(57)【要約】  高い神経突起伸長効果を発揮する、新規な神経突起伸長剤、神経変性疾患治療剤又は予防剤、当該疾患の治療用又は予防用の食品又は飲料、神経突起伸長の誘導方法、神経疾患の治療又は予防方法、学習及び／又は記憶能力の向上又は改善方法、神経疾患の治療又は予防のための医薬の製造のための前記糖鎖の使用並びに学習及び／又は記憶能力の向上剤又は改善剤の製造のための前記糖鎖の使用を提供すること。【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖の誘導体、該複合糖質の誘導体、該糖鎖の薬理学的に許容されうる塩、該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩、該糖鎖の合成に係る酵素及び該酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１種を有効成分として含有してなる、神経突起伸長誘導剤。
【請求項２】
バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖が、下記式（１）：
【化１】
2005097155.tif 000028
（式中、Ｒ1は、糖残基を示し、±は、ＧｌｃＮＡｃ残基の有無を意味する）
で表される糖鎖である、請求項１記載の神経突起伸長誘導剤。
【請求項３】
バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖が、下記式（２）：
【化２】
2005097155.tif 000029
〔式中、Ｒ1は、糖残基を示し、Ｒ2及びＲ3は、β１−２結合、β１−４結合又はβ１−６結合を介して、マンノースに結合していてもよいＧｌｃＮＡｃ残基を示す（但し、Ｒ2及びＲ3がＧｌｃＮＡｃ残基を有する場合、１又は２個のＲ2及びＲ3が直接マンノースに結合していてもよい）〕
で表される糖鎖である、請求項１記載の神経突起伸長誘導剤。
【請求項４】
バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖の誘導体、該複合糖質の誘導体、該糖鎖の薬理学的に許容されうる塩、該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩、該糖鎖の合成に係る酵素及び該酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１種を有効成分として含有してなる、神経疾患治療剤又は予防剤。
【請求項５】
バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖が、下記式（１）：
【化３】
2005097155.tif 000030
（式中、Ｒ1は、糖残基を示し、±は、ＧｌｃＮＡｃ残基の有無を意味する）
で表される糖鎖である、請求項４記載の神経疾患治療剤又は予防剤。
【請求項６】
バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖が、下記式（２）：
【化４】
2005097155.tif 000031
〔式中、Ｒ1は、糖残基を示し、Ｒ2及びＲ3は、β１−２結合、β１−４結合又はβ１−６結合を介して、マンノースに結合していてもよいＧｌｃＮＡｃ残基を示す（但し、Ｒ2及びＲ3がＧｌｃＮＡｃ残基を有する場合、１又は２個のＲ2及びＲ3が直接マンノースに結合していてもよい）〕
で表される糖鎖である、請求項４記載の神経疾患治療剤又は予防剤。
【請求項７】
神経変性疾患、痴呆症又は脳腫瘍の治療又は予防に使用される、請求項４〜６いずれか１項に記載の神経疾患治療剤又は予防剤。
【請求項８】
バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖の誘導体、該複合糖質の誘導体、該糖鎖の薬理学的に許容されうる塩、該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩、該糖鎖の合成に係る酵素及び該酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１種を有効成分として含有してなる、学習及び／又は記憶能力の向上剤又は改善剤。
【請求項９】
バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖が、下記式（１）： 
【化５】
2005097155.tif 000032
（式中、Ｒ1は、糖残基を示し、±はＧｌｃＮＡｃ残基の有無を意味する）
で表される糖鎖である、請求項８記載の学習及び／又は記憶能力の向上剤又は改善剤。
【請求項１０】
バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖が、下記式（２）：
【化６】
2005097155.tif 000033
〔式中、Ｒ1は、糖残基を示し、Ｒ2及びＲ3は、β１−２結合、β１−４結合又はβ１−６結合を介して、マンノースに結合していてもよいＧｌｃＮＡｃ残基を示す（但し、Ｒ2及びＲ3がＧｌｃＮＡｃ残基を有する場合、１又は２個のＲ2及びＲ3が直接マンノースに結合していてもよい）〕
で表される糖鎖である、請求項８記載の学習及び／又は記憶能力の向上剤又は改善剤。
【請求項１１】
バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖の誘導体、該複合糖質の誘導体、該糖鎖の薬理学的に許容されうる塩及び該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩からなる群より選ばれた少なくとも１種を含有してなる、食品又は飲料。
【請求項１２】
バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖が、下記式（１）：
【化７】
2005097155.tif 000034
（式中、Ｒ1は、糖残基を示し、±はＧｌｃＮＡｃ残基の有無を意味する）
で表される糖鎖である、請求項１１記載の食品又は飲料。
【請求項１３】
バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖が、下記式（２）：
【化８】
2005097155.tif 000035
〔式中、Ｒ1は、糖残基を示し、Ｒ2及びＲ3は、β１−２結合、β１−４結合又はβ１−６結合を介して、マンノースに結合していてもよいＧｌｃＮＡｃ残基を示す（但し、Ｒ2及びＲ3がＧｌｃＮＡｃ残基を有する場合、１又は２個のＲ2及びＲ3が直接マンノースに結合していてもよい）〕
で表される糖鎖である、請求項１１記載の食品又は飲料。
【請求項１４】
神経変性疾患、痴呆症又は脳腫瘍の治療又は予防に使用される、請求項１１〜１３いずれか１項に記載の食品又は飲料。
【請求項１５】
学習及び／又は記憶能力の改善又は予防に使用される、請求項１１〜１３いずれか１項に記載の食品又は飲料。
【請求項１６】
バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖の誘導体、該複合糖質の誘導体、該糖鎖の薬理学的に許容されうる塩、該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩、該糖鎖の合成に係る酵素及び該酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１種を検体に投与することを特徴とする、神経突起伸長の誘導方法。
【請求項１７】
バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖が、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖が、下記式（１）：
【化９】
2005097155.tif 000036
（式中、Ｒ1は、糖残基を示し、±は、ＧｌｃＮＡｃ残基の有無を意味する）
で表される糖鎖である、請求項１６記載の神経突起伸長の誘導方法。
【請求項１８】
バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖が、下記式（２）：
【化１０】
2005097155.tif 000037
〔式中、Ｒ1は、糖残基を示し、Ｒ2及びＲ3は、β１−２結合、β１−４結合又はβ１−６結合を介して、マンノースに結合していてもよいＧｌｃＮＡｃ残基を示す（但し、Ｒ2及びＲ3がＧｌｃＮＡｃ残基を有する場合、１又は２個のＲ2及びＲ3が直接マンノースに結合していてもよい）〕
で表される糖鎖である、請求項１６記載の神経突起伸長の誘導方法。
【請求項１９】
神経疾患を罹患した個体又は該神経疾患に罹患するおそれのある個体に、下記式（２）：
【化１１】
2005097155.tif 000038
〔式中、Ｒ1は、糖残基を示し、Ｒ2及びＲ3は、β１−２結合、β１−４結合又はβ１−６結合を介して、マンノースに結合していてもよいＧｌｃＮＡｃ残基を示す（但し、Ｒ2及びＲ3がＧｌｃＮＡｃ残基を有する場合、１又は２個のＲ2及びＲ3が直接マンノースに結合していてもよい）〕
で表されるバイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖の誘導体、該複合糖質の誘導体、該糖鎖の薬理学的に許容されうる塩、該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩、該糖鎖の合成に係る酵素及び該酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１種を投与することを特徴とする、神経疾患治療又は予防方法。
【請求項２０】
学習能力の向上又は改善を必要とする個体に、下記式（２）：
【化１２】
2005097155.tif 000039
〔式中、Ｒ1は、糖残基を示し、Ｒ2及びＲ3は、β１−２結合、β１−４結合又はβ１−６結合を介して、マンノースに結合していてもよいＧｌｃＮＡｃ残基を示す〕
で表されるバイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖の誘導体、該複合糖質の誘導体、該糖鎖の薬理学的に許容されうる塩、該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩、該糖鎖の合成に係る酵素及び該酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１種を供給することを特徴とする、学習及び／又は記憶能力の向上又は改善方法。
【請求項２１】
神経疾患の治療又は予防のための医薬の製造のための、下記式（２）：
【化１３】
2005097155.tif 000040
〔式中、Ｒ1は、糖残基を示し、Ｒ2及びＲ3は、β１−２結合、β１−４結合又はβ１−６結合を介して、マンノースに結合していてもよいＧｌｃＮＡｃ残基を示す（但し、Ｒ2及びＲ3がＧｌｃＮＡｃ残基を有する場合、１又は２個のＲ2及びＲ3が直接マンノースに結合していてもよい）〕
で表されるバイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖の誘導体、該複合糖質の誘導体、該糖鎖の薬理学的に許容されうる塩、該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩、該糖鎖の合成に係る酵素及び該酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１種の使用。
【請求項２２】
学習及び／又は記憶能力の向上剤又は改善剤の製造のための、下記式（２）：
【化１４】
2005097155.tif 000041
〔式中、Ｒ1は、糖残基を示し、Ｒ2及びＲ3は、β１−２結合、β１−４結合又はβ１−６結合を介して、マンノースに結合していてもよいＧｌｃＮＡｃ残基を示す（但し、Ｒ2及びＲ3がＧｌｃＮＡｃ残基を有する場合、１又は２個のＲ2及びＲ3が直接マンノースに結合していてもよい）〕
で表されるバイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖の誘導体、該複合糖質の誘導体、該糖鎖の薬理学的に許容されうる塩、該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩、該糖鎖の合成に係る酵素及び該酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１種の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経突起伸長作用を有する糖鎖、複合糖質、該糖鎖若しくは該複合糖質の誘導体、該糖鎖若しくは該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩又は該糖鎖の合成に係る酵素及び該酵素をコードする核酸を有効成分とする医薬組成物、試薬、食品又は飲料に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経細胞は、通常、１本の軸索と複数の樹状突起とを伸長させて、他の細胞との間でシグナルをやり取りすることによって複雑なネットワークを構築している。神経細胞の生存や幼若神経芽細胞から成熟した神経細胞への分化、神経突起の伸長等、神経細胞の機能維持には、神経栄養因子とよばれる一連の物質が重要な役割を果たしていると考えられている。【０００３】
神経損傷や神経変性を伴う疾患、例えば、神経切断、脊髄損傷、糖尿病性神経障害、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＬＳ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＭＳ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病等の末梢神経系、中枢神経系の疾患等の治療方法は、損傷を受けた神経細胞の生存と機能修復とを促す方法（温存再生）と、神経細胞に分化しうる細胞（例えば、神経幹細胞）を損傷部位に補充して機能の回復を図る方法（補充再生）とに大別される。このうち、前記補充再生は、補充される細胞の入手の困難性や倫理的問題の存在のため、普及するには至っていないのが現状である。一方、前記温存再生は、より具体的には、残存する神経細胞から軸索を再生させ、新たなシナプスを形成させることで機能回復を図る方法である。【０００４】
近年、神経変性疾患の予防、治療の目的に神経栄養因子が着目されている。例えば、神経成長因子（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ＮＧＦ）や脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ，ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン（Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）−３、ニューロトロフィン−４／５等が見出されている。これらの神経成長因子は各種神経細胞障害による神経機能障害の治療薬や痴呆症等の予防薬として有望である（例えば、非特許文献１参照）。【０００５】
また、例えば、特許文献１には、アストロサイトーマ、グリア細胞又はシュワン細胞培養培地から得られる分子量６００００±５０００の神経栄養因子及び分子量１２００００±５０００の神経栄養因子が報告されている。かかる特許文献１に記載の神経栄養因子は、神経芽細胞腫増殖抑制活性を示すとともに、神経細胞に対し生存活性又は神経突起伸長作用を有する。さらに、特許文献２には、抗血液凝固活性が低く、神経突起伸長作用を示すグリコサミノグリカン誘導体が報告されている。【０００６】
しかしながら、これらのタンパク質性神経栄養因子や多糖誘導体等は、高分子量の化合物であるため、血液脳関門等の障壁を超えて脳内患部へ栄養因子を到達させることが極めて困難であり、投与方法により、前記タンパク質性神経栄養因子や多糖誘導体等の効果が大きく影響されることが問題となっている。【０００７】
一方、低分子量の神経栄養因子としては、例えば、ミカン科植物から抽出されるポリアルコキシフラボノイドを含有する神経突起伸長剤（特許文献３）、神経細胞増殖作用並びに神経突起伸展作用等の神経細胞成長促進作用を示すシクロヘキセノール誘導体（特許文献４）及びピロリジン誘導体又はピペリジン誘導体を含有する神経突起伸長剤（特許文献５）が報告されている。しかしながら、これらの物質は、いずれも効果が十分でないのが現状である。
【特許文献１】特開平０７−１０１９９０号
【特許文献２】特開平１１−３１０６０２号
【特許文献３】特開２００２−０６０３４０号
【特許文献４】特開２００１−０８９４０４号
【特許文献５】特開２００１−２４７５６９号
【非特許文献１】「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、第３４４巻、第３３９頁〜第３４１頁（１９９０年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、高い神経突起伸長効果を発揮する、新規な神経突起伸長剤、神経変性疾患治療剤又は予防剤、当該疾患の治療用又は予防用の食品又は飲料、神経突起伸長の誘導方法、神経疾患の治療又は予防方法、学習及び／又は記憶能力の向上又は改善方法、神経疾患の治療又は予防のための医薬の製造のための前記糖鎖の使用並びに学習及び／又は記憶能力の向上剤又は改善剤の製造のための前記糖鎖の使用を提供することに関する。１つの側面では、本発明は、神経突起の伸長に基づいて新たな神経ネットワークの形成を促すこと等を可能にする、神経突起伸長誘導剤を提供することに関する。他の側面では、本発明は、神経変性を伴う疾患の症状を改善すること、前記疾患の発症又は進行を抑制すること等を可能にする、神経疾患治療剤又は予防剤を提供することに関する。さらに他の側面では、本発明は、動物個体の学習及び／又は記憶能力を伸ばすこと、種々の要因で低下した個体の学習及び／又は記憶能力の回復を行なうこと等を可能にする、学習及び／又は記憶能力の向上剤又は改善剤を提供することに関する。別の側面では、本発明は、摂取することにより神経疾患の治療又は予防効果、学習及び／又は記憶能力の向上又は改善効果等を得ることができる、食品又は飲料を提供することに関する。さらに別の側面では、本発明は、軸索又は樹状突起に分化する神経突起の生成及び／又は伸長を誘導すること等を可能にする、神経突起伸長の誘導方法を提供することに関する。また、他の側面では、本発明は、神経変性を伴う疾患の症状を改善すること、前記疾患の発症又は進行を抑制すること等を可能にする、神経疾患治療又は予防方法並びに、前記神経疾患治療又は予防方法を行なうに適した医薬の供給、神経疾患の治療又は予防等を可能にする、神経疾患の治療又は予防のための医薬の製造のための規定された糖鎖の使用を提供することに関する。さらに、別の側面では、本発明は、動物個体の学習及び／又は記憶能力を伸ばすこと、種々の要因で低下した個体の学習及び／又は記憶能力の回復を行なうこと等を可能にする、学習及び／又は記憶能力の向上又は改善方法、並びに前記学習及び／又は記憶能力の向上又は改善方法を行なうに適した学習及び／又は記憶能力の向上剤又は改善剤の供給、個体における学習及び／又は記憶能力の向上又は改善等を可能にする、学習及び／又は記憶能力の向上剤又は改善剤の製造のための規定された糖鎖の使用を提供することに関する。なお、本発明の他の課題は、本明細書の記載により導き出される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明の第１の発明は、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖若しくは該複合糖質の誘導体、該糖鎖若しくは該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩、該糖鎖の合成に係る酵素及び該酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１種を有効成分として含有する、神経突起伸長誘導剤に関する。【００１０】
本発明の第２の発明は、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖若しくは該複合糖質の誘導体、該糖鎖若しくは該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩、該糖鎖の合成に係る酵素及び該酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１種を有効成分として含有する、神経疾患の治療剤又は予防剤に関する。前記神経疾患としては、神経変性疾患、痴呆症、脳腫瘍等が例示される。【００１１】
本発明の第３の発明は、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖若しくは該複合糖質の誘導体、該糖鎖若しくは該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩、該糖鎖の合成に係る酵素及び該酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１種を有効成分として含有する、学習及び／又は記憶能力の向上剤又は改善剤に関する。【００１２】
本発明の第４の発明は、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖若しくは該複合糖質の誘導体、該糖鎖若しくは該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩、該糖鎖の合成に係る酵素及び該酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１種を含有する、食品又は飲料に関する。本発明の第４の発明において、食品又は飲料としては、神経変性疾患、痴呆症又は脳腫瘍の治療用若しくは予防用に用いられる食品又は飲料、前記神経変性疾患、痴呆症又は脳腫瘍の治療若しくは予防を補助するための食品又は飲料、学習及び／又は記憶能力の向上用若しくは改善用に用いられる食品又は飲料、学習及び／又は記憶能力の向上若しくは改善を補助するための食品又は飲料等が例示される。【００１３】
本発明の第５の発明は、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖若しくは該複合糖質の誘導体、該糖鎖若しくは該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩、該糖鎖の合成に係る酵素及び該酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１種を検体に投与することを特徴とする神経突起伸長の誘導方法に関する。【００１４】
本発明の第１〜５の発明において、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖としては、下記式（１）：【００１５】
【化１】
2005097155.tif 000002
【００１６】
（式中、Ｒ1は、糖残基を示し、±は、ＧｌｃＮＡｃ残基の有無を意味する）
で表される糖鎖が例示される。【００１７】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕  バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖の誘導体、該複合糖質の誘導体、該糖鎖の薬理学的に許容されうる塩、該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩、該糖鎖の合成に係る酵素及び該酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１種を有効成分として含有してなる、神経突起伸長誘導剤、
〔２〕  バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖が、下記式（１）：【００１８】
【化２】
2005097155.tif 000003
【００１９】
（式中、Ｒ1は、糖残基を示し、±は、ＧｌｃＮＡｃ残基の有無を意味する）
で表される糖鎖である、前記〔１〕記載の神経突起伸長誘導剤、
〔３〕  バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖が、下記式（２）：【００２０】
【化３】
2005097155.tif 000004
【００２１】
〔式中、Ｒ1は、糖残基を示し、Ｒ2及びＲ3は、β１−２結合、β１−４結合又はβ１−６結合を介して、マンノースに結合していてもよいＧｌｃＮＡｃ残基を示す（但し、Ｒ2及びＲ3がＧｌｃＮＡｃ残基を有する場合、１又は２個のＲ2及びＲ3が直接マンノースに結合していてもよい）〕
で表される糖鎖である、前記〔１〕記載の神経突起伸長誘導剤、
〔４〕  バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖の誘導体、該複合糖質の誘導体、該糖鎖の薬理学的に許容されうる塩、該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩、該糖鎖の合成に係る酵素及び該酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１種を有効成分として含有してなる、神経疾患治療剤又は予防剤、
〔５〕  バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖が、下記式（１）：【００２２】
【化４】
2005097155.tif 000005
【００２３】
（式中、Ｒ1は、糖残基を示し、±は、ＧｌｃＮＡｃ残基の有無を意味する）
で表される糖鎖である、前記〔４〕記載の神経疾患治療剤又は予防剤、
〔６〕  バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖が、下記式（２）：【００２４】
【化５】
2005097155.tif 000006
【００２５】
〔式中、Ｒ1は、糖残基を示し、Ｒ2及びＲ3は、β１−２結合、β１−４結合又はβ１−６結合を介して、マンノースに結合していてもよいＧｌｃＮＡｃ残基を示す（但し、Ｒ2及びＲ3がＧｌｃＮＡｃ残基を有する場合、１又は２個のＲ2及びＲ3が直接マンノースに結合していてもよい）〕
で表される糖鎖である、前記〔４〕記載の神経疾患治療剤又は予防剤、
〔７〕  神経変性疾患、痴呆症又は脳腫瘍の治療又は予防に使用される、前記〔４〕〜〔６〕いずれか１項に記載の神経疾患治療剤又は予防剤、
〔８〕  バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖の誘導体、該複合糖質の誘導体、該糖鎖の薬理学的に許容されうる塩、該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩、該糖鎖の合成に係る酵素及び該酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１種を有効成分として含有してなる、学習及び／又は記憶能力の向上剤又は改善剤、
〔９〕  バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖が、下記式（１）： 【００２６】
【化６】
2005097155.tif 000007
【００２７】
（式中、Ｒ1は、糖残基を示し、±は、ＧｌｃＮＡｃ残基の有無を意味する）
で表される糖鎖である、前記〔８〕記載の学習及び／又は記憶能力の向上剤又は改善剤、
〔１０〕  バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖が、下記式（２）：【００２８】
【化７】
2005097155.tif 000008
【００２９】
〔式中、Ｒ1は、糖残基を示し、Ｒ2及びＲ3は、β１−２結合、β１−４結合又はβ１−６結合を介して、マンノースに結合していてもよいＧｌｃＮＡｃ残基を示す（但し、Ｒ2及びＲ3がＧｌｃＮＡｃ残基を有する場合、１又は２個のＲ2及びＲ3が直接マンノースに結合していてもよい）〕
で表される糖鎖である、前記〔８〕記載の学習及び／又は記憶能力の向上剤又は改善剤、
〔１１〕  バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖の誘導体、該複合糖質の誘導体、該糖鎖の薬理学的に許容されうる塩及び該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩からなる群より選ばれた少なくとも１種を含有してなる、食品又は飲料、
〔１２〕  バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖が、下記式（１）：【００３０】
【化８】
2005097155.tif 000009
【００３１】
（式中、Ｒ1は、糖残基を示し、±は、ＧｌｃＮＡｃ残基の有無を意味する）
で表される糖鎖である、前記〔１１〕記載の食品又は飲料、
〔１３〕  バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖が、下記式（２）：【００３２】
【化９】
2005097155.tif 000010
【００３３】
〔式中、Ｒ1は、糖残基を示し、Ｒ2及びＲ3は、β１−２結合、β１−４結合又はβ１−６結合を介して、マンノースに結合していてもよいＧｌｃＮＡｃ残基を示す（但し、Ｒ2及びＲ3がＧｌｃＮＡｃ残基を有する場合、１又は２個のＲ2及びＲ3が直接マンノースに結合していてもよい）〕
で表される糖鎖である、前記〔１１〕記載の食品又は飲料、
〔１４〕  神経変性疾患、痴呆症又は脳腫瘍の治療又は予防に使用される、前記〔１１〕〜〔１３〕いずれか１項に記載の食品又は飲料、
〔１５〕  学習及び／又は記憶能力の改善又は予防に使用される、前記〔１１〕〜〔１３〕いずれか１項に記載の食品又は飲料、
〔１６〕  バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖の誘導体、該複合糖質の誘導体、該糖鎖の薬理学的に許容されうる塩、該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩、該糖鎖の合成に係る酵素及び該酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１種を検体に投与することを特徴とする、神経突起伸長の誘導方法、
〔１７〕  バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖が、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖が、下記式（１）：【００３４】
【化１０】
2005097155.tif 000011
【００３５】
（式中、Ｒ1は、糖残基を示し、±は、ＧｌｃＮＡｃ残基の有無を意味する）
で表される糖鎖である、前記〔１６〕記載の神経突起伸長の誘導方法、
〔１８〕  バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖が、下記式（２）：【００３６】
【化１１】
2005097155.tif 000012
【００３７】
〔式中、Ｒ1は、糖残基を示し、Ｒ2及びＲ3は、β１−２結合、β１−４結合又はβ１−６結合を介して、マンノースに結合していてもよいＧｌｃＮＡｃ残基を示す（但し、Ｒ2及びＲ3がＧｌｃＮＡｃ残基を有する場合、１又は２個のＲ2及びＲ3が直接マンノースに結合していてもよい）〕
で表される糖鎖である、前記〔１６〕記載の神経突起伸長の誘導方法、
〔１９〕  神経疾患を罹患した個体又は該神経疾患に罹患するおそれのある個体に、下記式（２）：【００３８】
【化１２】
2005097155.tif 000013
【００３９】
〔式中、Ｒ1は、糖残基を示し、Ｒ2及びＲ3は、β１−２結合、β１−４結合又はβ１−６結合を介して、マンノースに結合していてもよいＧｌｃＮＡｃ残基を示す（但し、Ｒ2及びＲ3がＧｌｃＮＡｃ残基を有する場合、１又は２個のＲ2及びＲ3が直接マンノースに結合していてもよい）〕
で表されるバイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖の誘導体、該複合糖質の誘導体、該糖鎖の薬理学的に許容されうる塩、該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩、該糖鎖の合成に係る酵素及び該酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１種を投与することを特徴とする、神経疾患治療又は予防方法、
〔２０〕  学習能力の向上又は改善を必要とする個体に、下記式（２）：【００４０】
【化１３】
2005097155.tif 000014
【００４１】
〔式中、Ｒ1は、糖残基を示し、Ｒ2及びＲ3は、β１−２結合、β１−４結合又はβ１−６結合を介して、マンノースに結合していてもよいＧｌｃＮＡｃ残基を示す〕
で表されるバイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖の誘導体、該複合糖質の誘導体、該糖鎖の薬理学的に許容されうる塩、該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩、該糖鎖の合成に係る酵素及び該酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１種を供給することを特徴とする、学習及び／又は記憶能力の向上又は改善方法、
〔２１〕  神経疾患の治療又は予防のための医薬の製造のための、下記式（２）：【００４２】
【化１４】
2005097155.tif 000015
【００４３】
〔式中、Ｒ1は、糖残基を示し、Ｒ2及びＲ3は、β１−２結合、β１−４結合又はβ１−６結合を介して、マンノースに結合していてもよいＧｌｃＮＡｃ残基を示す（但し、Ｒ2及びＲ3がＧｌｃＮＡｃ残基を有する場合、１又は２個のＲ2及びＲ3が直接マンノースに結合していてもよい）〕
で表されるバイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖の誘導体、該複合糖質の誘導体、該糖鎖の薬理学的に許容されうる塩、該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩、該糖鎖の合成に係る酵素及び該酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１種の使用、並びに
〔２２〕  学習及び／又は記憶能力の向上剤又は改善剤の製造のための、下記式（２）：【００４４】
【化１５】
2005097155.tif 000016
【００４５】
〔式中、Ｒ1は、糖残基を示し、Ｒ2及びＲ3は、β１−２結合、β１−４結合又はβ１−６結合を介して、マンノースに結合していてもよいＧｌｃＮＡｃ残基を示す（但し、Ｒ2及びＲ3がＧｌｃＮＡｃ残基を有する場合、１又は２個のＲ2及びＲ3が直接マンノースに結合していてもよい）〕
で表されるバイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖の誘導体、該複合糖質の誘導体、該糖鎖の薬理学的に許容されうる塩、該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩、該糖鎖の合成に係る酵素及び該酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１種の使用、
に関する。
【発明の効果】
【００４６】
本発明によりバイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、複合糖質、それらの誘導体及び／又はそれらの塩を含有する医薬、試薬、食品又は飲料が提供される。すなわち、本発明の神経突起伸長誘導剤によれば、神経突起の伸長に基づいて新たな神経ネットワークの形成を促すことができるという優れた効果を奏する。また、本発明の神経疾患治療剤又は予防剤によれば、神経変性を伴う疾患の症状を改善することができ、また、前記疾患の発症又は進行を抑制することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の学習及び／又は記憶能力の向上剤又は改善剤によれば、動物個体の学習及び／又は記憶能力を伸ばすことができ、また、種々の要因で低下した個体の学習及び／又は記憶能力の回復を行なうことができるという優れた効果を奏する。本発明の食品又は飲料によれば、該食品又は飲料の摂取により神経疾患の治療又は予防効果、学習及び／又は記憶能力の向上又は改善効果が得られるという優れた効果を奏する。さらに本発明の神経突起伸長の誘導方法によれば、軸索又は樹状突起に分化する神経突起の生成及び／又は伸長を誘導することができるという優れた効果を奏する。本発明の神経疾患治療又は予防方法によれば、神経変性を伴う疾患の症状を改善することができ、また、前記疾患の発症又は進行を抑制することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の学習及び／又は記憶能力の向上又は改善方法によれば、動物個体の学習及び／又は記憶能力を伸ばすことができ、また、種々の要因で低下した個体の学習及び／又は記憶能力の回復を行なうことができるという優れた効果を奏する。また、本発明の神経疾患の治療又は予防のための医薬の製造のための規定された糖鎖の使用によれば、前記神経疾患治療又は予防方法を行なうに適した医薬の供給、神経疾患の治療又は予防を可能にするという優れた効果を奏する。さらに、本発明の学習及び／又は記憶能力の向上剤又は改善剤の製造のための規定された糖鎖の使用によれば、前記学習及び／又は記憶能力の向上又は改善方法を行なうに適した学習及び／又は記憶能力の向上剤又は改善剤の供給、個体における学習及び／又は記憶能力の向上又は改善を可能にするという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、Gn(Gn)Gn-bi-GPによる神経突起伸長誘導作用を示す図である。図中、白バーは、神経伸長を示し、黒バーは、細胞伸展を示す。
【００４８】
【図２】図２は、GnT-III遺伝子導入細胞における神経突起伸長を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
本発明は、バイセクティングＧｌｃＮＡｃ（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ  ＧｌｃＮＡｃ）構造を持つ糖鎖、該糖鎖構造を有する複合糖質及び該糖鎖の合成に係る酵素が優れた神経突起伸長作用を示すという本発明者らの驚くべき知見に基づく。【００５０】
本発明は、１つの側面では、神経突起伸長誘導剤に関する。【００５１】
本発明の神経突起伸長誘導剤は、前記バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖若しくは該複合糖質の誘導体、該糖鎖若しくは該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩、該糖鎖の合成に係る酵素及び該酵素をコードする核酸からなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有することを１つの大きな特徴とする。したがって、本発明の神経突起伸長誘導剤によれば、神経突起伸長が望まれる部位等、例えば、神経損傷部位、神経変性が認められる部位等において、高い神経突起伸長誘導効果を得ることができ、神経突起を効率よく伸長させることができるという優れた効果を発揮する。【００５２】
なお、未分化の神経細胞の分化では、まず、神経突起の伸長が起こり、次いで、該神経突起のうちの１本が急速に伸長して、軸索の性質を示すようになり、さらに残りの神経突起が樹状突起としての性質を獲得する。こうして生成した細胞の軸索と樹状突起とが他の細胞との間でシナプスを形成して神経回路が構築される。本発明の神経突起伸長誘導剤によれば、誘導された神経突起から軸索又は樹状突起が生成し、新たな神経ネットワークの形成が促されるという優れた効果を発揮する。さらには、本発明の神経突起伸長誘導剤によれば、神経突起を伸長させることにより、神経細胞の再生、神経変性疾患等の神経疾患の治療、予防等が可能になる。【００５３】
一般に、糖タンパク質の糖鎖は、タンパク質のアスパラギン残基に結合しているＮ−グリコシド結合型糖鎖（本明細書では、「Ｎ−グリカン」ともいう）と、タンパク質のセリン残基又はスレオニン残基の水酸基を介して結合しているＯ−グリコシド結合型糖鎖（「Ｏ−グリカン」ともいう）とに分類される。前記Ｎ−グリカンは、その還元末端糖残基であるＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）がペプチド鎖上のアスパラギンのアミノ基と結合しており、還元末端Ｎ−アセチルグルコサミンのアノメリック水酸基はとれて、〔糖鎖−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨ〕という形の結合状態を形成している。【００５４】
Ｎ−グリカンは、さらに、シアル酸、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン等の糖残基からなる複合型糖鎖（「Ｎ−アセチルラクトサミン型糖鎖」ともいう）、マンノース（Ｍａｎ）とＮ−アセチルグルコサミンとからなるオリゴマンノース型糖鎖、該Ｎ−アセチルラクトサミン型糖鎖とオリゴマンノース型糖鎖とが合わさったような構造をもつ混成型糖鎖（「ハイブリッド型糖鎖」ともいう）の３つに分類されている。【００５５】
本発明におけるバイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖としては、上記の複合型糖鎖又は混成型糖鎖に分類される糖鎖であって、該糖鎖のβマンノース残基の４位の水酸基に結合したＮ−アセチルグルコサミンを有する糖鎖等が挙げられる。【００５６】
本発明に使用できる複合型のバイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖としては、例えば、下記式（１）：【００５７】
【化１６】
2005097155.tif 000017
【００５８】
（式中、Ｒは、糖残基を示し、±は、ＧｌｃＮＡｃ残基の有無を意味する）
に示される糖鎖等が挙げられる。【００５９】
なお、前記式（１）の糖鎖は、言い換えれば、下記式（２）：【００６０】
【化１７】
2005097155.tif 000018
【００６１】
〔式中、Ｒ1は、糖残基を示し、Ｒ2及びＲ3は、β１−２結合、β１−４結合又はβ１−６結合を介して、マンノース（Ｍａｎ）に結合していてもよいＧｌｃＮＡｃ残基を示す（但し、Ｒ2及びＲ3がＧｌｃＮＡｃ残基を有する場合、１〜３個のＲ2及びＲ3が直接マンノース（Ｍａｎ）に結合していてもよい）〕
で表される糖鎖に包含される糖鎖である。【００６２】
具体的には、例えば、下記式（３）：【００６３】
【化１８】
2005097155.tif 000019
【００６４】
〔式中、Ｒ1は、任意の糖残基を示し、Ｒ2は、マンノース（Ｍａｎ）とβ１−６結合又はβ１−４結合を介して結合していてもよいＧｌｃＮＡｃ残基を示し、Ｒ3は、マンノース（Ｍａｎ）とβ１−４結合又はβ１−６結合を介して結合していてもよいＧｌｃＮＡｃ残基を示す〕
で表される糖鎖が挙げられる。【００６５】
前記糖鎖として、より具体的には、例えば、下記式（４）：【００６６】
【化１９】
2005097155.tif 000020
【００６７】
（式中、Ｒ1は、糖残基を示す）
で表されるような２本鎖構造を持つ糖鎖、下記式（５）若しくは（６）：【００６８】
【化２０】
2005097155.tif 000021
【００６９】
（式中、Ｒ1は、糖残基を示す）
若しくは【００７０】
【化２１】
2005097155.tif 000022
【００７１】
（式中、Ｒ1は、糖残基を示す）
で表されるような３本鎖構造を持つ糖鎖、下記式（７）：【００７２】
【化２２】
2005097155.tif 000023
【００７３】
（式中、Ｒ1は、糖残基を示す）
で表されるような４本鎖構造を持つ糖鎖が例示される。なお、本発明においては、酵素的に糖鎖の合成を行なう場合には、製造の容易性の観点から、好適には、２本鎖構造を持つ糖鎖を使用することができる。【００７４】
本発明に用いられる糖鎖としては、上記の複合型糖鎖の他、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する混成型糖鎖も例示される。本発明に用いられるバイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する混成型糖鎖としては、２本鎖構造を有する糖鎖、３本鎖構造を有する糖鎖、４本鎖構造を有する糖鎖等が挙げられる。【００７５】
前記式（１）〜（７）で表される糖鎖中のＲ1として表される糖残基としては、例えば、ＧｌｃＮＡｃ残基、グルコース残基、フコース残基、シアル酸残基、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基、ガラクトース残基、マンノース残基、Ｎ−アセチルマンノサミン残基、キシロース残基等が挙げられる。【００７６】
前記式（２）で表される糖鎖中のＲ2及びＲ3は、ＧｌｃＮＡｃ残基を示す。前記Ｒ2及びＲ3は、マンノース残基と、β１−２結合、β１−４結合又はβ１−６結合を介して、結合していてもよく、前記式（２）で表される糖鎖中に存在しなくてもよい。また、前記式（２）で表される糖鎖中にＲ2が存在する場合、１つのマンノース残基に対して、１又は２個のＲ2が、結合しうる。２個のＲ2が、１つのマンノース残基に対して結合している場合、該２個のＲ2は、互いに異なる結合様式でマンノース残基に結合する。一方、前記式（２）で表される糖鎖中にＲ3が存在する場合、該Ｒ3も、前記Ｒ2と同様に、１つのマンノース残基に対して、１又は２個のＲ3が、結合しうる。また、２個のＲ3が、１つのマンノース残基に対して結合している場合、前記Ｒ2と同様に、該２個のＲ3は、互いに異なる結合様式でマンノース残基に結合する。【００７７】
また、本発明に用いられるバイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖としては、上記式（４）〜（６）で表されるような非還元末端がＮ−アセチルグルコサミンである糖鎖が挙げられるが、本発明における所望の効果を発現するものであれば、これらに限定されるものではない。すなわち、本発明に用いられるバイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖は、該糖鎖の非還元末端側が、ガラクトース、シアル酸、フコース、グルクロン酸、ＧｌｃＮＡｃ、マンノース等でさらに修飾されている糖鎖であってもよい。【００７８】
本発明において、前記バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖を構造中に有する複合糖質とは、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖が任意のタンパク質やペプチドや脂質等に付加されている化合物を示す。すなわち、本発明に用いられるバイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖を構造中に有する複合糖質としては、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質等が例示される。【００７９】
本発明に用いられるバイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖又は該糖鎖を構造中に有する複合糖質（以下、「バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖又は複合糖質」と称する）の製造方法としては、所望の効果を発現する糖鎖又は複合糖質が得られればよく、特に限定されないが、例えば、天然物から得られたバイセクティングＧｌｃＮＡｃを有さない糖鎖や複合糖質に人工的にバイセクティングＧｌｃＮＡｃを導入する方法等が挙げられる。バイセクティングＧｌｃＮＡｃの導入は、特に限定されないが、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（本明細書では、「ＧｎＴ−ＩＩＩ」ともいう）を使用して酵素的に行われうる。【００８０】
以下、ＧｎＴ−ＩＩＩによる酵素的なバイセクティングＧｌｃＮＡｃの導入について詳細に述べる。まず、ＧｎＴ−ＩＩＩの基質となる糖鎖又は複合糖質を取得する。【００８１】
前記基質として用いられる複合糖質として、糖タンパク質を取得する場合は、公知の糖タンパク質の製造方法を用いることができる。例えば、公知の方法により、仔牛血清フェツイン、トランスフェリン、γ−グロブリン等を製造することができる。【００８２】
また、前記基質として用いられる複合糖質として、糖ペプチドを取得する場合は、上述した糖タンパク質をトリプシン、リジルエンドペプチダーゼ、キモトリプシン等のプロテアーゼ等の酵素を用いてタンパク質限定加水分解により分解することによって、糖ペプチドを得ることができる。糖タンパク質をプロテアーゼでタンパク質限定加水分解により分解する際に、透析膜や限外ろ過膜の中で酵素反応を行うことによって、酵素と分解して生じた糖ペプチドを容易に分離することができる。さらに、分解後のペプチド、糖ペプチド混合物から、遠心分離、ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、レクチンアフィニティークロマトグラフィー等の精製手段によって目的の糖ペプチドを精製することができる。【００８３】
また、前記基質として、ほ乳類の卵子、鳥類、魚類等の卵に存在する遊離の糖ペプチドを使用することもできる。この場合は、卵黄部分から、溶媒抽出、遠心分離、ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、レクチンアフィニティークロマトグラフィー等の精製手段によって目的の糖ペプチドを精製することができる。卵からの糖ペプチドを取得する場合の例を以下に述べる。ニワトリ卵黄に等量の水を加えた後、フェノール／水（９：１）混合液を１／１０量添加して良く撹拌する。ついで、得られた混合物を、遠心分離に供して上清を回収する。得られた上清を濃縮後、セファデックスＧ−５０を用いたゲルろ過クロマトグラフィーを行って、フェノール硫酸法による中性糖の呈色反応で陽性となった画分を集める。これにより、２本鎖型の複合型糖鎖を持つ糖ペプチドを得ることができる。このようにして得られる糖ペプチド（配列番号：１）の構造を、下記式（８）に示す。【００８４】
【化２３】
2005097155.tif 000024
【００８５】
また、基質として用いられる糖鎖を取得する場合は、前述の仔牛血清フェツイン、トランスフェリン、γ−グロブリン等の糖タンパク質からヒドラジン分解等の化学的方法やグリコペプチダーゼＡ（アーモンド由来、例えば、生化学工業株式会社製）、グリコペプチダーゼＦ（フラボバクテリウム由来、「ＰＮＧａｓｅ」ともいう。例えば、タカラバイオ株式会社製）等を用いる酵素的手法を用いて、複合型糖鎖を遊離することができる（糖蛋白質糖鎖研究法、生物化学実験法２３、学会出版センター発行、１９８９年）。【００８６】
上記のようにして得られた糖鎖又は複合糖質にＧｎＴ−ＩＩＩを作用させる場合には、通常、これらの非還元末端から、シアル酸、ガラクトース残基又はフコース残基を除去する。非還元末端の糖残基の除去方法には公知の方法を使用すればよく、例えば、シアル酸の除去は、例えば、希塩酸、希硫酸等の無機酸の希薄溶液中で、５０℃から１００℃、１０分から２時間程度、好ましくは、０．０２５〜０．１Ｎの塩酸溶液又は０．０２５〜０．１Ｎの硫酸溶液中で８０℃、１時間加熱することによってシアル酸を遊離させることにより行なわれうる。酵素的な方法で糖残基を除去する場合には、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、フコシダーゼ等の酵素処理によって、シアル酸残基、ガラクトース残基、フコース残基等を除去する。これにより、ＧｎＴ−ＩＩＩの好適な基質となる非還元末端がＧｌｃＮＡｃである糖鎖や複合糖質を得ることができる。【００８７】
ここで用いられるシアリダーゼとして、例えば、アリスロバクター  ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）由来のシアリダーゼ、クロストリジウム  パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）由来のシアリダーゼ等の基質特異性の広い酵素が好適に用いられる。また、ガラクトシダーゼとして、例えば、ナタ豆由来のβ−ガラクトシダーゼ、アスペルギルス  ナイジャー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のβ−ガラクトシダーゼ等の基質特異性の広い酵素が好適に用いられる。フコシダーゼとして、例えば、ストレプトマイセス  スピーシーズ  １４２（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．１４２）株由来のα−フコシダーゼ、ウシ腎臓由来のα−フコシダーゼ等を用いることができる。【００８８】
このようにして得られた非還元末端がＧｌｃＮＡｃである糖鎖や複合糖質に、ＧｎＴ−ＩＩＩをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとともに作用させて、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを酵素的に導入する。この際、所望により、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ（本明細書では、「ＧｎＴ−ＩＶ」ともいう）、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（本明細書では、「ＧｎＴ−Ｖ」ともいう）をＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとともに作用させることにより、３本鎖構造又は４本鎖構造を有する様々な糖鎖又は複合糖質を取得することができる。【００８９】
前記ＧｎＴ−ＩＩＩ、ＧｎＴ−ＩＶ及びＧｎＴ−Ｖとして、特許第２７８９２８３号、特開平６−１９７７５６号、国際公開第９８／２６０５３号パンフレット等に記載の精製酵素が用いられる。【００９０】
また、前記ＧｎＴ−ＩＩＩ、ＧｎＴ−ＩＶ及びＧｎＴ−Ｖとして、ＧｎＴ−ＩＩＩをコードする核酸（遺伝子）、ＧｎＴ−ＩＶをコードする核酸（遺伝子）、ＧｎＴ−Ｖをコードする核酸（遺伝子）でそれぞれ形質転換した動物細胞等から調製された細胞溶解液、粗酵素液又は精製酵素を用いることもできる。例えば、アクチンプロモーター下流に、ＧｎＴ−ＩＩＩ遺伝子、ＧｎＴ−ＩＶ遺伝子又はＧｎＴ−Ｖ遺伝子を連結したコンストラクトを含有し、ネオマイシン耐性遺伝子を持つ動物細胞用発現ベクターを、Ｂ１６メラノーマ細胞、ラット副腎褐色細胞腫由来ＰＣ１２細胞等にエレクトロポレーション法、リポフェクトアミン等によってトランスフェクトし、得られた細胞について、Ｇ４１８耐性を指標として、形質転換細胞をスクリーニングすることによって、ＧｎＴ−ＩＩＩ、ＧｎＴ−ＩＶ又はＧｎＴ−Ｖを発現する細胞が得られる。得られた細胞を超音波処理して、不溶物を遠心分離によって除去した上清を粗酵素液として使用することができる。前記粗酵素液、又は精製酵素を用いた酵素反応により、本発明に用いられる糖鎖化合物やその誘導体を合成した後、得られた酵素反応溶液から、例えば、商品名：セファデックスＧ１５（アマシャム・バイオサイエンス社製）を用いたゲルろ過クロマトグラフィー、商品名：セルロースカートリッジ（タカラバイオ社製）を用いた分離により、糖鎖化合物又はその誘導体を、酵素、糖ヌクレオチド、塩類等から分離精製することができる。【００９１】
本発明においては、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖又は複合糖質としては、例えば、非還元末端がＧｌｃＮＡｃである糖鎖又は複合糖質等が挙げられる。また、本発明においては、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖又は複合糖質は、前記適宜、非還元末端側がフコース、ガラクトース、シアル酸、グルクロン酸、ＧｌｃＮＡｃ、マンノース等で修飾された糖鎖又は複合糖質であってもよい。【００９２】
また、本発明に用いられるバイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖や複合糖質には、上記の酵素反応物のほかに、天然物より取得されたバイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖又は複合糖質等も含まれる。バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖又は複合糖質の選択的な取得方法としては、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖に特異的に結合するレクチン、例えば、インゲンマメレクチン（Ｅ４ＰＨＡ）等を使用する方法が例示される。また、本発明においては、公知の方法により得られたバイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖タンパク質、例えば、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ、γ−グロブリン等を、そのまま用いてもよく、適宜処理を施して得られた糖ペプチド又は糖鎖として用いてもよい。このようにして得られた糖鎖や複合糖質において、その非還元末端側の糖残基は、特に限定されないが、例えば、ＧｌｃＮＡｃ残基、ガラクトース残基、シアル酸残基、フコース残基、マンノース残基等のいずれの糖残基であってもよい。【００９３】
また、本発明に用いられるバイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖又は複合糖質は、合成により製造された糖鎖又は複合糖質であってもよい。【００９４】
本発明においては、神経突起伸長作用を発揮するものであれば、前記バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖又は複合糖質の誘導体を用いることもできる。本発明において、前記誘導体としては、所望の活性、すなわち、神経突起伸長作用が失われない範囲で、前記糖鎖又は複合糖質を修飾して得られた化合物が例示される。前記修飾としては、特に本発明を限定するものではないが、非天然型糖残基の導入、標識化合物又はリガンド類（ビオチン、ヒスチジン−タグ等）の付加、担体への固定化等が例示される。【００９５】
糖鎖の誘導体の場合には、例えば、還元アミノ化反応によってその還元末端とアミノ基を有する化合物とを結合させることによって誘導体を得ることができる。本発明においては、例えば、糖鎖に疎水的な性質を付与するために、脂肪族アミン、スフィンゴシン、フォスファチジルエタノールアミン等を、前記糖鎖の還元末端を介して結合させてもよい。また、複合糖質（糖ペプチド）の誘導体の場合には、例えば、ペプチド部分のリジン残基のアミノ基又はＮ末端アミノ基を利用して、脂肪酸、ビオチン等を結合させることによって、誘導体を得ることができる。【００９６】
本発明に用いられる糖鎖、複合糖質、それらの誘導体等の純度及び構造を確認するためには、糖鎖の場合は還元末端を２−アミノピリジンやピレンヒドラジン等の蛍光物質で標識し、得られた標識物を、ＨＰＬＣ等で分析すること、複合糖質、例えば、糖ペプチドの場合は、ペプチド部分に、ダンシルクロリド、ＦＩＴＣ等の蛍光物質で標識し、得られた標識物を、ＨＰＬＣ等で分析することによって、収量及び純度の確認を行うことができる。なお、このような標識物についても本発明に用いられる誘導体に包含される。また、ＬＣ−ＭＳ分析又はＴＯＦ−ＭＳ分析を行って分子量を求めることによって、本発明に用いられる糖鎖、複合糖質、それらの誘導体の構造を確認することができる。【００９７】
本発明に用いられるバイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、複合糖質及びそれらの誘導体は、安定性及び水への溶解性を向上させるために塩の形態にすることもでき、特に限定されないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、塩化物、炭酸塩等の塩の形態で提供される。前記糖鎖の塩、複合糖質の塩又はそれらの誘導体の塩は、例えば、商品名：ダウエックス５０Ｗ、商品名：ダウエックスＭＲ３（ともにダウ・ケミカル社製）等の一般的な脱塩用イオン交換樹脂を用いて、遊離状態の糖鎖、複合糖質又はそれらの誘導体として得ることができ、また、他の塩に交換することもできる。【００９８】
本発明の神経突起伸長誘導剤による神経突起伸長の誘導効果は、例えば、神経系細胞、好ましくは、例えば、神経芽細胞腫細胞、クロム親和性細胞腫細胞、グリア細胞腫細胞等を、被験対象となる試料の存在下に培養し、得られた細胞を観察することにより評価され、ここで、神経突起を持つ細胞が存在する場合、該試料が、神経突起伸長誘導効果を有することの指標となる。また、同様の手法により、細胞伸展における作用を評価することもできる。【００９９】
前記神経系細胞としては、具体的には、例えば、マウス神経芽細胞腫細胞株であるＮｅｕｒｏ−２ａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１３１）等、ヒト神経芽細胞腫細胞株であるＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１１）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、ラットクロム親和性細胞腫細胞株であるＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１７２１）等、ラットアストログリア細胞腫細胞株であるＣ６細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０７）等が挙げられる。【０１００】
前記神経細胞の培養条件としては、特に限定されないが、１０重量％  ウマ血清と５重量％  ＦＣＳとを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、０．０１重量％  ポリ−Ｌ−リジンコート培養ディッシュに１×１０5個／ディッシュとなるように接種し、５容積％  ＣＯ2存在下、３７℃で培養する条件等が挙げられる。【０１０１】
また、培地中における被験対象の試料の濃度は、適宜設定されうる。【０１０２】
細胞における神経突起の形成は、例えば、位相差顕微鏡等により観察されうる。なお、本発明においては、好ましくは、例えば、３μｍ以上の神経突起を２本以上持つ細胞を「神経突起を持つ細胞」、位相差顕微鏡で観察したときに輝度が低い細胞を「伸展した細胞」として評価される。【０１０３】
また、本発明の神経突起伸長誘導剤について、細胞に対する分化誘導能を評価してもよい。前記分化誘導能は、前記神経系細胞を、被験対象の試料の存在下に培養し、得られた細胞について、細胞の分化の指標となる各種マーカー、例えば、ニューロフィラメントＨ等の発現の有無を測定することにより評価されうる。【０１０４】
本発明に用いられるバイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、複合糖質、それらの誘導体及び／又はそれらの塩（以下、本発明の有効成分と称することがある）は、神経突起伸長活性を有するため、神経突起伸長剤（すなわち、神経突起伸長誘導剤）、ひいては、神経疾患の治療に有効な治療剤又は予防剤並びに学習及び／又は記憶能力の向上剤又は改善剤として使用することができる。前記神経疾患は、神経変性を伴う疾患を意味し、例えば、脳腫瘍（例えば、神経損傷、神経機能の低下を伴う脳腫瘍）；アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、クロイツフェルトヤコブ病、筋萎縮性側索硬化症等の神経変性疾患；痴呆症；脳虚血障害等の疾患等が例示される。【０１０５】
さらに、本発明においては、前記バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖の合成に係る酵素及び当該酵素をコードする核酸を、前記有効成分として使用することもできる。前記酵素としては、特に限定されないが、ＧｎＴ−ＩＩＩ等が例示される。前記ＧｎＴ−ＩＩＩをコードする核酸としては、ラット由来のＧｎＴ−ＩＩＩをコードする核酸〔Journal of Biological Chemistry、第267巻、第18199頁〜第18204頁、1992年〕、ヒト由来のＧｎＴ−ＩＩＩをコードする核酸〔Journal of Biochemistry、第113巻、第692頁〜第698頁、1992年〕等が挙げられる。【０１０６】
前記ＧｎＴ−ＩＩＩによれば、ＧｎＴ−ＩＩＩが投与された細胞において、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖が合成され、それにより、神経突起伸長作用を発現するという優れた効果を発揮する。また、前記ＧｎＴ−ＩＩＩをコードする核酸によれば、ＧｎＴ−ＩＩＩをコードする核酸が投与された細胞において、前記核酸からＧｎＴ−ＩＩＩに翻訳され、該ＧｎＴ−ＩＩＩにより、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖が合成され、それにより、神経突起伸長作用を発現するという優れた効果を発揮する。【０１０７】
したがって、本発明は、他の側面では、神経疾患治療剤又は予防剤、痴呆症治療剤又は予防剤、学習及び／又は記憶能力の向上剤又は改善剤に関する。【０１０８】
また、本発明は、さらに他の側面では、神経疾患治療剤又は予防剤、痴呆症治療剤又は予防剤、学習及び／又は記憶能力の向上剤又は改善剤等の製造のための、前記バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、特に、前記式（２）で表される糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖の誘導体、該複合糖質の誘導体、該糖鎖の薬理学的に許容されうる塩、該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩、該糖鎖の合成に係る酵素及び該酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１種の使用に関する。【０１０９】
前記バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、複合糖質、それらの誘導体及び／又はそれらの塩により、神経突起を伸長させることができるため、個体、例えば、ヒト、非ヒト動物等における神経疾患の治療又は予防、学習及び／又は記憶能力の向上又は改善等が可能になる。【０１１０】
本発明の神経疾患治療剤又は予防剤、痴呆症治療剤又は予防剤、学習及び／又は記憶能力の向上剤又は改善剤は、注射剤、経口剤、軟膏剤等の通常用いられている製剤形態がいずれも使用できるが、好ましくは注射剤として患部へ直接投与される。注射剤として調剤する場合は、本発明の糖鎖誘導体にＰＢＳ等の緩衝液、ｐＨ調製剤、生理食塩水、安定化剤等を添加して、常法により静脈内、皮内、皮下、筋肉内、静脈内投与用注射剤を調製することができる。【０１１１】
本発明の神経突起伸長誘導剤、神経疾患の治療剤又は予防剤、学習及び／又は記憶能力の向上剤又は改善剤が、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖若しくは該複合糖質の誘導体及び該糖鎖若しくは該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩からなる群より選ばれた少なくとも１種を有効成分として含有するものである場合、患者（例えば、体重、年齢、既往歴等）や適応症例によって投与量は異なるが、例えば、注射剤として１回あたり０．００１〜１００ｍｇ程度の有効成分量となるように、投与することが好ましい。【０１１２】
本発明の神経突起伸長誘導剤、神経疾患の治療剤又は予防剤、学習及び／又は記憶能力の向上剤又は改善剤が、ＧｎＴ−ＩＩＩを有効成分として含有するものである場合、細胞への投与は、公知のタンパク質医薬に用いられる方法、例えば、注射剤として、目的の細胞又はその周辺の組織に投与することにより行なわれうる。【０１１３】
本発明の神経突起伸長誘導剤、神経疾患の治療剤又は予防剤、学習及び／又は記憶能力の向上剤又は改善剤が、ＧｎＴ−ＩＩＩをコードする核酸を有効成分として含有するものである場合、細胞への投与は、公知の遺伝子導入方法により行なわれうる。【０１１４】
前記遺伝子導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法；エレクトロポレーション法、リポフェクション法、リポソーム法のような物理化学的方法；アデノウイルス、ＳＶ４０ウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス等のウイルスベクターを使用する方法が挙げられる。物理化学的方法においては、前記核酸を含むＤＮＡ断片、あるいは前記核酸が挿入されたベクター、例えば、プラスミドベクターが、細胞に導入される。継続的な効果が望まれる場合には、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスのような目的遺伝子を染色体に組み込む性質を有するウイルスベクターを使用することが好適である。【０１１５】
なお、生体への本発明の神経突起伸長剤、脳腫瘍・神経変性疾患・痴呆症、がん・悪性腫瘍の治療剤又は予防剤、学習及び／又は記憶能力の向上剤又は改善剤は、有効成分である核酸を含むＤＮＡ断片又は適切なベクターに組み込んだ核酸として、投与が望まれる部位に投与してもよく、また、前記核酸が導入された細胞を投与が望まれる部位に移植してもよい。【０１１６】
ＧｎＴ−ＩＩＩ又はＧｎＴ−ＩＩＩをコードする核酸は、神経突起の伸長が望まれる細胞（標的細胞）の周辺の細胞に投与されれば、標的細胞に投与されなかった場合であってもその周辺の細胞で生成されたバイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖が、標的細胞に対しても神経突起伸長作用を発揮することから、本発明の目的を達成することができる。【０１１７】
本発明の神経疾患治療剤又は予防剤は、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖若しくは該複合糖質の誘導体、該糖鎖若しくは該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩、該糖鎖の合成に係る酵素及び該酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１種を有効成分として含有することに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明の神経疾患治療剤又は予防剤によれば、神経疾患に罹患した個体において、神経突起伸長を誘導し、それにより、神経疾患を治療又は予防することができるという優れた効果を発揮する。【０１１８】
本発明の神経疾患治療剤又は予防剤の薬理評価は、例えば、前記神経突起伸長の誘導効果の評価と同様の手法によるインビトロでの評価法；神経疾患モデル動物を用いた評価法；神経疾患を罹患した個体におけるポジトロンエミッショントモグラフィーによる解析；神経疾患を罹患した個体における脳磁場計測による脳機能計測；神経疾患を罹患した個体における磁気共鳴機能描画による機能解析等により行なわれうる。神経疾患モデル動物を用いた評価法は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル等のモデル動物に、評価対象の薬剤を投与し、モデル動物における疾患に基づく生理学的指標の変化及び／又は生化学的指標の変化を診断すること、解剖学的な検査による疾患部位を観察すること等により行なわれる。ここで、モデル動物において、生理学的指標及び／又は生化学的指標が、神経疾患モデル動物の供給源となる正常動物（すなわち、実質的に神経疾患を罹患していない個体）における生理学的指標及び／又は生化学的指標と同様の状態を示した場合、疾患部位における疾患状態が、前記正常動物における対応部位と同様の状態である場合等が、評価対象の薬剤が、神経疾患の治療又は予防効果を有することの指標となる。また、ポジトロンエミッショントモグラフィーによる解析は、疾患部位において、例えば、神経伝達物質、例えば、ドーパミン、セロトニン、ヒスタミン、ノルアドレナリン、アセチルコリン、オピエート、γアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、グルタミン酸等の代謝回転、再取り込み部位等を解析することにより行なわれうる。ここで、前記代謝回転等が、正常個体における対応部位と同様の状態を示した場合、評価対象の薬剤が、神経疾患の治療又は予防効果を有することの指標となる。【０１１９】
本発明の学習及び／又は記憶能力の向上剤又は改善剤は、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖若しくは該複合糖質の誘導体、該糖鎖若しくは該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩、該糖鎖の合成に係る酵素及び該酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１種を有効成分として含有することに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明の学習及び／又は記憶能力の向上剤又は改善剤によれば、学習及び／又は記憶能力の向上又は改善を必要とする個体において、神経突起伸長を誘導し、それにより、学習及び／又は記憶能力を向上又は改善させることができる。【０１２０】
なお、本明細書において、「学習及び／又は記憶能力の向上」とは、正常個体、例えば、ヒト、非ヒト動物等により日常的に発揮される学習及び／又は記憶能力のレベルを、実質的に増加させることを意味する。また、「学習及び／又は記憶能力の改善」とは、神経疾患、脳虚血障害、外傷等により、学習及び／又は記憶能力を実質的に喪失した個体又は学習及び／又は記憶能力が低下した個体において、学習及び／又は記憶能力のレベルを、実質的に増加させることを意味する。【０１２１】
本発明の学習及び／又は記憶能力の向上剤又は改善剤の薬理評価は、例えば、正常動物、学習及び／又は記憶能力の低いモデル動物等を用いた評価法、学習能力試験、記憶能力試験等により行なわれうる。前記正常動物、モデル動物等を用いた評価法は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル等の動物に、被験対象の薬剤を投与し、ゴール地点にエサを置いた迷路を抜け出す時間を数回測定すること等により行なわれうる。ここで、被験対象の薬剤を投与しない正常動物に比べ、該被験対象の薬剤を投与した正常動物において、スタート地点からエサを置いたゴール地点までに要する時間の短縮がより大きい場合等が、該被験対象の薬剤が、学習及び／又は記憶能力の向上を示すことの指標となる。また、被験対象の薬剤を投与する前のモデル動物に比べ、被験対象の薬剤を投与したモデル動物において、スタート地点からエサを置いたゴール地点までに要する時間が、より短縮された場合等が、該被験対象の薬剤が、学習及び／又は記憶能力の向上を示すことの指標となる。【０１２２】
本発明は、他の側面では、神経突起伸長の誘導方法に関する。【０１２３】
本発明の神経突起伸長の誘導方法は、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖の誘導体、該複合糖質の誘導体、該糖鎖の薬理学的に許容されうる塩、該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩、該糖鎖の合成に係る酵素及び該酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１種を検体に投与することを１つの特徴とする。【０１２４】
前記検体としては、例えば、培養細胞、神経組織、動物個体等が挙げられる。前記動物個体としては、ヒト、非ヒト動物等が挙げられる。【０１２５】
本発明の誘導方法による神経突起伸長の誘導効果は、前記神経突起伸長誘導剤による神経突起伸長誘導効果の評価と同様の手法により評価されうる。【０１２６】
本発明の誘導方法において、投与は、前記神経疾患治療剤又は予防剤等の場合と同様の手法により行われうる。なお、本発明の誘導方法においては、本発明の神経突起伸長誘導剤を用いてもよい。【０１２７】
本発明の誘導方法により神経突起の伸長が起こった培養細胞（例えば、神経系の細胞、神経前駆細胞）や神経組織は、神経疾患の治療を目的とした移植に使用されうる。【０１２８】
本発明は、別の側面では、神経疾患治療又は予防方法に関する。【０１２９】
本発明の神経疾患治療又は予防方法は、神経疾患を罹患した個体又は該神経疾患に罹患するおそれのある個体に、前記バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、特に、前記式（２）で表されるバイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖の誘導体、該複合糖質の誘導体、該糖鎖の薬理学的に許容されうる塩、該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩、該糖鎖の合成に係る酵素及び該酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１種を投与することを１つの特徴とする。【０１３０】
前記個体としては、ヒト、非ヒト動物等が挙げられる。【０１３１】
本発明の神経疾患治療又は予防方法による治療又は予防効果は、本発明の神経疾患治療剤又は予防剤の薬理評価と同様の手法により評価されうる。【０１３２】
また、本発明の神経疾患治療又は予防方法において、投与は、本発明の神経疾患治療剤又は予防剤等の場合と同様の手法により行われうる。なお、本発明の神経疾患治療又は予防方法においては、本発明の神経疾患治療剤又は予防剤を用いてもよい。【０１３３】
本発明は、さらに他の側面では、学習及び／又は記憶能力の向上又は改善方法に関する。【０１３４】
本発明の学習及び／又は記憶能力の向上又は改善方法は、学習能力の向上又は改善を必要とする個体に、前記バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、特に、前記式（２）で表されるバイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖の誘導体、該複合糖質の誘導体、該糖鎖の薬理学的に許容されうる塩、該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩、該糖鎖の合成に係る酵素及び該酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１種を供給することを１つの大きな特徴とする。【０１３５】
前記学習能力の向上又は改善を必要とする個体としては、正常個体、例えば、ヒト、非ヒト動物等；神経疾患、脳虚血障害、外傷等により、学習及び／又は記憶能力を実質的に喪失した個体；神経疾患、脳虚血障害、外傷等により、学習及び／又は記憶能力が低下した個体等が挙げられる。【０１３６】
本発明の学習及び／又は記憶能力の向上又は改善方法による学習及び／又は記憶能力の向上又は改善効果は、前記学習及び／又は記憶能力の向上剤又は改善剤の薬理評価と同様の手法により評価されうる。【０１３７】
また、本発明の学習及び／又は記憶能力の向上又は改善方法において、投与は、本発明の神経疾患治療剤又は予防剤等の場合と同様の手法により行われうる。なお、本発明の学習及び／又は記憶能力の向上又は改善方法においては、本発明の学習及び／又は記憶能力の向上剤又は改善剤が用いられうる。【０１３８】
また、本発明は、別の側面では、食品又は飲料に関する。【０１３９】
本発明の食品又は飲料は、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、該糖鎖を構造中に有する複合糖質、該糖鎖の誘導体、該複合糖質の誘導体、該糖鎖の薬理学的に許容されうる塩及び該複合糖質の薬理学的に許容されうる塩からなる群より選ばれた少なくとも１種（前記有効成分）を含有することに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明の食品又は飲料は、その神経突起伸長作用により、上記の疾患の症状改善、予防に極めて有用である。さらに、前記の食品又は飲料は、上記の疾患の症状改善、予防を目的であることを表示した機能性食品又は機能性飲料（例えば、特定保健用食品）とすることもできる。【０１４０】
本発明の食品又は飲料は、前記有効成分を含有しているため、神経変性疾患、痴呆症又は脳腫瘍の治療又は予防に使用することができる。さらに、本発明の食品又は飲料は、前記有効成分を含有しているため、学習及び／又は記憶能力の改善又は予防に使用することができる。なお、本発明の食品又は飲料には、神経変性疾患、痴呆症又は脳腫瘍の治療若しくは予防を補助するための食品又は飲料並びに、学習及び／又は記憶能力の改善若しくは予防を補助するための食品又は飲料も含まれる。【０１４１】
ここで、本発明の食品又は飲料について用いられる「含有」の語は、「添加」及び／又は「希釈」の意味を包含する。【０１４２】
なお、本明細書において、本発明の食品又は飲料について用いられる前記「含有」とは、食品又は飲料中に本発明で用いられる前記有効成分が含まれるという態様を、前記「添加」とは、食品又は飲料の原料に、本発明で用いられる前記有効成分を添加するという態様を、前記「希釈」とは、本発明で用いられる前記有効成分に、食品又は飲料の原料を添加するという態様をいう。【０１４３】
本発明の食品又は飲料の製造法には、特に限定されるものではない。例えば、配合、調理、加工等は一般の食品又は飲料の製造法に従えばよく、それらの製造法により製造することができ、得られた食品又は飲料に前記有効成分が含有されていればよい。【０１４４】
本発明の食品又は飲料としては、前記有効成分を含有しているものであればよく、特に限定されないが、例えば、穀物加工品（小麦粉加工品、デンプン類加工品、プレミックス加工品、麺類、マカロニ類、パン類、あん類、そば類、麩、ビーフン、はるさめ、包装餅等）、油脂加工品（可塑性油脂、てんぷら油、サラダ油、マヨネーズ類、ドレッシング等）、大豆加工品（豆腐類、味噌、納豆等）、食肉加工品（ハム、ベーコン、プレスハム、ソーセージ等）、水産製品（冷凍すり身、かまぼこ、ちくわ、はんぺん、さつま揚げ、つみれ、すじ、魚肉ハム、ソーセージ、かつお節、魚卵加工品、水産缶詰、つくだ煮等）、乳製品（原料乳、クリーム、ヨーグルト、バター、チーズ、練乳、粉乳、アイスクリーム等）、野菜・果実加工品（ペースト類、ジャム類、漬け物類、果実飲料、野菜飲料、ミックス飲料等）、菓子類（ガム、飴、チョコレート、ビスケット類、菓子パン類、ケーキ、餅菓子、米菓類等）、アルコール飲料（日本酒、中国酒、ワイン、ウイスキー、焼酎、ウオッカ、ブランデー、ジン、ラム酒、ビール、清涼アルコール飲料、果実酒、リキュール等）、嗜好飲料（緑茶、紅茶、ウーロン茶、コーヒー、清涼飲料、乳酸飲料等）、調味料（しょうゆ、ソース、酢、みりん等）、缶詰・瓶詰め・袋詰め食品（牛飯、釜飯、赤飯、カレー、その他の各種調理済み食品）、半乾燥又は濃縮食品（レバーペースト、その他のスプレッド、そば・うどんの汁、濃縮スープ類）、乾燥食品（即席麺類、即席カレー、インスタントコーヒー、粉末ジュース、粉末スープ、即席味噌汁、調理済み食品、調理済み飲料、調理済みスープ等）、冷凍食品（すき焼き、茶碗蒸し、うなぎかば焼き、ハンバーグステーキ、シュウマイ、餃子、各種スティック、フルーツカクテル等）、固形食品、液体食品（スープ等）、香辛料類等の農産・林産加工品、畜産加工品、水産加工品等が挙げられる。【０１４５】
本発明の食品又は飲料は、前記有効成分を、単独又は複数種を混合して、含有、添加及び／又は希釈されており、神経突起伸長作用を発現するための必要量が含まれていればよく、タブレット状、顆粒状、カプセル状等の形状の経口的に摂取可能な形状物も包含する。【０１４６】
本発明の食品又は飲料中の前記有効成分の含有量は、その機能及び神経突起伸長活性の観点から適宜選択できるが、例えば、本発明の食品又は飲料中、０．０１重量％以上、好ましくは、０．１重量％以上、より好ましくは、１重量％以上であり、１０重量％以下、より好ましくは、５重量％以下であることが望ましい。なお、前記含有量は、前記範囲で任意に選択できる。また、本発明の食品又は飲料は、好ましくはそれらに含有される有効成分が、ヒト（例えば、成人）１日当り０．００００１ｍｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．００１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の摂取量となるように摂取されればよい。かかる摂取量は、種々の条件によって変動する場合があり、上記摂取量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。【０１４７】
本発明の食品又は飲料の評価は、例えば、本発明の神経疾患治療剤又は予防剤の薬理評価に用いられる神経疾患モデル動物を用いた評価法等により実施することができる。【０１４８】
ところで、ＧｎＴ−Ｖの作用により生成されるものであり、ＧｌｃＮＡｃ残基を非還元末端に持つ３本鎖構造又は４本鎖構造を有する糖鎖や前記糖鎖を有する複合糖質は、下記実施例に記載された創傷閉鎖の抑制から明らかなように細胞の移動、運動の阻害活性を有することから、ガン細胞の浸潤や転移を阻害することによる悪性腫瘍の治療に有効な治療剤又は転移阻害剤として使用することができる。前記の悪性腫瘍の治療剤又は転移阻害剤は、本発明の神経疾患治療剤又は予防剤に準じて製造することができる。【０１４９】
以下の実施例等により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。
【実施例１】
【０１５０】
Gn(Gn)Gn-bi-糖ペプチドの製造
（１）ニワトリ卵黄からのシアリル糖ペプチド（ＳＧＰ）の調製
１Ｌ（５０個分）の白色レグホン新鮮卵黄に等量の水を加えた。得られた卵黄希釈液に、１／１０量のフェノール／水（９：１、重量比）を加え、２時間激しく攪拌した。７０００×ｇ（６０００ｒｐｍ）、３０分間遠心分離を行い、上清を得た。ロータリーエバポレーターで、前記上清を６ｍＬまで濃縮し、不要物を除去した。得られた産物を、商品名：Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０（アマシャムバイオサイエンス社製）カラム（２．５ｃｍ×１００ｃｍ）を用いたゲルろ過に供した。このとき、０．１Ｍ  ＮａＣｌを溶離液として用いた。溶出されてきた画分に含まれる糖を、フェノール硫酸法（日本生化学会編、新生化学実験講座第３巻、糖質Ｉ、糖タンパク質（上）、第１４３頁、１９９０年、東京化学同人発行）により測定し、２番目に溶出されてくる主要な糖陽性画分を集めた。ロータリーエバポレーターを用いて、前記糖陽性画分を５ｍＬまで濃縮した。得られた産物を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（アマシャムバイオサイエンス社製）カラム（２．５ｃｍ×５２ｃｍ）を用いて、脱塩した。このとき、５容積％  エタノールを溶離液として用いた。フェノール硫酸法により、各画分の糖含量を測定して糖陽性画分を集めた。得られた産物を、ロータリーエバポレーターで５ｍＬまで濃縮し、濃縮液を得た。５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化した商品名：ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＤＥＡＥ−６５０Ｍ（東ソー株式会社製、商品番号：０７４７３）カラム（３．０ｃｍ×２４ｃｍ）に前記濃縮液を負荷し、素通り画分を集めた。ロータリーエバポレーターを用いて、前記素通り画分を５ｍＬまで濃縮した。得られた産物を、商品名：Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムを用いて脱塩し、凍結乾燥させ、ＳＧＰを得た。【０１５１】
（２）酵素処理による、ＳＧＰからのシアル酸とガラクトースの除去
実施例１−（１）で得られたＳＧＰを、１７０μｍｏｌ／１．５ｍＬとなるように水に溶解させた。得られた溶液に、４５  ｍｇの粉末ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（商品名、ＰＩＥＲＣＥ社製、商品番号：２１２１７）を添加し、速やかに激しく攪拌し、その後、室温で１時間振盪した。得られた混合物を、遠心濃縮機を用いて０．５ｍＬまで濃縮した。得られた濃縮物に、２．４ｍＬの１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）と３Ｕ／３００μＬのノイラミニダーゼ（ナカライテスク社製、商品番号：２４２２９−７４）を加えて３７℃で２４時間反応させた。得られた産物に、３Ｕ／７０μＬのβ−ガラクトシダーゼ（生化学工業株式会社製、商品番号：１００５７０）を添加し、さらに２４時間反応させた。反応後、得られた反応物を９８℃で５分間加熱し、酵素を失活させ、１３０００×ｇ（１４０００ｒｐｍ）、１０分間遠心分離した。得られた上清を、遠心濃縮機を用いて４００μＬまで濃縮した。得られた産物を、商品名：ＰＤ−１０脱塩カラム（アマシャムバイオサイエンス社製、商品番号：１７−０８５１−０１）に供して、脱塩し、さらに、セルロースカートリッジカラム（タカラバイオ株式会社製、商品番号：４４０４）に負荷して、精製し、粗精製ビオチン化Gn.Gn-bi-糖ペプチド（以下、「粗精製Gn.Gn-bi-GP」）を得た。Gn.Gn-bi-GP（配列番号：１）の構造を、下記式（９）に示す。【０１５２】
【化２４】
2005097155.tif 000025
【０１５３】
（３）ＧｎＴ−ＩＩＩによるバイセクティングＧｌｃＮＡｃ残基の導入
ラットＧｎＴ−ＩＩＩ  ｃＤＮＡ〔ニシカワ（Nishikawa, A.）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２６７巻、第１８１９９頁〜第１８２０４頁、１９９２年〕をｐＣＸＮＩＩ〔ニワ（Ｎｉｗａ）ら、Ｇｅｎｅ、第１５巻、第１９３頁〜第１９９頁、１９９１年〕のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングしてプラスミドｐＣＸＮＩＩ／ＧｎＴ−ＩＩＩを構築した。【０１５４】
商品名：リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社製、商品番号：１１６６８−０１９）を用いて、ラット副腎褐色細胞腫細胞株ＰＣ１２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７２１）に、前記ｐＣＸＮＩＩ／ＧｎＴ−ＩＩＩをトランスフェクトし、１０重量％  ウマ血清と５重量％  ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）と１ｍｇ／ｍＬ  Ｇ４１８とを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、５容積％  ＣＯ2、３７℃で培養した。培養２週間後にコロニーを単離し、限界希釈法により再クローニングを行って、ＰＣ１２（ＧｎＴ−ＩＩＩ）細胞を得た。同様の方法で、ＰＣ１２細胞に前記ｐＣＸＮＩＩをトランスフェクトし、クローン化して、ＰＣ１２（ｍｏｃｋ）細胞を得た。得られたＰＣ１２（ＧｎＴ−ＩＩＩ）細胞を、３枚のコラーゲンコート１０ｃｍディッシュ（旭テクノグラス社製、商品番号：４０２０−０１０）上、１０重量％  ウマ血清と５重量％  ＦＣＳとを含有するＤＭＥＭ中で５容積％  ＣＯ2存在下、３７℃でコンフルエントになるまで培養した。【０１５５】
培養終了後、培地を捨ててリン酸緩衝食塩水〔ＰＢＳ（−）〕で洗浄した。セルスクレーパーを用いて細胞をディッシュから剥離させ、１５００×ｇ（５０００ｒｐｍ）で５分間遠心分離して、細胞を回収した。上清を捨て、得られた細胞に、１０μｇ／ｍＬ  ロイペプチンと１０μｇ／ｍＬ  アプロチニンと１ｍＭ  フッ化フェニルメチルスルホニルとを含むＰＢＳ（−）  ２００μＬを添加し、ピペッティングにより細胞を懸濁した。この細胞懸濁液を超音波処理に供し、得られた産物を、７００×ｇ、１０分間遠心分離して、約２００μＬの上清を得た。得られた上清を、ＧｎＴ−ＩＩＩ粗酵素液として用いた。【０１５６】
１００μＬのＧｎＴ−ＩＩＩ粗酵素液と、２００μＬの２×緩衝液〔組成：２５０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．２５）、２０ｍＭ  ＭｎＣｌ2、４００ｍＭ  Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、１．０％（Ｖ／Ｖ）  ＴｒｉｔｏｎTM  Ｘ−１００〕と、４０μＬの５００ｍＭ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと、５０μＬの実施例１−（２）で調製した０．８２５μｍｏｌ／５０μＬ  粗精製Gn.Gn-bi-GP水溶液と、１０μＬの水とを混合し、３７℃で２４時間反応させた。反応後、９８℃で５分間加熱して酵素を失活させ、１３０００×ｇ（１４０００ｒｐｍ）、１０分間遠心分離して上清を得た。商品名：ＰＤ−１０カラムを用いて上清を脱塩し、セルロースカートリッジカラムを用いて精製し、減圧下濃縮、乾固した。得られた産物を、２００μＬの水に溶解して、粗精製Gn(Gn)Gn-bi-糖ペプチドを含む試料Ａを得た。試料A中の糖ペプチド濃度をフェノール硫酸法で測定したところ、４．１ｍＭであった。Gn(Gn)Gn-bi-糖ペプチド（配列番号：１）の構造を下記式（１０）に示す。【０１５７】
【化２５】
2005097155.tif 000026
【０１５８】
（４）試料Ａの糖鎖構造解析
以下の方法で試料Ａの糖鎖構造を解析した。試料Ａを水で１００倍希釈したもの  １μＬに、０．５μＬの０．５Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）と、０．５μＬの１０容積％  Ｎｏｎｉｄｅｔ（商品名）  Ｐ／４０（ＮＰ−４０、メルク社製、商品番号：ＢＤＨ５６００９２Ｌ）と、０．５μＬの５００Ｕ／μＬペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦ〔ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）社製、商品番号：Ｐ０７０４Ｓ〕と、２．５μＬの水とを加え、３７℃で２４時間反応させた。得られた反応液を５分間煮沸し、１３０００×ｇ（１４０００ｒｐｍ）、５分間の遠心分離によって上清を得た。【０１５９】
前記上清の全量のピリジルアミノ（ＰＡ）化を、商品名：ＧｌｙｃｏＴＡＧ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製、商品番号：ＧＴ５００）を用いて行った。ＰＡ化された糖鎖を、４５μＬの水に溶解し、そのうち２０μＬをＨＰＬＣにより分析した。前記ＨＰＬＣにおいて、カラムとして、商品名：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０ＴM（４．６×１５０ｍｍ、東ソー株式会社製、商品番号：０８１４８）、溶離液として、０．２容積％  １−ブタノール含有２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．０）を用い、カラム温度は、５０℃、流速は１．０ｍｌ／分に設定した。検出には蛍光検出器を用い、励起波長を３２０ｎｍ、検出波長を４００ｎｍに設定した。この条件でPA-Gn.Gn-bi-糖鎖は、７．１分に、PA-Gn(Gn)Gn-bi-糖鎖は、１３．０分に溶出された。【０１６０】
この結果、粗精製Gn.Gn-bi-GPからはPA-Gn(Gn)Gn-bi-糖鎖が検出されなかったのに対して、試料Ａからは１５％のPA-Gn(Gn)Gn-bi-糖鎖が検出された。
【実施例２】
【０１６１】
Gn.Gn.Gn-tri'-糖ペプチドの製造
（１）ビオチン化Gn.Gn-bi-糖ペプチドへのβ１，６−ＧｌｃＮＡｃ残基の導入
グらの方法〔グ（Ｇｕ，Ｊ．）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１１３巻、第６１４頁〜第６１９頁、１９９３年〕に従い、ヒト肺小細胞癌細胞株ＱＧからＧｎＴ−Ｖを精製した。得られたＧｎＴ−Ｖを用いて、粗精製Gn.Gn-bi-GPに対して実施例１−（３）と同様の反応を行い、試料Ｂを得た。なお、ＧｎＴ−Ｖを用いた反応の際、緩衝液として、２×緩衝液〔組成：２５０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．２５）、４００ｍＭ  ＧｌｃＮＡｃ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ・３Ｎａ、１．０容積％  ＴｒｉｔｏｎTMＸ−１００〕を用いた。【０１６２】
生成物であるGn.Gn.Gn-tri'-糖ペプチド（配列番号：１）の構造を下記式（１１）に示す。【０１６３】
【化２６】
2005097155.tif 000027
【０１６４】
（２）試料Ｂの糖鎖構造解析
実施例１−（３）と同じ条件下で、試料ＢのＰＮＧａｓｅ  Ｆ処理、ＰＡ化及びＨＰＬＣによる分析を行った。この条件でPA-Gn.Gn-bi-糖鎖は7.1分に、PA-Gn.Gn.Gn-tri'-糖鎖は5.2分に溶出された。【０１６５】
この結果、粗精製Gn.Gn-bi-GPからはPA-Gn.Gn.Gn-tri'-糖鎖が検出されなかったのに対して、試料Ｂからは６３％のPA-Gn.Gn.Gn-tri'-糖鎖が検出された。
【実施例３】
【０１６６】
Gn(Gn)Gn-bi-糖ペプチド及びGn.Gn.Gn-tri'-糖ペプチドによる神経突起形成と細胞伸展
（１）Gn(Gn)Gn-bi-糖ペプチド及びGn.Gn.Gn-tri'-糖ペプチドによるＮｅｕｒｏ−２ａ細胞の神経突起形成と細胞伸展
実施例１−（３）の方法で調製した２００μＬのＧｎＴ−ＩＩＩ粗酵素液を９８℃で５分間の熱処理し、１３０００×ｇ（１４０００ｒｐｍ）で１０分間遠心分離して上清を得た。得られた上清を、セルロースカートリッジカラム（タカラバイオ株式会社製、商品番号：４４０４）に負荷して、溶出画分を得た。この画分を遠心濃縮乾固し、２００μＬの水に溶解して試料Ｃを得た。【０１６７】
ＰＣ１２（ｍｏｃｋ）細胞から同様の方法により試料Ｄを得た。【０１６８】
マウス神経芽細胞腫細胞株Ｎｅｕｒｏ−２ａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１３１）を、１０重量％  ウマ血清と５重量％  ＦＣＳとを含有するＤＭＥＭに懸濁し、０．０１％  ポリ−Ｌ−リジン〔シグマ（ＳＩＧＭＡ）社製、商品番号：Ｐ４８３２〕でコートした３５ｍｍガラス底培養ディッシュ〔マットテック（ＭａｔＴｅｋ）社製、商品番号：Ｐ３５Ｇ−０−１０−Ｃ〕に１×１０5個／ディッシュとなるように接種し、５容積％  ＣＯ2存在下、３７℃で１晩培養した。【０１６９】
培地を吸引除去した後、試料Ａ、試料Ｃ又は試料Ｄを１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ含有ＰＢＳ（−）で１００倍希釈して得られた希釈試料  １００μＬをディッシュのくぼみ部分に添加し、３７℃で９０分インキュベートした。その後、細胞を、３．７容積％  ホルマリン含有ＰＢＳ（−）で固定した。固定された細胞を、位相差顕微鏡（カールツァイス社製、商品名：Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ）で観察し、神経突起を持つ細胞の比率と伸展した細胞の比率とを計算した。なお、ここでは３μｍ以上の神経突起を２本以上持つ細胞を「神経突起を持つ細胞」、位相差顕微鏡で観察したときに輝度が低い細胞を「伸展した細胞」とした。【０１７０】
結果を図１に示す。図１は、神経突起を持つ細胞数及び伸展した細胞数それぞれの、全細胞数に対する比率を示す図であり、３視野の平均と標準偏差を表す。試料Ａ添加区では、ほとんどの細胞が神経突起の伸長及び細胞伸展を示した。これに対して、試料Ｃ添加区では、若干の神経突起形成は認められたが、細胞伸展は見られず、試料Ｄ添加区では、神経突起の形成及び細胞伸展は、ほとんど見られなかった。【０１７１】
被検試料として、粗精製Gn.Gn-bi-GP、試料Ａ及び試料Ｂを用い、上記と同様に、細胞をインキュベートし、被検試料添加後９０分にホルマリン固定を行った。ホルマリン固定後、ＰＢＳ（−）で洗浄した。ついで、Ａｌｅｘａ  ５４６−ファロイジンによりアクチンを染色し、共焦点レーザー顕微鏡（カールツァイス社製、商品番号：ＬＳＭ  ５  Ｐａｓｃａｌ）による観察も行った。【０１７２】
この結果、粗精製Gn.Gn-bi-GP添加区では大部分の細胞が球状で神経突起がほとんど見られなかったのに対して、Gn(Gn)Gn-bi-GPを含む試料Ａ添加区では大部分の細胞が数多くの神経突起を形成し、細胞伸展を示した。また、Gn.Gn.Gn-tri'-GPを含む試料Ｂ添加区では大部分の細胞が球形で神経突起の形成はほとんど見られなかったが、葉状仮足様のアクチン細胞骨格再編が見られた。【０１７３】
（２）Gn(Gn)Gn-bi-糖ペプチドによるＮｅｕｒｏ−２ａ細胞の分化誘導
Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞を、実施例３−（１）と同様に培養した後、培地を除去し、ＤＭＥＭで１００倍希釈した試料Ａ、ＤＭＥＭ又は１０重量％  ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ  ２ｍＬを添加して５容積％  ＣＯ2存在下、３７℃で３６時間培養した。培地を除去し、４重量％  パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳで１．５分間細胞を固定した。ついで、１重量％  ＴｒｉｔｏｎTMＸ−１００含有５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）中、室温で１５分間緩やかに振盪した。４重量％  パラホルムアルデヒドにより、４℃で３０分間、細胞を再度固定した。細胞をＰＢＳで洗浄し、５０ｍＭ  ＮＨ4Ｃｌ中３０分間インキュベートした。次に、前記細胞を、２重量％  ウシ血清アルブミンと０．１重量％  ＴｒｉｔｏｎTMＸ−１００とを含むＰＢＳで２０００倍希釈した抗リン酸化ニューロフィラメントＨ（ＮＦ−Ｈ）マウスモノクローナル抗体ＳＭＩ−３１〔シュテルンベルガーモノクローナルズ（Sternberger Monoclonals）社製、商品番号：ＳＭＩ−３１〕中、４℃で１晩インキュベートした。さらに、得られた細胞を、１０重量％  ヤギ血清含有ＰＢＳ中、室温で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで３００倍希釈したＡｌｅｘａ  ５４６標識ヤギ抗マウスＩｇＧ中、室温で２時間インキュベートした。なお、インキュベーション毎にＰＢＳで２〜３回洗浄した。インキュベーション後の細胞を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。【０１７４】
この結果、１０重量％  ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ添加区では神経突起の形成は、ほとんど観察されず、ＤＭＥＭ添加区ではＮＦ−Ｈ陽性神経突起が一部の細胞で観察された。試料Ａ添加区ではＤＭＥＭ添加区に比べてより多くのＮＦ−Ｈ陽性神経突起が観察された。【０１７５】
（３）Gn(Gn)Gn-bi-糖ペプチドによるＴ９８Ｇ細胞の伸展
ヒトグリオーマ細胞Ｔ９８Ｇ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６９０）を用いて、実施例３−（１）と同様の実験を行った。但し、被検試料として粗精製Gn.Gn-bi-GP、試料Ａ及び試料Ｂを使用し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ含有ＰＢＳ（−）による希釈は、５０倍とした。試料添加からホルマリン固定までの時間は９０分とし、位相差顕微鏡による観察とＡｌｅｘａ  ５４６−ファロイジン（インビトロジェン社製）染色によるアクチンの観察を行った。【０１７６】
この結果、粗精製Gn.Gn-bi-GP添加区と試料Ｂ添加区では細胞伸展が阻害されて球形であったのに対して、試料A添加区では大部分の細胞が伸展し、ストレスファイバーを顕著に形成した。
【実施例４】
【０１７７】
Gn.Gn.Gn-tri'-糖ペプチドによるＴ９８Ｇの運動能の抑制
１ウェルあたり０．５×１０6個のＴ９８Ｇ細胞を２４穴プレートに播種し、１０重量％  ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中、５容積％  ＣＯ2存在下、３７℃で１晩培養した。ブルーチップを用いてウェルの中央部に線を引いて細胞層に約１２０μｍ幅の傷をつけ、注意深く培地を除去した。１％  ＦＣＳ含有ＤＭＥＭで洗浄したあと、２５０μＬの上記培地、上記培地で５００倍希釈した粗精製Ｇｎ．Ｇｎ−ｂｉ−ＧＰ又は上記培地で５００倍希釈した試料Ｂを添加した。２４時間培養後、４．０容積％  パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳ（−）で固定し、位相差顕微鏡で観察した。【０１７８】
この結果、培地のみを添加した場合には、創傷閉鎖（wound closure）が亢進されていた（細胞層の傷が細胞でほぼ埋めつくされていた）のに対し、粗精製Gn.Gn-bi-GP添加区では創傷閉鎖が抑制されており、Gn.Gn.Gn-tri'-糖ペプチドを含む試料Ｂ添加区ではさらに抑制されていた。
【実施例５】
【０１７９】
ＧｎＴ−ＩＩＩ遺伝子の導入による神経突起伸長の亢進
ラットＧｎＴ−ＩＩＩ  ｃＤＮＡ〔ニシカワ（Nishikawa, A.）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２６７巻、第１８１９９頁〜第１８２０４頁、１９９２年〕をプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）に連結した。得られたプラスミドを、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社製）を用いてＮｅｕｒｏ−２Ａ細胞に導入した。その後、Ｇ４１８耐性を指標として形質転換細胞を選択し、ＧｎＴ−ＩＩＩを安定的に過剰発現する複数の細胞株を樹立した。【０１８０】
対照として、ＧｎＴ−ＩＩＩ  ｃＤＮＡを含まないプラスミドプラスミドｐｃＤＮＡ３．１を導入した細胞株（Ｍｏｃｋと呼ぶ）を同様の操作で樹立した。【０１８１】
低密度になるように、同数のＧｎＴ−ＩＩＩ遺伝子導入細胞株とＭｏｃｋ細胞株とを、それぞれ３５ｍｍガラス底培養ディッシュに播種し、１０重量％  ＦＣＳを含むｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｙｐｅ  ＤＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ製）で、５容積％  ＣＯ2で１２時間培養した。【０１８２】
その後、培地を、ＦＣＳを含まないＤＭＥＭ培地に交換することにより、血清飢餓による分化誘導を行った。対照として、ＦＣＳを含有する培地で両細胞株の培養を継続する群も試験した。２４時間培養後、４容積％  ホルムアルデヒドを含むＰＢＳで細胞を１０分間固定した。固定後の細胞を、アクチン細胞骨格について、Ａｌｅｘａ  ５４６−ファロイジン、神経分化マーカーであるＮＦ−Ｈについて、抗リン酸化ＮＦ−Ｈマウスモノクローナル抗体ＳＭＩ−３１とＡｌｅｘａ  ５４６標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体とを用いて一般的な間接蛍光抗体染色法で二重染色し、共焦点レーザー顕微鏡で撮像した。【０１８３】
レーザー顕微鏡視野（７３．１×７３．１μｍ）内の全細胞数とＮＦ−Ｈ陽性細胞数とを計数し、ＮＦ−Ｈ陽性（伸長した突起部分が抗ＮＦ−Ｈ抗体で染色されているもの）の全細胞数に占める割合を百分率で評価した。ＧｎＴ−ＩＩＩ遺伝子導入細胞株及びＭｏｃｋそれぞれ、異なる３クローンずつを実験に用い、それらの平均をグラフとして図２に示す。図中、＋、−はそれぞれＦＣＳの有無を示す。【０１８４】
その結果、図２に示されるように、血清飢餓による分化誘導を伴うＮｅｕｒｏ−２ａ細胞からの神経突起伸長は、ＧｎＴ−ＩＩＩ遺伝子の過剰発現により亢進されることが明らかとなった。【０１８５】
上記の結果は、神経分化の中でも、特に、神経突起伸長プロセスにおいて、ＧｎＴ−ＩＩＩ遺伝子産物が深く関与することを強く示唆している。
【実施例６】
【０１８６】
前記実施例２で得られた糖ペプチド（神経突起伸長誘導剤）を、滅菌条件下に、滅菌生理的食塩水と注射剤用助剤とを含む溶液に混合し、注射剤形の神経疾患治療又は予防剤を得る。【０１８７】
前記神経疾患治療又は予防剤を、個体の神経損傷部に投与する。経時的に、当該神経損傷に伴い損なわれた運動能力、言語能力、及び／又は外部からの刺激に対する反応の回復度を評価する。【０１８８】
これにより、神経損傷に伴い損なわれた運動能力、言語能力、及び／又は外部からの刺激に対する反応が回復した場合、神経疾患治療又は予防剤による薬理効果が得られたことの指標として評価される。
【実施例７】
【０１８９】
前記実施例２で得られた糖ペプチド（神経突起伸長誘導剤）を、飲料及び食品の製造の際に原料と共に混合する。【０１９０】
得られた飲料又は食品を、正常個体及び神経損傷により学習能力及び／又は記憶能力が低下した個体に供給する。その後、飲料又は食品の供給前後における学習能力及び記憶能力を試験し、その成績を評価する。【０１９１】
これにより、飲料又は食品の供給前に比べ、飲料又は食品の供給後、正常個体の成績が向上した場合、飲料又は食品により学習能力及び記憶能力の向上効果が見られることの指標となる。また、飲料又は食品の供給前に比べ、飲料又は食品の供給後、神経損傷により学習能力及び／又は記憶能力が低下した個体の成績が通常レベルに近づいている場合、飲料又は食品により学習能力及び記憶能力の改善効果が見られることの指標となる。
【産業上の利用可能性】
【０１９２】
本発明により、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、複合糖質、それらの誘導体、それらの塩、前記糖鎖の合成に係る酵素、及び前記酵素をコードする核酸を含有する医薬、試薬、食品又は飲料が提供される。当該医薬、食品又は飲料はバイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖、複合糖質、それらの誘導体及び／又はそれらの塩の神経突起伸長誘導作用により、神経疾患の治療又は予防、学習記憶能力の向上又は改善に有用である。また、本発明により、当該有効成分を含有する神経突起伸長誘導作用を有する試薬が提供される。
【配列表フリーテキスト】
【０１９３】
配列番号：１は、糖ペプチドのペプチド部分のアミノ酸配列を示す。
【図１】
2005097155.tif 000042
【図２】
2005097155.tif 000043
【配列表】
2005097155000001.app
【国際調査報告】
2005097155.tif 000044
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