(57)【要約】  標的核酸中の目的ヌクレオチド領域を同定するためのプローブユニットであって、電極と、電極に結合した、標的核酸を認識するプローブと、プローブに結合したホール移動誘起剤とを備え、プローブのホール移動誘起剤結合位置と電極結合末端との間に目的ヌクレオチド領域と対合するヌクレオチド領域が位置しているプローブユニット。このプローブユニットと標的核酸とをハイブリダイズさせた前後のエネルギー誘起ホール移動による電気化学的信号の大きさを比較することにより、標的核酸中の目的ヌクレオチド領域の状態を同定できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸中の目的ヌクレオチド領域を同定するためのプローブユニットであって、電極と、電極に結合した、標的核酸を認識するプローブと、プローブに結合したホール移動誘起剤とを備え、プローブのホール移動誘起剤結合位置と電極結合末端との間に目的ヌクレオチド領域と対合するヌクレオチド領域が位置しているプローブユニット。
【請求項２】
標的核酸中の目的ヌクレオチドを同定するためのプローブユニットであって、プローブのホール移動誘起剤結合位置と電極結合末端との間に目的ヌクレオチドと対合するヌクレオチドが位置している請求項１に記載のプローブユニット。
【請求項３】
プローブが、標的核酸とハイブリダイズすることにより標的核酸を認識するものである請求項１に記載のプローブユニット。
【請求項４】
プローブが６〜30個のヌクレオチド又はその誘導体からなるものである請求項１に記載のプローブユニット。
【請求項５】
ホール移動誘起剤が光増感剤である請求項１に記載のプローブユニット。
【請求項６】
光増感剤が、光励起ホール移動を起こすことができるものである請求項５に記載のプローブユニット。
【請求項７】
光増感剤が、キノン系増感剤、フラビン系増感剤、及びベンゾフェノン系増感剤からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項５に記載のプローブユニット。
【請求項８】
プローブが、スペーサーを介して電極に結合している請求項１に記載のプローブユニット。
【請求項９】
スペーサーが、有機低分子化合物、核酸、及びポリペプチドからなる群より選ばれる物質である請求項８に記載のプローブユニット。
【請求項１０】
スペーサーの長さが１〜3nmである請求項８に記載のプローブユニット。
【請求項１１】
電極のスペーサー結合面に複数の電極スペーサーを備える請求項1に記載のプローブユニット。
【請求項１２】
プローブがDNAであり、プローブ中の目的ヌクレオチドに対合するヌクレオチドの塩基がグアニン又はシトシンである請求項２に記載のプローブユニット。
【請求項１３】
プローブが、標的核酸の目的ヌクレオチドと対合する位置に、下記式（１）
【化１】
2006075497.tif 000006
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、それぞれ独立して水素原子、アミノ基、モノ低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、水酸基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、メルカプト基、低級アルキルチオ基、又はアリール基を示す。）
で表されるヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチド誘導体である請求項２に記載のプローブユニット。
【請求項１４】
プローブ中のA及びTからなる群より選ばれるヌクレオチドの連続数が３以下である請求項１に記載のプローブユニット。
【請求項１５】
プローブ中の、ホール移動誘起剤が結合したヌクレオチドに対して、電極結合末端とは反対側に位置するヌクレオチドがG及びC以外のヌクレオチドである請求項１に記載のプローブユニット。
【請求項１６】
プローブ内部のヌクレオチドにホール移動誘起剤が結合している請求項１に記載のプローブユニット。
【請求項１７】
基体と、１又は複数の請求項１〜１６のいずれかに記載のプローブユニットと、プローブの電極から電気化学的信号を検出するための手段とを備え、プローブユニットの電極が電気化学的信号を検出できるように基体に配置されているヌクレオチド領域同定装置。
【請求項１８】
目的ヌクレオチド領域の同定方法であって、
標的核酸と電極に結合したプローブとをハイブリダイズさせる第１工程と、
第１工程の前又は後に、プローブ又は標的核酸に、直接又は間接的にホール移動誘起剤を結合させ、このときプローブのホール移動誘起剤結合位置と電極結合位置との間に目的ヌクレオチド領域と対合するヌクレオチド領域が位置するようにプローブにホール移動誘起剤を結合させるか、標的核酸中のプローブの電極結合位置に対応する位置とホール移動誘起剤結合位置との間に目的ヌクレオチド領域が位置するように、標的核酸にホール移動誘起剤を結合させる第２工程と、
上記ハイブリダイズ産物へのエネルギー供給により、ホール移動誘起剤結合位置から電極へのプローブ中のホール移動を引き起こして電極から検出される電気化学的信号を検出し、ハイブリダイズ前のプローブにエネルギー供給した場合に電極から検出される電気化学的信号と比較することにより、標的核酸中の目的ヌクレオチド領域がプローブ中の対応する領域と完全相補的であるか否かを判定する第３工程と
を含む目的ヌクレオチド領域の同定方法。
【請求項１９】
ホール移動誘起剤をプローブに結合させる請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
第１工程の前に第２工程を行う請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
目的ヌクレオチド領域が一つの目的ヌクレオチドからなるものである請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
プローブが６〜３０個のヌクレオチド又はその誘導体からなるものである請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
ホール移動誘起剤が光増感剤である請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
光増感剤が、光励起ホール移動を起こすことができるものである請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
光増感剤が、キノン系増感剤、フラビン系増感剤、及びベンゾフェノン系増感剤からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
プローブが、スペーサーを介して電極に結合している請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
スペーサーが、有機低分子化合物、核酸、及びポリペプチドからなる群より選ばれる物質である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
スペーサーの長さが１〜3nmである請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
電極が、スペーサー結合面に複数の電極スペーサーを備えるものである請求項１８に記載の方法。
【請求項３０】
プローブがDNAであり、プローブ中の目的ヌクレオチドに対合するヌクレオチドの塩基がグアニン又はシトシンであり、第３工程において標的核酸中の目的ヌクレオチドの塩基がシトシン又はグアニンであるか否かを判定する請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
プローブが、標的核酸の目的ヌクレオチドと対合する位置に、下記式（１）
【化２】
2006075497.tif 000007
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、それぞれ独立して水素原子、アミノ基、モノ低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、水酸基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、メルカプト基、低級アルキルチオ基、又はアリール基を示す。）
で表されるヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチド誘導体であり、第３工程において標的核酸中の目的ヌクレオチドの塩基がチミンであるか否かを判定する請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
プローブ中のA及びTからなる群より選ばれるヌクレオチドの連続数が３以下である請求項１８に記載の方法。
【請求項３３】
プローブ中の、ホール移動誘起剤が結合したヌクレオチドに対して、電極結合末端とは反対側に位置するヌクレオチドがG及びC以外のヌクレオチドである請求項１８に記載の方法。
【請求項３４】
プローブ内部のヌクレオチドにホール移動誘起剤が結合している請求項１８に記載の方法。
【請求項３５】
エネルギーを1〜100mW・cm-2照射する請求１８に記載の方法。
【請求項３６】
波長300〜600nmの光を照射する請求項２３に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１２に記載のプローブユニット中のプローブと標的核酸とをハイブリダイズさせる工程と、
このプローブにエネルギー供給して電極から電気化学的信号を検出し、標的核酸をハイブリダイズさせないプローブにエネルギー供給する場合に電極から検出される電気化学的信号と比較することにより、標的核酸中の目的ヌクレオチド領域がプローブ中の対応する領域と完全相補的であるか否かを判定する工程と
を含む目的ヌクレオチド領域の同定方法。
【請求項３８】
目的ヌクレオチド領域が一つのヌクレオチドからなるものであり、判定工程において、標的核酸中の目的ヌクレオチドがプローブ中の対応する領域と相補的であるか否かを判定することにより、標的核酸中の目的ヌクレオチドの塩基がシトシン又はグアニンであるか否かを判定する請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
エネルギーを１〜100mW・cm-2供給する請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
エネルギーが光であり、波長300〜600nmの光を照射する請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
請求項１３に記載のプローブユニット中のプローブと標的核酸とをハイブリダイズさせる工程と、
このプローブにエネルギー供給して電極から電気化学的信号を検出し、標的核酸をハイブリダイズさせないプローブにエネルギー供給する場合に電極から検出される電気化学的信号と比較することにより、標的核酸中の目的ヌクレオチド領域がプローブ中の対応する領域と完全相補的であるか否かを判定する工程と
を含む目的ヌクレオチド領域の同定方法。
【請求項４２】
目的ヌクレオチド領域が一つのヌクレオチドからなるものであり、判定工程において、標的核酸中の目的ヌクレオチドがプローブ中の対応する領域と相補的であるか否かを判定することにより、標的核酸中の目的ヌクレオチドの塩基がチミンであるか否かを判定する請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
エネルギーを１〜100mW・cm-2供給する請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
エネルギーが光であり、波長300〜600nmの光を照射する請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
標的核酸中の目的ヌクレオチド領域を同定するためのプローブユニットの製造方法であって、標的核酸を認識するプローブに直接又は間接的にホール移動誘起剤を結合させる工程と、プローブの一端を電極と結合させる工程とを含み、ホール移動誘起剤結合工程において、プローブのホール移動誘起剤結合位置と電極結合末端との間に目的ヌクレオチド領域と対合するヌクレオチド領域が位置するようにホール移動誘起剤を結合させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的核酸中の特定位置のヌクレオチド領域の状態を同定するためのプローブユニット、このプローブを備えるヌクレオチド同定装置、及びヌクレオチド同定方法に関する。
【従来技術】
【０００２】
従来、核酸プローブを用いた核酸塩基決定方法としては、プローブと標的核酸とをハイブリダイズさせ、その融解温度を測定する方法が知られている。詳述すれば、プローブの所定位置の塩基が標的核酸の対応塩基と塩基対を形成する場合としない場合とで、融解温度が若干異なることを利用して、塩基を同定している。
【０００３】
この場合、プローブ又は標的核酸は、通常蛍光物質又は放射性物質を用いて標識される。放射標識する場合は、管理区域内での煩雑な作業を必要とする。また、蛍光標識する場合は、特殊な検出器が必要であり、コスト高になる。
【０００４】
さらに、この方法は、対合する塩基が塩基対を形成する場合としない場合との融解温度の差ができるだけ大きくなるようなハイブリダーゼーション条件を個々の標的核酸ごとに設定する必要がある。また、塩基間の非特異的な吸着や塩基対形成の不安定性などによる検出エラーが生じ易い。
【０００５】
蛍光又は放射標識する方法に代わるヌクレオチドの検出方法として、電気化学的方法が用いられるようになってきた。
【０００６】
例えば、特許文献１、２は、核酸プローブを電極表面に固定したものと標的核酸とをハイブリダイズさせた後、この反応液に２本鎖核酸へのインターカレーターのような電気応答性試薬を添加してこの電気応答性試薬に由来する酸化還元電位を検出することにより、ハイブリダイズの有無、ひいては特定位置のヌクレオチドを同定する方法を開示している。
【０００７】
しかし、この方法は、ミスマッチ塩基数が少ない場合は、全てマッチする場合との間で熱力学的バックグランドが同程度であるため、ミスマッチとして検出することができず、検出感度が低い。また個々の標的核酸ごとに電気応答性試薬の種類や使用量を設定する必要があり、これが検出エラーの原因となる。また、ハイブリダイゼーションの有無により標的ヌクレオチドを同定することから、個々の標的核酸ごとに最適なハイブリダイゼーション条件を設定する手間を要するとともに、ハイブリダイゼーション効率の変動により検出エラーが生じ易い。
【０００８】
また、この方法は、距離依存的一段階電子移動を基礎とした技術であるために、比較的短い標的核酸でしか正確な同定ができない。従って、現実には生体由来の核酸を対象にすることができない。また、標的核酸を比較的密に配置する必要があり、コスト高になる。
【０００９】
また特許文献３は、核酸プローブをスペーサーを介して電極に接続し、標的核酸と核酸プローブとをハイブリダイズさせた後、インターカレーターのような電気応答性試薬を添加して、この電気応答性試薬に由来する酸化還元電位を検出することにより、ハイブリダイズの有無、ひいては特定位置のヌクレオチドを同定する方法を開示している。特許文献２の方法は、スペーサーを用いることから核酸プローブが反応液中で動き易くなるため、標的核酸とのハイブリダイゼーション効率が高くなって、特定核酸の同定効率が向上する。
【００１０】
特許文献３の方法も、電気応答性試薬の添加を必要とする点、及びハイブリダイゼーション効率の影響を受ける点で特許文献１、２の方法と変わりがない。
【００１１】
また特許文献４は、分子内に互いに相補的な逆向き配列と、それらに挟まれた標的核酸に相補的な配列とを有するプローブであって、一方の末端に酸化還元性ユニットが結合され、他方の末端を電極に接続させたものを用いて標的核酸中の特定ヌクレオチドを同定する方法を開示している。このプローブは、それ単独では、分子内でハイブリダイズすることによりヘアピン構造を採り、酸化還元ユニットと電極とが近接しているが、標的核酸とハイブリダイズすることによりヘアピン構造が開いて、酸化還元ユニットが電極から遠ざかる。この変化を電気化学的信号として検出することにより、ハイブリダイズの有無を検出する。
【００１２】
特許文献４の方法は、電気応答性試薬を必要としないが、標的核酸と核酸プローブとのハイブリダイゼーション効率に左右されるために、最適なハイブリダイゼーション条件を設定する必要がある。
【特許文献１】特許2573443号明細書
【特許文献２】特表2002-510791号公報
【特許文献３】特開2004-61237号公報
【特許文献４】WO2004/035829号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、ハイブリダイゼーション効率に依存せずに、標的核酸中の目的ヌクレオチド領域の状態を同定できる高感度なプローブユニット、ヌクレオチドの同定装置、及びヌクレオチド領域の同定方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ね、以下の(i)及び(ii)の知見を得た。
(i)  オリゴヌクレオチドからなるプローブの一端部にホール移動誘起剤を結合させ、他端を電極に結合したものを用いて、プローブと標的核酸とをハイブリダイズさせた後、プローブに光などのエネルギーを供給すると、プローブ中のグアニン又はシトシンを有するヌクレオチドを介してホール移動（ホールホッピング）が起こり、このホール移動が電極において電気信号として検出される。【００１５】
また、標的核酸のプローブとの結合末端部にホール移動誘起剤を結合させたものと、ホール移動誘起剤結合位置とは反対側の端に電極を結合したプローブとをハイブリダイズさせ、エネルギー供給してもホール移動による電気信号が検出される。【００１６】
さらに、プローブ及び標的核酸のいずれにホール移動誘起剤を結合させる場合も、ハイブリダイズさせた後にホール移動誘起剤を結合させ、エネルギー供給しても、ホール移動による電気信号が検出される。
(ii)  標的核酸中のグアニンと対合するヌクレオチドがデオキシシチジル酸若しくはシチジル酸である場合、又は標的核酸中のシトシンと対合するヌクレオチドがデオキシグアニル酸若しくはグアニル酸である場合、即ちGC塩基対が形成される場合は、ホール移動が起こり易く、その結果大きな電気信号が検出されるが、グアニンと対合するヌクレオチドが、デオキシシチジル酸若しくはシチジル酸以外であるか、シトシンと対合するヌクレオチドがデオキシグアニル酸若しくはグアニル酸以外である場合、即ち塩基対がミスマッチする場合は、ホール移動が起こり難く、その結果電気信号が小さくなる。【００１７】
この現象を利用することにより、標的核酸中の特定位置のヌクレオチドの塩基がシトシン又はグアニンであるか否かを、ハイブリダイゼーション効率に影響されずに、かつ高感度で検出できる。【００１８】
また、標的核酸がプローブと完全相補的でなく、欠失や挿入がある場合もホール移動が起こり難く、その結果電気信号が小さくなる。
(iii)   以下の式（１）【００１９】
【化１】
2006075497.tif 000002
【００２０】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、それぞれ独立して水素原子、アミノ基、モノ低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、水酸基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、メルカプト基、低級アルキルチオ基、又はアリール基を示す。）
で表されるヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチド誘導体をプローブとして用いて、(i)と同様にしてホール移動による電気信号を検出すると、上記ヌクレオチド誘導体と対合するヌクレオチドがデオキシチミジル酸である場合には、ホール移動が起こり易く大きな電気信号が得られるが、その他のヌクレオチドである場合は、ホール移動が起こり難く得られる電気信号が小さくなる。【００２１】
この現象を利用すれば、標的核酸中の特定ヌクレオチドがデオキシチミジル酸であるか否かを、ハイブリダイゼーション効率に影響されずに、かつ高感度で検出できる。【００２２】
また、標的核酸中の特定位置のヌクレオチドがデオキシアデニル酸であるか否かは、標的核酸の相補鎖の対応ヌクレオチドがデオキシチミジル酸であるか否かを調べることにより同定できる。【００２３】
また、標的核酸がプローブと完全相補的でなく、欠失や挿入がある場合もホール移動が起こり難く、その結果電気信号が小さくなる。【００２４】
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下のプローブユニット、ヌクレオチド領域の同定装置、及びヌクレオチド領域の同定方法を提供する。【００２５】
項１．  標的核酸中の目的ヌクレオチド領域を同定するためのプローブユニットであって、電極と、電極に結合した、標的核酸を認識するプローブと、プローブに結合したホール移動誘起剤とを備え、プローブのホール移動誘起剤結合位置と電極結合末端との間に目的ヌクレオチド領域と対合するヌクレオチド領域が位置しているプローブユニット。【００２６】
項２．  標的核酸中の目的ヌクレオチドを同定するためのプローブユニットであって、プローブのホール移動誘起剤結合位置と電極結合末端との間に目的ヌクレオチドと対合するヌクレオチドが位置している項１に記載のプローブユニット。【００２７】
項３．  プローブが、標的核酸とハイブリダイズすることにより標的核酸を認識するものである項１に記載のプローブユニット。【００２８】
項４．  プローブが６〜30個のヌクレオチド又はその誘導体からなるものである項１に記載のプローブユニット。【００２９】
項５．  ホール移動誘起剤が光増感剤である項１に記載のプローブユニット。【００３０】
項６．  光増感剤が、光励起ホール移動を起こすことができるものである項５に記載のプローブユニット。【００３１】
項７．  光増感剤が、キノン系増感剤、フラビン系増感剤、及びベンゾフェノン系増感剤からなる群より選ばれる少なくとも１種である項５に記載のプローブユニット。【００３２】
項８．  プローブが、スペーサーを介して電極に結合している項１に記載のプローブユニット。【００３３】
項９．  スペーサーが、有機低分子化合物、核酸、及びポリペプチドからなる群より選ばれる物質である項８に記載のプローブユニット。【００３４】
項１０．  スペーサーの長さが１〜3nmである項８に記載のプローブユニット。【００３５】
項１１．  電極のスペーサー結合面に複数の電極スペーサーを備える項1に記載のプローブユニット。【００３６】
項１２．  プローブがDNAであり、プローブ中の目的ヌクレオチドに対合するヌクレオチドの塩基がグアニン又はシトシンである項２に記載のプローブユニット。【００３７】
項１３．  プローブが、標的核酸の目的ヌクレオチドと対合する位置に、下記式（１）【００３８】
【化２】
2006075497.tif 000003
【００３９】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、それぞれ独立して水素原子、アミノ基、モノ低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、水酸基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、メルカプト基、低級アルキルチオ基、又はアリール基を示す。）
で表されるヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチド誘導体である項２に記載のプローブユニット。【００４０】
項１４．  プローブ中のA及びTからなる群より選ばれるヌクレオチドの連続数が３以下である項１に記載のプローブユニット。【００４１】
項１５．  プローブ中の、ホール移動誘起剤が結合したヌクレオチドに対して、電極結合末端とは反対側に位置するヌクレオチドがG及びC以外のヌクレオチドである項１に記載のプローブユニット。【００４２】
項１６．  プローブ内部のヌクレオチドにホール移動誘起剤が結合している項１に記載のプローブユニット。【００４３】
項１７．  基体と、１又は複数の項１〜１６のいずれかに記載のプローブユニットと、プローブの電極から電気化学的信号を検出するための手段とを備え、プローブユニットの電極が電気化学的信号を検出できるように基体に配置されているヌクレオチド領域同定装置。【００４４】
項１８．  目的ヌクレオチド領域の同定方法であって、
標的核酸と電極に結合したプローブとをハイブリダイズさせる第１工程と、
第１工程の前又は後に、プローブ又は標的核酸に、直接又は間接的にホール移動誘起剤を結合させ、このときプローブのホール移動誘起剤結合位置と電極結合位置との間に目的ヌクレオチド領域と対合するヌクレオチド領域が位置するようにプローブにホール移動誘起剤を結合させるか、標的核酸中のプローブの電極結合位置に対応する位置とホール移動誘起剤結合位置との間に目的ヌクレオチド領域が位置するように、標的核酸にホール移動誘起剤を結合させる第２工程と、
上記ハイブリダイズ産物へのエネルギー供給により、ホール移動誘起剤結合位置から電極へのプローブ中のホール移動を引き起こして電極から検出される電気化学的信号を検出し、ハイブリダイズ前のプローブにエネルギー供給した場合に電極から検出される電気化学的信号と比較することにより、標的核酸中の目的ヌクレオチド領域がプローブ中の対応する領域と完全相補的であるか否かを判定する第３工程と
を含む目的ヌクレオチド領域の同定方法。【００４５】
項１９．  ホール移動誘起剤をプローブに結合させる項１８に記載の方法。【００４６】
項２０．  第１工程の前に第２工程を行う項１８に記載の方法。【００４７】
項２１．  目的ヌクレオチド領域が一つの目的ヌクレオチドからなるものである項１８に記載の方法。【００４８】
項２２．  プローブが６〜３０個のヌクレオチド又はその誘導体からなるものである項１８に記載の方法。【００４９】
項２３．  ホール移動誘起剤が光増感剤である項１８に記載の方法。【００５０】
項２４．  光増感剤が、光励起ホール移動を起こすことができるものである項２３に記載の方法。【００５１】
項２５．  光増感剤が、キノン系増感剤、フラビン系増感剤、及びベンゾフェノン系増感剤からなる群より選ばれる少なくとも１種である項２３に記載の方法。【００５２】
項２６．  プローブが、スペーサーを介して電極に結合している項１８に記載の方法。【００５３】
項２７．  スペーサーが、有機低分子化合物、核酸、及びポリペプチドからなる群より選ばれる物質である項２６に記載の方法。【００５４】
項２８．  スペーサーの長さが１〜3nmである項２６に記載の方法。【００５５】
項２９．  電極が、スペーサー結合面に複数の電極スペーサーを備えるものである項１８に記載の方法。【００５６】
項３０．  プローブがDNAであり、プローブ中の目的ヌクレオチドに対合するヌクレオチドの塩基がグアニン又はシトシンであり、第３工程において標的核酸中の目的ヌクレオチドの塩基がシトシン又はグアニンであるか否かを判定する項２１に記載の方法。【００５７】
項３１．  プローブが、標的核酸の目的ヌクレオチドと対合する位置に、下記式（１）【００５８】
【化３】
2006075497.tif 000004
【００５９】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、それぞれ独立して水素原子、アミノ基、モノ低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、水酸基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、メルカプト基、低級アルキルチオ基、又はアリール基を示す。）
で表されるヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチド誘導体であり、第３工程において標的核酸中の目的ヌクレオチドの塩基がチミンであるか否かを判定する項２１に記載の方法。【００６０】
項３２．  プローブ中のA及びTからなる群より選ばれるヌクレオチドの連続数が３以下である項１８に記載の方法。【００６１】
項３３．  プローブ中の、ホール移動誘起剤が結合したヌクレオチドに対して、電極結合末端とは反対側に位置するヌクレオチドがG及びC以外のヌクレオチドである項１８に記載の方法。【００６２】
項３４．  プローブ内部のヌクレオチドにホール移動誘起剤が結合している項１８に記載の方法。【００６３】
項３５．  エネルギーを1〜100mW・cm-2照射する請求１８に記載の方法。【００６４】
項３６．  波長300〜600nmの光を照射する項２３に記載の方法。【００６５】
項３７．  項１２に記載のプローブユニット中のプローブと標的核酸とをハイブリダイズさせる工程と、
このプローブにエネルギー供給して電極から電気化学的信号を検出し、標的核酸をハイブリダイズさせないプローブにエネルギー供給する場合に電極から検出される電気化学的信号と比較することにより、標的核酸中の目的ヌクレオチド領域がプローブ中の対応する領域と完全相補的であるか否かを判定する工程と
を含む目的ヌクレオチド領域の同定方法。【００６６】
項３８．  目的ヌクレオチド領域が一つのヌクレオチドからなるものであり、判定工程において、標的核酸中の目的ヌクレオチドがプローブ中の対応する領域と相補的であるか否かを判定することにより、標的核酸中の目的ヌクレオチドの塩基がシトシン又はグアニンであるか否かを判定する項３７に記載の方法。【００６７】
項３９．  エネルギーを１〜100mW・cm-2供給する項３７に記載の方法。【００６８】
項４０．  エネルギーが光であり、波長300〜600nmの光を照射する項３７に記載の方法。【００６９】
項４１．  項１３に記載のプローブユニット中のプローブと標的核酸とをハイブリダイズさせる工程と、
このプローブにエネルギー供給して電極から電気化学的信号を検出し、標的核酸をハイブリダイズさせないプローブにエネルギー供給する場合に電極から検出される電気化学的信号と比較することにより、標的核酸中の目的ヌクレオチド領域がプローブ中の対応する領域と完全相補的であるか否かを判定する工程と
を含む目的ヌクレオチド領域の同定方法。【００７０】
項４２．  目的ヌクレオチド領域が一つのヌクレオチドからなるものであり、判定工程において、標的核酸中の目的ヌクレオチドがプローブ中の対応する領域と相補的であるか否かを判定することにより、標的核酸中の目的ヌクレオチドの塩基がチミンであるか否かを判定する項４１に記載の方法。【００７１】
項４３．  エネルギーを１〜100mW・cm-2供給する項４１に記載の方法。【００７２】
項４４．  エネルギーが光であり、波長300〜600nmの光を照射する項４１に記載の方法。【００７３】
項４５．  標的核酸中の目的ヌクレオチド領域を同定するためのプローブユニットの製造方法であって、標的核酸を認識するプローブに直接又は間接的にホール移動誘起剤を結合させる工程と、プローブの一端を電極と結合させる工程とを含み、ホール移動誘起剤結合工程において、プローブのホール移動誘起剤結合位置と電極結合末端との間に目的ヌクレオチド領域と対合するヌクレオチド領域が位置するようにホール移動誘起剤を結合させる方法。
【発明の効果】
【００７４】
本発明のヌクレオチド領域の同定方法は、核酸プローブ内のエネルギー誘起ホール移動による電気信号を検出し、対合するヌクレオチドの種類によってこのホール移動効率が異なる現象を利用して標的核酸中の目的ヌクレオチドを同定する方法であることから、極めて高感度にヌクレオチドを同定できる。また、標的核酸中にプローブに対して欠失や挿入があって、プローブと標的核酸とが1対１でハイブリダイズしない場合には、ホール移動効率が低くなるため、このような欠失や挿入の検出も含めて標的核酸のヌクレオチド領域を同定できる。【００７５】
詳述すれば、標的核酸とプローブとをハイブリダイズさせる場合に、プローブ中の特定ヌクレオチドと対合するヌクレオチドとの間で１個でもミスマッチ等の不整合を生じていると、そこから先へはホール移動が起こらない又は殆ど起こらないことから、１塩基の違いでも検出できる。このため、この方法は、一塩基多型の検出にも実用できる。また、標的核酸が例えばゼプトモル（10-21モル）オーダーの極めて微量しか存在しない場合にも、その中の目的ヌクレオチドを同定できる。さらに、ホール移動による信号を検出することから、ハイブリダイゼーション効率に影響されない。【００７６】
また、個々の標的核酸ごとにハイブリダイゼーション条件を設定する手間を要さないとともに、ハイブリダイゼーション条件の差により検出誤差が生じることがない。【００７７】
また、ホール移動による電気信号を検出することから、電気応答性試薬の添加を要さない。このため、電気応答性試薬の種類や添加量の違いによる検出誤差が生じない。また、個々の標的核酸ごとに、電気応答性試薬の添加及び過剰の電気応答性試薬の除去を行う手間を要さない。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】プローブ１を用いたヌクレオチドの同定結果を示すグラフである。
【図２】プローブ２を用いたヌクレオチドの同定結果を示すグラフである。
【図３】MDA含有デオキシリボヌクレオシド誘導体の合成方法を示す図である。
【図４】MDA含有オリゴヌクレオチド誘導体の合成方法を示す図である。
【図５】プローブ３を用いたヌクレオチドの同定結果を示すグラフである。
【図６】プローブ４を用いたヌクレオチドの同定結果を示すグラフである。
【図７】Gプローブ、及びMDAプローブの双方を用いたヌクレオチドの同定により、25人のパネラーを、T/Tホモ接合、C/Cホモ接合、又はC/Tヘテロ接合に分類した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７９】
以下、本発明を詳細に説明する。
(I)プローブユニット
本発明のプローブユニットは、標的核酸中の目的ヌクレオチド領域を同定するためのプローブユニットであって、電極と、電極に結合した、標的核酸を認識するプローブと、プローブに結合したホール移動誘起剤とを備える。プローブにおいて、目的ヌクレオチド領域と対合するヌクレオチド領域は、電極結合末端とホール移動誘起剤結合位置との間に位置する。
プローブ
プローブは、標的核酸を認識するオリゴヌクレオチド又はその誘導体であり、標的核酸に何らかの条件下でハイブリダイズすることによりこれを認識するものが含まれる。【００８０】
本発明のプローブユニットに包含されるのは、オリゴヌクレオチド若しくはその誘導体（第一のプローブ）、又は上記式（１）で表されるヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチド誘導体（第二のプローブ）である。【００８１】
第一のプローブが、標的核酸とのマッチ又はミスマッチの別を検出するためのもの、即ち、標的核酸中の目的ヌクレオチドの種類を同定するためのものである場合は、第一のプローブは、標的核酸中の同定されるべきヌクレオチドに対応するヌクレオチドを除き、実質的に全てのヌクレオチドが標的核酸の対応領域と相補的であればよい。第一のプローブにおいて、同定されるべきヌクレオチドに対応するヌクレオチドの塩基はグアニン又はシトシンである。【００８２】
第二のプローブが、標的核酸とのマッチ又はミスマッチの別を検出するためのもの、即ち、標的核酸中の目的ヌクレオチドの種類を同定するためのものである場合は、第二のプローブも、標的核酸中の同定されるべきヌクレオチドに対応するヌクレオチドを除き、実質的に全てのヌクレオチドが標的核酸の対応領域と相補的であればよい。第二のプローブにおいて、標的核酸中の目的ヌクレオチドに対合するのが式（１）で表されるヌクレオチド誘導体である。式（１）のヌクレオチド誘導体の中でも、Ｒ１又はＲ２がアミノ基である化合物が好ましく、Ｒ１がアミノ基であり、Ｒ４がメトキシ基であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６が水素原子である化合物（メトキシベンゾデアザアデニン；MDA含有ヌクレオチド誘導体)がより好ましい。MDA含有ヌクレオチド誘導体の構造を以下に示す。【００８３】
【化４】
2006075497.tif 000005
【００８４】
第一及び第二のプローブが、標的核酸のプローブに対するヌクレオチド数の過多、即ちヌクレオチドの挿入を検出するべきものである場合は、ハイブリダイズさせた場合に標的核酸のヌクレオチドが２本鎖から外に飛び出る。この場合は、標的核酸のその飛び出る領域を除く領域とプローブとは実質的に全てが相補的であればよい。
また、第一及び第二のプローブが、標的核酸のプローブに対するヌクレオチドの不足、即ちヌクレオチドの欠失を検出するべきものである場合は、ハイブリダイズさせた場合にプローブのヌクレオチドが２本鎖から外に飛び出る。この場合は、プローブ中のその飛び出る領域を除く領域と標的核酸とは実質的に全てが相補的であればよい。
第一及び第二のプローブにおいて、ホール移動誘起剤が結合したヌクレオチドに対して電極結合末端とは反対側に位置するヌクレオチド、即ちホール移動誘起剤の結合位置より開放末端側に位置するヌクレオチドを G にせざるを得ない場合、これらの G に代えて、イノシン含有ヌクレオチドを採用することが好ましい。これにより、ホール移動誘起剤から電極方向へのホール移動が一層効率的に行われるようになる。【００８５】
また、第一及び第二のプローブにおいて、標的核酸をハイブリダイズさせる上で、A又はTの連続数が４個以上となる場合は、いずれかのA又はTに代えて一般式（１）のヌクレオチド誘導体（代表的にはMDA含有ヌクレオチド）を採用することが好ましい。これにより、A又はTの存在によるホール移動効率の低下が抑制される。この場合の一般式（１）のヌクレオチド誘導体は標的核酸中のヌクレオチドの同定には関与しない。【００８６】
第一及び第二の各プローブは、DNAであってもよく、RNAであってもよいが、ホール移動が起こり易く検出感度が高い点で、DNAであることが好ましい。また、ホスホロチオエートDNA、H-ホスホネートDNAのような修飾DNAや、2'-O-RNA、ホスホロチオエートRNAのような修飾RNAも使用できる。さらに、DNAとRNAとのいわゆるキメリックヌクレオチドも使用できる。【００８７】
また、プローブの長さは特に限定されず、通常オリゴヌクレオチドと称されるものの他に、ポリヌクレオチドと称されるものも含まれる。但し、その長さは、それには限定されないが、6〜30塩基程度が好ましく、６〜20塩基程度がより好ましい。上記の長さであれば、融解温度(Tm)が室温以上になって室温下で標的核酸と安定な塩基対を形成できるとともに、エネルギー供給に対して十分に強い電気化学的応答が得られる。【００８８】
第一及び第二の各プローブにおいて、同定されるべきヌクレオチド領域に対合するヌクレオチド又はその誘導体からなる領域は、ホール移動誘起剤が結合したヌクレオチドと電極結合末端との間に位置していればよいが、余りに端部であると、マッチする場合とミスマッチ等する場合との電気化学的信号の差が小さくなる傾向にあるため、できるだけプローブの中央部に位置するように設計することが望ましい。
ホール移動誘起剤
ホール移動誘起剤は、光、電子線等のエネルギー照射によりそれが結合するプローブ中のホール移動を誘起できるものであればよい。ホール移動誘起剤としては、代表的には光増感剤が挙げられる。光増感剤は、特に限定されず、公知のものを使用できる。例えば、アントラキノンのようなキノン系分子、ルミフラビンのようなフラビン系分子、シアノベンゾフェノンのようなベンゾフェノン系分子、臭化エチジウムのような核酸結合性色素、トリフェニルルテニウムのような核酸結合性金属錯体などが挙げられる。【００８９】
中でも検出感度が高くなる点で、キノン系、フラビン系、及びベンゾフェノン系増感剤が好ましい。また、キノン系分子、フラビン系分子はインターカレーターであるため、標的核酸とのハイブリダイズ後に2本鎖間にインターカレートしてその位置が安定に保たれる。特に、キノン系増感剤が好ましく、アントラキノンがより好ましい。【００９０】
ホール移動誘起剤は、プローブ中の同定されるべきヌクレオチド領域に対応するヌクレオチド領域を挟んで、電極結合末端とは反対側に位置するヌクレオチドに結合していればよい。ホール移動誘起剤はプローブの末端ヌクレオチドより内部のヌクレオチドに結合していることが好ましく、これによりホール移動誘起剤が２本鎖間に位置してその位置が安定に保たれる。【００９１】
エネルギー誘起ホール移動はプローブ中を5'末端側から3'末端側へ、及び3'末端側から５'末端側への双方向に起こり得ることから、ホール移動誘起剤は、プローブにおいて、目的ヌクレオチドに対合する位置より5'末端側に結合していてもよく、3'末端側に結合していてもよい。【００９２】
ホール移動誘起剤は、プローブに直接結合していてもよいが、プローブ中のヌクレオチドを例えばアミノ化し、このアミノ基に結合させることもできる。【００９３】
また、ホール移動誘起剤の結合量は、プローブ１個当たり１〜20分子程度が好ましく、１〜３分子程度がより好ましい。上記の結合量であれば、オリゴヌクレオチド内でホール移動を引き起こすことができるとともに、塩基同定感度が高くなる。即ち、ホール移動誘起剤量が極端に多いと、ミスマッチ塩基対等が存在していてもホール移動が起こってしまい、マッチする塩基対を特異的に検出できないが、上記範囲であればこのような問題は生じない。
スペーサー
プローブは、スペーサーを介して電極に結合していることが好ましい。スペーサーは、プローブが折れ曲がる等により電極と接触してプローブ全体を通したホール移動を妨げるのを防止する役割を果たす。スペーサー分子の種類は特に限定されず、例えば有機低分子化合物；ポリペプチド；核酸などを使用できる。【００９４】
スペーサーは、一端に電極と結合するための官能基を有していればよい。このような官能基としては、チオール基、ケイ酸残基、リン酸残基、アミノ基、ビオチン残基などが挙げられる。【００９５】
スペーサーの長さは、１〜３nm程度であることが好ましい。上記の範囲であれば、スペーサーの機能を十分に果たすことができるとともに、プローブの末端から電極へのホール移動を妨げない。この長さは、スペーサーの末端官能基を除く部分が直鎖状飽和炭化水素である場合に、C2〜C10程度の長さに該当する。また、スペーサーが核酸である場合には、ヌクレオチド１〜５個程度の長さに該当する。また、スペーサーがポリペプチドである場合には、アミノ酸１〜10個程度の長さに該当する。【００９６】
スペーサーは、末端官能基を除く部分がC2〜C10程度、特にC４〜C８程度の長さの直鎖状飽和炭化水素であることが好ましい。このようなスペーサーの具体例としては、C2〜C10（特に、C４〜C８）のアルキルチオール、アルキルアミンが挙げられる。
電極
電極は、プローブ内を流れる光電流を検出するためのものである。【００９７】
電極材料は、特に限定されず、例えば、金、白金、白金黒、パラジウム、ロジウムのような貴金属；グラファイト、グラシーカーボンのような炭素；酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛、ＩＴＯのような金属酸化物；シリコン、ゲルマニウム、ガリウム砒素、酸化亜鉛のような半導体；チタンなどが挙げられる。【００９８】
この電極は、例えば電気化学的信号の検出手段として２電極方式又は３電極方式の電気化学セルを用いる場合の作用電極とすることができる。【００９９】
電極の面積は特に限定されないが、通常１mm2〜1cm2程度とすればよい。この範囲であれば、一つの電極上に、検出できる程度の大きさの電気信号を与える量のプローブを結合させることができる。【０１００】
一つの電極上には、通常１mm2当たり1fmol〜１μmol程度、好ましくは1pmol〜10nmol程度のプローブが結合されていればよい。この範囲であれば、１塩基の違いや１塩基の挿入又は欠失でも検出できる程度の大きさの電気化学信号を検出することができる。
電極スペーサー
本発明のプローブユニットは、電極のプローブユニット結合面に、複数の電極スペーサーを備えることが好ましい。この電極スペーサーは、プローブユニットが電極に直接接触してプローブを通したホール移動を妨げるのを防止する役割を果たす。【０１０１】
電極スペーサーは、一端に電極と結合するための官能基を有し、他端部に、水酸基、アミノ基、カルボキシル基のような親水性の官能基を備えることが好ましい。電極スペーサーの電極結合末端とは反対側の端部に親水性官能基を備えることにより、電極スペーサーとプローブや標的核酸との非特異的な相互作用を防止でき、電極スペーサーによる光誘起ホール移動の阻害が生じない。【０１０２】
電極スペーサーの長さは、１〜３nm程度であることが好ましい。上記の範囲であれば、電極スペーサーの機能を十分に果たすことができる。この長さは、電極スペーサーの末端官能基を除く部分が直鎖状飽和炭化水素である場合に、C2〜C10程度の長さに該当する。また、スペーサーが核酸である場合には、ヌクレオチド1〜5個程度の長さに該当する。また、電極スペーサーがポリペプチドである場合には、アミノ酸1〜10個程度の長さに該当する。【０１０３】
電極スペーサーは、末端官能基を除く部分がC2〜C10程度、特にC4〜C８程度の長さの直鎖状飽和炭化水素であることが好ましい。このような電極スペーサーの具体例としては、C2〜C10（特に、C４〜C８）のメルカプトアルカノール、アルキルアミンが挙げられる。【０１０４】
電極スペーサーは、プローブ１分子当たり、通常1〜1000分子程度、好ましくは100〜500分子程度が電極に結合していればよい。上記範囲であれば十分にその効果が得られる。
(II)プローブユニットの製造方法
本発明のプローブユニットの製造方法は、標的核酸を認識するプローブにホール移動誘起剤を結合させる工程と、プローブの一端を電極と結合させる工程とを含み、ホール移動誘起剤結合工程において、プローブのホール移動誘起剤結合位置と電極結合末端との間に目的ヌクレオチド領域と対合するヌクレオチド領域が位置するようにホール移動誘起剤を結合させる方法である。【０１０５】
プローブと領域との間、及びプローブと電極との間は、通常、共有結合により結合すればよい。【０１０６】
(III)ヌクレオチド同定装置
本発明のヌクレオチド同定装置は、基体と、１又は複数の上記プローブユニットと、プローブユニットの電極から電気化学的信号を検出するための手段とを備える。プローブユニットは、その電極から電気化学的信号を検出できるように基体に配置されている。【０１０７】
基体は、プローブユニットを支持するとともに、複数のプローブユニットを用いる場合は、これらのプローブユニットの電極間を絶縁する役割を果たす。【０１０８】
基体の材料は、電気絶縁性材料であればよく特に限定されない。例えば、ガラス、セメント、陶磁器のようなセラミックス；ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレートのようなポリマー；シリコーン、活性炭などが挙げられる。【０１０９】
プローブユニットの電極は、互いに基体材料で絶縁されており、また電気化学的信号の検出手段と接続されている。【０１１０】
電気化学的信号の検出手段は、ホール移動による微小な電流を、電流、電圧、クーロン量、抵抗値などとして検出できるものであればよく、特に限定されない。このような微小な電流を検出できるものとして、例えば２電極方式又は３電極方式の電気化学セルが挙げられる。この場合、電気化学的信号検出手段は、参照電極又は参照電極及び対電極、並びに電圧計又は電流計を備えるものであり、プローブの電極を作用電極としてこれとともに電気化学セルを構成して、光電流を検出する。
(IV)ヌクレオチドの同定方法
本発明の目的ヌクレオチド領域の同定方法は、
標的核酸と電極に結合したプローブとをハイブリダイズさせる第１工程と、
第１工程の前又は後に、プローブ又は標的核酸に、直接又は間接的にホール移動誘起剤を結合させ、このときプローブのホール移動誘起剤結合位置と電極結合位置との間に目的ヌクレオチド領域と対合するヌクレオチド領域が位置するようにプローブにホール移動誘起剤を結合させるか、標的核酸中のプローブの電極結合位置に対応する位置とホール移動誘起剤結合位置との間に目的ヌクレオチド領域が位置するように、標的核酸にホール移動誘起剤を結合させる第２工程と、
上記ハイブリダイズ産物へのエネルギー供給により、ホール移動誘起剤結合位置から電極へのプローブ中のホール移動を引き起こして電極から検出される電気化学的信号を検出し、ハイブリダイズ前のプローブにエネルギー供給した場合に電極から検出される電気化学的信号と比較することにより、標的核酸中の目的ヌクレオチド領域がプローブ中の対応する領域と完全相補的であるか否かを判定する第３工程と
を含む。【０１１１】
ホール移動誘起剤は、プローブ又は標的核酸のいずれに結合させてもよい。いずれの場合も、供給されたエネルギーがホール移動誘起剤によりホールの発生のために使用されて二本鎖中の電極へのホール移動が起こる。【０１１２】
プローブに結合させる場合は、プローブのホール移動誘起剤結合位置と電極結合位置との間に目的ヌクレオチド領域と対合するヌクレオチド領域が位置するように、ホール移動誘起剤を結合させればよい。【０１１３】
また、標的核酸に結合させる場合は、プローブの電極結合位置に対応する位置と、ホール移動誘起剤結合位置との間に、同定されるべきヌクレオチド領域が位置するように、ホール移動誘起剤を結合させればよい。【０１１４】
ホール移動誘起剤は、直接結合させてもよいが、プローブと標的核酸とをハイブリダイズさせた後に結合させる場合は、ヘキスト３３２５８、マイトマイシン、シスプラチン、ディスタマイシンなどのＤＮＡ結合剤を2本鎖間にバインド（結合）させ、そのＤＮＡ結合剤にホール移動誘起剤を結合させてもよい。さらに、ホール移動誘起剤がＤＮＡ結合剤である場合は、２本鎖間にバインド（結合）させるだけでもよい。【０１１５】
プローブ、スペーサー、電極、電極スペーサー、ホール移動誘起剤については、本発明のプローブユニットについて説明した通りである。【０１１６】
第１工程の前にホール移動誘起剤をプローブに結合させる場合は、第２工程を行わず、上記説明した本発明のプローブユニットを用いることもできる。この場合、本発明のヌクレオチド領域の同定方法は、以下の第一及び第二の２方法に分けることができる。【０１１７】
本発明の第一のヌクレオチドの同定方法は、本発明のプローブユニットの第一のプローブ（オリゴヌクレオチド）と標的核酸とをハイブリダイズさせる工程と；このプローブにエネルギー供給して電極から電気化学的信号を検出し、標的核酸をハイブリダイズさせないプローブにエネルギー供給する場合に電極から検出される電気化学的信号と比較することにより、標的核酸中の目的ヌクレオチド領域とプローブの対応する領域とが完全相補的であるか否かを判定する工程とを含む方法である。代表的には、標的核酸中の目的ヌクレオチドとプローブの対応するヌクレオチドとが相補的であるか否かを判定し、これにより、標的核酸中の目的ヌクレオチドの塩基がグアニン又はシトシンであるか否かを判定する。【０１１８】
第一の方法において、標的核酸中の同定しようとする目的ヌクレオチドに対合するプローブ中の特定ヌクレオチドの塩基がグアニンである場合は、標的核酸中の目的ヌクレオチドの塩基がシトシンであるか否かを判定し、プローブ中の特定ヌクレオチドの塩基がシトシンである場合は、標的核酸中の目的ヌクレオチドの塩基がグアニンであるか否かを判定する。【０１１９】
また、本発明の第二のヌクレオチドの同定方法は、上記の第一の同定方法において、第一のプローブに代えて、式（１）で表されるヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチド誘導体からなる第二のプローブを備えたプローブユニットを用いる方法である。第二の方法では、代表的には、標的核酸中の目的ヌクレオチドとプローブの対応するヌクレオチドとが相補的であるか否かを判定し、これにより、標的核酸中の目的ヌクレオチドの塩基がチミンであるか否かを判定する。
標的核酸
標的核酸は、１本鎖核酸であればよい。標的核酸はDNAであってもよく、RNAであってもよいが、DNAの方が検出感度が高い。特に、プローブとしてDNA又はその誘導体を用い、標的核酸としてDNAを用いる場合には、高感度にヌクレオチドを同定できる。【０１２０】
一般式（１）のヌクレオチド誘導体を含むプローブを用いる場合は、そのヌクレオチド誘導体がデオキシチミジンと対合する場合に強いホール移動が生じることから、標的核酸はDNAである。【０１２１】
また、標的核酸をPCRのような公知の方法で増幅した後に、プローブとハイブリダイズさせることにより、検出感度が向上する。この場合、本発明のヌクレオチド同定方法は、ハイブリダイズ工程に先立ち、標的核酸を増幅させる工程を含めばよい。【０１２２】
また、標的核酸は、例えばヒトから採取された血液や、微生物を含むかもしれない食品からの核酸抽出液のような夾雑物質を多く含むサンプルの形態で用いることもできる。この場合、サンプルを60〜100℃程度で熱処理することにより、２本鎖核酸を１本鎖核酸に変性させ、好ましくはPCRなどにより増幅させた後に使用すればよい。
ハイブリダイズ工程
ハイブリダイズに際しては、例えば1nM〜1mM程度の濃度の標的核酸を本発明のプローブに接触させればよい。【０１２３】
ハイブリダイズ条件は、プローブ中のオリゴヌクレオチドと標的核酸との相補性の程度などによって異なるが、例えば、10〜100mMの中性バッファー(代表的には50mM  リン酸ナトリウムバッファー（ｐH7.0))中で、５〜40℃程度、30秒間〜１時間程度の条件が挙げられる。また、従来のハイブリダイゼーションを利用したヌクレオチドの同定方法においては、ハイブリダイズ後に洗浄により未結合の核酸を除去しない場合に検出エラーが生じ易いが、本発明方法は、残存する未結合核酸が核酸内ホール移動を妨げることがない。従って、ハイブリダイゼーション後の洗浄は必ずしも要さないが、洗浄を行っても構わない。洗浄は、例えば10〜100mMの中性バッファーで、５〜40℃程度、30秒間〜１時間程度の条件で行えばよい。【０１２４】
また、このようなハイブリダイゼーション溶液を使用しなくても、血液サンプル、食品からの核酸抽出液のような粗サンプルをそのまま、本発明のプローブと接触させることもできる。この場合は、5〜40℃程度の粗サンプルを、30秒間〜１時間程度プローブと接触させればよい。
光照射工程
このようにして、標的核酸をハイブリダイズさせたプローブに、通常１〜100mW・cm-2程度、好ましくは５〜50mW・cm-2程度のエネルギー密度で、数msec〜１分間程度、光のようなエネルギーを供給すればよい。エネルギー密度が上記範囲であれば、十分にホール移動を起こすことができる。また、これ以上エネルギー密度が高くてもコスト高になるだけである。【０１２５】
また、エネルギーが光である場合は、光の波長は特に限定されず、ホール移動誘起剤（この場合光増感剤）の感光域に合わせた波長にすればよいが、例えば300〜600nm程度の紫外光が好ましい。余りに波長が短いと、ポリヌクレオチドや基板が光を吸収して電流を誘起し、エラーが生じる恐れがあるが、上記範囲であればこのような問題は生じない。
電気化学的信号の検出・判定
判定工程においては、標的核酸をハイブリダイズさせたプローブにエネルギー供給して検出される電気化学的信号と、標的核酸をハイブリダイズさせていないプローブに同じ条件でエネルギー供給した場合に検出される電気化学的信号とを比較する。これは、標的核酸やプローブの配列、長さによって信号の絶対値が異なるためである。【０１２６】
オリゴヌクレオチドプローブを用いる第一の方法では、標的核酸とハイブリダイズさせる前の信号値（電流、電圧など）を１とした場合に、ハイブリダイズ後の信号値が例えば1.5以上、好ましくは３以上である場合に、標的核酸中の目的ヌクレオチドの塩基がシトシン又はグアニンであると判定することができる。それより低い場合は、目的ヌクレオチドの塩基がシトシン又はグアニン以外であるか、プローブに対して欠失や挿入が存在して１対１にはハイブリダイズしていないと判定することができる。【０１２７】
また、オリゴヌクレオチド誘導体プローブを用いる第二の方法では、標的核酸とハイブリダイズさせる前の信号値（電流、電圧など）を１とした場合に、ハイブリダイズ後の信号値が例えば1.5以上、好ましくは３以上である場合に、標的核酸中の目的ヌクレオチドがデオキシチミジル酸であると判定することができる。それより低い場合は、目的ヌクレオチドの塩基がチミン以外であるか、プローブに対して欠失や挿入が存在して１対１にはハイブリダイズしていないと判定することができる。【０１２８】
なお、標的核酸をハイブリダイズさせた後のプローブは、熱処理やホルムアミド処理により１本鎖にして、再使用することができる。【０１２９】
実施例
以下、本発明を実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
＜測定方法＞
1H NMRは、Varian Mercury 400(400MHz)スペクトロメーターを用いて測定した。カップリング定数(J値)はhertzで表した。化学シフトは、残存するクロロフォルムを内部標準として用いて（H NMRにおいてδ=7.24）テトラメチルシランから下流にppmで示した。【０１３０】
FAB massは、JEOL JMS HX-110Aスペクトロメーターで記録した。DNA合成試薬はGlen Rsearchから購入した。【０１３１】
オリゴデオキシヌクレオチドの量はMALDI-TOF MS(Perseptive Voyager Elite,アクセレーション電圧 21kV,ネガティブモード)で、マトリクスとして2',3',4'-トリヒドロキシアセトフェノンを用い、オリゴヌクレオチドの内部標準としてT8（[M -H-]2370.61）及びT17（[M -H-]5108.37）を用いて、決定した。【０１３２】
逆相HPLCは、Gilsonクロマトグラフモデル305付きのCHEMOCOBOND 5-ODS-Hカラム（10×150mm。4.6×150mm）及び254nmのUV検出器モデル118を用いて行った。
【実施例１】
【０１３３】
2-アントラキノンカルボキシリックアシッドN-ヒドロキシスクシンイミドエステルの合成
以下のようにして光増感剤である2-アントラキノンカルボキシリックアシッドN-ヒドロキシスクシンイミドエステルを合成した。【０１３４】
2-アントラキノンカルボキシリックアシッド（200mg、0.79mmol）及びN-ヒドロキシスクシンイミド（91mg,0.79mmol）のアセトニトリル(6ml)溶液に、EDCI（152mg,0.79mmol）を添加し、この混合物を室温で２時間攪拌した。この反応混合物を蒸発させ、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロフォルム/メタノール＝100:1）で精製し、2-アントラキノンカルボキシリックアシッドN-ヒドロキシスクシンイミドエステルを薄黄色固体として得た。【０１３５】
生成物について1H NMR(CDCl3,400MHz)を行った結果、δ9.08(d,J＝1.6Hz,1H),8.52(dd,J=8.2,1.8Hz,1H),8.47(d,J=8.0Hz,1H),8.39-8.34(2H),7.88-7.85(2H),2.96(s,4H)の化学シフトが検出された。【０１３６】
また、FABMSを行った結果、m/e(%)350[(M+H)+]の結果が得られた。【０１３７】
また、C19H12NO6についてHRMSを行った結果、計算上の[(M+H)+]350.0665が350.0663の位置に検出された。
【実施例２】
【０１３８】
アントラキノン修飾オリゴデオキシヌクレオチド
applied Biosystem 392 DNA/RNAシンセサイザーを用いて、フォスフォルアミダイト法によりDNAを合成した。アミノ基及びジスルフィド基の取り込みは、それぞれAmino-Modifier C2 T2及びThiol-Modifier C6 S-S(Glen Research)を用いて行った。合成したDNAは、5-ODS-Hカラム（10×150mm）の逆相HPLCにアプライし、0.1M酢酸トリエチルアミン(pH7.0)を5-20%のアセトニトリルの直線的濃度勾配をつけて3.0mL/分間の流量で30分間流すことにより溶出を行った。【０１３９】
この方法で、3'末端にジスルフィド基を含む、Uがアミノ修飾されたオリゴデオキシヌクレオチド5'-d(TaminoUCACTTCAGTG)-(CH2)6-S-S-(CH2)6-T-3'(核酸部分は配列番号１)、及び5'-d(TaminoUACACTGAAGTG)-(CH2)6-S-S-(CH2)6-T-3'(核酸部分は配列番号２)を合成した。【０１４０】
この２種のオリゴデオキシヌクレオチドの各50mMリン酸ナトリウムバッファー（pH8.0）溶液（25μM,全量100μL）に、実施例１で得られた2-アントラキノンカルボキシリックアシッドN-ヒドロキシスクシンイミドエステルの1:1 DMF-ジオキサン（40μL）溶液（50mM）を添加し、室温で12時間インキュベートした。【０１４１】
反応混合物を逆相HPLCにアプライした後、0.1M酢酸トリエチルアミン(pH7.0)を0-60%のアセトニトリルの直線的濃度勾配をつけて3.0mL/分間の流量で１時間流すことにより溶出を行い、アントラキノン修飾オリゴデオキシヌクレオチドを精製した。【０１４２】
得られたアントラキノン修飾オリゴデオキシヌクレオチドは、それぞれ5'-d(TAQUCACTTCAGTG)-(CH2)6-S-S-(CH2)6-T-3'(核酸部分は配列番号１)、及び5'-d(TAQUACACTGAAGTG)-(CH2)6-S-S-(CH2)6-T-3'(核酸部分は配列番号２)である。
【実施例３】
【０１４３】
チオール化したオリゴデオキシヌクレオチドの調製
3'-ジスルフィド修飾オリゴデオキシヌクレオチドの50mMリン酸ナトリウムバッファー(pH8.0)溶液（25μM,全量100μL）に、ジチオスレイトールの50ｍMリン酸ナトリウム(pH8.0)溶液(0.1M)を300μL添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物を逆相HPLCにアプライした後、0.1M酢酸トリエチルアミン(pH7.0)を0-60%のアセトニトリルの直線的濃度勾配をつけて3.0mL/分間の流量で１時間流すことにより溶出を行い、チオール化アントラキノン修飾オリゴデオキシヌクレオチドを精製した。【０１４４】
得られたチオール化アントラキノン修飾オリゴデオキシヌクレオチドは、それぞれ5'-d(TAQUCACTTCAGTG)-(CH2)6-SH-3'（プローブ１）(核酸部分は配列番号１)、及び5'-d(TAQUACACTGAAGTG)-(CH2)6-SH-3'(プローブ２) (核酸部分は配列番号２)である。
＜質量分析＞
実施例２及び３で合成した６種のオリゴデオキシヌクレオチド誘導体は、以下のようにして、MAILDI-TOF MS分析を行うことにより、その構造を確認した。【０１４５】
精製された各オリゴデオキシヌクレオチド誘導体の溶液の少量を仔牛腸アルカリフォスファターゼ(50U/ml)、ヘビ毒フォスフォジエステラーゼ(0.15U/ml)、及びP1ヌクレアーゼ(50U/ml)を用いて37℃で３時間完全消化した。消化DNA溶液をCosmosil 5C-18ARのHPLC又はCHEMCOBOND 5-ODS-Hカラム(4.6×150mm)にアプライし、0.1M酢酸トリエチルアミン(pH7.0)を0-20%のアセトニトリルの直線的濃度勾配をつけて1.0mL/分間の流量で20分間流すことにより溶出を行った。【０１４６】
各オリゴデオキシヌクレオチド誘導体の濃度は、dA、dC、dG及びdTの0.1mM標準溶液のピーク面積と比較することにより決定した。【０１４７】
各オリゴデオキシヌクレオチド誘導体についてMALDI-TOF MS分析を行い、以下の結果が得られた。
(a)ジスルフィド含有アミノ修飾オリゴデオキシヌクレオチド
5'-d(TaminoUCACTTCAGTG-(CH2)6-S-S-(CH2)6-T-3'(核酸部分の配列は配列番号１)；m/z計算上の[M -H] -4342.09が4342.75に検出された。
5'-d(TaminoUACACTGAAGTG-(CH2)6-S-S-(CH2)6-T-3'(核酸部分の配列は配列番号２)；m/z計算上の[M -H] -4713.35が4715.52に検出された。
(b)アントラキノン修飾オリゴデオキシヌクレオチド
5'-d(TAQUCACTTCAGTG-(CH2)6-S-S-(CH2)6-T-3'(核酸部分の配列は配列番号１)；m/z計算上の[M -H] -4575.30が4578.57に検出された。
5'-d(TAQUACACTGAAGTG-(CH2)6-S-S-(CH2)6-T-3'(核酸部分の配列は配列番号２)；m/z計算上の[M -H] -4946.56が4949.27に検出された。
(c)チオール化オリゴデオキシヌクレオチド
5'-d(TAQUCACTTCAGTG-(CH2)6-SH)-3'(核酸部分の配列は配列番号１)；m/z計算上の[M -H] -4138.88が4140.67に検出された。
5'-d(TAQUACACTGAAGTG-(CH2)6-SH)-3'(核酸部分の配列は配列番号２)；m/z計算上の[M -H] -4507.83が4510.48に検出された。
【実施例４】
【０１４８】
チオール化されたオリゴデオキシヌクレオチドの金電極への固定
面積2mm2の金電極を使用した。オリゴデオキシヌクレオチド誘導体の固定の前に、電極を沸騰した2M水酸化カリウムに３時間浸漬し、脱イオン水で洗浄した。次いで、この電極を濃硝酸に１時間浸漬し、脱イオン水で洗浄した。【０１４９】
電極への化学吸着のために、実施例３で得られた２種のチオール化アントラキノン修飾オリゴデオキシヌクレオチドの溶液(プローブ１，２)（10μM）の１μLを電極上に載置し、溶液が蒸発しないように電極の端にゴムキャップを被せた。これを室温で２時間静置した。【０１５０】
次いで、金表面を隠すために、6-メルカプトヘキサノールの10mM Tris-EDTAバッファー（pH8.0）溶液(1mM)の１μLを金電極上に載せ、溶液の蒸発を防ぐために電極の端にゴムキャップを被せた。これを室温で１時間静置した。次いで、この電極を少量の脱イオン水で洗浄した。
【実施例５】
【０１５１】
標的DNAのハイブリダイゼーション
標的DNAを金電極に固定化されたプローブにハイブリダイズさせるために、10μMの標的DNA溶液の１μLを、金電極の上に載せ、溶液の蒸発を防ぐために電極の端をゴムキャップで覆い、室温で30分間静置した。【０１５２】
標的DNAとしては、プローブ１に対して、サンプル１（3'-AAGTGAAGTCAC-5'）(配列番号３)、及びサンプル２（3'-AAGTGAAATCAC-5'）(配列番号４)を用いた。配列番号３の標的DNAは、プローブ１の配列番号１の塩基番号８のCに対応する塩基がGでマッチしている。また、配列番号４の標的DNAは、プローブ１の配列番号１の塩基番号８のCに対応する塩基がAでミスマッチしている。配列番号３及び４は、アルコール代謝系で働くアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH2)の部分配列であり、配列番号３は塩基番号８がGであるが、配列番号４のように、これがAである場合（G1510A)は、アルコールを代謝し難いことが知られている。【０１５３】
また、サンプル１の塩基配列を含む全長91塩基のサンプル３（3'-GGGAGTGGCCGGGAGTTGGGCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTGAAGTGAAAACTGTCACAGTCAAAGTGCCTCAGAAGAACTCATAAG-5'）(配列番号５）及び、サンプル２の塩基配列を含む全長91塩基のサンプル４（3'-GGGAGTGGCCGGGAGTTGGGCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTAAAGTGAAAACTGTCACAGTCAAAGTGCCTCAGAAGAACTCATAAG-5'）(配列番号６）も、プローブ１に対する標的核酸として用いた。配列番号５の標的DNAは、プローブ１の配列番号１の塩基番号46のCに対応する塩基がGでマッチしている。また、配列番号６の標的DNAは、プローブ１の配列番号１の塩基番号46のCに対応する塩基がAでミスマッチしている。【０１５４】
プローブ２に対する標的DNAとしては、サンプル５（3'-TATGTGACTTCAC-5'）(配列番号７)、及びサンプル６（3'- TATGTGATTTCAC -5'）(配列番号８)を用いた。配列番号７の標的DNAは、プローブ２の配列番号２の塩基番号８のGに対応する塩基がCでマッチしている。一方、配列番号８の標的DNAは、プローブ２の配列番号２の塩基番号８のGに対応する塩基がTでミスマッチしている。【０１５５】
標的DNAの溶液は、10mMカコジル酸ナトリウム(pH7.0)を含む水溶液とした。
【実施例６】
【０１５６】
光電気化学的測定
１コンパートメントパイレックス（登録商標）セルを用いて光電気化学的測定を行った。このセルに、200WのUVランプ（Sumida  YLT-MX200）を用いて365±5nmのバンドパスフィルター（φ25mm,Asahi Bunko）を通して単色励起光を照射した。光電流を、修飾Au作用電極（電極面積2mm2）、プラチナ対電極、及びSCE参照電極を備える３電極方式(ALS,モデル660A)を用いて25℃で測定した。光強度を光強度計（Ushio UIT-150）を用いて測定した。光電流測定は、10mMカコジル酸ナトリウム（pH7.0）の中で、λ=365±5nmの光で、13.0±0.3mW・cm-2の電力密度で、SCE電極への印加電圧を＋0.5Vとして行った。【０１５７】
プローブ１の結果を図１a及び図1bに示し、プローブ２の結果を図２に示す。図１a及び図２は、20回の実験結果を示し、図1bは、10回の実験結果を示す。プローブ１及び２において、標的DNAと対合させる前の電流密度は-187±23 nA・cm-2であった。【０１５８】
図1aに示すように、プローブ１については、プローブ１のCと12塩基長の標的DNA（サンプル１）のGとが対合するとき電流密度は-299±21nA・cm-2であり、この値は、標的DNAと対合させる前の電流密度の約1.6倍であった。一方、プローブ１のCと12塩基長の標的DNA（サンプル２）のAとが対合するとき電流密度は-153±32nA・cm-2であり、この値は標的DNAと対合させる前の電流密度と同程度であった。【０１５９】
図1bに示すように、プローブ１については、プローブ１のCと91塩基長の標的DNA(サンプル３）のGとが対合するとき電流密度は-297±20nA・cm-2であり、この値は、この値は標的DNAと対合させる前の電流密度の約1.6倍であった。一方、プローブ１のCと91塩基長の標的DNA(サンプル４）のAとが対合するとき電流密度は-205±25nA・cm-2であり、この値は標的DNAと対合させる前の電流密度と同程度であった。標的DNAの長さにかかわらず、正確にヌクレオチドを同定できることが分かる。【０１６０】
図２に示すように、プローブ２については、プローブ２のGと標的DNA(サンプル５）のCとが対合するとき、電流密度は-271±25nA・cm-2であり、この値は、標的DNAと対合させる前の電流密度の約1.4倍であった。一方、プローブ２のGと標的DNA(サンプル６）のTとが対合するとき、電流密度は-170±12nA・cm-2であり、この値は、標的DNAと対合させる前の電流密度と同程度であった。
【実施例７】
【０１６１】
金電極に固定されたオリゴデオキシヌクレオチドの定量
電極表面に固定されたプローブ１，２の量をchronocoulometric assayにより、ルテニウム(III)ヘキサアミンの存在下で、Tarlovの方法（Steel,A,B.:Herne,T.M.;Tarlov,M.J. Anal.Chem.1998,70,4670-4677）に従い行った。面積2mm2の電極上に、それぞれ1cm2当たり6.0×1012個（9.9±0.8pmol／cm2)のプローブ１、２が結合していた。
【実施例８】
【０１６２】
MDA含有ヌクレオシド誘導体の合成
図３を参照して説明する。2-ブタノン(50ml)中に3-フルオロ-4-ニトロフェノール（6.0g、38.2mmol）、インドメタン(25ml)及び炭酸カリウム（10.0g、72.0mmol）を含む混合物を40℃で４時間加熱した。反応混合物を蒸発し、クロロホルム(50ml)中に注入した。これにより白色固体として6.81gの3-フルオロ-4-ニトロアニソール（図３化合物（k））が得られた。【０１６３】
無水THF（153ml）中のエチルシアノアセテート（9.8ml、93.4mmol）の氷冷溶液に、窒素ガス下で、tert-カリウムブトキシド（10.9g、101.9mmol）を添加した。得られた白色懸濁液を15分間撹拌し、化合物(k)（8.0g、46.7mmol）を添加した。懸濁液を還流しつつ1.5時間加熱した。溶液を水中に注入し、水性混合物をエーテルで３回抽出し、有機化合物相を乾燥し、濃縮して油にした。次いで、この油をクロロフォルムに溶解し、カラムクロマトグラフィーでクロロフォルムを用いて溶出させることにより精製した。精製物画分を合わせて、濃縮することにより、淡黄色油としてシアノ（2-ニトロフェニル）酢酸エチルエステル（図３化合物（l））14.5gを得た。【０１６４】
化合物（l）（13.2g、46.3mmol）の氷酢酸（185ml）溶液にZn粉末（12.1mg、185mmol）を添加した。混合物を超音波処理し、55℃で45分間加熱し、さらに4gのZn粉末を添加した。超音波処理後、さらに105分間加熱し、茶色混合物を濾過した。濾液を濃縮し、残さを得た。残さをカラムクロマトグラフィーにより精製し、連続的に０％、５％、10％の酢酸エチルのヘキサン溶液で溶出した。これにより、2-アミノ-5-メトキシ-1H-インドール-3-カルボキシリックアシッドエチルエステル（図３化合物(m)）2.07g（収率52%）を得た。【０１６５】
化合物(m)（100mg、0.42mmol）、ナトリウムメトキシド（50mg、0.93mmol）及びフォルムアミド(20ml)の懸濁液を220℃で1.5時間加熱した。溶液を25℃に冷却し、水中に注入した。茶色固体を集め、乾燥することにより1,9-ジヒドロ-6-メトキシ-4H-ピリミド［4,5-b］インドール-4-オン（図３化合物(n)）（47mg、収率52%）を得た。【０１６６】
化合物(n)（500mg、2.3mmol）、フォスフォリルクロリド（25ml）及び1,4-ジオキサン(25ml)の混合物を６時間還流した。混合物を減圧下に濃縮し、残さをエタノール中に注入した。５分間撹拌後、茶色の懸濁液を濾過し濾液を水中に注入した。白色固体として4-クロロ-6-メトキシ-1H-ピリミド［4,5-b］インドール（図３化合物(o)）を回収した（620mg、収率96%）。【０１６７】
化合物(o)（100mg、0.43mmol）を無水アセトニトリル(10ml)に室温で懸濁した。この懸濁液に水素化ナトリウム（油中60％、19mg、0.47mmol）を添加し、混合物を10分間還流しつつ撹拌した。リボース（184mg、0.47mmol）を添加し、混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、ヘキサン中の20%酢酸エチルで溶出させることより精製した。これにより、4-クロロ-6-メトキシ-7-（2-デオキシ-3,5-ジ-O-p-トルオイル-β-D-エリスロ-ペントフラノシル）-7H-ピリミド［4,5-b］インドール（図３化合物（p））210mg（収率82%）を得た。【０１６８】
20mlメタノール／アンモニア（-76℃で飽和）中の化合物(p)（500mg、0.85mmol）を密閉容器内で150℃で10時間撹拌した。濁った溶液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィによりクロロフォルム中の10％メタノールを用いて溶出し、4-アミノ-6-メトキシ-9-（2’-デオキシ-β-D-エリスロ-ペントフラノシル）-7H-ピリミド［4,5-b］インドール（図３化合物(r)）（420mg、75%）を得た。【０１６９】
この化合物は、塩基としてメトキシベンゾデアザアデニン(MDA)を有するデオキシリボヌクレオシド誘導体である。
【実施例９】
【０１７０】
MDA含有オリゴヌクレオチド誘導体の合成
図４を参照して、実施例８により得られたMDA含有ヌクレオシド誘導体からMDA含有オリゴヌクレオチド誘導体を合成した例を説明する。【０１７１】
N,N-ジメチルフォルムアミドジメチルアセタール（10ml、28mmol）を含む、図３の化合物（r）（90mg、0.27mmol）のジメチルフォルムアミド(10ml)溶液を60℃の温度下で３時間撹拌した。この溶液を減圧下で濃縮した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロフォルム：メタノール＝10:1）により精製し、白色固体として（図４化合物（s））（120mg、0.1mmol、88%）を得た。【０１７２】
ジメトキシトリチルクロリド(DMT-Cl)（137mg,0.41mmol）を含む、化合物(s) （120mg、0.1mmol）のピリジン(10ml)溶液を室温下で２時間撹拌した。この溶液を減圧下で濃縮した。残さをシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール：トリエチルアミン）＝90:３：５）により精製し、白色固体として（図４化合物（t））（161mg、75%）を得た。【０１７３】
化合物(t)（50mg、72.7mmol）、N,N,N’,N’-テトライソプロピル-2-シアノエチルフォスフォロアミダイト（25μl、79.9μmol）及びテトラゾール（7mg、0.１mmol）の0.3mlアセトニトリル溶液を室温下で２時間撹拌した。混合物を濾過した。これにより、（図４化合物（u））を得た。この化合物(u)を精製せずにDNA合成に供した。【０１７４】
化合物(u)を用いてアプライドバイオシステム392DNA/RNAシンセサイザーを用いてフォスフォロアミダイト法によりオリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体5’-AAQUACACTｎAAGTG-3’（配列番号７）である（ｎは、MDA含有デオキシリボヌクレオチド誘導体；化合物(u)相当）。得られたMDA含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体を5-ODS-Hカラム（10×150mm）を用いた逆相HPLCにより精製した。溶出は、0.1Mトリエチルアミンアセテート(TEAA),pH7.0においてアセトニトリルを20分間で５％から25％の勾配をつけて、流速3.0ml/分間で行った。
【実施例１０】
【０１７５】
光電気化学的測定
実施例９で得られたオリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体を用いて実施例２〜４と同様にして、MDA含有オリゴヌクレオチドを含むプローブ３を金電極に固定した。プローブ３の核酸部分の塩基配列は、5'-AAQUACACTMDAAAGTG-3'（配列番号９）である。【０１７６】
実施例５と同様にして、このプローブ３と、サンプル５（配列番号７）及び６（配列番号８）とをそれぞれハイブリダイズさせた。配列番号７の標的DNAは、プローブ３の塩基番号８のMDAに対合する塩基がCでマッチしている。一方、配列番号８の標的DNAは、プローブ３の塩基番号８のMDAに対合する塩基がTでミスマッチしている。さらに、実施例６と同様にして、光電気化学的測定を行った。結果を図５に示す。【０１７７】
プローブ３において、標的DNAと対合させる前の電流密度は-187±23 nA・cm-2であった。プローブ３のMDA含有ヌクレオチドと標的DNA(サンプル６)のTとが対合するとき、電流密度は-282±21nA・cm-2であり、この値は、標的DNAと対合させる前の電流密度の約1.5倍であった。一方、MDA含有ヌクレオチドと標的DNAのCとが対合するとき(サンプル５)
電流密度は-198±15nA・cm-2であり、この値は、標的DNAと対合させる前の電流密度と同程度であった。
【実施例１１】
【０１７８】
実施例２〜４と同様にして、核酸部分の塩基配列が5'-IAQUAGACATMDAAC-3'(配列番号10)であるプローブ４を金電極に固定した。プローブ４の塩基番号９は、標的DNAのTと相補的な塩基であることが必要であるが、プローブ４中にA又はTが４塩基以上連続しないように塩基番号９をAに代えてMDA含有ヌクレオチドにしたものである。従って、塩基番号９のMDA含有ヌクレオチドは多型を検出するためのものではない。【０１７９】
実施例５と同様にして、このプローブ４と、サンプル７（3'-CATCTGTATTG-5'；配列番号11）及び８（3'-CATCTATATTG-5'；配列番号12）とをそれぞれハイブリダイズさせた。サンプル７及び８は、ヒトチオプリンS-メチルトランスフェラーゼ(TPMT)遺伝子の部分配列である。TPMTは血液悪性腫瘍の治療剤であるアザチオプリンや6-メルカプトプリンの代謝に関与している。TPMT遺伝子の多型は多数存在するが、日本人の有する変異アレルの殆どはTPMT＊3Cである。TPMT＊3Cの変異は、塩基番号６がAからGになったものであり、これにより上記治療剤の代謝が行われ難くなることが知られている。【０１８０】
配列番号11の標的DNAは、プローブ４の塩基番号６のCに対合する塩基がGでマッチしている。一方、配列番号12の標的DNAは、プローブ４の塩基番号６のCに対合する塩基がAでミスマッチしている。【０１８１】
さらに、実施例６と同様にして、光電気化学的測定を行った。10回の実験結果を図６に示す。プローブ４において、標的DNAと対合させる前の電流密度は-135±13nA・cm-2であった。プローブ４のCと標的DNA(サンプル７)のGとが対合するとき、電流密度は-234±14nA・cm-2であり、この値は、標的DNAと対合させる前の電流密度の約1.7倍であった。一方、プローブ４のCと標的DNA(サンプル８)のAとが対合するとき、電流密度は-118±17nA・cm-2であり、この値は、標的DNAと対合させる前の電流密度と同程度であった。
【実施例１２】
【０１８２】
25人のパネラーから、同意を得て、その染色体DNA中のALDH2遺伝子のG1459A位置を含む91塩基の領域を、フォワードプライマー（5'-GGGAGTGGCCGGGAGTT-3'）（配列番号13)、及びリバースプライマー(5'-CTTATGAGTTCTTCTGA-3'）（配列番号14)を用いたPCRにより増幅して標的DNAを得た。【０１８３】
C又はGを検出するためのGプローブ（核酸部分の塩基配列： 5'- AAQUACACTGAAGTG(配列番号15)、及びT又はAを検出するためのMDAプローブ（核酸部分の塩基配列： 5'- AAQUACACTMDAAAGTG(配列番号16)を用いて、実施例３及び４と同様にして金電極に固定されたプローブを作成し、次いで、実施例５と同様にしてこれらのプローブをそれぞれ標的DNAとハイブリダイズさせ、実施例６と同様にして光電気化学的測定を行った。【０１８４】
Gプローブを用いた場合に検出される電流密度に対して、MDAプローブを用いた場合に検出される電流密度をプロットした結果を図7aに示す。図7a中のコントロールは、各プローブを標的DNAとハイブリダイズさせる前に検出された電流密度を示す。【０１８５】
また、Gプローブを用いた場合に検出される電流密度に対するMDAプローブを用いた場合に検出される電流密度の比の値を、図7bに示す。図7bにおいて、上記比の値が1.04〜1.29であるのがC/Tヘテロ接合群であり、0.78以下であるのがC/Cホモ接合群であり、1.73以上であるのがT/Tホモ接合群である。【０１８６】
図７a及びbに示されるように、両プローブを用いて電流密度を測定することにより、25人のパネラーは、T/Tホモ接合、C/Cホモ接合、又はC/Tヘテロ接合のいずれかの群に明確に区別された。また、両プローブを用いた結果に相関性が認められることから、これらのプローブを用いたヌクレオチドの同定は信頼性の高い方法であることが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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