(57)【要約】  先体反応後の精子にのみ特異的に反応する、ユニークなモノクローナル抗体を得、この抗体の認識する抗原（OBF）を同定した。この抗体により、マウス精子と卵子との融合が阻害されることが分かった。さらに、OBFの生体内での機能を解明するため、OBF遺伝子ノックアウトマウスを作製し解析した。その結果、OBF遺伝子ノックアウト雄マウスは不妊であり、その精子は、卵子に結合することができるにもかかわらず、全く融合能を有していないことが分かった。【特許請求の範囲】
【請求項１】
精子と卵子との結合または融合を阻害する活性を有する抗体であって、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のタンパク質またはその断片を抗原とする抗体（OBF13抗体を除く）。
（ａ）配列番号：１、３、５のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAよりコードされるタンパク質
（ｂ）配列番号：２、４、６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｃ）配列番号：２、４、６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質であって、配列番号：２、４、６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質
（ｄ）配列番号：１、３、５のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする天然由来のDNAよりコードされるタンパク質であって、配列番号：２、４、６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質
【請求項２】
精子と卵子との結合または融合を阻害する活性を有する抗体であって、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のタンパク質またはその断片を抗原とする抗体を有効成分として含有する避妊薬。
（ａ）配列番号：１、３、５のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAよりコードされるタンパク質
（ｂ）配列番号：２、４、６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｃ）配列番号：２、４、６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質であって、配列番号：２、４、６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質
（ｄ）配列番号：１、３、５のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする天然由来のDNAよりコードされるタンパク質であって、配列番号：２、４、６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質
【請求項３】
請求項２に記載のタンパク質またはその断片を有効成分として含有する避妊ワクチン。
【請求項４】
請求項２に記載のタンパク質またはその断片の精子と卵子との結合または融合に関連する因子としての使用。
【請求項５】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、避妊薬の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）請求項２に記載のタンパク質またはその断片に被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該請求項２に記載のタンパク質またはその断片と被検化合物との結合を検出する工程
（ｃ）該請求項２に記載のタンパク質またはその断片と結合する被検化合物を選択する工程
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、避妊薬の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）請求項２に記載のタンパク質をコードするDNAを有する細胞に被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該細胞における請求項２に記載のタンパク質をコードするDNAの発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、該DNAの発現レベルを減少させる化合物を選択する工程
【請求項７】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、避妊薬の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）請求項２に記載のタンパク質をコードするDNAを有する非ヒト動物に被検化合物を投与する工程
（ｂ）該非ヒト動物における請求項２に記載のタンパク質をコードするDNAの発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を投与していない場合と比較して、該DNAの発現レベルを減少させる化合物を選択する工程
【請求項８】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、避妊薬の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）請求項２に記載のタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｄ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを減少させる化合物を選択する工程
【請求項９】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、避妊薬の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）請求項５〜８に記載の方法の１または複数の組み合わせによって選択された化合物を、雄性動物の精子に接触させる工程
（ｂ）該精子の受精能を確認する工程
（ｃ）該精子の受精能を阻害する化合物を選択する工程
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、避妊薬の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）請求項５〜８に記載の方法の１または複数の組み合わせによって選択された化合物を、非ヒト雄性動物に投与する工程
（ｂ）該非ヒト雄性動物の精子の受精能を確認する工程
（ｃ）該非ヒト雄性動物の精子の受精能を阻害する化合物を選択する工程
【請求項１１】
請求項２に記載のタンパク質をコードする遺伝子の機能が人為的に抑制された非ヒト動物。
【請求項１２】
請求項２に記載のタンパク質をコードする遺伝子の機能が人為的に抑制された非ヒト動物細胞。
【請求項１３】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、不妊治療薬の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）被検化合物を請求項１１に記載の非ヒト動物に投与する工程
（ｂ）被検化合物が請求項２に記載のタンパク質の機能を代替しているか否かを判定する工程
（ｃ）被検化合物を投与していない場合と比較して、該タンパク質の機能を代替する化合物を選択する工程
【請求項１４】
請求項２に記載のタンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定する工程を含む、不妊の検査方法。
【請求項１５】
請求項２に記載のタンパク質をコードする遺伝子領域における変異を検出する工程を含む、不妊の検査方法。
【請求項１６】
請求項２に記載のタンパク質をコードする遺伝子領域にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項１４または１５に記載の方法に用いるための検査薬。
【請求項１７】
請求項２に記載のタンパク質またはその断片を抗原とする抗体を含む、請求項１４に記載の方法に用いるための検査薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精子膜タンパク質OBF (Oocyte binding/fusion factor)、及びOBFに対する抗体の利用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
受精は、生命現象の始まりという極めて重要な現象にもかかわらず、分子生物学的な機構については分かっていない点が多い。しかし、近年ジーンターゲティング法による遺伝子改変動物の作製により受精における重要な因子が報告され始めた。しかし、融合のステップに関しては、卵子上のCD9が融合に必須な分子として最近報告されたのみである（非特許文献１）。精子側の融合因子を明らかにすることにより、受精の基礎研究の発展のみならずその抗原を用いた避妊ワクチンにも応用できる可能性があり、臨床的な応用も期待される。【０００３】
本発明者らはこれまでに、精子膜タンパク質OBF（Oocyte binding/fusion factor)に関し、以下の報告をしてきた。まず、精子を抗原としていくつかのMabを作製した。そのうちのOBF13と名づけた抗体は精子染色パターンが精子を培養するあいだに変わり、その様子は精子の受精能と相関していることを明らかにした（非特許文献２）。OBF13を体外受精の系にいれると、受精（融合）が阻害されたが、ハムスターとの融合は阻害されなかった（非特許文献３）。また、腹水をメスに投与する受動免疫で、受精（融合）が阻害される様子を報告した（非特許文献４）。さらに、OBF13と反応する精子は3つの染色パターンに別れ、それをFACSで分別できることを報告した（非特許文献５）。【０００４】
【非特許文献１】Miyado, K. et al., Science (2000) 287, 321-324
【非特許文献２】Capacitation related changes in antigen distribution on mouse sperm heads and its relation to fertilization rate in vitro. J. Reproductive Immunology, 11, 91-100 (1987)
【非特許文献３】Effect of monoclonal anti-mouse sperm antibody (OBF13) on the interaction of mouse sperm with zona-free mouse and hamster eggs.  J. Reproductive Immunology 13, 211-219 (1988)
【非特許文献４】An anti-mouse sperm monoclonal antibody (OBF13) and its inhibitory activity on fertilization.  日本不妊学会雑誌  33, 473-478 (1988)
【非特許文献５】OBF13  J. Reproductive. Immunology. 16, 71-82 (1989)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、精子側の融合因子を明らかにし、該因子、該因子に対する抗体、およびそれらの利用法を提供することにある。より具体的には、該因子に対する抗体、該抗体を含む避妊薬、該因子を用いた避妊ワクチン、OBFタンパク質またはその断片の精子と卵子との結合または融合に関連する因子としての使用、該因子をコードする遺伝子の機能が抑制された非ヒト動物、該因子を用いた避妊薬のスクリーニング方法、該因子を指標とした不妊の検査方法および検査薬などを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った。まず、先体反応後の精子にのみ特異的に反応する、ユニークなモノクローナル抗体を得、この抗体の認識する抗原（OBF）を同定した。同抗体で処理したマウス精子においては、卵子透明体結合能、通過能は正常であったものの、その後の卵子との融合能に関しては、抗体処理濃度依存的に阻害された。さらに、OBFの生体内での機能を解明するために、OBF遺伝子ノックアウトマウスを作製し、解析した。その結果、OBF遺伝子ノックアウト雄マウスは不妊であり、OBFノックアウトマウスの精子は、マウス卵子に結合することができるにもかかわらず、全く融合能を有していないことが分かった。様々な動物種が融合可能なハムスター裸卵を用いた実験においては、OBFノックアウトマウスの精子はハムスター裸卵に結合するが、全く融合できないことが判明した。また、ヒトOBFポリクローナル抗体を用いた実験から、ヒト精子はハムスター裸卵に対して融合はおろか結合さえしなくなることが明らかとなった。これらの結果から、OBFは、動物種をこえて受精における卵子との結合または融合に必須な分子であることが分かった。OBFを欠損したマウスの受精能は、トランスジーンとしてOBFを発現させることにより回復することができた。すなわち、このような原因をもつ不妊はOBFの遺伝子またはタンパク質の添加により、治療できる可能性がある。なお、本明細書においてOBFと称されるタンパク質は、その他の文献等（例えばNature 434, 234-238 (2005)）においてＩzumoと称される。【０００７】
本発明は、以下の〔１〕〜〔１７〕を提供するものである。
〔１〕  精子と卵子との結合または融合を阻害する活性を有する抗体であって、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のタンパク質またはその断片を抗原とする抗体（OBF13抗体を除く）。
（ａ）配列番号：１、３、５のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAよりコードされるタンパク質
（ｂ）配列番号：２、４、６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｃ）配列番号：２、４、６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質であって、配列番号：２、４、６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質
（ｄ）配列番号：１、３、５のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする天然由来のDNAよりコードされるタンパク質であって、配列番号：２、４、６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質
〔２〕  精子と卵子との結合または融合を阻害する活性を有する抗体であって、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のタンパク質またはその断片を抗原とする抗体を有効成分として含有する避妊薬。
（ａ）配列番号：１、３、５のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAよりコードされるタンパク質
（ｂ）配列番号：２、４、６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｃ）配列番号：２、４、６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質であって、配列番号：２、４、６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質
（ｄ）配列番号：１、３、５のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする天然由来のDNAよりコードされるタンパク質であって、配列番号：２、４、６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質
〔３〕  〔２〕に記載のタンパク質またはその断片を有効成分として含有する避妊ワクチン。
〔４〕  〔２〕に記載のタンパク質またはその断片の精子と卵子との結合または融合に関連する因子としての使用。
〔５〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、避妊薬の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）〔２〕に記載のタンパク質またはその断片に被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該〔２〕に記載のタンパク質またはその断片と被検化合物との結合を検出する工程
（ｃ）該〔２〕に記載のタンパク質またはその断片と結合する被検化合物を選択する工程
〔６〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、避妊薬の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）〔２〕に記載のタンパク質をコードするDNAを有する細胞に被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該細胞における〔２〕に記載のタンパク質をコードするDNAの発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、該DNAの発現レベルを減少させる化合物を選択する工程
〔７〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、避妊薬の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）〔２〕に記載のタンパク質をコードするDNAを有する非ヒト動物に被検化合物を投与する工程
（ｂ）該非ヒト動物における〔２〕に記載のタンパク質をコードするDNAの発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を投与していない場合と比較して、該DNAの発現レベルを減少させる化合物を選択する工程
〔８〕  以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、避妊薬の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）〔２〕に記載のタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｄ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを減少させる化合物を選択する工程
〔９〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、避妊薬の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）〔５〕〜〔８〕に記載の方法の１または複数の組み合わせによって選択された化合物を、雄性動物の精子に接触させる工程
（ｂ）該精子の受精能を確認する工程
（ｃ）該精子の受精能を阻害する化合物を選択する工程
〔１０〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、避妊薬の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）〔５〕〜〔８〕に記載の方法の１または複数の組み合わせによって選択された化合物を、非ヒト雄性動物に投与する工程
（ｂ）該非ヒト雄性動物の精子の受精能を確認する工程
（ｃ）該非ヒト雄性動物の精子の受精能を阻害する化合物を選択する工程
〔１１〕  〔２〕に記載のタンパク質をコードする遺伝子の機能が人為的に抑制された非ヒト動物。
〔１２〕  〔２〕に記載のタンパク質をコードする遺伝子の機能が人為的に抑制された非ヒト動物細胞。
〔１３〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、不妊治療薬の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）被検化合物を〔１１〕に記載の非ヒト動物に投与する工程
（ｂ）被検化合物が〔２〕に記載のタンパク質の機能を代替しているか否かを判定する工程
（ｃ）被検化合物を投与していない場合と比較して、該タンパク質の機能を代替する化合物を選択する工程
〔１４〕  〔２〕に記載のタンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定する工程を含む、不妊の検査方法。
〔１５〕  〔２〕に記載のタンパク質をコードする遺伝子領域における変異を検出する工程を含む、不妊の検査方法。
〔１６〕  〔２〕に記載のタンパク質をコードする遺伝子領域にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、〔１４〕または〔１５〕に記載の方法に用いるための検査薬。
〔１７〕  〔２〕に記載のタンパク質またはその断片を抗原とする抗体を含む、〔１４〕に記載の方法に用いるための検査薬。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】（Ａ）OBF13抗体を用いた精子の先体反応前後の蛍光免疫染色の写真である。上から順に、1. 新鮮精子、2. 凍結融解して膜の透過性を上げたもの、3. 培養下で先体反応を起したもの、4.培養下で先体反応を起したもの。（Ｂ）卵透明帯通過後のOBF13抗体を用いた蛍光免疫染色の写真である。
【図２】ヘキスト33342を取り込ませた裸卵を用いた、受精阻害実験の結果を示す写真およびグラフである。
【図３Ａ】OBF13モノクローナル抗体を用いた、マウス精子の二次元電気泳動によるウエスタンブロットの結果を示す写真である。
【図３Ｂ】同定したOBF13抗原の一次構造を示す図である。図中の、下線はシグナル配列を示し、囲み線はImmunoglobulin-likeドメインを示し、点線は細胞膜貫通領域を示す。また、182残基目のシステインと233残基目のシステイン間ではジスルフィド結合が予想される。
【図３Ｃ】マウスOBFに対するポリクローナル抗体を用いた各組織のウエスタンブロットの結果を示す写真である。
【図３Ｄ】OBFタンパク質の一次構造図を示すものである。
【図４】（Ａ）OBF遺伝子をネオマイシン耐性遺伝子に置き換えたターゲティングベクターの構造を示す図である。（Ｂ）-（Ｄ）サザンブロット、ノーザンブロット、ウエスタンブロットによる、マウス個体で相同組換えの有無の評価の結果を示す写真である。
【図５】（Ａ）OBFノックアウト雄および雌マウスの平均産仔数のグラフである。（Ｂ）OBFノックアウト精子の体外受精 (IVF) の結果を示すグラフである。（Ｃ）OBFノックアウト精子の卵子との融合解析の結果を示すグラフである。（Ｄ）OBFノックアウト精子とCD9ノックアウト卵子を用いた体外受精、および融合解析の結果を示す写真である。
【図６】（Ａ）マウスのOBF -/-精子とハムスター裸卵の融合解析の結果を示す写真である。（Ｂ）ヒトOBFポリクローナル抗体を用いた、ヒト精子とハムスター裸卵の融合解析の結果を示す写真およびグラフである。
【図７】OBFノックアウトマウスにOBF遺伝子のcDNA配列を組み込んだマウスで受精能が回復することを示した写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、精子と卵子との結合または融合を阻害する活性を有する抗体であって、精子と卵子との結合または融合に必須な精子膜タンパク質OBFまたはその断片を抗原とする抗体（OBF13抗体を除く）を提供する。
また、本発明は、OBFまたはその断片を抗原とする抗体（OBF13抗体を含む）を有効成分として含有する避妊薬、OBFまたはその断片を有効成分として含有する避妊ワクチンを提供する。【００１０】
本発明のOBF抗原としては、配列番号：１、３、５のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAよりコードされるタンパク質またはその断片、配列番号：２、４、６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質またはその断片、配列番号：２、４、６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質であって、配列番号：２、４、６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質またはその断片、または、配列番号：１、３、５のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする天然由来のDNAよりコードされるタンパク質であって、配列番号：２、４、６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質またはその断片が挙げられる。【００１１】
上記の「配列番号：２、４、６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質」としては、配列番号：２、４、６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、および配列番号：２、４、６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を含む融合タンパク質が挙げられる。【００１２】
また、上記の「配列番号：２、４、６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質」としては、配列番号：２、４、６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質、および該タンパク質を含む融合タンパク質が挙げられる。置換、欠失、挿入、および／または付加は自然界において生じたものであり、置換、欠失、挿入、および／または付加されるアミノ酸数は、通常、30アミノ酸以内であり、好ましくは15アミノ酸以内であり、より好ましくは5アミノ酸以内（例えば、3アミノ酸以内）であり、さらに好ましくは2アミノ酸以内である。【００１３】
本発明のタンパク質との融合に付される他のタンパク質やペプチドとしては、融合タンパク質が本発明のタンパク質と機能的に同等なタンパク質である限り、特に限定されない。本発明のタンパク質との融合に付される他のペプチドとしては、例えば、FLAG（Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210 ）、6個のHis（ヒスチジン）残基からなる6×His、10×His等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明のタンパク質との融合に付される他のタンパク質としては、例えば、GST（グルタチオン−S−トランスフェラーゼ）等が挙げられる。【００１４】
ここで「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が、配列番号：２、４、６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の生物学的機能、生化学的機能を有することを指す。該生物学的機能としては、精子と卵子との結合または融合に必須な機能が挙げられる。対象となるタンパク質が、配列番号：２、４、６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同様の性質を有するか否かは、例えば、対象となるタンパク質に対する抗体を得て、その抗体が精子と卵子との結合または融合を阻害するか否かで判定することができる。【００１５】
配列番号：２、４、６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質は、配列番号：２、４、６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と共通または類似の構造的特徴を有する。構造的特徴としては、例えば、シグナル配列、細胞外領域、細胞膜貫通領域、および細胞内領域を有する点、細胞外領域には1つのIg-like (Immunoglobulin-like) ドメインを有する点、また、Ig-likeドメイン内にN結合型糖鎖付加配列が存在する点、などが挙げられる。【００１６】
OBFタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば42℃、5×SSC、0.1％SDSの条件であり、好ましくは50℃、5×SSC 、0.1％SDSの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば65℃、0.1×SSC及び0.1％SDSの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するDNAが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。【００１７】
また、OBFタンパク質をコードするDNA（配列番号：１、３、５）の配列情報を基に合成したプライマーを用いる遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法を利用して、OBFタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを単離することも可能である。【００１８】
これらハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術により単離されるDNAがコードする、OBFタンパク質と機能的に同等なタンパク質は、通常、OBFタンパク質とアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、配列番号：２、４、６のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、通常、少なくとも50％以上の同一性、好ましくは75％以上の同一性、さらに好ましくは85％以上の同一性、さらに好ましくは95％以上の同一性を指す。アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、BLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul et al. J. Mol. Biol.215:403-410, 1990)。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばscore = 100、wordlength = 12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばscore = 50、wordlength = 3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
本発明の抗原の断片としては、例えば、Ig-likeドメイン（例えばマウスOBFのアミノ酸167〜253番目）が挙げられるがこれに限定されない。【００１９】
本発明の抗体は、OBFタンパク質を認識し、精子と卵子との結合または融合を阻害することができれば特に限定されず、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。また、本発明の抗体として、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体等を適宜用いることができる。さらに本発明の抗体として、低分子化抗体等を用いることもできる。【００２０】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は当業者に周知の方法により作製することができる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製できる。免疫される動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、サル、などの哺乳動物を用いることができる。抗原の調製は公知の方法、例えばバキュロウイルスを用いた方法（WO98/46777など）等に準じて行うことができる。免疫原として、バキュロウイルス膜上に発現したOBFを用いる場合には、免疫動物としてgp64トランスジェニックマウスを用いることができる（日本特許出願番号 特願2002-180351、特願2002-164834）。【００２１】
ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46 ）等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。【００２２】
また、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることができる（例えば、Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。具体的には、ハイブリドーマのmRNAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（V領域）のcDNAを合成する。目的とする抗体のV領域をコードするDNAが得られれば、これを所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のV領域をコードするDNAを、抗体C領域のDNAを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。【００２３】
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（chimeric）抗体、ヒト化（humanized）抗体などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。【００２４】
ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region；FR）を連結するように設計したDNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR法により合成する。得られたDNAをヒト抗体定常領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 239400 、国際特許出願公開番号WO 96/02576参照）。CDRを介して連結されるヒト抗体のFRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856）。【００２５】
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号WO 93/12227, WO 92/03918，WO 94/02602, WO 94/25585，WO 96/34096, WO 96/33735参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は周知であり、WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388を参考にすることができる。【００２６】
抗体遺伝子を一旦単離し、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を用いることができる。動物細胞としては、(1) 哺乳類細胞、例えば、CHO, COS，ミエローマ、BHK （baby hamster kidney），HeLa，Vero，(2) 両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは(3) 昆虫細胞、例えば、sf9, sf21, Tn5などが知られている。植物細胞としては、ニコティアナ（Nicotiana）属、例えばニコティアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces serevisiae）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属、例えばアスペスギルス・ニガー（Aspergillus niger）などが知られている。原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E. coli）、枯草菌が知られている。これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をin vitroで培養することにより抗体が得られる。【００２７】
また、抗体はOBFタンパク質に結合し、OBFタンパク質の機能を阻害するかぎり、低分子化抗体であってもよい。低分子化抗体は、全長抗体(whole antibody、例えばwhole IgG等)の一部分が欠損している抗体断片を含み、抗原への結合能を有していれば特に限定されない。本発明の抗体断片は、全長抗体の一部分であれば特に限定されないが、重鎖可変領域（VH）又は／及び軽鎖可変領域（VL）を含んでいることが好ましい。VHまたはVLのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び／又は挿入がされていてもよい。さらに抗原への結合能を有する限り、VH又は/及びVLの一部を欠損させてもよい。又、可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fvなどを挙げることができる。また、低分子化抗体の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv（single chain Fv）、Diabody、sc(Fv)2（single chain (Fv)2）などを挙げることができる。【００２８】
ここで、「Fv」断片は最小の抗体断片であり、完全な抗原認識部位と結合部位を含む。「Fv」断片は1つのVHおよびVLが非共有結合により強く連結されたダイマー（VH-VLダイマー）である。各可変領域の3つの相補鎖決定領域（complementarity determining region；CDR）が相互作用し、VH-VLダイマーの表面に抗原結合部位を形成する。6つのCDRが抗体に抗原結合部位を付与している。しかしながら、1つの可変領域（または、抗原に特異的な3つのCDRのみを含むFvの半分）であっても、全結合部位よりも親和性は低いが、抗原を認識し、結合する能力を有する。【００２９】
scFvには、抗体のVHおよびVLが含まれ、これらの領域は単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、FvはさらにVHおよびVLの間にペプチドリンカーを含んでおり、これによりscFvは、抗原結合のために必要な構造を形成することができる（scFvの総説については、Pluckthun『The Pharmacology of Monoclonal Antibodies』Vol.113（Rosenburg and Moore ed (Springer Verlag, New York) pp.269-315, 1994）を参照）。本発明におけるリンカーは、その両端に連結された抗体可変領域の発現を阻害するものでなければ特に限定されない。【００３０】
scFvをコードするDNAは、前記抗体のH鎖またはH鎖V領域をコードするDNA、およびL鎖またはL鎖V領域をコードするDNAのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするDNA部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてPCR法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするDNA、およびその両端が各々H鎖、L鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅することにより得られる。また、一旦scFvをコードするDNAが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってscFvを得ることができる。これらの抗体断片は、前記と同様にして遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。【００３１】
Diabodyは、遺伝子融合により構築された二価(bivalent)の抗体断片を指す(Holliger P et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 6444-6448 (1993)、EP404,097号、WO93/11161号等)。Diabodyは、2本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーであり、通常、ポリペプチド鎖は各々、同じ鎖中でVL及びVHが、互いに結合できない位に短い、例えば、5残基程度のリンカーにより結合されている。同一ポリペプチド鎖上にコードされるVLとVHとは、その間のリンカーが短いため単鎖可変領域フラグメントを形成することが出来ず二量体を形成するため、Diabodyは2つの抗原結合部位を有することとなる。【００３２】
sc(Fv)2は、2つのVH及び2つのVLをリンカー等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である（Hudson et al、J Immunol. Methods 1999；231：177-189）。sc(Fv)2は、例えば、scFvをリンカーで結ぶことによって作製できる。2つのVHと2つのVLの順序は特に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。【００３３】
抗体の可変領域を結合するリンカーとしては、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、又は合成化合物リンカー（例えば、Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996参照）に開示されるリンカー等を用いることができる。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能であるが、通常、1〜100アミノ酸、好ましくは3〜50アミノ酸、更に好ましくは5〜30アミノ酸、特に好ましくは12〜18アミノ酸（例えば、15アミノ酸）である。但し、ペプチドリンカーの長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。【００３４】
合成化学物リンカー（化学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋剤、例えばN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、ジスクシンイミジルスベレート（DSS）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（DSP）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（DTSSP）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−EGS）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（DST）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ−DST）、ビス［2-（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（BSOCOES）、ビス［2-（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ-BSOCOES）などであり、これらの架橋剤は市販されている。4つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、3つのリンカーが必要となるが、全て同じリンカーを用いてもよいし、異なるリンカーを用いてもよい。【００３５】
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（PEG）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。又、抗体に放射性同位元素、化学療法剤、細菌由来トキシン等の細胞傷害性物質などを結合することも可能である。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野において、すでに確立されている。【００３６】
本発明で使用される抗体は二重特異性抗体(bispecific antibody)であってもよい。二重特異性抗体はOBFタンパク質分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有する二重特性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位がOBFタンパク質を認識し、他方の抗原結合部位が放射性物質、化学療法剤、細胞由来トキシン等の細胞障害性物質を認識してもよい。二重特異性抗体は2種類の抗体のHL対を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。【００３７】
又、本発明においては、糖鎖を改変した抗体などを用いることも可能である。抗体の糖鎖改変技術は既に知られている（例えば、ＷＯ00/61739、ＷＯ02/31140など）。本発明における「抗体」にはこれらの抗体も包含される。【００３８】
前記のように発現、産生された抗体は、通常のタンパク質の精製で使用されている公知の方法により精製することができる。例えば、プロテインAカラムなどのアフィニティーカラム、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる(Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)。【００３９】
抗体の抗原結合活性(Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)の測定には公知の手段を使用することができる。例えば、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、EIA（酵素免疫測定法）、RIA（放射免疫測定法）あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。【００４０】
特定の分子がOBFタンパク質に結合するか否かは、公知の方法により測定することができる。公知の方法としては、例えば、免疫沈降法、ウエストウエスタンブロッティング法、ELISA、EIA、RIA、蛍光免疫法、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを用いた方法、などが挙げられる。【００４１】
本発明の抗体は、避妊薬として利用できる。抗体の投与を行う対象は特に制限はないが、例えば、ヒト、愛玩動物、家畜、野外動物、鳥類を挙げることができる。
本発明の避妊薬は、経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型、経膣投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回につき体重1kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり0.001〜100000mg/bodyの範囲で投与量を選ぶことができる。【００４２】
本発明の抗体を避妊薬として用いる場合には、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。このような治療目的で使用される本発明の抗体を含む避妊薬は、必要に応じ、それらに対して不活性な適当な医薬的に許容される担体、媒体等と混和して製剤化することができる。例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、酸化防止剤(アスコルビン酸等)、緩衝剤(リン酸、クエン酸、他の有機酸等)、防腐剤、界面活性剤(PEG、Tween等)、キレート剤(EDTA等)、結合剤等を挙げることができる。また、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン及びリシン等のアミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、マンニトールやソルビトール等の糖アルコールを含んでいてもよい。注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール(エタノール等)、ポリアルコール(プロピレングリコール、PEG等)、非イオン性界面活性剤(ポリソルベート80、HCO-50)等と併用してもよい。【００４３】
本発明は、OBF抗原（OBFまたはその断片）を有効成分として含有する避妊ワクチンを提供するものである。本発明の避妊ワクチンにおけるOBF抗原は、天然のタンパク質の他、公知の遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。また、本発明の避妊ワクチンにおけるOBF抗原は、細胞に発現させた状態でも調製することができる。本発明の避妊ワクチンにおけるOBF抗原の由来する生物種に特に制限はなく、避妊ワクチンの投与対象の生物種に応じて適宜選択可能である。【００４４】
天然のタンパク質は、例えばOBFタンパク質が発現している精巣、精子等の組織の抽出液に対し、OBFタンパク質に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いる方法により調製することが可能である。【００４５】
一方、組換えタンパク質は、当業者においては公知の方法により、例えばOBFタンパク質またはその断片として調製することができる。OBFタンパク質またはその断片は、例えば、OBFタンパク質をコードするDNAを、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいはOBFタンパク質に対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。【００４６】
また、OBFタンパク質をグルタチオン S-トランスフェラーゼ蛋白質との融合タンパク質として、あるいはヒスチジンを複数付加させたOBFタンパク質として宿主細胞（例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させたOBFタンパク質はグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。融合タンパク質を作製するには、例えば、OBFタンパク質をコードするDNAと他のタンパク質やペプチドをコードするDNAをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよい。【００４７】
上記ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、JM109、DH5α、HB101、XL1Blue）等で大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ori」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール)により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Script等が挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7等が挙げられる。OBFタンパク質を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blue等の大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Wardら, Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモーター（Betterら, Science (1988) 240, 1041-1043 ）、またはT7プロモーター等を持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1（ファルマシア社製）、「QIAexpress system」（キアゲン社製）、pEGFP、またはpET等が挙げられる。【００４８】
また、ベクターには、タンパク質分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。タンパク質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。【００４９】
大腸菌以外にも、例えば、OBFタンパク質を製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3 (インビトロゲン社製)や、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF 、pCDM8 ）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」（ギブコBRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（インビトロゲン社製）、pNV11、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）等が挙げられる。【００５０】
CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーター等を持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418等）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等が挙げられる。【００５１】
また、in vivoでタンパク質を産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。この動物または植物にOBFタンパク質をコードするDNAを導入し、動物または植物の体内でOBFタンパク質を産生させ、回収する。【００５２】
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。【００５３】
例えば、OBFタンパク質をコードするDNAを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、OBFタンパク質を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるタンパク質を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702）。【００５４】
また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、OBFタンパク質をコードするDNAを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液からOBFタンパク質を得ることができる（Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594）。【００５５】
さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、OBFタンパク質をコードするDNAを植物発現用ベクター、例えばpMON 530に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）に感染させ、本タバコの葉よりOBFタンパク質を得ることができる（Julian K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138）。【００５６】
これにより得られたOBFタンパク質は、宿主細胞内または細胞外（培地等）から単離し、実質的に純粋で均一なタンパク質として精製することができる。タンパク質の分離、精製は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればタンパク質を分離、精製することができる。【００５７】
なお、本発明のOBFタンパク質を精製前又は精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。蛋白質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼ等が用いられる。【００５８】
本発明のワクチン製剤には、医薬上許容される担体を添加してもよい。ここで医薬上許容される担体とは、それ自体は抗原（または免疫原性）とは異なる物質であって、ワクチン投与において抗原とともに投与可能な医薬上許容される材料を意味する。例えば、アジュバント、保存剤、安定剤等のワクチン添加物が例示できるが、これらに限定されるものではない。アジュバントとしてはヒト用ワクチンに認可されたアジュバントとして、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＭＦ５９などを使用することが出来るが、これらに限定されるものではない。【００５９】
安定剤としては、0.2%程度のゲラチンやデキストラン、0.1-1.0%のグルタミン酸ナトリウム、あるいは約5%の乳糖や約2%のソルビトールなどを使用することが出来るが、これらに限定されるものではない。保存剤としては、0.01%程度のチメロサール、0.1%程度のベータプロピオノラクトンや、0.5%程度のフェノキシエタノールなどを使用することが出来るが、これらに限定されるものではない。【００６０】
注射剤を調製する場合、必要により、pH 調製剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤等を添加し、常法により、皮下、筋肉内、静脈内注射剤とする。注射剤は、溶液を容器に収納後、凍結乾燥等によって、固形製剤として、用時調製の製剤としてもよい。また、一投与量を容器に収納してもよく、また、投与量を同一の容器に収納してもよい。【００６１】
本発明のワクチンの接種法としては、公知の種々の方法が使用できる。接種法としては皮下注射、筋肉内注射、経鼻接種、経口接種、経皮接種、経膣接種等が例示できる。
どの接種方法が適切かはワクチン抗原の種類、剤型、抗体発現時期、抗体持続期間、接種対象者の年齢、等を考慮して決定される。接種方法は専門家による臨床試験を通じて最終決定され、これらの方法は同業者にとって公知である。一回接種用製品でも複数回接種用製品でも良い。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。【００６２】
本発明のOBFタンパク質またはその断片は、精子と卵子との結合または融合に関連する因子として使用することができる。
精子と卵子との結合または融合に関連する因子としての使用としては、以下のような例が挙げられるが、これに限定されない。例えば、体外受精の系において、OBFタンパク質またはその断片を、OBF欠損又は機能不全が原因である不妊男性の精子に加え、妊孕性を回復させることができる。逆に、OBFタンパク質またはその断片を、直接膣内に投与し、精子上のOBFタンパク質と卵子上のOBFタンパク結合分子との結合を拮抗阻害させ、避妊作用を誘導することができる。【００６３】
本発明者らは、抗体によるOBFタンパク質の阻害、およびOBFタンパク質の発現抑制により、受精が阻害されることを見出した。この結果は、OBFタンパク質を標的とした避妊薬のスクリーニングが可能であることを示す。【００６４】
本発明のスクリーニング方法に用いる被検化合物は特に限定されず、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、抗体、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、抗体ライブラリー、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等を挙げることができる。【００６５】
本発明のスクリーニング方法の第一の態様は、OBFタンパク質またはその断片と結合する化合物のスクリーニングに関するものである。このスクリーニングにおいては、まず、OBFタンパク質またはその断片に被検化合物を接触させる。次いで、該OBFタンパク質またはその断片と被検化合物との結合を検出する。次いで、該OBFタンパク質またはその断片と結合する被検化合物を選択する。この方法によって、単離された化合物は、避妊薬の候補化合物になりうる。また、後述のスクリーニング方法の被検化合物として使用することもできる。【００６６】
OBFタンパク質を用いて、これに結合するタンパク質をスクリーニングする方法としては、当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。このようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降法により行うことができる。具体的には、以下のように行うことができる。OBFタンパク質をコードするDNAを、pSV2neo, pcDNA I, pCD8 などの外来遺伝子発現用のベクターに挿入することで動物細胞などで当該遺伝子を発現させる。発現に用いるプロモーターとしては SV40 early promoter (Rigby In Williamson (ed.), Genetic Engineering, Vol.3. Academic Press, London, p.83-141(1982)), EF-1 α promoter (Kimら Gene 91, p.217-223 (1990)), CAG promoter (Niwa et al. Gene 108, p.193-200 (1991)), RSV LTR promoter (Cullen Methods in Enzymology 152, p.684-704 (1987), SR α promoter (Takebe et al. Mol. Cell. Biol. 8, p.466 (1988)), CMV immediate early promoter (Seed and Aruffo Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, p.3365-3369 (1987)), SV40 late promoter (Gheysen and Fiers J. Mol. Appl. Genet. 1, p.385-394 (1982)), Adenovirus late promoter (Kaufman et al. Mol. Cell. Biol. 9, p. 946 (1989)), HSV TK promoter 等の一般的に使用できるプロモーターであれば何を用いてもよい。【００６７】
動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺伝子を発現させるためには、エレクトロポレーション法 (Chu, G. et al. Nucl. Acid Res. 15, 1311-1326 (1987))、リン酸カルシウム法 (Chen, C and Okayama, H. Mol. Cell. Biol. 7, 2745-2752 (1987))、DEAEデキストラン法 (Lopata, M. A. et al. Nucl. Acids Res. 12, 5707-5717 (1984); Sussman, D. J. and Milman, G. Mol. Cell. Biol. 4, 1642-1643 (1985))、リポフェクチン法 (Derijard, B. Cell 7, 1025-1037 (1994); Lamb, B. T. et al. Nature Genetics 5, 22-30 (1993); Rabindran, S. K. et al. Science 259, 230-234 (1993))等の方法があるが、いずれの方法によってもよい。【００６８】
特異性の明らかとなっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）をOBFタンパク質のN末またはC末に導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位を有する融合タンパク質としてOBFタンパク質を発現させることができる。用いるエピトープ−抗体系としては市販されているものを利用することができる（実験医学 13, 85-90 (1995)）。マルチクローニングサイトを介して、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）などとの融合タンパク質を発現することができるベクターが市販されている。また、融合タンパク質にすることによりOBFタンパク質の性質をできるだけ変化させないようにするために数個から十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープ部分のみを導入して、融合タンパク質を調製する方法も報告されている。例えば、ポリヒスチジン（His-tag）、インフルエンザ凝集素 HA、ヒトc-myc、FLAG、Vesicular stomatitis ウイルス糖タンパク質（VSV-GP）、T7 gene10 タンパク質（T7-tag）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（HSV-tag）、E-tag（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープとそれを認識するモノクローナル抗体を、OBFタンパク質に結合するタンパク質のスクリーニングのためのエピトープ−抗体系として利用できる（実験医学 13, 85-90 (1995)）。【００６９】
免疫沈降においては、これらの抗体を、適当な界面活性剤を利用して調製した細胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。この免疫複合体はOBFタンパク質、それと結合能を有するタンパク質、および抗体からなる。上記エピトープに対する抗体を用いる以外に、OBFタンパク質に対する抗体を利用して免疫沈降を行うことも可能である。OBFタンパク質に対する抗体は、例えば、OBFタンパク質をコードするDNAを適当な大腸菌発現ベクターに導入して大腸菌内で発現させ、発現させたタンパク質を精製し、これをウサギやマウス、ラット、ヤギ、ニワトリなどに免疫することで調製することができる。また、合成したOBFタンパク質の部分ペプチドを上記の動物に免疫することによって調製することもできる。【００７０】
免疫複合体は、例えば、抗体がマウスIgG 抗体であれば、Protein A SepharoseやProtein G Sepharoseを用いて沈降させることができる。また、OBFタンパク質を、例えば、GSTなどのエピトープとの融合タンパク質として調製した場合には、グルタチオン-Sepharose 4Bなどのこれらエピトープに特異的に結合する物質を利用して、OBFタンパク質の抗体を利用した場合と同様に、免疫複合体を形成させることができる。【００７１】
免疫沈降の一般的な方法については、例えば、文献（Harlow,E. and Lane, D.: Antibodies, pp.511-552, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York (1988) ）記載の方法に従って、または準じて行えばよい。【００７２】
免疫沈降されたタンパク質の解析にはSDS-PAGEが一般的であり、適当な濃度のゲルを用いることでタンパク質の分子量により結合していたタンパク質を解析することができる。また、この際、一般的にはOBFタンパク質に結合したタンパク質は、クマシー染色や銀染色といったタンパク質の通常の染色法では検出することは困難であるので、放射性同位元素である35S-メチオニンや35S-システインを含んだ培養液で細胞を培養し、該細胞内のタンパク質を標識して、これを検出することで検出感度を向上させることができる。タンパク質の分子量が判明すれば直接SDS-ポリアクリルアミドゲルから目的のタンパク質を精製し、その配列を決定することもできる。【００７３】
また、OBFタンパク質またはその断片に結合するタンパク質を単離する方法としては、例えば、Skolnikらの方法（Skolnik, E. Y. et al.,Cell (1991) 65, 83-90）を用いて行うことができる。すなわち、OBFタンパク質またはその断片と結合すると予想されるタンパク質を発現している細胞、組織よりファージベクター（λgt11, ZAPなど）を用いたcDNAライブラリーを作製し、これをLB-アガロース上で発現させフィルターに発現させたタンパク質またはその断片を固定し、精製して標識したOBFタンパク質またはその断片と上記フィルターとを反応させ、OBFタンパク質またはその断片と結合したタンパク質を発現するプラークを標識により検出すればよい。OBFタンパク質またはその断片を標識する方法としては、ビオチンとアビジンの結合性を利用する方法、OBFタンパク質もしくはその断片又はOBFタンパク質もしくはその断片に融合したタンパク質（例えばGSTなど）に特異的に結合する抗体を利用する方法、ラジオアイソトープを利用する方法又は蛍光を利用する方法等が挙げられる。【００７４】
また、本発明のスクリーニング方法の第一の態様としては、細胞を用いた2-ハイブリッドシステム（Fields, S., and Sternglanz, R.,Trends. Genet. (1994) 10, 286-292、Dalton S, and Treisman R (1992) Characterization of SAP-1, a protein recruited by serum response factor to the c-fos serum response element. Cell 68, 597-612、「MATCHMARKER Two-Hybrid System」,「Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit」,「MATCHMAKER One-Hybrid System」(いずれもクロンテック社製)、「HybriZAP Two-Hybrid Vector System」(ストラタジーン社製)）を用いて行う方法が挙げられる。【００７５】
2-ハイブリッドシステムにおいては、OBFタンパク質またはその断片（部分ペプチド）をSRF DNA結合領域またはGAL4 DNA結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させ、OBFタンパク質またはその断片と結合するタンパク質を発現していることが予想される細胞より、VP16またはGAL4転写活性化領域と融合する形で発現するようなcDNAライブラリーを作製し、これを上記酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリー由来cDNAを単離する（酵母細胞内でOBFタンパク質と結合するタンパク質が発現すると、両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、陽性のクローンが確認できる）。単離したcDNAを大腸菌に導入して発現させることにより、該cDNAがコードするタンパク質を得ることができる。これによりOBFタンパク質に結合するタンパク質またはその遺伝子を調製することが可能である。【００７６】
2-ハイブリッドシステムにおいて用いられるレポーター遺伝子としては、例えば、HIS3遺伝子の他、Ade2遺伝子、LacZ遺伝子、CAT遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、PAI-1（Plasminogen activator inhibitor type1）遺伝子等が挙げられるが、これらに制限されない。2ハイブリッド法によるスクリーニングは、酵母の他、哺乳動物細胞などを使って行うこともできる。【００７７】
OBFタンパク質またはその断片と結合する化合物のスクリーニングは、アフィニティクロマトグラフィーを用いて行うこともできる。例えば、OBFタンパク質またはその断片をアフィニティーカラムの担体に固定し、ここにOBFタンパク質またはその断片と結合するタンパク質を発現していることが予想される被検化合物を適用する。この場合の被検化合物としては、例えば細胞抽出物、細胞溶解物等が挙げられる。被検化合物を適用した後、カラムを洗浄し、OBFタンパク質またはその断片に結合したタンパク質を調製することができる。【００７８】
得られたタンパク質は、そのアミノ酸配列を分析し、それを基にオリゴDNAを合成し、該DNAをプローブとしてcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、該タンパク質をコードするDNAを得ることができる。【００７９】
また、タンパク質に限らず、OBFタンパク質またはその断片に結合する化合物を単離する方法としては、例えば、固定したOBFタンパク質またはその断片に、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、OBFタンパク質またはその断片に結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法（Wrighton NC; Farrell FX; Chang R; Kashyap AK; Barbone FP; Mulcahy LS;Johnson DL; Barrett RW; Jolliffe LK; Dower WJ., Small peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin, Science (UNITED STATES) Jul 26 1996, 273 p458-64、Verdine GL., The combinatorial chemistry of nature. Nature (ENGLAND) Nov 7 1996, 384 p11-13、Hogan JC Jr.,Directed combinatorial chemistry. Nature (ENGLAND) Nov 7 1996, 384 p17-9）が当業者に公知である。【００８０】
本発明において、結合した化合物を検出又は測定する手段として表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは、OBFタンパク質またはその断片と被検化合物との間の相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えばBIAcore、Pharmacia製）。【００８１】
本発明におけるスクリーニング方法の別の態様は、OBFタンパク質をコードするDNAの発現レベルを減少させる化合物のスクリーニングに関するものである。OBFタンパク質をコードするDNAの発現レベルを減少させる化合物は避妊薬の候補化合物となりうる。【００８２】
このスクリーニングにおいては、まず、OBFタンパク質をコードするDNAを有する細胞に被検化合物を接触させる。OBFタンパク質をコードするDNAを有する細胞（ヒト細胞を含む）としては、精子、精子細胞、筋細胞が例示できる。このような細胞としては、マウスにおいては精子及び精子細胞、ヒトにおいては精子、精子細胞及び筋細胞が挙げられる。また、本発明において「接触」は、例えば、細胞の培養液に被検化合物を添加することにより行うことができる。このスクリーニングにおいては、次いで、該細胞におけるOBFタンパク質をコードするDNAの発現レベルを測定し、被検化合物を接触させていない場合と比較して、該DNAの発現レベルを減少させる化合物を選択する。【００８３】
DNAの発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、mRNAを定法に従って抽出し、このmRNAを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、またはRT-PCR法を実施することによってDNAの発現レベルの測定を行うことができる。さらに、DNAアレイ技術を用いて、DNAの発現レベルを測定することも可能である。また、OBFタンパク質を含む画分を定法に従って回収し、該OBFタンパク質の発現をSDS-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。また、OBFタンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、酵素結合免疫測定法(ELISA)、および免疫蛍光法などを実施し、該OBFタンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。【００８４】
OBFタンパク質をコードするDNAの発現レベルを減少させる化合物のスクリーニングの別の態様としては、まず、OBFタンパク質をコードするDNAを有する非ヒト動物に被検化合物を投与する。OBFタンパク質をコードするDNAを有する非ヒト動物として、例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ブタ、ネコ、サル、スナネズミ、ハムスター等の実験動物を用いることができるが、これらに制限されるものではない。【００８５】
非ヒト動物への被検化合物の投与は、例えば、経口的または非経口的に行うことができるが、それらに限定されない。被検化合物がタンパク質である場合には、例えば、該タンパク質をコードする遺伝子を有するウイルスベクターを構築し、その感染力を利用して、非ヒト動物に該遺伝子を導入することも可能である。【００８６】
このスクリーニングにおいては、次いで、該非ヒト動物におけるOBFタンパク質をコードするDNAの発現レベルを測定し、被検化合物を投与していない場合と比較して、該DNAの発現レベルを減少させる化合物を選択する。DNAの発現レベルは、上述の方法で測定することができる。【００８７】
OBF遺伝子の発現レベルを減少させる化合物のスクリーニングは、レポーター遺伝子を用いた系でも行うことができる。まず、OBF遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞または細胞抽出液を提供する。ここで、「機能的に結合した」とは、OBF遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、OBF遺伝子のプロモーター領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、OBF遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。【００８８】
上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるCAT遺伝子、lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β-グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）およびGFP遺伝子等を挙げることができる。【００８９】
このスクリーニングにおいては、次いで、上記細胞または上記細胞抽出液に被検化合物を接触させる。次いで、該細胞または該細胞抽出液における上記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポーター遺伝子の発現レベルは、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がCAT遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポーター遺伝子がlacZ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、β-グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるGlucuron（ICN社）の発光や5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-グルクロニド（X-Gluc）の発色を検出することにより、さらに、GFP遺伝子である場合には、GFPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。
このスクリーニングにおいては、次いで、被検化合物を接触させていない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを減少させる化合物を選択する。【００９０】
本発明におけるスクリーニング方法の別の態様は、まず、上述または後述のスクリーニング方法の１または複数の組み合わせによって選択された化合物を、ヒトを含む雄性動物から採取した精子に接触させる。次いで、該精子の受精能を確認し、受精能を阻害する化合物を選択する。受精能の確認は、例えば、該精子と同種の雌性動物から採取した未受精卵との接触により受精が成立するか否か、また、該精子とハムスター裸卵が融合するか否か等を指標に行うことができる。動物の精子や未受精卵の採取、精子と化合物との接触、精子と未受精卵との接触、受精の確認は、当業者に周知の方法を用いて実施することができる。また、例えば、受精後におこる精子頭部の膨化を観察したり、その後におこる前核形成の有無を位相差顕微鏡を用いて観察したり、あるいはそのまま培養を続けて卵割を観察することで行うこともできる。【００９１】
本発明におけるスクリーニング方法のさらに別の態様は、まず、上述のスクリーニング方法の１または複数の組み合わせによって選択された化合物を、非ヒト雄性動物に投与する。次いで、該非ヒト雄性動物の精子の受精能を確認し、受精能を阻害する化合物を選択する。受精能の確認は、例えば、化合物を投与した非ヒト雄性動物と同種の非ヒト雌性動物とを交配させることで産仔が得られるか否か（あるいは妊娠が確認できるか否か）、該化合物を投与した非ヒト雄性動物から採取した精子と同種の雌性動物から採取した未受精卵との接触により受精が成立するか否か、また、該化合物を投与した非ヒト雄性動物から採取した精子とハムスター裸卵が融合するか否か等を指標に行うことができる。【００９２】
また、本発明は、OBF遺伝子の機能が人為的に抑制された非ヒト動物を用いた不妊治療薬のスクリーニング方法を提供する。このような方法としては、まず、被検化合物を本発明の非ヒト雄性動物に投与する。本発明の非ヒト雄性動物への被検化合物の投与は、上述の方法で実施できる。次いで、被検化合物がOBFタンパク質の機能を代替しているか否かを判定し、被検化合物を投与していない場合と比較して、OBFタンパク質の機能を代替する化合物を選択する。被検化合物がOBFタンパク質の機能を代替しているか否かは、例えば、上記非ヒト雄性動物と同種の非ヒト雌性動物との交配により産仔が得られるか否か（あるいは妊娠が確認できるか否か）、上記非ヒト雄性動物から採取した精子と同種の非ヒト雌性動物から採取した未受精卵との接触により受精が成立するか否か、または、上記遺伝子改変非ヒト雄性動物から採取した精子とハムスター裸卵との融合が成立するか否か、等により判定できる。【００９３】
また、本発明は、OBF遺伝子の機能が人為的に抑制された非ヒト動物を提供する。このような非ヒト動物は、不妊のモデル非ヒト動物として、上記の不妊治療薬のスクリーニングに利用できる。また、本発明は、OBF遺伝子の機能が人為的に抑制された非ヒト動物の細胞を提供する。該細胞としては、例えば、精子及び精子細胞が挙げられる。特に、OBF遺伝子の機能が人為的に抑制された非ヒト動物の精子は、受精能がないモデル精子となりうる。【００９４】
本発明において「OBF遺伝子の機能が人為的に抑制されている」とは、通常、OBF遺伝子の遺伝子対の一方または双方に、ヌクレオチドの挿入、欠失、置換等の遺伝子変異を有することにより該遺伝子の発現が抑制されている状態を指すが、アンチセンスDNAを用いた方法、リボザイムをコードするDNAを用いた方法、または、RNAi技術を用いた方法等により、OBF遺伝子の機能を人為的に抑制することもできる。【００９５】
正常なOBFタンパク質としての機能が減少または喪失している変異OBFタンパク質が発現している場合も、この「OBF遺伝子の機能の抑制」に含まれる。上記「抑制」には、OBF遺伝子の発現が完全に抑制されている場合のほか、該遺伝子の遺伝子対の一方の遺伝子の発現のみが抑制されている場合も含まれる。本発明における遺伝子変異の存在する部位は、該遺伝子の発現が抑制されるような部位であれば特に制限されず、例えばエクソン部位、プロモーター部位等を挙げることができる。【００９６】
本発明においてOBF遺伝子の改変の対象となる動物が由来する生物種は、通常、ヒト以外の哺乳動物であり、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ等のげっ歯類であり、その中でも特にマウスが好ましい。【００９７】
本発明の非ヒト動物において、OBF遺伝子の機能を人為的に抑制する手段としては、OBF遺伝子全体またはその一部を欠損させる方法やOBF遺伝子の発現制御領域の全部またはその一部を欠損させる方法等を例示することができるが、好ましくはOBF遺伝子の遺伝子対の一方または双方に外来遺伝子を挿入することによりOBF遺伝子を不活性化する方法である。即ち、本発明の好ましい態様において、非ヒト動物は、OBF遺伝子の遺伝子対の一方または双方に外来遺伝子が挿入されていることを特徴とする。【００９８】
本発明の非ヒト動物は、当業者においては一般的に公知の遺伝子工学技術により作製することができる。例えば、以下のようにして遺伝子の機能が抑制されたマウスを作製することができる。まず、マウスからOBF遺伝子のエクソン部分を含むDNAを単離し、このDNA断片に適当なマーカー遺伝子を挿入し、ターゲッティングベクターを構築する。このターゲッティングベクターをエレクトロポーレーション法などによりマウスのES細胞株に導入し、相同組み換えを生じた細胞株を選抜する。挿入するマーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子が好ましい。抗生物質耐性遺伝子を挿入した場合には、抗生物質を含む培地で培養するだけで相同組み換えを生じた細胞株を選抜することができる。また、より効率的な選抜を行うためには、ターゲッティングベクターにチミジンキナーゼ遺伝子などを結合させておくことも可能である。これにより、非相同組み換えを起こした細胞株を排除することができる。また、PCRおよびサザンブロットにより相同組み換え体の検定を行い、OBF遺伝子の遺伝子対の一方が不活性化された細胞株を効率よく得ることもできる。【００９９】
相同組み換えを生じた細胞株を選抜する場合、相同組み換え箇所以外にも、遺伝子挿入による未知の遺伝子破壊の恐れがあることから、複数のクローンを用いてキメラ作製を行うことが好ましい。得られたES細胞株をマウス胚盤葉にインジェクションしキメラマウスを得ることができる。このキメラマウスを交配させることで、OBF遺伝子の遺伝子対の一方を不活性化したマウスを得ることができる。さらに、このマウスを交配させることで、OBF遺伝子の遺伝子対の双方を不活性化したマウスを取得することができる。マウス以外のES細胞が樹立された動物においても、同様の手法により、遺伝子改変を行うことができる。【０１００】
また、OBF遺伝子の遺伝子対の双方を不活性化したES細胞株は、以下の方法により取得することも可能である。すなわち、遺伝子対の一方を不活性化したES細胞株を高濃度の抗生物質を含む培地で培養することにより、遺伝子対のもう一方も不活性化された細胞株、即ち、OBF遺伝子の遺伝子対の双方を不活性化したES細胞株を得ることができる。また、遺伝子対の一方を不活性化したES細胞株を選抜し、この細胞株に再度ターゲッティングベクターを導入し、相同組換えを生じた細胞株を選択することでも作製することができる。ターゲッティングベクターに挿入するマーカー遺伝子は、前出のマーカー遺伝子とは異なるものを使用することが好ましい。作出したES細胞を分化させることで、OBF遺伝子の遺伝子対の双方を不活性化した精子を得ることも可能である。【０１０１】
また、本発明は、OBF遺伝子の発現量を測定する工程を含む、不妊の検査方法を提供するものである。ここで、「OBF遺伝子の発現」には、OBFのmRNAの発現だけでなく、OBFタンパク質の発現もまた含まれる。
以下に、本発明の検査方法の態様を例示するが、本発明の検査方法はそれらに限定されるものではない。上記検査方法の一つの態様としては、まず、被検者のRNA試料を調製する。RNA試料は、例えば被検者の精子や精巣から抽出することができる。【０１０２】
本方法においては、次いで、該RNA試料に含まれるOBFタンパク質をコードするRNAの量を測定する。次いで、測定されたRNAの量を対照と比較する。このような方法としては、ノーザンブロッティング法、DNAアレイ法、または、RT-PCR法等を例示することができる。【０１０３】
また、上記検査方法は、OBFタンパク質の発現量を測定することにより、下記の如く実施することができる。まず、被検者からタンパク質試料を調製する。タンパク質試料は、例えば被検者の精子や精巣から調製することができる。
本方法においては、次いで、該タンパク質試料に含まれるOBFタンパク質の量を測定する。次いで、測定されたOBFタンパク質の量を対照と比較する。このような方法としては、SDSポリアクリルアミド電気泳動法、並びにOBFタンパク質に結合する抗体を用いた、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、酵素結合免疫測定法(ELISA)、および免疫蛍光法を例示することができる。【０１０４】
また、本発明は、OBF遺伝子領域における変異を検出する工程を含む、不妊の検査方法を提供する。
本発明において、OBF遺伝子領域とは、OBF遺伝子および該遺伝子の発現に影響する領域を意味する。該遺伝子の発現に影響する領域としては、特に制限はないが、例えば、プロモーター領域などが例示できる。【０１０５】
また、本発明における変異は、精子の受精能の低下または消失を引き起こす変異であれば、その種類、その数、その部位などに制限はない。上記変異の種類としては、例えば、欠失、置換または挿入変異などが挙げられる。
以下、OBF遺伝子領域に生じた変異を検出する工程を含む検査方法の好ましい態様を記載するが、本発明の方法はそれらの方法に限定されるものではない。【０１０６】
上記検査方法の好ましい態様においては、まず、被検者からDNA試料を調製する。DNA試料は、例えば染色体DNA、あるいはRNAを基に調製することができる。
本方法においては、次いで、OBF遺伝子領域を含むDNAを単離する。該遺伝子領域の単離は、例えば、該遺伝子領域を含むDNAにハイブリダイズするプライマーを用いて、染色体DNA、あるいはRNAを鋳型としたPCR等によって行うことができる。【０１０７】
本方法においては、次いで、単離したDNAの塩基配列を決定する。単離したDNAの塩基配列の決定は、当業者に公知の方法で行うことができる。
本方法においては、次いで、決定したDNAの塩基配列を、対照と比較する。本発明において、対照とは、正常な（野生型の）OBF遺伝子領域を含むDNAを言う。一般に健常人のOBF遺伝子領域を含むDNAの配列は正常であるものと考えられることから、上記「対照と比較する」とは、通常、健常人のOBF遺伝子領域を含むDNAの配列と比較することを意味する。【０１０８】
本発明における変異の検出は、以下のような方法によっても行うことができる。まず、被検者からDNA試料を調製する。次いで、調製したDNA試料を制限酵素により切断する。次いで、DNA断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたDNA断片の大きさを、対照と比較する。また、他の一つの態様においては、まず、被検者からDNA試料を調製する。次いで、OBF遺伝子領域を含むDNAを増幅する。さらに、増幅したDNAを制限酵素により切断する。次いで、DNA断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたDNA断片の大きさを、対照と比較する。【０１０９】
このような方法としては、例えば、制限酵素断片長変異（Restriction Fragment Length Polymorphism／RFLP）を利用した方法やPCR-RFLP法等が挙げられる。具体的には、制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、あるいは制限酵素処理によって生じるDNA断片内に塩基挿入または欠失がある場合、制限酵素処理後に生じる断片の大きさが対照と比較して変化する。この変異を含む部分をPCR法によって増幅し、それぞれの制限酵素で処理することによって、これらの変異を電気泳動後のバンドの移動度の差として検出することができる。あるいは、染色体DNAをこれらの制限酵素によって処理し、電気泳動した後、本発明のプローブDNAを用いてサザンブロッティングを行うことにより、変異の有無を検出することができる。用いられる制限酵素は、それぞれの変異に応じて適宜選択することができる。この方法では、ゲノムDNA以外にも被検者から調製したRNAを逆転写酵素でcDNAにし、これをそのまま制限酵素で切断した後、サザンブロッティングを行うことも可能である。また、このcDNAを鋳型としてPCRでOBF遺伝子領域を含むDNAを増幅し、それを制限酵素で切断した後、移動度の差を調べることも可能である。【０１１０】
さらに別の方法においては、まず、被検者からDNA試料を調製する。次いで、OBF遺伝子領域を含むDNAを増幅する。さらに、増幅したDNAを一本鎖DNAに解離させる。次いで、解離させた一本鎖DNAを非変性ゲル上で分離する。分離した一本鎖DNAのゲル上での移動度を対照と比較する。【０１１１】
該方法としては、例えばPCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism、一本鎖高次構造変異)法(Cloning and polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism analysis of anonymous Alu repeats on chromosome 11. Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.、Detection of p53 gene mutations in human brain tumors by single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products. Oncogene. 1991 Aug 1; 6(8): 1313-1318.、Multiple fluorescence-based PCR-SSCP analysis with postlabeling. 、PCR Methods Appl. 1995 Apr 1; 4(5): 275-282.)が挙げられる。この方法は操作が比較的簡便であり、また被検化合物の量も少なくて済む等の利点を有するため、特に多数のDNA試料をスクリーニングするのに好適である。その原理は次の通りである。二本鎖DNA断片を一本鎖に解離すると、各鎖はその塩基配列に依存した独自の高次構造を形成する。この解離したDNA鎖を、変性剤を含まないポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、それぞれの高次構造の差に応じて、相補的な同じ鎖長の一本鎖DNAが異なる位置に移動する。一塩基の置換によってもこの一本鎖DNAの高次構造は変化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において異なる移動度を示す。従って、この移動度の変化を検出することによりDNA断片に点突然変異や欠失、あるいは挿入等による変異の存在を検出することができる。【０１１２】
具体的には、まず、OBF遺伝子領域を含むDNAをPCR法等によって増幅する。増幅される範囲としては、通常200〜400bp程度の長さが好ましい。PCRは、当業者においては反応条件等を適宜選択して行うことができる。PCRの際に、32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識したプライマーを用いることにより、増幅DNA産物を標識することができる。あるいはPCR反応液に32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を加えてPCRを行うことにより、増幅DNA産物を標識することも可能である。さらに、PCR反応後にクレノウ酵素等を用いて、32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を、増幅DNA断片に付加することによっても標識を行うことができる。こうして得られた標識DNA断片を、熱を加えること等により変性させ、尿素などの変性剤を含まないポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行う。この際、ポリアクリルアミドゲルに適量（5から10％程度）のグリセロールを添加することにより、DNA断片の分離の条件を改善することができる。また、泳動条件は各DNA断片の性質により変動するが、通常、室温（20から25℃）で行い、好ましい分離が得られないときには4から30℃までの温度で最適の移動度を与える温度の検討を行う。電気泳動後、DNA断片の移動度を、Ｘ線フィルムを用いたオートラジオグラフィーや、蛍光を検出するスキャナー等で検出し、解析を行う。移動度に差があるバンドが検出された場合、このバンドを直接ゲルから切り出し、PCRによって再度増幅し、それを直接シークエンシングすることにより、変異の存在を確認することができる。また、標識したDNAを使わない場合においても、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドや銀染色法などによって染色することによって、バンドを検出することができる。【０１１３】
さらに別の方法においては、まず、被検者からDNA試料を調製する。次いで、OBF遺伝子領域を含むDNAを増幅する。さらに、増幅したDNAを、DNA変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する。次いで、分離したDNAのゲル上での移動度を対照と比較する。【０１１４】
このような方法としては、例えば、変性剤濃度勾配ゲル（denaturant gradient gel electrophoresis： DGGE法）等を例示することができる。DGGE法は、変性剤の濃度勾配のあるポリアクリルアミドゲル中で、DNA断片の混合物を泳動し、それぞれの不安定性の違いによってDNA断片を分離する方法である。ミスマッチのある不安定なDNA断片が、ゲル中のある変性剤濃度の部分まで移動すると、ミスマッチ周辺のDNA配列はその不安定さのために、部分的に1本鎖へと解離する。この部分的に解離したDNA断片の移動度は、非常に遅くなり、解離部分のない完全な二本鎖DNAの移動度と差がつくことから、両者を分離することができる。具体的には、OBF遺伝子領域を含むDNAを本発明のプライマー等を用いたPCR法等によって増幅し、これを尿素などの変性剤の濃度が移動するに従って徐々に高くなっているポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、対照と比較する。変異が存在するDNA断片の場合、より低い変性剤濃度位置でDNA断片が一本鎖になり、極端に移動速度が遅くなるため、この移動度の差を検出することにより変異の有無を検出することができる。【０１１５】
さらに別の方法においては、まず、被検者から調製したOBF遺伝子領域を含むDNA、および、該DNAにハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する。
本発明において「基板」とは、ヌクレオチドプローブを固定することが可能な板状の材料を意味する。本発明においてヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが含まれる。本発明の基板は、ヌクレオチドプローブを固定することができれば特に制限はないが、一般にDNAアレイ技術で使用される基板を好適に用いることができる。一般にDNAアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのDNAは非透過性(non- porous)の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性(porous)の膜、例えばニトロセルロースメンブレムを使用することができる。【０１１６】
本発明において、ヌクレオチドの固定（アレイ）方法として、Affymetrix社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常in situで合成される。例えば、photolithographicの技術（Affymetrix社）、および化学物質を固定させるためのインクジェット(Rosetta Inpharmatics社)技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。【０１１７】
基板に固定するヌクレオチドプローブは、OBF遺伝子領域の変異を検出することができるものであれば、特に制限されない。即ち該プローブは、例えば、OBF遺伝子領域を含むDNAにハイブリダイズするようなプローブである。特異的なハイブリダイズが可能であれば、ヌクレオチドプローブは、該遺伝子領域を含むDNAに対し、完全に相補的である必要はない。本発明において基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常10〜100bpであり、好ましくは10〜50bpであり、さらに好ましくは15〜25bpである。【０１１８】
本方法においては、次いで、該OBF遺伝子領域を含むDNAと該基板を接触させる。この過程により、上記ヌクレオチドプローブに対し、DNAをハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの反応液および反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さ等の諸要因により変動しうるが、一般的に当業者に周知の方法により行うことができる。【０１１９】
本方法においては、次いで、該OBF遺伝子領域を含むDNAと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出する。この検出は、例えば、蛍光シグナルをスキャナー等によって読み取ることによって行うことができる。尚、DNAアレイにおいては、一般的にスライドガラスに固定したDNAをプローブといい、一方溶液中のラベルしたDNAをターゲットという。従って、基板に固定された上記ヌクレオチドを、本明細書においてヌクレオチドプローブと記載する。本方法においては、さらに、検出したハイブリダイズの強度を対照と比較する。
このような方法としては、例えば、DNAアレイ法（SNP遺伝子変異の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、p128-135、Nature Genetics(1999)22:164-167）等が挙げられる。【０１２０】
上記の方法以外にも、特定位置の変異のみを検出する目的にはアレル特異的オリゴヌクレオチド（Allele Specific Oligonucleotide／ASO）ハイブリダイゼーション法が利用できる。変異が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを作製し、これとDNAでハイブリダイゼーションを行わせると、変異が存在する場合、ハイブリッド形成の効率が低下する。それをサザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法等により検出することができる。【０１２１】
また、本発明においては、MALDI-TOF/MS法(SNP遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、p106-117、Trends Biotechnol (2000):18:77-84)、TaqMan PCR法（SNP遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、p94-105、Genet Anal. (1999)14:143-149）、Invader法（SNP遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、p94-105、Genome Research (2000)10:330-343）、Pyrosequencing法（Anal. Biochem. (2000)10:103-110）、AcycloPrime法（Genome Research (1999)9:492-498）、SNuPE法(Rapid Vommun Mass Spectrom. (2000)14:950-959)等も使用することができる。【０１２２】
さらに、本発明は、本発明の検査方法に使用するための検査薬を提供する。その一つの態様としては、OBF遺伝子領域にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む検査薬である。【０１２３】
該オリゴヌクレオチドは、OBF遺伝子領域を含むDNA（正常型DNAまたは変異型DNA）に特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら,Molecular Cloning,Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,USA,第２版1989に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするDNAとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、OBF遺伝子領域を含むDNAに対し、完全に相補的である必要はない。【０１２４】
OBF遺伝子領域を含むDNAにハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドは、上記本発明の検査方法におけるプローブ（該プローブが固定された基板を含む）やプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常15bp〜100bpであり、好ましくは17bp〜30bpである。プライマーは変異部分を含むOBF遺伝子領域の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。【０１２５】
また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、OBF遺伝子領域を含むDNAに特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも15bp以上の鎖長を有する。【０１２６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖DNA断片として作製することもできる。【０１２７】
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの5'端を32Pでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のDNAポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。【０１２８】
本発明の検査薬の別の態様は、本発明のOBF抗原を認識する抗体を含む検査試薬である。上記抗体は、検査に用いることが可能な抗体であれば、特に制限はない。抗体は必要に応じて標識される。【０１２９】
上記の検査薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチドや抗体以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定剤（BSAやゼラチンなど）、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１３０】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕実験材料と方法
１．抗精子抗体の作製とその抗体を用いた体外受精の阻害解析
1-1 OBF13モノクローナル抗体の作製
12週齢以上の雄のC57BL/6マウス (Japan SLC) の精巣上体尾部の精子をPBS (-) に懸濁し、2回PBS (-) で洗浄した。この精子 (1x106) をFreund’s complete adjuvant、Freund’s incomplete adjuvant (Difco) と混合し、それぞれ免疫開始時と21日後に雌のC57BL/6マウスの腹腔内に免疫した。3回目の免疫 (28日後) はPBS (-) と精子を混合したもので行った。32日目にマウスの脾臓から脾細胞 (1x108) を抽出しポリエチレングリコール4000 (Sigma Chem.) を用いてmyeloma cell line P3U1 (1x107) と融合させた。Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium (DMEM) (Flow Lab.) に100 IU/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin (Flow Lab.), 1 μg/ml Fungizone (Flow Lab.), 80 μg/ml Gentacin (Shionogi Pharm. Co., Ltd.), 2x10-5 M 2-mercaptoethanol (Nakarai Chem.), 15% fetal calf serum (M.A. Bioproducts) を添加し、さらにHAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) を加えた選択用培地でハイブリドーマを選択後、その培養上清と96 well plateを用いた精子の蛍光染色により精子特異的抗体産生クローンの選別を行った。【０１３１】
その中で精子に強く反応する抗体 (OBF13) を産生するハイブリドーマ (1x108) を、0.5 mlのpristane (Sigma Chem.) を予め14日前に投与したCBF1マウスの腹腔内にインジェクションし、さらに10日から14日後に腹水を採取した（Okabe, M., et al. J Reprod Immunol 11, 91-100 (1987).）。【０１３２】
1-2 精子の蛍光染色
マウスの精巣上体精子をマウス精子用培地 (TYH)（Toyoda, Y., et al. Jpn J Anim Reprod 16, 147-51 (1971).）で2時間培養したのち、これらの精子 (1x105) をハイブリドーマ (OBF13) から得た培養上清50 μlと2時間、37℃で反応させた。PBS (-) を用いて数回の洗浄後、PBSに5% NBCS (new-born calf serum) を加えた溶液で25 μg/mlに希釈したFITC-conjugated anti-mouse IgM (Miles-Yeda Ltd.) を20 μl加え1時間反応させた。PBS (-) で数回の洗浄後、蛍光顕微鏡下でそれらの精子を観察した。【０１３３】
1-3 OBF 13モノクローナル抗体による体外受精の阻害
8週齢以上の雌のBDF1マウスの腹腔に5 IUのpregnant mare serum gonadotropin (PMSG) (Teikoku Zoki)、48時間後に5 IUのhuman chorionic gonadotropin (hCG) (Teikoku Zoki) を注射し、過排卵をおこさせた。13-15時間後に卵管膨大部から未受精卵を回収し、そのまま、あるいは0.01% (w/v) Hyaluronidase (Sigma Chem.) により卵丘細胞を取り除いた未受精卵を使用した。精子は精巣上体から抽出し、TYH培地で37℃、1時間培養後、OBF13モノクローナル抗体を添加し1時間インキュベーション後、終濃度2x105 sperm/mlになるように卵子の含まれる培地に加えた。また、受精卵はTYH培地中で、ホフマンコントラストを用いた位相差顕微鏡下で前核形成を基準に識別した。【０１３４】
２．OBF遺伝子のクローニング
2-1 二次元電気泳動
12週齢以上のICR雄マウス (10匹) から精巣上体と輸精管を摘出し、精子を回収後、Lysis buffer (1% TritonX-114、PBS、10 mM Benzamidine、1 mM PMSF、1 μg/ml Pepstatin、1 μg/ml Leupeptin) を用いて精子を可溶化した。可溶化したタンパク質は、不溶性画分を遠心分離で除いた後、6% Sucroseの上に重層し37℃、5分間静置した。室温で600xg、15分間の遠心分離後、下層の画分に2Dバッファー (8M Urea、2% CHAPS、1 mg/ml OrangeG) を加え、懸濁して、20,000xg、20分間遠心後の上清を脱塩カラムを用いて脱塩処理した。400 μlのサンプルにIPGバッファーを0.5%加え、Immobiline DryStrip Reswelling Tray中で12時間Immobiline DryStrip pH4-7 (Amersham)を膨潤させた。Multiphor II (Amersham) で等電点電気泳動後、DryStripを平衡化バッファー (50 mM Tris/HCl (pH6.8)、6M Urea、30% glycerol、1% SDS) に20分浸し非還元条件下で7.5%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEに供した。泳動後のゲルは銀染色、1 μg/mlのOBF13抗体を用いたウエスタンブロットを行った。【０１３５】
2-2 配列の決定
二次元電気泳動で同定されたOBF13に反応するスポットをCYPRO Ruby protein gel stain (Molecular Probes, Inc.) で染色後、ゲルから切り出しLC-MS/MSによりペプチドシーケンスを行った。ペプチド配列をもとにNCBIデータベースにおいて配列解析を行い、OBF13の抗原のmRNA配列、アミノ酸配列を決定した(accession number：XM_133424)。また、その配列の正確性を確認するために、マウスの精巣から抽出したtotal RNAを鋳型としてRT-PCRとDNAシークエンスを行い配列を決定した。さらに、ヒトOBFについてもマウスOBFとのホモロジー解析をもとにして、ヒトOBFと推測される遺伝子を同定し (accession number：BC034769)、マウスと同様の方法でその配列を確認した。【０１３６】
３．OBFポリクローナル抗体の作製とin vitroにおけるOBFの機能解析
3-1 恒常的にヒト、マウスOBFを発現する細胞株の作製
ヒトおよびマウスOBFに対するポリクローナル抗体を作製するために、OBFの抗原の作製を行った。OBFタンパク質を発現させるためのプラスミドDNAは、N末端にKozak配列、C末端にヒスチジンタグを付加するように構築したDNA配列をほ乳類発現ベクター、pCXN2（Niwa, H., et al. Gene 108, 193-9 (1991).）に組込み作製した。これらプラスミドDNAをウサギの腎臓由来のセルラインRK13細胞 (RIKEN Cell Bank) にlipofectamine 2000 (Invitrogen) を用いて導入し、600 μg/ml G418 (Invitrogen) で細胞を選択後、ペニシリンカップを用いてクローニングした。また細胞の維持は、Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium (DMEM) (Invitrogen) に100 IU/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 2 mM L-glutamine, 0.1 mM MEM Non-essential amino acids (Invtrogen), 10% fetal calf serum (JRH Biosciences) を用いて行った。【０１３７】
3-2 ヒト、マウスOBFポリクローナル抗体の作製
OBFタンパク質の抗原は、3-1のように作製した細胞株を用いた。これら細胞株に10 mM EDTAを用いて1x107個の細胞を回収し、PBS (-) で数回洗浄後、0.5 mlのPBS (-) に懸濁した。このPBS (-) 懸濁溶液に0.6 ml のFreund’s complete adjuvant (Difco) を加え、エマルジョンをつくり、1週間ごとに計4回ウサギの両足のリンパ節付近に免疫を行った。4回目の免疫後、ブーストを行い、ウサギから採血した。血清中のIgGは、終濃度33%の硫酸アンモニウムを用いて沈澱させ、PBS (-) に対して透析後、-80℃に保存した（Inoue, N., et al. J Immunol 166, 424-31 (2001).）。【０１３８】
3-3 マウスの各組織を用いたウエスタンブロット
様々なマウス組織のタンパク質は、各組織を100 mg/mlでlysis buffer (1% (v/v) Triton X-100、PBS、10 mM Benzamidine、1 mM PMSF、1 μg/ml Pepstatin、1 μg/ml Leupeptin) に懸濁し、Potter型ホモジナイザーを用いて組織を破砕し、可溶化した。可溶化したサンプルは、4℃、20,000xg、30分で遠心分離し、可溶性画分を回収した。可溶性画分は、CBB法でタンパク質量をBAS当量で定量し、30 μgをSDS-PAGE (10% polyacrylamide gel) で分離し、polyvinylidene difluoride (PVDF) 膜に転写した。転写後の膜は、10%スキムミルクを含むブロッキングバッファー (0.15% Tween 20、0.5 M NaCl、20 mM Tris-HCl (pH 7.4))でブロッキングを行ったのち、ブロッキングバッファーに加えた1 μg/mlのマウスOBFポリクローナル抗体と室温で2時間反応させた。メンブラン洗浄液 (0.1% (v/v) Tween 20, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7.4)) で数回の膜の洗浄後、ブロッキングバッファーに加えたペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG (1/10,000希釈) (Jackson ImmunoResearch) と室温で1時間反応させ、再びメンブラン洗浄液で洗浄後、ECL system (Amersham) で発色、検出を行った。【０１３９】
3-4 抗体を用いたマウス精子と卵子の融合解析
1-3と同じ手順で未受精卵を準備し、ピエゾマニュピレーターを用いて透明帯を取り除いた（Yamagata, K., et al. Dev Biol 250, 348-57 (2002).）。裸卵は、パラフィンオイルでカバーした終濃度1 μg/mlのヘキスト33342を含むTYHドロップ (100 μl) 中で、10分間インキュベーションした。裸卵を別のドロップに移して37℃、30分間、静置することで余分なヘキスト33342 (Molecular probes) を除く操作を3回繰り返した。精巣上体の精子はTYH培地中で2時間と6時間培養後、終濃度2x105 sperm/mlになるようにヘキスト33342処理裸卵に添加した。また、25 μg/ml OBF13モノクローナル抗体、25 μg/ml OBFポリクローナル抗体、25 μg/ml CD9ポリクローナル抗体 (KMC8.8, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) は、媒精1時間前に精子と卵子のドロップ中に添加した。精子が卵子と融合すると卵子中のヘキスト33342が精子頭部に移り、蛍光を発するようになるので、これを融合精子とみなしその数を蛍光顕微鏡下で測定した。【０１４０】
４．OBF ノックアウトマウスの作製とその解析
4-1 OBFノックアウトマウスの作製
OBFの機能を不活性化するために、図４Ａのようにエキソン2から10までをネオマイシン耐性遺伝子と置き換えたターゲティングベクターを作製し、D3 embryonic stem (ES) cellにエレクトロポレーション法により導入した。150 μg/ml G418 (Invitrogen) で選択後、そのゲノムDNAからPCRにより4個のポジティブコロニーを選別した。さらに、予想どおり相同組換えが起こっている細胞株をサザンブロットにより4クローン選別した。この4つの細胞株は、C57BL/6マウスのブラストシスト期の胚にインジェクションした。その結果、子孫にターゲティングアリルを伝えるキメラマウスが得られた。そのマウスと野生型マウスとの交配により、OBFへテロマウスを得た (F1マウス)。さらにF1マウス同士の交配により、OBFノックアウトマウスを得た (F2マウス)。解析には主に、F2マウスまたは、F2マウス同士の交配から得たF3マウスを用いた。【０１４１】
4-2 サザンブロット
ES細胞やマウスの尾からゲノムDNAを抽出し、Eco RIにより消化した。0.8%アガロースゲル、1xTAEバッファー (0.04 M Tris, 0.04 M CH3COOH, 1 mM EDTA (pH 8.0)) を用いて電気泳動後、変性バッファー (0.5 N NaOH, 1.5 M NaCl) を用いてゲルの変性、中和バッファー (0.5 M Tris-HCl (pH7.5), 3M NaCl) を用いて中和を経て、ナイロン膜 (Hybond-N+, Amersham) に転写した。その転写膜は、長腕の外側に作製したDNAを32Pでラベルし、ハイブリダイゼーションバッファー (Express Hybridization buffer, Clontech) 中で60℃、1時間反応させた。メンブラン洗浄液 (洗浄液1; 2xSSC, 0.05% SDS, 洗浄液2; 0.1xSSC, 0.1%SDS) を用いて数回の洗浄後、転写膜をX線フィルム (Hyper film MP, Amersham) に露光した。【０１４２】
4-3 ノーザンブロット
精巣からTRIZOL Reagent (Invtrogen) を用いてtotal RNAを抽出し20 μgずつ、1xMOPS、18% ホルムアルデヒドを含む1%アガロースゲルで分離し、変性バッファー (50 mM NaOH) を用いてゲルの変性、中和バッファー (200 mM CH3COONa) を用いてゲルの中和を行い、ナイロン膜 (Hybond-N+, Amersham) に転写した。RNAを転写したナイロン膜は、32PでラベルしたORF全長のOBFフラグメントとともにハイブリダイゼーションバッファー (Express Hybridization buffer, Clontech) 中で68℃、1時間反応させた。メンブラン洗浄液 (洗浄液1; 2xSSC, 0.05% SDS, 洗浄液2; 0.1xSSC, 0.1%SDS) を用いて数回の洗浄後、転写膜をX線フィルム (Hyper film MP, Amersham) に露光した。【０１４３】
4-4 ウエスタンブロット
ウエスタンブロットの方法は、3-3に従った。12週齢の各遺伝子型のマウスから、精巣、精子を抽出後、lysis bufferを用いてタンパク質を可溶化した。各タンパク質を30 μgずつ10%アクリルアミドを用いたSDS-PAGEで分離し、1 μg/ml OBFポリクローナル抗体、10 μg/ml マウスCD46ポリクローナル抗体（Inoue, N., et al. Mol Cell Biol 23, 2614-22 (2003).）、0.1 μg/ml sp56 モノクローナル抗体 (QED Bioscience Inc.)、1 μg/ml マウスCD55ポリクローナル抗体 (名古屋大、岡田秀親教授より供与された)、0.4 μg/ml CD147ポリクローナル抗体 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.)、1 μg/ml Fertilin βモノクローナル抗体 (9D, CHEMICON International)でそれぞれのタンパク質を検出した。【０１４４】
4-5 平均産仔数
12週齢以上の雄のOBF +/-と-/-マウスと8週齢以上の雌のC57BL6もしくは、OBF-/-マウスを同ケージに入れ、プラグを確認後、自然出産された産仔数をもとに平均産仔数を測定した。なおそれぞれの遺伝子型について8ペアー以上つくり、1ペアーについて2産以上観察した。【０１４５】
4-6 体外受精と精子と卵子の融合解析
体外受精は1-3と同様の方法で行ったが、未受精卵は卵丘細胞をHyaluronidaseで除去せず、結合した状態で行った。
精子と卵子の融合解析は、3-4と同様の方法で行った。【０１４６】
4-7 ハムスター裸卵を用いた融合解析
精液は健康なボランティアの男性より用手法にて採取した。この精液は37℃、1時間インキュベートすることで液化し、試験管に入れた2 mlのBWW培地（Overstreet, J.W., et al. Fertil Steril 33, 534-42 (1980).）の底に0.5 mlの液化精液を加え、試験管の角度を30°に保ちながら1時間インキュベーションした。上清1.5 mlからSwim-upした精子を回収しBWWで1回洗浄し、200 μlのBWWに懸濁後、200 μlのドロップに加え (total 400 μl)、37℃、6時間インキュベーションした。その間に、凍結ハムスター卵 (日本農産工業) を融解し、ピエゾマニュピレーターを用いて透明帯を外した（Yamagata, K., et al. Dev Biol 250, 348-57 (2002).）。25 μg/ml ヒトOBFポリクローナル抗体処理精子もしくは、OBF+/-、-/-精子を終濃度1x106/mlの精子をハムスター裸卵とともに37℃でインキュベーションした。6時間後、1 μg/mlのヘキスト33342で膨化した精子の頭部を染色し融合した精子の数を蛍光顕微鏡下で観察した。【０１４７】
4-8 卵細胞質内精子注入法 (intracytoplasmic sperm injection: ICSI)
体外受精と同様の方法で卵子を準備し、0.01% (w/v) Hyaluronidase (Sigma Chem.)を用いて卵丘細胞を除去した。未受精卵はkSOM（Ho, Y., et al. Mol Reprod Dev 41, 232-8 (1995).）のドロップで数回洗浄後、別のkSOMのドロップに入れ37℃、5%CO2インキュベーターに保存しておいた。精子はOBF +/-と-/-マウスの精巣上体尾部より採取し、TYHで1時間、37℃で培養後、1x107 sperm/ml の濃度で10 μlずつチューブに分注し液体窒素で凍結した。ICSIにあたっては、6 cmシャーレの蓋に約2 μlの融解した精子を加えた12% (w/v) PVP/H-CZB（Chatot, C.L., et al. J Reprod Fertil 86, 679-88 (1989).）のスポットをつくり、同じシャーレ上にFHM（Lawitts, J.A., & Biggers, J.D. J Reprod Fertil 91, 543-56 (1991).）でスポットを数個つくり、その中に未受精卵を入れた。ピエゾマニュピレーターを用いて、外径約7 μmのインジェクション針で精子の頭部のみを未受精卵の細胞質内に入れ込んだ（Kimura, Y. & Yanagimachi, R. Biol Reprod 52, 709-20 (1995).）。これらの受精卵は、kSOM中で24時間培養し、2細胞期になってから0.5日目の偽妊娠雌マウスの卵管に移植した。19日後、帝王切開または自然分娩により仔マウスを産出させた。【０１４８】
５．OBFレスキューマウスの作製とその解析
5-1 OBFレスキューマウスの作製
OBFノックアウトマウスにおける雄性不妊の原因が本当にOBFタンパク質の欠失によるものであるのかを確認するために、精巣内でOBFを発現するトランスジェニックマウスを作製し、雌のOBF -/-マウスとの交配によりOBF -/-でOBF transgeneをもつ雄マウスを作製した。マウスOBFトランスジェニックマウスに用いたベクターは、精巣特異的に発現するカルメジンのプロモーター制御下で発現するように作製した（Ikawa, M., et al. Dev Biol 240, 254-61 (2001).）。このベクターを雄OBF +/-と過排卵処理後の雌OBF -/-マウスとの交配により得た受精卵を用いて、前核期の前核にベクターをインジェクションする方法か、もしくは2細胞期にレンチウイルスを用いて感染させ（Ikawa, M., et al. Mol Ther 8, 666-73 (2003).）遺伝子を導入する方法でトランスジェニックマウスを作製した。【０１４９】
5-2 輸卵管内卵子の受精率の測定
1-3のように過排卵マウスを準備し、hCG注射後に雄マウスと同ゲージに入れ交配させた。使用した雄は、(1) OBF +/-、(2) OBF -/-、及び (3) OBF -/-でありOBF transgeneでもあるダブルトランスジェニックマウスである。次の日の朝、雌の膣を観察し、交尾したことを示すプラグを確認後、卵管膨大部より卵子を採取した。またこの時、細胞質が異常な卵子を取り除き、受精卵はホフマンコントラストを用いた顕微鏡下で前核形成を基準に識別した。【０１５０】
〔実施例２〕
本研究者らは、受精機構に寄与する精子上の膜タンパク質を網羅的に同定するために、C57BL/6雄マウスの精巣上体から精子を抽出し、それを同系統の雌マウスに免疫し多数のモノクローナル抗体を作製した。それらのなかで、精子が受精可能な状態になるために精子細胞膜と先体外膜との融合による形態変化である先体反応後の精子にのみ特異的に反応する、ユニークなモノクローナル抗体が1クローン得られた。この抗体 (OBF13) は、先体反応が起こるにつれて徐々に精子の頭部全体に広がる抗原に反応するもので (図１Ａ)、卵透明帯通過後の精子に対しては頭部全体に反応した (図１Ｂ)。さらにOBF13処理後の精子は、透明帯への結合、通過には何ら影響を与えなかったが、その後の卵子との融合に対して抗体処理濃度依存的に阻害効果を示した (表１、２)。【０１５１】
【表１】
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【０１５２】
【表２】
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【０１５３】
すなわち、透明帯を取り除いた裸卵にヘキスト33342を取り込ませておいてから精子を加えると、卵子に融合した精子はヘキスト33342が移り融合したことが確認されるが、OBF13モノクローナル抗体、マウスOBFポリクローナル抗体で受精阻害実験を行うと、精子は卵子に正常に結合するにも関わらず、コントロールIgGにくらべ有意に融合精子が減少していることが分かった。この作用は、マウスCD9抗体 (KMC8.8) を添加した時と同様であった (図２)。【０１５４】
本研究者らは、この抗体の認識する抗原は精子が卵子への結合または融合に必須な分子であると考え、10匹のICR雄マウスの精巣上体から精子を集め、膜画分と水層画分に粗抽出できる界面活性剤、Triton X-114を用いて可溶化し、抗原の同定を試みた。その後、この膜画分を二次元電気泳動 (一次元目：pH 4.0-7.0、二次元目：7.5% SDS-PAGE ポリアクリルアミドゲル) で分離した。PVDF膜に転写後OBF13を用いてウエスタンブロットを行い抗原のスポットの位置を同定した (図３Ａ)。次いで同定したスポットをゲルから切り出して、LC-MS/MSにより一次構造を決定した (図３Ｂ)。【０１５５】
OBF13の抗原は、機能未知の分子としてすでにORF全長のcDNAがNCBIデータベースに登録されており (accession number：XM_133424)、mRNAの配列を推定することができた。その正確性を確認するために、マウスの精巣から抽出したtotal RNAを鋳型としてRT-PCRとDNAシークエンスを行い配列を確認した。この分子 (OBF (Oocyte binding/fusion factor)) のモチーフを解析すると、シグナル配列、細胞外領域、細胞膜貫通領域、細胞内領域をもつ典型的なI型の膜タンパク質であることが分かった (図３Ｂ)。さらにデータベースサーチの結果、OBFはマウスだけではなく少なくともヒト、ラットにも存在し、それぞれのアミノ酸配列レベルでの相同性は57%を超える高い相同性を示した。ヒト、マウスまたはラットのOBFの塩基配列を配列番号：１、３または５に、アミノ酸配列を配列番号：２、４または６に示す。これら全ての動物種のOBFの細胞外領域は1つのIg-like (Immunoglobulin-like) ドメインを有し、システイン同士のジスルフィド結合でこのドメインを形成していることが推測された (図３Ｄ)。またこのドメイン内にあるN結合型糖鎖付加配列は、全ての動物種間で完全に保存されていた。
マウスOBFは、ESTデータベースにおいて精巣と脳に発現していることが示されたが、マウスOBFに対するポリクローナル抗体を作製し、各組織のウエスタンブロットを行うと精巣や精子に特異的にタンパク質レベルで存在することが明らかになった (図３Ｃ)。【０１５６】
OBFが本当に生体内で融合に関与する分子として働いていることを明らかにするために、ノックアウトマウスの作製とその解析を行った。10個のエキソンから成るOBF遺伝子のエキソン2から10までをネオマイシン耐性遺伝子に置き換えるターゲティングベクターを構築し、常法どおり相同組換えを引き起こしたES細胞をクローニングしてノックアウトマウスを作製した (図４Ａ)。マウス個体で相同組換えの有無の評価は、サザンブロット、ノーザンブロット、ウエスタンブロットを行い調べた (図４Ｂ-Ｄ)。その結果、相同組換えが行われたマウスではOBF遺伝子由来のmRNA、タンパク質が欠失していることが確認できた。また、調査した限りOBFタンパク質が欠失することによって、他の精子膜タンパク質 (CD46: 先体内膜タンパク質, sp56: 先体マトリックスタンパク質, CD55; 細胞膜タンパク質, CD147; Ig スーパーファミリータンパク質, Fertilin β; 透明帯結合に関わるタンパク質) が欠失したり、発現量が減少したりする2次的な影響は見られなかった (図４Ｄ)。【０１５７】
OBF -/-雄マウスの妊孕性を調べるために、C57BL/6雌マウスとの産仔数を自然交配させて調べた。その結果、OBF -/-雌マウスからは正常な数の産仔が得られたがOBF -/-雄マウスからは、全く産仔が得られず不妊であることが示された (図５Ａ)。OBF -/-雄マウスの不妊の原因を調べるために、体外受精の系で詳細な検討を行った。その結果、OBF -/-雄マウスの精子は卵丘細胞を拡散することや透明帯に結合することまた透明帯を通過することができることが確認されたが、受精して2細胞になるものは得られなかった (図５Ｂ)。さらに裸卵を用いた研究ではOBF -/-の精子は、卵子に結合することができるにもかかわらず、全く融合能を有していないことが分かった (図５Ｃ)。また、精子と融合ができないCD9 -/-卵子にOBF -/-精子を加えた場合でも卵子に結合することはできることから、結合と融合は同時におこる現象ではなく別々の事象として分別できることが推測された (図５Ｄ)。また、カルメジン、ファーティリン、ACEノックアウト雄マウスはいずれも、輸卵管へ精子が上がらないことが不妊の原因の一つとして知られている。OBF -/-精子の場合は雌マウスとの交配後、卵管膨大部の卵子の周辺や囲卵腔に精子が存在することから、正常に精子が上昇していることが分かった。さらに精巣の大きさや、精子の数、形、運動性などどれも正常であった。【０１５８】
OBF -/-雄マウスの不妊の原因が融合能の欠失に限られているとすると、融合の過程をバイパスすることができればその後の受精のステップは正常に起こり、その産仔が得られるはずである。このことを確認するために、ICSI (intracytoplasmic sperm injection) 法によりOBF -/-精子に適用した。その結果、OBF -/-の精子から健康な産仔が得られた (表３)。【０１５９】
【表３】
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【０１６０】
ハムスター裸卵に対して、様々な動物種の精子が融合可能であることが知られている。OBFの動物種間の多様性を調べるために、マウスのOBF -/-精子を用いて、ハムスター裸卵との融合性について検討した。その結果、OBF -/-精子はマウス卵子を用いた場合と同様に結合はするが、全く融合できないことが示された (図６Ａ)。さらにヒトOBFポリクローナル抗体を作製し、ヒト精子とハムスター裸卵との融合に及ぼす影響をみたところ、ヒト精子はハムスター裸卵に対して融合はおろか結合さえしなくなることが明らかとなった (図６Ｂ)。これらの結果から、OBFは、動物種をこえて受精における卵子との結合または融合に必須な分子であることが分かった。
最後に、精巣特異的な分子シャペロンであるカルメジンのプロモーター制御下にOBFを発現するベクターを導入したトランスジェニックマウスを用いて、OBFノックアウトマウスのレスキューを行ったところ、受精能が回復することが確認され、OBF -/-マウスに見られた不妊の表現型はOBF遺伝子欠損によるものであることを確かめた (図７)。【０１６１】
以上により、OBFはマウスに限定されずヒトにおいても、受精の最も大事なステップである卵子との結合や融合に欠くことのできない重要な分子であることが明らかになった。また、この抗体に受精阻害作用があることから、避妊ワクチンの抗原として使用できる。また逆にOBFを調べることにより不妊の診断にも応用可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１６２】
本発明により精子と卵子の結合または融合に必須なタンパク質OBFとその抗体の利用法が提供される。OBFは避妊ワクチンとして利用可能であり、OBFに対する抗体は避妊薬として利用できる。また、OBFタンパク質の発現等を指標とした避妊薬のスクリーニングや不妊の検査方法が提供できる。さらに、OBF遺伝子の機能が抑制された非ヒト動物は、不妊のモデル動物として利用できる。
【図３Ｂ】
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【図３Ｄ】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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