(57)【要約】【課題】テロメレースの活性調節に関与する蛋白質を見出し、テロメレース活性を阻害する手段、並びにテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止および／または治療を可能にする手段を提供すること。【解決手段】ＴＥＲＴ（テロメレース触媒サブユニット）とＵＳＰ２１との結合、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとＵＳＰ２１との結合、またはＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化、を阻害することを特徴とするテロメレースの分解促進方法、該分解促進方法を用いるテロメレース活性阻害方法、前記結合または前記脱ＮＥＤＤ８化を阻害する化合物の同定方法、該化合物を含むテロメレース活性阻害剤、該阻害剤を含むテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止剤・治療剤、前記阻害方法または前記阻害剤を用いる該疾患の防止方法・治療方法、並びに試薬キット。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＥＤＤ８（ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ８）化テロメレース逆転写酵素（ＴＥＲＴ）とユビキチン特異的プロテアーゼ２１（ＵＳＰ２１）との結合を阻害することを特徴とする、ＴＥＲＴの分解促進方法。
【請求項２】
ユビキチン特異的プロテアーゼ２１（ＵＳＰ２１）によるＮＥＤＤ８（ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ８）化テロメレース逆転写酵素（ＴＥＲＴ）の脱ＮＥＤＤ８化を阻害することを特徴とする、ＴＥＲＴの分解促進方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載のテロメレース逆転写酵素（ＴＥＲＴ）の分解促進方法を用いることを特徴とする、テロメレース活性阻害方法。
【請求項４】
ユビキチン特異的プロテアーゼ２１（ＵＳＰ２１）とテロメレース逆転写酵素（ＴＥＲＴ）との結合を阻害する化合物の同定方法であって、ある化合物とＵＳＰ２１および／またはＴＥＲＴの相互作用を可能にする条件下で、該化合物とＵＳＰ２１および／またはＴＥＲＴを接触させ、次いで、ＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合により生じるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、該シグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、該化合物がＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法。
【請求項５】
ユビキチン特異的プロテアーゼ２１（ＵＳＰ２１）とＮＥＤＤ８（ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ８）化テロメレース逆転写酵素（ＴＥＲＴ）との結合を阻害する化合物の同定方法であって、ある化合物とＵＳＰ２１および／またはＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの相互作用を可能にする条件下で、該化合物とＵＳＰ２１および／またはＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴを接触させ、次いで、ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合により生じるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、該シグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、該化合物がＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法。
【請求項６】
ユビキチン特異的プロテアーゼ２１（ＵＳＰ２１）によるＮＥＤＤ８（ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ８）化テロメレース逆転写酵素（ＴＥＲＴ）の脱ＮＥＤＤ８化を阻害する化合物の同定方法であって、ある化合物とＵＳＰ２１および／またはＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの相互作用を可能にする条件下で、該化合物とＵＳＰ２１および／またはＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴを接触させ、次いで、ＵＳＰ２１によるＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの脱ＮＥＤＤ８化により生じるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、該シグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、該化合物がＵＳＰ２１によるＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの脱ＮＥＤＤ８化を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法。
【請求項７】
ユビキチン特異的プロテアーゼ２１（ＵＳＰ２１）とＮＥＤＤ８（ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ８）化テロメレース逆転写酵素（ＴＥＲＴ）との結合を阻害する化合物を含んでなるテロメレース活性阻害剤。
【請求項８】
ユビキチン特異的プロテアーゼ２１（ＵＳＰ２１）によるＮＥＤＤ８（ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ８）化テロメレース逆転写酵素（ＴＥＲＴ）の脱ＮＥＤＤ８化を阻害する化合物を含んでなるテロメレース活性阻害剤。
【請求項９】
請求項７または８に記載のテロメレース活性阻害剤を含んでなるテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止剤および／または治療剤。
【請求項１０】
請求項７または８に記載のテロメレース活性阻害剤を含んでなる抗癌剤。
【請求項１１】
請求項３に記載のテロメレース活性阻害方法を用いることを特徴とするテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項１２】
請求項３に記載のテロメレース活性阻害方法を用いることを特徴とする癌の防止方法および／または治療方法。
【請求項１３】
請求項７または８に記載のテロメレース活性阻害剤を用いることを特徴とするテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項１４】
請求項７または８に記載のテロメレース活性阻害剤を用いることを特徴とする癌の防止方法および／または治療方法。
【請求項１５】
ユビキチン特異的プロテアーゼ２１（ＵＳＰ２１）、ＵＳＰ２１をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび該組換えベクターを含有する形質転換体のうち少なくともいずれか１つ、テロメレース逆転写酵素（ＴＥＲＴ）、ＴＥＲＴをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび該組換えベクターを含有する形質転換体のうち少なくともいずれか１つ、並びにＮＥＤＤ８（ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ８）、ＮＥＤＤ８をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび該組換えベクターを含有する形質転換体のうち少なくともいずれか１つを含有してなる試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テロメレース逆転写酵素（以下、ＴＥＲＴと略称することもある）とユビキチン特異的プロテアーゼ２１（以下、ＵＳＰ２１と略称することもある）との結合を阻害することを特徴とする、ＴＥＲＴの分解促進方法、および該分解促進方法を用いることを特徴とするテロメレース活性阻害方法、並びにＮＥＤＤ８（ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ８）化ＴＥＲＴとＵＳＰ２１との結合を阻害することを特徴とする、ＴＥＲＴの分解促進方法、および該分解促進方法を用いることを特徴とするテロメレース活性阻害方法に関する。【０００２】
また、本発明は、ＵＳＰ２１によるＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの脱ＮＥＤＤ８化を阻害することを特徴とする、ＴＥＲＴの分解促進方法、および該分解促進方法を用いることを特徴とするテロメレース活性阻害方法に関する。【０００３】
さらに、本発明は、ＴＥＲＴとＵＳＰ２１との結合を阻害する化合物、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとＵＳＰ２１との結合を阻害する化合物、またはＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を阻害する化合物の同定方法に関する。【０００４】
また、本発明は、前記化合物を含んでなるテロメレース活性阻害剤に関する。【０００５】
さらに、本発明は、前記テロメレース活性阻害剤を含んでなる、テロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止剤および／または治療剤に関する。【０００６】
また、本発明は、前記テロメレース活性阻害剤または前記テロメレース活性阻害方法を用いることを特徴とする、テロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止方法および／または治療方法に関する。【０００７】
さらに、本発明は、ＵＳＰ２１、ＵＳＰ２１をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび該組換えベクターを含有する形質転換体のうち少なくともいずれか１つ、ＴＥＲＴ、ＴＥＲＴをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび該組換えベクターを含有する形質転換体のうち少なくともいずれか１つ、並びにＮＥＤＤ８、ＮＥＤＤ８をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび該組換えベクターを含有する形質転換体のうち少なくともいずれか１つを含有してなる試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００８】
テロメレースは、真核細胞の染色体末端のテロメア配列の伸張反応を触媒する酵素であり、鋳型となるＲＮＡ分子であるテロメレースＲＮＡ（以下、ＴＲと略称することもある）と触媒サブユニットであるＴＥＲＴからなるリボ核蛋白質である（非特許文献１）。【０００９】
テロメレースは、テロメア長を維持することにより、細胞に不死化能（無限寿命）を与える。テロメアは真核細胞の染色体ＤＮＡの末端部分に存在する単純な繰り返し配列であり、染色体の安定性維持に寄与している。細胞分裂においてＤＮＡの複製を司る通常のＤＮＡポリメラーゼではＤＮＡの最末端までの完全な複製が行われないため、細胞分裂に伴いテロメアは短縮される。正常な体細胞では一定回数分裂後に増殖が停止し、細胞の老化あるいは細胞死が生じる。【００１０】
テロメレース活性は生殖細胞、各種幹細胞および末梢血リンパ球を除く正常細胞では検出されない。大多数の正常細胞は、分裂毎にテロメア長が短縮するためにテロメア長を維持できず、その寿命は有限である。【００１１】
一方、癌細胞等の不死化した細胞の大多数においてはテロメレース活性が検出される。このような細胞では、細胞分裂に伴い短縮されたテロメアがテロメレースにより伸張され、その結果、テロメア長が維持される。このことが、癌細胞の無限増殖性獲得機序の１つであると考えられる。テロメレースによるテロメア長の維持が癌細胞の不死化に寄与することは、アンチセンスＲＮＡを用いて癌細胞のテロメレース活性を消失させると、１０数回の細胞分裂の後に細胞増殖が停止し、細胞死が誘導されるという報告により明らかである。また、癌細胞内でドミナントネガティブ型テロメレースを発現させることにより、テロメレース活性の消失と細胞分裂に伴ったテロメア長の短小化、染色体末端融合の出現および細胞死が誘導されることが報告されている。【００１２】
テロメレースの活性化に関しては、ＴＥＲＴ遺伝子の発現活性化による活性化やＴＥＲＴのリン酸化を介した活性化等が報告されている。前者については、多くの正常細胞においてＴＲ遺伝子の発現は検出されるもののＴＥＲＴ遺伝子の発現は検出されないのに対し、多くの癌細胞ではＴＲおよびＴＥＲＴ両遺伝子の発現が認められることから、癌細胞等テロメレース活性が検出される細胞では何らかの機構によりＴＥＲＴ遺伝子の発現が活性化されていると考えられている。後者については、癌細胞の核抽出液を脱リン酸化処理すると該核抽出液中のテロメレース活性が低減することが報告されており、テロメレースの活性化にリン酸化が関与している可能性が示唆されている（非特許文献２）。また、癌細胞由来の核抽出液をＡｋｔやプロテインキナーゼＣと反応させることにより抽出液中のテロメレース活性が上昇することが報告されており、これらキナーゼがテロメレース活性化に関与する可能性が示唆されている（非特許文献３および４）。【００１３】
また、本願の優先日の後に、ＴＥＲＴのユビキチン化、そのプロテアソームによる分解、ＭＫＲＮ１がＴＥＲＴのユビキチン化を促進するＥ３リガーゼであること、および、ＭＫＲＮ１によりテロメレース活性が調節されていることが報告された（非特許文献１１、２００５年４月１日）。【００１４】
しかしながら、ユビキチン化ＴＥＲＴを脱ユビキチン化する具体的な酵素の報告はなく、その他のＴＥＲＴの翻訳後修飾、例えばアセチル化、グリコシル化、ＮＥＤＤ８化によるテロメレース活性調節についての報告はない。【００１５】
ＮＥＤＤ８は、ユビキチンとアミノ酸レベルで約８０％の相同性を有するユビキチン様蛋白質の一つであり、８１アミノ酸残基からなる。ユビキチンは、ユビキチンリガーゼの作用により、標的である蛋白質内のリジン残基と共有結合する。標的蛋白質内のリジン残基に結合したユビキチン内のリジン残基には、別のユビキチンがさらに共有結合する。このようにして、蛋白質には複数のユビキチンが鎖状に結合する。１分子の蛋白質に１以上のユビキチンが共有結合することによる、ユビキチンによる該蛋白質の修飾を蛋白質のユビキチン化と称する。また、１以上のユビキチンにより修飾された蛋白質をユビキチン化蛋白質と称する。ユビキチン化蛋白質はプロテアソーム依存的に分解される。そのため、ユビキチン化は蛋白質の安定性の調節に関与していると考えられている（非特許文献５）。【００１６】
ＮＥＤＤ８は、ユビキチンと同様に、蛋白質の翻訳後修飾の一つとして蛋白質内のリジン残基と共有結合する。蛋白質にＮＥＤＤ８が共有結合することを、蛋白質のＮＥＤＤ８化と称する。ＮＥＤＤ８化される蛋白質として、複合体型ユビキチンリガーゼの構成蛋白質の一つであるカリン（Ｃｕｌｌｉｎ）ファミリー蛋白質が唯一報告されている。また、ＣｕｌｌｉｎのＮＥＤＤ８化を介したユビキチンリガーゼ活性調節機構の存在が示唆されている（非特許文献５および６）。【００１７】
ＮＥＤＤ８が一次構造および立体構造レベルにおいてユビキチンと非常に高い相同性を有していること（非特許文献５）を考えると、蛋白質のユビキチン化が蛋白質分解のシグナルとして作用しているのと同様に、蛋白質のＮＥＤＤ８化がプロテアソーム依存的な蛋白質分解のシグナルとして作用している可能性が示唆されている（非特許文献５）。しかし、ＮＥＤＤ８化が関与するプロテアソーム依存的な蛋白質分解機構の存在についての報告は無い。【００１８】
プロテアソームはプロテアーゼの複合体である。２０Ｓプロテアソーム、２６Ｓプロテアソームおよびフットボール型プロテアソームが知られている。ユビキチン化蛋白質の選択的かつエネルギー依存的な分解には、２６Ｓプロテアソームが関与している。２６Ｓプロテアソームは、ＡＴＰ非依存性プロテアーゼ複合体である２０Ｓプロテアソームに２分子のＰＡ７００が結合してなる沈降係数２６ＳのＡＴＰ依存性プロテアーゼ複合体である。２０Ｓプロテアソームは、７つのαサブユニットからなるαリングおよび７つのβサブユニットからなるβリングが、α、β、β、αの順に筒状に積み重なって形成された中空の構造を有する。２０Ｓプロアソームの上下にＰＡ７００が結合することにより、２６Ｓプロテアソームが形成される。ＰＡ７００は、不活性型として存在するプロテアソームを活性化する内在性の活性化因子であり、多成分複合体であるその構成分子中にユビキチン認識サブユニットを保持する。ユビキチン化蛋白質は、２６Ｓプロテアソームを構成するＰＡ７００により認識され、プロテアソーム内にリクルートされる。プロテアソーム内では、ユビキチン化蛋白質の変性に伴って該蛋白質からユビキチンが遊離され、該蛋白質はβサブユニットにより分解される。【００１９】
ＮＵＢ１（ＮＥＤＤ８  ｕｌｔｉｍａｔｅ  ｂｕｓｔｅｒ−１）は、ＮＥＤＤ８と結合する蛋白質であることが知られている（非特許文献７）。また、ＮＵＢ１が２６Ｓプロテアソームの１９Ｓサブユニットの構成蛋白質であるＳ５ａと結合すること、およびその過剰発現によりＳ５ａと共沈降するＮＥＤＤ８化蛋白質量が増大することが報告されている（非特許文献８）。これら報告から、ＮＵＢ１はＮＥＤＤ８化蛋白質のＮＥＤＤ８部分を認識して結合することにより、ＮＥＤＤ８化蛋白質の２６Ｓプロテアソームへの移行を担うリクルーター蛋白質として働いており、その後、２６ＳプロテアソームにおいてＮＥＤＤ８化蛋白質が分解されると考えられる。【００２０】
ＵＳＰ２１はシステインプロテアーゼの一つであり、ユビキチン化蛋白質およびＮＥＤＤ８化蛋白質からそれぞれユビキチンおよびＮＥＤＤ８を切断する脱ユビキチン化／脱ＮＥＤＤ８化酵素としての活性を有していることが報告されている（非特許文献９）。また、ＵＳＰ２１と同様に、ＤＥＮ１（ｈｕｍａｎ  ｄｅｎｅｄｄｙｌａｓｅ  １）がＮＥＤＤ８化カリン（Ｃｕｌｌｉｎ）を脱ＮＥＤＤ８化する活性を有していることが報告されている（非特許文献１０）。【００２１】
しかし、ＵＳＰ２１が不特定の蛋白質に対し、脱ＮＥＤＤ８化活性を有していることは報告されているものの、ＵＳＰ２１により脱ＮＥＤＤ８化を受ける蛋白質は同定されていない。また、ＮＥＤＤ８やＵＳＰ２１とテロメレースとの関連、およびプロテアソーム系によるテロメレースの分解については報告されていない。【００２２】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ０１／６７２９９号パンフレット。
【非特許文献１】ケラー（Ｋｅｌｌｅｈｅｒ  Ｃ．）ら、「トレンズ  イン  バイオケミカル  サイエンシズ（ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、２００２年、第２７巻、ｐ．５７２−５７９。
【非特許文献２】「ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９７年、第２７２巻、ｐ．１６７２９−１６７３２。
【非特許文献３】「ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９９年、第２７４巻、ｐ．１３０８５−１３０９０。
【非特許文献４】「ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９８年、第２７３巻、ｐ．３３４３６−３３６４２。
【非特許文献５】「ジーン（Ｇｅｎｅ）」、２０００年、第２４８巻、ｐ．１−１４。
【非特許文献６】「実験医学」、２００４年、第２２巻、第２号、ｐ．６９−７５。
【非特許文献７】「ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００１年、第２７６巻、第２３号、ｐ．２０６０３−２０６０９。
【非特許文献８】「ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００１年、第２７６巻、第４９号、ｐ．４６６５５−４６６６０。
【非特許文献９】「ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２０００年、第７５巻、ｐ．１４２１２−１４２１６。
【非特許文献１０】「ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００３年、第２７８巻、第３１号、ｐ．２８８８２−２８８９１。
【非特許文献１１】「ジーンズ  アンド  ディベロプメント（Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、２００５年、第１９巻、ｐ．７７６−７８１。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明の課題は、テロメレースの活性調節に関与する蛋白質を見出して提供することである。また、本発明の課題には、テロメレース活性を阻害する手段を提供することが含まれる。さらに、本発明の課題には、テロメレース活性の亢進に起因する疾患、例えば癌疾患の防止および／または治療を可能にする手段を提供することが含まれる。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意努力し、テロメレースの触媒サブユニットであるＴＥＲＴが、ユビキチン様蛋白質であるＮＥＤＤ８およびシステインプロテアーゼであるＵＳＰ２１それぞれと相互作用する可能性をインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）で予測した。そして、ＴＥＲＴがＮＥＤＤ８およびＵＳＰ２１それぞれと結合することを実験的に検証した。さらに、ＴＥＲＴがＮＥＤＤ８化されること、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴがＵＳＰ２１により脱ＮＥＤＤ８化されること、プロテアソーム依存的にＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴが分解されることによりプロテアソーム依存的にＴＥＲＴが分解されること、ＵＳＰ２１によりＴＥＲＴが安定化されること、およびＵＳＰ２１によりそのシステインプロテアーゼ活性依存的に細胞核内テロメレース活性が上昇することを明らかにした。これら実験結果から、ＴＥＲＴのＮＥＤＤ８化およびＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を介した、プロテアソーム依存的なＴＥＲＴ分解制御機構が存在し、本機構により細胞核内のテロメレース活性が調節されていることを見出し、本発明を完成した。【００２５】
すなわち、本発明は、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとＵＳＰ２１との結合を阻害することを特徴とする、ＴＥＲＴの分解促進方法に関する。【００２６】
また本発明は、ＵＳＰ２１によるＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの脱ＮＥＤＤ８化を阻害することを特徴とする、ＴＥＲＴの分解促進方法に関する。【００２７】
さらに本発明は、前記ＴＥＲＴの分解促進方法を用いることを特徴とする、テロメレース活性阻害方法に関する。【００２８】
さらにまた本発明は、ＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合を阻害する化合物の同定方法であって、ある化合物とＵＳＰ２１および／またはＴＥＲＴの相互作用を可能にする条件下で、該化合物とＵＳＰ２１および／またはＴＥＲＴを接触させ、次いで、ＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合により生じるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、該シグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、該化合物がＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法に関する。【００２９】
また本発明は、ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合を阻害する化合物の同定方法であって、ある化合物とＵＳＰ２１および／またはＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの相互作用を可能にする条件下で、該化合物とＵＳＰ２１および／またはＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴを接触させ、次いで、ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合により生じるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、該シグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、該化合物がＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法に関する。【００３０】
さらに本発明は、ＵＳＰ２１によるＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの脱ＮＥＤＤ８化を阻害する化合物の同定方法であって、ある化合物とＵＳＰ２１および／またはＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの相互作用を可能にする条件下で、該化合物とＵＳＰ２１および／またはＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴを接触させ、次いで、ＵＳＰ２１によるＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの脱ＮＥＤＤ８化により生じるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、該シグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、該化合物がＵＳＰ２１によるＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの脱ＮＥＤＤ８化を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法に関する。【００３１】
さらにまた本発明は、ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合を阻害する化合物を含んでなるテロメレース活性阻害剤に関する。【００３２】
また本発明は、ＵＳＰ２１によるＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの脱ＮＥＤＤ８化を阻害する化合物を含んでなるテロメレース活性阻害剤に関する。【００３３】
さらに本発明は、前記テロメレース活性阻害剤を含んでなるテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止剤および／または治療剤に関する。【００３４】
さらにまた本発明は、前記テロメレース活性阻害剤を含んでなる抗癌剤に関する。【００３５】
また本発明は、前記テロメレース活性阻害方法を用いることを特徴とするテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止方法および／または治療方法に関する。【００３６】
さらに本発明は、前記テロメレース活性阻害方法を用いることを特徴とする癌の防止方法および／または治療方法に関する。【００３７】
さらにまた本発明は、前記テロメレース活性阻害剤を用いることを特徴とするテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止方法および／または治療方法に関する。【００３８】
また本発明は、前記テロメレース活性阻害剤を用いることを特徴とする癌の防止方法および／または治療方法に関する。【００３９】
さらに本発明は、ＵＳＰ２１、ＵＳＰ２１をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび該組換えベクターを含有する形質転換体のうち少なくともいずれか１つ、ＴＥＲＴ、ＴＥＲＴをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび該組換えベクターを含有する形質転換体のうち少なくともいずれか１つ、並びにＮＥＤＤ８、ＮＥＤＤ８をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび該組換えベクターを含有する形質転換体のうち少なくともいずれか１つを含有してなる試薬キットに関する。
【発明の効果】
【００４０】
本発明においては、ＴＥＲＴがＵＳＰ２１およびＮＥＤＤ８それぞれと相互作用する可能性をインシリコで予測し、さらにその可能性を実験的に検証した。その結果、ＴＥＲＴがＵＳＰ２１と直接的に結合すること、ＴＥＲＴがＮＥＤＤ８化されること、ＮＥＤＤ８化されたＴＥＲＴがＵＳＰ２１により脱ＮＥＤＤ８化されること、プロテアソーム依存的にＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴが分解されることによりプロテアソーム依存的にＴＥＲＴが分解されること、およびＵＳＰ２１がＴＥＲＴを安定化することを明らかにした。【００４１】
これら実証結果から、ＴＥＲＴの分解（安定性）が、ＴＥＲＴのＮＥＤＤ８化およびＮＥＤＤ８化されたＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化により調節されていることを見出した。さらに、ＵＳＰ２１がそのシステインプロテアーゼ活性依存的に細胞核内テロメレース活性を上昇させることを明らかにした。すなわち、ＴＥＲＴのＮＥＤＤ８化およびＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を介した、プロテアソーム依存的なＴＥＲＴ分解制御機構が存在し、本機構により細胞内のテロメレース活性が調節されていることを見出した。【００４２】
したがって、ＵＳＰ２１によるＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの脱ＮＥＤＤ８化を阻害することにより、プロテアソーム、例えば２６ＳプロテアソームによるＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの分解を促進できる。プロテアソームによるＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの分解が促進されることにより、ＴＥＲＴの分解が促進され、その結果、細胞内ＴＥＲＴ量が減少する。ＴＥＲＴはテロメレースの触媒サブユニットであるため、ＴＥＲＴ量の減少によりテロメレース活性は阻害される。【００４３】
ＵＳＰ２１によるＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの脱ＮＥＤＤ８化を阻害することは、例えば、ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合を阻害することにより実施できる。したがって、ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合を阻害することにより、プロテアソーム依存的なＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの分解を促進でき、その結果、ＴＥＲＴの分解を促進し、テロメレース活性を阻害できる。【００４４】
このように本発明により、テロメレース活性を阻害することができる。そのため本発明により、テロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止および／または治療を実施できる。テロメレースは、細胞に不死化能（無限寿命）を与える機能を有し、癌細胞等の不死化細胞においてその活性が検出されている。本発明によるテロメレース活性阻害により、癌細胞の有限寿命化と染色体の不安定化による細胞死が誘導できる。したがって本発明により、例えば、癌疾患の防止および／または治療が実施できる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１−Ａ】ＴＥＲＴとＮＥＤＤ８の相互作用をインシリコで予測した結果を示す図である。ＴＥＲＴとＮＥＤＤ８の間でローカルアライメントを行い、高いスコアを示した領域を図示した。アミノ酸配列は１文字表記した。図中の数字は、ＴＥＲＴまたはＮＥＤＤ８の各アミノ酸配列における、図示した各領域のＮ末端アミノ酸の位置を意味する。（実施例１）
【図１−Ｂ】ＴＥＲＴとＵＳＰ２１の相互作用をインシリコで予測した結果を示す図である。ＴＥＲＴとＵＳＰ２１の間でローカルアライメントを行い、高いスコアを示した領域を図示した。アミノ酸配列は１文字表記した。図中の数字は、ＴＥＲＴまたはＵＳＰ２１の各アミノ酸配列における、図示した各領域のＮ末端アミノ酸の位置を意味する。（実施例１）
【図２】Ｎ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇ付加型ＴＥＲＴ（ＦＬＡＧ−ＴＥＲＴ）とＮ末端ＨＡ−ｔａｇ付加型ＵＳＰ２１（ＨＡ−ＵＳＰ２１）とを一過性共発現させた培養細胞の細胞溶解物（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）において、抗ＨＡ抗体（αＨＡ）によりＨＡ−ＵＳＰ２１の免疫沈降（ＩＰ）を行ったときにＦＬＡＧ−ＴＥＲＴの共沈降が認められた（レーン２：下パネル）ことを示す図である。ＦＬＡＧ−ＴＥＲＴの共沈降は抗ＦＬＡＧ抗体（αＦＬＡＧ）を用いたウエスタンブロッティング（ＷＢ）により検出された。一方、ＦＬＡＧ−ＴＥＲＴ単独発現細胞では抗ＨＡ抗体によるＦＬＡＧ−ＴＥＲＴの共沈降は認められなかった（レーン１：下パネル）。培養細胞におけるＨＡ−ＵＳＰ２１またはＦＬＡＧ−ＴＥＲＴの発現は、それぞれ抗ＨＡ抗体または抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロッティングで確認した（レーン１およびレーン２の上パネルおよび中パネル）。（実施例２）
【図３】Ｎ末端グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合ＵＳＰ２１（ＧＳＴ−ＵＳＰ２１）およびＮ末端ＧＳＴ融合ＵＳＰ２１不活性化型変異体（ＧＳＴ−ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａ）それぞれとＴＥＲＴとの結合が、ＧＳＴプルダウン（ＧＳＴ  ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ）法を用いたインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）結合試験において認められたこと（それぞれレーン３および４）を示す図である。一方、ＧＳＴとＴＥＲＴとの結合は認められなかった（レーン２）。（実施例２）
【図４】Ｎ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇ付加型ＴＥＲＴ（ＦＬＡＧ−ＴＥＲＴ）とＮ末端ＨＡ−ｔａｇ付加型ＮＥＤＤ８（ＨＡ−ＮＥＤＤ８）とを一過性共発現させた培養細胞の細胞溶解物（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）において、抗ＨＡ抗体（αＨＡ）によりＨＡ−ＮＥＤＤ８の免疫沈降（ＩＰ）を行ったときに、ＦＬＡＧ−ＴＥＲＴの共沈降が認められられた（レーン２：上パネル）ことを示す図である。ＦＬＡＧ−ＴＥＲＴの共沈降は抗ＦＬＡＧ抗体（αＦＬＡＧ）を用いたウエスタンブロッティング（ＷＢ）により検出された。検出された高分子領域のスメア状のシグナルは１以上のＨＡ−ＮＥＤＤ８により修飾されたＴＥＲＴ（（ＨＡ−ＮＥＤＤ８）ｎ−ＦＬＡＧ−ＴＥＲＴ）であると考えられた。一方、ＦＬＡＧ−ＴＥＲＴ単独発現細胞では抗ＨＡ抗体によるＦＬＡＧ−ＴＥＲＴの共沈降および高分子領域のスメア状のシグナルは認められなかった（レーン１：上パネル）。用いた細胞溶解物中のＦＬＡＧ−ＴＥＲＴの量は、ＦＬＡＧ−ＴＥＲＴを単独で発現させた細胞についても、ＦＬＡＧ−ＴＥＲＴとＨＡ−ＮＥＤＤ８を共発現させた細胞についても、ほぼ同等であった（それぞれレーン１および２：下パネル）。（実施例２）
【図５】ＴＥＲＴとＮ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇ付加型ＮＥＤＤ８（ＦＬＡＧ−ＮＥＤＤ８）とを一過性共発現させた培養細胞の細胞溶解物（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）において、１以上のＦＬＡＧ−ＮＥＤＤ８により修飾されたＴＥＲＴ（（ＦＬＡＧ−ＮＥＤＤ８）ｎ−ＦＬＡＧ−ＴＥＲＴ）と考えられるスメア状のシグナルが高分子領域に検出された（レーン３：上パネル）こと、および該シグナルがＮ末端ＨＡ−ｔａｇ付加型ＵＳＰ２１（ＨＡ−ＵＳＰ−２１）の共発現により顕著に減少した（レーン４：上パネル）ことを示す図である。ＴＥＲＴまたはＦＬＡＧ−ＮＥＤＤ８を単独で発現させた培養細胞の細胞溶解物では、このようなシグナルは認められなかった（それぞれレーン１および２：上パネル）。また、該シグナルの減少はＮ末端ＨＡ−ｔａｇ付加型ＵＳＰ２１不活性化型変異体（ＨＡ−ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａ）を共発現させたときには認められなかった（レーン５：上パネル）。用いた細胞溶解物中のＴＥＲＴの量は、ＴＥＲＴを単独で発現させた細胞、ＴＥＲＴとＦＬＡＧ−ＮＥＤＤ８を共発現させた細胞、ＴＥＲＴ、ＦＬＡＧ−ＮＥＤＤ８およびＨＡ−ＵＳＰ２１を共発現させた細胞、並びにＴＥＲＴ、ＦＬＡＧ−ＮＥＤＤ８およびＨＡ−ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａを共発現させた細胞のいずれの細胞についても、ほぼ同等であった（それぞれレーン１、３、４および５：中パネル）。用いた細胞溶解物中でＨＡ−ＵＳＰ２１またはＨＡ−ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａが発現されていることも確認された（レーン４および５：下パネル）。（ＦＬＡＧ−ＮＥＤＤ８）ｎ−ＦＬＡＧ−ＴＥＲＴは、抗ＴＥＲＴ抗体（αＴＥＲＴ）による免疫沈降（ＩＰ）後に、抗ＦＬＡＧ抗体（αＦＬＡＧ）を用いたウエスタンブロッティング（ＷＢ）を行うことにより検出された。ＴＥＲＴの検出は、αＴＥＲＴを用いたウエスタンブロッティングにより行った。ＨＡ−ＵＳＰ２１およびＨＡ−ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａの検出は、抗ＨＡ抗体（αＨＡ）を用いたウエスタンブロッティングにより行った。（実施例３）
【図６】プロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２で処理した細胞の細胞溶解物において（レーン２：上パネル）、ＭＧ１３２で処理しなかった細胞（レーン１：上パネル）の細胞溶解物と比較して、ＴＥＲＴ量の増加が認められたことを示す図である。内在性蛋白質であるβ−チューブリン（β−ｔｕｂｕｌｉｎ）の量に変化は認められなかった（レーン１および２：下パネル）。ＴＥＲＴおよびβ−ｔｕｂｕｌｉｎの各蛋白質は、それぞれ抗ＴＥＲＴ抗体（αＴＥＲＴ）および抗β−ｔｕｂｕｌｉｎ抗体（α  β−ｔｕｂｕｌｉｎ）を用いたウエスタンブロッティング（ＷＢ）により検出した。（実施例４）
【図７】Ｎ末端ＨＡ−ｔａｇ付加型ＵＳＰ２１（ＨＡ−ＵＳＰ２１）とＴＥＲＴとを共発現させた細胞の細胞溶解物において（レーン３：上パネル）、ＴＥＲＴを単独で発現させた細胞またはＴＥＲＴとＮ末端ＨＡ−ｔａｇ付加型ＵＳＰ２１不活性化型変異体（ＨＡ−ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａ）とを共発現させた細胞の細胞溶解物と比較して（それぞれレーン２および４：上パネル）、ＴＥＲＴ量の増加が認められたことを示す図である。内在性蛋白質であるβ−チューブリン（β−ｔｕｂｕｌｉｎ）の量に変化は認められなかった（レーン１から４：下パネル）。用いた細胞溶解物中におけるＵＳＰ２１またはＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａの各蛋白質量は、ほぼ同等であった（レーン３および４：中パネル）。ＴＥＲＴおよびβ−ｔｕｂｕｌｉｎの各蛋白質は、それぞれ抗ＴＥＲＴ抗体（αＴＥＲＴ）および抗β−ｔｕｂｕｌｉｎ抗体（α  β−ｔｕｂｕｌｉｎ）を用いたウエスタンブロッティング（Ｂｌｏｔ）により検出した。ＨＡ−ＵＳＰ２１およびＨＡ−ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａは、抗ＨＡ抗体（αＨＡ）を用いたウエスタンブロッティングにより検出した。（実施例５）
【図８−Ａ】細胞核内テロメレース活性が低いＳａＯＳ２細胞において、ＴＥＲＴと共にＮ末端ＨＡ−ｔａｇ付加型ＵＳＰ２１（ＨＡ−ＵＳＰ２１）を過剰発現させることにより、ＴＥＲＴを単独で発現させたときと比較して、細胞核内テロメレース活性（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）が上昇したことを示す図である。ＨＡ−ＵＳＰ２１の過剰発現による細胞核内テロメレース活性の上昇は、Ｎ末端ＨＡ−ｔａｇ付加型ＵＳＰ２１不活性化型変異体（ＨＡ−ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａ）の過剰発現では認められなかった。（実施例６）
【図８−Ｂ】細胞核内テロメレース活性が低いＳａＯＳ２細胞の細胞溶解物において、該細胞にＴＥＲＴと共にＮ末端ＨＡ−ｔａｇ付加型ＵＳＰ２１（ＨＡ−ＵＳＰ２１）を過剰発現させることにより、ＴＥＲＴを単独で発現させたときと比較して（レーン１：上パネル）、ＴＥＲＴ量の増加が認められたこと（レーン２：上パネル）を示す図である。ＴＥＲＴと共にＮ末端ＨＡ−ｔａｇ付加型ＵＳＰ２１不活性化型変異体（ＨＡ−ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａ）を過剰発現させた細胞の細胞溶解物においては、ＴＥＲＴ量の増加は認められなかった（レーン３：上パネル）。細胞におけるＨＡ−ＵＳＰ２１およびＨＡ−ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａの発現はウエスタンブロッティング（ＷＢ）により確認できた（それぞれレーン２および３：下パネル）。ＴＥＲＴは、抗ＴＥＲＴ抗体（αＴＥＲＴ）を用いたウエスタンブロッティング（ＷＢ）により検出した。ＨＡ−ＵＳＰ２１およびＨＡ−ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａは、抗ＨＡ抗体（αＨＡ）を用いたウエスタンブロッティングにより検出した。（実施例６）
【図９】Ｎ末端ＨＡ−ｔａｇ付加型ＵＳＰ２１（ＨＡ−ＵＳＰ２１）の過剰発現により細胞核内テロメレース活性（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）の上昇が認められたことを示す図である。このテロメレース活性の上昇は、Ｎ末端ＨＡ−ｔａｇ付加型ＵＳＰ２１不活性化型変異体（ＨＡ−ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａ）の過剰発現では認められなかった。（実施例７）
【図１０】ＨｅＬａ細胞におけるヒトＵＳＰ２１遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲにより検出した結果（レーン２および３）を示す図である。ヒトＵＳＰ２１遺伝子のｃＤＮＡ断片はエチジウムブロマイド染色により検出した。ＲＴ−ＰＣＲは、２組のプライマーペア（ｐｒｉｍｅｒ  ｐａｉｒ）、１Ｆ＆１Ｒおよび２Ｆ＆２Ｒをそれぞれ用いて実施した。レーン１はサイズマーカー（Ｓｉｚｅ  ｍａｒｋｅｒ）を示す。（実施例８）
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
以下、本発明について発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。
本明細書においては単離された若しくは合成の完全長蛋白質；単離された若しくは合成の完全長ポリペプチド；または単離された若しくは合成の完全長オリゴペプチドを意味する総称的用語として「蛋白質」という用語を使用することがある。ここで蛋白質、ポリペプチド若しくはオリゴペプチドはペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合している２個以上のアミノ酸を含むものである。以降、アミノ酸を表記する場合、１文字または３文字にて表記することがある。【００４７】
本発明においては、ＴＥＲＴがＵＳＰ２１およびＮＥＤＤ８それぞれと相互作用する可能性をインシリコで予測し、さらにその可能性を実験的に検証した。その結果、ＴＥＲＴがＵＳＰ２１と直接的に結合すること、ＴＥＲＴがＮＥＤＤ８化されること、ＮＥＤＤ８化されたＴＥＲＴがＵＳＰ２１により脱ＮＥＤＤ８化されること、プロテアソーム依存的にＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴが分解されることによりプロテアソーム依存的にＴＥＲＴが分解されること、およびＵＳＰ２１がＴＥＲＴを安定化することを明らかにした。【００４８】
これら実証結果から、ＴＥＲＴの分解（安定性）が、ＴＥＲＴのＮＥＤＤ８化およびＮＥＤＤ８化されたＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化により調節されている可能性を見出した。さらに、ＵＳＰ２１がそのシステインプロテアーゼ活性依存的に細胞核内テロメレース活性を上昇させることを明らかにした。【００４９】
一方、ＮＥＤＤ８は一次構造および立体構造レベルにおいてユビキチンと非常に高い相同性を有していることから、ユビキチン化修飾の場合と同様に、蛋白質のＮＥＤＤ８化修飾がプロテアソーム依存的な蛋白質分解のシグナルとして働いている可能性が示唆されている（非特許文献５）。また、ＭＫＲＮ１によるＴＥＲＴのユビキチン化およびプロテアソームによるユビキチン化ＴＥＲＴの分解も報告されている（非特許文献１１）。本発明において、プロテアソーム依存的にＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴが分解されることによりプロテアソーム依存的にＴＥＲＴが分解されることを実証した。本実証結果から、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴは、プロテアソームにより分解されると考える。【００５０】
以上のことから、ＴＥＲＴのＮＥＤＤ８化およびＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を介した、プロテアソーム依存的なＴＥＲＴの分解制御機構が存在し、本機構により、細胞内のテロメレース活性が調節されている可能性を見出した。このＴＥＲＴ分解制御機構に、プロテアソームが関与していると考える。すなわち、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴはプロテアソームにより分解されると考える。よって、ＴＥＲＴはＮＥＤＤ８化されることによりプロテアソームにより分解され、本分解はＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴがＵＳＰ２１により脱ＮＥＤＤ８化されることにより阻害されていると考える。【００５１】
したがって、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を阻害することにより、プロテアソーム依存的なＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの分解を促進することができる。また、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとＵＳＰ２１との結合を阻害することにより、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を阻害することができ、その結果、プロテアソーム依存的なＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの分解を促進することができる。【００５２】
ＴＥＲＴはテロメレースの触媒サブユニットであるため、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの分解を促進してＴＥＲＴ量を減少させることによりテロメレース活性は阻害される。したがって、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの分解を促進することによりテロメレース活性を阻害できる。【００５３】
これら知見に基づいて達成した本発明の一態様は、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を阻害することを特徴とする、ＴＥＲＴの分解促進方法、および該分解促進方法を用いることを特徴とする、テロメレース活性阻害方法に関する。また、本発明の別の態様は、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとＵＳＰ２１との結合を阻害することを特徴とする、ＴＥＲＴの分解促進方法、および該分解促進方法を用いることを特徴とする、テロメレース活性阻害方法に関する。本結合阻害および／または脱ＮＥＤＤ８化阻害により、プロテアソーム、例えば２６ＳプロテアソームによるＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの分解が促進され、その結果、ＴＥＲＴの分解が促進され、細胞内ＴＥＲＴ量が低下し、テロメレース活性が阻害される。【００５４】
「ＴＥＲＴ」は、テロメレースを構成する蛋白質であり、テロメレースの酵素活性の触媒サブユニットである。ＴＥＲＴ遺伝子および該遺伝子によりコードされる蛋白質として、それぞれ配列表の配列番号１および配列番号２に記載の各配列で表されるヒト由来のポリヌクレオチドおよび蛋白質を好ましく例示できる。テロメレースは、真核細胞の染色体末端のテロメア配列の伸張反応を触媒する酵素であり、テロメア長を維持することにより細胞に不死化能（無限寿命）を与える。【００５５】
「ＮＥＤＤ８」は、ユビキチンとアミノ酸レベルで約８０％の相同性を有するユビキチン様蛋白質であり、８１アミノ酸からなる。ＮＥＤＤ８遺伝子および該遺伝子によりコードされる蛋白質として、それぞれ配列表の配列番号３および配列番号４に記載の各配列で表されるヒト由来のポリヌクレオチドおよび蛋白質を好ましく例示できる。ユビキチン内のユビキチン化を受ける部位として、そのアミノ酸配列第４８番目のリジン残基が同定されている。ＮＥＤＤ８においても第４８番目のアミノ酸残基がリジン残基であることおよびＮＥＤＤ８化とユビキチン化のそれぞれの反応機構が類似していると考えられることから、ＮＥＤＤ８のアミノ酸配列第４８番目のリジン残基に別のＮＥＤＤ８がさらに共有結合（イソペプチド結合）することにより、蛋白質に複数のＮＥＤＤ８が鎖状に結合していくと考えられる（非特許文献５）。【００５６】
「ＮＥＤＤ８化」は、１分子の蛋白質に１以上のＮＥＤＤ８が共有結合することによる、ＮＥＤＤ８による該蛋白質の修飾を意味する。ＮＥＤＤ８は、標的蛋白質内のリジン残基に共有結合すると考えられる。蛋白質のユビキチン化と同様、標的蛋白質内のリジン残基に結合したＮＥＤＤ８内のリジン残基に、別のＮＥＤＤ８がさらに共有結合することにより、蛋白質には複数のＮＥＤＤ８が鎖状に結合すると考えられる。【００５７】
「ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴ」とは、ＮＥＤＤ８化されたＴＥＲＴ、すなわち１分子のＴＥＲＴに１以上のＮＥＤＤ８が共有結合することにより修飾されたＴＥＲＴを意味する。【００５８】
「プロテアソーム」は、好ましくは２６Ｓプロテアソームである。２６Ｓプロテアソームは、ユビキチン化蛋白質の選択的かつエネルギー依存的な分解に関与しているプロテアーゼ複合体である。２６Ｓプロテアソームの構成サブユニットに結合するＮＵＢ１はＮＥＤＤ８と結合することが報告されている（非特許文献７）。ＮＵＢ１は、２６Ｓプロテアソームの１９Ｓサブユニットの構成蛋白質であるＳ５ａと結合すること、さらにＮＵＢ１過剰発現によりＳ５ａと共沈降するＮＥＤＤ８化蛋白質量が増大することが報告されている（非特許文献８）。したがって、ＮＵＢ１はＮＥＤＤ８化蛋白質のＮＥＤＤ８部分を認識して結合することにより、ＮＥＤＤ８化蛋白質の２６Ｓプロテアソームへの移行を担うリクルーター蛋白質として働いていると考えられ、その後、２６ＳプロテアソームにおいてＮＥＤＤ８化蛋白質が分解されると考えられる。よって、「プロテアソーム」として好ましく２６Ｓプロテアソームを例示できる。しかし、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのプロテアソームによる分解機構に関与するプロテアソームは２６Ｓプロテアソームに限らず、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの分解機構に関与する限りにおいて、いずれのプロテアソームであってもよい。【００５９】
「プロテアソーム依存的なＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの分解」とは、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴが、リクルーター蛋白質、例えばＮＵＢ１の作用によりプロテアソームへ移行した後、プロテアソームにおいて分解される一連の反応を意味する。【００６０】
本発明において、ＵＳＰ２１とＴＥＲＴが結合することを明らかにした（実施例２参照）。さらに、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴがＵＳＰ２１により脱ＮＥＤＤ８化されることを確認した（実施例３参照）。【００６１】
このことから、ＵＳＰ２１がＴＥＲＴと結合した後、該ＴＥＲＴが細胞内のＮＥＤＤ８化機構によりＮＥＤＤ８化され、その結果生成したＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴが該ＵＳＰ２１により脱ＮＥＤＤ８化されると考えることができる。【００６２】
「ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化」とは、ＵＳＰ２１がＴＥＲＴと結合した後、該ＴＥＲＴが細胞内のＮＥＤＤ８化機構によりＮＥＤＤ８化され、その結果生成したＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴから、該ＵＳＰ２１のシステインプロテアーゼ活性依存的にＮＥＤＤ８が遊離する一連の反応を意味する。【００６３】
このことから、ＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合を阻害することにより、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化が阻害されると考える。【００６４】
したがって、本発明の別の一態様は、ＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合を阻害することを特徴とする、ＴＥＲＴの分解促進方法、および該分解促進方法を用いることを特徴とするテロメレース活性阻害方法に関する。本結合阻害により、プロテアソーム、例えば２６ＳプロテアソームによるＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの分解が促進され、その結果、ＴＥＲＴの分解が促進され、細胞内ＴＥＲＴ量が低下し、テロメレース活性が阻害される。【００６５】
「ＵＳＰ２１」は、システインプロテアーゼの一つであり、ユビキチン化蛋白質およびＮＥＤＤ８化蛋白質からそれぞれユビキチンおよびＮＥＤＤ８を切断する脱ユビキチン化／脱ＮＥＤＤ８化酵素としての活性を有していることが報告されている（非特許文献９）。ＵＳＰ２１遺伝子および該遺伝子によりコードされる蛋白質として、それぞれ配列表の配列番号５および配列番号６に記載の各配列で表されるヒト由来のポリヌクレオチドおよび蛋白質を好ましく例示できる。【００６６】
ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化の検出は、例えば、ＴＥＲＴの発現またはテロメレース活性が認められた真核細胞または培養細胞株を用いて、該細胞または細胞株にＵＳＰ２１を一過性に発現させ、該細胞または細胞株の細胞溶解液中のＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴ量および／またはＴＥＲＴ量を測定することにより実施できる（実施例３参照）。ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴ量およびＴＥＲＴ量は、公知のウエスタンブロット法等により測定できる。テロメレース活性は、例えばトラップ法（ＴＲＡＰ法）等公知のテロメレース活性測定方法により測定できる。ＴＥＲＴのＮＥＤＤ８化は細胞が有する内在性のＮＥＤＤ８化機構により行なわれる。脱ＮＥＤＤ８化した後、細胞溶解液中のＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴ量が減少若しくは消失する場合、または細胞溶解液中のＴＥＲＴ量が増大若しくは発生する場合には、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴがＵＳＰ２１により脱ＮＥＤＤ８化されたと判定できる。細胞は、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴを一過性に発現させた細胞を用いることもできる。細胞におけるＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの発現は、ＴＥＲＴをコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターとＮＥＤＤ８をコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターとを用いて慣用の遺伝子工学的手法でこれらを細胞にトランスフェクションすることにより達成できる。【００６７】
ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化の検出は、例えば、テロメレース活性が認められない真核細胞または培養細胞株（例えばＳａＯＳ２細胞等）を用いて、該細胞または細胞株にＵＳＰ２１およびＴＥＲＴを一過性に発現させ、該細胞または細胞株の核抽出液が示すテロメレース活性を測定することにより実施できる（実施例６参照）。テロメレース活性は、例えばトラップ法（ＴＲＡＰ法）等公知のテロメレース活性測定方法により測定できる。ＴＥＲＴのＮＥＤＤ８化は、細胞が有する内在性のＮＥＤＤ８化機構により行われる。脱ＮＥＤＤ８化した後、核抽出液が示すテロメレース活性が増大または発生する場合には、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴがＵＳＰ２１により脱ＮＥＤＤ８化されたと判定できる。また、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化は、例えば、内在性テロメレース活性を示す細胞または細胞株（例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞等）を用いて、該細胞または細胞株にＵＳＰ２１を一過性に発現させ、該細胞または細胞株の核抽出液が示すテロメレース活性により検出することもできる（実施例７参照）。【００６８】
ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化の阻害の検出は、例えば、ＴＥＲＴの発現またはテロメレース活性が認められた真核細胞または培養細胞株を用いて、該細胞または細胞株にＵＳＰ２１を一過性に発現させ、該細胞または細胞株の細胞溶解液中のＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴ量および／またはＴＥＲＴ量を測定することにより実施できる（実施例３参照）。ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴ量およびＴＥＲＴ量は、公知のウエスタンブロット法等により測定できる。テロメレース活性は、例えばトラップ法（ＴＲＡＰ法）等公知のテロメレース活性測定方法により測定できる。ＴＥＲＴのＮＥＤＤ８化は細胞が有する内在性のＮＥＤＤ８化機構により行なわれる。脱ＮＥＤＤ８化を阻害した後、阻害しない場合と比較して、細胞溶解液中のＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴ量が増加若しくは発生する場合、または細胞溶解液中のＴＥＲＴ量が減少若しくは消失する場合には、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化が阻害されたと判定できる。細胞は、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴを一過性に発現させた細胞を用いることもできる。細胞におけるＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの発現は、ＴＥＲＴをコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターとＮＥＤＤ８をコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターとを用いて慣用の遺伝子工学的手法でこれらを細胞にトランスフェクションすることにより達成できる。【００６９】
ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化の阻害の検出は、例えば、テロメレース活性が認められない真核細胞または培養細胞株（例えばＳａＯＳ２細胞等）を用いて、該細胞または細胞株にＵＳＰ２１およびＴＥＲＴを一過性に発現させ、該細胞または細胞株の核抽出液が示すテロメレース活性を測定することにより実施できる（実施例６参照）。テロメレース活性は、例えばトラップ法（ＴＲＡＰ法）等公知のテロメレース活性測定方法により測定できる。ＴＥＲＴのＮＥＤＤ８化は、細胞が有する内在性のＮＥＤＤ８化機構により行われる。脱ＮＥＤＤ８化を阻害した後、阻害しない場合と比較して、核抽出液が示すテロメレース活性が減弱または消失する場合には、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化が阻害されたと判定できる。また、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化の阻害の検出は、例えば、内在性テロメレース活性を示す細胞または細胞株（例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞等）を用いて、該細胞または細胞株にＵＳＰ２１を一過性に発現させ、該細胞または細胞株の核抽出液が示すテロメレース活性を測定することにより実施することもできる（実施例７参照）。【００７０】
「ＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合」とは、ＵＳＰ２１とＴＥＲＴとが、複合体を形成するように、水素結合、疎水結合または静電的相互作用等の非共有結合により相互作用することを意味する。ここでの結合とは、ＵＳＰ２１とＴＥＲＴがその一部分において結合すれば足りる。例えば、ＵＳＰ２１またはＴＥＲＴを構成するアミノ酸の中に、ＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合に関与しないアミノ酸が含まれていてもよい。【００７１】
「ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合」とは、ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとが、複合体を形成するように、水素結合、疎水結合または静電的相互作用等の非共有結合により相互作用することを意味する。ここでの結合とは、ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴがその一部分において結合すれば足りる。例えば、ＵＳＰ２１またはＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴを構成するアミノ酸の中に、ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合に関与しないアミノ酸が含まれていてもよい。【００７２】
本発明において、ＵＳＰ２１とＴＥＲＴが結合することを明らかにした（実施例２参照）。さらに、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴがＵＳＰ２１により脱ＮＥＤＤ８化されることを確認した（実施例３参照）。このことから、ＵＳＰ２１がＴＥＲＴと結合した後、該ＴＥＲＴが細胞内のＮＥＤＤ８化機構によりＮＥＤＤ８化され、その結果生成したＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴが該ＵＳＰ２１により脱ＮＥＤＤ８化されると考えることができる。したがって、ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合として、例えば、ＵＳＰ２１またはその一部分とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴを構成するＴＥＲＴまたはその一部分との結合を例示できる。【００７３】
ＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合を阻害するまたはＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合を阻害することにより、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化が阻害される。その結果、プロテアソーム依存的なＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの分解が促進される。本促進の結果、ＴＥＲＴの分解が促進され、テロメレース活性が阻害される。【００７４】
ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴまたはＴＥＲＴとの結合の検出は、免疫沈降法、プルダウン法、ツーハイブリッド法、ウエスタンブロット法および蛍光共鳴エネルギー転移法等の自体公知の方法により、またはこれらの方法を組合わせて用いることにより実施できる。ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴは、例えば、ＮＥＤＤ８およびＴＥＲＴを細胞、例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一過性に発現させ、該細胞内のＮＥＤＤ８化機構によりＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴを生成させることにより取得できる。該細胞に含まれるＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの精製は、例えば、該細胞の細胞溶解液から、抗ＴＥＲＴ抗体および抗ＮＥＤＤ８抗体を用いた免疫沈降法またはアフィニティクロマトグラフィー法等により実施できる。【００７５】
ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴまたはＴＥＲＴとの結合の検出を実施するとき、ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合に続くＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化反応の進行を阻害するために、ＵＳＰ２１のシステインプロテアーゼ活性に必要な還元剤、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはβメルカプトエタノールを本結合反応液に混在させないことが好ましい。または、ＵＳＰ２１の不活性化型変異体であって、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合能を有するＵＳＰ２１変異体を用いることも好ましい。このような変異体として、ＵＳＰ２１のシステインプロテアーゼ活性の活性部位である第２２１番目のシステインを他のアミノ酸、例えば、アラニンまたはセリン等に置換したＵＳＰ２１変異体を例示できる。【００７６】
ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴまたはＴＥＲＴとの結合の阻害の検出は、前記のＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴまたはＴＥＲＴとの結合を検出する方法を用いて実施できる。例えば、ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴまたはＴＥＲＴとの結合により生じるシグナルが、該結合を阻害する前と比較して低減または消失する場合には、該結合が阻害されたと判定できる。【００７７】
ＴＥＲＴ、ＮＥＤＤ８、ＵＳＰ２１およびこれらの遺伝子は上記各配列で表されるものに限らず、一般に知られている機能を有する限りにおいて、上記各配列において１乃至数個の変異を有する蛋白質および遺伝子であることができる。また、これらの機能を促進するあるいは欠失させるといった所望の目的のために、上記各配列に１乃至数個の変異を導入した変異体を用いることもできる。【００７８】
ＴＥＲＴ、ＮＥＤＤ８およびＵＳＰ２１をそれぞれコードする遺伝子は、例えば、各遺伝子の発現が認められる適当な起源（例えば、ヒト脳、腎臓、胸腺および乳癌由来の細胞）から、自体公知のクローニング方法等を用いて容易に取得できる。これら遺伝子によりコードされる蛋白質は、例えば、それぞれの遺伝子を用いた自体公知の遺伝子工学的手法により取得できる。例えば、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴは、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴを発現させた細胞の細胞溶解物から抗ＴＥＲＴ抗体等を用いて得られる免疫沈降物として調製できる。ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの発現は、ＮＥＤＤ８をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよびＴＥＲＴをコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを自体公知の方法により細胞に導入することにより実施できる。細胞内で発現されたＮＥＤＤ８およびＴＥＲＴは、細胞に内在するＮＥＤＤ８化機構により、該細胞内においてＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴを生じる。ＮＥＤＤ８化機構が存在する細胞として、例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞を例示できる。【００７９】
プロテアソームは、プロテアソームを有する細胞から調製することができる。好ましい細胞として、例えば、ヒト赤血球を例示できる。プロテアソームの調製は、エマーリッチらの方法（「ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２０００年、第２７５巻、ｐ．２１１４０−２１１４８）に従って実施できる。あるいは、市販のプロテアソームを用いることもできる。例えば、アフィニティーリサーチプロダクツ社（ＡＦＦＩＮＩＴＩ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌｔｄ．、ＵＫ）からプロテアソームを購入することができる。【００８０】
ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化の阻害は、例えば、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を阻害する化合物を用いることにより実施できる。ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合の阻害は、例えばＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合を阻害する化合物を用いることにより実施できる。ＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合の阻害は、例えばＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合を阻害する化合物を用いることにより実施できる。ここでは、このような阻害効果を有する化合物（後述する例として競合阻害効果を有するポリペプチド類、抗体および低分子化合物等が挙げられる）を阻害剤と称する。【００８１】
ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を阻害する化合物として、例えば、ＵＳＰ２１のシステインプロテアーゼ活性を低減し得る化合物が挙げられる。このような化合物として、システインプロテアーゼ阻害剤を例示できる。システインプロテアーゼ阻害剤は、ＵＳＰ２１のシステインプロテアーゼ活性を特異的に阻害する阻害剤が好ましい。ＵＳＰ２１のシステインプロテアーゼ活性を特異的に阻害するとは、ＵＳＰ２１のシステインプロテアーゼ活性を強く阻害するが、他の酵素の酵素活性を阻害しないか、弱く阻害することを意味する。【００８２】
ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を阻害する化合物として、例えば、ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合を阻害する化合物が挙げられる。ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合を阻害する化合物として、好ましくは当該結合を特異的に阻害する化合物、より好ましくは当該結合を特異的に阻害する低分子量化合物が挙げられる。ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合を特異的に阻害するとは、当該結合を強く阻害するが、他の蛋白質間結合は阻害しないか、弱く阻害することを意味する。【００８３】
ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を阻害する化合物として、また、例えば、ＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合を阻害する化合物が挙げられる。ＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合を阻害する化合物として、好ましくは当該結合を特異的に阻害する化合物、より好ましくは当該結合を特異的に阻害する低分子量化合物が挙げられる。ＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合を特異的に阻害するとは、当該結合を強く阻害するが、他の蛋白質間結合は阻害しないか、弱く阻害することを意味する。【００８４】
ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合を阻害する化合物として、ＵＳＰ２１の不活性化型変異体が挙げられる。好ましい不活性化型変異体として、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合能を有する不活性化型変異体を例示できる。このような不活性化型変異体は、野生型のＵＳＰ２１と拮抗してＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴと結合することにより、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴに対するＵＳＰ２１の作用を阻害することができる。このような不活性化型変異体は、後述のＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合を阻害する化合物の同定方法を実施することにより、同定できる。【００８５】
ＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合を阻害する化合物として、ＵＳＰ２１の不活性化型変異体が挙げられる。好ましい不活性化型変異体として、ＴＥＲＴとの結合能を有する不活性化型変異体を例示できる。このような不活性化型変異体は、野生型のＵＳＰ２１と拮抗してＴＥＲＴと結合することにより、ＴＥＲＴに対するＵＳＰ２１の作用を阻害することができる。このような不活性化型変異体は、後述のＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合を阻害する化合物の同定方法を実施することにより、同定できる。【００８６】
「ＵＳＰ２１の不活性化型変異体」とは、ＵＳＰ２１に、アミノ酸の欠失、置換、付加または挿入等の変異が導入されたＵＳＰ２１であって、ＵＳＰ２１（野生型のＵＳＰ２１）と比較してシステインプロテアーゼ活性が減弱したまたは消失したＵＳＰ２１を意味する。ＵＳＰ２１の不活性化型変異体は、天然に存在するものであってもよく、人工的に変異を導入したものであってもよい。このような変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマーの技術（ウルマー（Ｋ．Ｍ．Ｕｌｍｅｒ）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１）を利用して実施できる。変異部位は、例えば、ＵＳＰ２１のアミノ酸配列においてＵＳＰ２１のシステインプロテアーゼ活性に必要な部位を例示できる。具体的には、本部位として、第２２１番目のシステインを例示できる。該システインはシステインプロテアーゼの活性部位であり、ＵＳＰ２１のシステインプロテアーゼ活性に必須なアミノ酸残基である（非特許文献９）。【００８７】
ＵＳＰ２１の不活性化型変異体（以下、不活性化型ＵＳＰ２１と称することがある）とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合は、前記ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合の検出方法と同様の方法により検出できる。【００８８】
ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合を阻害する化合物として、ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとが結合する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドを例示できる。ＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合を阻害する化合物として、ＵＳＰ２１とＴＥＲＴとが結合する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドを例示できる。このようなポリペプチドは、蛋白質間の結合を競合的に阻害することができる。このようなポリペプチドは、ＵＳＰ２１またはＴＥＲＴのアミノ酸配列から設計し、自体公知のペプチド合成法により合成したものから、ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合またはＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合を阻害するものを選択することにより得ることができる。このように特定されたポリペプチドに、１乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入したものも本発明の範囲に包含される。このような変異を導入したポリペプチドは、ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合またはＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合を阻害するものが好ましい。変異を有するポリペプチドは天然に存在するものであってよく、また人工的に変異を導入したものであってもよい。このような変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマーの技術（ウルマー（Ｋ．Ｍ．Ｕｌｍｅｒ）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１）を利用して実施できる。このような変異の導入において、当該ポリペプチドの基本的な性質（物性、機能または免疫学的活性等）を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。さらに、これら利用できるポリペプチドは、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度に改変することができる。【００８９】
上記ポリペプチドは、ペプチド化学において知られる一般的な方法で製造できる。例えば、成書（「ペプチド合成」、丸善株式会社、１９７５年および「ペプチド  シンテシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、インターサイエンス（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９９６年）に記載の方法を例示できるが、これらに限らず公知の方法が広く利用できる。具体的には、通常の液相法および固相法によるペプチド合成法、例えばＦｍｏｃ法等を挙げることができる。または市販のアミノ酸合成装置を用いてペプチドを製造することができる。あるいは遺伝子工学的手法によりペプチドを取得することもできる。例えば目的とするポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞中で発現できる組換え発現ベクターを作成し、これを適当な宿主細胞、例えば大腸菌にトランスフェクションして形質転換した後に該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から目的とするポリペプチドを回収することにより製造することができる。【００９０】
ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合の阻害は、ＵＳＰ２１またはＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴを認識する抗体であって、ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合を阻害する抗体を用いることによっても実施できる。かかる抗体は、ＵＳＰ２１またはＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴ自体、またはこれら蛋白質の断片、好ましくはＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとが結合する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原として自体公知の抗体作製法により得ることができる。【００９１】
ＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合の阻害は、ＵＳＰ２１またはＴＥＲＴを認識する抗体であって、ＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合を阻害する抗体を用いることによっても実施できる。かかる抗体は、ＵＳＰ２１またはＴＥＲＴ自体、またはこれら蛋白質の断片、好ましくはＵＳＰ２１とＴＥＲＴとが結合する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原として自体公知の抗体作製法により得ることができる。【００９２】
ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合の阻害は、また、ＵＳＰ２１の発現を阻害する化合物によって実施することができる。ＵＳＰ２１の発現を阻害する化合物として、ＵＳＰ遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドを例示できる。また、ＵＳＰ２１の発現をＲＮＡ干渉の手法により低下または消失させ得るｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）もＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合を阻害する化合物として例示できる。【００９３】
ＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合の阻害は、また、ＵＳＰ２１の発現を阻害する化合物によって実施することができる。ＵＳＰ２１の発現を阻害する化合物として、ＵＳＰ遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドを例示できる。また、ＵＳＰ２１の発現をＲＮＡ干渉の手法により低下または消失させ得るｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）もＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合を阻害する化合物として例示できる。【００９４】
本発明の別の一態様は、本発明に係るＴＥＲＴの分解促進方法を用いることを特徴とする、テロメレース活性阻害方法に関する。【００９５】
「テロメレース活性阻害」とは、テロメレースを構成するＴＥＲＴが分解された結果、ＴＥＲＴの分解前と比較して、テロメレース活性が低下するまたは消失することを意味する。テロメレースは、鋳型となるＲＮＡ分子であるテロメレースＲＮＡと触媒サブユニットであるＴＥＲＴからなるリボ核蛋白質である。本発明においては、ＴＥＲＴのＮＥＤＤ８化およびＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を介した、プロテアソーム依存的なＴＥＲＴの分解制御機構が存在し、このＴＥＲＴ分解制御機構により細胞内のテロメレース活性が調節されている可能性を見出した。一方、ＴＥＲＴ遺伝子を発現しておらずＴＲ遺伝子のみを発現しているＳａＯＳ２細胞（ヒト骨肉種細胞）は、テロメレース活性を有さないことが知られている。このことから、テロメレース活性は、ＴＥＲＴ量により調節されていると考えることができる。したがって、本発明に係るＴＥＲＴの分解促進方法を用い、細胞内のＴＥＲＴ量を低減させることにより、テロメレース活性を阻害することができる。【００９６】
本発明の別の一態様は、ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合を阻害する化合物の同定方法に関する。本化合物の同定方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して実施できる。例えば、調べようとする化合物（以下、被検化合物と称する）とＵＳＰ２１および／またはＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの相互作用を可能にする条件を選択し、当該条件下で、被検化合物とＵＳＰ２１および／またはＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとを接触させ、ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合を検出することができるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合を阻害する化合物を同定できる。【００９７】
さらに、本発明の別の一態様は、ＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合を阻害する化合物の同定方法に関する。本化合物の同定方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して実施できる。例えば、被検化合物とＵＳＰ２１および／またはＴＥＲＴとの相互作用を可能にする条件を選択し、当該条件下で、被検化合物とＵＳＰ２１とおよび／またはＴＥＲＴとを接触させ、ＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合を検出することができるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、ＵＳＰ２１とＴＥＲＴの結合を阻害する化合物を同定できる。【００９８】
ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合を阻害する化合物の同定方法において、被検化合物をＵＳＰ２１および／またはＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴと予め接触させ、その後にＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合反応を行なうことも可能であり、または被検化合物をこれらの結合反応に共存させることも可能である。被検化合物とＵＳＰ２１および／またはＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの相互作用を可能にする条件は、インビトロのものであってよく、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）のものであってもよい。例えばＴＥＲＴの発現またはテロメレース活性が認められた真核細胞または培養細胞株を用いることができる。また、ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとを共発現させた細胞を用いることもできる。細胞における発現は、ＵＳＰ２１をコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクター、ＴＥＲＴをコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターおよびＮＥＤＤ８をコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターとを用いて慣用の遺伝子工学的手法でこれらベクターを細胞にトランスフェクションすることにより達成できる。【００９９】
ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合を阻害する化合物の同定方法において、例えばＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合により生じるシグナルまたは該結合のマーカーが、被検化合物をＵＳＰ２１および／またはＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴと接触させたときに低下あるいは消失する等の変化を示す場合、当該被検化合物はＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合を阻害すると判定できる。ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合は、簡便には、これら蛋白質の結合の存在若しくは不存在の検出および／または結合量の変化の測定により判定できる。これら蛋白質の結合の検出は、自体公知の蛋白質の検出方法、例えばウエスタンブロット法等を用いて実施できる。【０１００】
ＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合を阻害する化合物の同定方法において、被検化合物をＵＳＰ２１および／またはＴＥＲＴと予め接触させ、その後にＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合反応を行なうことも可能であり、または被検化合物をこれらの結合反応に共存させることも可能である。被検化合物とＵＳＰ２１および／またはＴＥＲＴとの相互作用を可能にする条件は、インビトロのものであってよく、インビボのものであってもよい。例えばＴＥＲＴの発現またはテロメレース活性が認められた真核細胞または培養細胞株を用いることができる。また、ＵＳＰ２１とＴＥＲＴとを共発現させた細胞を用いることもできる。細胞における発現は、ＵＳＰ２１をコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターおよびＴＥＲＴをコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターを用いて慣用の遺伝子工学的手法でこれらベクターを細胞にトランスフェクションすることにより達成できる。【０１０１】
ＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合を阻害する化合物の同定方法において、例えばＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合により生じるシグナルまたは該結合のマーカーが、被検化合物をＵＳＰ２１および／またはＴＥＲＴと接触させたときに低下あるいは消失する等の変化を示す場合、当該被検化合物はＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合を阻害すると判定できる。ＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合は、簡便には、これら蛋白質の結合の存在若しくは不存在の検出および／または結合量の変化の測定により判定できる。これら蛋白質の結合の検出は、自体公知の蛋白質の検出方法、例えばウエスタンブロット法等を用いて実施できる。【０１０２】
ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合を阻害する化合物の同定方法は、例えば、ＧＳＴ融合ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとをインビトロで反応させて、グルタチオン樹脂を用いたプルダウン法により両蛋白質の結合を検出する試験系を用いて実施できる。両蛋白質の結合は、ウエスタンブロット法等を用いて検出できる。【０１０３】
このような試験系において、ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとが結合した後、ＵＳＰ２１のシステインプロテアーゼ活性によるＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴからのＮＥＤＤ８の遊離を抑制または停止するために、ＵＳＰ２１のシステインプロテアーゼ活性に必要な還元剤、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはβメルカプトエタノールを試験系に混在させないことが好ましい。または、ＵＳＰ２１の不活性化型変異体であって、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合能を有するＵＳＰ２１変異体を用いることも好ましい。このような変異体として、ＵＳＰ２１のシステインプロテアーゼ活性の活性部位である第２２１番目のシステインを他のアミノ酸、例えば、アラニンまたはセリン等に置換したＵＳＰ２１変異体を例示できる。【０１０４】
このような試験系において、被検化合物を共存させたときに検出される両蛋白質の結合の量が、共存させないときに検出される結合の量と比較し、低減または消失する場合には、被検化合物は該結合を阻害すると判定できる。【０１０５】
本発明において、ＵＳＰ２１とＴＥＲＴが結合することを明らかにした（実施例２参照）。さらに、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴがＵＳＰ２１により脱ＮＥＤＤ８化されることを確認した（実施例３参照）。このことから、ＵＳＰ２１がＴＥＲＴと結合した後、該ＴＥＲＴが細胞内のＮＥＤＤ８化機構によりＮＥＤＤ８化され、その結果生成したＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴが該ＵＳＰ２１により脱ＮＥＤＤ８化されると考えることができる。したがって、ＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合阻害により、ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合を阻害することができると考える。よって、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの代わりにＴＥＲＴを用いて本同定方法を実施することもできる。【０１０６】
ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合を阻害する化合物の同定方法は、例えば、上述のＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合の測定方法を利用して実施できる。具体的には、適当な動物細胞に、標識物質で標識化したＵＳＰ２１と該標識物質とは別の標識物質で標識化したＴＥＲＴとを発現させて得られた細胞を用いて細胞内における結合反応を検出する試験系（実施例２参照）を用いて実施できる。このような試験系におけるＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合の検出は、免疫沈降法やウエスタンブロッティング等の公知方法で実施できる。このような試験系に被検化合物を共存させたとき、被検化合物の非共存下における結果と比較して、結合する蛋白質量が減少するあるいは結合が検出されなくなる場合、該被検化合物はＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合およびＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合を阻害すると判定できる。【０１０７】
ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合を阻害する化合物の同定方法は、また、ＧＳＴ融合ＵＳＰ２１とＴＥＲＴとをインビトロで反応させて、グルタチオン樹脂を用いたプルダウン法により両蛋白質の結合を検出する試験系（実施例２参照）を用いて実施できる。このような試験系におけるＧＳＴ融合ＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合の検出は、（ｉ）ＴＥＲＴを予め標識物質で標識しておき、（ｉｉ）ＧＳＴ融合ＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合反応を行い、（ｉｉｉ）グルタチオンセファロースと反応生成物を混合し、（ｉｖ）ＧＳＴ融合ＵＳＰ２１とＴＥＲＴの複合体を分画し、その後、（ｖ）該複合体に含まれる標識物質を検出することにより実施できる。標識物質は、一般に蛋白質の検出に使用されている標識物質であればいずれも使用できる。例えば、３５Ｓ等の放射性同位体等が好ましく例示できる。このような試験系に被検化合物を共存させたときに検出される標識物質の量が、被検化合物の非共存下において検出される標識物質の量と比較して低減するまたは消失する場合、該被検化合物はＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合およびＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合を阻害すると判定できる。【０１０８】
ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合を阻害する化合物の同定方法に用いる試験系として、公知のツーハイブリッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）法を用いることもできる。例えば、ＵＳＰ２１とＤＮＡ結合蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、ＴＥＲＴと転写活性化蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、および適切なプロモーター遺伝子に接続したレポーター遺伝子を含有するプラスミドを酵母、真核細胞等に導入し、被検化合物を共存させた場合のレポーター遺伝子の発現量を被検化合物非存在下でのレポーター遺伝子の発現量とを比較することにより達成できる。被検化合物を共存させた場合のレポーター遺伝子の発現量が被検化合物非存在下でのレポーター遺伝子の発現量と比較して減少する場合、該被検化合物はＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合およびＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合を阻害する作用を有すると判定できる。レポーター遺伝子として、ｌａｃＺを例示できる。【０１０９】
本発明の別の一態様は、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を阻害する化合物の同定方法に関する。本化合物の同定方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して実施できる。例えば、調べようとする化合物（以下、被検化合物と称する）とＵＳＰ２１および／またはＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの相互作用を可能にする条件を選択し、当該条件下で、被検化合物とＵＳＰ２１および／またはＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとを接触させ、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を検出することができるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を阻害する化合物を同定できる。【０１１０】
ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を阻害する化合物の同定方法において、被検化合物をＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴと予め接触させ、その後にＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化反応を行なうことも可能であり、または被検化合物を該反応に共存させることもできる。被検化合物とＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの相互作用を可能にする条件は、インビトロのものであってよく、インビボのものであってもよい。例えばＴＥＲＴの発現またはテロメレース活性が認められた真核細胞または培養細胞株を用いることができる。また、ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとを共発現させた細胞を用いることもできる。細胞における発現は、ＵＳＰ２１をコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクター、ＴＥＲＴをコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターおよびＮＥＤＤ８をコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターとを用いて慣用の遺伝子工学的手法でこれらベクターを細胞にトランスフェクションすることにより達成できる。【０１１１】
ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を阻害する化合物の同定方法において、例えばＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化により生じるシグナルまたは該脱ＮＥＤＤ８化のマーカーが、被検化合物をＵＳＰ２１および／またはＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴと接触させたときに低下あるいは消失する等の変化を示す場合、当該被検化合物はＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を阻害すると判定できる。【０１１２】
本発明において、ＵＳＰ２１がＴＥＲＴと結合した後、該ＴＥＲＴが細胞内のＮＥＤＤ８化機構によりＮＥＤＤ８化され、その結果生成したＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴが該ＵＳＰ２１により脱ＮＥＤＤ８化され、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴ量が減少すると考えることができることを示した。ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴがＵＳＰ２１により脱ＮＥＤＤ８化されてその量が減少するのに伴い、ＴＥＲＴ量は増加すると考えられる。したがって、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化および該脱ＮＥＤＤ８化の阻害を、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴ量およびＴＥＲＴ量により検出することができる。よって、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を阻害する化合物の同定方法を、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴ量および／またはＴＥＲＴ量を指標として実施することができる。ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴ量を指標として本同定方法を実施する場合、被検化合物を用いる前と比較して、被検化合物によりＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴ量が増大または発生するときには、該被検化合物はＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を阻害すると判定できる。また、ＴＥＲＴ量を指標として本同定方法を実施する場合、被検化合物によりＴＥＲＴ量が減少または消失するときには、該被検化合物はＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を阻害すると判定できる。【０１１３】
ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を阻害する化合物の同定方法は、例えば、ＵＳＰ２１、ＴＥＲＴおよびＮＥＤＤ８を一過性に共発現させた細胞の細胞溶解液から、ウエスタンブロッティングによりＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴおよびＴＥＲＴを検出する試験系を用いて実施できる（実施例３参照）。このような試験系におけるＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴおよびＴＥＲＴの検出は、ＮＥＤＤ８および／またはＴＥＲＴを予め標識しておき、その標識物質を検出することにより実施できる。例えば、標識物質としてＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇ等を好ましく例示できる。このような試験系において、被検化合物を共存させたときに検出されるＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの量が、共存させないときに検出されるＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの量と比較して、増大または発生する場合には、被検化合物はＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を阻害すると判定できる。また、被検化合物を共存させたときに検出されるＴＥＲＴの量が、共存させないときに検出されるＴＥＲＴの量と比較して、減少または消失する場合にも、被検化合物はＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を阻害すると判定できる。なお、被検化合物を共存させたときに検出されるＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴおよびＴＥＲＴの総量が、被検化合物を共存させないときに検出されるこれらの総量と実質的に等しい場合が好ましい。【０１１４】
本発明においては、ＵＳＰ２１がＴＥＲＴと結合した後、該ＴＥＲＴが細胞内のＮＥＤＤ８化機構によりＮＥＤＤ８化され、その結果生成したＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴが該ＵＳＰ２１により脱ＮＥＤＤ８化されることにより、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴ量が減少する一方、ＴＥＲＴ量が増加すると考えることができることを示した。また、ＴＥＲＴはＮＥＤＤ８化されることによりプロテアソームにより分解されると考えることができることを示した。ＴＥＲＴがテロメレースの触媒サブユニットであることを考慮すると、ＴＥＲＴ量の増加によって、細胞核内テロメレース活性が上昇すると考えることができる。したがって、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴの脱ＮＥＤＤ８化、該脱ＮＥＤＤ８化の阻害を、テロメレース活性により検出することができる。よって、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を阻害する化合物の同定方法を、テロメレース活性を指標として実施することができる。テロメレース活性を指標として本同定方法を実施する場合、被検化合物を用いる前と比較して、被検化合物によりテロメレース活性が減少または消失するときには、該被検化合物はＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を阻害すると判定できる。【０１１５】
ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を阻害する化合物の同定方法は、例えば、ＵＳＰ２１およびＴＥＲＴを一過性に共発現させた細胞の核抽出液が示すテロメレース活性を自体公知のテロメレース活性測定方法により測定する試験系を用いて実施できる（実施例６参照）。テロメレース活性測定方法として、トラップ（ＴＲＡＰ）法を好ましく例示できる。用いられる細胞として、内在性テロメレース活性を有さない動物細胞を好ましく例示できる。より好ましくはＳａＯＳ２細胞（ヒト骨肉腫細胞株）を用いることができる。このような試験系において、被検化合物を共存させたときに検出されるテロメレース活性が、共存させないときに検出されるテロメレース活性と比較して、低減または消失する場合には、被検化合物はＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を阻害すると判定できる。【０１１６】
ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を阻害する化合物の同定方法は、例えば、ＵＳＰ２１を一過性に発現させた細胞の核抽出液が示すテロメレース活性を自体公知のテロメレース活性測定方法により測定する試験系を用いて実施できる（実施例７参照）。テロメレース活性測定方法として、トラップ（ＴＲＡＰ）法を好ましく例示できる。用いられる細胞として、内在性テロメレース活性を有する動物細胞を好ましく例示できる。より好ましくはＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いることができる。このような試験系において、被検化合物を共存させたときに検出されるテロメレース活性が、共存させないときに検出されるテロメレース活性と比較して、低減または消失する場合には、被検化合物はＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を阻害すると判定できる。【０１１７】
ＴＥＲＴ、ＮＥＤＤ８およびＵＳＰ２１は、これらを遺伝子工学的手法で発現させた細胞や生体試料から調製したもの、無細胞系合成産物または化学合成産物であってよく、あるいはこれらからさらに精製されたものであってもよい。また、ＴＥＲＴ、ＮＥＤＤ８およびＵＳＰ２１を遺伝子工学的手法で発現させた細胞を使用することもできる。ＴＥＲＴ、ＮＥＤＤ８およびＵＳＰ２１は、その性質や機能に影響がない限りにおいて、Ｎ末端側やＣ末端側に別の蛋白質やポリペプチド、例えばＧＳＴ、β−ガラクトシダーゼ、ＩｇＧ等の免疫グロブリンＦｃ断片、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、またはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のｔａｇペプチド類を、直接的にまたはリンカーペプチド等を介して間接的に、遺伝子工学的手法等を用いて付加してもよい。ＴＥＲＴ、ＮＥＤＤ８およびＵＳＰ２１の性質や機能として、例えば、ＴＥＲＴとＮＥＤＤ８の結合、ＴＥＲＴとＵＳＰ２１の結合、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとＮＵＢ１の結合、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとＳ５ａの結合、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとＵＳＰ２１の結合、ＵＳＰ２１のシステインプロテアーゼ活性、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化等が挙げられる。【０１１８】
被検化合物は、例えば化学ライブラリーや天然物由来の化合物、またはＴＥＲＴ、ＵＳＰ２１およびＮＥＤＤ８の一次構造や立体構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等が挙げられる。あるいは、ＴＥＲＴとＵＳＰ２１の結合部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドの構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等も被検化合物として好適である。【０１１９】
本発明の別の一態様は、ＴＥＲＴの分解を促進する化合物を含んでなるテロメレース活性阻害剤に関する。本テロメレース活性阻害剤は、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を阻害する化合物を含んでなるテロメレース活性阻害剤であり得る。本テロメレース活性阻害剤は、ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合を阻害する化合物を含んでなるテロメレース活性阻害剤であり得る。本テロメレース活性阻害剤は、ＵＳＰ２１とＴＥＲＴとの結合を阻害する化合物を含んでなるテロメレース活性阻害剤であり得る。【０１２０】
本発明の別の一態様は、上記化合物および上記テロメレース活性阻害剤を含む医薬組成物に関する。上記化合物および上記テロメレース活性阻害剤は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することにより、医薬組成物として調製できる。医薬組成物の調製において、これら化合物や阻害剤は、単独で使用することもできるし、複数を組合わせて使用することもできる。上記テロメレース活性阻害剤および医薬組成物は、テロメレースの作用やその活性の亢進に起因する疾患の防止剤および／または治療剤として使用できる。また、上記テロメレース活性阻害剤および医薬組成物を用いて、このような疾患の防止方法および／または治療方法を実施できる。このような疾患の防止方法および／または治療方法は、また、上記テロメレース活性阻害方法を用いることにより実施できる。テロメレース活性の亢進に起因する疾患として、例えば癌疾患が挙げられる。すなわち、上記テロメレース活性阻害剤および上記医薬組成物は、抗癌剤として用いることができる。また、上記テロメレース活性阻害剤、上記医薬組成物、上記テロメレース活性阻害方法を用いて、テロメレース活性の亢進に起因する疾患、例えば癌の防止方法および／または治療方法を実施できる。【０１２１】
ＵＳＰ２１およびＮＥＤＤ８は、ヒト生体の様々な組織においてその発現が認められる（ユビキタスな）蛋白質である。本実施例において、ヒト子宮がん組織由来細胞であるＨｅＬａ細胞を用いて、本細胞において、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴおよびＴＥＲＴのプロテアソーム依存的な分解機構が存在している可能性を示した。さらに、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、本細胞におけるＵＳＰ２１の発現を検出した（実施例８参照）。したがって、癌細胞においても、ＴＥＲＴのＮＥＤＤ８化およびＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を介した、プロテアソーム依存的なＴＥＲＴの分解制御機構が存在し、このＴＥＲＴ分解制御機構により癌細胞内のテロメレース活性が調節されていると考える。【０１２２】
テロメレースは腫瘍の種類に関わらず大多数の腫瘍においてその活性が確認されていることから、本医薬組成物は多様な癌細胞の増殖阻害に有効であると考える。したがって、本医薬組成物を癌疾患に使用する場合、対象となる腫瘍の種類は特に限定されず、固形腫瘍または非固形腫瘍のいずれにも適用できる。固形腫瘍または非固形腫瘍の種類も特に限定されず、テロメレース活性を有するあらゆる種類の腫瘍において適用できる。例えば、胃癌、食道癌、大腸癌、小腸癌、十二指腸癌、肺癌、肝臓癌、胆嚢癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、口腔癌、骨癌、皮膚癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、脳腫瘍、神経芽腫等の固形腫瘍、あるいは白血病や悪性リンパ腫等の非固形腫瘍等を挙げることができるが、本医薬組成物の適用対象はこれら疾患に限定されない。【０１２３】
本発明に係る疾患の防止剤および／または治療剤は、上記化合物および上記阻害剤のうち少なくともいずれか１つを有効成分としてその有効量含む医薬として製造できる。通常は、該有効成分に加えて１種または２種以上の医薬用担体を含む医薬組成物として製造することが好ましい。【０１２４】
本発明に係る医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択される。通常、約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲とするのが適当である。【０１２５】
医薬用担体は、製剤の使用形態に応じて一般的に使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤および賦形剤等を例示できる。これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択して使用される。【０１２６】
より具体的には、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等が挙げられる。これらは、本医薬組成物の剤形に応じて適宜１種類または２種類以上を組合わせて使用される。【０１２７】
所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、界面活性剤、およびｐＨ調整剤等を適宜使用することもできる。【０１２８】
安定化剤は、例えばヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体等を例示できる。これらは単独でまたは界面活性剤等と組合わせて使用できる。特にこの組合わせによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。Ｌ−アミノ酸は、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸等のいずれでもよい。糖類も特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等およびそれらの誘導体等のいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のいずれでもよい。【０１２９】
界面活性剤も特に限定はなく、イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。界面活性剤には、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が包含される。【０１３０】
緩衝剤は、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）等を例示できる。【０１３１】
等張化剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン等を例示できる。【０１３２】
キレート剤は、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸等を例示できる。【０１３３】
本発明に係る医薬および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生理的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することもできる。【０１３４】
医薬および医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ乃至１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ乃至１ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。上記投与量は１日１回乃至数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。【０１３５】
本発明の医薬組成物を投与するときは、該医薬組成物を単独で使用してもよく、あるいは目的の疾患の防止および／または治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。例えば、他のテロメレース活性阻害剤または抗腫瘍用医薬の有効成分等を配合してもよい。【０１３６】
投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内等への投与を挙げることができる。あるいは経口経路で投与もすることもできる。さらに、経粘膜投与または経皮投与も可能である。癌疾患に用いる場合は、腫瘍に注射等により直接投与することが好ましい。【０１３７】
投与形態は、各種の形態が目的に応じて選択できる。その代表的なものは、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リポソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらはさらに投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。【０１３８】
さらに本発明の一態様は、試薬キットに関する。本試薬キットは、ＵＳＰ２１、ＵＳＰ２１をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび該組換えベクターを含有する形質転換体のうち少なくともいずれか１つと、ＴＥＲＴ、ＴＥＲＴをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび該組換えベクターを含有する形質転換体のうち少なくともいずれか１つと、ＮＥＤＤ８、ＮＥＤＤ８をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび該組換えベクターを含有する形質転換体のうち少なくともいずれか１つとを含んでなる試薬キットであり得る。好ましくはＴＥＲＴのＮＥＤＤ８化に必要な酵素、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含有するベクター、該ベクターを含有する形質転換体のうち少なくともいずれか１つを含む。また、本試薬キットは、ＴＥＲＴ、ＴＥＲＴをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび該組換えベクターを含有する形質転換体のうち少なくともいずれか１つと、ＮＥＤＤ８、ＮＥＤＤ８をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび該組換えベクターを含有する形質転換体のうち少なくともいずれか１つと、プロテアソームとを含んでなる試薬キットであり得る。本試薬キットは、例えば本発明に係る化合物の同定方法に使用できる。【０１３９】
ＵＳＰ２１、ＴＥＲＴおよびＮＥＤＤ８は、上述の製造方法により取得できる。また、ポリヌクレオチド、組換えベクターおよび形質転換体は、上述の遺伝子工学的手法により調製することができる。プロテアソームは、上述の製造方法により調製することができるし、また、市販のプロテアソームを用いることもできる。本試薬キットは、上記同定方法において用いるシグナルおよび／またはマーカー、緩衝液、並びに塩等、必要とされる物質を含むことができる。さらに、安定化剤および／または防腐剤等の物質を含んでいてもよい。製剤化にあたっては、使用する各物質それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。【０１４０】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。
【実施例１】
【０１４１】
（ＴＥＲＴと相互作用する機能を有する蛋白質のインシリコでの探索）
テロメレースの触媒サブユニットであるＴＥＲＴと相互作用する機能を有する蛋白質を、特許文献１に記載の予測方法に従って予測した。すなわち、ＴＥＲＴのアミノ酸配列をある長さのオリゴペプチドに分解し、各オリゴペプチドのアミノ酸配列あるいはそのアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を持った蛋白質をデータベース中で検索し、得られた蛋白質とＴＥＲＴとの間でローカルアライメントを行い、ローカルアライメントのスコアの高いものをＴＥＲＴと相互作用すると予測した。【０１４２】
解析の結果、ＴＥＲＴと相互作用する機能を有すると予測される蛋白質として、ＮＥＤＤ８およびＵＳＰ２１を見出した（それぞれ図１−Ａおよび図１−Ｂ）。ＮＥＤＤ８のアミノ酸配列（配列番号４）中には、ＴＥＲＴ由来のアミノ酸残基からなるオリゴペプチド（ＡＬＲＧＳＧＡ（配列番号８）、ＡＲＲＲＧＧ（配列番号１０）、ＶＳＴＬＴＤ（配列番号１２）、ＬＬＧＡＳＶＬＧＬ（配列番号１４））と相同性のあるオリゴペプチド（ＡＬＲＧＧＧＧ（配列番号９）、ＡＬＲＧＧＧ（配列番号１１）、ＶＫＴＬＴＧ（配列番号１３）、ＩＬＧＧＳＶＬＨＬ（配列番号１５））が、存在することが分かった（図１−Ａ）。ＵＳＰ２１のアミノ酸配列（配列番号６）中には、ＴＥＲＴ由来のアミノ酸残基からなるオリゴペプチド（ＰＲＡＰＲＣＲＡ（配列番号１６）、ＨＡＳＧＰＲＲＲ（配列番号１８）、ＳＬＰＬＰＫＲ（配列番号２０）、ＧＲＴＲＧＰ（配列番号２２）、ＧＲＴＲＧＰＳＤＲＧ（配列番号２４）、ＡＡＥＨＲＬ（配列番号２６）、ＨＲＡＷＲＴ（配列番号２８）、ＴＳＰＬＲＤ（配列番号３０））と相同性のあるオリゴペプチド（ＰＦＡＰＲＡＲＳ（配列番号１７）、ＲＴＳＧＰＲＰＲ（配列番号１９）、ＳＬＰＩＰＫＫ（配列番号２１）、ＧＲＴＲＥＰ（配列番号２３）、ＧＲＴＳＧＰＲＰＲＧ（配列番号２５）、ＡＳＥＨＲＬ（配列番号２７）、ＨＲＬＧＲＴ（配列番号２９）、ＴＲＰＬＲＤ（配列番号３１））が、存在することが分かった（図１−Ｂ）。
【実施例２】
【０１４３】
（ＴＥＲＴとＵＳＰ２１およびＮＥＤＤ８との結合）
ＴＥＲＴがＵＳＰ２１およびＮＥＤＤ８それぞれと結合するか否かを、細胞内共発現系を用いてインビボで検討した。さらに、ＴＥＲＴとＵＳＰ２１の結合を、プルダウン法によるインビトロ結合試験により検討した。【０１４４】
＜材料およびその調製＞
ヒトＴＥＲＴ  ｃＤＮＡ、ヒトＵＳＰ２１  ｃＤＮＡおよびヒトＮＥＤＤ８  ｃＤＮＡは、それぞれヒト胸腺ｃＤＮＡ、ヒト腎臓ｃＤＮＡおよびヒト脳ｃＤＮＡ（いずれもＣｌｏｎｔｅｃｈ社製）から、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＲＴ−ＰＣＲと略称する）によりクローニングした。【０１４５】
動物細胞用ＴＥＲＴ発現プラスミドは、ヒトＴＥＲＴ  ｃＤＮＡを動物細胞用発現ベクターｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）へ組込むことにより構築した。本プラスミドを、ｐＣＩｎｅｏ−ＴＥＲＴと呼称する。【０１４６】
動物細胞用Ｎ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇ付加型ＴＥＲＴ発現プラスミドは、開始コドン直前にＦＬＡＧ−ｔａｇコード配列を挿入したヒトＴＥＲＴ  ｃＤＮＡをｐＣＩ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）へ組込むことにより構築した。本プラスミドを、ｐＣＩ−ＦＬＡＧ−ＴＥＲＴと呼称する。【０１４７】
動物細胞用Ｎ末端ＨＡ−ｔａｇ付加型ＵＳＰ２１発現プラスミドは、開始コドン直前にＨＡ−ｔａｇコード配列を挿入したヒトＵＳＰ２１  ｃＤＮＡをｐＣＩ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）へ組込むことにより構築した。本プラスミドを、ｐＣＩ−ＨＡ−ＵＳＰ２１と呼称する。【０１４８】
また、ＵＳＰ２１においてそのシステインプロテアーゼ活性に必須な第２２１番目のシステイン（該システインはシステインプロテアーゼの活性部位である（非特許文献９））をアラニンに置換した不活性化型ヒトＵＳＰ２１（ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａ）の発現プラスミドを構築した。具体的には、まず、ＵＳＰ２１遺伝子において該システインをコードするコドンをアラニンをコードするコドンに置換したｃＤＮＡを作成した（不活性化型ヒトＵＳＰ２１  ｃＤＮＡ）。次いで、開始コドン直前にＨＡ−ｔａｇコード配列を挿入した該ｃＤＮＡをｐＣＩへ組込むことにより動物細胞用Ｎ末端ＨＡ−ｔａｇ付加型不活性化型ＵＳＰ２１発現プラスミドを構築した。本プラスミドを、ｐＣＩ−ＨＡ−ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａと呼称する。【０１４９】
さらに、大腸菌用Ｎ末端ＧＳＴ融合ＵＳＰ２１発現プラスミドおよび大腸菌用Ｎ末端ＧＳＴ融合不活性化型ＵＳＰ２１発現プラスミドを、ヒトＵＳＰ２１  ｃＤＮＡおよび不活性化型ヒトＵＳＰ２１  ｃＤＮＡをそれぞれｐＧＥＸ−４Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）へ組込むことにより構築した。これらプラスミドを、それぞれｐＧＥＸ−ＵＳＰ２１およびｐＧＥＸ−ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａと呼称する。【０１５０】
動物細胞用Ｎ末端ＨＡ−ｔａｇ付加型ＮＥＤＤ８発現プラスミドおよび動物細胞用Ｎ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇ付加型ＮＥＤＤ８発現プラスミドは、開始コドン直前にそれぞれＨＡ−ｔａｇコード配列およびＦＬＡＧ−ｔａｇコード配列を挿入したヒトＮＥＤＤ８  ｃＤＮＡをｐＣＩ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）へ組込むことにより構築した。これらプラスミドを、それぞれｐＣＩ−ＨＡ−ＮＥＤＤ８およびｐＣＩ−ＦＬＡＧ−ＮＥＤＤ８と呼称する。【０１５１】
＜インビボ結合試験（細胞内共発現／免疫沈降法）＞
細胞数４×１０５のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を５％ＣＯ２の存在下で３７℃にて一晩培養した後（直径６０ｍｍシャーレ）、２μｇのｐＣＩ−ＦＬＡＧ−ＴＥＲＴを単独で、あるいは２μｇのｐＣＩ−ＨＡ−ＵＳＰ２１またはｐＣＩ−ＨＡ−ＮＥＤＤ８と共にフュ−ジーン６  トランスフェクション  リエージェント（ＦｕＧＥＮＥ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてトランスフェクションした。２日間培養後、細胞を回収し、５００μＬの細胞溶解バッファー（Ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）／１ｍＭ  エチレングリコールビス四酢酸（ＥＧＴＡ）／１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／２．５ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）／１ｍＭ  β−グリセロホスフェート（β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）／１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４／プロテアーゼ阻害剤カクテル（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ））に懸濁後、氷上で２０分間放置した。その後、４℃にて１４，０００ｒｐｍで１０分間の遠心処理を行い、上清を回収した。得られた上清を細胞溶解物（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）として用いた。次に、４５０μｌの細胞溶解物に、予め０．１％  牛血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキング処理した１０μｌの正常ウサギＩｇＧ結合アガロース（ｎｏｒｍａｌ  ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ−ａｇａｒｏｓｅ、Ｓｉｇｍａ社製）を加え、４℃にて１時間転倒混和した後、遠心処理を行い、上清を回収した。得られた上清に１０μｌの抗ＨＡ抗体結合アガロース（ａｎｔｉ−ＨＡ（Ｙ−１１）−ａｇａｒｏｓｅ、Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ社製）を加え、４℃にて一晩転倒混和した後、遠心処理によりビーズを回収した。ビーズを５００μｌの細胞溶解バッファーで４回洗浄した後、３０μｌの２×ＳＤＳサンプルバッファー（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８／４％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）／２０％  グリセロール／０．０１％  ブロモフェノールブルー）を加え、１００℃で５分間加熱後、その上清を５−２０％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離した。その後、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を用いてウエスタンブロッティングを行い、共沈降したＮ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇ付加型ＴＥＲＴ（以下、ＦＬＡＧ−ＴＥＲＴと呼称する）を検出した。また、細胞溶解物中のＴＥＲＴおよびＵＳＰ２１の各蛋白質量を抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）および抗ＨＡ（Ｙ−１１）抗体（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ社製）を用いたウエスタンブロッティングによりそれぞれ測定した。なお、検出はイーシーエル  ウエスタンブロッティング  ディテクション  キット（ＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用して実施した【０１５２】
＜インビトロ結合試験（ＧＳＴ  ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ法）＞
ＧＳＴ、Ｎ末端ＧＳＴ融合ＵＳＰ２１（以下、ＧＳＴ−ＵＳＰ２１と呼称する）およびＮ末端ＧＳＴ融合不活性化型ＵＳＰ２１（以下、ＧＳＴ−ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａと呼称する）は、ｐＧＥＸ−４Ｔ、ｐＧＥＸ−ＵＳＰ２１およびｐＧＥＸ−ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａを各々導入した大腸菌ＢＬ２１株で誘導発現後、グルタチオンセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で精製することにより得た。ＴＥＲＴは、ｐＣＩｎｅｏ−ＴＥＲＴを鋳型としてティーエヌティー  ティー７  クイック  カップルド  トランスクリプション／トランスレーション  システム（ＴＮＴ  Ｔ７  ｑｕｉｃｋ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にて３５Ｓ−メチオニンを用いたインビトロ合成により得た。各５μｇのＧＳＴ、ＧＳＴ−ＵＳＰ２１またはＧＳＴ−ＵＳＰ２１Ｃ２２１ＡとＴＥＲＴを含むインビトロ合成反応液２０μｌを終容量５００μｌのバインディングバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０／１４０ｍＭ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）／１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）中にて混合後、氷上にて１時間静置した。その後、２０μｌのグルタチオンセファロース４Ｂ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を添加し、４℃にて一晩転倒混和した後、遠心処理によりビーズを回収した。ビーズを５００μｌのバインディングバッファーで４回洗浄した後、２０μｌの２×ＳＤＳサンプルバッファー（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８／４％  ＳＤＳ／２０％  グリセロール／０．０１％  ブロモフェノールブルー）を加え、１００℃で５分間加熱後、その上清を５−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。その後、ＦＬＡ３０００（Ｆｕｊｉ  ｆｉｌｍ社製）を用いてＴＥＲＴを検出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＴＥＲＴ検出のコントロールとして、３５Ｓ−メチオニン標識化したＴＥＲＴを用いた。【０１５３】
＜結果＞
ＦＬＡＧ−ＴＥＲＴとＮ末端ＨＡ−ｔａｇ付加型ＵＳＰ２１（以下、ＨＡ−ＵＳＰ２１と呼称する）とを一過性共発現させた培養細胞の細胞溶解物において、抗ＨＡ抗体によりＨＡ−ＵＳＰ２１の免疫沈降を行ったときに、抗ＦＬＡＧ抗体で検出される蛋白質の共沈降が認められられた（図２のレーン２：下パネル）。共沈降した蛋白質は、ＦＬＡＧ−ＴＥＲＴであると考えられた。一方、ＦＬＡＧ−ＴＥＲＴ単独発現細胞では抗ＨＡ抗体によるＦＬＡＧ−ＴＥＲＴの共沈降は認められなかった（図２のレーン１：下パネル）。培養細胞におけるＨＡ−ＵＳＰ２１またはＦＬＡＧ−ＴＥＲＴの発現は、それぞれ抗ＨＡ抗体または抗ＦＬＡＧ抗体を用いて確認した（図２のレーン１およびレーン２の上パネルおよび中パネル）。以上の結果から、ＴＥＲＴとＵＳＰ２１が結合する可能性が示唆された。【０１５４】
ＧＳＴ  ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ法を用いたインビトロ結合試験において、ＧＳＴ−ＵＳＰ２１およびＧＳＴ−ＵＳＰ２１Ｃ２２１ＡそれぞれとＴＥＲＴとの結合が認められた（それぞれ図３のレーン３および４）。一方、ＧＳＴとＴＥＲＴとの結合は認められなかった（図３のレーン２）。【０１５５】
この結果から、ＴＥＲＴとＵＳＰ２１との結合は直接的な結合であることが明らかになった。さらに、不活性化型ＵＳＰ２１であるＵＳＰ２１Ｃ２２１ＡとＴＥＲＴが結合することが明らかになった。【０１５６】
ＦＬＡＧ−ＴＥＲＴとＮ末端ＨＡ−ｔａｇ付加型ＮＥＤＤ８（以下、ＨＡ−ＮＥＤＤ８と呼称する）とを一過性共発現させた培養細胞の細胞溶解物において、抗ＨＡ抗体によりＨＡ−ＮＥＤＤ８の免疫沈降を行ったときに、抗ＦＬＡＧ抗体で検出される蛋白質の共沈降が認められた（図４のレーン２：上パネル）。共沈降した蛋白質は、ＦＬＡＧ−ＴＥＲＴであると考えられた。しかし、共沈降した蛋白質を示すシグナルは、ＦＬＡＧ−ＴＥＲＴの分子量より高分子領域でも検出され、さらにそのシグナルはスメア状であった。ＮＥＤＤ８はユビキチン様蛋白質の一つであり、蛋白質の翻訳後修飾の一つとして蛋白質に共有結合することが知られている。このことから、検出された高分子領域のスメア状のシグナルは、１以上のＨＡ−ＮＥＤＤ８により修飾されたＦＬＡＧ−ＴＥＲＴである可能性が考えられた。一方、ＦＬＡＧ−ＴＥＲＴ単独発現細胞では抗ＨＡ抗体によるＦＬＡＧ−ＴＥＲＴの沈降および高分子領域のスメア状のシグナルは認められなかった（図４のレーン１：上パネル）。用いた細胞溶解物中のＦＬＡＧ−ＴＥＲＴの量は、ＦＬＡＧ−ＴＥＲＴのみを発現させた細胞についても、ＦＬＡＧ−ＴＥＲＴとＨＡ−ＮＥＤＤ８を共発現させた細胞についても、ほぼ同等であった（それぞれ図４のレーン１および２：下パネル）。【０１５７】
以上の結果から、ＴＥＲＴとＮＥＤＤ８が結合することが確認された。さらに、ＴＥＲＴに１以上のＮＥＤＤ８が結合することにより、ＴＥＲＴがＮＥＤＤ８化される可能性が示唆された。
【実施例３】
【０１５８】
（ＴＥＲＴのＮＥＤＤ８化とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化）
実施例２において、ＴＥＲＴがＮＥＤＤ８化される可能性が示唆された。そこで、脱ユビキチン化／脱ＮＥＤＤ８化プロテアーゼであることが報告されているＵＳＰ２１（非特許文献９）を用いて、ＮＥＤＤ８化されたＴＥＲＴがＵＳＰ２１により脱ＮＥＤＤ８化されるか否かについて、実施例２と同様の細胞内共発現／免疫共沈降法による結合試験により検討した。【０１５９】
＜材料＞
ＴＥＲＴ発現プラスミド、Ｎ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇ付加型ＮＥＤＤ８発現プラスミド、Ｎ末端ＨＡ−ｔａｇ付加型ＵＳＰ２１発現プラスミドおよびＮ末端ＨＡ−ｔａｇ付加型ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａ発現プラスミドは、いずれも実施例２で作製した各発現プラスミドを用いた。【０１６０】
＜方法＞
細胞数４×１０５のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を５％ＣＯ２の存在下で３７℃にて一晩培養した後（直径６０ｍｍシャーレ）、ｐＣＩｎｅｏ−ＴＥＲＴ（２μｇ）、ｐＣＩ−ＦＬＡＧ−ＮＥＤＤ８（２μｇ）およびｐＣＩ−ＨＡ−ＵＳＰ２１（２μｇ）またはｐＣＩ−ＨＡ−ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａ（２μｇ）を様々な組合わせでＦｕＧＥＮＥ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてトランスフェクションした。２日間培養後、回収した細胞を５００μｌのＲＩＰＡバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／１ｍＭ  ＥＧＴＡ／１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／０．５％  デオキシコール酸ナトリウム／０．１％  ＳＤＳ／２．５ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム／１  ｍＭ  β−グリセロホスフェート／１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４／プロテアーゼ阻害剤カクテル）に懸濁し、１０秒間の超音波処理後、氷上に２０分間放置した。その後、４℃にて１４，０００ｒｐｍで１０分間の遠心処理を行い、上清を回収した。得られた上清を細胞溶解物として用いた。次に、４５０μｌの細胞溶解物に、予め０．１％  ＢＳＡでブロッキング処理した１５μｌのｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加え、４℃にて１時間転倒混和した後、遠心処理を行い、上清を回収した。回収した上清に２μｇの抗ＴＥＲＴ（Ｌ−２１）抗体（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ社製）を加え、４℃にて４時間転倒混和した。その後、１５μｌのｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを加え、４℃にて一晩転倒混和した後、遠心処理によりビーズを回収した。ビーズを５００μｌのＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒで４回洗浄した後、３０μｌの２×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、１００℃で５分間加熱後、その上清を５−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。その後、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を用いたウエスタンブロッティングによりＮ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇ付加型ＮＥＤＤ８（以下、ＦＬＡＧ−ＮＥＤＤ８と呼称する）により修飾されたＴＥＲＴを検出した。細胞溶解物中のＴＥＲＴ、ＵＳＰ２１および不活性化型ＵＳＰ２１の各蛋白質量は、抗ＴＥＲＴ（Ｌ−２０）抗体および抗ＨＡ（Ｙ−１１）抗体（いずれもＳａｎｔａ  ｃｒｕｚ社製）を用いたウエスタンブロッティングによりそれぞれ測定した。なお、検出はＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用して実施した。【０１６１】
＜結果＞
ＴＥＲＴとＦＬＡＧ−ＮＥＤＤ８を一過性共発現させた培養細胞の細胞溶解物において、１以上のＦＬＡＧ−ＮＥＤＤ８により修飾されたＴＥＲＴと考えられるスメア状のシグナルが高分子領域に検出された（図５のレーン３：上パネル）。ＴＥＲＴのみまたはＦＬＡＧ−ＮＥＤＤ８のみを発現させた培養細胞の細胞溶解物では、このようなシグナルは認められなかった（それぞれ図５のレーン１および２：上パネル）。これら結果から、ＴＥＲＴがＮＥＤＤ８化されることが明らかになった。【０１６２】
検出された高分子領域のスメア状のシグナル、すなわち１以上のＦＬＡＧ−ＮＥＤＤ８により修飾されたＴＥＲＴを示すシグナルは、ＨＡ−ＵＳＰ２１の共発現により顕著に減少した（図５のレーン４：上パネル）。このようなシグナルの減少はＨＡ−ＵＳＰ２１の代わりに不活性化型ＵＳＰ２１であるＨＡ−ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａを共発現させたときには認められなかった（図５のレーン５：上パネル）。用いた細胞溶解物中のＴＥＲＴの量は、ＴＥＲＴのみを発現させた細胞、ＴＥＲＴとＦＬＡＧ−ＮＥＤＤ８を発現させた細胞、ＴＥＲＴ、ＦＬＡＧ−ＮＥＤＤ８およびＨＡ−ＵＳＰ２１またはＨＡ−ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａを共発現させた細胞のいずれの細胞についても、ほぼ同等であった（それぞれ図５のレーン１、３、４および５：中パネル）。用いた細胞溶解物中でＨＡ−ＵＳＰ２１またはＨＡ−ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａが発現されていることも確認された（図５のレーン４および５：下パネル）。【０１６３】
以上の結果から、ＮＥＤＤ８化されたＴＥＲＴがＵＳＰ２１により脱ＮＥＤＤ８化されることが明らかになった。また、ＮＥＤＤ８化されたＴＥＲＴは不活性化型ＵＳＰ２１（ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａ）によっては脱ＮＥＤＤ８化されないことが判明した。
【実施例４】
【０１６４】
（ＴＥＲＴのプロテアソーム依存的な分解）
ＮＥＤＤ８はユビキチン様蛋白質の一つであり、蛋白質の翻訳後修飾の一つとして蛋白質と共有結合することが知られている。ＮＥＤＤ８化される蛋白質としては複合体型ユビキチンリガーゼの構成蛋白質の一つであるＣｕｌｌｉｎファミリー蛋白質のみが唯一報告されている（非特許文献５および６）。また、ＣｕｌｌｉｎのＮＥＤＤ８化を介したユビキチンリガーゼ活性調節機構の存在が示唆されている。一方、ユビキチン化された蛋白質はプロテアソーム依存的な分解を受けることが知られており、ユビキチン化は蛋白質の安定性の調節に関与していると考えられている（非特許文献５）。ＮＥＤＤ８は一次構造および立体構造レベルにおいてユビキチンと非常に高い相同性を有している。したがって、ユビキチン化の場合と同様に、蛋白質のＮＥＤＤ８化がプロテアソーム依存的な蛋白質分解のシグナルとして働いている可能性が考えられる（非特許文献５）。すなわち、ＴＥＲＴのＮＥＤＤ８化修飾およびＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化によるＴＥＲＴの分解制御機構が存在している可能性が考えられる。そこで、ＴＥＲＴがプロテアソーム依存的に分解されるか否かについて検討した。具体的には、以下に示すように、ＨｅＬａ細胞へのＴＥＲＴ一過性発現系を用いて、該細胞内のＴＥＲＴ量に対するプロテアソーム阻害剤（ＭＧ１３２）の影響について検討した【０１６５】
＜材料＞
ＴＥＲＴ発現プラスミドは実施例２で構築した発現プラスミドを用いた。【０１６６】
＜方法＞
細胞数８×１０４／ｗｅｌｌ（１２ウエルプレート）のＨｅＬａ細胞を５％ＣＯ２存在下で３７℃にて一晩培養した後、１μｇのｐＣＩｎｅｏ−ＴＥＲＴをＦｕＧＥＮＥ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてトランスフェクションした。４８時間培養後、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ−１３２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を終濃度２５μＭとなるように培地に添加し、さらに２４時間培養した後、細胞を回収した。コントロールとして、ＭＧ−１３２の代わりに等量のジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳＯ）を培地に添加して同様に培養した細胞を用いた。回収した細胞を６０μＬのＲＩＰＡバッファー（実施例３に記載のＲＩＰＡバッファーと同組成）に懸濁し、１０秒間の超音波処理後、氷上に２０分間放置した。その後、４℃にて１４，０００ｒｐｍで１０分間の遠心処理を行い、上清を回収した。得られた上清を細胞溶解物として用いた。次に、細胞溶解物を５−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、抗ＴＥＲＴ（Ｌ−２０）抗体（ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ社製）を用いたウエスタンブロッティングによりＴＥＲＴを検出した。また、内在性コントロール蛋白質として細胞溶解物中のβ−チューブリン（β−ｔｕｂｕｌｉｎ）を抗β−ｔｕｂｕｌｉｎ（Ｈ−２３５）抗体（ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ社製）を用いたウエスタンブロッティングにより検出した。検出はＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用して実施した。【０１６７】
＜結果＞
ＭＧ１３２を添加した細胞の細胞溶解物において（図６のレーン２：上パネル）、ＭＧ１３２を添加しなかった細胞（図６のレーン１：上パネル）の細胞溶解物と比較して、ＴＥＲＴ量の増加が認められた。なお、内在性蛋白質であるβ−ｔｕｂｕｌｉｎの量に変化は認められなかった（図６のレーン１および２：下パネル）。これらの結果は、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２の添加によりＴＥＲＴのプロテアソーム依存的な分解が抑制されたことを示す。すなわち、ＴＥＲＴがプロテアソーム依存的に分解されることが明らかになった。
【実施例５】
【０１６８】
（ＵＳＰ２１によるＴＥＲＴの安定化）
ＵＳＰ２１がＮＥＤＤ８化されたＴＥＲＴを脱ＮＥＤＤ８化することによりＴＥＲＴのプロテアソーム依存的な分解が抑制されるか否かについて検討した。この検討により、ＵＳＰ２１によるＴＥＲＴ安定化の可能性が明らかになる。具体的には、以下に示すようにＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのＴＥＲＴ一過性発現系を用いて、該細胞内のＴＥＲＴ量に対するＵＳＰ２１一過性過剰発現の影響について検討した。【０１６９】
＜材料＞
ＴＥＲＴ発現プラスミド、Ｎ末端ＨＡ−ｔａｇ付加型ＵＳＰ２１発現プラスミドおよびＮ末端ＨＡ−ｔａｇ付加型ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａ発現プラスミドは、いずれも実施例２で構築した発現プラスミドを用いた。【０１７０】
＜方法＞
細胞数２×１０５／ｗｅｌｌ（６ウエルプレート）のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を５％ＣＯ２存在下で３７℃にて一晩培養した後、１μｇのｐＣＩｎｅｏ−ＴＥＲＴを、１μｇのｐＣＩ（空ベクター）、ｐＣＩ−ＨＡ−ＵＳＰ２１またはｐＣＩ−ＨＡ−ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａと共にＦｕＧＥＮＥ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてトランスフェクションした。２日間培養後、細胞を回収し、２００μＬのＲＩＰＡバッファー（実施例３に記載のＲＩＰＡバッファーと同組成）に懸濁し、１０秒間の超音波処理後、氷上に２０分間放置した。その後、４℃にて１４，０００ｒｐｍで１０分間の遠心処理を行い、上清を回収した。得られた上清を細胞溶解物として用いた。次に、細胞溶解物を５−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、抗ＴＥＲＴ（Ｌ−２０）抗体（ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ社製）および抗ＨＡ（Ｙ−１１）抗体（ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ社製）を用いたウエスタンブロッティングによりＴＥＲＴおよびＨＡ−ＵＳＰ２１をそれぞれ検出した。また、内在性コントロール蛋白質として細胞溶解物中のβ−ｔｕｂｕｌｉｎを抗β−ｔｕｂｕｌｉｎ（Ｈ−２３５）抗体（ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ社製）を用いたウエスタンブロッティングにより検出した。検出はＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用して実施した。【０１７１】
＜結果＞
ＨＡ−ＵＳＰ２１とＴＥＲＴを共発現させた細胞の細胞溶解物において（図７のレーン３：上パネル）、ＴＥＲＴ単独またはＴＥＲＴとＨＡ−ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａとを発現させた細胞の細胞溶解物と比較して（それぞれ図７のレーン２および４：上パネル）、ＴＥＲＴ量の増加が認められた。この結果から、ＵＳＰ２１の一過性過剰発現によりＴＥＲＴが安定化される可能性が示唆された。内在性蛋白質であるβ−ｔｕｂｕｌｉｎの量に変化は認められなかったことから（図７のレーン１から４：下パネル）、上記ＴＥＲＴ量の増加がサンプル間の蛋白質量の差異によるものではないことは明らかである。用いた細胞溶解物中におけるＵＳＰ２１およびＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａの各蛋白質量は、ほぼ同等であった（図７のレーン３および４：中パネル）。【０１７２】
以上の結果から、ＵＳＰ２１がＮＥＤＤ８化されたＴＥＲＴを脱ＮＥＤＤ８化することにより、ＴＥＲＴのプロテアソーム依存的な分解が抑制されることが明らかになった。
【実施例６】
【０１７３】
（ＵＳＰ２１による外来性ＴＥＲＴ依存的細胞内テロメレース活性の上昇）
実施例２から５の結果により、ＴＥＲＴのＮＥＤＤ８化およびＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を介したＴＥＲＴの分解制御機構が存在している可能性が強く示唆された。ＴＥＲＴがテロメレースの触媒サブユニットであることから、このようなＴＥＲＴの分解制御機構がテロメレースの活性調節に関与していると考えた。そこで、実際にＵＳＰ２１がテロメレースの活性調節に関与しているか否かについて検討を行った。具体的には、以下に示すように、内在性テロメレース活性を有さないＳａＯＳ２細胞（ヒト骨肉腫細胞株）へのＴＥＲＴ一過性発現系を用いて、外来性ＴＥＲＴ発現依存的なテロメレース活性に対するＵＳＰ２１過剰発現の影響について検討した。ＳａＯＳ２細胞は、ＴＥＲＴ遺伝子を発現しておらずｈＴＲ遺伝子のみを発現しているため、テロメレース活性を有さない。【０１７４】
＜材料＞
ＴＥＲＴ発現プラスミド、Ｎ末端ＨＡ−ｔａｇ付加型ＵＳＰ２１発現プラスミドおよびＮ末端ＨＡ−ｔａｇ付加型ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａ発現プラスミドは、いずれも実施例２で構築した発現プラスミドを用いた。【０１７５】
＜方法＞
細胞数４×１０５／ｗｅｌｌ（６ウエルプレート）のＳａＯＳ２細胞を５％ＣＯ２存在下で３７℃にて一晩培養した後、０．８μｇのｐＣＩｎｅｏ−ＴＥＲＴを、２μｇのｐＣＩ（空ベクター）、ｐＣＩ−ＨＡ−ＵＳＰ２１またはｐＣＩ−ＨＡ−ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａと共にリポフェクトアミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてトランスフェクションした。２４時間培養後、細胞を回収し、エヌイー  ピーイーアール  ヌクレアー  アンド  サイトプラスミック  エクストラクション  リエージェンツ（ＮＥ−ＰＥＲ  Ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて核抽出液を調製した。方法は添付の説明書に従った。核抽出液中の蛋白質濃度をクマシー  プラス−２００  プロテイン  アッセイ  リエージェント（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ−２００  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｐｉｅｒｃｅ社製）で測定後、蛋白質量２０ｎｇの核抽出液を用いてＴＲＡＰ反応を行った。ＴＲＡＰ反応は、ＴＲＡＰＥＺＥ  ＸＬ  Ｋｉｔ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社製）を用いて、添付の説明書に従い実施した。具体的には、３０℃にて３０分間テロメア伸長反応を行った後、生成したテロメアリピート配列の増幅をＰＣＲにより行った。ＰＣＲは、９４℃で３０秒間、５９℃で３０秒間の反応の後、７２℃で１分間の反応を３６サイクル、最後に５５℃で２５分間の反応を行なうという条件で実施した。ＰＣＲを行なった後、反応液の蛍光強度を蛍光分光光度計Ｆ−２０００（Ｈｉｔａｃｈｉ社製）を用いて測定し、核抽出液中のテロメレース活性を算出した。具体的には、蛍光強度の測定は、ＰＣＲに用いたプライマーに標識されたフルオレセイン（テロメレース反応産物の指標）およびスルホローダミン（内部標準の指標）の各蛍光強度を、それぞれの測定波長（１Ｅｘ＝４８５ｎｍ／１Ｅｍ＝５３５ｎｍおよび１Ｅｘ＝５８５ｎｍ／１Ｅｍ＝６２０ｎｍ）で計測することにより行なった。テロメレース活性は、内部標準との比（ΔＦＬ／ΔＲＬ）により表した。また、調製した核抽出液中のＴＥＲＴおよびＨＡ−ＵＳＰ２１の各蛋白質量を、抗ＴＥＲＴ（Ｌ−２０）抗体（ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ社製）および抗ＨＡ（Ｙ−１１）抗体（ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ社製）を用いたウエスタンブロッティングによりそれぞれ測定した。【０１７６】
＜結果＞
ＴＥＲＴ遺伝子を発現しておらずＴＲ遺伝子のみを発現しているために細胞核内テロメレース活性が低いＳａＯＳ２細胞において、ＴＥＲＴ遺伝子を発現させることによりテロメレース活性が上昇した（図８−Ａ、カラム２〜４）。さらに、ＳａＯＳ２細胞において、ＴＥＲＴと共にＮ末端ＨＡ−ｔａｇ付加型ＵＳＰ２１（ＨＡ−ＵＳＰ２１）を過剰発現させることにより、ＴＥＲＴ単独を発現させたときと比較して、細胞核内テロメレース活性（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）が上昇した（図８−Ａ、カラム３）。このような細胞核内テロメレース活性の上昇は、不活性化型ＵＳＰ２１であるＨＡ−ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａの過剰発現では認められなかった（図８−Ａ、カラム４）。この結果から、ＨＡ−ＵＳＰ２１の過剰発現による細胞核内テロメレース活性の上昇は、ＵＳＰ２１のシステインプロテアーゼ活性依存的であると考えられる。また、ＴＥＲＴを一過性発現させたＳａＯＳ２細胞の核抽出液中のＴＥＲＴ量をウエスタンブロッティングにより測定した結果、ＨＡ−ＵＳＰ２１過剰発現細胞の核抽出液において、ＨＡ−ＵＳＰ２１を発現させなかった細胞の核抽出液と比較して、ＴＥＲＴ量の増加が認められた（図８−Ｂのレーン２：上パネル）。ＨＡ−ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａ過剰発現細胞の核抽出液においては、ＴＥＲＴ量の増加は認められなかった（図８−Ｂのレーン３：上パネル）。また、細胞におけるＨＡ−ＵＳＰ２１およびＨＡ−ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａの発現が確認された（それぞれ図８−Ｂのレーン２および３：下パネル）【０１７７】
これら結果から、ＵＳＰ２１の過剰発現によるテロメレース活性の上昇は、ＴＥＲＴの増加によるものであることが示唆された。この結果は、実施例５に示したＵＳＰ２１によるＴＥＲＴの安定化の結果と一致する。すなわち、ＵＳＰ２１によるＴＥＲＴの安定化により核内テロメレース活性が上昇したと考えられる。
【実施例７】
【０１７８】
（ＵＳＰ２１による細胞内在性テロメレース活性の上昇）
内在性テロメレース活性を有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて、内在性テロメレース活性に対するＵＳＰ２１過剰発現の影響について検討した。【０１７９】
＜材料＞
Ｎ末端ＨＡ−ｔａｇ付加型ＵＳＰ２１発現プラスミドおよびＮ末端ＨＡ−ｔａｇ付加型ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａ発現プラスミドは、いずれも実施例２で構築した発現プラスミドを用いた。【０１８０】
＜方法＞
細胞数１×１０５／ｗｅｌｌ（６ウエルプレート）のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を５％ＣＯ２存在下で３７℃にて一晩培養した後、１μｇのｐＣＩ（空ベクター）、ｐＣＩ−ＨＡ−ＵＳＰ２１またはｐＣＩ−ＨＡ−ＵＳＰ２１Ｃ２２１ＡをＦｕＧＥＮＥ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてトランスフェクションした。４８時間培養後、細胞を回収し、ＮＥ−ＰＥＲ  Ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて核抽出液を調製した。方法は添付の説明書に従った。核抽出液中の蛋白質濃度をＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ−２００  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）で測定後、蛋白質量１０ｎｇの核抽出液を用いてＴＲＡＰ反応を行ない、テロメレース活性を測定した。ＴＲＡＰ反応および核抽出液中のテロメレース活性の算出は、実施例６に記載の方法と同じ方法で実施した。【０１８１】
＜結果＞
ＨＡ−ＵＳＰ２１過剰発現により細胞核内テロメレース活性の上昇が認められた（図９、カラム２）。不活性化型ＵＳＰ２１であるＨＡ−ＵＳＰ２１Ｃ２２１Ａの過剰発現ではテロメレース活性の上昇は認められなかった（図９、カラム３）。これらの結果から、ＨＡ−ＵＳＰ２１過剰発現によるテロメレース活性の上昇は、ＵＳＰ２１のシステインプロテアーゼ活性依存的であることが明らかになった（図９）。すなわち、ＵＳＰ２１がそのシステインプロテアーゼ活性依存的に細胞核内テロメレース活性を上昇させることが判明した。
【実施例８】
【０１８２】
（癌細胞株におけるＵＳＰ２１の発現）
ヒト子宮癌由来細胞株であるＨｅＬａ細胞においてＵＳＰ２１が発現しているか否かについてをＲＴ−ＰＣＲにより検討した。【０１８３】
＜方法＞
ＨｅＬａ細胞から総ＲＮＡを調製し、ＵＳＰ２１  ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより検出した。具体的にはまず、ＨｅＬａ細胞からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて総ＲＮＡを調製後、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてＨｅＬａ細胞由来ｃＤＮＡを合成した。調製したＨｅＬａ  ｃＤＮＡを鋳型として、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ社製）およびヒトＵＳＰ２１遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲを実施した。反応液を２．５％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色により目的のＰＣＲ産物を検出した。ヒトＵＳＰ２１遺伝子特異的プライマーは、フォワードプライマー１（１Ｆ、配列番号３２）とリバースプライマー１（１Ｒ、配列番号３３）、フォワードプライマー２（２Ｆ、配列番号３４）とリバースプライマー２（２Ｒ、配列番号３５）の２通りの組合わせをそれぞれ使用した。両プライマー組共に、１０１ｂｐのＵＳＰ２１  ｃＤＮＡ断片が増幅されるように設計した。【０１８４】
＜結果＞
ＵＳＰ２１のＨｅＬａ細胞における発現を２通りのプライマーの組み合わせでＲＴ−ＰＣＲにより検討した結果、いずれのプライマーの組み合わせにおいても予想されるサイズ（１０１  ｂｐ）の増幅産物が確認された（図１０のレーン２および３）。なお、使用したヒトＵＳＰ２１遺伝子特異的プライマーは、イントロンをはさむように設計してあるため、増幅されたＰＣＲ産物はゲノミックＤＮＡ由来のものではない。【０１８５】
以上の結果から、ＴＥＲＴのＮＥＤＤ８化およびＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を介した、ＴＥＲＴの分解制御機構が存在し、このＴＥＲＴ分解制御機構により細胞内のテロメレース活性が調節されている可能性が強く示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１８６】
本発明によれば、テロメレース活性を阻害する化合物の同定方法を提供できる。例えば、ＵＳＰ２１とＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴとの結合を阻害する化合物の同定方法、ＮＥＤＤ８化ＴＥＲＴのＵＳＰ２１による脱ＮＥＤＤ８化を阻害する化合物の同定方法等を提供できる。【０１８７】
また、本発明によれば、テロメレース活性を阻害することができる。さらに、テロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止および／または治療を実施できる。テロメレースが癌の種類を問わずほとんどの癌細胞で発現しており、生殖細胞以外の正常体細胞ではほとんど発現していないことから、本発明は例えば、多様な癌疾患の防止および／または治療に有効であると考えられる。【０１８８】
このように本発明は、テロメレースが関与する細胞増殖や細胞老化のメカニズムおよびテロメレースの作用やその活性の亢進に起因する疾患等に関する基礎的研究等に有用である。さらにテロメレース活性の亢進に起因する疾患、例えば癌疾患に用いる医薬や治療法の開発に非常に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１８９】
配列番号１：ヒトＴＥＲＴ遺伝子。
配列番号２：ヒトＴＥＲＴ遺伝子（配列番号１）によりコードされる蛋白質。
配列番号３：ヒトＮＥＤＤ８遺伝子。
配列番号４：ヒトＮＥＤＤ８遺伝子（配列番号３）によりコードされる蛋白質。
配列番号５：ヒトＵＳＰ２１遺伝子。
配列番号６：ヒトＵＳＰ２１遺伝子（配列番号５）によりコードされる蛋白質。
配列番号７：配列番号６のアミノ酸配列において、第２２１番目のシステインのアラニンへの置換変異を有する設計されたポリペプチド。
配列番号８：ＮＥＤＤ８の部分配列（配列番号９）と高い相同性を有する、ＴＥＲＴ（配列番号２）の部分配列。
配列番号９：ＴＥＲＴの部分配列（配列番号８）と高い相同性を有する、ＮＥＤＤ８（配列番号４）の部分配列。
配列番号１０：ＮＥＤＤ８の部分配列（配列番号１１）と高い相同性を有する、ＴＥＲＴ（配列番号２）の部分配列。
配列番号１１：ＴＥＲＴの部分配列（配列番号１０）と高い相同性を有する、ＮＥＤＤ８（配列番号４）の部分配列。
配列番号１２：ＮＥＤＤ８の部分配列（配列番号１３）と高い相同性を有する、ＴＥＲＴ（配列番号２）の部分配列。
配列番号１３：ＴＥＲＴの部分配列（配列番号１２）と高い相同性を有する、ＮＥＤＤ８（配列番号４）の部分配列。
配列番号１４：ＮＥＤＤ８の部分配列（配列番号１５）と高い相同性を有する、ＴＥＲＴ（配列番号２）の部分配列。
配列番号１５：ＴＥＲＴの部分配列（配列番号１４）と高い相同性を有する、ＮＥＤＤ８（配列番号４）の部分配列。
配列番号１６：ＵＳＰ２１の部分配列（配列番号１７）と高い相同性を有する、ＴＥＲＴ（配列番号２）の部分配列。
配列番号１７：ＴＥＲＴの部分配列（配列番号１６）と高い相同性を有する、ＵＳＰ２１（配列番号６）の部分配列。
配列番号１８：ＵＳＰ２１の部分配列（配列番号１９）と高い相同性を有する、ＴＥＲＴ（配列番号２）の部分配列。
配列番号１９：ＴＥＲＴの部分配列（配列番号１８）と高い相同性を有する、ＵＳＰ２１（配列番号６）の部分配列。
配列番号２０：ＵＳＰ２１の部分配列（配列番号２１）と高い相同性を有する、ＴＥＲＴ（配列番号２）の部分配列。
配列番号２１：ＴＥＲＴの部分配列（配列番号２０）と高い相同性を有する、ＵＳＰ２１（配列番号６）の部分配列。
配列番号２２：ＵＳＰ２１の部分配列（配列番号２３）と高い相同性を有する、ＴＥＲＴ（配列番号２）の部分配列。
配列番号２３：ＴＥＲＴの部分配列（配列番号２２）と高い相同性を有する、ＵＳＰ２１（配列番号６）の部分配列。
配列番号２４：ＵＳＰ２１の部分配列（配列番号２５）と高い相同性を有する、ＴＥＲＴ（配列番号２）の部分配列。
配列番号２５：ＴＥＲＴの部分配列（配列番号２４）と高い相同性を有する、ＵＳＰ２１（配列番号６）の部分配列。
配列番号２６：ＵＳＰ２１の部分配列（配列番号２７）と高い相同性を有する、ＴＥＲＴ（配列番号２）の部分配列。
配列番号２７：ＴＥＲＴの部分配列（配列番号２６）と高い相同性を有する、ＵＳＰ２１（配列番号６）の部分配列。
配列番号２８：ＵＳＰ２１の部分配列（配列番号２９）と高い相同性を有する、ＴＥＲＴ（配列番号２）の部分配列。
配列番号２９：ＴＥＲＴの部分配列（配列番号２８）と高い相同性を有する、ＵＳＰ２１（配列番号６）の部分配列。
配列番号３０：ＵＳＰ２１の部分配列（配列番号３１）と高い相同性を有する、ＴＥＲＴ（配列番号２）の部分配列。
配列番号３１：ＴＥＲＴの部分配列（配列番号３０）と高い相同性を有する、ＵＳＰ２１（配列番号６）の部分配列。
配列番号３２：ＵＳＰ２１  ｃＤＮＡ断片が特異的に増幅するよう設計されたＰＣＲ用フォワードプライマー。
配列番号３３：ＵＳＰ２１  ｃＤＮＡ断片が特異的に増幅するよう設計されたＰＣＲ用リバースプライマー。
配列番号３４：ＵＳＰ２１  ｃＤＮＡ断片が特異的に増幅するよう設計されたＰＣＲ用フォワードプライマー。
配列番号３５：ＵＳＰ２１  ｃＤＮＡ断片が特異的に増幅するよう設計されたＰＣＲ用リバースプライマー。
【図１−Ａ】
2006070804.tif 000002
【図１−Ｂ】
2006070804.tif 000003
【図８−Ａ】
2006070804.tif 000004
【図９】
2006070804.tif 000005
【図２】
2006070804.tif 000006
【図３】
2006070804.tif 000007
【図４】
2006070804.tif 000008
【図５】
2006070804.tif 000009
【図６】
2006070804.tif 000010
【図７】
2006070804.tif 000011
【図８−Ｂ】
2006070804.tif 000012
【図１０】
2006070804.tif 000013
【配列表】
2006070804000001.app
【国際調査報告】
2006070804.tif 000014
2006070804.tif 000015
2006070804.tif 000016
2006070804.tif 000017
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2006070804.tif 000019