(57)【要約】  本発明の目的は、ＲＮＡｉ現象を利用した新規な抗腫瘍剤を提供することである。本発明によれば、ＲＮＡｉによりHSP105の発現を抑制することができる因子を含む、抗腫瘍剤が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡｉによりHSP105の発現を抑制することができる因子を含む、抗腫瘍剤。
【請求項２】
ＲＮＡｉによりHSP105の発現を抑制することができる因子が含む、癌細胞におけるアポトーシス誘導剤。
【請求項３】
ＲＮＡｉによりHSP105の発現を抑制することができる因子が、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである、請求項１又は２に記載の薬剤。
【請求項４】
抗癌剤と組み合わせて使用される、請求項１から３の何れかに記載の薬剤。
【請求項５】
野生型ｐ５３を発現する癌細胞に対して使用される、請求項１から４の何れかに記載の薬剤。
【請求項６】
上記ｓｉＲＮＡが、配列番号１に記載の塩基配列を有するＲＮＡと配列番号２に記載の塩基配列を有するＲＮＡとから成る二本鎖ＲＮＡである、請求項１から５の何れかに記載の薬剤。
【請求項７】
大腸癌、膵癌、食道癌、乳癌、又は悪性黒色腫の治療のために使用する、請求項１から６の何れかに記載の薬剤。
【請求項８】
配列番号１に記載の塩基配列を有するＲＮＡと配列番号２に記載の塩基配列を有するＲＮＡとから成る二本鎖ＲＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡｉを利用した抗腫瘍剤に関する。より詳細には、本発明は、ＲＮＡｉによりHSP105の発現を抑制することができる因子を用いた抗腫瘍剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
RNAiは機能阻害したい遺伝子の特定領域と相同なsense RNAと antisense RNAからなる２本鎖 RNAが、標的遺伝子の転写産物であるmRNAの相同部分を干渉破壊するという現象で、1998年に線虫を用いた実験によって初めて提唱された。その後2001年になって、哺乳類細胞においても21〜23塩基対の二本鎖RNAが細胞毒性を示すことなくRNAi効果を誘導できることがわかった。【０００３】
これまでの塩基配列が分かっている遺伝子の機能を抑制する方法としては、相同組換え遺伝子ノックアウト法、アンチセンス法、リボザイム法などがあるが、このような従来の遺伝子機能解析法に比べ、RNA interference法は簡便で安価で、短時間で遺伝子の機能が解析でき、また、機能阻害したい遺伝子の配列は最低19塩基わかっていればよいという利点があり、非常に有用な手法である。さらに、siRNA発現ベクターも開発され、医療への応用にむけウイルスベクターを使ったデリバリー法も開発の段階である。上記の通り、RNA interference法は特異的に遺伝子産物の合成を抑える技術として利用され、医療への応用も報告されているが、実際に効果があったとの報告はあまりない。【０００４】
HSP105はHSP105/HSP110 familyに属するheat shock proteinで、熱ショックほか薬剤などの様々なストレスによりその発現が誘導される蛋白であることが知られている。その機能はまだ十分に解明されていないが、種々の蛋白と結合し、分解保護作用や機能の抑制・活性化に関わることが考えられている。また、マウスのembryoにおいては胎生期に一過性に発現が上昇していることが示されている（Hatayama. T. ら. Cell Struct. Funct. 22,517-525. (1997)）。rat神経細胞にHSP105を過剰発現させると様々なストレスにより誘導されるアポトーシスが抑制されることも示されている（Hatayama. T. ら. Biochem. Biophys. Res. Commun. 288, 528-534. (2001)）。本発明者らは、膵癌・大腸癌患者の血清を用いたSEREX法において、HSP105を同定したが、このことは癌患者の血清中にHSP105に対するIgG抗体が存在することを示している（Nakatsura. T. ら. Biochem. Biophys. Res. Commun. 281, 936-944. (2001)）。また本発明者らはHSP105が膵癌・大腸癌だけでなく様々なヒト腫瘍においても過剰発現していることを発見した（Kai. M. ら. Oncol. Rep. 10.1777-1782. (2003)）。一方、ヒト正常組織においては精巣で最も発現が高く、その他、脳などの一部の臓器に弱い発現を認めることが分かった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
癌においては手術困難例や術後の治療手段として、様々な方法を駆使した集学的治療が行われているが、副作用の問題も含めて決定的な治療法は未だ確立されていないのが現状である。本発明は、ＲＮＡｉ現象を利用した新規な抗腫瘍剤を提供することを解決すべき課題とした。より具体的には、本発明は、HSP105のｓｉＲＮＡを用いてHSP105の発現を抑制し、腫瘍に与える影響を検討し、新規な抗腫瘍剤を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、マウスNIH3T3細胞にHSP105遺伝子を導入すると形質転換したことから、HSP105は癌遺伝子様の機能を有し、その主なものはアポトーシスの抑制にあると考えた。上記の仮説に基づいて本発明者らは、HSP105のsiRNAを用いて、HSP105を発現する様々な癌におけるHSP105の発現を抑制した結果、その細胞をアポトーシスに陥れることに成功した。その効果は、野生型のp53を発現している癌細胞においてより顕著であり、また抗がん剤アドリアマイシンと併用することでその効果は増大した。【０００７】
以上の結果から見て、野生型のp53遺伝子導入により癌細胞をアポトーシスに陥れることを用いた遺伝子治療は既に行われているが、この遺伝子治療が効きにくいとされる野生型p53を発現した癌に対してHSP105 siRNAは有効であると考えられ、さらに変異型p53を有する癌に対してもこの遺伝子治療と併用することで相加・相乗効果が期待できる。【０００８】
即ち、本発明によれば、ＲＮＡｉによりHSP105の発現を抑制することができる因子を含む、抗腫瘍剤が提供される。
本発明の別の態様によれば、ＲＮＡｉによりHSP105の発現を抑制することができる因子が含む、癌細胞におけるアポトーシス誘導剤が提供される。【０００９】
好ましくは、ＲＮＡｉによりHSP105の発現を抑制することができる因子は、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである。
好ましくは、本発明の薬剤は、抗癌剤と組み合わせて使用される。
好ましくは、本発明の薬剤は、野生型ｐ５３を発現する癌細胞に対して使用される。【００１０】
好ましくは、上記ｓｉＲＮＡは、配列番号１に記載の塩基配列を有するＲＮＡと配列番号２に記載の塩基配列を有するＲＮＡとから成る二本鎖ＲＮＡである。
好ましくは、本発明の薬剤は、HSP105を高発現している大腸癌、膵癌、食道癌、乳癌、悪性黒色腫などの治療のために使用する。【００１１】
本発明のさらに別の態様によれば、配列番号１に記載の塩基配列を有するＲＮＡと配列番号２に記載の塩基配列を有するＲＮＡとから成る二本鎖ＲＮＡが提供される。【００１２】
本発明のさらに別の態様によれば、ＲＮＡｉによりHSP105の発現を抑制することができる因子をヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、腫瘍を抑制する方法が提供される、
本発明のさらに別の態様によれば、ＲＮＡｉによりHSP105の発現を抑制することができる因子をヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、癌細胞においてアポトーシスを誘導する方法が提供される。【００１３】
本発明のさらに別の態様によれば、抗腫瘍剤の製造のための、ＲＮＡｉによりHSP105の発現を抑制することができる因子の使用が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、癌細胞におけるアポトーシス誘導剤の製造のための、ＲＮＡｉによりHSP105の発現を抑制することができる因子の使用が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明は、ＲＮＡｉによりHSP105の発現を抑制することができる因子を含む、抗腫瘍剤並びに癌細胞におけるアポトーシス誘導剤（以下、これらを総称して、本発明の薬剤と称することがある）に関する。ＲＮＡｉによりHSP105の発現を抑制することができる因子の具体例としては、下記に説明するようなｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなどが挙げられる。このような因子が細胞に導入されると、ＲＮＡｉ現象が生じ、相同な配列を有するＲＮＡが分解される。このようなＲＮＡｉ現象は、線虫，昆虫、原虫、ヒドラ、植物、脊椎動物（哺乳動物を含む）において見られる現象である。【００１５】
好ましい態様によれば、本発明においてはｓｉＲＮＡ と呼ばれる、約２０塩基（例えば、約２１〜２３塩基）またはそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡを用いることができる。このようなｓｉＲＮＡ は、細胞に発現させることにより遺伝子発現を抑制し、そのｓｉＲＮＡ の標的となる遺伝子（本発明においては、HSP105遺伝子）の発現を抑制することができる。【００１６】
本発明において用いられるｓｉＲＮＡ は、ＲＮＡｉを引き起こすことができる限り、どのような形態のものでもよい。ここで、「ｓｉＲＮＡ 」とは、ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖ＲＮＡをいい、通常、５'−リン酸、３'−ＯＨの構造を有しており、３'末端は約２塩基突出している。このｓｉＲＮＡ に特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体は、ｓｉＲＮＡ と同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡ の中央部でｍＲＮＡを切断する。【００１７】
ｓｉＲＮＡ の配列と、標的として切断するｍＲＮＡの配列とは１００％一致することが好ましい。しかし、ｓｉＲＮＡ の中央から外れた位置の塩基が一致していない場合については、ＲＮＡｉによる切断活性は部分的には残存することが多いので、必ずしも１００％一致していなくてもよい。【００１８】
ｓｉＲＮＡの塩基配列と、発現を抑制すべきHSP105遺伝子の塩基配列との間で相同性のある領域は、HSP105遺伝子の翻訳開始領域を含まないことが好ましい。翻訳開始領域には種々の転写因子や翻訳因子が結合することが予想されるため、ｓｉＲＮＡ が効果的にｍＲＮＡに結合することができず、効果が低減することが予測されるからである。従って、相同性を有する配列は、HSP105遺伝子の翻訳開始領域から２０塩基離れていることが好ましく、より好ましくはHSP105遺伝子の翻訳開始領域から７０塩基離れている。相同性を有する配列としては、例えば、HSP105遺伝子の３'末端付近の配列でもよい。【００１９】
本発明では、ｓｉＲＮＡをＲＮＡｉを引き起こす因子として用いることができるし、ｓｉＲＮＡ を生成するような因子（例えば、約４０塩基以上のｄｓＲＮＡ）をそのような因子として用いることができる。例えば、HSP105遺伝子の核酸配列の一部に対して少なくとも約７０％、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％の相同性を有する配列を含む、二本鎖部分を含むＲＮＡまたはその改変体を使用することができる。相同性を有する配列部分は、通常は、少なくとも約１５ヌクレオチド以上であり、好ましくは少なくとも約１９ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは少なくとも約２１ヌクレオチド長である。【００２０】
本発明で用いることができるｓｉＲＮＡの具体例としては、HSP105のmRNAの138〜158番目に対応する21塩基の塩基配列を有するＲＮＡが挙げられ、具体的には、配列番号１に記載の塩基配列を有するＲＮＡと配列番号２に記載の塩基配列を有するＲＮＡとから成る二本鎖ＲＮＡが挙げられるが、これに限定されるものではない。なお、HSP105遺伝子の塩基配列は公知であり、例えば、NCBI, Nucleotide Sequence Database accession No. AB003334などに記載されている。【００２１】
本発明の別の態様によれば、ＲＮＡｉによりHSP105の発現を抑制することができる因子として、３'末端に突出部を有する短いヘアピン構造から成るｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）を使用することができる。ｓｈＲＮＡとは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子のことを言う。そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡ と同様にＲＮＡｉを引き起こすことができる。上記の通りｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ と同様にＲＮＡｉを引き起こすことから、本発明において有効に用いることができる。【００２２】
ｓｈＲＮＡは好ましくは、３'突出末端を有している。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは約１０ヌクレオチド以上であり、より好ましくは約２０ヌクレオチド以上である。ここで、３'突出末端は、好ましくはＤＮＡであり、より好ましくは少なくとも２ヌクレオチド以上のＤＮＡであり、さらに好ましくは２〜４ヌクレオチドのＤＮＡである。【００２３】
上記の通り、本発明では、ＲＮＡｉによりHSP105の発現を抑制することができる因子として、ｓｉＲＮＡ またはｓｈＲＮＡを使用することができる。ｓｉＲＮＡの長所としては、（１）細胞内に導入してもＲＮＡ自体は正常細胞の染色体内に組み込まれないので、子孫に伝わる変異を起こすような治療ではなく、安全性が高いこと、及び（２）短鎖二本鎖ＲＮＡは化学合成が比較的容易であり二本鎖にするとより安定であること、などが挙げられる。また、ｓｈＲＮＡの長所としては、遺伝子発現を長期間抑制することによって治療を行う場合、細胞内でｓｈＲＮＡを転写するようなベクターを作製して細胞内に導入することができることなどが挙げられる。【００２４】
本発明で用いるＲＮＡｉによりHSP105の発現を抑制することができる因子（即ち、上記したようなｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなど）は、人工的に化学合成してもよいし、センス鎖およびアンチセンス鎖のＤＮＡ配列を逆向きに連結したヘアピン構造のＤＮＡをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによってインビトロでＲＮＡを合成することによって作製することもできる。インビトロで合成する場合は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡを合成することができる。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、ＲＮＡｉが引き起こされ、HSP105の発現が抑制される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法、又は各種のトランスフェクション試薬（例えば、oligofectamine、Lipofectamineおよびlipofectionなど）を用いてそのようなＲＮＡを細胞内に導入することができる。【００２５】
さらに本発明によれば、ＲＮＡｉによりHSP105の発現を抑制することができる因子（好ましくは、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ）をコードする核酸配列を含む発現ベクターが提供される。さらに本発明によれば、上記した発現ベクターを含む細胞が提供される。本発明の細胞は、ＲＮＡｉを引き起こす因子を一過性発現しても安定に発現してもよい。上記した発現ベクターや細胞の種類は特に限定されないが、好ましくは、治療に使用できるものである。【００２６】
本発明の薬剤は、腫瘍の抑制のために広く使用することができる。腫瘍の抑制とはより具体的には、腫瘍発生の防止、腫瘍増大の抑制、腫瘍の退縮、並びに腫瘍の転移の抑制などが含まれ、臨床的には癌及び／又は腫瘍の予防及び／又は治療の全てを包含することを意味する。【００２７】
本発明の抗腫瘍剤を用いることができる癌の種類は特には限定されず、良性腫瘍及び悪性腫瘍の全てを包含する。癌の具体例としては、悪性黒色腫、悪性リンパ腫、消化器癌、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、尿管腫瘍、胆嚢癌、胆管癌、胆道癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、睾丸腫瘍、上顎癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、甲状腺癌、脳腫瘍、カポジ肉腫、血管腫、白血病、真性多血症、神経芽腫、網膜芽腫、骨髄腫、膀胱腫、肉腫、骨肉腫、筋肉腫、皮膚癌、基底細胞癌、皮膚付属器癌、皮膚転移癌、皮膚黒色腫などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。【００２８】
本発明の薬剤は、他の抗癌剤と併用することもできる。そのような場合、本発明の薬剤は、ある種の抗癌剤と一緒に、または前後に別々に投与することができる。このように別の抗癌剤を投与することによって、そのような抗癌剤に対して耐性のできた癌細胞にも効果的に治療または予防効果を発揮することができる。【００２９】
本発明の薬剤と併用できる抗癌剤の具体例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（１）アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、ブスルファン、チオテパ、ダカルバジンなど）
（２）代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）など）
（３）ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、カンプトテシン、エトポシドなど）
（４）チューブリン作用薬（ビンブラスチン、ビンクリスチンなど）
（５）白金化合物（シスプラチン、カルボプラチンなど）
（６）抗がん抗生物質（アドリアマイシン、ダウノルビシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシンなど）
（７）ホルモン剤（タモキシフェン、リュープロレリンなど）
（８）生物製剤（アスパラギナーゼ、インターフェロンなど）
（９）免疫賦活剤（シイタケ由来のレンチナンなど）【００３０】
本発明の薬剤の投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）、患部への直接投与などが挙げられる。【００３１】
本発明の薬剤は、医薬組成物として使用する場合、必要に応じて薬学的に許容可能な添加剤を配合することができる。  薬学的に許容可能な添加剤の具体例としては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、キャリア、賦形剤および／または薬学的アジュバントなどが挙げられるが、これらに限定されない。【００３２】
本発明の薬剤の製剤形態は特に限定されないが、例えば、液剤、注射剤、徐放剤などが挙げられる。本発明の薬剤を上記製剤として処方するために使用される溶媒としては、水性または非水性のいずれでもよい。【００３３】
注射剤は当該分野において周知の方法により調製することができる。例えば、適切な溶剤（生理食塩水、ＰＢＳのような緩衝液、滅菌水など）に溶解した後、フィルターなどで濾過滅菌し、次いで無菌容器（例えば、アンプルなど）に充填することにより注射剤を調製することができる。この注射剤には、必要に応じて、慣用の薬学的キャリアを含めてもよい。非侵襲的なカテーテルを用いる投与方法も使用され得る。本発明で用いることができるキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水などが挙げられる。【００３４】
さらに、本発明の薬剤の有効成分であるＲＮＡｉによりHSP105の発現を抑制することができる因子は、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターの形態で投与することができる。このような投与形態は、当該分野において公知であり、例えば、別冊実験医学「遺伝子治療の基礎技術」羊土社、１９９６；別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されている。【００３５】
非ウイルスベクター形態の場合、リポソームを用いて核酸分子を導入する方法（リポソーム法、ＨＶＪ−リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクション法、リポフェクトアミン法など）、マイクロインジェクション法、遺伝子銃（Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ）でキャリア（金属粒子）とともに核酸分子を細胞に移入する方法などを利用することができる。発現ベクターとしては、例えば、ｐＣＡＧＧＳ、ｐＢＪ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＺｅｏＳＶ（Invitrogen社又はStratagene社から入手可能）などが挙げられる。【００３６】
リポフェクションを用いる場合、例えば、リポフェクトアミン２０００、オリゴフェクトアミン（silencer siRNA TransfectionKit,GeneSilencer siRNA Transfection Reagent）などを用いることができる。【００３７】
ＨＶＪ−リポソーム法は、脂質二重膜で作製されたリポソーム中に核酸分子を封入し、このリポソームと不活化したセンダイウイルス（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｏｆ Ｊａｐａｎ、ＨＶＪ）とを融合させることを包含する。ＨＶＪ−リポソーム調製法は、例えば、別冊実験医学「遺伝子治療の基礎技術」羊土社、１９９６；別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７に記載されている。【００３８】
ＲＮＡｉによりHSP105の発現を抑制することができる因子をウイルスベクターを用いて生体に投与する場合は、組換えアデノウイルス、レトロウイルスなどのウイルスベクターを利用することができる。無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０などのＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、ＲＮＡｉによりHSP105の発現を抑制することができる因子を発現するＤＮＡを導入し、細胞または組織にこの組換えウイルスを感染させることにより、細胞または組織内に遺伝子を導入することができる。【００３９】
さらにまた、ＲＮＡｉによりHSP105の発現を抑制することができる因子は、生体の器官や組織などに直接注入することもできる。【００４０】
本発明の薬剤の投与量は、使用目的、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、又は有効成分であるＲＮＡｉによりHSP105の発現を抑制することができる因子の種類などを考慮して、当業者が決定することができる。【００４１】
有効成分であるＲＮＡｉによりHSP105の発現を抑制することができる因子の投与量は特に限定されないが、例えば、約０．１ｎｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１ｎｇ〜約１０ｍｇである。ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターとして投与される場合は、成人一人当たり、通常、０．０００１〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１〜１０ｍｇ、より好ましくは０．０１〜１ｍｇである。【００４２】
また本発明の薬剤の投与頻度としては、例えば、一日一回〜数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回〜１ヶ月に１回）の頻度で投与することができる。ＲＮＡｉは、一般に投与後１〜３日間効果が見られる。したがって、毎日〜３日に１回の頻度で投与することが好ましい。発現ベクターを用いる場合、１週間に１回程度投与することも可能である。【００４３】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００４４】
〔実施例１〕ヒト細胞系におけるHSP105 mRNAの発現
逆転写‐PCR (RT-PCR)を用いたHSP105 mRNA発現を検討した。ヒト大腸癌細胞株HCT116はJohns Hopkins UniversityのB. Vogelstein博士より入手した。正常大腸粘膜のcDNAはClontech社より購入した。【００４５】
RT-PCRは公知の方法に従って行った。407bpの断片を増幅するヒトHSP105遺伝子PCRプライマーを設計し、これを用いて94℃、5分の初期変性、及び58℃のアニーリング温度での33増幅サイクルからなるRT-PCR反応を行った。用いたHSP105 PCRプライマー配列は、センス：5'-AGAGTAAAAGTCAAAGTG-3'（配列番号５）、アンチセンス：5'-TTAAGAAGGTCTTTCCCT-3'（配列番号６）である。対照実験のためのβ-アクチン  PCRプライマー配列は、センス：5'-CCTCGCCTTTGCCGATCC-3'（配列番号７）、アンチセンス：5'-GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC-3'（配列番号８）である。【００４６】
対照であるβ-アクチンmRNAによる標準化の後、ヒト細胞系においてHSP105  mRNAの発現を比較した。その結果、HCT116細胞株においては正常大腸粘膜と比較してHSP105 mRNAは強く発現していた（図１）。【００４７】
〔実施例２〕small interference RNAを用いたHSP105蛋白の発現抑制とapoptosisの誘導
heat shock protein 105 (HSP105)のmRNA(138〜158) の21塩基からなるsmall interference RNA (siRNA)を設計し、Dharmacon社より購入した（図２）。また、対照用としてのLuciferase siRNA もDharmacon社より購入した。いずれも 20μMとなるようにannealing buffer(100mM KOAc, 30mM HEPES-KOH pH7.4, 2mM MgOAc)にて溶解した。【００４８】
HSP105 siRNA配列は、センス：5'-UUGGCUGCAACUCCGAUUGdTdT-3'（配列番号１）、アンチセンス：5'-CAAUCGGAGUUGCAGCCAAdTdT-3'（配列番号２）である。
Luciferase siRNA配列は、センス：5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3'（配列番号３）、アンチセンス：5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3'（配列番号４）である。【００４９】
opti-MEM (GIBCO)16μl に oligofectamine(invitrogen)4μlを加え5分間室温放置ののち、これを、対照としてのopti-MEM180μl 、およびopti-MEM175μlに対照用Luciferase-siRNA およびHSP105-siRNAをそれぞれ100pmol (5μl) 加えた溶液と混ぜ20分室温放置。この溶液(200μl)を、前日に6穴plateに１×105 /wellで10％FCS DMEM medium 2 mlで撒き、opti-MEM にて一度wash し、300μlのopti-MEMを入れた、ヒト大腸癌細胞株HCT116(wild type p53 保有株)およびHCT116(wild type p53 欠損株)の各wellに加えた。4時間後に2mlの10％FCS DMEM mediumをさらに加え、24、48時間後にtrypsin処理にて細胞を回収し、一部をflowcytometry用に、残りをWestern blotting 用にlysis buffer(20mM Tris-HCl pH7.4, 10％ glycerol, 1％ NP-40〔Roche〕, 200mM NaCl, 1mM Na3VO4, Protease inhibitor cocktail tablet 1個〔Roche〕)に溶解しcell lysateを作製した。【００５０】
Western blotting は公知の方法で行った。サンプルを7％ アクリルアミドゲルにて電気泳動ののち、ニトロセルロースメンブレン(Bio Rad)へtransferし、5％スキムミルク、1％BSAを加えた0.2％Tween20-TBS溶液にてblocking (4℃, overnight)した。HSP105 ウサギポリクローナル抗体(Santa Cruz, California)および、対照としてマウスモノクローナルβ-アクチン抗体(Sigma)を1次抗体として1時間室温でインキュベーションし、洗浄の後HRP 標識抗マウス抗体、HRP標識抗ウサギ抗体(Amersham Bioscience)にて30分インキュベーションし,洗浄の後、ECL Western Blottiong detection Reagents (Amersham Bioscience)にて検出した。【００５１】
ヒト大腸癌細胞株HCT116(wild type p53 保有株)およびHCT116(wild type p53 欠損株)のHSP105蛋白の発現は同等に経時的に低下していた。対照として用いたLuciferase siRNA処理群ではHSP105の発現は低下しなかった（図３）。
ANNEXIN V-FITC detection kit (Bio Vision Inc.)を用いてflowcytometerで早期のアポトーシス変化を調べた。ヒト大腸癌細胞株HCT116(wild type p53 保有株)およびHCT116(wild type p53 欠損株)はいずれもアポトーシスが誘導されたが、wild type p53保有株のほうがよりその効果が顕著であった（48時間後の ％ of apoptosis：HCT116 p53-/- Oligofectamineのみ12.0％ Luciferase-siRNA処理 8.4％ HSP105-siRNA処理 18.1％ HCT116 p53+/+ Oligofectamine のみ 11.2％ Luciferase-siRNA処理 9.6％ HSP105-siRNA処理 51.1％）（図４及び図５）。【００５２】
〔実施例３〕siRNAと抗がん剤の併用実験
実施例2においてさらに、siRNA添加12時間後に各well に200 ng/mlの濃度でアドリアマイシンを添加し、その効果を検討した。【００５３】
アドリアマイシンの添加により、より効果的にアポトーシスを誘導できた（HSP105-siRNA処理48時間後〔アドリアマイシン添加後36時間後〕の ％ of apoptosis ：  HCT116 p53-/-   27.8％ HCT116 p53+/+ 78.4％）（図６）。【００５４】
〔実施例４〕そのほかのヒト細胞株でのアポトーシス誘導実験
ヒト大腸癌細胞株SW620、ヒト肝臓癌SK-Hep1において実施例２の要領でsiRNAを用いてその効果を検討した。SK-Hep1の実験に際しては、対照siRNAとしてGFP siRNAをQIAGENより購入して用いた。GFP siRNA配列は、センス：  5'-GCAAGCUGACCCUGAAGUUCAU-3'（配列番号９）、アンチセンス：5'-GAACUUCAGGGUCAGCUUGCCG-3'（配列番号１０）である。【００５５】
ヒト大腸癌細胞株SW620は24時間後においてHSP105蛋白の発現がもっとも低下しており、このときにアポトーシスも強く誘導されていた。これはSW620の増殖が早い為、48時間後にはsiRNAが充分に効かなかった細胞が増殖したため、相対的にこのような結果が得られたと考えられる。ヒト肝臓癌SK-Hep1は48時間後にHSP105の発現がもっとも抑制されアポトーシスも強く誘導されていた（図７〜図９）。【００５６】
また、ヒト膵癌細胞株 PK8 、胃癌細胞株KATO-III、及びMKN28 において上記と同様にしてアポトーシス誘導実験を行った。ヒト膵癌細胞株 PK8 、胃癌細胞株KATO-III、及びMKN28においても、48時間後に、HSP105の発現が抑制され、アポトーシスが誘導された（図１０）。【００５７】
〔実施例５〕in vivo実験
2×106 のヒト胃癌細胞株KATO-IIIを100μl のHBSSに溶き、NOD SCID マウスの背部の皮下に注射した。腫瘍が約6ｍｍ大になったところで、３日毎に腫瘍内にsiRNA（実施例２に記載した配列番号１及び配列番号２で表されるHSP105 siRNA）溶液を注射した。siRNA 1 nmol +20 μl oligofectamin + ブドウ糖水で最終濃度5％ブドウ溶液60μlとなるように合成した。コントロールsiRNA との各4匹ずつの腫瘍の体積を追っていった。
Ｖ ＝ Ｌ ×  Ｗ2 ×  ０．５
（Ｖは体積を示し、Ｌは長さを示し、Ｗは幅を示す）
測定結果を図１１に示す。図１１の結果から分かるように、HSP105-siRNAは明らかに腫瘍の増殖を抑制した。【００５８】
〔実施例６〕正常細胞におけるsiRNAの効果
ヒト正常細胞におけるHSP105-siRNAの効果（副作用の検索）をみた。ヒト正常fibroblast TURU およびMORI （熊本大学の山泉教授より供与していただいた）を用いて、実施例２に記載した方法と同様の方法により、control GFP-siRNA およびHSP105-siRNA を各100 pmol 加え、3日後にWestern blotting とAnnexin V を用いたflowcytometry（HSP105-siRNA群）を行った。得られた結果を図１２に示す。図１２の結果から分かるように、HSP105-siRNA は正常細胞においてもHSP105蛋白の発現を抑制したが、アポトーシスは誘導しなかった。さらにこの蛋白発現抑制も一過性で、siRNA を導入してから約10日ほどで回復した。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明の抗腫瘍剤では、新たな手段を用いて腫瘍特異的抗原を標的とすることにより、これまでなかった抗腫瘍効果が期待される。また本発明の抗腫瘍剤の効果は、他の抗癌剤との併用により増強された。また、最先端治療としての野生型ｐ５３発現ベクターを用いた遺伝子治療においては野生型ｐ５３を発現する悪性腫瘍においては治療効果が低いのが現状であるが、本発明の抗腫瘍剤は、野生型ｐ５３を発現する癌細胞株においてより高い効果を示すことが実証された。また、変異型ｐ５３を有する癌に対してもこの遺伝子治療と併用することで相加・相乗効果が期待できる。上記の通り、本発明の抗腫瘍剤は、医療治療薬の分野において新たな悪性腫瘍治療薬として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、RT-PCRによるヒト正常大腸とヒト大腸癌細胞株HCT116のHSP105の発現を調べた結果を示す。正常大腸と比べて明らかにHCT116ではHSP105のmRNAの発現が高かった。
【図２】図２は、ヒトHSP105のsiRNA配列を示す。
【図３】図３は、ウエスタン・ブロッティングによりsiRNA処理後のHSP105蛋白の発現を確認した結果を示す。A : HCT116 p53-/-B : HCT116 p53+/+(wild type)  HCT116 wild type 、HCT116 p53-/-  ともに経時的に同等にHSP105蛋白の発現が低下している。一方、コントロールのluciferase siRNA 処理ではHSP105の発現は低下していない。
【図４】図４は、flowcytometryを用いたANNEXIN V染色によるHCT116細胞株のsiRNA処理48時間後のアポトーシスの検出を示す。HCT116 wild type 、HCT116 p53-/-  ともにコントロールのOligofectamineのみ、またはluciferase siRNA処理と比べてHSP105 siRNA処理では明らかにアポトーシスが誘導されており、それはHCT116 wild typeではより顕著であった。
【図５】図５は、図４の結果を24時間後と併せてグラフ化したものを示す。
【図６】図６は、flowcytometryを用いたANNEXIN V染色によるHCT116細胞株のsiRNA処理48時間後（アドリアマイシン200ng/ml添加36時間後）のアポトーシスの検出を示す。アドリアマイシンを併用することでより細胞をアポトーシスへと誘導することができた。
【図７】図７は、ヒト大腸癌細胞株SW620のsiRNA処理後のウエスタン・ブロッティングによるHSP105の蛋白発現を確認した結果を示す。SW620はsiRNA処理24時間後に最もHSP105の発現が低下した。
【図８】図８は、ヒト大腸癌細胞株SW620のsiRNA処理後の、flowcytometryを用いたSW620のANNEXIN V染色によるアポトーシスの検出を示す。アポトーシスはsiRNA処理24時間後に最も誘導されており、蛋白発現量の減少がアポトーシス量と相関していた。
【図９】図９は、SK-Hep1のsiRNA処理48時間後のウエスタン・ブロッティングによるHSP105の蛋白発現ならびにANNEXIN V染色によるアポトーシスの検出を示す。SK-Hep1はsiRNA処理48時間後でHSP105蛋白発現が著明に低下しており、アポトーシスが誘導されていた。
【図１０】図１０は、ヒト膵癌細胞株 PK8 、胃癌細胞株KATO-III、及びMKN28 においてsiRNA処理48時間後のウエスタン・ブロッティングによるHSP105の蛋白発現ならびにANNEXIN V染色によるアポトーシスの検出を示す。
【図１１】図１１は、マウス背部の腫瘍にHSP105 siRNAを注入した後、腫瘍の体積を経時的に測定した結果を示す。HSP105-siRNAは腫瘍の増殖を抑制した。
【図１２】図１２は、ヒト正常fibroblast TURU およびMORIのsiRNA処理後のウエスタン・ブロッティングによるHSP105の蛋白発現を確認した結果、並びに、ヒト正常fibroblast TURU およびMORIのsiRNA処理後のflowcytometryを用いたANNEXIN V染色によるアポトーシスの検出を示す。
【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１】
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【図３】
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【図７】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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