(57)【要約】  本発明は、抗不安作用を有するポリペプチド、当該ポリペプチドを含有する治療剤、当該ポリペプチドを用いる不安の治療方法、当該ポリペプチドの受容体の賦活化もしくは抑制化をする不安調節に係る化合物もしくはその塩またはそれらの水和物をスクリーニングする方法およびそのスクリーニング用キットなどを提供することを目的とする。本発明によれば、リラキシン−３を含有してなる、抗不安剤が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リラキシン−３、その塩、あるいはこれらの水和物を含有する抗不安剤。
【請求項２】
リラキシン−３が、ヒト型リラキシン−３である、請求項１に記載の抗不安剤。
【請求項３】
リラキシン−３が、リラキシン−３のプレプロプロテインと機能的に等価な改変ポリペプチドから得られるＡ鎖およびＢ鎖もしくはリラキシン−３のプレプロプロテインの相同ポリペプチドから得られるＡ鎖およびＢ鎖からなるポリペプチドであって、Ａ鎖およびＢ鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されているポリペプチドである、請求項１に記載の抗不安剤。
【請求項４】
次の工程；被験物質を、
（Ａ）リラキシン−３受容体またはリラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
（Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする抗不安作用を有する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。
【請求項５】
次の工程；
リラキシン−３、その塩、あるいはこれらの水和物と、被験物質とを、
（Ａ）リラキシン−３受容体またはリラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
を含むことを特徴とする不安作用を抑制または促進する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。
【請求項６】
リラキシン−３が、ヒト型リラキシン−３である、請求項５に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
リラキシン−３が、リラキシン−３のプレプロプロテインと機能的に等価な改変ポリペプチドから得られるＡ鎖およびＢ鎖もしくはリラキシン−３のプレプロプロテインの相同ポリペプチドから得られるＡ鎖およびＢ鎖からなるポリペプチドであって、Ａ鎖およびＢ鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されているポリペプチドである、請求項５に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
次の工程；
（Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
をさらに含むことを特徴とする、請求項５〜７のいずれか一項に記載の不安を抑制または亢進する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。
【請求項９】
リラキシン−３受容体が、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする請求項４〜８のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
ＳＡＬＰＲが、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
リラキシン−３受容体またはリラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分を含むことを特徴とする、抗不安作用を有する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング用キット。
【請求項１２】
リラキシン−３、その塩、あるいはこれらの水和物をさらに含んでなる、請求項１１に記載のスクリーニング用キット。
【請求項１３】
リラキシン−３が、ヒト型リラキシン−３である、請求項１２に記載のスクリーニング用キット。
【請求項１４】
リラキシン−３が、リラキシン−３のプレプロプロテインと機能的に等価な改変ポリペプチドから得られるＡ鎖およびＢ鎖もしくはリラキシン−３のプレプロプロテインの相同ポリペプチドから得られるＡ鎖およびＢ鎖からなるポリペプチドであって、Ａ鎖およびＢ鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されているポリペプチドである、請求項１２に記載のスクリーニング用キット。
【請求項１５】
リラキシン−３が標識されている、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のスクリーニング用キット。
【請求項１６】
リラキシン−３受容体が、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載のスクリーニング用キット。
【請求項１７】
ＳＡＬＰＲが、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする、請求項１６に記載のスクリーニング用キット。
【請求項１８】
リラキシン−３受容体に作用する化合物をヒトまたはヒト以外の生物に投与し、投与後の不安作用を測定する工程を含むことを特徴とする、不安作用を抑制または促進する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。
【請求項１９】
不安作用を測定する工程が、defensive burying testまたは高架式十字迷路試験である、請求項１８に記載のスクリーニング方法。
【請求項２０】
リラキシン−３受容体に作用する化合物が、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の方法により得られる化合物である、請求項１８または１９に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、抗不安作用を有するポリペプチド、当該ポリペプチドを用いる不安の治療方法、当該ポリペプチドの受容体の賦活化もしくは抑制化をする不安調節に係る化合物もしくはその塩またはそれらの水和物をスクリーニングする方法およびそのスクリーニング用キットなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
脳腸管ホルモン、ケモカイン、神経ペプチドや神経伝達物質などの生理活性物質は、細胞膜に存在する特異的なレセプターを介して機能を発揮する。これらのレセプターの中で細胞膜を７回貫通する構造を有し、細胞内で３量体Ｇタンパク質と共役するレセプターは特にＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）と分類されている。ＧＰＣＲは特異的なリガンドが結合した時に細胞内にシグナルを伝達し、細胞の賦活化や抑制化をすることで、各種臓器・器官での機能発現に重要な役割を担っている。それ故にＧＰＣＲを賦活化するアゴニストや抑制するアンタゴニストと呼ばれる物質は、医薬品として使用されている。ＧＰＣＲに分類されるレセプターの中でもその特異的なリガンドが未同定のものが数多く知られており、それらはオーファンＧＰＣＲと呼ばれている。オーファンＧＰＣＲは新たな治療薬のターゲットとしての可能性を秘めており、生体内のリガンド同定や機能を賦活もしくは抑制する物質の研究が進められている。このようにして同定されたリガンドや物質を生体に投与してレセプターとそのリガンドの機能を解明することは、医薬品の開発を提供する上できわめて重要である。【０００３】
近年の遺伝子配列情報の充実により、既知のタンパク質・ペプチドの配列を元にその相同性や法則性を導きだし、未知のペプチドやタンパク質を予測して、ＧＰＣＲの新たなリガンドとして同定する方法も可能となった。インスリン・リラキシン（Ｉｎｓｕｌｉｎ・Ｒｅｌａｘｉｎ）ファミリーに属するリラキシンは、黄体や胎盤から産生される分泌ペプチドであり、妊娠の維持と出産に関わる作用をもつことが以前から知られていた。リラキシンをコードするＤＮＡの塩基配列を元に遺伝子配列データベースから新たに同定されたＤＮＡをコードするタンパク質が、リラキシン−３（Ｒｅｌａｘｉｎ−３）（またはＩＮＳＬ７とも称される。）と名づけられたポリペプチドである（国際公開第０１／０６８８６２号パンフレット）。成熟型または活性型のリラキシン−３は、リラキシン−３のプレプロプロテイン（ｐｒｅｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）から切断されたＢ鎖およびＡ鎖から構成され、当該Ｂ鎖および当該Ａ鎖がジスルフィド結合により結合されているポリペプチドである。リラキシン−３は、免疫細胞系であるＴＨＰ−１の細胞内サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の上昇をともなって細胞を賦活化することが報告された（国際公開第０１／８１５６２号パンフレット、Bathgate et al., J. Biol. Chem., 277, p.1148-1157, 2002）。その後、リラキシン−３はリラキシン−２とともに、ＧＰＣＲであるＬＧＲ７に結合するリガンドの一つであることが示されるとともに、リラキシン−３によるｃＡＭＰの上昇にはＬＧＲ７が関与していることが示された（Sudo et al., J. Biol. Chem., 278, p.7855-7862, 2003）。ＬＧＲ７は脳と末梢組織に発現しており、これまでには生殖器官の発達や妊娠・出産に関わることが示唆されているが、精神症状との関連については良く分かっていない。【０００４】
最近、生体内のリガンドが未同定のＧＰＣＲであった、ＳＡＬＰＲ（ＧＰＣＲ１３５）と名づけられているレセプターや、ＧＰＲ１００（ｈＧＰＣＲ１１、ＧＰＣＲ１４２）と呼ばれるレセプターのリガンドがリラキシン−３であることが報告された（Takeda et al., FEBS Letter, 520, p.97-101, 2002、Liu et al., J. Biol. Chem., 278, p.50754-50764, 2003、Liu et al., J. Biol. Chem., 278, p.50765-50770, 2003、国際公開第２００４／０８２５９８号パンフレット）。また、リラキシン−３によるｃＡＭＰの低下にはＳＡＬＰＲ（Liu et al., J. Biol. Chem., 278, p.50754-50764, 2003）やＧＰＲ１００（Liu et al., J. Biol. Chem., 278, p.50765-50770, 2003）が関与していることが報告された。さらに、国際公開第００／２４８９１号パンフレット、国際公開第０１／４８１８９号パンフレット、国際公開第０２／３１１１１号パンフレット、および国際公開第０２／６１０８７号パンフレットにもこれらのレセプターに関連する記載がある。ＳＡＬＰＲは脳に局在することが知られており（Matsumoto et al., Gene, 248, p.183-189, 2000）、特に視床下部の室傍核と視索上核に存在することが報告された（国際公開第２００４／０８２５９８号パンフレット、Liu et al., J. Biol. Chem., 278, p.50754-50764, 2003）。さらに、ＳＡＬＰＲへの選択的な結合を示すリラキシン−３とＩＮＳＬ５のキメラペプチドを用いて、ペプチドの脳内での結合領域を示すことでＳＡＬＰＲの発現を調べている報告もあるが（Sutton et al., Neuroendocrinology, 180, p.298-307, 2004）、ＳＡＬＰＲの機能については良く分かっていない。一方、ＧＰＲ１００は全身性に発現しているレセプターであることが報告されている（Liu et al., J. Biol. Chem., 278, p.50765-50770, 2003、Boels et al., Br. J. Pharamacol., 140, p.932-938, 2003）が、ＧＰＲ１００の機能についても不明なままである。【０００５】
一方、リラキシン−３は脳内の特定の領域に存在することが報告されており（Liu et al., J. Biol. Chem., 278, p.50754-50764, 2003）、リラキシン−３が脳内ペプチドとして中枢性に何らかの機能を発揮している可能性は考えられていたが、これまでにリラキシン−３が不安やうつをはじめとする精神状態を調節するか否かについては知られていなかった。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、抗不安作用を有するポリペプチド、当該ポリペプチドを含有する治療剤、当該ポリペプチドを用いる不安の治療方法、当該ポリペプチドの受容体の賦活化もしくは抑制化をする不安調節に係る化合物もしくはその塩またはそれらの水和物をスクリーニングする方法およびそのスクリーニング用キットなどを提供することを目的とする。
【０００７】
本発明者は、リラキシン−３をラットまたはマウス脳室内に投与し、不安惹起作用、抗不安作用を評価するための実験系にて投与後の前記ラットまたは前記マウスの行動を観察することにより、リラキシン−３が抗不安作用を有することを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。
【０００８】
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）リラキシン−３、その塩、あるいはこれらの水和物を含有する抗不安剤。
（２）リラキシン−３が、ヒト型リラキシン−３である、前記（１）に記載の抗不安剤。
（３）リラキシン−３が、リラキシン−３のプレプロプロテインと機能的に等価な改変ポリペプチドから得られるＡ鎖およびＢ鎖もしくはリラキシン−３のプレプロプロテインの相同ポリペプチドから得られるＡ鎖およびＢ鎖からなるポリペプチドであって、Ａ鎖およびＢ鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されているポリペプチドである、前記（１）に記載の抗不安剤。
（４）次の工程；被験物質を、
（Ａ）リラキシン−３受容体またはリラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
（Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする抗不安作用を有する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。
（４’）次の工程；被験物質を、
（Ａ）リラキシン−３受容体またはリラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
（Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
（Ｃ）リラキシン−３受容体(例えば、ＳＡＬＰＲ)を介した細胞刺激活性が、アデニル酸シクラーゼの活性抑制を示した場合に、当該被験物質が不安作用を抑制する作用を有する化合物であると判定する工程、
を含むことを特徴とする抗不安作用を有する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。
（５）次の工程；
リラキシン−３、その塩、あるいはこれらの水和物と、被験物質とを、
（Ａ）リラキシン−３受容体またはリラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
を含むことを特徴とする不安作用を抑制または促進する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。
（６）リラキシン−３が、ヒト型リラキシン−３である、前記（５）に記載のスクリーニング方法。
（７）リラキシン−３が、リラキシン−３のプレプロプロテインと機能的に等価な改変ポリペプチドから得られるＡ鎖およびＢ鎖もしくはリラキシン−３のプレプロプロテインの相同ポリペプチドから得られるＡ鎖およびＢ鎖からなるポリペプチドであって、Ａ鎖およびＢ鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されているポリペプチドである、前記（５）に記載のスクリーニング方法。
（８）次の工程；
（Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
をさらに含むことを特徴とする、前記（５）〜（７）のいずれか一項に記載の不安を抑制または亢進する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。
（８’）次の工程；
（Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
（Ｃ）リラキシン−３受容体(例えば、ＳＡＬＰＲ)を介した細胞刺激活性が、アデニル酸シクラーゼの活性抑制を示した場合に、当該被験物質が不安作用を抑制する作用を有する化合物であると判定する工程、
をさらに含むことを特徴とする、前記（５）〜（７）のいずれか一項に記載の不安を抑制する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。
（９）リラキシン−３受容体が、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記（４）、（４’）、（５）、（６）、（７）、（８）、および（８’）のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
（１０）ＳＡＬＰＲが、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする、前記（９）に記載のスクリーニング方法。
（１１）リラキシン−３受容体またはリラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分を含むことを特徴とする、抗不安作用を有する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング用キット。
（１２）リラキシン−３、その塩、あるいはこれらの水和物をさらに含んでなる、前記（１１）に記載のスクリーニング用キット。
（１３）リラキシン−３が、ヒト型リラキシン−３である、前記（１２）に記載のスクリーニング用キット。
（１４）リラキシン−３が、リラキシン−３のプレプロプロテインと機能的に等価な改変ポリペプチドから得られるＡ鎖およびＢ鎖もしくはリラキシン−３のプレプロプロテインの相同ポリペプチドから得られるＡ鎖およびＢ鎖からなるポリペプチドであって、Ａ鎖およびＢ鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されているポリペプチドである、前記（１２）に記載のスクリーニング用キット。
（１５）リラキシン−３が標識されている、前記（１２）〜（１４）のいずれか一項に記載のスクリーニング用キット。
（１６）リラキシン−３受容体が、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする、前記（１１）〜（１５）のいずれか一項に記載のスクリーニング用キット。
（１７）ＳＡＬＰＲが、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする、前記（１６）に記載のスクリーニング用キット。
（１８）リラキシン−３受容体に作用する化合物をヒトまたはヒト以外の生物に投与し、投与後の不安作用を測定する工程を含むことを特徴とする、不安作用を抑制または促進する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。
（１９）不安作用を測定する工程が、defensive burying testまたは高架式十字迷路試験である、前記（１８）に記載のスクリーニング方法。
（２０）リラキシン−３受容体に作用する化合物が、前記（４）、（４’）、（５）、（６）、（７）、（８）、（８’）、（９）、および（１０）のいずれか一項に記載の方法により得られる化合物である、前記（１８）または（１９）に記載のスクリーニング方法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ｐＢａｂｅＣＬ（ＳＡＬＰＲ）ＩＨの構築図を示す。
【図２Ａ】ＣＲＥ４ＶＩＰ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）の構築図を示す。
【図２Ｂ】ｐＢａｂｅＣＬＸの構築図を示す。
【図２Ｃ】ｐＢａｂｅＣＬｃｒｅ４ｖＰｄＮＮの構築図を示す。
【図３】ＳＡＬＰＲを発現させたＳＥ３０２細胞におけるフォルスコリン添加によって上昇した転写活性のリラキシン−３による特異的な用量依存的抑制を示す。黒四角はリラキシン−３を添加した場合を示す。白四角はインスリンを添加した場合を示す。横軸の数字は添加した各リガンドの最終濃度（ｎｍｏｌ／Ｌ）を示す。縦軸はフォルスコリン１μｍｏｌ／Ｌを添加した細胞上清のアルカリフォスファターゼの活性を１００、フォルスコリンを添加していない細胞上清の活性を０として算出した各活性の割合を示す。各点は平均値（Ｎ＝３）と標準偏差を示す。
【図４】Ｄｅｆｅｎｓｉｖｅ ｂｕｒｙｉｎｇテストを用いた、ラット脳室内へのリラキシン−３の単回投与による抗不安作用を示す。白四角は対照（ｖｅｈｉｃｌｅ）投与群を、斜線はリラキシン−３の０．０５ｎｍｏｌ投与群を、黒四角はリラキシン−３の１ｎｍｏｌ投与群を示す。縦軸は各群の一匹あたりの電極を床敷きで埋めている時間（秒）の平均値と標準誤差を示す。図中において＊は、ヒト型リラキシン−３投与群が対照（ｖｅｈｉｃｌｅ）投与群に有意差（Ｄｕｎｎｅｔｔ型多重比較検定、Ｐ＜０．０５）があることを意味する。
【図５】マウスを用いた高架式十字迷路試験（５分間）における、オープンおよびクローズドアームへの進入回数の合計を示した図である。
【図６】マウスを用いた高架式十字迷路試験（５分間）における、オープンアームにおける滞在時間の割合を示した図である。図中において＊は、ヒト型リラキシン−３投与群が対照（ｖｅｈｉｃｌｅ）投与群に有意差（ｔ検定、Ｐ＜０．０５）があることを意味する。
【図７】ラットを用いた高架式十字迷路試験における、オープンおよびクローズドアームへの進入回数の合計を示した図である。
【図８】ラットを用いた高架式十字迷路試験（５分間）における、オープンアームにおける滞在時間の割合を示した図である。図中において＊は、ヒト型リラキシン−３投与群が対照（ｖｅｈｉｃｌｅ）投与群に有意差（Ｄｕｎｎｅｔｔ型多重比較検定、Ｐ＜０．０５）があることを意味する。
【発明の具体的説明】
【００１０】
リラキシン−３
本発明のリラキシン−３は、リラキシン−３（またはＩＮＳＬ７とも称される。）と名づけられたポリペプチドであり、成熟型または活性型のリラキシン−３を意味する。
【００１１】
具体的には、本発明のリラキシン−３は、配列番号２のＮ末端から第２６番目（Ａｒｇ）〜第５２番目（Ｔｒｐ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは当該ポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは当該ポリペプチドの相同ポリペプチド（以下、単に「Ｂ鎖」と略記する場合がある。）と配列番号２のＮ末端から第１１９番目（Ａｓｐ）〜第１４２番目（Ｃｙｓ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは当該ポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは当該ポリペプチドの相同ポリペプチド（以下、単に「Ａ鎖」と略記する場合がある。）が、Ｂ鎖およびＡ鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されていることを特徴とするポリペプチドを意味する。ジスルフィド結合は、Ｂ鎖およびＡ鎖のシステイン残基が、分子間および分子内で結合していることが望ましい。
【００１２】
より具体的には、本発明のリラキシン−３は、配列番号２のＮ末端から第２６番目（Ａｒｇ）〜第５２番目（Ｔｒｐ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型Ｂ鎖）と配列番号２のＮ末端から第１１９番目（Ａｓｐ）〜第１４２番目（Ｃｙｓ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型Ａ鎖）がジスルフィド結合により結合されていることを特徴とするポリペプチドを意味し、Ｂ鎖およびＡ鎖のシステイン残基が分子間および分子内でジスルフィド結合を形成しているポリペプチドである。当該ジスルフィド結合は、配列番号２のＮ末端から第３５番目のＢ鎖のシステインおよび配列番号２のＮ末端から第１２９番目のＡ鎖のシステインが結合し、配列番号２のＮ末端から第４７番目のＢ鎖のシステインおよび配列番号２のＮ末端から第１４２番目のＡ鎖のシステインが結合し、並びに配列番号２のＮ末端から第１２８番目のＡ鎖のシステインおよび配列番号２のＮ末端から第１３３番目のＡ鎖のシステインが結合していることが望ましい。
【００１３】
本発明のリラキシン−３としては、下記のものが挙げられる。（数字はジスルフィド結合するシステイン残基を示し、同じ数字同士のシステイン残基がジスルフィド結合する。）
［ヒト型リラキシン−３］
Ｂ鎖：ＲＡＡＰＹＧＶＲＬＣＧＲＥＦＩＲＡＶＩＦＴＣＧＧＳＲＷ（配列番号５）
１                       ２
Ａ鎖：ＤＶＬＡＧＬＳＳＳＣＣＫＷＧＣＳＫＳＥＩＳＳＬＣ（配列番号６）
３１         ３                 ２
Ｂ鎖およびＡ鎖のアミノ酸配列は、本発明のリラキシン−３のプレプロプロテインのアミノ酸配列に含まれる。本発明のリラキシン−３のプレプロプロテインは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型プレプロプロテイン）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０８０８６４）または当該ポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは当該ポリペプチドの相同ポリペプチド（以下、単に「プレプロプロテイン」と略記する場合もある。）が挙げられる。本発明のリラキシン−３は、前記プレプロプロテインから切断されたＢ鎖およびＡ鎖が、Ｂ鎖およびＡ鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されていることを特徴とするポリペプチドを含む。
【００１４】
本発明のリラキシン−３、Ｂ鎖、Ａ鎖およびプレプロプロテインは、ヒトまたはヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］に由来する天然由来のポリペプチドであっても良く、組換えポリペプチド、合成ポリペプチドであっても良い。本発明のリラキシン−３には、本発明のリラキシン−３の塩が含まれ、さらには本発明のリラキシン−３またはその塩は糖鎖を有しないものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。塩については、後述の塩の記載を参照するとよい。また、本発明のリラキシン−３、Ｂ鎖、Ａ鎖およびプレプロプロテインには、Ｎ末端環状グルタミン化、Ｃ末端アミド化など、分泌タンパクのプロセッシングを受けた形のポリペプチドを含む。
【００１５】
上述の機能的に等価な改変ポリペプチドとは、配列番号２のＮ末端から第２６番目（Ａｒｇ）〜第５２番目（Ｔｒｐ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型Ｂ鎖）、配列番号２のＮ末端から第１１９番目（Ａｓｐ）〜第１４２番目（Ｃｙｓ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型Ａ鎖）または配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型プレプロプロテイン）において、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であって、しかもＢ鎖およびＡ鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されていることを特徴とするポリペプチドが本発明のリラキシン−３と実質的に同じ活性［例えばリラキシン−３受容体との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性（例えば細胞内のＣａ２＋の遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍ｐＨ変化、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの誘導活性、アラキドン酸遊離など）、不安作用の調節］を有するのであれば、上述の生物由来のポリペプチド、組換えポリペプチド、合成ポリペプチドのいずれであってもよい。
【００１６】
配列番号２のＮ末端から第２６番目（Ａｒｇ）〜第５２番目（Ｔｒｐ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型Ｂ鎖）、配列番号２のＮ末端から第１１９番目（Ａｓｐ）〜第１４２番目（Ｃｙｓ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型Ａ鎖）または配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型プレプロプロテイン）のアミノ酸配列が欠失、置換および／または挿入される場合は、その位置は、特に限定されないが、前記のアミノ酸配列中のシステイン残基以外のアミノ酸残基が挙げられる。
【００１７】
本明細書において「置換」は、好ましくは、ペプチドの活性を実質的に改変しないように、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換える保存的置換を意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行なうことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００１８】
前記の欠失、置換、挿入および／または付加されてもよいアミノ酸残基の数は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個である。
【００１９】
上述の相同ポリペプチドとは、配列番号２のＮ末端から第２６番目（Ａｒｇ）〜第５２番目（Ｔｒｐ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型Ｂ鎖）、配列番号２のＮ末端から第１１９番目（Ａｓｐ）〜第１４２番目（Ｃｙｓ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型Ａ鎖）または配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型プレプロプロテイン）のアミノ酸配列に関して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる限り、特に限定されるものではないが、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、しかもＢ鎖およびＡ鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されていることを特徴とするポリペプチドが本発明のリラキシン−３と実質的に同じ活性（例えばリラキシン−３受容体との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、不安作用の調節）を有するのであれば、上述の生物由来のポリペプチド、組換えポリペプチド、合成ポリペプチドのいずれであってもよい。
【００２０】
本明細書において、「相同性」（「同一性」ということがある）の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えば全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算出することができる。
【００２１】
上述の機能的に等価な改変ポリペプチドまたは相同ポリペプチドのＢ鎖、Ａ鎖、リラキシン−３またはプレプロプロテインの好ましい例としては、例えば、それ自体公知のマウス型、ラット型またはブタ型のＢ鎖、Ａ鎖、リラキシン−３またはそのプレプロプロテイン（国際公開第０１／８１５６２号パンフレット）や、リラキシン−１、リラキシン−２、またはインスリン様ペプチド３（ＩＮＳＬ−３）のプレプロプロテインまたはＢ鎖（国際公開第２００６／０２６３５５号パンフレット）などが挙げられる。
【００２２】
「リラキシン−３のプレプロプロテインと機能的に等価な改変ポリペプチドから得られるＡ鎖およびＢ鎖もしくはリラキシン−３のプレプロプロテインの相同ポリペプチドから得られるＡ鎖およびＢ鎖からなるポリペプチドであって、Ａ鎖およびＢ鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されているポリペプチド」は、好ましくは、本発明のリラキシン−３と実質的に同じ活性（例えばリラキシン−３受容体との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、不安作用の調節）を有する下記（１）または（２）のポリペプチドである：
（１）配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型Ｂ鎖）またはそのアミノ酸配列において、１または複数個（好ましくは１または数個、より好ましくは１、２、３、または４個、さらに好ましくは、１または２個、特に好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加された改変ヒト型Ｂ鎖と、配列番号６のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型Ａ鎖）またはそのアミノ酸配列において、１または複数個（好ましくは１または数個、より好ましくは１、２、３、または４個、さらに好ましくは、１または２個、特に好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加された改変ヒト型Ａ鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号５のＮ末端から第１０番目のＢ鎖のシステインと、配列番号６のＮ末端から第１１番目のＡ鎖のシステインとが結合し、配列番号５のＮ末端から第２２番目のＢ鎖のシステインと、配列番号６のＮ末端から第２４番目のＡ鎖のシステインとが結合し、そして配列番号６のＮ末端から第１０番目のＡ鎖のシステインと、配列番号６のＮ末端から第１５番目のＡ鎖のシステインとが結合しているポリペプチド；および
（２）配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型Ｂ鎖）またはそのアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ヒト型Ｂ鎖と、配列番号６のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型Ａ鎖）またはそのアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ヒト型Ａ鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号５のＮ末端から第１０番目のＢ鎖のシステインと、配列番号６のＮ末端から第１１番目のＡ鎖のシステインとが結合し、配列番号５のＮ末端から第２２番目のＢ鎖のシステインと、配列番号６のＮ末端から第２４番目のＡ鎖のシステインとが結合し、そして配列番号６のＮ末端から第１０番目のＡ鎖のシステインと、配列番号６のＮ末端から第１５番目のＡ鎖のシステインとが結合しているポリペプチド。
また、「リラキシン−３のプレプロプロテインと機能的に等価な改変ポリペプチドから得られるＡ鎖およびＢ鎖もしくはリラキシン−３のプレプロプロテインの相同ポリペプチドから得られるＡ鎖およびＢ鎖からなるポリペプチドであって、Ａ鎖およびＢ鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されているポリペプチド」の例としては、国際公開第２００６／０２６３５５号パンフレットやChanglu Liu et al., Mol Pharmacol. 67(1):231-40(2005)に開示されたリラキシン−３のキメラペプチドが挙げられる。
リラキシン−３のキメラペプチドは、好ましくは、本発明のリラキシン−３と実質的に同じ活性（例えばリラキシン−３受容体との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、不安作用の調節）を有する以下（３）〜（１０）のポリペプチドである：
（３）配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型Ｂ鎖）またはそのアミノ酸配列において、１または複数個（好ましくは１または数個、より好ましくは１、２、３、または４個、さらに好ましくは、１または２個、特に好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加された改変ヒト型Ｂ鎖と、配列番号７のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型リラキシン−１のＡ鎖）またはそのアミノ酸配列において、１または複数個（好ましくは１または数個、より好ましくは１、２、３、または４個、さらに好ましくは、１または２個、特に好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加された改変ヒト型リラキシン−１のＡ鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号５のＮ末端から第１０番目のＢ鎖のシステインと、配列番号７のＮ末端から第１１番目のＡ鎖のシステインとが結合し、配列番号５のＮ末端から第２２番目のＢ鎖のシステインと、配列番号７のＮ末端から第２４番目のＡ鎖のシステインとが結合し、そして配列番号７のＮ末端から第１０番目のＡ鎖のシステインと、配列番号７のＮ末端から第１５番目のＡ鎖のシステインとが結合しているポリペプチド；
（４）配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型Ｂ鎖）またはそのアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ヒト型Ｂ鎖と、配列番号７のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型リラキシン−１のＡ鎖）またはそのアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ヒト型リラキシン−１のＡ鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号５のＮ末端から第１０番目のＢ鎖のシステインと、配列番号７のＮ末端から第１１番目のＡ鎖のシステインとが結合し、配列番号５のＮ末端から第２２番目のＢ鎖のシステインと、配列番号７のＮ末端から第２４番目のＡ鎖のシステインとが結合し、そして配列番号７のＮ末端から第１０番目のＡ鎖のシステインと、配列番号７のＮ末端から第１５番目のＡ鎖のシステインとが結合しているポリペプチド；
（５）配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型Ｂ鎖）またはそのアミノ酸配列において、１または複数個（好ましくは１または数個、より好ましくは１、２、３、または４個、さらに好ましくは、１または２個、特に好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加された改変ヒト型Ｂ鎖と、配列番号８のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型リラキシン−２のＡ鎖）またはそのアミノ酸配列において、１または複数個（好ましくは１または数個、より好ましくは１、２、３、または４個、さらに好ましくは、１または２個、特に好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加された改変ヒト型リラキシン−２のＡ鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号５のＮ末端から第１０番目のＢ鎖のシステインと、配列番号８のＮ末端から第１１番目のＡ鎖のシステインとが結合し、配列番号５のＮ末端から第２２番目のＢ鎖のシステインと、配列番号８のＮ末端から第２４番目のＡ鎖のシステインとが結合し、そして配列番号８のＮ末端から第１０番目のＡ鎖のシステインと、配列番号８のＮ末端から第１５番目のＡ鎖のシステインとが結合しているポリペプチド；
（６）配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型Ｂ鎖）またはそのアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ヒト型Ｂ鎖と、配列番号８のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型リラキシン−２のＡ鎖）またはそのアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ヒト型リラキシン−２のＡ鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号５のＮ末端から第１０番目のＢ鎖のシステインと、配列番号８のＮ末端から第１１番目のＡ鎖のシステインとが結合し、配列番号５のＮ末端から第２２番目のＢ鎖のシステインと、配列番号８のＮ末端から第２４番目のＡ鎖のシステインとが結合し、そして配列番号８のＮ末端から第１０番目のＡ鎖のシステインと、配列番号８のＮ末端から第１５番目のＡ鎖のシステインとが結合しているポリペプチド；
（７）配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型Ｂ鎖）またはそのアミノ酸配列において、１または複数個（好ましくは１または数個、より好ましくは１、２、３、または４個、さらに好ましくは、１または２個、特に好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加された改変ヒト型Ｂ鎖と、配列番号９のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型インスリン様ペプチド３の改変Ａ鎖）またはそのアミノ酸配列において、１または複数個（好ましくは１または数個、より好ましくは１、２、３、または４個、さらに好ましくは、１または２個、特に好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加された改変ヒト型インスリン様ペプチド３のＡ鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号５のＮ末端から第１０番目のＢ鎖のシステインと、配列番号９のＮ末端から第９番目のＡ鎖のシステインとが結合し、配列番号５のＮ末端から第２２番目のＢ鎖のシステインと、配列番号９のＮ末端から第２２番目のＡ鎖のシステインとが結合し、そして配列番号９のＮ末端から第８番目のＡ鎖のシステインと、配列番号９のＮ末端から第１３番目のＡ鎖のシステインとが結合しているポリペプチド；
（８）配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型Ｂ鎖）またはそのアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ヒト型Ｂ鎖と、配列番号９のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型インスリン様ペプチド３の改変Ａ鎖）またはそのアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ヒト型インスリン様ペプチド３のＡ鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号５のＮ末端から第１０番目のＢ鎖のシステインと、配列番号９のＮ末端から第９番目のＡ鎖のシステインとが結合し、配列番号５のＮ末端から第２２番目のＢ鎖のシステインと、配列番号９のＮ末端から第２２番目のＡ鎖のシステインとが結合し、そして配列番号９のＮ末端から第８番目のＡ鎖のシステインと、配列番号９のＮ末端から第１３番目のＡ鎖のシステインとが結合しているポリペプチド；
（９）配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型Ｂ鎖）またはそのアミノ酸配列において、１または複数個（好ましくは１または数個、より好ましくは１、２、３、または４個、さらに好ましくは、１または２個、特に好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加された改変ヒト型Ｂ鎖と、配列番号１０のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型インスリン様ペプチド６の改変Ａ鎖）またはそのアミノ酸配列において、１または複数個（好ましくは１または数個、より好ましくは１、２、３、または４個、さらに好ましくは、１または２個、特に好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加された改変ヒト型インスリン様ペプチド６のＡ鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号５のＮ末端から第１０番目のＢ鎖のシステインと、配列番号１０のＮ末端から第７番目のＡ鎖のシステインとが結合し、配列番号５のＮ末端から第２２番目のＢ鎖のシステインと、配列番号１０のＮ末端から第２０番目のＡ鎖のシステインとが結合し、そして配列番号１０のＮ末端から第６番目のＡ鎖のシステインと、配列番号１０のＮ末端から第１１番目のＡ鎖のシステインとが結合しているポリペプチド；および
（１０）配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型Ｂ鎖）またはそのアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ヒト型Ｂ鎖と、配列番号１０のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型インスリン様ペプチド６の改変Ａ鎖）またはそのアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ヒト型インスリン様ペプチド６のＡ鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号５のＮ末端から第１０番目のＢ鎖のシステインと、配列番号１０のＮ末端から第７番目のＡ鎖のシステインとが結合し、配列番号５のＮ末端から第２２番目のＢ鎖のシステインと、配列番号１０のＮ末端から第２０番目のＡ鎖のシステインとが結合し、そして配列番号１０のＮ末端から第６番目のＡ鎖のシステインと、配列番号１０のＮ末端から第１１番目のＡ鎖のシステインとが結合しているポリペプチド。
【００２３】
リラキシン−３のキメラペプチドは、より好ましくは、下記のものが挙げられる。（数字はジスルフィド結合するシステイン残基を示し、同じ数字同士のシステイン残基がジスルフィド結合する。）これらのキメラペプチドは、ＳＡＬＰＲ（ＧＰＣＲ１３５）、ＧＰＲ１００（ＧＰＣＲ１４２）、およびＬＧＲ７に対するリガンド活性が確認されている（国際公開第２００６／０２６３５５号パンフレットおよびChanglu Liu et al., Mol Pharmacol. 67(1):231-40(2005)）。
［ヒト型Ｂ鎖とヒト型リラキシン−１のＡ鎖とのキメラペプチド］
Ｂ鎖：ＲＡＡＰＹＧＶＲＬＣＧＲＥＦＩＲＡＶＩＦＴＣＧＧＳＲＷ（配列番号５）
１                       ２
Ａ鎖：ＲＰＹＶＡＬＦＥＫＣＣＬＩＧＣＴＫＲＳＬＡＫＹＣ（配列番号７）
３１       ３                  ２
［ヒト型Ｂ鎖とヒト型リラキシン−２のＡ鎖とのキメラペプチド］
Ｂ鎖：ＲＡＡＰＹＧＶＲＬＣＧＲＥＦＩＲＡＶＩＦＴＣＧＧＳＲＷ（配列番号５）
１                       ２
Ａ鎖：ＱＬＹＳＡＬＡＮＫＣＣＨＶＧＣＴＫＲＳＬＡＲＦＣ（配列番号８）
３１        ３                  ２
［ヒト型Ｂ鎖とヒト型インスリン様ペプチド３の改変Ａ鎖とのキメラペプチド］
Ｂ鎖：ＲＡＡＰＹＧＶＲＬＣＧＲＥＦＩＲＡＶＩＦＴＣＧＧＳＲＷ（配列番号５）
１                       ２
Ａ鎖：ＡＴＮＰＡＲＹＣＣＬＳＧＣＴＱＱＤＬＬＴＬＣ（配列番号９）
３１       ３                  ２
［ヒト型Ｂ鎖とヒト型インスリン様ペプチド６の改変Ａ鎖とのキメラペプチド］
Ｂ鎖：ＲＡＡＰＹＧＶＲＬＣＧＲＥＦＩＲＡＶＩＦＴＣＧＧＳＲＷ  （配列番号５）
１                       ２
Ａ鎖：ＧＹＳＥＫＣＣＬＴＧＣＴＫＥＥＬＳＩＡＣ（配列番号１０）
３１       ３                  ２
本発明において用いられるリラキシン−３は、また、リラキシン−３と実質的に同じ活性を有するのであれば、Ｂ鎖およびＡ鎖の分子内あるいは分子間で、ジスルフィド結合あるいはそれ以外の結合形式により、結合していてもよい。このようなペプチドの例は、国際公開第２００４／１１３３８１号パンフレット、Halls et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 313, p.677-687,2005、 Rosengren et al., J. Biol. Chem., 281, p.5845-5851,2006、Bathgate et al., Biochemistry, 45, p.1043-1053,2006などに記載されている。
【００２４】
本発明のリラキシン−３、Ｂ鎖、Ａ鎖またはプレプロプロテインは、種々の公知の方法、例えば遺伝子工学的手法、合成法などによって得ることができる。具体的には、遺伝子工学的手法の場合、本発明のリラキシン−３、Ｂ鎖、Ａ鎖またはプレプロプロテインをコードするポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、得られた形質転換体から発現可能な条件下で培養し、発現タンパク質の分離および精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から所望のポリペプチドを分離および精製することによって調製することができる。また、合成法の場合は、液相法、固相法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自動合成機を利用することができる。化学修飾物の合成は常法により行なうことができる。
【００２５】
リラキシン−３をコードするポリヌクレオチド
本発明のリラキシン−３、Ｂ鎖、Ａ鎖またはプレプロプロテインをコードするポリヌクレオチド（以下、単に「本発明のリラキシン−３をコードするポリヌクレオチド」と略記する場合もある。）は、本発明のリラキシン−３、Ｂ鎖、Ａ鎖またはプレプロプロテインをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を意味する。
【００２６】
本発明のリラキシン−３をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１の５'末端から第７６番目（ｃ）〜第１５６番目（ｇ）の塩基配列からなるポリヌクレオチド（ヒト型Ｂ鎖をコードするポリヌクレオチド）、配列番号１の５'末端から第３５５番目（ｇ）〜第４２６番目（ｃ）の塩基配列からなるポリヌクレオチド（ヒト型Ａ鎖をコードするポリヌクレオチド）、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（ヒト型プレプロプロテインをコードするポリヌクレオチド）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のリラキシン−３、Ｂ鎖、Ａ鎖またはプレプロプロテインと実質的に同じ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００２７】
本明細書において、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、具体的には、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（Meth. Enzym., 164, 765, 1988）などの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルト（初期設定）のパラメーターを用いて計算したときに、配列番号１の５'末端から第７６番目（ｃ）〜第１５６番目（ｇ）の塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号１の５'末端から第３５５番目（ｇ）〜第４２６番目（ｃ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは配列番号１で表される塩基配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の相同性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。また、「ストリンジェントな条件下」とは、当業者が通常使用し得るハイブリダイゼーション緩衝液中で、温度が４０℃〜７０℃、好ましくは６０℃〜６５℃などで反応を行い、塩濃度が１５〜３００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１５〜６０ｍｍｏｌ／Ｌなどの洗浄液中で洗浄する方法に従って行なうことができる。温度、塩濃度は使用するプローブの長さに応じて適宜調整することが可能である。
【００２８】
本発明のリラキシン−３をコードするポリヌクレオチドは、例えば天然由来のものであることもできるし、または全合成したものであることもできる。さらには、天然由来のものの一部を利用して合成を行なったものであることもできる。本発明のリラキシン−３をコードするポリヌクレオチドの典型的な取得方法としては、例えば市販のライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば本発明のリラキシン−３、Ｂ鎖、Ａ鎖またはプレプロプロテインの部分アミノ酸配列の情報を基にして作成した適当なＤＮＡプローブを用いてスクリーニングを行なう方法などを挙げることができる。
【００２９】
Ｂ鎖（配列番号２のＮ末端から第２６番目（Ａｒｇ）〜第５２番目（Ｔｒｐ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号１の５'末端から第７６番目（ｃ）〜第１５６番目（ｇ）の塩基配列を含むポリヌクレオチドなどが挙げられる。
【００３０】
Ａ鎖（配列番号２のＮ末端から第１１９番目（Ａｓｐ）〜第１４２番目（Ｃｙｓ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号１の５'末端から第３５５番目（ｇ）〜第４２６番目（ｃ）の塩基配列を含むポリヌクレオチドなどが挙げられる。
【００３１】
プレプロプロテイン（配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドなどが挙げられる。
【００３２】
プラスミド
前記形質転換に使用されるプラスミドは、上記のような本発明のリラキシン−３をコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、当該ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるプラスミドを挙げることができる。また、分離および精製の操作を容易にするために、必要に応じて本発明のリラキシン−３、Ｂ鎖、Ａ鎖またはプレプロプロテインを切り出す融合タンパク質として発現することのできるプラスミドであってもよい。
【００３３】
形質転換体
また、前記形質転換体も、上記のような本発明のリラキシン−３をコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば当該ポリヌクレオチドが宿主細胞の染色体に組み込まれた形質転換体であることもできるし、あるいは、当該ポリヌクレオチドを含むプラスミドの形で含有する形質転換体であることもできるし、あるいは、本発明のリラキシン−３を発現していない形質転換体であることもできる。当該形質転換体は、例えば前記プラスミドにより、あるいは、前記ポリヌクレオチドそれ自体により、所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。また、別の態様によれば、前記形質転換体は、Ｂ鎖、Ａ鎖が切り出される切断部位に作用するプロテアーゼを発現するプラスミドを同時に含んでいてもよい。
【００３４】
前記宿主細胞としては、例えば通常使用される公知の微生物、例えば大腸菌（例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株）または酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｗ３０３株）、あるいは、公知の培養細胞、例えば動物細胞（例えばＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、またはＣＯＳ細胞）または昆虫細胞（例えばＢｍＮ４細胞）を挙げることができる。
【００３５】
また、公知の前記発現ベクターとしては、例えば大腸菌に対しては、ｐＵＣ、ｐＴＶ、ｐＧＥＸ、ｐＫＫ、またはｐＴｒｃＨｉｓを；酵母に対しては、ｐＥＭＢＬＹまたはｐＹＥＳ２を；ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞およびＣＯＳ細胞に対しては、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＡＭｎｅｏまたはｐＢａｂｅ  Ｐｕｒｏを；ＢｍＮ４細胞に対しては、カイコ核多角体ウイルス（ＢｍＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーターを有するベクター（例えばｐＢＫ２８３）を挙げることができる。
【００３６】
前記形質転換体を、本発明のリラキシン−３、Ｂ鎖、Ａ鎖またはプレプロプロテインの発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできるし、あるいは、適当な細胞に、本発明のリラキシン−３、Ｂ鎖、Ａ鎖またはプレプロプロテインをコードするＲＮＡを注入し、本発明のリラキシン−３、Ｂ鎖、Ａ鎖またはプレプロプロテインの発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできる。
【００３７】
本発明のリラキシン−３、Ｂ鎖、Ａ鎖またはプレプロプロテインを、前記形質転換体の培養物から取得する場合は、培養後に、菌体、細胞または培養液を集め、分離および精製の公知の方法を組合せ、リラキシン−３、Ｂ鎖、Ａ鎖またはプレプロプロテインの生化学的性質または物理的性質などを利用しながら行なうことができる。例えば、限外濾過、液体クロマトグラフィー（例えば、アフィニティクロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）など）、透析法などの技術を利用することができる。
【００３８】
本発明のリラキシン−３のＢ鎖およびＡ鎖をそれぞれ独立に調製した場合、または融合タンパク質からＢ鎖またはＡ鎖を切り出して調製する場合は、生産されたまたは切り出されたＢ鎖およびＡ鎖を、常法に従い、単離精製し、それぞれ同士をジスルフィド結合で結合させることもできる。
【００３９】
リラキシン−３を含有する医薬組成物
定義
本願明細書において、「精神状態」とは、例えば、不安、緊張、抑うつ状態を意味する。
【００４０】
本願明細書において、「不安（ａｎｘｉｅｔｙ）」とは、身体的微候（例えば発汗、頻拍、早められた呼吸、震え）を伴う感覚（例えば危惧、恐怖）で表される感情状態、不快な情緒状態を意味する。不安は正常な感情であるが、重篤になれば不安障害になるため、前記不安には不安障害も含まれる。不安障害には、例えば広場恐怖をもつまたはもたないパニック障害、パニック障害の病歴をもたない広場恐怖（Ａｇｏｒａｐｈｏｂｉａ）、特別な恐怖症、例えば、特定動物恐怖症、社会恐怖症、強迫性、外傷性ストレス障害および急性ストレス障害を含むストレス障害、アルコール、薬物（例えばアンフェタミン、カフェイン、大麻、コカイン、幻覚剤、吸入剤、フェンシクジン（ｐｈｅｎｃｙｃｈｄｉｎｅ））、鎮静剤、催眠薬、不安解薬、その他物質により引き起こされる不安障害、不安または不安と抑うつの両者を伴う不安障害を含む。不安または不安障害はしばしば、他の病気（例えば精神疾患、免疫疾患、代謝疾患、消化管疾患など）および症状と関連しているか、または、そのような他の症状によって引き起こされるものを含む。不安は、他の障害、例えば抑うつ障害における抑うつを伴ってまたは伴わないで存在しうる。
【００４１】
本願明細書において、「抑うつ（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）」とは、悲観的な悩み、激しい悲しみ、失望、動揺、精神活動の遅延、集中力の低下および卑下の感情状態を意味する。抑うつは程度によっては、食欲不振、体重減少、過食、不眠、過眠症、性的衝動、正常な概日性リズム（例えば、体温、内分泌機能）の破壊を生じる状態を含む。
【００４２】
本発明のリラキシン−３または本発明のリラキシン−３をコードするポリヌクレオチドは、精神状態の治療、好ましくは不安の治療の抗不安剤として用いることができる。例えば、それらは、精神状態の調節、好ましくは不安作用の調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、他の病気（例えば精神疾患、免疫疾患、代謝疾患、消化管疾患など）および症状と関連しているか、または、そのような他の症状によって引き起こされる不安の治療、アルコール、薬物等の他物質によって引き起こされる不安障害の治療、検査時または手術前後における不安の緩化の治療に用いることができる。また、それらは不安症状を伴う精神疾患の治療、リラキシン−３またはリラキシン−３をコードするポリヌクレオチドの異常に起因する疾患の治療の医薬としても用いることができる。
【００４３】
具体的には、不安作用とは、不快な情緒状態であって、しばしば恐怖によって引き起こされるものに似た生理学的変化や行動を伴うことから、抗不安作用を有するリラキシン−３は、ヒトまたはヒト以外の生物の精神状態を安定化させる作用を有する。例えば、不安症、全般性不安障害、パニック障害、恐怖症、強迫性障害、心的外傷後ストレス障害、心的外傷後ストレス障害の治療、精神疾患（例えばうつ病、抑うつ症状、双極性障害、循環性格、感情障害、情緒障害、睡眠障害、統合失調症）、免疫疾患（例えば慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、腎疾患、強皮症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、多発性硬化症、リウマチ性間質性肺炎、サルコイド-シス、クローン病、炎症性大腸炎、肝硬変、慢性肝炎、劇症肝炎、脳脊髄炎、重症筋無力症）、代謝疾患（例えば糖尿病、肥満性糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、動脈硬化、狭心症、心筋梗塞、肥満、肥満症、摂食障害、拒食症）、消化管疾患（例えば下痢、便秘、機能性便秘症、過敏性腸症候群）、ＡＩＤＳ、癌、悪液質）およびそのような症状と関連しているか、または、そのような症状によって引き起こされる不安の治療、アルコール、薬物（例えばアンフェタミン、カフェイン、大麻、コカイン、幻覚剤、吸入剤、フェンシクジン（ｐｈｅｎｃｙｃｈｄｉｎｅ））、鎮静剤、催眠薬、不安解薬により引き起こされる不安障害の治療に用いることができる。また、不安症状を伴う精神疾患（例えばうつ病、抑うつ症状、双極性障害、循環性格、感情障害、情緒障害、睡眠障害、統合失調症）の治療にも用いることができる。
【００４４】
前記疾患の治療の医薬として使用するにあたり、本発明のリラキシン−３または本発明のリラキシン−３をコードするポリヌクレオチドは塩を形成していてもよく、さらにそれらは水和物を形成していてもよく、本発明に含まれる。前記疾患の治療の医薬として使用するにあたり、本発明のリラキシン−３をコードするポリヌクレオチドは、単独または適当なベクターに挿入して、あるいは、シグナル配列、ポリペプチド安定化配列などの配列を付加して用いることができる。前記ベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、センダイウイルスベクター、プラスミド、ファージミド、コスミドなどの公知のものを使用することができる。本発明のリラキシン−３または本発明のリラキシン−３をコードするポリヌクレオチドもしくはその塩またはそれらの水和物は単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬組成物として用いることもできる。
【００４５】
本願明細書における前記の「塩」とは、本発明のリラキシン−３または本発明のリラキシン−３をコードするポリヌクレオチドと塩を形成し、かつ薬学的に許容され得る塩であれば特に限定されないが、好ましくはハロゲン化水素酸塩（例えばフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩など）、無機酸塩（例えば硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩など）有機カルボン酸塩（例えば酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩など）、有機スルホン酸塩（例えばメタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩など）、アミノ酸塩（例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩など）、四級アミン塩、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（マグネシウム塩、カルシウム塩など）などが挙げられ、当該「薬学的に許容され得る塩」として、より好ましくは、トリフルオロ酢酸塩、塩酸塩、シュウ酸塩、などである。
【００４６】
この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は、ヒトまたはヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばウシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］に、種々の形態、経口または非経口（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与）のいずれかの投与経路で投与することができる。従って、本発明のリラキシン−３またはリラキシン−３をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物は、投与経路に応じて適当な剤形とされ、具体的には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤などによる経口剤、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤などによる非経口剤を挙げることができる。これらの製剤は通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤などを用いて常法により製造することができる。使用可能な無毒性の上記添加剤としては、例えば乳糖、果糖、ブドウ糖、デンプン、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、またはその塩、エタノール、クエン酸、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００４７】
それらの投与形態としては、また、必要な投与量範囲は、本発明のリラキシン−３または本発明のリラキシン−３をコードするポリヌクレオチドの選択、投与対象、投与経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右される。適当な投与量は患者の体重１ｋｇあたり例えば約０．１〜５００μｇ、好ましくは約０．１〜１００μｇ、より好ましくは１〜５０μｇ程度を投与するのが好ましい範囲である。投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動することが予測される。例えば経口投与は静脈注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想される。こうした投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。
【００４８】
リラキシン−３受容体を用いた精神状態の調節に係る化合物のスクリーニング方法
リラキシン−３受容体
本発明のリラキシン−３に対する受容体としては、種々の受容体のうち、本発明のリラキシン−３と結合活性を有し、リラキシン−３受容体発現細胞の細胞刺激活性（例えば細胞内のＣａ２＋の遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍ｐＨ変化、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの誘導活性、アラキドン酸遊離など）を有するものであれば、その起源は特に限定されず、例えばヒトまたはヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］のリラキシン−３受容体を発現する臓器、組織、細胞などの天然由来のもの、公知の遺伝子工学的手法、合成法などにより人為的に調製したものも包含される。また、リラキシン−３受容体の部分ポリペプチドとして後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されず、例えば本発明のリラキシン−３に対する結合能を有する部分ポリペプチド、細胞膜外領域に相当するアミノ酸配列を含む部分ポリペプチドなども使用することもできる。この場合、部分ポリペプチドを構成するアミノ酸数は、リラキシン−３受容体のアミノ酸数の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％または５％である。
【００４９】
具体的には、リラキシン−３受容体として、報告されている公知の受容体、例えばＬＧＲ７（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０２１６３４）、ＳＡＬＰＲ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６５６８）（ＧＰＣＲ１３５とも称されている。）またはＧＰＲ１００（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ＿０８３５９３）（ｈＧＰＣＲ１１、ＧＰＣＲ１４２とも称されている。）などを使用することが可能である。
【００５０】
ＳＡＬＰＲを用いた不安作用の調節に係る化合物のスクリーニング方法
以下、本願明細書においては、本発明の好ましい一例として、ＳＡＬＰＲを使用し、精神状態の調節、例えば不安作用の調節（不安作用を抑制または促進する）に係る化合物のスクリーニング方法について本発明の内容を詳述する。すなわち、本発明は、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドに結合し、不安作用の調節（不安作用を抑制または促進する）に係る化合物のスクリーニング方法を提供するものである。また、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドに被験物質を作用させ、細胞刺激活性を測定することにより、当該被験物質に不安作用を抑制または促進する作用を有するか否かを決定することができる。
【００５１】
ここで、本発明のＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドは、種々の公知の方法により得ることができ、例えば本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチド（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６５６８）を用いて公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。また別の態様として、公知のポリペプチドの合成法により得ることができ、例えば液相法、固相法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自動合成機を利用することができる。さらに、別の態様によれば、ＳＡＬＰＲの部分ポリペプチドは、ＳＡＬＰＲを適当なタンパク質分解酵素で切断することによって調製することができる。別の態様によれば、ＳＡＬＰＲの部分ポリペプチドは、結合活性部位を有する部分ポリペプチドを調製するのが好ましい。
【００５２】
本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリペプチドは、配列番号４で表されるアミノ酸を含むポリペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチド、または配列番号４で表されるアミノ酸配列に関して、７０％以上の相同性、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸配列であって、しかもＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性（例えばリラキシン−３との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または不安作用の調節）を有するポリペプチドを意味する。
【００５３】
ここで、配列番号４で表されるアミノ酸を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチドとは、そのアミノ酸配列が、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であって、しかもＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性（例えばリラキシン−３との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または不安作用の調節）を有するポリペプチドを意味する。
【００５４】
さらに、ＳＡＬＰＲの部分ポリペプチドも、ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性（例えばリラキシン−３との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または不安作用の調節）を有する限り、使用することができる。ＳＡＬＰＲの部分ポリペプチドには、リラキシン−３との結合活性部位を有する部分ポリペプチドを使用することができる。
【００５５】
以下、遺伝子工学的手法について、より具体的にはＳＡＬＰＲを使用する場合について詳述するが、その部分ポリペプチドについても、後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されない。
【００５６】
ＳＡＬＰＲの調製方法
ＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、得られた形質転換体から発現可能な条件下で培養し、その培養物から所望のポリペプチドを精製しないで調製したものを用いても良いし、発現タンパク質の分離および精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から所望のポリペプチドを分離および精製することにより調製することができる。前記の分離および精製方法としては、例えば硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、または凍結乾燥などを挙げることができる。
【００５７】
ＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチド
本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドは、本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。
【００５８】
なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方が含まれる。本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドには、具体的には下記の（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるものが挙げられる。
（ａ）配列番号３で表される塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；
（ｂ）「配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｃ）「配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、前記ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）「配列番号４で表されるアミノ酸配列の１または複数個（好ましくは１または数個）の箇所において、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、前記ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；および（ｅ）「配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチドに関する。
【００５９】
本発明の一つの態様によれば、本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。配列番号３で表される前記ポリヌクレオチドは、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＳＡＬＰＲをコードする。
【００６０】
本発明の別の一つの態様によれば、本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドは、「配列番号４で表されるアミノ酸配列の１または複数個（好ましくは１または数個）の箇所において、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、前記ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。ここで、欠失、置換、挿入および／または付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個である。
【００６１】
本発明の別の一つの態様によれば、本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドは、「配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。さらに、本発明の別の一つの態様によれば、本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドは、「配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。
【００６２】
プラスミド
前記形質転換に使用されるプラスミドは、上記のようなＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、当該ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるプラスミドを挙げることができる。
【００６３】
形質転換体
また、前記形質転換体も、上記のようなＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば当該ポリヌクレオチドが宿主細胞の染色体に組み込まれた形質転換体であることもできるし、あるいは、当該ポリヌクレオチドを含むプラスミドの形で含有する形質転換体であることもできるし、あるいは、ＳＡＬＰＲを発現していない形質転換体であることもできる。当該形質転換体は、例えば前記プラスミドにより、あるいは、前記ポリヌクレオチドそれ自体により、所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。
【００６４】
前記宿主細胞としては、例えば通常使用される公知の微生物、例えば大腸菌（例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株）または酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｗ３０３株）、あるいは、公知の培養細胞、例えば動物細胞（例えばＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、またはＣＯＳ細胞）または昆虫細胞（例えばＢｍＮ４細胞）を挙げることができる。
【００６５】
また、公知の前記発現ベクターとしては、例えば大腸菌に対しては、ｐＵＣ、ｐＴＶ、ｐＧＥＸ、ｐＫＫ、またはｐＴｒｃＨｉｓを；酵母に対しては、ｐＥＭＢＬＹまたはｐＹＥＳ２を；ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞およびＣＯＳ細胞に対しては、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＡＭｎｅｏまたはｐＢａｂｅ  Ｐｕｒｏを；ＢｍＮ４細胞に対しては、カイコ核多角体ウイルス（ＢｍＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーターを有するベクター（例えばｐＢＫ２８３）を挙げることができる。
【００６６】
ＳＡＬＰＲを含有する細胞は、ＳＡＬＰＲを細胞膜表面に発現している限り、特に限定されるものではなく、例えば前記形質転換体（すなわち、ＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで形質転換された細胞）を、ＳＡＬＰＲの発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできるし、あるいは、適当な細胞に、ＳＡＬＰＲをコードするＲＮＡを注入し、ＳＡＬＰＲの発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできる。
【００６７】
細胞膜画分
また、ＳＡＬＰＲを含有する本発明の細胞膜画分は、例えば本発明によるＳＡＬＰＲを発現する細胞を破砕した後、細胞膜が多く含まれる画分を分離することにより得ることができる。細胞の破砕方法としては、例えばホモジナイザー（例えばＰｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｉｅｍ型ホモジナイザー）で細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーまたはポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社）による破砕、超音波による破砕、あるいは、フレンチプレスなどで加圧しながら細いノズルから細胞を噴出させることによる破砕などを挙げることができる。また、細胞膜の分画方法としては、例えば遠心力による分画法、例えば分画遠心分離法または密度勾配遠心分離法を挙げることができる。
【００６８】
ＳＡＬＰＲを介する、本発明による不安作用を促進または抑制する化合物のスクリーニング方法では、ＳＡＬＰＲまたは前記細胞（すなわち、ＳＡＬＰＲを含有する細胞）もしくは前記細胞膜画分（すなわち、ＳＡＬＰＲを含有する細胞膜画分）を用いることができる。
【００６９】
また、本発明によるスクリーニング方法においては、第一の態様として、被験物質がＳＡＬＰＲに特異的に結合するか否かを調べる方法と、第二の態様として、ＳＡＬＰＲに被験物質が結合することにより生じる細胞刺激活性（例えば細胞内のＣａ２＋の遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍ｐＨ変化、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの誘導活性、アラキドン酸遊離など）を調べる方法とが挙げられ、それらを利用することができる。
【００７０】
本発明によるスクリーニング方法の第一の態様では、例えばＳＡＬＰＲまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と、被験物質とを接触させ、ＳＡＬＰＲまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と、被験物質が結合するか否かを分析することにより、ＳＡＬＰＲを介する不安作用を促進または抑制する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。
【００７１】
具体的には、被験物質非存在下および被験物質存在下の各条件下において、ＳＡＬＰＲまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と、標識した本発明のリラキシン−３とを接触させ、前記条件下におけるＳＡＬＰＲまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と当該リラキシン−３の特異的結合量を比較することにより、ＳＡＬＰＲを介する不安作用を促進または抑制する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。すなわち、前記被験物質が、ＳＡＬＰＲを介する不安作用を促進または抑制する能力を有する場合には、被験物質非存在下におけるＳＡＬＰＲまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と当該リラキシン−３の特異的結合量に対して、被験物質存在下における前記特異的結合量が低下する。
【００７２】
本発明によるスクリーニング方法において、ＳＡＬＰＲまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と本発明のリラキシン−３の特異的結合量を比較する場合には、当該リラキシン−３として、標識した当該リラキシン−３を用いることができる。前記指標としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、［3Ｈ］、［14Ｃ］、［125Ｉ］、［35Ｓ］などを用いることができる。前記酵素としては、例えばβ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼなどを用いることができる。蛍光物質としては、例えばフルオレセイソチオシアネート、ＢＯＤＩＰＹなどを用いることができる。発光物質としてはルシフェリン、ルシゲニンなどを用いることができる。場合によっては、本発明のリラキシン−３と標識物質を結合させるためにビオチン−アビジンの系、リラキシン−３に対する抗体を用いることもできる。
【００７３】
このように、本発明によるスクリーニング方法において、ＳＡＬＰＲまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分に結合して、これらと本発明のリラキシン−３との結合を阻害する化合物を、ＳＡＬＰＲを介する不安作用を促進または抑制する能力を区別せずにスクリーニングすることができる。
【００７４】
本発明によるスクリーニング方法における第二の態様では、被験物質非存在下および被験物質存在下の各条件下において、前記細胞と標識化した本発明のリラキシン−３とを接触させ、前記各条件下における前記細胞を介する当該リラキシン−３の特異的結合量を比較し、さらに、前記条件下における当該リラキシン−３の特定の細胞刺激活性を比較することにより、ＳＡＬＰＲを介する不安作用を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。
【００７５】
前記態様においては、前記細胞に結合し、前記細胞に含まれる受容体を介して細胞刺激活性を有する被験物質を、ＳＡＬＰＲを介する不安作用を抑制する化合物として選択することができる。
【００７６】
一方、前記態様において、前記細胞と当該リラキシン−３との結合を阻害するものの、細胞刺激活性を有しない被験物質を、ＳＡＬＰＲを介する不安作用を促進する化合物として選択することができる。
【００７７】
本発明によるスクリーニング方法は、細胞刺激活性として、例えばアデニル酸シクラーゼの活性抑制を利用することによって実施することができる。
【００７８】
この態様のスクリーニング方法においては、例えばアデニル酸シクラーゼの活性化によって細胞内に生成するｃＡＭＰを公知の手法で測定すればよく、ＳＡＬＰＲを介する不安作用を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、ＳＡＬＰＲに本発明のリラキシン−３が結合することにより生じる細胞内シグナル伝達、すなわち、ＳＡＬＰＲの細胞刺激活性の一つであるアデニル酸シクラーゼの活性抑制を利用するものである。具体的には、ＳＡＬＰＲに当該リラキシン−３が結合すると、ＳＡＬＰＲに共役しているＧタンパク質ファミリーの一つであるＧｉファミリーが、アデニル酸シクラーゼを抑制し、細胞内に生成されるサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ：アデニル酸シクラーゼによりＡＴＰから生成される）量を減少させることによる。
【００７９】
例えばＳＡＬＰＲを細胞膜上に発現（好ましくは、ＳＡＬＰＲを含む発現ベクターを導入し過剰に発現）した哺乳動物由来細胞（例えばＨＥＫ−２９３細胞もしくはＣＨＯ細胞）にアデニル酸シクラーゼの活性化剤［例えばフォルスコリン（ＦＳＫ）］を添加すると、細胞内のｃＡＭＰの濃度が上昇する。
【００８０】
また、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を添加する際に、本発明のリラキシン−３を加えると、アデニル酸シクラーゼ活性化剤に起因する前記のアデニル酸シクラーゼ活性促進に加え、当該リラキシン−３が本発明によるＳＡＬＰＲに作用して生じるアデニル酸シクラーゼの活性抑制も起こるため、結果として、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独投与した場合に比べて、ｃＡＭＰの生成量が減少する。従って、不安作用を抑制する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系でＳＡＬＰＲを介する当該リラキシン−３に代わり、被験物質を単独で接触させてｃＡＭＰの生成量を減少させる（すなわち当該リラキシン−３と同様の作用を有する）化合物を選択すると良い。
【００８１】
不安作用を促進する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、本発明のリラキシン−３、および被験物質をスクリーニング用細胞に添加するとよい。アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比べて、当該リラキシン−３の作用でｃＡＭＰの生成量が減少するが、被験物質が当該リラキシン−３の作用に拮抗する場合には、ｃＡＭＰ生成量の減少を抑制する。このときには、前記被験物質は不安作用を促進する化合物として選択できる。
【００８２】
細胞内ｃＡＭＰ量を測定する方法としては、例えばイムノアッセイなどがあるが、例えば市販のｃＡＭＰ定量キットを使用することもできる。
【００８３】
別の態様のスクリーニング方法においては、例えばＳＡＬＰＲを細胞膜上に発現（好ましくは、ＳＡＬＰＲを含む発現ベクターを導入し過剰に発現）し、しかも、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）が５’上流に位置するレポーター遺伝子（例えばアルカリフォスファターゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ベータラクタマーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ベータガラクトシダーゼ遺伝子など、またはＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）などの蛍光タンパク質遺伝子など）を含有する細胞（以下、「スクリーニング用細胞」と称することもある）を用いることにより、ＳＡＬＰＲを介する不安作用を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、前述のｃＡＭＰの生成が減少するとその結果、前記スクリーニング用細胞に導入されているＣＲＥをプロモーター領域に有するレポーター遺伝子の転写が抑制されることを利用している。
【００８４】
以下、前記態様による、ＳＡＬＰＲを介する不安作用を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングする手順について、より具体的に説明する。
【００８５】
すなわち、前記スクリーニング用細胞に導入されているＣＲＥは、細胞内のｃＡＭＰの濃度が上昇すると発現が亢進する遺伝子群（ｃＡＭＰ誘導性遺伝子）の転写調節領域に共通して存在する塩基配列である。従って、アデニル酸シクラーゼの活性化剤（例えばＦＳＫ）をスクリーニング用細胞に添加すると、細胞内のｃＡＭＰの濃度が上昇し、その結果、ＣＲＥの下流に位置するレポーター遺伝子の発現量が増加する。レポーター遺伝子産物の発現量は、レポーター遺伝子産物と反応し基質から生成した発光物質の量に由来する発光を測定することによりもしくはレポーター遺伝子として産生された蛍光タンパク質由来の蛍光を測定することで容易に測定することが可能である。
【００８６】
また、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を添加する際に、本発明のリラキシン−３を加えると、アデニル酸シクラーゼ活性化剤に起因する前記のアデニル酸シクラーゼ活性促進に加え、当該リラキシン−３が本発明によるＳＡＬＰＲに作用して生じるアデニル酸シクラーゼの活性抑制も起こるため、結果として、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独投与した場合に比べて、レポーター遺伝子産物の発現量が低下する。従って、不安作用を抑制する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系で、ＳＡＬＰＲを介する当該リラキシン−３に代わり被験物質を単独で接触させてレポーター遺伝子産物の発現量を減少させる（すなわち当該リラキシン−３と同様の作用を有する）化合物を選択すると良い。
【００８７】
不安作用を促進する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、本発明のリラキシン−３、および被験物質をスクリーニング用細胞に添加するとよい。アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比べて、当該リラキシン−３の作用でレポーター遺伝子産物の発現量は減少するが、被験物質が当該リラキシン−３の作用に拮抗する場合には、レポーター遺伝子産物の発現減少を抑制する。このときには、前記被験物質は不安作用を促進する化合物として選択できる。
【００８８】
被験物質による作用が、ＳＡＬＰＲに対する結合を介した作用であるか否かは、簡単に確認することができる。例えばスクリーニング用細胞（すなわち、ＳＡＬＰＲを細胞膜上に発現し、しかも、ＣＲＥが５’上流に位置するレポーター遺伝子を含有する細胞）を用いた前記試験と並行して、コントロール用細胞（例えばＣＲＥが５’上流に位置するレポーター遺伝子を含有するものの、ＳＡＬＰＲを細胞膜上に発現していない細胞）を用いて同様の試験を実施する。その結果、前記被験物質による作用が、ＳＡＬＰＲに対する結合による作用でない場合には、スクリーニング用細胞およびコントロール用細胞でレポーター遺伝子産物の発現量に関して同じ現象が観察されるのに対して、前記被験物質による作用が、ＳＡＬＰＲに対する結合による作用である場合には、スクリーニング用細胞とコントロール用細胞とでレポーター遺伝子産物の発現量に関して異なる現象が観察される。
【００８９】
また、別の態様として、被験物質、好ましくは上記のスクリーニング方法により選択される被験物質（以下、単に「被験物質」と略記する場合がある。）を被験動物、例えばヒトまたはヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばウシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］に投与し、投与後の行動観察、自発運動量、血中パラメーター（例えば、血中や脳内のホルモンや分泌ペプチドの量など）の変動などの指標を解析することにより不安作用の調節に影響を与える化合物（すなわち、不安作用を抑制または促進する化合物）を確認および決定することができる。具体的には、Ｄｅｆｅｎｓｉｖｅ ｂｕｒｙｉｎｇテスト（Treitら、Pharamacology Biochemistry and Behavior, 15, p.619-626, 1981）、オープンフィールド試験、明暗試験、高架式十字迷路試験、Ｇｅｌｌｅｒ−Ｓｅｉｆｔｅｒ型コンフリクトテスト、Ｖｏｇｅｌ型コンフリクトテスト、ｓｏｃｉａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ試験、Ｈｏｌｅ−ｂｏａｒｄ試験、Ｍａｒｂｌｅ  ｂｕｒｙｉｎｇ試験、恐怖条件付けストレス試験、強制水泳試験、ｔａｉｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ試験による行動観察をすることができる。非ヒト哺乳動物としては、正常の動物に限らず、遺伝性の病態モデル動物または遺伝子改変動物が挙げられる。
【００９０】
被験物質の投与形態としては、経口的または非経口的に投与する。非経口的な投与経路の様態としては、例えば静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、気道内、直腸内、脳内、好ましくは視床下部近傍の脳室内投与が挙げられる。被験物質の被験動物の脳室内への投与方法は、薬物などを脳室内の所定の位置へ投与する際の常法に従えばよく、限定はされない。
【００９１】
例えば、まず被験動物を麻酔した上で、ガイドカニューレを所定の位置に固定する手術を施しておき、適当な回復期間（例えば７日間〜１４日間、好ましくは少なくとも１週間程度）の経過後、ガイドカニューレにインジェクションニードルを挿し込み、還流ポンプを接続したマイクロシリンジを用い、上記ニードルを介して被験物質を投与することが好ましい。被験物質の投与量は、限定はされず、適宜設定できる。被験物質は、一般的には人工的脳脊髄液（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ）または生理食塩水などを用いて所望の濃度の溶液として調製しておく。人工的脳脊髄液としては、公知の常用されているものを用いればよく、限定はされないが、例えば、ａＣＳＦ（ｇｌｕｃｏｓｅ  １０ｍＭ、ＫＣｌ  ２ｍＭ、ＮａＣｌ  １１５ｍＭ、ＣａＣｌ２  ２．５ｍＭ、ＭｇＳＯ４  １．２ｍＭ、ＮａＨＣＯ３  ２５ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４  ２．２ｍＭ；ｐＨ７．４）などが好ましい。被験物質の投与回数は１日あたり一回でも数回に分けても良く、被験物質を投与する期間や観察する期間は１日から数週間にわたってもよい。
【００９２】
リラキシン−３の被験動物への投与方法などは、前記の被験物質の場合と同様の方法が好ましい。また、リラキシン−３の被験動物の脳室内への投与方法も、前記の被験物質と同様に、一般的には人工的脳脊髄液を用いて所望の濃度の溶液となるよう調製しておくことが好ましい。
【００９３】
被験物質
ここで、上述の被験物質はどのような化合物であってもよいが、例えば遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、核酸（オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ）、合成ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）抽出液、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または動物など由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを挙げることができる。当該化合物は塩を形成してもよく、さらに当該化合物およびその塩は水和物を形成していてもよく、これらは本発明の被験物質に含まれる。
【００９４】
本願明細書において被験化合物の「塩」とは、薬学的に許容される塩を示し、化合物と薬学的に許容される塩を形成するものであれば特に限定されない。具体的には、例えば好ましくはハロゲン化水素酸塩（例えばフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩など）、無機酸塩（例えば硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩など）、有機カルボン酸塩（例えば酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩など）、有機スルホン酸塩（例えばメタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩など）、アミノ酸塩（例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩など）、四級アミン塩、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例えばマグネシウム塩、カルシウム塩など）などが挙げられる。
【００９５】
スクリーニング用キット
本発明のスクリーニング用キットは、リラキシン−３受容体または前記細胞（すなわち、リラキシン−３受容体を含有する細胞）もしくは前記細胞膜画分（すなわち、リラキシン−３受容体を含有する細胞膜画分）と、場合によっては、リラキシン−３とを少なくとも含有する。当該リラキシン−３は、標識した当該リラキシン−３であってもよい。前記スクリーニング用キットは、所望により、種々の試薬、例えば結合反応用緩衝液、洗浄用緩衝液、説明書、および／または器具などをさらに含むことができる。ここで、リラキシン−３受容体の好適な例は、ＳＡＬＰＲである。
【００９６】
本発明の別の態様のスクリーニング用キットは、本発明のリラキシン−３、およびリラキシン−３受容体を細胞膜上に発現（好ましくは、リラキシン−３受容体を含む発現ベクターを導入して過剰に発現）し、しかも、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）が５’上流に位置するレポーター遺伝子（例えば、アルカリフォスファターゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子など）を含有する細胞とを少なくとも含有する。前記スクリーニング用キットは、所望により、種々の試薬、例えばレポーター遺伝子産物（例えば、アルカリフォスファターゼもしくはルシフェラーゼなど）の基質、アデニル酸シクラーゼ活性化剤（例えばＦＳＫ）、結合反応用緩衝液、洗浄用緩衝液、説明書、および／または器具などをさらに含むことができる。また、前記スクリーニング用キットは、ＣＲＥが５’上流に位置するレポーター遺伝子を含有するものの、リラキシン−３受容体を細胞膜上に発現していない細胞を含んでいてもよい。
【００９７】
ここで、リラキシン−３受容体の好適な例は、ＳＡＬＰＲである。
【００９８】
本発明のスクリーニング方法により得られる化合物を含有する医薬組成物
本発明のスクリーニング方法により得られる化合物は、精神状態の調節、好ましくは不安作用の調節（不安作用を抑制または促進する）に係る化合物である。当該化合物は塩を形成してもよく、さらに当該化合物およびその塩は水和物を形成していてもよい。
【００９９】
従って、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物は、精神状態の治療、好ましくは不安の治療の抗不安剤として用いることができる。例えば、それらは、精神状態の調節、好ましくは不安作用の調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、他の病気（例えば精神疾患、免疫疾患、代謝疾患、消化管疾患など）および症状と関連しているか、または、そのような他の症状によって引き起こされる不安の治療、アルコール、薬物等の他物質によって引き起こされる不安障害の治療、検査時または手術前後における不安の緩化の治療に用いることができる。また、それらは、不安症状を伴う精神疾患の治療、リラキシン−３またはリラキシン−３をコードするポリヌクレオチドの異常に起因する疾患の治療の医薬にも用いることができる。
【０１００】
具体的には、不安作用とは、不快な情緒状態であって、しばしば恐怖によって引き起こされるものに似た生理学的変化や行動を伴うことから、不安作用を抑制する化合物は、ヒトまたはヒト以外の生物の精神状態を安定化させる作用を有する。従って、例えば不安症、全般性不安障害、パニック障害、恐怖症、強迫性障害、心的外傷後ストレス障害、心的外傷後ストレス障害の治療、精神疾患（例えばうつ病、抑うつ症状、双極性障害、循環性格、感情障害、情緒障害、睡眠障害、統合失調症）、免疫疾患（例えば慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、腎疾患、強皮症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、多発性硬化症、リウマチ性間質性肺炎、サルコイド-シス、クローン病、炎症性大腸炎、肝硬変、慢性肝炎、劇症肝炎、脳脊髄炎、重症筋無力症）、代謝疾患（例えば糖尿病、肥満性糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、動脈硬化、狭心症、心筋梗塞、肥満、肥満症、摂食障害、拒食症）、消化管疾患（例えば下痢、便秘、機能性便秘症、過敏性腸症候群）、ＡＩＤＳ、癌、悪液質）およびそのような症状と関連しているか、または、そのような症状によって引き起こされる不安の治療、アルコール、薬物（例えばアンフェタミン、カフェイン、大麻、コカイン、幻覚剤、吸入剤、フェンシクジン（ｐｈｅｎｃｙｃｈｄｉｎｅ））、鎮静剤、催眠薬、不安解薬により引き起こされる不安障害の治療に用いることができる。また、不安症状を伴う精神疾患（例えばうつ病、抑うつ症状、双極性障害、循環性格、感情障害、情緒障害、睡眠障害、統合失調症）の治療にも用いることができる。
【０１０１】
本発明のスクリーニング方法により得られる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は、ヒトまたはヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばウシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］に、種々の形態、経口または非経口（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与）のいずれかの投与経路で投与することができる。従って、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物を含有する医薬組成物は、投与経路に応じて適当な剤形とされ、具体的には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤などによる経口剤、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤などによる非経口剤を挙げることができる。これらの製剤は通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤などを用いて常法により製造することができる。使用可能な無毒性の上記添加剤としては、例えば乳糖、果糖、ブドウ糖、デンプン、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、またはその塩、エタノール、クエン酸、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
【０１０２】
それらの投与形態としては、また、必要な投与量範囲は、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物の選択、投与対象、投与経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右される。しかし、適当な投与量は患者の体重１ｋｇあたり例えば約１．０〜１，５００μｇ、好ましくは約１０〜５００μｇ程度を投与するのが好ましい範囲である。投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動することが予測される。例えば経口投与は静脈注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想される。こうした投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。
【０１０３】
本明細書において「治療」とは、一般的に、所望の薬理学的効果および/または生理学的効果を得ることを意味する。効果は、疾病および／または症状を完全にまたは部分的に防止する点では予防的であり、疾病および/または疾病に起因する悪影響の部分的または完全な治癒という点では治療的である。本明細書において「治療」とは、哺乳動物、特にヒトの疾病の任意の治療を含み、例えば以下の（a）〜(c)の治療を含む：
（a）疾病または症状の素因を持ちうるが、まだ持っていると診断されていない患者において、疾病または症状が起こることを予防すること；
（b）疾病症状を阻害する、即ち、その進行を阻止または遅延すること；
（c）疾病症状を緩和すること、即ち、疾病または症状の後退、または症状の進行の逆転を引き起こすこと。
【０１０４】
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１０５】
以下、実施例により本発明についてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何等限定されるものではない。【０１０６】
［実施例１］ＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドの調製
ＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドの単離は、配列番号３で表される塩基配列を基にして、以下のように行った。配列番号３では１４１０塩基対が示されており、ＳＡＬＰＲをコードする領域は、１番目から１４０７番目（１４１０塩基対，４６９アミノ酸残基）とされている（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＮＭ＿０１６５６８）。ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）により遺伝子を単離するために、配列番号１１および配列番号１２で表されるＰＣＲプライマーを常法に従い作製した。【０１０７】
ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｏｓｔｉｃｓ社）を鋳型として、配列番号１１および配列番号１２の組合せからなるＰＣＲプライマーと、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用い、（９８℃  １分−５７℃  １分−７２℃  ３分）を添付の操作方法に従い、３０回繰り返すことによりＰＣＲを行った。その結果、約１，４００塩基対のＤＮＡ断片を得た。【０１０８】
このＤＮＡ断片を、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入し、ＡＢＩ  ｐｒｉｓｍ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により配列を確認した。その結果、配列番号１１および１２からなるプライマーの組合せによって得られたｐＣＲ２．１−ＳＡＬＰＲに挿入された１４１０塩基対の配列は、配列番号３における３６１番目から１７７０番目と長さは同一であったが、配列中には１つの変異が見られた。この変異は、該当部位の核酸配列から翻訳されるアミノ酸には影響を与えないことは明らかであったので、ＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドを得ることができた。【０１０９】
［実施例２］レトロウイルスベクタープラスミドの調製
ｐＢａｂｅ  Ｐｕｒｏ（Morgenstern, J.P. and Land, H. Nucleic Acids Res.,18, p.3587-3596, 1990）（配列番号１３）からＳａｌＩおよびＣｌａＩで切断することによりＳＶ４０  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｐｕｒｏ（ｒ）領域を除き、末端をＫｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔにより平滑化した。ここへｐＩＲＥＳｈｙｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）からＮｓｉＩおよびＸｂａＩで切断することによりＩＲＥＳ−ｈｙｇ（ｒ）領域を切り出し、Ｔ４ポリメラーゼにより末端を平滑化したものを挿入しｐＢａｂｅＸＩＨを得た。【０１１０】
ｐＢａｂｅＸＩＨからＳｓｐＩおよびＢａｍＨＩで切断することにより５’−ＬＴＲ−ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌを除いた。ここへｐＣＬＸＳＮ（ＩＭＧＥＮＥＸ社）からＳｓｐＩおよびＢａｍＨＩで切断することにより切り出した５’ＬＴＲ−ＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌを挿入しｐＢａｂｅＣＬＸＩＨを得た。【０１１１】
［実施例３］ＳＡＬＰＲ遺伝子導入用レトロウイルスベクタープラスミドの調製
前記実施例２に記載のレトロウイルス発現用プラスミドｐＢａｂｅＣＬＸＩＨを制限酵素ＨｐａＩで切断した。ここへ前記実施例１で得たｐＣＲ２．１−ＳＡＬＰＲからＥｃｏＲＶで切断することによりＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドを切り出し、Ｔ４ポリメラーゼにより末端を平滑化したものを挿入しｐＢａｂｅＣＬ（ＳＡＬＰＲ）ＩＨを得た（図１）。【０１１２】
［実施例４］ＳＡＬＰＲ遺伝子導入用レトロウイルスベクターの調製
２×１０6個の２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を１０ｃｍコラーゲンコートディッシュ（ＩＷＡＫＩ社）でＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社）−１０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  （ＦＣＳ）−ペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）  １００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）  １００μｇ／ｍｌ（ＰＳ）（以下、「ＥＢＮＡ培養液」と称する）１０ｍＬを用いて培養した。翌日、ｐＶ−ｇｐ（ｐＶＰａｃｋ−ＧＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）からＮｓｉＩおよびＸｂａＩで切断することによりＩＲＥＳ−ｈｉｓＤを除きＴ４ポリメラーゼによる平滑化後、自己環化したもの）、ｐＶＰａｃｋ−ＶＳＶ−Ｇ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、および実施例３で得たＳＡＬＰＲ遺伝子導入用レトロウイルスベクタープラスミド（ｐＢａｂｅＣＬ（ＳＡＬＰＲ）ＩＨ）それぞれ３．３μｇをリポフェクション試薬であるＴｒａｎｓＩＴ（Ｐａｎｖｅｒａ社）を用いて、前記２９３−ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクションした。その６〜１２時間後にＥＢＮＡ培養液を交換し、３７℃で培養を続けた。【０１１３】
トランスフェクション２日後に培養液を回収し、１，２００×ｇで１０分間遠心した。【０１１４】
その上清を０．４５μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過したものを非濃縮レトロウイルスベクターとして、さらにウイルスベクターの濃縮を以下のように行った。【０１１５】
超遠心用チューブ５０  Ｕｌｔｒａ−Ｃｌｅａｒ  Ｔｕｂｅｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ社）を７０％エタノールで消毒後に蒸留水ですすぎ、ここへ非濃縮ウイルスベクター約３５ｍＬを入れた。これを超遠心ローターＳＷ２８（Ｂｅｃｋｍａｎ社）に入れ、超遠心装置ＸＬ−９０（Ｂｅｃｋｍａｎ社）を使って１９，５００ｒｐｍ  １００分間の遠心操作を行った。遠心後、上清を捨てたチューブを氷に入れて放置した。１時間後、チューブ壁面に残った培養液約１００μＬ程度の濃縮ウイルスベクター溶液が得られた。【０１１６】
［実施例５］サイクリックＡＭＰ応答配列を含むレポーター系導入細胞ＳＥ３０２の構築
（１）サイクリックＡＭＰ応答配列を含むレポーターＤＮＡの作成
公表された論文（Durocher et al. Anal Biochem 2000 284(2):316-26）を参考にｃＡＭＰに応じた転写がみられるｕｎｉｔを以下のように構築した。【０１１７】
ｃＡＭＰ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ（ＣＲＥ）を含むｕｎｉｔの作成のために、ＣＲＥｘ２ｈｂ用として配列番号１４および配列番号１５、ＣＲＥｘ２ｂｐ用として配列番号１６および配列番号１７で表されるオリゴＤＮＡを常法に従い作成した。【０１１８】
それぞれの組合せからなるオリゴＤＮＡを９５℃に熱処理後、徐々に温度を室温まで下げることにより二本鎖ＤＮＡ（ＣＲＥｘ２ｈｂ、ＣＲＥｘ２ｂｐ）を形成させた。ＣＲＥｘ２ｈｂをＨｉｎｄＩＩＩ，ＢａｍＨＩ、ＣＲＥｘ２ｂｐをＢａｍＨＩ，ＰｓｔＩで消化するとともに、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）をＨｉｎｄＩＩＩ，ＰｓｔＩで消化した。消化したＤＮＡを電気泳動して両端に制限酵素消化部位をもつＤＮＡを精製した後、これら３つのＤＮＡ（ＣＲＥｘ２ｈｂ、ＣＲＥｘ２ｂｐ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋））を一度に連結し（ｌｉｇａｔｉｏｎ）、得られたプラスミドの配列を解析して、ＣＲＥ４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫを作成した。【０１１９】
次にＶＩＰ（ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）プロモーターを含むＤＮＡを得るために配列番号１８および配列番号１９で表されるＰＣＲプライマーを常法に従い作成した。【０１２０】
Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｏｓｔｉｃｓ社）を鋳型とし、配列番号１８および配列番号１９の組合せからなるＰＣＲプライマーと、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社）を用いて（９４℃  ３０秒−５５℃  ３０秒−７２℃  １分）を３５回繰り返すことによりＰＣＲしたところ、２６４塩基対のＤＮＡ（配列番号２０）が得られた。この２６４塩基対のＤＮＡをＰｓｔＩで消化するとともにＣＲＥ４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）のＰｓｔＩサイトに挿入し、得られたプラスミドの配列を確認してＣＲＥ４ＶＩＰ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）を作成した（図２Ａ）。得られたＣＲＥ４ＶＩＰ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）からＨｉｎｄＩＩＩとＳｍａＩで消化した後、得られたＣＲＥ４ＶＩＰプロモーター断片の末端平滑化を行なった。【０１２１】
前述の発現用ウイルスベクタープラスミドｐＢａｂｅＣＬＸＩＨよりＩＲＥＳ〜ｈｙｇｒｏ（ｒ）領域を除去したｐＢａｂｅＣＬＸを作成した（図２Ｂ）。ｐＢａｂｅＣＬＸよりレトロウイルス本来のエンハンサー活性（ＬＴＲ）中のＮｈｅＩ〜ＮａｒＩ領域を除去することによって得られた外来性プロモーター導入用レトロウイルスベクタープラスミドに、ＣＲＥとＶＩＰプロモーターを含む配列と、レポーター遺伝子である胎盤由来アルカリフォスファターゼ（ＰＬＡＰ）（Goto et al., Molecular Pharmacology, 49, p.860-873, 1996）を導入し、ｐＢａｂｅＣＬｃｒｅ４ｖＰｄＮＮを得た（図２Ｃ）。【０１２２】
（２）サイクリックＡＭＰ応答配列を含むレポーター系導入細胞ＳＥ３０２の樹立
サイクリックＡＭＰ応答配列によりレポーター遺伝子ＰＬＡＰが誘導されるレトロウイルスベクタープラスミドｐＢａｂｅＣＬｃｒｅ４ｖＰｄＮＮを用い、実施例４に記載の方法に準じてレトロウイルスベクターを調製した。調製したレトロウイルスベクターをＨＥＫ２９３細胞に導入し、限界希釈法により細胞をクローン化して、ＰＬＡＰ誘導の反応性が最も良かったクローン（以下、「ＳＥ３０２細胞」と称する）を以下の実験に供した。【０１２３】
［実施例６］ＳＡＬＰＲ遺伝子導入用レトロウイルスベクターによるＳＡＬＰＲ発現細胞の調製
前記の実施例４で調製したレトロウイルスベクターによる細胞へのＳＡＬＰＲ遺伝子導入を以下のように行った。【０１２４】
前記実施例５で構築した３×１０3個のＳＥ３０２細胞を９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（旭テクノガラス社）にＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ社）−１０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  （ＦＣＳ）−ＰＳ（以下、「培養液」と称する）１００μＬを用いて培養した。翌日、実施例４で調製したレトロウイルスベクターを適宜希釈し、その１００μＬを培養液で調製したｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（最終濃度８μｇ／ｍＬ）（別名  ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ  ｂｒｏｍｉｄｅ  Ｓｉｇｍａ社）とともにＳＥ３０２細胞に加えた。その翌日、培養液を５００μｇ／ｍＬのハイグロマイシン（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）含有の培養液２００μＬと交換し培養した。この条件で増殖してきたＳＡＬＰＲ遺伝子導入ＳＥ３０２細胞（以下、「ＳＡＬＰＲ−ＳＥ３０２細胞」と称する）を適時継代して実験に供した。【０１２５】
［実施例７］ＳＡＬＰＲ−ＳＥ３０２細胞におけるフォルスコリン添加によって増加させた転写活性のリラキシン−３による抑制
前記実施例６で構築したＳＡＬＰＲ−ＳＥ３０２細胞を、転写活性測定用培地（ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ（６５℃にて３０分非働化）を加えたもの）にて縣濁した後、９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｓｏｎ社）に１穴あたり１×１０4細胞となるようにまいた。翌日、アッセイ用培地（ＤＭＥＭに０．１％ウシ血清アルブミンを加えたもの）で希釈した各濃度のヒト型リラキシン−３（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒａｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）またはインスリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加し、その後フォルスコリン（Ｃａｒｂｉｏ  Ｃｈｅｍ社）を最終濃度１μｍｏｌ／Ｌとなるように添加した。さらに一日培養後、細胞上清を１５μＬ回収して化学発光測定用の９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（住友ベークライト社）に移し、アッセイ用緩衝液（２８０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ2ＣＯ3−ＮａＨＣＯ3、８ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＳＯ4、ｐＨ１０）を６０μＬ、Ｌｕｍｉｐｈｏｓ５３０（Ｌｕｍｉｇｅｎ社）７０μＬを添加して、室温にて１時間反応させた後、各ｗｅｌｌの化学発光をＦｕｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）にて測定し転写活性量とした。フォルスコリン１μｍｏｌ／Ｌを添加した細胞上清の転写活性を１００％とし、フォルスコリンを添加していない細胞の上清の活性を０％として各被験サンプルを加えた細胞上清中の活性を％で表示した（図３）。【０１２６】
その結果、フォルスコリンによる転写活性の上昇をリラキシン−３はＳＡＬＰＲの活性化を介して抑制することが分かった。この転写活性の上昇は関連ペプチドであるインスリンでは影響がなかったので、リラキシン−３特異的な反応であることが分かった。すなわちこの実験系を用いることで、リラキシン−３によるＳＡＬＰＲの活性化に影響を与える化合物、物質を判別できることが示された。【０１２７】
［実施例８］Defensive buryingテストを用いたリラキシン−３脳室内投与による抗不安作用（ラット）
Ｄｅｆｅｎｓｉｖｅ ｂｕｒｙｉｎｇテスト（Treit et al., Pharamacology Biochemistry and Behavior, 15, p.619-626, 1981）を用いて、リラキシン−３の不安作用へ及ぼす影響を調べた。Ｄｅｆｅｎｓｉｖｅ ｂｕｒｙｉｎｇテストは、被験動物に電極を介して電流刺激を与えると、その直後から電極を床敷きで覆い隠す行動をとることを利用して、不安作用やその他の精神症状（例えば  うつ状態）を評価する実験系である。【０１２８】
リラキシン−３は、株式会社ペプチド研究所にて合成されたヒト型リラキシン−３（以下、単に「ヒト型リラキシン−３（ペプチド研究所社製）」と略記する場合もある。）を用いて実験を行った。ヒト型リラキシン−３は、配列番号２のＮ末端から第２６番目（Ａｒｇ）〜第５２番目（Ｔｒｐ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型Ｂ鎖）と配列番号２のＮ末端から第１１９番目（Ａｓｐ）〜第１４２番目（Ｃｙｓ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型Ａ鎖）が、配列番号２のＮ末端から第３５番目のＢ鎖のシステインおよび配列番号２のＮ末端から第１２９番目のＡ鎖のシステインが結合し、配列番号２のＮ末端から第４７番目のＢ鎖のシステインおよび配列番号２のＮ末端から第１４２番目のＡ鎖のシステインが結合し、並びに配列番号２のＮ末端から第１２８番目のＡ鎖のシステインおよび配列番号２のＮ末端から第１３３番目のＡ鎖のシステインが結合しているポリペプチドである。【０１２９】
（１）被験ラットと脳室内投与のための前処置
Ｆ３４４雄性ラット（７週齢、日本チャールスリバー（株））に実験動物用飼料ＭＦ（オリエンタル酵母社）を与えて馴化した。ラット（１５０〜２００ｇ）を麻酔下で、側脳室にカニューレを挿入した。その後一週間以上、前記ラットを飼育した後にリラキシン−３の投与実験を行った。【０１３０】
（２）試験箱への馴化
Ｄｅｆｅｎｓｉｖｅ ｂｕｒｙｉｎｇテスト実施の３日前より毎日一回、５ｃｍの高さまで床敷きを敷いた試験箱に被験ラットを導入し３０分間以上放置して、被験ラットを試験環境へ馴化させた。テスト実施時まで試験箱には刺激用電極を取り付けず被験ラットを環境に馴化させた。【０１３１】
（３）リラキシン−３溶液の調製
ヒト型リラキシン−３（ペプチド研究所社製）を生理食塩水にて溶解した後、最終濃度０．０５ｎｍｏｌ／ラットまたは１ｎｍｏｌ／ラットとなるように調製した。【０１３２】
（４）リラキシン−３溶液の脳室内投与
ガイドカニューレを装着した被験ラットを３群に分け、ヒト型リラキシン−３投与液（０．０５ｎｍｏｌ／ラット、Ｎ＝６、１ｎｍｏｌ／ラット、Ｎ＝８）もしくはｖｅｈｉｃｌｅ（生理食塩水、Ｎ＝６）各５μＬを５μＬ／２分の速度でインフュージョンポンプを用いて投与した。【０１３３】
（５）Ｄｅｆｅｎｓｉｖｅ ｂｕｒｙｉｎｇｔｅｓｔの実施と行動観察
試験当日は、刺激用電極を取り付けた試験箱（床敷きの高さ５ｃｍ）に被験ラットを導入して実験を開始する。被験ラットが刺激用電極に触れた際に５ｍＡの電気ショックが与えられる。その後、刺激用電極に５ｍＡ の電流を通電したまま被験ラットを放置し、１５分間（９００秒）の行動観察を開始した。被験ラットの行動は全てビデオカメラにて撮影し、録画テープを用いて、最初の電気ショックを受けてから１５分間における覆い隠し行動時間（ｂｕｒｙｉｎｇｔｉｍｅ（秒））を測定した。なお、覆い隠し行動は、被験ラットが前足を用いて電極方向へ向けて床敷きをかける行動と定義した。ヒト型リラキシン−３投与群とｖｅｈｉｃｌｅ群との比較には、Ｄｕｎｎｅｔｔ型多重比較検定法による有意差検定を行った。図中において＊は、Ｐ＜０．０５を示す。図４に示されるように、ｖｅｈｉｃｌｅ投与群に比べてヒト型リラキシン−３投与群で、覆い隠し行動時間の低下が見られ、１ｎｍｏｌ投与群では有意な減少が観察された。この結果から、リラキシン−３が抗不安作用を有することが明らかとなった。【０１３４】
［実施例９］高架式十字迷路を用いたリラキシン−３脳室内投与による抗不安作用（マウス）
高架式十字迷路を用いて、リラキシン−３の不安作用へ及ぼす影響を調べた。高架式十字迷路試験は、オープンアームにおける探索行動(オープンアーム滞在時間など)を指標にして、実験動物（例えば、ラットまたはマウス）の不安水準の測定や抗不安薬の薬効評価に広く用いられる行動薬理学的試験である。
（１）被験マウスと脳室内投与のための前処置
麻酔下の７週令のＢＡＬＢ／ｃ雄性マウス（日本チャールスリバー（株））の側脳室にカニューレを挿入した。その後一週間以上マウスを飼育した後にリラキシン−３の投与実験を行った。【０１３５】
（２）リラキシン−３溶液の調製
ヒト型リラキシン−３（ペプチド研究所社製）を生理食塩水にて溶解した後、最終濃度が１ｎｍｏｌ／マウスになるように調製した。【０１３６】
（３）リラキシン−３溶液の脳室内投与
ガイドカニューレを装着した被験マウスに、ヒト型リラキシン−３投与液（Ｎ＝８）もしくはｖｅｈｉｃｌｅ（生理食塩水）（Ｎ＝９）各２μＬを１μＬ／分の速度でインフュージョンポンプを用いて脳室内に投与した。【０１３７】
（４）抗不安作用の測定
抗不安作用の測定は高架式十字迷路を用いて行った。迷路は床から４５ｃｍの高さに設置し、中心に位置する中心プラットフォーム（５ｃｍ×５ｃｍ）からそれぞれ広がった２つの対立するオープンアーム（長さ３０ｃｍ×幅５ｃｍ）と２つの対立するクローズドアーム（長さ３０ｃｍ×幅５ｃｍ×壁高さ１５ｃｍ）からなっている。照明はオープンアームの床面が６０〜８０ルクスになるようにセットした。試験は、脳室内投与１０分後にマウスを一方のオープンアームに頭が向くように中心プラットフォームに置いて、５分間行った。試験時間は午前１１時から１６時に限定した。マウスの行動はビデオで記録し、試験終了後ビデオ解析により、各マウスのオープンおよびクローズドアームへの進入回数、オープンおよびクローズドアームでの滞在時間を測定した。図５および図６に、オープンおよびクローズドアームへの進入回数の合計、５分間中のオープンアームに滞在した割合（％）をそれぞれ示した。ヒト型リラキシン−３投与群とｖｅｈｉｃｌｅ群との比較には、ｔ検定法による有意差検定を行った。図中において＊は、Ｐ＜０．０５を示す。図５に示されるように、ヒト型リラキシン−３投与群とｖｅｈｉｃｌｅ群間でのオープンおよびクローズドアームへの進入回数の合計に差はなかった。しかしながら図６に示されるように、ヒト型リラキシン−３投与群はｖｅｈｉｃｌｅ群と比較して、オープンアーム内の滞在時間の割合が有意に高かった。この結果から、リラキシン−３には抗不安作用があることが示された。【０１３８】
［実施例１０］高架式十字迷路を用いたリラキシン−３脳室内投与による抗不安作用（ラット）
高架式十字迷路を用いて、リラキシン−３の不安作用へ及ぼす影響を調べた。
（１）被験ラットと脳室内投与のための前処置
麻酔下の９週令のＷｉｓｔａｒ雄性ラット（日本チャールスリバー（株））の側脳室にカニューレを挿入した。その後一週間以上飼育した後にリラキシン−３の投与実験を行った。【０１３９】
（２）リラキシン−３溶液の調製
ヒト型リラキシン−３（ペプチド研究所社製）を生理食塩水にて溶解した後、最終濃度が１０ｐｍｏｌ／ラットまたは５０ｐｍｏｌ／ラットになるように調製した。【０１４０】
（３）リラキシン−３溶液の脳室内投与
ガイドカニューレを装着した被験ラットに、ヒト型リラキシン−３投与液（１０ｐｍｏｌ／ラット、Ｎ＝８、５０ｐｍｏｌ／ラット、Ｎ＝７）、もしくはｖｅｈｉｃｌｅ群（生理食塩水、Ｎ＝７）各５μＬを２．５μＬ／分の速度でインフュージョンポンプを用いて投与した。【０１４１】
（４）抗不安作用の測定
抗不安作用の測定は高架式十字迷路を用いて行った。迷路は床から５０ｃｍの高さに設置し、中心に位置する中心プラットフォーム（１０ｃｍ×１０ｃｍ）からそれぞれ広がった２つの対立するオープンアーム（長さ５０ｃｍ×幅１０ｃｍ）および２つの対立するクローズドアーム（長さ５０ｃｍ×幅１０ｃｍ×壁高さ４０ｃｍ）からなっている。照明はオープンアームの床面が６０〜８０ルクスになるようにセットした。試験は、脳室内投与１０分後にラットを一方のオープンアームに頭が向くように中心プラットフォームに置いて５分間行った。試験時間は午前１１時から１６時に限定した。ラットの行動はビデオで記録し、試験終了後ビデオ解析により、各ラットについて、オープンおよびクローズドアームへの進入回数、オープンおよびクローズドアームでの滞在時間を測定した。図７および図８に、オープンおよびクローズドアームへの進入回数の合計、５分間中のオープンアームに滞在した割合（％）をそれぞれ示した。ヒト型リラキシン−３投与群とｖｅｈｉｃｌｅ群との比較には、Ｄｕｎｎｅｔｔ型多重比較検定法による有意差検定を行った。図中において＊印は、Ｐ＜０．０５を示す。図７に示されるように、１０ｐｍｏｌ／ラット投与群、５０ｐｍｏｌ／ラット投与群はｖｅｈｉｃｌｅ群と比較して、オープンおよびクローズドアームへの進入回数の合計に差はなかった。しかしながら図８に示されるように、１０ｐｍｏｌ／ラット投与群および５０ｐｍｏｌ／ラット投与群はｖｅｈｉｃｌｅ群と比較してオープンアーム内の滞在時間の割合が高く、１０ｐｍｏｌ／ラットの作用は統計学的に有意であった。この結果から、リラキシン−３には抗不安作用があることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１４２】
リラキシン−３は抗不安作用を有するので、例えば、不安の治療に有用である。また、リラキシン−３が抗不安作用を有することから、リラキシン−３受容体の賦活化または抑制化をする化合物もしくはその塩またはそれらの水和物は、不安の治療に利用可能であり、リラキシン−３受容体の賦活化または抑制化をする不安調節に係る化合物もしくはその塩またはそれらの水和物をスクリーニングする方法およびそのスクリーニング用キットは有用である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2006118131.tif 000009
【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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