(57)【要約】  対物レンズ２１及び試料Ｓの光像を第１光路及び第２光路へと分岐するビームスプリッタ２５を含む導光光学系２０と、第１光路上に設置されて試料Ｓの画像の取得に用いられる光検出器３１と、第２光路上に設置されて焦点制御用の２次元の画像を取得するＣＣＤカメラ３２とを備えて顕微鏡装置を構成する。また、カメラ３２を、ｚ軸方向に沿って導光光学系２０での光路長が変化するように、光路に対して角度θで傾いた状態で設置する。そして、このカメラ３２によって取得された画像を焦点制御部３７で解析し、その解析結果に基づいて試料Ｓに対する撮像の焦点を制御する。これにより、試料の画像取得と、撮像の焦点制御とを同時に行うことが可能な顕微鏡装置が実現される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の光像を画像取得用の第１光路及び焦点制御用の第２光路へと分岐する光分岐手段を含む導光光学系と、
前記第１光路上に設置され、前記第１光路へと分岐された前記光像による１次元または２次元の第１画像の取得に用いられる第１撮像手段と、
前記第２光路上に、その撮像面内において所定の変化方向に沿って前記導光光学系での光路長が変化するように構成され、前記第２光路へと分岐された前記光像による焦点制御用の２次元の第２画像を取得する第２撮像手段と、
前記第２撮像手段によって取得された前記第２画像を解析し、その解析結果に基づいて前記第１撮像手段による撮像の焦点を制御する焦点制御手段と、
前記第１撮像手段による前記第１画像の取得を制御する画像取得制御手段と
を備えることを特徴とする顕微鏡装置。
【請求項２】
前記第２撮像手段は、
前記変化方向に沿って前記光路長が変化するように撮像面が前記第２光路に対して所定角度で傾いた状態で設置された撮像装置
を有することを特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
【請求項３】
前記第２撮像手段は、
撮像装置と、
前記撮像装置の撮像面に対して所定位置に、前記変化方向に沿って前記光路長が変化するように設置された光路長変更手段と
を有することを特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
前記第２撮像手段は、前記光路長変更手段として、前記撮像装置の撮像面の一の撮像領域に対して所定位置に、前記変化方向に沿って光路長が変化するように設置された一の光路長変更手段と、前記撮像装置の撮像面の他の撮像領域に対して所定位置に、前記変化方向に沿うとともに前記一の光路長変更手段とは異なる変化率で光路長が変化するように設置された他の光路長変更手段とを有することを特徴とする請求項３記載の顕微鏡装置。
【請求項５】
前記第２画像を取得するための前記光像を、前記一の光路長変更手段及び前記撮像装置の撮像面の前記一の撮像領域への一の光路、及び前記他の光路長変更手段及び前記撮像装置の撮像面の前記他の撮像領域への他の光路へと分岐する光分岐光学系を備えることを特徴とする請求項４記載の顕微鏡装置。
【請求項６】
前記第２撮像手段は、撮像面内において前記変化方向に沿って光路長が変化するように配置された一の撮像装置と、撮像面内において前記変化方向に沿うとともに前記一の撮像装置とは異なる変化率で光路長が変化するように配置された他の撮像装置との２つの撮像装置を有することを特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
【請求項７】
前記第１光路上に配置された第１結像レンズ、及び前記第２光路上に配置された第２結像レンズを備え、前記第２結像レンズは、前記第１結像レンズよりも結像倍率が小さいことを特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
【請求項８】
前記焦点制御手段は、前記第２画像における前記変化方向についての画像のコントラスト変化を解析し、その解析結果に基づいて撮像の焦点を制御することを特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
【請求項９】
前記焦点制御手段は、前記第２画像から前記変化方向に沿った所定幅の計測対象画像を切り出し、前記計測対象画像、及び前記計測対象画像を前記変化方向と垂直方向にシフトさせたシフト画像の差分絶対値画像によって前記画像のコントラスト変化を解析することを特徴とする請求項８記載の顕微鏡装置。
【請求項１０】
前記焦点制御手段は、前記第２画像が撮像の焦点の制御に適用可能な画像であるかどうかを判断し、適用可能と判断した場合に前記第２画像を解析し、その解析結果に基づいて撮像の焦点を制御することを特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料の画像の取得に用いられる顕微鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
顕微鏡を用いて試料の画像を取得する場合、装置内の光学系、機構系の傾き、あるいは試料自体の傾き、凹凸形状などによる焦点ずれが問題となる。これに対して、従来、顕微鏡装置において、ＣＣＤカメラなどの撮像装置による撮像の焦点を自動的に制御する自動焦点（オートフォーカス）が行われている。このような自動焦点を行う装置としては、例えば、文献１：特許第３３９０１０６号公報、文献２：特開平９−２３０２５０号公報、文献３：特開平８−２１９６１号公報、文献４：特開平１１−２６４９３７号公報に記載された装置がある。
【特許文献１】特許第３３９０１０６号公報
【特許文献２】特開平９−２３０２５０号公報
【特許文献３】特開平８−２１９６１号公報
【特許文献４】特開平１１−２６４９３７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記文献のうち、文献１に記載された顕微鏡では、光軸に対して傾いた状態で設置されたラインセンサと、ラインセンサの前段に配置された回動する反射鏡とを用いる。そして、試料にレーザ光を照射して、反射鏡を介してラインセンサに入射される反射レーザ光の光量を参照して焦点を制御している。また、文献２に記載された顕微鏡では、光量を検出するフォトセンサと、フォトセンサの前段に配置された厚み変化ガラスとを用いる。そして、上記文献１と同様に試料にレーザ光を照射して、厚み変化ガラスを介してフォトセンサに入射される反射レーザ光の光量を参照して焦点を制御している。【０００４】
しかしながら、これらの装置構成では、焦点を制御する際に、焦点計測用のレーザ光を試料に照射する必要がある。このため、撮像装置によって試料の画像を取得するための撮像の焦点制御と、レーザ光を照射しない状態で撮像装置によって行われる実際の画像取得とを同時に行うことができないという問題がある。【０００５】
一方、文献３に記載された顕微鏡の自動焦点装置では、試料の画像を取得するための撮像装置において、光軸に対して垂直になる垂直位置と、所定角度で傾いた傾斜位置とで取付け角度を変化させて焦点の制御を行っている。しかしながら、このような装置構成では、撮像装置の位置を変化させる必要があるため、上記したレーザ光を照射する構成と同様に、撮像の焦点制御と、実際の画像取得とを同時に行うことができない。また、撮像装置の位置制御が必要なため、全体として撮像動作が複雑化するという問題がある。【０００６】
また、文献４に記載された顕微鏡では、自動焦点調整部において、結像光学系から分岐された光像を検出するセンサ部を設けている。そして、このセンサ部を予定焦点面の前方及び後方にずらして、２つの光像のコントラストレベルの差分を検出して焦点調整を行っている。しかしながら、このような装置構成では、センサ部を移動させて２つの光像を取得しなくてはならないため、その装置構成や撮像動作が複雑化する。また、センサ部を移動させる際に、試料とセンサ部との間の光路長が固定されないうちに試料の光像を取り込むと光像がぼやけてしまうため、その光路長が固定されるまでの待ち時間が必要となる。このため、焦点調整及び試料の画像取得を短時間で行うことができないという問題がある。【０００７】
本発明は、以上の問題点を解決するためになされたものであり、試料の画像取得と、撮像の焦点制御とを同時に行うことが可能な顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
このような目的を達成するために、本発明による顕微鏡装置は、（１）試料の光像を画像取得用の第１光路及び焦点制御用の第２光路へと分岐する光分岐手段を含む導光光学系と、（２）第１光路上に設置され、第１光路へと分岐された光像による１次元または２次元の第１画像の取得に用いられる第１撮像手段と、（３）第２光路上に、その撮像面内において所定の変化方向に沿って導光光学系での光路長が変化するように構成され、第２光路へと分岐された光像による焦点制御用の２次元の第２画像を取得する第２撮像手段と、（４）第２撮像手段によって取得された第２画像を解析し、その解析結果に基づいて第１撮像手段による撮像の焦点を制御する焦点制御手段と、（５）第１撮像手段による第１画像の取得を制御する画像取得制御手段とを備えることを特徴とする。【０００９】
上記した顕微鏡装置においては、画像取得の対象となる試料に対して、第１撮像手段及び第２撮像手段の２つの撮像手段を設けている。これにより、第１撮像手段による実際の画像取得と、第２撮像手段による焦点制御用の画像取得とを別に行うことが可能となる。このような構成では、例えば、試料の画像取得と、撮像の焦点制御とを同時に行うことも可能である。【００１０】
さらに、上記した装置では、焦点制御に用いられる第２撮像手段として、２次元の画像を取得可能な撮像手段を用いるとともに、光像が試料から導光される光路長が所定方向で変化する撮像条件となるように撮像手段を配置している。このような撮像手段を用いて取得された２次元の画像を解析して焦点制御を行う構成によれば、試料への焦点計測用のレーザ光の照射等が不要となる。したがって、試料の画像取得と、撮像の焦点制御とを好適に両立することができる。なお、画像取得制御手段は、さらに試料に対する撮像位置の設定を制御することとしても良い。【００１１】
ここで、焦点制御用の画像を取得するための第２撮像手段の具体的な構成については、第２撮像手段は、変化方向に沿って光路長が変化するように撮像面が第２光路に対して所定角度で傾いた状態で設置された撮像装置を有する構成を用いることができる。このような構成によれば、焦点制御用の画像取得を好適に行うことができる。【００１２】
あるいは、第２撮像手段は、撮像装置と、撮像装置の撮像面に対して所定位置に、変化方向に沿って光路長が変化するように設置された光路長変更手段とを有する構成を用いることができる。このような構成によっても、焦点制御用の画像取得を好適に行うことができる。このような光路長変更手段としては、例えば、所定勾配のウエッジ形状に形成され光を透過する光路長変更部材がある。【００１３】
この場合、第２撮像手段は、光路長変更手段として、撮像装置の撮像面の一の撮像領域に対して所定位置に、変化方向に沿って光路長が変化するように設置された一の光路長変更手段と、撮像装置の撮像面の他の撮像領域に対して所定位置に、変化方向に沿うとともに上記一の光路長変更手段とは異なる変化率で光路長が変化するように設置された他の光路長変更手段とを有する構成としても良い。また、このような構成では、２つの光路長変更手段について、互いに逆方向に光路長が変化するように構成することが好ましい。これにより、焦点制御の精度を向上することができる。【００１４】
また、第２撮像手段は、撮像面内において変化方向に沿って光路長が変化するように配置された一の撮像装置と、撮像面内において変化方向に沿うとともに上記一の撮像装置とは異なる変化率で光路長が変化するように配置された他の撮像装置との２つの撮像装置を有する構成としても良い。また、このような構成では、２つの撮像装置について、互いに逆方向に光路長が変化するように構成することが好ましい。これにより、焦点制御の精度を向上することができる。【００１５】
また、顕微鏡装置は、第１光路上に配置された第１結像レンズ、及び第２光路上に配置された第２結像レンズを備え、第２結像レンズは、第１結像レンズよりも結像倍率が小さい構成としても良い。これにより、第１光路における第１画像の取得、及び第２光路における第２画像の取得をそれぞれ好適に行うことができる。【００１６】
第２撮像手段によって取得された第２画像を用いた焦点制御については、焦点制御手段は、第２画像における変化方向についての画像のコントラスト変化を解析し、その解析結果に基づいて撮像の焦点を制御することが好ましい。これにより、試料の光像による２次元の画像を用いた撮像の焦点制御を精度良く実現することができる。【００１７】
この場合、具体的には、焦点制御手段は、第２画像から変化方向に沿った所定幅の計測対象画像を切り出し、計測対象画像、及び計測対象画像を変化方向と垂直方向にシフトさせたシフト画像の差分絶対値画像によって画像のコントラスト変化を解析する構成を用いることが好ましい。【００１８】
また、焦点制御手段は、第２画像が撮像の焦点の制御に適用可能な画像であるかどうかを判断し、適用可能と判断した場合に第２画像を解析し、その解析結果に基づいて撮像の焦点を制御することが好ましい。これにより、不適当な画像を用いて焦点制御が行われることを防止して、撮像の焦点制御を好適に行うことができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の顕微鏡装置によれば、試料に対して２つの撮像手段を設け、焦点制御用の第２撮像手段として、２次元の画像を取得可能な撮像手段を用いるとともに、導光光路長が所定方向で変化する撮像条件となるように撮像手段を配置し、得られた２次元の画像を解析して焦点制御を行うことにより、試料の画像取得と、撮像の焦点制御とを同時に行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、顕微鏡装置の第１実施形態の構成を示すブロック図である。
【図２】図２は、焦点制御部の構成の一例を示すブロック図である。
【図３】図３は、焦点制御方法の一例を示すフローチャートである。
【図４】図４は、図３に示した焦点制御方法について示す模式図である。
【図５】図５は、焦点制御方法の他の例を示すフローチャートである。
【図６】図６は、焦点制御方法の他の例を示すフローチャートである。
【図７】図７は、焦点制御に用いられる計測対象画像の例を示す図である。
【図８】図８は、図７に示した計測対象画像でのコントラスト変化を示す図である。
【図９】図９は、顕微鏡装置の第２実施形態の構成を示すブロック図である。
【図１０】図１０は、顕微鏡装置の第３実施形態の構成を示すブロック図である。
【図１１】図１１は、焦点制御方法の一例を示すフローチャートである。
【図１２】図１２は、焦点制御に用いられる計測対象画像の例を示す図である。
【図１３】図１３は、焦点制御に用いられる計測対象画像の例を示す図である。
【図１４】図１４は、焦点制御に用いられる計測対象画像の例を示す図である。
【図１５】図１５は、焦点制御に用いられる計測対象画像の例を示す図である。
【図１６】図１６は、焦点制御に用いられる計測対象画像の例を示す図である。
【図１７】図１７は、図１２〜１６に示した計測対象画像でのコントラスト変化を示す図である。
【図１８】図１８は、図１２〜１６に示した計測対象画像でのコントラスト変化を示す図である。
【図１９】図１９は、顕微鏡装置の第４実施形態の構成を示すブロック図である。
【図２０】図２０は、光路長変更部材の構成の例を示す斜視図である。
【図２１】図２１は、光路長変更部材の具体的な構成例を示す側面図である。
【図２２】図２２は、焦点制御に用いられる計測対象画像の例を示す図である。
【図２３】図２３は、図２２に示した計測対象画像でのコントラスト変化を示す図である。
【図２４】図２４は、顕微鏡装置の第５実施形態の構成を示すブロック図である。
【図２５】図２５は、顕微鏡装置の第６実施形態の構成を示すブロック図である。
【図２６】図２６は、顕微鏡装置の第７実施形態の構成を示すブロック図である。
【図２７】図２７は、焦点制御用の撮像装置に対する光分岐光学系について示す図である。
【符号の説明】
【００２１】
１０…照射光源、１１…集光レンズ、１５…試料ステージ（ＸＹステージ）、１６…ＸＹステージ駆動部、２０…導光光学系、２１…対物レンズ、２２…ピエゾアクチュエータ、２３…ピエゾ駆動部、２５、２６、２７ａ、２７ｂ…ビームスプリッタ、２６ａ、２６ｂ…結像レンズ、３１、４１…画像取得用の光検出器（第１撮像装置）、３２、３３、３４、４２、４３、４４…焦点制御用のＣＣＤカメラ（第２撮像装置）、４２ａ、４３ａ、４４ａ…光路長変更部材、３６、４６…画像取得制御部、３７、４７…焦点制御部、３７ａ…Ａ／Ｄ変換器、３７ｂ…画像メモリ、３７ｃ…データ処理部、８０…照射光源、８１…レンズ、８５…照射光学系、８６…ダイクロイックミラー、８７…励起フィルタ、８８…カットフィルタ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、図面とともに本発明による顕微鏡装置の好適な実施形態について詳細に説明する。なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。また、図面の寸法比率は、説明のものと必ずしも一致していない。【００２３】
図１は、本発明による顕微鏡装置の第１実施形態の構成を示すブロック図である。この顕微鏡装置は、試料Ｓの画像の取得に用いられる透過型の顕微鏡として構成されている。画像取得の対象となる試料Ｓは、例えば生物サンプルであり、試料ステージ１５上に載置されている。【００２４】
試料ステージ１５は、ｘ方向及びｙ方向（水平方向）に可動なＸＹステージからなり、このＸＹステージ１５をｘｙ面内で駆動することにより、試料Ｓに対する撮像位置が設定または変更される。また、試料ステージ１５は、ＸＹステージ駆動部１６によって駆動制御されている。試料ステージ１５の下方には、撮像対象となる光像を生成するための光を試料Ｓへと照射する照射光源１０、及び照射光源１０からの光を試料Ｓで設定されている撮像位置へと集光する集光レンズ１１が設置されている。【００２５】
照射光源１０からの光が照射される試料ステージ１５上の試料Ｓに対し、試料ステージ１５の上方に、試料Ｓの光像を導光するための導光光学系２０が設けられている。本実施形態においては、導光光学系２０は、試料Ｓからの光が入射する対物レンズ２１と、対物レンズ２１の後段に配置されたビームスプリッタ２５とを有している。このうち、ビームスプリッタ２５は、試料Ｓの光像を第１光路及び第２光路の２つの光路へと分岐する光分岐手段である。【００２６】
図１においては、対物レンズ２１からの光がビームスプリッタ２５を通過する光路が、試料Ｓの画像取得に用いられる第１光路となっている。また、対物レンズ２１からの光がビームスプリッタ２５で反射される光路が、撮像の焦点制御に用いられる第２光路となっている。ビームスプリッタ２５は、第１光路に対して約４５°の角度で配置されており、第２光路は第１光路に対して略直交している。ここで、説明の便宜のため、照射光源１０及び対物レンズ２１を含む顕微鏡光学系の光軸方向であり、第１光路に沿う方向をｚ軸方向、第１光路に直交する第２光路に沿う方向をｙ軸方向、ｙ軸及びｚ軸に直交する方向をｘ軸方向とする。【００２７】
また、対物レンズ２１に対して、ピエゾアクチュエータ２２が設けられている。ピエゾアクチュエータ２２は、対物レンズ２１をｚ軸方向（垂直方向、光軸方向）に駆動する対物レンズ駆動手段である。また、ピエゾアクチュエータ２２は、ピエゾ駆動部２３によって駆動制御されている。本顕微鏡装置では、このピエゾアクチュエータ２２を用いて対物レンズ２１のｚ軸方向の位置を変えることにより、試料Ｓの画像取得における撮像の焦点が調整可能になっている。【００２８】
第１光路上には、ビームスプリッタ２５を通過した試料Ｓの光像の結像面に対応する位置に、光検出器３１が設置されている。光検出器３１は、ビームスプリッタ２５で画像取得用の第１光路へと分岐された光像による画像（第１画像）の取得に用いられる第１撮像手段である。この光検出器３１としては、具体的には、試料Ｓの１次元の画像を取得可能なリニアセンサ、または２次元の画像を取得可能なイメージセンサが用いられる。【００２９】
一方、第２光路上には、ビームスプリッタ２５で反射された試料Ｓの光像の結像面に対応する位置に、撮像装置３２が設置されている。撮像装置３２は、２次元の画像を取得可能なＣＣＤカメラからなり、ビームスプリッタ２５で焦点制御用の第２光路へと分岐された光像による画像（第２画像）を取得する第２撮像手段である。図１に示した顕微鏡装置では、このＣＣＤカメラ３２によって取得される試料Ｓの２次元の画像を用いて、撮像の焦点制御が行われる。【００３０】
具体的には、ＣＣＤカメラ３２は、その撮像面が第２光路に直交するｘｚ面と略一致するとともに、ｚ軸方向を傾き方向として角度θで第２光路に対して傾いた状態で設置されている。このとき、ＣＣＤカメラ３２の撮像面内において、ｚ軸方向を変化方向として、試料ＳからＣＣＤカメラ３２へと光が導かれる導光光学系２０での光路長がｚ軸方向に沿って変化するようになっている。【００３１】
これらの試料ステージ１５、導光光学系２０、光検出器３１、及びＣＣＤカメラ３２に対し、画像取得制御部３６、及び焦点制御部３７が設けられている。画像取得制御部３６は、試料Ｓの画像の取得、及び試料Ｓに対する撮像位置の設定を制御することによって、試料Ｓの画像取得動作を制御する制御手段である。具体的には、画像取得制御部３６は、光検出器３１による画像の取得を制御する。また、制御部３６は、ＸＹステージ駆動部１６を介して試料ステージ１５を駆動制御することにより、試料ステージ１５上に載置された試料Ｓで顕微鏡光学系の光軸上にある撮像位置を設定または変更する。【００３２】
焦点制御部３７は、ＣＣＤカメラ３２によって取得された画像について所定の解析方法で解析を行う。そして、その解析結果に基づいて、光検出器３１による撮像の焦点を制御する。本実施形態においては、焦点制御部３７は、ピエゾ駆動部２３を介してピエゾアクチュエータ２２を駆動制御して対物レンズ２１のｚ軸方向の位置を調整することにより、撮像の焦点制御を行う。【００３３】
ここで、焦点制御用の撮像装置であるＣＣＤカメラ３２は、上記したように第２光路の光軸に対して傾いて配置されている。このため、ＣＣＤカメラ３２によって取得される２次元の画像は、ｚ軸方向に沿って焦点位置からのずれが変化する画像となる。このような所定の変化方向に沿って焦点位置からのずれが変化する画像を、焦点制御部３７において解析することにより、撮像の焦点のずれ、焦点調整の必要性の有無、焦点を合わせるために必要な補正量などについての焦点制御情報が得られる。【００３４】
図２は、焦点制御部３７の具体的な構成の一例を示すブロック図である。本構成例においては、焦点制御部３７は、Ａ／Ｄ変換器３７ａ、画像メモリ３７ｂ、及びデータ処理部３７ｃから構成されている。ＣＣＤカメラ３２によって取得された画像のデータ信号は、Ａ／Ｄ変換器３７ａでＡ／Ｄ変換された後、焦点制御用の画像データとして画像メモリ３７ｂに格納される。データ処理部３７ｃは、画像メモリ３７ｂから必要な画像データを読み出し、その解析を行うとともに、解析結果に基づいてピエゾ駆動部２３を制御する。【００３５】
本実施形態による顕微鏡装置の効果について説明する。【００３６】
図１に示した顕微鏡装置においては、画像取得の対象となる試料Ｓに対して、第１撮像手段である光検出器３１、及び第２撮像手段であるＣＣＤカメラ３２の２つの撮像手段を設けている。これにより、光検出器３１による実際の画像取得と、ＣＣＤカメラ３２による焦点制御用の画像取得とを別に行うことが可能となる。このような構成では、例えば、試料Ｓの画像取得と、撮像の焦点制御とを同時に行うことも可能である。すなわち、ＣＣＤカメラ３２で取得された画像を参照して焦点制御部３７によって焦点の自動制御を行いつつ、画像取得制御部３６によって光検出器３１による試料Ｓの画像の取得を行うことが可能である。【００３７】
さらに、上記した装置では、焦点制御に用いられる第２撮像装置として、２次元の画像を取得可能なＣＣＤカメラ３２を用いるとともに、光像が試料Ｓから導光される光路長がｚ軸方向で変化する撮像条件となるように、光軸に対して傾けてカメラ３２を配置している。このようなカメラ３２を用いて取得された２次元の画像を解析して焦点制御を行う構成によれば、試料Ｓへの焦点計測用のレーザ光の照射等が不要となる。したがって、試料Ｓの画像取得と、撮像の焦点制御とを好適に両立することができる。【００３８】
このように、光検出器３１による試料Ｓの画像の取得を行いつつ、ＣＣＤカメラ３２によって取得される試料Ｓの２次元の画像を用いた焦点制御をリアルタイムで行うリアルタイムフォーカス技術は、試料Ｓの画像取得作業を高速化する上で有効である。例えば、近年、生物サンプルの全体を画像データとして電子化するバーチャルスライドの開発がすすめられているが、このようなサンプルの電子化を高速で行うためには、リアルタイムでの焦点制御が非常に重要となる。【００３９】
また、上記実施形態では、試料Ｓから光検出器３１への焦点制御を、ピエゾアクチュエータ２２を駆動制御して対物レンズ２１のｚ軸方向の位置を調整することによって行っている。これにより、ＣＣＤカメラ３２で取得された画像を用いた焦点のフィードバック制御を高速で確実に実行することができる。ただし、このような焦点制御には、対物レンズ２１を駆動する構成に限らず、例えば試料Ｓが載置される試料ステージ１５をｚ軸方向に駆動する構成を用いても良い。また、対物レンズ２１や試料ステージ１５を駆動する駆動機構としては、ピエゾアクチュエータ以外にも、例えばステッピングモータなどを用いることができる。【００４０】
また、焦点制御に用いられる試料Ｓの２次元の画像を取得するための第２撮像装置については、ＣＣＤカメラ以外にも、例えばＣＭＯＳ型の撮像装置など、２次元の画像を取得可能な他の撮像装置を用いても良い。【００４１】
図１に示した顕微鏡装置における焦点制御方法について説明する。図３は、焦点制御方法の具体的な一例を示すフローチャートである。また、図４は、図３に示した焦点制御方法について示す模式図である。なお、以下に説明する焦点制御は、図１に示した構成において焦点制御部３７によって行われる。【００４２】
この制御方法では、まず、図４に示すように、ＣＣＤカメラ３２により、その撮像面の傾き方向であるｚ軸方向にａ画素、傾きと垂直方向であるｘ軸方向にｂ画素で、ａ×ｂ画素からなる試料Ｓの２次元の画像Ｘを取得する（ステップＳ１０１）。そして、この画像Ｘから、傾き方向の全幅（ａ画素）、傾きと垂直方向の一定の幅（ｂ’画素）からなる、傾き方向に沿った計測対象画像Ｘ’を切り出す（Ｓ１０２）。【００４３】
次に、切り出した計測対象画像Ｘ’について、傾きと垂直方向に一定画素（ｓ画素）だけシフトさせたシフト画像Ｘ”を作成する（Ｓ１０３）。また、画像Ｘ”と画像Ｘ’との間で差分（Ｘ’−Ｘ”）をとり、さらに、その絶対値｜Ｘ’−Ｘ”｜の計算を行って、差分絶対値画像Ｙを作成する（Ｓ１０４）。この差分画像Ｙは、計測対象画像Ｘ’をシフトさせた画素分が無効画素となるため、ａ×（ｂ’−ｓ）画素の画像となる。ここで、計測対象画像Ｘ’をシフトさせる画素数ｓについては、光学的な倍率及び対物レンズの開口数ＮＡを考慮して適当な画素数を選択することが好ましい。【００４４】
続いて、差分絶対値画像Ｙについて、傾きと垂直方向のｂ’−ｓ画素分で平均値を求めて、傾き方向のａ画素のデータ列Ｚを作成する（Ｓ１０５）。この差分絶対値画像Ｙ、及び傾きと垂直方向について平均したデータ列Ｚは、傾き方向に沿った計測対象画像Ｘ’の各位置での画像成分の微分の絶対値を求めたものに相当する。【００４５】
一方、画像取得の対象となる試料Ｓのコントラストパターンが均一な場合、カメラ３２で取得される画像では、焦点が合っているほど画像のコントラストが大きくなる。また、画像のコントラストが大きいと、対応する画像成分の微分の絶対値が大きくなる。したがって、データ列Ｚにおいて、傾き方向についての画像のコントラスト変化に相当するデータ値の変化を求める解析を行うことにより、焦点制御についての情報が得られる。また、その解析結果を参照することにより、撮像の焦点制御を好適に実行することができる。【００４６】
図３においては、具体的には、図４に示すように、データ列Ｚの各データについて、その傾き方向に沿った中心位置のアドレスを０、前方に傾いているｚ軸の正の方向にある各位置のアドレスを−、後方に傾いているｚ軸の負の方向にある各位置のアドレスを＋として、それぞれの位置のデータにアドレスを割り振る。そして、そのデータ列Ｚでのアドレスとデータとの積をとり、それらの総和Ｔを計算する（Ｓ１０６）。【００４７】
このようにして求められる総和Ｔにおいて、総和Ｔが負の値の場合、現在の焦点位置は正しい焦点位置よりも近い位置にあり、また、その絶対値が大きいほど正しい焦点位置からのずれが大きい。一方、総和Ｔが正の値の場合、現在の焦点位置は正しい焦点位置よりも遠い位置にあり、また、その絶対値が大きいほど正しい焦点位置からのずれが大きい。したがって、このような総和Ｔの値を参照して焦点制御を行えば、実際の焦点位置を正しい焦点位置に近付けることができる。【００４８】
この場合の具体的な制御方法としては、例えば、総和Ｔに対して負の側の閾値ｍ、及び正の側の閾値ｎを設定しておき、総和Ｔがこれらの閾値ｍ〜ｎの範囲外になったときに焦点位置を調整する方法がある。この方法では、図３に示すように、総和Ｔが負の閾値ｍよりも小さい（Ｔ＜閾値ｍ）かどうかを判定する（Ｓ１０７）。そして、閾値ｍよりも小さい場合に、焦点位置を上げるように焦点制御を行う（Ｓ１０８）。また、総和Ｔが正の閾値ｎよりも大きい（Ｔ＞閾値ｎ）かどうかを判定する（Ｓ１０９）。そして、閾値ｎよりも大きい場合に、焦点位置を下げるように焦点制御を行う（Ｓ１１０）。【００４９】
以上のステップＳ１０１〜Ｓ１１０の焦点制御動作を、試料Ｓでの撮像位置をスキャンしつつ繰返し行うことにより、試料Ｓの画像を良好な画質で高速に取得することが可能となる。【００５０】
なお、上記した焦点制御方法では、データ列Ｚの作成を画素毎に行っているが、データ列Ｚの具体的な作成方法は上記方法に限定されない。例えば、複数画素毎にサンプリングによる間引き処理を行ってデータ列Ｚを作成しても良い。このような方法では、焦点制御をさらに高速化することができる。【００５１】
また、具体的な焦点の制御方法については、これ以外にも、様々な方法を用いることができる。【００５２】
図５は、焦点制御方法の他の例を示すフローチャートである。この制御方法において、ステップＳ２０１〜Ｓ２１０については、図３の制御方法におけるステップＳ１０１〜Ｓ１１０と同様である。【００５３】
この制御方法では、差分絶対値画像Ｙを作成するステップＳ２０４と、傾き方向のデータ列Ｚを作成するステップＳ２０５との間に、ノイズ除去を行うステップＳ２１１を設けている。ここでは、差分絶対値画像Ｙにおける画像のノイズなどの焦点制御への影響を取り去るために、各画素のデータ値に対してノイズレベルｐを設定している。【００５４】
そして、差分絶対値画像Ｙの各画素のうち、そのデータ値がノイズレベルｐよりも小さければ、ノイズデータであるとしてその画素のデータ値を０とし、ノイズ除去がなされた差分絶対値画像Ｙ’を作成する（Ｓ２１１）。傾き方向のデータ列Ｚは、このノイズ除去画像Ｙ’を用いて作成される。これにより、導光光学系２０やＣＣＤカメラ３２に起因するノイズなどが焦点制御に与える影響を抑制することができる。【００５５】
図６は、焦点制御方法の他の例を示すフローチャートである。この制御方法において、ステップＳ３０１〜Ｓ３１０については、図３の制御方法におけるステップＳ１０１〜Ｓ１１０と同様である。【００５６】
この制御方法では、焦点制御部３７は、ＣＣＤカメラ３２によって取得された画像が撮像の焦点の制御に適用可能な画像であるかどうかを判断する。そして、適用可能であると判断した場合に画像を解析し、その解析結果に基づいて撮像の焦点を制御することとしている。【００５７】
具体的には、まず、計測対象画像Ｘ’を切り出すステップＳ３０２と、シフト画像Ｘ”を作成するステップＳ３０３との間に、ステップＳ３１１〜Ｓ３１３を追加している。ここでは、計測対象画像Ｘ’について、画像Ｘ’をブロックに分割し、それぞれのブロックの標準偏差を計算して、標準偏差データ列ＳＤを作成する。また、この標準偏差データ列ＳＤから、その標準偏差ＳｄＳＤ及び平均値ＡｖＳＤを計算し（Ｓ３１１）、標準偏差と平均値との比ＳｄＳＤ／ＡｖＳＤが閾値ｐよりも大きい（ＳｄＳＤ／ＡｖＳＤ＞閾値ｐ）かどうかを判断する（Ｓ３１２）。そして、閾値ｐよりも大きい場合に、試料Ｓ自体のコントラストが不均一であり、したがって、焦点位置の判断不可（Ｓ３１３）であるとして焦点制御を行わないこととする。【００５８】
また、傾き方向のデータ列Ｚを作成するステップＳ３０５と、データ列Ｚのアドレスとデータとの積の総和Ｔを計算するステップＳ３０６との間に、ステップＳ３２１、Ｓ３２２を追加している。ここでは、計測対象画像Ｘ’について、傾きと垂直方向のｂ’画素分で平均値を求めて、傾き方向のａ画素のデータ列Ａを作成するとともに、データ列Ｚの平均値／データ列Ａの平均値（変化量／明るさ、すなわちコントラストに相当）が閾値ｒよりも小さい（Ｚの平均値／Ａの平均値＜閾値ｒ）かどうかを判定する（Ｓ３２１）。そして、閾値ｒよりも小さい場合に、撮像位置に試料Ｓが存在しないか、または焦点が大きくずれており、したがって、焦点位置の判断不可（Ｓ３２２）であるとして焦点制御を行わないこととする。【００５９】
このように、ＣＣＤカメラ３２によって取得された画像について焦点制御に適当な画像かどうかを判断した上で画像の解析及び焦点制御を行うことにより、不適当な画像を用いて焦点制御が行われることを防止して、撮像の焦点制御を好適に行うことができる。【００６０】
なお、上記した各焦点制御方法では、焦点制御用の画像のコントラスト変化の解析を、撮像面の傾き方向に沿って所定幅で切り出した計測対象画像と、そのシフト画像との差分絶対値画像を用いて行っている。このような方法を用いることにより、画像のコントラスト変化を簡易な方法で確実に解析することができる。ただし、コントラストの具体的な解析方法については、上記以外の方法を用いても良い。【００６１】
また、上記した焦点制御方法では、データ列Ａ及びＺの作成を画素毎に行っているが、これらのデータ列の具体的な作成方法は上記方法に限定されない。例えば、複数画素毎にサンプリングによる間引き処理を行って各データ列を作成しても良い。このような方法では、焦点制御をさらに高速化することができる。【００６２】
また、図６に示した方法では、ステップＳ３１１及びＳ３１２において画像Ｘ’を分割するブロックは、２次元マトリクス状の分割に限らず、一方向のブロック分割としても良い。また、ブロックのサイズについては、光学的な倍率、ＣＣＤカメラのサイズ、画素数等を考慮して適当なサイズに設定することが好ましい。【００６３】
また、上記方法では、ステップＳ３１３及びＳ３２２において、対象画像が均一なコントラストパターンでない場合、あるいは画像の一部にのみ試料Ｓが存在して充分なコントラストレベルが得られない場合等に、焦点位置が判断不可であるとして焦点制御を行わないこととしている。これに対して、ステージ１５を駆動させて試料Ｓの画像を順次取得する際には、焦点位置が判断不可の撮像位置に関する焦点制御情報は、他の撮像位置についての焦点制御情報を参照して設定しても良い。この場合、例えば、焦点位置が判断不可の撮像位置に関する焦点制御情報を、一連の焦点計測で取得されてデータ記憶部に記憶された任意の焦点制御情報、もしくは直近（最新）の焦点制御情報と同一とみなして焦点制御を実行する方法を用いることができる。【００６４】
また、ＣＣＤカメラ３２によって取得された画像を用いた焦点制御については、画像のコントラスト変化を解析する方法を用いることにより、撮像の焦点制御を精度良く実現することができる。ただし、このような焦点制御方法については、コントラスト変化を用いる以外の方法を用いても良い。【００６５】
上記した顕微鏡装置を用いた焦点制御方法の具体的な一実施例について説明する。【００６６】
本実施例では、試料Ｓとして平滑筋肉腫の病理サンプルを用いる。この病理サンプルを顕微鏡（ＮＩＫＯＮＴＭＤ，２０×，ＮＡ０．７５）にセットし、ＣＣＤカメラ（ＯＲＣＡ，浜松ホトニクス製）をθ＝２５°の傾きで配置する。このとき、ＣＣＤの撮像面の傾き方向の両端は、光軸方向に約３．７ｍｍの深さを持つ。これは、試料Ｓ上での光軸方向の変化は撮像面上では倍率の自乗となることから、サンプル上での深さに換算すると約９μｍとなる。【００６７】
また、ＣＣＤカメラで取得される焦点制御用の画像において、計測対象画像Ｘ’のサイズをａ×ｂ’＝１０２４画素×１９０画素とし、焦点位置の正しい焦点位置からのずれが−４μｍ、−２μｍ、０μｍ、２μｍ、４μｍの５点について焦点計測を行った。【００６８】
図７は、焦点制御に用いられる計測対象画像の例を示す図である。図７の画像（ａ）〜（ｅ）は、それぞれ焦点位置のずれが（ａ）−４μｍ、（ｂ）−２μｍ、（ｃ）０μｍ、（ｄ）２μｍ、及び（ｅ）４μｍの場合について取得された計測対象画像Ｘ’を示している。このような計測対象画像Ｘ’に対し、４画素のシフトでシフト画像Ｘ”を作成し、画像Ｘ’、Ｘ”から差分絶対値画像Ｙ、及びデータ列Ｚを求める。そして、データ列Ｚでのアドレスとデータとの積の総和Ｔである焦点重心のデータＦを求める。【００６９】
図８は、図７に示した計測対象画像でのコントラスト変化を示す図である。図８のグラフ（ａ）〜（ｅ）において、横軸は傾き方向の画素位置を示し、縦軸は各位置でのコントラストに対応するデータ列Ｚを示している。また、図８のグラフ（ａ）〜（ｅ）は、それぞれ図７の画像（ａ）〜（ｅ）に対応している。【００７０】
これらのデータ列Ｚから、各焦点位置に対する焦点重心Ｆ（総和Ｔ）は、（ａ）焦点位置−４μｍに対してＦ＝−４９．７、（ｂ）焦点位置−２μｍに対してＦ＝−４６．７、（ｃ）焦点位置０μｍに対してＦ＝２１．４、（ｄ）焦点位置２μｍに対してＦ＝９１．０、（ｅ）焦点位置４μｍに対してＦ＝１１７．０とそれぞれ求められる。この結果より、上記した解析方法で得られる解析結果では、焦点位置のずれと、データ列Ｚから求められる焦点重心Ｆの値の変化とが、良く対応していることがわかる。したがって、このような解析結果を参照することで、撮像の焦点制御を好適に実行することができる。【００７１】
図９は、本発明による顕微鏡装置の第２実施形態の構成を示すブロック図である。本実施形態において、照射光源１０、集光レンズ１１、試料ステージ１５、ＸＹステージ駆動部１６、ピエゾ駆動部２３、画像取得制御部３６、及び焦点制御部３７については、図１に示した実施形態と同様である。【００７２】
試料ステージ１５上の試料Ｓに対し、試料ステージ１５の上方に導光光学系２０が設けられている。本実施形態においては、導光光学系２０は、対物レンズ２１と、ビームスプリッタ２６と、結像レンズ２６ａ、２６ｂとを有している。また、対物レンズ２１に対して、対物レンズ２１をｚ軸方向に駆動するピエゾアクチュエータ２２が設けられている。【００７３】
対物レンズ２１からの光がビームスプリッタ２６を通過する光路上には、第１撮像手段である光検出器３１が設置されている。また、対物レンズ２１からの光がビームスプリッタ２６で反射される光路上には、光路に対して傾いた状態で第２撮像手段であるＣＣＤカメラ３２が設置されている。【００７４】
図９においては、対物レンズ２１からビームスプリッタ２６への光路が無限遠光路となっている。これに対応して、ビームスプリッタ２６と光検出器３１との間には、光検出器３１へと光像を結像させる第１結像レンズ２６ａが設置されている。また、ビームスプリッタ２６とＣＣＤカメラ３２との間には、カメラ３２へと光像を結像させる第２結像レンズ２６ｂが設置されている。【００７５】
このような構成では、画像取得用の光検出器３１に対する結像の倍率と、焦点制御用のＣＣＤカメラ３２に対する結像の倍率とを、レンズ２６ａ、２６ｂによって別々に設定することができる。したがって、試料Ｓの画像取得に影響を与えることなく、カメラ３２への結像の倍率を焦点計測に好適な倍率に設定することが可能となる。この場合、画像取得用の第１光路上に配置された第１結像レンズ２６ａ、及び焦点制御用の第２光路上に配置された第２結像レンズ２６ｂについて、第２結像レンズ２６ｂは、第１結像レンズ２６ａよりも結像倍率が小さいことが好ましい。【００７６】
図１０は、本発明による顕微鏡装置の第３実施形態の構成を示すブロック図である。本実施形態において、照射光源１０、集光レンズ１１、試料ステージ１５、ＸＹステージ駆動部１６、ピエゾ駆動部２３、画像取得制御部３６、及び焦点制御部３７については、図１に示した実施形態と同様である。【００７７】
試料ステージ１５上の試料Ｓに対し、試料ステージ１５の上方に導光光学系２０が設けられている。本実施形態においては、導光光学系２０は、対物レンズ２１と、ビームスプリッタ２７ａ、２７ｂとを有している。また、対物レンズ２１に対して、対物レンズ２１をｚ軸方向に駆動するピエゾアクチュエータ２２が設けられている。【００７８】
対物レンズ２１からの光がビームスプリッタ２７ａ、２７ｂを通過する光路上には、第１撮像手段である光検出器３１が設置されている。また、対物レンズ２１からの光が前段のビームスプリッタ２７ａで反射される光路上には、ｚ軸方向に沿って光路長が変化するように撮像面が光路に対して傾いた状態でＣＣＤカメラ３３が設置されている。また、対物レンズ２１からの光が後段のビームスプリッタ２７ｂで反射される光路上には、ｚ軸方向に沿うとともにカメラ３３とは逆方向に光路長が変化するように撮像面が光路に対して傾いた状態でＣＣＤカメラ３４が設置されている。【００７９】
図１０においては、ｚ軸方向を傾き方向として互いに逆方向に傾いた状態で設置された上記のＣＣＤカメラ３３、３４によって、焦点制御用の第２撮像手段が構成されている。このように、逆方向に傾いた２つの撮像装置を用いて焦点計測を行うことにより、試料Ｓ自体のコントラストパターンが不均一な場合においても、その影響を低減して好適に焦点制御を行うことができる。また、このような構成では、２つのカメラ３３、３４を光軸に対して傾きが対称となるように配置することが好ましい。【００８０】
なお、本実施形態においては、ＣＣＤカメラ３３、３４について、上記したように所定の変化方向に沿って互いに逆方向に光路長が変化するように構成している。これにより、焦点制御の精度を向上することができる。これらのＣＣＤカメラ３３、３４については、一般には、所定の変化方向に沿って互いに異なる変化率で光路長が変化するように構成すれば良い。そのような構成としては、例えば、同方向であるが互いに異なる変化量で光路長が変化する構成がある。【００８１】
図１０に示した顕微鏡装置における焦点制御方法について説明する。図１１は、焦点制御方法の一例を示すフローチャートである。なお、以下に説明する焦点制御は、図１０に示した構成において焦点制御部３７によって行われる。また、画像の具体的な解析方法については、図３及び図４に示した焦点制御方法と同様である。【００８２】
この制御方法では、まず、ＣＣＤカメラ３３、３４により、試料Ｓの２つの２次元の画像Ｘ１，Ｘ２を取得する（ステップＳ５０１）。そして、これらの画像Ｘ１，Ｘ２から、それぞれ傾き方向に沿った計測対象画像Ｘ１’，Ｘ２’を切り出す（Ｓ５０２）。これらの計測対象画像Ｘ１’，Ｘ２’は、上記したように、ｚ軸方向について逆方向に傾いた画像である。【００８３】
次に、切り出した計測対象画像Ｘ１’，Ｘ２’について、傾きと垂直方向に一定画素だけシフトさせたシフト画像Ｘ１”，Ｘ２”を作成する（Ｓ５０３）。また、カメラ３３で取得された画像Ｘ１について、画像Ｘ１”と画像Ｘ１’との間で差分（Ｘ１’−Ｘ１”）をとり、さらに、その絶対値｜Ｘ１’−Ｘ１”｜の計算を行って、差分絶対値画像Ｙ１を作成する。また、カメラ３４で取得された画像Ｘ２について、画像Ｘ２”と画像Ｘ２’との間で差分（Ｘ２’−Ｘ２”）をとり、さらに、その絶対値｜Ｘ２’−Ｘ２”｜の計算を行って、差分絶対値画像Ｙ２を作成する（Ｓ５０４）。【００８４】
続いて、差分絶対値画像Ｙ１，Ｙ２について、傾きと垂直方向で平均値を求めて、傾き方向のデータ列Ｚ１，Ｚ２を作成する（Ｓ５０５）。また、データ列Ｚ１，Ｚ２の各データについて、中心位置のアドレスを０として、それぞれの位置のデータにアドレスを割り振る。そして、そのデータ列Ｚ１，Ｚ２でのアドレスとデータとの積をとり、それらの総和Ｔ１，Ｔ２を計算する（Ｓ５０６）。なお、データ列Ｚ１，Ｚ２に対するアドレスの割り振りは、撮像面の傾き方向であるｚ軸方向について同方向に行う。図１１に示す焦点制御方法においては、さらに、これらのカメラ３３、３４で取得された２画像Ｘ１，Ｘ２に対して求められた総和Ｔ１，Ｔ２について、その差分Ｔ＝Ｔ１−Ｔ２を計算する（Ｓ５１１）。そして、この総和の差分Ｔを参照して、閾値ｍ，ｎを用いた焦点制御を行う（Ｓ５０７〜Ｓ５１０）。【００８５】
以上のステップＳ５０１〜Ｓ５１１の焦点制御動作を、試料Ｓでの撮像位置をスキャンしつつ繰返し行うことにより、試料Ｓの画像を良好な画質で高速に取得することが可能となる。特に、本実施形態においては、互いに逆方向に傾いたＣＣＤカメラ３３、３４によって取得された画像Ｘ１，Ｘ２を用い、それぞれについて求められた総和Ｔ１，Ｔ２の差分Ｔをとって焦点制御を行うことにより、試料Ｓ自体のコントラストパターンの影響を低減することができる。【００８６】
上記した顕微鏡装置を用いた焦点制御方法の具体的な一実施例について説明する。ここで、以下においては、焦点制御用の第２撮像手段を構成する２つのＣＣＤカメラ３３、３４について、前段のＣＣＤカメラ３３をカメラ１、後段のＣＣＤカメラ３４をカメラ２とする。【００８７】
本実施例では、試料Ｓとして口腔肉腫瘤の病理サンプルを用いる。この病理サンプルを顕微鏡（ＮＩＫＯＮＴＭＤ，２０×，ＮＡ０．７５）にセットし、ＣＣＤカメラ（ＯＲＣＡ，浜松ホトニクス製）を配置する。本実施例では、傾き方向が逆方向の２つの画像を用いることによる効果の確認を目的とするため、単一のＣＣＤカメラを用い、その配置角度をθ＝±２５°で変えて２度の焦点計測を行う。このとき、ＣＣＤの撮像面の傾き方向の両端は、光軸方向に約３．７ｍｍの深さを持つ。これは、試料Ｓ上での光軸方向の変化は撮像面上では倍率の自乗となることから、サンプル上での深さに換算すると約９μｍとなる。【００８８】
また、２つのＣＣＤカメラのそれぞれで取得される焦点制御用の画像において、計測対象画像Ｘ１’，Ｘ２’のサイズをａ×ｂ’＝１０２４画素×１９０画素とし、焦点位置の正しい焦点位置からのずれが−４μｍ、−２μｍ、０μｍ、２μｍ、４μｍの５点について焦点計測を行った。【００８９】
図１２〜図１６は、焦点制御に用いられる計測対象画像の例を示す図である。ここで、図１２の画像（ａ）、（ｂ）は、焦点位置のずれが−４μｍの場合について取得された（ａ）カメラ１の計測対象画像Ｘ１’、及び（ｂ）カメラ２の計測対象画像Ｘ２’を示している。また、図１３の画像（ａ）、（ｂ）は、焦点位置のずれが−２μｍの場合について取得された（ａ）カメラ１の計測対象画像Ｘ１’、及び（ｂ）カメラ２の計測対象画像Ｘ２’を示している。【００９０】
また、図１４の画像（ａ）、（ｂ）は、焦点位置のずれが０μｍの場合について取得された（ａ）カメラ１の計測対象画像Ｘ１’、及び（ｂ）カメラ２の計測対象画像Ｘ２’を示している。また、図１５の画像（ａ）、（ｂ）は、焦点位置のずれが２μｍの場合について取得された（ａ）カメラ１の計測対象画像Ｘ１’、及び（ｂ）カメラ２の計測対象画像Ｘ２’を示している。また、図１６の画像（ａ）、（ｂ）は、焦点位置のずれが４μｍの場合について取得された（ａ）カメラ１の計測対象画像Ｘ１’、及び（ｂ）カメラ２の計測対象画像Ｘ２’を示している。【００９１】
このような２種類の計測対象画像Ｘ１’，Ｘ２’に対し、４画素のシフトでシフト画像Ｘ１”，Ｘ２”を作成し、画像Ｘ’、Ｘ”から差分絶対値画像Ｙ１，Ｙ２、及びデータ列Ｚ１，Ｚ２を求める。そして、データ列Ｚ１，Ｚ２でのアドレスとデータとの積の総和Ｔ１，Ｔ２である焦点重心のデータＦ１，Ｆ２を求める。また、この焦点重心のデータＦ１，Ｆ２の差分Ｆ＝Ｆ１−Ｆ２（総和Ｔ１，Ｔ２の差分Ｔ＝Ｔ１−Ｔ２）を求めて、焦点制御に用いる。【００９２】
図１７は、図１２〜図１６の画像（ａ）に示したカメラ１の計測対象画像Ｘ１でのコントラスト変化を示す図である。図１７のグラフ（ａ）〜（ｅ）において、横軸は傾き方向の画素位置を示し、縦軸は各位置でのコントラストに対応するデータ列Ｚ１を示している。また、図１７のグラフ（ａ）〜（ｅ）は、それぞれ図１２の画像（ａ）、図１３の画像（ａ）、図１４の画像（ａ）、図１５の画像（ａ）、図１６の画像（ａ）に対応している。【００９３】
これらのデータ列Ｚ１から、各焦点位置に対する焦点重心Ｆ１（総和Ｔ１）は、（ａ）焦点位置−４μｍに対してＦ１＝５．４、（ｂ）焦点位置−２μｍに対してＦ１＝４９．０、（ｃ）焦点位置０μｍに対してＦ１＝７５．２、（ｄ）焦点位置２μｍに対してＦ１＝９４．１、（ｅ）焦点位置４μｍに対してＦ１＝１２０．８とそれぞれ求められる。この結果では、焦点位置のずれに対してデータ列Ｚ１から求められる焦点重心Ｆ１の値の変化において、Ｆ１のすべてが正の値であって負の値から正の値へと移行する点が存在しない。このような焦点重心Ｆ１の値の変化は、試料Ｓ自体のコントラストパターンの変化に起因するものである。【００９４】
一方、図１８は、図１２〜図１６の画像（ｂ）に示したカメラ２の計測対象画像Ｘ２でのコントラスト変化を示す図である。図１８のグラフ（ａ）〜（ｅ）において、横軸は傾き方向の画素位置を示し、縦軸は各位置でのコントラストに対応するデータ列Ｚ２を示している。また、図１８のグラフ（ａ）〜（ｅ）は、それぞれ図１２の画像（ｂ）、図１３の画像（ｂ）、図１４の画像（ｂ）、図１５の画像（ｂ）、図１６の画像（ｂ）に対応している。【００９５】
これらのデータ列Ｚ２から、各焦点位置に対する焦点重心Ｆ２（総和Ｔ２）は、（ａ）焦点位置−４μｍに対してＦ２＝８９．２、（ｂ）焦点位置−２μｍに対してＦ２＝５５．８、（ｃ）焦点位置０μｍに対してＦ２＝１２．０、（ｄ）焦点位置２μｍに対してＦ２＝−１３．４、（ｅ）焦点位置４μｍに対してＦ２＝−６１．６とそれぞれ求められる。【００９６】
また、これらの焦点重心Ｆ１、Ｆ２から焦点重心の差分Ｆ（総和の差分Ｔ）は、（ａ）焦点位置−４μｍに対してＦ＝−８３．８、（ｂ）焦点位置−２μｍに対してＦ＝−６．８、（ｃ）焦点位置０μｍに対してＦ＝６３．２、（ｄ）焦点位置２μｍに対してＦ＝１０７．５、（ｅ）焦点位置４μｍに対してＦ＝１８２．４とそれぞれ求められる。この結果より、上記のように光軸に対して逆方向に傾いた２つのカメラによって取得される画像を解析して得られる解析結果では、試料Ｓ自体が有するコントラストパターンにかかわらず、焦点位置のずれと、データ列Ｚ１，Ｚ２から求められる焦点重心の差分Ｆの値の変化とが、良く対応していることがわかる。したがって、このような解析結果を参照することで、撮像の焦点制御を好適に実行することができる。【００９７】
本発明による顕微鏡装置について、さらに説明する。【００９８】
図１９は、本発明による顕微鏡装置の第４実施形態の構成を示すブロック図である。本実施形態において、照射光源１０、集光レンズ１１、試料ステージ１５、ＸＹステージ駆動部１６、導光光学系２０、ピエゾアクチュエータ２２、及びピエゾ駆動部２３については、図１に示した実施形態と同様である。【００９９】
第１光路上には、ビームスプリッタ２５を通過した試料Ｓの光像の結像面に対応する位置に、光検出器４１が設置されている。光検出器４１は、ビームスプリッタ２５で画像取得用の第１光路へと分岐された光像による画像（第１画像）の取得に用いられる第１撮像手段である。この光検出器４１としては、具体的には、試料Ｓの１次元の画像を取得可能なリニアセンサ、または２次元の画像を取得可能なイメージセンサが用いられる。【０１００】
一方、第２光路上には、ビームスプリッタ２５で反射された試料Ｓの光像の結像面に対応する位置に、撮像装置４２が設置されている。撮像装置４２は、２次元の画像を取得可能なＣＣＤカメラからなり、ビームスプリッタ２５で焦点制御用の第２光路へと分岐された光像による画像（第２画像）を取得する第２撮像手段である。図１９に示した顕微鏡装置では、このＣＣＤカメラ４２によって取得される試料Ｓの２次元の画像を用いて、撮像の焦点制御が行われる。【０１０１】
具体的には、ＣＣＤカメラ４２は、その撮像面が第２光路に直交するｘｚ面と略一致するように配置されている。また、ビームスプリッタ２５とカメラ４２との間で撮像面に対して所定位置に、光路長変更部材４２ａが設置されている。光路長変更部材４２ａは、試料Ｓからの光を透過する光透過材料により、ｚ軸方向に沿って厚さが変化していくウエッジ形状に形成されている。このとき、ＣＣＤカメラ４２の撮像面内において、ｚ軸方向を変化方向として、試料ＳからＣＣＤカメラ４２へと光が導かれる導光光学系２０での光路長がｚ軸方向に沿って変化するようになっている。【０１０２】
これらの試料ステージ１５、導光光学系２０、光検出器４１、及びＣＣＤカメラ４２に対し、画像取得制御部４６、及び焦点制御部４７が設けられている。画像取得制御部４６は、試料Ｓの画像の取得、及び試料Ｓに対する撮像位置の設定を制御することによって、試料Ｓの画像取得動作を制御する制御手段である。具体的には、画像取得制御部４６は、光検出器４１による画像の取得を制御する。また、制御部４６は、ＸＹステージ駆動部１６を介して試料ステージ１５を駆動制御することにより、試料ステージ１５上に載置された試料Ｓで顕微鏡光学系の光軸上にある撮像位置を設定または変更する。【０１０３】
焦点制御部４７は、ＣＣＤカメラ４２によって取得された画像について所定の解析方法で解析を行う。そして、その解析結果に基づいて、光検出器４１による撮像の焦点を制御する。本実施形態においては、焦点制御部４７は、ピエゾ駆動部２３を介してピエゾアクチュエータ２２を駆動制御して対物レンズ２１のｚ軸方向の位置を調整することにより、撮像の焦点制御を行う。【０１０４】
ここで、焦点制御用の撮像装置であるＣＣＤカメラ４２では、上記したように第２光路の光軸に対して前方側にウエッジ形状の光路長変更部材４２ａが配置されている。このため、ＣＣＤカメラ４２によって取得される２次元の画像は、ＣＣＤカメラ３２を傾けて配置する図１に示した構成と同様に、ｚ軸方向に沿って焦点位置からのずれが変化する画像となる。このような所定の変化方向に沿って焦点位置からのずれが変化する画像を、焦点制御部４７において解析することにより、撮像の焦点のずれ、焦点調整の必要性の有無、焦点を合わせるために必要な補正量などについての焦点制御情報が得られる。【０１０５】
本実施形態による顕微鏡装置の効果について説明する。【０１０６】
図１９に示した顕微鏡装置においては、画像取得の対象となる試料Ｓに対して、光検出器４１、及びＣＣＤカメラ４２の２つの撮像手段を設けている。これにより、光検出器４１による実際の画像取得と、ＣＣＤカメラ４２による焦点制御用の画像取得とを別に行うことが可能となる。このような構成では、例えば、試料Ｓの画像取得と、撮像の焦点制御とを同時に行うことも可能である。すなわち、ＣＣＤカメラ４２で取得された画像を参照して焦点制御部４７によって焦点の自動制御を行いつつ、画像取得制御部４６によって光検出器４１による試料Ｓの画像の取得を行うことが可能である。【０１０７】
さらに、上記した装置では、焦点制御に用いられる第２撮像装置として、２次元の画像を取得可能なＣＣＤカメラ４２を用いるとともに、光像が試料Ｓから導光される光路長がｚ軸方向で変化する撮像条件となるように、ｚ軸方向で厚さが変化する光路長変更部材４２ａをカメラ４２の前方側に配置している。このようなカメラ４２及び光路長変更部材４２ａを用いて取得された２次元の画像を解析して焦点制御を行う構成によれば、試料Ｓへの焦点計測用のレーザ光の照射等が不要となる。したがって、試料Ｓの画像取得と、撮像の焦点制御とを好適に両立することができる。【０１０８】
また、焦点制御に用いられる第２撮像装置を光軸に対して傾いた状態で設置する図１の構成に対し、本構成では、撮像装置と光路長変更部材とを組み合わせて用いて焦点計測を行っている。このような構成によっても、撮像の焦点制御を好適に実現することが可能である。一般には、第２撮像手段は、光路上に、その撮像面内において所定の変化方向に沿って導光光学系での光路長が変化するように構成、配置されていれば良い。【０１０９】
特に、光路長変更部材を用いる構成では、撮像装置を傾けて配置する必要がなく顕微鏡へのマウントが簡単になるという利点がある。また、ＣＣＤカメラの撮像面に対して斜めに光が入射したときに、画素の不均一性に起因する固定パターンノイズが顕著となる場合があるが、光軸に対して垂直に撮像装置を配置する上記構成では、そのようなノイズの問題は発生しない。【０１１０】
また、試料Ｓ上での光軸方向の変化は撮像面上では倍率の自乗となるため、撮像装置を傾ける構成では制御可能な焦点位置の範囲に限界がある。これに対して、光路長変更部材を用いる構成では、制御しようとする焦点位置の範囲に合わせて光路長変更部材の形状を選択することが可能である。なお、このように光路長変更部材を用いた場合の光路長（光学距離）の差Δｘは、変更部材のガラスなどの厚みｄ、及び屈折率ｎからΔｘ＝ｄ（ｎ−１）／ｎと求められる。【０１１１】
第２撮像装置の前方側に設置される光路長変更部材については、図２０の構成例（ａ）〜（ｆ）に示すように、具体的には様々な形状のものを用いて良い。これらの図２０に示す光路長変更部材のうち、図２０の構成例（ａ）は、図１９に関して上述した光路長の変化方向に沿って厚さが連続的に変化するウエッジ形状のものである。また、図２０の構成例（ｂ）は、厚さが階段状に変化するステップウエッジ形状のものである。また、図２０の構成例（ｃ）では、焦点距離が異なる複数のマイクロレンズを変化方向に沿って配列したレンズアレイを、光路長変更部材としている。【０１１２】
また、図２０の構成例（ｄ）〜（ｆ）では、厚さが変化する変化量や変化していく方向（厚さの変化率）が異なる複数のウエッジ形状の光路長変更部材を組み合わせて用いる構成を示している。このように複数種類の部材を用いることにより、様々な条件での焦点計測が可能となる。例えば、図２０の構成例（ｅ）に示すように、厚さの変化率に相当するウエッジの勾配が小さいウエッジ部材と大きいウエッジ部材とを組み合わせて使用する構成では、ウエッジの勾配に応じて焦点計測の計測範囲及び分解能を選択して、精度良く焦点制御を行うことができる。【０１１３】
この場合、例えば、次のような焦点制御方法が可能である。最初に勾配が大きいウエッジ部材を用いて焦点位置を計測して、低精度で焦点位置を調整する。次に、勾配が小さいウエッジ部材を用いて高精度で焦点位置を調整する。このような制御方法では、画像取得の開始時などにおいて、焦点位置の設定を高速かつ簡単に行うことができる。【０１１４】
あるいは、画像取得中に勾配が小さいウエッジ部材を用いて焦点位置の調整を行う。そして、焦点位置が計測されない場合に、勾配が大きいウエッジ部材を用いて焦点位置を計測して、低精度で焦点位置を調整する。さらに、再び勾配が小さいウエッジ部材を用いて高精度で焦点位置を調整する。このような制御方法では、画像取得の対象となる試料が厚さの変化の大きい試料である場合にも好適に焦点制御を実現することができる。【０１１５】
また、顕微鏡が複数の倍率に設定可能な構成である場合には、複数の倍率のそれぞれに対応した勾配のウエッジ部材を設けておくことが好ましい。これにより、顕微鏡の倍率を変更する場合にも焦点計測部分の光学的、機構的な変更が不要な構成の顕微鏡装置とすることができる。【０１１６】
なお、光路長変更部材を用いる構成では、変更部材は、撮像装置に密着させて直接取り付けるか、または多少の距離をあけて配置しても良い。また、光路長変更手段としては、光を透過する光路長変更部材以外の光学素子を用いても良い。また、図１９に示した顕微鏡装置においても、その具体的な焦点制御方法については、図１に示した顕微鏡装置に関して上述したものと同様である。【０１１７】
上記した顕微鏡装置を用いた焦点制御方法の具体的な一実施例について説明する。【０１１８】
本実施例では、試料Ｓとして平滑筋肉腫の病理サンプルを用いる。この病理サンプルを顕微鏡（ＮＩＫＯＮＴＭＤ，２０×，ＮＡ０．７５）にセットし、ＣＣＤカメラ（ＯＲＣＡ，浜松ホトニクス製）を配置するとともに、ＣＣＤカメラ４２の前面に、図２１に示す構成の光路長変更部材４２ａを取り付ける。この光路長変更部材４２ａは、厚さ１．１ｍｍで長さが異なる３枚のガラス板４２１、４２２、４２３を張り合わせたもので、カメラ４２に対して、厚さ０ｍｍ、１．１ｍｍ、２．２ｍｍ、３．３ｍｍの４ステップのステップウエッジ形状をなしている。【０１１９】
また、ＣＣＤカメラで取得される焦点制御用の画像において、計測対象画像Ｘ’のサイズをａ×ｂ’＝１０２４画素×１９０画素とし、焦点位置の正しい焦点位置からのずれが−４μｍ、−２μｍ、０μｍ、２μｍ、４μｍの５点について焦点計測を行った。【０１２０】
図２２は、焦点制御に用いられる計測対象画像の例を示す図である。図２２の画像（ａ）〜（ｅ）は、それぞれ焦点位置のずれが（ａ）−４μｍ、（ｂ）−２μｍ、（ｃ）０μｍ、（ｄ）２μｍ、及び（ｅ）４μｍの場合について取得された計測対象画像Ｘ’を示している。このような計測対象画像Ｘ’に対し、４画素のシフトでシフト画像Ｘ”を作成し、画像Ｘ’、Ｘ”から差分絶対値画像Ｙ、及びデータ列Ｚを求める。そして、データ列Ｚでのアドレスとデータとの積の総和Ｔである焦点重心のデータＦを求める。【０１２１】
図２３は、図２２に示した計測対象画像でのコントラスト変化を示す図である。図２３のグラフ（ａ）〜（ｅ）において、横軸は光路長の変化方向の画素位置を示し、縦軸は各位置でのコントラストに対応するデータ列Ｚを示している。また、図２３のグラフ（ａ）〜（ｅ）は、それぞれ図２２の画像（ａ）〜（ｅ）に対応している。【０１２２】
これらのデータ列Ｚから、各焦点位置に対する焦点重心Ｆ（総和Ｔ）は、（ａ）焦点位置−４μｍに対してＦ＝−１３４．７、（ｂ）焦点位置−２μｍに対してＦ＝−７４．９、（ｃ）焦点位置０μｍに対してＦ＝２９．４、（ｄ）焦点位置２μｍに対してＦ＝１０７．６、（ｅ）焦点位置４μｍに対してＦ＝１２３．４とそれぞれ求められる。この結果より、上記した解析方法で得られる解析結果では、焦点位置のずれと、データ列Ｚから求められる焦点重心Ｆの値の変化とが、良く対応していることがわかる。したがって、このような解析結果を参照することで、撮像の焦点制御を好適に実行することができる。【０１２３】
図２４は、本発明による顕微鏡装置の第５実施形態の構成を示すブロック図である。本実施形態において、照射光源１０、集光レンズ１１、試料ステージ１５、ＸＹステージ駆動部１６、ピエゾ駆動部２３、画像取得制御部４６、及び焦点制御部４７については、図１９に示した実施形態と同様である。【０１２４】
試料ステージ１５上の試料Ｓに対し、試料ステージ１５の上方に導光光学系２０が設けられている。本実施形態においては、導光光学系２０は、対物レンズ２１と、ビームスプリッタ２６と、結像レンズ２６ａ、２６ｂとを有している。また、対物レンズ２１に対して、対物レンズ２１をｚ軸方向に駆動するピエゾアクチュエータ２２が設けられている。【０１２５】
対物レンズ２１からの光がビームスプリッタ２６を通過する光路上には、第１撮像手段である光検出器４１が設置されている。また、対物レンズ２１からの光がビームスプリッタ２６で反射される光路上には、その前方側に光路長変更部材４２ａが配置された第２撮像手段であるＣＣＤカメラ４２が設置されている。【０１２６】
図２４においては、対物レンズ２１からビームスプリッタ２６への光路が無限遠光路となっている。これに対応して、ビームスプリッタ２６と光検出器４１との間には、光検出器４１へと光像を結像させる第１結像レンズ２６ａが設置されている。また、ビームスプリッタ２６とＣＣＤカメラ４２との間には、カメラ４２へと光像を結像させる第２結像レンズ２６ｂが設置されている。【０１２７】
このような構成では、図９に示した構成と同様に、画像取得用の光検出器４１に対する結像の倍率と、焦点制御用のＣＣＤカメラ４２に対する結像の倍率とを、レンズ２６ａ、２６ｂによって別々に設定することができる。したがって、試料Ｓの画像取得に影響を与えることなく、カメラ４２への結像の倍率を焦点計測に好適な倍率に設定することが可能となる。【０１２８】
図２５は、本発明による顕微鏡装置の第６実施形態の構成を示すブロック図である。本実施形態において、照射光源１０、集光レンズ１１、試料ステージ１５、ＸＹステージ駆動部１６、ピエゾ駆動部２３、画像取得制御部４６、及び焦点制御部４７については、図１９に示した実施形態と同様である。【０１２９】
試料ステージ１５上の試料Ｓに対し、試料ステージ１５の上方に導光光学系２０が設けられている。本実施形態においては、導光光学系２０は、対物レンズ２１と、ビームスプリッタ２７ａ、２７ｂとを有している。また、対物レンズ２１に対して、対物レンズ２１をｚ軸方向に駆動するピエゾアクチュエータ２２が設けられている。【０１３０】
対物レンズ２１からの光がビームスプリッタ２７ａ、２７ｂを通過する光路上には、第１撮像手段である光検出器４１が設置されている。また、対物レンズ２１からの光が前段のビームスプリッタ２７ａで反射される光路上には、その前方側にｚ軸方向に沿って光路長が変化するような光路長変更部材４３ａが配置されたＣＣＤカメラ４３が設置されている。また、対物レンズ２１からの光が後段のビームスプリッタ２７ｂで反射される光路上には、その前方側にｚ軸方向に沿うとともにカメラ４３とは逆方向に光路長が変化するような光路長変更部材４４ａが配置されたＣＣＤカメラ４４が設置されている。【０１３１】
図２５においては、ｚ軸方向を変化方向として互いに逆方向に光路長が変化するように光路長変更部材４３ａ、４４ａが設けられた上記のＣＣＤカメラ４３、４４によって、焦点制御用の第２撮像手段が構成されている。このように、逆方向に光路長が変化する２つの撮像装置を用いて焦点計測を行うことにより、図１０に示した構成と同様に、試料Ｓ自体のコントラストパターンが不均一な場合においても、その影響を低減して好適に焦点制御を行うことができる。【０１３２】
また、本実施形態においては、ＣＣＤカメラ４３、４４について、上記したように所定の変化方向に沿って互いに逆方向に光路長が変化するように構成している。これにより、焦点制御の精度を向上することができる。このような構成については、一般には、所定の変化方向に沿って互いに異なる変化率で光路長が変化するように構成すれば良い。そのような構成としては、例えば、同方向であるが互いに異なる変化量で光路長が変化する構成がある。【０１３３】
なお、撮像装置の前方側に光路長変更部材を配置することによって光路長を変化させる構成では、２つの撮像装置を用いる図２５の構成に限らず、例えば図２０の構成例（ｄ）に示したように、厚さの変化方向が逆方向となる２種類の光路長変更部材を１つの撮像装置に対して設ける構成を用いることが可能である。この場合、撮像装置の撮像面の一の撮像領域に対して、所定の変化方向に沿って光路長が変化する一の光路長変更部材を配置し、撮像面の他の撮像領域に対して、上記変化方向に沿うとともに異なる変化率、好ましくは逆方向に光路長が変化する他の光路長変更部材を配置する構成とすれば良い。【０１３４】
本発明による顕微鏡装置は、上記した実施形態及び構成例に限られるものではなく、様々な変形が可能である。例えば、上記した各実施形態では、顕微鏡装置を透過型の顕微鏡として構成しているが、反射型の顕微鏡、または蛍光顕微鏡に対しても同様に焦点制御を行うことが可能である。【０１３５】
図２６は、本発明による顕微鏡装置の第７実施形態の構成を示すブロック図である。本顕微鏡装置は、図１に示した顕微鏡装置の変形例である。具体的には、試料ステージ１５の下方に照射光源１０及び集光レンズ１１を設置した図１に示した透過型の構成に対し、図２６に示す顕微鏡装置は、照射光源１０及び集光レンズ１１に代えて照射光源８０、レンズ８１、及び照射光学系８５を設置した蛍光顕微鏡の構成となっている。【０１３６】
すなわち、図２６においては、導光光学系２０において、ビームスプリッタ２５と、対物レンズ２１との間に、ダイクロイックミラー８６が配置されている。ダイクロイックミラー８６は、照射光源８０からレンズ８１を介して入射される光を反射して励起光として試料Ｓへと照射するとともに、試料Ｓで発生した蛍光をビームスプリッタ２５へと通過させる。また、ダイクロイックミラー８６と照射光源８０との間、ダイクロイックミラー８６と対物レンズ２１との間には、それぞれ励起フィルタ８７、カットフィルタ８８が配置され、これらのダイクロイックミラー８６、励起フィルタ８７、及びカットフィルタ８８によって照射光学系８５（Fluorescence filter cube）が構成されている。【０１３７】
このような構成の蛍光顕微鏡においても、上記した透過型の顕微鏡の場合と同様に焦点制御を行うことができる。また、顕微鏡を反射型の構成とする場合には、図２６の構成において、ダイクロイックミラー８６をハーフミラーに置き換え、フィルタ８７、８８を取り除けば良い。【０１３８】
なお、撮像装置の前方側に光路長変更部材を配置することによって光路長を変化させる構成では、上記したように、例えば図２０の構成例（ｄ）に示したように、厚さの変化方向が逆方向となる２種類の光路長変更部材を１つの撮像装置に対して設ける構成を用いることが可能である。この場合、撮像装置の撮像面の第１撮像領域に対して、所定の変化方向に沿って光路長が変化する第１光路長変更部材を配置し、撮像面の第２撮像領域に対して、上記変化方向に沿うとともに異なる変化率、好ましくは逆方向に光路長が変化する第２光路長変更部材を配置する構成とする。【０１３９】
このような構成では、通常、第１撮像領域、及び第２撮像領域に入射する光像が異なるものとなる。これに対して、焦点制御用の画像を取得するための光像を、第１光路長変更部材及び撮像装置の撮像面の第１撮像領域への一の光路、及び第２光路長変更部材及び撮像装置の撮像面の第２撮像領域への他の光路へと分岐する光分岐光学系を備えることが好ましい。【０１４０】
図２７は、焦点制御用の撮像装置に対する光分岐光学系について示す図である。図２７の構成（ａ）では、焦点制御用の画像を取得するための撮像装置１００の第１撮像領域１０１に対して第１光路長変更部材１１１を配置し、第２撮像領域１０２に対して第１光路長変更部材１１１とは逆方向に光路長が変化する第２光路長変更部材１１２を配置している。この場合、上記したように、撮像装置１００の２つの撮像領域１０１、１０２に入射する光像が異なるものとなる。【０１４１】
一方、図２７の構成（ｂ）では、光像を第１撮像領域１０１へと反射する５０％反射ミラー１２１、及び光像を第２撮像領域１０２へと反射する１００％反射ミラー１２２を有する光分岐光学系１２０を設けている。これにより、光分岐光学系１２０で分岐された同一の光像が撮像領域１０１、１０２に入射することとなり、焦点制御の精度を向上することができる。【０１４２】
なお、この構成（ｂ）では、光分岐光学系１２０の前段に１００％反射ミラー１２５を配置している。このような反射ミラー１２５を設けることにより、撮像装置１００へと入射される光像の視野を絞って、撮像領域１０１、１０２間での光像の重畳等を防止することができる。ただし、このような反射ミラー１２５については、不要であれば設けなくても良い。また、この構成（ｂ）では、反射ミラー１２２と第２撮像領域１０２との間に光路長調整部材１２６を設置して、光路長の補正を行っている。また、光分岐光学系としては、図２７の構成（ｃ）に示す光分岐プリズム１３０等を用いても良い。【０１４３】
また、上記した構成では、撮像領域１０１、１０２で取得された２つの計測対象画像Ｘ１’，Ｘ２’に対して求められた総和Ｔ１，Ｔ２について、それらの輝度差を補正するため、Ｔ１をＴ１×（Ｘ２’の平均／Ｘ１’の平均）に置き換えることが好ましい（図１１のフローチャート参照）。
【産業上の利用可能性】
【０１４４】
本発明による顕微鏡装置は、試料の画像取得と、撮像の焦点制御とを同時に行うことが可能な顕微鏡装置として利用可能である。すなわち、本発明の顕微鏡装置によれば、試料に対して２つの撮像手段を設け、焦点制御用の第２撮像手段として、２次元の画像を取得可能な撮像手段を用いるとともに、導光光路長が所定方向で変化する撮像条件となるように撮像手段を配置し、得られた２次元の画像を解析して焦点制御を行うことにより、試料の画像取得と、撮像の焦点制御とを同時に行うことが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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