(57)【要約】  パルサー法を利用したターゲット遺伝子の検出におけるシグナル感度、定量性及び操作性を向上させることができるシグナル増幅方法、該方法を用いたターゲット遺伝子の検出方法、及び該方法に用いられるオリゴヌクレオチド・プローブを提供する。  互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有する複数種のオリゴヌクレオチド・プローブを用いて形成されるポリマーを利用したターゲット遺伝子の検出におけるシグナル増幅方法であって、前記複数種のオリゴヌクレオチド・プローブの少なくとも１つをアクリジニウムエステルで標識することにより検出するようにした。【特許請求の範囲】
【請求項１】
互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有する複数種のオリゴヌクレオチド・プローブを用いて形成されるポリマーを利用したターゲット遺伝子の検出におけるシグナル増幅方法であって、前記複数種のオリゴヌクレオチド・プローブの少なくとも１つをアクリジニウムエステルで標識することにより検出することを特徴とするシグナル増幅方法。
【請求項２】
前記複数種のオリゴヌクレオチド・プローブの少なくとも総計２箇所をアクリジニウムエステルで標識することを特徴とする請求項１記載のシグナル増幅方法。
【請求項３】
前記複数種のオリゴヌクレオチド・プローブが、５’端部から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚが設けられ、下記化学式（１）の構造を有する、３箇所以上の核酸領域からなる第１プローブと、５’端部から順に少なくとも核酸領域Ｘ’、核酸領域Ｙ’及び核酸領域Ｚ’が設けられ、下記化学式（２）の構造を有する、３箇所以上の核酸領域からなる第２プローブと、からなる一対のオリゴヌクレオチド・プローブであることを特徴とする請求項１又は２記載のシグナル増幅方法。
【化１】
2006093150.tif 000014
【化２】
2006093150.tif 000015
（前記化学式（１）及び（２）において、ＸとＸ’、ＹとＹ’、ＺとＺ’はそれぞれハイブリダイズ可能な相補的核酸領域である。）
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の方法を用いたターゲット遺伝子の検出方法。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチド・プローブの少なくとも１つが前記ターゲット遺伝子の一部に相補的な配列を有することを特徴とする請求項４記載のターゲット遺伝子の検出方法。
【請求項６】
前記ターゲット遺伝子と前記ポリマーを繋ぐために、ターゲット遺伝子の塩基配列と前記オリゴヌクレオチド・プローブの塩基配列に対して、それぞれに相補的な領域を持つアシスト・プローブを用いることを特徴とする請求項４記載のターゲット遺伝子の検出方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項記載の方法に用いられるアクリジニウムエステルで標識されたオリゴヌクレオチド・プローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチド・プローブの自己集合反応により形成されるポリマーを利用したターゲット遺伝子の検出におけるシグナル増幅方法、該方法を用いた遺伝子の検出方法、及び該方法に用いられるオリゴヌクレオチド・プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素を使用しないシグナル増幅方法として、互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有する複数種のオリゴヌクレオチド・プローブを反応させて、該プローブ同士の自己集合体（ポリマー）を形成させるシグナル増幅方法（以下、パルサー法（ＰＡＬＳＡＲ法）と称す）、並びにパルサー法を利用して、該ポリマーを測定することにより試料中のターゲット遺伝子を検出するターゲット遺伝子の検出方法が報告されている（特許文献１〜５等）。【０００３】
ポリマーを測定する方法としては、従来、ポリマー形成後、臭化エチジウム等のインターカレーターを添加し、蛍光測定により検出する方法や、Ｃｙ３等の蛍光物質で標識したプローブを用いてポリマーを形成させ、蛍光測定により測定する方法が用いられてきた。
【特許文献１】特許第３２６７５７６号
【特許文献２】特許第３３１０６６２号
【特許文献３】国際公開第０２／３１１９２号明細書
【特許文献４】特開２００２−３５５０８１号公報
【特許文献５】国際公開第２００３／０２９４４１号明細書
【特許文献６】特表平２−５０３２６８号
【非特許文献１】CLINICAL CHEMISTRY, Vol. 35, No. 8, 1588-1594, 1989
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、パルサー法を利用したターゲット遺伝子の検出におけるシグナル感度、定量性及び操作性を向上させることができるシグナル増幅方法、該方法を用いたターゲット遺伝子の検出方法、及び該方法に用いられるオリゴヌクレオチド・プローブを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、ポリマーの検出におけるシグナル感度をさらに向上させるべく鋭意研究を重ねた結果、アクリジニウムエステルで標識したオリゴヌクレオチド・プローブを用いることにより、シグナルの感度、定量性及び操作性を著しく向上させることができることを見出した。
即ち、本発明のシグナル増幅方法は、互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有する複数種のオリゴヌクレオチド・プローブを用いて形成されるポリマーを利用したターゲット遺伝子の検出におけるシグナル増幅方法であって、前記複数種のオリゴヌクレオチド・プローブの少なくとも１つをアクリジニウムエステルで標識することにより検出することを特徴とする。【０００６】
前記複数種のオリゴヌクレオチド・プローブの少なくとも総計２箇所をアクリジニウムエステルで標識することが好ましい。【０００７】
前記複数種のオリゴヌクレオチド・プローブとして、５’端部から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚが設けられ、下記化学式（１）の構造を有する、３箇所以上の核酸領域からなる第１プローブと、５’端部から順に少なくとも核酸領域Ｘ’、核酸領域Ｙ’及び核酸領域Ｚ’が設けられ、下記化学式（２）の構造を有する、３箇所以上の核酸領域からなる第２プローブと、からなる一対のオリゴヌクレオチド・プローブを用いることが好ましい。
【化１】
2006093150.tif 000002
【化２】
2006093150.tif 000003
（前記化学式（１）及び（２）において、ＸとＸ’、ＹとＹ’、ＺとＺ’はそれぞれハイブリダイズ可能な相補的核酸領域である。）【０００８】
本発明のターゲット遺伝子の検出方法は、本発明のシグナル増幅方法を用いてターゲット遺伝子を検出することを特徴とする。【０００９】
本発明方法において、前記オリゴヌクレオチド・プローブの少なくとも１つが、前記ターゲット遺伝子の一部に相補的な配列を有することが好ましい。また、前記ターゲット遺伝子と前記ポリマーを繋ぐために、ターゲット遺伝子の塩基配列と前記オリゴヌクレオチド・プローブの塩基配列に対して、それぞれに相補的な領域を持つアシスト・プローブを用いることが好ましい。【００１０】
本発明のオリゴヌクレオチド・プローブは、前記本発明方法に用いられるプローブであって、アクリジニウムエステルで標識されてなることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ポリマーの形成を、立体障害を受けることなく直接的に捕えることができるため、パルサー法を利用したターゲット遺伝子の検出におけるシグナル感度及び定量性を著しく向上させることができる。また、本発明によれば、ターゲット遺伝子を簡便に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１、実施例２及び比較例１の結果を示すグラフである。
【図２】実施例３、実施例４及び比較例２の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、図示例は例示的に示されるもので、本発明の技術思想から逸脱しない限り種々の変形が可能なことはいうまでもない。【００１４】
本発明のシグナル増幅方法は、互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有する複数種のオリゴヌクレオチド・プローブを用いて形成されるポリマーを利用したターゲット遺伝子の検出におけるシグナル増幅方法であって、前記複数種のオリゴヌクレオチド・プローブの少なくとも１つをアクリジニウムエステルで標識することを特徴とする。【００１５】
前記複数種のオリゴヌクレオチド・プローブを用いたポリマーの形成方法としては、特許文献１〜５に記載されているようなパルサー法を使用することができる。
ポリマー形成の第１の例として、５’端部から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚが設けられ、下記化学式（１）の構造を有する、３箇所以上の核酸領域からなる第１プローブと、５’端部から順に少なくとも核酸領域Ｘ’、核酸領域Ｙ’及び核酸領域Ｚ’が設けられ、下記化学式（２）の構造を有する、３箇所以上の核酸領域からなる第２プローブと、からなる一対のオリゴヌクレオチド・プローブ（以下、ＨＣＰとも称する）の複数対を用いて、互い違いに交差するようにハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチド・プローブが自己集合し、二本鎖の自己集合体（ポリマー）を形成させる方法が挙げられる（特許文献１及び２）。
【化３】
2006093150.tif 000004
【化４】
2006093150.tif 000005
前記式（１）及び（２）において、領域Ｘと領域Ｘ’、領域Ｙと領域Ｙ’、領域Ｚと領域Ｚ’はそれぞれハイブリダイズ可能な相補的核酸領域であり、複数対のＨＣＰの結合により下記化学式（３）で示される自己集合体が形成される。
【化５】
2006093150.tif 000006
【００１６】
ポリマー形成の第２の例として、Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対のダイマー形成用プローブを含む第１番目の系から第（２ｎ−１）番目（ｎ≧１）の系まで順番にｎ個形成されたダイマー形成用プローブ含有系と、
Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域及び５’側領域の２つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の架橋プローブをそれぞれ含む第２番目の系から第２ｎ番目の系まで順番にｎ個形成された架橋プローブ含有系とを有し、
該架橋プローブを、該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な塩基配列とし、
該プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、自己集合体を形成させる方法が挙げられる（特許文献４）。【００１７】
上記第２の例において、ｎ＝１の場合、第１の系のダイマープローブと第２の系の架橋プローブの相補的な塩基配列の組み合わせは、２通り存在する。ｎ＝１の場合の１例として、前記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。【００１８】
ｎ＝１の場合の別の例として、前記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。【００１９】
上記第２の例において、ｎ≧２の場合、第１、第３、・・、第（２ｎ−１）の系のダイマー形成用プローブと第２、第４、・・、第２ｎの系の架橋プローブの相補的な塩基配列の組み合わせは、２通り存在する。ｎ≧２の場合の１例として、上記プローブの塩基配列を、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。【００２０】
ｎ≧２の場合の別の例として、前記プローブの塩基配列を、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。【００２１】
ポリマー形成の第３の例として、Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３’側領域、及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第１番目の系から第ｋ番目（ｋ≧２）の系まで順番に複数個形成し、
（ａ）第（ｋ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第ｋ番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
（ｂ）第（ｋ−１）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第ｋ番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
（ｃ）最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
（ｄ）最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とし、第１番目の系から第ｋ番目の系までの複数対のダイマー形成用プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、自己集合体を形成させる方法が挙げられる（特許文献３）。【００２２】
ポリマー形成の第４の例として、Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３’側領域、及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第１番目の系から第ｋ番目（ｋ≧２）の系まで順番に複数個形成し、
（ａ）第（ｋ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第ｋ番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
（ｂ）第（ｋ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第ｋ番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
（ｃ）最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
（ｄ）最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とし、第１番目の系から第ｋ番目の系までの複数対のダイマー形成用プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、自己集合体を形成させる方法が挙げられる（特許文献３）。【００２３】
本発明のオリゴヌクレオチド・プローブにおいて、アクリジニウムエステルの標識部位及び数は特に限定されず、ポリマー形成に用いられる複数種のオリゴヌクレオチド・プローブ中、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド・プローブの１箇所以上がアクリジニウムエステルで標識されていればよいが、複数種のオリゴヌクレオチド・プローブ中、２箇所以上が標識されていることが好ましい。２箇所以上を標識する場合、１種のオリゴヌクレオチド・プローブを２箇所以上標識してもよく、２種以上のオリゴヌクレオチド・プローブをそれぞれ１箇所以上標識してもよい。【００２４】
例えば、オリゴヌクレオチド・プローブとして前記ＨＣＰを用いる場合、一対のＨＣＰの一方のみアクリジニウムエステルで標識した一対のＨＣＰ、及び一対のＨＣＰの両方をアクリジニウムエステルで標識した一対のＨＣＰのいずれも使用可能であるが、一対のＨＣＰを共に標識することが好ましい。この場合の標識部位も特に限定されないが、ＨＣＰがハイブリダイズする際に対称になる部位が好ましく、例えば、各ＨＣＰの５’末端、又は３’末端を標識部位とすることが好ましい。【００２５】
オリゴヌクレオチド・プローブにアクリジニウムエステルを標識する方法は特に限定されず、公知の方法、例えば、特許文献６や非特許文献１記載の方法等を用いることができる。また、アクリジニウムエステルにより標識されたオリゴヌクレオチド・プローブからなるポリマーを測定する方法も特に限定されず、特許文献６及び非特許文献１等に記載されているような公知の方法により測定することができる。【００２６】
前記ターゲット遺伝子に一本鎖のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ、並びに二本鎖のＤＮＡ及び／又はＲＮＡを用いることができる。また、前記ターゲット遺伝子にＳＮＰｓ（一塩基多形）を用いることができる。【００２７】
ターゲット遺伝子の検出方法としては、具体的には、ターゲット遺伝子とポリマーの複合体を形成させ、アクリジニウムエステル標識されたポリマーの検出により、ターゲット遺伝子を検出する方法や、ターゲット遺伝子が存在する場合にのみポリマーが形成されるような方法を用いて、アクリジニウムエステル標識されたポリマーの検出によりターゲット遺伝子を検出する方法が挙げられる。【００２８】
前記オリゴヌクレオチド・プローブを、前記ターゲット遺伝子の一部に相補的な配列を有するように構成することが好ましい。また、前記ターゲット遺伝子と前記ポリマーを繋ぐために、ターゲット遺伝子の塩基配列とオリゴヌクレオチド・プローブの塩基配列に対して、それぞれに相補的な領域を持つアシスト・プローブを用いることが好ましい。【００２９】
上記オリゴヌクレオチド・プローブは、通常ＤＮＡ又はＲＮＡで構成されるが、核酸類似体でも構わない。核酸類似体として、たとえば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）やLocked Nucleic Acid（ＬＮＡ）が挙げられる。また、一対のオリゴヌクレオチド・プローブは、通常、同じ種類の核酸で構成されるが、たとえばＤＮＡプローブとＲＮＡプローブが一対になっても差し支えない。即ち、プローブの核酸の種類はＤＮＡ、ＲＮＡまたは核酸類似体（たとえばＰＮＡやＬＮＡ等）から選択することができる。又、一つのプローブ内での核酸組成は一種類、たとえばＤＮＡのみから構成される必要はなく、必要に応じて、たとえば、ＤＮＡとＲＮＡから構成されるオリゴヌクレオチド・プローブ（キメラプローブ）を使用することも可能であり、本発明に含まれる。【００３０】
上記オリゴヌクレオチド・プローブの各相補的塩基配列領域の長さは、塩基数にして、少なくとも５塩基であり、好ましくは１０〜１００塩基、さらに好ましくは１３〜３０塩
基である。これらプローブは公知の方法により合成することができる。たとえばＤＮＡプローブの場合、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystem Inc.）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミダイド法により合成することができる。また、別法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであってもよい。【００３１】
本発明において、使用するオリゴヌクレオチド・プローブの本数は特に限定されないが、１０２〜１０１５本の範囲で用いられる。反応緩衝液の組成、濃度は特に限定されず、核酸増幅に常用される通常の緩衝液が好適に使用できる。ｐＨも常用の範囲で好適であり、好ましくはｐＨ７．０〜９．０の範囲のものが使用できる。ハイブリダイゼーション反応の温度条件も特に限定されず、通常の温度条件でよいが、反応溶液中に反応温度領域を部分的に形成させ、当該反応温度領域において自己集合反応を行わせるようにすることが好ましい。部分的な反応温度領域に適用される反応温度は４０〜８０℃、好ましくは５５〜６５℃である。【００３２】
本発明は、遺伝子検出用の反応機材で捕捉したターゲット遺伝子に対して、自己集合可能なオリゴヌクレオチド・プローブで集合体を形成させ、ターゲット遺伝子を検出することが好ましい。前記反応機材としては、特に限定されないが、マイクロプレート、ＤＮＡマイクロアレイ又は磁性体粒子等が好適である。【００３３】
本発明におけるターゲット遺伝子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）測定用試料は、該核酸を含む可能性のあるあらゆる試料が適用できる。ターゲット遺伝子は試料より適宜調製または単離したものでもよく、特に限定されない。たとえば、血液、血清、尿、糞便、脳脊髄液、組織液、細胞培養物等の生体由来試料、ウイルス、細菌、カビ等の含有または感染した可能性のある試料等が挙げられる。また、試料中のターゲット遺伝子を公知の方法で増幅したＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸も使用できる。
【実施例】
【００３４】
以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は例示的に示されるもので限定的に解釈されるべきでないことはいうまでもない。【００３５】
（実施例１）
ポリマー形成に用いられるオリゴヌクレオチド・プローブとして、５’末端をアクリジニウムエステルで標識したＨＣＰ−１（配列番号４記載の塩基配列）及び標識されていないＨＣＰ−２（配列番号５記載の塩基配列）からなる一対のＨＣＰを用いた。アクリジニウムエステル標識は200201 Acridinium Protein Labeling Kit（Cayman社製）を用いて行った。５’末端をアクリジニウムエステルで標識した場合の構造式を下記化学式（Ｘ）に示す。
【化６】
2006093150.tif 000007
【００３６】
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureu）のｒＲＮＡに相補的な配列を有する捕捉用プローブ（配列番号１記載の塩基配列）をマイクロプレートに固相化した。
前記マイクロプレートに、各濃度（２５，５０，１００，２００，４００，８００又は１６００ｆｍｏｌ／ｍＬ）にトリス緩衝液で希釈した黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureu）のｒＲＮＡと同じ配列を有するオリゴヌクレオチド（ターゲット；配列番号２記載の塩基配列）５０μＬと、アシスト・プローブ（配列番号３記載の塩基配列）２４ｐｍｏｌ／ｍＬを含む第１ハイブリダイゼーション溶液［４ＸＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ、1%Blocking reagent（Roche製）、２０％ホルムアミド、Salmon sperm DNA（１０μｇ／ｍＬ）］５０μＬを順次加え、マイクロプレートの下部を４５℃、上部を２０℃に設定した条件下で、２時間インキュベートした。【００３７】
その後、ウェル中の反応液を捨て、洗浄液［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ７．６］で３回洗った後、アクリジニウムエステルで標識した一対のＨＣＰを２００ｐｍｏＬ／ｍＬ含む第２ハイブリダイゼーション溶液［４ＸＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ、１％Blocking reagent（Roche製）］１００μＬを加えた。マイクロプレートの下部を５５℃、上部を２０℃に設定した条件下で、３０分インキュベートした。【００３８】
ウェル中の反応液を捨て、洗浄液で３回洗ったあと、発光試薬Ａ［０．１％Ｈ２Ｏ２、０．００１Ｎ  ＨＮＯ３］５０μＬと発光試薬Ｂ［１Ｎ  ＮａＯＨ］５０μＬを加える。直ちにルミノメータ（Berthold社製、Ｃｅｎｔｒｏ  ＬＢ−９６０）で発光強度（ＲＬＵ）を測定した。結果を図１及び表１に示す。【００３９】
【表１】
2006093150.tif 000008
【００４０】
（実施例２）
ポリマー形成に用いられるオリゴヌクレオチド・プローブとして、５’末端をアクリジニウムエステルで標識したＨＣＰ−１（配列番号４記載の塩基配列）及び５’末端をアクリジニウムエステルで標識したＨＣＰ−２（配列番号６記載の塩基配列）からなる一対のＨＣＰを用いた以外は実施例１と同様の方法により実験を行った。結果を図１及び表２に示す。【００４１】
【表２】
2006093150.tif 000009
【００４２】
（比較例１）
オリゴヌクレオチド・プローブとして、５’末端をアクリジニウムエステルで標識したＨＣＰ−１（配列番号４記載の塩基配列）のみを用いた以外は実施例１と同様の方法により実験を行った。結果を図１、表１及び表２に示す。【００４３】
表１，２及び図１に示した如く、ポリマーが形成される実施例１及び２はポリマーが形成されない比較例１に比べて、ターゲット遺伝子の検出感度が向上しており、２箇所標識されたオリゴヌクレオチド・プローブを用いた実施例２は特に検出感度が向上しており、定量性も優れていた。【００４４】
（実施例３、４及び比較例２）
実施例３として、第２ハイブリダイゼーション溶液中のＨＣＰ濃度を１０００ｐｍｏｌ／ｍＬに変更した以外は実施例１と同様に実験を行った。実施例４として、第２ハイブリダイゼーション溶液中のＨＣＰ濃度を１０００ｐｍｏｌ／ｍＬに変更した以外は実施例２と同様に実験を行った。比較例２として、第２ハイブリダイゼーション溶液中のＨＣＰ濃度を１０００ｐｍｏｌ／ｍＬに変更した以外は比較例１と同様に実験を行った。結果を表３，４及び図２に示す。表３，４及び図２に示した如く、実施例３及び４は比較例２に比べ、検出感度が向上しており、実施例４は特に著しく感度及び定量性が向上していた。【００４５】
【表３】
2006093150.tif 000010
【００４６】
【表４】
2006093150.tif 000011
【００４７】
（実施例５、実施例６及び比較例３）
実施例５として、マイクロプレートのインキュベートの条件を上部を下部の温度条件に合わせて変更し、４５℃の恒温条件とした以外は実施例３と同様の方法により実験を行った。実施例６として、マイクロプレートのインキュベートの条件を上部を下部の温度条件に合わせて変更し、４５℃の恒温条件とした以外は実施例４と同様の方法により実験を行った。比較例３として、マイクロプレートのインキュベートの条件を上部を下部の温度条件に合わせて変更し、４５℃の恒温条件とした以外は比較例２と同様の方法により実験を行った。結果を表５，６に示す。【００４８】
【表５】
2006093150.tif 000012
【００４９】
【表６】
2006093150.tif 000013
【００５０】
表５及び表６に示した如く、実施例５及び６は比較例３に比べ、検出感度が向上しており、実施例６は特に著しく感度及び定量性が向上していた。
【図１】
2006093150.tif 000016
【図２】
2006093150.tif 000017
【配列表】
2006093150000001.app
【国際調査報告】
2006093150.tif 000018
2006093150.tif 000019