(57)【要約】本発明の目的は、無細胞系ポリペプチド合成方法において、高効率かつ低コストで、目的ポリペプチドを合成する方法を提供することである。本発明によれば、少なくとも、ポリペプチド合成能を有する細胞抽出液、鋳型核酸、および基質アミノ酸を含むが、ＧＴＰが添加されていない合成反応液を反応容器中でインキュベートすることにより無細胞系でポリペプチド合成を行うことを含む、ポリペプチド合成方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも、ポリペプチド合成能を有する細胞抽出液、鋳型核酸、および基質アミノ酸を含むが、ＧＴＰが添加されていない合成反応液を反応容器中でインキュベートすることにより無細胞系でポリペプチド合成を行うことを含む、ポリペプチド合成方法。
【請求項２】
少なくとも、ポリペプチド合成能を有する細胞抽出液、鋳型核酸、ＧＴＰ、および基質アミノ酸を含むが、ＡＴＰが添加されていない合成反応液を反応容器中でインキュベートすることにより無細胞系でポリペプチド合成を行うことを含む、ポリペプチド合成方法。
【請求項３】
細胞抽出液が、コムギ胚芽由来である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
合成反応液を緩衝液と接触させながらインキュベートすることによりポリペプチド合成を行い、かつ該緩衝液が、該合成反応液のポリペプチド合成能を維持するための物質を含むが、ＧＴＰを含まない水溶液である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
合成反応液と緩衝液との接触が、膜を介して行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
膜が、透析膜、限外濾過膜、セラミック膜、半透膜および中空子膜よりなる群から選ばれる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
合成反応液と緩衝液との接触が、界面を有して行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
緩衝液が、ゾル又はゲルに含まれている、請求項４〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
緩衝液が、上記ポリペプチド合成反応で消費される物質、およびマグネシウムイオンを含み、かつｐＨが６．８〜７．６の水溶液である、請求項４〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも、ポリペプチド合成能を有する細胞抽出液、鋳型核酸、基質アミノ酸、および３ｍＭ以下のＧＴＰを含む合成反応液を反応容器中で緩衝液と接触させながらインキュベートすることにより無細胞系でポリペプチド合成を行うことを含む、ポリペプチド合成方法であって、該緩衝液が、該合成反応液のポリペプチド合成能を維持するための物質を含むが、ＧＴＰを含まない水溶液であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
ポリペプチド合成能を有する細胞抽出液が、ＧＴＰ再生系を有する細胞抽出液である、請求項１および３〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ポリペプチド合成能を有する細胞抽出液が、ヌクレオチドジフォスフェートキナーゼを含む細胞抽出液である、請求項１および３〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも、ポリペプチド合成能を有する細胞抽出液、およびＧＴＰを含まない緩衝液を含む、請求項４〜１２のいずれかに記載の方法によりポリペプチド合成を行うための試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、無細胞系ポリペプチド合成方法、および該方法を行うための試薬キットなどに関する。さらに詳しくは、本発明は、無細胞系ポリペプチド合成方法において、従来の合成反応系では添加されていた不必要な成分を添加しないことにより効率化された合成方法、および該方法を行うための試薬キットなどに関する。
【背景技術】  細胞内で行われているポリペプチドの合成反応は、遺伝情報をもつＤＮＡから、その情報がｍＲＮＡに転写され、リボソームがそのｍＲＮＡの情報を翻訳することにより、ポリペプチドが合成されるという工程で進行している。現在、この細胞内におけるポリペプチド合成を試験管等の生体外で行う方法（以下、これを「無細胞系」と称することがある）としては、例えば、リボソームなどのポリペプチド合成に必要な成分を生物体から抽出した細胞抽出液を用いて行われている（例えば、特開平６−９８７９０号公報、特開平６−２２５７８３号公報、特開平７−１９４号公報、特開平９−２９１号公報、及び特開平７−１４７９９２号公報を参照）。これらの方法において細胞抽出液は、大腸菌、植物胚芽、ウサギ網状赤血球などから抽出されたものが用いられている。
上記細胞抽出液を用いて無細胞系でポリペプチド合成を行う場合、合成反応をバッチで行うと反応が途中で停止してしまい、十分なポリペプチド合成量が得られないという問題点があった。近年、Ｓｐｉｒｉｎ等は、上記細胞抽出液を含む合成反応液に、ポリペプチドの原料であるアミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰ等の反応基質を含む溶液をポンプなどを用いて連続的に供給して、合成反応液中の反応基質の初期濃度を維持すると同時に、合成された目的ポリペプチド等を限外濾過により該合成反応液から除去することによって、反応時間を２０時間以上にわたって持続させることに成功したと報告している（Ａ．Ｓ．Ｓｐｉｒｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４、及び特公平７−１１０２３６号公報を参照）。
また山根等は、上記細胞抽出液を含む合成反応液と基質アミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰの反応基質を含む溶液とを中空子膜を介して接触させ、低分子基質を合成反応液中に移行させ、該合成反応液中の低分子基質濃度をほぼ一定に維持する方法を提案し、この方法により、ポリペプチド合成量を顕著に高くすることができることを報告している（特開平１０−８０２９５号公報を参照）。
この様に、従来は、上記細胞抽出液を含む合成反応液中に含まれる基質アミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰなどの濃度を、上記合成反応により消費された分を供給することにより一定に維持する（初期濃度を維持する）ことが反応の持続に必須であると考えられてきた。しかしながら、過剰量の基質アミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰなどの濃度は、ポリペプチド合成を阻害することも知られていたため、合成反応に適当な上記物質の濃度調整法の開発も行われていた（ＷＯ２０００／５８４９３号公報を参照）。
上記の無細胞系ポリペプチド合成方法において、基質アミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰなどの初期濃度を維持するためにこれらを外部から合成反応液に供給する方法では、合成系に対し比較的大量の基質溶液が必須であり、それら試薬のコストがかかっていた点で必ずしも満足のいくものではなく、特に産業上の有用性の向上のため、さらにポリペプチド合成能が高く、低コストで、目的ポリペプチドを大量に効率よく合成し得る方法が求められていた。
【発明の開示】
本発明の第一の目的は、無細胞系ポリペプチド合成方法において、高効率かつ低コストで、目的ポリペプチドを合成する方法を提供することである。また、本発明の第二の目的は、無細胞系ポリペプチド合成方法において、高効率かつ低コストで、目的ポリペプチドを合成するための試薬キットを提供することである。
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、従来の無細胞系ポリペプチド合成方法で必須の成分として添加されていたＧＴＰを、合成反応液等に添加しないで合成反応を行うと充分量のポリペプチドが得られること、また従来法で必須であったＧＴＰ濃度をほぼ一定に維持するために外部から高濃度で供給する必要もないこと、さらには従来法で必須の成分であったＧＴＰ、ＡＴＰを合成反応液等に添加しないで合成反応を行ってもポリペプチド合成が行われることを見出した。また、上記ＧＴＰを添加していないコムギ胚芽抽出液を用いた合成反応液中にはＧＴＰを再生する機構が含まれることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  少なくとも、ポリペプチド合成能を有する細胞抽出液、鋳型核酸、および基質アミノ酸を含むが、ＧＴＰが添加されていない合成反応液を反応容器中でインキュベートすることにより無細胞系でポリペプチド合成を行うことを含む、ポリペプチド合成方法。
（２）  少なくとも、ポリペプチド合成能を有する細胞抽出液、鋳型核酸、ＧＴＰ、および基質アミノ酸を含むが、ＡＴＰが添加されていない合成反応液を反応容器中でインキュベートすることにより無細胞系でポリペプチド合成を行うことを含む、ポリペプチド合成方法。
（３）  細胞抽出液が、コムギ胚芽由来である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）  合成反応液を緩衝液と接触させながらインキュベートすることによりポリペプチド合成を行い、かつ該緩衝液が、該合成反応液のポリペプチド合成能を維持するための物質を含むが、ＧＴＰを含まない水溶液である、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）  合成反応液と緩衝液との接触が、膜を介して行われる、（４）に記載の方法。
（６）  膜が、透析膜、限外濾過膜、セラミック膜、半透膜および中空子膜よりなる群から選ばれる、（５）に記載の方法。
（７）  合成反応液と緩衝液との接触が、界面を有して行われる、（４）に記載の方法。
（８）  緩衝液が、ゾル又はゲルに含まれている、（４）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）  緩衝液が、上記ポリペプチド合成反応で消費される物質、およびマグネシウムイオンを含み、かつｐＨが６．８〜７．６の水溶液である、（４）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）  少なくとも、ポリペプチド合成能を有する細胞抽出液、鋳型核酸、基質アミノ酸、および３ｍＭ以下のＧＴＰを含む合成反応液を反応容器中で緩衝液と接触させながらインキュベートすることにより無細胞系でポリペプチド合成を行うことを含む、ポリペプチド合成方法であって、該緩衝液が、該合成反応液のポリペプチド合成能を維持するための物質を含むが、ＧＴＰを含まない水溶液であることを特徴とする方法。
（１１）  ポリペプチド合成能を有する細胞抽出液が、ＧＴＰ再生系を有する細胞抽出液である、（１）および（３）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）  ポリペプチド合成能を有する細胞抽出液が、ヌクレオチドジフォスフェートキナーゼを含む細胞抽出液である、（１）および（３）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）  少なくとも、ポリペプチド合成能を有する細胞抽出液、およびＧＴＰを含まない緩衝液を含む、（４）〜（１２）のいずれかに記載の方法によりポリペプチド合成を行うための試薬キット。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明の方法によるＧＦＰ蛋白質合成の結果を示す図である。図中、縦軸は合成反応液１ｍｌあたりに含まれるＧＦＰの蛍光強度を示し、横軸は各合成反応液と緩衝液中の平均ＧＴＰ濃度を示す。従来法の合成反応液（２５０μＭＧＴＰ含む）を用いた合成反応より、ＧＴＰを添加しない合成反応液およびＧＴＰを含まない緩衝液を用いた合成反応により多くのＧＦＰ蛋白質が合成された。
図２は、本発明の方法によるＰＴＰ１ｂ蛋白質合成の結果を示す図である。図中、縦軸は合成反応液１ｍｌあたりに含まれるＰＴＰ１ＢのｐＮＰＰ脱リン酸化活性を４０５ｎｍの波長で測定した結果を示し、横軸は各合成反応液および緩衝液中の平均ＧＴＰ濃度を示す。従来法の合成反応液（２５０μＭＧＴＰ含む）を用いた合成反応より、ＧＴＰを添加しない合成反応液およびＧＴＰを含まない緩衝液を用いた合成反応により多くのＰＴＰ１Ｂ蛋白質が合成された。
図３は、ＧＴＰを含まない緩衝液を用いたときの合成反応液中のＧＴＰ濃度がＧＦＰ蛋白質合成量へ与える影響を示す図である。図中、縦軸は合成反応液１ｍｌあたりに含まれるＧＦＰの蛍光強度を示し、横軸は各合成反応液のＧＴＰ濃度を示す。３ｍＭ以上のＧＴＰを含む合成反応液では合成が阻害された。
図４は、ＧＴＰを含まない緩衝液を用いたときの合成反応液中のＧＴＰ濃度がＰＴＰ１Ｂ蛋白質合成量へ与える影響を示す図であるである。図中、縦軸はポリペプチド合成反応液１ｍｌあたりに含まれるＰＴＰ１ＢのｐＮＰＰ脱リン酸化活性を４０５ｎｍの波長で測定した結果を示し、横軸は各合成反応液のＧＴＰ濃度を示す。３ｍＭ以上のＧＴＰを含む合成反応液では合成が阻害された。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明の実施の形態をさらに詳細に説明する。
本発明のポリペプチド合成方法は、少なくとも、ポリペプチド合成能を有する細胞抽出液、鋳型核酸、および基質アミノ酸を含むが、ＧＴＰが添加されていない合成反応液を反応容器中でインキュベートすることにより無細胞系でポリペプチド合成を行う方法である。上記において、好ましくは、合成反応液を緩衝液と接触させながらインキュベートすることによりポリペプチド合成を行うことができ、該緩衝液は、該合成反応液のポリペプチド合成能を維持するための物質を含むが、ＧＴＰを含まない水溶液である。別の態様によれば、本発明のポリペプチド合成方法は、少なくとも、ポリペプチド合成能を有する細胞抽出液、鋳型核酸、基質アミノ酸、および３ｍＭ以下のＧＴＰを含む合成反応液を反応容器中で緩衝液と接触させながらインキュベートすることにより無細胞系でポリペプチド合成を行う方法であって、該緩衝液は、該合成反応液のポリペプチド合成能を維持するための物質を含むが、ＧＴＰを含まない水溶液である。
本発明は、ポリペプチド合成反応液にＧＴＰを添加しないでポリペプチド合成反応を行う点、また、合成反応液を緩衝液と接触させる場合には、該ポリペプチド合成反応液中のＧＴＰ濃度を３ｍＭ以下とし、緩衝液にＧＴＰを含まないものを用いてポリペプチド合成を行う点、さらに合成反応液あるいは緩衝液にＡＴＰも添加しない点に特徴を有するものである。これにより、合成反応系において不必要な成分を添加しないことにより、低コストで、高効率の無細胞ポリペプチド合成が可能となる。
（１）ポリペプチド合成反応液
本発明において、「ポリペプチド合成反応液」または「合成反応液」とは、ポリペプチド合成能を有する細胞抽出液、鋳型核酸、および基質アミノ酸を少なくとも含むが、ＧＴＰが添加されていないもので、無細胞系ポリペプチド合成に用いられるものを意味する。即ち、生細胞を用いずにｍＲＮＡを翻訳鋳型として目的ポリペプチドを合成する能力を有する水溶液であって、ＧＴＰが添加されていないものであれば如何なるものであってもよい。また上記の水溶液で、ＡＴＰとその再生に必要な成分が外から添加されていないものも本発明のポリペプチド合成反応液として用いることができる。
「ポリペプチド合成能を有する細胞抽出液」は、無細胞系ポリペプチド合成法に用いられ得る、ポリペプチド合成に必要な成分を細胞から抽出した抽出物を含有する水溶液を意味する。具体的には、例えば、大腸菌、植物種子の胚芽、ウサギ網状赤血球等の細胞抽出液等が挙げられる。これらの細胞抽出液は、市販のものを用いることができるし、それ自体既知の方法、例えば、大腸菌の場合は、Ｐｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ，１７９−２０９，Ｂ．Ｄ．＆Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４）等に記載の方法を用いて調製したものでもよい。
市販の細胞抽出液として、例えば大腸菌由来のものは、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｓ３０ｅｘｔｒａｃｔ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ＲＴＳ  ５００  Ｒａｐｉｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ等を挙げことができる。ウサギ網状赤血球由来のものは、Ｒａｂｂｉｔ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等、さらにコムギ胚芽由来のものは、ＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（ＴＯＹＯＢＯ社製）等を挙げることができる。本発明においては、コムギ胚芽の細胞抽出液が好ましく、さらには、ＷＯ０３／０６４６７１号公報に記載の方法により調製されたコムギ胚芽の細胞抽出液が特に好ましく用いられる。これらの細胞抽出液中には、ＧＴＰやＡＴＰが含まれているので、本発明の方法に用いるためには、これらをゲルろ過などの方法で除去したものが用いられる。また、これらの細胞抽出液からリボソーム画分を分離・精製したものを再構成したものも用いることもできる。
また、本発明で用いるポリペプチド合成能を有する細胞抽出液は、ＧＴＰ再生系を有する細胞抽出液であることが好ましい。本明細書の実施例５の結果から、小麦胚芽抽出液を用いた合成反応液中ではＧＤＰ及びＧＭＰを使用して、ＧＴＰが再生される可能性が示され、このことがＧＴＰ非添加状態下での連続の無細胞系ポリペプチド合成を可能にしていると考えられる。またＧＴＰの再生系としては、ＡＴＰを利用したヌクレオチドジフォスフェートキナーゼ（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ）作用機構などが挙げられる。
「鋳型核酸」とは、目的ポリペプチドをコードする配列（ＯＲＦ）を有し、ＯＲＦの上流に、プロモーター配列、翻訳活性増強配列等を有し、下流には停止配列とｍＲＮＡの安定性のための非翻訳領域を含むＤＮＡ、それを転写したｍＲＮＡを意味する。ＯＲＦとしては、目的ポリペプチドの精製等に用いられるタグとの融合ポリペプチドをコードする配列を用いることもできる。また、プロモーター配列は、ポリペプチド合成に用いる細胞抽出液、また転写に用いるＲＮＡ合成酵素（ＲＮＡポリメラーゼ）により適宜選択することができる。具体的には、転写にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いる場合には、Ｔ７プロモーターを用い、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いる場合には、ＳＰ６プロモーターを用いることができる。翻訳活性増強配列として、真核生物においては、例えば５’キャップ構造（Ｓｈａｔｋｉｎ，Ｃｅｌｌ，９，６４５−（１９７６））、コザック配列（Ｋｏｚａｋ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１２，８５７−（１９８４））等があり、また原核生物においては、例えばシャインダルガーノ配列等が知られている。更にはＲＮＡウィルスの５’−非翻訳リーダー配列にも翻訳促進活性があることが見出されており（特許第２８１４４３３号公報）、これらの配列を用いることもできる（特開平１０−１４６１９７号公報）。
「基質アミノ酸」とは、本発明のポリペプチド合成法において、ポリペプチドを形成するアミノ酸として用いられ得るものであればいかなるものでもよい。具体的には、２０種類のＬ−アミノ酸が挙げられる。これら基本アミノ酸以外に、例えば１３Ｃ又は１５Ｎのシングルラベルのアミノ酸、１３Ｃ、１５Ｎおよび２Ｈの３種類核種から選ばれる２つずつの組み合わせのダブルラベルのアミノ酸、１３Ｃ、１５Ｎおよび２Ｈのトリプルラベルのアミノ酸、３Ｈ（放射性）ラベルのアミノ酸、１４Ｃ（放射性）ラベルのアミノ酸、３５Ｓ（放射性）ラベルのアミノ酸（メチオニン、システイン）、蛍光物質の付いたアミノ酸、例えばＢＯＤＩＰＹ結合リジン、硫黄原子がセレン原子で置換されたアミノ酸、例えばセレノメチオニン等が挙げられる。特にこれらのラベルアミノ酸（非天然アミノ酸）は、ポリペプチドの構造解析や機能解析に重要な役割を有するものであり、特に高価な物質である。
基質アミノ酸の合成反応液中の内在量は、下限が通常０．０１ｍＭ以上、より好ましくは０．３ｍＭ以上、上限が通常１０ｍＭ以下、好ましくは５ｍＭ以下である。濃度範囲はこれら上限と下限の組み合わせで特定される範囲であればよいが、好ましくは１〜５ｍＭ、より好ましくは１．２５〜４ｍＭの範囲が適当である。
本発明で用いる合成反応液には、上記以外にも以下の構成成分が添加されることが好ましい。
ＡＴＰは１．０〜１．５ｍＭ以下の濃度となるように添加されることが好ましいが、添加しないものも用いることができる。また、ＡＴＰの再生系として、例えばクレアチンリン酸とクレアチンキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼ等が添加されることも好ましい。これらの合成反応液中の内在量は、ＡＴＰの再生系が機能し得る濃度であれば特に限定されないが、例えばクレアチンリン酸が１００ｍＭ以下、好ましくは１０〜５０ｍＭ、さらに好ましくは１６〜２８ｍＭ、クレアチンキナーゼが０．００１〜５μｇ／μｌ、好ましくは０．０１〜１μｇ／μｌ、さらに好ましくは０．０４〜０．４μｇ／μｌ、ホスホエノールピルビン酸が１〜２０ｍＭ、ピルビン酸キナーゼが０．０１〜１μｇ／μｌ程度が適当である。
転移ＲＮＡ（ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＲＮＡ）としては、それ自体既知の基質アミノ酸に対応する転移ＲＮＡが用いられる。反応液中の転移ＲＮＡの内在量としては、ポリペプチド合成反応が起こり得る濃度添加することもできる。転移ＲＮＡは、Ｍｏｎｉｔｅｒ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，４３，１（１９６０）等に記載の方法により取得することができるし、市販のものを用いることもできる。なお、上記ＷＯ０３／０６４６７１号公報に記載の方法により調製されたコムギ胚芽の細胞抽出液を用いる場合は、合成反応に必要な転移ＲＮＡが抽出液に含まれており、特に反応液に添加しなくともよい。
金属イオン類、少なくともマグネシウムイオンが含有されることも好ましく、さらにカリウムイオンが含まれることも好ましい。マグネシウムイオンの内在量は、通常１〜１０ｍＭ、好ましくは２〜３ｍＭ程度、カリウムイオンの内在量は、通常１０〜３００ｍＭ、好ましくは６０〜１５０ｍＭ程度が適当である。これらイオン類の内在量は、酢酸マグネシウム、酢酸カリウムを添加することにより調整することができる。
合成反応液中には、さらに核酸分解酵素阻害剤、還元剤、核酸安定化剤、３’，５’−ｃＡＭＰ、葉酸塩、抗菌剤等が内在していてもよい。核酸分解酵素阻害剤としては、０．３〜３Ｕ／μｌのリボヌクレアーゼインヒビターや、０．３〜３Ｕ／μｌのヌクレアーゼインヒビター等が挙げられる。このうち、リボヌクレアーゼインヒビターとしては、例えばヒト胎盤由来のＲＮａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＴＯＹＯＢＯ社製等）等が用いられる。還元剤としては、０．１〜３ｍＭのジチオスレイトール等が挙げられる。核酸安定化剤としては、０．３〜０．５ｍＭスペルミジン等が用いられる。３’，５’−ｃＡＭＰの濃度は０．１〜２４ｍＭ程度が適当である。抗菌剤としては、０．００１〜０．０１％のアジ化ナトリウム、又は０．１〜０．２ｍｇ／ｍｌのアンピシリン等が挙げられる。これらの物質は、目的ポリペプチドの種類や用いる反応系に応じて成分や濃度を適宜選択して反応液に内在させればよい。
また、合成反応液を鋳型核酸の転写・翻訳用または翻訳用のいずれにも用いることができる。合成反応液を転写・翻訳用とする場合は、合成反応液にはＲＮＡポリメラーゼを内在させる必要がある。ＲＮＡポリメラーゼとしては、鋳型核酸に含まれるプロモーターに適したものが用いられる、具体的には、例えばＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼやＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ等を用いることができる。これらの内在量は、それ自体既知であり、適宜選択して合成反応液を調製すればよい。
合成反応液のｐＨは、本発明のポリペプチド合成反応が起こり得る範囲であれば特に限定されないが、通常ｐＨ６．８〜７．６の範囲が適当である。ｐＨの調整に用いる緩衝剤は特に限定されないが、通常、１５〜３５ｍＭ程度のＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ、あるいは１０〜５０ｍＭ程度のＴｒｉｓ−酢酸等が挙げられる。
上記合成反応液の調製に用いる成分及び試薬は、それ自体既知であり、市販品を購入するか、または通常用いられる方法により調製することができる。なお、上記各成分の濃度（内在量）は、反応液中の初期濃度である。
（２）緩衝液
本発明において「緩衝液」は、上記ポリペプチド合成反応液と接触させて、合成反応液をインキュベートすることにより、合成反応液のポリペプチド合成能の維持に用いられるものである。該緩衝液は、合成反応液のポリペプチド合成能を維持するための物質を含むが、ＧＴＰを含まない水溶液である。さらに、ＡＴＰとその再生系を含まないものも、本発明の方法において緩衝液として用いることができる。本明細書において「ポリペプチド合成能の維持」とは、合成反応時間を延長（持続）させて反応効率を高めることを意味する。「合成反応液のポリペプチド合成能を維持するための物質」とは、たとえば、基質アミノ酸、ＡＴＰ、クレアチンキナーゼなど、ポリペプチド合成により消費される物質、またはそれを再生させる物質が挙げられる。また、該緩衝液には、少なくともマグネシウムイオンを含むことが好ましく、またｐＨは６．８〜７．６の範囲内が好ましい。ｐＨの調整に用いられる緩衝剤は、通常上記した１５〜３５ｍＭ程度のＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ、あるいは１０〜５０ｍＭ程度のＴｒｉｓ−酢酸等を用いればよい。マグネシウムやカリウム等の金属イオン源としては、上記酢酸マグネシウム、酢酸カリウム等を用いればよい。これら成分の濃度は、上記反応液と同様である。
該緩衝液には、更に核酸分解酵素阻害剤、還元剤、核酸安定化剤、３’，５’−ｃＡＭＰ、葉酸塩、抗菌剤等を含んでいてもよい。これら成分の具体例、濃度等も上記反応液と同様である。
（３）無細胞系ポリペプチド合成方法
本発明の無細胞系ポリペプチド合成方法は、ポリペプチド合成反応液のみで行う方法と、ポリペプチド合成反応液と緩衝液を接触させて行う方法のいずれも用いられる。ポリペプチド合成反応液のみで行う場合、上記のポリペプチド合成反応液を適当な反応容器に投入し、適度な温度でインキュベートすることによりポリペプチドが合成される。ポリペプチド合成の反応温度、及び時間は用いるポリペプチド合成系において適宜選択されるが、コムギ胚芽抽出液を用いた系においては、通常１０〜４０℃で、好ましくは８〜３０℃、さらに好ましくは２０〜２６℃で、通常１０分〜５時間、好ましくは３０分〜３時間行うことができる。大腸菌抽出物を用いた系では通常３０〜３７℃、好ましくは３０℃程度が適当である。
ポリペプチド合成反応液と緩衝液とを接触させてポリペプチド合成を行う場合、反応液と緩衝液との接触は、両者が接触時に混合しない方法であれば如何なる方法であってもよい。本発明において、反応液と緩衝液との接触は、膜を介して行ってもよいし、界面を有して行ってもよい。これにより、反応液中でポリペプチド合成反応により生成されるＡＭＰ、ＧＤＰ、ピロリン酸、無機リン酸塩等の低分子副産物・分解物を、分子拡散により緩衝液中に排出させることができる。その結果、合成反応が維持され、ポリペプチド合成反応時間を延長（持続）させることができる。
ポリペプチド合成は反応容器中で行うことができる。反応容器とは、本発明のポリペプチド合成方法が行われるものであればいかなるものであってもよい。ただし、上記方法によりポリペプチド合成反応を長時間わたって維持することができるので、反応容器は、ポリペプチド合成反応中に合成反応液が蒸発して濃縮されないように密閉手段を有するものが好ましい。
反応容器に入れられる合成反応液量としては、特に制限はないが、通常１０μｌ〜５０ｍｌ、好ましくは５０μｌ〜１０ｍｌ程度である。合成反応液に接触させる緩衝液の容量は、接触させる条件により異なり、各条件におけるポリペプチド合成能の維持に充分な量であれば特に制限されないが、通常、外液の量は内液の量の１０〜５０倍程度が適当である。
膜を介して反応液と緩衝液とを接触させる場合、使用される膜としては、高分子物質と低分子物資とが分離できるものであれば、如何なる材質の膜でもよい。具体的には、例えば透析膜、限外濾過膜、セラミック膜、半透膜、中空子膜等が挙げられる。反応により生成する低分子副産物・分解物を透過させ、かつ生成物である目的ポリペプチドやポリペプチド合成に必要なリボソーム、鋳型核酸、基質エネルギー再生系等の高分子物質を透過させないためには、分子量限界が１００，０００Ｄａ以下、好ましくは１，０００〜６０，０００Ｄａ、さらに好ましくは３，０００〜２０，０００Ｄａ程度の膜を用いるのが適当である。膜を介して内液と外液とを接触させる方法は、例えば特開平１０−８０２９５号公報等に記載されている方法、あるいは透析法（木川等、第２１回日本分子生物学会、ＷＩＤ６）と呼ばれる方法に準じて行うことができる。
これらの膜の中で、透析膜を用いるのが特に好ましい。透析膜を用いる場合、緩衝液の量は合成反応液の量の最低で１０倍程度、最高で５０倍程度である。この場合、透析膜が付加されている適当な透析容器に反応液を入れて反応内液とし、それを緩衝液に浸漬させることにより、反応液と緩衝液とを接触させることができる。緩衝液は、必要量を一度に接触させてもよいし、また必要に応じて逐次交換して接触させてもよい。透析容器としては、底部に透析膜が付加されている容器（第一化学社製：透析カップ１２，０００等）や、透析用チューブ（三光純薬社製：１２，０００等）が挙げられる。透析膜は、１０，０００ダルトン以上の分子量限界を有するものが用いられるが、１２，０００ダルトン程度の分子量限界を有するものが好ましい。
ポリペプチド合成反応液と緩衝液とは、上記のように膜を介することなく、界面を有して直接接触させてもよい（以下これを「重層法」と称することがある）。重層法は、ＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ  Ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｃｏｒｅ  ｋｉｔ取扱説明書（ＴＯＹＯＢＯ社製）、ＷＯ０２／２４９３９号公報の記載に準じて次の通り行うことができる。
重層法を用いてポリペプチド合成を行う場合には、合成反応液を適当な容器に入れ、該反応液上に、上記緩衝液を、界面を乱さないように重層することによりポリペプチド合成を行う。具体的には、例えば、鋳型核酸を除いた上記合成反応液を必要に応じて適当時間プレインキュベートした後、鋳型核酸を添加して、適当な容器に入れ反応相とする。容器としては、例えばマイクロタイタープレート等が挙げられる。この反応相の上層に上記緩衝液を、界面を乱さないように重層して反応を行う。
両相の界面は必ずしも重層によって水平面状に形成させる必要はなく、両相を含む混合液を遠心分離することによって、水平面を形成することも可能である。両相の円形界面の直径が７ｍｍの場合、反応相と緩衝液相の容量比は、好ましくは１：４〜１：８、特に好ましくは１：５程度が適当である。両相からなる界面面積は大きいほど拡散による物質交換率が高く、ポリペプチド合成効率が上昇する。従って、両相の容量比は、両相の界面面積によって変化する。合成反応は静置条件下で、反応温度および時間は用いるポリペプチド合成系において適宜選択される。
さらに、合成反応液と緩衝液との接触は、緩衝液と接触させずにポリペプチド合成を行い、合成反応が停止した時点で、該反応液を、上記緩衝液を含むゲルに供給し、合成物や低分子副産物・分解物を排出することによりポリペプチド合成を行う方法（特開２０００−３３３６７３号公報：以下これを「不連続ゲルろ過法」と称することがある）で行うこともできる。具体的には、例えば、鋳型核酸を除いた上記反応液を必要に応じて適当時間プレインキュベートした後、鋳型核酸を添加して、適当な容器に入れ反応を行う。容器としては、例えばマイクロプレート等が挙げられる。
ポリペプチド合成の反応温度、及び時間は用いるポリペプチド合成系において適宜選択されるが、リボソームとしてコムギ胚芽抽出物を用いた系においては、通常１０〜４０℃で、好ましくは１８〜３０℃、さらに好ましくは２０〜２６℃で、通常１０分〜１２日間、好ましくは１０〜４８時間行うことができる。大腸菌抽出物を用いた系では通常３０〜３７℃、好ましくは３０℃程度が適当である。
合成反応液と緩衝液を接触させる他の方法として、緩衝液はゲルまたはゾルに含ませて反応液と接触させる方法も挙げられる。この場合、上記膜を介して両者を接触させてもよいし、界面を有するように直接接触させてもよい。反応容器中で、上記緩衝液が含まれるゲルまたはゾルと反応液とを界面を有して接触させる方法としては、上記の通り反応液中の低分子副産物・分解物が緩衝液へ拡散するに十分な接触面を有する方法であれば特に制限はない。ゲルとしてアガロースゲルを用い、該アガロースゲルを緩衝液で固化させて調製した場合、このアガロースゲルの上に反応液を載せる方法が好ましい。また、緩衝液に浸漬するように調製したアガロースゲルの場合には、反応容器に反応液とアガロースゲルを投入する方法が用いられる。このとき、投入する順番は特に制限はないが、アガロースゲルを投入した後に反応液を投入すれば、アガロースゲルの投入の際に反応液の飛散等を考慮に入れずに操作することができる。上記の通り、反応液とゲルおよびゾルとを接触させる方法の具体例としては、反応液をゾルまたはゲルの表面に重層する方法、反応液に固形ゲルを投入する方法、ゾルまたはゲルの表面に界面を有して接触させる方法などが挙げられる。
さらに、ゾルの１例としてゲルろ過剤を用いた場合については、該反応容器に上記緩衝液で平衡化したゲルろ過剤を充填した後に、この上部に反応液を重層する方法が好ましい。
本発明で用いられるゲルまたはゾルとは、上記緩衝液をそのマトリックス及び排除容積の両方に含有でき、これと界面を有して接触させた反応液との間で、少なくとも緩衝液および低分子副産物・分解物等が自由拡散し得るものであれば如何なるものであってもよい。具体的には、高分子物質を構成要素とするものが挙げられる。ゲルとは、構成要素が独立した流動性を失って、集合して固化した状態のものをいい、ゾルとは、構成要素が液体中に分散して流動性を示す状態のものをいう。本発明で用いられるゲルの好ましい例としては、アガロース、またはアクリルアミド等を構成要素とするもの等が挙げられる。また、ゾルの好ましい例としては、ゲルろ過剤、アフィニティゲル剤、磁性ビーズ等を構成要素とするもの等が挙げられる。また、マトリックスとは、ゲルまたはゾルが占める空間のうち、ゲルまたはゾルの構成分子が占める空間を意味する。更に、排除容積とは、ゲルまたはゾルが占める空間のうち、マトリックス以外の空間を意味する。
緩衝液を含むゲルまたはゾルの調製方法としては、上記の性質を有し、かつそのマトリックス及び排除容積の両方に無細胞ポリペプチド合成反応を行うに充分な量の緩衝液が含有される方法であれば特に制限はない。
かくして得られたポリペプチドは、それ自体既知の方法により確認することができる。具体的には、例えばアミノ酸のポリペプチドへの取りこみ測定や、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による分離とクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）による染色、オートラジオグラフィー法（Ｅｎｄｏ，Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２５，２２１−２３０（１９９２）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９７，  ５５９−５６４（２０００））等を用いることができる。また、培養後の合成反応液には、目的ポリペプチドが高濃度に含まれているので、透析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲルろ過等のそれ自体既知の分離、精製法により、該合成反応液から目的ポリペプチドを容易に取得することができる。
（４）ＧＴＰを含まない緩衝液を用いる無細胞系ポリペプチド合成方法
本発明ではさらに、少なくとも、ポリペプチド合成能を有する細胞抽出液、鋳型核酸、基質アミノ酸、および３ｍＭ以下のＧＴＰを含む合成反応液を反応容器中で緩衝液と接触させながらインキュベートすることにより無細胞系でポリペプチド合成を行うことを含む、ポリペプチド合成方法であって、該緩衝液が、該合成反応液のポリペプチド合成能を維持するための物質を含むが、ＧＴＰを含まない水溶液であることを特徴とする方法が提供される。
「ポリペプチド合成反応液」は、３ｍＭ以下のＧＴＰを含むこと以外は上記と同様のものが用いられる。ＧＴＰは合成反応液の初期濃度として好ましくは３ｍＭ以下、さらに好ましくは２．５ｍＭ以下の濃度となるように添加することが適当である。「緩衝液」の上記と同様のものが用いられ、「合成反応方法」も上記と同様にして行うことができる。
（５）試薬キット
本発明の試薬キットは、少なくとも、ポリペプチド合成能を有する細胞抽出液、およびＧＴＰを含まない緩衝液を含む。ポリペプチド合成能を有する細胞抽出液としては、例えば、ＧＴＰを除去する工程により調製された細胞抽出液を用いてもよい。該キットには、他に、無細胞ポリペプチド合成反応のための試薬、上記した反応液を作製するために必要な成分、ＲＮＡポリメラーゼ、陽性コントロール用鋳型核酸、鋳型核酸を作製するためのベクター、バッファー類、反応容器等が含まれるが、これら全てを含む必要はなく、本発明の方法に用い得るキットであれば如何なる試薬および容器の組み合わせであってもよい。
【実施例】  以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものではない。なお、以下の実施例において、特に明記しない限り、ｍｉｎは分、ｌはリットル、ｍｌはミリリットル、Ｍはモル／リットル、ｍＭはミリモル／リットル、μｇはマイクログラムをそれぞれ表す。
実施例１  小麦胚芽抽出液の調製（ワーリングブレンダーによる微粉砕抽出）
北海道産のチホク小麦（未消毒）を用い、ＷＯ０２／２９５３７７号公報の実施例に記載の方法に準じて、胚芽を分離し、胚芽の純度（任意のサンプル１ｇ当たりに含まれる胚芽の重量割合）が９８％以上になるまで選別した。得られた小麦胚芽５０ｇを、４℃の蒸留水中に懸濁し、超音波洗浄器を用いて洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄した。次に、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０の０．５容量％溶液に懸濁し、超音波洗浄器を用いて洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄して胚乳分を除去した小麦胚芽を得た。
次いで、以下の操作を４℃で行い、小麦胚芽抽出液を得た。まず、洗浄した小麦胚芽を抽出Ｂｕｆｆｅｒ（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）８０ｍＭ、酢酸カリウム２００ｍＭ、酢酸マグネシウム１０ｍＭ、塩化カルシウム４ｍＭ、Ｌ型アミノ酸２０種類各０．６ｍＭ及びジチオスレイトール８ｍＭ）１００ｍｌとともにワーリングブレンダーに入れ、回転数５０００〜２００００ｒｐｍで３０秒間粉砕した。ブレンダー内壁に付着した胚芽等をかき落とした後再び５０００乃至２００００ｒｐｍで３０秒間粉砕する作業を２回行った。得られた胚芽粉砕物の粒径分布を、レーザー散乱方式粒度分布装置（堀場製作所製ＬＡ−９２０）を用いて測定した。
得られた抽出液と粉砕胚芽の混合物を遠心管に移し３００００ｇ、３０分間で遠心分離し上清を採取した。これをさらに３００００ｇ、３０分間で遠心分離し上清を採取する操作を５回繰り返した。これをあらかじめＢｕｆｆｅｒ（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）４０ｍＭ、酢酸カリウム１００ｍＭ、酢酸マグネシウム５ｍＭ及びジチオスレイトール４ｍＭ、各２０種アミノ酸濃度が０．３ｍＭ）で平衡化しておいたセファデックスＧ−２５カラムでゲルろ過を行った。得られた液を３００００ｇ、１２分間で遠心分離し上清を採取し、限外ろ過膜を使用して濃縮を行った。これを小麦胚芽抽出液（リボソーム画分）とした。試料の濃度は、２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が１８０〜２５０（Ａ２６０／Ａ２８０＝１．５程度）になるように調製した。
実施例２  ｍＲＮＡ溶液の調製
（１）鋳型プラスミドの作製
ＳＰ６プロモーター配列およびリボソーム結合配列を５’→３’の順に含むオリゴＤＮＡ（配列番号１）を化学合成により取得した。
ポリペプチド合成用ベクターであるｐＥＵ３ｂ（Ｓａｗａｓａｋｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９（２３），１４６５２−１４６５７（２００２））からＳＰ６プロモーター配列、Ω配列およびマルチクローニングサイトを除去して、ＮａｅＩで切断し、上記で取得した配列番号１で示されるＤＮＡ断片とライゲーションを行った。このプラスミドをｐＥＵｂｌｕｎｔとした。
緑色蛍光ポリペプチド（ＧＦＰ）をコードするＤＮＡ配列が含まれるプラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ−ｐＣａＭＶ３５Ｓ−ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）−ＮＯＳ３’（２５）、Ｈａａｓ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，６（３），３１５−３２４（１９９６））を鋳型として、配列番号２および３に記載の塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡ断片をＳｆｉＩで切断し、ｐＥＵｂｌｕｎｔをＳｍａＩおよびＳｆｉＩで切断したものとライゲーションを行った。得られたプラスミドをＧＦＰ／ｐＥＵとした。
また、ＰＴＰ１Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＣ０１５６６０）鋳型として、配列番号４および５に記載の塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡ断片をＳｆｉＩで切断し、ｐＥＵｂｌｕｎｔをＳｍａＩおよびＳｆｉＩで切断したものとライゲーションを行った。得られたプラスミドをＰＴＰ１Ｂ／ｐＥＵとした。
（２）ｍＲＮＡ溶液の調製
上記（１）で調製したＧＦＰ／ｐＥＵおよびＰＴＰ１Ｂ／ｐＥＵを鋳型として、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて転写を行い、得られたＲＮＡをエタノール沈殿により定法に従い精製して用いた。精製を行ったｍＲＮＡを３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．４ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８０ｍＭスペルミジンに溶解させ、ｍＲＮＡ溶液とした。
実施例３  合成反応液の調製
（１）合成前の反応液の調製
実施例１で調製した小麦胚芽細胞抽出液を、２６０ｎｍの波長での吸光度が７５Ａｂｓ濃度とし、合成反応液を調製した。合成反応液の組成は、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．４ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８ｍＭスペルミジン、各２０種アミノ酸濃度が０．３ｍＭで、ＧＴＰ濃度は、０、１．５、１５、３７．５、７５、３７５μＭになるように６種類調製した。次に、上記で調製した溶液：４０μｌと、実施例２で調製したｍＲＮＡ溶液：２０μｌとを混合した。調製された合成反応液の最終ＧＴＰ濃度は、各々０μＭ、１μＭ（１．９６ｎＭ）、１０μＭ（０．１９６μＭ）、２５μＭ（０．４９μＭ）、５０μＭ（０．９８μＭ）、２５０μＭ（２５０μＭ）となる。カッコ内は、緩衝液と反応液とをあわせた平均濃度を示す。
（２）合成反応
上記で調製した合成反応液：６０μｌを、透析カップ（第一化学社製）中に入れ、ＧＴＰ非添加緩衝液１（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．３８ｍＭスペルミジン、各２０種アミノ酸濃度が０．３ｍＭ）：３ｍｌを透析外液とし２６℃の条件で２２時間および４６時間合成反応を行った。
又、コントロールとして、従来法と同様に合成反応液中のＧＴＰ濃度および透析を行う緩衝液中のＧＴＰ濃度がともに２５０μＭとして上記と同様に合成反応を行った。これらの反応後の合成反応液に含まれるＧＦＰの蛍光強度を測定した。この結果を図１に示す。Ｘ軸は各合成系の合成反応液と緩衝液の平均ＧＴＰ濃度を示す。Ｙ軸は合成反応液１ｍｌあたりに含まれるＧＦＰの蛍光強度を示す。
また、実施例２で調製したＰＴＰ１Ｂを含むｍＲＮＡを用いて、上記のように合成反応を行い、合成反応液１ｍｌあたりに含まれるＰＴＰ１ＢのｐＮＰＰ脱リン酸化活性を４０５ｎｍの波長で測定した。この結果を図２に示す。図中、Ｘ軸は各合成系の合成反応液と緩衝液の平均ＧＴＰ濃度を示し、Ｙ軸は合成反応液１ｍｌあたりに含まれるＰＴＰ１ＢのｐＮＰＰ脱リン酸化活性を４０５ｎｍの波長で測定した値を示す。ｐＮＰＰ脱リン酸化活性測定は、ＮｉｃｈｏｌａｓＫ．Ｔｏｎｋｓらの論文（Ｔｈｅ  Ｊｏｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ，２６３，Ｎｏ．１４，Ｉｓｓｕｅ  ｏｆ  Ｍａｙ  １５，ｐｐ．６７３１−６７３７，１９８８）に記載の方法を用いた。
図１および２から明らかな通り、いずれのポリペプチドにおいても、合成反応液および緩衝液中のＧＴＰ濃度が平均して０．９８μＭ以下の全ての濃度で、該反応系で十分量のポリペプチドが合成され、さらに、合成反応液にも緩衝液にもＧＴＰを添加しない系においても従来法を上回る量のポリペプチドが合成されることが判った。
実施例４  ＧＴＰ濃度の検討
（１）合成前の反応液の調製
実施例１で調製した小麦胚芽抽出液を、２６０ｎｍの波長での吸光度が７５Ａｂｓの条件で、組成が３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．４ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８ｍＭスペルミジン、各２０種アミノ酸濃度が０．３ｍＭ、ＧＴＰ濃度が、０、７８μＭ、２６５．５μＭ、４５３μＭ、１．０１５ｍＭ、１．９５３ｍＭ、３．８２８ｍＭ、７．５７８ｍＭ、１５．０８ｍＭになるように調製した。
実施例１で調製した小麦胚芽細胞抽出液を、２６０ｎｍの波長での吸光度が７５Ａｂｓ濃度とし、合成反応液を調製した。合成反応液の組成は、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．４ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８ｍＭスペルミジン、各２０種アミノ酸濃度が０．３ｍＭで、ＧＴＰ濃度は、０、７８μＭ、２６５．５μＭ、４５３μＭ、１．０１５ｍＭ、１．９５３ｍＭ、３．８２８ｍＭ、７．５７８ｍＭ、１５．０８ｍＭになるように９種類調製した。上記で調製した合成反応液：４０μｌと実施例２で調製したｍＲＮＡ溶液：２０μｌとを混合した。調製されたポリペプチド合成反応液に添加したＧＴＰの最終濃度は、各々０、５２μＭ、１７７μＭ、３０２μＭ、６７７μＭ、１．３０２ｍＭ、２．５５２ｍＭ、５．０５２ｍＭ、１０．０５２ｍＭとなる。
（２）合成反応
上記で調製した合成反応液：６０μｌを透析カップ（第一化学社製）中に入れ、ＧＴＰ非添加緩衝液１（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．３８ｍＭスペルミジン、各２０種アミノ酸濃度が０．３ｍＭ）：３ｍｌを透析外液とし２６℃の条件で２２時間および４６時間合成反応を行った。
又、コントロールとして、従来法と同様に合成反応液中のＧＴＰ濃度および透析を行う干渉液中のＧＴＰ濃度がともに２５０μＭとして上記と同様に合成反応を行った。反応後、これらの反応液に含まれるＧＦＰの蛍光強度を測定した。この結果を図３に示す。Ｘ軸は各合成系の合成反応液に添加したＧＴＰ濃度を示す。Ｙ軸は合成反応液１ｍｌあたりに含まれるＧＦＰの蛍光強度を示す。また、実施例２で調製したＰＴＰ１Ｂを含むｍＲＮＡを用いて、上記のように合成反応を行い、合成反応液１ｍｌあたりに含まれるＰＴＰ１ＢのｐＮＰＰ脱リン酸化活性を４０５ｎｍの波長で測定した。この結果を図４に示す。図中、Ｘ軸は各合成系の合成反応液と緩衝液の平均ＧＴＰ濃度を示し、Ｙ軸は合成反応液１ｍｌあたりに含まれるＰＴＰ１ＢのｐＮＰＰ脱リン酸化活性を４０５ｎｍの波長で測定した値を示す。ｐＮＰＰ脱リン酸化活性測定は、ＮｉｃｈｏｌａｓＫ．Ｔｏｎｋｓらの論文（Ｔｈｅ  Ｊｏｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ，２６３，Ｎｏ．１４，Ｉｓｓｕｅ  ｏｆ  Ｍａｙ  １５，ｐｐ．６７３１−６７３７，１９８８）に記載の方法を用いた。
図３および４から明らかな通り、いずれのポリペプチドにおいても合成反応液に添加するＧＴＰ濃度が３ｍＭ以下の場合、充分量のポリペプチド合成が行われるが、これ以上の濃度にすると合成量が低下することが判った。
実施例５  小麦胚芽抽出液および合成反応液の中に含まれるＧＴＰ濃度の解析
実施例１で作製した小麦胚芽抽出液及び、実施例３（１）にて作製した合成反応液のうち、ＧＴＰを添加していないものについて、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で含有するグアノシン類の濃度を定量した。
分析方法は分析装置にＷａｔｅｒｓ２６９０，９９６ＰＤＡ検出器を用い、カラムにＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫＣ１８  ４．６×７５ｍｍ（３μｍ）を使用し、溶離液にＡ液：２０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、５ｍＭ（Ｃ４Ｈ９）４ＮＢｒとＢ液：ＣＨ３ＣＮ／２０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、５ｍＭ（Ｃ４Ｈ９）４ＮＢｒをそれぞれ６０／４０で使用し、グラジエントをかけて定量を行った。実施例１で作製した小麦胚芽抽出液はＡ液とＢ液を９５：５の比率でまぜた溶液で２倍に希釈したサンプルで測定を行った。実施例３で作製した合成反応液（ＧＴＰ添加なし）は希釈を行わず、測定を行った。調整したサンプルは０．４５μｍフィルターでろ過し、ＨＰＬＣ用測定サンプルとした。
ＨＰＬＣでの各サンプルの測定結果を表１に示す。表１に示すように、実施例１で作製した小麦胚芽抽出液中にはＧＴＰが検出されず、ＧＤＰ及びＧＭＰがそれぞれ１８，１９μＭであった。また、実施例３で作製した合成反応液（ＧＴＰ添加なし）にはＧＴＰが３５μＭ、ＧＤＰ及びＧＭＰは検出されなかった。
【表１】
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これらの結果から、小麦胚芽抽出液を用いた合成反応液中ではＧＤＰ及びＧＭＰを使用して、ＧＴＰが再生される可能性が十分考えられ、このことがＧＴＰ非添加状態下での連続の無細胞系ポリペプチド合成を可能にしている理由と考察される。またＧＴＰの再生系としてはＡＴＰを利用したｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ作用機構の可能性が最も高いと考えられる。
実施例６  小麦胚芽抽出液中に含まれるｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｍＲＮＡの同定
実施例５の結果から、実施例１で作製した小麦胚芽抽出液中に存在するｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製し、それをＢＬＡＳＴにかけることによってｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｋｉｎａｓｅが小麦胚芽抽出液中に存在するかを検討した。
ｃＤＮＡライブラリーの作製はＰｒｏｍｅｇａ社製のＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＲｉｂｏＣｌｏｎｅ  ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して行った。
その結果、小麦胚芽抽出液のｃＤＮＡライブラリーの中で、イネのｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｋｉｎａｓｅとホモロジーが高い配列を確認した。このことからもＧＴＰの再生系としてはＡＴＰを利用したｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ作用機構もっとも可能性が高いと考えられる。
【産業上の利用可能性】  本発明によれば、無細胞系ポリペプチド合成反応時に、必要以上の濃度では合成を阻害するＧＴＰやＡＴＰを必要最低限の濃度添加することにより、ポリペプチド合成反応が基質量に対して非常に高効率に行われる無細胞系ポリペプチド合成法が提供される。また、ポリペプチド合成反応にＧＴＰおよびＡＴＰを添加しないか、または使用量を最小限に押さえることができるため、簡便で高効率、かつ低コストの無細胞系ポリペプチド合成が可能となる。また、ＧＴＰを添加しない無細胞系ポリペプチド合成法によれば、従来の合成法を用いるより高い合成効率を実現することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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