(57)【要約】ＩｇＡモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ及びＩｇＡモノクローナル抗体の製造方法、及びＩｇＡモノクローナル抗体の提供。  架橋した抗原を用いて非ヒト哺乳動物を経鼻的に免疫すること、上記動物の鼻腔関連リンパ組織から免疫グロブリンＡを発現するＢ細胞を得ること、得られたＢ細胞をマウスミエローマ細胞と細胞融合させ、ハイブリドーマを得ること、及び得られたハイブリドーマの中から、上記抗原に特異的な免疫グロブリンＡを分泌するハイブリドーマをクローニングすることを含む、免疫グロブリンＡモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの製造方法、及び上記方法によって製造されるＩｇＡモノクローナル抗体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
（１）架橋した抗原を用いて非ヒト哺乳動物を経鼻的に免疫すること、
（２）上記動物の鼻腔関連リンパ組織から免疫グロブリンＡを発現するＢ細胞を得ること、
（３）得られたＢ細胞をマウスミエローマ細胞と細胞融合させ、ハイブリドーマを得ること、及び
（４）得られたハイブリドーマの中から、上記抗原に特異的な免疫グロブリンＡを分泌するハイブリドーマをクローニングすること
を含む、免疫グロブリンＡモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの製造方法。
【請求項２】
上記抗原が、志賀毒素Ｓｔｘ１Ｂである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
非ヒト哺乳動物が、ＢＡＬＢ／ｃマウスである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
上記工程（１）において、架橋した抗原に加えてアジュバントを用いる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
上記アジュバントが、コレラトキシンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
上記マウスミエローマ細胞が、Ｐ３Ｘ６３／Ａｇ８．６５３である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法により製造されたハイブリドーマ。
【請求項８】
請求項７に記載のハイブリドーマを培養し、分泌されたＩｇＡモノクローナル抗体を取得することを含む、ＩｇＡモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法により製造された、ＩｇＡモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、モノクローナル抗体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  分泌性免疫グロブリンＡ（Ｓ−ＩｇＡ）は、免疫応答によって生ずる宿主組織への不要な損傷を与えることなく病原体に対する宿主防御に関与すると考えられている。分泌性免疫グロブリンＡ、特に単一特異性ＩｇＡの作用形態を研究することは、粘膜免疫に関する諸問題を研究するための具体的なツールとして理想的である。また、分泌性免疫グロブリンＡは、経口投与することができる抗体医薬としての応用も期待されている。【０００３】  免疫グロブリンＧ製造と比べるとモノクローナルＩｇＡを製造することは困難である。マウスにおいては、強い抗原性を有する抗原、例えば、呼吸器合胞体ウイルス、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）とレオウィルス、コレラトキシン、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅのＬＰＳ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの線毛、及びＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉのＬＰＳに対するモノクローナルＩｇＡ抗体を製造することに成功している。これらの多くは、免疫経路として抗原を経口投与しており、Ｂ細胞の供給源としてパイエル板を用いている。抗原を鼻腔内投与する例、また、肺リンパ球のような別の組織又は顎下腺から酵素を用いて単離されたリンパ球をＢ細胞供給源として用いる例もある。【０００４】  しかし、免疫経路の最適化、細胞融合に適したＢ細胞供給源の選択、複数回免疫のために必要な十分な量の抗原の調製、マウスにおける所定の抗原に対する粘膜免疫応答の誘発等についての問題点は、いまだ解決されておらず、抗原特異的なＩｇＡ抗体、特に、Ｔ細胞依存性抗原に対するＩｇＡ抗体を特異的に製造する一般的な方法は確立されていない。【０００５】  また、特に腸管粘膜においては、腸内の常在性細菌の抗原を提示する樹状細胞によって抗体産生が誘導されることから、腸内細菌に対するＩｇＡ抗体が大量に作られている。そのため、バックグラウンドとなるＩｇＡの産生が常に高く保たれている（非特許文献１）。【０００６】  これらの原因によって、現時点では、外来性の抗原に対するＩｇＡモノクローナル抗体の製造方法は確立されておらず、ＩｇＡのはたす生理的な役割に関する研究の進展にとって大きな障害となっている。【０００７】  志賀毒素（Ｓｔｘ）は、ベロ毒素とも呼ばれるが、血清型Ｏ１５７：Ｈ７に代表される腸管出血性大腸菌から産生される外毒素であり、病原因子である（非特許文献２）。【０００８】  Ｓｔｘには、Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２の２つのタイプがあり、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）や中枢神経障害のような重篤な合併症を含むヒトの疾患に関連する。Ｓｔｘ１は、Ｓｔｘのタイプの一つで、赤痢菌の産生する毒素と同一である。Ｓｔｘは、細胞毒性サブユニット（Ａサブユニット）と細胞表面の糖鎖リガンドと結合するサブユニット（Ｂサブユニット）の５量体とから構成される（非特許文献３）。Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２のＢサブユニットの両者は、糖脂質グロボトリアオシルセラミド上に提示される糖質リガンド（Ｇｂ３−Ｃｅｒ，Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１Ｃｅｒ）のような糖質リガンドを認識し、そして、それ自体では毒性を示さない。【０００９】  ＩｇＡ抗体製造方法としては、細胞毒性がなく安全に取り扱うことができる組換え型Ｂサブユニ��ト（Ｓｔｘ１Ｂ）を製造し、それを用いてマウスを経粘膜免疫する方法が開発されている（非特許文献４）。【００１０】  Ｓｔｘ１Ｂは、マウスにおいて抗原性が低く、経粘膜免疫によって高力価の分泌型ＩｇＡを作ることが困難であったが、Ｓｔｘ１Ｂを化学的に架橋することによって、抗原提示の過程を改善すること、及び経鼻免疫の採用によってこの問題点は克服された（非特許文献４）。【００１１】  しかし、これらの技術によっても、一般的なＩｇＡモノクローナル抗体の製造方法は、未だ提供されていない。
【非特許文献１】Ｍａｃｐｈｅｒｓｏｎ，Ａ．Ｊ．，Ｕｈｒ，Ｔ．（２００４）Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ＩｇＡ  ｂｙ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｄｅｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｃｏｍｍｅｎｓａｌ  ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３，１６６２−５．
【非特許文献２】Ｎａｔａｒｏ，Ｊ．Ｐ．，Ｋａｐｅｒ，Ｊ．Ｂ．（１９９８）Ｄｉａｒｒｈｅａｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１１，１４２−２０１
【非特許文献３】Ｌｉｎｇｗｏｏｄ，Ｃ．Ａ．（１９９６）Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｖｅｒｏｔｏｘｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４，１４７−１５３
【非特許文献４】Ｉｍａｉ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ａ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｓｈｉｇａ  ｔｏｘｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７２，８８９−８９５．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】  本発明は、ＩｇＡモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ及びＩｇＡモノクローナル抗体の製造方法、及びＩｇＡモノクローナル抗体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】  本発明者は、架橋Ｓｔｘ１Ｂを用いた経鼻免疫を活用することで、マウス上部気道の粘膜免疫誘導組織である鼻腔関連リンパ組織（ＮＡＬＴ）を出発材料として、ＩｇＡモノクローナル抗体を製造することができることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、以下の通りである。【００１４】  １．下記工程：
（１）架橋した抗原を用いて非ヒト哺乳動物を経鼻的に免疫すること、
（２）上記動物の鼻腔関連リンパ組織から免疫グロブリンＡを発現するＢ細胞を得ること、
（３）得られたＢ細胞をマウスミエローマ細胞と細胞融合させ、ハイブリドーマを得ること、及び
（４）得られたハイブリドーマの中から、上記抗原に特異的な免疫グロブリンＡを分泌するハイブリドーマをクローニングすること
を含む、免疫グロブリンＡモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの製造方法。
２．上記抗原が、志賀毒素Ｓｔｘ１Ｂである、上記１に記載の方法。
３．非ヒト哺乳動物が、ＢＡＬＢ／ｃマウスである、上記１又は２に記載の方法。
４．上記工程（１）において、架橋した抗原に加えてアジュバントを用いる、上記１〜３のいずれかに記載の方法。
５．上記アジュバントが、コレラトキシンである、上記１〜４のいずれかに記載の方法。
６．上記マウスミエローマ細胞が、Ｐ３Ｘ６３／Ａｇ８．６５３である、上記１〜４のいずれかに記載の方法。
７．上記１〜６のいずれかに記載の方法により製造されたハイブリドーマ。
８．上記７に記載のハイブリドーマを培養し、分泌されたＩｇＡモノクローナル抗体を取得することを含む、ＩｇＡモノクローナル抗体の製造方法。
９．上記８に記載の方法により製造された、ＩｇＡモノクローナル抗体。
【発明の効果】
【００１５】  本発明に従えば、ＩｇＡモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを効率よく製造することができ、種々の抗原に特異的なＩｇＡモノクローナル抗体を安定的に供給することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ＴＥＰＣ  １５を用いて作成した、ＩｇＡ濃度測定のための標準曲線を示す。ウサギ抗マウスＩｇＡを固相化したウェルにタンパク質の濃度が既知（横軸）のミエローマＴＥＰＣ  １５由来のＩｇＡを添加して反応させた。結合したＩｇＡ抗体をＨＲＰ−ヤギ抗マウスＩｇＡによって検出し、酵素抗体法による吸光度で示した（縦軸）。ハイブリドーマ培養上清を適宜希釈して同様に試験を行い、この標準曲線の範囲内にある吸光度を示したサンプルより、培養上清中のＩｇＡのタンパク質濃度を算出した。
【図２】図２は、ＩｇＡモノクローナル抗体のＳｔｘ１Ｂへの特異的結合を示す。図１よりハイブリドーマ培養上清中のＩｇＡ濃度をあらかじめ求めておいたモノクローナル抗体産生クローンＧ２の培養上清（黒丸）、又はＩｇＡミエローマＴＥＰＣ  １５精製タンパク質（白丸）を系列希釈し、固相化したＳｔｘ１Ｂに反応させた。Ｓｔｘ１Ｂに結合したＩｇＡをウサギ抗マウスＩｇＡとＨＲＰ−ヤギ抗ウサギＩｇＧを順次反応させることで検出した。抗体濃度（横軸）に対応する特異的吸光度（横軸）で抗体の結合を表示した。ＥＬＩＳＡは、トリプリケートで行い、平均値±標準偏差を示した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】  本発明においては、抗原とは、生体内でＩｇＡ抗体の産生を誘導し得るものならば、いずれの抗原を用いてもよい。例えば、コレラトキシン、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）、卵白アルブミンなどの、抗原となりうるすべての物質を抗原として好適に使用することができる。【００１８】  また、本発明の抗原は、好ましくは、Ｔ細胞依存性抗原である。また、本発明の抗原は、好ましくは、抗原性の弱い、低分子量の抗原である。これらの、抗原としては、志賀毒素Ｓｔｘ１Ｂ、Ｓｔｘ２Ｂ、レジオネラ菌の菌体タンパク質の一部を挙げることができる。【００１９】  これらの抗原は、通常用いられるアジュバントを含む適当な緩衝液、例えば生理食塩水、リン酸緩衝液等に溶解して用いることもできる。本発明の方法に用いることができるアジュバントは、粘膜アジュバントであり、好ましくは、大腸菌易熱性毒素（ＬＴ）、インターロイキン１２、ｚｏｎｕｌａ  ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ  ｔｏｘｉｎ又はコレラ毒素であり、より好ましくは、コレラ毒素である。【００２０】  本発明の方法に用いる「架橋した抗原」は、架橋剤によって架橋された抗原を意味する。抗原性を損なうような大幅な立体構造の変化を生じることがなく、タンパク質の変性条件下でも解離しないように、架橋した抗原は、５量体以上であることが好ましく、１０量体以上であることがより好ましい。本発明の方法に使用される架橋した抗原は、必ずしも単一の多量体である必要はなく、様々な重合度の多量体の混合物であることができる。【００２１】  本発明の抗原を架橋するために用いる架橋剤としては、タンパク質のアミノ基同士を架橋するもの、アミノ基とカルボキシル基とを縮合するもの、ＳＨ基同士を架橋するもの、ＳＨ基とアミノ基とを架橋するものなどを、常法にしたがって用いることができる。タンパク質のアミノ基同士を架橋するものとしては、たとえばジスクシニミジルグルタレート（ＤＳＧ）、グルタルアルデヒドが挙げられる。アミノ基とカルボキシル基とを縮合するものとしては、たとえば１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）が挙げられる。ＳＨ基同士を架橋するものとしては、たとえばＢｉｓ−マレイミドヘキサン（ＢＭＨ）が挙げられる。ＳＨ基とアミノ基とを架橋するものとしては、たとえばＮ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）が挙げられる。【００２２】  本明細書において、用語「アジュバント」とは、抗原と共に投与したとき、その抗原に対する免疫反応を増強する物質を意味する。また、本発明で動物を免疫する際に投与する「抗原」には、抗原に上記のようにアジュバントを加えたものも包含される。【００２３】  免疫に用いる動物免疫に用いる動物としては、ヒト以外の哺乳動物、すなわち非ヒト哺乳動物を用いることができる。具体的には、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ラット、ハムスター、モルモット、及びマウスなどを挙げることができる。また、他の動物由来の抗体を産生するように作出されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いることもできる。【００２４】  本発明において用いられる非ヒト哺乳動物は、好ましくは、抗原特異的ＩｇＡ抗体産生能の高く、���要組織適合遺伝子複合体の型が、目的とする抗原を提示可能である必要があり、たとえば、Ｓｔｘ１Ｂを抗原として用いた場合にはＨ−２ｄである動物であり、好ましくは、ＢＡＬＢ／ｃマウス、ＤＢＡ／２マウス，Ｂ１０．Ｄ２であり、より好ましくは、ＢＡＬＢ／ｃマウスである。【００２５】  免疫に用いる動物としてマウスを用いる場合には、６〜１０週齢のマウスを用いることが好ましい。【００２６】  免疫及び抗体産生細胞の採取
上記抗原を上記非ヒト哺乳動物に投与することによって、上記非ヒト哺乳動物を上記抗原に対して免疫にする。抗原の投与の方法としては、経鼻腔投与が好ましい。【００２７】  抗原の投与量は、必要に応じて適宜増減できるが、例えば、非ヒト哺乳動物がマウスの場合、マウス１匹当たり、抗原単独では、１０〜５０００μｇ、好ましくは１０〜１０００μｇであり、アジュバントと共に投与するときには、抗原量として１０〜１０００μｇ、好ましくは４０〜２００μｇである。【００２８】  本発明では、抗原の投与を１回以上行って動物を免疫する。抗原投与は１回でもよいが、１回目の抗原投与（初回免疫）後、所定の間隔を空けて、さらに同じ抗原を投与する追加免疫を行うことがより好ましい。免疫間隔は、１〜８週、好ましくは１〜２週の間隔で免疫を行う。免疫間隔は、初回免疫から最終免疫まで同じ間隔で免疫してもよいし、抗原投与毎に異なる間隔で免疫してもよい。【００２９】  さらに本発明では、抗原投与を２回以上行う場合、初回免疫から最終免疫までの期間（免疫期間と呼ぶ）が１〜２００日、好ましくは１〜１００日となるように免疫する。従って本発明においては、免疫は、上記免疫期間の範囲内となるように免疫間隔と免疫の回数とを定めることができる。このようにして定められる免疫の回数は、特に限定されるものではないが、好ましくは１〜１０回、より好ましくは、５〜８回である。【００３０】  ブースト免疫は、それ以前の免疫から３〜８週間後に実施する。ブースト免疫の回数は、１回であり、抗原の投与量は、通常の免疫と同じか、又は抗原が調製可能であれば、通常の免疫の２〜３倍の量を投与する。【００３１】  続いて、本発明では、最終免疫から２〜５日後、より好ましくは２〜４日後、最も好ましくは３日後に、抗体産生細胞を採取する。採取する抗体産生細胞としては、パイエル板細胞、粘膜固有層リンパ球、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血リンパ球などが挙げられるが、好ましくは、鼻腔関連リンパ組織（ＮＡＬＴ）由来のリンパ球である。【００３２】  抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、マウス、ラット、ヒトなどの種々の動物に由来し、当業者が入手可能である株化細胞を使用することができるが、そのような株化細胞を新たに作製して使用することもできる。目的の抗体の安定的な産生のためには、抗体産生細胞とミエローマ細胞は同種の動物に由来するものである方がよいが、異種の動物に由来するものでもよい。またミエローマ細胞としてヒト由来のミエローマ細胞を用いることも、ヒト型ＩｇＡ抗体を目的とした場合に有用である。【００３３】  ミエローマ細胞は、薬剤抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地（例えば、ＨＡＴ培地）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ該選択培地で生存できる性質を有するものが好ましい。一般的には、８−アザグアニン耐性株を使用することができる。この細胞株は、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを欠損し（ＨＧＰＲＴ−）、ＨＡＴ培地で生育することができない。【００３４】  このようなミエローマ細胞としては、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（６５３；ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１５８０）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４、Ｓｐ２／０／ＦＯ−２等のマウスミエローマ細胞株、２１０．ＲＣＹ．Ａｇ１．２．３等のラットミエローマ細胞株、ＳＫＯ−００７等のヒトミエローマ細胞株等を使用できる。特に好ましいミエローマ細胞として、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３を挙げることができる。【００３５】  細胞融合は、例えば、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合比１０：１〜２：１の割合で、好ましくは、３：１の割合で、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０培地等の培地中で融合促進剤の存在下、室温で、好ましくは３７℃で、１〜１０分間細胞同士を接触させることにより行うことができる。このとき、融合促進剤としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール等を使用することができる。【００３６】  細胞融合の後、融合した細胞を選択し、さらにスクリーニングを行う。ハイブリドーマの選択方法は、通常の方法に従えばよく、特に限定されない。例えば、ハイブリドーマは、該ハイブリドーマを選択培地（例えばＨＡＴ培地）で培養することにより選択することができる。この際の培養は、通常の方法に従えばよく、特に限定されない。通常は、３０〜３７℃で１０〜１４日間培養すればよい。次いで、スクリーニングとして、例えば以下のＥＬＩＳＡ法を用いたＩｇＡ産生ハイブリドーマの同定を行うことができる。【００３７】  標的となる抗原をＥＬＩＳＡプレートに固相化した後、余剰の抗原を洗い流し、ＢＳＡ等のブロッキング剤でブロックし、余剰のブロッキング液を洗い流す。次に該マイクロプレートの各ウェルにハイブリドーマの培養上清を加え、反応させた後、余剰の培養上清を洗い流す。次いで、ウサギ抗マウスＩｇＡ抗体（例えば、１：１０００希釈）を分注、反応させ、余剰の抗体を洗い流した後、ＨＲＰ標識−ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を分注、反応させ、余剰の抗体を洗い流す。次に、適切な酵素基質、例えば過酸化水素存在下ＡＢＴＳを用い、吸光度を測定し、抗体の結合を定量することができる。【００３８】  上記の通りＩｇＡ抗体産生ハイブリドーマが確認されたウェルから目的のハイブリドーマをクローニングする。クローニング法は、通常の方法に従えばよく、特に限定されないが、例えば、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法などが挙げられる。さらに、所望のハイブリドーマ株を樹立するために、クローニングされたハイブリドーマについて、抗原特異性及びクラスを確認する。【００３９】  抗原特異的ＩｇＡモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを用いて抗原特異的ＩｇＡモノクローナル抗体を製造する方法としては、通常の細胞培養法や腹水形成法等を用いることができる。細胞培養法においては、例えば、ハイブリドーマをウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地、ＭＥＭ培地、Ｅ−ＲＤＦ培地又は無血清培地等の動物細胞培地中で、通常の培養条件（例えば、３７℃、５％ＣＯ２濃度）で３〜４日間培養し、その培養上清から目的とするＩｇＡモノクローナル抗体を取得することができる。【００４０】  上記抗体の製造方法において、抗体の精製が必要とされる場合には、硫酸アンモニウム塩析法、ＤＥＡＥ−セルロース等の陰イオン交換体を利用す���イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＬセファロース等を用いるアフィニティークロマトグラフィー、分子量や構造によってふるい分ける分子ふるいクロマトグラフィー等の当業者に公知の方法を適宜選択し、これらを単独で又は組み合わせて用いることにより精製を行うことができる。
【実施例１】
【００４１】  以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。【００４２】  材料及び方法
マウス：ＳＰＦの雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを日本エスエルシー株式会社より購入し、６週齢で実験に用いた。【００４３】  抗原：
Ｓｔｘ１の組換え型結合サブユニット（Ｓｔｘ１Ｂ）は、既に報告されたとおりに、大腸菌ＪＭ１０５（ｐＶＴ１−Ｂ５）で発現させ、タンパク質を陰イオン交換クロマトグラフィー及びクロマトフォーカシングによって精製した（Ｍｉｙａｓｈｉｔａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｂ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  Ｓｈｉｇａ−ｌｉｋｅ  ｔｏｘｉｎ  １  ａｓ  ａ  ｐｒｏｂｅ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．１６，６９７−７０５．）。ただし、陰イオン交換クロマトグラフィーについては、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０（東ソー）のカラム（１．５×１１ｃｍ）を用いた。タンパク質濃度は、ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて定量した。【００４４】  架橋Ｓｔｘ１Ｂを、既に報告したとおりにグルタルアルデヒド法で製造した（Ｉｍａｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ，（２００４）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ａ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｓｈｉｇａ  Ｔｏｘｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  ｂｙ  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７２，８８９−９５）。概略は、精製されたＳｔｘ１Ｂ（１．５ｍｇ）を１．１ｍｌのカルシウム／マグネシウム不含ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶かした。この溶液に、１．１ｍｌのグルタルアルデヒド（０．２％ＰＢＳ溶液）を攪拌しながら滴下して加えた。この混合物を２０℃で１時間攪拌しながらインキュベーションした。反応を止めるために、５５０μｌの１ＭグリシンＰＢＳ溶液を加え、さらに２０℃で１時間インキュベーションした。この混合物をＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ３  ｍｅｍｂｒａｎｅ（分子量３，５００排除、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，ＣＡ）を用いてＰＢＳで透析した。この透析した溶液をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ−３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｌｄ，ＭＡ）を用いてタンパク質が３ｍｇ／ｍｌになるまで濃縮した。【００４５】  試薬：
非分泌型マウスミエローマ細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３をＡｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より購入し、ハイブリドーマ製造に用いた。ヤギ抗ウサギＩｇＧミクロ磁気ビーズをＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）より購入し、精製したウサギ抗マウスＩｇＡ（α鎖特異的）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識−ヤギ抗マウスＩｇＡ（α鎖特異的）、ＨＲＰ標識−ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）及びＭｏｕｓｅ  ＭｏｎｏＡｂ（商標）ＩＤ  ｋｉｔをＺｙｍｅｄ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）より購入し、ＴＥＰＣ  １５（ＩｇＡ、κ）精製ミエローマタンパク質、ポリエチレングリコール［５０％溶液］Ｈｙｂｒｉ−Ｍａｘ（登録商標）、ＯＰＩ培地添加物、ＨＡＴ培地添加物、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；フラクションＶ）をＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より購入した。【００４６】  また、ダルベッコ改変ＭＥＭ（ＤＭＥＭ）をニッスイ製薬（東京）より購入し、ペニシリンＧをＩＣＮ（Ａｕｒｏｒａ，ＯＨ）より購入し、ストレプトマイシンを和光純薬（大阪）より購入し、Ｔｗｅｅｎ２０、ＨＥＰＥＳ、２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）をナカライテスク（京都）より購入し、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）をＨｙｃｌｏｎｅ（Ｓｏｕｔｈ  Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）より購入し、コレラトキシン（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ，ｔｙｐｅ  Ｉｎａｂａ  ５６９Ｂ、アジ化ナトリウム不含）をＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）より購入した。【００４７】  免疫：
架橋Ｓｔｘ１Ｂ（４０μｇ）とコレラトキシン（１μｇ）を１５μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、ケタミン／キシラジンで麻酔したマウスに片鼻７．５μＬずつ経鼻免疫した（Ｉｍａｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ，（２００４）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ａ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｓｈｉｇａ  Ｔｏｘｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  ｂｙ  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７２，８８９−９５）。免疫は、０、８、１４及び３１日目に行い、さらに７８日目に同じ条件でブースト免疫した。【００４８】  細胞の調製：
最終免疫から３日後（８１日目）にマウスを安楽死させ、上あごを分離し、硬口蓋を取り外した。鼻腔関連リンパ組織（ＮＡＬＴ）は、文献（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ａｒｃｈ，Ｈｉｓｔｏｌ．Ｃｙｔｏｌ．５４，２７９−２８７、Ａｓａｎｕｍａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２，１２３−１３１）に記載されたとおりに、鼻腔断片及び上顎に残存した組織断片として、先の尖ったピンセットを用いて採取した。１０匹分のＮＡＬＴを集め、シャーレに入れたＤＭＥＭ中で注射針を用いて組織をほぐしてリンパ球を遊離させた。細胞を０．５％ＢＳＡ−２ｍＭ  ＥＤＴＡ−ＰＢＳ（ＢＥ−ＰＢＳ）中で遠心洗浄後、２μｇ／ｍｌのウサギ抗マウスＩｇＡを含む１ｍｌのＢＥ−ＰＢＳ中で５分間氷上にて抗体を反応させた。細胞（約１×１０８個）を０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳ（Ｂ−ＰＢＳ）中で遠心洗浄し、次に、ヤギ抗ウサギＩｇＧミクロ磁気ビーズ（５倍希釈）を含む１ｍｌのＢＥ−ＰＢＳに加え、８℃で１５分間反応させた。再びＢ−ＰＢＳ中で遠心洗浄後、細胞を０．５ｍｌのＢＥ−ＰＢＳに再浮遊させ、マグネチックセルソーター（Ｖａｒｉｏ  ＭＡＣＳ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて表面にＩｇＡを保有する細胞を濃縮した。【００４９】  ハイブリドーマの製造：
Ｐ３Ｘ６３／Ａｇ８．６５３ミエローマ細胞は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、５０μｌ  ２−ＭＥ、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ（以下、完全ＤＭＥＭという。）に１０％ＦＣＳを加えた培地中で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。ＮＡＬＴ由来の表面ＩｇＡ陽性細胞（１．２×１０６個）を４×１０５個のミエローマ細胞と１５ｍｌ遠心管の中で混合し、３００×ｇで１０分間遠心した。上清を完全に除去後、３７℃に加温した５０％ポリエチレングリコール溶液１６μｌを１分間かけて徐々に添加した。ミクロピペットの先端を用いて攪拌をさらに１分間継続した。次に、ポリエチレングリコールを希釈するために、３７℃に加温した無血清のＤＭＥＭ培地１６μｌを１分間かけて攪拌しながら加え、次いで、同培地１４４μｌを２分間かけて攪拌しながら加えた。【００５０】  その後、無血清のＤＭＥＭ培地を加えて全量を１０ｍｌとした後、２００×ｇで５分間遠心して細胞を集めた。細胞を２０％ＦＣＳ、ＯＰＩ培地添加物及びＨＡＴ培地添加物を含む完全ＤＭＥＭ（ＨＡＴ培地）に１×１０６個／ｍｌで懸濁し、この懸濁液を９６穴マイクロプレートに１００μｌずつ加えた。このプレートを３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養し、ＨＡＴ選択を９日間行った後、培地を２０％ＦＣＳ、ＯＰＩ培地添加物、ＨＴ培地添加物を含む完全ＤＭＥＭ（ＨＴ培地）に順次交換し、定法に従って、アミノプテリンを希釈した（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．Ｌａｎｅ，Ｄ．（１９８８）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。【００５１】  ＥＬＩＳＡ：
Ｓｔｘ１Ｂに特異的に結合するＩｇＡ抗体のスクリーニングは、すでに報告したようなＥＬＩＳＡによる方法によった（Ｉｍａｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）１３０，６６５−６７０）。すなわち、ＥＬＩＳＡプレートにＳｔｘ１Ｂを５００ｎｇ／１００μｌ／ウェルで加え、４℃で１６時間吸着させた。非特異的な結合部位をＢＳＡでブロッキングした後、ハイブリドーマ培養上清を加え、特異的な抗体を固相のＳｔｘ１Ｂに結合させた。ウェルを洗った後、Ｓｔｘに結合したＩｇＡの検出のために、ウサギ抗マウスＩｇＡ（１：１０００希釈）とＨＲＰ標識−ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（１：１０００希釈）を順次反応させた。酵素基質としてＡＢＴＳ（Ｈ２Ｏ２）を用い、吸光度の測定によって抗体の結合を定量した（Ｉｍａｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）１３０，６６５−６７０）。【００５２】  一方、ハイブリドーマ培養上清中のＩｇＡ量を測定するため、サンドイッチＥＬＩＳＡを行った。すなわち、精製したウサギ抗マウスＩｇＡ（１：１０００希釈）を含むＰＢＳ溶液１００μｌでプレートのウェルをコート（４℃、１６時間）したのち、１％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキングした。０．１％ＢＳＡ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで適宜希釈したハイブリドーマの培養上清１００μｌを加え、２０℃で１時間反応させた。結合した抗体は、ＨＲＰ−ヤギ抗マウスＩｇＡ（１：１０００希釈）で検出した。タンパク質の濃度が既知の精製したミエローマタンパク質（ＴＥＰＣ  １５）を系列希釈したものを用い、標準曲線を作成し、抗体量を測定した。ハイブリドーマ培養上清中のＩｇＡ抗体の量は、標準曲線の範囲内の吸光度に対応するように希釈されたサンプルを用いて計算した。【００５３】  架橋したＳｔｘ１Ｂで経鼻免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス１０匹分のＮＡＬＴより、細胞表面にＩｇＡを保有するＩｇＡにクラススイッチしたＢ細胞を濃縮し、それをマウスミエローマ細胞と細胞融合させることで、ＩｇＡ型のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを製造した。細胞融合後、固相化したＳｔｘ１Ｂに結合活性を示すウェルが１つ見られたため、これをクローニング及び再クローニングしてクローンＧ２を確立した。Ｍｏｕｓｅ  ＭｏｎｏＡｂ（商標）ＩＤ  ｋｉｔを用いてＨ鎖のクラス、Ｌ鎖のタイプを確認したところ、ＩｇＡ、κであることがわかった。【００５４】  サンドイッチＥＬＩＳＡによって、ハイブリドーマ培養上清中のＩｇＡ量の測定を行った。すなわち、ミエローマ細胞であるＴＥＰＣ  １５（ＩｇＡ、κ）から精製されたタンパク質濃度が既知のＩｇＡ抗体標品を系列希釈し、固相化した抗マウスＩｇＡに反応させ、ＨＲＰ−抗マウスＩｇＡで検出することによって標準曲線を作成した。【００５５】  図１に示すように、加えたＴＥＰＣ  １５タンパク質の濃度に比例して、抗体の結合を示す吸光度の上昇が認められた。この標準曲線を用いて、ハイブリドーマ培養上清中のＩｇＡ濃度を算出した。【００５６】  クローンＧ２培養上清又はＴＥＰＣ  １５  ＩｇＡミエローマタンパク質について、様々なＩｇＡ濃度条件を用いて固相化したＳｔｘ１Ｂへの結合を比較した（図２���。クローンＧ２では、濃度依存的に結合量が増加し、高濃度で結合の飽和が認められた。５０％結合量に対応するＩｇＡ量は、およそ０．３５μｇ／ｍｌであった。一方、対照であるＴＥＰＣ  １５ミエローマタンパク質は、Ｓｔｘ１Ｂとは全く結合しなかった。【００５７】  得られたハイブリドーマ由来のＩｇＡは、抗体濃度依存的にＳｔｘ１Ｂに結合したのに対して、対照であるＩｇＡミエローマタンパク質であるＴＥＰＣ  １５は全く結合せず、Ｓｔｘ１Ｂ特異的ＩｇＡモノクローナル抗体であることが示された。【００５８】  架橋Ｓｔｘ１ＢによるＢＡＬＢ／ｃマウスの経鼻免疫と、ＮＡＬＴから細胞表面にＩｇＡを保有するＢ細胞を選別して微量細胞融合（ｍｉｃｒｏ−ｓｃａｌｅ  ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ）を実施することで、抗原性の低いＳｔｘ１Ｂに対しても、ＩｇＡ産生モノクローナル抗体を取得することができることが示された。【００５９】  ＮＡＬＴ組織からの表面ＩｇＡ陽性Ｂ細胞の回収数が少ないことから、標準的な細胞融合プロトコールは、適切ではない。ポリエチレングリコール溶液中の総細胞密度を１×１０８細胞／ｍｌに固定し、細胞同士の接触に付すことが好ましい。さらに、磁気細胞ソーティングによりＩｇＡ産生にコミットした細胞が濃縮されることを考慮すると、リンパ球に対するミエローマ細胞の割合を１：３にすることが好ましい。ＮＡＬＴから回収可能な細胞数がＢＡＬＢ／ｃマウス当たり１×１０７細胞であること、そして表面ＩｇＡ陽性画分中の回収率が約１％であることから、微量細胞融合手段が必須である。
【産業上の利用可能性】
【００６０】  経口投与することができる抗体医薬として有用な、免疫原性の弱い抗原に対して特異的なＩｇＡモノクローナル抗体を製造することができる。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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