(57)【要約】  本発明は、グルコサミンまたはその誘導体を含む分化誘導培地中で、軟骨細胞に分化可能な細胞を、軟骨細胞に分化するに十分な期間培養する工程からなる軟骨細胞を含む移植用細胞調製物の製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコサミンまたはその誘導体を含む分化誘導培地中で、軟骨細胞に分化可能な細胞を、軟骨細胞に分化するに十分な期間培養する工程からなる軟骨細胞を含む移植用細胞調製物の製造方法。
【請求項２】
前記グルコサミンまたはその誘導体が分化誘導培地中に０．００１〜１０ｍｇ/ｍｌの範囲で存在する請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記グルコサミンまたはその誘導体が、グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよびカルボキシメチルキチンからなる群より選択される請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記軟骨細胞に分化可能な細胞が脱分化軟骨細胞である請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
前記培養工程の前に、前記軟骨細胞に分化可能な細胞を増殖させる工程をさらに含む請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
前記培養工程中または該工程後に、軟骨細胞が三次元組織化される請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法により製造された、軟骨細胞を含む移植用細胞調製物。
【請求項８】
グルコサミンまたはその誘導体の、軟骨細胞に分化可能な細胞の分化誘導促進剤としての使用。
【請求項９】
前記グルコサミンまたはその誘導体が、グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよびカルボキシメチルキチンからなる群より選択される請求項８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、移植用軟骨細胞調製物の製造方法に関する。具体的には、軟骨細胞に分化可能な細胞の軟骨細胞への分化誘導を促進することにより、関節軟骨欠損部を修復するのに適した移植用軟骨細胞調製物を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
軟骨細胞は、高度に分化した細胞でありほとんど分裂・増殖せず、その修復能力は極端に低い。従来、軽度の変形性膝関節症や離断性の軟骨欠損の再生・修復には、軟骨層下の骨から組織修復能力が高い骨髄由来細胞を供給するマイクロフラクチャー術が行なわれてきた。しかしながら、本手法の適用は軽度の軟骨欠損に限定され、また一過性の症状改善はみられるものの経時的に悪化することが知られている。【０００３】
また、患者自身の非荷重領域軟骨から健全な軟骨を取出して、欠損部にモザイク状に移植するモザイクプラスティと呼ばれる治療方法が開発された。しかしながら、この治療法も、採取可能な健全軟骨の量に限界があるため、適用が限られ、さらに患者の負担も大きいという欠点があった。【０００４】
近年、自家軟骨細胞を培養し移植する自家軟骨細胞移植術（ACI）が開発され、Genzyme社がCarticelとして商品化している（J.B. Richardsonら：非特許文献１；http://www.genzymebiosurgery.com/prod/cartilage/gzbx_p_pt_cartilage.aspもまた参照）。この手法は、患者から採取した軟骨細胞を増殖後、軟骨欠損部位に移植するものであり、移植に必要な量の軟骨細胞を増殖により確保できるため、サイズの大きな軟骨欠損にも適用可能な治療法として期待されている。しかしながら、採取された軟骨細胞は、単層培養中に脱分化を起こして本来の分化機能を消失してしまい、培養軟骨細胞により修復された軟骨層は関節軟骨本来の硝子軟骨組織ではなく線維軟骨組織が主体である等の欠点を有する。【０００５】
上記ACI（およびCarticel）における欠点である軟骨細胞の脱分化を抑制する試みとして、１）マイクロ・マス・カルチャーなどの高密度培養法（Park JSら：非特許文献２）や、２）ポリマー基材やコラーゲンゲル培養等による三次元培養技術（S.Kawamuraら：非特許文献３）が挙げられる。しかしながら、これらの手法においても、埋植に必要な軟骨細胞の量を確保するためには、依然として、予め単層培養にて増殖させることが必要であり、この増殖過程中の軟骨細胞の脱分化が避けられないことが多い。また、一度脱分化した細胞を軟骨細胞に再分化させるには、三次元培養においても長時間を要する。
【非特許文献１】J Bone Joint Surg [Br] 1998;81-B:1064-8
【非特許文献２】Yonsei Med J. 1994 Dec;35(4):378-87
【非特許文献３】Acta Orthop Scand 1998;69(1):56-62
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明の目的は、軟骨細胞に分化可能な細胞を分化誘導する過程において、軟骨細胞に分化可能な細胞の軟骨細胞への分化を促進または効率化して、軟骨の移植処置に適切な移植用細胞調製物を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、グルコサミンまたはその誘導体を含む分化誘導培地中で軟骨細胞に分化可能な細胞を培養することにより、軟骨細胞に分化可能な細胞の軟骨細胞への分化が促進または効率化されることを見出し、本発明に至った。【０００８】
したがって、本発明は、グルコサミンまたはその誘導体を含む分化誘導培地中で、軟骨細胞に分化可能な細胞を、軟骨細胞に分化するに十分な期間培養する工程からなる軟骨細胞を含む移植用細胞調製物の製造方法及び該方法により製造された軟骨細胞を含む移植用細胞調製物を提供する。【０００９】
本発明はまた、グルコサミンまたはその誘導体の、軟骨細胞または軟骨細胞に分化可能な細胞の分化誘導促進剤としての使用を提供する。【００１０】
本発明は更に、グルコサミンまたはその誘導体を含む分化誘導培地中で、軟骨細胞に分化可能な細胞を、軟骨細胞に分化するに十分な期間培養する工程からなる細胞培養方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、軟骨細胞に分化可能な細胞から軟骨細胞を効率的に得ることが可能となり、よって正常な軟骨組織の再生に適切な軟骨細胞を含む細胞調製物を容易に製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】コントロール群、ＣＭキチン添加群、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン添加群、Ｄ−グルコサミン添加群の細胞溶解物中のタイプＩＩコラーゲン量をウェスタンブロッティングにより相対比較で示した写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明に使用し得る「軟骨細胞に分化可能な細胞」とは、脱分化軟骨細胞、間葉系幹細胞（軟骨前駆細胞を含む）、および胚性幹細胞をいう。「軟骨細胞」は、軟骨を構成する、タイプＩＩコラーゲンを産生することができる細胞であり、増殖能が著しく低い。軟骨細胞は、動物（好ましくはヒト）の軟骨組織を酵素処理（例えば、トリプシン処理および/またはコラゲナーゼ処理）することにより結合組織から細胞を分離することによって得ることができる。「脱分化軟骨細胞」は、軟骨細胞がタイプＩＩコラーゲン産生能を失い、代わりにタイプＩコラーゲンを産生するようになった細胞であり、増殖能を有する。脱分化軟骨細胞は、一般には、軟骨細胞を一定期間（例えば２週間以上）単層培養することにより得られる。「間葉系幹細胞」は、間葉系細胞に分化する能力を持った幹細胞の一つであり、骨、軟骨、脂肪細胞に分化し得る。間葉系幹細胞は、動物（好ましくはヒト）の骨髄、骨膜、脂肪組織、末梢血、さい帯血のような組織に含まれる細胞のうち付着性を有する細胞として得ることができる。また、あらかじめ軟骨へ分化するよう体内で誘導された軟骨前駆細胞も含まれる。「胚性幹細胞」（ES細胞）は、あらゆる臓器へ分化する能力を潜在的に有する未分化な細胞である。胚性幹細胞は、受精卵がある程度分裂した過程（約５〜６日間）で形成される胚盤胞より内部細胞塊を取り出し、LIF(leukemia inhibitory factor)の存在下でフィーダー細胞と共培養することにより得ることができる。【００１４】
上記細胞は、動物、特に哺乳動物(例えばヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヒヒ)由来の細胞を使用することができるが、ヒト由来細胞が特に好ましい。また、これら細胞は、本発明の製造方法で製造される移植用細胞調製物のレシピエントの自家細胞または同種細胞が好ましく、自家細胞が特に好ましい。軟骨細胞は非荷重部軟骨組織から採取するのが好ましい。【００１５】
上記軟骨細胞に分化可能な細胞は、グルコサミンまたはその誘導体を含む分化誘導培地中で、軟骨細胞に分化するに十分な期間培養される。グルコサミンとしては、Ｄ−グルコサミンが好ましい。Ｄ−グルコサミンは塩酸塩あるいは硫酸塩として添加されてもよい。グルコサミンの誘導体は、例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−プロピオニル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−ブチリル−Ｄ−グルコサミンのようなＮ−アシル化グルコサミン、およびカルボキシメチルキチンのようなポリマー（ダイマー、トリマー、テトラマー、オリゴマーのような低重合体を含む）を含み、好ましくはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンまたはカルボキシメチルキチンである。これらの物質は、単独でまたは組合せで使用できる。グルコサミンまたはその誘導体は、分化誘導培地中に、０．００１〜１０ｍｇ/ｍｌの範囲で、好ましくは０．０１〜５ｍｇ/ｍｌの範囲で、より好ましくは０．０５〜５ｍｇ/ｍｌの範囲であり、最も好ましくは０．２〜２ｍｇ/ｍｌの範囲で存在するように添加される。【００１６】
分化誘導培地は、当該分野において公知のものを使用できるが、基本の細胞培養培地に分化誘導因子を添加して作成してもよい。細胞培養用培地は、好ましくは動物細胞用培地であり、より好ましくは無血清の動物細胞用培養培地である。細胞培養培地としては、特に限定されず、一般には当該分野において公知の培地から使用する細胞に適切な培地を選択できるが、使用する細胞のために特別に処方された培地を用いることもできる。これらの培地は必要に応じて適切に改変してもよい。当該分野において公知の培地には、例えばイーグル培地のような最少必須培地（MEM）、Dulbecco改変イーグル培地（DMEM）、α−MEM、Ham's F-12およびF-10培地、DMEM/F12培地、Williams培地Ｅ、RPMI-1640培地、MCDB培地、199培地、Fisher培地、Iscove改変Dulbecco培地（IMDM）、McCoy改変培地が含まれるがこれらに限定されない。これらの培地には、必要であれば、ペニシリン、ストレプトマイシンなどのような抗生物質も添加してもよい。また、必要に応じて、種々の成長因子/増殖因子、栄養因子、接着因子なども培地に添加することができる。このような添加剤には、例えば、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGFまたはFGF-2）、トランスフェリン、インスリン、インスリン様成長因子（IGF）、ヒアルロン酸、アスコルビン酸、亜セレン酸、リノレイン酸、ピルビン酸が含まれる。【００１７】
本発明において使用可能な分化誘導因子には、トランスフォーミング増殖因子−β（TGFβ；例えばTGF-β1およびTGF-β3）、骨形成因子（BMP）（例えばBMP-2、BMP-4、BMP-6）およびグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）、インヒビンＡ、軟骨形成刺激活性因子（CSA）、コンドロモジュリン（ChM）（ChM-1）、カドヘリンが挙げられるがこれらに限定されない。【００１８】
分化誘導培養は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、すなわちディッシュ、ウェル、シャーレ、ボトル、フラスコなどの培養容器中で行なわれる。培養温度は、２５℃〜４５℃、好ましくは３０℃〜４０℃、より好ましくは３５℃〜３８℃である。細胞培養培地のｐＨ値は、一般に７〜９、好ましくは７．５〜８．５である。一般には、培養は、例えばＣＯ2インキュベータを用いて、約３％〜１０％のＣＯ2雰囲気下で行なう。【００１９】
分化誘導培養のための期間は、軟骨細胞に分化可能な細胞が軟骨細胞に分化するに十分な期間であればよく特に限定されないが、例えば３日以上、４日以上、１週間以上、２週間以上、３週間以上、４週間以上であり、具体的には、例えば、３日〜１２週間、３日〜１０週間、３日〜８週間、３日〜６週間、３日〜４週間、３日〜３週間、３日〜２週間、３日〜１週間、４日〜１２週間、４日〜１０週間、４日〜８週間、４日〜６週間、４日〜４週間、４日〜３週間、４日〜２週間、４日〜１週間、４日〜１２週間、４日〜１０週間、４日〜８週間、４日〜６週間、４日〜４週間、４日〜３週間、４日〜２週間、４日〜１週間、１週間〜１２週間、１週間〜１０週間、１週間〜８週間、１週間〜６週間、１週間〜４週間、１週間〜３週間、１週間〜２週間、２週間〜１２週間、２週間〜１０週間、２週間〜８週間、２週間〜６週間、２週間〜４週間、２週間〜３週間、３週間〜１２週間、３週間〜１０週間、３週間〜８週間、３週間〜６週間、３週間〜４週間、４週間〜１２週間、４週間〜１０週間、４週間〜８週間、４週間〜６週間、４週間から５週間であり得る。培養期間中、培地は、通常１週間で、好ましくは５〜６日で、より好ましくは３日〜４日で、さらに好ましくは２日で、最も好ましくは毎日、新鮮なものに交換する。【００２０】
分化誘導のために播種する細胞の数もまた、特に限定されず、必要に応じて選択されるが、例えば、一般に１×１０4〜１×１０7細胞/ｃｍ2、好ましくは１×１０5〜１×１０7細胞/ｃｍ2、より好ましくは１×１０6〜１×１０7細胞/ｃｍ2である【００２１】
軟骨細胞への分化は、軟骨細胞に特徴的なタイプＩＩコラーゲンおよびコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを指標として、組織化学的に確認することができる。例えば、タイプＩＩコラーゲンに特異的な結合性を有する抗体を用いた免疫組織化学染色により、軟骨細胞の存在を確認できる。また、ＲＴ−ＰＣＲ法によりタイプＩＩコラーゲンおよびプロテオグリカンのｍＲＮＡを検出することによっても軟骨細胞への分化を確認できる。さらには、ELISA法により上記細胞外基質の産生量を定量的に評価することも可能である。【００２２】
本発明の製造方法の好ましい実施形態において、軟骨細胞に分化可能な細胞は、グルコサミンまたはその誘導体を含む分化誘導培地中で軟骨細胞に分化するに十分な期間培養する工程に付される前に増殖される。増殖工程は、移植に必要な軟骨細胞の数を確保するために必要となり得る。増殖工程は、上記のような当該分野において公知の培地中で行なわれ得る。増殖のためには、上記のような細胞培養用培地に、軟骨細胞に分化可能な細胞の増殖を刺激し得る因子を添加する。このような因子には、例えば、血清（例えば、ヒト血清またはウシ血清）、軟骨由来因子（CDF）、血小板由来増殖因子（PDGF）、血管内皮細胞増殖因子(VEGF）、繊維芽細胞増殖因子(FGF)、インスリン、インスリン用成長因子(IGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、コロニー刺激因子(CSF)、アスコルビン酸、血清アルブミン、トランスフェリン、亜セレン酸、リノレイン酸、ピルビン酸が含まれる。増殖培養のための期間は、移植に必要な量の軟骨細胞を得られるような軟骨細胞に分化可能な細胞の数を確保するに十分な期間であればよく特に限定されない。培養期間中、培地は、通常１週間で、好ましくは５〜６日で、より好ましくは３日〜４日で、さらに好ましくは２日で、最も好ましくは毎日、新鮮なものに交換する。【００２３】
本発明の製造方法の別の好ましい実施形態において、軟骨細胞に分化可能な細胞から分化した軟骨細胞は三次元組織化される。三次元組織化は、分化誘導培地中で同時に行なってもよいし、または分化誘導後に別工程として行なってもよい。軟骨細胞を三次元組織化するには、細胞成長の足場を提供する基材上で培養する。基材は、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイトまたはこれらの混合物のような無機材料（好ましくはセラミックスとする）；アルミナ、Ｔｉ、Ｔｉ合金、Ｃｏ−Ｃｒのような金属材料；ポリ乳酸（ＰＬＡ）（ポリ−Ｌ−乳酸、ポリ−Ｄ−乳酸、ポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、乳酸／グリコール酸コポリマー、ポリεカプロラクトン（ＰＣＬ）、乳酸／εカプロラクトンコポリマー、ポリエチレングリコール酸のような高分子材料；あるいはフィブリン、例えばタイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＶコラーゲンのようなコラーゲンまたはこれらのアテロコラーゲン、寒天またはゼラチンから作成される。細胞と共に被検体に移植することを意図する場合、基材は生体適合性および/または生分解性材料から作成されていることが好ましい。基材は、例えば、多孔質、繊維状、シート状、メッシュ状、スポンジ状、ゲル状であることができる。基材が生体適合性および/または生分解性の基材、例えば、ポリ乳酸（ＰＬＡ）（ポリ−Ｌ−乳酸、ポリ−Ｄ−乳酸、ポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、乳酸／グリコール酸コポリマー、ポリεカプロラクトン（ＰＣＬ）、乳酸／εカプロラクトンコポリマー、ポリエチレングリコール酸、ヒアルロン酸、アルギン酸のような高分子材料；あるいはフィブリン、例えばタイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＶコラーゲンのようなコラーゲンまたはこれらのアテロコラーゲン、寒天またはゼラチンから作成された基材であれば、そのような基材は最終的な移植用細胞調製物中に含まれてもよい。【００２４】
分化誘導培地から軟骨細胞を回収する。このとき、軟骨細胞は、培地（例えばグルコサミンまたはその誘導体を任意に含む分化誘導培地）中に回収してもよいし、他の生理学的に受容可能な溶液、例えば生理食塩水又は緩衝液（例えば、Dulbeccoリン酸緩衝生理食塩水、Hanks平衡塩溶液）中に回収してもよい。グルコサミンまたはその誘導体の濃度は、０．００１〜１０ｍｇ/ｍｌの範囲、好ましくは０．０１〜５ｍｇ/ｍｌの範囲、より好ましくは０．０５〜５ｍｇ/ｍｌの範囲であり、最も好ましくは０．２〜２ｍｇ/ｍｌの範囲であり得る。軟骨細胞が三次元組織化されている場合には、三次元組織化に使用した基材とともに軟骨細胞を回収してもよい。【００２５】
本発明の移植用細胞調製物においては、好ましくは、その調製物に含まれる全細胞（軟骨細胞＋軟骨細胞に分化可能な細胞）の少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、なお好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、なおさらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％が軟骨細胞である。【００２６】
本発明の移植用細胞調製物中の軟骨細胞細胞密度は高い状態にすることが好ましく、例えば細胞密度を１×１０7個／ｃｍ3以上、具体的には例えば１×１０8個／ｃｍ3〜１×１０9個／ｃｍ3とすることが好ましい。【００２７】
本発明の移植用細胞調製物において、軟骨細胞は、水性媒体（例えば上記のような培地又は生理学的緩衝液）中で懸濁状態であってもよい。移植用細胞調製物は、軟骨細胞に加えて、可溶化コラーゲンを含んでいてもよい。【００２８】
或いは、本発明の移植用細胞調製物において、軟骨細胞は、生体適合性および/または生分解性のキャリア（好ましくはゲル状又はスポンジ状）、例えば、ポリ乳酸（ＰＬＡ）（ポリ−Ｌ−乳酸、ポリ−Ｄ−乳酸、ポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、乳酸／グリコール酸コポリマー、ポリεカプロラクトン（ＰＣＬ）、乳酸／εカプロラクトンコポリマー、ポリエチレングリコール酸、ヒアルロン酸、アルギン酸のような高分子材料；あるいはフィブリン若しくはフィブリン糊、例えばタイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＶコラーゲンのようなコラーゲン若しくはこれらのアテロコラーゲン、寒天またはゼラチン中に包埋されていてもよい。【００２９】
本発明の移植用細胞調製物は更に、10％ヒト血清(特には、移植される患者本人の自家血清)を含有してもよい。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明の内容を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら制限されるものではない。【００３１】
インビトロにおけるヒト軟骨細胞の再分化
購入したヒト正常軟骨細胞（ＮＨＡＣ−ｋｎ，Ｌｏｔ  Ｎｏ．１Ｆ２１５３，ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，ＵＳＡ；入手時点で２継代）を専用培地（Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＣＧＭ［商標］）  Ｂｕｌｌｅｔ  Ｋｉｔ  ＣＣ−３２１６：ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，ＵＳＡ）で１継代単層培養し、トリプシン処理により軟骨細胞を回収した。次いで、２４ウェルプレートの各ウェルに１．８×１０5細胞／ｃｍ2の細胞密度で播種後、５％ＣＯ2インキュベータ内に３７．０℃で静置した。３時間後に細胞接着を確認後、脱分化細胞を、分化誘導因子としてＴＧＦ−β１を含む専用分化誘導培地（Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔ  Ｋｉｔ  ＣＣ−３２２５：ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，ＵＳＡ）で培養することにより再分化を誘導した。この際、細胞を４群に分け、このうち３群のＣＧＭ培地には、それぞれ、１）１ｍｇ／ｍｌのＤ−グルコサミン（キッコーマン，日本）、２）１ｍｇ／ｍｌのＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ［商標］，ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）、３）１ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチルキチン（甲陽ケミカル，日本）を添加した。残る１群のＣＧＭ培地には何も添加せず、４）コントロール群として用いた。１、２、３週間後に細胞をセルスクレーバで回収して、インビトロ評価の検体とした。細胞を回収する緩衝液には、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を２００μｌ／ウェルで使用した。【００３２】
タイプＩＩコラーゲン産生の評価
ウェスタンブロッティング法により、細胞外基質中に発現されたタイプＩＩコラーゲン量をタンパク質レベルで評価した。まず、回収した細胞を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で溶解して細胞溶解物とした。５％分離ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により、１レーンあたり５μｇの細胞溶解物を電気泳動して分離し、これをセミドライブロッティング法によりＰＶＤＦ膜に転写した。なお、転写後のアクリルアミドゲルをクマシー・ブリリアントブルーＲ２５０に染色することにより、タンパク質の転写効率に検体間で相違が無いことを確認した。転写後のＰＶＤＦ膜をＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）によるブロッキングした後、抗ヒトタイプＩＩコラーゲン−マウスポリクローナル抗体（一次抗体；ＣＨＥＭＩＣＯＮ，ＵＳＡ）と４℃で一晩反応させた。反応後の膜をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄後、ＡＬＰ標識された抗マウスＩｇＧ−ヤギアフィニティー精製抗体（二次抗体）とさらに反応させた。ＰＢＳでの洗浄後、ＰＶＤＦ膜上に存在するＡＬＰをＮＢＴ／ＢＣＩＰ系発色基質により発色させた。【００３３】
結果を図１に示す。使用した一次抗体はタイプＩＩコラーゲンを構成するα１（ＩＩ）鎖を特異的に認識するので、図１中に示された結合活性は、各細胞溶解物中のタイプＩＩコラーゲンおよびその分解物の存在（およびその量）を証明する。コントロール群では、分化誘導前（ｔ＝０）に比べ、分化誘導後１週目でわずかにタイプＩＩコラーゲン量の増加がみられるものの、２週、３週と経過するに従い減少した（図１Ａ、左の３つのレーン）。一方、カルボキシメチルキチンを分化誘導培地に添加した群では、１週目よりコントロール群と比べて顕著なタイプＩＩコラーゲン量の増加が認められ、この高レベルのタイプＩＩコラーゲン量は、評価した３週目まで維持された（図１Ａ、右の３つのレーン）。Ｄ−グルコサミン添加群およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン添加群においても、カルボキシメチルキチン添加群と同様に、顕著なタイプＩＩコラーゲン量の増加および増加状態の維持が観察された（図１Ｂ）。このことは、コントロール群においては、分化誘導因子により脱分化軟骨細胞は一旦軟骨細胞に分化するが、その後の培養継続により、再び脱分化状態に戻ってしまうことを示す。これに対し、グルコサミン添加群、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン添加群およびカルボキシメチルキチン添加群においては、脱分化軟骨細胞が、タイプＩＩコラーゲンを産生する能力を有する軟骨細胞に効率的に分化し、そしてその分化状態が長期間（実施例では、３週間以上）維持されることを示している。【００３４】
以上の結果より、グルコサミン、ならびにＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよびカルボキシメチルキチンを含むグルコサミンの誘導体は、軟骨細胞に分化可能な細胞の軟骨細胞への分化を促進する効果を有し、よって軟骨細胞に分化可能な細胞の培養補助剤として有用であることが示された。【００３５】
上記の実施形態および実施例は、本発明の理解を容易にするために例示として記載されたものであって、本発明は本明細書または添付図面に記載された具体的な構成および配置のみに限定されるものではないことに留意すべきである。本明細書に記載した具体的構成、手段、方法、および装置は、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、変更又は変形が可能であり、そのような変更例及び変形例もまた本発明に包含されることを、当業者は容易に認識する。【００３６】
この出願は、２００５年２月３日に出願された日本国特許出願  特願２００５−０２７８０８号に関する。
本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、適用される特許法が許す範囲内で、言及によって、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容全体が本明細書に組み込まれているものとみなされる。
【図１】
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【国際調査報告】
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