(57)【要約】血栓治療薬として高い有用性を有し、容易、廉価に提供することができる線維素溶解剤であって、ウリ科植物の果実から精製された、線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤でなる、またはウリ科植物から調製された、線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している果汁でなる、というものである。  また、広く血栓治療を行うことができるウリ科植物の果実の用法であって、ウリ科植物の果実自体乃至その果汁自体を、線維素溶解剤として用いる、というものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウリ科植物の果実から精製された、線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤でなることを特徴とする線維素溶解剤。
【請求項２】
ウリ科植物の果実から、線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤を、線維素溶解剤として精製することを特徴とする線維素溶解剤の製法。
【請求項３】
ウリ科植物の果実から調製された、線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している果汁でなることを特徴とする線維素溶解剤。
【請求項４】
ウリ科植物の果実から、線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している果汁を、線維素溶解剤として調製することを特徴とする線維素溶解剤の製法。
【請求項５】
ウリ科植物の果実自体乃至その果汁自体を、線維素溶解剤として用いることを特徴とするウリ科植物の果実の用法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳血栓などの血栓の成分であるフイブリン（ｆｉｂｒｉｎ）で形成されている線維素を溶解する、血栓治療薬として用いることができる線維素溶解剤、及びその製法、並びにウリ科植物の果実の用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、特開昭６１−１６２１８４号公報に、人に広く食されている納豆に、プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）であるナットウキナーゼが含まれ、そのナットウキナーゼが、脳血栓などの血栓の成分であるフイブリンで形成されている線維素（以下、簡単のため、単に線維素と称す）を溶解する活性（以下、簡単のため線維素溶解活性と称す）を有することの知見から、納豆を水溶液中でホモジナイズし、その上清液を濃縮し、その濃縮液を透析する、という工程を経て、納豆から線維素溶解活性を有するナットウキナーゼを含有している剤を精製し、その精製された線維素溶解活性を有するナットウキナーゼを含有している剤を線維素溶解剤とすることが提案されている。従って、従来、納豆から精製された、線維素溶解活性を特有するプロテアーゼであるナットウキナーゼを含有している剤でなる線維素溶解剤（以下、簡単のため、納豆由来の線維素溶解剤と称す）が提案されている。
従来提案されている納豆由来の線維素溶解剤によれば、それが、線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤であり、また、その納豆由来の線維素溶解剤が、字句通り、人に広く食されている納豆由来の線維素溶解剤であることから、その納豆由来の線維素溶解剤を人体内に経口投与してもその人体にほとんど悪影響を及ぼさないものとして得ることができる、ということから、血栓治療薬として高い有用性を有する。
【発明の開示】
【０００３】
従来提案されている納豆由来の線維素溶解剤の場合、上述したところから明らかなように、納豆から、線維素溶解剤としての、線維素溶解活性を有するプロテアーゼであるナットウキナーゼを含有している剤を精製するのに、工程が少なくて済むといえるものでないとともに、その工程に困難を伴わないとはいえるものでもなく、また、納豆には、プロテアーゼであるナットウキナーゼがごく微量でしか含まれていないことから、線維素溶解活性を有するプロテアーゼであるナットウキナーゼを含有している剤を、納豆からきわめて低い収率でしか精製できず、さらに、納豆自体、それを廉価に入手し得るというものでもないので、線維素溶解剤を、必ずしも、容易、廉価に提供することができるとはいえない、という欠点を有していた。
よって、本発明は、上述した欠点を伴わない、新規な線維素溶解剤、及びその製法、並びにウリ科植物の果実の用法を提案せんとするものである。
本発明者等は、上述した欠点のない線維素溶解剤を提供すべく種々の実験を重ねたところ、ウリ科植物の果実自体に、線維素溶解活性を有するプロテアーゼが、納豆の場合と同様に、しかしながら納豆の場合と同じ量で納豆の場合に比し格段的に多量に、含まれていること、従って、ウリ科植物の果実自体、またはウリ科植物の果実からその果汁を調製して得たそのウリ科植物の果汁自体を、線維素溶解剤とすることもでき、そこに、困難を伴うというものでもなく、また、ウリ科植物の果実から、それに含まれている線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤を、線維素溶解剤として、納豆の場合に比し格段的に高い収率で精製することができ、そこに、納豆からそれに含まれているプロテアーゼを含有している剤を精製する場合に比し多くのまたは大きな困難を伴うものであるとはいえないこと、さらに、ウリ科植物の果実自体、それが納豆の原料である豆に相当していることから、それを、納豆の場合に比し廉価に入手することができることを確認するに到った。
本願第１番目の発明による線維素溶解剤は、上述した確認に基づき提案されたもので、ウリ科植物の果実から精製された、線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤でなる、というものである。
本願第１番目の発明による線維素溶解剤によれば、それが、納豆由来の線維素溶解剤の場合と同様の線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤でなり、また、その線維素溶解剤が、ウリ科植物由来の線維素溶解剤であることから、納豆由来の線維素溶解剤の場合と同様に、その線維素溶解剤を人体内に経口投与してもその人体にほとんど悪影響を及ぼさないものとして得ることができることから、納豆由来の線維素溶解剤の場合と同様に、血栓治療薬として高い有用性を有する。
しかしながら、本願第１番目の発明による線維素溶解剤の場合、その線維素溶解剤としての線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤をウリ科植物の果実から精製するのは、納豆由来の線維素溶解剤としての線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤を納豆から精製する場合に比し困難であるとはいえず、また、ウリ科植物の果実から線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤を、納豆から線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤を精製する場合に比し格段的に高い収率で精製することができ、さらに、ウリ科植物の果実自体、それが納豆の原料である豆に相当していることから、それを、納豆の場合に比し廉価に入手することができるので、線維素溶解剤を、納豆由来の線維素溶解剤の場合に比し、容易、廉価に提供することができる。
本願第２番目の発明による線維素溶解剤の製法も、上述した確認に基づき提案されたもので、ウリ科植物の果実から、線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤を、線維素溶解剤として精製する、というものである。
この場合、果実からの精製は、果実から、その果汁を得、その果実についてクロマトグラフィを行い、それによってプロテアーゼを溶解している溶液を溶出させ、その溶液を透析し、凍結乾燥して目的とする剤を得る、というものとするのを可とする。
本願第２番目の発明による線維素溶解剤の製法によれば、上述した特徴を有する本願第１番目の発明による線維素溶解剤を、容易に製造することができる。
本願第３番目の発明による線維素溶解剤も、上述した確認に基づき提案されたもので、ウリ科植物の果実から調製された、線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している果汁でなる、というものである。
本願第３番目の発明による線維素溶解剤によれば、それが、ウリ科植物の果実から調製された、線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している果汁でなることから、本願第１番目の発明による線維素溶解剤の場合と同様に、その線維素溶解剤を人体内に経口投与してもその人体にほとんど悪影響を及ぼさないものとして得ることができ、よって、本願第１番目の発明による線維素溶解剤の場合と同様に、血栓治療薬として高い有用性を有する。
また、本願第３番目の発明による線維素溶解剤の場合、ウリ科植物の果実から線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している果汁を調製するのは、きわめて容易であり、また、ウリ科植物の果実から線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している果汁を高い収率で調製することができることは明らかであり、さらに、ウリ科植物の果実自体、本願第１番目の発明による線維素溶解剤の場合で述べたように、廉価に入手することができるので、線維素溶解剤を、本願第１番目の発明による線維素溶解剤の場合と同様に、容易、廉価に提供することができる。
本願第４番目の発明による線維素溶解剤の製法も、上述した確認に基づき提案されたもので、ウリ科植物の果実から、線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している果汁を、線維素溶解剤として調製する、というものである。
この場合、果実からの調製は、果実について、冷凍を行って後、解凍し、細胞の破壊された果実を得、その細胞の破壊された果実を圧搾して果汁を得る、というものとするのを可とする。
本願第４番目の発明による線維素溶解剤の製法によれば、上述した特徴を有する本願第３番目の発明による線維素溶解剤を、容易に製造することができる。
本願第５番目の発明によるウリ科植物の果実の用法も、上述した確認に基づき提案されたもので、ウリ科植物の果実自体またはその果汁自体を、線維素溶解剤として用いる、というものである。
本願第５番目の発明によるウリ科植物の果実の用法によれば、それによって、人体にほとんど悪影響を及ぼすことなしに、血栓治療を容易に行うことができ、そこに、ウリ科植物の果実から線維素溶解剤を精製したりする必要がない。
ここで、上述した本願第１〜第５番目の発明に用いるウリ科植物の果実としては、それを、プリンスメロン、マスクメロン、ハニデュメロン、アンデスメロン、リュウキュウトウガン、トウガンなどの食用ウリ、または、カラスウリ、オオカラスウリ、キカラスウリなどの野生ウリとし得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００４】
本発明による線維素溶解剤及びその製法並びにウリ科植物の果実の用法は、ウリ科植物の果実を用いて構成されている。
【実施例１】
【０００５】
次に、本発明による線維素溶解剤の第１の実施例を、本発明による線維素溶解剤の製法の第１の実施例とともに述べよう。
本発明による線維素溶解剤の第１の実施例は、本発明による線維素溶解剤の製法の第１の実施例によって製造された、線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤でなる、というものである。
このことから、本発明による線維素溶解剤の製法の第１の実施例を述べれば、次のとおりである。
すなわち、
（１）まず、ウリ科植物をプリンスメロンとし、そのウリ科植物としてのプリンスメロンの果実の１．５Ｋｇについて、蒸留水で洗浄してから、−２０℃の温度で冷凍し、次いで４℃の温度で解凍し、それによって、細胞の破砕されたプリンスメロンの果実を得、その細胞の破砕されたプリンスメロンの果実を、綿布製袋に入れて圧搾し、それによって、清澄なプリンスメロンの果実の果汁を得、
（２）次で、その清澄なプリンスメロンの果実の果汁について、ｐＨ５．０の５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭの酢酸水溶液と５０ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液との混液でなる）で平衡化したＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セルロースカラム（陰イオン交換樹脂カラムの一種）を用いたクロマトグラフィーを行い、それにより、そのＤＥＡＥ−セルロースカラムから、それを通過した溶液を得、次いで、そのＤＥＡＥ−セルロースカラムを通過した溶液について、ｐＨ５．０の５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で平衡化したＣＭ（カルボキシルメチル）−セファロースカラム（陽イオン交換樹脂カラムの一種）を用いたクロマトグラフィーを行い、それにより、そのＣＭ−セファロースカラムに、プリンスメロンの果実の果汁の成分を吸着させ、
（３）次で、そのプリンスメロンの果実の果汁の成分を吸着させているＣＭ−セファロースカラムに、ｐＨ５．０の５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を、それに、０．３Ｍ塩化ナトリウム水溶液によって当該５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中の塩化ナトリウム濃度が時間とともに直線的に高くなるリニアグラジエントを施して、流し、それによって、そのＣＭ−セファロースカラムから、プロテアーゼを溶解している溶液を溶出させ、
（４）次で、そのＣＭ−セファロースカラムから溶出されたプロテアーゼを溶解している溶液について透析を行い、それによって、透析されたプロテアーゼを溶解している溶液を得、
（５）次いで、その透析されたプロテアーゼを溶解している溶液に、凍結乾燥処理を施し、それによって得られた凍結乾燥処理の施された剤を、目的とする線維素溶解活性を有するプロテアーゼでなる剤として得た。
以上のようにして、プリンスメロンの果実の１．５ｋｇから、４１％の収率で、３６０ｍｇの凍結乾燥処理の施された剤を、目的とする線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤として得た。
以上が、本発明による線維素溶解剤の製法の第１の実施例であるが、いま、その本発明による線維素溶解剤の製法の第１の実施例によって線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤として得た凍結乾燥処理の施された剤が、線維素溶解活性を有することについて述べれば、次のとおりである。
（１）線維素が、［背景技術］で述べているようにフイブリンで形成されていることから、フィブリノーゲン（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）を用い、そのフィブリノーゲンの１００ｍｇを、ｐＨ７．４の０．９％塩化ナトリウムを含む６７ｍＭリン酸ナトリウムーカリウム緩衝液の１０ｍｌに溶かし、
（２）次で、その溶液に対し、遠心分離（５０００×ｇ、５分間）を施し、それによって、フィブリノーゲンを溶解しているフィブリノーゲン溶解上清液を得、
（３）次で、そのフィブリノーゲン溶解上清液を、それに０．５ｍｇ／ｍｌメチルオレンジの１ｍｌとトロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）の２．２ｍｇとを加えて撹拌後、２４穴マイクロプレート（溶液を保持する穴の２４個を設けている透光性板）の穴に、１穴あたり１００μｌの量で、注入し、
（４）次で、その２４穴マイクロプレートを、室温の温度に、１時間保ち、それによって、その２４穴マイクロプレートの穴内に、それに注入されたフィブリノーゲン溶解上清液による、フィブリンのゲルを得、
（５）次いで、その２４穴マイクロプレートの穴内のフィブリンのゲル内に、上述した本発明による線維素溶解剤の製法の実施例によって得た凍結乾燥処理の施された剤の溶液を、２４穴マイクロプレートの１穴あたり１００μｌの量で、注入し、
（６）次いで、２４穴マイクロプレートを室温で３０分間放置し、プロテアーゼでなる剤の溶液中のプロテアーゼによってフィブリンのゲルを構成しているフィブリンを溶解をさせる状態にし、
（７）次で、その状態で、２４穴マイクロプレートに対応のマイクロプレートリーダー（マイクロプレートの穴に保持されている溶液の吸光度を測定する装置）を用いて、２４穴マイクロプレートの穴内のプロテアーゼを含有している剤の溶液の注入されたフィブリンのゲルの、波長５２０ｎｍの光の吸光度を、測定した。
しかるところ、波長５２０ｎｍの光の吸光度が、１０分間に０．０５の割合で減少する測定結果が得られた。
以上のことから、上述した本発明による線維素溶解剤の製法の第１の実施例によって線維素溶解活性を有するプロテアーゼとして得た凍結乾澡処理の施された剤が、線維素溶解活性を有することを確認した。
なお、上述した本発明による線維素溶解剤の製法の第１の実施例によって線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤として得た凍結乾燥処理の施された剤について、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｏｄｅｃｙｌ  Ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ）の溶液を用いた電気泳動上のバンドを観測したところ、その電気泳動上のバンドが単一で得られたことから、線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤として得た凍結乾燥処理の施された剤が、高い純度を有することを確認した。
以上で、本発明による線維素溶解剤の第１の実施例、及びそれを製造する本発明による線維素溶解剤の製法の第１の実施例の具体例が明らかになった。
本発明による線維素溶解剤の第１の実施例は、本発明による線維素溶解剤の製法の第１の実施例によって製造された、線維素溶解活性を有するプロテアーゼを有する剤でなるというものであるが、ウリ科植物としてのプリンスメロンの果実から精製された、線維素溶解活性を有するプロテアーゼを有する剤でなる、というものである。
このような本発明による線維素溶解剤の第１の実施例によれば、それが、納豆由来の線維素溶解剤の場合と同様の線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤であり、また、その線維素溶解剤が、プリンスメロン由来の線維素溶解剤であることから、納豆由来の線維素溶解剤の場合と同様に、その線維素溶解剤を人体内に経口投与してもその人体にほとんど悪影響を及ぼさないものとして得ることができることから、納豆由来の線維素溶解剤の場合と同様に、血栓治療薬として高い有用性を有する。
しかしながら、本発明による線維素溶解剤の第１の実施例の場合、その線維素溶解剤としての線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤をウリ科植物であるプリンスメロンの果実から精製するのは、本発明による線維素溶解剤の第１の実施例を製造する、上述した本発明による線維素溶解剤の製法の第１の実施例から明らかなように、納豆由来の線維素溶解剤としての線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤を納豆から精製する場合に比し困難であるとはいえず、また、ウリ科植物であるプリンスメロンの果実から線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤を、納豆から線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤を精製する場合に比し格段的に高い収率で精製することができ、さらに、ウリ科植物であるプリンスメロンの果実自体、それが納豆の原料である豆に相当していることから、それを、納豆の場合に比し廉価に入手することができるので、線維素溶解剤を、納豆由来の線維素溶解剤の場合に比し、容易、廉価に提供することができる。
また、本発明による線維素溶解剤の製法の第１の実施例は、上述したところであるが、ウリ科植物としてのプリンスメロンの果実から、線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している剤を、線維素溶解剤として精製する、というものである。
このような本発明による線維素溶解剤の製法の第１の実施例によれば、上述した特徴を有する本発明による線維素溶解剤の第１の実施例を、容易に製造することができる。
【実施例２】
【０００６】
次に、本発明による線維素溶解剤の第２の実施例を、本発明による線維素溶解剤の製法の第２の実施例とともに述べよう。
本発明による線維素溶解剤の第２の実施例は、本発明による線維素溶解剤の製法の第２の実施例によって製造された、線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している果汁でなる、というものである。
このことから、本発明による線維素溶解剤の第２の実施例を述べれば、次のとおりである。
すなわち、本発明による線維素溶解剤の製法の第１の実施例の場合と同様に、ウリ科植物をプリンスメロンとし、そして、本発明による線維素溶解剤の製法の第１の実施例の第４段落中の（１）に記載していると同様に、プリンスメロンの果実の１．５Ｋｇについて、蒸留水で洗浄してから、−２０℃の温度で冷凍し、次いで４℃の温度で解凍し、それによって、細胞の破砕されたプリンスメロンを得、その細胞の破砕されたプリンスメロンを綿布製袋に入れて圧搾し、それによって、清澄なプリンスメロンの果汁を得、その果汁を、目的とする線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している果汁として得た。
以上が、本発明による線維素溶解剤の製法の第２の実施例であるが、その本発明による線維素溶解剤の製法の第２の実施例によって線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している果汁として得たプリンスメロンの果実の果汁によれば、それが種々の試験の結果、線維素溶解活性を有することを確認した。
以上で、本発明による線維素溶解剤の第２の実施例、及びそれを製造する本発明による線維素溶解剤の製法の第２の実施例の具体例が明らかになった。
本発明による線維素溶解剤の第２の実施例は、本発明による線維素溶解剤の製法の第２の実施例によって製造された、線維素溶解活性を有するプロテアーゼを有する果汁でなるというものであるが、ウリ科植物としてのプリンスメロンの果実から調製された、線維素溶解活性を有するプロテアーゼを有する果汁でなる、というものである。
このような本発明による線維素溶解剤の第２の実施例によれば、詳細説明は省略するが、本発明による線維素溶解剤の第１の実施例の場合に準じた優れた特徴を有することは明らかである。
また、本発明による線維素溶解剤の製法の第２の実施例は、上述したところであるが、ウリ科植物としてのプリンスメロンの果実から、線維素溶解活性を有するプロテアーゼを含有している果汁を、線維素溶解剤として調製する、というものである。
このような本発明による線維素溶解剤の製法の第２の実施例によれば、本発明による線維素溶解剤の第１の実施例に準じた優れた特徴を有する本発明による線維素溶解剤の第２の実施例を、容易に製造することができる。
【実施例３】
【０００７】
次に、本発明によるウリ科植物の果実の用法の実施例を述べよう。
本発明によるウリ科植物の果実の用法の実施例は、ウリ科植物をプリンスメロンとし、そのウリ科植物としてのプリンスメロンの果実自体乃至その果汁自体を、線維素溶解剤として用いる、というものである。
このような本発明によるウリ科植物の果実の用法の実施例によれば、それによって、人体にほとんど悪影響を及ぼすことなしに、血栓治療を容易に行うことができ、そこにウリ科植物としてのプリンスメロンの果実から線維素溶解剤の精製をしたりする必要がない。
上述した実施例においては、、ウリ科植物を食用ウリであるプリンスメロンとした場合の実施例を述べたものであるが、ウリ科植物を、プリンスメロン以外のマスクメロン、ハニデュメロン、アンデスメロン、リュウキュウトウガン、またはトウガンでなる食用ウリ、または、カラスウリ、オオカラスウリ、またはキカラスウリでなる野生ウリとすることもでき、その他、本発明の精神を脱することなしに種々の変型、変更をなし得るであろう。
【産業上の利用可能性】
【０００８】
本発明による線維素溶解剤、及びその製法は、血栓治療に用い得る線維素溶解剤、及びその製法として広く使用することができ、また、本発明によるウリ科植物の果実の用法は、血栓治療を広く行うことができる。
【国際調査報告】
2006107093.tif 000002
2006107093.tif 000003
2006107093.tif 000004
2006107093.tif 000005
2006107093.tif 000006
2006107093.tif 000007