(57)【要約】  ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ誘導体または製剤学的に許容されるそれらの塩を含有する角膜神経突起形成促進剤、特に、角膜神経突起形成促進作用による角膜知覚改善用、ドライアイ治療用および角膜上皮傷害治療用の角膜神経突起形成促進剤を提供する。該角膜神経突起形成促進剤は、レーザー角膜切削形成術（レーシック；ＬＡＳＩＫ）や角膜移植などの角膜手術後や白内障手術後の角膜知覚低下、あるいは角膜神経変性疾患に伴う角膜知覚機能低下、およびそれら角膜知覚低下に伴うドライアイ症状と角膜上皮傷害を改善する医薬として有用である。さらに、ドライアイ患者におけるドライアイ症状、角膜知覚低下および角膜上皮傷害を改善する医薬として、また、角膜上皮傷害とそれに伴うドライアイ症状と角膜知覚低下を改善する医薬として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ誘導体または製剤学的に許容されるそれらの塩を含有する角膜神経突起形成促進剤。
【請求項２】
ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ誘導体または製剤学的に許容されるそれらの塩を含有する角膜知覚改善剤。
【請求項３】
ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ誘導体または製剤学的に許容されるそれらの塩を含有するドライアイ治療剤。
【請求項４】
ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ誘導体または製剤学的に許容されるそれらの塩を含有する角膜上皮傷害治療剤。
【請求項５】
ＰＡＣＡＰ誘導体が、下記式(Ｉ)
His-Ser-Asp-Ala-X1-Phe-Thr-X2-X3-Tyr-X4-Arg-X5-Arg-X6-Gln-X7-Ala-Val-X8-X9-Tyr-Leu-Ala-Ala-X10-X11-X12  (Ｉ)
(式中、 X1は、ValまたはIle；
X2は、Asp、AlaまたはGlu；
X3は、AsnまたはSer；
X4は、ThrまたはSer；
X5は、LeuまたはTyr；
X6,X8,X9はLysまたはArg；
X7は、LeuまたはNle；
X10は、Ile、Valまたは化学結合；
X11は、Leu、Leu-Asn、Leu-Gly、Leu-Gly-Lys、Leu-Gly-Arg、Leu-Gly-Lys-Lys、Leu-Gly-Lys-Arg、Leu-Gly-Arg-Arg、Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys-Gln-Arg-Val-Lys-Asn-Lys、Leu-Gly-Arg-Arg-Tyr-Arg-Gln-Arg-Val-Arg-Asn-Argまたは化学結合；
X12はC末端アミノ酸のα位カルボキシ基修飾を表し、-NH2または-OHを示す。)
で示されるペプチドのうち、Ｎ末端より少なくとも２３残基からなるペプチド（配列番号１〜１４）または製剤学的に許容されるその塩である請求項１記載の角膜神経突起形成促進剤。
【請求項６】
ＰＡＣＡＰ誘導体が、上記式(Ｉ)で表されるペプチドのうち、Ｎ末端より少なくとも２３残基からなるペプチドまたは製剤学的に許容されるその塩である請求項２記載の角膜知覚改善剤。
【請求項７】
ＰＡＣＡＰ誘導体が、上記式(Ｉ)で表されるペプチドのうち、Ｎ末端より少なくとも２３残基からなるペプチドまたは製剤学的に許容されるその塩である請求項３記載のドライアイ治療剤。
【請求項８】
ＰＡＣＡＰ誘導体が、上記式(Ｉ)で表されるペプチドのうち、Ｎ末端より少なくとも２３残基からなるペプチドまたは製剤学的に許容されるその塩である請求項４記載の角膜上皮傷害治療剤。
【請求項９】
ＰＡＣＡＰ誘導体が、上記式(Ｉ)において、X1がIle、X2がAsp、X3がSer、X4がSer、X5がTyr、X6、X8およびX9がArg、X7がLeu、X10がVal、X11がLeu-Gly-Arg-Argであるペプチドである請求項５記載の角膜神経突起形成促進剤。
【請求項１０】
ＰＡＣＡＰ誘導体が、上記式(Ｉ)において、X1がIle、X2がAsp、X3がSer、X4がSer、X5がTyr、X6、X8およびX9がArg、X7がLeu、X10がVal、X11がLeu-Gly-Arg-Argであるペプチドである請求項６記載の角膜知覚改善剤。
【請求項１１】
ＰＡＣＡＰ誘導体が、上記式(Ｉ)において、X1がIle、X2がAsp、X3がSer、X4がSer、X5がTyr、X6、X8およびX9がArg、X7がLeu、X10がVal、X11がLeu-Gly-Arg-Argであるペプチドである請求項７記載のドライアイ治療剤。
【請求項１２】
ＰＡＣＡＰ誘導体が、上記式(Ｉ)において、X1がIle、X2がAsp、X3がSer、X4がSer、X5がTyr、X6、X8およびX9がArg、X7がLeu、X10がVal、X11がLeu-Gly-Arg-Argであるペプチドである請求項８記載の角膜上皮傷害治療剤。
【請求項１３】
ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ誘導体または製剤学的に許容されるそれらの塩の角膜神経突起形成促進剤製造における使用。
【請求項１４】
ＰＡＣＡＰ誘導体が、上記式(Ｉ)で示されるペプチドのうち、Ｎ末端より少なくとも２３残基からなるペプチドまたは製剤学的に許容されるその塩である請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ誘導体または製剤学的に許容されるそれらの塩の角膜知覚改善剤製造における使用。
【請求項１６】
ＰＡＣＡＰ誘導体が、上記式(Ｉ)で示されるペプチドのうち、Ｎ末端より少なくとも２３残基からなるペプチドまたは製剤学的に許容されるその塩である請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ誘導体または製剤学的に許容されるそれらの塩のドライアイ治療剤製造における使用。
【請求項１８】
ＰＡＣＡＰ誘導体が、上記式(Ｉ)で示されるペプチドのうち、Ｎ末端より少なくとも２３残基からなるペプチドまたは製剤学的に許容されるその塩である請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ誘導体または製剤学的に許容されるそれらの塩の角膜上皮傷害治療剤製造における使用。
【請求項２０】
ＰＡＣＡＰ誘導体が、上記式(Ｉ)で示されるペプチドのうち、Ｎ末端より少なくとも２３残基からなるペプチドまたは製剤学的に許容されるその塩である請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ誘導体または製剤学的に許容されるそれらの塩の有効量を、角膜神経突起形成促進の必要な対象に投与することを特徴とする角膜神経突起形成促進方法。
【請求項２２】
ＰＡＣＡＰ誘導体が、上記式(Ｉ)で示されるペプチドのうち、Ｎ末端より少なくとも２３残基からなるペプチドまたは製剤学的に許容されるその塩である請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ誘導体または製剤学的に許容されるそれらの塩の有効量を、角膜知覚改善の必要な対象に投与することを特徴とする角膜知覚改善方法。
【請求項２４】
ＰＡＣＡＰ誘導体が、上記式(Ｉ)で示されるペプチドのうち、Ｎ末端より少なくとも２３残基からなるペプチドまたは製剤学的に許容されるその塩である請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ誘導体または製剤学的に許容されるそれらの塩の有効量を、ドライアイ治療の必要な対象に投与することを特徴とするドライアイ治療方法。
【請求項２６】
ＰＡＣＡＰ誘導体が、上記式(Ｉ)で示されるペプチドのうち、Ｎ末端より少なくとも２３残基からなるペプチドまたは製剤学的に許容されるその塩である請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ誘導体または製剤学的に許容されるそれらの塩の有効量を、角膜上皮傷害治療の必要な対象に投与することを特徴とする角膜上皮傷害治療方法。
【請求項２８】
ＰＡＣＡＰ誘導体が、上記式(Ｉ)で示されるペプチドのうち、Ｎ末端より少なくとも２３残基からなるペプチドまたは製剤学的に許容されるその塩である請求項２７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、角膜神経突起形成促進剤、角膜知覚改善剤、トライアイ治療剤および角膜上皮傷害治療剤に関し、さらにまた、角膜神経突起形成促進作用による角膜知覚の改善、ドライアイの治療および角膜上皮傷害治療に有用な角膜神経突起形成促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
レーザー屈折矯正角膜切除術（ＰＲＫ）、レーザー角膜切削形成術（レーシック；ＬＡＳＩＫ）、角膜移植などの角膜手術後には、角膜神経が切断されるため、通常約３週間から１年間角膜知覚機能の低下症状が起きるといわれている。例えば、ＬＡＳＩＫ後には明らかに角膜神経が切断されていること(非特許文献１参照)、また、ＬＡＳＩＫ後に神経像が認められないか、あるいは神経線維束が短く連結していない角膜領域において、角膜の知覚が低下することが報告されている（非特許文献２参照）。
ＰＲＫおよびＬＡＳＩＫ後の角膜知覚の低下が涙腺応答低下、涙液減少の原因であることが示唆されている（非特許文献３参照）。この角膜知覚機能低下のため、角膜手術後の患者では瞬目回数が減少しドライアイ症状が認められることが問題となっている。一方、ドライアイ患者では涙液機能の低下が角膜知覚の低下をもたらし、この角膜知覚の低下が涙液機能の低下をさらに悪化させ、角膜表面の症状を重篤化させることが問題となっている。また、ＰＲＫやＬＡＳＩＫにより引き起されたドライアイによって角膜創傷治癒が障害されたり(非特許文献４)、ＬＡＳＩＫの術後に再発性の角膜糜爛が認められたとの報告もある(非特許文献５)。
しかし、現在角膜手術後の低下した角膜知覚の回復は自然回復に委ねられ、またドライアイの治療においても角膜知覚を回復させるための積極的治療は施されていないのが現状である。また、神経麻痺性角膜症、角膜潰瘍、糖尿病性角膜症などの角膜神経変性を伴う疾患でも角膜知覚低下が引き起こされるが、適切な治療法はない。【０００３】
ＶＩＰ(血管作動性腸管ペプチド；Vasoactive Intestinal Peptide)は、初めブタ腸管から抽出された２８個のアミノ酸残基からなるペプチドであり(例えば、非特許文献６参照)、消化管や血管の平滑筋を弛緩させ、多彩な生物学的活性を有する。涙腺への作用に関して、ＶＩＰが涙腺からのタンパク質分泌を促進させることが報告されており(例えば、非特許文献７参照)、また、ＶＩＰ誘導体のドライアイ治療剤としての用途を開示した出願があるが、角膜知覚に関する記載は一切ない(特許文献１参照)。【０００４】
一方、ＰＡＣＡＰ(下垂体アデニレートサイクラーゼ活性化ペプチド；Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide)は、１９８９年、ヒツジの視床下部から下垂体培養細胞のアデニレートサイクラーゼを活性化させるバイオアッセイ系を指標に単離、構造決定された３８個のアミノ酸残基よりなるペプチドである。ＰＡＣＡＰには、３８アミノ酸残基からなるＰＡＣＡＰ３８に加えて、そのＮ末側２７アミノ酸残基からなるＰＡＣＡＰ２７の２種があることが知られている(例えば、非特許文献８参照)。このＰＡＣＡＰのＮ末側から２７個のアミノ酸配列はＶＩＰと極めて類似した構造を有している。また、ＶＩＰとＰＡＣＡＰのアミノ酸配列は、セクレチン、グルカゴン等に類似していることから、グルカゴン−セクレチンスーパーファミリーに属するとされている。ＰＡＣＡＰ受容体は３種(ＰＡＣ１、ＶＰＡＣ１、ＶＰＡＣ２)同定されており、ＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２受容体はＰＡＣＡＰとともにＶＩＰに対しても同程度の結合親和性を示す(非特許文献９)。ＰＡＣＡＰの作用として気管支平滑筋弛緩作用や末梢血管拡張作用などがあるが、中枢作用として神経細胞保護作用も報告されている(例えば、非特許文献１０参照)。また、ＰＡＣＡＰは非神経系の培養ＰＣ１２細胞の細胞突起形成を促進することが報告されているが、角膜に分布する神経細胞への作用について、さらに、涙液分泌に関する記載はない(例えば、非特許文献１１参照)。【０００５】
ＰＡＣＡＰおよびＶＩＰのアミノ酸配列の異同に着目して合成された誘導体の用途に関して、例えば、気管支拡張・降圧作用、血流増加作用、育毛作用、性行動活性化作用(例えば、特許文献２参照)、消化管運動抑制作用(例えば、特許文献３参照)、アルツハイマー型痴呆症やパーキンソン病などを改善する神経突起誘発作用(例えば、特許文献４参照)などの用途が開示されているが、それら文献には、角膜知覚改善作用、涙液分泌促進作用および角膜上皮創傷治癒作用あるいはそれらを示唆する記載は一切ない。【０００６】
ＬＡＳＩＫなどの手術後の角膜神経傷害の治療に関して、神経再生または神経突起伸長を促進する化合物が有用であるとする特許出願があり、それら化合物の例として神経栄養性因子刺激物質であるネオトロフィンなどの化合物が例示されているが、ＶＩＰやＰＡＣＡＰあるいはそれらの誘導体についての記載は一切なく、またそれらを示唆する記載もない(特許文献５参照)。
【特許文献１】国際公開０３／０３９５７７号公パンフレット
【特許文献２】特開平１１−１００３９９号公報
【特許文献３】特開２００１-１５１７９９号公報
【特許文献４】特開２００１−２２６２８４号公報
【特許文献５】国際公開０３／０２０２８１号パンフレット
【非特許文献１】ツーリ  ユー，リナ(Linna, Tuuli U)、他５名、イクスペリメンタル  アイ  リサーチ（Experimental Eye Research）１９９８年、６６巻、ｐ.７５５−７６３
【非特許文献２】ツーリ  ユー，リナ（Linna, Tuuli U）、他６名、インベスティゲイティブ  オフサルモロジー  アンド  ビジュアル  サイエンス（Investigative Ophthalmology & Visual Sciences），２０００年， ４１巻， ｐ．３９３−３９７
【非特許文献３】ロバート  ティー，アング（Robert T. Ang）、他２名、 カレント  オピニオン  オブ  オフサルモロジー（Current Opinion of Ophthalmology）, ２００１年, １２巻,ｐ．３１８−３２２
【非特許文献４】アング(Ang R.T.)、他２名、カレント  オピニオン  オフサルモロジー（Current Opinion Ophthalmology、２００１年、１２巻、ｐ３１８−３２２
【非特許文献５】ソロモン(Solomon R.)他２名、ザ  オキュラー  サーフィス  ２００４年、２巻、ｐ３４−４２
【非特許文献６】サイド(Said, S. I.)、他１名、サイエンス(Science)（米国）１９７０年、１６９巻、ｐ.１２１７−１２１８
【非特許文献７】ダルト(Dartt, D. A.)、他３名、アメリカン  ジャーナル  オブ  フイジオロジー、１９８４年、２４７巻、ｐ.Ｇ５０２−５０９
【非特許文献８】宮田(Miyata, A)、他７名、バイオケミカル  アンド  バイオフィジカル  リサーチ  コミュニケーションズ(Biochemical and biophysical communications)、１９８９年、１６４巻、ｐ.５６７−５７４
【非特許文献９】ボードリー(Vaudry, D)、他５名、ファーマコロジカル  レビューズ (Pharmacological Reviews)、２０００年、５２巻、ｐ.２６９−３２４
【非特許文献１０】アリムラ(Arimura, A)、他６名、アニュアルズ  オブ  ニューヨーク  アカデミー  オブ  サイエンス(Annuals of New York Academy of Science)、１９９４年、７３９巻、ｐ.２２８−２４３
【非特許文献１１】ドイシュ(Deutsch P.J.)、他１名、ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー(The Journal of Biological Chemistry)、１９９２年、２６７巻、ｐ.５１０８−５１１３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、レーザー角膜切削形成術（レーシック；ＬＡＳＩＫ）や角膜移植などの角膜手術後の角膜知覚低下、あるいは角膜神経変性疾患に伴う角膜知覚機能低下、および角膜知覚機能低下に伴うドライアイ症状や角膜上皮傷害を改善する医薬を提供し、また、ドライアイ患者におけるドライアイ症状、角膜知覚機能低下や角膜上皮傷害を改善する医薬を提供し、さらに角膜上皮傷害とそれに伴う角膜知覚機能低下とドライアイ症状を改善する医薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、角膜手術後の角膜知覚低下やドライアイにおける角膜知覚低下症状を改善する新しいタイプの医薬を提供することを目的に検討を行ったところ、ＰＡＣＡＰならびにＰＡＣＡＰの溶液状態における安定性を高められた新規の誘導体(以下、ＰＡＣＡＰ誘導体と称することがある。）が三叉神経（以後、角膜神経ということもある。）細胞の神経突起形成促進効果と、それによる角膜知覚改善効果を有し、さらに涙液分泌促進効果と、角膜上皮創傷治癒作用をも有することを初めて見出した。これらの知見に基づいてさらに研究をすすめ、ＰＡＣＡＰおよびＰＡＣＡＰ誘導体を角膜神経突起形成促進、角膜知覚改善、ドライアイ治療および角膜上皮傷害治療のための医薬として利用する本発明を完成した。【０００９】
すなわち、本発明は、
（１）ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ誘導体または製剤学的に許容されるそれらの塩を含有する角膜神経突起形成促進剤、
（２）ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ誘導体または製剤学的に許容されるそれらの塩を含有する角膜知覚改善剤、
（３）ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ誘導体または製剤学的に許容されるそれらの塩を含有するドライアイ治療剤、
（４）ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ誘導体または製剤学的に許容されるそれらの塩を含有する角膜上皮傷害治療剤、
（５）ＰＡＣＡＰ誘導体が、下記式(Ｉ)
His-Ser-Asp-Ala-X1-Phe-Thr-X2-X3-Tyr-X4-Arg-X5-Arg-X6-Gln-X7-Ala-Val-X8-X9-Tyr-Leu-Ala-Ala-X10-X11-X12  (Ｉ)
(式中、 X1は、ValまたはIle；
X2は、Asp、AlaまたはGlu；
X3は、AsnまたはSer；
X4は、ThrまたはSer；
X5は、LeuまたはTyr；
X6,X8,X9はLysまたはArg；
X7は、LeuまたはNle；
X10は、Ile、Valまたは化学結合；
X11は、Leu、Leu-Asn、Leu-Gly、Leu-Gly-Lys、Leu-Gly-Arg、Leu-Gly-Lys-Lys、Leu-Gly-Lys-Arg、Leu-Gly-Arg-Arg、Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys-Gln-Arg-Val-Lys-Asn-Lys、Leu-Gly-Arg-Arg-Tyr-Arg-Gln-Arg-Val-Arg-Asn-Argまたは化学結合；
X12はC末端アミノ酸のα位カルボキシ基修飾を表し、-NH2または-OHを示す。)
で示されるペプチドのうち、Ｎ末端より少なくとも２３残基からなるペプチド（配列番号１〜１４）または製剤学的に許容されるその塩である上記（１）記載の角膜神経突起形成促進剤、
（６）ＰＡＣＡＰ誘導体が、上記式(Ｉ)で表されるペプチドのうち、Ｎ末端より少なくとも２３残基からなるペプチドまたは製剤学的に許容されるその塩である上記（２）記載の角膜知覚改善剤、
（７）ＰＡＣＡＰ誘導体が、上記式(Ｉ)で表されるペプチドのうち、Ｎ末端より少なくとも２３残基からなるペプチドまたは製剤学的に許容されるその塩である上記（３）記載のドライアイ治療剤、
（８）ＰＡＣＡＰ誘導体が、上記式(Ｉ)で表されるペプチドのうち、Ｎ末端より少なくとも２３残基からなるペプチドまたは製剤学的に許容されるその塩である上記（４）記載の角膜上皮傷害治療剤、
（９）ＰＡＣＡＰ誘導体が、上記式(Ｉ)において、X1がIle、X2がAsp、X3がSer、X4がSer、X5がTyr、X6、X8およびX9がArg、X7がLeu、X10がVal、X11がLeu-Gly-Arg-Argであるペプチドである上記（５）記載の角膜神経突起形成促進剤、
（１０）ＰＡＣＡＰ誘導体が、上記式(Ｉ)において、X1がIle、X2がAsp、X3がSer、X4がSer、X5がTyr、X6、X8およびX9がArg、X7がLeu、X10がVal、X11がLeu-Gly-Arg-Argであるペプチドである上記（６）記載の角膜知覚改善剤、
（１１）ＰＡＣＡＰ誘導体が、上記式(Ｉ)において、X1がIle、X2がAsp、X3がSer、X4がSer、X5がTyr、X6、X8およびX9がArg、X7がLeu、X10がVal、X11がLeu-Gly-Arg-Argであるペプチドである上記（７）記載のドライアイ治療剤、
（１２）ＰＡＣＡＰ誘導体が、上記式(Ｉ)において、X1がIle、X2がAsp、X3がSer、X4がSer、X5がTyr、X6、X8およびX9がArg、X7がLeu、X10がVal、X11がLeu-Gly-Arg-Argであるペプチドである上記（８）記載の角膜上皮傷害治療剤、
（１３）ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ誘導体または製剤学的に許容されるそれらの塩の角膜神経突起形成促進剤製造における使用。
（１４）ＰＡＣＡＰ誘導体が、上記式(Ｉ)で示されるペプチドのうち、Ｎ末端より少なくとも２３残基からなるペプチドまたは製剤学的に許容されるその塩である上記（１３）記載の使用、
（１５）ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ誘導体または製剤学的に許容されるそれらの塩の角膜知覚改善剤製造における使用、
（１６）ＰＡＣＡＰ誘導体が、上記式(Ｉ)で示されるペプチドのうち、Ｎ末端より少なくとも２３残基からなるペプチドまたは製剤学的に許容されるその塩である上記（１５）記載の使用、
（１７）ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ誘導体または製剤学的に許容されるそれらの塩のドライアイ治療剤製造における使用、
（１８）ＰＡＣＡＰ誘導体が、上記式(Ｉ)で示されるペプチドのうち、Ｎ末端より少なくとも２３残基からなるペプチドまたは製剤学的に許容されるその塩である上記（１７）記載の使用、
（１９）ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ誘導体または製剤学的に許容されるそれらの塩の角膜上皮傷害治療剤製造における使用、
（２０）ＰＡＣＡＰ誘導体が、上記式(Ｉ)で示されるペプチドのうち、Ｎ末端より少なくとも２３残基からなるペプチドまたは製剤学的に許容されるその塩である上記（１９）記載の使用、
（２１）ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ誘導体または製剤学的に許容されるそれらの塩の有効量を、角膜神経突起形成促進の必要な対象に投与することを特徴とする角膜神経突起形成促進方法、
（２２）ＰＡＣＡＰ誘導体が、上記式(Ｉ)で示されるペプチドのうち、Ｎ末端より少なくとも２３残基からなるペプチドまたは製剤学的に許容されるその塩である上記（２１）記載の方法、
（２３）ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ誘導体または製剤学的に許容されるそれらの塩の有効量を、角膜知覚改善の必要な対象に投与することを特徴とする角膜知覚改善方法、
（２４）ＰＡＣＡＰ誘導体が、上記式(Ｉ)で示されるペプチドのうち、Ｎ末端より少なくとも２３残基からなるペプチドまたは製剤学的に許容されるその塩である上記（２３）記載の方法、
（２５）ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ誘導体または製剤学的に許容されるそれらの塩の有効量を、ドライアイ治療の必要な対象に投与することを特徴とするドライアイ治療方法、
（２６）ＰＡＣＡＰ誘導体が、上記式(Ｉ)で示されるペプチドのうち、Ｎ末端より少なくとも２３残基からなるペプチドまたは製剤学的に許容されるその塩である上記（２５）記載の方法、
（２７）ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ誘導体または製剤学的に許容されるそれらの塩の有効量を、角膜上皮傷害治療の必要な対象に投与することを特徴とする角膜上皮傷害治療方法、
（２８）ＰＡＣＡＰ誘導体が、上記式(Ｉ)で示されるペプチドのうち、Ｎ末端より少なくとも２３残基からなるペプチドまたは製剤学的に許容されるその塩である上記（２７）記載の方法などに関するものである。【００１０】
ここで、「角膜神経」とは、知覚神経である三叉神経の支配をうけ角膜周囲に形成される輪状神経叢、角膜実質に網目上に分布する実質内神経叢、ボーマン膜直下で形成される上皮下神経叢、ボーマン膜を貫通したところで形成される基底細胞神経叢および神経線維をいう。本発明における「神経突起」とは、ニューロン（神経細胞）の細胞体から出る突起（樹状突起および軸索）をいい、「形成」とは、細胞体から前記神経突起が生成および／または伸展することをいう。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＰＡＣＡＰまたはＰＡＣＡＰ誘導体を含有する医薬は、三叉神経細胞の神経突起形成促進作用、角膜知覚改善作用、涙液分泌促進作用および角膜上皮創傷治癒促進作用を有することから、１）角膜神経の損傷などに伴う角膜知覚機能低下の改善および角膜知覚機能低下に伴うドライアイ症状や角膜上皮傷害の改善に有用であり、また、２）ドライアイ患者のドライアイ症状、角膜知覚機能低下および角膜上皮傷害の改善に有用であり、さらに、３）角膜上皮傷害とそれに伴う角膜知覚機能低下とドライアイ症状の改善に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】試験例１における、培養ウサギ三叉神経細胞の蛍光顕微鏡像示す。(Ａ)無添加群、(Ｂ)ＰＡＣＡＰ２７（1 μM）添加群および(Ｃ)ペプチド１７（1 μM）添加群の細胞を示す。Bar = 100 μm
【図２】グラフは、試験例１における、全細胞数中に占める神経突起形成細胞の比率（％）を示す。縦軸は、全細胞に占める神経突起形成細胞の割合を示す。図中***は無添加群に対する有意差（ｐ<0.001）を示す。
【図３】試験例２における、ウサギ角膜知覚の経時変化を示す。図中*および**は対照群に対する有意差（*:ｐ<0.05、**:ｐ<0.005）を示す。
【図４】試験例３における、ウサギ摘出涙腺におけるタンパク分泌率の時間経過を示す。図中*は対照群に対する有意差（ｐ<0.05）を示す。
【図５】試験例４の培養ウサギ三叉神経細胞の蛍光顕微鏡像示す。(Ａ)無添加群、(Ｂ)ＰＡＣＡＰ２７（1 μＭ）添加群および(Ｃ)ペプチド２４（1 μＭ）添加群の細胞を示す。図中のバーは100 μmを示す。
【図６】試験例４において、ＰＡＣＡＰ２７およびペプチド２４による神経突起形成促進作用の結果を示す。縦軸は、全細胞に占める神経突起形成細胞の比率(％)を示す。図中*は無添加群に対する有意差を示す（ｐ<0.05、各群3例、平均値±標準偏差）。
【図７】試験例５のウサギ摘出涙腺からのタンパク分泌率を示す。図中*は対照群に対する有意差を示す（ｐ<0.05、各群3例、平均値±標準誤差）。
【図８】試験例６のウサギ涙液分泌変化量の経時変化を示す。図中*は対照群に対する有意差を示す（ｐ<0.05、各群10例、平均値±標準誤差）。
【図９】試験例７におけるウサギの角膜神経切断前後の角膜知覚の推移を示す。縦軸は角膜知覚測定に用いた角膜知覚計のナイロンフィラメントの長さを、横軸は角膜フラップ作製（角膜神経切断）後の経過時間(週)を示す。測定値は各測定時点での平均値（対照群は8例、ペプチド24点眼群は7例）±標準誤差として表示し、＊は対照群に対する有意差を示す（ｐ<0.05）。
【図１０】試験例８における培養ヒト角膜上皮細胞にペプチド24またはPACAP27を添加したときの細胞の増殖を示す。縦軸は対照群の細胞数に対する被験物質添加群の細胞数の割合(％)を示す。図中，*は対照群に対する有意差を示す(平均値±標準誤差、ｎ＝8〜16，ｐ＜0.05)。
【図１１】試験例９におけるウサギ角膜上皮創傷治癒の経過を示す。縦軸は残存角膜上皮欠損面積(%)を、横軸は時間（hours）を示す。10μMおよび100μM  PACAP２７点眼群は対照群に対して有意差を示した（* p < 0.05, vs. 対照群、Dunnett-test、平均値 ± 標準偏差、N = 4 ：対照群および100 μM PACAP27群 、N = 5 ：10 μM PACAP27群）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明で使用されるペプチドの中で、ＰＡＣＡＰは、ＰＡＣＡＰ２７(配列番号１５)またはＰＡＣＡＰ３８(配列番号１６)のペプチドであり、ＰＡＣＡＰ誘導体は、ＰＡＣＡＰを構成するアミノ酸の一部を他のアミノ酸で置換、もしくは挿入または削除したペプチドを指すが、具体的には、一般式(Ｉ)で示されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその製剤学的に許容される塩がより好ましい。一般式(Ｉ)に含まれるペプチドのＮ末端はアミノ基でもよいが、必要に応じて化学修飾できる。また、ＰＡＣＡＰ（Kitada, C et al., Peptide Chemistry 1990, 239-244, 1991)およびＶＩＰ（Onoue, S et al., Eur. Journal Pharmacol. 485:307-16, 2004)の活性最小単位はＮ末端より２３残基であるので、本ＰＡＣＡＰ誘導体に関してＮ末端より少なくとも２３残基を保持していることを条件とする。一般式(Ｉ)に含まれるペプチドの代表例を表１に示した。ここに示したペプチド１〜２４は、配列番号１７〜４０に対応するペプチドである。ただし、ペプチド１、１３、１５、２２、２３はＮ末端より２３残基に相当するペプチドであり、ペプチド４、１９、２３はＮ末端アミノ基にアセチル基が、そしてペプチド５のＮ末端アミノ基にはステアロイル基が結合している。これらペプチドの中で、より好ましいペプチドは、ペプチド１、３、１２、１４、１６、１７、２０、２２および２４であり、とりわけ好ましくはペプチド１７および２４である。【００１４】
【表１】
2005102375.tif 000002
【００１５】
本発明の化合物の製剤学的に許容される塩としては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等とのアルカリ土類金属との塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩；トリメチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン等の有機塩基との塩；塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等の無機酸との塩；ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸との塩；およびタンニン酸、カルボキシメチルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等の重合酸との塩などが挙げられる。【００１６】
本発明で使用されるペプチドは、特に限定するものではないが、公知のペプチド合成の常法に従って合成できる。例えば「ザ．ペプチド(The Peptides)」第1巻(1966年) [Schreder and Luhke 著、Academic Press, New York, U.S.A.] 、あるいは「ペプチド合成」［泉屋ら著、丸善株式会社(1975年)］の記載に従い、具体的には、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法（P-ニトロフェニルエステル法、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル法、シアノメチルエステル法など）、ウッドワード試薬Ｋを用いる方法、カルボイミダゾール法、酸化還元法、ＤＣＣ−アディティブ（ＨＯＮＢ、ＨＯＢｔ、ＨＯＳｕ）法など、各種の方法により合成することができる。これらの方法は、固相合成及び液相合成のいずれにも適用できる。【００１７】
本発明においてペプチド合成は、上記のような一般的なポリペプチドの合成法に従って、例えば末端アミノ酸に順次１個ずつアミノ酸を縮合させるいわゆるステップワイズ法によって、または数個のフラグメントに分けてカップリングさせていく方法により行われる。
例えばステップワイズ法による固相合成は、具体的には、メリフィールド（Merrifield. R.B.）の方法 [Solid phase peptide synthesis, J.Amer.Chem.Soc., 85, 2149-2159 (1963)]に従い、以下のようにして行うことができる。まず、Ｃ末端アミノ酸（アミノ基を保護したもの）をそのカルボキシル基によって不溶性樹脂に結合させ、その後、該Ｃ末端アミノ酸のアミノ基の保護基を除去する。次いで、得られたこの遊離の反応性アミノ基に、目的とするペプチドのアミノ酸配列に従って、アミノ基を保護したアミノ酸の反応性カルボキシル基を縮合反応により順次結合させる。このようにして一段階ずつ全配列を合成した後、ペプチドを不溶性樹脂からはずす。【００１８】
上記の固相合成において用いられる不溶性樹脂は、反応性カルボキシル基との結合性を有するものであればいずれをも使用でき、例えばベンズヒドリルアミン樹脂（BHA樹脂）、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、アミノメチル樹脂、メチルベンズヒドリル樹脂（MBHA樹脂）、４−アミノメチルフェノキシメチル樹脂、４−ヒドロキシメチルフェノキシメチル樹脂、４−オキシメチルフェニルアセタミドメチル樹脂などが挙げられる。【００１９】
また、α−アミノ基の保護基として９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Fmoc)を使用する場合は４−ヒドロキシメチルフェノキシメチル樹脂など、トリフルオロ酢酸(TFA)によってペプチドを樹脂から脱離させることができるものがよく、ｔ−ブトキシカルボニル基(Boc)を使用する場合は４−オキシメチルフェニルアセタミドメチル樹脂（PAM樹脂）など、フッ化水素などによってペプチドを樹脂から脱離させることができるものがよい。樹脂1g当りのペプチド濃度は0.5mmole以下とすることが好ましい。【００２０】
上記の方法においては、アミノ酸のペプチド結合に関与するアミノ基への保護基の結合及び該保護基の脱離、ならびにアミノ酸のペプチド結合に関与するカルボキシル基の活性化が必要である。【００２１】
アミノ基の保護基として、例えば、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｔ−ブトキシカルボニル（Boc）、ｔ−アミノオキシカルボニル（Aoc）、イソボニルオキシカルボニル、p-メトキシベンジルオキシカルボニル、２−クロル−ベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、o-ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイルなどの基が挙げられる。【００２２】
また、アミノ酸の中で、側鎖に官能基を有するもの、例えばHis、Tyr、Thr、Lys、Asp、Arg及びSerは、その側鎖の官能基を保護しておくのが好ましい。官能基の保護は、通常用いられている方法で、下記のような通常の保護基を結合させることにより行われ、反応終了後、該保護基は脱離される。
Hisのイミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシメチル（Bom）、p-トルエンスルホニル（Tos)、ベンジル（Bzl）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、トリチル基などが挙げられる。
Ser及びThrの水酸基は、例えばエステル化またはエーテル化によって保護することができるが、この保護は必須ではない。エステル化に適する基としては、アセチルなどの低級アルカノイル基、ベンゾイルなどのアロイル基、ベンゾイルオキシカルボニル、エチルオキシカルボニルなどの炭酸から誘導される基などが挙げられる。またエーテル化に適する基としては、ベンジル（Bzl）、テトラヒドロピラニル、tert−ブチル基などが挙げられる。
Tyrの水酸基の保護基としては、例えばベンジル（Bzl）、ブロモベンジルオキシカルボニル（Br-Z) 、ジクロロベンジル（Cl2-Bzl) 、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、アセチル、p-トルエンスルホニル（Tos)基などが挙げられる。
Lysのアミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、クロロベンジルオキシカルボニル（Cl-Z) 、ジクロロベンジル（Cl2-Bzl)、ｔ−ブトキシカルボニル基（Boc）、p-トルエンスルホニル（Tos）基などが挙げられる。
Argのグアニジノ基の保護基としては、例えばp-トルエンスルホニル（Tos）、ニトロ、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｔ−アミルオキシカルボニル（Aoc）基などが挙げられる。
Aspのカルボキシル基の保護は、例えばベンジルアルコール、メタノール、エタノール、tert−ブタノール、シクロヘキシル(cHex)などによるエステル化により行われる。
その他のアミノ酸の保護基として、Trpのインドリル基の保護基としては、例えばホルミル、カルボベンゾキシル、4-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル、2,2,2-トリクロロエチルオキシカルボニルなどが挙げられるが、この保護は必須ではない。
Metのチオメチル基の保護基としては予めメチルスルホキシドにしておき、後に還元する方法があるが、この保護は必須ではない。【００２３】
一方、カルボキシル基の活性化は、従来公知の方法にて行うことができ、用いられる試薬なども公知のものから適宜選択し得る。例えば、カルボキル基の活性化は、該カルボキシル基と種々の試薬とを反応させ、対応する酸クロライド、酸無水物または混合酸無水物、アジド、活性エステル（ペンタクロロフェノール、p-ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等とのエステル）などを形成させることにより行う。【００２４】
上記の固相における反応性アミノ基と反応性カルボキシル基との縮合反応（ペプチド結合形成反応）に用いる溶媒としては、ペプチド結合形成に使用できるものであればいずれでもよい。例えば無水または含水のジメチルホルムアミド（DMF）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、ジクロロメタン（DCM）、テトラヒドロフラン（THF）、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドン、ヘキサメチルリン酸トリアミド（HMPA）などを単独で、あるいは２種以上の混合溶媒として使用することができる。
また、上記縮合反応は、縮合剤、例えばジシクロヘキシルカルボキシイミド（DCC）、カルボジイミダゾールなどのカルボジイミド試薬やテトラエチルピロホスフェイト、ベンゾトリアゾール−Ｎ−ヒドロキシトリスジメチルアミノホスホニウムヘキサフルオロリン化物塩（Bop試薬）などの存在下に行うこともできる。【００２５】
合成されたペプチドは、通常の方法に従い脱塩、精製することができる。例えば、DEAE−セルロースなどのイオン交換クロマトグラフィー、セファデックスLH-20 、セファデックスG-25などの分配クロマトグラフィー、シリカゲルなどの順相クロマトグラフィー、ODS−シリカゲルなどの逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどが挙げられる。【００２６】
本発明の医薬は、哺乳動物（例えば、ヒト、サル、ラット、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）や鳥類(例えば、ニワトリ、ハト、七面鳥など)において、角膜神経突起形成を促進させ、角膜知覚機能低下、ドライアイ症状および角膜上皮傷害を改善する治療薬として有用である。すなわち、角膜神経が傷害、切断または欠損することによって低下した角膜知覚を改善し、また角膜知覚低下に伴うドライアイ症状や角膜上皮傷害を改善する治療薬として有用であり、さらに、角膜知覚障害と関係なく生起するドライアイ症状や角膜傷害を改善する治療薬としても有用である。例えば、白内障手術やＰＲＫ、ＬＡＳＩＫ、ＬＡＳＥＫ(ラゼック；Laser epithelial keratomileusis、Jutta Horwath-Winter et al. J Cataract Refract Surg 30:2316-2321, 2004)または角膜移植手術などの角膜手術に際して低下した角膜知覚機能を、あるいは神経麻痺性角膜症、角膜潰瘍、糖尿病角膜症などの角膜神経変性疾患に伴って、低下した角膜知覚機能を改善させる治療薬として、また、角膜知覚低下に伴うドライアイや角膜上皮傷害の治療薬として有用である。さらに、涙液減少症、シェーグレン症候群、乾性角結膜炎、スティーブ−ジョンソン症候群などの患者のドライアイ症状、また、角膜上皮糜爛、眼瞼縁炎、眼類天疱瘡、春季カタル、アレルギー性結膜炎などの疾患や、ＶＤＴ（Visual Display Terminal）作業に伴うドライアイ症状と、ドライアイに伴う角膜知覚低下と角膜上皮傷害を改善する治療薬として有用である。また、角膜潰瘍、角膜上皮糜爛、糖尿病角膜症、眼瞼縁炎、眼類天疱瘡、春季カタル、アレルギー性結膜炎などに伴う角膜上皮傷害と、角膜上皮傷害に伴うドライアイと角膜知覚低下を改善する治療薬として有用である。【００２７】
本発明の医薬は、全身的または局所的に投与される。全身的には経口投与の他、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射など非経口的にも投与される。局所的には、眼に投与される。【００２８】
本発明の医薬は、粉末、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、坐剤などの固形剤、およびシロップ剤、注射剤、点眼剤などの液剤などの製剤形態の医薬組成物とすることができる。顆粒剤および錠剤として製造する場合には、例えば賦形剤（乳糖、白糖、ブドウ糖、デンプン、結晶セルロースなど）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウムなど）、崩壊剤（デンプン、カルメロースナトリウム、炭酸カルシウムなど）、結合剤（デンプン糊液、ヒドロキシプロピルセルロース液、カルメロース液、アラビアゴム液、ゼラチン液、アルギン酸ナトリウム液など）などを用いることにより任意の剤形を製造することができる。また、顆粒剤および錠剤には、適当なコーティング剤（ゼラチン、白糖、アラビアゴム、カルナバロウなど）、腸溶性コーティング剤（例えば酢酸フタル酸セルロース、メタアクリル酸コポリマー、ヒドロキシプロピルセルロースフタレート、カルボキシメチルエチルセルロースなど）などで剤皮を施してもよい。【００２９】
カプセル剤として製造する場合には、適当な賦形剤、例えば流動性と滑沢性を向上させるためのステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、軽質無水ケイ酸など、また加圧流動性のための結晶セルロースや乳糖などの他、上記崩壊剤などを適宜添加したものを均等に混和または粒状としたもの、もしくは粒状としたものに適当なコーティング剤で剤皮を施したものを充填するか、適当なカプセル基剤（ゼラチンなど）にグリセリンまたはソルビトールなどを加えて塑性を増したカプセル基剤で被包成形することもできる。これらカプセル剤には必要に応じて、着色剤、保存剤［二酸化イオウ、パラベン類（パラオキシ安息香酸メチル、エチル、プロピルエステル）］などを加えることができる。カプセル剤は通常のカプセルの他、腸溶性コーティングカプセル、胃内抵抗性カプセル、放出制御カプセルとすることもできる。腸溶性カプセルとする場合、腸溶性コーティング剤でコーティングした化合物または化合物に上記の適当な賦形剤を添加したものを通常のカプセルに充填または、カプセル自身を腸溶性コーティング剤でコーティング、もしくは腸溶性高分子を基剤として成形することができる。【００３０】
坐剤として製造する場合には坐剤基剤（例えばカカオ脂、マクロゴールなど）を適宜選択して使用することができる。【００３１】
シロップ剤として製造する場合、例えば安定剤（エデト酸ナトリウムなど）、懸濁化剤（アラビアゴム、カルメロースなど）、矯味剤（単シロップ、ブドウ糖など）、芳香剤などを適宜選択して使用することができる。【００３２】
本発明の医薬を注射剤または点眼剤として製造する場合、医薬上許容される添加物、例えば等張化剤（塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、エリスリトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコールなど）、緩衝剤（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液など）、保存剤（パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂など）、増粘剤（ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースなど）、安定化剤（亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエンなど）、ｐＨ調整剤（塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸など）などを適宜添加した溶液に溶解または分散することによって製造することができる。【００３３】
上記シロップ剤、注射剤および点眼剤における添加剤の添加量は、添加する添加剤の種類、用途などによって異なるが、添加剤の目的を達成し得る濃度を添加すればよく、等張化剤は、通常、浸透圧が約２２９〜約３４３ｍＯｓｍとなるよう、約０．５〜約５．０ｗ／ｖ％を添加する。また、緩衝剤は約０．０１〜約２．０ｗ／ｖ％程度、増粘剤は約０．０１〜約１．０ｗ／ｖ％程度、安定化剤は約０．００１〜約１．０ｗ／ｖ％程度になるように添加する。ｐＨ調整剤は、適宜添加し、通常ｐＨ約３〜約９、好ましくはｐＨ約４〜約８になるようにする。【００３４】
特に点眼剤として使用する場合、ペプチドの濃度は、通常下限は約０．００００１ｗ／ｖ％、約０．００００５ｗ／ｖ％または約０．０００１ｗ／ｖ％であり、上限は約０．１ｗ／ｖ％、約０．０５ｗ／ｖ％、約０．０１ｗ／ｖ％、約０．００５ｗ／ｖ％または約０．００１ｗ／ｖ％に調製される。【００３５】
本発明における、ペプチドの投与量は対象となる疾患、症状、投与対象、投与方法などにより異なるが、例えばＬＡＳＩＫ手術後の角膜知覚改善剤として成人の眼に局所的に適用する場合には、例えばペプチドを約０．００１ｗ／ｖ％含有する点眼液を、１回約２０〜約５０μＬ、１日数回点眼するのがよい。【００３６】
本発明の医薬は、本発明の目的を損なわない限り、他の薬効成分と併用することもできる。
本発明を以下の実施例にしたがい、さらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３７】
ペプチドの合成
配列番号１９に示すアミノ酸配列を有するペプチド３をペプチド固相合成の常法に従い製造した。
MBHA 樹脂 HCl 塩 (ポリスチレン-1% ジビニルベンゼン共重合体，100〜200 mesh) をマニュアル合成用反応槽（ガラス製，φ6.0 x 29.5 cm）に加え、樹脂容量の 2〜3 倍量のメタノールで攪拌洗浄し、次いでジクロロメタン（樹脂容量の 2〜3 倍量）で攪拌洗浄して樹脂を膨潤させた。10% トリエチルアミン/ジクロロメタンにて中和反応を行い、C 末端アミノ酸に相当する Boc-Arg (Tos)-OH を樹脂の約2倍当量用い、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよび N-ハイドロキシベンゾトリアゾールを加えて縮合反応を行った。約2時間の反応（攪拌下）後、メタノールおよびジクロロメタンにて洗浄し、カイザー試験にてα-アミノ基の消失を確認後、50% トリフルオロ酢酸/ジクロロメタンにて30分間処理して脱保護を行った。次いで、10% トリエチルアミン/ジクロロメタンにて中和し、メタノールおよびジクロロメタンにて再洗浄後、再びカイザー試験を実施して脱保護反応の確認を行った。確認後はC末より2番目の Boc-Arg (Tos)-OH のカップリングを行うため、同様の工程を繰り返した。その後、Boc-Gly-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Tyr (Cl2-Bzl)-OH, Boc-Arg (Tos)-OH, Boc-Arg (Tos)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln (Xan)-OH, Boc-Arg (Tos)-OH, Boc-Arg (Tos)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Arg (Tos)-OH, Boc-Thr (Bzl)-OH, Boc-Tyr (Cl2-Bzl)-OH, Boc-Asn (Xan)-OH, Boc-Asp (OcHex)-OH, Boc-Thr (Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Val-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHex)-OH, Boc-Ser (Bzl)-OH, Boc-His (Bom)-OH の順に順次カップリング/脱保護を行い、ペプチド３に相当する保護ペプチド; His (Bom)-Ser (Bzl)-Asp (OcHex)-Ala-Val-Phe-Thr (Bzl)-Asp (OcHex)-Asn-Tyr (Cl2-Bzl)-Thr (Bzl)-Arg (Tos)-Leu-Arg (Tos)-Arg (Tos)-Gln-Leu-Ala-Val-Arg (Tos)- Arg (Tos)-Tyr (Cl2-Bzl)-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Arg (Tos)-Arg (Tos)-MBHA を得た。ここで得られた保護ペプチド-MBHA 樹脂にエタンジチオールおよびアニソール存在下で無水フッ化水素を加えて反応させた。反応後、無水フッ化水素を減圧下留去後、残渣をエーテルで洗浄し、これに 10%酢酸を加えてペプチドを抽出した。抽出液を逆相カラムクロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥を行いペプチド３を得た。【００３８】
上記方法と同様にして、下記のＰＡＣＡＰ２７、ＰＡＣＡＰ３８およびペプチド１〜２４を化学合成した。
ＰＡＣＡＰ２７（配列番号１５）：
His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-NH2
ＰＡＣＡＰ３８（配列番号１６）：
His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys-Gln-Arg-Val-Lys-Asn-Lys-NH2
ペプチド１（配列番号１７）：
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-NH2
ペプチド２（配列番号１８）：
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Asn-NH2
ペプチド３（配列番号１９）：
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Arg-Arg-NH2
ペプチド４（配列番号２０）：
Acetyl-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Arg-Arg-NH2
ペプチド５（配列番号２１）：
Stearoyl-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Arg-Arg-NH2
ペプチド６（配列番号２２）：
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Arg-Arg-OH
ペプチド７（配列番号２３）：
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Nle-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Arg-Arg-NH2
ペプチド８（配列番号２４）：
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-NH2
ペプチド９（配列番号２５）：
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Lys-NH2
ペプチド１０（配列番号２６）：
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Arg-NH2
ペプチド１１（配列番号２７）：
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Lys-Arg-NH2
ペプチド１２（配列番号２８）：
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Arg-Arg-NH2
ペプチド１３（配列番号２９）：
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-NH2
ペプチド１４（配列番号３０）：
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Ala-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Arg-Arg-NH2
ペプチド１５（配列番号３１）：
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Ala-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-NH2
ペプチド１６（配列番号３２）：
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Arg-Arg-NH2
ペプチド１７（配列番号３３）：
His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Arg-Arg-OH
ペプチド１８（配列番号３４）：
His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Arg-Arg-NH2
ペプチド１９（配列番号３５）：
Acetyl-His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Arg-Arg-NH2
ペプチド２０（配列番号３６）：
His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Arg-Arg-Tyr-Arg-Gln-Arg-Val-Arg-Asn-Arg-NH2
ペプチド２１（配列番号３７）：
His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Arg-Arg-Tyr-Arg-Gln-Arg-Val-Arg-Asn-Arg-NH2
ペプチド２２（配列番号３８）：
His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-NH2
ペプチド２３（配列番号３９）：
Acetyl-His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-NH2
ペプチド２４(配列番号４０)
His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Arg-Arg-NH2
【試験例１】
【００３９】
培養ウサギ三叉神経細胞における神経突起形成促進作用（１）
１．使用動物
北山ラベスより購入した日本白色種ウサギ（生後２〜３日）を使用した。
２．被験物質
ＰＡＣＡＰ２７およびペプチド１７
３．試験方法
1)細胞培養
ウサギ三叉神経細胞の単離はChanらの報告を参考にして行った（Kwan Y. Chan and Richard H. Haschke. Exp. Eye Res. 41: 687-699, 1985）。すなわち、エーテル麻酔下、生理食塩水で心臓灌流を施した後、三叉神経節を切り出し、神経分散液（住友ベークライト）を用いて三叉神経節を分散させ、三叉神経細胞を調製した。細胞培養にはNeurobasal 培地 (Invitrogen Corp.)にB27 Supplement (Invitrogen Corp., 最終濃度 2 % v/v)およびL-グルタミン (Invitrogen Corp., 最終濃度 1 mM)を添加した培養液を用い、培養条件は、5 % CO2, 95 % 空気, 100 % 湿度, 37 ℃とした。細胞は、24ウェルプレート中に浸漬したポリリジン／ラミニンコーティング済みカバーグラス（住友ベークライト）上に約3×103細胞／ウェルとなるよう播種した。培養液中には、ＰＡＣＡＰ２７（最終濃度１μM）またはペプチド１７（最終濃度１μM）を添加し、無添加群を対照とした。
2)染色
４８時間培養終了後のウサギ三叉神経細胞は４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で２時間固定した。神経細胞体および神経突起を構成するニューロフィラメントを特異的に認識する抗ニューロフィラメント200抗体（Sigma）、および、これと反応する蛍光二次抗体（Molecular Probes社）を用いて、固定した標本を蛍光染色した。染色された細胞を蛍光顕微鏡下で観察し、細胞像をコンピュータに画像として取り込んだ。
3)画像解析
培養ウサギ三叉神経細胞の神経突起形成の程度を評価するために、コンピュータに取り込んだ染色細胞の最長の神経突起長および細胞体長径を画像解析ソフト（Image-Pro Plus ver.4.0, Planetron. Inc.）を用いて、各群につき３ウェルの細胞を計測した。細胞体長径の2倍以上長さの神経突起を有する細胞を神経突起形成細胞として、その細胞数の全細胞数に占める比率（%）を算出した(Otori Y, Wei JY, Barnstable CJ. Invest. Ophthalmol Vis Sci (1998) 39, 972-981)。
【００４０】
４．試験結果
図１は、培養ウサギ三叉神経細胞の蛍光顕微鏡像であり、それぞれ、(Ａ)無添加群、(Ｂ)ＰＡＣＡＰ２７添加群および(Ｃ)ペプチド１７添加群の細胞を示す。長く伸展した神経突起が蛍光免疫染色される神経突起形成細胞は無添加群ではほとんど観察されないのに対し、ＰＡＣＡＰ２７およびペプチド１７添加群では神経突起形成細胞がより多く観察された。
図２は、各添加群における全細胞数中に占める神経突起形成細胞の比率(％)を示すグラフである。神経突起形成細胞の比率は、対照群で24.1％、ＰＡＣＡＰ２７添加群で59.5％、ペプチド１７添加群で54.1％であった。統計学的解析の結果、ＰＡＣＡＰ２７およびペプチド１７添加群は無添加群に対して有意な突起形成促進作用が認められた（N = 3，平均値±標準偏差、***： p<0.001 vs 無添加群；Dunnettの多重比較検定）。
以上の結果より、ＰＡＣＡＰ２７およびペプチド１７は培養ウサギ三叉神経細胞の神経突起形成促進作用を有することが明らかにされた。
【試験例２】
【００４１】
マイクロケラトームを用いたウサギ角膜知覚低下に対する改善効果（１）
１．使用動物
北山ラベスより購入した体重1.5 〜 2.0 kgの日本白色種ウサギを使用した。動物は、入荷後から試験終了日まで、室温23 ± 3℃、湿度55 ± 10%、12時間照明（8:00点灯、20:00消灯）に設定された飼育室内で1ケージあたり1匹収容して飼育した。動物には固型飼料（ラボRストック、日本農産工業）を1日100 g制限給餌し、水道水を自由に摂取させた。
２．被験物質
被験物質としてＰＡＣＡＰ２７を用いた。被験物質は以下に示す基剤に10 μＭ(約0.003％)となるように溶解し、点眼液を調製した。対照群には被験物質を含まない下記基剤を点眼投与した。
2005102375.tif 000003
３．試験方法
1）群分け
点眼投与前日に動物の前眼部肉眼観察とフルオレセインによる角膜染色斑の観察を行ない、それらに異常が認められないウサギを選定し、点眼開始前にCochet-Bonnet角膜知覚計（LUNEAU 社製）を用いて角膜知覚の初期値を測定した。角膜知覚の初期値が均一になるようにSAS 前臨床パッケージ（Version 5.0, SAS Institute Japan）を用いて多変数によるブロック化割付け手法により群分けした。
2）角膜フラップの作製
動物にセラクタール(2%キシラジン)：ケタラール(5%ケタミン)＝0.5：１混合液の筋肉内注射（0.9 mL/kg）を行なって全身麻酔を施し、眼球を十分に露出した。マイクロケラトーム(MK2000、ニデック社)を用い(Arbelaez MC. et al. J. Refract Surg. 2002 May-jun; 18(3 Suppl):S357-60 )、ウサギ眼用アダプターを吸引リング内側に装着した。130μｍ厚のブレードを使用し、直径8.5 mmの角膜フラップを作製した。顕微鏡下で角膜フラップを確実に元の位置に戻し、フラップの位置が動かないように動物を観察しながら麻酔から覚醒させた。
3）投与
被験物質点眼液および基剤は、角膜フラップ作製当日から８週間点眼投与した。点眼投与は、手術眼に対して2時間間隔で1日4回、マイクロピペットを用いて1回あたり50 μLずつとした。手術後一週間は1日4回の点眼の際に、同時に0.3%オフロキサシン点眼液（タリビッド点眼液、参天製薬）を投与した。
4）角膜知覚測定
Cochet-Bonnet 角膜知覚計を用いて、手術後1週目から8週目まで毎週一回角膜知覚を測定した。なお、測定者には測定するウサギがいずれの投与群に属するか分からないように、測定はブラインドで実施した。
5）統計解析
統計解析には2群のt検定法（SAS前臨床パッケージ；Version 5.0, SAS Institute Japan）を用い、危険率5%未満を有意であると判定した。
【００４２】
４．試験結果
図３に角膜知覚の経時変化を示している。角膜知覚は、Cochet-Bonnet角膜知覚計のナイロンフィラメント（直径0.12 mm）の先を角膜中央部に接触させた時に瞬目反応を示すフィラメントの最長の長さで示されるが、その長さを図３の縦軸に表示した。手術後1週目に、基剤点眼群およびＰＡＣＡＰ２７点眼群で角膜知覚の急激な低下が認められたが、その後は基剤点眼群およびＰＡＣＡＰ２７点眼群とも緩やかな角膜知覚の回復が認められた。各測定時点でのＰＡＣＡＰ２７点眼群の角膜知覚を基剤点眼群の角膜知覚と比較した結果、点眼3、4、5週目と8週目にＰＡＣＡＰ２７点眼群の角膜知覚は有意に高かった（n=6〜7、平均値±標準偏差、*;p<0.05, **;p<0.005 、t-検定）。
レーザー角膜切削形成術（ＬＡＳＩＫ）では、マイクロケラトームを用いて作製した角膜フラップ（角膜片）を折り返して角膜実質を表出し、エキシマレーザー照射により角膜実質を切削して屈折矯正を行った後、角膜フラップを元の位置に戻す。本試験はこのマイクロケラトームを用いたウサギ角膜知覚低下モデルにおける効果を検討したものであり、以上の試験結果より、ＰＡＣＡＰ２７が角膜知覚低下の回復を促進させる作用を有することが明らかにされた。
【試験例３】
【００４３】
摘出涙腺からのタンパク分泌促進作用（１）
ウサギ摘出涙腺にＰＡＣＡＰ２７またはペプチド１７を処置し、分泌されるタンパク量の増加に及ぼす薬理効果を検討した。
１．被験物質溶液の調製
ａ）塩化ナトリウム（137.92g）、塩化カリウム（7.01g）、塩化カルシウム・２水和物（3.53g）および塩化マグネシウム・6水和物（1.2g）に精製水を加え、全量を1000mLとした（溶液1）。また、リン酸2水素カリウム（8.17g）に精製水を加え、全量を500mLとした（溶液2）。精製水900mLに溶液1（50mL）および溶液2（10mL）を加え、グルコース2.07gおよび炭酸水素ナトリウム2.1gを溶解し、全量を1000mL（pH 約7.4）とし、これを培養液とした。培養液には95％酸素および5％二酸化炭素の混合ガスを通気した。
ｂ）培養液にＰＡＣＡＰ２７またはペプチド１７を10-7Ｍの濃度になるように溶解し、これを被験物質溶液とした。薬物の対照として、ムスカリン作動作用のあるカルバコール(ナカライテスク)を10-４Ｍの濃度になるように溶解した液を用いた（カルバコール添加群）。対照群には何も添加しない培養液を用いた。
２．涙腺切片標品の作製
雄性日本白色ウサギに全身麻酔を施し、腹大動脈より灌流液（116mM 塩化ナトリウム、5.4mM 塩化カリウムを含む）を灌流し、主涙腺組織を摘出して脂肪結合組織を除去した後、2等分した（1片は約40mg）。この涙腺組織切片を各ウェルに培養液0.5mLを満たした24ウェルプレートに移し、37℃でインキュベーションした。20分毎に3回培養液を交換して合計60分間置き、定常状態の涙腺切片標品とした。
３．実験方法
ａ）定常状態にした切片標品を用い、新たな培養液0.5ｍＬと交換し、37℃で20分間インキュベーションした。この培養液を採取し、タンパク質染色試薬(DC Protein assay reagent, Bio Rad)を加えタンパク量を測定し、湿重量1ｍｇ当たりのタンパク分泌量に換算した。この時のタンパク量をタンパク分泌率100％とし、処置前の分泌率とした。
ｂ）a）におけるインキュベーション後の切片標品の培養液を被験物質溶液0.5ｍＬと交換し、20分間隔で合計5回、交換・採取した。採取した液にタンパク染色試薬を加えてタンパク量を測定した。対照群の切片標品は培養液を同様に交換してタンパク量を測定した。
【００４４】
４．結果
実験結果を図４に示した。縦軸は処置前を１００％とするウサギ摘出涙腺におけるタンパク分泌率(ｎ＝6、平均値±標準誤差)を、横軸は時間経過を示す。カルバコールを処置した群では、0-20分にピークとなる有意なタンパク分泌率の増加を示した。一方、10-7ＭのＰＡＣＡＰ２７あるいはペプチド１７を処置した群では、タンパク分泌率は処置開始20分以降、有意に増加し、処置後40分から60分の間で最大となり(*;ｐ<0.05、Dunnett多重比較検定)、カルバコール添加群に比べて、その作用がより長く持続した。対照群ではこのようなタンパク分泌率の増加は認められなかった。
以上の結果から、摘出涙腺において、ＰＡＣＡＰ２７およびペプチド１７は優れたタンパク分泌促進作用を有していることが示された。すなわち、ＰＡＣＡＰ２７およびペプチド１７は涙液分泌促進作用を有し、ドライアイの治療に有用である。
【試験例４】
【００４５】
培養ウサギ三叉神経細胞の神経突起形成促進作用（２）
１．使用動物
北山ラベスより購入した日本白色種ウサギ（生後２〜３日）を使用した。
２．被験物質
ＰＡＣＡＰ２７およびペプチド２４
３．試験方法
1)細胞培養
ウサギ三叉神経細胞の単離はChanらの報告を参考にして行った（Kwan Y. Chan and Richard H. Haschke. Exp. Eye Res. 41: 687-699, 1985）。すなわち、エーテル麻酔下、生理食塩水で心臓灌流を施した後、三叉神経節を切り出し、神経分散液（住友ベークライト）を用いて三叉神胞節を分散させ、三叉神経細胞を調製した。細胞培養にはNeurobasal medium (Invitrogen Corp.)にB27 Supplement (Invitrogen Corp., 最終濃度 2 % v/v)およびL-Glutamine (Invitrogen Corp., 最終濃度 1 mM)を添加した培養液を用い、培養条件は、5 % CO2, 95 % 空気, 100 % 湿度, 37 ℃とした。細胞は、24ウェルプレート中に浸漬したポリリジン／ラミニンコーティング済みカバーグラス（住友ベークライト）上に約3×103細胞／ウェルとなるよう播種した。培養液中には、ＰＡＣＡＰ２７（最終濃度0.1μＭ、１μＭ）またはペプチド２４（最終濃度0.1μＭ、１μＭ）を添加し、無添加群を対照とした。
2)染色
４８時間培養終了後のウサギ三叉神経細胞は４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で２時間固定した。神経細胞体および神経突起を構成するニューロフィラメントを特異的に認識する抗ニューロフィラメント200抗体（Sigma）、および、これと反応する蛍光二次抗体（Molecular Probes社）を用いて、固定した標本を蛍光染色した。染色された細胞を蛍光顕微鏡下で観察し、細胞像をコンピュータに画像として取り込んだ。
3)画像解析
培養ウサギ三叉神経細胞の神経突起形成の程度を評価するために、コンピュータに取り込んだ染色細胞の最長の神経突起長および細胞体長径を画像解析ソフト（Image-Pro Plus ver.4.0, Planetron. Inc.）を用いて、各群につき３ウェルの細胞を計測した。細胞体長径の2倍以上長さの神経突起を有する細胞を神経突起形成細胞として、その細胞数の全細胞数に占める比率（%）を算出した (Otori Y, Wei JY, Barnstable CJ. Invest. Ophthalmol Vis Sci (1998) 39, 972-981)。
4）統計解析
統計解析にはDunnettの多重比較検定法（SAS前臨床パッケージ；Version 5.4, SAS Institute Japan）を用い、危険率５%未満を有意であると判定した。
【００４６】
４．試験結果
図５は、培養ウサギ三叉神経細胞の蛍光顕微鏡像であり、それぞれ、(Ａ)無添加群、(Ｂ)ＰＡＣＡＰ２７添加群および(Ｃ)ペプチド２４添加群の細胞を示す。無添加群では伸長した神経突起を有する神経突起形成細胞が少ないのに対し、ペプチドＰＡＣＡＰ２７およびペプチド２４添加群では神経突起形成細胞が多く観察された。
図６は、各添加群での全細胞数中に占める神経突起形成細胞の比率(％)を示すグラフである。神経突起形成細胞の比率は、対照群で20.7％、ＰＡＣＡＰ２７の0.1μＭおよび１μＭの各添加群で37.6％と51.1％、ペプチド２４の0.1μＭおよび１μＭの各添加群で42.5％および51.4％であった。統計学的解析の結果、ＰＡＣＡＰ２７およびペプチド２４添加群は無添加群に対して有意な突起形成細胞の増加作用が認められた。
以上の結果より、ＰＡＣＡＰ２７およびペプチド２４は培養ウサギ三叉神経細胞の神経突起形成促進作用を有することが明らかとなった。
【試験例５】
【００４７】
摘出涙腺からのタンパク分泌促進作用（２）
ウサギから摘出した涙腺をＰＡＣＡＰ２７またはペプチド２４を含む溶液中でインキュベートした際に分泌されるタンパク量の変化を、涙腺刺激作用として検討した。
１．使用動物
福崎養兎組合より購入した体重1.5 〜 2.0 kgの日本白色種ウサギを使用した。動物は、入荷後から試験終了日まで、室温23 ± 3℃、湿度55 ± 10%、12時間照明（8:00点灯、20:00消灯）に設定された飼育室内で1ケージあたり1匹収容して飼育した。動物には固型飼料（ラボRストック、日本農産工業）を1日100ｇ制限給餌し、水道水を自由に摂取させた。
２．被験物質
被験物質としてＰＡＣＡＰ２７およびペプチド２４を用いた。被験物質溶液は以下のとおり調製した。
1）塩化ナトリウム（137.92g）、塩化カリウム（7.01g）、塩化カルシウム・２水和物（3.53g）および塩化マグネシウム・6水和物（1.2g）に精製水を加え、全量を1000mLとした（溶液1）。また、リン酸2水素カリウム（8.２４g）に精製水を加え、全量を500mLとした（溶液2）。精製水900mLに溶液1（50mL）および溶液2（10mL）を加え、グルコース2.07gおよび炭酸水素ナトリウム2.1gを溶解し、全量を1000mL（pH 約7.4）とし、これをインキュベート溶液とした。
2）インキュベート溶液にＰＡＣＡＰ２７またはペプチド２４を10-7Ｍの濃度になるように溶解し、これを被験物質溶液とした。薬物の対照として、ムスカリン作動作用のあるカルバコール(ナカライテスク)を10-４Ｍの濃度になるように溶解したインキュベート溶液を用いた。対照群には何も添加しないインキュベート溶液を用いた。各インキュベート溶液は、試験前にあらかじめ95％酸素および5％二酸化炭素の混合ガスを通気しておいた。
３．試験方法
1）涙腺切片標品の調製
動物に全身麻酔を施し、腹大動脈より灌流液（116ｍＭ塩化ナトリウム、5.4ｍＭ 塩化カリウムを含む）を灌流した後、主涙腺組織を摘出して脂肪結合組織を除去し、これを2等分した（1片は約40mg）。この涙腺組織切片を各ウェルにインキュベート溶液0.5mLを満たした24ウェルプレートに移し、95％酸素および5％二酸化炭素の混合ガス通気条件下、37℃でインキュベーションした。20分毎に3回培養液を交換して合計60分間処置し、これを定常状態の涙腺切片標品とした。
2）分泌タンパク量の定量
定常状態にした切片標品を、新たなインキュベート溶液0.5ｍＬと交換し、95％酸素および5％二酸化炭素の混合ガス通気条件下、37℃で20分間インキュベーションした。インキュベーション終了後、この溶液を採取し、タンパク質染色試薬(DC Protein assay reagent, Bio Rad)を用いて溶液中に含まれるタンパク量を測定した。このタンパク量を試験開始前の摘出涙腺切片標品からのタンパク分泌量とした。続いて、インキュベート溶液を被験物質を含むインキュベート溶液0.5ｍＬに交換し、95％酸素および5％二酸化炭素の混合ガス通気条件下、37℃で60分間インキュベーションした。このインキュベート溶液を採取し、これに含まれるタンパク量を測定した。対照群およびカルバコール群の切片標品も同様にインキュベート溶液をそれぞれのインキュベート溶液に交換し、95％酸素および5％二酸化炭素の混合ガス通気条件下、37℃で60分間インキュベーションし、このインキュベート溶液に含まれるタンパク量を測定した。インキュベート溶液のタンパク量は、涙腺切片標品の湿重量1ｍｇ当たりのタンパク分泌量に換算した。試験開始前のタンパク分泌率を100％として被験物質を含むインキュベート溶液でインキュベーションした後のタンパク分泌率を算出し、被験物質によるタンパク分泌促進作用を検討した。
3）統計解析
統計解析にはDunnettの多重比較検定法（SAS前臨床パッケージ；Version 5.4, SAS Institute Japan）を用い、危険率５%未満を有意であると判定した。
【００４８】
４．試験結果
試験結果を図７に示した。縦軸は処置前を100％とするウサギ摘出涙腺のタンパク分泌率を示す。カルバコール群、ＰＡＣＡＰ２７群あるいはペプチド２４群では、タンパク分泌率は薬剤無添加の対照群に比べて有意に増加した(*：ｐ＜０．０５)。
以上の結果から、ＰＡＣＡＰ２７およびペプチド２４は摘出涙腺からのタンパク分泌促進作用を有していることが示された。
【試験例６】
【００４９】
ウサギ涙液分泌促進作用
ＰＡＣＡＰ２７およびペプチド２４をウサギに点眼した際の涙液量の変化を検討した。
１．使用動物
北山ラベスより購入した体重1.5 〜 2.0 kgの日本白色種ウサギを使用した。動物は、入荷後から試験終了日まで、室温23 ± 3℃、湿度55 ± 10%、12時間照明（8:00点灯、20:00消灯）に設定された飼育室内で1ケージあたり1匹収容して飼育した。動物には固型飼料（ラボRストック、日本農産工業）を1日100ｇ制限給餌し、水道水を自由に摂取させた。
２．被験物質
被験物質としてＰＡＣＡＰ２７およびペプチド２４を用いた。被験物質は下記の基剤溶液に溶解し、各被験物質の濃度が０．１％となるように点眼液を調製した。また、対照群には基剤溶液を用いた。
基剤溶液処方：
リン酸二水素ナトリウム二水和物                          0.1g
塩化ナトリウム                                          0.9g
水酸化ナトリウム                                        適量
精製水                                                  適量            
100 mL (pH 7.0)
３．試験方法
被験物質点眼液あるいは基剤溶液の涙液分泌に対する作用は、ウサギの片眼にこれらを１回、50 μＬ点眼投与することにより分泌される涙液量を測定することにより検討した。涙液量はSchirmer法を用いて点眼8.5分前，点眼10分，20分，30分，60分，120分後の分泌量を測定した。すなわち、涙液量測定の7.5分前に0.4%塩酸オキシブプロカイン（ベノキシール点眼液；参天製薬（株））10 μＬを点眼して局所麻酔を施し、濾紙を用いて下眼瞼結膜嚢内の涙液を拭き取った後、シルメル試験紙（昭和薬品化工（株））を使用して1分間の涙液分泌量を測定した。点眼後の各時点での涙液分泌量と点眼前の涙液分泌量との差の値を被験物質による涙液の変化量として算出した。
４．統計解析
基剤点眼群および薬剤点眼群での涙液変化量の群間比較をDunnett多重比較検定法（SAS前臨床パッケージ；Version 5.4, SAS Institute Japan）を用いて行ない、危険率5%以下を有意であると判定した。
【００５０】
５．試験結果
図８に各点眼液をウサギへ点眼した際の分泌涙液の変化量を示した。基剤点眼群では点眼直後から点眼120分後まで涙液分泌量に大きな変動はなかった。ＰＡＣＡＰ２７点眼群では点眼の30分後および120分後に、また、ペプチド２４点眼群では点眼20分後以降120分後まで基剤点眼群に対して有意な涙液分泌量の増加が認められた。
以上の結果から、ＰＡＣＡＰ２７およびペプチド２４は涙液分泌促進作用を有していることが示され、これらは涙液減少型のドライアイ症状の改善に有用な薬剤となり得ることが明らかにされた。
【試験例７】
【００５１】
マイクロケラトームを用いたウサギ角膜知覚低下に対する改善効果（２）
１．使用動物
北山ラベスより購入した体重1.5 〜 2.0 kgの雄性日本白色種ウサギを使用した。動物は、入荷後から試験終了日まで、室温23 ± 3℃、湿度55 ± 10%、 12時間照明（8:00点灯、20:00消灯）に設定された飼育室内で1ケージあたり1匹収容して飼育した。動物には固型飼料（ラボRストック；日本農産工業(株)）を1日100g 制限給餌し、飲料として水道水を自由に摂取させた。
２．被験物質
被験物質としてペプチド２４を用いた。被験物質は下記の基剤に0.01%となるように溶解して点眼液を調製した。また、対照群には被験物質を含まない下記基剤を点眼投与した。
基剤組成
リン酸二水素ナトリウム二水和物                      0.1 g
塩化ナトリウム                                      0.9 g
水酸化ナトリウム                                    適量
精製水                                              適量   
全量                                            100 mL (pH 7)
３．試験方法
1）角膜フラップの作製
セラクタール（2% キシラジン）：ケタラール（5% ケタミン） ＝ 0.5 ： 1混合液の筋肉内注射（0.9 mL/kg）により動物に全身麻酔を施し、眼球を露出させた後、マイクロケラトーム（ニデック(株)）を用いて直径8.5 mmの角膜フラップを作製した。手術にはウサギ眼用のアダプターおよび130 μm厚のブレードを使用した。
2）点眼投与
被験物質点眼液および基剤の点眼は、角膜フラップ作製当日から8週間継続しておこなった。点眼液量は1回あたり50 μLとし、投与は1日4回、2時間間隔でおこなった。なお、角膜フラップ作製当日から1週間は、被験物質あるいは点眼基剤の1, 3回目点眼時に抗炎症剤としてニフラン点眼液（千寿製薬(株)）を、また、2, 4回目点眼時には抗菌剤として0.3％ガチフロキサシン点眼液（ガチフロ点眼液、千寿製薬）を各1滴、点眼した。
3）角膜知覚測定
Cochet-Bonnet 角膜知覚計を用いて、手術前および手術後1週目から8週目までの間の毎週1回、角膜知覚を測定した。
角膜知覚は角膜知覚計のナイロンフィラメントを角膜中央部に接触させた際の動物の瞬目により判定し、10回の角膜知覚計接触に対して5回以上の瞬目が確認された場合を角膜知覚有り、5回未満であった場合を角膜知覚無し、と判定した。この判定を3回繰り返し、2回以上角膜知覚有り、と判定できた最高値（角膜知覚計のナイロンフィラメントの最長値）を、その測定時点での個体の角膜知覚として記録した。なお、測定者に点眼群が判断できないよう、測定はブラインドで実施した。
４．統計学的解析
各時点での角膜知覚について、基剤点眼群と被験物質点眼群との比較をt-検定 (SAS前臨床パッケージ; Version 5.0, SAS Institute Japan) により解析し、危険率5%未満を有意であると判定した。
【００５２】
５．試験結果
図９は、角膜神経切断に伴う角膜知覚の低下、および、その後の角膜知覚の推移を示している。角膜フラップ作製の1週間後に、対照群およびペプチド24点眼群の両群で角膜知覚の急激な低下が認められた。その後、対照群では試験終了時まで角膜知覚がほとんど回復しなかったのに対し、ペプチド24点眼群では角膜知覚は緩やかに改善し、角膜フラップ作製7週後および8週後では、対照群に対して統計学的に有意な角膜知覚改善効果が認められた。以上の結果より、ペプチド２４が角膜知覚改善作用を有することが明らかにされた。
【試験例８】
【００５３】
培養角膜上皮細胞における増殖促進効果
１．使用細胞
正常ヒト角膜上皮細胞（クラボウ，Strain No.4C0466）を使用した。
２．被験物質および調製方法
被験物質としてペプチド24およびPACAP27を使用した。被験物質を最終濃度（10-5 M）の1000倍になるように蒸留水に溶解し，マウス上皮増殖因子不含の無血清ヒト角膜上皮細胞増殖用培地（EpiLife (−），クラボウ）で最終濃度の2倍になるように調製した。
３．試験方法
1）培養および被験物質添加
凍結保存正常ヒト角膜上皮細胞を融解後，定法に従い細胞を播種し，37℃，5% CO2下で7日間培養した。培養後，定法に従い細胞を採取し，EpiLife (−)で1.0×104個/mLになるように細胞を懸濁した。上記被験物質溶液を0.5 mL分注した24 ウエルプレートの各ウェルに細胞懸濁液0.5 mLを播種し（5.0×103個/well），8日間培養した。培地交換は48時間毎に行った。対照群には被験物質無添加のEpiLife (−)を使用した。
2）細胞数測定
培養終了後、24 well plateの培養上清を除去し，1.0 mLのEpiLife (−)で3回洗浄した。その後，Cell Counting Kit-8 (DOJINDO)のプロトコールに従って， MTT（3-(4,5-Dimethyl  -2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide）還元能により細胞数測定を行った。すなわち，24 ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルにEpiLife (−)を400 μLずつ注入した後，Cell Counting Kit-8溶液を各ウエルに40 uLずつ添加し，37℃，5% CO2下で2時間インキュベーション後，マイクロプレートリーダーを用い450 nmの吸光度を測定した。
４．統計学的解析
対照群，各被験物質添加群の吸光度の平均を算出し，対照群と各被験物質群間でDunnettの多重比較検定（片側）を行った。なお，有意水準は5％とした。
５．試験結果
細胞数の測定結果（MTT還元能）を図10に示した。縦軸は対照群の細胞数に対する被験物質添加群の細胞数の割合(％)を示す。８日間培養後のペプチド24添加群およびPACAP27添加群の細胞数は対照群のそれより高値を示し，対照群との間に有意差が認められた（p<0.05）。以上の結果から，PACAPおよびPACAP誘導体(ペプチド24)が角膜上皮細胞に作用し増殖促進作用を示すことが明らかにされた。
【試験例９】
【００５４】
ウサギ角膜上皮創傷治癒促進効果
１．使用動物
北山ラベスより購入した体重2.0 〜2.5 kgの雄性日本白色種ウサギを使用した。動物は、入荷後から試験終了日まで、室温23 ± 3℃、湿度55 ± 10 %、 12時間照明（8:00点灯、20:00消灯）に設定された飼育室内で1ケージあたり1匹収容して飼育した。動物には固型飼料（ラボRストック；日本農産工業(株)）を1日100g 制限給餌し、水道水を自由に摂取させた。
２．被験物質
被験物質としてPACAP27を用いた。被験物質は下記の基剤に10μMまたは100μMとなるように溶解して、被験物質点眼液を調製した。また、対照群には薬剤を含まない下記基剤を点眼投与した。
基剤組成
リン酸二水素ナトリウム二水和物                            0.1 g
塩化ナトリウム                                            0.9 g
水酸化ナトリウム                                          適量
精製水                                                    適量
全量                                              100 mL (pH 7)
３．試験方法
1）角膜フラップの作製
セラクタール（2 % キシラジン）：ケタラール（5 % ケタミン） ＝ 0.5 ： 1混合液の筋肉内注射（0.9 mL/kg）により動物に全身麻酔を施し、眼球を露出させた後、マイクロケラトーム（ニデック(株)）を用いて直径8.5 mmの角膜フラップを作製した。手術にはウサギ眼用のアダプターおよび130 μm厚のブレードを使用した。
2）角膜上皮欠損作製
フラップ作製後、角膜フラップを実体顕微鏡下で正確に元の位置に戻した。手術の1週後、ウサギに全身麻酔を施し、直径6 mmのろ紙にn-ヘプタノールを十分に浸透させ、余分なn-ヘプタノールを除いたものを角膜中央部に60秒間接触させて角膜上皮を剥離した。
3）点眼投与
被験物質点眼液および基剤の点眼は、角膜フラップ作製当日から角膜上皮創傷治癒完了まで継続しておこなった。動物は、基剤点眼（対照）群、10 μM PACAP27点眼群、100 μM PACAP27点眼群、にそれぞれ群分けした。点眼液量は1回あたり50 μL とし、投与は1日4回、2時間間隔でおこなった。なお、手術後の感染防止のために、フラップ形成術直後の一週間は、被験物質あるいは基剤を点眼する際に、0.3%ロメフロキサシン点眼液(ロメフロン、千寿製薬）を1滴、点眼投与した。
4）画像解析
角膜上皮剥離直後と上皮剥離の18, 24, 42および48時間後に、0.1 %フルオレセイン点眼により角膜上皮欠損部位を染色し、染色された角膜上皮欠損部位をフラッシュ部にコバルトフィルターを取り付けたスリットランプで撮影した。撮影した写真はコンピュータにデジタル画像として保存し、画像解析ソフト (Image-Pro Plus ver.4.0, Planetron. Inc.) を用いて染色された角膜上皮欠損部の面積を測定した。
４．統計学的解析
角膜上皮欠損作製直後の面積に対する各測定時点での角膜上皮欠損面積の割合（%）について、対照群と被験物質点眼群との比較をDunnett多重比較検定 (SAS前臨床パッケージ; Version 5.0, SAS Institute Japan) によって解析し、危険率5 %未満を有意であると判定した。
５．試験結果
図11にPACAP27点眼による角膜上皮創傷治癒の経過を示した。角膜上皮欠損面積の初期値を100%とし、各測定時点での残存角膜上皮欠損面積を%で表して角膜上皮創傷治癒の指標とした。時間の経過とともに各群の残存角膜上皮欠損面積は徐々に小さくなり、その程度はPACAP27点眼群の方が対照群よりも速やかであった。10 μM PACAP27点眼群では角膜上皮剥離24時間目、42時間目および48時間目に、また100 μM PACAP27点眼群では角膜上皮剥離24時間目に、対照群との間に残存角膜上皮欠損部面積の割合に有意な差が認められた。以上の結果よりPACAP27点眼による角膜上皮創傷治癒促進作用が明らかにされた。
【実施例２】
【００５５】
以下に製剤実施例を示す。
（製剤実施例１）錠剤
ペプチド１７                １０  ｍｇ
乳糖                        ８０  ｍｇ
デンプン                    １７  ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム      ３  ｍｇ
結晶セルロース              １０  ｍｇ  
以上の成分を１錠分の材料として、常法により錠剤を成形する。錠剤には必要に応じて通常用いられる腸溶性コーティング剤（例えばフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、糖衣およびフィルム（例えばエチルセルロース）を適用してもよい。【００５６】
（製剤実施例２）カプセル剤 
ＰＡＣＡＰ２７          ５０  ｍｇ
マンニトール            ７５  ｍｇ
デンプン                １７  ｍｇ
ステアリン酸カルシウム    ３  ｍｇ
以上の成分を１カプセル剤の材料として均一に混合し、常法により顆粒状とし、硬カプセルに充填する。この充填する前に必要に応じて顆粒には通常用いられる腸溶性コーティング剤（例えばフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、糖衣またはフィルム（例えばエチルセルロース）を適用してもよい。【００５７】
（製剤実施例３）注射剤
ＰＡＣＡＰ３８                          ７５０  ｍｇ
カルボキシメチルセルロースナトリウム    ５００  ｍｇ
注射用水                        全量    １００  ｍＬ
以上の成分を常法により無菌的に混和して注射剤を調製する。【００５８】
（製剤実施例４）点眼剤
ペプチド１７                                ５  ｍｇ
ホウ酸                                  ７００  ｍｇ
ホウ砂                                  適量（ｐＨ７．０）
塩化ナトリウム                          ５００  ｍｇ
ヒドロキシメチルセルロース              ０．５  ｇ
エデト酸ナトリウム                      ０．０５  ｇ
塩化ベンザルコニウム                    ０．００５ｇ
滅菌精製水                      全量    １００ｍＬ
滅菌精製水８０ｍＬを約８０℃まで加温し、ヒドロキシメチルセルロースを加えて攪拌し、液温を室温まで戻す。この液に、ペプチド１７、塩化ナトリウム、ホウ酸、エデト酸ナトリウムおよび塩化ベンザルコニウムを加えて溶解する。ホウ砂を適量加えてｐＨを７．０に調整する。滅菌精製水を加えて１００ｍＬまでメスアップする。【００５９】
（製剤実施例５）点眼剤
ＰＡＣＡＰ２７                          １０  ｍｇ
Ｄ−マンニトール                      ４．５  ｇ
リン酸二水素ナトリウム                ０．１  ｇ
水酸化ナトリウム                      適量（ｐＨ  ７．０）
滅菌精製水                     全量   １００ｍＬ
滅菌精製水８０ｍＬにＰＡＣＡＰ２７、Ｄ−マンニトール、リン酸二水素ナトリウムを加えて溶解する。水酸化ナトリウムを適量加えてｐＨを７．０に調整する。滅菌精製水を加えて１００ｍＬまでメスアップする。調製した点眼剤をメンブランフィルターで滅菌ろ過後、ディスポーザブル（ユニットドース）容器に充填、密封する。【００６０】
（製剤実施例６）点眼剤
ペプチド２４                              ５  ｍｇ
ホウ酸                                ７００  ｍｇ
ホウ砂                                適量（ｐＨ７．０）
塩化ナトリウム                        ５００  ｍｇ
ヒドロキシエチルセルロース            ０．２  ｇ
エデト酸ナトリウム                    ０．０５  ｇ
グルコン酸クロルヘキシジン            ０．００５ｇ
滅菌精製水                      全量  １００ｍＬ
滅菌精製水８０ｍＬを約８０℃まで加温し、ヒドロキシメチルセルロースを加えて攪拌し、液温を室温まで戻す。この液に、ペプチド２４、塩化ナトリウム、ホウ酸、エデト酸ナトリウムおよびグルコン酸クロルヘキシジンを加えて溶解する。ホウ砂を適量加えてｐＨを７に調整する。滅菌精製水を加えて１００ｍＬまでメスアップする。【００６１】
（製剤実施例７）点眼剤
ペプチド２４                              ０．０１ｇ
リン酸二水素ナトリウム二水和物            ０．１ｇ
塩化ナトリウム                            ０．９ｇ
水酸化ナトリウム                          適量
塩化ベンザルコニウム                      ０．００５ｇ
精製水                          全量  １００ｍＬ
精製水約９０ｍＬにリン酸二水素ナトリウム二水和物、塩化ナトリウム、塩化ベンザルコニウムを順次溶解する。この液に、ペプチド２４を加えて溶かし、攪拌しながら水酸化ナトリウムを加え、ｐＨを８．０に調整する。精製水を加えて１００ｍＬまでメスアップし、濾過滅菌する。【００６２】
（製剤実施例８）点眼剤
ペプチド２４                              ０．０１ｇ
酢酸ナトリウム三水和物                    ０．１ｇ
塩化ナトリウム                            ０．９ｇ
塩酸                                      適量
塩化ベンザルコニウム                      ０．００５ｇ
精製水                          全量  １００ｍＬ
精製水約９０ｍＬに酢酸ナトリウム三水和物、塩化ナトリウム、塩化ベンザルコニウムを順次溶解する。この液に、ペプチド２４を加えて溶かし、攪拌しながら塩酸を加え、ｐＨを５．０に調整する。精製水を加えて１００ｍＬまでメスアップし、濾過滅菌する。【００６３】
（製剤実施例９）点眼剤
ペプチド２４                              ０．０１ｇ
ＨＥＰＥＳ                                ０．１ｇ
塩化ナトリウム                            ０．９ｇ
水酸化ナトリウム                          適量
塩化ベンザルコニウム                      ０．００５ｇ
精製水                          全量  １００ｍＬ
精製水約９０ｍＬにＨＥＰＥＳ、塩化ナトリウム、塩化ベンザルコニウムを順次溶解する。この液に、ペプチド２４を加えて溶かし、攪拌しながら水酸化ナトリウムを加え、ｐＨを７．０に調整する。精製水を加えて１００ｍＬまでメスアップし、濾過滅菌する。
【配列表フリーテキスト】
【００６４】
配列番号１；Xaaは、ValまたはIle（存在位置：５）
配列番号１；Xaaは、Asp、AlaまたはGlu（存在位置：８）
配列番号１；Xaaは、AsnまたはSer（存在位置：９）
配列番号１；Xaaは、ThrまたはSer（存在位置：１１）
配列番号１；Xaaは、LeuまたはTyr（存在位置：１３）
配列番号１；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：１５）
配列番号１；Xaaは、LeuまたはNle（存在位置：１７）
配列番号１；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：２０）
配列番号１；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：２１）
配列番号１；Xaaは、Leu-NH2またはLeu-OH（存在位置：２３）
配列番号２；Xaaは、ValまたはIle（存在位置：５）
配列番号２；Xaaは、Asp、AlaまたはGlu（存在位置：８）
配列番号２；Xaaは、AsnまたはSer（存在位置：９）
配列番号２；Xaaは、ThrまたはSer（存在位置：１１）
配列番号２；Xaaは、LeuまたはTyr（存在位置：１３）
配列番号２；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：１５）
配列番号２；Xaaは、LeuまたはNle（存在位置：１７）
配列番号２；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：２０）
配列番号２；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：２１）
配列番号２；Xaaは、Ala-NH2またはAla-OH（存在位置：２４）
配列番号３；Xaaは、ValまたはIle（存在位置：５）
配列番号３；Xaaは、Asp、AlaまたはGlu（存在位置：８）
配列番号３；Xaaは、AsnまたはSer（存在位置：９）
配列番号３；Xaaは、ThrまたはSer（存在位置：１１）
配列番号３；Xaaは、LeuまたはTyr（存在位置：１３）
配列番号３；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：１５）
配列番号３；Xaaは、LeuまたはNle（存在位置：１７）
配列番号３；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：２０）
配列番号３；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：２１）
配列番号３；Xaaは、Ala-NH2またはAla-OH（存在位置：２５）
配列番号４；Xaaは、ValまたはIle（存在位置：５）
配列番号４；Xaaは、Asp、AlaまたはGlu（存在位置：８）
配列番号４；Xaaは、AsnまたはSer（存在位置：９）
配列番号４；Xaaは、ThrまたはSer（存在位置：１１）
配列番号４；Xaaは、LeuまたはTyr（存在位置：１３）
配列番号４；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：１５）
配列番号４；Xaaは、LeuまたはNle（存在位置：１７）
配列番号４；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：２０）
配列番号４；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：２１）
配列番号４；Xaaは、Ile-NH2、Ile-OH、Val-NH2またはVal-OH（存在位置：２６）
配列番号５；Xaaは、ValまたはIle（存在位置：５）
配列番号５；Xaaは、Asp、AlaまたはGlu（存在位置：８）
配列番号５；Xaaは、AsnまたはSer（存在位置：９）
配列番号５；Xaaは、ThrまたはSer（存在位置：１１）
配列番号５；Xaaは、LeuまたはTyr（存在位置：１３）
配列番号５；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：１５）
配列番号５；Xaaは、LeuまたはNle（存在位置：１７）
配列番号５；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：２０）
配列番号５；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：２１）
配列番号５；Xaaは、IleまたはVal（存在位置：２６）
配列番号５；Xaaは、Leu-NH2またはLeu-OH（存在位置：２７）
配列番号６；Xaaは、ValまたはIle（存在位置：５）
配列番号６；Xaaは、Asp、AlaまたはGlu（存在位置：８）
配列番号６；Xaaは、AsnまたはSer（存在位置：９）
配列番号６；Xaaは、ThrまたはSer（存在位置：１１）
配列番号６；Xaaは、LeuまたはTyr（存在位置：１３）
配列番号６；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：１５）
配列番号６；Xaaは、LeuまたはNle（存在位置：１７）
配列番号６；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：２０）
配列番号６；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：２１）
配列番号６；Xaaは、IleまたはVal（存在位置：２６）
配列番号６；Xaaは、Asn-NH2またはAsn-OH（存在位置：２８）
配列番号７；Xaaは、ValまたはIle（存在位置：５）
配列番号７；Xaaは、Asp、AlaまたはGlu（存在位置：８）
配列番号７；Xaaは、AsnまたはSer（存在位置：９）
配列番号７；Xaaは、ThrまたはSer（存在位置：１１）
配列番号７；Xaaは、LeuまたはTyr（存在位置：１３）
配列番号７；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：１５）
配列番号７；Xaaは、LeuまたはNle（存在位置：１７）
配列番号７；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：２０）
配列番号７；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：２１）
配列番号７；Xaaは、IleまたはVal（存在位置：２６）
配列番号７；Xaaは、Gly-NH2またはGly-OH（存在位置：２８）
配列番号８；Xaaは、ValまたはIle（存在位置：５）
配列番号８；Xaaは、Asp、AlaまたはGlu（存在位置：８）
配列番号８；Xaaは、AsnまたはSer（存在位置：９）
配列番号８；Xaaは、ThrまたはSer（存在位置：１１）
配列番号８；Xaaは、LeuまたはTyr（存在位置：１３）
配列番号８；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：１５）
配列番号８；Xaaは、LeuまたはNle（存在位置：１７）
配列番号８；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：２０）
配列番号８；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：２１）
配列番号８；Xaaは、IleまたはVal（存在位置：２６）
配列番号８；Xaaは、Lys-NH2またはLys-OH（存在位置：２９）
配列番号９；Xaaは、ValまたはIle（存在位置：５）
配列番号９；Xaaは、Asp、AlaまたはGlu（存在位置：８）
配列番号９；Xaaは、AsnまたはSer（存在位置：９）
配列番号９；Xaaは、ThrまたはSer（存在位置：１１）
配列番号９；Xaaは、LeuまたはTyr（存在位置：１３）
配列番号９；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：１５）
配列番号９；Xaaは、LeuまたはNle（存在位置：１７）
配列番号９；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：２０）
配列番号９；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：２１）
配列番号９；Xaaは、IleまたはVal（存在位置：２６）
配列番号９；Xaaは、Arg-NH2またはArg-OH（存在位置：２７）
配列番号１０；Xaaは、ValまたはIle（存在位置：５）
配列番号１０；Xaaは、Asp、AlaまたはGlu（存在位置：８）
配列番号１０；Xaaは、AsnまたはSer（存在位置：９）
配列番号１０；Xaaは、ThrまたはSer（存在位置：１１）
配列番号１０；Xaaは、LeuまたはTyr（存在位置：１３）
配列番号１０；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：１５）
配列番号１０；Xaaは、LeuまたはNle（存在位置：１７）
配列番号１０；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：２０）
配列番号１０；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：２１）
配列番号１０；Xaaは、IleまたはVal（存在位置：２６）
配列番号１０；Xaaは、Lys-NH2またはLys-OH（存在位置：３０）
配列番号１１；Xaaは、ValまたはIle（存在位置：５）
配列番号１１；Xaaは、Asp、AlaまたはGlu（存在位置：８）
配列番号１１；Xaaは、AsnまたはSer（存在位置：９）
配列番号１１；Xaaは、ThrまたはSer（存在位置：１１）
配列番号１１；Xaaは、LeuまたはTyr（存在位置：１３）
配列番号１１；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：１５）
配列番号１１；Xaaは、LeuまたはNle（存在位置：１７）
配列番号１１；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：２０）
配列番号１１；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：２１）
配列番号１１；Xaaは、IleまたはVal（存在位置：２６）
配列番号１１；Xaaは、Arg-NH2またはArg-OH（存在位置：３０）
配列番号１２；Xaaは、ValまたはIle（存在位置：５）
配列番号１２；Xaaは、Asp、AlaまたはGlu（存在位置：８）
配列番号１２；Xaaは、AsnまたはSer（存在位置：９）
配列番号１２；Xaaは、ThrまたはSer（存在位置：１１）
配列番号１２；Xaaは、LeuまたはTyr（存在位置：１３）
配列番号１２；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：１５）
配列番号１２；Xaaは、LeuまたはNle（存在位置：１７）
配列番号１２；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：２０）
配列番号１２；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：２１）
配列番号１２；Xaaは、IleまたはVal（存在位置：２６）
配列番号１２；Xaaは、Arg-NH2またはArg-OH（存在位置：３０）
配列番号１３；Xaaは、ValまたはIle（存在位置：５）
配列番号１３；Xaaは、Asp、AlaまたはGlu（存在位置：８）
配列番号１３；Xaaは、AsnまたはSer（存在位置：９）
配列番号１３；Xaaは、ThrまたはSer（存在位置：１１）
配列番号１３；Xaaは、LeuまたはTyr（存在位置：１３）
配列番号１３；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：１５）
配列番号１３；Xaaは、LeuまたはNle（存在位置：１７）
配列番号１３；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：２０）
配列番号１３；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：２１）
配列番号１３；Xaaは、IleまたはVal（存在位置：２６）
配列番号１３；Xaaは、Lys-NH2またはLys-OH（存在位置：３８）
配列番号１４；Xaaは、ValまたはIle（存在位置：５）
配列番号１４；Xaaは、Asp、AlaまたはGlu（存在位置：８）
配列番号１４；Xaaは、AsnまたはSer（存在位置：９）
配列番号１４；Xaaは、ThrまたはSer（存在位置：１１）
配列番号１４；Xaaは、LeuまたはTyr（存在位置：１３）
配列番号１４；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：１５）
配列番号１４；Xaaは、LeuまたはNle（存在位置：１７）
配列番号１４；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：２０）
配列番号１４；Xaaは、LysまたはArg（存在位置：２１）
配列番号１４；Xaaは、IleまたはVal（存在位置：２６）
配列番号１４；Xaaは、Arg-NH2またはArg-OH（存在位置：３８）
配列番号１５；Xaaは、Leu-NH2（存在位置２７）
配列番号１６；Xaaは、Lys-NH2（存在位置３８）
配列番号１７；Xaaは、Leu-NH2（存在位置２３）
配列番号１８；Xaaは、Asn-NH2（存在位置２８）
配列番号１９；Xaaは、Arg-NH2（存在位置３０）
配列番号２０；Xaaは、Acetyl-His（存在位置１）
配列番号２０；Xaaは、Arg-NH2（存在位置３０）
配列番号２１；Xaaは、Stearoyl-His（存在位置１）
配列番号２１；Xaaは、Arg-NH2（存在位置３０）
配列番号２２；Xaaは、Arg-OH（存在位置３０）
配列番号２３；Xaaは、Nle（存在位置１７）
配列番号２３；Xaaは、Arg-NH2（存在位置３０）
配列番号２４；Xaaは、Gly-NH2（存在位置２８）
配列番号２５；Xaaは、Lys-NH2（存在位置２９）
配列番号２６；Xaaは、Arg-NH2（存在位置２９）
配列番号２７；Xaaは、Arg-NH2（存在位置３０）
配列番号２８；Xaaは、Arg-NH2（存在位置３０）
配列番号２９；Xaaは、Leu-NH2（存在位置２３）
配列番号３０；Xaaは、Arg-NH2（存在位置３０）
配列番号３１；Xaaは、Leu-NH2（存在位置２３）
配列番号３２；Xaaは、Arg-NH2（存在位置３０）
配列番号３３；Xaaは、Arg-OH（存在位置３０）
配列番号３４；Xaaは、Arg-NH2（存在位置３０）
配列番号３５；Xaaは、Acetyl-His（存在位置１）
配列番号３５；Xaaは、Arg-NH2（存在位置３０）
配列番号３６；Xaaは、Arg-NH2（存在位置３８）
配列番号３７；Xaaは、Arg-NH2（存在位置３８）
配列番号３８；Xaaは、Leu-NH2（存在位置２３）
配列番号３９；Xaaは、Acetyl-His（存在位置１)
配列番号３９；Xaaは、Leu-NH2（存在位置２３）
配列番号４０；Xaaは、Arg-NH2（存在位置３０）
【図１】
2005102375.tif 000004
【図２】
2005102375.tif 000005
【図３】
2005102375.tif 000006
【図４】
2005102375.tif 000007
【図５】
2005102375.tif 000008
【図６】
2005102375.tif 000009
【図７】
2005102375.tif 000010
【図８】
2005102375.tif 000011
【図９】
2005102375.tif 000012
【図１０】
2005102375.tif 000013
【図１１】
2005102375.tif 000014
【配列表】
2005102375000001.app
【国際調査報告】
2005102375.tif 000015
2005102375.tif 000016
2005102375.tif 000017
2005102375.tif 000018
2005102375.tif 000019
2005102375.tif 000020