(57)【要約】  細胞の増殖促進、生存維持、または腫瘍の増殖抑制のための組成物および方法の提供を目的とする。  本発明は、従来報告されていたｃｇｒ１１タンパク質の生物学的活性とは、全く異なる新規な活性を見出したことに基づき、ｃｇｒ１１ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド、または該ポリペプチドに対するアンタゴニストなどを包含せしめた細胞の増殖促進、生存維持に関与し得る組成物、及び疾患の治療、予防又は診断方法を提供するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリペプチド、又はそのアゴニスト、及び薬剤的に許容される担体を含んでなる、細胞の増殖促進又は生存維持のための組成物。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、細胞の増殖促進活性または生存維持活性を有するポリペプチド
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリヌクレオチドを含む組換えベクター、及び薬剤的に許容される担体を含んでなる、細胞の増殖促進又は生存維持のための組成物。
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが細胞の増殖促進活性または生存維持活性を有するポリヌクレオチド
【請求項３】
前記細胞が血管内皮細胞である請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記細胞が下垂体を形成する細胞である請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項５】
前記細胞が神経細胞又はクロム親和細胞である請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項６】
血流障害関連疾患の治療、又は予防に供される請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項７】
低血圧症の治療、又は予防に供される請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項８】
発育障害関連疾患の治療、又は予防に供される請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項９】
神経疾患の治療、又は予防に供される請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリペプチドに対するアンタゴニスト、及び薬剤的に許容される担体を含んでなる、細胞の増殖抑制又は生存抑制のための組成物。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、細胞の増殖促進活性または生存維持活性を有するポリペプチド
【請求項１１】
前記アンタゴニストが抗体である請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗体が配列番号１３又は１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと特異的に結合するものである請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリヌクレオチドの機能を阻害する核酸を含む組換えベクター、及び薬剤的に許容される担体を含んでなる、細胞の増殖抑制又は生存抑制のための組成物。
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが細胞の増殖促進活性または生存維持活性を有するポリヌクレオチド
【請求項１４】
前記機能を阻害する核酸がｃｇｒ１１遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡである請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記細胞が血管内皮細胞である請求項１０又は１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記細胞が下垂体を形成する細胞である請求項１０又は１３に記載の組成物。
【請求項１７】
癌の治療、又は予防に供される請求項１０又は１３に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
発育障害関連疾患の治療、又は予防に供される請求項１０又は１３に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
高血圧症の治療、又は予防に供される請求項１０又は１３に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリペプチドに対する抗体を含んでなる、血流障害関連疾患、低血圧症、発育障害関連疾患、癌、高血圧症又は神経疾患の発症の有無、予後、又は悪性度の診断用組成物。  
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、細胞の増殖促進活性または生存維持活性を有するポリペプチド
【請求項２１】
前記抗体が配列番号１３又は１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと特異的に結合するものである請求項２０に記載の診断用組成物。
【請求項２２】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリペプチドに対するアンタゴニスト。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、細胞の増殖促進活性または生存維持活性を有するポリペプチド
【請求項２３】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリペプチドに対する抗体。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、細胞の増殖促進活性または生存維持活性を有するポリペプチド
【請求項２４】
配列番号１３又は１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと特異的に結合する請求項２３に記載の抗体。
【請求項２５】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリペプチド、又はそのアゴニストの治療的有効量を投与することを含んでなる、哺乳動物の血流障害関連疾患、低血圧症、発育障害関連疾患又は神経疾患の治療又は予防方法。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、細胞の増殖促進活性または生存維持活性を有するポリペプチド
【請求項２６】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリペプチドに対するアンタゴニストの治療的有効量を投与することを含んでなる、哺乳動物の癌、発育障害関連疾患又は高血圧症の治療又は予防方法。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、細胞の増殖促進活性または生存維持活性を有するポリペプチド
【請求項２７】
前記アンタゴニストが抗体である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリヌクレオチドの機能を阻害する核酸を含む組換えベクターの治療的有効量を投与することを含んでなる、哺乳動物の癌、発育障害関連疾患又は高血圧症の治療又は予防方法。
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが細胞の増殖促進活性または生存維持活性を有するポリヌクレオチド
【請求項２９】
前記機能を阻害する核酸がｃｇｒ１１遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡである請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
哺乳動物から得た組織細胞又は血液中における、以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリペプチドの量を定量的に検出する事を含んでなる、血流障害関連疾患、低血圧症、発育障害関連疾患、癌、高血圧症、心臓疾患又は神経疾患の診断方法。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、細胞の増殖促進活性または生存維持活性を有するポリペプチド
【請求項３１】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリヌクレオチドを含む組換えベクターを細胞に導入し、不死化した細胞を製造する方法。
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが細胞の増殖促進活性または生存維持活性を有するポリヌクレオチド
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法により得られた細胞。
【請求項３３】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリペプチド。
（ａ）配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、細胞の増殖促進活性または生存維持活性を有するポリペプチド
【請求項３４】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが細胞の増殖促進活性または生存維持活性を有するポリヌクレオチド
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の増殖促進、生存維持、または腫瘍の増殖抑制のための組成物に関する。より詳細には、細胞の増殖促進、生存維持に関与するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド、または該ポリペプチドに対するアンタゴニストなどを包含せしめた組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の増殖の制御および生存維持は、生体秩序を維持する上で極めて重要な機構であると考えられる。例えば、細胞の増殖の制御が十分に機能せず、無秩序な細胞の増殖が行われると、癌などの深刻な疾患を引き起こす可能性があり、一方、細胞の増殖または維持が適切に行われない場合には、生体内器官または生体自体の発達障害に関連する疾患の発症が予期される。【０００３】
なかでも、癌は、依然として疾患による死因のトップを占めており、癌を効果的に治療するための薬剤および治療方法を開発することは、医学・生物学領域において、最も重要な研究課題となっている。
また、発達障害についても、生活の質（Quality of life）の向上を行う上でも解決すべき重要な課題となっている。
生体の成長、生殖、免疫などの機能に深く関わる器官の一つに下垂体を挙げることができる。下垂体はホルモンなどを分泌する器官で、この器官において発現、機能している因子は、生体の成長の制御等に重要な役割を果たしている可能性が予想される。そして、下垂体の細胞レベルにおける機能について鑑みるに、下垂体は各種生体臓器を形成する細胞の成長・増殖、維持等にも何らかの制御的役割を果たしていると思われる。
このように、秩序立った正常な生体機能を発揮する上での下垂体の重要性が明らかになってきた反面、下垂体における未知なる機能因子の探索はなかなか進展しない状況が続いていた。【０００４】
Ｍａｄｄｅｎ等により、ｐ５３により発現が制御される遺伝子としてｃｇｒ１１遺伝子が同定された（非特許文献１）。また、ｃｇｒ１１遺伝子は機能的ｐ５３遺伝子発現に伴い、発現上昇が認められる（特許文献１及び２）。Ｍａｄｄｅｎ等によると、ｃｇｒ１１はｐ５３経路の下流において細胞増殖の抑制的制御に関与しているとのことであるが、その詳細については明らかにされていない。その他、胃ガンにおける遺伝子発現率が高いこと（特許文献３）、さらに最近では、ｃｇｒ１１遺伝子が痛みに関連することが示唆される遺伝子として同定されたことが報告されており（特許文献４）、ｃｇｒ１１の実際の機能については統一的見解が得られておらず、未だその機能を解明するには至っていない。さらには、ｃｇｒ１１によってコードされるタンパク質がどのような形態、すなわち、タンパク質に翻訳されたままで機能するのか、分泌タンパク質して機能しているのか、或いは、糖鎖などによる翻訳後修飾などが行われているかどうかなど、生体内における機能メカニズムを理解する上で重要な情報が不足している。【０００５】
【非特許文献１】Ｍａｄｄｅｎ等  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６；５３８４-５３９０  １９９６
【特許文献１】国際公開公報ＷＯ９９／０１５８１
【特許文献２】国際公開公報ＷＯ９７／４５５４２
【特許文献３】国際公開公報ＷＯ２００５／０１０２１３
【特許文献４】国際公開公報ＷＯ０３／０１６４７５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、上記事情に鑑み、細胞の増殖制御等に関与する新規下垂体因子の存否について鋭意研究を行った結果、下垂体由来の遺伝子産物が腫瘍形成の促進・細胞生存の維持などに関与していること、分泌タンパク質として機能する可能性などを明らかにした。
よって、本発明は、細胞の増殖促進又は生存維持のための組成物、及び関連疾患の治療方法の提供を目的とする。
さらに、本発明は細胞増殖抑制のための組成物、及び関連疾患の治療方法の提供を目的とする。
また、本発明は、癌、高血圧症などの発症の有無等を判定するための診断用組成物及び診断方法の提供を目的とする。
また、本発明は、実際の生体内で機能するｃｇｒ１１コードタンパク質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、生体の成長等をコントロールする上で重要な役割を担っている下垂体で機能する因子において、特に細胞の増殖制御等に深く関与すると考えられる因子としてｃｇｒ１１遺伝子産物を見出したことに基づくものである。具体的には、ホルモン産生能の異なる下垂体細胞間におけるタンパク質発現の差に着目し、ホルモン産生細胞においてのみ発現が認められる因子の探索を行い、その１つとしてｃｇｒ１１を同定した。発明者は、ｃｇｒ１１遺伝子産物がｐ５３の下流において細胞抑制に関与しているとの従来の知見とは全く異なる結果を明らかにし、ｃｇｒ１１タンパク質の新規な活性に着目し、本課題を解決するに至った。【０００８】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（３４）に関する。
（１）本発明の第１の態様は、「以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリペプチド、又はそのアゴニスト、及び薬剤的に許容される担体を含んでなる、細胞の増殖促進又は生存維持のための組成物。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、細胞の増殖促進活性または生存維持活性を有するポリペプチド」である。
（２）本発明の第２の態様は、「以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリヌクレオチドを含む組換えベクター、及び薬剤的に許容される担体を含んでなる、細胞の増殖促進又は生存維持のための組成物。
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが細胞の増殖促進活性または生存維持活性を有するポリヌクレオチド」である。
（３）本発明の第３の態様は、「前記細胞が血管内皮細胞である上記（１）又は（２）に記載の組成物」である。
（４）本発明の第４の態様は、「前記細胞が下垂体を形成する細胞である上記（１）又は（２）に記載の組成物」である。
（５）本発明の第５の態様は、「前記細胞が神経細胞又はクロム親和細胞である上記（１）又は（２）に記載の組成物」である。
（６）本発明の第６の態様は、「血流障害関連疾患の治療、又は予防に供される上記（１）又は（２）に記載の医薬組成物」である。
（７）本発明の第７の態様は、「低血圧症の治療、又は予防に供される上記（１）又は（２）に記載の医薬組成物」である。
（８）本発明の第８の態様は、「発育障害関連疾患の治療、又は予防に供される上記（１）又は（２）に記載の医薬組成物」である。
（９）本発明の第９の態様は、「神経疾患の治療、又は予防に供される上記（１）又は（２）に記載の医薬組成物」である。
（１０）本発明の第１０の態様は、「以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリペプチドに対するアンタゴニスト、及び薬剤的に許容される担体を含んでなる、細胞の増殖抑制又は生存抑制のための組成物。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、細胞の増殖促進活性または生存維持活性を有するポリペプチド」である。
（１１）本発明の第１１の態様は、「前記アンタゴニストが抗体である上記（１０）に記載の組成物」である。
（１２）本発明の第１２の態様は、「前記抗体が配列番号１３又は１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと特異的に結合するものである上記（１１）に記載の組成物」である。
（１３）本発明の第１３の態様は、「以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリヌクレオチドの機能を阻害する核酸を含む組換えベクター、及び薬剤的に許容される担体を含んでなる、細胞の増殖抑制又は生存抑制のための組成物。
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが細胞の増殖促進活性または生存維持活性を有するポリヌクレオチド」である。
（１４）本発明の第１４の態様は、「前記機能を阻害する核酸がｃｇｒ１１遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡである上記（１３）に記載の組成物」である。
（１５）本発明の第１５の態様は、「前記細胞が血管内皮細胞である上記（１０）又は（１３）に記載の組成物」である。
（１６）本発明の第１６の態様は、「前記細胞が下垂体を形成する細胞である上記（１０）又は（１３）に記載の組成物」である。
（１７）本発明の第１７の態様は、「癌の治療、又は予防に供される上記（１０）又は（１３）に記載の医薬組成物」である。
（１８）本発明の第１８態様は、「発育障害関連疾患の治療、又は予防に供される上記（１０）又は（１３）に記載の医薬組成物」である。
（１９）本発明の第１９態様は、「高血圧症の治療、又は予防に供される上記（１０）又は（１３）に記載の医薬組成物」である。
（２０）本発明の第２０の態様は、「以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリペプチドに対する抗体を含んでなる、血流障害関連疾患、低血圧症、発育障害関連疾患、癌、高血圧症又は神経疾患の発症の有無、予後、又は悪性度の診断用組成物。  
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、細胞の増殖促進活性または生存維持活性を有するポリペプチド」である。
（２１）本発明の第２１の態様は、「前記抗体が配列番号１３又は１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと特異的に結合するものである上記（２０）に記載の診断用組成物」である。
（２２）本発明の第２２の態様は、「以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリペプチドに対するアンタゴニスト。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、細胞の増殖促進活性または生存維持活性を有するポリペプチド」である。
（２３）本発明の第２３の態様は、「以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリペプチドに対する抗体。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、細胞の増殖促進活性または生存維持活性を有するポリペプチド」である。
（２４）本発明の第２４の態様は、「配列番号１３又は１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと特異的に結合する上記（２３）に記載の抗体」である。
（２５）本発明の第２５の態様は、「以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリペプチド、又はそのアゴニストの治療的有効量を投与することを含んでなる、哺乳動物の血流障害関連疾患、低血圧症、発育障害関連疾患又は神経疾患の治療又は予防方法。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、細胞の増殖促進活性または生存維持活性を有するポリペプチド」である。
（２６）本発明の第２６の態様は、「以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリペプチドに対するアンタゴニストの治療的有効量を投与することを含んでなる、哺乳動物の癌、発育障害関連疾患又は高血圧症の治療又は予防方法。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、細胞の増殖促進活性または生存維持活性を有するポリペプチド」である。
（２７）本発明の第２７の態様は、「前記アンタゴニストが抗体である上記（２６）に記載の方法」である。
（２８）本発明の第２８の態様は、「以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリヌクレオチドの機能を阻害する核酸を含む組換えベクターの治療的有効量を投与することを含んでなる、哺乳動物の癌、発育障害関連疾患又は高血圧症の治療又は予防方法。
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが細胞の増殖促進活性または生存維持活性を有するポリヌクレオチド」である。
（２９）本発明の第２９の態様は、「前記機能を阻害する核酸がｃｇｒ１１遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡである上記（２８）に記載の方法」である。
（３０）本発明の第３０の態様は、「哺乳動物から得た組織細胞又は血液中における、以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリペプチドの量を定量的に検出する事を含んでなる、血流障害関連疾患、低血圧症、発育障害関連疾患、癌、高血圧症、心臓疾患又は神経疾患の診断方法。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、細胞の増殖促進活性または生存維持活性を有するポリペプチド」である。
（３１）本発明の第３１の態様は、「以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリヌクレオチドを含む組換えベクターを細胞に導入し、不死化した細胞を製造する方法。
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが細胞の増殖促進活性または生存維持活性を有するポリヌクレオチド」である。
（３２）本発明の第３２の態様は、「上記（３１）に記載の方法により得られた細胞」である。
（３３）本発明の第３３の態様は、「以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリペプチド。
（ａ）配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、細胞の増殖促進活性または生存維持活性を有するポリペプチド」である。
（３４）本発明の第３４の態様は、「以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが細胞の増殖促進活性または生存維持活性を有するポリヌクレオチド」である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、ｃｇｒ１１タンパク質の成熟形態のアミノ酸配列が明らかとなったことから、各種疾患の治療又は診断等に有効な組成物又は方法の提供が可能となる。【００１０】
本発明に係る組成物を用いることにより、癌の予防及び／又は治療に有効な医薬の開発が可能となる。【００１１】
本発明に係る組成物を用いることにより、血流障害に関わる種々の疾患の予防及び／又は治療に有効な医薬の開発が可能となる。【００１２】
本発明に係る組成物を用いることにより、高血圧症、低血圧症などの予防及び／又は治療に有効な医薬の開発が可能となる。【００１３】
本発明に係る組成物を用いることにより、発育障害などの予防及び／又は治療に有効な医薬の開発が可能となる。【００１４】
本発明に係る組成物を用いることにより、神経疾患などの予防及び／又は治療に有効な医薬の開発が可能となる。【００１５】
本発明に係る組成物を用いることにより、培養細胞の生存維持などの工業的応用に供される製品の開発、又は農学的な応用分野における発展に寄与することが可能となる。【００１６】
本発明に係る組成物は、種々の細胞の分泌機能と強く関与するｃｇｒ１１遺伝子またはその産物の検出手段を包含していることから、該遺伝子またはその産物の生体内、例えば、血中における存在濃度などを測定することにより、生体の老化、疲労などの度合いを検査するための製品などの開発が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】下垂体由来細胞株を使用して二次元電気泳動を行い、ホルモン産生細胞（ＭｔＴ／Ｓ）で産生され、非ホルモン産生細胞（ＭｔＴ／ＥＢ−３）では産生されないタンパク質（spot2）を同定した結果を示す。
【図２】Spot2のトリプシン分解ペプチドの質量分析パターンを示す。このスポットがｃｇｒ１１遺伝子産物に相当することが明らかとなった。
【図３】ラットおよびヒト由来のｃｇｒ１１タンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図４】シグナルペプチド予測を行うＳＯＳＵＩｓｉｇｎａｌ（ｈｔｔｐ：／／ｓｏｓｕｉ．ｐｒｏｔｅｏｍｅ．ｂｉｏ．ｔｕａｔ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉｓｉｇｎａｌ／ｓｏｓｕｉｓｉｇｎａｌ＿ｓｕｂｍｉｔ．ｈｔｍｌ）によって予測されたラットｃｇｒ１１タンパク質のシグナルペプチド配列を示す。
【図５】ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）由来のｃｇｒ１１タンパク質のアミノ酸配列のアライメントを行い、分泌されたｃｇｒ１１タンパク質のＮ末端アミノ酸解析から明らかとなった実際のシグナル配列（下線部）を示す。Ｒ２及びＨ２は、各々、ラットとヒトのａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｓｉｔｅを示す。
【図６】ｃｇｒ１１プロモーター領域に見出された低酸素反応エレメントの位置を示す。（Ａ）は、ＨＩＦ−１α結合コンセンサス配列を、（Ｂ）は、ｃｇｒ１１遺伝子プロモーター領域に存在する低酸素反応エレメントの位置を示す。
【図７】下垂体由来のホルモン産生細胞（ＭｔＴ／Ｓ細胞）とホルモン非産生細胞（ＭｔＴ／Ｓｅ細胞、ＭｔＴ／ＳＭ細胞、ＭｔＴ／Ｅ−Ｂ３細胞）において、定量ＰＣＲを行いｃｇｒ１１の細胞内ｍＲＮＡの存在量を測定した結果を示す。
【図８】ｃｇｒ１１タンパク質に対する抗体を用いて免疫組織化学染色を行った結果を示す。Ａは抗ｃｇｒ１１抗体を用いて、Ｂは抗成長ホルモン抗体を用いてＭｔＴ／Ｓ細胞を染色した図である。
【図９】下垂体（Ａ）、下垂体前葉拡大図（Ｂ）、大腸（Ｃ）、成熟卵胞の外卵胞膜（Ｄ）に対し、抗ｃｇｒ１１抗体を用いて免疫組織染色を行った結果を示す。（Ａ）の、ＰＮ，ＰＩ，ＰＤは、それぞれ、下垂体後葉、下垂体中葉、下垂体前葉を示す。
【図１０】ｃｇｒ１１遺伝子導入のためのベクターのコンストラクトを示す。
【図１１】ｃｇｒ１１遺伝子をＭｔＴ／Ｅ−Ｂ３細胞（Ａ）およびＭｔＴ／Ｓｅ（Ｃ）に導入し、抗ｃｇｒ１１タンパク質抗体を用いて免疫染色した結果を示す。いずれもゴルジ装置に陽性反応が認められた。これに対しベクターのみを導入したＭｔＴ／Ｅ−Ｂ３細胞（Ｂ）およびＭｔＴ／Ｓｅ細胞（Ｄ）では陽性反応は認められない。
【図１２】ｃｇｒ１１タンパク質を強制発現した細胞の細胞抽出物、培養上清及びＭｔＴ／Ｓ細胞の細胞抽出物に対して抗ｃｇｒ１１タンパク質抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った結果を示す。
【図１３】ｃｇｒ１１タンパク質非発現細胞（レーン１）とｃｇｒ１１タンパク質発現細胞（レーン２）の培養液をサンプルとして抗ｃｇｒ１１タンパク質抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った結果を示す。Ｍ：マーカー
【図１４】ｃｇｒ１１をＭｔＴ／Ｅ−Ｂ３細胞に強制発現させ、得られた細胞をラット（Ｆｉｓｃｈｅｒ  メス  １００ｇ）の鼠径部皮下に注射（２ｘ１０６細胞／２００μｌ/ラット）し、２０日後に腫瘍を採取しその重量を測定した。移植部位に血管の豊富な腫瘍が形成されたことを示す図である。
【図１５】図１４に示した腫瘍を採取しその重量を測定し、腫瘍形成率（％）と腫瘍重量を定量した結果を示す。
【図１６】ｃｇｒ１１発現ベクターを強制発現させた細胞（ＭｔＴ／Ｅ−Ｂ３−Ｓｏ）とベクターのみを導入した細胞（ＭｔＴ／Ｅ−Ｂ３−Ｖｅ）の増殖率を比較した図を示す。
【図１７】ｃｇｒ１１強制発現ＰＣ１２細胞（クローンＣ〜Ｇ）とｃｇｒ１１を強制発現させていないＰＣ１２細胞（コントロール）を、無血清培地中で培養し、８日目の生存細胞数を比較したグラフを示す。
【図１８】ｃｇｒ１１遺伝子強制発現細胞とｃｇｒ１１遺伝子を発現させていない対照細胞を培養した培養液を０％、１％、５％、１０％加えて５日後に細胞数をカウントした結果を示す。
【図１９】ＭｔＴ／Ｓｅ細胞（ｃｇｒ１１非発現、エストロゲン依存性増殖を示す）にＣＧＲ１１を含む培養液（無血清）と含まない培養液（無血清）を加えて培養し、生存細胞の数をグラフ化したものである。
【図２０】精製した分泌型ｃｇｒ１１をラット腹腔内に注入した後、血圧の変化を示す図である。矢印はｃｇｒ１１タンパク質を注入した時点を示す。ここでの、血圧は、拡張血圧と収縮血圧の平均値として示してある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
１．ｃｇｒ１１ポリヌクレオチド
本発明の組成物の有効成分の１つであるｃｇｒ１１ポリヌクレオチドには、配列番号１、３、５、７、９又は１１で表される塩基配列からなるＤＮＡのみならず、配列番号１、３、５、７、９又は１１で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと高ストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、細胞の増殖促進活性または生存維持活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡからなるものも含まれる。ここで、「細胞」とは、ｃｇｒ１１ポリペプチドが作用し得る細胞であればいかなる細胞であってもよく、例えば、動物細胞、好ましくは、ヒト、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ヒツジ、ニワトリ、イヌ、ネコなど由来の細胞である。
また、本発明のポリヌクレオチドには、本発明の「遺伝子」も含まれる。本発明の遺伝子とは、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡも含まれ、該遺伝子のエクソン、イントロンのみならず、プロモーター、エンハンサーなどの転写調節領域も含まれる。本発明のポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡが含まれ、二本鎖であっても一本鎖であってもよい、二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡとＲＮＡとのハイブリッドでもよい。【００１９】
配列番号１、３、５、７、９又は１１で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、配列番号１、３、５、７、９又は１１で表わされる塩基配列と好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％のポリヌクレオチド配列相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡ等が挙げられる。【００２０】
ここで、ストリンジェントな条件とは、当業者によって容易に決定されるハイブリダイゼーション条件のことで、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的鎖がその融点に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。
具体的には、例えば、低ストリンジェントな条件として、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄段階において、３７℃〜４２℃の温度条件下、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中で洗浄することなどが上げられる。また、高ストリンジェントな条件として、例えば、洗浄段階において、６５℃、５×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で洗浄することなどが挙げられる。ストリンジェントな条件をより高くすることにより、相同性の高いポリヌクレオチドを得ることができる。【００２１】
ｃｇｒ１１ポリヌクレオチドは、例えば、下垂体由来の細胞であってホルモン産生を行っている細胞から取得することができる。例えば、ホルモンを産生する細胞およびその対照としてホルモンを産生しない細胞中に存在する全タンパク質を抽出し、各々を二次元電気泳動などを行って、その泳動プロフィールを比較し、ホルモン産生細胞においてのみ確認されるタンパク質のスポットから、質量分析法などを用いてアミノ酸配列情報を取得する。次に、得られたアミノ酸配列情報に基づいて、適当なｃＤＮＡライブラリーなどから、ｃｇｒ１１ポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡを単離することができる。【００２２】
また、すでに公知となっているｃｇｒ１１遺伝子の配列情報をデータベースなどから取得し、その配列情報に基づいて、所望の組織または動物種由来のｃｇｒ１１遺伝子を得ることも可能である。ｃｇｒ１１遺伝子のクローニングは当該技術分野における通常の知識に基づいて行うことができる。該遺伝子は、該遺伝子を発現している細胞よりｃＤＮＡライブラリーを調製し、定法のスクリーニング方法により取得することができる。あるいは、該遺伝子が発現している細胞よりＲＮＡを調製し、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成した後、該遺伝子配列に基づいてＰＣＲ用プライマーを調製してｃＤＮＡを増幅させることにより該ｃＤＮＡを取得してもよい。【００２３】
本発明におけるｃｇｒ１１ポリヌクレオチドの取得に使用可能な細胞は、ｃｇｒ１１ポリペプチドのｍＲＮＡが発現している細胞であれば如何なる細胞も使用可能であるが、例えば、脳下垂体のホルモン産生細胞などが好ましい。また、前記細胞が由来する動物は、本発明の遺伝子を有するものであれば如何なる動物（例えば、ヒト、ラットなど）であってもよい。
ｃｇｒ１１ポリヌクレオチドを取得するためのｍＲＮＡの調製、ｃＤＮＡの調製には、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Pharmasia社）、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（生化学工業社）、などの市販のキットを用いてもよい。【００２４】
２．ｃｇｒ１１ポリペプチド及びその部分ペプチド
本発明におけるｃｇｒ１１ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０又は１２で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド」とは、配列番号２、４、６、８、１０又は１２で表わされるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ細胞の増殖促進又は活性を有するポリペプチドである。ここで、「細胞」とは、ｃｇｒ１１ポリペプチドが作用し得る細胞であればいかなる細胞であってもよく、例えば、動物細胞、好ましくは、ヒト、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ヒツジ、ニワトリ、イヌ、ネコなど由来の細胞である。
なお、本明細書中において、特に断らない限り、「ポリペプチド」と「タンパク質」は同じ意味で用いるものとする。【００２５】
あるいは、配列番号２、４、６、８、１０又は１２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドとしては、配列番号２、４、６、８、１０又は１２で表わされるアミノ酸配列中の１又は数個（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞の増殖促進又は活性を有するポリペプチドである。ここで、「細胞」とは、ｃｇｒ１１ポリペプチドが作用し得る細胞であればいかなる細胞であってもよく、例えば、動物細胞、好ましくは、ヒト、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ヒツジ、ニワトリ、イヌ、ネコなど由来の細胞である。
上記アミノ酸の欠失、付加及び置換は、単離した天然ポリペプチドに存在していてもよく、また、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって新たに導入したものでもよい。例えば、特定のアミノ酸残基の置換は、市販のキット（例えば、MutanTM−G（TAKARA社）、MutanTM−K（TAKARA社））等を使用し、Ｇｕｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法により塩基の置換を行なうことによって達成することができる。【００２６】
また、本発明におけるｃｇｒ１１ポリペプチドのＣ末端は、通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）又はカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、当該カルボキシル基は、アミド（−ＣＯＮＨ２）やエステル（−ＣＯＯＲ）等に化学修飾されていてもよい。ここで、エステル中のＲとしては、Ｃ１−６アルキル基（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル）、Ｃ３−８シクロアルキル基（例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル）、Ｃ１−６アリール基（例えば、フェニル、α−ナフチル）、フェニル−Ｃ１−２アルキル基（例えば、ベンジル、フェネチル）、α−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基（例えば、α−ナフチルメチル）等が挙げられる。その他、経口用エステルとして汎用されているピバロイルオキシメチルエステルとすることも可能である。本発明のポリペプチドがＣ末端以外にもそのポリペプチド鎖中にカルボキシル基を有する場合には、当該カルボキシル基がアミド化又はエステル化されているものも本発明のポリペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては上記の各エステルが挙げられる。同様に、本発明のポリペプチドのＮ末端は、通常アミノ基（−ＮＨ２）であるが、当該アミノ基は、ホルミル基、アセチル基等のＣ１−６アシル基等で化学修飾されていてもよい。その他、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したものや、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な官能基（例えば、ホルミル基、アセチル等）で化学修飾されているものや糖鎖の結合しているものも本発明のポリペプチドに含まれる。【００２７】
本発明におけるｃｇｒ１１ポリペプチド中の部分アミノ酸配列を含むペプチド（部分ペプチドともいう）も本発明の組成物に含まれてもよい。また、部分ペプチドは本発明における抗体を調製するための抗原にもなり得る。すなわち、本発明の部分ペプチドは、配列番号２、配列番号４又は配列番号６で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列を含むものである限り、如何なるものであってもよい。
本発明の部分ペプチドを構成するアミノ酸数は、少なくとも１０個以上、好ましくは３０個以上、より好ましくは８０個以上である。通常、本発明の部分ペプチドのＣ末端はカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、Ｎ末端はアミノ基（−ＮＨ２）であるが、化学修飾されていてもよい。【００２８】
本発明におけるｃｇｒ１１ポリペプチド又はその塩は、ｃｇｒ１１ポリペプチドを発現しているヒトや動物（例えば、ラット、マウスなど）由来の培養細胞又は組織から、当該分野における通常の技術により抽出・分離することができ、あるいは後述のように本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを発現可能な状態で含む形質転換体を培養することにより、該培養物から抽出・分離することによっても調製することができる。ヒトや動物の組織又は細胞から調製する場合、ヒトや動物の組織または細胞をホモジナイズ後、酸等で抽出を行ない、得られた抽出液を疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィーを組み合わせることにより単離精製することができる。【００２９】
また、本発明における部分ペプチドまたはその塩は、公知のペプチド合成法又はｃｇｒ１１ポリペプチドを適当なペプチダーゼ（例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ）で切断することによって製造することができる。ペプチド合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。すなわち、本発明のポリペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる（例えば、Bondanszky等, 1996；Schroeder等, 1965を参照のこと）。合成反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを単離精製することができる。
上記の方法で得られるｃｇｒ１１ポリペプチド又はその部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができる、塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。【００３０】
３．ｃｇｒ１１組換えベクター
ｃｇｒ１１ポリヌクレオチド又はその一部を組み込んだ組換えベクターは、適切なベクターにｃｇｒ１１ポリヌクレオチド又はその一部を連結することにより得ることができる。該組換えベクターは、クローニング用に供される場合には、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されない。また、ｃｇｒ１１ポリペプチド又はその一部を発現するためのベクターとしては、宿主中で複製可能なものであって、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を発現させることができるプロモーターなどを有するものが使用可能である。【００３１】
使用可能なベクターとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＣＢＤ−Ｃ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０、ＹＩｐ３０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ等が挙げられる。さらに、レトロウイルス、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルス、トガウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。【００３２】
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば特に限定されない。
例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター等が挙げられる。
宿主が大腸菌である場合には、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター等が、宿主が枯草菌である場合には、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等が挙げられる。
宿主が酵母である場合には、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が挙げられる。
宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。【００３３】
本発明の組換えベクターにはｃｇｒ１１ポリペプチド又はその一部のコード化配列、プロモーター配列以外にも、選択マーカー、ターミネーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、ＳＶ４０複製起点（ＳＶ４０ｏｒｉ）などを連結することができる。
選択マーカーとしては、限定はしないが、ハイグロマイシン耐性マーカー（Ｈｙｇｒ）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ，  Ｇ４１８）などが利用可能である。
また、組換えタンパク質の単離・精製を容易にするなどの目的で、本発明のポリペプチドのＮ末端側に適当なシグナル配列を付加してもよい。
宿主が大腸菌である場合にはアルカリホスファターゼシグナル、ＯｍｐＡシグナルなどが利用可能であり、宿主が枯草菌である場合にはα−アミラーゼシグナル配列、ズブチリスシグナル配列などが利用可能であり、宿主が酵母である場合には、α因子シグナル配列、インベルターゼシグナル配列などが利用可能であり、宿主が動物細胞である場合には、例えば、インシュリンシグナル配列、α−インターフェロンシグナル配列、抗体分子シグナル配列などが利用可能である。【００３４】
上述のベクターに対してｃｇｒ１１ポリヌクレオチド又はその一部を挿入することは、クローニングされたＤＮＡをそのまま、又は所望により制限酵素で消化して、リンカーを付加し、ベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入することにより行うことができる。連結するＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡ又はＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。連結するＤＮＡは、当該ＤＮＡ中にコードされている本発明のポリペプチドが宿主細胞中で発現されるようにベクターに組み込まれることが必要である。
以上の方法により、ｃｇｒ１１ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むベクターを構築することができる。【００３５】
４．形質転換体
４−１．ｃｇｒ１１ポリペプチド発現のための形質転換体
ｃｇｒ１１の形質転換体は、本発明の組換え発現ベクターを、ｃｇｒ１１遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、ｃｇｒ１１遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、大腸菌（Escherichia coli）等のエシェリシア属、枯草菌（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）等の酵母、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、あるいはＳｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞が挙げられる。【００３６】
大腸菌への組換えベクターの導入方法としては、カルシウムイオンを用いる方法（Cohen等, 1972）、エレクトロポレーション法（Shigekawa及びDower, 1988）等が利用可能である。酵母への組換えベクターの導入方法としては、エレクトロポレーション法（Becker等, 1990）、スフェロプラスト法（Hinnen等, 1978）、酢酸リチウム法（Itoh等, 1983）等が利用可能である。動物細胞又は動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、ＤＥＡＥデキストラン法（Lopata等, 1984）、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法（Chen及びOkayama, 1988）、カチオン性脂質による方法（Elroy-Stein及びMoss, 1990）等が挙げられる。【００３７】
４−２．不死化又は生存維持を達成するための形質転換体
本発明において、ｃｇｒ１１が細胞、特に動物細胞の増殖促進活性又は生存維持活性を有することが初めて開示された。従って、ｃｇｒ１１遺伝子を不死化または生存維持を望む細胞に発現可能に導入することで該細胞の不死化又は生存維持を達成することができる。不死化又は生存維持が望まれる形質転換体を培養する際、培地としては所望の細胞が通常生存するのに適した培地であればいかなるものでもよく、例えば、約５〜２０％のウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地等が用いられる。また、ｐＨや培養の温度も所望の細胞に適した条件を設定することができ、これらの条件は当業者であれば容易に設定可能である。以上のようにして、ｃｇｒ１１ポリペプチドが不死化又は生存維持が望まれる細胞中で発現されれば、該細胞の不死化又は生存維持が達成される。【００３８】
５．ｃｇｒ１１ポリペプチド及びその部分ペプチドの製造
本発明の組成物に含まれるｃｇｒ１１ポリペプチド又はその部分ペプチドは、ｃｇｒ１１遺伝子又はその一部の発現ベクターを導入した形質転換体を培養し、ｃｇｒ１１ポリペプチド又はその一部を発現させ、培養物から該ポリペプチド又はその一部を単離することにより製造することができる。「培養物」とは、培養上清、あるいは培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。【００３９】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。【００４０】
培養は、宿主細胞に適した条件下で行う。例えば、大腸菌を培養する際の培地としては、ＬＢ培地、Ｍ９培地等が好ましい。所望によりプロモーターを効率よく働かせるために、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。大腸菌の場合、培養は通常約１５〜３７℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主が枯草菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。【００４１】
酵母を培養するための培地としては、ＳＤ培地、ＹＰＤ培地があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、ウシ血清を含むグレース昆虫培地等が挙げられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。  【００４２】
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％のウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地等が用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。上記培養物からｃｇｒ１１ポリペプチド又はその部分ペプチドを分離精製するには、例えば、下記の方法により行うことができる。【００４３】
ｃｇｒ１１ポリペプチド又はその部分ペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／又は凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離や濾過によりｃｇｒ１１ポリペプチド又はその部分ペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジン等のタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００などの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にｃｇｒ１１ポリペプチド又はその部分ペプチドが分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清又は抽出液中に含まれる本発明のポリペプチドの精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行うことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。【００４４】
６．ｃｇｒ１１ポリヌクレオチド（遺伝子を含む）の機能を阻害する核酸
ｃｇｒ１１遺伝子の機能を阻害する核酸は、ｃｇｒ１１遺伝子の機能を喪失させることにより、ｃｇｒ１１遺伝子が発現し、機能している細胞の増殖又は生存維持を阻害することが可能となる。その結果、例えば、ｃｇｒ１１の無秩序な過剰発現などが原因で癌化、腫瘍化した細胞、又は癌化、腫瘍化する可能性のある細胞の増殖を抑えることが可能となる。遺伝子の機能を阻害する核酸としては、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡなどの一本鎖核酸およびその誘導体、該遺伝子領域の一部と相補的配列を有する短い二本鎖ＲＮＡなどを挙げることができる。
アンチセンスは、ＲＮＡ又はＤＮＡまたはそれらの誘導体であってよく、ｃｇｒ１１遺伝子の発現に関する有効な阻害因子として作用する。アンチセンスＲＮＡは、例えば、インビボにおいてｍＲＮＡとハイブリダイズし、ｍＲＮＡからｃｇｒ１１ポリペプチドへの翻訳を阻害するようにデザインされる（Okano等, 1991）。また、ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、例えば、ｃｇｒ１１遺伝子の転写開始領域に対して相補的となるようにデザインされ、その結果、該遺伝子の発現を阻害する（Cohen, 1989）。
これらのアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡがｃｇｒ１１遺伝子又はポリペプチドの発現を阻害するようにインビボにおいて機能し得るように細胞へ導入することができる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合には、例えば、標的遺伝子配列の約−１０と＋１０の間の位置に結合するオリゴヌクレオチドであることが望ましい。
また、ｃｇｒ１１遺伝子と相補的な配列を有する二本鎖ＲＮＡはＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）に用いることもできる。ＲＮＡｉは、目的のｍＲＮＡ（例えば、ｃｇｒ１１遺伝子のｍＲＮＡ）が、目的のｍＲＮＡと相補的な配列を持つ二本鎖ＲＮＡにより分解される現象のことである。この現象を利用して人工的に二本鎖ＲＮＡを導入することにより、目的の遺伝子の発現を抑制することができる。従って、上述のアンチセンス法とは異なる原理に基づくと考えられる。【００４５】
７．ｃｇｒ１１ポリペプチドに対する抗体
ｃｇｒ１１ポリペプチドに対する抗体は、ｃｇｒ１１ポリヌクレオチドの活性を喪失させることにより、ｃｇｒ１１ポリペプチドが発現し、機能している細胞の増殖又は生存維持を阻害することが可能となる。その結果、例えば、ｃｇｒ１１の無秩序な過剰発現などが原因で癌化、腫瘍化した細胞、又は癌化、腫瘍化する可能性のある細胞の増殖を抑えることが可能となる。
さらに、例えば、ｃｇｒ１１ポリペプチドの過剰発現による癌の発症の有無、又は予後の判断をｃｇｒ１１ポリペプチドに対する抗体を用いて行うことができる。例えば、検体から取得した血中に存在するｃｇｒ１１ポリペプチドの濃度を、該抗体を用いて測定することにより、癌化の有無又は癌の予後の判断を行うことができる。【００４６】
ｃｇｒ１１に対する抗体には、ｃｇｒ１１ポリペプチドと特異的に結合する抗体、及びそのＦａｂ又はＦ(ａｂ’)２などの抗体断片が含まれる。
本発明における「抗体」（本発明のポリペプチドの活性を促進する抗体、本発明のポリペプチドの活性を阻害する抗体の両方を含む）には、ｃｇｒ１１ポリペプチドに対するモノエピトープ特異抗体、ポリエピトープ特異抗体、単一鎖抗体、及びこれらの断片が含まれる。これらの抗体には、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体などが含まれる。
７−１．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、例えば、哺乳類宿主動物に対して、免疫原及びアジュバントの混合物をインジェクトすることにより調製することができる。通常は、免疫原及び／又はアジュバントを宿主動物の皮下又は腹腔内へ複数回インジェクトする。免疫原には本発明のポリペプチド及びその異種ポリペプチドとの融合体又はこれらの断片が含まれる。例えば、配列番号１３又は１４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、非常に優れた免疫原となる。
アジュバントの例には、完全フロイト及びモノホスホリル脂質Ａ合成−トレハロースジコリノミコレート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）が含まれる。特に、本発明のポリペプチドの部分ペプチドを免疫原とする場合は、免疫応答を増強するために、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターなどの免疫原性を有するタンパク質と該免疫原とを結合させたのち、インジェクトしてもよい。
あるいは、ＩｇＹ分子を産生するニワトリを用いて調製してもよい（Schade等, 1996）。
抗体産生方法の詳細については、例えば、Ausubel等, 1987又はHarlow及びLane, 1988を参照されたい。【００４７】
７−２．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法を用いて調製することができる（Milstein及びCuello, 1983）。
この方法には以下に示す４つの工程が含まれる：（ｉ）宿主動物または、宿主動物由来のリンパ球を免疫する、（ｉｉ）モノクローナル抗体分泌性（又は潜在的に分泌性）のリンパ球を回収する、（ｉｉｉ）リンパ球を不死化細胞に融合させる、（ｉｖ）所望のモノクローナル抗体を分泌する細胞を選択する。
マウス、ラット、モルモット、ハムスター、又は他の適当な宿主動物が、免疫動物として選択され免疫原がインジェクトされる。或いは、免疫動物から取得したリンパ球をインビトロで免疫化してもよい。ヒト細胞が望ましい場合には、末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）が一般に使用される。しかしながら、他の哺乳類由来の脾臓細胞又はリンパ球がより一般的で好ましい。免疫原には、ｃｇｒ１１ポリペプチド及びその異種ポリペプチドとの融合体又はこれらの断片も含まれる。免疫原としては、例えば、配列番号１３又は１４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、非常に優れた免疫原となる。【００４８】
免疫後、宿主動物から得られたリンパ球はハイブリドーマ細胞を樹立するために、ポリエチレングリコールなどの融合剤を用いて不死化細胞株と融合される（Goding, 1996）。融合細胞としては、トランスフォーメーションによって不死化されたげっ歯類、ウシ、又はヒトのミエローマ細胞が使用されるか、ラットもしくはマウスのミエローマ細胞株が使用される。細胞融合を行った後、融合しなかったリンパ球及び不死化細胞株の成長又は生存を阻害する一又は複数の基質を含む適切な培地中で細胞を生育させる。通常の技術では、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く親細胞を使用する。この場合、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンがＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻害し、ハイブリドーマの成長を許容する培地（ＨＡＴ培地）に添加される。【００４９】
モノクローナル抗体の調製にあたり、好ましい不死化細胞株はマウスミエローマ株で、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Manassas, VA）より入手可能である。ヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株による、ヒトモノクローナル抗体産生に関しては、Kozbor等, 1984；Schook, 1987を参照のこと。
ハイブリドーマ細胞は細胞外に抗体を分泌するため、目的のモノクローナル抗体の産生の有無を培養液を用いて確認することができる。産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などの免疫沈降又はインビトロでの結合アッセイにより評価することができる（Harlow及びLane, 1988；Harlow及びLane, 1999）。
モノクローナル抗体分泌性ハイブリドーマ細胞は、限界希釈法及びサブカルチャーにより単一クローンとして単離することができる（Goding, 1996）。適切な培地にはダルベッコ改変イーグル培地、ＲＰＭＩ−１６４０、場合によっては、タンパク質を含まない培地若しくは無血清培地などが含まれる。また、ハイブリドーマ細胞は、適切な宿主動物の腹水中で増殖させてもよい。【００５０】
モノクローナル抗体は、培地又は腹水からプロテインＡセファロース、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、硫安沈殿又はアフィニティークロマトグラフィー（Harlow及びLane, 1988；Harlow及びLane, 1999）などの当業者にとって周知の方法によって単離、精製される。
また、モノクローナル抗体は遺伝子組換え技術によっても作製することができる（米国特許第4166452号, 1979）。目的の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株から目的のモノクローナル抗体ポリペプチドをコードする遺伝子を同定するのに、例えば、マウスの重鎖及び軽鎖抗体遺伝子と特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブを用いてもよい。その結果、抗体重鎖及び軽鎖遺伝子が取得された場合は、その遺伝子の配列を決定することにより目的の抗体遺伝子を同定することができる。単離されたＤＮＡ断片は、モノクローナル抗体を発現させるために、適当な発現ベクターに抗体遺伝子を導入し、該ベクターを他の免疫グロブリンタンパク質を生産しないｓｉｍｉａｎ  ＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はミエローマ細胞などのホスト細胞中へトランスフェクトする。単離されたＤＮＡ断片は、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインに対するコード化配列を相同なマウス配列と置換することにより（米国特許第4816567号, 1989；Morrison等, 1987）、又は非免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列の全て又は一部と免疫グロブリンコード化配列を融合することにより、修飾することができる。そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、キメラ二価抗体を調製するために、抗体の定常ドメインと置換することが可能であり、又は一抗原結合部位の定常ドメインと置換することができる。【００５１】
７―３．ヒト化及びヒト抗体
ｃｇｒ１１ポリペプチド抗体には、ヒト化又はヒト抗体が含まれる。非ヒト抗体のヒト化型は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片（Ｆｖ，Ｆａｂ，Ｆａｂ’，Ｆ（ａｂ’）２又は他の抗体の抗原結合領域など）である。
一般に、ヒト化抗体は非ヒト由来の免疫グロブリンから導入された一又は複数のアミノ酸残基を持つ。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、可変ドメインから選ばれる。ヒト化抗体は、例えばマウスのＣＤＲｓ又はＣＤＲ（相補性決定領域）配列と対応するヒト抗体配列とを置換することにより作製することができる（Jones等, 1986；Riechmann等, 1988；Verhoeyen等, 1988）。つまり、ヒト化抗体とは、ヒト由来の特定のＣＤＲ中のある残基と、該残基に相当するマウス、ラット又はウサギなどの非ヒト種のＣＤＲ中の残基と置換されているヒト抗体のことである。また、非ヒト由来の残基によって、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が置換される場合もある（Jones等, 1986；Presta, 1992；Riechmann等, 1988）。【００５２】
８．ｃｇｒ１１ポリペプチドに対するアゴニストおよびアンタゴニスト
本発明における「アゴニスト」とは、ｃｇｒ１１ポリペプチド、そのレセプター、又は相互作用因子（結合パートナー）に特異的に結合して、本発明のポリペプチドの生物学的活性を促進するものを意味し、上述の抗体の一部も「アゴニスト」に含まれる。抗体以外のアゴストとしては、限定はしないが、ポリペプチドまたはその断片、核酸、その他低分子化合物などを挙げることができる。また、本発明における「アンタゴニスト」とは、ｃｇｒ１１ポリペプチドまたはそのレセプター、相互作用因子（結合パートナー）に特異的に結合して、本発明のポリペプチドの生物学的活性を抑制するものを意味し、上述の抗体の一部も「アンタゴニスト」に含まれる。【００５３】
９．ｃｇｒ１１ポリペプチドに対するアプタマー
アプタマーは標的タンパク質と特異的に結合する能力を持った核酸分子又はペプチドで、標的タンパク質の活性を阻害することができる。また、活性阻害ができないものでも、標的タンパク質と結合することができるため、該タンパク質の有無を調べるために使用することができる。
従って、ｃｇｒ１１ポリペプチドに対するアプタマーは、ｃｇｒ１１ポリペプチドの活性を喪失させることにより、ｃｇｒ１１ポリペプチドが発現し、機能している細胞の増殖又は生存維持を阻害することが可能となる。あるいは、ｃｇｒ１１ポリペプチドの過剰発現による疾患、例えば、癌の発症の有無、又は予後の判断をｃｇｒ１１ポリペプチドに対するアプタマーを用いて行うことができる。例えば、検体から取得した血中に存在するｃｇｒ１１ポリペプチドの濃度を、該アプタマーを用いて測定することにより、例えば、癌化の有無又は癌の予後の判断を行うことができる。【００５４】
「アプタマー」が核酸の場合、ＲＮＡであってもＤＮＡであってもよく、これらのＲＮＡまたはＤＮＡがｃｇｒ１１ポリペプチドに特異的に結合するものである限り特に限定はしないが、好ましくはＤＮＡである。また、「アプタマー」には、リン酸骨格において修飾を加え、生体内における安定性を増大させたものも含み、特に限定はしないが、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホラミドチオエート結合、ホスホラミデート結合、ホスホルジアミデート結合、メチルホスホネート結合を含むリン酸骨格が好ましい。【００５５】
１０．ｃｇｒ１１ポリペプチドと相互作用する因子の決定方法
ｃｇｒ１１ポリペプチドと相互作用する因子は、ｃｇｒ１１ポリペプチドによる細胞の増殖促進又は生存維持活性に対し促進又は抑制効果をもたらすことが期待される。従って、該因子を本発明の組成物にさらに含有せしめることで、目的に応じた効果を実現することが可能となる。ここで「相互作用する因子」には、タンパク質、ペプチド、小分子化合物など、当業者の想定し得るものが含まれる。例えば、タンパク質としては、ｃｇｒ１１ポリペプチドに対するレセプターが含まれる。ｃｇｒ１１ポリペプチドと相互作用する因子を決定する場合、限定はしないが、ｃｇｒ１１ポリペプチドもしくはその一部と候補因子（例えば、レセプターなど）又は候補因子をその表面に提示する細胞（例えば、候補レセプタータンパク質をその表面に発現させた細胞など）とを接触させた場合における、ｃｇｒ１１ポリペプチドもしくはその一部と候補因子との結合量、あるいは、細胞などを使用した場合には、該細胞内における生物学的な変化を検出することにより相互作用の有無を決定することができる。
具体的には、ｃｇｒ１１ポリペプチドもしくはその一部、又は候補因子を標識（例えば、蛍光標識、放射標識）し、両者を接触させた後、標識から得られるシグナル（例えば、蛍光、放射活性など）の強度を指標にし、定法及び技術常識に基づいて、両者の結合量を検出し、その結果、両者が強く結合しているとの評価が可能である場合には、候補因子を相互作用因子であると決定することができる。あるいは、レセプターを決定する場合には、候補レセプターを発現させている細胞と、ｃｇｒ１１ポリペプチドもしくはその一部とを接触させ、レセプターを介した細胞特有の細胞内シグナル（例えば、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化など）における変動が検出されたときは、候補レセプターが実際にレセプターとして機能しているとの予測をすることが可能となる。【００５６】
１１．組成物
ｃｇｒ１１ポリヌクレオチド、ポリペプチド、該ポリペプチドに対するアゴニストなどを含んでなる組成物は、細胞の増殖促進若しくは生存維持を目的として使用することができ、また、該ポリヌクレオチドの活性阻害核酸又は該ポリペプチドに対する抗体、アンタゴニストなどを含んでなる組成物は、細胞の異常増殖（腫瘍化など）を抑制することを目的として使用することができる。本組成物は、培養細胞などへの使用のためにインビトロにおいても使用することができる。本組成物には、ｃｇｒ１１ポリヌクレオチドなどの有効成分の他に、細胞の等張性を保つための物質、あるいは該有効成分の細胞内への移行を促進するための物質、バッファーなどの補助物質が含まれる。これらの補助物質は当業者が利用可能なものであれば全て利用することができる。【００５７】
１２．医薬組成物
ｃｇｒ１１ポリヌクレオチド、ポリペプチド、該ポリペプチドに対するアゴニストなどを含んでなる組成物は、細胞の増殖促進若しくは生存維持を目的として使用することができ、また、該ポリヌクレオチドの活性阻害核酸又は該ポリペプチドに対する抗体、アンタゴニストなどを含んでなる組成物は、細胞の異常増殖（腫瘍化など）を抑制することを目的として使用することができることから医薬組成物としても利用可能である。該医薬組成物は、例えば、血管内皮細胞を標的として使用すれば、血流障害関連疾患の治療にその効果が期待でき、また、下垂体を形成する細胞等を標的として使用すれば、発育障害関連疾患の治療にその効果が期待でき、一方、腫瘍又は癌化した異常増殖を示す細胞を標的として使用すれば、癌の治療又は予防などにおいて効果が期待できる。【００５８】
さらに、本発明に係るｃｇｒ１１ポリヌクレオチド、ポリペプチド、該ポリペプチドに対するアゴニストなどを含んでなる組成物は、血圧を上昇させる効果を有し、また、該ポリヌクレオチドの活性阻害核酸又は該ポリペプチドに対する抗体、アンタゴニストなどを含んでなる組成物は、血圧を降下させる効果を有することから、医薬組成物としても利用可能である。該医薬組成物は、例えば、昇圧剤、血圧降下剤、低血圧症の治療剤、高血圧症の治療剤としての効果が期待される。【００５９】
ここで、「血流障害関連疾患」とは、体の全体又は一部において血液の循環に支障を来す結果引き起こされる疾患又は血液の循環に支障を来す原因となる疾患のことで、例えば、動脈硬化症、炎症性脈管炎、動脈瘤、血栓静脈炎、さらに、腎臓病なども含まれ、当業者の技術常識の範囲に含まれる全ての疾患のことである。
また、「高血圧症」、「低血圧症」には血圧の異常によって引き起こされる関連疾患、例えば、心臓疾患（例えば、心筋梗塞、大動脈狭窄、心臓肥大症、肥大性心筋症及び心不全など）も含まれる。
「癌」とは、細胞の異常な成長又は増殖と伴う疾患のことで、例えば、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、黒色腫、肉腫、及び白血病など、当業者の技術常識の範囲に含まれる全ての疾患のことである。
「神経疾患」とは、一般的な用いられる意味で理解されるべきもので、神経細胞又はパラニューロンの変性もしくは損傷によって引き起こされる全ての疾患がふくまれ、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症など、当業者の技術常識の範囲に含まれる全ての疾患のことである。
「発育障害」とは、主として身体的な発育に何らかの異常が認められること状態のことで、その関連疾患としては、限定はしないが、例えば、小人症、巨人症などを挙げることができる。【００６０】
上記ｃｇｒ１１ポリヌクレオチドなどは、生体に対して悪影響を及ぼさない医薬組成物の形態で治療薬として使用することができる。通常、そのような組成物には、核酸分子、タンパク質又は抗体などの他、薬剤的に受容可能な担体が含まれる。
「薬剤的に受容可能な担体」は、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌及び抗真菌剤、アイソトニックに作用して吸着を遅らせる薬剤及びその類似物を含み、薬剤的投与に適するもののことである（Gennaro, 2000）。該担体及び該担体を希釈するために好ましいものの例には、限定はしないが、水、生理食塩水、フィンガー溶液、デキストロース溶液、及びヒト血清アルブミンなどが含まれる。また、リポソーム及び不揮発性油などの非水溶性媒体も用いられる。さらに、上記ｃｇｒ１１ポリヌクレオチドなどの活性を保護又は促進するような特定の化合物が、該組成物中に包含されていてもよい。【００６１】
本発明に係る医薬組成物は、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入なども含む）、経皮及び経粘膜への投与を含み、治療上適切な投与経路に適合するように製剤化される。非経口、皮内、又は皮下への適用に使用される溶液又は懸濁液には、限定はしないが、注射用の水などの滅菌的希釈液、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒、ベンジルアルコール又は他のメチルパラベンなどの保存剤、アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなどの無痛化剤、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩などの緩衝剤、塩化ナトリウム又はデキストロースなど浸透圧調製のための薬剤を含んでもよい。
ｐＨは塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調製することができる。非経口的標品はアンプル、ガラスもしくはプラスチック製の使い捨てシリンジ又は複数回投与用バイアル中に収納される。【００６２】
１２−１．注射可能な製剤
注射に適する医薬組成物には、滅菌された注射可能な溶液又は分散媒を、使用時に調製するための滅菌水溶液（水溶性の）又は分散媒及び滅菌されたパウダーが含まれる。静脈内の投与に関し、適切な担体には生理食塩水、静菌水、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ  ＥＬＴＭ（BASF, Parsippany, N.J.）、又はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。注射剤として使用する場合、組成物は滅菌的でなくてはならず、また、シリンジを用いて投与されるために十分な流動性を保持していなくてはならない。該組成物は、調剤及び保存の間、化学変化及び腐食等に対して安定でなくてはならず、細菌及び真菌などの微生物由来のコンタミネーションを防止する必要がある。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及び適切な混合物を含む溶媒又は分散媒培地を使用することができる。例えば、レクチンなどのコーティング剤を用い、分散媒においては必要とされる粒子サイズを維持し、界面活性剤を用いることにより適度な流動性が維持される。種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、及びチメロサールなどは、微生物のコンタミネーションの防止に対して使用可能である。また、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール及び塩化ナトリウムのような等張性を保つ薬剤が組成物中に含まれてもよい。吸着を遅らせることができる組成物には、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの薬剤が含まれる。【００６３】
滅菌的な注射可能溶液は、必要な成分を単独で、又は他の成分と組み合わせた後に、適切な溶媒中に必要量の活性化合物を加え、滅菌することで調製される。一般に、分散媒は、基本的な分散培地及び上述したその他の必要成分を含む滅菌的媒体中に活性化合物を取り込むことにより調製される。滅菌的な注射可能な溶液の調製のための滅菌的なパウダーの調製方法には、活性な成分及び滅菌溶液に由来する何れかの所望な成分を含むパウダーを調製する真空乾燥及び凍結乾燥が含まれる。【００６４】
１２−２．経口組成物
通常、経口組成物には、不活性な希釈剤又は体内に取り込んでも害を及ぼさない担体が含まれる。経口組成物には、例えば、ゼラチンのカプセル剤に包含されるか、加圧されて錠剤化される。経口的治療のためには、活性化合物は賦形剤と共に取り込まれ、錠剤、トローチ又はカプセル剤の形態で使用される。また、経口組成物は、流動性担体を用いて調製することも可能であり、流動性担体中の該組成物は経口的に適用される。さらに、薬剤的に適合する結合剤、及び／又はアジュバント物質などが包含されてもよい。
錠剤、丸薬、カプセル剤、トローチ及びその類似物は以下の成分又は類似の性質を持つ化合物の何れかを含み得る：微結晶性セルロースのような賦形剤、アラビアゴム、トラガント又はゼラチンなどの結合剤；スターチ又はラクトースなどの、アルギン酸、ＰＲＩＭＯＧＥＬ、又はコーンスターチなどの膨化剤；ステアリン酸マグネシウム又はＳＴＲＲＯＴＥＳなどの潤滑剤；コロイド性シリコン二酸化物などの滑剤；スクロース又はサッカリンなどの甘味剤；又はペパーミント、メチルサリチル酸又はオレンジフレイバーなどの香料添加剤。【００６５】
１２−３．担体
上記ｃｇｒ１１ポリヌクレオチドなどは、植込錠及びマイクロカプセルに封入された送達システムなどの徐放性製剤として、体内から即時に除去されることを防ぎ得る担体を用いて調製することができる。エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの、生物分解性、生物適合性ポリマーを用いることができる。このような材料は、ALZA Corporation（Mountain View, CA）及びNOVA  Pharmaceuticals, Inc.（Lake Elsinore, CA）などから入手することが可能で、また、当業者によって容易に調製することもできる。また、リポソームの懸濁液も薬剤的に受容可能な坦体として使用することができる。有用なリポソームは、限定はしないが、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノール（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物として、使用に適するサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製され、逆相蒸発法によって精製される。例えば、抗体のＦａｂ’断片などは、ジスルフィド交換反応を介して、リポソームに結合させてもよい（Martin及びPapahadjopoulos, 1982）。【００６６】
１２−４．投与量
上記ｃｇｒ１１ポリペプチドの又は該ポリペプチドをコードする遺伝子等による特定の疾患の治療又は予防において、適切な投与量レベルは、投与される患者の状態、投与方法等に依存するが、当業者であれば、容易に最適化することが可能である。
注射投与の場合は、例えば、一日に患者の体重あたり約０．１μｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇを投与するのが好ましく、一般に一回又は複数回に分けて投与され得るであろう。好ましくは、投与量レベルは、一日に約０．１μｇ／ｋｇから約２５０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは一日に約０．５〜約１００ｍｇ／ｋｇである。
経口投与の場合は、組成物は、好ましくは１．０から１０００ｍｇの活性成分を含む錠剤の形態で提供され、好ましくは活性成分が１．０，５．０，１０．０，１５．０，２０．０，２５．０，５０．０，７５．０，１００．０，１５０．０，２００．０，２５０．０，３００．０，４００．０，５００．０，６００．０，７５０．０，８００．０，９００．０及び１０００．０ｍｇである。化合物は一日に１〜４回の投与計画で、好ましくは一日に一回又は二回投与される。【００６７】
１２−５．単位投与量
医薬組成物又は製剤は、一定の投与量を保障すべく、均一単位投与量により構成されなくてはならない。単位投与量は、患者の治療に有効な一回の投与量を含み、薬剤的に受容可能な担体と共に製剤化された一単位のことである。本発明の単位投与量を決定する場合には、製剤化される化合物の物理的、化学的特徴、期待される治療上の効果、及び該化合物に特有な製剤化における留意事項等により影響を受ける。【００６８】
１２−６．遺伝子治療組成物
本発明において開示される核酸分子（例えば、ｃｇｒ１１ポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドが挿入されたベクター、ｃｇｒ１１ポリヌクレオチドに対するアンチセンス核酸も含む）を患者の細胞に導入する方法には、主としてインビボ又はエキソビボの２つの方法がある。インビボ送達においては、治療が必要とされる患者の部位に直接注入される。エキソビボ処理では、患者の治療が意図される部位の細胞を単離し、単離された細胞に製剤化した核酸分子を導入し、導入された細胞を患者に直接又は、例えば、患者に埋め込まれる多孔性膜にカプセル化して投与することができる（米国特許第4,892,538号及び第5,283,187号参照）。核酸分子を生細胞に導入するために利用可能な技術は、培養細胞等にインビトロで導入されるか、又は患者にインビボで導入するかに依存して選択される。哺乳動物細胞にインビトロで核酸分子を導入するのに適した技術としては、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスフェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リン酸カルシウム沈降法などが挙げられる。トランスフェクションには、組換えウイルス（好ましくはレトロウイルス）粒子の細胞レセプターとの結合、次いで粒子に含まれる核酸分子の細胞への導入が含まれる。遺伝子のエキソビボ送達に通常用いられるベクターはレトロウイルスである。【００６９】
現在、インビボ核酸移入技術で好ましいのは、ウイルス又は非ウイルスベクター（アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ））、及びカチオン性脂質ベースの系（遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ−Ｃｈｏ１である；例えば、Tonkinson等, Cancer Investigation, 14(1):54-65 (1996) 参照）を利用した系が含まれる。遺伝子治療で使用するために最も好ましいベクターはウイルスでありその中でも、最も好ましくはアデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルス又はレトロウイルスである。レトロウイルスベクター等のウイルスベクターには、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサー又は位置決定因子などが含まれる。さらに、レトロウイルスベクター等のウイルスベクターは、例えば、ナルコレプシー関連遺伝子を含んだ状態で転写される場合、該コード化遺伝子の翻訳を可能とするシスエレメント、即ち翻訳開始配列として機能する核酸配列を含む。このようなベクター構築物は、用いるウイルスに適したパッケージングシグナル、末端反復配列（ＬＴＲ）又はその一部を含む。さらに、これらのベクターには、通常、該ベクターを含む宿主細胞から発現ポリペプチドを分泌させるシグナル配列が含まれる。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は哺乳動物シグナル配列である。場合によっては、ベクター構築物は、ポリアデニル化並びに翻訳終結配列も含む。例えば、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、ＤＮＡ合成の開始点、及び３’ＬＴＲ又はその一部を含む。非ウイルス性の他のベクターは、例えばカチオン性脂質、ポリリジン、及びデンドリマーを用いることもできる。
場合によっては、治療に用いる核酸を目的の細胞にターゲティングする試薬、例えば、細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体、又は標的細胞上のレセプターのリガンドなどと共に提供するのが望ましい。現在知られている遺伝子標識化及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Anderson等, Science, 256:808-813 (1992)などを参照のこと。【００７０】
１３．医薬組成物に関するキット
医薬組成物はキット、容器、パック中に投与の説明書と共に含めることができる。本発明に係る医薬組成物がキットとして供給される場合、該医薬組成物のうち異なる構成成分が別々の容器中に包装され、使用直前に混合される。このように構成成分を別々に包装するのは、活性構成成分の機能を失うことなく長期間の貯蔵を可能にするためである。【００７１】
１３−１．容器
キット中に含まれる試薬は、構成成分が活性を長期間有効に持続し、容器の材質によって吸着されず、変質を受けないような何れかの種類の容器中に供給される。例えば、封着されたガラスアンプルは、窒素ガスのような中性で不反応性ガスの下において包装されたバッファーを含む。アンプルは、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー、セラミック、金属、又は試薬を保持するために通常用いられる他の何れかの適切な材料などから構成される。他の適切な容器の例には、アンプルなどの類似物質から作られる簡単なボトル、及び内部がアルミニウム又は合金などのホイルで裏打ちされた包装材が含まれる。他の容器には、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジ、又はその類似物が含まれる。容器は、皮下用注射針で貫通可能なストッパーを有するボトルなどの無菌のアクセスポートを有する。【００７２】
１３−２．使用説明書
また、キットには使用説明書も添付される。当該医薬組成物からな成るキットの使用説明は、紙又は他の材質上に印刷され、及び／又はフロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどの電気的又は電磁的に読み取り可能な媒体として供給されてもよい。詳細な使用説明は、キット内に実際に添付されていてもよく、あるいは、キットの製造者又は分配者によって指定され又は電子メール等で通知されるウェブサイトに掲載されていてもよい。【００７３】
１４．診断
ある細胞内において、ｃｇｒ１１ポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現、及び／又は活性に異常が認められる場合には、該細胞の増殖、生存維持に異常を来している危険性が高いものと判断することができる。この場合、ｃｇｒ１１遺伝子（エクソン領域のみならずイントロン領域、およびプロモーター領域も含む）又はｃｇｒ１１ポリペプチドの変異（例えば、点突然変異、欠失など）、該遺伝子の発現制御領域の変異の有無を調べることによって、上記異常の発症およびその発症の危険性を予測することができる。【００７４】
ｃｇｒ１１ポリペプチドの発現量を調べるには、該ポリペプチドに特異的な抗体を利用することができる。例えば、特定の細胞の増殖、生存維持に異常を来していることが疑われる患者から被検試料を取得し、該被検試料に前記抗体を接触させ、該被検試料と該抗体との結合の有無を検出することで、該細胞の増殖、生存維持における異常の発症または発症の可能性を調べることができる。被検試料と抗体との結合の有無は、抗体を用いた免疫沈降法、ウェスタンブロッティング法、免役組織化学法、ＥＬＩＳＡ法などにより確認することができる。確認の結果、本発明のポリペプチドが全く検出されないか、または著しく少ない生体内存在量であると判断される場合には、上記異常の発症が疑われる。【００７５】
ｃｇｒ１１遺伝子の異常を確認するには、該遺伝子のｃＤＮＡ配列、ゲノムＤＮＡ配列（転写制御領域、イントロン領域なども含む）またはこれらの相補鎖とアニールすることができるプライマー、プローブなどを利用することができる。利用可能なプライマーとしては、一般に、１５ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは、１７ｂｐ〜３０ｂｐの長さを有し、本発明の遺伝子のコード領域、非コード領域（転写制御領域、イントロン領域などを含む）の少なくとも部分領域を増幅することができるものであれば如何なるものであっても利用可能である。【００７６】
利用可能なプローブとしては、一般に、１５ｂｐ以上の長さを有し、本発明の遺伝子のコード領域、非コード領域（転写制御領域、イントロン領域などを含む）の少なくとも部分領域とハイブリダイズすることができるものであれば如何なるものであっても利用可能である。また、プローブが目的のＤＮＡ領域にハイブリダイズすることを確認するために、該プローブは蛍光色素、放射標識などにより検出可能な状態で利用することができる。【００７７】
ｃｇｒ１１遺伝子の機能異常を確認する他の方法には、例えば、被検者から被検試料を取得し、該被検試料から調製したｃｇｒ１１遺伝子のｍＲＮＡ、または該ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡなどに前記プローブ、プライマーなどを接触させ、本発明の遺伝子のコード領域、非コード領域（転写制御領域、イントロン領域などを含む）の少なくとも部分領域との結合を検出する工程、または該部分領域を増幅する工程が含まれる。検出の結果、本発明の遺伝子の発現量等を健常者由来の試料と比較して異常が認められる場合には、ｃｇｒ１１遺伝子の機能異常の発症又はその危険性を予測することができる。
ここで、診断の対象となるのはヒトのみならず「哺乳動物」全般である。「哺乳動物」とは、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、イヌ、ネコなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などのことである。特に好ましい「哺乳動物」は、ヒトである。【００７８】
１５．治療
本発明には、疾患に罹患した、又は罹患する危険性のある哺乳動物の該疾患に関する予防又は治療方法が含まれる。
ここで、「治療」とは、疾患に罹患するおそれがあるか又は罹患した哺乳動物において、該疾患の病態の進行を阻止又は緩和することを意味し、治療的処置のみならず予防的処置をも含む広い意味として使用される。また、「疾患」には、ｃｇｒ１１遺伝子又はポリペプチドの存否又は量的変動によって引き起こされる病態の全てがふくまれ、例えば、血流障害、発育障害関連疾患、神経疾患、癌、低血圧症、高血圧症、心臓疾患などが含まれる。
ここで、治療の対象となるのはヒトのみならず「哺乳動物」全般である。「哺乳動物」とは、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、イヌ、ネコなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などのことである。特に好ましい「哺乳動物」は、ヒトである。【００７９】
以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００８０】
１．ｃｇｒ１１ポリペプチドの化学的性質：
ホルモン産生能の異なる下垂体細胞間の異なるタンパク質のプロテオーム解析から特定のタンパク質を同定した（図１，２）。具体的には、下垂体腫瘍（ラット由来）から分離されたクローン細胞のうち、ホルモンを産生しないＭｔＴ／Ｅ―Ｂ３細胞とホルモンを産生するＭｔＴ／Ｓ細胞の細胞抽出液の２次元電気泳動を行った。この結果図１に示すようにホルモン産生のＭｔＴ／Ｓ細胞で特異的に発現するスポット２を同定した。このスポットのトリプシン分解ペプチドの質量分析から図２のパターンを得た。このペプチドパターン相当するアミノ酸配列をコードする遺伝子としてｃｇｒ１１が同定された。図１のｓｐｏｔ２に対応するタンパク質をコードする遺伝子はｃｇｒ１１でＥＦ-ｈａｎｄ  ｍｏｔｉｆを有し、ｐ５３により細胞増殖を抑制することが報告されていたものである。本発明において、このタンパク質（ｃｇｒ１１ポリペプチド）が分泌シグナルを持ち、分泌シグナルの位置で切られること、分子量の実測値と遺伝子から推定されるタンパク質の分子量が予想される値よりも大きいことから糖による修飾を受けていることが推察された。このことは従来の報告になく、本タンパク質が新規の分泌タンパク質であることを示している。図３には、ラットとヒト由来のｃｇｒ１１ポリペプチドのアミノ酸配列のアライメントを示す。【００８１】
上述したようにｃｇｒ１１ポリペプチドのアミノ酸配列には分泌シグナル配列の特徴がみとめられるため、シグナルペプチド予測プログラムＳＯＳＵＩｓｉｇｎａｌ（ｈｔｔｐ：／／ｓｏｓｕｉ．ｐｒｏｔｅｏｍｅ．ｂｉｏ．ｔｕａｔ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉｓｉｇｎａｌ／ｓｏｓｕｉｓｉｇｎａｌ＿ｓｕｂｍｉｔ．ｈｔｍｌ）を用いてシグナル領域の予測を行ったところ、２１残基からなるアミノ酸配列が予測された（図４）。この結果は他の予測プログラムであるＳｉｇｎａｌＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）でも同じであった。
しかしながら、ラットｃｇｒ１１を細胞内に強制発現させ（図１０に示すコンストラクトを使用）、培養上清からアフィニティー精製したｃｇｒ１１タンパク質のＮ末端アミノ酸配列を、定法に従って解析したところ、シグナルペプチド領域２９アミノ酸配列から構成されることが明らかになった（図５）。この知見は、従来から知られているシグナルペプチド配列の切断ルールとは異なるものである。従って、この結果は、ｃｇｒ１１タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏにおける機能領域を初めて明らかにしたもので、重要な知見である。【００８２】
さらに、発明者は、ｃｇｒ１１遺伝子のプロモーター領域の解析を行ったところ、低酸素反応エレメント（ＨＲＥ；ｈｙｐｏｘｉａ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）の存在を明らかにした（図６）。このＤＮＡエレメントには共通のコンセンサス配列が存在しており、低酸素状態に応答し、ＨＩＦ−１（ｈｙｐｏｘｉａ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ-１）などの転写因子がこのエレメントに作用し、遺伝子の転写制御を行っていることが明らかになっている。低酸素状態で誘導される因子として、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）など、血管新生、癌化に関与している因子などが報告されている。このことにより、プロモーター領域に低酸素反応エレメントを持つｃｇｒ１１遺伝子は、低酸素に反応し血管新生、血管透過性、の促進により腫瘍形成、組織の維持にかかわることが示唆される。【００８３】
２．抗体の作成：
遺伝子配列上から推定されるアミノ酸配列の親水性部位に対するペプチドを合成し抗体を作成した。この結果、図３及び図５に存在する部位（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｓｉｔｅとして示す配列部位）が抗原として有効であり、特異的な抗体の作成に成功した。この部位は今後ｃｇｒ１１の存在量の測定などに応用できる。【００８４】
３．ｃｇｒ１１の産生細胞と組織内分布：
ＰＣＲ法によりｃｇｒ１１が下垂体のホルモン産生細胞（ＭｔＴ／Ｓ）に特異的に発現することを示した（図７）。このことから、ｃｇｒ１１タンパク質が細胞の分泌機能と関わりが強いことが示唆された。そして、ｃｇｒ１１タンパク質の存在量などを指標にすることにより、生体内のホルモン等分泌能を測定するために使用され得ることも示唆された。
また、細胞レベルでは、ｃｇｒ１１タンパク質がゴルジ装置に特異的に存在することが確認され（図８）、ｃｇｒ１１ポリヌクレオチドが分泌タンパク質であるとの上記見解が支持された。さらに、その分布はホルモン産生細胞内の成長ホルモンの分布と一致していた（図８）。ｃｇｒ１１タンパク質に特異的な抗体を使用した免疫細胞化学ではｃｇｒ１１タンパク質を持つ細胞は下垂体の後、前葉であり、下垂体中葉にはまったく発現されていないことが分かった（図９Ａ）。このような発現の様式から、ｃｇｒ１１タンパク質が豊富な血管を持つ部位（下垂体後葉、前葉）に多く発現し、一方、血管を全く持たない部位（下垂体中葉）には全く発現していないことが強く示唆された。このほか大腸（図９Ｃ）および卵巣の成熟卵胞の外卵胞膜（図９Ｄ）などにもｃｇｒ１１タンパク質の発現が確認された。これらの部位は、いずれも血管の豊富な部位であることから、ｃｇｒ１１タンパク質が血管系の形成及び／又は維持の重要な役割を担っていることが示唆される。【００８５】
４．ｃｇｒ１１強制発現系：
ｃｇｒ１１タンパク質の機能を検討するために、細胞内強制発現系の確立を行った。図１０には、発現ベクターのコンストラクトを示す。発現に用いたベクターｐＣｌ−ｎｅｏ  Ｖｅｃｔｏｒ（Promega社）のＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩサイトにｃｇｒ１１遺伝子を挿入し、定法に従ってサブクローニングを行った。得られた発現ベクターは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いて下垂体由来細胞株、ＭｔＴ／Ｅ−Ｂ３細胞（理研バイオリソースセンター登録ＭｔＴ／Ｅ細胞：ＲＣＢ１２７８のサブクローン細胞）およびＭｔＴ／Ｓｅ細胞（理研バイオリソースセンター登録：ＲＣＢ０５２９）に導入した。
ｃｇｒ１１強制発現細胞において、ｃｇｒ１１タンパク質はゴルジ装置に局在し（図１１Ａ，Ｃ）、強制発現細胞においてもｃｇｒ１１タンパク質が分泌タンパク質として機能していることが示唆された。さらに、培養液中に、ｃｇｒ１１タンパク質の存在が確認されたことから、ｃｇｒ１１タンパク質が分泌タンパク質であることが強く示唆された（図１２、１３）。【００８６】
５．ｃｇｒ１１の細胞増殖、生存維持に対する影響：
ｃｇｒ１１遺伝子産物の細胞増殖に対する影響を調べるために、ＭｔＴ／Ｅ−Ｂ３細胞にｃｇｒ１１タンパク質を強制発現させ、得られた細胞をラット（Ｆｉｓｃｈｅｒ３４４：メス、１００ｇ）の鼠径部皮下に移植（２ｘ１０６細胞／２００μｌ/ラット）した。移植後、２０日目に動物を開腹し腫瘍を取り出し、その重量を測定した。
その結果、強制発現系では腫瘍の形成が早く（図１４、１５）、血管の豊富な腫瘍を形成した（図１４）。また、強制発現細胞はバッチ培養法による細胞の死滅期が遅延した（図１６）。なお、ベクターのみを導入した細胞の分裂時間（ＤＴ）が２５．７時間であったのに対し、ｃｇｒ１１強制発現細胞の分裂時間（ＤＴ）が２７．７時間であり、細胞の増殖速度には有意な差は認められなかった。【００８７】
また、副腎の褐色細胞腫で神経前駆細胞として有名なＰＣ１２細胞の増殖及び生存維持に対するｃｇｒ１１タンパク質の影響を検討した。ＰＣ１２細胞は、無血清培地下では生存できないことが知られている。この細胞ではｃｇｒ１１タンパク質の発現が少ないため、ｃｇｒ１１遺伝子を導入したＰＣ１２細胞に導入し、強制発現系を構築した。４８ウェルプレートに強制発現クローン（図１７；クローンＣ〜Ｇ）と強制発現させていないクローン（図１７；コントロール）を５．００Ｅ＋４／ウェル（２００μｌ／ウェル）でまきこみ、２日後に無血清培地に交換した。無血清培養８日目に生存細胞数をカウントした。その結果、ｃｇｒ１１タンパク質が強制発現されるＰＣ１２細胞は、無血清培地下においてもその生存が顕著に促進されることが明らかになった（図１７）。【００８８】
さらに、無血清培地で培養したｃｇｒ１１タンパク質産生細胞もしくは強制発現系の細胞の培養液を無血清培地で培養したＰＣ１２細胞に添加した場合の影響について検討した（図１８）。４８ウェルプレートに４．００Ｅ＋３／ウェル（２００μｌ／ウェル）でＰＣ１２細胞をまきこみ、２日後に無血清培地に交換した。交換時に、ｃｇｒ１１強制発現細胞（ＭｔＴ／Ｂ３−Ｓｏ）及び強制発現させていない対照細胞（ＭｔＴ／Ｅ−Ｂ３ｖｅｃｔｏｒ）を培養した培養液を０％、１％、５％、１０％濃度になるように無血清培地に加えた。５日間培養した後、細胞数をカウントした。その結果、濃度依存的に細胞数が増加し、その生存が濃度依存的に促進されることが明らかとなった（図１８）。【００８９】
またさらに、ラット下垂体前葉由来の細胞を用いて同様の実験を行った（図１９）。エストロゲン依存性下垂体前葉細胞（ＭｔＴ／Ｓｅ）を１．００Ｅ＋５／ウェル（２００μｌ／ウェル）でまきこみ、無血清Ｄ／Ｆ培地にｃｇｒ１１タンパク質を含む培養液（図１９；ＣＧＲ１１を含む培養液）と含まない培養液（図１９；ＣＧＲ１１を含まない培養液）を添加して培養を行った。その結果、エストロゲンの有無によらず、無血清培地下での細胞の生存を顕著に促進した。【００９０】
６．ｃｇｒ１１の血管系に対する影響
ｃｇｒ１１タンパク質が豊富な血管を持つ部位（下垂体後葉、前葉）に多く発現し、一方、血管を全く持たない部位（下垂体中葉）には全く発現していないこと、また、大腸（図９Ｃ）及び卵巣の成熟卵胞の外卵胞膜（図９Ｄ）などにもｃｇｒ１１タンパク質の発現が確認されたことから、ｃｇｒ１１タンパク質が血管系の形成及び／又は維持の重要な役割を担っていることが示唆された。
そこで、ｃｇｒ１１の血圧に対する影響を調べた。
まず、血圧測定用カニューレの留置を行った。
ラットをエーテルで麻酔した後、左大腿部を切開し、左大腿動脈を剥離した。ピンセットで左大腿動脈を固定することで止血した。左大腿動脈の近位側と遠位側に縫合糸を通した。ウェッケル剪刀で大腿動脈に穴をあけ、５００Ｕヘパリン（持田製薬）／生理食塩水を満たした血圧測定用カニューレのＰＥ１０側を挿入した。先に通しておいた縫合糸でカニューレと血管を固定し、血液がチューブ内へ拍動しながら入るかを確認した。カニューレは切開した部位から皮下を通して後頭部に出した。このとき、カニューレが折れないよう注意した。再度、血液が拍動しながら上がってくるか確認し、ストッパー（長さ２ｃｍ、直径０．６６ｍｍ）（銀鱗１６号、TRAY）で栓をした。皮下のチューブを固定するために後頭部の皮膚に接するチューブをガムテープで巻き、ガムテープと皮膚を縫い、後頭部から外に出るチューブを４ｃｍ程度に切断した。手術後１日後に動物の回復を待って非麻酔下で以下の方法で血圧を測定した。【００９１】
ラットをケージに入れ、血圧測定用カニューレと延長チューブを接続し、トランスデューサ（バイオリサーチ株式会社）につないだ。チューブ内を１０Ｕヘパリン／生理食塩水で満たし、空気が入らないように気をつけた。また、カニューレと延長チューブの接続は、ステンレスパイプを用いた。また、血圧の測定および解析ソフトは、ＰｏｗｅｒＬａｂ（バイオリサーチ株式会社）を用いた。
ラット腹腔内にｃｇｒ１１タンパク質分泌細胞の培養液から抗体でアフィニティー精製したｃｇｒ１１タンパク質（０．１μｇ／５００μｌ）を注入し平均血圧の経時変化を測定した。その結果、精製ｃｇｒ１１タンパク質を腹腔内に注入した後、血圧の上昇が認められた（図２０）。これに対し、精製ｃｇｒ１１タンパク質を含まない培養液を用いたコントロールサンプルを注入した場合には血圧の上昇が認められなかった。
この結果から、ｃｇｒ１１タンパク質は血圧上昇効果を有することが明らかとなった。【００９２】
参考文献
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図１】
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【図２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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