(57)【要約】【課題】生体の静止時のみならず振動時においてもブレの少ない精細な画像を得る。【解決手段】レーザ光を射出するレーザ光源３と、該レーザ光源３からのレーザ光を２次元的に走査するスキャナ４と、該スキャナ４により走査されたレーザ光を試料Ｓに集光する一方、試料Ｓにおいて発生した蛍光を集光する対物レンズ５と、該対物レンズ５により集光され、スキャナ４を介して戻る蛍光を検出する光検出器７と、試料Ｓの被検査部位の変位を計測する変位計測部１４と、該変位計測部１４により計測された変位の方向にレーザ光の走査位置を補正する走査位置補正部９とを備える生体観察装置１を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光を射出するレーザ光源と、
該レーザ光源からのレーザ光を２次元的に走査するスキャナと、
該スキャナにより走査されたレーザ光を試料に集光する一方、試料において発生した蛍光を集光する対物レンズと、
該対物レンズにより集光され、スキャナを介して戻る蛍光を検出する光検出器と、
試料の被検査部位の変位を計測する変位計測部と、
該変位計測部により計測された変位の方向にレーザ光の走査位置を補正する走査位置補正部とを備える生体観察装置。
【請求項２】
前記走査位置補正部が、前記スキャナにより走査されたレーザ光の走査位置を前記変位計測部により計測された変位の方向に移動させる補正スキャナを備える請求項１に記載の生体観察装置。
【請求項３】
前記走査位置補正部が、前記変位計測部により計測された変位の方向に補正した走査位置にレーザ光が配置されるように前記スキャナを駆動する請求項１に記載の生体観察装置。
【請求項４】
前記走査位置補正部が、前記スキャナにより走査されたレーザ光の走査位置を前記変位計測部により計測された変位の方向に移動させるよう対物レンズを駆動する請求項１に記載の生体観察装置。
【請求項５】
前記走査位置補正部が、所定時間間隔でレーザ光の走査位置を補正する請求項１から請求項４のいずれかに記載の生体観察装置。
【請求項６】
前記所定時間が、試料が画質的に許容できる程度の変位を生じる時間内に設定されている請求項５に記載の生体観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体観察装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体試料の動きを検出して試料が静止しているときの画像のみを抽出することにより、呼吸等によって振動する生体試料の像ブレのない画像を取得する生体観察装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−２７４７８３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来の生体観察装置では、生体が動いていない期間の画像が得られるのみで、動いている期間の状態を観察することができないという不都合がある。また、麻酔下のマウス等の生体試料では、心拍数が毎秒約１０回、呼吸は毎秒約１回発生し、マウスの肝臓において心拍による振動は３００μｍ程度、呼吸による振動は２ｍｍ程度の振幅を有している。このため、このような生体試料を高倍率で詳細に観察しようとすると、静止している期間が短く、像ブレのない画像を得ることができないという不都合がある。
【０００５】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、生体の静止時のみならず振動時においてもブレの少ない精細な画像を得ることができる生体観察装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、レーザ光を射出するレーザ光源と、該レーザ光源からのレーザ光を２次元的に走査するスキャナと、該スキャナにより走査されたレーザ光を試料に集光する一方、試料において発生した蛍光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光され、スキャナを介して戻る蛍光を検出する光検出器と、試料の被検査部位の変位を計測する変位計測部と、該変位計測部により計測された変位の方向にレーザ光の走査位置を補正する走査位置補正部とを備える生体観察装置を提供する。
【０００７】
本発明によれば、レーザ光源から発せられたレーザ光がスキャナにより２次元的に走査され対物レンズにより試料に集光されると、試料内に存在する蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。発生した蛍光は対物レンズにより集光され、スキャナを介して戻り、光検出器により検出される。スキャナによるレーザ光の走査位置と光検出器により検出された蛍光強度とを対応づけて記憶しておくことにより、事後的に２次元的な蛍光画像を取得することができる。
【０００８】
この場合において、変位計測部の作動により試料の被検査部位の変位が計測され、走査位置補正部の作動によりレーザ光の走査位置が補正される。すなわち、試料の被検査部位に変位が発生した場合には、その変位の方向にレーザ光の走査位置を変位と同じ距離だけ移動させることにより、静止している試料に対してレーザ光を走査するのと同じ走査範囲においてレーザ光を走査させることができる。その結果、試料が振動していてもブレが少なく精細な被検査部位の蛍光画像を取得することができる。
【０００９】
上記発明においては、前記走査位置補正部が、前記スキャナにより走査されたレーザ光の走査位置を前記変位計測部により計測された変位の方向に移動させる補正スキャナを備えていてもよい。
このようにすることで、補正スキャナが、試料の変位に応じた移動量および移動方向にレーザ光の走査位置を補正するので、スキャナには、静止時および振動時にかかわらず、常に同一のスキャン動作を行わせることができ、スキャナの制御を簡易にすることができる。
【００１０】
また、上記発明においては、前記走査位置補正部が、前記変位計測部により計測された変位の方向に補正した走査位置にレーザ光が配置されるように前記スキャナを駆動することとしてもよい。
このようにすることで、スキャナの制御は複雑になるが、元来レーザ光の走査を行うスキャナにその走査位置の補正動作をも受け持たせることで、装置を簡易にすることができる。
【００１１】
また、上記発明においては、前記走査位置補正部が、前記スキャナにより走査されたレーザ光の走査位置を前記変位計測部により計測された変位の方向に移動させるよう対物レンズを駆動することとしてもよい。
このようにすることで、対物レンズが、試料の変位に移動量および移動方向にレーザ光の走査位置を補正するので、スキャナには、静止時および振動時にかかわらず、常に同一のスキャン動作を行わせることができ、スキャナの制御を簡易にすることができる。
【００１２】
また、上記発明においては、前記走査位置補正部が、所定時間間隔でレーザ光の走査位置を補正することとしてもよい。
この場合においては、前記所定時間が、試料が画質的に許容できる程度の変位を生じる時間内に設定されていることが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、生体の静止時のみならず振動時においてもブレの少ない精細な画像を得ることができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の一実施形態に係る生体観察装置１について、図１〜図５を参照して説明する。
本実施形態に係る生体観察装置１は、図１に示されるように、試料Ｓを搭載するステージ２と、レーザ光を出射するレーザ光源３と、該レーザ光源３からのレーザ光を２次元的に走査するスキャナ４と、該スキャナ４により走査されたレーザ光をステージ２上の試料Ｓに集光する対物レンズ５と、試料Ｓにおいて発生し、対物レンズ５により集光され、スキャナ４を介して戻る蛍光をレーザ光から分岐するダイクロイックミラー６と、該ダイクロイックミラー６により分岐された蛍光を検出する光検出器７と、試料Ｓの被検査部位の変位を計測する変位計測部８と、該変位計測部８により計測された変位に基づいてスキャナ４の走査位置を制御するスキャニング制御部９とを備えている。
【００１５】
ステージ２は、ハンドル２ａの操作により、搭載した試料Ｓを、Ｘ，Ｙ，Ｚ方向に位置調節することができるようになっている。
スキャナ４は、例えば、相互に直交するＸ，Ｙ方向に揺動させられることにより、試料Ｓ上においてＸ，Ｙ方向にレーザ光のスポットを走査させる２つのガルバノミラー４ａ，４ｂを備えている。各ガルバノミラー４ａ，４ｂは、現在の揺動角度をスキャニング制御部９に対して出力するようになっている。
対物レンズ５は、Ｚステージ１０に取り付けられ、Ｚステージ１０の作動により試料Ｓの光軸方向（Ｚ方向）に沿う変位に追従して常に合焦状態に維持されるようになっている。
【００１６】
光検出器７は、例えば、光電子増倍管であり、蛍光の強度を検出するようになっている。光検出器７の前段には、対物レンズ５の焦点位置と共役な位置に配置された共焦点ピンホール１１と、レーザ光を遮断するバリアフィルタ１２とが配置されている。
【００１７】
変位計測部８は、照明光を照射する光源１３と、ＸＹ変位計測部１４と、Ｚ変位計測部１５とを備えている。図１中、符号１６は、照明光を対物レンズ５に向かう光路に合波させるダイクロイックミラー、符号１７は、試料Ｓにおいて反射して戻る照明光を光路から分岐させるダイクロイックミラー、符号１８はバリアフィルタである。また、符号１９は、観察条件等を入力する入力部、符号２０は、入力された観察条件に基づいてスキャナ４の走査位置情報を算出してスキャニング制御部９に指示し、光検出器７により検出された蛍光強度および走査位置情報に基づいて蛍光画像を生成してモニタ２１に表示する制御部である。また、符号２２はミラーである。
【００１８】
ＸＹ変位計測部１４は、２次元の撮像素子１４ａと、該撮像素子１４ａにより取得された２次元の画像を処理して特徴点の変位を抽出する画像処理部１４ｂとを備えている。
画像処理部１４ｂは、撮像素子１４ａにより取得された２次元の画像を処理することにより、特徴点の座標を抽出する。
【００１９】
ここでは、例えば、スキャナ４によるＸ方向の走査速度が速く、Ｘ方向のガルバノミラー４ａが１ライン走査する間の試料Ｓの変位量が十分に小さい場合について説明する。
ここで、試料Ｓが静止している場合には、図２に示されるように、レーザ光を走査する１ライン目の初期位置（ｘ０，ｙ０）＝（０，０）とし、ガルバノミラー４ｂによるＹ方向の送り量をΔとすると、２ライン目の開始位置の座標は（０，Δ）、３ライン目の開始位置の座標は（０，２Δ）・・・となる。
【００２０】
一方、図３に示されるように、試料Ｓが振動することにより特徴点が変位する場合について説明する。図３には、画像処理部１４ｂによる処理の結果、時刻ｔ１に計測された特徴点の位置から算出される走査ラインの開始位置が（ｘ（ｔ１），ｙ（ｔ１））、時刻ｔ２に計測された特徴点の位置から算出される走査ラインの開始位置が（ｘ（ｔ２），ｙ（ｔ２））となった場合が示されている。
【００２１】
スキャニング制御部９は、画像処理部１４ｂによる処理の結果、時刻ｔ１において走査ラインの開始位置が（ｘ（ｔ１），ｙ（ｔ１））であると算出された場合には、次に時刻ｔ２において走査ラインの開始位置が算出されるまでの間、次の走査ラインの開始位置を（ｘ（ｔ１），ｙ（ｔ１）＋Δ）と設定し、さらにその次の走査ラインの開始位置を（ｘ（ｔ１），ｙ（ｔ１）＋２Δ）…と設定するようになっている。また、スキャニング制御部９は、時刻ｔ２において走査ラインの開始位置が（ｘ（ｔ２），ｙ（ｔ２））であると算出された場合には、次に走査ラインの開始位置が算出されるまでの間、次の走査ラインの開始位置を（ｘ（ｔ２），ｙ（ｔ２）＋Δ）と設定し、さらにその次の走査ラインの開始位置を（ｘ（ｔ２），ｙ（ｔ２）＋２Δ）…と設定するようになっている。
【００２２】
すなわち、スキャニング制御部９は、図４に示されるように、ＸＹ変位計測部１４によって試料ＳのＸ，Ｙ方向の変位量の絶対値が計測されるので、該変位量の絶対値に対して検出位置補正として、必要な収差補正等の補正を行った後、その変位量と元来の走査位置情報とを加算して新たな走査位置目標値を生成し、スキャナ４の走査位置をフィードバックして制御するようになっている。
【００２３】
また、Ｚ変位計測部１５は、例えば、レーザ変位計であって、対物レンズ５の先端から試料Ｓまでの距離を計測するようになっている。このＺ変位計測部１５により検出された対物レンズ５の先端から試料Ｓまでの距離の変化は、Ｚ方向制御部２３に送られ、Ｚ方向制御部２３は、図５に示されるように、距離の変化とは逆方向にＺステージ１０を駆動させるようになっている。図中符号２４は、検出光を分岐するダイクロイックミラーである。
【００２４】
このように、本実施形態に係る生体観察装置１によれば、試料Ｓの被検査部位がＸ，Ｙ方向に変位してもその変位に追従するようにスキャナ４によるレーザ光の走査位置を補正するので、静止している試料Ｓの観察範囲と同一の観察範囲の２次元的な画像を取得することができる。その結果、ブレの少ない精細な画像を取得して精度の高い観察を行うことができるという利点がある。また、試料Ｓの被検査部位がＺ方向に変位しても、その変位をキャンセルする方向に対物レンズ５が駆動されるので、合焦状態が維持されて、鮮明な蛍光画像を取得することができる。
【００２５】
なお、本実施形態においては、Ｘ方向に複数ライン走査する毎に１回補正動作を行う場合について説明したが、Ｘ方向に１ライン走査する毎に１回補正動作を行うことにしてもよい。また、画像処理による変位の計測に時間がかかる場合には、過去の計測結果に基づいて、次の走査位置を予測することにしてもよい。
【００２６】
この場合には、画像処理により取得された複数回の過去の計測結果に対して最小二乗法、移動平均あるいはローパスフィルタのようなノイズ低減処理を行った後に、後退差分や最小二乗法を用いて次の走査位置を予測することにすればよい。
【００２７】
また、Ｘ方向に１ライン走査する間に試料Ｓが変位するほど走査速度が遅い場合や、試料Ｓの変位が急峻に行われる場合には、１ライン走査する間に複数回の補正動作を行うことにしてもよい。この場合、補正動作を行う時間間隔は、試料Ｓが画質的に許容できる程度の変位を生じる時間内に設定されていることが好ましい。
【００２８】
すなわち、例えば、試料Ｓである細胞の細胞核が１０μｍ程度の寸法である場合には、その１／１０程度の１μｍ程度移動する時間間隔で補正動作を行うことが好ましい。これにより、ブレの少ない精細な画像を取得することができる。
【００２９】
また、本実施形態においては、ＸＹ変位計測部１４において計測された変位量に基づいて、レーザ光を試料Ｓ上でＸＹ方向に走査するためのスキャナ４の走査位置を調整することとしたが、これに代えて、図６に示されるように、スキャナ４とは別の補正ミラー（補正スキャナ）２５ａ，２５ｂと、ＸＹ変位計測部１４により計測された変位量に基づいて補正ミラー２５ａ，２５ｂの走査位置を算出する補正ミラー制御部２６とを備えることとしてもよい。
【００３０】
この場合には、ＸＹ変位計測部１４には、図７に示されるように、試料の変位から補正ミラー２５ａ，２５ｂによる補正量を減算した差分値が検出されるので、これにスキャニング制御部９から入力されたガルバノミラー４ａ，４ｂの走査位置を加えて絶対値変換した後に、上記と同様のフィードバック制御を行うことにすればよい。
このようすることで、スキャナ４は、試料Ｓが静止しているか振動しているかに関わらず、同一の動作を行えばよいので、制御が複雑にならずに済むという利点がある。
この場合に、補正ミラー２５ａ，２５ｂの位置をＸＹ変位計測部１４に対して試料Ｓとは逆方向の位置に配置することで、ＸＹ変位計測部１４により試料Ｓの変位の絶対値を計測することとしてもよい。
【００３１】
また、補正ミラー２５ａ，２５ｂに代えて、図８に示されるように、対物レンズ５をＸＹ方向に駆動するＸＹステージ２７と、該ＸＹステージ２７の移動量を制御するＸＹステージ制御部２８とを設け、試料Ｓの変位方向と同一方向に対物レンズ５を駆動することにより、試料Ｓに対するレーザ光の走査位置を補正することにしてもよい。
これによっても、スキャナ４は、試料Ｓが静止しているか振動しているかに関わらず、同一の動作を行えばよいので、制御が複雑にならずに済むという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の一実施形態に係る生体観察装置を示す全体構成図である。
【図２】図１の生体観察装置において、試料が静止している場合のレーザ光の走査パターンの一例を示す図である。
【図３】図１の生体観察装置において、試料が変位している場合のレーザ光の走査位置の補正動作を説明する図である。
【図４】図１の生体観察装置のスキャニング制御部の制御動作を説明するブロック図である。
【図５】図１の生体観察装置のＺスキャナ制御部の制御動作を説明するブロック図である。
【図６】図１の生体観察装置の変形例を示す全体構成図である。
【図７】図６の生体観察装置の補正ミラー制御部の制御動作を説明するブロック図である。
【図８】図１の生体観察装置の他の変形例を示す全体構成図である。
【符号の説明】
【００３３】
Ｓ  試料
１  生体観察装置
３  レーザ光源
４  スキャナ
５  対物レンズ
７  光検出器
９  スキャニング制御部（走査位置補正部）
１４  ＸＹ変位計測部（変位計測部）
２５ａ，２５ｂ  補正ミラー（補正スキャナ）
２６  補正ミラー制御部（走査位置補正部）
２８  ＸＹステージ制御部（走査位置補正部）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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