(57)【要約】本発明は、血中安定性（血中滞留性）、及び標的臓器への移行性（標的移行性）に優れており、酵素補充療法等に有効に用い得る酵素製剤を提供することを課題とする。  脂質二分子膜で形成される小胞体に酵素が内包されている脂質小胞体組成物であって、前記酵素の安定ｐＨ領域外においても当該酵素の活性を安定に保持し得ることを特徴とする前記組成物により、上記課題を解決する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質二分子膜で形成される小胞体に酵素が内包されている脂質小胞体組成物であって、前記酵素の安定ｐＨ領域外においても当該酵素の活性を安定に保持し得る、前記組成物。
【請求項２】
血流を介して生体内の標的臓器へ酵素を送達させる酵素運搬体として機能することができる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記脂質二分子膜がアニオン性脂質を含むものである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記アニオン性脂質が１，５−Ｏ−ジヘキサデシル−Ｎ−スクシニル−Ｌ−グルタメートである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記酵素がグルコセレブロシダーゼである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の組成物を含むことを特徴とする、ゴーシェ病治療薬。
【請求項７】
ｐＨ緩衝液及び／又は界面活性剤の存在下で、酵素を脂質二分子膜で形成される小胞体に内包することを特徴とする、酵素の安定化方法。
【請求項８】
前記酵素がグルコセレブロシダーゼである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ｐＨ緩衝液及び／又は界面活性剤の存在下で、酵素を脂質二分子膜で形成される小胞体に内包することを特徴とする、脂質小胞体組成物の製造方法。
【請求項１０】
前記小胞体の内水相及び外水相のいずれにもｐＨ緩衝液及び／又は界面活性剤が存在する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記酵素がグルコセレブロシダーゼである、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
ゴーシェ病患者に請求項５に記載の組成物を投与することを特徴とする、ゴーシェ病の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質小胞体の内水相に酵素が含有されている脂質小胞体組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
リソソーム病は、リソソーム酵素およびその関連因子の活性低下又は欠損が原因となり、当該酵素の基質となる物質が体内に蓄積することにより生じる遺伝病である。例えば、リソソーム病の一つであるゴーシェ病では、グルコセレブロシダーゼ（β−グルコシダーゼ）の活性低下により、細網内皮系組織のマクロファージなどの細胞にグルコセレブロシドが蓄積して、肝脾腫、脾機能亢進に伴う貧血や血小板減少、骨変化、血中酸性フォスファターゼ及びアンギオテンシン変換酵素値の上昇等の症状や所見が見られる。
このようなリソソーム病の治療方法としては、従来より、酵素補充療法がよく採用されている。例えば、ゴーシェ病では、ヒトのグルコセレブロシダーゼをコードするｃＤＮＡをチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株で発現させた組換え酵素が、標的細胞マクロファージへの取り込みが容易となるように糖鎖修飾された形（例えば、酵素の糖鎖の非還元末端にマンノース残基を有するタイプとし、標的細胞マクロファージの表面に存在するマンノース受容体に認識され易くしたもの）で用いられている。
しかしながら、酵素補充療法においては、酵素製剤の血中安定性（血中滞留性）及び標的臓器への移行性（標的移行性）が十分であるとは言えず、これは上記のように糖鎖修飾を施して標的移行性を付与又は向上させたものであっても依然同様であった。
そのため、例えばゴーシェ病（特にゴーシェ病１型）の治療においては、グルコセレブロシダーゼを「１〜２時間／１回，６０ｕｎｉｔ／ｋｇ体重，２週間間隔」で点滴静注するという、投与時間及び投与量並びに投与間隔のいずれにおいても非常に拘束性の高い療法となっており、しかも合計投与量は必然的に多くなるため、患者への負担や経済性等の面で深刻な問題が生じていた。
ところで、ゴーシェ病に密接に関連するグルコセレブロシダーゼについては、それをリポソームに内包したもの（リポソーム組成物）が既に知られている（ＩＳＯＢＥＬ  Ｐ．ＢＲＡＩＤＭＡＮ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｐｉｄ  Ｐａｒｔｉａｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  Ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄｅ  β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，ｖｏｌ．１６４，１９７７，ｐ．４３９−４４５；Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｓ  Ａｆｔｅｒ  Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  Ｇａｕｃｈｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｐａｔｉｅｎｔ  Ｗｉｔｈ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ−Ｅｎｔｒａｐｐｅｄ  Ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄｅ：  β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ，”ＥＮＺＹＭＥ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ＩＮ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＤＩＳＥＡＳＥＳ：２”，ＡＬＡＮ  Ｒ．ＬＩＳＳ，ＩＮＣ．，ＮＥＷ  ＹＯＲＫ，１９８０，ｐ．３８３−３９２；Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＬＩＰＯＳＯＭＥＳ  ＩＮ  ＧＡＵＣＨＥＲ  ＴＹＰＥ  Ｉ  ＤＩＳＥＡＳＥ：ＵＳＥ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＥ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ＡＮＤ  ＴＨＥ  ＣＲＥＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＡＮ  ＡＮＩＭＡＬ  ＭＯＤＥＬ，”ＧＡＵＣＨＥＲ  ＤＩＳＥＡＳＥ：  Ａ  ＣＥＮＴＵＲＹ  ＯＦ  ＤＥＬＩＮＥＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ”，ＡＬＡＮ  Ｒ．ＬＩＳＳ，ＩＮＣ．，ＮＥＷ  ＹＯＲＫ，１９８２，ｐ．６８１−７０１）。しかしながら、いずれのリポソーム組成物も、血漿中（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）あるいは血流中（ｉｎ  ｖｉｖｏ）において、その酵素活性が十分安定に保持され得るよう考慮されたものではなかった。従って、酵素補充療法用の酵素製剤として用いたとしても、従来の酵素そのものの場合と同様に、血中滞留性及び標的移行性に乏しいものであることは容易に推測できる。
【発明の開示】
【０００３】
本発明が解決しようとする課題は、血中安定性（血中滞留性）、及び標的臓器への移行性（標的移行性）に優れており、酵素補充療法等に有効に用い得る酵素製剤を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その過程において、目的酵素を脂質二分子膜の小胞体に内包し（脂質小胞体組成物）、かつ内包酵素の本来の活性が、安定ｐＨ領域外の環境下に存在させた場合でも十分に保たれるようにした状態で取り扱うことに着目した。その結果、酵素そのものの場合、及び従来の小胞体内包酵素の場合と比較して、血中安定性及び標的移行性を飛躍的に高めることに成功した。これにより、この脂質小胞体組成物を酵素補充療法に用いた場合、従来に比べ、投与時間（１回投与量）の低減、及び投与間隔の延長が有効に図られ、患者への負担が大幅に軽減及び改善できると考えられる。これは、患者の生活の質（ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ）の向上に大きく貢献し得るものと言える。本発明は、以上のようにして完成されたものである。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）脂質二分子膜で形成される小胞体に酵素が内包されている脂質小胞体組成物であって、前記酵素の安定ｐＨ領域外においても当該酵素の活性を安定に保持し得る、前記組成物。
上記脂質小胞体組成物は、例えば、血流を介して生体内の標的臓器へ酵素を運搬させる酵素運搬体として機能することができる。
上記脂質二分子膜は、例えば、アニオン性脂質を含むことができ、当該アニオン性脂質としては、例えば、１，５−Ｏ−ジヘキサデシル−Ｎ−スクシニル−Ｌ−グルタメート（ＤＨＳＧ）を挙げることができる。
上記酵素としては、例えば、グルコセレブロシダーゼを挙げることができる。
（２）上記（１）の脂質小胞体組成物にグルコセレブロシダーゼを含めた組成物は、ゴーシェ病治療薬として使用することができる。
（３）ｐＨ緩衝液及び／又は界面活性剤の存在下で、酵素を脂質二分子膜で形成される小胞体に内包することを特徴とする、酵素の安定化方法。
上記酵素としては、例えば、グルコセレブロシダーゼを挙げることができる。
（４）ｐＨ緩衝液及び／又は界面活性剤の存在下で、酵素を脂質二分子膜で形成される小胞体に内包することを特徴とする、脂質小胞体組成物の製造方法。
上記方法においては、形成された小胞体の内水相及び外水相のいずれにもｐＨ緩衝液及び／又は界面活性剤が存在するようにすることができる。
上記酵素としては、例えば、グルコセレブロシダーゼを挙げることができる。
（５）ゴーシェ病患者に、上記（１）に記載の組成物であってグルコセレブロシダーゼを含む組成物を投与することを特徴とする、ゴーシェ病の治療方法。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、グルコセレブロシダーゼ／フリー体及びリポソーム製剤投与後の血漿中酵素活性推移を示すグラフである。
図２Ａ〜Ｃは、グルコセレブロシダーゼ／フリー体及びリポソーム製剤投与後の組織中酵素活性を示すグラフである。図２Ａは脾臓における酵素活性、図２Ｂは肝臓における酵素活性、図２Ｃは腎臓における酵素活性を示す。
図３は、グルコセレブロシダーゼ／フリー体及びリポソーム製剤投与後の脾臓サンプルのウエスタンブロットの写真である。
図４は、グルコセレブロシダーゼ／フリー体及びリポソーム製剤のヒト血漿中安定性（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）を示すグラフである。
図５は、グルコセレブロシダーゼ／フリー体及びリポソーム製剤投与後の肝臓におけるグルコセレブロシダーゼ（緑色）、クッパー細胞（赤色）の免疫染色写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明の検出方法について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２００５−１３９１７４号明細書の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての先行技術文献、並びに公開公報、特許公報及びその他の特許文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
１．脂質小胞体組成物
（１）脂質小胞体
小胞体の膜構成脂質としては、水性媒体中で二分子膜構造を形成し得る公知の種々の両親媒性分子から選ばれる１種以上の脂質を用いることができ、好ましくは、天然又は合成の飽和リン脂質及び不飽和リン脂質、並びにこれらの組合せであり、なかでも合成の飽和リン脂質がより好ましい。
飽和リン脂質としては、限定はされないが、例えば、水添卵黄レシチン、水添大豆レシチン、肝形質膜、赤血球膜、大腸菌膜等の細胞外膜の抽出物及び細胞内膜の抽出物等の天然リン脂質並びにその誘導体のほか、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリンなどのジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジルイノシトール、スフィンゴリン脂質類等が好ましく挙げられ、なかでも、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリンがより好ましい。
不飽和リン脂質としては、限定はされないが、例えば、卵黄レシチン、大豆レシチンなどの天然不飽和リン脂質、１−パルミトイル，２−オレオイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリンなどの合成不飽和リン脂質、１，２−ジ（オクタデカ−ｔｒａｎｓ−２，ｔｒａｎｓ−４−ジエノイル）ホスファチジルコリン、１，２−ビスエレオステアロイルホスファチジルコリン等の重合性リン脂質などが好ましく挙げられる。上記重合性リン脂質は、非重合性の長鎖を有していてもよく、該非重合性の長鎖としては、限定はされないが、例えば、炭素数２〜２４の直鎖又は分枝鎖のアルキル基、アシル基、非重合性アルケニル基、非重合性アルケノイル基等が挙げられる。
飽和リン脂質及び不飽和リン脂質を組合せて用いる場合は、限定はされないが、例えば、水添卵黄リン脂質と卵黄リン脂質との組合せ、合成飽和リン脂質であるジパルミトイルホスファチジルコリンやジステアロイルホスファチジルコリンと合成不飽和リン脂質である１−パルミトイル，２−オレオイルホスファチジルコリンやジオレオイルホスファチジルコリンとの組合せ等が挙げられ、なかでもジパルミトイルホスファチジルコリンと１−パルミトイル，２−オレオイルホスファチジルコリンとの組合せが好ましい。
小胞体の膜構成脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）型脂質、すなわちＰＥＧ鎖が結合した脂質を含むことが好ましい。ＰＥＧ型脂質を含有することにより、形成される脂質小胞体はその表面にＰＥＧ鎖を有するものとなり、これによって、乾燥後の小胞体を水性溶液に再分散させる場合や保存時等における小胞体の凝集や融合による粒子径変化を効果的に抑制することができるほか、例えば粒径制御のための押出法を行う際のフィルター透過性の低下や目詰まりを防止することができる。さらに、血中での血流動態を効果的に改善することもできる。
ＰＥＧ型脂質を含有する場合、その含有割合は、限定はされないが、膜構成脂質全体に対し、０．０１〜１０モル％であることが好ましく、より好ましくは０．１〜１モル％であり、さらに好ましくは０．１〜０．３モル％である。上記範囲を下回ると、ＰＥＧ鎖による凝集抑制効果や血流動態改善効果が弱くなるおそれがあり、上記範囲を上回ると、小胞体の内水相に伸びたＰＥＧ鎖の排除体積効果により内包物質の封入効率が低下したり、無駄なＰＥＧ鎖はコスト高に繋がるおそれがある。
ＰＥＧ型脂質におけるＰＥＧ鎖の分子量は、限定はされないが、例えば１，０００〜１２，０００であり、より好ましくは２，０００〜５，０００である。ＰＥＧ鎖の分子量が上記範囲を満たしていれば、上述した粒子径変化や凝集の抑制効果をより効果的に得ることができる。
小胞体の膜構成脂質は、多糖等の糖鎖が結合した脂質を含んでいてもよい。当該脂質を含有することにより、形成される脂質小胞体はその表面に糖鎖を有するものとなり、これによって、標的となる細胞、組織及び臓器への移行性をより一層向上させることができる。糖鎖としては、限定はされないが、例えば、マンノース又はマンノース６−リン酸を末端に持つ多糖類が挙げられる。
糖鎖が結合した脂質を含有する場合、その含有割合は、限定はされないが、膜構成脂質全体に対し、０．０１〜１０モル％であることが、上述した標的移行性等の向上がより効果的に達成される点で好ましく、より好ましくは０．１〜１モル％である。
小胞体の膜構成脂質は、負電荷脂質（アニオン性脂質）を含んでいてもよい。負電荷脂質としては、限定はされないが、例えば、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルイノシトール、ジアシルホスファチジルセリン、及び脂肪酸等が挙げられる。ここで、脂肪酸としては、限定はされないが、例えば、炭素数１２〜２０の飽和又は不飽和脂肪酸、具体的には、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸又はオクタデカ−２，４−ジエン酸等が挙げられる。
負電荷脂質を含有する場合、その含有割合は、限定はされないが、膜構成脂質全体に対し、１〜５０モル％であることが好ましく、より好ましくは５〜２０モル％である。上記範囲を下回ると、内包物質の封入効率が低下するおそれがあり、上記範囲を上回ると、小胞体膜が不安定となるおそれがある。
さらに小胞体の膜構成脂質は、安定化剤としての脂質成分を含んでいてもよい。このような安定化剤としては、限定はされないが、例えばステロール類が挙げられる。具体的には、エルゴステロール及びコレステロール等が挙げられ、なかでもコレステロールが好ましい。
上記安定化剤としての脂質成分を含む場合、小胞体膜を効果的に安定化するためには、その含有割合は、膜構成脂質全体に対し、５〜５０モル％であり、好ましくは１５〜４０モル％である。
また安定化剤となる脂質としては、例えば、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）及びパルミチン酸（ＰＡ）等のアニオン性脂質を使用することもできる。ＤＰＰＧ及びＰＡの化学式を以下に示す。
2006121199.tif 000002
さらに安定化剤となる脂質（アニオン性脂質）としては、リン酸基を持たないカルボン酸型脂質を使用することもできる。このようなカルボン酸型脂質は、膜形成脂質に含有させた場合に、（ｉ）脂質小胞体が生体内で血小板活性化作用を有しないこと、（ｉｉ）脂質小胞体の生体内への投与が循環血液中の血小板数を減少させないこと、（ｉｉｉ）脂質小胞体が生体内で血小板の一過性接着反応を引き起こさないこと、及び（ｉｖ）脂質小胞体が生体内で白血球接着活性化作用を有しないこと、のうちの少なくとも１つの特徴を有する。
上記カルボン酸型脂質としては、例えば、下記一般式（１）で表される脂質を挙げることができる。
2006121199.tif 000003
〔一般式（１）中、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のうち、いずれか１つは下記一般式（１’）
2006121199.tif 000004
（一般式（１’）中、Ｍは水素原子又は一価の陽イオンであり、ｍはメチレン鎖長を示す１〜５の整数である。）
で示される基であり、他の２つは炭化水素基（例えば鎖状炭化水素基）であり、
Ａ１、Ａ２及びＡ３は、互いに独立して、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＣＯＮＨ、又はＮＨＣＯから選択される基であり、すべて同一であってもよいし何れか１つ又は２つが他と異なっていてもよく、
ｎはメチレン鎖長を示す１〜３の整数である。〕
上記鎖状炭化水素基としては、例えば炭素数２〜２０の、直鎖状又は分枝状の非環式飽和炭化水素基又は非環式不飽和炭化水素基（非環式テルペンも含む）であればよく、特に限定はされないが、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルカジエニル基、アルキリデン基、アルキリジン基等に分類される各種炭化水素基が挙げられる。
ここで、一般式（１）においては、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の結合部位は、リジン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、チロシン等の三官能性アミノ酸であることが好ましい。特に、１つの反応性官能基と２つの等しい反応性官能基とを有する三官能性アミノ酸、即ち、１つの末端アミノ基と２つの末端カルボキシル基とを有するアスパラギン酸やグルタミン酸など、あるいは１つの末端カルボキシル基と２つの末端アミノ基とを有するリジン、アスパラギン、グルタミンなどが好ましい。アスパラギン酸やグルタミン酸がより好ましく、また、ホモシステインやグルタチオン等でもよい。
一般式（１）で表されるカルボン酸型脂質としては、例えば、下記式で表されるＤＨＳＧ（１，５−Ｏ−ジヘキサデシル−Ｎ−スクシニル−Ｌ−グルタメート）が挙げられる。
2006121199.tif 000005
（２）内包物質としての酵素
脂質小胞体に内包される酵素としては、限定はされず、公知の種々の酵素を採用できるが、なかでも、本発明の効果を考慮した場合、いわゆる酵素補充療法に使用される酵素が好ましく、例えば、リソソーム病関連する各種リソソーム酵素などが挙げられる。
これらリソソーム酵素としては、例えば、下記表１の最右欄の酵素が挙げられ、なかでもゴーシェ病に関連するグルコセレブロシダーゼ（β−グルコシダーゼ）が好ましい。
【表１】
2006121199.tif 000006
脂質小胞体に内包される酵素は、それ自体、糖鎖修飾されたものであってもよいが、本発明においては、糖鎖修飾がされていないものも好ましい実施態様として挙げられる。
一般に、従来の酵素補充療法では、酵素の標的移行性を高めるため、酵素の糖鎖の非還元末端に、標的細胞が有する受容体のリガンドとなる糖が存在することが、好ましい態様として知られている。糖鎖修飾された酵素としては、例えば、グルコセレブロシダーゼのようにマンノースが結合した酵素や、α−ガラクトシダーゼの糖鎖の非還元末端にマンノース６−リン酸が結合した酵素等が好ましく挙げられる。
但し、本発明においては、補充されるべき酵素は脂質小胞体に包まれた状態で標的細胞に取り込まれる過程を経るため、酵素自体に標的移行性を高めるための改良がされていなくても、十分に標的細胞に補充され得る。したがって、本発明においては酵素に糖鎖修飾がされていなくても生産性が向上するほか、本来有する酵素活性をより発揮させ易くなり、例えば酵素補充療法に用いた場合に治療効果を一層高めること等ができる。
酵素は、通常、酵素水溶液の状態で脂質小胞体に内包されている。当該水溶液に含まれる水性媒体としては、限定はされないが、少なくとも内包する酵素の活性を安定な状態（すなわち本来有する酵素活性又は同程度の活性を発揮し得る状態）に保持し得るものが好ましく、例えば、水のほか、ｐＨ緩衝液、生理食塩水、各種蛋白質保存液、臓器保存液、各種細胞培養液等が挙げられる。ｐＨ緩衝液としては、例えば、グリシン緩衝液、フタル酸一カリウム緩衝液、コハク酸緩衝液、クエン酸一カリウム緩衝液、トリス（ヒトロキシメチル）アミノメタン緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液等が挙げられ、なかでも酵素がグルコセレブロシダーゼの場合は、クエン酸一カリウム緩衝液が好ましい。
また上記水溶液のｐＨは、限定はされず、内包する酵素の安定ｐＨ領域に応じて適宜調整及び設定され得る。例えばグルコセレブロシダーゼの場合は、ｐＨ２〜７であることが好ましく、より好ましくはｐＨ４〜６．５である。従来、リソソーム病等に対する酵素補充療法に用いられていた酵素製剤（酵素そのもの等）については、標的細胞に移行するまでの活性低下が顕著であるものがあったが、これは血流中（血漿中）のｐＨ（中性領域）が当該酵素の活性の安定ｐＨ領域外であったため移行中に活性低下又は失活したことが主な要因であると考えられる。従って、上述のように、酵素が安定ｐＨ領域内の条件を維持しながら脂質小胞体に内包されていることで、移行時の活性の安定化を図ることができ、ひいては標的移行性の向上につながる。
上記酵素水溶液における酵素濃度（すなわち本発明の組成物の内水相における酵素濃度）は、限定はされず、目的酵素の種類、組成物の用途、及び疾患の進行状況等を考慮した上で、適宜決定すればよい。
（３）その他の成分
本発明の脂質小胞体組成物は、上述した脂質小胞体及びこれに内包される酵素（酵素水溶液）以外に、適宜他の成分を含むものであってもよく、限定はされない。
上記他の成分としては、例えば、脂質小胞体の内水相に含有させるアミノ酸類、糖類、還元剤、ビタミン剤、塩基類等が挙げられる。
（４）脂質小胞体組成物の製造方法
本発明の脂質小胞体組成物の製造方法は、前述したように、ｐＨ緩衝液及び／又は界面活性剤の存在下で、酵素を脂質二分子膜で形成される小胞体に内包することを特徴とする。
本発明の製造方法において、酵素を脂質二分子膜で形成される小胞体に内包する方法としては、脂質小胞体を調製する場合に用いられる公知の一般的な方法を採用すればよく、例えば、ボルテックス法、超音波照射法、高圧吐出法、高圧押出法、強制撹拌（ホモジナイザー）法、凍結融解法、有機溶媒注入法、界面活性剤除去法、逆相蒸発法、及びマイクロフルイダイザー法等を、適宜選択し又は組み合せて採用できる。なお、各方法の実施における手段及び条件等は、当業者の技術常識に基づき適宜選択し設定することができる。
具体的には、所望の膜形成脂質（一般には粉末状）を、内包しようとする酵素の水溶液に添加して、該脂質を水和及び膨潤させた後、静置し、ボルテックスミキサー、強制攪拌機、超音波照射機（ホモジナイザー等）、マイクロフルイダイザー、高圧押出機（エクストルーダー）又は凍結融解等により脂質を分散させることにより、内水相として酵素水溶液を含む（酵素を内包する）脂質小胞体の分散体を得ることができる。なかでも、凍結融解の場合、あるいは凍結融解と高圧押出機とを組合せて行った場合は、被覆層数を効果的に減少でき、フィルターの透過性、ひいては処理時間が顕著に向上するため好ましい。一般に、最終的に得られる脂質小胞体組成物の粒子径は、この段階で得られるものより縮小されることが多いため、本発明においては予めその縮小分を見越した粒径に調製しておくことが、歩留まり等の生産性の面でも好ましい。なお、最終的に得られる本発明の脂質小胞体組成物の粒子径（数平均粒子径）は、限定はされないが、内包効率、除菌処理、血中動態等の効果が得られる点で、３０〜４５０ｎｍが好ましく、より好ましくは８０〜２５０ｎｍである。次いで、必要に応じ、押出法等により所望の粒径（平均粒子径）及び粒子径分布に制御した後、ゲル濾過、遠心分離（超遠心分離）及び限外濾過膜処理等により未内包酵素を分離除去することにより、本発明の脂質小胞体組成物を得ることができる。
本発明の製造方法は、上述の脂質二分子膜の形成を、ｐＨ緩衝液及び／又は界面活性剤の存在下で行うこと（より好ましくは、例えば、ｐＨ緩衝液及の存在下、又は、ｐＨ緩衝液及び界面活性剤の存在下で行うこと）が重要であり、これによって、内包する酵素の安定ｐＨ領域外においても当該酵素の活性を安定に保持し得る脂質小胞体組成物を得ることができる。従って、本発明の製造方法は、酵素の安定化方法をも包含するものである。
具体的には、少なくとも膜形成脂質の会合による脂質二分子膜の形成を開始させるまでに、ｐＨ緩衝液及び／又は界面活性剤を調製液中に存在させていればよく、限定はされないが、一般には、膜形成脂質を酵素水溶液に添加する前又は添加とともに、ｐＨ緩衝液及び／又は界面活性剤と当該水溶液とを混合しておくことが好ましい。
上記ｐＨ緩衝液としては、限定はされないが、例えば（前述と同様に）、グリシン緩衝液、フタル酸一カリウム緩衝液、コハク酸緩衝液、クエン酸一カリウム緩衝液、トリス（ヒトロキシメチル）アミノメタン緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液等が挙げられ、なかでも酵素がグルコセレブロシダーゼの場合は、クエン酸一カリウム緩衝液が好ましい。
ｐＨ緩衝液を用いることにより、酵素水溶液のｐＨを、当該酵素の安定ｐＨ領域に応じて適宜調整及び設定することができる。例えばグルコセレブロシダーゼを内包しようとする場合、酵素水溶液はｐＨ２〜７であることが好ましく、より好ましくはｐＨ４〜６．５である。また、ｐＨ緩衝液の使用量は、限定はされず、適宜設定することができる。
上記界面活性剤としては、限定はされないが、例えば、ポリソルベート８０などのモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、トリオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン等が好ましく挙げられる。このような界面活性剤を適当量用いることにより、脂質小胞体の形成が悪影響を及ぼさず、内包酵素の安定性につながる作用効果を得ることができる。なお本発明でいう界面活性剤は、一般に乳化剤や可溶化剤に属するすべての化合物を含むこととする。
本発明の製造方法においては、脂質二分子膜の形成に際し、上記ｐＨ緩衝液及び界面活性剤以外に、他の各種添加剤等の成分を混合しておいてもよく、限定はされない。
本発明の製造方法においては、内包する酵素の変性（活性低下）を防止するため、一般には、酵素を取り扱う過程では、２０℃以下の温度条件下で行うことが好ましいが、限定はされない。
また本発明の製造方法においては、得られた脂質小胞体組成物における小胞体の内水相（内液）及び外水相（外液）のいずれにも、ｐＨ緩衝液及び／又は界面活性剤が存在するようにすることが好ましい態様として挙げられる。通常は、本発明の製造方法によれば、形成された小胞体の内水相側には酵素と共にｐＨ緩衝液及び／又は界面活性剤も存在し、かつ、当該小胞体はｐＨ緩衝液及び／又は界面活性剤を含む溶液中で形成されるため当該小胞体の外水相にもｐＨ緩衝液及び／又は界面活性剤が存在することになる。よって、本発明の製造方法の実施は、必然的に上記好ましい態様となり得る。しかしこれに限定はされず、未内包の酵素を除去すること等を目的とし、得られた脂質小胞体組成物を一旦単離して別の溶液中に存在させるなど、小胞体の外水相を別の溶液（ｐＨ緩衝液及び／又は界面活性剤を含む溶液）に置き換えるようにして上記好ましい態様としてもよい。
上記好ましい態様を採ることにより、小胞体に内包された酵素をより安定な状態で保持することができ、有効な酵素活性をより長期間維持しておくことができるため、例えば酵素補充法等に用いる製剤の長期保存において安定度をより一層高めることができる。
上記好ましい態様においては、外水相及び内水相に存在するｐＨ緩衝液や界面活性剤の諸条件（ｐＨ、濃度、種類等）は、互いに同じであってもよいし異なっていてもよく、適宜設定することができる。
（５）脂質小胞体組成物の特性
本発明の脂質小胞体組成物は、内包酵素の安定ｐＨ領域外においても当該酵素の活性を安定に保持し得る特性を有する。例えば、酸性領域下で安定に存在し、活性を示す酵素（例えばグルコセレブロシダーゼ等）を、その活性が低下又は失活する中性領域下に存在させた場合であっても、本発明の脂質小胞体組成物であれば、酸性領域下と同様の活性を安定に保持し発揮させることができる。
上記「酵素の活性を安定に保持し得る」という特性については、具体的には、例えば下記（ａ）に示すように定義されることが好ましいが、これに限定はされない。
（ａ）酵素を内包する脂質小胞体組成物について、当該酵素の安定ｐＨ領域から安定ｐＨ領域外（不安定ｐＨ領域）に存在させ、その後２時間経過させるという条件下において、酵素活性の残存率（安定ｐＨ領域での酵素活性を基準とする）が、８０％以上であることが好ましく、より好ましくは９０％以上である。但し、この数値範囲は、内包する酵素自身が、上記条件下において８０％未満の酵素活性残存率を示すものである場合の範囲である。
本発明の脂質小胞体組成物は、酵素活性の安定性に関し、上述したような特性を有するものであるため、例えば、血流を介して生体内の標的臓器へ目的の酵素（脂質小胞体に内包した酵素）を補充し得る、いわゆる酵素運搬体として有効に機能し得る。よって、以下に説明するように、酵素補充が必要な疾患に対する治療薬あるいは治療方法において極めて有用である。
２．治療薬及び治療方法
（１）治療薬
本発明の治療薬は、前述したように、酵素欠損又は酵素活性の低下を原因とする疾患の治療薬（医薬組成物、治療用組成物）であって、上記本発明の脂質小胞体組成物を含むことを特徴とする。また本発明は、酵素欠損又は酵素活性の低下を原因とする疾患の治療薬を製造するための上記本発明の脂質小胞体組成物の使用をも含むものである。
ここで、酵素欠損又は酵素活性の低下を原因とする疾患としては、先天的な疾患であっても後天的な疾患であってもよく、限定はされない。先天的な疾患例としては、例えばリソソーム病等が挙げられ、具体的にはゴーシェ病等が挙げられる。上記疾患がゴーシェ病の場合は、本発明の治療薬に含まれる脂質小胞体組成物の内包酵素としてグルコセレブロシダーゼを必須とすることが好ましい。
本発明の治療薬は、一般には、生体内への投与に際し点滴静注等が可能なように、本発明の脂質小胞体組成物を適当な分散媒に分散させてなる分散体であることが好ましい。
上記分散媒としては、限定はされず、例えば、純水、水溶液、及び緩衝溶液等の水性媒体が挙げられ、用法や疾患の種類等応じて適宜選択できる。一般には、注射用水や生理食塩水が生体内における安全性が高い点で好ましく、酵素補充療法においては特に好ましい。分散媒のｐＨは、生理的ｐＨとして許容される範囲であればよく、脂質小胞体組成物の安定性の低下や集合形態の変化等に顕著な支障がない範囲で適宜設定することができる。生理的ｐＨ範囲とは、生体内、血液内等のｐＨ範囲であり、例えば、ｐＨ４〜１１、好ましくはｐＨ６〜９、より好ましくはｐＨ７〜８（ほぼ中性）である。
本発明の治療薬においては、上記分散媒中における脂質小胞体組成物の含有割合は、疾患の種類や進行度合い、患者の容態、及び補充する酵素の種類等に応じて適宜設定すればよい。
本発明の治療薬は、脂質小胞体組成物及び分散媒以外に他の成分を含んでいてもよく、限定はされない。他の成分としては、例えば、薬剤製造上一般に用い得る賦形剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等のほか、各種注射剤とする場合は、グリセロール及びプロピレングリコールや、ポリエチレングリコール等の脂肪族ポリアルコール等が挙げられ、常法により含有させ調製することができる。
本発明の治療薬が、注射剤等の非経口剤として用いられる場合、一般にその形態は限定はされず、例えば、静脈内注射剤（点滴を含む）、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、及び皮下注射剤等のいずれであってもよい。各種注射剤の場合、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態や、使用時に溶解液に再溶解させる凍結乾燥粉末の状態で提供され得る。
（２）治療方法
本発明にかかる酵素欠損又は酵素活性の低下を原因とする疾患の治療方法は、前述したように、当該疾患を有する患者に上記本発明の脂質小胞体組成物を投与することを特徴とする。また本発明は、酵素欠損又は酵素活性の低下を原因とする疾患を治療するための上記本発明の脂質小胞体組成物の使用をも含むものである。なお、ここで言う脂質小胞体組成物の投与又は使用とは、実質的には、上記本発明の治療薬の投与又は使用であると言える。
ここで、酵素欠損又は酵素活性の低下を原因とする疾患としては、先天的な疾患であっても後天的な疾患であってもよく、限定はされない。先天的な疾患例としては、例えばリソソーム病等が挙げられ、具体的にはゴーシェ病等が好ましく挙げられる。上記疾患がゴーシェ病の場合は、本発明の治療薬に含まれる脂質小胞体組成物の内包酵素としてグルコセレブロシダーゼを必須とすることが好ましい。
本発明の治療方法において、前記疾患の患者体内への投与方法は、限定はされないが、一般には、公知の非経口の用法が好ましく、具体的には、静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射、及び皮下注射等が挙げられ、好ましくは静脈内注射である。
また投与量、投与時間、投与間隔、投与回数（／１日）は、一般には、製剤（本発明の治療薬）中の有効成分（酵素）の含有割合等を考慮した上で、投与対象（患者）の年齢、体重及び容態、並びに疾患の種類及び進行状況等を勘案し、適宜設定することができる。しかし、本発明の治療方法による酵素補充療法では、前述したとおり、酵素を脂質小胞体に内包した状態で用るため、従来に比べ、結果として酵素の血中安定性及び標的移行性が非常に高く、投与量及び投与時間の低減、並びに投与間隔の延長等に関して顕著な改善効
果が得られる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
グルコセレブロシダーゼ内包リポソーム製剤の作製とその評価
１．方法
１−１．グルコセレブロシダーゼ内包リポソーム製剤の調製
混合脂質（計７０ｍｇ，１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン／コレステロール／１，５−Ｏ−ジヘキサデシル−Ｎ−スクシニル−Ｌ−グルタメート（ＤＨＳＧ）／Ｎ−［メトキシポリエチレングリコール（５０００）−カルバミル］ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン＝５／５／１／０．０３３（モル比））を、グルコセレブロシダーゼ溶液（２ｍｇ／ｍＬ，２ｍＬ，０．０２８％ポリソルベート８０，１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０））で水和させ攪拌した後（室温，１ｈｒ）、押出法により粒径を制御した（φ０．８，０．６，０．４５，０．２２μｍ）。
遠心分離（１００，０００Ｇ，３０ｍｉｎ，４℃）により未内包グルコセレブロシダーゼを除去することにより、酵素を内包した脂質小胞体組成物としてのグルコセレブロシダーゼ内包リポソーム製剤（グルコセレブロシダーゼ／リポソーム製剤）を得た（脂質濃度＝１９．３ｍｇ／ｍＬ，１．７ｍＬ）。なお、当該リポソーム製剤の分散媒としては、０．０１４％ポリソルベート８０含有１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いた。
１−２．酵素活性測定法
酵素溶液（１０μＬ）および２％ポリオキシエチレン１０ラウリルエーテルおよび０．０１４％ポリソルベート８０含有１６０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０，１０μＬ）を混合し、５０℃の水浴で４０秒加温してリポソームを可溶化した後、直ちに氷冷した。これに４ｍＭ  ４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルコピラノシドおよび０．８％タウロコール酸ナトリウム含有０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５，６０μＬ）を添加、混合した後、３７℃、３０ｍｉｎインキュベートした。０．２Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ１０．７，７００μＬ）を添加して反応を停止させ、遊離した４−メチルウンベリフェロン（以下「４ＭＵ」）の蛍光を測定した（Ｅｘ；３６５ｎｍ，Ｅｍ；４５０ｎｍ）。
別途作成した４ＭＵの検量線にて、遊離４ＭＵ濃度を算出し、酵素溶液１ｍＬが１時間あたりに遊離させることのできる４ＭＵ量を溶液中酵素活性とした。また、この４ＭＵ量をタンパク濃度（ｍｇ／ｍＬ単位）で除した値を、組織中酵素活性とした。
１−３．実験動物および群構成
マウス、Ｃ５７ＢＬ／６  ＣｒＳＬＣ、雌性、１２週齢を１群３匹として用いた。群構成を以下に示す。
１）フリー体投与／２４ｈｒ評価
２）リポソーム製剤投与／２４ｈｒ評価
３）フリー体投与／２ｈｒ評価
４）リポソーム製剤投与／２ｈｒ評価
５）コントロール（未処理）
１−４．投与液および投与量
フリー体の投与量を１ｍｇ／ｋｇとし、リポソーム製剤についてはこの酵素活性値と同じ量を投与した。
各製剤を０．４５μｍの除菌フィルターでろ過した後、酵素活性を測定し、除菌フィルターろ過済みの０．０１４％ポリソルベート８０含有１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で希釈し、１３５μｍｏｌ／ｈｒ／ｍＬとした。マウスの体重は２５ｇとし、投与ボリュームは０．２ｍＬ／ｈｅａｄとして計算した。
・フリー体；１．０８ｍｍｏｌ／ｈｒ／ｋｇ  ＢＷ＝１．０ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ
・リポソーム製剤；１．０８ｍｍｏｌ／ｈｒ／ｋｇ  ＢＷ＝２．８ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ
１−５．投与、採血および組織摘出
１／５皮下針を装着した１ｍＬのツベルクリン注射筒を用い、上記投与液（２００μＬ）をマウス尾静脈よりｂｏｌｕｓ投与した。採血ポイントは次の通り。
・２４ｈｒ評価群；投与終了後３，１０，３０ｍｉｎ，１，２，３，４，２４ｈｒ
・２ｈｒ評価群；投与終了後３，１０，３０ｍｉｎ，１，２ｈｒ
マウス尾部からヘマトクリット採血管で血液（約２５μＬ）を採取し、遠心分離して血漿画分を得た後、直ちに−８０℃で凍結保存した。最終採血はエーテル麻酔下、眼窩より行い、同様に血漿検体を得た。採血終了後、頚椎脱臼および断頭して安楽死させ、脾臓、肝臓、腎臓を摘出した。これら臓器はＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、液体窒素で急速冷凍させ、−８０℃で凍結保存した。
１−６．血漿・組織中酵素活性測定
血漿はそのまま、あるいは０．０１４％ポリソルベート８０含有５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で適宜希釈して、上記酵素活性の項目に従い酵素活性を測定した。
脾臓は組織重量の１９倍容、肝臓および腎臓は４倍容の０．０１４％ポリソルベート８０含有５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を添加し、ポリトロンでホモジネートを調製した。ホモジネートはさらに超音波処理（５ｓｅｃ）した。脾ホモジネートはそのまま、肝・腎ホモジネートは０．０１４％ポリソルベート８０含有５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で１０倍希釈して酵素活性を測定した。また、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によりタンパク濃度も測定した。
１−７．ウエスタンブロッティング
組織中酵素活性用に調製した超音波処理済み脾臓ホモジネートを１２，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ遠心した上清を試料とした。抽出タンパク質（２．５ｍｇ）にＣｏｎ  Ａセファロース（３０μＬ）を加え、４℃で１夜結合させた。１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＴＢＳにて洗浄した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液を添加、ボイルしてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その後、抗グルコセレブロシダーゼ抗体を用いてウエスタンブロッティングした。
１−８．ＰＫパラメータ算出
ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  ｖｅｒ．４．１を用いてノンコンパートメント解析により、最高血漿中酵素活性到達時間（Ｔｍａｘ）、最高血漿中酵素活性（Ｃｍａｘ）、血漿中酵素活性−時間曲線下面積（ＡＵＣ）および消失半減期（ｔ１／２）を求めた。
２．結果
２−１．製剤スペック
下記表２に製剤のスペックを表す。
リポソーム製剤化における内包効率は１７．４％、粒径は２６０±６０ｎｍ、脂質濃度は１９．３ｍｇ／ｍＬであった。製剤化の工程で約５割の比活性低下が認められたが、評価上問題なしと判断した。
【表２】
2006121199.tif 000007
２−２．血漿中酵素活性推移およびＰＫパラメータ
血漿中酵素活性およびＰＫパラメータを下記表３に、平均血漿中酵素活性推移を図１に示す。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血漿中の酵素活性は１１．７ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍＬであった。
グルコセレブロシダーゼ／フリー体を静脈内投与後、血漿中酵素活性は極めて速やかに減少した。投与直後、２ｈｒおよび２４ｈｒ後の平均酵素活性はそれぞれ１６．１μｍｏｌ／ｈｒ／ｍＬ、３１．９ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍＬおよび１６．０ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍＬであり、平均ＡＵＣ２４ｈｒは４．７９μｍｏｌ／ｍＬであった。
一方、リポソーム製剤投与後の血漿中酵素活性については、フリー体に比べて緩慢に減少した。投与直後、２ｈｒおよび２４ｈｒ後の平均酵素活性はそれぞれ３４．５μｍｏｌ／ｈｒ／ｍＬ、１３．２μｍｏｌ／ｈｒ／ｍＬおよび１１４ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍＬであり、平均ＡＵＣ２４ｈｒは１１６μｍｏｌ／ｍＬであった。
なお、リポソーム投与／２ｈｒ群の１例は投与不備があり、データを不採用とした。また、最初の採血ポイントは採血時間のバラツキがあったが平均値の３．８ｍｉｎとしてグラフ化した。ＰＫパラメータの計算には実測値を用いた。
【表３】
2006121199.tif 000008
２−３．組織中酵素活性
組織中酵素活性を下記表４、及び図２Ａ〜Ｃに示す。
非標的臓器の腎臓ではいずれの製剤もほとんど活性の増加は無く、酵素の取り込みが僅かであった。
脾臓中酵素活性は、コントロール群で１３．２ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであり、フリー体投与２ｈｒおよび２４ｈｒ後ではそれぞれ２８．２および１５．２ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであった。リポソーム製剤投与群では、２ｈｒおよび２４ｈｒ後でそれぞれ９７．６および３１．２ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎを示した。
肝臓中酵素活性は、コントロール群で２８．５ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであり、フリー体投与２ｈｒおよび２４ｈｒ後ではそれぞれ４９．０および３０．８ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであった。リポソーム製剤投与群では、２ｈｒおよび２４ｈｒ後でそれぞれ５１．４および３７．９ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎを示した。
【表４】
2006121199.tif 000009
２−４．ウエスタンブロッティング
臓器全体に占める標的細胞の含有率が最も高いと考えられる脾臓を用いて評価した。脾ホモジネートの抽出タンパクをウエスタンブロッティングに供したところ、コントロールではグルコセレブロシダーゼの分子量（約６０ｋＤ）付近に、ほとんどバンドは検出されなかった。フリー体については、投与後２ｈｒでグルコセレブロシダーゼに対応するバンドが僅かに検出されたが、２４ｈｒでは確認できないレベルであった。一方、リポソーム製剤投与では、投与後２ｈｒで非常に高濃度のタンパクが確認でき、さらに、２４ｈｒにおいてもフリー体投与２ｈｒ後よりも高い濃度が検出された（図３）。
【実施例２】
【０００７】
免疫染色によるグルコセレブロシダーゼ内包リポソームの局在確認
１．材料と方法
１−１．グルコセレブロシダーゼ内包リポソームの調製
リポソーム内にグルコセレブロシダーゼを内包した製剤（グルコセレブロシダーゼ内包リポソーム製剤）は、実施例１と同様の手順で作製した。
１−２．凍結切片の作製
グルコセレブロシダーゼ内包リポソーム製剤を投与して２時間後に摘出したマウスの肝臓、脾臓及び腎臓から、常法によって各臓器の凍結切片を各々作製した。
凍結切片はクライオスタットを用いて作製し、スライドグラスに貼り付け、十分に乾燥させた。
１−３．免疫染色
スライドガラスに貼り付けた切片に対して、４％パラホルムアルデヒドＰＢＳ（−）溶液で３０分固定化処理を行った。ＰＢＳ（−）で３回洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（−）溶液で１時間ブロッキング処理を行った。ＰＢＳ（−）洗浄後、一次抗体として抗ウサギグルコセレブロシダーゼ血清及びラット抗マクロファージ抗体を用いて、１％ＢＳＡ存在下、室温で１時間抗体反応を行った。０．３％ポリソルベート２０含有ＰＢＳ（−）溶液で３回洗浄後、２次抗体として抗ウサギＡｌｅｘａ４８８及び抗ラットローダミンを用いて、１％ＢＳＡ存在下、室温で１時間抗体反応を行った。０．３％ポリソルベート２０含有ＰＢＳ（−）溶液で３回洗浄後、封入剤を用いて封入した。
１−４．蛍光観察
蛍光染色マウス肝臓組織切片は、レーザー共焦点顕微鏡を用いて観察した。
２．結果
マウス肝臓切片において肝臓クッパー細胞が染色されていることを確認することができた（図５、上段、中段及び下段のパネルの各赤色染色部分）。また、グルコセレブロシダーゼ内包リポソームを投与したマウス肝臓では、フリー体、生理食塩水投与に比較して（図５、中段及び下段のパネル各赤色染色部分）クッパー細胞が肥大化している様子が確認できた（図５、上段のパネルの赤色染色部分）。
グルコセレブロシダーゼの染色は、グルコセレブロシダーゼ及びグルコセレブロシダーゼ内包リポソームを投与したマウス肝臓のいずれにおいても確認することができた（図５、上段及び中段のパネルの緑色染色部分）。グルコセレブロシダーゼを投与したマウス肝臓では実質細胞への移行を示す蛍光が広範囲に観察されたが、一方でグルコセレブロシダーゼ内包リポソーム製剤を投与したマウス肝臓ではクッパー細胞に限局した蛍光が観察された。また、生理食塩水を投与したマウス肝臓ではグルコセレブロシダーゼに由来する蛍光は観察されなかった（図５、下段中央）。
両蛍光像を重ね合わせた画像により、グルコセレブロシダーゼ内包リポソームを投与したマウス肝臓においてマクロファージとグルコセレブロシダーゼの局在が一致していることが確認された（図５、上段右パネル）。
以上のことから、本発明の酵素内包リポソームは、標的臓器（本実施例の場合は肝臓）への移行性に優れており、酵素補充療法に有用であることが示された。
［考察］
グルコセレブロシダーゼ／フリー体を静脈内投与後、血漿中酵素活性は極めて速やかに減少した。投与後２ｈｒでコントロールの２．７倍を示したが、２４ｈｒで１．４倍まで低下した。一方、リポソーム製剤投与後の血漿中酵素活性については、フリー体に比べて緩慢に減少し、投与後２ｈｒでコントロールの１１２４倍もの活性を示し、２４ｈｒでも１０倍の活性を維持した。また、リポソーム製剤／フリー体の血漿中酵素活性比を求めると投与後２ｈｒでは４１３倍、２４ｈｒでは７倍高いものであり、暴露量の指標となるＡＵＣ２４ｈｒで比較すると２４倍もの増加が認められた。
リソソーム酵素はリソソーム内の弱酸性ｐＨでは安定であるが、血漿などの中性条件では不安定である。本発明者は、本実施例に先立ち、グルコセレブロシダーゼのヒト血漿中安定性についても確認しており、フリー体は極めて不安定であるが、本実施例と同様の処方のリポソーム化により安定化できることを確認している（図４）。このような安定化は血漿という中性環境から酵素を隔離することにより達成できているものと考えられる。この知見を踏まえ、本実施例ではマウスｉｎ  ｖｉｖｏにおいても同様に安定化できることが判り、ＡＵＣを増加させることに成功した。
血漿中動態が改善したことにより、標的組織への送達も増加した。
脾臓ではフリー体投与２ｈｒ後の酵素活性がコントロールの２．１倍であったが、リポソーム投与では７．４倍の値を示した。さらに、２４ｈｒ後ではフリー体ではバックグランドレベルに低下したが、リポソームでは２．４倍の活性を維持した。
肝臓では両製剤ともに２ｈｒで２倍弱の活性増加が認められたが、２４ｈｒではバックグランドレベルであった。脾臓に比べて肝臓への取り込みが少ないようであるが、肝臓全細胞に対するリポソーム製剤が選択的に取り込まれると考えられているクッパー細胞（ターゲット細胞）の割合が約１５％であること及び、一般的にフリー体のほとんどが肝実質細胞に取り込まれることから、十分な量が標的細胞に取り込まれているものと考えられる。
そこで、上記を明らかにするために肝臓切片の免疫染色を行った結果、グルコセレブロシダーゼ内包リポソームは標的細胞である肝臓のクッパー細胞に選択的に取り込まれていることが示された（図５）。
今回の結果から、グルコセレブロシダーゼのリポソーム製剤化により、標的組織（細胞）に対するより効果的な送達が達成できることが確認できた。この要因の一つとして血中滞留性の改善が挙げられる。すなわち、フリー体では標的組織に取り込まれるより前に投与された酵素のほとんどが活性を消失しているのに対し、リポソーム製剤では血中安定性を獲得したことにより、失活しない状態で体循環しており、これらが徐々に且つ効率的に組織に取り込まれたものと言える。
【産業上の利用可能性】
【０００８】
本発明によれば、血中安定性及び標的臓器への移行性に極めて優れた脂質小胞体組成物を提供することができる。また、当該組成物を有効成分として含むゴーシェ病治療薬を提供することができる。さらには、当該組成物の製造方法、酵素の安定化方法、及び、ゴーシェ病の治療方法を提供することができる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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