(57)【要約】測定精度及び信頼性に優れ、特別の設備、装置を必要とせず、操作が簡単であり、しかも生体試料に簡単に適用可能なアロマターゼ活性の測定方法を提供する。  ２α−ブロムアンドロステンジオン等の基質からアロマターゼにより生成するエストラジオール誘導体に対してペンタハロゲン化ベンジル化合物又はペンタハロゲン化ベンゾイル化合物をアルカリ条件下で反応させた後、１−低級アルキル−２−ハロゲン化ピリジンを反応させ、得られた反応混合物に含まれるエストラジオール若しくはエストラジオール誘導体のペンタハロゲン化ベンジル又はペンタハロゲン化ベンゾイル及び１−低級アルキル−２−ピリジニウム誘導体をＬＣ−ＭＳで測定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アロマターゼ活性の測定方法であって、下記（Ａ）工程、（Ｂ）工程、（Ｃ）工程及び（Ｄ）工程を含む測定方法。
（Ａ）工程：基質であるアンドロステンジオン若しくはその誘導体に対し、アロマターゼを作用させて、エストラジオール若しくはその誘導体を生成させる工程。
（Ｂ）工程：アルカリ条件下、前記（Ａ）工程で生成した前記エストラジオール若しくはその誘導体を、下記一般式（１）で示されるペンタハロゲン化ベンジル化合物又は一般式（２）で示されるペンタハロゲン化ベンゾイル化合物と反応させる工程。
【化５】
2006051986.tif 000012
前記一般式（１）及び（２）において、Ｘ１は、ハロゲン原子を表し、Ｌ及びＬ’は、それぞれ脱離基を表す。
（Ｃ）工程：前記（Ｂ）工程で生成したペンタハロゲン化ベンジル化合物又はペンタハロゲン化ベンゾイル化合物による誘導体を、１−低級アルキル−２−ハロゲン化ピリジンと反応させる工程。
（Ｄ）工程：前記（Ｃ）工程において生成した１−低級アルキル−２−ピリジニウム誘導体を測定し、この測定値からアロマターゼ活性を求める工程。
【請求項２】
前記一般式（１）及び（２）で示される化合物において、Ｌ又はＬ’が、ハロゲン原子を表す、請求の範囲１記載の測定方法。
【請求項３】
前記（Ｄ）工程において、前記１−低級アルキル−２−ピリジニウム誘導体の測定が、ＬＣ−ＭＳによる測定である請求の範囲１記載の測定方法。
【請求項４】
前記ＬＣ−ＭＳ測定において、ＭＳのイオン化がＥＳＩにより行われる請求の範囲３記載の測定方法。
【請求項５】
前記基質として、２−置換アンドロステンジオン、６−置換アンドロステンジオン、１９−置換アンドロステンジオン及び６，１９−置換アンドロステンジオンからなる群から選択される少なくとも一つのアンドロステンジオン誘導体を使用する請求の範囲１記載の測定方法。
【請求項６】
２−置換アンドロステンジオンが、２−ハロアンドロステンジオン及び２−アルコキシアンドロステンジオンの少なくとも一方である請求の範囲５記載の測定方法。
【請求項７】
２−ハロアンドロステンジオンが、２α−クロロアンドロステンジオン及び２α−ブロムアンドロステンジオンの少なくとも一方であり、２−アルコキシアンドロステンジオンが、２α−メトキシアンドロステンジオンである請求の範囲６記載の測定方法。
【請求項８】
１９−置換アンドロステンジオンが、１９−オキソアンドロステンジオン及び１９−ヒドロキシアンドロステンジオンの少なくとも一方である請求の範囲５記載の測定方法。
【請求項９】
６，１９−置換アンドロステンジオンが、６α−メチル−１９−オキソアンドロステンジオンである請求の範囲５記載の測定方法。
【請求項１０】
前記アロマターゼが、試料中のアロマターゼである請求の範囲１記載の測定方法。
【請求項１１】
さらに、前記試料中のエストラジオールの量（Ｅ２）を測定し、これと前記試料中のアロマターゼ活性（Ａｒｏｍ）との比を求める請求の範囲１０記載の測定方法。
【請求項１２】
前記エストラジオールの量（Ｅ２）の測定方法が、下記（Ｅ）工程、（Ｆ）工程及び（Ｇ）工程を含む請求の範囲１１記載の測定方法。
（Ｅ）工程：アルカリ条件下、前記試料中のエストラジオール若しくはその誘導体を、下記一般式（１）で示されるペンタハロゲン化ベンジル化合物又は一般式（２）で示されるペンタハロゲン化ベンゾイル化合物と反応させる工程。
【化６】
2006051986.tif 000013
前記一般式（１）及び（２）において、Ｘ１は、ハロゲン原子を表し、Ｌ及びＬ’は、それぞれ脱離基を表す。
（Ｆ）工程：前記（Ｅ）工程で生成したペンタハロゲン化ベンジル化合物又はペンタハロゲン化ベンゾイル化合物による誘導体を、１−低級アルキル−２−ハロゲン化ピリジンと反応させる工程。
（Ｇ）工程：前記（Ｆ）工程において生成した１−低級アルキル−２−ピリジニウム誘導体を測定し、その値から前記試料中のエストラジオールの量（Ｅ２）を求める工程。
【請求項１３】
前記試料が、生体由来試料である請求の範囲１０記載の測定方法。
【請求項１４】
前記生体由来試料が、生体組織及び体液の少なくとも一方に由来する試料である請求の範囲１３記載の測定方法。
【請求項１５】
前記生体組織が、病変部組織及び非病変部組織の少なくとも一方に由来する生体組織である請求の範囲１４記載の測定方法。
【請求項１６】
前記体液が、血液（全血）、血清、血漿、リンパ液、腸液、尿、髄液、唾液、月経血、鼻汁及び涙からなる群から選択される少なくとも一つである請求の範囲１４記載の測定方法。
【請求項１７】
前記アロマターゼ活性の測定方法が、エストロゲン依存性疾患の診断に用いる測定方法である請求の範囲１記載の測定方法。
【請求項１８】
前記エストロゲン依存性疾患が、月経困難症、不妊症、流産、子宮内膜症、子宮腺筋症、子宮筋腫、卵巣チョコレート嚢胞、卵巣癌、乳癌、子宮体癌、子宮頸癌、ＰＭＳ（月経周期に伴い、心身に変調をきたす症候群）、冠動脈心疾患、脂質代謝異常及び甲状腺機能異常からなる群から選択される少なくとも一つの疾患である請求の範囲１７記載の測定方法。
【請求項１９】
アロマターゼ活性の測定方法に使用する測定キットであって、前記アロマターゼ活性の測定方法が、請求の範囲１記載のアロマターゼ活性の測定方法であり、前記一般式（１）で示されるペンタハロゲン化ベンジル化合物又は一般式（２）で示されるペンタハロゲン化ベンゾイル化合物を含む測定キット。
【請求項２０】
さらに、１−低級アルキル−２−ハロゲン化ピリジンを含む請求の範囲１９記載の測定キット。
【請求項２１】
さらに、アンドロステンジオン若しくはその誘導体を含む請求の範囲１９記載の測定キット。
【請求項２２】
エストロゲン依存性疾患の診断方法であって、アロマターゼ活性を測定する測定工程、及び、前記測定値と正常生体試料のそれとを比較し、これによりエストロゲン依存性疾患の罹患のし易さを判断する判断工程を含み、前記測定工程が、前記請求の範囲１記載の測定方法である診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、新規で有用なアロマターゼ活性の測定方法及びそれに用いる測定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】  アロマターゼは、ステロイドホルモン生合成経路の最終段階で、アンドロゲンをエストロゲンに変換する酵素であり、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ−４５０  ａｒｏｍとも呼ばれている。アロマターゼは、分子量が５５ｋＤであり、ＣＹＰ１９遺伝子にコードされている。アロマターゼは、生体において広く分布しており、例えば、胎盤、卵巣の顆粒膜細胞、Ｓｅｒｔｏｌｉ細胞、Ｌｅｙｄｉｇ細胞、脳、筋肉、毛髪などに存在している。組織中では、ミクロソームの膜に存在している。【０００３】  従来から、アロマターゼと疾患との関係が研究されており、例えば、アロマターゼが、乳癌・子宮癌等のエストロゲン依存性疾患にも密接に関与することがわかっている。最近では、子宮内膜症、子宮腺筋症及び子宮筋腫などに伴ってアロマターゼが発現することが報告されている（非特許文献１参照）。その他に、アロマターゼと、毛髪の成長・脱毛との関係が報告されている（特許文献１参照）。その他に、アロマターゼと内分泌撹乱物質（いわゆる環境ホルモン）との関係も注目されている。このような状況から、アロマターゼの酵素活性の測定方法が重要となっている。【０００４】  アロマターゼ活性の測定方法としては、例えば、下記の方法が開発され、一部は実際に使用されている。
（１）動物細胞や酵母を用いたインビトロでの測定方法（特許文献２、非特許文献２及び非特許文献３参照）
（２）トリチウム水遊離アッセイ法（非特許文献４参照）
（３）蛍光法（非特許文献５参照）
（４）液体クロマトグラフィー法（非特許文献６参照）
（５）ｍＲＮＡによる測定方法（特許文献３参照）
【特許文献１】特表平１０−５０８８２８号公報
【特許文献２】特表平４−５０２２６１号公報
【特許文献３】特開２００３−２０７５０９号公報
【非特許文献１】Ｋｉｔａｗａｋｉ，Ｊ．，ｅｔ．ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，Ｖｏｌ．５７，５１４−５１９（１９９７）
【非特許文献２】Ｓｃｈｅｎｋｅｌ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｖｏｌ．３３，ｐｐ１２５−１３１（１９８９）
【非特許文献３】Ｐｏｎｐｏｎ  Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．３，ｐｐ１４７７−１４８７（１９８９）
【非特許文献４】Ｂｅｌｌｉｎｏ，Ｆ．Ｌ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，Ｖｏｌ．４４，ｐｐ６９９（１９７７）
【非特許文献５】Ｓｔｒｅｓｓｅｒ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２８４，ｐｐ４２７−４３０（２０００）
【非特許文献６】Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｈ．，ｅｔ．ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１８１，ｐｐ１６７−１７１（１９８９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  前記（１）の動物細胞等を用いる方法及び前記（５）のｍＲＮＡを用いる方法は、直接アロマターゼの活性を測定しないので、測定精度及び信頼性に問題がある。前記（２）のトリチウム水遊離アッセイ法は、一般的な方法として、広く使用されているが、放射性化合物を使用するため、特別の設備、装置を必要とし、また操作も煩雑である。前記（３）の蛍光法及び前記（４）の液体クロマトグラフィー法は、操作が煩雑であるという問題がある。そして、これらの従来の測定方法は、月経血等の生体試料中に存在した状態でのアロマターゼの測定に、そのまま適用することが困難であるという問題を共通して有する。【０００６】  そこで、本発明は、測定精度及び信頼性に優れ、特別の設備、装置を使用する必要がなく、操作が簡単であり、かつ生体試料にも簡単に適用可能なアロマターゼ活性の測定方法及びそれに用いる測定キットの提供を、その目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  前記目的を達成するために、本発明の測定方法は、アロマターゼ活性の測定方法であって、下記（Ａ）工程、（Ｂ）工程、（Ｃ）工程及び（Ｄ）工程を含む測定方法である。
（Ａ）工程：基質であるアンドロステンジオン若しくはその誘導体に対し、アロマターゼを作用させて、エストラジオール若しくはその誘導体を生成させる工程。
（Ｂ）工程：アルカリ条件下、前記（Ａ）工程で生成した前記エストラジオール若しくはその誘導体を、下記一般式（１）で示されるペンタハロゲン化ベンジル化合物又は下記一般式（２）で示されるペンタハロゲン化ベンゾイル化合物と反応させる工程。
【化１】
2006051986.tif 000002
前記一般式（１）及び（２）において、Ｘ１は、ハロゲン原子を表し、Ｌ及びＬ’は、それぞれ脱離基を表す。
（Ｃ）工程：前記（Ｂ）工程で生成したペンタハロゲン化ベンジル化合物又はペンタハロゲン化ベンゾイル化合物による誘導体を、１−低級アルキル−２−ハロゲン化ピリジンと反応させる工程。
（Ｄ）工程：前記（Ｃ）工程において生成した１−低級アルキル−２−ピリジニウム誘導体を測定し、この測定値からアロマターゼ活性を求める工程。【０００８】  本発明の測定キットは、前記本発明のアロマターゼ活性の測定に用いるキットであって、前記一般式（１）で示されるペンタハロゲン化ベンジル化合物又は一般式（２）で示されるペンタハロゲン化ベンゾイル化合物を含む測定キットである。
【発明の効果】
【０００９】  このように、本発明のアロマターゼ活性の測定方法では、アロマターゼの酵素反応による生成物であるエストラジオール若しくはその誘導体を直接測定する。このため、本発明の測定方法は、測定精度及び信頼性に優れ、しかも放射性物質を用いないため特別の設備、装置を必要としない、簡便な方法である。そして、これらに加え、本発明の測定方法は、生体試料（特に、月経血等の体液試料）にも簡単に適用できる方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】  本発明の測定方法は、アロマターゼの酵素反応で生成するエストラジオール若しくはその誘導体の測定工程（工程（Ｂ）〜（Ｄ））に特徴を有する。従来の測定方法では、通常は２０ｐｇ／ｍＬレベル（検出限界は５ｐｇ／ｍＬ）であったが、本発明の測定方法は、微量に存在するエストラジオール若しくはその誘導体を、２ｐｇ／ｍＬ（定量下限値）のレベルで定量することができる。本発明の測定方法のように、ペンタハロゲン化ベンジルエーテル又はペンタハロゲン化ベンゾイルエステルと、１−低級アルキル−２−ハロゲン化ピリジンとを併用して、エストラジオール若しくはエストラジオール誘導体におけるすべての水酸基を誘導体化することにより液体クロマトグラフィー−質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）測定時における２価のイオンの生成が抑制され、より高感度の測定が可能となる。【００１１】  本発明の前記測定方法において、前記（Ｄ）工程の誘導体の測定は、ＬＣ−ＭＳにより実施することが好ましい。【００１２】  前記基質としては、特に制限されないが、前記アンドロステンジオン誘導体として、例えば、２−置換アンドロステンジオン、６−置換アンドロステンジオン、１９−置換アンドロステンジオン、６，１９−置換アンドロステンジオンがあげられる。【００１３】  前記２−置換アンドロステンジオンとしては、例えば、２−ハロアンドロステンジオン及び２−アルコキシアンドロステンジオンがあげられる。【００１４】  前記２−ハロアンドロステンジオンとしては、例えば、２α−クロロアンドロステンジオン、２β−クロロアンドロステンジオン、２α−ブロムアンドロステンジオン及び２β−ブロムアンドロステンジオン等があげられ、この中でも、２α−ブロムアンドロステンジオンが好ましい。また、前記２−アルコキシアンドロステンジオンとしては、例えば、炭素数１〜６のアルコキシで２位が置換されたアンドロステンジオンがあり、このなかでも、２α−メトキシアンドロステンジオン、２β−メトキシアンドロステンジオン、２α−エトキシアンドロステンジオン及び２β−エトキシアンドロステンジオンが好ましい。【００１５】  前記６−置換アンドロステンジオンとしては、例えば、６−メチルアンドロステンジオン等があげられ、中でも、６α−メチルアンドロスタ−４−エン−３，１７−ジオンが好ましい。【００１６】  前記１９−置換アンドロステンジオンとしては、例えば、１９−オキソアンドロステンジオン及び１９−ヒドロキシアンドロステンジオン等があげられる。【００１７】  前記６，１９−置換アンドロステンジオンとしては、例えば、６−アルキル−１９−オキソアンドロステンジオン及び６−アルキル−１９−ヒドロキシアンドロステンジオン等があげられる。前記アルキル基としては、例えば、前記炭素数１〜６のアルキル基があげられ、これは、直鎖状もしくは分岐鎖状のいずれであってもよく、このようなアルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル及びｔｅｒｔ−ペンチルなどを挙げることができる。前記６，１９−置換アンドロステンジオンとしては、例えば、６−メチル−１９−オキソアンドロステンジオン、６−エチル−１９−オキソアンドロステンジオン、６−メチル−１９−ヒドロキシアンドロステンジオン及び６−エチル−１９−ヒドロキシアンドロステンジオン等があげられ、このなかでも、６−メチル−１９−オキソアンドロステンジオンが好ましく、より好ましくは、６α−メチル−１９−オキソアンドロステンジオンである。【００１８】  本発明において、前記アロマターゼは、試料中のアロマターゼであることが好ましい。前記試料は、特に制限されないが、生体由来試料であることが好ましい。前記生体由来試料は、特に制限されず、例えば、生体組織、体液、培養組織及び培養細胞等があげられ、中でも生体組織及び体液が好ましい。前記生体組織としては、後述のエストロゲン依存性疾患に関係する病変部組織及び非病変部組織の少なくとも一方であることが好ましい。また、前記生体組織としては、例えば、胎盤等がある。前記体液としては、例えば、血液（全血）、血清、血漿、リンパ液、腸液、尿、髄液、唾液、月経血、鼻汁及び涙等が好ましい。【００１９】  本発明のアロマターゼ活性の測定方法において、さらに、前記試料中のエストラジオールの量（Ｅ２）を測定し、これと前記試料中のアロマターゼ活性（Ａｒｏｍ）との比（Ｅ２／Ａｒｏｍ若しくはＡｒｏｍ／Ｅ２）を求めることが好ましい。すなわち、アロマターゼ活性に加えて試料中のエストラジオール量を測定し、その比を求めることにより、後述のエストロゲン依存性疾患の診断において、さらに信頼性が高い診断が可能になる。【００２０】  前記エストラジオールの量（Ｅ２）の測定方法は、前述のように測定感度等の観点から、下記（Ｅ）工程、（Ｆ）工程及び（Ｇ）工程を含む測定方法であることが好ましい。
（Ｅ）工程：アルカリ条件下、前記試料中のエストラジオール若しくはその誘導体を、下記一般式（１）で示されるペンタハロゲン化ベンジル化合物又は一般式（２）で示されるペンタハロゲン化ベンゾイル化合物と反応させる工程。
【化２】
2006051986.tif 000003
前記一般式（１）及び（２）において、Ｘ１は、ハロゲン原子を表し、Ｌ及びＬ’は、それぞれ脱離基を表す。
（Ｆ）工程：前記（Ｅ）工程で生成したペンタハロゲン化ベンジル化合物又はペンタハロゲン化ベンゾイル化合物による誘導体を、１−低級アルキル−２−ハロゲン化ピリジンと反応させる工程。
（Ｇ）工程：前記（Ｆ）工程において生成した１−低級アルキル−２−ピリジニウム誘導体を測定し、その値から前記試料中のエストラジオールの量（Ｅ２）を求める工程。【００２１】  なお、このエストラジオールの量（Ｅ２）の測定方法は、前記本発明のアロマターゼ活性の測定方法の（Ｂ）工程、（Ｃ）工程及び（Ｄ）工程と実質的に同じであるから、使用する化学物質（試薬等）、測定操作及び測定条件等は、前記本発明のアロマターゼの酵素活性の測定方法と同様のものを使用できる。【００２２】  本発明のアロマターゼ活性の測定方法は、その用途を特に制限しないが、エストロゲン依存性疾患の診断に用いることが好ましい。前記エストロゲン依存性疾患としては、例えば、月経困難症、不妊症、流産、子宮内膜症、子宮腺筋症、子宮筋腫、卵巣チョコレート嚢胞、卵巣癌、乳癌、子宮体癌、子宮頸癌、ＰＭＳ（月経周期に伴い、心身に変調をきたす症候群）、冠動脈心疾患、脂質代謝異常及び甲状腺機能異常などがある。【００２３】  本発明の前記測定キットにおいて、さらに、１−低級アルキル−２−ハロゲン化ピリジンを含むことが好ましい。また、本発明の測定キットにおいて、さらに、前記アンドロステンジオン若しくはその誘導体を含むことが好ましい。前記アンドロステンジオン誘導体としては、前述のものが挙げられ、好ましいものも同様である。また、本発明の測定キットは、例えば、前記エストロゲン依存性疾患の診断に用いることができる。【００２４】  次に、本発明の診断方法は、エストロゲン依存性疾患の診断方法であって、アロマターゼ活性を測定する測定工程、及び、前記測定値と正常生体試料のそれとを比較し、これによりエストロゲン依存性疾患の罹患のし易さを判断する判断工程を含み、前記測定工程が、前記本発明のアロマターゼ活性測定方法である。前記診断には、例えば、被験者が前記疾患に羅患しているか否かの判定、将来的に前記疾患に羅患する危険性が存在するか否かの判定、治療後に前記疾患を再発する危険性が存在するか否かの判定、及び、前記疾患の羅患やその危険性がどの程度であるかの判定等を含む。【００２５】  つぎに、本発明をさらに詳しく説明する。【００２６】  本発明の測定方法において、前記基質は、アンドロステンジオン若しくはその誘導体であり、前記誘導体は、前述のとおりである。また、これらの基質は、市販品を使用してもよいし、公知の方法で自家調製してもよい。【００２７】  本発明において、「エストラジオール誘導体」とは、例えば、エストリオール、２−ヒドロキシ−３−メトキシエストラジオール、４−ヒドロキシ−３−メトキシエストラジオール、２−メトキシエストラジオール及び４−メトキシエストラジオール等を挙げることができる。これらの誘導体は、例えば、生体内に存在している。その他に、前述のように、アンドロステンジオン誘導体を基質として使用した場合、アロマターゼによる酵素反応により、前記アンドロステンジオン誘導体に由来する「エストラジオール誘導体」が生成する。【００２８】  また、本発明の前記測定方法において、「ＬＣ−ＭＳ」としては、例えば、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析計）、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ（液体クロマ��グラフィー−エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析計）及びＬＣ−ＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー−大気圧化学イオン化タンデム質量分析計）等を挙げることができ、中でもＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳが好ましい。【００２９】  前記一般式（１）で示す前記ペンタハロゲン化ベンジル化合物において、Ｘ１は、ハロゲン原子を表し、Ｌは、脱離基を表す。Ｘ１は、具体的には、フッ素原子、臭素原子、塩素原子、ヨウ素原子を表す。脱離基Ｌとしては、ハロゲン原子、トシルオキシ、メシルオキシ、若しくはトリフルオロメタンスルホニルオキシ基などの脱離基を挙げることができ、好適にはハロゲン原子を挙げることができる。このペンタハロゲン化ベンジル化合物としては、例えば、ペンタフルオロベンジルクロライド、ペンタフルオロベンジルブロマイド、ペンタブロムベンジルクロライド及びペンタブロムベンジルブロマイド等を挙げることができ、中でも、ペンタフルオロベンジルブロマイドが好適である。【００３０】  前記一般式（２）で示す前記ペンタハロゲン化ベンゾイル化合物においては、Ｘ１は、ハロゲン原子を表し、Ｌ’は、脱離基を表し、好適にはハロゲン原子を挙げることができる。このペンタハロゲン化ベンゾイル化合物としては、例えば、ペンタフルオロベンゾイルクロライド、ペンタフルオロベンゾイルブロマイド、ペンタブロムベンゾイルクロライド及びペンタブロムベンゾイルブロマイド等を挙げることができ、中でも、ペンタフルオロベンゾイルブロマイドが好適である。【００３１】  これらのペンタハロゲン化ベンジル化合物及びペンタハロゲン化ベンゾイル化合物は、公知化合物（市販品）を使用してもよいし、または公知化合物から公知の方法で合成してもよい。【００３２】  本発明にかかる「１−低級アルキル−２−ハロゲン化ピリジン」において、低級アルキルは、炭素数１〜６、好ましくは炭素数１〜３の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基を意味する。このような低級アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル及びｔｅｒｔ−ペンチルなどを挙げることができ、好適にはメチル、エチル、ｎ−プロピルを挙げることができる。また、「１−低級アルキル−２−ハロゲン化ピリジン」において、ハロゲンは、具体的には、フッ素原子、臭素原子、塩素原子、ヨウ素原子を意味する。「１−低級アルキル−２−ハロゲン化ピリジン」としては、例えば、１−メチル−２−フルオロピリジン、１−エチル−２−フルオロピリジン、１−プロピル−２一フルオロピリジン、１−メチル−２−クロロピリジン、１−メチル−２−ブロムピリジン、１−エチル−２−クロロピリジン及び１−エチル−２−ブロムピリジン等を挙げることができる。この中でも特に、１−メチル−２−フルオロピリジンが好ましい。この「１−低級アルキル−２−ハロゲン化ピリジン」も、公知化合物（市販品）を使用してもよいし、または公知化合物から公知の方法で合成してもよい。【００３３】  つぎに、本発明のアロマターゼ活性の測定方法について、以下に具体例を挙げて説明する。【００３４】  本発明のアロマターゼ活性の測定方法��、アロマターゼにより、基質であるアンドロステンジオン若しくはその誘導体を、エストラジオール若しくはその誘導体に変換し、その生成量を測定することにより前記アロマターゼ活性を測定する。【００３５】  前記アロマターゼとしては、試料中に存在する形態のものであってもよいし、試料から抽出して精製したものであってもよい。例えば、血液、月経血及び胎盤等の生体試料を使用する場合は、そのまま酵素として使用してもよいし、緩衝液で希釈等し、これを酵素液として使用してもよい。前記基質としては、前述のものが使用できるが、そのなかでも、２α−ブロムアンドロステンジオン及び６α−メチル−１９−オキソアンドロステンジオンを使用することが好ましい。このような誘導体を使用することで、測定感度がさらに向上する。【００３６】  また、酵素反応の条件は、特に制限されないが、温度は、例えば、２０〜７０℃の範囲、好ましくは２０〜５０℃の範囲、より好ましくは３０〜４５℃の範囲であり、最適には、約３７℃であり、ｐＨは、例えば、ｐＨ４．５〜９．０の範囲、好ましくはｐＨ６．５〜８．０の範囲、より好ましくはｐＨ７．０〜７．８の範囲であり、最適には、約ｐＨ７．２である。反応は緩衝液中で行うことが好ましく、例えば、リン酸バッファー、グッドのバッファー等がある。また、アロマターゼの反応には、酸素が必要であるが、酸素は、空気中若しくは液中から自然に供給されるものを利用すればよい。また、アロマターゼの反応には、ＮＡＤＰＨが必要であるので、これを反応系に添加することが好ましい。ＮＡＤＰＨは、ナトリウム塩、カリウム塩等の塩の形態であってもよい。ＮＡＤＰＨの添加量は、反応液全体に対し、例えば、０．１〜１０ｍｇであり、好ましくは０．５〜５ｍｇであり、より好ましくは０．８〜２ｍｇであり、最適には約１ｍｇである。なお、反応液全体の量は、例えば、約１ｍＬまたは約１ｇである。酵素反応の停止は、一般的な方法を適用でき、例えば、高温や薬剤でアロマターゼを失活させる方法、至適ｐＨから外れたｐＨに反応液を調整する等の手法が適用できる。そして、アロマターゼ活性は、その酵素反応により生成したエストラジオール若しくはその誘導体を測定することにより、求めることができる。なお、アロマターゼの酵素反応では、エストラジオール若しくはその誘導体に加え、エストロン若しくはその誘導体も生成するため、ＮａＢＨ４を用いて処理することが好ましい。前記処理には、例えば、ＮａＢＨ４メタノール溶液が使用できる。【００３７】  つぎに、生成したエストラジオール若しくはその誘導体の測定方法を、具体例を挙げて説明する。【００３８】 ペンタハロゲン化ベンジル誘導体又はペンタハロゲン化ベンゾイル誘導体の調製
前記酵素反応液をアセトニトリル等の不活性溶媒に溶解し、アルカリ条件下でペンタハロゲン化ベンジル化合物又はペンタハロゲン化ベンゾイル化合物を反応させることにより、上記で調製した試料中のエストラジオール若しくはエストラジオール誘導体をペンタハロゲン化ベンジル誘導体又はペンタハロゲン化ベンゾイル誘導体に変換する（エストラジオールについての例を下記ステップ−１（式（３））に示す）。【００３９】
【化３】
2006051986.tif 000004
（前記式（３）中、Ｘ１は、ハロゲン原子を表し、Ｌ及びＬ’は、それぞれ脱離基を表す）【００４０】  この反応は、例えば、−１０〜６０℃の範囲内の温度で行うことができ、好ましくは５〜４０℃の範囲内の温度が適している。また、ペンタハロゲン化ベンジル化合物又はペンタハロゲン化ベンゾイル化合物の使用割合は、特に制限されるものではないが、例えば、生体由来試料１ｍＬ又は１ｇに対して０．２〜２０ｍｇとすることができ、好ましくは１〜４ｍｇが適している。さらに、アルカリ条件下とは、反応液のｐＨを８〜１３、好ましくは９〜１１の範囲とすることを意味し、例えば、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム及び炭酸カリウムなどの塩基の中から、反応液を上記ｐＨの範囲にするのに十分な種類及び量の塩基を適宜選択して用いることができる。ここで、本反応は、アルカリ条件下で行うことによって、エストラジオール及び／又はエストラジオール誘導体における水酸基のうちフェノール性水酸基が選択的にペンタハロゲン化ベンジルエーテル化又はペンタハロゲン化ベンゾイルエステル化されるため、最終的に得られる１−低級アルキル−２−ピリジニウム誘導体をＬＣ−ＭＳを用いて高感度で測定することが可能となる。【００４１】  上記ステップ−１と同様の方法により調製されるペンタハロゲン化ベンジル誘導体又はペンタハロゲン化ベンゾイル誘導体としては、例えば、エストラジオール−３−ペンタフルオロベンジルエーテル、エストラジオール−３−ペンタフルオロベンゾイルエステル、２−メトキシエストラジオール−３−ペンタフルオロベンジルエーテル、２−エトキシエストラジオール−３−ペンタフルオロベンジルエーテル、２−クロロエストラジオール−３−ペンタフルオロベンジルエーテル、２−ブロムエストラジオール−３−ペンタフルオロベンジルエーテル、３−メトキシエストラジオール−２−ペンタフルオロベンジルエーテル、４−メトキシエストラジオール−３−ペンタフルオロベンジルエーテル、３−メトキシ−４−ヒドロキシエストラジオール−４−ペンタフルオロベンジルエーテル、６−メチルエストラジオール−３−ペンタフルオロベンジルエーテル及び６−エチルエストラジオール−３−ペンタフルオロベンジルエーテル等を挙げることができる。【００４２】 ピリジニウム誘導体の調製
上記ステップ−１の方法により調製したエストラジオール若しくはエストラジオール誘導体のペンタハロゲン化ベンジル誘導体又はペンタハロゲン化ベンゾイル誘導体は、ジクロロメタン等の不活性溶媒に溶解した後、トリエチルアミン等の塩基性触媒の存在下で、１−低級アルキル−２−ハロゲン化ピリジンと反応させることにより、ピリジニウム誘導体へと変換することができる（エストラジオールについての例を下記ステップ−２（式（４））に示す）。【００４３】
【化４】
2006051986.tif 000005
（前記式（４）中、Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立に、ハロゲン原子を表し、Ｒは、低級アルキル基を表す。）【００４４】  この反応は、例えば、−１０〜６０℃の範囲内の温度で行うことができ、好ましくは５〜４０℃の範囲内の温度が適している。また、反応溶媒としては、一般的な不活性有機溶媒、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、アセトニトリル及び酢酸エチル等を使用することができる。【００４５】  また、エストラジオール若しくはエストラジオール誘導体のペンタハロゲン化ベンジル誘導体又はペンタハロゲン化ベンゾイル誘導体に対する１−低級アルキル−２−ハロゲン化ピリジンの使用割合は、特に制限されるものではないが、例えば、試料（酵素反応液）１ｍＬ又は１ｇに対して０．２〜２０ｍｇとすることができ、好ましくは１〜４ｍｇが適している。【００４６】  上記ステップ−２と同様の方法により調製されるピリジニウム誘導体としては、例えば、エストラジオール−３−ペンタフルオロベンジルエーテル１７−Ｏ−メチルピリジニウム、
エストラジオール−３−ペンタフルオロベンゾイルエステル１７−Ｏ−メチルピリジニウム、
２−メトキシエストラジオール−３−ペンタフルオロベンジルエーテル１７−Ｏ−メチルピリジニウム、
２−エトキシエストラジオール−３−ペンタフルオロベンジルエーテル１７−Ｏ−メチルピリジニウム、
２−クロロエストラジオール−３−ペンタフルオロベンジルエーテル１７−Ｏ−メチルピリジニウム、
２−ブロムエストラジオール−３−ペンタフルオロベンジルエーテル１７−Ｏ−メチルピリジニウム、
３−メトキシエストラジオール−２−ペンタフルオロベンジルエーテル１７−Ｏ−メチルピリジニウム、
４−メトキシエストラジオール−３−ペンタフルオロペンジルエーテル１７−Ｏ−メチルピリジニウム、
３−メトキシ−４−ヒドロキシエストラジオール−４−ペンタフルオロベンジルエーテル１７−Ｏ−メチルピリジニウム、
６−メチルエストラジオール−３−ペンタフルオロベンジルエーテル１７−Ｏ−メチルピリジニウム、
６−エチルエストラジオール−３−ペンタフルオロベンジルエーテル１７−Ｏ−メチルピリジニウム等を挙げることができる。【００４７】  また、本発明の測定方法におけるＬＣ−ＭＳ測定は、一般的な方法により行うことができる。【００４８】  そして、この測定により、生成したエストラジオール若しくはその誘導体の量を求め、これからアロマターゼの酵素活性を求めることができる。酵素活性の表現の仕方は特に制限されず、例えば、後述の実施例に示す表現がある。また、酵素活性を求める際に、検量線を使用してもよい。【００４９】  なお、例えば、血清試料、月経血試料、胎盤試料等の生体試料中のエストラジオール若しくはその誘導体の量を測定する場合は、そのまま測定に供しても良いし、その試料を処理して測定試料を調製してもよい。その処理方法としては、例えば、緩衝液で希釈する処理や、簡易カラムクロマトグラフィーにより分離精製する一般的調製方法を適宜選択して用いることができる。【００５０】  つぎに、本発明の実施例について、比較例と併せて説明する。ただし、本発明は、下記の実施例等に限定されない。
【実施例１】
【００５１】  本実施例は、２α−ブロムアンドロステンジオンを基質として使用し、アロマターゼの酵素活性を測定した例である。【００５２】  （１）アロマターゼ酵素反応（２−ブロムエストロジェンの調製）
アロマターゼ酵素液として、胎盤ミクロソームの燐酸緩衝液溶液（ｐＨ７．２、タンパク質量として５０μｇ／５００μＬ）を準備した。この溶液にニコチンアデニンジヌクレオチド還元型水溶液（ＮＡＤＰＨ、１ｍｇ／４５０μＬ）及び２α−ブロムアンドロステンジオンのメタノール溶液（１．５μｇ／５０μＬ）を加えて総量１．０ｍＬとし、３７℃で振とうしながら１５分間インキュベートして、酵素反応させた。【００５３】  （２）２−ブロムエストラジオールの調製
酵素反応後、反応容器を氷冷下で冷却した。酵素反応で２−ブロムエストロン及び２−ブロムエストラジオールの両者が生成するので、前者を２−ブロムエストラジオールへ変換させるため、ＮａＢＨ４メタノール溶液（１５ｍｇ／ｍＬ）を２００μＬ加え、室温で１０分間放置した。ついで、０．０５Ｎ塩酸水（１ｍＬ）で反応を停止させた後、内部標準物質として重水素標識エストラジオール２００ｐｇを添加し、エーテルでステロイド画分を抽出、溶媒を留去した。【００５４】  （３）２−ブロムエストラジオール−３−ペンタフルオロベンジルエーテルの調製
得られた残留物をアセトニトリル５０μＬに溶解し、ついで０．８％水酸化カリウムのエタノ−ル溶液５０μＬを加えて反応液のｐＨを１１とし、５％ペンタフルオロベンジルブロマイド溶液５０μＬを加え、５０℃で１時間加温した。反応液を水で希釈後、エーテルで抽出し、溶媒を留去した。【００５５】  （４）２−ブロムエストラジオール−３−ペンタフルオロベンジルエーテル１７−Ｏ−メチルピリジニウムの調製
得られた残留物に２％の１−メチル−２−フルオロピリジンのジクロロメタン溶液２００μＬ及び５％トリエチルアミンのジクロロメタン溶液３０μＬを加え、室温で９０分間放置した。ついで、溶媒を留去した後、２５％メタノール水溶液１．２５ｍＬに溶解し、予めメタノール６ｍＬ及び水６ｍＬで調製したＢｏｎｄ  Ｅｌｕｔ  Ｃ１８カラムに負荷した。水１ｍＬ、３％アンモニア水３ｍＬ、メタノール２ｍＬ及び０．０１％ギ酸／メタノール混液（１：１）で順次洗浄した後、１０％ギ酸／アセトニトリル（１：４）混液３．５ｍＬで溶出した。溶出液を減圧下で留去した後、０．０５％ギ酸／アセトニトリル（１：１）混液１００μＬに溶解した。【００５６】  （５）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法による測定
前記（４）の工程で得た液から、１０μＬをサンプルとして採取し、これをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定に使用した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、液体クロマトグラフィー装置（アジデント１１００型）に接続したマススペクトロメータ（日本アプライドバイオシステム社製）ＡＰＩ４０００を用い、ＥＳＩ法で測定した。ＬＣとＭＳの測定条件は、下記に示すとおりである。この測定では、前記酵素反応の条件下で、２α−ブロムアンドロステンジオンから生成した２−ブロムエストラジオールのピリジニウム誘導体のピーク面積を測定し、それと内部標準物質とのピーク面積比を算出し、これから２−ブロムエストラジオール濃度を求めた。測定は、３回行い、その平均値を算出した。その結果を、下記表１に示す。なお、アロマターゼの酵素活性は、タンパク質１００ｍｇとしての前記胎盤ミクロソームにおいて、インキュベーション時間（１５分間）中に生成したエストラジオールの量（ｐｇ）として表した。したがって、アロマターゼの酵素活性の単位は、「ｐｇ／１５分間／１００ｍｇタンパク質」となる。【００５７】  （測定条件）
（１）ＬＣの条件
カラム：Ｄｏｃｏｓｉｌ（内径２ｍｍ×長さ１００ｍｍ、センシュ科学社製）
流量：０．４ｍＬ／分
（２）ＭＳの条件
機種：ＡＰＩ４０００
モード：ＥＳＩ＋（ＳＲＭ）
Ｄｅｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ：６５Ｖ
Ｅｎｔｒａｎｃｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ：８Ｖ
Ｃｏｌｌｉｓｏｎ  ｅｎｅｒｇｙ：４０Ｖ
Ｃｏｌｌｉｓｏｎ  ｃｅｌｌ  ｅｘｉｔ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ：１０Ｖ
測定イオン
親イオン（Ｍ／Ｚ）：６２４．２（Ｉ．Ｓ．．  Ｍ／Ｚ  ５４７．０）
娘イオン（Ｍ／Ｚ）：１１０．０（Ｉ．Ｓ．．  Ｍ／Ｚ  １０９．８）【００５８】  （比較例１）
アロマターゼ酵素反応において、基質及びＮＡＤＰＨを添加せずに、酵素反応を行った。これ以外は、前記実施例と同様にしてアロマターゼの酵素活性を測定した。その結果を、下記表１に示す。【００５９】  （比較例２）
アロマターゼ酵素反応において、ＮＡＤＰＨを添加せずに、酵素反応を行った。これ以外は、前記実施例と同様にしてアロマターゼの酵素活性を測定した。その結果を、下記表１に示す。【００６０】
【表１】
2006051986.tif 000006
【００６１】  前記表１からわかるように、実施例１では、アロマターゼの酵素反応によって、エストラジオールが大量に生成し、これによってアロマターゼの酵素活性が測定できた。これに対し、比較例１及び２では、エストラジオールは微量であった。
【実施例２】
【００６２】  本実施例は、６α−メチルアンドロスタ−４−エン−３，１７−ジオン（ＭｅＡＤ）を基質として使用し、試料中のアロマターゼの酵素活性を測定した例である。【００６３】  （１）検量線の作成
６α−メチル−１，３，５（１０）−エストラトリエン−３，１７β−ジオール（０、１、３、１０、３０、１００及び３００ｐｇ）に、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２、１／１５ｍｏｌ／Ｌ）１ｍＬ及び内標準物質（１，３，５（１０）エストラトリエン−３−ｏｌ−１７−オン−２，４，１６，１６−ｄ４（Ｅ１−ｄ４）（ＣＤＮ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ社製））２００ｐｇを添加し、ジエチルエーテルで抽出した。溶媒を乾固して、後述の（３）及び（４）と同様にして６α−メチルエストラジオール−３−ペンタフルオロベンジルオキシ−１７β−２−メチルピリジニウムエーテル（ＭｅＥ２−ＰＦＢＺＰＹ）誘導体を調製し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定した。【００６４】  （２）アロマターゼ酵素反応
まず、被験者から月経血を採取し、等量のリン酸緩衝液（１／１５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．２）と混合し、ホモジェナイズして試料を調製した。つぎに、ヒト胎盤ミクロソームを、０．５％ＢＳＡを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、１／１５ｍｏｌ／Ｌ）に溶解し、この溶液をヒト胎盤ミクロソームの添加量が０．５μｇとなるように、前記試料４００μＬに添加し、酵素溶液を調製した。前記酵素溶液０．８ｍＬに、基質（ＭｅＡＤ、２０μｍｏｌ／Ｌ、５０％メタノール水溶液）０．１ｍＬ及び補酵素（β−ＮＡＤＰＨ（オリエンタル酵母製）、１ｍｇ、リン酸緩衝液）０．１ｍＬを加えて総量１．０ｍＬとし、３７℃で振とうしながらインキュベート（６０分間）して、酵素反応させた。酵素反応後、反応容器を氷冷下で冷却し、その状態で内部標準物質（１，３，５（１０）エストラトリエン−３−ｏｌ−１７−オン−２，４，１６，１６−ｄ４（Ｅ１−ｄ４）（ＣＤＮ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ社製））２００ｐｇを添加し、ジエチルエーテルでステロイド画分を抽出し、溶媒を乾固した。【００６５】  （３）６α−メチルエストラジオール−３−ペンタフルオロベンジルオキシ−１７β−２−メチルピリジニウムエーテル（ＭｅＥ２−ＰＦＢＺＰＹ）の調製
得られた残留物にＮａＢＨ４（２．５ｍｇ／０．２５ｍＬメタノール溶液）を添加し、室温で約１０分間放置後、精製水１ｍＬを加えてＢｏｎｄ  Ｅｌｕｔ  Ｃ１８（２００ｍｇ、Ｖａｒｉａｎ製）に負荷した。精製水１ｍＬ及び３０％アセトニトリル水溶液２ｍＬで洗浄後、７０％アセトニトリル水溶液２．５ｍＬで溶出した。【００６６】  前記溶出液を溶媒乾固後、残渣をＡｃＮ  ０．０５ｍＬで溶解してペンタフルオロベンジルブロマイド／アセトニトリル（１：１９）溶液０．０５ｍＬ及び０．８％ＫＯＨエタノール溶液０．０５ｍＬを添加し、５２〜５３℃で１時間反応させた。溶媒を乾固後、２％２−Ｆｌｕｏｒｏ−１−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｐ−Ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅのジクロロメタン懸濁液０．２ｍＬ及び１０％トリエチルアミンのジクロロメタン溶液０．０３ｍＬを加えて室温で１．５時間反応させた。【００６７】  前記反応液を溶媒乾固後、残渣をメタノール０．２５ｍＬで溶解し、精製水１ｍＬを加えてＢｏｎｄ  Ｅｌｕｔ  Ｃ１８に負荷した。精製水１ｍＬ、０．３％アンモニア水３ｍＬ、ＭｅＯＨ３ｍＬ、及び０．０１％ギ酸水溶液／ＭｅＯＨ（１：１）混液３ｍＬで順次洗浄し、その後、１０％ギ酸水溶液／ＡｃＮ（１：９）混液２．５ｍＬで溶出した。【００６８】  （４）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法による測定
前記（２）の工程で得た溶出液を溶媒乾固後、移動相（０．０５％ギ酸溶液／（アセトニトリル：メタノール＝１０：３））１００μＬに溶解し、１０μＬをサンプルとして採取し、これをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定に使用した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、液体クロマトグラフィー装置（商品名：アジデント１１００型）に接続したマススペクトロメータ（日本アプライドバイオシステム社製）ＡＰＩ４０００（商品名）を用い、ＥＳＩ法で測定した。ＬＣとＭＳの測定条件は、下記に示すとおりである。この測定では、前記酵素反応の条件下で、ＭｅＥ２−ＰＦＢＺＰＹのピーク面積を測定し、それと内部標準物質とのピーク面積比を算出し、これからＭｅＥ２濃度を求めた。測定は、２回行い、それぞれアロマターゼ酵素活性を算出した。その結果を、測定値とあわせて下記表１に示す。なお、アロマターゼの酵素活性は、タンパク質１ｍｇとしての前記胎盤ミクロソームにおいて、インキュベーション時間（６０分間）中に生成したＭｅＥ２（Ｍｗ２８６．４）の量（ｐｍｏｌ）として表した。したがって、アロマターゼの酵素活性の単位は、「ｐｍｏｌ／６０分間／１ｍｇタンパク質」となる。【００６９】  （測定条件）
（１）ＨＰＬＣの条件
カラム：商品名ＸＴｅｒｒａ  ＭＳ  Ｃ１８（３．５μｍ、内径２．１ｍｍ×長さ１００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ製）
移動相：０．０５％ギ酸溶液／（アセトニトリル：メタノール＝１０：３）
０．０〜０．５分；３５：６５→０：１００
０．５〜２．５分；０：１００
２．５〜６．０分；３５：６５
カラム温度：４０℃
流量：０．４ｍＬ／分
注入量：１０μＬ
Ｒｕｎ  Ｔｉｍｅ：６．０分
（２）ＭＳの条件
機種：ＡＰＩ４０００
イオン化法：ＥＳＩ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ）
ＣＡＤ  ：４ｐｓｉ
ＣＵＲ  ：１０ｐｓｉ
Ｇａｓ１  ：３０ｐｓｉ
Ｇａｓ２  ：６５ｐｓｉ
ＩｏｎＳｐｒａｙ  Ｖｏｌｔａｇｅ：５０００Ｖ
イオン電源温度：５００℃
Ｄｅｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ：６５Ｖ
Ｅｎｔｒａｎｃｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ：９．０Ｖ
Ｃｏｌｌｉｓｏｎ  ｅｎｅｒｇｙ：４５Ｖ
Ｃｏｌｌｉｓｏｎ  ｃｅｌｌ  ｅｘｉｔ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ：１３Ｖ
ＩＱ１：−９．０
測定イオン（ｍ／ｚ）：５５８．３／３５３．１【００７０】
【表２】
2006051986.tif 000007
【００７１】  前記表２に示すように、本発明の測定方法によれば、安定して優れた精度でアロマターゼの酵素活性を測定できる。
【実施例３】
【００７２】  本実施例は、本発明の測定方法の測定精度及び感度を示す例である。なお、比較例として、トリチウム水遊離アッセイ法により同様の測定を行った。【００７３】  ヒト胎盤ミクロソームの添加量を、０．０．０１、０．０２、０．０５及び０．１０μｇとし、基質（ＭｅＡＤ）の濃度を２μｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記実施例２と同様にしてＭｅＥ２量を測定し、前記測定値からアロマターゼの酵素活性を算出し、その平均値を、標準誤差及び変動係数（ＣＶ）とあわせて下記の表３に示す。【００７４】  （比較例３）
酵素溶液０．５ｍＬに基質（１β−３Ｈ−Ａｎｄｒｏｓｔ−４−ｅｎｅ−３，１７−ｄｉｏｎｅ（３Ｈ−ＡＤ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製；０．５μＣｉ）０．１ｍＬ及び補酵素（β−ＮＡＤＰＨ  １ｍｇ）０．１ｍＬを加え、３７℃で６０分間インキュベートした。次いで、エタノール２ｍＬを添加して反応を止め、氷冷下で１５分間放置後、遠心分離（４℃、３０００ｒｐｍ、１０分）し、その上清に精製水１ｍＬを加えた。クロロフォルム２ｍＬで水層を２回洗浄（４℃、３０００ｒｐｍ、５分）した後、活性炭約１００ｍｇを添加し、室温で２０分間放置した。遠心分離（４℃、３０００ｒｐｍ、１０分）した上清０．８５ｍＬにシンチレーター（クリアゾルＩＩ、ナカライテスク製）４ｍＬを加えて液体シンチレーションカウンター（Ａｌｏｋａ製；商品名ＬＳＣ２０００）で放射能を計測した。下記の表３に示す各ヒト胎盤ミクロソーム量においてＭｅＥ２量を測定し、その結果を下記の表３に示す。【００７５】
【表３】
2006051986.tif 000008
【００７６】  前記表３に示すように、本発明の測定方法は、比較例３の方法と比べて、精度及び感度が優れていた。また、本発明の測定方法と比較例の方法とは、良好な正の相関（Ｒ２＝０．９６４５）を示した。したがって、本発明の測定方法は、測定精度及び信頼性に優れるといえる。
【実施例４】
【００７７】  本実施例は、本発明の測定方法の日差再現性を示す例である。【００７８】  測定日を変えて３回行った以外は、実施例２と同様して、ＭｅＥ２量を測定し、それを用いてアロマターゼの酵素活性を算出した。その結果を、下記表４に示す。【００７９】
【表４】
2006051986.tif 000009
【００８０】  前記表４に示すように、アロマターゼの酵素活性の日差変動は２０％以下であったことから、本発明の測定方法は、安定して優れた精度でアロマターゼの酵素活性を測定できる。
【実施例５】
【００８１】  本実施例は、種々の温度で保存した試料を用いてアロマターゼの酵素活性を測定した例である。【００８２】  予め、４℃で０．５又は２時間、室温２時間、及び７０℃で１又は３週間のそれぞれの条件で保存した試料を使用し、試料の量を０．１５ｍＬとした以外は、実施例２と同様にして測定した。その結果（ｎ＝３）について、４℃で０．５時間保存した場合の活性値を１００とした場合における相対値とあわせて下記表５に示す。【００８３】
【表５】
2006051986.tif 000010
【００８４】  前記表５に示すように、様々な条件で保存した試料であっても、本発明の測定方法によれば、精度よくアロマターゼの酵素活性を測定できた。
【実施例６】
【００８５】  本実施例は、エストロゲン依存性疾患患者及び健常者の経血を使用し、アロマターゼの酵素活性を使用した例である。【００８６】  エストロゲン依存性疾患患者群（ｎ＝７）及び健常者（ｎ＝５）について、前記実施例２と同様にしてアロマターゼの酵素活性を測定した。その結果を表６に示す。【００８７】
【表６】
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【００８８】  前記表６に示すように、本発明の測定方法は、偽陽性もなく、精度よくアロマターゼの酵素活性を測定できることから、子宮内膜症等のエストロゲン依存性疾患の診断に適用できる。
【産業上の利用可能性】
【００８９】  本発明のアロマターゼの酵素活性の測定方法は、その用途が制限されず、例えば、生物学、医学、農学、薬学、生化学等の広い分野に適用可能であり、特に、月経困難症、不妊症、流産、子宮内膜症、子宮腺筋症、子宮筋腫、卵巣チョコレート嚢胞、卵巣癌、乳癌、子宮体癌、子宮頸癌、ＰＭＳ（月経周期に伴い、心身に変調をきたす症候群）、冠動脈心疾患、脂質代謝異常及び甲状腺機能異常等のエストロゲン依存性疾患の診断に、好ましく適用できる。
【国際調査報告】
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