(57)【要約】  本発明は日本人における関節リウマチ感受性遺伝子を提供し、かつ関節リウマチの発症リスクを検出し判定する方法を提供する。また本発明はこの検出方法の実施にあたり有効に使用することができる関節リウマチ易罹患性診断マーカー、プローブ、プライマー並びに試薬キットを提供する。本発明は、関節リウマチ感受性遺伝子としてSEC8L1遺伝子を、また関節リウマチ感受性ＳＮＰとして、SNP440、SNP441、SNP442、SNP443、SNP445、SNP447およびSNP449（LDブロック4に存在）を提供する。さらに、関節リウマチの罹患リスクを検出する方法として、ヒト被験者から得られるゲノムDNAを対象として、上記各ブロックから選択されるSNP441と他のSNP（SNP440、SNP445、SNP447およびSNP449）から選ばれる少なくとも１つのSNPを検出し同定する工程を含む方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の(1)〜(7)からなる群から選択される少なくとも一つのオリゴまたはポリヌクレオチドからなる、関節リウマチの罹患診断マーカー：
(1) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、379258 位（SNP440）に位置するＧまたはＣを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(2) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、393668 位（SNP441）に位置するＣまたはＴを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(3) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、405691 位（SNP442）に位置するＣまたはＴを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(4) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、411544 位（SNP443）に位置するＡまたはＴを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(5) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、476136 位（SNP445）に位置するＡまたはＧを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(6) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、569133 位（SNP447）に位置するＡまたはＧを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(7) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、628601 位（SNP449）に位置するＴまたはＣを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド。
【請求項２】
（Ａ）ヒト被験者から得られるゲノムＤＮＡを対象として、下記(2)に記載する塩基と、(1)及び(5)〜(7)に記載する塩基の中から選択される少なくとも１つの塩基とを検出し同定する工程を含む、当該被験者について関節リウマチの罹患リスクを検出する方法：
(1) ヒトSEC8L1遺伝子の379258 位（SNP440）の塩基
(2) ヒトSEC8L1遺伝子の393668 位（SNP441）の塩基
(5) ヒトSEC8L1遺伝子の476136 位（SNP445）の塩基
(6) ヒトSEC8L1遺伝子の569133 位（SNP447）の塩基
(7) ヒトSEC8L1遺伝子の628601 位（SNP449）の塩基
【請求項３】
（Ｂ）上記工程（Ａ）で検出し同定した(2)の塩基（SNP441）がシトシンであり、かつ(1)及び(5)〜(7)に記載する塩基（SNP440、SNP445、SNP447、SNP449）から選択される少なくとも１つの塩基が、下記の条件：
(1)の塩基（SNP440）：グアニン
(5)の塩基（SNP445）：グアニン
(6)の塩基（SNP447）：グアニン
(7)の塩基（SNP449）：シトシン
を満たしている場合に、当該被験者が関節リウマチ易罹患性であると判定する工程を有する、請求項２に記載する関節リウマチの罹患リスクを検出する方法。
【請求項４】
下記の(2) のオリゴまたはポリヌクレオチド（但し、当該オリゴ若しくはポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする。以下同じ）にハイブリダイズする15〜30塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物と、(1)および(5)〜(7)からなる群から選択される少なくとも一つのオリゴまたはポリヌクレオチドにハイブリダイズする15〜30塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物との組み合わせからなる、関節リウマチ罹患リスクを検出するために用いられるプライマーセット：
(1) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、379258 位（SN440）に位置するヌクレオチドを含む16塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(2) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、393668 位（SN441）に位置するヌクレオチドを含む16塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(5) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、476136 位（SN445）に位置するヌクレオチドを含む16塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(6) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、569133 位（SN447）に位置するヌクレオチドを含む16塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(7) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、628601 位（SN449）に位置するヌクレオチドを含む16塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド。
【請求項５】
下記の(2) のオリゴまたはポリヌクレオチド（但し、当該オリゴ若しくはポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする。以下、同じ）にハイブリダイズする16〜500塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物と、(1)および(5)〜(7)からなる群から選択される少なくとも一つのオリゴまたはポリヌクレオチドにハイブリダイズする16〜500塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物との組み合わせからなる、関節リウマチ罹患リスクを検出するために用いられるプローブセット：
(1) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、379258 位（SN440）に位置するヌクレオチドを含む16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(2) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、393668 位（SN441）に位置するヌクレオチドを含む16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(5) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、476136 位（SN445）に位置するヌクレオチドを含む16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(6) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、569133 位（SN447）に位置するヌクレオチドを含む16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(7) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、628601 位（SN449）に位置するヌクレオチドを含む16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド。
【請求項６】
各オリゴヌクレオチドまたはその標識物が任意の固相に固定してなる固相化プローブである請求項５に記載するプローブセット。
【請求項７】
請求項４に記載するプライマーセット、または／及び、請求項５に記載するプローブセットを含む、関節リウマチ罹患リスク検出用試薬、または当該試薬を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節リウマチ罹患の危険度を測定し判定する方法に関する。より詳細には、当該方法は、ヒトゲノムＤＮＡを含む試料から関節リウマチ罹患に関連したＳＮＰｓ（単一塩基多型）、特にハプロタイプを検出することにより、該試料提供者（被験者）が関節リウマチに罹患する潜在的な危険度を有するか否かを検出し、判定する方法である。【０００２】
さらに本発明は、かかる検出方法の実施にあたり有効に使用することができる関節リウマチ罹患診断マーカー、プローブ、プライマー並びに試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００３】
関節リウマチ（rheumatoid arthritis：以下、単に「RA」ともいう）は、最も頻度の高い自己免疫疾患のひとつであり、その有病率は世界中でほぼ均一で0.3%〜1%であるといわれている(非特許文献１)。滑膜の慢性炎症とそれに引き続く関節破壊が主徴である。関節リウマチの詳細な病態は解明されていないが、家系研究、双生児研究より遺伝的要因と環境要因（感染、ホルモン、妊娠等）がともに関与することが示唆されている(非特許文献２および３)。HLA領域とRAの相関は以前より知られており、特にシェアードエピトープをコードする複数のHLA-DRB1のアレルは疾患のリスクや重症度に関与することが知られていた(非特許文献４)。しかしHLAだけではRAの遺伝的要因の1/3程度しか説明がつかず(非特許文献５)、HLA以外の複数の遺伝子がRAの発症に関与していることが予想される。TNFα、CTLA-4、サイトカイン関連遺伝子等の候補遺伝子の関与が調査されてきたが、その結果は一貫していない(非特許文献６)。RA家系を用いたゲノムワイドの連鎖解析が少なくとも4つのグループより報告されており(非特許文献７〜１２)、いくつかのHLA以外の領域が複数の研究で同定されているが、HLA以外で共通した領域は同定されていない。【０００４】
一般に関節リウマチのような多因子疾患では、連鎖解析だけでは感受性遺伝子を同定するのに十分な結果は得られず、SNPを用い連鎖不平衡解析による当該領域の詳細な解析が必要である。実際このような方法で2型糖尿病、クローン病などと言った多因子疾患の関連遺伝子が同定され始めている(非特許文献１３〜１５)。関節リウマチではPADI4遺伝子内のハプロタイプと日本人RAの関連が報告されている(非特許文献１６)。PADI4は1番染色体q36に位置しこれまで2つの研究で候補領域であると報告されている(非特許文献７および８)。また最近、同じグループがSLC22A4遺伝子内のRANX1結合領域にあるSNPとRAの関連を同定している(非特許文献１７)。【０００５】
しかしながら、前述するように、RAは遺伝的要因と環境的要因とが共に関与して発症にいたる多因子疾患であるため、一遺伝子の変異や異常だけからその罹患リスクを判断することは困難であり、さらなる検討が求められている。
【非特許文献１】Felson D: Epidemiology of the rheumatic diseases. In: Koopman WJ (ed) Arthritis and allied conditions: a textbook of rheumatology, 13th ed. Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, pp3-34, 1996.
【非特許文献２】Lawrence JS. Heberden Oration, 1969. Rheumatoid arthritis--nature or nurture? Ann Rheum Dis 1970;29:357-79.
【非特許文献３】del Junco D, Luthra HS, Annegers JF, Worthington JW, Kurland LT. The familial aggregation of rheumatoid arthritis and its relationship to the HLA-DR4 association. Am J Epidemiol 1984;119:813-29.
【非特許文献４】Wordsworth BP, Lanchbury JS, Sakkas LI, Welsh KI, Panayi GS, Bell JI. HLA-DR4 subtype frequencies in rheumatoid arthritis indicate that DRB1 is the major susceptibility locus within the HLA class II region. Proc Natl Acad Sci U S A 1989; 86:10049-53.
【非特許文献５】Deighton CM, Walker DJ, Griffiths ID, Roberts DF. The contribution of HLA to rheumatoid arthritis. Clin Genet 1989;36:178-82.
【非特許文献６】Barton A, Ollier W. Genetic approaches to the investigation of rheumatoid arthritis. Curr Opin Rheumatol 2002;14:260-9.
【非特許文献７】Cornelis F, Faure S, Martinez M, Prud'homme JF, Fritz P, Dib C, et al. New susceptibility locus for rheumatoid arthritis suggested by a genome-wide linkage study. Proc Natl Acad Sci U S A 1998;95:10746-50.
【非特許文献８】Shiozawa S, Hayashi S, Tsukamoto Y, Goko H, Kawasaki H, Wada T, et al. Identification of the gene loci that predispose to rheumatoid arthritis. Int Immunol 1998;10:1891-5.
【非特許文献９】Jawaheer D, Seldin MF, Amos CI, Chen WV, Shigeta R, Monteiro J, et al. A genomewide screen in multiplex rheumatoid arthritis families suggests genetic overlap with other autoimmune diseases. Am J Hum Genet 2001;68:927-36.
【非特許文献１０】MacKay K, Eyre S, Myerscough A, Milicic A, Barton A, Laval S, et al. Whole-genome linkage analysis of rheumatoid arthritis susceptibility loci in 252 affected sibling pairs in the United Kingdom. Arthritis Rheum 2002;46:632-9.
【非特許文献１１】Jawaheer D, Seldin MF, Amos CI, Chen WV, Shigeta R, Etzel C, et al. Screening the genome for rheumatoid arthritis susceptibility genes: a replication study and combined analysis of 512 multicase families. Arthritis Rheum 2003;48:906-16.
【非特許文献１２】Eyre S, Barton A, Shephard N, Hinks A, Brintnell W, MacKay K, et al. Investigation of susceptibility loci identified in the UK rheumatoid arthritis whole-genome scan in a further series of 217 UK affected sibling pairs. Arthritis Rheum 2004;50:729-35.
【非特許文献１３】Horikawa Y, Oda N, Cox NJ, Li X, Orho-Melander M, Hara M, et al. Genetic variation in the gene encoding calpain-10 is associated with type 2 diabetes mellitus. Nat Genet 2000;26:163-75.
【非特許文献１４】Hugot JP, Chamaillard M, Zouali H, Lesage S, Cezard JP, Belaiche J, et al. Association of NOD2 leucine-rich repeat variants with susceptibility to Crohn's disease. Nature 2001;411:599-603.
【非特許文献１５】Ogura Y, Bonen DK, Inohara N, Nicolae DL, Chen FF, Ramos R, et al. A frameshift mutation in NOD2 associated with susceptibility to Crohn's disease. Nature 2001;411:603-6.
【非特許文献１６】Suzuki A, Yamada R, Chang X, Tokuhiro S, Sawada T, Suzuki M, et al. Functional haplotypes of PADI4, encoding citrullinating enzyme peptidylarginine deiminase 4, are associated with rheumatoid arthritis. Nat Genet 2003;34:395-402.
【非特許文献１７】Tokuhiro S, Yamada R, Chang X, Suzuki A, Kochi Y, Sawada T, et al. An intronic SNP in a RUNX1 binding site of SLC22A4, encoding an organic cation transporter, is associated with rheumatoid arthritis. Nat Genet 2003;35:341-8.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、個々の被験者について関節リウマチの罹患リスクを判定するための方法を提供することである。さらに本発明の目的は、当該方法を簡便に実施するために有用な試薬および試薬キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、日本人集団を対象として、関節リウマチ（ＲＡ）の発症に関与するＲＡ感受性遺伝子および遺伝子多型を見いだすことを目的として、かねてより複数の人種間で繰り返して連鎖が報告されてきた領域（第７染色体長腕31-34：7q31-34）（Takeuchi F, Moritani M, Nabeta H, Mori M, Goto M, Hanyu T, et al. Nine Japanese RA susceptibility genes areas, TIRA1-9, by preliminaly genome-wide screening.: 10th Asia PasificLeague of Associations for Rheumatology Congress. Bangkok, Thailand, 2002 Dec 1-6）を候補領域として選択し、関節リウマチ患者と対照者（健常者）との間（ケースコントロール間）で大規模な関連解析および連鎖不平衡解析を行ったところ、当該ヒト第７染色体（7q31-34）に存在するSEC8L1遺伝子がRAの疾患感受性候補遺伝子であることを見出し、さらに、当該遺伝子のイントロン10の中にケースコントロール間でアレル頻度に有意差を認める特定の遺伝子多型（SNP441）が存在しており、当該SNP441およびこれを含むハプロタイプが関節リウマチの感受性を規定するうえで重要であることを見出した。【０００８】
そして、個々の被験者について当該SEC8L1遺伝子の遺伝子多型（SNP441）およびこれを含むハプロタイプを検出することにより、当該被験者について関節リウマチを発症する潜在的な危険度が、高い確率で検出できることを見いだし、本発明を完成するにいたった。【０００９】
すなわち、本発明は下記の発明を提供するものである：
（１）関節リウマチの罹患診断マーカー
項１．下記の(1)〜(7)からなる群から選択される少なくとも一つのオリゴまたはポリヌクレオチドからなる、関節リウマチの罹患診断マーカー：
(1) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、379258 位（SNP440）に位置するＧまたはＣを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(2) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、393668 位（SNP441）に位置するＣまたはＴを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(3) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、405691 位（SNP442）に位置するＣまたはＴを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(4) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、411544 位（SNP443）に位置するＡまたはＴを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(5) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、476136 位（SNP445）に位置するＡまたはＧを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(6) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、569133 位（SNP447）に位置するＡまたはＧを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(7) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、628601 位（SNP449）に位置するＴまたはＣを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド。【００１０】
（２）関節リウマチの罹患リスクを検出する方法
項２．（Ａ）ヒト被験者から得られるゲノムＤＮＡを対象として、下記(2)に記載する塩基と、(1)及び(5)〜(7)に記載する塩基の中から選択される少なくとも１つの塩基とを検出し同定する工程を含む、当該被験者について関節リウマチの罹患リスクを検出する方法：
(1) ヒトSEC8L1遺伝子の379258 位（SNP440）の塩基
(2) ヒトSEC8L1遺伝子の393668 位（SNP441）の塩基
(5) ヒトSEC8L1遺伝子の476136 位（SNP445）の塩基
(6) ヒトSEC8L1遺伝子の569133 位（SNP447）の塩基
(7) ヒトSEC8L1遺伝子の628601 位（SNP449）の塩基
項３．（Ｂ）上記工程（Ａ）で検出し同定した(2)の塩基（SNP441）がシトシンであり、かつ(1)及び(5)〜(7)に記載する塩基（SNP440、SNP445、SNP447、SNP449）から選択される少なくとも１つの塩基が、下記の条件：
(1)の塩基（SNP440）：グアニン
(5)の塩基（SNP445）：グアニン
(6)の塩基（SNP447）：グアニン
(7)の塩基（SNP449）：シトシン
を満たしている場合に、当該被験者が関節リウマチ易罹患性であると判定する工程を有する、項２に記載する関節リウマチの罹患リスクを検出する方法。【００１１】
（３）関節リウマチの罹患リスク検出用試薬または試薬キット
項４．下記の(2) のオリゴまたはポリヌクレオチド（但し、当該オリゴ若しくはポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする。以下同じ）にハイブリダイズする15〜30塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物と、(1)および(5)〜(7)からなる群から選択される少なくとも一つのオリゴまたはポリヌクレオチドにハイブリダイズする15〜30塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物との組み合わせからなる、関節リウマチ罹患リスクを検出するために用いられるプライマーセット：
(1) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、379258 位（SN440）に位置するヌクレオチドを含む16塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(2) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、393668 位（SN441）に位置するヌクレオチドを含む16塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(5) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、476136 位（SN445）に位置するヌクレオチドを含む16塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(6) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、569133 位（SN447）に位置するヌクレオチドを含む16塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(7) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、628601 位（SN449）に位置するヌクレオチドを含む16塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド。
項５．下記の(2) のオリゴまたはポリヌクレオチド（但し、当該オリゴ若しくはポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする。以下、同じ）にハイブリダイズする16〜500塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物と、(1)および(5)〜(7)からなる群から選択される少なくとも一つのオリゴまたはポリヌクレオチドにハイブリダイズする16〜500塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物との組み合わせからなる、関節リウマチ罹患リスクを検出するために用いられるプローブセット：
(1) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、379258 位（SN440）に位置するヌクレオチドを含む16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(2) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、393668 位（SN441）に位置するヌクレオチドを含む16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(5) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、476136 位（SN445）に位置するヌクレオチドを含む16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(6) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、569133 位（SN447）に位置するヌクレオチドを含む16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(7) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、628601 位（SN449）に位置するヌクレオチドを含む16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド。
項６． 各オリゴヌクレオチドまたはその標識物が任意の固相に固定してなる固相化プローブである項５に記載するプローブセット。
項７．項４に記載するプライマーセット、または／及び、項５若しくは６に記載するプローブセットを含む、関節リウマチ罹患リスク検出用試薬、または当該試薬を含むキット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、関節リウマチ（ＲＡ）を発症する相対的な危険度を簡便に検出することができる。本発明の検出方法は、in vitroでしかも医師等の専門的な知識を要することなく簡単に実施することができる方法である。本発明の検出方法によってＲＡを発症する潜在的な危険度が相対的に高いことが判明した被験者に対しては、その旨を告知し、予めＲＡの発症を防ぐか、または少しでも遅延させるための的確な対策を講じることができる。従って、本発明は、ＲＡの発症を予防するための、またはＲＡ発症を遅延させるための検査方法として極めて有用である。さらに本発明は上記検出法において使用される試薬を提供するものであり、これにより上記方法を簡便に実施することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
１．本発明で使用する用語の定義
本明細書における塩基配列（ヌクレオチド配列）、核酸などの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAc-IUB communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138; 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作製のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。【００１４】
本明細書中において「遺伝子」は、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、及び１本鎖ＤＮＡ（センス鎖）、並びに当該センス鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖）、及びそれらの断片のいずれもが含まれる、また、本明細書で「遺伝子」とは、特に言及しない限り、調節領域、コード領域、エクソン、及びイントロンを区別することなく示すものとする。【００１５】
また、本明細書中において、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、核酸と同義であって、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むものとする。また、これらは２本鎖であっても１本鎖であってもよく、ある配列を有する「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」）といった場合、特に言及しない限り、これに相補的な配列を有する「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」）も包括的に意味するものとする。さらに、「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」）がＲＮＡである場合、配列表に示される塩基記号「Ｔ」は「Ｕ」と読み替えられるものとする。【００１６】
本明細書において「遺伝子多型」とは、２つ以上の遺伝的に決定された対立遺伝子がある場合にそれらの対立遺伝子を指す。具体的には、ヒトの集団において、ある一個体のゲノム配列を基準として、他の１または複数の個体ゲノム中の特定部位に、１又は複数のヌクレオチドの置換、欠失、挿入、転移、逆位などの変異が存在するとき、その変異が当該１または複数の個体に生じた突然変異でないことが統計学的に確実か、または当該個体内特異変異でなく、１％以上の頻度で集団内に存在することが家系的に証明される場合、その変異を「遺伝子多型」とする。本明細書で用いる「遺伝子多型」の意味には、単一のヌクレオチドの変化によって引き起こされる多型であるいわゆる１塩基多型〔Single Nucleotide Polymorphism：ＳＮＰ（又はＳＮＰｓ）〕と連続した複数ヌクレオチドにわたる多型の両方が含まれる。「一塩基多型」とは、単一の核酸の変化によって引き起こされる多型である。多型は選択された集団の１％より大きな頻度、好ましくは１０％以上の頻度で存在する。また「ハプロタイプ」とは、一つのアレル（ハプロイド）に存在する遺伝子変異の組み合わせをいう。【００１７】
本明細書において「関節リウマチ感受性遺伝子」（ＲＡ感受性遺伝子）とは、多遺伝子性疾患である関節リウマチ（ＲＡ）を発症しやすい体質を決める遺伝子のことをいう。【００１８】
また、本明細書において「アレル頻度」とは、一つの遺伝子の座位について、集団中に存在する全遺伝子数のうち、その対立遺伝子が占める割合をいう。【００１９】
本明細書において「連鎖不平衡」とは、集団における任意の対立遺伝子の組み合わせの頻度について、偶然によって期待されるよりも、より頻繁に近傍の特定対立と出現する関係のことをいう。例えば、遺伝子座Ｘが対立遺伝子ａ及びｂ（これらは等しい頻度で存在する）を有し、近傍の遺伝子座Ｙが対立遺伝子ｃ及びｄ（これらは等しい頻度で存在する）を有する場合、別の遺伝子多型の組み合わせであるハプロタイプａｃは、集団において０.２５の頻度で存在することが期待される。ハプロタイプａｃがこうした期待値よりも大きい場合、つまりａｃという特定の遺伝子型が頻繁に出現する場合、対立遺伝子ａｃは連鎖不平衡にあるという。連鎖不平衡は、対立遺伝子の特定の組み合わせの自然選択または集団に導入された時期が進化的にみて最近であることによって生じたもので、連鎖する対立遺伝子同士が平衡に達していないことから生じ得る。従って、民族や人種などのように、別の集団においては連鎖不平衡の様式は異なり、ある集団においてａｃが連鎖不平衡である場合でも、別の集団でａｄが連鎖不平衡の関係である場合もある。連鎖不平衡における遺伝子多型の検出は、当該多型そのものが直接疾患を引き起こさないにも拘わらず、疾患に対する感受性を検出するのに有効である。例えば、ある遺伝子座Ｘの対立遺伝子ａについて、それが疾患の原因遺伝子要素ではないが、遺伝子座Ｙの対立遺伝子ｃとの連鎖不平衡により、疾患感受性を示し得ることがある。【００２０】
本明細書において「連鎖不平衡解析」とは、ゲノム領域における連鎖不平衡の強さの度合いを解析することをいう。例えば、連鎖不平衡解析は２つのマーカー間での連鎖不平衡の強さを示す連鎖不平衡係数｜Ｄ’｜を健常者（対照者）のタイピングデータから算出することで行うことができる。【００２１】
本明細書において「マイナーアレル」とは、一つの遺伝子の座位について２つの対立遺伝子が存在する場合において、遺伝子頻度の低い対立遺伝子（アレル）をいう。【００２２】
なお、本明細書に記載する各塩基番号は、The National Center for Biotechnology Information data baseの位置情報に基づくものである。また、本明細書において「ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列中、xxxx位」という場合の「xxxx位」というのは、ヒトSEC8L1遺伝子の132395078位の１番目の塩基を１としたときの位置情報を意味する。【００２３】
２．関節リウマチ感受性遺伝子
多因子疾患である関節リウマチ（ＲＡ）の遺伝的要因や環境因子を同定することは、個々の因子が病因や病態に関与する度合いが少ないがゆえに困難である。均一に配置された頻度の高いＳＮＰを使用して、広範囲領域にわたってケースコントロール関連解析を行うアプローチ（領域ワイドのケースコントロール関連解析）は、多因子疾患であるＲＡの疾患感受性遺伝子を同定するための効果的かつ強力なアプローチである。【００２４】
そこで本発明者らは、日本人におけるＲＡ感受性遺伝子を探索するために、第７番染色体のq31-34（7q31-34）の領域をＲＡの感受性候補領域として選び、gene-centric evenly-spaced common SNP「遺伝子領域に均一に配置された頻度の高い一塩基多型（SNP）」を用いて、領域ワイドのケースコントロール関連解析ならびに連鎖不平衡（LD）マッピングを行うことにより、エクソシストコンプレックスの構成成分であるSEC8（蛋白質）をコードするヒトSEC8L1遺伝子がＲＡの感受性を規定する遺伝子であることを見出した。酵母では、このSec8複合体は、エクソサイトーシスに必要であり、ゴルジ体からの分泌小胞の分泌への道標となる（35）。哺乳類のエクソシストも酵母のようにゴルジ体から細胞膜への小胞の輸送に関わると考えられている（36）。当該ヒトSEC8L1遺伝子は、ヒト第７染色体のゲノム配列（Genbank Sequence Accession IDs: NC 000007）中、塩基番号132395078 番〜133207769 番に位置する812691 bpの遺伝子である（Gene Name: Homo sapiens gene exocyst complex component 4）。【００２５】
なお本発明のＲＡ感受性遺伝子の同定は、実施例に記載するように、具体的には下記に説明する方法によって行われた。  【００２６】
ＲＡの感受性候補領域として第７番染色体のq31-34（7q31-34）を選択し、その領域内に等間隔に配置されたマイナーアレル頻度15％以上の728のSNPを用いて、２段階のケースコントロール関連解析を行った（関節リウマチ患者380名×2、健常対照者380名×2）。第１段階の関連解析では728のSNPのうち、48のSNPがＲＡと有意な関連を示し、続いて行った第２段階めのケースコントロール関連解析では、SEC8L1遺伝子内の４つのSNP（SNP441、SNP442、SNP443、SNP445）が再現性をもって有意差を示した（P<0.05）。なかでも、SNP441がP=0.000059と最も関節リウマチと強い相関を示した。【００２７】
これらのSEC8L1遺伝子内のSNPは、いずれもSEC8L1遺伝子内のイントロン10に位置し、保存された連鎖不平衡ブロック４（LDブロック4）に存在していた。また、当該ブロック内に位置するほぼすべてのSNP（SNP441-461）は、ＲＡと相関することが認められた。このことから、ＲＡ感受性座位はSEC8L1遺伝子のイントロン10〜13にわたる300kbの領域にある連鎖不平衡ブロック４に存在することが明らかになった。なお、ここで連鎖不平衡ブロック４（ＬＤブロック４）はヒト第７染色体のゲノム配列中、塩基番号132747619番〜133035115番（SEC8L1遺伝子の塩基配列中、393668 〜681164位に相当する）に位置する領域である。ＬＤブロック４には、図１Ｂに示すように21つのSNPが存在している。当該ブロック内にはSEC8L1遺伝子以外の遺伝子はなく、観察されたRAとの相関は、SEC8L1遺伝子そのものに由来すると思われた。【００２８】
次いで、連鎖不平衡ブロック４（ＬＤブロック４）に存在するSNPの相互関係を明らかにするために、当該ブロックから有意差を示したＳＮＰ (SNP440, SNP441, SNP445, SNP447, SNP449)を選択し、それぞれＳＮＰ同士の遺伝子型の組み合わせの分布をケースコントロール間で比較した。その結果、ＲＡ感受性ハプロタイプ（P=0.0015）とＲＡ抵抗性ハプロタイプ（P=0.0000062）が同定された。【００２９】
以上説明するように、上記ヒト第７染色体（7q31）に位置するヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列上の連鎖不平衡ブロック４に存在するSNP441とそれを含むハプロタイプがＲＡと強い相関を示したことから、このヒトSEC8L1遺伝子がＲＡの感受性に寄与していると考えられた（RA感受性遺伝子）。【００３０】
また実験例２および３に示すように、ヒトSEC8L1遺伝子は滑膜線維芽細胞を含むヒト組織でユビキタスに発現しており、さらに免疫担当細胞であるリンパ球系の全ての細胞（Ｔ細胞、樹状細胞、、マクロファージ、Ｂ細胞、ＮＫ細胞など）でSEC8L1が発現していた。これらのことは、SEC8L1遺伝子が、有力な関節リウマチ（ＲＡ）の疾患感受性遺伝子であるという本発明の知見を裏付けるものである。【００３１】
３．関節リウマチ罹患診断マーカー
本発明は、上記RA感受性遺伝子であるヒトSEC8L1遺伝子の上記連鎖不平衡ブロック４（LDブロック4）内に存在する関節リウマチ感受性SNP（RA感受性SNP）を含むオリゴまたはポリヌクレオチドであって、ヒトゲノム上で特異的に認識されるオリゴまたはポリヌクレオチドを、関節リウマチ罹患診断マーカー（RA罹患診断マーカー）として提供する。【００３２】
ここでRA感受性SNPとしては、LDブロック4に存在する下記の７つのＳＮＰを挙げることができる。【００３３】
(1) SNP440；ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列中、379258 位に位置するＳＮＰ
(2) SNP441；ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列中、393668 位に位置するＳＮＰ
(3) SNP442；ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列中、405691 位に位置するＳＮＰ
(4) SNP443；ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列中、411544 位に位置するＳＮＰ
(5) SNP445；ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列中、476136 位に位置するＳＮＰ
(6) SNP447；ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列中、569133 位に位置するＳＮＰ
(7) SNP449；ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列中、628601 位に位置するＳＮＰ。【００３４】
これらの各ＳＮＰを含むオリゴまたはポリヌクレオチドの長さ（塩基長）は、ヒトゲノム上で特異的に認識される長さであればよく、その限りにおいて特に制限されない。通常１０塩基長以上、好ましくは２０塩基長以上である。従って、本発明のＲＡ罹患診断マーカーは、ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、上記ＬＤブロック内に存在する各ＲＡ感受性ＳＮＰ（(1)〜(7)）を中心として、５１塩基（上記各SNPの5’側及び3’側各25塩基ずつ）、２０１塩基（上記各SNPの5’側及び3’側各100塩基ずつ）、６０１塩基（上記各SNPの5’側及び3’側各300塩基ずつ）などを有するオリゴまたはポリヌクレオチドであることができる。【００３５】
本発明のＲＡ罹患診断マーカーとして、具体的には下記の塩基配列を含有するオリゴまたはポリヌクレオチドを挙げることができる：
(1) SNP440（塩基GまたはC）を挟んで、少なくとも配列番号１記載の塩基配列と配列番号２記載の塩基配列を含有する、塩基長が51〜601の範囲にあるオリゴまたはポリヌクレオチド、
(2) SNP441（塩基CまたはT）を挟んで、少なくとも配列番号３記載の塩基配列と配列番号４記載の塩基配列を含有する、塩基長が51〜601の範囲にあるオリゴまたはポリヌクレオチド、
(3) SNP442（塩基CまたはT）を挟んで、少なくとも配列番号５記載の塩基配列と配列番号６記載の塩基配列を含有する、塩基長が51〜601の範囲にあるオリゴまたはポリヌクレオチド、
(4) SNP443（塩基AまたはT）を挟んで、少なくとも配列番号７記載の塩基配列と配列番号８記載の塩基配列を含有する、塩基長が51〜601の範囲にあるオリゴまたはポリヌクレオチド、
(5) SNP445（塩基AまたはG）を挟んで、少なくとも配列番号９記載の塩基配列と配列番号１０記載の塩基配列を含有する、塩基長が51〜601の範囲にあるオリゴまたはポリヌクレオチド、
(6) SNP447（塩基AまたはG）を挟んで、少なくとも配列番号１１記載の塩基配列と配列番号１２記載の塩基配列を含有する、塩基長が51〜601の範囲にあるオリゴまたはポリヌクレオチド、
(7) SNP449（塩基TまたはC）を挟んで、少なくとも配列番号１３記載の塩基配列と配列番号１４記載の塩基配列を含有する、塩基長が51〜601の範囲にあるオリゴまたはポリヌクレオチド。【００３６】
これらの塩基配列で特定されるオリゴまたはポリヌクレオチド（DNA断片）は、関節リウマチに対する罹患性（易罹患性、抵抗性）を規定する遺伝的素因マーカーである。ゆえに、当該マーカーを含む遺伝子を検出することにより、被験者における関節リウマチ罹患の遺伝的素因を検査・診断することができる。この意味で、上記オリゴまたはポリヌクレオチドは、ＲＡ罹患診断マーカーとして規定することができ、かつ使用することができる。【００３７】
４．関節リウマチの罹患リスクを検出する方法
本発明は、また被験者について関節リウマチ（ＲＡ）の罹患リスク（関節リウマチを発症し易いか、発症し難いかの別）を検出する方法を提供する。本発明のＲＡ罹患リスクの検出方法は、被験者から得られるゲノムＤＮＡを対象として、下記(2)に示す塩基と、(1)及び(5)〜(7)に記載する塩基の中から選択される少なくとも１つの塩基とを検出し同定する工程を有するものである。【００３８】
(1) ヒトSEC8L1遺伝子の379258 位（SNP440）の塩基
(2) ヒトSEC8L1遺伝子の393668 位（SNP441）の塩基
(5) ヒトSEC8L1遺伝子の476136 位（SNP445）の塩基
(6) ヒトSEC8L1遺伝子の569133 位（SNP447）の塩基
(7) ヒトSEC8L1遺伝子の628601 位（SNP449）の塩基。【００３９】
なお、これらはＬＤブロック４（ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列中、393668〜681164位）内に存在するＲＡ疾患感受性ＳＮＰの集合である。【００４０】
ここで検出し同定する塩基（SNP）の組合せとしては、(2)の塩基（SNP441）と、 (1)および(5)〜(7)から選択されるいずれか１つの塩基（SNP440、SNP445、SNP447、SNP449）との組合せであればよく、例えば(2)の塩基（SNP441）と(1) の塩基（SNP440）との組合せ、(2)の塩基（SNP441）と(5) の塩基（SNP445）との組合せ、(2)の塩基（SNP441）と(6) の塩基（SNP447）との組合せ、(2)の塩基（SNP441）と(7) の塩基（SNP449）との組合せを挙げることができる。しかし(2)の塩基（SNP441）と組み合わせる対象のSNPは１つである必要はなく、(1)および(5)〜(7)から選択される任意の２つまたは３つであってもよいし、または(1)および(5)〜(7)の４つすべてであってもよい。【００４１】
本発明の検出方法として好ましくは、ヒト被験者から得られるゲノムＤＮＡを対象として、(2)の塩基（SNP441）と、(1)および(5)〜(7)から選択される少なくとも１つの塩基（SNP440、SNP445、SNP447、SNP449）とを検出し同定する工程〔工程（Ａ)〕を有する方法である。当該方法は、さらに、工程（Ａ）で検出し同定した(2)の塩基（SNP441）と、(1)および(5)〜(7)から選択される少なくとも１つの塩基が、下記の条件を満たしている場合に当該被験者が関節リウマチに罹りやすい（ＲＡ易罹患性）と判定する工程〔工程（Ｂ）〕を有することができる。【００４２】
(2)の塩基（SNP441）：シトシン
(1)の塩基（SNP440）：グアニン
(5)の塩基（SNP445）：グアニン
(6)の塩基（SNP447）：グアニン
(7)の塩基（SNP449）：シトシン。【００４３】
当該方法によれば、ＲＡ易罹患性及びＲＡ難罹患性の別、すなわちＲＡ罹患リスクを判定し診断することができる。当該ＲＡ罹患リスクの判定（診断）は、上記塩基の別を判断基準（判断指標）として医師等の専門知識を有する者の判断を要することなく、機械的に行なうことができる。このため、本発明の方法は、関節リウマチの罹患リスクの検出方法と言うことができる。【００４４】
なお、上記ゲノムＤＮＡの抽出および目的塩基の検出は、公知の方法〔例えば、Bruce, et al., Geneme Analysis/A laboratory Manual (vol.4), Cold Spring Harbor Laboratory, NY., (1999)〕を用いて行うことができる。【００４５】
ゲノムＤＮＡの抽出を行う検体は、被験者および臨床検体等から単離されたあらゆる細胞（培養細胞を含む。但し生殖細胞は除く）、組織（培養組織を含む）、臓器、または体液（例えば、唾液、リンパ液、気道粘膜、精液、汗、尿等）などを材料とすることができる。該材料としては末梢血から分離した白血球または単核球が好ましく、特に白血球が最も好適である。これらの材料は、臨床検査において通常用いられる方法に従って単離することができる。【００４６】
例えば白血球を材料とする場合、まず被験者より単離した末梢血から常法に従って白血球を分離する。次いで、得られた白血球にプロティナーゼＫとドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加えてタンパク質を分解、変性させた後、フェノール／クロロホルム抽出を行うことによりゲノムＤＮＡ（ＲＮＡを含む）を得る。ＲＮＡは、必要に応じてＲＮaseにより除去することができる。なお、ゲノムＤＮＡの抽出は、上記の方法に限定されず、当該技術分野で周知の方法（例えば、Sambrook J. et. al., “Molecular Cloning: A Laboratry Manual (2nd Ed.)”Cold Spring Harbor Laboratory, NY）や、市販のＤＮＡ抽出キット等を利用して行なうことができる。さらに必要に応じて、ヒト第７染色体上のSEC8L1遺伝子またはそのＬＤブロック４を含むＤＮＡを単離してもよい。当該ＤＮＡの単離は、SEV8L1遺伝子またはそのＬＤブロック４にハイブリダイズするプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によって行うことができる。【００４７】
目的塩基を検出する工程において、上記のようにして得られたヒトゲノムＤＮＡを含む抽出物から、関節リウマチに極めて関連性の深いＲＡ感受性ＳＮＰを検出する。なお、当該塩基の検出は、ヒトゲノムＤＮＡを含む試料からさらに単離したヒト第７染色体上のSEC8L1遺伝子、好ましくはそのＬＤブロック４中の塩基配列を直接決定し、各ブロック内に位置する各種ＳＮＰの塩基の変異を調べる方法によってもよい。【００４８】
例えば目的の塩基を検出する方法としては、上記のように該当領域の遺伝子配列を直接決定する方法の他に、多型配列が制限酵素認識部位である場合は、制限酵素切断パターンの相違を利用して、遺伝子型を決定する方法（以下、ＲＦＬＰという）、多型特異的なプローブを用いハイブリダイゼーションを基本とする方法（例えば、チップやガラススライド、ナイロン膜上に特定なプローブを張り付け、それらのプローブに対するハイブリダイゼーション強度の差を検出することによって、多型の種類を決定する、または、特異的なプローブのハイブリダイゼーションの効率を、鋳型２本鎖増幅時にポリメレースが分解するプローブの量を検出することにより遺伝子型を特定する方法、ある種の２本鎖特異的な蛍光色素が発する蛍光を温度変化を追うことにより２本鎖融解の温度差を検出し、これにより多型を特定する方法、多型部位特異的なオリゴプローブの両端に相補的な配列を付け、温度によって該当プローブが自己分子内で２次構造をつくるか、ターゲット領域にハイブリダイズするかの差を利用して遺伝子型を特定する方法など）がある。また、さらに鋳型特異的なプライマーからポリメレースによって塩基伸長反応を行わせ、その際に多型部位に取り込まれる塩基を特定する方法（ダイデオキシヌクレオタイドを用い、それぞれを蛍光標識し、それぞれの蛍光を検出する方法、取り込まれたダイデオキシヌクレオタイドをマススペクトロメトリーにより検出する方法）、さらに鋳型特異的なプライマーに続いて変異部位に相補的な塩基対または非相補的な塩基対の有無を酵素によって認識させる方法などがある。【００４９】
以下、従来公知の代表的な遺伝子多型の検出方法を列記するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。【００５０】
(a)ＲＦＬＰ（制限酵素切断断片長多型）法、（b）ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析）〔Biotechniques, 16, 296-297 (1994)、及びBiotechniques, 21, 510-514 (1996)〕、（c）ＡＳＯ（Allele Specific Oligonucleotide）ハイブリダイゼーション法〔Clin. Chim. Acta, 189, 153-157 (1990)〕、（d）ダイレクトシークエンス法〔Biotechniques, 11, 246-249 (1991)〕、（e）ＡＲＭＳ（Amplification Refracting Mutation System）法〔Nuc. Acids. Res., 19, 3561-3567 (1991)；Nuc. Acids. Res., 20, 4831-4837 (1992)〕、（f）変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis；ＤＧＧＥ）法〔Biotechniques, 27, 1016-1018 (1999)〕、（g）ＲＮaseＡ切断法〔DNA Cell. Biol., 14, 87-94 (1995)〕、（h）化学切断法〔Biotechniques, 21, 216-218 (1996)〕、（i）ＤＯＬ（Dye-labeled Oligonucleotide Ligation）法〔Genome Res., 8, 549-556 (1998)〕、（j）ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法〔Genet. Anal., 14, 143-149 (1999)；J. Clin. Microbiol., 34, 2933-2936 (1996)〕、（k）インベーダー法〔Science, 5109, 778-783 (1993)；J.Biol.Chem., 30,21387-21394 (1999)；Nat. Biotechnol., 17, 292-296 (1999)〕、（l）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法（Matrix Assisted Laser Desorption-time of Flight/Mass Spectrometry）法〔Genome Res., 7, 378-388 (1997)；Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem., 35, 545-548 (1997)〕、（m）ＴＤＩ（Template-directed Dye-terminator Incorporation）法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10756-10761 (1997)〕、（n）モレキュラー・ビーコン（Molecular Beacons）法〔Nat. Biotechnol., 1, p49-53 (1998)；遺伝子医学、4, p46-48 (2000)〕、（o）ダイナミック・アレル−スペシフィック・ハイブリダイゼーション（Dynamic Allele-Specific Hybridization；ＤＡＳＨ）法〔Nat.Biotechnol.,1.p.87-88 (1999)；遺伝子医学,4, 47-48 (2000)〕、（p）パドロック・プローブ（Padlock Probe）法〔Nat. Genet.,3,p225-232 (1998) ；遺伝子医学,4, p50-51 (2000)〕、（q）ＵＣＡＮ法〔タカラ酒造株式会社ホームぺージ（http://www.takara.co.jp）参照〕、（r）ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイ（「ＳＮＰ遺伝子多型の戦略」松原謙一・榊佳之、中山書店、p128-135）、（s）ＥＣＡ法〔Anal. Chem., 72, 1334-1341, (2000)〕。【００５１】
以上は代表的な遺伝子多型検出方法であるが、本発明のＲＡ罹患リスクの判定には、これらに限定されず、他の公知または将来開発される遺伝子多型検出方法を広く用いることができる。また、本発明の遺伝子多型検出に際して、これらの遺伝子多型検出方法を単独で使用してもよいし、また２以上を組み合わせて使用することもできる。【００５２】
以上の方法によって、関節リウマチ（ＲＡ）を発症する潜在的な危険度が相対的に高いことが判明した被験者に対しては、その旨を告知し、予めＲＡの発症を防ぐための的確な対策を講じることができる。従って、本発明は、ＲＡの発症を予防するための検査方法として、さらにはＲＡに伴って生じる他の疾患や症状発生の予防のための検査方法として極めて有用である。【００５３】
５．関節リウマチ罹患リスクの検出用試薬、これを含むキット
（１）プローブ
目的とする塩基（RA感受性SNP）並びに当該塩基を含むヌクレオチドの検出には、ヒト第７染色体のSEC8L1遺伝子上のＲＡ感受性ＳＮＰを含むオリゴまたはポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし、当該ＳＮＰを検出することができるオリゴヌクレオチドが用いられる。かかるオリゴヌクレオチドは、上記SEC8L1遺伝子上において個々のＳＮＰ（SNP440、SNP441、SNP445、SNP447、SNP449）を各々含む16〜500塩基長、好ましくは20〜200塩基長、より好ましくは20〜50塩基長の連続した遺伝子領域と特異的にハイブリダイズするように、通常16〜500塩基長を有するオリゴまたはポリヌクレオチドとして設計される。【００５４】
ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら、Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 第２版、1989に記載の条件）において、他のＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。好適には当該オリゴまたはポリヌクレオチドは、上記検出するＳＮＰを含む遺伝子領域の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有することが望ましいが、かかる特異的なハイブリダイゼーションが可能であれば、完全に相補的である必要はない。【００５５】
かかるオリゴまたはポリヌクレオチドとしては、下記(1)、(2)および(5)〜(7)からなる群から選択される少なくとも一つのオリゴまたはポリヌクレオチド（但し、当該オリゴ若しくはポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチドを挙げることができる〔以下、これらのオリゴまたはポリヌクレオチドを、ハイブリダイズする対象のオリゴまたはポリヌクレオチド（(1)、(2)および(5)〜(7)）に対応して、(1’)、(2’)および(5’)〜(7’)として示す場合もある〕。【００５６】
(1) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、379258 位（SNP440）に位置するヌクレオチドを含む16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(2) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、393668 位（SNP441）に位置するヌクレオチドを含む16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(5)ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、476136 位（SNP445）に位置するヌクレオチドを含む16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(6)ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、569133 位（SNP447）に位置するヌクレオチドを含む16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(7)ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、628601 位（SNP449）に位置するヌクレオチドを含む16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド。【００５７】
当該オリゴまたはポリヌクレオチドは、被験者について関節リウマチに対する罹患性を判定するために、ヒト第７染色体上のSEC8L1遺伝子上に位置するＲＡ受性ＳＮＰ（SNP440、SNP441、SNP445、SNP447、SNP449）を含むオリゴまたはポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴまたはポリヌクレオチド「プローブ」として設計される。なお、これらのオリゴまたはポリヌクレオチドは、SEC8L1遺伝子の塩基配列に基づいて、例えば市販のヌクレオチド合成機によって常法に従って作成することができる。【００５８】
本発明において関節リウマチ罹患リスクの検出に使用するための好適なプローブは、上記(2’)のオリゴまたはポリヌクレオチドからなるプローブと、上記(1’)および(5’)〜(7’)から選択される少なくとも一つのオリゴまたはポリヌクレオチドからなるプローブとの組み合わせである。ここでプローブの組合せとしては、(2’)のプローブと、 (1’)および(5’)〜(7’)から選択されるいずれか１つのプローブとの組合せであればよく、例えば(2’)のプローブと(1’)のプローブとの組合せ、(2’)のプローブと(5’)のプローブとの組合せ、(2’)のプローブと(6’)のプローブとの組合せ、(2’)のプローブと(7’)のプローブとの組合せを挙げることができる。しかし(2’)のプローブと組み合わせる対象のプローブは１つである必要はなく、(1’)および(5’)〜(7’)から選択される任意の２つまたは３つであってもよいし、または(1’)および(5’)〜(7’)の４つすべてであってもよい。【００５９】
さらに好ましくは、当該プローブは、上記各ＳＮＰ（SNP440、SNP441、SNP445、SNP447、SNP449）を含むオリゴまたはポリヌクレオチドが検出できるように、放射性物質、蛍光物質、化学発光物質、または酵素等で標識される（後述）。【００６０】
上記プローブ（オリゴまたはポリヌクレオチド）は任意の固相に固定化して用いることもできる。このため本発明はまた、上記プローブ（オリゴまたはポリヌクレオチド）を固定化プローブ（例えばプローブを固定化した遺伝子チップ、ｃＤＮＡマイクロアレイ、オリゴＤＮＡアレイ、メンブレンフィルター等）として提供するものである。当該プローブは、好適にはＲＡ感受性遺伝子検出用のＤＮＡチップとして利用することができる。【００６１】
固定化に使用される固相は、オリゴまたはポリヌクレオチドを固定化できるものであれば特に制限されることなく、例えばガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリーまたはその他の基板等を挙げることができる。固相へのオリゴまたはポリヌクレオチドの固定は、予め合成したオリゴまたはポリヌクレオチドを固相上に載せる方法であっても、また目的とするオリゴまたはポリヌクレオチドを固相上で合成する方法であってもよい。固定方法は、例えばＤＮＡマイクロアレイであれば、市販のスポッター（Amersham社製など）を利用するなど、固定化プローブの種類に応じて当該技術分野で周知である〔例えば、photolithographic技術(Affymetrix社)、インクジェット技術(Rosetta Inpharmatics社)によるオリゴヌクレオチドのin situ合成等〕。【００６２】
例えば、ＡＳＯ法の一例であるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法〔Livak KJ. Gene Anal 14, 143 (1999), Morris T et al., J Clin Microbiol 34, 2933 (1996)〕の場合、各種のＲＡ感受性ＳＮＰを含む領域に相補的な20塩基長程度のオリゴヌクレオチドがプローブとして設計される。当該プローブは、5’末端を蛍光色素、3’末端を消光物質により標識され、検体ＤＮＡと特異的にハイブリダイズするが、そのままでは発光せず、別に加えられたＰＣＲプライマーの上流からの伸長反応により5’側の蛍光色素結合が切断され、遊離した蛍光色素により検出される。【００６３】
ＡＳＯ法の別の１例であるＩｎｖａｄｅ法〔Lyamichev V. et al., Nat Biotechnol 17, 292 (1999)〕では、多型部位に隣接する配列（3’側と5’側の２種）に相補的なオリゴヌクレオチドがプローブとして設計される。検出は、これら２種のプローブと検体とは無関係な第３のプローブによって達成される。 【００６４】
（２）プライマー
本発明は、またヒト第７染色体のSEC8L1遺伝子上のＲＡ感受性ＳＮＰを含む配列領域を特異的に増幅するためのプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドを提供する。【００６５】
かかるオリゴヌクレオチドとしては、下記(1)、(2)および(5)〜(7)からなる群から選択される少なくとも一つのオリゴまたはポリヌクレオチド（但し、当該オリゴ若しくはポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする15〜30塩基長のオリゴヌクレオチドを挙げることができる〔以下、これらのオリゴヌクレオチドを、ハイブリダイズする対象のオリゴまたはポリヌクレオチド（(1)、(2)および(5)〜(7)）に対応して、(1”)、(2”)および(5”)〜(7”)として示す場合もある〕。【００６６】
(1) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、379258 位（SNP440）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(2) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、393668 位（SNP441）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(5) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、476136 位（SNP445）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(6) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、569133 位（SNP447）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(7) ヒトSEC8L1遺伝子の塩基配列において、628601 位（SNP449）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド。【００６７】
このようなオリゴヌクレオチドは、SEC8L1遺伝子において、ＲＡ感受性ＳＮＰの塩基（ヌクレオチド）を含む連続したオリゴまたはポリヌクレオチドの１部に特異的にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための15〜30塩基長、好ましくは18〜25塩基長程度のオリゴヌクレオチドとして設計される。増幅するオリゴまたはポリヌクレオチドの長さは、用いられる検出方法に応じて適宜設定されるが、一般的には15〜1000塩基長、好ましくは20〜500塩基長、より好ましくは20〜200塩基長である。【００６８】
本発明において関節リウマチ罹患リスクの検出に使用するための好適なプライマーは、上記(2”)のオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、上記(1”)および(5”)〜(7”)から選択される少なくとも一つのオリゴヌクレオチドからなるプライマーとの組み合わせである。ここでプライマーの組合せとしては、(2”)のプライマーと、 (1”)および(5”)〜(7”)から選択されるいずれか１つのプライマーとの組合せであればよく、例えば(2”)のプライマーと(1”)のプライマーとの組合せ、(2”)のプライマーと(5”)のプライマーとの組合せ、(2”)のプライマーと(6”)のプライマーとの組合せ、(2”)のプライマーと(7”)のプライマーとの組合せを挙げることができる。しかし(2”)のプライマーと組み合わせる対象のプライマーは１つである必要はなく、(1”)および(5”)〜(7”)から選択される任意の２つまたは３つであってもよいし、または(1”)および(5”)〜(7”)の４つすべてであってもよい。【００６９】
ヒト第７染色体のSEC8L1遺伝子上の、各種ＲＡ感受性ＳＮＰ（SNP440、SNP441、SNP445、SNP447、SNP449）近傍の15塩基以上連続した塩基配列に特異的にハイブリダイズする塩基配列を有する上記の各種オリゴヌクレオチドは、本発明においてプライマーとして利用することができる。なお、これらのオリゴヌクレオチドは、SEC8L1遺伝子の塩基配列に基づいて、例えば市販のヌクレオチド合成機によって常法に従って作成することができる。【００７０】
Ｍａｓｓ Ａｒｒａｙ法にＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ／ＭＳ（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry）を応用した方法〔Haff LA et al. Genome Res 7, 378 (1997), Little DP et al., Nature Medicine vol.3, No.12, 1413-1416, (1997)〕を例にとって、プライマーの具体的な利用方法を説明する。この場合、シリコンチップ上に固定した検体ＤＮＡに前記プライマーをハイブリダイズさせ、ｄｄＮＴＰを添加して一塩基だけを伸長させる。次いで、一塩基伸長産物を分離し、質量分析法により多型を検出する。この方法では、プライマーは通常15塩基長以上で可能な限り短く設計することが望ましい。【００７１】
（３）標識物
上記本発明のプローブまたはプライマーには、遺伝子多型検出のための適当な標識物、例えば蛍光色素、酵素、タンパク質、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン等が付加されたものが含まれる。【００７２】
なお、本発明において用いられる蛍光色素としては、一般にヌクレオチドを標識して、核酸の検出や定量に用いられるものが好適に使用でき、例えば、ＨＥＸ（4,7,2’,4’,5’,7’-hexachloro-6-carboxylfluorescein、緑色蛍光色素）、フルオレセイン（fluorescein）、ＮＥＤ（商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄色蛍光色素）、あるいは、６−ＦＡＭ（商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄緑色蛍光色素）、ローダミン（rhodamin）またはその誘導体〔例えば、テトラメチルローダミン（TMR）〕を挙げることができるが、これらに限定されない。蛍光色素でヌクレオチドを標識する方法は、公知の標識法のうち適当なものを使用することができる〔Nature Biotechnology, 14, 303-308 (1996)参照〕。また、市販の蛍光標識キットを使用することもできる（例えば、アマシャム・ファルマシア社製、オリゴヌクレオチドＥＣＬ  ３’−オリゴラベリングシステム等）。【００７３】
また、本発明のプライマーには、その末端に多型検出のためのリンカー配列が付加されたものも含まれる。このようなリンカー配列としては、例えば、前述したインベーダー法で用いられるオリゴヌクレオチド５’末端に付加される、フラップ（多型近傍の配列とは全く無関係な配列）等が挙げられる。【００７４】
以上の、プローブまたはプライマー（標識されていてもよい）は、ＲＡ発症リスクの検出用試薬として利用することができる。【００７５】
（４）関節リウマチ罹患リスク検出用試薬キット
本発明はまた、上記ＲＡ罹患リスク検出用試薬をキットとして提供するものである。当該キットは、上記プローブまたはプライマーとして用いられるオリゴまたはポリヌクレオチド（なお、これらは標識されていても、また固相に固定化されていてもよい）を少なくとも１つ含むものである。本発明のキットは上記プローブまたはプライマーの他、必要に応じてハイブリダイゼーション用の試薬、プローブの標識、ラベル体の検出剤、緩衝液など、本発明の方法の実施に必要な他の試薬、器具などを適宜含んでいてもよい。
【実施例】
【００７６】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。【００７７】
解析対象
下記の実施例で示す解析は、合計1566人の日本人の被験者を対象として行った。1566人のうち、760人は関節リウマチ患者（ＲＡ患者）（156人の男性と603人の女性）であり、806人は非関節リウマチ患者（健常対照者）（189人の男性と617人の女性）である。すべてのＲＡ患者はＡＣＲの診断基準(Arnett FC, Edworthy SM, Bloch DA, McShane DJ, Fries JF, Cooper NS, et al. The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1988;31:315-24)を満たし、発症から最低３年以上経過した症例者である。本研究は、徳島大学倫理委員会の承認を得ており、全ての参加者から、書面でのインフォームドコンセントが得られたのちに採血を行い、標準のプロトコルを用いて、末梢血リンパ球またはEBウイルスを用いた不死化リンパ芽球よりゲノムＤＮＡを抽出し、被験サンプルとして使用した。また、滑膜組織は、人工関節手術を受けた３名のＲＡ患者から採取し、文献(Mishiro T, Nakano S, Takahara S, Miki M, Nakamura Y, Yasuoka S, et al. Relationship between cathepsin B and thrombin in rheumatoid arthritis. J Rheumatol 2004;31:1265-73)に記載する方法に従って滑膜線維芽細胞を培養した。なお、ＲＡの病型は越智らの分類(Ochi T, Iwase R, Yonemasu K, Matsukawa M, Yoneda M, Yukioka M, et al. Natural course of joint destruction and fluctuation of serum C1q levels in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1988;31:37-43)に従って、３群に分類した。【００７８】
RA患者および健常対照者の臨床像を表１にまとめた。【００７９】
【表１】
2006098401.tif 000002
【００８０】
サンプル採取時年齢±SDは、RA患者では61.9±12.2歳、健常対照者では38.8±15.4歳であった。【００８１】
下記の実施例において、ＳＮＰのアレル頻度に関する関連検定は、２Ｘ２の分割表を作成し、カイ２乗検定を行った。permutation 法を利用したハプロタイプ頻度のカイ２乗検定は、SNPAlyze ver.3.2プロ（DYNACOM、日本）を用いて行った。ペアワイズの連鎖不平衡の程度は、連鎖不平衡係数（|Ｄ‘|）と相関係数（r2）を算出することによって評価した。【００８２】
実施例１ 
（１）ＲＡ感受性領域のＳＮＰ探索とタイピング
53家系を用いたゲノムワイド罹患同胞対解析で、7q31-34領域のマーカーD7S2560でLODスコアー1.41という結果が得られている(Nyholt DR. All LODs are not created equal. Am J Hum Genet 2000;67:282-8）。そこで、D7S2560からの1-LODインターバルであるD7S486からD7S2513の領域（25.3Mb）にＲＡの感受性や重症度に関わる遺伝子が存在するのではないかと考えた。この領域にはNCBIのMap View Build 34 Version2で179の遺伝子が存在している。そこで、これらの候補遺伝子に対し有用なマーカーセットを作成するために、公共のデータベース(dbSNP, TSC)やセレラ社のデータベースからSNPの探索を行った。膨大な数のSNPの中で、下記の3つの基準を満たす728のSNPを抽出した。【００８３】
(i)転写開始点から10kb上流からストップコドンの10kb下流までの遺伝子領域に存在し、かつ可能な限り等間隔（10〜20kb）に一つの割合で配置されたSNPであること。
(ii)TaqManアッセイで用いるプローブの設計に適した配列を持つこと。
(iii)46人の健常対照者サンプルを用いた頻度解析で、マイナーアレル頻度が15%以上の頻度の高いSNPであること。【００８４】
次いで、この抽出した728SNPに対しTaqManアッセイ系を作成した。TaqManプローブとプライマーのセットはアプライドバイオシステムズ社のPrimer Expressを用いて作成した。遺伝子型のタイピングはTaqMan Universal Master MixまたはQuantiTect Prove PCR Kit、5ngのDNA、450nMのプライマー、および100nMのプローブを用いた反応系（4μl）で行った。PCRは、サーマルサイクラー（ABI GeneAmp PCR System 9700）を用いて、酵素の活性化95℃10分、その後92℃または94℃で15秒、60℃で1分の反応を40サイクル繰り返して行った。384ウェルのプレートに遺伝子型のわからない380サンプルを注入し、残る4ウェルはコントロールとした。PCR反応後、PCR増幅産物のVICおよびFAMに基づく蛍光シグナルを、ABI Prism 7900HT Sequence Detector SystemとSDS Softwareを用いて検出した。【００８５】
（２）ケースコントロール関連解析
実験
タイピングにかかる時間と費用を削減するために、1520症例を２つのグループ（１グループ：RA患者380人、健常対照者380人）に分け、２段階の解析を行った。なお、性差、発症年齢、RAのサブタイプは各段階で均一になるよう調整した。第１段階の解析ではすべてのSNPをタイピングし、RAと関連（P<0.05）を示したSNPを異なるサンプルセットで再現性の確認を行った。各段階で患者、健常対照者のアレル頻度を2×2の分割表を用いたχ2乗検定にかけた。有意差を示したSNPについては、さらに遺伝子型頻度、ドミナントモデル、リセッシブモデルでの検討を行った。各SNPでのハーディー・ワインバーグ平衡も、χ2乗検定で検討を行った(Nielsen DM, Ehm MG, Weir BS. Detecting marker-disease association by testing for Hardy-Weinberg disequilibrium at a marker locus. Am J Hum Genet 1998;63:1531-40)。なお、マイナーアレル頻度が15%未満、タイピング成功率が97%未満、コントロールサンプルでハーディー・ワインバーグ平衡が成立しないSNPは解析から除外した。候補領域での連鎖不平衡および相の推定は第１段階の380人の健常対照者サンプルの遺伝子型を用いた。ペアワイズの連鎖不平衡はハプロタイプ頻度A1B1をx11、A、Bのアレル頻度をそれぞれp1、q1としたとき、D = x11-p1q1で推定した。またrはA、Bの他方のアレル頻度をそれぞれp2、q2としたときr = D/(p1p2q1q2)1/2で推定した(Hill WG RA. Linkage disequilibrium in finite populations. Theor Appl Genet 1968;38:226-31)。D’はD < 0のときDmax = minimum(p1q2,p2q1)、D > 0のときDmax = minimum(p1q1,p2q2)としD’ = D/Dmaxで表した(Lewontin RC. The interaction of selection and linkage. I. General considerations: heterotic models. Genetics 1964;49:49-67)。多点でのハプロタイプ頻度の推定は最尤推定法で行った。【００８６】
パーミューテーションテストを含む統計は、SNP Alyze ProまたはFujitsu Disease Susceptibility Gene Discovery Systemを用いた。連鎖不平衡の構成はGOLD(Abecasis GR, Cookson WO. GOLD--graphical overview of linkage disequilibrium. Bioinformatics 2000;16:182-3)を用いて図示した。ポピュレーションアトリビュータブルリスクは、RAの有病率を0.01とし、fをリスクアレルの頻度、r1、r2を遺伝子型のリスクレイシォと推定したとき、X = (1-f) 2 + 2f(1-f)r1 + f2r2を用い(X-1)/Xで表される(Esterbauer H, Schneitler C, Oberkofler H, Ebenbichler C, Paulweber B, Sandhofer F, et al. A common polymorphism in the promoter of UCP2 is associated with decreased risk of obesity in middle-aged humans. Nat Genet 2001;28:178-83)。【００８７】
結果
Genetic Power Calculatorを用いた検出力は、380人ずつのRA患者および健常対照者を用いて、遺伝子型相対危険度f1/f0、f2/f0をそれぞれ1.2、1.5、マーカーアレルの頻度を0.45、αを0.05とした場合、0.5125であった(Purcell S, Cherny SS, Sham PC. Genetic Power Calculator: design of linkage and association genetic mapping studies of complex traits. Bioinformatics 2003;19:149-50)。【００８８】
第１段階でタイピングをした728SNPのうち69SNPはマイナーアレル頻度が15%未満またはコントロールサンプルでハーディー・ワインバーグ平衡が不成立であったため、解析から除外した。解析を行った695SNPのうち13遺伝子領域に存在する48SNPが、RAと有意な相関(P < 0.05)を示した。そこで、これらの48SNPについて、第２グループ（380人のRA患者、380人の健常対照者）を対象として第２段階の解析を行った。【００８９】
48SNP中、3SNPは同様に規定を満たさなかったため解析より除外した。残る45SNP中5SNP(SNP411, 441, 442, 443および445：当初の0.69%)が再現性を持って有意差を示した。各段階の結果を統合したところ、SNP441, 442, 443, 445ではさらに小さなP値を示したが、一方でSNP411の有意差は消失した。このSNP411は、各解析段階では有意差が確認されていたが、第１段階と第２段階でアレル頻度が逆転していたため、統合された結果では有意差が消失したと考えられる。【００９０】
これらのSNPのうち、SNP441が最も強い有意差（RAとの相関）を示した (P = 0.000059、オッズ比1.34、95%信頼区間1.16-1.55)（表２参照）。本実験のように多数のSNPを用いた関連解析では多重検定に伴う偽陽性の出現を排除することが重要である。SNP441は、多重検定による偽陽性を補正するボンフェローニの補正を行っても有意性は保たれていた(P = 0.039)。【００９１】
SNP441のpopulation attributable riskはアレル頻度を0.57としたとき40%であり、genotype risk ratioは、T/Tに対するC/Tをr1、C/Cをr2とすると、それぞれ1.075と1.708となった。当該SNP441は、罹患同胞対解析でピークとなったマーカーD7S2560からわずか3.9Mbの位置にあった。このことは、孤発例サンプルを用いた連鎖不平衡解析の結果と家系例サンプルを用いた罹患同胞対解析の結果に矛盾がなかったことを意味する。【００９２】
表２にSEC8L1遺伝子に存在するSNPsについて、関連解析の結果を示す。【００９３】
【表２】
2006098401.tif 000003
【００９４】
これからわかるように、上記でRA患者で有意差が認められたSNP441, 442, 443および445は、いずれもエクソシストコンプレックスの構成成分であるSEC8L1遺伝子のイントロン10の82kb領域内に存在していた。SEC8L1遺伝子内のSNP449〜SNP455とSNP457〜SNP461の12SNPは、第２段階の解析では有意差は認められなかったが、第１段階、第２段階の結果を統合した解析では有意差を示した。SNP444, 446および456は第１段階では有意差を示したため、第２段階の解析を行ったが、統合した結果でのハーディー・ワインバーグ平衡が不成立であったため第１段階の結果のみ記載し、連鎖不平衡解析からは除外した。【００９５】
統合した結果では、これ以外にも４遺伝子内の6SNPが少なくとも１つの形質でRAと強い相関(P < 0.01)を示した（表３）。【００９６】
【表３】
2006098401.tif 000004
【００９７】
（３）連鎖不平衡解析、ハプロタイプ解析
SEC8L1遺伝子は、18のエキソンから構成される800kbからなる遺伝子である。これまでの研究で頻度の高い多型ではSNP間での連鎖不平衡は10から60kbにわたり、また数百kbに及ぶこともあるといわれている。この相関がSEC8L1遺伝子そのものによることを証明するため、SEC8L1遺伝子の前後２遺伝子（CHCHD3遺伝子, FLJ32786遺伝子）を含めた領域の連鎖不平衡のパターンを評価した。その結果、|D’|> 0.9を基準として６つの連鎖不平衡ブロックを同定した（図１）。【００９８】
そのうち、ブロック４内に存在するほぼすべてのSNP(SNP441-461)に、ＲＡとの相関性が認められた。このブロックは、SEC8L1遺伝子内のイントロン10〜13にわたる約300kbの領域である（図１ＢおよびＣ）。この連鎖不平衡ブロック内には他の遺伝子はなく、このことから、上記で観察されたＲＡとの相関は、SEC8L1遺伝子そのものに由来することが判明した。【００９９】
これらのブロック４内のSNPが組み合わせとなってRAのリスクに寄与する可能性を考え、ハプロタイプの解析を行った。ブロック４には22のSNPが存在したが、3SNP(SNP444, 446, 456)は上記理由により解析から除外した。残るブロック４に存在する19SNPのうち、r 2> 0.9以上の連鎖不平衡にあるものを、５つのグループに分類した。各グループから1SNPずつ選択(SNP440,441,445,447,449)し、ハプロタイプを構築した。なお、SNP440と447は第２段階のタイピングを行っていなかったが、ハプロタイプ解析のため第２段階の解析を行った。その結果、表４に示すように、４つの頻度の高いハプロタイプ（ハプロタイプ１〜４）が同定された。【０１００】
【表４】
2006098401.tif 000005
【０１０１】
ハプロタイプ1（G,C,G,G,C）は最も頻度が高く、RAと正の相関(P =0.0015)を示し、ＲＡ感受性ハプロタイプであると認められた。一方、ハプロタイプ２はRAと負の相関(P = 0.0000062)を示し、ＲＡ抵抗性ハプロタイプであると認められた。P値は、多重検定の補正のためパーミューテーションテストにより求めた（ハプロタイプ１：P = 0.001、ハプロタイプ２：P < 0.0001）。このことから、単点SNP441、およびSNP441を含むハプロタイプはどちらもＲＡに対して強い有意性を示したが、同様にＲＡの感受性を規定するうえで重要であると考えられる。【０１０２】
実験例２    ヒト組織でのSEC8L1の発現
なお、リアルタイムPCRにあたり、滑膜線維芽細胞（FLS）からのトータルRNAの抽出はRNeasy KITを用いて行った。またその他の組織（脳、骨髄、肺、心臓、胸腺、脾臓、腎臓、骨格筋）からのRNAは、Human Total TNA Master Panel II Kitを用いて調製した。調製したRNAは、オリゴdTプライマーおよびSuperScript IIを用いて逆転写し、SEC8L1遺伝子およびコントロールとしたβアクチンTaqMan Assays on Demandを用いたリアルタイムPCRで定量した。骨髄でのSEC8L1の発現量を基準（１とする）にスタンダードカーブ法により他の組織の発現量を算出した。
結果を図２に示す。図２に示すように、健常対照者の正常組織ではSEC8L1はユビキタスに発現しており、特に骨格筋に高い発現が認められた。またRA患者において、SEC8L1は培養滑膜線維芽細胞で中等度の発現が確認された。滑膜線維芽細胞は、マクロファージから放出されるTNF-αなどの炎症性サイトカインによってＭＭＰ（関節軟骨を分解する酵素）を放出することが知られており、病因に深く関わっていると考えられている細胞である。【０１０３】
実験例３    マウス免疫細胞内でのSEC8遺伝子の発現
Sec8L1の発現は、脳と脾臓に特異的に認められたことから、さらに限定した生体内での局在を解明するべく、どの組織あるいは細胞に発現が高いかを検討した。関節リウマチにおける炎症病理にSEC8L1の関与が考えられることから、免疫担当細胞に着目した。【０１０４】
マウス(系統;BALB/c)の脾臓を摘出後、各リンパ球に特異的な分子マーカー(B cell:B220、 NK cell:DX5α、Macrophage:Mac1)に対する抗体に磁気ビーズを結合させた抗体を反応させた後，autoMACSTM(自動磁気分離)システムにてリンパ球を分離した。T cellはpan T cell isolation kit（Tcell以外を排除するキット、Miltenyi製）を用いて分離を行った。得られたリンパ球集団はFACS解析によって、各々の純度を評価した。その結果、すべて80％以上の純度の高い細胞集団であった。樹状細胞はマウス(系統;BALB/c)の四肢の長官骨由来の骨髄細胞集団を出発材料とし、GM-CSF(20ng/ml)環境下で７日間培養した。培養後、樹状細胞の特異的マーカー分子であるCD11cに対する磁気ビーズ結合抗体を使って同様にautoMACSTMで分離した。【０１０５】
上記の方法により分離・精製した各種リンパ球から、RNeasy micro kit（Qiagen製）を用いてRNAを抽出し、マウスSEC8L1遺伝子の発現をRT-PCRで解析した。なお、RT-PCR によるcDNAの作成には 「superscript first-strand synthesis for RT-PCR」（Miltenyi製）、および下記に示すプライマーを使用した。【０１０６】
(1)primer-1(マウスSEC8L1遺伝子のイントロン3,4,5を検出するように設計)
(i)Forward primer ：5’-CGACATGCTGGTGTCAGCAGT-3’（配列番号１５）
(ii)Reverse primer  ：5’-TCATCTCCCTCACACTTGAGCCTC-3’ （配列番号１６）。【０１０７】
(2) primer-2(マウスSEC8L1遺伝子のイントロン14を検出するように設計) 
(i)Forward primer  ：5’-CTTCATAAGGGCAGCCTTTG-3’ （配列番号１７）
(ii)Reverse primer  ：5’-GGGGAAAGCATCTGGGATGT-3’ （配列番号１８）。【０１０８】
上記primer-1セットおよびprimer-2セットを用いてRT-PCRを行った結果、図３に示すように、免疫担当細胞に相当するいずれのリンパ球系細胞（Ｂ細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞（DC））でSEC8L1の発現が確認された。またPrimer-1による検出結果では、特にＴ細胞が他のリンパ球系細胞と比べて発現が高く、次いで樹状細胞（DC）、マクロファージ、Ｂ細胞で高い発現を示した。Primer-2の場合も、わずかではあるがＴ細胞において高いSEC8L1の発現が認められた。(図３)
以上示すように、すべてのリンパ球でSEC8L1遺伝子の発現が認められ、特にＴ細胞で高い発現が認められた。関節リウマチ患者滑膜内には多数のＴ細胞の浸潤が確認されており、関節リウマチにおいてＴ細胞は非常に重要な役割をするといわれている（Smeets, T. J. et al.  Poor expression of T cell-derived cytokines and activation and proliferation markers in early rheumatoid synovial tissue. Clin. Immunol. Immunopathol. 88:84-90 (1998)）。Ｔ細胞はCD4陽性細胞であり、細胞性免疫を誘導するTh1細胞へ分化したものが多い。これらが放出するサイトカインはIFN-γやIL-17であり、マクロファージや滑膜線維芽細胞などに作用することが示唆されている。またTNF-α、IL-1などの炎症性サイトカインを放出して軟骨破壊、滑膜の炎症を引き起こすことが報告されている（Lubberts, E. et al. IL-17 promotes bone erosion in murine collagen-induced arthritis through loss of the receptor activator of NF-kB ligand/osteoprotegerin balance. J. Immunol. 170:2655-2662（2003））。さらにＴ細胞やマクロファージは破骨細胞活性化因子であるRANKL (Recptor Activator of NF-kB Ligand)を産生・分泌し、骨破壊を誘導するとの報告もある（Nakae, S. et al. IL-17 production from activated T cell is required for the spontaneous development of destructive arthritis in mice deficient IL-1 receptor antagonist. PNAS.100:5986-5990（2003））。SEC8L1はExocyst Complexのサブユニットであり、主に小胞輸送に関与しており、小胞と細胞膜が結合する際に繋留（小胞を細胞膜に一時的につなぎとめておく）させて膜への結合能を高める作用を示す（Grindstaff,K.K. et al. Sec6/8 complex is recruited to cell-cell contacts and specifies transport vesicle delivery to the basal-lateral membrane in epithelial cell. Cell. 93:731-740（1998））。関節リウマチ患者ではかかるExocyst Complexの機能不全があり、ある特定のサイトカイン発現やそのSEC8L1の膜への輸送障害が生じ、その結果、関節リウマチを誘発、助長させている可能性が示唆される。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図Ａは、|D’|を用いた日本人健常対照者380人のSNP間でのペアワイズの連鎖不平衡を示す図である。図Ｂは、ケースコントロール関連解析の-log10(P値)と物理位置の対比を示す。横にひいた線はP = 0.05を示す。1520人（２グループ：各グループ患者380人および健常対照者380人）からタイピングされた21SNPのみを記載する。矢印は最も強い有意差を示したSNP441の物理位置を示す。図Ｃは、SEC8L1遺伝子周辺のゲノム構造と６つの連鎖不平衡ブロックの位置関係を示す。縦線はSEC8L1遺伝子のエキソンを示す。
【図２】ヒト組織でのSEC8L1遺伝子の骨髄での発現に対する発現パターンを示す図である。SEC8L1の発現量をβアクチンの発現量で標準化した結果である。なお、図中「FLS」は滑膜線維芽細胞を意味する。
【図３】マウス脾臓、骨髄より採取した生体細胞由来のリンパ球（Bsaibou、マクロファージ、T細胞、NK細胞、樹状細胞（DC））でのSEC8L1の発現を示す。いずれの細胞でも発現が確認された。Primer-1による検出結果では特にT細胞が他のリンパ球と比べて発現が高く、次いで樹状細胞、マクロファージ、B細胞でも高い発現を示した。Primer-2でもわずかではあるがT 細胞において高いSEC8L1発現が認められた。
【図２】
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【図３】
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【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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