(57)【要約】  本発明は、ＶＥＧＦ−Ａ１６５のヘパリンあるいはヘパラン硫酸プロテオグリカンに対する結合を阻害し、ＫＤＲとＶＥＧＦ−Ａ１６５との相互作用に起因する種々の生理的反応を抑制可能な、新規なヘパリン結合性ペプチドとして、  ヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質ｖａｍｍｉｎ中のヘパリン結合部位に基づき設計された、該ヘパリン結合部位に由来する第一の部分アミノ酸配列：Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｘ−Ｋ−Ｑ−Ｇ（Ｘは、Ｒ，Ｗ，Ｈ，Ｋのいずれか）を少なくとも含み、７〜２０アミノ酸残基からなるヘパリン結合能を有するペプチドを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｖａｍｍｉｎ中のヘパリン結合部位に由来する第一の部分アミノ酸配列：
Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｘ−Ｋ−Ｑ−Ｇ（Ｘは、Ｒ，Ｗ，Ｈ，Ｋのいずれか）を少なくとも含み、
７〜２０アミノ酸残基からなる
ことを特徴とするヘパリン結合能を有するペプチド。
【請求項２】
さらに、前記第一の部分アミノ酸配列：Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｘ−Ｋ−Ｑ−Ｇに加えて、
ｖａｍｍｉｎ中のヘパリン結合部位に由来する第二の部分アミノ酸配列：
Ｋ−Ｅ−Ｋ−Ｐ−Ｒをも含み、
前記第一の部分アミノ酸配列のＣ末端に、前記第二の部分アミノ酸配列が、４〜６アミノ酸残基からリンカー配列を介して連結されている
ことを特徴とする請求の範囲  第１項に記載のヘパリン結合能を有するペプチド。
【請求項３】
ｖａｍｍｉｎ中のヘパリン結合部位に由来するアミノ酸配列：
Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｒ−Ｋ−Ｑ−Ｇ−Ｅ−Ｐ−Ｄ−Ｇ−Ｐ−Ｋ−Ｅ−Ｋ−Ｐ−Ｒ
からなるアミノ酸配列、または、その配列中に少なくとも一つのアミノ酸置換を有し、且つ前記第一の部分アミノ酸配列を保持してなる改変型アミノ酸配列を含むペプチドである
ことを特徴とする請求の範囲  第１項または第２項に記載のヘパリン結合能を有するペプチド。
【請求項４】
ｖａｍｍｉｎ中のヘパリン結合部位に由来する第一の部分アミノ酸配列：
Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｘ−Ｋ−Ｑ−Ｇ（Ｘは、Ｒ，Ｗ，Ｈ，Ｋのいずれか）を少なくとも含み、
ＡＮ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｘ−Ｋ−Ｑ−Ｇ−ＡＣ
（ＡＮ、ＡＣは、それぞれアミノ酸数０〜１３までのペプチド鎖から選択され、ＡＮ、ＡＣのアミノ酸数の合計は、１３以下である）
からなる、７〜２０アミノ酸残基のアミノ酸配列を有する
ことを特徴とする請求の範囲  第１項に記載のヘパリン結合能を有するペプチド。
【請求項５】
ＶＥＧＦ−Ａ１６５のヘパリンに対する結合の競争的阻害剤であって、
該競争阻害活性成分は、請求の範囲  第１項〜第４項のいずれか一項に記載のヘパリン結合能を有するペプチドである
ことを特徴とするＶＥＧＦ−Ａ１６５とヘパリンとの結合に対する阻害剤。
【請求項６】
ＶＥＧＦ−Ａ１６５とヘパリンとの結合に対する阻害剤としての用途を有する医薬組成物であって、
前記阻害活性成分は、請求の範囲  第１項〜第４項のいずれか一項に記載のヘパリン結合能を有するペプチドであり、
投与対象者の静脈内投与に適する、薬学的に許容される液性担体中に、前記ヘパリン結合能を有するペプチドの有効量を溶解してなる
ことを特徴とする組成物。
【請求項７】
ｖａｍｍｉｎ中のヘパリン結合部位に由来する、改変された第一の部分アミノ酸配列：
Ｒ−Ｘ０１−Ｘ０２−Ｘ０３−Ｋ−Ｑ−Ｇ（Ｘ０１は、ＰまたはＲ、Ｘ０２は、ＲまたはＫ、Ｘ０３は、Ｋ、ＨまたはＲである）を少なくとも含み、
７〜２０アミノ酸残基からなる
ことを特徴とするヘパリン結合能を有するペプチド。
【請求項８】
さらに、前記改変された第一の部分アミノ酸配列：Ｒ−Ｘ０１−Ｘ０２−Ｘ０３−Ｋ−Ｑ−Ｇ（Ｘ０１は、ＰまたはＲ、Ｘ０２は、ＲまたはＫ、Ｘ０３は、Ｋ、ＨまたはＲである）に加えて、
ｖａｍｍｉｎ中のヘパリン結合部位に由来する第二の部分アミノ酸配列：
Ｋ−Ｅ−Ｋ−Ｐ−Ｒをも含み、
前記第一の部分アミノ酸配列のＣ末端に、前記第二の部分アミノ酸配列が、４〜６アミノ酸残基からリンカー配列を介して連結されている
ことを特徴とする請求の範囲  第７項に記載のヘパリン結合能を有するペプチド。
【請求項９】
前記リンカー配列として、Ｅ−Ｐ−Ｄ−Ｇ−Ｐを選択してなる、
Ｒ−Ｘ０１−Ｘ０２−Ｘ０３−Ｋ−Ｑ−Ｇ−Ｅ−Ｐ−Ｄ−Ｇ−Ｐ−Ｋ−Ｅ−Ｋ−Ｐ−Ｒ
（Ｘ０１は、ＰまたはＲ、Ｘ０２は、ＲまたはＫ、Ｘ０３は、Ｋ、ＨまたはＲである）からなるアミノ酸配列、または、その配列中に少なくとも一つのアミノ酸置換を有し、且つ前記改変された第一の部分アミノ酸配列を保持してなる改変型アミノ酸配列を含むペプチドである
ことを特徴とする請求の範囲  第８項に記載のヘパリン結合能を有するペプチド。
【請求項１０】
ｖａｍｍｉｎ中のヘパリン結合部位に由来する、改変された第一の部分アミノ酸配列：
Ｒ−Ｘ０１−Ｘ０２−Ｘ０３−Ｋ−Ｑ−Ｇ（Ｘ０１は、ＰまたはＲ、Ｘ０２は、ＲまたはＫ、Ｘ０３は、Ｋ、ＨまたはＲである）を少なくとも含み、
ＡＮ１−Ｒ−Ｘ０１−Ｘ０２−Ｘ０３−Ｋ−Ｑ−Ｇ−ＡＣ１
（ＡＮ１、ＡＣ１は、それぞれアミノ酸数０〜１３までのペプチド鎖から選択され、ＡＮ１、ＡＣ１のアミノ酸数の合計は、１３以下である）
からなる、７〜２０アミノ酸残基のアミノ酸配列を有する
ことを特徴とする請求の範囲  第７項に記載のヘパリン結合能を有するペプチド。
【請求項１１】
ＶＥＧＦ−Ａ１６５のヘパリンに対する結合の競争的阻害剤であって、
該競争阻害活性成分は、請求の範囲  第７項〜第１０項のいずれか一項に記載のヘパリン結合能を有するペプチドである
ことを特徴とするＶＥＧＦ−Ａ１６５とヘパリンとの結合に対する阻害剤。
【請求項１２】
ＶＥＧＦ−Ａ１６５とヘパリンとの結合に対する阻害剤としての用途を有する医薬組成物であって、
前記阻害活性成分は、請求の範囲  第７項〜第１０項のいずれか一項に記載のヘパリン結合能を有するペプチドであり、
投与対象者の静脈内投与に適する、薬学的に許容される液性担体中に、前記ヘパリン結合能を有するペプチドの有効量を溶解してなる
ことを特徴とする組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管内皮増殖因子受容体２型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２；ＫＤＲ）に対する特異的結合性を有し、一方、血管内皮増殖因子受容体１型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １；Ｆｌｔ−１）に対する結合性は示さない、ヘビ毒由来の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）様タンパク質中のヘパリン結合部位に由来するアミノ酸配列に基づき設計されたヘパリン結合性ペプチドと、その医学分野における用途に関する。より具体的には、Ｖｉｐｅｒａ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓのヘビ毒から単離されたＶＥＧＦ様タンパク質；ｖａｍｍｉｎ、ならびに、Ｄａｂｏｉａ  ｒｕｓｓｅｌｌｉ  ｒｕｓｓｅｌｌｉのヘビ毒から単離されたＶＥＧＦ様タンパク質；ＶＲ−１中のヘパリン結合部位に由来するアミノ酸配列に基づき設計されたヘパリン結合性ペプチドと、該ヘパリン結合性ペプチドを利用する、血管内皮増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ−Ａ）に対するヘパリン結合の抑制を介する、ＶＥＧＦのＫＤＲへの結合に起因する生理作用抑制などの医学分野における用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管内皮増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ−Ａ）は、血管形成（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）と血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）において、中心的な役割を担っている。血管新生は、創傷治癒、女性の性周期における子宮内膜や黄体形成などといった生理的現象において重要な役割を果たす一方、固形腫瘍の増殖、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、乾癬などの種々の疾患に対しても、関与していることが知られている。ＶＥＧＦ−Ａは、分子量２３  ｋＤａのサブユニットがジスルフィド結合によりホモダイマーを形成した糖タンパク質である。ＶＥＧＦ−Ａと類似する増殖因子として、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、胎盤成長因子（ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＰＩＧＦ）がある（渋谷正史、倉林正彦編、  実験医学、２０（増刊）、  １０７０−１２６９  （２００２）；小野真弓、桑野信彦著、  血管新生とがんの生物学、  共立出版、  １−９７  （２０００）；佐藤靖史編、  血管新生の最前線、  羊土社、  １０−１７１  （１９９９）を参照）。ＶＥＧＦは、血管内皮細胞のＶＥＧＦＲ−１（ｆｍｓ−ｌｉｋｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ−１：Ｆｌｔ−１）とＶＥＧＦＲ−２（ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｓｅｒｔ  ｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＫＤＲ）に高親和性に結合する。ＶＥＧＦ−Ａの内皮細胞の増殖シグナルおよび血圧降下作用には、主にＫＤＲを介していることが示唆されている（Ｌｉ，  Ｂ．等，  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，  ３９，  １０９５−１１００  （２００２）を参照）。また、ＫＤＲを介したシグナル伝達により産生されるＮＯは、血管弛緩作用、血小板凝集阻害、抗血栓作用、抗炎症作用などさまざまな生理活性を有し、抗動脈硬化的に働いていると考えられている（渋谷正史、倉林正彦編、  実験医学、２０（増刊）、  １０７０−１２６９  （２００２）を参照）。【０００３】
ＶＥＧＦ−Ａをコードするヒト遺伝子は、８個のエキソンで構成され、ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇに由来するスプライシング変異体の存在が確認されている。すなわち、成熟モノマーとして、１２１、１４５、１６５、１８９、ならびに、２０６アミノ酸残基を有する５種のｉｓｏ−ｆｏｒｍ；ＶＥＧＦ−Ａ１２１、ＶＥＧＦ−Ａ１４５、ＶＥＧＦ−Ａ１６５、ＶＥＧＦ−Ａ１８７、ＶＥＧＦ−Ａ２０６が存在し、特に、ＶＥＧＦ−Ａ１６５は、エキソン６でコードされる部分アミノ酸配列を欠き、また、ＶＥＧＦ−Ａ１２１は、エキソン６、エキソン７でコードされる部分アミノ酸配列を欠いていることが確認されている。なかでも、ＶＥＧＦ−Ａ１６５は、多くの組織において遊離型として発現され、成熟型かつ活性型のＶＥＧＦとして機能することが確認されている。また、ＶＥＧＦ−Ａ１６５は、ヘパリンあるいはヘパラン硫酸プロテオグリカンに対する結合性をも有し、低い濃度ヘパリンの共存下においては、ＫＤＲに対するＶＥＧＦ−Ａ１６５の親和性の亢進がなされ、一方、高い濃度ヘパリンを存在させた際には、ＫＤＲに対するＶＥＧＦ−Ａ１６５の親和性の亢進は認められないことも報告されている（国際公開  第０１／  ７２８２９号パンフレットを参照）。その他、ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１もＶＥＧＦ−Ａ１６５と結合し、ＫＤＲへの親和性を亢進することによって、ＶＥＧＦ−Ａ１６５に対する特異的なｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒとして機能することも報告されている（特開  ２００３−１２５４１号公報を参照）。【０００４】
一方、ＫＤＲとＶＥＧＦ−Ａ１６５との相互作用を阻害すると、固形腫瘍の増殖あるいは転移、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症における血管新生が抑制され、これら疾患の進行を阻害可能である。従って、ＫＤＲとＶＥＧＦ−Ａ１６５との相互作用を阻害する機能を有する、ＫＤＲに対する特異的な親和性を示すアンタゴニスト、あるいは、ＶＥＧＦ−Ａ１６５に対して特異的な結合性を有するＫＤＲとの結合阻害物質の探索が進められている。
なお、上記のＰａｒａｐｏｘウィルスに由来するＶＥＧＦ−Ｅの他、ＶＥＧＦ−Ａ１６５と類似するアミノ酸配列を有し、ＫＤＲに対する結合性を示すタンパク質としては、Ｖｅｐｅｒａ  ａｓｐｉｓ  ａｓｐｉｓのヘビ毒素中から、血圧降下因子（ｈｙｐｏｔｅｎｓｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ：ＨＦ）が、ＶＥＧＦと相同性を有するＶＥＧＦ様分子として単離された（Ｋｏｍｏｒｉ，  Ｙ．等，  Ｔｏｘｉｃｏｎ，  ２８，  ３５９−３６９  （１９９０）；Ｋｏｍｏｒｉ，  Ｙ．等，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３８，  １１７９６−１１８０３  （１９９０）を参照）。更には、つい最近、ｓｎａｋｅ  ｖｅｎｏｍ  ＶＥＧＦとｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＣＰＰ）の２種のＶＥＧＦ様分子が、それぞれ、他のヘビ毒から単離されており、この二種のヘビ毒由来のＶＥＧＦ様蛋白質は、血管透過性と血管新生の活性を有することが示されている（Ｊｕｎｑｕｅｉｒａ  ｄｅ  Ａｚｅｖｅｄｏ，  Ｉ．  Ｌ．等，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７６，  ３９８３６−３９８４２  （２００１）；Ｇａｓｍｉ，  Ａ．等，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ２６８，  ６９−７２  （２０００）；Ｇａｓｍｉ，  Ａ．等，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７７，  ２９９９２−２９９９８  （２００２）を参照）。
【発明の開示】
【０００５】
上述するように、ＫＤＲとＶＥＧＦ−Ａ１６５との相互作用を阻害すると、固形腫瘍の増殖あるいは転移、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症における血管新生が抑制され、これら疾患の進行を阻害可能である。従来の研究においては、ＫＤＲとＶＥＧＦ−Ａ１６５との相互作用を阻害する手段として、ＫＤＲとＶＥＧＦ−Ａ１６５との相互作用を阻害する機能を有する、ＫＤＲに対する特異的な親和性を示すアンタゴニスト、あるいは、ＶＥＧＦ−Ａ１６５に対して特異的な結合性を有するＫＤＲとの結合阻害物質の探索に研究の関心が集中している。
【０００６】
本発明者らは、これら従来のアプローチに加えて、ＶＥＧＦ−Ａ１６５は、ヘパリンあるいはヘパラン硫酸プロテオグリカンに対する結合性をも有し、低い濃度の遊離型ヘパリンの共存下においては、ＫＤＲに対するＶＥＧＦ−Ａ１６５の親和性の亢進がなさる点に着目して、このヘパリンあるいはヘパラン硫酸プロテオグリカンとＶＥＧＦ−Ａ１６５との結合を抑制する手段も、ＫＤＲとＶＥＧＦ−Ａ１６５との相互作用の抑制に大きな貢献を有することに想到した。しかしながら、現状では、細胞表面に存在するヘパリンあるいはヘパラン硫酸プロテオグリカンのＶＥＧＦ−Ａ１６５に対する結合性を抑制する手段として、高い特異性を有し、また有効な手段は提案されてなく、これから解決すべき課題であることも判明した。
【０００７】
本発明は、前記の課題を解決するものであり、本発明の目的は、ＶＥＧＦ−Ａ１６５の細胞表面に存在するヘパリンあるいはヘパラン硫酸プロテオグリカンに対する結合を阻害し、例えば、ヘパリンの存在下における、ＫＤＲとＶＥＧＦ−Ａ１６５との相互作用に起因する種々の生理的反応を抑制可能な、新たな手段を提供することにある。具体的には、ＶＥＧＦ−Ａ１６５が細胞膜上に存在するＫＤＲとの結合を形成するに際して、同時に結合して、ＶＥＧＦ−Ａ１６５に対するｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ様の機能を有する、細胞表面に存在しているヘパリンあるいはヘパラン硫酸プロテオグリカンと高い結合性を示し、ＶＥＧＦ−Ａ１６５とヘパリンとの複合体形成を競争的に阻害する新規な物質を提供することにある。
【０００８】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく、鋭意研究を進める過程において、先ず、ＶＥＧＦ−Ａ１６５のヘパリンあるいはヘパラン硫酸プロテオグリカンに対する結合に関与する部位は、そのＣ末端側に存在することが報告されていること（Ｋｅｙｔ，Ｂ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ｖｏｌ．２７１  ７７８８−７７９５  （１９９６）などを参照）に着目し、具体的には、組換え生産ＶＥＧＦ−Ａ１６５モノマーにおいて、Ａｌａ１１１〜Ａｒｇ１６５の部位をプラスミン消化により除いた、Ｃ末端切除型タンパク質モノマーを調製し、そのヘパリン結合性を検証したところ、ヘパリン結合性を喪失していることが確認された。加えて、かかるＶＥＧＦ１６５由来のＣ末端切除型タンパク質のホモ二量体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＫＤＲに対する結合性は、ペパリン非存在下においては、基としたＶＥＧＦ−Ａ１６５のホモ二量体と遜色のないものであることも確認された。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのウシ大動脈内皮細胞の増殖試験において、その増殖惹起作用は、ＶＥＧＦ１６５由来のＣ末端切除型改変タンパク質のホモ二量体は、基としたＶＥＧＦ１６５のホモ二量体よりも、格段に低下していることも判明した。すなわち、ＶＥＧＦ１６５のＫＤＲへの結合に加えて、内皮細胞表面に存在するプロテオグリカン型のペパリン、またはヘパラン硫酸プロテオグリカンとも同時に結合することが、ＫＤＲとの結合に引き続く、細胞内での生理的反応の誘起に必須であることが確認される。
【０００９】
さらには、発明者らが、ヘビ毒由来の血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ様タンパク質として、新たに単離・同定したＶｉｐｅｒａ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓ由来のＶＥＧＦ様タンパク質；ｖａｍｍｉｎ、Ｄａｂｏｉａ  ｒｕｓｓｅｌｌｉ  ｒｕｓｓｅｌｌｉ由来のＶＥＧＦ様タンパク質；ＶＲ−１に関しても、ＫＤＲとの結合に引き続く、細胞内での生理的反応の誘起には、細胞表面に存在するプロテオグリカン型のペパリン、またはヘパラン硫酸プロテオグリカンとも同時に結合すること必要であることを見出した。これらヘビ毒由来の血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ様タンパク質における、ヘパリンあるいはヘパラン硫酸プロテオグリカンに対する結合に関与する部位を探索したところ、そのＣ末端の部分のみが、ヘパリンとの結合に関与することを見出した。実際に、このｖａｍｍｉｎのＣ末端部分アミノ酸配列（Ａｒｇ９４〜Ａｒｇ１１０）あるいはＶＲ−１のＣ末端部分アミノ酸配列（Ａｒｇ９４〜Ａｒｇ１０９）を有するペプチド断片を合成し、そのヘパリン結合能（親和性）を評価したところ、ｖａｍｍｉｎ、ＶＲ−１中のヘパリン結合部位に由来するアミノ酸配列を示すことが確認された。また、ｖａｍｍｉｎ、ＶＲ−１中のヘパリン結合部位に由来するアミノ酸配列に加えて、そのアミノ酸配列に基づき設計された改変型アミノ酸配列を有する一連のペプチド群も高いヘパリン結合能（親和性）を保持することも検証した。さらには、そのヘパリン結合能（親和性）において、支配的な機能を有するアミノ酸配列部分は、Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｘ−Ｋ−Ｑ−Ｇ（Ｘは、ＲまたはＷ）の部分であることも確認した。
【００１０】
さらには、前記ｖａｍｍｉｎ、ＶＲ−１中のヘパリン結合部位に由来するアミノ酸配列に基づき設計された、ヘパリン結合能（親和性）を保持する合成ペプチド断片は、ＶＥＧＦ−Ａ１６５、あるいはｖａｍｍｉｎによる血管内皮細胞の増殖誘導作用を濃度依存的に抑制する作用を示し、また、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいては、ＶＥＧＦ−Ａ１６５が示す、ＫＤＲを介したシグナル伝達により産生されるＮＯに因る血圧降下能を濃度依存的に抑制する作用を示すことをも検証した。以上の知見に基づき、本発明者らは、本発明の第一の形態を完成するに到った。
【００１１】
すなわち、本発明の第一の形態にかかるヘパリン結合能を有するペプチドは、
ｖａｍｍｉｎ中のヘパリン結合部位に由来する第一の部分アミノ酸配列：
Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｘ−Ｋ−Ｑ−Ｇ（Ｘは、Ｒ，Ｗ，Ｈ，Ｋのいずれか）を少なくとも含み、
７〜２０アミノ酸残基からなることを特徴とするヘパリン結合能を有するペプチドである。
【００１２】
従って、本発明の第一の形態にかかるヘパリン結合能を有するペプチドには、
ｖａｍｍｉｎ中のヘパリン結合部位に由来する第一の部分アミノ酸配列：
Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｘ−Ｋ−Ｑ−Ｇ（Ｘは、Ｒ，Ｗ，Ｈ，Ｋのいずれか）を少なくとも含み、
ＡＮ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｘ−Ｋ−Ｑ−Ｇ−ＡＣ
（ＡＮ、ＡＣは、それぞれアミノ酸数０〜１３までのペプチド鎖から選択され、ＡＮ、ＡＣのアミノ酸数の合計は、１３以下である）
からなる、７〜２０アミノ酸残基のアミノ酸配列を有するヘパリン結合能を有するペプチドが包含される。
【００１３】
さらに、前記第一の部分アミノ酸配列：Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｘ−Ｋ−Ｑ−Ｇに加えて、
ｖａｍｍｉｎ中のヘパリン結合部位に由来する第二の部分アミノ酸配列：
Ｋ−Ｅ−Ｋ−Ｐ−Ｒをも含み、
前記第一の部分アミノ酸配列のＣ末端に、前記第二の部分アミノ酸配列が、４〜６アミノ酸残基からリンカー配列を介して連結されているヘパリン結合能を有するペプチドとすることもできる。
【００１４】
特には、ｖａｍｍｉｎ中のヘパリン結合部位に由来するアミノ酸配列：
Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｒ−Ｋ−Ｑ−Ｇ−Ｅ−Ｐ−Ｄ−Ｇ−Ｐ−Ｋ−Ｅ−Ｋ−Ｐ−Ｒ
からなるアミノ酸配列、または、その配列中に少なくとも一つのアミノ酸置換を有し、且つ前記第一の部分アミノ酸配列を保持してなる改変型アミノ酸配列を含む、ヘパリン結合能を有するペプチドとすることもできる。
【００１５】
加えて、本発明は、上記の本発明の第一の形態にかかるヘパリン結合能を有するペプチドを利用する方法の発明として、ＶＥＧＦ−Ａ１６５とヘパリンとの結合に対する阻害剤としての用途発明をも提供し、
すなわち、本発明の第一の形態にかかるＶＥＧＦ−Ａ１６５とヘパリンとの結合に対する阻害剤は、
ＶＥＧＦ−Ａ１６５のヘパリンに対する結合の競争的阻害剤であって、
該競争阻害活性成分は、上述する本発明の第一の形態にかかるヘパリン結合能を有するペプチドであることを特徴とするＶＥＧＦ−Ａ１６５とヘパリンとの結合に対する阻害剤である。
【００１６】
かかる本発明の第一の形態にかかるＶＥＧＦ−Ａ１６５とヘパリンとの結合に対する阻害剤は、例えば、注射液剤の剤形に調製する際には、
投与対象者の静脈内投与に適する、薬学的に許容される液性担体中に、上述する本発明の第一の形態にかかるヘパリン結合能を有するペプチドの有効量を溶解してなる組成物とすることができる。
【００１７】
あるいは、点眼薬の剤形に調製する際には、
投与対象者に対して、その眼球または眼窩への適用に適する、薬学的に許容される液性担体中に、上述する本発明の第一の形態にかかるヘパリン結合能を有するペプチドの有効量を溶解してなる組成物とすることができる。
【００１８】
本発明の第一の形態にかかる新規なヘパリン結合能を有するペプチドは、ヘビ毒由来の血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ様タンパク質；ｖａｍｍｉｎならびにＶＲ−１中のヘパリン結合部位のアミノ酸配列に基づき設計された、７〜２０アミノ酸残基からなるペプチド化合物であり、ＶＥＧＦ−Ａ１６５、あるいはｖａｍｍｉｎのＫＤＲへの結合により誘起される、一酸化窒素（ＮＯ）依存性の強力な血圧降下活性や血管新生促進作用の発揮に必要な、ＶＥＧＦ−Ａ１６５、あるいはｖａｍｍｉｎと細胞表面上のヘパリンとの間の結合を、競争的に阻害する作用を有する。その結果、例えば、固形腫瘍の増殖や転移、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、乾癬など、種々の疾患の要因となる、ＶＥＧＦ−Ａ１６５に起因する血管新生促進の抑制を目的とする治療用途に、本発明にかかる新規なヘパリン結合能を有するペプチドは利用可能である。その際、塩基性アミノ酸を多数含有する７〜２０アミノ酸残基のペプチドであるため、ＭＨＣにより提示される抗原ペプチドとはならず、免疫原性を示さないので、反復投与に付随する抗体創製に起因する治療効果の低減もないものとなる。
【００１９】
加えて、本発明者らは、本発明の第一の形態にかかるヘパリン結合能を有するペプチドを基礎として、更なるアミノ酸配列の改変を行い、遜色の無いヘパリン結合能を有する合成ペプチド断片を創製した。具体的には、本発明の第一の形態にかかるヘパリン結合能を有するペプチドが有するヘパリン結合能（親和性）において、支配的な機能を有する前記第一のアミノ酸配列部分：Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｘ−Ｋ−Ｑ−Ｇ（Ｘは、ＲまたはＷ）に対して改変を施し、Ｒ−Ｘ０１−Ｘ０２−Ｘ０３−Ｋ−Ｑ−Ｇ（Ｘ０１は、ＰまたはＲ、Ｘ０２は、ＲまたはＫ、Ｘ０３は、Ｋ、ＨまたはＲ）へと変換する際、遜色の無いヘパリン結合能を示すことを見出した。
【００２０】
さらには、前記Ｒ−Ｘ０１−Ｘ０２−Ｘ０３−Ｋ−Ｑ−Ｇ（Ｘ０１は、ＰまたはＲ、Ｘ０２は、ＲまたはＫ、Ｘ０３は、Ｋ、ＨまたはＲ）の改変された第一のアミノ酸配列部分を有し、ヘパリン結合能（親和性）を保持する合成ペプチド断片は、同様に、ＶＥＧＦ−Ａ１６５による血管内皮細胞の増殖誘導作用を濃度依存的に抑制する作用を示すことをも検証した。以上の知見に基づき、本発明者らは、本発明の第二の形態を完成するに到った。
【００２１】
すなわち、本発明の第二の形態にかかるヘパリン結合能を有するペプチドは、
ｖａｍｍｉｎ中のヘパリン結合部位に由来する、改変された第一の部分アミノ酸配列：
Ｒ−Ｘ０１−Ｘ０２−Ｘ０３−Ｋ−Ｑ−Ｇ（Ｘ０１は、ＰまたはＲ、Ｘ０２は、ＲまたはＫ、Ｘ０３は、Ｋ、ＨまたはＲである）を少なくとも含み、
７〜２０アミノ酸残基からなることを特徴とするヘパリン結合能を有するペプチドである。
【００２２】
従って、本発明の第二の形態にかかるヘパリン結合能を有するペプチドには、
ｖａｍｍｉｎ中のヘパリン結合部位に由来する、改変された第一の部分アミノ酸配列：
Ｒ−Ｘ０１−Ｘ０２−Ｘ０３−Ｋ−Ｑ−Ｇ（Ｘ０１は、ＰまたはＲ、Ｘ０２は、ＲまたはＫ、Ｘ０３は、Ｋ、ＨまたはＲである）を少なくとも含み、
ＡＮ１−Ｒ−Ｘ０１−Ｘ０２−Ｘ０３−Ｋ−Ｑ−Ｇ−ＡＣ１
（ＡＮ１、ＡＣ１は、それぞれアミノ酸数０〜１３までのペプチド鎖から選択され、ＡＮ１、ＡＣ１のアミノ酸数の合計は、１３以下である）
からなる、７〜２０アミノ酸残基のアミノ酸配列を有するヘパリン結合能を有するペプチドが包含される。
【００２３】
さらに、前記改変された第一の部分アミノ酸配列：Ｒ−Ｘ０１−Ｘ０２−Ｘ０３−Ｋ−Ｑ−Ｇに加えて、
ｖａｍｍｉｎ中のヘパリン結合部位に由来する第二の部分アミノ酸配列：
Ｋ−Ｅ−Ｋ−Ｐ−Ｒをも含み、
前記改変された第一の部分アミノ酸配列のＣ末端に、前記第二の部分アミノ酸配列が、４〜６アミノ酸残基からリンカー配列を介して連結されているヘパリン結合能を有するペプチドとすることもできる。
【００２４】
特には、前記リンカー配列として、Ｅ−Ｐ−Ｄ−Ｇ−Ｐを選択してなる、
Ｒ−Ｘ０１−Ｘ０２−Ｘ０３−Ｋ−Ｑ−Ｇ−Ｅ−Ｐ−Ｄ−Ｇ−Ｐ−Ｋ−Ｅ−Ｋ−Ｐ−Ｒ
（Ｘ０１は、ＰまたはＲ、Ｘ０２は、ＲまたはＫ、Ｘ０３は、Ｋ、ＨまたはＲである）からなるアミノ酸配列、または、その配列中に少なくとも一つのアミノ酸置換を有し、且つ前記改変された第一の部分アミノ酸配列を保持してなる改変型アミノ酸配列を含む、ヘパリン結合能を有するペプチドとすることもできる。
【００２５】
加えて、本発明は、上記の本発明の第二の形態にかかるヘパリン結合能を有するペプチドを利用する方法の発明として、ＶＥＧＦ−Ａ１６５とヘパリンとの結合に対する阻害剤としての用途発明をも提供し、
すなわち、本発明の第二の形態にかかるＶＥＧＦ−Ａ１６５とヘパリンとの結合に対する阻害剤は、
ＶＥＧＦ−Ａ１６５のヘパリンに対する結合の競争的阻害剤であって、
該競争阻害活性成分は、上述する本発明の第二の形態にかかるヘパリン結合能を有するペプチドであることを特徴とするＶＥＧＦ−Ａ１６５とヘパリンとの結合に対する阻害剤である。
【００２６】
かかる本発明の第二の形態にかかるＶＥＧＦ−Ａ１６５とヘパリンとの結合に対する阻害剤は、例えば、注射液剤の剤形に調製する際には、
投与対象者の静脈内投与に適する、薬学的に許容される液性担体中に、上述する本発明の第二の形態にかかるヘパリン結合能を有するペプチドの有効量を溶解してなる組成物とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、ｐｅｐｔｉｄｅ  １〜ｐｅｐｔｉｄｅ  ６の６種合成ペプチドのヘパリン結合能の評価結果を示し、標品ペプチド（１００μｇ）を、１０ｍＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０に溶解後、ＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰカラム（カラム容量１０ｍＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にアプライし、流速１ｍＬ／ｍｉｎで、該緩衝液を５カラム容量流し、引き続き、１０カラム容量、１．０Ｍ  ＮａＣｌまでの直線勾配で溶出を行い、溶出条件（ＮａＣｌ濃度）を測定した結果を示す。
【図２】図２は、本発明にかかるヘパリン結合能を有するペプチドの設計の基礎を説明し、  図２のＡは、ｖａｍｍｉｎとヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５のペプチド鎖のアミノ酸配列アライン結果から予測される、ｖａｍｍｉｎモノマー鎖内、二量体の鎖間のジスルフィド結合部位と、システインナット・モチーフを表示し、また、ヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５中のヘパリン結合に関与する領域を点線で囲って示し、  図２のＢは、ｖａｍｍｉｎのＣ末端部アミノ酸配列（Ａ中に下線で表示）と、それに基づき設計された、ｐｅｐｔｉｄｅ  １〜３のアミノ酸配列を対比して示す。
【図３】図３は、ｐｅｐｔｉｄｅ  １のＶＥＧＦ−Ａ１６５による血管内皮細胞の増殖促進作用、ならびにｖａｍｍｉｎによる血管内皮細胞の増殖促進作用に対する阻害能評価結果を示し、低血清培養条件において、ＶＥＧＦ−Ａ１６５またはｖａｍｍｉｎ（各最終濃度１ｎＭ）の添加によるウシ大動脈内皮細胞の増殖促進に対する、共添加するｐｅｐｔｉｄｅ  １による抑制を、６日間培養後の細胞数によって評価した、白：コントロール、黒：ＶＥＧＦ−Ａ１６５またはｖａｍｍｉｎのみ添加（陽性対照）、薄い灰色：３０μＭ（最終濃度）のｐｅｐｔｉｄｅ  １の添加、濃い灰色：１００μＭ（最終濃度）のｐｅｐｔｉｄｅ  １の添加時の結果を対比して示す。
【図４】図４は、ｐｅｐｔｉｄｅ  １のＶＥＧＦ−Ａ１６５による血圧降下作用、ならびにｖａｍｍｉｎによる血圧降下作用に対する阻害能評価結果を示し、  図４（Ａ）は、上：ｖａｍｍｉｎ（用量  ０．１μｇ／ｇ）の静脈注射後（↓印）のラット頸動脈圧の時間推移、下：ｐｅｐｔｉｄｅ  １（用量  ３μｇ／ｇ）を事前投与後（▼印）、ｖａｍｍｉｎ（用量  ０．１μｇ／ｇ）の静脈注射後（↓印）のラット頸動脈圧の時間推移、  図４（Ｂ）は、上：ＶＥＧＦ−Ａ１６５（用量  ０．１μｇ／ｇ）の静脈注射後（↓印）のラット頸動脈圧の時間推移、中：ｐｅｐｔｉｄｅ  １（用量  ３μｇ／ｇ）を事前投与後（▼印）、ＶＥＧＦ−Ａ１６５（用量  ０．１μｇ／ｇ）の静脈注射後（↓印）のラット頸動脈圧の時間推移、下：ｐｅｐｔｉｄｅ  １（用量  ３０μｇ／ｇ）を事前投与後（▼印）、ＶＥＧＦ−Ａ１６５（用量  ０．１μｇ／ｇ）の静脈注射後（↓印）のラット頸動脈圧の時間推移を対比して示す。
【図５】図５は、ｐｅｐｔｉｄｅ  １〜３の三種ペプチドのＶＥＧＦ−Ａ１６５による血圧降下作用に対する阻害能を比較評価した結果を示し、図中、Ａ：ＶＥＧＦ−Ａ１６５（用量  ０．１μｇ／ｇ）のみを投与した際（↓印）（陽性対照）、Ｂ：ｐｅｐｔｉｄｅ  １（用量  ３０μｇ／ｇ）を予め投与後（▼印）、ＶＥＧＦ−Ａ１６５（用量  ０．１μｇ／ｇ）を投与した際（↓印）、Ｃ：ｐｅｐｔｉｄｅ  ２（用量  ３０μｇ／ｇ）を予め投与後（▼印）、ＶＥＧＦ−Ａ１６５（用量  ０．１μｇ／ｇ）を投与した際（↓印）、Ｄ：ｐｅｐｔｉｄｅ  ３（用量  ３０μｇ／ｇ）を予め投与後（▼印）、ＶＥＧＦ−Ａ１６５（用量  ０．１μｇ／ｇ）を投与した際（↓印）における、ラット頸動脈圧の時間推移を対比して示す。
【図６】図６は、ヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質とヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５のペプチド鎖のアミノ酸配列アライン結果を示す。ヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質において、一致するアミノ酸残基は網掛けで、システイン残基は、白ヌキで示し、鎖内、鎖間のジスルフィド結合を表示し、また、システインナット・モチーフを形成する、ヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５鎖内のループ部分は横線で示されている。また、ヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５のヘパリン結合部位は、点線で囲まれている。ヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５中の、ＫＧＲ受容体結合のための重要な残基を、●印で、Ｆｌｔ−１結合のために重要な残基を、□印で、ヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質における、Ｆｌｔ−１への結合性の低下に寄与する、アミノ酸置換部位を、▼印で示す。ＨＦ：Ｖｉｐｅｒａ  ａｓｐｉｓ  ａｓｐｉｓのヘビ毒由来のｈｙｐｏｔｅｎｓｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ；  ＩＣＰＰ：Ｖｉｐｅｒａ  ｌｅｂｅｔｉｎａのヘビ毒由来のｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ；  ＶＥＧＦ１６５：  ヒト血管内皮増殖因子  ヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号，  ＡＡＭ０３１０８）
【図７】図７は、培地中に共添加されるヘパリンと、ＶＥＧＦ−Ａ１６５ならびにｖａｍｍｉｎとの結合に起因する、ＶＥＧＦ−Ａ１６５またはｖａｍｍｉｎ刺激による血管内皮細胞増殖作用の抑制効果を示す。血清添加培養条件において、種々の濃度の未分画ヘパリンと、ＶＥＧＦ−Ａ１６５またはｖａｍｍｉｎ（最終濃度１ｎＭ）を添加し、３日間培養後の生存細胞数を評価した。黒丸●：ｖａｍｍｉｎ、白丸○：ＶＥＧＦ−Ａ１６５刺激による血管内皮細胞の増殖促進時、培地中にヘパリンを各濃度で共添加した際における、ＷＳＴ−８法における、発色の吸収係数Ａ４０５−６３０（生存細胞数）を示す。
【図８】図８は、ｐｅｐｔｉｄｅ  １、ｐｅｐｔｉｄｅ  ２、ｐｅｐｔｉｄｅ  ３の各ペプチドが示す、ＶＥＧＦ−Ａ１６５による血管内皮細胞の増殖促進作用に対する阻害能評価結果を示す。血清添加培養条件において、ＶＥＧＦ−Ａ１６５（最終濃度１ｎＭ）の添加によるヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖促進に対する、共添加する各ペプチドによる抑制を、３日間培養後の細胞数によって評価した。黒丸●：ｐｅｐｔｉｄｅ  １、白丸○：ｐｅｐｔｉｄｅ  ２、黒三角▲：ｐｅｐｔｉｄｅ  ３を、各濃度添加した際における、増殖促進率を示す。
【図９】図９は、ｐｅｐｔｉｄｅ  １とｐｅｐｔｉｄｅ  ９（ＴＦＰＩ２５４−２６５）の各ペプチドが示す、ＶＥＧＦ−Ａ１６５による血管内皮細胞の増殖促進作用に対する阻害能評価結果を示す。血清添加培養条件において、ＶＥＧＦ−Ａ１６５（最終濃度１ｎＭ）の添加によるヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖促進に対する、共添加する各ペプチドによる抑制を、３日間培養後の細胞数によって評価した。黒色：ｐｅｐｔｉｄｅ  １、灰色：ｐｅｐｔｉｄｅ  ９（ＴＦＰＩ２５４−２６５）を、各濃度添加した際における、増殖促進率を示す。
【図１０】図１０は、ｐｅｐｔｉｄｅ  １、ｐｅｐｔｉｄｅ  ７、ｐｅｐｔｉｄｅ  ８の各ペプチドが示す、ＶＥＧＦ−Ａ１６５による血管内皮細胞の増殖促進作用に対する阻害能評価結果を示す。血清添加培養条件において、ＶＥＧＦ−Ａ１６５（最終濃度１ｎＭ）の添加によるヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖促進に対する、共添加する各ペプチドによる抑制を、３日間培養後の細胞数によって評価した。黒丸●：ｐｅｐｔｉｄｅ  １、白丸○：ｐｅｐｔｉｄｅ  ７、黒三角▲：ｐｅｐｔｉｄｅ  ８を、各濃度添加した際における、増殖促進率を示す。
【図１１】図１１は、培地中に共添加されるｐｅｐｔｉｄｅ  １に因る、ＶＥＧＦ−Ａ１６５または塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）刺激による血管内皮細胞増殖作用の抑制効果を示す。血清添加培養条件において、種々の濃度のｐｅｐｔｉｄｅ  １と、ＶＥＧＦ−Ａ１６５またはｂＦＧＦ（最終濃度１ｎＭ）を添加し、３日間培養後の生存細胞数を評価した。黒丸●：ＶＥＧＦ−Ａ１６５、白丸○：ｂＦＧＦ刺激による血管内皮細胞の増殖促進時、培地中にｐｅｐｔｉｄｅ  １を各濃度で共添加した際における、増殖促進率を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下に、本発明をより詳細に説明する。【００２９】
本発明に先立ち、本発明者らは、
Ｖｉｐｅｒａ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓのヘビ毒から精製・単離されたＶＥＧＦ様タンパク質：ｖａｍｍｉｎおよびＤａｂｏｉａ  ｒｕｓｓｅｌｌｉ  ｒｕｓｓｅｌｌｉのヘビ毒から精製・単離されたＶＥＧＦ様タンパク質：ＶＲ−１は、それぞれ、１１０アミノ酸からなるペプチド鎖二本が、鎖間のジスルフィド結合で連結されたホモ２量体、ならびに、１０９アミノ酸からなるペプチド鎖二本が、鎖間のジスルフィド結合で連結されたホモ２量体であること、加えて、これらｖａｍｍｉｎおよびＶＲ−１は、血管内皮増殖因子受容体２型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２；ＫＤＲ）に対する結合性を有し、血管内皮増殖因子受容体１型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １；Ｆｌｔ−１）、血管内皮増殖因子受容体３型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３；Ｆｌｔ−４）、およびニューロピリン−１（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１）に対する結合性は示さない特徴を有することを解明した。具体的には、ｖａｍｍｉｎを構成する、１１０アミノ酸からなるペプチド鎖の一次構造（アミノ酸配列）は、下記の配列１：
配列１：ｖａｍｍｉｎの１１０アミノ酸からなるペプチド鎖の一次構造
ＥＶＲＰＦＬＥＶＨＥ  ＲＳＡＣＱＡＲＥＴＬ  ＶＰＩＬＱＥＹＰＤＥ  
ＩＳＤＩＦＲＰＳＣＶ  ＡＶＬＲＣＳＧＣＣＴ  ＤＥＳＬＫＣＴＰＶＧ  
ＫＨＴＶＤＬＱＩＭＲ  ＶＮＰＲＴＱＳＳＫＭ  ＥＶＭＫＦＴＥＨＴＡ  
ＣＥＣＲＰＲＲＫＱＧ  ＥＰＤＧＰＫＥＫＰＲ  
また、ＶＲ−１を構成する、１０９アミノ酸からなるペプチド鎖の一次構造（アミノ酸配列）は、下記の配列２：
配列２：ＶＲ−１の１０９アミノ酸からなるペプチド鎖の一次構造
ＥＶＲＰＦＬＤＶＹＱ  ＲＳＡＣＱＴＲＥＴＬ  ＶＳＩＬＱＥＨＰＤＥ  
ＩＳＤＩＦＲＰＳＣＶ  ＡＶＬＲＣＳＧＣＣＴ  ＤＥＳＭＫＣＴＰＶＧ  
ＫＨＴＡＤＩＱＩＭＲ  ＭＮＰＲＴＨＳＳＫＭ  ＥＶＭＫＦＭＥＨＴＡ  
ＣＥＣＲＰＲＷＫＱＧ  ＥＰＥＧＰＫＥＰＲ  
である。【００３０】
なお、前記Ｖｉｐｅｒａ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓのヘビ毒から精製・単離されたＶＥＧＦ様タンパク質：ｖａｍｍｉｎ１１０アミノ酸からなるペプチド鎖の一次構造は、同様に、１１０アミノ酸からなるペプチド鎖二本が、鎖間のジスルフィド結合で連結されたホモ２量体である、Ｖｅｐｅｒａ  ａｓｐｉｓ  ａｓｐｉｓのヘビ毒素から単離されているＨＦの一次構造、下記配列３：
配列３：ＨＦの１１０アミノ酸からなるペプチド鎖の一次構造
ＥＶＲＰＦＬＥＶＨＥ  ＲＳＡＣＱＡＲＥＴＬ  ＶＳＩＬＱＥＹＰＤＥ  
ＩＳＤＩＦＲＰＳＣＶ  ＡＶＬＲＣＳＧＣＣＴ  ＤＥＳＬＫＣＴＰＶＧ  
ＫＨＴＶＤＬＱＩＭＲ  ＶＮＰＲＴＱＳＳＫＭ  ＥＶＭＫＦＴＥＨＴＡ  
ＣＥＣＲＰＲＲＫＱＧ  ＥＰＤＧＰＫＥＫＰＲ  
あるいは、Ｖｉｐｅｒａ  ｌｅｂｅｔｉｎａのヘビ毒から単離されているＩＣＰＰの一次構造、下記配列４：
配列４：ＩＣＰＰの１１０アミノ酸からなるペプチド鎖の一次構造
ＥＶＲＰＦＰＤＶＨＥ  ＲＳＡＣＱＡＲＥＴＬ  ＶＳＩＬＱＥＹＰＤＥ  
ＩＳＤＩＦＲＰＳＣＶ  ＡＶＬＲＣＳＧＣＣＴ  ＤＥＳＬＫＣＴＰＶＧ  
ＫＨＴＶＤＭＱＩＭＲ  ＶＮＰＲＴＱＳＳＫＭ  ＥＶＭＫＦＴＥＨＴＡ  
ＣＥＣＲＰＲＲＫＱＧ  ＥＰＤＧＰＫＥＫＰＲ  
と対比すると、図６に示すように極めて高い相同性を示すことを、同時に、これら一連のヘビ毒由来ＶＥＧＦ様タンパク質の生理活性と、そのアミノ酸配列との相関を十分に検討した結果、アミノ酸配列の一致部分のなかでも、ＫＤＲとの高い親和性を維持しつつ、一方、Ｆｌｔ−１との結合性を持たないという特性に深く関与する、あるいは、顕著に貢献するアミノ酸配列上の特徴の一つとして、配列１中のＡｌａ１３、Ｌｙｓ５５、Ａｒｇ７４、Ｓｅｒ７７、Ｌｙｓ７９の５つのアミノ酸の存在と、ＫＤＲに対する高い選択性との間に高い相関性が見出されることを既に解明し、それを報告している（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ｖｏｌ．２７８  ５１９８５−５１９８８  （２００３）を参照）。【００３１】
一方、分子量３８．２ｋＤａのホモ二量体タンパク質である、ヒトの血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ−Ａ１６５は、ヘパリンあるいはヘパラン硫酸プロテオグリカンに対する結合性をも有し、低い濃度ヘパリンの共存下においては、ＫＤＲに対するＶＥＧＦ−Ａ１６５の親和性の亢進がなさる点に着目して、ＶＥＧＦ−Ａ１６５中に存在するヘパリン結合性を支配する領域の特定を進めた。その過程で、プラスミン消化によりＣ末端のＡｒｇ１１１〜Ａｒｇ１６５の領域を切除した、Ｃ末端切除体は、ヘパリン結合性を喪失することを見出した。さらには、Ｃ末端切除体（ＶＥＧＦ１１０）は、例えば、ＶＥＧＦ−Ａ１６５が本来示す血管内皮増殖促進活性と対比すると、その血管内皮増殖促進活性は著しく低下することが確認され、ＶＥＧＦ−Ａ１６５のＫＤＲへの結合に伴い発揮される種々の生理活性発現には、該ＫＤＲが発現されている対象細胞表面に存在するヘパリンとの結合も不可欠な過程であることが判明した。【００３２】
実際に、ＶＥＧＦ−Ａ１６５中に存在するＣ末端のＡｒｇ１１１〜Ａｒｇ１６５の領域は、図２に示すように、かかる領域内部で鎖内のジスルフィド結合により形成される三次元構造を有しており、その三次元構造を構成した際、含まれる複数の塩基性アミノ酸残基がヘパリン中の酸性置換基の硫酸エステル、硫酸アミド構造と相互作用する結果、ヘパリンとの結合を達成していると推断される。【００３３】
また、ヘパリンの多糖鎖は、下に模式的に示すように、Ｌ−イズロン酸、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−グルコサミンを構成単位とし、硫酸化は、ほとんど全てのＤ−グルコサミンのアミノ基、その他、一部６位のヒドロキシ基、一部ウロン酸２位のヒドロキシ基にも存在している。細胞においては、多くは、タンパク質のアミノ残基側鎖上に結合したプロテオグルカンの形態で存在している。また、細胞種類に応じて、ヘパリンの多糖鎖上に存在する、この硫酸化部位、ならびに、構成糖単位の配列の差違が存在し、様々な生理活性に関与している。【００３４】
【化１】
2005077971.tif 000002
【００３５】
一方、ｖａｍｍｉｎでは、図２に示す対比から、ＶＥＧＦ−Ａ１６５中に存在するＣ末端のＡｒｇ１１１〜Ａｒｇ１６５領域のような、三次元構造を有するヘパリン結合部位は無いにも係わらず、同じく、ヘパリンとの結合性を示すこと、また、ｖａｍｍｉｎのＫＤＲへの結合に伴い発揮される種々の生理活性発現においても、該ＫＤＲが発現されている対象細胞表面に存在するヘパリンとの結合も不可欠な過程であることを解明した。さらには、ＶＲ−１に関しても、やはりヘパリンとの結合性を示すこと、また、ＶＲ−１のＫＤＲへの結合に伴い発揮される種々の生理活性発現においても、該ＫＤＲが発現されている対象細胞表面に存在するヘパリンとの結合も不可欠な過程であることを解明した。これらの新事実から、ｖａｍｍｉｎやＶＲ−１において見出されるヘパリンとの結合性は、それらのＣ末端部分、すなわち、ｖａｍｍｉｎのＣ末端部分アミノ酸配列（Ａｒｇ９４〜Ａｒｇ１１０）あるいはＶＲ−１のＣ末端部分アミノ酸配列（Ａｒｇ９４〜Ａｒｇ１０９）により支配されているとの着想を得て、実際に、下記の実施例に示す通り、かかるＣ末端部分アミノ酸配列に相当する合成ペプチドｐｅｐｔｉｄｅ  １を作製して、いずれもヘパリンとの結合能を示すペプチドであることを検証した。【００３６】
従って、ｖａｍｍｉｎやＶＲ−１のみならず、他のヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質ＨＦ、ＩＣＰＰにおいても、共通して、かかるＣ末端部分アミノ酸配列（Ａｒｇ９４〜Ａｒｇ１１０）がヘパリンとの結合を可能としていることも結論された。【００３７】
引き続き、ｖａｍｍｉｎのＣ末端部分アミノ酸配列（Ａｒｇ９４〜Ａｒｇ１１０）あるいはＶＲ−１のＣ末端部分アミノ酸配列（Ａｒｇ９４〜Ａｒｇ１０９）により支配されているヘパリンとの結合性において、その主要な部分領域を特定するため、図２のＢに示すｐｅｐｔｉｄｅ  ２、ｐｅｐｔｉｄｅ  ３の二種の部分断片型ペプチドを調製し、そのヘパリン結合性を評価したところ、合成ペプチドｐｅｐｔｉｄｅ  ２は、合成ペプチドｐｅｐｔｉｄｅ  １と遜色のないヘパリン結合性を示すが、合成ペプチドｐｅｐｔｉｄｅ  ３は、ヘパリン結合性を喪失していることが判明した。【００３８】
さらに、合成ペプチドｐｅｐｔｉｄｅ  ２に含まれる、ｖａｍｍｉｎ由来の部分アミノ酸配列：Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｒ−Ｋ−Ｑ−Ｇ−Ｅと、ＶＥＧＦ−Ａ１６５由来のＣ末端切除体（ＶＥＧＦ１１０）においてＣ末端に残余する部分アミノ酸配列：Ｒ−Ｐ−Ｋ−Ｋ−Ｄ−Ｒと対比させると、双方ともに、塩基性アミノ酸残基に富むアミノ酸配列であるものの、部分アミノ酸配列：Ｒ−Ｐ−Ｋ−Ｋ−Ｄ−Ｒでは、ヘパリン結合性が損なわれているという決定的な相違がある。【００３９】
すなわち、ｖａｍｍｉｎ由来の部分アミノ酸配列：Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｒ−Ｋ−Ｑ−Ｇ−Ｅと、ＶＲ−１の対応する領域、ならびに、ヘパリン結合性を示さないＶＥＧＦ１１０のＣ末端に残余する部分アミノ酸配列を相互に対比すると、
ｖａｍｍｉｎ  ：Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｒ−Ｋ−Ｑ−Ｇ−Ｅ
ＶＲ−１      ：Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｗ−Ｋ−Ｑ−Ｇ−Ｅ
ＶＥＧＦ１１０：Ｒ−Ｐ−Ｋ−Ｋ−Ｄ−Ｒ
想定部分配列  ：Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｘ−Ｋ−Ｑ−Ｇ  （Ｘは、Ｒ，Ｗ，Ｈ，Ｋのいずれか）
前記の想定部分配列（第一の部分アミノ酸配列）を保持すると、少なくとも、合成ペプチドｐｅｐｔｉｄｅ  ２におけるヘパリン結合性と遜色ないヘパリン結合性を示すと判断される。特には、下線を付した４アミノ酸が、上に例示するような、ヘパリン中の硫酸化された糖鎖における硫酸エステル構造、硫酸アミド構造との相互作用に適する相対配置に塩基性アミノ酸残基を配置する役割を果たしていると判断される。従って、本発明の第一の形態にかかるヘパリン結合能を有するペプチドでは、
前記第一の部分アミノ酸配列：Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｘ−Ｋ−Ｑ−Ｇ  （Ｘは、Ｒ，Ｗ，Ｈ，Ｋのいずれか）をその内部に含み、全体のアミノ酸残基数は、７〜２０アミノ酸残基からなるペプチドとする。前記全体のアミノ酸残基数の範囲は、種々のペプチド・ホルモンを構成するペプチド鎖長、例えば、アンギオテンシンＩＩの８アミノ酸残基、あるいは、インスリンＡ鎖の２１アミノ酸残基など、機能を発揮しつつ、水溶性を保持する上で適正なペプチド鎖長に相当している。【００４０】
上述するように、本発明の第一の形態にかかるヘパリン結合能を有するペプチドには、
ｖａｍｍｉｎ中のヘパリン結合部位に由来する第一の部分アミノ酸配列：
Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｘ−Ｋ−Ｑ−Ｇ（Ｘは、Ｒ，Ｗ，Ｈ，Ｋのいずれか）を少なくとも含み、
ＡＮ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｘ−Ｋ−Ｑ−Ｇ−ＡＣ
（ＡＮ、ＡＣは、それぞれアミノ酸数０〜１３までのペプチド鎖から選択され、ＡＮ、ＡＣのアミノ酸数の合計は、１３以下である）
からなる、７〜２０アミノ酸残基のアミノ酸配列を有するヘパリン結合能を有するペプチドが包含されるが、例えば、下記する合成ペプチドｐｅｐｔｉｄｅ  ４、５の例にしめされるように、ＡＮの部分には、アミノ酸が存在しない形態とすることができる。一般に、Ｎ末に保護用のアミノ酸として、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａなどの嵩の小さなアミノ酸を付加し、最小のアミノ酸数８以上の形態とすることが望ましい。【００４１】
加えて、合成ペプチドｐｅｐｔｉｄｅ  １では、Ｃ末端にＫ−Ｅ−Ｋ−Ｐ−Ｒの部分配列をも備えており、合成ペプチドｐｅｐｔｉｄｅ  ２よりも若干ヘパリン結合性が優っており、この第二の部分アミノ酸配列：Ｋ−Ｅ−Ｋ−Ｐ−Ｒをも有することが望ましい。その際、第一の部分アミノ酸配列と第二の部分アミノ酸配列の間を適正な間隔に配置することが好ましく、リンカー配列として、５アミノ酸残基程度、従って、４〜６アミノ酸残基からリンカー配列、より好ましくは、５アミノ酸残基からリンカー配列を設ける、
Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｘ−Ｋ−Ｑ−Ｇ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｋ−Ｅ−Ｋ−Ｐ−Ｒ
（Ｘは、Ｒ，Ｗ，Ｈ，Ｋのいずれか、なお、−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−は、リンカー配列）
と表記されるアミノ酸配列を含むことが好ましい。特には、ｖａｍｍｉｎ中のヘパリン結合部位に由来するアミノ酸配列：
Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｒ−Ｋ−Ｑ−Ｇ−Ｅ−Ｐ−Ｄ−Ｇ−Ｐ−Ｋ−Ｅ−Ｋ−Ｐ−Ｒ
からなるアミノ酸配列、または、その配列中に少なくとも一つのアミノ酸置換を有し、且つ前記第一の部分アミノ酸配列を保持してなる改変型アミノ酸配列を含む、ヘパリン結合能を有するペプチドとすることもできる。この種の改変アミノ酸配列の好ましい一例として、
Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｘ−Ｋ−Ｑ−Ｇ−Ｅ−Ｐ−Ｄ−Ｇ−Ｐ−Ｋ−Ｅ−Ｋ−Ｐ−Ｒ
（Ｘは、Ｗ，Ｈ，Ｋのいずれか）
また、Ｃ末端にＲを付加している、
Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｘ−Ｋ−Ｑ−Ｇ−Ｅ−Ｐ−Ｄ−Ｇ−Ｐ−Ｋ−Ｅ−Ｋ−Ｐ−Ｒ−Ｒ
（Ｘは、Ｒ，Ｗ，Ｈ，Ｋのいずれか）
などを挙げることができる。【００４２】
加えて、前記第二の部分アミノ酸配列：Ｋ−Ｅ−Ｋ−Ｐ−Ｒに代えて、第一の部分アミノ酸配列：Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｘ−Ｋ−Ｑ−Ｇ（Ｘは、Ｒ，Ｗ，Ｈ，Ｋのいずれか）をリンカー配列で連結している
Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｘ−Ｋ−Ｑ−Ｇ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｘ−Ｋ−Ｑ−Ｇ
と表記されるアミノ酸配列を選択することも可能である。すなわち、第一の部分アミノ酸配列がリンカー配列を介して、タンデム型に連結された形態となり、ヘパリンとの結合に関与できる部位が増したものとなる。あるいは、ＡＣの部分として、ＶＥＧＦ−Ａ１６５中に存在するＣ末端の５アミノ酸残基（Ａｓｐ１６１〜Ａｒｇ１６５）：Ｄ−Ｋ−Ｐ−Ｒ−Ｒに対応させて、前記Ｋ−Ｅ−Ｋ−Ｐ−Ｒ−Ｒを、Ｋ−Ｄ−Ｋ−Ｐ−Ｒ−Ｒへと変換した、
Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｘ−Ｋ−Ｑ−Ｇ−Ｅ−Ｐ−Ｄ−Ｇ−Ｐ−Ｋ−Ｄ−Ｋ−Ｐ−Ｒ−Ｒ
（Ｘは、Ｒ，Ｗ，Ｈ，Ｋのいずれか）
のようなアミノ酸配列を有するものとすることもできる。【００４３】
更には、第一の部分アミノ酸配列部分としては、ＸとしてＲを選択する、Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｒ−Ｋ−Ｑ−Ｇを用いることがより好ましい。【００４４】
なお、上記リンカー配列、例えば、５アミノ酸残基からリンカー配列：−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−部分の役割は、第一の部分アミノ酸配列部分に対して、第二の部分アミノ酸配列部分を連結し、第一の部分アミノ酸配列部分が主体となるヘパリン結合性に対して、第二の部分アミノ酸配列部分とヘパリン間の弱い相互作用の寄与を付加することを目的とするものである。従って、投与対象の体内に存在する、プロテアーゼ、ペプチダーゼの作用によって、かかるリンカー配列：−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−部分の切断がなされないものを利用することができる。加えて、Ｌ体アミノ酸からなるリンカー配列に代えて、Ｄ体アミノ酸からなるリンカー配列を利用することで、体内のプロテアーゼによる消化を抑制することも可能である。また、種々のペプチド試薬において利用される、ペプチド結合のミミック構造をかかるリンカー配列部分に利用することで、体内のプロテアーゼによる消化を抑制することも可能である。但し、このリンカー配列内で切断を受けた場合にも、第一の部分アミノ酸配列部分自体の切断が成されない限り、ヘパリン結合性を保持する第一の部分アミノ酸配列部分側断片を副生するので、特には、問題とはならない。【００４５】
一般に、ペプチド化合物の体内分解を防止する上では、Ｎ末端ならびにＣ末端に余剰のアミノ酸を付加する、あるいは、修飾を施す手法が有効である。例えば、Ｎ末端のアミノ基に種々のアシル基修飾を施す、あるいは、Ｃ末端のカルボキシ基をアミド化することもできる。本発明の第一の形態にかかるヘパリン結合能を有するペプチドは、化学的合成手法を利用して作製することが可能であるので、例えば、固相合成法を利用して、Ｃ末端側からペプチド鎖の延長を行う際には、樹脂上に固定されるＣ末端のアミド化を行うと、合成上も好適である。また、前記リンカー配列：−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−部分などは、天然のアミノ酸に代えて、人工のアミノ酸を含むものとすることができる。人工のアミノ酸を利用することで、ペプチド鎖の酵素的切断を抑制するものに、該リンカー配列を設計することも可能である。【００４６】
また、ｖａｍｍｉｎ中のヘパリン結合部位に由来するアミノ酸配列において、前記リンカー配列：−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−部分に相当するアミノ酸配列は、−Ｅ−Ｐ−Ｄ−Ｇ−Ｐ−となっているが、それに含まれる、−Ｄ−Ｇ−（Ａｓｐ−Ｇｌｙ）の配列では、場合によっては、Ａｓｐの側鎖上のカルボキシ基（−ＣＯＯＨ）とＧｌｙのＮ末のイミノ窒素（−Ｎ−）との間の反応に伴いスクシイミド構造の形成、あるいは、β位への転位が起こることが知られている。【００４７】
【化２】
2005077971.tif 000003
【００４８】
【化３】
2005077971.tif 000004
【００４９】
この種のペプチド分子内の反応に伴う、構造変化を抑制するため、例えば、−Ｄ−Ｇ−（Ａｓｐ−Ｇｌｙ）の配列を、−Ｄ−Ａ−（Ａｓｐ−Ａｌａ）や−Ｎ−Ｇ−（Ａｓｎ−Ｇｌｙ）のような構造的には類似するものの、不要な分子内反応を抑制するアミノ酸置換を行うこともできる。【００５０】
本発明の第一の形態にかかるヘパリン結合能を有するペプチドは、全体のアミノ酸残基数は、７〜２０アミノ酸残基からなるペプチドであり、また、親水性アミノ酸、特には、塩基性アミノ酸を多く含有しており、広い濃度範囲の水溶液とすることが可能である。医薬用途に適用する際には、水性媒体、例えば、種々のペプチド・ホルモンを含有する注射液の調製に利用される水性媒体、あるいは、経口投与可能なペプチド性生理活性物質を含有する液剤の調製に利用される水性媒体を担体とする組成物に調製することが好ましい。また、所定量の水を加えることによって、前記水性媒体を用いた組成物の作製が可能な、凍結乾燥混合物の形態とすることも可能である。一般に、水溶解性は、ペプチドを構成するアミノ酸残基数が増加するに伴い、低下する傾向を有するが、本発明にかかるヘパリン結合能を有するペプチドは、第一の部分アミノ酸配列部分、さらには、第二の部分アミノ酸配列部分にも、親水性に富むアミノ酸を高い比率で有するため、その水に対する溶解度は、少なくとも、２０ｍｇ／ｍＬを超えるものとなる。【００５１】
一方、本発明の第二の形態にかかるヘパリン結合能を有するペプチドは、
上述する本発明の第一の形態にかかるヘパリン結合能を有するペプチドにおいて利用される、前記第一の部分アミノ酸配列：Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｘ−Ｋ−Ｑ−Ｇ  （Ｘは、Ｒ，Ｗ，Ｈ，Ｋのいずれか）に代えて、改変された第一の部分アミノ酸配列：
Ｒ−Ｘ０１−Ｘ０２−Ｘ０３−Ｋ−Ｑ−Ｇ（Ｘ０１は、ＰまたはＲ、Ｘ０２は、ＲまたはＫ、Ｘ０３は、Ｋ、ＨまたはＲである）をその内部に含み、全体のアミノ酸残基数は、７〜２０アミノ酸残基からなるペプチドとする。先に説明したように、前記全体のアミノ酸残基数の範囲は、種々のペプチド・ホルモンを構成するペプチド鎖長、例えば、アンギオテンシンＩＩの８アミノ酸残基、あるいは、インスリンＡ鎖の２１アミノ酸残基など、機能を発揮しつつ、水溶性を保持する上で適正なペプチド鎖長に相当している。【００５２】
上述するように、本発明の第二の形態にかかるヘパリン結合能を有するペプチドには、
ｖａｍｍｉｎ中のヘパリン結合部位に由来する、改変された第一の部分アミノ酸配列：
Ｒ−Ｘ０１−Ｘ０２−Ｘ０３−Ｋ−Ｑ−Ｇ（Ｘ０１は、ＰまたはＲ、Ｘ０２は、ＲまたはＫ、Ｘ０３は、Ｋ、ＨまたはＲである）を少なくとも含み、
ＡＮ１−Ｒ−Ｘ０１−Ｘ０２−Ｘ０３−Ｋ−Ｑ−Ｇ−ＡＣ１
（ＡＮ１、ＡＣ１は、それぞれアミノ酸数０〜１３までのペプチド鎖から選択され、ＡＮ１、ＡＣ１のアミノ酸数の合計は、１３以下である）
からなる、７〜２０アミノ酸残基のアミノ酸配列を有するヘパリン結合能を有するペプチドが包含されるが、例えば、下記する合成ペプチドｐｅｐｔｉｄｅ  ７、８の例にしめされるように、ＡＮの部分には、アミノ酸が存在しない形態とすることができる。一般に、Ｎ末に保護用のアミノ酸を付加する際には、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａなどの嵩の小さなアミノ酸を付加し、最小のアミノ酸数８以上の形態とすることが望ましい。【００５３】
加えて、合成ペプチドｐｅｐｔｉｄｅ  ７、８では、合成ペプチドｐｅｐｔｉｄｅ  １と同様に、Ｃ末端にＫ−Ｅ−Ｋ−Ｐ−Ｒの部分配列をも備えており、合成ペプチドｐｅｐｔｉｄｅ  ２よりも若干ヘパリン結合性が優っており、この第二の部分アミノ酸配列：Ｋ−Ｅ−Ｋ−Ｐ−Ｒをも有することが望ましい。その際、前記改変された第一の部分アミノ酸配列と第二の部分アミノ酸配列の間を適正な間隔に配置することが好ましく、リンカー配列として、５アミノ酸残基程度、従って、４〜６アミノ酸残基からリンカー配列、より好ましくは、５アミノ酸残基からリンカー配列を設ける、
Ｒ−Ｘ０１−Ｘ０２−Ｘ０３−Ｋ−Ｑ−Ｇ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｋ−Ｅ−Ｋ−Ｐ−Ｒ
（Ｘ０１は、ＰまたはＲ、Ｘ０２は、ＲまたはＫ、Ｘ０３は、Ｋ、ＨまたはＲ、なお、−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−は、リンカー配列）
と表記されるアミノ酸配列を含むことが好ましい。【００５４】
特には、前記改変された第一の部分アミノ酸配列と、前記第二の部分アミノ酸配列とを連結する、リンカー配列として、Ｅ−Ｐ−Ｄ−Ｇ−Ｐを選択してなる、
Ｒ−Ｘ０１−Ｘ０２−Ｘ０３−Ｋ−Ｑ−Ｇ−Ｅ−Ｐ−Ｄ−Ｇ−Ｐ−Ｋ−Ｅ−Ｋ−Ｐ−Ｒ
（Ｘ０１は、ＰまたはＲ、Ｘ０２は、ＲまたはＫ、Ｘ０３は、Ｋ、ＨまたはＲである）からなるアミノ酸配列、または、その配列中に少なくとも一つのアミノ酸置換を有し、且つ前記改変された第一の部分アミノ酸配列を保持してなる改変型アミノ酸配列を含む、ヘパリン結合能を有するペプチドとすることもできる。この種の改変アミノ酸配列の好ましい一例として、
Ｒ−Ｘ０１−Ｘ０２−Ｘ０３−Ｋ−Ｑ−Ｇ−Ｅ−Ｐ−Ｄ−Ｇ−Ｐ−Ｋ−Ｅ−Ｋ−Ｐ−Ｒ
（Ｘ０１は、ＰまたはＲ、Ｘ０２は、ＲまたはＫ、Ｘ０３は、Ｋ、ＨまたはＲである）
に対して、Ｃ末端にＲを付加している、
Ｒ−Ｘ０１−Ｘ０２−Ｘ０３−Ｋ−Ｑ−Ｇ−Ｅ−Ｐ−Ｄ−Ｇ−Ｐ−Ｋ−Ｅ−Ｋ−Ｐ−Ｒ−Ｒ
（Ｘ０１は、ＰまたはＲ、Ｘ０２は、ＲまたはＫ、Ｘ０３は、Ｋ、ＨまたはＲである）
を挙げることができる。あるいは、ＡＣの部分に含まれる前記第二の部分アミノ酸配列に代えて、ＶＥＧＦ−Ａ１６５中に存在するＣ末端の５アミノ酸残基（Ａｓｐ１６１〜Ａｒｇ１６５）：Ｄ−Ｋ−Ｐ−Ｒ−Ｒに対応させて、前記Ｋ−Ｅ−Ｋ−Ｐ−Ｒ−Ｒを、Ｋ−Ｄ−Ｋ−Ｐ−Ｒ−Ｒへと変換した、
Ｒ−Ｘ０１−Ｘ０２−Ｘ０３−Ｋ−Ｑ−Ｇ−Ｅ−Ｐ−Ｄ−Ｇ−Ｐ−Ｋ−Ｄ−Ｋ−Ｐ−Ｒ−Ｒ
（Ｘ０１は、ＰまたはＲ、Ｘ０２は、ＲまたはＫ、Ｘ０３は、Ｋ、ＨまたはＲである）
のようなアミノ酸配列を有するものとすることもできる。【００５５】
更には、第一の部分アミノ酸配列部分としては、ＸとしてＲを選択する、Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｒ−Ｋ−Ｑ−Ｇを用いることがより好ましい。【００５６】
なお、上記リンカー配列、例えば、５アミノ酸残基からリンカー配列：−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−部分の役割は、第一の部分アミノ酸配列部分に対して、第二の部分アミノ酸配列部分を連結し、第一の部分アミノ酸配列部分が主体となるヘパリン結合性に対して、第二の部分アミノ酸配列部分とヘパリン間の弱い相互作用の寄与を付加することを目的とするものである。従って、投与対象の体内に存在する、プロテアーゼ、ペプチダーゼの作用によって、かかるリンカー配列：−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−部分の切断がなされないものを利用することができる。加えて、Ｌ体アミノ酸からなるリンカー配列に代えて、Ｄ体アミノ酸からなるリンカー配列を利用することで、体内のプロテアーゼによる消化を抑制することも可能である。また、種々のペプチド試薬において利用される、ペプチド結合のミミック構造をかかるリンカー配列部分に利用することで、体内のプロテアーゼによる消化を抑制することも可能である。但し、このリンカー配列内で切断を受けた場合にも、第一の部分アミノ酸配列部分自体の切断が成されない限り、ヘパリン結合性を保持する第一の部分アミノ酸配列部分側断片を副生するので、特には、問題とはならない。【００５７】
一般に、ペプチド化合物の体内分解を防止する上では、Ｎ末端ならびにＣ末端に余剰のアミノ酸を付加する、あるいは、修飾を施す手法が有効である。例えば、Ｎ末端のアミノ基に種々のアシル基修飾を施す、あるいは、Ｃ末端のカルボキシ基をアミド化することもできる。本発明の第二の形態にかかるヘパリン結合能を有するペプチドも、化学的合成手法を利用して作製することが可能であるので、例えば、固相合成法を利用して、Ｃ末端側からペプチド鎖の延長を行う際には、樹脂上に固定されるＣ末端のアミド化を行うと、合成上も好適である。また、前記リンカー配列：−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−部分などは、天然のアミノ酸に代えて、人工のアミノ酸を含むものとすることができる。人工のアミノ酸を利用することで、ペプチド鎖の酵素的切断を抑制するものに、該リンカー配列を設計することも可能である。【００５８】
すなわち、本発明の第二の形態にかかるヘパリン結合能を有するペプチドでは、前記改変された第一の部分アミノ酸配列以外のペプチド鎖部分は、上述する本発明の第一の形態にかかるヘパリン結合能を有するペプチドにおいて説明した、様々な変異、修飾、改変を同様に利用する態様とすることも可能である。【００５９】
本発明にかかる新規なヘパリン結合能を有するペプチドは、ＶＥＧＦ−Ａ１６５のＫＤＲへの結合により誘起される血管新生促進作用の発揮に必要な、ＶＥＧＦ−Ａ１６５と血管内皮細胞表面上のヘパリンとの間の結合を、競争的に阻害する作用を有し、抗ＶＥＧＦ−Ａ１６５剤として利用可能であり、例えば、固形腫瘍の増殖や転移、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、乾癬など、種々の疾患の要因となる、ＶＥＧＦ−Ａ１６５に起因する血管新生促進の抑制を目的とする治療薬、予防薬の用途に、適用可能である。【００６０】
これら内因性の血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ−Ａ１６５に起因する血管新生促進の抑制を目的とする治療用途では、本発明にかかるヘパリン結合能を有するペプチドは、血流中に直接投与し、作用部位の血管内皮細胞表面へ供給する形態での投与が適しており、通常、静脈内投与に適する剤形の医薬組成物に調製することが好ましい。具体的には、種々の生理活性を有するペプチド製剤の静脈内投与に利用されている剤形、例えば、静脈注射剤、点滴剤などの剤形とされ、各単位投与用量は、その治療用途に応じて、適宜決定される。また、投与対象（患者）の状況、症状の重篤さ、性別、年齢、体重、その他の健康状態などを考慮して、その推定される総血液量において、所望の生理活性が発揮される血中濃度となるように、投与用量を設定することが好ましい。なお、本発明にかかるヘパリン結合能を有するペプチドを静脈注射剤の剤形で利用する際には、通常、複数回に分けて投与することも可能であるが、合計される用量は、１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、好ましくは、３〜５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲に設定することが望ましい。例えば、総血液量を考慮した上で、投与直後の投与量が均一に分散すると仮定した際、その平均血中濃度が、０．１μＭ〜１０μＭの範囲、好ましくは、１μＭ〜３μＭの範囲に投与総量を設定することが望ましい。【００６１】
また、適用される器官部位が特定される、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症に対する、ＶＥＧＦ−Ａ１６５に起因する血管新生促進の抑制を目的とする治療薬、予防薬としては、点眼薬の剤形に調製することも可能である。この投与対象者に対して、その眼球または眼窩への適用に適する、薬学的に許容される液性担体中に、ヘパリン結合能を有するペプチドの有効量を溶解した点眼薬の剤形では、通常、液中濃度を、０．１μＭ〜１０μＭの範囲、好ましくは、１μＭ〜３μＭの範囲に設定することが望ましい。
【実施例】
【００６２】
以下に、実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。ここに示す具体例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるものの、本発明は、これら具体例に限定されるものではない。【００６３】
実施例１
（ペプチド合成と精製）
ヘビ毒由来の血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ様タンパク質；ｖａｍｍｉｎならびにＶＲ−１のアミノ酸配列を参照して、そのヘパリン結合性に関与すると想定される、ｖａｍｍｉｎのＣ末端部分アミノ酸配列（Ａｒｇ９４〜Ａｒｇ１１０）あるいはＶＲ−１のＣ末端部分アミノ酸配列（Ａｒｇ９４〜Ａｒｇ１０９）に基づき、下記表１に示すｐｅｐｔｉｄｅ  １〜ｐｅｐｔｉｄｅ  ６の６種のペプチドを設計した。【００６４】
設計されたアミノ酸配列に基づき、各ペプチドは、ペプチドシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  モデル４３１Ａ）を用いて、Ｆ−ｍｏｃ法による固相合成法により調製した。常法に従って、合成ペプチドは、脱保護ならびに、Ｆ−ｍｏｃクリーベッジ法よる基材レジンから分離、溶出し、回収される粗ペプチドを凍結乾燥した。【００６５】
粗ペプチドの精製は、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ならびにＨＰＬＣシステム（日本分光）を利用して行った。なお、カラム溶出画分におけるペプチドの検出は、２４０ｎｍの吸光度測定により行った。【００６６】
得られた粗ペプチド４０ｍｇを、１０ｍＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０に溶解後、ＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰカラム（カラム容量１０ｍＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にアプライした。該ヘパリン・アフィニティカラムより、流速１ｍＬ／ｍｉｎで、５カラム容量、１．０Ｍ  ＮａＣｌまでの直線勾配で溶出を行った。【００６７】
前記ヘパリンに対する結合性を示すペプチド画分をプール、回収した後、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８ＡＲ−３００（２ｃｍφ×２５ｃｍ（Ｌ））にアプライし、アセトニトリル  ０％〜  ３０％の線形勾配で溶出し、所望のアミノ酸数を有するペプチド画分を単離した。精製ペプチドは凍結乾燥し、アミノ酸シーケンサーによりアミノ酸配列を確認した後、アミノ酸分析法によって、ペプチド濃度を定量した。【００６８】
（アミノ酸配列分析）
前記精製済みのペプチドのアミノ酸配列確認は、プロテイン・シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｍｏｄｅｌｓ  ４７３Ａ，  ４７７、  Ｓｈｉｍａｄｚｕ  モデル  ＰＰＳＱ−２１Ａ）を用いて行った。【００６９】
（ヘパリン結合性の評価）
精製済みペプチド（１００μｇ）を、１０ｍＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０に溶解後、ＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰカラム（カラム容量１０ｍＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にアプライした。その後、流速１ｍＬ／ｍｉｎで、前記緩衝液を５カラム容量流し、引き続き、１０カラム容量、１．０Ｍ  ＮａＣｌまでの直線勾配で溶出を行い、溶出条件（ＮａＣｌ濃度）を測定した。【００７０】
図１に、各ペプチドについて、ヘパリンに対する結合性を示すペプチド画分の溶出ピーク位置（太線部）を示す。また、表１に、そのピーク極大点における溶出ＮａＣｌ濃度をまとめて示す。【００７１】
【表１】
2005077971.tif 000005
【００７２】
また、ヘビ毒由来の血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ様タンパク質；ｖａｍｍｉｎならびにＶＲ−１に関しても、同様に前記ヘパリン・アフィニティカラムから溶出されるタンパク質画分のピーク極大点における溶出ＮａＣｌ濃度を測定した結果を表２にしめす。【００７３】
【表２】
2005077971.tif 000006
【００７４】
（ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＶＥＧＦ−Ａ１６５による血管内皮細胞の増殖促進作用に対する阻害能評価）
上記のヘパリン結合能を有するペプチドが、ＶＥＧＦ−Ａ１６５による血管内皮細胞の増殖促進作用を抑制することを、下記するｉｎ  ｖｉｔｒｏの評価系において検証した。同時に、ｖａｍｍｉｎによる血管内皮細胞の増殖促進作用を抑制することも、併せて検証した。【００７５】
ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）の細胞懸濁液を、５，０００個／ウエルの密度で、９６ウエルの細胞培養プレートに播種した。ウエル中の細胞の接着後、０．１％ウシ胎児血清を添加した培地に交換し、延べ１８時間培養した。その時点で、培地に、血管内皮増殖因子タンパク質のＶＥＧＦ−Ａ１６５あるいはｖａｍｍｉｎを最終濃度１  ｎＭ、ならびにｐｅｐｔｉｄｅ  １を、それぞれ、所定の最終濃度で添加した。その後、６日間培養を継続した後、各ウエル中の細胞数について、Ｔｅｔｒａ  Ｃｏｌｏｒ  Ｏｎｅ（生化学工業）を用いて、ＷＳＴ−８法により生存細胞数密度を評価した。【００７６】
ＷＳＴ−８法における、発色の吸収係数Ａ４０５−６３０を、生存細胞数の指標とした。図３に、同じプレート上において併行して評価された、
左側：血管内皮増殖因子タンパク質ならびにｐｅｐｔｉｄｅ  １を添加していないウエル（陰性対照：白色カラム）、
中央：ｖａｍｍｉｎに加えて、ｐｅｐｔｉｄｅ  １を最終濃度１００μＭ（濃い灰色カラム：中央の右）、３０μＭ（薄い灰色カラム：中央の中）、０μＭ（無添加：陽性対照；黒色カラム：中央の左）添加したウエル、
右側：ＶＥＧＦ−Ａ１６５に加えて、ｐｅｐｔｉｄｅ  １を最終濃度１００μＭ（濃い灰色カラム：中央の右）、３０μＭ（薄い灰色カラム：中央の中）、０μＭ（無添加：陽性対照；黒色カラム：中央の左）添加したウエル、
における測定結果を示す。【００７７】
図３に示す結果を比較すると、添加されるＶＥＧＦ−Ａ１６５ならびにｖａｍｍｉｎは血管内皮細胞の増殖促進作用をしているが、ｐｅｐｔｉｄｅ  １の共存下においては、その添加濃度依存的に、その細胞の増殖促進作用が抑制を受けている。従って、ヘパリン結合能を有するｐｅｐｔｉｄｅ  １は、ＢＡＥＣ細胞表面に存在するヘパリンに対して結合することで、ＶＥＧＦ−Ａ１６５ならびにｖａｍｍｉｎが血管内皮細胞の増殖促進作用を発揮する上で必要な、ＫＤＲへの結合とヘパリンとの結合のうち、ヘパリンとの結合を競争的に阻害する結果、ＶＥＧＦ−Ａ１６５ならびにｖａｍｍｉｎが示す血管内皮細胞の増殖促進作用を抑制していると判断される。【００７８】
（ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＶＥＧＦ−Ａ１６５による血圧降下作用に対する阻害能評価）
上記のヘパリン結合能を有するペプチドが、ＶＥＧＦ−Ａ１６５による血圧降下作用を抑制することを、下記するｉｎ  ｖｉｖｏの評価系において検証した。同時に、ｖａｍｍｉｎによる血圧降下作用を抑制することも、併せて検証した。【００７９】
ＶＥＧＦ−Ａ１６５あるいはｖａｍｍｉｎによる血圧降下能の測定は、オスのＷｉｓｔａｒ  ｒａｔ（各群個体数  ｎ＝３または５，  １５０〜２２０  ｇ）を使用して行った。各個体について、カルバミン酸エチルエステル（１  ｇ／ｋｇ）の腹膜注射による麻酔後、２５％  ＭｇＳＯ４で満たしたポリエチレンチューブを頸動脈に挿入し、圧力トランスデューサー（モデルＰ１０ＥＺ，  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に接続して、頸動脈圧をモニターした。圧力トランスデューサーで測定される頸動脈圧は、アンプ（ｍｏｄｅｌ  ＡＰ−６２１日本光電）につながれたレコーダーで記録した。【００８０】
各被験個体に対して、生理食塩水（６００  μＬ）注射により血圧が安定していることを確認後、ヘパリン結合能を有するペプチド（６００  μＬ）、ならびに、ＶＥＧＦ−Ａ１６５またはｖａｍｍｉｎ（６００  μＬ）を左大腿静脈から投与した。【００８１】
図４のＡは、上：ｖａｍｍｉｎ（用量  ０．１μｇ／ｇ）のみを投与した際、
下：ｐｅｐｔｉｄｅ  １（用量  ３μｇ／ｇ）を予め投与後、ｖａｍｍｉｎ（用量  ０．１μｇ／ｇ）を投与した際における、頸動脈圧の低下量を示し、
図４のＢは、上：ＶＥＧＦ−Ａ１６５（用量  ０．１μｇ／ｇ）のみを投与した際、
中：ｐｅｐｔｉｄｅ  １（用量  ３μｇ／ｇ）を予め投与後、ＶＥＧＦ−Ａ１６５（用量  ０．１μｇ／ｇ）を投与した際、
下：ｐｅｐｔｉｄｅ  １（用量  ３０μｇ／ｇ）を予め投与後、ＶＥＧＦ−Ａ１６５（用量  ０．１μｇ／ｇ）を投与した際における、頸動脈圧の低下量を示している。【００８２】
図４に示す結果を比較すると、投与されるＶＥＧＦ−Ａ１６５ならびにｖａｍｍｉｎは血圧降下を誘起しているが、ｐｅｐｔｉｄｅ  １の共存下においては、その添加濃度依存的に、その血圧降下の誘起作用が抑制を受けている。なお、ここで評価されるＶＥＧＦ−Ａ１６５ならびにｖａｍｍｉｎが示す血圧降下作用は、ＶＥＧＦタンパク質のＫＤＲへの結合により誘起される、一酸化窒素（ＮＯ）依存性の強力な血圧降下活性に基づくものであり、従って、ヘパリン結合能を有するｐｅｐｔｉｄｅ  １は、ＫＤＲを発現している細胞表面に存在するヘパリンに対して結合することで、ＶＥＧＦ−Ａ１６５ならびにｖａｍｍｉｎが血圧降下作用を発揮する上で必要な、ＫＤＲへの結合とヘパリンとの結合のうち、ヘパリンとの結合を競争的に阻害する結果、ＶＥＧＦ−Ａ１６５ならびにｖａｍｍｉｎによる血圧降下作用を抑制していると判断される。【００８３】
上記のＲ−Ｐ−Ｒ−Ｘ−Ｋ−Ｑ−Ｇ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｋ−Ｅ−Ｋ−Ｐ−Ｒのアミノ酸配列を含む、本発明にかかるヘパリン結合能を有するペプチドにおいて、特に、Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｘ−Ｋ−Ｑ−Ｇ（Ｘは、Ｒ，Ｗ，Ｈ，Ｋのいずれか）の部分のみによって、ＶＥＧＦ−Ａ１６５ならびにｖａｍｍｉｎが血圧降下作用を発揮する上で必要な、ＫＤＲへの結合とヘパリンとの結合のうち、ヘパリンとの結合を競争的に阻害する結果、ＶＥＧＦ−Ａ１６５ならびにｖａｍｍｉｎによる血圧降下作用を抑制する効果が達成されることの検証も行った。【００８４】
具体的には、ｐｅｐｔｉｄｅ  １に加えて、ｐｅｐｔｉｄｅ  １のＮ末領域に相当するｐｅｐｔｉｄｅ  ２、ならびにＣ末領域に相当するｐｅｐｔｉｄｅ  ３について、ＶＥＧＦ−Ａ１６５による血圧降下作用を抑制する効果の有無について、前記のｉｎ  ｖｉｖｏ評価系で併行して評価した。【００８５】
図５中、Ａ：ＶＥＧＦ−Ａ１６５（用量  ０．１μｇ／ｇ）のみを投与した際（陽性対照）、
Ｂ：ｐｅｐｔｉｄｅ  １（用量  ３０μｇ／ｇ）を予め投与後、ＶＥＧＦ−Ａ１６５（用量  ０．１μｇ／ｇ）を投与した際、
Ｃ：ｐｅｐｔｉｄｅ  ２（用量  ３０μｇ／ｇ）を予め投与後、ＶＥＧＦ−Ａ１６５（用量  ０．１μｇ／ｇ）を投与した際、
Ｄ：ｐｅｐｔｉｄｅ  ３（用量  ３０μｇ／ｇ）を予め投与後、ＶＥＧＦ−Ａ１６５（用量  ０．１μｇ／ｇ）を投与した際における、頸動脈圧の低下量をそれぞれ示している。【００８６】
図５に示す結果を比較すると、投与されるＶＥＧＦ−Ａ１６５が誘起している血圧降下作用に対して、事前に投与されるｐｅｐｔｉｄｅ  １およびｐｅｐｔｉｄｅ  ２は、その血圧降下作用を抑制する効果を示しているが、ｐｅｐｔｉｄｅ  ３に関しては、抑制効果は観測されていない。従って、ヘパリン結合能を有するｐｅｐｔｉｄｅ  １およびｐｅｐｔｉｄｅ  ２は、ＫＤＲを発現している細胞表面に存在するヘパリンに対して結合することで、ＶＥＧＦ−Ａ１６５が血圧降下作用を発揮する上で必要な、ＫＤＲへの結合とヘパリンとの結合のうち、ヘパリンとの結合を競争的に阻害する結果、ＶＥＧＦ−Ａ１６５による血圧降下作用を抑制していると判断される。一方、ｐｅｐｔｉｄｅ  ３は、ヘパリン結合能を示さず、そのため、抑制効果は観測されていないと判断される。【００８７】
結論として、上記のＲ−Ｐ−Ｒ−Ｘ−Ｋ−Ｑ−Ｇ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｋ−Ｅ−Ｋ−Ｐ−Ｒのアミノ酸配列を含む、本発明にかかるヘパリン結合能を有するペプチドにおいて、特に、Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｘ−Ｋ−Ｑ−Ｇ（Ｘは、Ｒ，Ｗ，Ｈ，Ｋのいずれか）の部分が、ヘパリン結合能を支配する部位であると判断される。加えて、該Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｘ−Ｋ−Ｑ−Ｇ（Ｘは、Ｒ，Ｗ，Ｈ，Ｋのいずれか）の部分を利用することで、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても、ＫＤＲを発現している細胞表面に存在するヘパリンに対して結合することで、ＶＥＧＦ−Ａ１６５が種々の生理的活性、作用を発揮する上で必要な、ＫＤＲへの結合とヘパリンとの結合のうち、ヘパリンとの結合を競争的に阻害する結果、ＶＥＧＦ−Ａ１６５による生理的活性、作用を抑制していると判断される。【００８８】
参考例１
本例では、ＶＥＧＦ−Ａ１６５ならびにｖａｍｍｉｎが血管内皮細胞の増殖促進作用を発揮する上で必要な、ＫＤＲへの結合とヘパリンとの結合のうち、血管内皮細胞表面上のヘパリンとの結合を阻害することで、ＶＥＧＦ−Ａ１６５ならびにｖａｍｍｉｎが示す血管内皮細胞の増殖促進作用が抑制されることを検証した。【００８９】
（ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＶＥＧＦ−Ａ１６５またはｖａｍｍｉｎによる血管内皮細胞の増殖促進作用に対する、未分画ヘパリンの阻害能評価）
上述するように、ＶＥＧＦ−Ａ１６５ならびにｖａｍｍｉｎは、遊離型ヘパリンとの結合能を示すので、予め、ＶＥＧＦ−Ａ１６５ならびにｖａｍｍｉｎに対して、遊離型ヘパリンを結合させると、結果的に、血管内皮細胞表面上のヘパリンとの結合を阻害することが可能となる。【００９０】
ＶＥＧＦ−Ａ１６５ならびにｖａｍｍｉｎとの結合能を示す未分画ヘパリンは、ＶＥＧＦ−Ａ１６５またはｖａｍｍｉｎによる血管内皮細胞の増殖促進作用を抑制する効果を示すことを、下記するｉｎ  ｖｉｔｒｏの評価系において検証した。【００９１】
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の細胞懸濁液を、５，０００個／ウエルの密度で、コラーゲンコートした９６ウエルの細胞培養プレートに播種した。播種後、６時間培養し、ウエル中の細胞の接着を行った後、１％ヒト血清を添加した培地に交換し、一夜（延べ１８時間）培養した。その時点で、培地に、血管内皮増殖因子タンパク質のＶＥＧＦ−Ａ１６５またはｖａｍｍｉｎを最終濃度１  ｎＭ、ならびに、未分画ヘパリンを所定の最終濃度で添加した。その後、３日間培養を継続した後、各ウエル中の細胞数について、Ｔｅｔｒａ  Ｃｏｌｏｒ  Ｏｎｅ（生化学工業）を用いて、ＷＳＴ−８法により生存細胞数密度を評価した。【００９２】
ＷＳＴ−８法における、発色の吸収係数Ａ４０５−６３０を、生存細胞数の指標とした。ＶＥＧＦ−Ａ１６５またはｖａｍｍｉｎ、ならびに未分画ヘパリンを添加しない状態で、前記１％血清添加培地において培養した際の生存細胞数を、陰性対照（ｕｎｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ）、未分画ヘパリンを添加せず、ＶＥＧＦ−Ａ１６５またはｖａｍｍｉｎのみが添加されている状態で、前記１％血清添加培地において培養した際の生存細胞数を、陽性対照（ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ）とし、評価された生存細胞数に基づき、増殖促進に対する抑制効果を見積もる。【００９３】
図７は、培地中に共添加される未分画ヘパリンと、ＶＥＧＦ−Ａ１６５ならびにｖａｍｍｉｎとの結合に起因する、ＶＥＧＦ−Ａ１６５またはｖａｍｍｉｎ刺激による血管内皮細胞増殖作用の抑制効果を示す。血清添加培養条件において、種々の濃度の未分画ヘパリンと、ＶＥＧＦ−Ａ１６５またはｖａｍｍｉｎ（最終濃度１ｎＭ）を添加し、３日間培養後の生存細胞数を評価した。黒丸●：ｖａｍｍｉｎ、白丸○：ＶＥＧＦ−Ａ１６５刺激による血管内皮細胞の増殖促進時、培地中に未分画ヘパリンを各濃度で共添加した際における、ＷＳＴ−８法における、発色の吸収係数Ａ４０５−６３０（生存細胞数）を示す。【００９４】
培地中に添加される未分画ヘパリンの濃度に依存して、ＶＥＧＦ−Ａ１６５またはｖａｍｍｉｎ刺激による血管内皮細胞増殖作用は抑制を受けている。すなわち、ＶＥＧＦ−Ａ１６５またはｖａｍｍｉｎに予め未分画ヘパリンを結合させておくと、血管内皮細胞の増殖促進作用を発揮する上で必要な、ＫＤＲへの結合とヘパリンとの結合のうち、血管内皮細胞表面上のヘパリンとの結合が阻害を受け、結果として、ＫＤＲへの結合は生じるものの、ＶＥＧＦ−Ａ１６５またはｖａｍｍｉｎによる血管内皮細胞増殖作用は発揮されていない。【００９５】
以上の結果は、ＶＥＧＦ−Ａ１６５またはｖａｍｍｉｎ刺激による血管内皮細胞増殖作用の発揮は、ＶＥＧＦ−Ａ１６５またはｖａｍｍｉｎと、血管内皮細胞表面上のヘパリンとの結合を阻害することで、抑制可能であることを査証している。【００９６】
実施例２
更に、前記のｐｅｐｔｉｄｅ  ６：Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｒ−Ｋ−Ｑ−Ｇ−Ｅ−Ｐ−Ｄ−Ｇ−Ｐ−Ｋ−Ｅ−Ｋ−Ｐ−Ｒ−Ｒに基づき、その第一の部分アミノ酸配列部分に相当するＲ−Ｐ−Ｒ−Ｒ−Ｋ−Ｑ−Ｇ部分に改変を施し、下記表３に示すｐｅｐｔｉｄｅ  ７、ｐｅｐｔｉｄｅ  ８の２種のペプチドを設計した。加えて、ヘパリン結合性を有するＴｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＴＦＰＩ）蛋白質中の部分アミノ酸配列（Ｌｙｓ２５４〜Ｌｙｓ２６５）に相当するｐｅｐｔｉｄｅ  ９を、対照ヘパリン結合性ペプチドとして設計した。【００９７】
（ヘパリン結合性の評価）
実施例１に記載する（ペプチド合成と精製）と（アミノ酸配列分析）の手順に従って、ｐｅｐｔｉｄｅ  ７、ｐｅｐｔｉｄｅ  ８、ならびにｐｅｐｔｉｄｅ  ９の３種のペプチドの精製済み評品を作製した。【００９８】
次いで、実施例１に記載する（ヘパリン結合性の評価）の手法に従って、ＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰカラム上に結合した精製済みペプチドに対する、溶出条件（ＮａＣｌ濃度）を測定した。【００９９】
表３に、前記三種のペプチドについて、溶出ピークのピーク極大点における溶出ＮａＣｌ濃度の測定結果をまとめて示す。【０１００】
【表３】
2005077971.tif 000007
【０１０１】
（ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＶＥＧＦ−Ａ１６５による血管内皮細胞の増殖促進作用に対する阻害能評価）
上記のヘパリン結合能を有するペプチドが、ＶＥＧＦ−Ａ１６５による血管内皮細胞の増殖促進作用を抑制することを、下記するｉｎ  ｖｉｔｒｏの評価系において検証した。【０１０２】
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の細胞懸濁液を、５，０００個／ウエルの密度で、コラーゲンコートした９６ウエルの細胞培養プレートに播種した。播種後、６時間培養し、ウエル中の細胞の接着を行った後、１％ヒト血清を添加した培地に交換し、一夜（延べ１８時間）培養した。その時点で、培地に、血管内皮増殖因子タンパク質のＶＥＧＦ−Ａ１６５を最終濃度１  ｎＭ、ならびに各ペプチドを、それぞれ、所定の最終濃度で添加した。その後、３日間培養を継続した後、各ウエル中の細胞数について、Ｔｅｔｒａ  Ｃｏｌｏｒ  Ｏｎｅ（生化学工業）を用いて、ＷＳＴ−８法により生存細胞数密度を評価した。【０１０３】
ＷＳＴ−８法における、発色の吸収係数Ａ４０５−６３０を、生存細胞数の指標とした。ＶＥＧＦ−Ａ１６５、ならびに被験ペプチドを共に添加しない状態で、前記１％血清添加培地において培養した際の生存細胞数を、陰性対照：増殖促進０％、被験ペプチドを添加せず、ＶＥＧＦ−Ａ１６５のみが添加されている状態で、前記１％血清添加培地において培養した際の生存細胞数を、陽性対照：増殖促進１００％とし、評価された生存細胞数に基づき、増殖促進率を算出した。【０１０４】
図８に、ｐｅｐｔｉｄｅ  １、ｐｅｐｔｉｄｅ  ２、ｐｅｐｔｉｄｅ  ３の各ペプチドが示す、ＶＥＧＦ−Ａ１６５による血管内皮細胞の増殖促進作用に対する阻害能評価結果を示す。血清添加培養条件において、ＶＥＧＦ−Ａ１６５（最終濃度１ｎＭ）の添加によるヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖促進に対する、共添加する各ペプチドによる抑制効果を、３日間培養後の生存細胞数によって評価した。【０１０５】
なお、培地内に添加されている血清中には、若干量のＶＥＧＦが元々含有されており、ＶＥＧＦ−Ａ１６５による血管内皮細胞の増殖促進作用を完全に阻害する条件では、この血清由来のＶＥＧＦに起因する増殖促進作用も同様に阻害される。従って、ＶＥＧＦ−Ａ１６５による血管内皮細胞の増殖促進作用が完全に阻害されている場合、見かけ上、増殖促進率は負の値を示す。一般には、「増殖促進率が負の値を示す」場合には、被験化合物（ペプチド）は、対象細胞に対する「細胞毒性」を示すと推断される。しかしながら、この血清添加培養条件を利用する評価系では、この図に示される程度の「負の増殖促進率」は、「細胞毒性」を意味しない点は、予め、血清添加量を０．１％以下に抑えた低濃度血清添加培地による培養時の生存細胞数を測定することで確認される。【０１０６】
図８中、黒丸●で示す、ｐｅｐｔｉｄｅ  １の添加濃度依存性は、ＶＥＧＦ−Ａ１６５による血管内皮細胞の増殖促進作用に対する濃度依存的な阻害活性を示している。一方、ｐｅｐｔｉｄｅ  １と比較して、ヘパリン結合能が劣る、白丸○：ｐｅｐｔｉｄｅ  ２、黒三角▲：ｐｅｐｔｉｄｅ  ３を添加した際には、そのヘパリン結合能の差違を反映して、５０％阻害を達成できる添加濃度（ＥＤ５０）は高濃度となっている。従って、ｐｅｐｔｉｄｅ  １、ｐｅｐｔｉｄｅ  ２、ｐｅｐｔｉｄｅ  ３の各ペプチドは、いずれも、血管内皮細胞表面上のＫＤＲへの結合とヘパリンとの結合のうち、ヘパリンとの結合を競争的に阻害する結果、ＶＥＧＦ−Ａ１６５が示す血管内皮細胞の増殖促進作用を抑制していると判断される。また、５０％阻害添加濃度（ＥＤ５０）の差違は、ｐｅｐｔｉｄｅ  １、ｐｅｐｔｉｄｅ  ２、ｐｅｐｔｉｄｅ  ３の各ペプチドが示す、血管内皮細胞表面上のヘパリンとの結合能の差違に起因することも確認される。【０１０７】
市販のヘパリン親和性カラムに利用される遊離型ヘパリンに対しては、ｐｅｐｔｉｄｅ  ９（ＴＦＰＩ２５４−２６５）は、ｐｅｐｔｉｄｅ  １と同等の結合能を有するものの、ｐｅｐｔｉｄｅ  １は、血管内皮細胞表面上のヘパリンに対して特異的な結合能を有するが、一方、ｐｅｐｔｉｄｅ  ９（ＴＦＰＩ２５４−２６５）は、血管内皮細胞表面上のヘパリンに対して、特異的な結合能を示さないことを、以下の評価法によって検証した。
前記のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＶＥＧＦ−Ａ１６５による血管内皮細胞の増殖促進作用に対する阻害能評価系において、ｐｅｐｔｉｄｅ  ９（ＴＦＰＩ２５４−２６５）の示す阻害活性と、ｐｅｐｔｉｄｅ  １の示す阻害活性とを対比評価した。【０１０８】
図９は、ｐｅｐｔｉｄｅ  １とｐｅｐｔｉｄｅ  ９（ＴＦＰＩ２５４−２６５）の各ペプチドが示す、ＶＥＧＦ−Ａ１６５刺激によるヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖促進作用に対する阻害能評価結果を示す。血清添加培養条件において、ＶＥＧＦ−Ａ１６５（最終濃度１ｎＭ）の添加によるヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖促進に対する、共添加する各ペプチドによる抑制を、３日間培養後の細胞数によって評価した。黒色：ｐｅｐｔｉｄｅ  １、灰色：ｐｅｐｔｉｄｅ  ９（ＴＦＰＩ２５４−２６５）を、各濃度添加した際における、増殖促進率を示す。
ｐｅｐｔｉｄｅ  １は、濃度依存的にＶＥＧＦ−Ａ１６５刺激によるヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖を抑制しているが、ｐｅｐｔｉｄｅ  ９（ＴＦＰＩ２５４−２６５）は、僅かな抑制効果を示すのみである。【０１０９】
すなわち、ｐｅｐｔｉｄｅ  １は、血管内皮細胞表面上のヘパリンに対して、特異的な結合能を有するため、血管内皮細胞表面上のＫＤＲへの結合とヘパリンとの結合のうち、ヘパリンとの結合を競争的に阻害する結果、ＶＥＧＦ−Ａ１６５が示す血管内皮細胞の増殖促進作用を効果的に抑制している。一方、ｐｅｐｔｉｄｅ  ９（ＴＦＰＩ２５４−２６５）は、血管内皮細胞表面上のヘパリンに対して、特異的な結合能を有していないため、同じ添加濃度では、血管内皮細胞表面上のヘパリンの一部と結合するのみである。その場合、ＶＥＧＦ−Ａ１６５は、血管内皮細胞表面上のＫＤＲへと結合した際、相当部分は、細胞表面上のヘパリンとの結合が可能であり、結果的に、ＶＥＧＦ−Ａ１６５が示す血管内皮細胞の増殖促進作用は、大部分が保持された状態を保つ。【０１１０】
換言するならば、ｐｅｐｔｉｄｅ  １は、該ｐｅｐｔｉｄｅ  ９（ＴＦＰＩ２５４−２６５）のアミノ酸配列を内在している、Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＴＦＰＩ）蛋白質と特異的に複合体を形成し、血液凝固抑制作用を発揮する遊離型ヘパリン分子に対しては、特異性を示さないと判断される。その起源によって、ヘパリン鎖の構造、硫酸化部位に相違が存在するため、ｐｅｐｔｉｄｅ  １は、血管内皮細胞表面上に存在するプロテオグリカン型のヘパリン鎖に対して、特異的な結合能を有するが、他の起源のヘパリンに対しては、特異的な結合能を具えていないと判断される。【０１１１】
本実施例２で作製したｐｅｐｔｉｄｅ  ７、ｐｅｐｔｉｄｅ  ８が、ｐｅｐｔｉｄｅ  １と同様に、ＶＥＧＦ−Ａ１６５による血管内皮細胞の増殖促進作用を効果的に抑制することを、前記のｉｎ  ｖｉｔｒｏの評価系を利用して検証した。【０１１２】
図１０は、ｐｅｐｔｉｄｅ  １、ｐｅｐｔｉｄｅ  ７、ｐｅｐｔｉｄｅ  ８の各ペプチドが示す、ＶＥＧＦ−Ａ１６５による血管内皮細胞の増殖促進作用に対する阻害能評価結果を示す。血清添加培養条件において、ＶＥＧＦ−Ａ１６５（最終濃度１ｎＭ）の添加によるヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖促進に対する、共添加する各ペプチドによる抑制を、３日間培養後の細胞数によって評価した。黒丸●：ｐｅｐｔｉｄｅ  １、白丸○：ｐｅｐｔｉｄｅ  ７、黒三角▲：ｐｅｐｔｉｄｅ  ８を、各濃度添加した際における、増殖促進率を示す。ｐｅｐｔｉｄｅ  ７、ｐｅｐｔｉｄｅ  ８は、ｐｅｐｔｉｄｅ  １と同様に、濃度依存的にＶＥＧＦ−Ａ１６５刺激によるヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖を抑制している。また、この三種のペプチドが示す阻害活性は、実質的に差違を有していないことも確認される。【０１１３】
なお、図１０に示す結果では、被験ペプチドの高添加濃度においては、見かけ上、「増殖促進率が負の値を示している」が、培地内に添加されている血清中には、若干量のＶＥＧＦが元々含有されており、この図に示される程度の「負の増殖促進率」は、「細胞毒性」を意味しない点は、先に説明した通りである。【０１１４】
実施例３
上記のヘパリン結合能を有するペプチドは、ＶＥＧＦ−Ａ１６５による血管内皮細胞の増殖促進作用を抑制するが、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）による血管内皮細胞の増殖促進作用への抑制効果を示さないことを、下記するｉｎ  ｖｉｔｒｏの評価系において検証した。【０１１５】
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の細胞懸濁液を、５，０００個／ウエルの密度で、コラーゲンコートした９６ウエルの細胞培養プレートに播種した。播種後、６時間培養し、ウエル中の細胞の接着を行った後、１％ヒト血清を添加した培地に交換し、一夜（延べ１８時間）培養した。その時点で、培地に、ＶＥＧＦ−Ａ１６５またはｂＦＧＦを最終濃度１  ｎＭ、ならびに被験ペプチドを所定の最終濃度で添加した。その後、３日間培養を継続した後、各ウエル中の細胞数について、Ｔｅｔｒａ  Ｃｏｌｏｒ  Ｏｎｅ（生化学工業）を用いて、ＷＳＴ−８法により生存細胞数密度を評価した。【０１１６】
ＷＳＴ−８法における、発色の吸収係数Ａ４０５−６３０を、生存細胞数の指標とした。ＶＥＧＦ−Ａ１６５またはｂＦＧＦ、ならびに被験ペプチドを添加しない状態で、前記１％血清添加培地において培養した際の生存細胞数を、陰性対照：増殖促進０％、被験ペプチドを添加せず、ＶＥＧＦ−Ａ１６５またはｂＦＧＦのみが添加されている状態で、前記１％血清添加培地において培養した際の生存細胞数を、陽性対照：増殖促進１００％とし、評価された生存細胞数に基づき、増殖促進率を算出した。【０１１７】
図１１は、培地中に共添加されるｐｅｐｔｉｄｅ  １に因る、ＶＥＧＦ−Ａ１６５またはｂＦＧＦ刺激による血管内皮細胞増殖作用の抑制効果を示す。血清添加培養条件において、種々の濃度のｐｅｐｔｉｄｅ  １と、ＶＥＧＦ−Ａ１６５またはｂＦＧＦ（最終濃度１ｎＭ）を添加し、３日間培養後の生存細胞数を評価した。黒丸●：ＶＥＧＦ−Ａ１６５、白丸○：ｂＦＧＦ刺激による血管内皮細胞の増殖促進時、培地中にｐｅｐｔｉｄｅ  １を各濃度で共添加した際における、増殖促進率を示す。【０１１８】
ＶＥＧＦ−Ａ１６５刺激による血管内皮細胞増殖作用に対して、ｐｅｐｔｉｄｅ  １は添加濃度依存的に抑制効果をしめすが、ｂＦＧＦ刺激による血管内皮細胞増殖作用に対しては、見かけ上、僅かに抑制効果が示すのみであった。培地内に添加されている血清中には、若干量のＶＥＧＦが元々含有されており、ｐｅｐｔｉｄｅ  １を添加すると、この血清由来のＶＥＧＦに起因する血管内皮細胞増殖は抑制を受ける。そのため、ｂＦＧＦ刺激による血管内皮細胞増殖作用は、抑制を受けないが、全体の増殖促進率では、見かけ上、僅かに抑制効果が観測される。また、上で説明した通り、ＶＥＧＦ−Ａ１６５刺激による血管内皮細胞増殖を行う系では、ｐｅｐｔｉｄｅ  １を高濃度で添加する際、見かけ上、「増殖促進率が負の値を示す」という評価結果となる。つまり、ｂＦＧＦ刺激による血管内皮細胞増殖を行う系において、ｐｅｐｔｉｄｅ  １を高濃度で添加する際、図１１に示される程度、見かけ上「増殖促進率が若干低下する」状態は、ｂＦＧＦ刺激による血管内皮細胞増殖作用に対して、ｐｅｐｔｉｄｅ  １は高い添加濃度でも、全く抑制効果を示していないと判断される。【０１１９】
従って、以上の結果から、ｐｅｐｔｉｄｅ  １は、血管内皮細胞表面上に存在するプロテオグリカン型のヘパリン鎖に対して、特異的な結合能を有し、特には、ＶＥＧＦ−Ａ１６５が血管内皮細胞増殖作用を発揮する上で必要な、血管内皮細胞表面上のＫＤＲへの結合とヘパリンとの結合のうち、血管内皮細胞表面上のヘパリンとの結合を競争的に阻害すること、一方、ｐｅｐｔｉｄｅ  １あるいはＶＥＧＦ−Ａ１６５が特異的に結合可能な、血管内皮細胞表面上のヘパリンは、ｂＦＧＦ刺激による血管内皮細胞増殖の機構には、直接的な関与をしていなことが判る。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】
本発明にかかる新規なヘパリン結合能を有するペプチドは、ヘビ毒由来の血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ様タンパク質；ｖａｍｍｉｎならびにＶＲ−１中のヘパリン結合部位のアミノ酸配列に基づき設計された、７〜２０アミノ酸残基からなるペプチド化合物であり、ＶＥＧＦ−Ａ１６５のＫＤＲへの結合に付随する、ＶＥＧＦ−Ａ１６５と細胞表面上のヘパリンとの間の結合を競争的に阻害する作用を有し、その結果、ＶＥＧＦ−Ａ１６５のＫＤＲへの結合および細胞表面上のヘパリンとの結合の双方を必要とする、血管新生促進作用の発揮を抑制するペプチド性医薬として利用可能である。
【図１】
2005077971.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
2005077971000001.app
【国際調査報告】
2005077971.tif 000019
2005077971.tif 000020