(57)【要約】本発明は、温和な条件下でタンパク質を修飾してタンパク質のイオン化効率を向上させる。  特定の官能基を有しかつ三座配位子を有する金属錯体を目的のタンパク質と結合させることによって、タンパク質の性質に依存することなくタンパク質を高感度で検出する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質イオン化効率を向上させるための方法であって、目的のタンパク質表面に有機残基誘導体を導入する工程を包含することを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記有機残基誘導体が金属錯体であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記金属錯体の配位子が三座配位子であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記金属錯体の配位子がテルピリジンであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記金属錯体の金属元素が遷移元素または典型元素であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記金属錯体の金属元素がＰｔ、Ｐｄ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｃｒ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ａｇ、Ａｕ、ＯｓまたはＩｒであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記金属錯体が４級アンモニウムを有することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記金属錯体が、以下の式
【化１】
2006080210.tif 000015
によって示され、
ここで、Ｒは、Ｈまたは４級アンモニウムであり、Ｘは、ＰｔまたはＣｕであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
目的のタンパク質表面に存在するアミノ酸側鎖の非共有電子対と前記金属錯体とを配位させる工程を包含することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
三座配位子を有する金属錯体を備えることを特徴とする、タンパク質イオン化効率を向上させるためのキット。
【請求項１１】
前記配位子がテルピリジンであることを特徴とする、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記金属錯体の金属元素が遷移元素または典型元素であることを特徴とする、請求項１０に記載のキット。
【請求項１３】
前記金属錯体の金属元素がＰｔ、Ｐｄ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｃｒ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ａｇ、Ａｕ、ＯｓまたはＩｒであることを特徴とする、請求項１０に記載のキット。
【請求項１４】
前記金属錯体が４級アンモニウムを有することを特徴とする、請求項１０に記載のキット。
【請求項１５】
前記金属錯体が、以下の式
【化２】
2006080210.tif 000016
によって示され、
ここで、Ｒは、Ｈまたは４級アンモニウムであり、Ｘは、ＰｔまたはＣｕであることを特徴とする、請求項１０に記載のキット。
【請求項１６】
三座配位子を有することを特徴とする、金属錯体。
【請求項１７】
前記配位子がテルピリジンであることを特徴とする、請求項１６に記載の金属錯体。
【請求項１８】
前記金属錯体の金属元素が遷移元素または典型元素であることを特徴とする、請求項１６に記載の金属錯体。
【請求項１９】
前記金属錯体の金属元素がＰｔ、Ｐｄ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｃｒ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ａｇ、Ａｕ、ＯｓまたはＩｒであることを特徴とする、請求項１６に記載の金属錯体。
【請求項２０】
４級アンモニウムを有することを特徴とする、請求項１６に記載の金属錯体。
【請求項２１】
以下の式
【化３】
2006080210.tif 000017
によって示され、
ここで、Ｒは、Ｈまたは４級アンモニウムであり、Ｘは、ＰｔまたはＣｕであることを特徴とする、請求項１６に記載の金属錯体。
【請求項２２】
請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の金属錯体を含み、タンパク質の質量分析におけるイオン化効率を向上させることを特徴とする組成物。
【請求項２３】
質量分析において、検出感度を向上させるために用いられることを特徴とする請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
請求項１０〜１５のいずれか１項に記載のキット、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の金属錯体、または請求項２２に記載の組成物を用いて、
タンパク質の表面に機能性残基を導入することによって、当該タンパク質に前記機能性残基に起因する機能を付与することを特徴とする人工タンパク質の製造方法。
【請求項２５】
請求項１０〜１５のいずれか１項に記載のキット、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の金属錯体、または請求項２２に記載の組成物を用いて、タンパク質におけるヒスチジン残基、アルギニン残基、および／またはシステイン残基の有無を判定することを特徴とするタンパク質の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、タンパク質の質量分析におけるイオン化効率を向上させるための試薬、方法およびキットに関するものであり、具体的には、イオン化する前のタンパク質表面に導入する試薬、該試薬を導入してタンパク質を修飾するための方法、および該試薬を備えるキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】  分析化学、特に質量分析の分野においては、多くのイオン化法が開発され、ポストゲノムの研究において利用されている。しかし、不安定な有機化合物、ホスト分子−ゲスト分子、および／または生体分子間の相互作用を質量分析によって測定することは非常に困難である。質量分析では、分子のイオン化の過程において、測定する分子に電圧、熱、レーザーなどによって一定のエネルギーを加える必要がある。その結果、溶液中の分子間に生じる水素結合などの弱い相互作用が切断されたり、分子内結合の開裂によるフラグメント化が生じたりするので、質量分析を用いて溶液中の本来の分子の挙動を観測することが困難であった。【０００３】  近年、より本来の分子挙動を観測するために、従来のイオン化法を改良した新しいイオン化法に基づく質量分析装置（コールドスプレーイオン化質量分析（ｃｏｌｄ  ｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＣＳＩ−Ｍａｓｓ）装置）が開発された（非特許文献１を参照のこと）。この装置は、より安定な有機分子および／または分子間のクラスターなどを観測するために、従来のエレクトロニクススプレーイオン化質量分析（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＥＳＩ−Ｍａｓｓ）装置を改良したものである。【０００４】  ＣＳＩ−Ｍａｓｓは、不安定な分子を分析するために非常に有効であり、特に溶液中での分子動態の解析（非共有結合性相互作用に基づく分子種の溶液動態解析）に現在多用されている。【０００５】  ＣＳＩ−Ｍａｓｓ装置の特徴は、従来のＥＳＩ−Ｍａｓｓにおいてイオン化に用いられるネブライジングガスを１５℃〜−８０℃という低温に制御することができ、イオン化を低温で行えることである。本来ＥＳＩ−Ｍａｓｓでは、電圧をかけたニードル先端からネブライジングガスとともに試料溶液をスプレーし、２５０℃〜室温の脱溶媒室にてスプレーされた液滴の蒸発を行うことによって試料分子のイオン化を促進させる。一方、ＣＳＩ−Ｍａｓｓでは、低温にして分子の分極率を増大させ、イオン化を促進させるという新たな方法を取り入れている。【０００６】  ＣＳＩ−Ｍａｓｓの最大の利点は、イオン化の際に高温にする必要がない点であり、溶液内の試料分子が有する弱い相互作用を観測することに適している。その証拠に、山口らはＣＳＩ−Ｍａｓｓを利用して不安定な有機金属錯体および／または生体分子（アミノ酸、ＤＮＡなど）、水の溶液構造解析を行い、装置の有する優位性を示している（非特許文献１を参照のこと）。【０００７】  イオン化効率を向上させるために、質量分析計の改良が試みられている（例えば、特許文献１〜３を参照のこと）。また、特許文献４には、オリゴヌクレオチド試料にトリエチルアミンを加えることによってオリゴヌクレオチドのイオン化効率を向上させて検出効率が２０％上昇したことが記載されている。【０００８】
【特許文献１】特開２００３−２８８４９公報（平成１５年１月２９日公開）
【特許文献２】特開２００３−１５１４８６公報（平成１５年５月２３日公開）
【特許文献３】特開２００４−２５７８７３公報（平成１６年９月１６日公開）
【特許文献４】特開２００３−０４７０４公報（平成１５年１月８日公開）
【非特許文献１】Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，３８：４７３−４９０（２００３）
【発明の開示】
【０００９】  しかし、ＣＳＩ−Ｍａｓｓは以下のような欠点を有する。第１に、イオン化の際の脱溶媒を促すために必要な加温および脱溶媒ガスを使用しないために、ＥＳＩ−Ｍａｓｓと比べて試料分子の測定感度が低いことである。第２に、試料分子が溶媒分子または他の分子との非特異的な結合をしたままイオン化されるために、試料分子の感度の低下を招くと同時に、特異的に結合している分子の観測を妨げることである。特に、タンパク質などの高分子試料においては、試料の特性（分子量および／またはアミノ酸組成）に依存した影響が顕著に現れる。
【００１０】  したがって、ＣＳＩ−Ｍａｓｓを用いたタンパク質の相互作用解析をより汎用性の高いものとするためには、タンパク質の物性に依存することなく効率的にイオン化する方法を開発することが不可欠である。タンパク質を質量分析する際のイオン化効率を向上させる従来法として、タンパク質表面に化学的にアミジンまたはグアニジンを導入する方法が知られているが、このような方法では塩基性条件にすることが必要であり、反応制御も困難であった。
【００１１】  本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、低温および／または中性などの温和な条件下でのタンパク質修飾を実現することにある。具体的には、ＣＳＩ−ＴＯＦ  Ｍａｓｓにおけるイオン化効率を向上させ得る試薬を提供し、本試薬を用いる低温および中性の温和な条件下でのタンパク質修飾を実現することにある。
【００１２】  本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるための方法は、目的のタンパク質表面に有機残基誘導体を導入する工程を包含することを特徴としている。
【００１３】  本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるための方法において、上記有機残基誘導体は金属錯体であることが好ましい。
【００１４】  本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるための方法において、上記金属錯体の配位子は三座配位子であることが好ましい。
【００１５】  本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるための方法において、上記金属錯体の配位子はテルピリジンであることが好ましい。
【００１６】  本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるための方法において、上記金属錯体の金属元素は遷移元素または典型元素であることが好ましい。
【００１７】  本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるための方法において、上記金属錯体の金属元素はＰｔ、Ｐｄ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｃｒ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ａｇ、Ａｕ、ＯｓまたはＩｒであることが好ましい。
【００１８】  本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるための方法において、上記金属錯体は４級アンモニウムを有することが好ましい。
【００１９】  本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるための方法において、上記金属錯体は、以下の式
【００２０】
【化４】
2006080210.tif 000002
【００２１】によって示され、
ここで、Ｒは、Ｈまたは４級アンモニウムであり、Ｘは、ＰｔまたはＣｕであることが好ましい。
【００２２】  本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるための方法は、目的のタンパク質表面に存在するアミノ酸側鎖の非共有電子対と上記金属錯体とを配位させる工程を包含することが好ましい。
【００２３】  本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるためのキットは、三座配位子を有する金属錯体を備えることを特徴としている。
【００２４】  本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるためのキットにおいて、上記配位子はテルピリジンであることが好ましい。
【００２５】  本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるためのキットにおいて、上記金属錯体の金属元素は遷移元素または典型元素であることが好ましい。
【００２６】  本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるためのキットにおいて、上記金属錯体の金属元素はＰｔ、Ｐｄ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｃｒ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ａｇ、Ａｕ、ＯｓまたはＩｒであることが好ましい。
【００２７】  本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるためのキットにおいて、上記金属錯体は４級アンモニウムを有することが好ましい。
【００２８】  本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるためのキットにおいて、上記金属錯体は、以下の式
【００２９】
【化５】
2006080210.tif 000003
【００３０】によって示され、
ここで、Ｒは、Ｈまたは４級アンモニウムであり、Ｘは、ＰｔまたはＣｕであることが好ましい。
【００３１】  本発明に係る金属錯体は、三座配位子を有することを特徴としている。
【００３２】  本発明に係る金属錯体において、上記配位子はテルピリジンであることが好ましい。
【００３３】  本発明に係る金属錯体において、上記金属錯体の金属元素は遷移元素または典型元素であることが好ましい。
【００３４】  本発明に係る金属錯体において、上記金属錯体の金属元素はＰｔ、Ｐｄ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｃｒ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ａｇ、Ａｕ、ＯｓまたはＩｒであることが好ましい。
【００３５】  本発明に係る金属錯体は、４級アンモニウムを有することが好ましい。
【００３６】  本発明に係る金属錯体は、以下の式
【００３７】
【化６】
2006080210.tif 000004
【００３８】によって示され、
ここで、Ｒは、Ｈまたは４級アンモニウムであり、Ｘは、ＰｔまたはＣｕであることが好ましい。
【００３９】  本発明に係る組成物は、上記金属錯体を含み、タンパク質の質量分析におけるイオン化効率を向上させることを特徴としている。
【００４０】  上記組成物は、質量分析において、検出感度を向上させるために用いられることが好ましい。
【００４１】  本発明に係る人工タンパク質の製造方法は、上記キット、金属錯体、または組成物を用いて、タンパク質の表面に機能性残基を導入することによって、当該タンパク質に前記機能性残基に起因する機能を付与することを特徴としている。
【００４２】  また、本発明に係るタンパク質の分析方法は、上記キット、金属錯体、または組成物を用いて、タンパク質におけるヒスチジン残基、アルギニン残基、および／またはシステイン残基の有無を判定することを特徴としている。
【００４３】  本発明に係る方法を使用すれば、導入する残基の化学構造に制限されることなくタンパク質への機能性残基導入を実現することができる。また、本発明に係る方法を使用すれば、錯体形成反応を利用した温和な条件下でタンパク質表面を修飾することができるので、タンパク質機能を損なうことなく機能分子を導入することができる。さらに、本発明に係る方法を使用すれば、人工タンパク質創成への応用を促進することができる。
【００４４】  本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、化合物（１）（白金クロロ（２，２’：６’，２’’−テルピリジン））でのＧａｌＴの修飾を種々の脱溶媒室温度にて行った際の質量分析の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、未修飾のＧａｌＴおよび修飾されたＧａｌＴを示す図１中のスペクトルに対してデコンボリューション処理を行った結果を示すグラフである。
【図３】図３は、図２に示したグラフにおける未修飾のＧａｌＴおよび修飾されたＧａｌＴのピーク面積について、２００℃にて測定した値を１とした場合の相対値を示すグラフである。
【図４】図４は、修飾されたＧａｌＴのピーク面積と未修飾のＧａｌＴのピーク面積との面積比を示すグラフである。
【図５】図５は、化合物（２）でのＧａｌＴの修飾を種々の脱溶媒室温度にて行った際の質量分析の結果を示すグラフである。
【図６】図６は、未修飾のＧａｌＴおよび修飾されたＧａｌＴを示す図５中のスペクトルに対してデコンボリューション処理を行った結果を示すグラフである。
【図７】図７は、図６に示したグラフにおける未修飾のＧａｌＴおよび修飾されたＧａｌＴのピーク面積について、２００℃にて測定した値を１とした場合の相対値を示すグラフである。
【図８】図８は、修飾されたＧａｌＴのピーク面積と未修飾のＧａｌＴのピーク面積との面積比を示すグラフである。
【図９】図９は、化合物（１）を修飾したＧａｌＴ、または未修飾のＧａｌＴとＵＤＰとの複合体の質量分析の結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、図９中のスペクトルに対してデコンボリューション処理を行った結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、化合物（１）を修飾したＧａｌＴ、または未修飾のＧａｌＴとＵＤＰ−Ｇａｌとの複合体の質量分析の結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、図１１中のスペクトルに対してデコンボリューション処理を行った結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】  本発明者らは、タンパク質表面のアミノ酸側鎖の非共有電子対に金属錯体を導入し、錯体導入によってタンパク質機能が損なわれていないことを確認した。また、本発明者らの作製した金属錯体は、官能基を改良することによってイオン化効率を向上させることができた。【００４７】  本発明は、タンパク質の質量分析におけるイオン化効率を向上させるための試薬、方法およびキットを提供する。以下に、これらについて詳述する。【００４８】  〔１〕イオン化効率を向上させるための試薬
本発明は、タンパク質の質量分析におけるイオン化効率を向上させるための金属錯体を提供する。本発明に係る金属錯体の有する配位子は、単座配位子または多座配位子のいずれでもよいが、錯体の安定性の観点から、三座配位子が好ましい。三座配位子としては、テルピリジン、ジエチレントリアミン、シッフ塩基、トリアザシクロアルカン、テトラキス（２’−アミノエチル）−１，２−ジアミノプロパン、オクタアザビシクロ［６．６．６］アイコサンなどが挙げられるが、官能基を導入しやすい配位子として、テルピリジンが好ましい。官能基としては、グアニジン（−ＮＨ−Ｃ（−ＮＨ２）＝ＮＨ２＋）もしくはアミジン（−Ｃ（−ＮＨ２）＝ＮＨ２＋）を有するもの（例えば、アルギニン）、または４級カチオン（−Ｎ（ＣＨ３）＋）を有するものが好ましいが、質量分析におけるイオン化の段階で開裂しないものであることが好ましく、４級アンモニウムが特に好ましい。本発明に係る金属錯体は、上記官能基を１つまたは複数個有する。【００４９】  本発明に係る金属錯体において、上記金属錯体の金属元素は遷移元素または典型元素であることが好ましく、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｃｒ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ａｇ、Ａｕ、ＯｓまたはＩｒがより好ましい。【００５０】  本発明に係る金属錯体は、以下の式【００５１】
【化７】
2006080210.tif 000005
【００５２】によって示され、
ここで、Ｒは、Ｈまたは４級アンモニウムであり、Ｘは、ＰｔまたはＣｕであることが好ましい。【００５３】  本発明の上記官能基を有する金属錯体は、まず、上記官能基を有する配位子を調製し、次いで、この配位子を金属に配位させることによって合成することができる。例えば、【００５４】
【化８】
2006080210.tif 000006
【００５５】に示される化合物（２）を合成する場合、まず、アミンがテルピリジン骨格の４位に導入された化合物（３）【００５６】
【化９】
2006080210.tif 000007
【００５７】を調製し、次いで、化合物（３）を還元して化合物（４）【００５８】
【化１０】
2006080210.tif 000008
【００５９】を得、化合物（４）を金属塩と反応させて、４級アンモニウムを有するテルビリジン金属錯体を得る。得られた金属錯体は、核磁気共鳴スペクトル、可視紫外吸収スペクトル、質量分析等によって同定することができる。【００６０】  本発明に係る金属錯体は、タンパク質表面のアミノ酸側鎖の非共有電子対（ヒスチジン、アルギニン、システイン）との配位を利用してタンパク質表面に結合するものであり、本発明に係る金属錯体を使用すれば、タンパク質表面に任意の機能性物質（例えば、糖鎖）を温和な条件で導入することができる。これによって、タンパク質にターゲット能および／または加水分解抵抗性を付与することができる。【００６１】  なお、本発明には、上記金属錯体の溶液のように、上記金属錯体に加えて、その他の化合物を含み、タンパク質の質量分析におけるイオン化効率を向上させる組成物も含まれる。当該組成物は、質量分析において、検出感度を向上させるために好適に用いることができる。【００６２】  また、上記金属錯体および組成物は、上述のように、タンパク質表面に任意の機能性残基を温和な条件で導入することができるため、タンパク質に新たな機能を付与した人工タンパク質を創成するために用いることができる。したがって、本発明には、上記金属錯体または組成物を用いて、タンパク質の表面に機能性残基を導入することにより、当該タンパク質に前記機能性残基に起因する機能を付与する人工タンパク質の製造方法も含まれる。上記機能性残基としては、例えば、糖鎖を挙げることができるが、本発明はこれに限定されるものではない。【００６３】  さらに、上記金属錯体によれば、タンパク質のヒスチジン残基、アルギニン残基、および／またはシステイン残基が修飾されるので、当該タンパク質における上記アミノ酸残基の有無を判定することができる。したがって、本発明には、上記金属錯体または組成物を用いて、タンパク質におけるヒスチジン残基、アルギニン残基、および／またはシステイン残基の有無を判定するタンパク質の分析方法も含まれる。【００６４】  上記アミノ酸残基の有無は、上記金属錯体または組成物とタンパク質とを反応させ、反応後のタンパク質をそのまま、もしくは当該タンパク質を適宜プロテアーゼ等で分解することにより得られるペプチドを質量分析することにより判定することができる。【００６５】  〔２〕イオン化効率を向上させるためのキット
本発明は、タンパク質の質量分析におけるイオン化効率を向上させるための試薬を備えたキットを提供する。本発明に係るキットは、金属錯体を試薬として備えることが好ましく、上述したように、該金属錯体の有する配位子は、単座配位子または多座配位子のいずれでもよいが、錯体の安定性の観点から、三座配位子が好ましい。三座配位子としては、テルピリジン、ジエチレントリアミン、シッフ塩基、トリアザシクロアルカン、テトラキス（２’−アミノエチル）−１，２−ジアミノプロパン、オクタアザビシクロ［６．６．６］アイコサンなどが挙げられるが、官能基を導入しやすい配位子として、テルピリジンが好ましい。官能基としては、グアニジン（−ＮＨ−Ｃ（−ＮＨ２）＝ＮＨ２＋）もしくはアミジン（−Ｃ（−ＮＨ２）＝ＮＨ２＋）を有するもの（例えば、アルギニン）、または４級カチオン（−Ｎ（ＣＨ３）＋）を有するものが好ましいが、質量分析におけるイオン化の段階で開裂しないものであることが好ましく、４級アンモニウムが特に好ましい。本発明に係るキットに備えられる試薬（金属錯体）は、上記官能基を１つまたは複数個有する。【００６６】  本発明に係る金属錯体において、上記金属錯体の金属元素は遷移元素または典型元素であることが好ましく、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｃｒ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ａｇ、Ａｕ、ＯｓまたはＩｒがより好ましい。【００６７】  本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるためのキットにおいて、上記金属錯体は、以下の式【００６８】
【化１１】
2006080210.tif 000009
【００６９】によって示され、
ここで、Ｒは、Ｈまたは４級アンモニウムであり、Ｘは、ＰｔまたはＣｕであることが好ましい。【００７０】  本発明に係るキットは、タンパク質表面のアミノ酸側鎖の非共有電子対（ヒスチジン、アルギニン、システイン）と配位する金属錯体を試薬として利用してタンパク質表面に任意の機能性物質（例えば、糖鎖）を温和な条件で導入するためのものである。これによって、タンパク質にターゲット能および／または加水分解抵抗性を付与することができる。【００７１】  すなわち、本発明に係るキットによれば、タンパク質に新たな機能を付与した人工タンパク質を創成するために用いることができる。したがって、本発明には、上記キットを用いて、タンパク質表面に機能性残基を導入することにより、人工タンパク質を創成する方法も含まれる。上記機能性残基としては、例えば、糖鎖を挙げることができるが、本発明はこれに限定されるものではない。【００７２】  また、発明に係る金属錯体は、タンパク質のヒスチジン残基、アルギニン残基、および／またはシステイン残基を修飾するので、当該タンパク質における上記アミノ酸残基の有無を判定することができる。したがって、本発明には、上記キットを用いて、タンパク質におけるヒスチジン残基、アルギニン残基、および／またはシステイン残基の有無を判定するタンパク質の分析方法も含まれる。【００７３】  〔３〕イオン化効率を向上させるための方法
本発明は、タンパク質の質量分析におけるイオン化効率を向上させるための方法を提供する。本発明に係る方法は、目的のタンパク質表面に有機残基誘導体を導入する工程を包含することが好ましく、該有機残基誘導体は、金属錯体であることが好ましい。すなわち、本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるための方法は、目的のタンパク質表面に存在するアミノ酸側鎖の非共有電子対と上記金属錯体とを配位させる工程を包含することが好ましい。【００７４】  上述したように、該金属錯体の有する配位子は、単座配位子または多座配位子のいずれでもよいが、錯体の安定性の観点から、三座配位子が好ましい。三座配位子としては、テルピリジン、ジエチレントリアミン、シッフ塩基、トリアザシクロアルカン、テトラキス（２’−アミノエチル）−１，２−ジアミノプロパン、オクタアザビシクロ［６．６．６］アイコサンなどが挙げられるが、官能基を導入しやすい配位子として、テルピリジンが好ましい。官能基としては、グアニジン（−ＮＨ−Ｃ（−ＮＨ２）＝ＮＨ２＋）もしくはアミジン（−Ｃ（−ＮＨ２）＝ＮＨ２＋）を有するもの（例えば、アルギニン）、または４級カチオン（−Ｎ（ＣＨ３）＋）を有するものが好ましいが、質量分析におけるイオン化の段階で開裂しないものであることが好ましく、４級アンモニウムが特に好ましい。本発明に係るイオン化効率を向上させるための方法に用いる金属錯体は、上記官能基を１つまたは複数個有する。【００７５】  本発明に係る金属錯体において、上記金属錯体の金属元素は遷移元素または典型元素であることが好ましく、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｃｒ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ａｇ、Ａｕ、ＯｓまたはＩｒがより好ましい。【００７６】  本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるためのキットにおいて、上記金属錯体は、以下の式【００７７】
【化１２】
2006080210.tif 000010
【００７８】によって示され、
ここで、Ｒは、Ｈまたは４級アンモニウムであり、Ｘは、ＰｔまたはＣｕであることが好ましい。【００７９】  本発明に係る方法は、タンパク質表面のアミノ酸側鎖の非共有電子対（ヒスチジン、アルギニン、システイン）と金属（Ｐｔ、Ｃｕなど）の錯体との配位を利用するものであり、本発明に係る方法を使用すれば、タンパク質表面に任意の機能性物質（例えば、糖鎖）を温和な条件で導入することができる。これによって、タンパク質にターゲット能および／または加水分解抵抗性を付与することができる。【００８０】  以下に、本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、請求項および上記実施形態に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。【００８１】  〔実施例〕
（実施例１：タンパク質修飾用金属錯体の合成）【００８２】
【化１３】
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【００８３】  テトラクロロ白金（ＩＩ）酸カリウム１００ｍｇを、蒸留水１．６ｍｌに溶解した後に酢酸２．４ｍｌを添加して、室温にて攪拌した。この溶液に、１，５−シクロオクタジエンを０．１ｍｌ加えた後に加熱して、９０℃で３０分間攪拌した。その結果、白色結晶が析出した。この溶液を、減圧下で約１ｍｌになるまで濃縮した後、減圧濾過によって結晶を得た。この結晶を、蒸留水、エタノール、およびジエチルエーテルを用いて洗浄した後、減圧下にて乾燥して、白金ジクロロ（１，５−シクロオクタジエン）の結晶５９ｍｇを得た。白金ジクロロ（１，５−シクロオクタジン）５０ｍｇを、フラスコ中にてＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド４ｍｌに溶解した。この溶液を５０℃に加熱した後、２，２’：６’，２’’−テルピリジン３１．１ｍｌを加え、１５分間攪拌した、この溶液を室温に戻した後、減圧濾過によって固体物質を除去した。得られた濾液を、減圧下にて濃縮した後に乾燥させて、化合物（１）（白金クロロ（２，２’：６’，２’’−テルピリジン））の結晶４２．５ｍｇを得た。この結晶をＥＳＩ−Ｍａｓｓによって確認した。【００８４】  （実施例２：４級アンモニウムを有する白金錯体の合成）【００８５】
【化１４】
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【００８６】  ４’−クロロ−２，２’：６’，２’’−テルピリジン１ｇ、水酸化カリウム２８０ｍｇおよび１−アミノ−３−プロパノール０．３２ｍｌを、フラスコ内にてジメチルスルホキシド約５ｍｌに溶解した。この溶液を９０分間室温にて攪拌した後に加熱して、５５℃で４０時間攪拌した。この溶液を室温に戻し、０℃の蒸留水５ｍｌを加えた。この溶液を減圧下で濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーを用いて化合物（３）【００８７】
【化１５】
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【００８８】を精製した。ＮＭＲおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  Ｍａｓｓによって同定した。化合物（３）４２２ｍｇおよび炭酸カリウム３００ｍｇをフラスコ中で乾燥させた後にクロロホルム１５ｍｌに溶解させた。フラスコ内の気体を窒素に置換し、過剰量のヨウ化メチルを少量ずつ添加しながら室温で約６時間攪拌した。セライトを用いてこの溶液を減圧濾過することによって、炭酸カリウムを除去した。得られた濾液を濃縮し、減圧下にて乾燥させて、化合物（４）【００８９】
【化１６】
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【００９０】を３８１ｍｇ得た。化合物（４）を、ニトロメタン２０ｍｌに溶解した後、テトラクロロ白金（ＩＩ）酸カリウム２１８ｍｇおよびフッ化銀２４４ｍｇを添加した。この溶液を１１０℃に加熱した後２１時間攪拌し、次いで減圧濾過して溶液中の固体物質を除去した。濾液を濃縮した後、ジエチルエーテルを少量ずつ添加することによって生成物を析出させた後、再度減圧濾過を行って化合物（２）２０８ｍｇを得た。【００９１】  （実施例３：化合物（１）および（２）のタンパク質への導入、ならびにＣＳＩ−ＴＯＦ  Ｍａｓｓによるイオン化効率の比較）
ガラクトース転位酵素（ＴＯＹＯＢＯ）（以下、ＧａｌＴと称する）を、２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７）に置換して、１３μＭのタンパク質溶液を調整した。このタンパク質溶液１００μｌに、タンパク質に対して１等量の化合物（１）または２等量の化合物（２）を添加した後、室温で４時間攪拌した。これらの溶液を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて限外濾過し、未反応の化合物（１）または（２）を除去した。ＭＳ−Ｔ１００ＣＳ（日本分光）を用いて、これらのタンパク質溶液の質量分析を行った。測定条件を以下に示す：加速電圧−７ｋＶ、ニードル電圧２ｋＶ、オレフィス電圧８０Ｖ、分解能６０００（半値全幅）、ガス流速３ｌ／分、脱溶媒室温度２００℃、１００℃、８０℃、５０℃、１０℃。【００９２】  化合物（１）で修飾されたＧａｌＴについて、脱溶媒室温度２００℃、８０℃、１０℃の条件下で質量分析を行った（図１）。得られたスペクトルのデコンボリューション処理を行い、タンパク質の一部が化合物（１）によって修飾されていることを確認した（図２）。得られたデータからＧａｌＴおよび修飾されたＧａｌＴのそれぞれのピーク面積を求めた。２００℃にて測定した値を１とした場合のグラフを図３に示す。さらに、各温度条件下でのＧａｌＴおよび修飾されたＧａｌＴの面積比のグラフを図４に示す。【００９３】  化合物（２）で修飾されたＧａｌＴについて、脱溶媒室温度２００℃、１００℃、５０℃、１０℃の条件下で質量分析を行った（図５）。得られたスペクトルのデコンボリューション処理を行い、タンパク質の一部が化合物（２）で修飾されていることを確認した（図６）。得られたデータに基づいて、ＧａｌＴおよび修飾されたＧａｌＴのそれぞれのピーク面積を求めた。２００℃にて測定した値を１とした場合のグラフを図７に示す。さらに、各温度条件下でのＧａｌＴおよび修飾されたＧａｌＴの面積比のグラフを図８に示す。【００９４】  図２および図６より、ＧａｌＴおよびそれぞれ１つの化合物（１）または化合物（２）で修飾されたＧａｌＴのピークを確認した。この結果より、白金錯体またはテルピリジンを用いることによって、タンパク質を中性条件下で修飾することができることがわかった。すなわち、テルピリジンを有する種々の分子を用いれば、温和な条件下でのタンパク質修飾法を提供することができる。【００９５】  図３および図７より、脱溶媒室温度の変化によってタンパク質のピーク面積が変化していること、温度低下に伴ってピーク面積が低下すること、およびＧａｌＴでの修飾の有無によって温度低下に伴うピーク面積低下の割合が異なることが確認された。【００９６】  図４および図８より、温度低下に伴って修飾タンパク質のピーク面積比が増大することがわかった。この理由としては、修飾に用いた白金錯体または４級アミンの有するカチオンが分子イオン化を促進していることが考えられる。【００９７】  図１０および図１２より、修飾の有無にかかわらず、ＧａｌＴがＵＤＰまたはＵＤＰ−Ｇａｌと複合体を形成していることが確認された。この結果より、修飾されたＧａｌＴもまた、タンパク質の酵素活性部位を保存していることがわかった。【００９８】  これらの結���より、白金錯体を利用した化合物（１）および（２）は、温和な条件下においてタンパク質の活性を保持したまま修飾することができることがわかった。さらに、修飾したＧａｌＴは、未修飾のものと比較してＣＳＩ−Ｍａｓｓでのイオン化効率の低下が軽減された。これらの化合物の修飾を利用すれば、ＣＳＩ−Ｍａｓｓ状態でのタンパク質−リガンド分子複合体の測定またはスクリーニングを高感度で行うことができる。【００９９】  発明を実施するための最良の形態の項においてなされた具体的な実施形態または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する特許請求事項の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用可能性】
【０１００】  タンパク質の質量分析におけるイオン化効率は、個々のタンパク質に固有の性質（例えば、タンパク質の分子量および／または等電点など）に依存することが多い。イオン化効率を向上させ得る構造を有する化合物を本発明に係る方法によって導入することによって、タンパク質の性質に依存することなくタンパク質を高感度で検出することができる。これによって、タンパク質相互作用を高速かつ高感度で解析することができる。また、タンパク質表面に糖鎖などの機能性残基を導入することによって、タンパク質の機能改変および／または多機能化が可能となり、人工糖タンパク質の新規創成を実現することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年11月17日(2006.11.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
タンパク質イオン化効率を向上させるための方法であって、目的のタンパク質表面のアミノ酸側鎖に有機残基誘導体を導入する工程を包含することを特徴とする、方法。
【国際調査報告】
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