(57)【要約】本発明は、幹細胞自己複製促進剤、癌の予防薬、組織破壊を伴う疾患もしくは組織不全の予防薬もしくは治療薬、該幹細胞自己複製促進剤を添加してなる幹細胞培養用培地、該培地で培養した幹細胞、幹細胞の製造方法または造血幹細胞自己複製促進剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。  本発明によれば、幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質を有効成分として含有する幹細胞自己複製促進剤、癌の予防薬、組織破壊を伴う疾患もしくは組織不全の予防もしくは治療薬、該幹細胞自己複製促進剤を添加してなる幹細胞培養用培地、該培地で培養した幹細胞、幹細胞の製造方法または造血幹細胞自己複製促進剤のスクリーニング方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質を有効成分として含有する幹細胞自己複製促進剤。
【請求項２】
幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質が、抗酸化作用を有する物質である、請求項１記載の幹細胞自己複製促進剤。
【請求項３】
抗酸化作用を有する物質が、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＥ、カロテノイド、ユビキノン、システインのＮ−アシル誘導体、システインを少なくとも一つ含むジペプチドまたはトリペプチド、ポリフェノール類、クルクミン、およびテトラヒドロクルクミンからなる群から選ばれる少なくとも一つの物質である、請求項２記載の幹細胞自己複製促進剤。
【請求項４】
幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質が、該幹細胞に抗酸化酵素の発現を誘導および／または該抗酸化酵素の活性を増強する能力を有する物質である、請求項１記載の幹細胞自己複製促進剤。
【請求項５】
抗酸化酵素が、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオンリダクターゼおよびスーパーオキシドジスムターゼからなる群から選ばれる酵素である、請求項４記載の幹細胞自己複製促進剤。
【請求項６】
抗酸化酵素の発現を誘導および／または該抗酸化酵素の活性を増強する能力を有する物質が、該抗酸化酵素をコードする遺伝子を導入した遺伝子治療用ベクターである、請求項４または５に記載の幹細胞自己複製促進剤。
【請求項７】
抗酸化酵素の発現を誘導および／または該抗酸化酵素の活性を増強する能力を有する物質がメラトニンである、請求項４または５に記載の幹細胞自己複製促進剤。
【請求項８】
幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質が、該幹細胞にアタキシア・テランジエクタシア・ミューテイティッド（Ａｔａｘｉａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ  ｍｕｔａｔｅｄ、以下「ＡＴＭ」という。）蛋白質の発現を誘導および／またはＡＴＭ蛋白質の活性を増強する能力を有する物質である、請求項１記載の幹細胞自己複製促進剤。
【請求項９】
ＡＴＭ蛋白質の発現を誘導および／またはＡＴＭ蛋白質の活性を増強する能力を有する物質が、ＡＴＭを導入した遺伝子治療用ベクターである、請求項８記載の幹細胞自己複製促進剤。
【請求項１０】
幹細胞内の活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性を有する物質がｐ３８ＭＡＰＫの阻害剤である、請求項１記載の幹細胞自己複製促進剤。
【請求項１１】
ｐ３８ＭＡＰＫの阻害剤がＳＢ２０３５８０、ＳＢ２０２１９０、ＦＲ１６７６５３およびＢＩＲＢ７９６ＢＳからなる群から選ばれる少なくとも一つの物質である、請求項１０記載の幹細胞自己複製促進剤。
【請求項１２】
幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質を有効成分として含有する癌の予防薬。
【請求項１３】
幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質を有効成分として含有する、組織破壊を伴う疾患または組織不全の予防薬または治療薬。
【請求項１４】
幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質と、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）阻害剤、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）からなる群より選ばれる少なくとも一つとを有効成分として含有する、組織破壊を伴う疾患または組織不全の予防薬または治療薬。
【請求項１５】
組織が、赤血球、白血球、血小板、繊維芽細胞、脂肪細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、ニューロン、グリア、オリゴデンドロサイト、血管内皮細胞、皮膚表皮細胞、皮膚真皮細胞、毛胞細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、気管上皮細胞、肺胞細胞、消化管上皮細胞、口腔上皮、エナメル芽細胞、ゾウゲ芽細胞、肝細胞、クッパー細胞、胆嚢上皮細胞、膵臓内分泌細胞、膵臓外分泌細胞、腎臓尿細管細胞、腎糸球体細胞、尿管上皮細胞、尿路上皮細胞、下垂体内分泌細胞、甲状腺細胞、副腎皮質細胞、副腎髄質細胞、前立腺細胞、乳腺細胞、視細胞、色素上皮細胞、角膜細胞、涙腺細胞および鼓膜細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種類の細胞を含む組織である、請求項１３または１４に記載の予防薬または治療薬。
【請求項１６】
幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質が、抗酸化作用を有する物質である、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の予防薬または治療薬。
【請求項１７】
抗酸化作用を有する物質が、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＥ、カロテノイド、ユビキノン、システインのＮ−アシル誘導体、システインを少なくとも一つ含むジペプチドまたはトリペプチド、ポリフェノール、クルクミン、およびテトラヒドロクルクミンからなる群から選ばれる少なくとも一つの物質である、請求項１６に記載の予防薬または治療薬。
【請求項１８】
幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質が、該幹細胞に抗酸化酵素の発現を誘導および／または該抗酸化酵素の活性を増強する能力を有する物質である、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の予防薬または治療薬。
【請求項１９】
抗酸化酵素が、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオンリダクターゼおよびスーパーオキシドジスムターゼからなる群から選ばれる酵素である、請求項１８記載の予防薬または治療薬。
【請求項２０】
抗酸化酵素の発現を誘導および／または該抗酸化酵素の活性を増強する能力を有する物質が、該抗酸化酵素をコードする遺伝子を導入した遺伝子治療用ベクターである、請求項１８または１９に記載の予防薬または治療薬。
【請求項２１】
抗酸化酵素の発現を誘導および／または該抗酸化酵素の活性を増強する能力を有する物質がメラトニンである、請求項１８または１９に記載の予防薬または治療薬。
【請求項２２】
幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質が、該幹細胞にＡＴＭ蛋白質の発現を誘導および／またはＡＴＭ蛋白質の活性を増強する能力を有する物質である、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の予防薬または治療薬。
【請求項２３】
ＡＴＭ蛋白質の発現を誘導および／またはＡＴＭ蛋白質の活性を増強する能力を有する物質が、ＡＴＭを導入した遺伝子治療用ベクターである、請求項２２記載の予防薬または治療薬。
【請求項２４】
幹細胞内の活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性を有する物質がｐ３８ＭＡＰＫの阻害剤である、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の予防薬または治療薬。
【請求項２５】
ｐ３８ＭＡＰＫの阻害剤がＳＢ２０３５８０、ＳＢ２０２１９０、ＦＲ１６７６５３およびＢＩＲＢ７９６ＢＳからなる群から選ばれる少なくとも一つの物質である、請求項２４記載の予防薬または治療薬。
【請求項２６】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の幹細胞自己複製促進剤を添加してなる幹細胞培養用培地。
【請求項２７】
請求項２６記載の培地で培養した幹細胞を含む組織破壊を伴う疾患または組織不全の予防薬または治療薬。
【請求項２８】
被験物質存在下または被験物質非存在下で、ＡＴＭホモ欠失マウス由来の造血幹細胞を含む細胞の自己複製能を測定し、被験物質存在下および被験物質非存在下での該細胞の自己複製能を比較し、被験物質存在下での該自己複製能が被験物質非存在下での該自己複製能よりも増強されている物質を造血幹細胞自己複製促進剤として選択することを特徴とする、造血幹細胞自己複製促進剤のスクリーニング方法。
【請求項２９】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の幹細胞自己複製促進剤の存在下、幹細胞を培養して幹細胞の自己複製を促進させ、該培養物中から幹細胞を採取することを特徴とする、幹細胞の製造方法。
【請求項３０】
幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質を被験体に投与する工程を包含する、組織破壊を伴う疾患または組織不全の予防または治療方法。
【請求項３１】
幹細胞自己複製促進剤の製造のための、幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質の使用。
【請求項３２】
組織破壊を伴う疾患または組織不全の予防薬または治療薬の製造のための、幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、幹細胞自己複製促進剤、癌の予防薬、組織破壊を伴う疾患または組織不全の予防薬または治療薬、該幹細胞自己複製促進剤を添加してなる幹細胞培養用培地、該培地で培養した幹細胞、幹細胞の製造方法および造血幹細胞自己複製促進剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  成体組織中の細胞は細胞自身の寿命、物理的な傷害、感染など様々な原因により失われる。そのため、生体には細胞死に伴い細胞新生を引き起こす仕組みが存在する。このような細胞新生は、各組織や骨髄に存在する幹細胞により担われている。造血幹細胞は、毎日数千億個の様々な血液系の細胞を産生しつつも、一生の間枯渇しないことから、幹細胞は多分化能を有すると同時に幹細胞が幹細胞を産み出すという自己複製能を持つと考えられている。このような幹細胞システムにより産生される細胞群には、血液細胞以外に、皮膚上皮細胞、角膜上皮、神経系細胞、肺胞上皮細胞、気管上皮細胞、消化管粘膜細胞、肝細胞、膵内分泌・外分泌細胞、唾液腺細胞、血管、骨格筋や骨などの間葉系組織、腎尿細管上皮細胞、腎糸球体細胞、精巣生殖細胞などがある。【０００３】  成体の幹細胞が完全な自己複製能を有するとするならば、幹細胞は加齢に伴ってその機能を変化させることはないはずである。しかし細胞新生の障害を原因とする臓器不全や癌は加齢に比例して増加することが知られており、これは幹細胞の老化が原因と考えられている（非特許文献１〜３参照）。【０００４】  細胞の老化に関する最初の重要な発見は、１９６１年にＨａｙｆｌｉｃｋにより観察された“分裂老化”である（非特許文献４参照）。分裂老化とは、正常細胞が限られた回数の分裂を終えると細胞分裂を停止するという現象である。細胞分裂を停止した細胞は、その形態を大きく変化させ、最終的には細胞死が誘導される。このような分裂老化の分子メカニズムとして、染色体の末端のテロメアの短縮が原因であることが示されている（非特許文献５参照）。【０００５】  血管拡張性運動失調症（Ａｔａｘｉａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ、Ａ−Ｔ）は、進行性の小脳性運動失調、眼球粘膜や皮膚の毛細管拡張症と易感染性を呈し、また高率な悪性腫瘍の合併を特徴としている（非特許文献６参照）。Ａ−Ｔは常染色体劣性遺伝で男女に発症する。また、Ａ−ＴではＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥの低下と多糖体抗原に対する抗体産生の低下、Ｔ細胞数の低下、機能不全が認められる。さらに、細胞の放射線高感受性、ＤＮＡ修復能や細胞周期監視機構にも欠陥が観察されている。【０００６】  Ａ−Ｔの原因遺伝子（ＡＴＭ）欠失マウスとテロメアーゼ遺伝子欠失マウスを掛け合わせたマウスでは、テロメアの顕著な欠失が観察され、幹細胞のプールが減少することが報告されている（非特許文献７参照）。しかし幹細胞は、通常テロメアの短縮を防ぐためにテロメアーゼを発現していることから、テロメアーゼ遺伝子を欠失していない個体における幹細胞の老化をテロメアの短縮で説明するのは困難である（非特許文献８参照）。実際、幹細胞の老化と幹細胞のテロメア長の間には相関がないことが観察されている。【０００７】  一方、細胞老化のもう一つの仮説として“ストレス誘導老化”が提唱されている。これは分裂加齢のようにプログラムされた加齢とは異なり、細胞が長期間ストレスに暴露される環境下にいると、これらストレスにより誘導されるＤＮＡの障害が蓄積し、細胞の老化が起こるという仮説である（非特許文献９参照）。細胞に対するストレスには、酸化ストレス、紫外線、化学物質な���が考えられている。線虫において、インスリン／ＩＧＦ−Ｉシグナル経路の変異がフォークヘッド転写因子の活性化によりスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）などの抗酸化酵素の転写を促進し寿命を延ばすことが観察されていることから、酸化ストレスは特に加齢との関係で注目されている（非特許文献１０参照）。細胞内で活性酸素が最も多く産生されるのはミトコンドリアの電子伝達系であり、ヒトなどの哺乳類では、骨格筋や肝臓などが活性酸素の産生の中心を担うと考えられている。また慢性炎症に伴うマクロファージからの継続的な活性酸素の暴露も、細胞の老化を促進すると考えられている。これら活性酸素は細胞を老化に導くだけではなく、ＤＮＡの障害により癌遺伝子を活性化し幹細胞に老化の代わりに癌化を誘導すると考えられている。しかし、骨髄の幹細胞では骨格筋や肝臓由来の活性酸素や炎症に伴うマクロファージ由来の活性酸素に暴露される可能性は低く、“ストレス誘導老化”で幹細胞の老化を説明することは難しい。
【非特許文献１】「ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲイション（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」、２００４年、第１１３巻、ｐ．４−７
【非特許文献２】「ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲイション（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」、２００４年、第１１３巻、ｐ．１６−１６８
【非特許文献３】「ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲイション（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」、２００４年、第１１３巻、ｐ．１７５−１７９
【非特許文献４】「エクスペリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９６１年、第２５巻、ｐ．５８５−６２１
【非特許文献５】「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、１９９０年、第３４５巻、ｐ．４５８−４６０
【非特許文献６】「ネイチャー・レヴューズ・キャンサー・ジャーナル（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ）」、２００３年、第３巻、ｐ．１５５−１６８
【非特許文献７】「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、２００３年、第４２１巻、ｐ．６４３−６４８
【非特許文献８】「ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲイション（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」、２００４年、第１１３巻、ｐ．４−７
【非特許文献９】「フィジオロジカル・レヴューズ（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ）」、２００２年、第８２巻、ｐ．４７−９５
【非特許文献１０】「トレンド・イン・バイオケミカル・サイエンシズ（Ｔｒｅｎｄ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、２００２年、第２７巻、ｐ．３５２−３６０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】  本発明は、幹細胞自己複製促進剤、癌の予防薬、組織破壊を伴う疾患もしくは組織不全の予防薬もしくは治療薬、該幹細胞自己複製促進剤を添加してなる幹細胞培養用培地、該培地で培養した幹細胞、幹細胞の製造方法または造血幹細胞自己複製促進剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】  本発明は以下の（１）〜（３２）に関する。
（１）幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質を有効成分として含有する幹細胞自己複製促進剤。
（２）幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質が、抗酸化作用を有する物質である、上記（１）記載の幹細胞自己複製促進剤。
（３）抗酸化作用を有する物質が、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＥ、カロテノイド、ユビキノン、システインのＮ−アシル誘導体、システインを少なくとも一つ含むジペプチドまたはトリペプチド、ポリフェノール類、クルクミン、およびテトラヒドロクルクミンからなる群から選ばれる少なくとも一つの物質である、上記（２）記載の幹細胞自己複製促進剤。
（４）幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質が、該幹細胞に抗酸化酵素の発現を誘導および／または該抗酸化酵素の活性を増強する能力を有する物質である、上記（１）記載の幹細胞自己複製促進剤。
（５）抗酸化酵素が、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオンリダクターゼおよびスーパーオキシドジスムターゼからなる群から選ばれる酵素である、上記（４）記載の幹細胞自己複製促進剤。
（６）抗酸化酵素の発現を誘導および／または該抗酸化酵素の活性を増強する能力を有する物質が、該抗酸化酵素をコードする遺伝子を導入した遺伝子治療用ベクターである、上記（４）または（５）に記載の幹細胞自己複製促進剤。
（７）抗酸化酵素の発現を誘導および／または該抗酸化酵素の活性を増強する能力を有する物質がメラトニンである、上記（４）または（５）に記載の幹細胞自己複製促進剤。
（８）幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質が、該幹細胞にアタキシア・テランジエクタシア・ミューテイティッド（Ａｔａｘｉａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ  ｍｕｔａｔｅｄ、以下「ＡＴＭ」という。）蛋白質の発現を誘導および／またはＡＴＭ蛋白質の活性を増強する能力を有する物質である、上記（１）記載の幹細胞自己複製促進剤。
（９）ＡＴＭ蛋白質の発現を誘導および／またはＡＴＭ蛋白質の活性を増強する能力を有する物質が、ＡＴＭを導入した遺伝子治療用ベクターである、上記（８）記載の幹細胞自己複製促進剤。
（１０）幹細胞内の活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性を有する物質がｐ３８ＭＡＰＫの阻害剤である、上記（１）記載の幹細胞自己複製促進剤。
（１１）ｐ３８ＭＡＰＫの阻害剤がＳＢ２０３５８０、ＳＢ２０２１９０、ＦＲ１６７６５３およびＢＩＲＢ７９６ＢＳからなる群から選ばれる少なくとも一つの物質である、上記（１０）記載の幹細胞自己複製促進剤。
（１２）幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質を有効成分として含有する癌の予防薬。
（１３）幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質を有効成分として含有する、組織破壊を伴う疾患または組織不全の予防薬または治療薬。
（１４）幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質と、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）阻害剤、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）からなる群より選ばれる少なくとも一つとを有効成分として含有する、組織破壊を伴う疾患または組織不全の予防薬または治療薬。
（１５）組織が、赤血球、白血球、血小板、繊維芽細胞、脂肪細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、ニューロン、グリア、オリゴデンドロサイト、血管内皮細胞、皮膚表皮細胞、皮膚真皮細胞、毛胞細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、気管上皮細胞、肺胞細胞、消化管上皮細胞、口腔上皮細胞、エナメル芽細胞、ゾウゲ芽細胞、肝細胞、クッパー細胞、胆嚢上皮細胞、膵臓内分泌細胞、膵臓外分泌細胞、腎臓尿細管細胞、腎糸球体細胞、尿管上皮細胞、尿路上皮細胞、下垂体内分泌細胞、甲状腺細胞、副腎皮質細胞、副腎髄質細胞、前立腺細胞、乳腺細胞、視細胞、色素上皮細胞、角膜細胞、涙腺細胞および鼓膜細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種類の細胞を含む組織である、上記（１３）または（１４）に記載の予防薬または治療薬。
（１６）幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質が、抗酸化作用を有する物質である、上記（１２）〜（１５）のいずれか１項に記載の予防薬または治療薬。
（１７）抗酸化作用を有する物質が、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＥ、カロテノイド、ユビキノン、システインのＮ−アシル誘導体、システインを少なくとも一つ含むジペプチドまたはトリペプチド、ポリフェノール類、クルクミン、およびテトラヒドロクルクミンからなる群から選ばれる少なくとも一つの物質である、上記（１６）に記載の予防薬または治療薬。
（１８）幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質が、該幹細胞に抗酸化酵素の発現を誘導および／または該抗酸化酵素の活性を増強する能力を有する物質である、上記（１２）〜（１５）のいずれか１項に記載の予防薬または治療薬。
（１９）抗酸化酵素が、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオンリダクターゼおよびスーパーオキシドジスムターゼからなる群から選ばれる酵素である、上記（１８）記載の予防薬または治療薬。
（２０）抗酸化酵素の発現を誘導および／または該抗酸化酵素の活性を増強する能力を有する物質が、該抗酸化酵素をコードする遺伝子を導入した遺伝子治療用ベクターである、上記（１８）または（１９）に記載の予防薬または治療薬。
（２１）抗酸化酵素の発現を誘導および／または該抗酸化酵素の活性を増強する能力を有する物質がメラトニンである、上記（１８）または（１９）に記載の予防薬または治療薬。
（２２）幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質が、該幹細胞にＡＴＭ蛋白質の発現を誘導および／またはＡＴＭ蛋白質の活性を増強する能力を有する物質である、上記（１２）〜（１５）のいずれか１項に記載の予防薬または治療薬。
（２３）ＡＴＭ蛋白質の発現を誘導および／またはＡＴＭ蛋白質の活性を増強する能力を有する物質が、ＡＴＭを導入した遺伝子治療用ベクターである、上記（２２）記載の予防薬または治療薬。
（２４）幹細胞内の活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性を有する物質がｐ３８ＭＡＰＫの阻害剤である、上記（１２）〜（１５）のいずれか１項に記載の予防薬または治療薬。
（２５）ｐ３８ＭＡＰＫの阻害剤がＳＢ２０３５８０、ＳＢ２０２１９０、ＦＲ１６７６５３およびＢＩＲＢ７９６ＢＳからなる群から選ばれる少なくとも一つの物質である、上記（２４）記載の予防薬または治療薬。
（２６）上記（１）〜（１１）のいずれか１項に記載の幹細胞自己複製促進剤を添加してなる幹細胞培養用培地。
（２７）上記（２６）記載の培地で培養した幹細胞を含む組織破壊を伴う疾患または組織不全の予防薬または治療薬。
（２８）被験物質存在下または被験物質非存在下で、ＡＴＭホモ欠失マウス由来の造血幹細胞を含む細胞の自己複製能を測定し、被験物質存在下および被験物質非存在下での該細胞の自己複製能を比較し、被験物質存在下での該自己複製能が被験物質非存在下での該自己複製能よりも増強されている物質を造血幹細胞自己複製促進剤として選択することを特徴とする、造血幹細胞自己複製促進剤のスクリーニング方法。
（２９）上記（１）〜（１１）のいずれか１項に記載の幹細胞自己複製促進剤の存在下、幹細胞を培養して幹細胞の自己複製を促進させ、該培養物中から幹細胞を採取することを特徴とする、幹細胞の製造方法。
（３０）幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質を被験体に投与する工程を包含する、組織破壊を伴う疾患または組織不全の予防または治療方法。
（３１）幹細胞自己複製促進剤の製造のための、幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質の使用。
（３２）組織破壊を伴う疾患または組織不全の予防薬または治療薬の製造のための、幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質の使用。
【発明の効果】
【００１０】  本発明により、幹細胞自己複製促進剤、癌の予防薬、組織破壊を伴う疾患もしくは組織不全の予防薬もしくは治療薬、該幹細胞自己複製促進剤を添加してなる幹細胞培養用培地、該培地で培養した幹細胞、幹細胞の製造方法または造血幹細胞自己複製促進剤のスクリーニング方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】１．幹細胞自己複製促進剤
本発明の幹細胞自己複製促進剤は、幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質を有効成分として含有する。【００１２】  幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制および／または産生された活性酸素を消去することにより活性酸素を減少させる活性を有する物質としては、抗酸化作用を有する物質、幹細胞に抗酸化酵素の発現を誘導および／または該抗酸化酵素の活性を増強する能力を有する物質、幹細胞にアタキシア・テランジエクタシア・ミューテイティッド（Ａｔａｘｉａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ  ｍｕｔａｔｅｄ、以下「ＡＴＭ」という。）蛋白質の発現を誘導および／またはＡＴＭ蛋白質の活性を増強する能力を有する物質等をあげることができる。【００１３】  抗酸化作用を有する物質としては、例えば、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＥ、カロテノイド、ユビキノン、システインのＮ−アシル誘導体、システインを少なくとも一つ含むジペプチドまたはトリペプチド、ポリフェノール類、クルクミン、テトラヒドロクルクミン等をあげることができる。
ビタミンＢ１２としては、例えば、塩酸ヒドロキソコバラミン、酢酸ヒドロキソコバラミン、ヒドロキソコバラミン、シアノコバラミン、メチルコバラミン、ニトリトコバラミン、アデノシルコバラミン、アココバラミン等をあげることができる。【００１４】  ビタミンＣとしては、例えば、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸ステアリン酸エステル等をあげることができる。
ビタミンＥとしては、例えば、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、δ−トコフェロール、α−トコトリエノール、β−トコトリエノール、γ−トコトリエノールおよびδ−トコトリエノール、ならびにこれらの酢酸エステル、ニコチン酸エステルおよびリン酸エステル等の誘導体等をあげることができる。【００１５】  カロテノイドとしては、天然物、合成品のいずれであってもよく、例えば、α−カロテン、β−カロテン、γ−カロテン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、リコペン、クリプトキサンチン、クロシン、ロドキサンチン、ルテイン等をあげることができる。また、当該カロテノイドと脂肪酸等とのエステル、例えば、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、ミリスチン酸等とのモノエステルまたはジエステル等を用いることもできる。【００１６】  ユビキノンとしては、ユビキノンの有するイソプレン残基数が１〜１２のものが好適に用いられ、残基数が６〜１２のものがさらに好適に用いられ、残基数が１０のもの（ユビデカレノン）が特に好適に用いられる。
システインのＮ−アシル誘導体としては、Ｎ−アセチルシステインが好ましく用いられる。【００１７】  システインを少なくともひとつ含むジペプチドまたはトリペプチドとしては、グルタチオンが好ましく用いられる。
ポリフェノール類としては、例えば、フラボノイド、タンニン、カフェー酸、カフェー酸誘導体、リグナン類等をあげることができる。
フラボノイドとしては、例えば、フラボン、イソフラボン、フラボノール、フラバノン、フラバン−３−オール、カテキン、オーロン、アントシアニジン、カルコン、ジヒドロカルコン等があげられ、より具体的には、例えば、ケルセチン、ゲニステイン、ルチン、ヘスペリジン、シリマリン、（＋）−カテキン、（−）−エピガロカテキンガレート、（−）−エピカテキン、（−）−エピガロカテキン、（−）−エピカテキンガレート等をあげることができる。
カフェー酸誘導体としては、例えば、３，４−ジカフェオイルキナ酸、３，５−ジカフェオイルキナ酸、４，５−ジカフェオイルキナ酸、３，４，５−トリカフェオイルキナ酸、クロロゲン酸、ロズマリン酸等をあげることができる。
リグナン類としては、例えば、セサミン、セサモリン、セサモール、セサミノール、シザンドリン、デオキシシザンドリン、ゴミシン等をあげることができる。
上記の幹細胞に抗酸化酵素の発現を誘導および／または該抗酸化酵素の活性を増強する能力を有する物質としては、例えば、メラトニン等をあげることができる。また、該抗酸化酵素をコードする遺伝子を導入した遺伝子治療用ベクターを、幹細胞に抗酸化酵素の発現を誘導および／または該抗酸化酵素の活性を増強する能力を有する物質として用いることができる。【００１８】  抗酸化酵素としては、例えば、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオンリダクターゼ、スーパーオキシドジスムターゼ等をあげることができる。
遺伝子治療用ベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター等をあげることができる。【００１９】  レトロウイルスベクターは、ＲＮＡウイルスであるマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ：Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）をベクターとして利用するものである。ＭｏＭＬＶが属するレトロウイルスゲノムの基本構造は、両端に存在するＬＴＲ（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）と、その間に挟まれるｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖおよび５’側のＬＴＲとｇａｇの間のψからなる。レトロウイルスベクターは、Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．１９９５  Ｊａｎ；５１（１）：１２−３０．Ｖｉｌｅ  ＲＧ，Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＳＪ等に記載の方法に従って、遺伝子治療用ベクターとして使用することができる。すなわち、レトロウイルスベクターを作製するには、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖの遺伝子部分は不要であるため、まずその大部分を取り除き、代わりに上記の抗酸化酵素遺伝子のいずれか一つを挿入したベクタープラスミドを構築する（ψ＝パッケージングシグナル配列は残す）。次に該ベクタープラスミドをウイルス蛋白（ｇａｇ、ｐｏｌの遺伝子産物）を発現するように作られたパッケージング細胞株に導入し、該細胞を培養することにより、培養上清中に組換えレトロウイルス（レトロウイルスベクター）が産生される。該培養液中の組換えレトロウイルスは遠心分離により濃縮することができる。【００２０】  一方、アデノウイルスベクターは、レトロウイルスベクターとは異なるＤＮＡウイルスであるアデノウイルスに由来するベクターである。アデノウイルスベクターは、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９  Ｏｃｔ；１０（５）：４４０−７．Ｂｅｎｉｈｏｕｄ  Ｋ，Ｙｅｈ  Ｐ，Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ  Ｍ．等に記載の方法に従って、遺伝子治療用ベクターとして使用することができる。すなわち、アデノウイルスを遺伝子治療用ベクターとして用いるためには、まず約３６ｋｂの大きさの線状二本鎖ＤＮＡかちなるウイルスゲノムのうち、Ｅ１遺伝子領域を削除してそこに上記の抗酸化酵素遺伝子のいずれか一つを挿入した形のコスミドを構築する。該コスミドを、Ｅ１遺伝子領域を複数箇所で切断した親ウイルスＤＮＡと共にＥ１Ａ、Ｅ１Ｂを持続的に発現しているヒト胎児腎由来細胞株（２９３細胞）に導入することにより、該細胞内で相同組換えが起こり、非増殖性の組換えアデノウイルス（アデノウイルスベクター）が産生される。この組換えアデノウイルスベクターは細胞の凍結融解により回収することができる。【００２１】  上記の幹細胞にＡＴＭ蛋白質の発現を誘導および／またはＡＴＭ蛋白質の活性を増強する能力を有する物質としては、例えば、ＡＴＭを導入した遺伝子治療用ベクターをあげることができる。遺伝子治療用ベクターとしては、例えば、上記の遺伝子治療用ベクター等をあげることができる。【００２２】  幹細胞内において、活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性を有する物質としては、例えばｐ３８ＭＡＰＫの阻害剤等をあげることができる。活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系において、ｐ３８ＭＡＰＫは活性酸素による活性化を受け、その結果、幹細胞の自己複製は抑制される。従って、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、ｐ３８ＭＡＰＫの活性化を抑制することにより、該細胞内情報伝達系を抑制する結果、幹細胞の自己複製を促進することができる。【００２３】  ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤としては、ＳＢ２０３５８０（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７２（１８）１２１１６−１２１２１，１９９７）、ＳＢ２０２１９０（ＢＩＯＭＯＬ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ．，Ｉｎｃ．）、ＰＤ１６９３１６（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ＦＲ１６７６５３（Ｎｉｋｋｅｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、ＢＩＲＢ７９６ＢＳ（Ｂｌｏｏｄ  １０１，４４４６−４４４８，２００３）等をあげることができる。また、ｐ３８ＭＡＰＫに対するｓｍａｌｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）等のｐ３８ＭＡＰＫの遺伝子発現の抑制剤を用いてもよい。
本発明の幹細胞自己複製促進剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、幹細胞と接触させたとき、該幹細胞の自己複製を促進させることができる。
幹細胞としては、成体組織に存在する幹細胞（成体幹細胞）であれば特に限定されないが、骨髄、末梢血、皮膚、脂肪組織、骨格筋等に存在する幹細胞が好ましい。【００２４】  上記に記載した、幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質（以下「本発明における物質」ともいう。）は、幹細胞自己複製促進剤として、そのまま単独で用いることも可能であるが、通常は薬理学的に許容される一つまたはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。【００２５】  投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、例えば、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、筋肉内、皮下、皮内もしくは静脈内等の非経口投与等があげられ、好ましくは筋肉内、皮下、皮内、静脈内または気道内投与等があげられる。
投与形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、注射剤、軟膏、テープ剤、ドライパウダー、エアロゾル等の吸入剤等があげられる。【００２６】  錠剤等の固形製剤の製造には、例えば、乳糖等の賦形剤、澱粉等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いることができる。
筋肉内、皮下、皮内、静脈内または気道内投与に適当な製剤としては、例えば、注射剤、噴霧剤等があげられる。【００２７】  注射剤の製造にあたっては、例えば、水、生理食塩水、大豆油等の植物油、溶剤、可溶化剤、等張化剤、保存剤、抗酸化剤等を用いることができる。
また、吸入剤は本発明における物質そのもの、または受容者の口腔及び気道粘膜を刺激せず、かつ該物質を微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。担体としては、例えば、乳糖、グリセリン等があげられる。本発明における物質および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。【００２８】  投与量または投与回数は、目的とする予防または治療効果、投与方法、投与期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり、例えば、ビタミンＢ１２は２０〜２５ｍｇ、ビタミンＣは２００〜１０００ｍｇ、ビタミンＥは４００〜８００ＩＵ、カロテノイドは５〜６０ｍｇ、ユビキノンは３０〜１５０ｍｇ、Ｎ−アセチルシステインは２５０〜１５００ｍｇ、グルタチオンは５００〜１０００ｍｇ、ポリフェノール類は１〜１０００ｍｇ、クルクミン、テトラヒドロクルクミンは１０〜１０００ｍｇ、ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２０２１９０、ＰＤ１６９３１６、ＦＲ１６７６５３、ＢＩＲＢ７９６ＢＳは１００〜１０００μｇをそれぞれ投与するのが好ましい。【００２９】  本発明の幹細胞自己複製促進剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて幹細胞と接触させ、該幹細胞を培養することにより、該幹細胞の自己複製を促進することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで本発明の幹細胞自己複製促進剤を用いる場合、本発明における物質を、該物質を溶解することができる溶液に溶解して用いることが好ましい。該溶液としては、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等をあげることができる。【００３０】  幹細胞を分離できる組織としては、例えば、骨髄、末梢血、皮膚、脂肪組織、骨格筋等があげられる。これらの組織から酵素処理等により分離した細胞からＣＤ４５陰性、グリコホリン−Ａ陰性細胞を選別し、Ｌｏｗ−ＧＬＵＣＯＳＥ  ＤＭＥＭ、ＭＣＤＢ−２０１等を基本培地として、１０μｇ／ｍｌインスリン、５．５μｇ／ｍｌトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌセレニウム、０．５μｇ／ｍｌ牛血清アルブミン、０．０１μｍｏｌ／ｌデキサメタゾン、０．１ｍｍｏｌ／ｌＬ−アスコルビン酸２リン酸、２％牛胎児血清、１０ｎｇ／ｍｌ血小板由来増殖因子、１０ｎｇ／ｍｌ上皮細胞増殖因子、１０ｎｇ／ｍｌインスリン様増殖因子、１０００ＩＵ白血病阻害因子および本発明の物質を含む培地、または１０％の馬血清と本発明の物質を含むＤＭＥＭ培地を用い、５ｎｇ／ｍｌのフィブロネクチンでコートした培養皿の上で培養することにより、幹細胞の自己複製を効率よく行うことができる。【００３１】  上記培養に用いる培地中の本発明における物質の濃度は、培養する細胞の密度により調整することが必要であるが、例えば、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＥ、カロテノイド、ユビキノン、Ｎ−アセチルシステイン、グルタチオン、ポリフェノール類、クルクミン、テトラヒドロクルクミン等であれば１〜５００μｍｏｌ／ｌ、ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２０２１９０、ＰＤ１６９３１６、ＦＲ１６７６５３、ＢＩＲＢ７９６ＢＳ等であれば５０ｎｍｏｌ／ｌ〜１０μｍｏｌ／ｌが好ましい。【００３２】  ｉｎ  ｖｉｔｒｏで自己複製させた幹細���を疾患の予防または治療に用いる場合、用いる機器は完全閉鎖系で培養細胞の濃縮、洗浄、回収処理が可能なものがあげられ、ヘモネティックス社のヘモライト２プラス等を用いて培養細胞を生理食塩水により洗浄し、培養に用いたサイトカイン等の物質をできる限り除去できるものが好ましい。【００３３】２．幹細胞自己複製促進活性の評価方法
本発明の幹細胞自己複製促進剤の幹細胞自己複製促進活性は、例えば以下の方法により評価することができる。【００３４】  すなわち、本発明の幹細胞自己複製促進剤を、幹細胞自己複製能低下非ヒト動物に投与し、該非ヒト動物の幹細胞自己複製能を測定することにより、本発明の幹細胞自己複製促進剤の幹細胞自己複製促進活性を評価することができる。幹細胞自己複製能は、幹細胞自己複製能低下に伴う症状の低減を観察するか、該動物から分離した幹細胞を、本発明の幹細胞自己複製促進剤の存在下で培養し、該幹細胞のコロニー形成能を測定すること等により、測定することができる。【００３５】  幹細胞自己複製能低下非ヒト動物としては、例えば、ＡＴＭホモ欠失マウスを用いることができる。該マウスでは、造血幹細胞の細胞内活性酸素量の上昇により自己複製能が低下する結果、ミエロイド系細胞、リンパ系細胞、エリスロイド系細胞等が顕著に減少しており、造血幹細胞のコロニー形成能は著しく低下している。【００３６】  従って、幹細胞自己複製能低下非ヒト動物としてＡＴＭホモ欠失マウスを用いた場合、本発明の幹細胞自己複製促進剤を該マウスに投与した後、フローサイトメトリー法で上記貧血状態の低減を観察すること等により、本発明の幹細胞自己複製促進剤の幹細胞自己複製促進活性を評価することができる。【００３７】  また、該マウスから回収した骨随細胞や、該骨髄細胞からＦＡＣＳソーター等で分離したｃ−Ｋｉｔ陽性、Ｓｃａ−１陽性およびＬｉｎｅａｇｅ陰性細胞（ＫＳＬ細胞）等、造血幹細胞を含む細胞を、本発明の幹細胞自己複製促進剤の存在下で培養し、メチルセルロース上で形成される幹細胞のコロニー数を計測すること等により、本発明の幹細胞自己複製促進剤の幹細胞自己複製促進活性を評価することができる。【００３８】  また、被験物質存在下または被験物質非存在下で、ＡＴＭホモ欠失マウス由来の造血幹細胞を含む細胞の自己複製能を上記の方法で測定し、被験物質存在下および被験物質非存在下での該細胞の自己複製能を比較し、被験物質存在下での該自己複製能が被験物質非存在下での該自己複製能よりも増強されている物質を造血幹細胞自己複製促進剤として選択することにより、造血幹細胞自己複製促進剤をスクリーニングすることができる。【００３９】３．癌の予防薬、組織破壊を伴う疾患または組織不全の予防薬または治療薬
本発明の幹細胞自己複製促進剤は幹細胞の老化を防ぐ作用があることから、加齢に伴い発症頻度が高まる癌や組織破壊を伴う疾患の予防薬として利用することができる。【００４０】  また、本発明の幹細胞自己複製促進剤は、傷害を受けた組織の幹細胞や骨髄幹細胞の自己複製を促進することで組織修復を促進することから、組織破壊を伴う疾患の治療集として利用することができる。
組織破壊を伴う疾患としては、例えば、神経疾患、循環器系疾患、肝臓疾患、膵臓疾患、消化管系疾患、腎臓疾患、皮膚疾患、肺疾患等があげられる。【００４１】  神経疾患としては、例えば、脳梗塞、脳血管障害、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、脊髄損傷、うつ病、躁鬱病等があげられる。
循環器系疾患としては、例えば、閉塞性血管病、心筋梗塞、心不全、冠動脈疾患等があげられる。
臓疾患としては、例えば、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、アルコール性肝炎、肝硬変、肝不全等があげられる。【００４２】  膵臓疾患としては、例えば、糖尿病、膵炎等があげられる。
消化管系疾患としては、例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎等があげられる。
腎臓疾患としては、例えば、ＩｇＡ腎症、腎炎、腎不全等があげられる。
皮膚疾患としては、例えば、褥瘡、熱傷、縫合創、裂傷、切開創、咬傷、皮膚炎、肥厚性瘢痕、ケロイド、糖尿病性潰瘍、動脈性潰瘍、静脈性潰瘍等があげられる。
肺疾患としては、例えば、肺気腫、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、特発性間質性肺炎（肺線維症）、びまん性肺線維症、結核、喘息等があげられる。【００４３】  また、本発明の幹細胞自己複製促進剤は、成体組織に存在する幹細胞に対して広く自己複製を促進することから、様々な疾患に伴う組織不全の治療薬として用いることができる。すなわち、本発明の幹細胞自己複製促進剤は、組織不全が生じている組織に存在する幹細胞の自己複製を促進することにより、該組織を形成する細胞の新生を促進し、該組織不全を治療することができる。【００４４】  組織不全を伴う疾患としては、例えば、骨髄不全、運動機能障害、循環器系疾患、神経疾患、褥瘡、骨粗しょう症、関節炎、肺疾患、消化管系疾患、歯槽膿漏、肝臓疾患、膵臓疾患、腎臓疾患、内分泌異常、網膜障害、白内障、難聴等をあげることができる。【００４５】  上記組織不全において、本発明の幹細胞自己複製促進剤により新生が促進される細胞としては、例えば、骨髄不全では赤血球、白血球、血小板、運動機能障害では繊維芽細胞、脂肪細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、循環器系疾患では心筋細胞、血管内皮細胞、神経疾患ではニューロン、グリア、オリゴデンドロサイト、褥瘡では皮膚表皮細胞、皮膚真皮細胞、毛胞細胞、骨粗しょう症では骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、関節炎では軟骨細胞、肺疾患では気管上皮細胞、肺胞細胞、消化管系疾患では消化管上皮細胞、歯槽膿漏では口腔上皮細胞、エナメル芽細胞、ゾウゲ芽細胞、肝臓疾患では肝細胞、クッパー細胞、胆嚢上皮細胞、膵臓疾患では膵臓内分泌細胞、膵臓外分泌細胞、腎臓疾患では腎臓尿細管細胞、腎糸球体細胞、尿管上皮細胞、尿路上皮細胞、内分泌異常では下垂体内分泌細胞、甲状腺細胞、副腎皮質細胞、副腎髄質細胞、前立腺細胞、乳腺細胞、網膜障害では視細胞、色素上皮細胞、白内障では角膜細胞、涙腺細胞、難聴では鼓膜細胞等をあげることができる。【００４６】  上記１記載の方法により本発明の幹細胞自己複製促進剤を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで自己複製させた幹細胞は、通常の点滴法で静脈中に注入するか、患部に直接注入することにより、上記各疾患の予防または治療に用いることができる。【００４７】４．本発明の幹細胞自己複製促進剤とＧＳＫ−３阻害剤、ＨＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦとの併用
本発明の幹細胞自己複製促進剤は、幹細胞の増殖と分化を促進するグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）阻害剤および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ならびに幹細胞の動員、増殖、分化を促進する顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）からなる群より選ばれる一つ以上と併用することによって、上記３記載の各種疾患の予防または治療に対する効果を高めることができる。以下、ＧＳＫ−３阻害剤、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦを総称して「併用成分」という。【００４８】  ＧＳＫ−３阻害剤としては、Ｌ８０３−ｍｔｓ（Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．２００４  Ａｐｒ  １５；５５：７８１−４．）、ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ  ｂｉｓ−７−ａｚａｉｎｄｏｌｙｍａｌｅｉｍｉｄｅｓ（Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００４  Ｍａｒ  １；１２：１２３９−５５）、６−ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ−３’−ｏｘｉｍｅ（Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００４  Ｊａｎ；１０：５５−６３．）、１−ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．２００４  Ｊａｎ  １９；１４：４１３−６．）等があげられる。【００４９】  Ｇ−ＣＳＦとしては、例えばナルトグラスチム（商品名ノイアップ、協和発酵工業製）、フィルグラスチム（商品名グラン、三共製；商品名Ｇｒａｎｕｌｏｋｉｎｅ、ホフマン・ラ・ロシュ製；商品名Ｎｅｕｐｏｇｅｎ、アムジェン製）、レノグラスチム（商品名ノイトロジン、中外製薬製；商品名Ｇｒａｎｏｃｙｔｅ、アベンティス製）、ペグフィルグラスチム（商品名Ｎｅｕｌａｓｔａ、アムジェン製）、サルグラモスチム（商品名Ｌｅｕｋｉｎｅ、シェーリング製）等があげられる。また、例えば、ＷＯ００／５１６２６に記載の方法等で、これらのポリペプチドをポリエチレングリコール等で修飾（ＰＥＧ化）したもの等も用いることができる。【００５０】  Ｍ−ＣＳＦとしては、例えば、ミリモスチム（商品名ロイコプロール、協和発酵工業製）等があげられる。
ＧＭ−ＣＳＦとしては、例えば、ロムルチド（商品名ノピア注、第一製薬製）等があげられる。
本発明の幹細胞自己複製促進剤と併用成分は、これらそれぞれの有効成分を含有するように製剤化したものであれば、単剤（合剤）としてでも複数の製剤の組み合わせとしてもよい。製剤の調製方法、投与形態、投与方法等は、上記１と同様にして行うことができる。【００５１】  複数の製剤の組み合わせとして投与する際には、例えば（ａ）幹細胞自己複製促進剤を含有する第一成分と、（ｂ）併用成分を含有する第二成分とを、それぞれ製剤化し、キットを作製し、このキットを用いてそれぞれの成分を同時にまたは時間をおいて、同一対象に対して同一経路または異なった経路で投与することができる。【００５２】  該キットとしては、例えば、保存する際に外部の温度や光による内容物である成分の変性、容器からの化学成分の溶出等がみられない容器であれば材質、形状等は特に限定されない２つ以上の容器（例えばバイアル、バッグ等）と内容物からなり、内容物である上記第一成分と第二成分が別々の経路（例えばチューブ等）または同一の経路を介して投与可能な形態を有するものが用いられる。具体的には、錠剤、注射剤、吸入剤等のキットがあげられる。【００５３】  幹細胞自己複製促進剤と併用成分との好ましい用量比（重量／重量）は、使用する幹細胞自己複製促進剤と併用成分の組み合わせ、併用成分の効力等に応じて適宜調整すればよいが、例えば、１／５００００〜１００／１、好ましくは１／１００００〜２０／１、さらに好ましくは１／１０００〜１０／１の用量比で用いられる。【００５４】  幹細胞自己複製促進剤と併用成分との併用において、投与量または投与回数は、目的とする予防または治療効果、投与方法、期間、年齢、体重等により異なるが、幹細胞自己複製促進剤については上記１記載の用量を、ＧＳＫ−３阻害剤については、通常成人１日当たり０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇを、ＨＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦについては、通常成人１日当たり０．１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇを投与するのが好ましい。【００５５】  以下、試験例により、本発明の幹細胞自己複製促進剤の効果をより具体的に説明する。
試験例１  ＡＴＭホモ欠失マウス造血幹細胞における活性酸素量の上昇と自己複製能の低下
（１）８週齢のＡＴＭホモ欠失マウス造血幹細胞の自己複製能の低下
ＡＴＭホモ欠失マウスは、聖ジュード小児研究病院（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）のピーター・マッキノン博士（Ｄｒ．Ｐｅｔｅｒ  ＭｃＫｉｎｎｏｎ）より入手したＡＴＭヘテロ欠失マウスの雌雄をつがわせることにより得た。対照として、同腹の野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｌｙ５．２）を用いた。【００５６】  ８週齢のＡＴＭホモ欠失マウスおよび野生型マウスを頚椎脱臼により致死させ、７０％エタノールで十分に消毒した後、ハサミとメスを用いて皮膚を切除し、下肢大腿骨および脛骨を取得した。ハサミで両端の骨端部を切除し、ＰＢＳ入りの注射器の針を骨髄内に挿入し、十分量のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を流すことにより骨髄細胞を回収した。【００５７】  回収した骨髄細胞からＦＡＣＳソーターと抗ｃ−Ｋｉｔ抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ社製、２Ｂ８）、抗Ｓｃａ−１抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ社製、Ｄ７）、抗ＣＤ４抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ社製、Ｌ３Ｔ４）、抗ＣＤ８抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ社製、５３−６．７２）、抗Ｂ２２０抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ社製、ＲＡ３−６Ｂ２）、抗ＴＥＲ−１１９抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、抗Ｇｒ−１抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ社製、ＲＢ６−８Ｃ５）および抗Ｍａｃ−１抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ社製、Ｍ１／７０）を用いて、ｃ−Ｋｉｔ陽性、Ｓｃａ−１陽性およびＬｉｎｅａｇｅ陰性細胞（ＫＳＬ細胞）、Ｌｉｎｅａｇｅ陰性細胞ならびにＬｉｎｅａｇｅ陽性細胞を分離した。それぞれの細胞からは全ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成した。ここで、Ｌｉｎｅａｇｅ陰性細胞とは、Ｔ細胞のマーカーであるＣＤ４およびＣＤ８、Ｂ細胞のマーカーであるＢ２２０、赤血球のマーカーであるＴＥＲ−１１９、顆粒球のマーカーであるＧｒ−１、ならびにマクロファージのマーカーであるＭａｃ−１のすべてについて陰性である細胞を意味し、Ｌｉｎｅａｇｅ陽性細胞とはこれらのマーカーのいずれか一つ以上が陽性である細胞を意味する。【００５８】  野生型マウス由来のＫＳＬ細胞、Ｌｉｎｅａｇｅ陰性細胞、Ｌｉｎｅａｇｅ陽性細胞について、ＡＴＭ遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲで解析した結果、ＡＴＭ遺伝子のｍＲＮＡは、造血幹細胞が濃縮されているＫＳＬ細胞で強く検出され、Ｌｉｎｅａｇｅ陰性細胞ではほとんど検出されず、またＬｉｎｅａｇｅ陽性細胞では全く検出されなかった。この結果から、ＡＴＭは造血幹細胞で機能していることが示唆された。【００５９】  次に、ＡＴＭを欠失した造血幹細胞の骨髄再構築能を解析するために、競合的骨髄再構築試験を行った。すなわち、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｌｙ５．２）もしくはＡＴＭホモ欠失マウス（Ｌｙ５．２）の骨髄由来単核細胞５×１０５個またはＫＳＬ細胞２，０００個を、コンペテイターとなるＣ５７ＢＬ／６−Ｌｙ５．１／５．２マウスまたはＣ５７ＢＬ／６−Ｌｙ５．１マウスの骨髄由来単核細胞５×１０５個と一緒に、致死量の放射線を照射したＣ５７ＢＬ／６−Ｌｙ５．１マウスに移植した。移植１ヶ月後および４ヵ月後に、Ｌｙ５．２ドナー由来のミエロイド系およびリンパ系細胞の割合を、抗Ｌｙ５．２抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ���製）、抗Ｌｙ５．１抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、抗ＣＤ３抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、抗Ｂ２２０抗体、抗Ｍａｃ−１抗体および抗Ｇｒ−１抗体で染色することにより、造血幹細胞の骨髄再構築能を解析した。【００６０】  その結果、移植１ヶ月後における骨髄再構築能は、ＡＴＭホモ欠失マウス由来の細胞と野生型マウス由来の細胞とでほとんど差は見られなかった。一方、移植４ヶ月後では、ＡＴＭホモ欠失マウス由来の細胞数は著しく低下した。また、この傾向は、未分化な細胞集団であるＫＳＬ細胞を移植した場合により顕著に観察された。また、このような骨髄再構築の不全は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ミエロイド系の３つの系列全てにおいて観察された。【００６１】  長期間に渡る骨髄の再構築には、造血幹細胞が造血前駆細胞を供給すると同時に自己複製によって幹細胞自身を維持することが必要となる。上記の実験で、ＡＴＭホモ欠失マウス由来の細胞を移植した４ヶ月後において、顕著な骨髄不全が観察されたことは、ＡＴＭ遺伝子の欠失により造血幹細胞の自己複製能が低下していることを示している。【００６２】（２）２４週齢のＡＴＭホモ欠失マウス造血幹細胞の自己複製能の低下
ＡＴＭ遺伝子の欠失による造血幹細胞の自己複製能の低下が、移植を介さない通常の環境下でも起こることを明らかにするために、２４週齢のＡＴＭホモ欠失マウスにおける造血系構築能力について解析を行った。【００６３】  ＡＴＭホモ欠失マウスは、８週齢以降、高頻度でリンパ腫瘍を発症するが、一部のマウスではリンパ腫瘍を発症することなく長期生存する。このような長期生存したＡＴＭホモ欠失マウスを観察すると、野生型マウスとは異なり、２０週齢以降、高度の貧血を呈することが明らかになった。【００６４】  ２４週齢において、ヘモグロビンとヘマトクリットの量は、野生型マウスではそれぞれ、１５．３±０．９４ｇ／ｄｌ、５０．３±０．４７％であるのに対して、ＡＴＭホモ欠失マウスではそれぞれ、９．９３±０．３７ｇ／ｄｌ、２８．０±１．４１％であった。また、白血球と血小板の数は、野生型マウスではそれぞれ、１０，８３３±２１３／μｌと１２５．５±１８．９×１０４／μｌであるのに対して、ＡＴＭホモ欠失マウスではそれぞれ、７，３３３±９４３／μｌと７５．７±６．０×１０４／μｌであった。また、ＡＴＭホモ欠失マウスの骨髄中の単核細胞の数は、野生型マウスの３６．９±２．０％まで減少し、脂肪組織が増加していたまた、骨髄中のＭａｃ−１陽性およびＧｒ−１陽性のミエロイド系細胞、Ｂ２２０陽性のＢ細胞、Ｔｅｒ−１１９陽性のエリスロイド系細胞のいずれもが、ＡＴＭホモ欠失マウスで減少しており、中でもエリスロイド系細胞の減少が顕著であった。【００６５】  フローサイトメトリーの結果、ＡＴＭホモ欠失マウスでは、野生型マウスと比較して、ＫＳＬ細胞画分中のｃ−Ｋｉｔを高発現する細胞、すなわち造血幹細胞の数が顕著に減少していた。
以上の結果は、２４週齢のＡＴＭホモ欠失マウスにおいて造血系構築能力が顕著に低下していること、およびそれが造血幹細胞の自己複製能の低下に起因することを示している。【００６６】（３）ＡＴＭホモ欠失マウス由来造血幹細胞における活性酸素量の上昇とｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子発現の上昇
ＡＴＭ遺伝子が欠失することにより造血幹細胞の自己複製能が低下するメカニズムを明らかにするために、以下の実験を行った。【００６７】  ８週齢のＡＴＭホモ欠失マウスまたは野生型マウスから上記（１）の方法により分離した直後のＫＳＬ細胞を、１００ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＥＣ社製）および１００ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＥＣ社製）の存在下、終濃度５μｍｏｌ／ｌの２’−７’−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ（ＤＣＦ−ＤＡ、Ｓｉｇｍａ社製）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした後、４８８ｎｍの励起光により発生する５２５ｎｍの蛍光を測定することにより、細胞内の活性酸素量を測定した。その結果、ＡＴＭホモ欠失マウス由来のＫＳＬ細胞では、野生型マウス由来のＫＳＬ細胞の約１５〜２０倍に上昇していることが明らかになった。さらに、ＳＣＦおよびＴＰＯの存在下で２日間培養した後に細胞内の活性酸素量を測定した結果、ＡＴＭホモ欠失マウス由来のＫＳＬ細胞では、野生型マウス由来のＫＳＬ細胞の約４０〜５０倍にも達した。かかる培養に伴うＫＳＬ細胞の遺伝子発現の変化をＲＴ−ＰＣＲで解析したところ、ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子の顕著な発現上昇が観察された。【００６８】  また、ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子の発現がｉｎ  ｖｉｖｏでも変化していることを明らかにするために、２４週齢のＡＴＭホモ欠失マウスより分離したＫＳＬ細胞における該遺伝子の発現変化を解析した結果、該遺伝子の発現が亢進していることが明らかとなった。【００６９】  ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子の発現上昇は、一般に細胞老化と関連することが知られている。従って、上記の結果から、ＡＴＭ遺伝子が欠失することにより造血幹細胞の自己複製能が低下するメカニズムとして、細胞内活性酸素量の上昇がｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子の発現上昇を介して自己複製能を低下させていることが示唆された。【００７０】  試験例２  ＡＴＭホモ欠失マウス造血幹細胞における自己複製能の低下の抗酸化物質投与による回復
８週齢のＡＴＭホモ欠失マウスおよび野生型マウスから試験例１記載の方法により分離したＫＳＬ細胞２，０００個を、ＯＰ９ストローマ細胞上で、１２．５％仔牛血清（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、１２．５％馬血清（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）および１０−９ｍｏｌ／ｌのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ社製）を含むｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ  ｍｅｄｉｕｍ培地を用いて共培養を行った。培養開始２週間後、４週間後、６週間後に細胞を回収し、メチルセルロース上で、２０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＥＣ社製）および２Ｕ／ｍｌエリスロポエチン（中外製薬社製）の存在下、コロニー形成試験を行った。【００７１】  その結果、抗酸化物質を添加せずに６週間培養した場合、ＡＴＭホモ欠失マウス由来のＫＳＬ細胞のコロニー形成能は、野生型マウス由来のＫＳＬ細胞のコロニー形成能の５％程度にまで低下した。一方、１００μｍｏｌ／ｌのＮ−アセチルシステイン（以下「ＮＡＣ」という。）（Ｓｉｇｍａ社製）または１００Ｕ／ｍｌのカタラーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）を添加して６週間培養した場合には、ＡＴＭホモ欠失マウス由来のＫＳＬ細胞のコロニー形成能は、野生型マウス由来のＫＳＬ細胞のコロニー形成能の６０〜７０％程度まで回復した試験例１記載の方法によりＫＳＬ細胞内の活性酸素量を測定した結果、１００μｍｏｌ／ｌのＮＡＣを添加して培養したＡＴＭホモ欠失マウス由来のＫＳＬ細胞内の活性酸素量は、野生型マウス由来のＫＳＬ細胞内の活性酸素量と同程度にまで低下していた。【００７２】  ＫＳＬ細胞のコロニー形成には、ＫＳＬ細胞に含まれる造血幹細胞が自己複製することが必要である。上記の結果は、ＮＡＣやカタラーゼの添加により、造血幹細胞内の活性酸素量が低下し、該幹細胞の自己複製能が回復したことを示している。【００７３】  次に、ＡＴＭホモ欠失マウスにＮＡＣを１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量で３週間皮下投与し、該マウスの骨髄から上記方法により分離したＫＳＬ細胞内の活性酸素の量を上記方法により測定した結果、野生型マウス由来のＫＳＬ細胞内の活性酸素の量と同等であった。また、ＮＡＣを投与したＡＴＭホモ欠失マウス由来のＫＳＬ細胞を用い、試験例１記載の方法により競合的骨髄再構築試験を行った結果、ＮＡＣを投与していない対照群とは異なり、造血系の回復が観察された。さらに、ＮＡＣを投与したＡＴＭホモ欠失マウス由来のＫＳＬ細胞を移植したレシピエントマウスに対して、ＮＡＣを１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量で皮下投与した結果、造血系は野生型マウスと同程度にまで回復した。また、再構築された血液中には、ＡＴＭホモ欠失マウス由来のＢ細胞、Ｔ細胞、ミエロイド系細胞が観察されたことから、ＮＡＣ投与により自己複製能を回復した造血幹細胞は、野生型マウスの造血幹細胞と同等の分化能を有することが明らかとなった。【００７４】  上記の結果は、ＮＡＣの投与により、造血幹細胞内の活性酸素量が低下し、該幹細胞の自己複製能が回復したことを示している。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。
【実施例１】
【００７５】  注射剤（Ｎ−アセチルシステイン）
常法により、次の組成からなる注射剤を調製する。
Ｎ−アセチルシステイン          １ｍｇ
日局ポリソルベート８０        ２．５ｇ
日局乳糖                      ５ｍｇ
日局生理食塩液                  ０．５ｍｌ
【実施例２】
【００７６】  注射剤（Ｎ−アセチルシステインとナルトグラスチムの単剤）
常法により、次の組成からなる注射剤を調整する。
Ｎ−アセチルシステイン          １ｍｇ
ナルトグラスチム            ２５μｇ
日局ポリソルベート８０        ２．５ｇ
日局乳糖                      ５ｍｇ
日局生理食塩液                  ０．５ｍｌ
【産業上の利用可能性】
【００７７】  本発明により、幹細胞自己複製促進剤、癌の予防薬、組織破壊を伴う疾患もしくは組織不全の予防薬もしくは治療薬、該幹細胞自己複製促進剤を添加してなる幹細胞培養用培地、該培地で培養した幹細胞、幹細胞の製造方法または造血幹細胞自己複製促進剤のスクリーニング方法が提供される。
【国際調査報告】
2005121320.tif 000002
2005121320.tif 000003
2005121320.tif 000004
2005121320.tif 000005
2005121320.tif 000006
2005121320.tif 000007
2005121320.tif 000008
2005121320.tif 000009