(57)【要約】  標的の核酸における反復配列多型（ＶＮＴＲ）の検出と当該ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）の検出を同時に行うことを特徴とする多型の検出方法であって、多型の検出を行う標的の核酸と少なくとも３つのオリゴヌクレオチドとを同時にハイブリダイズさせる工程を包含する検出方法および該方法に使用する組成物、キット。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的の核酸における反復配列多型（ＶＮＴＲ）の検出と当該ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）の検出を同時に行うことを特徴とする多型の検出方法であって、多型の検出を行う標的の核酸と少なくとも３つのオリゴヌクレオチドとを同時にハイブリダイズさせる工程を包含する検出方法。
【請求項２】
３つのオリゴヌクレオチドが、
（１）ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチド、
（２）反復配列の中で最も上流にある反復配列と該配列に隣接するその上流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
（３）反復配列の中で最も下流にある反復配列と該配列に隣接するその下流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
である請求項１記載の多型の検出方法。
【請求項３】
多型の検出を行う標的の核酸の増幅反応と同時にハイブリダイゼーションを行う請求項１又は２記載の多型の検出方法。
【請求項４】
以下の工程：
（１）ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も上流にある反復配列と該配列に隣接するその上流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も下流にある反復配列と該配列に隣接するその下流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる３つのオリゴヌクレオチド、多型の検出を行う標的の核酸を含有すると思われる試料、多型の検出を行う標的の核酸を増幅するためのプライマー、を含有する反応溶液を調製する工程；
（２）工程（１）で調製した反応溶液を、多型の検出を行う標的の核酸を増幅する反応に供する工程；および
（３）増幅反応の過程および／または反応後の反応溶液中の標識オリゴヌクレオチド由来の信号を検出する工程；
を包含する標的の核酸におけるＶＮＴＲの検出と当該ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰの検出を同時に行うことを特徴とする多型の検出方法。
【請求項５】
多型の検出を行う標的の核酸がチミジル酸合成酵素（ＴＳ）遺伝子の５’非翻訳領域に相当する核酸である、請求項１〜４のいずれか１項記載の多型の検出方法。
【請求項６】
配列表の配列番号１及び２記載のオリゴヌクレオチドからなる群、配列番号３及び１２記載のオリゴヌクレオチドからなる群、および配列番号４、１３及び１４記載のオリゴヌクレオチドからなる群よりそれぞれ少なくとも１つずつ選択されるオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする、請求項５記載の多型の検出方法。
【請求項７】
標的の核酸におけるＶＮＴＲの検出と当該ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰの検出を同時に行う多型の検出方法に使用される組成物であって、ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も上流にある反復配列と該配列に隣接するその上流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も下流にある反復配列と該配列に隣接するその下流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する組成物。
【請求項８】
ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も上流にある反復配列と該配列に隣接するその上流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、および反復配列の中で最も下流にある反復配列と該配列に隣接するその下流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号１及び２記載のオリゴヌクレオチドからなる群、配列番号３及び１２記載のオリゴヌクレオチドからなる群、および配列番号４、１３及び１４記載のオリゴヌクレオチドからなる群よりそれぞれ少なくとも１つずつ選択されるオリゴヌクレオチドである請求項７記載の組成物。
【請求項９】
標的の核酸におけるＶＮＴＲの検出と当該ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰの検出を同時に行う多型の検出方法に使用されるキットであって、ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も上流にある反復配列と該配列に隣接するその上流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も下流にある反復配列と該配列に隣接するその下流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有するキット。
【請求項１０】
ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も上流にある反復配列と該配列に隣接するその上流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も下流にある反復配列と該配列に隣接するその下流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが、それぞれ配列表の配列番号１及び２記載のオリゴヌクレオチドからなる群、配列番号３及び１２記載のオリゴヌクレオチドからなる群、および配列番号４、１３及び１４記載のオリゴヌクレオチドからなる群よりそれぞれ少なくとも１つずつ選択されるオリゴヌクレオチドである請求項９記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は疾病予知や薬効ならびに副作用に関連した遺伝子のＶＮＴＲと当該ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰを迅速・簡便・高感度に検出する方法、組成物及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
同一種に属する生物個体のゲノム上に含有される遺伝暗号は同一ではなく、多型（polymorphism）と呼ばれる塩基配列上の差違が存在することが知られている。多型には１〜数十塩基の欠失や挿入、特定の塩基配列が重複するもの（反復配列多型：ＶＮＴＲ）などが知られているが、１個の塩基が他の塩基に置換されているものは一塩基置換多型（single nucleotide polymorphism、ＳＮＰ）と呼ばれている。【０００３】
ＶＮＴＲを検出する方法として、直接塩基配列を解読する方法、制限断片長多型（restriction fragment length polymorphism：ＲＦＬＰ）解析法、核酸増幅反応後、アガロースゲル電気泳動により増幅断片長を決定する方法などが用いられている。【０００４】
ＳＮＰを検出する方法としては、ハイブリダイゼーションに基づくもの、プライマー伸長に基づくもの、あるいは酵素の基質特異性を利用するものに大別される。
例えば、サイクリングプローブ反応（ｃｙｃｌｉｎｇ  ｐｒｏｂｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、例えば特許文献１）、ＴａｑＭａｎ法（例えば、特許文献２）、ＤＮＡポリメラーゼを使用する方法として塩基置換を検出しようとする塩基部分に３’末端がアニーリングするプライマーを使用し、プライマー伸長反応の有無から塩基置換を検出する方法（例えば、特許文献３）、３’末端から２番目のヌクレオチドに検出しようとする塩基置換部位が位置するプライマーを使用し、プライマー伸長反応の有無から塩基置換を検出する方法（例えば、特許文献４）、塩基置換を検出しようとする塩基の３’側に隣接する塩基に３’末端がアニーリングするプライマーを使用し、当該プライマーに取り込まれる塩基を判別して目的部分の変異の有無とその塩基を決定する方法、ＤＮＡリガーゼを使用する方法、インベーダー（Ｉｎｖａｄｅｒ）法（例えば、特許文献５）が開発されている。【０００５】
チミジル酸合成酵素（Ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ：ＴＳ）は、細胞内で５’デオキシウリジル酸（ｄＵＭＰ）から５’チミジル酸（ｄＴＭＰ）を合成する酵素で、ヒト由来のＴＳ（ｈＴＳ）の遺伝子配列が解読され、５’ＵＴＲ領域に２８ｂｐの３回反復配列があることが示されている（例えば、非特許文献１）。【０００６】
さらに、ＴＳ遺伝子の５’ＵＴＲ領域の２８ｂｐ反復配列は２回の反復（２Ｒ）と３回の反復（３Ｒ）の反復配列多型（ＶＮＴＲ）をなしていることが示され（例えば、非特許文献２）、次いで５’ＵＴＲの３Ｒ配列がＴＳ発現を高めていることが明らかとなり、ＴＳを標的とする抗がん剤５−ＦＵ（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）治療との関連が示唆された（例えば、非特許文献３）。上記知見に基づき、ＴＳ遺伝子の５’ＵＴＲ領域に存在するＶＮＴＲの検出を行う方法が報告されている（例えば、特許文献６、特許文献７）。特許文献７には、３Ｒに特異的なオリゴヌクレオチドのハイブリダイズによるＶＮＴＲのみが検出可能な方法が開示されているが、数塩基のミスマッチに基づいたハイブリダイズの可否による検出であるため、厳密なハイブリダイズの条件下での検出が求められる。【０００７】
ＴＳ遺伝子の５’ＵＴＲ領域の多型は、上記ＶＮＴＲに加えて、該ＶＮＴＲの反復配列中に一塩基置換多型（ＳＮＰ）が存在することが明らかにされている（例えば、特許文献８）。特許文献１には、ＴＳ遺伝子の５’ＵＴＲ領域をＰＣＲ法により増幅し、その増幅産物の半分をアガロースゲル電気泳動法に供し、その増幅産物の長さによりＶＮＴＲを決定し、残りの半分を制限断片長多型（ＲＦＬＰ）解析技術によりＳＮＰを検出する方法が開示されている。上記ＳＮＰと５−ＦＵの薬効との関連についても報告されている（例えば、非特許文献４、非特許文献５）。さらに、３ＲＧアレルはＴＳ高発現遺伝子多型と評価され、５ＦＵの薬効、副作用の判定に利用できることが示されている（例えば、非特許文献６）。また、特に東洋人では単なる２Ｒ／３Ｒの遺伝子多型だけでは５−ＦＵの薬効、副作用との関連は認められず、３ＲＧ多型が大きく影響していることが示されている（例えば、非特許文献７）。【０００８】
従来のＳＮＰ解析方法は、ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰには、ＳＮＰおよびその周辺の配列が反復しているため適用は困難であり、ＶＮＴＲの検出はできない。従って、現在ＶＮＴＲと当該ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰの解析は、ＰＣＲ法などにより標的遺伝子を増幅した後、増幅産物を複数のチューブに分け、必要に応じて増幅産物を精製し、数種の制限酵素により消化し、ゲル電気泳動法によりＲＦＬＰ分析によって行われている。しかし、上記方法は時間がかかり（２４時間）、結果判定も複雑で、煩雑な検査操作を必要としていた。さらに疫学調査や大規模な臨床試験では、ＰＣＲ反応後チューブを開けることによるクロスコンタミネーションによる間違ったタイピング結果がもたらされるなど、多くの問題が生じている。【０００９】
【特許文献１】米国特許第５，６６０，９８８号明細書
【特許文献２】米国特許第５，２１０，０１５号明細書
【特許文献３】米国特許第５，１３７，８０６号明細書
【特許文献４】国際公開第２００１／４２４９８号パンフレット
【特許文献５】米国特許第５，８４６，７１７号明細書
【特許文献６】国際公開第２００１／３６６８６号パンフレット
【特許文献７】国際公開第２００４／０３１４０８号パンフレット
【特許文献８】国際公開第２００４／０３７８５２号パンフレット
【非特許文献１】Ｔａｋｅｉｓｈｉ  Ｋ、他５名、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８５年、ｖｏｌ．１３、ｐ．２０３５−４３
【非特許文献２】Ｈｏｒｉｅ  Ｎ、他４名、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、１９９５年、ｖｏｌ．２０、ｐ．１９１−７
【非特許文献３】Ｋａｗａｋａｍｉ  Ｋ、他３名、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９９年、ｖｏｌ．１９、ｐ．３２４９−５２
【非特許文献４】Ｍａｎｄｏｌａ  Ｍ  Ｖ、他６名、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３年、ｖｏｌ．６３、ｐ．２８９８−２９０４
【非特許文献５】Ｋａｗａｋａｍｉ  Ｋ、他１名、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３年、ｖｏｌ．６３、ｐ．６００４−７
【非特許文献６】Ｍａｒｃｕｅｌｌｏ  Ｅ、他５名、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００４年、ｖｏｌ．１１２、ｐ．７３３−７３７
【非特許文献７】川上和之、Ｂｉｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、２００４年、ｖｏｌ．２１、ｐ．５０−５７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、上記従来技術を鑑みて行われたものであり、ＶＮＴＲと当該ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰのタイピングを同時に、簡便かつ高感度に検出する方法および該方法に使用する組成物、キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、少なくとも３つのオリゴヌクレオチドを同時にハイブリダイズさせる工程により、ＶＮＴＲと当該ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰのタイピングを同時に、簡便かつ高感度に検出する方法および該方法に使用する組成物、キットを構築し、本発明を完成させた。【００１２】
すなわち、本発明の第１の発明は、標的の核酸における反復配列多型（ＶＮＴＲ）の検出と当該ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）の検出を同時に行うことを特徴とする多型の検出方法であって、多型の検出を行う標的の核酸と少なくとも３つのオリゴヌクレオチドとを同時にハイブリダイズさせる工程を包含する検出方法に関する。本発明の第１の発明において、３つのオリゴヌクレオチドが、
（１）ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチド、
（２）反復配列の中で最も上流にある反復配列と該配列に隣接するその上流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
（３）反復配列の中で最も下流にある反復配列と該配列に隣接するその下流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、であってもよい。さらに、多型の検出を行う標的の核酸の増幅反応と同時にハイブリダイゼーションを行ってもよい。【００１３】
本発明の第２の発明は、以下の工程：
（１）ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も上流にある反復配列と該配列に隣接するその上流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も下流にある反復配列と該配列に隣接するその下流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる３つのオリゴヌクレオチド、多型の検出を行う標的の核酸を含有すると思われる試料、多型の検出を行う標的の核酸を増幅するためのプライマー、を含有する反応溶液を調製する工程；
（２）工程（１）で調製した反応溶液を、多型の検出を行う標的の核酸を増幅する反応に供する工程；および
（３）増幅反応の過程および／または反応後の反応溶液中の標識オリゴヌクレオチド由来の信号を検出する工程；
を包含する標的の核酸におけるＶＮＴＲの検出と当該ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰの検出を同時に行うことを特徴とする多型の検出方法に関する。【００１４】
本発明の第１の発明および第２の発明において、多型の検出を行う標的の核酸がチミジル酸合成酵素（ＴＳ）遺伝子の５’非翻訳領域に相当する核酸であってもよく、この場合、配列表の配列番号１及び２記載のオリゴヌクレオチドからなる群、配列番号３及び１２記載のオリゴヌクレオチドからなる群、および配列番号４、１３及び１４記載のオリゴヌクレオチドからなる群よりそれぞれ少なくとも１つずつ選択されるオリゴヌクレオチドを使用してもよい。【００１５】
本発明の第３の発明は、標的の核酸におけるＶＮＴＲの検出と当該ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰの検出を同時に行う多型の検出方法に使用される組成物であって、ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も上流にある反復配列と該配列に隣接するその上流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も下流にある反復配列と該配列に隣接するその下流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する組成物に関する。本発明の第３の発明において、ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も上流にある反復配列と該配列に隣接するその上流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、および反復配列の中で最も下流にある反復配列と該配列に隣接するその下流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号１及び２記載のオリゴヌクレオチドからなる群、配列番号３及び１２記載のオリゴヌクレオチドからなる群、および配列番号４、１３及び１４記載のオリゴヌクレオチドからなる群よりそれぞれ少なくとも１つずつ選択されるオリゴヌクレオチドであってもよい。【００１６】
本発明の第４の発明は、標的の核酸におけるＶＮＴＲの検出と当該ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰの検出を同時に行う多型の検出方法に使用されるキットであって、ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も上流にある反復配列と該配列に隣接するその上流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も下流にある反復配列と該配列に隣接するその下流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有するキットに関する。本発明の第３の発明において、ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も上流にある反復配列と該配列に隣接するその上流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も下流にある反復配列と該配列に隣接するその下流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが、それぞれ配列表の配列番号１及び２記載のオリゴヌクレオチドからなる群、配列番号３及び１２記載のオリゴヌクレオチドからなる群、および配列番号４、１３及び１４記載のオリゴヌクレオチドからなる群よりそれぞれ少なくとも１つずつ選択されるオリゴヌクレオチドであってもよい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、ＶＮＴＲと当該ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰのタイピングを同時に、簡便かつ高感度に検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の遺伝子多型の検出方法による多型検出の結果を示す図である。
【図２】本発明の遺伝子多型の検出方法による多型検出の結果を示す図である。
【図３】本発明の遺伝子多型の検出方法の一例を示す模式図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本明細書において反復配列多型（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ：ＶＮＴＲ）とは、同一あるいは極めてよく似た塩基配列が２つ以上反復して存在する反復配列において、その塩基配列の反復回数が異なる多型を示す。ＶＮＴＲはミニサテライトともいう。また、その反復する繰り返し単位である塩基配列は反復単位配列と記載する。反復単位配列の比較的短いものに、マイクロサテライト（ｓｈｏｒｔ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ：ＳＴＲとも言う）があるが、ＶＮＴＲとＳＴＲの明確な区別はなく、本発明の方法に使用するオリゴヌクレオチドが設計可能なＳＴＲもＶＮＴＲに含める。【００２０】
本明細書において一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）とは、複数の個体間においてゲノムなどの核酸の塩基配列が１塩基異なる多型を意味する。【００２１】
本明細書において上流および下流とは、プロモーター配列からＲＮＡが転写される方向に対する位置関係を示す。例えば翻訳開始点を基準とする場合、５’ＵＴＲ（非翻訳領域：ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）が上流であり、コード領域が下流となる。【００２２】
本明細書において、ＶＮＴＲの検出と当該ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰの検出を同時に行うとは、複数の構成成分の混合により１つの反応溶液もしくは組成物を調製し、該調製物を反応させた反応溶液がＶＮＴＲとＳＮＰの検出が可能な状態にあることを意味する。【００２３】
本明細書においてハイブリダイズとは、一本鎖の核酸が相補的塩基対形成によってハイブリッド（雑種二本鎖核酸分子）を形成することを意味する。本明細書においては、核酸がハイブリッドを形成すればハイブリダイズすることを意味し、ハイブリッドを形成する核酸の配列が完全に相補的、一部相補的のどちらであってもよい。【００２４】
本明細書において境界領域とは、連結された２つの特定の配列において境界となる領域（連結部分）を意味する。境界領域にハイブリダイズするということは、上記２つの特定の配列それぞれに、全部又は一部においてハイブリダイズすることを意味する。【００２５】
（１）  本発明の遺伝子の多型の検出方法
本発明の方法は、ＶＮＴＲと該ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰの同時検出を特徴とする遺伝子の多型の検出方法であって、少なくとも３つのオリゴヌクレオチドを同時にハイブリダイズさせる工程を包含する検出方法である。本発明の方法に使用するオリゴヌクレオチドは、ＶＮＴＲとＳＮＰの検出を同時に行うことができれば特に限定はされないが、例えば、
（ａ）ＶＮＴＲの反復単位の配列中のＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチド、
（ｂ）反復配列の中で最も上流にある反復配列と該配列に隣接するその上流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
（ｃ）反復配列の中で最も下流にある反復配列と該配列に隣接するその下流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、が挙げられる。本明細書において、少なくとも３つのオリゴヌクレオチドを同時にハイブリさせるとの記載は、標的の核酸に少なくとも３箇所においてオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしている状態を意味し、それぞれのオリゴヌクレオチドがハイブリダイズに関係しない部分で連結されていても少なくとも３箇所でハイブリダイズしていれば、実質的に少なくとも３つのオリゴヌクレオチドであることを示す。【００２６】
（ａ）ＶＮＴＲの反復単位の配列中のＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズしてからのエンドヌクレアーゼやエキソヌクレアーゼなどの酵素によるオリゴヌクレオチドの切断、ＤＮＡポリメラーゼなどによるオリゴヌクレオチドの伸長反応によりＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチドのいずれもが好適に使用できる。また、ＳＮＰの部位をオリゴヌクレオチドの５’末端、３’末端又はオリゴヌクレオチドの内部に設定することが可能である。ＳＮＰを識別する方法は、特に限定はされないが、例えば特許文献１〜特許文献５の方法を用いることができる。【００２７】
標識オリゴヌクレオチドの内部にＳＮＰ部位を設定した場合、標的のＶＮＴＲ反復配列にハイブリダイズした後、ミスマッチ感受性のヌクレアーゼによる切断によりＳＮＰの識別を行うことができる。例えば、標的のＶＮＴＲ反復配列と標識オリゴヌクレオチドが完全にハイブリダイズする場合、ＳＮＰ部位を切断する制限酵素、ニッキングエンドヌクレアーゼ（ＮＥＢ社製）、特定のＤＮＡ構造を認識するｃｌｅａｖａｓｅ（特許文献５参照）などが使用できる。上記ヌクレアーゼにより切断された標識オリゴヌクレオチドを検出することによりＳＮＰを識別する。標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする標的の核酸の切断を避けたい場合は、標的核酸のメチル化、核酸アナログの使用などにより、ヌクレアーゼによる切断を防ぐことができる（Ｎｅｌｓｏｎ  Ｍ、他２名、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９３年、ｖｏｌ．２１、ｐ．３１３９−５４、Ｓａｙｅｒｓ  Ｊ、他２名、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８９年、ｖｏｌ．１７、ｐ．９４９５参照）。さらに、オリゴヌクレオチドのＳＮＰ部位をリボヌクレオチドとすることにより、リボヌクレアーゼＨが好適に使用できる。この場合、ＳＮＰ部位と、必要に応じてその前後の配列をリボヌクレオチドとし、その他のヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドとすることで、キメラオリゴヌクレオチドのＳＮＰ部位又はその前後の部位をマッチ、ミスマッチに応じて切断することが可能となりＳＮＰを識別できる。リボヌクレアーゼＨは市販の酵素を使用してもよく、耐熱性のリボヌクレアーゼＨは国際公開第０２／２２８３１号パンフレット記載の方法で調製することができる。また、標的のＶＮＴＲ反復配列と標識オリゴヌクレオチドのハイブリダイズにミスマッチが生じる場合、ミスマッチ特異的ヌクレアーゼを使用することができる（Ｓｍｉｔｈ  Ｊ、他１名、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９６年、ｖｏｌ．９３、ｐ．４３７４−９参照）。
標識オリゴヌクレオチドの標的の核酸へのハイブリダイズは、オリゴヌクレオチドの長さ、反応溶液、温度によって決定される。反応溶液、温度は、使用する酵素が活性を保持しうる範囲でそれぞれ適宜設定すればよい。設定した反応溶液、温度に応じて、標的の核酸にハイブリダイズする適切な長さの標識オリゴヌクレオチドを設計することができる。設計したオリゴヌクレオチドのＴｍを算出し、反応温度と比較することにより、標的の核酸にハイブリダイズするかどうか予測できる。一般的に、オリゴヌクレオチドのＴｍは、例えば、下記の式により求められる。
Ｔｍ＝８１．５−１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）
（式中、Ｎはオリゴヌクレオチドの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー中のグアニンおよびシトシン残基の含有量である。）また、オリゴヌクレオチドの鎖長が１８塩基より短い場合、Ｔｍは、例えば、Ａ＋Ｔ（アデニン＋チミン）残基の含有量と２℃との積と、Ｇ＋Ｃ残基の含有量と４℃との積との和〔（Ａ＋Ｔ）×２＋（Ｇ＋Ｃ）×４〕により推定してもよい。
内部にＳＮＰ部位を設定した場合の標識オリゴヌクレオチドは、標的の核酸にハイブリダイズし、酵素により開裂した後、標的の核酸から遊離するような鎖長であってもよい。この場合、別の標識オリゴヌクレオチド分子が標的の核酸に対してハイブリダイズを繰り返し、検出感度が向上するので本発明の方法に好適である。開裂した後のオリゴヌクレオチド断片のＴｍが反応温度と比較して小さくなるほど、標的の核酸から遊離しやすい。開裂した後の標識オリゴヌクレオチドの鎖長は、特に限定されないが例えば、３〜４０塩基、好ましくは４〜２５塩基、より好ましくは５〜２０塩基である。【００２８】
標識オリゴヌクレオチドの５’末端にＳＮＰ部位を設定した場合、標的のＶＮＴＲ反復配列にハイブリダイズした後、例えば、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼによる５’末端の切断により生じる遊離した核酸の標識を検出することにより、ＳＮＰを識別することができる。例えば、ＳＮＰを検出する標識オリゴヌクレオチドとして、特許文献２に記載されるＴａｑＭａｎプローブを使用し、該プローブの５’末端の分解を検出することにより、本発明の検出方法を実施することができる。【００２９】
標識オリゴヌクレオチドの３’末端にＳＮＰ部位を設定した場合、標的のＶＮＴＲ反復配列にハイブリダイズした後、標的配列を鋳型とするポリメラーゼ反応などによる３’末端の塩基の取り込みの有無によりＳＮＰを識別することができる。また、標識オリゴヌクレオチドの３’末端を標的配列のＳＮＰ部位の隣の塩基に設定し、ポリメラーゼ反応などにより取り込まれるＳＮＰ部位の塩基によりＳＮＰを識別することも可能である。例えば、ＳＮＰを検出する標識オリゴヌクレオチドとして、特許文献３、４に記載されるプライマーを使用し、該プライマーの３’末端からの伸長反応を検出することにより、本発明の検出方法を実施することができる。【００３０】
ＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチドは、そのＳＮＰに応じて複数使用してもよく、それぞれのＳＮＰの塩基に応じて標識を選択することが可能である。さらに、標識オリゴヌクレオチドの設計、使用するヌクレアーゼ、検出方法に応じて適宜標識を選択することができる。本発明に使用できる標識物質はＳＮＰの識別が可能であれば特に限定はないが、例えば、ビオチン、アビジン、抗原、抗体などの相互作用による標識、ラジオアイソトープ、色素、蛍光物質などによる信号の検出による標識であってもよい。特に、ヌクレアーゼによる切断によりＳＮＰを識別する方法の場合、切断により生じる分子のそれぞれに異なる蛍光物質や、蛍光物質と消光物質を組み合わせて標識することが好適である。当該物質の組み合わせとしては、６−ＦＡＭ（6-carboxyfluorescein）とＤＡＢＣＹＬ（4-dimethylaminoazobenzene-4'-sulfone）、ＲＯＸ（6-carboxy-X-rhodamine）とＤＡＢＣＹＬ、６−ＦＡＭとＥｃｌｉｐｓｅ（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ＲＯＸとＥｃｌｉｐｓｅ、ＴＥＴ（tetrachlorofluorescein）とＤＡＢＣＹＬ、ＴＥＴとＥｃｌｉｐｓｅ等が好適に使用できる。さらに、ＨＥＸ（hexachlorofluorescein）も好適に使用できる。【００３１】
（ｂ）反復配列の中で最も上流にある反復配列と該配列に隣接するその上流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、最も上流にある反復配列と該配列に隣接するその上流の配列の両方にハイブリダイズし、最も上流にある反復配列へのＶＮＴＲの反復単位の配列中のＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチドのハイブリダイズを阻害又は競合するオリゴヌクレオチドである。【００３２】
（ｃ）反復配列の中で最も下流にある反復配列と該配列に隣接するその下流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、最も下流にある反復配列と該配列に隣接するその下流の配列の両方にハイブリダイズし、最も下流にある反復配列へのＶＮＴＲの反復単位の配列中のＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチドのハイブリダイズを阻害又は競合するオリゴヌクレオチドである。【００３３】
本発明に使用するオリゴヌクレオチド、すなわち上記（ａ）〜（ｃ）のオリゴヌクレオチドは、必要に応じて、その３’末端からのポリメラーゼなどによる伸長が生じないように修飾されていてもよい。反応液中にＤＮＡポリメラーゼなど、伸長反応を触媒する酵素が存在し、オリゴヌクレオチドからの伸長反応を望まない場合に修飾すればよい。例えば、３'末端にジデオキシヌクレオチド、リボースの３位の水酸基が修飾されたヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長が立体障害により妨害されるような修飾を付されたヌクレオチド等を付加することがあげられる。上記のヌクレオチドのリボースの３位の水酸基の修飾方法としては、アルキル化、アミド化、アミノ化やその他の公知の修飾方法を利用することができ、例えばアミノアルキル化することにより、ＤＮＡ伸長反応を防ぐことができる。該修飾は、上記性質を獲得できるものであれば、当該オリゴヌクレオチドの３’末端あるいは３’末端側のいずれに位置していてもよい。【００３４】
さらに、本発明に使用するオリゴヌクレオチドは、必要に応じて、その５’末端がエキソヌクレアーゼによる切断を生じないように修飾されていてもよい。反応液中に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼなど、切断、分解反応を触媒する酵素が存在し、オリゴヌクレオチド５’末端の切断を望まない場合に修飾すればよい。該修飾は特に限定するものではないが、例えば５’末端の脱リン酸化、リボースの３位の水酸基の修飾、リン酸基に結合する酸素原子が硫黄原子に置換された（α−Ｓ）ヌクレオチドの使用、ペプチド核酸（ＰＮＡ、peptide nucleic acid; Nature, 365, 566-568 (1993)）の使用、アミノアルキル化、色素・蛍光物質・発光物質・消光物質・種々のリガンド（ビオチン、ジゴキシゲニン等）・酵素等の付加、立体障害となり得る置換基の導入などが挙げられる。該修飾は、上記性質を獲得できるものであれば、当該オリゴヌクレオチドの５’末端あるいは５’末端側のいずれに位置していてもよい。オリゴヌクレオチドの合成は、通常合成を行う会社が受託しており、オリゴヌクレオチドの合成を受託する会社により、上記オリゴヌクレオチドの３’末端、５’末端の修飾が、通常のオプションメニューとして提供されている。【００３５】
本発明に使用するオリゴヌクレオチドは、標的の核酸とのハイブリダイズにおいて、標的核酸の配列と相補的であることが好ましく、また一部分の配列が相補的であってもよい。さらに、本発明に使用するオリゴヌクレオチドの相補的な配列は、ハイブリダイズすればオリゴヌクレオチド内で局在していてもよく、散在していても良い。オリゴヌクレオチドの長さ、塩基の組成、オリゴヌクレオチドが含まれる溶液の組成、温度などのハイブリダイズの条件は、当技術分野において公知の知見に基づき決定すればよい。特に限定はされないが、例えば２００１年、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら、モレキュラー  クローニング：ア  ラボラトリー  マニュアル第３版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．）のチャプター８〜１１、１４に記載のハイブリダイゼーション条件、核酸の増幅反応を同時に行う場合はＰＣＲ反応条件を参照すればよい。特に、市販のリアルタイムＰＣＲシステムが推奨するバッファー、反応条件、及び該条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが好適に使用できる。さらに、本発明に使用するオリゴヌクレオチドは、標的核酸中ＶＮＴＲの反復単位と反復単位の境界領域をまたいで複数の反復単位にハイブリダイズする１つのオリゴヌクレオチドであってもよく、標的核酸中ＶＮＴＲの反復単位と反復単位の境界領域をまたがない複数の反復単位にハイブリダイズしない１つのオリゴヌクレオチドであってもよい。【００３６】
本発明に使用するオリゴヌクレオチドの長さは、その標的とする遺伝子のＶＮＴＲ反復単位の長さ、使用する酵素、標識する場合は標識の種類、ハイブリダイズの条件により適切な長さを選択すればよく、特に限定はされないが例えば、６〜８０塩基、好ましくは８〜５０塩基、より好ましくは１０〜４０塩基の長さである。【００３７】
本発明の遺伝子多型の検出方法は、ＶＮＴＲの反復配列の中で最も上流にある反復配列と最も下流にある反復配列に、上記（ｂ）、（ｃ）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする。従って、（ａ）の標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすれば、反復配列が３回以上反復するＶＮＴＲであり、ハイブリダイズしなければ反復配列が２回の反復、若しくは反復しないＶＮＴＲであることが分かる。つまり、反復配列がない、または１回の反復の場合は、（ａ）の標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズせず、３回の反復の場合は、（ａ）の標識オリゴヌクレオチドが標的配列の１箇所にハイブリダイズする。同様に、４回の反復の場合は、（ａ）の標識オリゴヌクレオチドが標的配列の２箇所に、５回の反復の場合は３箇所にハイブリダイズする。さらに、（ａ）の標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする、ＶＮＴＲの反復配列の中で最も上流の反復配列と最も下流にある反復配列以外の反復配列のＳＮＰが同時に区別可能である。例えば、３回の反復の場合は、真ん中の反復配列のＳＮＰが識別可能となる。また、（ａ）の標識オリゴヌクレオチドが標的配列の複数箇所にハイブリダイズする場合は、ＳＮＰに応じて（ａ）の標識オリゴヌクレオチドを複数用意することにより、ＳＮＰの種類を分類することが可能である。つまり、本発明の遺伝子多型の検出方法は、ある特定の多型のタイピング、複数のタイプのうちのいずれかのタイプであることの検出、ある特定のタイプではないことの確認が包含される。【００３８】
本発明の方法は、上記ＶＮＴＲとＳＮＰの検出は、１つの反応系、１つの反応容器で行うことができ、検出反応の過程で試薬などの追加、反応産物の精製、分離、抽出、反応系の変更、バッファー交換などの作業が必要なく、極めてコンタミネーションなどの事故の少ない方法である。さらに、上記（ａ）の標識オリゴヌクレオチドは、上記（ｂ）、（ｃ）のオリゴヌクレオチドと競合的にハイブリダイズするため、厳密なハイブリダイズ条件を設定し、コントロールする必要がなく、検出の精度が高いという特徴を有する。【００３９】
本発明の遺伝子多型の検出方法は、その多型の検出が迅速に行える。本発明のＶＮＴＲとＳＮＰの検出に要する時間は、特に限定はされないが、１２時間以内、好ましくは６時間以内、より好ましくは３時間以内、さらに好ましくは２時間以内、特に好ましくは９０分以内である。【００４０】
本発明の遺伝子多型の検出方法は、その多型の検出が高感度に行える。標的の遺伝子に対立遺伝子がある場合、その遺伝子多型のタイプがヘテロであれば、標的の核酸を含有する試料には複数のタイプが混在することになる。本発明の遺伝子多型の検出方法は、異なるタイプの多型が、特に限定はされないが、５０％、好ましくは３０％以上、より好ましくは１０％以上、さらに好ましくは５％以上存在する試料のタイピングが可能であり、高感度な検出方法である。【００４１】
本発明の遺伝子多型の検出方法は、ＶＮＴＲの反復単位の配列中にＳＮＰの存在が疑われる多型であれば、いかなる遺伝子も標的の遺伝子とすることができる。特に限定はされないが、例えば、チミジル酸合成酵素（Ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ：ＴＳ）遺伝子の５’ＵＴＲ領域の多型を検出する場合、２８塩基からなるＶＮＴＲの反復単位（配列番号７）の配列中に存在するＳＮＰ（１２番目の塩基のＣとＧ）を識別する標識オリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も上流にある反復配列と該配列に隣接するその上流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も下流にある反復配列と該配列に隣接するその下流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを使用すればよい。【００４２】
以下、本明細書において、ＴＳ遺伝子の５’ＵＴＲ多型の遺伝子型を以下の通り定義する。２ＲはＶＮＴＲにおいて反復単位（配列番号７）の反復回数が２回であり、２ＲＧは、ＳＮＰが上流から順にＧ（すなわち、配列番号７において１２番目の塩基がＧである）、Ｇの遺伝子型を示す。２ＲＣは、ＳＮＰが上流からＧ、Ｃ（すなわち、配列番号７において１２番目の塩基がＣである）の遺伝子型を示す。３ＲはＶＮＴＲにおいて反復回数が３回であり、３ＲＧは、ＳＮＰが上流からＧ、Ｇ、Ｃの遺伝子型を示す。３ＲＣは、ＳＮＰが上流からＧ、Ｃ、Ｃの遺伝子型を示す。【００４３】
本発明の方法を用いたＴＳ遺伝子５’ＵＴＲ多型の検出は、特に限定はされないが例えば、ＳＮＰのＣを識別する標識ヌクレオチドとＳＮＰのＧを識別する別の標識オリゴヌクレオチドを使用すれば、これらの標識オリゴヌクレオチドのハイブリダイズにより２Ｒと３Ｒ以上のＶＮＴＲが判別できる。すなわち、上記標識ヌクレオチドのどちらかがハイブリダイズすれば３Ｒ以上のＶＮＴＲであることを示し、ハイブリダイズしなければ２ＲのＶＮＴＲまたはＶＮＴＲが存在しないことを示す。さらに標識オリゴヌクレオチドの信号により、ＣとＧのＳＮＰが判別できる。すなわち、３Ｒの場合、Ｇを識別する標識ヌクレオチドにより３ＲＧが、Ｃを識別する標識ヌクレオチドにより３ＲＣが判別可能である。また、４Ｒの場合、Ｇを識別する標識ヌクレオチドの信号のみであれば真ん中の２つの反復配列がＧＧ、Ｃを識別する標識ヌクレオチドの信号のみであれば真ん中の２つの反復配列がＣＣ、両方の標識ヌクレオチドの信号が検出されれば真ん中の２つの反復配列がＧＣまたはＣＧであることを示す。例えば、試料中に、２ＲＧ、２ＲＣ、３ＲＧ、３ＲＣのタイプの核酸が存在する可能性がある場合、例えばＳＮＰのＧを識別する標識オリゴヌクレオチドの信号が得られれば、３ＲＧのタイプの核酸が存在することが検出できる。ＴＳ遺伝子の３ＲＧ多型および４Ｒ以上の多型は、抗がん剤５−ＦＵの感受性、薬効に大きく影響を与えるため、５−ＦＵ治療の前に３ＲＧ多型を検出し、遺伝子のタイピングを行うことは、非常に有用である。【００４４】
ＴＳ遺伝子の５’ＵＴＲ領域の多型を検出する場合、特に限定はされないが、例えば、ＶＮＴＲの反復単位の配列中のＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチドのうち、ＧのＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチドとして、５’末端がＦＡＭ、３’末端がＥｃｌｉｐｓｅで標識された配列番号１記載の配列を有するオリゴヌクレオチド、ＣのＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチドとして、５’末端がＨＥＸ、３’末端がＥｃｌｉｐｓｅで標識された配列番号２記載の配列を有するオリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も上流にある反復配列と該配列に隣接するその上流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとして、３’末端がアミノ化により修飾された配列番号３又は１２記載の配列を有するオリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も下流にある反復配列と該配列に隣接するその下流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとして、３’末端がアミノ化により修飾された配列番号４、１３又は１４記載の配列を有するオリゴヌクレオチドが好適に使用できる。この場合、ＶＮＴＲの反復単位の配列中のＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチドが標的の核酸にハイブリダイズし、該オリゴヌクレオチドのリボヌクレアーゼＨによる切断により、蛍光物質のエネルギー転移に伴う波長の変化を検出することにより、多型を検出することができる。本発明のＴＳ遺伝子の５’ＵＴＲ領域の多型を検出する方法としては、特に限定はされないが一例として、図３に模式図を示す。図３において、標的の核酸の多型が３ＲＧの場合にはＧのＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチドの標識（標識Ｇ）が検出され（＋）、３ＲＣの場合にはＣのＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチドの標識（標識Ｃ）が検出される（＋）。【００４５】
本発明の遺伝子多型の検出方法は、多型の検出と同時に、多型の存在する領域の核酸増幅を行っても良い。同時に核酸の増幅を行うことにより、多型の検出感度を向上させることができる。核酸の増幅方法は、公知の方法を用いることができるが、例えば例えばポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ；polymerase chain reaction、米国特許第4,683,195号）、鎖置換型増幅法（ＳＤＡ；strand displacement amplification、特公平7-114718号）、ＩＣＡＮ法（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids、国際公開第00/56877号パンフレット）等の核酸増幅方法を使用することができる。
核酸の増幅反応は、市販の製品に添付されているバッファーを使用すればよく、添付の手順書に従い行うことができる。【００４６】
ＴＳ遺伝子の５’ＵＴＲ領域の多型を検出する場合、特に限定はされないが、例えば、配列番号５記載の配列を有するプライマー、配列番号６記載の配列を有するプライマーを用いたＰＣＲ反応が好適である。【００４７】
本発明の遺伝子多型の検出方法は、継続的、断続的に標識の信号を検出するリアルタイム検出を行ってもよく、反応途中の任意の特定の時点、反応終了後の時点でエンドポイント検出を行ってもよい。【００４８】
（２）本発明の遺伝子多型を検出するための組成物及びキット
本発明の組成物及びキットは、ＶＮＴＲの検出と該ＶＮＴＲの反復単位中に存在するＳＮＰの検出を同時に行うことを特徴とする遺伝子の多型の検出方法に使用でき、少なくとも以下の３つのオリゴヌクレオチドを含有する組成物及びキットである。
（ａ）ＶＮＴＲの反復単位の配列中のＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチド、
（ｂ）反復配列の中で最も上流にある反復配列と該配列に隣接するその上流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
（ｃ）反復配列の中で最も下流にある反復配列と該配列に隣接するその下流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。【００４９】
本発明の組成物及びキットは、（１）記載の本発明の方法に使用できる。また、標的遺伝子のＶＮＴＲ領域の核酸を増幅するためのプライマーを含有していても良い。さらに、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素、ｃｌｅａｖａｓｅ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼＨなどの酵素や蛍光色素などの標準物質としての標識を含有していても良い。また本発明のキットには、指示書が含まれていてもよい。該「指示書」とは、当該キットの使用方法、例えば試薬液の調製方法、推奨される反応条件等を記載した印刷物であり、パンフレットまたはリーフレット形式の取り扱い説明書のほか、キットに添付されたラベル、キットが納められたパッケージ等に記載されたものを含む。さらに、インターネットのような電子媒体を通し、開示、提供された情報も含まれる。
本発明の組成物は、反応バッファーを含有していてもよい。本発明に使用する反応バッファーは、ＳＮＰを検出する方法、標識の信号を検出する方法、さらに核酸の増幅を行う方法により、適宜選択すればよい。これらの方法は、大腸菌をはじめとする微生物由来の酵素を使用する場合が多く、一般的に反応が進行する環境には共通点が多いので、それぞれの反応が進行する共通の反応溶液を設定することは容易である。特に限定はされないが例えば、本発明に使用する反応バッファーは、緩衝成分、マグネシウム塩やその他の金属塩、ｄＮＴＰを含有するものが使用される。また、使用する酵素の金属要求性等に応じて塩の種類及び濃度を最適化するのは当然のことである。緩衝成分は、特に限定はないが、例えば、ビシン、トリシン、ヘペス、トリス、リン酸塩（リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等）が好適に使用できる。特にビシン、トリシン、ヘペス、あるいはリン酸塩を緩衝成分として含有するバッファーが本発明に好適である。特に限定はされないが、例えば、反応温度が高い場合は、温度変化によるｐＨの変化が少ないビシン緩衝液が好ましく、また使用するＲＮａｓｅＨの種類によってはヘペス緩衝液が好ましい場合がある。従って、反応温度、使用するＤＮＡポリメラーゼあるいはエンドヌクレアーゼ等によって、最適な緩衝液を選択すればよい。該緩衝成分の最終濃度は５ｍＭ〜１００ｍＭの範囲、特に好ましくは１０ｍＭ〜５０ｍＭの範囲であり、またｐＨ６．０〜９．５、特に好ましくはｐＨ７．０〜９．２の範囲のものが使用される。また、マグネシウム塩を含む場合は、特に限定はないが例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウムあるいは硫酸マグネシウムが好適に使用でき、その濃度は、最終濃度で１ｍＭ〜２０ｍＭ、特に好ましくは２ｍＭ〜１０ｍＭの範囲である。また、ＤＮＡ伸長反応の基質となるｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ混合物）を含む場合は、最終濃度で、それぞれ０．１ｍＭ〜３．０ｍＭ、特に好ましくは０．２ｍＭ〜１．２ｍＭの範囲である。使用するオリゴヌクレオチドの量は、０．０１μＭ〜１０μＭの範囲であり、特に０．０５μＭ〜１μＭの範囲が好ましい。さらに、反応液中には増幅反応の安定化等を目的とした添加物を共存させることができ、それぞれ最終濃度として０．１％以下のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１０％以下のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、４ｍＭ以下のプトレスシン２塩酸塩あるいは０．０１％以下のプロピレンジアミンを添加してもよい。この他、ＮＭＰ（１−メチル−２−ピロロリジノン）、グリセロール、ポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシドおよび／またはホルムアミドを含んでもよく、これらの有機溶媒の添加により、オリゴヌクレオチドの非特異的なアニーリングが軽減されることが期待される。
エンドヌクレアーゼを使用する場合は、例えば、大腸菌由来のＲＮａｓｅＨならば、反応液量５０μｌ当たり３〜２００Ｕの範囲が好ましく、特に１５Ｕ〜６０Ｕの範囲が好適である。同様に、ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカエオグロバス属細菌由来ＲＮａｓｅＨならば、反応液量５０μｌあたり３〜２００Ｕの範囲、さらに好ましくは５〜５０Ｕの範囲である。また、ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、ＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）ならば、反応液量５０μｌ当たり０．５Ｕ〜１００Ｕの範囲、特に１Ｕ〜２２Ｕの範囲が好ましい。
本発明においてエンドヌクレアーゼとＤＮＡポリメラーゼを組み合わせる場合、特に限定はされないが、例えば大腸菌由来、ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカエオグロバス属細菌由来のＲＮａｓｅＨ及びＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼの組み合わせが好適である。さらに、上記エンドヌクレアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼはいずれもその種類によって好適に使用できるユニット数が異なる場合が予想される。その際には、検出感度の向上あるいは増幅産物量を指標にして、使用されるバッファーの組成ならびに酵素の添加量を調整すればよい。いずれの場合においても、使用する酵素の種類にあわせて反応バッファーの組成等を至適化するのは当然のことである。【００５０】
本発明の組成物及びキットは、ＶＮＴＲの反復単位の配列中にＳＮＰが存在が疑われる多型を有するあらゆる遺伝子の多型の検出方法に使用できる。特に限定はされないが、例えば、チミジル酸合成酵素（Ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ：ＴＳ）遺伝子の５’ＵＴＲ領域の多型を検出する場合、本発明の組成物及びキットは、２８塩基からなるＶＮＴＲの反復単位（配列番号７）の配列中に存在するＳＮＰ（１２番目の塩基のＣとＧ）を識別する標識オリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も上流にある反復配列と該配列に隣接するその上流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も下流にある反復配列と該配列に隣接するその下流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する。【００５１】
ＴＳ遺伝子の５’ＵＴＲ領域の多型を検出するための組成物及びキットの場合、特に限定はされないが、例えば、ＶＮＴＲの反復単位の配列中のＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチドのうち、ＧのＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチドとして、５’末端がＦＡＭ、３’末端がＥｃｌｉｐｓｅで標識された配列番号１記載の配列を有するオリゴヌクレオチド、ＣのＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチドとして、５’末端がＨＥＸ、３’末端がＥｃｌｉｐｓｅで標識された配列番号２記載の配列を有するオリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も上流にある反復配列と該配列に隣接するその上流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとして、３’末端がアミノ化により修飾された配列番号３又は１２記載の配列を有するオリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も下流にある反復配列と該配列に隣接するその下流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとして、３’末端がアミノ化により修飾された配列番号４、１３又は１４記載の配列を有するオリゴヌクレオチドが好適である。【００５２】
さらに、本発明の組成物及びキットは、ＴＳ遺伝子の５’ＵＴＲ領域の核酸を増幅するためのプライマーを含有していてもよく、特に限定はされないが、例えば、配列番号５記載の配列を有するプライマー、配列番号６記載の配列を有するプライマーを含有していても良い。
【実施例】
【００５３】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
また、本明細書に記載の操作のうち、基本的な操作については２００１年、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー  クローニング：ア  ラボラトリー  マニュアル第３版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．）に記載の方法によった。【００５４】
実施例１  ＴＳ  ５’−ＵＴＲ  ＶＮＴＲ／ＳＮＰの検出
５’末端をＦＡＭ、３’末端をｅｃｌｉｐｓｅ（エポック  バイオサイエンス）により標識したオリゴヌクレオチドＶＮ２Ｇ（配列番号１）、５’末端をＨＥＸ、３’末端をｅｃｌｉｐｓｅにより標識したオリゴヌクレオチドＶＮ２Ｃ（配列番号２）、オリゴヌクレオチドＶＮ１（配列番号３）、オリゴヌクレオチドＶＮ３（配列番号４）、プライマー１Ｆ（配列番号５）、プライマー２Ｒ（配列番号６）をＤＮＡ合成機を用いて作製した。
検出系を評価するために、３ＲＧ３ＲＧ（すなわち、対立遺伝子がいずれも３ＲＧ、以下同様）、２ＲＧ３ＲＧ、２ＲＣ３ＲＧ、３ＲＧ３ＲＣ、２ＲＣ３ＲＣ、２ＲＧ３ＲＣ、３ＲＣ３ＲＣ、２ＲＧ２ＲＣ、２ＲＣ２ＲＣの遺伝子型を有する標準ゲノムＤＮＡを用いた。標準ゲノムＤＮＡは、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３年、ｖｏｌ．６３、ｐ．６００４−７（非特許文献５）の方法に従って、インフォームドコンセントの得られたヒト血液より調製し、ＨａｅＩＩＩを用いたＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によりＴＳ  ５’ＵＴＲのＶＮＴＲ／ＳＮＰのジェノタイプを決定した。配列番号８記載に３ＲＧ、配列番号９記載に３ＲＣ、配列番号１０記載に２ＲＧ、配列番号１１記載に２ＲＣのＶＮＴＲ／ＳＮＰ領域の配列を示す。
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（Ｔｌｉ）由来のリボヌクレアーゼＨを国際公開第０２／２２８３１号パンフレット記載の方法で調製した。【００５５】
ＧＣ  ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（タカラバイオ）、０．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、０．２μＭ  ｐｒｉｍｅｒ  １Ｆ、０．２μＭ  ｐｒｉｍｅｒ  ２Ｒ、０．１μＭ  ＶＮ２Ｇ、０．１μＭ  ＶＮ２Ｃ、１．６μＭ  ＶＮ１、１．６μＭ  ＶＮ３、１％  ＲＯＸ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｄｙｅ（インビトロジェン）、１．２５Ｕ  ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ）、５０Ｕ  Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  ＩＩ（タカラバイオ）、１００ｎｇ  標準ゲノムＤＮＡからなる２５μｌの増幅反応液を作成した。ＡＢＩ７５００  ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、ＰＣＲ増幅および検出を行った。ＰＣＲ反応条件は、９５℃、１５秒、６０℃、４０秒、７２℃、３０秒のサイクルを４５サイクル行った。ＡＢＩ７５００  ｓｙｓｔｅｍによりＦＡＭおよびＨＥＸの蛍光を測定した。その結果を図１に示す。図１は各遺伝子型について、縦軸にＶＮ２ＧによるＦＡＭの蛍光シグナルを、横軸にＶＮ２ＣによるＨＥＸの蛍光シグナルをプロットした図を示す。その結果、３ＲＧ３ＲＧ（図中３Ｇ３Ｇ）、２ＲＧ３ＲＧ（図中２Ｇ３Ｇ）、２ＲＣ３ＲＧ（図中２Ｃ３Ｇ）の３ＲＧを有する遺伝子型ではＶＮ２ＧによるＦＡＭの蛍光シグナルの上昇が検出され、ＶＮ２ＣによるＨＥＸの蛍光シグナルの上昇は認められなかった。２ＲＣ３ＲＣ（図中２Ｃ３Ｃ）、２ＲＧ３ＲＣ（図中２Ｇ３Ｃ）、３ＲＣ３ＲＣ（図中３Ｃ３Ｃ）の３ＲＣを有する遺伝子型では、ＶＮ２ＣによるＨＡＭの蛍光シグナルの上昇が検出され、ＶＮ２ＧによるＦＡＭの蛍光シグナルの上昇は認められなかった。また、３ＲＧ３ＲＣ（図中３Ｇ３Ｃ）の遺伝子型では、両方のオリゴヌクレオチドによるＦＡＭおよびＨＥＸの蛍光の上昇が認められた。２ＲＧ２ＲＣ（図中２Ｇ２Ｃ）および２ＲＣ２ＲＣ（図中２Ｃ２Ｃ）の３Ｒの遺伝子型を有しない遺伝子型では、両方の蛍光シグナルともに上昇は認められなかった。図１に示すとおり、本方法により、ＴＳ  ５’−ＵＴＲ  ＶＮＴＲ／ＳＮＰの３ＲＧおよび３ＲＣの遺伝子型を明確に判定することができた。【００５６】
実施例２  ＴＳ  ５’−ＵＴＲ  ＶＮＴＲ／ＳＮＰの検出感度
本方法による３ＲＧの検出感度を求めるために、３ＲＧ３ＲＧの遺伝子型を有するゲノムＤＮＡを３ＲＣ３ＲＣの遺伝子型を有するゲノムＤＮＡで希釈し、１００、５０、２５、１０、５％の３ＲＧ３ＲＧゲノム溶液を作成した。これらを実施例１と同様の方法により、ロータージーン２０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を用いて３ＲＧの検出を行った。その結果を図２に示す。図２に示すとおり、５％  ３ＲＧ３ＲＧゲノム溶液においてもＶＮ２ＧによるＦＡＭの蛍光シグナルの上昇が検出され、１００％  ３ＲＣ３ＲＣ（図２の０％）のゲノム溶液と比較して優位に高い蛍光シグナルが得られた。したがって、本方法は、５％の３ＲＧゲノムの混入でも検出可能な高感度な検出系であることが示された。【００５７】
実施例３  オリゴヌクレオチドの検討
実施例１におけるＶＮ１の代わりにＶＮ１．２（配列番号１２）、ＶＮ３の代わりにＶＮ３．２（配列番号１３）、ＶＮ３．３（配列番号１４）を使用し、実施例１と同様の実験を行った。その結果、実施例１と同様に遺伝子型の判定をすることができた。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明により、ＶＮＴＲとＳＮＰのタイピングを同時に、簡便かつ高感度に検出する方法および該方法に使用するキットを提供される。
【配列表フリーテキスト】
【００５９】
SEQ ID NO:1: Chimeric oligonucleotide designated as VN2G. "nucleotide 4 is ribonucleotide-other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO:2: Chimeric oligonucleotide designated as VN2C. "nucleotide 4 is ribonucleotide-other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO:3: Oligonucleotide designated as VN1.
SEQ ID NO:4: Oligonucleotide designated as VN3.
SEQ ID NO:5: Oligonucleotide primer designated as 1F.
SEQ ID NO:6: Oligonucleotide primer designated as 2R.
SEQ ID NO:12: Oligonucleotide designated as VN1.2.
SEQ ID NO:13: Oligonucleotide designated as VN3.2.
SEQ ID NO:14: Oligonucleotide designated as VN3.3.
【図１】
2006070666.tif 000002
【図２】
2006070666.tif 000003
【図３】
2006070666.tif 000004
【配列表】
2006070666000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年4月12日(2007.4.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的の核酸における反復配列多型（ＶＮＴＲ）の検出と当該ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）の検出を同時に行うことを特徴とする多型の検出方法であって、多型の検出を行う標的の核酸と少なくとも以下の３つのオリゴヌクレオチドとを同時にハイブリダイズさせる工程を包含する検出方法：
（１）ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチド、
（２）反復配列の中で最も上流にある反復配列と該配列に隣接するその上流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
（３）反復配列の中で最も下流にある反復配列と該配列に隣接するその下流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
多型の検出を行う標的の核酸の増幅反応と同時にハイブリダイゼーションを行う請求項１記載の多型の検出方法。
【請求項３】
以下の工程：
（１）ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も上流にある反復配列と該配列に隣接するその上流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も下流にある反復配列と該配列に隣接するその下流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる３つのオリゴヌクレオチド、多型の検出を行う標的の核酸を含有すると思われる試料、多型の検出を行う標的の核酸を増幅するためのプライマー、を含有する反応溶液を調製する工程；
（２）工程（１）で調製した反応溶液を、多型の検出を行う標的の核酸を増幅する反応に供する工程；および
（３）増幅反応の過程および／または反応後の反応溶液中の標識オリゴヌクレオチド由来の信号を検出する工程；
を包含する標的の核酸におけるＶＮＴＲの検出と当該ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰの検出を同時に行うことを特徴とする多型の検出方法。
【請求項４】
多型の検出を行う標的の核酸がチミジル酸合成酵素（ＴＳ）遺伝子の５’非翻訳領域に相当する核酸である、請求項１〜３のいずれか１項記載の多型の検出方法。
【請求項５】
配列表の配列番号１及び２記載のオリゴヌクレオチドからなる群、配列番号３及び１２記載のオリゴヌクレオチドからなる群、および配列番号４、１３及び１４記載のオリゴヌクレオチドからなる群よりそれぞれ少なくとも１つずつ選択されるオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする、請求項４記載の多型の検出方法。
【請求項６】
標的の核酸におけるＶＮＴＲの検出と当該ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰの検出を同時に行う多型の検出方法に使用される組成物であって、ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も上流にある反復配列と該配列に隣接するその上流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も下流にある反復配列と該配列に隣接するその下流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する組成物。
【請求項７】
ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も上流にある反復配列と該配列に隣接するその上流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、および反復配列の中で最も下流にある反復配列と該配列に隣接するその下流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号１及び２記載のオリゴヌクレオチドからなる群、配列番号３及び１２記載のオリゴヌクレオチドからなる群、および配列番号４、１３及び１４記載のオリゴヌクレオチドからなる群よりそれぞれ少なくとも１つずつ選択されるオリゴヌクレオチドである請求項６記載の組成物。
【請求項８】
標的の核酸におけるＶＮＴＲの検出と当該ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰの検出を同時に行う多型の検出方法に使用されるキットであって、ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も上流にある反復配列と該配列に隣接するその上流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も下流にある反復配列と該配列に隣接するその下流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有するキット。
【請求項９】
ＶＮＴＲの反復単位配列中に存在するＳＮＰを識別する標識オリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も上流にある反復配列と該配列に隣接するその上流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、反復配列の中で最も下流にある反復配列と該配列に隣接するその下流の配列との境界領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが、それぞれ配列表の配列番号１及び２記載のオリゴヌクレオチドからなる群、配列番号３及び１２記載のオリゴヌクレオチドからなる群、および配列番号４、１３及び１４記載のオリゴヌクレオチドからなる群よりそれぞれ少なくとも１つずつ選択されるオリゴヌクレオチドである請求項８記載のキット。
【国際調査報告】
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