(57)【要約】  基材上にタンパク質を簡便に効率よく、かつ、簡易に固定化する方法、該タンパク質と相互作用し得る物質の検出を高感度で行う方法、ならびにこれらの方法に用いるタンパク質及びタンパク質固定化基材を提供することを課題とする。  本発明の固定化タンパク質を用いた該タンパク質と相互作用し得る物質の検出法においては、生体分子固定化用基材又は基材上の担体に結合し得る基を有する化合物が結合したタンパク質であって、基材上に固定化されたタンパク質を固定化タンパク質として用いる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
固定化生体分子（ただし、核酸を除く）を用いた該生体分子と相互作用し得る物質の検出法に用いられる固定化される生体分子であって、該生体分子が固定化される生体分子固定化用基材又は基材上の担体に結合し得る基を有する化合物が結合した生体分子。
【請求項２】
前記生体分子固定化用基材又は基材上の担体に結合し得る基を有する化合物が不飽和結合を有する化合物を含むポリマーである請求項１に記載の生体分子。
【請求項３】
前記ポリマーの平均重合度が２以上で１００００００以下である請求項２に記載の生体分子。
【請求項４】
前記ポリマーを構成するモノマーがヌクレオチドである請求項２又は３に記載の生体分子。
【請求項５】
前記生体分子固定化用基材又は基材上の担体に結合し得る基を有する化合物がナイトレン前駆体、カルベン前駆体又はケトン基を有する化合物から選ばれる、少なくとも一つの光反応性基を有する化合物である請求項１に記載の生体分子。
【請求項６】
前記生体分子が、タンパク質、糖、抗原、抗体、ペプチド及び酵素から選ばれる請求項１〜５のいずれか１項に記載の生体分子。
【請求項７】
生体分子固定化用基材と、この基材上に固定化された請求項１〜６のいずれか１項に記載の生体分子とを有する生体分子固定化基材。
【請求項８】
生体分子固定化用基材と請求項１〜６のいずれか１項に記載の生体分子を接触させ、接触部に電磁波を照射することを含む生体分子固定化基材の製造法。
【請求項９】
固定化生体分子を用いた該固定化生体分子と相互作用し得る物質の検出法において、請求項７記載の生体分子固定化基材を用いることを特徴とする固定化生体分子と相互作用し得る物質の検出法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固定化生体分子を用いた該生体分子と相互作用し得る物質の検出に関し、詳しくは、固定化生体分子を用いた該生体分子と相互作用し得る物質の検出法、並びに同方法に用いる生体分子及び生体分子固定化基材に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ハイブリダイゼーションによる核酸の分析や、イムノアッセイ等においては、核酸やタンパク質を膜や平板などの担体に固定化する技術が利用されており、これらの技術の中でタンパク質の固定化法として以下のものが知られている（非特許文献１）。【０００３】
（１）ニトロセルロースメンブレンあるいはポリ−Ｌ−リジン上にタンパク質を物理的に吸着させる方法。
（２）ガラス等の基板表面にアルデヒド基あるいはエポキシ基を導入した基板を作製し、これら官能基とタンパク質のアミノ基を反応させ、固定する方法。
（３）金基板上に二官能チオールアルキレンを用いてタンパク質を固定する方法。【０００４】
しかしながら、（１）の方法では固定反応に物理吸着を利用しているため、タンパク質が基材から剥がれやすく、また、非特異的な吸着により高いバックグラウンドノイズが観測される欠点がある。【０００５】
また、（２）の方法では、共有結合を形成するためタンパク質が基材表面から剥がれる欠点を克服できるが、固定反応を行う場合に有害な還元剤等の試薬を必要とし、また、再現性のあるデータを得るためには熟練の操作を必要とする。【０００６】
さらに、（３）の方法では、金―チオール間の結合が物理吸着であることやチオール基自体の安定性が乏しいことが再現性のある定量的なデータを得ることを困難にしている。【０００７】
また、核酸の固定化法として核酸にヌクレオチドポリマー等を結合させ、紫外線照射等により固定化用基材に結合させる技術が知られている（特許文献１）。
【非特許文献１】Zhu, H. and Snyder, M. (2003) Protein chip technology. Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 55-63.
【特許文献１】特開２００１−２８１２４６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、基材上に生体分子を簡便に効率よく、かつ、簡易に固定化する方法、及び生体分子と相互作用し得る物質の検出を高感度で行う方法、及びこの方法に用いる生体分子及び生体分子固定化基材を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため、検討を行った結果、生体分子に、不飽和結合を有する化合物を含むポリマー又は光反応性基を有する化合物が結合した生体分子が、強固に固定化できること、さらにこのようにして生体分子を基材に固定化したものを用いると、該生体分子と相互作用し得る物質の検出感度を向上できることを見出し、本発明の完成に至った。【００１０】
すなわち本発明は、以下の通りである。
（１）  固定化生体分子（ただし、核酸を除く）を用いた該生体分子と相互作用し得る物質の検出法に用いられる固定化される生体分子であって、該生体分子が固定化される生体分子固定化用基材又は基材上の担体に結合し得る基を有する化合物が結合した生体分子。
（２）  前記生体分子固定化用基材又は基材上の担体に結合し得る基を有する化合物が不飽和結合を有する化合物を含むポリマーである（１）に記載の生体分子。
（３）  前記ポリマーの平均重合度が２以上で１００００００以下である（２）に記載の生体分子。
（４）  前記ポリマーを構成するモノマーがヌクレオチドである（２）又は（３）に記載の生体分子。
（５）  前記生体分子固定化用基材又は基材上の担体に結合し得る基を有する化合物がナイトレン前駆体、カルベン前駆体又はケトン基を有する化合物から選ばれる、少なくとも一つの光反応性基を有する化合物である（１）に記載の生体分子。
（６）  前記生体分子が、タンパク質、糖、抗原、抗体、ペプチド及び酵素から選ばれる（１）〜（５）のいずれかに記載の生体分子。
（７）  生体分子固定化用基材と、この基材上に固定化された（１）〜（６）のいずれかに記載の生体分子とを有する生体分子固定化基材。
（８）  生体分子固定化用基材と（１）〜（６）のいずれかに記載の生体分子を接触させ、接触部に電磁波を照射することを含む生体分子固定化基材の製造法。
（９）  固定化生体分子を用いた該固定化生体分子と相互作用し得る物質の検出法において、（７）記載の生体分子固定化基材を用いることを特徴とする固定化生体分子と相互作用し得る物質の検出法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、安定に基材又は基材上の担体上に固定化できる生体分子が提供される。任意の生体分子に基材又は基材上の担体上に結合し得る基を有する化合物を付加することにより、基材又は基材上の担体上に固定できる任意の生体分子の量を増やすことができるため、検出感度を向上できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
＜１＞生体分子
本発明の生体分子は、生体分子固定化用基材又は基材上の担体上に結合し得る基を有する化合物が結合した生体分子である。生体分子としては、タンパク質、糖、抗原、抗体、ペプチド及び酵素等が挙げられる。【００１３】
以下、生体分子としてタンパク質を例として説明するが、生体分子固定化用基材又は基材上の担体上に結合し得る基を有する化合物を結合させること以外は、他の物質でも通常固定化に用いられている方法や条件を採用して本発明を実施することができる。【００１４】
本発明のタンパク質は、生体分子固定化用基材又は基材上の担体上に結合し得る基を有する化合物が結合していること以外は、通常の固定化（固相化）タンパク質を用いた固定化タンパク質と相互作用し得る物質の検出法（例えば、イムノアッセイ等）等に用いられる固定化タンパク質と特に変わることは無く、タンパク質と相互作用し得る物質との結合が可能なタンパク質であれば特に制限されず、例えば、天然又は合成のタンパク質が挙げられる。また、タンパク質の大きさは、タンパク質と相互作用し得る物質との結合が可能な大きさであれば特に制限されない。【００１５】
タンパク質において、生体分子固定化用基材又は基材上の担体上に結合し得る基を有する化合物が結合する部分は、タンパク質のアミノ末端又はカルボキシ末端、側鎖アミノ基、側鎖カルボキシキル基、側鎖チオール基、側鎖アルコール基等の部分である。【００１６】
タンパク質に生体分子固定化用基材又は基材上の担体上に結合し得る基を有する化合物を結合させる方法としては、公知の方法を用いることができる。このような方法としては、例えば、市販のクロスリンク試薬を用いてタンパク質に該化合物を結合させる方法やタンパク質が有する官能基と該官能基と反応性を有する原子、官能基又は構造とを反応させることによりタンパク質に該化合物を結合させる方法を挙げることができる。【００１７】
クロスリンク試薬を用いてタンパク質に生体分子固定化用基材又は基材上の担体上に結合し得る基を有する化合物を結合させる方法としては、例えば、以下の方法等が挙げられる。市販されているペプチド合成機を用いて、目的とするペプチドを合成する。ポリマーを構成する化合物として、市販されている核酸合成機を用いて、アデニン、シトシン、チミン、ウラシル等の核酸塩基を有するヌクレオチドから選ばれる１種又は２種以上が少なくとも２塩基以上重合したヌクレオチドを合成し、市販のアミノ基導入試薬を用いてアミノ基を導入する。前記ペプチドとアミノ基が導入されたヌクレオチドを、市販のクロスリンク試薬（例えば、DSS（Disuccinimidyl suberate）等）を用いて、常法に従って結合させる。【００１８】
また、糖に生体分子固定化用基材又は基材上の担体上に結合し得る基を有する化合物を結合させる方法としては、例えば、以下の方法等が挙げられる。グルコースの６位の水酸基をトリチル基で保護した後、残りの水酸基をアセチル化し、６位にアジド基を導入した後、アミノ基に変換する。次いで、アミノ化グルコースにDSSを大過剰量加え、精製する。次いで、例えば、上記のように合成した５'末端あるいは３'末端アミノ基が導入されたポリデオキシアデニル酸、ポリデオキシシチジル酸、ポリデオキシチミジル酸、ポリデオキシウリジル酸等のヌクレオチド又はこれらの複合ポリマーを、上記アミノ化グルコースのスクシニミジル基に反応させる。ナトリウムメトキシドを用いて脱アセチル化を行い、ポリマーが導入されたグルコースを合成する。【００１９】
タンパク質が有する官能基と反応性を有する原子、官能基又は構造として、具体的には、以下のものを挙げることができる。アミノ基と反応する原子、官能基又は構造としては、イソチオシアネート基、スクシンイミドエステル、スルホニルスクシンイミドエステル等に含まれるイミドエステル基、ハロゲン化スルホニル基、ハロゲン化アルキル等に含まれるハロゲン、イソシアネート基、窒素イペリット等に含まれるハロゲン化アルキル基、プラチナ錯体、カルボジイミド基、アルデヒド基、アジド基、オキシイミノ-フェニルアセトニトリル等に含まれるシアノ基、ジメチルチオピリミジン等に含まれるメチルチオ基、ジカルボナート等に含まれるジエステル基等；
カルボキシル基と反応する原子、官能基又は構造としては、ジアゾアルカン等に含まれるジアゾ基、ハロゲン化アルキル等に含まれるハロゲン、トリフルオロメタンスルホネート等に含まれるスルホニル基、カルボジイミド基、ヒドラジン等に含まれるヒドラジノ基、フェナシルエステル等に含まれるフェナシル基、４−スルホ−２，３，５，６−テトラフルオロフェノール等に含まれる水酸基、アルキルトリフルオロメタンスルホネート等；
チオール基と反応する原子、官能基又は構造としては、ヨードアセトアミド等に含まれるヨウ素、マレインイミド等に含まれるイミド基、アルキルハライド等に含まれるハロゲン、アジリジン等に含まれるアジリジノ基、エポキシ基、シンメトリックジサルファイド等に含まれるジスルフィド基、ビニルスルホン等に含まれるビニル基、ブロモピルビン酸等に含まれる臭素等；
アルコール基と反応する原子、官能基又は構造としては、２−オキソニトリル、酸クロライド、イソシアネート基等を挙げることができる。【００２０】
タンパク質が有する官能基と該官能基と反応性を有する原子、官能基又は構造とを反応させることによりタンパク質に該化合物を結合させる方法として、例えば、以下の方法等が挙げられる。炭酸セシウム、ナトリウム、カルボジイミド、塩化チオニル等を用いて、タンパク質中のカルボキシル基を活性化した後に、生体分子固定化用基材又は基材上の担体上に結合し得る基を有する化合物中のハロゲン又はアミノ基を常法に従って反応させる。【００２１】
さらに、本発明のタンパク質としては、生体分子固定化用基材又は基材上の担体上に結合し得る基を有する化合物、すなわち、不飽和結合を有する化合物を含むポリマーあるいは光反応性基を有する化合物を結合させたアミノ酸を、基材又は基材上の担体上に予め後に記載する電磁波を照射すること等により固定して、さらに、Spot synthesis法(Heine N, Germeroth L, Schneider-Mergener J, Wenschuh H: A modular approach to the spot synthesis of 1,2,5-trisubstituted hybridizations on cellulose membranes. Tetrahedron Lett 2001, 42:227-230.)、フォトリソグラフィー技術（Fodor SPA, Read JL, Pirrung LC, Stryer L, Lu AT, Solas D: Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis. Science 1991, 251:767-773.）やFmoc法（Hasegawa K, Sha YL, Bang JK, Kawakami T, Akaji K, Aimoto S: Preparation of phosphopeptide thioesters by Fmoc- and Fmoc(2-F)-solid phase synthesis. Lett Pept Sci 2002, 8:277-284.）等を用いて、基材又は基材上の担体上に固定したアミノ酸に新たに複数の任意のアミノ酸を結合（伸長）させることもできる。【００２２】
生体分子固定化用基材又は基材上の担体上に結合し得る基を有する化合物における、基材又は基材上の担体上に結合し得る基とは、基材又は基材上の担体と反応性を有し、共有結合等の強固な結合を形成するものであれば特に制限されない。基材又は基材上の担体上に結合し得る基は、化合物中に、タンパク質がタンパク質固定化用基材に固定化されるのに十分に含まれていればよく、一つ又は複数であってよい。このような生体分子固定化用基材又は基材上の担体上に結合し得る基を有する化合物としては、例えば、不飽和結合を有する化合物を含むポリマー、光反応性基を有する化合物等を挙げることができる。【００２３】
不飽和結合を有する化合物を含むポリマーとは、ポリマーを構成するモノマーの少なくとも一つが不飽和結合を有する化合物を含むポリマーを意味する。不飽和結合を有する化合物は、タンパク質がタンパク質固定化用基材に固定化されるのに十分に含まれていればよい。また、ポリマーを構成するモノマーの全てが不飽和結合を有する化合物であってもよい。なお、「不飽和結合を有する化合物を含む」とは、不飽和結合を含む化合物の残基からなる又は該残基を含むことを意味する。【００２４】
ポリマーの長さとしては、その平均重合度が２〜１００００００であることが好ましく、５〜１０００００であることがより好ましく、７〜１０００であることが特に好ましい。【００２５】
この平均重合度が１以下であると、十分な量のタンパク質を担体上に固定できないことがあり、また、重合度が１０００００１以上であると、立体障害のため標的分子がタンパク質に接近できず、測定を妨げることがある。【００２６】
ポリマーとしては、具体的には、アデニン、アデニン誘導体、シトシン、シトシン誘導体、グアニン、グアニン誘導体、チミン、チミン誘導体、ウラシル、ウラシル誘導体を塩基として有するヌクレオチド、アクリル酸又はメタクリル酸のエステル系モノマー、スチレン系モノマー、ポリオレフィン系モノマー、ビニル系モノマー、ニトリル系モノマー、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、テトラエチレングリコールジアクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、テトラメチロールプロパンテトラアクリレート、ジペンタエリスリトールペンタアクリレート等から選ばれるモノマーが含まれるポリマーが挙げられ、ポリマー中の上記モノマーの種類は同一又は異なってもよい。好ましいモノマーはヌクレオチドであり、特に好ましいモノマーはアデニンを塩基として有するヌクレオチド、シトシンを塩基として有するヌクレオチド、チミンを塩基として有するヌクレオチド、ウラシルを塩基として有するヌクレオチドである。【００２７】
光反応性基を有する化合物において光反応性基とは、光を照射することにより、基材又は基材上の担体と高い反応性を有する基を生じる基を意味する。【００２８】
光反応性基を有する化合物としては、一分子又は光反応性基を有する化合物を含むポリマーであってもよい。光反応性基を有する化合物を含むポリマーとは、ポリマーを構成するモノマーの少なくとも一つが光反応性基を有する化合物を含むポリマーを意味する。光反応性基を有する化合物は、タンパク質がタンパク質固定化用基材に固定化されるのに十分に含まれていればよい。また、ポリマーを構成するモノマーの全てが光反応性基を有する化合物であってもよい。【００２９】
光反応性基としては、具体的には、ナイトレン前駆体、カルベン前駆体又はケトン基等が挙げられる。ここで前駆体とは、ナイトレン、カルベン等の活性種を発生し得る基を意味する。光反応性基を有する化合物は、各種光反応性基のうちの任意の１又は２以上の光反応性基を含むものである。光反応性基を有する化合物としては、具体的には、アリルケトン、アジド又はジアゾ化合物等を挙げることができる。【００３０】
生体分子固定化用基材又は基材上の担体上に結合し得る基を有する化合物には、固定化した生体分子が標的分子と立体的に十分に接近できるように固定化する生体分子と基材表面の距離を適切に保つために、スペーサー化合物を導入してもよい。このスペーサー化合物としては、生体分子及び光生体分子固定化用基材又は基材上の担体上に結合し得る基を有する化合物と結合し得る非光反応性原子、官能基又は構造を有する化合物を用いることができる。非光反応性原子、官能基又は構造を有する化合物としては、例えば、アルキル基、シクロアルキル基、ハロゲン、ヒドロキシル基、エーテル基（ハロエーテル基を含む）、アルデヒド基、カルボニル基、エステル基、アミド基、イミド基、カルボキシル基、スルホニル基、ホスホニル基、ニトロ基、アミノ基、チオール基等から選ばれる任意の原子、官能基又は構造を２以上含む化合物であれば特に制限されない。【００３１】
なお、生体分子固定化用基材又は基材上の担体上に結合し得る基を有する化合物としては、上記した光反応性基を有する化合物と不飽和結合を有する化合物を含むポリマーを含むものであってもよい。【００３２】
本発明の生体分子には、生体分子固定化用基材又は基材上の担体上に結合し得る基を有する化合物とともに、さらにビニル化デオキシグアノシン、ビニル化デオキシグアノシン誘導体、ソラレン、ソラレン誘導体（4'5'-ジヒドロソラレン、4,5'8-トリメチルソラレン、アンゲリシン等）等の光架橋剤を導入してもよく、このような光架橋剤を用いて生体分子を三次元的に固相担体上に固定することもできる。【００３３】
＜２＞タンパク質固定化用基材
本発明のタンパク質固定化用基材に用いる基材は、タンパク質固定化用基材又は基材上の担体上に結合し得る基を有する化合物と反応性を有し、化学結合によってこれらの化合物が結合したタンパク質を固定化することができ、通常の固定化タンパク質を用いた固定化タンパク質と相互作用し得る物質の検出法等の条件に耐えうるものであれば特に制限されない。具体的には、タンパク質の固定及び固定化タンパク質と相互作用し得る物質の検出法等に用いる溶剤に不溶であり、かつ常温若しくはその付近の温度範囲内（例えば０〜１００℃）で固体又はゲル状であるものが挙げられる。尚、基材が溶剤に不溶性であるとは、基材に後述のようにしてカルボジイミド基等のタンパク質に結合性を有する基を有する担体が担持され、次いでタンパク質が固定化され、その後、例えば、プロテインチップ等として使用される際の各過程で用いられる水性溶剤、有機溶剤等の各種溶剤に実質的に不溶性であることをいう。【００３４】
このような基材の材質として、具体的には、プラスチック、無機高分子、金属、セラミック等が挙げられる。【００３５】
上記プラスチックとして具体的には合成樹脂（熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂、共重合体等）及び天然樹脂を挙げることができる。【００３６】
より具体的に、熱可塑性樹脂としては、ポリカルボジイミド、アイオノマー（スチレン系、オレフィン系）、ポリノルボルネン、ポリアセタール、ポリアリレート、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエチレンオキサイド、ポリオキシメチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリパラメチルスチレン、ポリアリルアミン、ポリフェニレンエーテル、ポリフェニレンサルファイド、ポリブタジエン、ポリブチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、ポリエーテルスルホン、ポリフェニレンスルフィド、ポリオキシベンゾイル、ポリオキシエチレン、酢酸セルロース、ポリジメチルシロキサン、ポリイソブチレン、セルローストリアセテート、ポリ−ｐ−フェニレンテレフタラミド、ポリイソプレン、ポリアクリロニトリル、ポリメチルペンテン、塩素プラスチック（ポリ塩化ビニル、ポリ塩化エチレン、塩素化ポリプロピレン、ポリ塩化ビニリデン）、フッ素プラスチック（テトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン）、ニトロセルロース、ポリアミド（ナイロン6、ナイロン66）、ポリアミドイミド、ポリイミド（熱可塑性ポリイミド、ポリエーテルイミド）、ポリエチレンプラスチック（塩素化、高密度、低密度）、ポリビニルプラスチック（ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリパラビニルフェノール、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルブチラール、ポリビニルホルマール）、液晶ポリマ−（ポリエステル系液晶高分子）、アクリレートプラスチック（アミノポリアクリルアミド、ポリアクリルアミド、ポリメチルメタクリレート、エチルポリメタクリレート、ブチルポリメタクリレート）、熱可塑性エラストマー（スチレン系、オレフィン系、ウレタン系、ポリエステル系、ポリアミド系、1，2−ポリブタジエン系、塩化ビニル系、フッ素系、ポリアイオノマー系、塩素化ポリエチレン系、シリコーン系）等を挙げることができる。【００３７】
より具体的に、熱硬化性プラスチックとしては、エポキシ、ポリキシレン、ポリグアナミン、ポリジアリルフタレート、ポリビニルエステル、ポリフェノール、不飽和ポリエステル、ポリフラン、ポリイミド、ポリウレタン、ポリマレイン酸、メラミン、ユリア、アルキド、ベンゾグアナミン、ポリシアナート、ポリイソシアナート等を挙げることができる。【００３８】
また、プラスチックとしては、共重合体を用いることもでき、より具体的に、共重合体としては、イソブチレン無水マレイン酸共重合体、アクリロニトリルアクリレートスチレン共重合体、アクリロニトリルEPDMスチレン共重合体、アクリロニトリルスチレン共重合、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、ブタジエンスチレンメチルメタクリレート共重合体、エチレン塩化ビニル共重合体、エチレン酢酸ビニル共重合体、エチレン−エチルアクリレート共重合体、アクリロニトリル−ブタジエンスチレン共重合体、ポリエーテルエーテルケトン共重合体、フッ化エチレンポリプロピレン共重合体、テトラフルオロエチレンパーフロロアルキルビニルエーテル共重合体、テトラフルオロエチレンエチレン共重合体等を挙げることができる。【００３９】
さらに、より具体的に、天然樹脂としては、セルロース、ロジン、コーバル、ダンマル、カナダバルサム、エレミ、サンダラック、グッタベルカ、ウルシ、シュラック、コハク、じん皮繊維、葉脈繊維、果実繊維、獣毛繊維、繭繊維、羽毛繊維、キチン、キトサン、石綿、アスベスト及びこれらの誘導体等を挙げることができる。【００４０】
また、上記合成樹脂に、染料、発色剤、可塑剤、顔料、重合禁止剤、表面改質剤、安定剤、密着性付与剤、熱硬化剤、分散剤、紫外線劣化防止剤等を必要に応じて添加した合成樹脂を用いることができる。さらに、前記合成樹脂としては、形状を保持するために異なる種類の前記合成樹脂を積層させていてもよく、単一合成樹脂であってもよい。また、前記合成樹脂を２種類以上混合したポリマーアロイであってもよい。【００４１】
また、無機高分子として具体的には、ガラス、水晶、カーボン、シリカゲル及びグラファイト等が挙げられる。【００４２】
また、金属として好ましくは、周期律表第２周期〜第７周期のI、II、III、IV、V、VI、VII、VIII族および遷移元素から選ばれる金属、又は同金属を含む合金が挙げられる。【００４３】
上記周期律表第２周期〜第７周期のI、II、III、IV、V、VI、VII、VIII族および遷移元素から選ばれる金属として特に好ましいものとしては、アルミニウム、チタン、白金、タングステン、モリブデン、金、銅、ニッケル等が挙げられる。【００４４】
また、上記合金として具体的には、洋白（成分：Cu, Ni, Zn）、真鍮（成分：Cu, Zn）、ブロンズ（成分：Cu, Be）、モネル（成分：Cu, Ni, Fe, Mn）、ニッケルコバルト合金（成分：Ni, Co）、ニッケルクロム合金（成分：Ni, Cr）、コバルト合金（成分：Co, Ni, Cr）、ステンレス（成分：Ni, Cr, Fe）、銀タングステン（成分：Ag, W）、bチタン（成分：Ti, V, Al）、abチタン（成分：Ti, V, Al）、NT合金（成分：Ti, Ni）、アルミニウム合金（成分：Al, Cu, Mg, Si, Mn, Zn）、ジュラルミン（成分：Al, Cu, Si, Fe, Mn, Mg, Zn）、マグネシウム合金（成分：Mg, Al, Zn）、K24（成分：Au）、K18（成分：Au, Ag, Cu）、ベリリウム銅（成分：Cu, Be）、鋳鉄（成分：Fe, Mn, S, C）、炭素鋼（成分：Fe, C, Si, Mn, P, S）、青銅鋳物（成分：Cu, Sn, Zn, Pb）、りん青銅鋳物（成分：Cu, Zn, P）、黄銅鋳物（成分：Cu, Zn, Pb）、マンガン黄銅（成分：Cu, Zn, Mn, Fe,Al）、シルジン青銅鋳物（成分：Cu, Si, Zn）、アルミニウム青銅鋳物（成分：Cu, Al,Fe, Ni, Mn）、エリンバー（成分：Ni, Cr, Mn）、エリンバーエクストラ（成分：Ni, Cr, Co, Mn）、インバー（成分：Ni, Fe）、スーパーインバー（成分：Fe, Ni, Co）、ステンレスインバー（成分：Fe, Co, Cr）、Malottes（成分：Sn, Bi, Pb）、リポウィッツ（Lipowitz）（成分：Sn, Bi, Pb, Cd）、ウッズ（Wood's）（成分：Sn, Bi, Pb, Cd）、マンガニン（成分：Cu, Mn, Ni, Fe）、イザベリン（成分：Cu, Mn, Al）、コンスタンタン（成分：Cu, Ni）、アルクレス（成分：Fe, Cr, Al）、カンタル（成分：Cr, Fe, Al, Co）、アルメル（成分：Ni, Al）、磁性材料（Fe, Ni, Co等強磁性遷移元素を含む材料）、パーマロイ（成分：Fe, Ni）、アルパーム（成分：Fe, Al）、フェライト（Fe2O3を主成分とする複合酸化物）、センダスト（成分：Fe, Si, Al）、スーパーセンダスト（成分：Fe, Si, Al, Ni,）、アルニコ（成分：Fe, Al, Ni, Co）、水素吸蔵金属（ランタンニッケル合金（成分：La, Ni）等）、Co-Cr系合金、SnO2系酸化物、Nb-Ti合金、制振合金（振動を低減もしくは吸収、振動の伝播を遮断する合金材料、Al-Zn超塑性合金、サイレントアロイ、ニチノール等）、電極用材料、半導体材料（シリコン、ゲルマニウム、カリウムヒ素等）等が挙げられる。【００４５】
また、前記金属は、他の金属で蒸着又はメッキ処理（加工）されていてもよい。さらに、前記金属は、形状を保持するために異なる種類の前記金属を積層させていてもよく、単一金属であってもよい。【００４６】
本発明における基材として上記金属を用いる場合、基材が金属のみから構成されていてもよいし、非金属材料上に金属が接着、蒸着又はメッキ等により積層されていてもよい。【００４７】
また、セラミックとして具体的には、アパタイト、アルミナ、シリカ、炭化ケイ素、窒化ケイ素及び炭化ホウ素等が挙げられる。【００４８】
上記基材の形状は、特に問われないが、箔（フォイル）状、平板（プレート）状、薄片（ウェーハ）状、フィルター状、ビーズ状等が挙げられる。また、マイクロタイタープレートのような形状であってもよい。さらに、得られる結果の保存を容易にするため、平板等の裏面をシール等に使用できる材料（接着剤等）を塗布、コート等をすることによって、シールとしても使用することもできる。また、それらの大きさについては、特に制限は無い。【００４９】
上記基材にタンパク質を固定化するに当たって、基材にタンパク質を直接固定化してもよく、担体を基材に担持させて、担体を介してタンパク質を基材に固定化してもよい。担体としては、前述のタンパク質固定化用基材又は基材上の担体上に結合し得る基を有する化合物に結合性を有するものが使用できる。ここで、「担持」とは、担体にタンパク質を固定化する際やタンパク質固定化基材をプロテインチップ等として使用する際等に用いられる水溶性溶剤、有機溶剤等の各種溶剤中で、基材から上記担体が実質的に脱離しないことを意味する。【００５０】
本発明に用いられる上記担体は、上記基材上に担持される限り、単に物理的な接着性を利用して担持されていてもよく、また、化学的に共有結合等を介して担持されていてもよい。また、上記担体は、必要に応じ、基材上の全面において担持されても、また、その一部において担持されてもよい。【００５１】
担体としては、有機低分子、プラスチック、無機高分子、金属、セラミック等が挙げられる。【００５２】
上記有機低分子として具体的には、ポリリジン、３−アミノトリエトキシアミノシラン、３−アミノトリメトキシアミノシラン等の一級アミノ基を有するシランカップリング剤、マレインイミド、スクシンイミドエステル等のイミド基含有化合物、カルボジイミド基含有化合物、イソシアネート基含有化合物、イソチオシアネート基含有化合物、窒素イペリット基含有化合物、アルデヒド基含有化合物、アミノ基含有化合物、カルボキシル基含有化合物、ハロゲン含有化合物等が挙げられる。【００５３】
また、プラスチックとして具体的には、基材材料として上記したような合成樹脂（熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂、共重合体等）及び天然樹脂を用いることができる。【００５４】
また、無機高分子として具体的には、ガラス、水晶、カーボン、シリカゲル及びグラファイト等が挙げられる。【００５５】
また、金属として好ましくは、基材材料として上記したような周期律表第２周期〜第７周期のI、II、III、IV、V、VI、VII、VIII族および遷移元素から選ばれる金属、又は同金属を含む合金を用いることができる。【００５６】
上記周期律表第２周期〜第７周期のI、II、III、IV、V、VI、VII、VIII族および遷移元素から選ばれる金属として特に好ましいものとしては、アルミニウム、チタン、白金、タングステン、モリブデン、金、銅、ニッケル等が挙げられる。【００５７】
また、セラミックとして具体的には、アパタイト、アルミナ、シリカ、炭化ケイ素、窒化ケイ素及び炭化ホウ素等が挙げられる。【００５８】
このような担体は、上記基材に対して高い接着性を有するものであり、この接着性を利用して基材に担持されるものである。尚、前記担体が基材上に物理的な接着性を利用して担持される際の代表的な形態は皮膜である。【００５９】
前記基材上に前記担体を皮膜で担持させる方法としては、スプレー、浸漬、ブラッシング、スタンプ、蒸着、フィルムコータを用いたコーティング等の公知の方法を用いることができる。【００６０】
例えば、ガラス基材の表面全体にカルボジイミド基（樹脂）を導入する方法については、まず、３−アミノプロピルトリエトキシシラン等のアミノ置換オルガノアルコキシシランを適当な溶媒に溶解して得られた溶液に７０〜８０℃程度の温度条件下でガラス基材を概ね２〜３時間程度浸漬した後、これを取り出して水洗し、さらに、１００〜１２０℃程度で約４〜５時間加熱乾燥する。乾燥後、適当な溶媒中に浸し、カルボジイミド樹脂を加え３０〜１７０℃程度の温度条件下で１２時間程度攪拌し、洗浄すればよい。また、上記３−アミノプロピルトリエトキシシランのアミノ基と窒素イペリット基のタンパク質結合基以外の官能基を適当な溶媒を用いて反応させ、ガラス基材の表面に窒素イペリット基を導入することもできる。【００６１】
また、ガラス基材にアミノ基以外の官能基を導入する場合や、基材がガラス以外の材料からなる場合においても、上記基材の説明で挙げた各種材料表面に種々の官能基を導入することは、従来より一般的に行われていることであり、その方法も公知であるので、このような公知の方法を用いて基材表面への官能基の導入を行うことができる。【００６２】
さらに、上記で挙げた基材のプラスチック基材の中には、基材表面に既に上記のような官能基を有するものも有り、この場合には基材表面に官能基を導入することなしに、これをそのまま担体の製造に用いることも可能である。また、このようなプラスチック基材であってもさらに官能基を導入して上記担体の製造に用いることも可能である。【００６３】
また、上記担体又は基材、あるいは担体及び基材の材料に公知の光重合開始剤を混合することもできる。光重合開始剤を混合することによって、紫外線等の電磁波の照射によるタンパク質の固定化の際の反応性が向上し得る。【００６４】
＜３＞タンパク質固定化基材
上記担体の所定の位置に、タンパク質の溶液をスポットする。タンパク質としては、上記＜１＞で挙げたタンパク質が特に制限無く挙げられる。【００６５】
タンパク質を溶解する溶媒も特に制限されず、蒸留水、又は通常タンパク質溶液の調製に用いられる緩衝液、例えばTris緩衝液、PBS緩衝液（137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, 8.1 mM Na2HPO4）、リン酸を含む水溶液、食塩を含む水溶液等の他、カルボキシル基、スルホニル基、ホスホニル基を含む化合物から選ばれるアニオンと、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、オニウムイオンから選ばれるカチオンとを含む溶媒を用いることができる。同アニオンとカチオンとを含む溶媒を用いることにより、電磁波を用いてより効率よくタンパク質を担体に固定化することができる。同アニオンとカチオンとを含む溶媒として、具体的には、例えば、カルボン酸塩を含む水溶液（クエン酸ナトリウム、クエン酸アンモニウム、酢酸ナトリウム等）、スルホン酸塩を含む水溶液（ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸アンモニウム等）、ホスホン酸塩を含む水溶液等（リン酸ナトリウム、リン酸アンモニウム等）等を挙げることができる。また、タンパク質溶液の濃度も特に制限されないが、通常1 mmol/μl〜1 fmol/μl、好ましくは100 μmol/μl〜100 fmol/μlの濃度である。【００６６】
タンパク質溶液を担体上にスポットする方法としては、ピペットでタンパク質溶液を担体上に滴下する方法、又は市販のスポッタを用いる方法等が挙げられる。スポットの形状及びスポット量としては、タンパク質溶液をスポットした位置を把握することができる程度であれば、特に制限されないが、形状としては点状又は円状が好ましい。また、好ましいスポット量は10nl〜10mlである。タンパク質溶液は、担体上に１箇所又は複数箇所にスポットされる。スポットされるタンパク質溶液は、１種類でも２種類又はそれ以上であってもよい。尚、担体にタンパク質が固定されたことを示す陽性コントロールとして、標識したタンパク質を固定化しておいてもよい。【００６７】
タンパク質溶液を担体上にスポットした後に、電磁波、好ましくは紫外線を照射する。また、前記タンパク質溶液をスポット後紫外線照射前に乾燥させることができる。前記タンパク質溶液の乾燥方法としては、自然に乾燥させてもよく、加熱して乾燥させてもよい。加熱する場合の温度は、通常３０〜１００℃、好ましくは３５〜４５℃である。【００６８】
不飽和結合を有する化合物を用いてタンパク質を固定化する場合、担体、少なくとも担体のタンパク質を固定した部位に照射する紫外線としては、波長240〜380nmの成分を含む紫外線等を好ましく挙げることができる。具体的には、波長254nm又は335nmを含むブロードな波形を有する紫外線であっても良い。照射量は、累積照射量として通常20〜2400mJ/cm2、好ましくは50〜900mJ/cm2である。【００６９】
光架橋剤及び／又は光反応性基を有する化合物を用いてタンパク質を固定化する場合、担体、少なくとも担体のタンパク質を固定した部位に照射する紫外線の波長、照射量等は用いる光架橋剤及び／又は光反応性基を有する化合物に応じて、適宜決定することができる。【００７０】
本発明のタンパク質固定化用基材は、これを用いて分析等を行う際に、上記固定化タンパク質以外のタンパク質等を接触させる機会が多いが、基材又は基材上の担体に担持された未反応タンパク質固定部分に上記固定化タンパク質以外のタンパク質等が非特異的に結合することを防ぐため、上記のようにして点状にタンパク質を基材又は基材上の担体に固定化した後に、過剰量のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン等を基材又は基材上の担体に接触させ、未反応タンパク質固定部分をブロックしておくことが好ましい。【００７１】
本発明のタンパク質固定化基材を用いた検出法により検出される物質は、前記タンパク質固定化用基材上に固定化された固定化タンパク質と相互作用し得る物質であれば特に制限されない。なお、「相互作用」とは、固定化タンパク質とある物質間において、共有結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス結合及び静電気による結合等により生じる分子間における作用であり、特に限定されない。【００７２】
このようにして得られる本発明のタンパク質固定化基材は、前記タンパク質が担体に非常に強固に担持されたものであり、固定化タンパク質を用いた固定化タンパク質と相互作用し得る物質の検出法（例えば、イムノアッセイ等）等で広く使用されている洗浄方法（界面活性剤を用いた洗浄方法等）によっても脱離することがなく、これを用いて分析等を行った場合、再現性及び定量性に優れた分析が可能となる。また、本発明のタンパク質固定化基材は、タンパク質が、大きさや種類に制限されずに固定され得るので、同一基材上で種々のタンパク質を同時に取り扱うことができる。【００７３】
これらのことから、本発明のタンパク質固定化基材は、プロテインチップ（プロテインマイクロアレイ）等に優れた性能を持って適用可能であるといえる。
【実施例１】
【００７４】
＜クエン酸二アンモニウム水溶液を溶媒としたペプチド溶液の担体への固定化、ペプチド固定化担体の抗体反応による評価＞
常法に従い、ペプチド合成機を用いて、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチド（７残基）を合成した。さらに、配列番号２で示すチロシンをリン酸化したペプチド（７残基）も合成した。なお、ペプチド合成の詳細については、ペプチド合成の基礎と実験（丸善株式会社）を参照した。次いで、配列番号３に示すオリゴヌクレオチド（１０残基）の５'末端にアミノ基を導入したオリゴヌクレオチドを定法に従い合成した。【００７５】
上記合成ペプチド及び上記オリゴヌクレオチドを等モルずつリン酸バッファー（ｐH7.5）に溶解し、１０倍モルのDSS(ピアス社製)を加えて、３７℃にて２時間インキュベートした。次いで、NAP5カラム（アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いて精製・濃縮し、45mMクエン酸二アンモニウム水溶液に溶解してペプチド溶液（1 pmol/μl）を調製した。【００７６】
担体上の所定の位置に、前記ペプチド溶液をスポットした。スポット量は、それぞれ0.5μlであり、スポット径の大きさは直径1mmであった。次いで、Uvstratalinker 2400(ストラタジーン社製，中心波長254nm)を用い、紫外線を16cmの距離から、600mJ/cm2照射した。照射時間は240秒であった。その後、前記担体を水中で30分間振とうし、洗浄した後に乾燥させた。【００７７】
一方、コントロールとしてペプチドを含まない溶液（クエン酸二ナトリウム水溶液）も同様に担体にスポットし、前述のような固定化の操作を行った。【００７８】
担体として、カルボジイミド基を有する高分子化合物で処理したガラス基材を用いた。【００７９】
上記担体の試料固定部分に、ローダミン標識抗リン酸化アミノ酸抗体を含む溶液(1μg/100μl 抗体, 1×PBS, 0.2% Tween 20, 1% BSA)を載せ、５時間インキュベートした。ローダミン標識抗リン酸化アミノ酸抗体は、ローダミンNHS(モレキュラープローブス社製)を用いて０．１M NaHCO3（pH 9）中でローダミンを抗リン酸化アミノ酸抗体（コスモバイオ社製）に導入したものを用いた。次いで、上記担体を滅菌水で洗浄し、ScanArray 4000（GSI社製）を用いて蛍光を測定した。【００８０】
リン酸化ペプチドを含むスポットのみにシグナルが明瞭、かつ、特異的に検出されたことから、ペプチドが確実に固定化されていることが示された。また、コントロール（ペプチドを含まないスポット及びリン酸化されていないペプチドを含むスポット）では、蛍光を検出しなかった。
【実施例２】
【００８１】
＜タンパク質の担体への固定化、タンパク質固定化担体の抗体反応による評価＞
Protein G（フナコシ社製）及びBSA（シグマアルドリッチ社製）各500μgをリン酸バッファー（pH7.5）及びDMF（N,N-dimethylformamide）(1:1 vol/vol)混合溶液(2ml)に溶解し、等モルの配列番号４に示すポリチミン誘導体の５'末端にアミノ基を導入したオリゴヌクレオチド（グレンリサーチ社製,１２塩基）及び１０倍モルのDSS(ピアス社製)を加えて、4℃にて10時間インキュベートした。次いで、NAP5カラム（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて精製し、タンパク質溶液（50μg/ml）を調製した。ガラス板に金蒸着させた担体の所定の位置に、前記タンパク質溶液をスポットした。スポット量は、それぞれ0.5μlであり、スポット径の大きさは直径1mmであった。次いで、CRM-FA Spectro Iradiator (JASCO社製)を用い、中心波長335 nmの紫外線を照射した。このときの照射強度は、1.5mW/cm2であり、照射時間は120秒であった。その後、前記担体を水中で30分間振とうし、洗浄した後に乾燥させた。一方、コントロールとして紫外線を照射していない担体も作製した。【００８２】
上記タンパク質固定化担体のタンパク質固定部分に、Cy3標識抗Protein G IgG（アマシャム  バイオサイエンス社製）を含む溶液（1μg/200μl IgG, 1×PBS, 0.2% TritonX-100）を載せ、５時間インキュベートした。次いで、上記タンパク質固定化担体を1×PBS-0.2% TritonX-100溶液で洗浄し、ScanArray 4000（GSI社製）を用いて蛍光を測定した。【００８３】
紫外線を照射した担体上のProtein Gを含むスポットのみにシグナルが明瞭、かつ、特異的に検出されたことから、タンパク質が確実に固定化されていることが示された。また、コントロール（紫外線を照射していないスポット及びBSAを含むスポット）では、蛍光を検出しなかった。
【実施例３】
【００８４】
＜光架橋剤を用いたペプチドの担体への固定化、ペプチド固定化担体の抗体反応による評価＞
実施例１で作製したペプチド溶液（1pmol/μl）100μlにソラレン（モレキュラープローブ社製）溶液(200μg/ml)を0.1ml加えよく混合し、ソラレン含有ペプチド溶液（ペプチド0.5pmol/μl）を調製した。次いで、カルボジイミド基を有する高分子化合物で処理したガラス担体上の所定の位置に、前記ペプチド溶液をスポットした。スポット量はそれぞれ0.5μlであり、スポット径の大きさは直径1mmであった。次いで、HPW125 Philips Lamp（Philips Lighting社製）(中心波長365 nm)を2.9×1016quanta/secのエネルギーで60分間照射し、さらに、Uvstratalinker 2400(ストラタジーン社製、中心波長254 nm)を用い、紫外線を16cmの距離から、300mJ/cm2照射した。照射時間は120秒であった。その後、前記担体を水中で30分間振とうし、洗浄した後に乾燥させた。【００８５】
一方、コントロールとしてペプチドを含まない溶液（クエン酸二ナトリウム水溶液）も同様に担体にスポットし、前述のような固定化の操作を行った。【００８６】
上記担体の試料固定部分に、ローダミン標識抗リン酸化アミノ酸抗体を含む溶液(1μg/100μl 抗体, 1×PBS, 0.2% Tween 20, 1% BSA)を載せ、５時間インキュベートした。ローダミン標識抗リン酸化アミノ酸抗体は、ローダミンNHS(モレキュラープローブス社製)を用いて０．１M NaHCO3（pH 9）中でローダミンを抗リン酸化アミノ酸抗体（コスモバイオ社製）に導入したものを用いた。次いで、上記担体を滅菌水で洗浄し、ScanArray 4000（GSI社製）を用いて蛍光を測定した。【００８７】
リン酸化ペプチドを含むスポットのみにシグナルが明瞭、かつ、特異的に検出されたことから、ペプチドが確実に固定化されていることが示された。また、コントロール（ペプチドを含まないスポット及びリン酸化されていないペプチドを含むスポット）では、蛍光を検出しなかった。
【実施例４】
【００８８】
＜ペプチドの担体への固定化、ペプチド固定化担体の抗体反応による評価＞
ペプチド合成機を用いて、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するペプチド（８残基）及び配列番号６で示すセリンをリン酸化したペプチド（８残基）を合成した。これらペプチドのN末端を常法に従い、固相担体上(2-クロロトリチルクロライド  レジン)でアセチル化した。側鎖の保護基［BOC（t-ブトキシカルボニル）基及びt-Bu（t-ブチル）基］を有したままのこれらペプチドを酢酸：トロフルオロエタノール：ジクロロメタン溶液(1:2:7 vol/vol)を用いて固相担体上から切り離した。これらペプチドをDMF中で1,3-ジイソプロピルカルボジイミド, 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール, N,N-ジイソプロピルエチルアミン及び4-ジメチルアミノピリジンを用いて、常法に従い、ペプチドのC末端に、配列番号４に示すポリチミン誘導体の５'末端にアミノ基を導入したオリゴヌクレオチドを導入した。次いで、ペプチドの保護基をトリフルオロ酢酸:水:ジエタンジチオール:チオアニソール:フェノール溶液(10 ml:0.5 ml:0.25 ml: 0.5 ml: 0.75 g)を用いて脱保護し、NAP5カラム（アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いて精製・濃縮し、50mMリン酸水溶液(pH 8.5)に溶解してペプチド溶液（1pmol/μl）を調製した。【００８９】
カルボジイミド基を有する高分子化合物で処理したガラス担体上の所定の位置に、前記ペプチド溶液をスポットした。スポット量は、それぞれ0.5μlであり、スポット径の大きさは直径1mmであった。次いで、CRM-FA Spectro Iradiator (JASCO社製)を用い、中心波長335 nmの紫外線を照射した。このときの照射強度は、1.5mW/cm2であり、照射時間は120秒であった。照射時間は60秒であった。その後、前記担体を水中で30分間振とうし、洗浄した後に乾燥させた。一方、コントロールとして紫外線を照射していない担体も作製した。【００９０】
上記ペプチド固定化担体のペプチド固定部分に、ローダミン標識抗リン酸化アミノ酸抗体を含む溶液(1μg/100μl 抗体, 1×PBS, 0.2% Tween 20, 1% BSA)を載せ、５時間インキュベートした。ローダミン標識抗リン酸化アミノ酸抗体は、ローダミンNHS(モレキュラープローブス社製)を用いて０．１M NaHCO3（pH 9）中でローダミンを抗リン酸化アミノ酸抗体（コスモバイオ社製）に導入したものを用いた。次いで、上記ペプチド固定化担体を滅菌水で洗浄し、ScanArray 4000（GSI社製）を用いて蛍光を測定した。【００９１】
紫外線を照射した担体上のリン酸化ペプチドを含むスポットのみにシグナルが明瞭、かつ、特異的に検出されたことから、ペプチドが確実に固定化されていることが示された。また、コントロール（紫外線を照射していないスポット及びリン酸化されていないペプチドを含むスポット）では、蛍光を検出しなかった。
【実施例５】
【００９２】
＜ペプチドの担体への固定化、ペプチド固定化担体の抗体反応による評価＞
実施例４で作製したペプチド溶液（1pmol/μl）を、アミノシランで処理したガラス担体（Telechem International社製）上の所定の位置にスポットした。スポット量は、それぞれ0.5μlであり、スポット径の大きさは直径1mmであった。次いで、CRM-FA Spectro Iradiator (JASCO社製)を用い、中心波長335 nmの紫外線を照射した。このときの照射強度は、1.5mW/cm2であり、照射時間は120秒であった。その後、前記担体を水中で30分間振とうし、洗浄した後に乾燥させた。一方、コントロールとして紫外線を照射していない担体も作製した。【００９３】
上記ペプチド固定化担体のペプチド固定部分に、ローダミン標識抗リン酸化アミノ酸抗体を含む溶液(1μg/100μl 抗体, 1×PBS, 0.2% Tween 20, 1% BSA)を載せ、５時間インキュベートした。ローダミン標識抗リン酸化アミノ酸抗体は、ローダミンNHS(モレキュラープローブス社製)を用いて０．１M NaHCO3（pH 9）中でローダミンを抗リン酸化アミノ酸抗体（コスモバイオ社製）に導入したものを用いた。次いで、上記ペプチド固定化担体を滅菌水で洗浄し、ScanArray 4000（GSI社製）を用いて蛍光を測定した。【００９４】
紫外線を照射した担体上のリン酸化ペプチドを含むスポットのみにシグナルが明瞭、かつ、特異的に検出されたことから、ペプチドが確実に固定化されていることが示された。また、コントロール（紫外線を照射していないスポット及びリン酸化されていないペプチドを含むスポット）では、蛍光を検出しなかった。
【実施例６】
【００９５】
＜光反応性基によるペプチドの担体への固定化、ペプチド固定化担体の抗体反応による評価＞
4-ベンゾイル安息香酸から4-ベンゾイル安息香酸クロライドを常法により合成した。4-ベンゾイル安息香酸クロライド(30g)をクロロホルム(500ml)に溶解し、6-アミノヘキサン酸溶液(17g/400ml 1N NaOH)を0℃にて滴下し、60分間室温にて攪拌した。反応混合溶液に12N HCl(40ml)を加え、有機溶媒層を抽出した。有機溶媒層を減圧濃縮し、乾燥した。次いで、得られた乾燥物に1,4-ジオキサン(500ml)を加えて、溶解し、N-ヒドロキシスクシンイミド(10.7g)、1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド(20.1g)を加え、室温にて18時間攪拌した。濾過後、溶液を減圧濃縮して、N-スクシンイミジル6-(4-ベンゾイルベンズアミド)ヘキサノエートを25g得ることができた。【００９６】
常法に従い、ペプチド合成機を用いて、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するペプチド（８残基）を合成した。さらに、配列番号６で示すセリンをリン酸化したペプチド（８残基）も合成した。次いで、ペプチド(10nmol)に対して1M 炭酸水素ナトリウムバッファー(pH 9.0)(0.5ml)を加えて溶解し、DMFに溶解したN-スクシンイミジル6-(4-ベンゾイルベンズアミド)ヘキサノエート(100nmol)を加えて、室温にて１８時間攪拌した。次いで、NAP5カラム（アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いて精製・濃縮し、50mMリン酸水溶液(pH 8.5)に溶解してペプチド溶液（1pmol/μl）を調製した。【００９７】
前記ペプチド溶液を市販のポリプロピレン担体（ポリプロピレンプレート：タキロン社製）上の所定の位置にスポットした。スポット量は、それぞれ0.5μlであり、スポット径の大きさは直径1mmであった。次いで、CRM-FA Spectro Iradiator (JASCO社製)を用い、中心波長335 nmの紫外線を照射した。このときの照射強度は、1.5mW/cm2であり、照射時間は120秒であった。その後、前記担体を水中で30分間振とうし、洗浄した後に乾燥させた。また、コントロールとして、紫外線を照射していない担体も作製した。【００９８】
上記ペプチド固定化担体のペプチド固定部分に、ローダミン標識抗リン酸化アミノ酸抗体を含む溶液(1μg/100μl 抗体, 1×PBS, 0.2% Tween 20, 1% BSA)を載せ、５時間インキュベートした。ローダミン標識抗リン酸化アミノ酸抗体は、ローダミンNHS(モレキュラープローブス社製)を用いて０．１M NaHCO3（pH 9）中でローダミンを抗リン酸化アミノ酸抗体（コスモバイオ社製）に導入したものを用いた。次いで、上記ペプチド固定化担体を滅菌水で洗浄し、ScanArray 4000（GSI社製）を用いて蛍光を測定した。【００９９】
紫外線を照射した担体上のリン酸化ペプチドを含むスポットのみにシグナルが明瞭、かつ、特異的に検出されたことから、ペプチドが確実に固定化されていることが示された。また、コントロール（紫外線を照射していないスポット及びリン酸化されていないペプチドを含むスポット）では、蛍光を検出しなかった。
【実施例７】
【０１００】
＜光反応性基によるタンパク質の担体への固定化、タンパク質固定化担体の抗体反応による評価＞
Protein G（フナコシ社製）及びBSA（シグマアルドリッチ社製）各500μgに対して1M 炭酸水素ナトリウムバッファー(pH9.0)(1ml)を加えて、実施例６で作製したN-スクシンイミジル6-(4-ベンゾイルベンズアミド)ヘキサノエート(100nmol)DMF溶液を加えて、室温にて１８時間攪拌した。次いで、NAP5カラム（アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いて精製・濃縮し、50mMリン酸水溶液(pH 8.5)に溶解してタンパク質溶液（30μg/ml）を調製した。【０１０１】
得られたタンパク質を市販のポリカーボネート担体（一般ポリカーボネートプレート：タキロン社製）上の所定の位置にスポットした。スポット量は、それぞれ0.5μlであり、スポット径の大きさは直径1mmであった。次いで、CRM-FA Spectro Iradiator(JASCO社製)を用い、中心波長335 nmの紫外線を照射した。このときの照射強度は、1.5mW/cm2であり、照射時間は120秒であった。その後、前記担体を水中で30分間振とうし、洗浄した後に乾燥させた。また、コントロールとして、紫外線を照射していない担体も作製した。【０１０２】
上記タンパク質固定化担体のタンパク質固定部分に、Cy3標識抗Protein G IgG（アマシャム  バイオサイエンス）を含む溶液（0.5μg/200μl IgG, 1×PBS, 0.2% TritonX-100）を載せ、５時間インキュベートした。次いで、上記タンパク質固定化担体を1×PBS-0.2% TritonX-100溶液で洗浄し、ScanArray 4000（GSI社製）を用いて蛍光を測定した。【０１０３】
紫外線を照射した担体上のProtein Gを含むスポットのみにシグナルが明瞭、かつ、特異的に検出されたことから、タンパク質が確実に固定化されていることが示された。また、コントロール（紫外線を照射していないスポット及びBSAを含むスポット）では、蛍光を検出しなかった。
【実施例８】
【０１０４】
＜糖の担体への固定化、糖固定化担体のレクチンを用いた相互作用による評価＞
２−アミノエチル−β−D−ガラクトピラノシド（三谷産業株式会社製）及び配列番号７に示すデオキシチミジル酸とデオキシシチジル酸から構成されるポリマーの５'末端にアミノ基を導入したオリゴヌクレオチド（１０塩基）をメタノール：イソプロピルアルコール：滅菌水：DMSO（５：５：５：１）に溶解し、トリブチルアミン溶液（和光純薬社製）を加えてpHを8.0に調整した。次いで、２倍モルのDSS（ピアス社製）を加えて、42℃にて5時間インキュベートした。次いで、逆相HPLC (Waters社製, μBondaspphere, C8 300A, 3.9x150)を用いて精製した後に濃縮し、45mMクエン酸二アンモニウム水溶液に溶解して糖溶液（1 pmol/μl）を調製した。【０１０５】
平底型96-wellポリスチレン製マイクロタイタープレート（株式会社テックジャム社製）の所定の位置に、前記糖溶液及びバッファー溶液をそれぞれスポットした。スポット量は、それぞれ0.5μlであり、スポット径の大きさは直径1mmであった。次いで、Uvstratalinker 2400(ストラタジーン社製，中心波長254nm)を用い、紫外線を16cmの距離から、80m J/cm2照射した。照射時間は30秒であった。その後、前記担体を水中で30分間振とうし、洗浄した後に乾燥させた。一方、コントロールとして紫外線を照射していない担体も作製した。【０１０６】
A. McPherson等（McPherson, A.; Hankins, C. N.; Shannon, L. J. Biol. Chem. 1987, 262, 1791-1794）の方法に準じて作製したFITC標識レクチン（Sophora japonica由来）を1% BSAを含む1×PBST溶液に1 mMの濃度で溶解した。次いで、上記担体の糖固定部分に、FITC標識レクチンを含む溶液を載せ、室温で１２時間インキュベートした。次いで、上記糖固定化担体を滅菌水で洗浄し、FLA 5000（富士写真フィルム社製）を用いて蛍光を測定した。【０１０７】
紫外線を照射した担体上のガラクトースを含むスポットのみにシグナルが明瞭、かつ、特異的に検出されたことから、糖が確実に固定化されていることが示された。また、コントロール（紫外線を照射していないスポット）では、バックグラウンドノイズ（バッファー溶液）と同じ強度の蛍光強度しか検出できなかった。
【実施例９】
【０１０８】
＜ペプチドのポリアクリルアミド担体への固定化、ペプチド固定化担体の酵素反応による評価＞
ペプチド合成機を用いて、配列番号８に示すアミノ酸配列を有するペプチド（６残基）を合成した。前記合成ペプチド及び配列番号７に示すオリゴヌクレオチド（１０塩基）の５'末端にアミノ基を導入したオリゴヌクレオチドを等モルずつ0.1M 炭酸水素ナトリウムバッファー（ｐH 8.0）に溶解し、DMFに溶解した１０倍モルのDSS(ピアス社製)を加えて、３７℃にて２時間インキュベートした。次いで、逆相HPLC (Waters社製, μBondaspphere, C8 300A, 3.9x150)を用いて精製した後に濃縮し、45mMクエン酸二アンモニウム水溶液に溶解してペプチド溶液（5 pmol/μl）を調製した。【０１０９】
Nano-PlotterTM (GeSim社製)を用いて、前記ペプチド溶液をスライド表面にポリアクリルアミドを有する3D-LinkTM Activated Slide (Surmodics社製)上にスポットした。スポット径の大きさは直径0.3 mmであった。次いで、Uvstratalinker 2400(ストラタジーン社製，中心波長254nm)を用い、紫外線を16cmの距離から、60 mJ/cm2照射した。照射時間は24秒であった。その後、前記担体を水中で30分間振とうし、洗浄した後に乾燥させた。一方、コントロールとしてペプチドを含まない溶液（クエン酸二ナトリウム水溶液）も同様に担体にスポットし、前述のような固定化の操作を行った。【０１１０】
上記ペプチド固定化担体の試料固定部分に、チロシンp60c-src kinase (Upstate社製)を含むバッファー[2 U/50μl 酵素， 25 mM Tris (pH 7.4), 15 mM MgCl2, 7 mM MnCl2, 0.5 mM EGTA, 100 μM ATP]を載せ、５時間インキュベートした。次いで、上記試料固定化担体を1×PBS-0.2% Tween 20溶液で洗浄し、FITC標識anti-phosphotyrosine (シグマアルドリッチ社製)を含むバッファー(1 μg/100μl 抗体, 1×PBS, 0.2% Tween 20, 1%BSA)を上記ペプチド固定化担体のペプチド固定部分に載せ、２時間インキュベートした。次いで、上記ペプチド固定化担体を1×PBS-0.2% Tween 20溶液で洗浄し、FLA 5000（富士写真フィルム社製）を用いて蛍光を測定した。【０１１１】
一方、チロシンp60c-src kinaseを含まないバッファー[25 mM Tris (pH 7.4), 15 mM MgCl2, 7 mM MnCl2, 0.5 mM EGTA, 100 μM ATP]を載せ、５時間インキュベートし、前記FITC標識anti-phosphotyrosineを用いて２時間インキュベートしたペプチド固定化担体も作製した。【０１１２】
チロシンp60c-src kinaseを含むバッファーでインキュベートした担体上のペプチドを含むスポットのみにシグナルが明瞭、かつ、特異的に検出されたことから、ペプチドが確実に固定化され、特異的な酵素反応を検出できることが示された。また、コントロール（チロシンp60c-src kinaseを含まないバッファーでインキュベートした担体上のペプチドスポット及びペプチドを含まないスポット）では、蛍光を検出しなかった。
【実施例１０】
【０１１３】
＜ペプチドのニトロセルロース担体への固定化、ペプチド固定化担体の酵素反応による評価＞
Nano-PlotterTM (GeSim社製)を用いて、実施例９で作製したペプチド溶液（5 pmol/μl）をスライド表面にニトロセルロースを有するFAST Slide (Schleicher & Schuell社製)上にスポットした。スポット径の大きさは直径0.4 mmであった。次いで、Uvstratalinker 2400(ストラタジーン社製，中心波長254nm)を用い、紫外線を16cmの距離から、120 mJ/cm2照射した。照射時間は48秒であった。その後、前記担体を3%BSA溶液中で30分間振とうし、洗浄した後に乾燥させた。一方、コントロールとしてペプチドを含まない溶液（クエン酸二ナトリウム水溶液）も同様に担体にスポットし、前述のような固定化の操作を行った。【０１１４】
上記ペプチド固定化担体の試料固定部分に、チロシンp60c-src kinase (Upstate社製)を含むバッファー[2 U/50μl 酵素, 25 mM Tris (pH 7.4), 15 mM MgCl2, 7 mM MnCl2, 0.5 mM EGTA, 100 μM ATP）を載せ、５時間インキュベートした。次いで、上記ペプチド固定化担体を1×PBS-0.2% Tween 20溶液で洗浄し、FITC標識anti-phosphotyrosine (シグマアルドリッチ社製)を含むバッファー(1μg/100μl 抗体, 1×PBS, 0.2% Tween 20, 1%BSA)を上記ペプチド固定化担体の試料固定部分に載せ、２時間インキュベートした。次いで、上記ペプチド固定化担体を1×PBS-0.2% Tween 20溶液で洗浄し、FLA 5000（富士写真フィルム社製）を用いて蛍光を測定した。【０１１５】
一方、チロシンp60c-src kinaseを含まないバッファー[25 mM Tris (pH 7.4), 15 mM MgCl2, 7 mM MnCl2, 0.5 mM EGTA, 100 μM ATP]を載せ、５時間インキュベートし、前記FITC標識anti-phosphotyrosineを用いて２時間インキュベートしたペプチド固定化担体も作製した。【０１１６】
チロシンp60c-src kinaseを含むバッファーでインキュベートした担体上のペプチドを含むスポットのみにシグナルが明瞭、かつ、特異的に検出されたことから、ペプチドが確実に固定化され、特異的な酵素反応を検出できることが示された。また、コントロール（チロシンp60c-src kinaseを含まないバッファーでインキュベートした担体上のペプチドスポット及びペプチドを含まないスポット）では、蛍光を検出しなかった。
【実施例１１】
【０１１７】
＜ペプチドのアクリルアミドゲル担体への固定化、ペプチド固定化担体の酵素反応による評価＞
スライド表面にアクリルアミドゲルを有するスライドをNallur等の方法[Nallur G, Luo C, Fang L, Cooley S, Dave V, Lambert J, Kukanskis K, Kingsmore S, Lasken R, Schweitzer B. (2001) Signal amplification by rolling circle amplification on DNA microarrays. Nucleic Acids Res., 29, e118.]に準して作製した。Nano-PlotterTM (GeSim社製)を用いて、実施例９で作製したペプチド溶液（5 pmol/μl）を前記スライド表面にアクリルアミドゲルを有するスライド上にスポットした。スポット径の大きさは直径0.5 mmであった。次いで、Uvstratalinker 2400(ストラタジーン社製，中心波長254nm)を用い、紫外線を16cmの距離から、120 mJ/cm2照射した。照射時間は48秒であった。その後、前記担体を3%BSA溶液中で30分間振とうし、洗浄した後に乾燥させた。一方、コントロールとしてペプチドを含まない溶液（クエン酸二ナトリウム水溶液）も同様に担体にスポットし、前述のような固定化の操作を行った。【０１１８】
上記ペプチド固定化担体の試料固定部分に、チロシンp60c-src kinase (Upstate社製)を含むバッファー[2 U/50μl 酵素, 25 mM Tris (pH 7.4), 15 mM MgCl2, 7 mM MnCl2, 0.5 mM EGTA, 100 μM ATP]を載せ、５時間インキュベートした。次いで、上記ペプチド固定化担体を1×PBS-0.2% Tween 20溶液で洗浄し、FITC標識anti-phosphotyrosine (シグマアルドリッチ社製)を含むバッファー(1μg/100μl 抗体, 1×PBS, 0.2% Tween 20, 1%BSA)を上記ペプチド固定化担体の試料固定部分に載せ、２時間インキュベートした。次いで、上記ペプチド固定化担体を1×PBS-0.2% Tween 20溶液で洗浄し、FLA 5000（富士写真フィルム社製）を用いて蛍光を測定した。【０１１９】
一方、チロシンp60c-src kinaseを含まないバッファー[25 mM Tris (pH 7.4), 15 mM MgCl2, 7 mM MnCl2, 0.5 mM EGTA, 100 μM ATP]を載せ、５時間インキュベートし、前記FITC標識anti-phosphotyrosineを用いて２時間インキュベートしたペプチド固定化担体も作製した。【０１２０】
チロシンp60c-src kinaseを含むバッファーでインキュベートした担体上のペプチドを含むスポットのみにシグナルが明瞭、かつ、特異的に検出されたことから、ペプチドが確実に固定化され、特異的な酵素反応を検出できることが示された。また、コントロール（チロシンp60c-src kinaseを含まないバッファーでインキュベートした担体上のペプチドスポット及びペプチドを含まないスポット）では、蛍光を検出しなかった。
【実施例１２】
【０１２１】
＜ペプチドのポリリジン担体への固定化、ペプチド固定化担体の酵素反応による評価＞
ペプチド合成機を用いて、配列番号８に示すアミノ酸配列を有するペプチド（６残基）を合成した。前記合成ペプチド及び配列番号９に示すオリゴヌクレオチド（２０塩基）の５'末端にアミノ基を導入したオリゴヌクレオチドを等モルずつ0.1M 炭酸水素ナトリウムバッファー（ｐH 8.0）に溶解し、DMFに溶解した１０倍モルのDSS(ピアス社製)を加えて、３７℃にて２時間インキュベートした。次いで、逆相HPLC (Waters社製, μBondaspphere, C8 300A, 3.9x150)を用いて精製した後に濃縮し、45mMクエン酸二アンモニウム水溶液に溶解してペプチド溶液（10 pmol/μl）を調製した。【０１２２】
SP-BIO (Hitachi社製)を用いて、前記ペプチド溶液をスライド表面にポリリジンを有するスライド上にスポットした。スポット径の大きさは直径0.3 mmであった。次いで、Uvstratalinker 2400(ストラタジーン社製，中心波長254nm)を用い、紫外線を16cmの距離から、240 mJ/cm2照射した。照射時間は96秒であった。その後、前記担体を1% BSA溶液中で30分間振とうし、洗浄した後に乾燥させた。一方、コントロールとしてペプチドを含まない溶液（クエン酸二ナトリウム水溶液）も同様に担体にスポットし、前述のような固定化の操作を行った。【０１２３】
上記ペプチド固定化担体の試料固定部分に、チロシンp60c-src kinase (Upstate社製)を含むバッファー[2 U/50μl酵素, 25 mM Tris (pH 7.4), 15 mM MgCl2, 7 mM MnCl2, 0.5 mM EGTA, 100 μM ATP]を載せ、５時間インキュベートした。次いで、上記ペプチド固定化担体を1×PBS-0.2% Tween 20溶液で洗浄し、FITC標識anti-phosphotyrosine (シグマアルドリッチ社製)を含むバッファー(1μg/100μl 抗体, 1×PBS, 0.2% Tween 20, 1%BSA)を上記ペプチド固定化担体の試料固定部分に載せ、２時間インキュベートした。次いで、上記ペプチド固定化担体を1×PBS-0.2% Tween 20溶液で洗浄し、FLA 5000（富士写真フィルム社製）を用いて蛍光を測定した。【０１２４】
一方、チロシンp60c-src kinaseを含まないバッファー[25 mM Tris (pH 7.4), 15 mM MgCl2, 7 mM MnCl2, 0.5 mM EGTA, 100 μM ATP]を載せ、５時間インキュベートし、前記FITC標識anti-phosphotyrosineを用いて２時間インキュベートしたペプチド固定化担体も作製した。【０１２５】
チロシンp60c-src kinaseを含むバッファーでインキュベートした担体上のペプチドを含むスポットのみにシグナルが明瞭、かつ、特異的に検出されたことから、ペプチドが確実に固定化され、特異的な酵素反応を検出できることが示された。また、コントロール（チロシンp60c-src kinaseを含まないバッファーでインキュベートした担体上のペプチドスポット及びペプチドを含まないスポット）では、蛍光を検出しなかった。
【実施例１３】
【０１２６】
＜ペプチドのポリカルボジイミド担体への固定化、SPOT法による伸長反応、ペプチド固定化担体の抗体反応による評価＞
実施例１記載の方法に準じて、配列番号１０に示すポリヌクレオチドが結合したペプチド（Ala-Ala：２残基）を作製し、カルボジイミド基を有する高分子化合物で処理したガラス基材上に前記ポリヌクレオチドが結合したペプチドを固定した。【０１２７】
Tegge等の方法（Tegge W, Frank R: Determination of Cyclic Nucleotide-Dependent Protein Kinase Substrate Specificity by the Use of Peptide Libraries on Cellulose Paper. Biochemistry 1995, 34:10569-105777.）に準じて、前記ガラス基材上の試料固定部分でアミノ酸のカップリング（伸長）反応を繰り返し行い、配列番号１１に示すペプチド（１２残基）を前記ガラス基板上に合成した。このとき、N末端をFmoc基、側鎖をt-Bu基、trityl基あるいはBoc基で保護したアミノ酸を用い、さらに、カップリング試薬として、等モルのジイソプロピルカルボジイミド（和光純薬社製）及びヒドロキシベンゾトリアゾール（和光純薬社製）を用いて伸長反応を行った。また、各伸長反応において、DMF溶液に溶解したブロモフェノールブルー (0.1 mg/ml)を用いて、前記ガラス基材の試料固定部分を処理して試料固定部分が青色を呈色することを確認した後に、次の伸長反応を行った。【０１２８】
次いで、前記ガラス基材の試料固定部分を２％無水酢酸/DMF溶液で処理して合成したペプチドのN末端をアセチル化し、さらに、３％トリイソブチルシラン及び２％水を含むジクロロメタン/トリフルオロ酢酸（１：１）溶液を用いて、前記ガラス基材の試料固定部分を２時間室温にて処理してペプチド側鎖の脱保護反応を行った。【０１２９】
また、コントロールとして、前記ポリヌクレオチドが結合したペプチドを前記ガラス基板上に固定した後に、前記伸長反応を行わない試料も作製した。【０１３０】
上記担体の試料固定部分に、Cy3標識抗アンジオテンシンI抗体を含む溶液（2.2 μg/100 μl 抗体, 1×PBS, 0.2% Tween 20, 1% BSA）を載せ、２時間インキュベートした。Cy3標識抗アンジオテンシンI抗体は、Cy3-NHS（GEヘルスケア社製）を用いて0.1M NaHCO3（pH 9）中でCy3を抗アンジオテンシンI抗体（コスモバイオ社から購入）に導入したものを用いた。次いで、上記担体を滅菌水で洗浄し、ScanArray 4000（GSI社製）を用いて蛍光を測定した。【０１３１】
伸長反応を行ったスポットのみにシグナルが明瞭、かつ、特異的に検出されたことから、ペプチドが確実に固定化されていることが示された。また、コントロール（伸長反応を行っていないスポット）では、蛍光を検出しなかった。
【産業上の利用の可能性】
【０１３２】
タンパク質が強固に基材又は基材上の担体に結合できるため、本発明のタンパク質固定化基材は、再現性、定量性に優れたプロテインチップ等としての用途に有効なタンパク質固定化基材となり得る。
【配列表】
2005085857000001.app
【国際調査報告】
2005085857.tif 000002
2005085857.tif 000003
2005085857.tif 000004
2005085857.tif 000005
2005085857.tif 000006