(57)【要約】  フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた組換えタンパク質、特に抗体の作製方法に関し、相同染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子の発現が人為的に抑制されている細胞を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子の発現が人為的に抑制されている細胞。
【請求項２】
フコーストランスポーター遺伝子が破壊されていることを特徴とする請求項１記載の細胞。
【請求項３】
動物細胞である請求項１または２記載の細胞。
【請求項４】
動物がチャイニーズハムスター細胞である、請求項３記載の細胞。
【請求項５】
動物細胞がCHO細胞である請求項４記載の細胞。
【請求項６】
遺伝子の破壊がジーンターゲティングベクターを用いた相同組換えにより行われる、請求項２から５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７】
外来タンパク質をコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８】
外来タンパク質をコードする遺伝子が抗体をコードする遺伝子である請求項７記載の細胞。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１項に記載の細胞を培養することを特徴とするタンパク質の製造方法。
【請求項１０】
タンパク質が抗体である請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
フコースが付加されていないタンパク質を製造することを特徴とする請求項１０記載の製造方法。
【請求項１２】
細胞を用いて組換えタンパク質を製造する際に、染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子の発現を人為的に抑制することを特徴とする、タンパク質へのフコース付加阻害方法。
【請求項１３】
遺伝子の発現の人為的抑制が、遺伝子を欠損することによる行われることを特徴とする請求項１２記載のタンパク質へのフコース付加阻害方法。
【請求項１４】
タンパク質が抗体である請求項１２または１３に記載のタンパク質へのフコース付加阻害方法。
【請求項１５】
細胞がCHO細胞である請求項１２から１４のいずれか１項に記載のタンパク質へのフコース付加阻害方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた組換えタンパク質、特に抗体の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、ADCC（抗体依存性細胞障害）活性やCDC（補体依存性細胞障害）活性により抗腫瘍効果を発揮しうる。抗体は糖鎖が結合した糖タンパク質であり、抗体の細胞障害活性の強さは抗体に結合する糖鎖の種類および量により変化しうることが知られている。特に、抗体と結合したフコースの量が細胞障害活性の強さに強く拘わっていることが報告されている（非特許文献１参照）。さらに、細胞障害活性が増強された抗体を得るために抗体産生の際に糖鎖へのフコースの結合を触媒する酵素を発現させないように操作し、フコースを有しない組換え抗体を作製する方法が報告されている（特許文献１参照）。
【非特許文献１】Shields et al., J Biol Chem., 277(30),26733-26740, 2002
【特許文献１】国際公開公報  WO00/61739号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、容易かつ確実にフコースの結合が消失または低下した組換えタンパク質を製造する方法の提供を目的とする。特にフコースの結合が消失または低下し、細胞障害活性が増強された抗体を製造する方法の提供を目的とする。本発明は、さらにこのようなタンパク質を産生するための宿主細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
抗体産生細胞中で抗体にフコースが結合する機構として、細胞内に取り込まれたフコースにGDPが結合し、その後GDP-フコースがゴルジ体中に取り込まれゴルジ体中でGDP-フコースのフコースがタンパク質に糖鎖として付加されているN-アセチルグルコサミンに転移することが知られている。具体的には、抗体分子のFc領域には、N-グリコシド結合糖鎖が結合する部位が２箇所あり、N-グリコシド結合糖鎖のN-アセチルグルコサミン部分にフコースが結合する（Pate L. Smith etal. J.Cell Biol. 2002, 158, 801-815）。【０００５】
本発明者らは、染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子を破壊することにより、ゴルジ体へのフコースの取り込みが阻害され、結果として抗体にフコースが付加されるのを阻害することができると考え、染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子を破壊した細胞を作製することにより、本発明を完成させるに至った。【０００６】
本発明において、抗体へのフコースの付加を阻害するとは、製造される抗体全てがフコースが付加されていないことは必要ではなく、抗体組成物中のフコースが付加されているタンパク質の割合が減少していればよい。【０００７】
すなわち、本発明は以下の通りである。【０００８】
[１]  染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子の発現が人為的に抑制されている細胞。【０００９】
[２]  フコーストランスポーター遺伝子が破壊されていることを特徴とする[１]の細胞。【００１０】
[３]  動物細胞である[１]または[２]の細胞。【００１１】
[４]  動物がチャイニーズハムスター細胞である、[３]の細胞。【００１２】
[５]  動物細胞がCHO細胞である[４]の細胞。【００１３】
[６]  遺伝子の破壊がジーンターゲティングベクターを用いた相同組換えにより行われる、[２]から[５]のいずれかの細胞。【００１４】
[７]  外来タンパク質をコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする[１]から[６]のいずれかの細胞。【００１５】
[８]  外来タンパク質をコードする遺伝子が抗体をコードする遺伝子である[７]の細胞。【００１６】
[９]  [１]から[８]のいずれかの細胞を培養することを特徴とするタンパク質の製造方法。【００１７】
[１０]  タンパク質が抗体である[９]の製造方法。【００１８】
[１１]  フコースが付加されていないタンパク質を製造することを特徴とする[１０]の製造方法。【００１９】
[１２]  細胞を用いて組換えタンパク質を製造する際に、染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子の発現を人為的に抑制することを特徴とする、タンパク質へのフコース付加阻害方法。【００２０】
[１３]  遺伝子の発現の人為的抑制が、遺伝子を欠損することによる行われることを特徴とする[１２]のタンパク質へのフコース付加阻害方法。【００２１】
[１４]  タンパク質が抗体である[１２]または[１３]のタンパク質へのフコース付加阻害方法。【００２２】
[１５]  細胞がCHO細胞である[１２]から[１４]のいずれかのタンパク質へのフコース付加阻害方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明は、染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子の発現が人為的に抑制されている細胞を提供し、該細胞をタンパク質の製造に用いた場合、フコースを有しない組換えタンパク質を製造することができる。フコースを有しない組換えタンパク質は、細胞障害活性が低減されており、特に抗体医薬として用いる組換え抗体において有利である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】３種類のターゲッティングベクターの構造を示す図である。
【図２】第一段階のノックアウト後、Bgl IIによる切断で、出現するバンドの構造を示す図である。
【図３】第一段階のノックアウトのサザンブロット解析の結果を示す図である。
【図４】第二段階のノックアウトの相同組み換え効率を示す図である。
【図５】フコーストランスポーター遺伝子欠損株のサザンブロット解析の結果を示す図である。
【図６】フコーストランスポーター遺伝子欠損株（wild/KO）のフコースの発現解析の結果を示す図である。
【図７】フコーストランスポーター遺伝子欠損株（KO/KO）のフコースの発現解析の結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明においてフコーストランスポーターとはフコース輸送活性を有するポリペプチドのことをいい、例えば、フコーストランスポーターが細胞膜上に発現している場合には通常、フコースを細胞内に取り込み、フコーストランスポーターがゴルジ膜上に発現している場合には通常、フコースをゴルジ体内に取り込む。本発明においては好ましいフコーストランスポーターはチャイニーズハムスターフコーストランスポーターであり、より好ましくは配列番号２に記載されたアミノ酸配列を有するフコーストランスポーターである。配列番号１にはチャイニーズハムスターフコーストランスポーター遺伝子の塩基配列を示す。【００２６】
ゴルジ体は主にゴルジ膜上に存在するフコーストランスポーターを介して、フコースをゴルジ体内に取り込んでいることから、該フコーストランスポーターの機能を阻害することにより、ゴルジ体内へのフコースの取り込みを阻害することができ、ゴルジ体内に取り込まれるフコースの量を減少させることが可能である。【００２７】
細胞のフコーストランスポーターの機能を阻害するとは、フコーストランスポーターのフコース輸送活性を低下または消滅させることをいう。【００２８】
細胞のフコーストランスポーターの機能の阻害はどのような方法で行われてもよいが、フコーストランスポーターの発現を阻害する方法が好ましい。【００２９】
フコーストランスポーターの発現阻害は、正常な輸送能を有するフコーストランスポーターの数が減少する限り、特に制限はされないが、フコーストランスポーターを標的としたターゲティングベクターなどを用いてフコーストランスポーターをコードする遺伝子（フコーストランスポーター遺伝子）を欠失（ノックアウト）する方法が好ましい。【００３０】
通常、細胞は染色体上の両方にフコーストランスポーター遺伝子を有しているが、本発明のフコーストランスポーターの機能が阻害された細胞は、染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子が欠失している。又、本発明のフコーストランスポーターの機能が阻害された細胞は、染色体上の２つのフコーストランスポーター遺伝子が欠失していれば特に限定されないが、染色体上に存在するフコーストランスポーター遺伝子の全てが欠失していることが好ましい。例えば、染色体上に3つのフコーストランスポーター遺伝子が存在する場合には、３つのフコーストランスポーター遺伝子が欠失していることが好ましい。染色体上の全てのフコーストランスポーター遺伝子が欠失しているか否かは、例えば、実施例記載のサザンブロット解析や、あるいはＦＩＳＨ法などを用いて調べることが可能である。【００３１】
本発明の製造方法により作製されるタンパク質はどのようなタンパク質でもよいが、通常、糖タンパク質であり、好ましくは抗体である。【００３２】
本発明の方法により作製する抗体の種類は特に制限されず、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体、ヒト抗体等や、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体等を適宜用いることができる。遺伝子組換え型抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region；FR）を連結するように設計したDNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR法により合成する。得られたDNAをヒト抗体定常領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 239400 、国際特許出願公開番号WO 96/02576参照）。CDRを介して連結されるヒト抗体のFRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.et al., Cancer Res, 1993, 53, 851-856.）。また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号WO 93/12227, WO 92/03918，WO 94/02602, WO 94/25585，WO 96/34096, WO 96/33735参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列を基に適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に衆知であり、WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, 
WO 95/15388を参考にすることができる。【００３３】
また、抗体は抗原に結合することができれば、抗体断片等の低分子化抗体や抗体の修飾物などであってもよい。例えば、抗体断片としては、Fab、F(ab')2、Fv又はH鎖とL鎖のFvを適当なリンカーで連結させたシングルチェインFv(scFv) (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883)、Diabodyなどが挙げられる。このような抗体断片を得るには、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照）。Diabodyは、可変領域と可変領域をリンカー等で結合したフラグメント（例えば、scFv等）（以下、Diabodyを構成するフラグメント）を2つ結合させて二量体化させたものであり、通常、2つのVLと2つのVHを含む(P.Holliger et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90, 6444-6448 (1993)、 EP404097号、WO93/11161号、Johnson et al., Method in Enzymology, 203, 88-98, (1991)、Holliger et al., Protein Engineering, 9, 299-305, (1996)、Perisic et al., Structure, 2, 1217-1226, (1994)、John et al., Protein Engineering, 12(7), 597-604, (1999)、Holliger et al,. Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 90, 6444-6448, (1993)、Atwell et al., Mol.Immunol.33, 1301-1312, (1996))。【００３４】
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（PEG）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。又、抗体に放射性同位元素、化学療法剤、細菌由来トキシン等の細胞傷害性物質などを結合することも可能であり、特に放射性標識抗体は有用である。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。【００３５】
＜本発明の方法によるタンパク質の製造方法＞
組み換えポリペプチドの製造方法は、当業者に知られている公知の方法で行うことが可能である。一般的にはポリペプチドをコードするDNAを、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明のポリペプチドに対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。【００３６】
また、タンパク質をグルタチオン S-トランスフェラーゼ蛋白質との融合ポリペプチドとして、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えポリペプチドとして宿主細胞（例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた組み換えポリペプチドはグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。融合ポリペプチドの精製後、必要に応じて融合ポリペプチドのうち、目的のポリペプチド以外の領域を、トロンビンまたはファクターXaなどにより切断し、除去することも可能である。【００３７】
本発明の製造方法において製造されるタンパク質としては、結合したフコースにより細胞傷害活性が影響を受ける抗体が好ましい。【００３８】
抗体遺伝子を適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて抗体を産生させる方法は当業者によく知られている（例えば、Carl, A.K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。【００３９】
＜本発明のタンパク質の製造方法において用いる細胞および該細胞を用いてのタンパク質の製造＞
さらに、本発明は外来のタンパク質を産生し得る宿主細胞であって、染色体に存在するフコーストランスポーター遺伝子の両方の発現が人為的に抑制されている細胞を包含する。【００４０】
このような、染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子の発現が人為的に抑制されている細胞を宿主細胞として外来タンパク質を発現させることにより、フコースの結合していないタンパク質を得ることができる。ここで、外来のタンパク質とはその細胞自体に由来しないタンパク質をいう。宿主細胞には特に制限はなく、例えば、組換えタンパク質を発現させた際に該タンパク質に糖が付加される細胞等を用いることができる。より具体的には種々の動物細胞などを用いることができ、好ましくはCHO細胞である。本発明においては特にフコーストランスポーター遺伝子がノックアウトされたCHO細胞を好適に使用することができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、CHO（J. Exp. Med. (1995) 108, 945）、COS、3T3、ミエローマ、BHK（baby hamster kidney）、HeLa、Vero、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340）、あるいは昆虫細胞、例えば、Sf9、Sf21、Tn5が知られている。CHO細胞としては、例えば、DHFR遺伝子を欠損したCHO細胞であるdhfr-CHO（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980)77, 4216-4220）やCHO K-1（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275）などを例示することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にCHO細胞が好ましい。【００４１】
上記の外来のタンパク質を産生し得る宿主細胞であって、フコーストランスポーターの機能が阻害されている細胞に産生させようとする抗体等の外来タンパク質をコードする遺伝子を組込んだ発現ベクターを組込めば、フコースの結合していないタンパク質を得ることができる。ベクターとしては、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3 (インビトロゲン社製)や、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」（ギブコBRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（インビトロゲン社製）、pNV11、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）等が挙げられるが、宿主細胞をCHO細胞とする場合には哺乳動物由来のベクターを使用することが好ましい。【００４２】
CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とする場合には、通常、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーターなどを持っており、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。【００４３】
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート（MTX）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター（pcDなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（BPV）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。【００４４】
宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリボソームDOTAP（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。【００４５】
細胞の培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができる。その際、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のpHは、約6〜8であるのが好ましい。培養は、通常、約30〜40℃で約15〜200時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。【００４６】
染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子の発現が人為的に抑制されている細胞として、染色体に存在するフコーストランスポーター遺伝子の両方が破壊された細胞を挙げることができる。【００４７】
「遺伝子の破壊」とは、遺伝子の塩基配列に部分的な欠失、置換、挿入、付加等を行い、該遺伝子の発現を抑制することをいう。ここで「遺伝子の発現を抑制」には、遺伝子自体は発現するが、正常な機能を有する蛋白質をコードする遺伝子が発現されない場合も含まれる。【００４８】
又、遺伝子の発現が完全に抑制されている場合だけでなく、部分的に抑制されている場合も本発明の「遺伝子の破壊」に含まれる。「遺伝子の欠損（ノックアウト）」および「遺伝子の不活性化」も「遺伝子の破壊」と同等の意味として用いられる。さらに、ジーンターゲティングを用いた相同組換えにより遺伝子が破壊された細胞を遺伝子がノックアウトされた細胞という。フコーストランスポーターをコードする遺伝子を破壊した細胞は、フコーストランスポーターの発現が人為的に抑制されている細胞の１つである。【００４９】
フコーストランスポーターをコードする遺伝子を破壊した細胞は、通常、ゴルジ体内に存在するフコースの量がフコーストランスポーター遺伝子が破壊されていない細胞に比べ有意に減少する、または、細胞内におけるフコース輸送能が低下または欠損する、または、細胞内のゴルジ体へのフコース取込み活性が低下または欠損する。【００５０】
特に、相同染色体の2対のフコーストランスポーター遺伝子の両方が欠損した細胞は、片方のみのフコーストランスポーターが欠損した細胞と比較して、上記の性質がより顕著に現れる。【００５１】
ゴルジ体中のフコースの量は細胞よりゴルジ体を単離し糖を抽出し、抗原抗体反応、糖とレクチンの結合反応、液体クロマトグラフィー、電気泳動等により測定することができる。また、細胞内におけるフコース輸送能および細胞内のゴルジ体へのフコース取込み活性は例えば、蛍光物質やラジオアイソトープ等で標識したフコースを用いて測定することができる。【００５２】
遺伝子の破壊は、例えば、相同組換え法により行うことが可能である。【００５３】
相同組換え法は、染色体上の遺伝子と外来DNAとの間で相同的遺伝子組換えによって目的の遺伝子だけを任意に改変する方法をいい、タンパク質をコードする配列を分断する目的で、その遺伝子のエクソンに別のDNA配列を挿入する。ジーンターゲティングベクターを持つ細胞を同定しやすくするため、遺伝子を分断する配列には一般にバクテリア由来のネオマイシン耐性遺伝子のような選択マーカーを用いる。本明細書に記載のフコーストランスポーター遺伝子の配列情報を基にターゲティングベクターを設計・作製し、該ターゲティングベクターを用いて破壊しようとするフコーストランスポーター遺伝子を相同組換えすればよい。例えば、置換型ベクターは、導入する変異の5'および3'側に連結された相同領域、ポジティブセレクション用のマーカー、相同領域の外側でベクターを直鎖状化するための制限酵素部位、相同領域の外側に配置されたネガティブセレクション用のマーカー、変異検出用の制限酵素切断部位等を含むことができる。ターゲティングベクターは、山村研一ら編  トランスジェニック動物  共立出版株式会社  1997年３月1日、相沢慎一  ジーンターゲティング  ES細胞を用いた変異マウスの作製  バイオマニュアルシリーズ８  羊土社  1995、Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Hoarbor Laboratory Press (1944)、Joyner, A.L., Gene Targeting, A Practical Approach Series, IRL Press (1993)、松村正實ら編  実験医学別冊  新遺伝子工学ハンドブック（改定第３版）  羊土社  1999  等に記載の方法に従って作製することができる。ターゲティングベクターは挿入型および置換型のどちらを用いてもよい。また、Cre-lox系を用いたターゲティングにより組換えを起こさせることもできる。Cre-lox系を用いたターゲティングは、例えば特表平11-503015号公報に記載の方法に従って行うことができる。相同組換えを起こした相同組換え体の選別方法としては、ポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリA選択等の公知の選択方法を用いればよい。相同組換え体の同定は、PCR法でもサザンブロッティング法のいずれの方法をも用いることができる。【００５４】
さらに、本発明のフコーストランスポーター遺伝子が破壊された細胞は、染色体の2対のフコーストランスポーターの両方が欠損する限り、細胞にランダムに変異を導入しても得ることができる。ランダムに変異を導入する方法として、マーカーの入った遺伝子破壊ベクターを細胞のゲノムにランダムに導入してフコーストランスポーター遺伝子が破壊された細胞をスクリーニングする方法と、ENU(N-ethyl-N-nitrosourea)等の化学変異原でランダムな変異を導入してフコーストランスポーター遺伝子が破壊された細胞をスクリーニングする方法が挙げられる。フコーストランスポーターが産生されなくなった細胞のスクリーニングは、フコーストランスポーターの活性を指標に行ってもよいし、ウエスタンブロッティングやノーザンブロッティングによりフコーストランスポーター遺伝子の転写、発現を指標にして行うこともできる。【００５５】
さらに本発明のフコーストランスポーター遺伝子が破壊された細胞は、フコーストランスポーター遺伝子をノックアウトした動物から得ることができる。フコーストランスポーター遺伝子をノックアウトした動物は、ES細胞のフコーストランスポーターを前記方法で破壊し、該ES細胞から例えば、WO02/33054号公報に記載の方法で作出することができる。この際用いる動物としては、限定されないがヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、マウス、ハムスター、ラット等が挙げられる。フコーストランスポーター遺伝子をノックアウトした動物から株化細胞を作製することにより、フコーストランスポーター遺伝子を有しない株化細胞を得ることができる。【００５６】
本発明の染色体上の2つのフコーストランスポーター遺伝子の両方が破壊された宿主細胞で外来の組換えタンパク質を産生させた場合、細胞中のフコースがゴルジ体中にトランスポートされないためタンパク質へのフコースの付加が阻害される。フコーストランスポーター遺伝子が破壊された宿主細胞で産生した組換えタンパク質は、フコーストランスポーター遺伝子が破壊されていない宿主細胞で産生した組換えタンパク質に比較して結合しているフコース量が有意に少なく、好ましくは検出できない。外来タンパク質が抗体の場合、抗体１分子の２つのH鎖のFc領域に存在する２箇所の糖鎖結合部位に結合したN-グリコシド結合糖鎖にフコースが結合していないものが得られる。このようなフコースが結合していない抗体は細胞傷害活性が増強されている。なお、本発明の細胞を用いて、抗体へのフコースの付加が阻害された抗体を製造する場合、製造される抗体全てがフコースが付加されていないことは必要ではなく、抗体組成物中のフコースが付加されているタンパク質の割合が減少していればよい。【００５７】
さらに、本発明は、染色体上のフコーストランスポーター遺伝子の両方が欠損した動物（ヒトを除く）も包含する。このような動物を用いることによりin vivoで組換えポリペプチドを産生することができる。【００５８】
これらの動物に目的とするタンパク質をコードするDNAを導入し、動物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物などを包含する。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993）。【００５９】
例えば、目的とするDNAを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的のポリペプチドを得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるポリペプチドを含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702）。【００６０】
得られたポリペプチドは、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一なポリペプチドとして精製することができる。ポリペプチドの分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればポリペプチドを分離、精製することができる。【００６１】
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。【００６２】
なお、ポリペプチドを精製前又は精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。蛋白質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。【００６３】
本発明の製造方法により製造される抗体のＨ鎖又はＬ鎖をコードする遺伝子は既知の配列を用いることも可能であり、又、当業者に公知の方法で取得することも可能である。例えば、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから抗体をコードする遺伝子をクローニングして取得することも可能であるし、抗体ライブラリから取得することも可能である。ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製できる。得られたハイブリドーマのmRNAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（V領域）のcDNAを合成し、これを所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNAと連結することによりＨ鎖又はＬ鎖をコードする遺伝子を得ることができる。免疫の際の感作抗原としては特に限定されないが、例えば、目的の全長タンパク質や、部分ペプチドなどを用いることができる。抗原の調製は、当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、バキュロウイルスを用いた方法（例えば、WO98/46777など）などに準じて行うことができる。ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法（Kohler, G., and Milstein, C., Methods Enzymol. 1981, 73, 3-46.）等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。【００６４】
抗体ライブラリについては既に多くの抗体ライブラリが公知になっており、又、抗体ライブラリの作製方法も公知であるので、当業者は適宜抗体ライブラリを入手することが可能である。【００６５】
上述のように発現、産生された抗体は、通常のタンパク質の精製で使用されている公知の方法により精製することができる。例えば、プロテインAカラムなどのアフィニティーカラム、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる(Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)。【００６６】
抗体の抗原結合活性(Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)の測定には公知の手段を使用することができる。例えば、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、EIA（酵素免疫測定法）、RIA（放射免疫測定法）あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。【００６７】
本発明の細胞を用いて産生させたタンパク質の糖鎖構造の解析は、２次元糖鎖マップ法（Anal.Biochem,,171,73,(1988)、生物化学実験法23-糖タンパク質糖鎖研究法  高橋禮子編  学会出版センター  (1989)等に記載の方法により行うことができる。さらに、糖鎖をMALDI-TOF-MS等の質量分析により解析することもできる。【００６８】
抗体の細胞障害活性
本発明の方法で製造される抗体は細胞障害活性が増加した抗体である。【００６９】
本発明における細胞障害活性とは、例えば抗体依存性細胞介在性細胞障害(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity：ADCC)活性、補体依存性細胞障害（complement-dependent cytotoxicity：CDC）活性などを挙げることができる。本発明において、CDC活性とは補体系による細胞障害活性を意味し、ADCC活性とは標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、そのFc部分にFcγ受容体保有細胞（免疫細胞等）がFcγ受容体を介して結合し、標的細胞に障害を与える活性を意味する。【００７０】
抗体がADCC活性を有するか否か、又はCDC活性を有するか否かは公知の方法により測定することができる（例えば、Current protocols in Immunology, Chapter7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc.,(1993)等）。【００７１】
具体的には、まず、エフェクター細胞、補体溶液、標的細胞の調製を行う。【００７２】
（１）  エフェクター細胞の調製
CBA/Nマウスなどから脾臓を摘出し、RPMI1640培地(GIBCO社製)中で脾臓細胞を分離する。10％ウシ胎児血清(FBS、HyClone社製)を含む同培地で洗浄後、細胞濃度を5×106/mlに調製し、エフェクター細胞を調製する。【００７３】
（２）補体溶液の調製
Baby Rabbit Complement(CEDARLANE社製)を10％ FBS含有培地(GIBCO社製)にて10倍希釈し、補体溶液を調製する。【００７４】
（３）標的細胞の調製
膵臓癌細胞株（AsPC-1、Capan-2等）を0.2ｍCiの51Cr-sodium chromate(Amersham Pharmacia Biotech社製)とともに、10％ FBS含有DMEM培地中で37℃にて1時間培養することにより放射性標識する。放射性標識後、細胞を10％ FBS含有RPMI1640培地にて3回洗浄し、細胞濃度を2×105/mlに調製して、標的細胞を調製する。【００７５】
次いで、ADCC活性、又はCDC活性の測定を行う。ADCC活性の測定の場合は、96ウェルU底プレート(Beckton Dickinson社製)に、標的細胞と、抗体を50μlずつ加え、氷上にて15分間反応させる。その後、エフェクター細胞100μlを加え、炭酸ガスインキュベーター内で4時間培養する。抗体の終濃度は0または10μg/mlとする。培養後、100μlの上清を回収し、ガンマカウンター(COBRAIIAUTO-GMMA、MODEL D5005、Packard Instrument Company社製)で放射活性を測定する。細胞障害活性(%)は(A-C)/(B-C)×100により求めることができる。Aは各試料における放射活性(cpm)、Bは1％ NP-40(半井社製)を加えた試料における放射活性(cpm)、Cは標的細胞のみを含む試料の放射活性(cpm)を示す。【００７６】
一方、CDC活性の測定の場合は、96ウェル平底プレート(Becton Dickinson社製)に、標的細胞と、抗PepT抗体を50μlずつ加え、氷上にて15分間反応させる。その後、補体溶液100μlを加え、炭酸ガスインキュベーター内で4時間培養する。抗体の終濃度は0または3μg/mlとする。培養後、100μlの上清を回収し、ガンマカウンターで放射活性を測定する。細胞障害活性はADCC活性の測定と同様にして求めることができる。
【実施例】
【００７７】
CHO細胞におけるフコーストランスポーター遺伝子の破壊
１．ターゲッティングベクターの構築
（１）  KO1ベクターの作製
pcDNA3.1/Hygro（インビトロジェン社）よりHyg5-BHとHyg3-NTのプライマーでPCRすることによって、Hygromycin耐性遺伝子（Hygr）の開始コドンの5’側にBamH IサイトとTGCGCの配列を付加することで、フコーストランスポーター遺伝子の開始コドンの5’側と同じ配列にし、SV40 polyA付加シグナルまでの領域を含む3’側にはNot Iサイトを付加してHygrを抜き出した。【００７８】
フォワードプライマー
Hyg5-BH    5’- GGA TCC TGC GCA TGA AAA AGC CTG AAC TCA CC -3’（配列番号３）
リバースプライマー
Hyg3-NT    5’- GCG GCC GCC TAT TCC TTT GCC CTC GGA CG -3’（配列番号４）
フコーストランスポーターのターゲッティングベクターver.1（以下、KO1ベクターと称する）はpMC1DT-Aベクター（Yagi T, Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol.87, p9918-9922, 1990）に、フコーストランスポーターの5’側（配列番号１に示す塩基配列のNo.2,780のSma IからNo.4,232のBamH I）、3’側（No.4,284からNo.10,934のSac Iまで）、及びHygrフラグメントを各々挿入することで構築した（図１）。ベクターの特徴としては、Hygrにプロモーターが付加されていないことから、相同組み換えを起こしたときにフコーストランスポーターのプロモーターによって、Hygrが発現することとなる。しかしながら、相同組み換えによって1コピーのみベクターが細胞に導入されても、ハイグロマイシンBに対する耐性を獲得するほどHygrが発現するとは限らない。なお、KO1ベクターはNot Iで切断して細胞に導入した。KO1ベクターによって、フコーストランスポーターは開始コドンを含むエクソン１の41塩基対を欠損することになり、機能を失うものと考えられる。【００７９】
（２）pBSK-pgk-1-Hygrの作製
pKJ2ベクター（Popo H, Biochemical Genetics vol.28, p299-308, 1990）よりマウスpgk-1遺伝子のプロモーターをEcoR I-Pst Iによって切り出し、pBluescript(ストラタジーン社)のEcoR I-Pst IサイトにクローニングしてpBSK-pgk-1を作製した。HygrはpcDNA3.1/HygroよりHyg5-AVとHyg3-BHのプライマーでPCRすることによって、Hygrの5’側にEcoT22 IサイトとKozak配列を付加し、SV40 polyA付加シグナルまでの領域を含む3’側にはBamH Iサイトを付加してHygrを抜き出した。【００８０】
フォワードプライマー
Hyg5-AV    5’- ATG CAT GCC ACC ATG AAA AAG CCT GAA CTC ACC -3’（配列番号５）
リバースプライマー
Hyg3-BH    5’- GGA TCC CAG GCT TTA CAC TTT ATG CTT C -3’（配列番号６）
このHygr（EcoT22 I-BamH I）フラグメントをpBSK-pgk-1のPst I-BamH Iサイトに挿入し、pBSK-pgk-1-Hygrを作製した。【００８１】
（３）KO2ベクターの作製
フコーストランスポーターのターゲッティングベクターver.2（以下、KO2ベクターと称する）はpMC1DT-Aベクターにフコーストランスポーターの5’側（配列番号１に示す塩基配列のNo.2,780のSma IからNo.4,232のBamH I）、3’側（No.4,284からNo.10,934のSac Iまで）、及びpgk-1- Hygrフラグメントを各々挿入することで構築した（図１）。KO1ベクターと異なり、KO2ベクターはHygrにpgk-1遺伝子のプロモーターが付加されていることから、相同組み換えによって1コピーのみベクターが細胞に導入されても、ハイグロマイシンBに対する耐性を獲得する。なお、KO2ベクターはNot Iで切断して細胞に導入した。KO2ベクターによって、フコーストランスポーターは開始コドンを含むエクソン１の46塩基対を欠損することになり、機能を失うものと考えられる。【００８２】
（４）pBSK-pgk-1-Purorの作製
pPURベクター（BD Biosciences社）をPst IとBamH Iで切断し、切り出されたフラグメント（Puror）をpBSK-pgk-1のPst I-BamH Iサイトに挿入し、pBSK-pgk-1-Purorを作製した。【００８３】
（５）KO3ベクターの作製
フコーストランスポーターのターゲッティングベクターver.3（以下、KO3ベクターと称する）はpMC1DT-Aベクターにフコーストランスポーターの5’側（配列番号１に示す塩基配列のNo.2,780のSma IからNo.4,232のBamH I）、3’側（No.4,284からNo.10,934のSac Iまで）、及びpgk-1- Purorフラグメントを各々挿入することで構築した（図１）。なお、pgk-1- Purorの3’末端には、以下に示すスクリーニング用のプライマーが結合する配列を予め付加しておいた。なお、KO3ベクターはNot Iで切断して細胞に導入した。KO3ベクターによって、フコーストランスポーターは開始コドンを含むエクソン１の46塩基対を欠損することになり、機能を失うものと考えられる。【００８４】
リバースプライマー
RSGR-A    5’- GCT GTC TGG AGT ACT GTG CAT CTG C -3’（配列番号７）
以上の3種類のターゲッティングベクターを用いて、フコーストランスポーター遺伝子のノックアウトを試みた。【００８５】
２．CHO細胞へのベクターの導入
CHO-S-SFMII HT- (インビトロジェン社、cat 12052-098)にHT Supplement(100X)（インビトロジェン社  cat. 11067-030）とペニシリンストレプトマイシン（インビトロジェン社  cat. 15140-122）をCHO-S-SFMII HT-の容量に対して、それぞれ1/100 量を加えた。これを培養用の培地（以下、SFMII (+)と称する）としてCHO細胞のDXB11株を継代し、さらに遺伝子導入後の培養もこのSFMII(+)で行った。8 X 106個のCHO細胞を0.8mLのダルベッコリン酸緩衝液(以下、PBSと略す。インビトロジェン社  cat 14190-144)に懸濁した。細胞懸濁液に30μgのターゲッティングベクターを加え、Gene Pulser Cuvette(4mm)（バイオラッド社  cat. 1652088）に細胞懸濁液を移した。氷上で10分間放置した後に、GENE-PULSER II（バイオラッド社code No. 340BR）で1.5kV, 25μFDの条件で、エレクトロポレーション法によりベクターを細胞に導入した。ベクターを導入後、細胞を200mlのSFMII(+)培地に懸濁して20枚の96穴平底プレート（イワキ社 cat. 1860-096）に100μl/ウェルで細胞を播きこんだ。プレートをCO2インキュベータ内で、24時間、37℃で培養した後、薬剤を添加した。【００８６】
３．ノックアウトの第一段階
KO1ベクター、もしくはKO2ベクターをそれぞれCHO細胞に導入し、ベクター導入から24時間後にハイグロマイシンB （インビトロジェン社  cat. 10687-010）による選抜を行った。ハイグロマイシンBは0.3mg/mlになるようにSFMII(+)に溶解し、100μl/ウェル添加した。【００８７】
４．PCRによる相同組み換え体のスクリーニング
（１）PCR用のサンプルの調整
相同組み換え体はPCR法によってスクリーニングした。スクリーニングで用いるCHO細胞は96穴平底プレートで培養し、培養上清除去後に細胞溶解用の緩衝液を50μl/ウェル加えて55℃、2時間加温し、続いて95℃、15分加熱することで、プロティナーゼ Kを失活させてPCRの鋳型とした。細胞溶解用の緩衝液は、1ウェルあたり10 X LA 緩衝液II(タカラ社LA Taqに添付)  5μl、10% NP-40 （ロッシュ社  cat. 1 332 473）  2.5μl、プロティナーゼ K (20mg/ml、タカラ社  cat. 9033)  4μl、及び蒸留水（ナカライテスク社  cat. 36421-35）38.5μlで構成されている。【００８８】
（２）PCRの条件
PCR反応混合物は上記のPCRサンプル1μl、10 X LA緩衝液II 5μl、MgCl2 (25mM) 5μl、dNTP(2.5mM) 5μl、プライマー（各10μM）2μl、LA Taq(5 IU/μl cat.RR002B) 0.5μl、及び蒸留水 29.5μl(全50μl)とした。KO1ベクターを導入した細胞のスクリーニングには、TP-F4とTHygro-R1、KO2ベクターを導入した細胞のスクリーニングには、TP-F4とTHygro-F1をPCRプライマーに用いた。【００８９】
KO1ベクターを導入した細胞のPCRは、95℃にて1分間の前加熱、95℃にて30秒間、60℃にて30秒間、及び60℃にて2分間の増幅サイクル40サイクル、並びに72℃にて7分の複加熱とした。KO2ベクターを導入した細胞のスクリーニングには95℃にて1分間の前加熱、95℃にて30秒間、及び70℃にて3分間の増幅サイクル40サイクル、並びに70℃にて7分の複加熱とした。【００９０】
プライマーは以下の通りで、相同組み換えを起こした細胞のサンプルでは、KO1ベクターでは、約1.6kb、KO2ベクターでは約2.0kbのDNAが増幅される。プライマーはTP-F4がベクターの外側で、かつ5’側のフコーストランスポーターのゲノム領域に設定し、THygro-F1、及びTHygro-R1はベクター内のHygrの中に設定した。【００９１】
フォワードプライマー（KO1, KO2）
TP-F4  5’- GGA  ATG  CAG  CTT  CCT  CAA  GGG  ACT  CGC -3’（配列番号８）
リバースプライマー(KO1)
THygro-R1  5’- TGC ATC AGG TCG GAG ACG CTG TCG AAC -3’（配列番号９）
リバースプライマー(KO2)
THygro-F1  5’- GCA  CTC  GTC  CGA  GGG  CAA  AGG  AAT  AGC -3’（配列番号１０）
５．PCRスクリーニング結果
KO1ベクターを導入した細胞は918個を解析し、そのうち相同組み換え体と考えられる細胞は1個であった（相同組み換え効率は約0.1%）。また、KO2ベクターを導入した細胞は537個を解析し、そのうち相同組み換え体と考えられる細胞は17個であった（相同組み換え効率は約3.2%）。【００９２】
６．サザンブロット解析
さらに、サザンブロット法によっても確認を行った。培養した細胞から定法に従ってゲノムDNAを10μg調整し、サザンブロットを行った。配列番号１に示す塩基配列のNo.2,113-No.2,500 の領域から、以下の二種類のプライマーを用いてPCR法により387bpのプローブを調整し、これをサザンブロット法による確認に用いた。ゲノムDNAはBgl IIで切断した。【００９３】
フォワードプライマー
Bgl-F：5’- TGT GCT GGG AAT TGA ACC CAG GAC -3’（配列番号１１）
リバースプライマー
Bgl-R：5’- CTA CTT GTC TGT GCT TTC TTC C -3’（配列番号１２）
Bgl IIによる切断によって、フコーストランスポーターの染色体からは約3.0kb、KO1ベクターで相同組み換えを起こした染色体からは約4.6kb、KO2ベクターで相同組み換えを起こした染色体からは約5.0kbのバンドがそれぞれ出現する。図2は第一段階のノックアウト後、Bgl IIによる切断で、出現するバンドの構造を示す図であり、図3は実際にサザンプロットを行ったときのデータを示したものである。KO1ベクター、及びKO2ベクターによって相同組み換えを起こした細胞のそれぞれ1、7種類を実験に用いた。KO1ベクターで唯一獲得された細胞は5C1と名づけたが、その後の解析により複数の細胞集団から構成されることが明らかになったので、限界希釈によってクローン化し、その後の実験に用いることにした。また、KO2ベクターで獲得された細胞の一つを6E2と名付けた。【００９４】
７．ノックアウトの第二段階
KO1ベクター、及びKO2ベクターによって相同組み換えが成功した細胞に対し、3種類のベクターを用いて、フコーストランスポーター遺伝子が完全に欠損した細胞株の樹立を試みた。ベクターと細胞の組み合わせは、以下の通りである。方法1. KO2ベクターと5C1細胞（KO1）、方法2. KO2ベクターと6E2細胞(KO2)、方法3. KO3ベクターと6E2細胞(KO2)。ベクターをそれぞれの細胞に導入し、ベクター導入から24時間後にハイグロマイシンB 、ピューロマイシン（ナカライテスク社、cat.29455-12）による選抜を開始した。ハイグロマイシンBは方法１では最終濃度が1mg/ml、方法2では最終濃度が7mg/mlになるようにした。さらに方法３では、ハイグロマイシンBの最終濃度が0.15mg/ml、ピューロマイシンの最終濃度が8μg/mlになるように添加した。【００９５】
８．PCRによる相同組み換え体のスクリーニング
サンプルの調整は前述の通り。方法1に関するスクリーニングは、前述のKO1ベクター、及びKO2ベクターで相同組み換えを起こした細胞を検出するPCRを両方行った。方法2に関しては、下記のPCRプライマーを設計した。配列番号１に示す塩基配列のNo.3,924-3,950の領域にTPS-F1を、 No.4,248-4,274にSHygro-R1を設定した。このPCRプライマーによって、KO2ベクターにより欠損するフコーストランスポーターの遺伝子領域の350bpが増幅される。従って、方法2におけるPCRスクリーニングにおいては、350bpが増幅されないものを、フコーストランスポーター遺伝子が完全に欠損した細胞とみなすことにした。PCRの条件は、95℃にて1分間の前加熱、95℃にて30秒間、70℃にて1分間の増幅サイクル35サイクル、並びに70℃にて7分の複加熱とした。【００９６】
フォワードプライマー
TPS-F1：5’- CTC GAC TCG TCC CTA TTA GGC AAC AGC -3’（配列番号１３）
リバースプライマー
SHygro-R1：5’- TCA GAG GCA GTG GAG CCT CCA GTC AGC -3’（配列番号１４）
方法3に関しては、フォワードプライマーにTP-F4、リバースプライマーにRSGR-Aを用いた。PCRの条件は、95℃にて1分間の前加熱、95℃にて30秒間、60℃にて30秒間、72℃にて2分間の増幅サイクル35サイクル、並びに72℃にて7分の複加熱とした。KO3ベクターによって相同組み換えを起こした細胞のサンプルでは、約1.6kbのDNAが増幅される。このPCRでKO3ベクターによって相同組み換えを起こした細胞を検出するとともに、KO2ベクターでの相同組み換えが残っていることも確認した。【００９７】
９．PCRスクリーニング結果
方法１では616個を解析し、そのうち相同組み換え体と考えられる細胞は18個であった（相同組み換え効率は2.9%）（図４）。方法2では524個を解析し、そのうち相同組み換え体と考えられる細胞は2個であった（相同組み換え効率は約0.4%）。さらに、方法3では382個を解析し、そのうち相同組み換え体と考えられる細胞は7個であった（相同組み換え効率は約1.8%）。【００９８】
１０．サザンブロット解析
前述の方法に準じて解析を行った。その結果、解析できた細胞のうち、フコーストランスポーターの遺伝子が完全に欠損している細胞を1つ見出した。第一段階のノックアウトでは、PCRとサザンブロットの解析結果が一致したが、この第二段階のノックアウトでは、一致しなかった。この原因としては、1. 例えば、方法１でKO1、KO2のそれぞれ単独で相同組み換えを起こした細胞が混在している、2. フコーストランスポーター遺伝子が一対（2遺伝子）ではなく複数対（あるいは3遺伝子以上）存在する、3. 第一段階のノックアウトが成功した細胞株を培養していると、継代中に残ったフコーストランスポーター遺伝子がコピー数を増やすことなどの可能性が考えられた。【００９９】
１１．フコースの発現解析
さらに、PCRで相同組み換え体と判断された26の細胞におけるフコースの発現を解析した。5μg/mLのLens culinaris Agglutinin, FITC Conjugate (ベクターラボラトリー社 cat. FL-1041)、2.5% のFBS、0.02%のアジ化ナトリウムを含むPBS（以下、FACS溶解液と称する）100μlで1×106個の細胞を氷冷中で1時間染色した。その後、 FACS溶解液で細胞を3回洗浄してFACSCalibur（ベクトンディッキンソン社）で測定を行った。その結果、サザンブロット解析でフコーストランスポーターの遺伝子が完全に欠損していると判断された細胞のみ、フコースの発現が低下していることが明らかになった。図５から７は得られたクローンのサザンブロット解析（図５）と、フコースの発現を示した図である。図６は、wild/KOの結果を示し、図７は、KO/KOの結果を示す。【０１００】
以上の結果より以下のことが判明した。【０１０１】
フコーストランスポーターの遺伝子が完全に欠失している細胞は１株しかなく、スクリーニングした数が616個であったことを考えると、相同組み換えの頻度は約0.16%と低い結果になった。第二段階のノックアウトで、PCRとサザンブロットの解析結果が一致しなかった理由は、前述のようにいくつか考えられるが、方法3においては、2種類の薬剤で選抜しているため、得られた細胞株がKO2ベクター、KO3ベクターのそれぞれ単独で相同組み換えを起こした細胞が混在しているとは考えられない。また、その他のPCRで相同組み換えを起こしたと判断された細胞株もすべて、複数の細胞集団から構成されているとは考えにくい。前述のようにフコーストランスポーター遺伝子が3以上存在した場合には、細胞におけるターゲッティングは格段に難しくなり、KO1ベクターのようなHygrが発現しにくいもの使用し、なおかつ数多くのスクリーニングを行わないと相同組み換え体が得られないものと考えられた。【０１０２】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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