(57)【要約】フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた組換えタンパク質、特に抗体の作製方法に関し、相同染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子の発現が人為的に抑制されている細胞を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子の発現が人為的に抑制されている細胞。
【請求項２】
フコーストランスポーター遺伝子が破壊されていることを特徴とする請求項１記載の細胞。
【請求項３】
動物細胞である請求項１または２記載の細胞。
【請求項４】
動物がチャイニーズハムスター細胞である、請求項３記載の細胞。
【請求項５】
動物細胞がＣＨＯ細胞である請求項４記載の細胞。
【請求項６】
遺伝子の破壊がジーンターゲティングベクターを用いた相同組換えにより行われる、請求項２から５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７】
外来タンパク質をコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８】
外来タンパク質をコードする遺伝子が抗体をコードする遺伝子である請求項７記載の細胞。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１項に記載の細胞を培養することを特徴とするタンパク質の製造方法。
【請求項１０】
タンパク質が抗体である請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
フコースが付加されていないタンパク質を製造することを特徴とする請求項１０記載の製造方法。
【請求項１２】
細胞を用いて組換えタンパク質を製造する際に、染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子の発現を人為的に抑制することを特徴とする、タンパク質へのフコース付加阻害方法。
【請求項１３】
遺伝子の発現の人為的抑制が、遺伝子を欠損することによる行われることを特徴とする請求項１２記載のタンパク質へのフコース付加阻害方法。
【請求項１４】
タンパク質が抗体である請求項１２または１３に記載のタンパク質へのフコース付加阻害方法。
【請求項１５】
細胞がＣＨＯ細胞である請求項１２から１４のいずれか１項に記載のタンパク質へのフコース付加阻害方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた組換えタンパク質、特に抗体の作製方法に関する。
【背景技術】  抗体は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞障害）活性やＣＤＣ（補体依存性細胞障害）活性により抗腫瘍効果を発揮しうる。抗体は糖鎖が結合した糖タンパク質であり、抗体の細胞障害活性の強さは抗体に結合する糖鎖の種類および量により変化しうることが知られている。特に、抗体と結合したフコースの量が細胞障害活性の強さに強く拘わっていることが報告されている（非特許文献１参照）。さらに、細胞障害活性が増強された抗体を得るために抗体産生の際に糖鎖へのフコースの結合を触媒する酵素を発現させないように操作し、フコースを有しない組換え抗体を作製する方法が報告されている（特許文献１参照）。
【非特許文献１】Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７７（３０），２６７３３−２６７４０，２００２
【特許文献１】国際公開公報  ＷＯ００／６１７３９号公報
【発明の開示】
本発明は、容易かつ確実にフコースの結合が消失または低下した組換えタンパク質を製造する方法の提供を目的とする。特にフコースの結合が消失または低下し、細胞障害活性が増強された抗体を製造する方法の提供を目的とする。本発明は、さらにこのようなタンパク質を産生するための宿主細胞を提供することを目的とする。
抗体産生細胞中で抗体にフコースが結合する機構として、細胞内に取り込まれたフコースにＧＤＰが結合し、その後ＧＤＰ−フコースがゴルジ体中に取り込まれゴルジ体中でＧＤＰ−フコースのフコースがタンパク質に糖鎖として付加されているＮ−アセチルグルコサミンに転移することが知られている。具体的には、抗体分子のＦｃ領域には、Ｎ−グリコシド結合糖鎖が結合する部位が２箇所あり、Ｎ−グリコシド結合糖鎖のＮ−アセチルグルコサミン部分にフコースが結合する（Ｐａｔｅ  Ｌ．Ｓｍｉｔｈ  ｅｔａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００２，１５８，８０１−８１５）。
本発明者らは、染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子を破壊することにより、ゴルジ体へのフコースの取り込みが阻害され、結果として抗体にフコースが付加されるのを阻害することができると考え、染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子を破壊した細胞を作製することにより、本発明を完成させるに至った。
本発明において、抗体へのフコースの付加を阻害するとは、製造される抗体全てがフコースが付加されていないことは必要ではなく、抗体組成物中のフコースが付加されているタンパク質の割合が減少していればよい。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］  染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子の発現が人為的に抑制されている細胞。
［２］  フコーストランスポーター遺伝子が破壊されていることを特徴とする［１］の細胞。
［３］  動物細胞である［１］または［２］の細胞。
［４］  動物がチャイニーズハムスター細胞である、［３］の細胞。
［５］  動物細胞がＣＨＯ細胞である［４］の細胞。
［６］  遺伝子の破壊がジーンターゲティングベクターを用いた相同組換えにより行われる、［２］から［５］のいずれかの細胞。
［７］  外来タンパク質をコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする［１］から［６］のいずれかの細胞。
［８］  外来タンパク質をコードする遺伝子が抗体をコードする遺伝子である［７］の細胞。
［９］  ［１］から［８］のいずれかの細胞を培養することを特徴とするタンパク質の製造方法。
［１０］  タンパク質が抗体である［９］の製造方法。
［１１］  フコースが付加されていないタンパク質を製造することを特徴とする［１０］の製造方法。
［１２］  細胞を用いて組換えタンパク質を製造する際に、染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子の発現を人為的に抑制することを特徴とする、タンパク質へのフコース付加阻害方法。
［１３］  遺伝子の発現の人為的抑制が、遺伝子を欠損することによる行われることを特徴とする［１２］のタンパク質へのフコース付加阻害方法。
［１４］  タンパク質が抗体である［１２］または［１３］のタンパク質へのフコース付加阻害方法。
［１５］  細胞がＣＨＯ細胞である［１２］から［１４］のいずれかのタンパク質へのフコース付加阻害方法。
本明細書は本願の優先権の基礎であるＰＣＴ国際特許出願ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１９２６１の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１は、３種類のターゲッティングベクターの構造を示す図である。
図２は、第一段階のノックアウト後、Ｂｇｌ  ＩＩによる切断で、出現するバンドの構造を示す図である。
図３は、第一段階のノックアウトのサザンブロット解析の結果を示す写真である。
図４は、第二段階のノックアウトの相同組み換え効率を示す図である。
図５は、フコーストランスポーター遺伝子欠損株のサザンブロット解析の結果を示す写真である。
図６は、フコーストランスポーター遺伝子欠損株（ｗｉｌｄ／ＫＯ）のフコースの発現解析の結果を示す図である。
図７は、フコーストランスポーター遺伝子欠損株（ＫＯ／ＫＯ）のフコースの発現解析の結果を示す図である。
図８は各抗ＨＭ１．２４抗体の、ヒトＰＢＭＣを用いＡＲＨ−７７を標的細胞とした場合のＡＤＣＣ活性を示す図である。
図９は、各抗ＧＰＣ３抗体の、ヒトＰＢＭＣを用いＨｕＨ−７を標的細胞とした場合のＡＤＣＣ活性を示す図である。
図１０は、ＦＴ−ＫＯ細胞産生ヒト化抗ＨＭ１．２４抗体（ａ）およびＣＨＯ細胞産生ヒト化抗ＨＭ１．２４抗体（ｂ）から調製した２−ＡＢ化糖鎖の順相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
図１１は、ＦＴ−ＫＯ細胞産生ヒト化抗ＧＰＣ３抗体（ａ，ｂ，ｃ）およびＣＨＯ細胞産生ヒト化抗ＧＰＣ３抗体から調製したアガラクトシル２−ＡＢ化糖鎖の順相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
図１２は、図１１で示したピークＧ（０）およびＧ（０）−Ｆｕｃの推定構造を示す図である。
図１３は、ＦＴ−ＫＯ細胞産生抗体（ａ）およびＣＨＯ細胞産生抗体（ｂ）についてのＤＳＣ（示差走査熱量計）測定チャートを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明においてフコーストランスポーターとはフコース輸送活性を有するポリペプチドのことをいい、例えば、フコーストランスポーターが細胞膜上に発現している場合には通常、フコースを細胞内に取り込み、フコーストランスポーターがゴルジ膜上に発現している場合には通常、フコースをゴルジ体内に取り込む。本発明においては好ましいフコーストランスポーターはチャイニーズハムスターフコーストランスポーターであり、より好ましくは配列番号２に記載されたアミノ酸配列を有するフコーストランスポーターである。配列番号１にはチャイニーズハムスターフコーストランスポーター遺伝子の塩基配列を示す。
ゴルジ体は主にゴルジ膜上に存在するフコーストランスポーターを介して、フコースをゴルジ体内に取り込んでいることから、該フコーストランスポーターの機能を阻害することにより、ゴルジ体内へのフコースの取り込みを阻害することができ、ゴルジ体内に取り込まれるフコースの量を減少させることが可能である。
細胞のフコーストランスポーターの機能を阻害するとは、フコーストランスポーターのフコース輸送活性を低下または消滅させることをいう。
細胞のフコーストランスポーターの機能の阻害はどのような方法で行われてもよいが、フコーストランスポーターの発現を阻害する方法が好ましい。
フコーストランスポーターの発現阻害は、正常な輸送能を有するフコーストランスポーターの数が減少する限り、特に制限はされないが、フコーストランスポーターを標的としたターゲティングベクターなどを用いてフコーストランスポーターをコードする遺伝子（フコーストランスポーター遺伝子）を欠失（ノックアウト）する方法が好ましい。
通常、細胞は染色体上の両方にフコーストランスポーター遺伝子を有しているが、本発明のフコーストランスポーターの機能が阻害された細胞は、染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子が欠失している。又、本発明のフコーストランスポーターの機能が阻害された細胞は、染色体上の２つのフコーストランスポーター遺伝子が欠失していれば特に限定されないが、染色体上に存在するフコーストランスポーター遺伝子の全てが欠失していることが好ましい。例えば、染色体上に３つのフコーストランスポーター遺伝子が存在する場合には、３つのフコーストランスポーター遺伝子が欠失していることが好ましい。染色体上の全てのフコーストランスポーター遺伝子が欠失しているか否かは、例えば、実施例記載のサザンブロット解析や、あるいはＦＩＳＨ法などを用いて調べることが可能である。
本発明の製造方法により作製されるタンパク質はどのようなタンパク質でもよいが、通常、糖タンパク質であり、好ましくは抗体である。
本発明の方法により作製する抗体の種類は特に制限されず、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体、ヒト抗体等や、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体等を適宜用いることができる。遺伝子組換え型抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ  ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９３，５３，８５１−８５６．）。また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９３／１２２２７，ＷＯ  ９２／０３９１８，ＷＯ  ９４／０２６０２，ＷＯ  ９４／２５５８５，ＷＯ  ９６／３４０９６，ＷＯ  ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を基に適当な��現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に衆知であり、ＷＯ  ９２／０１０４７，ＷＯ  ９２／２０７９１，ＷＯ  ９３／０６２１３，ＷＯ  ９３／１１２３６，ＷＯ  ９３／１９１７２，ＷＯ  ９５／０１４３８，ＷＯ  ９５／１５３８８を参考にすることができる。
また、抗体は抗原に結合することができれば、抗体断片等の低分子化抗体や抗体の修飾物などであってもよい。例えば、抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）、Ｄｉａｂｏｄｙなどが挙げられる。このような抗体断片を得るには、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４７６−４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６５２−６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２−１３７参照）。Ｄｉａｂｏｄｙは、可変領域と可変領域をリンカー等で結合したフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ等）（以下、Ｄｉａｂｏｄｙを構成するフラグメント）を２つ結合させて二量体化させたものであり、通常、２つのＶＬと２つのＶＨを含む（Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，６４４４−６４４８（１９９３）、ＥＰ４０４０９７号、ＷＯ９３／１１１６１号、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３，８８−９８，（１９９１）、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９，２９９−３０５，（１９９６）、Ｐｅｒｉｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２，１２１７−１２２６，（１９９４）、Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１２（７），５９７−６０４，（１９９９）、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９０，６４４４−６４４８，（１９９３）、Ａｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３，１３０１−１３１２，（１９９６））。
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。又、抗体に放射性同位元素、化学療法剤、細菌由来トキシン等の細胞傷害性物質などを結合することも可能であり、特に放射性標識抗体は有用である。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
＜本発明の方法によるタンパク質の製造方法＞
組み換えポリペプチドの製造方法は、当業者に知られている公知の方法で行うことが可能である。一般的にはポリペプチドをコードするＤＮＡを、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー。あるいは本発明のポリペプチドに対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。
また、タンパク質をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼタンパク質との融合ポリペプチドとして、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えポリペプチドとして宿主細胞（例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた組み換えポリペプチドはグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。融合ポリペプチドの精製後、必要に応じて融合ポリペプチドのうち、目的のポリペプチド以外の領域を、トロンビンまたはファクターＸａなどにより切断し、除去することも可能である。
本発明の製造方法において製造されるタンパク質としては、結合したフコースにより細胞傷害活性が影響を受ける抗体が好ましい。
抗体遺伝子を適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて抗体を産生させる方法は当業者によく知られている（例えば、Ｃａｒｌ，Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｊａｍｅｓ，Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋ，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ｂｙ  ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ  ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ  ＬＴＤ，１９９０参照）。
＜本発明のタンパク質の製造方法において用いる細胞および該細胞を用いてのタンパク質の製造＞
さらに、本発明は外来のタンパク質を産生し得る宿主細胞であって、染色体に存在するフコーストランスポーター遺伝子の両方の発現が人為的に抑制されている細胞を包含する。
このような、染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子の発現が人為的に抑制されている細胞を宿主細胞として外来タンパク質を発現させることにより、フコースの結合していないタンパク質を得ることができる。ここで、外来のタンパク質とはその細胞自体に由来しないタンパク質をいう。宿主細胞には特に制限はなく、例えば、組換えタンパク質を発現させた際に該タンパク質に糖が付加される細胞等を用いることができる。より具体的には種々の動物細胞などを用いることができ、好ましくはＣＨＯ細胞である。本発明においては特にフコーストランスポーター遺伝子がノックアウトされたＣＨＯ細胞を好適に使用することができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１０８，９４５）、ＣＯＳ、３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９１，３５８−３４０）、あるいは昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５が知られている。ＣＨＯ細胞としては、例えば、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞であるｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，４２１６−４２２０）やＣＨＯ  Ｋ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９６８）６０，１２７５）などを例示することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。
上記の外来のタンパク質を産生し得る宿主細胞であって、フコーストランスポーターの機能が阻害されている細胞に産生させようとする抗体等の外来タンパク質をコードする遺伝子を組込んだ発現ベクターを組込めば、フコースの結合していないタンパク質を得ることができる。ベクターとしては、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ  ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ」（ギブコＢＲＬ社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ」（インビトロゲン社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）等が挙げられるが、宿主細胞をＣＨＯ細胞とする場合には哺乳動物由来のベクターを使用することが好ましい。
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とする場合には、通常、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、ＭＭＬ  Ｖ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、ＣＭＶプロモーターなどを持っており、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３などが挙げられる。
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するＤＨＦＲ遺伝子を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩなど）を導入し、メトトレキセート（ＭＴＸ）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０  Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製起点を持つベクター（ｐｃＤなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
細胞の培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができる。その際、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のｐＨは、約６〜８であるのが好ましい。培養は、通常、約３０〜４０℃で約１５〜２００時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子の発現が人為的に抑制されている細胞として、染色体に存在するフコーストランスポーター遺伝子の両方が破壊された細胞を挙げることができる。
「遺伝子の破壊」とは、遺伝子の塩基配列に部分的な欠失、置換、挿入、付加等を行い、該遺伝子の発現を抑制することをいう。ここで「遺伝子の発現を抑制」には、遺伝子自体は発現するが、正常な機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が発現されない場合も含まれる。
又、遺伝子の発現が完全に抑制されている場合だけでなく、部分的に抑制されている場合も本発明の「遺伝子の破壊」に含まれる。「遺伝子の欠損（ノックアウト）」および「遺伝子の不活性化」も「遺伝子の破壊」と同等の意味として用いられる。さらに、ジーンターゲティングを用いた相同組換えにより遺伝子が破壊された細胞を遺伝子がノックアウトされた細胞という。フコーストランスポーターをコードする遺伝子を破壊した細胞は、フコーストランスポーターの発現が人為的に抑制されている細胞の１つである。
フコーストランスポーターをコードする遺伝子を破壊した細胞は、通常、ゴルジ体内に存在するフコースの量がフコーストランスポーター遺伝子が破壊されていない細胞に比べ有意に減少する、または、細胞内におけるフコース輸送能が低下または欠損する、または、細胞内のゴルジ体へのフコース取込み活性が低下または欠損する。
特に、相同染色体の２対のフコーストランスポーター遺伝子の両方が欠損した細胞は、片方のみのフコーストランスポーターが欠損した細胞と比較して、上記の性質がより顕著に現れる。
ゴルジ体中のフコースの量は細胞よりゴルジ体を単離し糖を抽出し、抗原抗体反応、糖とレクチンの結合反応、液体クロマトグラフィー、電気泳動等により測定することができる。また、細胞内におけるフコース輸送能および細胞内のゴルジ体へのフコース取込み活性は例えば、蛍光物質やラジオアイソトープ等で標識したフコースを用いて測定することができる。
遺伝子の破壊は、例えば、相同組換え法により行うことが可能である。
相同組換え法は、染色体上の遺伝子と外来ＤＮＡとの間で相同的遺伝子組換えによって目的の遺伝子だけを任意に改変する方法をいい、タンパク質をコードする配列を分断する目的で、その遺伝子のエクソンに別のＤＮＡ配列を挿入する。ジーンターゲティングベクターを持つ細胞を同定しやすくするため、遺伝子を分断する配列には一般にバクテリア由来のネオマイシン耐性遺伝子のような選択マーカーを用いる。本明細書に記載のフコーストランスポーター遺伝子の配列情報を基にターゲティングベクターを設計・作製し、該ターゲティングベクターを用いて破壊しようとするフコーストランスポーター遺伝子を相同組換えすればよい。例えば、置換型ベクターは、導入する変異の５’および３’側に連結された相同領域、ポジティブセレクション用のマーカー、相同領域の外側でベクターを直鎖状化するための制限酵素部位、相同領域の外側に配置されたネガティブセレクション用のマーカー、変異検出用の制限酵素切断部位等を含むことができる。ターゲティングベクターは、山村研一ら編  トランスジェニック動物  共立出版株式会社１９９７年３月１日、相沢慎一  ジーンターゲティング  ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製  バイオマニュアルシリーズ８  羊土社  １９９５、Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈｏａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９４４）、Ｊｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、松村正實ら編  実験医学別冊  新遺伝子工学ハンドブック（改定第３版）羊土社  １９９９  等に記載の方法に従って作製することができる。ターゲティングベクターは挿入型および置換型のどちらを用いてもよい。また、Ｃｒｅ−ｌｏｘ系を用いたターゲティングにより組換えを起こさせることもできる。Ｃｒｅ−ｌｏｘ系を用いたターゲティングは、例えば特表平１１−５０３０１５号公報に記載の方法に従って行うことができる。相同組換えを起こした相同組換え体の選別方法としては、ポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択等の公知の選択方法を用いればよい。相同組換え体の同定は、ＰＣＲ法でもサザンブロッティング法のいずれの方法をも用いることができる。
さらに、本発明のフコーストランスポーター遺伝子が破壊された細胞は、染色体の２対のフコーストランスポーターの両方が欠損する限り、細胞にランダムに変異を導入しても得ることができる。ランダムに変異を導入する方法として、マーカーの入った遺伝子破壊ベクターを細胞のゲノムにランダムに導入してフコーストランスポーター遺伝子が破壊された細胞をスクリーニングする方法と、ＥＮＵ（Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）等の化学変異原でランダムな変異を導入してフコーストランスポーター遺伝子が破壊された細胞をスクリーニングする方法が挙げられる。フコーストランスポーターが産生されなくなった細胞のスクリーニングは、フコーストランスポーターの活性を指標に行ってもよいし、ウエスタンブロッティングやノーザンブロッティングによりフコーストランスポーター遺伝子の転写、発現を指標にして行うこともできる。
さらに本発明のフコーストランスポーター遺伝子が破壊された細胞は、フコーストランスポーター遺伝子をノックアウトした動物から得ることができる。フコーストランスポーター遺伝子をノックアウトした動物は、ＥＳ細胞のフコーストランスポーターを前記方法で破壊し、該ＥＳ細胞から例えば、ＷＯ０２／３３０５４号公報に記載の方法で作出することができる。この際用いる動物としては、限定されないがヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、マウス、ハムスター、ラット等が挙げられる。フコーストランスポーター遺伝子をノックアウトした動物から株化細胞を作製することにより、フコーストランスポーター遺伝子を有しない株化細胞を得ることができる。
本発明の染色体上の２つのフコーストランスポーター遺伝子の両方が破壊された宿主細胞で外来の組換えタンパク質を産生させた場合、細胞中のフコースがゴルジ体中にトランスポートされないためタンパク質へのフコースの付加が阻害される。フコーストランスポーター遺伝子が破壊された宿主細胞で産生した組換えタンパク質は、フコーストランスポーター遺伝子が破壊されていない宿主細胞で産生した組換えタンパク質に比較して結合しているフコース量が有意に少なく、好ましくは検出できない。外来タンパク質が抗体の場合、抗体１分子の２つのＨ鎖のＦｃ領域に存在する２箇所の糖鎖結合部位に結合したＮ−グリコシド結合糖鎖にフコースが結合していないものが得られる。このようなフコースが結合していない抗体は細胞傷害活性が増強されている。なお、本発明の細胞を用いて、抗体へのフコースの付加が阻害された抗体を製造する場合、製造される抗体全てがフコースが付加されていないことは必要ではなく、抗体組成物中のフコースが付加されているタンパク質の割合が減少していればよい。
例えば、本発明のフコーストランスポーター遺伝子が破壊されている動物細胞を用いて作製した抗体において、総糖鎖の５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上が、フコースが付加されていない。
さらに、本発明は、染色体上のフコーストランスポーター遺伝子の両方が欠損した動物（ヒトを除く）も包含する。このような動物を用いることによりｉｎ  ｖｉｖｏで組換えポリペプチドを産生することができる。
これらの動物に目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを導入し、動物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物などを包含する。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ  Ｇｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。
例えば、目的とするＤＮＡを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的のポリペプチドを得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるポリペプチドを含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
得られたポリペプチドは、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一なポリペプチドとして精製することができる。ポリペプチドの分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればポリペプチドを分離、精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
なお、ポリペプチドを精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。
本発明の製造方法により製造される抗体のＨ鎖又はＬ鎖をコードする遺伝子は既知の配列を用いることも可能であり、又、当業者に公知の方法で取得することも可能である。例えば、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから抗体をコードする遺伝子をクローニングして取得することも可能であるし、抗体ライブラリから取得することも可能である。ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製できる。得られたハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成し、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結することによりＨ鎖又はＬ鎖をコードする遺伝子を得ることができる。免疫の際の感作抗原としては特に限定されないが、例えば、目的の全長タンパク質や、部分ペプチドなどを用いることができる。抗原の調製は、当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、バキュロウイルスを用いた方法（例えば、ＷＯ９８／４６７７７など）などに準じて行うことができる。ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８１，７３，３−４６．）等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。
抗体ライブラリについては既に多くの抗体ライブラリが公知になっており、又、抗体ライブラリの作製方法も公知であるので、当業者は適宜抗体ライブラリを入手することが可能である。
上述のように発現、産生された抗体は、通常のタンパク質の精製で使用されている公知の方法により精製することができる。例えば、プロテインＡカラムなどのアフィニティーカラム、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。
抗体の抗原結合活性（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）の測定には公知の手段を使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。
本発明の細胞を用いて産生させたタンパク質の糖鎖構造の解析は、２次元糖鎖マップ法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，，１７１，７３，（１９８８）、生物化学実験法２３−糖タンパク質糖鎖研究法  高橋禮子編  学会出版センター（１９８９）等に記載の方法により行うことができる。さらに、糖鎖をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ等の質量分析により解析することもできる。
また、本発明の細胞を用いて産生させたフコースが付加されていないタンパク質の熱安定性等の安定性はフコースが付加されたタンパク質と同等である。
抗体の細胞障害活性
本発明の方法で製造される抗体は細胞障害活性が増加した抗体である。
本発明における細胞障害活性とは、例えば抗体依存性細胞介在性細胞障害（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞障害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＣＤＣ）活性などを挙げることができる。本発明において、ＣＤＣ活性とは補体系による細胞障害活性を意味し、ＡＤＣＣ活性とは標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、そのＦｃ部分にＦｃγ受容体保有細胞（免疫細胞等）がＦｃγ受容体を介して結合し、標的細胞に障害を与える活性を意味する。
抗体がＡＤＣＣ活性を有するか否か、又はＣＤＣ活性を有するか否かは公知の方法により測定することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ７．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｊｏｈｎ  Ｅ，Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９３）等）。
具体的には、まず、エフェクター細胞、補体溶液、標的細胞の調製を行う。
（１）  エフェクター細胞の調製
ＣＢＡ／Ｎマウスなどから脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）中で脾臓細胞を分離する。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＨｙＣｌｏｎｅ社製）を含む同培地で洗浄後、細胞濃度を５×１０６／ｍｌに調製し、エフェクター細胞を調製する。
（２）補体溶液の調製
Ｂａｂｙ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ社製）を１０％  ＦＢＳ含有培地（ＧＩＢＣＯ社製）にて１０倍希釈し、補体溶液を調製する。
（３）標的細胞の調製
膵臓癌細胞株（ＡｓＰＣ−１、Ｃａｐａｎ−２等）を０．２ｍＣｉの５１Ｃｒ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｒｏｍａｔｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）とともに、１０％  ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃にて１時間培養することにより放射性標識する。放射性標識後、細胞を１０％  ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地にて３回洗浄し、細胞濃度を２×１０５／ｍｌに調製して、標的細胞を調製する。
次いで、ＡＤＣＣ活性、又はＣＤＣ活性の測定を行う。ＡＤＣＣ活性の測定の場合は、９６ウェルＵ底プレート（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に、標的細胞と、抗体を５０μｌずつ加え、氷上にて１５分間反応させる。その後、エフェクター細胞１００μｌを加え、炭酸ガスインキュベータ内で４時間培養する。抗体の終濃度は０または１０μｇ／ｍｌとする。培養後、１００μｌの上清を回収し、ガンマカウンター（ＣＯＢＲＡＩＩＡＵＴＯ−ＧＭＭＡ、ＭＯＤＥＬ  Ｄ５００５、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ社製）で放射活性を測定する。細胞障害活性（％）は（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）×１００により求めることができる。Ａは各試料における放射活性（ｃｐｍ）、Ｂは１％ＮＰ−４０（半井社製）を加えた試料における放射活性（ｃｐｍ）、Ｃは標的細胞のみを含む試料の放射活性（ｃｐｍ）を示す。
一方、ＣＤＣ活性の測定の場合は、９６ウェル平底プレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に、標的細胞と、抗ＰｅｐＴ抗体を５０μｌずつ加え、氷上にて１５分間反応させる。その後、補体溶液１００μｌを加え、炭酸ガスインキュベータ内で４時間培養する。抗体の終濃度は０または３μｇ／ｍｌとする。培養後、１００μｌの上清を回収し、ガンマカウンターで放射活性を測定する。細胞障害活性はＡＤＣＣ活性の測定と同様にして求めることができる。
例えば、本発明のフコーストランスポーター遺伝子が破壊されている動物細胞を用いで作製した抗体と同種の動物細胞であって、フコーストランスポーター遺伝子が破壊されていない動物細胞を用いて作製した抗体のＡＤＣＣ活性を、抗体濃度−細胞障害活性（％）曲線から５０％細胞障害活性を与える抗体濃度を求めて比較した場合、フコーストランスポーター遺伝子が破壊されている動物細胞を用いて作製した抗体の５０％細胞障害活性を与える抗体濃度はフコーストランスポーター遺伝子が破壊されていない動物細胞を用いて作製した抗体の５０％細胞障害活性を与える抗体濃度の１／２、好ましくは１／５、さらに好ましくは１／１０である。すなわち、本発明のフコーストランスポーター遺伝子が破壊されている動物細胞を用いて作製した抗体のＡＤＣＣ活性は、フコーストランスポーター遺伝子が破壊されていない動物細胞を用いて作製した抗体に比較して、２倍以上、好ましくは５倍以上、さらに好ましくは１０倍以上増強される。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例】実施例１  ＣＨＯ細胞におけるフコーストランスポーター遺伝子の破壊
１．ターゲッティングベクターの構築
（１）  ＫＯ１ベクターの作製
ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（インビトロジェン社）よりＨｙｇ５−ＢＨとＨｙｇ３−ＮＴのプライマーでＰＣＲすることによって、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子（Ｈｙｇｒ）の開始コドンの５’側にＢａｍＨ  ＩサイトとＴＧＣＧＣの配列を付加することで、フコーストランスポーター遺伝子の開始コドンの５’側と同じ配列にし、ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡ付加シグナルまでの領域を含む３’側にはＮｏｔ  Ｉサイトを付加してＨｙｇｒを抜き出した。
フォワードプライマー
Ｈｙｇ５−ＢＨ  ５’−ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＧＣ  ＧＣＡ  ＴＧＡ  ＡＡＡ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＡＡＣ  ＴＣＡ  ＣＣ−３’（配列番号３）
リバースプライマー
Ｈｙｇ３−ＮＴ  ５’−ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＴＡＴ  ＴＣＣ  ＴＴＴ  ＧＣＣ  ＣＴＣ  ＧＧＡ  ＣＧ−３’（配列番号４）
フコーストランスポーターのターゲッティングベクターｖｅｒ．１（以下、ＫＯ１ベクターと称する）はｐＭＣ１ＤＴ−Ａベクター（Ｙａｇｉ  Ｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ｖｏｌ．８７，ｐ９９１８−９９２２，１９９０）に、フコーストランスポーターの５’側（配列番号１に示す塩基配列のＮｏ．２，７８０のＳｍａ  ＩからＮｏ．４，２３２のＢａｍＨ  Ｉ）、３’側（Ｎｏ．４，２８４からＮｏ．１０，９３４のＳａｃ  Ｉまで）、及びＨｙｇｒフラグメントを各々挿入することで構築した（図１）。ベクターの特徴としては、Ｈｙｇｒにプロモーターが付加されていないことから、相同組み換えを起こしたときにフコーストランスポーターのプロモーターによって、Ｈｙｇｒが発現することとなる。しかしながら、相同組み換えによって１コピーのみベクターが細胞に導入されても、ハイグロマイシンＢに対する耐性を獲得するほどＨｙｇｒが発現するとは限らない。なお、ＫＯ１ベクターはＮｏｔ  Ｉで切断して細胞に導入した。ＫＯ１ベクターによって、フコーストランスポーターは開始コドンを含むエクソン１の４１塩基対を欠損することになり、機能を失うものと考えられる。
（２）ｐＢＳＫ−ｐｇｋ−１−Ｈｙｇｒの作製
ｐＫＪ２ベクター（Ｐｏｐｏ  Ｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｖｏｌ．２８，ｐ２９９−３０８，１９９０）よりマウスｐｇｋ−１遺伝子のプロモーターをＥｃｏＲ  Ｉ−Ｐｓｔ  Ｉによって切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン社）のＥｃｏＲ  Ｉ−Ｐｓｔ  ＩサイトにクローニングしてｐＢＳＫ−ｐｇｋ−１を作製した。ＨｙｇｒはｐｃＤＮＡ３．１／ＨｙｇｒｏよりＨｙｇ５−ＡＶとＨｙｇ３−ＢＨのプライマーでＰＣＲすることによって、Ｈｙｇｒの５’側にＥｃｏＴ２２  ＩサイトとＫｏｚａｋ配列を付加し、ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡ付加シグナルまでの領域を含む３’側にはＢａｍＨ  Ｉサイトを付加してＨｙｇｒを抜き出した。
フォワードプライマー
Ｈｙｇ５−ＡＶ  ５’−ＡＴＧ  ＣＡＴ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＡＡＧ  ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＣＴＣ  ＡＣＣ−３’（配列番号５）
リバースプライマー
Ｈｙｇ３−ＢＨ  ５’−ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＣＡＧ  ＧＣＴ  ＴＴＡ  ＣＡＣ  ＴＴＴ  ＡＴＧ  ＣＴＴ  Ｃ−３’（配列番号６）
このＨｙｇｒ（ＥｃｏＴ２２  Ｉ−ＢａｍＨ  Ｉ）フラグメントをｐＢＳＫ−ｐｇｋ−１のＰｓｔ  Ｉ−ＢａｍＨ  Ｉサイトに挿入し、ｐＢＳＫ−ｐｇｋ−１−Ｈｙｇｒを作製した。
（３）ＫＯ２ベクターの作製
フコーストランスポーターのターゲッティングベクターｖｅｒ．２（以下、ＫＯ２ベクターと称する）はｐＭＣ１ＤＴ−Ａベクターにフコーストランスポーターの５’側（配列番号１に示す塩基配列のＮｏ．２，７８０のＳｍａ  ＩからＮｏ．４，２３２のＢａｍＨ  Ｉ）、３’側（Ｎｏ．４，２８４からＮｏ．１０，９３４のＳａｃ  Ｉまで）、及びｐｇｋ−１−Ｈｙｇｒフラグメントを各々挿入することで構築した（図１）。ＫＯ１ベクターと異なり、ＫＯ２ベクターはＨｙｇｒにｐｇｋ−１遺伝子のプロモーターが付加されていることから、相同組み換えによって１コピーのみベクターが細胞に導入されても、ハイグロマイシンＢに対する耐性を獲得する。なお、ＫＯ２ベクターはＮｏｔ  Ｉで切断して細胞に導入した。ＫＯ２ベクターによって、フコーストランスポーターは開始コドンを含むエクソン１の４６塩基対を欠損することになり、機能を失うものと考えられる。
（４）ｐＢＳＫ−ｐｇｋ−１−Ｐｕｒｏｒの作製
ｐＰＵＲベクター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）をＰｓｔ  ＩとＢａｍＨ  Ｉで切断し、切り出されたフラグメント（Ｐｕｒｏｒ）をｐＢＳＫ−ｐｇｋ−１のＰｓｔ  Ｉ−ＢａｍＨ  Ｉサイトに挿入し、ｐＢＳＫ−ｐｇｋ−１−Ｐｕｒｏｒを作製した。
（５）ＫＯ３ベクターの作製
フコーストランスポーターのターゲッティングベクターｖｅｒ．３（以下、ＫＯ３ベクターと称する）はｐＭＣ１ＤＴ−Ａベクターにフコーストランスポーターの５’側（配列番号１に示す塩基配列のＮｏ．２，７８０のＳｍａ  ＩからＮｏ．４，２３２のＢａｍＨ  Ｉ）、３’側（Ｎｏ．４，２８４からＮｏ．１０，９３４のＳａｃ  Ｉまで）、及びｐｇｋ−１−Ｐｕｒｏｒフラグメントを各々挿入することで構築した（図１）。なお、ｐｇｋ−１−Ｐｕｒｏｒの３’末端には、以下に示すスクリーニング用のプライマーが結合する配列を予め付加しておいた。なお、ＫＯ３ベクターはＮｏｔ  Ｉで切断して細胞に導入した。ＫＯ３ベクターによって、フコーストランスポーターは開始コドンを含むエクソン１の４６塩基対を欠損することになり、機能を失うものと考えられる。
リバースプライマー
ＲＳＧＲ−Ａ    ５’−ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＴＧＧ  ＡＧＴ  ＡＣＴ  ＧＴＧ  ＣＡＴ  ＣＴＧ  Ｃ−３’（配列番号７）
以上の３種類のターゲッティングベクターを用いて、フコーストランスポーター遺伝子のノックアウトを試みた。
２．ＣＨＯ細胞へのベクターの導入
ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ  ＨＴ−（インビトロジェン社、ｃａｔ  １２０５２−０９８）にＨＴ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００Ｘ）（インビトロジェン社  ｃａｔ．１１０６７−０３０）とペニシリンストレプトマイシン（インビトロジェン社  ｃａｔ．１５１４０−１２２）をＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ  ＨＴ−の容量に対して、それぞれ１／１００量を加えた。これを培養用の培地（以下、ＳＦＭＩＩ（＋）と称する）としてＣＨＯ細胞のＤＸＢ１１株を継代し、さらに遺伝子導入後の培養もこのＳＦＭＩＩ（＋）で行った。８Ｘ１０６個のＣＨＯ細胞を０．８ｍＬのダルベッコリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳと略す。インビトロジェン社  ｃａｔ  １４１９０−１４４）に懸濁した。細胞懸濁液に３０μｇのターゲッティングベクターを加え、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅ（４ｍｍ）（バイオラッド社ｃａｔ．１６５２０８８）に細胞懸濁液を移した。氷上で１０分間放置した後に、ＧＥＮＥ−ＰＵＬＳＥＲＩＩ（バイオラッド社ｃｏｄｅ  Ｎｏ．３４０ＢＲ）で１．５ｋＶ，２５μＦＤの条件で、エレクトロポレーション法によりベクターを細胞に導入した。ベクターを導入後、細胞を２００ｍｌのＳＦＭＩＩ（＋）培地に懸濁して２０枚の９６穴平底プレート（イワキ社ｃａｔ．１８６０−０９６）に１００μｌ／ウェルで細胞を播きこんだ。プレートをＣＯ２インキュベータ内で、２４時間、３７℃で培養した後、薬剤を添加した。
３．ノックアウトの第一段階
ＫＯ１ベクター、もしくはＫＯ２ベクターをそれぞれＣＨＯ細胞に導入し、ベクター導入から２４時間後にハイグロマイシンＢ（インビトロジェン社  ｃａｔ．１０６８７−０１０）による選抜を行った。ハイグロマイシンＢは０．３ｍｇ／ｍｌになるようにＳＦＭＩＩ（＋）に溶解し、１００μｌ／ウェル添加した。
４．ＰＣＲによる相同組み換え体のスクリーニング
（１）ＰＣＲ用のサンプルの調整
相同組み換え体はＰＣＲ法によってスクリーニングした。スクリーニングで用いるＣＨＯ細胞は９６穴平底プレートで培養し、培養上清除去後に細胞溶解用の緩衝液を５０μｌ／ウェル加えて５５℃、２時間加温し、続いて９５℃、１５分加熱することで、プロティナーゼＫを失活させてＰＣＲの鋳型とした。細胞溶解用の緩衝液は、１ウェルあたり１０  Ｘ  ＬＡ緩衝液ＩＩ（タカラ社ＬＡ  Ｔａｑに添付）５μｌ、１０％  ＮＰ−４０（ロッシュ社  ｃａｔ．１  ３３２  ４７３）２．５μｌ、プロティナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ、タカラ社ｃａｔ．９０３３）４μｌ、及び蒸留水（ナカライテスク社  ｃａｔ．３６４２１−３５）３８．５μｌで構成されている。
（２）ＰＣＲの条件
ＰＣＲ反応混合物は上記のＰＣＲサンプル１μｌ、１０  Ｘ  ＬＡ緩衝液ＩＩ  ５μｌ、ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）５μｌ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）５μｌ、プライマー（各１０μＭ）２μｌ、ＬＡ  Ｔａｑ（５  ＩＵ／μｌ  ｃａｔ．ＲＲＯ０２Ｂ）０．５μｌ、及び蒸留水２９．５μｌ（全５０μｌ）とした。ＫＯ１ベクターを導入した細胞のスクリーニングには、ＴＰ−Ｆ４とＴＨｙｇｒｏ−Ｒ１、ＫＯ２ベクターを導入した細胞のスクリーニングには、ＴＰ−Ｆ４とＴＨｙｇｒｏ−Ｆ１をＰＣＲプライマーに用いた。
ＫＯ１ベクターを導入した細胞のＰＣＲは、９５℃にて１分間の前加熱、９５℃にて３０秒間、６０℃にて３０秒間、及び６０℃にて２分間の増幅サイクル４０サイクル、並びに７２℃にて７分の複加熱とした。ＫＯ２ベクターを導入した細胞のスクリーニングには９５℃にて１分間の前加熱、９５℃にて３０秒間、及び７０℃にて３分間の増幅サイクル４０サイクル、並びに７０℃にて７分の複加熱とした。
プライマーは以下の通りで、相同組み換えを起こした細胞のサンプルでは、ＫＯ１ベクターでは、約１．６ｋｂ、ＫＯ２ベクターでは約２．０ｋｂのＤＮＡが増幅される。プライマーはＴｐ−Ｆ４がベクターの外側で、かつ５’側のフコーストランスポーターのゲノム領域に設定し、ＴＨｙｇｒｏ−Ｆ１、及びＴＨｙｇｒｏ−Ｒ１はベクター内のＨｙｇｒの中に設定した。
フォワードプライマー（ＫＯ１，ＫＯ２）
ＴＰ−Ｆ４  ５’−ＧＧＡ  ＡＴＧ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＣＡＡ  ＧＧＧ  ＡＣＴ  ＣＧＣ−３’（配列番号８）
リバースプライマー（ＫＯ１）
ＴＨｙｇｒｏ−Ｒ１  ５’−ＴＧＣ  ＡＴＣ  ＡＧＧ  ＴＣＧ  ＧＡＧ  ＡＣＧ  ＣＴＧ  ＴＣＧ  ＡＡＣ−３’（配列番号９）
リバースプライマー（ＫＯ２）
ＴＨｙｇｒｏ−Ｆ１  ５’−ＧＣＡ  ＣＴＣ  ＧＴＣ  ＣＧＡ  ＧＧＧ  ＣＡＡ  ＡＧＧ  ＡＡＴ  ＡＧＣ−３’（配列番号１０）
５．ＰＣＲスクリーニング結果
ＫＯ１ベクターを導入した細胞は９１８個を解析し、そのうち相同組み換え体と考えられる細胞は１個であった（相同組み換え効率は約０．１％）。また、ＫＯ２ベクターを導入した細胞は５３７個を解析し、そのうち相同組み換え体と考えられる細胞は１７個であった（相同組み換え効率は約３．２％）。
６．サザンブロット解析
さらに、サザンブロット法によっても確認を行った。培養した細胞から定法に従ってゲノムＤＮＡを１０μｇ調整し、サザンブロットを行った。配列番号１に示す塩基配列のＮｏ．２，１１３−Ｎｏ．２，５００の領域から、以下の二種類のプライマーを用いてＰＣＲ法により３８７ｂｐのプローブを調整し、これをサザンブロット法による確認に用いた。ゲノムＤＮＡはＢｇｌ  ＩＩで切断した。
フォワードプライマー
Ｂｇｌ−Ｆ：５’−ＴＧＴ  ＧＣＴ  ＧＧＧ  ＡＡＴ  ＴＧＡ  ＡＣＣ  ＣＡＧ  ＧＡＣ  −３’（配列番号１１）
リバースプライマー
Ｂｇｌ−Ｒ：５’−ＣＴＡ  ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＴＧＴ  ＧＣＴ  ＴＴＣ  ＴＴＣ  Ｃ  −３’（配列番号１２）
Ｂｇｌ  ＩＩによる切断によって、フコーストランスポーターの染色体からは約３．０ｋｂ、ＫＯ１ベクターで相同組み換えを起こした染色体からは約４．６ｋｂ、ＫＯ２ベクターで相同組み換えを起こした染色体からは約５．０ｋｂのバンドがそれぞれ出現する。図２は第一段階のノックアウト後、Ｂｇｌ  ＩＩによる切断で、出現するバンドの構造を示す図であり、図３は実際にサザンプロットを行ったときのデータを示したものである。ＫＯ１ベクター、及びＫＯ２ベクターによって相同組み換えを起こした細胞のそれぞれ１、７種類を実験に用いた。ＫＯ１ベクターで唯一獲得された細胞は５Ｃ１と名付けたが、その後の解析により複数の細胞集団から構成されることが明らかになったので、限界希釈によってクローン化し、その後の実験に用いることにした。また、ＫＯ２ベクターで獲得された細胞の一つを６Ｅ２と名付けた。
７．ノックアウトの第二段階
ＫＯ１ベクター、及びＫＯ２ベクターによって相同組み換えが成功した細胞に対し、３種類のベクターを用いて、フコーストランスポーター遺伝子が完全に欠損した細胞株の樹立を試みた。ベクターと細胞の組み合わせは、以下の通りである。方法１．ＫＯ２ベクターと５Ｃ１細胞（ＫＯ１）、方法２．ＫＯ２ベクターと６Ｅ２細胞（ＫＯ２）、方法３．ＫＯ３ベクターと６Ｅ２細胞（ＫＯ２）。ベクターをそれぞれの細胞に導入し、ベクター導入から２４時間後にハイグロマイシンＢ、ピューロマイシン（ナカライテスク社、ｃａｔ．２９４５５−１２）による選抜を開始した。ハイグロマイシンＢは方法１では最終濃度が１ｍｇ／ｍｌ、方法２では最終濃度が７ｍｇ／ｍｌになるようにした。さらに方法３では、ハイグロマイシンＢの最終濃度が０．１５ｍｇ／ｍｌ、ピューロマイシンの最終濃度が８μｇ／ｍｌになるように添加した。
８．ＰＣＲによる相同組み換え体のスクリーニング
サンプルの調整は前述の通り。方法１に関するスクリーニングは、前述のＫＯ１ベクター、及びＫＯ２ベクターで相同組み換えを起こした細胞を検出するＰＣＲを両方行った。方法２に関しては、下記のＰＣＲプライマーを設計した。配列番号１に示す塩基配列のＮｏ．３，９２４−３，９５０の領域にＴＰＳ−Ｆ１を、Ｎｏ．４，２４８−４，２７４にＳＨｙｇｒｏ−Ｒ１を設定した。このＰＣＲプライマーによって、ＫＯ２ベクターにより欠損するフコーストランスポーターの遺伝子領域の３５０ｂｐが増幅される。従って、方法２におけるＰＣＲスクリーニングにおいては、３５０ｂｐが増幅されないものを、フコーストランスポーター遺伝子が完全に欠損した細胞とみなすことにした。ＰＣＲの条件は、９５℃にて１分間の前加熱、９５℃にて３０秒間、７０℃にて１分間の増幅サイクル３５サイクル、並びに７０℃にて７分の複加熱とした。
フォワードプライマー
ＴＰＳ−Ｆ１：５’−ＣＴＣ  ＧＡＣ  ＴＣＧ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＴＡ  ＧＧＣ  ＡＡＣ  ＡＧＣ−３’（配列番号１３）
リバースプライマー
ＳＨｙｇｒｏ−Ｒ１：５’−ＴＣＡ  ＧＡＧ  ＧＣＡ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＣＣＴ  ＣＣＡ  ＧＴＣ  ＡＧＣ−３’（配列番号１４）
方法３に関しては、フォワードプライマーにＴＰ−Ｆ４、リバースプライマーにＲＳＧＲ−Ａを用いた。ＰＣＲの条件は、９５℃にて１分間の前加熱、９５℃にて３０秒間、６０℃にて３０秒間、７２℃にて２分間の増幅サイクル３５サイクル、並びに７２℃にて７分の複加熱とした。ＫＯ３ベクターによって相同組み換えを起こした細胞のサンプルでは、約１．６ｋｂのＤＮＡが増幅される。このＰＣＲでＫＯ３ベクターによって相同組み換えを起こした細胞を検出するとともに、ＫＯ２ベクターでの相同組み換えが残っていることも確認した。
９．ＰＣＲスクリーニング結果
方法１では６１６個を解析し、そのうち相同組み換え体と考えられる細胞は１８個であった（相同組み換え効率は２．９％）（図４）。方法２では５２４個を解析し、そのうち相同組み換え体と考えられる細胞は２個であった（相同組み換え効率は約０．４％）。さらに、方法３では３８２個を解析し、そのうち相同組み換え体と考えられる細胞は７個であった（相同組み換え効率は約１．８％）。
１０．サザンブロット解析
前述の方法に準じて解析を行った。その結果、解析できた細胞のうち、フコーストランスポーターの遺伝子が完全に欠損している細胞を１つ見出した。第一段階のノックアウトでは、ＰＣＲとサザンブロットの解析結果が一致したが、この第二段階のノックアウトでは、一致しなかった。この原因としては、１．例えば、方法１でＫＯ１、ＫＯ２のそれぞれ単独で相同組み換えを起こした細胞が混在している、２．フコーストランスポーター遺伝子が一対（２遺伝子）ではなく複数対（あるいは３遺伝子以上）存在する、３．第一段階のノックアウトが成功した細胞株を培養していると、継代中に残ったフコーストランスポーター遺伝子がコピー数を増やすことなどの可能性が考えられた。
１１．フコースの発現解析
さらに、ＰＣＲで相同組み換え体と判断された２６の細胞におけるフコースの発現を解析した。５μｇ／ｍＬのＬｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，ＦＩＴＣ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ベクターラボラトリー社ｃａｔ．ＦＬ−１０４１）、２．５％のＦＢＳ、０．０２％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ（以下、ＦＡＣＳ溶解液と称する）１００μｌで１×１０６個の細胞を氷冷中で１時間染色した。その後、ＦＡＣＳ溶解液で細胞を３回洗浄してＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン社）で測定を行った。その結果、サザンブロット解析でフコーストランスポーターの遺伝子が完全に欠損していると判断された細胞のみ、フコースの発現が低下していることが明らかになった。図５から７は得られたクローンのサザンブロット解析（図５）と、フコースの発現を示した図である。図６は、ｗｉｌｄ／ＫＯの結果を示し、図７は、ＫＯ／ＫＯの結果を示す。
以上の結果より以下のことが判明した。
フコーストランスポーターの遺伝子が完全に欠失している細胞は１株しかなく、スクリーニングした数が６１６個であったことを考えると、相同組み換えの頻度は約０．１６％と低い結果になった。第二段階のノックアウトで、ＰＣＲとサザンブロットの解析結果が一致しなかった理由は、前述のようにいくつか考えられるが、方法３においては、２種類の薬剤で選抜しているため、得られた細胞株がＫＯ２ベクター、ＫＯ３ベクターのそれぞれ単独で相同組み換えを起こした細胞が混在しているとは考えられない。また、その他のＰＣＲで相同組み換えを起こしたと判断された細胞株もすべて、複数の細胞集団から構成されているとは考えにくい。前述のようにフコーストランスポーター遺伝子が３以上存在した場合には、細胞におけるターゲッティングは格段に難しくなり、ＫＯ１ベクターのようなＨｙｇｒが発現しにくいもの使用し、なおかつ数多くのスクリーニングを行わないと相同組み換え体が得られないものと考えられた。
実施例２  抗体発現ベクターの調製
ヒト化抗ＨＭ１．２４抗体発現ベクター、ＡＨＭ（Ｉ）／Ｎ５ＫＧ１（ＷＯ２００５／０１４６５１）はＳｓｐ  Ｉにて、また、ヒト化抗ＧＰＣ３抗体のＨ鎖がバージョンＫであって、Ｌ鎖のＡｓｎ３３をＡｒｇに置換した改変抗体遺伝子（後記の参考実施例１〜参考実施例３）を発現するベクターであるｐＣＸＮＤ３／ｈＧＣ３３／Ｋ／ＡｒｇはＰｖｕ  Ｉにて切断し実験に用いた。
実施例３  抗体産生細胞の樹立
ＳＦＭＩＩ（＋）培地にハイグロマイシンＢの最終濃度が１ｍｇ／ｍｌになるように調製し、実施例１で得られたフコーストランスポーター欠損株（ＦＴ−ＫＯ細胞、クローン名３Ｆ２）を継代した。８Ｘ１０６個の３Ｆ２を０．８ｍＬのダルベッコリン酸緩衝液に懸濁した。細胞懸濁液に２５μｇの各抗体発現ベクターを加え、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅに細胞懸濁液を移した。氷上で１０分間放置した後に、ＧＥＮＥ−ＰＵＬＳＥＲ  ＩＩで１．５ｋＶ，２５μＦＤの条件で、エレクトロポレーション法によりベクターを細胞に導入した。ベクターを導入後、細胞をＳＦＭＩＩ（＋）培地４０ｍＬに懸濁して９６穴平底プレート（イワキ社）に１００μｌ／ウェルで細胞を播きこんだ。プレートをＣＯ２インキュベータ内で、２４時間、３７℃で培養した後、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（インビトロジェン社、ｃａｔ．１０１３１−０２７）を終濃度０．５ｍｇ／ｍＬになるように添加した。薬剤に耐性になった細胞の抗体産生量を測定し、ヒト化抗ＨＭ１．２４抗体産生細胞株、ヒト化抗ＧＰＣ３抗体産生細胞株をそれぞれ樹立した。
実施例４  抗体の精製
抗体発現株より培養上清を回収し、Ｐ−１ポンプ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてＨｉｔｒａｐｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＣＡＴ＃  １７−５０８０−０１）にチャージした。結合バッファ（２０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．０））にて洗浄後、溶出バッファ（０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎ−ＨＣｌ（ｐＨ２．７））で溶出した。溶出液は直ちに中和バッファ（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））で中和した。ＤＣ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（ＢＩＯ−ＲＡＤ  ＣＡＴ＃  ５００−０１１１）により抗体の溶出画分を選択しプールした後、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−ＹＭ１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＣＡＴ＃  ４３０４）にて２ｍＬ程度まで濃縮した。次に、２０ｍＭ酢酸バッファ，１５０ｍＭ  Ｎａｃｌ，（ｐＨ６．０）にて平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００２６／６０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてゲルろ過により分離した。モノマー画分のピークを回収し、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−ＹＭ１０にて濃縮後、ＭＩＬＬＥＸ−ＧＷ  ０．２２μｍ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＣＡＴ＃  ＳＬＧＶ  ０１３ＳＬ）を用いてＦｉｌｔｒａｔｉｏｎした後、４℃で保管した。精製された抗体の濃度は、２８０ｎｍの吸光度を測定し、モル吸光計数から換算した。
実施例５  ＦＴ−ＫＯ細胞産生ヒト化抗ＨＭ１．２４抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣ活性
１．ヒトＰＢＭＣ溶液の調製
健常人よりヘパリン加採血した末梢血を、ＰＢＳ（−）で２倍に希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＴＭ  ＰＬＵＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に重層した。これを遠心（５００×ｇ、３０分間、２０℃）した後、単核球画分である中間層を分取した。３回洗浄後、１０％  ＦＢＳ／ＲＰＭＩに懸濁し、ヒトＰＢＭＣ溶液とした。
２．標的細胞の調製
１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地で培養したＡＲＨ−７７細胞（ＡＴＣＣ）を、ピペッティングでディッシュから剥離し、チューブ内で遠心後１００μＬの培地に懸濁させた。そこに５．５５ＭＢｑのＣｒ−５１を加え、５％炭酸ガスインキュベータ中３７℃、１時間培養し、この細胞を培地で２回洗浄し、１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地を加え、９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ）の各ウェルに１×１０４細胞／ウェルで分注し、標的細胞とした。
３．クロム遊離試験（ＡＤＣＣ活性）
標的細胞に各濃度に調製した抗体溶液５０μＬを添加し、室温で１５分反応させた後に、ヒトＰＢＭＣ溶液１００μＬ（５×１０５細胞／ウェル）を加え、５％炭酸ガスインキュベータ中３７℃、４時間培養し、培養後、プレートを遠心分離し、培養上清１００μＬ中の放射活性をガンマカウンターで測定した。下式により特異的クロム遊離率を求めた。
特異的クロム遊離率（％）＝（Ａ−Ｃ）×１００／（Ｂ−Ｃ）
Ａは各ウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値、Ｂは標的細胞に２％  ＮＰ−４０水溶液（Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．２５２−２３、ナカライテスク株式会社）を１００μＬ、１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地を５０μＬ添加したウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値、Ｃは標的細胞に１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地を１５０μＬ添加したウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値を示す。試験は三重に行い、ＡＤＣＣ活性（％）について平均値および標準偏差を算出した。
抗ＨＭ１．２４抗体のヒトＰＢＭＣを用いたＡＤＣＣ活性を図８に示す。白抜きはＷｉｌｄ  ＴｙｐｅのＣＨＯ細胞産生ヒト化抗ＨＭ１．２４抗体の活性を、黒塗りはＦＴ−ＫＯ細胞産生ヒト化抗ＨＭ１．２４抗体の活性をそれぞれ示す。ＦＴ−ＫＯ細胞産生ヒト化抗ＨＭ１．２４抗体は、Ｗｉｌｄ  ＴｙｐｅのＣＨＯ細胞産生ヒト化抗ＨＭ１．２４抗体に比較して強いＡＤＣＣ活性を示したことより、ＦＴ−ＫＯ細胞で産生させた抗体のＡＤＣＣ活性が増強されることが明らかとなった。
実施例６  ＦＴ−ＫＯ細胞産生ヒト化抗ＧＰＣ３抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣ活性
１．ヒトＰＢＭＣ溶液の調製
健常人よりヘパリン加採血した末梢血を、ＰＢＳ（−）で２倍に希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＴＭ  ＰＬＵＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に重層した。これを遠心（５００×ｇ、３０分間、２０℃）した後、単核球画分である中間層を分取した。３回洗浄後、１０％  ＦＢＳ／ＲＰＭＩに懸濁し、ヒトＰＢＭＣ溶液とした。
２．標的細胞の調製
１０％ＦＢＳ／Ｄ−ＭＥＭ培地で培養したＨｕＨ−７細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンク）を、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてディッシュから剥離し、９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ）の各ウェルに１×１０４細胞／ウェルで分注し、１日間培養した。培養後、５．５５ＭＢｑのＣｒ−５１を加え、５％炭酸ガスインキュベータ中３７℃、１時間培養し、この細胞を培地で１回洗浄し、５０μＬの１０％ＦＢＳ／Ｄ−ＭＥＭ培地を加え標的細胞とした。
３．クロム遊離試験（ＡＤＣＣ活性）
ヒトＰＢＭＣ溶液の調製、クロム遊離試験は実施例１に記載の方法に従って行った。ヒト化抗ＧＰＣ３抗体のヒトＰＢＭＣを用いたＡＤＣＣ活性を図９に示す。白抜きはＷｉｌｄ  ＴｙｐｅのＣＨＯ細胞産生ヒト化抗ＧＰＣ３抗体の活性を、黒塗りはＦＴ−ＫＯ細胞産生ヒト化抗ＧＰＣ３抗体の活性をそれぞれ示す。ＦＴ−ＫＯ細胞産生ヒト化抗ＧＰＣ３抗体は、Ｗｉｌｄ  ＴｙｐｅのＣＨＯ細胞産生ヒト化抗ＧＰＣ３抗体に比較して強いＡＤＣＣ活性を示したことより、ＦＴ−ＫＯ細胞で産生させた抗体のＡＤＣＣ活性が増強されることが明らかとなった。
実施例７  ＦＴ−ＫＯ細胞産生ヒト化抗ＨＭ１．２４抗体糖鎖の解析
１．  ２−アミノベンズアミド標識糖鎖（２−ＡＢ化糖鎖）の調製
本発明のＦＴ−ＫＯ細胞産生抗体、及び対照試料としてＣＨＯ細胞産生抗体に、Ｎ−Ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ  Ｆ（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を作用させ、糖鎖をタンパク質から遊離させた（Ｗｅｉｔｚｈａｎｄｌｅｒ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８３：１２（１９９４），１６７０−１６７５）。エタノールを用いた除タンパク質後（Ｓｃｈｅｎｋ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １０８：１１（２００１），１６８７−１６９５）、濃縮乾固し、２−アミノピリジンによる蛍光標識を行った（Ｂｉｇｇｅ  Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３０：２（１９９５），２２９−２３８）。得られた２−ＡＢ化糖鎖を、セルロースカートリッジを用いた固相抽出により脱試薬した後遠心濃縮し、精製２−ＡＢ化糖鎖とした。
２．  精製２−ＡＢ化糖鎖の順相ＨＰＬＣによる分析
前項の方法で、本発明のＦＴ−ＫＯ細胞産生抗体、及び対照試料としてＣＨＯ細胞産生抗体について２−ＡＢ化糖鎖の調製を行った後、アミドカラム（東ソー製  ＴＳＫｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ−８０）による順相ＨＰＬＣ分析を行い、クロマトグラムを比較した。ＣＨＯ細胞産生抗体ではＧ（０）−Ｆｕｃはわずかにしか含まれておらず、アガラクトシル糖鎖（Ｇ（０）＋Ｇ（０）−Ｆｕｃ）に占めるＧ（０）−Ｆｕｃの割合は、１．５％程度であった。一方、ＦＴ−ＫＯ細胞産生抗体ではＧ（０）−Ｆｕｃが９０％以上含まれていた（図１０および表１）。
【表１】
2006067913.tif 000002
実施例８  ＦＴ−ＫＯ細胞産生ヒト化抗ＧＰＣ３抗体糖鎖の解析
１．  ２−アミノベンズアミド標識糖鎖（２−ＡＢ化糖鎖）の調製
本発明のＦＴ−ＫＯ細胞産生抗体、及び対照試料としてＣＨＯ細胞産生抗体に、Ｎ−Ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ  Ｆ（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を作用させ、糖鎖をタンパク質から遊離させた（Ｗｅｉｔｚｈａｎｄｌｅｒ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８３：１２（１９９４），１６７０−１６７５）。エタノールを用いた除タンパク質後（Ｓｃｈｅｎｋ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １０８：１１（２００１），１６８７−１６９５）、濃縮乾固し、２−アミノピリジンによる蛍光標識を行った（Ｂｉｇｇｅ  Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３０：２（１９９５），２２９−２３８）。得られた２−ＡＢ化糖鎖を、セルロースカートリッジを用いた固相抽出により脱試薬した後遠心濃縮し、精製２−ＡＢ化糖鎖とした。次に、β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（生化学工業）を精製２−ＡＢ化糖鎖に作用させ、アガラクトシル２−ＡＢ化糖鎖とした。
２．  アガラクトシル２−ＡＢ化糖鎖の順相ＨＰＬＣによる分析
前項の方法で、本発明のＦＴ−ＫＯ細胞産生抗体、及び対照試料としてＣＨＯ細胞産生抗体についてアガラクトシル２−ＡＢ化糖鎖の調製を行った後、アミドカラム（東ソー製  ＴＳＫｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ−８０）による順相ＨＰＬＣ分析を行い、クロマトグラムを比較した。ＣＨＯ細胞産生抗体ではＧ（０）が主成分として存在しており、フコースの付加されていないＧ（０）−Ｆｕｃはピーク面積比として４％程度であった。一方，ＦＴ−ＫＯ細胞産生抗体ではＧ（０）−Ｆｕｃが主成分であり、いずれの産生株においてもピーク面積比として９０％以上存在していた（図１１および表２）。図１２には、ピークＧ（０）およびＧ（０）−Ｆｕｃの推定構造を示す。
【表２】
2006067913.tif 000003
実施例９  ＦＴ−ＫＯ細胞産生ヒト化抗ＧＰＣ３抗体の熱安定性分析
１．  ＤＳＣ測定用試料溶液の調製
２００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む２０ｍｏｌ／Ｌの酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ６．０）を透析外液とし、これに７００μｇ相当量の抗体溶液を封入した透析膜を浸して一昼夜透析し，試料溶液とした。
２．  ＤＳＣによる熱変性温度測定
試料溶液およびリファレンス溶液（透析外液）を十分に脱気した後、これらをそれぞれ熱量計セルに封入し２０℃での熱平衡化を十分に行った。次にＤＳＣ走査を２０℃〜１００℃で約１Ｋ／分走査速度で行った。結果は、温度の関数としての変性ピークの頂点として表される（図１３）。本測定より、ＣＨＯ細胞産生抗体およびＦＴ−ＫＯ細胞産生抗体における熱変性温度は同等であった。
参考実施例１  抗ＧＰＣ３抗体の作製
１．ヒトグリピカン３（ＧＰＣ３）のｃＤＮＡクローニング
ヒトＧＰＣ３をコードする全長ｃＤＮＡは、大腸癌細胞株Ｃａｃｏ２より常法により調製した１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型とし、Ａｄｖａｎｔａｇｅ２  ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いたＰＣＲ反応により増幅した。すなわち、２μｌのＣａｃｏ２由来ｃＤＮＡ、１μｌのセンスプライマー（ＧＡＴＡＴＣ−ＡＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＧＴＧＣＧＣＡＣＣＧＣＧＴ：配列番号１５）、１μｌのアンチセンスプライマー（ＧＣＴＡＧＣ−ＴＣＡＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＡＣ：配列番号１６）、５μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ２  １０ｘＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ、８μｌのｄＮＴＰ  ｍｉｘ（１．２５ｍＭ）、１．０μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘを含む５０μｌの反応液を、９４℃で１分、６３℃で３０秒、６８℃で３分からなるサイクルを３５回行った。ＰＣＲ反応による増幅産物はｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてＴＡベクターｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙに挿入した。ＡＢＩ３１００  ＤＮＡシーケンサーを用い配列の確認を行った結果、ヒトＧＰＣ３の全長をコードするｃＤＮＡを単離した。配列番号１７で表される配列はヒトＧＰＣ３遺伝子の塩基配列を、配列番号１８で表される配列はヒトＧＰＣ３タンパク質のアミノ酸配列を示す。
２．可溶型ＧＰＣ３の作製
抗ＧＰＣ３抗体作製のための免疫タンパク質として、Ｃ末端側の疎水性領域（５６４−５８０アミノ酸）を欠損させた可溶型ＧＰＣ３タンパク質を作製した。
完全長ヒトＧＰＣ３  ｃＤＮＡを鋳型としてアンチセンスプライマー（ＡＴＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＣＡＣＣＡＴ  ＧＧＣ  ＣＧＧ  ＧＡＣ  ＣＧＴ  ＧＣＧ  Ｃ：配列番号１９）とＥｃｏＲＩ認識配列、Ｋｏｚａｋ配列を加えたセンスプライマー（ＡＴＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＣＴＴ  ＣＡＧ  ＣＧＧ  ＧＧＡ  ＡＴＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  Ｃ：配列番号２０）を用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ断片（１７１１ｂｐ）をｐＣＸＮＤ２−Ｆｌａｇにクローニングした。ｐＣＸＮＤ２−Ｆｌａｇは、ｐＣＸＮ２（Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ  １９９１；１０８；１９３−１９９）のＨｉｎｄＩＩＩ部位にｐＣＨＯＩ（Ｈｉｒａｔａら、ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒ  １９９４；３５６；２４４−２４８）のＤＨＦＲ遺伝子発現部位を挿入し、また、マルチクローニングサイトの下流にＦｌａｇタグ配列を付加し、Ｆｌａｇタグ付加タンパクとして発現されるよう設計した。作製された発現プラスミドＤＮＡをＣＨＯ細胞ＤＸＢ１１株へ導入し、５００μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎでの選抜により、可溶型ＧＰＣ３高発現ＣＨＯ株を得た。１７００ｃｍ２ローラーボトルを用い可溶型ＧＰＣ３高発現ＣＨＯ株の大量培養を行い、培養上清を回収し精製を行った。培養上清をＤＥＡＥ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）にチャージし、洗浄後、５００ｍＭ  ＮａＣｌを含むバッファにより溶出した。次に、Ａｎｔｉ−Ｆｌａｇ  Ｍ２  ａｇａｒｏｓｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｇｅｌ（ＳＩＧＭＡ社）を用いてアフィニティー精製を行った。溶出は２００μｇ／ｍＬのＦＬＡＧペプチドにより行った。Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）による濃縮後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ１０／３０（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）によるゲルろ過を行いＦＬＡＧペプチドを除去した。最後にＤＥＡＥ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムを用いて濃縮し、同時にＴｗｅｅｎ２０を含まないＰＢＳ（５００ｍＭのＮａＣｌを含む）で溶出を行うことによりバッファ置換を行った。
３．可溶型ＧＰＣ３  コアタンパク質の作製
ＧＰＣ３はヘパラン硫酸による修飾を受け巨大分子となる。抗ＧＰＣ３抗体のスクリーニングにおいてヘパラン硫酸に対する抗体を排除する為、ヘパラン硫酸付加部位に点変異を導入した可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質を作製し、スクリーニングに用いた。
上記可溶型ＧＰＣ３（１−５６３）を鋳型とし、アッセンブリーＰＣＲ法によって４９５番目と５０９番目のＳｅｒをＡｌａに置換させたｃＤＮＡを作製した。この際、Ｃ末端にＨｉｓタグが付加されるようにプライマーを設計し、得られたｃＤＮＡをｐＣＸＮＤ３ベクターにクローニングした。ｐＣＸＮＤ３は、ｐＣＸＮ２のＨｉｎｄＩＩＩ部位にｐＣＨＯＩのＤＨＦＲ遺伝子発現部位を挿入して作製した。作製された発現プラスミドＤＮＡをＤＸＢ１１株へ導入し、５００μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎでの選抜により、可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質高発現ＣＨＯ株を得た。
１７００ｃｍ２ローラーボトルを用い大量培養を行い、培養上清を回収し精製を行った。培養上清をＱ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）にチャージし、洗浄後、５００ｍＭＮａＣｌを含むリン酸バッファにより溶出した。次に、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いてアフィニティー精製を行った。１０〜１５０ｍＭのイミダゾールでグラジエント溶出を行った。最後にＱ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いて濃縮し、５００ｍＭ  ＮａＣｌを含むリン酸バッファにより溶出した。
還元条件下にてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、７０ｋＤａ、４０ｋＤａ、３０ｋＤａの３つのバンドが得られた。ＡＢＩ４９２  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてアミノ酸シークエンスを行った結果、３０ｋＤａのバンドはＧＰＣ３の３５９番目以降、もしくは３７５番目以降のアミノ酸配列と一致し、ＧＰＣ３はＡｒｇ３５８とＳｅｒ３５９の間、若しくはＬｙｓ３７４とＶａｌ３７５の間で切断を受け、４０ｋＤａのＮ末端断片と３０ｋＤａのＣ末端側断片に分割していることが判明した。
４．全長ヒトＧＰＣ３発現ＣＨＯ細胞の作製
フローサイトメトリを用いた結合活性評価用の細胞株を得るために、全長ＧＰＣ３を発現するＣＨＯ細胞の樹立を行った。
１０μｇの全長ヒトＧＰＣ３遺伝子発現ベクターと６０μＬのＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を混合し、複合体を形成させた後に、ＣＨＯ細胞ＤＸＢ１１株に添加することにより、遺伝子導入を行った。ＣＯ２インキュベータで２４時間培養後、終濃度０．５ｍｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎおよび１０％  ＦＢＳを含むαＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）を用いて、選抜を開始した。得られたＧｅｎｅｔｉｃｉｎ耐性コロニーを集め、限界希釈法により細胞のクローニングを行った。それぞれの細胞クローンを可溶化し、抗ＧＰＣ３抗体を用いたウエスタンブロットにより全長ヒトＧＰＣ３の発現を確認し、安定発現細胞株を取得した。
５．ＥＬＩＳＡによる結合活性の評価
可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質を１μｇ／ｍＬとなるようにコーティングバッファ（０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．６），０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３）で希釈したものをイムノプレートに加え、４℃にて一晩放置しコーティングした。希釈バッファ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．１），１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２，１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ，０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０，０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３，１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）にてブロッキング処理を行った後、抗ＧＰＣ３抗体を加え、室温で１時間放置した。リンスバッファ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０，ＰＢＳ）にて洗浄後、アルカリホスファターゼ標識した抗マウスＩｇＧ抗体（ＺＹＭＥＤ社）を加え、室温で１時間放置した。リンスバッファにて洗浄後、ＳＩＧＭＡ１０４（ＳＩＧＭＡ社）を１ｍｇ／ｍＬとなるように基質バッファ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．８），１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２）に希釈したものを添加し、室温で１時間発色させた後、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｐｌｕｓ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて吸光度（４０５ｎｍ，参照波長６５５ｎｍ）を測定した。
６．可溶型ＧＰＣ３の免疫およびハイブリドーマの選抜
ヒトＧＰＣ３とマウスＧＰＣ３のホモロジーはアミノ酸レベルで９４％の高い相同性を示すため、通常のマウスに免疫しても抗ＧＰＣ３抗体を得難い可能性を考え、自己免疫疾患マウスであるＭＲＬ／ＭｐＪＵｍｍＣｒｊ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウス（以下、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス、日本チャールズ・リバーより購入）を免疫動物として用いた。７週齢、もしくは８週齢より免疫を開始し、初回免疫には可溶型ＧＰＣ３を１００μｇ／ｈｅａｄとなるように調製し、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ、ベクトンディッキンソン社）を用いてエマルジョン化したものを皮下に投与した。２週間後に５０μｇ／ｈｅａｄとなるように調製したものをフロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ、ベクトンディッキンソン社）でエマルジョン化したものを皮下に投与した。以降１週間間隔で追加免疫を合計５回行った。その内２匹に対し、最終免疫として５０μｇ／ｈｅａｄとなるようにＰＢＳに希釈し尾静脈内に投与した。最終免疫の４日後、脾臓細胞を摘出し、マウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１（Ｐ３Ｕ１、ＡＴＣＣより購入）と２：１になるように混合し、ＰＥＧ１５００（ロシュ・ダイアグノスティック社）を徐々に加える事により細胞融合を行った。慎重にＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）を加えＰＥＧ１５００を希釈し、遠心操作によりＰＥＧ１５００を除去した後、１０％ＦＢＳ入りＲＰＭＩ１６４０にて懸濁したものを１００μＬ／ウエルとなるように９６穴培養プレートに播種した。翌日、１００μＬ／ウエルとなるように１０％ＦＢＳ、１  ｘ  ＨＡＴ  ｍｅｄｉａ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＩＧＭＡ社）、０．５  ｘ  ＢＭ−Ｃｏｎｄｉｍｅｄ  Ｈ１  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ロシュ・ダイアグノスティック社）を含むＲＰＭＩ１６４０（以降、ＨＡＴ培地）を添加した。２、３、５日後に培養液の半分をＨＡＴ培地に置き換え、７日後の培養上清を用いてスクリーニングを行った。スクリーニングは可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質を固相化したイムノプレートを用いたＥＬＩＳＡにより行った。陽性クローンについては限界希釈法によりモノクローン化した。その結果、ＧＰＣ３に対して強い結合活性を有する抗体を１１クローン（Ｍ３Ｃ１１、Ｍ１３Ｂ３、Ｍ１Ｅ７、Ｍ３Ｂ８、Ｍ１１Ｆ１、Ｌ９Ｇ１１、Ｍ１９Ｂ１１、Ｍ６Ｂ１、Ｍ１８Ｄ４、Ｍ５Ｂ９、Ｍ１０Ｄ２）取得した。
７．抗ＧＰＣ３抗体可変領域のクローニング
抗ＧＰＣ３抗体産生ハイブリドーマより抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて１×１０７細胞のハイブリドーマより抽出した。１μｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡを使用して、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）、以下の合成オリゴヌクレオチド：
マウスＩｇＧ１定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドＭＨＣ−ＩｇＧ１
ＧＧＧ  ＣＣＡ  ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＡＧＡＣＡＧ  ＡＴＧ（配列番号２１）
マウスＩｇＧ２ａ定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドＭＨＣ−ＩｇＧ２ａ
ＣＡＧ  ＧＧＧ  ＣＣＡ  ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＡＧＡ  ＣＣＧ  ＡＴＧ（配列番号２２）
マウスＩｇＧ２ｂ定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドＭＨＣ−ＩｇＧ２ｂ
ＣＡＧ  ＧＧＧ  ＣＣＡ  ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＡＧＡ  ＣＴＧ  ＡＴＧ（配列番号２３）
またはマウスκ鎖定常領域塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドｋａｐｐａ
ＧＣＴ  ＣＡＣ  ＴＧＧ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＴＧ（配列番号２４）
を用い、５’末端側遺伝子断片を増幅した。
逆転写反応は４２℃で１時間３０分間反応した。ＰＣＲ溶液５０μＬは、５μＬの１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、５μＬの１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ  Ｍｉｘ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、１μＬのＡｄｖａｎｔａｇｅ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（以上、ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）、２．５μＬの逆転写反応産物、１０ｐｍｏｌｅの合成オリゴヌクレオチドＭＨＣ−ＩｇＧ１、ＭＨＣ−ＩｇＧ２ａ、ＭＨＣ−ＩｇＧ２ｂまたはｋａｐｐａを含有し、９４℃の初期温度にて３０秒間そして９４℃にて５秒間、７２℃にて３分間のサイクルを５回反復し、９４℃にて５秒間、７０℃にて１０秒間、７２℃にて３分間のサイクルを５回反復し、さらに９４℃にて５秒間、６８℃にて１０秒間、７２℃にて３分間のサイクルを２５回反復した。最後に反応産物を７２℃で７分間加熱した。各ＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、アガロースゲルから精製した後、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）へクローニングし、塩基配列を決定した。
Ｍ３Ｃ１１、Ｍ１３Ｂ３、Ｍ１Ｅ７、Ｍ３Ｂ８、Ｍ１１Ｆ１、Ｍ１９Ｂ１１、Ｍ６Ｂ１、Ｍ１８Ｄ４、Ｍ５Ｂ９、Ｍ１０Ｄ２、Ｌ９Ｇ１１のＨ鎖可変領域の塩基配列をそれぞれ配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５に、アミノ酸配列をそれぞれ配列番号３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６に、Ｌ鎖可変領域の塩基配列を配列番号４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７に、アミノ酸配列をそれぞれ配列番号５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８に示す。
８．抗ＧＰＣ３抗体マウス−ヒトキメラ抗体の作製
抗ＧＰＣ３抗体のＨ鎖およびＬ鎖可変領域配列をヒトＩｇＧ１およびκ鎖定常領域配列に連結した。各抗体のＨ鎖可変領域の５’末端側塩基配列に相補的でコザック配列を有する合成オリゴヌクレオチドおよびＮｈｅＩ部位を有する３’末端側塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をヒトＩｇＧ１定常領域がｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋ベクター（東洋紡社）に挿入されているｐＢ−ＣＨベクターにクローニングした。ＮｈｅＩ部位により、マウスＨ鎖可変領域とヒトＨ鎖（γ１鎖）定常領域が連結している。作製されたＨ鎖遺伝子断片を発現ベクターｐＣＸＮＤ３にクローニングした。また、各抗体のＬ鎖可変領域の５’末端側塩基配列に相補的でコザック配列を有する合成オリゴヌクレオチドおよびＢｓｉＷＩ部位を有する３’末端側塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をヒトｋａｐｐａ鎖定常領域がｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋ベクター（東洋紡社）に挿入されているｐＢ−ＣＬベクターにクローニングした。ＢｓｉＷＩ部位により、ヒトＬ鎖可変領域と定常領域が連結している。作製されたＬ鎖遺伝子断片を発現ベクターｐＵＣＡＧクローニングした。本ベクターｐＵＣＡＧは、ｐＣＸＮ（Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ  １９９１；１０８：１９３−２００）を制限酵素ＢａｍＨＩで消化して得られる２．６ｋｂｐの断片をｐＵＣ１９ベクター（東洋紡社）の制限酵素ＢａｍＨＩ部位に連結し、クローニングしたベクターである。
抗ＧＰＣ３マウス−ヒトキメラ抗体発現ベクターを作製するために、Ｌ鎖遺伝子断片が挿入されたｐＵＣＡＧベクターを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社）で消化して得られる遺伝子断片をＨ鎖遺伝子が挿入されたｐＣＸＮＤ３の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に連結し、クローニングした。本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子、抗ＧＰＣ３マウス−ヒトキメラ抗体遺伝子を発現する。
ＣＨＯ細胞（ＤＧ４４株）を用いた安定発現細胞株の作製は次のようにして行った。Ｇｅｎｅ  ＰｕｌｓｅｒＩＩ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）を用いたエレクトロポレーション法により遺伝子導入した。２５μｇの各抗ＧＰＣ３マウス−ヒトキメラ抗体発現ベクターとＰＢＳに懸濁したＣＨＯ細胞（１×１０７細胞／ｍｌ）の０．７５ｍｌを混合したものを氷上で１０分間冷却し、キュベットに移した後に１．５ｋＶ、２５μＦＤの容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、ＨＴｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を１倍濃度で含むＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）４０ｍＬに懸濁した。同様の培地で５０倍希釈溶液を作製し、９６ウェル培養用プレートに１００μｌ／ウェルで分注した。ＣＯ２インキュベータ（５％ＣＯ２）で２４時間培養後、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を０．５ｍｇ／ｍＬになるように添加して２週間培養した。Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ耐性を示す形質転換細胞のコロニーが観察されたウェルの培養上清中のＩｇＧ量について以下に示す濃度定量法で測定した。高産生細胞株を順次拡大培養し、抗ＧＰＣ３マウス−ヒトキメラ抗体安定発現細胞株を取得し、大量培養を行い、培養上清を得た。各抗ＧＰＣ３マウス−ヒトキメラ抗体の精製は、Ｈｉ  Ｔｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＧ  ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて行った。
９．ＧＣ−３の免疫およびハイブリドーマの選抜
得られた抗ＧＰＣ３抗体のうち、Ｍ１１Ｆ１、Ｍ３Ｂ８のみが強いＣＤＣ活性を示したことから、ＣＤＣ活性にはエピトープ依存性があることが判明した。ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性を併せもつ抗体の取得を目的とし、Ｍ１１Ｆ１、Ｍ３Ｂ８のエピトープを含むＧＳＴ融合タンパク質であるＧＣ−３の免疫を行った。ＧＣ−３は上記方法により大量に精製し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いてゲルろ過を行い、バッファをＰＢＳに置換したものを免疫蛋白として使用した。Ｂａｌｂ／ｃ（日本チャールズリバーより購入）３匹、ＭＲＬ／ｌｐｒ３匹に対し、上記方法に従いＧＣ−３の免疫を行った。初回免疫にはＧＣ−３を１００μｇ／ｈｅａｄとなるように調製し、ＦＣＡを用いてエマルジョン化したものを皮下に投与した。２週間後に５０μｇ／ｈｅａｄとなるように調製したものをＦＩＡでエマルジョン化したものを皮下に投与した。５回免疫の後、全マウスに対し最終免疫（５０μｇ／ｈｅａｄ）を尾静脈内に行い細胞融合を行った。スクリーニングは可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質を固相化したイムノプレートを用いたＥＬＩＳＡにより行った。陽性クローンについては限界希釈法によりモノクローン化した。その結果、ＧＰＣ３に対して強い結合活性を有する抗体を５クローン（ＧＣ１９９、ＧＣ２０２、ＧＣ３３、ＧＣ１７９、ＧＣ１９４）取得した。
ＧＣ１９９、ＧＣ２０２、ＧＣ３３、ＧＣ１７９、ＧＣ１９４について上記方法に従いＨ鎖、Ｌ鎖の可変領域をクローニングし、配列を決定した。ＧＣ１９４のＬ鎖については２種類の配列がクローニングされた。ＧＣ１９９、ＧＣ２０２、ＧＣ３３、ＧＣ１７９、ＧＣ１９４のＨ鎖可変領域の塩基配列をそれぞれ配列番号６９、７０、７１、７２、７３に、アミノ酸配列をそれぞれ配列番号７４、７５、７６、７７、７８に示す。ＧＣ１９９、ＧＣ２０２、ＧＣ３３、ＧＣ１７９、ＧＣ１９４（１）、ＧＣ１９４（２）のＬ鎖可変領域の塩基配列をそれぞれ配列番号７９、８０、８１、８２、８３、８４に、アミノ酸配列をそれぞれ配列番号８５、８６、８７、８８、８９、９０に示す。
参考実施例２  ＧＣ３３のヒト化
公開されているＫａｂａｔ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｕｂ／ｄａｔａｂａｓｅｓ／ｋａｂａｔ／）、およびＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＭＧＴ）より抗体の配列データを入手し、Ｈ鎖可変領域、Ｌ鎖可変領域に分けてホモロジー検索を行った。その結果、Ｈ鎖可変領域はＤＮ１３（Ｓｍｉｔｈｓｏｎら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９；３６：１１３−１２４）と高い相同性を持つことが分かった。また、Ｌ鎖可変領域はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０６４１０５のｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ  ＩＧＫ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｋａｐｐａ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ＶＬＪ  ｒｅｇｉｏｎ，ｐａｒｔｉａｌｃｄｓ，ｃｌｏｎｅ：Ｋ６４と高い相同性を持つことが分かった。また、Ｌ鎖のシグナル配列についてはＡＢ０６４１０５と相同性の高いＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｓ４０３５７のシグナル配列を利用した。これらの抗体のフレームワーク領域（以下、ＦＲ）に相補性抗原決定領域（以下、ＣＤＲ）を移植したヒト化抗体を作製した。
具体的には、５０  ｂａｓｅ程度の合成オリゴＤＮＡを約２０  ｂａｓｅ程度ハイブリダイズするように設計し、これらの合成オリゴＤＮＡをＰＣＲ法によりアッセンブリさせて各可変領域をコードする遺伝子を作製した。５’端の合成オリゴＤＮＡの末端に挿入したＨｉｎｄＩＩＩ配列、および３’端の合成オリゴＤＮＡの末端に挿入したＢａｍＨＩ配列で切断し、ヒトＩｇＧ１定常領域がクローニングされた発現ベクターＨＥＦｇγ１、ヒトκ鎖定常領域がクローニングされた発現ベクターＨＥＦｇκへクローニングした（Ｓａｔｏら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４；３７１−３８１）。このようにして作製したヒト化ＧＣ３３はＨ鎖、Ｌ鎖それぞれｖｅｒ．ａと命名した。Ｈ鎖、Ｌ鎖ともにｖｅｒ．ａのヒト化ＧＣ３３（ｖｅｒ．ａ／ｖｅｒ．ａ）はマウスＧＣ３３可変領域の抗体（ｍｏｕｓｅ／ｍｏｕｓｅ）と比較して結合活性が低かった。Ｈ鎖とＬ鎖についてマウスＧＣ３３配列とｖｅｒ．ａ配列をキメラに組み合わせた抗体（ｍｏｕｓｅ／ｖｅｒ．ａ、ｖｅｒ．ａ／ｍｏｕｓｅ）を作製し結合活性を評価した結果、ｖｅｒ．ａ／ｍｏｕｓｅで結合活性の低下が認められ、アミノ酸置換による結合活性の低下はＨ鎖に起因する事が判明した。そこで、Ｈ鎖の改変体ｖｅｒ．ｃ、ｖｅｒ．ｆ、ｖｅｒ．ｈ、ｖｅｒ．ｉ、ｖｅｒ．ｊ、ｖｅｒ．ｋを作製した。全てのヒト化ＧＣ３３はマウスＧＣ３３可変領域を有するキメラ抗体と同等の結合活性を示した。ヒト化ＧＣ３３Ｈ鎖可変領域ｖｅｒ．ａ、ｖｅｒ．ｃ、ｖｅｒ．ｆ、ｖｅｒ．ｈ、ｖｅｒ．ｉ、ｖｅｒ．ｊ、ｖｅｒ．ｋの塩基配列を配列番号９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７に、アミノ酸配列を配列番号９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４に示す。ヒト化ＧＣ３３Ｌ鎖可変領域ｖｅｒ．ａの塩基配列を配列番号１０５に、アミノ酸配列を配列番号１０６に示す。
ヒト化ＧＣ３３Ｈ鎖可変領域ｖｅｒ．ｉ、ｖｅｒ．ｊ、ｖｅｒ．ｋでは、６番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されているが、これらの抗体は熱安定性が顕著に増加していた。
参考実施例３  ヒト化ＧＣ３３Ｌ鎖の改変
タンパク質の脱アミド化については一次配列依存的な脱アミド化の反応速度定数が知られており、Ａｓｎ−Ｇｌｙが特に脱アミド化し易い配列として知られている（Ｒｏｃｉｎｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００１；９８；９４４−９４９．）。配列番号１０５に示されるヒト化ＧＣ３３Ｌ鎖ｖｅｒ．ａ可変領域のＣＤＲ１内にあるＡｓｎ３３については、一次配列がＡｓｎ−Ｇｌｙであることから、脱アミド化が容易に起きやすい配列である事が予想された。
Ａｓｎ３３の脱アミド化による結合活性に対する影響を評価する為に、Ａｓｎ３３をＡｓｐに置換した改変抗体を作製した。点変異の導入には、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を使用した。すなわち、１２５ｎｇのセンスプライマー（ＣＴＴ  ＧＴＡ  ＣＡＣ  ＡＧＴ  ＧＡＣ  ＧＧＡ  ＡＡＣ  ＡＣＣ  ＴＡＴ：配列番号１０７）、１２５ｎｇのアンチセンスプライマー（ＡＴＡ  ＧＧＴ  ＧＴＴ  ＴＣＣ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  ＧＴＧ  ＴＡＣ  ＡＡＧ：配列番号１０８）、５μＬの１０ｘ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ、１μＬのｄＮＴＰ  ｍｉｘ、１０ｎｇのヒト化ＧＣ３３Ｌ鎖ｖｅｒ．ａがクローニングされたＨＥＦｇκ、１μμＬのＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む５０μＬの反応液を、９５℃で３０秒、５５℃で１分、６８℃で９分からなるサイクルを１２回行った。その後制限酵素ＤｐｎＩを加え３７℃で２時間消化したものを添付のＸＬ１−Ｂｌｕｅコンピテント細胞に導入し形質転換体を得た。正しく変異の導入されたクローンについて、可変領域を切り出し、再度ＨＥＦｇκへクローニングし直した。ヒト化ＧＣ３３Ｈ鎖ｖｅｒ．ｋがクローニングされたＨＥＦｇγ１と共にＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてＣＯＳ７細胞へ導入し一過性に発現させた培養上清を回収した。抗ヒトＩｇＧ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより抗体濃度を定量し、可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質を固相化したＥＬＩＳＡにより改変抗体の結合活性を評価した。Ａｓｎ３３をＡｓｐに置換した改変抗体（Ｎ３３Ｄ）では結合活性が消失しており、Ａｓｎ３３で脱アミド化が起きた場合結合活性に与える影響は大きいと考えられた。
Ａｓｎ３３の脱アミド化を抑制する方法として、Ｇｌｙ３４を他のアミノ酸に改変する方法が報告されている（ＷＯ０３０５７８８１Ａ１）。上記方法に従い、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いＣｙｓ、Ｍｅｔを除く他の１７アミノ酸に置換した改変抗体Ｇ３４Ａ、Ｇ３４Ｄ、Ｇ３４Ｅ、Ｇ３４Ｆ、Ｇ３４Ｈ、Ｇ３４Ｎ、Ｇ３４Ｐ、Ｇ３４Ｑ、Ｇ３４Ｉ、Ｇ３４Ｋ、Ｇ３４Ｌ、Ｇ３４Ｖ、Ｇ３４Ｗ、Ｇ３４Ｙ、Ｇ３４Ｒ、Ｇ３４Ｓ、Ｇ３４Ｔを作製し、ＣＯＳ７細胞一過性発現培養上清を用いて結合活性の評価を行った。その結果、Ｐｒｏ（Ｇ３４Ｐ）、Ｖａｌ（Ｇ３４Ｖ）以外へのアミノ酸置換は結合活性を維持している事が判明した。
上述の改変抗体の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１０９（Ｇ３４Ａ）、配列番号１１０（Ｇ３４Ｄ）、配列番号１１１（Ｇ３４Ｅ）、配列番号１１２（Ｇ３４Ｆ）、配列番号１１３（Ｇ３４Ｈ）、配列番号１１４（Ｇ３４Ｎ）、配列番号１１５（Ｇ３４Ｔ）、配列番号１１６（Ｇ３４Ｑ）、配列番号１１７（Ｇ３４Ｉ）、配列番号１１８（Ｇ３４Ｋ）、配列番号１１９（Ｇ３４Ｌ）、配列番号１２０（Ｇ３４Ｓ）、配列番号１２１（Ｇ３４Ｗ）、配列番号１２２（Ｇ３４Ｙ）、配列番号１２３（Ｇ３４Ｒ）、配列番号１２４（Ｇ３４Ｖ）、配列番号１２５（Ｇ３４Ｐ）に記載する。また、上述の改変抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１２６（Ｇ３４Ａ）、配列番号１２７（Ｇ３４Ｄ）、配列番号１２８（Ｇ３４Ｅ）、配列番号１２９（Ｇ３４Ｆ）、配列番号１３０（Ｇ３４Ｈ）、配列番号１３１（Ｇ３４Ｎ）、配列番号１３２（Ｇ３４Ｔ）、配列番号１３３（Ｇ３４Ｑ）、配列番号１３４（Ｇ３４Ｉ）、配列番号１３５（Ｇ３４Ｋ）、配列番号１３６（Ｇ３４Ｌ）、配列番号１３７（Ｇ３４Ｓ）、配列番号１３８（Ｇ３４Ｗ）、配列番号１３９（Ｇ３４Ｙ）、配列番号１４０（Ｇ３４Ｒ）、配列番号１４１（Ｇ３４Ｖ）、配列番号１４２（Ｇ３４Ｐ）に記載する。
【産業上の利用可能性】  本発明は、染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子の発現が人為的に抑制されている細胞を提供し、該細胞をタンパク質の製造に用いた場合、フコースを有しない組換えタンパク質を製造することができる。フコースを有しない組換えタンパク質は、フコースを有するタンパク質に比べ細胞障害活性が低減されており、また、安定性はフコースを有するタンパク質と同等である。本発明のタンパク質は、特に抗体医薬として用いる組換え抗体において有利である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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