(57)【要約】癌細胞の転移を、TM7XN1に対する抗体を用いて阻害する新しい方法、および当該方法に使用するための医薬組成の提供。TM7XN1に対する抗体を有効成分として含む癌転移抑制剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
TM7XN1に対する抗体を有効成分として含む癌転移抑制剤。
【請求項２】
癌が癌細胞表面にTM7XN1を発現している癌である請求項１記載の癌転移抑制剤。
【請求項３】
癌が骨転移し得る癌である請求項１または２記載の癌転移抑制剤。
【請求項４】
癌が脾臓転移し得る癌である請求項１または２記載の癌転移抑制剤。
【請求項５】
癌が乳癌、前立腺癌、肺癌、甲状腺癌、胃癌、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、および膵臓癌からなる群から選択される請求項１から４のいずれか１項に記載の癌転移抑制剤。
【請求項６】
癌細胞の骨髄への転移を抑制し得る請求項１から５のいずれか１項に記載の癌転移抑制剤。
【請求項７】
癌細胞の脾臓への転移を抑制し得る請求項１から５のいずれか１項に記載の癌転移抑制剤。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載の癌転移抑制剤を癌に罹患している非ヒト動物に投与して癌の転移を抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、TM7XN1という特定の細胞表面受容体に対する抗体を用いることにより、TM7XN1を発現している様々な癌細胞の転移を抑制する新しい方法、および当該方法に使用するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の転移について
原発性癌は例え完全に除去されたとしても、悪性腫瘍は、しばしば転移を引き起こす。原発巣から離れた場所で、原発性腫瘍に起因する転移悪性腫瘍の形成は、癌治療における最も重要な課題の１つである。すなわち、原発巣が処置されている場合においても、他の臓器へ転移した腫瘍の増殖により患者が死亡する。このため、悪性腫瘍の転移は、癌治療が失敗に至る原因の大部分を占める (Bertinoら（1996年編）, Encyclopedia of Cancer, Academic Press; Devitaら（1997年編）, Cancer: Principles & Practice of Oncology, Lippincott, Williams and Wilkins; Cavalliら（1996）, Textbook of Medical Oncology, Dunitz Martin Ltd; Peckhamら（1995年編）, Oxford Textbook of Oncology, Oxford Univ. Press; Mendelsohnら（1995）, The Molecular Basis of Cancer, Saunders, Philadelphiaを参照のこと)。【０００３】
例えば、臨床的に診断された多くの固形癌（この腫瘍は局在的増殖である原発巣）において、外科的除去が最初の処置手段と考えられる。しかし、外科手術後にしばしば、原発性癌細胞の転移が観察され、転移部位の癌浸潤が全身にわたって広がり、その結果として、患者は転移癌の増殖により死ぬことになる。切除可能な腫瘍を有する個体において、原発性腫瘍の増殖または局在的な再発が、しばしば死の原因であることが報告されるものの、現在では、手術可能な腫瘍を有する癌犠牲者のほぼ40%は、外科手術に続く転移性疾患で最終的に死亡するとされる。【０００４】
現在利用可能な癌の治療方法には、外科的治療、放射線治療、化学療法、および免疫学的方法がある。そして、外科的治療で対処できない場合には、化学療法や放射線療法が施される。しかし、化学療法剤は、細胞増殖阻害により癌細胞の増殖を阻止することから、化学療法は、癌の治療に幅広く使用されるものの、増殖している癌細胞のみならず活発に増殖している正常細胞に対しても影響を与える非特異的な処置様式であるため、重篤な副作用（例えば、免疫抑制、汎血球減少症（貧血、血小板減少、および白血球減少を伴う骨髄細胞増殖阻害）、下痢、吐気、および脱毛（体毛減少））をしばしば引き起こす。放射線治療もまた、細胞増殖阻害により癌細胞の増殖を阻止する非特異的な処置様式であることから、化学療法の場合と同様の問題点を抱えている。一方、免疫療法は、化学療法や放射線療法に比べて重篤な副作用を引き起こす可能性は低いと考えられるが、強力な癌増殖阻止効果を示す免疫療法は未だ確立されていない。【０００５】
癌治療は、上記の治療方法を組み合わせて集学的に行われるが、再発性癌には有効性が非常に低いことが知られている。しかも、これらの治療法は、既に存在する転移巣には、ほとんど効果がないこともよく知られている。さらに、上記のいずれの方法も、転移抑制効果については、限界があることも知られている。以上のことから、転移抑制効果を発揮する薬剤は、現在の癌治療の問題点を克服する手段の１つとなり得ることは、明らかである。【０００６】
悪性黒色腫、乳癌、肺癌、結腸癌、および前立腺癌は、転移しやすいとされる癌種とされ、転移する範囲は、癌種により異なる。癌の標的臓器としては、肺あるいは肝臓がよく知られているが、脳や骨髄にも高頻度で転移する。骨転移は、他の臓器への転移と異なり、直接生命を脅かすことは稀であるが、耐えがたい骨痛や運動制限などを合併するために、患者のQOLは著しく低下し、間接的に死期を早めることになる。【０００７】
癌細胞の転移は、原発巣から血管内に侵入した癌細胞が循環血中を流れて標的となる臓器に到達し、その部位で血管外へ出て、その臓器に定着することにより起こる。この過程は、肺、肝臓、脳、骨髄などへの転移で共通である。しかし、骨髄への転移が成立するためには、骨膜上の栄養血管から静脈洞を経て骨髄内へ侵入する過程、および最終的に骨内膜表面に定着する過程という２つの過程が成立する必要がある。【０００８】
癌の転移機構に基づき、癌の血管への侵入を阻止する薬剤、あるいは血管から標的臓器への侵入を阻止する薬剤などの様々な転移抑制剤の開発が試みられているが、効果的に癌細胞転移を抑制する方法は、いまだ確立されておらず、そして癌細胞の転移を抑制する効果を有する薬は、いまだ市販されていない。【０００９】
以上のことから、腫瘍の転移を効率的に阻害する方法、特に、重篤な副作用を引き起こさずに転移を阻害する方法が、希求されている。【００１０】
TM7XN1とGPR56について
TM7XN1とGPR56は、それぞれヒト由来のGTP結合蛋白共役型受容体(GPCR:  G-Protein Coupled Receptor)である。GPCRとは、７個の疎水性ドメインを含むアミノ酸配列、すなわち7回膜貫通領域によって特徴付けられた膜タンパク質である。GPCRは広範な生物に見出される。GPCRは、脂質アナログ、アミノ酸誘導体、低分子ペプチド、および他の分子を含む広範で多様な範囲の物質に応答し、様々な生理的な活性を有する(RuffoloおよびHollinger(1995年編), G-Protein Coupled Transmembrane Signaling Mechanisms, CRC Press, Boca Raton, FL; WatsonおよびArkinstall(1994), The G-Protein Linked Receptor FactsBook, Academic Press, San Diego, CA; Peroutka(1994年編), G Protein-Coupled Receptors, CRC Press, Boca Raton, FL; HouslayおよびMilligan(1990), G-Proteins as Mediators of Cellular Signaling Processes, Wiley & Sons, New York, NY; Dohlmanら(1991),Ann. Rev. Biochem. 60: 653-688、などを参照のこと)。【００１１】
TM7XN1のcDNAは、1999年にヒトの悪性黒色腫由来のcDNAライブラリーからクローニングされた（非特許文献１参照）。また、GPR56のcDNAは、同時期に別のグループによって、ヒトの心臓由来のcDNAライブラリーからクローニングされた（非特許文献２参照）。TM7XN1とGPR56は、構造的に極めて類似しており、相違点は、（１）  N末端側から1番目の細胞内ループ領域において、GPR56には、TM7XN1には存在しない6個のアミノ酸からなる配列が挿入されていること、（２）  それぞれ離れて存在する3ヶ所（3個）のアミノ酸（うち2ヶ所は細胞外領域）が多形性を示すこと、の2点にとどまり、それ以外の部分は完全に一致する。したがって、TM7XN1とGPR56はゲノム上の同一の遺伝子（以下、GPR56遺伝子と表記）から転写・翻訳されるスプライシング・バリアントの関係にあると考えられる。なお、GPR56に存在する6個のアミノ酸からなる配列の挿入は、細胞内領域に存在することから、細胞外領域は、多形性を示す部分以外は、TM7XN1とGPR56で完全に一致している。したがって、細胞表面上に発現したTM7XN1を認識する抗体は、細胞表面上に発現したGPR56も認識する可能性が極めて高い。【００１２】
TM7XN1とGPR56に共通して見られる構造的な特徴は、最もN末端側に位置する細胞外領域である。その領域は約400ものアミノ酸からなり、多数の糖鎖が付加しうるムチン様蛋白の特徴的な構造を有していることから、TM7XN1とGPR56は、細胞間の接着に関与する可能性が示唆されている。また、TM7XN1とGPR56は、7回膜貫通領域付近のアミノ酸配列がSecretin受容体に相同性を有し、かつ、N末端側の細胞外領域が長い (約400アミノ酸以上)ことから、GPCRスーパーファミリーのサブグループであるLNB-TM7に分類される（Stacey Mら(2000), Trends Biochem Sci. 25:284-289）。【００１３】
TM7XN1の発現部位については、Zendmanらにより、ヒトの脳・腎臓・精巣・前立腺・甲状腺等の正常な臓器に発現している他、悪性黒色腫（A375, Bowes）・結腸癌（Caco-2, HT29）・扁平上皮癌（A431）・リンパ腫（Molt-4）など、様々なヒト癌細胞株においても発現していることが明らかにされた。また、彼らは、悪性黒色腫における転移能とTM7XN1の発現量とが逆相関しているという興味深い結果も報告した (非特許文献１参照)。また、GPR56の発現部位については、Liuらにより、脳・心臓・腎臓・精巣・膵臓・骨格筋・甲状腺など、様々な正常な臓器に発現していることが明らかにされた（非特許文献２参照）。なお、上記の報告においては、RT-PCR法、またはノーザンブロッティング法により発現部位が調べられているが、それらに用いられるプライマーやプローブには、TM7XN1のcDNAとGPR56のcDNAに共通の配列が含まれていることから、TM7XN1とGPR56を区別せずに発現部位を報告している可能性が極めて高い。【００１４】
さらに、TM7XN1(報文においては、専らGPR56と表記)がCD9やCD81などのTetraspaninと呼ばれる分子と相互作用すること（非特許文献３参照）、および、GPR56遺伝子の変異によって、ヒト前頭葉皮質の奇形が起こること(非特許文献４参照)が、最近相次いで報告された。ごく最近になって、TM7XN1(報文においては、専らGPR56と表記)が神経膠腫細胞において発現していることや、神経膠腫細胞の培養系において、TM7XN1のN末端側細胞外領域の組換えタンパクが、培養皿への細胞の接着を抑制することなども示された(非特許文献５参照)。さらには、TM7XN1(報文においては、専らGPR56と表記)は、癌抑制遺伝子産物pVHLによって誘導される標的遺伝子であることも示された(非特許文献６参照)。【００１５】
なお、TM7XN1については、「転移性ヒトメラノーマ細胞において減少調節される新遺伝子及びそのタンパク質、その生産方法、並びに使用」という名称で、特許出願が既になされている（特許文献１参照）。【００１６】
また、TM7XN1およびGPR56のマウスホモログであるCyt28のcDNAは、造血幹細胞を調節する遺伝子の一つとしてクローニングされ (Phillips RLら(1999), GenBank Accession Number AF166382)、特許出願もなされている（特許文献２参照）さらに、別のグループにより、マウス骨髄全体の細胞と骨髄造血幹細胞との遺伝子の発現量を比較した場合に、マウス骨髄造血幹細胞により多く発現している遺伝子の一つとして、Cyt28のcDNAが同定された（非特許文献７参照）。Cyt28は、TM7XN1およびGPR56と約75%の相同性（アミノ酸配列）を持つGPCRで、N末端側に位置する細胞外領域や7回膜貫通領域付近のアミノ酸配列など、TM7XN1およびGPR56と同様の分子的特徴を有し、LNB-TM7に分類される。Cyt28はマウス胎仔肝臓造血幹細胞における発現も確認されており、さらに、マウス神経幹細胞においても発現している可能性が高いことも確認されている(非特許文献７参照)。
【特許文献１】特開2000−217585号公報
【特許文献２】国際公開第WO 00/11168号パンフレット
【非特許文献１】Zendman AJら(1999), FEBS Lett. 446: 292-298
【非特許文献２】Liu Mら (1999), Genomics 55: 296-305
【非特許文献３】Little KDら(2004), Mol Biol Cell 15: 2375-2387
【非特許文献４】Piao Xら (2004), Science 303: 2033-2036
【非特許文献５】Shashidhar Sら (2005), Oncogene 24: 1673-1682
【非特許文献６】Maina ENら (2005), Oncogene 24: 4549-4558
【非特許文献７】Terskikh AJら(2001), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 7934-7939
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、TM7XN1という特定のGTP結合蛋白共役型の細胞表面受容体を発現する様々な癌細胞の転移を、TM7XN1に対する抗体、例えばアンタゴニストとして作用する抗体を用いて阻害する新しい方法、および当該方法に使用するための医薬組成の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記のように、TM7XN1に関する様々な知見が蓄積されつつあるものの、TM7XN1の生理的なリガンドは未同定であることから、TM7XN1の生理的な役割はいまだ完全には明らかにはされていなかった。【００１９】
本発明者らは、TM7XN1の生理的な機能を明らかにすることを目的として、まず、TM7XN1に結合する単クローン抗体KSA7を作製した。そして、様々な病態モデルに対するこの抗体の作用を検討した。その１つとして、悪性黒色腫における転移能とTM7XN1の発現量とが逆相関しているというZendmanらの知見に基づき、TM7XN1を発現しているヒト急性骨髄性白血病細胞株（KG1a）を免疫不全マウスの静脈に移植して骨髄転移を起こさせるという骨転移モデルを用いて、この抗体の作用の検討も行った。その結果、コントロール群と比較して、KSA7投与群では、骨髄への転移が有意に抑制されるという、Zendmanらの知見からは予期されない結果が得られた。【００２０】
さらに追加的に、TM7XN1に結合する単クローン抗体4M2B、7M1および21M1を作製した。改めて、TM7XN1を発現しているヒト急性骨髄性白血病細胞株（KG1a）を免疫不全マウスの静脈に移植して骨髄転移を起こさせるという骨転移モデルを用いて、KSA7と同時に4M2B、7M1および21M1の作用の検討も行った。その結果、KSA7以外の3クローンの投与群でも、骨髄への転移が有意に抑制されるという結果が得られた。よって、特定の単クローン抗体でなくても、TM7XN1に結合する単クローン抗体ならば、このような活性を持ち得ることが示され、TM7XN1分子が骨髄への転移を抑制するための重要な標的分子であることが新たに示された。【００２１】
さらに、上記骨転移モデルにおいて、KSA7、4M2B、7M1および21M1の各クローンの中で最も活性の高かった21M1を用いて、以下の検討を実施した。【００２２】
まず、TM7XN1を発現しているヒト多発性骨髄腫細胞株（RPMI8226）を免疫不全マウスの静脈に移植して骨髄転移を起こさせるという骨転移モデルを用いて、21M1の作用の検討を行った。その結果、21M1によって骨髄への転移が抑制される傾向が示された。【００２３】
また、TM7XN1を発現しており、なおかつGFPで標識したヒト膵臓癌細胞株（BxPC3）の腫瘍塊を免疫不全マウスの膵臓（同所）に移植し、原発巣を生着させた後、全身に転移を起こさせるという同所移植・転移モデルを用いて、21M1の作用の検討を行った。その結果、21M1に膵臓癌細胞の脾臓への転移が抑制される傾向が示された。【００２４】
以上から、TM7XN1に結合する単クローン抗体は急性骨髄性白血病・多発性骨髄腫・膵臓癌を含む様々な種類の腫瘍の転移を抑制する可能性が示され、TM7XN1分子が様々な種類の腫瘍の転移を抑制するための重要な標的分子であることが新たに示された。【００２５】
TM7XN1は、ムチン様蛋白の構造を有していることから、細胞間の接着に関与する可能性は示唆されていたが、現在まで癌細胞の転移等に関する知見は具体的には確認されていない。そして、本発明における実施例によって、初めて、TM7XN1が腫瘍細胞の転移に関与するであろうこと、およびTM7XN1に対する抗体がTM7XN1を発現している癌細胞の転移の抑制に有用であろうことが示された。しかも、この抗体は、重篤な副作用を引き起こすことなく、明らかな転移抑制作用を示すことを見出し、本発明を完成させるに至った。【００２６】
本発明の態様は、以下のとおりである。【００２７】
[１]  TM7XN1に対する抗体を有効成分として含む癌転移抑制剤。【００２８】
[２]  癌が癌細胞表面にTM7XN1を発現している癌である[１]の癌転移抑制剤。【００２９】
[３]  癌が骨転移し得る癌である[１]または［２］の癌転移抑制剤。【００３０】
[４]  癌が脾臓転移し得る癌である［１］または［２］の癌転移抑制剤。【００３１】
[５]  癌が乳癌、前立腺癌、肺癌、甲状腺癌、胃癌、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、および膵臓癌からなる群から選択される[１]から［４］のいずれかの癌転移抑制剤。【００３２】
[６]  癌細胞の骨髄への転移を抑制し得る[１]から[５]のいずれかの癌転移抑制剤。【００３３】
[７]  癌細胞の脾臓への転移を抑制し得る[１]から[５]のいずれかの癌転移抑制剤。【００３４】
[８]  [１]から[７]のいずれかの癌転移抑制剤を癌に罹患している非ヒト動物に投与して癌の転移を抑制する方法。【００３５】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2004-330814号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００３６】
本発明によって、TM7XN1という特定のGTP結合蛋白共役型の細胞表面受容体を発現する様々な癌細胞に対して、TM7XN1に対する抗体で処置することによって、TM7XN1を発現する癌細胞の転移、特に、骨髄及び脾臓などの他の臓器への転移を抑制することにより、癌治療の質の向上、および患者のQOLの向上に結びつくことが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】骨転移モデルにおける抗TM7XN1単クローン抗体KSA7の転移抑制効果を骨髄キメラ率で示す図である。
【図２】抗TM7XN1単クローン抗体KSA7の、TM7XN1に対する結合活性をTM7XN1発現細胞と非発現細胞との比較で示す図である。
【図３】抗TM7XN1単クローン抗体KSA7の、TM7XN1に対する結合活性をKSA7とアイソタイプ抗体との比較で示す図である。
【図４】TM7XN1-EGFP融合タンパクの発現量とアイソタイプ抗体の結合量との相関を示す図である。
【図５】TM7XN1-EGFP融合タンパクの発現量とKSA7の結合量との相関を示す図である。
【図６−１】KG1a細胞におけるTM７XN1の発現を、アイソタイプコントロール抗体と抗TM７XN1単クローン抗体21M1の結合活性の比較で示す図であり、KG1a細胞に対するアイソタイプコントロール抗体の結合量を蛍光強度で示す図である。
【図６−２】KG1a細胞におけるTM７XN1の発現を、アイソタイプコントロール抗体と抗TM７XN1単クローン抗体21M1の結合活性の比較で示す図であり、KG1a細胞に対する21M1の結合量を蛍光強度で示す図である。
【図７】KG1a細胞を用いた骨転移モデルにおける抗TM７XN1単クローン抗体の複数のクローン（KSA7、4M2B、7M1および21M1）それぞれの転移抑制効果を骨髄キメラ率で示す図である。
【図８−１】RPMI8226細胞におけるTM７XN1の発現を、アイソタイプコントロール抗体と抗TM７XN1単クローン抗体21M1の結合活性の比較で示す図であり、RPMI8226細胞に対するアイソタイプコントロール抗体の結合量を蛍光強度で示す図である。
【図８−２】RPMI8226細胞におけるTM７XN1の発現を、アイソタイプコントロール抗体と抗TM７XN1単クローン抗体21M1の結合活性の比較で示す図であり、RPMI8226細胞に対する21M1の結合量を蛍光強度で示す図である。
【図９−１】RPMI8226を用いた転移モデルにおける抗TM７XN1単クローン抗体21M1の効果を示す図であり、抗TM７XN1単クローン抗体21M1の骨転移抑制効果を骨髄キメラ率で示す図である。
【図９−２】RPMI8226を用いた転移モデルにおける抗TM７XN1単クローン抗体21M1の効果を示す図であり、抗TM７XN1単クローン抗体21M1の脾臓転移抑制効果を脾臓キメラ率で示す図である。
【図１０−１】膵臓癌細胞株BxPC-3におけるTM７XN1の発現を、アイソタイプコントロール抗体と抗TM７XN1単クローン抗体21M1の結合活性の比較で示す図であり、膵臓癌細胞株BxPC-3に対するアイソタイプコントロール抗体の結合量を蛍光強度で示す図である。
【図１０−２】膵臓癌細胞株BxPC-3におけるTM７XN1の発現を、アイソタイプコントロール抗体と抗TM７XN1単クローン抗体21M1の結合活性の比較で示す図であり、膵臓癌細胞株BxPC-3に対する21M1の結合量を蛍光強度で示す図である。
【図１１−１】固形癌細胞を同所移植した後の転移を視覚的に検出するモデルにおける、抗TM７XN1単クローン抗体21M1の効果を示す図であり、抗TM７XN1単クローン抗体21M1の原発巣の退縮に対する効果を、原発巣の重量で示す図である。
【図１１−２】固形癌細胞を同所移植した後の転移を視覚的に検出するモデルにおける、抗TM７XN1単クローン抗体21M1の効果を示す図であり、抗TM７XN1単クローン抗体21M1の脾臓転移に対する効果を、脾臓転移の発生率で示す図である。
【図１２−１】TM７XN1-EGFP融合タンパクの発現量と抗TM７XN1単クローン抗体の結合量との相関を示す図であり、TM７XN1-EGFP融合タンパクの発現量とKSA７の結合量との相関を示す図である。
【図１２−２】TM７XN1-EGFP融合タンパクの発現量と抗TM７XN1単クローン抗体の結合量との相関を示す図であり、TM７XN1-EGFP融合タンパクの発現量と4M2Bの結合量との相関を示す図である。
【図１２−３】TM７XN1-EGFP融合タンパクの発現量と抗TM７XN1単クローン抗体の結合量との相関を示す図であり、TM７XN1-EGFP融合タンパクの発現量と7M1の結合量との相関を示す図である。
【図１２−４】TM７XN1-EGFP融合タンパクの発現量と抗TM７XN1単クローン抗体の結合量との相関を示す図であり、TM７XN1-EGFP融合タンパクの発現量と21M1の結合量との相関を示す図である。
【図１３−１】TM７XN1-EGFP融合タンパクの発現量とアイソタイプコントロール抗体の結合量との相関を示す図であり、TM７XN1-EGFP融合タンパクの発現量とラットIgG2bの結合量との相関を示す図である。
【図１３−２】TM７XN1-EGFP融合タンパクの発現量とアイソタイプコントロール抗体の結合量との相関を示す図であり、TM７XN1-EGFP融合タンパクの発現量とマウスIgG2bの結合量との相関を示す図である。
【図１３−３】TM７XN1-EGFP融合タンパクの発現量とアイソタイプコントロール抗体の結合量との相関を示す図であり、TM７XN1-EGFP融合タンパクの発現量とマウスIgG1の結合量との相関を示す図である。
【図１４−１】EGFPの発現量と抗TM７XN1単クローン抗体の結合量との相関を示す図であり、EGFPの発現量とKSA７の結合量との相関を示す図である。
【図１４−２】EGFPの発現量と抗TM７XN1単クローン抗体の結合量との相関を示す図であり、EGFPの発現量と4M2Bの結合量との相関を示す図である。
【図１４−３】EGFPの発現量と抗TM７XN1単クローン抗体の結合量との相関を示す図であり、EGFPの発現量と7M1の結合量との相関を示す図である。
【図１４−４】EGFPの発現量と抗TM７XN1単クローン抗体の結合量との相関を示す図であり、EGFPの発現量と21M1の結合量との相関を示す図である。
【図１５−１】抗TM７XN1単クローン抗体であるKSA7（標識抗体）とKSA7、4M2B、7M1および21M1（精製抗体）との競合性を示す図であり、KSA7（標識抗体）単独でTM７XN1-EGFP融合タンパク発現株を染色した場合の、KSA7（標識抗体）の結合量（蛍光強度）を示す図である。
【図１５−２】抗TM７XN1単クローン抗体であるKSA7（標識抗体）とKSA7、4M2B、7M1および21M1（精製抗体）との競合性を示す図であり、KSA7（標識抗体）とKSA7（精製抗体）でTM７XN1-EGFP融合タンパク発現株を染色した場合の、KSA7（標識抗体）の結合量（蛍光強度）を示す図である。
【図１５−３】抗TM７XN1単クローン抗体であるKSA7（標識抗体）とKSA7、4M2B、7M1および21M1（精製抗体）との競合性を示す図であり、KSA7（標識抗体）と4M2B（精製抗体）でTM７XN1-EGFP融合タンパク発現株を染色した場合の、KSA7（標識抗体）の結合量（蛍光強度）を示す図である。
【図１５−４】抗TM７XN1単クローン抗体であるKSA7（標識抗体）とKSA7、4M2B、7M1および21M1（精製抗体）との競合性を示す図であり、KSA7（標識抗体）と7M1（精製抗体）でTM７XN1-EGFP融合タンパク発現株を染色した場合の、KSA7（標識抗体）の結合量（蛍光強度）を示す図である。
【図１５−５】抗TM７XN1単クローン抗体であるKSA7（標識抗体）とKSA7、4M2B、7M1および21M1（精製抗体）との競合性を示す図であり、KSA7（標識抗体）と21M1（精製抗体）でTM７XN1-EGFP融合タンパク発現株を染色した場合の、KSA7（標識抗体）の結合量（蛍光強度）を示す図である。
【図１６−１】抗TM７XN1単クローン抗体である4M2B（標識抗体）とKSA7、4M2B、7M1および21M1（精製抗体）との競合性を示す図であり、4M2B（標識抗体）単独でTM７XN1-EGFP融合タンパク発現株を染色した場合の、4M2B（標識抗体）の結合量（蛍光強度）を示す図である。
【図１６−２】抗TM７XN1単クローン抗体である4M2B（標識抗体）とKSA7、4M2B、7M1および21M1（精製抗体）との競合性を示す図であり、4M2B（標識抗体）とKSA7（精製抗体）でTM７XN1-EGFP融合タンパク発現株を染色した場合の、4M2B（標識抗体）の結合量（蛍光強度）を示す図である。
【図１６−３】抗TM７XN1単クローン抗体である4M2B（標識抗体）とKSA7、4M2B、7M1および21M1（精製抗体）との競合性を示す図であり、4M2B（標識抗体）と4M2B（精製抗体）でTM７XN1-EGFP融合タンパク発現株を染色した場合の、4M2B（標識抗体）の結合量（蛍光強度）を示す図である。
【図１６−４】抗TM７XN1単クローン抗体である4M2B（標識抗体）とKSA7、4M2B、7M1および21M1（精製抗体）との競合性を示す図であり、4M2B（標識抗体）と7M1（精製抗体）でTM７XN1-EGFP融合タンパク発現株を染色した場合の、4M2B（標識抗体）の結合量（蛍光強度）を示す図である。
【図１６−５】抗TM７XN1単クローン抗体である4M2B（標識抗体）とKSA7、4M2B、7M1および21M1（精製抗体）との競合性を示す図であり、4M2B（標識抗体）と21M1（精製抗体）でTM７XN1-EGFP融合タンパク発現株を染色した場合の、4M2B（標識抗体）の結合量（蛍光強度）を示す図である。
【図１７−１】抗TM７XN1単クローン抗体である7M1（標識抗体）とKSA7、4M2B、7M1および21M1（精製抗体）との競合性を示す図であり、7M1（標識抗体）単独でTM７XN1-EGFP融合タンパク発現株を染色した場合の、7M1（標識抗体）の結合量（蛍光強度）を示す図である。
【図１７−２】抗TM７XN1単クローン抗体である7M1（標識抗体）とKSA7、4M2B、7M1および21M1（精製抗体）との競合性を示す図であり、7M1（標識抗体）とKSA7（精製抗体）でTM７XN1-EGFP融合タンパク発現株を染色した場合の、7M1（標識抗体）の結合量（蛍光強度）を示す図である。
【図１７−３】抗TM７XN1単クローン抗体である7M1（標識抗体）とKSA7、4M2B、7M1および21M1（精製抗体）との競合性を示す図であり、7M1（標識抗体）と4M2B（精製抗体）でTM７XN1-EGFP融合タンパク発現株を染色した場合の、7M1（標識抗体）の結合量（蛍光強度）を示す図である。
【図１７−４】抗TM７XN1単クローン抗体である7M1（標識抗体）とKSA7、4M2B、7M1および21M1（精製抗体）との競合性を示す図であり、7M1（標識抗体）と7M1（精製抗体）でTM７XN1-EGFP融合タンパク発現株を染色した場合の、7M1（標識抗体）の結合量（蛍光強度）を示す図である。
【図１７−５】抗TM７XN1単クローン抗体である7M1（標識抗体）とKSA7、4M2B、7M1および21M1（精製抗体）との競合性を示す図であり、7M1（標識抗体）と21M1（精製抗体）でTM７XN1-EGFP融合タンパク発現株を染色した場合の、7M1（標識抗体）の結合量（蛍光強度）を示す図である。
【図１８−１】抗TM７XN1単クローン抗体である21M1（標識抗体）とKSA7、4M2B、7M1および21M1（精製抗体）との競合性を示す図であり、21M1（標識抗体）単独でTM７XN1-EGFP融合タンパク発現株を染色した場合の、21M1（標識抗体）の結合量（蛍光強度）を示す図である。
【図１８−２】抗TM７XN1単クローン抗体である21M1（標識抗体）とKSA7、4M2B、7M1および21M1（精製抗体）との競合性を示す図であり、21M1（標識抗体）とKSA7（精製抗体）でTM７XN1-EGFP融合タンパク発現株を染色した場合の、21M1（標識抗体）の結合量（蛍光強度）を示す図である。
【図１８−３】抗TM７XN1単クローン抗体である21M1（標識抗体）とKSA7、4M2B、7M1および21M1（精製抗体）との競合性を示す図であり、21M1（標識抗体）と4M2B（精製抗体）でTM７XN1-EGFP融合タンパク発現株を染色した場合の、21M1（標識抗体）の結合量（蛍光強度）を示す図である。
【図１８−４】抗TM７XN1単クローン抗体である21M1（標識抗体）とKSA7、4M2B、7M1および21M1（精製抗体）との競合性を示す図であり、21M1（標識抗体）と7M1（精製抗体）でTM７XN1-EGFP融合タンパク発現株を染色した場合の、21M1（標識抗体）の結合量（蛍光強度）を示す図である。
【図１８−５】抗TM７XN1単クローン抗体である21M1（標識抗体）とKSA7、4M2B、7M1および21M1（精製抗体）との競合性を示す図であり、21M1（標識抗体）と21M1（精製抗体）でTM７XN1-EGFP融合タンパク発現株を染色した場合の、21M1（標識抗体）の結合量（蛍光強度）を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
以下、本発明を詳細に説明する。【００３９】
本発明は、TM7XN1に対する抗体がTM7XN1を発現している癌細胞の転移を有意に抑制するという発見に基づく。今回、骨転移モデル・同所移植による脾臓転移モデルを用いたが、癌細胞の転移に共通する機構を考え合わせると、骨髄・脾臓のみならず、肺、肝臓、脳などの他の臓器への転移も有効に抑制できると考えられる。TM7XN1とGPR56は、細胞外領域の構造がほぼ完全に一致することから、抗TM7XN1単クローン抗体KSA7、4M2B、7M1および21M1は、細胞表面に発現しているGPR56にも結合すると考えられる。さらに、発現部位・細胞についても、TM7XN1とGPR56が区別されずに報告されている可能性が極めて高い（上記非特許文献１参照、非特許文献２参照）ことから、それらの報告における、TM7XN1またはGPR56の一方についての発現部位・細胞などの記述は、TM7XN1またはGPR56の他方についても当てはまる可能性が極めて高い。したがって、KSA7、4M2B、7M1および21M1が結合している細胞表面の分子は、発現部位・細胞に関わらず、TM7XN1のみならずGPR56でもあり得ることから、本発明において、TM7XN1について得られた新たな知見は、GPR56についても当てはまる可能性が極めて高い。よって、本発明の「TM7XN1に対する抗体」には、抗TM7XN1単クローン抗体KSA7、4M2B、7M1および21M1のようなTM7XN1に対する抗体のみならず、GPR56に対する抗体も含まれる。また、抗体としては、TM7XN1に結合することによりリガンドに対して拮抗的に働く抗体が挙げられ、例えばTM7XN1とリガンドの結合を立体的に阻止する抗体やアンタゴニスト抗体が挙げられる。本発明で「抗体」とは、イムノグロブリンを構成する重鎖可変領域及び重鎖定常領域並びに軽鎖の可変領域及び軽鎖の定常領域をコードする遺伝子（「抗体遺伝子」と総称する）に由来するものである。本発明の「抗体」には抗体の機能的断片も含まれる。「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、抗体の抗原への作用を1つ以上保持するものを意味し、具体的にはF（ab'）2 、Fab'、Fab、Fv、ジスルフィド結合Fv、一本鎖Fv（scFv）、及びこれらの重合体等が挙げられる[D.J.King., Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies., 1998 T.J.International Ltd]。あるいは、「機能的断片」は、抗体の断片であって抗原と結合しうる断片である。【００４０】
「抗体の変異体」とは、ハイブリドーマにより生産される抗体の有するアミノ酸配列に、１アミノ酸以上の欠失、置換、挿入もしくは付加を生じたものをいう。本件発明の抗体の変異体は、当業者に周知であるハイブリドーマからの抗体遺伝子の単離方法、ヒト抗体定常領域の配列情報、遺伝子への部位特異的変異導入方法等を用いることにより適宜作製しうる。【００４１】
本発明においては、抗体は、抗体遺伝子を発現ベクターに組み込み、ベクターを適当な宿主細胞に導入し、細胞もしくは細胞の培養上清から回収、精製することにより得ることができる。【００４２】
本発明の抗体は、例えば、下記のような方法によって製造することができる。即ち、例えば、前記で定義したようなTM7XN1若しくはその一部、又は抗原の抗原性を高めるための適当な物質（例えば、bovine serum albumin等）との結合物、又はTM7XN1を細胞表面に多量に発現している細胞を、必要に応じて免疫賦活剤（Freund's Adjuvant等）とともに、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等の非ヒト哺乳動物に免疫する。あるいは、TM7XN1を組み込んだ発現ベクターを非ヒト哺乳動物に投与することにより免疫感作を行うことができる。モノクローナル抗体は、免疫感作動物から得た抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマを調製し、ハイブリドーマをクローン化し、免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造される。また好ましくは、再配列されていないヒト抗体遺伝子を保持し、免疫感作により当該免疫原に特異的なヒト抗体を産生する非ヒト動物を免疫に用いることにより、本発明の抗体をヒト抗体として得ることができる。該非ヒト動物としてマウスが挙げられ、ヒト抗体を産生し得るマウスの作成方法は、国際公開WO02/43478に記載されている。ここで、ヒト抗体とは、ヒト由来の抗体遺伝子の発現産物である抗体、又はその機能的な断片を意味する。【００４３】
また、ハイブリドーマ等の抗体産生細胞からモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主（例えばチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞等の哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞など）に導入し、遺伝子組換え技術を用いて組換型抗体を調製することができる（P.J.Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY、P.Shepherd and C.Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, J.W.Goding., Monoclonal Antibodies:principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS）。さらに、トランスジェニック動物作製技術を用いて目的抗体の遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれたトランスジェニックなウシ、ヤギ、ヒツジ又はブタを作製し、そのトランスジェニック動物のミルク中からその抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。ハイブリドーマをインビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地又は既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。【００４４】
骨に高頻度に転移する癌としては、以下の癌が知られている。血液性悪性腫瘍である多発性骨髄腫は、ほぼ100%の頻度で骨に定着 (ホーミング)し、骨を破壊しながら増殖する (Pearse RNら(2001), Proc Natl Acad Sci USA 98:11581-11586)。骨を転移標的臓器とする癌としては、固形癌では、乳癌、前立腺癌、肺癌、甲状腺癌、胃癌、そして悪性黒色腫などが知られている(Celeman (1997), Cancer 80:1588-1594)。また、小児の神経芽細胞腫も高頻度に骨に転移し、予後不良の大きな原因となっている(Michigamiら(2001), Cancer Res 61:1637-1644)。今回の実施例と癌の性質を考え合わせれば、本発明で示す抗体は、少なくともTM7XN1を発現している多発性骨髄腫、乳癌、前立腺癌、肺癌、甲状腺癌、胃癌、悪性黒色腫、および神経芽細胞腫の骨転移には有効であると考えられる。【００４５】
また、転移の機構という観点からは、原発性癌が血管内に侵入し、血中を流れて標的臓器に到達する過程は、全ての標的臓器への転移に共通であることから、本発明で示す抗体は、肺、肝臓、脳などへの癌転移にも有効である可能性は高いと考えられる。従って、本発明の方法は、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、骨膜腫、内皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、リンパ腫、白血病、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺肉腫、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、嚢胞腺癌、隋様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、繊毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウイルムス腫、頚部癌、精巣腫、肺癌、肺小細胞癌、膀胱癌、上皮腫、神経膠癌、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭癌、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、および網膜芽腫を含む様々な癌腫において、TM7XN1が発現している場合には、その癌種の転移の予防においても有用である。【００４６】
また、前述したとおり、TM7XN1とGPR56は、細胞外領域の構造がほぼ完全に一致することから、抗TM7XN1単クローン抗体KSA7、4M2B、7M1および21M1は、細胞表面に発現しているGPR56にも結合する可能性が極めて高い。さらに、発現部位・細胞についても、TM7XN1とGPR56が区別されずに報告されている可能性がきわめて高い（上記の非特許文献１および２参照）ことから、それらの報告における、TM7XN1またはGPR56の一方についての発現部位・細胞などの記述は、TM7XN1またはGPR56の他方についても当てはまる可能性が極めて高い。従って、KSA7、4M2B、7M1および21M1が結合している細胞表面の分子は、発現部位・細胞に関わらず、TM7XN1のみならずGPR56でもあり得ることから、本発明において、TM7XN1について得られた新たな知見は、GPR56についても当てはまる可能性が極めて高い。よって、本発明の「癌細胞表面にTM7XN1を発現している癌」には、癌細胞表面にTM7XN1を発現している癌のみならず、GPR56を発現している癌も含まれる。【００４７】
投与法など
本発明は、癌に関連する医学的状態または疾患の処置において有用である。本発明の抗体は、本明細書中に記載される医学的状態の他の処置（例えば、化学療法、照射療法、免疫療法または外科的方法）と組み合わせられ得、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗ホルモン、種々の症状のための治療薬（例えば、鎮痛剤、利尿薬、抗利尿薬、抗ウイルス剤、抗生物質、栄養補給剤、貧血治療薬、血液凝固治療薬、骨治療薬、ならびに精神医学的および心理学的治療薬）を含む。【００４８】
例えば、本発明の抗体を含む薬学的または無菌の組成物を調製するために、材料は、好ましくは不活性な薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤と混合される。このような薬学的組成物の調製は、当該分野において公知である。代表的に、治療的組成物は、無菌である。【００４９】
本発明の抗体組成物は、通常、非経口で、好ましくは、静脈内に投与される。このような抗体組成物は、免疫原性であり得るので、これらは、好ましくは、従来のＩＶ投与セットによってか、または皮下の貯蔵所からのいずれかで、10μg〜100mg/kg/dayの投与量になるよう、ゆっくりと投与される。【００５０】
非経口で投与される場合、治療薬は、代表的に、薬学的に受容可能な非経口のビヒクルと組み合わせて、単位用量の注射可能な形態（溶液、懸濁液、乳濁液）に処方される。このようなビヒクルは、本来、無毒で、そして非治療的である。抗体は、水、生理的食塩水のような水溶性ビヒクル、または種々の添加剤および／または賦形剤を伴うか、またはこれらを伴わない緩衝化ビヒクルの形態で投与され得る。あるいは、亜鉛懸濁液のような懸濁液は、抗体を含むように調製され得る。このような懸濁液は、皮下（ＳC）、皮内（ＩＤ）または筋肉内（ＩＭ）注射に有用であり得る。治療薬実体および添加剤の割合は、両方が有効量で存在しさえすれば、幅広い範囲にわたって変化し得る。治療薬は、好ましくは、実質的に凝集物、他のタンパク質、内毒素などを含まない精製された形態で、約５〜３０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で処方される。好ましくは、内毒素レベルは、２．５ＥＵ／ｍｌ未満である。【００５１】
治療用抗体のための投与レジメンの選択は、いくつかの因子（治療薬の血清または組織交代速度、治療薬の免疫抗原性、標的細胞の接近性、および治療ストレスに対する患者の通常の寛容性を含む）に依存する。好ましくは、投与レジメンは、受容可能なレベルの副作用に合わせて患者に到達される治療薬の量を最大にする。従って、送達される治療薬の量は、処置される状態の重篤度に部分的に依存する。【００５２】
適切な用量の決定は、臨床医によって、例えば、処置に影響をおよぼすか、処置に影響を及ぼすと推測される当該分野において公知のパラメーターまたは因子を用いてなされる。通常、この用量は、最適な用量よりいくぶん少ない量で始まり、そしてその後、任意の関連する副作用に関して所望または最適な効果が達成されるまで、少しの増大で増加させる。規定されたサンプル中のレセプター保有細胞の数は、有効用量が到達される場合の重要な指標であり得る。好ましくは、使用される抗体またはそれらの結合化合物は、処置のために標的化された動物と同じ種に由来し、それによって、試薬に対する体液性応答を最小限にする。【００５３】
抗体やその結合フラグメントに対する週間用量範囲は、体重１ｋｇ当たり約１０μｇ、好ましくは、少なくとも５０μｇ、そしてより好ましくは少なくとも約１００μｇからの範囲である。通常、この範囲は、体重１ｋｇ当たり約１０００μｇ未満、好ましくは約５００μｇ未満、そしてより好ましくは、約１００μｇ未満である。用量は、所望の処置をもたらす計画に基づき、そしてより短いかより長い期間にわたって周期的であり得る。通常、範囲は、体重１ｋｇ当たり少なくとも約１０μｇ〜約５０μｇ、好ましくは約１００μｇ〜約１０ｍｇである。【００５４】
「有効量」とは、所望の応答をもたらすために、もしくは、例えば、転移または原発性腫瘍進行の症状または徴候、サイズあるいは増殖を緩和するために十分な量を意味する。本発明の抗体を含む組成物により治療され得る代表的な哺乳動物としては、マウス、ラット、ネコ、イヌおよび霊長類（ヒトを含む）が挙げられる。特定の患者に対する有効量は、処置される状態、患者の全体的な健康、投与の方法、経路および用量、ならびに副作用の重篤度のような因子に依存して変化し得る。効果としては、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、３０％、５０％、７０％または９０％以上の定量化できる変化が期待される。組み合わせる場合、有効量は、成分の組合せに対する割合であり、そして効果は、個々の成分単独に限定されない。【００５５】
有効量の治療薬は、代表的に、少なくとも約１０％；通常、少なくとも約２０％；好ましくは少なくとも約３０％；またはより好ましくは少なくとも約５０％だけ症状を調節する。あるいは、移動の調節は、種々の細胞型の移動または情報交換に影響を与えることを意味する。これは、影響を受ける細胞の数に、例えば、統計学的に有意で、そして定量化できる変化を引き起こす。これは、ある時間内または標的領域内に誘引される標的細胞の数における減少であり得る。原発性腫瘍進行の速度、サイズ、または増殖はまた、モニターされ得る。【００５６】
さらに、本発明が適用される治療薬として、抗体に代わって、アンチセンス核酸が使用され得る。例えば、TM7XN1に対するアンチセンスポリヌクレオチドは、細胞内に導入することによってTM7XN1の遺伝子の発現を特異的に抑制でき、レセプターアンタゴニストのように機能し得る。これによって、目的の治療効果を発揮させることができる。【００５７】
さらに、本発明が適用される治療薬として、抗体に代わって、RNAi（RNA interference）法が使用されうる。RNAiは、siRNA (short interfering RNA) と呼ばれる21〜23塩基の二本鎖RNAにより、配列特異的に遺伝子発現が抑制される現象である(Fire Aら(1998), Nature 391: 806-811, Elbashir SMら(2001), Nature 411: 494-498)。RNAi法において、細胞内にsiRNAを導入する方法には、合成siRNAを細胞内に導入する方法と、siRNA発現ベクターを細胞内に導入して二本鎖RNAを発現させる方法に分類することができる。そこで、例えば、TM7XN1の遺伝子配列に一致する合成siRNAまたはsiRNA発現ベクターは、細胞内に導入することによって、TM7XN1の遺伝子レセプターアンタゴニストのように機能し得る。これによって、目的の治療効果を発揮させることができる。
【実施例】
【００５８】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【００５９】
実施例１：骨転移モデルにおける抗TM7XN1単クローン抗体KSA7の転移抑制効果実験材料  ヒト急性骨髄性白血病細胞株（KG1a）は、大日本製薬から購入し、IMDM + 10％FBS, 37℃, ５％ CO2の条件下で培養した。免疫不全マウス（NOD/SCID/γcnullマウス：通称NOGマウス）は、財団法人  実験動物中央研究所から5週齢のオス個体を購入し、14週齢において移植実験に使用した。KSA7は、キリンビール医薬探索研究所において、TM7XN1強制発現3Y1ラット細胞株をラットに免疫して取得した単クローン抗体（ラットIgG2b）であり、5mg/mLのPBS 溶液の状態に調製して保存・使用した。【００６０】
実験方法
KG1a細胞を1.0x105〜5.0x105個/mLの細胞密度で培養した。コントロール群とKSA7投与群として、それぞれ３匹のNOGマウスを用いた。コントロール群に移植するために、IMDM + 0.1％ BSAを用いて、KG1a細胞3.6x106個/600μLの細胞懸濁液を調製した。抗体投与群に移植するために、IMDM + 0.1％ BSAと、５mg/mLのKSA7のPBS溶液を用いて、KG1a細胞3.6x106個+KSA7 45μg /600μLの細胞懸濁液を調製した。それぞれの細胞懸濁液を４℃で60分静置した。移植前に200cGyのX線を照射したNOGマウスに対し、１匹当たり200μLのコントロール用あるいは抗体投与群用に調製した細胞懸濁液を、尾静脈から移植した。移植２週間後に、各群のマウスの大腿骨の骨髄細胞を採取し、抗マウスCD45 PE 標識抗体と抗ヒトCD45 APC標識抗体で二重染色を行い、一定の個数の生細胞中に含まれるマウスCD45陽性細胞とヒトCD45陽性細胞の個数をフローサイトメトリー法により測定した。そして、ヒトCD45陽性細胞数÷（マウスCD45陽性細胞数+ヒトCD45陽性細胞数）x 100(%)をキメラ率として算出した。キメラ率が高いことは、KG1a細胞（ヒトCD45陽性細胞）の骨髄での生着率が高い、すなわち骨髄転移した細胞が多いことを示す。【００６１】
結果
コントロール群の平均キメラ率（±標準偏差）は、10.42％(±6.49)、KSA7投与群の平均キメラ率は2.69％(±1.22)となった(図１)。そこで、有意水準0.05でZ検定を行ったところ、p=0.02となった。この結果は、KSA7処置により、コントロール群と比較して、KG1a細胞の骨髄転移が有意に抑制されたことを示す。また、この結果より、抗TM7XN1単クローン抗体KSA7は、TM7XN1を発現している癌細胞の骨髄転移を抑制することができることが示唆された。【００６２】
実施例２：抗TM7XN1単クローン抗体KSA7の、TM7XN1に対する結合活性
実験材料
HEK293株（ヒト胚性腎臓細胞由来）は、DMEM + 10％FBS, 37℃, 5％ CO2の条件下で培養した。TM7XN1-EGFP融合蛋白強制発現HEK293株は、キリンビール医薬探索研究所において樹立し、DMEM + 10％FBS + 5μg/mL Blasticidin, 37℃, 5％ CO2の条件下で培養した。KSA7は、キリンビール医薬探索研究所において、TM7XN1強制発現3Y1ラット細胞株をラットに免疫して取得した単クローン抗体（ラットIgG2b）であり、500μg/mLのPBS 溶液の状態に調製して使用した。アイソタイプ抗体（ラットIgG2b、500μg/mL）は、日本ベクトンディッキンソン社のBD-553986を使用した。２次抗体（PE標識抗ラットIgG抗体F(ab’)2断片）は、コスモバイオ社のOBMSTAR73を使用した。フローサイトメーターは、FACSCalibur4A（日本ベクトンディッキンソン社）を使用した。Staining Mediumは、PBSに２％(v/v)FBS、5mM EDTA-2Na、0.05％(w/v) NaN3（いずれも終濃度）を添加して調製した。PI+Staining Mediumは、Staining MediumにPropidium Iodideを1μg/mL（終濃度）添加して調製した。【００６３】
実験方法
HEK293株（以後、対照株と表記）・TM7XN1-EGFP融合タンパク強制発現HEK293株（以後、発現株と表記）を培養皿からはがして、Staining Mediumに、1.0x107個/mLの細胞濃度に調製し、1.5mLチューブに50μLずつ分注した。そこへ、KSA7またはアイソタイプ抗体が、終濃度50μg/mLになるように添加した。４℃、30分で静置した後、1mL Staining Mediumを添加して400Gで３分間遠心し、上清を除去して細胞を洗浄した。そこへ、２次抗体の原液をStaining Medium で1/50に希釈した液を50μL添加した。４℃、30分で静置した後、1mL Staining Mediumを添加して、400Gで３分間遠心し、上清を除去して細胞を洗浄した。そこへ、PI+Staining Mediumを400μL添加して細胞を懸濁し、フローサイトメーターにて、細胞に対する抗体の結合や、TM7XN1-EGFP融合タンパクの発現量などを蛍光強度によって測定した。【００６４】
結果
対照株と発現株に、それぞれKSA7を結合させた場合の蛍光強度を比較すると、図２のようになり、KSA7は発現株に対してのみ結合することが判明した。【００６５】
また、発現株に対して、それぞれアイソタイプ抗体とKSA7を結合させた場合を比較すると、図３のようになり、KSA7のみが発現株に対して結合することが判明した。また、発現株に対して、それぞれアイソタイプ抗体とKSA7を結合させた場合に、抗原となるTM7XN1-EGFP融合タンパクの発現量と、KSA7の結合量との相関を見ると、図４（アイソタイプ抗体の場合）、図５（KSA7の場合）のようになり、抗原の発現量に応じて、KSA7が結合していることが判明した。以上の結果から、KSA7は、TM7XN1に特異的に結合していることが判明した。【００６６】
実施例３： ヒト急性骨髄性白血病細胞株の骨転移モデルにおける4種類の抗TM７XN1単クローン抗体KSA7、4M2B、7M1、21M1それぞれの転移抑制効果
実験材料
ヒト急性骨髄性白血病細胞株（KG1a）は、大日本製薬から購入し、IMDM + 10％FBS, 37℃, 5% CO2の条件下で培養した。免疫不全マウスであるNOD/Shi-scid,IL-2Rγnullマウス（NOGマウス）は、財団法人  実験動物中央研究所から6週齢のオス個体を購入し、11週齢において移植実験に使用した。KSA7は、キリンビール医薬探索研究所において、TM７XN1強制発現3Y1ラット細胞株をラットに免疫して取得した抗TM７XN1単クローン抗体（ラットIgG2b）であり、5mg/mLのPBS溶液の状態に調製して保存・使用した。また、4M2B、7M1および21M1は、それぞれ、免疫生物研究所に委託して、TM７XN1強制発現Balb3T3マウス細胞株をマウスに免疫して取得した抗TM７XN1単クローン抗体（4M2B: マウスIgG2b, 7M1, 21M1: マウスIgG1）であり、2mg/mLのPBS溶液の状態に調製して保存・使用した。アイソタイプコントロール抗体については、日本ベクトンディッキンソン社の製品の、ラットIgG2b（BD-553986、クローンA95-1）、マウスIgG2b（BD-559530、クローンMPC-11）、マウスIgG1（BD-557273、クローンMOPC-31C）を購入し、NAP-25カラム（アマシャムバイオサイエンス）を用いてアジ化ナトリウムを除去した後、限外ろ過により濃縮して2mg/mLのPBS溶液の状態に調製して保存・使用した。【００６７】
さらに、21M1はAlexa Fluor 647 Protein Labeling Kit（Molecular Probes社）を用いてAlexa Fluor 647で標識した後、0.5mg/mLのPBS溶液（0.05%(w/v) NaN3を添加）の状態に調製して使用した。標識21M1に対応する標識アイソタイプコントロール抗体は、日本ベクトンディッキンソン社のマウスIgG1-Alexa647標識（BD-557732、クローンMOPC-21）を購入して使用した。抗ヒトCD45 APC標識抗体はベックマンコールター社のIM2473、抗マウスCD45 PE標識抗体は日本ベクトンディッキンソン社のBD-553081を使用した。Staining Mediumは、PBSに2%(v/v)FBS、5mM EDTA-2Na、0.05%(w/v) NaN3（いずれも終濃度）を添加して調製した。PI+Staining Mediumは、Staining MediumにPropidium Iodideを1μg/mL（終濃度）添加して調製した。フローサイトメーターは、FACSCalibur4A（日本ベクトンディッキンソン社）を使用した。【００６８】
実験方法
KG1a細胞は、1.0x105〜5.0x105個/mLの細胞密度で培養した。【００６９】
（KG1a細胞におけるTM７XN1の発現の確認）
移植のためにKG1a細胞を培養状態から回収するときに、KG1a細胞の一部を分取した。Staining Mediumを用いて、その細胞を1.0x107個/mLの細胞濃度に調製し、1.5mLチューブに50μLずつ分注した。そこへ標識21M1、または標識アイソタイプ抗体を1/10量（5.0μL）添加した。4℃、30分で静置した後、1mL Staining Mediumを添加して400Gで3分間遠心し、上清を除去して細胞を洗浄した。そこへ、PI+Staining Mediumを350μL添加して細胞を懸濁し、フローサイトメーターにて、生細胞における表面抗原に対する抗体の結合量、すなわち、TM７XN1の発現量を蛍光強度によって測定した。【００７０】
（KG1a細胞の移植）
PBS投与群、ラットIgG2b投与群、マウスIgG1投与群、マウスIgG2b投与群、KSA7投与群、4M2B投与群、7M1投与群および21M1投与群のそれぞれについて、1群6匹（計48匹）のNOGマウスを用いた。まず、IMDM + 0.1％ BSAを用いて、KG1a細胞1.0x107個/mLの必要量の細胞懸濁液を調製した。次に、PBS投与群に移植するために、当該細胞懸濁液1400μLにPBS 175μLを添加したもの、ラットIgG2b投与群・マウスIgG1投与群・マウスIgG2b投与群にそれぞれ移植するために、当該細胞懸濁液1400μLに各アイソタイプコントロール抗体溶液175μLを添加したもの、KSA7投与群に移植するために、当該細胞懸濁液1400μLにKSA7溶液70μLとPBS 105μLを添加したもの、4M2B投与群・7M1投与群・21M1投与群にそれぞれ移植するために、当該細胞懸濁液1400μLに各抗TM７XN1単クローン抗体溶液175μLを添加したもの、をそれぞれ調製した。【００７１】
それぞれの細胞懸濁液を移植の時点まで4℃で60分静置した。移植前に200cGyのX線を照射したNOGマウスに対し、1匹当たり225μLの各投与群用に調製した細胞懸濁液（KG1a細胞：2.0x106個、抗体：50μg（抗体投与群の場合）を含有）を尾静脈から移植した。移植2週間後に、各群のマウスの大腿骨の骨髄細胞を採取し、抗マウスCD45 PE 標識抗体と抗ヒトCD45 APC標識抗体で二重染色を行い、一定の個数の生細胞中に含まれるマウスCD45陽性細胞とヒトCD45陽性細胞の個数をフローサイトメトリー法により測定した。そして、ヒトCD45陽性細胞数÷（マウスCD45陽性細胞数+ヒトCD45陽性細胞数）x 100 (%)をキメラ率として算出した。キメラ率が高いことは、KG1a細胞（ヒトCD45陽性細胞）の骨髄での生着率が高い、すなわち骨髄転移した細胞が多いことを示す。【００７２】
結果
移植に用いたKG1a細胞に対して、アイソタイプコントロール抗体と21M1をそれぞれ結合させた場合の、抗体の結合量（蛍光強度）をみると、図６のようになった。アイソタイプコントロール抗体を結合させた場合（図６−１）に比べて、21M1を結合させた場合（図６−２）の方が、明らかに抗体の結合量（蛍光強度）が増大していることから、移植に用いたKG1a細胞にはTM７XN1が発現していることが確認できた。【００７３】
一方、移植2週間後の各投与群の骨髄の平均キメラ率（±標準偏差）を順に示すと、PBS投与群は2.69% (±0.71)、ラットIgG2b投与群は2.89 % (±0.93)、マウスIgG1投与群は1.58 % (±0.39)、マウスIgG2b投与群は2.86 % (±1.55)、KSA7投与群は0.26% (±0.15)、4M2B投与群は0.09% (±0.09)、7M1投与群は0.37% (±0.14)、21M1投与群は0.05% (±0.03)となった（図７）。これらのうち、抗TM７XN1単クローン抗体投与群と、それに対応するアイソタイプコントロール抗体投与群について、有意水準 p<0.01でt検定（片側検定）を行ったところ、KSA7投与群とラットIgG2b投与群でp=0.0002、4M2B投与群とマウスIgG2b投与群でp=0.0007、7M1投与群とマウスIgG1投与群でp=0.001、21M1投与群とマウスIgG1投与群でp=0.0002となり、いずれも有意な差が付いた。この結果は、抗TM７XN1単クローン抗体投与により、KG1a細胞の骨髄転移が有意に抑制されたことを示す。また、この結果より、TM７XN1分子に対する単クローン抗体は、特殊な単一のクローンでなくても、TM７XN1を発現している癌細胞の骨髄転移を抑制しうることが示された。したがって、TM７XN1分子は癌細胞の転移抑制を目指す上での重要な標的分子であることが示された。【００７４】
実施例４： ヒト多発性骨髄腫細胞株の骨髄・脾臓転移モデルにおける抗TM７XN1単クローン抗体21M1の転移抑制効果
実験材料
ヒト多発性骨髄腫細胞株（RPMI8226）は、JCRB（Japanese Collection of Research Bioresources）から購入し、RPMI 1640 + 10％FBS, 37℃, 5% CO2の条件下で培養した。免疫不全マウスであるNOD/Shi-scid,IL-2Rγnullマウス（NOGマウス）は、財団法人  実験動物中央研究所から6週齢のオス個体を購入し、19週齢において移植実験に使用した。21M1は、免疫生物研究所に委託して、TM７XN1強制発現Balb3T3マウス細胞株をマウスに免疫して取得した抗TM７XN1単クローン抗体（マウスIgG1）であり、2mg/mLのPBS 溶液の状態に調製して保存・使用した。さらに、21M1はAlexa Fluor 647 Protein Labeling Kit（Molecular Probes社）を用いてAlexa Fluor 647で標識した後、0.5mg/mLのPBS溶液（0.05%(w/v) NaN3を添加）の状態に調製して使用した。標識21M1に対応する標識アイソタイプコントロール抗体は、日本ベクトンディッキンソン社のマウスIgG1-Alexa647標識（BD-557732、クローンMOPC-21）を購入して使用した。ヒトHLA-ABC FITC標識抗体は日本ベクトンディッキンソン社のBD-555552、抗マウスCD45 PE 標識抗体は日本ベクトンディッキンソン社のBD-553081を使用した。Staining Mediumは、PBSに2%(v/v)FBS、5mM EDTA-2Na、0.05%(w/v) NaN3（いずれも終濃度）を添加して調製した。PI+Staining Mediumは、Staining MediumにPropidium Iodideを1μg/mL（終濃度）添加して調製した。フローサイトメーターは、FACSCalibur4A（日本ベクトンディッキンソン社）を使用した。【００７５】
実験方法
RPMI8226細胞は1.0x105〜5.0x105個/mLの細胞密度で培養した。【００７６】
（RPMI8226細胞におけるTM７XN1の発現の確認）
移植のためにRPMI8226細胞を培養状態から回収するときに、RPMI8226細胞の一部を分取した。Staining Mediumを用いて、その細胞を1.0x107個/mLの細胞濃度に調製し、1.5mLチューブに50μLずつ分注した。そこへ標識21M1、または標識アイソタイプ抗体を1/10量（5.0μL）添加した。4℃、30分で静置した後、1mL Staining Mediumを添加して400Gで3分間遠心し、上清を除去して細胞を洗浄した。そこへ、PI+Staining Mediumを350μL添加して細胞を懸濁し、フローサイトメーターにて、生細胞における表面抗原に対する抗体の結合量、すなわち、TM７XN1の発現量を蛍光強度によって測定した。【００７７】
（RPMI8226細胞の移植）
PBS投与群（計1群）、21M1投与群（計1群）について、それぞれ1群6匹（計12匹）のNOGマウスを用いた。まず、IMDM + 0.1％ BSAを用いて、RPMI8226細胞2.0x107個/mLの必要量の細胞懸濁液を調製した。次に、PBS投与群に移植するために、当該細胞懸濁液1300μLにPBS 162.5μLを添加したもの、21M1投与群に移植するために、当該細胞懸濁液1300μLに抗体溶液162.5μLを添加したものをそれぞれ調製した。【００７８】
それぞれの細胞懸濁液を移植の時点まで4℃で60分静置した。移植前に200cGyのX線を照射したNOGマウスに対し、1匹当たり225μLの各群用に調製した細胞懸濁液（RPMI8226細胞：4.0x106個、21M1：50μg（21M1投与群の場合）を含有）を尾静脈から移植した。移植4週間後に、各群のマウスの大腿骨の骨髄細胞と脾臓細胞を採取し、抗マウスCD45 PE標識抗体と抗ヒトHLA-ABC FITC標識抗体で二重染色を行い、一定の個数の生細胞中に含まれるマウスCD45陽性細胞とヒトHLA-ABC陽性細胞の個数をフローサイトメトリー法により測定した。そして、ヒトHLA-ABC陽性細胞÷（マウスCD45陽性細胞数+ヒトHLA-ABC陽性細胞）x 100 (%)をキメラ率として算出した。キメラ率が高いことは、RPMI8226細胞（ヒトHLA-ABC陽性細胞）の骨髄または脾臓での生着率が高い、すなわち骨髄または脾臓に転移した細胞が多いことを示す。【００７９】
結果
移植に用いたRPMI8226細胞に対して、アイソタイプコントロール抗体と21M1をそれぞれ結合させた場合の、抗体の結合量（蛍光強度）をみると、図８−１および図８−２のようになった。アイソタイプコントロール抗体を結合させた場合（図８−１）に比べて、21M1を結合させた場合（図８−２）の方が、明らかに抗体の結合量（蛍光強度）が増大していることから、移植に用いたRPMI8226細胞にはTM７XN1が発現していることが確認できた。【００８０】
一方、移植4週間後の骨髄における各投与群の平均キメラ率（±標準偏差）を順に示すと、PBS投与群は0.11% (±0.07)、21M1投与群は0.08 % (±0.07)となった（図９−１）。また、脾臓における各投与群の平均キメラ率（±標準偏差）を順に示すと、PBS投与群は4.55% (±1.72)、21M1投与群は3.36 % (±2.49)となった（図９−２）。この結果から、抗TM７XN1単クローン抗体によって、RPMI8226細胞の骨髄転移と脾臓転移が抑制される傾向があることが判明した。さらに、この結果より、TM７XN1分子に対する単クローン抗体は、TM７XN1を発現している癌細胞の骨髄転移・脾臓転移を抑制しうることが示された。したがって、TM７XN1分子は癌細胞の転移抑制を目指す上での重要な標的分子であることが示された。【００８１】
実施例５：固形癌細胞を同所移植した後の転移を視覚的に検出するモデルにおける、抗TM７XN1単クローン抗体21M1の転移抑制効果
実験材料
TM7XN1を発現し、なおかつGFPを強制発現させたヒト膵臓癌細胞株BxPC3（以後、癌細胞株と表記）は、アンチキャンサー社（米国カリフォルニア州サンディエゴ市）において樹立・培養・移植された。癌細胞株を移植する動物として、ヌードマウス（NCr nu/nu）の5〜6週齢のオスを使用した。21M1は、免疫生物研究所に委託して、TM７XN1強制発現Balb3T3マウス細胞株をマウスに免疫して取得した抗TM７XN1単クローン抗体（マウスIgG1）であり、2mg/mLのPBS 溶液の状態に調製して保存・使用した。アイソタイプコントロール抗体については、日本ベクトンディッキンソン社のマウスIgG1（BD-557273、クローンMOPC-31C）を購入し、NAP-25カラム（アマシャムバイオサイエンス）を用いてアジ化ナトリウムを除去した後、限外ろ過により濃縮して2mg/mLのPBS 溶液の状態に調製して保存・使用した。さらに、21M1はAlexa Fluor 647 Protein Labeling Kit（Molecular Probes社）を用いてAlexa Fluor 647で標識した後、0.5mg/mLのPBS溶液（0.05%(w/v) NaN3を添加）の状態に調製して使用した。標識21M1に対応する標識アイソタイプコントロール抗体は、日本ベクトンディッキンソン社のマウスIgG1-Alexa647標識（BD-557732、クローンMOPC-21）を購入して使用した。Staining Mediumは、PBSに2%(v/v)FBS、5mM EDTA-2Na、0.05%(w/v) NaN3（いずれも終濃度）を添加して調製した。PI+Staining Mediumは、Staining MediumにPropidium Iodideを1μg/mL（終濃度）添加して調製した。GFPイメージングには、水銀ランプを装備したLZ12実体蛍光顕微鏡（Leica社）を使用した。GFPの励起にはD425/60 band-pass filterと470 DCXR dichroic mirror（Chroma Technology社）を使用した。また、放射されたGFPの蛍光はGG475 long-pass filter（Chroma Technology社）とHamamatsu C5810 3-chip cooled color CCD カメラ（浜松ホトニクス社）を使用して画像イメージとして取り込んだ。取り込んだ画像イメージはImage Pro Plus 3.1ソフトウェア（Media Cybernetics社）を用いることにより処理・解析した。【００８２】
実験方法
（癌細胞株におけるTM７XN1の発現の確認）
培養皿に付着状態で培養されている癌細胞株を、0.05％トリプシン溶液で数分処理することにより、培養皿から剥離させて回収した。そして、トリプシンを不活化させるためにStaining Mediumを等量添加し、400Gで3分間遠心して細胞を洗浄した。そこへStaining Mediumを添加して細胞を懸濁し、約2.5x107/mLの細胞濃度になるように調製し、1.5mLチューブに20μLずつ分注した。そこへ標識21M1、または標識アイソタイプ抗体を1/10量（2.0μL）添加した。4℃、30分で静置した後、4％ Paraformaldehyde / PBS溶液を添加して細胞を固定した後、400Gで3分間遠心し、上清を除去した。そこへ、Staining Mediumを350μL添加して細胞を懸濁し、フローサイトメーターにて、癌細胞株の表面抗原に対する抗体の結合量、すなわち、TM７XN1の発現量を蛍光強度によって測定した。【００８３】
（癌細胞株の移植）
癌細胞株ストック用のヌードマウスにおいて維持・継代されている癌細胞株の塊を1mm3大に刻み、麻酔・開腹した移植用のヌードマウスの膵臓に3〜4個の1mm3大の癌細胞株を移植して縫合した。移植してから約4週間後、触診によって癌細胞株の生着が確認されたヌードマウスを選抜し、PBS（媒体）投与群、21M1 3mg/kg投与群、マウスIgG1（アイソタイプコントロール抗体）3mg/kg投与群に振り分けた（計3群、1群あたり10匹、計30匹）。生着の確認・群の振り分けの直後に、各群に対して当該投与量の各抗体（またはPBS）を尾静脈から投与し、その後1週間ごとに、各抗体（またはPBS）を投与した。投与を開始してから5週間後、各個体を開腹してGFPの蛍光を画像イメージとして取り込み、転移巣の有無を判定した。また、膵臓に生着させた原発巣の重量も測定した。【００８４】
結果
癌細胞株に対して、アイソタイプコントロール抗体と21M1をそれぞれ結合させた場合の、抗体の結合量（蛍光強度）をみると、（図１０）のようになった。アイソタイプコントロール抗体を結合させた場合（図１０−１）に比べて、21M1を結合させた場合（図１０−２）の方が、明らかに抗体の結合量（蛍光強度）が増大していることから、癌細胞株にはTM７XN1が発現していることが確認できた。【００８５】
一方、移植したヌードマウスの解析について、開腹して解析を実施するまでに、PBS投与群のうちの1匹が死亡した。したがって、PBS投与群：9匹、21M1 3mg/kg投与群：10匹、マウスIgG1 3mg/kg投与群：10匹について、開腹して解析を実施した。開腹時に、脾臓における転移巣の有無を判定した上で、脾臓への転移発生率を比較すると、PBS投与群は66.7%（9匹中6匹）、21M1 3mg/kg投与群は30.0%（10匹中3匹）、マウスIgG1 3mg/kg投与群は80.0%（10匹中8匹）となった（図１１−２）。よって、21M1投与によって脾臓転移の発生率が減少する傾向があるといえる。【００８６】
以上の結果より、TM７XN1分子に対する単クローン抗体は、TM７XN1を発現している膵臓癌細胞（BxPC3-3）の脾臓転移を抑制しうることが示された。【００８７】
実施例6：抗TM７XN1単クローン抗体KSA7、4M2B、7M1および21M1のTM７XN1に対する結合の特異性
実験材料
HEK293株（ヒト胚性腎臓細胞由来）は、DMEM + 10％FBS, 37℃, 5% CO2の条件下で培養した。EGFP蛋白強制発現HEK293株とTM７XN1-EGFP融合蛋白強制発現HEK293株は、キリンビール医薬探索研究所において樹立し、DMEM + 10％FBS + 5μg/mL Blasticidin, 37℃, 5% CO2の条件下で培養した。KSA7は、キリンビール医薬探索研究所において、TM７XN1強制発現3Y1ラット細胞株をラットに免疫して取得した抗TM７XN1単クローン抗体（ラットIgG2b）である。このKSA7は、Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit（Molecular Probes社）を用いてAlexa Fluor 647で標識した後、0.5mg/mLのPBS溶液（0.05%(w/v) NaN3を添加）の状態に調製して使用した。4M2B、7M1および21M1は、それぞれ、免疫生物研究所に委託して、TM７XN1強制発現Balb3T3マウス細胞株をマウスに免疫して取得した抗TM７XN1単クローン抗体（4M2B: マウスIgG2b, 7M1, 21M1: マウスIgG1）である。これら4M2B, 7M1および21M1は、それぞれAlexa Fluor 647 Protein Labeling Kit（Molecular Probes社）を用いてAlexa Fluor 647で標識した後、0.5mg/mLのPBS溶液（0.05%(w/v) NaN3を添加）の状態に調製して使用した。アイソタイプコントロール抗体については、日本ベクトンディッキンソン社のラットIgG2b（BD-553986、クローンA95-1）、マウスIgG2b-Alexa647標識（BD-557903、クローン27-35）、マウスIgG1-Alexa647標識（BD-557732、クローンMOPC-21）を購入して使用した。なお、ラットIgG2bはAlexa Fluor 647 Protein Labeling Kit（Molecular Probes社）を用いてAlexa Fluor 647で標識した後、0.5mg/mLのPBS溶液（0.05%(w/v) NaN3を添加）の状態に調製してから使用した。フローサイトメーターは、FACSCalibur4A（日本ベクトンディッキンソン社）を使用した。Staining Mediumは、PBSに2%(v/v)FBS、5mM EDTA-2Na、0.05%(w/v) NaN3（いずれも終濃度）を添加して調製した。PI+Staining Mediumは、Staining MediumにPropidium Iodideを1μg/mL（終濃度）添加して調製した。【００８８】
実験方法
EGFP強制発現HEK293株（以後、EGFP発現対照株と表記）・TM７XN1-EGFP融合タンパク強制発現HEK293株（以後、TM7XN1発現株と表記）を培養皿からはがして、Staining Mediumを用いて1.0x107個/mLの細胞濃度に調製し、1.5mLチューブに25μLずつ分注した。そこへKSA7、4M2B、7M1、21M1またはアイソタイプ抗体を1/10量（2.5μL）添加した。4℃、30分で静置した後、1mL Staining Mediumを添加して400Gで3分間遠心し、上清を除去して細胞を洗浄した。そこへ、PI+Staining Mediumを350μL添加して細胞を懸濁し、フローサイトメーターにて、生細胞における表面抗原に対する抗体の結合量・EGFPの発現量・TM７XN1-EGFP融合タンパクの発現量などを蛍光強度によって測定した。【００８９】
結果
TM7XN1発現株に対して、それぞれKSA7、4M2B、7M1および21M1を結合させた場合の、TM７XN1-EGFP融合タンパクの発現量と抗体の結合量との関係をみると、図１２のようになり、KSA7（図１２−１）、4M2B（図１２−２）、7M1（図１２−３）、21M1（図１２−４）はそれぞれTM７XN1-EGFP融合タンパクの発現量依存的に結合することが判明した。【００９０】
また、TM7XN1発現株に対して、それぞれKSA7、4M2B、7M1および21M1に対応するアイソタイプ抗体（ラットIgG2b、マウスIgG2bおよびマウスIgG1）を結合させた場合の、TM７XN1-EGFP融合タンパクの発現量と抗体の結合量との関係をみると、図１３のようになり、ラットIgG2b（図１３−１）、マウスIgG2b（図１３−２）、マウスIgG1（図１３−３）はそれぞれTM７XN1-EGFP融合タンパクの発現量に関係なく、ほとんど結合しないことが判明した。【００９１】
さらに、EGFP発現対照株に対して、それぞれKSA7、4M2B、7M1および21M1を結合させた場合の、EGFPの発現量と抗体の結合量との関係をみると、（図１４）のようになり、KSA7（図１４−１）、4M2B（図１４−２）、7M1（図１４−３）、21M1（図１４−４）はそれぞれEGFPの発現量に関係なく、ほとんど結合しないことが判明した。【００９２】
以上から、それぞれKSA7、4M2B、7M1および21M1は、TM７XN1に特異的に結合していることが確認できた。【００９３】
実施例7：抗TM７XN1単クローン抗体KSA7、4M2B、7M1および21M1のTM７XN1に対する結合の競合性
実験材料
TM７XN1-EGFP融合蛋白強制発現HEK293株は、キリンビール医薬探索研究所において樹立し、DMEM + 10％FBS + 5μg/mL Blasticidin, 37℃, 5% CO2の条件下で培養した。KSA7は、キリンビール医薬探索研究所において、TM７XN1強制発現3Y1ラット細胞株をラットに免疫して取得した抗TM７XN1単クローン抗体（ラットIgG2b）である。KSA7は、5mg/mLのPBS 溶液の状態に調製して、精製抗体として保存・使用するとともに、Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit（Molecular Probes社）を用いてAlexa Fluor 647で標識した後、0.5mg/mLのPBS溶液（0.05%(w/v) NaN3を添加）の状態に調製して、標識抗体として使用した。4M2B、7M1および21M1は、それぞれ、免疫生物研究所に委託して、TM７XN1強制発現Balb3T3マウス細胞株をマウスに免疫して取得した抗TM７XN1単クローン抗体（4M2B: マウスIgG2b、7M1および21M1: マウスIgG1）である。これら4M2B、7M1および21M1は、それぞれ、2mg/mLのPBS 溶液の状態に調製して、精製抗体として保存・使用するとともに、Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit（Molecular Probes社）を用いてAlexa Fluor 647で標識した後、0.5mg/mLのPBS溶液（0.05%(w/v) NaN3を添加）の状態に調製して、標識抗体として使用した。フローサイトメーターは、FACSCalibur4A（日本ベクトンディッキンソン社）を使用した。Staining Mediumは、PBSに2%(v/v)FBS、5mM EDTA-2Na、0.05%(w/v) NaN3（いずれも終濃度）を添加して調製した。PI+Staining Mediumは、Staining MediumにPropidium Iodideを1μg/mL（終濃度）添加して調製した。【００９４】
実験方法
TM７XN1-EGFP融合タンパク強制発現HEK293株（以後、TM7XN1発現株と表記）を培養皿からはがして、Staining Mediumを用いて1.0x107個/mLの細胞濃度に調製し、1.5mLチューブに25μLずつ、必要な本数を分注した。そこへ、まず精製抗体（KSA7、4M2B、7M1および21M1）をチューブに20μg/mL（終濃度）添加した。その5分後、さらにそのチューブに標識抗体（KSA7、4M2B、7M1および21M1）を0.2μg/mL（終濃度）ずつ添加した。以上のサンプル調製を、標識抗体単独の場合と、精製抗体と標識抗体の全ての組み合わせについて実施した。4℃、30分で静置した後、1mL Staining Mediumを添加して400Gで3分間遠心し、上清を除去して細胞を洗浄した。そこへ、PI+Staining Mediumを350μL添加して細胞を懸濁し、フローサイトメーターにて、生細胞の表面に発現しているTM７XN1分子に対する標識抗体の結合量を蛍光強度の幾何平均値（Geo Mean）によって測定した。【００９５】
結果
標識抗体と精製抗体のすべての組み合わせについて、各標識抗体を基準にして順に結果を並べると以下のようになった。【００９６】
（１）  KSA7標識抗体に対して、各精製抗体を組み合わせたものを並べると、図１５に示す結果となった。標識抗体単独の場合のGeo Mean値が155.43（図１５−１）であるのに対して、KSA7添加の場合（陽性対象）のGeo Mean値は6.40（図１５−２）、4M2B添加の場合のGeo Mean値は156.18（図１５−３）、7M1添加の場合のGeo Mean値は51.23（図１５−４）、21M1添加の場合のGeo Mean値は51.05（図１５−５）となった。よって、KSA7は 7M1, 21M1とは明確に競合するといえる。【００９７】
（２）  4M2B標識抗体に対して、各精製抗体を組み合わせたものを並べると、（図１６）に示す結果となった。標識抗体単独の場合のGeo Mean値が156.25（図１６−１）であるのに対して、KSA7添加の場合のGeo Mean値は94.32（図１６−２）、4M2B添加の場合（陽性対象）のGeo Mean値は6.44（図１６−３）、7M1添加の場合のGeo Mean値は134.96（図１６−４）、21M1添加の場合のGeo Mean値は131.15（図１６−５）となった。よって、4M2BはKSA7、7M1および21M1のすべてと競合するとはいえ、その程度は低かった。【００９８】
（３）  7M1標識抗体に対して、各精製抗体を組み合わせたものを並べると、（図１７）に示す結果となった。標識抗体単独の場合のGeo Mean値が204.85（図１７−１）であるのに対して、KSA7添加の場合のGeo Mean値は31.47（図１７−２）、4M2B添加の場合のGeo Mean値は216.75（図１７−３）、7M1添加の場合（陽性対象）のGeo Mean値は8.78（図１７−４）、21M1添加の場合のGeo Mean値は8.61（図１７−５）となった。よって、7M1はKSA7および21M1とは明確に競合するといえる。【００９９】
（４）  21M1標識抗体に対して、各精製抗体を組み合わせたものを並べると、（図１８）に示す結果となった。標識抗体単独の場合のGeo Mean値が239.69（図１８−１）であるのに対して、KSA7添加の場合のGeo Mean値は33.43（図１８−２）、4M2B添加の場合のGeo Mean値は247.94（図１８−３）、7M1添加の場合（陽性対象）のGeo Mean値は8.50（図１８−４）、21M1添加の場合のGeo Mean値は8.87（図１８−５）となった。よって、21M1はKSA7および7M1とは明確に競合するといえる。【０１００】
以上、（１）〜（４）の結果から、すべてのクローンの組み合わせ（括弧内）について、競合の程度を、◎：高い程度で競合する、○：中程度で競合する、△：低い程度で競合する、で大別すると、（△KSA7, 4M2B）、（○KSA7, 7M1）、（○KSA7, 21M1）、（△4M2B, 7M1）、（△4M2B, 21M1）、（◎7M1, 21M1）となった。このように、検討した4クローン全てについて競合が見られたが、その程度は大きく異なった。高い程度で競合するクローンについてはその認識部位が共通であるか、極めて近接している可能性が高いと考えられた。中程度または低い程度で競合するクローンについては、認識部位が近接するもの、異なる可能性が高いと考えられた。よって、KSA7と4M2Bはそれ自身以外のクローンすべてと認識部位が異なる可能性が高く、7M1と21M1は、KSA7と4M2Bとは認識部位が異なる可能性が高いと考えらた。一方、実施例3の結果から、KSA7、4M2B、7M1および21M1すべてのクローンにおいて有意な骨髄転移阻害活性が見られている。したがって、TM７XN1分子の異なった部位を認識する単クローン抗体でも、それぞれ骨髄転移阻害活性を持ちうることから、TM７XN1分子は癌細胞の転移抑制を目指す上で重要な標的分子であることが示された。【０１０１】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１５−５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１６−５】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１７−５】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１８−５】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年6月7日(2007.6.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
（１）  KSA7標識抗体に対して、各精製抗体を組み合わせたものを並べると、図１５に示す結果となった。標識抗体単独の場合のGeo Mean値が155.43（図１５−１）であるのに対して、KSA7添加の場合（陽性対照）のGeo Mean値は6.40（図１５−２）、4M2B添加の場合のGeo Mean値は156.18（図１５−３）、7M1添加の場合のGeo Mean値は51.23（図１５−４）、21M1添加の場合のGeo Mean値は51.05（図１５−５）となった。よって、KSA7は 7M1, 21M1とは明確に競合するといえる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
（２）  4M2B標識抗体に対して、各精製抗体を組み合わせたものを並べると、（図１６）に示す結果となった。標識抗体単独の場合のGeo Mean値が156.25（図１６−１）であるのに対して、KSA7添加の場合のGeo Mean値は94.32（図１６−２）、4M2B添加の場合（陽性対照）のGeo Mean値は6.44（図１６−３）、7M1添加の場合のGeo Mean値は134.96（図１６−４）、21M1添加の場合のGeo Mean値は131.15（図１６−５）となった。よって、4M2BはKSA7、7M1および21M1のすべてと競合するとはいえ、その程度は低かった。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
（３）  7M1標識抗体に対して、各精製抗体を組み合わせたものを並べると、（図１７）に示す結果となった。標識抗体単独の場合のGeo Mean値が204.85（図１７−１）であるのに対して、KSA7添加の場合のGeo Mean値は31.47（図１７−２）、4M2B添加の場合のGeo Mean値は216.75（図１７−３）、7M1添加の場合（陽性対照）のGeo Mean値は8.78（図１７−４）、21M1添加の場合のGeo Mean値は8.61（図１７−５）となった。よって、7M1はKSA7および21M1とは明確に競合するといえる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
（４）  21M1標識抗体に対して、各精製抗体を組み合わせたものを並べると、（図１８）に示す結果となった。標識抗体単独の場合のGeo Mean値が239.69（図１８−１）であるのに対して、KSA7添加の場合のGeo Mean値は33.43（図１８−２）、4M2B添加の場合のGeo Mean値は247.94（図１８−３）、7M1添加の場合のGeo Mean値は8.50（図１８−４）、21M1添加の場合（陽性対照）のGeo Mean値は8.87（図１８−５）となった。よって、21M1はKSA7および7M1とは明確に競合するといえる。
【国際調査報告】
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