(57)【要約】  肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）またはＨＧＦレセプターのアゴニストからなる抗ウイルス剤及びこれらと他の抗ウイルス剤を同時に、または、別々に使用するＣ型肝炎ウイルスに起因する疾患の予防及び／又は治療剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝実質細胞増殖因子または肝実質細胞増殖因子レセプターのアゴニストからなる抗ウイルス剤。
【請求項２】
ウイルスがＣ型肝炎ウイルスである請求項１記載の抗ウイルス剤。
【請求項３】
肝実質細胞増殖因子または肝実質細胞増殖因子レセプターのアゴニストと、１種または２種以上の抗ウイルス剤とを同時に、または、別々に使用することを特徴とする医薬品製剤。
【請求項４】
抗ウイルス剤が、Ｃ型肝炎ウイルス-subgenomic repliconにおける阻害活性を有する物質である請求項３記載の医薬品製剤。
【請求項５】
抗ウイルス剤が、Ｃ型肝炎ウイルスプロテアーゼ阻害剤、Ｃ型肝炎ウイルスポリメラーゼ阻害剤及びＣ型肝炎ウイルスヘリカーゼ阻害剤から選ばれる1種または２種以上である請求項３または４に記載の医薬品製剤。
【請求項６】
抗ウイルス剤がイノシンモノフォスフェートデヒドロゲナーゼ阻害剤であることを特徴とする請求項３に記載の医薬品製剤。
【請求項７】
抗ウイルス剤が、インターフェロン及びリバビリンから選ばれる1種または２種である請求項３から６のいずれかに記載の医薬品製剤。
【請求項８】
Ｃ型肝炎ウイルスに起因する疾患を予防及び／または治療するための請求項３から７のいずれかに記載の医薬品製剤。
【請求項９】
Ｃ型肝炎ウイルスに起因する疾患が、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変及び肝癌から選ばれる請求項８記載の医薬品製剤。
【請求項１０】
ウイルス血症を改善するための請求項３から９のいずれかに記載の医薬品製剤。
【請求項１１】
肝実質細胞増殖因子または肝実質細胞増殖因子レセプターのアゴニストと、１種または２種以上の抗ウイルス剤とを同時に、または、別々に使用することを特徴とするＣ型肝炎ウイルスに起因する疾患の予防及び／または治療方法。
【請求項１２】
抗ウイルス剤が、Ｃ型肝炎ウイルス-subgenomic repliconにおける阻害活性を有する物質である請求項１１記載の予防及び／または治療方法。
【請求項１３】
抗ウイルス剤が、Ｃ型肝炎ウイルスプロテアーゼ阻害剤、Ｃ型肝炎ウイルスポリメラーゼ阻害剤及びＣ型肝炎ウイルスヘリカーゼ阻害剤から選ばれる1種または２種以上である請求項１１または１２に記載の予防及び／または治療方法。
【請求項１４】
抗ウイルス剤がイノシンモノフォスフェートデヒドロゲナーゼ阻害剤であることを特徴とする請求項１１に記載の予防及び／または治療方法。
【請求項１５】
抗ウイルス剤が、インターフェロン及びリバビリンから選ばれる1種または２種である請求項１１から１４のいずれかに記載の予防及び／または治療方法。
【請求項１６】
Ｃ型肝炎ウイルスに起因する疾患が、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変及び肝癌から選ばれる請求項１１から１５のいずれかに記載の予防及び／または治療方法。
【請求項１７】
肝実質細胞増殖因子または肝実質細胞増殖因子レセプターのアゴニストと、１種または２種以上の抗ウイルス剤とを同時に、または、別々に使用することを特徴とするウイルス血症の改善方法。
【請求項１８】
抗ウイルス剤が、Ｃ型肝炎ウイルス-subgenomic repliconにおける阻害活性を有する物質である請求項１７記載の改善方法。
【請求項１９】
抗ウイルス剤が、Ｃ型肝炎ウイルスプロテアーゼ阻害剤、Ｃ型肝炎ウイルスポリメラーゼ阻害剤及びＣ型肝炎ウイルスヘリカーゼ阻害剤から選ばれる1種または２種以上である請求項１７または１８に記載の改善方法。
【請求項２０】
抗ウイルス剤がイノシンモノフォスフェートデヒドロゲナーゼ阻害剤であることを特徴とする請求項１７に記載の改善方法。
【請求項２１】
抗ウイルス剤が、インターフェロン及びリバビリンから選ばれる1種または２種である請求項１７から２０のいずれかに記載の改善方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ウイルス剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス(Hepatitis virus type C、以下「ＨＣＶ」と略することもある)は、日本において肝炎・肝硬変・肝癌の第一の原因となっている。日本には約150万人の慢性肝炎患者、約30万人の肝硬変患者がいると推定されるが、そのうちＨＣＶを原因とするものは、70%-80%を占める。ＨＣＶは血液を介して感染するため、輸血血液はスクリーニングされ、現在では輸血による感染はほぼ除外できるが、それ以前の医療行為による感染者を中心に、現在でも約200万人のキャリアが存在し、新たな慢性肝炎患者の温床となっている。【０００３】
ＨＣＶは、感染がヒトおよびチンパンジーでしか成立しないこと、及びin vitroでの適当な感染系・複製系が無かったことから、Ｃ型肝炎に対する薬剤の開発は遅れていた。種々の医薬品が治療に使用されているが、ウイルス血症改善に効果のあるものは、現在までに種々のインターフェロン(以下「ＩＦＮ」と略することもある)製剤、リバビリンのみである。しかし、その効果も十分とは言えず、リバビリン単独ではＨＣＶに対して無効でＩＦＮとの併用のみ効果が認められ、ＩＦＮ単独では奏功率30％、両剤併用でも50%である。特にわが国に蔓延するＨＣＶ-1b型(遺伝子の型)やウイルス量が多い患者では治癒する可能性は極めて低い。このような状況で、Ｃ型慢性肝炎・肝硬変・肝癌に対する有効な薬剤の開発が望まれている。【０００４】
抗ウイルス剤以外に、Ｃ型肝炎を含む慢性肝炎全般に対して、肝細胞壊死の進行抑制を目的に肝庇護剤と呼ばれる薬剤が投与されることがある。上市された肝庇護剤には、注射剤として強力ネオミノファーゲンＣ・アデラビン９号・タチオン・経口剤としてグリチロン・チオラ・ウルソ・プロヘパール・小柴胡湯などがある。これらは、肝細胞膜の安定化などを介して対症療法的に肝機能検査(漏出酵素など)値を改善するのであり、原因であるウイルスを排除する効果はない。従ってウイルス血症を改善する薬効は全く期待できない。【０００５】
近年、ＨＣＶ-subgenomic repliconというin vitroのＣ型肝炎ウイルスの複製を模倣する系が確立された（非特許文献１）。
ＨＣＶ-subgenomic repliconとは、ＲＮＡを細胞内に含有するＨＣＶ複製モデルである（図３）。ＨＣＶ-ＩＲＥＳ（internal ribosome entry site）下流にネオマイシン耐性遺伝子を、ＥＭＣＶ-ＩＲＥＳ下流にＨＣＶ非構造遺伝子配列を持つ「ＨＣＶ擬似ＲＮＡ」を、ヒト肝癌細胞株であるHuh7細胞にトランスフェクトしてG418存在下で選択する。得られた耐性クロンでは、replicon ＲＮＡはＨＣＶ由来のポリメラーゼ, プロテアーゼなどを利用して自立複製をしており、ＨＣＶの複製モデルとなりうる。本システムは抗ＨＣＶ剤のスクリーニングに広く用いられており、本システムでreplicon ＲＮＡの複製を阻害するＨＣＶプロテアーゼ阻害剤BILN-2061は、C型肝炎患者のウイルス血症を改善することも示されており、系の妥当性は認められている（非特許文献２）。【０００６】
一方、肝実質細胞増殖因子(Hepatocyte growth factor、以下「ＨＧＦ」ともいう。)は、成熟肝細胞に対する強力な増殖促進因子として発見され、その遺伝子クローニングがなされた（非特許文献３）。その後の研究により、ＨＧＦは生体内で腎、肺、胃、十二指腸、皮膚などの創傷治癒にも関係していることが明らかとなり、またＨＧＦの受容体に関しては、ｃ−Ｍｅｔ原腫瘍遺伝子がＨＧＦ受容体をコードしていることが明らかにされている（非特許文献４、５）。現在ではＨＧＦは、当該受容体を介することにより、多くの組織修復、器官再生に働く因子であると考えられている（非特許文献６、７）。【０００７】
特に、肝疾患分野においては、ＨＧＦの持つ肝細胞増殖促進作用・肝細胞壊死抑制作用・肝機能促進作用から、劇症肝炎・肝不全・肝移植などの急性適応、慢性肝炎・肝硬変などの慢性適応の両面が考案され、その医薬応用が期待されている（特許文献１）。しかしながら、ＨＧＦ自体に直接肝炎ウイルスを排除する機能があるか否かについては、現在まで全く具体的証明が為されていない。
【特許文献１】特開平３−７２８８３号公報
【非特許文献１】SCIENCE 285, No.5424, 110-113 (1999)
【非特許文献２】Nature 426, No.6963, 186-189 (2003)
【非特許文献３】Biochem. Biophys. Res. Commun., 163, 967 (1989)
【非特許文献４】Science, 251,802-804 (1991)
【非特許文献５】Oncogene, 6, 501-504 (1991)
【非特許文献６】実験医学 10, 144-153 (1992)
【非特許文献７】動脈硬化 23, 683-688 (1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、新たな抗ウイルス剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＨＧＦ単独投与でＨＣＶの複製抑制が起こること、及びＨＧＦとＩＦＮに代表される抗ウイルス剤との併用により、該抗ウイルス剤のＨＣＶ複製抑制が増強されることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
すなわち、本発明の要旨は、以下のとおりである。
（１）  肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）またはＨＧＦレセプターのアゴニストからなる抗ウイルス剤。
（２）  ウイルスがＣ型肝炎ウイルスである（１）記載の抗ウイルス剤。
（３）  ＨＧＦまたはＨＧＦレセプターのアゴニストと、１種または２種以上の抗ウイルス剤とを同時に、または、別々に使用することを特徴とする医薬品製剤。
（４）  抗ウイルス剤が、ＨＣＶ-subgenomic repliconにおける阻害活性を有する物質である（３）記載の医薬品製剤。
（５）  抗ウイルス剤が、ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤、ＨＣＶポリメラーゼ阻害剤及びＨＣＶヘリカーゼ阻害剤から選ばれる1種または２種以上である（３）または（４）に記載の医薬品製剤。
（６）抗ウイルス剤がイノシンモノフォスフェートデヒドロゲナーゼ（以下「ＩＭＰＤＨ」と称することもある）阻害剤であることを特徴とする（３）記載の医薬品製剤。
（７）  抗ウイルス剤が、インターフェロン(ＩＦＮ)及びリバビリンから選ばれる1種または２種である（３）から（６）のいずれかに記載の医薬品製剤。
（８）  Ｃ型肝炎ウイルスに起因する疾患を予防及び／または治療するための（３）から（７）のいずれかに記載の医薬品製剤。
（９）  Ｃ型肝炎ウイルスに起因する疾患が、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変及び肝癌から選ばれる（８）記載の医薬品製剤。
（１０）  ウイルス血症を改善するための（３）から（９）のいずれかに記載の医薬品製剤。
（１１）  ＨＧＦまたはＨＧＦレセプターのアゴニストと、１種または２種以上の抗ウイルス剤とを同時に、または、別々に使用することを特徴とするＣ型肝炎ウイルスに起因する疾患の予防及び／または治療方法。
（１２）  抗ウイルス剤が、ＨＣＶ-subgenomic repliconにおける阻害活性を有する物質である（１１）記載の予防及び／または治療方法。
（１３）  抗ウイルス剤が、ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤、ＨＣＶポリメラーゼ阻害剤及びＨＣＶヘリカーゼ阻害剤から選ばれる1種または２種以上である（１１）または（１２）に記載の予防及び／または治療方法。
（１４）  抗ウイルス剤がＩＭＰＤＨ阻害剤であることを特徴とする（１１）記載の予防及び／または治療方法。
（１５）  抗ウイルス剤が、ＩＦＮ及びリバビリンから選ばれる1種または２種以上である（１１）から（１４）のいずれかに記載の予防及び／または治療方法。
（１６）  Ｃ型肝炎ウイルスに起因する疾患が、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変及び肝癌から選ばれる（１１）から（１５）のいずれかに記載の予防及び／または治療方法。
（１７）  ＨＧＦまたはＨＧＦレセプターのアゴニストと、１種または２種以上の抗ウイルス剤とを同時に、または、別々に使用することを特徴とするウイルス血症の改善方法。
（１８）  抗ウイルス剤が、ＨＣＶ-subgenomic repliconにおける阻害活性を有する物質である（１７）記載の改善方法。
（１９）  抗ウイルス剤が、ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤、ＨＣＶポリメラーゼ阻害剤及びＨＣＶヘリカーゼ阻害剤から選ばれる1種または２種以上である（１７）または（１８）に記載の改善方法。
（２０）  抗ウイルス剤がＩＭＰＤＨ阻害剤であることを特徴とする（１７）に記載の改善方法。
（２１）  抗ウイルス剤が、ＩＦＮ及びリバビリンから選ばれる1種または２種である（１７）から（２０）のいずれかに記載の改善方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、新規な抗ウイルス剤を提供することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＨＣＶ-replicon細胞におけるＩＦＮ及び／又はＨＧＦのＨＣＶ-replicon複製抑制効果を、種々の濃度において示した図である。横軸にＩＦＮ濃度（IU／ml）、縦軸にreplicon複製量（定量ＰＣＲのarbitrary unit）を示す。各ＩＦＮ濃度におけるＨＧＦ添加量の違いを３本の棒グラフで色分けして示してある。また、それぞれのサンプルの標準偏差を棒線で示す。
【図２】図１と同一の実験条件における、細胞増殖作用への作用を示した図である。横軸にＩＦＮ濃度（IU／ml）、縦軸に細胞増殖量（OD490 nmの吸光度）を示す。各ＩＦＮ濃度におけるＨＧＦ添加量の違いを３本の棒グラフで色分けして示してある。また、それぞれのサンプルの標準偏差を棒線で示す。
【図３】ＨＣＶ subgenomic repliconの構造の模式図を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。【００１４】
本発明におけるＨＧＦは公知物質であり、前述の特許文献１に記載の物質である。【００１５】
ＨＧＦ自体はそのレセプターに結合して作用を発揮することが公知であり（非特許文献４）、本発明でＨＧＦを用いて得られた効果はＨＧＦレセプターに作用するアゴニストによっても同様の効果が得られる。ゆえに、本発明ではＨＧＦの代わりに、ＨＧＦと同様の作用を有するＨＧＦ誘導体・部分ペプチド・ＨＧＦ様低分子化合物や、抗ＨＧＦレセプターアゴニスト抗体などを用いても同様の効果を期待しうる。ＨＧＦ誘導体の例としてはNature. 342,440-443 （1989）.に記載された誘導体などが挙げられる。また、抗ＨＧＦレセプター抗体としてはJ Cell Sci. 111, 237-247 （1998）に記載された抗体などが挙げられる。さらに、部分ペプチドとしてはFEBS Lett. Vol. 22,1-6, (1997)に記載されたHGFに由来しアゴニスティックな活性を持つ部分ペプチドなどが挙げられる。しかし、ＨＧＦレセプターに対してアゴニストとしての効果を有する物質であれば特に上記物質に限定されない。さらに、ＨＧＦレセプターに直接的な作用をせず、公知のＨＧＦレセプター下流シグナル伝達やＨＧＦの活性化に関与するＨＧＦアクチベーター、ＨＧＦアクチベーターインヒビターなどに作用するような物質も本発明のＨＧＦレセプターのアゴニストに含まれうる。【００１６】
本発明の特徴は、上記のＨＧＦまたはＨＧＦレセプターのアゴニストを抗ウイルス剤として使用可能なことを見出した点にあるが、更なる特徴として、ＨＧＦまたはＨＧＦレセプターのアゴニストを他の抗ウイルス剤と併用することにより、該抗ウイルス剤のＨＣＶ複製抑制が増強されることを見出した点にある。【００１７】
本発明において使用される抗ウイルス剤の一例としては、ＨＣＶ-subgenomic replicon（非特許文献１）における阻害活性を有する物質であれば特に限定はされない。ここで、ＨＣＶ-subgenomic repliconを阻害する物質とは、ＨＣＶ-subgenomic repliconに薬剤を添加した時に細胞１個あたりに含まれるレプリコンＲＮＡ量を５０％以下、より好ましくは１０％以下に減少させることが可能である薬剤をいう。例としてはＢＩＬＮ２０６１（非特許文献２）などが挙げられるが、上記作用を有する薬剤であれば特に限定されない。具体的には、ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤、ＨＣＶポリメラーゼ阻害剤及びＨＣＶヘリカーゼ阻害剤から選ばれる1種または２種以上が挙げられる。【００１８】
さらに、リバビリンに代表されるイノシンモノフォスフェートデヒドロゲナーゼ（ＩＭＰＤＨ）阻害剤もヒトにインターフェロン（ＩＦＮ）と併用することにより抗ＨＣＶ活性を有することが知られているが、本発明でいう抗ウイルス剤にＩＭＰＤＨ阻害剤も含まれうる。【００１９】
具体的には、ＩＦＮ及びリバビリンから選ばれる1種または２種が挙げられる。【００２０】
なお、上記ＨＧＦやＩＦＮは医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを使用することができる。例えば、ＨＧＦまたはＩＦＮを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養上清等から分離、精製して該ＨＧＦまたはＩＦＮを得ることができる。あるいは遺伝子工学的手法によりＨＧＦまたはＩＦＮをコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを適当な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換えＨＧＦ又はＩＦＮを得ることができる。上記の宿主細胞は、従来から遺伝子工学的手法で用いられる各種の宿主細胞、たとえば大腸菌、酵母、バキュロウィルス（節足動物多角体ウイルス）−昆虫細胞または動物細胞などを用いることができるが特にこれらに限定されるわけではない（Biochem. Biophys. Res. Commun. 175, 660 (1991)、特許第2577091号公報等参照）。【００２１】
組換えベクターを導入した形質転換体は、それぞれに適した培地により培養される。培地中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物、ビタミン、血清および耐性スクリーニングに用いられる薬剤などが含有される。具体的には、形質転換体の宿主が大腸菌の場合には、たとえばＬＢ培地（ナカライテスク社製）等、酵母の場合には、YPD培地（Genetic Engineering, vol. 1, p. 117, Plenum Press(1979)）等、宿主が昆虫細胞および動物細胞の場合は、２０％以下のウシ胎仔血清を含有するHam-12培地、MEM培地、DMEM培地、RPMI1640培地（SIGMA社製）等を挙げることができる。また、培養温度、CO2濃度、培養時間は、宿主及び組換えベクター等によって適宜選択することができる。さらに、必要に応じて通気、攪拌が行われる。これら以外の培地組成あるいは培養条件下でも導入宿主が生育し、挿入されたＨＧＦまたはＩＦＮポリヌクレオチドがコードする蛋白質が生成されればいかなるものであってもよい。【００２２】
このようにして培養された導入体の回収方法は、たとえば宿主が細胞である場合には、培養物を遠心分離等により細胞を分離した後、細胞体あるいは培養上清として回収する方法等が用いられる。回収された細胞体からの組換え蛋白質の抽出方法としては、それ自体既知の通常用いられる方法が挙げられる。【００２３】
ＨＧＦ又はＩＦＮは、公知の無細胞蛋白質合成系等によっても調製することができる。無細胞蛋白質合成系に用いられる細胞抽出液として具体的には、大腸菌等の微生物、植物種子の胚芽、ウサギ網状赤血球等の細胞抽出液等、既知のものが用いられる。これらは市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には大腸菌抽出液は、Pratt, J. M. et al., Transcription and Translation, Hames, B. D. & Higgins, S. J., et. al., p179-209,  IRL Press, Oxford(1984)に記載の方法等に準じて調製することもできる。【００２４】
さらに、ＩＦＮは試薬や医薬品として上市されているものも使用しうる。例えば、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、コンセンサスIFNなどが挙げられる。さらにポリエチレングリコール化などの修飾をされたIFNも使用可能であるが、抗ウイルス効果が認められるものであれば特に上記サブタイプおよび修飾体には限定されない。【００２５】
なお、本発明で使用されるＨＧＦまたはＩＦＮは、天然型と実質的に同じ作用を有する限り、そのアミノ酸配列中の１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されていてもよく、また同様に糖鎖が置換、欠失及び／又は付加されていてもよい。【００２６】
また、定法のノーザンブロッティングにより特許文献１に示した核酸とハイブリダイズする核酸およびそれに由来する蛋白も本発明でいうＨＧＦに含まれうる。ノーザンブロッティングは具体的にはバイオ実験イラストレイテッド  ２  遺伝子解析の基礎（秀潤社）の第１０章ノーザンハイブリダイゼーションに記載された方法で実施することが可能であるが、これに限らず一般的なノーザンブロッティングのプロトコールで実施可能であり、上記参考文献に記載の方法および下記に例示した方法のみに限定されることはない。【００２７】
すなわち、定法に従い細胞から抽出したRNAのアガロース電気泳動を行ったゲルからRNAをニトロセルロースまたはナイロンメンブレンにトランスファーをしたメンブレンに特許文献１に示した核酸に由来するプローブを用いてハイブリダイズさせることができる。具体的には特許文献１に示した核酸を用いて作成した核酸プローブとともにメンブレンをハイブリダイズ用バッファー＜5×SSPE(750mM NaCl, 43.3mM NaPO4 (pH7.4), 6.25mM EDTA)、50%ホルムアミド、5×Denhalt’ solution(0.1% BSA, 0.1% ficol400, 0.1% PVP)、0.5% SDS＞中で42〜65℃にてインキュベートすることによりプローブと目的RNAのハイブリダイゼーションは可能である。ハイブリダイズ用バッファーとして上記の例示を行ったが、一般的なノーザンブロッティングに用いられうるハイブリダイズ用のバッファーであれば特に限定はされない。核酸プローブは定法に従いRI標識、あるいはDIG、biotin、フルオレセイン等の化学物標識したもの、あるいはアルカリフォスファターゼやパーオキシダーゼなどの酵素標識したものを用いることができる。ハイブリダイズさせた核酸プローブの検出はRI標識の場合は直接X線フィルムへの露光を、化学物標識の場合は酵素標識されたそれに対する抗体添加後に発光物質とインキュベーションすることによりX線フィルムに露光する方法を、酵素標識であればメンブレンを発光物質とインキュベーションすることによりX線フィルムに露光する方法などにより行うことができるが、核酸プローブとRNAのハイブリダイゼーションを検出可能な方法なのであれば特にこれら方法に限定されない。【００２８】
なお、ハイブリダイズ用バッファーの塩濃度を下げる、あるいはホルムアミド濃度を上げてハイブリダイズを行うことも可能である。具体的にはNa濃度が150mM〜800mMの間のバッファーを用いて同様にハイブリダイズを行うことはできる。また、ホルムアミド濃度も50〜70%の濃度でハイブリダイズを行うことは可能で、これらの塩およびホルムアミド濃度の範囲内で42〜65℃でハイブリダイズした核酸およびそれに由来する蛋白は本特許の請求範囲に含まれる。【００２９】
リバビリンは医薬品として上市しているものを使用しうる。具体的には、シェリング・プラウ社からレベトール（登録商標）として販売されているものを使用可能である。用量としては、1日量として50〜5000mgの間で投与可能であるが、好ましくは600〜800mgを1日2回に分けて経口服用することが望ましい。しかし、抗ウイルス活性が見られるのであれば、特に上記用量に限定はされない。さらに、メルクから試薬として販売されているもの（製品番号555580）も使用可能である。【００３０】
本発明は、ＨＧＦまたはＨＧＦレセプターのアゴニストと抗ウイルス剤とを同時に、または、別々に使用することを特徴とするＣ型肝炎ウイルスに起因する疾患を予防及び／または治療方法を提供することが可能である。ここで、Ｃ型肝炎ウイルスに起因する疾患とは、例えば、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変及び肝癌が挙げられる。また、本発明においては、ＨＧＦまたはＨＧＦレセプターのアゴニストと抗ウイルス剤とを併用してウイルス血症を改善する方法も提供する。【００３１】
本発明においては、ＨＧＦまたはＨＧＦレセプターのアゴニストを単独で、あるいはＩＦＮに代表されるような他の抗ウイルス剤と共に、さらには適当な製剤用添加物と共に製剤形態の医薬組成物として調製し、投与することができる。このような医薬組成物の投与形態としては、一般的に使用されるものであれば特に限定されないが、注射用アンプル剤や注射用凍結乾燥粉末剤等を用いることができる。各種製剤形態への調製は、当業者が利用可能な周知の製剤添加物、たとえば、希釈剤や添加剤などを用いて慣用の手法に従って行うことができる。【００３２】
例えば、注射用凍結乾燥粉末剤は、精製された前記ＨＧＦ及び／又は他の抗ウイルス剤の有効量を希釈液に溶解し、必要に応じて賦形剤、安定化剤、保存剤、無痛化剤、ｐＨ調節剤等を加え、常法により製造することができる。また、注射用アンプル剤は、前記ＨＧＦ又は他の抗ウイルス剤の有効量を希釈剤に溶解し、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、等張化剤、安定化剤、保存剤、無痛化剤、ｐＨ調節剤等の添加剤を加えた後、通常の加熱滅菌、無菌ろ過等により無菌化して調製することができる。【００３３】
なお、本発明において「ＨＧＦまたはＨＧＦレセプターのアゴニストと他の抗ウイルス剤を同時に使用する」とは、これらを併用して用いる場合、及び、合剤として用いる場合の双方の意味で解釈される。【００３４】
本発明においては、上記した非経口投与以外に、医薬上許容される担体等を用いて、錠剤、顆粒、カプセル剤、散剤等の固型状、または液剤、懸濁剤、シロップ、乳剤、レモナーデ剤等の液状の態様で、経口投与、吸入投与または外用に適した剤型に製剤化した医薬製剤として用いることもできる。必要ならば、上記製剤に補助剤、安定化剤、湿潤剤、その他の常用添加剤を配合してもよい。【００３５】
上記各種医薬製剤の用量は、投与ルート、病気の種類、患者の症状、体重あるいは年齢等によって異なり、また適用しようとする薬物の種類などによっても変動するが、一般には、ＨＧＦの場合、１日当たり１ｍｇ〜２００ｍｇ程度またはそれ以上の量を患者１人当たりに投与することができる。有効成分として含有されるＨＧＦの平均１回量を、５ｍｇ〜１００ｍｇ程度として、肝障害の予防及び／又は治療に適用することが好ましい。ＩＦＮの場合、既に「Ｃ型慢性活動性肝炎におけるウイルス血症の改善」という適応で上市されており、例えばキャンフェロンＡ(ＩＦＮアルファ-2a遺伝子組換え製剤、武田薬品工業)では、１日300万〜900万国際単位が投与されている。【００３６】
さらに本発明では、ＨＧＦ遺伝子及び／又はＩＦＮ遺伝子をＣ型肝炎ウイルスに起因する肝障害の予防及び／又は治療を行うための遺伝子治療薬として、また、適当な細胞にＨＧＦ遺伝子及び／又はＩＦＮ遺伝子を導入してその細胞を組織内に移植する細胞治療薬として使用することができる。たとえば、本発明のＨＧＦ遺伝子及び／又はＩＦＮ遺伝子をリポフェクション試薬に混合し、これを生体に投与することにより、局所のＨＧＦ及び／又はＩＦＮをＣ型肝炎ウイルスに起因する肝障害の予防及び／又は治療に必要な濃度に維持することができる。本発明のＨＧＦ及び／又はＩＦＮの投与は、疾病の状態の重篤度や生体の応答性などによるが、予防及び／又は治療の有効性が認められるまで、あるいは疾病状態の軽減が達成されるまでの期間にわたり、適当な用量、投与方法、頻度で行えばよい。
【実施例】
【００３７】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
（実施例１）ＨＣＶ-replicon細胞におけるＩＦＮのＨＣＶ-replicon複製抑制に対するＨＧＦの添加効果
（実験材料と方法）
In vitroでＨＣＶを複製する細胞系として、ヒト肝癌細胞株Huh7を親株とするＨＣＶ-replicon細胞のクロン、#5-15を用いた（ReBLikon GmbHより購入）。#5-15を2%ウシ胎児血清を含むダルベッコイーグルＭＥＭ培地に懸濁し、1.5×104／100μl／wellとなるよう96ウェルプレートに播種した。ブランクとして細胞を播種しないで培地のみ添加したウェルを設けた（Day0）。5%CO2ガス下、37℃の湿式インキュベーター内で一昼夜培養後、ヒト組換えＩＦＮα（BIOMEDICAL LABORATORIES社製、Cat.No.11105-1, lot No.#2122）及び／又はヒト組換えＨＧＦ（自社製、Lot.920629）を各ウェルに50μlずつ添加した。ＩＦＮαの最終濃度は、0、0.1、0.3国際単位（IU）／ml、ＨＧＦの最終濃度は、0、10、100ng／mlとし、全ウェルが200ulとなるよう調製した。各サンプルは3ウェルずつ用意した（triplicate）（Day1）。48時間培養後、各ウェルより全RNAをABI-PRIZM 6100 Nucleic Acid PrepStation（アプライドバイオシステム社）により抽出した。抽出方法は装置の操作手引書に従った。抽出したRNA溶液は-80℃に保管した（Day3）。翌日サンプルを解凍後、定量PCR（Polymerase chain reaction）法により、ＨＣＶ-repliconのRNA量を定量した。装置はABI PRISM7900（アプライドバイオシステム社）を用い、竹内らの方法(Takeuchi, T. et al. Gastroenterology Vol.116, 636-642 (1999))に従い定量を行った。【００３８】
定量PCRに用いた標準曲線用のＲＮＡは、T7 promoter下流にＨＣＶ MKC-1A株の遺伝子(Genbank accession No.D45172)をつないだベクターを用いてT7 RiboMAX Express Large Scale RNA production System  (プロメガ社製)でin vitro transcriptionを行い調製し、上記定量PCRにおいて102−108にかけて直線性の得られることを確認した。
（結果）
上記方法によって、種々のＩＦＮ・ＨＧＦ濃度の組合せにおけるＨＣＶ-repliconのRNA量を定量したところ、以下のことが明らかとなった。
(1)ＨＧＦ高濃度（100 ng／ml）においては、ＨＧＦ単独でＨＣＶ-replicon複製を抑制した。
(2)ＩＦＮがＨＣＶ-replicon複製抑制に十分な濃度（0.3 IU／ml）においては、ＨＧＦの効果は認められなかった。
(3)ＩＦＮがＨＣＶ-replicon複製抑制に部分的に作用する濃度（0.1 IU／ml）においては、ＨＧＦが相乗的に作用してＨＣＶ-replicon複製を抑制した（図１）。
（実施例２）ＨＣＶ-replicon細胞株の増殖に対するＩＦＮ、ＨＧＦまたはその併用の影響
（実験材料と方法）
実施例１で認められたＨＣＶ-replicon複製量の減少が、細胞数自体の減少に起因するものか否かを見極める目的で、以下の実験を行った。
#5-15を2%ウシ胎児血清を含むダルベッコイーグルＭＥＭ培地に懸濁し、1.5×104／100μl／wellとなるよう96ウェルプレートに播種した。ブランクとして細胞を播種しないで培地のみ添加したウェルを設けた（Day0）。5%CO2ガス下、37℃の湿式インキュベーター内で一昼夜培養後、ヒト組換えＩＦＮα（BIOMEDICAL LABORATORIES社、Cat.No.11105-1, lot No.#2122）及び／又はヒト組換えＨＧＦ（自社製、Lot.920629）を各ウェルに50μlずつ添加した。ＩＦＮαの最終濃度は、0、0.1、0.3国際単位（IU）／ml、ＨＧＦの最終濃度は、0、10、100ng／mlとし、全ウェルが200ulとなるよう調整した。各サンプルは3ウェルずつ用意した（triplicate）（Day1）。48時間培養後、細胞増殖測定アッセイの一種であるCellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay（プロメガ社、Lot.#171755）により、細胞数を定量化した。操作はアッセイキットの操作手順書に従った。すなわち、各ウェルより培養上清を100μl除去し、アッセイキット中のOne Solution Reagent 20μlを各ウェルに添加した。次いでプレートを37℃に設定した5%CO2を含む湿式インキュベーターで１時間培養し、その後、96ウェルプレートリーダーを使って490nmの吸光度を測定した。
（結果）
実験に用いたいずれのＨＧＦ、ＩＦＮα濃度と、そのいずれの組合せにおいても、ＨＣＶ-replicon細胞株に対する増殖抑制は認められなかった（図２）。
（結論）
ＨＧＦが比較的高濃度（100 ng／ml）においては、ＨＧＦ単独でＨＣＶ-replicon複製抑制作用が認められた。この時、細胞自身の増殖は全く抑制されていなかったことから、ウイルス複製抑制作用は宿主増殖抑制によるものではない。従来、ＨＧＦは肝実質細胞増殖因子であることから、慢性肝疾患の改善剤・肝庇護剤としての適応が想定されていた。我々が今回初めて示した結果は、ＨＣＶに起因する疾患の予防及び／又は治療剤としてのＨＧＦの新規な用途を提供するものである。【００３９】
また、ＩＦＮが部分的に作用する濃度（0.1 IU／ml）においては、ＨＧＦが相乗的に作用してＨＣＶ-replicon複製を抑制した。この時、細胞自身の増殖は全く抑制されていなかったことから、ウイルス複製抑制作用は宿主増殖抑制によるものではない。また、ＨＧＦ単独では複製抑制が殆ど認められない濃度（10 ng／ml）においてもＩＦＮ依存的ウイルス複製抑制作用は相乗的に増強されていることから、ＩＦＮとＨＧＦは、違ったメカニズムでウイルス複製を抑制していることが示唆される。ＩＦＮをはじめとする従来のＨＣＶ抗ウイルス剤は、臨床において、極めて高用量投与しても十分なウイルス排除力を持っていない。我々が示した結果は、ＨＧＦが従来の抗ウイルス剤とは違ったメカニズムでＨＣＶウイルス血症改善を増強する可能性を示唆しており、ＨＧＦと既存抗ウイルス剤の併用又は混合製剤という、ＨＣＶに起因する疾患に対して有望かつ新たな治療を提供するものである。【００４０】
さらに、ＩＦＮには種々の副作用が報告されている。それらは、投与開始直後に多く見られるインフルエンザ様症状・発疹・白血球/血小板減少・蛋白尿から、投与開始後しばらくして見られる脱毛・眼底出血・精神神経症状・間質性肺炎・甲状腺疾患など自己免疫性疾患の発症／憎悪・糖尿病の憎悪まで多岐に及ぶ。中には重篤な副作用も含み、患者の命に関わるケースや、投与中断を余儀なくされるケースも多い。今回我々が初めて示したＨＧＦとＩＦＮとの併用又は混合製剤は、ＩＦＮ用量を従来よりも低く抑えて従来又はそれ以上の薬効を期待できることから、ＩＦＮに起因するこれらの副作用を軽減するという効果を有する。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。本発明によれば、新規な抗ウイルス剤を提供することが可能である。
なお本出願は、２００５年３月２日付で出願された日本特許出願（特願２００５−０５７６９９）に基づいており、その全体が引用により援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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