(57)【要約】本発明の目的は、遺伝子変化の直接原因となるＤＮＡ損傷又はＤＮＡの予定外複製（unscheduled-replication）等を高感度に検出することを可能ならしめる、新しい分子マーカーを提供すること等である。  本発明は、被検体におけるＦｒａｇ１遺伝子、該遺伝子産物若しくはそのリン酸化物、又はそれらが関与する細胞応答をマーカーとして用いる、ＤＮＡ損傷の検出方法、該検出方法を用いる、各種のＤＮＡ複製阻害剤、発癌物質及び潜在的発癌物質等のような各種の発癌性物質を含む外因性発癌刺激、又は抗癌剤のスクリーニング方法及びＦｒａｇ１の発現又は活性が関与する疾病の検査又は診断方法、並びに、それらに用いるキット等に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体におけるＦｒａｇ１遺伝子、該遺伝子産物若しくはそのリン酸化物、又はそれらが関与する細胞応答をマーカーとして用いる、ＤＮＡ損傷の検出方法。
【請求項２】
Ｆｒａｇ１遺伝子の発現量を測定することからなる、請求項１記載のＤＮＡ損傷の検出方法。
【請求項３】
Ｆｒａｇ１遺伝子産物又はそのリン酸化物の産生量を測定することからなる、請求項１記載のＤＮＡ損傷の検出方法。
【請求項４】
抗Ｆｒａｇ１蛋白質抗体を用いて、Ｆｒａｇ１遺伝子産物又はそのリン酸化物の産生量を測定することからなる、請求項３記載のＤＮＡ損傷の検出方法。
【請求項５】
細胞応答がアポトーシスである、請求項１記載のＤＮＡ損傷の検出方法。
【請求項６】
細胞応答がアポトーシスを誘導する分子の活性化である、請求項１記載のＤＮＡ損傷の検出方法。
【請求項７】
活性化される分子がカスペース蛋白質である、請求項６記載のＤＮＡ損傷の検出方法。
【請求項８】
活性化される分子がＢａｘである、請求項６記載のＤＮＡ損傷の検出方法。
【請求項９】
被検体として、Ｆｒａｇ１遺伝子発現が阻害若しくは抑制された形質転換細胞、又はＦｒａｇ１、その変異体若しくはそれらの一部をコードする遺伝子が導入された形質転換細胞を用いて行うことを特徴とする、請求項１〜８に記載のＤＮＡ損傷の検出方法。
【請求項１０】
ｓｉＲＮＡによりＦｒａｇ１遺伝子発現が抑制されている形質転換細胞を用いる、請求項９に記載のＤＮＡ損傷の検出方法。
【請求項１１】
被検体として、遺伝子工学的操作により得られた、Ｆｒａｇ１遺伝子発現が阻害若しくは抑制されたノックアウト又はノックダウン動物（ヒトを除く）、又はＦｒａｇ１、その変異体若しくはそれらの一部をコードする遺伝子が導入されたトランスジェニック動物（ヒトを除く）を用いて行うことを特徴とする、請求項１〜８に記載のＤＮＡ損傷の検出方法。
【請求項１２】
動物が齧歯類に属する、請求項１１記載のＤＮＡ損傷の検出方法。
【請求項１３】
ＤＮＡ損傷が外因性発癌刺激により引き起こされたものであることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項記載のＤＮＡ損傷の検出方法。
【請求項１４】
外因性発癌刺激が化合物によるものであることを特徴とする、請求１３記載のＤＮＡ損傷の検出方法。
【請求項１５】
ＤＮＡ損傷が癌細胞で生起しているものであることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項記載のＤＮＡ損傷の検出方法。
【請求項１６】
請求項１４記載のＤＮＡ損傷の検出方法を用いる、外因性発癌刺激又は抗癌剤のスクリーニング方法。
【請求項１７】
請求項１５記載のＤＮＡ損傷の検出方法を用いる、Ｆｒａｇ１の発現又は活性が関与する疾病の検査又は診断方法。
【請求項１８】
請求項１５記載のＤＮＡ損傷の検出方法を用いる、癌又は癌細胞の検査又は診断方法。
【請求項１９】
請求項１〜１４のいずれか一項記載のＤＮＡ損傷の検出方法、請求項１６記載のスクリーニング方法、又は請求項１６若しくは１７記載の検査又は診断方法に用いるキット。
【請求項２０】
Ｆｒａｇ１遺伝子産物、そのリン酸化物、又はそれらの部分ポリペプチドを特異的に認識する抗体。
【請求項２１】
Ｆｒａｇ１遺伝子若しくはその一部、又はそれらの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子。
【請求項２２】
アンチセンスオリゴＤＮＡ、アンチセンスｃＤＮＡ、又はｓｉＲＮＡ若しくはそれを生じるｄｓＲＮＡ若しくはｓｓＲＮＡである、請求項２１記載の核酸分子。
【請求項２３】
遺伝子工学的操作により得られた、Ｆｒａｇ１遺伝子が欠損し又はＦｒａｇ１遺伝子発現が阻害若しくは抑制され、ＤＮＡ損傷に対して高い細胞応答を示すことが出来るノックアウト又はノックダウン動物（ヒトを除く）又はそれから樹立された培養細胞株。
【請求項２４】
Ｆｒａｇ１の変異体若しくはそれらの一部をコードする遺伝子が導入され、 ＤＮＡ損傷に対する細胞応答が変化しているトランスジェニック動物（ヒトを除く）又はそれから樹立された培養細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍抑制に係わるケアテーカー（care taker）遺伝子であるＦｒａｇ１遺伝子及びその遺伝子産物をマーカーとするＤＮＡ損傷（予定外複製（unscheduled-replication）又は複製阻害等）の検出方法、特に、細胞周期のＳ期におけるＤＮＡ損傷の高感度の検出方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍の増殖過程における、染色体位置の異常に関連するゲノム損傷領域の蓄積によって、癌原遺伝子が活性化され、癌抑制遺伝子が不活性化される（非特許文献１）。染色体ペインティング、染色体比較ハイブリダイゼーション、レプリゼンテイショナル示差分析、制限ランドマークゲノムスキャニング及び異型接合性欠如のハイスループット分析等の全ゲノム規模での分析技術によって、癌細胞ゲノムの不安定性の結果、非常に多くの染色体損傷が蓄積されることが明らかとなった。従って、影響を受ける遺伝子を同定し、腫瘍形成におけるその役割を解明する為には、重要なゲノム損傷をその他のノイズから区別する必要がある。【０００３】
癌抑制遺伝子を、「ゲートキーパー（gate keeper）」と「ケアテーカー（care taker）」の二つの型に分類することが提案されている（非特許文献２）。ゲートキーパーとは対照的に、ケアテーカー遺伝子は細胞増殖を直接には制御せず、ゲノムの不安定化を予防・阻止すべく機能する。この機能は、直接的又は間接的に、相同組換え経路によるＤＮＡ鎖切断の修復において働く。このようなゲノムの不安定化は、毛細血管拡張性運動疾患、遺伝性乳癌、ブルーム症候群（Bloom’s syndrome）及びウェルナー症候群（Welner’s syndrome）のような、発癌易罹患性の臨床的症候群に関連する。ゲノム全体のケアテーカーの異常が蓄積すると変異したゲートキーパーと協同して、深刻な病変の原因となり、選択的増殖能及び生存能力を獲得した形質転換細胞を生じることとなる。【０００４】
大規模な染色体の再配列はＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢｓ）が不適切に修復された結果生じ得る。このＤＳＢｓは染色体異常の第一の原因であり、ＤＮＡ複製の自然な順番がＤＮＡ損傷によって混乱させられたときに生じることがある。ＤＳＢｓから細胞死に至ることもあり、又は、切断によっても生存可能なまたは即座には細胞死には致らないような場合には、娘細胞における転座、倒置、増幅、及び欠失のような染色体異常に至る。複製ストレスが複製フォークを減速又は停止させる原因となることもあるが、酵母の研究で知られている複製フォークバリア及び複製スローゾーンのような自然の配列もこのような停止の原因となり得る。このような事象が引き金となって細胞チェックポイントの活性化が起こり、細胞周期が進行する前に損傷を修復する時間が与えられる。従って、減速又は停止された複製フォークにおけるプロセスを解明することは、ＤＮＡ複製損傷が関わる発癌を予防するための複製に忠実な制御機構を理解するのに重要である。しかしながら、ＤＮＡ損傷がアポトーシスを誘発する機構は未だ完全に解明されてはいない（非特許文献３）。【０００５】
細胞外の環境または細胞内の生理的活動に起因する個々の細胞に対する障害ストレスは、細胞周期の進行を阻止し、それに対する細胞側の応答がＤＮＡ修復を調節し、そして、細胞膜貫通型細胞死誘導性受容体及びミトコンドリア細胞死誘導経路を通じてのアポトーシスの引き金となるチェックポイント−シグナル経路を活性化する。
この細胞外または細胞内の事象に起因する障害ストレスのうち、ＤＮＡに損傷を誘導する遺伝毒性ストレス（複製ストレス）に対する細胞応答の１つとしての細胞死の誘導に関しては、ミトコンドリア細胞死誘導経路が重要な役割をはたす。このミトコンドリア細胞死誘導経路において重要な役割をはたす機能分子としてはＢｃｌ２ファミリー蛋白質が最も重要である。このＢｃｌ２ファミリー蛋白質には、２つの相反する機能をもつ抗アポトーシス蛋白質群とアポトーシス誘導蛋白質群がある。抗アポトーシス蛋白質群の例はＢｃｌ２及びＢｃｌ−ＸＬである。またアポトーシス誘導蛋白質群の例はＢａｘ及びＢａｄである。これらのＢｃｌ２ファミリー蛋白質の機能バランスの結果が細胞全体としての細胞死誘導に関わる運命決定機構を担っていると考えられるが、ＤＮＡに損傷を誘導する遺伝毒性ストレスに対する細胞死誘導機構のうち、ＤＮＡ損傷からミトコンドリアに致る部分は未知の点が多く残されている（非特許文献４）。
ＤＮＡ損傷誘導チェックポイントの調節に関与する蛋白質であるＲａｄ９は本発明においてFrag1機能の下流分子として同定されたものである。このＲａｄ９はこの抗アポトーシスＢｃｌ２ファミリー蛋白質であるＢｃｌ２及びＢｃｌ−ＸＬと相互作用をするが、アポトーシス促進蛋白質であるＢａｘ及びＢａｄとは反応しない。酵母及びヒトにおける研究によって、Ｒａｄ９、Ｈｕｓ１及びＲａｄ１はヘテロ三量複合体、即ち、「９−１−１複合体」としてＰＣＮＡ様滑りクランプとして機能することが判った。ＤＮＡ損傷に応答して、９−１−１複合体はＤＮＡ病変周辺にＲａｄ１７を介して結合し、これがＡｔｒを介してＣｈｋ１キナーゼのリン酸化及び活性化を促進する。ヒトＲａｄ１７蛋白質は損傷の前のクロマチンに結合し、損傷後にＲａｄ９蛋白質をクロマチン上に捕捉することが示された。９−１−１−複合体がＤＮＡ修復にも関与しているとの最近の報告と合わせて考えると、９−１−１複合体はチェックポイント活性化、ＤＮＡ修復及びアポトーシスの複数の機能を調整していることが示唆される。
【非特許文献１】Hanahan, D., Weinberg, R.A. The hallmarks of cancer, Cell 100, 1, 57-70, 2000.
【非特許文献２】Levitt, N.C., Hickson, I.D., Trends Mol Med., 2002. 8(4): p.179-86
【非特許文献３】Russell, P., Checkpoints on the road to mitosis. Trends Biochem Sci., 1998. 23((10)): p. 399-402.
【非特許文献４】Adams, J.M., Cory, S. The Bcl-2 protein family: arbiters of cell survival. Science281(5381) 1322-6, 1998
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
既に記載したように、染色体・遺伝子の変化が起こるより以前の段階（すなわち、発癌の超早期）において、外因性・内因性の複製ストレスにより一時的にゲノム変化が生じた場合にチェックポイントが活性化、細胞周期を減速・停止させてゲノム損傷を修復するが、不完全修復または修復失敗に帰したような場合、危険な変異細胞はアポトーシスで除去される。本発明者は、Frag1遺伝子がこの細胞運命決定機構で中心的役割を果たすことを新たに解明し、Frag1遺伝子の発現変化、遺伝子産物の変化、及び蛋白質のリン酸化変化等を検出することにより、遺伝子変化の直接原因となるＤＮＡ損傷を高感度に検出することが可能であることを見出した。【０００７】
即ち、以下の実施例で具体的に示されるように、本発明者は、外因性又は内因性である何らかの複製ストレスが細胞にかかり複製阻害等のＤＮＡ損傷が起こると、Ｆｒａｇ１が抑制調節されて、ＡｔｒによるＦｒａｇ１のリン酸化（２箇所）を介してＲａｄ９−Ｆｒａｇ１結合が解離され、解離したＲａｄ９が抗アポトーシスＢｃｌ２に抑制的に結合してＢａｘを介するアポトーシスを誘導することを明らかにした（図１１参照）。本発明は、このような知見に基き完成されたものである。
【０００８】
従って、本発明の一つの目的は、遺伝子変化の直接原因となるＤＮＡ損傷又はＤＮＡの予定外複製（unscheduled-replication）等を高感度に検出することを可能ならしめる、新しい分子マーカーを提供することである。更に別の目的は、該分子マーカーを用いて、発癌の分水嶺において、損傷細胞が非生理的に生存する「からくり」を個体レベルで検出したり、医学研究、前癌病変の診断、物質の発癌性評価（ゲノム毒性を持つ物質に加えて、ゲノム毒性を持たない潜在的物質も含む）、発癌物質の閾値の設定、類似の作用点を持つ環境発癌物質を高感度に検出する等を目的とした各種の方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
即ち、本発明は、少なくとも以下の各態様を含むものである。
（１）被検体におけるＦｒａｇ１遺伝子、該遺伝子産物若しくはそのリン酸化物、又はそれらが関与する細胞応答をマーカーとして用いる、ＤＮＡ損傷の検出方法。
（２）本発明のＤＮＡ損傷の検出方法を用いる、各種のＤＮＡ複製阻害剤、発癌物質及び潜在的発癌物質等のような各種の発癌性物質を含む外因性発癌刺激、又は抗癌剤のスクリーニング方法。
（３）本発明のＤＮＡ損傷の検出方法を用いる、Ｆｒａｇ１の発現又は活性が関与する疾病、癌、若しくは癌細胞の検査又は診断方法。
（４）本発明のＤＮＡ損傷の検出方法、スクリーニング方法、又は、検査又は診断方法に用いるキット。
（５）Ｆｒａｇ１遺伝子産物、そのリン酸化物、又はそれらの部分ポリペプチドを特異的に認識する抗体。
（６）Ｆｒａｇ１遺伝子若しくはその一部、又はそれらの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子。
（７）遺伝子工学的操作により得られた、Ｆｒａｇ１遺伝子が欠損し又はＦｒａｇ１遺伝子発現が阻害若しくは抑制され、ＤＮＡ損傷に対して高い細胞応答を示すことが出来るノックアウト又はノックダウン動物（ヒトを除く）又はそれから樹立された培養細胞株。
（８）Ｆｒａｇ１の変異体若しくはそれらの一部をコードする遺伝子が導入され、ＤＮＡ損傷に対する細部応答が変化しているトランスジェニック動物（ヒトを除く）又はそれから樹立された培養細胞株。
【発明の効果】
【００１０】
被検体におけるＦｒａｇ１遺伝子、該遺伝子産物、若しくは該遺伝子産物のリン酸化物、又はそれらが関与する細胞応答をマーカーとして用いることによって、ＤＮＡ損傷の検出変化の直接原因となるようなＤＮＡ損傷又はＤＮＡの予定外複製を高感度に検出することが可能となる。特に、本発明の各種形質転換細胞（形質転換体）又はノックアウト又はノックダウン動物等の遺伝子改変動物の系を使用することによって、細胞周期のＳ期（特に、Ｓ期の中期である、ｍｉｄ−Ｓ期）においてＤＮＡ損傷を高感度に検出することができる。更に、本発明の検出、検査又は診断方法、及びキットに用いられる抗体及び核酸分子が提供される。【００１１】
更に、本発明の方法及びキット等を利用することによって、発癌の分水嶺において、損傷細胞が非生理的に生存する「からくり」を個体レベルで検出したり、医学研究、前癌病変の診断、物質の発癌性評価（ゲノム毒性（複製ストレス要因）を持つ物質に加えて、ゲノム毒性を持たない潜在的物質も含む）、発癌物質の閾値の設定、類似の作用点を持つ環境発癌物質を高感度に検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Frag1 遺伝子の発現解析の結果を示す。レーン１は10％FCS/DMEM培地、レーン２は10％FCS/DMEM培地で培養した細胞にMMSと同量のFCSを陰性コントロール実験として加えた）。(A) RNAブロット解析。ダブルチミジンブロックにより細胞周期を同期させた細胞をアフィデコリン（0.4 μM）で処理して  20 μg の 総RNAsをゲル内で分離、膜に転写してプローブでハイブリダイズした。 Frag1/N と Frag1/Cの２つのプローブはCにも示した。 (B) 様々な細胞でのFrag1遺伝子の発現。レーン1, PU5-1.8 (リンパ様腫瘍); レーン 2, RAW264.7 (白血病ウイルス誘導腫瘍); レーン 3, K-BALB (Kirstenマウス白血病ウイルス形質転換線維芽細胞; レーン 4, 3T3 (線維芽細胞);レーン 5, L-M (マウスL細胞, 形質転換脂肪組織細胞); レーン6, P19 (奇型腫); レーン 7, Hepa 1-6 (肝癌); レーン 8, R1.1 (T細胞リンパ腫); レーン 9, L1210 (リンパ様白血病); レーン 10, P388D1 (リンパ腫); レーン 11, P815 (形質細胞腫);レーン 12, NB41A3 (神経芽腫)。 (C) Frag1断片: F1, F2, F3, F4, FZの図示。Rb結合モチーフ、LxCxE, ２つの Atrリン酸化部位が示されている。クローニングで得られた２つのcDNA断片の位置は、第一メチオニンから数えて、321-1835（=Frag1/N）と3750-5388（=Frag1/C）であり、またハイブリダイゼーション実験に用いたcDNA断片の位置は、第一メチオニンから数えて、1580-1830 と5130-5380である。NLS：核移行シグナルモチーフ。
【図２】複製ストレスによるFrag1遺伝子発現のダウンレギュレーションの生物学的効果を示す。(A) Frag1 siRNAによるFrag1 遺伝子発現のダウンレギュレーション。マウス線維芽細胞をFrag1 siRNAのU6発現ベクターを遺伝子導入してピューロマイシン1ug/ml選択培地で培養した。RNAsと蛋白質を抽出してRT-PCRとウエスタンブロットで解析した。２つの独立したクローンの実験結果を示す（#403と #406）。 C1及びC2はコントロールsiRNAを導入した細胞のもの。(B) MMS暴露後のコロニー生存試験。細胞周期をmid S期に同調させた（右）または同調させない（左）1x106 個の細胞をダブルサイミジンブロックを実施した後にサイミジン無添加培地で2時間培養し細胞周期をS期に入れた。MMSを示された濃度添加して1時間培養したあとMMSを洗浄して除去した。放射線照射は示された線量を照射した（下）。コロニー生存試験として細胞を1.5%メチルセルロースの中に埋め込んで10日間培養し形成されたコロニーを観察した。無処理の細胞に対する生存率を示した。a, bは２つの独立した実験の結果を示す（●）。w は野性型コントロール細胞を示す（○）。
【図３】Frag1はゲノム毒（複製ストレス）への応答に役割を果たすことを示す。(A) ゲノム毒ストレスによるFrag1 のダウンレギュレーション。マウス線維芽細胞を0.4 nMアフィディコリンまたは0.01%MMSで示された時間処理した。細胞を集めて蛋白質を抽出してSDS-PAGE、ウエスタンブロットを施行した。(B) Frag1 のダウンレギュレーションはゲノム毒ストレスに対する感受性を亢進させる。２つの独立したFrag1 siRNA導入マウス線維芽細胞 (#403 と #406)をG1細胞周期に同調させた後サイミジン無添加培地で培養するとともにMMSを加えた。細胞を集めて蛋白質を抽出してSDS-PAGE、ウエスタンブロットを施行した。ミスマッチsiRNAをコントロール（図２における野性型コントロール細胞）として用いた。
【図４】Frag1はRad9-Bcl2経路に関与することを示す。(A) Frag1と Rad9 と Bcl2の共免疫沈降。マウス線維芽細胞を0.4 nMアフィディコリンまたは0.01%MMSで24時間処理した。または紫外線(8 J/m2)に暴露させて24時間培養した。左は無処理。細胞を集めて蛋白質を抽出して抗Rad9抗体または正常ウサギ血清(NRS)での免疫沈降 (IP)をおこない、引き続いて抗Frag1抗体, 抗Rad9抗体, 抗Bcl2抗体でのウエスタンブロットを行った。  (B) 試験管内転写翻訳(IVTT) されたFrag1 F1, F2, F3, F4 および FZ蛋白質断片とGST-Rad9 結合蛋白質の引き落とし実験。試験管内転写翻訳(IVTT)は[35S]メチオニンでラベルしてGST-Rad9 結合蛋白質とインキュベーションした。結合体はグルタチオンアガロースビーズで結合させて回収し、SDS-PAGEを実施、フィルムに感光させた。上が引き落とし実験。下左が実験でもちいた試験管内転写翻訳(IVTT) されたFrag1 F1, F2, F3, F4 および FZ蛋白質断片。下右が実験でも用いた抗GST抗体でのウエスタンブロット。(C) MMS暴露後のマウス線維芽細胞のコロニー生存アッセイ。マウス線維芽細胞はF1, F2, F3, F4 または FZを組み込んだ cDNApcDNA発現ベクターを遺伝子導入してG418選択培地で培養してコロニー生存アッセイを実施した。(D) MMS暴露後の細胞死。Rad9  または  Rad9-N terminal delta または Bcl2 プラスミドを 選択プラスミドとともにF2遺伝子導入細胞に重ねて導入してハイグロマイシン耐性細胞を調整した。 MMS暴露後24時間にエリスロシンB染色で生細胞を評価した。下は示された抗V5 tag (F2)抗体、抗HA tag (Rad9)抗体、抗HA tag (Rad9Ndelta)抗体、抗Bcl2 抗体でのウエスタンブロット。
【図５】DNA損傷応答への Frag1の果たす役割を示す。 (A)細胞周期を同調させたマウス線維芽細胞をMMS (0.01%)を添加または無添加で示された時間培養した。抗Rad9抗体での免疫沈降の前後において示された抗体でウエスタンブロットを実施した。(B)  LxGxK, LxGxE または 野性型 Frag1の遺伝子導入体の細胞周期をG1で同調させて抗Rb抗体での免疫沈降の前後において抗V5 (tag)抗体または抗アクチン抗体でウエスタンブロットを実施した。  (C)マウス線維芽細胞をAtr siRNAで処理して1日後に、細胞をMMS (0.01%)を添加または無添加で4時間培養した。細胞を集めて蛋白質を抽出して免疫沈降またはウエスタンブロットを実施した。(D) MMS処理後のFrag1 と Rad9の細胞内局在。MMS処理後に細胞のコンポーネントを分画調整してウエスタンブロットを実施した。P1, 全細胞ぺレット;S2, 細胞質と核; P2, 界面活性剤で不容性の核;  S3, DNase I-抽出核; P3, DNase I-抵抗性の核; S4, クロマチンを含む分画;P4, 核マトリックス.  CB, クマシーブリリアントブルー染色(CBB); 抗Grb2抗体と抗Orc2抗体でのウエスタンブロットをそれぞれ膜性のまたはクロマチン分画のコントロールとして実施した。
【図６】DNA損傷への Frag1応答を示す。 (A) DNA損傷応答におけるFrag1 と Rad9の会合。野性型 または変異型Frag1の遺伝子導入体の細胞周期をG1で同調させてサイミジン無添加培地でMMS (0.01%) を加えて4または8時間培養した。細胞を集めて蛋白質を抽出して抗Rb抗体による免疫沈降の前後で抗V5 (tag)抗体または抗アクチン抗体でウエスタンブロットを実施した。  (B) MMS暴露後の野性型 または変異型Frag1の遺伝子導入体の細胞死。  野性型 または変異型Frag1の遺伝子導入体をMMS (0.01%)を添加して示された時間培養し、エリスロシンB染色で細胞死を評価した。
【図７】DNA損傷へ応答する Frag1の発現変化を示す。Frag1遺伝子を同定し、アフィディコリン存在下でFrag1遺伝子および比較にもちいた遺伝子のmRNA安定性を解析した。
【図８】DNA損傷へ応答と Frag1を示す。(A)Caspase7の発現変化。(B) Bax及びp53(Ser15)の発現変化。（右）２つの独立したMEFs から作成したFrag1 siRNA遺伝子導入体（#403 と #406）の細胞周期をダブルチミジンブロックでG1期に同期させて、リン酸緩衝液で洗浄後チミジンの入っていない10％ DMEMにいれて示された時間に細胞を回収した。細胞から蛋白質を抽出して抗caspase7抗体、抗Bax抗体、及び抗p53(Ser15) 抗体によりウエスタンブロットをおこなった。（左）コントロール。 (C)p53欠損マウス線維芽細胞。Frag1ダウンレギュレーションがミトコンドリアからのチトクロームCの遊離にあたえる影響を共焦点顕微鏡で観察した。マウス線維芽細胞にFRAG1 siRNAを導入した細胞またはコントロール細胞を0.01% MMS存在下で２時間培養した。（上と中）２４時間後、細胞を固定、抗ミトコンンドリア抗体(Mit.) or 抗チトクロームC抗体 (cyto.) で染色して２次抗体で染色した。白い陰影が抗体で染まっているところ。（下）２つのイメージを重ねた。
【図９】Frag1と結合蛋白質および細胞死誘導を示す。 (A)免疫沈降法（IP）のあとウエスタンブロット法（Wt）で解析した。500マイクログラムの蛋白質抽出液を示された抗体をもちいて免疫沈降法（IP）したあとに、示された抗体をもちいてウエスタンブロット法（Wt）をおこなった。（B）共焦点顕微鏡。（上と中）免疫蛍光顕微鏡によるBax（上）とチトクロームc（中）の局在の研究。F2遺伝子導入細胞とコントロールを、MMS添加培地にいれる前といれた後24時間において検討した。（下）Baxとチトクロームcの検討。白い陰影が抗体で染まっているところがBaxとチトクロームcの局在をしめす。
【図１０】共焦点顕微鏡によるMMS暴露後のFrag1 とAtrの局在を経時的に観察した。MEFsをチャンバーカバースリップの上で培養して0.01% MMSのはいった培地で示された時間培養した。そのあとメタノール、0.05% Triton X-100で固定して、示された抗体で染めて共焦点顕微鏡で観察した。（上と中）Atr (上) と Frag1 (中)のフォーカス形成を観察した。（下）上と中を重ねたイメージ。白い陰影が抗体で染まっているところを示す。
【図１１】Frag1機能スキーマを示す模式図である。Atrは複製阻害のあとRad9の活性化に直接または間接的な役割を果たす。Frag1はRad9活性化のための場を提供する。AtrはFrag1からのRad9の遊離に役割を演じて、その結果Rad9は抗アポトーシス分子Bcl2と結合してBaxを介するアポトーシスを誘導する。細胞周期G1期でのRbはゲノム異常が進行するのを抑制し、細胞周期の負の制御をおこない、その結果細胞の生存を促進する機能をしめす。そこにおいてRbはFrag1蛋白質上のLxCxEモチーフを介してFrag1と結合して、Frag1がRad9を活性化するのを抑制する。RbはS期への進行に際してFrag1をDNA損傷部位にリクルートするのに関わると考えられ、そこにはサイクリン依存性リン酸化酵素や転写因子E2f1の活性化が関与する。
【図１２】蛋白質を抽出して抗ヒトFrag1抗体および抗リン酸化Frag1抗体によりウエスタンブロットをおこなった結果を示す。
【図１３】Frag1欠損マウスの作製に使用するベクターの一例を示す。
【図１４】Frag1トランスジェニックマウスの作製に使用するベクターの一例を示す。
【図１５】マウスの腫瘍発生頻度とリン酸化Frag1の発現変化(増強)との相関を示す。
【図１６】マウスの腫瘍発生頻度とリン酸化Frag1の発現変化、及びFhit遺伝子及びｐ５３遺伝子の発現変化との相関をまとめたものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本明細書における「Ｆｒａｇ１遺伝子、該遺伝子産物若しくはそのリン酸化物、又はそれらが関与する細胞応答」とは、Ｆｒａｇ１遺伝子、該遺伝子産物、又は該遺伝子産物のリン酸化物が関与する一連の分子相互作用の経路において、それらの発現・産生等に付随してそれらの周辺又は下流で生起する分子的変化及び細胞的変化、例えば、アポトーシス、カスペース蛋白質及びＢａｘ等の活性化、Ｆｒａｇ１とＲａｄ９との解離、及びＲａｄ９とＢｃｌ２との結合等の細胞内における反応・変化を意味する。【００１４】
本明細書における「ＤＮＡ損傷」とは、ＤＮＡ鎖断裂等のＤＮＡに対する直接の損傷に加えて、予定外複製（unscheduled-replication）、ポリメラーゼの阻害等による複製フォークの減速又は停止のような複製阻害を含み、その程度によってＤＮＡ修復又はアポトーシスに向かうような、正常な複製が阻害される状態を包括的に意味するものである。その原因となるＤＮＡ損傷性刺激には様々なものが考えられ、例えば、各種のＤＮＡ複製阻害剤、発癌物質及び潜在的発癌物質等のような各種の発癌性物質、更に、放射線、紫外線等の電磁波、及び熱等のその他の外因性発癌刺激、或いは、内因性要因（複製ストレス等）によってＤＮＡ損傷が引き起こされる。【００１５】
Ｆｒａｇ１遺伝子は、以下の実施例に示したように、本発明者によって複製阻害負荷下のマウス細胞、及びデータベース検索によりヒト細胞から同定されたものである。その具体的な塩基配列及びそれにコードされるアミノ酸配列の例として、配列番号２及び配列番号３（マウスＦｒａｇ１遺伝子）、及び配列番号５及び配列番号６（ヒトＦｒａｇ１遺伝子）を挙げることが出来る。但し、該遺伝子の生物学的由来に関しては特に制限はなく、マウス及びヒトに由来する遺伝子に限定されるものではない。【００１６】
尚、本明細書における「Ｆｒａｇ１遺伝子産物（蛋白質）」には、上記の配列番号に具体的に示されたアミノ酸配列において、一つ又は数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列、該アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％以上の相同性を有し、Ｆｒａｇ１蛋白質と実質的に同等の活性を有する蛋白質(ピリペプチド)も含まれる。【００１７】
更に、本明細書における「Ｆｒａｇ１遺伝子」には、上記の配列番号に具体的に示された塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、Ｆｒａｇ１蛋白質と実質的に同等の活性を有する蛋白質(ピリペプチド)をコードするＤＮＡ（核酸分子）も含まれる。【００１８】
本明細書において、「ＤＮＡのハイブリダイズにおける「ストリンジェント（stringent）な条件」は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、及びその他公知の条件の適当な組み合わせによって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー（stringency）は増加する。更に、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。【００１９】
従って、「ストリンジェントな条件下」とは、各塩基配列間の相同性の程度が、例えば、全体の平均で９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上であるような、高い相同性を有する塩基配列間のみで、特異的にハイブリッドが形成されるような条件を意味する。具体的には、例えば、温度６０℃〜６８℃において、ナトリウム濃度150〜900mM、好ましくは600〜900mM、pH 6〜8であるような条件を挙げることが出来る。ストリンジェントな条件の好適な一具体例としては、5 x SSC (750 mM NaCl、75 mM クエン酸三ナトリウム)、1% SDS、5 x デンハルト溶液50% ホルムアルデヒド、及び42℃の条件でハイブリダイゼーションを行い、0.1 x SSC (15 mM NaCl、1.5 mM クエン酸三ナトリウム)、0.1% SDS、及び55℃の条件で洗浄を行うものである。【００２０】
ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。【００２１】
本明細書において、「相同性」（又は、「同一性」）とは、ポリペプチド配列（あるいはアミノ酸配列）又はポリヌクレオチド配列（あるいは塩基配列）における２本の鎖の間で該鎖を構成している各アミノ酸残基同志又は各塩基同志の互いの適合関係において同一であると決定できるようなものの量（数）を意味し、二つのポリペプチド配列又は二つのポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味するものである。相同性は容易に算出できる。二つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列間の相同性を測定する方法は数多く知られており、「相同性」なる用語は、当業者には周知である (例えば、Lesk, A. M. (Ed.), Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988);Smith, D. W. (Ed.), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Grifin, A. M. & Grifin, H. G. (Ed.), Computer Analysis of Sequence Data: Part I, Human Press, New Jersey, (1994);von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press,New York, (1987); Gribskov, M. & Devereux, J. (Ed.), Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press, New York, (1991) 等) 。二つの配列の相同性を測定するのに用いる一般的な方法には、Martin, J. Bishop (Ed.), Guide to Huge Computers, Academic Press, San Diego, (1994);Carillo, H. & Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988) 等に開示されているものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。相同性を測定するための好ましい方法としては、試験する二つの配列間の最も大きな適合関係部分を得るように設計したものが挙げられる。このような方法は、コンピュータープログラムとして組み立てられているものが挙げられる。二つの配列間の相同性を測定するための好ましいコンピュータープログラム法としては、GCG プログラムパッケージ (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research, 12(1): 387 (1984)) 、BLASTP、BLASTN、FASTA (Atschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215: 403 (1990)) 等が挙げられるが、これらに限定されるものでなく、当該分野で公知の方法を使用することができる。【００２２】
本明細書において、Ｆｒａｇ１蛋白質と「実質的に同等の活性」とは、蛋白質の生理的活性、生物学的活性及び物理化学的活性等の各種活性が実質的に同等又は同質であることを意味する。このような活性の具体例として、例えば、本明細書の各実施例に示されたような、Ｒｄ９及びＲｂとの結合能、Ａｔｒによるリン酸化、アポトーシス誘導経路におけるその他の機能等を挙げることが出来る。【００２３】
Ｆｒａｇ１遺伝子（ＤＮＡ）は当業者であれば、本明細書の記載及び当該技術分野における公知技術に基き容易に調製することが可能である。例えば、実施例に記載されているようなＲＴ−ＰＣＲを用いてクローニングしたり、その他のICACN (Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids)法、 NASBA（Nucleic acid sequence based amplification）法、TMA（Transcription-mediated amplification）法及びSDA（Strand Displacement Amplification）法等の当業者に公知の任意ＤＮＡ増幅技術を用いることにより、ｃＤＮＡとして容易調製することが出来る。尚、その際に使用する各種のプライマーは、本明細書に開示したＦｒａｇ１遺伝子の塩基配列情報に基き適宜設計・選択することが出来る。【００２４】
又、上記ＤＮＡは、公知の方法（例えば、Carruthers（1982）Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418;Adams（1983）J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov（1997）Nucleic Acid Res. 25:3440-3444; Frenkel（1995）Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers（1994）Biochemistry 33:7886-7896; Narang（1979）Meth. Enzymol. 68:90; Brown（1979）Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage（1981）Tetra. Lett. 22:1859; 米国特許第4,458,066号）に記載されているような周知の化学合成技術により、in vitroにおいて合成することもできる。また、本発明のポリヌクレオチドを適当な制限酵素で切断する等の方法によって作製することもできる。更に、該ＤＮＡに、当業者に公知の部位特異的突然変異誘発に基づき、市販のミューテーションシステム等を用いて塩基変異を導入することも可能である。【００２５】
更に、当業者に周知の任意の方法に従い、こうして取得されたＦｒａｇ１遺伝子産物（蛋白質）をコードするＤＮＡをプラスミドベクター、ファージベクター、及び各種の混成ベクター等の適当な組換え用ＤＮＡに挿入し適当な発現ベクターに組込み、該発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換することができる。【００２６】
この組換え用ＤＮＡは、当業者に公知の通常の組換えＤＮＡ手法によって取り扱うことが可能な任意のベクターである。これらのベクターは、その導入すべき宿主細胞に依存して適当に選択することが出来る。該ベクターは、宿主細胞の中に導入され、本発明の蛋白質を一過性で発現したり、或いは、宿主細胞のゲノムの中にその全体あるいはその一部がゲノム中の１箇所以上に組込まれることができる。このようなベクターとして、当業者に公知の各種の市販のベクターを使用することが出来る。【００２７】
本発明の発現ベクターには、典型的には、当業者に公知の、構成的発現プロモーター又は各種の誘導型発現プローター等の各種プロモーター、エンハンサー及びサイレンサー等の各種調節配列、リボソーム結合部位、シグナル配列、および翻訳開始配列等の各種要素ならびにその他の外来性あるいは内在性タンパク質をコードする遺伝子、各種薬剤耐性遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子等を任意に含むことができる。【００２８】
宿主細胞として、原核微生物、真核微生物、植物細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、ヒト等の霊長類及びマウス等の齧歯類を含む哺乳類細胞等を用いることができる。たとえば、原核微生物の例としてはエシェリヒア属、バチルス属、又は、ストレプトマイセス・グリセウス若しくはストレプトコッカス・セリカラー等のストレプトマイセス属を宿主とすることができる。真核生物としては、サッカロミセス属及びピヒア属等の酵母、アスペルギルス・オリゼ及びアスペルギルス・ソーエ等のアスペルギルス属、ペニシリウム属、リゾプス属、メタリチウム属、モナスカス属、アクレモニウム属、及びムコール属等の糸状菌、並びに、トリコデルマ属等の担子菌などから選択することができる。昆虫細胞としてはキイロショウジョウバエ、カイコ等の細胞を用いることができる。【００２９】
本発明のＤＮＡを含む発現ベクター（組換え用ＤＮＡ）は、例えば、塩化カルシウム法、プロトプラスト‐ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、Ｔｉプラスミド法、パーティクルガン法、バキュロウィルス法などの公知の任意の方法によって宿主細胞へと導入でき、形質転換体を作成することができる。更に、複数種の組換えＤＮＡを用いるコトランスフェクション法によっても可能である。【００３０】
上記発現ベクターの代わりに、ＰＣＲ増幅等により取得される上記の蛋白質をコードする遺伝子を含む適当なＤＮＡ断片自体を用いて本発明の形質転換体を得ることも可能である。そのような場合には、かかるＤＮＡ断片に加えてさらに適当な緩衝液及びその他の助剤を任意に含む溶液等の組成物として形質転換に使用することができる。【００３１】
こうして得られた形質転換体を該蛋白質の生産に好ましい適当な条件で培養条件で培養して該蛋白質を発現させ、その宿主細胞および／または培地から回収することによりＦｒａｇ１遺伝子産物（蛋白質）製造することができる。宿主細胞の培養に用いる培地は、当業者に公知である任意の培地の中から、使用する発現ベクターの構成（プロモーターの種類等）及び宿主の種類等に応じて適当なものを適宜選択することができる。【００３２】
尚、上記蛋白質は、ウサギ網状赤血球抽出液又はコムギ胚芽細胞抽出液等を利用する当業者に公知の任意のインビトロ転写翻訳系を使用して製造することも可能である。【００３３】
このようにして産生されたＦｒａｇ１遺伝子産物（蛋白質）は、当業者に公知の任意の手段の適当な組み合わせ、例えば、遠心または濾過による培地と細胞の分離、および硫酸アンモニウムの様な塩による培地のタンパク質成分の沈殿、及びこれに続く疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、又はその他のクロマトグラフィーの使用により培地から回収することができる。或いは、本発明の蛋白質は化学合成法により製造することも可能である。【００３４】
本発明の検出方法において、ＤＮＡ損傷は、当業者に公知の任意の方法・手段を用いて測定することが出来る。例えば、Ｆｒａｇ１遺伝子の発現量をｍＲＡＮ又はｃＤＮＡの量として測定したり、又は、Ｆｒａｇ１遺伝子産物又はそのリン酸化物（蛋白質若しくはポリペプチド）の産生量を測定したりすることで検出することができる。尚、これらの測定は必ずしも定量的である必要はなく、具体的な測定法・手段に応じて、目視などによる定性的又は半定量的な測定であっても本発明の効果は十分に得ることが出来る。【００３５】
Ｆｒａｇ１遺伝子産物又はそのリン酸化物の産生量は、例えば、該蛋白質と特異的に反応する抗Ｆｒａｇ１抗体を用いた免疫染色、免疫沈降（プルダウンアッセイ）、イムノブロット分析、ウェスタンブロット分析、及びEIA等の各種の免疫学的特異反応を利用する方法、エドマン法を用いた気相シークエンサー等ペプチドのアミノ酸配列分析法、更には、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ及びＥＳＩ  Ｑ−ＴＯＦ／ＭＳ法等に代表される質量分析によって検出することが出来る。【００３６】
尚、本明細書中における「抗Ｆｒａｇ１抗体」は、Ｆｒａｇ１遺伝子産物、そのリン酸化物、又は、以下の実施例に具体的に示されるようなそれらの部分ポリペプチドを検出できる抗体を意味する。従って、それらに特異的に認識する抗体に加えて、それらが各種の標識物質と結合している場合には、そのような標識物質を認識する抗体も含まれる。このような抗体は、例えば、上記のような方法で作製した蛋白質若しくはその適当な一部（部分的なポリペプチド断片）又はそれらの各種誘導体又は複合体等を抗原物質又は免疫原として用いて、当業者に公知の適当な方法で調製することが可能である。例えば、ポリクローナル抗体の場合には、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ニワトリ等の適当な動物に投与し、その抗血清から調製することが可能である。或いは、モノクローナル抗体作成法（「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、1990年； "Monoclonal Antibody" James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996）等に記載の公知の細胞融合を用いる方法でモノクローナル抗体として調製することも可能である。尚、本明細書中の実施例で使用されるその他の抗体も当業者であれば同様な方法で容易に作製することが出来る。【００３７】
尚、上記の本発明の抗体は、その元来の抗体活性を失わない限り、遺伝子工学（ＤＮＡ組換え技術）により、例えば、Fab、F(ab')2、Fv断片等の完全な抗体由来の各種誘導体を含む、当業者に公知の様々な形態に改変された誘導体、組換え体又はフラグメントであっても良い。【００３８】
上記蛋白質をコードする遺伝子に標識物質をコードするレポーター遺伝子を結合させて、これらの融合蛋白質を発現させ、この標識蛋白質を測定することにより、上記蛋白質の発現量を測定することも可能である。このような標識物質の例としては、発現した蛋白質の検出に使用する物質として当業者に公知の任意の蛋白質を使用することが出来る。このような物質の代表例として、ＧＳＴ、Ｈｉｓ６、ＡｖｉＴａｇ、Ｖ５及びＦＬＡＧのような各種のタグ物質、オワンクラゲ由来のＧＦＰ（Green fluorescent protein）、ＹＦＰ（Yellow fluorescent protein）、ＲＦＰ（Red fluorescent protein）及びＢＦＰ（Blue fluorescent protein）のような緑、黄色、赤、青等の可視光域の多彩な色彩で自家蛍光を発する蛋白質、又は、経時に色彩が変化する蛋白質を挙げること出来る。更には、赤外光域や紫外光域の蛍光を発する蛋白質を使用することも可能である。【００３９】
また、標識蛋白質として特定の抗原性を持つ蛋白質を用い、その抗原性を認識する蛍光抗体を用いれば、測定対象である蛋白質に蛍光を付与させることが可能となる。更に、標識蛋白質としてルシフェラーゼのような酵素蛋白質を用い、その酵素蛋白質の働きにより、蛍光を発する物質が産生されるような基質を用いることも出来る。【００４０】
一方、Ｆｒａｇ１遺伝子（ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ）の発現量の測定は、本明細書中の実施例に記載された該蛋白質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）の塩基配列に基づき適宜設計した各種のプローブ又はプライマーを使用した、ノザン分析、ＲＴ−ＰＣＲ法等の各種定量的ＰＣＲ法、及びマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）法等の当業者に公知の方法で行うことが出来る。【００４１】
更に、本発明の検出方法において、ＤＮＡ損傷は、Ｆｒａｇ１遺伝子、該遺伝子産物若しくはそのリン酸化物、又はそれらが関与する細胞応答を当業者に公知の任意の測定法・手段によって測定することによって検出することができる。これら細胞応答の測定も必ずしも定量的である必要はなく、具体的な測定法・手段に応じて、目視などによる定性的又は半定量的な測定であっても本発明の効果は十分に得ることが出来る。【００４２】
かかる細胞応答の具体的な例としては、既に記載したような、アポトーシス、Caspase 7のような各種のカスペース蛋白質及びＢａｘのようなアポトーシスを誘導する分子の活性化、Ｆｒａｇ１とＲａｄ９との解離、及びＲａｄ９とＢｃｌ２との結合等の反応・変化を挙げることができる。アポトーシスは、例えば、当業者に公知の任意の方法で培養細胞数を計測してそれから生存率を求めることによって測定することが出来る。各種分子の活性化又は蛋白質の解離又は結合等の反応・変化は、例えば、既に記載したような、これら反応・変化に関与する蛋白質に対する抗体を使用した各種の免疫学的特異反応を利用する方法によって測定することが出来る。このような各種の抗体も上記の抗Ｆｒａｇ１抗体の作製方法に準じて容易に作製することが出来る。【００４３】
本発明の検出方法において、被検体としては、例えば、ヒト又はマウス等の動物細胞に由来する当業者に公知の任意の培養細胞株、又は、例えば、癌組織のような摘出された組織に由来する癌細胞及びその他の各種細胞等を使用することができる。【００４４】
更に、Ｆｒａｇ１遺伝子発現が阻害若しくは抑制された形質転換細胞、又はＦｒａｇ１、その変異体若しくはそれらの一部をコードする遺伝子が導入された形質転換細胞を使用することができる。このような形質転換細胞を作製する際に使用する宿主細胞に特に制限はないが、通常、元のＦｒａｇ１遺伝子の取得源と同一種類の細胞を使用することが好ましい。このような形質転換細胞は既に記載した方法に準じて、容易に作製することが出来る。【００４５】
例えば、Ｆｒａｇ１遺伝子発現が阻害若しくは抑制された形質転換細胞は、アンチセンスオリゴＤＮＡ、アンチセンスｃＤＮＡ、又は、ｓｉＲＮＡ若しくはそれを生じるｄｓＲＮＡ若しくはｓｓＲＮＡ等に代表される、Ｆｒａｇ１遺伝子若しくはその一部、又はそれらの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子を用いてアンチセンス法又はＲＮＡｉ法等により作成することが出来る。このような核酸分子は、本明細書に開示したＦｒａｇ１遺伝子の塩基配列情報に従って、当業者であれば、容易に設計及び調製することが出来る。【００４６】
又、Ｆｒａｇ１の変異体の例としては、本明細書の実施例に具体的に記載されているような、Ａｔｒによるリン酸化部位又はＲｂ結合部位と思われるモチーフにアミノ酸変異が導入された結果それらの機能が喪失したような蛋白質変異体を挙げることが出来る。【００４７】
更に、本発明の検出方法における被検体として、本明細書中の実施例に具体的に記載されるような、遺伝子工学的操作により得られた、Ｆｒａｇ１遺伝子が欠損し又はＦｒａｇ１遺伝子発現が阻害若しくは抑制されたノックアウト又はノックダウン動物（ヒトを除く）、又はＦｒａｇ１、その変異体若しくはそれらの一部をコードする遺伝子が導入されたトランスジェニック動物（ヒトを除く）等の遺伝子改変動物、又は、それらの遺伝子改変動物から樹立された培養細胞株を用いることが可能である。【００４８】
既に記載したように、ＤＮＡ損傷は、例えば、各種のＤＮＡ複製阻害剤、発癌物質及び潜在的発癌物質等のような各種の発癌性物質、更に、放射線、紫外線等の電磁波、及び熱等のその他の外因性発癌刺激、或いは、内因性要因（複製ストレス等）によって引き起こされる。従って、本発明のＤＮＡ損傷の検出方法は、外因性発癌刺激化合物又は、抗癌剤（抗腫瘍剤、発癌予防剤等を含む）のスクリーニング方法、又は、Ｆｒａｇ１の発現又は活性が関与する疾病、癌又は癌細胞の検査又は診断方法に利用することが出来る。間接的な状況証拠または観察からＦｒａｇ１の潜在的な関与が示唆されている疾患としては、例えば、Jenne, D.E., Tinschert, S., Stegmann, E., Reimann, H., Nurnberg, P., Horn, D., Naumann, I., Buske, A., Thiel, G. A common set of at least 11 functional genes is lost in the majority of NF1 patients with gross deletions. Genomics. 66. (1), 93-7, 2000）に記載されているような、Ｆｒａｇ１遺伝子が位置している第17番染色体のＦｒａｇ１遺伝子座近傍にゲノム変化を来す疾患、例えば、神経線芽腫症を挙げることができる。【００４９】
例えば、発癌性物質のような外因性発癌刺激は以下の工程でスクリーニングすることが出来る：
(a)被検物質の存在下に上記に示した各種の形質転換体又は細胞（被検体）を培養するか、又は、上記の遺伝子改変動物（被検体）に被検物質を作用させる工程、
(b)該被検体において、Ｆｒａｇ１遺伝子の発現量、Ｆｒａｇ１遺伝子産物又はそのリン酸化物の産生量、又は、それらに誘導される細胞応答を測定する工程、及び
(c)発現量、産生量又は細胞応答を増加又は減少させる被検物質を選択する工程、を含む方法。【００５０】
又、例えば、抗癌剤は以下の工程でスクリーニングすることが出来る：
(a) ＤＮＡ損傷が引き起こされるような条件下で、被検物質の存在下に上記に示した各種の形質転換体又は細胞（被検体）を培養するか、又は、上記の遺伝子改変動物（被検体）に被検物質を作用させる工程、
(b) 該被検体において、Ｆｒａｇ１遺伝子の発現量、Ｆｒａｇ１遺伝子産物又はそのリン酸化物の産生量、又は、それらに誘導される細胞応答を測定する工程、及び
(c)発現量、産生量又は細胞応答を増加又は減少させる被検物質を選択する工程、を含む方法。【００５１】
ここで、例えば、（１）Ｆｒａｇ１遺伝子発現が阻害若しくは抑制された形質転換細胞、（２）Ｆｒａｇ１の変異体若しくはそれらの一部をコードする遺伝子が導入された形質転換細胞、（３）Ｆｒａｇ１遺伝子発現が阻害若しくは抑制されたノックアウト又はノックダウン動物、（４）Ｆｒａｇ１の変異体若しくはそれらの一部をコードする遺伝子が導入されたトランスジェニック動物（その結果、それらがＦｒａｇ１のドミナントネガティブとして過剰発現している）、及び（５）該動物から樹立された培養細胞株は、ＤＮＡ損傷に対する感受性が高く、細胞応答を検出し易くなっているので、より低濃度の被検物質として用いた場合でも、発癌性物質のような外因性発癌刺激を高感度でスクリーニングすることが可能となる。又、より低い程度のＤＮＡ損傷性刺激との共存において、抗癌剤をスクリーニングすることが可能となる。更に、この遺伝子改変動物は、即座にはＤＮＡ損傷を起こさない物質でも、暴露後の任意の時間経過の間での細胞の営みにより結果的にはＤＮＡ損傷またはそれに関連した作用点を示すことにより類似する病態を引きおこす物質による潜在的なＤＮＡ損傷様活性を検出することも可能となる。この際の関連した作用点としては、直接ＤＮＡ損傷経路の効果と100％一致することもあろうが、多くは99％以下望ましくは80％以上、場合によっては50％以上、または仮にそれ以下であっても細胞の生理的営みの時間経過とともに暴露効果を示すことが可能である。【００５２】
それに対して、例えば、（１）Ｆｒａｇ１をコードする遺伝子が導入された形質転換細胞（その結果、それが過剰発現している）、（２）Ｆｒａｇ１をコードする遺伝子が導入されたトランスジェニック動物（その結果、それが過剰発現している）、及び（３）該動物から樹立された培養細胞株では、ＤＮＡ損傷に対する細胞応答への感受性が低くなっており（「しきい値」が高い）、ＤＮＡ損傷を受けても直ちには細胞応答を起こさず、その結果、アポトーシスにも至らずに生存しつづけることから、潜在的な発癌性物質のような急には変化が検出できない晩発性の効果を有する物質、又は、複数種類の被検物質による複合暴露を有効にスクリーニングすることが出来る。【００５３】
本発明のＤＮＡ損傷の検出方法、スクリーニング方法、又は検査又は診断方法に用いるキットは、本発明方法の具体的な測定原理等に応じて、適当な構成をとることが出来る。該キットは、例えば、抗Ｆｒａｇ１抗体、ＤＮＡ損傷による誘導される各種の生物応答に関与する蛋白質に対する抗体、又は、アンチセンスオリゴＤＮＡ、アンチセンスｃＤＮＡ、又はｓｉＲＮＡ若しくはそれを生じるｄｓＲＮＡ若しくはｓｓＲＮＡに代表される、Ｆｒａｇ１遺伝子若しくはその一部、又はそれらの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、Ｆｒａｇ１遺伝子（ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ）の発現量の測定の為の、上記遺伝子の増幅用プライマー及びハイブリダイゼーション用のプローブを含むことが出来る。これらの各種のプライマー及びプローブは、その用途に応じて、適当な長さ、例えば、１０〜３００個の連続した塩基配列から成る。
【００５４】
以上のキットに構成要素として含まれる、各種のプライマー、プローブ、又は、抗体は、当業者に公知の任意の放射性物質、蛍光物質、色素等の適当な標識物質によって標識されていても良い。更に、上記キットには、その構成・使用目的などに応じて、当業者に公知の他の要素又は成分、例えば、各種試薬、酵素、緩衝液、反応プレート（容器）等が含まれる。  
ある。【００５５】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。又、特に記載のない場合には、以下の実施例は、当該技術分野における常法及び当業者に公知の標準的な方法、例えば、Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている遺伝子工学及び分子生物学的技術に従い実施した。又、本明細書中に参考文献などとして引用された文献の記載内容は本明細書の開示内容の一部を構成するものである。
【実施例１】
【００５６】
（マウスFrag1遺伝子のcDNAのクローニング）
妊娠マウス13.5日の胎児の皮下組織を分離して、10％血清入りダルベッコ変法イーグル培地（10％FCS/DMEM）にいれてプラスチック皿内で5日間培養し、その後２代継代してMEFs（マウス胎児線維芽細胞）を作成した。細胞周期をG1期にブロックする目的で、2x105個の細胞をチミジン（2.5mM）入り10％FCS/DMEM内で２４時間培養した (第一次ブロックと呼ぶ)。細胞をリン酸緩衝液（PBS）で洗い、チミジンがはいっていない新鮮10％FCS/DMEMで１0時間培養し、再びチミジン（2.5mM）入り10％FCS/DMEM内で16時間培養した (第二次ブロックと呼ぶ。第一次ブロックと第二次ブロックを合わせてダブルチミジンブロックと呼ぶ。)。【００５７】
この細胞をコントロールとし、一方で複製阻害負荷細胞として、第二次ブロックのときにDMSO (0.2%)にとかしたアフィデコリン（0.4 μM; Sigma, St. Louis, MO）を細胞培地に添加して（第二次ブロックをおこない）、チミジンがはいっていない新鮮10％FCS/DMEMに交換したときにはアフィデコリン（0.4μM）とカフェイン（0.2μM）を添加して4時間培養し、複製阻害負荷細胞を調整した。これらの細胞を回収してキアゲンキットとその説明書に従いRNAを抽出して、そのうちの2μg RNA を用いてSuperscript II 逆転写酵素とオリゴ-dTまたはランダムプライマーによるcDNA合成キット（Invitrogen）とその説明書に従いcDNAsを合成した。異なった発現をする遺伝子のcDNAを同定するために、コントロール細胞をテスター、 複製阻害負荷細胞をドライバーとして、テスターからドライバーをハイブリダイゼーションで引き算することをサブトラクションキット(Clontech)とその説明書に従いサブトラクションを実施した。さらに説明書に従い、2回のハイブリダイゼーションのあと、cDNAsを増幅して、pcDNAベクター(Clontech)に組み込んでシークエンス反応で塩基配列を決定した。【００５８】
我々が解析したのは、開始時のクローンとしては155 clonesあったが、データベース検索（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）の結果、その内訳として、86 clones (55%)はマウスの既知のexpressed sequence tags (ESTs)とコンピュータのデータベース上で一致または実質的に一致した状態であった。その中の86 クローンの中には、実際にはおなじ遺伝子由来であるが異なったcDNA部分の断片が複数含まれていて、最大公約数的には２つの配列が見いだされ、Frag1/N とFrag1/Cと名付けた。【００５９】
データベース検索（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）の結果、Frag1/N とFrag1/Cはマウス第１１番染色体に位置していたことまではわかったが、別個の遺伝子として表記されておりFrag1/N と Frag1/Cが同一の遺伝子であるとはデータベース検索から予測することは不可能であった。そこで我々は、Frag1/N とFrag1/Cをプローブとしてノザンブロット実験をおこなったところ（図１B）、両クローンはきわめて類似した発現パターンと遺伝子サイズをもつことがわかり、Frag1/N と Frag1/Cの配列情報をもとにして試行錯誤の末にcDNAライブラリーからのPCR法でFrag1/Nの３’末端 と Frag1/Cの５’末端 を繋ぐ連続するcDNAの合成に成功し、Frag1/N と Frag1/Cが同一遺伝子にあることを証明した。その実験に際してもちいたPCRプラーマーは以下の表１に示してある。RTPCR-MmELG1-F1とRTPCR-MmELG1-F2；RTPCR-MmELG1-R1とRTPCR-MmELG1-R2；RTPCR-MmELG1-F3とRTPCR-MmELG1-R4を対でもちいた。クローニングの後でデータベースを見返すとFrag1/N とFrag1/Cを繋ぐ部分はイントロンを挟んでおりマウスcDNAデータベースからは配列が欠けていた部分に相当していたため、我々はFrag1/N と Frag1/Cを含む機能未知の全長Frag1 (Ctf18/Rad24/Elg1-related gene 1)遺伝子としてデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）に登録した(AY557610)。また、以下の配列番号で本明細書名中に示す：Mouse Frag1 mRNA (SEQ. ID. NO: 1)  、Mouse Frag1 ORF (SEQ. ID. NO: 2)、Mouse Frag1 protein (SEQ. ID. NO: 3)。【００６０】
【表１】
2006090679.tif 000002
【実施例２】
【００６１】
（ヒトFrag1遺伝子のcDNAのクローニング）
マウスFrag1遺伝子のcDNAをもとに、ヒトのデータベース検索（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）の結果、既知のexpressed sequence tags (ESTs)とコンピュータのデータベース上で一致または実質的に一致したクローンがあり、ヒトFrag1遺伝子のcDNAとした（実質的に一致したとは100％未満であっても200 bp以上の任意の領域にわたって>95%の相同性が認められるものをさす。このような部分的不一致の原因はデータベース側の塩基配列検査の誤差が修正されずにのっている場合とユーザー側の塩基配列検査の誤差によるものまたは両者の混在に起因するが、実効上は同一のものとしてこのスクリーニングの段階では差し支えないとするのが一般的である）。ヒトFrag1遺伝子のcDNAのクローニングの実験に際してもちいたPCRプライマーの組み合わせ及び各PCRプライマーの塩基配列は夫々表２及び表３に示してある。こうして同定されたヒトFRAG1遺伝子をデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）に登録した(AY557611)。また、以下の配列番号で本明細書名中に示す：Human Frag1 mRNA (SEQ. ID. NO: 4)）、Human Frag1 ORF (SEQ. ID. NO: 5)、Human Frag1 protein (SEQ. ID. NO: 6)）。【００６２】
【表２】
2006090679.tif 000003
【００６３】
【表３】
2006090679.tif 000004
【実施例３】
【００６４】
（マウスFrag1蛋白質）
マウスFrag1遺伝子のcDNAが蛋白質として合成可能であることを調べるために、ウサギ網状赤血球抽出液を利用した試験管内転写翻訳システムをプロメガキットをもちいて実施した。その結果、マウスFrag1遺伝子のcDNAは蛋白質として合成可能であることが示された（図４B）。さらにマウスFrag1蛋白質及びヒトFrag1蛋白質のアミノ酸配列をもとに作製した、両者の間で共通性の高い領域をエピトープとして認識するウサギポリクローナル抗体（実施例１１に記載されている抗体）を用いてウエスタンブロットをおこなったところ、マウス細胞抽出液でマウスFrag1蛋白質が発現していることが示された（図２,３,４,５,６の中ではαFrag1と記載されている）。
【実施例４】
【００６５】
（ヒトFrag1蛋白質）
マウスFrag1遺伝子のcDNAが蛋白質として合成可能であることを調べるために、ウサギ網状赤血球抽出液を利用した試験管内転写翻訳システムとしてプロメガキットをもちいて実施した。その結果、ヒトFrag1遺伝子のcDNAは蛋白質として合成可能であり、実施例１１で作製したウサギポリクローナル抗体（を用いてウエスタンブロットをおこなったところ、ヒト細胞抽出液でヒトFrag1蛋白質が発現していることが示された（図１２）。
【実施例５】
【００６６】
（Frag1の発現の変化）
FRAG1遺伝子は複製阻害に応答する発現変化を指標としてクローニングしたので、これまでに既知の複製に関連する遺伝子群（RFC1, RAD17 and CTF18）もあわせて、Frag1についてはFrag1/N、 Frag1/Cをプローブとして、比較のためのノザン解析を実施した。ノザン解析のために、細胞周期を同調させたMEFsをもちいて、アフィデコリン（APD）又はDNA アルキル化剤であるメチルメタンスルホン酸 (MMS)に暴露した。アフィデコリンはポリメラーゼアルファの阻害剤であり、MMSは複製フォークの遅延を誘発するものであり、両者は具体的な作用点はことなるが、ともに結果としては複製過程を阻害する。Frag1の観察された変化が、特異な作用点によるものか、普編的な複製阻害にともなう現象なのかを調べるために２つをもちいた。  その結果、アフィデコリンまたは MMS暴露により、Frag1/N と Frag1/C の発現はともに同じように顕著に減少した。一方で、この変化は、RFC1, Rad17 and CTF18においてはそれほど顕著ではなかった（図１Ａ）。【００６７】
更に、Frag1の転写産物が複製阻害後で減少する機構が、それが、転写減少によるものか、分解亢進によるものかを判別するために、アクチノマイシンDで新生RNA合成を抑制して、転写産物の安定性をアフィデコリンのあるなしで経時的に調べた。その結果、新生RNA合成を抑制し、アフィデコリンを加えると、Frag1 mRNAの半減期は４時間以下であったが、CTF18, RFC and RAD17 mRNAsの半減期は１５時間以上であった。アフィデコリンを入れないとこの差は減少した。したがって、複製阻害下での転写産物の安定性がFrag1において特異的に減少していることがわかった（図７Dと図７E）。尚、以上の実験におけるPCRで使用したプライマーの塩基配列を以下の表４に示す。  【００６８】
【表４】
2006090679.tif 000005
【実施例６】
【００６９】
（Frag1の複製阻害感受性制御）
Frag1の発現減少に起因する生物効果を調べるために、siRNAをもちいて内因性のFrag1発現を抑制してみた。siRNAの発現ベクターの調整と細胞への導入はタカラキットをもちいてその説明書に従った。以下の表５に示すsiRNAをもちいて細胞への導入し、RT-PCR と イムノブロット分析 の結果、siRNA vectorをトランスフェクトしたあとピューロマイシン選択抗生剤（1μg/ml）入りの10％FCS/DMEMで選択することで実験材料を調整してしらべてみると、siRNAが効果的に機能して、Frag1発現を顕著に抑制していることが確認できた（図２A）。抑制の程度は理想的には90％以上であるが、しばしば80％以上であり、50％以上でも有効な形質を表すことがある。  【００７０】
次に、この細胞をもちいて、MMSを培地に添加、またはgamma-irradiation照射をおこなった。ここに、MMSは1本鎖DNAフォークの遅延損傷を誘発するが、gamma-irradiation照射は2本鎖DNA断裂損傷を誘発する。２つの独立したFRAG1 siRNA transfectantsをしらべたところ、いずれも複製ストレス（MMSによる）にたいする感受性が、コントロールと比較して上昇しており、この変化は細胞周期をS期に同期させたMEFsをつかってみるとさらに顕著であり、これらのことからS期チェックポイントを活性化していることが示唆される。この変化はgamma-irradiation照射における実験より顕著であった。 したがって、Frag1発現減少はMMS（による1本鎖DNAフォークの遅延損傷）に感受性を亢進させることが見いだされた（図２B）。【００７１】
【表５】
2006090679.tif 000006
【実施例７】
【００７２】
（Frag1の複製阻害によるアポトーシス経路の活性化） 
Frag1蛋白質のイムノブロット分析をおこなうと、Frag1蛋白質の発現は、アフィデコリンまたは MMSに暴露したあと2-６時間で減少することが観察され、その減少はコントロールとしてもちいた恒常性の発現が知られている細胞骨格アクチンまたは Rad17にくらべて早かった(図３Ａ)。すなわち、アクチンの恒常性が確認できる実験系において、Rad17より早く分解されるということは、Frag1はRad17と部分的には近縁の機能をもっているとはいえ、Frag1には固有の性質があることを示唆している。  【００７３】
更に、Bax蛋白質の発現をしらべたところ、細胞周期をダブルチミジンブロックで同調させた、siRNAによりFrag1を抑制した細胞において、G１／Sからのreleaseから８時間後において、イムノブロット解析のゲルの中でゆっくりと泳動される蛋白質分画がふえることが観察され、これはBaxの活性化を示す(図3B)。この変化は、独立して実験した２つの細胞でみられたことから、普遍性が高いものである。さらに、このBaxの活性化現象は、MMS処理後においては、siRNAによりFrag1を抑制した細胞において、ダブルチミジンブロックによる細胞周期同調（mid-S期）後の調べたすべての時間の分画において観察された。これらとは対称的に、control siRNA実験の細胞ではBaxの活性化はみられなかった  (図３B)。この結果は、Frag1抑制はアポトーシスを誘導する分子の１つであるBaxの活性化を誘導すること、またそのBaxの活性化誘導はMMS処理で顕著に亢進すること、すなわち、複製阻害への感受性が上昇することを示す。 更に、MMS暴露のあと、p53のセリン15がリン酸化されることが観察されたが、これは２つの独立した細胞（♯403と♯406）で共通して観察され、普編性の高いものであった(図３B)。また、MMSを負荷しなくても、細胞周期を同調させたsiRNAによるFrag1抑制細胞では、４時間後、または８時間後においてp53のセリン15のリン酸化がみられた。このことは、MMSを負荷しなくても、Frag1を強性的に抑制すると、p53経路のゲノム損傷センサーでも感受されていることを示すものであり、生命の応答システムがネットワークをなしていることを示している。またp53と比べてもFrag1の挙動はことなっており、これらはシステムとしてのクロストークはあるものの異なった機能をもつことを示す。  一方で、control siRNA 実験においては、p53のセリン15がリン酸化は、MMS暴露のまえではなく、あとのみに観察されること、またFrag1抑制は、MMS暴露がなくても細胞周期を同調させた細胞のreleaseのあと４または８時間あとでBaxの活性化を刺激していることから（図３BのFrag1siRNA でMMS暴露していない0,4,8時間）、Frag1の減少がゲノム毒（複製ストレス）への応答の感受性を亢進させることがわかる。Mdm2の変化はあきらかでなかったことから、Mdm2自体はFrag1経路と近くないことを示唆する。  【００７４】
一方で、siRNAによりFrag1を抑制した細胞においては、caspase 7の活性化がみられ、これはコントロールsiRNA実験ではみられないことから、Frag1抑制に特異的であった(図８A)。又、siRNAによりFrag1を抑制すると、またはMMSに暴露すると、ミトコンドリアからのcytochrome c遊離を促進することが観察された(図８C)。
以上の事実をあわせると、Frag1の抑制は細胞のDNA損傷への感受性を増し、Baxを活性化することでその経路によるアポトーシスを誘導することが示唆される。【００７５】
更に、siRNAによるFrag1の抑制細胞でのBaxの活性化においてp53が関わっているのかどうか調べるために、p53を遺伝子的に欠損させたMEFs（Trp53 deficient MEFs）を作成して実験した。その結果、siRNAによるFrag1を抑制することによるBaxの誘導は、p53遺伝子の２つのアレルのうち１つを欠くような遺伝的にp53遺伝子を半分しか持たないTrp53 (+/-)細胞と、２つのアレルとも欠損させて遺伝的にp53遺伝子を全くもたないTrp53 (-/-)において、いずれでも同じように、Baxが誘導されることがわかった (図８B)。また、p53のセリン15がリン酸化されるかどうか調べると、Trp53 (+/-)細胞ではリン酸化がおこり、Trp53 (-/-)においてはリン酸化がおこらなかったことが確認された。これらの結果は、Baxはp53の状態とは関係なく活性化されること、またFrag1経路における複製阻害あとの Baxの活性化においては、p53はなくてもよく、p53とは無関係におこりp53とは経路を異にしていることがわかった。  
【実施例８】
【００７６】
（Frag1とRad9-Bcl2経路） 
これまでに既知のこととして、Rad9分子に関しては、DNA 損傷のあとの細胞死の誘導に役割を演じることが知られており、それは、抗アポトーシス分子Bcl2と直接相互作用してその機能を抑制することによる。そこで我々は、Frag1シグナル経路を調べるために、複製阻害あとにおいて何らかの役割を演ずる蛋白質との相互作用を共免疫沈降解析でしらべた(図９A) 。試行錯誤の末に、抗Rad9抗体を用いた免疫沈降法の後に、抗Frag1抗体を用いたイムノブロットをおこなうと、両者の結合が観察された。アフィデコリンまたは MMS暴露のあとにはFrag1発現は減少したが、それにともなって、Frag1とRad9との結合も減少することが観察された(Fig. 4A)。かわって、Rad9はBcl2と強く結合するようになった。すなわち、複製阻害のときにおいて、Frag1-Rad9結合は時間とともに解離して、かわって、Rad9-Bcl2の結合が生じる。前者のFrag1-Rad9結合解離においては、前述のFrag1の発現減少がかかわっているとともに、あとで述べるように、Frag1のリン酸化修飾とRbの結合修飾がかかわっていることがわかり、複数の因子により精緻に制御されていることが示唆される。【００７７】
組み換えグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)-Rad9融合蛋白質 をもちいた試験管内プルダウンアッセイにより、結合している部位を生化学的に詳しくしらべた。GST結合Rad9と、試験管内転写翻訳反応でFrag1をさまざまな部分で人工的に作成した短い断片をもちいて結合実験をしたところ、GST結合Rad9はFrag1のF2断片と結合したが他とは結合しなかった(図１C 、図４B)。このことから、F2 fragment部分がRad9と結合して細胞死を制御していることが示唆される。Frag1の特異的な断片を発現するMEFの遺伝子導入体を作成して、コロニー形成能を検定したところ、Frag1のF2断片を過剰に発現すると、ゲノム毒のあとのコロニー形成能が比較的高いということが観察され（図４C）、F2断片が細胞死制御に関わっていて、そのためにコロニー形成に変化を生じたこと、またRad9と結合することで細胞死制御と関わっていることが示唆された。【００７８】
更に、このF2断片の遺伝子導入体をもちいてさらに実験をおこなった  (図４D)。ここでは、細胞死か抑制されているF2断片の遺伝子導入体をもちいて、更にRad9を重ねて導入して、hygromycin耐性を指標にして遺伝子のはいっている細胞を選択した。その結果、F2断片遺伝子導入体に重ねてRad9を過剰発現した結果は、アポトーシスを誘導した。一方で、Bcl2との結合部分を欠くRad9の変異体Rad9Ndelをかわりに重ねて導入すると、アポトーシスは抑制された。これはRad9の変異体はBcl2と結合できないために、アポトーシスを誘導できないためと考えられる。【００７９】
更に、F2断片遺伝子導入体に、Bcl2をかわりに重ねて導入すると、アポトーシスは顕著に抑制された  (以上、図４D)。確認のために、共焦点顕微鏡で観察しても、F2断片遺伝子導入体ではMMS暴露あとにチトクロームcの放出は抑制された(図９B)。【００８０】
これらの結果から、Frag1は、Rad9とBcl2の結合を制御して、DNA損傷で誘導されるアポトーシスを誘導することが強く示唆される。尚、Frag1の各断片は本明細書中で以下の配列番号で示す：Human Frag1 F1 fragment (SEQ. ID. NO: 7)、Human Frag1 F2 fragment (SEQ. ID. NO: 8)、Human Frag1 F3 fragment (SEQ. ID. NO: 9)、Human Frag1 F4 fragment (SEQ. ID. NO: 10)、Human Frag1 FZ fragment (SEQ. ID. NO: 11)。
【実施例９】
【００８１】
（細胞周期mid-S期においてFrag1はAtrとRad9の間の新規信号伝達経路を制御する）
Frag1の機能を調べるために、0.01%MMSを示された時間暴露あとにおいて、Rad9とFrag1の結合が、細胞周期に依存しているかどうかを調べた (図５A上)。抗Rad9抗体と抗Frag1抗体を用いた免疫沈降法による検討の結果、Rad9とFrag1の結合はダブルチミジンブロックにより細胞周期を同期させたG1期の細胞で弱いながら認められ、そのあとS期にはいると強くなった。同様にMMS暴露あとにおいては、Rad9とFrag1の結合は減少し、かわってRad9とBcl2の結合が促進された(図５A下)。この結果は、細胞周期S期において、Frag1がRad9のゲノム毒ストレスへの感受性を亢進させるという機能を示し、上記までのデータに一致する。  【００８２】
抗Frag1抗体 と抗Atr抗体を用いた共焦点顕微鏡で観察すると (図１０)、Frag1 とAtrはMMS暴露あと8-12時間で共存すること、またFrag1はAtrより先にfocusを形成する（数箇所に塊になって密集している）ということが観察され、Frag1はRad9経路において、DNA損傷に対するAtrキナーゼ応答を介して機能していることが示唆するものであり、したがって、Frag1はAtrとRad9の間の新規信号伝達経路を制御することが示された。【００８３】
更に、本発明者は他の蛋白質とのデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を利用した試行錯誤の末に、Frag1には、図１C で示したように、Atrキナーゼによるリン酸化部位と癌抑制遺伝子産物Rbとの結合部位を示唆するモチーフが含まれており、生化学的な修飾を少なくとも部分的に関与することが示唆されていたので、これらのAtrキナーゼやRbとの相互作用がFrag1の新規の信号伝達経路を修飾しているのかを調べることにした。以上の見い出したモチーフの重要性を調べるために、各種変異体を作成した。Atrキナーゼのリン酸化アミノ酸（セリン）をコードする遺伝子塩基配列をリン酸化ができない類似アミノ酸（アラニン）に変換することで点突然変異を導入することとして、Ser1169 と Ser 1187 を それぞれアラニンAla に変換した。また同様にRbの結合モチーフをRbが結合できないモチーフに変換するために、LxCxE1432 を変換して LxGxK1432 または LxGxE1432  を含む全長配列を作成した。（ここに、LxGxK1432 または LxGxE1432  と２つ変異体を作成した理由は、野性型から１つまたは２つのアミノ酸を変換した両方をそれぞれ実験に使うことで、より詳細な検討を加えるためである。）  免疫沈降法による検討の結果、野性型Frag1はRbと結合したが、LxGxEとLxGxKの変異体のFrag1は結合しないことが確認された。また、野性型Frag1とRbとの結合は、細胞集周期を同調させた細胞において、SよりもG1期においてあきらかであった（図5B）。0.01%MMSを示された時間暴露あとにおいて、ウエスタンブロットの結果、野性型Frag1の発現は感度以下まで減少したが、LxGxK変異体のFrag1ではFrag1は消失することなく検出され、またLxGxEでも弱いながらも同様の傾向をしめす結果が観察された。総じて、Frag1は複製阻害に対するmid-S期生体応答において、Frag1はAtrとRad9の間の新規信号伝達経路を制御するのであり、その結果、ゲノム毒に対する感受性を高める機能があることが明らかとなった。【００８４】
更に詳しく調べるために、TransIT-TKO transfection reagent (Mirus, Madison, WI)を使用書通りに用いて、内因性のAtrに対するsiRNAを細胞に導入して内因性Atrを抑制してみた(図５C)。ウエスタンブロットの結果、0.01%MMSを示された時間暴露の後においてコントロール細胞では内因性のFrag1の減少させることとなったが、一方でsiRNAによるAtrの抑制は、MMS暴露に対する内因性のFrag1の減少を阻害した。免疫沈降法の結果、0.01%MMSを示された時間暴露の後においてAtrを抑制すると、Rad9 と Frag1との結合も顕著に減少した。その減少は、siRNA によりATRを抑制した細胞において、コントロール細胞よりも明陵に観察できた。したがって、以上のことから、Atrは新規の機能を持っているのであり、それは２つの段階における制御にかかわっていることがわかる。その１つは、Rad9 と Frag1との結合の段階であり、もう１つはDNA損傷に応答してFrag1の量が減少する段階である。
【実施例１０】
【００８５】
（細胞周期mid-S期においてFrag1はAtrリン酸化とRb結合の両方を介してアポトーシスを制御する）
Frag1とRbとの結合やリン酸化が、Rad9とFrag1の結合解離と関係するかどうか調べた。そのために、野性型Frag1と変異型Frag1を発現する安定遺伝子導入体を作成しMMSに暴露して蛋白質を解析した(図６A)。ダブルチミジンブロックにより細胞周期を同期させたG1期細胞を0.01%MMSを示された時間暴露の後において、細胞周期を再開させた４及び８時間あとにおいて、Frag1 と Rad9との結合は減少したが、Ser1169Ala変異体や LxGxK変異体ではその減少は抑制され、またSer1187Ala変異体やLxGxE変異体では弱いながらもその減少は抑制された。これらのことから、Atrによるリン酸化はRad9の解離を促進し、RbとFrag1との結合もこのRad9の活性化に直接的または間接的に関与していることが示唆される。更に、アポトーシスをおこした細胞をしらべると、変異体のなかでもSer1169Ala変異体とLxGxK変異体では、DNA損傷があってもアポトーシスを起こしにくい（抵抗性の）形質をコントロールに比べて表した(図６B)。この結果は、細胞死誘導におけるFrag1-Rad9結合の重要性をさらに固めるものである。我々は最後に、Frag1とともに、野性型ATR (ATR-wt) またはキナーゼを欠損する kinase-dead ATR (ATR-kd)を細胞にGibcoBRLの遺伝子導入試薬を使用書に従って遺伝子導入して研究した。その結果、0.01%MMSを示された時間暴露の後において、Frag1の発現減少はATR-kdでは抑制されたが、ATR-wtでは抑制されなかった。従って、Atrのリン酸化がFrag1-Rad9に制御されるDNA損傷応答において役割を演じているという結論が再確認された（図１１）。
【実施例１１】
【００８６】
（Frag1に対する抗体およびその関連試薬）    
Frag1の性状と機能を明らかにするために、マウスFrag1のアミノ酸配列の一部345 CSLSDPENEQPVQKRKSN 362を合成してKSLアジュバンドを結合後にウサギに免疫、血清採血後に免疫源に用いたマウスFrag1のアミノ酸配列の一部で親和性精製をおこないポリクリーナル抗体を常法に従い作製した。この抗体をもちいた使用例は上記でのべた通りであり、DNA損傷応答におけるFrag1の機能をしめた（図２、３、4、５、６、８、９、１０、１２）。人工的にリン酸化修飾を加えたFrag1蛋白質の全部または一部（化学合成したヒトFrag1の<1169S>に対するリン酸化抗体の抗原配列の部分であるCGRQIL<pS>QLKEA）を免疫源としてもちいて作成した抗リン酸化Frag1抗体の例を図１２に示した。尚、本抗体はマウスFrag1にも使える。【００８７】
尚、以上の本発明における各実施例で使用した一次抗体は、夫々、以下の市販されているものを使用した。human p53 (Cell Signaling, a component of kit #9919), phosphorylated p53 (Ser 15) (Cell Signaling, a component of kit #9919), Mdm2 (Santa Cruz Biotechnology, #5304), Rb (BD Biosciences, #G3-245), Atr (EMD Biosciences, San Diego, CA, #ab-2), Rad9 (Santa Cruz Biotechnology, #8324), phospho-H2AX (Upstate, Chicago, IL, #07-164), mitochondria (Chemicon, Temecula, CA, #RbtX, Ab3598), 及び Orc2 (EMD Biosciences, #NA73) 、Rad9 (Santa Cruz Biotechnology, #10465) 及び Atr (Santa Cruz Biotechnology, sc-1887)、cytochrome c (BD Pharmingen, San Diego, CA, #6H2.B4, 556432), phospho-H2AX (Upstate, Chicago, IL, #05-636), Grb2 (BD Transduction Laboratory, #610111), V5 (Invitrogen, #46-705), Flag (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, #M-2), 及び actin (ICN, Irvine CA, #C4)。
【実施例１２】
【００８８】
（Ｆｒａｇ１欠損マウスの作成）
Ｆｒａｇ１欠損マウス（ノックアウトマウス）の場合は、まず、マウスＦｒａｇ１遺伝子のゲノム領域をBAC（大腸菌人工染色体）からサブクローニングし、遺伝子組み換え技術で図１３に示すベクターを作製する。遺伝子ノックアウトの方法としては、例えば、適当な薬剤（例えば、テトラサイクリン・ステロイド誘導体・亜鉛誘導体）や付加的遺伝子操作（例えば、LOXP配列）を用いたり、また作製するマウスでの発現を追跡するためのマーカー（例えば、緑色蛍光色素（GFP））を付加的に挿入したり置換したりする等の当業者に公知の任意の方法を挙げることが出来る。このノックアウトベクターを用いて、例えば、マウス及びラット等の齧歯類の幹細胞（例えば、胚性幹細胞・生殖幹細胞・胚性腫瘍幹細胞・胚性テラトーマ幹細胞に導入して、ノックアウトベクターとの間で相同組み換えをさせてＦｒａｇ１遺伝子又はＦｒａｇ１遺伝子座の改変されたアレルをもつ細胞を作製する。この細胞を初期胚（例えば、胞胚期が４または８細胞期）に導入して偽妊娠マウスの子宮にいれて出産させる。このあとは一般的に行われている方法にしたがってキメラマウスの交配をすすめてＦｒａｇ１欠損マウスを作成することができる。【００８９】
更に応用例として、遺伝子の組み換えや発現をあらかじめ用意した特異的遺伝子配列を用いることにより、ノックアウトを人為的に制御するコンディショナルノックアウト（例として、Cre-LoxP配列システム）、又は、標的とする遺伝子の発現を人為的に制御する発現誘導システム（例として、テトラサイクリン、亜鉛、ステロイド、副腎皮質ホルモン、エクダイソン等の昆虫由来ホルモンによる方法があるがこれには限定しない）がある。【００９０】
更に、こうして作成したノックアウト動物と他の遺伝子改変動物（例えば、蛍光色素遺伝子を組み込んだ動物や他の癌抑制遺伝子、癌関連遺伝子の遺伝子操作動物）との交配によりＦｒａｇ１遺伝子改変の効果を増強・減弱・不変とする交配種を作製することも出来る。
【実施例１３】
【００９１】
（Ｆｒａｇ１トランスジェニックマウスの作成）
又、Ｆｒａｇ１トランスジェニックマウスの場合は、例えば、マウスＦｒａｇ１遺伝子をプロモーターの下流に組み込んでベクターを作製する（図１４）。組み込む遺伝子としては、Ｆｒａｇ１遺伝子の全長cDNA、リン酸化部位アミノ酸に相当する塩基を変異させることで作成したリン酸化部位欠損Ｆｒａｇ１に対応する全長cDNA、Ｆｒａｇ１遺伝子の一部に相当するもの、更に、Ｆｒａｇ１遺伝子への塩基挿入・置換・欠落・挿入・融合などによって作製されるＤＮＡの全長または一部等を使用することができる。プロモーターの代表例としては、CAG、CMVプロモーター、組織特異的プロモーターとしてC-KIT, TECプロモーターを挙げることが出来る。テトラサイクリン・ステロイド誘導体・亜鉛誘導体等の適当な薬剤に応答する誘導性プロモーターも使用することが出来る。又、Ｆｒａｇ１の発現を増強・減弱・不変とする為の加的遺伝子操作を目的とする配列要素（例えば、LOXP配列）、及び、作製するマウスでの発現を追跡するためのマーカー（例えば、緑色蛍光色素（GFP））を付加的に挿入したり置換したりすることも出来る。こうして作成したベクターを、例えば、マウス及びラット等の齧歯類の実験動物の受精卵に注入して偽妊娠マウスの子宮にいれて出産させる。このあとは一般的に行われている方法にしたがってトランスジェニックマウスの交配をすすめてトランスジェニックマウスを作成することが出来る。更に、こうして作成したトランスジェニック動物と他の遺伝子改変動物との交配によりＦｒａｇ１遺伝子改変の効果を増強・減弱・不変とする交配種を作製することも出来る。
【実施例１４】
【００９２】
B6野性型マウスまたはFhit+/-p53+/-マウスに、発癌物質NMBA (N-methylbenzylamine)を2mg／gを週2回６回経口投与して、投与開始日から0日（NMBA未投与）、10日、37日、58日、84日経過後、解剖した組織を解析した。前胃に形成された腫瘤数を計測し、２ミリ以上の腫瘍が発生したマウスの頻度を腫瘍頻度として示した。組識をホルマリン固定後、パラフィン封埋し、組識切片を作成した。2.5％BSAと2.5％血清でブロッキングしたあと、抗リン酸化Frag1抗体、抗Fhit抗体、抗p53抗体で染色し、２次抗体で染色、DABにて発色検出し、核をカウンター染色した。また、隣接した切片からH＆Ｅ染色した。H＆Ｅ染色標本から顕微鏡下に腫瘤を過形成（H）と癌腫（C）に区別し、表６にまとめた。また、免疫組識染色から正常組識との比較において腫瘤で、リン酸化Frag1の発現が２０視野観察中の５０％以上で増強している事例、 Fhitの発現が２０視野観察中の５０％以上で減弱または欠損している事例、およびp53の発現が２０視野観察中の５０％以上で増強または減弱または欠損している事例数を表６にまとめた。図１５には、経過日数と共に腫瘍頻度が増加する様子と、リン酸化Frag1の発現増強が認められる腫瘍頻度が増加する様子を示した。図中に示した数字は実験に供したマウスの個体数である。図１６には、84日が経過した後の腫瘍頻度とリン酸化Frag1、Fhitおよびp53の各遺伝子発現の顕著な変化が認められる腫瘍頻度を示した。【００９３】
なお、抗リン酸化Frag1抗体陽性例を抗Frag1抗体で免疫組識染色すると同様に陽性であった。抗リン酸化Frag1抗体と抗Frag1抗体はともに有用であると考えられるが、上記の基礎的メカニズムの検討の結果及び免疫組識染色結果の鮮明度からデータは抗リン酸化Frag1抗体のもので集計した。Fhit+/-p53+/-マウスは癌抑制遺伝子の片アレルを欠いたマウスであり、発癌刺激に感受性が高い。Fhit+/-p53+/-マウスは２つの癌抑制遺伝子のそれぞれ片アレルを欠損した前癌病変に相当する動物モデルであるが、この前癌病変動物モデルにおいてFrag1は野性型より高率に当該リン酸化部位においてリン酸化されることが示された。またこのFrag1のリン酸化はFhit+/-p53+/-マウスを環境発癌物質NMBAにより癌を促進させたことによるFhitとp53の残りアレルの欠損または変異または不活性化によるFhitとp53の完全機能不全という多段階発癌プロセスの進行よりも先行して、高率にまたは高感度に発癌過程を検出しており、超早期発癌マーカーとしての有用性が示された。【００９４】
【表６】
2006090679.tif 000007
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明方法の利用分野は多岐に及び、その代表例として、発癌感受性試験、発癌安全性試験、潜在的ゲノム毒の安全性試験、ゲノムへの直接毒をもたいない発癌物質の安全性試験、発癌病態研究、発癌初期段階検出の動物実験、DNA損傷応答病態の研究、臨床的腫瘍の病態研究、臨床的腫瘍の早期検出に対応する動物実験を挙げることが出来る。【００９６】
また、抗癌剤は細胞毒であることが一般的であり、癌細胞と正常細胞の感受性の差を利用して癌治療に使用している。この感受性の差のレンジが広いものほど副作用が出にくく比較的安全に使用できる抗癌剤である。一方で感受性の差のレンジが狭いものは、癌細胞には抗腫瘍効果を発揮するが、同時に正常細胞にも影響が出かねず副作用が出やすい抗癌剤である。
感受性の差のレンジが狭い抗癌剤のみならず広い抗癌剤のいずれであっても、抗癌剤が正常細胞に分子細胞生物学的レベルに至るまで全く影響を及ぼさないという確証はなく、むしろ潜在的な細胞損傷を正常細胞にあたえていて、晩発性に毒性の影響が生じることは否定できない。【００９７】
今後、癌治療が進歩して生存率が向上した結果として、従来では早期死亡のために明らかでなかった正常細胞への毒性に起因する晩発性の障害が将来的に問題になってくる可能性がある。特に試験管内の実験において観察されることとして、又、げっ歯類を用いた動物発癌系でも少なくともその活性の一部は検出可能であるが、細胞周期S期の損傷を誘導する抗癌剤は癌細胞とともに正常細胞にもS期にDNA損傷を誘導するが、癌細胞では修復系が異常をきたしている（多段階発癌プロセスによる高度の変異集積の結果）ためにDNA損傷を修復できずに細胞の生存が不可能となり細胞死となるが、正常細胞では修復系が機能してDNA損傷を修復して細胞は生存し続ける。【００９８】
しかし、この正常細胞でのDNA損傷の修復が約30億塩基対におよぶヒトゲノムの全てに関して完全修復されているかは不明であり、細胞の当座の生存を許容する程度の修復がなされているにすぎない細胞が正常細胞または非癌細胞として生存していることは否定できない。このような細胞は少なくとも部分的にはゲノムに傷をおっていると推定されるため、時間の経過を経た後で癌にいたる可能性がある。現実的にも、臨床的にS期に作用する抗癌剤（例えば、エトポシドなどがあるがこれには限定しない）を悪性腫瘍の治療に使用して晩発性２次癌が生じる例があることが知られており、このことを鑑みれば、抗癌剤が正常細胞のゲノムの忠実性においておよぼす影響の詳細な解明は極めて重要な課題であり、２次発癌の制圧をコンセプトに掲げた医療関係または生命科学関連の市場が発展してくる可能性が強く示唆される。【００９９】
従って、本発明方法を用いて試験官内で正常細胞を抗癌剤に暴露させた時のDNA損傷の程度を検出することにより、１）当該抗癌剤を使用した場合に将来に発生しうる２次癌の予測、２）当該抗癌剤の正常細胞でのDNA損傷を最小限に軽減した形での最大の抗癌効果を得るための至適な濃度または投与量の設定、３）個人のゲノム情報として最近注目されている遺伝的多様性または個体差（例えば、単塩基多型、ポリモルフィズムなどがあるがこれには限定しない）による抗癌剤の副作用予測と合わせることで、より正確なゲノム損傷情報を指標にすえた短期的な副作用予測（過剰反応や急性死に関連する感受性）または長期的な副作用予測（２次癌のリスク）等を目的とした各種の方法が可能となる。
【図１】
2006090679.tif 000008
【図２】
2006090679.tif 000009
【図３】
2006090679.tif 000010
【図４】
2006090679.tif 000011
【図５】
2006090679.tif 000012
【図６】
2006090679.tif 000013
【図７】
2006090679.tif 000014
【図８】
2006090679.tif 000015
【図９】
2006090679.tif 000016
【図１０】
2006090679.tif 000017
【図１１】
2006090679.tif 000018
【図１２】
2006090679.tif 000019
【図１３】
2006090679.tif 000020
【図１４】
2006090679.tif 000021
【図１５】
2006090679.tif 000022
【図１６】
2006090679.tif 000023
【配列表】
2006090679000001.app
【国際調査報告】
2006090679.tif 000024
2006090679.tif 000025
2006090679.tif 000026
2006090679.tif 000027
2006090679.tif 000028
2006090679.tif 000029