(57)【要約】  より簡便な操作で測定が実施でき、安価で、視覚的に特定化学物質の検出が可能なバイオセンサーを提供する。本発明によれば、スフェロイデンモノオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子を欠損した紅色非硫黄細菌の色素変異株にセンサーベクターが導入された組換え紅色非硫黄細菌からなる、特定の化学物質を検出するためのバイオセンサーであって、前記センサーベクターが、スフェロイデンモノオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子の上流に特定の化学物質に対して特異的に応答を示す誘導性プロモーターが操作可能に連結されたセンサーベクターであることを特徴とするバイオセンサーが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
スフェロイデンモノオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子を欠損した紅色非硫黄細菌の色素変異株にセンサーベクターが導入された組換え紅色非硫黄細菌からなる、特定の化学物質を検出するためのバイオセンサーであって、前記センサーベクターが、スフェロイデンモノオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子の上流に特定の化学物質に対して特異的に応答を示す誘導性プロモーターが操作可能に連結されたセンサーベクターであることを特徴とするバイオセンサー。
【請求項２】
紅色非硫黄細菌がロドヴルム・スルフィドフィルム（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ  ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）であることを特徴とする請求項１記載のバイオセンサー。
【請求項３】
特定の化学物質がジメチルスルフィドであり、特定の化学物質に対して応答を示す誘導プロモーターがジメチルスルフィド誘導性プロモーターであることを特徴とする請求項１又は２記載のバイオセンサー。
【請求項４】
ジメチルスルフィド誘導性プロモーターが、ジメチルスルフィドデヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子のオペロンの上流域に存在するプロモーターであることを特徴とする請求項３記載のバイオセンサー。
【請求項５】
プロモーターが、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号１の塩基配列と少なくとも６０％相同な塩基配列からなりかつジメチルスルフィド誘導性プロモーター活性を有するＤＮＡであることを特徴とする請求項４記載のバイオセンサー。
【請求項６】
特定の化学物質が砒素であり、特定の化学物質に対して応答を示す誘導性プロモーターが、配列番号２９の塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号２９の塩基配列と少なくとも６０％相同な塩基配列からなりかつ砒素誘導性プロモーター活性を有するＤＮＡであることを特徴とする請求項１又は２記載のバイオセンサー。
【請求項７】
以下の工程を含むことを特徴とする、特定の化学物質を検出するためのバイオセンサーの作成方法：
スフェロイデンモノオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子を欠損した紅色非硫黄細菌の色素変異株を作成し；
プロモーターを欠いたスフェロイデンモノオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子のオープンリーディングフレームをベクター上にクローニングし；
このベクター中のスフェロイデンモノオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子の上流に、特定の化学物質に対して特異的に応答を示す誘導性プロモーターを操作可能に連結してセンサーベクターを構築し；そして
このセンサーベクターを紅色非硫黄細菌の色素変異株に導入して組換え紅色非硫黄細菌を作成する。
【請求項８】
紅色非硫黄細菌がロドヴルム・スルフィドフィルム（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ  ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）であることを特徴とする請求項７記載のバイオセンサーの作成方法。
【請求項９】
特定の化学物質がジメチルスルフィドであり、特定の化学物質に対して応答を示す誘導プロモーターがジメチルスルフィド誘導性プロモーターであることを特徴とする請求項７又は８記載のバイオセンサーの作成方法。
【請求項１０】
ジメチルスルフィド誘導性プロモーターが、ジメチルスルフィドデヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子のオペロンの上流域に存在するプロモーターであることを特徴とする請求項９記載のバイオセンサーの作成方法。
【請求項１１】
プロモーターが、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号１の塩基配列と少なくとも６０％相同な塩基配列からなりかつジメチルスルフィド誘導性プロモーター活性を有するＤＮＡであることを特徴とする請求項１０記載のバイオセンサーの作成方法。
【請求項１２】
特定の化学物質が砒素であり、特定の化学物質に対して応答を示す誘導性プロモーターが、配列番号２９の塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号２９の塩基配列と少なくとも６０％相同な塩基配列からなりかつ砒素誘導性プロモーター活性を有するＤＮＡであることを特徴とする請求項７又は８記載のバイオセンサーの作成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の微生物を利用したバイオセンサーに関し、より詳細には、紅色非硫黄細菌の色素合成遺伝子を利用して環境中の有害物質を簡便な手法で視覚的に検出するためのバイオセンサー及びかかるバイオセンサーの作成方法に関する。特に、本発明は、紅色非硫黄細菌の色素合成遺伝子を利用して環境中の砒素を安価で高感度かつ簡便な手法で検出するためのバイオセンサー及びかかるバイオセンサーの作成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、海洋や河川、湖沼などの水系環境においては、農薬、重金属、内分泌攪乱物質などをはじめとする種々の有害物質による汚染が深刻な問題のひとつとなっており、環境浄化や公衆衛生の向上といった観点からその除去ならびに水質改善等が求められ続けている。環境中に存在するそれら種々の有害物質を除去することや、特定の化学物質の環境への影響をモニタリングすることに関してはその検出手法ならびに濃度測定手法がまず重要となる。このような検出・濃度把握の手法としては、現地でサンプルを採取したのち研究室の機器で測定を行うといった手順が一般的であるが、この場合、濃度の短時間的な変化を追跡することができない。また、通常、計測対象が混合物として存在しているため、その分離にクロマトグラフィーなどの手法が必要となる場合があり、さらには計測対象の濃度が一般にたいへん希薄であるため、分析には大量の試料を必要とすることがある。加えて、目的としている化学物質の種類によってはその分析操作が煩雑であったり、劇薬もしくは危険試薬を必要とする場合があるなどの問題があり、そして、複数の試料を計測するには機器が大型化しコストがかかるなど、環境モニタリングに機器分析を用いる場合には多くの問題が挙げられる［軽部征夫編著「バイオセンシング」（１９８８）啓学出版］。これらの問題点に対して、近年ではバイオセンサーに注目が集まり、研究されてきている。【０００３】
バイオセンサーとは、生理学的もしくは生化学的変化の情報を検出、検知、記録するデバイスを指す。その機能は生物学的に活性を持つ物質の生化学的な特異性に基づいており、高等動植物の細胞や組織、酵素、抗体、ＤＮＡ、受容体、微生物細胞などが生物学的測定要素となる。酵素と基質、抗体と抗原、受容体とリガンドといった例のように、その反応の特異性がバイオセンサーの主な利点である。また、微量な物質にも鋭敏に応答する感受性を持つ点、光学的機器分析手法とは異なり不透明溶液においても機能を発揮する点、直接計測が可能で、分離分析や試料の精製が不要な点やそれに伴いシステムの微小化が図れることで可搬性に優れる点、生物学的要素に由来するため劇薬・危険試薬は不要であり、常温・常圧の温和な環境下でモニターが可能である点、応答の迅速さからリアルタイム分析が可能である点、さらには操作が簡便である点なども、バイオセンサーの利点である［軽部征夫編著「バイオセンシング」（１９８８）啓学出版；Ｓ．Ｆ．Ｄ’Ｓｏｕｚａ，（２００１）Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．，１６：３３７−５３］。【０００４】
しかしながら、バイオセンサーの要素の中でも酵素や抗体などは特異性が非常に高く有用とされている反面、その精製には時間および費用がかかり、分子自体の不安定性や環境中の重金属などの毒性物質による不活化が起こりうるなどの欠点もある。環境モニタリングの観点では微生物バイオセンサーが、変異や組換えなどの遺伝子操作が容易であること、培養が容易であるためコストが抑えられること、耐性を獲得するなどして厳しい環境条件にも適した種類の微生物が存在することなどの特徴から、他種バイオセンサーに比較して有利であると考えられる。【０００５】
微生物バイオセンサーは基本的に次の三要素、すなわち、宿主としての組換え微生物、特定の化学物質に特異的に応答する遺伝子プロモーター配列、そのプロモーター配列の下流に配置するレポーター遺伝子から成り、場合によってはこれにセンサーの発するシグナルを検出するために必要な物理化学デバイスを組合わせる（図１、［Ｓ．Ｂｅｌｋｉｎ，（２００３）Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６：２０６−１２］）。このシステムでは、環境ストレスまたは分析対象物質が存在すると組換え微生物細胞内にそのシグナルが伝達され、特異的にプロモーター配列の機能が「ＯＮ」になり、プロモーター配列下流の遺伝子転写が誘導される。このレポーター遺伝子の発現シグナルを検出・測定することで環境モニタリングが可能となる。実際にこれまでに行われてきている微生物バイオセンサー構築を例に取ると、プロモーターとしては重金属応答性プロモーターやＤＮＡダメージ応答性のものなど宿主が従来備えている二成分制御系やリプレッサーを応答調節に介するものが、レポーター遺伝子としては発光に関与する遺伝子や蛍光タンパクなどシグナルの検出・測定が感度良く行えるものを用いる例が代表格として挙げられる［Ｓ．Ｆ．Ｄ’Ｓｏｕｚａ，（２００１）Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．，１６：３３７−５３］。【０００６】
特にレポーター遺伝子に関してはこれまでに種々の比較検討が行われてきており、それぞれの問題点もまた見出されている［Ｋ．Ｈａｋｋｉｌａ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３０１：２３５−４２］。緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）や赤色蛍光タンパク（ＤｓＲｅｄ）はそれぞれの遺伝子から発現したタンパク自身が補因子や基質などの添加を必要とせず蛍光を発することで測定の簡便さと感度の高さが期待できるが、翻訳されたタンパクがそのコンフォメーションを蛍光を発することができる活性型へと移行させるまでに長時間を要する欠点がある。ホタルルシフェラーゼ遺伝子ｌｕｃＦＦや微生物発光遺伝子オペロンであるｌｕｘＣＤＡＢＥも微生物バイオセンサーに良く用いられるレポーター遺伝子であるが、前者は反応基質を添加する必要があり、後者は発光反応の基質を産生する酵素と発光反応を触媒する酵素とをコードしているため基質などを添加する必要はないが、細菌細胞は常に光ストレスにさらされることになる点や５つのポリペプチドの産生が必須であることから、レポーター遺伝子を持つプラスミドのコピー数によっては細胞の増殖や代謝に負荷がかかる点が指摘されている。また、発光もしくは蛍光レポーター遺伝子のいずれもサンプルの測定には遮光チャンバー、光ファイバー、高感度光度計などの測定要件が必要となる。【０００７】
上述の水系環境を汚染する有害物質のうち、特に深刻なものは砒素である。砒素は０．０００１％と非常に低い濃度ではあるが地表に広く分布しており、銅や鉛、金のような金属の鉱物に結合して存在している。多くの砒素は河川や雨の作用により、水圏に溶出し、地下水や海洋水に蓄積する［Ｒ．Ｓ．Ｏｒｅｍｌａｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：９３９−４４］。このように砒素は地質学的に特定水圏に蓄積する特徴をもっている。しかし、砒素の蓄積はその周辺で生活する人々の健康に重大な影響を及ぼし、動脈硬化、心筋梗塞、四肢末梢循環障害などの健康障害をもたらしている。現在、砒素による深刻な影響を受けている地域は世界中に及んでいる。多くの砒素中毒患者の発生場所は、バングラディッシュ全域、インドの西ベンガル地区、中国の内モンゴル自治州であり、その他にアルゼンチンのコルドバ州、メキシコのトレオン市においても砒素中毒患者の存在が確認されている。そのほとんどは、砒素に汚染された地下水の利用が原因である。根本的な解決策は、砒素に汚染されていない水源を確保することであるが、その地域の経済事情等の問題もあり、解決に至っていないのが現状である。【０００８】
一方、一般的に砒素の検出は、高感度な測定が可能な誘導結合プラズマ発光分光分析（ＩＣＰ−ＡＥＳ）により行われている。しかし、この分析法に用いられる装置は極めて高価であり（数千万円）、莫大なコストを要する。そこで、化学反応を利用した比較的安価な（しかし感度の劣る）砒素検出キットが開発され、実際に用いられている。しかし、かかる検出キットは操作手順が煩雑であり、反応に塩酸や塩化スズといった劇物を必要とすることから、簡単に砒素を測定することはできないのが問題点となっている（Ｍ．Ｍ．Ｒａｈｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，３６：５３８５−９４）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は上述の従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、より簡便な操作で測定が実施でき、安価で、視覚的に特定化学物質の検出が可能なバイオセンサーを提供することである。また、本発明のさらなる目的は、安価で高感度かつ簡便な操作で砒素を検出することができる装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らはかかる目的を達成するために、光合成細菌の科に属する紅色非硫黄細菌の色素合成系に着目して鋭意研究した結果、この細菌の色素合成系において中心的な役割を担う酵素遺伝子がバイオセンサーのレポーター遺伝子として極めて有用であることを見出し、遂に本発明を完成するに至った。また、本発明者らはこのバイオセンサーの誘導性プロモーターとして砒素に対して特異的に応答を示す誘導性プロモーターを採用することにより、安価で高感度かつ簡便な操作で砒素を検出できることを想起し、好適な砒素誘導性プロモーター配列について鋭意検討の結果、遂に本発明を完成するに至った。【００１１】
即ち、本発明によれば、スフェロイデンモノオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子を欠損した紅色非硫黄細菌の色素変異株にセンサーベクターが導入された組換え紅色非硫黄細菌からなる、特定の化学物質を検出するためのバイオセンサーであって、前記センサーベクターが、スフェロイデンモノオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子の上流に特定の化学物質に対して特異的に応答を示す誘導性プロモーターが操作可能に連結されたセンサーベクターであることを特徴とするバイオセンサーが提供される。【００１２】
また、本発明によれば、以下の工程を含むことを特徴とする特定の化学物質を検出するためのバイオセンサーの作成方法が提供される：
スフェロイデンモノオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子を欠損した紅色非硫黄細菌の色素変異株を作成し；
プロモーターを欠いたスフェロイデンモノオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子のオープンリーディングフレームをベクター上にクローニングし；
このベクター中のスフェロイデンモノオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子の上流に、特定の化学物質に対して特異的に応答を示す誘導性プロモーターを操作可能に連結してセンサーベクターを構築し；そして
このセンサーベクターを紅色非硫黄細菌の色素変異株に導入して組換え紅色非硫黄細菌を作成する。【００１３】
本発明の好ましい実施態様によれば、上記紅色非硫黄細菌はロドヴルム・スルフィドフィルム（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ  ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）である。【００１４】
本発明の好ましい実施態様によれば、上記特定の化学物質はジメチルスルフィドであり、上記特定の化学物質に対して応答を示す誘導プロモーターはジメチルスルフィド誘導性プロモーターである。【００１５】
本発明の更に好ましい実施態様によれば、上記ジメチルスルフィド誘導性プロモーターは、ジメチルスルフィドデヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子のオペロンの上流域に存在するプロモーターである。【００１６】
本発明の特に好ましい実施態様によれば、上記プロモーターは、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号１の塩基配列と少なくとも６０％相同な塩基配列からなりかつジメチルスルフィド誘導性プロモーター活性を有するＤＮＡである。【００１７】
本発明の別の好ましい実施態様によれば、上記特定の化学物質は砒素であり、上記特定の化学物質に対して応答を示す誘導性プロモーターは、配列番号２９の塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号２９の塩基配列と少なくとも６０％相同な塩基配列からなりかつ砒素誘導性プロモーター活性を有するＤＮＡである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のバイオセンサーは、上述のようにスフェロイデンモノオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子を新規のレポーター遺伝子として用いることにより、測定結果をバイオセンサーの培養液の明確な色調変化として表現することができる。従って、本発明のバイオセンサーを用いれば、発光もしくは蛍光レポーター遺伝子を用いる従来技術のバイオセンサーの場合のような高感度光度計等の測定設備は不要であり、環境中の有害物質を簡便な手法で視覚的に検出することが可能となる。特に、本発明の好ましい実施態様のバイオセンサーは、バイオセンサーの誘導性プロモーターとして砒素に対して特異的に応答を示す誘導性プロモーターを採用しているので、安価で高感度かつ簡便な操作で砒素を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】微生物バイオセンサーの原理を示す。
【図２】視覚的バイオセンサーの構築手順を示す。図中、Ｐはプロモーターであり、Ωはターミネーターヘアピン構造であり、ＫｍＲはカナマイシン耐性遺伝子カセットである。
【図３】本発明の砒素検出バイオセンサーの構築手順を示す。図中、Ｐはプロモーターである。
【図４】本発明の砒素検出バイオセンサーの原理を示す。
【図５】Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  Ｗ−１Ｓ株（Ａ）から、およびｃｒｔＡ−１株（Ｂ）から抽出された色素のＨＰＬＣ溶出プロフィールである。番号で示されているいくつかのピークは本文中で言及されている。
【図６】ＨＰＬＣによって分離された色素の吸光スペクトルを示す。各サンプルは図５に示されている。
【図７ａ】カロチノイド色素のＬＣ−ＭＳスペクトルを示す。各サンプルのピーク数は図５に対応する。
【図７ｂ】カロチノイド色素のＬＣ−ＭＳスペクトルを示す。各サンプルのピーク数は図５に対応する。
【図８】Ｒｂ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのＣｒｔＡアミノ酸配列（Ｒｂ．ｃａｐ．）、Ｒｂ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓのＣｒｔＡアミノ酸配列（Ｒｂ．ｓｐｈ．）およびＲｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍのＣｒｔＡの仮想的アミノ酸配列（Ｒｖ．ｓｕｌ．）のアラインメントを示す。
【図９】（Ａ）はＵ断片およびＤ断片を増幅するために用いられたプライマー（Ｕ１，ｃｒｔＡｕｐ１；Ｕ２，ｃｒｔＡｕｐ２；Ｄ１，ｃｒｔＡｄｏｗｎ１；Ｄ２，ｃｒｔＡｄｏｗｎ２）のハイブリダイズ位置を矢印で示す。（Ｂ）はＵＫＤ断片のクローニング用プラスミドの構築を示す。
【図１０】プライマーｃｒｔＡｕｐ１とｃｒｔＡｄｏｗｎ２を用いたＰＣＲによる、ｃｒｔＡ遺伝子およびその上流および下流域を含むＤＮＡ断片の増幅を示す。アニーリング温度が各レーンの上に示されている。Ｍは１００ｂｐ  ＤＮＡラダーとλ−ＨｉｎｄＩＩＩマーカーの混合物である。
【図１１】ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅を示す。レーンＤはプライマーｃｒｔＡｕｐ１とｃｒｔＡｕｐ２を用いたＰＣＲであり；レーンＵはプライマーｃｒｔＡｄｏｗｎ１とｃｒｔＡｄｏｗｎ２を用いたＰＣＲであり；Ｍは１００ｂｐ  ＤＮＡラダーとλ−ＨｉｎｄＩＩＩマーカーの混合物である。
【図１２】３つのプライマー対を用いたＵＫＤ断片をチェックするためのＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅を示す。プライマー対ａはｃｒｔＡｕｐ１とｃｒｔＡｕｐ２であり、ｂはｃｒｔＡｄｏｗｎ１とｃｒｔＡｄｏｗｎ２であり、ｃはｃｒｔＡｕｐ１とｃｒｔＡｄｏｗｎ２である。
【図１３】野生株（左側の３本）と色素変異株（右側の３本）の色調を示す。
【図１４】ｃｒｔＡ遺伝子を標的とするプライマーを用いたＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅を示す。レーンＭはλ−ＥｃｏＴ１４Ｉであり、レーン３２〜３４はコンジュガントであり、レーンＳは一回交叉色素変異株であり、レーンＷはＲｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  Ｗ−１Ｓ株であり、ＥはプラスミドｐＨＤＲ２を有するＥ．ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１  λ−ｐｉｒである。
【図１５】Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ株ｃｒｔＡ−３２，ｃｒｔＡ−３３およびｃｒｔＡ−３４からのカロチノイドのＨＰＬＣ溶出プロフィールを示す。ＤＭＳＥはデメチルスフェロイデンであり、ＳＯはスフェロイデノンであり、ＳＥはスフェロイデンである。
【図１６】ターミネーター配列Ωの可能な構造を示す。
【図１７】ｐＲＶ１ΩおよびｐＲＶ５Ωの地図を示す。ＴｃＲはテトラサイクリン耐性遺伝子であり、ＳＤはシャイン・ダルガーノ配列であり、ＰｌａｃはｌａｃＺプロモーターであり、ＰｃｒｔはｃｒｔＡプロモーターであり、Ωはターミネーターである。矢印は転写方向を示す。
【図１８】Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ株Ｗ−１Ｓ、ｃｒｔＡ−３２およびその形質転換体（ｐＲＶ１ΩおよびｐＲＶ５Ω）からのカロチノイドのＨＰＬＣ溶出プロフィールを示す。ＤＭＳＯはデメチルスフェロイデノンであり、ＤＭＳＥはデメチルスフェロイデンであり、ＳＯはスフェロイデノンであり、ＳＥはスフェロイデンであり、ＮＳはノイロスポレンである。
【図１９】ｄｄｈＡ遺伝子およびｒＲＮＡを標的とするプライマーを用いたＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅を示す。アニーリング温度が各レーンの上に示されている。
【図２０】様々な増殖条件下でのＤＭＳの添加によるｄｄｈＡの転写誘導を示す。
【図２１】インバースＰＣＲ手法を模式的に示す。
【図２２】ＳａｌＩによって制断酵素処理されたＲｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  Ｗ−１Ｓ株ゲノムＤＮＡを示す。各分画に含まれるＤＮＡ断片が抽出された。
【図２３】ｄｄｈＡ領域を含む分画を検出するためのＰＣＲによるｄｄｈＡ遺伝子断片の増幅を示す。
【図２４】ｄｄｈＡ遺伝子のフランキング領域を増幅するためのインバースＰＣＲの適用を示す。鋳型ＤＮＡは３〜４ｋｂ分画から抽出された。
【図２５】ｄｄｈＡ上流域のＤＮＡ配列を示す。
【図２６】ＤＭＳを検出するためのセンサープラスミドの構築を示す。
【図２７】Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ株のＤＭＳバイオセンサーからのカロチノイドのＨＰＬＣ溶出プロフィールを示す。Ｂｃｈｌはバクテリオクロロフィルであり、ＤＭＳＥはデメチルスフェロイデンであり、ＳＯはスフェロイデノンであり、ＳＥはスフェロイデンである。
【図２８】培養３日目のＤＭＳに対するＤＭＳバイオセンサー株の応答を示す。
【図２９】培養６日目のＤＭＳに対するＤＭＳバイオセンサー株の応答を示す。
【図３０】実施例３で用いたＰＣＲプログラムを示す。
【図３１】サザンハイブリダイゼーション分析によるＲｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ中のＥ．ｃｏｌｉ  ａｒｓＲの相同遺伝子探索の結果を示す。ハイブリダイゼーション温度は５０℃（Ａ），５５℃（Ｂ）及び６０℃（Ｃ）である。レーン１；ＥｃｏＲＩ消化物，レーン２；ＨｉｎｄＩＩＩ消化物，レーン３；ＰｓｔＩ消化物，レーン４；ＳａｃＩ消化物，レーン５；ポジティブコントロールとしてのＰｖｕＩＩで消化されたＥ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡ。
【図３２】Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｐａｒｓのプロモーター活性を評価するためのｐＲＶ５ΩＰａｒｓの構築を示す。図中、ＰはＰａｒｓを意味する。
【図３３】ｃｒｔＡ−３２形質転換体ｐＲＶ５ΩＰａｒｓの色を示す。
【図３４】ｃｒｔＡ−３２形質転換体（ｐＲＶ５Ω、ｐＲＶ５ΩＰａｒｓ、ｐＲＶ１Ω）からのカロチノイドのＨＰＬＣクトマトグラムプロファイルを示す。ＤＭＳＯ；デメチル−スフェロイデノン，ＤＭＳＥ；デメチル−スフェロイデン，ＳＯ；スフェロイデノン，ＳＥ；スフェロイデン。
【図３５】ｃｒｔＡの制御配列としてのＥ．ｃｏｌｉ  Ｐａｒｓ及びａｒｓＲを示す。
【図３６】砒素検出のためのバイオセンサープラスミドとしてのｐＳＥＮＳ−ＡＳ株の構築を示す。
【図３７】２４時間培養後のＡｓ２Ｏ３に対するＳＥＮＳ−ＡＳ株の応答を示す。
【図３８】１ｍｌの培養液中の総カロチノイドの相対値を示す。
【図３９】０．０６ｐｐｍ  Ａｓ２Ｏ３の添加によるｃｒｔＡ及びａｒｓＲの転写誘導を示す。
【図４０】最適反応時間を示す。
【図４１】ＳＥＮＳ−ＡＳ株の特異性を示す。Ａｓ，砒素；Ｂｉ，ビスマス；Ｃｄ，カドミウム；Ｃｏ，コバルト；Ｎｉ，ニッケル；Ｐｂ，鉛；Ｓｂ，アンチモン；Ｚｎ，亜鉛；Ｍｉｘ，鉄＋銅＋アルミニウム＋マンガン。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明のバイオセンサーの主要な構成要素である紅色非硫黄細菌は、一般的なイソプレノイド生合成経路の産物であるゲラニルゲラニル二リン酸からカロテノイド色素を合成する。紅色非硫黄細菌の一種である淡水性のＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属においてはカロテノイド合成経路に関わる８種の酵素の存在ならびにそれぞれをコードする遺伝子がクラスターを形成していることがすでに知られている［Ｈ．Ｐ．Ｌａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７（８）：２０６４−７３］。紅色非硫黄細菌はカロテノイドの最終産物であるスフェロイデノンあるいはその誘導体を蓄積し、培養液はその色素由来の赤褐色を呈する。【００２１】
スフェロイデノンの産生は、前駆体である黄色色素スフェロイデン（あるいはその誘導体）が酸化されることで行われ、この反応はＣｒｔＡ酵素（スフェロイデンモノオキシゲナーゼ）により触媒される。したがって、ＣｒｔＡ酵素を欠損した紅色非硫黄細菌株においてはスフェロイデン蓄積に伴い培養液は黄褐色を呈する。本発明の根底にある発想は、このＣｒｔＡ酵素の発現を調節することで黄色から赤色への培養液の色調変化をもたらし、これを利用することにより「視覚的バイオセンサー」の構築を可能とするということである。特に、本発明の根底にある発想は、砒素誘導性プロモーターを用いてこのＣｒｔＡ酵素の発現を調節することで砒素存在下でのみ黄色から赤色への培養液の色調変化をもたらし、これを利用することにより砒素の存在を視覚的に検出するということである。【００２２】
本発明による「視覚的バイオセンサー」構築の流れは図２に示す手順による。
まず、紅色非硫黄細菌においてＣｒｔＡをコードする遺伝子（ｃｒｔＡ）を欠損した、スフェロイデン蓄積に伴い黄色を呈する変異株である色素変異株を構築する。次に、プロモーター配列を欠いたｃｒｔＡ遺伝子ＯＲＦをプラスミド上にクローニングした、ｃｒｔＡベクターを構築する。このｃｒｔＡベクターに、特定の化学物質に対して特異的に応答を示す、いわゆる誘導性プロモーターを挿入することでセンサープラスミドを構築する。最後に、センサープラスミドを色素変異株へと導入することで、目的とするバイオセンサー株を構築する。こうして構築されたバイオセンサー株は、標的化合物非存在下ではｃｒｔＡ遺伝子上流の誘導性プロモーターが働かず、ＣｒｔＡ欠損のためスフェロイデンが蓄積し黄褐色を呈する。一方、標的化合物存在下では、誘導性プロモーターが活性化され、下流に配置したｃｒｔＡ遺伝子の転写が促される。発現したＣｒｔＡにより、蓄積していたスフェロイデンはスフェロイデノンへと変換され、細胞は赤褐色を呈する。この色調変化により、標的化合物の検出が可能になる。【００２３】
本発明のバイオセンサーに使用する紅色非硫黄細菌としては、バイオセンサー中でレポーター遺伝子として作用するスフェロイデンモノオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子をゲノム中に有している紅色非硫黄細菌であって、黄色色素スフェロイデンを酸化して赤褐色色素スフェロイデノンを産生し、細菌細胞内に蓄積する能力を有する紅色非硫黄細菌であればいずれの種も用いることができるが、例えば海産性の紅色非硫黄細菌であるロドヴルム・スルフィドフィルム（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ  ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）を用いることができる。ロドヴルム・スルフィドフィルムは本発明者らの以前の研究により、スフェロイデンモノオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子ｃｒｔＡのクローニング及び塩基配列解読が既に完了している。従ってロドヴルム・スルフィドフィルムはレポーター遺伝子を含有する紅色非硫黄細菌として用いるのに好適である。【００２４】
本発明のバイオセンサーでは上記の紅色非硫黄細菌をそのまま用いるのではなく、スフェロイデンモノオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子を欠損した色素変異株を作成し、この色素変異株に、バイオセンサーの検出対象である特定の化学物質に対して特異的に応答を示す誘導性プロモーターを遺伝子工学技術によりレポーター遺伝子の上流に操作可能に連結したセンサーベクターを導入して組換え体を作成し、これをバイオセンサーとして用いる。特定の化学物質に対して特異的に応答を示す誘導性プロモーターは、本発明のバイオセンサーの検出対象に応じて好適なものを適宜選択すればよく、例えばセンサーの検出対象がジメチルスルフィドである場合、ジメチルスルフィドに対して特異的に応答を示すジメチルスルフィド誘導性プロモーターとしては、ジメチルスルフィドデヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子のオペロンの上流域に存在するプロモーターを用いることができる。このプロモーターは具体的には配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡである。また、配列番号１の塩基配列と少なくとも６０％相同な塩基配列からなりかつジメチルスルフィド誘導性プロモーター活性を有するＤＮＡ、即ち配列番号１の塩基配列と均等の範囲にあるＤＮＡも本発明のバイオセンサー中のプロモーターとして用いることができる。【００２５】
均等の範囲にあるＤＮＡの配列番号１の塩基配列に対する相同性の好ましい範囲は少なくとも７０％であり、更に好ましい範囲は少なくとも８０％であり、更に好ましい範囲は少なくとも９０％であり、更に好ましい範囲は少なくとも９５％であり、最も好ましい範囲は少なくとも９８％である。なお、かかる相同なＤＮＡは例えば周知の部位特異的突然変異法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．２０，ｐ．６４８７−６５００，１９８２）等により容易に調製することができる。また、得られたＤＮＡがジメチルスルフィド誘導性プロモーター活性を有するかどうかは、例えば得られたＤＮＡを適当なレポーター遺伝子の上流に導入した形質転換体大腸菌を作成し、ジメチルスルフィドの存在下で培養してレポーター遺伝子の発現の有無を検出することにより確認することができる。【００２６】
なお、本発明において、用語「操作可能に連結された」は、プロモーターが遺伝子の上流に、遺伝子の発現制御を可能とする態様で配置されることを意味する。【００２７】
本発明のバイオセンサーの検出対象は、使用する誘導性プロモーターの特異性によって決まり、標的化学物質に対して特異的に応答を示す誘導性プロモーターが存在する限り、いかなる化学物質をも検出対象とすることができる。特に、本発明のバイオセンサーはその測定操作の簡便性、測定結果の視覚性を活かして海洋や河川、湖沼などの水系環境中の農薬、重金属、内分泌攪乱物質を検出するのに有利に使用できる。例えば、誘導性プロモーターとしてジメチルスルフィド誘導性プロモーターを選択すれば、本発明のバイオセンサーは地球の気候変動に寄与するおそれがある海洋中のジメチルスルフィドを検出してその濃度の変動を調査するために用いることができる。【００２８】
本発明のバイオセンサーは、紅色非硫黄細菌のスフェロイデンモノオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子の上流に元来存在する構成的プロモーターを、特定の化学物質に対して特異的に応答を示す誘導性プロモーターに、何らかの方法で置換したものであり、具体的には以下の工程により作成することができる：
スフェロイデンモノオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子を例えばカナマイシン耐性遺伝子等の他の遺伝子で置換することにより、スフェロイデンモノオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子を欠損した紅色非硫黄細菌の色素変異株を作成し；
プロモーターを欠いたスフェロイデンモノオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子のオープンリーディングフレームをプラスミド等のベクター上にクローニングし；
このベクター中のスフェロイデンモノオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子の上流に、特定の化学物質に対して特異的に応答を示す誘導性プロモーターを操作可能に連結してセンサーベクターを構築し；そして
このセンサーベクターを紅色非硫黄細菌の色素変異株に導入して組換え紅色非硫黄細菌を作成する。
これらの工程はいずれも当業者には周知の常法に従って適宜行えばよく、その詳細な説明は省略する。【００２９】
本発明のバイオセンサーを用いて検出対象化学物質を検出するためには、本発明のバイオセンサーを構成する組換え紅色非硫黄細菌を光好気条件下で培養しておき、その培地に検出対象化学物質を含む可能性があるサンプルを添加し、更に継続して培養する。サンプルに検出対象化学物質が含まれていなければ、誘導性プロモーターは不活性のままであるので、紅色非硫黄細菌細胞はスフェロイデンモノオキシゲナーゼ酵素遺伝子を転写・発現することができず、この酵素の欠損のため、細胞中に黄色色素スフェロイデンが蓄積し、黄褐色を呈したままである。これに対し、サンプルに検出対象化学物質が含まれていれば、誘導性プロモーターは活性化され、下流に存在するスフェロイデンモノオキシゲナーゼ酵素遺伝子の転写が促されてスフェロイデンモノオキシゲナーゼ酵素が紅色非硫黄細菌細胞中に発現され、この酵素の触媒作用により、細胞中に蓄積していた黄色色素スフェロイデンは酸化されて赤褐色色素スフェロイデノンへと変換され、細胞は黄褐色から赤褐色へと色調を変化する。この色調変化により、検出対象化学物質の検出が視覚的に可能になる。【００３０】
次に、本発明の特に好ましい実施態様である砒素検出バイオセンサーについて以下に説明する。
本発明による砒素検出バイオセンサー構築の流れは図３に示す手順による。
まず、紅色非硫黄細菌においてＣｒｔＡをコードする遺伝子（ｃｒｔＡ）を欠損した、スフェロイデン蓄積に伴い黄色を呈する変異株である色素変異株を構築する。次に、プロモーター配列を欠いたｃｒｔＡ遺伝子ＯＲＦをプラスミド上にクローニングした、ｃｒｔＡベクターを構築する。このｃｒｔＡベクターに、砒素に対して特異的に応答を示す、いわゆる誘導性プロモーターを挿入することでセンサープラスミドを構築する。最後に、センサープラスミドを色素変異株へと導入することで、目的とするバイオセンサー株を構築する。こうして構築されたバイオセンサー株は、砒素の非存在下ではｃｒｔＡ遺伝子上流の誘導性プロモーターが働かず、ＣｒｔＡ欠損のためスフェロイデンが蓄積し黄褐色を呈する。一方、砒素の存在下では、誘導性プロモーターが活性化され、下流に配置したｃｒｔＡ遺伝子の転写が促される。発現したＣｒｔＡにより、蓄積していたスフェロイデンはスフェロイデノンへと変換され、細胞は赤褐色を呈する。この色調変化により、砒素の検出が可能になる。【００３１】
本発明の砒素検出バイオセンサーで使用する砒素誘導性プロモーターは大腸菌（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の砒素耐性遺伝子オペロンの上流のプロモーター領域及び砒素耐性遺伝子オペロンの最上流の遺伝子領域からなる。大腸菌の砒素耐性遺伝子オペロンは、ａｒｓＲ，ａｒｓＢ及びａｒｓＣの三つの遺伝子から構成されており、最も上流側のａｒｓＲ遺伝子の上流にプロモーター領域であるＰａｒｓが連結されている。このオペロンは砒素が存在する時にのみ強く発現する制御を受けていることを特徴とし、これはａｒｓＲ遺伝子がコードする発現制御タンパクＡｒｓＲとａｒｓＲＢＣのプロモーター領域であるＰａｒｓとの相互作用によって担われている。ＡｒｓＲタンパク質は砒素結合能を示す配列と、ａｒｓＲＢＣのプロモーター領域であるＰａｒｓに結合能を示す配列を有しており、砒素が存在していない時にはＰａｒｓに結合し、ａｒｓＲＢＣの転写を抑制している。一方、砒素が存在する時には、ＡｒｓＲタンパク質は砒素と結合することによりコンフォメーション変化を起こし、Ｐａｒｓから解離する結果、Ｐａｒｓからの転写が行われる。このように大腸菌の砒素耐性遺伝子オペロンでは、ＡｒｓＲタンパク質とａｒｓＲＢＣのプロモーター領域であるＰａｒｓとの相互作用により砒素への応答及び転写制御が行われている。本発明は、この大腸菌のＰａｒｓ及びａｒｓＲの領域をバイオセンサーの制御システムとして用いることで、砒素を検出可能なバイオセンサーの構築を可能としたものである。【００３２】
次に、本発明の砒素検出バイオセンサーを用いた砒素検出の原理について図４を参照してさらに詳しく説明する。本発明の砒素検出バイオセンサーを用いて砒素を検出するためには、本発明の砒素検出バイオセンサーを構成する組換え紅色非硫黄細菌を光好気条件下で培養しておき、その培地に砒素を含む可能性があるサンプルを添加し、更に継続して培養する。サンプルに砒素が含まれていなければ、誘導性プロモーターのＰａｒｓ領域にはＡｒｓＲタンパク質が（二量体の状態で）結合しているため、誘導性プロモーターは不活性のままであり、紅色非硫黄細菌細胞はスフェロイデンモノオキシゲナーゼ酵素遺伝子を転写・発現することができず、この酵素の欠損のため、細胞中に黄色色素スフェロイデンが蓄積し、黄褐色を呈したままである（図４の上側参照）。これに対し、サンプルに砒素が含まれていれば、ＡｒｓＲタンパク質は砒素と結合することによりコンフォメーション変化を起こしてＰａｒｓ領域から解離するため、誘導性プロモーターは活性化され、下流に存在するスフェロイデンモノオキシゲナーゼ酵素遺伝子の転写が促されてスフェロイデンモノオキシゲナーゼ酵素が紅色非硫黄細菌細胞中に発現され、この酵素の触媒作用により、細胞中に蓄積していた黄色色素スフェロイデンは酸化されて赤褐色色素スフェロイデノンへと変換され、細胞は黄褐色から赤褐色へと色調を変化する（図４の下側参照）。この色調変化により、砒素の検出が視覚的に可能になる。【００３３】
具体的には、本発明の砒素検出バイオセンサーで使用する砒素誘導性プロモーターは配列番号２９の塩基配列からなるＤＮＡである。また、配列番号２９の塩基配列と少なくとも６０％相同な塩基配列からなりかつ砒素誘導性プロモーター活性を有するＤＮＡ、即ち配列番号２９の塩基配列と均等の範囲にあるＤＮＡも本発明の砒素検出バイオセンサー中の砒素誘導性プロモーターとして用いることができる。【００３４】
配列番号２９の塩基配列に対して均等の範囲にあるＤＮＡの配列番号２９の塩基配列に対する相同性の好ましい範囲は少なくとも７０％であり、更に好ましい範囲は少なくとも８０％であり、更に好ましい範囲は少なくとも９０％であり、更に好ましい範囲は少なくとも９５％であり、最も好ましい範囲は少なくとも９８％である。なお、かかる相同なＤＮＡは例えば周知の部位特異的突然変異法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．２０，ｐ．６４８７−６５００，１９８２）等により容易に調製することができる。また、得られたＤＮＡが砒素誘導性プロモーター活性を有するかどうかは、例えば得られたＤＮＡを適当なレポーター遺伝子の上流に導入した形質転換体大腸菌を作成し、砒素の存在下で培養してレポーター遺伝子の発現の有無を検出することにより確認することができる。【００３５】
なお、本発明において、用語「砒素誘導性プロモーター」又は「砒素に対して特異的に応答を示す誘導性プロモーター」は砒素の存在下でのみその下流に連結された遺伝子の転写を可能とするＤＮＡを意味し、これは通常のプロモーター領域に加えて、必要により大腸菌のａｒｓＲ遺伝子のようなプロモーター領域と相互作用する追加の制御タンパク質の遺伝子配列も含む概念である。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、実施例の記載は純粋に発明の理解のためのみに挙げるものであり、本発明はこれによって何ら限定されるものではない。【００３７】
実施例１
実験材料および方法
１：  本実施例で用いた菌株および培地
本実施例で用いた菌株を表１に、培地を表２に示す。なお、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ  ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  Ｗ−１Ｓ株は独立行政法人産業技術総合研究所の特許生物寄託センター［日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）］（旧通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所［日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）］）にＦＥＲＭ  Ｐ−１５３２０として寄託されている（寄託日：平成７年１２月１１日）。
Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  Ｗ−１Ｓ株およびそれぞれの変異株や形質転換株の培養には４ＣｙＭＯＭ培地を用いた。バイオセンサー株の培養には、酵母抽出物を含まない４ＣｙＭＯＭ培地として４ＣＭＯＭ培地を調製し、これを用いた。Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１株、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１  λ−ｐｉｒ株、およびそれぞれの形質転換株の培養にはＬＢ培地を用いた。それぞれの培地には必要に応じてアンピシリン（Ａｍｐ）、カナマイシン（Ｋｍ）、テトラサイクリン（Ｔｃ）をそれぞれ終濃度５０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌになるように加えた。ただし、光合成細菌についてはＴｃ添加量を終濃度５μｇ／ｍｌとなるようにした。
形質転換過程およびエレクトロポレーション後の一時的な培養時にはＳＯＣ培地を用いた。【００３８】
2006022235.tif 000002
【００３９】
２：  本実施例で用いたプラスミド
本実施例で用いたプラスミドは後述においてそれぞれまとめる。ここでは各プラスミド構築に利用した基本的なものやベクターを紹介する。
ＰＣＲで増幅した断片はｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に組込んだ。Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ色素変異株の作製には自殺ベクターであるｐＳＭ３０６５［Ｓ．Ｍａｓｕｄａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８１（１４）：４２０５−１５］を利用した。Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ色素変異株でのｃｒｔＡ発現には広宿主域ベクターであるｐＲＫ４１５［Ｎ．Ｔ．Ｋｅｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ，７０：１９１−７］を用いた。カナマイシンカセット（ＫｍＲ）はｐＵＣ４Ｋ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に含まれる配列を利用した。【００４０】
2006022235.tif 000003
【００４１】
３：  ｔｏｔａｌ  ＤＮＡの抽出
Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  Ｗ−１Ｓ株からのｔｏｔａｌ  ＤＮＡ抽出は参考文献［中山広樹、西方敬人著「バイオ実験イラストレイテッド（ｉｉ）遺伝子解析の基礎」（１９９５）秀潤社］のプロトコールに従って行った。【００４２】
４：  ＰＣＲ
ＰＣＲはＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＴａｑＴＭ  ｗｉｔｈ  ＧＣ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ社）を用いて添付のプロトコールに従い操作を行った。鋳型は各ｔｏｔａｌ  ＤＮＡやプラスミドＤＮＡを用いるか、または培養液やコロニーを懸濁した液からのｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲを行った。ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲでは、培養液５０μｌもしくはコロニーを５０μｌのＨ２Ｏに懸濁した液を９５℃で５分間加熱処理し、遠心上清を鋳型とした。【００４３】
５：  ゲルからのＤＮＡ断片回収、ライゲーション、形質転換
ＰＣＲで増幅された断片をクローニングする際はｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒに組込んだ後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入した。方法はｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍのプロトコールに従って行った。また、プラスミドＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１に導入する際にも同プロトコールに従った。
制限酵素で処理したＤＮＡ断片はアガロースゲルで電気泳動した後、ゲルから切り出して回収した。ゲル断片からＤＮＡを抽出する際には透析チューブを用いて行った［村松正寛編「ラボマニュアル遺伝子工学」（１９８８）丸善株式会社］。ゲルが入らないように注意しつつ透析チューブ内の液を回収したのち、ＰＣＩ（フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール）で抽出［西方敬人著「バイオ実験イラストレイテッド（ｉ）分子生物学実験の基礎」（１９９５）秀潤社］およびエタノール沈殿にてＤＮＡを回収した。エタノール沈殿操作においてはＤＮＡ回収効率を向上させる目的で共沈剤としてグリコーゲン（ナカライテクス）を用いた。
切り出したＤＮＡ断片をライゲーションする際にはＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（ＴａＫａＲａ社）を用いて行った。【００４４】
６：  プラスミドＤＮＡの抽出
プラスミド抽出は  ＣＯＮＣＥＲＴ  Ｒａｐｉｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）またはＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて行った。【００４５】
７：  コンジュゲーション
組換えプラスミドを導入した大腸菌からＲｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍへとプラスミドＤＮＡを導入する際にコンジュゲーションを行った。方法は以下に記す通りである。また、以下の操作で用いるものはすべてオートクレーブ滅菌を行ったものである。
Ｅ．ｃｏｌｉは試験管中の１０ｍｌ  ＬＢ培地中で３７℃振盪培養、Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍはＲｏｕｘ  ｂｏｔｔｌｅ中の３０ｍｌ  ４ＣｙＭＯＭ培地中でスターラーで撹拌しつつ光条件下で培養を行った。Ｅ．ｃｏｌｉはＯＤ６６０≒０．２、Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍはＯＤ６６０≒１．６になるまで培養し、それぞれの菌液１７０μｌ、６０μｌをエッペンドルフチューブに混合した。集菌後２３０μｌ  ＬＢ培地に再懸濁し、その液を２％ＮａＣｌ  ＬＢ寒天プレート上のＭＦ−ミリポア  タイプＨＡメンブレンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）の上に広げた。３２℃下オーバーナイトでプレートを静置した後、メンブレンをバイヤル中に回収した。バイヤル中に２５０μｌ  ＬＢ培地を加えてボルテックスすることでメンブレン上の菌を回収し、エッペンドルフチューブに移した。そのＬＢ懸濁液に濾過滅菌した５０μｌ  Ｔ４ファージ液［Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｏｓａｋａ，（１９９２）Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ：２２９］を加えた後３７℃  １５分インキュベートした。集菌して４Ｃｙ  ＭＯＭで洗菌した後、４Ｃｙ  ＭＯＭに再懸濁した。菌液を４Ｃｙ  ＭＯＭ寒天プレート上に塗布し、光条件下で数日間インキュベートした。【００４６】
８：  エレクトロポレーション
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１  λ−ｐｉｒにプラスミドを導入する際にはエレクトロポレーションを用いた。氷上で融解したＥ．ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１  λ−ｐｉｒ  ５０μｌにプラスミド溶液２μｌを加え、ピペッティングで混和した後  キュベットに移し、氷上で１０分間静置した。エレクトロポレーションの条件は以下の通りである。電圧２．５ｋＶ、キュベット壁間隔０．２ｃｍ、コンデンサ値１μＦ。エレクトロポレーション後ただちに２００μｌ  ＳＯＣ培地を加え、ピペッティングで混和後エッペンドルフチューブに移して３７℃  １時間振盪培養を行った。その後ＬＢ寒天プレートに蒔いた。【００４７】
９：  ＤＮＡシーケンス
ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ上にクローニングした断片の塩基配列解読には、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ−ＭおよびＭ４（ＴａＫａＲａ社）、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｗｉｔｈ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，  ＦＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた。サンプルの調製はキットに添付のプロトコールに従って、シーケンサの操作は機器に付属のマニュアルに従って行った。【００４８】
１０：  色素解析
Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍの野生株もしくは変異株や形質転換株各種のカロテノイド色素組成解析は以下の方法で行った。
細菌株を３０ｍｌ培地入りのＲｏｕｘ  Ｂｏｔｔｌｅで微好気・明条件・マグネティックスターラーにより撹拌しつつ一晩培養した。８０００ｒｐｍ、１５分の遠心分離操作後に上清を捨て、菌ペレットを−８０℃で一晩凍結させ、翌日から菌体を二晩凍結乾燥した。得られた凍結乾燥体を遠心チューブからバイヤルに移し、これにアセトン：メタノール７：２（ｖ／ｖ）混液５ｍｌを加え、２分間ｖｏｌｔｅｘを行った［１６］。この懸濁液を濾過したものを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析サンプルとした。
また、細菌株の培養を試験管中の１０ｍｌ培地中で各種（微好気・明、微好気・暗、嫌気・明）行った際には、培養を３日間行った。培養液をエッペンドルフチューブに１ｍｌずつ取り、遠心後のペレットを−８０℃で２時間凍結させたのちに一晩凍結乾燥した。得られた凍結乾燥体にアセトン：メタノール混液を適量（１００μｌ〜５００μｌ）加え、２分間ｖｏｌｔｅｘ後に卓上遠心機で１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離した上清をＨＰＬＣ分析サンプルとした。
ＨＰＬＣ分析は、島津高速液体クロマトグラフィー用機器、送液ユニットＬＣ−１０ＡＳ、オートインジェクタＳＩＬ−９Ａ、紫外可視分光光度計検出器ＳＰＤ−１０Ａ、ならびにクロマトパックＣ−Ｒ３Ａ（島津製作所）、そして、μＢｏｎｄａｐａｋＴＭ  Ｃ１８  １２５Å  １０μｍ  ３．９×３００ｍｍ  ＨＰＬＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ社）を用いて行った。液相にはメタノールを用い、測定波長４８１ｎｍで検出を行った。サンプルの注入量、液相の流速、クロマトパックの記録条件などはサンプル濃度などの条件により適宜変更した。【００４９】
１１：  ＲＮＡ抽出、ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡ抽出はＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、添付のプロトコールに従って行った。この際の細胞溶解にはリソチームをプロトコールに指定された濃度で添加した。混入したＤＮＡの除去にはＤＮａｓｅ  Ｉ（ＴａＫａＲａ社）を添付の緩衝液とともにプロトコールに指示のあった方法で用いた。インキュベーションは３７℃で３０分間行い、その後ＰＣＩ処理ならびにエタノール沈殿操作を経てＲＮＡを精製した。精製ＲＮＡ  １μｇを鋳型に、ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１（ＴａＫａＲａ社）を用いて逆転写反応を行った。逆転写反応にはＫｉｔに含まれる逆転写酵素、ＲＮａｓｅ阻害剤、ランダム９マー、緩衝液、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ２を用い、４５℃で２８分間行った。逆転写反応後の溶液４μｌを鋳型に用い、上記「４：ＰＣＲ」の項と同様にＰＣＲ反応を行った。【００５０】
実施例１−Ａ  Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍの色素組成解析
１．本実施例の目的
これまでに、本発明者らはＲｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  Ｗ−１Ｓのゲノム上のｃｒｔＡ配列中にカナマイシン耐性遺伝子カセット（ＫｍＲ）を挿入することでＣｒｔＡ欠損がもたらされたと考えられる、ＣｒｔＡ欠損色素変異株ｃｒｔＡ−１の構築に成功している。しかしながら、この色素変異株は当初は予測した通り培養液色調において黄色を呈していたものの、培養を続けるにつれて次第に赤味を帯びてくる性質が見出された。この点についての解析も含め、Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍの色素組成などの基礎データを得る目的で、本章では色素抽出ならびにＨＰＬＣを介した色素組成解析を行った。また、ＨＰＬＣを用いてカロテノイド色素組成の変化を見出すことは、色素変異株やその形質転換株など、バイオセンサー開発の各段階で得られる各種変異株におけるＣｒｔＡ発現状態の詳細な比較・分析に重要である。【００５１】
２．  Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍの色素解析
カロテノイド色素組成を分析する対象としては、Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  Ｗ−１Ｓ株と色素変異株ｃｒｔＡ−１を選択した。これらから、上述の方法で色素抽出を行い、ＨＰＬＣ解析を介して各色素ピークを検出した（図５）。主なピークと保持時間の関係から各ピークに対する、スフェロイデノン（ＳＯ）とスフェロイデン（ＳＥ）ならびにその誘導体、ノイロスポレン（ＮＳ）といったカロテノイド色素の対応が推測された［Ｓ．Ｔａｋａｉｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈ．Ｒｅｓ．，６７：２０７−１４］。また、検出器を通過した排出液より、主要ピークに相当する分画を分取し、３５０ｎｍから６００ｎｍにかけての吸光スペクトルを測定した（図６）。その結果、測定した主要ピークはＳＥもしくはＳＯに類似する特徴的な吸収曲線［Ａ．Ａ．Ｙｅｌｉｓｅｅｖ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４０３（１）：１０−４］を示し、保持時間も考慮したところ、ピーク１はＳＯ誘導体、ピーク２はＳＥ誘導体、ピーク３はＳＯ、ピーク４はＳＥであろうと推測された。【００５２】
各ピークの類推が正しいか否かの確認、また、各カロテノイド誘導体に該当する物質の特定を目的に、液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）を用いて各主要ピークの解析を行った。その結果を図７に示す。各ピークそれぞれにおいて、プロトン化分子（Ｍ＋Ｈ）＋を示すｍ／ｚ  ５６９、５５５、５８３、５６９が観察され、それぞれのピーク成分の分子量は５６８、５５４、５８２、５６８であると示された。ピーク３及び４の分子量はそれぞれＳＯ及びＳＥに一致している。また、ピーク１、２はそれぞれ分子量からデメチルスフェロイデノン（ＤＭＳＯ）、デメチルスフェロイデン（ＤＭＳＥ）であると考えられた。【００５３】
以上の結果から、Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ野生株Ｗ−１ＳはＳＯを主に、次いでＤＭＳＯ、ＤＭＳＥの蓄積が見られること、そして、色素変異株ｃｒｔＡ−１はＤＭＳＥを主に蓄積し、次いでＳＥ、ＳＯの蓄積も見られることが示唆された。色素変異株ｃｒｔＡ−１においてＳＯの蓄積があることは、数日間の長期培養に伴って培養液が赤味がかってくることから予期されていたことである。これはｃｒｔＡ−１株において低いながらもＣｒｔＡ活性が残存していることを示唆するものであろうと考えられる。この可能性は以下のことからも支持される。【００５４】
色素変異株作製の際には、本発明者らがクローニングに成功したｃｒｔＡを含む１．５ｋｂ断片を利用した。この断片の中央付近にある単一の制限酵素サイトにＫｍＲを挿入し、この配列とＲｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍゲノム上のｃｒｔＡ領域との相同組換えにより色素変異株ｃｒｔＡ−１の作製に成功した。しかし、ｃｒｔＡを含む１．５ｋｂ断片についてＤＮＡ配列をシーケンス解読したところ、その断片は約８３０ｂｐのｃｒｔＡ遺伝子領域およびその上流域約２９０ｂｐ、下流域約４００ｂｐからなることが明らかになり、ＫｍＲを挿入したＸｈｏＩサイトはｃｒｔＡ開始コドンから約６５０ｂｐ下流に存在することが判明した。つまり、プラスミド上に構築した（もしくは色素変異株ゲノム上）のｃｒｔＡ：：ＫｍＲ配列においてはｃｒｔＡが開始コドンから約８０％は無傷であることが考えられた。このことから、ｃｒｔＡ−１株においては、全２７７アミノ酸からなる野生株のＣｒｔＡ配列のうち、そのＮ末端から２１５アミノ酸残基部分は翻訳されていることが推測され、この部分的ＣｒｔＡに由来した低いスフェロイデン酸化活性が発現していることで、ｃｒｔＡ−１においてＨＰＬＣチャートでのＳＯに該当するピーク出現が説明できると思われた。Ｒｂ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓおよびＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのＣｒｔＡアミノ酸配列（それぞれＧｅｎｅＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＪ０１０３０２，Ｎｏ．Ｘ５２２９１）とＲｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍのＣｒｔＡの推測されるアミノ酸配列との相同性比較の結果からは活性中心と考えられるような保存領域を見出すことができず、ＫｍＲ挿入によりＣｒｔＡ欠損を完全に引き起こせたと言えないものであった（図８）。したがって、先に述べたような、ｃｒｔＡ−１株において発現するＮ末側の部分的ＣｒｔＡが弱いながらも活性を持っているという可能性は完全には否定できない。【００５５】
色素変異株ｃｒｔＡ−１株におけるＣｒｔＡ活性は野生株に比較すればその活性は大きく抑えられたものであるが、バイオセンサー株においては、不完全に破壊された染色体上ｃｒｔＡからの低いＣｒｔＡ活性が測定時のバックグラウンドを高め、測定精度に大きな影響をもたらすと考えられる。そこで、ゲノム上のｃｒｔＡ遺伝子を完全に破壊した、新規のＲｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ色素変異株を構築する必要があると考えられた。【００５６】
３．  まとめ
本実施例の結果は以下の通りである。
・  ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳ解析の結果、Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ野生株および色素変異株のカロテノイド色素組成の解析に成功した。
・  色調から予測された通り、ｃｒｔＡ−１株においてはＳＯの蓄積が観察され、この変異株をバイオセンサーの宿主として用いることは適切でないと考えられた。
これらの結果から、バイオセンサー構築にあたっては新規に、ゲノム上のｃｒｔＡ遺伝子をより完全に欠失した色素変異株を構築しなければならないと言える。【００５７】
実施例１−Ｂ  新規色素変異株の作製
１．本実施例の目的
色素変異株ｃｒｔＡ−１株においては、染色体上ｃｒｔＡ遺伝子中にＫｍＲを挿入する形でＣｒｔＡ欠損株構築を行ったが、結果として不完全なＣｒｔＡ欠損であり赤色色素の蓄積がもたらされた。そこで今回は、ＣｒｔＡの完全欠損を目的とし、ｃｒｔＡ遺伝子ＯＲＦに相当する部分をＫｍＲで置き換えて色素変異株を構築した（図９）。手順としては、まず、ｃｒｔＡ遺伝子の上流域（Ｕ）および下流域（Ｄ）をそれぞれ５００ｂｐ以上の長さに渡ってクローニングした。これらの断片の間にＫｍＲ配列を挟み込む形でＵ−ＫｍＲ−Ｄ断片（ＵＫＤ断片）を構築し、これを自殺ベクター  ｐＳＭ３０６５上に挿入したプラスミドｐＨＤＲ２を作製した。このプラスミドをコンジュゲーションを介してＲｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  Ｗ−１Ｓ株へと導入し、相同二回組換えを起こした目的の色素変異株を得た。【００５８】
本実施例で用いたあるいは構築したプラスミドを表３に、プライマーを表４にまとめる。【００５９】
2006022235.tif 000004
【００６０】
2006022235.tif 000005
【００６１】
２．  新規色素変異株の作製
Ｕ、Ｄ両断片のクローニングのため、Ｕ断片増幅用プライマーｃｒｔＡｕｐ１およびｃｒｔＡｕｐ２、Ｄ断片増幅用プライマーｃｒｔＡｄｏｗｎ１およびｃｒｔＡｄｏｗｎ２を設計した。プライマーｃｒｔＡｕｐ２およびｃｒｔＡｄｏｗｎ１はｃｒｔＡのＤＮＡシーケンスデータをもとに、プライマーｃｒｔＡｕｐ１およびｃｒｔＡｄｏｗｎ２はデータベース上のＲｂ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓのＤＮＡシーケンスデータ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＪ０１０３０２）をもとに設計した。Ｄ断片のｃｒｔＡ遺伝子側にはｃｒｔＡ遺伝子の一部が含まれるが（図９Ａ）、Ｒｂ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓにおいて見出されたのと同様に［Ｈ．Ｐ．Ｌａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７（８）：２０６４−７３］、Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍにおいてもｃｒｔＡ遺伝子の停止コドンとその下流に位置するｂｃｈＩ（バクテリオクロロフィル合成に関わる酵素）遺伝子の開始コドンが一部重なっていること、そしてｂｃｈＩ開始コドン上流にはｃｒｔＡ遺伝子コード領域と重なってＳＤ配列が存在していることがｃｒｔＡ遺伝子シーケンスから見出されており、ｂｃｈＩへのダメージを避ける目的で削除せずにＤ断片中に含ませたものである。【００６２】
まず、Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  Ｗ−１Ｓ  ｔｏｔａｌ  ＤＮＡを鋳型にプライマーｃｒｔＡｕｐ１およびｃｒｔＡｄｏｗｎ２を用いてＰＣＲを行った（図１０）。得られた約２．２ｋｂの増幅断片にはｃｒｔＡ遺伝子が含まれることをｃｒｔＡ遺伝子クローニング用プライマーを用いたＰＣＲにより確認した。この約２．２ｋｂ増幅断片を鋳型に、プライマーｃｒｔＡｕｐ１およびｃｒｔＡｕｐ２、または、プライマーｃｒｔＡｄｏｗｎ１およびｃｒｔＡｄｏｗｎ２を用いたそれぞれのＰＣＲを行ったところ、Ｕ断片と推測される６００ｂｐの増幅断片およびＤ断片と推測される８００ｂｐの増幅断片がそれぞれ得られた（図１１）。この２つの断片をそれぞれｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換株のプラスミドに挿入された断片のシーケンス解読を行い、ｃｒｔＡ遺伝子の既知シーケンスと照らし合せた結果、目的のＵ断片ならびにＤ断片がクローニングされたことを確認した。得られたプラスミドをそれぞれｐＧＥＭ−Ｕ、ｐＧＥＭ−Ｄとした。また、クローニング断片のベクターに対する挿入方向は２通り考えられるが、ｐＧＥＭ−Ｕに関してはプライマーｃｒｔＡｕｐ２に予め付与していたＸｈｏＩサイト、ｐＧＥＭ−Ｄに関してはｃｒｔＡＲｖの配列既知領域にあるＳａｃＩサイトに着目し、制限酵素処理により目的の（図９）プラスミドを保持する形質転換株を選別した。【００６３】
次に、クローニングしたＵ断片およびＤ断片、そしてＫｍＲを用いて、広宿主域プラスミドｐＲＫ４１５上にＵＫＤ断片を作製した。【００６４】
プラスミドｐＵＣ４Ｋから制限酵素ＳａｌＩ処理によりＫｍＲを切出し、ｐＧＥＭ−ＵプラスミドのＸｈｏＩサイトに挿入した。ＫｍＲのプラスミド中への挿入は、培地中に含まれるＫｍに対してのＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９形質転換株の耐性、プライマーｋｍＲ１およびｋｍＲ２を用いたＰＣＲによるＫｍＲの存在確認により確かめられた。構築したプラスミドをｐＧＥＭ−ＵＫとした。【００６５】
また、ｐＧＥＭ−ＤプラスミドからＤ断片をＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＩ処理により切出し、Ｔ４  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いて末端平滑化したのち、ＳａｃＩ処理後に同じく末端平滑化を施したｐＲＫ４１５プラスミドへと挿入した。Ｄ断片の挿入は、Ｘ−Ｇａｌを用いた青白判定ならびに、プライマーｃｒｔＡｄｏｗｎ１およびｃｒｔＡｄｏｗｎ２を用いたＰＣＲにより確認した。Ｄ断片にはプラスミドへの挿入方向が２通り考えられるが、目的のものを制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ処理により選別した。構築したプラスミドをｐＲＫ−Ｄとした。【００６６】
プラスミドｐＧＥＭ−ＵＫからＵＫ断片をＥｃｏＲＩ処理により切出したのち末端平滑化し、同じく末端平滑化したプラスミドｐＲＫ−ＤのＰｓｔＩサイトに挿入した。このＵＫ断片の挿入方向もまた２通りある。得られたプラスミドの中で、目的のものはプライマーｃｒｔＡｕｐ１およびｃｒｔＡｄｏｗｎ２を用いたＰＣＲによりＵＫＤ断片に相当する増幅断片を生じるが、もう一方は増幅断片が確認されない。この違いを利用し、各形質転換株のプラスミドに対してＰＣＲを行い（図１２）、目的のプラスミドｐＲＫ−ＵＫＤを得ることができた。【００６７】
得られたプラスミドｐＲＫ−ＵＫＤからプラスミドｐＳＭ３０６５へとＵＫＤ断片を移し変え、プラスミドｐＨＤＲ２を構築するために、新たに設計したプライマーｃｒｔＡｕｐ３およびｃｒｔＡｄｏｗｎ３を用いて一旦プラスミドｐＲＫ−ＵＫＤからＵＫＤ断片（約２．６ｋｂ）を増幅し、ＴＡクローニングを経てプラスミドｐＧＥＭ−ＵＫＤを構築した。形質転換株から抽出したプラスミドｐＧＥＭ−ＵＫＤを制限酵素ＳｐｅＩ処理して切出したＵＫＤ断片と、ＸｂａＩ処理により開環したｐＳＭ３０６５断片を混合し、ライゲーションさせた。ライゲーション反応液をＰＣＩ抽出およびエタノール沈殿操作を経て精製した後、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１  λ−ｐｉｒの菌懸濁液を添加してエレクトロポレーションによりプラスミドを導入した。その結果、ＴｃおよびＫｍを含有するＬＢ寒天プレート上にコロニーが観察され、抗生物質耐性様式やＰＣＲによるＵＫＤ断片の存在確認の結果から、目的のｐＨＤＲ２プラスミドの構築に成功したと考えられた。【００６８】
次いで、このプラスミドをＲｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  Ｗ−１Ｓへとコンジュゲーションを介して導入し、相同組換えを経て色素変異株を得た。【００６９】
コンジュゲーションの結果、プレート上には赤褐色、橙色、黄褐色、黄色、白色を呈する５種類のコロニーが観察された。橙色コロニーはさらにインキュベート期間を置くことで赤褐色を呈するに至った。また、黄褐色コロニーはピックアップして液体培養を続けるにつれて赤褐色を呈した。これら橙色、黄褐色、そして赤褐色のコロニーはその色調ならびにＫｍ耐性を持つことから一回交叉株であると考えられる。また、白色のコロニーはコンジュゲーションに用いた組換え大腸菌である。黄色コロニーはピックアップして液体培養を続けても色調は赤味を帯びず、目的の二回交差色素変異株である可能性が高いと考えられた。今回得られた黄色コロニーは３コロニーであり、これらをそれぞれｃｒｔＡ−３２、ｃｒｔＡ−３３、ｃｒｔＡ−３４株とした（図１３）。【００７０】
これら３つの色素変異株それぞれのｃｒｔＡ遺伝子をＰＣＲにより確認した。用いたプライマーは、ｃｒｔＡ遺伝子クローニングに用いたものである。野生型のｃｒｔＡ遺伝子からは１．５ｋｂの増幅断片が観察され、ＫｍＲ断片で置き換えた配列からは１．９ｋｂの増幅断片が得られると予想された。実際にＰＣＲを行った結果（図１４）、Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  Ｗ−１Ｓにおいては１．５ｋｂの増幅断片が、コンジュゲーションに用いた組換え大腸菌においてはＵＫＤ断片に含まれる領域の１．９ｋｂ増幅断片が観察された。また、一回交叉色素変異株であろうと予測された黄褐色のクローンからは１．５ｋｂ増幅および１．９ｋｂ増幅の２つのバンドが確認された。今回得られたｃｒｔＡ−３２株、ｃｒｔＡ−３３株、ｃｒｔＡ−３４株はいずれも１．９ｋｂ増幅断片しか示さず、目的の二回交叉株であることが示唆された。【００７１】
次に、これら３株のカロテノイド色素組成を解析した。３株それぞれを一晩培養し、凍結乾燥処理を経て色素抽出を行った。色素抽出操作ならびにＨＰＬＣ分析条件は前回行ったものと同様である。ＨＰＬＣの結果（図１５）、３株ともにＳＯの目立ったピークは見出されず、ＤＭＳＥおよびＳＥの高いピークが見られた。バイオセンサーシステムの基本となる色素変異株の機能においては問題は無いと判断できる。【００７２】
３．  まとめ
本実施例の結果は以下の通りである。
・  自殺ベクター  ｐＳＭ３０６５上にＵＫＤ断片を挿入し、プラスミドｐＨＤＲ２の構築に成功した。
・  プラスミドｐＨＤＲ２をＲｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  Ｗ−１Ｓ株に導入したところ、野生株の赤褐色を示さず、黄色を呈する新規色素変異株が得られた。
・  ＰＣＲでの確認を行った結果、この色素変異株のｃｒｔＡ遺伝子領域は、ｃｒｔＡ遺伝子のＯＲＦがＫｍＲに一部置き換えられているものに相当するバンドが見出され、また、一回交叉色素変異株に見られるような野生型ｃｒｔＡに相当するバンドが見出されなかった。
・  ＨＰＬＣを用いた色素組成解析の結果、得られた新規色素変異株にはＳＯの目立った蓄積は見出されなかった。
これらの結果から、得られた新規色素変異株ｃｒｔＡ−３２、ｃｒｔＡ−３３、ｃｒｔＡ−３４は目的の、相同二回組換えが起こった結果の変異株であると言える。また、その色素組成および安定した色調から、これらの色素変異株はバイオセンサーに応用可能であろうと考えられた。【００７３】
実施例１−Ｃ  ｃｒｔＡベクターの構築
１．本実施例の目的
これまでにも記述してきた通り、バイオセンサーには３つの要素として、宿主細菌、レポーター遺伝子、誘導性プロモーター配列が欠かせない。このうち、今回目的とするバイオセンサーシステムの宿主細菌たるＲｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  色素変異株の構築に成功したことを前実施例でまとめた。本実施例では、センサーシステム構築の次のステップとして、レポーター遺伝子の検討ならびにｃｒｔＡベクターの構築について記述する。【００７４】
バイオセンサー構築に用いるセンサープラスミドは、広宿主域ベクター、誘導性プロモーター、プロモーター下流に配置したレポーター遺伝子、レポーター遺伝子への誘導性プロモーター以外のプロモーターに由来するリードスルーを防ぐ目的で挿入されるターミネーターヘアピン配列の４種のＤＮＡ配列から構成される。このセンサープラスミドの前段階であり、誘導性プロモーターが挿入されていない段階のプラスミド、ｃｒｔＡベクターを構築し、その機能を検討するのが本実施例の目的である。このレポーター遺伝子にはｃｒｔＡのＯＲＦを、ターミネーター配列にはデータベース上のこれまでにＲｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍにおいて報告されている遺伝子配列中に存在が示されているものを用いる。また、目的とするｃｒｔＡベクター以外にも、ｃｒｔＡのプロモーター配列を有するタイプのベクターを構築する。これは色素変異株のＣｒｔＡ欠損がプラスミド上から発現されるｃｒｔＡにより相補されるかの確認を目的としてである。【００７５】
本実施例で用いたあるいは構築したプラスミドを表５に、プライマーを表６にまとめた。【００７６】
2006022235.tif 000006
【００７７】
2006022235.tif 000007
【００７８】
２．  ｃｒｔＡベクターの構築
ｃｒｔＡベクターの構築は以下のストラテジーに沿って行った。
使用したターミネーター配列は、Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  Ｗ−１Ｓがゲノム上に持つｐｕｆオペロンのｐｕｆＣ遺伝子下流域に存在するものを参考に設計した［Ｌ．Ｖａｓｉｌｙｅｖａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７７−７９：３３７−４５；Ｓ．Ｍａｓｕｄａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４（１６）：１０７９５−８０１］。ｐｕｆＣ遺伝子下流域に存在するヘアピン構造をもとに、ｔｅｒｍ１配列として５’−ＧＧＡＡＡＧＣＴＴＧＣＧＣＣＧＣＧＣＧＧＧＣＴＣＣＴＣＣＣＣＧＣＧＣＧＧＣＧＣＴＴＴＴＴＴＴＣＴＧＣＡＧＡＡ−３’の配列からなるオリゴヌクレオチドを設計した（図１６）。これは、ヘアピンのステム部分で１００％の相補が可能であり、両サイドに制限酵素サイト（ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ）を設計している。また、この配列を用いてｃｒｔＡベクターを構築した場合を想定したΩ：：ＳＤ：：ｃｒｔＡ  ＯＲＦ配列に関してプロモーター類似配列が生じ得ないかをＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０．０（ソフトウエア開発株式会社）プログラムを用いて検索し、プロモーター配列との類似性が比較的高いヘアピン構造上の箇所については適宜塩基配列の変更を行い設計している。この配列を鋳型に、ｔｅｒｍ１の３’末端に相補的なプライマーｔｅｒｍ２を用いてＰＣＲの要領で５サイクルの伸長反応を経て５４ｂｐのΩ配列を作製した。この断片を精製後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ処理を一晩行い、両末端を付着末端にした。プラスミドｐＲＫ４１５上に存在するＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩサイトにこの断片を挿入し、ｐＲＫΩプラスミドを構築した。この確認はＤＮＡ配列を解読することで行った。このプラスミドにｃｒｔＡ断片を挿入し、ｃｒｔＡベクターを構築する。【００７９】
ｃｒｔＡ断片はＲｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  Ｗ−１Ｓゲノムを鋳型としたＰＣＲで増幅したのち、ＴＡクローニングを介してｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ上に挿入した。このＰＣＲにはプライマーｃｒｔＡｒｖ１ならびにｃｒｔＡｒｖ３を用いた。このＰＣＲにより増幅される断片は、ｃｒｔＡ開始コドンの約３００ｂｐ上流から停止コドンの約３０ｂｐ下流に至る配列を含み、この断片の制限酵素処理により得られる断片のパターンがシーケンスデータから予測されたものと一致したことから確認された。すなわち、このｃｒｔＡ配列中にはｃｒｔＡ遺伝子のＯＲＦ、ＳＤ配列ならびにプロモーター（Ｐｃｒｔ）が含まれる。この断片を挿入して構築したプラスミドをｐＧＶ２とした。【００８０】
プラスミドｐＧＶ２上のｃｒｔＡ断片の全長あるいは部分的な配列をそれぞれ精製し、ｐＲＫΩプラスミドへと挿入することで２種類のプラスミドを構築した（図１７）。一つは、ｐＧＶ２プラスミド上のｃｒｔＡ配列全長を制限酵素ＳｐｈＩ−ＳｐｅＩ処理により切出しＴ４  ＤＮＡ  ポリメラーゼ処理により平滑末端化したのちにｐＲＫΩの同じく平滑末端化したＥｃｏＲＩサイトへと連結させることで構築した、Ω：：Ｐｃｒｔ：：ＳＤ：：ｃｒｔＡ  ＯＲＦ配列を含むｐＲＶ１Ωプラスミドである。プラスミドｐＲＶ１Ωを色素変異株へと導入すると、プラスミド上からｃｒｔＡ遺伝子が発現されると考えられ、それにより色素変異株のＣｒｔＡ欠損が相補され赤色の形質転換株を生じると予想される。もう一つは、ｐＧＶ２プラスミドを鋳型にプライマーｃｒｔＡｒｖ２およびｃｒｔＡｒｖ３を用いた断片から上記と同様の過程を経て構築した、Ω：：ＳＤ：：ｃｒｔＡ  ＯＲＦ配列を含むｐＲＶ５Ωプラスミドである。このプラスミドは目的とするｃｒｔＡベクターであり、ｐＲＶ５Ω導入色素変異株においてＳＯ蓄積が見られないならば、Ω配列は機能面で問題無くプラスミド上Ｐｌａｃ由来のリードスルーを抑えることが示されることになる。【００８１】
これら２種のプラスミドをそれぞれコンジュゲーションを介して色素変異株ｃｒｔＡ−３２株へと導入した。Ｋｍ  ３０μｇ／ｍｌ、Ｔｃ  ５μｇ／ｍｌ含有４ＣｙＭＯＭ寒天プレート上に得られたコロニーを単離し、同濃度の抗生物質を含む液体培地中で培養を行った。培養液から細胞を回収後、一晩凍結乾燥を行い、色素抽出後にＨＰＬＣ解析を行った（図１８）。プラスミドｐＲＶ１Ω導入株においては顕著なＳＯ蓄積が観察され、期待通り、プラスミド上から発現したｃｒｔＡが色素変異株のＣｒｔＡ欠損を相補したものと考えられた。このことから、色素変異株においてはｃｒｔＡ遺伝子をレポーター遺伝子として利用することが可能であると言える。また、ｃｒｔＡ遺伝子ＯＲＦ上流にＳＤ配列を持つｐＲＶ５Ωプラスミドを導入した形質転換株においてはＳＯ蓄積がほとんどみられない。ＳＤ配列が存在するため、Ｐｌａｃからのリードスルーが起こればこの形質転換株はｃｒｔＡを発現すると考えられるが、ＳＯ蓄積が見られなかったことはすなわち、今回用いたターミネーター配列は目的の機能を発揮し、Ｐｌａｃ由来のリードスルーを抑えることができたものと考えられ、目的のｃｒｔＡベクターの構築に成功したと言える。【００８２】
３．  まとめ
本実施例の結果は以下の通りである。
・  ＣｒｔＡ欠損による色素変異株に対して、ｃｒｔＡ遺伝子は黄色から赤色への色調変化に基づくレポーター系として利用することが可能であると判明した。
・  機能面に優れたターミネーター配列を設計し、この配列によりその上流からの転写が抑えられることが示された。
・  Ω配列ならびにＳＤを含むｃｒｔＡ  ＯＲＦ配列を挿入したｐＲＶ５Ωプラスミドの構築に成功した。このプラスミドからはｃｒｔＡ発現がリードスルーを含めて起こらないことが確認された。
これらの結果から、バイオセンサー構築過程の第二ステップであるｃｒｔＡベクターの構築に成功したと言える。このｃｒｔＡベクターに誘導性プロモーターを挿入することでセンサープラスミドが構築できると考えられる。【００８３】
５．  結論
実施例１の内容について以下にまとめる。
１．  Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  Ｗ−１Ｓゲノム上のｃｒｔＡ遺伝子ＯＲＦの大半をカナマイシン耐性遺伝子カセットで置換した形のＣｒｔＡ欠損色素変異株の構築に成功した。この色素変異株においては赤色色素の蓄積は認められなかった。
２．  Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ色素変異株へ、ｃｒｔＡ遺伝子上流域にｃｒｔＡプロモーターを持つプラスミドｐＲＶ１Ωを挿入して色素組成を解析した結果、色素変異株においてＲｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍのｃｒｔＡ遺伝子をレポーター遺伝子として利用することが可能であると示された。【００８４】
実施例２
実施例２−Ａ  硫黄化合物誘導性プロモーター
１．本実施例の目的
Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍにおいてこれまでに報告され配列が判明している遺伝子は少なく、なおかつその発現に転写調節が関わっていることが明らかとなっているものは限られている。そのような限られた情報の中に、Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍのＤＭＳデヒドロゲナーゼに関するものがある。【００８５】
ＤＭＳ（ジメチルスルフィド）は医薬や農薬など各種の有機硫黄化合物の出発原料として、あるいは、付臭剤として利用される臭気物質である。また、地球環境規模では硫黄循環に含まれており、植物プランクトンにより海洋にて産生され、大気中に放出されたのち酸化を受けて硫酸となることが知られている。硫酸はその蒸気圧の低さから粒子化し、雲の凝結核を形成する。雲の形成により太陽光が遮断、反射されることが温暖化抑制の観点から注目され、地球の気候変動への寄与の調査目的から海洋におけるＤＭＳ濃度変動の調査などが行われてきている［Ｍ．Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｎｉｐｐｏｎ  Ｎｏｇｅｉｋａｇａｋｕ  Ｋａｉｓｈｉ，７３（１）：３５−４４］。【００８６】
以上を踏まえると、ＤＭＳセンサーの応用用途として、微量ＤＭＳ汚染の検出、ＤＭＳ除去が正常になされたかどうかの検査、地球環境レベルのＤＭＳ変動の調査などが考えられる。【００８７】
本実施例では、Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍで報告されているＤＭＳデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターがバイオセンサーへの利用に適したものであるかの検討を行い、良好なデータが得られた場合にはこれをクローニングし、センサープラスミドの構築を目指す。【００８８】
本実施例で用いたあるいは構築したプラスミドを表７に、プライマーを表８にまとめる。なお、本実施例で用いたその他の実験材料および方法は実施例１と同じである。【００８９】
2006022235.tif 000008
【００９０】
2006022235.tif 000009
【００９１】
２．  ＤＭＳデヒドロゲナーゼ遺伝子オペロン
ＤＭＳデヒドロゲナーゼは、ＤＭＳを酸化しジメチルスルフォキシドを生じる反応を担う酵素で、これまでに、Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍにおいて存在が確認され、酵素タンパクが精製されるに至っている［Ｓ．Ｐ．Ｈａｎｌｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４０：１９５３−８；Ｓ．Ｐ．Ｈａｎｌｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３９：３９１−６］。ＤＭＳデヒドロゲナーゼは、ジメチルスルフォキシドをＤＭＳへと還元する反応を担うジメチルスルフォキシドレダクターゼと同じファミリーに属する酵素であることが示唆されており、酵素タンパクの発現が基質の存在により誘導されることが証明されている。つまり、Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍのＤＭＳデヒドロゲナーゼのＤＭＳによる誘導がタンパク発現のレベルで起こりうることは確認されている。また、近年ではＤＭＳデヒドロゲナーゼタンパクをコードする遺伝子オペロン（ｄｄｈＡＢＤＣ）が同定され［Ｃ．Ａ．ＭｃＤｅｖｉｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌ．ｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４４（６）：１５７５−８７］、その塩基配列もデータベースから利用可能である（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＦ４５３４７９）。ｄｄｈオペロンの上流には、Ｒｂ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓのジメチルスルフォキシドレダクターゼ系の二成分制御系（ＤｏｒＲ、ＤｏｒＳ）の一方であるＤｏｒＳタンパクにＮ末端アミノ酸配列同士が類似すると推測されるＤｄｈＳをコードすると考えられるｄｄｈＳ遺伝子配列の存在も示唆されている。しかしながら、ｄｄｈオペロンに関してデータベース上に登録されている情報はｄｄｈＡ遺伝子開始コドンより下流域に限られており、そのプロモーター配列やさらなる上流域の情報は公開されていない。したがって、ｄｄｈオペロンのプロモーター（Ｐｄｄｈ）をバイオセンサーに応用する場合には、（ｉ）ＰｄｄｈはＤＭＳの存在下で下流遺伝子の転写を誘導すること、（ｉｉ）ｄｄｈＡ上流域をクローニングし、その配列を明らかにすることの二点が必要となる。【００９２】
まずはＰｄｄｈのＤＭＳ誘導性を検討することにした。プライマーｄｄｈＡ１ならびにｄｄｈＡ２をデータベース上のｄｄｈＡ遺伝子配列をもとに設計した。また、Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  Ｗ−１ＳのｒＲＮＡ配列情報（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ５５２７７）をもとにプライマーｒｒｎａ１およびｒｒｎａ２を設計した。これらのプライマーを用いたＰＣＲでｄｄｈＡ遺伝子領域に含まれる約１．５ｋｂ領域またはｒＲＮＡ配列約７００ｂｐを増幅することが確認できた（図１９）。これらの増幅断片が目的の断片であることは複数種の制限酵素でそれぞれ処理して得られる断片のパターンから確認した。これらのプライマーを用い、ＲＴ−ＰＣＲを介してＤＭＳ添加によるｄｄｈＡ遺伝子の転写誘導を解析した。【００９３】
Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  Ｗ−１Ｓを４ＣＭＯＭ培地にてＤＭＳ添加、ジメチルスルフォキシド添加あるいはいずれも添加しない条件で３日間培養し、対数増殖期で培養液から細胞を回収した。これよりＲＮＡを抽出し、ＤＮａｓｅ処理後に精製したものに対してＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲの際、ｄｄｈＡをターゲットとしたものは４０サイクル、ｒＲＮＡを標的としたものは２０サイクルに設定した。また、ゲノムＤＮＡが混入していないことを確認するためプライマーｃｒｔＡｕｐ１およびｃｒｔＡｒｖ３を用いたＲＴ−ＰＣＲを併せて行った。これは、ｃｒｔＡ遺伝子開始コドンより６００ｂｐ上流からｃｒｔＡ  ＯＲＦの停止コドン下流に至る領域をターゲットとしており、この領域の転写は全長に渡ってはなされないと考えられる。ＲＴ−ＰＣＲの結果（図２０）、光好気条件ならびに暗好気条件ではＤＭＳ添加により明白なｄｄｈＡ遺伝子転写誘導が観察された。この際、ゲノムＤＮＡの混入は確認されていない。また、ジメチルスルフォキシド添加によるｄｄｈＡ遺伝子転写の顕著な誘導は見られないが、わずかに光嫌気条件でその傾向が見られた。硫黄化合物非添加条件においては、光好気条件ならびに暗好気条件のいずれにおいても低いながらもゼロではないｄｄｈＡ転写活性が見られ、Ｐｄｄｈが受ける抑制は非常に強力なものではないと思われた。さらに、光嫌気条件においては硫黄化合物非添加でも比較的強いｄｄｈＡ誘導活性が見られることから、ＰｄｄｈはＤＭＳによる制御のみならず、細胞内酸化還元平衡が関わっている可能性が示唆された。これは、Ｒｂ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓのジメチルスルフォキシドレダクターゼ遺伝子調節に関わる二成分制御系において示唆されている、ジメチルスルフォキシドによる活性化経路ならびに光刺激やＲｅｄｏｘ制御系を介して調節される経路の存在と類似している［Ｎ．Ｊ．Ｍｏｕｎｃｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８０（２１）：５６１２−８］。【００９４】
以上から、ＤＭＳ添加により光好気条件でｄｄｈＡ遺伝子の著しい転写誘導が確認され、Ｐｄｄｈを用いることでＤＭＳバイオセンサーの構築が可能であると考えられた。【００９５】
３．  プロモーターＰｄｄｈのクローニング
続いて、ｄｄｈＡ上流域に存在するであろうＰｄｄｈをクローニングし、その塩基配列の解読を行った。その領域は配列が既知のｄｄｈＡ遺伝子に隣接する配列未知領域であるため、このような領域のクローニングに適した手段であるインバースＰＣＲ法［Ｈ．Ｏｃｈｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２０：６２１−３］を用いることにした。以下にこの手法を概説する（図２１）。配列既知遺伝子領域に隣接した配列の両方あるいは片方をクローニングするのに優れたこの手法はまず、ゲノムＤＮＡを単一の制限酵素で処理することが最初のステップとなる。こうして生じた断片を自己ライゲーションさせ環状化し、これを鋳型に予め配列既知遺伝子配列をもとに、従来の遺伝子配向から見て外向きに設計したプライマーを用いてＰＣＲを行う。増幅され得られる断片は配列が未知の領域を特異的に含んだ配列であり、これをクローニングすることが容易となる。【００９６】
ｄｄｈＡ遺伝子のＯＲＦは２７３３ｂｐであることが報告されている。プライマーｄｄｈＡ１およびｄｄｈＡ２のターゲット領域は、ｄｄｈＡ開始コドンを＋１とすると＋８０１から＋２２４０の領域に当たり、この下流域にはｄｄｈＡ  ＯＲＦ中で唯一のＳａｌＩサイトが＋２７１３の位置に存在している。したがって、Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  Ｗ−１Ｓ株ゲノムに対してＳａｌＩ処理を行った場合、少なくとも２７００ｂｐ以上の大きさの断片中にｄｄｈＡ上流の未知配列とｄｄｈＡ  ＯＲＦの大半が含まれることになり、その断片の検出はプライマーｄｄｈＡ１ならびにｄｄｈＡ２を用いることで可能であると考えられる。これに基づき、前述のインバースＰＣＲ手法を介してｄｄｈＡ遺伝子上流域をクローニングすることにした。【００９７】
まず、Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  Ｗ−１ＳのゲノムＤＮＡをＳａｌＩで一晩処理し、反応液を１％アガロースゲル電気泳動したものから、２〜３ｋｂ分画、３〜４ｋｂ分画、４〜６ｋｂ分画、６ｋｂ〜分画の４分画を切出した（図２２）。それぞれの分画に含まれる混在したＤＮＡ断片を鋳型にしてプライマーｄｄｈＡ１およびｄｄｈＡ２を用いてＰＣＲを行った（図２３）。この結果、少なくとも３〜４ｋｂ分画でｄｄｈＡ遺伝子が存在していることが確認できた。この３〜４ｋｂ分画ＤＮＡ溶液に対して一晩ライゲーション反応を行った。この反応液を鋳型に、プライマーｉ−ｄｄｈＡ１およびｉ−ｄｄｈＡ２を用いてインバースＰＣＲを行った（図２４）。こうして増幅に成功した断片のＴＡクローニングを試みた結果、約６００ｂｐ断片のクローニングに成功し、このプラスミドをｐＧＥＭ−Ｉ３４とした。プライマーにｉ−ｄｄｈＡ１ならびにｉ−ｄｄｈＡ２を用いてシーケンスを行った結果、ｐＧＥＭ−Ｉ３４プラスミドに挿入されている断片がｄｄｈＡ遺伝子のＯＲＦ上流側を含む上流域４５３ｂｐおよびｄｄｈＡ遺伝子ＯＲＦ下流側１０９ｂｐにより構成されていることが明らかになった。図２５において、シーケンスの結果明らかになった、ＳａｌＩサイトからｄｄｈＡ開始コドンに至るｄｄｈＡ上流域配列（配列番号１）を示す。ｐＧＥＭ−Ｉ３４プラスミド上では、このＳａｌＩサイトより上流には＋２７１３の位置より上流側のｄｄｈＡ遺伝子ＯＲＦが連結されている。【００９８】
クローニングに成功した約３５０ｂｐ領域についての解析から、ｄｄｈＡのＳＤ配列が見出され、また、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮプログラムを用いた解析の結果、−１５０近傍にプロモーター配列と推測されるものが２箇所見出された。しかしながら、プロモーターの活性の制御に関わるシステムを示唆するモチーフやＲｂ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓのジメチルスルフォキシドレダクターゼオペロンに見られるゲノム上の二成分制御系結合領域であるＤｏｒ  Ｂｏｘに類似の配列［Ｎ．Ｊ．Ｍｏｕｎｃｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８０（１１）：２９２４−３０］は見出すことができなかった。制御領域の特定には至らなかったが、今回クローニングした断片から見出されたプロモーター様領域や以前になされたｄｄｈＡ上流域に関する報告［Ｃ．Ａ．ＭｃＤｅｖｉｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌ．ｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４４（６）：１５７５−８７］を踏まえると、この領域にＰｄｄｈが含まれる可能性は比較的高いと考えられ、この領域をＰｄｄｈ領域としてセンサープラスミドを構築することにした。【００９９】
４．  まとめ
本実施例の結果は以下の通りである。
・  ＤＭＳデヒドロゲナーゼをコードするｄｄｈ遺伝子オペロンのプロモーターＰｄｄｈによる下流遺伝子の転写がＤＭＳ存在下で誘導されることが示された。
・  ｄｄｈＡ遺伝子上流域約３５０ｂｐのクローニングに成功し、その塩基配列が明らかとなった。
・  制御系についてはなお不明だが、Ｐｄｄｈと考えられる領域を見出すことができた。
今回クローニングに成功したｄｄｈＡ上流域には目的のＰｄｄｈが含まれると予想され、この領域をｃｒｔＡベクターへと挿入することでＤＭＳバイオセンサー構築に必要なセンサープラスミドの構築が可能ではないかと考えられる。【０１００】
実施例２−Ｂ  ＤＭＳバイオセンサーの構築
１．  本実施例の目的
これまでに、バイオセンサーの構成要素として、色素変異株の作製、レポーター遺伝子を含むｃｒｔＡベクターの構築、ＤＭＳ誘導性プロモーターのクローニングを行ってきた。本実施例では、最終段階としてバイオセンサー構築を行い、その機能評価を行った。【０１０１】
バイオセンサー構築にむけて、まず、誘導性プロモーターをｃｒｔＡベクターへと組込みセンサープラスミドを構築し、続いてセンサープラスミドを色素変異株へと導入する。こうして得られる色素変異株はバイオセンサーとして予測される機能、すなわち、ＤＭＳ非添加条件ではｃｒｔＡ発現が起こらず色素変異株と同等の色調を示し、ＤＭＳ添加時にはｃｒｔＡ発現により培養液の色調が変化すると考えられる。【０１０２】
本実施例で用いたあるいは構築したプラスミドを表９に、プライマーを表１０に示す。【０１０３】
2006022235.tif 000010
【０１０４】
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【０１０５】
２．  ＤＭＳバイオセンサー株の作製
プラスミドｐＧＥＭ−Ｉ３４を鋳型に、プライマーｐｄｄｈ１およびｐｄｄｈ２を用いてＰＣＲを行った。これは鋳型プラスミド上のｄｄｈＡ上流域に対してＳａｌＩサイトからｄｄｈＡのＳＤ配列の上流に至る約３２０ｂｐをターゲットとしている。この配列中にＳＤ配列は含まれない。増幅された断片が目的配列であることは制限酵素処理により生じる断片のパターンとｄｄｈＡ上流域シーケンスデータとを照らし合わせて確認した。この断片をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ上へＴＡクローニングし、プラスミドｐＧＰｄｄｈを構築した。この断片をＸｂａＩ処理により切出し、ｃｒｔＡベクターであるプラスミドｐＲＶ５ΩのΩとｃｒｔＡ  ＯＲＦとの間に存在するＸｂａＩサイトへと挿入し、センサープラスミドｐＳＤＭＳを構築した（図２６）。構築したプラスミドへのＰｄｄｈ断片挿入にはその配列の配向から２通りのパターンが考えられるが、形質転換コロニーからＤＮＡを抽出してＰＣＲを行い、プライマーｐｄｄｈ１とｃｒｔＡｒｖ３の組合せで増幅断片を生じ、かつ、プライマーｐｄｄｈ２とｃｒｔＡｒｖ３の組合せで増幅断片を生じないものを目的のプラスミドを保持するクローンと断定した。【０１０６】
次に、構築に成功したセンサープラスミドをコンジュゲーションを介して色素変異株へと導入した。得られた形質転換株は黄褐色コロニーを形成した。ＫｍならびにＴｃに耐性を示したことやＰＣＲから、この形質転換株にはセンサープラスミドが導入されていることが確認できた。この形質転換株を、ＤＭＳ非添加で光好気条件下３日間培養を行い、色素組成の解析を行った。その結果（図２７）、全体的に色素変異株の色素組成に類似したＨＰＬＣチャートが得られた。ＳＯの蓄積もわずかながら観察されるが、これは前実施例の図１８で観察された、硫黄化合物非添加時の弱いｄｄｈＡ転写活性から説明できる。ＤＭＳバイオセンサーとしては、ＤＭＳ添加時の誘導がこの微量のＳＯ蓄積を大きく上回るような著しいレベルであれば問題は無いと考えられた。【０１０７】
３．  ＤＭＳバイオセンサー株の機能評価
続いて、構築したバイオセンサー株に対してＤＭＳを添加し、その機能を評価することにした。まず、培養初期からＤＭＳを添加し、ＤＭＳに対する応答が見られるかを検討した。【０１０８】
ＤＭＳは水に難溶であるため、濃縮ストックの作製や希釈系列の調製にはエタノールを溶媒に用いた。ＤＭＳを含むエタノールは培養液に対して０．１％容量添加し、コントロールとしてはエタノールのみを０．１％容量添加した。また、各サンプルで添加したＤＭＳの終濃度が３ｍＭ、０．３ｍＭ、３０μＭ、３μＭ、０．３μＭとなるよう調製し、すべてのサンプルで実験試行ｎ＝３とした。培養は光好気条件において行ない、３日目（対数増殖期）および６日目（静止期）に色調観察ならびに集菌サンプルからの色素組成解析を行った。色素組成の解析はこれまでと同様にＨＰＬＣ解析を介して行ったが、得られたＨＰＬＣチャートに示された各ピークの面積値より全カロテノイド色素（ＤＭＳＯ、ＤＭＳＥ、ＳＯ、ＳＥ、ノイロスポレン）の総計に対する赤色色素（ＤＭＳＯおよびＳＯ）の比率を算出した。各サンプルについてこの値から平均値ならびに標準偏差を算出し、グラフを作製した。培養３日目の色調ならびに赤色色素比率を図２８に、培養６日目の同データを図２９に示す。培養３日目において、特に３ｍＭ  ＤＭＳ添加サンプルで有意なＳＯ蓄積が観察され、その色調もコントロールに比較して識別が可能であった。このことから、今回用いたプロモーター配列には目的としたＰｄｄｈが含まれていることが示唆され、また、構築したバイオセンサー株は当初の目的とした「視覚的バイオセンサー」としての機能を持つことが明らかとなった。また、培養６日目においては有意なＳＯ蓄積がＤＭＳ濃度３０μＭ（２ｐｐｍ）サンプルから観察されており、ＤＭＳ応答の濃度依存性や微量での応答性が示唆された。【０１０９】
４．  まとめ
本実施例の結果は以下の通りである。
・  ｄｄｈＡ遺伝子上流域配列中にｄｄｈオペロンプロモーターＰｄｄｈが含まれることが示された。
・  ＤＭＳセンサープラスミドの構築に成功した。
・  ＤＭＳセンサープラスミドを導入した色素変異株はＤＭＳ添加条件での培養において有意な赤色色素蓄積を示したことから、ＤＭＳバイオセンサーの構築に成功したと言える。
・  ＤＭＳバイオセンサー株のＤＭＳ応答による色調変化は目視で識別が可能なレベルに達し、「視覚的バイオセンサーシステム」の構築に成功した。【０１１０】
５．  結論
実施例２の内容について以下にまとめる。
１．  ＤＭＳデヒドロゲナーゼをコードするｄｄｈ遺伝子オペロンの転写がＤＭＳの存在により誘導されることを明らかにし、そのプロモーター配列を含むｄｄｈＡ上流域のクローニングに成功した。
２．  色素変異株、ｃｒｔＡ遺伝子、ｄｄｈＡプロモーターを組合せて用い、ＤＭＳに応答して黄色から黄褐色への色調変化を伴う「視覚的バイオセンサー」の構築に成功した。【０１１１】
実施例３
実験材料および方法
１：  本実施例で用いた菌株および培地
本実施例で用いた菌株を表１１に、培地を表１２に示す。
Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  Ｗ−１Ｓ株およびそれぞれの変異株や形質転換株の培養には４ＣｙＭＯＭ培地を用いた。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１株、およびそれぞれの形質転換株の培養にはＬＢ培地を用いた。それぞれの培地には必要に応じてアンピシリン（Ａｍｐ）、カナマイシン（Ｋｍ）、テトラサイクリン（Ｔｃ）をそれぞれ終濃度５０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌになるように加えた。ただし、Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍについてはＴｃ添加量を終濃度５μｇ／ｍｌとなるようにした。
形質転換過程の一時的な培養時にはＳＯＣ培地を用いた。【０１１２】
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【０１１３】
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【０１１４】
２：  ｔｏｔａｌ  ＤＮＡの抽出
Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  Ｗ−１Ｓ株からのｔｏｔａｌ  ＤＮＡ抽出は「バイオ実験イラストレイテッド（ｉｉ）遺伝子解析の基礎」（西方敬人著（１９９５）秀潤社）のプロトコールに従って行った。【０１１５】
３：  ＰＣＲ
ＰＣＲはＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＴａｑＴＭ  ｗｉｔｈ  ＧＣ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ社）を用いて添付のプロトコールに従って操作を行った。鋳型としては各ｔｏｔａｌ  ＤＮＡやプラスミドＤＮＡを用いるか、または培養液やコロニーを懸濁した液を用いた。後者の場合は培養液５０μｌもしくはコロニーを５０μｌのＨ２Ｏに懸濁した液を９５℃で５分間加熱処理し、遠心上清を鋳型としてｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲを行った。ＰＣＲの基本プログラムは、図３０に示した。このプログラムにおいて、アニーリング温度と伸長反応時間は各ＰＣＲにおいて適宜変更した。【０１１６】
４：  ゲルからのＤＮＡ断片回収、ライゲーション、形質転換
ＰＣＲで増幅された断片をクローニングする際はｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒに組込んだ後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入した。方法はｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍのプロトコールに従って行った。また、プラスミドＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１に導入する際にも同プロトコールに従った。
制限酵素で処理したＤＮＡ断片はアガロースゲルで電気泳動した後、ゲルから切り出して回収した。ゲル断片からＤＮＡを抽出する際には透析チューブを用いて行った［村松正寛編「ラボマニュアル遺伝子工学」（１９８８）丸善株式会社］。ゲルが入らないように注意しつつ透析チューブ内の液を回収した後、ＰＣＩ（フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール）での抽出［西方敬人著「バイオ実験イラストレイテッド（ｉ）分子生物学実験の基礎」（１９９５）秀潤社］およびエタノール沈殿にてＤＮＡを回収した。エタノール沈殿操作においてはＤＮＡ回収効率を向上させる目的で共沈剤としてグリコーゲン（ナカライテクス）を用いた。
切り出したＤＮＡ断片をライゲーションする際にはＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（ＴａＫａＲａ社）を用いて行った。【０１１７】
５：  プラスミドＤＮＡの抽出
プラスミド抽出は  ＣＯＮＣＥＲＴ  Ｒａｐｉｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）またはＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて行った。【０１１８】
６：  コンジュゲーション
組換えプラスミドを導入した大腸菌からＲｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍへプラスミドＤＮＡを導入する際にコンジュゲーションを行った。方法は以下に記す通りである。また、以下の操作で用いるものはすべてオートクレーブ滅菌を行ったものである。
Ｅ．ｃｏｌｉは試験管中の１０ｍｌ  ＬＢ培地中で３７℃振盪培養し、Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍはＲｏｕｘ  ｂｏｔｔｌｅ中の３０ｍｌ  ４ＣｙＭＯＭ培地中でスターラーで撹拌しつつ光条件下で培養を行った。Ｅ．ｃｏｌｉはＯＤ６６０≒０．２、Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍはＯＤ６６０≒１．６になるまで培養し、それぞれの菌液１７０μｌ、６０μｌをエッペンドルフチューブに混合した。集菌後２３０μｌ  ＬＢ培地に再懸濁し、その液を２％ＮａＣｌ  ＬＢ寒天プレート上のＭＦ−ミリポア  タイプＨＡメンブレンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）の上に広げた。３２℃下オーバーナイトでプレートを静置した後、メンブレンをバイアル中に回収した。バイアル中に２５０μｌ  ４ＣｙＭＯＭを加えてボルテックスすることでメンブレン上の菌を集菌して洗菌した後、４ＣｙＭＯＭに再懸濁した。菌液を４ＣｙＭＯＭ寒天プレート上に塗布し、光条件下で数日間インキュベートした。【０１１９】
７：  ＤＮＡシーケンス
ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ上にクローニングした断片の塩基配列解読には、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ−ＭおよびＭ４（ＴａＫａＲａ社）、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｗｉｔｈ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＦＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた。サンプルの調製はキットに添付のプロトコールに従って行い、シーケンサの操作は機器に付属のマニュアルに従って行った。【０１２０】
８：  色素解析
Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍの野生株もしくは変異株や形質転換株各種のカロチノイド色素組成解析は以下の方法で行った。
細菌株を３０ｍｌ培地入りのＲｏｕｘ  Ｂｏｔｔｌｅで微好気・明条件・マグネティックスターラーにより撹拌しつつ一晩培養した。その後菌液１ｍｌを採取し、卓上遠心機ＨＩＴＡＣＨＩ  ＣＥＮＴＲＩＦＵＧＥ  ＳＣＴ１５Ｂ（日立工機社）を用い、１４，０００ｒｐｍ、５分の遠心分離操作後に上清を捨て、菌ペレットを−８０℃で３０分間凍結させ、菌体を１晩凍結乾燥した。得られた凍結乾燥体を遠心チューブからバイアルに移し、これにアセトン：メタノール７：２（ｖ／ｖ）混液１５０μｌを加え、２分間ｖｏｌｔｅｘを行った［Ｓ．Ｔａｋａｉｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈ．Ｒｅｓ．，６７：２０７−１４］。この懸濁液を濾過したものを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析サンプルとした。
また、細菌株の培養を試験管中の１０ｍｌ培地中で各種条件（微好気・明、微好気・暗、嫌気・明）下で行った際には、培養を３日間行った後、培養液をエッペンドルフチューブに１ｍｌずつ取り、遠心後のペレットを−８０℃で２時間凍結させた後に一晩凍結乾燥した。得られた凍結乾燥体にアセトン：メタノール混液を１５０μｌ加え、２分間ｖｏｌｔｅｘ後に卓上遠心機で１４，０００ｒｐｍ、２分間遠心分離した上清をＨＰＬＣ分析サンプルとした。
ＨＰＬＣ分析は、島津高速液体クロマトグラフィー用機器、送液ユニットＬＣ−１０ＡＳ、オートインジェクタＳＩＬ−９Ａ、紫外可視分光光度計検出器ＳＰＤ−１０Ａ、ならびにクロマトパックＣ−Ｒ３Ａ（島津製作所）、そして、μＢｏｎｄａｐａｋＴＭ  Ｃ１８  １２５Å  １０μｍ  ３．９×３００ｍｍ  ＨＰＬＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ社）を用いて行った。液相にはメタノールを用い、測定波長４８１ｎｍで検出を行った。サンプルの注入量、液相の流速、クロマトパックの記録条件などはサンプル濃度などの条件により適宜変更した。【０１２１】
９：  ＲＮＡ抽出、ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡ抽出はＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、添付のプロトコールに従って行った。この際の細胞溶解にはリソチームをプロトコールに指定された濃度で添加した。混入したＤＮＡの除去にはＤＮａｓｅ  Ｉ（ＴａＫａＲａ社）を添付の緩衝液とともにプロトコールに指示された方法で用いた。インキュベーションは３７℃で６０分間行い、その後ＰＣＩ処理ならびにエタノール沈殿操作を経てＲＮＡを精製した。精製ＲＮＡ  １μｇを鋳型に、ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１（ＴａＫａＲａ社）を用いて逆転写反応を行った。逆転写反応はＫｉｔに含まれる逆転写酵素、ＲＮａｓｅ阻害剤、ランダム９マー、緩衝液、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ２を用い、４５℃で２８分間行った。逆転写反応後の溶液４μｌを鋳型に用い、上記「３：ＰＣＲ」の項と同様にＰＣＲ反応を行った。【０１２２】
１０：  プローブ作成、サザンハイブリダイゼーション
プローブ作成はＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用い、附属のマニュアルに従って行った。
サザンハイブリダイゼーションに用いるメンブレン作成は以下の通りに行った。まず、ゲノムＤＮＡ１０μｇを用いて各種制限酵素処理を２４時間行った。その後、アガロースゲルを用いて４０Ｖ、１４時間電気泳動後、臭化エチジウム染色によりバンドを確認した。次にアルカリトランスファー法によりＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）メンブレンにブロッティングを行い、２×ＳＳＣで洗浄後に８０℃、２ｈインキュベートすることで固定化した。  固定化したメンブレンに対して、プローブのハイブリダイゼーションを２４時間行い、洗浄後に蛍光基質を添加した。蛍光測定はＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ５９５（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて行った。【０１２３】
実施例３−Ａ  好適な砒素誘導性プロモーターの選択
１．本実施例の目的
高感度の砒素検出バイオセンサーを作成するためには、用いる砒素誘導性プロモーターの種類が重要である。この点について、特に細菌においては、砒素耐性遺伝子群ａｒｓオペロンの発現制御に微量濃度の砒素に応答性を示す制御タンパクをコードするａｒｓＲが関与していることが知られており［Ａ．ｃａｒｋｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７（４）：９８１−６］、これを本発明のバイオセンサーの制御領域として利用することで、高感度の砒素検出バイオセンサーを作成できると考えられる。【０１２４】
そこで、本実施例においては、砒素に対して応答性を示し、ｃｒｔＡの発現制御に必要なａｒｓＲをＲｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍから探索することを試みる。【０１２５】
本実施例において構築したプラスミドを表１３に、プライマーを表１４に示す。
2006022235.tif 000014
2006022235.tif 000015
【０１２６】
２．  サザンハイブリダイゼーションによるａｒｓＲの探索
まず、Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍを含む光合成細菌において、砒素耐性遺伝子が存在するかを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｒｓＲの塩基配列情報を用いてブラストサーチ解析を行うことにより確認した。その結果、Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍの近縁種であるＲｂ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓが、ａｒｓＲＢＣと比較的高いスコアの相同性を示す配列を有していることが判った。このことから、Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍもａｒｓＲを含む砒素耐性遺伝子を有していることが予想できた。そこで、Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｒｓＲをプローブとしたサザンハイブリダイゼーションにより、Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍのａｒｓＲのクローニングを試みた。まず、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２のゲノムＤＮＡを鋳型に、プライマーＥ．ｃｏｌｉ−ａｒｓＲ−Ｓ１およびＥ．ｃｏｌｉ−ａｒｓＲ−Ａ１を用いてＰＣＲを行った。この結果得られる断片を精製し、アルカリフォスファターゼを架橋反応により結合させ、蛍光検出が可能なプローブとして用いた。プローブのハイブリダイゼーション時の温度は５０℃、５５℃及び６０℃のそれぞれで行った。その結果、ハイブリダイゼーションの温度が５０℃の場合、非特異的なバンドの検出はできたが、ａｒｓＲと考えられるシグナルは得られなかった。また、ハイブリダイゼーション時の温度が５５℃と６０℃においてはいずれもポジティブコントロールの強さのシグナルを得ることはできなかった。以上のことから、Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍはＥ．ｃｏｌｉ  ａｒｓＲと相同性を示す配列を有していないことが示唆された（図３１）。【０１２７】
３．  Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍにおけるＥ．ｃｏｌｉ  Ｐａｒｓのプロモーター活性の評価
前実験の結果を踏まえ、砒素バイオセンサーの構築には、機能と配列が十分に明らかになっているＥ．ｃｏｌｉのＰａｒｓ及びａｒｓＲを用いることが好ましいと考えられた。【０１２８】
ａｒｓＲによる発現制御は、Ｐａｒｓに含まれるＡｒｓＲ結合部位へのＡｒｓＲタンパクの結合による転写阻害である。この結合はＤＮＡとタンパクとの物理的な相互作用によるものであり、発現させる菌種が異なっている場合においても同様の結合性を示すと考えられる。ここで問題となるのは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＰａｒｓがＲｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍのＲＮＡポリメラーゼに認識され、転写開始を起こすことができるかどうかということである。このことを確認するために、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＰａｒｓを組込んだｃｒｔＡベクター（図３２）を構築し、色素変異株にコンジュゲーションを介して導入することでプロモーターの機能を確認することにした。また、このときにポジティブコントロールとしてＲｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍのｃｒｔＡのプロモーターＰｃｒｔを組込んだｐＲＶ１Ωを用い、ネガティブコントロールとしてはプロモーター配列を組込んでいないｐＲＶ５Ωを用いてＰａｒｓの機能の評価を行った。【０１２９】
まず、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２のゲノムＤＮＡを鋳型に、プライマーＥ．ｃｏｌｉ−Ｐａｒｓ−Ｓ１およびＥ．ｃｏｌｉ−Ｐａｒｓ−Ａ１を用いてＰＣＲを行った。次いでこの断片をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ上へＴＡクローニングし、プラスミドｐＧＰａｒｓを構築した。この断片をＸｂａＩ処理により切出し、ｃｒｔＡベクターであるプラスミドｐＲＶ５ΩのΩとｃｒｔＡ  ＯＲＦとの間に存在するＸｂａＩサイトへと挿入し、センサープラスミドｐＲＶ５ΩＰａｒｓを構築した（図３２）。構築したプラスミドへのＰａｒｓ断片挿入にはその配列の配向から２通りのパターンが考えられるが、形質転換コロニーからＤＮＡを抽出し、プライマーＥ．ｃｏｌｉ−Ｐａｒｓ−Ｓ１と、プライマーｃｒｔＡｒｖ４を用いたＰＣＲを行うことで増幅断片を生じるものを目的のプラスミドを保持するクローンと断定した。最後にｐＲＶ５ΩＰａｒｓのｃｒｔＡの５’上流の塩基配列をシークエンスにより確認した。【０１３０】
次に、構築に成功したプラスミドｐＲＶ５ΩＰａｒｓとｐＲＶ１Ω、ｐＲＶ５Ωのそれぞれをコンジュゲーションを介して色素変異株へと導入し、光好気条件下で３日間培養することでコロニーを得た。それぞれのコロニーをピックアップし、光好気条件下３日間液体培養し、その時の培養液の色調観察ならびにＨＰＬＣによる色素組成解析を行った。その結果、プラスミドｐＲＶ５ΩＰａｒｓを導入した色素変異株では培養液は赤色を示し、Ｐａｒｓを組込むことでＳＯの蓄積が起こっていることが予想できた（図３３）。ＨＰＬＣによる色素解析の結果からは、ｐＲＶ５Ωを導入した色素変異株ではプラスミドを導入していない色素変異株と同程度のＳＯの蓄積が確認でき、これに対してｐＲＶ５ΩＰａｒｓを導入した色素変異株ではｐＲＶ１Ωと同程度のＳＯの蓄積が確認できた（図３４）。以上のことから、Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍにおけるＥ．ｃｏｌｉ  ＰａｒｓはＰｃｒｔと同程度のプロモーター活性を有していることが示唆された。【０１３１】
４．  まとめ
本実施例の結果は以下のとおりである。
・  Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍには、ａｒｓＲが存在していないことが示唆された。
・  Ｅ．ｃｏｌｉのａｒｓオペロンのプロモーターＰａｒｓはＲｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍのＲＮＡポリメラーゼに認識され、プロモーターとして機能することが明らかとなった。
以上の結果から、Ｅ．ｃｏｌｉのＰａｒｓ及びａｒｓＲを砒素誘導性プロモーターとして用いることで、砒素検出バイオセンサーを構築できることが予想できた。【０１３２】
実施例３−Ｂ  砒素検出バイオセンサーの構築
１．  本実施例の目的
実施例３−Ａの結果から、砒素検出バイオセンサー構築において、砒素誘導性プロモーターとしてＥ．ｃｏｌｉのＰａｒｓ及びａｒｓＲを用いることが有効であることが予想された。そこで、本実施例はこれらを用いてセンサープラスミドの構築を試みた。本実施例で構築したのは、ＰａｒｓからａｒｓＢの開始コドンの直前までの配列（これはＰａｒｓ及びａｒｓＲの配列を含み、配列番号２９の配列に相当する。なお、配列番号２９中、第１番目〜第９７番目の塩基がＰａｒｓに相当し、第９８番目〜第４５１番目の塩基がａｒｓＲに相当する。）をｃｒｔＡの上流に組込んだセンサープラスミドであり、これは野生型のａｒｓオペロンと同様の制御をｃｒｔＡにおいても行う目的で構築された（図３５）。また、かかるセンサープラスミドの導入株がバイオセンサーとして機能するかを調べた。【０１３３】
本実施例において構築したプラスミドを表１５に、プライマーを表１６に示す。
2006022235.tif 000016
2006022235.tif 000017
【０１３４】
２．  砒素検出バイオセンサープラスミドの構築
まず、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２のゲノムＤＮＡを鋳型に、プライマーＥ．ｃｏｌｉ−Ｐａｒｓ−Ｓ１とプライマーＥ．ｃｏｌｉ−ａｒｓＲ−Ａ２の組合せでＰＣＲを行った。この結果得られる増幅配列はＰａｒｓからａｒｓＢの開始コドンの直前までの配列（配列番号２９）に相当する。この断片をｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ上へＴＡクローニングし、プラスミドｐＧＡＳＫを構築した。この断片をＸｂａＩ処理により切出し、ｃｒｔＡベクターであるプラスミドｐＲＶ５ΩのΩとｃｒｔＡ  ＯＲＦとの間に存在するＸｂａＩサイトへと挿入し、センサープラスミドｐＳＥＮＳ−ＡＳを構築した（図３６）。この時、ｃｒｔＡベクターへのインサートの挿入方向は２通り考えられるので、プライマーＥ．ｃｏｌｉ−Ｐａｒｓ−Ｓ１とプライマーｃｒｔＡｒｖ４を用いたＰＣＲにより方向確認、ならびにシークエンスによる確認を行った。【０１３５】
次に、構築に成功したセンサープラスミドをコンジュゲーションにより色素変異株へ導入し、砒素検出バイオセンサーＳＥＮＳ−ＡＳ株とした。センサープラスミドの導入確認は、ＫｍやＴｅｔに耐性を示すことやＰＣＲの結果から行った。【０１３６】
３．  砒素検出バイオセンサーの機能評価
続いて、構築したバイオセンサー株に対して砒素を添加し、その応答性を評価した。ここでは３価の砒素として亜砒酸（以下Ａｓ２Ｏ３と称する）を用いた。Ａｓ２Ｏ３の添加は、最終濃度が０．０００６ｐｐｍ、０．００６０ｐｐｍ、０．０６００ｐｐｍ、０．６０００ｐｐｍ又は６．００００ｐｐｍとなるように行い、すべてのサンプルで実験試行ｎ＝３とした。培養開始２４時間後に色調観察と集菌サンプルからの色素組成解析を行った。色素組成の解析はＨＰＬＣ解析を介して行い、得られたＨＰＬＣチャートに示された各ピークの面積値よりＤＭＳＯ、ＤＭＳＥ、ＳＯ及びＳＥの総計に対する赤色色素（ＤＭＳＯおよびＳＯ）の比率を算出した。また、各サンプルについての平均値ならびに標準偏差を算出し、グラフを作製した。その結果、ＳＥＮＳ−ＡＳ株にＡｓ２Ｏ３を添加することで、黄色から赤色への色調変化を示し、その色調変化は０．００６０ｐｐｍから０．６０００ｐｐｍの濃度範囲のＡｓ２Ｏ３の添加で確認することができた（図３７）。また、ＨＰＬＣによる色素組成の解析結果からは、Ａｓ２Ｏ３の添加によりいずれのサンプルにおいても赤色色素の蓄積の促進が確認できた。しかし６．００００ｐｐｍのＡｓ２Ｏ３を添加したときでは色調変化は確認できなかった。そこで１ｍｌの培養液中に含まれるカロチノイド色素量を確認した結果、６．００００ｐｐｍのＡｓ２Ｏ３を添加した場合にのみ大幅な減少が確認できた（図３８）。この原因としてＡｓ２Ｏ３の毒性によりＳＥＮＳ−ＡＳ株自身の増殖が阻害された結果、カロチノイドの生合成量が減少し色調変化が確認できなかったためと考えられる。【０１３７】
また０．０６ｐｐｍのＡｓ２Ｏ３を添加２４時間後のサンプルからＲＮＡ抽出ならびにＲＴ−ＰＣＲを行い、Ａｓ２Ｏ３に対するｍＲＮＡの転写量の変化を調べ、その応答性を評価した。ＲＴ反応後のサンプルを鋳型として、ｃｒｔＡに関してはプライマーｃｒｔＡ−ＲＴ−Ｓ１とプライマーｃｒｔＡ−ＲＴ−Ａ１を用い、ａｒｓＲに関してはプライマーａｒｓＲ−ＲＴ−Ｓ１とプライマーａｒｓＲ−ＲＴ−Ａ１、ｒＲＮＡに関してはプライマーｒＲＮＡ−ＲＴ−Ｓ１とプライマーｒＲＮＡ−ＲＴ−Ａ１を用いてＰＣＲを行った。その結果からＡｓ２Ｏ３の添加によりｃｒｔＡの転写誘導が起こることが確認でき、バイオセンサープラスミドのコンストラクトどおりの発現制御が行えていることが予想できた（図３９）。また、ｃｒｔＡはＡｓ２Ｏ３が非添加の場合においても弱い転写活性が見られ、これがＡｓ２Ｏ３を添加していない条件におけるＳＯの蓄積、すなわちバックグランドの原因になっていることが予想できた。一方ａｒｓＲは砒素を添加していない状態においても明らかな転写量が確認でき、砒素を添加した状態では転写誘導が観察できた。つまり、砒素を添加していない状態における転写抑制に必要なＡｒｓＲを翻訳するために必要なａｒｓＲのｍＲＮＡが検出されており、砒素の添加でＡｒｓＲによる転写抑制が解除され、ａｒｓＲ自身の転写も誘導されていることが予想できる。これはＥ．ｃｏｌｉにおいても確認されている現象である［Ａ．ｃａｒｋｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７（４）：９８１−６］。以上のことより、ａｒｓＲとｃｒｔＡの両遺伝子の転写誘導が砒素の添加に応答して生じている事が確認され、Ｅ．ｃｏｌｉのＰａｒｓとａｒｓＲはＲｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍにおいても砒素誘導性プロモーターの機能を果たしていることが示唆された。【０１３８】
また、Ａｓ２Ｏ３の添加により培養液が赤色を呈するまでにどの程度の時間を要するかを評価した。Ａｓ２Ｏ３を添加した培養液と添加していない培養液を用意し、それぞれ０、３、６、１２、２４及び４８時間後におけるサンプルからカロチノイド色素を抽出し、ＨＰＬＣ解析を行い、得られたＨＰＬＣチャートに示された各ピークの面積値よりＤＭＳＯ、ＤＭＳＥ、ＳＯ及びＳＥの総計に対する赤色色素（ＤＭＳＯおよびＳＯ）の比率を算出した。また、各サンプルについての平均値ならびに標準偏差を算出し、グラフを作製した。その結果、Ａｓ２Ｏ３を添加６時間後から赤色色素の割合が増加していることがわかり、２４時間後までにかけてその増加は進み、最終的に約５５％の赤色色素の蓄積が確認できた。一方、砒素を添加していない場合においては測定開始６時間後までに約３０％の赤色色素が確認でき、その後の変化はあまり見られなかった。これらの結果から、Ａｓ２Ｏ３を添加２４時間後における色調観察が最も短時間で、かつＡｓ２Ｏ３を添加していないコントロールと比較して最も色調変化が分かりやすいことがわかった（図４０）。【０１３９】
４．  砒素バイオセンサーの特異性
これまでの実験によりバイオセンサーＳＥＮＳ−ＡＳ株は砒素に対して応答性を示すことが明らかになったが、その特異性は不明である。そこで、ＳＥＮＳ−ＡＳ株に砒素以外の金属を含むサンプルを添加し、これらのサンプルに対する応答性を調べることで、ＳＥＮＳ−ＡＳ株の金属特異性を検討した。ここでは、砒素以外の金属としてＡｒｓＲに本来応答性を示すと報告されているアンチモンとビスマス、また、ＡｒｓＲが有する金属結合部位と類似した配列を持つタンパク質での応答性が確認されているコバルト、カドミウム、ニッケル、亜鉛及び鉛を用いた［Ｌ．Ｓ．Ｂｕｓｅｎｌｅｈｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，２７：１３１−４３］。さらに水道水中に多く含まれる鉄、マンガン、銅及びアルミニウムを混合した溶液についても応答性を検証した。実験は砒素の検出と同様の方法で行い、  ＨＰＬＣ解析の結果得られたチャートに示された各ピークの面積値よりＤＭＳＯ、ＤＭＳＥ、ＳＯ及びＳＥの総計に対する赤色色素（ＤＭＳＯおよびＳＯ）の比率を算出し、各サンプルについての平均値ならびに標準偏差を算出し、グラフを作製した。その結果、０．６０００ｐｐｍから６．００００ｐｐｍの濃度範囲のビスマスにおいては応答が確認されたが、その他の金属に対しての応答は見られなかった（図４１）。【０１４０】
以上の結果から、砒素検出バイオセンサーＳＥＮＳ−ＡＳ株は砒素とビスマスに応答することが明らかとなった。しかし、ビスマスに応答するためには砒素と比較して１００倍高い濃度のビスマスが必要であった。従って、ＳＥＮＳ−ＡＳ株はビスマスより砒素に対する特異性が明らかに高く、砒素を検出する上でＳＥＮＳ−ＡＳ株は有効であることが示された。【０１４１】
５．  まとめ
本実施例の結果は以下のとおりである。
・  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰａｒｓとａｒｓＲはＲｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍにおいて砒素応答能を示し、砒素誘導性プロモーターとして機能することが明らかとなった。
・  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰａｒｓとａｒｓＲ、およびＲｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍのｃｒｔＡを用いることで砒素バイオセンサーＳＥＮＳ−ＡＳ株の構築に成功した。
・  ＳＥＮＳ−ＡＳ株は０．０００６ｐｐｍから６．００００ｐｐｍの濃度範囲の砒素に応答することが明らかとなった。また、０．００６０ｐｐｍから０．６０００ｐｐｍの濃度範囲の砒素に対してはバイオセンサー株の黄色から赤色への色調変化による視覚的な砒素の検出が可能であった。
・  ＳＥＮＳ−ＡＳ株は砒素以外にビスマスに応答性を示したが、検出限界濃度は砒素が最も低く、砒素に対する特異性が最も高いことが明らかとなった。【０１４２】
以上、本実施例では砒素に応答性を示す砒素検出バイオセンサーの構築に成功した。かかるバイオセンサーは砒素の検出感度が高く、その特異性も高いことから飲料水中における砒素混入のスクリーニング調査に十分に利用できる性能を有しており、極めて有用である。【０１４３】
参考文献（追加の参考文献は本文中に記されている）
［１］  山城秀仁  平成十三年度  卒業論文
［２］  Ｙ．Ｍｉｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６（５）：７５１−４
［３］  Ｒ．Ｓｉｍｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １：  ３７−４５
［４］  Ｖ．Ｌｏｒｅｎｚｏ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２：６５６８−７２
［５］  山城秀仁  平成十五年度  修士論文
【配列表フリーテキスト】
【０１４４】
配列番号５は表４に記載したプライマーｃｒｔＡｄｏｗｎ１の配列である。
配列番号６は表４に記載したプライマーｃｒｔＡｄｏｗｎ２の配列である。
配列番号７は表４に記載したプライマーｃｒｔＡｄｏｗｎ３の配列である。
配列番号８は表４に記載したプライマーｃｒｔＡｕｐ１の配列である。
配列番号９は表４に記載したプライマーｃｒｔＡｕｐ２の配列である。
配列番号１０は表４に記載したプライマーｃｒｔＡｕｐ３の配列である。
配列番号１１は表４に記載したプライマーｋｍＲ１の配列である。
配列番号１２は表４に記載したプライマーｋｍＲ２の配列である。
配列番号１３は表６に記載したプライマーｃｒｔＡｒｖ１の配列である。
配列番号１４は表６に記載したプライマーｃｒｔＡｒｖ２の配列である。
配列番号１５は表６に記載したプライマーｃｒｔＡｒｖ３の配列である。
配列番号１６は表６に記載したプライマーｔｅｒｍ１の配列である。
配列番号１７は表６に記載したプライマーｔｅｒｍ２の配列である。
配列番号１８は表８に記載したプライマーｄｄｈＡ１の配列である。
配列番号１９は表８に記載したプライマーｄｄｈＡ２の配列である。
配列番号２０は表８に記載したプライマーｒｒｎａ１の配列である。
配列番号２１は表８に記載したプライマーｒｒｎａ２の配列である。
配列番号２２は表８に記載したプライマーｃｒｔＡｕｐ１の配列である。
配列番号２３は表８に記載したプライマーｃｒｔＡｒｖ３の配列である。
配列番号２４は表８に記載したプライマーｉ−ｄｄｈＡ１の配列である。
配列番号２５は表８に記載したプライマーｉ−ｄｄｈＡ２の配列である。
配列番号２６は表１０に記載したプライマーｃｒｔＡｒｖ３の配列である。
配列番号２７は表１０に記載したプライマーｐｄｄｈ１の配列である。
配列番号２８は表１０に記載したプライマーｐｄｄｈ２の配列である。
配列番号３１は表４に記載したプライマーＥ．ｃｏｌｉ−ａｒｓＲ−Ｓ１の配列である。
配列番号３２は表１４に記載したプライマーＥ．ｃｏｌｉ−ａｒｓＲ−Ａ１の配列である。
配列番号３３は表１４に記載したプライマーＥ．ｃｏｌｉ−Ｐａｒｓ−Ｓ１の配列である。
配列番号３４は表１４に記載したプライマーＥ．ｃｏｌｉ−Ｐａｒｓ−Ａ１の配列である。
配列番号３５は表１４に記載したプライマーｃｒｔＡｒｖ４の配列である。
配列番号３６は表１６に記載したプライマーＥ．ｃｏｌｉ−ａｒｓＲ−Ａ２の配列である。
配列番号３７は表１６に記載したプライマーｃｒｔＡ−ＲＴ−Ｓ１の配列である。
配列番号３８は表１６に記載したプライマーｃｒｔＡ−ＲＴ−Ａ１の配列である。
配列番号３９は表１６に記載したプライマーａｒｓＲ−ＲＴ−Ｓ１の配列である。
配列番号４０は表１６に記載したプライマーａｒｓＲ−ＲＴ−Ａ１の配列である。
配列番号４１は表１６に記載したプライマーｒＲＮＡ−ＲＴ−Ｓ１の配列である。
配列番号４２は表１６に記載したプライマーｒＲＮＡ−ＲＴ−Ａ１の配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２１】
2006022235.tif 000029
【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図３０】
2006022235.tif 000033
【図３２】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図４０】
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【図４１】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３１】
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【図３３】
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【図３９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年2月27日(2007.2.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
実施例１
実験材料および方法
１：  本実施例で用いた菌株および培地
本実施例で用いた菌株を表１に、培地を表２に示す。なお、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ  ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  Ｗ−１Ｓ株は独立行政法人産業技術総合研究所の特許生物寄託センター［日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）］（旧通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所［日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）］）にＦＥＲＭ  Ｐ−１５３２０として寄託され（寄託日：平成７年１２月１１日）、前記特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４２２（国際寄託への移管日：平成１７年１０月３日）として寄託されている。
Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  Ｗ−１Ｓ株およびそれぞれの変異株や形質転換株の培養には４ＣｙＭＯＭ培地を用いた。バイオセンサー株の培養には、酵母抽出物を含まない４ＣｙＭＯＭ培地として４ＣＭＯＭ培地を調製し、これを用いた。Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１株、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１  λ−ｐｉｒ株、およびそれぞれの形質転換株の培養にはＬＢ培地を用いた。それぞれの培地には必要に応じてアンピシリン（Ａｍｐ）、カナマイシン（Ｋｍ）、テトラサイクリン（Ｔｃ）をそれぞれ終濃度５０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌになるように加えた。ただし、光合成細菌についてはＴｃ添加量を終濃度５μｇ／ｍｌとなるようにした。
形質転換過程およびエレクトロポレーション後の一時的な培養時にはＳＯＣ培地を用いた。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
１０：  色素解析
Ｒｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍの野生株もしくは変異株や形質転換株各種のカロテノイド色素組成解析は以下の方法で行った。
細菌株を３０ｍｌ培地入りのＲｏｕｘ  Ｂｏｔｔｌｅで微好気・明条件・マグネティックスターラーにより撹拌しつつ一晩培養した。８０００ｒｐｍ、１５分の遠心分離操作後に上清を捨て、菌ペレットを−８０℃で一晩凍結させ、翌日から菌体を二晩凍結乾燥した。得られた凍結乾燥体を遠心チューブからバイヤルに移し、これにアセトン：メタノール７：２（ｖ／ｖ）混液５ｍｌを加え、２分間ｖｏｌｔｅｘを行った［Ｓ．Ｔａｋａｉｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈ．Ｒｅｓ．，６７：２０７−１４］。この懸濁液を濾過したものを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析サンプルとした。
また、細菌株の培養を試験管中の１０ｍｌ培地中で各種（微好気・明、微好気・暗、嫌気・明）行った際には、培養を３日間行った。培養液をエッペンドルフチューブに１ｍｌずつ取り、遠心後のペレットを−８０℃で２時間凍結させたのちに一晩凍結乾燥した。得られた凍結乾燥体にアセトン：メタノール混液を適量（１００μｌ〜５００μｌ）加え、２分間ｖｏｌｔｅｘ後に卓上遠心機で１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離した上清をＨＰＬＣ分析サンプルとした。
ＨＰＬＣ分析は、島津高速液体クロマトグラフィー用機器、送液ユニットＬＣ−１０ＡＳ、オートインジェクタＳＩＬ−９Ａ、紫外可視分光光度計検出器ＳＰＤ−１０Ａ、ならびにクロマトパックＣ−Ｒ３Ａ（島津製作所）、そして、μＢｏｎｄａｐａｋＴＭ  Ｃ１８  １２５Å  １０μｍ  ３．９×３００ｍｍ  ＨＰＬＣ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ社）を用いて行った。液相にはメタノールを用い、測定波長４８１ｎｍで検出を行った。サンプルの注入量、液相の流速、クロマトパックの記録条件などはサンプル濃度などの条件により適宜変更した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
実施例３−Ａ  好適な砒素誘導性プロモーターの選択
１．本実施例の目的
高感度の砒素検出バイオセンサーを作成するためには、用いる砒素誘導性プロモーターの種類が重要である。この点について、特に細菌においては、砒素耐性遺伝子群ａｒｓオペロンの発現制御に微量濃度の砒素に応答性を示す制御タンパクをコードするａｒｓＲが関与していることが知られており［Ａ．Ｃａｒｋｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７（４）：９８１−６］、これを本発明のバイオセンサーの制御領域として利用することで、高感度の砒素検出バイオセンサーを作成できると考えられる。
【国際調査報告】
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