(57)【要約】本発明は、癌患者において、骨転移発症前から骨転移発症後にかけて血清中で経時的に発現が増加するペプチドであって、弱陽イオン交換体にｐＨ６の条件下で吸着する、質量分析による見かけの分子量が約５，８００であるペプチド、成熟アズロシジンの１０〜６２位のアミノ酸配列からなるペプチド断片、並びに癌患者由来の生体試料における上記いずれかのペプチドの発現を検出することを特徴とする、該患者における骨転移の診断方法を提供する。本発明の方法によれば、骨転移の早期発見・早期治療が可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の性質を有するペプチド。
（ａ）癌患者において、骨転移発症前から骨転移発症後にかけて血清中で経時的に発現が増加する
（ｂ）弱陽イオン交換体にｐＨ６の条件下で吸着する
（ｃ）質量分析による見かけの分子量：約５，８００
【請求項２】
配列番号２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１０〜６２で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項３】
請求項１または２記載のペプチドに対する抗体。
【請求項４】
癌患者における骨転移の診断方法であって、該患者由来の生体試料における請求項１または２記載のペプチドの発現を検出することを特徴とする方法。
【請求項５】
生体試料が血漿または血清である請求項４記載の方法。
【請求項６】
生体試料を陽イオン交換体と接触させ、該陽イオン交換体に吸着した該試料中の成分を質量分析にかけて、分子量約５，８００のペプチドを検出することを特徴とする、請求項４または５記載の方法。
【請求項７】
請求項３記載の抗体を用いて請求項１または２記載のペプチドを検出することを特徴とする、請求項４または５記載の方法。
【請求項８】
癌患者から時系列で生体試料を採取し、該試料における請求項１または２記載のペプチドの発現の経時変化を調べることを特徴とする、請求項４〜７のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、骨転移におけるマーカーとして用い得るペプチド、並びに被検試料中の該ペプチド量を測定することを特徴とする骨転移の診断方法等に関する。
【背景技術】  昭和５６年から現在まで、わが国における死因の１位は癌である。平成１４年には死亡数３０４，２８６人、人口１０万対死亡率２４１．５、総死亡の３１．０％となっている。西暦２０１５年には１年間に８９万人が癌にかかると推測されている（財団法人がん研究振興財団「がんの統計’０３」）。骨は、肺、肝臓に次いで癌転移好発部位であり、現在、癌で死亡する患者の２５−５０％に骨転移が見られ、人生の最期を骨転移で苦しむ人は７−１５万人に達すると考えられる。
骨への癌転移は、骨折や神経の麻痺を引き起こす進行癌の重大な問題である。骨転移による症状を抱えながら、進行癌として対処されず寝たきりの患者も多く見られる。これらの患者のＱＯＬを高く維持し、充実した人生を送らせることは、医学の義務であるといえる。
癌の診断においては、血中や尿中の腫瘍マーカーが臨床の場で利用されている。骨転移マーカーとしては、これまでに血中ＩＣＴＰ、血中もしくは尿中ＮＴｘ、血中ＰＩＣＰ（非特許文献１）等が報告されている。また、特許文献１には、骨芽細胞の活性を反映するマーカーとしてＰＩＣＰ、ＰＩＮＰもしくはＢＡＬＰおよびオステオカルシンを、破骨細胞の活性を反映するマーカーとしてデオキシピリジノリンおよび／またはＩＣＴＰを用いた悪性腫瘍の骨転移診断方法が記載されている。
しかしながら、国内外において、ヒト骨転移の特異的なマーカーとして臨床での利用にたえ得るものは未だに発見されておらず、骨転移の診断は、骨シンチレーション、ポジトロンＣＴ（ＰＥＴ）、ＭＲＩ、ＣＴなどの画像診断や生検により行われているのが現状である。そのために、早期発見・早期治療が不可能となり、患者のＱＯＬを著しく損なう結果を招いている。
【特許文献１】ＷＯ  ００／１１４８０
【非特許文献１】Ｍｉｕｒａ  Ｈ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｉ．，Ｔａｋａｄａ  Ｍ．，Ｋｉｇａｍｉ  Ｙ．，Ｏｈｔａ  Ｔ．，Ｙｕｕ  Ｉ．，Ｈａｍａｎａｋａ  Ｙ．，Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  Ｒ．ａｎｄ  Ｍｏｒｉｔａ  Ｒ．“Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｖａｌｉｄｉｔｙ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｂｏｎｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ”Ｅｎｄｏｃｒ．Ｊ．，４４（５）：７５１−７（１９９７）
【発明の開示】
従って、本発明の目的は、癌の骨転移の早期発見を可能にするヒト骨転移の特異的マーカーを提供することであり、癌患者の生体試料中の該マーカー量を測定することによる骨転移の早期診断方法を提供することである。
本発明者らは、上記の目的を達成すべく、腫瘍マーカーをはじめとする疾患マーカーの探索に威力を発揮しているプロテインチップを用いた質量分析により、癌患者の骨転移発症前後における血清サンプル中のプロテオームを経時的に解析した結果、骨転移発症前から発症後・治療開始までの血清中で経時的に増加し、治療により減少する分子量約５，８００のペプチドを見出した。さらに、本発明者らは、質量分析を用いた種々のプロテオーム解析法によって該ペプチドの解析を進めた結果、該ペプチドが、単球走化性因子として知られる、好中球由来のヘパリン結合蛋白質アズロシジン（Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＡＰ）３７とも呼ばれる）の断片であることを見出して、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
［１］下記の性質を有するペプチド、
（ａ）癌患者において、骨転移発症前から骨転移発症後にかけて血清中で経時的に発現が増加する
（ｂ）弱陽イオン交換体にｐＨ６の条件下で吸着する
（ｃ）質量分析による見かけの分子量：約５，８００
［２］配列番号２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１０〜６２で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチド、
［３］上記［１］または［２］記載のペプチドに対する抗体、
［４］癌患者における骨転移の診断方法であって、該患者由来の生体試料における上記［１］または［２］記載のペプチドの発現を検出することを特徴とする方法、
［５］生体試料が血漿または血清である上記［４］記載の方法、
［６］生体試料を陽イオン交換体と接触させ、該陽イオン交換体に吸着した該試料中の成分を質量分析にかけて、分子量約５，８００のペプチドを検出することを特徴とする、上記［４］または［５］記載の方法、
［７］上記［３］記載の抗体を用いて上記［１］または［２］記載のペプチドを検出することを特徴とする、上記［４］または［５］記載の方法、および
［８］癌患者から時系列で生体試料を採取し、該試料における上記［１］または［２］記載のペプチドの発現の経時変化を調べることを特徴とする、上記［４］〜［７］のいずれかに記載の方法を提供する。
本発明の骨転移ペプチドマーカーは、骨転移の症状が顕在化するより相当期間早い時期から血清中レベルが増加し始めるので、現在の画像診断より早く、骨転移の早期発見と早期予防が可能となる。また、該ペプチドマーカーは、ターゲットが狭いために診断の曖昧さがないという長所がある。さらに、少ない用量の患者血清から解析が出来るので、患者負担が少ない。
【図面の簡単な説明】  図１は、同一肝臓癌患者から時系列で採取した血清サンプルを陽イオン交換プロテインチップに接触させ、該チップ上の陽イオン交換体に捕捉された成分の質量分析スペクトルを示す。横軸は分子量を示す。チャート左側の数字は血清サンプル採取時の患者の受診後の月数を、（−）は骨転移発症前であることを、（＋）は骨転移発症後であることを、（‡）は骨転移後／治療開始後であることをそれぞれ示す。
図２は、図１において分子量５，８１３に出現するピークの平均ピーク強度の経時変化を示す。横軸の数字は血清サンプル採取時の患者の受診後の月数を、（−）は骨転移発症前であることを、（＋）は骨転移発症後であることを、（‡）は骨転移後／治療開始後であることをそれぞれ示す。
図３は、陽イオン交換チップ分析で分子量５，８１３の骨転移マーカーが検出された血清（＋）および検出されなかった血清（−）の陽イオン交換カラム（ｐＨ６．０）溶出画分（１Ｍ  ＮａＣｌ）を、Ｏｎ  Ｃｈｉｐ還元およびＯｎ  Ｃｈｉｐトリプシン消化後、ＳＥＬＤＩを用いて質量分析した結果を示す。（ａ）はチャート全体、（ｂ）はＭ／Ｚ２，０００〜３，２５０の拡大図、（ｃ）はＭ／Ｚ１，０００〜２，０００の拡大図をそれぞれ示す。各チャートにおいて、上段は（＋）血清、下段は（−）血清を示す。囲み数字は（＋）血清特異的ピークの質量（Ｍ／Ｚ）を示す。
図４は、陽イオン交換チップ分析で分子量５，８１３の骨転移マーカーが検出された血清（＋）および検出されなかった血清（−）の陽イオン交換カラム（ｐＨ６．０）溶出画分（１Ｍ  ＮａＣｌ）を、Ｏｎ  Ｃｈｉｐ還元およびＯｎ  Ｃｈｉｐトリプシン消化後、ＰＣＩ−Ｑｓｔａｒを用いて質量分析した結果を示す。（ａ）はＭ／Ｚ３，０００〜４，０００、（ｂ）はＭ／Ｚ２，６００〜３，０００、（ｃ）はＭ／Ｚ１，１００〜１，９００のチャートをそれぞれ示す。各チャートにおいて、上段は（＋）血清、下段は（−）血清を示す。囲み数字は（＋）血清特異的ピークの質量（Ｍ／Ｚ）を示す。
図５は、陽イオン交換チップ分析で分子量５，８１３の骨転移マーカーが検出された血清の、ヘパリンカラム添加前（上段）、カラム非吸着（素通り）画分（中段）およびコントロールカラム（ＩＤＭ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｅａｄｓ：Ｃ５４０−００１９）素通り画分の質量分析の結果（ａおよびｂ）およびヘパリンカラム２Ｍ  ＮａＣｌ溶出画分の質量分析の結果（ｃおよびｄ）を示す。（ａ）および（ｃ）はチャート全体、（ｂ）および（ｄ）はＭ／Ｚ５，２５０〜６，７５０の拡大図である。矢印は目的ピークを示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明は、ヒトの骨転移マーカーとして有用なペプチドを提供する。該ペプチド（以下、「本発明のペプチド」と称する場合がある）は、下記の性質：
（ａ）癌患者において、骨転移発症前から骨転移発症後にかけて血清中で経時的に発現が増加する、
（ｂ）弱陽イオン交換体にｐＨ６の条件下で吸着する、および
（ｃ）質量分析による見かけの分子量：約５，８００
によって特定される。
ここで「骨転移発症」とは、骨転移の症状（例えば、骨や手足の痛み、痺れ、麻痺、骨折等）を発現することをいい、「骨転移発症前」は骨転移が起こっているが無症候な状態と、実際に骨転移が起こる前の両方を含む。また、「骨転移発症後」は骨転移の症状が発現し始めた後であって、骨転移に対する治療により症状に改善が認められる前をいう。該ペプチドの血清レベルが上昇し始める時期は個人間で異なるが、例えば発症約４〜約１２ヶ月前である。
本発明のペプチドは、弱陽イオン交換体、特にサイファージェン・バイオシステムズ社製の陽イオン交換プロテインチップであるＣＭ１０またはＷＣＸ２  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ  Ａｒｒａｙ（型番：Ｃ５５３−００７５またはＣ５５３−００２６）上に固定化された陽イオン交換体に、少なくともｐＨ６の条件下で吸着することを特徴とする。より詳細には、本発明のペプチドは、ｐＨ８．５以下であれば、質量分析により検出可能な程度に弱陽イオン交換体に吸着するが、ｐＨ６．５以下でより効率よく吸着する。但し、ノイズピーク吸着が少ないという点で、質量分析による検出においては、ｐＨ６の条件が特に好ましい。また、該ペプチドの質量分析による見かけの分子量は約５，８００であり、特に、上記チップを用いたＭＡＬＤＩ法（マトリックス：シナピン酸（ＳＰＡ））による質量分析により、分子量５，８１３±０．５％（好ましくは±０．３％、より好ましくは±０．１％）の位置にピークを生じることを特徴とする。
あるいは、本発明のペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１０〜６２で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列からなることによって特定される。配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、単球走化性因子として知られる、好中球由来のヘパリン結合蛋白質であるヒトアズロシジンの前駆体（プレプロ蛋白質）であり、アミノ酸番号−２６〜−１で示される２６アミノ酸からなる配列が推定シグナルペプチドであり、さらにＣ末の３アミノ酸残基が切断されて成熟蛋白質になると考えられている。しかしながら、アミノ酸番号１０〜６２で示されるアミノ酸配列（プレプロ蛋白質の３６〜８８位のアミノ酸配列に相当するので、以下、「ＡＺＵ（３６−８８）」と称する場合もある）からなるアズロシジン分解産物の存在はこれまで全く知られておらず、新規なペプチドである。
ＡＺＵ（３６−８８）と「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、アミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を伴うアズロシジンタンパク質の変異体もしくは多型であって、該置換、欠失もしくは挿入が配列番号２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１０〜６２で示されるアミノ酸配列内に存在する該変異体もしくは多型における、ＡＺＵ（３６−８８）と対応する部分のアミノ酸配列を意味する。
本発明はまた、本発明のペプチドを骨転移マーカーとして、癌患者由来の生体試料におけるその発現を検出することによる、該患者における骨転移の診断方法を提供する。ここで「骨転移の診断」とは、既に骨転移が起こっているか否かの判定だけでなく、まだ骨転移は起こっていないが、近い将来起こる可能性が高いか否かを判定することを包含する意味で使用される。
本発明の診断方法の被検対象となり得る癌患者は、癌の原発巣に特に制限はない。該方法は、骨転移を生じ得るあらゆる癌（例：乳癌、肺癌、前立腺癌、甲状腺癌、腎癌、胃癌、肝癌、子宮癌、大腸癌など）に罹患したヒトに適用可能であるが、特に乳癌、肺癌および前立腺癌患者において骨転移の割合が高いことから、これらの癌患者に対して好ましく適用される。患者の年齢、性別等は何ら限定されない。
被検試料となる患者由来の生体試料は特に限定されないが、患者への侵襲が少ないものであることが好ましく、例えば、血液、血清、血漿、唾液、粘膜、涙などの人から分泌されるものや、生検から採取されるものが挙げられる。
血清や血漿を用いる場合、常法に従って患者から採血し、液性成分を分離することにより調製することができる。検出対象である本発明のペプチドは分子量約５，８００であるので、必要に応じて、スピンカラムなどを用いて、予め高分子量の蛋白質画分などを分離除去しておくこともできる。また、後述するように、検出対象を本発明のペプチドをコードするｍＲＮＡとする場合には、採取した血液から常法を用いて全ＲＮＡもしくはポリ（Ａ）＋ＲＮＡ画分を抽出・精製しておいてもよい。
生体試料における本発明のペプチドの発現は、該ペプチドもしくはそれをコードするｍＲＮＡを従来公知の方法を用いて検出することにより調べることができる。例えば、本発明のペプチドを検出する場合は、該試料を陽イオン交換体に接触させた後、適当な条件で洗浄し、該陽イオン交換体に結合した成分から、分子量約５，８００のペプチドを検出することによって行うことができる。ここで「陽イオン交換体」とは、負の荷電基を持ち、陽イオンを捕捉するイオン交換体をいい、その性状により強陽イオン交換体（例えば、プロピルスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等を官能基とするスチレン系、アクリル系等の母体構造を有する不溶性担体など）、および弱陽イオン交換体（例えば、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基等を官能基とするスチレン系、アクリル系等の母体構造を有する不溶性担体など）に分けられる。本発明の方法においては、いずれの交換体でもよく、特に限定されないが、好ましくは弱陽イオン交換体が用いられる。
洗浄は水または緩衝液を用いて行うことができるが、例えば、ｐＨは、各々の試料のターゲットマーカの等電点に合わせて使用し、よってｐＨ４〜８のトリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液等が用いられる。
陽イオン交換体に結合した成分からの分子量約５，８００のペプチドの検出は、例えば、陽イオン交換体に塩濃度を変化させながら溶離液（例：１００〜１０００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液など）を加えて吸着成分を溶出し、必要に応じて濃縮後、溶出液を各種の分子量測定法、例えば、ゲル電気泳動や、各種の分離精製法（例：イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなど）、イオン化法（例：電子衝撃イオン化法、フィールドディソープション法、二次イオン化法、高速原子衝突法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、エレクトロスプレーイオン化法など）、質量分析計（例：二重収束質量分析計、四重極型分析計、飛行時間型質量分析計、フーリエ変換質量分析計、イオンサイクロトロン質量分析計など）を組み合わせる方法等に供することにより行うことができる。
分子量約５，８００とは各測定方法の誤差の範囲を考慮したものであり、例えば、質量分析計を用いる方法による場合は、分子量５，８１３±０．５％（好ましくは±０．３％、より好ましくは±０．１％）の位置に出現するピーク強度を測定することが好ましい。
本発明の診断方法における分子量約５，８００のペプチドの検出において、最も好ましい測定法として、陽イオン交換クロマトグラフィーと飛行時間型質量分析（ＴＯＦ−ＭＳ）を組み合わせて、陽イオン交換体に一定条件下で捕捉されるすべての生体試料成分の質量を一括して測定する方法、とりわけ飛行時間型質量分析に使用するプローブの表面に陽イオン交換体を固定し、このプローブ表面と被検試料を接触させ、適当な条件で洗浄した後、該プローブ表面に捕捉された成分の質量を飛行時間型質量分析計で測定する方法などが挙げられる。陽イオン交換体としては、上記と同様のものを用いることができ、弱陽イオン交換体が特に好ましい。弱陽イオン交換体を表面に固定化した飛行時間型質量分析計に適合可能なプローブとしては、前記したサイファージェン・バイオシステムズ社製のＣＭ１０またはＷＣＸ２  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ  Ａｒｒａｙ（型番：Ｃ５５３−００７５またはＣ５５３−００２６）等が挙げられるが、それらに限定されない。洗浄は、上記した緩衝液等を用いて、室温等で行うことができる。質量分析は適当なマトリックスを用いてＭＡＬＤＩ法で行うことが好ましく（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）、使用するマトリックス分子としては、例えばシナピン酸（ＳＰＡ）、飽和２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）、インドールアクリル酸（ＩＡＡ）、桂皮酸などが挙げられる。
本発明の診断方法における本発明のペプチドの検出は、該ペプチドに対する抗体を用いて行うこともできる。本発明のペプチドに対する抗体は、例えば、本発明のペプチドを、これを発現する癌患者由来の生体試料から単離・精製し、該ペプチドを抗原として動物を免疫することにより調製することができる。あるいは、得られるペプチド量が少量である場合等は、該ペプチドをペプチダーゼ等によって部分消化し、得られる断片のアミノ酸配列をエドマン法などにより決定し、その配列を基に該ペプチドをコードする核酸とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドを合成、これをプローブとして該患者由来のｃＤＮＡラリブラリーを鋳型にハイブリダイゼーション法により該ペプチドをコードするｃＤＮＡを得るか、あるいは該オリゴヌクレオチドをプライマーとして該患者由来のＲＮＡを鋳型にしてＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、該ペプチドをコードするｃＤＮＡを得て、該ｃＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込んで適当な宿主細胞に導入し、得られる形質転換体を培養して組換えペプチドを採取することによって、本発明のペプチドを大量に調製することができる。あるいは上記のようにして得られるｃＤＮＡを鋳型として、無細胞転写・翻訳系を用いて本発明のペプチドを取得することもできる。
あるいはまた、上記の陽イオン交換体と質量分析を組み合わせた検出法において、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）法を用いることにより、直接本発明のペプチドのアミノ酸配列を同定し、該配列情報に基づいて該ペプチドの全部もしくは一部を合成し、これを抗原（ハプテン）として利用することもできる。ＭＳ／ＭＳ法を用いたペプチド同定法としては、ＭＳ／ＭＳスペクトルを解析してアミノ酸配列を決定するｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法と、ＭＳ／ＭＳスペクトル中に含まれる部分的な配列情報（質量タグ）を用いてデータベース検索を行い、ペプチドを同定する方法等が挙げられる。
上述のように、本発明のペプチドはヒトアズロシジンの断片であり、そのアミノ酸配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１０〜６２で示されるアミノ酸配列（ＡＺＵ（３６−８８））と同一もしくは実質的に同一の配列である。従って、本発明のペプチドに対する抗体は、例えば、ＡＺＵ（３６−８８）の配列の全部もしくは一部を、上記アミノ酸配列情報に基づき、公知のペプチド合成法を用いて合成するか、あるいは単離したアズロシジンを適当なペプチダーゼ等で切断して、ＡＺＵ（３６−８８）の配列の全部もしくは一部を含むペプチド断片を取得し、これを免疫原として調製することが望ましい。
本発明のペプチドに対する抗体（以下、「本発明の抗体」と称する場合がある）は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製することができる。また、該抗体は完全抗体分子だけでなくそのフラグメントをも包含し、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＳｃＦｖ、ｍｉｎｉｂｏｄｙ等が挙げられる。
例えば、ポリクローナル抗体は、上記のいずれかの方法または他の方法によって調製された本発明のペプチドもしくはその部分ペプチド（必要に応じて、ウシ血清アルブミン、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）等のキャリアータンパク質に架橋した複合体とすることもできる）を抗原として、市販のアジュバント（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し（部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく）、最終免疫から約３〜約１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。
また、モノクローナル抗体は、細胞融合法（例えば、渡邊武、細胞融合法の原理とモノクローナル抗体の作成、谷内昭、高橋利忠編、「モノクローナル抗体とがん−基礎と臨床−」、第２−１４頁、サイエンスフォーラム出版、１９８５年）により作成することができる。例えば、本発明のペプチドもしくはその部分ペプチドを市販のアジュバントと共にマウスに２〜４回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の約３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ−１，Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８など）を細胞融合して該ペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はＰＥＧ法［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，８１（２）：２２３−２２８（１９８５）］でも電圧パルス法［Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，７（６）：６２７−６３３（１９８８）］であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡまたはＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、このましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得することができる。
本発明の抗体を用いる本発明の診断方法は、特に制限されるべきものではなく、被検試料中の抗原量に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法等が好適に用いられる。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。
サンドイッチ法においては、不溶化した本発明の抗体に被検試料を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明の抗体を反応させ（２次反応）た後、不溶化担体上の標識剤の量（活性）を測定することにより、被検試料中の本発明のペプチド量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。
本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を、サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることもできる。
競合法では、被検試料中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検試料中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検試料の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検試料中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検試料中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検試料中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のペプチドの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ．７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ａ））、同書Ｖｏｌ．７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｂ））、同書Ｖｏｌ．７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｃ））、同書Ｖｏｌ．８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、同書Ｖｏｌ．９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ））、同書Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
あるいは、本発明の抗体を用いる別の本発明の診断方法として、該抗体を上記したような質量分析計に適合し得るプローブの表面上に固定化し、該プローブ上の該抗体に被検試料を接触させ、該抗体に捕捉された生体試料成分を質量分析にかけ、分子量約５，８００のペプチドのピークを検出する方法が挙げられる。
本発明の診断方法において、生体試料における本発明のペプチドの発現を、該ペプチドをコードするｍＲＮＡ（即ち、分解により該ペプチドを生ずるアズロシジンをコードするｍＲＮＡ、具体的には、配列番号１に示される塩基配列を含むＲＮＡ）を検出することにより行う場合、該ｍＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸（プローブ）や、該ｍＲＮＡの一部もしくは全部を増幅するプライマーとして機能し得るオリゴヌクレオチドのセットを用いて、ノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲなどにより行うことができる。プローブとして用いられる核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。好ましくはＤＮＡが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。該核酸の長さは標的ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限はなく、例えば約１５塩基以上、好ましくは約３０塩基以上である。該核酸は、標的ｍＲＮＡの検出・定量を可能とするために、標識剤により標識されていることが好ましい。標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔３２Ｐ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、プローブと標識剤との結合にビオチン−（ストレプト）アビジンを用いることもできる。
プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドのセットとしては、アズロシジンをコードするｍＲＮＡの塩基配列（センス鎖）およびそれに相補的な塩基配列（アンチセンス鎖）とそれぞれ特異的にハイブリダイズすることができ、それらに挟まれるＤＮＡ断片を増幅し得るものであれば特に制限はなく、例えば、各々約１５〜約１００塩基、好ましくは各々約１５〜約５０塩基の長さを有し、約１００ｂｐ〜数ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅するようにデザインされたオリゴＤＮＡのセットが挙げられる。
微量ＲＮＡ試料を用いて本発明のペプチドの遺伝子発現を定量的に解析するためには、競合ＲＴ−ＰＣＲまたはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いることが好ましい。競合ＲＴ−ＰＣＲとは、目的のＤＮＡを増幅し得るプライマーのセットにより増幅され得る既知量の他の鋳型核酸をｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒとして反応液中に共存させて競合的に増幅反応を起こさせ、増幅産物の量を比較することにより、目的ＤＮＡの量を算出する方法をいう。従って、競合ＲＴ−ＰＣＲを用いる場合、上記プライマーセットに加えて、該プライマーセットにより増幅され、目的ＤＮＡと区別することができる増幅産物（例えば、目的のＤＮＡとはサイズの異なる増幅産物、制限酵素処理により異なる泳動パターンを示す増幅産物など）を生じる核酸をさらに含有することができる。このｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。ＤＮＡの場合、ＲＮＡ試料から逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した後にｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒを添加してＰＣＲを行えばよく、ＲＮＡの場合は、ＲＮＡ試料に最初から添加してＲＴ−ＰＣＲを行うことができる。後者の場合、逆転写反応の効率も考慮に入れているので、元のｍＲＮＡの絶対量を推定することができる。
一方、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ＰＣＲの増幅量をリアルタイムでモニタリングできるので、電気泳動が不要で、より迅速に本発明のペプチドの遺伝子発現を解析可能である。通常、モニタリングは種々の蛍光試薬を用いて行われる。これらの中には、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、エチジウムブロマイド等の二本鎖ＤＮＡに結合することにより蛍光を発する試薬（インターカレーター）の他、上記プローブとして用いることができる核酸（但し、該核酸は増幅領域内で標的核酸にハイブリダイズする）の両端をそれぞれ蛍光物質（例：ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＦＩＴＣ等）および消光物質（例：ＴＡＭＲＡ、ＤＡＢＣＹＬ等）で修飾したもの等が含まれる。
上記プローブとして用いる核酸は、アズロシジンをコードするｃＤＮＡやその断片（例えば、ＡＺＵ（３６−８８）等）をコードするＤＮＡであってよく、あるいはその塩基配列情報（配列番号１参照）に基づいて、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機等を用いて化学的に合成することによって得られるものであってもよい。また、上記プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドのセットは、上記塩基配列情報に基づいて、該塩基配列およびその相補鎖配列の一部を市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機等を用いて化学的に合成することによって得ることができる。
本発明の診断方法は、癌患者から時系列で生体試料を採取し、各試料における本発明のペプチドの発現の経時変化を調べることにより行うことが好ましい。生体試料の採取間隔は特に限定されないが、骨転移の早期発見という本発明の目的を考慮すれば、患者のＱＯＬを損なわない範囲でできるだけ頻繁にサンプリングすることが望ましく、例えば、血液（血清、血漿）を試料とする場合には、約１ヶ月間の間隔で採血を行うことが好ましい。各試料について上記のようにして本発明のペプチドの発現を調べ、経時的に該ペプチドの発現が増加した場合には、骨転移が起こっている、もしくは近い将来骨転移を起こす可能性が高いと判定することができる。
後述の実施例において示される通り、本発明のペプチドの発現は、骨転移の発症後、骨転移に対する治療が奏効した場合には減少傾向を示す。従って、本発明の診断方法は、骨転移発症後の患者における治療効果の早期判定にも用いることができる。例えば、骨転移に対する治療開始から一定期間を経過しても本発明のペプチドの発現が低下しないか増加し続ける場合には、治療計画の変更等を考慮すべきであると判定することができる。また、実際に骨転移が起こる前に本発明のペプチドの発現増加が認められ、骨転移に対する予防的措置を施した場合に、継続的に本発明のペプチドの発現をモニタリングすることにより予防効果の成否を判定することもできる。
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。尚、測定は、特にことわらない限り、サイファージェン・バイオシステムズ社のプロテインチップシステムと添付の試薬類を用いて行った。
【実施例１】  骨転移マーカーの検出
久留米大学医学部第二内科学受診肝臓癌患者より、骨転移発症前（受診２ヶ月後）から骨転移発症後（同１１ヶ月後）、骨転移治療開始後（同１５ヵ月後）まで時系列で採血を行い、常法に従って血清を調製した。血清１μＬに変性バッファー９μＬを加え、よく混合した。１０分間、氷上でインキュベーションを行い、プロテインチップ実験バッファー（ｐＨ６）９０μＬを加えた。
プロテインチップ実験バッファー１５０μＬを陽イオン交換プロテインチップ（ＣＭ１０型番：Ｃ５７３００７５）に添加し、５分間室温で振盪しながら平衡化を行った。この作業を２回繰り返した。上記の調整済みの血清サンプルを１００μＬずつ該プロテインチップに添加し、３０分間室温で振盪しながらインキュベーションを行った。プロテインチップ実験バッファー（ｐＨ６）１５０μＬをプロテインチップに添加し、５分間室温で振盪しながら平衡化を行った。この作業を３回繰り返した。ＭｉｌｌｉＱ水２００μＬを各プロテインチップに添加し、リンス、脱塩を行った。この作業を２回繰り返した。プロテインチップを風乾し、飽和エネルギー吸収分子（シナピン酸）溶液を０．５μＬ添加し、風乾し、この作業を２回行った。その後、プロテインチップリーダーにより測定を行った。
ベースライン補正、分子量校正、正規化処理を行った。シングルマーカーの解析は、ｔ検定、ＲＯＣ解析、マルチマーカー解析（主成分分析、クラスタリング、ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。
結果を図１および２に示す。分子量５，８１３の位置のピーク強度は、骨転移発症前の受診７ヶ月後より経時的に増加し（受診１１ヶ月後まで）、骨転移に対する治療開始後は減少した（受診１５ヵ月後）。
【実施例２】  骨転移マーカーの精製
（１）精製条件の検討
陽イオン交換プロテインチップ（ＣＭ１０型番：Ｃ５７３００７５）または陰イオン交換プロテインチップ（Ｑ１０型番：Ｃ５７３００８０）を用い、プロテインチップ実験バッファー（５０ｍＭリン酸緩衝液）のｐＨを５．０〜８．５の範囲で変動させ、分子量５，８１３の位置にピークが検出された血清サンプルにつき、実施例１と同様にして質量分析を行った、その結果、陰イオン交換プロテインチップでは、いずれのｐＨでも、分子量５，８１３の位置にピークは検出されなかった。一方、陽イオン交換プロテインチップでは、目的のピークはｐＨ６．５以下で効率よく検出され、検出感度は低いもののｐＨ８．５でも検出された。このことから、目的ピークのペプチドの等電点（ｐＩ）がｐＨ８．５よりも高い可能性が示唆された。また、目的ピーク以外のピーク（ノイズ）吸着が少ないことから、以後、ｐＨ６．０を標準的な吸着条件とした。
次に、ｐＨ６．０の吸着条件下で陽イオン交換プロテインチップに吸着した分子量５，８１３の位置のピークの溶出塩濃度を検討した。０、１００、２００、３００、５００ｍＭおよび１Ｍ  ＮａＣｌでそれぞれ処理した後に、プロテインチップを質量分析にかけたところ、２００ｍＭ  ＮａＣｌで目的ピークの消失が確認された。
（２）マーカーペプチドの精製
分子量５，８１３の位置にピークが検出される血清（（＋）血清）および該ピークが検出されない血清（（−）血清）各５００μｌに、４．５ｍｌの変性バッファー（尿素／チオ尿素／ＣＨＡＰＳ）を加えて、よく混合した。１０分間、氷上でインキュベーションを行った後、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６）で５倍希釈し、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６）で平衡化した陽イオン交換カラム（ＣＭ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄ  Ｆ  Ｓｐｉｎ  Ｃｌｏｕｍｕｓ：Ｃ５４０−００２４）１０００μｌに上清を通し、１００、２００、３００、５００ｍＭ、１Ｍおよび１Ｍ  ＮａＣｌでステップワイズに溶出させた。各溶出フラクション５μｌを順相プロテインチップ（ＮＰ２０）に添加し、ＭｉｌｌｉＱ水で洗浄後、マトリックスとして１００％シナピン酸を添加してＭＡＬＤＩ法にて質量分析を行った。その結果、（＋）血清では、３００ｍＭ  ＮａＣｌで少量の目的ピークの溶出が開始し、１Ｍ  ＮａＣｌにおいて最大に溶出された。各血清サンプルの１Ｍ  ＮａＣｌでの溶出フラクションを回収し、限外濾過膜（５ｋＤａカットオフ；ＶＩＶＡ  ＳＰＩＮ）を用いて１５，０００ｒｐｍで１０分遠心した後、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６）５００μｌを添加・１５，０００ｒｐｍで１０分遠心の操作を２回繰り返してサンプルの濃縮・脱塩を行った（最終容量３０μｌ、ペプチド濃度０．２ｍｇ／ｍｌ）。濃縮・脱塩後のサンプルを上記と同様にして質量分析にかけたところ、（＋）血清の濃縮サンプルでは、目的ピークが効率よく検出された。
【実施例３】  骨転移マーカーの同定
（１）Ｏｎ  Ｃｈｉｐ還元
実施例２（２）で得られた（＋）血清の濃縮脱塩サンプルを、ＮＰ２０チップの１スポットあたり０．５μｌ添加し、ＭｉｌｌｉＱ水５μｌで２回洗浄後、５ｍＭ  ＤＴＴ（２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３，ｐＨ８中）５μｌを添加し、７０℃で還元処理してチップを乾固させた後、飽和シナピン酸０．５μｌを２回添加して質量分析を行った。その結果、還元前（５８１０．６＋Ｈ）に比して約２Ｄａの質量増加が認められたことから、目的のペプチドにはＳ−Ｓ結合が１箇所含まれることが示唆された。そこで、下記のトリプシン消化の前に還元処理を行うこととした。
（２）ペプチドマスフィンガープリンティング
実施例２（２）で得られた（＋）血清および（−）血清の各濃縮脱塩サンプルを、ＮＰ２０チップの１スポットあたり１μｇ添加し、乾固させた後水洗し、５ｍＭ  ＤＴＴ（２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３，ｐＨ８中）５μｌを添加し、７０℃で還元処理した。５ｎｇのトリプシン（２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３，ｐＨ８中）を添加して３７℃で２時間消化した後、２０％  ＣＨＣＡ  ０．５μｌを２回添加し、ＳＥＬＤＩおよびＰＣＩ−Ｑｓｔａｒをそれぞれ用いて質量分析を行った。その結果、（＋）血清サンプルと（−）血清サンプルとを比較すると、複数の（＋）血清特異的ピークが確認された（ＳＥＬＤＩ：図３、ＰＣＩ−Ｑｓｔａｒ：図４）。これらの（＋）血清特異的ピークをＰｒｏＦｏｕｎｄ検索（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｗｌ．ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ／ｐｒｏｆｏｕｎｄ＿ｂｉｎ／ＷｅｂＰｒｏＦｏｕｎｄ．ｅｘｅ）してペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、９５％以上の高確率でアズロシジンがヒットした。ペプチドマスフィンガープリンティングにおける（＋）血清特異的ピークのうち、アズロシジン由来と推測されるピークは、Ｍ／Ｚ  １１８１．１５、１５０５．７９、２８６１．４０および３０５７．４３であった（それぞれ配列番号２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号２４〜３４、１１〜２３、３５〜６１および１６７〜１９８で示されるアミノ酸配列からなる断片に相当する）。
（３）ＭＳ／ＭＳ解析
上記のアズロシジン由来と推測されるピークの中から、Ｍ／Ｚ  １５０５．７８９６のピークをＰＣＩ−Ｑｓｔａｒを用いたＭＳ／ＭＳ解析に付し、得られるピークをＭＳ−Ｔａｇで検索したところ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｕｃｓｆｈｔｍ１４．０／ｍｓｔａｇ．ｈｔｍ）、プレプロアズロシジンの３７〜４９位（配列番号２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１１〜２３で示されるアミノ酸配列）の断片であると同定された。分子量５，８１３、等電点８．５以上、Ｓ−Ｓ結合を１箇所形成するという条件でアズロシジンの部分アミノ酸配列を検索したところ、プレプロアズロシジンの３６〜８８位（配列番号２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１０〜６２で示されるアミノ酸配列）の断片が、アミノ酸配列からの予測分子量５８２５．６９、予測ｐＩ値１０．６６で、５２位のシステイン残基と６８位のシステイン残基との間でＳ−Ｓ結合を１箇所形成すると推定されることから、このアズロシジン由来ペプチド（ＡＺＵ（３６−８８））を骨転移マーカーとして同定した。
【実施例４】  ヘパリン結合性の確認
アズロシジンはヘパリン結合タンパク質であり、分子内に２箇所のヘパリン結合配列モチーフ（配列番号２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号５〜１０および６１〜６５でそれぞれ示されるアミノ酸配列）を有することから、ヘパリンカラムへの目的ピークの吸着を調べた。未変性の（＋）血清サンプルをカラム結合バッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５））で１０倍希釈した後、同バッファーで平衡化したヘパリンカラム（Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨｙｐｅｒＤ（登録商標）Ｍ；ＢｉｏＳｅｐｒａ社製）に添加し、非吸着画分、および吸着画分を２Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で溶出した画分を分取した。各画分をそれぞれ濃縮・脱塩、変性した後、実施例１記載の方法に準じて陽イオン交換チップ（ｐＨ６．０）により目的ピークを検出した。その結果、非吸着画分では目的ピークが著しく減少し、カラム溶出画分に目的ピークが検出された（図５）。
【産業上の利用可能性】  本発明の骨転移ペプチドマーカーは、骨転移の症状が顕在化するより相当期間早い時期から血清中レベルが増加し始めるので、現在の画像診断より早く、骨転移の早期発見と早期予防が可能となり、また、少ない用量の患者血清から解析が出来るので、患者負担が少なく、迅速・簡便且つ安価な骨転移の診断方法およびそのための試薬・キット等への応用という意味で極めて有用である。
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
本出願は、日本国で出願された特願２００４−２８２８２２および特願２００５−２３１１９３を基礎としており、そこに開示される内容は本明細書にすべて包含されるものである。また、ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【図１】
2006036002.tif 000002
【図２】
2006036002.tif 000003
【図３】
2006036002.tif 000004
【図４】
2006036002.tif 000005
【図５】
2006036002.tif 000006
【配列表】
2006036002000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年5月8日(2006.5.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】請求の範囲
【請求項１】下記の性質を有するペプチド。
（ａ）癌患者において、骨転移発症前から骨転移発症後にかけて血清中で経時的に発現が増加する
（ｂ）弱陽イオン交換体にｐＨ６の条件下で吸着する
（ｃ）質量分析による見かけの分子量：約５，８００
【請求項２】配列番号２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１０〜６２で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項３】請求項１または２記載のペプチドに対するモノクローナル抗体。
【請求項４】癌患者における骨転移の判定方法であって、該患者由来の生体試料における請求項１または２記載のペプチドの発現を検出することを特徴とする方法。
【請求項５】生体試料が血漿または血清である請求項４記載の方法。
【請求項６】生体試料を陽イオン交換体と接触させ、該陽イオン交換体に吸着した該試料中の成分を質量分析にかけて、分子量約５，８００のペプチドを検出することを特徴とする、請求項４または５記載の方法。
【請求項７】請求項３記載の抗体を用いて請求項１または２記載のペプチドを検出することを特徴とする、請求項４または５記載の方法。
【請求項８】癌患者から時系列で採取された生体試料における、請求項１または２記載のペプチドの発現の経時変化を調べることを特徴とする、請求項４〜７のいずれかに記載の方法。
【国際調査報告】
2006036002.tif 000011
2006036002.tif 000012
2006036002.tif 000013
2006036002.tif 000014