(57)【要約】全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が２０重量％より大きい、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸とするジアシルグリセロール含有油脂の製造方法において、当該油脂を産生することが出来る微生物を培養し、所望により当該油脂を採取することを特徴とする方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が２０重量％より大きい、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸とするジアシルグリセロール含有油脂の製造方法において、当該油脂を産生することが出来る微生物を培養し、所望により当該油脂を採取することを特徴とする方法。
【請求項２】
全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が３０重量％以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が４０重量％以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が５０重量％以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物が、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属の微生物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記微生物が、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）亜属の微生物である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記微生物が、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）種の微生物である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記微生物が、高度不飽和脂肪酸を含む油脂を産生することが出来る微生物の変異株である、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が２０重量％より大きい、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸とするジアシルグリセロール含有油脂を産生することが出来るモルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属微生物。
【請求項１０】
全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が３０重量％以上である、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸とするジアシルグリセロール含有油脂を産生することが出来るモルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属微生物。
【請求項１１】
モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）である、請求項９又は１０に記載の微生物。
【請求項１２】
変異株である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１３】
全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が２０重量％より大きい、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸とするジアシルグリセロール含有油脂を含む微生物菌体。
【請求項１４】
全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が３０重量％以上である、請求項１３に記載の微生物菌体。
【請求項１５】
全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が４０重量％以上である、請求項１３に記載の微生物菌体。
【請求項１６】
全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が５０重量％以上である、請求項１３に記載の微生物菌体。
【請求項１７】
前記微生物が、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属の微生物である、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の微生物菌体。
【請求項１８】
前記微生物が、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）種の微生物である、請求項１７に記載の微生物菌体。
【請求項１９】
全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が２０重量％より大きい、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸とするジアシルグリセロール含有油脂であって、当該油脂を生産することが出来る微生物の培養菌体から抽出された油脂。
【請求項２０】
全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が３０重量％以上である、請求項１９に記載の油脂。
【請求項２１】
全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が４０重量％以上である、請求項１９に記載の油脂。
【請求項２２】
全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が６０重量％以上である、請求項１９に記載の油脂。
【請求項２３】
非極性溶剤を用いて抽出した、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の油脂。
【請求項２４】
親水性溶剤を用いて抽出した、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の油脂。
【請求項２５】
高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として成る油脂を産生しうる微生物を培養して得たジアシルグリセロールとトリアシルグリセロールを含む菌体から油脂を抽出し蒸留により分別し得た、中性脂質中にジアシルグリセロールが７０％以上でトリアシルグリセロールが３０％以下の油脂。
【請求項２６】
高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として成る油脂を産生しうる微生物を培養して得たジアシルグリセロールとトリシルグリセロールを含む菌体から油脂を抽出し蒸留により分別し得た、中性脂質中にトリグリセリドが９５％以上でジアシルグリセロールが５％以下の油脂。
【請求項２７】
油脂を構成する高度不飽和脂肪酸が、ジホモ−γ−リノレン酸（２０：３ω６）、アラキドン酸（２０：４ω６）、７，１０，１３，１６−ドコサテトラエン酸（２２：４ω６）、４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸（２２：５ω６）、６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸（１８：４ω３）、８，１１，１４，１７−エイコサテトラエン酸（２０：４ω３）、エイコサペンタエン酸（２０：５ω３）、７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸（２２：５ω３）、４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（２２：６ω３）、６，９−オクタデカジエン酸（１８：２ω９）、８，１１−エイコサジエン酸（２０：２ω９）若しくは５，８，１１−エイコサトリエン酸（ミード酸：２０：３ω９）又はこれらの組み合わせであることを特徴とする請求項１９〜２６記載の油脂中の高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として成る油脂。
【請求項２８】
請求項１９〜２７のいずれか１項に記載の油脂を含有するもしくは該油脂を原料として用いた、もしくは該油脂を化学修飾した、食品組成物、動物用飼料組成物、ペットフード、化学製品原料、医薬、化粧品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として成るジアシルグリセロール油脂の製造方法に関する。
さらにトリアシルグリセロールとジアシルグリセロールを含む油脂を分別蒸留することによりトリアシルグリセロールが高含量でジアシルグリセロールが低含量の油脂もしくはトリアシルグリセロールが低含量でジアシルグリセロールが高含量の油脂の製造方法に関する。
さらには該油脂並びに該油脂を配合してなる飲食物、治療用栄養食品、動物用飼料、ペットフード及び医薬品に関するものである。
本発明において、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロールとは、微生物から抽出されたものをいう。
【背景技術】  ここでいう高度不飽和脂肪酸とは、炭素数１８以上で二重結合を２個以上持つ脂肪酸のことである。高度不飽和脂肪酸は種々のユニークな生理活性を持つため、各種の食品及び動物飼料へ添加してその機能性を高めるために使用される。主なものとしては、リノール酸（ＬＡ）、α−リノレン酸（ＡＬＡ）、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）、ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）、ミード酸（ＭＡ）、アラキドン酸（ＡＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）等が挙げられる。利用にあたっては、遊離脂肪酸型やリン脂質型として用いられることもあるが、主として、トリグリセリド型として用いられ、そのアシル残基に高度不飽和脂肪酸が構成成分として含まれている場合が多い。
ヒトの高度不飽和脂肪酸の生合成には、代表的な二つの系列、ω３系とω６系があり（ωとは、脂肪酸のメチル基末端から数えて最初の二重結合がある炭素数までの数を示している）、例えばω６系の場合は、リノール酸（１８：２ω６）から、不飽和化と炭素鎖長延長が繰り返されて、γ−リノレン酸（１８：３ω６）、ジホモ−γ−リノレン酸（２０：３ω６）、アラキドン酸（２０：４ω６）及び４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸（２２：５ω６）へと変換される。
同様にω３系の場合は、α−リノレン酸（１８：３ω３）から、不飽和化と炭素鎖長延長が繰り返されて、エイコサペンタエン酸（２０：５ω３）、７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸（２２：５ω３）及び４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（２２：６ω３）へと変換される。ω３系の高度不飽和脂肪酸として、エイコサペンタエン酸（以下「ＥＰＡ」と称する）、ドコサヘキサエン酸（以下「ＤＨＡ」と称する）は、特に、動脈硬化症、血栓症などの成人病の予防効果や抗ガン作用、学習能の増強作用などで多くの生理機能を有していることが知られ、医薬品、特定保健用食品への利用で様々な試みがなされている。しかし、最近ではω３系以外の高度不飽和脂肪酸（ω６系及びω９系）の生理機能にも注目が集っている。
アラキドン酸は、血液や肝臓などの重要な器官を構成する脂肪酸の約１０％程度を占めており（例えば、ヒト血液のリン脂質中の脂肪酸組成比では、アラキドン酸は１１％、エイコサペンタエン酸は１％、ドコサヘキサエン酸は３％）、細胞膜の主要構成成分として膜の流動性の調節に関与し、体内の代謝で様々な機能を示す一方、プロスタグランジン類の直接の前駆体として重要な役割を果たす。特に最近は、乳幼児栄養および老人用栄養補助食品として注目されている。通常はリノール酸を富む食品を摂取すればアラキドン酸に変換されるが、成人病患者やその予備軍、乳児、老人では生合成に関与する酵素の働きが低下し、これらアラキドン酸は不足しがちとなるため、油脂として、直接に摂取することが望まれる。
ω３系の高度不飽和脂肪酸であるＥＰＡやＤＨＡには、魚油という豊富な供給源が存在するが、ω６系の高度不飽和脂肪酸であるγ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸及び４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸（２２：５ω６）は、従来の油脂供給源から殆ど得ることができず、現在では微生物を発酵して得た高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として成る油脂が一般に使用されている。例えば、アラキドン酸を構成脂肪酸として成る油脂を産生することのできる種々の微生物を培養して、アラキドン酸を構成脂肪酸として成る油脂を得る方法が提案されている。この中でも、特にモルティエレラ属の微生物を用いることによって、アラキドン酸高含有油脂が得られることが知られている（特開昭６３−４４８９１、特開昭６３−１２２９０）。これらの油脂は主にトリアシルグリセロールからなっている。
一方、ジアシルグリセロールは天然油脂にも広く存在する。ジアシルグリセロールは血中中性脂肪の上昇を抑制する作用を有することから注目されている。近年、酵素合成法による工業的な生産が可能となりジアシルグリセロールが血中中性脂肪の上昇を抑制する食品として注目され、利用もなされている（科学と工業、７４（１）３３ページ（２０００年））。化粧品、医薬品などの分野で利用されている。
鈴木ら（油科学第３１巻第１１号（１９８２）９２１ページ）はＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ  ＩＦＯ７８８４を炭酸アンモニウムを窒素原として培養したところ、３５％の１，３ジアシルグリセロールを含んだ中性脂肪が生産できることを示している。
しかるにこれらのジアシルグリセロールに含まれる脂肪酸組成は開示されていない。
また、鈴木ら（油科学第３７巻第１１号（１９８８）１０８１ページ）はモルティエレラ・イサベリナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）ＩＦＯ８１８７を培養して得た乾燥菌体を極性溶媒であるエタノールで抽出したところ中性脂肪の６６．６％を占めるジアシルグリセロールが生産されることを示している。しかるに、これらのジアシルグリセロール中の脂肪酸組成が開示されていない。また、この方法では極性脂質も多量に抽出されてしまい、中性脂質の純度を上げるためには更に極性脂質の除去を行なわなければならない。さらにこの油脂は抽出条件の検討によりジアシルグリセロールが濃縮されたものであり微生物生産された油脂そのものではない。
清水ら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｏｒｅｓｔｒｙ  ｖｏｌ．３３  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ  ＶＩＩＩ  ３６０ページ）はモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）１Ｓ−４の変異株が２０％のジアシルグリセロールを含有する油脂を生産し、その中のアラキドン酸含量は１９．４％を生産することを示している。
一方、ジアシルグリセロールは天然油脂にも広く存在する。化粧品、医薬品などの分野で利用されているが、近年、大量にかつ高純度で製造する方法が見出されるようになり、その栄養学的研究もすすみ、その結果、血中中性脂肪の上昇を抑制する食品としての利用もなされている。（科学と工業、７４（１）３３ページ（２０００年））
また、ジアシルグリセロールを酵素などを用いて工業的に製造する方法は以下の様に開示されている。
例えば、特開平１−７１４９５号公報は固定化リパーセを用いて脂肪酸の低級アルコールエステルとグリセリンからジアシルグリセロールを製造し、ジアシルグリセロールが８０．１％の油脂を製造している。また特開昭６２−２５９８７号公報ではアルカリ性リパーゼで実質的に水がない状態で、脂肪酸と低級アルコールとグリセリンから６０−７０％のジアシルグリセロールを製造している。
然るにこれらのジアシルグリセロールは、酵素を用いて製造している。また高度不飽和脂肪酸を含有したジアシルグリセロールの製造方法は未だみいだされていない。
すなわち、アラキドン酸などの高度不飽和脂肪酸を含有ししかもジアシルグリセロールを高濃度に含む油脂は、未だ報告されずましてや工業的にも製造されておらずその組成物は全く未知であった。ましてや酵素や化学的に修飾することなく、微生物などの天然界から得ることは全くしられず、実施されるには至っていない。
また、トリアシルグリセロールが高含量でアラキドン酸を含む微生物油脂はすでにその製造方法やその油脂は開示されているが、トリアシルグリセロールが高含量でしかもジアシルグリセロールが低含量の微生物油脂はいまだ製造方法が開示されていない。
ジアシルグリセロールは血中中性脂肪の上昇を抑制する作用等を有することから近年注目されている。ただし、酸化安定性の面からはモノアシルグリセロールが少ない油脂が好まれる、すなわち、ジアシルグリセロールが高度に精製されたものよりも、トリアシルグリセロールと共存することが好ましい。
鈴木ら（油科学第３７巻第１１号（１９８８）１０８１ページ）は中性脂肪の６６．６％を占めるジアシルグリセロールが生産されることを示しているが、これは乾燥菌体を極性溶媒であるエタノールで抽出しており、この方法では極性脂質も多量に抽出されてしまい、中性脂質の純度を上げるためには更に極性脂質の除去を行なわなければならない。さらにこの油脂は抽出条件の検討によりジアシルグリセロールが濃縮されたものであり微生物生産された油脂そのものではない。
特開平１−７１４９５および特開昭６２−２５９８７は酵素を用いて工業的に製造している。しかし、高度不飽和脂肪酸を含有したジアシルグリセロールの製造方法は未だみいだされていない。
Ｓｈｉｍａｄａらは（ＬＩＰＩＤｖｏｌ．３１．ｎｏ．１２（２００３））アラキドン酸含有トリアシルグリセロールとエタノールを酵素でエステル交換反応をさせることにより、反応途中で２５％程度のジアシルグリセロールが副生成されているが、モノアシルグリセロールも同程度副生成されている。
すなわち、アラキドン酸などの高度不飽和脂肪酸を含有ししかもジアシルグリセロールを高濃度に含む油脂は、未だ報告されずましてや工業的にも製造されておらずその組成物は全く未知であった。ましてや酵素や化学的に修飾することなく、微生物などの天然界から得ることは全くしられず、実施されるには至っていない。
また、トリアシルグリセロールが高含量でアラキドン酸を含む微生物油脂はすでにその製造方法やその油脂は開示されているが、トリアシルグリセロールが高含量でしかもジアシルグリセロールが低含量の微生物油脂はいまだ製造方法が開示されていない。
ジアシルグリセロールを含有する微生物油脂は既に報告されているが、これらの製造法は、ジアシルグリセロールの濃度が低いため経済生産するには適していない。そこで、中性脂質中のジアシルグリセロールを２１％以上含有する油脂が生産できる微生物の開発を課題とした。
【特許文献１】特開昭６３−４４８９１号公報
【特許文献２】特開昭６３−１２２９０号公報
【特許文献３】特開平１−７１４９５号公報
【特許文献４】特開昭６２−２５９８７号公報
【非特許文献１】科学と工業、７４（１）３３ページ（２０００年）
【非特許文献２】油科学第３１巻第１１号（１９８２）９２１ページ）
【非特許文献３】油科学第３７巻第１１号（１９８８）１０８１ページ）
【非特許文献４】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｏｒｅｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．３３  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ  ＶＩＩＩ  ｐ．３６０
【非特許文献５】ＬＩＰＩＤ  Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．１２，２００３
【発明の開示】
本発明者等は、中性脂質中のジアシルグリセロールを２１％以上含有する油脂が生産できる微生物を得ることを目的にして、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）の数多くの変異株を得、その中からジアシルグリセロール濃度の高い油脂を生産する変異株を選抜した。その結果、驚くべきことに、グルコース濃度、培養時間を最適化させることにより、中性脂質に対するジアシルグリセロールが３０％以上でありトリアシルグリセロールが５０％以下の高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸としてなる油脂を含有する微生物の製造法を得た。
また、この微生物菌体内の油脂を適宜溶媒で抽出しその後分別蒸留などの周知の技術を用いて分離することにより、菌体内油脂よりもさらにジアシルグリセロールが高含量でありトリアシルグリセロールが低含量の油脂を得ることができる。この方法で分離された一方の油脂はトリアシルグリセロールが高含量でありジアシルグリセロールが低濃度の油脂を得ることができる。
従って本発明は、ジアシルグリセロール高含量成る油脂の製造方法、さらに該油脂を配合して成る飲食物、治療用栄養食品及び医薬品を提供する。
従って、本発明は、全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が２０重量％より大きい、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸とするジアシルグリセロール含有油脂の製造方法において、当該油脂を産生することが出来る微生物を培養し、所望により当該油脂を採取することを特徴とする方法を提供する。
上記の方法において、好ましくは、全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が３０重量％以上であり、更に好ましくは全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が４０重量％以上であり、例えば全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が５０重量％以上である。
上記の方法において、好ましくは、前記微生物は、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属の微生物であり、更に好ましくはモルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）亜属の微生物であり、例えばモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）種の微生物である。前記微生物は、好ましくは、高度不飽和脂肪酸を含む油脂を産生することが出来る微生物の変異株である。
本発明はまた、全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が２０重量％より大きい、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸とするジアシルグリセロール含有油脂を産生することが出来るモルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属微生物、好ましくは全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が３０重量％以上である、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸とするジアシルグリセロール含有油脂を産生することが出来るモルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属微生物を提供する。前記微生物は、好ましくはモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）であり、例えば変異株である。
本発明はまた、全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が２０重量％より大きい、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸とするジアシルグリセロール含有油脂を含む微生物菌体を提供する。好ましくは、全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率は３０重量％以上であり、更に好ましくは全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が４０重量％以上であり、例えば全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が５０重量％以上である。上記の記微生物は、好ましくはモルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属微生物の微生物菌体であり、例えばモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）種の微生物の微生物菌体である。菌体は生菌であっても、死菌であってもあるいは乾燥させたものであってもよい。
本発明は更に、全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が２０重量％より大きい、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸とするジアシルグリセロール含有油脂であって、当該油脂を生産することが出来る微生物の培養菌体から抽出された油脂を提供する。好ましくは、全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率は３０重量％以上であり、更に好ましくは全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が４０重量％以上であり、例えば全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が６０重量％以上である。上記の抽出は、例えば非極性溶剤又は親水性溶剤を用いて行なわれる。
本発明は更に、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として成る油脂を産生しうる微生物を培養して得たジアシルグリセロールとトリアシルグリセロールを含む菌体から油脂を抽出し蒸留により分別し得た、中性脂質中にジアシルグリセロールが７０％以上でトリアシルグリセロールが３０％以下の油脂を提供する。
本発明はまた、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として成る油脂を産生しうる微生物を培養して得たジアシルグリセロールとトリアシルグリセロールを含む菌体から油脂を抽出し蒸留により分別し得た、中性脂質中にトリアシルグリセロールが９５％以上でジアシルグリセロールが５％以下の油脂を提供する。
本発明の油脂を構成する高度不飽和脂肪酸は、例えば、ジホモ−γ−リノレン酸（２０：３ω６）、アラキドン酸（２０：４ω６）、７，１０，１３，１６−ドコサテトラエン酸（２２：４ω６）、４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸（２２：５ω６）、６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸（１８：４ω３）、８，１１，１４，１７−エイコサテトラエン酸（２０：４ω３）、エイコサペンタエン酸（２０：５ω３）、７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸（２２：５ω３）、４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（２２：６ω３）、６，９−オクタデカジエン酸（１８：２ω９）、８，１１−エイコサジエン酸（２０：２ω９）若しくは５，８，１１−エイコサトリエン酸（ミード酸：２０：３ω９）又はこれらの組み合わせである。
本発明はまた、上記の本発明の油脂を含有するもしくは油脂を原料として用いた、もしくは化学修飾した、食品組成物、動物用飼料組成物、ペットフード、化学製品原料、医薬、化粧品組成物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】 変異株取得
本発明は、油脂中、具体的には粗油中のジアシルグリセロールが高い高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として成る微生物を培養して該油脂を生産させ、該油脂を精製して得た精製油脂を配合して成る飲食物、治療用栄養食品及び医薬品に関するものである。
したがって、本発明においては、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として成る油脂（ジアシルグリセロール）を産生しうる微生物であればすべて使用することができる。例えば、アラキドン酸を構成脂肪酸として成る油脂（トリグリセリド）の生産能を有する微生物としては、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、コニディオボラス（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、フィチウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）属、フィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）属、ペニシリューム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、クロドスポリューム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、フザリューム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、エントモフトラ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ）属、エキノスポランジウム（Ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ）属、サプロレグニア（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ）属に属する微生物を挙げることができる。
モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）亜属に属する微生物では、例えばモルティエレラ・エロンガタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅｌｏｎｇａｔａ）、モルティエレラ・エキシグア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅｘｉｇｕａ）、モルティエレラ・フィグロフィラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）等を挙げることができる。
具体的にはモルティエレラ・エロンガタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅｌｏｎｇａｔａ）ＩＦＯ８５７０、モルティエレラ・エキシグア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅｘｉｇｕａ）ＩＦＯ８５７１、モルティエレラ・フィグロフィラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）ＩＦＯ５９４１、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）ＩＦＯ８５６８、ＡＴＣＣ１６２６６、ＡＴＣＣ３２２２１、ＡＴＣＣ４２４３０、ＣＢＳ２１９．３５、ＣＢＳ２２４．３７、ＣＢＳ２５０．５３、ＣＢＳ３４３．６６、ＣＢＳ５２７．７２、ＣＢＳ５２９．７２、ＣＢＳ６０８．７０、ＣＢＳ７５４．６８等の菌株を挙げることができる。
例えば、ＤＨＡを産生しうる微生物として、クリプテコデニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｅｎｉｕｍ）属、スラウトキトリウム（Ｔｈｒａｕｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属、ジャポノキトリウム（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属又はハリフォトリス（Ｈａｌｉｐｈｔｈｏｒｏｓ）属に属する微生物を挙げることもできる。
これらの菌株はいずれも、大阪市の財団法人醗酵研究所（ＩＦＯ）、及び米国のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）及び、Ｃｅｎｔｒｒａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）からなんら制限なく入手することができる。また本発明の研究グループが土壌から分離した菌株モルティエレラ・エロンガタＳＡＭ０２１９（微工研菌寄第８７０３号）（微工研条寄第１２３９号）を使用することもできる。
これらのタイプカルチャーに属する菌株、あるいは自然界から分離した菌株をそのまま用いることができるが、増殖及び／又は単離を１回以上行うことによって得られる元の菌株とは性質の異なる自然突然変異を用いることができる。すなわち、これらの脂質生産菌に突然変異処理を施し、選択することにより、ジアシルグリセロールの生成能力の高まった脂質生産菌を選択することもできる。
突然変異処理は、上記の脂質生産菌に適用可能であれば特に限定されるものではないが、放射線（Ｘ線、ガンマー線、中性子線）照射や紫外線照射、高熱処理等を行ったり、また微生物を適当なバッファー中などに懸濁し、変異剤を加えて一定時間インキュベート後、適当に希釈して寒天培地に植菌し、変異株のコロニーを得るといった一般的な突然変異操作を挙げることができる。変異剤としては、ナイトロジェンマスタード、メチルメタンサルホネートやＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等にアルキル化剤、５−ブロモウラシル等の塩基類似体、マイトマイシンＣ等の抗生物質、６−メルカプトプリン等の塩基合成阻害剤、プロフラビン等の色素類、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキシド等のある種の発がん剤、塩化マンガン、ホルムアルデヒド等の化合物を挙げることができる。また、使用する微生物は、生育菌体（菌糸）でも良いし、胞子でも良い。
突然変異処理した脂質生産菌からジアシルグリセロールの生成能力の高まった脂質生産菌を選択する方法は、特に限定されるものではないが、突然変異処理した脂質生産菌が生成する脂質を液体高速クロマトグラフィーなどで分析することが好ましい。
実施例１に示す通り、変異処理を施した約３，０００個の菌株を上記のようにして選択したところ、全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が２０重量％より大きい、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸とするジアシルグリセロール含有油脂を産生する変異体が３株得られた。このことは、変異処理した菌株約１，０００株当り、平均１株の目的とする変異株が得られたことを意味する。従って、本発明の変異株が得られる頻度は、一般の変異処理−選択によるランダム選択法の場合に比べて非常に高く、本発明において実際に得た３本の変異株と同等の上記の特性を有する変異株は、本発明の実施例１に記載の方法を反復することにより容易に得ることができる。
モルティエレラ属モルティエレラ亜属に属する微生物は、アラキドン酸を主たる構成脂肪酸として成る油脂（トリアシルグリセロール）を産生しうる微生物として知られているが、本発明者らは、上記菌株に変異処理を施すことによって、ジホモ−γ−リノレン酸を主たる構成脂肪酸としてなる油脂（トリアシルグリセロール）を産生しうる微生物（特開平５−９１８８７）や、ω９系高度不飽和脂肪酸を主たる構成脂肪酸としてなる油脂（トリアシルグリセロール）を産生しうる微生物を（特開平５−９１８８８）得ている。さらに、高濃度の炭素源に耐性を有する微生物（ＷＯ９８／３９４６８）も得ており、これら微生物は、モルティエレラ属モルティエレラ亜属の微生物であり、これらの菌株を本発明と同様の変異処理を施すことにより、ジホモ−γ−リノレン酸やω９系高度不飽和脂肪酸を主たる構成脂肪酸とするジアシルグリセロールが高含量の油脂を蓄積する微生物を得ることができる。
本発明の油脂は、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として成る油脂を産生しうる微生物を培養し、その培養物から得られる微生物油脂であって、微生物を培養槽で培養することにより、菌体中にジアシルグリセロールを高濃度で含有する油脂を蓄積させその油脂を抽出して得るものである。
具体的には、油脂に対してジアシルグリセロール含量が２１重量％以上、好ましくは３５重量％以上であり、しかも、ジアシルグリセロール中の総脂肪酸に対する高度不飽和脂肪酸を２％重量％以上、好ましくは９重量％以上含有する油脂である。したがって、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として成る油脂（ジアシルグリセロール）を産生しうる微生物を培養することが必須である。ここでいう微生物としては、炭素数が１８以上で二重結合は３以上のω６系高度不飽和脂肪酸、炭素数が１８以上で二重結合が２以上のω９系高度不飽和脂肪酸、及び炭素数が１８以上で二重結合が３以上のω３系高度不飽和脂肪酸の少なくとも１種の高度不飽和脂肪酸を主にジアシルグリセロールの構成脂肪酸として産生する微生物が望ましい。
そして、炭素数が１８以上で二重結合は３以上のω６系高度不飽和脂肪酸としては、γ−リノレン酸（６，９，１２−オクタデカトリエン酸）、ジホモ−γ−リノレン酸（８，１１，１４−エイコサトリエン酸）、アラキドン酸（５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸）、７，１０，１３，１６−ドコサテトラエン酸（２２：４ω６）及びＤＰＡω６（４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸）を、炭素数が１８以上で二重結合が２以上のω９系高度不飽和脂肪酸としては、６，９−オクタデカジエン酸、８，１１−エイコサジエン酸、及びミード酸（５，８，１１−エイコサトリエン酸）を、炭素数が１８以上で二重結合が３以上のω３系高度不飽和脂肪酸として、α−リノレン酸（９，１２，１５−オクタデカトリエン酸）、６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸（１８：４ω３）、８，１１，１４，１７−エイコサテトラエン酸（２０：４ω３）、ＥＰＡ（５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸）、ＤＰＡω３（７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸）、及びＤＨＡ（４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸）を挙げることができる。
本発明に使用される菌株を培養する為には、その菌株の胞子、菌糸、又は予め培養して得られた種培養液あるいは種培養より回収した菌体を、液体培地に接種し本培養する。液体培地の場合に、炭素源としてはグルコース、フラクトース、キシロース、サッカロース、マルトース、可溶性デンプン、糖蜜、グリセロール、マンニトール、糖化澱粉等の一般的に使用されているものが、いずれも使用できるが、これらに限られるものではない。窒素源としてはペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、カザミノ酸、コーンスティープリカー、大豆タンパク、脱脂ダイズ、綿実カス等の天然窒素源の他に、尿素等の有機窒素源、ならびに硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素源を用いることができる。
大豆から得られる窒素源、具体的には大豆、脱脂大豆、大豆フレーク、食用大豆タンパク、おから、豆乳、きな粉等が挙げられるが、特に、脱脂大豆に熱変性を施したもの、より好ましくは脱脂大豆を約７０〜９０℃で熱処理し、さらにエタノール可溶成分を除去したものを単独または複数で、あるいは前記窒素源と組み合わせて使用することができる。この他必要に応じて、リン酸イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン以外に、鉄、銅、亜鉛、マンガン、ニッケル、コバルト等の金属イオンやビタミン等を微量栄養源として使用できる。
これらの培地成分は微生物の生育を害しない濃度であれば特に制限はない。実用上、一般に炭素源は総添加量は０．１〜４０重量％、好ましくは１〜２５重量％、窒素源の総添加量は１〜１５重量％、好ましくは２〜１０重量％とするのが望ましく、より好ましくは初発の炭素源添加量を１〜５重量％、初発の窒素源添加量を３〜８重量％として、培養途中に炭素源及び窒素源を、さらにより好ましくは炭素源のみを流加して培養する。
なお、高度不飽和脂肪酸の収率を増加せしめるために、高度不飽和脂肪酸の前駆体として、例えば、ヘキサデカン若しくはオクタデカンのごとき炭化水素；オレイン酸若しくはリノール酸のごとき脂肪酸又はその塩、又は脂肪酸エステル、例えばエチルエステル、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル；又はオリーブ油、大豆油、なたね油、綿実油若しくはヤシ油のごとき油脂類を単独で、又は組み合わせて使用できる。基質の添加量は培地に対して０．００１〜１０％、好ましくは０．５〜１０％である。またこれらの基質を唯一の炭素源として培養してもよい。
高度不飽和脂肪酸を産生する微生物の培養温度は使用する微生物によりことなるが、５〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃とし、また２０〜３０℃にて培養して菌体を増殖せしめた後５〜２０℃にて培養を続けて高度不飽和脂肪酸を生産せしめることもできる。このような温度管理によっても、生成脂肪酸中の高度不飽和脂肪酸の割合を上昇せしめることができる。種培養では通気攪拌培養、振盪培養、固体培養、又は静置液体培養を、本培養では通気攪拌培養を行う。培養期間は通常２〜３０日間、好ましくは５〜２０日間、より好ましくは５〜１５日間行なう。
例えば、ジアシルグリセロール酸生産菌ＫＹ−１株を、酵母エキス２％、グルコース６％、ｐＨ６．０、４０００Ｌを１０ｋＬ通気攪拌培養操に入れ、温度２８℃、通気量１ＶＶＭ、槽内圧１．０ｋｇ／ｃｍ２の条件で７日間通気攪拌培養を行い、培養終了後、殺菌した後、連続式脱水機で湿菌体を回収し、乾燥機で水分含量５ｗｔ％まで乾燥し、乾燥菌体を得ることができる。
本発明の油脂は、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸としてなる油脂（ジアシルグリセロール）を産生しうる微生物を培養し、その培養物から得られる微生物油脂であって、培養槽を用いて、培養することにより、菌体に含まれる油脂中のジアシルグリセロール含量を増加させることを最大の特徴としているため、培養培地や培養条件、さらに油脂の抽出精製方法はこれらに限定されるわけではない。
菌体回収油脂抽出
ジアシルグリセロール含量が高い高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として成る油脂を菌体内に蓄積した微生物から、油脂を得る方法として、培養終了後、培養液をそのままかあるいは殺菌、濃縮、酸性化などの処理を施した後、自然沈降、遠心分離および／又は濾過などの常用の固液分離手段により培養菌体を得る。固液分離を助けるために、凝集剤や濾過助剤を添加してもよい。凝集剤としては、例えば、塩化アルミニウム、塩化カルシウム、アルギン酸、キトサンなどを使用できる。濾過助剤としては、例えば、珪藻土を使用できる。培養菌体は好ましくは、水洗、破砕、乾燥する。
乾燥は、凍結乾燥、風乾、流動層乾燥などによって行うことができる。乾燥菌体から粗油を得る手段としては、有機溶剤による抽出法や圧搾法を用いることができるが、好ましくは窒素気流下で有機溶剤によって抽出する。有機溶剤としてはエタノール、ヘキサン、メタノール、エタノール、クロロホルム、ジクロロメタン、石油エーテル、アセトン等を用いることができ、またメタノールと石油エーテルの交互抽出やクロロホルム−メタノール−水の三層系の溶媒も用いることができる。
これらの溶剤の中で、ヘキサンなどの疎水性溶剤を使用して抽出すれば、リン脂質などの極性脂質を抽出することなく、ジアシルグリセロール、トリアシルグリセロールなどの中性脂質を純度高く抽出することができる。得られた抽出油脂は、リン脂質などを除く脱ガム酸工程、遊離脂肪酸などを除く脱酸工程などの精製工程に大きな負荷をかけることなく精製油脂を得ることができる。
さらにエタノールなどの親水性溶剤を使用すれば、リン脂質などの極性脂質は抽出されるものの、ジアシルグリセロールをより選択的に抽出でき、菌体内に存在する中性脂肪中のジアシルグリセロール濃度以上の高濃度のジアシルグリセロール油脂を抽出することができる。たとえば、溶剤にエタノールを使用することにより、中性脂質中にジアシルグリセロール７０％以上でトリアシルグリセロールが３０％以下を含有する油脂を得ることができる。
さらにこのエタノール抽出残渣を更にヘキサンで抽出することにより、菌体内に存在する中性脂肪中トリアシルグリセロール濃度を高めることが出来る。すなわち、中性脂質中にジアシルグリセロールが１０％以下でトリアシルグリセロールが８０％以上含む油脂を得ることができる。
また、粗油の取得に用いる抽出法を上記の方法に限定しているわけではなく、菌体内の油脂を効率的に抽出する手法はすべて使用することができる。例えば、超臨界抽出法なども有効な手段として使用することができる。
有機溶剤や超臨界流体で抽出された抽出物から減圧下などの条件下で有機溶剤や超臨界流体成分を除去することにより、目的とする粗油を得ることができる。また、上記の方法に代えて湿菌体を用いて抽出を行うことができる。この場合にはメタノール、エタノール、アセトン等の水に対して相溶性の溶媒、又はこれらと水及び／又は他の溶媒とからなる水に対して相溶性の混合溶媒を使用する。その他の手順は上記と同様である。
本発明で得たジアシルグリセロール含量を増加せしめた高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として成る粗油は、動物飼料に配合して直接使用することができる。しかし、食品への適応を考えた場合、一般の油脂精製工程に供して使用することが望ましい。油脂精製工程として、脱ガム、脱酸、脱臭、脱色、カラム処理、分子蒸留、ウィンタリングなどの常法の工程を用いることができる。
分子蒸留を適当な条件で使用することにより、蒸留出油脂分に、今までにない高純度のジアシルグリセロール含有精製油脂を得ることができる。さらにヘキサン抽出してトリアシルグリセロール濃度が高い油脂をさらに分子蒸留でジアシルグリセロールを蒸留液として除去した油脂はトリグリセリドが９０％以上と高含量でジアシルグリセロールが５％以下と非常に少ない油脂として得ることが出来る。
すなわち、高濃度のジアシルグリセロール含有油脂は、さらに様々な抽出精製方法を用いることにより、目的とする用途に合わせて、ジアシルグリセロール、トリアシルグリセロールの純度を任意の油脂を同時に得ることが出来る。
油脂の用途
本発明の油脂（ジアシルグリセロールおよびトリアシルグリセロール）の用途に関しては無限の可能性があり、食品、飲料、動物飼料、ペットフード、化粧品、医薬品の原料並びに添加物として使用することができる。とくに、ジアシルグリセロールは親水性がトリアシルグリセロールより高いことを利用した食品への利用は大きく広がる。
例えば、食品組成物としては、一般食品の他、機能性食品、栄養補助食品、未熟児用調製乳、成熟児用調製乳、乳児用調製乳、乳児用食品、妊産婦食品又は老人用食品等を挙げることができる。油脂を含む食品例として、肉、魚、またはナッツ等の本来油脂を含む天然食品、スープ等の調理時に油脂を加える食品、ドーナッツ等の熱媒体として油脂を用いる食品、バター等の油脂食品、クッキー等の加工時に油脂を加える加工食品、あるいはハードビスケット等の加工仕上げ時に油脂を噴霧または塗布する食品等が挙げられる。さらに、油脂を含まない、農産食品、醗酵食品、畜産食品、水産食品、または飲料に添加することができる。さらに、機能性食品・医薬品の形態であっても構わなく、例えば、経腸栄養剤、粉末、顆粒、トローチ、内服液、懸濁液、乳濁液、シロップ等の加工形態であってもよい。
【実施例】  次に、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。しかし、本発明は、実施例に限定されない。
実施例１． 変異株の作製
モルティエレラ・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）１Ｓ−４をＣｚａｐｅｃｋ寒天培地（０．２％ＮａＮＯ３、０．１％Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０５％ＫＣｌ、０．００１％ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３％シュークロース、２％寒天、ｐＨ６．０）３００ｍｌを含む大型スラントビンに植菌し、２週間、２８℃で培養することで胞子形成を行った。培養後、大型スラントビンにＴｗｅｅｎ  ８０を２滴加えた滅菌水５０ｍｌを加えよく振り、４重のガーゼでろ液をろ過した。この操作を２回繰り返し、ろ液を、８，０００×ｇ、１０分間遠心した。
こうして得られた胞子をトリス・マレイン酸緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ｍａｌｅａｔｅ、ｐＨ７．５）で１×１０６胞子／ｍｌになるように懸濁した。その後、ＮＴＧを用いて変異処理を行った。
ＮＴＧ処理した胞子懸濁液を数段階に希釈し、ＧＹ寒天培地（１％グルコース、０．５％酵母エキス、０．００５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１．５％寒天、ｐＨ６．０）に塗布した。２８℃で培養し、コロニーが出現したものからランダムに新しいプレートにピックアップし、２８℃で０．５〜１ｃｍのコロニーを形成後、１２℃で２日間培養した。
上記の様にプレートにピックアップした変異株をＧＹ液体培地（グルコース２％、酵母エキス１％、ｐＨ６．０）４ｍｌを含む試験管（１２．３×２００ｍｍ）で、７日間振とう培養した。得られた菌体の脂質を以下のＢｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法に従って抽出した。菌体約１ｇを乳鉢に入れ、２ｍｌの１％ＫＣｌ水溶液でよくすりつぶした後、ねじ口試験管に移した。そこに溶媒Ａ（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ、２／１、ｖ／ｖ）、を４ｍｌ加え、回転撹拌して２層をよく混合させた後、数分間遠心し、下層のＣＨＣｌ３層を分取した。こうして分取したＣＨＣｌ３層を遠心エバポレーターで濃縮乾固し、溶媒Ａを５００μｌ前後加え、−２０℃で保存した。
ＴＬＣには、シリカゲルでコートしたプレート（Ａｒｔ  ５７２１、２００×２００×０．２５ｍｍ、Ｍｅｒｃｋ）を用いた。トリアシルグリセロール（ＴＧ）、ジアシルグリセロール（ＤＧ）、モノアシルグリセロール（ＭＧ）、及び遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を主に分析するため、ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（７０：３０：１、ｖ／ｖ）を溶媒展開として用いた。展開後、５％（ｗ／ｖ）エタノール中リンモリブデン酸溶液を噴霧し、１２０℃で加熱することで各脂質のスポットを検出しその様子が親株と異なっているものを探索した。
その結果、ＴＬＣによる一次スクリーニングにおいてトリアシルグリセロール（ＴＧ）のスポットが他の脂質成分のスポットより薄い、あるいはジアシルグリセロール（ＤＧ）、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）のスポットが濃い株を確認し、この株を蒸発光散乱分析システムを用いてのＨＰＬＣ分析の結果、ジアシルグリセロールとステロールの含有率がやや高くなっていることが、親株であるスタンダード（１Ｓ−４）と比較することで明らかになった。
約３，０００個のコロニーを調べた結果、総脂質に占めるジアシルグリセロールの割合が高まった変異株３株（＃１株、＃２株、＃３株）を得た。これらの株のジアシルグリセロールの含有率は３１％、２８％、２２％であった。
【表１】
2006022356.tif 000002
実施例２． 実施例１で得た変異株と親株との比較
ジアシルグリセロールの割合が高まった変異株３株（＃１株、＃２株、＃３株）の中でもっともジアシルグリセロール含量が高い＃１株（ＫＹ−１株）を、酵母エキス１％、グルコース０、２、３、４、６％の培地に接種し、往復振盪３００ｒｐｍ、温度２８℃の条件にて培養を開始し、７日間培養した。
培養終了時の湿菌体当たりのトリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、ステロールの含量を実施例１の方法で分析し、その結果を表２に示す。モノアシルグリセロールは検出されなかった。グルコース２％での培養で、菌体中のジアシルグリセロールが１５．３６ｍｇ／ｇと最大となりそのときのジアシルグリセロールの中性脂質に占める割合も３４．５％と最大となった。
【表２】
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比較例として、１Ｓ−４株を、実施例同じ方法で培養し、分析を行なった。結果を表３に示す。
【表３】
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実施例３．
ジアシルグリセロール酸生産菌ＫＹ−１株を、ＧＹ培地（酵母エキス１％、グルコース２％、ｐＨ６．０）に４ｍｌが入った１００ｍｌの三角フラスコに接種し、振盪３００ｒｐｍ、温度２８℃の条件にて培養を開始し、４，６，８日間培養した。
培養終了後の菌体は乾燥後菌体重量を測定した。こうして得た菌体は、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法で脂質抽出を行った後、液体クロマトグラフーの蒸発光散乱検出器を用いて各脂質成分の定量をおこなった。
結果を表４に示す。モノアシルグリセロールは検出されなかった。培養日数８日目で菌体あたりの総中性質量が最大となり１６ｍｇ／ｇとなった。培養４、６、８日目のジアシルグリセロールの全中性脂質に占める割合はそれぞれ１３％、３１．５％、１８．１％に達した。
【表４】
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また、培養４日目、６日目及び８日目のトリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、遊離脂肪酸に含まれる脂肪酸組成を分析した結果を表５に示す。アラキドン酸はジアシルグリセロールに８．１〜１３．８％含まれていた。
【表５】
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比較例として、１Ｓ−４株を、実施例と同じ方法で培養し分析を行った。結果を表６に示す。培養６日目でジアシルグリセロール蓄積量が２．４ｍｇ／ｇ菌体と最大になり、そのときのジアシルグリセロールの中性脂質に占める割合は５．８％と少なかった。
【表６】
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実施例４． 培養５０Ｌジャーファーメンターによる製造
ジアシルグリセロール酸生産菌ＫＹ−１株を、酵母エキス２％及びグルコース２％を含む培地（ｐＨ６．０）３０Ｌを含む５０Ｌ通気攪拌培養槽に接種し、温度２８℃、通気量１ＶＶＭ、攪拌２００ＲＰＭの条件で７日間通気攪拌培養を行った。培養２日、３日、４日にグルコース濃度が２％増加するようにグルコースを添加した。培養終了後、９８℃、２０分の条件で殺菌した後、ろ過して湿菌体を回収し、乾燥機で水分含量５ｗｔ％まで乾燥し、乾燥菌体６３０ｇを得た。この菌体からヘキサンで油脂を抽出し、４３ｇの油脂を得た。
この油脂の中性脂質に含まれるジアシルグリセロールは３６％でジアシルグリセロールに含まれるアラキドン酸は全脂肪酸の１５．２％であった。
【手続補正書】
【提出日】平成19年7月11日(2007.7.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として成るジアシルグリセロール油脂の製造方法に関する。
さらにトリアシルグリセロールとジアシルグリセロールを含む油脂を分別蒸留することによりトリアシルグリセロールが高含量でジアシルグリセロールが低含量の油脂もしくはトリアシルグリセロールが低含量でジアシルグリセロールが高含量の油脂の製造方法に関する。
【０００２】
さらには該油脂並びに該油脂を配合してなる飲食物、治療用栄養食品、動物用飼料、ペットフード及び医薬品に関するものである。
本発明において、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロールとは、微生物から抽出されたものをいう。
【背景技術】
【０００３】
ここでいう高度不飽和脂肪酸とは、炭素数18以上で二重結合を２個以上持つ脂肪酸のことである。高度不飽和脂肪酸は種々のユニークな生理活性を持つため、各種の食品及び動物飼料へ添加してその機能性を高めるために使用される。主なものとしては、リノール酸（LA）、α-リノレン酸（ALA）、γ-リノレン酸（GLA）、ジホモ−γ−リノレン酸（DGLA）、ミード酸（MA）、アラキドン酸（AA）、エイコサペンタエン酸（EPA）、ドコサヘキサエン酸（DHA）等が挙げられる。利用にあたっては、遊離脂肪酸型やリン脂質型として用いられることもあるが、主として、トリグリセリド型として用いられ、そのアシル残基に高度不飽和脂肪酸が構成成分として含まれている場合が多い。
【０００４】
ヒトの高度不飽和脂肪酸の生合成には、代表的な二つの系列、ω3系とω6系があり（ωとは、脂肪酸のメチル基末端から数えて最初の二重結合がある炭素数までの数を示している）、例えばω6系の場合は、リノール酸（18:2 ω6）から、不飽和化と炭素鎖長延長が繰り返されて、γ-リノレン酸（18:3 ω6）、ジホモ-γ-リノレン酸（20:3 ω6）、アラキドン酸（20:4 ω6）及び4,7,10,13,16-ドコサペンタエン酸（22:5 ω6）へと変換される。
【０００５】
同様にω3系の場合は、α-リノレン酸（18:3 ω3）から、不飽和化と炭素鎖長延長が繰り返されて、エイコサペンタエン酸（20:5 ω3）、7,10,13,16,19-ドコサペンタエン酸（22:5 ω3）及び4,7,10,13,16,19-ドコサヘキサエン酸（22:6 ω3）へと変換される。ω3系の高度不飽和脂肪酸として、エイコサペンタエン酸（以下「EPA」と称する）、ドコサヘキサエン酸（以下「DHA」と称する）は、特に、動脈硬化症、血栓症などの成人病の予防効果や抗ガン作用、学習能の増強作用などで多くの生理機能を有していることが知られ、医薬品、特定保健用食品への利用で様々な試みがなされている。しかし、最近ではω3系以外の高度不飽和脂肪酸（ω6系及びω9系）の生理機能にも注目が集っている。
【０００６】
アラキドン酸は、血液や肝臓などの重要な器官を構成する脂肪酸の約10%程度を占めており（例えば、ヒト血液のリン脂質中の脂肪酸組成比では、アラキドン酸は11%、エイコサペンタエン酸は1%、ドコサヘキサエン酸は3%）、細胞膜の主要構成成分として膜の流動性の調節に関与し、体内の代謝で様々な機能を示す一方、プロスタグランジン類の直接の前駆体として重要な役割を果たす。特に最近は、乳幼児栄養および老人用栄養補助食品として注目されている。通常はリノール酸を富む食品を摂取すればアラキドン酸に変換されるが、成人病患者やその予備軍、乳児、老人では生合成に関与する酵素の働きが低下し、これらアラキドン酸は不足しがちとなるため、油脂として、直接に摂取することが望まれる。
【０００７】
ω3系の高度不飽和脂肪酸であるEPAやDHAには、魚油という豊富な供給源が存在するが、ω6系の高度不飽和脂肪酸であるγ-リノレン酸、ジホモ-γ-リノレン酸、アラキドン酸及び4,7,10,13,16-ドコサペンタエン酸（22:5 ω6）は、従来の油脂供給源から殆ど得ることができず、現在では微生物を発酵して得た高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として成る油脂が一般に使用されている。例えば、アラキドン酸を構成脂肪酸として成る油脂を産生することのできる種々の微生物を培養して、アラキドン酸を構成脂肪酸として成る油脂を得る方法が提案されている。この中でも、特にモルティエレラ属の微生物を用いることによって、アラキドン酸高含有油脂が得られることが知られている（特開昭63-44891、特開昭63-12290）。これらの油脂は主にトリアシルグリセロールからなっている。
【０００８】
一方、ジアシルグリセロールは天然油脂にも広く存在する。ジアシルグリセロールは血中中性脂肪の上昇を抑制する作用を有することから注目されている。近年、酵素合成法による工業的な生産が可能となりジアシルグリセロールが血中中性脂肪の上昇を抑制する食品として注目され、利用もなされている（科学と工業、74（1）33ページ（2000年））。化粧品、医薬品などの分野で利用されている。
【０００９】
鈴木ら（油科学第31巻第11号（1982）921ページ）はMortierella isabellina  IFO7884を炭酸アンモニウムを窒素原として培養したところ、35％の1,3ジアシルグリセロールを含んだ中性脂肪が生産できることを示している。
【００１０】
しかるにこれらのジアシルグリセロールに含まれる脂肪酸組成は開示されていない。
また、鈴木ら（油科学第37巻第11号（1988）1081ページ）はモルティエレラ・イサベリナ（Mortierella isabellina）IFO8187を培養して得た乾燥菌体を極性溶媒であるエタノールで抽出したところ中性脂肪の66.6％を占めるジアシルグリセロールが生産されることを示している。しかるに、これらのジアシルグリセロール中の脂肪酸組成が開示されていない。また、この方法では極性脂質も多量に抽出されてしまい、中性脂質の純度を上げるためには更に極性脂質の除去を行なわなければならない。さらにこの油脂は抽出条件の検討によりジアシルグリセロールが濃縮されたものであり微生物生産された油脂そのものではない。
【００１１】
清水ら（Biotechnology in Agriculture and Forestry vol.33 Medical Aromatic Plants VIII 319ページ）はモルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）1Ｓ-4の変異株が20％のジアシルグリセロールを含有する油脂を生産し、その中のアラキドン酸含量は19.4％を生産することを示している。
【００１２】
一方、ジアシルグリセロールは天然油脂にも広く存在する。化粧品、医薬品などの分野で利用されているが、近年、大量にかつ高純度で製造する方法が見出されるようになり、その栄養学的研究もすすみ、その結果、血中中性脂肪の上昇を抑制する食品としての利用もなされている。（科学と工業、74（1）33ページ（2000年））
また、ジアシルグリセロールを酵素などを用いて工業的に製造する方法は以下の様に開示されている。
【００１３】
例えば、特開平1-71495号公報は固定化リパーセを用いて脂肪酸の低級アルコールエステルとグリセリンからジアシルグリセロールを製造し、ジアシルグリセロールが80.1％の油脂を製造している。また特開昭62-25987号公報ではアルカリ性リパーゼで実質的に水がない状態で、脂肪酸と低級アルコールとグリセリンから60-70％のジアシルグリセロールを製造している。
【００１４】
然るにこれらのジアシルグリセロールは、酵素を用いて製造している。また高度不飽和脂肪酸を含有したジアシルグリセロールの製造方法は未だみいだされていない。
すなわち、アラキドン酸などの高度不飽和脂肪酸を含有ししかもジアシルグリセロールを高濃度に含む油脂は、未だ報告されずましてや工業的にも製造されておらずその組成物は全く未知であった。ましてや酵素や化学的に修飾することなく、微生物などの天然界から得ることは全くしられず、実施されるには至っていない。
【００１５】
また、トリアシルグリセロールが高含量でアラキドン酸を含む微生物油脂はすでにその製造方法やその油脂は開示されているが、トリアシルグリセロールが高含量でしかもジアシルグリセロールが低含量の微生物油脂はいまだ製造方法が開示されていない。
ジアシルグリセロールは血中中性脂肪の上昇を抑制する作用等を有することから近年注目されている。ただし、酸化安定性の面からはモノアシルグリセロールが少ない油脂が好まれる、すなわち、ジアシルグリセロールが高度に精製されたものよりも、トリアシルグリセロールと共存することが好ましい。
【００１６】
鈴木ら（油科学第37巻第11号（1988）1081ページ）は中性脂肪の66.6％を占めるジアシルグリセロールが生産されることを示しているが、これは乾燥菌体を極性溶媒であるエタノールで抽出しており、この方法では極性脂質も多量に抽出されてしまい、中性脂質の純度を上げるためには更に極性脂質の除去を行なわなければならない。さらにこの油脂は抽出条件の検討によりジアシルグリセロールが濃縮されたものであり微生物生産された油脂そのものではない。
【００１７】
特開平1-71495および特開昭62-25987は酵素を用いて工業的に製造している。しかし、高度不飽和脂肪酸を含有したジアシルグリセロールの製造方法は未だみいだされていない。
Shimadaらは（LIPIDvol.31.no.12(2003)）アラキドン酸含有トリアシルグリセロールとエタノールを酵素でエステル交換反応をさせることにより、反応途中で25％程度のジアシルグリセロールが副生成されているが、モノアシルグリセロールも同程度副生成されている。
【００１８】
すなわち、アラキドン酸などの高度不飽和脂肪酸を含有ししかもジアシルグリセロールを高濃度に含む油脂は、未だ報告されずましてや工業的にも製造されておらずその組成物は全く未知であった。ましてや酵素や化学的に修飾することなく、微生物などの天然界から得ることは全くしられず、実施されるには至っていない。
また、トリアシルグリセロールが高含量でアラキドン酸を含む微生物油脂はすでにその製造方法やその油脂は開示されているが、トリアシルグリセロールが高含量でしかもジアシルグリセロールが低含量の微生物油脂はいまだ製造方法が開示されていない。
【００１９】
ジアシルグリセロールを含有する微生物油脂は既に報告されているが、これらの製造法は、ジアシルグリセロールの濃度が低いため経済生産するには適していない。そこで、中性脂質中のジアシルグリセロールを21％以上含有する油脂が生産できる微生物の開発を課題とした。
【００２０】
【特許文献１】特開昭63-44891号公報
【特許文献２】特開昭63-12290号公報
【特許文献３】特開平1-71495号公報
【特許文献４】特開昭62-25987号公報
【００２１】
【非特許文献１】科学と工業、74（1）33ページ（2000年）
【非特許文献２】油科学第31巻第11号（1982）921ページ）
【非特許文献３】油科学第37巻第11号（1988）1081ページ）
【非特許文献４】Biotechnology in Agriculture and Forestry Vol.33 Medical Aromatic Plants VIII p.319
【非特許文献５】LIPID Vol.31, No.12, 2003
【発明の開示】
【００２２】
本発明者等は、中性脂質中のジアシルグリセロールを21％以上含有する油脂が生産できる微生物を得ることを目的にして、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）の数多くの変異株を得、その中からジアシルグリセロール濃度の高い油脂を生産する変異株を選抜した。その結果、驚くべきことに、グルコース濃度、培養時間を最適化させることにより、中性脂質に対するジアシルグリセロールが30％以上でありトリアシルグリセロールが50％以下の高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸としてなる油脂を含有する微生物の製造法を得た。
【００２３】
また、この微生物菌体内の油脂を適宜溶媒で抽出しその後分別蒸留などの周知の技術を用いて分離することにより、菌体内油脂よりもさらにジアシルグリセロールが高含量でありトリアシルグリセロールが低含量の油脂を得ることができる。この方法で分離された一方の油脂はトリアシルグリセロールが高含量でありジアシルグリセロールが低濃度の油脂を得ることができる。
従って本発明は、ジアシルグリセロール高含量成る油脂の製造方法、さらに該油脂を配合して成る飲食物、治療用栄養食品及び医薬品を提供する。
【００２４】
従って、本発明は、全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が20重量％より大きい、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸とするジアシルグリセロール含有油脂の製造方法において、当該油脂を産生することが出来る微生物を培養し、所望により当該油脂を採取することを特徴とする方法を提供する。
上記の方法において、好ましくは、全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が30重量％以上であり、更に好ましくは全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が40重量％以上であり、例えば全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が５0重量％以上である。
【００２５】
上記の方法において、好ましくは、前記微生物は、モルティエレラ（Mortierella）属の微生物であり、更に好ましくはモルティエレラ（Mortierella）属モルティエレラ（Mortierella）亜属の微生物であり、例えばモルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）種の微生物である。前記微生物は、好ましくは、高度不飽和脂肪酸を含む油脂を産生することが出来る微生物の変異株である。
【００２６】
本発明はまた、全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が20重量％より大きい、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸とするジアシルグリセロール含有油脂を産生することが出来るモルティエレラ（Mortierella）属微生物、好ましくは全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が30重量％以上である、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸とするジアシルグリセロール含有油脂を産生することが出来るモルティエレラ（Mortierella）属微生物を提供する。前記微生物は、好ましくはモルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）であり、例えば変異株である。
【００２７】
本発明はまた、全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が20重量％より大きい、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸とするジアシルグリセロール含有油脂を含む微生物菌体を提供する。好ましくは、全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率は30重量％以上であり、更に好ましくは全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が40重量％以上であり、例えば全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が５0重量％以上である。上記の記微生物は、好ましくはモルティエレラ（Mortierella）属微生物の微生物菌体であり、例えばモルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）種の微生物の微生物菌体である。菌体は生菌であっても、死菌であってもあるいは乾燥させたものであってもよい。
【００２８】
本発明は更に、全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が20重量％より大きい、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸とするジアシルグリセロール含有油脂であって、当該油脂を生産することが出来る微生物の培養菌体から抽出された油脂を提供する。好ましくは、全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率は30重量％以上であり、更に好ましくは全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が40重量％以上であり、例えば全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が60重量％以上である。上記の抽出は、例えば非極性溶剤又は親水性溶剤を用いて行なわれる。
【００２９】
本発明は更に、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として成る油脂を産生しうる微生物を培養して得たジアシルグリセロールとトリアシルグリセロールを含む菌体から油脂を抽出し蒸留により分別し得た、中性脂質中にジアシルグリセロールが70％以上でトリアシルグリセロールが30％以下の油脂を提供する。
本発明はまた、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として成る油脂を産生しうる微生物を培養して得たジアシルグリセロールとトリアシルグリセロールを含む菌体から油脂を抽出し蒸留により分別し得た、中性脂質中にトリアシルグリセロールが95％以上でジアシルグリセロールが5％以下の油脂を提供する。
【００３０】
本発明の油脂を構成する高度不飽和脂肪酸は、例えば、ジホモ-γ-リノレン酸（20:3 ω6）、アラキドン酸（20:4 ω6）、7,10,13,16-ドコサテトラエン酸（22:4 ω6）、4,7,10,13,16-ドコサペンタエン酸（22:5 ω6）、6,9,12,15-オクタデカテトラエン酸（18:4 ω3）、8,11,14,17-エイコサテトラエン酸（20:4 ω3）、エイコサペンタエン酸（20:5 ω3）、7,10,13,16,19-ドコサペンタエン酸（22:5 ω3）、4,7,10,13,16,19-ドコサヘキサエン酸（22:6 ω3）、6,9-オクタデカジエン酸（18:2 ω9）、8,11-エイコサジエン酸（20:2 ω9）若しくは5,8,11-エイコサトリエン酸（ミード酸：  20:3 ω9）又はこれらの組み合わせである。
【００３１】
本発明はまた、上記の本発明の油脂を含有するもしくは油脂を原料として用いた、もしくは化学修飾した、食品組成物、動物用飼料組成物、ペットフード、化学製品原料、医薬、化粧品組成物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
変異株取得
本発明は、油脂中、具体的には粗油中のジアシルグリセロールが高い高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として成る微生物を培養して該油脂を生産させ、該油脂を精製して得た精製油脂を配合して成る飲食物、治療用栄養食品及び医薬品に関するものである。
【００３３】
したがって、本発明においては、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として成る油脂（ジアシルグリセロール）を産生しうる微生物であればすべて使用することができる。例えば、アラキドン酸を構成脂肪酸として成る油脂（トリグリセリド）の生産能を有する微生物としては、モルティエレラ（Mortierella）属、コニディオボラス（Conidiobolus）属、フィチウム（Pythium）属、フィトフトラ（Phytophthora）属、ペニシリューム（Penicillium）属、クロドスポリューム（Cladosporium）属、ムコール（Mucor）属、フザリューム（Fusarium）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、ロードトルラ（Rhodotorula）属、エントモフトラ（Entomophthora）属、エキノスポランジウム（Echinosporangium）属、サプロレグニア（Saprolegnia）属に属する微生物を挙げることができる。
【００３４】
モルティエレラ（Mortierella）属モルティエレラ（Mortierella）亜属に属する微生物では、例えばモルティエレラ・エロンガタ（Mortierella elongata）、モルティエレラ・エキシグア（Mortierella exigua）、モルティエレラ・フィグロフィラ（Mortierella hygrophila）、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）等を挙げることができる。
【００３５】
具体的にはモルティエレラ・エロンガタ（Mortierella elongata）IFO8570、モルティエレラ・エキシグア（Mortierella exigua）IFO8571、モルティエレラ・フィグロフィラ（Mortierella hygrophila）IFO5941、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等の菌株を挙げることができる。
例えば、DHAを産生しうる微生物として、クリプテコデニウム（Crypthecodenium）属、スラウトキトリウム（Thrautochytrium）属、シゾキトリウム（Schizochytrium）属、ウルケニア（Ulkenia）属、ジャポノキトリウム（Japonochytrium）属又はハリフォトリス（Haliphthoros）属に属する微生物を挙げることもできる。
【００３６】
これらの菌株はいずれも、大阪市の財団法人醗酵研究所（IFO）、及び米国のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection, ATCC）及び、Centrralbureau voor Schimmelcultures（CBS）からなんら制限なく入手することができる。また本発明の研究グループが土壌から分離した菌株モルティエレラ・エロンガタSAM0219（微工研菌寄第8703号）（微工研条寄第1239号）を使用することもできる。
【００３７】
これらのタイプカルチャーに属する菌株、あるいは自然界から分離した菌株をそのまま用いることができるが、増殖及び／又は単離を１回以上行うことによって得られる元の菌株とは性質の異なる自然突然変異を用いることができる。すなわち、これらの脂質生産菌に突然変異処理を施し、選択することにより、ジアシルグリセロールの生成能力の高まった脂質生産菌を選択することもできる。
【００３８】
突然変異処理は、上記の脂質生産菌に適用可能であれば特に限定されるものではないが、放射線（Ｘ線、ガンマー線、中性子線）照射や紫外線照射、高熱処理等を行ったり、また微生物を適当なバッファー中などに懸濁し、変異剤を加えて一定時間インキュベート後、適当に希釈して寒天培地に植菌し、変異株のコロニーを得るといった一般的な突然変異操作を挙げることができる。変異剤としては、ナイトロジェンマスタード、メチルメタンサルホネートやN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（NTG）等にアルキル化剤、5-ブロモウラシル等の塩基類似体、マイトマイシンC等の抗生物質、6-メルカプトプリン等の塩基合成阻害剤、プロフラビン等の色素類、4-ニトロキノリン-N-オキシド等のある種の発がん剤、塩化マンガン、ホルムアルデヒド等の化合物を挙げることができる。また、使用する微生物は、生育菌体（菌糸）でも良いし、胞子でも良い。
【００３９】
突然変異処理した脂質生産菌からジアシルグリセロールの生成能力の高まった脂質生産菌を選択する方法は、特に限定されるものではないが、突然変異処理した脂質生産菌が生成する脂質を液体高速クロマトグラフィーなどで分析することが好ましい。
【００４０】
実施例１に示す通り、変異処理を施した約3,000個の菌株を上記のようにして選択したところ、全中性脂質に対するジアシルグリセロールの比率が20重量％より大きい、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸とするジアシルグリセロール含有油脂を産生する変異体が３株得られた。このことは、変異処理した菌株約1,000株当り、平均１株の目的とする変異株が得られたことを意味する。従って、本発明の変異株が得られる頻度は、一般の変異処理−選択によるランダム選択法の場合に比べて非常に高く、本発明において実際に得た３本の変異株と同等の上記の特性を有する変異株は、本発明の実施例１に記載の方法を反復することにより容易に得ることができる。
【００４１】
モルティエレラ属モルティエレラ亜属に属する微生物は、アラキドン酸を主たる構成脂肪酸として成る油脂（トリアシルグリセロール）を産生しうる微生物として知られているが、本発明者らは、上記菌株に変異処理を施すことによって、ジホモ-γ-リノレン酸を主たる構成脂肪酸としてなる油脂（トリアシルグリセロール）を産生しうる微生物（特開平5-91887）や、ω9系高度不飽和脂肪酸を主たる構成脂肪酸としてなる油脂（トリアシルグリセロール）を産生しうる微生物を（特開平5-91888）得ている。さらに、高濃度の炭素源に耐性を有する微生物（WO98/39468）も得ており、これら微生物は、モルティエレラ属モルティエレラ亜属の微生物であり、これらの菌株を本発明と同様の変異処理を施すことにより、ジホモ-γ-リノレン酸やω9系高度不飽和脂肪酸を主たる構成脂肪酸とするジアシルグリセロールが高含量の油脂を蓄積する微生物を得ることができる。
【００４２】
本発明の油脂は、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として成る油脂を産生しうる微生物を培養し、その培養物から得られる微生物油脂であって、微生物を培養槽で培養することにより、菌体中にジアシルグリセロールを高濃度で含有する油脂を蓄積させその油脂を抽出して得るものである。
【００４３】
具体的には、油脂に対してジアシルグリセロール含量が21重量%以上、好ましくは35重量%以上であり、しかも、ジアシルグリセロール中の総脂肪酸に対する高度不飽和脂肪酸を2%重量%以上、好ましくは9重量%以上含有する油脂である。したがって、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として成る油脂（ジアシルグリセロール）を産生しうる微生物を培養することが必須である。ここでいう微生物としては、炭素数が18以上で二重結合は3以上のω6系高度不飽和脂肪酸、炭素数が18以上で二重結合が2以上のω9系高度不飽和脂肪酸、及び炭素数が18以上で二重結合が3以上のω3系高度不飽和脂肪酸の少なくとも1種の高度不飽和脂肪酸を主にジアシルグリセロールの構成脂肪酸として産生する微生物が望ましい。
【００４４】
そして、炭素数が18以上で二重結合は3以上のω6系高度不飽和脂肪酸としては、γ-リノレン酸（6,9,12-オクタデカトリエン酸）、ジホモ-γ-リノレン酸（8,11,14-エイコサトリエン酸）、アラキドン酸（5,8,11,14-エイコサテトラエン酸）、7,10,13,16-ドコサテトラエン酸（22:4 ω6）及びDPAω6（4,7,10,13,16-ドコサペンタエン酸）を、炭素数が18以上で二重結合が2以上のω9系高度不飽和脂肪酸としては、6,9-オクタデカジエン酸、8,11-エイコサジエン酸、及びミード酸（5,8,11-エイコサトリエン酸）を、炭素数が18以上で二重結合が3以上のω3系高度不飽和脂肪酸として、α-リノレン酸（9,12,15-オクタデカトリエン酸）、6,9,12,15-オクタデカテトラエン酸（18:4ω3）、8,11,14,17-エイコサテトラエン酸（20:4 ω3）、EPA（5,8,11,14,17-エイコサペンタエン酸）、DPAω3（7,10,13,16,19-ドコサペンタエン酸）、及びDHA（4,7,10,13,16,19-ドコサヘキサエン酸）を挙げることができる。
【００４５】
本発明に使用される菌株を培養する為には、その菌株の胞子、菌糸、又は予め培養して得られた種培養液あるいは種培養より回収した菌体を、液体培地に接種し本培養する。液体培地の場合に、炭素源としてはグルコース、フラクトース、キシロース、サッカロース、マルトース、可溶性デンプン、糖蜜、グリセロール、マンニトール、糖化澱粉等の一般的に使用されているものが、いずれも使用できるが、これらに限られるものではない。窒素源としてはペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、カザミノ酸、コーンスティープリカー、大豆タンパク、脱脂ダイズ、綿実カス等の天然窒素源の他に、尿素等の有機窒素源、ならびに硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素源を用いることができる。
【００４６】
大豆から得られる窒素源、具体的には大豆、脱脂大豆、大豆フレーク、食用大豆タンパク、おから、豆乳、きな粉等が挙げられるが、特に、脱脂大豆に熱変性を施したもの、より好ましくは脱脂大豆を約70〜90℃で熱処理し、さらにエタノール可溶成分を除去したものを単独または複数で、あるいは前記窒素源と組み合わせて使用することができる。この他必要に応じて、リン酸イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン以外に、鉄、銅、亜鉛、マンガン、ニッケル、コバルト等の金属イオンやビタミン等を微量栄養源として使用できる。
【００４７】
これらの培地成分は微生物の生育を害しない濃度であれば特に制限はない。実用上、一般に炭素源は総添加量は0.1〜40重量%、好ましくは1〜25重量%、窒素源の総添加量は1〜15重量%、好ましくは2〜10重量%とするのが望ましく、より好ましくは初発の炭素源添加量を1〜5重量%、初発の窒素源添加量を3〜8重量%として、培養途中に炭素源及び窒素源を、さらにより好ましくは炭素源のみを流加して培養する。
【００４８】
なお、高度不飽和脂肪酸の収率を増加せしめるために、高度不飽和脂肪酸の前駆体として、例えば、ヘキサデカン若しくはオクタデカンのごとき炭化水素；オレイン酸若しくはリノール酸のごとき脂肪酸又はその塩、又は脂肪酸エステル、例えばエチルエステル、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル；又はオリーブ油、大豆油、なたね油、綿実油若しくはヤシ油のごとき油脂類を単独で、又は組み合わせて使用できる。基質の添加量は培地に対して0.001〜10%、好ましくは0.5〜10%である。またこれらの基質を唯一の炭素源として培養してもよい。
【００４９】
高度不飽和脂肪酸を産生する微生物の培養温度は使用する微生物によりことなるが、5〜40℃、好ましくは20〜30℃とし、また20〜30℃にて培養して菌体を増殖せしめた後5〜20℃にて培養を続けて高度不飽和脂肪酸を生産せしめることもできる。このような温度管理によっても、生成脂肪酸中の高度不飽和脂肪酸の割合を上昇せしめることができる。種培養では通気攪拌培養、振盪培養、固体培養、又は静置液体培養を、本培養では通気攪拌培養を行う。培養期間は通常2〜30日間、好ましくは5〜20日間、より好ましくは5〜15日間行なう。
【００５０】
例えば、ジアシルグリセロール酸生産菌ＫＹ-1株を、酵母エキス2％、グルコース6％、ｐＨ6.0、4000Lを10ｋL通気攪拌培養操に入れ、温度28℃、通気量1VVM、槽内圧1.0kg/cm2の条件で7日間通気攪拌培養を行い、 培養終了後、殺菌した後、連続式脱水機で湿菌体を回収し、乾燥機で水分含量5wt%まで乾燥し、乾燥菌体を得ることができる。
【００５１】
本発明の油脂は、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸としてなる油脂（ジアシルグリセロール）を産生しうる微生物を培養し、その培養物から得られる微生物油脂であって、培養槽を用いて、培養することにより、菌体に含まれる油脂中のジアシルグリセロール含量を増加させることを最大の特徴としているため、培養培地や培養条件、さらに油脂の抽出精製方法はこれらに限定されるわけではない。
【００５２】
菌体回収油脂抽出
ジアシルグリセロール含量が高い高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として成る油脂を菌体内に蓄積した微生物から、油脂を得る方法として、培養終了後、培養液をそのままかあるいは殺菌、濃縮、酸性化などの処理を施した後、自然沈降、遠心分離および／又は濾過などの常用の固液分離手段により培養菌体を得る。固液分離を助けるために、凝集剤や濾過助剤を添加してもよい。凝集剤としては、例えば、塩化アルミニウム、塩化カルシウム、アルギン酸、キトサンなどを使用できる。濾過助剤としては、例えば、珪藻土を使用できる。培養菌体は好ましくは、水洗、破砕、乾燥する。
【００５３】
乾燥は、凍結乾燥、風乾、流動層乾燥などによって行うことができる。乾燥菌体から粗油を得る手段としては、有機溶剤による抽出法や圧搾法を用いることができるが、好ましくは窒素気流下で有機溶剤によって抽出する。有機溶剤としてはエタノール、ヘキサン、メタノール、エタノール、クロロホルム、ジクロロメタン、石油エーテル、アセトン等を用いることができ、またメタノールと石油エーテルの交互抽出やクロロホルム−メタノール−水の三層系の溶媒も用いることができる。
【００５４】
これらの溶剤の中で、ヘキサンなどの疎水性溶剤を使用して抽出すれば、リン脂質などの極性脂質を抽出することなく、ジアシルグリセロール、トリアシルグリセロールなどの中性脂質を純度高く抽出することができる。得られた抽出油脂は、リン脂質などを除く脱ガム酸工程、遊離脂肪酸などを除く脱酸工程などの精製工程に大きな負荷をかけることなく精製油脂を得ることができる。
【００５５】
さらにエタノールなどの親水性溶剤を使用すれば、リン脂質などの極性脂質は抽出されるものの、ジアシルグリセロールをより選択的に抽出でき、菌体内に存在する中性脂肪中のジアシルグリセロール濃度以上の高濃度のジアシルグリセロール油脂を抽出することができる。たとえば、溶剤にエタノールを使用することにより、中性脂質中にジアシルグリセロール70％以上でトリアシルグリセロールが30％以下を含有する油脂を得ることができる。
【００５６】
さらにこのエタノール抽出残渣を更にヘキサンで抽出することにより、菌体内に存在する中性脂肪中トリアシルグリセロール濃度を高めることが出来る。すなわち、中性脂質中にジアシルグリセロールが10％以下でトリアシルグリセロールが80％以上含む油脂を得ることができる。
また、粗油の取得に用いる抽出法を上記の方法に限定しているわけではなく、菌体内の油脂を効率的に抽出する手法はすべて使用することができる。例えば、超臨界抽出法なども有効な手段として使用することができる。
【００５７】
有機溶剤や超臨界流体で抽出された抽出物から減圧下などの条件下で有機溶剤や超臨界流体成分を除去することにより、目的とする粗油を得ることができる。また、上記の方法に代えて湿菌体を用いて抽出を行うことができる。この場合にはメタノール、エタノール、アセトン等の水に対して相溶性の溶媒、又はこれらと水及び／又は他の溶媒とからなる水に対して相溶性の混合溶媒を使用する。その他の手順は上記と同様である。
【００５８】
本発明で得たジアシルグリセロール含量を増加せしめた高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として成る粗油は、動物飼料に配合して直接使用することができる。しかし、食品への適応を考えた場合、一般の油脂精製工程に供して使用することが望ましい。油脂精製工程として、脱ガム、脱酸、脱臭、脱色、カラム処理、分子蒸留、ウィンタリングなどの常法の工程を用いることができる。
【００５９】
分子蒸留を適当な条件で使用することにより、蒸留出油脂分に、今までにない高純度のジアシルグリセロール含有精製油脂を得ることができる。さらにヘキサン抽出してトリアシルグリセロール濃度が高い油脂をさらに分子蒸留でジアシルグリセロールを蒸留液として除去した油脂はトリグリセリドが90％以上と高含量でジアシルグリセロールが5％以下と非常に少ない油脂として得ることが出来る。
すなわち、高濃度のジアシルグリセロール含有油脂は、さらに様々な抽出精製方法を用いることにより、目的とする用途に合わせて、ジアシルグリセロール、トリアシルグリセロールの純度を任意の油脂を同時に得ることが出来る。
【００６０】
油脂の用途
本発明の油脂（ジアシルグリセロールおよびトリアシルグリセロール）の用途に関しては無限の可能性があり、食品、飲料、動物飼料、ペットフード、化粧品、医薬品の原料並びに添加物として使用することができる。とくに、ジアシルグリセロールは親水性がトリアシルグリセロールより高いことを利用した食品への利用は大きく広がる。
【００６１】
例えば、食品組成物としては、一般食品の他、機能性食品、栄養補助食品、未熟児用調製乳、成熟児用調製乳、乳児用調製乳、乳児用食品、妊産婦食品又は老人用食品等を挙げることができる。油脂を含む食品例として、肉、魚、またはナッツ等の本来油脂を含む天然食品、スープ等の調理時に油脂を加える食品、ドーナッツ等の熱媒体として油脂を用いる食品、バター等の油脂食品、クッキー等の加工時に油脂を加える加工食品、あるいはハードビスケット等の加工仕上げ時に油脂を噴霧または塗布する食品等が挙げられる。さらに、油脂を含まない、農産食品、醗酵食品、畜産食品、水産食品、または飲料に添加することができる。さらに、機能性食品・医薬品の形態であっても構わなく、例えば、経腸栄養剤、粉末、顆粒、トローチ、内服液、懸濁液、乳濁液、シロップ等の加工形態であってもよい。
【実施例】
【００６２】
次に、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。しかし、本発明は、実施例に限定されない。
実施例１. 変異株の作製
モルティエレラ・アルピナ（M.alpina）1S-4をCzapeck寒天培地（0.2% NaNO3、0.1% K2HPO4、0.05% MgSO4・7H2O、0.05% KCl、0.001% FeSO4・7H2O、3% シュークロース、2% 寒天、pH 6.0）300 ml を含む大型スラントビンに植菌し、2週間、28℃で培養することで胞子形成を行った。培養後、大型スラントビンにTween 80を2滴加えた滅菌水50 mlを加えよく振り、4重のガーゼでろ液をろ過した。この操作を2回繰り返し、ろ液を、8,000×g、10分間遠心した。
【００６３】
こうして得られた胞子をトリス・マレイン酸緩衝液（50 mM Tris、50 mM maleate、pH 7.5）で1×106 胞子/ml になるように懸濁した。その後、NTGを用いて変異処理を行った。
NTG 処理した胞子懸濁液を数段階に希釈し、GY寒天培地（1% グルコース、0.5% 酵母エキス、0.005% Triton X-100、1.5% 寒天、pH 6.0）に塗布した。28℃で培養し、コロニーが出現したものからランダムに新しいプレートにピックアップし、28℃で0.5〜1 cmのコロニーを形成後、12℃で2日間培養した。
【００６４】
上記の様にプレートにピックアップした変異株をGY液体培地（グルコース 2%、酵母エキス 1%、pH6.0）４mlを含む試験管（12.3×200mm）で、7日間振とう培養した。得られた菌体の脂質を以下のBligh-Dyer法に従って抽出した。菌体約1 gを乳鉢に入れ、２mlの1% KCl水溶液でよくすりつぶした後、ねじ口試験管に移した。そこに溶媒A（CHCl3/MeOH、2/1、v/v）、を４ml加え、回転撹拌して２層をよく混合させた後、数分間遠心し、下層のCHCl3層を分取した。こうして分取したCHCl3層を遠心エバポレーターで濃縮乾固し、溶媒Aを500μl前後加え、-20℃で保存した。
【００６５】
TLCには、シリカゲルでコートしたプレート（Art 5721、200×200×0.25mm、Merck）を用いた。トリアシルグリセロール(TG)、ジアシルグリセロール(DG)、モノアシルグリセロール(MG)、及び遊離脂肪酸(FFA)を主に分析するため、ヘキサン/ジエチルエーテル/酢酸(70:30:1、v/v)を溶媒展開として用いた。展開後、5% (w/v)エタノール中リンモリブデン酸溶液を噴霧し、120℃で加熱することで各脂質のスポットを検出しその様子が親株と異なっているものを探索した。
【００６６】
その結果、TLCによる一次スクリーニングにおいてトリアシルグリセロール（TG）のスポットが他の脂質成分のスポットより薄い、あるいはジアシルグリセロール（DG）、遊離脂肪酸（FFA）のスポットが濃い株を確認し、この株を蒸発光散乱分析システムを用いてのHPLC分析の結果、ジアシルグリセロールとステロールの含有率がやや高くなっていることが、親株であるスタンダード（1S-4）と比較することで明らかになった。
約3,000個のコロニーを調べた結果、総脂質に占めるジアシルグリセロールの割合が高まった変異株３株（＃１株、＃２株、＃３株）を得た。これらの株のジアシルグリセロールの含有率は31％、28％、22％であった。
【００６７】
【表１】
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【００６８】
実施例２. 実施例１で得た変異株と親株との比較
ジアシルグリセロールの割合が高まった変異株３株（＃１株、＃２株、＃３株）の中でもっともジアシルグリセロール含量が高い＃１株（ＫＹ-1株）を、酵母エキス１％、グルコース0、2、3、4、6％の培地に接種し、往復振盪300rpm、温度28℃の条件にて培養を開始し、7日間培養した。
【００６９】
培養終了時の湿菌体当たりのトリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、ステロールの含量を実施例1の方法で分析し、その結果を表２に示す。モノアシルグリセロールは検出されなかった。グルコース2％での培養で、菌体中のジアシルグリセロールが15.36ｍｇ/ｇと最大となりそのときのジアシルグリセロールの中性脂質に占める割合も34.5％と最大となった。
【００７０】
【表２】
2006022356.tif 000009
【００７１】
比較例として、1Ｓ-4株を、実施例同じ方法で培養し、分析を行なった。結果を表３に示す。
【表３】
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【００７２】
実施例３.
ジアシルグリセロール酸生産菌KY-1株を、GY培地（酵母エキス１％、グルコース2％、ｐＨ6.0）に4mlが入った100mlの三角フラスコに接種し、振盪300rpm、温度28℃の条件にて培養を開始し、4,6,8日間培養した。
培養終了後の菌体は乾燥後菌体重量を測定した。こうして得た菌体は、Bligh-Dyer法で脂質抽出を行った後、液体クロマトグラフーの蒸発光散乱検出器を用いて各脂質成分の定量をおこなった。
結果を表４に示す。モノアシルグリセロールは検出されなかった。培養日数８日目で菌体あたりの総中性質量が最大となり16mg/ｇとなった。培養4、6、8日目のジアシルグリセロールの全中性脂質に占める割合はそれぞれ13％、31.5％、18.1％に達した。
【００７３】
【表４】
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【００７４】
また、培養４日目、6日目及び８日目のトリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、遊離脂肪酸に含まれる脂肪酸組成を分析した結果を表５に示す。アラキドン酸はジアシルグリセロールに8.1〜13.8％含まれていた。
【００７５】
【表５】
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【００７６】
比較例として、1Ｓ-4株を、実施例と同じ方法で培養し分析を行った。結果を表６に示す。培養6日目でジアシルグリセロール蓄積量が2.4ｍｇ/ｇ菌体と最大になり、そのときのジアシルグリセロールの中性脂質に占める割合は5.8％と少なかった。
【００７７】
【表６】
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【００７８】
実施例４. 培養50Lジャーファーメンターによる製造
ジアシルグリセロール酸生産菌KY-1株を、酵母エキス2％及びグルコース2％を含む培地（pH 6.0）30Lを含む50L通気攪拌培養槽に接種し、温度28℃、通気量1VVM、攪拌200RPMの条件で7日間通気攪拌培養を行った。培養2日、3日、4日にグルコース濃度が2％増加するようにグルコースを添加した。培養終了後、98℃、20分の条件で殺菌した後、ろ過して湿菌体を回収し、乾燥機で水分含量5wt%まで乾燥し、乾燥菌体630ｇを得た。この菌体からヘキサンで油脂を抽出し、43ｇの油脂を得た。
この油脂の中性脂質に含まれるジアシルグリセロールは36％でジアシルグリセロールに含まれるアラキドン酸は全脂肪酸の15.2％であった。
【国際調査報告】
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