(57)【要約】一対の生体特異的親和性（ｂｉｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有する物質の一方の構成員を、表面に結合した微粒子であって、該表面にさらに、ポリエチレングリコールセグメントを含有するポリマー誘導体が直接結合されている微粒子、並びにその微粒子の生体関連物質の精製等への使用が開示される。かような微粒子を使用することにより、効率のよい高い生体関連物質の精製方法等が提供できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一対の生体特異的親和性（ｂｉｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有する物質の一方の構成員を、直接もしくはスペーサーを介して表面に結合した微粒子であって、該表面にさらに、ポリエチレングリコールセグメントを含有するポリマー誘導体が直接結合されており、かつ、該誘導体中のポリエチレングリコール鎖が水性媒体中で自由に運動しうる形態にある微粒子を、前記生体特異的親和性を有する物質のもう一方の構成員を含有し、そして該微粒子に非特異的に結合しうる物質の存在が疑われる試料と水性媒体中で接触させる段階、及び
該微粒子上の該一方の構成員を該もう一方の構成員と選択的に結合を形成させる段階
を含んでなる一対の生体特異的親和性を有する物質の一方の構成員ともう一方構成員との特異的結合対の形成方法。
【請求項２】
一対の生体特異的親和性（ｂｉｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有する物質の一方の構成員を、直接もしくはスペーサーを介して表面に結合した微粒子であって、該表面にさらに、ポリエチレングリコールセグメントを含有するポリマー誘導体が直接結合されており、かつ、該誘導体中のポリエチレングリコール鎖が水性媒体中で運動しうる形態にある微粒子の、前記生体特異的親和性を有する物質のもう一方の構成員を含有し、そして該微粒子に非特異的に結合しうる物質の存在が疑われる試料中の該もう一方の構成員と微粒子上の該一方の構成員との選択的な結合を形成させる担体のための使用。
【請求項３】
微粒子の平均粒径が、０．０２μｍ〜５ｍｍである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
微粒子の平均粒径が、０．０２μｍ〜５ｍｍである、請求項２記載の使用。
【請求項５】
選択的に結合を形成させることが、試料中の一対の生体特異的親和性を有する物質のもう一方の構成員を検出すること、精製すること、または該結合を形成する物質のスクリーニングを目的にするものである請求項１または３記載の方法。
【請求項６】
選択的に結合を形成させることが、試料中の一対の生体特異的親和性を有する物質のもう一方の構成員を検出すること、精製すること、または該結合を形成する物質のスクリーニングを目的にするものである請求項２または４記載の使用。
【請求項７】
ポリエチレングリコール誘導体のポリエチレングリコールセグメントが、重合度２〜１００００からなる請求項１、３及び５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ポリエチレングリコール誘導体のポリエチレングリコールセグメントが、重合度２〜１００００からなる請求項２、４及び６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ポリエチレングリコール誘導体が、ポリアミンセグメントを有するブロック共重合体である請求項１、３、５及び７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ポリエチレングリコール誘導体が、ポリアミンセグメントを有するブロック共重合体である請求項２、４、６及び８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
ポリアミンセグメントが、下記一般式（１）及び（２）で表される請求項９記載の方法：
2006036003.tif 000007
式中、ｍは１〜１０の整数を表し、ｎは１〜１００の整数を表し、そしてＲ１及びＲ２は、互いに独立して、水素原子もしくは炭素原子数が１〜５のアルキル基である；
2006036003.tif 000008
式中、ｘ＋ｙは１〜３０までの整数であり、Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ独立して水素原子または炭素原子数が１〜５のアルキル基を表す。
【請求項１２】
ポリアミンセグメントが、下記一般式（１）及び（２）で表される請求項１０記載の使用：
2006036003.tif 000009
式中、ｍは１〜１０の整数を表し、ｎは１〜１００の整数を表し、そしてＲ１及びＲ２は、互いに独立して、水素原子もしくは炭素原子数が１〜５のアルキル基である；
2006036003.tif 000010
式中、ｘ＋ｙは１〜３０までの整数であり、Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ独立して水素原子または炭素原子数が１〜５のアルキル基を表す。
【請求項１３】
微粒子が、磁性体を含んでなる、請求項１、３、５、７、９及び１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
微粒子が、磁性体を含んでなる、請求項２、４、６、８，１０及び１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
微粒子が、磁性体を包埋した形態もしくは表層に有する形態にあるラテックス粒子、または磁性体をシリカもしくは金属アルコキシドで被覆した形態にある無機粒子である請求項１、３、５、７、９、１１及び１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
微粒子が、磁性体を包埋した形態もしくは表層に有する形態にあるラテックス粒子、または磁性体をシリカもしくは金属アルコキシドで被覆した形態にある無機粒子である請求項２、４、６、８、１０、１２及び１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
水性媒体中に分散している、一対の生体特異的親和性を有する物質の一方の構成員が直接もしくはスペーサーを介して表面に結合された微粒子を、該水性媒体中でポリエチレングリコールセグメントを含有するポリマー誘導体と接触させる段階、及び、
該微粒子表面に該ポリマー誘導体を結合させる段階、
を含んでなる一対の生体特異的親和性を有する物質の一方の構成員を、直接もしくはスペーサーを介して表面に結合した微粒子表面の改質方法。
【請求項１８】
該微粒子が、磁性体を包埋した形態もしくは表層に有する形態にあるラテックス粒子、または磁性体をシリカもしくは金属アルコキシドで被覆した形態にある無機粒子であり、ポリマー誘導体がポリエチレングリコールセグメント及びポリアミンセグメントを有する共重合体であって、ポリエチレングリコールセグメントが、重合度２〜１００００からなり、かつ、ポリアミンセグメントが、下記一般式（１）及び（２）：
2006036003.tif 000011
式中、ｍは１〜１０の整数を表し、ｎは１〜１００の整数を表し、そしてＲ１及びＲ２は、互いに独立して、水素原子もしくは炭素原子数が１〜５のアルキル基である；
2006036003.tif 000012
式中、ｘ＋ｙは１〜３０までの整数であり、Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ独立して水素原子または炭素原子数が１〜５のアルキル基を表す、のポリアミンのいずれかである、請求項１５記載の改質方法。
【請求項１９】
該微粒子が、磁性体を包埋した形態もしくは表層に有する形態にあるラテックス粒子であって、かつ、ラテックス表面にカルボキシル基が存在するものであり、そしてポリマー誘導体がポリエチレングリコールセグメント及びポリアミンセグメントを有する共重合体であって、ポリエチレングリコールセグメントが、重合度２〜１００００からなり、かつ、ポリアミンセグメントが、一般式（２）で表される請求項１８記載の改質方法。
【請求項２０】
一対の生体特異的親和性を有する物質の一方の構成員が、直接もしくはスペーサーを介して表面に結合しており、そしてポリエチレングリコール鎖が水性媒体中で運動しうる形態でポリエチレングリコールセグメントを含有するポリマー誘導体が表面に直接結合した微粒子であって、
該微粒子が、磁性体を包埋した形態もしくは表層に有する形態にあるラテックス粒子であり、かつ、ラテックス表面にカルボキシル基が存在するものであり、そしてポリマー誘導体がポリエチレングリコールセグメント及びポリアミンセグメントを有する共重合体であって、ポリエチレングリコールセグメントが、重合度２〜１００００からなり、かつ、ポリアミンセグメントが、一般式（２）；
2006036003.tif 000013
式中、ｘ＋ｙは１〜３０までの整数であり、Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ独立して水素原子または炭素原子数が１〜５のアルキル基を表す、で表されるポリアミンである、微粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、一対の生体特異的親和性（ｂｉｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有する物質の一方の構成員、例えば、抗体もしくは抗原、核酸等が結合した微粒子の、生物試料中に含まれる該構成員に対するもう一方構成員を検出、分離・精製するための使用、並びに該微粒子に関する。
【背景技術】  従来、血液、体液、生体組織から得られる破砕液、抽出液、無細胞タンパク質合成液などの試料（以下、これらを総称して「生物試料」と呼ぶ）中の特定の目的物質を、効率よく検出するか、または高収率で分離・精製するための多種多様な方法、手段およびアプローチが存在する。
一般的なアプローチの例として、分離担体に対する特異的親和性を利用する場合には、例えば、目的薬物に対して特異的に結合し得る抗体、目的配列を有する核酸に相補的な配列を有する核酸、あるいは目的物が細胞である場合には該細胞に特異的に発現する因子もしくはレセプターに特異的に結合しる抗体もしくはリガンドを水不溶性固相担体に固定した分離単体が使用されている。通常、このような分離担体をカラムに充填後、当該抗体、リガンド等と親和性を有し、特異的に結合し得る物質を含む生物試料をカラムに添加することにより、該物質を分離担体と接触させ、当該抗体、リガンド等と該物質の複合体を形成させ、適宜、バッファー等で洗浄の後、続いて、例えば非常にイオン強度が高いバッファー、界面活性剤溶液、または非常にｐＨが高いかもしくは低いバッファーにより、複合体を解離させて該物質を溶出させ、取得することを含んでなるアフィニティークロマトグラフィーが汎用されている。このアフィニティークロマトグラフィーは、目的とする物質と固相に固定化された、例えば、リガンドとの間の特異的な相互作用を利用する非常に選択的であり、かつ効果的な精製方法である。
しかしながら、この方法では回収率が悪く、また非常に時間がかかり、場合によっては精製した生体分子が変性して活性を失ってしまう可能性があるため、使用に際し、低温室、クロマトチャンバー等の特殊な施設の使用を必要とするという欠点があった。
一方、別法として、ミクロスフェア等の微粒子担体上で、上記複合体を形成させ、遠心分離等により分離担体を回収し、必要に応じ、適宜、バッファー等で洗浄した後、次いで必要に応じて、例えば、非常にイオン強度が高いバッファー、または非常にｐＨが高いかもしくは低いバッファーに上記複合体をさらすことにより、親和性により分離担体上に結合した目的物質を解離、溶出させる方法もある。
このような微粒子担体を用いて、目的物質、例えば特定のタンパク質を分離回収し、電気泳動、ウエスタンブロット等で検出する方法は、特に免疫沈降法（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）と呼ばれ、細胞抽出液等から微量タンパク質を検出する上で、非常に有用な手段である。しかしながら、この方法は、固相担体として用いるミクロスフェア表面へ、夾雑物が非特異吸着し、分離効率が悪くなることがよくある。
近年、生体関連物質の検出、分離に関する従来技術を実施する際の煩雑さの解消、および分離効率の向上を目的として、このような微粒子担体による検出法や分離法が注目され、種々の微粒子が提案されている。例えば、特開平１０−１９５０９９号公報（またはＥＰ７８７９８８Ａ２，以下、文献１という）に記載されたミクロスフィア、特開平１１−１９１５０９号公報（以下、文献２という）もしくは特開平１１−１９１５１０号公報（以下、文献３という）に記載された磁性粒子、さらに、本発明者等の一部による出願に基づくＷＯ  ２００４／０５６８９５Ａ１（以下、文献４という）に記載されたポリオキシエチレン鎖の一端でラテックス粒子に結合子し、該鎖の他端にリガンド等を担持しうるラテックス粒子が挙げられる。
文献１には、スチレン−グリシジルメタクリレート重合体にスペーサーを介して生理活性を有する物質を結合したミクロスフィアが記載されている。このミクロスフィアは該生理活性を有する物質に対して親和性を有する生物試料中の物質と効率よく特異的に結合し得ること等に利点を有することが示唆されている。文献２には磁性体とは異種の金属酸化物で被覆された磁性体からなり、表面に核酸が吸着せしめられた磁性粒子が、また、文献３には、磁性を有する金属または金属化合物からなる粒子をポリマーで被覆した磁性ポリマー粒子であって、表面に特定の抗体が吸着せしめられた磁性粒子が、記載されている。また、文献３では、さらに、かような磁性粒子を、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と、０．１％のポリエチレングリコールとを含むリン酸生理食塩緩衝液の溶液に振動分散させた後、室温で３０分間ゆるく振とうして、前記抗体が吸着されていない粒子表面をアルブミンでブロッキング処理した微粒子も記載されている。
しかしながら、目的以外の、すなわち、興味の対象でない、タンパク質、脂質、無機塩等が一般に混在する生体試料中から、例えば、文献１〜３のいずれかに記載の微粒子を用いて特定の物質を単離／精製するには、共存する分子の微粒子表面への非特異吸着が特異的反応と共に生じると同時に、粒子が容易に凝集、沈殿することがあり、分離効率、回収率が低下する場合があった。
【発明の開示】
文献３の粒子表面をアルブミンでブロッキング処理した微粒子は前記の非特異的吸着をある程度抑制でき、また、文献４に記載された粒子では、当該非特異的吸着をより一層抑制することができる。しかし、文献３に記載の微粒子にあっては、さらに当該非特異的吸着をより一層抑制でき、または、文献４に記載の微粒子にあっては、別の調製方法で取得でき、もしくは異なる構造を有するが、該微粒子と同等もしくはそれ以上の非特異的吸着特性を有する微粒子を提供できると、当該技術分野の進歩に寄与するであろう。
例えば、文献１、文献２または文献３（また、文献３で引用されている文献に記載された磁性体を含むポリマー粒子を含む）に記載された、リガンドもしくは抗体等が場合によりスペーサーを介して結合した微粒子が、ポリエチレングリコール（以下「ＰＥＧ」と略記することもある）鎖が水性媒体中で自由に運動しうるようにポリエチレングリコールセグメントを含有するポリマー誘導体を、さらに微粒子表面に結合させると、上記の非特異的吸着を有意に低下させることができることが、見出された。こちらは、市販されている微粒子から容易に作製できる点にも利点がある。
こうして、本発明は、
第一の態様として．一対の生体特異的親和性（ｂｉｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有する物質の一方の構成員を、直接もしくはスペーサーを介して表面に結合した微粒子であって、該表面にさらに、ポリエチレングリコールセグメントを含有するポリマー誘導体が直接結合されており、かつ、該誘導体中のポリエチレングリコール鎖が水性媒体中で自由に運動しうる形態にある微粒子を、前記生体特異的親和性を有する物質のもう一方の構成員を含有し、そして該微粒子に非特異的に結合しうる物質の存在が疑われる試料と水性媒体中で接触させる段階、及び
該微粒子上の該一方の構成員を該もう一方の構成員と選択的に結合を形成させる段階、
を含んでなる一対の生体特異的親和性を有する物質の一方の構成員ともう一方構成員との特異的結合対の形成方法、
または、
前記微粒子の、前記生体特異的親和性を有する物質のもう一方の構成員を含有し、そして該微粒子に非特異的に結合しうる物質の存在が疑われる試料中の該もう一方の構成員と微粒子上の該一方の構成員との選択的な結合を形成させる担体のための使用、
を提供する。
また、別の態様の本発明として、前記微粒子の内の特定の微粒子の、従来の微粒子の改質による製造方法、及び特定の微粒子も提供される。
発明の詳細な記述
本発明にいう、一対の生体特異的親和性を有する物質は、限定されるものでないが、抗体と抗原（またはハプテン）、薬物（またはリガンド）とそのレセプター（レセプターを発現している細胞を含む）、ある一本鎖オリゴもしくはポリヌクレオチドとその相補的ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、酵素とその基質、及び糖とレクチン等を挙げることができる。本発明で使用する微粒子には、前記物質間の対を形成するいずれか一方構成員である化合物もしくは物質が、微粒子表面の特性に応じてそれらの表面に物理的もしくは化学的に結合される。結合は、さらにスペーサーを介して達成されてもよい。かような、スペーサーには、例えば、文献１に記載されるようなエチレングリコールジグリシジルエーテル等の両末端が官能基を有するように修飾された化合物の官能基を利用して一対の生体特異的親和性を有する物質の一構成員と微粒子が結合、特に、共有結合されていてもよい。エチレングリコールは、ジ−、トリ−、テトラーエチレングリコール等のオリゴエチレングリコールであることができ、また、官能基は、グリシジル基に代え、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基またはスルホ基等であることができる。抗体等の高分子量の分子を微粒子に結合させる場合には、該分子に対する抗原との結合特性に悪影響を及ぼさない限り、抗体を直接微粒子に結合させることができる。
このような微粒子には、前記の文献１、文献２、文献３及びそれらの中で引用されている公知の微粒子からなる群より選ばれ、本発明の目的に使用できるものであれば、如何なる微粒子も包含される。したがって、引用することにより、文献１〜３の記載事項は、本明細書の内容となる。かかる、微粒子は、本発明の目的上、それらの平均粒径が、０．０２μｍ〜５ｍｍ、好ましくは０．０５μｍ〜１００μｍである。
本発明によれば、該微粒子は、ポリエチレングリコールセグメントを含有するポリマー誘導体が直接結合（物理的、例えば、イオン結合、水素結合、疎水結合等またはこれらの複数種の結合により、または化学、特に、共有結合により）されており、かつ、該誘導体中のポリエチレングリコール鎖が水性媒体中で自由に運動しうる形態にある。水性媒体中とは、緩衝剤の溶液、生物試料、例えば、血液、尿、体液、細胞破砕物含有緩衝液、細胞抽出液等、の本発明の目的に沿うそれらの水性溶液，希釈液、水性縣濁液、等をいう。ポリエチレングリコール鎖がかような水性媒体中で自由に運動しうる形態にあるとは、微粒子に非結合（または非付着）末端側のポリエチレングリコール鎖が水性媒体中に溶解した状態にあり、好ましくは、微粒子に結合した前記構成員が結合していない微粒子表面をポリエチレングリコール鎖からなるブラシ構造体が実質的に被覆しうるような状態にあることを意味する。表面に複数のポリエチレングリコール鎖を有するポリエチレングリコール鎖が水性媒体中でブラシ構造を有しうることは当該技術分野で周知であり、本明細書では、そのような周知の意味で用いている。
該ポリエチレングリコール誘導体は、その中のポリエチレングリコールセグメントが、重合度２〜１００００、好ましくは４０〜５００を有し、そして前記微粒子表面にポリエチレングリコール鎖が水性媒体中で自由に運動しうる形態で保持もしくは固定されるように結合できる部位乃至領域を構成する残基もしくは分子の部分を有する。このような部位乃至領域は、オリゴ−もしくはポリアミンからなるセグメントであり、ポリエチレングリコールとポリアミンのブロック共重合体であることができる。ポリアミンセグメントは、下記一般式（１）及び（２）で表されるポリマーセグメントであることができる。
一般式（１）：
2006036003.tif 000002
式中、ｍは１〜１０の整数を表し、ｎは１〜１００の整数を表し、そしてＲ１及びＲ２は、互いに独立して、水素原子もしくは炭素原子数が１〜５のアルキル基である。
一般式（２）：
2006036003.tif 000003
式中、ｘ＋ｙは１〜３０までの整数であり、Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ独立して水素原子または炭素原子数が１〜５のアルキル基を表す。
このようなポリエチレングリコール誘導体が表面に結合された微粒子（以下、ＰＥＧ修飾微粒子ともいう）で、特に好ましいものは、一対の生体特異的親和性を有する物質の一方の構成員が、直接もしくはスペーサーを介して表面に結合しており、そしてポリエチレングリコール鎖が水性媒体中で運動しうる形態でポリエチレングリコールセグメントを含有するポリマー誘導体が表面に直接結合した微粒子であって、該微粒子が、磁性体を包埋した形態もしくは表層に有する形態にあるラテックス粒子であり、かつ、ラテックス表面にカルボキシル基が存在するものであり、そしてポリマー誘導体がポリエチレングリコールセグメント及びポリアミンセグメントを有する共重合体であって、ポリエチレングリコールセグメントが、重合度２〜１００００からなり、かつ、ポリアミンセグメントが、一般式（２）；
2006036003.tif 000004
式中、ｘ＋ｙは１〜３０までの整数であり、Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ独立して水素原子または炭素原子数が１〜５のアルキル基を表す、で表されるポリアミンである、微粒子を挙げることができる。
ＰＥＧ修飾微粒子は、一例を挙げれば、水性媒体中に分散している、一対の生体特異的親和性を有する物質の一方の構成員が直接もしくはスペーサーを介して表面に結合された微粒子を、該水性媒体中でポリエチレングリコールセグメントを含有するポリマー誘導体と接触させる段階、及び該微粒子表面に該ポリマー誘導体を結合させる段階、を含んでなる一対の生体特異的親和性を有する物質の一方の構成員を、直接もしくはスペーサーを介して表面に結合した微粒子表面の改質方法により、都合よく製造できる。この改質方法では、該微粒子が、磁性体を包埋した形態もしくは表層に有する形態にあるラテックス粒子であるか、または磁性体をシリカもしくは金属アルコキシドで被覆した形態にある無機粒子であり、好ましくは、磁性体を包埋した形態もしくは表層に有する形態にあるラテックス粒子であって、かつ、ラッテックス表面にカルボキシル基が存在するものであり、他方、ポリマー誘導体がポリエチレングリコールセグメント及びポリアミンセグメントを有する共重合体であって、ポリエチレングリコールセグメントが、重合度２〜１００００からなり、かつ、ポリアミンセグメントが、下記一般式（１）及び（２）：
2006036003.tif 000005
式中、ｍは１〜１０の整数を表し、ｎは１〜１００の整数を表し、そしてＲ１及びＲ２は、互いに独立して、水素原子もしくは炭素原子数が１〜５のアルキル基である；
2006036003.tif 000006
式中、ｘ＋ｙは１〜３０までの整数であり、Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ独立して水素原子または炭素原子数が１〜５のアルキル基を表す、のポリアミンのいずれかであり、好ましくは、一般式（２）で表されるポリアミンを使用するのがよい。
上記の微粒子とポリマー誘導体と接触させる段階、及び該微粒子表面に該ポリマー誘導体を結合させる段階は、水性媒体中で、一方の構成員のもう一方の構成員に対する結合特性に悪影響を及ぼさない条件下、例えば、室温以下の温度で、単に、ポリマー誘導体が、該微粒子表面にイオン結合、水素結合、疎水結合等の物理的結合またはこれらの２種以上の結合がもたらされる条件下で、または該微粒子表面にカルボキシル基等の官能基が存在する場合には、縮合脱水剤（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）等）の存在する緩和な条件下で、該官能基と、例えば、ポリマー誘導体中に存在するアミノ基との間でアミド結合を形成させる条件下で行うことができる。
ＰＥＧ修飾微粒子は、該微粒子上の一方の構成員と特異的親和性を有し、特異的な対合物、もしくは複合体を形成するもう一方の構成員と、それらを含み、かつ、該微粒子に非特異的に結合しうる物質の存在が疑われる試料、特に、生物試料、例えば、血液、尿、体液、細胞破砕物含有緩衝液、細胞抽出液等それ等自体、またはそれらの希釈もしくは緩衝化された水性媒体中で接触させると、該微粒子上の該一方の構成員を該もう一方の構成員と選択的に結合が形成できるので、該試料中での、一対の生体特異的親和性を有する物質の一方の構成員ともう一方構成員との特異的結合対の形成方法に使用できる。このような使用は、該試料中に存在するもう一方の構成員を検出すること、精製すること、または該結合を形成する物質のスクリーニング方法を提供するのに使用できる。
例えば、もう一方の構成員たる物質を含有する試料から、該物質を精製する場合には、上記の特異的結合対を形成したのち、結合物を遠心により、また、使用する粒子が磁性粒子である場合には、磁界を印加することにより集め、水もしくは適当な緩衝液等で洗浄し、非特異的に吸着した夾雑物を洗い流した後、結合物をイオン強度が高い緩衝液、界面活性剤溶液、ｐＨが高いかもしくは低い緩衝液を用いて処理、例えば、当該溶液中でのインキュベーション、することにより該特異的結合対を形成した複合体から目的の物質を単離することができる。
また、例えば、特定のレセプターに特異的に結合する薬物をスクリーニングする場合には、興味のあるレセプターを発現している動物細胞、微生物細胞、およびそれらの破砕物から取得されるレセプタータンパク質が結合した微粒子を調製し、該微粒子とスクリーニングにかけるべき化合物もしくは物質と適当な緩衝剤溶液中でインキュベートする。次いで、洗浄により、特異的に結合した複合体が得られたなら、該複合体から、特異的に結合していた化合物もしくは物質を同定する。こうして同定された化合物もしくは物質を、当該レセプターを担持する細胞もしくは該細胞を有する動物を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏ試験に供し、それらが本来レセプターに対するリガンドのアンタゴニストもしくはアゴニストであるかについて評価し、目的化合物であるか否かを決定すればよい。
こうして、本発明によれば、ＰＥＧ修飾微粒子を使用する該試料中に存在するもう一方の構成員の検出方法もしくは分離もしくは精製方法、または該結合を形成する物質のスクリーニング方法が提供される。
該試料中での、微粒子上に結合された一対の生体特異的親和性を有する物質の一方の構成員ともう一方構成員との特異的結合対の形成方法は、限定されるものでないが、室温中、試料中に添加したＰＥＧ修飾微粒子を適当な時間、通常、１〜２４時間、インキュベートすることにより、実施できる。
上述したとおり、本発明に従う精製方法等が実施される場合には、表面に特異的リガンドを結合した微粒子、好ましくは、磁性粒子に、試料中から前記生体特異的親和性を有する物質を選択的に結合させ、磁気分離と洗浄とを行って非特異的結合した夾雑物を除き、磁性粒子から目的物質を分離する操作を行えばよい。前記ＰＥＧ修飾微粒子は、生理学的条件下での分散性に優れ、高イオン強度、あるいはタンパク等の夾雑物下でも沈降しにくい性質を持ち、その結果、リガンド等の特異的親和性を有する分子との結合効率が極めて高く、精製の収率、純度を向上させることができる。なお、微粒子に磁性を付与する磁性体は、本発明の目的に沿う限りいかなる種類もしくは起源によるものであっても使用できるが、磁気応答性を有する金属酸化物、限定されるものでないが、例えば、鉄、コバルト、ニッケル等の金属酸化物が挙げられ、特に、マグネタイト、マグヘマイト、マンガン酸亜鉛フェライト等の強磁性酸化鉄を好ましいものとして挙げることができる。
前記ＰＥＧ修飾微粒子は、磁性粒子修飾用ＰＥＧ溶液と非修飾微粒子、抽出用緩衝液、洗浄用緩衝液、溶出用緩衝液よりなる生体物質を高純度で単離するための試薬キットとして供することもできる。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明のＰＥＧ修飾磁性粒子（Ａ）、ＢＳＡ（Ｂ）、ゼラチン（Ｃ）を用いた場合の細胞抽出液処理後の分散性の比較を示す写真である。
図２は、本発明のＰＥＧ修飾磁性粒子（Ａ）ＢＳＡ（Ｂ）、ゼラチン（Ｃ）でコーティングした磁性粒子を用いて行った免疫沈降法の結果を示す。それぞれ左が銀染色、右がウエスタンブロットの結果を示す写真である。
図３は、本発明の磁性粒子とＢＳＡコーティングした磁性粒子を用いた場合の、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）を同じ濃度を含有する細胞抽出液からの回収率の比較結果を示すウエスタンプロットの結果を示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を具体例に基づいてより具体的に述べる。ただし、本発はこれらの例にのみ限定されるものではない。
製造例１：（オリゴアミン−ポリエチレングリコール共重合体（以下、ＮＸ−ＰＥＧ（１）と略記する）の製造）
アルゴン雰囲気下のナスフラスコに、溶媒として脱水テトラヒドロフラン（以下、ＴＨＦと略記する）２０ｍＬ、開始剤として２−メトキシエタノール１ｍｍｏｌ（８０．４μＬ）を入れ、そこにカリウムナフタレン１ｍｍｏｌ（０．３５ｍｏｌ／Ｌ  ＴＨＦ溶液２．８６ｍＬ）を加えてマグネチックスターラーにより１０分間攪拌後、アルコキシド化した開始剤に対して、蒸留エチレンオキシド（以下、ＥＯと略記する）１１４ｍｍｏｌ（約５．７ｍＬ）を冷やしたガラス製シリンジによって加え、常温で２４時間攪拌しＥＯの開環重合を行った。時間後、４−（ブロモメチル）安息香酸メチル５ｍｍｏｌ（１ｍｏｌ／Ｌ  ＴＨＦ溶液１．１５ｍｇ）を停止剤として反応系に加え、室温で２時間攪拌することによって重合反応を停止した。上記反応物を２０倍量のジエチルエーテルに対して滴下し、再沈法によって未反応物およびオリゴマーを除去した。次いで、沈殿物を適量のクロロホルムに溶解したのち飽和食塩水に対して抽出操作を行い、系内の塩を除去した。クロロホルム相を回収し、減圧下で溶媒を除去したのち、ベンゼンに再溶解し後凍結乾燥することによって末端にメチルエステルを有するポリマー（以下、ＭｅＯ−ＰＥＧ−Ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏａｔｅと略記する）が得られた。次いで、５０ｍＬナスフラスコに、上記ＭｅＯ−ＰＥＧ−Ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏａｔｅ  １ｇ（２６３μｍｏｌ）およびＰＥＧの１００倍モル量に相当するペンタエチレンヘキサミン（以下、ＰＥＨＡと略記する）６．２ｍＬ（２６３ｍｍｏｌ）を入れ、湯浴中１２０℃で２４時間攪拌し、ＰＥＧ末端にオリゴアミンを導入した。反応液を少量のメタノールに溶解したのち、冷却したイソプロピルアルコール（以下、ＩＰＡと略記する）に滴下するＩＰＡ再沈法によって未反応のＰＥＨＡを除去し、さらに未反応物を完全に除くため、沈殿物を遠心分離（４℃以下、５，０００ｒｐｍ、２０分）により回収し、再度少量のメタノールに溶解し、ＩＰＡ再沈による精製を計３回繰り返し、最終的にベンゼン凍結乾燥によって目的物であるポリマー誘導体（ＭｅＯ−ＰＥＧ−Ｐｈｅｎｙｌ−Ｎ５（以下、Ｎ５−ＰＥＧと略記する））を得た。
製造例２：（ＮＸ−ＰＥＧ（２）の製造）
片末端に１級アミンを有するＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ２（日本油脂株式会社製：ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−５０Ｈ）１ｇ（１９６μｍｏｌ）と、分子内に２つのメチルエステルを有するコハク酸ジメチル１２．８ｍＬ（ＰＥＧの５００倍モル量に相当）を５０ｍＬナスフラスコに加え、湯浴中１２０℃で２４時間攪拌を行った後、反応液を少量のメタノールに溶解し、ＩＰＡ再沈を行った。沈殿物は遠心分離（４℃以下、５，０００ｒｐｍ、２０分）により回収し、再度少量のメタノールに溶解し、ＩＰＡ再沈による精製を計３回繰り返すことによって未反応のコハク酸ジメチルを完全に除去した。沈殿物をベンゼン凍結乾燥によって回収し、片末端に有するＰＥＧ誘導体（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＣＨ３）を得た。
該ＰＥＧ誘導体５００ｍｇ（１０２μｍｏｌ）とＰＥＨＡ  １１．９ｍＬ（ＰＥＧの５００倍モル量）を脱水クロロホルムを含む５０ｍＬナスフラスコに加え、湯浴中１２０℃で２４時間攪拌し、ＰＥＧ末端へのオリゴアミンの導入を行った。時間後、反応液を少量のメタノールに溶解し、ＩＰＡ再沈を行い、沈殿物は遠心分離（４℃以下、５，０００ｒｐｍ、２０分）により回収した。再度少量のメタノールに溶解し、ＩＰＡ再沈による精製を計３回繰り返す事によって未反応のＰＥＨＡを完全に除去した。沈殿物をベンゼン凍結乾燥によって回収し、ＰＥＧ末端へのオリゴアミンが導入された目的物（以下、ＭｅＯ−ＰＥＧ−Ｎ５と略記する）を得た。
（磁性粒子のＰＥＧコーティングの方法および分散性評価）磁性粒子への抗体担持方法：
表面にカルボキシル基を有する磁性粒子（磁性体がポリスチレンをベースとする樹脂に被覆されている：固形分濃度１０％／ＰＢＳ分散液；ＪＳＲ社、東京、製）１５０μｌを５０ｍＭ  ２−モルホリノエタンスルホン酸（以下、ＭＥＳと略記する）バッファー（ｐＨ５．０）１．０ｍｌに分散させた後、磁性粒子を磁石にて回収し上清を除去した。この操作をさらに１回繰り返し、磁性粒子の洗浄を行った。５０ｍＭ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ５．０）１．０ｍｌを加え磁性粒子を分散させた後、室温にて１５分間静置し、次いで、上清を除去した後、５０ｍＭ  ＭＥＳバッファー３６０μｌを加え、再度磁性粒子を、分散させた。ここに５０ｍｇ／ｍｌ  Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｓ−ＮＨＳ）７．５μｌを加えて攪拌し、さらに５０ｍｇ／ｍｌ  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノ）カルボジイミド７．５μｌを加えて攪拌した。これを２０分間振とうし、上清を除去した後、１００ｍＭ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．０）を７１４μｌ加えて分散させ、ここに抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）マウスモノクローナル抗体溶液３６μｌを添加し、攪拌した。これを回転させながら２時間室温にて反応させた。反応終了後１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５）（ＰＢＳ）  １ｍｌにて抗体が固定された磁性粒子を２回洗浄し、１５００μｌのＰＢＳに分散した。
ＰＥＧコーティング方法：
抗体の固相化後、余剰のカルボキシル活性サイトのブロッキングを、Ｎ５−ＰＥＧを用いて行った。抗体を固相化した磁性粒子分散液（１％）を２００μｌ分取し上清を除去した後１％濃度のＮ５−ＰＥＧのＰＢＳ溶液を２００μｌ加え、攪拌後、室温にて１時間振とうし、４℃にて一晩静置した。未結合ポリマーを除去するためにＰＢＳにて２回洗浄した後、ＰＢＳ  １００μｌを加えて磁性粒子を分散させた。
分散性の比較：
ＰＥＧコーティングの方法に準拠しＢＳＡ及びゼラチンを用いたコーティングを行った。それぞれ、ＰＥＧ、ＢＳＡ及びゼラチンでコーティングを行った磁性粒子を用いて、細胞抽出液で処理した際の分散性の比較を行った。磁性粒子分散液５０μｌをエッペンドルフチューブに取り、上清を除去後、細胞抽出液（ＮＩＨ３Ｔ３）１００μｌを添加、攪拌し、１時間室温にて振とうして反応させた。上清を除去後２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０），０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）にて１回洗浄後の分散性を比較した。
図１に示すように、従来技術であるＢＳＡ、あるいはゼラチンを用いた処理系に比べ、本発明のＰＥＧ修飾微粒子は、水性媒体中での分散安定性が、著しく向上することが明らかである。
（生体特異的親和性磁性粒子を用いた特異的結合タンパク質の免疫沈降）
抗体結合後ＰＥＧでコーティング処理した磁性粒子を用いて以下の操作を行った。また、比較として、それぞれ、ＢＳＡ及びゼラチンコーティングした磁性粒子を用いた。磁性粒子分散液５０μｌをエッペンドルフチューブに取り、上清を除去後、ＡＦＰを１００ＩＵ／ｍｌとなるように添加したＮＩＨ３Ｔ３細胞抽出液１００μｌを加え、分散後、室温にて振とう反応した。上清を除去後ＴＢＳＴ２００μｌにて３回洗浄しＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｌａｅｍｍｌｉ）２５μｌを加えた。沸騰水にて３分間処理後、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミド１０％ゲル）にて分離した。さらに銀染色することによりタンパク質のバンドを、ウエスタンブロット法にてＡＦＰの活性の確認を行った。銀染色法はアマシャム社より購入した銀染色キットを用いて常法により行った。ウエスタンブロット法は、ＴＲＡＮＳ−ＢＬＯＴ  ＳＤ  ＳＥＭＩ  ＤＲＹ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＣＥＬＬ（バイオラッド社製）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動後のゲルからポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜へ蛋白を転写することにより実施した。転写条件は、１ｃｍ２あたり１ｍＡの定電流で、２時間行った。その後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液中で３０分間ブロッキングを行い、さらに５０００倍希釈した抗ＡＦＰウサギ抗体（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液）室温にて１時間振とう反応した。ＴＢＳＴにて３回洗浄後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液にて５０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ウサギ抗体（ヤギ）を加え、４℃にて一晩静置反応した。ＴＢＳＴにて３回洗浄した後、５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ／Ｎｉｔｒｏ  ｂｌｕｅ  ｔｅｒａｚｏｌｉｕｍ  （ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）基質溶液中で反応させた。
図２に示すように、本発明のＰＥＧ修飾磁性微粒子を用いることにより、従来技術のＢＳＡ、ゼラチンに比べ、非特異な夾雑物の量が減少するのと同時に、図３に示すように、同じ濃度の細胞抽出液からのタンパク質の回収率が著しく向上した。
【産業上の利用可能性】  上述したように、本発明の、例えば、リガンドを固定したＰＥＧ修飾磁性微粒子は、従来の磁性粒子に比べて、非特異的な夾雑物を含まず、また、高収率、高純度の生体物質の分離精製法に使用できる。したがって、本発明は医療産業で利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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