(57)【要約】ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７を標的とした最も効果の優れたｓｉＲＮＡ配列を決定する。  特定の塩基配列を有するオリゴリボヌクレオチド、及びこれを含有する抗ウイルス剤及び子宮頚癌治療剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ヒトパピローマウイルス１８型のＥ６遺伝子の発現を抑制し得る塩基長１９塩基のオリゴリボヌクレオチド、またはこれを含む塩基長２１〜２３塩基のオリゴリボヌクレオチド。
ｃａｔａｇａａａｔａ  ａｃｃｔｇｔｇｔａｔ  ａｔｔｇｃａａｇａｃ  ａｇｔａｔｔｇｇａａ  ｃｔｔａｃａｇａｇｇ  ｔａｔｔｔｇａａｔｔ  ｔｇｃａｔｔｔａａａ  ｇａｔｔｔ（配列番号１）
【請求項２】
配列番号２または４で示される塩基配列において、ウラシルがチミンで置換された配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ヒトパピローマウイルス１８型のＥ６遺伝子の発現を抑制し得る、塩基長２１〜２３塩基のオリゴリボヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５で示される塩基配列の５’側の１９塩基からなるオリゴリボヌクレオチドと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む２１〜２３塩基のオリゴリボヌクレオチドであって、ヒトパピローマウイルス１８型のＥ６遺伝子の発現を抑制し得るオリゴリボヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５で示される塩基配列からなるオリゴリボヌクレオチド。
【請求項５】
二本鎖である、請求項１〜４のいずれか１項記載のオリゴリボヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号２で示される塩基配列のうち５’側の１９塩基をＤＮＡに変換した塩基配列を含む発現ベクター。
【請求項７】
配列番号３で示される塩基配列のうち５’側の１９塩基をＤＮＡに変換した塩基配列を含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項記載のオリゴリボヌクレオチド、または請求項６若しくは７記載の発現ベクターを含有する抗ウイルス剤。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項記載のオリゴリボヌクレオチド、または請求項６若しくは７記載の発現ベクターを含有する子宮頚癌治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ヒトパピローマウイルス（以下、ＨＰＶという）１８型陽性子宮頸癌に対する遺伝子標的治療のために使用できる特定のオリゴリボヌクレオチド、およびこれを含有するＨＰＶに対する抗ウイルス剤並びに子宮頚癌治療剤に関する。
【背景技術】  近年の分子生物学の進歩と共に、主に米国ではいくつかの標的に対する癌の遺伝子治療の臨床応用が試みられているが、残念ながら現在まで満足な効果が得られていない。より効率的なベクターの開発と共に、正常細胞と癌細胞の本質的な差異を標的としたこれまで以上に効果的かつ危険性の少ない方法の確立が待ち望まれている。
このような状況の中、アンチセンス法といわれる相補的ＤＮＡを用いて遺伝子発現を抑制する治療法が開発され、欧米において実際の治療に用いられている。しかしこの治療では遺伝子発現抑制の効率が悪いため、満足のいく治療効果が得られていないのが実情である。
近年、遺伝子発現を特異的に阻害する新たな方法としてＲＮＡ干渉（以下、ＲＮＡｉという）が発見された。この方法は、標的遺伝子に相補的なＲＮＡ２重短鎖（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ、以下ｓｉＲＮＡという）の導入により標的遺伝子の発現をきわめて効果的に阻害する画期的な方法であり、機能ジェノミクスの分野に変革をもたらすことが期待されている。また、２００１年には哺乳動物培養細胞での遺伝子発現抑制の成功が初めて報告され、以後、数多くの遺伝子発現の抑制に成功した研究結果が次々と報告されている。
このようなことから、ｓｉＲＮＡは新しい遺伝子発現のノックダウン方法として大きな期待が寄せられている。子宮頸癌は婦人科領域の主要な悪性腫瘍の一つで、その主な原因は、ＨＰＶ、特に１６型（ＨＰＶ１６）および１８型（ＨＰＶ１８）であり、これらのウイルスのＥ６およびＥ７癌遺伝子の発現は、細胞癌化と癌化形質の維持に不可欠であることが証明されている。頚癌では大部分の癌細胞にＨＰＶゲノムの組み込みがみられ、上記Ｅ６およびＥ７遺伝子はそれぞれ癌抑制遺伝子産物Ｐ５３、Ｒｂタンパクと結合し、これらを不活性化することから、頚癌の発生と増殖に深いかかわりをもっていることが知られている。
現在までにｓｉＲＮＡを用いてＨＰＶ１６型陽性子宮頸癌細胞株の増殖抑制を行った報告は２編ある（非特許文献１及び２）。非特許文献１の報告では、ＨＰＶ  Ｅ６上のｓｉＲＮＡよりＥ７上のｓｉＲＮＡの方がより増殖抑制効果が著明であるとしている。しかしながら、本発明者は、先に報告した非特許文献２において、ＨＰＶ  Ｅ６上のｓｉＲＮＡを用いて十分な抑制効果が得られることを確認した。これらの結果からは、どのような配列を標的とした場合に最も効果的な抑制効果が得られるかは明らかでなかった。
【非特許文献１】ジアン（Ｍ．Ｊｉａｎｇ）及びミルナー（Ｊ．Ｍｉｌｎｅｒ），「ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡインターフェアレンスのプライマーで処置したＨＰＶ陽性ヒト子宮頚癌細胞におけるウイルス遺伝子発現の選択的サイレンシング（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ＨＰＶ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｉＲＮＡ，ａ  ｐｒｉｍｅｒ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．）」オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）２００２年，第２１巻，ｐ．６０４１−６０４８
【非特許文献２】吉野内（Ｍ．Ｙｏｓｈｉｎｏｕｃｈｉ）ら，「Ｅ６  ｓｉＲＮＡによるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６−陽性子宮頚癌細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ増殖の抑制（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｒｏｗｔｈ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ（ＨＰＶ）１６−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｅ６  ｓｉＲＮＡ）」モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ）２００３年、第８巻，第５号，ｐ．７６２−７６８
【発明の開示】
ＨＰＶ陽性子宮頸癌の約三分の二はＨＰＶ１６型と１８型であるので、これら２タイプのＥ６癌遺伝子に対するｓｉＲＮＡ療法が確立できれば、多くの子宮頸癌患者にとって有効かつ侵襲の少ない治療法となる。ところがＨＰＶ１８型については、十分な増殖抑制を示す標的配列が未だ明らかにされていない。
ｓｉＲＮＡの効果は標的とする部位によって大きく異なることが知られており、またその効果を予測することは非常に難しいとされている。
本発明者は、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７を標的としたｓｉＲＮＡのデザインは無数に可能であり、その中で最も効果の優れた配列を決定することがきわめて重要であることに鑑み、ＨＰＶ１８型を標的としたｓｉＲＮＡの作用機序を種々検討し、ＨＰＶ１８型陽性子宮頸癌の効果的治療に最適なｓｉＲＮＡの配列を明らかにして、かかる子宮頸癌の効果的治療薬を開発、提供せんとするものである。
本発明者は、子宮頸癌に対して蓄積してきたこれまでの研究成果を踏まえ、ＨＰＶ１８−Ｅ６を標的としたｓｉＲＮＡを第一エクソン上、スプライシングドナーサイト上から作製してその生物学的効果を比較解析し、増殖抑制効果のよりすぐれた標的配列を決定し、本発明を完成した。
従って本発明は以下の（１）〜（９）を提供する。
（１）  配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ヒトパピローマウイルス１８型のＥ６遺伝子の発現を抑制し得る、塩基長１９塩基のオリゴリボヌクレオチド、またはこれを含む塩基長２１〜２３塩基のオリゴリボヌクレオチド。
ｃａｔａｇａａａｔａ  ａｃｃｔｇｔｇｔａｔ  ａｔｔｇｃａａｇａｃ  ａｇｔａｔｔｇｇａａ  ｃｔｔａｃａｇａｇｇ  ｔａｔｔｔｇａａｔｔ  ｔｇｃａｔｔｔａａａ  ｇａｔｔｔ（配列番号１）
（２）  配列番号２または４で示される塩基配列において、ウラシルがチミンで置換された配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ヒトパピローマウイルス１８型のＥ６遺伝子の発現を抑制し得る、塩基長２１〜２３塩基のオリゴリボヌクレオチド。
（３）  配列番％２、配列番％３、配列番号４または配列番号５で示される塩基配列の５’側の１９塩基からなるオリゴリボヌクレオチドと９０％以上の配列同一性を有し、ヒトパピローマウイルス１８型のＥ６遺伝子の発現を抑制し得る、塩基長２１〜２３塩基のオリゴリボヌクレオチド。
（４）  配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５で示される塩基配列からなるオリゴリボヌクレオチド。
（５）  二本鎖である、上記（１）〜（４）のいずれか記載のオリゴリボヌクレオチド。
（６）  配列番号２で示される塩基配列のうち５’側の１９塩基をＤＮＡに変換した塩基配列を含む発現ベクター。
（７）  配列番号３で示される塩基配列のうち５’側の１９塩基をＤＮＡに変換した塩基配列を含む発現ベクター。
（８）  上記（１）〜（４）のいずれか記載のオリゴリボヌクレオチド、または上記（６）若しくは（７）記載の発現ベクターを含有する抗ウイルス剤。
（９）  上記（１）〜（４）のいずれか記載のオリゴリボヌクレオチド、または上記（６）若しくは（７）記載の発現ベクターを含有する子宮頚癌治療剤。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００４−２７９９９４号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明で用いた３×ＦＬＡＧ−１８Ｅ６発現ベクターの構造を示す。
図２は、本発明のｓｉＲＮＡによるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１８型Ｅ６遺伝子発現に対する抑制効果を示す。
図３は、ＨｅＬａ細胞及びＳＷ７５６細胞におけるｌａｍｉｎ  Ａ／Ｃ発現のｓｉＲＮＡによる抑制を示す。
図４は、ＨｅＬａ細胞におけるＥ６及びＥ７  ｍＲＮＡの発現に対する本発明のｓｉＲＮＡの抑制効果を示す。
図５は、ＨｅＬａ細胞及びＳＷ７５６細胞におけるｐ５３及びＥ７蛋白質発現に対するｓｉＲＮＡの効果を示す。
図６は、ＨｅＬａ細胞及びＳＷ７５６細胞の単層増殖及び足場非依存性増殖のｓｉＲＮＡによる抑制効果を示す。
図７は、ｓｉＲＮＡによるＨｅＬａ細胞のアポトーシス誘導をフローサイトメトリーを用いて確認した結果を示す。
図８は、ｓｉＲＮＡによるＨｅＬａ細胞のアポトーシス誘導をグラフで示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明は、ＨＰＶ１８型のＥ６遺伝子の塩基配列に基づき、その発現を抑制し得る効果的なｓｉＲＮＡを得るべく多数のｓｉＲＮＡ候補を作製し、その効果を検討した。ＨＰＶ１８型のゲノム配列情報に関しては、ＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースに例えば登録番号Ｘ０４３５４、Ｙ１８４９１として登録されており、これらの情報に基づいてｓｉＲＮＡ候補を作製することができる。
その結果、配列番号１：
ｃａｔａｇａａａｔａ  ａｃｃｔｇｔｇｔａｔ  ａｔｔｇｃａａｇａｃ  ａｇｔａｔｔｇｇａａ  ｃｔｔａｃａｇａｇｇ  ｔａｔｔｔｇａａｔｔ  ｔｇｃａｔｔｔａａａ  ｇａｔｔｔで示される塩基配列を認識するｓｉＲＮＡが、ＨＰＶ１８型のＥ６遺伝子の発現を効果的に抑制することを見出し、本発明を完成するに到った。
本発明は、配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ヒトパピローマウイルス１８型のＥ６遺伝子の発現を抑制し得る塩基長１９塩基のオリゴリボヌクレオチド、またはこれを含む塩基長２１〜２３塩基のオリゴリボヌクレオチドを提供する。
本明細書において、ストリンジェントな条件としては、限定するものではないが、例えばＳＳＣ／５×デンハルト溶液／１．０％ＳＤＳ中で６８℃におけるハイブリダイゼーション、及び０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で４２℃における洗浄または０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で６８℃における洗浄が含まれる。これらの条件に関しては、例えばＳａｍｂｒｏｏｋらの「分子クローニング：実験室マニュアル」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳ，１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌら編「分子生物学の現行プロトコル」（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９５）を参照のこと。
本発明のオリゴリボヌクレオチドとしては、例えば、配列番号２または３で示される塩基配列において、ウラシルがチミンで置換された配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ヒトパピローマウイルス１８型のＥ６遺伝子の発現を抑制し得る、塩基長２１〜２３塩基のオリゴリボヌクレオチドが挙げられる。
また、本発明のオリゴリボヌクレオチドとして、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５で示される塩基配列の５’側の１９塩基からなるオリゴリボヌクレオチドと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む２１〜２３塩基のオリゴリボヌクレオチドであって、ヒトパピローマウイルス１８型のＥ６遺伝子の発現を抑制し得るものが挙げられる。
本発明のオリゴリボヌクレオチドとして特に好ましいものとしては、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５で示される塩基配列からなるオリゴリボヌクレオチドが挙げられる。
2006035974.tif 000002
配列番号２〜５において、３’末端の２塩基のみがチミンとなるように設計されている。３’末端をウラシルではなくチミンにすることで、ｓｉＲＮＡが安定化するものと考えられる。尚、塩基がチミンの場合には、糖はリボースではなくデオキシリボースである。
上記オリゴリボヌクレオチドは、ＨＰＶ１８のＥ６遺伝子及びＥ７遺伝子の発現を効果的に抑制することができる。これらオリゴリボヌクレオチドは、一本鎖で用いることもできるが、好ましくは二本鎖である。この場合、配列番号２で示されるオリゴリボヌクレオチドと配列番号３で示されるオリゴリボヌクレオチド、配列番号４で示されるオリゴリボヌクレオチドと配列番号５で示されるオリゴリボヌクレオチドがそれぞれハイブリダイズして、３’末端の２個のチミン塩基が突出した（オーバーハング）二本鎖を形成し、これが本明細書において記載するｓｉＲＮＡとして作用する。以下、本明細書において、配列番号２で示されるオリゴリボヌクレオチドと配列番号３で示されるオリゴリボヌクレオチドが二本鎖を形成したオリゴリボヌクレオチドをＳｐ−１８Ｅ６、配列番号４で示されるオリゴリボヌクレオチドと配列番号５で示されるオリゴリボヌクレオチドをＥｘ−１８Ｅ６とそれぞれ記載する。
本発明のオリゴリボヌクレオチドによるＨＰＶ１８型Ｅ６遺伝子及びＥ７遺伝子の発現抑制は、ｍＲＮＡの分解、発現抑制、これらによる蛋白質の発現抑制として観察することができる。尚、本明細書において、発現の「抑制」とは、発現レベルをオリゴリボヌクレオチド不在下における対照となる発現と比較して、５０％以下に低下させることをいう。
しかしながら、ＨＰＶ関連癌細胞株においては、Ｅ６及びＥ７蛋白質の発現レベルが低く、特にＥ６蛋白質の発現を検出する方法や抗体が存在しない。本発明者等は、ｓｉＲＮＡの抑制効果を高感度かつ簡便に検出するために、３×ＦＬＡＧタグ付きＥ６及びＥ７発現プラスミドを開発した。その構成を図１に示す（Ｅ６の場合）。このプラスミドをＣＯＳ−１培養細胞に導入し、２４時間の培養後にＣＯＳ−１細胞の蛋白質を抽出し、ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロット法を行うことによって、Ｅ６及びＥ７蛋白質の発現を測定することができる。このプラスミドを、評価すべきｓｉＲＮＡと共にＣＯＳ−１培養細胞に導入すれば、Ｅ６及びＥ７蛋白質の発現の抑制率を測定することができる。この方法を用いることによって、合成二本鎖ｓｉＲＮＡだけでなく、より導入効率の低いｓｉＲＮＡ発現プラスミド、ｓｈＲＮＡ発現プラスミドのＲＮＡｉ活性についても容易に測定できる。
上記の方法によって蛋白質発現に対する抑制効果が確認されれば、ＲＮＡｉ活性を有するｓｉＲＮＡをＨｅＬａ細胞に導入して、ＲＴ−ＰＣＲによりＥ６及びＥ７をコードするＲＮＡレベルにおける発現抑制を評価すれば良い。
本発明において用いられるＨＰＶ１８型陽性子宮頸癌の最適ｓｉＲＮＡは上記配列番号２で示されるオリゴリボヌクレオチドと配列番号３で示されるオリゴリボヌクレオチドが二本鎖を形成したオリゴリボヌクレオチド（Ｓｐ−１８Ｅ６）である。これは、Ｅ６遺伝子におけるスプライシングドナーサイトを含む配列であることを特徴とする。かかるｓｉＲＮＡは培養法、人工的な合成法や遺伝子操作法などいずれの方法により調達されるものであっても良い。
Ｅ６・Ｅ７遺伝子からはＥ６／Ｅ７  ｍＲＮＡおよびスプライシングを受けたＥ６＊／Ｅ７  ｍＲＮＡが転写される。Ｅｘ−１８Ｅ６，Ｓｐ−１８Ｅ６はともにＥ６  ｍＲＮＡの発現をほぼ完全に抑制したが、Ｅ７  ｍＲＮＡの発現はＥｘ−１８Ｅ６でより完全に抑制された。このことは、Ｅ７蛋白の発現レベルでも同様であり、その結果としてＲｂ蛋白総量の増加と非リン酸化型Ｒｂ蛋白の増加を惹起した。一方、Ｓｐ−１８Ｅ６はＰ５３をより強力に増加させた。生物学的効果としての足場依存性および非依存性増殖の抑制効果は圧倒的にＳｐ−１８Ｅ６の方が優れており、Ｓｐ−１８Ｅ６はより強力にアポトーシスを誘導した。
本発明のｓｉＲＮＡは、Ｅ６蛋白質を発現する細胞中に単独で用いることができる。あるいはまた、発現ベクター中に組み込むことも可能である。本発明のために好適に使用できる発現ベクターとして、配列番号２で示される塩基配列のうち５’側の１９塩基をＤＮＡに変換した塩基配列を含む発現ベクター、及び配列番号３で示される塩基配列のうち５’側の１９塩基をＤＮＡに変換した塩基配列を含む発現ベクターが挙げられる。また、二本鎖を形成するそれぞれのオリゴヌクレオチドが共に転写されるように、例えば配列番号２で示される塩基配列及び配列番号３で示される塩基配列、あるいは配列番号４で示される塩基配列及び配列番号５で示される塩基配列を共に含む発現ベクターを構築することも好ましい。ベクターとしては、ｓｉＲＮＡの発現のために用いられることが知られているベクターであればいずれを使用することもできる。
本発明はまた、上記の本発明のオリゴリボヌクレオチド、または上記の本発明の発現ベクターを含有する抗ウイルス剤を提供する。
本発明は更に、上記の本発明のオリゴリボヌクレオチド、または上記の本発明の発現ベクターを含有する子宮頚癌治療剤を提供する。
本発明における抗ウイルス剤及び子宮頚癌治療剤は、本発明のオリゴリボヌクレオチド、または本発明の発現ベクターを有効量含有する他、必要に応じて緩衝剤、賦形剤、担体等の通常用いられる成分を適宜含有し得る。投与量は、患者の年齢、体重、癌の進行度、症状等に応じて適宜決定されるものであり、特に限定されるものではないが、通常、１ｎｇ〜１００ｍｇ／日の範囲であれば良い。投与方法は、当分野において通常用いられる投与経路のいずれであっても良く、経口投与、静脈内注射等の注射を含む非経口投与のいずれであっても良い。
ｓｉＲＮＡは、あたらしい遺伝子発現のノックダウン方法として注目を集めているが、アンチセンスオリゴＤＮＡやリボザイムに比較して低濃度でしかも、長期間配列特異的に細胞内遺伝子発現を抑制し、将来の癌治療薬として大きな期待がよせられている。子宮頚癌の発癌にはＨＰＶが大きく関与しており、これらのウイルスのＥ６およびＥ７癌遺伝子の発現を抑制することが子宮頚癌の治療に結びつくことには疑いの余地がない。外因性ウイルスであるＨＰＶを標的にしたｓｉＲＮＡはその配列特異性からＨＰＶ陽性細胞以外には作用しないため、副作用のない理想的な遺伝子標的治療であるといえる。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【実施例１】  以下の２種類のｓｉＲＮＡ（配列番号２／３の二本鎖からなるＳｐ−１８Ｅ６及び配列番号４／５の二本鎖からなるＥｘ−１８Ｅ６）をＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドとして合成し、ＨＰＬＣ（Ｊａｐａｎ  ＢｉｏＳｅｒｖｉｃｅｓ  Ｃｏ．Ｌｔｄ，Ｓａｉｔａｍａ，Ｊａｐａｎ；Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）によって精製した。
2006035974.tif 000003
対照となる二本鎖ＲＮＡとしては、以下の非特異的二本鎖ＸＩＩ（３１％ＧＣ含量、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）を用いた。
2006035974.tif 000004
それぞれ２０μＭのセンス及びアンチセンス鎖を、１００ｍＭの酢酸カリウム、３０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、２ｍＭの酢酸マグネシウム中で９０℃、１分間加熱後、３７℃で１時間処理して重合させて使用した。
ＣＯＳ−１細胞を２４穴プレートあたり８万まき、２４時間後に５００ｎｇの３×ＦＬＡＧ／１８Ｅ６発現ベクター（図１）と２０ｐｍｏｌｅのｓｉＲＮＡを遺伝子導入した。導入にはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、添付文書の方法に準じた。導入４８時間後にＰＢＳで洗浄した後、１００μｌのＳＤＳ−ゲルローディングバッファーに直接溶解して９５℃で５分間処理し、ウェスタンブロットを行った。抗体は抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｍ２）Ｓｉｇｍａ（ＳａｉｎｔＬｏｕｉｓ，ＭＺ）を用いた。蛋白量をモニターするため、抗−αビメンチン抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）でも反応させた。尚、ＨＰＶ１８ゲノムは京都大学ウイルス研究所の酒井博幸先生から御供与頂き、このゲノムを鋳型としたＰＣＲによってＥ６及びＥ７コード領域を増幅してプラスミドにクローニングし、塩基配列を決定した後にｐｃＤＮＡ３−３×ＦＬＡＧにサブクローニングした。Ｅ６領域内にスプライシングドナーサイトとレシピエントサイトがあるため、ｐｃＤＮＡ３−３×ＦＬＡＧ−１８Ｅ６を発現させることによって３×ＦＬＡＧ−Ｅ６及び３×ＦＬＡＧ−Ｅ６＊の双方が発現する。
その結果、図２に示すように、Ｓｐ−１８Ｅ６はＥ６の発現をほぼ完全に抑制したが、Ｅ６＊の発現には影響しなかった。これに対して、Ｅｘ−１８Ｅ６はＥ６／Ｅ６＊の両者の発現を中程度に抑制した。
【実施例２】  ＨＰＶ１８型陽性子宮頚癌細胞株ＨｅＬａ及びＳＷ７５６においてｓｉＲＮＡ投与によってＲＮＡｉを惹起し得ることを確認するため、ｌａｍｉｎＡ／Ｃの抑制実験を行った。
ＨｅＬａおよびＳＷ７５６細胞は、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地、５％ＣＯ２、３７℃にて培養した。用いたｌａｍｉｎＡ／ｃ  ｓｉＲＮＡの配列は
2006035974.tif 000005
ＨｅＬａおよびＳＷ７５６細胞を２４穴プレートあたりそれぞれ５×１０４個、及び７×１０４個ずつまき、２４時間後にｌａｍｉｎＡ／Ｃ  ｓｉＲＮＡを投与し、さらに導入４８時間後にＰＢＳで洗浄した後、１００μｌのＳＤＳ−ゲルローディングバッファーに直接溶解し、９５℃で５分間処理後、ウェスタンブロットを行った。抗体は抗−ｌａｍｉｎ  Ａ／Ｃ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いた。
ｓｉＲＮＡの導入は次のように行った。３μｌのオリゴフェクタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を１２μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と混合した。一方、３μｌのｓｉＲＮＡ（２０μＭ）を５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ培地と混合し、室温で５分静置した。両者を混合し、２０分間室温静置後、３２μｌのＯＰＴＩ  ＭＥＭ  Ｉ培地を加えた計１００μｌを５００μｌの培地に加えた。ｓｉＲＮＡの最終濃度は１００ｎＭである。血清非存在下の導入は５００μｌの血清不含培地で行い、ｓｉＲＮＡ投与４時間後に血清６０μｌを加えた。
その結果、図３に示すように、いずれの細胞でもｌａｍｉｎＡ／Ｃは効率的に抑制され、特に血清存在下でのｓｉＲＮＡ投与がより効率的であった。
【実施例３】  ＨｅＬａ細胞に実施例１で用いた２種のｓｉＲＮＡ（Ｓｐ−１８Ｅ６及びＥｘ−１８Ｅ６）を投与し、Ｅ６／Ｅ７  ｍＲＮＡの変化をそれぞれＲＴ−ＰＣＲで確認した。鋳型ｃＤＮＡの２５倍希釈、５倍希釈、希釈なしで増幅を行った。
ｓｉＲＮＡ導入７２時間後にＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの抽出はＲＮｅａｓｙ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ），ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｓｅｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で行った。５００ｎｇのＲＮＡからＲｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてｃＤＮＡに逆転写し，１：５および１：２５に希釈してＰＣＲを行った。ＰＣＲプライマーはＨＰＶ  １８  Ｅ６、Ｅ７、β−アクチンを増幅するよう設定し、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ，Ｋｙｏｔｏ，ＪＡＰＡＮ）を用いて増幅した。
その結果、図４に示すように、Ｅｘ−１８Ｅ６／Ｓｐ−１８Ｅ６はいずれもＥ６  ｍＲＮＡの発現を強力に抑制した。一方、Ｅ７  ｍＲＮＡの発現はＳｐ−１８Ｅ６では中等度に、Ｅｘ−１８Ｅ６ではほぼ完全に抑制された。
【実施例４】  ＨｅＬａ及びＳＷ７５６細胞に６０ｐｍｏｌｅのＳｐ−１８Ｅ６またはＥｘ−１８Ｅ６  ｓｉＲＮＡを投与し、７２時間後のｐ５３／Ｒｂ／Ｅ７蛋白レベルへの影響を検討した。ｓｉＲＮＡ投与、ウェスタンブロットについては実施例２と同様に行った。用いた抗体は抗ｐ５３抗体（Ｂｐ５３−１２）、抗ＨＰＶ１８−Ｅ７抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、及び抗−αビメンチン抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）である。
その結果、図５に示すように、Ｓｐ−１８Ｅ６及びＥｘ−１８Ｅ６はいずれもｐ５３蛋白質を増加させ、その効果はＳｐ−１８Ｅ６においてより強力であった。また、Ｅ７蛋白質の発現は、Ｓｐ−１８Ｅ６は中等度に、Ｅｘ−１８Ｅ６はほぼ完全に抑制した。
【実施例５】  ２種のｓｉＲＮＡをＨｅＬａ及びＳＷ７５６細胞に投与し、その増殖抑制効果を確認した。
単層増殖の検討はＷＳＴ−８（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ８，Ｄｏｊｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）で行った。
「コロニー形成能（足場非依存性増殖）」の検討は次のように行った。ｓｉＲＮＡ導入後２４時間で細胞を回収し、１０％ＦＣＳ、０．８ｍｌの０．５％  ａｇａｒ  ｎｏｂｌｅ（Ｄｉｆｃｏ）１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地に１．２ｍｌの０．３％  ａｇａｒ  ｎｏｂｌｅ１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地を重層し、５００細胞／ｍｌ（ＨｅＬａ）、２０００細胞／ｍｌ（ＳＷ７５６）でまいた。寒天培地上に１ｍｌの増殖培地をおき、３日毎に交換した。１０〜２０日後に５０細胞以上のコロニーをカウントした。実験はすべてトリプリケートで３回行った。
結果を図６に示すように、いずれのｓｉＲＮＡも単層培養での増殖を効率的に抑制したが、その効果はＳｐ−１８Ｅ６において著明であった（図６の上部のグラフ）。また、足場非依存性増殖の抑制を軟寒天培地でのコロニー形成能で確認すると、Ｓｐ−１８Ｅ６は単層培養の場合と同様に足場非依存性増殖をほぼ完全に抑制した（図６の下部のグラフ）。
【実施例６】  本発明のｓｉＲＮＡによるＨｅＬａ細胞の増殖抑制はアポトーシス誘導によることを確認するために、アネキシンＶ陽性細胞をフローサイトメトリーで同定した。アネキシンＶ陽性細胞の同定は、ｓｉＲＮＡ投与７２時間後に、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣ  アポトーシス検出キット（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）を用い、添付の説明書に記載された方法で行った。
その結果、図７及び８に示すように、Ｓｐ−１８Ｅ６及びＥｘ−１８Ｅ６は共にアポトーシスを誘導し、Ｓｐ−１８Ｅ６はＥｘ−１８Ｅ６より効果的にアポトーシスを誘導していることが確認された。
【産業上の利用可能性】  ｓｉＲＮＡによる子宮頚癌に対する遺伝子標的治療剤あるいはＨＰＶに対する抗ウイルス剤の開発においては、我々のデザインした配列を用いるのがもっとも有効であり、本発明によって、子宮頸癌がｓｉＲＮＡ遺伝子標的治療法の最初の成功例になるものと期待される。
ＲＮＡｉは細胞自体が持つ自己防衛システムともいうべき現象であり、その効果はアンチセンスＤＮＡによる遺伝子発現抑制の数十倍効率的で、かつ遺伝子配列特異性がきわめて高いことが特徴である。このことは、ＲＮＡｉを遺伝子治療に応用した場合副作用の危険性が低いことを意味している。さらに、２１−２３塩基の合成ＲＮＡ２重短鎖のみの投与で遺伝子発現を抑制できることから、プラスミドやウイルスゲノムの人体への効果を考慮する必要がないという大きな利点がある。本発明は、ｓｉＲＮＡにより癌遺伝子の発現を特異的かつ効果的に抑制することができ、新たな遺伝子治療の戦略として期待が大きい。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年6月28日(2006.6.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】請求の範囲
【請求項１】（削除）
【請求項２】（削除）
【請求項３】（削除）
【請求項４】（削除）
【請求項５】（削除）
【請求項６】（削除）
【請求項７】（削除）
【請求項８】（削除）
【請求項９】（削除）
【請求項１０】配列番号１で示される下記の塩基配列および／またはその相補的配列に対応するＲＮＡ配列あるいは該ＲＮＡ配列と９０％以上の同一性を有する配列からの、かつヒトパピローマウイルス１８型のＥ６遺伝子の発現を抑制し得る、連続する１９塩基の塩基配列を含む、塩基長２１〜２３塩基のオリゴリボヌクレオチド。
ｃａｔａｇａａａｔａ  ａｃｃｔｇｔｇｔａｔ  ａｔｔｇｃａａｇａｃ  ａｇｔａｔｔｇｇａａ  ｃｔｔａｃａｇａｇｇ  ｔａｔｔｔｇａａｔｔ  ｔｇｃａｔｔｔａａａ  ｇａｔｔｔ（配列番号１）
【請求項１１】配列番号２、３、４または５で示される塩基配列あるいは該塩基配列と９０％以上の同一性を有する配列を含む、請求項１０記載のオリゴリボヌクレオチド。
【請求項１２】二本鎖である、請求項１０または１１記載のオリゴリボヌクレオチド。
【請求項１３】配列番号２で示される塩基配列と配列番号３で示される塩基配列とを含む二本鎖のオリゴリボヌクレオチド、または配列番号４で示される塩基配列と配列番号５で示される塩基配列とを含む二本鎖のオリゴリボヌクレオチドである、請求項１２記載のオリゴリボヌクレオチド。
【請求項１４】配列番号２または４で示される塩基配列、あるいは該塩基配列と９０％以上の同一性を有する配列、のうち５’側の１９塩基に対応するＤＮＡ配列を含む発現ベクター。
【請求項１５】請求項１０〜１３のいずれか１項記載のオリゴリボヌクレオチド、または請求項１４記載の発現ベクター、を含有する、ヒトパピローマウイルス１８型に対する抗ウイルス剤。
【請求項１６】請求項１０〜１３のいずれか１項記載のオリゴリボヌクレオチド、または請求項１４記載の発現ベクター、を含有する子宮頚癌治療剤。
【国際調査報告】
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