(57)【要約】  本発明は、パントテン酸誘導体の生産性が高いコリネバクテリウム（Corynebacterium）属微生物由来の、パントテン酸キナーゼ活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを導入された組換えベクター、並びに、該ＤＮＡ又は組換えベクターを導入された形質転換体を提供する。  本発明によれば、生物学的手法によりコエンザイムＡをはじめとするパントテン酸誘導体を大量生産することができ、医薬品、機能性食品等の用途で望まれる、安全で高品質なパントテン酸誘導体を提供することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチド：
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１つもしくは数個のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつパントテン酸キナーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
以下の（Ｃ）または（Ｄ）のポリペプチド：
（Ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（Ｄ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１つもしくは数個のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつパントテン酸キナーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
以下の（ａ）または（ｂ）の単離されたＤＮＡ。
（ａ）配列番号３に示す塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号３に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつパントテン酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項４】
以下の（ｃ）または（ｄ）の単離されたＤＮＡ。
（ｃ）配列番号５に示す塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号５に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつパントテン酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項３又は４記載の核酸を含む組換えベクター。
【請求項６】
請求項３又は４のＤＮＡ、又は、請求項５記載の組換えベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項７】
前記宿主が微生物である請求項６記載の形質転換体。
【請求項８】
前記宿主がコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）である請求項６記載の形質転換体。
【請求項９】
前記宿主が大腸菌（Escherichia coli）である請求項６記載の形質転換体。
【請求項１０】
請求項１又は２記載のポリペプチド、又は、請求項６記載の形質転換体を利用して、ホスホパントテン酸、ホスホパントテノイルシステイン、ホスホパンテテイン、デホスホコエンザイムＡ、及びコエンザイムＡから選択される少なくとも１種のパントテン酸誘導体を生産することを特徴とするパントテン酸誘導体の製造方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の製造方法によって得られるパントテン酸誘導体を酸化することにより酸化型パントテン酸誘導体を生産することを特徴とする酸化型パントテン酸誘導体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物由来のコエンザイムＡの生合成に関わる酵素の遺伝子及びそれを導入した形質転換細胞及びそれを用いたパントテン酸誘導体の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コエンザイムＡは、パントテン酸誘導体の１種であり、ほとんどすべての生物によって生産され、生体内の数十種の反応において補酵素として働いていることが知られている。【０００３】
コエンザイムＡを生産する方法としては生物学的方法が知られており、種々の生物、特に生産性の高い細菌や酵母等の微生物を培養し、その菌体から抽出する方法が知られている。本方法は、試薬スケールのコエンザイムＡの製法としては現在も使用されているものの、菌体に含有されるコエンザイムＡの量が微量であり、大量生産するためには大量の菌体を必要とし、それに伴い抽出操作も煩雑になるなどの問題がある。【０００４】
これらの抽出法に加え、微生物やその菌体処理物を用いた菌体反応方法も検討され（特許文献１）（非特許文献１）、かつては実用化されていた実績も有る。しかし、菌体反応方法が複雑で条件設定が難しく、更にパントテン酸をリン酸化するパントテン酸キナーゼによる反応が律速で、酵素活性が十分でないなどのため現在は実施されていない。また、処理菌体を用いる方法（特許文献２）では高価なＡＴＰを用いるなど、安定して大量に生産できる状況ではなかった。
【特許文献１】特開昭６０−９８９９２
【特許文献２】特公昭４９−１３９９４
【非特許文献１】Shimizu S., et al., Appl. Environ. Microbiol., 48, 1118-1122 (1984)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
コエンザイムＡを始めとするパントテン酸誘導体は医薬品としての作用に加え、化粧品や機能性食品としての効果も期待できるなど用途及び利用が拡大しつつあり、安心できる品質のものが効率よく大量生産できることが望まれている。特に機能性食品として利用する際には安心できる品質のものを安定して供給できる生産系であることが重要であり、微生物による生産がこれらの点で優っていると考えられるが、上記のように、従来の製造方法では効率よく安定して大量生産することが困難である。【０００６】
本発明は、このような状況に鑑み、コエンザイムＡ等のパントテン酸誘導体を生物学的方法であって、且つ、大量に生産しうる方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、菌体反応法で最も反応性が優れているコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）に属する菌株について、生合成の律速酵素であるパントテン酸キナーゼ（CoaA）遺伝子を取得するため、近縁のコリネバクテリウム（Corynebacterium）属バクテリア由来の既知遺伝子について、データベースからの検索を実施してその配列を比較し、保存性の高い領域を発見した。この保存性の高い領域の部分の配列に着目し、これらの配列を含む様にミックスプライマーを設計したうえでコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（C. ammoniagenes）のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、CoaA遺伝子断片と考えられるの増幅断片を見出した。この増幅断片についてＤＮＡの塩基配列を決定したところ、配列表の配列番号１に示す配列が得られた。【０００８】
得られた本遺伝子を発現ベクターに組込み、適当な宿主に形質転換することによって、パントテン酸誘導体の生産を増強することが可能となる。【０００９】
本発明は、上記の通り複数の対象を有する。それらの対象の一部として、例えば以下のものを挙げることができる。
（１）以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチド：
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１つもしくは数個のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつパントテン酸キナーゼ活性を有するポリペプチド。
（２）以下の（Ｃ）または（Ｄ）のポリペプチド：
（Ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（Ｄ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１つもしくは数個のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつパントテン酸キナーゼ活性を有するポリペプチド。
（３）以下の（ａ）または（ｂ）の単離されたＤＮＡ：
（ａ）配列番号３に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号３に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつパントテン酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（４）以下の（ｃ）または（ｄ）の単離されたＤＮＡ：
（ｃ）配列番号５に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｄ）配列番号５に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつパントテン酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。【００１０】
本発明は、上記ＤＮＡを含む組換えベクター、その組換えベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体を含む。【００１１】
また本発明は、上記ポリペプチド、上記ＤＮＡまたは組換えベクターを導入した形質転換体を利用したパントテン酸誘導体(例えば、ホスホパントテン酸、ホスホパントテノイルシステイン、ホスホパンテテイン、デホスホコエンザイムＡ、又はコエンザイムＡ)の製造方法を含む。更に本発明は、上記パントテン酸誘導体を酸化することによって得られる酸化型パントテン酸誘導体の製造方法を含む。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により取得されたパントテン酸キナーゼ遺伝子を用いることによって律速となっている生合成酵素を強化することが出来るため、コエンザイムＡを始めとしたパントテン酸誘導体を効率よく生産することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】大腸菌で高発現させたパントテン酸キナーゼのSDS-PAGEでの分析結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
１．パントテン酸誘導体
本明細書においてパントテン酸誘導体とは、コエンザイムＡは言うまでもまく、ホスホパントテン酸、ホスホパントテノイルシステイン、ホスホパンテテイン、デホスホコエンザイムＡなども含まれる。以下、それらのパントテン酸誘導体をパントテン酸誘導体類と称する。【００１５】
２．パントテン酸キナーゼおよびＣｏａＡ様遺伝子
１態様では、本発明は、以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチドを提供する：
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１つもしくは数個のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつパントテン酸キナーゼ活性を有するポリペプチド。【００１６】
１態様では、本発明はまた、以下の（Ｃ）または（Ｄ）のポリペプチドを提供する：
（Ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（Ｄ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１つもしくは数個のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつパントテン酸キナーゼ活性を有するポリペプチド。【００１７】
１態様では、本発明はまた、以下の（a）または（b）の単離されたＤＮＡを提供する：
（a）配列番号３に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（b）配列番号３に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつパントテン酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。【００１８】
１態様では、本発明はまた、以下の（ｃ）または（ｄ）の単離されたＤＮＡを提供する：
（c）配列番号５に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（d）配列番号５に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつパントテン酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。【００１９】
本発明の上記ポリペプチドをコードするＤＮＡは、実施例においてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes） NBRC12612、及び NBRC12072由来のものを例示するが、これに限らず、当業者に周知の手段によってクローニング可能な、同株以外のコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）由来の遺伝子を含む。【００２０】
上記コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes） NBRC12612 及びNBRC12072は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ：〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に保存されており、同機関より入手することができる。【００２１】
以下、この態様における配列番号３又は配列番号５に関する実施態様をＣｏａＡ様遺伝子と称する。【００２２】
本明細書にいうパントテン酸キナーゼとは、パントテン酸からコエンザイムＡを生合成する際の最初のステップを触媒する性質を含む酵素であり、ほとんどの生物においてその存在が古くより知られ、その遺伝子も多くの生物より既に取得されている。具体的には、本発明の実施例としてのパントテン酸キナーゼとはＤ−パントテン酸、Ｄ−パントテノイルシステイン、又はＤ−パンテテインを基質とし、それぞれＤ−ホスホパントテン酸、Ｄ−ホスホパントテノイルシステイン、又はＤ−ホスホパンテテインを生成する反応を触媒できる酵素である。【００２３】
ある遺伝子がコードするポリペプチドが該パントテン酸キナーゼの性質（パントテン酸キナーゼ活性）を有するか否かは、例えば清水らのアッセイ方法（Shimizu S., et al., Agric. Biol. Chem., 37, 2863-2870 (1973)）により直接測定することも可能である。その他の方法として、例えば遺伝子を宿主微生物に形質転換してパントテン酸誘導体の生成増加を確認できれば、生体内での作用も含めて確認することが出来る。【００２４】
さらに、本発明のポリペプチド（パントテン酸キナーゼ）は、配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは同ポリペプチドと実質的に同一のポリペプチドを含む。【００２５】
実質的に同一のポリペプチドとは、例えば、ポリペプチドが、そのポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列と７０％以上、または８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸配列の同一性を有し、かつ、配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の機能を有する場合を含む。その他、実質的に同一のポリペプチドとは、本発明の実施例のポリペプチドの活性部位を形成し、そのポリペプチドの性質を特徴付けると推定されるアミノ酸配列を含む場合も含む。【００２６】
上記アミノ酸配列の「同一性」とは、比較対象となる配列の全領域にわたって最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。比較対象となる配列は、最適な状態にアラインメントされた場合に付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。アミノ酸配列の同一性は、例えば相同性検索プログラムBLAST（Altschul SF. et al, Nucleic Acids Res. (1997) 25:3389-3402）を用いて２つのアミノ酸配列を比較解析した場合に、配列全体に対するIdentityの値で算出することができる。アミノ酸配列中の１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加は、例えば部位特異的突然変異法など当業者に周知の方法によって行うことができる。【００２７】
さらに、本発明のＤＮＡは、例えば上記のような本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡであればよい。具体的には、配列番号３又は配列番号５で示される核酸であっても良いし、配列番号３又は配列番号５で示される核酸において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列を有する核酸であってもよい。【００２８】
また、配列表配列番号３又は配列番号５で示される塩基配列と６０％以上、または７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、そして最も好ましくは９９％以上の塩基配列の同一性を有するものであればよい。塩基配列の「同一性」の技術的意義は、上記アミノ酸配列の「同一性」として説明した内容と同様である。【００２９】
本明細書にいうストリンジェント条件下のハイブリダイゼーション条件は、試験遺伝子に含まれる塩基配列が、試験遺伝子と実質的に同等の機能を有する遺伝子に含まれる塩基配列とハイブリダイズする限り特に限定されないが、好ましくは、約５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と約０．５％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と約１０μｇ／ｍｌ  変性断片化サケ精子ＤＮＡを含む溶液中約５０℃でハイブリダイゼーションを行い、約２×ＳＳＣ、約０．１％のＳＤＳ中５０℃で洗浄を行う条件である。【００３０】
より望ましくは上記と同じ条件でハイブリダイゼーションを行い、約１×ＳＳＣ、約０．１％のＳＤＳ中約５０℃で洗浄を行う条件である。より望ましくは上記と同じ条件でハイブリダイゼーションを行い、約０．５×ＳＳＣ、約０．１％のＳＤＳ中約５０℃で洗浄を行う条件である。より好ましくは上記と同じ条件でハイブリダイゼーションを行い、約０．１×ＳＳＣ、約０．１％のＳＤＳ中約５０℃で洗浄を行う条件である。更に好ましくは上記と同じ条件でハイブリダイゼーションを行い、約０．１×ＳＳＣ、約０．１％のＳＤＳ中約６５℃で洗浄を行う条件である。【００３１】
もっとも、該条件は、ヌクレオチド鎖の長さ、該配列、および異なる環境パラメーターに依存して異なり得る。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの詳細なガイドは、例えばTijssen(1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2  "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay"  Elsvier, New Yorkに見出される。【００３２】
上記ポリペプチドまたはＤＮＡを得るための方法は特に限定されないが、例えば実施例に記載の方法にしたがって生産し得る。【００３３】
３．ベクターおよび宿主
ここにいうベクターとしては、例えばプラスミドベクター、またはファージベクターのいずれも使用可能であるが、適当な抗生物質などの薬剤耐性遺伝子に加え、外来遺伝子を組込むための制限酵素切断サイト、及びその上流にプロモーター配列を有するものが好ましい。【００３４】
上記ベクターとしては、例えば、タカラバイオやStratageneなどから市販されているものが使用可能で、大腸菌の系ではｐＵＣ系やｐＳＴＶ系などプロモーターを持つ汎用的なベクターが使用可能である。コリネバクテリウム（Corynebacterium）属バクテリアの系では大腸菌のｐＨＳＧ系ベクターを用いて変異遺伝子を組込むことも可能であるし、コリネバクテリウム（Corynebacterium）のベクターを利用することもできる。【００３５】
ここにいう宿主とは、導入遺伝子を組込み発現可能なベクターを用いた形質転換の方法が確立できる宿主ならいずれも使用可能である。【００３６】
上記宿主として、例えば、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、リゾビウム（Rhizobium）などの細菌、ストレプトマイセス（Streptomyces）などの放線菌、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastolis）などの酵母、アスペルギルス（Aspergillus）などのカビ、動物細胞、または植物細胞も利用可能である。【００３７】
物質生産に関する実用性の観点から好ましくは、宿主は、細菌などの微生物が有利であり、大腸菌 E. coli、又はコリネバクテリウム（Corynebacterium）属バクテリアなどから選択される。【００３８】
４．遺伝子等の利用方法
本発明者が見出した、実施例として後述する遺伝子に関しては、例えば次のような利用方法が挙げることができる。まず、同遺伝子を適切なプラスミドベクターと連結して大腸菌、又はコリネバクテリウム（Corynebacterium）属バクテリアなどの宿主に形質転換し、得られた形質転換体を必要な栄養源を含む培地で培養する。培養終了後には、菌体を遠心分離や濾過により回収し、その菌体に含まれるパントテン酸誘導体を抽出又は菌体を破砕して取得することが可能である。その他、菌体を用いた反応系として、基質としてのパントテン酸、Ｌ−システイン、アデノシン一リン酸（以後ＡＭＰと略す）、それに加え、グルコースや界面活性剤などを含む緩衝液に菌体を懸濁して反応させ、コエンザイムＡを生成させることも可能である。【００３９】
反応液中に産生されたパントテン酸誘導体は採取して、公知の精製法などによる適切な方法によって精製することができ、目的とするパントテン酸誘導体を得ることが出来る。反応液からのパントテン酸誘導体類の単離は、例えば活性炭、フロリジル、アルミナ、ケイ酸塩、粉末濾紙などや多孔性合成ポリマー担体（例えばアンバーライトＩＲ１２０(ローム・アンド・ハース社)やダイヤイオンＨＰ-２０(三菱化学)など）、各種イオン交換樹脂（例えばダウエックス１Ｘ２(アクロス・オーガニクス)、アンバーライトＩＲＣ-５０(ローム・アンド・ハース社)、ＤＥＡＥセルロース、ＤＥＡＥセファロースＣＬ-６Ｂ(アマシャム・バイオサイエンス)など）、ゲル濾過担体（例えばセファデックスＧ-２５、セファデックスＬＨ-２０(アマシャム・バイオサイエンス)、バイオゲルＰ-２(バイオラッド)など）、あるいは、各種アフィニティー担体などを担体そのまま、又はカラムクロマトグラフィーとして適宜組合わせることによって実行することができる。【００４０】
また、コエンザイムＡの生合成に関する他の遺伝子についても同時に導入することにより生産性が更に増加することが考えられる。コエンザイムＡの生合成に関する他の遺伝子については、既知の酵素遺伝子の場合には、公知のデータベース（例えばGenBankデータベース）から取得可能なＤＮＡ配列情報をもとに、それぞれの染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲ反応で取得出来る。また、未知の遺伝子の場合も、本発明の実施例に示すパントテン酸キナーゼ遺伝子の取得の場合と同様に、取得済みの他の生物由来の生合成遺伝子との親和性を利用してＰＣＲ反応で取得することが出来る。好ましくは遺伝子両端部分に適切な制限酵素切断点を付加した配列となるようにＰＣＲプライマーを設計し、ＰＣＲ反応により取得すればベクターへの挿入が容易になる。【００４１】
上記各方法で取得可能な生合成酵素遺伝子を発現するためには、上述のベクターを適切な制限酵素により切断し、同じ制限酵素により切断した生合成酵素遺伝子とライゲーションした後、宿主である大腸菌やコリネバクテリウム（Corynebacterium）属バクテリアに形質転換することで生産菌株を作製することが出来る。【００４２】
組換え生産菌の培養は、大腸菌の場合は２ＹＴ培地、またはＬ培地などが利用可能であり、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属バクテリアの場合は例えばＢ培地（１０ｇ グルコース、１５ｇ ペプトン、３ｇ Ｋ2ＨＰＯ4、２ｇ ＮａＣｌ、０．２ｇ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、1 g 酵母エキスを脱イオン水１Ｌに溶解（以後、「／１Ｌ」と記す）、(ｐＨ７．０)）、Ｇ培地（１５０ｇ グルコース、１０ｇ ＫＨ2ＰＯ4、１０ｇ Ｋ2ＨＰＯ4、１０ｇ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１ｇ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０２ｇ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０１ｇ ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０２ｇ ＭｎＳＯ4・６Ｈ2Ｏ、０．０２ｇ Ｌ-システイン、０．００５ｇ チアミン塩酸塩、０．０１５ｇ β-アラニン、０．１ｍｇ ビオチン、３ｇ 尿素、１５ｇ コーンスティープリカー、１ｇ グルタミン酸ナトリウム／１Ｌ、ｐＨ６．８）などが使用できる。培養後の培養液より菌体を採取し、パントテン酸誘導体類の生成反応に利用することが出来る。【００４３】
以上のように、本発明は、パントテン酸誘導体を宿主生物（例えば微生物）により有利に生産するために使用できる遺伝子、及びそれを導入した形質転換体、及び該形質転換体を用いたパントテン酸誘導体の製造法に関し、パントテン酸誘導体の生産に有利に利用できる。【００４４】
５．酸化型パントテン酸誘導体の製造
本発明では、上記のようにして製造されたパントテン酸誘導体を酸化することより、酸化型パントテン酸誘導体を製造することもできる。ここでいう、酸化型パントテン酸誘導体とは、コエンザイムＡ、デホスホコエンザイムＡ、ホスホパンテテイン、ホスホパントテノイルシステイン、及びパンテテイン等のパントテン酸誘導体とＲ−ＳＨ（Ｒは有機基）で表される化合物とを酸化することにより、ＳＳ結合を形成させて得られる化合物を表す。Ｒ−ＳＨで表される化合物としては、上記パントテン酸誘導体、システイン、システアミン、グルタチオン等が挙げられる。すなわち、酸化型パントテン酸誘導体としては、同種のパントテン酸誘導体同士を酸化して得られる化合物（二量体）、２種の異なるパントテン酸誘導体を酸化して得られる化合物、或いは、パントテン酸誘導体とシステイン、システアミン、又はグルタチオンとを酸化して得られる化合物等が含まれる。【００４５】
酸化の方法は、化学的な方法、酵素などを用いた生化学的方法などが実施可能であり、パントテン酸誘導体類を分解しない限り特に限定されないが、酸化剤を用いる方法が簡便であり、例えば、過酸化水素、ヨウ化カリウムなどの酸化剤を用いる方法等を挙げることができる。
【実施例】
【００４６】
本発明の実施例を以下に示し、更に詳しく説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。なお、以下の遺伝子組換えに関する基本操作については、モレキュラー・クロニング、ア・ラボラトリー・マニュアル 第３版（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリーズ(Cold Spring Harbor Laboratory)(2001)、メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology), vol.194 (1991)等に記載された方法を用いた。また、市販のキットを用いる場合は、添付されている使用説明書の指示に従った。【００４７】
（実施例１）ＣｏａＡ遺伝子の取得と確認
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes） NBRC12612のゲノムＤＮＡをDNA Tissue Kit（QIAGEN）を用いて調製した。【００４８】
コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）由来パントテン酸キナーゼ（CoaA）遺伝子、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来CoaA遺伝子、コリネバクテリウム・ジフテリア（Corynebacterium diphtheriae）由来CoaA遺伝子の塩基配列を比較し、保存性の高い領域の配列に着目してこれらの配列を含む様にミックスプライマーを設計した（Ｐｒｉｍｅｒ-1： 5'-TAYCTNCCRCTGTCSCGTCTSAT-3'（配列番号６）、Ｐｒｉｍｅｒ-２： 5'-GCKCGMACYCGRGTGGGMAGRAT-3' （配列番号７）、（これらの配列においてY: C,T、N: A,C,G,T、R: A,G、S: C,G、K: G,T、M: A,Cの基質混合物を用いて合成された配列を示す。））。このミックスプライマーを用いてＰＣＲによりコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（C. ammoniagenes） NBRC12612のゲノムＤＮＡからCoaA遺伝子断片の増幅を行った（反応液１００μＬ中にＥｘ Ｔａｑ ＨＳ（タカラバイオ） ２．５unit、1x付属バッファー、ｄＮＴＰそれぞれ０．２ｍＭ、Ｐｒｉｍｅｒ-1およびＰｒｉｍｅｒ-２をそれぞれ８０ｐｍｏｌ、鋳型ＤＮＡ１００ｎｇを添加。ホットスタートを実施。９８℃３０秒変性後、９８℃１０秒、５５℃３０秒、７２℃１分というサイクルを３０回繰り返した）。得られた特異的に増幅された約７００ｂｐの断片をｐＴ7Ｂｌｕｅ ｔ-Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ）にてクローニングし、塩基配列を決定した。【００４９】
塩基配列を決定した６６１ｂｐの塩基配列を元に外向きのプライマーを設計し、（Ｐｒｉｍｅｒ-３： 5'-GGTGGATTTGCCCACGGCAA-3'（配列番号８）、Ｐｒｉｍｅｒ-４： 5'-GCCGATATGAATGACGAGCA-3'（配列番号９））、上記コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（C. ammoniagenes） NBRC12612のゲノムＤＮＡを種々の制限酵素により消化し自己閉環させたＤＮＡ断片を鋳型とするインバースＰＣＲ反応を行った（反応液１００μＬ中にＥｘ Ｔａｑ ＨＳ ２．５unit、1x付属バッファー、ｄＮＴＰそれぞれ０．２ｍＭ、Ｐｒｉｍｅｒ-３およびＰｒｉｍｅｒ-４をそれぞれ８０ｐｍｏｌ、鋳型ＤＮＡ１００ｎｇを添加。ホットスタートを実施。９８℃３０秒変性後、９８℃１０秒、５５℃３０秒、７２℃２分というサイクルを３０回繰り返した。）。その結果、ＮｃｏＩにより消化し自己閉環させたＤＮＡ断片を鋳型とするインバースＰＣＲ反応により１．０ｋｂｐの特異的増幅断片が得られた。【００５０】
この断片の塩基配列を決定したところ、CoaA遺伝子の蛋白質コード部分（配列番号３）をすべてを含んでいることがわかった。【００５１】
（実施例２）大腸菌発現ベクターの作製
コリネバクテリウム（Corynebacterium）由来のＣｏａＡ遺伝子のコード部分を取得するためのプライマーとして、Ｐｒｉｍｅｒ-５： 5'-GGAATTCCATATGGCGCGGAACTCCGATTT-3' （配列番号１０）及びＰｒｉｍｅｒ-６： 5'-CGCGGATCCCTAGAGCTTGCGCATCCGGA-3'（配列番号１１）を合成し、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（C. ammoniagenes） NBRC12612の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断し、これらの制限酵素で切断したｐＵＣＮｄｅとライゲートし、組換えベクターｐＵＣ・ＣｏａＡを作製した。この組換えベクターでE. coliＤＨ５αに形質転換することにより組換え大腸菌を作製した。得られた組換え大腸菌は、「Escherichia coli DH5α/pUC・CoaA」と表示され、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ：〒305-8566  茨城県つくば市東１丁目１番地  中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５４１として寄託されている（寄託日２００６年２月２７日：原寄託日平成１７年（2005年）３月４日の国内寄託株をブダペスト条約に基づく国際寄託に移管）。【００５２】
（実施例３）大腸菌でのＣｏａＡ遺伝子発現評価
グルコース １％、ペプトン １．５％、酵母エキス ０．１％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．３％、ＮａＣｌ ０．２％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０２％ （ｐＨ７．０）の培地にコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（C. ammoniagenes） NBRC12612菌株を接種して、２８℃で２４時間培養し、これを種菌液として使用した。次に、グルコース １０％、尿素 １．５％（別滅菌）、ＫＨ2ＰＯ4 １％、Ｋ2ＨＰＯ4 １％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １％、酵母エキス １％、ペプトン ０．５％、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム ０．０５％、Ｌ−セリン ０．０５％、イソロイシン ０．０５％、β-アラニン ０．００５％ （ｐＨ６．８）の組成を有する培地へ上記種菌液を１０％接種して、２８℃で約７２時間振盪培養した。培養後の菌体を遠心分離により集め、コエンザイムＡ合成培養に用いた。【００５３】
一方、実施例２で得られた、組換え大腸菌、又は宿主であるE. coliＤＨ５αをLB培地（組換え大腸菌の場合は５０μl/mlのアンピシリンを含む）で３７℃にて前培養した後、この前培養液をLB培地（組換え大腸菌の場合は５０μl/mlのアンピシリンを含む）に１％接種し、３７℃にて２４時間振盪培養した。培養後の菌体を遠心分離により集め、コエンザイムＡ合成培養に用いた。【００５４】
５００ml容フラスコに、グルコース １５％、ＫＨ2ＰＯ4 ２％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０．５％、パントテン酸カルシウム ０．３５５％、システイン １．８％、ＡＭＰ・Ｎａ ０．６％、キシレン １％、ポリオキシエチレンステアリルアミン Ｓ−２２０ ０．４％、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（C. ammoniagenes） NBRC12612湿菌体  １００ｇ／ｌ、組換え大腸菌又は宿主大腸菌湿菌体  ５０ｇ／ｌの反応液２０ｍｌを入れ、２８℃にて９６時間振盪した後の培養液上清に蓄積されたＣｏＡの濃度を測定した。その結果、組換え大腸菌を用いた場合、０．０７３ｇ／ｌ（培養液１ｌ当たりのＣｏＡ濃度）の値が得られ、宿主大腸菌を用いた場合の約１．８倍の生産性を示した。【００５５】
（実施例４）組換え大腸菌によるＣｏａＡ遺伝子の活性発現
実施例２で取得したＣｏａＡ遺伝子をｐＥＴ−１７ｂにＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ制限酵素サイトを用いて挿入し、大腸菌Rosetta2(DE3)pLysSに形質転換を行った。その形質転換株を２ｍｌの５０μｇ／ｍｌ  アンピシリンと３０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコールを含むＬ培地で前培養し、それを１００  ｍｌの本培養培地（５０μｇ／ｍｌ アンピシリンと３０μｇ／ｍｌ クロラムフェニコールを含むＮＺＣＹＭ培地）に１％植菌して好気的に培養し、４時間後にＩＰＴＧを添加して誘導をかけ、３時間好気的に培養した。この培養液から遠心分離にて菌体を集め、超音波破砕によって無細胞抽出液を調製し、可溶性画分、不溶性画分をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。その結果、形質転換株では明らかにパントテン酸キナーゼの生成が増加している事が分かった（図１）。【００５６】
（実施例５）コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（C. ammoniagenes）でのＣｏａＡ遺伝子の活性発現
まず、大腸菌−コリネバクテリウム（Corynebacterium）のシャトルベクターを作製するため、大腸菌ベクターpGEM-T easyのクローニング部位に、コリネバクテリウム（Corynebacterium）のベクターpCG11のＰＣＲ増幅断片（Ｐｒｉｍｅｒ-７: 5'-GAACGTTCGTTATAATGGTG-3'（配列番号１２）と、Ｐｒｉｍｅｒ-８: 5'-TGTGTTTCTCCCGTGTCCGG-3'（配列番号１３）により増幅）を連結させ、大腸菌−コリネバクテリウム（Corynebacterium）のシャトルベクターpGEM-CG11を作製した。実施例２で取得したＣｏａＡ遺伝子をpGEM-CG11に制限酵素ＰｓｔＩサイトを用いて挿入し、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes） NBRC12612にエレクトロポレーション法によって形質転換を行った。その形質転換株を５ｍｌの１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＢ培地で前培養し、それを５０ｍｌの本培養培地に植菌して、３日間好気的に培養した。この培養液から遠心分離にて菌体を集め、超音波破砕によって無細胞抽出液を調製し、清水らの微生物学的なパントテン酸定量法（Agric. Biol. Chem., 37, 2863-2870 (1973)）によりパントテン酸キナーゼ活性を測定した。その結果、形質転換株においては比活性が１．７７ユニット／ｍｇ蛋白であり、野生株の０．１６ユニット／ｍｇ蛋白の１０倍以上の高発現をしていることが確認できた。【００５７】
（実施例６）コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes） NBRC12072のＣｏａＡ遺伝子の取得と確認
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（C. ammoniagenes） NBRC12072のゲノムＤＮＡをDNA Tissue Kit（QIAGEN）を用いて調製した。実施例１と同様にして、実施例１と同じプライマー、及びコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（C. ammoniagenes） NBRC12072のゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲを実施し、それにより取得した断片の塩基配列を決定したところ、ＣｏａＡ遺伝子の蛋白質コード部分（配列番号５）をすべてを含んでいることが確認できた。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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