(57)【要約】【課題】循環血液内を滞留し、尚且つ薬物の標的臓器、細胞における薬効を高める薬物送達システムの提供【解決手段】リポソーム形成基剤の一部としてポリエチレングリコールコレステリルエーテルを採用し、当該リポソーム形成基剤を用いて調製したリポソームによる治療用薬物含有リポソーム。更にポリエチレングリコールジアシルグリセロールエステルをリポソーム形成基剤の一部として採用することで、良好な薬効を得ることが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソーム形成基剤の一部としてポリエチレングリコールコレステリルエーテルを用いて調製したリポソームからなる薬物の標的細胞内送達性改善剤。
【請求項２】
ポリエチレングリコールコレステリルエーテルのポリエチレングリコールの平均分子量が２００から２００００である請求項１記載の薬物の標的細胞内送達性改善剤。
【請求項３】
リポソーム形成基剤の一部としてポリエチレングリコールジアシルグリセロールエステルをさらに含有する請求項１記載の薬物の標的細胞内送達性改善剤。
【請求項４】
ポリエチレングリコールジアシルグリセロールエステルがポリエチレングリコールジステアリルグリセロールエステル、ポリエチレングリコールジパルミトイルグリセロールエステル、ポリエチレングリコールジミリストイルグリセロールエステル、ポリエチレングリコールジラウリルグリセロールエステル、およびポリエチレングリコールジオレイルグリセロールエステルからなる群より選択された１種又は２種以上である請求項３記載の薬物の標的細胞内送達性改善剤。
【請求項５】
ポリエチレングリコールジアシルグリセロールエステルのポリエチレングリコールの平均分子量が２００から２００００である請求項３記載の薬物の標的細胞内送達性改善剤。
【請求項６】
ポリエチレングリコールコレステリルエーテルとポリエチレングリコールジアシルグリセロールエステルとのモル比が１：１００−１００：１である請求項３記載の標的細胞内送達性改善剤。
【請求項７】
薬物、ポリエチレングリコールコレステリルエーテル、およびポリエチレングリコールジアシルグリセロールエステルを含有する薬物含有リポソーム。
【請求項８】
平均粒子径が400nm以下である請求項７記載の薬物含有リポソーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポソーム形成基剤の一部としてポリエチレングリコールコレステリルエーテルを用いて調製したリポソームからなる薬物の標的細胞内送達性改善剤及びそのリポソームに関する。また、本発明は、更にリポソーム形成基剤の一部としてポリエチレングリコールジステアリルエステルを加えて調製したリポソームからなる薬物の標的細胞内送達性改善剤及びそのリポソームに関する。
【背景技術】
【０００２】
生理活性物質あるいは治療用化合物の体内での持続化あるいは薬物、とりわけ抗癌剤や抗菌剤の標的臓器への分布を高める目的で循環血液中を滞留するステルスリポソームが報告されている（
【非特許文献１】、
【非特許文献２】、
【非特許文献３】）。ステルスリポソームとはポリエチレングリコール(PEG)等の水溶性高分子をリポソーム表面に配位させることによってリポソームの血液成分や血球細胞、血管内皮細胞との相互作用を回避するリポソームを意味し、循環血液中を滞留するＰＥＧ修飾リポソームはその一態様である。このような血中滞留性を示すＰＥＧ修飾リポソームはＥＰＲ（enhanced permeability and retention：増強された血管透過性及び滞留性）効果により、血中から標的組織、例えば癌組織に漏出・集積しやすい特性を有すると報告されている（
【非特許文献４】）。
【０００３】
上記特性を利用したドキソルビシンを封入したＰＥＧ修飾リポソームはカポジ肉腫および乳癌を適応症として欧米で既に上市されており、副作用の軽減と治療効果の点から有用性が報告されている（
【非特許文献５】）。しかしながら、当該技術においては循環血液中の滞留性は維持されるものの、水溶性高分子の存在が障壁となり、反って薬物が作用する臓器、細胞への接近、接触等がが抑制される結果、作用点での薬物濃度が高まらない現象、分布しているリポソームの量が多いにも拘らず薬効が高まらない現象など、薬物の細胞内への送達が損なわれる現象が認められている。たとえば、担癌マウスを用いた検討結果より、薬物封入ＰＥＧ修飾リポソームの集積性と抗腫瘍効果は必ずしも相関しない、即ち、腫瘍への集積性が高くても抗腫瘍効果が常に高い訳ではないことが報告されている（
【非特許文献６】）。
【０００４】
このような状況下、循環血液内の滞留を保ちつつ、リポソーム内に封入させた薬物の標的臓器、細胞における薬効を高める手段について、いくつかの報告がなされている。その中の一つとして、投与時は親水性高分子等が有効に作用し、標的細胞近傍において水溶性高分子を脱離させる方法が報告されている。例えば、
【特許文献１】には、生物学的表面に特異的に結合するのに有効な親和性部分とこの親和性部分を遮蔽するのに有効な親水性高分子鎖を表面に有するリポソームが開示されている。
【０００５】
この方法によれば、循環血液中の滞留が達成されるまではリポソーム表面の親水性高分子鎖が有効に機能し、その後親水性高分子鎖を遊離させるための遊離剤を投与することにより、親水性高分子鎖が遊離し、遮蔽されていた親和性部分が機能することにより、細胞表面との特異的な結合性が発揮される。しかしながら、この方法においては親水性高分子（鎖）を遊離させるためにシステイン、アスコルベート等の遊離剤を投与する必要があり、実際上の使用においては、生体内における遊離剤の効果の懸念、遊離剤の安全性の点での課題が残されている。【０００６】
また、
【特許文献２】には、環境の相違に依存せず、生体に投与後経時的に水溶性高分子がリポソーム表面から離脱することによりリポソームの性質を変化させることができる技術が開示されている。さらに、
【非特許文献７】には、ポリエチレングリコールと脂質（リポソームを形成する脂質）との結合体の脂質部分のアルキル鎖長を変えることにより、標的細胞の細胞膜との膜融合速度を調節可能なＰＥＧ修飾融合性リポソームが開示されている。しかしながら、これらの技術においては、疾患部位にリポソームが到達する前に水溶性高分子が脱離し、循環血中での滞留性を維持できない可能性があり、まだなお改良の余地が残されている。
【０００７】
一方、
【非特許文献８】、
【非特許文献９】には肝臓、脾臓における貪食細胞によるリポソームの捕捉（RES系）を回避する目的で、ポリエチレングリコールコレステリルエーテルを用いたドラッグキャリアーとしてのリポソームが開示されている。当該リポソームは、ラットへの静脈内投与後、RES系を回避して循環血液内での滞留性を示した。しかしながら、ポリエチレングリコールコレステリルエーテルによる細胞への送達性改善または、ポリエチレングリコールコレステリルエーテルが細胞への送達性改善を達成する属性を有したリポソーム形成基剤であるということについては上記文献のいずれにも記載も示唆もされていない。
【０００８】
【特許文献１】特表２００１−５０３３９６号公報
【特許文献２】特開平１０−２８７５５４号公報
【非特許文献１】ティー・エム・アレン、エー・チョン、「ラージ  ユニラメラ  リポソームス  ウィズ  ロー  アップテイク  イントゥ  ザ  レティキュロエンドセリアル  システム」、フェブス  レター、1987, vol. 223, p.42-46（T. M. Allen and A. Chonn, “Large unilamellar liposomes with low uptake into the reticuloendothelial system”, FEBS Letter, 1987, vol. 223, p.42-46）
【非特許文献２】アレキサンダー  エル  クリバノフ、カズオ  ムラヤマ、フラデミール  ピー  トルヒリン、リーフ  ファン、「アンフィパシック  ポリエチレングリコールズ  エフェクティブリィ  プロロング  ザ  サーキュレーション  タイム  オブ  リポソームズ」、フェブス  レター、1990, vol. 268, p.235-237（Alexander L. Klibanov, Kazuo Maruyama, Vladimir P. Torchilin and Leaf Huang, “Amphipathic polyethyleneglycols effectively prolong the circulation time of liposomes”,  FEBS Letter, 1990, vol. 268, p.235-237）
【非特許文献３】竹内洋文, 小島宏行, 山本浩光, 川島嘉明,“種々の部分疎水化水溶性ポリマーによるリポソームの表面修飾（コーティング）とその血中滞留性の評価”, 薬剤学, 2001, vol.61, p.86-96
【非特許文献４】ヨコヤマ、オカノ、「ターゲッティング  オブ  アンチーキャンサー  ドラッグ  ウィズ  ナノサイズド  キャリアー  システム」、日本臨床、ジャパニーズ  ジャーナル  オブ  クリニカル  メディシン、1998, vol. 56, p.3227-34 （Yokoyama M. Okano T. “Targeting of anti-cancer drugs with nano-sized carrier system”. Nippon Rinsho - Japanese Journal of Clinical Medicine. 1998, vol. 56, p.3227-34）
【非特許文献５】コーケル、スペンサー、「ポリエチレン  グリコールーリポソーマル  ドキソルビシン．レビュー  オブ  イッツ  ファーマコダイナミック  アンド  ファーマコカイネティック  プロパティーズ、アンド  セラピューティック  エフィカシー  イン  ザ  マネージメント  オブ  エイズ  リレイティド  カポジ  サルコーマ」ドラッグス、1997, vol. 53, p.520-38、（Coukell AJ. Spencer CM. “Polyethylene glycol-liposomal doxorubicin. A review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties, and therapeutic efficacy in the management of AIDS-related Kaposi's sarcoma.” Drugs. 1997, vol. 53, p.520-38）
【非特許文献６】ホン、ハン、ツェン、パン、チェン、リュウ、チャン、「ダイレクト  コンパリソン  オブ  リポソーマル  ドキソルビシン  ウィズ  オア  ウィズアウト  ポリエチレングリコール  コーティング  イン  Ｃ−２６  チューマーーベアリング  マイス：イズ  サーフェイス  コーティング  ウィズ  ポリエチレングリコール  ベネフィシアル？」  クリニカル  キャンサー  リサーチ．1999, vol. 5, p.3645-52．  （Hong RL. Huang CJ. Tseng YL. Pang VF. Chen ST. Liu JJ. Chang FH. ≡Direct comparison of liposomal doxorubicin with or without polyethylene glycol coating in C-26 tumor-bearing mice: is surface coating with polyethylene glycol beneficial?≡. Clinical Cancer Research. 1999, vol. 5, p.3645-52）
【非特許文献７】ジンタンジャリ  アドラクハ−ハッチェオン、マーセル  ビー．バリィ、クリフォード  アール．シュー  アンド  トーマス  ディー．マッデン、「コントロールド  デスタビライゼーション  オブ  ア  リポソーマル  ドラッグ  デリバリー  システム  エンハンシーズ  ミトキサントロン  アンチチューマー  アクティビティ」、ネイチャー  バイオテクノロジィー、1999, vol. 17, p.775-779．  （Gitanjali Adlakha-Hutcheon, Marcel B. Bally, Clifford R. Shew & Thomas D. Madden, “Controlled destabilization of a liposomal drug delivery system enhances mitoxantrone antitumor activity”, Nature Biotechnology, 1999, vol. 17, p.775-779）
【非特許文献８】ヒデアキ  イシワタ、アリン  フェルツット−ドイ、タケオ  ヒロセ、  アンド  コーイチロウ  ミヤジマ、「フィジカル-ケミストリー  キャラクタリスティクス  アンド  バイオディストリビューション  オブ  ポリ（エチレン  グリコール）−コーティド  リポソームズ  ユージング  ポリ（オキシエチレン）  コレステリル  エーテル」、ケム  ファーム  ブル、1995、43(6)、p.1005-1011．  (Hideki ISHIWATA, Aline Vertut-Doi, Takeo HIROSE, and Koichiro MIYAJIMA, “Physical-Chemistry Characteristics and Biodistribution of Poly(ethylene glycol)- Coated Liposomes Using Poly(oxyethylene) Cholesteryl Ether”, Chem. Pharm. Bull. 1995、43(6)、p.1005-1011．
【非特許文献９】ヒデアキ  イシワタ、サトシ  B.  サトウ、サトエ  コバヤシ、マサヒデオク、アリン  フェルツット−ドイ、  アンド  コーイチロウ  ミヤジマ、「ポリ（エチレン  グリコール）  デリバティブ  オブ  コレステロール  レデューシーズ  バインディング  ステップ  オブ  リポソーム  アップテイク  バイ  ミューライン  マクロファージーライク  セル  ライン  J774  アンド  ヒューマン  ヘパトーマ  セル  ライン  ヘプジーツー」、ケム  ファーム  ブル、1998、46(12)、p.1907-1913．  (Hideki ISHIWATA, Satoshi B. SATO, Satoe KOBAYASHI, Masahide OKU, Aline Vertut-Doi, and Koichiro MIYAJIMA, “Poly(ethylene glycol) Derivative of Cholesterol Reduces Binding Step of Liposome Uptake by Murine Macrophage-like Cell Line J774 and Human Hepatoma Cell Line HepG2”, Chem. Pharm. Bull., 1998、46(12)、p.1907-1913．)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、遊離剤を投与する等の特別な操作を必要とすることがない、循環血中の滞留と標的細胞内の送達性に優れたリポソ−ム、並びに該リポソームからなる薬物の標的細胞内送達性改善剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
このような状況下、本発明者らはリポソーム内に封入させた薬物の標的臓器、細胞内への薬物送達性を高める方法について種々検討したところ、今まで循環血中での滞留性のみの作用しか明らかにされていなかったポリエチレングリコールコレステリルエーテルに、標的臓器、細胞における薬効を高める効果があることを知見した。また、ポリエチレングリコールコレステリルエーテルに加え、更にポリエチレングリコールジアシルグリセロールエステルを脂質膜構成成分の１つとしたリポソームは、同様に循環血中での滞留性を示し、かつ驚くべきことに薬物の水溶液を標的細胞に直接添加するよりも高い効果を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
本発明によれば、リポソームの循環血中の滞留を保ち、かつ薬物の標的臓器、細胞における薬効を高めることが可能となる。
すなわち本発明は、
１．リポソーム形成基剤の一部としてポリエチレングリコールコレステリルエーテルを用いて調製したリポソームからなる薬物の標的細胞内送達性改善剤、
２．ポリエチレングリコールコレステリルエーテルのポリエチレングリコールの平均分子量が２００から２００００である上記１記載の薬物の標的細胞内送達性改善剤、【００１２】
３．リポソーム形成基剤の一部としてポリエチレングリコールジアシルグリセロールエステルをさらに含有する上記１記載の薬物の標的細胞内送達性改善剤、
４．ポリエチレングリコールジアシルグリセロールエステルがポリエチレングリコールジステアリルグリセロールエステル、ポリエチレングリコールジパルミトイルグリセロールエステル、ポリエチレングリコールジミリストイルグリセロールエステル、ポリエチレングリコールジラウリルグリセロールエステル、およびポリエチレングリコールジオレイルグリセロールエステルからなる群より選択された１種または２種以上である上記３記載の薬物の標的細胞内送達性改善剤、
５．ポリエチレングリコールジアシルグリセロールエステルのポリエチレングリコールの平均分子量が２００から２００００である上記３記載の薬物の標的細胞内送達性改善剤、【００１３】
６．ポリエチレングリコールコレステリルエーテルとポリエチレングリコールジアシルグリセロールエステルとのモル比が１：１００−１００：１である上記３記載の標的細胞内送達性改善剤、
７．薬物、ポリエチレングリコールコレステリルエーテル、およびポリエチレングリコールジアシルグリセロールエステルを含有する薬物含有リポソーム、
８．平均粒子径が４００nm以下である上記７記載の薬物含有リポソーム、
に関する。【００１４】
また本発明は、薬物の標的細胞内送達性改善剤を製造するためのポリエチレングリコールコレステリルエーテルの使用に関し、ポリエチレングリコールコレステリルエーテルのポリエチレングリコールの平均分子量が２００から２００００である上記ポリエチレングリコールコレステリルエーテルの使用に関する。また、ポリエチレングリコールジアシルグリセロールエステルをさらに含有する態様であり、ポリエチレングリコールジアシルグリセロールエステルがポリエチレングリコールジステアリルグリセロールエステル、ポリエチレングリコールジパルミトイルグリセロールエステル、ポリエチレングリコールジミリストイルグリセロールエステル、ポリエチレングリコールジラウリルグリセロールエステル、およびポリエチレングリコールジオレイルグリセロールエステルであるポリエチレングリコールコレステリルエーテルからなる群より選択された１種又は２種以上の使用、ポリエチレングリコールジアシルグリセロールエステルのポリエチレングリコールの平均分子量が２００から２００００であるポリエチレングリコールコレステリルエーテルの使用、更にはポリエチレングリコールコレステリルエーテルとポリエチレングリコールジアシルグリセロールエステルのモル比が１：１００−１００：１であるポリエチレングリコールコレステリルエーテルの使用に関するものである。【００１５】
また他方で本願発明は、ポリエチレングリコールコレステリルエーテルをリポソーム形成基剤の一部とすることを特徴とするリポソームによる薬物の標的細胞内送達性改善方法に関するものであり、ポリエチレングリコールコレステリルエーテルのポリエチレングリコールの平均分子量が２００から２００００である上記改善方法、ポリエチレングリコールジアシルグリセロールエステルをさらに含有する薬物の標的細胞内送達性改善方法、ポリエチレングリコールジアシルグリセロールエステルがポリエチレングリコールジステアリルグリセロールエステル、ポリエチレングリコールジパルミトイルグリセロールエステル、ポリエチレングリコールジミリストイルグリセロールエステル、ポリエチレングリコールジラウリルグリセロールエステル、およびポリエチレングリコールジオレイルグリセロールエステルからなる郡より選択された１種又は２種以上である薬物の標的細胞内送達性改善方法に関するものである。更にまた、本発明は、ポリエチレングリコールジアシルグリセロールエステルのポリエチレングリコールの平均分子量が２００から２００００である上記改善方法に関し、また、ポリエチレングリコールコレステリルエーテルとポリエチレングリコールジアシルグリセロールエステルのモル比が１：１００−１００：１である薬物の標的細胞内送達性改善方法に関する。【００１６】
また、さらに別の側面として本願発明は、薬物、ポリエチレングリコールコレステリルエーテル、およびポリエチレングリコールジアシルグリセロールエステルからなる薬物の標的細胞内送達性が改善された薬物含有リポソームに関するものであり、また平均粒子径が４００nm以下である上記薬物含有リポソームに関するものであり、さらに薬物がカチオン性薬物である上記薬物含有リポソームであり、さらにまた、本発明は、薬物が抗癌剤もしくは抗菌剤である上記薬物含有リポソーム、に関するものである。【００１７】
本発明における薬物とは、細胞内に存在する生体内分子と相互作用し、薬効を発現するような薬物を意味する。その具体的な薬物としては特に限定はされないが、カチオン性の化合物が好ましい。リポソームへの封入に有利であるからである。例えば、ドキソルビシン、シスプラチン、イリノテカン、フルオロウラシル、カルモフール、塩酸アクラルビシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、マイトマイシン、パクリタキセル、塩酸エピルビシン、塩酸イダルビシン、塩酸ピラルビシン、ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、エトポシド、塩酸イリノテカン、塩酸ノギテカン、酒石酸ビノレルビン、ドセタキセル、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、硫酸ビンプラスチン、クエン酸タモキシフェン、シゾフィラン、クレスチン、ゲフィチニブ、シスプラチン、シクロホスファミド、チオテパ、遺伝子やアンチセンス、siRNA等の核酸医薬等を挙げることができる。また、一つの薬物に限定されることはなく、所望により数種の薬物を組み合わせて用いることも可能である。【００１８】
本発明における、細胞内送達性改善とは、細胞内への薬物の移行量を増大させることあるいは細胞内に化合物が入った後、作用点に到達する化合物の量を増大させることを意味し、種々の測定方法により、その送達性の改善を知ることが可能となる。例えば、ドキソルビシン等の場合には、下記に示す細胞障害性試験により、殺細胞効果を測定することで確認することができる。こうした効果は、ポリエチレングリコールコレステリルエーテル、好ましくはさらにポリエチレングリコールジアシルグリセロールエステルをリポソーム形成基剤の一部として調製したリポソームにより達成が可能となる。【００１９】
ポリエチレングリコールコレステリルエーテルとはポリエチレングリコール(PEG)あるいはPEG誘導体の水酸基とコレステロールの３位水酸基がエーテル結合によって結合したものを意味する。ポリエチレングリコールコレステリルエーテルのPEG部分の平均分子量（重量平均分子量）としては２００−２００００の範囲のものが好ましく、さらに４００−５０００の範囲、最も好ましくは１０００−２０００の範囲の平均分子量を持つものが好適である。これは、PEG部分の分子量がリポソームへのアンカーであるコレステリルエーテルに比し、大きくなるに従って、リポソームから離脱しやすくなり、結果として効果が発揮できない状態となるためである。【００２０】
ポリエチレングリコールコレステリルエーテルに加えてさらにポリエチレングリコールジアシルグリセロールエステルをリポソーム形成時に用いることにより、薬効をさらに高めることができる。ポリエチレングリコールジアシルグリセロールエステルとしてはポリエチレングリコールジステアリルグリセロールエステル、ポリエチレングリコールジパルミトイルグリセロールエステル、ポリエチレングリコールジミリストイルグリセロールエステル、ポリエチレングリコールジラウリルグリセロールエステル、およびポリエチレングリコールジオレイルグリセロールエステルからなる郡より選択され、１種又は２種以上を用いることができる。リポソームの脂質膜を構成する他のリン脂質、コレステロールの種類、ポリエチレングリコールコレステリルエーテルの種類、ならびにこれらの配合率によって適当なものを選択する。ポリエチレングリコールジアシルグリセロールエステルのPEG部分の平均分子量（重量平均分子量）としては２００−２００００の範囲のものが好ましく、さらに４００−５０００の範囲、最も好ましくは１０００−２０００の範囲の平均分子量を持つものが好適である。【００２１】
本発明におけるポリエチレングリコールコレステリルエーテルとポリエチレングリコールジアシルグリセロールエステルのモル比は、１：１００−１００：１、好ましくは１：５−５：１、最も好ましくは１：２−２：１である。これはポリエチレングリコールジアシルグリセロールエステルの配合量が少なくなるとリポソーム自身の血中安定性が悪くなり、結果として標的の細胞に到達する能力が失われ、in vivoにおいて細胞内送達効果が発揮できないためである。また、ポリエチレングリコールコレステリルエーテルの配合量が少なくなると細胞送達効果が減弱するためである。【００２２】
本発明のリポソームを調製する際には、一般的にリポソームの調製に用いられているリン脂質、コレステロール等を配合する。本発明における「リポソーム形成基剤の一部として」とは、本発明の効果に影響を与えない範囲内において、ポリエチレングリコールコレステリルエーテル、およびポリエチレングリコールジアシルグリセロールエステル以外の、以下に示すようなリン脂質、コレステロール等を配合することが可能であることを意味する。本発明における「リポソーム形成基剤」とは、リポソームを調製する際に必要な基剤を意味する。リン脂質としては卵黄レシチン、大豆レシチン、水素添加レシチン、ジステアリルフォスファチジルコリン、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、ジミリストイルフォスファチジルコリン、ジラウリルフォスファチジルコリン、ジオレオイルフォスファチジルコリン、ジステアリルフォスファチジルグリセロール、ジパルミトイルフォスファチジルグリセロール、ジミリストイルフォスファチジルグリセロール、ジラウリルフォスファチジルグリセロール、ジステアリルフォスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルフォスファチジルエタノールアミン、ジラウリルフォスファチジルエタノールアミン、ジステアリルフォスファチジン酸、ジパルミトイルフォスファチジン酸、ジミリストイルフォスファチジン酸、ジラウリルフォスファチジン酸等が挙げられる。これらの、１種又は２種以上を選択することを可能である。【００２３】
本発明のリポソームの粒子径は、本発明の効果を達成できる大きさであれば特に限定されないが、静脈内に投与された場合、平均粒子径が４００ｎｍ以下であることが望ましい。これは４００ｎｍを超える粒子径のリポソームは肝臓、脾臓等の細網内皮系や肺によって取り込まれ、血中での滞留性に乏しいため、作用点の存在する臓器への移行性が小さいためである。【００２４】
本発明のリポソームは、当該リポソーム製剤の技術分野において汎用される製造法を適用して調製される。リポソームを調製する際には、具体的には、例えば、「野島編、リポソーム、南江堂（１９８８）」に記載の Bangham法、凍結融解法、エタノール注入法、逆相蒸発法や、Methods in Enzymology 367, 99-110 （2003）、に記載の凍結乾燥法、或いはｐＨ勾配法、等を適用することができる。【００２５】
例えば、実施例１、２に記載されているように、ポリエチレングリコールコレステリルエーテル、必要ならば、さらにポリエチレングリコールジアシルグリセロールエステル、さらに任意のリポソーム形成基剤、例えばジステアリルフォスファチジルコリンなどのりん脂質を、所定の割合で、溶媒中に溶解ないし懸濁し、溶媒を留去する。これに緩衝剤や安定化剤を加えて水和し、窒素置換後、超音波処理等を適用してリポソーム分散液を調製する。リポソーム粒径を調整する場合は、さらにExtrusion法等を適用する。【００２６】
ポリエチレングリコールコレステリルエーテル、好ましくは更にポリエチレングリコールジアシルグリセロールエステルを採用することにより、標的細胞への送達性が改善された本発明のリポソームが提供される。当該リポソームは注射、経口投与、経肺投与、経鼻投与、その他の投与方法によって生体に投与される。このようなリポソームには本発明の効果を損なわない範囲において賦形剤等が添加されていてもよい。賦形剤としては、製薬学的に許容される塩類、界面活性剤、糖類、アミノ酸類、有機酸、その他水溶性物質等が挙げられる。【００２７】
具体的な塩類としては、Ｌ−グルタミン酸カリウム、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、カルバゾクロムスルホン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸マグネシウム、メタスルホ安息香酸ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化アルミニウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等が挙げられ、界面活性剤としては、セスキオレイン酸ソルビタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、マクロゴール４００、マクロゴール４０００、マクロゴール６００等が挙げられ、糖類としては、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、イノシトール、キシリトール、デキストラン、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース等が挙げられ、アミノ酸類としては、メチオニン、アスパラギン酸、アラニン、アルギニン、グリシン、システイン、タウリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グルタミン酸、リジン等が挙げられ、有機酸としてはクエン酸、コハク酸、リンゴ酸、乳酸等が挙げられ、その他水溶性物質としては、アスコルビン酸、人血清アルブミン、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ゼラチン、ゼラチン加水分解物、ヘパリンナトリウム等が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ドキソルビシン水溶液およびドキソルビシンのリポソーム製剤のP388白血病細胞に対する殺細胞効果の結果を示す。
【図２】ドキソルビシン水溶液およびドキソルビシンのリポソーム製剤のEhrlich 腹水癌細胞への薬物取り込みの結果を示す。
【図３】ドキソルビシン水溶液およびドキソルビシンのリポソーム製剤のP388白血病細胞移植マウスにおける抗腫瘍効果（腫瘍重量）の結果を示す。
【図４】ドキソルビシンのリポソーム製剤のP388白血病細胞移植マウスにおける腫瘍内ドキソルビシン濃度の結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。
【実施例】
【００３０】
実施例１
ジステアリルフォスファチジルコリン(DSPC)、コレステロール(Chol)、ジステアリルフォスファチジルグリセロール(DSPG)、ポリエチレングリコールの平均分子量２０００のポリエチレングリコールコレステリルエーテル（PEG-Chol）をそれぞれ、１００μmol：１００μmol：６０μmol：１５μmol、ドキソルビシン18μmolをクロロホルム／メタノール混液（４：１, v/v）に溶解し、窒素ガス気流下ロータリーエバポレーターで有機溶媒を減圧留去してナスフラスコの内壁にlipid filmを作成し、さらにデシケーター中に入れ、真空ポンプを用いて溶媒を完全に留去した。これに9.0%ショ糖／10mM乳酸緩衝液(pH4.0)10mlを加え、７５℃で水和させ、窒素置換後、超音波処理によってリポソーム分散液とした。さらにExtrusion法によりリポソームの粒子径を調整した(PEG-CHO(2000)-LDOX)。【００３１】
実施例２
DSPC、Chol、DSPG、ポリエチレングリコールの平均分子量２０００のポリエチレングリコールコレステリルエーテル（PEG-Chol）、ポリエチレングリコールの平均分子量２０００のポリエチレングリコールジステアリルグリセロールエステル（PEG-DSG）をそれぞれ、１００μmol、１００μmol、６０μmol、7.5μmol、7.5μmol、ドキソルビシン18μmolをクロロホルム／メタノール混液（４：１, v/v）に溶解し、実施例１と同様に操作して、粒子径を調整したリポソーム分散液を調製した
(PEG-(DSG(2000):CHO(2000)=1:1)-LDOX)。【００３２】
実施例 ３
DSPC、Chol、DSPG、ポリエチレングリコールの平均分子量２０００のポリエチレングリコールコレステリルエーテル（PEG-Chol）、ポリエチレングリコールの平均分子量２０００のポリエチレングリコールジステアリルグリセロールエステル（PEG-DSG）をそれぞれ、１００μmol、１００μmol、６０μmol、3.75μmol、11.25μmol、ドキソルビシン18μmolをクロロホルム／メタノール混液（４：１, v/v）に溶解し、実施例１と同様に操作して、粒子径を調整したリポソーム分散液を調製した
(PEG-(DSG(2000):CHO(2000)=3:1)-LDOX)。【００３３】
比較例１
DSPC、Chol、DSPGをそれぞれ、１００μmol、１００μmol、６０μmol、ドキソルビシン18μmolをクロロホルム／メタノール混液（４：１, v/v）に溶解し、実施例１と同様に操作して、粒子径を調整したリポソーム分散液を調製した(PLDOX)。【００３４】
比較例２
DSPC、Chol、DSPG、ポリエチレングリコールの平均分子量２０００のポリエチレングリコールジステアリルグリセロールエステル（PEG-DSG）をそれぞれ、１００μmol、１００μmol、６０μmol、１５μmol、ドキソルビシン18μmolをクロロホルム／メタノール混液（４：１, v/v）に溶解し、実施例１と同様に操作して、粒子径を調整したリポソーム分散液を調製した(PEG-DSG(2000)-LDOX)。【００３５】
比較例３
ドキソルビシン１８μmolを9.0%ショ糖／10mM乳酸緩衝液(pH4.0)１０mlに溶解し、ドキソルビシンの水溶液とした(DOX sol)。【００３６】
実験例１
Ehrlich 腹水癌細胞 (1×106)に実施例１、２、比較例１，２，３で調製した製剤を各種の濃度に調整した液を添加し、WSTを用いて殺細胞効果を検討した。
製剤中のドキソルビシン濃度と殺細胞効果の関係をプロットした結果より、５０％の殺細胞効果が得られるドキソルビシン濃度を算出した（表１）。これより、本発明のリポソーム製剤は比較例に比し、顕著な薬理効果を示すことが示された。
表１  ドキソルビシン水溶液およびドキソルビシンのリポソーム製剤のEhrlich 腹水癌細胞に対する殺細胞効果
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【００３７】
実験例２
P388白血病細胞(1×106)に実施例１、２、比較例１，２，３で調製した製剤をドキソルビシンの濃度として0.01μg/mlとなるように調整した液を添加し、実験例１と同様にWSTを用いてWSTを用いて殺細胞効果を検討した。生存細胞数の割合を図１に示した。これより、本発明のリポソーム製剤は比較例１，２に比し、顕著な薬理効果を示し、ポジティブコントロールである比較例３のドキソ
ルビシンの水溶液と同等の効果を示した。【００３８】
実験例3
P388 白血病細胞 (1×106)に実施例１、２、３、比較例２で調製した製剤を各種の濃度に調整した液を添加し、WSTを用いて殺細胞効果を検討した。
製剤中のドキソルビシン濃度と殺細胞効果の関係をプロットした結果より、５０％の殺細胞効果が得られるドキソルビシン濃度を算出した（表2）。これより、本発明のリポソーム製剤は比較例に比し、顕著な薬理効果を示すことが示された。
表２  ドキソルビシン水溶液およびドキソルビシンのリポソーム製剤のP388 白血病細胞に対する殺細胞効果
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【００３９】
実験例４
Ehrlich 腹水癌細胞に実施例１、２、比較例１，２で調製した製剤をドキソルビシンの濃度を5.0 μg／mlに調整した液を添加し、経時的な細胞への薬物取り込みについて検討した。
一定数の細胞数あたりのドキソルビシン濃度の時間推移を検討した結果より、本発明のリポソーム製剤を用いると比較例に比し、有意な薬物取り込みが得られることが示された(図２)。【００４０】
実験例５
マウスの背部皮下にP388白血病細胞（5.0×105）を植え付け、固形腫瘍とした。植え付け後５、８、11日目にコントロ−ル（生理食塩液）、比較例１、実施例３で調製した製剤をドキソルビシンの１回の投与量として2.5mg/kg となるように尾静注した（総投与量7.5mg/kg）。植え付け後13日目（3回目の投与から48時間後）に解剖し、腫瘍を摘出し、腫瘍重量及び腫瘍細胞中のドキソルビシン濃度を測定した。腫瘍重量は実施例３で有意に減少し（図３）、腫瘍内のドキソルビシン濃度も高まった(図４)。  
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明は遊離剤を投与する等の特別な操作を必要とすることなく、循環血液中の滞留性を保持しつつ、標的細胞内におけるリポソームによる薬物の細胞内送達性を著しく改善した薬物の標的細胞内送達性改善剤および該リポソームを提供するものとして有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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