配列から多様なP450遺伝子を効率よく単離できるプライマーは得られていなかった。なお、土壌等の自然界から直接、DNAを回収する際、存在量が多い微生物由来のDNA断片が多く回収され、このままライブラリーを作製すると、存在量が多い微生物由来の遺伝子が多く含まれてしまうことになり、目的の遺伝子が、その土壌等では少ししか存在しない微生物（稀少微生物）由来の遺伝子である場合は、当該遺伝子の単離が困難となる。稀少微生物由来遺伝子のDNAの多様性を確保するための方法として、土壌等の自然界から直接抽出したDNAを、ＧＣ含量の差を利用して平均化（normalization）した後で、ライブラリーを作製する方法が開示されている（特許文献1）。しかし、この平均化の方法は、稀少微生物と存在量が多い微生物のＧＣ含量が近似している場合は、利用することができない。【０００４】
P450の触媒反応による変換が期待される化合物として、アルカン（直鎖状炭化水素）等の石油成分が挙げられる。アルカンはその両末端を酸化することによってジオールやジカルボン酸に変換された後、ポリマー、香料、医薬等の工業原料として利用されている。現在は石油化学工業によって合成されているが、生物工学的製造法への代替が望まれていることもあり、生物種によるアルカン末端の酸化反応は注目されている。アルカン末端の酸化反応を行うP450としては、カンジダ・マルトーサ(Candida maltosa) やカンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)などの酵母に存在するCYP52ファミリーが知られている（非特許文献4）。 カンジダ・マルトーサにおいてはアルカンによって強く発現誘導されるCYP52Aサブファミリーに属する４種類の遺伝子が、アルカンや脂肪酸といった基質の種類や鎖長に関して異なる特異性をもつことが示されている。アルカンの分解に関与すると推察される原核生物由来のP450としては、最初に長鎖のn-アルカン資化細菌であるアシネトバクター・カルコアセツカス（Acinetobacter calcoaceticus）EB104株において発見された（非特許文献5）。最近ではアルカン資化能を有するアルカニボラックス・ボルクメンシス（Alcanivorax borkumensis）やロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）等の細菌数種類でP450の存在が明らかとなり、これらのP450はCYP153Aサブファミリーを形成している（非特許文献6、および、Nelson博士のホームページ（http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html））。しかしながら、このP450がアルカンの末端に水酸基を付与すると言う直接の証拠は得られていなかった。また、分子進化工学的手法で得られたバチルス・メガテリウム由来のP450の変異体P450BM-3 139-3が、炭素数3から8のアルカンの酸化能を有していることが明らかとなった（非特許文献7）。同P450遺伝子は還元酵素融合型P450であり、大腸菌での発現効率も高く、バイオコンバージョン技術への応用が期待されたが、アルカンの末端ではなく主に側鎖の水酸化反応であるため実用化には至っていない。以上述べてきたように、アルカン末端の酸化反応を行うP450は産業利用が期待されるため、研究が盛んに行われてきているが、限定された知見しか存在しなく、特に細菌由来の同P450に関する情報は非常に少ないということが言える。【０００５】
P450モノオキシゲナーゼは、電子伝達の方法の違いにより２種類の組（クラス）に分けられる。1つ目のクラス（クラスI）はフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD；flavin adenine dinucleotide）を補酵素として分子内に含有するNAD(P)H-鉄イオウタンパク質（フェレドキシン；ferredoxin）還元酵素（レダクターゼ；reductase）、及び、鉄イオウタンパク質（フェレドキシン）によってP450本体タンパク質にNAD(P)Hから電子供給が行われるものである（今後、このクラスを「三成分系のP450モノオキシゲナーゼ」と呼ぶことがある。）。ミトコンドリアや細菌のP450モノオキシゲナーゼは通常このクラスに属する。第2のクラス（クラスII）は、FADとフラビンモノヌクレオチド（FMN；flavin mononucleotide）を補酵素として分子内に含有するNADPH-P450還元酵素が、鉄イオウタンパク質の介在無しにNADPHからP450本体タンパク質に電子供給を行うものである（今後、このクラスを「二成分系のP450モノオキシゲナーゼ」と呼ぶことがある。）。哺乳動物の肝臓のミクロソーム中に存在するP450モノオキシゲナーゼがこのクラスIIに相当する。【０００６】
近年、細菌のゲノム解析が進むにつれ新しいP450（CYP；本体タンパク質）の遺伝子が数多く見つかっているが、そのP450に対応する電子伝達タンパク質をコードする遺伝子が不明な場合が多い。たとえば医薬品の合成などその利用が期待されているストレプトマイセス（Streptomyces）属45種において170以上のP450遺伝子が見つかりながら、それぞれに対応可能な電子伝達タンパク質の発見は20個未満に留まっている（Parajuli N. et al. Genome analyses of Streptomyces peucetius ATCC 27952 for the identification and comparison of cytochrome P450 complement with other Streptomyces. Arch Biochem Biophys. 425: 233-241, 2004）。【０００７】
対応する電子供与体が不明な場合にも、同じ菌株内に存在する電子伝達タンパク質や、別の菌株あるいは別の個体のP450電子伝達タンパク質を利用して酵素活性を生じさせた例はある。たとえば、ストレプトマイセス属のP450の幾つかは、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のフェレドキシン（プチダレドキシン；putidaredoxin）及びプチダレドキシン還元酵素と共存させることでP450モノオキシゲナーゼ活性を示すことが報告された（有澤 章ら, 放線菌シトクロムP450および電子伝達タンパクを共発現させた大腸菌による微生物変換系, 日本農芸化学会2003年大会講演要旨, p. 38, 2003）。また、コリネバクテリウム(Corynebacterium sp.) EP1株由来のP450(PB-1)はホウレンソウ由来の電子供与体との共存で活性を示した（Kawahara N, et al. Purification and characterization of 2-ethoxyphenol-induced cytochrome P450 from Corynebacterium sp. strain EP1. Can J Microbiol. 45: 833-839, 1999）。しかし当然のことながら、前述の電子供与体や電子伝達タンパク質がすべてのP450に適応できるものではなく、個々のP450に於いて相性の良い電子伝達タンパク質を探索して用いられているのが現状である。しかも、多大な労力をかけることなく相性の良い電子伝達タンパク質を見つけるためには、ある菌種に限定するか、お互いに相同性が高いP450ファミリーへと絞ってP450研究を進めざるを得ない。さらに機能する電子伝達タンパク質を選択できた場合でも、菌体内でP450と共発現させるには、遺伝子操作や誘導条件の最適化検討（たとえば、各構造遺伝子を別々のプラスミドにのせるのか、同一プラスミド上で発現させるのか、その場合の遺伝子の順番、各遺伝子の誘導のタイミングなど）に多くの時間が費やされる。また、in vitroでのP450機能解析においても、還元系酵素を別々に生産、精製し、それらを最適な割合になるよう検討しながら混合する、というステップを踏むため、ただ１つのP450を機能解析するのにも多くの時間と手間がかかる。これらのことから、莫大なP450遺伝子の構造に関する情報が蓄積されているにもかかわらず、P450遺伝子の機能に関する情報は少なく、多種多様なP450から目的とする基質特異性や触媒機能を持つ酵素を選択したり、新規に得られたP450が作用できる基質を探索する、といった選択系のハイスループット化は難しいのが現状であった。【０００８】
また、一般的なP450の問題点として、電子供与体からシトクロム P450への電子伝達が酵素反応の律速になるために、シトクロムP450一分子あたりの活性が低いことが挙げられる。この点を改善する鍵となると思われるのが、珍しい例であるが、融合型P450モノオキシゲナーゼと呼ばれるものであり、P450本体タンパク質と還元酵素が1本のポリペプチド鎖として繋がっているものである。よく知られている例は細菌バチラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）由来のP450BM3（非特許文献８）を始めとして、カビ由来のP450foxyなどである。これらの構造は、クラスIIに属する二成分系のP450モノオキシゲナーゼにおけるP450本体タンパク質と、FADとFMNを分子内に補酵素として含有するNADPH-P450還元酵素という構成成分からなっている。クラスIIの二成分系と違う部分はこの2つの構成成分がリンカー部分を介して1つのポリペプチドとして繋がっているというところである。この融合型P450モノオキシゲナーゼの特徴の１つとして、三成分系、二成分系のP450モノオキシゲナーゼと比べて酵素反応速度が速く、高い活性を保有できることである。その理由として、P450と還元酵素の融合により電子が分子内伝達となった有利性が考えられ、P450と還元酵素系の最も良い相互作用をもつ立体構造を実現している可能性がある。この融合型P450モノオキシゲナーゼを模倣して、人工的融合型P450モノオキシゲナーゼを作った例は真核生物のP450において広く認められ、N末端側にヒト肝臓P450本体タンパク質を有し、Ｃ末端側に酵母やラット、あるいは前述のP450BM3由来NADPH-P450還元酵素を付加した人工融合酵素などが作られている。P450BM3は細菌由来でありながら、P450本体タンパク質部分（ヘムドメイン）、NADPH-シトクロムP450還元酵素ドメイン共に、例外的に真核生物由来のクラスIIに属するP450及びP450還元酵素と相同性が高いため電子供与体として適用され得たものと考えられる。このようにP450BM3は細菌由来のP450でありながら、クラスIに属する三成分系の一般的な細菌由来のP450とは一線を画すものである。【０００９】
一方、P450BM3を除くと、細菌由来のP450本体タンパク質を用いてP450−還元酵素ドメインの融合酵素作製の成功例（活性のある融合酵素作製に成功した例）はわずか一例に留まり、しかも、それは元々同じシステム内のP450モノオキシゲナーゼの構成成分を融合化したものにすぎない（Sibbesen, O., et al. Putidaredoxin reductase-putidaredoxin-cytochrome P450cam triple fusion protein. Construction of a self-sufficient Escherichia coli catalytic system. J Biol Chem. 271: 22462-9, 1996）。一般的な細菌由来のP450本体タンパク質と異種P450モノオキシゲナーゼ成分由来の還元酵素部分との融合化についての試みの成功例はこれまでに報告されていない。これは先にも述べたように、細菌のP450機能システムがP450本体タンパク質、フェレドキシン、フェレドキシン還元酵素の三成分系から成るため複雑であることが要因であろう。微生物のP450モノオキシゲナーゼの産業利用において人工融合化酵素は簡便な酵素精製、または菌体内反応系を可能にするものでありながら、未だ確立された技術ではない。【００１０】
前述した、クラスI、クラスIIに属するP450モノオキシゲナーゼや融合型P450モノオキシゲナーゼのいずれにも当てはまらないP450モノオキシゲナーゼが最近報告された（非特許文献８）。これはロドコッカス（Rhodococcus）属NCIMB9784株より単離されたP450モノオキシゲナーゼ（P450RhFと命名された）であり、P450本体タンパク質（ヘムドメイン）、フラビンモノヌクレオチド（FMN）を補酵素にして分子内に含有するNADH-P450還元酵素ドメイン、鉄イオウタンパク質ドメインが1本のポリペプチドとして繋がったものである。本P450モノオキシゲナーゼ（P450RhF）における還元酵素ドメインがFMNしか要求しないというのも新奇である。クラスIのP450モノオキシゲナーゼにおける還元酵素がFADを要求し、クラスIIや従来の融合型のP450モノオキシゲナーゼにおける還元酵素がFADとFMNの両方を要求するからである。したがって、P450RhFはP450モノオキシゲナーゼの中で極めて例外的なものであると考えられる。【００１１】
【特許文献１】特表2000-513933号公報
【非特許文献１】Urlacher et al, Appl. Microbiol. Biotechnol. 64: 317-325 (2004)
【非特許文献２】Thomas et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 10494-10499 (2002)
【非特許文献３】Okuta, A. et al, Gene. 212: 221-228 (1998)
【非特許文献４】Ohkuma et al, J. Biol. Chem. 273: 3948-3953 (1998)
【非特許文献５】Thomas et al, Biochem. Biophy. Res. Comm. 286: 652-658 (2001)
【非特許文献６】Beilen et al, biocat 2004 Book of Abstracts, p. 233
【非特許文献７】Glieder et al, Nat. Biotechol. 20: 1135-1139 (2002)
【非特許文献８】Roberts, G.A., et al, Identification of a new class of cytochrome P450 from a Rhodococcus sp. J. Bacteriol. 184: 3898-3908, 2002.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の第一の目的は、多様な環境中に存在する微生物資源から効率良く、特に当該環境中では稀少な微生物から、多様なP450遺伝子を単離する方法を提供し、さらには、新規なP450遺伝子及び該遺伝子によって合成されるP450を提供し、該酵素によって多様な有機化合物を酸化する手段を提供することである。【００１３】
また、P450モノオキシゲナーゼは、基質特異性や反応特異性に関して非常に多様であるので、種々の有用な生体触媒反応への応用が期待されている。しかしながら、ほとんどのP450本体タンパク質（CYP）はそれだけでは触媒活性を持つことはできないので、せっかく新規なP450遺伝子を見出しても、コードされるP450が作用できる基質を特定し且つ実用化するためには多くの時間と労力が必要とされる。すなわち、P450本体タンパク質が本来有しているはずの酵素活性（触媒活性）を利用するには、活性のあるP450モノオキシゲナーゼを再構成しなければならず、そのためにはP450本体タンパク質に適切に電子供与する電子伝達タンパク質の共存が必須である。しかしながら、個々のP450、特に新規のP450に呼応する電子供与体を見つけるのは困難なこと、さらには、一般的にP450モノオキシゲナーゼのシステムそのものの酵素活性が弱く失活しやすいことが知られており、多様なP450本体タンパク質に対応し尚且つ効率の良い電子伝達を行うシステムの開発が強く求められていた。本発明の第二の目的はこのようなシステムを構築し、活性のあるP450モノオキシゲナーゼを生産する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記第一の目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、石油成分を資化する微生物に由来する複数のP450遺伝子により形成されているCYP153Aサブファミリーにおいてアミノ酸配列が比較的よく保存された領域を見出し、該領域に基づいて設計したプライマーにより様々な環境由来DNAサンプルから新規P450遺伝子断片の増幅が可能であることを見出した。さらに、カセットPCR法より、増幅されたP450遺伝子と既知P450遺伝子間のハイブリッド遺伝子を作製した上で、大腸菌発現系によるハイブリッド遺伝子の機能解析手法を確立し、検討を重ねた結果、環境中から得られた新規P450配列とのハイブリッド遺伝子産物がモノオキシゲナーゼ活性を有し、アルカン（直鎖状炭化水素）、アルケン（不飽和結合を含む直鎖状炭化水素）、環状炭化水素、及び、分子内に芳香環を含むアルカンやアルケンなどの有機化合物を基質とし、末端メチル基の水酸化反応や末端オレフィンのエポキシ化反応等の酸化反応を触媒することを見出した。【００１５】
また、本発明者らは、上記の第二の目的を達成するため、汎用性と効率性を兼ね備えたP450への電子伝達システムを開発すべく鋭意検討を重ねてきた。その過程で、ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）NCIMB9784株のシトクロムP450モノオキシゲナーゼ（P450RhF）に着目した。「背景技術」で説明したように、P450RhF はP450本体タンパク質とP450還元酵素ドメイン（領域）が融合して１本のポリペプチド鎖として存在する融合型P450モノオキシゲナーゼである。融合型P450モノオキシゲナーと言っても、前述したようにP450BM3やP450foxyとは違い、還元酵素領域には鉄-イオウタンパク質様コンポーネントとFMNタンパク質様コンポーネントを有するこれまでにない新奇な構造を持っていた（非特許文献１）。一般的に、ロドコッカス属細菌のようなアクチノバクテリアの場合、種々の有機化合物の変換反応に関与する多様な触媒機能を有しており、それに対応して煩雑な酵素系を有していることが知られているので、この新奇なP450RhFのような酵素に汎用性を期待するのは難しいと思われた。さらには、ロドコッカス属細菌由来の酵素系に関与する遺伝子を大腸菌のような汎用宿主で機能発現させるのは難しい場合が多いことが知られていた。したがって常識的に考えると、このP450RhFは、本発明者らの目的、すなわち汎用性と効率性を兼ね備えたP450への電子伝達システムの開発への材料として期待することはできないと思われた。それでも本発明者らは、P450RhFの還元酵素領域を利用し、種々の細菌由来のP450本体タンパク質への電子伝達システムとして働かせることはできないか、さらには電子伝達が分子内伝達になるように融合タンパクとして働かせることはできないかと考え鋭意検討を重ねた。その結果、思いがけないことに、このP450RhFの還元酵素ドメインを、異種の細菌由来のP450本体タンパク質のC末に適切なリンカー領域を介して融合化させることにより、触媒活性があり、しかも失活しにくいP450モノオキシゲナーゼを作ることができることがわかった。【００１６】
具体的には、細菌由来のシトクロムP450本体タンパク質（CYP）をコードする塩基配列を有する遺伝子とロドコッカス属（Rhodococcus sp.） NCIMB9784株由来のP450RhFの還元酵素ドメインをコードする塩基配列を有する遺伝子を接続することにより、単一のポリペプチド遺伝子とし、P450の有するモノオキシゲナーゼ活性およびP450RhFの還元酵素ドメインの有するNAD(P)H からの還元力供給能を同一分子内に有する人工融合酵素をコードする人工融合酵素遺伝子発現系を構築した。そして幾つかの異種細菌由来P450遺伝子についてこの発現系を適用し、大腸菌に人工融合酵素を生産させることに成功した。生産された人工融合酵素は単一分子内に電子伝達と基質の酸化能の両機能を有しており、構築した融合タンパク遺伝子発現系が多様なP450遺伝子に対応できることを確認した。更に、構築した融合タンパク遺伝子発現系を用いれば、大腸菌培養液を用いた簡易な生変換反応によりP450の生体触媒活性を観察できることを確認した。【００１７】
本発明は、以上の知見に基づき完成されたものである。【００１８】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（２３）を提供するものである。【００１９】
（１）配列番号５１又は５２記載のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配列、又はそれと相補的な塩基配列を含み、かつプライマー又はプローブとして実質的な機能を有するP450遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチド。【００２０】
（２）配列番号５３〜５６記載のいずれかの塩基配列、又はそれと相補的な配列の一部または全部を含み、かつプライマー又はプローブとして実質的な機能を有するP450遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチド。【００２１】
（３）（１）又は（２）記載のオリゴヌクレオチドを少なくとも一方のプライマーとして使用することを特徴とするP450遺伝子断片単離法。【００２２】
（４）試料から核酸を抽出する工程、及び抽出した核酸を鋳型とし、（１）又は（２）記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして核酸増幅反応を行う工程を含むP450遺伝子断片単離法。【００２３】
（５）（１）又は（２）記載のオリゴヌクレオチドを少なくとも一方のプライマーとして使用してP450遺伝子断片を単離する工程、及び単離されたP450遺伝子断片の5'末端及び3'末端のそれぞれに既知P450遺伝子の5'末端領域及び3'末端領域を付加する工程を含むハイブリッドP450遺伝子の作製方法。【００２４】
（６）既知P450遺伝子が、配列番号５７記載のアミノ酸配列をコードするP450遺伝子である（５）記載のハイブリッドP450遺伝子の作製方法。【００２５】
（７）以下の（a）〜（c）を含むことを特徴とするP450遺伝子単離用キット、
（a）（１）又は（２）記載のオリゴヌクレオチド、
（b）既知P450遺伝子の5’末端領域を含むDNA断片、
（c）既知P450遺伝子の3’末端領域を含むDNA断片。【００２６】
（８）以下の（a）又は（b）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子、
（a）配列番号１〜２５のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質、
（b）配列番号１〜２５のいずれかのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつP450として機能するタンパク質。【００２７】
（９）配列番号２６〜５０のいずれかの塩基配列からなり、P450として機能するタンパク質をコードする遺伝子。【００２８】
（１０）（８）又は（９）記載の遺伝子を含有する発現ベクター。【００２９】
（１１）以下の（a）または（b）のいずれかのタンパク質、
（a）配列番号１〜２５のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質、
（b）配列番号１〜２５のいずれかのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなりかつ、P450として機能するタンパク質。【００３０】
（１２）（１０）記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培地で培養し、得られる培養物から（１１）記載のタンパク質を回収することを特徴とするP450として機能するタンパク質の製造法。【００３１】
（１３）（１１）記載のタンパク質を基質と反応させ、酸化化合物を得ることを特徴とする酸化化合物の生産法。【００３２】
（１４）P450本体タンパク質のC末端側に、リンカー部分を介して、ロドコカッス属NCIMB9784株由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼに含まれる還元酵素ドメインと同様の機能を持つペプチドを付加してなる融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼ。【００３３】
（１５）ロドコカッス属NCIMB9784株由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼに含まれる還元酵素ドメインと同様の機能を持つペプチドが、（ａ）配列番号７０記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｂ）配列番号７０記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるペプチド、又は（ｃ）配列番号６９記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするペプチドであることを特徴とする（１４）に記載の融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼ。【００３４】
（１６）リンカー部分が、（ｄ）配列番号６８記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｅ）配列番号６８記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるペプチド、又は（ｆ）配列番号６７記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするペプチドであることを特徴とする（１４）又は（１５）に記載の融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼ。【００３５】
（１７）P450本体タンパク質が、細菌由来のP450本体タンパク質であることを特徴とする（１４）乃至（１６）のいずれか一項に記載の融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼ。【００３６】
（１８）P450本体タンパク質が、（１１）記載のタンパク質、又は配列番号５７若しくは配列番号８５のアミノ酸配列からなるタンパク質であることを特徴とする（１４）乃至（１６）のいずれかに記載の融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼ。【００３７】
（１９）（１４）乃至（１８）のいずれかに記載の融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼをコードするDNA。【００３８】
（２０）（１９）記載のDNAを導入した微生物。【００３９】
（２１）（２０）記載の微生物を培養し、培養物又は菌体から融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼを採取することを特徴とする融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼの生産方法。【００４０】
（２２）（１４）乃至（１８）のいずれか一項に記載の融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼを基質と反応させ、酸化化合物を得ることを特徴とする酸化化合物の生産法。【００４１】
（２３）基質が、n-へキサン、n-へプタン、n-オクタン、n-デカン、1-オクテン、シクロヘキサン、n-ブチルベンゼン、4-フェニル-1-ブテン、又は2-n-ブチルベンゾフランであり、生産される酸化化合物がそれぞれ1-ヘキサノール、1-ヘプタノール、1-オクタノール、1-デカノール、1,2-エポキシオクタン、シクロヘキサノール、4-フェニル-1-ブタノール、2-フェネチルオキシラン、又は4-ベンゾフラン-2-イル-ブタン-1-オールであることを特徴とする（２２）記載の酸化化合物の生産法。【００４２】
（２４）以下の（a）又は（b）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子、
（a）配列番号８５のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（b）配列番号８５のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつP450として機能するタンパク質。【００４３】
（２５）配列番号８６の塩基配列からなり、P450として機能するタンパク質をコードする遺伝子。
【発明の効果】
【００４４】
本発明により、環境サンプル等の雑多な微生物由来の核酸を含むサンプルから、新規P450遺伝子を効率的に単離する方法が提供される。本発明の方法によって提供されるP450遺伝子から生産されるP450は多様な低分子有機化合物の生産に利用することができる。【００４５】
また、既存および未知のP450タンパク質から本発明の融合型P450モノオキシゲナーゼを作製することにより、これらのP450タンパク質を、電子伝達と基質の酸化反応の両機能を有する一成分系の機能性P450モノオキシゲナーゼにすることが可能となり、従来P450モノオキシゲナーゼ活性の提示に必要だった電子伝達タンパク質との反応系の再構築検討実験の必要がなくなる。これにより、有用なP450生体触媒活性のスクリーニングの高速化、有用なP450酵素の簡便な精製、融合酵素遺伝子を発現した微生物による有用物質の生変換反応プロセスや産業廃水中の有害物質の酸化的除去等の実用的応用が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】獲得した新規P450のアミノ酸配列（配列番号１から２５）と既知P450のアミノ酸配列の相同性に基づく系統樹を示した図。
【図２】還元状態での一酸化炭素の通気処理による、粗抽出液A（図２Ａ）、粗抽出液B（図２Ｂ）および粗抽出液C（図２Ｃ）の吸収スペクトルの変化を示した図。
【図３】粗酵素液B、Dによるオクタン、1-デセンを基質とした酵素反応の後、反応液をガスクロマトグラフィー質量分析計にて分析したチャートを表す図。
【図４】融合型P450作製用発現プラスミドpREDの構造を示した図。
【図５】炭素数6から８のn-アルカンを基質とした場合に酸化物として検出された1-アルコールの生成量を比較した図。
【図６】菌懸濁液H5、H9、Alk及びコントロールのNonによるn-ブチルベンゼンを基質とした変換反応物を誘導体化し、ガスクロマトグラフィー質量分析計にて分析したチャートを表す図。
【図７】菌懸濁液H5、H9、Alk及びコントロールのNonによる4-フェニル-1-ブテンを基質とした変換反応の後、ガスクロマトグラフィー質量分析計にて分析したチャートを表す図。
【図８】人工融合化P450cam（図８Ａ）及び非融合化P450cam（図８Ｂ）の光学的性質を示す図である。
【図９】融合化及び非融合化P450cam生産大腸菌によるショウノウから5-水酸化ショウノウへの変換能を示す図である。
【図１０】融合化及び非融合化P450alk生産大腸菌によるn-オクタンから1-オクタノールへの変換能を示す図である。
【図１１】融合化及び非融合化P450bzo生産大腸菌による4-ヒドロキシ安息香酸から3,4-ジヒドロキシ安息香酸への変換能を示す図である。
【図１２】融合化及び非融合化P450SU-1、SU-2生産大腸菌による７-エトキシクマリンから７-ヒドロキシクマリンへの変換能を示す図である。レーン番号1：7-エトキシクマリン、2：7-ヒドロキシクマリン、3：P450非保有株、4：pETP450SU-1保有株、5：pSU-1RED保有株、6：pETP450SU-2保有株、７：pSU-2RED保有株。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．P450モノオキシゲナーゼ
P450モノオキシゲナーゼは、シトクロムP450本体タンパク質（CYP）以外に電子伝達タンパク質を必要とする複合酵素である。すなわち、P450が活性を発揮するには、NAD(P)Hから電子を伝達してくるタンパク質として、細菌や真核生物のミトコンドリアでは フェレドキシンレダクターゼとフェレドキシンの介在を必要とし、哺乳動物の肝臓ミクロソームでは NADPH-P450レダクターゼの介在を必要とする。一次構造上の特徴としてP450にはFXXGXR/HXCXGという共通配列がC末端から５０〜６０残基手前に存在する。この配列はヘム結合領域と呼ばれ、P450に独特の配列であり、塩基配列から推定されるアミノ酸配列にこの配列が見つかると、そのDNAはP450をコードしている遺伝子とみなされる( 大村ら編  P450の分子生物学 2003年  講談社サイエンティフィック)。P450遺伝子の分類はアミノ酸配列の類似度を基準にして行われ、最新情報はNelson博士のホームページ（http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html）に掲載される。公認された命名法において、P450スーパーファミリーに属する遺伝子は共通の接頭辞CYPで始まり、それに続くファミリー番号、サブファミリー記号、遺伝子番号によって区別される。アミノ酸配列が40％以上一致すれば同一ファミリーに、55％以上一致すれば同一サブファミリーに分類されるのが原則である。
本発明において、モノオキシゲナーゼ活性とは、酸素分子を還元して１分子の水を作ると共に、残りの酸素原子を様々な低分子有機化合物に導入して、酸化生成物に変換する反応を触媒する作用を意味する。また、P450モノオキシゲナーゼとは、還元状態で一酸化炭素を通気すると吸収スペクトルが変化し450 nmに極大をもつ差スペクトル（CO差スペクトル）が現れる性質を有し、さらにモノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質を意味する。
２．Ｐ450モノオキシゲナーゼCYP153ファミリー
Ｐ450モノオキシゲナーゼCYP153ファミリーは、最初にアシネトバクター・カルコアセツカス（Acinetobacter calcoaceticus）EB104株においてCYP153A１が発見された（非特許文献5）。その後、アルカンの資化能を有する微生物数種類でもCYP153ファミリーに属するP450が発見されている（Nelson博士のホームページ（http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html））。CYP153ファミリーの機能に関しては、アルカン（オクタン）資化能を喪失したシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）を宿主として、CYP153A1遺伝子を発現させ、オクタン入り培地での生育状態を観察することによって、同P450がオクタンの末端に水酸基を導入するモノオキシゲナーゼであることを示唆する報告がある（非特許文献6）。なお、CYP153ファミリーに属するP450に限らず、P450がアルカンの末端に水酸基を導入する活性を有していることを直接観察した報告は無く、本発明者によって初めて報告されるものである。なお、微生物由来の一般的なP450は、その酸化反応を触媒するために電子伝達タンパク質としてフェレドキシンレダクターゼ（ferredoxin reductase）とフェレドキシン（ferredoxin）の介在が必要であると考えられている。
３．カセットPCR法
（１）P450遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチドの作製
本発明のP450遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチド（以下「本オリゴヌクレオチド」という）は、配列番号５１又は５２記載のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配列、又はそれと相補的な塩基配列を含み、かつプライマーとして実質的に機能を有するオリゴヌクレオチドである。本オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用することによりP450遺伝子断片の単離が可能となる。本発明において、「オリゴヌクレオチド」とはデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドいずれをも意味し、「核酸」とはＤＮＡ又はＲＮＡいずれをも意味する。
本オリゴヌクレオチドは、Nelsonのホームページ（http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html）に登録されているP450スーパーファミリーのCYP153Aに属するもの３つ、すなわち、CYP153A1（accession no. AJ311718）、CYP153A2（accession no. AE005680）、CYP153A13a（配列番号５７）のアミノ酸配列に基づいて設計されたものである。すなわち、本オリゴヌクレオチドは、これらの配列のアライメントによって予測されたP450の保存領域に基づいて設計されたものである。
また、本オリゴヌクレオチドは、プライマーとして実質的な機能を有するように設計される。本発明において「プライマーとして実質的な機能を有する」とは、特異的なアニーリング又はハイブイダイズが可能な条件を満たす、例えば特異的なアニーリングまたはハイブリダイズが可能な長さ及び塩基組成（融解温度）を有する、という意味である。すなわち、本オリゴヌクレオチドは、その配列の長さが短いために又はその塩基組成が適切ではないために非特異的なアニーリングを頻繁に引き起こし、P450の特異的な増幅に使用できないオリゴヌクレオチドを排除することを意味するものである。本オリゴヌクレオチドがプライマーとして実質的な機能を有する長さとしては、好ましくは10塩基以上であり、さらに好ましくは16塩基以上であり、最も好ましくは18塩基以上である。好適な本オリゴヌクレオチドの具体例としては、配列番号５３〜５６記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを例示することができる。
また、本オリゴヌクレオチドには、後述するハイブリッド遺伝子の作製のために、5’末端にアッセンブリー配列が付加されていてもよい。アッセンブリー配列とは、既知P450遺伝子断片とアニーリングすることができる配列のことである。本オリゴヌクレオチドをフォワードプライマー及びリバースプライマーとして用いて増幅されたP450遺伝子断片は、フォワードプライマーとリバースプライマーで挟まれた領域の配列しか有していない。すなわち開始コドンを含む5’末端の配列と終始コドンを含む3’末端の配列が欠けている。この欠けている配列は、既知のP450遺伝子の5’末端断片及び3’末端断片とアニーリングさせ、伸長反応を行うことにより補うことができる。このとき既知P450遺伝子の5’末端断片又は3’末端断片とのアニーリングに供される配列がアッセンブリー配列である。本オリゴヌクレオチドがフォワードプライマーとして使用される場合には、アッセンブリー配列は、通常既知5’末端断片の3’末端配列となる。また本オリゴヌクレオチドがリバースプライマーとして使用される場合には、アッセンブリー配列は、通常既知3’末端断片の5’末端配列となる。本オリゴヌクレオチドには、このアッセンブリー配列が付加されたものも含まれる。
付加されるアッセンブリー配列の長さは既知5’末端断片または3’末端断片とのアニーリングが可能であり、かつ核酸増幅反応の妨げにならない長さであればよい。好ましくは５〜50塩基であり、さらに好ましくは10〜20塩基である。
本オリゴヌクレオチドは、ホスファイト法やホスホトリエステル法等の当業者に公知の方法に従って合成することができる。
（２）新規P450遺伝子断片の単離
新規P450遺伝子断片の単離は、「（１）P450遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチドの作製」の項に記載のオリゴヌクレオチドを用いて行うことができる。通常は、本オリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅反応を行うことにより、新規P450遺伝子断片を単離することができる（以下、「本単離法」という）。
本単離法において、新規P450遺伝子断片の単離を行う対象となる試料は、原核生物由来の核酸が含まれていると思われるものであればどのようなものでもよい。試料の例としては、微生物を人工的に培養した培養物の他、未知の微生物が雑多に含まれている環境由来の試料等が挙げられる。環境由来の試料の例としては、例えば、海水、淡水、土壌等が挙げられる。本単離法においては、通常、試料から核酸の抽出を行う。抽出する核酸は、DNA又はRNAのいずれでもよい。DNA又はRNAは、当技術分野で周知の方法を適宜使用して抽出することができる。例えば、DNAを抽出する場合には、フェノール抽出及びエタノール沈殿を行う方法、ガラスビーズを用いる方法など、またRNAを抽出する場合には、グアニジン−塩化セシウム超遠心法、ホットフェノール法、又はチオシアン酸グアジニウム−フェノール−クロロホルム（AGPC）法などを利用することができる。また、試料が海水、淡水等の液体である場合には、核酸の抽出作業を行う前に、試料の濃縮作業を行うことが望ましい。試料の濃縮は、適当な孔径のフィルターで試料をろ過することにより行うことができる。ろ過に使用するフィルターの材質は、フィルターに一般的に使用されるものであれば特に限定されないが、例えば、セルロースアセテート、ニトロセルロース、セルロース混合エステル、ポリビニリデンジフロライド、ポリテトラフルオロエチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、銀等が例示される。また、培地を含浸させた担体を水中に設置し、担体に付着した微生物由来を効率よく回収する手法も考案されている。（特開2003-334064）。以上のようにして回収した試料からは、必要に応じてSDS等の界面活性剤等で細胞を破壊した後、上記記載の適当な方法で核酸を抽出することができる。
また、試料が土壌である場合にも、当業者に公知の技術によって、核酸を抽出することができる。土壌から核酸を抽出する方法としては、例えば、Zhouらの方法（Zhou et al  Appl. Environ. Microbiol. 62: 316-322 (1996)）やGriffithsらの方法（Griffiths. Appl. Environ. Microbiol. 66: 5488-5491 (2000)）を挙げることができる。
上記のように抽出した核酸から、「（１）P450遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチドの作製」の項に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることにより、P450遺伝子断片を単離することができる。上記のように抽出した核酸を鋳型とし、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて核酸増幅反応を行うことにより、P450遺伝子断片を特異的に増幅することができる。通常、配列番号51記載のアミノ酸配列に基づいて設計された本オリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして使用し、配列番号52記載のアミノ酸配列に基づいて設計された本オリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして使用する。なお、核酸増幅反応においてプライマーとして使用する本オリゴヌクレオチドは、縮重プライマー（degenerated primer）であってもよい。核酸増幅反応を行う手法は、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅反応を行うことができる方法であれば特に限定されないが、最も適した方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法の原理を利用した公知の方法を挙げることができる。増幅は、増幅産物が検出可能なレベルになるまで行う。例えば、PCR法は、DNAを鋳型として、DNAポリメラーゼにより、一対のプライマー間の塩基配列を合成するものである。PCR法によれば、変性、アニーリング及び合成からなるサイクルを繰り返すことによって、増幅断片を指数関数的に増幅させることができる。PCRの最適条件は、当業者であれば容易に決定することができる。またRT-PCR法では、まず、RNAを鋳型として、逆転写酵素反応によりcDNAを作製し、その後、作製したcDNAを鋳型として一対のプライマーを用いてPCR法を行うものである。本オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた場合において、P450遺伝子の特異的な増幅が起こるような条件は、プライマーとして用いた本オリゴヌクレオチドの長さ及び塩基組成から、当業者であれば適宜設定することができる。増幅されたP450遺伝子断片は、アガロースゲル電気泳動等によって分画し、増幅の確認されたバンドを切り出して、DNAを抽出することによって得ることができる。
（３）ハイブリッドP450遺伝子の作製方法
「（２）新規P450遺伝子断片の単離」記載の方法で増幅されたP450遺伝子断片は、本オリゴヌクレオチドとアニーリングする領域に挟まれた領域の配列しか含まない。すなわち、開始コドンを含む5'末端領域及び終止コドンを含む3'末端領域は含まれていない。そのため、（２）記載の方法で増幅されたP450遺伝子断片では、P450遺伝子としての機能を持たない場合がある。この問題を解決し、P450遺伝子として機能するDNA断片を得るためには、（２）記載の方法で増幅されたP450遺伝子断片の両端を既知のP450遺伝子の配列で補えばよい。両端部の補充に使用する既知P450遺伝子は、これまでに公知となっている細菌由来のP450遺伝子であれば、どのようなものでもよいが、配列番号５1及び５２記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでいることが好ましい。そのようなP450遺伝子の例としては、Nelson博士のホームページ（http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html）に登録されているP450スーパーファミリーのCYP153Aに属する遺伝子を挙げることができる。
（２）記載の方法で増幅されたP450遺伝子断片の両端部を既知のP450遺伝子の配列で補うことにより、中央部が未知P450遺伝子の塩基配列であり、両末端部が既知P450伝子の塩基配列であるハイブリッド遺伝子を作製することができる。このハイブリッドP450遺伝子は、適当な宿主に導入することにより、P450を生産することが可能である。該P450遺伝子は、（２）記載の方法でP450遺伝子断片の増幅を行った後、既知P450遺伝子の5'末端領域（開始コドンから（２）記載の増幅法で使用されたフォワードプライマーとアニーリングする領域まで：以下、「5-armフラグメント」という）と、3'末端領域（（２）記載の増幅法で使用されたリバースプライマーとアニーリングする領域から終始コドンまで：以下、「3-armフラグメント」という）とアニーリングさせた後、伸長反応を行うことによって得ることができる。
ハイブリッドP450遺伝子を得る場合に使用するプライマーは、「（１）P450遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチド」の項で記載したアセンブリー配列を付加されたものでもよい。アッセンブリー配列を付加されたプライマーを使用することにより、増幅されたP450遺伝子断片と5-armフラグメント及び3-armフラグメントとのアニーリング効率を高めることができる。5-armフラグメント及び3-armフラグメントは、両端部を補う既知P450遺伝子を含むDNAを鋳型として核酸増幅反応を行うことにより作製することができる。プライマーの設計及び合成は、当業者に公知の知見に基づいて行うことができる。また、増幅反応の反応条件は、使用するプライマーの長さ及び塩基組成に基づき、当業者に公知の知見により設定することができる。（２）記載の増幅反応により増幅されたP450遺伝子断片と5-armフラグメント及び3-armフラグメントとのアニーリング反応、及びそれに続く伸長反応によって得られたハイブリッドP450遺伝子は、引き続き核酸増幅反応を行うことによって増幅することができる。増幅反応のプライマーには、5-armフラグメント及び3-armフラグメントをそのままプライマーとして用いることもできるが、5-armフラグメントの開始コドンを含む領域、及び3-armフラグメントの終始コドンを含む領域の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして加えた方が好ましい。プライマーの設計及び合成は、当業者に公知の知見に基づいて行うことができる。また、増幅反応の反応条件は、使用するプライマーの長さ及び塩基組成に基づき、当業者に公知の知見により設定することができる。増幅されたハイブリッドP450遺伝子は、アガロースゲル電気泳動法等によって核酸断片を分画し、増幅の確認されたバンドを切り出してDNAを抽出することにより単離することができる。
（２）記載の方法によって得られたP450遺伝子断片及び上述した方法によって得られたハイブリッド遺伝子が、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質、すなわちP450コードする遺伝子であるかどうかは塩基配列から推定されるアミノ酸配列にFXXGXR/HXCXG という共通配列がC末端から５０〜６０残基手前に存在するかどうかを調べることで確認することができる。また、得られた核酸断片を含む発現ベクターを適当な宿主に導入し、宿主の培養菌体又は宿主菌体の細胞を破砕した粗抽出液を用いてCO差スペクトル及びモノオキシゲナーゼ活性の有無を調べることでも確認することができる。
発現ベクターの作製、宿主の選択及び宿主への発現ベクターの導入は、多くの実験書に記載されているので（たとえば、Sambrook, J., Russel,D. W., Molecular Cloning  A Laboratory Manual, 3rd Edition, CSHL Press, 2001）、それらに従った公知の遺伝子工学的手法により行うことができる。
宿主に導入する発現ベクターには、ファージ、ファージミドベクター又はプラスミドベクターを用いることができる。また、宿主は、発現ベクターが機能するものであれば真核細胞でも原核細胞でも特に限定されず、動物細胞、酵母細胞、放線菌、細菌細胞等を使用することができる。細菌細胞の中で好適なものとしては、大腸菌、枯草菌等が挙げられる。また、発現ベクターは、挿入した遺伝子断片又はハイブリッド遺伝子の上流に、プロモーター等の発現調節領域を有している必要がある。そのような発現調節領域の例としては、例えば大腸菌を宿主として使用した場合には、lacプロモーター等が挙げられる。発現ベクターを導入した宿主は、宿主に応じた適当な培地で培養し、得られた菌体又は菌体を破砕した粗抽出液を用いてCO差スペクトル及びモノオキシゲナーゼ活性の測定を行えばよい。CO差スペクトルの測定は、粗抽出液を亜二チオン酸ナトリウム（Na2S2O4）で処理し、一酸化炭素を通気した後、吸光スペクトルを測定し、450 nmに極大をもつ差スペクトルを観察することで行うことができる。モノオキシゲナーゼ活性の測定は基質となる低分子の有機化合物の存在下において、P450遺伝子断片又はハイブリッド遺伝子、及び電子伝達タンパク質遺伝子を含む発現ベクターが発現する条件で宿主細胞を培養するか、P450遺伝子断片又はハイブリッド遺伝子、及び電子伝達タンパク質遺伝子を含む発現ベクターを発現させて培養した宿主細胞の粗抽出液を反応させ、基質の酸化が起こるかどうかを調べることにより行うことができる。
上記の方法によって、クローンの培養菌体からDNAを抽出することにより、P450遺伝子断片又はP450ハイブリッド遺伝子を得ることができる。
４．P450遺伝子単離用キット
本発明のP450遺伝子単離用キット（以下、「本キット」という）は、「３．カセットPCR法」の項に記載のハイブリッドP450遺伝子を単離するためのものである。本キットは、少なくとも、「３．カセットPCR法」の項に記載のオリゴヌクレオチドと、5-armフラグメント及び3-armフラグメントを含むことを特徴としている。
（１）一段階目の核酸増幅反応用プライマー
「３．カセットPCR法」の項に記載したように、ハイブリッドP450遺伝子を増幅するためには、二段階の核酸増幅反応を行う必要がある。一段階目の核酸増幅用プライマーには、「（１）P450遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチドの作製」の項に記載のオリゴヌクレオチドがフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使われる。具体的には、配列番号５１記載のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして使用し、配列番号５２記載のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして使用する。本キットは、これらのフォワードプライマー及びリバースプライマーを少なくとも一組含むことを特徴としている。これらのフォワードプライマー及びリバースプライマーは縮重プライマー（degenerated primer）であってもよい。
本キットに含まれるプライマーにはアッセンブリー配列が付加されていてもよい。
（２）5-armフラグメント及び3-armフラグメント
本キットは、「３．カセットPCR法」の項に記載した5-armフラグメント及び3-armフラグメントを含むことを特徴としている。5-armフラグメントは、既知P450遺伝子において、少なくとも、開始コドンから配列番号５１記載のアミノ酸配列をコードする領域までを含む核酸断片である。また、3-armフラグメントは、既知P450遺伝子において、少なくとも、配列番号５２記載のアミノ酸配列をコードする領域から終始コドンまでを含む核酸断片である。なお、「（１）一段階目の核酸増幅反応用プライマー」の項に記載したプライマーが、アッセンブリー配列を付加されているものである場合には、必ずしも配列番号５１又は５２記載のアミノ酸配列をコードする領域を含んでいる必要はない。5-armフラグメント及び3-armフラグメントの基となる既知P450遺伝子は、細菌由来のものであればどのようなものでも構わないが、配列番号５１及び５２記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでいることが好ましい。5-armフラグメント及び3-armフラグメントは、一本鎖DNAであってもよいし、二本鎖DNAであってもよい。
（３）その他の成分
本キットは、核酸増幅反応用のバッファー、dNTP混合物、酵素類（DNAポリメラーゼ等）等を含んでいてもよい。また、二段階目の核酸増幅反応のために、5-armフラグメントの開始コドンを含む領域に基づいて設計されたフォワードプライマーと、3-armフラグメントの終始コドンを含む領域に基づいて設計されたリバースプライマーを含んでいてもよい。
５．新規P450遺伝子
本発明の新規P450遺伝子（以下、「本P450遺伝子」）は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である。
（ａ）配列番号１〜２５又は配列番号８５のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１〜２５又は配列番号８５のいずれかのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつP450として機能するタンパク質
配列番号８５以外の（ａ）のタンパク質は、「３．カセットPCR法」の「（３）ハイブリッドP450遺伝子の作製方法」の項に記載された方法により、環境サンプルから抽出したDNAを基に作製されたハイブリッドP450遺伝子が生産するタンパク質である。配列番号８５のタンパク質は、グラム陽性細菌であるノカルディア科Hou_Blue株より単離された新規の遺伝子（配列番号８６）によりコードされるタンパク質である。（ａ）のタンパク質をコードする遺伝子の具体的な例としては、配列番号２６〜５０又は配列番号８６のいずれかの塩基配列で表される遺伝子が挙げられる
（ｂ）のタンパク質は、（ａ）のタンパク質に、P450としての機能を失わせない程度のアミノ酸変異が導入されたタンパク質である。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。人為的変異を生じさせる手段としては、部位特異的変異誘発法（Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982）などを挙げることができるが、これに限定されるわけではない。変異したアミノ酸の数は、モノオキシゲナーゼ活性を失わせない限り、その個数は制限されないが、好ましくは２０アミノ酸以内であり、更に好ましくは１０アミノ酸以内である。
なお、本P450遺伝子は、「３．カセットPCR法」の「（３）ハイブリッドP450遺伝子の作製方法」の項に記載された方法において、両末端を補う既知遺伝子として配列番号５７記載のアミノ酸配列をコードするアルカニボラックス・ボルクメンシス（Alcanivorax borkumensis）SK2株からクローニングしたCYP153A13a遺伝子を使用している。
本P450遺伝子は、以下に述べる方法によって得ることができる。まず、環境サンプル抽出DNAに由来する中央部の配列を公知のDNA合成法によって合成する。次に、アルカニボラックス・ボルクメンシスSK2から抽出したDNAを鋳型として、配列番号５４及び６１記載の塩基配列で表されるプライマーのセット、又は配列番号５６及び６２記載の塩基配列で表されるプライマーのセットを用いて核酸増幅反応を行い、5-armフラグメント及び3-armフラグメントを増幅する。次に、合成した中央部の配列と5-armフラグメント及び3-armフラグメントをアニーリングさせて伸長反応を行う。その後、配列番号６１及び６２記載の塩基配列で表されるプライマーのセットを用いて核酸増幅反応を行うことにより、本P450遺伝子を増幅することができる。増幅された本P450遺伝子は、アガロースゲル電気泳動法等によって分画し、1.4Kbp付近に分画されたバンドを切り出すことにより得ることができる。
上記のような方法によって得られたDNA断片は、チェーンターミネーター法やマキサム−ギルバート法等の公知の方法に従って塩基配列を決定することにより、本P450遺伝子であることを確認することができる。
なお、本P450遺伝子は、上述した方法だけでなく、塩基配列情報に基づいて化学合成することによっても取得できる。
６．新規P450
本発明の新規P450は、以下の（ａ）又は（ｂ）で示されるタンパク質である。
（ａ）配列番号１〜２５又は配列番号８５のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１〜２５又は配列番号８５のいずれかのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつP450として機能するタンパク質
本発明の新規P450は、「５．新規P450遺伝子」の項で記載した本P450遺伝子を含む発現ベクターを適当な宿主細胞に導入し、培地で培養することによって得ることができる。発現ベクターの作製及び宿主細胞への導入は、既に述べた通り、公知の方法に従って行うことができる。かくして得られる本発明の新規P450は、宿主の培養菌体を破砕した後、通常の方法に従って、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、ゲルパーミネーションクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の蛋白質精製、蛋白質製造の分野で汎用されている方法に従って精製を行うことができる。これらのクロマトグラフィーにおけるP450画分の選択は、CO差スペクトルの有無を目安に行うことができる。
７．P450による酸化化合物の生産
本P450は、触媒として使用することにより、酸化化合物を生産することが可能である（以下、「本生産法」という）。酸化化合物の生産方法としては、本P450遺伝子を含む発現ベクターを導入した宿主細胞によって生産する方法と精製したP450によって生産する方法が挙げられる。
いずれの方法においても、P450により酸化反応を触媒するには一般的に電子伝達タンパク質の介在が必要となる。細菌の場合は、フェレドキシンとフェレドキシンレダクターゼが電子伝達タンパク質として使われることが多い。宿主細胞によって酸化化合物を生産する場合は、電子伝達タンパク質をコードする遺伝子を共発現させるか、電子伝達タンパク質とP450との融合タンパク質遺伝子として発現させることが望ましいが、宿主細胞に由来する電子伝達タンパク質を利用しても良い。精製したP450によって酸化化合物を生産する場合は、電子伝達タンパク質と、NAD(P)Hを添加しP450と共存させることが望ましい。
本生産法の基質となる化合物は、P450の基質として反応可能ないずれの化合物でもよい。本生産法によれば、例えば、アルカンからアルコールを、さらにアルケンからエポキシドを生産することができる。
また、精製酵素を使用した場合の本生産法は、溶液中にて行うことができるほか、精製した本P450を適当な担体に固定化し、基質と接触させることによっても行うことができる。本P450を固定化できる担体は、特に限定されないが、例えば、ガラスビーズ、シリカゲル等の無機担体、セルロース、キトサン、セファロース、デキストラン、ポリピニルアルコール、エチレン・酢酸ビニル共重合体、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレン、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストラン等の有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる複合担体等が挙げられる。また、担体表面には、P450の固定化反応に用い得る官能基が存在することが好都合である。これらの官能基の代表例としては、水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基、シラノール基、エポキシ基、アミド基、ハロゲン基、サクシニルイミド基、酸無水物基等が挙げられる。
上記担体へのP450の固定化においては、蛋白質の立体障害を小さくすることにより吸着効率を向上させ、さらには非特異的吸着を抑えるために、親水性スペーサーを介して固定化することが好ましい。親水性スペーサーとしては、例えば、両末端をカルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等で置換した適当な有機分子を用いることができる。
８．新規融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼ
融合型P450モノオキシゲナーゼが最近報告された（Roberts, G.A., et al, Identification of a new class of cytochrome P450 from a Rhodococcus sp. J. Bacteriol. 184: 3898-3908, 2002）。これはロドコッカス（Rhodococcus）属NCIMB9784株より単離されたP450モノオキシゲナーゼ（「P450RhF」と命名された）であり、P450本体タンパク質（ヘムドメイン）、フラビンモノヌクレオチド（FMN）を補酵素として分子内に含有するNADH-P450還元酵素ドメイン（フェレドキシン還元酵素様配列）、鉄イオウタンパク質ドメイン（フェレドキシン様配列）が1本のポリペプチドとして繋がったものである。
本発明の融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼは、このP450RhFに含まれる還元酵素ドメインと同様の機能を持つペプチドをP450本体タンパク質のC末端側に、リンカー部分を介して、付加してなるものである。
P450RhFに含まれる還元酵素ドメインと同様の機能を持つペプチドとしては、（ａ）配列番号７０記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｂ）配列番号７０記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるペプチド、又は（ｃ）配列番号６９記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするペプチドなどを例示できる。
（ａ）のペプチドは、P450RhFにおける還元酵素ドメイン（NADH-P450還元酵素ドメインと鉄イオウタンパク質ドメインを含んだ領域）のペプチドである。
（ｂ）のペプチドは、（ａ）のペプチドに、（ａ）のペプチドの機能を失わせない程度のアミノ酸変異が導入されたペプチドである。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。人為的変異を生じさせる手段としては、部位特異的変異誘発法（Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982）などを挙げることができるが、これに限定されるわけではない。変異したアミノ酸の数は、（ａ）のペプチドの機能を失わせない限り、その個数は制限されないが、好ましくは２０アミノ酸以内であり、更に好ましくは１０アミノ酸以内である。
（ｃ）のペプチドは、DNA同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる（ａ）のペプチドと同様の機能を持つペプチドである。（ｃ）のペプチドにおける「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」程度であり、好ましくは「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」程度であり、更に好ましくは「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」程度である。ハイブリダイゼーションにより得られるDNAは、元のDNAと通常高い相同性を有する。高い相同性とは、60％以上の相同性、好ましくは75％以上の相同性、更に好ましくは90％以上の相同性を指す。
リンカー部分は、融合させる二つのタンパク質（ペプチド）の機能を失わせないものであればどのようなものでもよいが、（ｄ）配列番号６８記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｅ）配列番号６８記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるペプチド、又は（ｆ）配列番号６７記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするペプチドであることが好ましい。
（ｄ）のペプチドは、P450RhFのP450本体部分と、還元酵素ドメインとの間に存在するペプチドである。
（ｅ）のペプチドは、（ｄ）のペプチドに、リンカーとしての機能を失わせない程度のアミノ酸変異が導入されたペプチドである。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。人為的変異を生じさせる手段としては、部位特異的変異誘発法（Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982）などを挙げることができるが、これに限定されるわけではない。変異したアミノ酸の数は、リンカーとしての機能を失わせない限り、その個数は制限されないが、好ましくは５アミノ酸以内であり、更に好ましくは３アミノ酸以内であり、最も好ましくは１アミノ酸である。
（ｆ）のペプチドは、DNA同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる（ｄ）のペプチドと同様の機能を持つペプチドである。（ｆ）のペプチドにおける「ストリンジェントな条件」の意味は、（ｃ）のペプチドの場合と同じである。
使用するP450本体タンパク質に特に制限はなく、たとえば、細菌のゲノムDNAライブラリーや環境より抽出したDNAなどからPCR 法等の通常の方法を用いて単離してきたDNAから生産されるタンパク質や既存のP450に対してPCRによる無作為変異導入法やDNAシャフリング法などにより変異を導入した遺伝子やハイブリッド遺伝子などから生産されるタンパク質を使用できる。P450本体タンパク質は、細菌、植物、動物のいずれに由来するものを使ってもよいが、特に細菌由来のものを使用するのが好ましい。細菌由来のP450本体タンパク質としては、アシネトバクター・カルコアセツカム由来のP450本体タンパク質を例示できる。また、P450本体タンパク質としては、「６．新規P450」の項に記載のタンパク質を使用してもよい。
９．融合型P450モノオキシゲナーゼによる酸化化合物の生産
「８．新規融合型P450モノオキシゲナーゼ」の項に記載したタンパク質は、触媒として使用することにより酸化化合物を生産することが可能である。酸化化合物の生産方法としては、本融合型P450モノオキシゲナーゼ遺伝子を含む発現ベクターを導入した宿主細胞によって生産する方法と精製した本融合型P450モノオキシゲナーゼによって生産する方法が挙げられる。
いずれの方法においても、本融合型P450モノオキシゲナーゼはそれ自身の中に電子伝達タンパク質を有しているので、フェレドキシンやフェレドキシン還元酵素（レダクターゼ）といった電子伝達タンパク質の介在を必要としない。したがって、宿主細胞によって酸化化合物を生産する場合は、電子伝達タンパク質をコードする遺伝子を共発現させる必要はない。また、精製した本融合型P450モノオキシゲナーゼによって酸化化合物を生産する場合は、新たに電子伝達タンパク質を共存させる必要は無い。なお、この融合型P450モノオキシゲナーゼを精製する場合は、「７．P450による酸化化合物の生産」の項に記載した方法と同様の方法により行うことができる。
本生産法の基質となる有機化合物は、P450の基質として反応可能ないずれの化合物でもよい。本生産法によれば、例えば、アルカン（直鎖状炭化水素）、アルケン（不飽和結合を含む直鎖状炭化水素）、環状炭化水素、及び、分子内に芳香環を含むアルカンやアルケンなどの有機化合物を基質として、末端メチル基の水酸化体や末端オレフィンのエポキシ体等の酸化化合物を生産することができる。具体的には、n-へキサン、n-へプタン、n-オクタン、n-デカン、1-オクテン、シクロヘキサン、n-ブチルベンゼン、4-フェニル-1-ブテン、又は2-n-ブチルベンゾフランからそれぞれ1-ヘキサノール、1-ヘプタノール、1-オクタノール、1-デカノール、1,2-エポキシオクタン、シクロヘキサノール、4-フェニル-1-ブタノール、2-フェネチルオキシラン、又は4-ベンゾフラン-2-イル-ブタン-1-オールを生産することができる。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例により本発明について具体的に説明する。もっとも、本発明はこれにより限定されるものではない。
〔実施例１〕環境由来DNAの調製
多様な環境由来のDNAからP450遺伝子を獲得するため以下の環境由来サンプルからDNAを抽出した。
１．ポナペ・パラオ海域サンプル
培地を含浸させた担体を海水中に設置し、担体に付着した微生物由来のDNAを効率よく回収する手法が考案されている（特開2003-334064号公報）。今回、NSW培地（0.1% NH4NO3、0.002% クエン酸第二鉄、0.002% K2HPO4、0.05% 酵母抽出液、80%  濾過海水、1.5%  寒天）に滅菌済みの人工スポンジを入れ、培地を含ませた後、培地中の寒天を凝固させた人工スポンジを作製し、この人工スポンジをミクロネシア連邦共和国ポナペ州沿岸、パラオ共和国沿岸の海底5〜6 mの位置に設置した。設置した人工スポンジは3日後に引き上げて、微生物が付着した人工スポンジの小片を凍結後粉砕し、人工スポンジに付着した微生物からDneasy Plant Kit（キアゲン社製）を用いてDNAを回収した。
２．淡水サンプル
岩手県久慈市石油備蓄基地から地下水、また、北海道天塩郡豊富温泉から温泉水を回収し、フィルター（GV type: 0.22 μm、 47 mm、ミリポア社製）により水中の微生物を選択的に濃縮した。微生物を濃縮したフィルター1枚に対して5 mlの10 mM Tris-HCl バッファー(pH 8.0: 1 mM EDTA, 0.35 M sucrose)と10 mg/ml のプロテイナーゼＫ (10 mM Tris-HClに溶解)200 μlを加え、37℃で30分間インキュベートした。インキュベート後、激しく攪拌し細菌を懸濁させた。沈殿を除いた後にlysing solution (100 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0: 0.3 M NaCl, 20 mM EDTA, 2% sodium dodecyl sulfate) 7.5 ml を加え激しく攪拌した。さらに、10 ml のフェノール、クロロフォルム、イソミルアルコール50 : 4 9 : 1の溶液を加えた。５分後、遠心分離（5000  rpm, 15 min）を行い、上層を回収した。次に、2倍量の99％エタノールを添加し攪拌後、−80℃で2時間冷却した。その後、遠心分離（15000 rpm, 15 min）によりDNAを沈殿させ、冷却70％エタノールを加えて、さらに遠心分離（15000 rpm, 15  min）を行い沈殿画分としてDNAを回収した。
３．土壌サンプル
新潟県西山町の原油採掘井戸の油汚染土壌5 g に対して5 mlの10 mM Tris-HCl バッファー(pH 8.0: 1 mM EDTA, 0.35 M sucrose)と10 mg/ml のプロテイナーゼＫ (10 mM Tris-HClに溶解)200 μlを加え、37℃で30分間インキュベートした。インキュベート後、激しく攪拌し細菌を懸濁させた。沈殿を除いた後にlysing solution (100 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0: 0.3 M NaCl, 20 mM EDTA, 2% sodium dodecyl sulfate) 7.5 ml を加え激しく攪拌した。さらに、10 ml のフェノール、クロロフォルム、イソミルアルコール50 : 4 9 : 1の溶液を加えた。５分後、遠心分離（5000  rpm, 15 min）を行い、上層を回収した。次に、2倍量の99％エタノールを添加し攪拌後、−80℃で2時間冷却した。その後、遠心分離（15000 rpm, 15 min）によりDNAを沈殿させ、冷却70％エタノールを加えて、さらに遠心分離（15000 rpm, 15  min）を行い沈殿画分としてDNAを回収した。
〔実施例２〕PCRプライマーの設計
本発明者は、報告されているP450スーパーファミリーのCYP153Aサブファミリーに属するもの３つ、すなわち、CYP153A1（accession no. AJ311718）、CYP153A2（accession no. AE005680）、CYP153A13a（配列番号５８）のアミノ酸配列をアライメントした際に、２ヶ所の保存領域、すなわち、MFIAMDPP（N末側）、HRCMGNRL（C末側）があることを見出した。そこで、この２つの保存領域のアミノ酸配列（MFIAMDPP、HRCMGNRL）に基づいて４種類のプライマーを設計した。設計したプライマーは、保存アミノ酸配列MFIAMDPP側（N末側）（配列番号５１）として5’- ATGTTYATHGCNATGGAYCCNC-3’（配列番号５３）とその相補鎖である5’-GNGGRTCCATNGCDATRAACAT-3’（配列番号５４）であり、保存アミノ酸配列HRCMGNRL側（C末側）（配列番号５２）として5’- NARNCKRTTNCCCATRCANCKRTG-3’（配列番号５５）とその相補鎖である5’- CAYMGNTGYATGGGNAAYMGNYT-3’（配列番号５６）であった。プライマー配列中、YはCまたはT、HはA、CまたはT、NはA、T、G、またはC、RはAまたはG、DはA、GまたはT、KはGまたはT、MはAまたはCである。
〔実施例３〕P450遺伝子の増幅
実施例１で調製したDNAを鋳型とし、実施例２で設計したプライマーを用いてPCR法による増幅反応を行った。プライマーの組み合わせは配列番号５３のプライマーに対して配列番号５５のプライマーである。反応液はDNAポリメラーゼAmplitaq Gold（アプライドバイオシステムズ社製）0.5 unit、添付ポリメラーゼ用緩衝液5 μl、2 mM  dNTPを5  μl、50 pmol/μlの両プライマー各4 μl、各環境サンプルより調製したDNAを100 ng添加し、最後に滅菌水で調整し合計50 μlとした。反応は94℃、10分間 の熱変性後、94℃で30秒、58℃で45秒、72℃で1分を１サイクルとし、これを35サイクル行い、最後に72℃で10分間反応させた。増幅の確認は1.5％アガロースゲル電気泳動で行った。想定される長さ（約0.85 Kbp）のDNAをアガロースから切り出し、QIAquick Gel Extraction kit (キアゲン社製)により精製した。
〔実施例４〕アルカニボラックス・ボルクメンシスSK2株からのP450遺伝子の単離
本発明者は、アルカン資化性の海洋細菌アルカニボラックス・ボルクメンシス（Alcanivorax borkumensis）SK2株（DSM 11573株）からCYP153A13a（配列番号５８）を含むDNA断片を以下のようにして単離した。
最初に、長鎖のn-アルカン資化細菌であるアシネトバクター・カルコアセツカス（Acinetobacter calcoaceticus）EB104株のP450モノオキシゲナーゼの配列CYP153A1（accession no. AJ311718）をもとに２本のプライマー配列、配列番号59（5'-GCCGATGGAGTTTATGGGCAAT-3'）と配列番号60 (5'-GTACCACATCACCACCTTGTCGCC-3')を設計し、アルカニボラックス・ボルクメンシスSK2株より抽出したゲノムDNAをテンプレートにPCR法で増幅した。PCR Optimizer kit (インビトロゲン社製)により16種類のバッファーを用い、94℃で1分、55℃で2分、72℃で3分の条件で40サイクルの増幅を行った。また、増幅の確認は2%のアガロース電気泳動を行った。その結果、P450遺伝子断片（約250 bp）の増幅が確認された。そこで、増幅したP450遺伝子断片をプローブとしてハイブリダイゼーションによるP450モノオキシナーゼ遺伝子のクローニングを行った。最初に、アルカニボラックス・ボルクメンシス由来ゲノムDNAを制限酵素Sau3AIで部分分解し、コスミドベクターSuperCos 1のBamHI サイトに連結し、LAMBDA INN (和光純薬社製)を用いてファージ粒子にパッケージングした。そして、大腸菌XL1-Blue MR株に、そのファージを感染させ、抗生物質アンピシリンに耐性のコロニーをピックアップし、コスミドライブラリーを作製した。次に、AlkPhos Direct Labelling and Detection System（アマシャムバイオサイエンス社製）を用い、添付のプロトコールに従って、コロニーハイブリダイゼーションを行った。標識されたポジティブクローンを回収しAlkPhos Direct Labelling and Detection System（アマシャムバイオサイエンス社製）を用い、添付のプロトコールに従って、サザンハイブリダイゼーションを行った結果、P450モノオキシゲナーゼ遺伝子断片にハイブリダイズするバンドが検出された。そこで、得られたクローンのDNA配列の解析を行った結果、CYP153ファミリーに属するP450モノオキシゲナーゼ遺伝子（CYP153A13a：DNA配列を配列番号５８、アミノ酸配列を配列番号５７に示す。）全長のクローニングが確認された。
〔実施例５〕ハイブリッド遺伝子の作製
アルカニボラックス・ボルクメンシス（Alcanivorax borkumensis）SK2株よりクローニングしたCYP153A13a遺伝子（配列番号５８）から、開始コドンを含み、保存領域（アミノ酸配列MFIAMDPP）をコードする部位までのDNAフラグメント（以下「5-arm」とする）と第２の保存領域（アミノ酸配列HRCMGNRL）をコードする部位から終始コドンまでのDNAフラグメント（以下「3-arm」）をPCRによって増幅した。5-armについては次の通りPCRを行った。反応液はDNAポリメラーゼAmplitaq Gold（アプライドバイオシステムズ社製）0.5 unit、添付ポリメラーゼ用緩衝液5 μl、2mM  dNTPを5 μl、50 pmol/μlの配列番号６１（5’-CACCATGTCAACGAGTTCAAGTA-3’）と配列番号５４のプライマー各4 μlをCYP153A13a遺伝子がクローニングされたコスミドベクターを100 ng添加し、最後に滅菌水で調製し合計50μlとした。反応は94℃、10分間の熱変性後、94℃で30秒、58℃で45秒、72℃で1分を１サイクルとし、これを30サイクル行い、最後に72℃10分間反応させた。増幅の確認は1.5％アガロースゲル電気泳動で行った。3-armフラグメントについては、上記配列番号６１と５４の代わりに配列番号６２（5’-TGATTATTTTTTAGCCGTCAACT-3’）のプライマーと配列番号５６のプライマーを用いた。増幅の確認は1.5%アガロースゲル電気泳動で行った。想定される長さのDNAをアガロースから切り出し、QIAquick Gel Extraction kit (キアゲン社製)により精製した。続いて、実施例３で得られた環境サンプルから調製したDNAを基にしたPCR産物、および5-armと3-armフラグメントからPCRによりハイブリッド遺伝子を作製した。反応液はDNAポリメラーゼAmplitaq Gold（アプライドバイオシステムズ社製）0.5unit、添付ポリメラーゼ用緩衝液5μl、２ｍM  dNTPを5μl、50pmol/μlの配列番号６１と６２のプライマー各4 μl、実施例３で得られた環境サンプルから調製したDNAを基にしたPCR産物を20 ng、5-armフラグメント、3-armフラグメントを5 ng添加し、最後に滅菌水で調製し合計50μlとした。反応は94℃、10分間の熱変性後、94℃で30秒、58℃で45秒、72℃で1分を１サイクルとし、これを30サイクル行い、最後に72℃10分間反応させた。増幅の確認は1.5%アガロースゲル電気泳動で行った。想定される長さ(約1.4 Kbp)のDNAをアガロースから切り出し、QIAquick Gel Extraction kit (キアゲン社製)により精製した。精製したハイブリッド遺伝子はGATEWAYシステムpENTR Directional TOPO Cloning Kits（インビトロゲン社製）を用いてシーケンス用ベクター（pENTR/SD/D-TOPO）（インビトロゲン社製）へクローニングした。
〔実施例６〕DNA配列の解析
実施例５で得られたハイブリッド遺伝子の挿入されたプラスミドベクターを大腸菌（One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli インビトロゲン社製）に形質転換し、形質転換された大腸菌のコロニーをランダムに選抜し、LB液体培地(1% トリプトン、0.5% イーストイクストラクト、0.5% NaCl)に植え付け、プラスミドをQIAprep Spin Miniprep Kit  （キアゲン社製）で抽出した。次に、シーケンス反応をチェーンターミネーター法に基づくBig Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（アプライドサイエンス社製）を用いて行い、反応生成物の塩基配列をABI prism 3730 DNA Analyzerアプライドサイエンス社製）により解析することにより決定した。次に、得られた遺伝子配列の中から、推定されるアミノ酸配列のC末端から５０〜６０残基手前にFXXGXR/HXCXGというP450の共通配列が存在するものを選択した。同一な配列を除いたハイブリッド遺伝子のアミノ酸配列を配列番号１から２５、塩基配列を配列番号２６から５０に示す。
〔実施例７〕配列解析
実施例６で決定したハイブリッド化P450のアミノ酸配列（配列番号１から２５）と既知のP450のアミノ酸配列中の保存領域間（配列番号５１と５２）のアミノ酸配列を比較した。配列比較はアライメントソフトClustal W（Higgins, D. G., Thompson, J. D., and Gibson, T. J., Methods Enzymol. 266, 383-402, 1996）を用いて行った。既知のP450の配列はNCBIのBlast検索（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を行うことにより得た。配列比較の結果を図１には系統樹として示し、既知のCYP153Aサブファミリー4種との相同性を表１に示した。図１と表１の通り配列番号１から２５のアミノ酸配列中の保存領域間のアミノ酸配列は既知のP450のアミノ酸配列中の保存領域間の配列と異なる新規なものであることが示された。さらに、表１に示したように、ポナペ、パラオ海域、久慈地下水、北海道温泉水、新潟石油汚染土壌といった多様な環境サンプルから抽出した微生物由来のDNAを鋳型としてPCRを行うことにより新規のP450遺伝子を獲得できることが示された。【００４９】
【表１】
2006051729.tif 000002
〔実施例８〕ハイブリッド遺伝子の発現
実施例７で新規な配列であることが示されたハイブリッド遺伝子の３種類を大腸菌により発現させ、その機能性を確認した。３種類（配列番号４、５、９）のP450をコードする遺伝子を、GATEWAYシステムLR Clonase反応を用いることで、タンパク質発現用プラスミドベクター(pDEST14インビトロゲン社製)に挿入し、これを大腸菌DH5α株（インビトロゲン社製）に形質転換し、LB液体培地に植え付け、プラスミドをQIAprep Spin Miniprep Kit  （キアゲン社製）で抽出した。次に、得られたプラスミドを大腸菌BL21-AI株（インビトロゲン社製）に形質転換し、終濃度50 μg / mlのアンピシリン（和光純薬社製）が添加された5mlのLB液体培地に植え付け、一晩培養したのち、得られた培養液1 mlを終濃度50 μg / mlのアンピシリンが添加された100 mlのLB液体培地に植え継ぎ、37℃で培養し対数増殖期に達した時点で1 mM 5-アミノレブリン酸塩酸塩（和光純薬社製）、0.5  mM FeCl3を添加し、25℃で30分間培養後、0.2%アラビノース（和光純薬社製）を添加し引き続き培養した。（25℃16時間）培養終了後、遠心分離機により集菌し、２０％グリセロール（和光純薬社製）を含むPBS（phosphate-buffered saline; 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4 and 2.68 mM KCl）にけん濁し、超音波破砕機により菌体を破砕し遠心分離により得られた上清を粗抽出液とした。配列番号４をコードする遺伝子を挿入したプラスミドベクターを含む大腸菌から得られた粗抽出液を粗抽出液A、配列番号５をコードする遺伝子を挿入したプラスミドベクターを含む大腸菌から得られた粗抽出液を粗抽出液B、配列番号９をコードする遺伝子を挿入したプラスミドベクターを含む大腸菌から得られた粗抽出液を粗抽出液Cとした。
〔実施例９〕CO差スペクトル分析による機能解析
P450は亜二チオン酸ナトリウム（Na2S2O4）で処理し、一酸化炭素を通気すると吸収スペクトルが変化し450 nmに極大をもつ差スペクトルが現れることが知られている。そこで、実施例８で得られた粗抽出液A、粗抽出液Bおよび粗抽出液C 1 mlに対して一酸化炭素を１秒当たり数泡程度の速さで1分間通気を行った後、亜二チオン酸ナトリウムを2 mg加え混合し、5分間放置した後、吸光スペクトルを測定し、処理前の粗抽出液との間でスペクトルの比較を行った。図２に示したように粗抽出液A、B、C共に還元条件下で一酸化炭素通気処理による450 nmの吸光度の上昇が観察された。したがって、抽出液A、B、Cがいずれにおいても可溶性で機能的なP450の発現が確認されたことになり、３種類（配列番号４、５、９）のアミノ酸配列がP450として機能するタンパク質であることが示された。
〔実施例１０〕シュードモナス・プチダ由来のプチダレドキシンとプチダレドキシンレダクターゼの単離
一般的な微生物由来のP450と同様に、今回得られた新規P450が酸化反応を触媒するためには電子伝達タンパク質としてフェレドキシンレダクターゼ（ferredoxin reductase）とフェレドキシン（ferredoxin）の介在が必要であると考えられる。そこで、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のプチダレドキシン（putidaredoxin）とプチダレドキシンレダクターゼ（putidaredoxin reductase）を電子伝達タンパク質として活用することを考案し、それぞれの遺伝子のクローニングを行った。
プチダレドキシンにおいては、プチダレドキシンをコードする遺伝子（accession no. D00528）より制限酵素サイトを付加したプライマー（5’-CGTCTCCCATGTCTAAAGTAGTGTATGTGT-3’配列番号６３  、5’-CGTCTCATCGATTACCATTGCCTATCGGGA-3’ 配列番号６４）を設計し、シュードモナス・プチダ由来のゲノムDNAを鋳型としてPCR法で増幅した。反応液はDNAポリメラーゼAmplitaq Gold（アプライドバイオシステムズ社製）0.5 unit、添付ポリメラーゼ用緩衝液5 μl、2 mM  dNTPを5 μl、50 pmol/μlの両プライマー各4 μl、調製したDNAを100 ng添加し、最後に滅菌水で調整し合計50 μlとした。反応は94℃、10 minの熱変性後、94℃で30秒、58℃で45秒、72℃で1分を１サイクルとし、これを30サイクル行い、最後に72℃で10分間反応させた。増幅の確認は1.5％アガロースゲル電気泳動で行った。想定される長さのDNAをアガロースから切り出し、QIAquick Gel Extraction kit (キアゲン社製)により精製した。
プチダレドキシンレダクターゼにおいては、プチダレドキシンレダクターゼをコードする遺伝子（accession no. D00528 ）より制限酵素サイトを付加したプライマー（5’-CGTCTCCCATGAACGCAAACGACAACGTGG-3’配列番号65  、5’-CGTCTCATCGATCAGGCACTACTCAGTTCA-3’ 配列番号６６）を設計し、シュードモナス・プチダ由来のゲノムDNAを鋳型としてPCR法で増幅した。反応液はDNAポリメラーゼAmplitaq Gold（アプライドバイオシステムズ社製）0.5 unit、添付ポリメラーゼ用緩衝液5 μl、2 mM  dNTPを5 μl、50 pmol/μlの両プライマー各4 μl、調製したDNAを100 ng添加し、最後に滅菌水で調整し合計50 μlとした。反応は94℃、10 minの熱変性後、94℃で30秒、58℃で45秒、72℃で1分を１サイクルとし、これを30サイクル行い、最後に72℃で10分間反応させた。増幅の確認は1.5％アガロースゲル電気泳動で行った。想定される長さのDNAをアガロースから切り出し、QIAquick Gel Extraction kit (キアゲン社製)により精製した。
次に、PCRによって単離したプチダレドキシンとプチダレドキシンレダクターゼをコードする遺伝子全長を制限酵素BsmBIで処理した。次いで、タンパク質発現用ベクターpET-28a（ノバジェン社製）も制限酵素SalI およびNcoIで処理した。これらをライゲーション（Ligation High、東洋紡社製）後、大腸菌JM109株（宝酒造社製）に形質転換し、LB液体培地に植え付け、プラスミドをQIAprep Spin Miniprep Kit  （キアゲン社製）で抽出した。
〔実施例１１〕基質の酸化活性の観察
実施例９において可溶性で機能的なタンパク質発現が確認された新規なP450である３種類（配列番号４、５、９）の、基質に対する酸素添加活性を確認した。
実施例１０において単離したシュードモナス・プチダ由来プチダレドキシンの挿入したタンパク質発現用ベクターは大腸菌Rosseta DE3 株（ノバジェン社製）に形質転換し、シュードモナス・プチダ由来プチダレドキシンレダクターゼの挿入したタンパク質発現用ベクターは大腸菌BL21 DE3 pLysS株（ノバジェン社製）に形質転換し、それぞれを5mlのLB液体培地に植え付け、一晩培養した。次に、得られた培養液1 mlを、プチダレドキシンの挿入したタンパク質発現用ベクターを形質転換した菌株においては終濃度25 μg / mlのカナマイシンが添加された100 mlのTB液体培地(1.2% トリプトン、2.4% イーストイクストラクト、0.4% グリセロール、0.231% KH2PO4、1.254% K2HPO4)に、プチダレドキシンレダクターゼの挿入したタンパク質発現用ベクターを形質転換した菌株においては終濃度50 μg / mlのクロラムフェニコールと終濃度25 μg / mlのカナマイシンが添加された100 mlのTB液体培地にそれぞれ植え次いだ。それぞれの培養液を37℃で培養し対数増殖期に達した時点でIsopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)を終濃度0.5 mMになるように添加し引き続き培養した。（30℃16時間）培養終了後、遠心分離機により集菌し、２０％グリセロールを含むPBSにけん濁し、超音波破砕機により菌体を破砕し遠心分離により得られた上清を粗抽出液とした。それぞれの粗抽出液と新規なP450である３種類（配列番号４、５、９）を発現させた粗抽出液を等量ずつ混合し粗酵素液とした。配列番号4のP450と２種の電子伝達タンパク質の粗抽出液で構成される粗酵素液を粗酵素液A、配列番号5のP450と２種の電子伝達タンパク質の粗抽出液で構成される粗酵素液を粗酵素液B、配列番号9のP450と２種の電子伝達タンパク質の粗抽出液で構成される粗酵素液を粗酵素液C、２種の電子伝達タンパク質の粗抽出液のみで構成される粗酵素液を粗酵素液Dとし酵素反応に使用した。酵素反応は、それぞれの酵素反応液に終濃度1 mMになるように基質を添加した後、25℃10分間放置し、終濃度5 mMになるようにNADPを添加して酵素反応を開始した。なお、基質としては、オクタン、デカン、１-デセンを使用した。25℃12時間の反応の後、終濃度0.2 Nになるように塩酸を添加し、酵素反応を停止した。次に、酵素反応後の粗酵素液に酢酸エチルを添加し、ガスクロマトグラフィー質量分析計(GCMS-QP5050A 島津製作所社製)により粗酵素液の酢酸エチル抽出画分の成分分析を行うことで、各基質の酸化物の有無を観察した。
最初に、粗酵素液B、Dによるオクタン、1-デセンを基質とした酵素反応の後、反応液から酢酸エチルにより抽出した画分の分析結果を図３に示す。オクタンを基質とした場合、粗酵素液Bから抽出した画分ではオクタンの酸化物である1-オクタノール及びオクタン酸が検出された。一方、P450が含まれていない粗酵素液Dにおいてはオクタンの酸化物は検出されなかった。また1-デセンを基質とした場合、粗酵素液Bから抽出した画分ではオクタンの酸化物である1,2-エポキシデカン及び1,2-デカンジオールが検出された。一方、P450が含まれていない粗酵素液Dにおいては1-デセンの酸化物は検出されなかった。したがって、粗酵素液Bに含まれる今回獲得された新規なP450（配列番号５）がオクタンや1-デセンといった有機化合物の酸化反応を触媒する活性を有することが明らかとなった。
次にオクタン、デカン、１-デセンを基質として反応を行った後の粗酵素液A、B、CおよびDを分析した結果、検出した基質の酸化物を表２に示す。【００５０】
【表２】
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粗酵素液A、B、Cから抽出した画分ではオクタンの酸化物が検出され、各粗酵素液に含まれる新規なP450の３種類（配列番号４、５、９）がすべて酸素添加活性を保持していることが示された。また獲得した新規のP450の中にはオクタン、デカンといった鎖長の異なるアルカンの酸化反応や、エポキシ化反応を触媒する反応を有するものが存在していることが明らかとなった。
〔実施例１２〕  RhF還元酵素ドメインを有する融合タンパク質生産用プラスミドの構築
獲得したP450ハイブリッド遺伝子の種々の基質に対する酸化能を、大腸菌を宿主とした生変換反応により簡便に観察できるように、P450と電子伝達タンパク質（還元酵素ドメイン）との融合タンパク作製用発現プラスミドの構築を行った。
P450本体タンパク質部分（ヘムドメイン）と還元酵素ドメインが融合して１本のポリペプチド鎖として存在する融合型P450モノオキシゲナーゼ（P450RhF）遺伝子がロドコッカス属細菌NCIMB9784株から単離されている(非特許文献８)。そこで、ロドコッカス（Rhdococcus sp.）NCIMB9784株由来P450RhFのリンカー配列（塩基配列を配列番号６７、アミノ酸配列を配列番号６８に示す。）とそれに続く還元酵素ドメイン(塩基配列を配列番号６９、アミノ酸配列を配列番号７０に示す。) をコードする遺伝子を含むDNA断片1.0 kbを、ゲノムDNAから制限酵素部位を付加したプライマー (5'- GGGAATTCgtgctgcaccgccatcaaccg-3’、配列番号７１) と（5’- gggagctctcagaggcgcagggccaggcg -3'、配列番号７２）を用いてPCRにより増幅した。得られた1.0 kbのDNA断片は、EcoRIとSacIで切断後、大腸菌ベクターpET21a（ノバジェン社）のEcoRI-SacI部位に挿入した。以下、このプラスミドをpREDと呼ぶ。pREDのマップは図４に示されている。
〔実施例１３〕  ハイブリッドP450とRhF還元酵素ドメインとの人工融合酵素化
獲得したP450ハイブリッド遺伝子の種々の基質に対する酸化能を、大腸菌を宿主とした生変換反応により観察するべく、融合タンパク質生産用プラスミドベクターpREDにP450ハイブリット遺伝子を挿入することで、ハイブリッドP450の人工融合酵素化を行った。本融合タンパク質は、ハイブリッドP450がリンカー部分を介してRhF還元酵素ドメインと繋がった構造になるようにデザインされている。
制限酵素部位を付加したプライマー（5’- CACTAGTCatatgTCAACGAGTTCAAGTACA -3’配列番号７３  、5’- CAGCACCaattGTTTTTTAGCCGTCAACTT -3’ 配列番号７４）を設計し、実施例５で作製した５種類（配列番号３，５，７，９, 11）の新規P450をコードする遺伝子の挿入されたシーケンス用ベクターを鋳型としてPCR法で増幅した。尚、増幅した各P450遺伝子断片の終止コドンは削除してある。得られた1.4 kbのDNA断片は、制限酵素NdeIとMfeIで切断してプラスミドpREDのNdeI-EcoRI部位に挿入した。配列番号3をコードする遺伝子を挿入したプラスミドベクターをpH3RED、配列番号5をコードする遺伝子を挿入したプラスミドベクターをpH5RED、配列番号7をコードする遺伝子を挿入したプラスミドベクターをpH7RED、配列番号9をコードする遺伝子を挿入したプラスミドベクターをpH9RED、配列番号11をコードする遺伝子を挿入したプラスミドベクターをpH11REDとする。また、アルカニボラックス・ボルクメンシスSK2株よりクローニングしたCYP153A13a遺伝子を挿入したプラスミドベクターpAlkREDも作製した。
〔実施例１４〕  融合型P450モノオキシゲナーゼによるアルカン（直鎖状炭化水素）の変換試験
プラスミドベクターpH3RED、pH5RED、pH7RED、pH9RED、pH11RED、及びpAlkREDをそれぞれ大腸菌BL21-AI株に形質転換し、終濃度50 μg / mlのアンピシリンが添加された5mlのLB液体培地に植え付け、一晩培養したのち、得られた培養液1 mlを終濃度50 μg / mlのアンピシリンが添加された100 mlのLB液体培地に植え継ぎ、30℃で培養し対数増殖期に達した時点で1 mM 5-アミノレブリン酸塩酸塩、0.5  mM FeCl3を添加し、20℃で30分間培養後、0.2%アラビノースを添加し引き続き培養した。（20℃16時間）培養終了後、遠心分離機により集菌し、100 ｍMリン酸バッファー（ｐH＝7.5）10 mlに懸濁した。pH3RED発現菌株を含む菌懸濁液を菌懸濁液H3、pH5RED発現菌株を含む菌懸濁液を菌懸濁液H5 、pH7RED発現菌株を含む菌懸濁液を菌懸濁液H7、 pH9RED発現菌株を含む菌懸濁液を菌懸濁液H9、pH11RED発現菌株を含む菌懸濁液を菌懸濁液H11、pAlkRED発現菌株を含む菌懸濁液を菌懸濁液Alkとした。
次に、各菌懸濁液1 mlに基質を0.25 ml添加し、20℃で24時間反応を行った。尚、基質としては、n-ヘキサン、n-ヘプタン、n-オクタン、及びn-デカンを使用した。終濃度0.2 Nになるように塩酸を添加し、反応を停止した後、ヘキサンを0.25 ml添加し、ガスクロマトグラフィー質量分析計によりヘキサン抽出画分の成分分析を行うことで、各基質が酸化され生じた産物の同定と定量を行った。各菌懸濁液による酸化反応によって生成した酸化物の量（濃度）を表３に示す。【００５１】
【表３】
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生変換反応による直鎖の炭化水素の変換試験を実施した場合も、菌破砕液より調製した粗酵素液を用いて観察した試験結果（実施例１１）と同様にハイブリッドP450は、ヘキサン、オクタン、デカンといったn-アルカンのアルコール化反応を触媒することが確認された。
また、図５に示したように炭素数6から８のn-アルカンを基質とした場合に酸化物として検出された1-アルコールの生成量を比較すると、菌懸濁液Alkや菌懸濁液H5は基質としたn-アルカンの炭素数が少なくなるに従い1-アルコールの生成量が減少する傾向を示したが、菌懸濁液H9は基質としたn-アルカンの炭素数が少なくなるに従い1-アルコールの生成量が増加する傾向を示した。
以上のように新規P450によるn-アルカンから酸化物への変換量は、ハイブリット遺伝子のarmとして利用した既知P450遺伝子CYP153A13aによるアルカンの変換量とは異なる特徴を示し、基質特異性や比活性が変化しているものが存在していることが明らかとなった。
〔実施例１５〕  融合型P450モノオキシゲナーゼによるアルケンの変換試験
アルケン（不飽和を含む直鎖状炭化水素）の一種である1-オクテンを基質とした生変換反応試験を実施例１４で作製した菌懸濁液H3、H5、H7、H9、H11、Alkを用いて行った。各菌懸濁液1 mlに基質を0.25 ml添加し、20℃で24時間反応を行った。終濃度0.2 Nになるように塩酸を添加し、反応を停止した後、ヘキサンを0.25 ml添加し、ガスクロマトグラフィー質量分析計によりヘキサン抽出画分の成分分析を行うことで、1-オクテンが酸化され生じた1,2-エポキシオクタンの同定と定量を行った。各菌懸濁液による酸化反応によって生成した酸化物の量（濃度）を表４に示す。【００５２】
【表４】
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表４に示したように、ハイブリッドP450は、不飽和炭化水素の一種である1-オクテンのエポキシ化反応を触媒することが確認された。
〔実施例１６〕  融合型P450モノオキシゲナーゼによる環状炭化水素の変換試験
環状炭化水素（シクロアルカン）の一種であるシクロヘキサンを基質とした生変換反応試験を実施例１４で作製した菌懸濁液H3、H5、H7、H9、H11、Alkを用いて行った。各菌懸濁液1 mlに基質を0.25 ml添加し、20℃で24時間反応を行った。終濃度0.2 Nになるように塩酸を添加し、反応を停止した後、ヘキサンを0.25 ml添加し、ガスクロマトグラフィー質量分析計によりヘキサン抽出画分の成分分析を行うことで、シクロヘキサンが酸化され生じたシクロヘキサノールの同定と定量を行った。各菌懸濁液による酸化反応によって生成した酸化物の量（濃度）を表５に示す。【００５３】
【表５】
2006051729.tif 000006
表５に示したように、ハイブリッドP450は、環状炭化水素の一種であるシクロヘキサンのアルコール化反応を触媒することが確認された。
〔実施例１７〕  融合型P450モノオキシゲナーゼによる芳香族炭化水素の変換試験
芳香族炭化水素（分子内に芳香環を含むアルカンまたはアルケン）を基質とした生変換反応試験を実施例１４で作製した菌懸濁液H5、H9、Alkと、プラスミドベクターpAlkREDを大腸菌BL21-AI株に形質転換後、タンパク質発現誘導処理を行わず培養することで作製した菌懸濁液Nonを用いて行った。基質はn-ブチルベンゼンと4-フェニル-1-ブテンを使用した。各菌懸濁液1 mlに対して終濃度1 mMになるように基質を添加し、20℃で8時間反応を行った後、終濃度0.2 Nになるように塩酸を添加し、反応を停止した。酢酸エチルを0.25 ml添加し、ガスクロマトグラフィー質量分析計により酢酸エチル抽出画分の成分分析を行った。尚、n-ブチルベンゼンを基質とした場合は酢酸エチル抽出画分をシリル化剤TMSI-H（GLサイエンス社）により誘導体化した後、成分分析を行った。
図６にn-ブチルベンゼンを基質とした場合の分析結果を示す。菌懸濁液H5、H9、Alkから抽出した画分ではn-ブチルベンゼンの酸化物である4-フェニル-1-ブタノールが検出された。一方、P450が発現していない菌懸濁液Nonにおいてはn-ブチルベンゼンの酸化物は検出されなかった。なお、CYP153ファミリーに属するP450がn-ブチルベンゼンを4-フェニル-1-ブタノールに変換することは本発明により初めて明らかになったものである。
図７に4-フェニル-1-ブテンを基質とした場合の分析結果を示す。菌懸濁液H5、H9、Alkから抽出した画分で4-フェニル-1-ブテンの酸化物である2-フェネチルオキシラン（2-phenethyl-oxirane）が検出された。一方、P450が発現していない菌懸濁液Nonにおいては4-フェニル-1-ブテンの酸化物は検出されなかった。なお、CYP153ファミリーに属するP450が4-フェニル-1-ブテンを2-フェネチルオキシランに変換することは本発明により初めて明らかになったものである。
〔実施例１８〕  シュードモナス・プチダ由来P450の人工融合酵素化
シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のP450cam遺伝子（Nucleotide sequence of the Pseudomonas putida cytochrome P-450cam gene and its expression in Escherichia coli. J Biol Chem. 261:1158-1163, 1986、及び、NCBI accession No. M12546）を含む1.3 kbのDNA断片は、Pseudomonas putida ATCC17453株からゲノムDNAを抽出し、そのゲノムDNAからPrimer3（5'- GActagtCatatgacgactgaaaccataca -3'、配列番号７５）とPrimer4 ( 5'- gggaattctaccgctttggtagtcgccgga -3'、配列番号７６)を用いてPCRにより増幅した。下線部はNdeI部位（Primer3）、EcoRI部位（Primer4）をそれぞれ示している。尚、P450遺伝子の終止コドンは削除してある。得られた1.3 kbのDNA断片は、NdeIとEcoRIで切断して、前記のプラスミドpREDのNdeI−EcoRI部位にサブクローン化した。構築したプラスミドを以下pCAMREDと呼ぶ。比較対象として、P450cam遺伝子のみをpET21aのNdeI−EcoRI部位へクローニングしたプラスミドpETP450camも作製した。
〔実施例１９〕  融合化P450camの機能解析
大腸菌BL21(DE3)株を実施例１８で構築したプラスミドpCAMREDで形質転換し、LB培地（アンピシリン100 μg/mlを含む）３ｍLで16時間、30度で培養した。この前培養液1 ｍLをM9-グルコース培地（アンピシリン100 μg/ml含む）50 ｍLに植菌し、OD600値が約0.8になるまで培養した。この培養液に誘導物質としてIPTGを0.2 ｍMになるよう加え、更に25度で16時間培養した。その後集菌し、10 ｍMリン酸バッファー（ｐH＝7.0）10 mLに懸濁、超音波破砕した。その後遠心(10000×ｇ、20分間)し、上清を無細胞抽出液として抽出した。２本のキュベットに無細胞抽出液を0.8mlずつ分注し、サンプル側のキュベットに一酸化炭素を吹き込んだ後、両キュベット内にチオ硫酸ナトリウム５−10 mgを添加し、撹拌したのち400-500 nm のスペクトルを測定し、機能性P450であるか判定した。また、同無細胞抽出液0.8 mlに基質である樟脳（ショウノウ；camphor）を0.5 mMになるよう加えた時のスペクトル変化も観察した。その結果、図８Aに示すように人工融合P450は非融合化P450camスペクトル(図８B)と同様のパターンを示した。すなわち、還元状態での一酸化炭素との結合により420 nmから450 nmへのピーク移動が見られ（図８点線）、一酸化酸素の有無によるCO差スペクトルを求めると450 nmに極大吸収が確認された（図８挿入図）。尚かつ基質と混合した場合、基質結合スペクトルである390 nmへピーク極大が移動した（図８A破線）。従って還元酵素領域と人工融合化することによる悪影響（立体障害による基質との結合阻害など）は無く、融合型P450camは酵素として機能性を持つことが確認された。
〔実施例２０〕  融合化P450cam生産大腸菌によるショウノウの変換
プラスミドpCAMREDを含む大腸菌BL21(DE3)株は実施例１９と同様に培養し、遺伝子の発現誘導を行った。その後集菌し、10 ｍMリン酸バッファー（ｐH＝7.0）5 ｍLに懸濁、P450camの基質であるショウノウを終濃度0.5m Mになるように添加し、25℃で24時間インキュベートした。反応直後、3、6、24時間後の反応液をサンプリングし、酢酸エチルで基質及び反応産物（5’-exo-水酸化物）を含む液層を抽出、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050)で分析し、同定を行った。その結果、図９に示すように人工融合酵素遺伝子発現菌株において24時間後にはショウノウが完全に消失し、水酸化物である5-exo水酸化ショウノウが検出された。一方、比較対象の非融合型（RhF還元酵素ドメインを持たない）プラスミドpETP450camを導入した大腸菌BL21(DE3)株では約20%のショウノウが水酸化されたに留まった。なお、図９中のグラフの縦軸は基質の消費及び変換産物の蓄積を示している。基質については反応直後の濃度を100%、変換産物については、基質を100%消費した時の産物の量の理論値を100%としている。
〔実施例２１〕  アルカニボラックス・ボルクメンシス由来P450alkの融合化
アルカニボラックス・ボルクメンシス（Alcanivorax borkumensis） 由来のP450 alk（CYP153A13a）遺伝子を含む1.3 kbのDNA断片は、アルカニボラックス・ボルクメンシスSK2株（DSM11573株）からゲノムDNAを抽出し、そのゲノムDNAからPrimer5 (5'- CACTAGTCatatgTCAACGAGTTCAAGTACA -3'、配列番号７３) とPrimer6 (5'- CAGCACCaattGTTTTTTAGCCGTCAACTT -3'、配列番号７４) を用いてPCRにより増幅した。下線部はNdeI部位（Primer5）、MfeI部位（Primer6）をそれぞれ示している。尚、P450遺伝子の終止コドンは削除してある。得られた1.3 kbの断片は、NdeIとMfeIで切断して実施例で構築したプラスミドpREDのNdeI-EcoRI部位にサブクローン化した。構築したプラスミドを以下pAlkREDと呼ぶ。なお、Alcanivorax borkumensis SK2株（DSM11573株）のP450 alk（CYP153A13a）遺伝子の塩基配列は配列番号５８に示されている。
比較対象として、P450alk遺伝子のみをpET21aのNdeI−EcoRI部位へクローニングしたプラスミドpETP450alkも作製した。
〔実施例２２〕  融合化P450alk生産大腸菌によるアルカンの変換
プラスミドpAlkREDまたはpETP450alkを含む大腸菌BL21(DE3)株は実施例１９と同様に培養し、遺伝子の発現誘導を行った。その後集菌し、10 ｍMリン酸バッファー（ｐH＝7.0）5 ｍLに懸濁、その懸濁液1.5 mLにP450alkの基質であるオクタンを0.5 mL添加し、20℃で24時間インキュベートした。24時間反応後のサンプルについて、オクタンで反応産物（1-オクタノール）を含む液層を抽出、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050)で分析し、同定及び定量を行った。その結果、図１０に示すように人工融合酵素遺伝子発現菌株であるプラスミドpAlkREDを導入した大腸菌において、790.8 ppmの1-オクタノールが生産された。一方、比較対象の非融合型（RhF還元酵素ドメインを持たない）プラスミドpETP50alkを導入した大腸菌では40.3 ppmであり、人工融合酵素発現菌株の約5%程度に留まった。
〔実施例２３〕  環境DNAサンプルより得られたP450bzoの融合化
P450bzo遺伝子は内山らによりSIGEX法を使って環境メタゲノムライブラリーより得られている（Uchiyama T, et  al. Substrate-induced gene-expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes. Nat Biotechnol. 23:88-93, 2005、及び、GenBank code:AB186504）。サブクローン化されたP450bzo遺伝子について、Primer7 (5'- CGATATaCatatgTtCAGtTTtgAcccctat -3'、配列番号７７) とPrimer8 (5'- gGATTgcgtttgacgaatTTcacaaa -3'、配列番号７８) を用いてP450遺伝子のN末端側の1.2 kbのDNA断片を増幅した。さらに、Primer9  (5’- gggctcactttgtgaaattcgtcaaa -3'、配列番号７９)とPrimer10 (5’- gggaattccgaaacggccaattccag -3'、配列番号８０) を用いて、P450遺伝子のC末断片側の110 bpのDNA断片を増幅した。プライマー（primer）8の２０番目のTとプライマー9の１５番目のAは、遺伝子内部のEcoRIサイトを削除するため導入した変異である。尚、この変異によるアミノ酸配列の置換はない。増幅した1.2 kbと110 bpの両DNA断片を混合し、これを鋳型としてPrimer７、１０を用いて再度PCRすることによりP450bzo遺伝子全長断片を得た。Primer７、１０における下線部はそれぞれNdeI部位、EcoRI部位を示している。尚、P450遺伝子の終止コドンは削除してある。得られた1.3 kbの断片は、NdeIとEcoRIで切断して実施例で構築したプラスミドpREDのNdeI-EcoRI部位にサブクローン化した。構築したプラスミドを以下pBzoREDと呼ぶ。
比較対象としてP450bzo遺伝子のみを大腸菌ベクターpET21aのNdeI−EcoRI部位へクローニングしたプラスミドpETP450bzoも作製した。
〔実施例２４〕  融合化P450bzo生産大腸菌による4-ヒドロキシ安息香酸の変換
プラスミドpBzoREDまたはpETP450bzoを含む大腸菌BL21(DE3)株は実施例１９と同様に培養し、遺伝子の発現誘導を行った。その後集菌し、10 ｍMリン酸バッファー（ｐH＝7.0）5 ｍLに懸濁後、P450bzoの基質である4-ヒドロキシ安息香酸を終濃度0.6 mMになるよう添加し、20℃で６時間インキュベートした。反応直後、２、４、６時間後の反応液をサンプリングし、酢酸エチルで基質及び反応産物（3,4-ジヒドロキシ安息香酸）を含む液層を抽出、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050)で分析し、同定を行った。その結果、図１１に示すように、人工融合酵素遺伝子発現菌株であるプラスミドpBzoREDを導入した大腸菌において、基質が急速に変換され、４時間後には基質が完全に消失し、水酸化物である3,4-ジヒドロキシ安息香酸が約0.6 mM生産された。一方、比較対象の非融合型（RhF還元酵素ドメインを持たない）プラスミドpETP450bzoを導入した大腸菌では同時間を経た段階で基質の約半量(2.5 mM )が残存し、反応産物も0.1 mM程度であった。
〔実施例２５〕  ストレプトマイセス・グリセオラス由来P450SU-1またはP450SU-2の融合化
ストレプトマイセス・グリセオラス（Streptomyces griseolus）由来のP450SU-1（CYP105A1）またはP450SU-2（CYP105B1）遺伝子（Genes for two herbicide-inducible cytochromes P-450 from Streptomyces griseolus. J Bacteriol. 172:3335-45, 1990、及び、NCBI accession No. M32238及びM32239）を含む1.3 kbのDNA断片は、ストレプトマイセス・グリセオラスATCC11796株からゲノムDNAを抽出し、そのゲノムDNAからPrimer11 (5'- GGACTCCatatgACCGATACCGCCACGACG -3'、配列番号８１) とPrimer12 (5'- CTGaattCCCAGGTGACCGGGAGTTCGTTGAC -3'、配列番号８２) 、またはPrimer13 (5'- GGACTCCatatgACGACCGCAGAACGCACC-3'、配列番号８３) とPrimer14 (5'- CTGaattCCCAGGCGATCGGCAGCGAGTGGAC -3'、配列番号８４)を用いてPCRにより増幅した。下線部はNdeI部位（Primer11および13）、EcoRI部位（Primer12および14）をそれぞれ示している。尚、P450遺伝子の終止コドンは削除してある。得られた各々の1.3 kbのDNA断片をNdeIとEcoRIで切断した後、実施例１２で構築した機能発現用ベクターpREDのNdeI-EcoRI部位に挿入し、融合化P450SU-1または融合化P450SU-2遺伝子の発現用プラスミドを作製した。構築したプラスミドを以下、それぞれpSU-1RED、pSU-2REDと呼ぶ。比較対象として、P450SU-1またはP450SU-2遺伝子のみをpET21aのNdeI−EcoRI部位に挿入したプラスミドpETP450SU-1、pETP450SU-2も作製した。
〔実施例２６〕  融合化P450SU-1及びSU-2生産大腸菌による７-エトキシクマリンの変換
プラスミドpSU-1REDまたはpSU-2RED、またはpETP450SU-1またはpETP450SU-2が導入された大腸菌BL21(DE3)株を、実施例１９と同様に培養し、遺伝子の発現誘導を行った。遺伝子の発現誘導と同時にP450SU-1およびSU-2の基質である７-エトキシクマリンを終濃度1 mMになるよう培地に添加し、20℃で74時間インキュベートした。酢酸エチルで反応液中の基質及び反応産物（7-ヒドロキシクマリン）を含む液層を抽出し、薄層クロマトグラフィーにて分析した。その結果、人工融合酵素遺伝子発現用のプラスミドであるpSU-1REDまたはpSU-2REDを保有する大腸菌は両菌株とも、反応産物である7-ヒドロキシクマリンが検出された。一方、比較対象の非融合型プラスミドpETP450SU-1を導入した大腸菌では反応産物が検出されなかった。pETP450SU-2を導入した大腸菌では若干の反応産物が検出されたが、その量は融合化プラスミドpSU-2RED保持菌と比較して少なかった。
本実施例により、放線菌由来のP450も、本発明による機能発現システムに適応できることが明らかとなった。
〔実施例２７〕  P450HB153遺伝子の単離と融合化
グラム陽性細菌であるノカルディア科Hou_blue株（Nocardiaceae strain Hou_blue）は、新潟県西山町の石油噴出場の土壌（新潟県石油汚染土壌）より、石油系炭化水素であるアルカンの資化能を指標にして単離された新規の細菌である。本Hou_blue株は、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジー本部（千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に、平成16年6月8日に、寄託番号NITE P-3として寄託されている。
ノカルディア科Hou_blue株由来から、CYP153ファミリーに属する新規のP450遺伝子［以後、本遺伝子をP450HB153遺伝子と呼ぶ（配列番号８６にその塩基配列が、配列番号８５にコードされるP450タンパク質のアミノ酸配列が示されている）］を単離した。すなわち、本P450HB153遺伝子を含む1.3 kbのDNA断片は、同株からゲノムDNAを抽出し、そのゲノムDNAからプライマー Hou-1（5'- GTAGGCCATATGAACGTAATCGGTGCAGGT -3'、配列番号８７）とプライマー Hou-2（5'- CATGAATTCGACCTGTTCCATCTCGGTCTC -3'、配列番号８８）を用いてPCRにより増幅した。下線部はそれぞれ、NdeI部位及びEcoRI部位を示している。なお、P450HB153遺伝子の終止コドンは削除してある。得られた1.3 kbの断片は、NdeIとEcoRIで切断し、実施例１２で構築したベクターpREDのNdeI-EcoRI部位に挿入し、プラスミドpHB153-Redを構築した。
〔実施例２８〕  融合化P450HB153生産大腸菌による2-n-ブチルベンゾフランの変換
プラスミドpHB153-Redを有する大腸菌BL21(DE3)株を用いて、2-n-ブチルベンゾフラン（2-n-butylbenzofuran）の生変換試験を実施した。すなわち、大腸菌BL21(DE3)株を実施例２７で構築したプラスミドpHB153-Redで形質転換し、LB培地（アンピシリン100 μg/mlを含む）3 mlで16時間、30℃で培養した。この前培養液1 mlをM9-グルコース培地（アンピシリン100 μg/ml含む）50 ｍlに植菌し、OD600値が約0.8になるまで培養した。この培養液に誘導物質としてIPTGを0.2 ｍMになるよう加え、更に25度で16時間培養した。この培養液を遠心分離し(8000 rpm, 5 min.)、菌体を沈澱させた。上清を捨てたのち50 mMりん酸緩衝液（pH 7.0）10 mlを加え、良く撹拌して菌体を50 ml容ファルコンチューブに回収した。ここに基質を1.74 mg（終濃度 1 mM）になるように少量のDMSOに溶解して添加し、20℃で24時間振とう培養した。
2-n-ブチルベンゾフランの変換試験を行った培養液を含むファルコンチューブ10本分の100 ml（元培養1 L相当）を用いて、酢酸エチルと混合分配し、酢酸エチル相を分取し濃縮した。この酢酸エチル抽出物（18.6 mg）をTLC［ヘキサン：酢酸エチル（５：１）で展開］に供したところ、Rf値0.21の産物（化合物28-１と呼ぶ）が生成していることが判明した。本酢酸エチル抽出物をシリカゲルクロマトグラフィー［直径1 cm x 長さ20 cm、展開溶媒：ヘキサン：酢酸エチル（５：１）］にかけることにより精製し、化合物28-１（0.4 mg）の純品を得た。化合物28-１はEI-MSでm/z 190（基質＋酸素原子１）に分子イオンピークM+が観測された。1H NMRスペクトルを測定したところ、芳香環部分の信号は基質と全く同様であった。しかしながら基質の末端メチル基は消失し、d 3.70にとリプレットに分裂したオキシメチレン基及び3つのメチレン基が観測された。DQF-COSYスペクトルの解析によりこれら計４つのメチレン基は連続していることが判明したことと、前述のEI-MSの結果から、変換化合物は末端のメチル基に水酸基が導入されたものと同定された。すなわち、化合物28-１を下記に示す4-ベンゾフラン-2-イル-ブタン-１-オール (4-benzofuran-2-yl-butan-1-ol)と同定した。【００５４】
【化１】
2006051729.tif 000007
これはCASに記載のある化合物であるが、微生物変換により得られたのは初めての報告である。【００５５】
【表６】
2006051729.tif 000008
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明により、環境サンプル等の雑多な微生物由来の核酸を含むサンプルから、新規P450遺伝子を効率的に単離する方法が提供される。本発明の方法によって提供されるP450遺伝子から生産されるP450は基質特異性や比活性が多様に変化しており、アルカン、アルケン、環状炭化水素（シクロアルカン）、芳香族炭化水素（分子内に芳香環を有するアルカンまたはアルケン）をはじめ多様な低分子有機化合物の酸化反応に利用することができる。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願（特願2004-326139号、特願2005-83019号、特願2005-83122号）の明細書および／または図面に記載されている内容を包含する。また、本発明で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
2006051729.tif 000009
【図２】
2006051729.tif 000010
【図３】
2006051729.tif 000011
【図４】
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【図５】
2006051729.tif 000013
【図６】
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【図７】
2006051729.tif 000015
【図８】
2006051729.tif 000016
【図９】
2006051729.tif 000017
【図１０】
2006051729.tif 000018
【図１１】
2006051729.tif 000019
【図１２】
2006051729.tif 000020
【配列表】
2006051729000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年3月6日(2007.3.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、P450として機能するタンパク質をコードする遺伝子の単離方法、該方法に有用なオリゴヌクレオチド、該方法によって単離された新規遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質、該タンパク質を含む融合型P450モノオキシゲナーゼ、及び該酵素を用いた酸化化合物の生産法に関するものである。本発明の単離方法は、海水や土壌等の試料から細菌等の微生物の分離・培養する工程や分離・培養した微生物から抽出したDNAの平均化工程を経ずに、酵素遺伝子を単離できる方法であり、自然界の遺伝子資源から、特に当該遺伝資源中に目的の遺伝子を有する微生物の存在量が少ない場合において、新規のP450遺伝子を単離するのに有効である。本発明で得られる遺伝子から合成されるP450は生体触媒として化学工業における有用物質生産に利用することができる。
【背景技術】
【０００２】
シトクロムP450モノオキシゲナーゼは細菌から植物や哺乳動物に至る広範囲の生物種に分布している酸素添加酵素であり、酸素分子を還元して１分子の水を作ると共に、残りの酸素原子を様々な低分子有機化合物に導入して、酸化生成物に変換する反応（１原子酸素添加反応）を触媒する鉄・イオウ酵素である。P450は分子構造や基本的な触媒機構を保ちつつ、基質結合部位の構造を変化させることで炭化水素の水酸化のみならず、脱アルキル化、エポキシ化、C-C結合切断、芳香化、脱水素、還元など様々な酸化反応に対応しており、P450によって触媒される反応は、動物のホルモンや植物の２次代謝産物の生合成から、生体内に取り込まれた異物の活性化や生分解に至るまで、かなり多様で広範囲に及んでいる。このようにP450はあらゆる種類の有機化合物の酸化に関与することから、バイオインダストリー分野において注目を集めている。具体的には、既存の方法では酸化処理が難しい化合物に対してP450の触媒反応を利用することで、新しい有機低分子化合物の合成や環境負荷物質の分解処理を行う検討がなされている。また、最近では産業上の観点からも、バイオコンバージョン技術への応用を目的として、細菌をはじめとする微生物のP450の利用が考案されている（非特許文献1）。細菌でよく研究されているP450としては、P450で初めて結晶構造が解かれたシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のP450camと、P450の酸化反応に必要な還元酵素と融合した構造を持つバチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）由来のP450BM3等が挙げられる。これらの酵素は、分子進化工学的手法で酵素活性や基質特異性を改良する試みもなされている（非特許文献1）。しかしながら、従来知られていた細菌のP450は細菌種の豊富さに比べると非常に少なかった。一方、近年のゲノム解析の進展がP450研究に新局面をもたらした。多くの細菌のゲノム解析が完結し、細菌のP450も多数存在していることが明らかとなった。例えば、結核菌マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）には２０種類のP450配列が存在しており、放線菌ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）には１８種類のP450配列が存在していた。こうして新たに発見されたP450をバイオコンバージョン（生変換）における酸化酵素資源として利用する試みも開始されている。以上のように最近では、微生物から多数のP450が単離され解析が実施され始めているが、これらのP450はすべて、単離・培養の可能な生物種に由来するものである。しかし、単離・培養が可能な微生物は、土壌、海洋等の生息環境を問わず1%以下であるので（非特許文献2)、現在同定されている微生物由来のP450は限定的であり、未だ単離同定が困難なP450が環境中には多数存在することが推定される。こうした未同定のP450の中には有機化合物の種々の酸化反応に関与するものが多数存在することは否定できない。したがって、単離・培養が不可能または困難な微生物（難培養微生物）由来のP450を含め環境中から直接、多数の遺伝子を単離し、迅速に機能解析を行うことは、産業利用の観点からも非常に有意義である。
【０００３】
微生物の単離・培養を経ずに環境中から直接、目的遺伝子を単離・回収する例として、カセットPCR法という手法がOkutaらにより開発されている（非特許文献3）。この方法は、目的とする機能を有する既知のタンパク質又はその遺伝子のアミノ酸配列ないし塩基配列から当該遺伝子に特異的なプライマーを設計した上で、土壌や海水等の環境サンプルから直接抽出したDNAを鋳型としてPCR等のDNA増幅反応を行い、増幅されたDNA断片を単離した後、上記プライマーによる増幅反応で増幅されない遺伝子の両端部を既知類似遺伝子の塩基配列で補う手法である。これにより中央部が環境から直接抽出したDNA由来の新規遺伝子配列、両端部が既知遺伝子配列からなるハイブリッド遺伝子が生成され、大腸菌などを宿主とするタンパク質発現系にハイブリッド遺伝子を組み込むことにより、効率的に得られた遺伝子の機能解析を行うことが可能になる。この手法を用いて多様な新規遺伝子配列を獲得するためには、DNA増幅反応に用いるプライマーの配列、さらには、プライマー設計の基礎情報とする既存のタンパク質又は遺伝子配列の相同性が重要である。しかし、P450に関しては１次構造が著しく多様化しており、既知の配列から多様なP450遺伝子を効率よく単離できるプライマーは得られていなかった。なお、土壌等の自然界から直接、DNAを回収する際、存在量が多い微生物由来のDNA断片が多く回収され、このままライブラリーを作製すると、存在量が多い微生物由来の遺伝子が多く含まれてしまうことになり、目的の遺伝子が、その土壌等では少ししか存在しない微生物（稀少微生物）由来の遺伝子である場合は、当該遺伝子の単離が困難となる。稀少微生物由来遺伝子のDNAの多様性を確保するための方法として、土壌等の自然界から直接抽出したDNAを、ＧＣ含量の差を利用して平均化（normalization）した後で、ライブラリーを作製する方法が開示されている（特許文献1）。しかし、この平均化の方法は、稀少微生物と存在量が多い微生物のＧＣ含量が近似している場合は、利用することができない。
【０００４】
P450の触媒反応による変換が期待される化合物として、アルカン（直鎖状炭化水素）等の石油成分が挙げられる。アルカンはその両末端を酸化することによってジオールやジカルボン酸に変換された後、ポリマー、香料、医薬等の工業原料として利用されている。現在は石油化学工業によって合成されているが、生物工学的製造法への代替が望まれていることもあり、生物種によるアルカン末端の酸化反応は注目されている。アルカン末端の酸化反応を行うP450としては、カンジダ・マルトーサ(Candida maltosa) やカンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)などの酵母に存在するCYP52ファミリーが知られている（非特許文献4）。 カンジダ・マルトーサにおいてはアルカンによって強く発現誘導されるCYP52Aサブファミリーに属する４種類の遺伝子が、アルカンや脂肪酸といった基質の種類や鎖長に関して異なる特異性をもつことが示されている。アルカンの分解に関与すると推察される原核生物由来のP450としては、最初に長鎖のn-アルカン資化細菌であるアシネトバクター・カルコアセツカス（Acinetobacter calcoaceticus）EB104株において発見された（非特許文献5）。最近ではアルカン資化能を有するアルカニボラックス・ボルクメンシス（Alcanivorax borkumensis）やロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）等の細菌数種類でP450の存在が明らかとなり、これらのP450はCYP153Aサブファミリーを形成している（非特許文献6、および、Nelson博士のホームページ（http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html））。しかしながら、このP450がアルカンの末端に水酸基を付与すると言う直接の証拠は得られていなかった。また、分子進化工学的手法で得られたバチルス・メガテリウム由来のP450の変異体P450BM-3 139-3が、炭素数3から8のアルカンの酸化能を有していることが明らかとなった（非特許文献7）。同P450遺伝子は還元酵素融合型P450であり、大腸菌での発現効率も高く、バイオコンバージョン技術への応用が期待されたが、アルカンの末端ではなく主に側鎖の水酸化反応であるため実用化には至っていない。以上述べてきたように、アルカン末端の酸化反応を行うP450は産業利用が期待されるため、研究が盛んに行われてきているが、限定された知見しか存在しなく、特に細菌由来の同P450に関する情報は非常に少ないということが言える。
【０００５】
P450モノオキシゲナーゼは、電子伝達の方法の違いにより２種類の組（クラス）に分けられる。1つ目のクラス（クラスI）はフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD；flavin adenine dinucleotide）を補酵素として分子内に含有するNAD(P)H-鉄イオウタンパク質（フェレドキシン；ferredoxin）還元酵素（レダクターゼ；reductase）、及び、鉄イオウタンパク質（フェレドキシン）によってP450本体タンパク質にNAD(P)Hから電子供給が行われるものである（今後、このクラスを「三成分系のP450モノオキシゲナーゼ」と呼ぶことがある。）。ミトコンドリアや細菌のP450モノオキシゲナーゼは通常このクラスに属する。第2のクラス（クラスII）は、FADとフラビンモノヌクレオチド（FMN；flavin mononucleotide）を補酵素として分子内に含有するNADPH-P450還元酵素が、鉄イオウタンパク質の介在無しにNADPHからP450本体タンパク質に電子供給を行うものである（今後、このクラスを「二成分系のP450モノオキシゲナーゼ」と呼ぶことがある。）。哺乳動物の肝臓のミクロソーム中に存在するP450モノオキシゲナーゼがこのクラスIIに相当する。
【０００６】
近年、細菌のゲノム解析が進むにつれ新しいP450（CYP；本体タンパク質）の遺伝子が数多く見つかっているが、そのP450に対応する電子伝達タンパク質をコードする遺伝子が不明な場合が多い。たとえば医薬品の合成などその利用が期待されているストレプトマイセス（Streptomyces）属45種において170以上のP450遺伝子が見つかりながら、それぞれに対応可能な電子伝達タンパク質の発見は20個未満に留まっている（Parajuli N. et al. Genome analyses of Streptomyces peucetius ATCC 27952 for the identification and comparison of cytochrome P450 complement with other Streptomyces. Arch Biochem Biophys. 425: 233-241, 2004）。
【０００７】
対応する電子供与体が不明な場合にも、同じ菌株内に存在する電子伝達タンパク質や、別の菌株あるいは別の個体のP450電子伝達タンパク質を利用して酵素活性を生じさせた例はある。たとえば、ストレプトマイセス属のP450の幾つかは、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のフェレドキシン（プチダレドキシン；putidaredoxin）及びプチダレドキシン還元酵素と共存させることでP450モノオキシゲナーゼ活性を示すことが報告された（有澤 章ら, 放線菌シトクロムP450および電子伝達タンパクを共発現させた大腸菌による微生物変換系, 日本農芸化学会2003年大会講演要旨, p. 38, 2003）。また、コリネバクテリウム(Corynebacterium sp.) EP1株由来のP450(PB-1)はホウレンソウ由来の電子供与体との共存で活性を示した（Kawahara N, et al. Purification and characterization of 2-ethoxyphenol-induced cytochrome P450 from Corynebacterium sp. strain EP1. Can J Microbiol. 45: 833-839, 1999）。しかし当然のことながら、前述の電子供与体や電子伝達タンパク質がすべてのP450に適応できるものではなく、個々のP450に於いて相性の良い電子伝達タンパク質を探索して用いられているのが現状である。しかも、多大な労力をかけることなく相性の良い電子伝達タンパク質を見つけるためには、ある菌種に限定するか、お互いに相同性が高いP450ファミリーへと絞ってP450研究を進めざるを得ない。さらに機能する電子伝達タンパク質を選択できた場合でも、菌体内でP450と共発現させるには、遺伝子操作や誘導条件の最適化検討（たとえば、各構造遺伝子を別々のプラスミドにのせるのか、同一プラスミド上で発現させるのか、その場合の遺伝子の順番、各遺伝子の誘導のタイミングなど）に多くの時間が費やされる。また、in vitroでのP450機能解析においても、還元系酵素を別々に生産、精製し、それらを最適な割合になるよう検討しながら混合する、というステップを踏むため、ただ１つのP450を機能解析するのにも多くの時間と手間がかかる。これらのことから、莫大なP450遺伝子の構造に関する情報が蓄積されているにもかかわらず、P450遺伝子の機能に関する情報は少なく、多種多様なP450から目的とする基質特異性や触媒機能を持つ酵素を選択したり、新規に得られたP450が作用できる基質を探索する、といった選択系のハイスループット化は難しいのが現状であった。
【０００８】
また、一般的なP450の問題点として、電子供与体からシトクロム P450への電子伝達が酵素反応の律速になるために、シトクロムP450一分子あたりの活性が低いことが挙げられる。この点を改善する鍵となると思われるのが、珍しい例であるが、融合型P450モノオキシゲナーゼと呼ばれるものであり、P450本体タンパク質と還元酵素が1本のポリペプチド鎖として繋がっているものである。よく知られている例は細菌バチラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）由来のP450BM3（非特許文献８）を始めとして、カビ由来のP450foxyなどである。これらの構造は、クラスIIに属する二成分系のP450モノオキシゲナーゼにおけるP450本体タンパク質と、FADとFMNを分子内に補酵素として含有するNADPH-P450還元酵素という構成成分からなっている。クラスIIの二成分系と違う部分はこの2つの構成成分がリンカー部分を介して1つのポリペプチドとして繋がっているというところである。この融合型P450モノオキシゲナーゼの特徴の１つとして、三成分系、二成分系のP450モノオキシゲナーゼと比べて酵素反応速度が速く、高い活性を保有できることである。その理由として、P450と還元酵素の融合により電子が分子内伝達となった有利性が考えられ、P450と還元酵素系の最も良い相互作用をもつ立体構造を実現している可能性がある。この融合型P450モノオキシゲナーゼを模倣して、人工的融合型P450モノオキシゲナーゼを作った例は真核生物のP450において広く認められ、N末端側にヒト肝臓P450本体タンパク質を有し、Ｃ末端側に酵母やラット、あるいは前述のP450BM3由来NADPH-P450還元酵素を付加した人工融合酵素などが作られている。P450BM3は細菌由来でありながら、P450本体タンパク質部分（ヘムドメイン）、NADPH-シトクロムP450還元酵素ドメイン共に、例外的に真核生物由来のクラスIIに属するP450及びP450還元酵素と相同性が高いため電子供与体として適用され得たものと考えられる。このようにP450BM3は細菌由来のP450でありながら、クラスIに属する三成分系の一般的な細菌由来のP450とは一線を画すものである。
【０００９】
一方、P450BM3を除くと、細菌由来のP450本体タンパク質を用いてP450−還元酵素ドメインの融合酵素作製の成功例（活性のある融合酵素作製に成功した例）はわずか一例に留まり、しかも、それは元々同じシステム内のP450モノオキシゲナーゼの構成成分を融合化したものにすぎない（Sibbesen, O., et al. Putidaredoxin reductase-putidaredoxin-cytochrome P450cam triple fusion protein. Construction of a self-sufficient Escherichia coli catalytic system. J Biol Chem. 271: 22462-9, 1996）。一般的な細菌由来のP450本体タンパク質と異種P450モノオキシゲナーゼ成分由来の還元酵素部分との融合化についての試みの成功例はこれまでに報告されていない。これは先にも述べたように、細菌のP450機能システムがP450本体タンパク質、フェレドキシン、フェレドキシン還元酵素の三成分系から成るため複雑であることが要因であろう。微生物のP450モノオキシゲナーゼの産業利用において人工融合化酵素は簡便な酵素精製、または菌体内反応系を可能にするものでありながら、未だ確立された技術ではない。
【００１０】
前述した、クラスI、クラスIIに属するP450モノオキシゲナーゼや融合型P450モノオキシゲナーゼのいずれにも当てはまらないP450モノオキシゲナーゼが最近報告された（非特許文献８）。これはロドコッカス（Rhodococcus）属NCIMB9784株より単離されたP450モノオキシゲナーゼ（P450RhFと命名された）であり、P450本体タンパク質（ヘムドメイン）、フラビンモノヌクレオチド（FMN）を補酵素にして分子内に含有するNADH-P450還元酵素ドメイン、鉄イオウタンパク質ドメインが1本のポリペプチドとして繋がったものである。本P450モノオキシゲナーゼ（P450RhF）における還元酵素ドメインがFMNしか要求しないというのも新奇である。クラスIのP450モノオキシゲナーゼにおける還元酵素がFADを要求し、クラスIIや従来の融合型のP450モノオキシゲナーゼにおける還元酵素がFADとFMNの両方を要求するからである。したがって、P450RhFはP450モノオキシゲナーゼの中で極めて例外的なものであると考えられる。
【００１１】
【特許文献１】特表2000-513933号公報
【非特許文献１】Urlacher et al, Appl. Microbiol. Biotechnol. 64: 317-325 (2004)
【非特許文献２】Thomas et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 10494-10499 (2002)
【非特許文献３】Okuta, A. et al, Gene. 212: 221-228 (1998)
【非特許文献４】Ohkuma et al, J. Biol. Chem. 273: 3948-3953 (1998)
【非特許文献５】Thomas et al, Biochem. Biophy. Res. Comm. 286: 652-658 (2001)
【非特許文献６】Beilen et al, biocat 2004 Book of Abstracts, p. 233
【非特許文献７】Glieder et al, Nat. Biotechol. 20: 1135-1139 (2002)
【非特許文献８】Roberts, G.A., et al, Identification of a new class of cytochrome P450 from a Rhodococcus sp. J. Bacteriol. 184: 3898-3908, 2002.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の第一の目的は、多様な環境中に存在する微生物資源から効率良く、特に当該環境中では稀少な微生物から、多様なP450遺伝子を単離する方法を提供し、さらには、新規なP450遺伝子及び該遺伝子によって合成されるP450を提供し、該酵素によって多様な有機化合物を酸化する手段を提供することである。
【００１３】
また、P450モノオキシゲナーゼは、基質特異性や反応特異性に関して非常に多様であるので、種々の有用な生体触媒反応への応用が期待されている。しかしながら、ほとんどのP450本体タンパク質（CYP）はそれだけでは触媒活性を持つことはできないので、せっかく新規なP450遺伝子を見出しても、コードされるP450が作用できる基質を特定し且つ実用化するためには多くの時間と労力が必要とされる。すなわち、P450本体タンパク質が本来有しているはずの酵素活性（触媒活性）を利用するには、活性のあるP450モノオキシゲナーゼを再構成しなければならず、そのためにはP450本体タンパク質に適切に電子供与する電子伝達タンパク質の共存が必須である。しかしながら、個々のP450、特に新規のP450に呼応する電子供与体を見つけるのは困難なこと、さらには、一般的にP450モノオキシゲナーゼのシステムそのものの酵素活性が弱く失活しやすいことが知られており、多様なP450本体タンパク質に対応し尚且つ効率の良い電子伝達を行うシステムの開発が強く求められていた。本発明の第二の目的はこのようなシステムを構築し、活性のあるP450モノオキシゲナーゼを生産する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記第一の目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、石油成分を資化する微生物に由来する複数のP450遺伝子により形成されているCYP153Aサブファミリーにおいてアミノ酸配列が比較的よく保存された領域を見出し、該領域に基づいて設計したプライマーにより様々な環境由来DNAサンプルから新規P450遺伝子断片の増幅が可能であることを見出した。さらに、カセットPCR法より、増幅されたP450遺伝子と既知P450遺伝子間のハイブリッド遺伝子を作製した上で、大腸菌発現系によるハイブリッド遺伝子の機能解析手法を確立し、検討を重ねた結果、環境中から得られた新規P450配列とのハイブリッド遺伝子産物がモノオキシゲナーゼ活性を有し、アルカン（直鎖状炭化水素）、アルケン（不飽和結合を含む直鎖状炭化水素）、環状炭化水素、及び、分子内に芳香環を含むアルカンやアルケンなどの有機化合物を基質とし、末端メチル基の水酸化反応や末端オレフィンのエポキシ化反応等の酸化反応を触媒することを見出した。
【００１５】
また、本発明者らは、上記の第二の目的を達成するため、汎用性と効率性を兼ね備えたP450への電子伝達システムを開発すべく鋭意検討を重ねてきた。その過程で、ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）NCIMB9784株のシトクロムP450モノオキシゲナーゼ（P450RhF）に着目した。「背景技術」で説明したように、P450RhF はP450本体タンパク質とP450還元酵素ドメイン（領域）が融合して１本のポリペプチド鎖として存在する融合型P450モノオキシゲナーゼである。融合型P450モノオキシゲナーと言っても、前述したようにP450BM3やP450foxyとは違い、還元酵素領域には鉄-イオウタンパク質様コンポーネントとFMNタンパク質様コンポーネントを有するこれまでにない新奇な構造を持っていた（非特許文献１）。一般的に、ロドコッカス属細菌のようなアクチノバクテリアの場合、種々の有機化合物の変換反応に関与する多様な触媒機能を有しており、それに対応して煩雑な酵素系を有していることが知られているので、この新奇なP450RhFのような酵素に汎用性を期待するのは難しいと思われた。さらには、ロドコッカス属細菌由来の酵素系に関与する遺伝子を大腸菌のような汎用宿主で機能発現させるのは難しい場合が多いことが知られていた。したがって常識的に考えると、このP450RhFは、本発明者らの目的、すなわち汎用性と効率性を兼ね備えたP450への電子伝達システムの開発への材料として期待することはできないと思われた。それでも本発明者らは、P450RhFの還元酵素領域を利用し、種々の細菌由来のP450本体タンパク質への電子伝達システムとして働かせることはできないか、さらには電子伝達が分子内伝達になるように融合タンパクとして働かせることはできないかと考え鋭意検討を重ねた。その結果、思いがけないことに、このP450RhFの還元酵素ドメインを、異種の細菌由来のP450本体タンパク質のC末に適切なリンカー領域を介して融合化させることにより、触媒活性があり、しかも失活しにくいP450モノオキシゲナーゼを作ることができることがわかった。
【００１６】
具体的には、細菌由来のシトクロムP450本体タンパク質（CYP）をコードする塩基配列を有する遺伝子とロドコッカス属（Rhodococcus sp.） NCIMB9784株由来のP450RhFの還元酵素ドメインをコードする塩基配列を有する遺伝子を接続することにより、単一のポリペプチド遺伝子とし、P450の有するモノオキシゲナーゼ活性およびP450RhFの還元酵素ドメインの有するNAD(P)H からの還元力供給能を同一分子内に有する人工融合酵素をコードする人工融合酵素遺伝子発現系を構築した。そして幾つかの異種細菌由来P450遺伝子についてこの発現系を適用し、大腸菌に人工融合酵素を生産させることに成功した。生産された人工融合酵素は単一分子内に電子伝達と基質の酸化能の両機能を有しており、構築した融合タンパク遺伝子発現系が多様なP450遺伝子に対応できることを確認した。更に、構築した融合タンパク遺伝子発現系を用いれば、大腸菌培養液を用いた簡易な生変換反応によりP450の生体触媒活性を観察できることを確認した。
【００１７】
本発明は、以上の知見に基づき完成されたものである。
即ち、本発明は、以下の（１）〜（２３）を提供するものである。
（１）配列番号５１又は５２記載のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配列、又はそれと相補的な塩基配列を含み、かつプライマー又はプローブとして実質的な機能を有するP450遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチド。
（２）配列番号５３〜５６記載のいずれかの塩基配列、又はそれと相補的な配列の一部または全部を含み、かつプライマー又はプローブとして実質的な機能を有するP450遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチド。
（３）（１）又は（２）記載のオリゴヌクレオチドを少なくとも一方のプライマーとして使用することを特徴とするP450遺伝子断片単離法。
【００１８】
（４）試料から核酸を抽出する工程、及び抽出した核酸を鋳型とし、（１）又は（２）記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして核酸増幅反応を行う工程を含むP450遺伝子断片単離法。
（５）（１）又は（２）記載のオリゴヌクレオチドを少なくとも一方のプライマーとして使用してP450遺伝子断片を単離する工程、及び単離されたP450遺伝子断片の5'末端及び3'末端のそれぞれに既知P450遺伝子の5'末端領域及び3'末端領域を付加する工程を含むハイブリッドP450遺伝子の作製方法。
【００１９】
（６）既知P450遺伝子が、配列番号５７記載のアミノ酸配列をコードするP450遺伝子である（５）記載のハイブリッドP450遺伝子の作製方法。
（７）以下の（a）〜（c）を含むことを特徴とするP450遺伝子単離用キット、
（a）（１）又は（２）記載のオリゴヌクレオチド、
（b）既知P450遺伝子の5’末端領域を含むDNA断片、
（c）既知P450遺伝子の3’末端領域を含むDNA断片。
【００２０】
（８）以下の（a）又は（b）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子、
（a）配列番号１〜２５のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質、
（b）配列番号１〜２５のいずれかのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつP450として機能するタンパク質。
（９）配列番号２６〜５０のいずれかの塩基配列からなり、P450として機能するタンパク質をコードする遺伝子。
（１０）（８）又は（９）記載の遺伝子を含有する発現ベクター。
【００２１】
（１１）以下の（a）または（b）のいずれかのタンパク質、
（a）配列番号１〜２５のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質、
（b）配列番号１〜２５のいずれかのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなりかつ、P450として機能するタンパク質。
（１２）（１０）記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培地で培養し、得られる培養物から（１１）記載のタンパク質を回収することを特徴とするP450として機能するタンパク質の製造法。
【００２２】
（１３）（１１）記載のタンパク質を基質と反応させ、酸化化合物を得ることを特徴とする酸化化合物の生産法。
（１４）P450本体タンパク質のC末端側に、リンカー部分を介して、ロドコカッス属NCIMB9784株由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼに含まれる還元酵素ドメインと同様の機能を持つペプチドを付加してなる融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼ。
【００２３】
（１５）ロドコカッス属NCIMB9784株由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼに含まれる還元酵素ドメインと同様の機能を持つペプチドが、（ａ）配列番号７０記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｂ）配列番号７０記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるペプチド、又は（ｃ）配列番号６９記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするペプチドであることを特徴とする（１４）に記載の融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼ。
【００２４】
（１６）リンカー部分が、（ｄ）配列番号６８記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｅ）配列番号６８記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるペプチド、又は（ｆ）配列番号６７記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするペプチドであることを特徴とする（１４）又は（１５）に記載の融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼ。
【００２５】
（１７）P450本体タンパク質が、細菌由来のP450本体タンパク質であることを特徴とする（１４）乃至（１６）のいずれか一項に記載の融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼ。
（１８）P450本体タンパク質が、（１１）記載のタンパク質、又は配列番号５７若しくは配列番号８５のアミノ酸配列からなるタンパク質であることを特徴とする（１４）乃至（１６）のいずれかに記載の融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼ。
（１９）（１４）乃至（１８）のいずれかに記載の融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼをコードするDNA。
【００２６】
（２０）（１９）記載のDNAを導入した微生物。
（２１）（２０）記載の微生物を培養し、培養物又は菌体から融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼを採取することを特徴とする融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼの生産方法。
（２２）（１４）乃至（１８）のいずれか一項に記載の融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼを基質と反応させ、酸化化合物を得ることを特徴とする酸化化合物の生産法。
【００２７】
（２３）基質が、n-へキサン、n-へプタン、n-オクタン、n-デカン、1-オクテン、シクロヘキサン、n-ブチルベンゼン、4-フェニル-1-ブテン、又は2-n-ブチルベンゾフランであり、生産される酸化化合物がそれぞれ1-ヘキサノール、1-ヘプタノール、1-オクタノール、1-デカノール、1,2-エポキシオクタン、シクロヘキサノール、4-フェニル-1-ブタノール、2-フェネチルオキシラン、又は4-ベンゾフラン-2-イル-ブタン-1-オールであることを特徴とする（２２）記載の酸化化合物の生産法。
【００２８】
（２４）以下の（a）又は（b）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子、
（a）配列番号８５のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（b）配列番号８５のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつP450として機能するタンパク質。
（２５）配列番号８６の塩基配列からなり、P450として機能するタンパク質をコードする遺伝子。
【発明の効果】
【００２９】
本発明により、環境サンプル等の雑多な微生物由来の核酸を含むサンプルから、新規P450遺伝子を効率的に単離する方法が提供される。本発明の方法によって提供されるP450遺伝子から生産されるP450は多様な低分子有機化合物の生産に利用することができる。
【００３０】
また、既存および未知のP450タンパク質から本発明の融合型P450モノオキシゲナーゼを作製することにより、これらのP450タンパク質を、電子伝達と基質の酸化反応の両機能を有する一成分系の機能性P450モノオキシゲナーゼにすることが可能となり、従来P450モノオキシゲナーゼ活性の提示に必要だった電子伝達タンパク質との反応系の再構築検討実験の必要がなくなる。これにより、有用なP450生体触媒活性のスクリーニングの高速化、有用なP450酵素の簡便な精製、融合酵素遺伝子を発現した微生物による有用物質の生変換反応プロセスや産業廃水中の有害物質の酸化的除去等の実用的応用が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．P450モノオキシゲナーゼ
P450モノオキシゲナーゼは、シトクロムP450本体タンパク質（CYP）以外に電子伝達タンパク質を必要とする複合酵素である。すなわち、P450が活性を発揮するには、NAD(P)Hから電子を伝達してくるタンパク質として、細菌や真核生物のミトコンドリアでは フェレドキシンレダクターゼとフェレドキシンの介在を必要とし、哺乳動物の肝臓ミクロソームでは NADPH-P450レダクターゼの介在を必要とする。一次構造上の特徴としてP450にはFXXGXR/HXCXGという共通配列がC末端から５０〜６０残基手前に存在する。この配列はヘム結合領域と呼ばれ、P450に独特の配列であり、塩基配列から推定されるアミノ酸配列にこの配列が見つかると、そのDNAはP450をコードしている遺伝子とみなされる( 大村ら編  P450の分子生物学 2003年  講談社サイエンティフィック)。P450遺伝子の分類はアミノ酸配列の類似度を基準にして行われ、最新情報はNelson博士のホームページ（http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html）に掲載される。公認された命名法において、P450スーパーファミリーに属する遺伝子は共通の接頭辞CYPで始まり、それに続くファミリー番号、サブファミリー記号、遺伝子番号によって区別される。アミノ酸配列が40％以上一致すれば同一ファミリーに、55％以上一致すれば同一サブファミリーに分類されるのが原則である。
【００３２】
本発明において、モノオキシゲナーゼ活性とは、酸素分子を還元して１分子の水を作ると共に、残りの酸素原子を様々な低分子有機化合物に導入して、酸化生成物に変換する反応を触媒する作用を意味する。また、P450モノオキシゲナーゼとは、還元状態で一酸化炭素を通気すると吸収スペクトルが変化し450 nmに極大をもつ差スペクトル（CO差スペクトル）が現れる性質を有し、さらにモノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質を意味する。
【００３３】
２．Ｐ450モノオキシゲナーゼCYP153ファミリー
Ｐ450モノオキシゲナーゼCYP153ファミリーは、最初にアシネトバクター・カルコアセツカス（Acinetobacter calcoaceticus）EB104株においてCYP153A１が発見された（非特許文献5）。その後、アルカンの資化能を有する微生物数種類でもCYP153ファミリーに属するP450が発見されている（Nelson博士のホームページ（http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html））。CYP153ファミリーの機能に関しては、アルカン（オクタン）資化能を喪失したシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）を宿主として、CYP153A1遺伝子を発現させ、オクタン入り培地での生育状態を観察することによって、同P450がオクタンの末端に水酸基を導入するモノオキシゲナーゼであることを示唆する報告がある（非特許文献6）。なお、CYP153ファミリーに属するP450に限らず、P450がアルカンの末端に水酸基を導入する活性を有していることを直接観察した報告は無く、本発明者によって初めて報告されるものである。なお、微生物由来の一般的なP450は、その酸化反応を触媒するために電子伝達タンパク質としてフェレドキシンレダクターゼ（ferredoxin reductase）とフェレドキシン（ferredoxin）の介在が必要であると考えられている。
【００３４】
３．カセットPCR法
（１）P450遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチドの作製
本発明のP450遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチド（以下「本オリゴヌクレオチド」という）は、配列番号５１又は５２記載のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配列、又はそれと相補的な塩基配列を含み、かつプライマーとして実質的に機能を有するオリゴヌクレオチドである。本オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用することによりP450遺伝子断片の単離が可能となる。本発明において、「オリゴヌクレオチド」とはデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドいずれをも意味し、「核酸」とはＤＮＡ又はＲＮＡいずれをも意味する。
【００３５】
本オリゴヌクレオチドは、Nelsonのホームページ（http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html）に登録されているP450スーパーファミリーのCYP153Aに属するもの３つ、すなわち、CYP153A1（accession no. AJ311718）、CYP153A2（accession no. AE005680）、CYP153A13a（配列番号５７）のアミノ酸配列に基づいて設計されたものである。すなわち、本オリゴヌクレオチドは、これらの配列のアライメントによって予測されたP450の保存領域に基づいて設計されたものである。
【００３６】
また、本オリゴヌクレオチドは、プライマーとして実質的な機能を有するように設計される。本発明において「プライマーとして実質的な機能を有する」とは、特異的なアニーリング又はハイブイダイズが可能な条件を満たす、例えば特異的なアニーリングまたはハイブリダイズが可能な長さ及び塩基組成（融解温度）を有する、という意味である。すなわち、本オリゴヌクレオチドは、その配列の長さが短いために又はその塩基組成が適切ではないために非特異的なアニーリングを頻繁に引き起こし、P450の特異的な増幅に使用できないオリゴヌクレオチドを排除することを意味するものである。本オリゴヌクレオチドがプライマーとして実質的な機能を有する長さとしては、好ましくは10塩基以上であり、さらに好ましくは16塩基以上であり、最も好ましくは18塩基以上である。好適な本オリゴヌクレオチドの具体例としては、配列番号５３〜５６記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを例示することができる。
【００３７】
また、本オリゴヌクレオチドには、後述するハイブリッド遺伝子の作製のために、5’末端にアッセンブリー配列が付加されていてもよい。アッセンブリー配列とは、既知P450遺伝子断片とアニーリングすることができる配列のことである。本オリゴヌクレオチドをフォワードプライマー及びリバースプライマーとして用いて増幅されたP450遺伝子断片は、フォワードプライマーとリバースプライマーで挟まれた領域の配列しか有していない。すなわち開始コドンを含む5’末端の配列と終始コドンを含む3’末端の配列が欠けている。この欠けている配列は、既知のP450遺伝子の5’末端断片及び3’末端断片とアニーリングさせ、伸長反応を行うことにより補うことができる。このとき既知P450遺伝子の5’末端断片又は3’末端断片とのアニーリングに供される配列がアッセンブリー配列である。本オリゴヌクレオチドがフォワードプライマーとして使用される場合には、アッセンブリー配列は、通常既知5’末端断片の3’末端配列となる。また本オリゴヌクレオチドがリバースプライマーとして使用される場合には、アッセンブリー配列は、通常既知3’末端断片の5’末端配列となる。本オリゴヌクレオチドには、このアッセンブリー配列が付加されたものも含まれる。
【００３８】
付加されるアッセンブリー配列の長さは既知5’末端断片または3’末端断片とのアニーリングが可能であり、かつ核酸増幅反応の妨げにならない長さであればよい。好ましくは５〜50塩基であり、さらに好ましくは10〜20塩基である。
本オリゴヌクレオチドは、ホスファイト法やホスホトリエステル法等の当業者に公知の方法に従って合成することができる。
【００３９】
（２）新規P450遺伝子断片の単離
新規P450遺伝子断片の単離は、「（１）P450遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチドの作製」の項に記載のオリゴヌクレオチドを用いて行うことができる。通常は、本オリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅反応を行うことにより、新規P450遺伝子断片を単離することができる（以下、「本単離法」という）。
【００４０】
本単離法において、新規P450遺伝子断片の単離を行う対象となる試料は、原核生物由来の核酸が含まれていると思われるものであればどのようなものでもよい。試料の例としては、微生物を人工的に培養した培養物の他、未知の微生物が雑多に含まれている環境由来の試料等が挙げられる。環境由来の試料の例としては、例えば、海水、淡水、土壌等が挙げられる。本単離法においては、通常、試料から核酸の抽出を行う。抽出する核酸は、DNA又はRNAのいずれでもよい。DNA又はRNAは、当技術分野で周知の方法を適宜使用して抽出することができる。例えば、DNAを抽出する場合には、フェノール抽出及びエタノール沈殿を行う方法、ガラスビーズを用いる方法など、またRNAを抽出する場合には、グアニジン−塩化セシウム超遠心法、ホットフェノール法、又はチオシアン酸グアジニウム−フェノール−クロロホルム（AGPC）法などを利用することができる。また、試料が海水、淡水等の液体である場合には、核酸の抽出作業を行う前に、試料の濃縮作業を行うことが望ましい。試料の濃縮は、適当な孔径のフィルターで試料をろ過することにより行うことができる。ろ過に使用するフィルターの材質は、フィルターに一般的に使用されるものであれば特に限定されないが、例えば、セルロースアセテート、ニトロセルロース、セルロース混合エステル、ポリビニリデンジフロライド、ポリテトラフルオロエチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、銀等が例示される。また、培地を含浸させた担体を水中に設置し、担体に付着した微生物由来を効率よく回収する手法も考案されている。（特開2003-334064）。以上のようにして回収した試料からは、必要に応じてSDS等の界面活性剤等で細胞を破壊した後、上記記載の適当な方法で核酸を抽出することができる。
【００４１】
また、試料が土壌である場合にも、当業者に公知の技術によって、核酸を抽出することができる。土壌から核酸を抽出する方法としては、例えば、Zhouらの方法（Zhou et al  Appl. Environ. Microbiol. 62: 316-322 (1996)）やGriffithsらの方法（Griffiths. Appl. Environ. Microbiol. 66: 5488-5491 (2000)）を挙げることができる。
【００４２】
上記のように抽出した核酸から、「（１）P450遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチドの作製」の項に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることにより、P450遺伝子断片を単離することができる。上記のように抽出した核酸を鋳型とし、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて核酸増幅反応を行うことにより、P450遺伝子断片を特異的に増幅することができる。通常、配列番号51記載のアミノ酸配列に基づいて設計された本オリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして使用し、配列番号52記載のアミノ酸配列に基づいて設計された本オリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして使用する。なお、核酸増幅反応においてプライマーとして使用する本オリゴヌクレオチドは、縮重プライマー（degenerated primer）であってもよい。核酸増幅反応を行う手法は、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅反応を行うことができる方法であれば特に限定されないが、最も適した方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法の原理を利用した公知の方法を挙げることができる。増幅は、増幅産物が検出可能なレベルになるまで行う。例えば、PCR法は、DNAを鋳型として、DNAポリメラーゼにより、一対のプライマー間の塩基配列を合成するものである。PCR法によれば、変性、アニーリング及び合成からなるサイクルを繰り返すことによって、増幅断片を指数関数的に増幅させることができる。PCRの最適条件は、当業者であれば容易に決定することができる。またRT-PCR法では、まず、RNAを鋳型として、逆転写酵素反応によりcDNAを作製し、その後、作製したcDNAを鋳型として一対のプライマーを用いてPCR法を行うものである。本オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた場合において、P450遺伝子の特異的な増幅が起こるような条件は、プライマーとして用いた本オリゴヌクレオチドの長さ及び塩基組成から、当業者であれば適宜設定することができる。増幅されたP450遺伝子断片は、アガロースゲル電気泳動等によって分画し、増幅の確認されたバンドを切り出して、DNAを抽出することによって得ることができる。
【００４３】
（３）ハイブリッドP450遺伝子の作製方法
「（２）新規P450遺伝子断片の単離」記載の方法で増幅されたP450遺伝子断片は、本オリゴヌクレオチドとアニーリングする領域に挟まれた領域の配列しか含まない。すなわち、開始コドンを含む5'末端領域及び終止コドンを含む3'末端領域は含まれていない。そのため、（２）記載の方法で増幅されたP450遺伝子断片では、P450遺伝子としての機能を持たない場合がある。この問題を解決し、P450遺伝子として機能するDNA断片を得るためには、（２）記載の方法で増幅されたP450遺伝子断片の両端を既知のP450遺伝子の配列で補えばよい。両端部の補充に使用する既知P450遺伝子は、これまでに公知となっている細菌由来のP450遺伝子であれば、どのようなものでもよいが、配列番号５1及び５２記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでいることが好ましい。そのようなP450遺伝子の例としては、Nelson博士のホームページ（http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html）に登録されているP450スーパーファミリーのCYP153Aに属する遺伝子を挙げることができる。
【００４４】
（２）記載の方法で増幅されたP450遺伝子断片の両端部を既知のP450遺伝子の配列で補うことにより、中央部が未知P450遺伝子の塩基配列であり、両末端部が既知P450伝子の塩基配列であるハイブリッド遺伝子を作製することができる。このハイブリッドP450遺伝子は、適当な宿主に導入することにより、P450を生産することが可能である。該P450遺伝子は、（２）記載の方法でP450遺伝子断片の増幅を行った後、既知P450遺伝子の5'末端領域（開始コドンから（２）記載の増幅法で使用されたフォワードプライマーとアニーリングする領域まで：以下、「5-armフラグメント」という）と、3'末端領域（（２）記載の増幅法で使用されたリバースプライマーとアニーリングする領域から終始コドンまで：以下、「3-armフラグメント」という）とアニーリングさせた後、伸長反応を行うことによって得ることができる。
【００４５】
ハイブリッドP450遺伝子を得る場合に使用するプライマーは、「（１）P450遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチド」の項で記載したアセンブリー配列を付加されたものでもよい。アッセンブリー配列を付加されたプライマーを使用することにより、増幅されたP450遺伝子断片と5-armフラグメント及び3-armフラグメントとのアニーリング効率を高めることができる。5-armフラグメント及び3-armフラグメントは、両端部を補う既知P450遺伝子を含むDNAを鋳型として核酸増幅反応を行うことにより作製することができる。プライマーの設計及び合成は、当業者に公知の知見に基づいて行うことができる。また、増幅反応の反応条件は、使用するプライマーの長さ及び塩基組成に基づき、当業者に公知の知見により設定することができる。（２）記載の増幅反応により増幅されたP450遺伝子断片と5-armフラグメント及び3-armフラグメントとのアニーリング反応、及びそれに続く伸長反応によって得られたハイブリッドP450遺伝子は、引き続き核酸増幅反応を行うことによって増幅することができる。増幅反応のプライマーには、5-armフラグメント及び3-armフラグメントをそのままプライマーとして用いることもできるが、5-armフラグメントの開始コドンを含む領域、及び3-armフラグメントの終始コドンを含む領域の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして加えた方が好ましい。プライマーの設計及び合成は、当業者に公知の知見に基づいて行うことができる。また、増幅反応の反応条件は、使用するプライマーの長さ及び塩基組成に基づき、当業者に公知の知見により設定することができる。増幅されたハイブリッドP450遺伝子は、アガロースゲル電気泳動法等によって核酸断片を分画し、増幅の確認されたバンドを切り出してDNAを抽出することにより単離することができる。
【００４６】
（２）記載の方法によって得られたP450遺伝子断片及び上述した方法によって得られたハイブリッド遺伝子が、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質、すなわちP450コードする遺伝子であるかどうかは塩基配列から推定されるアミノ酸配列にFXXGXR/HXCXG という共通配列がC末端から５０〜６０残基手前に存在するかどうかを調べることで確認することができる。また、得られた核酸断片を含む発現ベクターを適当な宿主に導入し、宿主の培養菌体又は宿主菌体の細胞を破砕した粗抽出液を用いてCO差スペクトル及びモノオキシゲナーゼ活性の有無を調べることでも確認することができる。
【００４７】
発現ベクターの作製、宿主の選択及び宿主への発現ベクターの導入は、多くの実験書に記載されているので（たとえば、Sambrook, J., Russel,D. W., Molecular Cloning  A Laboratory Manual, 3rd Edition, CSHL Press, 2001）、それらに従った公知の遺伝子工学的手法により行うことができる。
【００４８】
宿主に導入する発現ベクターには、ファージ、ファージミドベクター又はプラスミドベクターを用いることができる。また、宿主は、発現ベクターが機能するものであれば真核細胞でも原核細胞でも特に限定されず、動物細胞、酵母細胞、放線菌、細菌細胞等を使用することができる。細菌細胞の中で好適なものとしては、大腸菌、枯草菌等が挙げられる。また、発現ベクターは、挿入した遺伝子断片又はハイブリッド遺伝子の上流に、プロモーター等の発現調節領域を有している必要がある。そのような発現調節領域の例としては、例えば大腸菌を宿主として使用した場合には、lacプロモーター等が挙げられる。発現ベクターを導入した宿主は、宿主に応じた適当な培地で培養し、得られた菌体又は菌体を破砕した粗抽出液を用いてCO差スペクトル及びモノオキシゲナーゼ活性の測定を行えばよい。CO差スペクトルの測定は、粗抽出液を亜二チオン酸ナトリウム（Na2S2O4）で処理し、一酸化炭素を通気した後、吸光スペクトルを測定し、450 nmに極大をもつ差スペクトルを観察することで行うことができる。モノオキシゲナーゼ活性の測定は基質となる低分子の有機化合物の存在下において、P450遺伝子断片又はハイブリッド遺伝子、及び電子伝達タンパク質遺伝子を含む発現ベクターが発現する条件で宿主細胞を培養するか、P450遺伝子断片又はハイブリッド遺伝子、及び電子伝達タンパク質遺伝子を含む発現ベクターを発現させて培養した宿主細胞の粗抽出液を反応させ、基質の酸化が起こるかどうかを調べることにより行うことができる。
【００４９】
上記の方法によって、クローンの培養菌体からDNAを抽出することにより、P450遺伝子断片又はP450ハイブリッド遺伝子を得ることができる。
【００５０】
４．P450遺伝子単離用キット
本発明のP450遺伝子単離用キット（以下、「本キット」という）は、「３．カセットPCR法」の項に記載のハイブリッドP450遺伝子を単離するためのものである。本キットは、少なくとも、「３．カセットPCR法」の項に記載のオリゴヌクレオチドと、5-armフラグメント及び3-armフラグメントを含むことを特徴としている。
【００５１】
（１）一段階目の核酸増幅反応用プライマー
「３．カセットPCR法」の項に記載したように、ハイブリッドP450遺伝子を増幅するためには、二段階の核酸増幅反応を行う必要がある。一段階目の核酸増幅用プライマーには、「（１）P450遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチドの作製」の項に記載のオリゴヌクレオチドがフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使われる。具体的には、配列番号５１記載のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして使用し、配列番号５２記載のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして使用する。本キットは、これらのフォワードプライマー及びリバースプライマーを少なくとも一組含むことを特徴としている。これらのフォワードプライマー及びリバースプライマーは縮重プライマー（degenerated primer）であってもよい。
本キットに含まれるプライマーにはアッセンブリー配列が付加されていてもよい。
【００５２】
（２）5-armフラグメント及び3-armフラグメント
本キットは、「３．カセットPCR法」の項に記載した5-armフラグメント及び3-armフラグメントを含むことを特徴としている。5-armフラグメントは、既知P450遺伝子において、少なくとも、開始コドンから配列番号５１記載のアミノ酸配列をコードする領域までを含む核酸断片である。また、3-armフラグメントは、既知P450遺伝子において、少なくとも、配列番号５２記載のアミノ酸配列をコードする領域から終始コドンまでを含む核酸断片である。なお、「（１）一段階目の核酸増幅反応用プライマー」の項に記載したプライマーが、アッセンブリー配列を付加されているものである場合には、必ずしも配列番号５１又は５２記載のアミノ酸配列をコードする領域を含んでいる必要はない。5-armフラグメント及び3-armフラグメントの基となる既知P450遺伝子は、細菌由来のものであればどのようなものでも構わないが、配列番号５１及び５２記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでいることが好ましい。5-armフラグメント及び3-armフラグメントは、一本鎖DNAであってもよいし、二本鎖DNAであってもよい。
【００５３】
（３）その他の成分
本キットは、核酸増幅反応用のバッファー、dNTP混合物、酵素類（DNAポリメラーゼ等）等を含んでいてもよい。また、二段階目の核酸増幅反応のために、5-armフラグメントの開始コドンを含む領域に基づいて設計されたフォワードプライマーと、3-armフラグメントの終始コドンを含む領域に基づいて設計されたリバースプライマーを含んでいてもよい。
【００５４】
５．新規P450遺伝子
本発明の新規P450遺伝子（以下、「本P450遺伝子」）は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である。
（ａ）配列番号１〜２５又は配列番号８５のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１〜２５又は配列番号８５のいずれかのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつP450として機能するタンパク質
【００５５】
配列番号８５以外の（ａ）のタンパク質は、「３．カセットPCR法」の「（３）ハイブリッドP450遺伝子の作製方法」の項に記載された方法により、環境サンプルから抽出したDNAを基に作製されたハイブリッドP450遺伝子が生産するタンパク質である。配列番号８５のタンパク質は、グラム陽性細菌であるノカルディア科Hou_Blue株より単離された新規の遺伝子（配列番号８６）によりコードされるタンパク質である。（ａ）のタンパク質をコードする遺伝子の具体的な例としては、配列番号２６〜５０又は配列番号８６のいずれかの塩基配列で表される遺伝子が挙げられる
【００５６】
（ｂ）のタンパク質は、（ａ）のタンパク質に、P450としての機能を失わせない程度のアミノ酸変異が導入されたタンパク質である。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。人為的変異を生じさせる手段としては、部位特異的変異誘発法（Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982）などを挙げることができるが、これに限定されるわけではない。変異したアミノ酸の数は、モノオキシゲナーゼ活性を失わせない限り、その個数は制限されないが、好ましくは２０アミノ酸以内であり、更に好ましくは１０アミノ酸以内である。
【００５７】
なお、本P450遺伝子は、「３．カセットPCR法」の「（３）ハイブリッドP450遺伝子の作製方法」の項に記載された方法において、両末端を補う既知遺伝子として配列番号５７記載のアミノ酸配列をコードするアルカニボラックス・ボルクメンシス（Alcanivorax borkumensis）SK2株からクローニングしたCYP153A13a遺伝子を使用している。
【００５８】
本P450遺伝子は、以下に述べる方法によって得ることができる。まず、環境サンプル抽出DNAに由来する中央部の配列を公知のDNA合成法によって合成する。次に、アルカニボラックス・ボルクメンシスSK2から抽出したDNAを鋳型として、配列番号５４及び６１記載の塩基配列で表されるプライマーのセット、又は配列番号５６及び６２記載の塩基配列で表されるプライマーのセットを用いて核酸増幅反応を行い、5-armフラグメント及び3-armフラグメントを増幅する。次に、合成した中央部の配列と5-armフラグメント及び3-armフラグメントをアニーリングさせて伸長反応を行う。その後、配列番号６１及び６２記載の塩基配列で表されるプライマーのセットを用いて核酸増幅反応を行うことにより、本P450遺伝子を増幅することができる。増幅された本P450遺伝子は、アガロースゲル電気泳動法等によって分画し、1.4Kbp付近に分画されたバンドを切り出すことにより得ることができる。
【００５９】
上記のような方法によって得られたDNA断片は、チェーンターミネーター法やマキサム−ギルバート法等の公知の方法に従って塩基配列を決定することにより、本P450遺伝子であることを確認することができる。
なお、本P450遺伝子は、上述した方法だけでなく、塩基配列情報に基づいて化学合成することによっても取得できる。
【００６０】
６．新規P450
本発明の新規P450は、以下の（ａ）又は（ｂ）で示されるタンパク質である。
（ａ）配列番号１〜２５又は配列番号８５のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１〜２５又は配列番号８５のいずれかのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつP450として機能するタンパク質
【００６１】
本発明の新規P450は、「５．新規P450遺伝子」の項で記載した本P450遺伝子を含む発現ベクターを適当な宿主細胞に導入し、培地で培養することによって得ることができる。発現ベクターの作製及び宿主細胞への導入は、既に述べた通り、公知の方法に従って行うことができる。かくして得られる本発明の新規P450は、宿主の培養菌体を破砕した後、通常の方法に従って、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、ゲルパーミネーションクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の蛋白質精製、蛋白質製造の分野で汎用されている方法に従って精製を行うことができる。これらのクロマトグラフィーにおけるP450画分の選択は、CO差スペクトルの有無を目安に行うことができる。
【００６２】
７．P450による酸化化合物の生産
本P450は、触媒として使用することにより、酸化化合物を生産することが可能である（以下、「本生産法」という）。酸化化合物の生産方法としては、本P450遺伝子を含む発現ベクターを導入した宿主細胞によって生産する方法と精製したP450によって生産する方法が挙げられる。
【００６３】
いずれの方法においても、P450により酸化反応を触媒するには一般的に電子伝達タンパク質の介在が必要となる。細菌の場合は、フェレドキシンとフェレドキシンレダクターゼが電子伝達タンパク質として使われることが多い。宿主細胞によって酸化化合物を生産する場合は、電子伝達タンパク質をコードする遺伝子を共発現させるか、電子伝達タンパク質とP450との融合タンパク質遺伝子として発現させることが望ましいが、宿主細胞に由来する電子伝達タンパク質を利用しても良い。精製したP450によって酸化化合物を生産する場合は、電子伝達タンパク質と、NAD(P)Hを添加しP450と共存させることが望ましい。
【００６４】
本生産法の基質となる化合物は、P450の基質として反応可能ないずれの化合物でもよい。本生産法によれば、例えば、アルカンからアルコールを、さらにアルケンからエポキシドを生産することができる。
【００６５】
また、精製酵素を使用した場合の本生産法は、溶液中にて行うことができるほか、精製した本P450を適当な担体に固定化し、基質と接触させることによっても行うことができる。本P450を固定化できる担体は、特に限定されないが、例えば、ガラスビーズ、シリカゲル等の無機担体、セルロース、キトサン、セファロース、デキストラン、ポリピニルアルコール、エチレン・酢酸ビニル共重合体、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレン、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストラン等の有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる複合担体等が挙げられる。また、担体表面には、P450の固定化反応に用い得る官能基が存在することが好都合である。これらの官能基の代表例としては、水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基、シラノール基、エポキシ基、アミド基、ハロゲン基、サクシニルイミド基、酸無水物基等が挙げられる。
【００６６】
上記担体へのP450の固定化においては、蛋白質の立体障害を小さくすることにより吸着効率を向上させ、さらには非特異的吸着を抑えるために、親水性スペーサーを介して固定化することが好ましい。親水性スペーサーとしては、例えば、両末端をカルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等で置換した適当な有機分子を用いることができる。
【００６７】
８．新規融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼ
融合型P450モノオキシゲナーゼが最近報告された（Roberts, G.A., et al, Identification of a new class of cytochrome P450 from a Rhodococcus sp. J. Bacteriol. 184: 3898-3908, 2002）。これはロドコッカス（Rhodococcus）属NCIMB9784株より単離されたP450モノオキシゲナーゼ（「P450RhF」と命名された）であり、P450本体タンパク質（ヘムドメイン）、フラビンモノヌクレオチド（FMN）を補酵素として分子内に含有するNADH-P450還元酵素ドメイン（フェレドキシン還元酵素様配列）、鉄イオウタンパク質ドメイン（フェレドキシン様配列）が1本のポリペプチドとして繋がったものである。
【００６８】
本発明の融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼは、このP450RhFに含まれる還元酵素ドメインと同様の機能を持つペプチドをP450本体タンパク質のC末端側に、リンカー部分を介して、付加してなるものである。
P450RhFに含まれる還元酵素ドメインと同様の機能を持つペプチドとしては、（ａ）配列番号７０記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｂ）配列番号７０記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるペプチド、又は（ｃ）配列番号６９記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするペプチドなどを例示できる。
【００６９】
（ａ）のペプチドは、P450RhFにおける還元酵素ドメイン（NADH-P450還元酵素ドメインと鉄イオウタンパク質ドメインを含んだ領域）のペプチドである。
（ｂ）のペプチドは、（ａ）のペプチドに、（ａ）のペプチドの機能を失わせない程度のアミノ酸変異が導入されたペプチドである。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。人為的変異を生じさせる手段としては、部位特異的変異誘発法（Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982）などを挙げることができるが、これに限定されるわけではない。変異したアミノ酸の数は、（ａ）のペプチドの機能を失わせない限り、その個数は制限されないが、好ましくは２０アミノ酸以内であり、更に好ましくは１０アミノ酸以内である。
【００７０】
（ｃ）のペプチドは、DNA同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる（ａ）のペプチドと同様の機能を持つペプチドである。（ｃ）のペプチドにおける「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」程度であり、好ましくは「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」程度であり、更に好ましくは「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」程度である。ハイブリダイゼーションにより得られるDNAは、元のDNAと通常高い相同性を有する。高い相同性とは、60％以上の相同性、好ましくは75％以上の相同性、更に好ましくは90％以上の相同性を指す。
【００７１】
リンカー部分は、融合させる二つのタンパク質（ペプチド）の機能を失わせないものであればどのようなものでもよいが、（ｄ）配列番号６８記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｅ）配列番号６８記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるペプチド、又は（ｆ）配列番号６７記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするペプチドであることが好ましい。
【００７２】
（ｄ）のペプチドは、P450RhFのP450本体部分と、還元酵素ドメインとの間に存在するペプチドである。
（ｅ）のペプチドは、（ｄ）のペプチドに、リンカーとしての機能を失わせない程度のアミノ酸変異が導入されたペプチドである。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。人為的変異を生じさせる手段としては、部位特異的変異誘発法（Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982）などを挙げることができるが、これに限定されるわけではない。変異したアミノ酸の数は、リンカーとしての機能を失わせない限り、その個数は制限されないが、好ましくは５アミノ酸以内であり、更に好ましくは３アミノ酸以内であり、最も好ましくは１アミノ酸である。
【００７３】
（ｆ）のペプチドは、DNA同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる（ｄ）のペプチドと同様の機能を持つペプチドである。（ｆ）のペプチドにおける「ストリンジェントな条件」の意味は、（ｃ）のペプチドの場合と同じである。
【００７４】
使用するP450本体タンパク質に特に制限はなく、たとえば、細菌のゲノムDNAライブラリーや環境より抽出したDNAなどからPCR 法等の通常の方法を用いて単離してきたDNAから生産されるタンパク質や既存のP450に対してPCRによる無作為変異導入法やDNAシャフリング法などにより変異を導入した遺伝子やハイブリッド遺伝子などから生産されるタンパク質を使用できる。P450本体タンパク質は、細菌、植物、動物のいずれに由来するものを使ってもよいが、特に細菌由来のものを使用するのが好ましい。細菌由来のP450本体タンパク質としては、アシネトバクター・カルコアセツカム由来のP450本体タンパク質を例示できる。また、P450本体タンパク質としては、「６．新規P450」の項に記載のタンパク質を使用してもよい。
【００７５】
９．融合型P450モノオキシゲナーゼによる酸化化合物の生産
「８．新規融合型P450モノオキシゲナーゼ」の項に記載したタンパク質は、触媒として使用することにより酸化化合物を生産することが可能である。酸化化合物の生産方法としては、本融合型P450モノオキシゲナーゼ遺伝子を含む発現ベクターを導入した宿主細胞によって生産する方法と精製した本融合型P450モノオキシゲナーゼによって生産する方法が挙げられる。
【００７６】
いずれの方法においても、本融合型P450モノオキシゲナーゼはそれ自身の中に電子伝達タンパク質を有しているので、フェレドキシンやフェレドキシン還元酵素（レダクターゼ）といった電子伝達タンパク質の介在を必要としない。したがって、宿主細胞によって酸化化合物を生産する場合は、電子伝達タンパク質をコードする遺伝子を共発現させる必要はない。また、精製した本融合型P450モノオキシゲナーゼによって酸化化合物を生産する場合は、新たに電子伝達タンパク質を共存させる必要は無い。なお、この融合型P450モノオキシゲナーゼを精製する場合は、「７．P450による酸化化合物の生産」の項に記載した方法と同様の方法により行うことができる。
【００７７】
本生産法の基質となる有機化合物は、P450の基質として反応可能ないずれの化合物でもよい。本生産法によれば、例えば、アルカン（直鎖状炭化水素）、アルケン（不飽和結合を含む直鎖状炭化水素）、環状炭化水素、及び、分子内に芳香環を含むアルカンやアルケンなどの有機化合物を基質として、末端メチル基の水酸化体や末端オレフィンのエポキシ体等の酸化化合物を生産することができる。具体的には、n-へキサン、n-へプタン、n-オクタン、n-デカン、1-オクテン、シクロヘキサン、n-ブチルベンゼン、4-フェニル-1-ブテン、又は2-n-ブチルベンゾフランからそれぞれ1-ヘキサノール、1-ヘプタノール、1-オクタノール、1-デカノール、1,2-エポキシオクタン、シクロヘキサノール、4-フェニル-1-ブタノール、2-フェネチルオキシラン、又は4-ベンゾフラン-2-イル-ブタン-1-オールを生産することができる。
【実施例】
【００７８】
以下、実施例により本発明について具体的に説明する。もっとも、本発明はこれにより限定されるものではない。
【００７９】
〔実施例１〕環境由来DNAの調製
多様な環境由来のDNAからP450遺伝子を獲得するため以下の環境由来サンプルからDNAを抽出した。
【００８０】
１．ポナペ・パラオ海域サンプル
培地を含浸させた担体を海水中に設置し、担体に付着した微生物由来のDNAを効率よく回収する手法が考案されている（特開2003-334064号公報）。今回、NSW培地（0.1% NH4NO3、0.002% クエン酸第二鉄、0.002% K2HPO4、0.05% 酵母抽出液、80%  濾過海水、1.5%  寒天）に滅菌済みの人工スポンジを入れ、培地を含ませた後、培地中の寒天を凝固させた人工スポンジを作製し、この人工スポンジをミクロネシア連邦共和国ポナペ州沿岸、パラオ共和国沿岸の海底5〜6 mの位置に設置した。設置した人工スポンジは3日後に引き上げて、微生物が付着した人工スポンジの小片を凍結後粉砕し、人工スポンジに付着した微生物からDneasy Plant Kit（キアゲン社製）を用いてDNAを回収した。
【００８１】
２．淡水サンプル
岩手県久慈市石油備蓄基地から地下水、また、北海道天塩郡豊富温泉から温泉水を回収し、フィルター（GV type: 0.22 μm、 47 mm、ミリポア社製）により水中の微生物を選択的に濃縮した。微生物を濃縮したフィルター1枚に対して5 mlの10 mM Tris-HCl バッファー(pH 8.0: 1 mM EDTA, 0.35 M sucrose)と10 mg/ml のプロテイナーゼＫ (10 mM Tris-HClに溶解)200 μlを加え、37℃で30分間インキュベートした。インキュベート後、激しく攪拌し細菌を懸濁させた。沈殿を除いた後にlysing solution (100 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0: 0.3 M NaCl, 20 mM EDTA, 2% sodium dodecyl sulfate) 7.5 ml を加え激しく攪拌した。さらに、10 ml のフェノール、クロロフォルム、イソミルアルコール50 : 4 9 : 1の溶液を加えた。５分後、遠心分離（5000  rpm, 15 min）を行い、上層を回収した。次に、2倍量の99％エタノールを添加し攪拌後、−80℃で2時間冷却した。その後、遠心分離（15000 rpm, 15 min）によりDNAを沈殿させ、冷却70％エタノールを加えて、さらに遠心分離（15000 rpm, 15  min）を行い沈殿画分としてDNAを回収した。
【００８２】
３．土壌サンプル
新潟県西山町の原油採掘井戸の油汚染土壌5 g に対して5 mlの10 mM Tris-HCl バッファー(pH 8.0: 1 mM EDTA, 0.35 M sucrose)と10 mg/ml のプロテイナーゼＫ (10 mM Tris-HClに溶解)200 μlを加え、37℃で30分間インキュベートした。インキュベート後、激しく攪拌し細菌を懸濁させた。沈殿を除いた後にlysing solution (100 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0: 0.3 M NaCl, 20 mM EDTA, 2% sodium dodecyl sulfate) 7.5 ml を加え激しく攪拌した。さらに、10 ml のフェノール、クロロフォルム、イソミルアルコール50 : 4 9 : 1の溶液を加えた。５分後、遠心分離（5000  rpm, 15 min）を行い、上層を回収した。次に、2倍量の99％エタノールを添加し攪拌後、−80℃で2時間冷却した。その後、遠心分離（15000 rpm, 15 min）によりDNAを沈殿させ、冷却70％エタノールを加えて、さらに遠心分離（15000 rpm, 15  min）を行い沈殿画分としてDNAを回収した。
【００８３】
〔実施例２〕PCRプライマーの設計
本発明者は、報告されているP450スーパーファミリーのCYP153Aサブファミリーに属するもの３つ、すなわち、CYP153A1（accession no. AJ311718）、CYP153A2（accession no. AE005680）、CYP153A13a（配列番号５８）のアミノ酸配列をアライメントした際に、２ヶ所の保存領域、すなわち、MFIAMDPP（N末側）、HRCMGNRL（C末側）があることを見出した。そこで、この２つの保存領域のアミノ酸配列（MFIAMDPP、HRCMGNRL）に基づいて４種類のプライマーを設計した。設計したプライマーは、保存アミノ酸配列MFIAMDPP側（N末側）（配列番号５１）として5’- ATGTTYATHGCNATGGAYCCNC-3’（配列番号５３）とその相補鎖である5’-GNGGRTCCATNGCDATRAACAT-3’（配列番号５４）であり、保存アミノ酸配列HRCMGNRL側（C末側）（配列番号５２）として5’- NARNCKRTTNCCCATRCANCKRTG-3’（配列番号５５）とその相補鎖である5’- CAYMGNTGYATGGGNAAYMGNYT-3’（配列番号５６）であった。プライマー配列中、YはCまたはT、HはA、CまたはT、NはA、T、G、またはC、RはAまたはG、DはA、GまたはT、KはGまたはT、MはAまたはCである。
【００８４】
〔実施例３〕P450遺伝子の増幅
実施例１で調製したDNAを鋳型とし、実施例２で設計したプライマーを用いてPCR法による増幅反応を行った。プライマーの組み合わせは配列番号５３のプライマーに対して配列番号５５のプライマーである。反応液はDNAポリメラーゼAmplitaq Gold（アプライドバイオシステムズ社製）0.5 unit、添付ポリメラーゼ用緩衝液5 μl、2 mM  dNTPを5  μl、50 pmol/μlの両プライマー各4 μl、各環境サンプルより調製したDNAを100 ng添加し、最後に滅菌水で調整し合計50 μlとした。反応は94℃、10分間 の熱変性後、94℃で30秒、58℃で45秒、72℃で1分を１サイクルとし、これを35サイクル行い、最後に72℃で10分間反応させた。増幅の確認は1.5％アガロースゲル電気泳動で行った。想定される長さ（約0.85 Kbp）のDNAをアガロースから切り出し、QIAquick Gel Extraction kit (キアゲン社製)により精製した。
【００８５】
〔実施例４〕アルカニボラックス・ボルクメンシスSK2株からのP450遺伝子の単離
本発明者は、アルカン資化性の海洋細菌アルカニボラックス・ボルクメンシス（Alcanivorax borkumensis）SK2株（DSM 11573株）からCYP153A13a（配列番号５８）を含むDNA断片を以下のようにして単離した。
【００８６】
最初に、長鎖のn-アルカン資化細菌であるアシネトバクター・カルコアセツカス（Acinetobacter calcoaceticus）EB104株のP450モノオキシゲナーゼの配列CYP153A1（accession no. AJ311718）をもとに２本のプライマー配列、配列番号59（5'-GCCGATGGAGTTTATGGGCAAT-3'）と配列番号60 (5'-GTACCACATCACCACCTTGTCGCC-3')を設計し、アルカニボラックス・ボルクメンシスSK2株より抽出したゲノムDNAをテンプレートにPCR法で増幅した。PCR Optimizer kit (インビトロゲン社製)により16種類のバッファーを用い、94℃で1分、55℃で2分、72℃で3分の条件で40サイクルの増幅を行った。また、増幅の確認は2%のアガロース電気泳動を行った。その結果、P450遺伝子断片（約250 bp）の増幅が確認された。そこで、増幅したP450遺伝子断片をプローブとしてハイブリダイゼーションによるP450モノオキシナーゼ遺伝子のクローニングを行った。最初に、アルカニボラックス・ボルクメンシス由来ゲノムDNAを制限酵素Sau3AIで部分分解し、コスミドベクターSuperCos 1のBamHI サイトに連結し、LAMBDA INN (和光純薬社製)を用いてファージ粒子にパッケージングした。そして、大腸菌XL1-Blue MR株に、そのファージを感染させ、抗生物質アンピシリンに耐性のコロニーをピックアップし、コスミドライブラリーを作製した。次に、AlkPhos Direct Labelling and Detection System（アマシャムバイオサイエンス社製）を用い、添付のプロトコールに従って、コロニーハイブリダイゼーションを行った。標識されたポジティブクローンを回収しAlkPhos Direct Labelling and Detection System（アマシャムバイオサイエンス社製）を用い、添付のプロトコールに従って、サザンハイブリダイゼーションを行った結果、P450モノオキシゲナーゼ遺伝子断片にハイブリダイズするバンドが検出された。そこで、得られたクローンのDNA配列の解析を行った結果、CYP153ファミリーに属するP450モノオキシゲナーゼ遺伝子（CYP153A13a：DNA配列を配列番号５８、アミノ酸配列を配列番号５７に示す。）全長のクローニングが確認された。
【００８７】
〔実施例５〕ハイブリッド遺伝子の作製
アルカニボラックス・ボルクメンシス（Alcanivorax borkumensis）SK2株よりクローニングしたCYP153A13a遺伝子（配列番号５８）から、開始コドンを含み、保存領域（アミノ酸配列MFIAMDPP）をコードする部位までのDNAフラグメント（以下「5-arm」とする）と第２の保存領域（アミノ酸配列HRCMGNRL）をコードする部位から終始コドンまでのDNAフラグメント（以下「3-arm」）をPCRによって増幅した。5-armについては次の通りPCRを行った。反応液はDNAポリメラーゼAmplitaq Gold（アプライドバイオシステムズ社製）0.5 unit、添付ポリメラーゼ用緩衝液5 μl、2mM  dNTPを5 μl、50 pmol/μlの配列番号６１（5’-CACCATGTCAACGAGTTCAAGTA-3’）と配列番号５４のプライマー各4 μlをCYP153A13a遺伝子がクローニングされたコスミドベクターを100 ng添加し、最後に滅菌水で調製し合計50μlとした。反応は94℃、10分間の熱変性後、94℃で30秒、58℃で45秒、72℃で1分を１サイクルとし、これを30サイクル行い、最後に72℃10分間反応させた。増幅の確認は1.5％アガロースゲル電気泳動で行った。3-armフラグメントについては、上記配列番号６１と５４の代わりに配列番号６２（5’-TGATTATTTTTTAGCCGTCAACT-3’）のプライマーと配列番号５６のプライマーを用いた。増幅の確認は1.5%アガロースゲル電気泳動で行った。想定される長さのDNAをアガロースから切り出し、QIAquick Gel Extraction kit (キアゲン社製)により精製した。続いて、実施例３で得られた環境サンプルから調製したDNAを基にしたPCR産物、および5-armと3-armフラグメントからPCRによりハイブリッド遺伝子を作製した。反応液はDNAポリメラーゼAmplitaq Gold（アプライドバイオシステムズ社製）0.5unit、添付ポリメラーゼ用緩衝液5μl、２ｍM  dNTPを5μl、50pmol/μlの配列番号６１と６２のプライマー各4 μl、実施例３で得られた環境サンプルから調製したDNAを基にしたPCR産物を20 ng、5-armフラグメント、3-armフラグメントを5 ng添加し、最後に滅菌水で調製し合計50μlとした。反応は94℃、10分間の熱変性後、94℃で30秒、58℃で45秒、72℃で1分を１サイクルとし、これを30サイクル行い、最後に72℃10分間反応させた。増幅の確認は1.5%アガロースゲル電気泳動で行った。想定される長さ(約1.4 Kbp)のDNAをアガロースから切り出し、QIAquick Gel Extraction kit (キアゲン社製)により精製した。精製したハイブリッド遺伝子はGATEWAYシステムpENTR Directional TOPO Cloning Kits（インビトロゲン社製）を用いてシーケンス用ベクター（pENTR/SD/D-TOPO）（インビトロゲン社製）へクローニングした。
【００８８】
〔実施例６〕DNA配列の解析
実施例５で得られたハイブリッド遺伝子の挿入されたプラスミドベクターを大腸菌（One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli インビトロゲン社製）に形質転換し、形質転換された大腸菌のコロニーをランダムに選抜し、LB液体培地(1% トリプトン、0.5% イーストイクストラクト、0.5% NaCl)に植え付け、プラスミドをQIAprep Spin Miniprep Kit  （キアゲン社製）で抽出した。次に、シーケンス反応をチェーンターミネーター法に基づくBig Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（アプライドサイエンス社製）を用いて行い、反応生成物の塩基配列をABI prism 3730 DNA Analyzerアプライドサイエンス社製）により解析することにより決定した。次に、得られた遺伝子配列の中から、推定されるアミノ酸配列のC末端から５０〜６０残基手前にFXXGXR/HXCXGというP450の共通配列が存在するものを選択した。同一な配列を除いたハイブリッド遺伝子のアミノ酸配列を配列番号１から２５、塩基配列を配列番号２６から５０に示す。
【００８９】
〔実施例７〕配列解析
実施例６で決定したハイブリッド化P450のアミノ酸配列（配列番号１から２５）と既知のP450のアミノ酸配列中の保存領域間（配列番号５１と５２）のアミノ酸配列を比較した。配列比較はアライメントソフトClustal W（Higgins, D. G., Thompson, J. D., and Gibson, T. J., Methods Enzymol. 266, 383-402, 1996）を用いて行った。既知のP450の配列はNCBIのBlast検索（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を行うことにより得た。配列比較の結果を図１には系統樹として示し、既知のCYP153Aサブファミリー4種との相同性を表１に示した。図１と表１の通り配列番号１から２５のアミノ酸配列中の保存領域間のアミノ酸配列は既知のP450のアミノ酸配列中の保存領域間の配列と異なる新規なものであることが示された。さらに、表１に示したように、ポナペ、パラオ海域、久慈地下水、北海道温泉水、新潟石油汚染土壌といった多様な環境サンプルから抽出した微生物由来のDNAを鋳型としてPCRを行うことにより新規のP450遺伝子を獲得できることが示された。
【表１】
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【００９０】
〔実施例８〕ハイブリッド遺伝子の発現
実施例７で新規な配列であることが示されたハイブリッド遺伝子の３種類を大腸菌により発現させ、その機能性を確認した。３種類（配列番号４、５、９）のP450をコードする遺伝子を、GATEWAYシステムLR Clonase反応を用いることで、タンパク質発現用プラスミドベクター(pDEST14インビトロゲン社製)に挿入し、これを大腸菌DH5α株（インビトロゲン社製）に形質転換し、LB液体培地に植え付け、プラスミドをQIAprep Spin Miniprep Kit  （キアゲン社製）で抽出した。次に、得られたプラスミドを大腸菌BL21-AI株（インビトロゲン社製）に形質転換し、終濃度50 μg / mlのアンピシリン（和光純薬社製）が添加された5mlのLB液体培地に植え付け、一晩培養したのち、得られた培養液1 mlを終濃度50 μg / mlのアンピシリンが添加された100 mlのLB液体培地に植え継ぎ、37℃で培養し対数増殖期に達した時点で1 mM 5-アミノレブリン酸塩酸塩（和光純薬社製）、0.5  mM FeCl3を添加し、25℃で30分間培養後、0.2%アラビノース（和光純薬社製）を添加し引き続き培養した。（25℃16時間）培養終了後、遠心分離機により集菌し、２０％グリセロール（和光純薬社製）を含むPBS（phosphate-buffered saline; 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4 and 2.68 mM KCl）にけん濁し、超音波破砕機により菌体を破砕し遠心分離により得られた上清を粗抽出液とした。配列番号４をコードする遺伝子を挿入したプラスミドベクターを含む大腸菌から得られた粗抽出液を粗抽出液A、配列番号５をコードする遺伝子を挿入したプラスミドベクターを含む大腸菌から得られた粗抽出液を粗抽出液B、配列番号９をコードする遺伝子を挿入したプラスミドベクターを含む大腸菌から得られた粗抽出液を粗抽出液Cとした。
【００９１】
〔実施例９〕CO差スペクトル分析による機能解析
P450は亜二チオン酸ナトリウム（Na2S2O4）で処理し、一酸化炭素を通気すると吸収スペクトルが変化し450 nmに極大をもつ差スペクトルが現れることが知られている。そこで、実施例８で得られた粗抽出液A、粗抽出液Bおよび粗抽出液C 1 mlに対して一酸化炭素を１秒当たり数泡程度の速さで1分間通気を行った後、亜二チオン酸ナトリウムを2 mg加え混合し、5分間放置した後、吸光スペクトルを測定し、処理前の粗抽出液との間でスペクトルの比較を行った。図２に示したように粗抽出液A、B、C共に還元条件下で一酸化炭素通気処理による450 nmの吸光度の上昇が観察された。したがって、抽出液A、B、Cがいずれにおいても可溶性で機能的なP450の発現が確認されたことになり、３種類（配列番号４、５、９）のアミノ酸配列がP450として機能するタンパク質であることが示された。
【００９２】
〔実施例１０〕シュードモナス・プチダ由来のプチダレドキシンとプチダレドキシンレダクターゼの単離
一般的な微生物由来のP450と同様に、今回得られた新規P450が酸化反応を触媒するためには電子伝達タンパク質としてフェレドキシンレダクターゼ（ferredoxin reductase）とフェレドキシン（ferredoxin）の介在が必要であると考えられる。そこで、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のプチダレドキシン（putidaredoxin）とプチダレドキシンレダクターゼ（putidaredoxin reductase）を電子伝達タンパク質として活用することを考案し、それぞれの遺伝子のクローニングを行った。
【００９３】
プチダレドキシンにおいては、プチダレドキシンをコードする遺伝子（accession no. D00528）より制限酵素サイトを付加したプライマー（5’-CGTCTCCCATGTCTAAAGTAGTGTATGTGT-3’配列番号６３  、5’-CGTCTCATCGATTACCATTGCCTATCGGGA-3’ 配列番号６４）を設計し、シュードモナス・プチダ由来のゲノムDNAを鋳型としてPCR法で増幅した。反応液はDNAポリメラーゼAmplitaq Gold（アプライドバイオシステムズ社製）0.5 unit、添付ポリメラーゼ用緩衝液5 μl、2 mM  dNTPを5 μl、50 pmol/μlの両プライマー各4 μl、調製したDNAを100 ng添加し、最後に滅菌水で調整し合計50 μlとした。反応は94℃、10 minの熱変性後、94℃で30秒、58℃で45秒、72℃で1分を１サイクルとし、これを30サイクル行い、最後に72℃で10分間反応させた。増幅の確認は1.5％アガロースゲル電気泳動で行った。想定される長さのDNAをアガロースから切り出し、QIAquick Gel Extraction kit (キアゲン社製)により精製した。
【００９４】
プチダレドキシンレダクターゼにおいては、プチダレドキシンレダクターゼをコードする遺伝子（accession no. D00528 ）より制限酵素サイトを付加したプライマー（5’-CGTCTCCCATGAACGCAAACGACAACGTGG-3’配列番号65  、5’-CGTCTCATCGATCAGGCACTACTCAGTTCA-3’ 配列番号６６）を設計し、シュードモナス・プチダ由来のゲノムDNAを鋳型としてPCR法で増幅した。反応液はDNAポリメラーゼAmplitaq Gold（アプライドバイオシステムズ社製）0.5 unit、添付ポリメラーゼ用緩衝液5 μl、2 mM  dNTPを5 μl、50 pmol/μlの両プライマー各4 μl、調製したDNAを100 ng添加し、最後に滅菌水で調整し合計50 μlとした。反応は94℃、10 minの熱変性後、94℃で30秒、58℃で45秒、72℃で1分を１サイクルとし、これを30サイクル行い、最後に72℃で10分間反応させた。増幅の確認は1.5％アガロースゲル電気泳動で行った。想定される長さのDNAをアガロースから切り出し、QIAquick Gel Extraction kit (キアゲン社製)により精製した。
【００９５】
次に、PCRによって単離したプチダレドキシンとプチダレドキシンレダクターゼをコードする遺伝子全長を制限酵素BsmBIで処理した。次いで、タンパク質発現用ベクターpET-28a（ノバジェン社製）も制限酵素SalI およびNcoIで処理した。これらをライゲーション（Ligation High、東洋紡社製）後、大腸菌JM109株（宝酒造社製）に形質転換し、LB液体培地に植え付け、プラスミドをQIAprep Spin Miniprep Kit  （キアゲン社製）で抽出した。
【００９６】
〔実施例１１〕基質の酸化活性の観察
実施例９において可溶性で機能的なタンパク質発現が確認された新規なP450である３種類（配列番号４、５、９）の、基質に対する酸素添加活性を確認した。
【００９７】
実施例１０において単離したシュードモナス・プチダ由来プチダレドキシンの挿入したタンパク質発現用ベクターは大腸菌Rosseta DE3 株（ノバジェン社製）に形質転換し、シュードモナス・プチダ由来プチダレドキシンレダクターゼの挿入したタンパク質発現用ベクターは大腸菌BL21 DE3 pLysS株（ノバジェン社製）に形質転換し、それぞれを5mlのLB液体培地に植え付け、一晩培養した。次に、得られた培養液1 mlを、プチダレドキシンの挿入したタンパク質発現用ベクターを形質転換した菌株においては終濃度25 μg / mlのカナマイシンが添加された100 mlのTB液体培地(1.2% トリプトン、2.4% イーストイクストラクト、0.4% グリセロール、0.231% KH2PO4、1.254% K2HPO4)に、プチダレドキシンレダクターゼの挿入したタンパク質発現用ベクターを形質転換した菌株においては終濃度50 μg / mlのクロラムフェニコールと終濃度25 μg / mlのカナマイシンが添加された100 mlのTB液体培地にそれぞれ植え次いだ。それぞれの培養液を37℃で培養し対数増殖期に達した時点でIsopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)を終濃度0.5 mMになるように添加し引き続き培養した。（30℃16時間）培養終了後、遠心分離機により集菌し、２０％グリセロールを含むPBSにけん濁し、超音波破砕機により菌体を破砕し遠心分離により得られた上清を粗抽出液とした。それぞれの粗抽出液と新規なP450である３種類（配列番号４、５、９）を発現させた粗抽出液を等量ずつ混合し粗酵素液とした。配列番号4のP450と２種の電子伝達タンパク質の粗抽出液で構成される粗酵素液を粗酵素液A、配列番号5のP450と２種の電子伝達タンパク質の粗抽出液で構成される粗酵素液を粗酵素液B、配列番号9のP450と２種の電子伝達タンパク質の粗抽出液で構成される粗酵素液を粗酵素液C、２種の電子伝達タンパク質の粗抽出液のみで構成される粗酵素液を粗酵素液Dとし酵素反応に使用した。酵素反応は、それぞれの酵素反応液に終濃度1 mMになるように基質を添加した後、25℃10分間放置し、終濃度5 mMになるようにNADPを添加して酵素反応を開始した。なお、基質としては、オクタン、デカン、１-デセンを使用した。25℃12時間の反応の後、終濃度0.2 Nになるように塩酸を添加し、酵素反応を停止した。次に、酵素反応後の粗酵素液に酢酸エチルを添加し、ガスクロマトグラフィー質量分析計(GCMS-QP5050A 島津製作所社製)により粗酵素液の酢酸エチル抽出画分の成分分析を行うことで、各基質の酸化物の有無を観察した。
【００９８】
最初に、粗酵素液B、Dによるオクタン、1-デセンを基質とした酵素反応の後、反応液から酢酸エチルにより抽出した画分の分析結果を図３に示す。オクタンを基質とした場合、粗酵素液Bから抽出した画分ではオクタンの酸化物である1-オクタノール及びオクタン酸が検出された。一方、P450が含まれていない粗酵素液Dにおいてはオクタンの酸化物は検出されなかった。また1-デセンを基質とした場合、粗酵素液Bから抽出した画分ではオクタンの酸化物である1,2-エポキシデカン及び1,2-デカンジオールが検出された。一方、P450が含まれていない粗酵素液Dにおいては1-デセンの酸化物は検出されなかった。したがって、粗酵素液Bに含まれる今回獲得された新規なP450（配列番号５）がオクタンや1-デセンといった有機化合物の酸化反応を触媒する活性を有することが明らかとなった。
【００９９】
次にオクタン、デカン、１-デセンを基質として反応を行った後の粗酵素液A、B、CおよびDを分析した結果、検出した基質の酸化物を表２に示す。
【表２】
2006051729.tif 000022
粗酵素液A、B、Cから抽出した画分ではオクタンの酸化物が検出され、各粗酵素液に含まれる新規なP450の３種類（配列番号４、５、９）がすべて酸素添加活性を保持していることが示された。また獲得した新規のP450の中にはオクタン、デカンといった鎖長の異なるアルカンの酸化反応や、エポキシ化反応を触媒する反応を有するものが存在していることが明らかとなった。
【０１００】
〔実施例１２〕  RhF還元酵素ドメインを有する融合タンパク質生産用プラスミドの構築
獲得したP450ハイブリッド遺伝子の種々の基質に対する酸化能を、大腸菌を宿主とした生変換反応により簡便に観察できるように、P450と電子伝達タンパク質（還元酵素ドメイン）との融合タンパク作製用発現プラスミドの構築を行った。
【０１０１】
P450本体タンパク質部分（ヘムドメイン）と還元酵素ドメインが融合して１本のポリペプチド鎖として存在する融合型P450モノオキシゲナーゼ（P450RhF）遺伝子がロドコッカス属細菌NCIMB9784株から単離されている(非特許文献８)。そこで、ロドコッカス（Rhdococcus sp.）NCIMB9784株由来P450RhFのリンカー配列（塩基配列を配列番号６７、アミノ酸配列を配列番号６８に示す。）とそれに続く還元酵素ドメイン(塩基配列を配列番号６９、アミノ酸配列を配列番号７０に示す。) をコードする遺伝子を含むDNA断片1.0 kbを、ゲノムDNAから制限酵素部位を付加したプライマー (5'- GGGAATTCgtgctgcaccgccatcaaccg-3’、配列番号７１) と（5’- gggagctctcagaggcgcagggccaggcg -3'、配列番号７２）を用いてPCRにより増幅した。得られた1.0 kbのDNA断片は、EcoRIとSacIで切断後、大腸菌ベクターpET21a（ノバジェン社）のEcoRI-SacI部位に挿入した。以下、このプラスミドをpREDと呼ぶ。pREDのマップは図４に示されている。
【０１０２】
〔実施例１３〕  ハイブリッドP450とRhF還元酵素ドメインとの人工融合酵素化
獲得したP450ハイブリッド遺伝子の種々の基質に対する酸化能を、大腸菌を宿主とした生変換反応により観察するべく、融合タンパク質生産用プラスミドベクターpREDにP450ハイブリット遺伝子を挿入することで、ハイブリッドP450の人工融合酵素化を行った。本融合タンパク質は、ハイブリッドP450がリンカー部分を介してRhF還元酵素ドメインと繋がった構造になるようにデザインされている。
【０１０３】
制限酵素部位を付加したプライマー（5’- CACTAGTCatatgTCAACGAGTTCAAGTACA -3’配列番号７３  、5’- CAGCACCaattGTTTTTTAGCCGTCAACTT -3’ 配列番号７４）を設計し、実施例５で作製した５種類（配列番号３，５，７，９, 11）の新規P450をコードする遺伝子の挿入されたシーケンス用ベクターを鋳型としてPCR法で増幅した。尚、増幅した各P450遺伝子断片の終止コドンは削除してある。得られた1.4 kbのDNA断片は、制限酵素NdeIとMfeIで切断してプラスミドpREDのNdeI-EcoRI部位に挿入した。配列番号3をコードする遺伝子を挿入したプラスミドベクターをpH3RED、配列番号5をコードする遺伝子を挿入したプラスミドベクターをpH5RED、配列番号7をコードする遺伝子を挿入したプラスミドベクターをpH7RED、配列番号9をコードする遺伝子を挿入したプラスミドベクターをpH9RED、配列番号11をコードする遺伝子を挿入したプラスミドベクターをpH11REDとする。また、アルカニボラックス・ボルクメンシスSK2株よりクローニングしたCYP153A13a遺伝子を挿入したプラスミドベクターpAlkREDも作製した。
【０１０４】
〔実施例１４〕  融合型P450モノオキシゲナーゼによるアルカン（直鎖状炭化水素）の変換試験
プラスミドベクターpH3RED、pH5RED、pH7RED、pH9RED、pH11RED、及びpAlkREDをそれぞれ大腸菌BL21-AI株に形質転換し、終濃度50 μg / mlのアンピシリンが添加された5mlのLB液体培地に植え付け、一晩培養したのち、得られた培養液1 mlを終濃度50 μg / mlのアンピシリンが添加された100 mlのLB液体培地に植え継ぎ、30℃で培養し対数増殖期に達した時点で1 mM 5-アミノレブリン酸塩酸塩、0.5  mM FeCl3を添加し、20℃で30分間培養後、0.2%アラビノースを添加し引き続き培養した。（20℃16時間）培養終了後、遠心分離機により集菌し、100 ｍMリン酸バッファー（ｐH＝7.5）10 mlに懸濁した。pH3RED発現菌株を含む菌懸濁液を菌懸濁液H3、pH5RED発現菌株を含む菌懸濁液を菌懸濁液H5 、pH7RED発現菌株を含む菌懸濁液を菌懸濁液H7、 pH9RED発現菌株を含む菌懸濁液を菌懸濁液H9、pH11RED発現菌株を含む菌懸濁液を菌懸濁液H11、pAlkRED発現菌株を含む菌懸濁液を菌懸濁液Alkとした。
【０１０５】
次に、各菌懸濁液1 mlに基質を0.25 ml添加し、20℃で24時間反応を行った。尚、基質としては、n-ヘキサン、n-ヘプタン、n-オクタン、及びn-デカンを使用した。終濃度0.2 Nになるように塩酸を添加し、反応を停止した後、ヘキサンを0.25 ml添加し、ガスクロマトグラフィー質量分析計によりヘキサン抽出画分の成分分析を行うことで、各基質が酸化され生じた産物の同定と定量を行った。各菌懸濁液による酸化反応によって生成した酸化物の量（濃度）を表３に示す。
【表３】
2006051729.tif 000023
生変換反応による直鎖の炭化水素の変換試験を実施した場合も、菌破砕液より調製した粗酵素液を用いて観察した試験結果（実施例１１）と同様にハイブリッドP450は、ヘキサン、オクタン、デカンといったn-アルカンのアルコール化反応を触媒することが確認された。
【０１０６】
また、図５に示したように炭素数6から８のn-アルカンを基質とした場合に酸化物として検出された1-アルコールの生成量を比較すると、菌懸濁液Alkや菌懸濁液H5は基質としたn-アルカンの炭素数が少なくなるに従い1-アルコールの生成量が減少する傾向を示したが、菌懸濁液H9は基質としたn-アルカンの炭素数が少なくなるに従い1-アルコールの生成量が増加する傾向を示した。
【０１０７】
以上のように新規P450によるn-アルカンから酸化物への変換量は、ハイブリット遺伝子のarmとして利用した既知P450遺伝子CYP153A13aによるアルカンの変換量とは異なる特徴を示し、基質特異性や比活性が変化しているものが存在していることが明らかとなった。
【０１０８】
〔実施例１５〕  融合型P450モノオキシゲナーゼによるアルケンの変換試験
アルケン（不飽和を含む直鎖状炭化水素）の一種である1-オクテンを基質とした生変換反応試験を実施例１４で作製した菌懸濁液H3、H5、H7、H9、H11、Alkを用いて行った。各菌懸濁液1 mlに基質を0.25 ml添加し、20℃で24時間反応を行った。終濃度0.2 Nになるように塩酸を添加し、反応を停止した後、ヘキサンを0.25 ml添加し、ガスクロマトグラフィー質量分析計によりヘキサン抽出画分の成分分析を行うことで、1-オクテンが酸化され生じた1,2-エポキシオクタンの同定と定量を行った。各菌懸濁液による酸化反応によって生成した酸化物の量（濃度）を表４に示す。
【表４】
2006051729.tif 000024
表４に示したように、ハイブリッドP450は、不飽和炭化水素の一種である1-オクテンのエポキシ化反応を触媒することが確認された。
【０１０９】
〔実施例１６〕  融合型P450モノオキシゲナーゼによる環状炭化水素の変換試験
環状炭化水素（シクロアルカン）の一種であるシクロヘキサンを基質とした生変換反応試験を実施例１４で作製した菌懸濁液H3、H5、H7、H9、H11、Alkを用いて行った。各菌懸濁液1 mlに基質を0.25 ml添加し、20℃で24時間反応を行った。終濃度0.2 Nになるように塩酸を添加し、反応を停止した後、ヘキサンを0.25 ml添加し、ガスクロマトグラフィー質量分析計によりヘキサン抽出画分の成分分析を行うことで、シクロヘキサンが酸化され生じたシクロヘキサノールの同定と定量を行った。各菌懸濁液による酸化反応によって生成した酸化物の量（濃度）を表５に示す。
【表５】
2006051729.tif 000025
表５に示したように、ハイブリッドP450は、環状炭化水素の一種であるシクロヘキサンのアルコール化反応を触媒することが確認された。
【０１１０】
〔実施例１７〕  融合型P450モノオキシゲナーゼによる芳香族炭化水素の変換試験
芳香族炭化水素（分子内に芳香環を含むアルカンまたはアルケン）を基質とした生変換反応試験を実施例１４で作製した菌懸濁液H5、H9、Alkと、プラスミドベクターpAlkREDを大腸菌BL21-AI株に形質転換後、タンパク質発現誘導処理を行わず培養することで作製した菌懸濁液Nonを用いて行った。基質はn-ブチルベンゼンと4-フェニル-1-ブテンを使用した。各菌懸濁液1 mlに対して終濃度1 mMになるように基質を添加し、20℃で8時間反応を行った後、終濃度0.2 Nになるように塩酸を添加し、反応を停止した。酢酸エチルを0.25 ml添加し、ガスクロマトグラフィー質量分析計により酢酸エチル抽出画分の成分分析を行った。尚、n-ブチルベンゼンを基質とした場合は酢酸エチル抽出画分をシリル化剤TMSI-H（GLサイエンス社）により誘導体化した後、成分分析を行った。
【０１１１】
図６にn-ブチルベンゼンを基質とした場合の分析結果を示す。菌懸濁液H5、H9、Alkから抽出した画分ではn-ブチルベンゼンの酸化物である4-フェニル-1-ブタノールが検出された。一方、P450が発現していない菌懸濁液Nonにおいてはn-ブチルベンゼンの酸化物は検出されなかった。なお、CYP153ファミリーに属するP450がn-ブチルベンゼンを4-フェニル-1-ブタノールに変換することは本発明により初めて明らかになったものである。
【０１１２】
図７に4-フェニル-1-ブテンを基質とした場合の分析結果を示す。菌懸濁液H5、H9、Alkから抽出した画分で4-フェニル-1-ブテンの酸化物である2-フェネチルオキシラン（2-phenethyl-oxirane）が検出された。一方、P450が発現していない菌懸濁液Nonにおいては4-フェニル-1-ブテンの酸化物は検出されなかった。なお、CYP153ファミリーに属するP450が4-フェニル-1-ブテンを2-フェネチルオキシランに変換することは本発明により初めて明らかになったものである。
【０１１３】
〔実施例１８〕  シュードモナス・プチダ由来P450の人工融合酵素化
シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のP450cam遺伝子（Nucleotide sequence of the Pseudomonas putida cytochrome P-450cam gene and its expression in Escherichia coli. J Biol Chem. 261:1158-1163, 1986、及び、NCBI accession No. M12546）を含む1.3 kbのDNA断片は、Pseudomonas putida ATCC17453株からゲノムDNAを抽出し、そのゲノムDNAからPrimer3（5'- GActagtCatatgacgactgaaaccataca -3'、配列番号７５）とPrimer4 ( 5'- gggaattctaccgctttggtagtcgccgga -3'、配列番号７６)を用いてPCRにより増幅した。下線部はNdeI部位（Primer3）、EcoRI部位（Primer4）をそれぞれ示している。尚、P450遺伝子の終止コドンは削除してある。得られた1.3 kbのDNA断片は、NdeIとEcoRIで切断して、前記のプラスミドpREDのNdeI−EcoRI部位にサブクローン化した。構築したプラスミドを以下pCAMREDと呼ぶ。比較対象として、P450cam遺伝子のみをpET21aのNdeI−EcoRI部位へクローニングしたプラスミドpETP450camも作製した。
【０１１４】
〔実施例１９〕  融合化P450camの機能解析
大腸菌BL21(DE3)株を実施例１８で構築したプラスミドpCAMREDで形質転換し、LB培地（アンピシリン100 μg/mlを含む）３ｍLで16時間、30度で培養した。この前培養液1 ｍLをM9-グルコース培地（アンピシリン100 μg/ml含む）50 ｍLに植菌し、OD600値が約0.8になるまで培養した。この培養液に誘導物質としてIPTGを0.2 ｍMになるよう加え、更に25度で16時間培養した。その後集菌し、10 ｍMリン酸バッファー（ｐH＝7.0）10 mLに懸濁、超音波破砕した。その後遠心(10000×ｇ、20分間)し、上清を無細胞抽出液として抽出した。２本のキュベットに無細胞抽出液を0.8mlずつ分注し、サンプル側のキュベットに一酸化炭素を吹き込んだ後、両キュベット内にチオ硫酸ナトリウム５−10 mgを添加し、撹拌したのち400-500 nm のスペクトルを測定し、機能性P450であるか判定した。また、同無細胞抽出液0.8 mlに基質である樟脳（ショウノウ；camphor）を0.5 mMになるよう加えた時のスペクトル変化も観察した。その結果、図８Aに示すように人工融合P450は非融合化P450camスペクトル(図８B)と同様のパターンを示した。すなわち、還元状態での一酸化炭素との結合により420 nmから450 nmへのピーク移動が見られ（図８点線）、一酸化酸素の有無によるCO差スペクトルを求めると450 nmに極大吸収が確認された（図８挿入図）。尚かつ基質と混合した場合、基質結合スペクトルである390 nmへピーク極大が移動した（図８A破線）。従って還元酵素領域と人工融合化することによる悪影響（立体障害による基質との結合阻害など）は無く、融合型P450camは酵素として機能性を持つことが確認された。
【０１１５】
〔実施例２０〕  融合化P450cam生産大腸菌によるショウノウの変換
プラスミドpCAMREDを含む大腸菌BL21(DE3)株は実施例１９と同様に培養し、遺伝子の発現誘導を行った。その後集菌し、10 ｍMリン酸バッファー（ｐH＝7.0）5 ｍLに懸濁、P450camの基質であるショウノウを終濃度0.5m Mになるように添加し、25℃で24時間インキュベートした。反応直後、3、6、24時間後の反応液をサンプリングし、酢酸エチルで基質及び反応産物（5’-exo-水酸化物）を含む液層を抽出、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050)で分析し、同定を行った。その結果、図９に示すように人工融合酵素遺伝子発現菌株において24時間後にはショウノウが完全に消失し、水酸化物である5-exo水酸化ショウノウが検出された。一方、比較対象の非融合型（RhF還元酵素ドメインを持たない）プラスミドpETP450camを導入した大腸菌BL21(DE3)株では約20%のショウノウが水酸化されたに留まった。なお、図９中のグラフの縦軸は基質の消費及び変換産物の蓄積を示している。基質については反応直後の濃度を100%、変換産物については、基質を100%消費した時の産物の量の理論値を100%としている。
【０１１６】
〔実施例２１〕  アルカニボラックス・ボルクメンシス由来P450alkの融合化
アルカニボラックス・ボルクメンシス（Alcanivorax borkumensis） 由来のP450 alk（CYP153A13a）遺伝子を含む1.3 kbのDNA断片は、アルカニボラックス・ボルクメンシスSK2株（DSM11573株）からゲノムDNAを抽出し、そのゲノムDNAからPrimer5 (5'- CACTAGTCatatgTCAACGAGTTCAAGTACA -3'、配列番号７３) とPrimer6 (5'- CAGCACCaattGTTTTTTAGCCGTCAACTT -3'、配列番号７４) を用いてPCRにより増幅した。下線部はNdeI部位（Primer5）、MfeI部位（Primer6）をそれぞれ示している。尚、P450遺伝子の終止コドンは削除してある。得られた1.3 kbの断片は、NdeIとMfeIで切断して実施例で構築したプラスミドpREDのNdeI-EcoRI部位にサブクローン化した。構築したプラスミドを以下pAlkREDと呼ぶ。なお、Alcanivorax borkumensis SK2株（DSM11573株）のP450 alk（CYP153A13a）遺伝子の塩基配列は配列番号５８に示されている。
比較対象として、P450alk遺伝子のみをpET21aのNdeI−EcoRI部位へクローニングしたプラスミドpETP450alkも作製した。
【０１１７】
〔実施例２２〕  融合化P450alk生産大腸菌によるアルカンの変換
プラスミドpAlkREDまたはpETP450alkを含む大腸菌BL21(DE3)株は実施例１９と同様に培養し、遺伝子の発現誘導を行った。その後集菌し、10 ｍMリン酸バッファー（ｐH＝7.0）5 ｍLに懸濁、その懸濁液1.5 mLにP450alkの基質であるオクタンを0.5 mL添加し、20℃で24時間インキュベートした。24時間反応後のサンプルについて、オクタンで反応産物（1-オクタノール）を含む液層を抽出、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050)で分析し、同定及び定量を行った。その結果、図１０に示すように人工融合酵素遺伝子発現菌株であるプラスミドpAlkREDを導入した大腸菌において、790.8 ppmの1-オクタノールが生産された。一方、比較対象の非融合型（RhF還元酵素ドメインを持たない）プラスミドpETP50alkを導入した大腸菌では40.3 ppmであり、人工融合酵素発現菌株の約5%程度に留まった。
【０１１８】
〔実施例２３〕  環境DNAサンプルより得られたP450bzoの融合化
P450bzo遺伝子は内山らによりSIGEX法を使って環境メタゲノムライブラリーより得られている（Uchiyama T, et  al. Substrate-induced gene-expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes. Nat Biotechnol. 23:88-93, 2005、及び、GenBank code:AB186504）。サブクローン化されたP450bzo遺伝子について、Primer7 (5'- CGATATaCatatgTtCAGtTTtgAcccctat -3'、配列番号７７) とPrimer8 (5'- gGATTgcgtttgacgaatTTcacaaa -3'、配列番号７８) を用いてP450遺伝子のN末端側の1.2 kbのDNA断片を増幅した。さらに、Primer9  (5’- gggctcactttgtgaaattcgtcaaa -3'、配列番号７９)とPrimer10 (5’- gggaattccgaaacggccaattccag -3'、配列番号８０) を用いて、P450遺伝子のC末断片側の110 bpのDNA断片を増幅した。プライマー（primer）8の２０番目のTとプライマー9の１５番目のAは、遺伝子内部のEcoRIサイトを削除するため導入した変異である。尚、この変異によるアミノ酸配列の置換はない。増幅した1.2 kbと110 bpの両DNA断片を混合し、これを鋳型としてPrimer７、１０を用いて再度PCRすることによりP450bzo遺伝子全長断片を得た。Primer７、１０における下線部はそれぞれNdeI部位、EcoRI部位を示している。尚、P450遺伝子の終止コドンは削除してある。得られた1.3 kbの断片は、NdeIとEcoRIで切断して実施例で構築したプラスミドpREDのNdeI-EcoRI部位にサブクローン化した。構築したプラスミドを以下pBzoREDと呼ぶ。
比較対象としてP450bzo遺伝子のみを大腸菌ベクターpET21aのNdeI−EcoRI部位へクローニングしたプラスミドpETP450bzoも作製した。
【０１１９】
〔実施例２４〕  融合化P450bzo生産大腸菌による4-ヒドロキシ安息香酸の変換
プラスミドpBzoREDまたはpETP450bzoを含む大腸菌BL21(DE3)株は実施例１９と同様に培養し、遺伝子の発現誘導を行った。その後集菌し、10 ｍMリン酸バッファー（ｐH＝7.0）5 ｍLに懸濁後、P450bzoの基質である4-ヒドロキシ安息香酸を終濃度0.6 mMになるよう添加し、20℃で６時間インキュベートした。反応直後、２、４、６時間後の反応液をサンプリングし、酢酸エチルで基質及び反応産物（3,4-ジヒドロキシ安息香酸）を含む液層を抽出、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050)で分析し、同定を行った。その結果、図１１に示すように、人工融合酵素遺伝子発現菌株であるプラスミドpBzoREDを導入した大腸菌において、基質が急速に変換され、４時間後には基質が完全に消失し、水酸化物である3,4-ジヒドロキシ安息香酸が約0.6 mM生産された。一方、比較対象の非融合型（RhF還元酵素ドメインを持たない）プラスミドpETP450bzoを導入した大腸菌では同時間を経た段階で基質の約半量(2.5 mM )が残存し、反応産物も0.1 mM程度であった。
【０１２０】
〔実施例２５〕  ストレプトマイセス・グリセオラス由来P450SU-1またはP450SU-2の融合化
ストレプトマイセス・グリセオラス（Streptomyces griseolus）由来のP450SU-1（CYP105A1）またはP450SU-2（CYP105B1）遺伝子（Genes for two herbicide-inducible cytochromes P-450 from Streptomyces griseolus. J Bacteriol. 172:3335-45, 1990、及び、NCBI accession No. M32238及びM32239）を含む1.3 kbのDNA断片は、ストレプトマイセス・グリセオラスATCC11796株からゲノムDNAを抽出し、そのゲノムDNAからPrimer11 (5'- GGACTCCatatgACCGATACCGCCACGACG -3'、配列番号８１) とPrimer12 (5'- CTGaattCCCAGGTGACCGGGAGTTCGTTGAC -3'、配列番号８２) 、またはPrimer13 (5'- GGACTCCatatgACGACCGCAGAACGCACC-3'、配列番号８３) とPrimer14 (5'- CTGaattCCCAGGCGATCGGCAGCGAGTGGAC -3'、配列番号８４)を用いてPCRにより増幅した。下線部はNdeI部位（Primer11および13）、EcoRI部位（Primer12および14）をそれぞれ示している。尚、P450遺伝子の終止コドンは削除してある。得られた各々の1.3 kbのDNA断片をNdeIとEcoRIで切断した後、実施例１２で構築した機能発現用ベクターpREDのNdeI-EcoRI部位に挿入し、融合化P450SU-1または融合化P450SU-2遺伝子の発現用プラスミドを作製した。構築したプラスミドを以下、それぞれpSU-1RED、pSU-2REDと呼ぶ。比較対象として、P450SU-1またはP450SU-2遺伝子のみをpET21aのNdeI−EcoRI部位に挿入したプラスミドpETP450SU-1、pETP450SU-2も作製した。
【０１２１】
〔実施例２６〕  融合化P450SU-1及びSU-2生産大腸菌による７-エトキシクマリンの変換
プラスミドpSU-1REDまたはpSU-2RED、またはpETP450SU-1またはpETP450SU-2が導入された大腸菌BL21(DE3)株を、実施例１９と同様に培養し、遺伝子の発現誘導を行った。遺伝子の発現誘導と同時にP450SU-1およびSU-2の基質である７-エトキシクマリンを終濃度1 mMになるよう培地に添加し、20℃で74時間インキュベートした。酢酸エチルで反応液中の基質及び反応産物（7-ヒドロキシクマリン）を含む液層を抽出し、薄層クロマトグラフィーにて分析した。その結果、人工融合酵素遺伝子発現用のプラスミドであるpSU-1REDまたはpSU-2REDを保有する大腸菌は両菌株とも、反応産物である7-ヒドロキシクマリンが検出された。一方、比較対象の非融合型プラスミドpETP450SU-1を導入した大腸菌では反応産物が検出されなかった。pETP450SU-2を導入した大腸菌では若干の反応産物が検出されたが、その量は融合化プラスミドpSU-2RED保持菌と比較して少なかった。
本実施例により、放線菌由来のP450も、本発明による機能発現システムに適応できることが明らかとなった。
【０１２２】
〔実施例２７〕  P450HB153遺伝子の単離と融合化
グラム陽性細菌であるノカルディア科Hou_blue株（Nocardiaceae strain Hou_blue）は、新潟県西山町の石油噴出場の土壌（新潟県石油汚染土壌）より、石油系炭化水素であるアルカンの資化能を指標にして単離された新規の細菌である。本Hou_blue株は、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジー本部（千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に、平成16年6月8日に、寄託番号NITE P-3として寄託されている。
ノカルディア科Hou_blue株由来から、CYP153ファミリーに属する新規のP450遺伝子［以後、本遺伝子をP450HB153遺伝子と呼ぶ（配列番号８６にその塩基配列が、配列番号８５にコードされるP450タンパク質のアミノ酸配列が示されている）］を単離した。すなわち、本P450HB153遺伝子を含む1.3 kbのDNA断片は、同株からゲノムDNAを抽出し、そのゲノムDNAからプライマー Hou-1（5'- GTAGGCCATATGAACGTAATCGGTGCAGGT -3'、配列番号８７）とプライマー Hou-2（5'- CATGAATTCGACCTGTTCCATCTCGGTCTC -3'、配列番号８８）を用いてPCRにより増幅した。下線部はそれぞれ、NdeI部位及びEcoRI部位を示している。なお、P450HB153遺伝子の終止コドンは削除してある。得られた1.3 kbの断片は、NdeIとEcoRIで切断し、実施例１２で構築したベクターpREDのNdeI-EcoRI部位に挿入し、プラスミドpHB153-Redを構築した。
【０１２３】
〔実施例２８〕  融合化P450HB153生産大腸菌による2-n-ブチルベンゾフランの変換
プラスミドpHB153-Redを有する大腸菌BL21(DE3)株を用いて、2-n-ブチルベンゾフラン（2-n-butylbenzofuran）の生変換試験を実施した。すなわち、大腸菌BL21(DE3)株を実施例２７で構築したプラスミドpHB153-Redで形質転換し、LB培地（アンピシリン100 μg/mlを含む）3 mlで16時間、30℃で培養した。この前培養液1 mlをM9-グルコース培地（アンピシリン100 μg/ml含む）50 ｍlに植菌し、OD600値が約0.8になるまで培養した。この培養液に誘導物質としてIPTGを0.2 ｍMになるよう加え、更に25度で16時間培養した。この培養液を遠心分離し(8000 rpm, 5 min.)、菌体を沈澱させた。上清を捨てたのち50 mMりん酸緩衝液（pH 7.0）10 mlを加え、良く撹拌して菌体を50 ml容ファルコンチューブに回収した。ここに基質を1.74 mg（終濃度 1 mM）になるように少量のDMSOに溶解して添加し、20℃で24時間振とう培養した。
【０１２４】
2-n-ブチルベンゾフランの変換試験を行った培養液を含むファルコンチューブ10本分の100 ml（元培養1 L相当）を用いて、酢酸エチルと混合分配し、酢酸エチル相を分取し濃縮した。この酢酸エチル抽出物（18.6 mg）をTLC［ヘキサン：酢酸エチル（５：１）で展開］に供したところ、Rf値0.21の産物（化合物28-１と呼ぶ）が生成していることが判明した。本酢酸エチル抽出物をシリカゲルクロマトグラフィー［直径1 cm x 長さ20 cm、展開溶媒：ヘキサン：酢酸エチル（５：１）］にかけることにより精製し、化合物28-１（0.4 mg）の純品を得た。化合物28-１はEI-MSでm/z 190（基質＋酸素原子１）に分子イオンピークM+が観測された。1H NMRスペクトルを測定したところ、芳香環部分の信号は基質と全く同様であった。しかしながら基質の末端メチル基は消失し、d3.70にとリプレットに分裂したオキシメチレン基及び3つのメチレン基が観測された。DQF-COSYスペクトルの解析によりこれら計４つのメチレン基は連続していることが判明したことと、前述のEI-MSの結果から、変換化合物は末端のメチル基に水酸基が導入されたものと同定された。すなわち、化合物28-１を下記に示す4-ベンゾフラン-2-イル-ブタン-１-オール (4-benzofuran-2-yl-butan-1-ol)と同定した。
【化１】
2006051729.tif 000026
これはCASに記載のある化合物であるが、微生物変換により得られたのは初めての報告である。
【表６】
2006051729.tif 000027
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
本発明により、環境サンプル等の雑多な微生物由来の核酸を含むサンプルから、新規P450遺伝子を効率的に単離する方法が提供される。本発明の方法によって提供されるP450遺伝子から生産されるP450は基質特異性や比活性が多様に変化しており、アルカン、アルケン、環状炭化水素（シクロアルカン）、芳香族炭化水素（分子内に芳香環を有するアルカンまたはアルケン）をはじめ多様な低分子有機化合物の酸化反応に利用することができる。
【０１２６】
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願（特願2004-326139号、特願2005-83019号、特願2005-83122号）の明細書および／または図面に記載されている内容を包含する。また、本発明で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】獲得した新規P450のアミノ酸配列（配列番号１から２５）と既知P450のアミノ酸配列の相同性に基づく系統樹を示した図。
【図２】還元状態での一酸化炭素の通気処理による、粗抽出液A（図２Ａ）、粗抽出液B（図２Ｂ）および粗抽出液C（図２Ｃ）の吸収スペクトルの変化を示した図。
【図３】粗酵素液B、Dによるオクタン、1-デセンを基質とした酵素反応の後、反応液をガスクロマトグラフィー質量分析計にて分析したチャートを表す図。
【図４】融合型P450作製用発現プラスミドpREDの構造を示した図。
【図５】炭素数6から８のn-アルカンを基質とした場合に酸化物として検出された1-アルコールの生成量を比較した図。
【図６】菌懸濁液H5、H9、Alk及びコントロールのNonによるn-ブチルベンゼンを基質とした変換反応物を誘導体化し、ガスクロマトグラフィー質量分析計にて分析したチャートを表す図。
【図７】菌懸濁液H5、H9、Alk及びコントロールのNonによる4-フェニル-1-ブテンを基質とした変換反応の後、ガスクロマトグラフィー質量分析計にて分析したチャートを表す図。
【図８】人工融合化P450cam（図８Ａ）及び非融合化P450cam（図８Ｂ）の光学的性質を示す図である。
【図９】融合化及び非融合化P450cam生産大腸菌によるショウノウから5-水酸化ショウノウへの変換能を示す図である。
【図１０】融合化及び非融合化P450alk生産大腸菌によるn-オクタンから1-オクタノールへの変換能を示す図である。
【図１１】融合化及び非融合化P450bzo生産大腸菌による4-ヒドロキシ安息香酸から3,4-ジヒドロキシ安息香酸への変換能を示す図である。
【図１２】融合化及び非融合化P450SU-1、SU-2生産大腸菌による７-エトキシクマリンから７-ヒドロキシクマリンへの変換能を示す図である。レーン番号1：7-エトキシクマリン、2：7-ヒドロキシクマリン、3：P450非保有株、4：pETP450SU-1保有株、5：pSU-1RED保有株、6：pETP450SU-2保有株、７：pSU-2RED保有株。
【国際調査報告】
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