(57)【要約】  本発明は、多糖類からなる、細胞への核酸の導入を促進するための組成物を提供する。本発明はまた、細胞に核酸を導入する方法であって、前記核酸と多糖類とのポリイオンコンプレックスを形成し、前記ポリイオンコンプレックスを前記細胞に取り込ませることを含む方法を提供する。好ましくは、細胞は、骨髄間葉系幹細胞、神経系細胞株、脂肪組織由来幹細胞、免疫細胞、神経細胞、および軟骨細胞から選択される。また好ましくは、多糖類はカチオン化プルラン誘導体、カチオン化デキストラン誘導体またはカチオン化マンナン誘導体である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖類からなる、細胞への核酸の導入を促進するための組成物。
【請求項２】
細胞が、骨髄間葉系幹細胞、神経系細胞株、脂肪組織由来幹細胞、免疫細胞、神経細胞、軟骨細胞、上皮細胞、初代培養細胞および癌細胞から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
多糖類がカチオン化プルラン誘導体、カチオン化デキストラン誘導体またはカチオン化マンナン誘導体である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
細胞に核酸を導入する方法であって、前記核酸と多糖類とのポリイオンコンプレックスを形成し、前記ポリイオンコンプレックスを前記細胞に取り込ませることを含む方法。
【請求項５】
細胞が、骨髄間葉系幹細胞、神経系細胞株、脂肪組織由来幹細胞、免疫細胞、神経細胞、軟骨細胞、上皮細胞、初代培養細胞および癌細胞から選択される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
多糖類がカチオン化プルラン誘導体、カチオン化デキストラン誘導体またはカチオン化マンナン誘導体である、請求項４または５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞に核酸を導入するための多糖類からなる製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内への核酸の導入、その発現を高める技術は、基礎生物医学研究だけではなく、遺伝子治療、細胞移植治療のための細胞の遺伝子改変、再生医療などに対しても重要である。これまで、細胞への核酸の導入方法には、大きく分けて、ウイルスを用いる方法と用いない方法がある。ウイルスは、自らの生存のために、細胞内に取り込まれやすい、あるいは積極的に取り込まれるための特性を持っている。この特性を利用して、ウイルスを担体とした核酸の細胞内への取り込みが行われ、その高い取り込み効率が得られている。しかしながら、ウイルス自身のもつ免疫原性、毒性などに問題がある。そこで、ウイルスを用いない方法で、核酸を細胞内に取り込ませることが試みられている。【０００３】
物質の細胞内への取り込みには２つのメカニズムがある。１つは、細胞自身が定常的に液体を取り込む（ピノサイトシス、飲作用）によって、細胞周辺の液体中に存在している物質が細胞内に取り込まれるものである。もう１つは、細胞表面に存在している特定分子を認識して取り込むレセプター介在の取り込みメカニズムである。物質の取り込み効率の点では、後者が前者に比べて有意に高いことが知られている。【０００４】
飲作用の例としては、カチオン化された高分子あるいはリポソームなどの核酸の担体としての利用がある。これは、負電荷をもつ核酸を負電荷表面をもつ細胞と相互作用させ、細胞内部へ取り込ませることを目的として、ポリイオンコンプレックスにより核酸の負電荷を中和、その分子サイズを下げることが、その基本アイデアである。しかしながら、この方法では、細胞内への取り込みは、飲作用メカニズムによっているため、高い効率は望めない。リン酸カルシウム法などもあるが、この方法も、基本的には、カチオン化担体と同じメカニズムであり、効率も高くない。【０００５】
そこで、取り込み効率を上げるため、種々の物理刺激により、細胞膜の透過性を高めることが試みられている。例えば、エレクトロポレーション、ソノポレーションなど、電気刺激、超音波照射の利用により取り込み効率の向上が報告されている。また、遺伝子銃、マイクロインジェクションなどの利用も報告されている。これらの試みは、ある程度の取り込み増強効果を示してはいるが、すべての細胞に対して有効ではなく、特に胚体あるいは組織などの増殖・分化能力の優れた幹細胞および前駆細胞、あるいは、免疫細胞、神経細胞、軟骨細胞などのような特定の生物機能をもっているような細胞には、ほとんど効果がない。加えて、前述の非ウイルス性のカチオン化高分子およびリポソーム担体を利用しても、核酸を細胞内に導入することは難しい。【０００６】
そのため、非ウイルス担体の開発研究の方向性として、飲作用に比べて、取り込み効率の高い細胞表面レセプターの利用が考えられている。このレセプターには大きく分けて２つの種類がある。その１つは、タンパク質の特定アミノ酸配列を認識するものであり、もう１つは糖分子を認識するものである。【０００７】
アミノ酸配列を認識するレセプターを利用した核酸の細胞内への取り込み促進についての研究は多い。レセプターに認識されるアミノ酸配列を水溶性高分子、リポソーム、粒子、高分子ミセルなどの核酸担体に化学導入することで、担体のアミノ酸認識レセプターを介した核酸の細胞内の取り込みの増強が報告されている。またアミノ酸配列自身を結合させ高分子化した物質が細胞表面レセプターに効率よく相互作用することも知られている。【０００８】
一方、糖分子を認識するレセプターについては、単糖分子あるいは二糖分子を水溶性高分子に化学結合した核酸担体が合成され、糖認識レセプターを介した担体の取り込みによる核酸の取り込みの増強についての報告がある。しかしながら、単糖分子、二糖分子、三糖分子自身を結合させ、高分子化した多糖が核酸の細胞内への取り込みを増強させることは、これまでには全く報告されていない。細胞表面に存在する糖認識レセプターは、認識できる糖分子の種類により多くのタイプが存在する。例えば、グルコースは、細胞の生存に必須の物質であるため、それを効率よく取り込む目的で、多くの細胞の表面にはグルコースを認識するレセプターが存在している。マクロファージ、単球、リンパ球、樹状細胞などの免疫担当細胞には、ガラクトースあるいはマンノースなどを認識するレセプターが、骨髄細胞にはガラクトース認識レセプターが存在することが知られている。これらの糖認識レセプターが細胞表面に存在していることが知られているにもかかわらず、多糖を利用してそれらのレセプターを介した核酸の細胞内への取り込みに関する報告はない。糖レセプターのタイプは細胞によって異なるため、この違いを利用して核酸を特定の細胞内に取り込ませることが可能となる。例えば、肝の実質細胞はその細胞表面にガラクトース認識レセプターをもっている。ガラクトース認識レセプターに認識される多糖類であるプルランが、体内における核酸の肝臓へのターゲティング能力をもつことが報告されている。これは、プルランがガラクトース残基認識レセプターと相互作用する性質を使用して、静脈内に投与されたプルランを肝臓へ特異的に集積（ターゲティング）する報告である。肝臓における核酸の生物作用の発現の増強は、プルランと複合体化された核酸が肝臓へターゲティングされたことが理由であり、プルランによって、核酸の細胞内への取り込みが増強されたことについては言及していない。【０００９】
幹細胞、例えば、骨髄から採取できる造血系幹細胞、未分化間葉系幹細胞、あるいは脂肪、皮膚、筋肉、神経、肝臓、膵臓などの組織・臓器から採取できる組織幹細胞などは、体細胞とは異なり、核酸の取り込みの効率が低いことが知られている。現在まで、カチオン化高分子あるいはカチオン化リポソームを用いた核酸担体が研究開発され、市販されている。しかしながら、通常の細胞とは違って、これらの担体を利用して幹細胞への核酸の導入を試みても、ほとんどよい結果が得られていない。通常の細胞と幹細胞との間で導入効率の違いがある理由については、現在よくわかっていない。もう１つは、通常細胞に比べて、幹細胞はカチオン化担体と培養した場合に、弱りやすく死にやすい。これは、細胞表面の負電荷と核酸−担体複合体の正電荷が相互作用するため、細胞膜の流動性が悪くなり、細胞が死にやすいと考えられる。これに比べて、レセプターを介した核酸−担体と細胞との相互作用、取り込みでは、細胞膜の流動性に与える影響は少なく、その結果として、細胞毒性は低くなる。電気パルス、超音波照射などを与えて、細胞膜の核酸透過性を一過性に上昇させ、核酸の細胞内への導入を増強させる試みが行われているが、これらの物理的刺激も細胞に対する傷害性が高く、細胞の生存率が低いことが問題となっている。【００１０】
本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある：ＷＯ０１／３４２０６、特開２００３−１０４９１４。【００１１】
本発明は、細胞に核酸を効率的に導入するための新規な製剤を提供することを目的とする。
【発明の開示】
【００１２】
本発明者は、糖認識レセプターに認識される糖分子自身が結合してなる高分子、すなわち多糖類を用いて、細胞内へ核酸を導入することにより、細胞への核酸の取込効率が高まることを見いだした。
【００１３】
本発明は、多糖類からなる、細胞への核酸の導入を促進するための組成物を提供する。本発明はまた、細胞に核酸を導入する方法であって、前記核酸と多糖類とのポリイオンコンプレックスを形成し、前記ポリイオンコンプレックスを前記細胞に取り込ませることを含む方法を提供する。好ましくは、細胞は、骨髄間葉系幹細胞、神経系細胞株、脂肪組織由来幹細胞、免疫細胞、神経細胞、軟骨細胞、上皮細胞、初代培養細胞および癌細胞から選択される。また好ましくは、多糖類はカチオン化プルラン誘導体、カチオン化デキストラン誘導体、またはカチオン化マンナン誘導体である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、未分化間葉系幹細胞へのルシフェラーゼ遺伝子導入によるルシフェラーゼ活性を示す。
【図２】図２は、神経由来細胞株へのルシフェラーゼ遺伝子導入によるルシフェラーゼ活性を示す。
【図３】図３は、ヒト脂肪組織由来幹細胞へのルシフェラーゼ遺伝子導入によるルシフェラーゼ活性を示す。
【図４】図４は、ヒト樹状細胞に導入したＥＧＦＰ遺伝子の発現効率をＦＡＣＳで解析した結果である。
【図５】図５は、マウス骨髄幹細胞（ＭＳＣ）へのルシフェラーゼ遺伝子導入によるルシフェラーゼ活性を示す。
【図６】図６は、ルシフェラーゼ遺伝子の量を変化させ導入した場合のルシフェラーゼ活性を示す。
【図７】図７は、異なる分子量のプルランを用いてルシフェラーゼ遺伝子を導入した場合のルシフェラーゼ活性を示す。
【図８】図８は、異なる分子量のプルランにスペルミンの導入率を変化させ、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した場合のルシフェラーゼ活性を示す。
【図９】図９は、癌細胞へのルシフェラーゼ遺伝子導入によるルシフェラーゼ活性を示す。
【図１０】図１０は、癌細胞へのルシフェラーゼ遺伝子導入によるルシフェラーゼ活性を示す。
【図１１】図１１は、癌細胞へのルシフェラーゼ遺伝子導入によるルシフェラーゼ活性を示す。
【図１２】図１２は、幹細胞へのルシフェラーゼ遺伝子導入によるルシフェラーゼ活性を示す。
【図１３】図１３は、初代培養細胞へのルシフェラーゼ遺伝子導入によるルシフェラーゼ活性を示す。
【図１４】図１４は、肺胞上皮typeII  RLE6TNへのルシフェラーゼ遺伝子導入によるルシフェラーゼ活性を示す。
【図１５】図１５は、マウス腹腔マクロファージへのルシフェラーゼ遺伝子導入によるルシフェラーゼ活性を示す。
【図１６】図１６は、ラット腹腔マクロファージへのルシフェラーゼ遺伝子導入によるルシフェラーゼ活性を示す。
【図１７】図１７は、マウスＥＳ細胞へのルシフェラーゼ遺伝子導入によるルシフェラーゼ活性を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
糖認識レセプターは、大きく分けて、グルコース、マンノースおよびガラクトースなどの糖鎖を認識する３つが特によく知られている。これらのレセプターに結合させるための多糖としては、例えば、それぞれの糖が結合した高分子であるアミロース、アミロペクチンあるいはデキストラン、グルコマンナン、およびプルラン、ならびにこれらの各種誘導体などが考えられる。また、用いる多糖が糖認識レセプターに認識されれば、多糖自体の水溶性、非水溶性などの溶解性、分枝などの物理化学的な性質は、多糖を選択する際の条件にはならない。また、動物、植物、微生物などの多糖の由来に関係なく、あるいは遺伝子産物であっても、本発明の核酸担体として用いることができる。これらの多糖に核酸を結合させる方法としては、例えば、多糖にジアミン化合物を化学反応させて、アミノ基を導入することで、多糖をカチオン化する。この結合反応は公知の反応技術を利用することができる。すなわち、核酸の負電荷とポリイオンコンプレックスを形成するような、１，２，３あるいは４級アミノ基を多糖に化学導入する。ヒアルロン酸レセプター（ＣＤ４４）あるいはアセチルグルコサミンレセプターを介した細胞内への導入を期待する場合には、核酸担体としてヒアルロン酸あるいはキチン、キトサンなどを使うことができる。多糖担体としては、上述の多糖あるいはその誘導体を複数混合して、あるいは複合物として利用することもできる。多糖−核酸ポリイオンコンプレックスが糖認識レセプターを介して細胞内に取り込まれているか否かは、認識される単糖あるいは物質で細胞を処理し、糖認識レセプターをあらかじめブロックした後、核酸の取り込みが減少するか否かを評価することで確認できる。【００１６】
本発明においては、いずれの多糖も用いることができる。以下の記載に特に限定されるわけではないが、例えば、多糖として水溶性多糖類のプルランがある。プルランは、デンプンの部分加水分解物を原料としてAureobasidium  pullulans菌により発酵産生されるα−グルカンであり、ブドウ糖３個よりなるマルトトリオースがα−１，６結合で連鎖した直鎖状の水溶性高分子である。プルランは、細胞表面上に発現しているアシアロ糖タンパク質レセプターを介して細胞内に取り込まれることが知られている。種々の分子量の製品が市販されているが、本発明において用いられるプルランの分子量は、好ましくは、約２，０００−５００，０００、より好ましくは約２０，０００−１００，０００である。多糖の種類が変わっても、好ましい分子量は前述の範囲である。【００１７】
本発明において特に好ましくは、核酸とのポリイオンコンプレックスを形成させるために、プルランにカチオン基を導入したカチオン化プルラン誘導体、デキストランにカチオン基を導入したカチオン化デキストラン誘導体、またはマンナンにカチオン基を導入したカチオン化マンナン誘導体を用いる。カチオン化の工程は、生理条件下でカチオン化する官能基を導入し得る方法であれば特に限定されないが、プルラン分子上の水酸基に１、２または３級のアミノ基またはアンモニウム基を温和な条件下で導入する方法が好ましい。例えばエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−ジアミノプロパン等のアルキルジアミンや、トリメチルアンモニウムアセトヒドラジド、スペルミン、スペルミジンまたはジエチルアミド塩化物等を、種々の縮合剤、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、塩化シアヌル、Ｎ，Ｎ’−カルボジイミダゾール、臭化シアン、ジエポキシ化合物、トシルクロライド、ジエチルトリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ペンタン酸ジ無水物等のジ無水物化合物、トリシルクロリド等を用いて反応させることができる。特に、エチレンジアミンまたはスペルミンを反応させる方法が簡便且つ汎用性があり好適である。本発明において用いられるカチオン基の導入率は、多糖類に存在する水酸基に対して、スペルミンが導入された割合（モル％比）で表すと、好ましくは２％−９０％、より好ましくは５％−６０％、さらに好ましくは１０％−３０％である。多糖の種類が変わっても、好ましいモル％比は前述の範囲である。【００１８】
本発明において用いる核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ複合体、ＰＮＡ、ならびに、糖、リン酸または塩基に修飾を有するこれらの誘導体が含まれる。核酸の例としては、種々の疾患の治療に有用なタンパク質等をコードする遺伝子、これを含有するベクター、アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびデコイＤＮＡを挙げることができる。疾患の治療に必要なタンパク質等をコードする遺伝子としては、ホルモン等の低分子量ペプチド、あるいはインターフェロン、インターロイキン、サイトカイン、ケモカイン、細胞成長因子あるいはマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）類等のタンパク質、これらのタンパク質の生理活性部位の部分ペプチド等、またはこれらタンパク質およびペプチドの中和抗体およびレセプターのアゴニスト等の遺伝子が挙げられる。ホルモン等の低分子量ペプチドとしては、特に治療に好適なものであれば限定するものではないが、ＩＦＮ等のものが挙げられる。細胞成長因子の例としては、ｈＧＨ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＩＧＦ等、およびこれらのフラグメント、例えばＨＧＦの分子内断片であるＮＫ４が挙げられる。【００１９】
タンパク質をコードするＤＮＡは、既知の配列に基づいてゲノムまたはｃＤＮＡライブラリからクローニングにより入手してもよく、化学合成により製造してもよい。タンパク質をコードするＤＮＡは、導入された細胞内でそのタンパク質の機能が発現されることができるようにプラスミドベクター中に導入して用いる。プラスミドベクターは、細胞内でＤＮＡが転写され、それにコードされるタンパク質が適切に発現されるような様式で配列された、プロモーター領域、開始コドン、終止コドンおよびターミネーター領域等を含む。このようなプラスミドベクターは、当分野において入手可能な発現ベクターに所望のＤＮＡを適当な制限酵素部位を利用して挿入することによって容易に調製することができる。また、導入すべきＤＮＡの塩基配列に基づいて、合成、半合成の手段により調製することも可能である。プラスミドベクター中のプロモーターの種類、開始コドン、終止コドン、ターミネータ領域は特に限定されるものではない。【００２０】
本発明において用いられる核酸から発現されるタンパク質は、所望の活性を有する限り、そのアミノ酸配列中の1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されていてもよく、また同様に糖鎖が置換、欠失及び／又は付加されていてもよい。さらに、別のタンパク質またはそのフラグメントとの融合タンパク質として産生されてもよい。したがって、ＤＮＡはそのような改変型のタンパク質をコードするものであってもよい。このような改変型タンパク質をコードするＤＮＡを部位特異的突然変異法、遺伝子組換え法または合成法により作成する方法は当該技術分野においてよく知られている。【００２１】
多糖を利用して核酸を細胞内に取り込ませるためには、両者の複合体を作製することが必要である。この複合体の作製方法は、複合体の形成によって、多糖が細胞表面の糖認識レセプターと相互作用する性質が残っていれば、特に限定されることはない。例えば、正電荷と負電荷の相互作用を利用したポリイオンコンプレックス、あるいは水素結合、疎水性相互作用、配位結合などの物理化学的な相互作用を介して、多糖と核酸との複合体を得ることができる。【００２２】
ポリイオンコンプレックスは、核酸と水溶性多糖類がイオン結合により結合することにより形成される複合体である。核酸とカチオン化プルラン誘導体、カチオン化デキストラン誘導体またはカチオン化マンナン誘導体とのポリイオンコンプレックスは、核酸とカチオン化プルラン誘導体、カチオン化デキストラン誘導体またはカチオン化マンナン誘導体とを、適当な緩衝溶液中で混合し、所定の時間放置することにより形成することができる。反応は室温で行うことができる。ポリイオンコンプレックスの形成は、混合液の濁度を指標として測定することができる。ポリイオンコンプレックスの特性は、用いるプルランの分子量およびカチオン化の程度を選択することにより調節することができる。カチオン化の程度は、カチオン化プルラン誘導体、カチオン化デキストラン誘導体またはカチオン化マンナン誘導体中のアミノ基のモル数と核酸中のリン酸基のモル数との比率を指標として測定することができる。用いる細胞および核酸に応じて、細胞中への取込に最適な分子量およびカチオン化の程度を選択することができる。本発明にしたがって核酸とカチオン化プルラン誘導体、カチオン化デキストラン誘導体またはカチオン化マンナン誘導体とのポリイオンコンプレックスを形成することにより、核酸の負電荷が中和されるとともに、その電気的反発の緩和による分子サイズの減少が生じる。また、製剤中で核酸が安定化される。さらに、プルランと細胞表面のアシアロ糖タンパク質レセプターとの高い親和性により、核酸を高い効率で細胞に取り込ませることができる。【００２３】
核酸とカチオン化プルラン誘導体、カチオン化デキストラン誘導体またはカチオン化マンナン誘導体とのポリイオンコンプレックスを細胞に導入するためには、細胞を適当な培地で培養した後、培地にポリイオンコンプレックスを加えて、３７℃でさらに２時間−２日間培養する。加えるポリイオンコンプレックスの量、濃度、培養条件については、用いる細胞の性質に応じて適宜選択することができる。【００２４】
本発明の組成物は、インビトロ培養系のみならず、生体内においても核酸を細胞内に導入するために用いることができる。例えば、核酸とカチオン化プルラン誘導体、カチオン化デキストラン誘導体またはカチオン化マンナン誘導体のポリイオンコンプレックスの水溶液を、動物の足の筋肉、神経近傍に投与する。１−２日後、投与部位周辺あるいはその近位側の神経細胞への核酸の導入による生物活性発現を測定する。【００２５】
ポリイオンコンプレックス水溶液を体内に投与することにより、その投与周辺組織内において、細胞に核酸を導入することもできる。投与する部位としては、限定されないが、皮下、皮内、血管内、筋肉内、胸腔内、心腔内、腹腔内、骨髄内、気道内、気管支内、鼻腔内、脳内、癌内、腸内、膣内、膀胱内、尿路内、リンパ内、硝子体内、網膜下などが挙げられる。投与形態としては、限定されないが、水溶液または分散液として、あるいは粒子、固形状、ロッド状、顆粒状、フィルム状などの担体と混合または複合化したものが挙げられる。【００２６】
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００４−１０３５６８号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。【００２７】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００２８】
カチオン化プルラン誘導体およびカチオン化ゼラチンの作製
カチオン化プルラン誘導体の作製は、プルランの水酸基へのＮ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）−１，４−ブタンジアミン（スペルミン）の導入反応により行った。プルラン（重量平均分子量４８，０００または１００，０００、昭和電工）を脱水ジメチルスルホキシドに溶解させた（１０ｍｇ／ｍｌ）。次に、０．２５２ＭのＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ、ナカライテスク）、および２．５２Ｍのスペルミン（シグマ）を加え、室温で２０時間撹拌した。反応溶液を蒸留水に対して２日間透析し、凍結乾燥することにより、スペルミン導入カチオン化プルラン誘導体（スペルミン−プルラン）を得た。【００２９】
ゼラチン（Ｍｗ＝１００，０００、等電点＝９．０、豚皮コラーゲン由来酸処理、新田ゼラチン）のカルボキシル基に、エチレンジアミン、スペルミジン、スペルミンなどのアミン化合物を化学導入することにより、カチオン化ゼラチンを作製した。詳細には、１０ｇのゼラチンに２５０ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝５）を加え、４０℃で１時間撹拌し、ゼラチン水溶液を得た。ゼラチンのカルボキシル基に対して５０倍モル当量のアミン化合物を加え、濃塩酸（ナカライテスク）にて水溶液のｐＨを５に調整した後、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ；ナカライテスク）を５．３５ｇ（ゼラチンのもつカルボキシル基に対して３倍モル当量）加えた。０．１Ｍリン酸緩衝液を加え、全量を５００ｍｌ（最終ゼラチン濃度０．０２ｇ／ｍｌ）とした後、３７℃で１８時間、撹拌下反応させた。反応後、蒸留水に対して２日間透析し、凍結乾燥することにより、カチオン化ゼラチンを得た（カチオン化ゼラチンの表記は、導入したアミン化合物にしたがって、エチレンジアミン、スペルミジン、スペルミンをそれぞれＥ５０、ＳＤ５０、ＳＭ５０として示す）。
【実施例２】
【００３０】
プラスミドＤＮＡの調製
プラスミドＤＮＡとしてルシフェラーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶ−ｌｕｃ）を用いた。アンピシリン耐性遺伝子を含むｐＣＭＶ−ｌｕｃを大腸菌にトランスフォームした後、アンピシリン含有ＬＢ培地にて、３７℃で１８時間培養した。増殖した大腸菌を遠心分離により回収し、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。プラスミドＤＮＡの純度評価として、得られたプラスミドＤＮＡ水溶液の２８０ｎｍに対する２６０ｎｍの比を測定したところ、１．８−２．０であった。
【実施例３】
【００３１】
アミノ基の導入率の測定
スペルミン導入カチオン化プルラン誘導体のスペルミンの導入率は、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）法を用いたアミノ基の定量によって算出した。すなわち、スペルミンプルラン溶液１００μｌに、０．２Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）１００μｌ、４ｗｔ％の炭酸水素ナトリウム水溶液２００μｌ、０．１ｗｔ％のＴＮＢＳ水溶液２００μｌを加え、３７℃で２時間反応させた。この反応溶液の４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。この吸光度値とβ−アラニンを用いた検量線から、分子量４８，０００および１００，０００のプルランの水酸基あたりのスペルミンの導入率を算出したところ、それぞれ２８．９±０．０８％および３２．３±０．１８％であった。【００３２】
カチオン化ゼラチンのアミンの導入率も同様にＴＮＢＳ法により算出し、ゼラチンのカルボキシル基に対するアミン化合物の導入率を算出したところ、Ｅ５０、ＳＤ５０およびＳＭ５０についてそれぞれ４７．８％、４５．９％および４９．０％であった。
【実施例４】
【００３３】
ポリイオンコンプレックス形成
スペルミンプルラン水溶液（分子量４８，０００：０．２１ｍｇ／ｍｌ、分子量１００，０００：０．２０ｍｇ／ｍｌ）とｐＣＭＶ−ｌｕｃのＰＢＳ溶液（１００μｇ／ｍｌ）とを同体積（５０μｌ）で混合し、室温で１５分間静置することにより、カチオン化プルラン誘導体とプラスミドＤＮＡとのポリイオンコンプレックスを形成させた。【００３４】
カチオン化ゼラチン水溶液（Ｅ５０（０．９２ｍｇ／ｍｌ）、ＳＤ５０（１．１８ｍｇ／ｍｌ）およびＳＭ５０（０．８５ｍｇ／ｍｌ）とｐＣＭＶ−ｌｕｃのＰＢＳ溶液（２００μｇ／ｍｌ）とを同体積（２５μｌ）で混合し、室温で１５分間静置することにより、カチオン化ゼラチンとプラスミドＤＮＡとのポリイオンコンプレックスを形成させた。【００３５】
ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標）（０．１ｍｇ／ｍｌ）とｐＣＭＶ−ｌｕｃのＰＢＳ溶液（５０μｇ／ｍｌ）とを同体積（１００μｌ）で混合し、室温で１５分間静置することにより、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標）とプラスミドＤＮＡとのポリイオンコンプレックスを形成させた。
【実施例５】
【００３６】
未分化間葉系幹細胞へのＤＮＡ導入
細胞としては、単離した未分化間葉系幹細胞（継代数２）を用いた。Ｆ３４４ラット（３週齢、雄）の大腿骨、脛骨から、１ｍｌのＰＢＳにて骨髄を洗い出し、５ｍｌの１５ｖｏｌ％の仔ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加した最小必須培地アルファ（αＭＥＭ−ＦＣＳ、Ｇｉｂｃｏ）の入ったＴ２５培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に加え、それぞれ３日ごとに培地交換を行い、コンフルエントになり次第継代した。さらに３日ごとに培地交換を行い、コンフルエントになった細胞を実験に用いた。６ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に、１×１０４個／ｃｍ２（１×１０５個／ウエル）の細胞を播種し、αＭＥＭ−ＦＣＳにて、５％ＣＯ２−９５％空気、３７℃で２４時間培養した。血清を含まないαＭＥＭ培地に交換した後、ｐＣＭＶ−ｌｕｃ（１００μｌ）あるいはそのスペルミン−プルラン、カチオン化ゼラチン、およびＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標）とのポリイオンコンプレックス（それぞれ１００μｌ、５０μｌおよび２００μｌ）を加えて、さらに６時間培養した。次に、培地をαＭＥＭ−ＦＣＳに交換し、さらに２４時間培養を続けた。培地を除去し、細胞をＰＢＳでよく洗浄した後、細胞溶解液（２５ｍＭトリス−リン酸緩衝液（ｐＨ７．８）、２ｍＭジチオスレイトール、２ｍＭ  １，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、１０％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）を加え、細胞を溶解させた。細胞溶解液中のルシフェラーゼタンパク質の化学発光を測定することによって、遺伝子発現を定量した。また、Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎａｔｅ（ＢＣＡ）法にて細胞溶解液中の総タンパク質量を測定した。【００３７】
未分化間葉系幹細胞へのルシフェラーゼ遺伝子導入の結果を図１に示す。図中、黒のバーはアシアロフェチュイン無添加、白のバーはアシアロフェチュイン添加、＊はｐ＜０．０５を示す。ｐＣＭＶ−ｌｕｃとカチオン化ゼラチンとの複合体、およびｐＣＭＶ−ｌｕｃとＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標）との複合体において、遺伝子発現が増強されたが、ｐＣＭＶ−ｌｕｃとスペルミン−プルランとを複合化すると、遺伝子発現をさらに増強することができることが示された。【００３８】
また、アシアロ糖タンパク質レセプターに結合するアシアロフェチュイン（１ｍｇ／ｍｌ）をポリイオンコンプレックスと同時に添加すると、有意に遺伝子発現量が減少した。骨髄組織中にアシアロ糖タンパク質レセプターが存在することが知られていることから、この結果は、スペルミン−プルランとプラスミドＤＮＡとのポリイオンコンプレックスがアシアロ糖タンパク質レセプターを介して未分化間葉系幹細胞内に取り込まれていることを示唆する。なお、カチオン化ゼラチンであるＥ５０、ＳＤ５０、ＳＭ５０は、遺伝子発現はきわめて低いレベルであった。
【実施例６】
【００３９】
神経由来細胞株へのＤＮＡ導入
６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ製）に、４×１０４細胞／ｃｍ２（４×１０５細胞／ウエル）のＰＣ１２細胞を播種し、１０ｖｏｌ％仔ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加した最小必須培地（ＭＥＭ−ＦＣＳ）中にて、５％ＣＯ２−９５％空気、３７℃で２４時間、培養した。血清を含まないＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ製）培地へ交換した後、ｐＣＭＶ−ｌｕｃ（１００μｌ）あるいはそのスペルミン−プルラン、およびＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（それぞれ１００および２００μｌ）とのポリイオンコンプレックス（ＤＮＡ量５μｇ／ウエル）を加えて、６時間、培養した。次に、培地をＭＥＭ−ＦＣＳに交換し、さらに４２時間、培養を続けた。培地を除去、細胞をＰＢＳでよく洗浄した後、細胞溶解液（２５ｍＭトリス−リン酸緩衝液（ｐＨ７．８）、２ｍＭジチオスレイトール、２ｍＭ１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、１０％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）を加え、細胞を溶解させた。細胞溶解液中のルシフェラーゼタンパク質の化学発光を測定することによって、遺伝子発現を定量した。また、Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎａｔｅ（ＢＣＡ）法にて細胞溶解液中の総タンパク質量を測定した。結果を図２に示す。図中、黒のバーはアシアロフェチュイン無添加、白のバーはアシアロフェチュイン添加、＊はｐ＜０．０５を示す。†は分子量１００，０００およびリポフェクタミンの値に対してｐ＜０．０５であることを示す。
【実施例７】
【００４０】
ヒト脂肪組織由来幹細胞へのＤＮＡ導入
細胞としてヒト脂肪組織由来幹細胞（継代数２）を用いた。患者の同意を得て乳癌切除時に採取されたヒト脂肪組織（５ｍｌ）をハサミで細切した後、２ｍｇ／ｍｌの濃度のコラゲナーゼＳ１（新田ゼラチン株式会社から供与）水溶液中で３７℃、１５〜２０分間、処理することによって組織を消化分解した。組織消化物をナイロンメッシュ（２００μｍの孔）にて濾別した後、遠心分離（４℃、１，０００ｒｐｍ、５分）することによって、ヒト脂肪組織由来幹細胞を含む細胞成分を得た。得られた細胞は１５ｖｏｌ％ＦＣＳを添加したＭｅｄｉｕｍ１９９Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｅｄｉｕｍ１９９−ＦＣＳ）で２回洗浄した後、Ｔ２５培養フラスコに播種した。ｂＦＧＦ（０．１μｇ／ｍｌ）を含むＭｅｄｉｕｍ１９９−ＦＣＳにて培養、それぞれ３日ごとに培地交換を行い、コンフルエントになり次第継代した。さらに３日ごとに培地交換を行い、コンフルエントになった細胞を実験に用いた。６ウェルプレートに、１×１０４細胞／ｃｍ２（１×１０５細胞／ウエル）の細胞を播種し、Ｍｅｄｉｕｍ１９９−ＦＣＳ中にて、５％ＣＯ２−９５％空気、３７℃で２４時間、培養した。血清を含まないＭｅｄｉｕｍ１９９Ｍｅｄｉｕｍへ交換した後、ｐＣＭＶ−ｌｕｃ（１００μｌ）あるいはそのスペルミン−プルラン、およびＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標）とのポリイオンコンプレックス（それぞれ１００および２００μｌ）（ＤＮＡ量５μｇ／ウエル）を加えて、６時間、培養した。次に、培地をＭｅｄｉｕｍ１９９−ＦＣＳに交換し、さらに２４時間、培養を続けた。培地を除去、細胞をＰＢＳでよく洗浄した後、細胞溶解液を加え、細胞を溶解させた。細胞溶解液中のルシフェラーゼタンパク質の化学発光を測定することによって、遺伝子発現を定量した。また、ＢＣＡ法にて細胞溶解液中の総タンパク質量を測定した。結果を図３に示す。図中、黒のバーはアシアロフェチュイン無添加、白のバーはアシアロフェチュイン添加、＊はｐ＜０．０５を示す。
【実施例８】
【００４１】
ヒト樹状細胞へのＤＮＡ導入
細胞としてヒト樹状細胞を用いた。すなわち、健常人より末梢血１５ｍｌをヘパリン採血し、ＰＢＳにて２倍希釈後、１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ液にゆっくりと重層させた。８００ｇで１５分間遠心後、中間層（単核球）を滅菌のピペットで採取し、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄、遠心して細胞を回収した。Ｔ２５培養フラスコに１×１０７ずつ単核球細胞を、１０％ＦＣＳ入りＲＰＭＩ１６４０培地（ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ）１０ｍｌに浮遊させた。２時間以上経過後、浮遊細胞を含む上清を吸引除去して、付着細胞にｒｈＩＬ−４を５０ｎｇ／ｍｌ、ｒｈＧＭ−ＣＳＦを５０ｎｇ／ｍｌ添加したＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ１０ｍｌを加え、５から７日間培養したものを実験に使用した。５から７日間培養したフラスコの上清を吸引回収し、遠心後、未分化のヒト樹状細胞を回収した。
６ウエルプレートに３から５×１０５／ウエルとなるようにＲＰＭＩ１６４０にヒト樹状細胞を播種、２００μｇ／ｍｌのｐＥＧＦＰ（５０μｌ）と０．４ｍｇ／ｍｌのスペルミン−プルラン（５０μｌ）とのポリイオンコンプレックス（１００μｌ）（ＤＮＡ量５μｇ／ウエル）を加え、２００ｇで１０分遠心した。２から６時間後にＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳに交換した。ＥＧＦＰの発現はフローサイトメトリ（ＦＡＣＳ）にて解析した。すなわち、遺伝子導入後２４から４８時間後に細胞を吸引回収して、ＰＢＳで一回洗浄し、ＰＥ標識したＨＬＡ−ＤＲやＣＤ８０抗体を添加した。暗室に４℃、３０分おいた後、再度ＰＢＳで洗浄し解析した。ＧＦＰはＦＬ１、ＰＥはＦＬ２で検出した。結果を図４に示す。ｐＥＧＦＰとスペルミン−プルランとを複合化すると、発現効率が２４−３０％となった。ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標）では０％であった。また、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標）では、ほとんどの細胞が死んでいたのに対して、スペルミン−プルランでは細胞はほとんど死んでいなかった。
【実施例９】
【００４２】
軟骨細胞へのＤＮＡ導入
実施例５と同様にして、ウサギ関節軟骨から採取した軟骨細胞にｐＣＭＶ−ｌｕｃ（１００μｌ）を導入し、遺伝子の発現を調べたところ、スペルミン−プルランを用いた場合に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標）に比較して、発現が高かった。
【実施例１０】
【００４３】
皮膚上皮細胞へのＤＮＡ導入
実施例５と同様にして、培養皮膚上皮細胞にｐＣＭＶ−ｌｕｃ（１００μｌ）を導入し、遺伝子の発現を調べたところ、スペルミン−プルランを用いた場合に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標）に比較して、発現が高かった。
【実施例１１】
【００４４】
角膜上皮細胞へのＤＮＡ導入
実施例５と同様にして、培養角膜上皮細胞にｐＣＭＶ−ｌｕｃ（１００μｌ）を導入し、遺伝子の発現を調べたところ、スペルミン−プルランを用いた場合に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標）に比較して、発現が高かった。
【実施例１２】
【００４５】
色素上皮細胞へのＤＮＡ導入
実施例５と同様にして、培養色素上皮細胞にｐＣＭＶ−ｌｕｃ（１００μｌ）を導入し、遺伝子の発現を調べたところ、スペルミン−プルランを用いた場合に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標）に比較して、発現が高かった。
【実施例１３】
【００４６】
尿細管上皮細胞へのＤＮＡ導入
実施例５と同様にして、培養尿細管上皮細胞にｐＣＭＶ−ｌｕｃ（１００μｌ）を導入し、遺伝子の発現を調べたところ、スペルミン−プルランを用いた場合に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標）に比較して、発現が高かった。
【実施例１４】
【００４７】
耳の有毛細胞へのＤＮＡ導入
実施例５と同様にして、培養耳有毛細胞にｐＣＭＶ−ｌｕｃ（１００μｌ）を導入し、遺伝子の発現を調べたところ、スペルミン−プルランを用いた場合に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標）に比較して、発現が高かった。
【実施例１５】
【００４８】
ケラチノサイトへのＤＮＡ導入
実施例５と同様にして、培養ケラチノサイトにｐＣＭＶ−ｌｕｃ（１００μｌ）を導入し、遺伝子の発現を調べたところ、スペルミン−プルランを用いた場合に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標）に比較して、発現が高かった。
【実施例１６】
【００４９】
メサンギウム細胞へのＤＮＡ導入
実施例５と同様にして、培養メサンギウム細胞にｐＣＭＶ−ｌｕｃ（１００μｌ）を導入し、遺伝子の発現を調べたところ、スペルミン−プルランを用いた場合に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標）に比較して、発現が高かった。
【実施例１７】
【００５０】
糸球体外メサンギウム細胞へのＤＮＡ導入
実施例５と同様にして、培養糸球体外メサンギウム細胞にｐＣＭＶ−ｌｕｃ（１００μｌ）を導入し、遺伝子の発現を調べたところ、スペルミン−プルランを用いた場合に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標）に比較して、発現が高かった。
【実施例１８】
【００５１】
毛乳頭細胞へのＤＮＡ導入
実施例５と同様にして、培養毛乳頭細胞にｐＣＭＶ−ｌｕｃ（１００μｌ）を導入し、遺伝子の発現を調べたところ、スペルミン−プルランを用いた場合に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標）に比較して、発現が高かった。
【実施例１９】
【００５２】
毛母基底細胞へのＤＮＡ導入
実施例５と同様にして、培養毛母基底細胞にｐＣＭＶ−ｌｕｃ（１００μｌ）を導入し、遺伝子の発現を調べたところ、スペルミン−プルランを用いた場合に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標）に比較して、発現が高かった。
【実施例２０】
【００５３】
毛包基底細胞へのＤＮＡ導入
実施例５と同様にして、培養毛包基底細胞にｐＣＭＶ−ｌｕｃ（１００μｌ）を導入し、遺伝子の発現を調べたところ、スペルミン−プルランを用いた場合に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標）に比較して、発現が高かった。
【実施例２１】
【００５４】
メラノーマ癌細胞へのＤＮＡ導入
実施例５と同様にして、培養メラノーマ癌細胞にｐＣＭＶ−ｌｕｃ（１００μｌ）を導入し、遺伝子の発現を調べたところ、スペルミン−プルランを用いた場合に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標）に比較して、発現が高かった。
【実施例２２】
【００５５】
インビボでの神経細胞へのＤＮＡ導入
カチオン化プルラン誘導体と核酸とのポリイオンコンプレックスの水溶液を、マウス大腿筋肉に投与した。２日後、筋肉内の神経細胞およびその神経につながる近位側の神経細胞を採取し、遺伝子の発現を調べた。その結果、スペルミン−プルランを用いた場合に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標）に比較して、有意に高い発現レベルが確認された。
【実施例２３】
【００５６】
マウス骨髄幹細胞へのＤＮＡ導入
カチオン化多糖（スペルミン−プルラン、スペルミン−デキストラン、スペルミン−マンナン、スペルミン−アミロペクチン）と核酸とのポリイオンコンプレックスの水溶液を作製した。実施例１と同様にして、プルラン、デキストラン、マンナンおよびアミロペクチンにスペルミンを導入した。スペルミンの導入率は、プルラン（12.3%）、デキストラン（9.51%）、マンナン（13.3%）およびアミロペクチン（12.3%）であった。次に、下記の表に示される濃度のカチオン化多糖水溶液を作製した。
【表１】
2005094894.tif 000002
この水溶液とＰＢＳ中に100μg/mlで溶解したプラスミド溶液とを等量で混合し、室温で15分間静置した。このポリイオンコンプレックスの所定量をマウス骨髄幹細胞（ＭＳＣ）の培養物に加え、血清なしの培地で６時間、次に血清入りの培地で２４時間インキュベートすることにより細胞に導入し、遺伝子の発現を調べた（図５）。スペルミン−プルラン（Ｎ／Ｐ比３）を用いた場合に、ＦｕＧＥＮＥ６（登録商標）に比較して、同程度の発現であり、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ２０００（登録商標）とＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（登録商標）に比較して、有意に発現が高かった。また、スペルミン−デキストラン、スペルミン−マンナンとも、Ｎ／Ｐ比３の場合、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ２０００（登録商標）に比較して、有意に発現が高かった。
【実施例２４】
【００５７】
ＤＮＡの量による導入効率の変化
実施例２３と同様にして、スペルミン−プルラン（プルラン分子量４７３００、ＣＤＩ３．０、Ｎ／Ｐ比３、スペルミン導入率２０．４％）を用いて、ｐＣＭＶ−ｌｕｃ（１００μｌ）の量を変化させて導入し、遺伝子の発現を調べたところ、ＤＮＡ量が２．５μｇ／ｗｅｌｌの場合に、もっとも発現が高かった（図６）。
【実施例２５】
【００５８】
異なる分子量のプルランによる導入効率の変化
実施例２３と同様にして、スペルミン−プルラン（プルラン分子量５９００から２１２０００、ＣＤＩ１．５、Ｎ／Ｐ比３、スペルミン導入率：５９００；１２．９％，１１８００；１２．３％，２２８００；１１．０％４７３００；１２．３％，１１２０００；１０．７％，２１２０００；９．７４％）を用いて、ｐＣＭＶ−ｌｕｃ（１００μｌ）を導入し、遺伝子の発現を調べたところ、プルラン分子量が４７３００の場合に、もっとも発現が高かった（図７）。
【実施例２６】
【００５９】
異なるスペルミンの導入率によるＤＮＡ導入の変化
分子量２２８００、４７３００、１１２０００の３種類のプルランに対して、スペルミン導入率を変化させ、それぞれ５種類、計１５のスペルミン−プルラン（Ｎ／Ｐ比３）を作製した。スペルミンの導入率は以下のとおりである。
【表２】
2005094894.tif 000003
実施例２３と同様にして、ｐＣＭＶ−ｌｕｃ（１００μｌ）を導入し、遺伝子の発現を調べたところ、プルラン分子量が２２８００の場合にはＣＤＩ／ＯＨのモル比が３（スペルミン導入率２３．０％）の場合に、プルラン分子量が４７３００の場合にはＣＤＩ／ＯＨのモル比が１．５（スペルミン導入率１２．３％）の場合に、プルラン分子量が１１２０００の場合にはＣＤＩ／ＯＨのモル比が１．５（スペルミン導入率１０．７％）の場合に、それぞれ発現が高かった。その中で、プルラン分子量が４７３００、ＣＤＩ／ＯＨのモル比が１．５（スペルミン導入率１２．３％）の場合に、最も発現が高かった（図８）。
【実施例２７】
【００６０】
癌細胞へのＤＮＡ導入
実施例２３と同様にして、スペルミン−プルラン、スペルミン−デキストランとｐＣＭＶ−ｌｕｃとのポリイオンコンプレックスの水溶液を、癌細胞に導入し、遺伝子の発現を調べた（図９−１１）。図９−１１に示すように、Lewis  Lung  carcinomaに核酸導入した場合、スペルミン−デキストランを用いると、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標）に比較して、有意に発現が高かった。
膀胱癌細胞株EJ、T24、UMUC3、RT4に核酸導入した場合、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標）では、ほとんど導入が見られなかったが、スペルミン−デキストランを用いると、有意に発現が高かった。
前立腺癌DU145、PC3、LNCaPに核酸導入した場合、DU145ではスペルミン−プルランを用いると、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標）に比較して、有意に発現が高かった。PC3では、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標）が、有意に発現が高かった。LNCaPでは、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標）と同程度の発現であった。
前立腺肥大症BPH-1に核酸導入した場合、スペルミン−プルランはＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標）に比較して、半分程度の発現であった。肝癌細胞株HepG2に核酸導入した場合、スペルミン−プルランを用いると、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標）に比較して、有意に発現が高かった。ヒト肺癌細胞株A549に核酸導入した場合、スペルミン−プルランを用いると、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ２０００（登録商標）に比較して、有意に発現が高かった。
【実施例２８】
【００６１】
幹細胞へのＤＮＡ導入
実施例２３と同様にして、スペルミン−プルラン、スペルミン−デキストランとｐＣＭＶ−ｌｕｃとのポリイオンコンプレックスの水溶液を、幹細胞に導入し、遺伝子の発現を調べた。
図１２に示すように、ラット骨髄未分化間葉系幹細胞、ヒト脂肪前駆細胞に核酸導入した場合、スペルミン−プルランを用いると、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ２０００（登録商標）に比較して、有意に発現が高かった。マウスＥＳ細胞に核酸導入した場合、スペルミン−デキストランを用いると、スペルミン−プルランよりもＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ２０００（登録商標）に比較して、有意に発現が高かった。
【実施例２９】
【００６２】
初代培養細胞へのＤＮＡ導入
実施例２３と同様にして、スペルミン−プルラン、スペルミン−デキストランとｐＣＭＶ−ｌｕｃとのポリイオンコンプレックスの水溶液を、初代培養細胞に導入し、遺伝子の発現を調べた。
図１３に示すように、ラット膀胱平滑筋細胞に核酸導入した場合、スペルミン−プルランを用いると、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ２０００（登録商標）に比較して、有意に発現が高かった。ウサギ膝関節軟骨細胞に核酸導入した場合、スペルミン−デキストランを用いると、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ２０００（登録商標）に比較して、半分程度の発現であった。マウス腹腔マクロファージ、ラット腹腔マクロファージに核酸導入した場合、スペルミン−デキストランを用いると、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ２０００（登録商標）に比較して、有意に発現が高かった。
【実施例３０】
【００６３】
肺胞上皮typeII  RLE6TNへのＤＮＡ導入
実施例２３と同様にして、肺胞上皮typeII  RLE6TNにｐＣＭＶ−ｌｕｃ（１００μｌ）を導入し、遺伝子の発現を調べた。図１４に示すように、スペルミン−プルランを用いた場合に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標）に比較して、有意に発現が高かった。
【実施例３１】
【００６４】
マウス腹腔マクロファージへのＤＮＡ導入
実施例２３と同様にして、マウス腹腔マクロファージにｐＣＭＶ−ｌｕｃ（１００μｌ）を導入し、遺伝子の発現を調べた。図１５に示すように、スペルミン−デキストランおよびスペルミン−マンナンを用いた場合に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ２０００（登録商標）に比較して、有意に発現が高かった。
【実施例３２】
【００６５】
ラット腹腔マクロファージへのＤＮＡ導入
実施例２３と同様にして、ラット腹腔マクロファージにｐＣＭＶ−ｌｕｃ（１００μｌ）を導入し、遺伝子の発現を調べた。図１６に示すように、スペルミン−マンナンを用いた場合に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ２０００（登録商標）に比較して同程度に、またスペルミン−デキストラン用いた場合に、有意に発現が高かった。
【実施例３３】
【００６６】
マウスＥＳ細胞へのＤＮＡ導入
実施例２３と同様にして、マウスＥＳ細胞にｐＣＭＶ−ｌｕｃ（１００μｌ）を導入し、遺伝子の発現を調べた。図１７に示すように、スペルミン−プルランおよびスペルミン−デキストランを用いた場合に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ２０００（登録商標）に比較して、有意に発現が高かった。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
細胞内に核酸を導入するための本発明の組成物および方法は、伝子治療、細胞移植治療および再生医療に、ならびに基礎生物医学研究に有用である。
【図１】
2005094894.tif 000004
【図２】
2005094894.tif 000005
【図３】
2005094894.tif 000006
【図４】
2005094894.tif 000007
【図５】
2005094894.tif 000008
【図６】
2005094894.tif 000009
【図７】
2005094894.tif 000010
【図８】
2005094894.tif 000011
【図９】
2005094894.tif 000012
【図１０】
2005094894.tif 000013
【図１１】
2005094894.tif 000014
【図１２】
2005094894.tif 000015
【図１３】
2005094894.tif 000016
【図１４】
2005094894.tif 000017
【図１５】
2005094894.tif 000018
【図１６】
2005094894.tif 000019
【図１７】
2005094894.tif 000020
【国際調査報告】
2005094894.tif 000021
2005094894.tif 000022
2005094894.tif 000023
2005094894.tif 000024
2005094894.tif 000025
2005094894.tif 000026