(57)【要約】動物Ａ由来の管腔臓器上皮細胞を特定の管腔臓器に模した管腔形態を持つ管腔臓器マトリクスに対してコロニー形成させてなる再生管腔臓器を、動物Ａ体内に着生させるための着生剤であって、動物Ａ由来の血管新生を促進し得る幹細胞を有効成分とする再生管腔臓器着生剤。これを用いて、動物Ａにおいて一部又は全部が欠失し又は切除された特定の管腔臓器を再生及び着生させる方法。この方法により、ヒトを前提とした大型哺乳動物の管腔臓器を良好に再生及び体内着生させる技術を提供することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物Ａ由来の管腔臓器上皮細胞を特定の管腔臓器に模した管腔形態を持つ管腔臓器マトリクスに対してコロニー形成させてなる再生管腔臓器を、前記動物Ａの体内に着生させるための着生剤であって、前記動物Ａ由来の血管新生を促進し得る幹細胞を有効成分とする再生管腔臓器着生剤。
【請求項２】
前記管腔臓器マトリクスが、前記動物Ａに由来する、少なくとも大網及び腸間膜を包含する群から選ばれる血流豊富な膜組織の無細胞化処理物からなるものである、請求の範囲１項に記載の再生管腔臓器着生剤。
【請求項３】
前記管腔臓器マトリクスが、少なくともポリグリコール酸、ポリ乳酸、コラーゲン及びキト酸を包含する群から選ばれる生分解性材料を用いた人工的成形物である、請求の範囲１項に記載の再生管腔臓器着生剤。
【請求項４】
前記幹細胞が、少なくとも下記（１）〜（４）を包含する群から選ばれる幹細胞である、請求の範囲１項〜３項のいずれかに記載の再生管腔臓器着生剤。
（１）骨髄単核球細胞又は抹消血単核球細胞。
（２）上記の単核球細胞に含まれる血管内皮前駆細胞又は各種の胎性幹細胞。
（３）脱分化型の脂肪組織に含まれる幹細胞。
（４）骨格筋に含まれる幹細胞。
【請求項５】
前記動物Ａが少なくともヒト、イヌを包含する大型哺乳動物のいずれかである請求の範囲１項〜４項のいずれかに記載の再生管腔臓器着生剤。
【請求項６】
前記特定の管腔臓器が尿管、尿道又は膀胱であり、前記管腔臓器上皮細胞が尿管、尿道、膀胱又は腎盂の移行上皮細胞である請求の範囲１項〜５項のいずれかに記載の再生管腔臓器着生剤。
【請求項７】
前記特定の管腔臓器が尿管であり、前記管腔臓器上皮細胞が膀胱内壁表面由来の移行上皮細胞である請求の範囲１項〜６項のいずれかに記載の再生管腔臓器着生剤。
【請求項８】
前記管腔臓器上皮細胞及び幹細胞が動物Ａの同一個体に由来するものであり、かつ再生管腔臓器を着生させる動物Ａが当該同一個体である請求の範囲１項〜７項のいずれかに記載の再生管腔臓器着生剤。
【請求項９】
動物Ａ由来の管腔臓器上皮細胞を特定の管腔臓器に模した管腔形態を持つ管腔臓器マトリクスに対してコロニー形成させてなる再生管腔臓器であって、前記管腔臓器マトリクスに対して動物Ａ由来の血管新生を促進し得る幹細胞が播種されている着生可能型再生管腔臓器。
【請求項１０】
前記動物Ａが少なくともヒト、イヌを包含する大型哺乳動物のいずれかである請求の範囲９項に記載の着生可能型再生管腔臓器。
【請求項１１】
前記特定の管腔臓器が尿管、尿道又は膀胱であり、前記管腔臓器上皮細胞が尿管、尿道、膀胱又は腎盂の移行上皮細胞である請求の範囲９項又は１０項に記載の着生可能型再生管腔臓器。
【請求項１２】
前記特定の管腔臓器が尿管であり、前記管腔臓器上皮細胞が膀胱内壁表面由来の移行上皮細胞である請求の範囲９項又は１０項に記載の着生可能型再生管腔臓器。
【請求項１３】
前記管腔臓器上皮細胞及び幹細胞が動物Ａの同一個体に由来するものであり、かつ、再生管腔臓器を着生させる動物Ａが当該同一個体である請求の範囲９項〜１２項のいずれかに記載の着生可能型再生管腔臓器。
【請求項１４】
以下の各ステップを含む着生可能型再生管腔臓器の製造方法。
（１）動物Ａに由来する、少なくとも大網及び腸間膜を包含する群から選ばれる血流豊富な膜組織を無細胞化処理することにより、又は、少なくともポリグリコール酸、ポリ乳酸、コラーゲン及びキト酸を包含する群から選ばれる生分解性材料を用いることにより、特定の管腔臓器に模した管腔形態を持つ管腔臓器マトリクスを調製するステップ。
（２）動物Ａから管腔臓器上皮細胞を採取して培養するステップ。
（３）培養した前記管腔臓器上皮細胞と、動物Ａ由来の血管新生を促進し得る幹細胞とを前記管腔臓器マトリクス内に注入してインキュベートすることにより、管腔臓器マトリクスに対して管腔臓器上皮細胞をコロニー形成させてなる再生管腔臓器を構成すると共にこの再生管腔臓器に着生能を付与するステップ。
【請求項１５】
前記動物Ａが少なくともヒト、イヌを包含する大型哺乳動物のいずれかである請求の範囲１４項に記載の着生可能型再生管腔臓器の製造方法。
【請求項１６】
前記特定の管腔臓器が尿管、尿道又は膀胱であり、前記管腔臓器上皮細胞が尿管、尿道、膀胱又は腎盂の移行上皮細胞である請求の範囲１４項又は１５項に記載の着生可能型再生管腔臓器の製造方法。
【請求項１７】
前記特定の管腔臓器が尿管であり、前記管腔臓器上皮細胞が膀胱内壁表面由来の移行上皮細胞である請求の範囲１４項又は１５項に記載の着生可能型再生管腔臓器の製造方法。
【請求項１８】
前記管腔臓器上皮細胞及び幹細胞が動物Ａの同一個体に由来するものであり、かつ、再生管腔臓器を着生させる動物Ａが当該同一個体である請求の範囲１４項〜１７項のいずれかに記載の着生可能型再生管腔臓器の製造方法。
【請求項１９】
動物Ａにおいて一部又は全部が欠失し又は切除された特定の管腔臓器を再生及び着生させる方法であって、当該特定の管腔臓器について行う請求の範囲１４項〜１８項のいずれかに記載の着生可能型再生管腔臓器の製造方法の各ステップに続いて、その着生可能型再生管腔臓器を動物Ａ体内の好適な着床ベース組織上に移植することにより、前記の欠失し又は切除された管腔臓器の一部又は全部を着生状態で再生させる管腔臓器の再生着生方法。
【請求項２０】
前記特定の管腔臓器が尿管であり、前記着床ベース組織が大網である請求の範囲１９項に記載の管腔臓器の再生着生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、再生管腔臓器着生剤、着生可能型再生管腔臓器、着生可能型再生管腔臓器の製造方法、及び管腔臓器の再生着生方法に関する。
更に詳しくは本発明は、動物の、とりわけヒトを包含する大型哺乳動物の各種管腔臓器、例えば尿管、尿道又は膀胱等の泌尿器系の管腔臓器の一部又は全部が欠失し又は切除された場合において、これを良好に着生した状態（安定的に生存・機能する状態）で再生させるための再生管腔臓器着生剤と、この再生管腔臓器着生剤を利用して調製される着生可能型再生管腔臓器と、この着生可能型再生管腔臓器の製造方法と、この着生可能型再生管腔臓器の製造方法を一部に含む管腔臓器の再生着生方法とに関する。
【背景技術】  ヒトその他の動物の各種管腔臓器の一部又は全部が事故又は病気によって欠失し、あるいは事故又は病気に対応するための手術等によって切除された場合、その管腔臓器の生理機能が損なわれるため、健康や生命の維持に対して重大な支障を生じることが多い。そして、管腔臓器における欠失・切除部分の幅が小さいために欠失・切除部分の断端同志の吻合で対処できる場合は限られている。
例えばヒトの尿管においては、５ｃｍを超える欠失・切除に対して断端同士の吻合は事実上不可能である。このような尿管の欠損においては、通常は、腎婁や自家腎移植等のいわゆる尿路変更や、ゴアテックスやテトラフルオロエチレン等の材料からなる人工的な管路体の埋め込みによるいわゆる尿路置換で対処している。
一方、特表２００２−５０７９０９号公報には、管腔臓器を無細胞化して得たコラーゲン基質を含有する材料に、上皮細胞を移植すると共に一定の成長因子等を投与して、生合成移植片を製造する方法が開示されている。
しかしながら、前記した腎婁は患者の生活上の不便や精神的な負荷が大きく、定期的な交換も必要である。自家腎移植は手術侵襲が大きい。人工的な管路体の使用は、感染、管路の狭窄、結石の形成等の合併症で拒絶される場合が多い。特許文献１に記載の技術は管腔臓器の再生を図るものであるが、この生合成移植片（再生した管腔臓器）は、ラットやマウス等の小動物には生着させることができるが、ヒトに対する適用を前提として概念される大型哺乳動物（イヌ）では、生着しないことを確認している。
【発明の開示】
本発明の目的は、ヒトに対する適用を前提とした大型哺乳動物の管腔臓器を良好に再生及び着生させる技術、具体的には、再生管腔臓器着生剤と、この再生管腔臓器着生剤を利用して調製される着生可能型再生管腔臓器と、この着生可能型再生管腔臓器の製造方法と、この着生可能型再生管腔臓器の製造方法をステップの一部として含む管腔臓器の再生着生方法とを提供することである。
本願の第１発明は、動物Ａ由来の管腔臓器上皮細胞を特定の管腔臓器に模した管腔形態を持つ管腔臓器マトリクスに対してコロニー形成させてなる再生管腔臓器を、前記動物Ａの体内に着生させるための着生剤であって、前記動物Ａ由来の血管新生を促進し得る幹細胞を有効成分とする再生管腔臓器着生剤である。
ここに、「特定の管腔臓器に模した管腔形態を持つ管腔臓器マトリクス」とは、例えば特定の管腔臓器が尿管である場合、管腔臓器マトリクスが尿管とほぼ同等のサイズ及び形状を有する管腔形態を持つことを言う。
本願発明者は、第１発明の再生管腔臓器着生剤を用いることによって、動物Ａ由来の管腔臓器上皮細胞を特定の管腔臓器に模した管腔形態を持つ管腔臓器マトリクスに対してコロニー形成させてなる再生管腔臓器を、動物Ａ体内に良好に着生させることに成功した。この成功例は、生物学的にヒトと同等視できる大型哺乳動物（イヌ）を対象としたものであり、今までに３回試みて、いずれも成功している。
第１発明の再生管腔臓器着生剤を用いる方法によれば、従来技術である腎婁のように患者に生活上及び精神面の大きな負荷を強いることがなく、もち論定期的な交換も必要としない。又、自家腎移植のような大きな手術侵襲を回避できる。更に、人工的な管路体の使用のように感染、管路の狭窄、結石の形成等の合併症で拒絶される恐れがない。
本願の第２発明に係る再生管腔臓器着生剤においては、前記第１発明に係る管腔臓器マトリクスが、前記動物Ａに由来する少なくとも大網及び腸間膜を包含する群から選ばれる血流豊富な膜組織の無細胞化処理物からなるものである。
即ち、前記の第１発明に用いる管腔臓器マトリクスとして、血流豊富な膜組織の無細胞化処理物を好ましく使用することができる。これらの膜状の無細胞化処理物は、必要な場合には管腔状の形態を整えて使用される。
本願の第３発明に係る再生管腔臓器着生剤においては、前記第１発明に係る管腔臓器マトリクスが、少なくともポリグリコール酸、ポリ乳酸、コラーゲン及びキト酸を包含する群から選ばれる生分解性材料を用いてなる、人工的な成形物である。
即ち、前記の第１発明に用いる管腔臓器マトリクスとして、生分解性材料を用いた人工的な成形物も、好ましく使用することができる。これらの生分解性材料は、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、コラーゲン、キト酸等のように、生分解性であると共に分解物が動物に対して無害であることが好ましい。
生分解性材料を用いて人工的に成形した管腔臓器マトリクスを使用する場合、再生管腔臓器が着生する過程で、及びその後に、管腔臓器マトリクス上に新たに動物由来の細胞によって管腔臓器が形成されると同時に、管腔臓器マトリクス自体は徐々に生分解される。管腔臓器マトリクスの構成材料がポリグリコール酸、ポリ乳酸、コラーゲン、キト酸等である場合は、その分解物は動物に対して無害である。
本願の第４発明に係る再生管腔臓器着生剤においては、前記第１発明〜第３発明のいずれかに係る幹細胞（動物Ａ由来の血管新生を促進し得る幹細胞）が、少なくとも下記（１）〜（４）を包含する群から選ばれる幹細胞である。
（１）骨髄単核球細胞又は抹消血単核球細胞。
（２）上記の単核球細胞に含まれる血管内皮前駆細胞又は各種の胎性幹細胞。
（３）脱分化型の脂肪組織に含まれる幹細胞。
（４）骨格筋に含まれる幹細胞。
本願の第５発明に係る再生管腔臓器着生剤においては、前記第１発明〜第４発明のいずれかに係る動物Ａが、少なくともヒト、イヌを包含する大型哺乳動物のいずれかである。
即ち、前記の第１発明に係る再生管腔臓器着生剤はマウスやラット等の小型の動物にも利用することができるが、第５発明のように、ヒトやイヌを包含する大型哺乳動物のいずれかに対して使用することが特に好ましい。大型哺乳動物としては、他にも、ウシ、ウマ、サル等が考えられる。
本願の第６発明に係る再生管腔臓器着生剤においては、前記第１発明〜第５発明のいずれかに係る特定の管腔臓器が尿管、尿道又は膀胱であり、前記管腔臓器上皮細胞が尿管、尿道、膀胱又は腎盂の移行上皮細胞である。
再生管腔臓器着生剤は、動物の特定された任意の再生管腔臓器を着生させるために使用することができるが、その好ましい例として、特定の管腔臓器が泌尿器系の尿管、尿道又は膀胱であり、管腔臓器上皮細胞が尿管、尿道、膀胱又は腎盂の移行上皮細胞である場合を挙げることができる。
本願の第７発明に係る再生管腔臓器着生剤においては、前記第１発明〜第６発明のいずれかに係る特定の管腔臓器が尿管であり、前記管腔臓器上皮細胞が膀胱内壁表面由来の移行上皮細胞である。
第７発明のように、再生管腔臓器着生剤の特に好ましい使用例として、特定の管腔臓器が尿管であり、管腔臓器上皮細胞が膀胱内壁表面由来の移行上皮細胞である場合を挙げることができる。
本願の第８発明に係る再生管腔臓器着生剤においては、前記第１発明〜第７発明のいずれかに係る管腔臓器上皮細胞及び幹細胞が動物Ａの同一個体に由来するものであり、かつ再生管腔臓器を着生させる動物Ａが当該同一個体である。
再生管腔臓器着生剤を利用する場合において、適合性もしくは拒絶反応の考慮からは、管腔臓器上皮細胞及び幹細胞が特定の動物Ａの同一個体に由来するものであり、かつ、再生管腔臓器を着生させる動物Ａが当該同一個体であること、即ち、いわゆる自家使用が、最も好ましい。
但し、管腔臓器上皮細胞及び幹細胞が同一種の動物Ａに由来し、かつ再生管腔臓器を着生させる動物も同一種である限りにおいて、いわゆる他家使用であっても十分に許容されると考えられる。又、管腔臓器マトリクスが血流豊富な膜組織の無細胞化処理物である場合において、膜組織は無細胞化処理によって抗原性を失っているので、動物Ａとは異なる種の動物Ｂ由来のものも使用できる可能性がある。
本願の第９発明は、動物Ａ由来の管腔臓器上皮細胞を特定の管腔臓器に模した管腔形態を持つ管腔臓器マトリクスに対してコロニー形成させてなる再生管腔臓器であって、前記管腔臓器マトリクスに対して動物Ａ由来の血管新生を促進し得る幹細胞が播種されている着生可能型再生管腔臓器である。
第９発明により、再生管腔臓器が動物Ａの体内で良好に着生することが可能となる。
管腔臓器マトリクスに対する管腔臓器上皮細胞のコロニー形成により、組織の外見上は管腔臓器が再生されたような外観を呈する。しかし、管腔臓器マトリクスには血管組織を伴っていない。管腔臓器マトリクスとして血流豊富な膜組織の無細胞化処理物を使用した場合でも、無細胞化処理の過程で血管組織が脱落している。そのため、このような再生管腔臓器は、特に大型哺乳動物の体内へ移植しても、組織として安定的に生存できる状態にない。
しかし、この再生管腔臓器に動物Ａ由来の血管新生を促進し得る幹細胞を播種しておくと、これを動物の体内へ移植したとき、その動物が大型哺乳動物であっても、管腔臓器マトリクス内部への新生血管の侵入が有効に促進されることが分かった。恐らくはこのため、第９発明に係る着生可能型再生管腔臓器は大型哺乳動物の体内でも良好に着生することができるのである。
再生管腔臓器に対して血管新生を促進し得る幹細胞を播種する形態は限定されないが、第１発明〜第８発明のいずれかに係る再生管腔臓器着生剤を投与する（例えば、管腔臓器マトリクスに対して注入し、又は塗布する）形態が、特に有効である。
本願の第１０発明に係る着生可能型再生管腔臓器においては、前記第９発明に係る動物Ａが、少なくともヒト、イヌを包含する大型哺乳動物のいずれかである。
着生可能型再生管腔臓器はマウスやラット等の小型の動物用のものも調製することができるが、ヒト、イヌ等を包含する大型哺乳動物においても有効に構築することができる点が重要であり、従って、これらの大型哺乳動物のいずれかに対して使用するものが、特に好ましい。
本願の第１１発明に係る着生可能型再生管腔臓器においては、前記第９発明又は第１０発明に係る特定の管腔臓器が尿管、尿道又は膀胱であり、前記管腔臓器上皮細胞が尿管、尿道、膀胱又は腎盂の移行上皮細胞である。
着生可能型再生管腔臓器は動物の特定された任意の管腔臓器について調製することができるが、その好ましい例として、特定の管腔臓器が泌尿器系の尿管、尿道又は膀胱であり、管腔臓器上皮細胞が尿管、尿道、膀胱又は腎盂の移行上皮細胞である場合を挙げることができる。
本願の第１２発明に係る着生可能型再生管腔臓器においては、前記第９発明又は第１０発明に係る特定の管腔臓器が尿管であり、前記管腔臓器上皮細胞が膀胱内壁表面由来の移行上皮細胞である。
着生可能型再生管腔臓器の特に好ましい調製例として、第１２発明のように、特定の管腔臓器が尿管であり、管腔臓器上皮細胞が膀胱内壁表面由来の移行上皮細胞である場合を挙げることができる。
本願の第１３発明に係る着生可能型再生管腔臓器においては、前記第９発明〜第１２発明のいずれかに係る管腔臓器上皮細胞及び幹細胞が動物Ａの同一個体に由来するものであり、かつ、再生管腔臓器を着生させる動物Ａが当該同一個体である。
着生可能型再生管腔臓器を調製する場合において、適合性もしくは拒絶反応の考慮からは、管腔臓器上皮細胞及び骨髄単核球細胞が特定の動物Ａの同一個体に由来するものであり、かつ、再生管腔臓器を着生させる動物Ａが当該同一個体であることが、即ち、いわゆる自家使用が最も好ましい。
但し、管腔臓器上皮細胞及び骨髄単核球細胞が同一種の動物Ａに由来し、かつ再生管腔臓器を着生させる動物も同一種である限りにおいて、いわゆる他家使用であっても十分に許容されると考えられる。又、管腔臓器マトリクスが血流豊富な膜組織の無細胞化処理物である場合において、膜組織は無細胞化処理によって抗原性を失っているので、動物Ａとは異なる種の動物Ｂ由来のものも使用できる可能性がある。
本願の第１４発明は、以下の各ステップを含む着生可能型再生管腔臓器の製造方法である。
（１）動物Ａに由来する、少なくとも大網及び腸間膜を包含する群から選ばれる血流豊富な膜組織を無細胞化処理することにより、又は、少なくともポリグリコール酸、ポリ乳酸、コラーゲン及びキト酸を包含する群から選ばれる生分解性材料を用いることにより、特定の管腔臓器に模した管腔形態を持つ管腔臓器マトリクスを調製するステップ。
（２）動物Ａから管腔臓器上皮細胞を採取して培養するステップ。
（３）培養した前記管腔臓器上皮細胞と、動物Ａ由来の血管新生を促進し得る幹細胞とを前記管腔臓器マトリクス内に注入してインキュベートすることにより、管腔臓器マトリクスに対して管腔臓器上皮細胞をコロニー形成させてなる再生管腔臓器を構成すると共にこの再生管腔臓器に着生能を付与するステップ。
第１４発明の着生可能型再生管腔臓器の製造方法において（１）及び（２）の各ステップは、例えば前記した特許文献１に開示された技術と類似しており、特徴的な点は（３）のステップである。
即ち、（３）のステップにおいては、特定の管腔臓器に模した管腔形態を持つ管腔臓器マトリクスに管腔臓器上皮細胞を注入するに当たり、併せて骨髄単核球細胞を投与（投与形態は任意であるが、例えば管腔臓器マトリクス内に注入）する。このことにより、管腔臓器マトリクスに対して管腔臓器上皮細胞をコロニー形成させることができると同時に、この再生管腔臓器に動物体内で良好に着生する能力を付与することができる。骨髄単核球細胞としては、前記第１発明〜第８発明のいずれかに係る再生管腔臓器着生剤を用いることが特に好ましい。
本願の第１５発明に係る着生可能型再生管腔臓器の製造方法においては、前記第１４発明に係る動物Ａが少なくともヒト、イヌを包含する大型哺乳動物のいずれかである。
即ち、上記した着生可能型再生管腔臓器の製造方法においては、ヒト、イヌ等の大型哺乳動物を対象とすることが、特に好ましい。
本願の第１６発明に係る着生可能型再生管腔臓器の製造方法においては、前記第１４発明又は第１５発明に係る特定の管腔臓器が尿管、尿道又は膀胱であり、前記管腔臓器上皮細胞が尿管、尿道、膀胱又は腎盂の移行上皮細胞である。
即ち、上記した着生可能型再生管腔臓器の製造方法においては、特定の管腔臓器が尿管、尿道又は膀胱であり、管腔臓器上皮細胞が尿管、尿道、膀胱又は腎盂の移行上皮細胞であることが、特に好ましい。
本願の第１７発明に係る着生可能型再生管腔臓器の製造方法においては、前記第１４発明又は第１５発明に係る特定の管腔臓器が尿管であり、前記管腔臓器上皮細胞が膀胱内壁表面由来の移行上皮細胞である。
即ち、上記した着生可能型再生管腔臓器の製造方法においては、特定の管腔臓器が尿管であり、管腔臓器上皮細胞が膀胱内壁表面由来の移行上皮細胞であることが、とりわけ好ましい。
本願の第１８発明に係る着生可能型再生管腔臓器の製造方法においては、前記第１４発明〜第１７発明のいずれかに係る管腔臓器上皮細胞及び血管新生を促進し得る幹細胞が動物Ａの同一個体に由来するものであり、かつ、再生管腔臓器を着生させる動物Ａが当該同一個体である。
着生可能型再生管腔臓器の製造方法において、適合性もしくは拒絶反応の考慮から、管腔臓器上皮細胞及び血管新生を促進し得る幹細胞が特定の動物Ａの同一個体に由来するものであり、かつ、再生管腔臓器を着生させる動物Ａが当該同一個体であることが、即ち、いわゆる自家使用が最も好ましい。
但し、管腔臓器上皮細胞及び血管新生を促進し得る幹細胞が同一種の動物Ａに由来し、かつ再生管腔臓器を着生させる動物も同一種の動物Ａである限りにおいて、いわゆる他家使用であっても十分に許容されると考えられる。又、管腔臓器マトリクスが血流豊富な膜組織の無細胞化処理物である場合において、膜組織は無細胞化処理によって抗原性を失っているので、動物Ａとは異なる種の動物Ｂ由来のものも使用できる可能性がある。
本願の第１９発明は、動物Ａにおいて一部又は全部が欠失し又は切除された特定の管腔臓器を再生及び着生させる方法であって、当該特定の管腔臓器について行う第１４発明〜第１８発明のいずれかに係る着生可能型再生管腔臓器の製造方法の各ステップに続いて、その着生可能型再生管腔臓器を動物Ａ体内の好適な着床ベース組織上に移植することにより、前記の欠失し又は切除された管腔臓器の一部又は全部を着生状態で再生させる管腔臓器の再生着生方法である。
本発明により得られる再生管腔臓器は、ヒト、イヌ等の大型動物に対しても着生可能なタイプであるため、これを第１９発明のように使用することにより、一部又は全部が欠失し又は切除された特定の管腔臓器を良好に再生及び着生させることができる。
本願の第２０発明に係る管腔臓器の再生着生方法においては、前記第１９発明に係る特定の管腔臓器が尿管であり、前記着床ベース組織が大網である。
即ち、前記の第１９発明において管腔臓器の種類や着床ベース組織の種類は限定されないが、好ましい例として、第２０発明のように管腔臓器が尿管であり、着床ベース組織が大網である場合を挙げることができる。
【図面の簡単な説明】  第１図は、敷石状に増殖した移行上皮細胞を示す顕微鏡写真である。第２図は、尿管様の構造体の断面を示す顕微鏡写真である。第３図は、尿管様の構造体からの移行上皮細胞層の脱落を示す顕微鏡写真である。第４図は、尿管マトリクス内部の移行上皮細胞層の生存を示す顕微鏡写真である。第５図は、第４図の部分拡大写真である。
【発明を実施するための最良の形態】  次に、本願の第１発明〜第２０発明を実施するための形態を、その最良の形態を含めて説明する。以下において、単に「本発明」と言う時は、第１発明〜第２０発明の内の該当する発明群を一括して指している。
〔再生管腔臓器着生剤とその有効成分〕
本発明に係る再生管腔臓器着生剤は、所定の再生管腔臓器を動物Ａの体内に着生させるための着生剤であって、動物Ａ由来の血管新生を促進し得る幹細胞を有効成分とする細胞製剤である。
上記において「血管新生を促進し得る幹細胞」とは、少なくとも下記（１）〜（４）を包含する群から選ばれる幹細胞を言う。
（１）骨髄単核球細胞又は抹消血単核球細胞。
（２）上記の単核球細胞に含まれる血管内皮前駆細胞又は各種の胎性幹細胞。
（３）脱分化型の脂肪組織に含まれる幹細胞。
（４）骨格筋に含まれる幹細胞。
以上の幹細胞のうち、例えば「骨髄単核球細胞」については、特に好ましくは骨髄細胞を生理食塩水と共にリンフォプレップ（９．１％  Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｉａｔｒｉｚｏａｔｅ  ＋  ５．７％  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：「リンフォプレップ」は商品名である）液と混ぜ、８００×ｇで２０分間、１１００×ｇで１０分間遠心した後に形成される６層の内の上から２層目のバンドに含まれる細胞を言う。
再生管腔臓器着生剤は、少なくとも上記した血管新生を促進し得る幹細胞の１種以上を含んでいれば良く、他の任意の成分を含んでいても構わない。例えば、幹細胞が骨髄単核球細胞や抹消血単核球細胞等である場合において、他の任意の血液成分、骨髄成分あるいは血球細胞等を含んでいても良く、含んでいなくても良い。従って、再生管腔臓器着生剤は、例えば骨髄単核球細胞が有効成分である場合には、リンフォプレップ法等の任意の方法によって骨髄から骨髄単核球細胞分画を分離する、等の操作により容易に調製することができる。
骨髄単核球細胞にも幾つかの種類が知られているが、再生管腔臓器の着生に対して、特定の種類の骨髄単核球細胞が寄与している可能性、各種類の骨髄単核球細胞がいずれも寄与している可能性、更には、各種類の骨髄単核球細胞が一定の役割分担のもとに寄与している可能性、等が考えられる。
〔着生可能型再生管腔臓器〕
本発明に係る着生可能型再生管腔臓器は、特定の管腔臓器に模した管腔形態を持つ管腔臓器マトリクスに、特定の動物Ａに由来する管腔臓器上皮細胞をコロニー形成させたものに対して、その動物Ａに由来する血管新生を促進し得る幹細胞が播種されているものである。「コロニー形成」とは、管腔臓器マトリクスに対して管腔臓器上皮細胞を投与した状態で栄養培地と共にインキュベートして、管腔臓器上皮細胞の増殖により、管腔臓器マトリクス上を管腔臓器上皮細胞が層状に覆うようにすることを言う。
又、「特定の管腔臓器に模した管腔形態を持つ管腔臓器マトリクス」とは、下記の構成材料を用いて特定の管腔臓器に近似したサイズと管腔形態を持つように形成したマトリクスを言う。
このような管腔臓器マトリクスとしては、動物Ａに由来する、少なくとも大網及び腸間膜を包含する群から選ばれる血流豊富な膜組織を無細胞化処理したものを構成材料とする場合が例示される。又、少なくともポリグリコール酸、ポリ乳酸、コラーゲン及びキト酸を包含する群から選ばれる生分解性材料を用いた人工的成形物も例示される。
〔着生可能型再生管腔臓器の製造方法〕
本発明に係る着生可能型再生管腔臓器の製造方法は、少なくとも以下に記載する（１）〜（３）の各ステップを含む方法である。
（１）動物Ａに由来する、少なくとも大網及び腸間膜を包含する群から選ばれる血流豊富な膜組織を無細胞化処理することにより、又は、少なくともポリグリコール酸、ポリ乳酸、コラーゲン及びキト酸を包含する群から選ばれる生分解性材料を用いることにより、特定の管腔臓器に模した管腔形態を持つ管腔臓器マトリクスを調製するステップ。
（２）動物Ａから管腔臓器上皮細胞を採取して培養するステップ。
（３）培養した前記管腔臓器上皮細胞と、動物Ａ由来の血管新生を促進し得る幹細胞とを前記管腔臓器マトリクス内に注入してインキュベートすることにより、管腔臓器マトリクスに対して管腔臓器上皮細胞をコロニー形成させてなる再生管腔臓器を構成すると共にこの再生管腔臓器に着生能を付与するステップ。
〔管腔臓器の再生着生方法〕
本発明に係る管腔臓器の再生着生方法は、動物Ａにおいて一部又は全部が欠失し又は切除された特定の管腔臓器を再生及び着生させる方法である。その具体的な内容は、当該特定の管腔臓器について行う上記着生可能型再生管腔臓器の製造方法における（１）〜（３）の各ステップに続き、その着生可能型再生管腔臓器を動物Ａ体内の好適な着床ベース組織上に移植して、前記の欠失し又は切除された管腔臓器の一部又は全部を着生状態で再生させる方法である。
この方法は、本願発明者により大型哺乳動物（イヌ）に対して初めて試みられ、管腔臓器の一部又は全部を着生状態で再生させることに成功した。なお上記の「着床ベース組織」とは、着生可能型再生管腔臓器を動物体内で着生させるために好適な着床用の支持体となる体内組織を言い、例えば管腔臓器が尿管等の泌尿器系の管腔臓器である場合には、着床ベース組織として大網等が好ましく例示される。
〔管腔臓器及び管腔臓器上皮細胞〕
本発明が再生及び着生の対象とする「管腔臓器」とは、動物、特に大型哺乳動物の体内の管腔状の形態を持つ各種臓器組織を限定なく包含する概念である。本願発明者が最も関心を持つ管腔臓器は泌尿器系の尿管、尿道又は膀胱であるが、その他にも、食道、胃、十二指腸、小腸、大腸、気管、胆管、卵管、精管、血管、子宮、膣、リンパ管等の多様な管腔臓器を例示することができる。
一方、「管腔臓器上皮細胞」とは、上記の各種の管腔臓器における上皮細胞を言い、例えば泌尿器系の管腔臓器である尿管、尿道、膀胱等の上皮細胞を好ましく例示することができる。なお、本発明においては、例えば腎盂の上皮細胞のように正確な意味での管腔臓器の上皮細胞でなくても、管腔臓器マトリクスに対するコロニー形成により再生管腔臓器を構成し得るものも「管腔臓器上皮細胞」に包含させている。
〔対象動物と自家／他家使用〕
本発明において、対象動物Ａは、ラット、マウス等の小型動物から、ヒトやイヌを含む大型動物までが限定なく含まれる。大型動物としては、特に大型の哺乳類動物を好ましく例示できる。大型の哺乳類動物としては、例えば、ヒト、チンパンジー、サル等の霊長類動物、ウシ、ウマ、イヌ、ブタ等を好ましく例示することができる。臓器の再生・移植と言う医学的見地からは、特にヒトあるいはヒトを前提として実験に供されることのある大型の哺乳類動物が重要である。
本発明の実施において、適合性もしくは拒絶反応の考慮からは、管腔臓器上皮細胞及び各種の幹細胞が特定の動物Ａに由来し、かつ、再生管腔臓器を着生させる対象も同一種の動物Ａであることが好ましい。管腔臓器上皮細胞及び各種の幹細胞が動物Ａの特定の個体に由来し、かつ、再生管腔臓器を着生させる対象もその同一の個体であること、即ち、自家使用が、とりわけ好ましい。
但し、現在までのところ、本願発明が同一種の動物間におけるいわゆる他家使用に適合していないと言う証拠は、見出していない。
管腔臓器マトリクスに関しては、これが、少なくとも大網及び腸間膜を包含する群から選ばれる血流豊富な膜組織の無細胞化処理物からなるものである場合無細胞化処理によって抗原性を失っているため、いわゆる他家使用は問題がないと考えられるし、異種動物間の使用であっても、特段の問題を生じない可能性がある。管腔臓器マトリクスが、少なくともポリグリコール酸、ポリ乳酸、コラーゲン及びキト酸を包含する群から選ばれる生分解性材料を用いた人工的成形物である場合、元々、自家使用、他家使用、異種動物間使用等の区別を生じない。
【実施例】  （実施例１：リンフォプレップ法による再生管腔臓器着生剤の調製）
１５ｍＬ容の遠心管に最初にＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｉｌｉｎｅ）を５ｍＬ収容しておき、そこに、イヌから採取した骨髄５ｍＬを追加して混合し、合計１０ｍＬの骨髄液とした。
別途に準備した５０ｍＬ容の遠心管に１５ｍＬの前記リンフォプレップを収容した後、このリンフォプレップ上に、上記の骨髄液１０ｍＬを、オートピペッターを用いて、非常に緩徐にかつ静かに、重層するように注加した。そしてこの５０ｍＬ容の遠心管を、重層が乱れないように静かに遠心機にセットし、ＲＴ、１４００ｒ．ｐ．ｍ．、３５ｍｉｎ．の条件で遠心分離した。
遠心分離の終了後、遠心管を重層が乱れないように静かに取り出し、その上下方向の中央部位に位置する白いモヤモヤした部分に骨髄単核球細胞が含まれているので、この部分を全て吸い取って別の５０ｍＬ容の遠心管に移した。
次いでこの遠心管に等量のＰＢＳを加えて良く混合した後、ＲＴ、１４００ｒ．ｐ．ｍ．、３５ｍｉｎ．の条件で遠心分離した。遠心分離の終了後、上澄みを除いてから、沈殿となっている骨髄単核球細胞をＭＳＣＧＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ  Ｉｎｃ．ＭＤ  ＵＳＡ）で懸濁した。そしてこの懸濁液を、骨髄単核球細胞の含有数を考慮したもとでフラスコに所定量を分注し、３７°Ｃ、炭酸ガス５％の雰囲気で培養した。これが本実施例に係る再生管腔臓器着生剤である。
（実施例２：再生管腔臓器の構築）
ハサミを用いてイヌの膀胱に割を入れて膀胱内壁を露出させ、上皮側の表面をメスを用いて丁寧に削ぎ落とした後、移行上皮細胞を細切した。この切片を分解酵素液（０．０５％トリプシン  ＰＢＳ）に３０分間浸漬して、移行上皮細胞をバラバラに分離させた後、これらの移行上皮細胞を単離した。
単離した移行上皮細胞を３７°Ｃ、炭酸ガス５％の雰囲気でインキュベーター内で培養したところ、初期培養後７〜１０日で、図１に示すように、敷石状の移行上皮細胞１、１、・・・の増殖を確認することができた。
一方、イヌの尿管をデオキシコリン酸を用いて脱細胞化することにより、管腔状の尿管マトリクスを調製しておいた。そして、この尿管マトリクスの管腔内部に上記の培養した移行上皮細胞を培地と共に注入した後、尿管マトリクスの両端の開口部を縫合糸で縛り、シャーレ上に載置して、３７°Ｃ、炭酸ガス５％の雰囲気でインキュベーター内で３日間培養した。
その後、この尿管マトリクスをインキュベーターから取り出し、管腔軸に対して直角方向に切断して観察したところ、図２に示すように、単層の移行上皮細胞層２が尿管マトリクス３の内壁４を完全に覆っており、尿管様の構造体（本発明で言う「再生管腔臓器」）が構築されていた。
（比較例及び実施例３：再生管腔臓器の着生）
比較例として、上記の尿管様の構造体をそのままヌードラットの大網内に移植し、移植後２週間で取り出したところ、図３に示すように、尿管マトリクス３の内壁４を完全に覆っていた移行上皮細胞層が脱落しており、その生存（着生）を確認できなかった。
一方、実施例３として、上記の実施例２において尿管マトリクスの管腔内部に移行上皮細胞を注入する際に、再生管腔臓器着生剤（実施例１によってイヌより取得していた骨髄単核球細胞）を併せて注入しておいた尿管様の構造体をヌードラットの大網内に移植し、移植後２週間で取り出したところ、図４及びその部分拡大図である図５に示すように尿管マトリクス３への新生血管５の侵入が促進されており、かつ尿管マトリクス３内部の移行上皮細胞層２の良好な生存（着生）を確認することができた。
（実施例４：大型哺乳動物での再生管腔臓器着生の臨床例）
実施例２と同様にイヌ個体Ｄ１から調製した尿管マトリクスの管腔内部に、他のイヌ個体Ｄ２から実施例２と同様に単離・培養・増殖させた移行上皮細胞を培地と共に注入し、併せてイヌ個体Ｄ２から実施例１と同様に取得・培養した再生管腔臓器着生剤も注入した。この尿管様の構造体をイヌ個体Ｄ２の尿管部に移植（尿管部を切断して、その切断部に連結）する手術を行ったところ、移植後２週間を経過した時点でもイヌ個体Ｄ２における正常な尿の流れを確認した。
【産業上の利用可能性】  本発明によって、ヒトを包含する大型哺乳動物の各種管腔臓器を良好に再生・着生させることが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年12月5日(2005.12.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】請求の範囲
【請求項１】（削除）
【請求項２】（削除）
【請求項３】（削除）
【請求項４】（削除）
【請求項５】（削除）
【請求項６】（削除）
【請求項７】（削除）
【請求項８】（削除）
【請求項９】少なくともヒト、イヌを包含する大型哺乳動物のいずれかである動物Ａ由来の管腔臓器上皮細胞を特定の管腔臓器に模した管腔形態を持つ管腔臓器マトリクスに対してコロニー形成させてなる再生管腔臓器であって、前記管腔臓器マトリクスに対して動物Ａ由来の血管新生を促進し得る幹細胞が播種されている着生可能型再生管腔臓器。
【請求項１０】（削除）
【請求項１１】前記特定の管腔臓器が尿管、尿道又は膀胱であり、前記管腔臓器上皮細胞が尿管、尿道、膀胱又は腎盂の移行上皮細胞である請求の範囲９項に記載の着生可能型再生管腔臓器。
【請求項１２】前記特定の管腔臓器が尿管であり、前記管腔臓器上皮細胞が膀胱内壁表面由来の移行上皮細胞である請求の範囲９項に記載の着生可能型再生管腔臓器。
【請求項１３】前記管腔臓器上皮細胞及び幹細胞が動物Ａの同一個体に由来するものであり、かつ、再生管腔臓器を着生させる動物Ａが当該同一個体である請求の範囲９項、１１項又は１２項に記載の着生可能型再生管腔臓器。
【請求項１４】以下の各ステップを含む着生可能型再生管腔臓器の製造方法。
（１）少なくともヒト、イヌを包含する大型哺乳動物のいずれかである動物Ａに由来する、少なくとも大網及び腸間膜を包含する群から選ばれる血流豊富な膜組織を無細胞化処理することにより、又は、少なくともポリグリコール酸、ポリ乳酸、コラーゲン及びキト酸を包含する群から選ばれる生分解性材料を用いることにより、特定の管腔臓器に模した管腔形態を持つ管腔臓器マトリクスを調製するステップ。
（２）動物Ａから管腔臓器上皮細胞を採取して培養するステップ。
（３）培養した前記管腔臓器上皮細胞と、動物Ａ由来の血管新生を促進し得る幹細胞とを前記管腔臓器マトリクス内に注入してインキュベートすることにより、管腔臓器マトリクスに対して管腔臓器上皮細胞をコロニー形成させてなる再生管腔臓器を構成すると共にこの再生管腔臓器に着生能を付与するステップ。
【請求項１５】（削除）
【請求項１６】前記特定の管腔臓器が尿管、尿道又は膀胱であり、前記管腔臓器上皮細胞が尿管、尿道、膀胱又は腎盂の移行上皮細胞である請求の範囲１４項に記載の着生可能型再生管腔臓器の製造方法。
【請求項１７】前記特定の管腔臓器が尿管であり、前記管腔臓器上皮細胞が膀胱内壁表面由来の移行上皮細胞である請求の範囲１４項に記載の着生可能型再生管腔臓器の製造方法。
【請求項１８】前記管腔臓器上皮細胞及び幹細胞が動物Ａの同一個体に由来するものであり、かつ、再生管腔臓器を着生させる動物Ａが当該同一個体である請求の範囲１４項、１６項又は１７項に記載の着生可能型再生管腔臓器の製造方法。
【請求項１９】少なくともヒト、イヌを包含する大型哺乳動物のいずれかである動物Ａにおいて一部又は全部が欠失し又は切除された特定の管腔臓器を再生及び着生させる方法であって、当該特定の管腔臓器について行う請求の範囲１４項、１６項、１７項又は１８項に記載の着生可能型再生管腔臓器の製造方法の各ステップに続いて、その着生可能型再生管腔臓器を動物Ａ体内の好適な着床ベース組織上に移植することにより、前記の欠失し又は切除された管腔臓器の一部又は全部を着生状態で再生させる管腔臓器の再生着生方法。
【請求項２０】前記特定の管腔臓器が尿管であり、前記着床ベース組織が大網である請求の範囲１９項に記載の管腔臓器の再生着生方法。
【国際調査報告】
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