(57)【要約】  飲料や加工食品の日持ち向上ならびに化粧品の防菌のために使用できる、耐熱性芽胞菌に対する抗菌活性を有する物質を提供する。  本発明は、カテキン類の水酸基の少なくとも１つと中鎖脂肪酸とがエステルを形成したカテキンエステル類である。本発明のカテキン類の中鎖脂肪酸エステル類は、単品あるいは組成物として、耐熱性芽胞菌に対して、強い増殖抑制を示し、飲食品に添加することによって、それらの腐敗や変質を防止することができ、また化粧品に添加することによって、化粧品の腐敗や変質を防止することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カテキン類の水酸基の少なくとも１つと中鎖脂肪酸とがエステルを形成したカテキンエステル類の少なくとも一種を有効成分として含有する抗菌剤。
【請求項２】
エステルを形成する中鎖脂肪酸の炭素数が８ないし１２である、請求項１の抗菌剤。
【請求項３】
エステルを形成する中鎖脂肪酸が炭素数が８である、請求項２の抗菌剤。
【請求項４】
カテキン類の少なくとも３位の水酸基はエステルを形成している、請求項１ないし３のいずれか１項の抗菌剤。
【請求項５】
カテキン類の少なくとも５位の水酸基はエステルを形成している、請求項１ないし３のいずれか１項の抗菌剤。
【請求項６】
カテキン類の少なくとも７位の水酸基はエステルを形成している、請求項１ないし３のいずれか１項の抗菌剤。
【請求項７】
２箇所の水酸基がエステルを形成している、請求項４ないし６のいずれか１項の抗菌剤。
【請求項８】
下記のエステル：
脂肪酸がカテキンの３位の水酸基とエステル形成したモノエステル、
脂肪酸がカテキンの５位および３’位もしくは４’位とエステル形成したジエステル、
脂肪酸がカテキンの３位および３’位もしくは４’位とエステル形成したジエステル、および
脂肪酸がカテキンの７位および３’位もしくは４’位とエステル形成したジエステル、
からなる群から選択されるカテキンエステル類の少なくとも一種を有効成分として含有する、請求項１ないし３のいずれか１項の抗菌剤。
【請求項９】
食品、飲料、化粧品、または医薬品用の抗菌剤である、請求項１ないし８のいずれか１項記載の抗菌剤。
【請求項１０】
耐熱性芽胞菌に対して抗菌活性を有する、請求項１〜９のいずれか１項の抗菌剤。
【請求項１１】
カテキン類もしくはそのエステル誘導体を、中鎖脂肪酸、そのエステルもしくはトリグリセリドからなる群から選択される脂肪酸供与体の存在下で、クロロゲン酸エステラーゼまたはフェルラ酸エステラーゼによりエステル形成もしくはエステル交換反応させ、カテキン類の水酸基の少なくとも１つと中鎖脂肪酸とがエステルを形成したカテキンエステル類を製造する方法。
【請求項１２】
エステル形成もしくは交換反応を、pH３〜７の緩衝液中、温度３０〜５０℃で、４〜４８時間行う、請求項１１の方法。
【請求項１３】
脂肪酸供与体が、オクタン酸、オクタン酸エチルまたはオクタン酸トリグリセリドである請求項１１または１２の方法。
【請求項１４】
カテキンの３位に中鎖脂肪酸とのエステルが形成される、請求項１１ないし１３のいずれか１項の方法。
【請求項１５】
カテキン類が、茶抽出物の状態で反応に使用される、請求項１１ないし１４のいずれか１項の方法。
【請求項１６】
カテキン類の水酸基の少なくとも１つと中鎖脂肪酸とがエステルを形成したカテキンエステル類（但し、３−Ｏ−デカノイルカテキンを除く）。
【請求項１７】
エステルを形成する中鎖脂肪酸の炭素数が８ないし１２である、請求項1６のカテキンエステル類。
【請求項１８】
エステルを形成する中鎖脂肪酸の炭素数が８である、請求項１７のカテキンエステル類。
【請求項１９】
カテキン類の少なくとも３位の水酸基はエステルを形成している、請求項1６ないし１８のいずれか１項のカテキンエステル類。
【請求項２０】
カテキン類の少なくとも５位の水酸基はエステルを形成している、請求項1６ないし１８のいずれか１項のカテキンエステル類。
【請求項２１】
カテキン類の少なくとも７位の水酸基はエステルを形成している、請求項1６ないし１８のいずれか１項のカテキンエステル類。
【請求項２２】
２箇所の水酸基がエステルを形成している、請求項１９ないし２１のいずれか１項のカテキンエステル類。
【請求項２３】
下記のエステル：
脂肪酸がカテキンの３位の水酸基とエステル形成したモノエステル、
脂肪酸がカテキンの５位および３’位もしくは４’位とエステル形成したジエステル、
脂肪酸がカテキンの３位および３’位もしくは４’位とエステル形成したジエステル、および
脂肪酸がカテキンの７位および３’位もしくは４’位とエステル形成したジエステル、
からなる群から選択される、請求項１６ないし１８のいずれか１項のカテキンエステル類。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
【０００２】
本発明は、抗菌活性を有し、飲食品や化粧品の分野で応用が期待できるカテキン類や茶抽出物の脂肪酸エステル類に関する。
【背景技術】
【０００３】
食品の安全・安心が強く求められている時代において、食品の安全性を確保することは大変重要である。健康志向の高まりとともに、一般食品において低塩化・低糖化が進む一方で、食品中の水分活性が上昇し、微生物が繁殖し易い環境がつくられている。食中毒発生原因の約８７％以上が細菌性であると報告されている（加藤洋次、２００１、月刊フードケミカル８月号１９５頁）。また、低温流通システムが発達したとは言え、食品の保存性、安全性を確保することが強く望まれている。また、飲料等は加熱殺菌処理をされているが、そのような場合には耐熱性芽胞菌が変敗等の原因になってくる。【０００４】
従来、食品や化粧品の腐敗や変質を防止する目的でパラオキシ安息香酸、安息香酸、ソルビン酸などが化学合成品保存剤として使われている。それらは食品に添加する場合は食品添加物の保存料として定義されており、使用に際して厳しい規制がある。また、ペクチン分解物、白子タンパク質、リゾチーム、茶抽出物、ヒノキチールなどが食品添加物の日持ち向上剤として使用されている。これらの天然抗菌剤は抗菌活性が弱いために腐敗等を完全に防止するためには多量に添加する必要がある。また、有効成分を精油成分とするものが多く、独特の強い芳香と水に対する溶解性の低さから使用範囲や量が限られるという制限がある。【０００５】
茶抽出物は安全でかつ適度な水に対する溶解性があるが、十分な抗菌効果を発揮させる濃度では、抗菌成分であるカテキン自体の苦味と渋味が生じるなどの食品の香味に影響を与えるという問題がある。この問題を解決するために、サイクロデキストリンを併用する方法（特開平３−１６８０４６）やタンパク質を使用する方法〔卵白や植物タンパク質等を使用した方法（特開平２−２０２９００）や脱脂卵黄を併用する組成物（特開２００１−３１６６９）〕が開示されている。同じく、苦味や渋みを低下したり、水溶性を向上させる目的で茶抽出物をシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼでカテキン類をα配糖体化したり（特開平８−２９８９３０）、シュークロースホスホリラーゼでカテキン類のα−配糖体を製造すること（特開平５−１７６７８６）が開示されている。これらの配糖体化されたものは食品の香味を損なうという面は改善されているものの、抗菌性を保持している、あるいは向上するということは全く記載がない。また、安全性が高く安価な天然物由来抗菌物質を提供することを目的として、緑茶飲料の加熱温度と加熱時間などを工夫することによってカテキン類由来抗菌物質が製造できると特開平１１−１１６４１８に記載されている。【０００６】
一方、茶カテキン類やテアフラビン類がメチシリン耐性ブドウ球菌に対する抗生物質の抗菌力を増強させるという内容（特開平９−１３２５３２）も開示されている。【０００７】
このように、カテキン類を主成分とする茶抽出物はその抗菌性と安全性から種々検討されているが、抗菌性を保持したままで、食品の香味や色調という品質を損なわないというところまでは至っていない。【０００８】
従って、安全・安心という消費者の要望に応えるべく、さらに低濃度で抗菌活性を持つ抗菌素材が求められている。【０００９】
また、カテキン類の脂肪酸エステル誘導体としてはエピガロカテキンの3位水酸基の脂肪酸エステルが知られている（S. Uesato et al, Bioorg. Med. Chem. Lett, 10 (2000) 1673-75、および US Pat. 2003/0105030 A1）。これらは抗腫瘍性を促進する活性を有すること、或いは5-αレダクターゼ阻害活性が記載されているが、抗菌活性については記載されていない。また、上記S. Uesato et alでは、カルボキシエステラーゼによって酵素合成を行っているが、その基質は脂肪酸ｐ−ニトロフェニルエステルという反応性が高い活性エステルでの酵素反応であり、通常の脂肪酸、アルキルエステルあるいはトリグリセリドではない。【００１０】
さらに、カテキンの3位水酸基の脂肪酸エステルとしてはデカノイルおよびパルミトイルエステルが知られている（特開昭５４−８１２７４）。これらは肝臓壊死の予防や脂肪過酸化の防止に有効であることが記載されている。しかしながら、カテキン類の脂肪酸エステル誘導体に抗菌活性があることは何ら記載されていない。また、カテキンやエピカテキンのオクタン酸エステルについては実施例が示されていない。
【特許文献１】特開平３−１６８０４６
【特許文献２】特開平２−２０２９００
【特許文献３】特開２００１−３１６６９
【特許文献４】特開平８−２９８９３０
【特許文献５】特開平５−１７６７８６
【特許文献６】特開平１１−１１６４１８
【特許文献７】特開平９−１３２５３２
【特許文献８】特開昭５４−８１２７４
【非特許文献１】加藤洋次、２００１、月刊フードケミカル８月号１９５頁
【非特許文献２】S. Uesato et al, Bioorg. Med. Chem. Lett, 10 (2000) 1673-75
【非特許文献３】US P.0105030 A1（2003年)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、カテキン類の抗菌活性に着目し、その活性を高めるとともに、カテキン類が有する苦み・渋みが少なく、そのため、飲料や加工食品の日持ち向上ならびに化粧品の防菌のために使用できる、耐熱性芽胞菌に対する抗菌活性を有する物質として、カテキン類の中鎖脂肪酸エステル類を提供する。【００１２】
本発明は、本発明のカテキン類の中鎖脂肪酸エステル類の製造方法も提供する。【００１３】
本発明はさらに、カテキン類の中鎖脂肪酸エステル類を有効成分とする抗菌剤も提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、カテキン類を含む茶抽出物やカテキン類から、酵素法または化学的方法で変換することによって、耐熱性芽胞菌に対して抗菌活性が向上するかどうかを鋭意検討した結果、クロロゲン酸エステラーゼと中鎖脂肪酸、それらのエステルまたはそれらのトリグリセリドを用いてカテキン類を処理することによって、または化学的に中鎖脂肪酸とカテキン類をエステル化することによって、もとの茶抽出物やカテキン類より耐熱性芽胞菌に対して抗菌活性が向上することを見出し、本発明を完成させた。【００１５】
従って、本発明は、カテキン類の水酸基の少なくとも１つと中鎖脂肪酸とがエステルを形成したカテキンエステル類である（本明細書において、カテキン類中鎖脂肪酸エステル類と略称することがある）。【００１６】
本発明のカテキン類の中鎖脂肪酸エステル類は、飲食した場合、消化管でリパーゼによって容易に加水分解され、もとの茶抽出物やカテキン類に戻るため、極めて安全性の高い抗菌剤である。すなわち、本発明物質およびそれを含む組成物は医薬部外品のみならず、化粧品や飲食品の保存や日持ち向上などへの応用が期待できる。【００１７】
本発明のカテキン類中鎖脂肪酸エステル類において、エステルを形成する中鎖脂肪酸の炭素数は、好ましくは８ないし１２、最も好ましくは８である。中鎖脂肪酸は、直鎖または分岐鎖、飽和または不飽和であってよいが、直鎖飽和脂肪酸が好ましく、例えば、カプリル酸、カプリン酸あるいはラウリル酸などの中鎖脂肪酸があげられる。最も好ましいのはカプリル酸である。【００１８】
抗菌活性の高い点で好ましい中鎖脂肪酸エステル類の非限定的な例示として下記のものがあげられる：
少なくとも３位、５位または７位の水酸基のいずれか１つはエステルを形成しているカテキンエステル類。【００１９】
２箇所の水酸基のみがエステルを形成しているカテキンエステル類（３’位と４’位の２箇所が同時にエステル形成している場合は、若干抗菌活性が弱いが、これらも本発明に含まれる）。【００２０】
より具体的には、下記のものがあげられる。【００２１】
脂肪酸がカテキン類、好ましくはカテキンまたはエピカテキンの３位の水酸基とエステル形成したモノエステル、
脂肪酸がカテキン類、好ましくはカテキンまたはエピカテキンの５位および３’位もしくは４’位とエステル形成したジエステル、
脂肪酸がカテキン類、好ましくはカテキンまたはエピカテキンの３位および３’位もしくは４’位とエステル形成したジエステル、および
脂肪酸がカテキン類、好ましくはカテキンまたはエピカテキンの７位および３’位もしくは４’位とエステル形成したジエステル。【００２２】
[発明の実施の形態]
カテキン類
本明細書において、原料として用いられるカテキン類は、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキンが好ましく、さらに、カテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピカテキンガレートおよびエピガロカテキンガレートも使用できる。これらは水酸基を有しており、中鎖脂肪酸とエステルを形成することが可能である。カテキン類の水酸基の一部または全部はその反応性に影響しないエステル化等の修飾を受けていてもよい。【００２３】
カテキン類は、茶抽出物に含まれるので、茶抽出物をそのまま本発明の原料として用いると都合がよい。茶抽出物としては特に限定するものではなく、例えば煎茶、ほうじ茶、玉露、かぶせ茶、蒸し製茶と称する緑茶類の不発酵茶、嬉野茶、青柳茶、釜入り茶と総称する各種中国茶などの不発酵茶、包種茶、ウーロン茶などの半発酵茶、紅茶、阿波番茶、碁石茶、プアール茶などの発酵茶およびマテ茶などの抽出物が挙げられる。また、茶抽出物として市販されている太陽化学（株）製のサンフェノン、三井農林（株）製のポリフェノン、サントリー（株）製のサンウーロンを使用してもよい。【００２４】
酵素反応による製造
カテキン類から、カテキン類中鎖脂肪酸エステル類を製造するためには、酵素反応が利用できる。【００２５】
カテキン類は、水性の液として反応に使用できる。カテキン類を豊富に含む茶抽出液をそのまま使用してもよい。反応のpHは３〜７である。反応系に水を用いずに、カテキン類を粉末として、反応系に添加する方法も可能である。【００２６】
反応に使用できる酵素は、エステラーゼ、例えばクロロゲン酸エステラーゼおよびフェルラ酸エステラーゼが含まれる。これらのエステラーゼは、Asp. japonicusやLactobacillus acidophilus由来の酵素として知られており、食品加工用酵素として市販されている
。例えば、クロロゲン酸エステラーゼ（キッコーマン社製）やフェルラ酸エステラーゼ（日本バイオコン社製）を使用するのが好都合である。【００２７】
これらのエステラーゼを使用して、カテキン類の水酸基に中性脂肪酸をエステル化することができる。中鎖脂肪酸は、遊離の酸として用いることもでき、あるいは中鎖脂肪酸の炭素数１〜３のアルキルエステル、あるいは中鎖脂肪酸のトリグリセリドの形で用いてもよい。中鎖脂肪酸は、溶媒としてヘキサン、ベンゼン、トルエンなどの反応に不活性な非極性溶媒と混合して、水の存在下、あるいは水が存在しない状態で反応させることができる。水の無い条件のとき、カテキン類は上記のように、粉末として反応系に添加する。【００２８】
反応は、カテキン類の水溶液および中鎖脂肪酸、それらのエステル、およびトリグリセリド類の有機溶媒液、あるいは、それらの溶媒無しのものに、酵素を粉末状でまたは水に溶解して添加して、静置、攪拌、振とうまたは混合することにより行うことができる。反応温度は１０〜６０℃、好ましくは３０〜５０℃程度で反応するのがよい。反応時間は４〜４８時間で十分であるが、反応液中の油層を経時的に分析しながらエステル体の生成量が最も高い時点で反応を終了することもできる。カテキン類の量、中鎖脂肪酸の量、および酵素の量は、目安として、１：２〜１０：０．５〜１０（W/W)を使用する。【００２９】
酵素は粉末酵素に代えて，担体に固定化した固定化酵素として用いることもできる。酵素の固定化方法は公知の方法によって行われ、固定化担体としてシリカゲル、セライト、к−カラギナン、キチン、アルギン酸ナトリウムなど公知の担体｛バイオリアクター福井三郎監修・編 講談社サイエンティフィック（１９８５年）、実践バイオリアクター，食品産業バイオリアクターシステム技術研究組合編食品化学新聞社（１９９０年）｝を用いることができる。さらに、水処理に使っているようなイオン交換樹脂に酵素を固定化して用いることもできる。その他に吸着クロマトグラフィーや疎水吸着クロマトグラフィーに用いる樹脂に酵素を固定化して用いることもでき、一般にタンパク質を吸着することができる樹脂担体に固定化して用いることもできる。【００３０】
カテキンやエピカテキンを原料として酵素反応させた場合は、３位の水酸基が中鎖脂肪酸とエステル化した生成物が得られる。エステル化生成物は、溶媒を除去して、そのまま使用してもよく、シリカゲルクロマトグラフィーおよび／または高速液体クロマトグラフィーによって精製してもよい。精製したエステル化生成物は、固形（粉末）状物である。【００３１】
化学合成による製造
カテキン類、例えばカテキンあるいはエピカテキンを、中鎖脂肪酸と脱水縮合剤例えばカルボジイミドの誘導体の存在下、あるいは中鎖脂肪酸クロリドとトリエチルアミンやピリジンなどの塩基の存在下、非プロトン性溶媒中であるいは無溶媒で、０〜６０℃、２〜２４時間反応させることによって、カテキン類の水酸基の１個エステル化されたものから全てに脂肪酸がエステル化されたものの混合物が得られる。これらの混合物は、必要であれば、例えば、シリカゲルクロマトグラフィーによって、またはさらに高速液体クロマトグラフィーなどの常法によって精製し、目的の位置がエステル化されたものに分離することができる。【００３２】
すべてエステル化されたカテキン類は、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウムなどアルカリ金属類あるいは有機塩基と水、アルコールなどのプロトン性溶媒中で、０〜５０℃、２〜４８時間処理することによって、カテキン類の水酸基の一部がエステル化されたものに変換することもできる。この場合、主として３位の水酸基がエステル化された生成物が得られる。【００３３】
抗菌活性
本発明のカテキン類の中鎖脂肪酸エステル類のうち、中鎖脂肪酸が１個あるいは２個エステル化したものは、芽胞菌例えばバチルス属の菌あるいは耐熱性好酸菌であるアシドフィラス菌に対して、もとの原料であるカテキンやエピカテキンに比べて強い増殖抑制作用を示す。上記以外にも、その他の一般細菌にも増殖抑制が期待できる。【００３４】
抗菌活性の測定法は公知の適当な方法で行うことができ、例えば実施例６の方法で行うことができる。
【発明の効果】
【００３５】
本発明のカテキン類の中鎖脂肪酸エステル類は、単品であるいは組成物として、食品分野では、緑茶、ノンアルコール飲料、アルコール飲料などの清涼飲料にまた、調味料、菓子類、シロップ類、果実加工品、野菜加工品、肉製品、缶・ビン詰類、などの一般食品にそれらの保存や日持ち向上に使用できる。また、化粧品分野では、化粧クリーム、軟膏、化粧液などの腐敗や変質の防止に使用できる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例に基づいて、本発明をさらに具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。【００３７】
実施例１  カテキンエステル体の化学合成
カテキン水和物（3.05g、10.5mmol）をテトラヒドロフラン（THF）20mlに溶解し、ピリジン2.5ml（30.9mmol）を加える。混合液を氷冷し、カプリル酸クロリド3.6ml（21.1mmol）を添加した。添加後、室温に戻し、一夜撹拌する。反応液に酢酸エチル（AcOEt）を加
え、飽和硫酸水素カリウム水溶液、水、飽和重ソー水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ソーダで乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで分画した（AcOEt/ヘキサン＝1/2〜2/1）。ジエステル画分の内、TLC（酢酸エチル／ヘキサン=1:1）で高純度のフラクションとして、1.25gの3’4’-O-ジオクタノイルカテキンを得た。また、モノエステル画分として、高純度の3’(および4’)-O-オクタノイルカテキンが0.78g得られた。3’あるいは4’に結合したオクタノイル基は相互に転移し、ほぼ1:1の混合物となった。【００３８】
3’4’-O-ジオクタノイル-(+)-D-カテキン：白色結晶、1H-NMR（DMSO-d6、ppm）：0.87(6H, m), 1.2-14 (16H, m), 1.60 (4H, m), 2.39 (1H, dd), 2.55 (4H, t), 2.75 (1H, dd), 3.86 (1H, m), 4.65 (1H, d), 5.11 (1H, d), 5.72 (1H, d), 6.00 (1H, d), 7.2-7.4 (3H, m), 8.99 (1H, s), 9.24 (1H, s)。【００３９】
3’-O-オクタノイルおよび4’-O-オクタノイル-(+)-D-カテキン：アモルファス、1H-NMR（DMSO-d6、ppm）：0.87 (3H, t), 1.2-1.4 (8H, m), 2.16 (2H, m), 1.63 (2H, m), 2.37 (1H, m), 2.54 (2H, t), 2.69 (1H, m), 3.83 (1H, m), 4.55 (1H, dd), 5.00 (1H, dd), 5.70 (1H, d), 5.90 (1H, s), 6.7-7.1 (3H, m), 9.05 (1H, s), 9.20 (1H, s), 9.59 (1H, s)。【００４０】
実施例２  カテキンエステル体の化学合成
カテキン水和物（3.04g、47.0mmol）をテトラヒドロフラン（THF）20mlに溶解し、ピリジン3.8ml（30.9mmol）を加える。混合液を氷冷し、カプリル酸クロリド5.4ml（31.6mmol）を添加した。添加後、室温に戻し、一夜撹拌する。反応液に酢酸エチル（AcOEt）を加え、飽和硫酸水素カリウム水溶液、水、飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ソーダで乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで分画した（AcOEt/ヘキサン＝1/2〜2/1）。ジエステル画分の内、TLC（酢酸エチル／ヘキサン=1:1）で高純度のフラクションとして、0.17gの3’(あるいは4’),5-ジ-O-オクタノイルカテキンおよび0.10gの3’(あるいは4’),3-ジ-O-オクタノイルカテキンを得た。また、他のフラクションとして、2成分の画分が得られ（0.54g）、一部をHPLC（カラム：Develosil  C30-UG5、10×250mm、溶出液：80%アセトニトリル水溶液））で精製し、3’(あるいは4’),7-ジ-O-オクタノイル、および、3’4’-O-ジオクタノイルカテキンを得た。【００４１】
3’(あるいは4’),5-ジ-O-オクタノイル-(+)-D-カテキン：1H-NMR（DMSO-d6、ppm）：085 (6H, m), 1.2-1.4 (16H, m), 1.63 (4H, m), 2.18(1H, m), 2.36 (1H, m), 2.54 (4H, m), 3.86 (1H, m), 4.63 (1H, dd), 5.13 (1H, dd), 6.0-6.2 (2H, m), 6.7-7.1 (3H, m), 9.5-9.7 (2H, m)。【００４２】
3’(あるいは4’),3-ジ-O-オクタノイル-(+)-D-カテキン：1H-NMR（DMSO-d6、ppm）：0.86 (6H, m), 1.1-1.4 (18H, m), 1.62 (2H, m), 2.15 (2H, m), 2.70 (1H, m), 4.9-5.2 (2H, m), 5.78 (1H, d), 5.94 (1H, s), 6.7-7.0 (3H, m), 9.08 (1H, d), 9.36 (1H, s), 9.69 (1H, s)。【００４３】
3’(あるいは4’),7-ジ-O-オクタノイル-(+)-D-カテキン：1H-NMR（DMSO-d6、ppm）： 0.86 (6H, m), 1.2-1.4 (16H, m), 1.60 (4H, m), 2.38 (1H, m), 2.55 (4H, t), 2.75 (1H, m), 3.90 (1H, m), 4.6-4.8 (1H, m), 5.0-5.2 (1H, m), 5.7-6.2 (2H, m), 6.7-7.4 (3H, m), 8.9-9.8 (2H, m)。【００４４】
実施例３  カテキンエステル体の化学合成
カテキン水和物（3g、10.3mmol）をテトラヒドロフラン（THF）15mlに溶解し、ピリジン6.3ml（77.9mmol）を加える。混合液を氷冷し、カプリル酸クロリド9.7ml（56.8mmol）を添加した。添加後、室温に戻し、一夜撹拌する。反応液に酢酸エチル（AcOEt）を加え、飽和硫酸水素カリウム水溶液、水、飽和重ソー水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ソーダで乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで分画した（AcOEt/ヘキサン＝1/20~1/4）。減圧濃縮後、7.0gのペンタ-O-オクタノイルカテキンおよび1.3gの5,7,3’,4’-テトラ-O-オクタノイルカテキンが得られた。ペンタ-O-オクタノイルカテキン（7.0ｇ、7.6mmol）を塩化メチレン20mlに溶解し、エタノールアミン（1.74ml、28.8mmol）を加え、室温下一夜攪拌した。反応液をAcOEt/ヘキサン＝1/4で希釈してそのままシリカゲルクロマトグラフィーで分画した（AcOEt/ヘキサン＝1/4〜2/1）。ジエステル画分を再クロマトグラフィー（塩化メチレン／アセトン=10/1〜4/1）で精製し、高純度の3,7-ジ-O-オクタノイルカテキン（75mg）を得た。また、モノエステル画分を濃縮し、1.46gの3-O-オクタノイルカテキンを得た。【００４５】
3,7-ジ-O-オクタノイル-(+)-D-カテキン：1H-NMR（DMSO-d6、ppm）：0.85 (6H, m), 1.1-1.4 (18H, m), 1.59 (2H, m), 2.15 (2H, t), 2.4-2.6 (4H, m), 5.00 (1H, d), 5.13 (1H, q), 6.13 (1H, d), 6.21 (1H, d), 6.56 (2H, dd), 6.6-6.7 (2H, m), 8.95 (2H, s), 9.60 (1H, s)。【００４６】
3-O-オクタノイル-(+)-D-カテキン：アモルファス結晶。1H-NMR（DMSO-d6、ppm）：0.85 (3H, t), 1.1-1.5 (10H, m), 2.16 (2H, m), 2.64 (1H, dd), 4.90 (1H, d), 5.10 (1H, q), 5.77 (1H, d), 5.93 (1H, d), 6.57 (1H, dd),  6.7-6.8 (2H, m), 8.91 (2H, bs), 9.05 (1H, s), 9.32 (1H, s)。【００４７】
実施例４  カテキンエステル体の化学合成
ペンタ-O-オクタノイルカテキン（6.6ｇ、7.2mmol）を塩化メチレン20mlに溶解し、エタノールアミン（1.21ml、20.0mmol）を加え、室温下一夜攪拌した。反応液をAcOEt/ヘキサン＝1/4で希釈してそのままシリカゲルクロマトグラフィーで分画した（AcOEt/ヘキサン＝1/4〜2/1）。ジエステル画分の内、TLC上、高純度のフラクションとして、3,5-ジ-O-オクタノイルカテキン（180mg）を得た。【００４８】
3,5-ジ-O-オクタノイル-(+)-D-カテキン：0.85 (6H, m), 1.0-1.4 (16H, m), 1.48 (2H, t), 1.61 (2H, t), 2.19 (2H, t), 2.5-2.7 (4H, m), 4.9-5.3 (2H, m), 6.11 (1H, d), 6.15 (1H, d), 6.57 (1H, dd), 6.6-6.8 (2H, m), 9.06 (2H, b), 9.86 (1H, b)。【００４９】
実施例５  カテキンエステル体の化学合成
テトラ-O-オクタノイルカテキン（3.5ｇ、4.4mmol）を塩化メチレン10mlに溶解し、エタノールアミン（0.47ml、7.8mmol）を加え、室温下一夜攪拌した。反応液をAcOEt/ヘキサン＝1/4で希釈してそのままシリカゲルクロマトグラフィーで分画した（AcOEt/ヘキサン＝1/4〜2/1）。ジエステル画分でTLC上、高純度である5,7-ジ-O-オクタノイルカテキン（0.3g）を得た。【００５０】
5,7-ジ-O-オクタノイルカテキン-(+)-D-カテキン：1H-NMR（DMSO-d6、ppm）：0.87 (6H, m), 1.2-1.4 (16H, m), 1.6-1.7 (4H, m), 2.4-2.7 (4H, m), 3.93 (1H, q), 4.71 (1H, d), 6.51 (2H, dd), 6.59 (1H, dd), 6.6-6.8 (2H, m), 8.90 (2H, bs).
実施例６  抗菌活性の測定：
実施例１〜５、および後記参考例１で製造した本発明物質およびカテキンをジメチルスルホキシドにて種々の濃度に溶解させ、平底の96ウェルマルチプルウェルプレート（コーニング＆コスター社製）に2μL入れたのち、あらかじめ芽胞形成培地｛ポリペプトン  10.0ｇ、酵母エキス  5.0ｇ、炭酸カルシウム  15.0ｇ、寒天  15.0ｇ、無機塩の水溶液  5.0ｍL、蒸留水  1000ｍL；但し、無機塩の水溶液の組成は、硫酸マグネシウム・7水和物4.0ｇ、硫酸マンガン・5水和物0.216ｇ、硫酸第二鉄・7水和物0.2ｇ、塩化ナトリウム0.2ｇ、蒸留水100ｍLである｝にて調製した枯草菌 Bacillus subtilisの芽胞  １×107 個/ｍLの生理食塩水懸濁液50μLを加えた。これに、ブイヨン液体培地（pH 7.0、日水製薬株式会社製）50μLを添加し、37℃にて一終夜培養した。培養開始時と培養後の690 ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（サーモラボシステムズ社製、フィンランド）によって計測した。下式から算出した増殖阻害度をもとに、阻害度と試料濃度を両軸とする散布図を作成し、本発明物の芽胞菌に対する50％  阻害濃度（IC50）を求めた。【００５１】
増殖阻害度（％）＝100 ×｛Δ690（無添加）- Δ690（試料添加）｝/Δ690（無添加）ここで、Δ690（無添加）とは培養開始前後の無添加群の690ｎｍの値の差、Δ690（試料）とは培養開始前後の試料添加群の690ｎｍの値の差を示す。結果を表１に示す。【００５２】
高温性好酸性芽胞性細菌：Alicyclobacillus acidoterrestrisに対しても、 培養温度条件と液体培地の種類の2点を変更して同様に行い、活性を求めた[ 培養温度：45℃；液体培地：乾燥酵母エキス（Difco  Laboratories製）0.4％、可溶性でんぷん（ナカライテスク（株）製）0.4％、グルコース（ナカライテスク（株）製）1％、1 N硫酸でpH 3.8に調整]。【００５３】
結果を表１に示す。【００５４】
【表１】
2006080328.tif 000002
【００５５】
実施例７  3-O-オクタノイル-(+)-D-カテキン（酵素合成）
3-O-カプリロイルカテキンの化学合成品のHPLCシステム（日立D-7000型、Diode-Array検出器L-7451型）、カラム：Develosil C30-UG-5（野村化学（株）製、4.6ｘ150 ｍｍ、移動相：5%-90%アセトニトリル／0.1%TFA、0-15分グラジエント溶出、流速：1.0 ml／分、検出波長：230 nmまたは280 nm）における保持時間14.2分を指標に、市販のリパーゼ、エステラーゼ酵素剤について検索した。なお、酵素反応系はカテキン5mgを20mM酢酸緩衝液（pH 5.0）0.3mlに溶解した後、酵素剤を添加しさらにオクタン酸0.3mlを添加して37℃で振とう反応した。反応液の油層部分についてHPLC分析した結果、クロロゲン酸エステラーゼ（キッコーマン社製）がカテキンへのエステル転移活性を有する事を見い出した。オクタン酸ピーク(12.9分)の直後14.2分の位置にピークが認められ、化学合成品とのコクロマト分析より3-O-カプリロイルカテキンと保持時間が一致した。【００５６】
実施例８  3-O-オクタノイル-(+)-D-カテキン（酵素合成）
カテキン5gをバッファー300mlに溶解しクロロゲン酸エステラーゼ50gさらにオクタン酸300mlをスターラー撹拌しながら20時間反応を行った。反応液を分液し、油層を水洗浄後、減圧蒸留（120℃、2mmHg）し、オクタン酸を除いた後、蒸留残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（塩化メチレン、塩化メチレン−メタノール（1%−30%のグラジエント）で溶出）で部分精製し、1.3gの粗生成物を得た。この一部をDevelosil ODS-HG-5分取カラム（野村化学（株）製、10ｘ250 ｍｍ、移動相：70%アセトニトリル／0.1%TFA、流速：1.3 ml／分、1.3 ml分画）を用いて分取し、高純度の表記化合物を得た。NMRおよびマススペクトルは相当する合成品と一致した。【００５７】
実施例９  3-O-オクタノイル-(+)-D-エピカテキンの酵素合成
エピカテキン5gをバッファー300mlに溶解しクロロゲン酸エステラーゼ50gさらにオクタン酸エチル300mlをスターラー撹拌しながら20時間反応を行った。反応液を分液し、油層を水洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、シリカゲルクロマトグラフィー（塩化メチレンでカプリル酸エチルを溶出後、塩化メチレン−メタノール（1%−30%のグラジエント）で溶出）で部分精製し、1.1g粗生成物を得た。この一部をDevelosil C30-UG-5分取カラム（野村化学（株）製、10ｘ250 ｍｍ、移動相：60%アセトニトリル／0.1%TFA、流速：1.3 ml／分、0.65 ml分画）を用いて分取し、高純度の表記化合物を得た。【００５８】
実施例１０  各種脂肪酸ドナーによるエステル体の酵素合成
オクタン酸(C8)、オクタン酸エチル(C8Et)、オクタン酸トリグリセリド(MCT)を脂肪酸供与体として実施例８と同様に酵素反応させ、反応液の油層部分について経時的にHPLC分析した結果、それぞれにエステル体ピークの増加が認められた。【００５９】
【表２】
2006080328.tif 000003
【００６０】
上記の結果から、本発明の酵素法において、遊離のオクタン酸のほかオクタン酸エチルおよびオクタン酸トリグリセリドは脂肪酸ドナーとなり、カテキンおよびエピカテキンの各脂肪酸エステル体が生成することを確認した。【００６１】
参考例１  3-O-デカノイル-(+)-カテキンの合成
実施例４と同様に、カテキン水和物（6.3g、21.8mmol）、およびカプロン酸クロリド25ｇ（131.1mmol）からクルードなペンタ-O-デカノイルカテキンを得た（23.5g）。このうちの6gを塩化メチレン20mlに溶解し、エタノールアミン（1.75ml、29.0mmol）を加え、室温下一夜攪拌した。反応液をAcOEt/ヘキサン＝1/4で希釈してそのままシリカゲルクロマトグラフィーで分画した（AcOEt/ヘキサン＝1/4〜2/1）。得られたモノエステル画分を濃縮し、1.25gの3-O-デカノイルカテキンを得た（アモルファス結晶）。
1H-NMR（DMSO-d6、ppm）：0.85 (3H, t), 1.1-1.5 (12H, m), 2.1-2.2 (2H, m), 2.6-2.7 (1H, m), 4.90 (1H, d), 5.10 (1H, q), 5.76(1H, d), 5.92 (1H, d), 6.56 (1H, dd), 6.6-6.8 (2H, m), 8.88 (1H, s), 8.93 (1H, s), 9.05 (1H, s), 9.32 (1H, s)。
【手続補正書】
【提出日】平成19年7月31日(2007.7.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
【０００２】
本発明は、抗菌活性を有し、飲食品や化粧品の分野で応用が期待できるカテキン類や茶抽出物の脂肪酸エステル類に関する。
【背景技術】
【０００３】
食品の安全・安心が強く求められている時代において、食品の安全性を確保することは大変重要である。健康志向の高まりとともに、一般食品において低塩化・低糖化が進む一方で、食品中の水分活性が上昇し、微生物が繁殖し易い環境がつくられている。食中毒発生原因の約８７％以上が細菌性であると報告されている（加藤洋次、２００１、月刊フードケミカル８月号１９５頁）。また、低温流通システムが発達したとは言え、食品の保存性、安全性を確保することが強く望まれている。また、飲料等は加熱殺菌処理をされているが、そのような場合には耐熱性芽胞菌が変敗等の原因になってくる。
【０００４】
従来、食品や化粧品の腐敗や変質を防止する目的でパラオキシ安息香酸、安息香酸、ソルビン酸などが化学合成品保存剤として使われている。それらは食品に添加する場合は食品添加物の保存料として定義されており、使用に際して厳しい規制がある。また、ペクチン分解物、白子タンパク質、リゾチーム、茶抽出物、ヒノキチールなどが食品添加物の日持ち向上剤として使用されている。これらの天然抗菌剤は抗菌活性が弱いために腐敗等を完全に防止するためには多量に添加する必要がある。また、有効成分を精油成分とするものが多く、独特の強い芳香と水に対する溶解性の低さから使用範囲や量が限られるという制限がある。
【０００５】
茶抽出物は安全でかつ適度な水に対する溶解性があるが、十分な抗菌効果を発揮させる濃度では、抗菌成分であるカテキン自体の苦味と渋味が生じるなどの食品の香味に影響を与えるという問題がある。この問題を解決するために、サイクロデキストリンを併用する方法（特開平３−１６８０４６）やタンパク質を使用する方法〔卵白や植物タンパク質等を使用した方法（特開平２−２０２９００）や脱脂卵黄を併用する組成物（特開２００１−３１６６９）〕が開示されている。同じく、苦味や渋みを低下したり、水溶性を向上させる目的で茶抽出物をシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼでカテキン類をα配糖体化したり（特開平８−２９８９３０）、シュークロースホスホリラーゼでカテキン類のα−配糖体を製造すること（特開平５−１７６７８６）が開示されている。これらの配糖体化されたものは食品の香味を損なうという面は改善されているものの、抗菌性を保持している、あるいは向上するということは全く記載がない。また、安全性が高く安価な天然物由来抗菌物質を提供することを目的として、緑茶飲料の加熱温度と加熱時間などを工夫することによってカテキン類由来抗菌物質が製造できると特開平１１−１１６４１８に記載されている。
【０００６】
一方、茶カテキン類やテアフラビン類がメチシリン耐性ブドウ球菌に対する抗生物質の抗菌力を増強させるという内容（特開平９−１３２５３２）も開示されている。
【０００７】
このように、カテキン類を主成分とする茶抽出物はその抗菌性と安全性から種々検討されているが、抗菌性を保持したままで、食品の香味や色調という品質を損なわないというところまでは至っていない。
【０００８】
従って、安全・安心という消費者の要望に応えるべく、さらに低濃度で抗菌活性を持つ抗菌素材が求められている。
【０００９】
また、カテキン類の脂肪酸エステル誘導体としてはエピガロカテキンの3位水酸基の脂肪酸エステルが知られている（S. Uesato et al, Bioorg. Med. Chem. Lett, 10 (2000) 1673-75、および US Pat. 2003/0105030 A1）。これらは抗腫瘍性を促進する活性を有すること、或いは5-αレダクターゼ阻害活性が記載されているが、抗菌活性については記載されていない。また、上記S. Uesato et alでは、カルボキシエステラーゼによって酵素合成を行っているが、その基質は脂肪酸ｐ−ニトロフェニルエステルという反応性が高い活性エステルでの酵素反応であり、通常の脂肪酸、アルキルエステルあるいはトリグリセリドではない。
【００１０】
さらに、カテキンの3位水酸基の脂肪酸エステルとしてはデカノイルおよびパルミトイルエステルが知られている（特開昭５４−８１２７４）。これらは肝臓壊死の予防や脂肪過酸化の防止に有効であることが記載されている。しかしながら、カテキン類の脂肪酸エステル誘導体に抗菌活性があることは何ら記載されていない。また、カテキンやエピカテキンのオクタン酸エステルについては実施例が示されていない。
【特許文献１】特開平３−１６８０４６
【特許文献２】特開平２−２０２９００
【特許文献３】特開２００１−３１６６９
【特許文献４】特開平８−２９８９３０
【特許文献５】特開平５−１７６７８６
【特許文献６】特開平１１−１１６４１８
【特許文献７】特開平９−１３２５３２
【特許文献８】特開昭５４−８１２７４
【非特許文献１】加藤洋次、２００１、月刊フードケミカル８月号１９５頁
【非特許文献２】S. Uesato et al, Bioorg. Med. Chem. Lett, 10 (2000) 1673-75
【非特許文献３】US P.0105030 A1（2003年)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、カテキン類の抗菌活性に着目し、その活性を高めるとともに、カテキン類が有する苦み・渋みが少なく、そのため、飲料や加工食品の日持ち向上ならびに化粧品の防菌のために使用できる、耐熱性芽胞菌に対する抗菌活性を有する物質として、カテキン類の中鎖脂肪酸エステル類を提供する。
【００１２】
本発明は、本発明のカテキン類の中鎖脂肪酸エステル類の製造方法も提供する。
【００１３】
本発明はさらに、カテキン類の中鎖脂肪酸エステル類を有効成分とする抗菌剤も提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、カテキン類を含む茶抽出物やカテキン類から、酵素法または化学的方法で変換することによって、耐熱性芽胞菌に対して抗菌活性が向上するかどうかを鋭意検討した結果、クロロゲン酸エステラーゼと中鎖脂肪酸、それらのエステルまたはそれらのトリグリセリドを用いてカテキン類を処理することによって、または化学的に中鎖脂肪酸とカテキン類をエステル化することによって、もとの茶抽出物やカテキン類より耐熱性芽胞菌に対して抗菌活性が向上することを見出し、本発明を完成させた。
【００１５】
従って、本発明は、カテキン類の水酸基の少なくとも１つと中鎖脂肪酸とがエステルを形成したカテキンエステル類である（本明細書において、カテキン類中鎖脂肪酸エステル類と略称することがある）。
【００１６】
本発明のカテキン類の中鎖脂肪酸エステル類は、飲食した場合、消化管でリパーゼによって容易に加水分解され、もとの茶抽出物やカテキン類に戻るため、極めて安全性の高い抗菌剤である。すなわち、本発明物質およびそれを含む組成物は医薬部外品のみならず、化粧品や飲食品の保存や日持ち向上などへの応用が期待できる。
【００１７】
本発明のカテキン類中鎖脂肪酸エステル類において、エステルを形成する中鎖脂肪酸の炭素数は、好ましくは８ないし１２、最も好ましくは８である。中鎖脂肪酸は、直鎖または分岐鎖、飽和または不飽和であってよいが、直鎖飽和脂肪酸が好ましく、例えば、カプリル酸、カプリン酸あるいはラウリル酸などの中鎖脂肪酸があげられる。最も好ましいのはカプリル酸である。
【００１８】
抗菌活性の高い点で好ましい中鎖脂肪酸エステル類の非限定的な例示として下記のものがあげられる：
少なくとも３位、５位または７位の水酸基のいずれか１つはエステルを形成しているカテキンエステル類。
【００１９】
２箇所の水酸基のみがエステルを形成しているカテキンエステル類（３'位と４'位の２箇所が同時にエステル形成している場合は、若干抗菌活性が弱いが、これらも本発明に含まれる）。
【００２０】
より具体的には、下記のものがあげられる。
【００２１】
脂肪酸がカテキン類、好ましくはカテキンまたはエピカテキンの３位の水酸基とエステル形成したモノエステル、
脂肪酸がカテキン類、好ましくはカテキンまたはエピカテキンの５位および３'位もしくは４'位とエステル形成したジエステル、
脂肪酸がカテキン類、好ましくはカテキンまたはエピカテキンの３位および３'位もしくは４'位とエステル形成したジエステル、および
脂肪酸がカテキン類、好ましくはカテキンまたはエピカテキンの７位および３'位もしくは４'位とエステル形成したジエステル。
【００２２】
[発明の実施の形態]
カテキン類
本明細書において、原料として用いられるカテキン類は、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキンが好ましく、さらに、カテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピカテキンガレートおよびエピガロカテキンガレートも使用できる。これらは水酸基を有しており、中鎖脂肪酸とエステルを形成することが可能である。カテキン類の水酸基の一部または全部はその反応性に影響しないエステル化等の修飾を受けていてもよい。
【００２３】
カテキン類は、茶抽出物に含まれるので、茶抽出物をそのまま本発明の原料として用いると都合がよい。茶抽出物としては特に限定するものではなく、例えば煎茶、ほうじ茶、玉露、かぶせ茶、蒸し製茶と称する緑茶類の不発酵茶、嬉野茶、青柳茶、釜入り茶と総称する各種中国茶などの不発酵茶、包種茶、ウーロン茶などの半発酵茶、紅茶、阿波番茶、碁石茶、プアール茶などの発酵茶およびマテ茶などの抽出物が挙げられる。また、茶抽出物として市販されている太陽化学（株）製のサンフェノン、三井農林（株）製のポリフェノン、サントリー（株）製のサンウーロンを使用してもよい。
【００２４】
酵素反応による製造
カテキン類から、カテキン類中鎖脂肪酸エステル類を製造するためには、酵素反応が利用できる。
【００２５】
カテキン類は、水性の液として反応に使用できる。カテキン類を豊富に含む茶抽出液をそのまま使用してもよい。反応のpHは３〜７である。反応系に水を用いずに、カテキン類を粉末として、反応系に添加する方法も可能である。
【００２６】
反応に使用できる酵素は、エステラーゼ、例えばクロロゲン酸エステラーゼおよびフェルラ酸エステラーゼが含まれる。これらのエステラーゼは、Asp. japonicusやLactobacillus acidophilus由来の酵素として知られており、食品加工用酵素として市販されている。例えば、クロロゲン酸エステラーゼ（キッコーマン社製）やフェルラ酸エステラーゼ（日本バイオコン社製）を使用するのが好都合である。
【００２７】
これらのエステラーゼを使用して、カテキン類の水酸基に中性脂肪酸をエステル化することができる。中鎖脂肪酸は、遊離の酸として用いることもでき、あるいは中鎖脂肪酸の炭素数１〜３のアルキルエステル、あるいは中鎖脂肪酸のトリグリセリドの形で用いてもよい。中鎖脂肪酸は、溶媒としてヘキサン、ベンゼン、トルエンなどの反応に不活性な非極性溶媒と混合して、水の存在下、あるいは水が存在しない状態で反応させることができる。水の無い条件のとき、カテキン類は上記のように、粉末として反応系に添加する。
【００２８】
反応は、カテキン類の水溶液および中鎖脂肪酸、それらのエステル、およびトリグリセリド類の有機溶媒液、あるいは、それらの溶媒無しのものに、酵素を粉末状でまたは水に溶解して添加して、静置、攪拌、振とうまたは混合することにより行うことができる。反応温度は１０〜６０℃、好ましくは３０〜５０℃程度で反応するのがよい。反応時間は４〜４８時間で十分であるが、反応液中の油層を経時的に分析しながらエステル体の生成量が最も高い時点で反応を終了することもできる。カテキン類の量、中鎖脂肪酸の量、および酵素の量は、目安として、１：２〜１０：０．５〜１０（W/W)を使用する。
【００２９】
酵素は粉末酵素に代えて，担体に固定化した固定化酵素として用いることもできる。酵素の固定化方法は公知の方法によって行われ、固定化担体としてシリカゲル、セライト、к−カラギナン、キチン、アルギン酸ナトリウムなど公知の担体｛バイオリアクター福井三郎監修・編 講談社サイエンティフィック（１９８５年）、実践バイオリアクター，食品産業バイオリアクターシステム技術研究組合編食品化学新聞社（１９９０年）｝を用いることができる。さらに、水処理に使っているようなイオン交換樹脂に酵素を固定化して用いることもできる。その他に吸着クロマトグラフィーや疎水吸着クロマトグラフィーに用いる樹脂に酵素を固定化して用いることもでき、一般にタンパク質を吸着することができる樹脂担体に固定化して用いることもできる。
【００３０】
カテキンやエピカテキンを原料として酵素反応させた場合は、３位の水酸基が中鎖脂肪酸とエステル化した生成物が得られる。エステル化生成物は、溶媒を除去して、そのまま使用してもよく、シリカゲルクロマトグラフィーおよび／または高速液体クロマトグラフィーによって精製してもよい。精製したエステル化生成物は、固形（粉末）状物である。
【００３１】
化学合成による製造
カテキン類、例えばカテキンあるいはエピカテキンを、中鎖脂肪酸と脱水縮合剤例えばカルボジイミドの誘導体の存在下、あるいは中鎖脂肪酸クロリドとトリエチルアミンやピリジンなどの塩基の存在下、非プロトン性溶媒中であるいは無溶媒で、０〜６０℃、２〜２４時間反応させることによって、カテキン類の水酸基の１個エステル化されたものから全てに脂肪酸がエステル化されたものの混合物が得られる。これらの混合物は、必要であれば、例えば、シリカゲルクロマトグラフィーによって、またはさらに高速液体クロマトグラフィーなどの常法によって精製し、目的の位置がエステル化されたものに分離することができる。
【００３２】
すべてエステル化されたカテキン類は、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウムなどアルカリ金属類あるいは有機塩基と水、アルコールなどのプロトン性溶媒中で、０〜５０℃、２〜４８時間処理することによって、カテキン類の水酸基の一部がエステル化されたものに変換することもできる。この場合、主として３位の水酸基がエステル化された生成物が得られる。
【００３３】
抗菌活性
本発明のカテキン類の中鎖脂肪酸エステル類のうち、中鎖脂肪酸が１個あるいは２個エステル化したものは、芽胞菌例えばバチルス属の菌あるいは耐熱性好酸菌であるアシドフィラス菌に対して、もとの原料であるカテキンやエピカテキンに比べて強い増殖抑制作用を示す。上記以外にも、その他の一般細菌にも増殖抑制が期待できる。
【００３４】
抗菌活性の測定法は公知の適当な方法で行うことができ、例えば実施例６の方法で行うことができる。
【発明の効果】
【００３５】
本発明のカテキン類の中鎖脂肪酸エステル類は、単品であるいは組成物として、食品分野では、緑茶、ノンアルコール飲料、アルコール飲料などの清涼飲料に、また調味料、菓子類、シロップ類、果実加工品、野菜加工品、肉製品、缶・ビン詰類、などの一般食品にそれらの保存や日持ち向上に使用できる。また、化粧品分野では、化粧クリーム、軟膏、化粧液などの腐敗や変質の防止に使用できる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例に基づいて、本発明をさらに具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００３７】
実施例１  カテキンエステル体の化学合成
カテキン水和物（3.05g、10.5mmol）をテトラヒドロフラン（THF）20mlに溶解し、ピリジン2.5ml（31.1mmol）を加える。混合液を氷冷し、カプリル酸クロリド3.6ml（21.1mmol）を添加した。添加後、室温に戻し、一夜撹拌する。反応液に酢酸エチル（AcOEt）を加え、飽和硫酸水素カリウム水溶液、水、飽和重ソー水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ソーダで乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで分画した（AcOEt/ヘキサン＝1/2〜2/1）。ジエステル画分の内、TLC（AcOEt／ヘキサン=1:1）で高純度のフラクションとして、1.25gの3'4'-O-ジオクタノイルカテキンを得た。また、モノエステル画分として、高純度の3'(および4')-O-オクタノイルカテキンが0.78g得られた。3'あるいは4'に結合したオクタノイル基は相互に転移し、ほぼ1:1の混合物となった。
【００３８】
3'4'-O-ジオクタノイル-(+)-D-カテキン：白色結晶、1H-NMR（DMSO-d6、ppm）：0.87(6H, m), 1.2-14 (16H, m), 1.60 (4H, m), 2.39 (1H, dd), 2.55 (4H, t), 2.75 (1H, dd), 3.86 (1H, m), 4.65 (1H, d), 5.11 (1H, d), 5.72 (1H, d), 6.00 (1H, d), 7.2-7.4 (3H, m), 8.99 (1H, s), 9.24 (1H, s)。
【００３９】
3'-O-オクタノイルおよび4'-O-オクタノイル-(+)-D-カテキン：アモルファス、1H-NMR（DMSO-d6、ppm）：0.87 (3H, t), 1.2-1.4 (8H, m), 2.16 (2H, m), 1.63 (2H, m), 2.37 (1H, m), 2.54 (2H, t), 2.69 (1H, m), 3.83 (1H, m), 4.55 (1H, dd), 5.00 (1H, dd), 5.70 (1H, d), 5.90 (1H, s), 6.7-7.1 (3H, m), 9.05 (1H, s), 9.20 (1H, s), 9.59 (1H, s)。
【００４０】
実施例２  カテキンエステル体の化学合成
カテキン水和物（3.04g、10.5mmol）をテトラヒドロフラン（THF）20mlに溶解し、ピリジン3.8ml（47.2mmol）を加える。混合液を氷冷し、カプリル酸クロリド5.4ml（31.6mmol）を添加した。添加後、室温に戻し、一夜撹拌する。反応液に酢酸エチル（AcOEt）を加え、飽和硫酸水素カリウム水溶液、水、飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ソーダで乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで分画した（AcOEt/ヘキサン＝1/2〜2/1）。ジエステル画分の内、TLC（AcOEt／ヘキサン=1:1）で高純度のフラクションとして、0.17gの3'(あるいは4'),5-ジ-O-オクタノイルカテキンおよび0.10gの3'(あるいは4'),3-ジ-O-オクタノイルカテキンを得た。また、他のフラクションとして、2成分の画分が得られ（0.54g）、一部をHPLC（カラム：Develosil C30-UG5、10×250mm、溶出液：80%アセトニトリル水溶液）で精製し、3'(あるいは4'),7-ジ-O-オクタノイル、および、3'4'-O-ジオクタノイルカテキンを得た。
【００４１】
3'(あるいは4'),5-ジ-O-オクタノイル-(+)-D-カテキン：1H-NMR（DMSO-d6、ppm）：085 (6H, m), 1.2-1.4 (16H, m), 1.63 (4H, m), 2.18(1H, m), 2.36 (1H, m), 2.54 (4H, m), 3.86 (1H, m), 4.63 (1H, dd), 5.13 (1H, dd), 6.0-6.2 (2H, m), 6.7-7.1 (3H, m), 9.5-9.7 (2H, m)。
【００４２】
3'(あるいは4'),3-ジ-O-オクタノイル-(+)-D-カテキン：1H-NMR（DMSO-d6、ppm）：0.86 (6H, m), 1.1-1.4 (18H, m), 1.62 (2H, m), 2.15 (2H, m), 2.70 (1H, m), 4.9-5.2 (2H, m), 5.78 (1H, d), 5.94 (1H, s), 6.7-7.0 (3H, m), 9.08 (1H, d), 9.36 (1H, s), 9.69 (1H, s)。
【００４３】
3'(あるいは4'),7-ジ-O-オクタノイル-(+)-D-カテキン：1H-NMR（DMSO-d6、ppm）： 0.86 (6H, m), 1.2-1.4 (16H, m), 1.60 (4H, m), 2.38 (1H, m), 2.55 (4H, t), 2.75 (1H, m), 3.90 (1H, m), 4.6-4.8 (1H, m), 5.0-5.2 (1H, m), 5.7-6.2 (2H, m), 6.7-7.4 (3H, m), 8.9-9.8 (2H, m)。
【００４４】
実施例３  カテキンエステル体の化学合成
カテキン水和物（3g、10.3mmol）をテトラヒドロフラン（THF）15mlに溶解し、ピリジン6.3ml（77.9mmol）を加える。混合液を氷冷し、カプリル酸クロリド9.7ml（56.8mmol）を添加した。添加後、室温に戻し、一夜撹拌する。反応液に酢酸エチル（AcOEt）を加え、飽和硫酸水素カリウム水溶液、水、飽和重ソー水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ソーダで乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで分画した（AcOEt/ヘキサン＝1/20〜1/4）。減圧濃縮後、7.0gのペンタ-O-オクタノイルカテキンおよび1.3gの5,7,3',4'-テトラ-O-オクタノイルカテキンが得られた。ペンタ-O-オクタノイルカテキン（7.0ｇ、7.6mmol）を塩化メチレン20mlに溶解し、エタノールアミン（1.74ml、28.8mmol）を加え、室温下一夜攪拌した。反応液をAcOEt/ヘキサン＝1/4で希釈してそのままシリカゲルクロマトグラフィーで分画した（AcOEt/ヘキサン＝1/4〜2/1）。ジエステル画分を再クロマトグラフィー（塩化メチレン／アセトン=10/1〜4/1）で精製し、高純度の3,7-ジ-O-オクタノイルカテキン（75mg）を得た。また、モノエステル画分を濃縮し、1.46gの3-O-オクタノイルカテキンを得た。
【００４５】
3,7-ジ-O-オクタノイル-(+)-D-カテキン：1H-NMR（DMSO-d6、ppm）：0.85 (6H, m), 1.1-1.4 (18H, m), 1.59 (2H, m), 2.15 (2H, t), 2.4-2.6 (4H, m), 5.00 (1H, d), 5.13 (1H, q), 6.13 (1H, d), 6.21 (1H, d), 6.56 (2H, dd), 6.6-6.7 (2H, m), 8.95 (2H, s), 9.60 (1H, s)。
【００４６】
3-O-オクタノイル-(+)-D-カテキン：アモルファス結晶。1H-NMR（DMSO-d6、ppm）：0.85 (3H, t), 1.1-1.5 (10H, m), 2.16 (2H, m), 2.64 (1H, dd), 4.90 (1H, d), 5.10 (1H, q), 5.77 (1H, d), 5.93 (1H, d), 6.57 (1H, dd), 6.7-6.8 (2H, m), 8.91 (2H, bs), 9.05 (1H, s), 9.32 (1H, s)。
【００４７】
実施例４  カテキンエステル体の化学合成
ペンタ-O-オクタノイルカテキン（6.6ｇ、7.2mmol）を塩化メチレン20mlに溶解し、エタノールアミン（1.21ml、20.0mmol）を加え、室温下一夜攪拌した。反応液をAcOEt/ヘキサン＝1/4で希釈してそのままシリカゲルクロマトグラフィーで分画した（AcOEt/ヘキサン＝1/4〜2/1）。ジエステル画分の内、TLC上、高純度のフラクションとして、3,5-ジ-O-オクタノイルカテキン（180mg）を得た。
【００４８】
3,5-ジ-O-オクタノイル-(+)-D-カテキン：0.85 (6H, m), 1.0-1.4 (16H, m), 1.48 (2H, t), 1.61 (2H, t), 2.19 (2H, t), 2.5-2.7 (4H, m), 4.9-5.3 (2H, m), 6.11 (1H, d), 6.15 (1H, d), 6.57 (1H, dd), 6.6-6.8 (2H, m), 9.06 (2H, b), 9.86 (1H, b)。
【００４９】
実施例５  カテキンエステル体の化学合成
テトラ-O-オクタノイルカテキン（3.5ｇ、4.4mmol）を塩化メチレン10mlに溶解し、エタノールアミン（0.47ml、7.8mmol）を加え、室温下一夜攪拌した。反応液をAcOEt/ヘキサン＝1/4で希釈してそのままシリカゲルクロマトグラフィーで分画した（AcOEt/ヘキサン＝1/4〜2/1）。ジエステル画分でTLC上、高純度である5,7-ジ-O-オクタノイルカテキン（0.3g）を得た。
【００５０】
5,7-ジ-O-オクタノイルカテキン-(+)-D-カテキン：1H-NMR（DMSO-d6、ppm）：0.87 (6H, m), 1.2-1.4 (16H, m), 1.6-1.7 (4H, m), 2.4-2.7 (4H, m), 3.93 (1H, q), 4.71 (1H, d), 6.51 (2H, dd), 6.59 (1H, dd), 6.6-6.8 (2H, m), 8.90 (2H, bs).
実施例６  抗菌活性の測定：
実施例１〜５、および後記参考例１で製造した本発明物質およびカテキンをジメチルスルホキシドにて種々の濃度に溶解させ、平底の96ウェルマルチプルウェルプレート（コーニング＆コスター社製）に2μL入れたのち、あらかじめ芽胞形成培地｛ポリペプトン  10.0ｇ、酵母エキス  5.0ｇ、炭酸カルシウム  15.0ｇ、寒天  15.0ｇ、無機塩の水溶液  5.0ｍL、蒸留水  1000ｍL；但し、無機塩の水溶液の組成は、硫酸マグネシウム・7水和物4.0ｇ、硫酸マンガン・5水和物0.216ｇ、硫酸第二鉄・7水和物0.2ｇ、塩化ナトリウム0.2ｇ、蒸留水100ｍLである｝にて調製した枯草菌 Bacillus subtilisの芽胞  １×107 個/ｍLの生理食塩水懸濁液50μLを加えた。これに、ブイヨン液体培地（pH 7.0、日水製薬株式会社製）50μLを添加し、37℃ にて一終夜培養した。培養開始時と培養後の690 ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（サーモラボシステムズ社製、フィンランド）によって計測した。下式から算出した増殖阻害度をもとに、阻害度と試料濃度を両軸とする散布図を作成し、本発明物の芽胞菌に対する50％  阻害濃度（IC50）を求めた。
【００５１】
増殖阻害度（％）＝100 ×｛Δ690（無添加）- Δ690（試料添加）｝/Δ690（無添加）ここで、Δ690（無添加）とは培養開始前後の無添加群の690ｎｍの値の差、Δ690（試料）とは培養開始前後の試料添加群の690ｎｍの値の差を示す。結果を表１に示す。
【００５２】
高温性好酸性芽胞性細菌：Alicyclobacillus acidoterrestrisに対しても、 培養温度条件と液体培地の種類の2点を変更して同様に行い、活性を求めた[ 培養温度：45℃；液体培地：乾燥酵母エキス（Difco Laboratories製）0.4％、可溶性でんぷん（ナカライテスク（株）製）0.4％、グルコース（ナカライテスク（株）製）1％、1 N硫酸でpH 3.8に調整]。
【００５３】
結果を表１に示す。
【００５４】
【表１】
2006080328.tif 000004
【００５５】
実施例７  3-O-オクタノイル-(+)-D-カテキン（酵素合成）
3-O-カプリロイルカテキンの化学合成品のHPLCシステム（日立D-7000型、Diode-Array検出器L-7451型）、カラム：Develosil C30-UG-5（野村化学（株）製、4.6ｘ150 ｍｍ、移動相：5%-90%アセトニトリル／0.1%TFA、0-15分グラジエント溶出、流速：1.0 ml／分、検出波長：230 nmまたは280 nm）における保持時間14.2分を指標に、市販のリパーゼ、エステラーゼ酵素剤について検索した。なお、酵素反応系はカテキン5mgを20mM酢酸緩衝液（pH 5.0）0.3mlに溶解した後、酵素剤を添加しさらにオクタン酸0.3mlを添加して37℃で振とう反応した。反応液の油層部分についてHPLC分析した結果、クロロゲン酸エステラーゼ（キッコーマン社製）がカテキンへのエステル転移活性を有する事を見い出した。オクタン酸ピーク(12.9分)の直後14.2分の位置にピークが認められ、化学合成品とのコクロマト分析より3-O-カプリロイルカテキンと保持時間が一致した。
【００５６】
実施例８  3-O-オクタノイル-(+)-D-カテキン（酵素合成）
カテキン5gをバッファー300mlに溶解しクロロゲン酸エステラーゼ50gさらにオクタン酸300mlをスターラー撹拌しながら20時間反応を行った。反応液を分液し、油層を水洗浄後、減圧蒸留（120℃、2mmHg）し、オクタン酸を除いた後、蒸留残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（塩化メチレン、塩化メチレン−メタノール（1%−30%のグラジエント）で溶出）で部分精製し、1.3gの粗生成物を得た。この一部をDevelosil ODS-HG-5分取カラム（野村化学（株）製、10ｘ250 ｍｍ、移動相：70%アセトニトリル／0.1%TFA、流速：1.3 ml／分、1.3 ml分画）を用いて分取し、高純度の表記化合物を得た。NMRおよびマススペクトルは相当する合成品と一致した。
【００５７】
実施例９  3-O-オクタノイル-(+)-D-エピカテキンの酵素合成
エピカテキン5gをバッファー300mlに溶解しクロロゲン酸エステラーゼ50gさらにオクタン酸エチル300mlをスターラー撹拌しながら20時間反応を行った。反応液を分液し、油層を水洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、シリカゲルクロマトグラフィー（塩化メチレンでカプリル酸エチルを溶出後、塩化メチレン−メタノール（1%−30%のグラジエント）で溶出）で部分精製し、1.1g粗生成物を得た。この一部をDevelosil C30-UG-5分取カラム（野村化学（株）製、10ｘ250 ｍｍ、移動相：60%アセトニトリル／0.1%TFA、流速：1.3 ml／分、0.65 ml分画）を用いて分取し、高純度の表記化合物を得た。
【００５８】
実施例１０  各種脂肪酸ドナーによるエステル体の酵素合成
オクタン酸(C8)、オクタン酸エチル(C8Et)、オクタン酸トリグリセリド(MCT)を脂肪酸供与体として実施例８と同様に酵素反応させ、反応液の油層部分について経時的にHPLC分析した結果、それぞれにエステル体ピークの増加が認められた。
【００５９】
【表２】
2006080328.tif 000005
【００６０】
上記の結果から、本発明の酵素法において、遊離のオクタン酸のほかオクタン酸エチルおよびオクタン酸トリグリセリドは脂肪酸ドナーとなり、カテキンおよびエピカテキンの各脂肪酸エステル体が生成することを確認した。
【００６１】
参考例１  3-O-デカノイル-(+)-カテキンの合成
実施例４と同様に、カテキン水和物（6.3g、21.8mmol）、およびカプロン酸クロリド25ｇ（131.1mmol）からクルードなペンタ-O-デカノイルカテキンを得た（23.5g）。このうちの6gを塩化メチレン20mlに溶解し、エタノールアミン（1.75ml、29.0mmol）を加え、室温下一夜攪拌した。反応液をAcOEt/ヘキサン＝1/4で希釈してそのままシリカゲルクロマトグラフィーで分画した（AcOEt/ヘキサン＝1/4〜2/1）。得られたモノエステル画分を濃縮し、1.25gの3-O-デカノイルカテキンを得た（アモルファス結晶）。
1H-NMR（DMSO-d6、ppm）：0.85 (3H, t), 1.1-1.5 (12H, m), 2.1-2.2 (2H, m), 2.6-2.7 (1H, m), 4.90 (1H, d), 5.10 (1H, q), 5.76(1H, d), 5.92 (1H, d), 6.56 (1H, dd), 6.6-6.8 (2H, m), 8.88 (1H, s), 8.93 (1H, s), 9.05 (1H, s), 9.32 (1H, s)。
【国際調査報告】
2006080328.tif 000006
2006080328.tif 000007
2006080328.tif 000008
2006080328.tif 000009