(57)【要約】  配列番号１に示されるアミノ酸配列よりなる蛋白質、配列番号１に示されたアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列よりなる蛋白質であってヒトＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制活性を有する蛋白質、またはそれらのヒトＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制活性を有する部分断片蛋白質よりなる群から選ばれる一もしくはそれ以上の蛋白質からなる、ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制剤。  本発明のＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制剤は、ヒト癌細胞において癌遺伝子であるＫ−ｒａｓ遺伝子の転写発現を特異的に抑制することにより、癌細胞の増殖抑制、さらには癌細胞の正常細胞への復帰を誘導することができ、正常細胞に対し副作用の少ない抗癌剤となり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列よりなる蛋白質、配列番号１に示されたアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列よりなる蛋白質であってヒトＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制活性を有する蛋白質、またはそれらのヒトＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制活性を有する部分断片蛋白質よりなる群から選ばれる一もしくはそれ以上の蛋白質からなる、ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制剤。
【請求項２】
部分断片蛋白質が、分子量４５ｋｄのＮ末端断片である、請求項１に記載のヒトＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制剤。
【請求項３】
部分断片蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号１の１〜２２９番目のアミノ酸配列または１〜２２９番目のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列である、請求項２に記載のヒトＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制剤。
【請求項４】
配列番号２〜４に示された何れかのアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号２〜４に示された何れかのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加され、かつヒトＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制活性を有する蛋白質。
【請求項５】
請求項４に記載の蛋白質をコードする核酸。
【請求項６】
配列番号２〜４の何れかに示された塩基配列からなる核酸、または配列番号２〜４に示された何れかの塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつヒトＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制活性を有する蛋白質をコードする核酸。
【請求項７】
請求項１〜４に規定される蛋白質をコードする核酸、請求項５または６に記載の核酸のいずれかを含む、癌の遺伝子治療用組換えウイルスベクター。
【請求項８】
請求項５または６のいずれかに記載の核酸を含む組換えベクター。
【請求項９】
請求項１〜３の何れかに記載の記載のヒトＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制剤または請求項４に記載の蛋白質を癌細胞に投与することを特徴とする、癌の治療方法。
【請求項１０】
請求項７に記載の組換えウイルスベクターを患者の癌細胞に導入することを含む、癌の遺伝子治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトのガン遺伝子であるＫ−ｒａｓ遺伝子、特にＫ−ｒａｓ癌遺伝子の発現を特異的に抑制することのできるヒトＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制剤ならびにヒトＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制活性を有する蛋白質に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｒａｓは、発ガンウイルスにより誘導される悪性腫瘍の原因となる遺伝子として最初に同定されたガン遺伝子（非特許文献１、非特許文献２）であり、Ｒａｓ遺伝子群（Ｈ−Ｒａｓ 、Ｋ−Ｒａｓ 、Ｎ−Ｒａｓ 、Ｒ−Ｒａｓ ）を構成している。【０００３】
Ｒａｓ遺伝子は、分子量２１ｋＤａのＧＴＰ結合タンパク質をコードしており、いずれも成長因子の受容体を介してＧＤＰ結合型からＧＴＰ結合型へと活性化されることで、ＭＡＰキナーゼカスケードにシグナルを伝達して細胞の増殖や分化に関与している。【０００４】
Ｒａｓ遺伝子（蛋白質）はそのままでは発癌活性を持たないが、これらの遺伝子に変異が生じると発癌活性を獲得し、該変異を有する細胞が形質転換されることが知られている（非特許文献３）。これまでにも数多くのヒトの癌細胞においてＲａｓ遺伝子の突然変異が報告されている（非特許文献４）。【０００５】
Ｒａｓ遺伝子群を構成するＫ−Ｒａｓ遺伝子は、ヒト第１２染色体の短腕上に位置している。その活性化型変異体（Ｋ−ｒａｓ癌遺伝子）は、ヒトの癌において最も多く見いだされる癌遺伝子の一つであり、ヒト大腸癌の約５０％、肺癌の２５〜５０％、膵癌の７０〜９０％においてその存在が認められている（非特許文献５、非特許文献６）。これらの癌では、Ｋ−ｒａｓ癌遺伝子からの変異型Ｋ−Ｒａｓ蛋白質の持続的な発現、生成が、細胞の癌化ならびに癌細胞としての形質維持に必要不可欠であることが明らかとなっている。【０００６】
このため、生体内において、ｒａｓ遺伝子、例えばＫ−ｒａｓ遺伝子、特にＫ−ｒａｓ癌遺伝子の発現あるいはＫ−ｒａｓ癌遺伝子産物の機能を抑制することで、癌を抑制しようとする試みがなされている。【０００７】
例えば、ＲＡＳ遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたＲＡＳ遺伝子の阻害（特許文献１）や、ファルネシルアミン、ゲラニルゲラニルアミンまたはそれらの誘導体の有効量を用いた膵癌治療剤が知られている（特許文献２）。【０００８】
本発明は、Ｋ−ｒａｓ遺伝子、特にＫ−ｒａｓ癌遺伝子の発現を抑制することのできる蛋白質性の医薬を提供するものである。【０００９】
【特許文献１】ＷＯ９９／０２７３２公報
【特許文献２】特開平１０−２１８７６４号公報
【非特許文献１】Ｂａｒｂａｃｉｄ，Ｍ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｅｍ．５６，７７９−８２７（１９８７）
【非特許文献２】Ｌｏｗｙ，Ｄ．Ｒ．  ＆  Ｗｉｌｌｕｍｓｅｎ，Ｂ．Ｍ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｅｍ．６２，８５１−８９１（１９９３）
【非特許文献３】Ｓｔｏｒｅｒ  ＲＤ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４６：１４５８−１４６４，１９８６
【非特許文献４】Ｍｉｎａｍｏｔｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ２４：１−１２，２０００
【非特許文献５】Ｃｌａｒｋ，Ｇ．Ｊ．  ＆  Ｄｅｒ，Ｃ．Ｊ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍａｒｋｅｒｓ（ｅｄｓ  Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｃ．Ｔ．  ＆  Ｓｅｌｌ，Ｓ．）１７−５２（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９５）
【非特許文献６】Ｂｏｓ，Ｊ．Ｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９，４６８２−４６８９（１９８９）
【発明の開示】
【００１０】
本発明者らは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる、ホメオドメインを含むヒト精巣で発現が確認されている蛋白質（以下、ＥＳＸＲ１とする）の生理学的機能について研究を行った結果、意外にも、ＥＳＸＲ１ならびにそのＮ末端部分断断片（以下、ＥＳＸＲ１−ΔＣとする）が、インビボで癌細胞におけるＫ−ｒａｓ遺伝子の転写を特異的に抑制する活性を有していることを見いだし、以下の各発明を完成した。
【００１１】
１）配列番号１に示されるアミノ酸配列よりなる蛋白質、配列番号１に示されたアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列よりなる蛋白質であってヒトＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制活性を有する蛋白質、またはそれらのヒトＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制活性を有する部分断片蛋白質よりなる群から選ばれる一もしくはそれ以上の蛋白質からなる、ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制剤。
【００１２】
２）部分断片蛋白質が、分子量４５ｋｄのＮ末端断片である、１）に記載のヒトＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制剤。
【００１３】
３）部分断片蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号１の１〜２２９番目のアミノ酸配列または１〜２２９番目のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列である、２）に記載のヒトＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制剤。
【００１４】
４）配列番号２〜４に示された何れかのアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号２〜４に示された何れかのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加され、かつヒトＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制活性を有する蛋白質。
【００１５】
５）４）に記載の蛋白質をコードする核酸。
【００１６】
６）配列番号２〜４の何れかに示された塩基配列からなる核酸、または配列番号２〜４に示された何れかの塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつヒトＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制活性を有する蛋白質をコードする核酸。
【００１７】
７）１）〜４）に規定される蛋白質をコードする核酸、５）または６）に記載の核酸のいずれかを含む、癌の遺伝子治療用組換えウイルスベクター。
【００１８】
８）５）または６）のいずれかに記載の核酸を含む組換えベクター。
【００１９】
９）１）〜３）の何れかに記載の記載のヒトＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制剤または４）に記載の蛋白質を癌細胞に投与することを特徴とする、癌の治療方法。
【００２０】
１０）７）に記載の組換えウイルスベクターを患者の癌細胞に導入することを含む、癌の遺伝子治療方法。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、ＧＳＴ−ＥＳＸＲ１−ＨＤとＰ３コンセンサス領域を有するＤＮＡとの結合試験のアガロース電気泳動を表す。
【図２】図２は、Ｍｙｃ−ＥＳＸＲおよびＭｙｃ−ＥＳＸＲ１−ΔＣ１と任意のＰ３コンセンサス領域を有するＤＮＡとの結合試験のラシオオートグラフィーを表す。
【図３】図３は、任意のＰ３コンセンサス領域を有するレポータープラスミドに対するＥＳＸＲ１の発現抑制効果を示す。
【図４】図４は、ＤＯＸ処理したＵ２／ｔｅｔＥＳＸＲ１細胞での細胞内Ｋ−Ｒａｓ蛋白質の発現レベルを示す。
【図５】図５は、ＤＯＸ処理したＵ２−ＯＳ細胞での、細胞内Ｋ−Ｒａｓ蛋白質の発現レベルを示す。
【図６】図６は、Ｓ期及びＧ２／Ｍ期で停止したＵ２／ｔｅｔＥＳＸＲ１細胞内のＫ−Ｒａｓ蛋白質の発現を表す。
【図７】図７は、ＤＯＸ処理したＵ２／ｔｅｔＥＳＸＲ１細胞での細胞内Ｈ−ｒａｓ蛋白質の発現レベルを表す。
【図８】図８は、ＥＳＸＲ１発現による、細胞内Ｋ−ｒａｓ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルの低下を示す。
【図９】図９は、ＥＳＸＲ１による、Ｋ−ｒａｓ遺伝子中のＰ３コンセンサス領域を有するレポータープラスミドに対するＥＳＸＲ１の発現抑制効果を示す。
【図１０】図１０は、ＥＳＸＲ１を発現する大腸癌細胞の増殖能を示す。
【図１１】図１１は、ＥＳＸＲ１を発現する大腸癌細胞の細胞内Ｋ−Ｒａｓ蛋白質の発現レベルを示す。
【図１２】図１２は、ＥＳＸＲ１を発現する大腸癌細胞の増殖能を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明のヒトＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制剤は、配列番号１に示されるアミノ酸配列よりなる蛋白質（ＥＳＸＲ１）、配列番号１に示されたアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列よりなる蛋白質であってヒトＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制活性を有する蛋白質、またはそれらのヒトＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制活性を有する部分断片蛋白質よりなる群から選ばれる一もしくはそれ以上の蛋白質からなる。【００２３】
ＥＳＸＲ１は、全４０６個のアミノ酸残基からなる蛋白質であり、フォーンらによって、これをコードする遺伝子（ＥＳＸＲ１）が主にヒト精巣で発現していることが報告されている（Ｆｏｈｎ  Ｌ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｖｏｌ．７４，ｐｐ．１０５−１０８，２００１）。この論文は、核酸配列上の特徴としてホメオボックスドメインを持つことを開示しているが、蛋白質としてのＥＳＸＲ１の生理学的機能については、何らの知見も与えていない。【００２４】
また、本発明者らの研究により、ＥＳＸＲ１は、ヒト細胞内においてサイクリン分解を抑制する機能を有すること、また細胞内プロテアーゼによってプロセッシングを受け、約４５ｋｄのＮ末端側断片と約２０ｋｄのＣ末端側断片となること、さらにこのＣ末端側断片がサイクリン分解に関与すること、Ｎ末端側断片は核内に局在していることなどが報告されている（Ｏｚａｗａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、Ｖｏｌ．２３、６５９０−６６０２、２００４）。【００２５】
意外なことに、このＥＳＸＲ１のＮ末端側断片であるＥＳＸＲ１−ΔＣは、ヒト癌細胞におけるＫ−ｒａｓ癌遺伝子に対して、同遺伝子の第１イントロンに存在する核酸配列であるＴＡＡＴＧＴＴＡＴＴＡを認識して結合することにより、その発現を特異的に抑制し、癌細胞の増殖を阻害する活性を有していることが明らかとなった。【００２６】
従って、ＥＳＸＲ１−ΔＣあるいは細胞内プロセッシングによってこれを生じさせるＥＳＸＲ１を癌細胞に投与する、あるいは癌細胞内でこれらをコードする遺伝子を発現させることにより、癌細胞内で発現しているＫ−ｒａｓ遺伝子、特にＫ−ｒａｓ癌遺伝子の発現を特異的に抑制することが可能となる。この特異性は、癌細胞以外の正常細胞に対しては何らの負の作用を示さないことを意味し、従って、本発明のＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制剤は、癌細胞に対して選択性の高い良好な抗癌剤となり得る。【００２７】
なお、Ｋ−ｒａｓ遺伝子転写抑制活性を有する限り、配列番号１または２に示されたアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が置換、欠失、および／若しくは付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドあるいは蛋白質、若しくはそれらを含むＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制剤も、本発明の範囲内である。【００２８】
蛋白質においては、アミノ酸残基の電荷、大きさ、疎水性等の物理化学的性質について、保存性の高い変異が許容されることが、経験的に認められている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）等が挙げられる。また、上述の意味の保存性を超えた場合でも、なおその蛋白質の本質的な機能、本発明においてはＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制活性を失わない変異、も当業者において経験されるところである。さらに、異なる生物種間に保存される同種の蛋白質が、幾つかのアミノ酸が集中あるいは分散して欠失あるいは挿入されていても、なお本質的な機能を保持している例も多く認められている。【００２９】
従って、配列番号１または２に示されたアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が置換、欠失、および／若しくは付加したアミノ酸配列からなる蛋白質であっても、Ｋ−ｒａｓ遺伝子転写抑制活性を有する蛋白質であれば、これらは本発明のＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制剤として範囲内にあると言うことができる。【００３０】
このようなアミノ酸の改変は、遺伝子多形等の様に自然界において認められ得る他、当業者に公知の方法、例えばＮＴＧなどの変異誘発剤を用いた突然変異誘発法や種々の組換遺伝子手法を用いた部位特異的変異法を利用して、人為的に行うことができる。【００３１】
アミノ酸の変異部位および個数は、Ｋ−ｒａｓ遺伝子転写抑制活性を有する蛋白質を提供する限り、特に制限はないが、変異個数は通常数十アミノ酸以内、好ましくは１０アミノ酸以内である。アミノ酸配列の同一性の程度で改変の許容範囲を表せば、本発明の蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号１または２に示されたアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有していればよい。【００３２】
本発明の核酸は、配列番号２〜４に示される何れかのアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子、典型的には配列番号２〜４に示される何れかの塩基配列からなる核酸である。かかる核酸は、配列番号２〜４に開示された塩基配列を基に、一般的なハイブリダイゼーション等の遺伝子工学的手法を用いたクローニングや、ホスホアミダイト法などの化学合成的手法を利用して、当業者により容易に調製される。その形態としてはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡの他、化学合成ＤＮＡなどが含まれるが、特に制限はない。【００３３】
また、配列番号２〜４に示される塩基配列から導かれるＲＮＡの配列や、これに相補的なＤＮＡおよびＲＮＡの配列などは一義的に決定されるので、本発明は、かかるＲＮＡ、相補鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡもまた提供する。【００３４】
また、本発明の核酸は、配列番号２〜４に示された何れかの塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつヒトＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制活性を有する蛋白質をコードする核酸をも含むものである。【００３５】
配列番号２〜４に記載の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸においては、その核酸にコードされる蛋白質がＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制活性を有する範囲内において、その塩基配列を変化させることができる。【００３６】
例えば、同一アミノ酸残基をコードする複数のコドン（縮重コドン）や、種々の人為的処理例えば部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断による核酸断片の変異・欠失・連結等により、部分的に塩基配列が変化したものであっても、これらが配列番号２〜４に記載の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制活性について配列番号２〜４に示された塩基配列からなる核酸にコードされる蛋白質と機能的に同等な蛋白質を提供する核酸であれば、配列番号２〜４に示した塩基配列との相違に関わらず、本発明の範囲内のものである。【００３７】
上記の変異の程度は、配列番号２〜４に記載の塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を有するものであれば許容範囲内である。また、ハイブリダイズする程度としては、通常の条件下、例えばDIG DNA Labeling kit（ベーリンガー・マンハイム社製）でプローブをラベルした場合に、３２℃のDIG Easy Hyb溶液（ベーリンガー・マンハイム社製）中でハイブリダイズさせ、５０℃の０．５×ＳＳＣ溶液（０．１％［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウムである）でのサザンハイブリダイゼーションで、配列表で特定した核酸にハイブリダイズする程度であればよい。【００３８】
本発明の核酸は、ＥＳＸＲ１−ΔＣの組換え的生産、あるいは遺伝子治療用ベクターの生産に使用することができる。すなわち、本発明の核酸は、形質転換細胞の調製、さらには該形質転換細胞を用いたＥＳＸＲ１−ΔＣの生産方法、さらにはＥＳＸＲ１−ΔＣを用いた癌の遺伝子治療に有用である。同様に、ＥＳＸＲ１−ΔＣを生体内で提供し得るＥＳＸＲ１をコードする核酸を含むベクター、特に遺伝子治療用ウイルスベクターは、癌の遺伝子治療に利用することができ、従って、かかるベクターも本発明を構成する。【００３９】
本発明のＥＳＸＲ１−ΔＣあるいはＥＳＸＲ１をコードする遺伝子を有する形質転換細胞は、当業者に公知の技術を適用して調製することが可能であり、例えば、市販されあるいは当業者が一般に入手容易な様々なベクターを利用して、適当な宿主細胞へ本発明の核酸を組み入れることが可能である。その際、プロモーターやエンハンサーに代表される発現制御遺伝子の影響下におくことで、宿主細胞内での発現を任意にコントロールすることが可能である。【００４０】
（核酸）
本発明の核酸は１本鎖であっても、それに相補的な配列を有する核酸やＲＮＡと結合して２重鎖、３重鎖を形成していても良い。また、当該核酸は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）等の酵素や放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質等で標識されていてもよい。【００４１】
本発明の核酸をＤＮＡライブラリーから得る例としては、ヒト精巣のゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを、ハイブリダイゼーションによるスクリーニング法や、抗体を用いたイムノスクリーニング法等でスクリーニングし、目的の核酸を有するクローンを増幅させ、そこから制限酵素等を用いて切り出す方法がある。【００４２】
ハイブリダイゼーション法によるスクリーニングは、配列番号２に記載の塩基配列もしくはその一部を有する核酸を３２Ｐ等でラベルしてプローブとし、任意のｃＤＮＡライブラリーに対して、公知の方法で（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．等，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８２年）行うことができる。【００４３】
イムノスクリーニング法で用いる抗体は、後述する本発明の抗体を使用することができる。本発明の核酸はまた、ゲノムＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーを鋳型とするＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）によっても得る事ができる。例えば、配列番号１または２に記載の塩基配列をもとに、センスプライマー、アンチセンスプライマーを作成し、任意のＤＮＡライブラリーに対し、公知の方法（例えばＭｉｃｈａｅｌ  Ａ．Ｉ．等，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９０年参照）等を行うことで、本発明の核酸を得る事もできる。【００４４】
上記各種方法で使用するＤＮＡライブラリーとしては、本発明の核酸を有するＤＮＡライブラリーを挙げることができ、好適にはヒト精巣由来のライブラリーであれば、いかなるものも使用可能である。また、本発明の核酸を有する細胞からｃＤＮＡライブラリーを作成するのに適した細胞を選び、公知の方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９年参照）に従って、ｃＤＮＡライブラリーを作製し、利用することができる。【００４５】
また本発明の核酸は、本明細書に開示された配列を基にホスホアミダイト法などの化学合成的手法により調製することも可能である。【００４６】
本発明の核酸を有する組換えベクターは、環状、直鎖状等いかなる形態のものであってもよい。かかる組換えベクターは、本発明の核酸に加え、必要ならば他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基配列とは、エンハンサー配列、プロモーター配列、リボゾーム結合配列、コピー数の増幅を目的として使用される塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、他のポリペプチドをコードする塩基配列、ポリＡ付加配列、スプライシング配列、複製開始点、選択マーカーとなる遺伝子の塩基配列等のことである。【００４７】
遺伝子組み換えに際しては、適当な合成DNAアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンを本発明の核酸に付加したり、あるいは塩基配列内に適当な制限酵素切断配列を新たに発生させたりあるいは消失させたりすることも可能である。これらは当業者が通常行う作業の範囲内であり、当業者は本発明の核酸を基に任意かつ容易に加工することができる。【００４８】
また本発明の核酸を保持するベクターは、使用する宿主に応じた適当なベクターを選択して使用すればよく、プラスミドの他にバクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス等の種々のウイルスを用いることも可能であるが、遺伝子治療用に開発されたウイルスベクターの利用が特に好ましい。【００４９】
本発明の遺伝子の発現は、該遺伝子固有のプロモーター配列の制御下に発現させることができる。あるいは、本発明の遺伝子の上流に別の適当な発現プロモーターを該遺伝子固有のプロモーター配列に接続あるいは置き換えて使用することもできる。この場合に使用するプロモーターは、宿主及び発現の目的に応じて適宜選択すればよく、例えば宿主が大腸菌である場合にはＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λＰＬプロモーターなどが、宿主が酵母である場合にはＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合にはＳＶ４０由来プロモーター、レトロウィルスプロモーター等を例示できるが、当然ながらこれらには限定されない。【００５０】
核酸をベクターに導入する方法は公知である（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），１９８９年、参照）。すなわち、核酸とベクターをそれぞれ適当な制限酵素で消化し、得られたそれぞれの断片をＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションさせればよい。【００５１】
（蛋白質）
本発明の蛋白質は、ヒト精巣から調製することもできるが、ペプチド合成機（例えば、ペプチドシンセサイザー４３０Ａ型、パーキンエルマージャパン（株）製）を使用した化学合成法、あるいは原核生物もしくは真核生物から選択される適当な宿主細胞を用いた組換え方法によって調製することが、生成物の純度ならびに回収量の面からも好ましい。【００５２】
前項の組換えベクターを用いて形質転換させる宿主細胞には特に制限はなく、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓあるいはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに代表される遺伝子工学手法において利用可能な下等細胞、昆虫細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、Ｈｅｌａ細胞に代表される動物細胞など多くの細胞が、本発明に対しても利用可能である。【００５３】
組換えベクターを宿主細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈澱法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、ウイルス粒子を用いる方法等があるが、いずれの方法も利用することができる。【００５４】
当該蛋白質を遺伝子工学的に生産するには、上述の形質転換体を培養して培養混合物を回収し、当該蛋白質を精製する。形質転換体の培養は、一般的な方法で行うことができる。【００５５】
培養混合物から本発明の蛋白質を精製する方法としては、蛋白質の精製に通常使用されている方法の中から適切な方法を適宜選択して行うことができる。すなわち、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィー等の各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー等、通常使用され得る方法の中から適切な方法を適宜選択し、必要によりHPLCシステム等を使用して適当な順序で精製を行えば良い。【００５６】
また、本発明の蛋白質を他の蛋白質やタグ（例、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡ、ヒキサヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグその他）との融合蛋白質として発現させることも可能である。発現させた融合型は、適当なプロテアーゼ（例、トロンビンその他）を用いて切り出すことが可能であり、ときとして蛋白質の調製をより有利に行うことが可能となる。本発明の蛋白質の精製は当業者に一般的な手法を適宜組み合わせて行えばよく、特に融合蛋白質の形態で発現させたときは、その形態に特徴的な精製法を採用することが好ましい。【００５７】
また、組換えＤＮＡ分子を利用して無細胞系の合成方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ｅｔ  ａｌ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．（１９８９年））で得る方法も、遺伝子工学的に生産する方法の１つである。【００５８】
この様に本発明の蛋白質は、それ単独の形態でも別種の蛋白質との融合蛋白質の形態でも調製することができるが、これらのみに制限されるものではなく、本願発明の蛋白質を更に種々の形態へと変換させることも可能である。例えば、蛋白質に対する種々の化学修飾、ポリエチレングリコール等の高分子との結合、不溶性担体への結合、リポソームへの封入など、当業者に知られている多種の手法による加工が考えられる。【００５９】
本発明のＫ−ｒａｓ転写抑制剤は、患者あるいは患者の癌組織に直接、単独であるいは適当な賦形剤及び／又は添加剤とともに投与することができる。例えば、適当なリポソームに本発明の転写抑制剤を封入し、これを癌組織に直接デリバリーすることができる。【００６０】
以下、本発明を、非限定的な実施例を示してさらに詳述する。以下の実施例において、特に断らない限り、制限酵素処理その他の市販されている酵素またはキットの利用は、すべてそれらについて推奨された反応条件下で行った。
【実施例１】
【００６１】
１）Ｍｙｃ−タグ付加ＥＳＸＲ１ならびにＥＳＸＲ１−ΔＣ発現ベクターの作製
Ｍｙｃ−エピトープならびにＥＳＸＲ１のＮ末端の１番目〜１１番目のアミノ酸残基をコードする下記配列のオリゴヌクレオチド１、ならびにＥＳＸＲ１のＣ末端の２３２番目〜２４１番目のアミノ酸残基をコードする核酸に相補する下記の配列からなるオリゴヌクレオチド２をそれぞれ合成した。【００６２】
オリゴヌクレオチド１:5'-CGGGATCCGCCGCCATGGAGCAAAAGCTCATTTCTGAAGAGGACTTGAACGAG
TCTCTTCGCGGGTACACCCACAGTGAT-3'
オリゴヌクレオチド２:5’-TAGTTGTGGCACCAGATGAACACACAAAGC-3’
オザワら（Ｏｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、Ｖｏｌ．２３、６５９０−６６０２、２００４）の方法に従ってクローニングされたＥＳＸＲ１遺伝子を鋳型にして、下記の条件で、Ｔａｋａｒａ  ＥｘＴａｑキット（Ｔａｋａｒａ社）を用いてＰＣＲ（全５０μｌ）を行い、Ｍｙｃ−タグがＮ末端に付加されたＥＳＸＲ１をコードするＤＮＡフラグメントを調製した。【００６３】
水                            ３８μｌ
オリゴヌクレオチド１          １μｌ（１０μＭ）
オリゴヌクレオチド２          １μｌ（１０μＭ）
ｄＮＴＰミックス              ４μｌ（２．５ｍＭ）
１０ｘＰＣＲ緩衝液            ５μｌ
Ｅｘ  Ｔａｑ                  ０．２５μｌ
鋳型ＤＮＡ                    １μｌ（１μｇ／μｌ）
反応サイクル：９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を３０回
上記のＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡフラグメントと哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３(Invitrogen社)とを制限酵素ＢａｍＨＩ(New England BioLabs （ＮＥＢ）社)とＸｂａＩ（ＮＥＢ社）で消化し、１５０９base pair（ｂｐ）の消化フラグメントと開環ｐｃＤＮＡ３とをＤＮＡリガーゼ（Takara社）を用いて連結させ、大腸菌ＤＨ５α株を宿主としてｐｃＤＮＡ３／Ｍｙｃ−ＥＳＸＲ１を作製した。また、前記増幅ＤＮＡフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩ（ＮＥＢ社）で消化して得られる７３１ｂｐの消化フラグメントと、同制限酵素で消化した開環ｐｃＤＮＡ３とをＤＮＡリガーゼ（Takara社）を用いて連結させて、大腸菌ＤＨ５α株を宿主としてｐｃＤＮＡ３／Ｍｙｃ−ＥＳＸＲ１−ΔＣを作製した。【００６４】
２）細胞株Ｕ２／ｔｅｔＥＳＸＲ１、Ｕ２／ｔｅｔΔＣの作製
制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ社）で消化し、DNA Blunting Kit（Takara社）を用い平滑末端化して得られる開環された発現ベクターｐＯＰＴＥＴ−ＢＳＤ（畠山ら、Anal. Biochem., 261, 211-218, 1998; Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 95, 8574-8579, 1998）と、１）で調整した２種類のベクターをそれぞれ、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ社）とＸｂａＩ（ＮＥＢ社）で消化して回収されるＭｙｃ−ＥＳＸＲ１（配列番号３）または制限酵素ＫｐｎＩ（ＮＥＢ社）とＸｂａＩ（ＮＥＢ社）で消化し回収されるＭｙｃ−ＥＳＸＲ１−ΔＣ（配列番号４）をコードする各消化断片をDNA Blunting Kit（Takara社）を用い平滑末端化後、ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、大腸菌ＤＨ５α株を宿主としてｐＯＰＴＥＴ−ＢＳＤ／Ｍｙｃ−ＥＳＸＲ１ならびにｐＯＰＴＥＴ−ＢＳＤ／Ｍｙｃ−ＥＳＸＲ１−ΔＣを作製した。【００６５】
Ｕ２−ＯＳヒト骨肉腫細胞由来のＴｅｔ−ｏｎ細胞（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）にリン酸カルシウム法（Ｈｉｎｄｓ，Ｐ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ、７０、９９３−１００６、１９９２）を用いてこれらのプラスミドベクターを遺伝子導入した後、１０μｇ／ｍｌのブラストサイジンを含むＤＭＥＭ培地を用いて形質転換細胞を選択し、Ｍｙｃ−ＥＳＸＲ１あるいはＭｙｃ−ＥＳＸＲ１−ΔＣをテトラサイクリン依存的に誘導発現する細胞株として、Ｕ２／ｔｅｔＥＳＸＲ１あるいはＵ２／ｔｅｔΔＣを樹立した。【００６６】
３）ＥＳＸＲ１の認識配列の確認
Ｍ１３ベクター由来のフォワードプライマー配列（Ｍ１３−２０）、制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列、ｐａｉｒｅｄ−ｌｉｋｅ  ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎが認識するＰ３コンセンサス配列、制限酵素ＸｂａＩ認識配列ならびにＭ１３由来リバースプライマー配列（Ｍ１３ｒｅｖｅｒｓｅ）を、５’末端から３’末端に向けた順序で連結した下記に示される５９ｍｅｒのオリゴヌクレオチド３を合成し、さらにこれを  ＥｘＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社）を用いて２本鎖ＤＮＡ化した。【００６７】
オリゴヌクレオチド３：5’-GTAAAACGACGGCCAGT-GGATCC-TAATNNNATTA-TCTAGA-CATGGTCAT
AGCTGTTTCC-3’
グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白質を調製するためのベクターｐＧＥＸ  ４Ｔ−２（Ａｍｅｒｓｈａｍｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）の所定の位置に、ＥＳＸＲ１の１３９番目〜１９８番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる合成ＤＮＡを挿入後、推奨条件下でＧＳＴ−ＥＳＸＲ１ホメオドメイン融合蛋白（ＧＳＴ−ＥＳＸＲ１ＨＤ）を誘導後、精製した。得られたＧＳＴ−ＥＳＸＲ１ＨＤの０．４μｇと前述の２本鎖化したＤＮＡの５μｇを、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１０μｇ／μｌロイペプチン、１０μｇ／μｌアプロチニンならびに１０μｇ／μｌトリプシンインヒビターを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）と、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及び０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ、ＳＩＧＭＡ社）とを含む緩衝液中でグルタチオンセファロース４Ｂビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）の存在下に混合して蛋白−ＤＮＡ複合体を形成させた後、ビーズをｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１％ＢＳＡ及び０．１％ＮＰ−４０を含む緩衝液を用いて洗浄した。【００６８】
次に、ビーズを下記の溶液４９.５μｌに浮遊し、１００℃で５分間処理した。ビーズを取り除いた溶液にExTaq ０．５μｌを加え、以下のＰＣＲを行なった。【００６９】
水                                  ２９．５μｌ
オリゴヌクレオチド４：5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’      ５μｌ(10pmol)
オリゴヌクレオチド５：5’-GGAAACAGCTATGACCATG-3’    ５μｌ(10pmol)
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ                    ５μｌ
１０ＸＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ          ５μｌ
反応サイクル：９４℃で１分インキュベート後、９４℃で３０秒、７０℃で３０秒ならびに７２℃で６０秒を、１０−２０回
上記のＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ（いずれもＮＥＢ社）で消化し、１７ｂｐの消化フラグメントを単離した後、再び上記と同様の条件でＧＳＴ−ＥＳＸＲ１ＨＤ融合蛋白と混合して蛋白−ＤＮＡ複合体を形成させ、グルタチオンセファロース４Ｂビーズにて回収した。この操作を合計８サイクル行った後、ＰＣＲにて増幅されたＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にクローニングし、ＤＮＡ塩基配列を決定した（図１）。その結果、ＥＳＸＲ１ホメオドメインは、ＴＡＡＴＮＮＮＡＴＴＡ（Ｎは任意のヌクレオチド）からなるＰ３コンセンサス領域に特異的に結合することが明らかとなった。【００７０】
４）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｓｈｉｆｔ  ａｓｓａｙ
３）の結果に基づき、下記の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドならびにこれに相補的なオリゴヌクレオチド６をそれぞれ合成し、２本鎖プローブとした。【００７１】
【化１】
2006046331.tif 000002
【００７２】
プローブは［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（３，０００μＣｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）とＫｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社）を用いて放射能標識した。１．５×１０６個のＣＯＳ−７細胞に、１）で調整したｐｃＤＮＡ３／Ｍｙｃ−ＥＳＸＲ１ならびにｐｃＤＮＡ３／Ｍｙｃ−ＥＳＸＲ１−ΔＣそれぞれ２０μｇをリン酸カルシウム法を用いてトランスフェクションした。ＤＭＥＭ培地で４０時間培養後に形質転換細胞を回収し、細胞抽出液１０μｇに８μｌの結合バッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、６０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＮＰ−４０、１０％グリセロール）、１μｇのポリ（ｄＩ−ｄｃ）、１０μｇのＢＳＡおよび０．０２ｐｍｏｌの前記放射性標識２本鎖プローブを加え、全量２０μｌの反応液とし、氷上にてＤＮＡ結合反応を行った。反応後のＤＮＡ−蛋白複合体を０．５×トリス硼酸−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液を泳動バッファーとして、４％ポリアクリルアミドゲルを用いて２００Ｖで電気泳動し、泳動後のゲルをオートラジオグラフィーによって解析した（図２）。【００７３】
５）ルシフェラーゼアッセイ
ルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＬ３−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のクローニング部位に、４）で得た２本鎖プローブを挿入した組み換えレポータープラスミドを調製した。このレポータープラスミド２μｇとｐｃＤＮＡ３／Ｍｙｃ−ＥＳＸＲ１  ２０μｇをリン酸カルシウム法を用いてＵ２−ＯＳ骨肉腫細胞に導入した。ＤＭＥＭ培地で１２時間培養後細胞を回収し、細胞抽出液中のルシフェラーゼ活性を推奨方法により測定した。その結果、Ｍｙｃ−ＥＳＸＲ１が発現している細胞中では、４）で得た塩基配列特異的にルシフェラーゼの発現が抑制されることがわかった（図３）。【００７４】
６）ＥＳＸＲ１の発現により転写が抑制される遺伝子の確認
ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した３．０×１０６個のＵ２ｔｅｔＥＳＸＲ１細胞に、２μｇ／ｍｌの濃度でＤＯＸを添加してＭｙｃ−ＥＳＸＲ１の発現を誘導し、１２時間後に細胞を回収した。コントロールとしてＤＯＸ未処理細胞を用いた。【００７５】
Ｔｒｉｚｏｌ試薬（ＧＩＢＣＯ社）を用いて細胞から全ＲＮＡを抽出し、ホルムアルデヒド変性ゲルにてＲＮＡの精度を確認した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社によって推奨されているプロトコールに従い、全ＲＮＡ５μｇをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて逆転写し、ｃＤＮＡ化した。ｃＤＮＡ作成の際のプライマーとして下記の配列からなるＡｍｅｒｓｈａｍ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社のオリゴヌクレオチド７を用いた。【００７６】
5’-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG-(T)24-3’
上記ｃＤＮＡを２本鎖化し、Ｐｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  Ｇｅｌ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）によって精製した。インビトロ転写反応は、Ｅｎｚｏ  ＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  ＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｅｎｚｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用い、１μｇのｃＤＮＡを用いて行った。得られたｃＲＮＡはＲＮｅａｓｙ  ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製後、１００ｍＭ  ＫＯＡｃならびに３０ｍＭ  ＭｇＯＡｃを含む４０ｍＭトリス酢酸緩衝液ｐＨ８．１中で熱を加えて断片化した。【００７７】
断片化されたｃＲＮＡ１０μｇを、１００ｍＭ ＭＥＳ、１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むハイブリダイゼーション緩衝液中でハイブリダイゼーション（４５℃、１６時間）に用いた。洗浄ならびに染色は、EukGE-WS2v4プロトコールのもとＦｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用いて行った。チップデータのスキャンニングには、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用いた。また、チップ分析には、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒ１．１（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用いた。【００７８】
上記のＤＮＡチップ解析データをもとに、ＥＳＸＲ１の発現により転写が抑制され、かつゲノムシーケンス上にＴＡＡＴＮＮＮＡＴＴＡ（Ｎは任意の塩基）配列が存在する既知遺伝子を選択した。その結果、第一イントロン塩基配列内にＴＡＡＴＧＴＴＡＴＴＡというＰ３コンセンサス配列を有するＫ−ｒａｓ遺伝子が、ＥＳＸＲ１による転写抑制の標的候補遺伝子として同定された。【００７９】
７）ＥＳＸＲ１によるＫ−Ｒａｓ発現抑制
５．０×１０５個のＵ２／ｔｅｔＥＳＸＲ１細胞を、ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した後、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）を２μｇ／ｍｌ培地となるように添加して、ＥＳＸＲ１の発現を誘導した。【００８０】
ＤＯＸ添加添加１２時間後に細胞を回収し、Ｅ１Ａバッファーを用いて細胞を溶解後、蛋白濃度を測定した。蛋白１５０μｇを用いて１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、ゲル上で分離された蛋白をポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に転写し、Ｋ−Ｒａｓ蛋白質を認識するモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。ＤＯＸ非添加細胞をコントロール細胞とし、内部コントロールには抗アクチン抗体を用いた。【００８１】
蛋白は、ＥＣＬ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を用いて検出し、蛋白質のバンドは、ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｓｅｒ（ＬＡＳ−１０００、富士フィルム社製）を用いて定量化した。【００８２】
その結果、ＥＳＸＲ１誘導発現にともないＵ２／ｔｅｔＥＳＸＲ１細胞内のＫ−Ｒａｓ蛋白レベルの有意な減少が観察された（図４）。【００８３】
一方、Ｋ−Ｒａｓ発現に及ぼすＤＯＸの影響を検討するため、親株であるＵ２−ＯＳ細胞を用いてＫ−Ｒａｓ蛋白の発現を比較したところ、ＤＯＸによるＫ−Ｒａｓ蛋白の変化は認められなかった（図５）。さらに、Ｕ２／ｔｅｔＥＳＸＲ１細胞において、ＤＯＸ誘導後１２時間では細胞周期に影響は及ぼさない（図４）が、ＥＳＸＲ１はＭ期細胞周期停止を誘導することが知られているため、５ｍＭのヒドロキシウレア、５０μＭのノコダゾール処理により、Ｓ期あるいはＧ２／Ｍ期にＵ２／ｔｅｔＥＳＸＲ１細胞を停止させた状態でのＫ−Ｒａｓ発現を比較したが、細胞周期依存的なＫ−Ｒａｓ蛋白の発現の変化は認められなかった（図６）。そこで、ＥＳＸＲ１によるＫ−Ｒａｓ蛋白の発現低下がＫ−Ｒａｓに特異的なものか否かを検討するため、同じＲａｓファミリー分子であるＨ−Ｒａｓの発現を検討したが、ＥＳＸＲ１発現はＨ−Ｒａｓ蛋白レベルに全く影響を与えなかった（図７）。【００８４】
以上より、ＥＳＸＲ１は、細胞内でＫ−Ｒａｓ発現を特異的に抑制していることが確認された。【００８５】
８）リアルタイムＰＣＲによるＫ−ｒａｓ  ｍＲＮＡ発現解析
３．０×１０６個のＵ２／ｔｅｔＥＳＸＲ１細胞あるいはＵ２／ｔｅｔΔＣ細胞からＴｒｉｚｏｌ（ＧＩＢＣＯ社）を用いて全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡ１０μｇからＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によりｃＤＮＡを合成し、以下の条件下に、ＳＹＢＲｇｒｅｅｎＰＣＲキット（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）ならびにＡＢＩＰＲＩＳＭ７７００シーケンスデテクター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いたリアルタイムＰＣＲを行った。【００８６】
ＰＣＲ反応では、まず以下の反応液(全量１３．６μｌ)を調製した。【００８７】
オリゴヌクレオチド８：5’-CCAGGTGCGGGAGAGAG-3’
オリゴヌクレオチド９：5’-CCCTCATTGCACTGTACTCC-3’
全ＲＮＡ溶液(１ｍｇ／ｍｌ)                          １０μｌ
オリゴ（ｄＴ）１２−１８溶液(５００μg/ｍｌ)            １μｌ
ＤＥＰＣ処理ｍｉｌｌｉ−Ｑ水                        ２．６μｌ
上記反応液を７０℃で１０分間加温後、氷上で１分放置し、その後下記の組成よりなるプレミックスから６．４μｌを取り、反応液に加えた。【００８８】
５ｘＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｕｆｆｅｒ（２５０ｍＭトリス塩酸ｐＨ８．３、３７５ｍＭ  ＫＣＬ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）          ４μｌ
２５ｍＭｄＮＴＰミックス                        １μｌ
０．１Ｍ  ＤＴＴ                                ２μｌ
次に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素１μｌ（２００ユニット）を加えよく混合後、４２℃で５０分、７０℃で１５分それぞれ放置後、ＲＮａｓｅＨを１μｌ（２ユニット）を加え、３７℃で２０分反応させて鋳型ＲＮＡを分解し、一本鎖ｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡを用い、下記の混合液（全量２５μｌ）を調製した。【００８９】
１ｓａｍｐｌｅ
ＳＹＢＲｇｒｅｅｎＰＣＲキット（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）    １２．５μｌ
Forward primer８(10pmol/μｌ)：5’-CCAGGTGCGGGAGAGAG-3’    １μｌ
Reverse primer９(10pmol/μｌ)：5’-CCCTCATTGCACTGTACTCC-3’  １μｌ
ｃＤＮＡ                                                  １μｌ
ＭＱ                                                      ９．５μｌ
反応液２０μｌを用い、ＡＢＩＰＲＩＳＭ７７００シーケンスデテクター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）にてリアルタイムＰＣＲを行った。反応は、５０℃で２分、９５℃で１０分それぞれ放置後、９５℃で１５秒、６０℃で１分を４０回繰り返した。その結果、Ｕ２／ｔｅｔＥＳＸＲ１あるいはＵ２／ｔｅｔΔＣ細胞において、ＥＳＸＲ１あるいはＥＳＸＲ１−ΔＣの誘導によりＫ−ｒａｓのｍＲＮＡ発現が低下することが確認された（図８）。得られた結果をさらに検証するため、ｐＧＬ３プロモーターベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のＳＶ４０プロモーターの上流に、Ｋ−ｒａｓ遺伝子第一イントロン内に存在する５’−ＴＡＡＴＧＴＴＡＴＴＡ−３’を含む下記の配列からなるオリゴヌクレオチド１０を挿入したレポーターベクターを作製し、ルシフェラーゼアッセイを行った。【００９０】
【化２】
2006046331.tif 000003
【００９１】
このレポーターアッセイにおいても、ＥＳＸＲ１依存的なルシフェラーゼの転写抑制が認められた（図９）。さらに、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｓｈｉｆｔ  ａｓｓａｙの結果から、ＥＳＸＲ１は、上記のコンセンサス配列部分と結合する一方、同配列を【００９２】
【化３】
2006046331.tif 000004
【００９３】
に改変したオリゴヌクレオチド１１とは結合しないことが確認された。【００９４】
９）癌細胞の増殖抑制能の確認
活性型Ｋ−ｒａｓ遺伝子変異を有するヒト大腸癌細胞ＳＷ４８０（４．０×１０６個）に、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて１９μｇのｐｃＤＮＡ３／Ｍｙｃ−ＥＳＸＲ１−ΔＣ及び１μｇのｐＢａｂｅ−ｐｕｒｏ  ｖｅｃｔｏｒを導入した。【００９５】
ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で２４時間後、細胞を１０分の１に希釈して培養を続け、その２４時間後より、１．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを加えてさらに３週間培養し、薬剤耐性細胞を選択した。コントロールとして、１９μｇのｐｃＤＮＡ３と１μｇのpBabe-puroを用いて同様に形質転換したＳＷ４８０細胞を用いた。ＥＳＸＲ１−ΔＣ発現細胞では、非発現細胞に比較して薬剤耐性コロニーの著しい減少を認めた（図１０）。さらに、大腸癌細胞ＳＷ４８０にリン酸カルシウム法を用いてｐｃＤＮＡ３／Ｍｙｃ−ＥＳＸＲ１−ΔＣ及びpBabe-puroを導入し、ピューロマイシンにて選択することによりＥＳＸＲ１−ΔＣを構成的に発現するトランスフェクタント細胞を得た。ＥＳＸＲ１−ΔＣ発現細胞群は、ＥＳＸＲ１−ΔＣ非発現細胞群に比較して、Ｋ−Ｒａｓ発現の有意な低下ならびに細胞増殖能の低下を認めた（図１１、図１２）。【００９６】
以上の結果から、ＥＳＸＲ１−ΔＣはＫ−ｒａｓ遺伝子発現を抑制しＫ−Ｒａｓ発現レベルを低下させることにより、変異型Ｋ−ｒａｓにより癌形質が維持されている癌細胞の増殖を抑制することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明のＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制剤は、ヒト癌細胞において癌遺伝子であるＫ−ｒａｓ遺伝子の転写発現を特異的に抑制することにより、癌細胞の増殖抑制、さらには癌細胞の正常細胞への復帰を誘導することができる。また、本発明のＫ−ｒａｓ遺伝子転写抑制剤によって正常Ｋ−ｒａｓ遺伝子の発現も抑制されるが、その機能は他のＲａｓファミリー遺伝子の発現により補填されるので、正常細胞における増殖あるいは分化には、本発明の抑制剤は影響を与えず、従って、正常細胞に対し副作用の少ない抗癌剤となり得る。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１】
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【図２】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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