(57)【要約】【課題】  活性化されて、組織・細胞を障害するに至ったＣＤ８＋キラーＴ細胞を抑制する制御性Ｔ細胞を提供すること。【解決手段】  活性化されたＣＤ８＋キラーＴ細胞の活性を抑制する制御性Ｔ細胞として、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞サブセットを提供する。このＴ細胞サブセットの投与により、組織・細胞の障害を抑制できる。また、本発明に記載する実験方法を利用することにより、このＴ細胞サブセットの免疫抑制活性を増強する薬剤の探索が可能となった。【選択図】図２【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表面にＣＤ８＋ＣＤ１２２＋の表面マーカーを有し、かつＣＤ８＋ＣＤ１２２−Ｔ細胞またはＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞のインターフェロンγ及び／又はインターロイキン２の産生活性を抑制することができることを特徴とするＴ細胞サブセット。
【請求項２】
請求項１に記載のＴ細胞サブセットの免疫抑制活性を増強する免疫抑制剤。
【請求項３】
請求項２に記載の免疫抑制剤を、請求項１に記載のＴ細胞サブセットの免疫抑制活性を指標として選択する免疫抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項４】
請求項３において、ＣＤ８＋ＣＤ１２２−Ｔ細胞またはＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞のインターフェロンγ及び／又はインターロイキン２の産生活性を指標とするスクリーニング方法。
【請求項５】
細胞表面にＣＤ８＋ＣＤ１２２＋の表面マーカーを持つＴ細胞を、自己免疫疾患に罹患した個体または移植拒絶反応を引き起こした個体または移植片対宿主反応を引き起こした個体または造血障害を引き起こした個体またはＣＤ８＋ＣＤ１２２−Ｔ細胞の活性が過度に亢進あるいは亢進する恐れのある個体または、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の活性が過度に亢進あるいは亢進する恐れのある個体に投与することを特徴とする自己免疫疾患の治療または予防方法。
【請求項６】
ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞を自己末梢血から分離または分離した後、増殖させてから投与することを特徴とする請求項５に記載の自己免疫疾患の治療または予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内において免疫応答の抑制に関わるＴ細胞サブセット及びその疾患治療への応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトは、外来の異物を排除する生体防御機構が備わっていると同時に、自己に対する免疫寛容が成立している。こうした免疫応答の誘起や制御は、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、抗体および抗原提示細胞（ＡＰＣ）の間の相互作用により行われる。まず、外来抗原はＡＰＣによるプロセシングを受け、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラス II分子に結合され、ヘルパーＴ細胞に提示される。ＭＨＣに結合した外来抗原が、ヘルパーＴ細胞により認識されることにより、Ｔ細胞の活性化が起こる。活性化されたＴ細胞がサイトカインを分泌すると、抗原で刺激されたＢ細胞が抗体産生細胞へと分化するのを助けると共に、キラーＴ細胞の分化を促す。分泌された抗体および活性化されたキラーＴ細胞により、抗原を提示する細胞が排除され、外来抗原を排除する細胞性・体液性の反応が進行する。すなわち、Ｔ細胞が中心的な役割を果たして、標的となる抗原を認識し免疫応答が動員される。例えば、抗腫瘍免疫応答においても、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞が極めて重要な役割を果たしていることが古くから知られている。【０００３】
ＣＤ８＋ＣＴＬ（cytotoxic T cell）は、生体内においても試験管内においても直接的に腫瘍細胞を破壊する能力を持つ主要なエフェクター細胞である。この細胞は、ＭＨＣクラスIに提示された抗原ペプチドの特異性に関して厳格である。これに対し、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞は、抗原特異性の制約が緩く、固有性の免疫応答を示すエフェクター細胞であると考えられている（非特許文献１参照）。
一方、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、直接には腫瘍細胞を破壊しないが、抗腫瘍免疫応答を複数の機構を通して制御する基本的な役割を担っているとされている（非特許文献２参照）。ＭＨＣクラス II分子に提示された腫瘍抗原ペプチドを認識したＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）との相互作用によるキラーＴ細胞の活性化と増殖とを増幅する。【０００４】
これに対し、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、抗腫瘍免疫応答や種々の自己免疫病の進展を抑制するのに有効であることが示されてきた（特許文献１および非特許文献３参照）。しかし、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を標的としてヘルパー機能を制御することを通して細胞障害性のＣＤ８＋キラーＴ細胞の活性を抑制するものであり、ＣＤ８＋キラーＴ細胞に直接作用するものではないので、活性化してしまったＣＤ８＋キラーＴ細胞を制御することはできないと考えられている。【０００５】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞以外にも種々のＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞あるいは樹状細胞が免疫応答の制御機能を果たしていることが一般に知られている。これらの種々の制御性細胞の中で、特にＣＤ８＋の抑制性Ｔ細胞は、古くから免疫応答を抑制する機能を有するサプレッサーＴ細胞と見なされて多くの研究が積み重ねられたが、明確に分離同定することが出来ず再び闇の中に埋もれてしまった。その中で、谷口らがマウスで見出したＶα１４ＮＫＴ細胞集団は、自己免疫疾患の発症との関連が数多く報告され、ヒトにおいても同様のＮＫＴ細胞が自己免疫疾患の発症において特異的に減少することが報告されている。また、活性化したＶα１４ＮＫＴ細胞は、移植の生着やＩｇＥ産生抑制にも関わっている一方で、強力な細胞障害活性を保持していて、劇症肝炎を引き起こすことも判明している。活性化されたＶα１４ＮＫＴ細胞は、インターフェロンγとＩＬ−４などのサイトカインを分泌し、そのバランスを介して免疫系を制御していると考えられているが、その分子機構の詳細は解明されていない。【０００６】
【特許文献１】米国公開公報  ＵＳ２００３０４９６９６号公報
【特許文献２】米国特許公報  ＵＳ６５３１４５３号公報
【非特許文献１】M.J.Smyth et al., J.Exp.Med. 191(2000),pp661-668
【非特許文献２】R.F.Wang, Trends. Immunol. 5(2001),pp269-276
【非特許文献３】S.Sakaguchi et al, Immunol. Rev. 182(2001),pp18-32
【非特許文献４】M.Taniguchi et al, Annu.Rev.Immunol. 21(2001),pp83-513
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
自己免疫疾患や移植拒絶反応において、組織・細胞を障害する主役を演じるのはＣＤ８＋キラーＴ細胞である。活性化されてしまったＣＤ８＋キラーＴ細胞を特異的に抑制する手段は、未だ見出されていない。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の制御を介して、間接的にＣＤ８＋キラーＴ細胞の活性化を抑制するため予防的な作用を果たす。しかし、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、すでに活性化されたＣＤ８＋キラーＴ細胞の抑制には、必ずしも有効とはいえないと考えられる。マウスＶα１４ＮＫＴ細胞のような抑制性のＮＫＴ細胞は、サイトカイン分泌のバランスを介しての免疫制御であるために、やはり直接的、特異的にＣＤ８＋キラーＴ細胞を制御するとは考えられず、様々な応答が予想される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＣＤ１２２（ＩＬ−２／ＩＬ−１５リセプターβ鎖）を欠損したため、造血細胞系に様々な異常を来たし、リンパ節におけるＴ細胞の異常な活性化と増加、自己免疫性の溶血による重篤な貧血等の症状を引き起こしたマウスに注目した。このマウスについて、上記異常な表現型からの回復の方法を鋭意検討した結果、ＣＤ１２２を欠損していない正常なマウスからＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞を分離し、これをＣＤ１２２欠損新生児マウスに投与することによって、正常なマウスが得られることを明らかにし、本発明に到達した。【０００９】
また、本発明者らは、分離したＣＤ８＋キラーＴ細胞をインビトロで活性化する条件での培養液中に、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞を共存させ、ＣＤ８＋キラーＴ細胞中に産生されるインターフェロンγを測定することにより、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞の免疫抑制活性をインビトロで証明した。ＣＤ８＋キラーＴ細胞の代わりにＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を用いた場合も、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞から産生されるインターロイキン２を測定することにより、同様にＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞の免疫抑制活性を証明した。更に、ＮＫ細胞についてもその細胞傷害活性を抑制することを明らかにした。これらの免疫活性を有するＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞そのものが免疫抑制剤として利用できる。また、これら免疫抑制活性を指標としてＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞を活性化する薬剤を探索することが出来る。【００１０】
こうして、本発明は、（１）ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋の表面マーカーをもつＴ細胞サブセットを含む免疫抑制剤、または（２）該サブセットを活性化する薬剤からなる免疫抑制剤を提供するものである。上記免疫抑制剤を個体に投与することによって、ＣＤ８＋キラーＴ細胞の活性を抑制し、その結果個体に障害を引き起こしていた免疫応答反応を特異的に抑制することができる。したがって、本発明は、上記免疫抑制剤を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において免疫応答を抑制する方法を提供する。さらに、薬理上有効な量の上記免疫抑制剤を哺乳動物に投与することを含む自己免疫疾患、移植拒絶反応、移植片対宿主反応、造血障害などの免疫異常を治療または予防する方法を提供する。また、上記免疫抑制剤を自己免疫疾患、移植拒絶反応、移植片対宿主反応、造血障害などの免疫異常の治療剤または予防剤を製造することに用いる用途を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
活性化されたＣＤ８＋ＣＤ１２２−キラーＴ細胞サブセットが、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞に比して圧倒的に多くなり、ＣＤ８＋細胞内のアンバランスが生じると免疫応答の異常が生じる。ここにＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞を投与すれば、この異常が解消されることが明らかとなった。したがって、本発明の効果は、ＣＤ８＋ＣＤ１２２−キラーＴ細胞が何らかの原因によって過度に活性化された結果としての免疫異常、すなわち種々の自己免疫疾患、移植拒絶反応、移植片対宿主反応、造血障害などに対して、その異常の要因であるＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞の量的あるいは活性の不足を解消し、もって該免疫異常を治療または予防することである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＣＤ８＋ＣＤ１２２−Ｔ細胞によるマウスの致死効果を示す図である。
【図２】ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞によるＣＤ８＋細胞とＣＤ４＋細胞からのインターフェロンγ産生の抑制効果を示す図である。
【図３】ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞によるＣＤ１２２ノックアウトマウスのＴ細胞に対する是正効果を示す図である。
【図４】ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞によるＣＤ１２２ノックアウトマウスの顆粒球に対する是正効果を示す図である。
【図５】ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞によるＣＤ１２２ノックアウトマウスの赤血球に対する是正効果を示す図である。
【図６】特定の抗原特異的Ｔ細胞に対するＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞の抑制効果を示す図である。
【図７】ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞による細胞増殖抑制の効果を示す図である。
【図８】ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞による細胞障害性Ｔ細胞（CTL）の抑制を示す図である。
【図９】ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞によるNK細胞の抑制を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の免疫抑制剤は、投与される個体自身のＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞を分離することで作製することができる。例えば、臓器や組織の移植を受けることが予定されている個体の場合には、移植を実施する前に自己血を採取し、その自己血から比重差を利用した密度勾配媒体中での遠心分離によってリンパ球分画を得、さらにマグネチックビーズに結合させた抗体やセルソーターを用いてＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞分画を無菌的に得る。得られたＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞分画はインターロイキン２などのサイトカイン等を含む適切な細胞培養液に懸濁させて増殖させ、移植と同時もしくは移植後にその個体にＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞を投与することによって移植拒絶反応や移植片対宿主反応を抑制することができる。【００１４】
ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞を増殖せしめる方法としては、ＮＯＧマウスなどの免疫不全マウスに分離した該細胞を養子移入する方法も取り得る。ＮＯＧマウスを用いた予備実験においては、このマウスに移入したヒトのＣＤ８＋Ｔ細胞が７〜８週後に１０倍以上に増えることが確認されている。このマウスの脾臓からヒトのＣＤ８＋細胞を、抗ヒトＣＤ８抗体を用いたセルソーティングによって分離できる。【００１５】
自己免疫疾患などにおいて予め発症の予測がなされずに発症した場合にも、発症個体の自己血を採取し、上記と同様にＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞を分離して増殖せしめ、これを免疫抑制剤として該個体に戻すことによって自己の組織に対する障害反応を鎮静することができる。【００１６】
また、本発明の免疫抑制剤は、ＣＤ８＋ＣＤ１２２−Ｔ細胞を個体から分離し、抗ＣＤ３抗体による刺激やインターロイキン２等のサイトカイン刺激によって活性化する条件での培養において、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞を共存させるとＣＤ８＋ＣＤ１２２−Ｔ細胞においてインターフェロンγの産生が非共存時に比して減少することを利用して、該培養時に候補物質を共存させ、あるいは予めＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞を候補物質で刺激する等の操作を加えることによってスクリーニングし、選択することが出来る。ＣＤ８＋ＣＤ１２２−Ｔ細胞の代わりにＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を用いた場合は、インターロイキン２の産生の減少を指標として同様に免疫抑制剤をスクリーニングし、選択することができる。さらに、ＮＫ細胞を用いても、その細胞傷害活性を指標として免疫抑制剤をスクリーニングし、選択することが出来る。
【実施例１】
【００１７】
リンパ球を欠損するＲＡＧ−２ノックアウトマウスに、セルソーターによって分離した正常マウス由来のＣＤ８＋ＣＤ１２２−Ｔ細胞もしくはＣＤ８＋細胞全体５０万個を経静脈的に移入し、移入後のマウスの生存率を２０週にわたって追跡した。その結果は図１に示すように、ＣＤ８＋ＣＤ１２２−Ｔ細胞を移入されたマウスは全例（１７匹）が移入後１０週以内に死亡したが、ＣＤ８＋細胞全体を移入されたマウスは全例が２０週後まで健康であった。
【実施例２】
【００１８】
セルソーターによって分離した正常マウス由来のＣＤ８＋ＣＤ１２２−Ｔ細胞５万個を、培養プレートに固層化した抗マウスＣＤ３抗体で刺激し、インターロイキン２（２５Ｕ／ｍｌ）存在下に３日間培養した。培養後に細胞を回収し、抗ＣＤ８抗体で細胞表面を染色後に細胞を固定し、細胞内のインターフェロンγを抗インターフェロンγ抗体で染色してフローサイトメトリー解析を行った。同様の実験を、培養中にＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞１万個を加えて行い、ＣＤ８＋ＣＤ１２２−Ｔ細胞からのインターフェロンγ（ＩＦＮγ）産生を調べた。【００１９】
その結果を図２に示した（図中、パネル内の数値は、インターフェロンγを産生している細胞の割合を示す）。両培養後の結果を比較すると、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞を培養に加えた場合には、その効果によってインターフェロンγ産生細胞の割合が低下していることがわかった。また、ＣＤ８＋ＣＤ１２２−Ｔ細胞の代わりにＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を用いて同様にＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞の効果を見たところ、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対してもインターフェロンγ産生を抑制する効果があることがわかった。
【実施例３】
【００２０】
セルソーターによって正常マウスから分離した細胞（ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋、ＣＤ８＋ＣＤ１２２−、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋の各細胞）５万個を、新生児のＣＤ１２２ノックアウトマウスの皮下に注射した。７週間後に、ノックアウトマウスの脾臓中のＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ６９抗体で染色してフローサイトメーターで解析することによってＴ細胞の活性化状況を見た。また同時に、末梢血の顆粒白血球数とヘマトクリットを計測した。【００２１】
その結果を図３〜図５に示した。ここで、図３のパネル内の数値は、ＣＤ６９＋の活性化Ｔ細胞の割合を示す。上段二つのパネルには、無処置の正常マウス（ＷＴ）とＣＤ１２２ノックアウトマウス（ＫＯ）の例を示す。下段には、各細胞を新生児期に移入したノックアウトマウスの状況を示す。又、図４において、無処置の正常マウス（ＷＴ）とＣＤ１２２ノックアウトマウス（ＫＯ）、及び各々のＴ細胞サブセットを移入したノックアウトマウスの末梢血中の顆粒白血球数を各５例の平均値で示す。更に、図５において、無処置の正常マウス（ＷＴ）とＣＤ１２２ノックアウトマウス（ＫＯ）、及び各々のＴ細胞サブセットを移入したノックアウトマウスのヘマトクリット値各５例の平均値を示す。【００２２】
これらの結果から、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋細胞を移入した場合にのみ、ノックアウトマウスのＴ細胞の活性化が正常近くに是正されていることがわかった。また、無処置のノックアウトマウスで見られる顆粒球の増加と貧血も、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋細胞の移入によって是正されることがわかった。
【実施例４】
【００２３】
卵白アルブミン（ＯＶＡ）の構成ペプチドに対して特異的に反応するＴ細胞受容体をもとに作られたトランスジェニックマウス（ＯＴ−１）のＴ細胞を、ＯＶＡペプチドで刺激下に培養した。この培養に、野生型Ｂ６マウスから採取したＣＤ８＋ＣＤ１２２＋細胞もしくはＣＤ８＋ＣＤ１２２−細胞を加えて共培養し、４８時間後にトランスジェニックマウスＴ細胞からのＩＦＮγの産生を細胞内サイトカイン染色とＦＡＣＳによって解析し、ＩＦＮγを産生する細胞の割合を求めた。その結果を図６（Ａ）に示した。ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋細胞と共培養された細胞では、有意にＩＦＮγを産生する細胞の割合が低下していることがわかる。次に、ＯＶＡペプチド特異的ヘルパー型Ｔ細胞クローン２種（３５−９Ｄと３５−８Ｈ）を、ＯＶＡペプチドで刺激下に野生型マウスのＣＤ８＋ＣＤ１２２＋細胞もしくはＣＤ８＋ＣＤ１２２−細胞と共培養した。培養後に、ヘルパーＴ細胞クローンからのＩＬ−２の産生を測った結果を図６（Ｂ）に示した。ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋細胞と共培養されたクローンでは、有意にＩＬ−２を産生する細胞の割合が低下していた。
【実施例５】
【００２４】
Ｂ６マウスから採取したＣＤ８＋ＣＤ１２２−細胞を蛍光物質ＣＦＳＥで標識し、固層化抗ＣＤ３抗体による刺激下に４８時間培養した。図７にその結果を示す。ＣＤ８＋ＣＤ１２２−細胞単独の培養では、細胞増殖が起こり細胞分裂を起こしたＣＦＳＥ蛍光の減弱した細胞が認められるた。一方、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋細胞（ＣＤ８＋ＣＤ１２２−細胞の４分の 1の数）と共培養されたＣＤ８＋ＣＤ１２２−細胞は、ＣＦＳＥ蛍光の減弱が認められず、細胞増殖を起こしていないことがわかる。
【実施例６】
【００２５】
Ｂ６マウスから採取したＴ細胞を、放射線照射したＢＡＬＢ／ｃマウス脾細胞と５日間の混合培養（ＭＬＣ）を行い、同種特異的ＣＴＬを誘導した。ＭＬＣの開始日（ｄａｙ０−５）、第３日（ｄａｙ３−５）もしくは第５日（ｄａｙ５）に、Ｂ６マウスから採取したＣＤ８＋ＣＤ１２２＋細胞を加え、ＭＬＣの後にブラスト化ＢＡＬＢ／ｃ細胞を標的とした細胞障害性試験を行った。その結果を図８に示す。ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋細胞をＭＬＣに加えなかった群と比較して、有意にＣＴＬ活性の低下が認められたものは、ＭＬＣの３日目にＣＤ８＋ＣＤ１２２＋細胞を加えたものであった。
【実施例７】
【００２６】
Ｂ６マウスにｐｏｌｙ［Ｉ］：［Ｃ］を腹腔内投与した後に脾細胞を回収し、ＩＬ−１２存在下に４２時間培養して活性化ＮＫ細胞を誘導した。培養中に、Ｂ６マウスから調製したＣＤ８＋ＣＤ１２２＋細胞もしくはＣＤ８＋ＣＤ１２２−細胞を添加し、培養後にＹＡＣ−１細胞を標的としたＮＫ活性の測定を行った。その結果を図９に示す。ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋細胞を添加して共培養を行った場合には、ＣＤ８＋ＣＤ１２２−細胞を添加した場合よりもＮＫ細胞の活性誘導が抑えられることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明は自己免疫疾患、移植拒絶反応、移植片対宿主反応、造血障害反応などの重篤な免疫異常疾患の治療または予防に利用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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