(57)【要約】  本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎患者の病態をより正確に反映した病態モデル動物を提供することを目的として、高脂肪食を摂取させることにより、通常食を摂取させた群に比較して有意に体重を増加させた動物に、テトラサイクリン系抗生物質を連続投与して作製される非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
高脂肪食を摂取させることにより、通常食を摂取させた群に比較して有意に体重を増加させた動物に、テトラサイクリン系抗生物質を連続投与して作製される非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物。
【請求項２】
前記高脂肪食は、少なくともタンパク質、炭水化物及び脂肪を含有し、全カロリーに占める脂肪由来のカロリーが３０％以上の高脂肪食である、請求項１記載の非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物。
【請求項３】
前記テトラサイクリン系抗生物質を、
血中ＡＬＴ濃度、血中ＡＳＴ濃度、肝臓ＴＧ量、肝臓ＴＮＦα ｍＲＮＡ量及び肝臓ＩＬ−１β ｍＲＮＡ量が、同種の健常動物に比べて有意に高くなるまで連続投与して作製される、請求項１又は２記載の非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物。
【請求項４】
少なくともタンパク質、炭水化物及び脂肪を含有し、全カロリーに占める脂肪由来のカロリーが３０％以上の高脂肪食を、
血中ＡＬＴ濃度、血中ＡＳＴ濃度、肝臓ＴＧ量、肝臓ＴＮＦα ｍＲＮＡ量及び肝臓ＩＬ−１β ｍＲＮＡ量が、同種の健常動物に比べて有意に高くなるまで連続的に摂取させて作製される非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物。
【請求項５】
高脂肪食を摂取させることにより、通常食を摂取させた群に比較して有意に体重を増加させた動物に、テトラサイクリン系抗生物質を連続投与する、非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物の作製方法。
【請求項６】
前記高脂肪食は、少なくともタンパク質、炭水化物及び脂肪を含有し、全カロリーに占める脂肪由来のカロリーが３０％以上の高脂肪食である、請求項５記載の非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物の作製方法。
【請求項７】
前記テトラサイクリン系抗生物質を、
血中ＡＬＴ濃度、血中ＡＳＴ濃度、肝臓ＴＧ量、肝臓ＴＮＦα ｍＲＮＡ量及び肝臓ＩＬ−１β ｍＲＮＡ量が、同種の健常動物に比べて有意に高くなるまで連続投与する、請求項５又は６記載の非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物の作製方法。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物に候補薬物を投与するステップを備える、非アルコール性脂肪性肝炎用薬物のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物、その作製方法、及びその動物を用いる薬物スクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、非アルコール性脂肪肝（アルコール摂取を原因としない脂肪肝）は、身体に悪影響を与えるものではなく、治療の必要のない状態と考えられていた。しかし、近年、非アルコール性脂肪肝の中に、酸化ストレス等の刺激によって肝炎に進展し、更に肝臓の線維化を引き起こして肝硬変又は肝癌に発展するものがあることが分かってきた。現在では、非アルコール性脂肪肝から進展した肝炎は、非アルコール性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis：ＮＡＳＨ）と呼ばれ、治療の対象となっている。【０００３】
非アルコール性脂肪性肝炎治療薬の開発を目的とするスクリーニングテストや薬理試験においては、健常動物でなく、非アルコール性脂肪性肝炎患者の病態をできるだけ多く具備する病態モデル動物を用いるのが好ましい。そのような病態モデル動物としては、現在、ＭＣＤ（methionine- and choline-deficient）ダイエットを摂取させることによって作製されるマウス（以下「ＭＣＤモデル」という。）が知られている（非特許文献１）。【０００４】
ＭＣＤモデルは、脂肪性肝炎の発症、血中におけるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の増加、肝臓におけるトリグリセリド（ＴＧ）の増加、肝臓における炎症性サイトカイン（腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）等）のｍＲＮＡの増加といった、非アルコール性脂肪性肝炎に特徴的な所見が認められる点で、優れた非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物と考えられている。
【非特許文献１】Rinella, M. E. et al., J. Hepatology, 40: 47-51 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、多くの非アルコール性脂肪性肝炎患者では体重、血中インスリン濃度及び血中グルコース濃度が正常値又はそれより高い値を示すのに対し、ＭＣＤモデルではそれらの値がいずれも正常値よりも低く、この点で、ＭＣＤモデルは非アルコール性脂肪性肝炎患者の実際の病態を正確に反映するものではない。【０００６】
そこで、本発明は、ＭＣＤモデルの上記問題点を克服し、非アルコール性脂肪性肝炎患者の実際の病態をより正確に反映した病態モデル動物、その作製方法、及び非アルコール性脂肪性肝炎治療薬の開発のためのより有効な薬物スクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するため、本発明は、高脂肪食を摂取させることにより、通常食を摂取させた群に比較して有意に体重を増加させた動物に、テトラサイクリン系抗生物質を連続投与して作製される非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物を提供する。【０００８】
このような非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物は、体重、血中インスリン濃度及び血中グルコース濃度が正常値又はそれより高い値を示す点で、非アルコール性脂肪性肝炎患者の実際の病態をより正確に反映した病態モデル動物となる。【０００９】
上記高脂肪食としては、少なくともタンパク質、炭水化物及び脂肪を含有する食餌であって、当該食餌の全カロリーに占める脂肪由来のカロリーが３０％以上の食餌が好ましく、また、上記テトラサイクリン系抗生物質は、血中ＡＬＴ濃度、血中ＡＳＴ濃度、肝臓ＴＧ量、肝臓ＴＮＦα ｍＲＮＡ量及び肝臓ＩＬ−１β ｍＲＮＡ量が、同種の健常動物に比べて有意に高くなるまで連続投与するのがよい。【００１０】
非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物としては、少なくともタンパク質、炭水化物及び脂肪を含有する食餌であって、当該食餌の全カロリーに占める脂肪由来のカロリーが３０％以上の高脂肪食を、血中ＡＬＴ濃度、血中ＡＳＴ濃度、肝臓ＴＧ量、肝臓ＴＮＦα ｍＲＮＡ量及び肝臓ＩＬ−１β ｍＲＮＡ量が、同種の健常動物に比べて有意に高くなるまで連続的に摂取させて作製される動物も採用することができる。このような病態モデル動物もまた、体重、血中インスリン濃度及び血中グルコース濃度が正常値又はそれより高い値を示す点で、非アルコール性脂肪性肝炎患者の実際の病態をより正確に反映したものとなる。また、高脂肪食の摂取期間によっては、肝臓の線維化を伴う、より進行した非アルコール性脂肪性肝炎の病態モデル動物となる。【００１１】
上述のように、非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物は、高脂肪食を摂取させることにより、通常食を摂取させた群に比較して有意に体重を増加させた動物に、テトラサイクリン系抗生物質を連続投与することにより、作製することができる。この場合において、高脂肪食としては、少なくともタンパク質、炭水化物及び脂肪を含有する食餌であって、当該食餌の全カロリーに占める脂肪由来のカロリーが３０％以上の食餌がよく、また、テトラサイクリン系抗生物質は、血中ＡＬＴ濃度、血中ＡＳＴ濃度、肝臓ＴＧ量、肝臓ＴＮＦα ｍＲＮＡ量及び肝臓ＩＬ−１β ｍＲＮＡ量が、同種の健常動物に比べて有意に高くなるまで連続投与するのが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ＭＣＤモデルの問題点を克服し、非アルコール性脂肪性肝炎患者の実際の病態をより正確に反映した病態モデル動物、その作製方法、及び非アルコール性脂肪性肝炎治療薬の開発のためのより有効な薬物スクリーニング方法を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＨＦＤ又は対照餌を８週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを１０日間腹腔内投与したマウスにおける体重の推移を示す折れ線グラフである。
【図２】ＨＦＤ又は対照餌を８週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを１０日間腹腔内投与したマウスの血漿ＡＬＴ濃度を示す棒グラフである。
【図３】ＨＦＤ又は対照餌を８週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを１０日間腹腔内投与したマウスの血漿ＡＳＴ濃度を示す棒グラフである。
【図４】ＨＦＤ又は対照餌を８週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを１０日間腹腔内投与したマウスの血漿インスリン濃度を示す棒グラフである。
【図５】ＨＦＤ又は対照餌を８週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを１０日間腹腔内投与したマウスの血漿グルコース濃度を示す棒グラフである。
【図６】ＨＦＤ又は対照餌を８週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを１０日間腹腔内投与したマウスの肝臓ＴＧ量を示す棒グラフである。
【図７】ＨＦＤ又は対照餌を８週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを１０日間腹腔内投与したマウスの肝臓ＴＮＦα ｍＲＮＡ量を示す棒グラフである。
【図８】ＨＦＤ又は対照餌を８週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを１０日間腹腔内投与したマウスの肝臓ＩＬ−１β ｍＲＮＡ量を示す棒グラフである。
【図９】ＨＦＤを８週間摂取させて塩酸テトラサイクリン３０ｍｇ／ｋｇ／日を１０日間腹腔内投与したマウスの肝臓中間葉の切片に対するヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す光学顕微鏡写真に対応する図である。
【図１０】図９の黒枠で示された部分を拡大した光学顕微鏡写真に対応する図である。
【図１１】ＨＦＤを８週間摂取させて塩酸テトラサイクリン３０ｍｇ／ｋｇ／日を１０日間腹腔内投与したマウスの肝臓中間葉の切片に対するオイルレッドＯ染色の結果を示す光学顕微鏡写真に対応する図である。
【図１２】ＨＦＤを８週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを１０日間皮下投与したマウスにおける体重の推移を示す折れ線グラフである。
【図１３】ＨＦＤを８週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを１０日間皮下投与したマウスの血漿ＡＬＴ濃度を示す棒グラフである。
【図１４】ＨＦＤを８週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを１０日間皮下投与したマウスの血漿ＡＳＴ濃度を示す棒グラフである。
【図１５】ＨＦＤを８週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを１０日間皮下投与したマウスの血漿インスリン濃度を示す棒グラフである。
【図１６】ＨＦＤを８週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを１０日間皮下投与したマウスの血漿グルコース濃度を示す棒グラフである。
【図１７】ＨＦＤを８週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを１０日間皮下投与したマウスの肝臓ＴＧ量を示す棒グラフである。
【図１８】ＨＦＤを８週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを１０日間皮下投与したマウスの肝臓ＴＮＦα ｍＲＮＡ量を示す棒グラフである。
【図１９】ＨＦＤを８週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを１０日間皮下投与したマウスの肝臓ＩＬ−１β ｍＲＮＡ量を示す棒グラフである。
【図２０】ＨＦＤ又は対照餌を５０週間摂取させたマウスの体重を示す棒グラフである。
【図２１】ＨＦＤ又は対照餌を５０週間摂取させたマウスの血漿ＡＬＴ濃度を示す棒グラフである。
【図２２】ＨＦＤ又は対照餌を５０週間摂取させたマウスの血漿ＡＳＴ濃度を示す棒グラフである。
【図２３】ＨＦＤ又は対照餌を５０週間摂取させたマウスの血漿インスリン濃度を示す棒グラフである。
【図２４】ＨＦＤ又は対照餌を５０週間摂取させたマウスの血漿グルコース濃度を示す棒グラフである。
【図２５】ＨＦＤ又は対照餌を５０週間摂取させたマウスの肝臓ＴＧ量を示す棒グラフである。
【図２６】ＨＦＤ又は対照餌を５０週間摂取させたマウスの肝臓ＴＮＦα ｍＲＮＡ量を示す棒グラフである。
【図２７】ＨＦＤ又は対照餌を５０週間摂取させたマウスの肝臓ＩＬ−１β ｍＲＮＡ量を示す棒グラフである。
【図２８】ＨＦＤを５０週間摂取させたマウスの肝臓中間葉の切片に対するヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す光学顕微鏡写真に対応する図である。
【図２９】対照餌を５０週間摂取させたマウスの肝臓中間葉の切片に対するヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す光学顕微鏡写真に対応する図である。
【図３０】ＨＦＤ又は対照餌を５０週間摂取させたマウスの肝臓Ｉ型コラーゲン（α１）ｍＲＮＡ量を示す棒グラフである。
【図３１】ＨＦＤ又は対照餌を５０週間摂取させたマウスの肝臓α−ＳＭＡ ｍＲＮＡ量を示す棒グラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。【００１５】
本発明の非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物（以下「ＮＡＳＨ病態モデル動物」という。）を作製するために用いられる動物としては、ヒトの疾患の病態モデル動物として一般的に用いられている、ラット、マウス、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、サル等が挙げられるが、これらの中ではマウスが好ましい。雄は性周期によるホルモン量の変化がなく、病態のばらつきを抑えることができることから、動物は雄であることが好ましい。【００１６】
ＮＡＳＨ病態モデル動物を作製するには、まず、このような動物に対して、高脂肪食を摂取させることにより、通常食を摂取させた群に比較して有意に体重を増加させる。摂取させる高脂肪食としては、少なくともタンパク質、炭水化物及び脂肪を含有しており、その全カロリーに占める脂肪由来のカロリーが３０％以上のものがよい。脂肪由来のカロリーの下限は４５％が好ましく、６０％がより好ましい。一方、上限は８０％が好ましく、７０％がより好ましい。【００１７】
なお、高脂肪食を摂取させた結果、通常食を摂取させた群に比較して有意に体重が増加したかどうかは、ｔ検定により判断することができる。ここで、ｔ検定における有意水準は、１％又は５％であり、好ましくは１％である。【００１８】
ＮＡＳＨ病態モデル動物は、上述のようにして有意に体重が増加した動物に対して、テトラサイクリン系抗生物質を連続投与して作製される。ここで、「連続投与」するとは、投与を複数回、好ましくは等間隔をもって行うことを意味する。連続投与されるテトラサイクリン系抗生物質としては、例えば、テトラサイクリン（ＴＣ）、オキシテトラサイクリン（ＯＴＣ）、メタサイクリン（ＭＴＣ）、ドキシサイクリン（ＤＯＸＹ）、ミノサイクリン（ＭＩＮＯ）、及びこれらの塩（塩酸塩等）が挙げられる。【００１９】
テトラサイクリン系抗生物質の投与は、血中ＡＬＴ濃度、血中ＡＳＴ濃度、肝臓ＴＧ量、肝臓ＴＮＦα ｍＲＮＡ量及び肝臓ＩＬ−１β ｍＲＮＡ量が、同種の健常動物に比べて有意に高くなるまで続けるのが好ましく、また、血中ＡＬＴ濃度、血中ＡＳＴ濃度、肝臓ＴＧ量、肝臓ＴＮＦα ｍＲＮＡ量及び肝臓ＩＬ−１β ｍＲＮＡ量が、同種の健常動物に比べて有意に高くなり、かつ、肝臓の病理組織学的検査において脂肪肝の存在及び炎症細胞の浸潤が認められるまで続けるのがより好ましい。ここで、上記の値が同種の健常動物に比べて有意に高いかどうかは、有意水準を１％又は５％（好ましくは１％）としたｔ検定により判断することができる。【００２０】
なお、少なくともタンパク質、炭水化物及び脂肪を含有する食餌であって、当該食餌の全カロリーに占める脂肪由来のカロリーが３０％以上の高脂肪食を、血中ＡＬＴ濃度、血中ＡＳＴ濃度、肝臓ＴＧ量、肝臓ＴＮＦα ｍＲＮＡ量及び肝臓ＩＬ−１β ｍＲＮＡ量が、同種の健常動物に比べて有意に高くなるまで、ある程度の期間連続的に摂取させれば、テトラサイクリン系抗生物質を連続投与しなくても、ＮＡＳＨ病態モデル動物を作製することができる。ここで、「連続的に摂取」するとは、摂取を複数回行うことを意味する。【００２１】
高脂肪食を摂取させた後、テトラサイクリン系抗生物質を投与することによりＮＡＳＨ病態モデル動物を作製する場合、テトラサイクリン系抗生物質投与前の高脂肪食摂取期間は、脂肪肝が形成されるのに十分な期間であればよく、例えば、マウスでは、好ましくは６〜１０週間であり、より好ましくは７〜９週間である。高脂肪食は、テトラサイクリン系抗生物質の投与中も摂取させるのが好ましい。【００２２】
高脂肪食を摂取させた後、テトラサイクリン系抗生物質を投与することによりＮＡＳＨ病態モデル動物を作製する場合、テトラサイクリン系抗生物質の投与量及び投与期間は、マウスでは、好ましくは２０〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、７〜１４日間であり、より好ましくは２０〜４０ｍｇ／ｋｇ／日、９〜１１日間である。２０ｍｇ／ｋｇ／日、７日間未満では、脂肪肝が肝炎に進展しないことがあり、他方、１００ｍｇ／ｋｇ／日、１５日間を超えると、体重、血中インスリン濃度及び血中グルコース濃度のいずれかが正常値よりも低くなる可能性がある。テトラサイクリン系抗生物質の投与方法は、好ましくは腹腔内投与又は皮下投与である。ここで、テトラサイクリン系抗生物質は、薬理学的に許容される塩の形態で投与してもよい。【００２３】
高脂肪食を連続的に摂取させることによりＮＡＳＨ病態モデル動物を作製する場合、高脂肪食の摂取期間は、脂肪性肝炎を発症させるのに十分な期間であればよく、マウスでは、好ましくは２０週間以上であり、より好ましくは４０週間以上である。２０週間未満では、脂肪性肝炎が十分に発症しない可能性がある。また、肝臓の線維化が生じているＮＡＳＨ病態モデル動物を作製するには、マウスでは、４０週間以上高脂肪食を摂取させるのが好ましい。肝臓の線維化が生じていることは、例えば、肝臓Ｉ型コラーゲン（α１）ｍＲＮＡ量又は肝臓α−ＳＭＡ（smooth muscle actin）ｍＲＮＡ量が、同種の健常動物に比べて有意に高いことをもって確認することができる。ここで、「Ｉ型コラーゲン（α１）」はＩ型コラーゲンのα１鎖を表す。【００２４】
上述したＮＡＳＨ病態モデル動物を用いて、非アルコール性脂肪性肝炎用薬物のスクリーニングが可能になる。すなわち、ＮＡＳＨ病態モデル動物に非アルコール性脂肪性肝炎用候補薬物を投与するステップを備える、非アルコール性脂肪性肝炎用薬物のスクリーニング方法が提供される。このスクリーニング方法においては、候補薬物を投与するステップの後に、候補薬物が非アルコール性脂肪性肝炎用薬物として有効かどうかを判定するステップを設けることができ、このステップでは、例えば、血中ＡＬＴ濃度、血中ＡＳＴ濃度、肝臓ＴＧ量、肝臓ＴＮＦα ｍＲＮＡ量及び肝臓ＩＬ−１β ｍＲＮＡ量が、同種の健常動物に比べて有意に高くなっていないことをもって、非アルコール性脂肪性肝炎用薬物としての有効性を判断することができる。また、肝臓の病理組織学的検査において炎症細胞の浸潤が認められなくなったことをもって、非アルコール性脂肪性肝炎用薬物としての有効性を判断することもできる。【００２５】
本発明のＮＡＳＨ病態モデル動物、及びこれを用いる薬物スクリーニング方法は、医薬品の開発を目的とするスクリーニングテストや薬理試験において、公知の病態モデル動物、及びこれを用いる薬物スクリーニング方法と同様に用いることができる。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例及び比較例に基づいて、本発明をより具体的に説明する。但し、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。【００２７】
以下の実施例及び比較例では、病態モデル動物作製のための動物として、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系の雄マウス（日本クレア社）を用いた。また、高脂肪食（以下「ＨＦＤ」という。）としては、Ｄ１２４９２（脂肪含有量：６０ｋｃａｌ％）（リサーチダイエット社）を用いた。対照餌としては、マウスの通常の飼育に用いられるＣＥ−２（日本クレア社）を用いた。テトラサイクリン系抗生物質としては塩酸テトラサイクリン（シグマ社）を用いた。塩酸テトラサイクリンの投与は、０．５％生理食塩水を用いて調製した塩酸テトラサイクリンの０、１０、３０及び１００ｍｇ／１０ｍＬ溶液の注射によって行った。ここで、「塩酸テトラサイクリンの０ｍｇ／１０ｍＬ溶液」とは、０．５％生理食塩水を意味する。【００２８】
（実施例１及び比較例１）
マウス（６週齢）２９匹を、ＨＦＤを摂取させる群（以下、「ＨＦＤ群」という。）１５匹と対照餌を摂取させる群（以下、「対照群」という。）１４匹とに分けた。ＨＦＤ群（１５匹）及び対照群（１４匹）に関する以下の実験を、それぞれ実施例１及び比較例１とする。【００２９】
ＨＦＤ又は対照餌の給餌、及び塩酸テトラサイクリンの腹腔内投与：
まず、ＨＦＤ群及び対照群のマウスにそれぞれＨＦＤ及び対照餌を８週間自由摂取させた。その後、体重及び体脂肪率が群間で均等になるように、ＨＦＤ群を３群（５匹×３）に、対照群を３群（５匹×２、４匹×１）に分け、ＨＦＤ群及び対照群のいずれにも塩酸テトラサイクリン０、１０及び３０ｍｇ／ｋｇ／日を１０日間腹腔内投与した（以下、塩酸テトラサイクリン０、１０及び３０ｍｇ／ｋｇ／日を投与した群をそれぞれ「ＴＣ０群」、「ＴＣ１０群」及び「ＴＣ３０群」という）。ＨＦＤ又は対照餌は、塩酸テトラサイクリン投与期間中もマウスに自由摂取させた。【００３０】
体重の測定：
マウスの体重を、塩酸テトラサイクリン投与開始の４日前、投与開始後１、３、５、７、１０及び１１日目に測定した。図１は、ＨＦＤ又は対照餌を８週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを１０日間腹腔内投与したマウスにおける体重の推移を示す折れ線グラフである。図１より、体重では、ＨＦＤ群のマウスが塩酸テトラサイクリン投与開始時に通常のマウス（対照群のうちのＴＣ０群のマウス）より有意に高い値を示し、この値が投与期間中もほぼ維持されたことが分かる。なお、図１において、「日数」は、塩酸テトラサイクリン投与開始後の経過日数を表す。【００３１】
採血及び解剖：
塩酸テトラサイクリン投与終了日翌日（投与開始後１１日目）に、マウスにイソフルランを吸入させて麻酔し、尾部をピンセットでつまんで痛覚が消失したことを確認した後、開腹して腹部大静脈よりヘパリン入りシリンジで採血した。採取した血液を４℃、７５００ｒｐｍで１０分間遠心し、血漿を分離した。得られた血漿は凍結保存した。採血後、速やかに胸郭を切開して十分に放血した後、肝臓を摘出した。肝臓の一葉は凍結保存した。また、肝臓の一部（約５０ｍｇ）を切り取り、液体窒素中で凍結保存した。更に、肝臓の中間葉を１０％中性緩衝ホルマリン液で固定した。【００３２】
血漿ＡＬＴ濃度、血漿ＡＳＴ濃度、血漿インスリン濃度及び血漿グルコース濃度の測定：
凍結保存していた血漿を用いて、血漿ＡＬＴ濃度、血漿ＡＳＴ濃度及び血漿グルコース濃度を日立自動分析装置7070（日立ハイテクノロジーズ社）で、血漿インスリン濃度をインスリン測定キット（生化学工業社）で測定した。図２は、ＨＦＤ又は対照餌を８週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを１０日間腹腔内投与したマウスの血漿ＡＬＴ濃度を示す棒グラフである。図３は、ＨＦＤ又は対照餌を８週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを１０日間腹腔内投与したマウスの血漿ＡＳＴ濃度を示す棒グラフである。図２及び３より、血漿ＡＬＴ濃度及び血漿ＡＳＴ濃度では、ＨＦＤ群のうち、ＴＣ３０群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示したことが分かる。図４は、ＨＦＤ又は対照餌を８週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを１０日間腹腔内投与したマウスの血漿インスリン濃度を示す棒グラフである。図５は、ＨＦＤ又は対照餌を８週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを１０日間腹腔内投与したマウスの血漿グルコース濃度を示す棒グラフである。図４及び５より、血漿インスリン濃度及び血漿グルコース濃度では、ＨＦＤ群のマウスが通常のマウスと同程度の値か、それより高い値を示したことが分かる。【００３３】
肝臓ＴＧ量の測定：
凍結保存していた肝臓の一葉をホモジネートとし、このホモジネートの一部から Folch の試薬で脂質画分を抽出した後、これを窒素ガスで乾固し、デタミナーＬ ＴＧII（協和メデックス社）でＴＧ量を測定した。図６は、ＨＦＤ又は対照餌を８週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを１０日間腹腔内投与したマウスの肝臓ＴＧ量を示す棒グラフである。図６より、肝臓ＴＧ量では、ＨＦＤ群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示し、中でもＴＣ３０群のマウスが著しく高い値を示したことが分かる。【００３４】
肝臓ＴＮＦα ｍＲＮＡ量及び肝臓ＩＬ−１β ｍＲＮＡ量の測定：
液体窒素中で凍結保存していた肝臓の一部から ISOGEN（ニッポンジーン社）でＲＮＡを抽出した後、アプライドバイオシステムズ社のリアルタイム定量ＰＣＲ試薬でｃＤＮＡを合成し、１８Ｓ ｒＲＮＡを内部標準として、ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System（アプライドバイオシステムズ社）でＴＮＦα ｍＲＮＡ量及びＩＬ−１β ｍＲＮＡ量を測定した。図７は、ＨＦＤ又は対照餌を８週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを１０日間腹腔内投与したマウスの肝臓ＴＮＦα ｍＲＮＡ量を示す棒グラフである。図８は、ＨＦＤ又は対照餌を８週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを１０日間腹腔内投与したマウスの肝臓ＩＬ−１β ｍＲＮＡ量を示す棒グラフである。図７及び８より、肝臓ＴＮＦα ｍＲＮＡ量及び肝臓ＩＬ−１β ｍＲＮＡ量では、ＨＦＤ群のうち、ＴＣ１０群及びＴＣ３０群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示したことが分かる。【００３５】
肝臓の病理組織学的検査：
ホルマリン液で固定した肝臓の中間葉からパラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色及びオイルレッドＯ染色（脂肪染色）を行って、病理組織学的検査を行った。図９は、ＨＦＤを８週間摂取させて塩酸テトラサイクリン３０ｍｇ／ｋｇ／日を１０日間腹腔内投与したマウスの肝臓中間葉の切片に対するヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す光学顕微鏡写真に対応する図である。図１０は、図９の黒枠で示された部分を拡大した光学顕微鏡写真に対応する図である。図１１は、ＨＦＤを８週間摂取させて塩酸テトラサイクリン３０ｍｇ／ｋｇ／日を１０日間腹腔内投与したマウスの肝臓中間葉の切片に対するオイルレッドＯ染色の結果を示す光学顕微鏡写真に対応する図である。図９〜１１より、ＨＦＤ群のうち、ＴＣ３０群のマウスにおいて、脂肪肝の存在及び炎症細胞の浸潤が認められたことが分かる。【００３６】
実施例１及び比較例１により、マウスに高脂肪食を８週間摂取させた後、塩酸テトラサイクリン３０ｍｇ／ｋｇ／日を１０日間腹腔内投与することによって、体重、血中インスリン濃度及び血中グルコース濃度が正常値又はそれより高い値を示すＮＡＳＨ病態モデル動物が作製されることが示された。【００３７】
（実施例２）
ＨＦＤの給餌、及び塩酸テトラサイクリンの皮下投与：
マウス（７週齢）２０匹にＨＦＤを８週間自由摂取させた。その後、体重及び体脂肪率が群間で均等になるように４群（５匹×４）に分け、塩酸テトラサイクリン０、３０、６０及び１００ｍｇ／ｋｇ／日を１０日間皮下投与した（以下、塩酸テトラサイクリン０、３０、６０及び１００ｍｇ／ｋｇ／日を投与した群をそれぞれ「ＴＣ０群」、「ＴＣ３０群」、「ＴＣ６０群」及び「ＴＣ１００群」という）。ＨＦＤは、塩酸テトラサイクリン投与期間中もマウスに自由摂取させた。【００３８】
体重の測定：
マウスの体重を、塩酸テトラサイクリン投与開始の３日前に測定し、更に投与開始日翌日から１１日目まで毎日測定した。図１２は、ＨＦＤを８週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを１０日間皮下投与したマウスにおける体重の推移を示す折れ線グラフである。図１２より、いずれの群のマウスも塩酸テトラサイクリン投与開始時に通常のマウスより有意に高い値を示したこと、及び体重は塩酸テトラサイクリンの投与量及び投与日数に応じて減少したが、いずれの群のマウスも塩酸テトラサイクリン投与終了時に通常のマウスと同程度か、それより高い値を示したことが分かる（図１参照）。なお、図１２において、「日数」は、塩酸テトラサイクリン投与開始後の経過日数を表す。【００３９】
採血及び解剖：
採血及び解剖を、実施例１と同様に行った。【００４０】
血漿ＡＬＴ濃度、血漿ＡＳＴ濃度、血漿インスリン濃度及び血漿グルコース濃度の測定：
血漿ＡＬＴ濃度、血漿ＡＳＴ濃度、血漿インスリン濃度及び血漿グルコース濃度を、実施例１と同様に測定した。図１３は、ＨＦＤを８週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを１０日間皮下投与したマウスの血漿ＡＬＴ濃度を示す棒グラフである。図１４は、ＨＦＤを８週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを１０日間皮下投与したマウスの血漿ＡＳＴ濃度を示す棒グラフである。図１３及び１４より、血漿ＡＬＴ濃度及び血漿ＡＳＴ濃度では、ＴＣ３０群、ＴＣ６０群及びＴＣ１００群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示したことが分かる（図２及び３参照）。図１５は、ＨＦＤを８週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを１０日間皮下投与したマウスの血漿インスリン濃度を示す棒グラフである。図１５より、血漿インスリン濃度では、ＴＣ０群、ＴＣ３０群及びＴＣ６０群のマウスが通常のマウスより高い値を示し、ＴＣ１００群のマウスが通常のマウスと同程度の値を示したことが分かる（図４参照）。図１６は、ＨＦＤを８週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを１０日間皮下投与したマウスの血漿グルコース濃度を示す棒グラフである。図１６より、血漿グルコース濃度では、いずれの群のマウスも通常のマウスより高い値を示したことが分かる（図５参照）。【００４１】
肝臓ＴＧ量の測定：
肝臓ＴＧ量を、実施例１と同様に測定した。図１７は、ＨＦＤを８週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを１０日間皮下投与したマウスの肝臓ＴＧ量を示す棒グラフである。図１７より、肝臓ＴＧ量では、いずれの群のマウスも通常のマウスより有意に高い値を示し、中でもＴＣ３０群のマウスが著しく高い値を示したことが分かる（図６参照）。【００４２】
肝臓ＴＮＦα ｍＲＮＡ量及び肝臓ＩＬ−１β ｍＲＮＡ量の測定：
肝臓ＴＮＦαｍＲＮＡ量及び肝臓ＩＬ−１β ｍＲＮＡ量を、実施例１と同様に測定した。図１８は、ＨＦＤを８週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを１０日間皮下投与したマウスの肝臓ＴＮＦα ｍＲＮＡ量を示す棒グラフである。図１９は、ＨＦＤを８週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを１０日間皮下投与したマウスの肝臓ＩＬ−１β ｍＲＮＡ量を示す棒グラフである。図１８及び１９より、肝臓ＴＮＦα ｍＲＮＡ量及び肝臓ＩＬ−１β ｍＲＮＡ量では、ＴＣ３０群、ＴＣ６０群及びＴＣ１００群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示し、中でもＴＣ３０群のマウスがいずれのｍＲＮＡ量においても著しく高い値を示したことが分かる（図７及び８参照）。【００４３】
肝臓の病理組織学的検査：
肝臓の病理組織学的検査を、実施例１と同様に行った。ＴＣ３０群、ＴＣ６０群及びＴＣ１００群のマウスにおいて、脂肪肝の存在及び炎症細胞の浸潤が認められた。【００４４】
実施例２により、マウスに高脂肪食を８週間摂取させた後、塩酸テトラサイクリンを１０日間皮下投与することによって、体重、血中インスリン濃度及び血中グルコース濃度が正常値又はそれより高い値を示すＮＡＳＨ病態モデル動物が作製されることが示された。【００４５】
（実施例３及び比較例２）
マウス（７週齢）１２匹をＨＦＤ群６匹と対照群６匹とに分けた。ＨＦＤ群（６匹）及び対照群（６匹）に関する以下の実験を、それぞれ実施例３及び比較例２とする。【００４６】
ＨＦＤ又は対照餌の給餌：
ＨＦＤ群及び対照群のマウスには、それぞれＨＦＤ及び対照餌を５０週間自由摂取させた。【００４７】
体重の測定：
マウスの体重を、ＨＦＤ又は対照餌の給餌を終了した後、採血前（麻酔前）に測定した。図２０は、ＨＦＤ又は対照餌を５０週間摂取させたマウスの体重を示す棒グラフである。図２０より、体重では、ＨＦＤ群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示したことが分かる（図１参照）。【００４８】
採血及び解剖：
採血及び解剖を、ＨＦＤ又は対照餌の給餌を終了した直後に、実施例１と同様に行った。【００４９】
血漿ＡＬＴ濃度、血漿ＡＳＴ濃度、血漿インスリン濃度及び血漿グルコース濃度の測定：
血漿ＡＬＴ濃度、血漿ＡＳＴ濃度、血漿インスリン濃度及び血漿グルコース濃度を、実施例１と同様に測定した。図２１は、ＨＦＤ又は対照餌を５０週間摂取させたマウスの血漿ＡＬＴ濃度を示す棒グラフである。図２２は、ＨＦＤ又は対照餌を５０週間摂取させたマウスの血漿ＡＳＴ濃度を示す棒グラフである。図２１及び２２より、血漿ＡＬＴ濃度及び血漿ＡＳＴ濃度では、ＨＦＤ群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示したことが分かる（図２及び３参照）。図２３は、ＨＦＤ又は対照餌を５０週間摂取させたマウスの血漿インスリン濃度を示す棒グラフである。図２３より、血漿インスリン濃度では、ＨＦＤ群のマウスが通常のマウスより高い値を示したことが分かる（図４参照）。図２４は、ＨＦＤ又は対照餌を５０週間摂取させたマウスの血漿グルコース濃度を示す棒グラフである。図２４より、血漿グルコース濃度では、ＨＦＤ群のマウスが通常のマウスと同程度の値を示したことが分かる（図５参照）。【００５０】
肝臓ＴＧ量の測定：
肝臓ＴＧ量を、実施例１と同様に測定した。図２５は、ＨＦＤ又は対照餌を５０週間摂取させたマウスの肝臓ＴＧ量を示す棒グラフである。図２５より、肝臓ＴＧ量では、ＨＦＤ群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示したことが分かる（図６参照）。【００５１】
肝臓ＴＮＦα ｍＲＮＡ量及び肝臓ＩＬ−１β ｍＲＮＡ量の測定：
肝臓ＴＮＦαｍＲＮＡ量及び肝臓ＩＬ−１β ｍＲＮＡ量を、実施例１と同様に測定した。図２６は、ＨＦＤ又は対照餌を５０週間摂取させたマウスの肝臓ＴＮＦα ｍＲＮＡ量を示す棒グラフである。図２７は、ＨＦＤ又は対照餌を５０週間摂取させたマウスの肝臓ＩＬ−１β ｍＲＮＡ量を示す棒グラフである。図２６及び２７より、肝臓ＴＮＦα ｍＲＮＡ量及び肝臓ＩＬ−１β ｍＲＮＡ量では、ＨＦＤ群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示したことが分かる（図７及び８参照）。【００５２】
肝臓の病理組織学的検査：
肝臓の病理組織学的検査を、実施例１と同様に行った。図２８は、ＨＦＤを５０週間摂取させたマウスの肝臓中間葉の切片に対するヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す光学顕微鏡写真に対応する図である。図２９は、対照餌を５０週間摂取させたマウスの肝臓中間葉の切片に対するヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す光学顕微鏡写真に対応する図である。図２８及び２９より、ＨＦＤ群のマウスにおいて、脂肪肝の存在及び炎症細胞の浸潤が認められたことが分かる。【００５３】
肝臓Ｉ型コラーゲン（α１）ｍＲＮＡ量及び肝臓α−ＳＭＡ ｍＲＮＡ量の測定：
肝臓の線維化が生じているかどうかを、肝臓Ｉ型コラーゲン（α１）ｍＲＮＡ量及び肝臓α−ＳＭＡ ｍＲＮＡ量を指標として確認した。
肝臓Ｉ型コラーゲン（α１）ｍＲＮＡ量及び肝臓α−ＳＭＡ ｍＲＮＡ量の測定は、実施例1における肝臓ＴＮＦαｍＲＮＡ量及び肝臓ＩＬ−１β ｍＲＮＡ量の測定と同様の方法で行った。図３０は、ＨＦＤ又は対照餌を５０週間摂取させたマウスの肝臓Ｉ型コラーゲン（α１）ｍＲＮＡ量を示す棒グラフである。図３１は、ＨＦＤ又は対照餌を５０週間摂取させたマウスの肝臓α−ＳＭＡ ｍＲＮＡ量を示す棒グラフである。図３０及び３１より、肝臓Ｉ型コラーゲン（α１）ｍＲＮＡ量及び肝臓α−ＳＭＡ ｍＲＮＡ量では、ＨＦＤ群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示したことが分かる。そして、そのことから、ＨＦＤ群のマウスでは、通常のマウスと異なり、肝臓の線維化が生じていたことが分かる。【００５４】
実施例３及び比較例２により、マウスに高脂肪食を５０週間摂取させることによって、体重、血中インスリン濃度及び血中グルコース濃度が正常値又はそれより高い値を示し、かつ肝臓の線維化が生じているＮＡＳＨ病態モデル動物が作製されることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎治療薬の開発に利用することができる。
【図１】
2006030792.tif 000002
【図２】
2006030792.tif 000003
【図３】
2006030792.tif 000004
【図４】
2006030792.tif 000005
【図５】
2006030792.tif 000006
【図６】
2006030792.tif 000007
【図７】
2006030792.tif 000008
【図８】
2006030792.tif 000009
【図９】
2006030792.tif 000010
【図１０】
2006030792.tif 000011
【図１１】
2006030792.tif 000012
【図１２】
2006030792.tif 000013
【図１３】
2006030792.tif 000014
【図１４】
2006030792.tif 000015
【図１５】
2006030792.tif 000016
【図１６】
2006030792.tif 000017
【図１７】
2006030792.tif 000018
【図１８】
2006030792.tif 000019
【図１９】
2006030792.tif 000020
【図２０】
2006030792.tif 000021
【図２１】
2006030792.tif 000022
【図２２】
2006030792.tif 000023
【図２３】
2006030792.tif 000024
【図２４】
2006030792.tif 000025
【図２５】
2006030792.tif 000026
【図２６】
2006030792.tif 000027
【図２７】
2006030792.tif 000028
【図２８】
2006030792.tif 000029
【図２９】
2006030792.tif 000030
【図３０】
2006030792.tif 000031
【図３１】
2006030792.tif 000032
【国際調査報告】
2006030792.tif 000033
2006030792.tif 000034