(57)【要約】  本発明の骨強化組成物は、卵黄タンパク質加水分解物で、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量分布分析において、タンパク質・ペプチド・アミノ酸の合計の面積比に対して、分子量５００以上２０，０００以下の部分の面積比が５０％以上を占めるものを有効成分とする。この組成物は、骨芽細胞増殖促進、骨成長及び骨強化作用を有するものであり、骨粗鬆症をはじめとする各種骨疾患の予防及び治療に有効であり、飲食品、医薬、又は飼料に広く用いる事ができ、日常的に継続して摂取可能である、安全かつ安価な製品として有用である。卵黄タンパク質加水分解物は、卵黄を有機溶媒により脱脂後、得られた粉末をタンパク質加水分解酵素で加水分解したものであるのが好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵黄タンパク質加水分解物であって、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量分布分析において、タンパク質・ペプチド・アミノ酸の合計の面積比に対して、分子量５００以上２０，０００以下の部分の面積比が５０％以上を占めるものを有効成分として含有してなることを特徴とする骨強化組成物。
【請求項２】
前記卵黄タンパク質加水分解物が、卵黄を食品加工に用いられる有機溶媒の少なくとも一種により脱脂処理した後、タンパク質加水分解酵素で加水分解したものであることを特徴とする請求項1記載の骨強化組成物。
【請求項３】
前記タンパク質加水分解酵素が、ペプシン、トリプシン、レニン、レニンを含むチーズ用途のレンネット、カルボキシペプチダーゼＡ、バチルス属細菌由来のプロテアーゼおよびアスペルギルス属麹菌由来プロテアーゼからなる群から選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする請求項1または２記載の骨強化組成物。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の骨強化組成物を配合した飲食品、医薬又は飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨成長及び骨強化作用を有する卵黄タンパク質加水分解物を含有する組成物に関する。また、本発明は、この卵黄タンパク質加水分解組成物を配合した飲食品、医薬品、又は飼料に関する。本発明の卵黄タンパク質加水分解物は骨芽細胞を増殖させ、骨の成長端における軟骨細胞の増殖も促進させる作用を有するので、骨代謝のバランスが崩れて起こる骨疾患の予防や治療や、学童など若年層において成長期の骨強化に有用である。
【背景技術】
【０００２】
近年の骨粗鬆症の増加や若年層での骨折率の増加など各種骨疾患の増加が社会問題となっている。骨粗鬆症の患者は全国に約１０００万人いると推定されており、高齢化の進行により２０１０年には患者数が１６００万人に達するとの予測もある。骨粗鬆症は、主に閉経後の女性において、女性ホルモンの減少の影響から骨形成と骨破壊のバランスが崩れ起こる疾患として注目されているが、男性でも老齢化に伴い骨塩量の減少が見られ、現在でも５０歳以上で約２００万人の骨粗鬆症患者がいる。また、最近２０年で小中学生の骨折率は２倍以上に増加しており、骨粗鬆症を予防すると言う見地からも若年期にしっかりと骨塩量を高めて、より高い最大骨量を得ることは非常に重要である。このように、いまや骨の健康を保つことは性別や年齢の関係なく全社会的な関心事である。【０００３】
従来より骨の疾患を予防あるいは治療する方法として、食餌療法によるカルシウム補給、軽い運動、日光浴、薬物治療等が行われている。食餌療法によるカルシウム補給には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム等のカルシウム塩や、牛骨粉、卵殻、魚骨粉等の天然カルシウム剤が使用されているが、溶解性や吸収性、呈味性の点で必ずしも経口摂取に適している素材であるとはいえない。適度な運動は、骨量を増やし、骨を強化するので、散歩やウオーキングは骨の健康によいとされるが、体が弱っている場合は軽い運動も厄介なものであり、まして寝たきりの老人ではほとんど運動できない。日光浴は活性化ビタミンＤ３の補給と言う点ではよいとされているが、これだけでは不十分である。薬物投与には、ビスホスホネートやカルシトニン製剤等が使用されており、骨粗鬆症の治療には有効であると言うことが知られている。しかし、これらの物質は医薬そのものであり、その服用には特別な注意が必要で、耳鳴り、頭痛、食欲不振など副作用の危険性もあり、継続的な食品素材として使用可能なものではない。【０００４】
そこで、天然素材を使用した骨強化剤として、ビタミン類を補強した鶏卵（特許文献１）や亜鉛を強化した牡蠣エキス（特許文献２）を使用するもの、乳由来の塩基性タンパク質を使用するもの（特許文献３、４）などが開発されている。
【特許文献１】特開平１０−５６９７８号公報
【特許文献２】特開２００２−８０３８０号公報
【特許文献３】特許２９７４６０４号公報
【特許文献４】特許３１１２６３７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明では、日常的に継続して摂取可能な骨強化剤として、骨強化作用を有し、安全、安価であり、飲食品に広く用いることが可能な新規な食品素材を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
卵は、３７℃で３週間温められるとヒヨコに変わると言う現象が示すように、生体を形作するすべての材料を含み、次世代を生み出すバイオカプセルであり、まだ見出されていない生理活性も多いと考えられる。また、卵は古くからの食経験があり、そのものの栄養価も高く安全であって食品素材としての利用価値は非常に高い。【０００７】
そこで、本発明者らは、卵の様々な画分について骨成長、骨強化を促進する成分の探索を行った結果、卵黄タンパク質加水分解物に骨芽細胞増殖及び石灰化促進活性があることを初めて見出し、また、この成分を経口摂取することによって骨成長を促進し、骨代謝を改善できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
本発明の骨強化組成物は、卵黄タンパク質加水分解物であって、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量分布分析において、タンパク質・ペプチド・アミノ酸の合計の面積比に対して、分子量５００以上２０，０００以下の部分の面積比が５０％以上を占めるものを有効成分として含有してなることを特徴とする。【０００９】
なお、本発明で使用する卵黄タンパク質加水分解物は、脱脂処理した卵黄を、タンパク質分解酵素で加水分解したものであるのが好ましい。【００１０】
卵黄の脱脂処理は、卵黄に食品加工に使用可能な有機溶媒（例えば、エタノール、イソプロパノール、ヘキサンなど）の少なくとも一種を作用させて実施するのが好ましい。また、タンパク質加水分解酵素としては、ペプシン、トリプシン、レニン、レニンを含むチーズ用途のレンネット、カルボキシペプチダーゼＡ、バチルス属細菌由来のプロテアーゼ及びアスペルギルス属麹菌由来プロテアーゼのいずれか、またはその組み合わせを使用するのがよい。【００１１】
かかる本発明の骨強化組成物は、天然物を使用した安全なものであるので、日常的に摂取可能な骨強化素材、飲食品、医薬または飼料として、広く使用が可能である。【００１２】
本発明で使用する、卵黄タンパク質加水分解物はゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量分布分析において、タンパク質・ペプチド・アミノ酸の合計の面積比に対して、分子量５００以上２０，０００以下の部分の面積比が５０％以上を占めるものであればよいが、前記面積比が５５％以上を占めるものであるのがより好ましく、特に前記面積比が６５％以上を占めるものが好ましい。かかる卵黄タンパク質加水分解物は、１）骨芽細胞増殖促進（骨を作り出す細胞の増殖を促す）、２）骨芽細胞分化促進（骨を作り出す細胞の機能を高め、コラーゲン産生促進、石灰化促進）、３）破骨細胞の分化増殖抑制（骨を溶かして代謝させる細胞の機能と増殖を抑える）、４）骨成長促進という効果を有するものであり、軟骨細胞の増殖を促進して骨の成長を促す活性をも有している。【００１３】
かかる卵黄タンパク質加水分解物を主成分とする骨強化組成物は、経口摂取が可能であるので、チーズ、バター、発酵乳等の乳食品、飲料乳、ドリンクヨーグルト、コーヒー飲料、果汁等の飲料、ゼリー、プリン、クッキー、ビスケット、ウエハース等の菓子、冷凍食品等の各種の形態の飲食品に添加し、骨強化作用を有する飲食品とすることができる。更に、カプセル、錠剤などの形態でサプリメントとして用いることもでき、骨粗鬆症の予防、症状改善を目的とした飲食品、医薬または飼料の素材として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１で得た卵黄タンパク質加水分解物の、ゲル濾過クロマトグラフィーでの分子量分析の結果を示した図である。斜線部分は、分子量５００以上２０，０００以下の部分を示す。
【図２】実施例１の卵黄タンパク質加水分解物とＢで得た卵黄水溶性画分の、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動での分析結果を示した図である。Ｍのレーンは図中左記の分子量マーカー、１のレーンは卵黄タンパク質加水分解物、２のレーンはＢで得た卵黄水溶性画分の、泳動結果を示す。
【図３】ラットに実施例１の卵黄タンパク質加水分解物を経口投与した場合と、投与しなかった場合における脛骨骨端の伸長を比較した図である。
【図４】実施例２で得た卵黄タンパク質加水分解物の、ゲル濾過クロマトグラフィーでの分子量分析の結果を示した図である。斜線部分は、分子量５００以上２０，０００以下の部分を示す。
【図５】実施例２で得た卵黄タンパク質加水分解物を用いて骨成長促進効果を測定した結果を示す図である。
【図６】実施例２で得た卵黄タンパク質加水分解物を用いて石灰化促進効果を測定した結果を示す図である。
【図７】異なる酵素を使用して得た卵黄タンパク質加水分解物を用いて骨芽細胞増殖促進活性を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明で用いられる卵黄は、鶏、アヒル、うずら等の卵の卵黄があげられるが、生産性の点から、鶏卵の卵黄が好ましく用いられる。また、鶏卵を用いる場合には、卵黄液、卵黄粉末、又は脱脂卵黄粉末を用いることができ、中でも卵黄粉末、又は脱脂卵黄粉末が好ましく用いられる。【００１６】
本発明の骨強化組成物は、卵黄粉末から食品加工において用いられる有機溶媒を用いて脱脂して得られた粉末を、タンパク質加水分解酵素で加水分解することにより得ることができる。脱脂に用いる有機溶媒としては、エタノール、イソプロパノール、ヘキサンなど食品加工に一般に用いられる有機溶媒の使用が可能であるが、簡便性と安全性の点からエタノールが好ましく用いられる。【００１７】
また、卵黄から卵黄油や卵黄レシチンを製造する際に副産物として生じる脱脂卵黄を加水分解の原料に用いることも可能である。【００１８】
本発明に用いられる上記タンパク質加水分解酵素としては、プロテアーゼ活性又はカルボキシペプチダーゼ活性を持ち食品製造に使用可能な、ペプシン（ＥＣ．３．４．２３．１）、トリプシン（ＥＣ．３．４．２１．４）、レニン（ＥＣ．３．４．２３．１５）、レニンを含むチーズ用途のレンネット、カルボキシペプチダーゼＡ（ＥＣ．３．４．１７．１）、バチルス属細菌由来のプロテアーゼ（商品名「アルカラーゼ」ノボザイム社製、商品名「オリエンターゼ２２ＢＦ」エイチビィアイ株式会社製、商品名「ヌクレイシン」エイチビィアイ株式会社製、商品名「プロテアーゼＳ『アマノ』Ｇ」天野エンザイム株式会社製、商品名「サモアーゼＰＣ１０」大和化成株式会社製等）、アスペルギルス属麹菌由来プロテアーゼ（商品名「オリエンターゼＯＮＳ」エイチビィアイ株式会社製、商品名「オリエンターゼ２０Ａ」エイチビィアイ株式会社製、商品名「プロテアーゼＰ『アマノ』３Ｇ」天野エンザイム株式会社製、商品名「フレーバーザイム」ノボザイム社製等）などのいずれか、又はそれらの組み合わせを使用することができる。本発明においては、上記酵素の中でもバチルス属細菌由来のプロテアーゼ及び／又はペプシンが特に好ましく用いられる。【００１９】
タンパク質加水分解酵素の濃度は、使用する酵素に応じて適宜変動するが、酵素と脱脂卵黄の質量比が１対２０から１対１０００が好ましい。また、酵素反応温度や反応時間も使用する酵素により異なるが、２５〜７５℃で１〜２４時間加水分解を行うことが好ましい。反応時間は長すぎても短すぎても、得られる加水分解物について、十分な骨芽細胞増殖促進、骨成長及び骨強化作用が得られない。【００２０】
上記のようにして得られる卵黄タンパク質加水分解物は、適宜脱塩してそのまま本発明の骨強化組成物の原料として用いることができる。また、限外ろ過膜、ゲルろ過や各種カラムクロマトグラフィー、メンブレンフィルター、等電点を利用した方法などで精製や分画して用いてもよい。【００２１】
上記のようにして得られた卵黄タンパク質加水分解物は、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量分布分析において、タンパク質・ペプチド・アミノ酸の合計の面積比に対して、分子量５００以上２０，０００以下の部分の面積比が５０％以上を占めることが重要であり、前記面積比が５５％以上を占めることがより好ましく、特に前記面積比が６５％以上を占めることが好ましい。分子量分布が上記範囲外であると、効果の低下や消失が生じたり、加熱による変性や凝集などが起こりやすくなる。ただし、分布が上記範囲を満たしていれば、未分解の卵黄タンパク質が、１０〜２０質量％残留していてもかまわない。【００２２】
本発明の骨強化組成物における卵黄タンパク質加水分解物は、骨芽細胞増殖促進活性が、卵黄タンパク質加水分解物無添加の対照に対して１．２倍以上であることが好ましく、更に、６５℃〜９０℃で３分間〜６分間の熱処理を経ても、骨芽細胞増殖促進活性が上記対照に対して１．２倍以上を維持していることが好ましい。【００２３】
上記骨芽細胞増殖促進活性の測定には、マウス骨芽細胞のＭＣ３Ｔ３−Ｔ１細胞やヒト由来骨芽細胞様細胞Ｕ２ＯＳ細胞を用いた定法で行うことができる。【００２４】
本発明の骨強化組成物における卵黄タンパク質加水分解物の含有量は、特に限定されるものではないが、卵黄タンパク質加水分解物を０．０５〜５０質量％含むことが好ましく、０．１〜２５質量％含むことがより好ましい。【００２５】
卵黄タンパク質加水分解物の含有量が０．０５質量％未満であると、本骨強化組成物を食品に高濃度で添加することになるため好ましくなく、５０質量％以上であると、溶解性に影響が出るため好ましくない。【００２６】
本発明の骨強化組成物は、骨粗鬆症や各種骨疾患の予防または改善に適用され、その有効摂取量は、成人一日当たり卵黄タンパク質加水分解物換算で５０mgから５gである。
なお、本発明の骨強化組成物には、ラットによる急性毒性は認められなかった。【００２７】
このようにして調製された骨強化組成物は、通常粉末化して用いられる。粉末化は、凍結乾燥によって、あるいは噴霧乾燥によって行ってもよく、通常は飲食品として経口的に投与される。【００２８】
本発明の骨強化組成物は、上述した成分のほかに、賦形剤、乳化剤、安定剤、甘味料、ｐＨ調整剤、増粘剤、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、多糖類、オリゴ糖等の通常、食品に用いられる成分を含んでいてもよい。【００２９】
本発明の骨強化組成物は、飲食品に加えるだけでなく投与形態に応じて種々の形に調製され、粉末（または顆粒）、ドリンク剤、錠剤、カプセル剤等として用いることもできる。また、卵は古くから食経験のある安全な素材であるので、継続的に用いても副作用の問題のない素材として、医薬または飼料に用いることもできる。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
Ａ．脱脂卵黄の調製
卵黄粉末１ｋｇにエタノール５Ｌを加え、ブレンダーで３０分間攪拌したのち固形物を回収した。この操作を３回繰り返して卵黄から脱脂を行い、風乾し、５６８ｇの脱脂卵黄を得た。【００３１】
Ｂ．卵黄の水溶性画分の調製
Ａで得た脱脂卵黄２８４ｇに３７℃の温水３Ｌを加えて、温度を保ちながらスターラーでよく攪拌した後、８，０００rpm、３０分間の遠心分離を行い、上清を得た。そして、凍結乾燥で粉末化して、１３．４ｇの卵黄の水溶性画分を得た。【００３２】
実施例１（卵黄タンパク質加水分解物の製造）
Ａで得た脱脂卵黄粉末３００ｇに水３Ｌを加え、塩酸でｐＨ３．５にあわせる。その後、ペプシン（シグマアルドリッチ社製）３ｇを添加して、３７℃にて3時間酵素反応を行った。その後、水酸化ナトリウムでｐＨ７に中和して酵素を失活させ、ろ過助剤（セライト）を３０ｇ加え、ブフナーロートにて濾過し、ろ液を凍結乾燥して卵黄タンパク質加水分解物４４．８ｇを得た。【００３３】
実施例１で得られた卵黄タンパク質加水分解物は、以下の条件のゲル濾過クロマトグラフィーで分子量の分析を行った。
カラム：Ｄｉｏｌ  ６０（６．０×３００ｍｍ） (商品名、ワイエムシイ社製)
溶出液：０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液、０．２Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．９）／アセトニトリル（７０：３０）
流速：０．７ml／分
検出波長：２８０ｎｍ
その結果を図１に示す。図１から、実施例１の卵黄タンパク質加水分解物はタンパク質・ペプチド・アミノ酸の合計を示す全面積に対して、分子量５００以上２０，０００以下の部分の面積比（斜線部）が約５７％を占めることが明らかとなった。
次に、実施例１の卵黄タンパク質加水分解物とＢで得た卵黄水溶性画分を用いて、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を常法にて行った。結果を図２に示す。図２から明らかなように、卵黄水溶性画分のバンドよりも小さい分子量２０，０００以下のバンドが多く見られた。【００３４】
試験１（骨芽細胞増殖活性の測定）
実施例１で得られた卵黄タンパク質加水分解物の骨芽細胞増殖活性を以下のようにして測定した。すなわち、マウス骨芽細胞のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を、１０％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ培養液を用い、３７℃、５％ＣＯ2-９５％ａｉｒの下でコンフルエントになるまで培養した後、トリプシン処理により細胞を集めた。集めた細胞を上記α−ＭＥＭ培養液に懸濁して細胞懸濁液（１×１０4個／ｍＬ）を調製した。この細胞懸濁液を２４穴プレートに０．５ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ2-９５％ａｉｒの下で培養した。翌日、卵黄タンパク質加水分解物を５０（v/v）％ＤＭＳＯに溶解して、卵黄タンパク質加水分解物を１００、２５、１２．５μｇ/ｍＬとなるように細胞に添加（ＤＭＳＯは培養液の１（v/v）％となるように添加）し、また石灰化促進剤であるα−グリセロリン酸塩（２ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加した。培養液は１日おきに交換し、２０日後にＭＴＴ（3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide)を用いて常法に従って骨芽細胞の数を測定した（ＭＴＴ法）。
卵黄タンパク質加水分解物（１００μｇ/ｍＬ）の骨芽細胞の増殖促進活性は、対照の増殖数を１００としたときの相対値で表すと１５０±１１であった。一方、上記Ｂで得られた卵黄水溶性画分の骨芽細胞増殖促進活性は、同様の相対値で表すと１２８±１８であった。
また、実施例１で得られた卵黄タンパク質加水分解物を８０℃で５分間熱処理を行い、同様に骨芽細胞の増殖促進活性を測定すると、対照群の増殖数を１００としたときの相対値で表せば１３０±１０であった。一方、上記Ｂで得られた卵黄水溶性画分で同様の熱処理を行った場合、骨芽細胞の増殖促進活性は同様の相対値で表せば１０５±１１であった。即ち、卵黄タンパク質加水分解物は熱処理に対して若干活性が減少してはいるが、充分に高い骨芽細胞の増殖促進活性を保ち、熱安定性を示すことが分かった。【００３５】
試験２（骨成長促進効果）
実施例１で得られた卵黄タンパク質加水分解物の骨成長促進効果をSprague-Dawley系ラットを用いて評価した。具体的には、蛍光物質であるテトラサイクリンを投与し、テトラサイクリンがカルシウムをキレートして骨に沈着される現象を利用して、骨に形成される蛍光バンドを観察することにより脛骨の成長を測定した。
すなわち、試験期間（１週間）中、２０ｍｇ／ｍｌの濃度で精製水に溶かした試料を、ラットに胃ゾンデで経口投与（１００ｍｇ／ｋｇ体重／１日）した。そして、試験期間中の第３日目と第５日目にテトラサイクリンを注射により投与した。なお、試験期間中におけるラットの飲料水と飼料（商品名「ＭＦ」、オリエンタル酵母社製）は自由摂取とした。
第７日目に脛骨を摘出し、テトラサイクリンの投与により脛骨成長板の下部（骨新生部）に形成された各蛍光バンドの間隔（テトラサイクリンを投与した第３日目から第５日目の２日間における脛骨骨端の伸長）を蛍光顕微鏡下で観察して測定した。
卵黄タンパク質加水分解物を投与しなかった場合（対照）の骨の伸長率を１００％として卵黄タンパク質加水分解物を投与した場合の骨の伸長率（％）を求めた結果を図３に示す。図３から、対照と比較して、卵黄タンパク質加水分解物を投与した場合、２本の蛍光バンドの間隔が３１％広く、骨成長促進効果があることが確認された。【００３６】
実施例２（卵黄タンパク質加水分解物の製造）
Ａと同様の方法で得た脱脂卵黄粉末５００ｋｇに水２．５トン及びノボザイムズ社製のアルカラーゼ（商品名、Bacillus licheniformis  由来のプロテアーゼ）２５ｋｇを加え、ｐＨ７、５５℃にて3時間酵素反応させ、その後、８０℃で１５分間の熱処理で酵素を失活させ、遠心力３０００ｇで２０分間、遠心分離し、不溶物を除去し、ろ過後、ろ液をスプレー乾燥して、約１４０ｋｇの卵黄タンパク質加水分解物を得た。【００３７】
実施例２で得た卵黄タンパク質加水分解物の分子量分析を、実施例１と同様の方法で実施した。その結果を図４に示す。図４から、得られた卵黄タンパク質加水分解物はタンパク質・ペプチド・アミノ酸の合計を示す全面積に対して、分子量５００以上２０，０００以下の部分の面積比（斜線部）が約８５％を占めることが明らかとなった。【００３８】
次に、実施例２の卵黄タンパク質加水分解物について、下記の試験を実施した。各試験におけるコントロールは、卵黄タンパク質加水分解物を使用しなかったものを示す。
試験１（骨成長促進効果）
実施例２で得た卵黄タンパク質加水分解物の骨成長促進効果を、実施例１の試験２と同様の方法で調べた。すなわち、Sprague-Dawley系ラットに、精製水に溶かした試料（濃度２０ｍｇ／ｍｌ）を、胃ゾンデで経口投与(毎日、体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ、２０ｍｇ又は５０ｍｇを投与）した。そして、試験期間中の第３日目と第５日目に蛍光物質（テトラサイクリン１０ｍｇ／ｋｇ）を注射で投与し、第７日目に脛骨を摘出して、蛍光顕微鏡下で観察される２本の蛍光バンドの間隔（テトラサイクリンを投与した第３日目から第５日目の２日間における脛骨骨端の伸長）を測定した。その結果を図５に示す。図５から、投与量依存的に骨成長促進効果が得られることが分かる。【００３９】
試験２（石灰化促進効果）
３．５ｃｍシャーレに６×１０５個のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を播種(α-ＭＥＭ培地、１０％ＦＣＳ、２ｍｍｏｌ／Ｌグリセロリン酸）し、実施例２で得た卵黄タンパク質加水分解物を１００μｇ／ｍｌの濃度で加え、２日ごとに培地とともに交換し、４週間培養を続けた後、細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝液）でリンスし、５（v/v）％過塩素酸を加え、超音波処理して、細胞に沈着したカルシウムを溶出させ、溶出したカルシウム量を「カルシウムＥテストワコー」（商品名、和光純薬工業株式会社製）を用いて測定して石灰化活性とした。その結果を図６に示す。図６から、卵黄タンパク質加水分解物を添加することにより、石灰化活性が有意（p<0.001）に上昇していることが分かる。【００４０】
試験３（破骨細胞の分化及び増殖抑制効果）
マウスの骨髄から骨髄細胞を単離して、破骨細胞への分化及び増殖を測定した。まず、マウスの大腿骨の骨髄細胞を、分化誘導因子であるRANKL (receptor activator of NF-κB Ligand：NF-κB活性化受容体リガンド）含有のα-ＭＥＭ培地で３日間培養、サンプル処理後、再び４日間培養した。その後、細胞を固定液で固定後、ＴＲＡＰ染色キット（商品名「387-A  Acid Phosphatase, Leukocyte」シグマアルドリッチジャパン社製）を用いて、ＴＲＡＰ染色を行い、赤く染色された破骨細胞の数を顕微鏡で観察した。実施例２の卵黄タンパク質加水分解物を５０μｇ／ｍｌ添加、１００μｇ／ｍｌ添加および２００μｇ／ｍｌ添加で培養したものと、無添加で培養したものについて、破骨細胞の発生頻度を測定した結果を次表に示す。【００４１】
．    卵黄タンパク質加水分解物      破骨細胞(赤色染色された細胞)
．    添加量（μｇ／ｍｌ）           発生頻度（％）                  
．                  ０                                      ２２．５
．                ５０                                      １６
．              １００                                        ２．５
．              ２００                                        ０
上記表から、破骨細胞の発生頻度が卵黄タンパク質加水分解物の濃度依存的に抑制されていることが分かる。【００４２】
実施例３（卵黄タンパク質加水分解物）
Ａで得た脱脂卵黄粉末３００ｇに水３Ｌを加え、表１に示す酵素・条件で酵素反応を行い、その後、沸騰水浴上８０℃達温後１０分間の加熱により酵素を失活させ、ろ過助剤（セライト）を３０ｇ加え、ブフナーロートにて濾過し、得られたろ液を凍結乾燥して７種の卵黄タンパク質加水分解物を得た。【００４３】
【表１】
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【００４４】
試験１（骨芽細胞増殖促進活性）
マウス骨芽細胞のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を、１０％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ培養液を用い、３７℃、５％ＣＯ2-９５％ａｉｒの下でコンフルエントになるまで培養した後、トリプシン処理により細胞を集めた。集めた細胞を上記α−ＭＥＭ培養液に懸濁して細胞懸濁液（２×１０4個／ｍＬ）を調製した。この細胞懸濁液を９６穴プレートに０．１ｍＬずつ播種し、また石灰化促進剤であるα−グリセロリン酸塩（２ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加して、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの下で培養した。２４時間後に、実施例３で得られた各試料を５０（v/v）％ＤＭＳＯに溶解して、試料が１００μｇ／ｍＬとなるように細胞に添加した（ＤＭＳＯは培養液の１（v/v）％となるように添加）。そして、培養２４時間後に実施例１の試験１と同様にしてＭＴＴ法により細胞増殖活性を測定した。
各卵黄タンパク質加水分解物（１００μｇ／ｍＬ）の骨芽細胞の増殖促進活性を、コントロール（卵黄タンパク質加水分解物未添加）の増殖数を１００としたときの相対値で表した結果を図７に示す。図７から、バチルス属細菌由来のプロテアーゼ、ペプシン、アスペルギルス属麹菌由来のプロテアーゼを用いて加水分解して得られた卵黄タンパク質加水分解物は、高い骨芽細胞増殖促進活性を有することが分かる（バチルス属細菌由来のプロテアーゼ及びペプシンを用いて加水分解して得られた卵黄タンパク質加水分解物についてはコントロールに対して有意差（p<0.005）有り）。【００４５】
以下の実施例において、特に断らない限り、「％」は「質量％」を表す。
実施例４（清涼飲料水）
実施例１で得られた卵黄タンパク質加水分解物を含有する清涼飲料水を調製した。すなわち、組成が混合異性化糖１５．０％、果汁１０％、卵黄タンパク質加水分解物２．０％、香料０．１％、カルシウム０．１％、水７２．８％である原料を混合し、プレート殺菌機を用いて９０℃、１５秒間殺菌し、骨強化作用を有する清涼飲料水を製造した。【００４６】
実施例５（ヨーグルト）
実施例１で得られた卵黄タンパク質加水分解物を含有するヨーグルトを調整した。すなわち、組成が卵黄タンパク質加水分解物３．０％、蔗糖７％、香料０．１％、ヨーグルト８９．９％である原料を混合し容器に充填して、骨強化作用を有するヨーグルトを製造した。【００４７】
実施例６（チーズ）
実施例１で得られた卵黄タンパク質加水分解物を含有するプロセスチーズを調整した。すなわち、ゴーダチーズ３５％、チェダーチーズ３５％、パルメザンチーズ２０％、卵黄タンパク質加水分解物２．０％、リン酸カルシウム１．０％、水７．０％を含むように各原料を混合後、乳化温度８５℃で乳化して、骨強化作用を有するプロセスチーズを製造した。【００４８】
実施例７（カプセル剤）
実施例１で得られた卵黄タンパク質加水分解物６０％、コーンスターチ３０％、乳糖１０％を含むように各原料を配合して、ゼラチンカプセルに充填（カプセル１個当たり２００ｍｇ）し、骨強化作用を有するカプセル剤を製造した。【００４９】
実施例８（錠剤）
実施例１で得られた卵黄タンパク質加水分解物６０％、還元麦芽糖１８％、結晶セルロース１８％、ショ糖エステル４％を含むように各原料を配合後打錠（１錠当たり３００ｍｇ）して、骨強化作用を有する錠剤を製造した。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明の骨強化組成物およびそれを含有する飲食品は、安全で安価な卵黄や卵黄油を製造した際の副産物である脱脂卵黄を原料とし、骨芽細胞増殖促進、骨成長及び骨強化作用をもつため、骨粗鬆症の予防や骨の成長促進及び骨の強化ための健康食品として利用することができる。
【図１】
2006075558.tif 000003
【図３】
2006075558.tif 000004
【図４】
2006075558.tif 000005
【図５】
2006075558.tif 000006
【図６】
2006075558.tif 000007
【図７】
2006075558.tif 000008
【図２】
2006075558.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成18年8月7日(2006.8.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵黄タンパク質加水分解物であって、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量分布分析において、タンパク質・ペプチド・アミノ酸の合計の面積比に対して、分子量５００以上２０，０００以下の部分の面積比が５０％以上を占めるものを有効成分として含有してなるものであり、前記卵黄タンパク質加水分解物が、卵黄を食品加工に用いられる有機溶媒の少なくとも一種により脱脂処理して得られた脱脂卵黄をそのままＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のタンパク質加水分解酵素を用いて加水分解して得られるものであることを特徴とする骨強化組成物。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
請求項１に記載の骨強化組成物を配合した飲食品、医薬又は飼料。
【請求項５】
前記卵黄タンパク質加水分解物を０．０５〜５０質量％含有する請求項１記載の骨強化組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
グラフィーによる分子量分布分析において、タンパク質・ペプチド・アミノ酸の合計の面積比に対して、分子量５００以上２０，０００以下の部分の面積比が５０％以上を占めるものを有効成分として含有してなることを特徴とする。
［０００９］
なお、本発明で使用する卵黄タンパク質加水分解物は、脱脂処理した卵黄をそのまま、タンパク質分解酵素で加水分解したものであるのが好ましい。
［００１０］
卵黄の脱脂処理は、卵黄に食品加工に使用可能な有機溶媒（例えば、エタノール、イソプロパノール、ヘキサンなど）の少なくとも一種を作用させて実施するのが好ましい。また、タンパク質加水分解酵素としては、バチルス属細菌由来のプロテアーゼ、特にＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のタンパク質加水分解酵素を使用するのがよい。
［００１１］
かかる本発明の骨強化組成物は、天然物を使用した安全なものであるので、日常的に摂取可能な骨強化素材、飲食品、医薬または飼料として、広く使用が可能である。
［００１２］
本発明で使用する、卵黄タンパク質加水分解物はゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量分布分析において、タンパク質・ペプチド・アミノ酸の合計の面積比に対して、分子量５００以上２０，０００以下の部分の面積比が５０％以上を占めるものであればよいが、前記面積比が５５％以上を占めるものであるのがより好ましく、特に前記面積比が６５％以上を占めるものが好ましい。かかる卵黄タンパク質加水分解物は、１）骨芽細胞増殖促進（骨を作り出す細胞の増殖を促す）、２）骨芽細胞分化促進（骨を作り出す細胞の機能を高め、コラーゲン産生促進、石灰化促進）、３）破骨細胞の分化増殖抑制（骨を溶かして代謝させる細胞の機能と増殖を抑える）、４）骨成長促進という効果を有するものであり、軟骨細胞の増殖を促進して骨の成長を促す活性をも有している。
［００１３］
かかる卵黄タンパク質加水分解物を主成分とする骨強化組成物は、経口摂取が可能であるので、チーズ、バター、発酵乳等の乳食品、飲料乳、ドリンクヨーグルト、コーヒー飲料、果汁等の飲料、ゼリー、プリン、クッキー、ビスケット、ウエハース等の菓子、冷凍食品等の各種の形態の飲食品に添加し、骨強化作用を有する飲食品とすること
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
ができる。更に、カプセル、錠剤などの形態でサプリメントとして用いることもでき、骨粗鬆症の予防、症状改善を目的とした飲食品、医薬または飼料の素材として有用である。
図面の簡単な説明
［００１４］
［図１］実施例１で得た卵黄タンパク質加水分解物の、ゲル濾過クロマトグラフィーでの分子量分析の結果を示した図である。斜線部分は、分子量５００以上２０，０００以下の部分を示す。
［図２］実施例１で得た卵黄タンパク質加水分解物を用いて骨成長促進効果を測定した結果を示す図である。
［図３］実施例１で得た卵黄タンパク質加水分解物を用いて石灰化促進効果を測定した結果を示す図である。
［図４］異なる酵素を使用して得た卵黄タンパク質加水分解物を用いて骨芽細胞増殖促進活性を測定した結果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
［００１５］
本発明で用いられる卵黄は、鶏、アヒル、うずら等の卵の卵黄があげられるが、生産性の点から、鶏卵の卵黄が好ましく用いられる。また、鶏卵を用いる場合には、卵黄液、卵黄粉末、又は脱脂卵黄粉末を用いることができ、中でも卵黄粉末、又は脱脂卵黄粉末が好ましく用いられる。
［００１６］
本発明の骨強化組成物は、卵黄粉末から食品加工において用いられる有機溶媒
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
を用いて脱脂して得られた粉末を、タンパク質加水分解酵素で加水分解することにより得ることができる。脱脂に用いる有機溶媒としては、エタノール、イソプロパノール、ヘキサンなど食品加工に一般に用いられる有機溶媒の使用が可能であるが、簡便性と安全性の点からエタノールが好ましく用いられる。
［００１７］
また、卵黄から卵黄油や卵黄レシチンを製造する際に副産物として生じる脱脂卵黄を加水分解の原料に用いることも可能である。
［００１８］
本発明ではタンパク質加水分解酵素として、バチルス属細菌由来のプロテアーゼ、特にＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のタンパク質加水分解酵素、例えばノボザイム社製の「アルカラーゼ」（商品名）を使用することが重要である。
［００１９］
タンパク質加水分解酵素の濃度は、使用する酵素に応じて適宜変動するが、酵素と脱脂卵黄の質量比が１対２０から１対１０００が好ましい。また、酵素反応温度や反応時間も使用する酵素により異なるが、２５〜７５℃で１〜２４時間加水分解を行うことが好ましい。反応時間は長すぎても短すぎても、得られる加水分解物について、十分な骨芽細胞増殖促進、骨成長及び骨強化作用が得られない。
［００２０］
上記のようにして得られる卵黄タンパク質加水分解物は、適宜脱塩してそのまま本発明の骨強化組成物の原料として用いることができる。また、限外ろ過膜、ゲルろ過や各種カラムクロマトグラフィー、メンブレンフィルター、等電点を利用した方法などで
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
［００２８］
本発明の骨強化組成物は、上述した成分のほかに、賦形剤、乳化剤、安定剤、甘味料、ｐＨ調整剤、増粘剤、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、多糖類、オリゴ糖等の通常、食品に用いられる成分を含んでいてもよい。
［００２９］
本発明の骨強化組成物は、飲食品に加えるだけでなく投与形態に応じて種々の形に調製され、粉末（または顆粒）、ドリンク剤、錠剤、カプセル剤等として用いることもできる。また、卵は古くから食経験のある安全な素材であるので、継続的に用いても副作用の問題のない素材として、医薬または飼料に用いることもできる。
実施例
［００３０］
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
Ａ．脱脂卵黄の調製
卵黄粉末１ｋｇにエタノール５Ｌを加え、ブレンダーで３０分間攪拌したのち固形物を回収した。この操作を３回繰り返して卵黄から脱脂を行い、風乾し、５６８ｇの脱脂卵黄を得た。
［００３１］
Ｂ．卵黄の水溶性画分の調製
Ａで得た脱脂卵黄２８４ｇに３７℃の温水３Ｌを加えて、温度を保ちながらスターラーでよく攪拌した後、８，０００ｒｐｍ、３０分間の遠心分離を行い、上清を得た。そして、凍結乾燥で粉末化して、１３．４ｇの卵黄の水溶性画分を得た。
［００３２］
［００３３］
［００３４］
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
［００３５］
［００３６］
実施例１（卵黄タンパク質加水分解物の製造）
Ａと同様の方法で得た脱脂卵黄粉末５００ｋｇに水２．５トン及びノボザイムズ社製のアルカラーゼ（商品名、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  由来のプロテアーゼ）２５ｋｇを加え、ｐＨ７、５５℃にて３時間酵素反応させ、その後、８０℃で１５分間の熱処理で酵素を失活させ、遠心力３０００ｇで２０分間、遠心分離し、不溶物を除去し、ろ過後、ろ液をスプレー乾燥して、約１４０ｋｇの卵黄タンパク質加水分解物を得た。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
［００３７］
実施例１で得た卵黄タンパク質加水分解物の分子量分析を、以下の条件のゲル濾過クロマトグラフィーで行った。
カラム：Ｄｉｏｌ  ６０（６．０×３００ｍｍ）（商品名、ワイエムシイ社製）
溶出液：０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液、０．２Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．９）／アセトニトリル（７０：３０）
流速：０．７ｍｌ／分
検出波長：２８０ｎｍ
その結果を図１に示す。図１から、得られた卵黄タンパク質加水分解物はタンパク質・ペプチド・アミノ酸の合計を示す全面積に対して、分子量５００以上２０，０００以下の部分の面積比（斜線部）が約８５％を占めることが明らかとなった。
［００３８］
次に、実施例１の卵黄タンパク質加水分解物について、下記の試験を実施した。各試験におけるコントロールは、卵黄タンパク質加水分解物を使用しなかったものを示す。
試験１（骨成長促進効果）
実施例１で得た卵黄タンパク質加水分解物の骨成長促進効果を、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラットを用いて評価した。具体的には、蛍光物質であるテトラサイクリンを投与し、テトラサイクリンがカルシウムをキレートして骨に沈着される現象を利用して、骨に形成される蛍光バンドを観察することにより脛骨の成長を測定した。
すなわち、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラットに、精製水に溶かした試料（濃度２０ｍｇ／ｍｌ）を、胃ゾンデで経口投与（毎日、体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ、２０ｍｇ又は５０ｍｇを投与）した。そして、試験期間中の第３日目と第５日目に蛍光物質（テトラサイクリン１０ｍｇ／ｋｇ）を注射で投与し、第７日目に脛骨を摘出して、蛍光顕微鏡下で観察される２本の蛍光バンドの間隔（テトラサイクリンを投与した第３日目から第５日目の２日間における脛骨骨端の伸長）を測定した。その結果を図２に示す。図２から、投与量依存的に骨成長促進効果が得られることが分かる。
［００３９］
試験２（石灰化促進効果）
３．５ｃｍシャーレに６×１０５個のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を播種（α−ＭＥＭ培地、１０％ＦＣＳ、２ｍｍｏｌ／Ｌグリセロリン酸）し、実施例１で得た卵黄タンパク質加水分解物を１００μｇ／ｍｌの濃度で加え、２日ごとに培地とともに交換し、４週間培養を続けた後、細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝液）でリンスし、５（ｖ／ｖ）％過塩素酸を加え、超音波処理して、細胞に沈着したカルシウムを溶出させ、溶出したカルシウム量を「カルシウムＥテストワコー」（商品名、和光純薬工業株式会社製）を用いて測定して石灰化活性とした。その結果を図３に示す。図３から、卵黄タンパク質加水分解物を添加することにより、石灰化活性が有意（ｐ＜０．００１）に上昇していることが分かる。
［００４０］
試験３（破骨細胞の分化及び増殖抑制効果）
マウスの骨髄から骨髄細胞を単離して、破骨細胞への分化及び増殖を測定した。まず、マウスの大腿骨の骨髄細胞を、分化誘導因子であるＲＡＮＫＬ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏ
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
ｒ  ｏｆ  ＮＦ−κ  Ｂ  Ｌｉｇａｎｄ：ＮＦ−κ  Ｂ活性化受容体リガンド）含有のα−ＭＥＭ培地で３日間培養、サンプル処理後、再び４日間培養した。その後、細胞を固定液で固定後、ＴＲＡＰ染色キット（商品名「３８７−Ａ  Ａｃｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ」シグマアルドリッチジャパン社製）を用いて、ＴＲＡＰ染色を行い、赤く染色された破骨細胞の数を顕微鏡で観察した。実施例１の卵黄タンパク質加水分解物を５０μｇ／ｍｌ添加、１００μｇ／ｍｌ添加および２００μｇ／ｍｌ添加で培養したものと、無添加で培養したものについて、破骨細胞の発生頻度を測定した結果を次表に示す。
［００４１］
・  卵黄タンパク質加水分解物      破骨細胞（赤色染色された細胞）
・  添加量（μｇ／ｍｌ）     発生頻度（％）                
・          ０                                  ２２．５
・        ５０                                  １６
・      １００                                    ２．５
・      ２００                                    ０
上記表から、破骨細胞の発生頻度が卵黄タンパク質加水分解物の濃度依存的に抑制されていることが分かる。
［００４２］
実施例２卵黄タンパク質加水分解物）
Ａで得た脱脂卵黄粉末３００ｇに水３Ｌを加え、表１に示す酵素・条件で酵素反応を行い、その後、沸騰水浴上８０℃達温後１０分間の加熱により酵素を失活させ、ろ過助剤（セライト）を３０ｇ加え、ブフナーロートにて濾過し、得られたろ液を凍結乾燥して７種の卵黄タンパク質加水分解物を得た。
［００４３］
［表１］
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
2006075558.tif 000010
［００４４］
試験１（骨芽細胞増殖促進活性）
マウス骨芽細胞のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を、１０％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ培養液を用い、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの下でコンフルエントになるまで培養した後、トリプシン処理により細胞を集めた。集めた細胞を上記α−ＭＥＭ培養液に懸濁して細胞懸濁液（２×１０４個／ｍＬ）を調製した。この細胞懸濁液を９６穴プレートに０．１ｍＬずつ播種し、また石灰化促進剤であるα−グリセロリン酸塩（２ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加して、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの下で培養した。２４時間後に、実施例２で得られた各試料を５０（ｖ／ｖ）％ＤＭＳＯに溶解して、試料が１００μｇ／ｍＬとなるように細胞に添加した（ＤＭＳＯは培養液の１（ｖ／ｖ）％となるように添加）。そして、培養２４時間後にＭＴＴ（３−（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ）を用いて常法に従って骨芽細胞の数を測定した。
各卵黄タンパク質加水分解物（１００μｇ／ｍＬ）の骨芽細胞の増殖促進活性を、コントロール（卵黄タンパク質加水分解物未添加）の増殖数を１００としたときの相対値で表した結果を図４に示す。図４から、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のタンパク質加水分解酵素を用いて得られた卵黄
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
タンパク質加水分解物（図４の１）は、最も高い骨芽細胞増殖促進活性を有することが分かる（図４の１〜６はいずれもコントロールに対して有意差（ｐ＜０．００５）有り）。
［００４５］
［００４６］
［００４７］
［００４８］
［００４９］
［００５０］
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2006075558.tif 000011
【図２】
2006075558.tif 000012
【図３】
2006075558.tif 000013
【図４】
2006075558.tif 000014
【図５】
2006075558.tif 000015
【図６】
2006075558.tif 000016
【図７】
2006075558.tif 000017
【国際調査報告】
2006075558.tif 000018
2006075558.tif 000019
2006075558.tif 000020
2006075558.tif 000021