(57)【要約】本発明は、２種以上のＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡの、５’非翻訳領域、ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、ｐ７タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列、及び３’非翻訳領域を含む塩基配列からなり、かつ自律複製能を有する、改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡを提供する。特に、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡのＮＳ３からＮＳ４、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ配列部分を、配列番号１で示されるＪＦＨ１株のＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５Ａ、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ部分配列に置換することにより、自律複製能を獲得した、改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２種以上のＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡからなり、５’非翻訳領域、ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、ｐ７タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、配列番号１で示されるＪＦＨ１株のＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５Ａ、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ部分配列、ならびに３’非翻訳領域を含み、かつ自律複製能を有する、改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡ。
【請求項２】
２種以上のＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡからなり、５’非翻訳領域、ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、ｐ７タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、配列番号２で示されるＪＦＨ１株のＮＳ５Ｂタンパク質コード配列、及び３’非翻訳領域を含み、かつ自律複製能を有する、改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡ。
【請求項３】
Ｃ型肝炎ウイルス株が遺伝子型１ａ、遺伝子型１ｂ、遺伝子型２ａ、遺伝子型２ｂ、遺伝子型３ａ、及び遺伝子型３ｂのウイルス株から選ばれるものである、請求項１又は２記載の改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡ。
【請求項４】
Ｃ型肝炎ウイルス株が遺伝子型１ｂ及び遺伝子型２ａのウイルス株から選ばれるものである、請求項１〜３のいずれか１項記載の改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡ。
【請求項５】
遺伝子型１ｂのウイルス株が、ＨＣＶ−ｃｏｎ１株、ＨＣＶ−ＴＨ株、ＨＣＶ−Ｊ株、ＨＣＶ−ＪＴ及びＨＣＶ−ＢＫ株から選ばれるものである、請求項３又は４記載の改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡ。
【請求項６】
遺伝子型２ａのウイルス株が、ＨＣＶ−Ｊ６株、ＨＣＶ−ＪＦＨ１株、及びＨＣＶ−ＪＣＨ１株から選ばれるものである、請求項３〜５のいずれか１項記載の改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載の改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡを含む、肝細胞指向性ウイルスベクター。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項記載の改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡを導入され、該Ｃ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡを複製しかつウイルス粒子を産生しうる細胞。
【請求項９】
請求項８記載の細胞を培養し、培養物中から得られるＣ型肝炎ウイルス粒子。
【請求項１０】
請求項９記載のＨＣＶを含有する液体又は、細胞破砕物を、カラムクロマトグラフィ及び／又は密度勾配遠心を組み合わせることによりＨＣＶ粒子を精製する方法。
【請求項１１】
前記記載のカラムクロマトグラフィが、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、及びアフィニティークロマトグラフィの中から選ばれる一つ以上のクロマトグラフィである請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記記載のイオン交換クロマトグラフィが、陰イオンクロマトグラフィ及び陽イオンクロマトグラフィの中から選ばれる一つ以上のクロマトグラフィであり、前記記載のゲル濾過クロマトグラフィがＳｅｐａｈｃｒｙｌ−Ｓ３００（登録商標）、Ｓｅｐａｈｃｒｙｌ−Ｓ４００（登録商標）又はＳｅｐｈａｃｒｙｌ−Ｓ５００（登録商標）から選ばれる樹脂を利用した一つ以上のクロマトグラフィであり、前記記載のアフィニティークロマトグラフィが硫酸化セルロファイン、ヘパリン及びレクチンの中から選ばれる樹脂を利用した一つ以上のクロマトグラフィである請求項１１の方法。
【請求項１３】
前記記載のクロマトグラフィが硫酸セルロファインクロマトグラフィである請求項１１の方法。
【請求項１４】
前記記載の密度勾配遠心が、塩化セシウム、ショ糖及び糖の重合体より選ばれる一つ以上の溶質を用いて行われる請求項１０の方法。
【請求項１５】
前記記載の精製方法で陰イオン交換クロマトグラフィ、硫酸セルロファインクロマトグラフィ、及びショ糖密度勾配遠心をそれぞれ一回以上任意の順番で組み合わせた請求項１０の方法。
【請求項１６】
請求項９記載ＨＣＶ粒子を含有する液体あるいは細胞破砕液を、カラムクロマトグラフィ及び密度勾配遠心を組み合わせるＨＣＶ粒子の精製方法により得られたＨＣＶ粒子。
【請求項１７】
前記記載のカラムクロマトグラフィが、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、及びアフィニティークロマトグラフィの中から選ばれる一つ以上のクロマトグラフィで精製された請求項１６のＨＣＶ粒子。
【請求項１８】
前記記載のイオン交換クロマトグラフィが、陰イオンクロマトグラフィ及び陽イオンクロマトグラフィの中から選ばれる一つ以上のクロマトグラフィであり、前記記載のゲル濾過クロマトグラフィがＳｅｐａｈｃｒｙｌ−Ｓ３００（登録商標）、Ｓｅｐａｈｃｒｙｌ−Ｓ４００（登録商標）又はＳｅｐｈａｃｒｙｌ−Ｓ５００（登録商標）から選ばれる樹脂を利用した一つ以上のクロマトグラフィであり、前記記載のアフィニティークロマトグラフィが硫酸化セルロファイン、ヘパリン及びレクチンの中から選ばれる一つ以上のクロマトグラフィにより精製された請求項１６のＨＣＶ粒子。
【請求項１９】
前記記載のクロマトグラフィが硫酸セルロファインクロマトグラフィで精製された請求項１６のＨＣＶ粒子。
【請求項２０】
前記記載の密度勾配遠心が、塩化セシウム、ショ糖及び糖の重合体より選ばれる一つ以上の溶質を用いて精製された請求項１６のＨＣＶ粒子。
【請求項２１】
前記記載の精製方法で陰イオン交換クロマトグラフィ、硫酸セルロファインクロマトグラフィ、及びショ糖密度勾配遠心を組み合わせて精製された請求項１６のＨＣＶ粒子。
【請求項２２】
請求項８記載のＣ型肝炎ウイルス粒子又はその一部分を抗原として使用して得られうるＣ型肝炎ワクチン及び／又は中和抗体。
【請求項２３】
請求項８記載のＣ型肝炎ウイルス粒子が感染したＣ型肝炎ウイルス感染細胞。
【請求項２４】
請求項８記載の細胞を培養し、培養物中からウイルス粒子を回収することを特徴とする、Ｃ型肝炎ウイルス感染細胞の製造方法。
【請求項２５】
請求項８記載の細胞を培養し、培養物中のウイルス粒子を他の細胞に感染させることを特徴とする、Ｃ型肝炎ウイルス感染細胞の製造方法。
【請求項２６】
被験物質の存在下で請求項８又は請求項２３記載の細胞を培養し、培養物中のＣ型肝炎ウイルスＲＮＡ又はウイルス粒子を検出することにより、該被験物質の抗Ｃ型肝炎ウイルス効果を評価することを特徴とする、抗Ｃ型肝炎ウイルス物質のスクリーニング方法。
【請求項２７】
請求項２２記載のＣ型肝炎ワクチン及び／又は中和抗体を製造する方法。
【請求項２８】
外来遺伝子をコードするＲＮＡを請求項１〜６のいずれか１項記載の改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡ中に挿入し、これを目的とする細胞中に導入して複製又は発現させることを特徴とする、細胞内で外来遺伝子を複製及び／又は発現させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、各種遺伝子型のヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を培養細胞系で自律複製させる方法と、そのための改変ＨＣＶゲノムＲＮＡ、及び該ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞に関する。
【背景技術】  近年の研究により、Ｃ型肝炎ウイルスは遺伝子型又は血清型により多数の型に分類されることが分かってきた。現在主流のＨＣＶ遺伝子型分類法である、ＳｉｍｍｏｎｄｓらによるＨＣＶ株の塩基配列を用いた系統解析法では、ＨＣＶは遺伝子型１ａ、遺伝子型１ｂ、遺伝子型２ａ、遺伝子型２ｂ、遺伝子型３ａ、遺伝子型３ｂの６タイプに分類され（非特許文献１）、さらにそれら各タイプがいくつかのサブタイプに分類される。そして、ＨＣＶの複数の遺伝子型についてはそのゲノム全長の塩基配列も決定されている（特許文献１、及び非特許文献２〜４）。
ＨＣＶは持続的に感染することにより慢性肝炎を引き起こす。現在、世界的規模で認められる慢性肝炎の主たる原因がＨＣＶ持続感染である。実際、持続感染者の５０％程度が慢性肝炎を発症し、そのうち約２０％の患者が１０年〜２０年を経て肝硬変に移行し、さらにその一部は肝癌といった致死的な病態へと進展する。
Ｃ型肝炎に対する現在の主な治療は、インターフェロン−α、インターフェロン−β、及びインターフェロン−αとプリン−ヌクレオシド誘導体であるリバビリンとの併用療法により行われている。しかしながら、これらの治療を行っても、全治療者の約６０％に治療効果が認められるだけで、効果が出た後に治療を中止すると半分以上の患者が再燃する。インターフェロンの治療効果は、ＨＣＶの遺伝子型と関連することが知られており、遺伝子型１ｂに対しては効果が低く、遺伝子型２ａに対してはより効果が高いと言われている（非特許文献５）。また、遺伝子型により、ＨＣＶが有するプロテアーゼの基質特異性が異なり、遺伝子型１ｂのＮＳ３プロテアーゼを用いて開発した阻害薬は、他の遺伝子型のＮＳ３プロテアーゼについては、その阻害活性が５０倍以上悪くなる（非特許文献６）。従って、効率の良いＨＣＶ治療薬を開発するためには、ＨＣＶの各遺伝子型での反応性を確認しながら、開発を行う必要がある。
最近になって、ＨＣＶ由来の自律複製能を有するＲＮＡとして、ＨＣＶサブゲノムＲＮＡレプリコンが作製されたことにより（特許文献２、３、及び非特許文献７〜９）、培養細胞を用いてＨＣＶの複製機構を解析することが可能となった。これらのＨＣＶサブゲノムＲＮＡレプリコンは、ＨＣＶゲノムＲＮＡの５’非翻訳領域中のＨＣＶ  ＩＲＥＳの下流に存在する構造タンパク質を、ネオマイシン耐性遺伝子及びその下流に連結したＥＭＣＶ−ＩＲＥＳによって置換したものである。このＲＮＡレプリコンは、ヒト肝癌細胞Ｈｕｈ７に導入してネオマイシン存在下で培養することにより、Ｈｕｈ７細胞内で自律複製することが証明された。さらに一部のＨＣＶサブゲノムＲＮＡレプリコンは、Ｈｕｈ７に限らずヒト子宮頸部癌細胞ＨｅＬａ、ヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２などの細胞内でも自律複製することが証明された（特許文献３）。
しかしながら、このようなＨＣＶの細胞内ＲＮＡ複製系は、未だ限られた遺伝子型についてのもの、というよりはむしろ、限られたＨＣＶ株のゲノムＲＮＡを用いたものしか作製されていない。従って、数多くの遺伝子型が存在するＨＣＶについて、開発したＨＣＶ治療薬の遺伝子型の違いによる治療効果の違いを検討することは極めて困難である。また、ＲＮＡレプリコンは、ＨＣＶウイルスの増殖複製過程における、ウイルスＲＮＡ複製のみ評価可能な実験系であり、ＨＣＶウイルス粒子の感染細胞内での形成と細胞外への放出、さらに新たな細胞への感染という過程を評価することはできない。
現在、ＨＣＶウイルス粒子の形成と細胞外への放出、さらに新たな細胞への感染という過程を評価する方法は、チンパンジーなどの動物を用いた実験系に限られる（非特許文献１０）。しかしながら、動物という生体をそのまま用いた実験系は、操作が煩雑で解析が極めて困難である。従って、ＨＣＶウイルス粒子の感染細胞内での形成と細胞外への放出、さらに新たな細胞への感染という過程の解析や、これらの過程の阻害を作用メカニズムとした抗ＨＣＶ薬の開発には、これらの過程を再現できる極めて単純化された実験系、すなわち、培養細胞系を用いたＨＣＶウイルス粒子の複製系を構築する必要がある。
また、培養細胞系による安定したＨＣＶウイルス粒子の供給が可能になれば、ウイルスを弱毒化したり、分子生物学的手法を用いて非感染性のＨＣＶウイルスを作製して、ワクチンに利用することもできる。しかしながら、ＨＣＶは遺伝子型によりタンパク質の配列が異なるため、ＨＣＶの抗原性も遺伝子型ごとに異なる。実際、多様な遺伝子型の存在はＨＣＶワクチンの生産における大きな障害となっている（非特許文献１１）。従って、効率の良いＨＣＶワクチンの生産のためにも、培養細胞系による、各遺伝子型のＨＣＶウイルス粒子の安定した生産が望まれる。
ＨＣＶは、５５〜６５ｎｍの球状粒子でありＨＣＶ感染患者の血中に存在することが知られている。ヒト血清中に存在するＨＣＶを精製する方法として、レクチンを用いたアフィニティークロマトグラフィ（非特許文献１２）及びヘパリンを用いたクロマトグラフィ（非特許文献１３）が知られている。しかし、これらの方法では、およそ１Ｍコピー／ｍＬ程度の濃度で１ｍＬに満たない量のウイルスしか精製できないことから、工業的な利用には全く結びつかない。
ＨＣＶ以外でウイルス粒子を精製する方法が現在までに複数発明されている（例えば特許文献４、５、及び６）。しかし、これらの文献をみてわかるようにウイルス粒子の性質は様々であり、ヒトＣ型肝炎ウイルスの精製に至適である方法についてなんら参考になる情報を与えない。また、同じ肝炎ウイルスであるヒトＡ型肝炎ウイルスについて特許文献７において、陰イオン交換クロマトグラフィによりＤＮＡを除去することによりヒトＡ型肝炎ウイルスを精製することができることを開示している。しかし、肝炎ウイルスであってもＡ型はＤＮＡを遺伝子としてもつウイルスであり、Ｃ型はＲＮＡを遺伝子としてもつウイルスであることからもわかるように全く類似点はなく、精製する方法についてなんら参考になる情報を与えない。今後、ヒトＣ型肝炎ウイルス粒子をワクチンなどに工業的に用いるためには大量かつ高度に精製する必要があることから、精製方法の開発が待たれている。
【特許文献１】特開２００２−１７１９７８号公報
【特許文献２】特開２００１−１７１８７号公報
【特許文献３】ＷＯ２００４／１０４１９８Ａ１
【特許文献４】特許３３１３１１７号
【特許文献５】特表２００２−５０３４８４号
【特許文献６】特表２０００−５１０６８２号
【特許文献７】特公平６−４８９８０
【非特許文献１】Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１０（１９９４）ｐ１３２１−１３２４
【非特許文献２】Ｃｈｏｏ，Ｑ．Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４（１９８９）ｐ３５９−３６２，
【非特許文献３】Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７３（１９９２）ｐ６７３−６７９
【非特許文献４】Ｍｏｒｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｉｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８３（１９９２）ｐ３３４−３４２）
【非特許文献５】Ｙｏｓｈｉｏｋａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１６（１９９２）ｐ２９３−２９９
【非特許文献６】Ｔｈｉｂｅａｕｌｔ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８（２００４）ｐ７３５２−７３５９
【非特許文献７】Ｂｌｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９０（２０００）ｐ１９７２−１９７４
【非特許文献８】Ｆｒｉｅｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５（２００１）ｐ１２０４７−１２０５７
【非特許文献９】Ｋａｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１２５（２００３）ｐ１８０８−１８１７
【非特許文献１０】Ｋｏｌｙｋｈａｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７（１９９７）ｐ５７０−５７４
【非特許文献１１】Ｆａｒｃｉ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ  ２０（２０００）ｐ１０３−１２６
【非特許文献１２】Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９６（１９９３）ｐ３５４−３５７
【非特許文献１３】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８６（２００５）ｐ６７７−６８５
【発明の開示】
本発明の課題は、各種遺伝子型のＣ型肝炎ウイルスを培養細胞系で複製増幅するための方法を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行い、自律複製能を有するＨＣＶ  ＪＦＨ１株のゲノムＲＮＡと、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで自律複製能を有しないＨＣＶ株のゲノムＲＮＡとを組み合わせた改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡを作製し、これが培養細胞系で自律複製可能なことを見出した。具体的には前記発明は、ＪＦＨ１株のＮＳ３タンパク質コード配列から３’末端までのゲノムを導入することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで自律複製能を有しないＨＣＶゲノムＲＮＡを培養細胞系で自律複製可能なＲＮＡに改変しうることを見出した。
すなわち、本発明は、２種以上のＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡの、５’非翻訳領域、ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ｐ７タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ならびにＪＦＨ１株のＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂの各タンパク質コード配列、及び３’非翻訳領域を含む塩基配列からなり、かつ自律複製能を有する、改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡに関する。
具体的には、本発明は１つの実施形態として、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡのＮＳ３タンパク質コード配列から３’末端までのゲノム配列ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列が配列番号１に示されるＪＦＨ１株のＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５Ａ、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ部分配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０４７６３９のＤＮＡ配列３８６７−９６７８で示される配列のＴをＵに置換したＲＮＡ配列）に置換され、かつ自律複製能を有する、改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡを提供する。
さらに別な実施形態として、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡのＮＳ５Ｂタンパク質コード配列が配列番号２で示されるＪＦＨ１株のＮＳ５Ｂタンパク質コード配列に置換され、かつ自律複製能を有する、改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡを提供する。
２種以上のＣ型肝炎ウイルスとしては、遺伝子型１ｂ及び遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスを用いることが好ましい。遺伝子型１ｂのウイルス株としては、ＨＣＶ−ｃｏｎ１株、ＨＣＶ−ＴＨ株、ＨＣＶ−Ｊ株、ＨＣＶ−ＪＴ及びＨＣＶ−ＢＫ株を挙げることができ、また遺伝子型２ａのウイルス株としては、ＨＣＶ−Ｊ６株、ＨＣＶ−ＪＦＨ１株、及びＨＣＶ−ＪＣＨ１株を挙げることができる。
本発明の改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡは、さらに、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子及び／又は少なくとも１つのリポーター遺伝子と、少なくとも１つのＩＲＥＳ配列とを含んでいてもよい。
この場合、前記５’非翻訳領域、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子及び／又は少なくとも１つのリポーター遺伝子、少なくとも１つのＩＲＥＳ配列、ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ｐ７タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列、及び３’非翻訳領域は、５’から３’方向へこの順番で改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡに含まれる。
本明細書では、この改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡの一例として、
（ａ）配列番号１１に示す塩基配列からなるＲＮＡ、又は
（ｂ）配列番号１１に示す塩基配列において１又は複数個、好ましくは１００個、より好ましくは５０個、さらに好ましくは１０個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるＲＮＡを含み、自律複製能及びＣ型肝炎ウイルス粒子産生能を有する、改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡを挙げることができる。
本発明はまた、本発明の改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡを導入され、該Ｃ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡを複製しかつウイルス粒子を産生しうる細胞を提供する。ここで、宿主細胞は増殖性細胞であることが好ましく、特に、真核細胞、例えば、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、ＨｅＬａ細胞、又は２９３細胞等のヒト肝由来細胞、ヒト子宮頸由来細胞、又はヒト胎児腎由来細胞が好ましい。
本発明は、前記細胞を培養し、培養物中からウイルス粒子を回収することを特徴とする、Ｃ型肝炎ウイルス粒子の製造方法、及び該方法によって製造されるＣ型肝炎ウイルス粒子も提供する。
本発明はまた、前記細胞を培養し、培養物中のウイルス粒子を他の細胞に感染させることを特徴とする、Ｃ型肝炎ウイルス感染細胞の製造方法、及び該方法によって製造されるＣ型肝炎ウイルス感染細胞も提供する。本発明は、カラムクロマトグラフィ及び／又は密度勾配遠心を用いてＨＣＶ粒子を精製することにより工業的に医薬に用いることが可能な精製度をもつＨＣＶ粒子を得ることができる。その際に用いるカラムクロマトグラフィが、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、及びアフィニティークロマトグラフィから選ばれるひとつ又は複数のクロマトグラフィであり、密度勾配遠心を、塩化セシウム、ショ糖及び糖重合体のより選ばれるひとつ又は複数の溶質を含んだ溶媒を用いて行うことによりＨＣＶを精製することができる。
本発明は、本発明の細胞やＣ型肝炎ウイルス感染細胞を利用した抗Ｃ型肝炎ウイルス物質のスクリーニング方法も提供する。該方法は、被験物質の存在下で本発明の細胞又はＣ型肝炎ウイルス感染細胞を培養し、培養物中のＣ型肝炎ウイルスＲＮＡ又はウイルス粒子を検出することにより、該被験物質の抗Ｃ型肝炎ウイルス効果を評価することを特徴とする。
また本発明は、本発明のＣ型肝炎ウイルス粒子又はその一部分を抗原として使用して、Ｃ型肝炎ワクチンを製造する方法を提供する。
さらに本発明は、外来遺伝子をコードするＲＮＡを本発明の改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡ中に挿入し、これを目的とする細胞中に導入して複製又は発現させることを特徴とする、細胞中で外来遺伝子を複製及び／又は発現する方法、並びに、本発明の改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡを含む肝細胞指向性ウイルスベクターを提供する。
本発明によれば、培養細胞系を用いて、感染性を有するＨＣＶウイルス粒子を作製することができる。さらに、患者から分離した自律複製能を有さないＨＣＶ株においても、そのＮＳ３領域より３’側の領域をＪＦＨ１のウイルスゲノムＲＮＡに置換することにより、あるいはＮＳ５Ｂ領域をＪＦＨ１のＮＳ５Ｂに置換することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで自律複製させることができる。従って、種々の遺伝子型のＨＣＶ株のウイルス粒子を培養細胞系により作製することができ、ＨＣＶ感染過程の研究、ＨＣＶ感染に影響を及ぼす各種物質のスクリーニング系、及びＨＣＶワクチンの製造等に有用である。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明のＨＣＶゲノムＲＮＡを作製するための鋳型ＤＮＡの構築手順を示す概略図で、Ｔ７プロモーターの下流に全長ＨＣＶゲノムを挿入して作製したプラスミドクローンｐＪＦＨ１の構造を示す。図中の記号は以下のとおりである。Ｔ７：Ｔ７  ＲＮＡプロモーター、５’ＵＴＲ：５’非翻訳領域、Ｃ：Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１、Ｅ２：エンベロープタンパク質。ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂ：非構造タンパク質。３’ＵＴＲ：３’非翻訳領域。Ａｇｅ  Ｉ、Ｐｍｅ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉ：制限酵素Ａｇｅ  Ｉ、Ｐｍｅ  Ｉ及びＸｂａ  Ｉの切断部位。ＧＤＤ：ＮＳ５Ｂタンパク質の活性中心に相当するアミノ酸モチーフＧＤＤの位置。
図２は、ＨＣＶゲノムＲＮＡであるｒＪＦＨ１を導入したＨｕｈ７細胞におけるｒＪＦＨ１の複製を示すノーザンブロット解析の結果を示す写真である。
図３は、培地中のＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、Ｅ２タンパク質の検出結果を示す。
図４は、ＨＣＶゲノムＲＮＡを導入した細胞の培地中への経時的なＣｏｒｅタンパク質の放出結果を示す。
図５は、ｒＪＦＨ１を導入したＨｕｈ７細胞の培養上清をショ糖密度勾配により分画した各画分における、ＨＣＶＣｏｒｅタンパク質とＨＣＶゲノムＲＮＡ量を示すグラフである。黒塗りの円はＨＣＶ  Ｃｏｒｅ（ｃｏｒｅ）タンパク質、白抜きの円はＨＣＶゲノムＲＮＡを示す。図５Ａは未処理、図５ＢはＲＮａｓｅ処理、図５ＣはＮＰ４０処理、図５ＤはＮＰ４０＋ＲＮａｓｅ処理したｒＪＦＨ１導入Ｈｕｈ７細胞の結果を示す。
図６は、ｒＪＦＨ１導入Ｈｕｈ７細胞の培養液中に分泌されたウイルス粒子の感染性に関する。図６Ａは、抗Ｃｏｒｅ抗体（左）、抗ＮＳ５Ａ抗体（右）による免疫染色の結果を示す写真である。図６Ｂは、抗Ｃｏｒｅ抗体染色陽性細胞の数を示すグラフである。図６Ｃは、細胞内（左）及び上清（右）におけるＨＣＶ  ＲＮＡ量の経時的変化を示すグラフである。、
図７は、ｒＪＣＨ１／ＮＳ５Ｂ（ｊｆｈ１）導入Ｈｕｈ７細胞の培養液中に分泌されたウイルス粒子の感染性に関する。図７Ａは、ＪＣＨ１／ＮＳ５Ｂ（ｊｆｈ１）導入Ｈｕｈ細胞の培養液中に分泌されたウイルス粒子のナイーブなＨｕｈ７細胞中でのＨＣＶ  ＲＮＡの増幅についてのグラフである。図７Ｂは、抗Ｃｏｒｅ抗体染色陽性細胞の数を示すグラフである。
図８は、ＴＨ／ＪＦＨ１キメラレプリコンの構造を示す。
図９は、ｒＴＨ／ＪＦＨ１キメラレプリコンＲＮＡトランスフェクションによるコロニー形成をみた結果である。
図１０は、ＴＨ／ＪＦＨ１キメラレプリコン培養上清感染によるコロニー形成をみた結果である。
図１１は、ゲル濾過クロマトグラフィにおける流出プロファイルを示す。縦軸は波長４９０ｎｍでの吸光度を示している。Ｓ−３００、Ｓ−４００及びＳ−５００はそれぞれＳｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）Ｓ−３００、Ｓ−４００及びＳ−５００である。また、横軸はカラムからの溶出した溶液量を示している。
図１２は、イオン交換クロマトグラフィにおける流出プロファイルを示す。縦軸はＨＣＶ粒子のコアタンパク質の量を示している。
図１３は、レクチンアフィニティークロマトグラフィにおける流出プロファイルを示す。縦軸はＨＣＶ粒子のコアタンパク質の量を示している。
図１４は、ヘパリン及び硫酸セルロファインおける流出プロファイルを示す。縦軸は波長４９０ｎｍでの吸光度を示している。
図１５は、ブルーダイアフィニティクロマトグラフィにおける流出プロファイルを示す。縦軸はＨＣＶ粒子のコアタンパク質の量を示している。
図１６は、カラムクロマトグラフィ及びショ糖密度勾配遠心を組み合わせた精製プロファイルを示す。縦軸はＨＣＶ粒子のコアタンパク質の量を示している。また、ショ糖密度勾配遠心ではＨＣＶのコアタンパク質の量とともに各フラクション溶液の密度が縦軸に示されている。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００４−２４３９７５号、特願２００４−２９０８０１号、特願２００５−６９５２７号、及び特願２００５−６９７２５号の明細書に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明について詳細に説明する。
１．改変されたキメラＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡ
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のゲノムは、約９６００ヌクレオチドからなる（＋）鎖の一本鎖ＲＮＡである。このゲノムＲＮＡは、５’非翻訳領域（５’ＮＴＲ又は５’ＵＴＲとも表記する）、構造領域と非構造領域とから構成される翻訳領域、及び３’非翻訳領域（３’ＮＴＲ又は３’ＵＴＲとも表記する）からなる。その構造領域にはＨＣＶの構造タンパク質がコードされており、非構造領域には複数の非構造タンパク質がコードされている。
このようなＨＣＶの構造タンパク質（ｃｏｒｅ、Ｅ１、及びＥ２）と非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、及びＮＳ５Ｂ）は、翻訳領域から一続きのポリプロテインとして翻訳された後、プロテアーゼによる限定分解を受けて遊離、生成される。これらの構造タンパク質及び非構造タンパク質（すなわち、ＨＣＶのウイルスタンパク質）のうち、ｃｏｒｅはコアタンパク質であり、Ｅ１及びＥ２はエンベロープタンパク質である。非構造タンパク質はウイルス自身の複製に関与するタンパク質であり、ＮＳ２はメタロプロテアーゼ活性、ＮＳ３はセリンプロテアーゼ活性（Ｎ末端側の３分の１）とヘリカーゼ活性（Ｃ末端側の３分の２）を有することが知られている。さらに、ＮＳ４ＡはＮＳ３のプロテアーゼ活性に対するコファクターであり、ＮＳ５ＢはＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性を有することも報告されている。
現在、ＨＣＶの遺伝子型としては、少なくとも１型から６型まで知られており、ＨＣＶはその配列から、Ｓｉｍｍｏｎｄｓら（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，（１９９４）１０，ｐ．１３２１−１３２４を参照）による国際分類に従って各種遺伝子型（ＨＣＶ１ａ、ＨＣＶ１ｂ、ＨＣＶ２ａ、ＨＣＶ２ｂ等）に分類されている。本発明において、自律複製能を有しないＨＣＶゲノムＲＮＡは、これらの既知のウイルス型に限定されず、全ての自律複製能を有しない、つまり感染性粒子を細胞外に放出する能力を有しないＨＣＶゲノムＲＮＡを含むものとする。なお、本発明においてＲＮＡが「自律複製能を有する」あるいは「自律的に複製する」とは、ＨＣＶゲノムＲＮＡを細胞中に導入したときに、そのＨＣＶゲノムＲＮＡが自己増殖すること、つまり感染性粒子を細胞外に放出する能力を有することを意味する。
本明細書では、上記のような培養細胞系自律複製能を有するＨＣＶゲノムＲＮＡを含むＲＮＡを、「レプリコンＲＮＡ」又は「ＲＮＡレプリコン」と称する。本明細書では、レプリコンＲＮＡの全長を含む本発明のレプリコンＲＮＡを、「全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ」と呼ぶ。本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡは、ウイルス粒子産生能を有する。また、本発明の改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡは、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡである。
本発明にかかる改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡは、２種以上のＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡの、５’非翻訳領域、ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ｐ７タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ならびにＪＦＨ１株のＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂの各タンパク質コード配列、及び３’非翻訳領域を含む塩基配列からなり、かつ自律複製能を有する、改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡを含む。具体的には、本発明は１つの実施形態として、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡのＮＳ３タンパク質コード配列から３’末端までのゲノム配列ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列が配列番号１に示されるＪＦＨ１株のＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５Ａ、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ部分配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０４７６３９のＤＮＡ配列３８６７−９６７８で示される配列のＴをＵに置換したＲＮＡ配列）に置換され、かつ自律複製能を有する、改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡを含む。
また別の実施形態として、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡのＮＳ５Ｂタンパク質コード配列が配列番号２で示されるＪＦＨ１株のＮＳ５Ｂタンパク質コード配列に置換され、かつ自律複製能を有する、改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡを提供する。
好適には、遺伝子型１ｂ及び遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスを用いた、５’非翻訳領域、ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ｐ７タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ならびにＪＦＨ１株のＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂの各タンパク質コード配列、及び３’非翻訳領域を含む塩基配列からなり、かつ自律複製能を有する、改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡを含む。
前記の改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡは、さらに、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子及び／又は少なくとも１つのリポーター遺伝子と、少なくとも１つのＩＲＥＳ配列とを含んでいてもよい。
本発明では、２種以上のＣ型肝炎ウイルスとして、培養細胞系で自律複製能を有するＨＣＶ株と培養細胞系で自律複製能を有しないＨＣＶ株とを組み合わせることにより、自律複製能を有しないＨＣＶ株を自律複製可能なものに改変することができる。あるいは、自律複製効率が低いウイルス株を複製効率の高いウイルス株に改変することができる。
ＨＣＶ株としては、具体的には、１ａ型にはＨＣＶ−１株、ＨＣＶ−Ｈ株、ＨＣＶ−Ｊ１株など、１ｂ型には、ＨＣＶ−ｃｏｎ１株、ＨＣＶ−ＴＨ株、ＨＣＶ−Ｊ株、ＨＣＶ−ＪＴ株、ＨＣＶ−ＢＫ株など、２ａ型にはＨＣＶ−Ｊ６株、ＪＦＨ−１株、ＪＣＨ１株など、２ｂ型にはＨＣ−Ｊ８株、３ａ型にはＥ−ｂ１株などが知られている。これらのウイルスの構造は、基本的には、５’−ＵＴＲから、ｃｏｒｅ、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、ＮＳ５ｂ、３’−ＵＴＲからなる（前掲）。上記各ＨＣＶ株の各領域の塩基配列も明らかになっており、例えば、ＴＨ株の全長配列上、ｃｏｒｅ、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２の領域は明らかになっている。また、ＨＣＶ−ＪＴ株では、ｃｏｒｅ、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２の領域が明らかになっている。本発明に係るレプリコンＲＮＡの１つの実施形態として、ＨＣＶ２ａ型のＪＦＨ１株と、ＪＦＨ−１株を除く他の株、例えば、ＨＣＶ−１株、ＨＣＶ−Ｈ株、ＨＣＶ−Ｊ１株、ＨＣＶ−ｃｏｎ１株、ＨＣＶ−ＴＨ株（Ｗａｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９９４）２６９，ｐ．１４２０５−１４２１０，及びＭｏｒａｄｐｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，（１９９８）２４６，ｐ．９２０−９２４）、ＨＣＶ−Ｊ株、ＨＣＶ−ＪＴ株、ＨＣＶ−ＢＫ株、ＨＣＶ−Ｊ６株、ＪＣＨ１株、ＨＣ−Ｊ８株、Ｅ−ｂ１株を用いたキメラＨＣＶレプリコンＲＮＡを挙げることができる。
さらに、本発明の改変されたＨＣＶゲノムＲＮＡの好適な実施形態として、Ｃ型肝炎ウイルスであるＪＦＨ１株のＨＣＶゲノムＲＮＡ中のＮＳ３領域より３’側の領域をＪＦＨ１のウイルスゲノムＲＮＡに置換した、あるいはＮＳ５Ｂタンパク質コード配列を他のＨＣＶゲノムＲＮＡ中のＮＳ５Ｂタンパク質コード配列に置換もしくは挿入されたＨＣＶゲノムＲＮＡを挙げることができる。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、複製する事が出来ないことが知られている、ＨＣＶゲノムＲＮＡであるＪＣＨ１（ｒｅｆ）のＮＳ３領域より３’側の領域をＪＦＨ１のウイルスゲノムＲＮＡに置換することにより、ＨＣＶゲノムＲＮＡを自律複製し得るＨＣＶゲノムＲＮＡに改変することが可能となる。
またＨＣＶゲノムＲＮＡであるＨＣＶ遺伝子型１ｂのＣｏｎ−１クローン（ｒｅｆ）（ＥＭＢＬ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＪ２３８７９９）のＮＳ３からＮＳ４、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ配列部分を、ＪＦＨ１株のＮＳ３からＮＳ４、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ配列に置換することにより、又はＨＣＶ遺伝子型１ｂのＣｏｎ−１クローン（ｒｅｆ）のＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ配列部分のみを、ＪＦＨ１株のＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ配列に置換することによりＨＣＶゲノムＲＮＡを自律複製し得るＨＣＶゲノムＲＮＡに改変する事が可能となる。
Ｃｏｎ−１クローンの遺伝子を利用した全長レプリコンは、自律複製能はあるが、ＨＣＶ粒子形成しない（Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒａｎｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，（２００２）７６，ｐ．４００８−４０２１を参照）。しかしながら、本発明の実施例に示すように、ＮＳ３からＮＳ４、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ配列部分を、ＪＦＨ１株のＮＳ３からＮＳ４、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ配列に置換することにより粒子が形成される。すなわち、本発明の方法により、自律複製能はあっても粒子形成不可能なＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡを粒子形成が可能な改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡにすることが可能となる。
また、ＴＨ株やＪＣＨ株のように自律複製能をもつレプリコンを作製できないＨＣＶにおいてもが、本発明の実施例に示すようにＪＦＨ−１株とのキメラ遺伝子を作製することにより粒子が形成された。従って、自律複製能しないＨＣＶゲノムＲＮＡから粒子形成が可能な改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡにすることが可能となる。
さらに、ＪＦＨ１株のＲＮＡ配列部分のうち、ＮＳ５Ｂに変異をいれることによりＨＣＶのゲノムＲＮＡの増殖が無くなりＨＣＶの粒子産生がなくなることから、自律複製能及び粒子産生能を与えるのにＮＳ５Ｂが重要であることは明白である。
現在、ＨＣＶはその配列から、Ｓｉｍｍｏｎｄｓら（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，（１９９４）１０，ｐ１３２１−１３２４を参照）による国際分類に従って各種遺伝子型（ＨＣＶ１ａ、ＨＣＶ１ｂ、ＨＣＶ２ａ、ＨＣＶ２ｂ等）に分類されている。本発明において、自律複製能のないＨＣＶゲノムＲＮＡは、これらの既知のウイルス型に限定されず、全ての自律複製能をもたないＨＣＶゲノムＲＮＡを含むものとする。
本明細書に係る、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列はＪＦＨ１株由来のＮＳ５Ｂタンパク質（配列番号３）のコード配列であって、配列番号２に示される塩基配列を有する。しかしながら、配列番号２に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる塩基配列も、それがＮＳ５Ｂタンパク質として機能するアミノ酸（例えば、保存的置換を含むＮＳ５Ｂタンパク質）をコードする限り、本発明のＮＳ５Ｂタンパク質コード配列に包含される。
なお、ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が３００−２０００ｍＭで温度が４０−７５℃、好ましくはナトリウム濃度が６００−９００ｍＭで温度が６５℃の条件をいう。当業者であれば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１０  Ｓｋｙｌｉｎｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ（１９８９））等を参照することにより、前記のようなＮＳ５Ｂホモログを容易に取得することができる。
本発明に係るＨＣＶゲノムＲＮＡは、ＪＦＨ１  ＨＣＶゲノムＲＮＡ中のＮＳ３からＮＳ４、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ配列部分を有する、あるいはＮＳ５Ｂタンパク質コード配列を有する。
一つの実施形態において、本発明のＨＣＶゲノムＲＮＡは、Ｃ型肝炎ウイルス株のゲノムＲＮＡ上の５’非翻訳領域、ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列、及び３’非翻訳領域を含む塩基配列からなるＲＮＡであって、かつ、前記ＮＳ３からＮＳ４、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ配列部分が外来性に導入されたＪＦＨ１  ＨＣＶゲノムＲＮＡ由来のＮＳ３からＮＳ４、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ配列部分であるＲＮＡである。好ましくはＮＳ５Ｂタンパク質コード配列が、外来性に導入されたＪＦＨ１  ＨＣＶゲノムＲＮＡ由来のＮＳ５Ｂタンパク質コード配列であるＲＮＡである。
本願明細書において、「５’非翻訳領域（５’ＮＴＲ又は５’ＵＴＲ）」、「ｃｏｒｅタンパク質コード配列（ｃｏｒｅ領域又はＣ領域）」、「Ｅ１タンパク質コード配列（Ｅ１領域）」、「Ｅ２タンパク質コード配列（Ｅ２領域）」、「Ｎ２タンパク質コード配列（ＮＳ２領域）」、「ＮＳ３タンパク質コード配列（ＮＳ３領域）」、「ＮＳ４Ａタンパク質コード配列（ＮＳ４Ａ領域）」、「ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列（ＮＳ４Ｂ領域）」、「ＮＳ５Ａタンパク質コード配列（ＮＳ５Ａ領域）」、「ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列（ＮＳ５Ｂ領域）」、及び「３’非翻訳領域（３’ＮＴＲ又は３’ＵＴＲ）」、並びにその他の特定の領域若しくは部位は、種々の遺伝子型において既に公知である。未知のＨＣＶ株についての上記各領域若しくは部位は、既知のＨＣＶの全長ゲノムＲＮＡ配列と当該ＨＣＶ株の全長ゲノムＲＮＡ配列をアライメントすることにより、容易に決定することができる。
本発明において「選択マーカー遺伝子」とは、その遺伝子が発現された細胞だけが選択されるような選択性を細胞に付与することができる遺伝子を意味する。選択マーカー遺伝子の一般的な例としては抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。本発明において好適な選択マーカー遺伝子の例としては、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ピリチアミン耐性遺伝子、アデニリルトランスフェラーゼ遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子などが挙げられるが、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子が好ましく、ネオマイシン耐性遺伝子がさらに好ましい。但し本発明における選択マーカー遺伝子はこれらに限定されるものではない。
また本発明において「リポーター遺伝子」とは、その遺伝子発現の指標となる遺伝子産物をコードするマーカー遺伝子を意味する。リポーター遺伝子の一般的な例としては、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が挙げられる。本発明において好適なリポーター遺伝子の例としては、トランスポゾンＴｎ９由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、大腸菌由来のβグルクロニダーゼ若しくはβガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子、クラゲ由来のエクオリン遺伝子、分泌型胎盤アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子等が挙げられる。但し本発明におけるリポーター遺伝子はこれらに限定されるものではない。
上記の選択マーカー遺伝子やリポーター遺伝子は、レプリコンＲＮＡ中にどちらか一方のみが含まれていてもよいし、両方が含まれていてもよい。選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子は、改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡに１つ含まれていてもよいし、２つ以上含まれていてもよい。
本発明に係るＨＣＶゲノムＲＮＡは、その全ＨＣＶゲノムＲＮＡを導入する細胞内で発現させたい任意の外来遺伝子をコードするＲＮＡをさらに含んでもよい。外来遺伝子をコードするＲＮＡは、５’非翻訳領域の下流に連結してもよいし、３’非翻訳領域の上流に連結してもよい。また、ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、及びＮＳ５Ｂタンパク質コード配列のいずれかの間に挿入してもよい。
外来遺伝子をコードするＲＮＡを含むＨＣＶゲノムＲＮＡは、導入された細胞内で翻訳される際に、該外来遺伝子にコードされる遺伝子産物を発現することができる。従って外来遺伝子をコードするＲＮＡを含むＨＣＶゲノムＲＮＡは、外来遺伝子の遺伝子産物を細胞内で生成させることを目的とする場合にも、好適に使用することができる。
本発明に係るＨＣＶゲノムＲＮＡにおいては、上述したようなウイルスタンパク質をコードする配列、並びに外来遺伝子等が、ＨＣＶゲノムＲＮＡから正しい読み枠で翻訳されるように連結される。ＨＣＶゲノムＲＮＡにコードされるタンパク質は、一続きのポリペプチドとして翻訳され発現された後でプロテアーゼによって各タンパク質へと切断され、遊離するように、プロテアーゼ切断部位等を介して互いに連結させることが好ましい。
こうして作製されたＪＦＨ１株のＮＳ３からＮＳ４、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ配列部分を含むＨＣＶゲノムＲＮＡを、適当な宿主細胞に導入すれば、ＨＣＶゲノムＲＮＡを自律複製、好ましくは持続的に自律複製できる（すなわち、ＨＣＶゲノムＲＮＡの複製能を有する）組換え細胞を得ることができる。以下、本明細書において、ＪＦＨ１株のＮＳ３からＮＳ４、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ配列部分を含むＨＣＶゲノムＲＮＡの複製能を有する組換え細胞を「ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞」と称することとする。
「ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞」のための宿主細胞は、継代培養可能な細胞であれば特に限定されないが、真核細胞であることが好ましく、ヒト細胞であることがより好ましく、ヒト肝由来細胞、ヒト子宮頸由来細胞、又はヒト胎児腎由来細胞であることがさらに好ましい。また、細胞としては、癌細胞株や幹細胞株などを含む増殖性細胞が好ましく、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、ＨｅＬａ細胞、又は２９３細胞等が特に好ましい。これらの細胞は、市販のものを利用してもよいし、細胞寄託機関から入手して使用してもよいし、任意の細胞（例えば癌細胞又は幹細胞）から株化した細胞を使用してもよい。
ＨＣＶゲノムＲＮＡの宿主細胞内への導入は、公知の任意の技術を使用して行うことができる。そのような導入法としては、例えば、エレクトロポレーション、パーティクルガン法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥセファロース法等が挙げられるが、エレクトロポレーションによる方法が特に好ましい。
ＨＣＶゲノムＲＮＡは、単独で導入してもよいし、他の核酸と混合させたものを導入してもよい。導入するＲＮＡ量を一定にしながらＨＣＶゲノムＲＮＡの導入量を変更したい場合には、所望の導入量のＨＣＶゲノムＲＮＡを、導入する細胞から抽出したトータル細胞性ＲＮＡと混合して一定のＲＮＡ総量とし、それを細胞内導入に用いればよい。細胞内導入に用いるＨＣＶゲノムＲＮＡの量は、使用する導入法に応じて決めればよいが、好ましくは１ピコグラム〜１００マイクログラム、より好ましくは１０ピコグラム〜１０マイクログラムの量を使用する。
「ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞」中でのＨＣＶゲノムＲＮＡの複製の確認は、公知の任意のＲＮＡ検出法に従って行うことができ、例えば、細胞から抽出したトータルＲＮＡについて、導入されたＨＣＶゲノムＲＮＡに対して特異的なＤＮＡ断片をプローブとして用いるノーザンハイブリダイゼーション法、あるいは導入したＨＣＶゲノムＲＮＡに特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法を用いることができる。
さらに、「ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞」から抽出したタンパク質中からＨＣＶタンパク質が検出されれば、その細胞は、ＨＣＶゲノムＲＮＡを複製しているものと判断することができる。ＨＣＶタンパク質の検出は、公知の任意のタンパク質検出法に従って行うことができ、例えば、導入されたＨＣＶゲノムＲＮＡから発現されるべきＨＣＶタンパク質に対する抗体を、細胞から抽出したタンパク質と反応させることによって行うことができる。より具体的には、例えば、細胞から抽出したタンパク質試料をニトロセルロース膜にブロッティングし、それに対して抗ＨＣＶタンパク質抗体（例えば、抗ＮＳ３特異的抗体、又はＣ型肝炎患者から採取した抗血清）を反応させ、さらにその抗ＨＣＶタンパク質抗体を検出することによって行うことができる。
限定するものではないが、ＨＣＶゲノムＲＮＡの自律複製能は、例えば、対象とするＲＮＡをＨｕｈ７細胞中にトランスフェクションし、そのＨｕｈ７細胞を培養し、得られる培養物中の細胞から抽出したＲＮＡについて、導入したＲＮＡを特異的に検出可能なプローブを用いたノーザンブロットハイブリダイゼーションを行うことにより、確認することができる。自律複製能を確認するための具体的な操作は、本明細書の実施例に記載されたＨＣＶタンパク質の発現確認、ＨＣＶゲノムＲＮＡの検出等の記載に例示される。
２．ＨＣＶ粒子の作製
上記のようにして作製されるＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞は、ＨＣＶウイルス粒子をｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生することができる。すなわち、本発明のＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞を適当な培地で培養し、その培養物（好ましくは培養液）中から産生されたウイルス粒子を採取することにより、ＨＣＶ粒子を簡単に取得することができる。
ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞のウイルス粒子産生能は、公知の任意のウイルス検出法を用いて確認することができる。例えば、ウイルス粒子を産生していると思われる細胞の培養液をショ糖密度勾配により分画し、各分画の密度、ＨＣＶコアタンパク質濃度、及びＨＣＶゲノムＲＮＡの量を測定した結果、ＨＣＶコアタンパク質とＨＣＶゲノムＲＮＡのピークが一致し、しかもそのピークが検出される画分の密度が、培養上清を０．２５％  ＮＰ４０（ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（９）Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ  Ｅｔｈｅｒ］）で処理してから分画した場合の同画分の密度と比較して軽い（例えば、１．１５〜１．２２ｍｇ）場合には、該細胞はウイルス粒子産生能を有すると判定することができる。
培養液中に放出されたＨＣＶウイルス粒子は、例えば、ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、又はＥ２タンパク質に対する抗体を用いて検出することもできる。また、培養液中のＨＣＶウイルス粒子が含有するＨＣＶゲノムＲＮＡを、特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法により増幅して検出することによって、ＨＣＶウイルス粒子の存在を間接的に検出することもできる。
３．本発明のＨＣＶ粒子の他の細胞への感染
本発明の方法で産生されるＨＣＶウイルス粒子は、細胞（好ましくはＨＣＶ感受性細胞）への感染能を有する。本発明は、ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞を培養し、得られた培養物（好ましくは、培養液）中のウイルス粒子を他の細胞（好ましくはＨＣＶ感受性細胞）に感染させることを含む、Ｃ型肝炎ウイルス感染細胞の製造方法も提供する。ここで、ＨＣＶ感受性細胞とは、ＨＣＶに対し感染性を有する細胞であり、好ましくは肝臓細胞又はリンパ球系細胞であるが、これらに限定されるものでは無い。具体的には、肝臓細胞としては初代肝臓細胞や、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、ＨｅＬａ細胞、２０３細胞などが挙げられ、リンパ球系細胞としてはＭｏｌｔ４細胞や、ＨＰＢ−Ｍａ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞などが挙げられるが、これらに限定されるものでは無い。
本発明のＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞において産生されたＨＣＶ粒子を細胞（例えば、ＨＣＶ感受性細胞）に感染させると、その感染細胞中ではＨＣＶゲノムＲＮＡが複製され、さらにウイルス粒子が形成される。本発明のＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞において産生されたウイルス粒子を細胞に感染させることにより、ＨＣＶゲノムＲＮＡが細胞内で複製され、ウイルス粒子をさらに製造することができる。
本発明のＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞において産生されたＨＣＶウイルス粒子は、チンパンジーなどのＨＣＶウイルスに感染しうる動物に感染して、ＨＣＶ由来の肝炎を引き起こすことができる。
４．ＨＣＶ粒子の精製
ＨＣＶ粒子を精製するにあたり、そのウイルスを含む溶液はＨＣＶ感染患者由来血液ならびに、ＨＣＶ感染培養細胞ならびに組換え遺伝子技術によりＨＣＶ粒子を産生する細胞の培養液及び細胞破砕液のいずれか一つ又は複数を由来としてよい。
ＨＣＶウイルスを含む溶液を遠心及び／もしくはフィルターなどを用いて細胞及び細胞の残渣を除去した。残渣を除去した溶液は、分画分子量１００，０００から５００，０００の限外濾過膜を用いて１０から１００倍程度に濃縮することもできる。
残渣を除去したＨＣＶを含んだ溶液は、以下に記載するクロマトグラフィ及び／もしくは密度勾配遠心を任意の順番に組み合わせてもしくは単独で精製することができる。以下に代表的なクロマトグラフィや密度勾配遠心の方法について記載するが、本発明はそれに限られるものではない。
ゲル濾過クロマトグラフィは、好ましくはアリルデキストランとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの架橋ポリマーをゲルマトリックスとするクロマトグラフィ担体で、さらに好ましくはＳｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）Ｓ−３００、Ｓ−４００及びＳ−５００からなるクロマトグラフィを用いることにより、ＨＣＶ粒子の精製を行うことができる。
イオン交換クロマトグラフィは、陰イオン交換樹脂として好ましくはＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）など、及び陽イオン交換樹脂として好ましくはＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）などをもちいてＨＣＶ粒子の精製を行うことができる。
アフィニティクロマトグラフィは、リガンドとして好ましくはヘパリン、硫酸化セルロファイン、レクチン、及び様々な色素から選ばれる基質を結合させた樹脂を担体として用いて、ＨＣＶ粒子の精製を行うことができる。さらに好ましくは、ＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰ（登録商標）、ＨｉＴｒａｐ  Ｂｌｕｅ  ＨＰ（登録商標）、ＨｉＴｒａｐ  Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ  ＦＦ（登録商標）、硫酸化セルロファイン、ならびにＬＣＡ、ＣｏｎＡ、ＲＣＡ−１２０及びＷＧＡが結合した担体を利用して、ＨＣＶ粒子を精製することができる。最も好ましくは、硫酸化セルロファインを担体として利用してＨＣＶ粒子を精製することであり、精製前と精製後で溶液中の総タンパク質量とＨＣＶのＲＮＡ  ｃｏｐｙ数の比率としてなんと３０倍以上も精製されていた。
密度勾配遠心による精製は、密度勾配を形成する溶質として好ましくは塩化セシウム、スクロース、ナイコデンツ（登録商標）ならびに、フィコール（登録商標）及びパーコール（登録商標）といった糖重合体を用いることができる。さらに好ましくは、スクロースを用いることができる。また、用いる溶媒として好ましくは水もしくは、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、又はグリシン緩衝液といった緩衝液を用いることができる。
精製を行う際の温度が好ましくは０〜４０℃であり、さらに好ましくは０〜２５℃であり、最も好ましくは０〜１０℃である。
密度勾配遠心による精製を行う際の遠心力が、好ましくは１ｘ１０４〜１ｘ１０９ｇであり、さらに好ましくは５ｘ１０４〜１ｘ１０７であり、最も好ましくは５ｘ１０４〜５ｘ１０５であるような精製方法。
精製方法の組み合わせは、密度勾配遠心とカラムクロマトグラフィはどのような順番にどのように組み合わせても良いが、好ましくは複数のカラムクロマトグラフィにより精製した後に密度勾配遠心を用いる組み合わせであり、更に好ましくは陰イオン交換カラムに次いでアフィニティークロマトグラフィを用いて得られたＨＣＶ粒子を含むフラクションを密度勾配遠心を用いて精製する組み合わせであり、最も好ましくはＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）を用いたカラムにより得られたＨＣＶ粒子を含むフラクションを硫酸セルロファインを用いたカラムを用いて更に精製して得られたＨＣＶ粒子を含むフラクションを密度勾配遠心により精製する組み合わせである。なおカラムクロマトグラフィ及び密度勾配遠心の工程の間に透析や限外濾過を用いることによりＨＣＶ粒子を含む溶液の溶質の置換及び／又はＨＣＶ粒子の濃縮を行うことができる。
５．本発明の他の実施形態
本発明のＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞では、ＨＣＶゲノムＲＮＡが高効率で複製される。従って、本発明のＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞を用いて、ＨＣＶゲノムＲＮＡを高効率で製造することができる。
本発明では、ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞を培養し、培養物（培養細胞及び／又は培養液）からＲＮＡを抽出し、それを電気泳動法により、分離されたＨＣＶゲノムＲＮＡを単離精製することによって、ＨＣＶゲノムＲＮＡを製造することができる。このようにして製造されるＲＮＡは、ＨＣＶのゲノム配列を含む。ＨＣＶのゲノム配列を含むＲＮＡの製造方法が提供されることにより、ＨＣＶゲノムに関してより詳細な分析が可能となる。
さらに本発明のＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞は、ＨＣＶタンパク質を製造するために好適に使用することができる。ＨＣＶタンパク質の製造は、公知の任意の方法によって行えばよいが、例えば、ＨＣＶゲノムＲＮＡを細胞に導入して組換え細胞を作製し、該組換え細胞を培養し、得られる培養物（培養細胞及び／又は培養液）から常法によりタンパク質を回収することによって行えばよい。
ＨＣＶウイルス粒子は、肝細胞指向性を有しうる。そのため本発明のＨＣＶゲノムＲＮＡを使用して、肝細胞指向性ウイルスベクターを製造することができる。このウイルスベクターは、遺伝子治療用に好適に用いられる。本発明では、外来遺伝子をコードするＲＮＡをＨＣＶゲノムＲＮＡに組み込み、そのＲＮＡを細胞に導入することにより、該外来遺伝子を細胞中に導入し、細胞内で複製させ、さらに発現させることができる。
さらに、ＨＣＶゲノムＲＮＡ中のＥ１タンパク質コード配列、及び／又はＥ２タンパク質コード配列を、他の生物種由来のウイルスの外殻タンパク質に変換したＲＮＡを作製し、細胞内に導入して、ウイルス粒子を作製することにより、そのＲＮＡを様々な生物種の細胞に感染させることも可能となる。この場合にも、ＨＣＶゲノムＲＮＡにさらに外来遺伝子を組み込んで、それを、該外来遺伝子を組み換えたウイルス外殻タンパク質の指向性に依存して、各種細胞で発現させるための細胞指向性ウイルスベクターとして使用することができる。
本発明は、ＨＣＶゲノムＲＮＡに外来遺伝子をコードするＲＮＡを挿入し、それを細胞に導入し、その細胞を培養してウイルス粒子を産生させることを含む、外来遺伝子を含有するウイルスベクターを製造する方法にも関する。
本発明は、本発明に係るＨＣＶ粒子又はその一部分を抗原として、あるいは細胞指向性を変えるためにウイルス外殻タンパク質を組み換えて作製した粒子又はその一部分を抗原として、Ｃ型肝炎ワクチンあるいは、外殻タンパク質を組み換えるに使用したウイルスに対するワクチンを製造する方法も提供する。さらに本発明に係るＨＣＶ粒子又はその一部分を抗原として、あるいは細胞指向性を変えるためにウイルス外殻タンパク質を組み換えて作製した粒子又はその一部分を抗原として利用してＨＣＶの感染中和抗体を作成することもできる。
本発明のＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞、又はそれらの細胞において産生されるウイルス粒子を感染させたＨＣＶ感染細胞は、例えばＨＣＶの複製、ウイルス粒子の再構築、ウイルス粒子の放出を促進又は抑制する物質（抗Ｃ型肝炎ウイルス物質）をスクリーニングするための試験系として使用することもできる。具体的には、例えば、被験物質の存在下でそれらの細胞を培養し、得られる培養物中のＨＣＶゲノムＲＮＡ又はウイルス粒子を検出し、その被験物質がレプリコンＲＮＡ若しくはＨＣＶゲノムＲＮＡの複製又はウイルス粒子の形成若しくは放出を促進又は抑制するかどうかを判定することにより、Ｃ型肝炎ウイルスの増殖を促進又は抑制する物質をスクリーニングすることができる。この場合、培養物中のＨＣＶゲノムＲＮＡの検出は、上記細胞から抽出したＲＮＡ中のＨＣＶゲノムＲＮＡの量、割合若しくは有無を測定することによるものであってよい。培養物（主として培養液）中のウイルス粒子の検出は、培養液中に含まれるＨＣＶタンパク質の量、割合若しくは有無を検出するものであってよい。
本発明のＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞において産生されたＨＣＶ粒子とＨＣＶ感受性細胞とを、ＨＣＶの細胞への結合を促進又は抑制する物質をスクリーニングするための試験系として使用することもできる。具体的には例えば、被験物質の存在下で、本発明のＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞において産生されたＨＣＶ粒子とともにＨＣＶ感受性細胞を培養し、得られる培養物中のＨＣＶゲノムＲＮＡ又はウイルス粒子を検出し、その被験物質がＨＣＶゲノムＲＮＡの複製又はウイルス粒子の形成を促進又は抑制するかどうかを判定することにより、Ｃ型肝炎ウイルスの増殖を促進又は抑制する物質をスクリーニングすることができる。
このようなＨＣＶゲノムＲＮＡ又はウイルス粒子の検出は、上述の手法又は後述の実施例に従って行うことができる。上記試験系は、Ｃ型肝炎ウイルス感染の予防剤、治療剤若しくは診断剤の製造又は評価のためにも使用することができる。
具体的には、本発明の上記試験系の利用例としては以下が挙げられる。
（１）ＨＣＶの増殖及び感染を抑制する物質の探索
ＨＣＶの増殖及び感染を抑制する物質としては、例えば、直接的若しくは間接的にＨＣＶの増殖及び感染に影響を及ぼす有機化合物、あるいはＨＣＶゲノム若しくはその相補鎖の標的配列にハイブリダイズすることによりＨＣＶの増殖若しくはＨＣＶタンパク質の翻訳に直接的又は間接的に影響を及ぼすアンチセンスオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
（２）細胞培養中で抗ウイルス作用を有する各種物質の評価
前記各種物質としては、合理的ドラッグデザイン又はハイスループットスクリーニングを用いて得られた物質（例えば単離精製された酵素）等が挙げられる。
（３）ＨＣＶに感染した患者の治療のための、新規攻撃標的の同定
例えばＨＣＶウイルス複製のために重要な役割を果たす宿主細胞性タンパク質を同定するために、本発明に係るＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞を使用することができる。
（４）ＨＣＶウイルスの薬剤等に対する耐性獲得能の評価及び該耐性に関わる変異の同定
（５）Ｃ型肝炎ウイルス感染の診断薬又は治療薬の開発、製造及び評価のために使用可能な抗原としてのウイルスタンパク質の製造
（６）Ｃ型肝炎ウイルス感染のワクチンの開発、製造及び評価のために使用可能な抗原としてのウイルスタンパク質及び弱毒化ＨＣＶの製造
【実施例】  本発明を、以下の実施例及び図面に基づいてさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］  ＨＣＶゲノムＲＮＡの作製
１．発現ベクターの構築
劇症肝炎の患者から分離したＣ型肝炎ウイルスＪＦＨ１株（遺伝子型２ａ）のウイルスゲノム全領域に対応するＤＮＡを、該ウイルス株の全長ゲノムｃＤＮＡを含むＪＦＨ１クローン（Ｋａｔｏ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．６４（２００１）ｐ３３４−３３９）から取得して、ｐＵＣ１９プラスミドに挿入したＴ７  ＲＮＡプロモーター配列の下流に挿入した。具体的には、ＪＦＨ１株のウイルスＲＮＡを増幅したＲＴ−ＰＣＲ断片をｐＧＥＭ−Ｔ  ＥＡＳＹ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングしてｐＧＥＭ１−２５８，ｐＧＥＭ４４−４８６，ｐＧＥＭ３１７−８４９，ｐＧＥＭ６１７−１３２３，ｐＧＥＭ１１４１−２３６７，ｐＧＥＭ２２８５−３５０９，ｐＧＥＭ３４７１−４６６５，ｐＧＥＭ４５４７−５９７０，ｐＧＥＭ５８８３−７００３，ｐＧＥＭ６９５０−８０３５，ｐＧＥＭ７９８４−８８９２，ｐＧＥＭ８６８０−９２８３，ｐＧＥＭ９２３１−９６３４，ａｎｄ  ｐＧＥＭ９５９４−９６７８の各プラスミドＤＮＡを得た（Ｋａｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１２５（２００３）ｐ．１８０８−１８１７）。この各プラスミドに含まれるウイルスゲノムのｃＤＮＡをＰＣＲ法及び制限酵素を用いて連結し、全長ゲノムｃＤＮＡをクローニングし、上流にＴ７Ｒ  ＲＮＡプロモーター配列を挿入し、ＪＦＨ１クローン（ｐＪＦＨ１）を得た（図１）。なお、ｐＪＦＨ１の全長ｃＤＮＡ配列は、国際ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）にアクセッション番号：ＡＢ０４７６３９として登録されている。
次に、ｐＪＦＨ１中のＮＳ５Ｂ領域（塩基配列：配列番号２、アミノ酸配列：配列番号３）について、該領域にコードされるＲＮＡポリメラーゼの活性中心に相当するアミノ酸モチーフＧＤＤをＧＮＤに変異させる突然変異を導入して、突然変異プラスミドクローンｐＪＦＨ１／ＧＮＤを作製した。なおｐＪＦＨ１／ＧＮＤ突然変異クローンは、それにコードされているＮＳ５Ｂタンパク質の活性部位のアミノ酸配列が変異しているため、ＨＣＶ  ＲＮＡを複製するために必要な活性ＮＳ５Ｂタンパク質を発現することができない。
次に、ＪＦＨ１のＥ１領域からＥ２領域を欠損させたｐＪＦＨ１／ΔＥ１−Ｅ２作製した。また、ＪＦＨ１株とは異なるＪ６ＣＦ株（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ１７７０３６）及び、ＪＣＨ１（Ｋａｔｏ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．６４（２００１）ｐ３３４−３３９）の全長ＨＣＶ  ｃＤＮＡをｐＵＣ１９プラスミドに挿入したＴ７  ＲＮＡプロモーター配列の下流に挿入した、ｐＪ６ＣＦ及びｐＪＣＨ１を作製した。さらに、ｐＪＣＨ１のＮＳ５Ｂをコードする領域をＪＦＨ１のＮＳ５Ｂに置き換えた、ｐＪＣＨ１／ＮＳ５Ｂ（ｊｆｈ１）を作製した。
２．ＨＣＶゲノムＲＮＡの作製
ＲＮＡ合成に用いる鋳型ＤＮＡを作製するために、上記のとおり構築したｐＪＦＨ１、ｐＪＦＨ１／ＧＮＤ  ｐＪＦＨ１／ΔＥ１−Ｅ２、ｐＪ６ＣＦ、ｐＪＣＨ１及び、ｐＪＣＨ１／ＮＳ５Ｂ（ｊｆｈ１）を、それぞれ制限酵素ＸｂａＩで切断した。次いで、これらのＸｂａＩ切断断片のそれぞれ１０から２０μｇを、Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ  ２０Ｕ（トータル反応液量５０μｌ）とともに３０℃で３０分間インキュベートした。Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅは、二本鎖ＤＮＡ中の一本鎖部分を選択的に分解する反応を触媒する酵素である。通常、上記ＸｂａＩ切断断片をそのまま鋳型として用いてＲＮＡ合成を行うと、ＸｂａＩの認識配列の一部であるＣＵＧＡの４塩基が３’末端に余分に付加されたレプリコンＲＮＡが合成されてしまう。そこで本実施例では、ＸｂａＩ切断断片をＭｕｎｇ  Ｂｅａｎ  ＮｕＣｌｅａｓｅで処理することにより、ＸｂａＩ切断断片からＣＵＧＡの４塩基を除去した。この後、ＸｂａＩ切断断片を含むＭｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ処理後の溶液について、常法に従ったタンパク質除去処理により、ＣＵＧＡの４塩基が除去されたＸｂａＩ切断断片を精製し、これを鋳型ＤＮＡとした。
次に、この鋳型ＤＮＡから、ＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成した。ＲＮＡ合成はＡｍｂｉｏｎ社のＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔを使用し、鋳型ＤＮＡを０．５から１．０μｇ含む反応液２０μｌを３７℃で３時間から１６時間反応させた。
ＲＮＡ合成終了後、反応溶液にＤＮＡｓｅ（２Ｕ）を添加して、３７℃で１５分間反応させた後、さらに酸性フェノールによるＲＮＡ抽出を行って、鋳型ＤＮＡを除去した。このようにしてｐＪＦＨ１及び、ｐＪＦＨ１／ＧＮＤに由来する上述の鋳型ＤＮＡから合成したＨＣＶ  ＲＮＡを、それぞれｒＪＦＨ１、ｒＪＦＨ１／ＧＮＤ、ｒＪＦＨ１／ΔＥ１−Ｅ２、ｒＪ６ＣＦ、ｒＪＣＨ１及び、ｒＪＣＨ１／ＮＳ５Ｂ（ｊｆｈ１）と命名した。
これらのＨＣＶ  ＲＮＡは、ｒＪＦＨ１はＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０４７６３９のＤＮＡを鋳型として作製したＲＮＡ、ＪＦＨ１／ＧＮＤはＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０４７６３９の８６１８番目のＧをＡに置換したＤＮＡを鋳型として作製したＲＮＡ、ｒＪＦＨ１／ΔＥ１−Ｅ２はＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０４７６３９のＤＮＡ配列９８９−２０４１を欠失したＤＮＡを鋳型として作製したＲＮＡ、ｒＪ６ＣＦはＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ１７７０３６のＤＮＡを鋳型として作製したＲＮＡ、ｒＪＣＨ１はＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０４７６４０のＤＮＡを鋳型として作製したＲＮＡ、ｒＪＣＨ１／ＮＳ５Ｂ（ｊｆｈ１）はＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０４７６４０のＤＮＡ配列１−３８６６とＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０４７６３９のＤＮＡ配列３８６７−９６７８の配列を制限酵素ＡｖｒＩＩサイトを利用して、連結させたＤＮＡを鋳型として作製したＲＮＡとして、その塩基配列を確認することができる。
［実施例２］  細胞内におけるＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞とウイルス粒子産生
１．細胞内におけるＨＣＶゲノム複製とウイルス粒子産生
上記の合成全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ（ｒＪＦＨ１、ｒＪＦＨ１／ＧＮＤ）のそれぞれについて、ＲＮＡ総量が１０μｇとなるように調製した。次いでその混合ＲＮＡをエレクトロポレーション法によりＨｕｈ７細胞に導入した。エレクトロポレーション処理を行ったＨｕｈ７細胞を培養ディッシュに播種し、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間培養した後に、細胞を回収して、細胞からＲＮＡを抽出して、ノーザンブロット法により解析した。ノーザンブロット解析は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）の記載に従って行った。細胞から抽出したＲＮＡを変性アガロース電気泳動に供し、泳動終了後に該ＲＮＡをポジティブチャージナイロン膜に転写した。ｐＪＦＨ１から作製した３２ＰラベルしたＤＮＡ又はＲＮＡプローブを、前記のとおり膜に転写したＲＮＡに対しハイブリダイゼーションさせ、次いでその膜を洗浄し、それをフィルムに感光させることにより、ＨＣＶゲノム特異的なＲＮＡバンドを検出した。
図２に示すように、ＪＦＨ１／ＧＮＤをトランスフェクションした場合、トランスフェクション４時間後において、導入したＲＮＡバンドは弱いシグナルとして確認できたが、時間の経過とともにシグナルは減弱し、２４時間後にはほとんどバンドのシグナルが確認できなかった。
一方、ｒＪＦＨ１をトランスフェクションした場合、トランスフェクション４時間から１２時間後では、導入したＲＮＡバンドのシグナルの強さはＪＦＨ１／ＧＮＤを導入した場合とほぼ同じでいったん減弱したが、２４時間以降にははっきりとしたＲＮＡバンドのシグナルが確認できた。このシグナルはＨＣＶに特異的なものであった。つまり導入したｒＪＦＨ１  ＲＮＡの一部が複製増殖したものと考えられた。ＲＮＡ複製酵素であるＮＳ５Ｂの活性モチーフを変異させたｒＪＦＨ１／ＧＮＤでは複製はみられず、ＮＳ５Ｂの活性がＨＣＶの全長ＲＮＡの複製に重要であることが確認された。また、発明者らが慢性肝炎から分離したＪＣＨ１株（Ｋａｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．６９（２００１）ｐ３３４−３３９）において、同様の実験をおこなったが、これらの株ではＨＣＶ  ＲＮＡの複製は全く確認できなかった。
２．ＨＣＶタンパク質の検出
ｒＪＦＨ１あるいは、ｒＪＦＨ１／ＧＮＤ  ＲＮＡをトランスフェクションした細胞から常法により、経時的にタンパク質を抽出して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法により解析した。解析にあたって、ＮＳ３、ＮＳ５Ａ、Ｃｏｒｅあるいは、Ｅ２遺伝子を含む発現プラスミドＤＮＡをＨｕｈ７細胞にトランジエントにトランスフェクションして得られた細胞抽出液を陽性対照（ＮＳ３タンパク質）とした。さらに、トランスフェクションしていないＨｕｈ７細胞から抽出したタンパク質を陰性対照とした。それぞれの細胞クローンから抽出したタンパク質試料をＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）にブロッティングし、抗ＮＳ３特異的抗体（Ｄｒ．Ｍｏｒａｄｐｏｕｒより分与されたもの；Ｗｏｌｋ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０００；７４：２２９３−２３０４）、抗ＮＳ５Ａ特異的抗体（ＪＦＨ１のＮＳ５Ａ領域を発現ベクターに挿入して、ネズミでＤＮＡ免疫法を用いて作製した）、抗Ｃｏｒｅ特異的抗体（クローン２Ｈ９抗体）、抗Ｅ２特異的抗体（ＪＦＨ１  Ｅ２領域のＧＴＴＴＶＧＧＡＶＡＲＳＴＮ（配列番号４）とＣＤＬＥＤＲＤＲＳＱＬＳＰＬ（配列番号５）のペプチドを合成して、２つの合成ペプチドでウサギを免役して作製した）、を用いてＪＦＨ１  ＲＮＡにコードされているＮＳ３、ＮＳ５Ａ、Ｃｏｒｅ及び、Ｅ２タンパク質を検出した。また、内在対照として、抗ａｃｔｉｎ抗体を用いて、ａｃｔｉｎタンパク質を検出した。
図３に示されるとおり、ｒＪＦＨ１をトランスフェクションした細胞においては、トランスフェクションの２４時間後からＮＳ３、ＮＳ５Ａ、Ｃｏｒｅ及び、Ｅ２タンパク質が検出でき、経時的に発現量が増加していることが確認された。一方、ｒＪＦＨ１／ＧＮＤをトランスフェクションした細胞あるいは、トランスフェクションしていないＨｕｈ７細胞でＮＳ３、ＮＳ５Ａ、Ｃｏｒｅ及び、Ｅ２タンパク質が検出されず、トランスフェクションされたｒＪＦＨ１が自律複製することにより，これらのタンパク質が発現されていることが判明した。
以上の１及び２の結果から、ｒＪＦＨ１をトランスフェクションして樹立した細胞では、ｒＪＦＨ１が複製されていることが確認された。
３．トランスフェクション細胞培養液中におけるＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質の検出
ｒＪＦＨ１、ｒＪＦＨ１／ＧＮＤ、ｒＪＦＨ１／ΔＥ１−Ｅ２、ｒＪ６ＣＦ及びｒＪＣＨ１をエレクトロポレーションによって細胞導入をおこなったＨｕｈ７細胞を培養ディッシュに播種し、２時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間培養した後の培養液中のＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質を測定した。測定はオーソＨＣＶ抗原ＩＲＭＡテストを用いて行った（Ａｏｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７（１９９９）ｐ．１８０２−１８０８）。
図４に示すとおり、ｒＪＦＨ１をトランスフェクションして４８時間から７２時間後の培養液中にコアタンパク質が検出された。一方、ｒＪＦＨ１／ＧＮＤ、ｒＪ６ＣＦ及びｒＪＣＨ１をトランスフェクションした細胞の培養液中にはＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質は検出されず、ｒＪＦＨ１／ΔＥ１−Ｅ２をトランスフェクションした細胞の培養液中には少量のＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質が検出された。ｒＪＦＨ１／ＧＮＤ、ｒＪ６ＣＦ及びｒＪＣＨ１はＨｕｈ７細胞中では自律複製ができず、ｒＪＦＨ１及び、ｒＪＦＨ１／ΔＥ１−Ｅ２はＨｕｈ７細胞中で自律複製ができる。よって、Ｃｏｒｅタンパク質の放出には、導入したＨＣＶ  ＲＮＡの自律複製が必須であり、かつ、安定して多量のＣｏｒｅタンパク質を細胞外に放出させるにはＥ１及び、Ｅ２が必要であることが示された。
４．トランスフェクション細胞培養液中におけるＨＣＶ粒子の検出
上記の実施例で培養液中に放出されるＣｏｒｅタンパク質がウイルス粒子として分泌されているかどうかを解析するため、ｒＪＦＨ１をトランスフェクションして６日後の培養液をしょ糖密度勾配により分画した。６０％（重量／重量）しょ糖溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５／０．１Ｍ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  ＥＤＴＡに溶解）２ｍｌ、５０％しょ糖溶液１ｍｌ、４０％しょ糖溶液１ｍｌ、３０％しょ糖溶液１ｍｌ、２０％しょ糖溶液１ｍｌ、１０％しょ糖溶液１ｍｌを遠心チューブに重層し、さらにサンプルの培養上清を４ｍｌ重層した。これをベックマンローターＳ  Ｗ４１Ｔｉで４００，０００ＲＰＭ、４℃、１６時間遠心し、遠心終了後遠心チューブの底から０．５ｍｌずつ分画回収した。各分画の密度、ＨＣＶコア蛋白濃度、ＨＣＶＲＮＡコピー数を定量した。レプリコンＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲによる検出は、Ｔａｋｅｕｃｈｉらの方法（Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１６：６３６−６４２（１９９９））に従いＨＣＶ  ＲＮＡの５’非翻訳領域のＲＮＡを検出することにより行った。具体的には、細胞から抽出したＲＮＡに含まれるレプリコンＲＮＡを、以下の合成プライマーとＥＺ  ｒＴｔｈ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＰＣＲ増幅し、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により検出した。
Ｒ６−１３０−Ｓ１７：５’−ＣＧＧＧＡＧＡＧＣＣＡＴＡＧＴＧＧ−３’（配列番号６）
Ｒ６−２９０−Ｒ１９：５’−ＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡＧＧＣＣＴＴＴＣＧ−３’（配列番号７）
ＴａｑＭａｎ  Ｐｒｏｂｅ，Ｒ６−１４８−Ｓ２１ＦＴ：５’−ＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴＡＣＡＣ−３’（配列番号８）
図５Ａに示すように、１．１７ｍｇ／ｍｌのフラクションでＣｏｒｅタンパク質とＨＣＶ  ＲＮＡのピークが一致した。このフラクションの密度は約１．１７ｍｇ／ｍｌであり、これまで報告されているＣｏｒｅタンパク質と核酸の結合物よりも軽い比重であった。もし、１．１７ｍｇ／ｍｌのフラクションに存在するＣｏｒｅタンパク質とＨＣＶ  ＲＮＡがＨＣＶ粒子構造を形成しているとすれば、ヌクレアーゼに耐性であると考えられる。そこで次に、ＪＦＨ１をトランスフェクションして６日後の培養液を１０μｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅ  Ａで２０分間処理した後にしょ糖密度勾配により分画した。
その結果、図５Ｂに示すようにＨＣＶ  ＲＮＡは分解され、ＲＮａｓｅ  Ａ未処理の場合と同じように、１．１７ｍｇ／ｍｌのフラクションにＣｏｒｅタンパク質とＨＣＶ  ＲＮＡのピークが検出された。すなわち、１．１７ｍｇ／ｍｌのフラクションに存在するＣｏｒｅタンパク質とＨＣＶ  ＲＮＡはＨＣＶ粒子様構造を形成していることが確認された。
さらに、培養液を０．２５％  ＮＰ４０で処理した後に同様の分画を行うと、Ｃｏｒｅタンパク質とＨＣＶ  ＲＮＡのピークは比重約１．２８ｍｇ／ｍｌへとシフトした（図５Ｃ）。さらに、０．２５％  ＮＰ４０処理と同時にＲＮａｓｅ  Ａ処理を行うと、ＨＣＶ  ＲＮＡのピークが消失した（図５Ｄ）。つまり、脂質を含み比重の軽い表面膜がＮＰ４０によりウイルス粒子から剥離して、ウイルス様構造を保持していない核酸とＣｏｒｅタンパク質のみのＣｏｒｅ粒子となり、比重が重くなったものと考えられた。
以上の結果から、ｒＪＦＨ１をＨｕｈ７細胞へトランスフェクションすることによりウイルスＲＮＡが複製し、さらにウイルス粒子が形成され、培養液中に分泌されたことが確認された。
５．培養液中のウイルス粒子の感染実験
ｒＪＦＨ１をＨｕｈ７細胞へトランスフェクションすることにより、培養液中に分泌されたＨＣＶ粒子に感染性があるかどうかについて検討した。ｒＪＦＨ１あるいは、ｒＪＦＨ１／ΔＥ１−Ｅ２をＨｕｈ７細胞にトランスフェクションして３日後に培養上清を回収した。回収した培養液を遠心して遠心上清を回収して、さらに０．４５μｍのフィルターで濾過した。この培養液存在下で、ＲＮＡをトランスフェクションしていないＨｕｈ７を培養して４８時間後に細胞を抗Ｃｏｒｅ抗体あるいは、抗ＮＳ５Ａ抗体で蛍光免疫染色した。図６Ａに示すように、ｒＪＦＨ１をＨｕｈ７細胞へトランスフェクションして得た培養液存在下で培養した細胞においては、細胞内にＣｏｒｅタンパク質及び、ＮＳ５Ａタンパク質の発現を認めた。一方、ＪＦＨ１／ΔＥ１−Ｅ２をＨｕｈ７細胞へトランスフェクションして得た培養液存在下で培養した細胞においては、細胞内にＣｏｒｅタンパク質及び、ＮＳ５Ａタンパク質の発現を認めなかった（データは示さない）。
次いで、ＪＦＨ１をｒＨｕｈ７細胞にトランスフェクションして３日後に培養上清を回収して、限外濾過膜（ｃｕｔ  ｏｆｆ  １ｘ１０５Ｄａ）を用いて３０倍に濃縮した。濃縮したＨＣＶ粒子を含む培養液１００μｌでＲＮＡをトランスフェクションしていないＨｕｈ７を１５ｍｍカバースリップ上で培養して、４８時間後に細胞を抗Ｃｏｒｅ抗体で免疫染色して、Ｃｏｒｅ抗体染色陽性、すなわち、感染細胞を数えたところ、図６Ｂに示すように３９４．０±２６．５個の感染細胞が確認された（全細胞中約０．５１％）。そこで、この感染がｒＪＦＨ１をＨｕｈ７細胞へトランスフェクションすることにより、培養液中に分泌されたＨＣＶ粒子によるものであるかどうかを確認した。すなわち、感染に用いる培養液をＵＶ処理、あるいは、ＲＮＡのトランスフェクションの過程を行わずに調製した培養液を用いて、トランスフェクションしていないＨｕｈ７を１５ｍｍカバースリップ上で培養して、４８時間後に細胞を抗Ｃｏｒｅ抗体で免疫染色して感染細胞を数えた。その結果、ＵＶ処理では感染細胞数が激減し、ＲＮＡのトランスフェクションの過程を行わずに調製した培養液では感染細胞が確認されなかった。
さらに、感染させたＨＣＶ粒子が細胞内でＲＮＡ増幅して、新たなＨＣＶ粒子を培養液中に放出するかどうかを検討した。ｒＪＦＨ１をＨｕｈ７細胞へトランスフェクションして４８時間後の培養液を濃縮したＨＣＶ粒子を含む培養液１００μｌでＲＮＡをトランスフェクションしていないＨｕｈ７を培養して、経日的に細胞及び、培養液を回収して、ＲＮＡを回収して、上述した方法でＨＣＶ  ＲＮＡ量を定量した。結果は、図６Ｃに示すよう、細胞内でＨＣＶ  ＲＮＡは一定量増幅しており、上清においては経日的にＨＣＶ  ＲＮＡ量が増加した。一方、ｒＪＦＨ１／ΔＥ１−Ｅ２をＨｕｈ７細胞へトランスフェクションして得た培養液を用いて、同様の検討を行っても、細胞内及び、培養液中でＨＣＶ  ＲＮＡを検出することはできなかった。
これらの結果から、ｒＪＦＨ１をＨｕｈ７細胞へトランスフェクションすることにより、培養液中に分泌されたＨＣＶ粒子は感染する能力を有し、さらに感染細胞中でＨＣＶ  ＲＮＡを増幅して、新たなＨＣＶ粒子を生産する能力を有することが確認された。
６．ｒＪＣＨ１／ＮＳ５Ｂ（ｊｆｈ１）を用いたＨＣＶウイルス粒子の作製
ｒＪＣＨ１／ＮＳ５Ｂ（ｊｆｈ１）をＨｕｈ７細胞へトランスフェクションすることにより、培養液中にＨＣＶ粒子が分泌されるかどうか、また分泌されたＨＣＶ粒子に感染性があるかどうかについて検討した。ｒＪＣＨ１／ＮＳ５Ｂ（ｊｆｈ１）をＨｕｈ７細胞にトランスフェクションして６日後の培養液を５．に記述した方法で濃縮後、この培養液存在下で、ＲＮＡをトランスフェクションしていないＨｕｈ７を培養して、経時的に細胞内のＨＣＶ  ＲＮＡ量を定量したところ、培養開始後１２時間後から経時的に細胞内のＨＣＶ  ＲＮＡ量が増加していた（図７Ａ）。さらに、ＲＮＡをトランスフェクションしていないＨｕｈ７を１５ｍｍカバースリップ上で培養して、濃縮した培養液存在下で培養４８時間後に細胞を抗Ｃｏｒｅ抗体で免疫染色して、Ｃｏｒｅ抗体染色陽性、すなわち、感染細胞を数えたところ、図７Ｂに示すように感染細胞が確認された。これらの結果から、ｒＪＣＨ１／ＮＳ５Ｂ（ｊｆｈ１）をＨｕｈ７細胞へトランスフェクションすることにより、培養液中に分泌されたＨＣＶ粒子は感染能力を獲得し、さらに感染細胞中でＨＣＶ  ＲＮＡを増幅して、新たなＨＣＶ粒子を生産する能力を有することが示された。
従って、患者から分離したＨＣＶ株のように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで自律複製能を有さない株についても、その株のＮＳ５Ｂ領域をｒＪＦＨ１のＮＳ５Ｂに置換することにより、培養細胞系で自律複製し、ＨＣＶ粒子を産生させることができた。
［実施例３］
１．Ｃｏｎ１／Ｃ−ＮＳ２／ＪＦＨ−１を用いたＨＣＶウイルス粒子の作製
ＨＣＶ遺伝子型１ｂのＣｏｎ−１株とＪＦＨ−１のＮＳ５Ｂ部分を含むキメラＨＣＶ  ＲＮＡをＨｕｈ７細胞にトランスフェクションすることにより培養液中にＨＣＶ粒子が分泌されるか、また分泌されたＨＣＶ粒子に感染性があるかどうかについて検討した。
ＪＦＨ−１株の５’ＵＴＲの下流にＨＣＶ遺伝子型１ｂのＣｏｎ−１株の遺伝子番号１から１０２６の配列（Ｃｏｎ  １株のＣｏｒｅ、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７及び、ＮＳ２領域）を連結して、その下流に、ＪＦＨ−１株の１０３１から３０３０の領域（ＮＳ３からＮＳ５ｂ）を連結させ、さらにその下流にＪＦＨ−１株の３’ＵＴＲを連結させたコンストラクトを作製した。このコンストラクトを用いて、実施例１の２に記した方法で、ｒＣｏｎ１／Ｃ−ＮＳ２／ＪＦＨ−１キメラＨＣＶ  ＲＮＡを作製し、実施例２の１に記す方法でＨｕｈ７にＲＮＡをトランスフェクションした。Ｈｕｈ７細胞にＨＣＶ  ＲＮＡをトランスフェクションして経時的に、上清中のコアタンパクを測定したところ、約４８時間以降から、上清中にコアタンパクが検出され、細胞上清中にＨＣＶ粒子が産生されていることが確認出来た。次に、その上清を限外濾過により２０倍に濃縮後、濃縮液を、Ｈｕｈ７細胞に添加した。培養４８時間後に、細胞を、ウサギ抗ＮＳ３抗体により細胞を染色した。
その結果、ｍｏｃｋ及びｒＪＦＨ−１／ΔＥＥＬ−Ｅ２では、抗ＮＳ３抗体陽性細胞は認められなかったが、ｒＪＦＨ−１及びｒＣｏｎ１／Ｃ−ＮＳ２／ＪＦＨ−１では、抗ＮＳ３抗体陽性細胞が検出された。以上の結果から、ｒＣｏｎ１／Ｃ−ＮＳ２／ＪＦＨ−１はＪＦＨ−１同様に感染性ＨＣＶ粒子を産生出来ることが確認できた。
［実施例４］  全長キメラＨＣＶゲノムＲＮＡ由来の全長キメラＨＣＶレプリコンＲＮＡの作製
（１）発現ベクターの構築
劇症肝炎の患者から分離したＣ型肝炎ウイルスであるＪＦＨ−１株（遺伝子型２ａ）のゲノム全長ＣＤＮＡを含むＤＮＡ（ＪＦＨ−１クローン：配列番号９）を、ｐＵＣ１９プラスミド中でＴ７ＲＮＡプロモーター配列の下流に挿入したプラスミドＤＮＡを作製した。
具体的には、ＪＦＨ−１株のウイルスＲＮＡを増幅したＲＴ−ＰＣＲ断片をｐＧＥＭ−ＴＥＡＳＹ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングしてｐＧＥＭ１−２５８、ｐＧＥＭ４４−４８６、ｐＧＥＭ３１７−８４９、ｐＧＥＭ６１７−１３２３、ｐＧＥＭ１１４１−２３６７、ｐＧＥＭ２２８５−３５０９、ｐＧＥＭ３４７１−４６６５、ｐＧＥＭ４５４７−５９７０、ｐＧＥＭ５８８３−７００３、ｐＧＥＭ６９５０−８０３５、ｐＧＥＭ７９８４−８８９２、ｐＧＥＭ８６８０−９２８３、ｐＧＥＭ９２３１−９６３４及びｐＧＥＭ９５９４−９６７８の各プラスミドＤＮＡを得た（Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，（２００３）１２５：ｐ．１８０８−１８１７）。各プラスミドに含まれるウイルスゲノムＲＮＡ由来のｃＤＮＡをＰＣＲ法及び制限酵素を用いてつなぎ合わせて、全長のウイルスゲノムｃＤＮＡをクローニングした。全長のウイルスゲノムの上流にＴ７Ｒ  ＲＮＡプロモーター配列を挿入した。このようにして構築されたプラスミドＤＮＡを、以下、ｐＪＦＨ１と称する。なお、上記ＪＦＨ−１クローンの作製については、特開２００２−１７１９７８号及びＫａｔｏら（Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，（２００１）６４（３）：ｐ．３３４−３３９）に記載されている。またＪＦＨ−１クローンの全長ｃＤＮＡの塩基配列は、国際ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）のアクセッション番号：ＡＢ０４７６３９に登録されている。
次に、プラスミドＤＮＡであるｐＪＦＨ１の５’非翻訳領域とｃｏｒｅ領域の間に、ＥＭＣＶ−ＩＲＥＳ（脳心筋炎ウイルスの内部リボゾーム結合部位）及びネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子とも称する）を挿入して、プラスミドＤＮＡであるｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１を構築した。この構築手順は、Ｉｋｅｄａら（Ｉｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，（２００２）７６（６）：ｐ．２９９７−３００６）に従った。
（２）キメラ発現ベクターの構築
ＪＦＨ１株は、ＨＣＶ２ａ型由来のＨＣＶであるが、ＨＣＶ１ｂ型由来のＴＨ株（Ｗａｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９９４）２６９，ｐ．１４２０５−１４２１０，及びＭｏｒａｄｐｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，（１９９８）２４６，ｐ．９２０−９２４）を用いて、キメラＨＣＶベクターを作製した。上記で作製した、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１の、コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７の部分をＴＨ株由来のコア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７に置換したキメラＨＣＶ、ｐＦＧＲＥＰ−ＴＨ／ＪＦＨ１を作製した。
なお、本明細書では、前記ＪＦＨ１株（ＪＦＨ−１クローン由来）の全長及びキメラに用いたＴＨ株の部分ＲＮＡ配列（ＨＣＶ  ＴＨ株の５’非翻訳領域からＮＳ３領域の一部を含む部分ゲノムＲＮＡ（１−３７４８））をそれぞれ配列表の配列番号９及び１０に示す。前記ＪＦＨ−１株の全長ゲノムＲＮＡ配列（配列番号９）中、「５’非翻訳領域」は１〜３４０番、「ｃｏｒｅタンパク質コード配列」は３４１〜９１３番、「Ｅ１タンパク質コード配列」は９１４〜１４８９番、「Ｅ２タンパク質コード配列」は１４９０〜２５９０番、「ＮＳ２タンパク質コード配列」は２７８０〜３４３０番、「ＮＳ３タンパク質コード配列」は３４３１〜５３２３番、「ＮＳ４Ａタンパク質コード配列」は５３２４〜５４８６番、「ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列」は５４８７〜６２６８番、「ＮＳ５Ａタンパク質コード配列」は６２６９〜７６６３番、「ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列」は７６６４〜９４４２番に該当する。
（３）全長キメラＨＣＶレプリコンＲＮＡの作製
全長キメラＨＣＶレプリコンＲＮＡ合成に用いる鋳型ＤＮＡを作製するために、上記のとおり構築した発現ベクターｐＦＧＲＥＰ−ＴＨ／ＪＦＨ１を、制限酵素ＸｂａＩで切断した。次いで、これらのＸｂａＩ切断断片ついて、１０〜２０μｇを５０μｌの反応液中に含有させ、Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ  ２０  Ｕを用いて３０℃で３０分間インキュベートすることにより、さらに処理した。Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅは、二本鎖ＤＮＡ中の一本鎖部分を選択的に分解する反応を触媒する酵素である。通常、上記ＸｂａＩ切断断片をそのまま鋳型として用いてＲＮＡ合成を行うと、ＸｂａＩの認識配列の一部であるＣＵＧＡの４塩基が３’末端に余分に付加されたレプリコンＲＮＡが合成されてしまう。そこで本実施例では、ＸｂａＩ切断断片をＭｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅで処理することにより、ＸｂａＩ断断片からＣＵＧＡの４塩基を除去した。この後、ＸｂａＩ切断断片を含むＭｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ処理後の溶液について、通常法に従ったタンパク質除去処理により、ＣＵＧＡの４塩基が除去されたＸｂａＩ切断断片を精製して、これを鋳型ＤＮＡとした。
次に、この鋳型ＤＮＡから、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成した。このＲＮＡ合成にはＡｍｂｉｏｎ社のＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔを用いた。鋳型ＤＮＡを０．５〜１．０μｇ含む反応液２０μｌを製造業者の使用説明書に従って反応させた。
ＲＮＡ合成終了後、反応溶液にＤＮａｓｅ（２Ｕ）を添加して３７℃で１５分間反応させた後、さらに酸性フェノールによるＲＮＡ抽出を行って、鋳型ＤＮＡを除去した。このようにしてｐＦＧＲＥＰ−ＴＨ／ＪＦＨ１に由来する上述の鋳型ＤＮＡから合成したＲＮＡを、ｒＦＧＲＥＰ−ＴＨ／ＪＦＨ１と命名した。このｒＦＧＲＥＰ−ＴＨ／ＪＦＨ中のキメラＨＣＶゲノムＲＮＡの塩基配列を配列番号１１に示す。ｒＦＧＲＥＰ−ＴＨ／ＪＦＨ１は、本発明における全長キメラＨＣＶレプリコンＲＮＡの一例である。
［実施例５］  全長キメラＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞の作製及び細胞クローンの樹立
（１）全長キメラＨＣＶゲノムＲＮＡの細胞内への導入
上記の通り合成した全長キメラＨＣＶゲノムＲＮＡ（ｒＦＧＲＥＰ−ＴＨ／ＪＦＨ１）を、様々な量で、Ｈｕｈ７細胞から抽出したトータル細胞性ＲＮＡと混合して、ＲＮＡ総量が１０μｇとなるように調製した。次いでその混合ＲＮＡをエレクトロポレーション法によりＨｕｈ７細胞に導入した。１６時間から２４時間培養した後にＧ４１８を様々な濃度で添加した。週に２回培養液を交換しながら培養を継続した。２１日間培養した後、クリスタルバイオレットで生存細胞を染色した。染色されるコロニー数を計測し、トランスフェクションしたＲＮＡ重量あたりに得られたコロニー数を計算した。また、一部の培養ディッシュでは生存細胞のコロニーをクローン化して培養を継続した。クローン化された細胞からＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、タンパク質をそれぞれ抽出した後、全長キメラＨＣＶレプリコンＲＮＡの検出、ネオマイシン耐性遺伝子のゲノムＤＮＡへの組み込みの有無、ＨＣＶタンパク質の発現を検討した。これらの結果の詳細は下記に示す。
（２）コロニー形成能
上記のトランスフェクションの結果、Ｇ４１８濃度が１．０ｍｇ／ｍｌの場合でも、細胞のコロニー形成が認められた。このことは、ｒＦＧＲＥＰ−ＴＨ／ＪＦＨ１レプリコンＲＮＡをトランスフェクションしたＨｕｈ７細胞のコロニー形成能は、ｒＦＧＲＥＰ−ＴＨ／ＪＦＨ１レプリコンＲＮＡが自律複製することによって、ネオマイシン耐性遺伝子が持続的に発現されＧ４１８耐性が維持される結果、細胞増殖が可能になったものと考えられた。
［実施例６］  培養上清中のキメラＨＣＶウイルスの感染
培養上清中のキメラＨＣＶウイルス粒子の感染実験
ｒＦＧＲＥＰ−ＴＨ／ＪＦＨ１をＨｕｈ７細胞へトランスフェクションし、樹立した全長キメラＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞クローンの培養上清を回収して、その培養上清をさらに、感染をさせていないＨｕｈ７細胞に添加して、培養上清中のウイルス粒子をＨｕｈ７細胞に感染させた。感染翌日に感染させたＨｕｈ７細胞の培養液にＧ４１８を０．３ｍｇ／ｍｌ添加し、さらに２１日間培養した。培養終了後に細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色したところ、ｒＦＧＲＥＰ−ＴＨ／ＪＦＨ１をトランスフェクションして得られた全長キメラＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞クローンの培養上清を用いて感染させた細胞についてコロニー形成が観察された。このことは、ｒＦＧＲＥＰ−ＴＨ／ＪＦＨ１をトランスフェクションして得られた全長キメラＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞クローンから感染性のＨＣＶが産生されていることを示しており、更に、そのＨＣＶは新たな細胞への感染性を保持していることを示している。
［実施例７］ＨＣＶ粒子の精製
（１）ゲル濾過
図１１にゲル濾過クロマトグラフィによるＨＣＶ粒子の各フラクションでの分布を示す。用いたゲル担体はセファクリル（登録商標）Ｓ３００、Ｓ４００及びＳ５００である。カラムクロマトグラフィに用いたＨＣＶ粒子を含む溶液をそれぞれのゲル担体を含むカラムクロマトグラフィを利用して精製した。精製する際に緩衝液は、１０ｍＭ  トリス塩酸塩、１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸及び１００ｍＭ  塩化ナトリウム（ｐＨ８．０）を用いた。その結果、セファクリル（登録商標）Ｓ−３００ではＨＣＶ粒子はＶｏｉｄ画分と呼ばれる素通り画分に得られた。従って、セファクリル（登録商標）Ｓ−３００を用いることにより分子量が小さなタンパク質と分離し、溶液の塩濃度の変更ができる。その際、ＨＣＶコアタンパク質／全タンパク質量の比率はカラム精製前のＨＣＶ粒子と比較して３．７８となりＨＣＶ粒子の占める全タンパク質にたいする割合が上昇した。一方、セファクリル（登録商標）Ｓ−４００及びＳ−５００ではＨＣＶ粒子は分子量に従って溶出される画分にあることから他の分子量のタンパク質と分離することができる。
（２）イオン交換クロマトグラフィ
図１２にイオン交換クロマトグラフィによるＨＣＶ粒子の各フラクションでの分布を示した。用いたゲル担体は、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（登録商標）及びＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（登録商標）である。
ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（登録商標）を用いたカラムでは、５０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６．２）でカラムを平衡化した。分画分子量１００，０００から５００，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し５０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６．２）で希釈したＨＣＶ粒子を含む溶液をカラムに添加後、５０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６．２）をカラム容量の１０倍程度カラムに流した。次いで、それぞれ０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ又は、１Ｍ  ＮａＣｌを加えた５０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６．２）をカラム容量の３倍程度順番に流した。その後、１Ｍ  ＮａＣｌを加えた５０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６．２）をカラム容量の５倍程度流した（１Ｍ  ＮａＣｌＷ分画）。その結果、ＨＣＶ粒子は０．１Ｍ  ＮａＣｌを加えた５０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６．２）画分に溶出した。
Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（登録商標）では、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）でカラムを平衡化した。分画分子量１００，０００から５００，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈したＨＣＶ粒子を含む溶液をカラムに添加後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）をカラム容量の１０倍程度カラムに流した。次いで、それぞれ０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ又は、１Ｍ  ＮａＣｌを加えた５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）をカラム容量の３倍程度順番に流した。その後、１Ｍ  ＮａＣｌを加えた５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）をカラム容量の５倍程度流した（１Ｍ  ＮａＣｌＷ分画）。その結果，ＨＣＶ粒子は０．３Ｍ  ＮａＣｌを加えた５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）画分に溶出した。その際、ＨＣＶコアタンパク質／全タンパク質量の比率はカラム精製前のＨＣＶ粒子と比較して２．３２となりＨＣＶ粒子の占める全タンパク質にたいする割合が上昇した。
（３）アフィニティークロマトグラフィ
図１３にレクチンアフィニティークロマトグラフィーによるＨＣＶ粒子の各フラクションでの分布を示した。レクチンアフィニティークロマトグラフィーは、ＲＣＡ−１２０、ＣｏｎＡ、ＬＣＡ及びＷＧＡがそれぞれ結合した担体を利用した。
ＣｏｎＡ、ＬＣＡ及びＷＧＡアフィニティークロマトグラフィでは、リン酸緩衝生理食塩水でカラムを平衡化した。分画分子量１００，０００から５００，０００の限外濾過膜を用いて濃縮しリン酸緩衝生理食塩水で希釈したＨＣＶ粒子を含む溶液をカラムに添加後、リン酸緩衝生理食塩水をカラム容量の１０倍程度カラムに流した。次いで、０．３５Ｍ  ラクトースを加えたリン酸緩衝生理食塩水をカラム容量の３倍程度流した。その後、０．５Ｍラクトースを加えたリン酸緩衝生理食塩水をカラム容量の５倍程度流した。その結果、ＬＣＡ及びＣｏｎＡアフィニティークロマトグラフィでは担体への特異的結合はなかった。ＷＧＡアフィニティークロマトグラフィでは、ＨＣＶ粒子は０．３５Ｍ  ラクトースを加えたリン酸緩衝生理食塩水画分へ溶出した。
ＲＣＡ−１２０アフィニティークロマトグラフィでは、リン酸緩衝生理食塩水でカラムを平衡化した。分画分子量１００，０００から５００，０００の限外濾過膜を用いて濃縮しリン酸緩衝生理食塩水で希釈したＨＣＶ粒子を含む溶液をカラムに添加後、リン酸緩衝生理食塩水をカラム容量の１０倍程度カラムに流した。次いで、０．３８Ｍ  ラクトースを加えたリン酸緩衝生理食塩水をカラム容量の３倍程度流した。その後、０．３８Ｍラクトースを加えたリン酸緩衝生理食塩水をカラム容量の５倍程度流した。ＲＣＡ−１２０アフィニティークロマトグラフィでは、ＨＣＶ粒子は０．３８Ｍ  ラクトースを加えたリン酸緩衝生理食塩水画分へ溶出した。
図１４にヘパリン、硫酸セルロファインによるＨＣＶ粒子の各フラクションでの分布を示した。
それぞれのクロマトグラフィでは、２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムを平衡化した。分画分子量１００，０００から５００，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈したＨＣＶ粒子を含む溶液をカラムに添加後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）をカラム容量の１０倍程度カラムに流した。次いで、０．１Ｍ、０．３Ｍ、０．５Ｍ、もしくは１Ｍ  ＮａＣｌを加えた２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）をカラム容量の３倍程度順番に流した。その後、１Ｍ  ＮａＣｌを加えた２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）をカラム容量の５倍程度流した。その結果、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィでは０．３Ｍ  ＮａＣｌを加えた２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）画分へ溶出した。その際、ＨＣＶコアタンパク質／全タンパク質量の比率はカラム精製前のＨＣＶ粒子と比較して０．３６となりＨＣＶ粒子の占める全タンパク質にたいする割合が低下した。硫酸セルロファインアフィニティークロマトグラフィでは、ＨＣＶ粒子は０．１Ｍ  ＮａＣｌを加えた２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）画分へ溶出した。
図１５にブルーダイアフィニティークロマトグラフィーによるＨＣＶ粒子の各フラクションでの分布を示した。
ブルーダイアフィニティークロマトグラフィでは、Ｃｉｂａｃｒｏｎ  Ｂｌｕｅ  Ｆ３Ｇ−Ａをアガロース粒子に結合した担体をカラムに利用した。２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムを平衡化した。分画分子量１００，０００から５００，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈したＨＣＶ粒子を含む溶液をカラムに添加後、リン酸緩衝生理食塩水をカラム容量の１０倍程度カラムに流した。次いで、１Ｍ又は２Ｍ  ＮａＣｌを加えた２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）をカラム容量の３倍程度順番に流した。その後、２Ｍ  ＮａＣｌを加えた２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）をカラム容量の５倍程度流した。その結果，ＨＣＶ粒子はカラム非結合画分に溶出した。その際、ＨＣＶコアタンパク質／全タンパク質量の比率はカラム精製前のＨＣＶ粒子と比較して３．３３となりＨＣＶ粒子の占める全タンパク質にたいする割合が上昇した。
（４）ショ糖密度勾配遠心
上記実施例を参考にカラムクロマトグラフィ及びショ糖密度勾配遠心を組み合わせてＨＣＶ粒子の精製を行った。
まずＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（登録商標）を用いてＨＣＶ粒子の精製を行った。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）でカラムを平衡化した。分画分子量１００，０００から５００，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈したＨＣＶ粒子を含む溶液をカラムに添加後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）をカラム容量の１０倍程度カラムに流した。次いで、それぞれ０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ又は、１Ｍ  ＮａＣｌを加えた５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）をカラム容量の３倍程度順番に流した。その後、１Ｍ  ＮａＣｌを加えた５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）をカラム容量の５倍程度流した（１Ｍ  ＮａＣｌＷ分画）。図１６Ａに示すように０．３Ｍ  ＮａＣｌを加えた５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１Ｍ  ＮａＣｌを加えた５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）分画及び１Ｍ  ＮａＣｌＷ分画にＨＣＶ粒子は溶出した。ＨＣＶ粒子を含んだ分画を収集したところＨＣＶコアタンパク質／全タンパク質量の比率はカラム精製前のＨＣＶ粒子と比較して２．２９となりＨＣＶ粒子の占める全タンパク質にたいする割合が上昇した。
次に、硫酸セルロファインクロマトグラフィを用いてＨＣＶ粒子の精製を行った。それぞれのクロマトグラフィでは、２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムを平衡化した。Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（登録商標）を用いて精製したＨＣＶ粒子を含んだ分画を分画分子量１００，０００から５００，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈したＨＣＶ粒子を含む溶液をカラムに添加後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）をカラム容量の１０倍程度カラムに流した。次いで、０．２５Ｍ又は１Ｍ  ＮａＣｌを加えた２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）をカラム容量の３倍程度順番に流した。その後、１Ｍ  ＮａＣｌを加えた２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）をカラム容量の５倍程度流した。図１６Ｂを示すように１Ｍ  ＮａＣｌを加えた２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にＨＣＶ粒子は主に溶出した。１Ｍ  ＮａＣｌを加えた２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）においてＨＣＶコアタンパク質／全タンパク質量の比率はカラム精製前のＨＣＶ粒子と比較して３１．４となりＨＣＶ粒子の占める全タンパク質にたいする割合が上昇した。
さらに、ショ糖密度勾配遠心を用いて精製を行った。硫酸セルロファインクロマトグラフィを用いた１Ｍ  ＮａＣｌを加えた２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）分画を分画分子量１００，０００から５００，０００の限外濾過膜を用いて濃縮しＴＥＮ緩衝液（１０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．１Ｍ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ｐＨ８．０））で希釈した。ＨＣＶ粒子を含んだ溶液を、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％及び１０％ショ糖溶液を積層した上に重層し、３９０ｋ×ｇ、１８時間、４℃で遠心をした。ほぼ比重が１．２のあたりにＨＣＶ粒子が集まっていたので、その分画を採取した。採取した分画において、ＨＣＶコアタンパク質／全タンパク質量の比率はカラム精製前のＨＣＶ粒子と比較して１．６９となりＨＣＶ粒子の占める全タンパク質にたいする割合が上昇した。
ショ糖密度勾配遠心により精製されたＨＣＶ粒子を含んだ分画は、精製を開始する前と比較するとＨＣＶコアタンパク質／全タンパク質量の比率は１２０倍程度まで精製された。最終的な分画にＨＣＶ粒子は１０９ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ含まれていた。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】  本発明により、種々の遺伝子型のＨＣＶ株のウイルス粒子を培養細胞系で生産することができる。すなわち、患者から分離したＨＣＶ株のように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで自律複製能を有さないＨＣＶ株についても、そのＮＳ３からＮＳ４、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ配列部分をＪＦＨ１のＮＳ３からＮＳ４、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ配列部分に置換することにより、培養細胞系で自律的に複製させ、ＨＣＶ粒子を産生させることができる。本発明により精製されたＨＣＶ粒子は、そのまま医療用途のワクチンとして利用することができる。本発明で提供されるＨＣＶゲノムＲＮＡやウイルス粒子は、外来遺伝子のウイルスベクターとしても利用できる。また、本発明の方法は、ＨＣＶの感染過程の研究や、ＨＣＶの感染過程に影響を及ぼす各種物質のスクリーニング系としても利用できる。
【配列表フリーテキスト】配列番号１：ＪＦＨ１株のＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５Ａ、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ部分配列（ＣＤＮＡ配列）
配列番号２：ＪＦＨ１のＮＳ５Ｂタンパク質コード配列（ｃＤＮＡ配列）
配列番号３：ＪＦＨ１のＮＳ５Ｂタンパク質
配列番号４：ＪＦＨ１  Ｅ２領域を基に設計した合成ペプチド
配列番号５：ＪＦＨ１  Ｅ２領域を基に設計した合成ペプチド
配列番号６：プライマー（Ｒ６−１３０−Ｓ１７）
配列番号７：プライマー（Ｒ６−２９０−Ｒ１９）
配列番号８：ＴａｑＭａｎプローブ（Ｒ６−１４８−Ｓ２１ＦＴ）
配列番号９：ＨＣＶ  ＪＦＨ１株（ＪＦＨ−１クローン）の全長ゲノムＲＮＡ
配列番号１０：ＨＣＶＴＨ株の５’非翻訳領域からＮＳ３領域の一部を含む部分ゲノムＲＮＡ（１−３７４８）
配列番号１１：ＨＣＶ  ＪＦＨ１株（ＪＦＨ−１クローン）のゲノムＲＮＡとＨＣＶＴＨ株のゲノムＲＮＡから構成されたキメラＨＣＶゲノムＲＮＡ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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