(57)【要約】  高い治療効果が望めるとともに移植時の安全性が高い生体組織シートを提供する。(a)生体由来細胞を調製し、(b)前記生体由来細胞を羊膜上に播種し、(c)異種動物細胞非存在下、前記生体由来細胞を培養して増殖させることによって、生体組織シートを作製する。生体由来細胞としては例えば、角膜上皮、結膜上皮、皮膚表皮、毛包上皮、口腔粘膜、気道粘膜又は腸管粘膜由来の細胞を使用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種動物細胞非存在下、羊膜上で増殖させた生体由来細胞を含有してなる生体組織シート。
【請求項２】
ヒト線維芽細胞を含有するコラーゲンゲル上に前記羊膜を載置した状態で前記生体由来細胞を増殖させることを特徴とする請求項１に記載の生体組織シート。
【請求項３】
無血清培地を使用して前記生体由来細胞を増殖させることを特徴とする、請求項１又は２に記載の生体組織シート。
【請求項４】
血清成分として、レシピエントに由来する血清のみを含む培地を使用して前記生体由来細胞を増殖させることを特徴とする、請求項１又は２に記載の生体組織シート。
【請求項５】
前記生体由来細胞が角膜上皮、結膜上皮、皮膚表皮、毛包上皮、口腔粘膜、気道粘膜又は腸管粘膜由来の細胞であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の生体組織シート。
【請求項６】
前記羊膜が、上皮が除去された羊膜であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の生体組織シート。
【請求項７】
増殖した細胞に加えて、培養基質としての前記羊膜を含有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の生体組織シート。
【請求項８】
第２の羊膜を介して組織欠損部に移植される移植材料であることを特徴とする請求項７に記載の生体組織シート。
【請求項９】
異種動物細胞非存在下、ヒト線維芽細胞を含有するコラーゲンゲル上に載置した羊膜上で増殖させた生体由来細胞を前記羊膜とともに第２の羊膜上に載置し、更に増殖させて得られる細胞を含有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の生体組織シート。
【請求項１０】
以下のステップを含んでなる、生体組織シートの作製方法：
(a)生体由来細胞を調製するステップ；
(b)前記生体由来細胞を羊膜上に播種するステップ；
(c)異種動物細胞非存在下、前記生体由来細胞を培養して増殖させるステップ。
【請求項１１】
前記ステップbが以下のステップからなる、請求項１０に記載の作製方法：
(b-1)コラーゲンゲル内でヒト線維芽細胞を培養するステップ；
(b-2)前記コラーゲンゲル上に羊膜を載置した後、前記生体由来細胞を該羊膜上に播種するステップ。
【請求項１２】
以下のステップを更に含むことを特徴とする、請求項１０又は１１に記載の作製方法：
(d)前記生体由来細胞が増殖した後、最表層を空気に接触させるステップ。
【請求項１３】
以下のステップを更に含むことを特徴とする、請求項１１又は１２に記載の作製方法：
(e)前記生体由来細胞を前記羊膜とともに回収するステップ；
(f)回収した前記生体由来細胞及び前記羊膜を、羊膜側を下にして第２の羊膜上に載置した後、前記生体由来細胞を培養して増殖させるステップ。
【請求項１４】
前記ステップcが、無血清培地を使用して実施されることを特徴とする、請求項１０〜１３のいずれかに記載の作製方法。
【請求項１５】
前記ステップcが、血清成分として、レシピエントに由来する血清のみを含む培地を使用して実施されることを特徴とする、請求項１０〜１３のいずれかに記載の作製方法。
【請求項１６】
前記生体由来細胞が角膜上皮、結膜上皮、皮膚表皮、毛包上皮、口腔粘膜、気道粘膜又は腸管粘膜由来の細胞であることを特徴とする、請求項１０〜１５のいずれかに記載の作製方法。
【請求項１７】
前記羊膜が、上皮が除去された羊膜であることを特徴とする、請求項１０〜１６のいずれかに記載の作製方法。
【請求項１８】
以下のステップを含んでなる、皮膚表皮細胞の調製方法：
(A)皮膚表皮細胞を羊膜上に播種するステップ；
(B)前記皮膚表皮細胞を培養して増殖させるステップ；
(C)増殖した皮膚表皮細胞を回収するステップ。
【請求項１９】
請求項１〜９のいずれかの生体組織シートを移植材料として使用する移植方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体組織シートに関する。詳細には、本発明は、異種動物由来細胞をフィーダー細胞として使用することなく、角結膜上皮細胞、皮膚表皮細胞、毛包上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、気道粘膜上皮細胞や腸管粘膜上皮細胞などの生体由来細胞を羊膜上で培養・増殖させることによって作製される生体組織シート及び同シートの作製方法、並びに同シートの利用（移植方法等）に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は生体の最外層を覆う器官であり、外界から生体を防御する一種のバリアである。皮膚は、表皮、真皮、および皮下組織から構成されており、表皮は主として角化細胞からなり、これに色素細胞、ランゲルハンス細胞などが少数混在する。表皮を構成する細胞は主に角化細胞であり、(1)最外層を占める、核の消失した角質細胞、(2)その下層にある核を有する細胞（顆粒細胞、有棘細胞、基底細胞）よりなり、さらに最下層の基底細胞と真皮の間に表皮基底膜が存在する。基底層は一層の細胞層で、表皮角化細胞の母細胞層であり、分裂能力を有する細胞は基底細胞のみであると考えられている。【０００３】
表皮が何らかの理由により失われた状態が潰瘍である。表皮の欠損した部位では、周辺からの角化細胞の増殖や、一部毛包由来の角化細胞の増殖によって表皮が再生され潰瘍面は上皮化する。しかし、一度に広範囲の表皮欠損が生じる熱傷や、難治性の深い、毛包の欠如した潰瘍では周辺からの表皮の再生のみでは上皮化に時間がかかる。【０００４】
基底層の細胞周期は約450時間である。分裂により生まれた娘細胞は有棘層へと移動するに伴い形態的、機能的に変化し、さらに顆粒層を経て角化し角層となり、最終的には体外に脱落する。脱落するまでの時間をturnover timeといい、47〜48日とみられている。【０００５】
現在一般的に認められている表皮の再生モデルでは表皮角化細胞をその分裂能力より、stem cell（幹細胞）、transit-amplifying cell（移行増殖期細胞）、post−mitotic cell（分裂後細胞）の3種類に分類している。stem cellとは、無限の自己再生能力を有する細胞で、分裂によりtransit-amplifying cellを生み出す。Transit-amplifying cellは一定の分裂能力を有し、分裂後、transit-amplifying cellとなるが、最終的に分裂能力を失い、post-mitotic cellとなる。【０００６】
表皮のstem cellは以下の特徴を有しているとされている。(1)stem cellそのものは細胞周期が長い（slow cycling）。(2)部位により存在場所が異なる。(3)集合して存在する。(4)α2β1およびα3β1インテグリンを強く発現する。しかし、基底細胞では約40％の細胞がインテグリンを強く発現しており、実際にはstem cellは基底細胞の約10％程度と推定されている。つまり、基底層にはstem cellのみではなく、transit−amplifying cell、post−mitotic cellも存在しているということである。【０００７】
表皮が傷害を受けた場合、増殖刺激が起こり、細胞は盛んに増殖を始め再生が開始される。このとき、最も重要な役割を担っているのが一連の上皮細胞成長因子群である。上皮細胞成長因子（epidermal growth factor、EGF）ファミリーには、EGF、トランスフォーミング増殖因子（transforming growth factor、TGF）−α、ヘパリン結合性EGF様増殖因子（heparin binding EGF like growth factor、HB−EGF）、ベタセルリン（betacellulin）、アンフィレギュリン（amphiregulin）、ニューレグリン（neuregulins）が含まれるが、実際に表皮角化細胞の増殖に関係するものはTGF−α、HB−EGF、アンフィレグリンであると考えられており、これらの因子は表皮角化細胞に対して自己増殖的に作用することが示されている。逆に、表皮角化細胞の増殖に対して抑制的に作用する因子としてはTGF−β、ビタミンD3、レチノイン酸（retinoic acid）などが知られている。【０００８】
再生医学の分野において、ヒト皮膚において真皮、上皮の全層が欠損した損傷部位を移植するための移植片の開発が進められている。例えば、特開平１０−２７７１４３号公報（特許文献１）には、ヒト皮膚等の全層欠損創を治療するための移植片及びその製造方法が記載されている。当該文献に開示される移植片は、ヒトのフィブリンシート内に真皮組織由来の線維芽細胞を包埋し、表皮組織をこのシートの表面に付着して作られる。
従来、皮膚欠損の修復には皮膚全層を移植する全層植皮と、表皮と真皮上層を移植する分層植皮が行われているが、採取部位の大きさに制限がある。その点、培養表皮は一度小皮膚片を採取するだけで数千倍の皮膚面積が得られるという利点があり、また、凍結保存が可能であるため繰り返し使用できることは従来の植皮術と比較すると最大の利点であると思われる。
表皮シートは使用する細胞の由来によって自家培養表皮シートと他家培養表皮シートに分かれる。自家培養表皮シート移植は表皮欠損部位を被覆し、生着させることを主な目的とする場合が多く、一方、他家培養表皮シート移植は、生物学的被覆材料（biological dressing）としての効果を期待する場合が多い。表皮細胞の基礎的研究から、表皮角化細胞は様々な細胞成長因子、サイトカインを産生することが明らかとなり他家培養表皮シートの有効性が判明している。【０００９】
培養表皮を安全かつ安定的に供給する技術が完成すれば、移植技術の進歩と相まって再生医療が実用化され、患者への福音は計り知れない。表皮の再生を考えた場合、分裂・増殖能を有する基底細胞を分離・培養し、大量に増殖させて表皮を再生させ、移植に用いるということは非常に理にかなったものであるといえる。しかし、基底細胞にはstem cellのみではなく、transit−amplifying cell、post−mitotic cellも含まれており、より効率の良い培養皮膚の作製には表皮stem cellを選択的に培養する技術の確立が望まれるところである。
これまでに多くの研究者によって表皮細胞を培養する技術の研究・開発が試みられ、その成果は皮膚生物学の分野において多大な恩恵をもたらした。具体的には、培養角化細胞を用いることで、表皮細胞の特性、表皮の再生、分化、増殖機構が急速に明らかになりつつある。一方で、患者より小皮膚片を採取し、角化細胞を継代培養し、大量に増殖させることが可能となり、また凍結保存ができるようになったことから、広範囲熱傷、難治性潰瘍などの治療に培養皮膚が用いられつつある。【００１０】
皮膚と並んで再生医療の貢献が期待されている組織の一つが角膜である。角膜は、眼球を構成する光学系の最も外層にあり、透明な血管のない組織であって、涙液と共に平滑な表面を形成することにより良好な視力を得ることに貢献している。また、角結膜上皮細胞は常に外界と接し、外界の微生物などの異物、紫外線などの光線などから眼球を守る防御作用を持っている。すなわち、角結膜上皮細胞は、角膜の透明性と眼球全体を防御し恒常性を維持するために極めて重要な役割を果たしている。【００１１】
角膜は、例えば、角膜炎、角膜潰瘍、穿孔等の病態により濁り、透明性が失われてしまう場合がある。このような角膜の濁りによる永続的な視力の低下に対しては、眼球提供者から提供された角膜を用いる角膜移植による治療が行われている。角膜移植は、患者の透明性が失われた角膜を取り除いた後、透明な角膜を移植するというものであって、この移植により透明性が回復し、再び視力を取り戻すことができる。
このような角膜移植によって効果的な治療効果が期待できる場合がある一方で、角膜の移植だけでは対処できない疾病が存在する。例えば、スティーブンス・ジョンソン症候群、眼類天疱瘡、化学外傷、熱傷などである。通常、角結膜上皮細胞は、毎日分裂を繰り返し、古くなった細胞は、はがれ落ち、幹細胞組織から新たな細胞が再生される。ところが以上のような病態では、角膜を再生させる幹細胞組織に障害があることがわかってきている。【００１２】
角膜上皮を再生させる幹細胞組織は「角膜輪部組織」と呼ばれ、ちょうど黒目と白目の境界部分に限局し、外界に露出された特殊な環境にある。上述した病態では、この幹細胞組織自体がなんらかの障害を受けて根絶してしまうと考えられている。そして、この幹細胞組織の根絶により、その欠損部分は周りに存在する結膜上皮で覆われ、透明性に欠け、視力の極端な低下がもたらされる。このように、上述の病態では角膜輪部が枯渇しているため、単に角膜を移植するだけでは移植された角膜を長期に維持できない。そのため、恒久的な眼表面再建を図るためには、角膜輪部をも移植する必要がある。この角膜輪部を移植する方法の一つとして、羊膜移植法が開発されている（メディカル朝日１９９９年９月号：ｐ６２〜６５、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ３４０：１６９７〜１７０３、１９９９：非特許文献１）。この移植法に用いられる羊膜は、帝王切開した妊婦等の胎盤から得られる。羊膜は厚い基底膜をもつことから、移植された場合、角結膜上皮細胞が増殖、分化するための基質として作用する。さらに、羊膜は免疫原性がほとんどなく、抗炎症、瘢痕形成抑制などの作用を併せ持つことから、羊膜上に移植される角結膜上皮やこれらの幹細胞組織は移植受容者（レシピエント）の拒絶反応等から保護されることになる。【００１３】
【特許文献１】特開平１０−２７７１４３号公報
【非特許文献１】メディカル朝日１９９９年９月号：ｐ６２〜６５、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ３４０：１６９７〜１７０３、１９９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
表皮角化細胞の培養は従来困難なものとされていたが、1975年、RheinwaldとGreenによりマウス3T3フィーダーレイヤー法が発表され、初めて表皮角化細胞の培養が可能となった。この方法はマウス3T3細胞をフィーダーレイヤーとして用いることや、牛胎仔血清を使用するためにロット間での差がみられることなどにより培養は決して容易なものではなかった。1980年代になり、HenningsとYuspaは培養液中のCa2＋濃度を低くすると表皮角化細胞が未分化状態となり増殖が亢進することを示した。さらにBoyceとHamは低Ca2＋濃度培地であるMCDB153培地を開発し、牛下垂体抽出液を添加することでヒト表皮角化細胞の無血清培養法が可能であることを示した。1986年にはPittelkowらは無血清培養法を用いて表皮角化細胞を培養し、さらに牛胎仔血清添加高カルシウム培地に変更することで培養表皮シートを作製し熱傷患者に移植し良好な成績を得た。現在ではこの無血清培養法が主流であるが、異種動物由来の3T3細胞がフィーダーレイヤーとして用いられている。異種動物由来の細胞の共存下で培養して得られる移植片では異種動物由来の産物が夾雑する危険性が存在する。従って、当該移植片を用いた移植術は異種移植ないしはそれに準ずるものとして捉えられ、倫理的、安全上に大きな問題があるとされている。事実、医療現場において異種移植が実用化された例はない。【００１５】
培養表皮シート移植は切手大の皮膚より角化細胞を継代培養することにより広範囲の創面を覆うことを可能とした。また、凍結保存可能であるため、繰り返し移植を必要とする難治性、再発性皮膚潰瘍治療に応用できる。従来の培養法で作製された培養シート、たとえば、移植された培養表皮シートを良好に生着させることは必ずしも容易なことではない。それは培養表皮シートが基底膜の構成成分を欠き、重層化した表皮が強固な角層を形成していないことによるものである。その点、Bellにより開発された三次元培養皮膚は角層、顆粒層も認められ現時点では皮膚に最も近い培養皮膚であるが、手技の煩雑さ、特殊技術の必要性より、いまだ本邦では普及していない。三次元培養皮膚は海外においてはすでに他家移植で有効性が示され商品化されている。しかし、他家移植では上皮化の促進作用は認められるが、永久的な生着は期待できない。本邦においては倫理面、安全性の確認の点で他家移植は普及する見込みが少なく自家移植の改善に焦点が当てられてきている。【００１６】
一方、角膜が結膜上皮で覆われ混濁を生じる眼表面疾患に対する外科的治療としては、現在は角膜上皮移植術が行われているが、強い炎症を伴った難治性角結膜疾患（Stevens-Johnson症候群や眼類天疱瘡、角膜腐食など）においては、その予後が極めて不良である。その最大の理由として、強い抗原性を有する異系（アロ）の角膜上皮が宿主の免疫系に認識され拒絶を受けることが挙げられる。更に、拒絶反応の予防のため術後に多量の免疫抑制剤を全身及び局所投与することによる合併症もその予後不良の大きな要因となっている。一方、アロの角膜上皮を利用する場合には、ドナー不足の問題がある。一眼から得られる角膜を用いて数十の角膜上皮シートの作製できる技術を達成すればドナー不足の課題は解決される。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は以上の背景及び課題に鑑みてなされたものであって、高い治療効果が望めるとともに移植時の安全性が高い生体組織シートを提供することを目的とする。かかる目的の下、本発明者らはまず培養表皮シートの作製を試みた。具体的には、安全性を考慮して上皮細胞の培養時に異種動物由来の細胞（フィーダー細胞）を使用しない条件とした上で、従来の培養表皮シート自家移植の発展系として三次元培養皮膚を作製し、基底膜構成成分、細胞接着分子、分化抗原について免疫組織学的ならびに電子顕微鏡的に検討した。その結果、従来の培養表皮シートと比較して、強固な角層の形成が認められ、細胞接着分子、分化のマーカーはvivo表皮と同様に十分に発現していた。基底膜構成成分については、へミデスモゾームの形成は良好で、類天疱瘡抗原、β4インテグリンは十分に発現していた。
培養表皮シートの生着性についてはその基底膜の構成成分の形成に左右される。すなわち、培養表皮シートは、プラスチックシャーレの底面に密着し培養されており、シートを作製する際にシャーレ底面より剥離する必要がある。この剥離にはディスパーゼやコラゲナーゼを用いるがこれらの酵素により基底膜の構成成分は分解される。これまでの報告では、ディスパーゼにより類天疱瘡抗原はウェスタンブロットで検出できなくなり、蛍光抗体法ではGB3モノクローナル抗体で認識されるラミニン5が分解される。また、コラゲナーゼでは係留線維やIV型、VII型コラーゲンの発現が減少するが、α6β4インテグリンは影響をうけないことが報告されている。これに対して、三次元培養皮膚はvivo表皮に近い構築を保っており、基底膜の構成成分の形成が認められる。本発明者らの検討においても、β1インテグリン、β4インテグリン、類天疱瘡抗原は比較的良好に形成されていることが判明し、電子顕微鏡所見においてもヘミデスモゾームは良好に形成していることが確認された。【００１８】
次に本発明者らは、培養表皮シートと同様の手法によって他の組織に適用可能な移植材料を作製できるか否かを検討した。具体的には角膜上皮シートの作製を試みた。その結果、線維芽細胞を含有したコラーゲン上に載置した羊膜上で角膜上皮細胞を培養することによって、フィーダー細胞を使用することなく、良好な重層化及び上皮化が達成された。
以上のように本発明者らは、異種動物由来の細胞を全く用いない安全で実用的な生体組織シートの作製に成功した。また、無血清培養条件下においても生体組織シートを作製可能であることを見出した。【００１９】
更に本発明者らは、表皮細胞の培養基質として羊膜が特に優れているとの仮定の下、種々の実験を行った。まず、線維芽細胞を含むコラーゲンゲルに羊膜を密着させ、その上にヒト表皮角化細胞（ケラチノサイト）を播種し、周辺へのヒト表皮角化細胞の遊走を観察したところ、線維芽細胞を含むコラーゲンゲル上に細胞を直接播種した場合（コントロール群）に比較して著明に遊走が亢進していた。一方、線維芽細胞を含むコラーゲンゲル上に載置した羊膜上で培養したヒト表皮角化細胞を羊膜とともに回収し、その後、線維芽細胞を含むコラーゲンゲルに密着させた別の羊膜上に載置し、周辺へのヒト表皮角化細胞の遊走を観察したところ、線維芽細胞を含むコラーゲンゲル上に載置した場合（コントロール群）に比較して著明に遊走が亢進していた。これらの実験結果から、羊膜上では表皮角化細胞の増殖が良好で、且つ細胞の遊走能力も良好に発揮されることが見出された。即ち、表皮角化細胞の培養基質として羊膜が極めて優れていることが明らかとなった。また、この知見に基づけば二通りの移植術、即ち(1)線維芽細胞を含むコラーゲンゲル上に載置した羊膜上で培養した表皮角化細胞を羊膜とともに回収し、その後、別の羊膜上に載置し培養することによって得られるシート状構築物（羊膜（第１の羊膜）の片面に別の羊膜（第２の羊膜）が接着しており、且つ一部で第１の羊膜を被覆し、他の一部では第２の羊膜を被覆する細胞層を備える構築物）を表皮欠損部に移植する方法、及び(2)線維芽細胞を含むコラーゲンゲル上に載置した羊膜上で培養した表皮角化細胞を羊膜とともに回収し、それを、予め皮膚欠損部に移植した別の羊膜上に移植する方法が優れた表皮再建術となると考えられた。ここで、真皮全層及び皮下組織までの欠損では保存的治療ではなかなか上皮化しないため、まず移植床を整える必要がある。真皮の欠損には従来、人工真皮が用いられており、ある程度の治療効果が得られている。人工真皮では血管の再生がみられるが、その上に培養表皮を移植する場合、基底膜の構成が不十分であることにより生着が不良になることが指摘されている。一方、人工真皮移植と組み合わせて上記の(1)又は(2)の移植術を用いれば、基底膜構成成分を有する羊膜を介して培養表皮が移植されることになるから高い生着率を期待できる。しかも、羊膜上に培養表皮が形成された状態となることから、移植後、培養表皮を構成する細胞の良好な増殖及び周辺への遊走が促され、その結果、培養表皮が速やかに伸展することで高い治療効果が得られる。従って、広範囲の皮下組織にまで至る皮膚欠損に対しても、人工真皮移植と上記移植術を組み合わせることによって整容的にも優れた治療法を確立できると期待される。【００２０】
本発明は以上の成果及び知見に基づいて完成されたものであって、次の構成を提供する。
即ち本発明は、異種動物細胞非存在下、羊膜上で増殖させた生体由来細胞を含有してなる生体組織シートを提供する。
本発明の一態様では、ヒト線維芽細胞を含有するコラーゲンゲル上に羊膜を載置した状態で生体由来細胞を増殖させる。これによって、生体由来細胞の増殖率の向上が図られる。
生体由来細胞を増殖させるときの培地として、(1)無血清培地、又は(2)血清成分として、レシピエントに由来する血清のみを含む培地を使用することができる。
生体由来細胞は好ましくは、角膜上皮、結膜上皮、皮膚表皮、毛包上皮、口腔粘膜、気道粘膜又は腸管粘膜由来の細胞である。
培養基質としての羊膜には、上皮が除去された羊膜を使用することが好ましい。【００２１】
本発明の一態様では、増殖した細胞に加えて、培養基質としての羊膜を含有して生体組織シートが構成される。
本発明の生体組織シートは例えば、直接、又は培養基質として使用した羊膜とは別の羊膜を介して組織欠損部に移植される。後者の場合、典型的には組織欠損部に対して羊膜（第２の羊膜、即ち生体組織シートの作製に使用する羊膜とは別の羊膜）を移植した後、当該羊膜の上に生体組織シートを移植することになる。
本発明の更なる一態様の生体組織シートは、異種動物細胞非存在下、ヒト線維芽細胞を含有するコラーゲンゲル上に載置した羊膜上で増殖させた生体由来細胞を前記羊膜とともに第２の羊膜上に載置し、更に増殖させて得られる細胞を含有することを特徴とする。【００２２】
本発明はさらに、生体組織シートの作製方法を提供する。本発明の作製方法の一態様は、以下のステップを含む。即ち、(a)生体由来細胞を調製するステップ；(b)前記生体由来細胞を羊膜上に播種するステップ；及び(c)異種動物細胞非存在下、前記生体由来細胞を培養して増殖させるステップである。
本発明の一態様では、前記ステップbとして、以下のステップが実施される。即ち、(b-1)コラーゲンゲル内でヒト線維芽細胞を培養するステップ；及び(b-2)前記コラーゲンゲル上に羊膜を載置した後、前記生体由来細胞を該羊膜上に播種するステップである。
本発明の他の一態様では、(d)前記生体由来細胞が増殖した後、最表層を空気に接触させるステップが更に実施される。このステップによって、細胞層の角化（上皮化）が促される。
本発明の更に他の一態様では、(e)前記生体由来細胞を前記羊膜とともに回収するステップ；及びf)回収した前記生体由来細胞及び前記羊膜を、羊膜側を下にして第２の羊膜上に載置した後、前記生体由来細胞を培養して増殖させるステップが更に実施される。即ち、２段階の培養が実施される。
ステップcを実施する際の培地として、(1)無血清培地、又は(2)血清成分として、レシピエントに由来する血清のみを含む培地を使用することができる。
生体由来細胞は好ましくは、角膜上皮、結膜上皮、皮膚表皮、毛包上皮、口腔粘膜、気道粘膜又は腸管粘膜由来の細胞である。
培養基質としての羊膜には、上皮が除去された羊膜を使用することが好ましい。【００２３】
本発明は更に、以下のステップ、即ち(A)皮膚表皮細胞を羊膜上に播種するステップ；(B)前記皮膚表皮細胞を培養して増殖させるステップ；及び(C)増殖した皮膚表皮細胞を回収するステップを含む、皮膚表皮細胞の調製方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】実施例１の方法で作製した三次元培養皮膚シート（培養表皮シート）のヘマトキシリン・エオジン染色像（エアーリフティング後８日目）を示す図である。上層から順に、表皮角化細胞層、羊膜、繊維芽細胞を含むコラーゲンゲル（マトリクス）である。表皮角化細胞層では、下から順に基底細胞層、有棘細胞層、顆粒層、角層が整然と構成されており、ヒト正常表皮に非常に近い形態を示している。
【図２】実施例２の方法で作製した三次元培養皮膚シート（培養表皮シート）のヘマトキシリン・エオジン染色像（エアーリフティング後８日目）を示す図である。羊膜上に播種されたヒト表皮角化細胞は一層の基底細胞層と５−６層の細胞層からなっており、角層の形成も認められ、表皮が再構成されている。
【図３】表皮角化細胞の増殖及び遊走に対する羊膜の効果について試験した結果を示す図である。右欄が試験群（線維芽細胞を含むコラーゲンゲルに密着させた羊膜上で表皮角化細胞を培養した場合）の結果（上から順に１日目、１０日目）である。左欄はコントロール群の結果である。
【図４】表皮角化細胞の増殖及び遊走に対する羊膜の効果について試験した結果を示す図である。左欄が試験群（線維芽細胞を含むコラーゲンゲルに密着させた羊膜の上に培養表皮シートを載置し、培養した場合）の結果（上から順に１日目、７日目、１０日目、及び１４日目）である。中央欄はコントロール群１（線維芽細胞を含むコラーゲンゲル上に培養表皮シートを載置し、培養した場合）の結果である。同様に右欄はコントロール群２（羊膜を使用せずに三次元培養して得られた細胞層を、線維芽細胞を含むコラーゲンゲル上に載置し、培養した場合）の結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明は、次の構成からなる生体組織シートを提供する。即ち、異種動物細胞非存在下、羊膜上で増殖させた生体由来細胞を含有してなる生体組織シートである。生体由来細胞は細胞層を形成している。以下に本発明の生体組織シート及びその製法の特徴を詳述する。【００２６】
本発明の生体組織シートは、(a)生体由来細胞を調製するステップ、(b)前記生体由来細胞を羊膜上に播種するステップ、(c)異種動物細胞非存在下、前記生体由来細胞を培養して増殖させるステップを含む方法によって作製される。
ステップaでは生体由来細胞を調製する。生体由来細胞としては、最終的に得られる生体組織シートの用途に適合した細胞を使用する。例えば皮膚表皮組織の再生用のシートを作製する場合には、皮膚表皮細胞（その幹細胞、前駆細胞を含む）や毛包上皮細胞（その幹細胞、前駆細胞を含む）などが好適に使用される。同様に、角膜上皮組織の再生を目的とする場合には角膜上皮細胞（その幹細胞、前駆細胞を含む）が好適に使用され、粘膜上皮組織の再生を目的とする場合には粘膜上皮細胞（その幹細胞、前駆細胞を含む）が好適に使用される。粘膜上皮細胞の例としては口腔粘膜上皮細胞、腸管粘膜上皮細胞、気道粘膜上皮細胞などを挙げることができる。
生体由来細胞の調製方法について、皮膚表皮細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、腸管粘膜上皮細胞及び気道粘膜上皮細胞を例に採り説明する。
（皮膚表皮細胞）
まず、皮膚の採取にあたっては、あらかじめ採取部位を予防的にポビドンヨードなどの消毒薬にて消毒し、抗真菌剤の外用塗布を行った後、小皮膚片を皮膚生検に準じて採取する。表皮角化細胞の培養にあたってはハサミで皮膚片から脂肪組織と真皮をできる限り取り除き、ダルベッコリン酸緩衝液（PBS）にて数回洗浄する。70％エタノールに１分間浸し滅菌する。短冊状に切り、ディスパーゼ液に浸し、4℃で一晩静置する。ついで表皮を真皮から剥離する。剥離した表皮を、洗浄後、表皮片をほぐし、表皮角化細胞浮遊液を調整する。細胞を無血清培地に懸濁し、コラーゲンコートシャーレに播種し、継代培養を行う。【００２７】
（角膜上皮細胞）
角膜上皮細胞は角膜輪部組織から得ることができる。例えば角膜輪部組織から内皮細胞を剥離除去し、結膜を切除し単一細胞懸濁液を作製する。そしてこれを窒素タンクで保存し、その後急速に37℃で融解して角膜上皮細胞浮遊液を調整する。必要に応じて継代培養する。継代培養には、例えば無血清培地であるEpiLifeTM（カスケード社）、MCDB153培地（日水製薬株式会社）やこれらの培地のアミノ酸組成等を改変して作製される培地などを使用することができる。【００２８】
（口腔粘膜上皮細胞）
口腔粘膜上皮細胞としては歯根部に存在する細胞（口腔内縁粘膜上皮細胞）、口唇部の細胞、口蓋部の細胞、頬部の細胞などが用いられる。中でも口腔内縁粘膜上皮細胞はその増殖能が高く、また抗原性が低いことから、これを用いることが特に好ましい。口腔粘膜上皮細胞は、目的とする細胞が存在する場所をメスなどで切除したり、掻爬したりすることにより採取することができる。口腔内縁粘膜上皮細胞にあっては、抜歯に付着している口腔粘膜上皮をエナメルセメント移行部より分離し、これより採取することができる。尚、結合組織などの不純物を除去するために、ディスパーゼやトリプシンなどの酵素による処理や、フィルター処理を施すことが好ましい。【００２９】
（腸管粘膜上皮細胞）
腸管粘膜上皮細胞は大腸内視鏡下腸管上皮生検組織より採取、または開腹手術時に通常の手法で採取される。また、組織よりlazer capture microdissectionにより上皮細胞を切除することもできる。食道、胃、十二指腸、小腸、大腸のヒトの全ての消化管上皮細胞を用いて作製される生体組織シートについても本発明の技術は適用される。潰瘍や炎症などでヒトの消化管上皮が傷害を受けた時、骨髄由来細胞が緊急事態に対応するレスキュー的な役割を果たし、上皮が修復される。消化管上皮細胞も一部とはいえ骨髄から作られる。この意味で本発明の意義は角膜上皮細胞を用いるものと同等とみなすことができる。通常はわずか1000個に数個程度しかない骨髄からできる上皮細胞が、胃潰瘍、大腸炎などでできた消化管内面の潰瘍(傷口)が治っていく過程では50倍から100倍にも増え、概ね10個に1個の消化管上皮細胞が骨髄由来であることが判明している。ここで作製される消化管粘膜上皮細胞由来生体組織シートは難病に指定されている重症腸管感染症、潰瘍性大腸炎、クローン病、ベーチェット病などの腸疾患の治りにくい潰瘍、炎症に対して、腸管上皮の再生を促す意味でもすこぶる有意義と考えられる。腸管アレルギーに対しての有用性も期待される。【００３０】
（気道粘膜上皮細胞）
気道粘膜上皮細胞は気道粘膜の生検組織より容易に得られ、前述の組織同様に結合組織などの不純物を除去するために、ディスパーゼやトリプシンなどの酵素による処理や、フィルター処理を施すことが好ましい。気道粘膜上皮細胞はβデフェンシンの生合成、放出などを介し、各種感染症の病態進展に重要な働きを担う。また、喘息やアレルギー疾患においても気道粘膜上皮の果たす役割は高い。組織障害を受けた気道粘膜に本発明になる気道粘膜上皮細胞から作製される生体組織シートを提供することは、緊急時対応を超え、人口気道の提供にも繋がるものである。特に羊膜上に作製されたシートの持つ免疫抑制作用は有益である。【００３１】
口腔粘膜上皮細胞や腸管粘膜上皮細胞などは特に、組織の採取後、結合組織などの不純物を除去するために、ディスパーゼやトリプシンなどの酵素による処理や、フィルター処理を施すことが好ましい。【００３２】
生体由来細胞は、生体組織シートの移植を受ける者（レシピエント）から調製することが好ましい。即ち、生体由来細胞のドナーと、生体移植シートのレシピエントが同一人であることが好ましい。このような自家細胞を用いることにより、免疫拒絶の問題が解消される。【００３３】
調製された生体由来細胞は、羊膜上に播種（載置）され（ステップb）、その後培養に供される（ステップｃ）。
「羊膜」とは、哺乳動物において子宮と胎盤の最表層を覆う膜であって、コラーゲンに富む実質組織上に基底膜、上皮層が形成されて構成される。羊膜としてヒト羊膜を使用することが好ましい。ヒト羊膜は、例えば分娩時に後産として得られるヒト胎仔膜、胎盤などから採取することができる。具体的には、分娩直後に得られるヒト胎仔膜、胎盤及び臍帯からなる一体物を処理、精製することによりヒト羊膜を調製することができる。処理、精製方法は、特開平５−５６９８号に記載される方法などの公知の方法を採用できる。すなわち、分娩時に得られる胎仔膜より羊膜を剥離し、超音波洗浄等の物理的処理及び酵素処理などにより残存組織を除去し、適宜洗浄工程を経てヒト羊膜を調製することができる。
このように調製したヒト羊膜は、使用時まで凍結して保存しておくことができる。ヒト羊膜の凍結は、例えば-80℃、DMEM（Dulbecco's modified Eagle's medium）とグリセロールとを体積比で等量混合した液中で行うことができる。凍結保存することにより操作性が向上することは勿論のこと、抗原性が低下することも期待できる。【００３４】
羊膜をそのまま利用することもできるが、羊膜から掻爬処理などによって上皮を除去したものを利用することが好ましい。例えば、上記のように凍結保存したヒト羊膜を解凍した後、EDTAやタンパク分解酵素で処理して細胞間の接着を緩め、そしてセルスクレイパーなどを用いて上皮を掻爬することにより、上皮が除去されたヒト羊膜を調製することができる。
上皮を除去したヒト羊膜を利用する場合には、上皮を除去して表出した面側（即ち、基底膜側）に生体由来細胞を播種することが好ましい。この面側には、IV型コラーゲンがリッチに含まれており、播種された生体由来細胞の増殖、重層化が良好に行われると考えられるからである。【００３５】
生体由来細胞は、例えば細胞密度が約1×103個／cm2以上、好ましくは約1×103個／cm2〜約1×107個／cm2、更に好ましくは約1×104個／cm2〜約1×106個／cm2となるように羊膜上に播種される。【００３６】
好適な一態様では、予め調製したヒト線維芽細胞含有コラーゲンマトリクス上に羊膜を載置し、その後、羊膜上に生体由来細胞を播種し、培養する。即ち、この態様では、コラーゲンゲル内でヒト線維芽細胞を培養するステップ（ステップb-1）、及び前記コラーゲンゲル上に羊膜を載置した後、前記生体由来細胞を該羊膜上に播種（載置）するステップ（ステップb-2）が実施される。このような手順で作製された生体組織シートは、ヒト線維芽細胞を含有するコラーゲンゲル上に載置した羊膜上で増殖させた生体由来細胞を含有することとなる。この態様の生体組織シートは、コラーゲンマトリクスごと移植材料として用いることもできる。また、コラーゲンマトリクスを除去した後に移植材料として用いることもできる。或いは、コラーゲンマトリクス及び羊膜を除去した後に移植材料として用いてもよい。
「コラーゲンゲル」はヒト線維芽細胞の培養基質として機能する。コラーゲンゲルの原材料となるコラーゲンの種類は特に限定されず、Ｉ型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲンなどを用いることができる。複数の種類のコラーゲンが混在するものを用いることもできる。これらのコラーゲンは、ブタ、ウシ、ヒツジなどの動物の皮膚、軟骨などの結合組織から、酸可溶化法、アルカリ可溶化法、酵素可溶化法などにより抽出、精製することができる。尚、抗原性を低下させる目的から、ペプシンやトリプシンなどの分解酵素で処理することによりテロペプチドを除去した、いわゆるアテロコラーゲンとしたものを用いることが好ましい。コラーゲンゲルの材料として羊膜由来、特にヒト羊膜由来のコラーゲンを用いてもよい。ここで、羊膜由来とは、広く羊膜を出発原料として得られたものであることを意味する。【００３７】
コラーゲンゲルが含有するヒト線維芽細胞の由来は特に限定されず、コラーゲンを産生するものであればいずれの組織由来のものでもよく、例えば、皮膚組織、口腔粘膜組織などから調製したヒト線維芽細胞を使用することができる。【００３８】
コラーゲンマトリクスの作製方法の具体例を示す。まず、以下の手順でヒト線維芽細胞を調製する。皮膚を採取し、続いて皮膚から真皮を剥離する。真皮を細切し、I型コラーゲンコートディッシュに密着させる。静置培養し、真皮片から遊走するヒト線維芽細胞を継代する。細胞がディッシュ底面から剥離させ、細胞浮遊液を調整し、細胞培養用ディッシュに播種する。適宜細胞を凍結保存（例えば液体窒素中で保存）する。
一方、Ｉ型コラーゲンを用いて中和コラーゲン液を調製する（後述の実施例を参照）。これを培養容器（例えばカルチャーインサート）に添加し、室温で10分間程度静置させてゲル化させる。次に、上述の方法によって予め培養しておいた対数増殖期のヒト線維芽細胞をこのゲルに混和し、再度ゲル化させる。その後、静置培養する。以上の手順によってヒト線維芽細胞を含有するコラーゲンマトリクスが得られる。この創意工夫により、必要な強度を有し、羊膜層や生体由来細胞を載置できるコラーゲンマトリクスとなったもので、本発明の根幹をなす。コラーゲンマトリクスの上には、別途用意した羊膜が載置（密着）される。【００３９】
羊膜上に播種した生体由来細胞の培養（ステップc）は、異種動物細胞非存在下で実施される。本発明において「異種動物細胞非存在下」とは、生体由来細胞を培養する際の条件として、当該生体由来細胞に対して異種である動物の細胞が使用されないことをいう。具体的には生体由来細胞としてヒト細胞（例えばヒト皮膚表皮細胞やヒト角膜上皮細胞）を使用する場合に、マウスやラット等、ヒト以外の動物種の細胞が培養液中に存在（併存）しない条件のことをいう。このような条件で培養を実施することによって、最終的に得られる移植材料（即ち生体組織シート）に異種由来の成分（異種細胞自体を含む）が混入するおそれがなくなる。
生体由来細胞を培養する際に用いられる培地は、当該細胞を増殖させるものであれば特に限定されない。例えば、MCDB153培地（日水製薬株式会社）や、EpiLifeTM（カスケード社）、これらの培地のアミノ酸組成等を改変して作製される培地、上皮細胞の成長に通常用いられるDMEM（Dulbecco's modified Eagle's medium）とハムF12培地（Ham's F12 medium）とを所定割合で混ぜた培地などを使用することができる。特に、本発明では無血清で且つ異種動物由来のタンパク質を含まない培地を用いることが好ましい。一方、成長因子や抗生物質等が添加された培地を使用してもよい。但し、血清を含まない培地を使用することが好ましい。即ち、本発明における培養方法として無血清培養法を採用することが好ましい。血清由来の成分の混入による免疫拒絶等の問題を回避することができるからである。尚、血清を含む培地中で培養することにしてもよいが、その場合には同種由来の血清（ヒトの生体由来細胞を培養する際にはヒト由来の血清）を使用するか、自家血清を使用することが好ましい。勿論、可能であれば、免疫拒絶反応の惹起のおそれがなくなる自家血清を使用することが好ましい。
生体由来細胞の良好な増殖を目的として培養ステップの途中で培養条件を変更することもできる。【００４０】
ステップcの結果、羊膜上で生体由来細胞が増殖する。このようにして得られた細胞層の表層を角化する必要がある場合（例えば皮膚表皮細胞を用いて皮膚表皮シートを作製する場合や、角膜上皮細胞を用いて角膜上皮シートを作製する場合）には、細胞層の表層を空気に接触させるステップ（ステップd）が実施される。尚、このステップを本明細書においてエアーリフティング（Air-lifting）とも呼ぶ。このステップdは、細胞層を形成する細胞の分化、及びバリア機能の誘導のために行われる。
このステップは、培養液の一部をスポイト、ピペットなどを用いて一時的に除去することにより培養液表面を低下させ、これにより細胞層の最表層を一時的に培養液外に露出させることによって行うことができる。又は、細胞層を羊膜ごと持ち上げて、最表層を培養液表面から一時的に露出させることにより行うこともできる。更には、チューブなどを用いて空気を培養液中に送り込み、細胞層の最上層に空気を接触させてもよい。操作の容易さの観点から、培養液表面を低下させて細胞層の最表層を露出させる方法により行うことが好ましい。
このステップdを行う時間、即ち細胞層の最表層を空気に接触させる時間は、細胞の状態や培養条件などによって変動するが、例えば３日〜３週間程度であり、好ましくは５日〜２週間、更に好ましくは約１週間である。【００４１】
本発明の一態様では、ステップc（培養ステップ)の後に、(e)前記生体由来細胞を前記羊膜とともに回収するステップとf)回収した前記生体由来細胞及び前記羊膜を、羊膜側を下にして第２の羊膜上に載置した後、前記生体由来細胞を培養して増殖させるステップが更に実施される。ステップe及びステップfを実施することによって、羊膜（第１の羊膜）の片面に別の羊膜（第２の羊膜）が接着しており、且つ一部で第１の羊膜を被覆し、他の一部では第２の羊膜を被覆する細胞層を備える構築物が得られる。尚、第２の羊膜の大きさや培養条件等を適宜調整することによって、第２の羊膜の表面の全体が細胞層で被覆されている構築物、及び第２の羊膜の表面の一部が細胞層で被覆されている構築物のいずれかを得ることができる。【００４２】
ステップeでは、培養後の生体由来細胞と、培養基質として用いた羊膜が回収される。例えば、培養皿内に載置した羊膜上で生体由来細胞を培養した場合には、培養後に羊膜を培養皿から剥離することで、増殖した生体由来細胞及び羊膜を回収することができる。一方、コラーゲンゲル上に載置した羊膜上で生体由来細胞を培養した場合には、培養後に羊膜をコラーゲンゲルから剥離することで、増殖した生体由来細胞及び羊膜を回収することができる。【００４３】
ステップfでは、回収した生体由来細胞と羊膜を、別の羊膜上に載置した後、生体由来細胞を再び培養する。このように、当該態様では二段階の培養（ステップc及びステップf）が実施される。
ステップfではまず、回収した生体由来細胞と羊膜からなる構築物（以下、「細胞-羊膜構築物」という）が、羊膜側を下にして、別途用意した羊膜（第２の羊膜）上に載置される。複数個の細胞-羊膜構築物を第２の羊膜上に載置することもできる。例えば、ステップcによる培養後に回収した細胞-羊膜構築物を裁断することによって複数個の細胞-羊膜構築物を得ることができる。或いは、互いに独立した複数の培養系を用意し、並行してステップcを実施することによって複数個の細胞-羊膜構築物を得ることもできる。
複数個の細胞-羊膜構築物を第２の羊膜上に載置する場合、均一に分散した状態、即ち間隔が一定となるように細胞-羊膜構築物を配置することが好ましい。その後の培養において（及び生体への移植後）細胞が増殖して細胞層が周囲へと伸展する際、第２の羊膜において当初細胞層が形成されていない領域を迅速且つ効率的に細胞層で被覆することができるからである。即ち、以上の方法を採用すれば、第２の羊膜上において、広い表面積の細胞層を短時間に形成させることができる。このように、一層効率的な細胞層の作製が可能となる。一方、第２の羊膜の表面全体を被覆する細胞層が形成される前に第２の羊膜ごと細胞層を生体の組織欠損部に移植することもでき、この場合には移植後に迅速な細胞層の形成が促されて高い治療効果が得られる。
広い表面積の細胞層を短時間に得ることができるから、以上の方法は培養表皮シートを作製する際に特に好適なものとなる。尚、細胞層の表層を角化する必要がある場合には、ステップeの前、ステップeとステップfの間、又はステップfの後に、上記と同様の方法でエアーリフティング（ステップd）を実施する。【００４４】
ステップfにおける培養は、上記ステップcにおける培養条件と同様の条件で実施することができる。即ち、異種動物細胞非存在下で培養することが好ましく、培地には無血清で且つ異種動物由来のタンパク質を含まないものを用いることが好ましい。血清を含む培地を採用する場合には同種由来の血清（ヒトの生体由来細胞を培養する際にはヒト由来の血清）を使用するか、自家血清を使用することが好ましい。また、ステップcと同様にステップfにおいても、生体由来細胞の良好な増殖を目的として培養ステップの途中で培養条件を変更してもよい。【００４５】
本発明の生体組織シートは、その作製過程において異種動物由来の細胞を使用しないこと、及び生体由来細胞を培養する際の足場として羊膜を使用することによって、安全性が極めて高いものとなる。羊膜を使用することは生着性の向上にも寄与することから、本発明の生体組織シートは移植した際に高い治療効果が得られるものとなる。特に、羊膜及びコラーゲンゲルを使用する方法で作製された生体組織シートでは極めて緻密な細胞層が形成され、移植後の生着性が非常に高くなる。【００４６】
本発明の生体組織シートは、皮膚表皮、毛包上皮、角膜上皮、口腔粘膜上皮、腸管粘膜上皮、及び気道粘膜上皮などの再生（再建）に利用される。例えば、本発明の生体組織シートを生体の組織欠損部に直接、移植することができる。ここでの「直接移植」とは、組織欠損部と生体組織シートの間に他の物質を実質的に介在させることなく移植することを意味する。一方、両者の間に他の物質が介在するように、本発明の生体組織シート（但し、作製過程において第２の羊膜を使用するものは除く）を、生体の組織欠損部に移植することもできる。例えば、培養基質として用いた羊膜とは別の羊膜（第２の羊膜）を介して、組織欠損部に生体組織シートを移植することができる。具体的には、組織欠損部に対して羊膜（第２の羊膜）を移植した後、予め作製しておいた生体組織シートを当該羊膜上に移植することができる。このような移植術によれば、羊膜が下地として存在することによって、生体組織シートに含有される細胞が効率的に増殖するとともに周囲へと良好に遊走することが期待される。即ち、生体組織シートを構成する細胞層の迅速な伸展を期待でき、高い治療効果が得られる。一方、組織欠損部が羊膜で被覆されることによって外部から保護される。このことも治療効果の向上に寄与する。【００４７】
本発明は更に、羊膜上では皮膚表皮細胞の増殖及び遊走が良好になるとの知見に基づいて、皮膚表皮細胞の新規な調製方法を提供する。本発明の調製方法は以下のステップ、即ち(A)皮膚表皮細胞を羊膜上に播種するステップ；(B)前記皮膚表皮細胞を培養して増殖させるステップ；及び(C)増殖した皮膚表皮細胞を回収するステップを含むことを特徴とする。本発明の調製方法によれば効率的に細胞が増殖し、周辺への細胞の遊走も良好となる。従って、短時間で大面積の細胞層（培養上皮）を作製することが可能である。ここで、皮膚表皮細胞の採取及び培養は常法（上記参照）で行うことができる。また、増殖した皮膚表皮細胞の回収には、物理的手段（セルスクレイパーなどによる剥離）、酵素的手段（ディスパーゼやトリプシンによる処理）などを用いることができる。尚、皮膚表皮細胞を層状態のままで回収しても、或いは個々の細胞に分離された状態で回収してもよい。【００４８】
以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４９】
羊膜を用いた三次元培養皮膚シート（培養表皮シート）の作製
１．羊膜の調製
１−１．羊膜の採取
全身的合併症のない帝王切開予定の妊婦に対して事前に産婦人科医とともに十分なインフォームドコンセントを行った後、手術室で帝王切開時に羊膜を採取した。操作は清潔に気をつけ、手術操作に準じて手洗いの後に専用ガウンを装用した。分娩前に清潔な羊膜採取用のバットと洗浄用の生理食塩水を準備した。分娩後に胎盤組織をバットに移し、用手的に羊膜組織を胎盤より剥離した。羊膜と胎盤との癒着が強い部分はハサミで切除した。【００５０】
１−２．羊膜の処理
羊膜処理の過程は（１）洗浄、（２）トリミング、（３）保存の順で行った。すべての過程において、操作は清潔なドラフト内で行うのが望ましく、使用する容器や器具もすべて滅菌されたものを使用し、シャーレ等は滅菌された使い捨て（ディスポーザブル）タイプのものを使用した。採取した羊膜に付着した血液成分を生理食塩水にて洗浄しながら除去し、さらに十分量の生理食塩水（0.005% ofloxacin添加）にて洗浄した。続いて、ペニシリン−ストレプトマイシン（50IU）を添加したリン酸緩衝液（PBS）で合計３回洗浄した。次に、羊膜をシャーレ内に移し、ハサミを用いて約4×3 cm程度のサイズに分割した。分割後、形状や厚さなどを基準に状態のよい羊膜を選別した。【００５１】
１−３．羊膜の保存
2ccの滅菌クライオチューブに1ccずつ保存液を入れ、そこに採取、洗浄して選別された羊膜を1枚ずついれラベルした後、−80℃のディープフリーザーに保存した。保存液には50％滅菌済みグリセロールを含むDMEM (ダルベッコ変法MEM培地、GIBCOBRL社)を使用した。保存された羊膜の使用期限は3ヶ月とし、期限が過ぎれば焼却処分した。尚、このような保存処理を行わずに、以下の上皮処理を実施してもよい。【００５２】
１−４．羊膜上皮の処理
−80℃で保存していた羊膜を室温で解凍した後、ペニシリン−ストレプトマイシン（50IU）を添加したリン酸緩衝液（PBS）で2回洗浄した。洗浄後の羊膜を0.02％EDTA溶液 (Nacalai tesque社)に浸し（100mm培養皿）、CO2インキュベーター内で37℃、1時間反応させた。反応後、羊膜を十分量のPBSで2回洗浄し、実体顕微鏡下、セルスクレイパー (Nunc社 USA)を用いて用手的に上皮を掻爬（除去）した。尚、この処理方法によって一層の羊膜上皮が完全に除去掻爬されたことを光学的及び電子顕微鏡的操作（走査型電子顕微鏡）で確認した（データ示さず）。【００５３】
２．表皮角化細胞の調製
２−１．皮膚の採取
あらかじめ採取部位を3日間程度予防的にポビドンヨードにて消毒・抗真菌剤の外用塗布を行った後、小皮膚片を皮膚生検に準じて採取する。【００５４】
２−２．表皮角化細胞の無血清培養法
ハサミで皮膚片から脂肪組織と真皮をできる限り取り除き、ダルベッコリン酸緩衝液（PBS）にて数回洗浄する。70％エタノールに１分間浸し滅菌する。PBSにて洗浄後、幅3mm長さ10mm程度の短冊状に切り、ディスパーゼ液（ディスパーゼII、 合同酒精社、250単位/mlダルベッコ変法MEM培地；DMEM）に浸し、4℃で一晩（18〜24時間）静置する。翌日、ピンセットを用いて表皮を真皮から剥離する。剥離した真皮は線維芽細胞培養に供する。剥離した表皮を、DMEMにて洗浄、続いて、PBSにて洗浄後、0.25%トリプシン溶液中にひたし、37℃、10分間の処理を行う。表皮をトリプシン中和液を入れたプラスチックシャーレに移しピンセットにて表皮片をほぐし、50mlの滅菌チューブに移す。PBSを添加し、表皮角化細胞浮遊液を調整する。細胞数を数え、1000rpm、5分間遠心し細胞を沈殿させる。上清を吸引し、細胞を無血清培地であるMCDB153培地で懸濁し、100mmコラーゲンコートシャーレ（旭テクノグラス、I型コラーゲンコートディッシュ；4010-010）当たり2〜3×106細胞/10ml 培養液の割合で播種する。翌日培養液を交換し、以後１日おきに培養液を交換する。細胞密度が70〜80%程度になった時点で継代培養を行う。【００５５】
３．線維芽細胞の調製
剥離した真皮をDMEMにて洗浄後、一辺が1〜2mmにメスを用いて細切する。細切した真皮片をI型コラーゲンコートディッシュに約1cmの間隔で密着させる。CO2インキュベーターに30分間静置し、完全に密着させる。その後、牛胎児血清を10％含むDMEM培地を約5ml添加し、7日間静置する。7日目に初回の培養液交換を行う。真皮片から線維芽細胞が遊走してくるのを確認する。細胞が増殖し、真皮片の周囲5mmまで遊走してきた段階で、継代を行う。PBSで洗浄後、0.125%トリプシン、0.05%EDTAを含む溶液を3ml添加し、37℃、3分間処理する。細胞がディッシュ底面から剥離したことを顕微鏡で確認した後、3mlのトリプシンインヒビターを添加し細胞を回収し50mlのチューブに移す。PBSを用いて残りの細胞を回収し、1000rpm、5分間の遠心処理にて細胞を沈殿させ、上清を吸引後、牛胎児血清を10％含むDMEM培地を添加し、細胞浮遊液を調整し、細胞培養用ディッシュに播種する。継代の細胞密度はおおむね1：3程度とする。適宜細胞を凍結保存する。凍結保存液は10％グリセロール、20%FCS、70%DMEMを用い、液体窒素中で保存する。【００５６】
４．中和コラーゲンゲルの作製
I型コラーゲン溶液（セルマトリクスタイプ1A：3mg/ml：新田ゼラチン）：6容量に対して0.1N NaOH：１容量、8倍濃度DMEM：１容量、20％FCS/DMEM：10容量の割合で中和コラーゲン液（コラーゲンの最終濃度：1mg/ml）を4℃にて作製し、直径24mmのカルチャーインサート（Corning-Costar社）に１mlずつ添加し、室温で10分間静置しゲル化させる。あらかじめ培養しておいた対数増殖期の線維芽細胞（ディスパーゼ処理し表皮を剥離した残りの真皮からoutgrowth法で培養し5-10代継代した細胞を用いる。）を5x105細胞/ml、10%FCS/DMEMの濃度に調整し、この細胞懸濁液：2容量に対して中和コラーゲン液：8容量の割合で混和し、細胞を含む中和コラーゲン溶液を調製する（コラーゲンの最終濃度：0.8mg/ml）。この溶液を各カルチャーインサートに3.5mlずつ添加し、CO2インキュベーター内(37℃、5%CO2)に静置する。約30分でゲル化したことを確認する。その後10％FCS/DMEMをゲルが浸る程度（カルチャーインサイト内側に3ml、カルチャーインサート外側に3ml）加え5日間静置培養する。培養2日目よりゲルは収縮を開始しはじめ、線維芽細胞の増殖を位相差顕微鏡下に観察できる。【００５７】
５．羊膜の接着
培養開始後5日後にはコラーゲンゲルの底面はメンブレンに密着しているがコラーゲンゲル上部は収縮し厚さが2〜3mmになっている。保存していた羊膜（上皮を除去した羊膜）をPBSにて２回洗浄、さらに角化細胞用培養液で１回洗浄する。羊膜の実質細胞側を下にしてカルチャーインサートに移し、ピンセットを用いてコラーゲンゲルと密着させる。ピンセットにて皺ができないようにのばし、カルチャーインサートの側壁に羊膜の周辺を密着させる。CO2インキュベーター内に移し、37℃で30分間静置する。【００５８】
６．角化細胞の播種
２−２．で調製した角化細胞をトリプシン・EDTAを用いてディッシュから剥離し、回収する。1000rpm、5分間遠心し、上清を除去し、200万個/0.25mlの濃度になるように細胞を懸濁する。カルチャーインサート内側の羊膜上に0.25mlの細胞懸濁液を播種し、CO2インキュベーター内に移し、角化細胞が羊膜に密着するように1.5〜2.0時間インキュベーター内で静置し、その後1mlの表皮細胞増殖用培地をカルチャーインサート内側に緩やかに添加し、さらにカルチャーインサート外側に1ml添加する。翌日表皮細胞増殖用培地をカルチャーインサート内側に緩やかに追加し、さらにカルチャーインサート外側にも1ml追加する。【００５９】
７．気相下培養
表皮細胞を羊膜に播種後3日目に空気曝露（エアーリフティング）を行う。空気曝露用の維持容器に滅菌したフィルターペーパーを設置し、重層化用培地をフィルターペーパーが浸る程度（約9ml）添加する。カルチャーインサート内側の培養液を注意深く除去し、カルチャーインサートをフィルターペーパー上に移し、CO2インキュベーター内で培養する。培養液は一日おきに交換する。7〜14日の空気曝露により三次元培養皮膚が完成する。重層化用培地は以下のごとく調整する。ダルベッコ変法MEM培地：F-12培地＝1:1、カルシウム濃度；1.95mM、monoethanolamine;0.1mM、0-phosphoethanolamine;0.1mM、insulin;5ug/ml、hydrocortisone;0.4ug/ml、L-glutamine;4mM、Adenin;0.18mM、transfferin;5ug/ml、selenious acid;53nM、triiodothyronine;20pM、serine;1mM、choline chloride;0.64mM、linoleic acid;2ug/ml、FCS;2%【００６０】
以上の操作の結果得られる培養表皮シートは、ディッシュ底面から若しくはコラーゲンマトリクスから容易に剥離する。従前の技術ではシートの収縮が起こるため、キチン膜（ベスキチンW）を支持体として用いることが必要であり、また破損することも多いが、以上の方法によれば強固なシートが作製され、シートの収縮も認められないことから、支持体の使用が不要となる。【００６１】
８．組織学的検索
以上の方法で培養表皮シートを作製したところ空気曝露後7日目では表皮は5〜8層となり、角層の形成が認められ、正常ヒト皮膚とほぼ同様の構造を呈していた。重層化した角化細胞の組織所見は一層の基底細胞様の細胞とその上に5〜8層の重層化し、分化した細胞構築が認められる（図１）。3代継代した細胞で培養表皮シートを作製した場合、皮膚採取後約4週間で培養表皮シートが使用可能となり、培養面表面積は計算上、数千倍に増加する。
一方、空気曝露前後で経時的に標本を作製し、HE染色を施行した。空気曝露後9日目の標本より凍結組織切片を作製し、ニチレイ社のヒストファインSAB−APキットを用いて免疫組織化学染色を行い、基質はニューフクシンを用いた。用いた抗体は以下の通りである。モノクローナル抗体；ラミニン5（GB3、Sera Lab）、IV型コラーゲン（MAB1910、Chemicon）、VII型コラーゲン（LH7.2、YLEM）、β4インテグリン（MAB1964、Chemicon）、β1インテグリン（P4ClO、Gibco BRL）、デスモグレイン1（DG3.10、Progen）、プラコグロビン（PG5.1、Progen）、デスモプラキン（DP−2.15、Progen）、Eカドヘリン（HECD−1、Takara）、Pan−ケラチン（Dako）、EGFレセプター（Ab3、Oncogene Science）、ポリクローナル抗体；インポルクリン（Biomedical Technologies Inc.）、デスモグレイン3（Serotec）。類天疱瘡抗原の確認には類天疱瘡患者血清を用い、FITC標識抗ヒトIgG抗体を使用し、蛍光顕微鏡下に観察した。電子顕微鏡検索には空気曝露後9日目の標本を定法で固定、包埋し、日立社製透過型電子顕微鏡で観察した。
空気曝露前のHE所見では角化細胞は1〜2層であり角層の形成は認められず、空気曝露後4日では角化細胞は重層化がみられ3〜4層の有棘層と明らかな角層の形成がみられた。7日後には有棘層は約5〜8層程度となり、この状態は14日頃までは確実に維持されていた。従来の培養表皮シートとくらべ明らかに強固なシートを形成しており、支持体を用いなくても操作は容易で非常に扱いやすいと思われた。免疫組織学的にはラミニン5、IV型コラーゲン、VII型コラーゲン、β4インテグリンは基底層の表皮基底細胞を中心として発現がみられ、vivo表皮の発現形式とは異なっていた。細胞間接着分子であるEカドヘリン、デスモグレイン1、デスモグレイン3、その裏打ち蛋白であるデスモプラキン、プラコグロビンは基底層から有棘層に発現されていた。EGFレセプター、β1インテグリンは基底層から傍基底層にかけて発現していた。類天疱瘡抗原は基底膜部に線状に発現がみられた。免疫組織所見をまとめると、細胞間接着分子、分化のマーカーはおおむねvivo表皮と同様に発現がみられたが、基底膜の構成成分の発現は不十分であると思われた。電顕所見ではデスモゾームは良好に形成されていた。基底膜部ではヘミデスモゾームの形成はおおむね良好であったが基底板は一部形成が認められるものの、断片的であった。係留線椎は断片的に形成がみられた。【００６２】
９．シートの保存
作製した培養表皮シートはキャリアーと共に若しくはキャリアーなしに少量の保存液を用いることで凍結可能である。具体的にはまず、−80℃のフリーザーで凍結保存し、翌日、−150℃の超低温フリーザーで保存する。−150℃での保存では長期間シートの形で保存可能であり、実際に十分な治療効果が得られている。その他、生体組織の保存に用いられる保存液を使用して4℃で保存することも可能であり、この場合には抗酸化物質を添加しておくことが望ましい。【００６３】
１０.培養表皮シートの移植
剥離したシートをプレートに付着していた面が創面を覆うように移植し、圧迫・固定を行う。通常、テープ固定と包帯による圧迫で十分である。培養シート移植も通常の皮膚移植と同様、自己の細胞を用いた自家移植と他人の細胞を用いた他家移植とに分類される。自家移植は生着性に優れるが作製に時間がかかる。他家移植は、生着しないが、biological dressing としての効果があり、一見生着したかのように見えることもある。シートの保存が可能となったことより、一度に大量に他家培養シートを作製しておけば必要時に直ちに使用できる利点を有する。これらの理由により、他家培養シートは、主に急性期の熱傷患者に応用されている。臨床応用の際には、熱傷、下腿潰瘍、先天性表皮水疱症、獣皮様母斑、瘢痕、分層採皮部位の被覆などが対象となる。
【実施例２】
【００６４】
三次元培養皮膚シート（培養表皮シート）の作製（コラーゲンゲルを用いない場合）
１．羊膜、表皮角化細胞の調製
実施例１と同様の手順で羊膜と表皮化角化細胞を調製した。【００６５】
２．角化細胞の播種
保存していた羊膜をPBSにて２回洗浄、さらに角化細胞用培養液で１回洗浄する。羊膜の実質細胞側を下にしてカルチャーインサートの底面上に接着させる。あらかじめ培養してあった角化細胞をトリプシン・EDTAを用いてディッシュから剥離し、回収する。1000rpm、5分間遠心し、上清を除去し、200万個/0.25mlの濃度になるように細胞を懸濁する。カルチャーインサート内側の羊膜上に0.25mlの細胞懸濁液を播種し、CO2インキュベーター内に移し、角化細胞が羊膜に密着するように1.5〜2.0時間インキュベーター内で静置し、その後1mlの表皮細胞増殖用培地をカルチャーインサート内側に緩やかに添加し、さらにカルチャーインサート外側に1ml添加する。翌日表皮細胞増殖用培地をカルチャーインサート内側に緩やかに追加し、さらにカルチャーインサート外側にも1ml追加する。【００６６】
３．気相下培養
表皮細胞を羊膜に播種後3日目に空気曝露（エアーリフティング）を行う。空気曝露用の維持容器に滅菌したフィルターペーパーを設置し、重層化用培地をフィルターペーパーが浸る程度（約9ml）添加する。カルチャーインサート内側の培養液を注意深く除去し、カルチャーインサートをフィルターペーパー上に移し、CO2インキュベーター内で培養する。培養液は一日おきに交換する。7〜14日の空気曝露により三次元培養皮膚が完成する。重層化用培地は以下のごとく調整する。ダルベッコ変法MEM培地：F-12培地＝1:1、カルシウム濃度；1.95mM、monoethanolamine;0.1mM、0-phosphoethanolamine;0.1mM、insulin;5ug/ml、hydrocortisone;0.4ug/ml、L-glutamine;4mM、Adenin;0.18mM、transfferin;5ug/ml、selenious acid;53nM、triiodothyronine;20pM、serine;1 mM、choline chloride;0.64mM、linoleic acid;2ug/ml、FCS;2%【００６７】
４．組織学的検索
以上の方法で培養表皮シートを作製したところ空気曝露後7日では表皮は5〜8層となり、角層の形成が認められ、正常ヒト皮膚とほぼ同様の構造を呈していた（図２）。
【実施例３】
【００６８】
羊膜を用いた三次元角膜上皮シートの作製
１．羊膜の調製
実施例１と同様の手順で羊膜を調製した。
２．角膜上皮細胞の調製
２−１．角膜の調達
角膜はドナー用のものをNorthwest Lions Eye Bank（シアトル、米国）より購入した。
２−２．角膜上皮細胞の無血清培養法
角膜をダルベッコリン酸緩衝液（PBS）の入ったシャーレに移し、実体顕微鏡下に輪部をメスにて一辺が2〜3mmに細切する。細切した輪部を数回PBSにて洗浄し、70％エタノールに１分間浸し滅菌する。PBSにて洗浄後、ディスパーゼ液（ディスパーゼII、合同酒精社、250単位/mlダルベッコ変法MEM培地；DMEM）に浸し、4℃で一晩（18〜24時間）静置する。翌日、実体顕微鏡下にピンセットを用いて上皮を実質から剥離する。剥離した角膜上皮を、DMEMにて洗浄、続いて、PBSにて洗浄後、0.25%トリプシン溶液中に浸し、37℃、10分間の処理を行う。表皮をトリプシン中和液を入れたプラスチックシャーレに移しピンセットにて表皮片をほぐし、15mlの滅菌チューブに移す。PBSを添加し、角膜上皮細胞浮遊液を調整する。細胞数を数え、1000rpm、5分間遠心し細胞を沈殿させる。上清を吸引し、細胞を無血清培地であるEpiLife培地で懸濁し、60mmコラーゲンコートシャーレ（旭テクノグラス、I型コラーゲンコートディッシュ；4010-020）当たり1〜2×106細胞/5ml培養液の割合で播種する。翌日培養液を交換し、以後１日おきに培養液を交換する。細胞密度が70〜80%程度になった時点で継代培養を行う。
尚、以上の方法では無血清培地中を使用して角膜上皮細胞を培養することにしたが、以下に示す手順のように血清を含む培地を使用することもできる。
(1)角膜輪部組織から内皮細胞を剥離除去し、結膜を切除する。
(2)ディスパーゼ液（ディスパーゼI、合同酒精社、250単位/mlダルベッコ変法MEM培地；DMEM）に浸して4℃で一晩（18〜24時間）静置する。
(3)0.25%トリプシン溶液中に浸し、37℃、10分間の処理を行う。
(4)顕微鏡下で上皮のみをトリプシン溶液中ではがす。
(5)ピペッティングして、30%FCS/DMEMを同量加えて懸濁する。
(6)PBS(-)で残りの細胞をさらに回収して遠心処理する。
(7)適量の培養液で単一細胞懸濁液とする。【００６９】
調製した角膜上皮細胞の凍結保存条件（保存液組成含む）及び融解条件の一例を以下に示す。
凍結保存条件：1℃/時間の速度で-20℃まで温度を低下させ、その後窒素タンクで保存する。
保存液組成：20%FCS/10%DMSO/DMEM
融解条件：出来るだけ急速に37℃で融解し、PBSで10倍希釈する。【００７０】
３．線維芽細胞の調製
剥離した真皮をDMEMにて洗浄後、一辺が1〜2mmにメスを用いて細切する。細切した真皮片をI型コラーゲンコートディッシュに約1cmの間隔で密着させる。CO2インキュベーターに30分間静置し、完全に密着させる。その後、牛胎児血清を10％含むDMEM培地を約5ml添加し、7日間静置する。7日目に初回の培養液交換を行う。真皮片から線維芽細胞が遊走してくるのを確認する。細胞が増殖し、真皮片の周囲5mmまで遊走してきた段階で、継代を行う。PBSで洗浄後、0.125%トリプシン、0.05%EDTAを含む溶液を3ml添加し、37℃、3分間処理する。細胞がディッシュ底面から剥離したことを顕微鏡で確認した後、3 mlのトリプシンインヒビターを添加し細胞を回収し50mlのチューブに移す。PBSを用いて残りの細胞を回収し、1000rpm、5分間の遠心処理にて細胞を沈殿させ、上清を吸引後、牛胎児血清を10％含むDMEM培地を添加し、細胞浮遊液を調整し、細胞培養用ディッシュに播種する。継代の細胞密度はおおむね1：3程度とする。適宜細胞を凍結保存する。凍結保存液は10％グリセロール、20%FCS、70%DMEMを用い、液体窒素中で保存する。【００７１】
４．中和コラーゲンゲルの作製
I型コラーゲン溶液（セルマトリクスタイプ1A：3mg/ml：新田ゼラチン）：6容量に対して0.1N NaOH：１容量、8倍濃度DMEM：１容量、20％FCS/DMEM：10容量の割合で中和コラーゲン液（コラーゲンの最終濃度：1mg/ml）を4℃にて作製し、直径24 mmのカルチャーインサート（Corning-Costar社）に１mlずつ添加し、室温で10分間静置しゲル化させる。あらかじめ培養しておいた対数増殖期の線維芽細胞（ディスパーゼ処理し表皮を剥離した残りの真皮からoutgrowth法で培養し5-10代継代した細胞を用いる。）を5x105細胞/ml、10%FCS/DMEMの濃度に調整し、この細胞懸濁液：2容量に対して中和コラーゲン液：8容量の割合で混和し、細胞を含む中和コラーゲン溶液を調製する（コラーゲンの最終濃度：0.8mg/ml）。この溶液を各カルチャーインサートに3.5mlずつ添加し、CO2インキュベーター内(37℃、5%CO2)に静置する。約30分でゲル化したことを確認する。その後10％FCS/DMEMをゲルが浸る程度（カルチャーインサイト内側に3ml、カルチャーインサート外側に3ml）加え5日間静置培養する。培養2日目よりゲルは収縮を開始しはじめ、線維芽細胞の増殖を位相差顕微鏡下に観察できる。【００７２】
５．羊膜の接着
培養開始後5日後にはコラーゲンゲルの底面はメンブレンに密着しているがコラーゲンゲル上部は収縮し厚さが2〜3mmになっている。保存していた羊膜をPBSにて２回洗浄、さらに角化細胞用培養液で１回洗浄する。羊膜の実質細胞側を下にしてカルチャーインサートに移し、ピンセットを用いてコラーゲンゲルと密着させる。ピンセットにて皺ができないようにのばし、カルチャーインサートの側壁に羊膜の周辺を密着させる。CO2インキュベーター内に移し、37℃で30分間静置する。【００７３】
６．角膜上皮細胞の播種
２−２．で調製した角膜上皮細胞をトリプシン・EDTAを用いてディッシュから剥離し、回収する。1000rpm、5分間遠心し、上清を除去し、200万個/0.25mlの濃度になるように細胞を懸濁する。カルチャーインサート内側の羊膜上に0.25mlの細胞懸濁液を播種し、CO2インキュベーター内に移し、角化細胞が羊膜に密着するように1.5〜2.0時間インキュベーター内で静置し、その後表皮細胞増殖用無血清培地を緩やかに添加し（カルチャーインサート内側に3ml、カルチャーインサート外側に3ml）さらに14日間液相下で培養を続ける。角膜上皮細胞播種3日目に培養液を重層化用培養液（下記参照）に変更し、以後2日に1回培養液を交換する。
重層化用培地は以下のごとく調整する。ダルベッコ変法MEM培地：F-12培地＝1:1、カルシウム濃度；1.95mM、monoethanolamine;0.1mM、0-phosphoethanolamine;0.1mM、insulin;5ug/ml、hydrocortisone;0.4ug/ml、L-glutamine;4mM、Adenin;0.18mM、transfferin;5ug/ml、selenious acid;53nM、triiodothyronine;20pM、serine;1mM、choline chloride;0.64mM、linoleic acid;2ug/ml、FCS;2%【００７４】
７．気相下培養
角膜上皮細胞を播種後14日目に空気曝露（エアーリフティング）を行う。空気曝露用の維持容器に滅菌したフィルターペーパーを設置し、重層化用培地をフィルターペーパーが浸る程度（約9ml）添加する。カルチャーインサート内側の培養液を注意深く除去し、カルチャーインサートをフィルターペーパー上に移し、CO2インキュベーター内で培養する。培養液は3日目に交換する。3日間の空気曝露により培養角膜が完成する。【００７５】
８．組織学的検索
空気曝露後3日目では角膜上皮は3〜4層となり、角層の形成が認められ、正常ヒト角膜とほぼ同様の構造を呈している。
【実施例４】
【００７６】
羊膜の細胞培養基質としての特性評価
１．羊膜上での表皮角化細胞の増殖及び遊走試験１
線維芽細胞を含むコラーゲンゲル上に、その上皮が存在していた側が上になるように、上皮が除去された羊膜を広げた状態で載せ、密着させた。次に、羊膜上にステンレス製のドーナツ状リング（内径6mm、高さ2mm)をおき、内部（6mmで穴の開いている部分）に表皮角化細胞懸濁液を播種した。尚、羊膜及び表皮角化細胞懸濁液はともに、実施例１に記載した方法で調製した。
２日後にリングをとり、空気曝露による重層化を開始した。周囲への表皮角化細胞の遊走を重層化１日後及び１０日後に観察した。羊膜を使用しないこと以外は同条件としたものを比較対象（コントロール群）とした。
重層化後１日目及び１０日目のシャーレ内の状態を図３に示す。図３の右欄が試験群（線維芽細胞を含むコラーゲンゲルに密着させた羊膜上で表皮角化細胞を培養した場合）の結果（上から順に１日目、１０日目）である。左欄はコントロール群（線維芽細胞を含むコラーゲンゲル上で表皮角化細胞を培養した場合）の結果である。シャーレの中央領域において円形、スポット状に観察されるのが細胞（細胞層）である。
試験群（左欄）では１日目から１０日目にかけて細胞層が大幅に拡大している。即ち、細胞が良好に増殖するとともに、周辺への遊走が亢進していることがわかる。一方、コントロール群では１日目と１０日目において細胞層の大きさに目立った変化は認められない。以上の結果から羊膜上では細胞の増殖率が高いとともに、著明に遊走が亢進することが明らかとなった。【００７７】
２．羊膜上での表皮角化細胞の増殖及び遊走試験２（三次元培養法との組合せ）
まず、実施例１に記載した手順で三次元培養（コラーゲンゲルに接着させた羊膜上での表皮角化細胞の培養、及びそれに続く空気曝露）を実施し、羊膜上に細胞層が形成されている培養表皮シート（空気曝露による重層化開始後７日目のもの）を作製した。一方、線維芽細胞を含むコラーゲンゲル上に、その上皮が存在していた側が上になるように、上皮が除去された羊膜を広げた状態で載せ、密着させた。次に、培養表皮シートを直径約8mmの円形にくり抜き、線維芽細胞を含むコラーゲンゲル上の羊膜上に載置し、静置した。そして、周囲への表皮角化細胞層の拡がりを１日後、７日後、１０日後、及び１４日後に観察した。羊膜を使用しないこと以外は同条件としたもの（コントロール群１）、及び羊膜を使用せずに三次元培養して得られた細胞層（コラーゲンゲル上に直接、表皮角化細胞を播種し、その後培養して得られた細胞層）を、線維芽細胞を含むコラーゲンゲル上に直接、載置したもの（コントロール群２）を比較対象とした。尚、羊膜及び表皮角化細胞懸濁液はともに、実施例１に記載した方法で調製した。
培養開始から１日目、７日目、１０日目及び１４日目のシャーレ内の状態を図４に示す。図４の左欄が試験群（線維芽細胞を含むコラーゲンゲルに密着させた羊膜の上に培養表皮シートを載置し、培養した場合）の結果（上から順に１日目、７日目、１０日目、及び１４日目）である。中央欄はコントロール群１（線維芽細胞を含むコラーゲンゲル上に培養表皮シートを載置し、培養した場合）の結果である。同様に右欄はコントロール群２（羊膜を使用せずに三次元培養して得られた細胞層を、線維芽細胞を含むコラーゲンゲル上に載置し、培養した場合）の結果である。
図４において、シャーレのほぼ中央に観察されるのが細胞（細胞層）である。試験群（左欄）では、時間の経過とともに細胞層が顕著に拡大している。即ち、細胞が良好に増殖するとともに、周辺への遊走が亢進していることがわかる。一方、コントロール群１（中央欄）では時間の経過とともに細胞層の若干の拡大が認められるが、その程度は試験群の場合と大きく相違する。また、コントロール群２（右欄）では観察期間を通して細胞層の大きさに目立った変化はない。以上のように、三次元培養によって得られた培養表皮シートを構成する細胞においても、羊膜上で培養することによって高い細胞増殖率が得られるとともに、細胞の周辺への遊走が著明に亢進することが明らかとなった。【００７８】
３．まとめ
１．及び２．の結果から、羊膜上では表皮角化細胞の増殖が良好であり、かつ細胞の遊走能力も良好に発揮されることが判明した。また、２．の結果によれば、線維芽細胞を含むコラーゲンゲル上に載置した羊膜上で培養した表皮角化細胞を羊膜とともに回収し、それを、予め皮膚欠損部に移植した別の羊膜上に移植する方法が優れた表皮再建術となると考えられた。この場合の移植術の具体例を以下に示す。
(1)皮膚全層及び皮下組織に至る欠損創について、まず創傷清拭（debridement）を施行し、壊死組織を除去する。詳しくは、１％キシロカインＥを欠損創の周囲に注射した後、メス又はハサミで壊死組織を除去し、潰瘍底面を平坦化させる。次に人工真皮を移植し、タイオーバー（tie over）固定を行う。
(2)1〜2週後にタイオーバーを除去し、人工真皮が生着していることを確認する。具体的には、人工真皮が潰瘍底面に密着していることを目視的に確認し、指で左右に動かしてみて動かないことを確認する。また、人工真皮の下に滲出液、血液が貯留していないことを目視的に確認する。続いて、生着した人工真皮の上に羊膜（上皮成分を除去し、細菌が陰性であることを確認し凍結保存している羊膜を37℃に温めた後、滅菌生理食塩水で２回洗浄した物）を移植し、包帯、テープ、tie-overなどで固定する。
(3)数日間、固定状態を保持した後、羊膜が人工真皮に生着していることを確認する。具体的には、羊膜と人工真皮の間に滲出液、血液が貯留していないことを目視的に確認する。さらに指で左右に動かしてみて動かないことを確認する。
(4)予め用意しておいた三次元培養表皮シート（羊膜と細胞層で構成されるもの、又は細胞層のみから構成されるもの）をパッチグラフトで移植する（例えば一つのパッチを直径15mmとする）。3日間固定し、以降2日に1回の割合で消毒処置（0.05%ヒビテン水、消毒用イソジン液）を行う。
(5)羊膜上に移植されることによって、三次元培養表皮シートを構成する細胞は良好に増殖及び遊走すると考えられる。その結果、細胞層が迅速に拡大し、高い治療効果が発揮されると期待される。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明が提供する生体組織シートの用途は広く、皮膚表皮、角膜上皮、口腔粘膜上皮、気道粘膜上皮及び腸管粘膜上皮などの再生（再建）に利用され得る。中でも、皮膚表皮又は角膜上皮の再生に好適に利用され得る。
また、本発明の生体組織シートを遺伝子治療に利用することも可能である。遺伝子治療には大きくin vivo 法とex vivo法があり、前者は遺伝子を直接生体内に導入する方法で、後者はいったん細胞を取り出し、遺伝子を導入した後再び体内に戻す方法である。遺伝子治療の現在の技術水準に鑑みると、培養皮膚、培養角膜上皮、培養腸管粘膜上皮シートに遺伝子を導入しさえすれば即座にex vivo法へと発展する。各種ウイルスベクターによるケラチノサイトへの遺伝子導入の有効性が示されてきており、特に、アデノウイルスベクターを用いた場合ほぼ100％のケラチノサイトに導入可能である。皮膚科領域での遺伝子治療では、VII型コラーゲン、ラミニン5等の異常が原因である先天性表皮水疱症などの遺伝病の治療には自家培養表皮シートに正常遺伝子を導入することで極めて有効な治療となることが予想される。また、糖尿病、血友病など体内の分子の欠乏により引き起こされる全身性疾患においてケラチノサイトに遺伝子を導入し欠乏分子を産生させ、補充する、いわゆるデリバリーシステムとしての培養皮膚の可能性もあり、今後ますます培養生体組織の応用が発展することが予想される。【００８０】
なお、本邦においては、他家移植に関しては倫理面、ならびに安全性の確認の点で問題であり一般的には普及しておらず、自家移植がもっぱら推進されているのが現状であり、その点で、三次元培養生体組織の自家移植が今後進められることになると思われる。【００８１】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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