(57)【要約】  本発明は、DJ-1において、１０６位のシステイン残基がシステインスルホン酸に酸化されてなるDJ-1誘導体に関する。該DJ-1誘導体は、神経変性疾患の診断用マーカーとして有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
DJ-1において、１０６位のシステイン残基がシステインスルホン酸及び／又はシステインスルフィン酸に酸化されてなるDJ-1誘導体。
【請求項２】
請求項１に記載のDJ-1誘導体に対する抗体。
【請求項３】
請求項１に記載のDJ-1誘導体からなる酸化ストレスマーカー。
【請求項４】
ヒトまたは哺乳動物由来のサンプルにおいて、
(1)請求項１に記載のDJ-1誘導体の量を測定する工程；または
(2)請求項１に記載のDJ-1誘導体とDJ-1の比率を測定する工程
を包含することを特徴とする、ヒトまたは哺乳動物における酸化ストレス状態を評価する方法。
【請求項５】
請求項１または２に記載のDJ-1誘導体からなる神経変性疾患の疾患マーカー。
【請求項６】
神経変性疾患がパーキンソン病またはアルツハイマー病である請求項５に記載のマーカー。
【請求項７】
ヒト由来のサンプルにおいて、
(1)請求項１に記載のDJ-1誘導体の量を測定する工程；または
(2)請求項１に記載のDJ-1誘導体とDJ-1の比率を測定する工程
を包含することを特徴とする、ヒトにおける神経変性疾患の診断方法。
【請求項８】
神経変性疾患がパーキンソン病またはアルツハイマー病である請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、DJ-1の酸化誘導体、該誘導体に対する抗体、並びに、酸化ストレスの指標としてのDJ-1酸化誘導体の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
DJ-1はNIH3T3細胞を形質転換させる癌遺伝子として発見された（非特許文献１）。【０００３】
また、パーキンソン病の原因遺伝子としてPARK7が同定され、該遺伝子がDJ-1の点突然変異（166番目のロイシンがプロリンに変異）産物と同一であることが判明した（非特許文献２）。【０００４】
さらに、DJ-1は過酸化水素、パラコートによる酸化ストレスで二次元電気泳動上のスポットがシフトし、スポットの位置の変化からシステインの酸化によることが示唆されている（非特許文献３）。【０００５】
さらに、非特許文献４は、DJ-1のX-線結晶構造解析に関する論文であり、パーキンソン病に関わるL166P変異の導入により二量体構造に変化が起こること、X線照射により106番目のシステインが酸化されてスルフィン酸（ＳＯ2Ｈ）になることを示唆している。【０００６】
ところで、酸化ストレスは老化や動脈硬化など重要な疾患の原因と考えられており、これらの疾患の早期マーカーとなる酸化ストレスマーカー分子同定は極めて重要である。【０００７】
しかしながら、現在のところ、酸化ストレスマーカーとして８−オキソグアニジンなどの低分子のマーカーが知られるのみであり、有用な酸化ストレスマーカーは実質的に知られていない。
【非特許文献１】Nagakubo D, Taira T, Kitaura H, Ikeda M, Tamai K, Iguchi-Ariga SM, Ariga H.J-1, a novel oncogene which transforms mouse NIH3T3 cells in cooperation with ras.Biochem Biophys Res Commun. (1997) 231, 509-13
【非特許文献２】Bonifati V, Rizzu P, van Baren MJ, Schaap O, Breedveld GJ, Krieger E, Dekker MC, Squitieri F, Ibanez P, Joosse M, van Dongen JW, Vanacore N, van Swieten JC, Brice A, Meco G, van Duijn CM, Oostra BA, Heutink P. Mutations in the DJ-1 gene associated with autosomal recessive early-onset parkinsonism. Science. (2003) 299, 256-9.
【非特許文献３】Mitsumoto A, Nakagawa Y, Takeuchi A, Okawa K, Iwamatsu A, Takanezawa Y.Oxidized forms of peroxiredoxins and DJ-1 on two-dimensional gels increased in response to sublethal levels of paraquat. Free Radic Res. (2001) 35, 301-10.
【非特許文献４】Wilson MA, Collins JL, Hod Y, Ringe D, Petsko GA. The 1.1-A resolution crystal structure of DJ-1, the protein mutated in autosomal recessive early onset Parkinson's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. (2003) 100, 9256-61.
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】二次元電気泳動の結果を示す。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、生体における酸化ストレスを評価し、ひいては、パーキンソン病、アルツハイマー病などの神経変性疾患の有用な診断マーカーを見出すための技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題に鑑み検討を重ねた結果、DJ-1誘導体の構造を決定し、それにより生体酸化ストレス或いはそれに基づく疾患の診断に関し、有用な技術を確立した。【００１１】
即ち、本発明は、以下の発明に関する。
１．  DJ-1において、１０６位のシステイン残基がシステインスルホン酸及び／又はシステインスルフィン酸に酸化されてなるDJ-1誘導体。
２．  項１に記載のDJ-1誘導体に対する抗体。
３．  項１に記載のDJ-1誘導体からなる酸化ストレスマーカー。
４．  ヒトまたは哺乳動物由来のサンプルにおいて、
(3)項１に記載のDJ-1誘導体の量を測定する工程；または
(4)項１に記載のDJ-1誘導体とDJ-1の比率を測定する工程
を包含することを特徴とする、ヒトまたは哺乳動物における酸化ストレス状態を評価する方法。
５．  項１または２に記載のDJ-1誘導体からなる神経変性疾患の疾患マーカー。
６．  神経変性疾患がパーキンソン病またはアルツハイマー病である項５に記載のマーカー。
７．  ヒト由来のサンプルにおいて、
(1)項１に記載のDJ-1誘導体の量を測定する工程；または
(2)項１に記載のDJ-1誘導体とDJ-1の比率を測定する工程
を包含することを特徴とする、ヒトにおける神経変性疾患の診断方法。
８．  神経変性疾患がパーキンソン病またはアルツハイマー病である項７に記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、酸化ストレス及びパーキンソン病などの神経変性疾患の指標となるDJ-1の構造を決定したことで、これらの病的状態の程度を容易に評価することができるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本明細書において、ヒトDJ-1は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質である。ヒトのDJ-1の場合、DJ-1誘導体は、１０６位のシステイン残基(Cys)がシステインスルホン酸(Cys(SO3H))及び／又はシステインスルフィン酸(Cys(SO2H))に酸化された酸化型誘導体（Cys(SO3H)106DJ-1）および（Cys(SO2H)106DJ-1）を包含する。ヒト以外の哺乳動物の場合、DJ-1の１０６位に対応するシステイン残基が酸化された酸化型DJ-1誘導体を意味する。【００１４】
以下、DJ-1としてヒトDJ-1を例に取り説明するが、ヒト以外の哺乳動物由来のDJ-1についてもヒトDJ-1についての記載を参考にして、当業者であれば容易に本発明を実施することができる。【００１５】
DJ-1は、酸化ストレスにより、その１０６位のシステイン残基がシステインスルホン酸、或いはその中間体であるシステインスルフィン酸に酸化されて、酸化型のDJ-1誘導体となる。この酸化は、生体に存在する過酸化水素だけでなく、tert-ブチルヒドロペルオキシドなどの他の過酸化物やＰＬＰＣ−ＯＯＨ（フォスファチジルコリンの過酸化物）などの生体由来の過酸化脂質を用いても進行することが本発明者により確認された。従って、このDJ-1の酸化は生理的条件下で生じているものである。データとしては示さないが、本発明者は、アルツハイマー病などの神経変性疾患の患者及び健常者の血液中に、DJ-1酸化体であるCys(SO3H)106DJ-1が存在すること、このDJ-1酸化体は年齢と共に存在量が増加する傾向にあることを本発明者は確認している。【００１６】
本発明のDJ-1誘導体を認識する抗体（モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体）は、DJ-1誘導体を免疫原として用いてラット、マウス、ウサギ、ヤギなどの適当な哺乳動物を免疫し、該免疫哺乳動物の抗体産生細胞を回収し、必要に応じてモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を産生する細胞をスクリーニングし、得られた免疫細胞と哺乳動物のミエローマ細胞とを融合する等の常法に従い得られる。【００１７】
該抗体は、１０６位のシステインスルホン酸を認識するものであれば、酸化型DJ-1誘導体を特異的に認識することができる。【００１８】
DJ-1誘導体の量またはDJ-1誘導体とDJ-1の比率を測定するためのヒト由来のサンプルとしては、血液、尿、唾液、リンパ液などが挙げられるが、好ましくは血液である。【００１９】
DJ-1誘導体の量またはDJ-1誘導体とDJ-1の比率を測定は、DJ-1誘導体に対する抗体と必要に応じてDJ-1に対する抗体を用い、ＥＬＩＳＡなどのアッセイにより行うのが好ましいが、二次元電気泳動により行うことも可能である。【００２０】
本発明において、DJ-1酸化誘導体により酸化ストレスの程度並びに診断が可能な神経変性疾患としては、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症候群（ＳＭＡ）、ハンチントン病、脳血管障害後の痴呆が例示される。【００２１】
酸化ストレスの強さおよび神経変性疾患（特にパーキンソン病とアルツハイマー病）の関連については、DJ-1誘導体の量（濃度）或いはDJ-1に対する酸化型のDJ-1誘導体の比率が高いほど、酸化ストレスが強く、神経変性疾患に罹っているか、罹る可能性が高いと考えられる。【００２２】
酸化ストレスの程度を測定する場合、１０６位がシステインスルホン酸及び／又はシステインスルフィン酸に酸化されたDJ-1の量を測定すればよく、これによりパーキンソン病の診断も行うことができる。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例には限定されない。
実施例１
（１）試料調製
培養ヒトさい帯静脈血管内皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell: HUVEC, 三光純薬より初代培養品を購入）を直径６ｃｍのディッシュで培養した。培地にEGM-2（三光純薬製）を用い、37oC, 5% CO2のCO2インキュベータにより培養を行う。細胞は４代継代して８０−９０％コンフルエントになった時点で、培地中に88.2 mM過酸化水素を3.4μl添加し（最終濃度100 μ M）１時間CO2インキュベータ内で培養を続けた。過酸化水素処理を行った細胞は回収した後リン酸緩衝液で洗浄し二次元電気泳動に供した。
（２）二次元電気泳動
回収した細胞は等電点電気泳動用溶液（9M尿素、2% CHAPS、65mM DTE、0.5% IPG Buffer(AmershamBioscience社)）280 μ lに溶解し、15000 rpm 20min遠心して不溶成分を除き250 μ lを Immobiline Dry Strip (13 cm長、pIレンジ4-7、AmershamBioscience社)に添加、１２時間膨潤させた。膨潤したのちIPGPhor 電気泳動装置(AmershamBioscience社)により500V１時間、1000V１時間、8000V６時間のタイムプログラムにより等電点電気泳動（一次元目）を行った。泳動終了後、等電点電気泳動を行ったゲルは50 mM Tris-HCl(pH 6.8)、6M尿素、30% グリセロール、2% SDS、20mM DTEにより平衡化し、12.5% のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって二次元目の電気泳動を行った。二次元電気泳動ゲルはSyproRuby (Molecular Probes社)により蛍光染色してスポットを可視化し、HUVECへの過酸化水素負荷の有無により位置の移動したスポットを切り出した。【００２４】
なお、過酸化水素添加前の試料（コントロール）を同様にして二次元電気泳動を行った。結果を図１に示す。
（３）質量分析によるタンパク質同定と構造解析
過酸化水素負荷に応答を示した（二次元電気泳動上で位置の移動した）スポットは、トリプシンを用いたゲル内消化によりペプチド断片とした。このペプチド混合物はナノスプレーイオン化LC-MS/MSシステムに導入した。（溶媒A：0.1%ギ酸、5% アセトニトリル水溶液；溶媒B：0.1%ギ酸、98%アセトニトリル水溶液；溶媒Aに対しBを5%から65%まで40分の直線グラジエントで2 μ l/minの流速で送液した。カラムは逆相C18カラム（MAGIC C18, MichromBioresources社）を通してイオントラップ型質量分析計（LCQ-DECA、ThermoElectron社）によりdeta dependent scan modeにより測定を行った。）測定データはMASCOTシステム（Matrix Science社）によりペプチド−マスフィンガープリント法、MS/MSデータサーチ法を併用しタンパク質同定を行った。これらのデータベース検索により、天然型DJ-1、ならびにDJ-1誘導体のトリプシン消化フラグメントの６８％、９３％を同定した。【００２５】
その結果、二次元電気泳動上で酸性側に現れたスポット(DJ-1誘導体)について、LC-MS/MSの測定データから構造決定を行ったところ、DJ-1の106番目のシステイン残基がシステインスルホン酸（Cys-SO3H）に酸化されていることがわかった。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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