(57)【要約】本発明は、シアリルガラクトース基結合性ペプチド、例えばガングリオシドＧＭ３結合性ペプチドを有効成分として含むインフルエンザウイルス感染抑制剤の提供を目的とし、具体的には、以下の（ａ）又は（ｂ）のシアリルガラクトース基結合性ペプチドを有効成分として含有するインフルエンザウイルス感染抑制剤を提供する。（ａ）  配列番号１または２で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド（ｂ）  配列番号１または２で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつシアリルガラクトース基結合活性を有するペプチド【特許請求の範囲】
【請求項１】
シアリルガラクトース基結合性ペプチドを有効成分として含有するインフルエンザウイルス感染抑制剤。
【請求項２】
シアリルガラクトース基結合性ペプチドがガングリオシドＧＭ３結合性ペプチドである、請求項１記載のインフルエンザウイルス感染抑制剤。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のシアリルガラクトース基結合性ペプチドを有効成分として含有する請求項１記載のインフルエンザウイルス感染抑制剤。
（ａ）  配列番号１または２で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）  配列番号１または２で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつシアリルガラクトース基結合活性を有するペプチド
【請求項４】
シアリルガラクトース基結合性ペプチドがアルキル化または脂質化されている請求項１から３のいずれか１項に記載のインフルエンザウイルス感染抑制剤。
【請求項５】
シアリルガラクトース基結合性ペプチドがリポソームに含有されている請求項１から３のいずれか１項に記載のインフルエンザウイルス感染抑制剤。
【請求項６】
インフルエンザウイルスが、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザおよびＣ型インフルエンザからなる群から選択される請求項１から５のいずれか１項に記載のインフルエンザウイルス感染抑制剤。
【請求項７】
インフルエンザウイルスが、トリインフルエンザまたはブタインフルエンザである請求項１から５のいずれか１項に記載のインフルエンザウイルス感染抑制剤。
【請求項８】
さらに医薬的に許容できる担体を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載のインフルエンザウイルス感染抑制剤。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１項に記載のインフルエンザウイルス抑制剤を非ヒト動物に投与することを含む、インフルエンザを予防または治療する方法。
【請求項１０】
非ヒト動物が、トリまたはブタである請求項９記載のインフルエンザを予防または治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、シアリルガラクトース基結合性ペプチド、例えばガングリオシドＧＭ３結合性ペプチドを有効成分として含むインフルエンザウイルス感染抑制剤に関する。
【背景技術】  細胞表面上の糖脂質、糖タンパク質およびプロテオグリカンのような糖コンジュゲートのオリゴ糖は、細胞外の分子の認識用の標的分子で、細胞特異的な結合プロセスと関係がある（文献（１），（２））。シアリルガラクトース（ＮｅｕＡｃ−Ｇａｌ）構造は細菌毒素、ウイルスおよび内皮細胞等の受容体としてよく知られている（文献（３）−（５））。シアル酸を有するグリコスフィンゴィリピド、いわゆるガングリオシドは、重要な生物学の機能と関係があり、それらはそれらの炭水化物部分に依存している（文献（６）−（８））。最近の十年間で、脂質、糖脂質および他のコンポーネントなどの膜コンポーネントの局在および分布に関する研究は、それらの特性と機能の関係に集中している（文献（９）−（１２））。ほとんどのグリコスフィンゴィリピドは、シグナル伝達分子とともに界面活性剤不溶性膜として細胞から抽出された（文献（１３）−（１５））。糖脂質を豊富に含むサブフラクションが細胞刺激およびシグナリングで修正されることが見出されている。糖脂質を含んでいる膜は、空気−水界面単分子膜として再構成された（文献（１６）−（１８））。佐藤らは、レクチンの結合様式が脂質単分子膜中のグリコスフィンゴィリピドの分布に依存すると報告した（文献（１９）−（２２））。細胞膜中の糖脂質に富んだ微小ドメインの構造および機能の関する情報が、細胞表面上の糖鎖の生物学の役割を明確にすることを助けるであろう。レクチンと抗体のような多数の糖結合タンパク質は糖コンジュゲートをラベルするために利用され、炭水化物に関連する疾患の治療に適用されてきた（文献（２３），（２４））。
生物学的選択システム（ファージディスプレイライブラリー）は標的分子に特異的に結合するペプチドを選択するために開発された（文献（２５），（２６））。このシステムの使用によって、多くの選択が様々な糖コンジュゲート、単糖（文献（２７），（２８））、腫瘍関連糖抗原（文献（２９）−（３２））、シアリルＬｅｗｉｓｘ（文献（３３），（３４））、グリコスフィンゴィリピド（文献（３５），（３６））、プロテオグリカン（文献（３７）−（３９））および多糖（文献（４０），（４１））に対してなされた。本発明者らは先の論文で、ガングリオシドＧＭ１（Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→４（ＮｅｕＡｃα２→３）Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１→１’Ｃｅｒ）結合ペプチドの選択を行なった（文献（３５））。選択されたペプチド配列がＧＭ１に特異的に結合し、ＧＭ１へのコレラ毒素の結合を阻害したことが示された。
インフルエンザウイルスの膜には、ヘマグルチニン（ＨＡ）及びシアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）の２種類の糖タンパク質が存在しており、それぞれウイルスの感染成立及びウイルスの宿主細胞からの出芽に重要な役割を果たしている。ヘマグルチニンは、動物である宿主の細胞膜上に存在するシアル酸含有糖鎖を受容体として認識し、特異的に結合し、インフルエンザウイルスの細胞内へのエンドサイトーシスを導く。また、シアリダーゼは、受容体破壊酵素であり、宿主細胞からウイルス粒子が出芽または遊離する際に、みずからのまたは宿主細胞膜上のシアル酸残基を切断する。
現在インフルエンザウイルス感染の予防薬または治療薬の選択肢は少ない。予防はワクチンにより行われているが、注射による投与が必要なためその使用は限られている。また、治療薬としてはインフルエンザウイルスの膜タンパク質であるシアリダーゼの阻害剤が最近、臨床において用いられている。シアリダーゼの阻害剤は、インフルエンザウイルスが細胞内で増殖した後に、細胞外に放出するのを抑制すると考えられている。従って、シアリダーゼ阻害剤は、予防薬としての効果はなく、またインフルエンザウイルスに感染後１日から２日の早い時間に投与する必要があり、その適用は限られていた。
本発明者は、インフルエンザウイルスが感染する際にヘマグルチニンと宿主細胞に存在するシアル酸含有糖鎖と結合することに鑑み、先に上述のファージディスプレイライブラリー方法でＨＡ（ヘマグルチニン）結合性ペプチドをスクリーニングし、該ペプチドがインフルエンザウイルスが細胞内へ侵入するのを防ぐことによりインフルエンザ感染を抑制しうることを報告し（特開２００２−２８４７９８号公報、ＷＯ０／５９９３２）、インフルエンザウイルスの感染防止にペプチドを用い得ることを示した。
【発明の開示】
本発明は、シアリルガラクトース基（シアル酸−ガラクトースの構造を有する基）に結合するシアリルガラクトース基結合性ペプチド、例えばガングリオシドＧＭ３結合性ペプチドを有効成分とするインフルエンザウイルスの感染抑制剤に関する。
上述のように、インフルエンザウイルスはウイルスの膜のヘマグルチニンが宿主細胞のシアル酸含有糖鎖を認識し結合し感染する。本発明においては、宿主細胞に存在するヘマグルチニンの受容体をブロックし、インフルエンザウイルスの感染を抑制することを目的とする。具体的には、細胞の表面に存在するシアリルガラクトース基に結合性のペプチドを用いて、インフルエンザウイルスが宿主細胞に結合するのをブロックすることにより、インフルエンザウイルスの感染を抑制することを目的とする。
本発明者は、先にインフルエンザウイルスのヘマグルチニンに結合するヘマグルチニン結合性ペプチドがインフルエンザウイルスの感染を抑制し得ることを見出していた。該ペプチドは、インフルエンザウイルスの膜に存在するヘマグルチニンに結合することによりインフルエンザウイルスが宿主細胞に結合することを阻害する。
ヘマグルチニン結合性ペプチドは、インフルエンザウイルスに作用して感染を防止し得るが、インフルエンザウイルスの存在を前提とする。従って、実際に臨床の現場で用いるときは、シアリダーゼの阻害剤と同様インフルエンザウイルスの感染を確認してから投与するのが効果的と考えられ、予防薬としてよりは、治療薬としての効果が期待される。本発明者等は、生体に作用する化合物ならば、インフルエンザの感染の有無に関わらず投与でき、大きな予防的効果を発揮し得ると考え、インフルエンザウイルスの感染を抑制する方法について鋭意検討を行い、インフルエンザウイルスの膜に存在するヘマグルチニンが結合する宿主細胞の受容体をブロックすることにより、インフルエンザウイルスの感染を抑制し得ると考えた。この場合、例え被験体中にインフルエンザウイルスが感染していなくても、宿主細胞の受容体を予めブロックすることによりインフルエンザウイルス感染の予防的効果が期待できると考えられる。また、生体への適合性、半減期、製造容易性等を考慮し、分子量のそれほど大きくない化合物が適するとも考えられた。しかし、インフルエンザウイルスが動物の細胞に感染する場合、シアリルガラクトースが受容体として機能することはわかっていたが、シアリルガラクトースに作用してインフルエンザウイルスの感染を阻害し得る化合物は従来報告されておらず、単独の化合物で受容体をブロックすることは困難であると考えられていた。本発明者らは、インフルエンザウイルスの宿主細胞表面の受容体であるシアリルガラクトースの構造に着目し、該構造に関与しているガングリオシドＧＭ３（ＮｅｕＡｃα２→３Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１→１’Ｃｅｒ）に結合する、アミノ酸残基数が十数個のペプチドの効果について検討を行った。本発明者らは、ランダムペプチドライブラリーを用いたファージディスプレイ法によりガングリオシドＧＭ３を細胞表面に高発現しているマウスＢ１６メラノーマ細胞をターゲットとしてガングリオシドＧＭ３に結合するペプチドを得た。本発明者らは得られたガングリオシドＧＭ３結合性ペプチドについて鋭意検討を行い、意外にも該ペプチドが単独でインフルエンザが細胞表面の受容体に結合し細胞内に侵入するのを防止することを見出し本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］  シアリルガラクトース基結合性ペプチドを有効成分として含有するインフルエンザウイルス感染抑制剤、
［２］  シアリルガラクトース基結合性ペプチドがガングリオシドＧＭ３結合性ペプチドである、［１］のインフルエンザウイルス感染抑制剤、
［３］  以下の（ａ）又は（ｂ）のシアリルガラクトース基結合性ペプチドを有効成分として含有する［１］のインフルエンザウイルス感染抑制剤、
（ａ）  配列番号１または２で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）  配列番号１または２で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつガングリオシドＧＭ３結合活性を有するペプチド
［４］  シアリルガラクトース基結合性ペプチドがアルキル化または脂質化されている［１］から［３］のいずれかのインフルエンザウイルス感染抑制剤、
［５］  シアリルガラクトース基結合性ペプチドがリポソームに含有されている［１］から［３］のいずれかのインフルエンザウイルス感染抑制剤、
［６］  インフルエンザウイルスが、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザおよびＣ型インフルエンザからなる群から選択される［１］から［５］のいずれかのインフルエンザウイルス感染抑制剤、
［７］  インフルエンザウイルスが、トリインフルエンザまたはブタインフルエンザである［１］から［５］のいずれかのインフルエンザウイルス感染抑制剤、
［８］  さらに医薬的に許容できる担体を含む、［１］から［７］のいずれかのインフルエンザウイルス感染抑制剤、
［９］  ［１］から［８］のいずれかのインフルエンザウイルス抑制剤を非ヒト動物に投与することを含む、インフルエンザを予防または治療する方法、
［１０］  非ヒト動物が、トリまたはブタである［９］のインフルエンザを予防または治療する方法、
［１１］  ［１］から［８］のいずれかのインフルエンザウイルス抑制剤を調製し、該抑制剤を被験体に投与することを含む、インフルエンザを予防または治療する方法、
［１２］  被験体がヒト、トリおよびブタからなる群から選択される［１１］のインフルエンザを予防または治療する方法、
［１３］  ［１］から［８］のいずれかのインフルエンザウイルス抑制剤のインフルエンザの予防または治療への使用、ならびに
［１４］  以下の（ａ）又は（ｂ）のガングリオシドＧＭ３結合性ペプチドのインフルエンザウイルス抑制剤の製造への使用。
（ａ）  配列番号１または２で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）  配列番号１または２で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつガングリオシドＧＭ３結合活性を有するペプチド
【図面の簡単な説明】  図１は、水晶発振子マイクロバランス上に固定したガングリオシドＧＭ３単分子膜に結合するファージのタイムコースを示す図である。
図２は、ＮｅｕＡｃ−Ｇａｌ構造へのファージクローンの結合選択性の検討の結果を示す図である。
図３は、フローサイトメーターによるマウスＢ１６メラノーマ細胞へのファージクローンの結合の検討の結果を示す図である。
図４は、ｃ０１ファージによるシアリルオリゴサッカライドの認識の検討の結果を示す図である。
図５は、ペプチド濃度の関数としてのＧＭ３への合成ペプチドの結合量を示す図である。
図６は、ペプチド含有リポソームによるインフルエンザウイルスのＭＤＣＫ細胞への感染の阻害を示す図である。
図７は、ガングリオシドＧＭ３結合性ペプチド含有リポソームおよびヘマグルチニン結合性ペプチド含有リポソームによるインフルエンザウイルスのＭＤＣＫ細胞への感染の阻害を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明は、シアリルガラクトース基、例えばガングリオシドＧＭ３結合性ペプチドを有効成分として含むインフルエンザウイルス感染の予防および治療に用い得る感染抑制剤である。
シアル酸とガラクトースが結合した構造を有するシアリルガラクトース基は、インフルエンザウイルスが細胞内に侵入するときにヘマグルチニンの受容体となっており、シアリルガラクトース基結合性ペプチドはインフルエンザウイルスがシアリルガラクトース基を介して細胞に結合することを防ぐことにより、インフルエンザが細胞に感染するのを抑制し得る。シアリルガラクトース基を有する化合物として、例えばガングリオシドＧＭ３が挙げられ、本発明のシアリルガラクトース基結合性ペプチドは、ガングリオシドＧＭ３結合性ペプチドを含む。
但し、本発明のペプチドは、シアリルガラクトース基に結合する限り限定されないので、シアリルガラクトース基が表面に発現されている細胞ならば、例えその表面にガングリオシドＧＭ３が発現していなくても、該細胞にインフルエンザウイルスが感染するのを抑制することができる。
本発明の感染抑制剤で感染を抑制するインフルエンザウイルスはオルソミクスウイルス科に属する直径約１００ｎｍの球状ＲＮＡウイルスであり、その型は限定されない。本発明のインフルエンザウイルス抑制剤は、細胞のインフルエンザが認識する受容体をブロックするため、インフルエンザウイルスの型を問わず、感染を抑制することができる。インフルエンザウイルスの型として、Ａ型（Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ１Ｎ１等）、Ｂ型、Ｃ型、ヒト分離型、トリ分離型（トリインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ７等））、ブタ分離型（ブタインフルエンザウイルス）、その他ウマ等の哺乳類の分離型等のインフルエンザウイルスの感染を広く抑制し得る。インフルエンザウイルスによっては、ヘマグルチニンとシアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）の抗原型の違いにより、多数の亜型が存在するが、本発明のインフルエンザウイルス感染抑制剤は、型、亜型を問わず、インフルエンザウイルスの感染を抑制することができる。
さらに、本発明のインフルエンザウイルス抑制剤は、インフルエンザウイルスが感染しうる動物ならばいかなる動物に対しても用いることができ、ヒト、トリ、ブタ等がインフルエンザウイルスに感染するのを抑制することができる。
本発明のシアリルガラクトース基結合性ペプチドは、以下のように公知のファージディスプレイライブラリーを用いたファージディスプレイライブラリー法により選別することができる。ファージディスプレイライブラリー法は、例えばスコットおよびスミスの方法により行うことができる（Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，３８６−３９０（１９９０）；Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１７，２２８−２５７（１９９３））。また、特開２０００−２５３９００号公報および特開２００２−２８４７９８号公報の記載に従って行うこともできる。
ファージディスプレイライブラリーとしては、市販のものを用いることができる。
まず、公知のファージディスプレイライブラリーにランダムなＤＮＡ配列を挿入して、ファージの外殻表面にランダムなアミノ酸配列を有するペプチドを発現し得るように構築する。この際、例えば、実施例に示すようにファージのコートタンパク質ｐＩＩＩ遺伝子にランダムなＤＮＡが挿入された、ファージ外殻表面にランダムな１５個のアミノ酸を有するペプチドが発現するように構築されたディスプレイファージを用いることができる。ディスプレイファージを用いることにより、約１０８種類のペプチドをそれぞれ発現したファージが得られる。
次いで、ペプチドをランダムに発現したファージをガングリオシドＧＭ３を用いてパニングする。この際、ガングリオシドＧＭ３の単分子膜を適当な基板上に作製し（ガングリオシドＧＭ３単分子膜累積基板）、該単分子膜へ結合するファージを選択すればよい。選別されたファージを大腸菌に感染させて大量に培養し、分離、精製し、ガングリオシドＧＭ３に結合するペプチド発現ファージを得る。パニング操作を数回繰り返すことにより、ガングリオシドＧＭ３と特異的に結合し得るペプチドを発現し得るファージを選別し、濃縮することができる。
次いで、選択されたファージからＤＮＡを抽出しその配列を決定することにより、ファージが発現するシアリルガラクトース基に特異的に結合するペプチドを得ることができる。ＤＮＡの配列決定は、公知のマキサム・ギルバート法等により行えばよく、市販のシーケンサーを用いることもできる。
このように、単分子膜を用いる場合、表面に糖鎖のみ突き出ているので、効率的にシアリルガラクトース基結合性ペプチドを選別することができる。なお、単分子膜を作製し、ガングリオシドＧＭ３と結合するペプチドを発現するファージを選択するときに、マイクロバランスとして知られる水晶発振子を用いることができる。該水晶発振子を用いることにより、ファージの結合に応じて生じる水晶発振子金電極表面の重量変化を周波数の変化として検出することができる。水晶発振子を用いた方法は例えば、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１３８，８２−９２（１９９８）またはＢｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２８５，１４−２０（１９９６）に記載の方法に従って行うことができる。具体的には、ＴＢＳ（トリス緩衝化生理食塩水）を下層水としてトラフに作製した単分子膜の表面に発振子電極表面を水平付着させ、発振させて、安定したところでファージライブラリー溶液を加え、ファージの結合に応じた発振子の振動数を計測し、結合の有無を調べればよい。
シアリルガラクトース基結合性ペプチドの例として、配列番号１および２に示す１５アミノ酸からなるガングリオシドＧＭ３結合性ペプチドが挙げられる。本発明のインフルエンザウイルス感染抑制剤の有効成分としてこれらのペプチドを用いることができる。また、配列番号１または２に表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなるペプチドであって、ガングリオシドＧＭ３に結合し得るペプチドも本発明のインフルエンザウイルス抑制剤の有効成分として用いることができる。上記「１もしくは数個」とは好ましくは１もしくは１０個、さらに好ましくは、１もしくは５個、１もしくは４個、１もしくは３個、１もしくは２個または１個である。また、配列番号１または２に表されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするＤＮＡの相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするアミノ酸配列からなるペプチドであってガングリオシドＧＭ３と結合するペプチドも本発明のインフルエンザウイルス抑制剤の有効成分として用いることができる。ここでストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣとは１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウムからなる）を用い、６８℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。さらに、配列番号１または２に表されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするＤＮＡの縮重変異体がコードするアミノ酸配列からなるペプチドであってガングリオシドＧＭ３に結合するペプチドも本発明のインフルエンザウイルス抑制剤の有効成分として用いることができる。ペプチドがガングリオシドＧＭ３に結合するか否かは、例えば上述のガングリオシド単分子膜を付着させた水晶発振子を用いて調べることができる。
上記ペプチドは、公知の液相法及び固相法ペプチド合成法により合成することができる。また、選択されたファージと大腸菌を用いて作製することもできる。このようにして得られたペプチドは、公知のペプチドの精製方法を用いて精製することができる。
また、ガングリオシドＧＭ３結合性ペプチドを修飾したペプチドを用いることもできる。ペプチドの修飾により親水性が増し、血中半減期が増大し、また細胞親和性や組織親和性が増大し得るので、よりインフルエンザ感染抑制剤としての効果を期待することができる。さらにペプチドを修飾により高分子化することにより、インフルエンザウイルスのガングリオシドＧＭ３への結合を立体的に障害しより抑制剤としての効果を期待することができる。
ペプチドの修飾として、例えばアルキル化、脂質化、ＰＥＧ化などの水溶性ポリマーの結合等が挙げられる。
アルキル基の結合は、公知の方法で行うことができ、例えばガングリオシドＧＭ３結合性ペプチドのＣ末端カルボキシル基にアルキルアミンを結合させるか、またはＮ末端アミノ基に脂肪酸を結合させればよい。末端カルボキシル基へのアルキルアミンの結合または末端アミノ基への脂肪酸の結合は、アミド結合形成反応により行うことができる。結合するアルキル基は、限定されないが、炭素数２から２０、例えば１８のアルキル基が挙げられる。脂肪酸を結合させるときに用いる脂肪酸も限定されないが、生体内に存在する脂肪酸が好適に採用でき、具体的にはラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸等の飽和脂肪酸；オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸等の不飽和脂肪酸など、炭素数が１２〜２０程度の脂肪酸を用いればよい。
ガングリオシドＧＭ３結合性ペプチドの脂質化も公知の方法により行うことができる。例えばＮｅｗ  Ｃｕｒｒｅｎｔ，１１（３），１５−２０（２０００）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ．，１１２８，４４−４９（１９９２）；ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ，４１３，１７７−１８０（１９９７）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７，２８６−２８８（１９８２）等の記載に従って行えばよい。具体的には、各種リン脂質の２位の水酸基或いは３位のリン酸基を介してガングリオシドＧＭ３結合性ペプチドを結合することができる。この際、適当なスペーサーを介して結合させてもよい。反応には各種の縮合法が採用できる。例えば、ガングリオシドＧＭ３結合性ペプチドのＮ末端またはＣ末端に、数個程度の適当な長さのシステインを含むアミノ酸配列を結合させ、反応性ＳＨ基を利用して行う方法がある。用いるリン脂質も限定されず、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール等が挙げられる。このように、脂質化したペプチドをリポペプチドと呼ぶ。
ペプチドを水溶性ポリマーの結合により修飾する際に用い得る水溶性ポリマーとして、例えば、ポリエチレングリコール、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリビニルアルコール等が挙げられる。これらのポリマーは、蛋白質のＮ末端のα−アミノ基やリシンのε−アミノ基とアルデヒドのような反応性基を介して共有結合することができる。この中でも、ＰＥＧが好ましく、ＰＥＧの分子量は６ｋＤａ〜５０ｋＤａのものが好ましい。
さらに、ガングリオシドＧＭ３結合性ペプチドを高分子化する方法として、デンドリマー化が挙げられる。
また、ガングリオシドＧＭ３結合性ペプチドを含有するリポソーム製剤も本発明のインフルエンザ感染抑制剤として用いることができる。「リポソーム」とは膜状に集合した脂質層および内部の水層から構成される膜状の閉鎖小胞を意味する。本発明のリポソーム製剤は、リポソームに、ガングリオシドＧＭ３結合性ペプチドを含有させることにより調製することができる。リポソームとしては、酸性リン脂質を膜構成成分とするリポソームまたは中性リン脂質と酸性リン脂質を膜構成成分とするリポソームがある。
膜構成成分としての酸性リン脂質としては、例えばジラウロイルホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、卵黄ホスファチジルグリセロール（卵黄ＰＧ）、水添卵黄ホスファチジルグリセロール等の天然または合成ホスファチジルグリセロール類（ＰＧ）およびジラウロイルホスファチジルイノシトール（ＤＬＰＩ）；ジミリストイルホスファチジルイノシトール（ＤＭＰＩ）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（ＤＰＰＩ）、ジステアロイルホスファチジルイノシトール（ＤＳＰＩ）、ジオレオイルホスファチジルイノシトール（ＤＯＰＩ）、大豆ホスファチジルイノシトール（大豆ＰＩ）、水添大豆ホスファチジルイノシトール等の天然または合成ホスファチジルイノシトール類（ＰＩ）が挙げられる。これらの構成成分は一種のみを単独で用いてもよいし、二種以上混合して用いてもよい。
中性リン脂質としては、大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン、水添大豆ホスファチジルコリン、水添卵黄ホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ミリストイルパルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、パルミトイルステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）等の天然または合成ホスファチジルコリン類（ＰＣ）、大豆ホスファチジルエタノールアミン、卵黄ホスファチジルエタノールアミン、水添大豆ホスファチジルエタノールアミン、水添卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ミリストイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＰＥ）、パルミトイルステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＳＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）等の天然または合成ホスファチジルエタノールアミン類（ＰＥ）等が挙げられる。これらの構成成分は一種のみを単独で用いてもよいし、二種以上混合して用いてもよい。
ガングリオシドＧＭ３結合性ペプチドを含むリポソームは、上記のリン脂質を用いて公知の方法に従い調製することができる。この場合、酸性リン脂質の割合は、リポソーム膜構成成分中に約０．１〜１００モル％程度、好ましくは約１〜９０モル％、より好ましくは約１０〜５０モル％程度とするのがよい。
上記リポソームの調製に当たっては、更にコレステロールなどを添加してもよい。コレステロールを添加することによりリン脂質の流動性を調整して、リポソームの調製をより簡便なものとすることができる。コレステロールは通常リン脂質に対して等量まで、好ましくは０．５〜１倍等量の量で添加配合されるのが好ましい。
リポソーム分散液中のガングリオシドＧＭ３結合性ペプチドと酸性リン脂質との配合割合は、ペプチドに対して酸性リン脂質が約０．５〜１００当量程度、好ましくは約１〜６０当量程度、より好ましくは約１．５〜２０当量程度が好ましい。
また、リポソームに含まれるガングリオシドＧＭ３結合性ペプチドの割合は、全脂質中、数モル％から数十モル％程度、好ましくは５〜３０モル％、さらに好ましくは５〜１０モル％程度である。
本発明のガングリオシドＧＭ３結合性ペプチドを含有するリポソーム製剤は、公知の方法を用いて製造することができる。
例えば多重層リポソーム（ＭＬＶ）は次のようにして調製される。まず、脂質を有機溶媒（クロロホルム、エーテル等）に溶解した後、丸底フラスコに入れ、窒素気流下または減圧下で有機溶媒を除去し、フラスコ底部に脂質の薄膜をつくる。この場合、さらに減圧下でデシケーター中に放置することによって有機溶媒を完全に除去することもできる。次いで、薬物溶液を脂質薄膜上に加えて脂質を水和させることによって乳濁色のリポソーム懸濁液が得られる。
また大きな一枚膜リポソーム（ＬＵＶ）は、ホスファチジルセリンの小さな一枚膜リポソームにＣａ２＋を添加し、融合させてシリンダー状のシートとした後、キレート剤であるＥＤＴＡを添加しＣａ２＋を除去する方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ３９４，４８３−４９１，１９７５）やエーテルに溶解した脂質を約６０℃の水溶液中に注入し、エーテルを蒸発させる方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ４４３，６２９−６３４，１９７６）により作ることができる。
また、Ｓｚｏｋａらの考案した逆相法によるリポソームの調製法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５，４１９４−４１９８，１９７８）を用いることもできる。この方法によると、リン脂質のエーテル溶液に薬物溶液を加え、超音波処理するとＷ／Ｏ型エマルションが作成される。このＷ／Ｏ型エマルションを減圧下、エバポレーターによりエーテルを除去し、次いで緩衝液を加えボルテックスミキサーで撹拌すると、Ｗ／Ｏ型エマルションからＯ／Ｗ型エマルションに転相し、更に残留する有機溶媒を除くことによってリポソームが作成できる。
これらの調製法のほかに、フレンチプレス法により粒子径の小さなリポソームを調製することもできる（ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔ．９９，２１０−２１４，１９７９）。また大沢らによって報告されているリポソームへの保持効率の高い凍結乾燥法（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３２，２４４２−２４４５，１９８４）と凍結融解法（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３３，２９１６−２９２３，１９８５）を使用することもできる。
このように調製されたリポソームは、透析法（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．７１，８０６−８１２，１９８２）やポリカーボネート膜を用いたろ過法（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ５５７，９−２３，１９７９；Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ６０１，５５９−５７１，１９８０）により、粒子径を一定にすることができる。また調製されたリポソーム溶液から、リポソーム内に保持されなかった薬物を除くためには、透析法、ゲルろ過法、遠心分離法を利用することができる（リポソーム．”脂質の化学”［日本生化学会編、生化学実験講座３］、東京化学同人、１９７４）。更にまた透析膜を用いてリポソームを濃縮することも可能である。
このようにして調製されるリポソーム分散液には、製剤設計上必要な添加剤として、防腐剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤、吸収促進剤等の各種の公知物質を適宜配合することができ、また必要に応じてこれらの添加物を含む液または水で希釈することもできる。上記添加剤の具体例としては、防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロヘキシジン、パラベン類（メチルパラベン、エチルパラベン等）、チメロサール等の真菌および細菌に有効な防腐剤を、等張化剤としてはＤ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−キシリトール、グリセリン、ブドウ糖、マルトース、庶糖、プロピレングリコール等の多価アルコール類や塩化ナトリウム等の電解質類を、また安定化剤としてはトコフェロール、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）、システイン等をそれぞれ例示できる。
また、本発明のＨＡ結合性ペプチドからなる上記リポソームの内部には、例えば抗ウイルス剤等の他の薬剤を更に封入させることができ、同様にリポソーム製剤とすることができる。
リポソーム製剤の製造は、具体的には例えばウッドレら（Ｌｏｎｇ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ｏｌｄ  ｄｒｕｇｓ，Ｎｅｗ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．，Ｍ．Ｃ．Ｗｏｏｄｌｅ，Ｇ．Ｓｔｏｒｍ，Ｅｄｓ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｂｅｒｌｉｎ（１９９８））またはナンバら（Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｙ．Ｎａｍｂａ，Ｎ．Ｏｋｕ，Ｊ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｃｏｍｐａｔ．Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，８，１５８−１７７（１９９３））に記載の方法に従って調製することができる。
リポソーム製剤を調製する際には、上述のアルキル化ペプチドや脂質化ペプチドを、脂質成分として用いることができる。
上記リポソーム製剤を含む本発明の薬学的組成物中のガングリオシドＧＭ３結合性ペプチドの量は、限定されず、投与する被験体に応じて適宜選択されるが、通常組成物中０．０００２〜０．２（ｗ／ｖ％）程度、好ましくは０．００１〜０．１（ｗ／ｖ％）程度である。
本発明のインフルエンザウイルス感染抑制剤は、インフルエンザウイルスに感染していない被験体に投与することによりインフルエンザウイルスの感染を予防することができ、また既に感染した被験体に投与することにより、体内でインフルエンザウイルスが他の細胞に感染するのを抑制し、インフルエンザウイルスの治療剤として用いることもできる。本発明のインフルエンザ感染抑制剤はガングリオシドＧＭ３結合性ペプチドを有効成分として含むとともに、さらに薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤を含んでいてもよい。水溶液製剤の場合、担体としては、精製水（滅菌水）または生理学的緩衝液、等張液等を利用することができる。また、グリコール、グリセロール、オリーブ油のような注射投与可能な有機エステルなどを使用することもできる。錠剤用の担体、賦形剤としては、ゲル化剤、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。
本発明のインフルエンザウイルス感染抑制剤は、医薬組成物として、種々の形態で投与することができる。このような投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、あるいは注射剤、点滴剤、座薬などによる非経口投与を挙げることができる。また、噴霧剤としても投与できる。噴霧剤として用いる場合、本発明のインフルエンザウイルス抑制剤を含む溶液を経口的または経鼻的に被検体に噴霧すればよく、トリ、ブタ等の家畜にも効率的に投与することが可能である。かかる組成物は、公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる。
本発明のインフルエンザウイルス感染抑制剤の投与経路は、限定されず、経口投与、静脈注射、筋肉注射、皮内注射、皮下注射、腹腔内注射、噴霧等がある。さらに、本発明のインフルエンザウイルス抑制剤をトリ、ブタ等の家畜が摂取する水、飼料等に混合して投与することもできる。投与量は、疾患の重篤度等により適宜決定できるが、本発明の組成物の医薬的に有効量を患者に投与する。ここで、「医薬的に有効量を投与する」とは、各種疾患を治療するのに適切なレベルの薬剤を患者に投与することをいう。本発明の医薬組成物の投与回数は適宜患者の症状に応じて選択される。例えば、ガングリオシドＧＭ３結合性ペプチドの量に換算して通常成人１日当り約０．００１〜１００ｍｇ程度の範囲から選ぶことができる。当該製剤は１日１回投与に限らず、数回に分けて投与することができる。トリ、ブタ等の家畜に投与する場合も、その体重等を考慮して適宜投与量を決定することができる。
また、さらに本発明のインフルエンザウイルス感染抑制剤は、有効成分として他のインフルエンザウイルスの感染を抑制し得る化合物を含んでいてもよい。他の化合物としては、例えば、特開２００２−２８４７９８号公報に記載のインフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合性ペプチドが挙げられ、具体的には、例えば特開２００２−２８４７９８号公報およびＷＯ００／５９９３２に記載されたペプチドがある。インフルエンザウイルス抑制剤に、ガングリオシドＧＭ３結合性ペプチドとインフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合性ペプチドを含ませることにより、インフルエンザウイルス自体が有する細胞と結合する部分および細胞の有するインフルエンザウイルスと結合する部分の両方がブロックされ、より大きなインフルエンザウイルス抑制効果が期待できる。該インフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合性ペプチドも上述のガングリオシドＧＭ３結合性ペプチドのように、アミノ酸の一部が変異したものを用いることができ、また修飾したものを用いることもできる。さらに、リポソームに含有されていてもよい。本発明のインフルエンザウイルス感染抑制剤がリポソーム製剤の場合、リポソーム中にガングリオシドＧＭ３結合性ペプチドとインフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合性ペプチドの両方が含まれていてもよい。
次に、本発明を実施例により具体的に説明する。
材料の入手
ガングリオシドＧＭ３（ＮｅｕＡｃα２→３Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１→１’Ｃｅｒ）は雪印乳業（日本）から入手した。合成のＧＭ３アナログである６’ＧＭ３（ＮｅｕＡｃα２→６Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１→１’Ｃｅｒ）は文献（４２）に記載の方法で調製した。ラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）、ガラクトシルセラミド（ＧａｌＣｅｒ）およびグルコセレブロシド（ＧｌｃＣｅｒ）はＳｉｇｍａ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。卵黄ホスファチジルコリン（卵ＰＣ）およびコレステロールはＮＯＦ株式会社およびｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ社（日本）からそれぞれ入手した。
ファージディスプレイ１５量体ランダムペプチドライブラリー（１０８の多様性）は、文献（４３）に記載のようにして得た。１５量体ペプチドアミド（ペプチド−ＮＨ２）およびＮ−ステアロイル（オクタデカノイル）ペプチドアミド（Ｃ１７Ｈ３５ＣＯ−ペプチド−ＮＨ２）は、標準のＦｍｏｃ法を使用して、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈからの自動ペプチドシンセサイザーＡＣＴ３５７により合成した。ペプチドアミドおよびＮ−ステアロイルペプチドアミドは逆相高速液体クロマトグラフィーによって精製した。次に、純度および期待された構造はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによって確認した。
マウスＢ１６メラノーマ細胞はＲＩＫＥＮセルバンク（日本）から得た。Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞およびインフルエンザＡ／プエルトリコ／８／３４ウイルス株（Ｈ１Ｎ１）は、Ｋ．Ｎａｇａｔａ（つくば大学（日本））から提供を受けた。
【実施例１】  ガングリオシドＧＭ３結合性ペプチドの選択
（１）シアリルガラクトース結合性ペプチドのアフィニティー選択
ガングリオシドＧＭ３（ｃａ．０．５ｍｇ／ｍＬ）を含む脂質溶液（クロロホルム／メタノール＝２：１，ｖ／ｖ）を、テフロンコーティングを施したラングミュアの水槽（ＵＳＩ社（日本））の中で、トリス緩衝塩溶液（ＴＢＳ）（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）上に展開した。下層水の温度は２０℃に保持した。表面の圧力（ｐ−Ａ）の等温線は、Ｗｉｌｈｅｌｍｙプレート法によってモニターした。ＧＭ３単分子膜は一定の割合（１０ｃｍ２ｍｉｎ−１）で圧縮され、３０ｍＮ  ｍ−１の表面圧力で水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ；９ＭＨｚ、ＡＴ−ｃｕｔ，直径４．５ｍｍ、面積１５．９ｍｍ２）の金表面へ水平に移した（文献（２１））。ＱＣＭは、１ｍｌのＴＢＳで満たされた手製のプラスチックチューブに写し、バッファー温度は攪拌しながら２０℃に維持した。ファージ（各選択ラウンド６．１−８７×１０１０形質導入ユニット）は、キュベットに注入した。インキュベーション時間を決定するために、単分子膜へのファージの結合（ΔＦ、Ｈｚ）を経時的に追跡した（文献（３５））。１５分後、ファージの結合はほとんど平衡（データは示さない）になった。ＱＣＭをピックアップし、３回ＴＢＳで洗浄し、単分子膜に結合したファージを１５分間０．１ＮのＧｌｙ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ２．２）で溶出した。溶出液は、１Ｍのｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ９．１）で中和し、次に、大腸菌Ｋ９１Ｋａｎ宿主細菌細胞にそれらを感染させることにより増幅した。このプロセスを４回繰り返し、ＧＭ３特異的ファージを増やした。個々のファージクローンを単離し、増幅し、ポリエチレングリコール／ＮａＣｌ（ＰＥＧ＃６０００）で沈殿させた（文献（２６））。各ファージクローンのＤＮＡはＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍ１３キット（ＱＩＡＧＥＮ）により精製し、アミノ酸アラインメントを推定するための配列決定の鋳型として使用した。
（２）  ＥＬＩＳＡによるファージクローンの結合性の分析
ポリスチレン製マルチウェルプレートは、１％のＢＳＡ／ＴＢＳであらかじめブロッキングし３回洗浄しておいた。プラスチックプレート（直径１３．５ｍｍ、住友ベークライト社、日本）は、上述のようにして調製したガングリオシドＧＭ３または６’ＧＭ３単分子膜に水平に結合させた。ファージクローン（２００μｌのＴＢＳ中に０．０１−１０ｎＭ）は、４℃で３０分間単分子膜とインキュベートした。プラスチックプレートの反対側は、０．５％のＢＳＡ／ＴＢＳを加えることによりブロッキングし、その後０．５％のＢＳＡ／ＴＢＳを用いて２回洗浄した。結合したファージは４℃で１時間で１：２０００（ｖ／ｖ）希釈抗ｆｄバクテリオファージ（Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートし、その後、１：２０００（ｖ／ｖ）希釈抗ウサギ免疫グロブリンＧペルオキシダーゼコンジュゲートを用いて４℃１時間標識した。ｏ−フェニレンジアミンで発色させ、４９２ｎｍで検出した。各実験は３回行った。吸光度の増加（４９２ｎｍでのΔＡ）は、ファージ濃度に対する単純飽和カーブを示し、これは、［ファージ］／ΔＡと［ファージ］の間のプロットとして以下の方程式のように直線的な関係を示した。
［ｐｈａｇｅ］／ΔＡ＝［ファージ］／ΔＡｍａｘ＋Ｋｄ／ΔＡｍａｘ    （Ｉ）
最大の吸光度（ΔＡｍａｘ）および解離定数（Ｋｄ）は、それぞれ方程式の傾きおよび切片から計算した。Ｋｄは０．０１８から０．０９１ｎＭの範囲にあった。コントロールファージのΔＡｍａｘも毎回アッセイし、相対的結合親和性（ΔＡｍａｘ／ΔＡｍａｘ、ｃｏｎｔｒｏｌ）を評価した（表１）。ファージの野生型はコントロールとして用いた。
（３）  細胞
マウスＢ１６メラノーマは１０％ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、１００ユニット／ｍｌのペニシリンＧ、１００ユニット／ｍｌのストレプトマイシンを補足したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）中で３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気の条件下で増殖させた。Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞は１０％ウシ胎児血清、０．１％ＮａＨＣＯ３、１０μｇ／ｍｌグルタミン、１００ユニット／ｍｌペニシリンＧおよび１００ユニット／ｍｌストレプトマイシンを添加したＭＥＭ（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  ｅａｇｌｅ）（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）中で３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気の条件下で増殖させた。
（４）  フローサイトメトリー
トリプシン処理Ｂ１６細胞（２×１０５）を、１％ＢＳＡ／リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）中で系列希釈したファージクローン（［ｐｈａｇｅ］＝０．１−５００ｎＭ）２００μｌとともに、氷上で１時間インキュベートした。１％のＢＳＡ／ＰＢＳを用いて３回洗浄し、細胞を４００倍希釈（ｖ／ｖ）のウサギ抗ｆｄバクテリオファージ抗体（Ｓｉｇｍａ）２００μｌとともに氷上で０．５時間インキュベートした。２回洗浄し、細胞を４００倍希釈（ｖ／ｖ）の抗ウサギＩｇＧフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート（Ｓｉｇｍａ）２００μｌとともに氷上で０．５時間インキュベートした。ＦＩＴＣ標識細胞を、１％のＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄し、フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ  ＸＬ、コールター）によって分析した。
（５）  単糖の添加による阻害
トリプシン処理Ｂ１６細胞（２×１０５）を、ファージクローン（［ｐｈａｇｅ］＝１０ｎＭ）２００μｌとともに、単糖（１または５ｍＭのＮ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）、グルコース（Ｇｌｃ）もしくはグルクロン酸（ＧｌｃＵ））の存在下または不存在下で氷上で１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、ＦＩＴＣで標識し、フローサイトメーターにより分析した。
（６）  細胞上の糖タンパク質のシアル酸の除去
トリプシン処理Ｂ１６細胞（２×１０５）を、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ（Ｓｉｇｍａ）由来の０．０５ユニットのノイラミニダーゼとともに３７℃で１．５時間（ｐＨ６．５または７．４）インキュベートした。１％のＢＳＡ／ＰＢＳを用いて３回洗浄後、細胞をファージクローン（［ｐｈａｇｅ］＝１０ｎＭ）とともにインキュベートし、ＦＩＴＣで標識し、フローサイトメーターにより分析した。
（７）  合成ペプチドおよび糖脂質単分子膜の間の相互作用の水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）分析
糖脂質（ＧＭ３、６’ＧＭ３、ＬａｃＣｅｒ、ＧａｌＣｅｒまたはＧｌｃＣｅｒ）の単分子膜は、ラングミュアタイプ水槽上で調製し、ＱＣＭ（２７ＭＨｚ、ＡＴ−ｃｕｔ、直径２．５ｍｍ、面積４．９ｍｍ２）の上に水平に写した。２７ＭＨｚのＱＣＭは９ＭＨｚよりも感度が高かった（約１０倍）（文献（４４）−（４６））。ＴＢＳ中０．１ｍＭ、１ｍＭおよび１０ｍＭのペプチド溶液を、ＱＣＭ装置のセルキュベットへ添加し、ペプチドの添加に応答するＱＣＭの周波数減少（ΔＦ、Ｈｚ）を経時的に追跡した。各実験は、２〜６回実行した。結合量（Δｍ、ｎｇ  ｃｍ２））およびΔＦの関係は、Ｓａｕｅｒｂｒｅｙの方程式に基づいて得られた（文献（４７））。この場合、１ＨｚのΔＦは、１．１ｎｇ  ｃｍ−２のペプチドの質量増加に相当した。Δｍを、ペプチド濃度（最終濃度＝１〜７０μＭ）に対してプロットした。次に、最大結合量（Δｍｍａｘ）および解離定数（Ｋｄ）を（４４−４５、４８）に記載の次の方程式から計算した。
［ｐｅｐｔｉｄｅ］／Δｍ＝［ペプチド］／Δｍａｘ＋Ｋｄ／Δｍａｘ    （ＩＩ）
（８）  ペプチドを含むリポソームの調製
クロロホルム／メタノール（２：１，ｖ／ｖ）に溶解された、卵黄ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびコレステロール（２：１，モル比）の混合脂質を、円形底フラスコへ加え蒸発させて薄い脂質膜を作製した。脂質フィルムは、真空中でオーバーナイトで乾燥させた。膜をボルテックスによりＰＢＳ（ｐＨ７．４）で膨潤させ、３０分間超音波処理した。ＰＣ／コレステロールリポソームは、Ｎ−ステアロイルペプチドアミドの水性溶液と混合した。ＰＣ：コレステロール：ペプチドの最終のモル比は２０：１０：３であった。
実施例１において以下の結果が得られた。
（ａ）  ＧＭ３単分子膜に対するファージディスプレイ選択
ＧＭ３の糖鎖に結合するペプチド配列は、文献（３５）に記載のような脂質単分子膜と結合したファージライブラリー法で選択した。空気と水の界面においてＧＭ３単層を調製し、アフィニティー選択のために使用した。ＧＭ３特異的ファージは、４回のアフィニティー選択のプロセスを通じて増加した。回収したファージの相対的な収量は、４ラウンドのバイオパニング（データは示さない）を通して０．２〜１５×１０６に増加した。ＧＭ３単分子膜に対する選択されたファージの結合親和性は、９ＭＨｚの水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）によって確認した（文献（２１）−（２２））。トリス緩衝化生理食塩水（５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中でのファージ（１０１０ＴＵ／ｍＬ）の添加に応答したＱＣＭの周波数減少（質量増加）を経時的に追跡した（図１）。
図１において、ファージライブラリー（白丸）またはＧＭ３単分子層を用いたアフィニティー選択の第４ラウンドのファージクローン（黒丸）の結果を示す。ＧＭ３単分子層は９ＭＨｚのＱＣＭ金表面へ結合させ、ＱＣＭはｐＨ７．５でトリス緩衝化生理食塩水１ｍｌへ浸漬した。６×１０１０の変換ユニットを含むファージ溶液を、緩衝液に注入し、ファージ結合に応答する周波数減少を時間に対してプロットした。この結果より、最終ファージ濃度は、２ｎＭであることがわかった。
周波数変化は、選択されたファージ（２６Ｈｚ）の結合量が最初のライブラリー（４Ｈｚ）の６．５倍であることを示した。これらの結果は、アフィニティー選択がランダムファージライブラリーからのＧＭ３結合ファージを与えたこと示す。
２７クローンのＧＭ３特異的ファージが単離され、ファージクローンのＤＮＡ配列が決定された。ランダム化された領域を示す推定アミノ酸配列は、表１に示すように７種類の１５−ｍｅｒ配列が見出されたことを示す（配列１から７）。配列は２つのグループに分類され、各グループは推定コンセンサスモチーフ、Ｗ−ｘｘｘＡ−ＲおよびＷＲｘ−ＶｘＦｘＳをそれぞれ有していた。各々のコンセンサスモチーフは、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｔｒｐ（Ｗ）およびＰｈｅ（Ｆ）から構成されていた。興味深いことに、ＧＭ１結合性ペプチドのコンセンサスモチーフも、これらの３つのアミノ酸（アルギニンおよび芳香性のアミノ酸）を含んでいた（文献（３５））。更に、この研究で選択されたｃ０１配列は、ＧＭ１結合性ペプチド（ＧＭ１／ペプチド２）のうちの１つと同じ配列であった。これは、用いたファージライブラリーが同一だったので、ライブラリーの多様性の限界による。これらの結果は、ｃ０１配列がシアル酸含有糖脂質に対する広いアフィニティーを有していることを示唆する。
【表１】
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ａ  推定アミノ酸配列  推定コンセンサスモチーフは太字で示してある。
ｂ  分離されたファージクローンの数。
Ｃ  ΔＡｍａｘ／ΔＡｍａｘ，コントロールの比  ＧＭ３へのファージクローンの結合をＥＬＩＳＡにより評価した。コントロールファージクローン（野生型）のＮ末端配列はＡＥＴＶＥＳＣＬＡＫＰＨＴＥＮである。
（ｂ）  ＥＬＩＳＡによるアフィニティースクリーニング
ＧＭ３に対する単離されたファージクローンの結合親和性は、ＥＬＩＳＡによって評価した。空気−水界面においてＧＭ３単分子膜を調製し、プラスチックプレートに移した。プラスチックプレートを２４ウェルマルチプレートに移し、ファージクローンとともに３０分間インキュベートした。酵素による発色の吸収ｖｓ．ファージ濃度のプロットにより飽和カーブが得られ、最大吸光度（ΔＡｍａｘ）は上記の方程式Ｉから計算した。ＥＬＩＳＡの結果は、単離された７つのファージクローンが次の順でＧＭ３に強く結合することを示した。ｃ０１＞ｃ０３＞ｃ１５＞ｃ３０＞ｃ０７＞ｃ２１＝ｃ１１。相対的結合アフィニティー、すなわち（選択されたファージのΔＡｍａｘ）／（ＡＥＴＶＥＳＣＬＡＫＰＨＴＥＮを提示するコントロールファージのΔＡｍａｘ）は、１．１と２．１の間であった（表１）。最も頻繁に出現した（１５／２７）ファージクローンｃ０１は、ＧＭ３への最も高いアフィニティーを示した。
（ｃ）  ファージクローンの結合アフィニティー
２つのファージクローンｃ０１およびｃ０３の結合アフィニティーを、ＥＬＩＳＡによってさらに調べた。これらのクローンの結合アフィニティーはＮｅｕＡｃα２→３Ｇａｌ結合を含むＧＭ３およびＮｅｕＡｃα２→６Ｇａｌ結合を含む合成６’ＧＭ３を用いてアッセイした。ｃ０１クローンは、ＧＭ３および６’ＧＭ３の両方に、コントロールクローンと比較して、それぞれ２．１と１．６の倍率で結合した（図２）。
単離されたｃ０１およびｃ０３ファージクローンは、系列希釈し（０．０５−１０ｎＭ）、ＧＭ３（ＮｅｕＡｃα２→３Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１→１’Ｃｅｒ）あるいは６’ＧＭ３（ＮｅｕＡｃα２→６Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１→１’Ｃｅｒ）単層と相互作用して、結合ファージクローンの量をＥＬＩＳＡ法によって評価した。相対的結合アフィニティー（ΔＡｍａｘ／ΔＡｍａｘｃｏｎｔｒｏｌ）はファージクローンの最大吸光度（ΔＡｍａｘ）をコントロールファージ（ΔＡｍａｘｃｏｎｔｒｏｌ）の最大吸光度で割ることにより得た。
ｃ０１ファージクローンはいずれのＮｅｕＡｃ−Ｇａｌ結合にも結合することが示された。他方では、ｃ０３クローンは、コントロールクローンと比較して、１．８の倍率でＧＭ３に特異的に結合した。ｃ０３ファージクローンは、シアル酸のガラクトースへのα２→３およびα２→６結合の間で異なる結合アフィニティーを示した。
（ｄ）  Ｂ１６細胞上の糖タンパク質中のシアリルオリゴサッカライドへの特異的な結合
動物細胞用に選択されたファージクローンの結合アフィニティーを調べた。マウスＢ１６メラノーマ細胞の表面上に２つのタイプのシアロシルガラクトース結合（α２→３およびα２→６）がある。Ｂ１６細胞株は主としてＧＭ３を発現し、他のガングリオシドをほとんど発現しない（文献（１３）、（１５）、（４９）−（５１））。細胞をファージクローンおよび結合クローンとともにインキュベートしフルオレセイン結合抗体で標識した。細胞の蛍光は、フローサイトメーターを用いて測定し、観察された蛍光強度は、ファージ濃度の関数としてプロットした（図３）。
Ｂ１６細胞は、ｃ０１ファージクローン（黒円）、ｃ０３ファージクローン（白円）またはコントロールファージクローン（野生型、黒三角形）とともに０℃で１時間１％のＢＳＡ／ＰＢＳ中でインキュベートした。結合したファージクローンは、抗ファージ一次抗体およびＦＩＴＣ結合二次抗体によって標識した。細胞へのファージクローンの結合量はフローサイトメーターによって決定した。
ｃ０１ファージクローンは、１〜１０ｎＭの範囲のファージ濃度でＢ１６細胞へ結合した。しかし、ｃ０３およびコントロールファージクローンでは有意の結合は観察されなかった。
ファージの結合が細胞表面のシアル酸によって仲介されているかどうかを確認するために、阻害アッセイおよび細胞のノイラミニダーゼ処理を行った。Ｂ１６細胞へのｃ０１ファージクローン（１０ｎＭ）の結合は、１ｍＭ  ＮｅｕＡｃの転化により阻害された（図４Ａ）。
図４Ａは、単糖による、ｃ０１ファージクローンとＢ１６細胞間の結合の阻害を示す。Ｂ１６細胞（２×１０５細胞）を、ＮｅｕＡｃ、ＧｌｃまたはＧｌｃＵ（１ｍＭ）の非存在下（−）または存在下でファージクローン（１０ｎＭ）とともにインキュベートした。
グルクロン酸（ＧｌｃＵ）の存在下で、わずかな阻害が観察された。ＧｌｃＵはＮｅｕＡｃと同様に酸性糖であるので、カルボン酸が、ファージと糖鎖の間の相互作用に部分的に関係していたと思われる。他方、グルコースの添加によっては阻害は認められなかった。Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓからのノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）は糖コンジュゲートの末端α２→３およびα２→６結合シアル酸を優先的に加水分解する（相対的な活性は、α２→６＞α２→３＞α２→８である）（文献（５２））。Ｂ１６細胞をバッファー（ｐＨ６．５）中においてノイラミニダーゼで３７℃、１．５時間処理した。この条件では、細胞から除去されたシアル酸の量は１０６個の細胞について０．３μｇであると推測され、それはほとんどある糖タンパク質のＮｅｕＡｃの総量と等しい（文献（４９）−（５０））。他方では、ＧＭ３からのＮｅｕＡｃの分解は薄層クロマトグラフィー分析によっては確認されなかった（データは示さない）。精製されたＧＭ３のシアル酸はノイラミニダーゼによって消化された。しかし、細胞全体の処理は、ＧＭ３からのシアル酸の分裂を示さなかった。したがって、細胞がノイラミニダーゼで処理されたとき、細胞上のシアリル糖コンジュゲートはＧＭ３のみであると考えられた。ＥＬＩＳＡはｃ０１ファージクローンがＧＭ３に結合することを示したが、ノイラミニダーゼ処理Ｂ１６細胞へのｃ０１ファージの結合は、コントロールファージと同じレベルに減少した（図４Ｂ）。
図４Ｂは、Ｂ１６細胞のファージ結合に対するノイラミニダーゼ処理の影響を示す。Ｂ１６細胞（２×１０５細胞）を、ノイラミニダーゼ（ｐＨ６．５）０．０５単位とともに３７℃、９０分間、１％のＢＳＡ／ＰＢＳ中でインキュベートし、さらにファージクローンとともにインキュベートした。図４Ｂにおいてアスタリスクはｐ＜０．０５を意味する。
細胞が酵素活性のない条件であるｐＨ７．４でノイラミニダーゼ処理されたとき、ｃ０１ファージは細胞に結合した（データは示さない）。これらの結果は、ｃ０１ファージクローンはＧＭ３にではなく糖タンパク質のシアリルオリゴサッカライドに結合することを示している。ファージが柔軟なフィラメント（長さ約１μｍ、厚さ６−１０ｎｍ）であるので、このアフィニティーはファージの立体障害による可能性がある（文献（２６））。ＥＬＩＳＡの結果（図２）に基づくと、ｃ０１ファージクローンが糖タンパク質中のα２→６結合したシアリルガラクトースと相互作用すると思われる。
（ｅ）  合成１５−ｍｅｒペプチドの糖認識
選択されたペプチドの糖認識を知るために、Ｈ−ＧＷＷＹＫＧＲＡＲＰＶＳＡＶＡ−ＮＨ２（ｃ０１ペプチド、配列番号１）の１５−ｍｅｒペプチドおよびＨ−ＲＡＶＷＲＨＳＶＡＴＰＳＨＳＶ−ＮＨ２（ｃ０３ペプチド、配列番号２）を合成した。糖脂質に対するこれらのペプチドの結合アッセイは、２７ＭＨｚのＱＣＭ法（２７ＭＨｚのＱＣＭは、９ＭＨｚより約１０倍高感度である）によって分析された（文献（４４）−（４６））。糖脂質（ＧＭ３、６’ＧＭ３、ＬａｃＣｅｒ、ＧａｌＣｅｒまたはＧｌｃＣｅｒ）の単分子膜は、空気−水界面で調製し、ＱＣＭ金表面へ移した。その後、ペプチド溶液をＱＣＭキュベットに注入し、時間でペプチド結合量を経時的に追跡した（データは示さない）。ペプチドの単分子膜への結合（Δｍ）は、図５に示すようにペプチド濃度の関数としてプロットした。
平衡で結合するｃ０１（黒円）およびｃ０３ペプチド（白円）に応答する質量増加の値は（Δｍ，ｎｇ  ｃｍ−２）、ＱＣＭ分析で最終ペプチド濃度１．０〜１０μＭの範囲であった。
最大結合量（Δｍｍａｘ）および解離定数（Ｋｄ）を、方程式ＩＩ（表２）を用いて相互のプロットから計算された（文献（４４）−（４５）、（４７））。Ｋｄ値は、最大の結合の５０％を要するペプチド濃度に相当する。ｃ０１およびｃ０３ペプチドは、それぞれ１．８および０．３４μＭのＫｄ値でＧＭ３への最も高いアフィニティーを有していた。ｃ０１ペプチドの最大結合量（４６ｎｇ  ｃｍ−２）は、ｃ０３ペプチド（１１ｎｇ  ｃｍ−２）より大きかった。しかしながら、これらのペプチドはさらに６’ＧＭ３とＬａｃＣｅｒへのアフィニティーを有していたが、Ｋｄ値はＧＭ３より高かった。これらの２つのペプチドはＧａｌＣｅｒとＧｌｃＣｅｒへの結合が低いかまたは結合しなかった。したがって、これらのペプチドが末端ＮｅｕＡｃ−Ｇａｌ構造と相互作用したように見えた。他方では、コントロールペプチド（Ｈ−ＡＥＴＶＥＳＣＬＡＫＰＨＴＥＮ−ＮＨ２）は、この研究で使用されたすべてのグリコスフィンゴ脂質に結合しなかった（データは示さない）。
【表２】
2005084694.tif 000003
ａ  ペプチドにより認識された部分には下線を付してある。
ｂ  ΔｍｍａｘとＫｄの値は、ＱＣＭ分析（１Ｈｚ＝０．９１ｎｇ  ｃｍ−２）により得た。
ｃ  Ｎｏｔ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ
実施例１に示すように、ファージライブラリー選択の方法は、空気−水界面の脂質単分子膜と組合わせて糖脂質結合ペプチド配列の決定に用いられた（文献（３５））。この方法では、糖脂質分子が表面圧３０ｍＮ  ｍ−１で高度に配向する（０．４ｎｍ２ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）ので、糖鎖だけが水相に露出する。したがって、ファージ粒子は糖鎖だけと相互作用することができる。この研究では、ＧＭ３が細胞表面に存在する主なオリゴ糖であるシアリルガラクトース残基を有するので、ＧＭ３はアフィニティー選択の標的分子として使用された。ＧＭ３結合ファージのプールは４ラウンドのアフィニティー選択によって豊富化された。豊富化は、それぞれのラウンドで水晶発振子マイクロバランスにより検出され（データは示さない）、最終的に６．５倍の質量増加が検出された（図１）。第４ラウンドで観察されたＱＣＭの周波数減少（２６Ｈｚ）は、ＱＣＭの電極上のファージの飽和結合量に対応していると考えられる。
単離された２７のファージクローンのＤＮＡ配列から、７種類のペプチド配列を推定した。７つのペプチド配列は、２つのコンセンサスモチーフ、Ｗ−ｘｘｘＡ−ＲおよびＷＲｘ−ＶｘＦｘＳに分類された（表１）。コンセンサスモチーフ中のアルギニンおよび芳香性のアミノ酸は、ＧＭ１結合性ペプチドにも認められた（文献（３５））。更に、ｃ０１ペプチドの配列は、ＧＭ１結合ペプチド（ＧＷＷＹＫＧＲＡＲＰＶＳＡＶＡ）と同じであった。選択された配列のｃ０１およびｃ０３  １５ｍｅｒペプチドを化学合成し、いくつかの糖脂質への結合アフィニティーを調べ、ペプチドとの相互作用に関係する糖部分を決定した（図５および表２）。２つのペプチドは、ＧＭ３に対して最低のＫｄ値を有しているので、末端ＮｅｕＡｃ−Ｇａｌ構造はペプチドによる炭水化物認識に必要であると考えられた。したがって、ペプチドモチーフ中のＡｒｇ（Ｒ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｐｈｅ（Ｆ）およびＳｅｒ（Ｓ）がＧＭ３のＮｅｕＡｃ−Ｇａｌギャルとの相互作用に関与したと考えられた。糖の水酸基は、同時に水素結合ドナーおよびアクセプターとして働く（文献（５３）、（５４））。多くの場合、ペプチドのアミド基が、さらに水素結合ドナーとして働き、ペプチドのカルボニル基またはカルボン酸基とＮｅｕＡｃは水素結合アクセプターとして働く。さらに、ガラクトピラノース環のＢ面およびＮｅｕＡｃのメチル基は、ＴｒｐとＰｈｅの芳香族環と相互作用し得る。ＧＭ３結合ペプチドのコンセンサスモチーフは糖結合アミノ酸から構成されていた。したがってこれらのペプチドは、水素結合およびヴァンデルワールス相互作用によってＮｅｕＡｃ−Ｇａｌ部分を認識し得る。
シアリルガラクトース（ＮｅｕＡｃ−Ｇａｌ）構造は、糖タンパク質と糖脂質中の末端糖配列である。マウスＢ１６マラノーマ細胞は主としてＧＭ３を発現し、他のガングリオシドをほとんど発現しないので、Ｂ１６細胞は、選択されたファージの細胞表面上のＧＭ３とのアフィニティーを決定するのに用いられた（文献（１３）、（１５）、（４９）−（５０））。Ｂ１６細胞が選択されたファージクローンとインキュベートされたとき、ｃ０１ファージクローンのみが細胞へ結合した（図３）。細胞のシアル酸の脱離および遊離のＮ−アセチルノイラミン酸の添加は、細胞へのファージの結合阻害をもたらした。これらの結果は、ｃ０１ファージクローンの結合が糖タンパク質中のシアル酸残基によって仲介されていることを示した。ｃ０１ファージクローンはＮｅｕα２→３ＧａｌおよびＮｅｕα２→６Ｇａｌ結合の両方に対するアフィニティーを有し、ｃ０３ファージクローンは、Ｎｅｕα２→３Ｇａｌ結合に対するアフィニティーを有していた（図２）。したがって、ファージクローンｃ０１のみがＢ１６細胞の細胞表面のＮｅｕα２→６Ｇａｌと相互作用することがわかった。ＧＭ３はＢ１６細胞の細胞表面上で発現されるが、細胞に対するファージの結合は認められなかった。また、ノイラミニダーゼは、ＧＭ３のＮｅｕＡｃを消化することはできなかった。これらの結果は、大きな分子（ファージクローンおよび酵素のような）がＢ１６細胞上のＧＭ３に接近することができないことを示した。
【実施例２】  インフルエンザウイルスの感染の抑制実験
プラークアッセイ
インフルエンザウイルスの感染の阻害をＭＤＣＫ細胞上のプラークアッセイにより決定した。６ウェルプレート中のＭＤＣＫ細胞は、リポソームあるいはペプチド含有リポソームを含むインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルス溶液（１００−２００ｐｆｕ、ｐｆｕとはプラーク形成ユニット）０．２ｍＬとインキュベートした。５％のＣＯ２の下での３７℃、３０分間のインキュベーションの後、上清を除去し、細胞をＰＢＳを用いて洗浄した。０．６％のアガロース（０．０１％のＯ−ジエチルアミノエチルセルロースデキストラン、０．１％ＮａＨＣＯ３、０．０１μｇ／ｍＬアセチルトリプシンを含む２×ＭＥＭ＋ＢＳＡ  ２ｍＬ（１つのウェル当たり）を添加し、２日間インキュベートした。生細胞をクリスタルバイオレット溶液（２０％のエタノール中１ｍｇ／ｍＬ）で染色し、プラークの数をカウントした。最高感染活性（１００％）はリポソームのない場合のプラークの数として定義した。ペプチド含有リポソームのＩＣ５０値（５０％抑制濃度）は、ｌｏｇ［ｆ／（１−ｆ）］とｌｏｇ［ペプチド含有リポソーム］、ここでｆは感染活性割合である、の間のプロットから得られた。
ＭＤＣＫ細胞へのインフルエンザウイルスの感染のペプチド含有リポソームによる阻害の検討の結果は以下の通りであった。
ＭＤＣＫ細胞へのインフルエンザウイルスの感染のペプチド含有リポソームによる阻害をプラークアッセイにより決定した。ペプチドはステアロイル基を用いて、Ｎ−末端でアシル化し、ＰＣ／コレステロールリポソーム（ペプチド含有リポソーム）に組み込んだ。合成ｃ０１およびｃ０３ペプチドの両方がＮｅｕＡｃα２→３ＧａｌおよびＮｅｕＡｃα２→６Ｇａｌ構造へのアフィニティーを有していたので、ペプチド含有リポソームは、ＭＤＣＫ細胞上のシアリルオリゴサッカライドと結合し得る。ペプチド含有リポソームの存在下で、ＭＤＣＫ細胞へのインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルス（Ｈ１Ｎ１）の感染は阻害された（図６）。
ＭＤＣＫ細胞を、ｃ０１ペプチド含有リポソーム（黒円）、ｃ０３ペプチド含有リポソーム（白円）またはリポソームのみ（黒三角形）の存在下で、インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスとともに３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、２日間インキュベートした。次いで、生細胞を染色し、プラークの数をカウントした。
ｃ０１およびｃ０３のペプチド含有リポソームのＩＣ５０値は、それぞれ０．３６および０．３７ｍＭであった（表３）。コントロールペプチド配列は阻害を示さなかった。ｃ０１およびｃ０３ファージクローンは、インフルエンザウイルスへのアフィニティーを有していなかった（データは示さない）。従って、ＭＤＣＫ細胞表面へのこれらのリポソームの結合がインフルエンザウイルスの感染を阻害することが示された。
【表３】
2005084694.tif 000004
また、同様の実験をガングリオシドＧＭ３結合性ペプチドであるｃ０１ペプチドおよびｃ０３ペプチドならびにインフルエンザヘマグルチニン結合性ペプチドＡ−１（ＡＲＬＳＰＴＭＶＨＰＮＧＡＱＰ（配列番号８））を含有するリポソームを用いて行った。図７に結果を示す。図７中、横軸はリポソーム中のｅｇｇＰＣの濃度（ｍＭ）を示し、縦軸は感染阻害率（％）を示す。感染阻害率は、ペプチドを含有しないリポソームを添加した場合のプラークの数に対して、ペプチド含有リポソームを添加した場合のプラークの数の減少率で示した。図７に示すように、いずれのペプチドもインフルエンザウイルスの感染を阻害し、ガングリオシドＧＭ３結合性ペプチドの阻害率がより高かった。ｅｇｇＰＣ濃度が１ｍＭ（ペプチド濃度０．１５ｍＭ）のときの感染阻害率は、ｃ０１ペプチドが８３％、ｃ０３ペプチドが９４％、Ａ１ペプチドが７６％であった。
多くの種類の毒素およびウイルスは、初期の感染ステップで細胞表面の糖鎖を認識する（文献（６））。アミロイドβタンパク質もガングリオシドＧＭ１と相互作用し、アミロイド−ＧＭ１複合体が線維形成をもたらすと考えられる（文献（５５）、（５６））。病原性分子および糖鎖の間の相互作用を阻害するいくつかの化合物は、医学応用するために開発されている（文献（５７）、（５８））。本発明において、インフルエンザウイルスの抑制剤としての機能を評価するために、合成ペプチドをリポソームに導入した。ペプチドをアミノ末端をステアロイル基でアシル化し、疎水性部分を与えた。期待通り、ペプチド含有リポソームは、ＭＤＣＫ細胞へのインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１タイプ）の感染を阻害した（図６）。インフルエンザＡ型ウイルスＡ／ＰＲ／８／３４（ＨＩＮ１）の赤血球凝集素のセロタイプＨ１は、ＮｅｕＡｃα→３Ｇａｌ結合に特異的である。ＭＤＣＫ細胞は、α２→３およびα２→６結合シアル酸の両方を細胞表面に有している（文献（５９））。ペプチドリポソームはＭＤＣＫ細胞のシアリルガラクトース部分に結合し、ＭＤＣＫ細胞上のシアリルガラクトース受容体へのインフルエンザウイルスの結合を阻害した。最近、滝川らは、糖模倣ペプチドを含むリポソームが癌細胞へ結合し、癌細胞の転移を阻害したと報告した（文献（５８））。機能的ペプチドのリポソーム中への導入は細胞−細胞および細胞−ウイルス相互作用を阻害する有効な方法になり得る。
ファージライブラリー選択によってシアリルガラクトース部分を認識する１５ｍｅｒペプチド配列を得た。得られたペプチドは、糖脂質単分子膜の糖鎖へのアフィニティーだけでなく、細胞表面の糖タンパク質へのアフィニティーも有していた。細胞表面へのペプチドの結合は、インフルエンザウイルス感染を有意に阻害した。本発明で選択されたペプチドはインフルエンザウイルス抑制剤として用い得る。
以下、本発明において参照した文献リストを掲げる。本明細書中で下記文献を参照する場合は、文献番号を示した。
文献リスト
１．Ｖａｒｋｉ，Ａ．（１９９３）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ３，９７−１３０
２．Ｄｗｅｋ，Ｒ．Ａ．（１９９６）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９６，６８３−７２０
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４．Ｌｉｓ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｓｈａｒｏｎ，Ｎ．（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９８，６３７−６７４
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６．Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｋ．−Ａ．（１９８９）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８，３０９−３５０
７．Ｋｏｌｔｅｒ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｓａｎｄｈｏｆｆ，Ｋ．（１９９９）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３８，１５３２−１５６８
８．Ｈａｋｏｍｏｒｉ，Ｓ．，Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｈａｎｄａ，Ａ．Ｋ．（１９９８）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４５，１−１０
９．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｔ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｔｉｌｌａｃｋ，Ｔ．Ｗ．（１９８５）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１４，３６１−３８６
１０．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ｇ．Ｗ．（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７，１９９−２２５
１１．Ｈａｋｏｍｏｒｉ，Ｓ．−Ｉ．（２０００）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１７，１４３−１５１
１２．Ｇａｌｂｉａｔｉ，Ｆ．，Ｒａｚａｎｉ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｌｉｓａｎｔｉ，Ｍ．Ｐ．（２００１）Ｃｅｌｌ  １０６，４０３−４１１
１３．Ｉｗａｂｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｈａｎｄａ，Ｋ．，Ｗｉｔｈｅｒｓ，Ｄ．Ａ．，Ｓｉｎａｙ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｈａｋｏｍｏｒｉ，Ｓ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，１５１７４−１７１８１
１４．Ｐｒｉｎｅｔｔｉ，Ａ．，Ｉｗａｂｕｃｈｉ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｈａｋｏｍｏｒｉ，Ｓ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，２０９１６−２０９２４
１５．Ｉｗａｂｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｓ．，Ｐｒｉｎｅｔｔｉ，Ａ．，Ｈａｎｄａ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｈａｋｏｍｏｒｉ，Ｓ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，９１３０−９１３８
１６．Ｙｕａｎ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｌ．Ｊ．（２０００）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７９，２７６８−２７８１
１７．Ｍｏｕ，Ｊ．，Ｙａｎｇ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｓｈａｏ，Ｚ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８，５０７−５１２
１８．Ｖｉｅ，Ｖ．，Ｍａｕ，Ｎ．Ｖ．，Ｌｅｓｎｉｅｗｓｋａ，Ｅ．，Ｇｏｕｄｏｎｎｅｔ，Ｊ．Ｐ．，Ｈｅｉｔｚ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｌｅ  Ｇｒｉｍｅｌｌｅｃ，Ｃ．（１９９８）Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １４，４５７４−４５８３
１９．Ｓａｔｏ，Ｔ．（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３，２３１−２３８
２０．Ｈａｓｈｉｚｕｍｅ，Ｍ．，Ｓａｔｏ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｏｋａｈａｔａ，Ｙ．（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，３９９−４００
２１．Ｓａｔｏ，Ｔ．，Ｓｅｒｉｚａｗａ，Ｔ．，Ｏｈｔａｋｅ，Ｆ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｍ．，Ｔｅｒａｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．，Ｋａｗａｎｉｓｈｉ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｏｋａｈａｔａ，Ｙ．（１９９８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３８０，８２−９２
２２．Ｓａｔｏ，Ｔ．，Ｓｅｒｉｚａｗａ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｏｋａｈａｔａ，Ｙ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２８５，１４−２０
２３．Ｓｅａｒｓ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｗｏｎｇ，Ｃ．−Ｈ．（１９９９）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３８，２３００−２３２４
２４．Ｆｅｉｚｉ，Ｔ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１４，５３−５７
２５．Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９，３８６−３９０
２６．Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７，２２８−２５７
２７．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｋ．，Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｉ．Ｎ．，ａｎｄ  Ｏｓａｋａ，Ｔ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）１２７，１３７−１４２
２８．Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｒａｄｉｃ，Ｍ．Ｚ．，Ｓｉｅｇｅｌ，Ｄ．，Ｃｈａｎｇ，Ｔ．，Ｂｒａｃｙ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｇａｌｉｌｉ，Ｕ．（１９９７）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４，６０９−６１８
２９．Ｐｅｌｅｔｓｋａｙａ，Ｅ．Ｎ．，Ｇｌｉｎｓｋｙ，Ｖ．Ｖ．，Ｇｌｉｎｓｋｙ，Ｇ．Ｖ．，Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｓ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｑｕｉｎｎ，Ｔ．Ｐ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０，３７４−３８４
３０．Ｐｅｌｅｔｓｋａｙａ，Ｅ．Ｎ．，Ｇｌｉｎｓｋｙ，Ｇ．，Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｓ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｑｕｉｎｎ，Ｔ．Ｐ．（１９９６）Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ．２，１３−１８
３１．Ｇｕｉ，Ｊ．，Ｍｏｙａｎａ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｘｉａｎｇ，Ｊ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１８，４１４−４１９
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３３．Ｍａｏ，Ｓ．，Ｇａｏ，Ｃ．，Ｌｏ，Ｃ．Ｈ．，Ｗｉｒｓｃｈｉｎｇ，Ｐ．，Ｗｏｎｇ，Ｃ．−Ｈ．，ａｎｄ  Ｊａｎｄａ，Ｋ．Ｄ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ  ９６，６９５３−６９５８
３４．Ｄｉｎｈ，Ｑ．，Ｗｅｎｇ，Ｎ．Ｐ．，Ｋｉｓｏ，Ｍ．，Ｉｓｈｉｄａ，Ｈ．，Ｈａｓｅｇａｗａ，Ａ．，ａｎｄ  Ｍａｒｃｕｓ，Ｄ．Ｍ．（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７，７３２−７３８
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３９．Ｒｅａｓｏｎ，Ｄ．Ｃ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ｔ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｌｕｃａｓ，Ａ．Ｈ．（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５，２６１−２６６
４０．Ｄｅｎｇ，Ｓ．，ＭａｃＫｅｎｚｉｅ，Ｃ．Ｒ．，Ｓａｄｏｗｓｋａ，Ｊ．，Ｍｉｃｈｎｉｅｗｉｃｚ，Ｊ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｎ．Ｍ．，Ｂｕｎｄｌｅ，Ｄ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｎａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，９５３３−９５３８
４１．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍ．Ｎ．Ｖ．，Ｆｒｅｓｈｏｕｒ，Ｇ．，Ｄａｒｖｉｌｌ，Ａ．Ｇ．，Ａｌｂｅｒｓｈｅｉｍ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｈａｈｎ，Ｍ．Ｇ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ８，６７３−６８５
４２．Ｈａｓｈｉｚｕｍｅ，Ｍ．，Ｓａｔｏ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｏｋａｈａｔａ，Ｙ．，ｉｎ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．
４３．Ｎｉｓｈｉ，Ｔ．，Ｂｕｄｄｅ，Ｒ．Ｊ．Ａ．，ＭｃＭｕｒｒｙ，Ｊ．Ｓ．，Ｏｂｅｙｅｓｅｋｅｒｅ，Ｎ．Ｕ．，Ｓａｆｄａｒ，Ｎ．，Ｌｅｖｉｎ，Ｖ．Ａ．，ａｎｄ  Ｓａｙａ，Ｈ．（１９９６）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３９９，２３７−２４０
４４．Ｏｋａｈａｔａ，Ｙ．，Ｎｉｉｋｕｒａ，Ｋ．，Ｓｕｇｉｕｒａ，Ｙ．，Ｓａｗａｄａ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｍｏｒｉｉ，Ｔ．（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７，５６６６−５６７２
４５．Ｎｉｉｋｕｒａ，Ｋ．，Ｍａｔｓｕｎｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｏｋａｈａｔａ，Ｙ．（１９９９）Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．５，１６０９−１６１６
４６．Ｎｉｉｋｕｒａ，Ｋ．，Ｍａｔｓｕｎｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｏｋａｈａｔａ，Ｙ．（１９９８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０，８５３７−８５３８
４７．Ｓａｕｅｒｂｒｅｙ，Ｇ．（１９５９）Ｚ．Ｐｈｙｓ．１５５，２０６−２２２
４８．Ｅｂａｒａ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｏｋａｈａｔａ，Ｙ．（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６，１１２０９−１１２１２
４９．Ｍｏｒｅｔｔｉ，Ｓ．，Ｍｏｎｔｏｒｆａｎｏ，Ｇ．，Ｒａｐｅｌｌｉ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｂｅｒｒａ，Ｂ．（１９９７）ＩＴＡＬ．Ｊ．Ｂｉｏｃ．４６，１８７−１９５
５０．Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｇａｒｄｉｎｅｒ，Ｊ．Ｍ．（１９８４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４４，３２６２−３２６
５１．Ｃｏｒｆｉｅｌｄ，Ａ．Ｐ．，Ｈｉｇａ，Ｈ．，Ｐａｕｌｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｒ．（１９８３）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ７４４，１２１−１２６
５２．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．，Ｎａｇａｎｏ，Ｙ．，Ｋａｔｏ，Ｈ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｎｅｒｏｍｅ，Ｋ．，Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｎｏｂｕｓａｗａ，Ｅ．（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１，１７０５７−１７０６１
５３．Ｗｅｉｓ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｓｈａｒｏｎ，Ｎ．（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９８，６３７−６
５４．Ｑｕｉｏｃｈｏ，Ｆ．Ａ．（１９８９）Ｐｕｒｅ  ＆  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６１，１２９３−１３０６
５５．Ｙａｎａｇｉｓａｗａ，Ｋ．，Ｏｄａｋａ，Ａ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｉｈａｒａ，Ｙ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１，１０６２−１０６６
５６．Ｋａｋｉｏ，Ａ．，Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｓ．，Ｙａｎａｇｉｓａｗａ，Ｋ．，Ｋｏｚｕｔｓｕｍｉ，Ｙ．，Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｋ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，２４９８５−２４９９０
５７．Ｔｏｔａｎｉ，Ｋ．，Ｋｕｂｏｔａ，Ｔ．，Ｋｕｒｏｄａ，Ｔ．，Ｍｕｒａｔａ，Ｔ．，Ｈｉｄａｒｉ，Ｋ．Ｉ．−Ｐ．Ｊ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．，Ａｓｈｉｄａ，Ｈ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｕｓｕｉ，Ｔ．（２００３）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １３，３１５−３２６
５８．Ｔａｋｉｋａｗａ，Ｍ．，Ｋｉｋｋａｗａ，Ｈ．，Ａｓａｉ，Ｔ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｎ．，Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｄ．，Ｔａｎａｋａ，Ｍ．，Ｏｇｉｎｏ，Ｋ．，Ｔａｋｉ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｏｋｕ，Ｎ．（２０００）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４６６，３８１−３８４
５９．Ｓｔｒａｙ，Ｓ．Ｊ．，Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｒ．Ｄ．，ａｎｄ  Ａｉｒ，Ｇ．Ｍ．（２０００）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０，６４９−６５８
【産業上の利用可能性】  本発明により、インフルエンザウイルスが宿主細胞に結合するのを宿主細胞の受容体をブロックすることにより阻害するインフルエンザウイルス感染抑制剤が提供される。
本発明のインフルエンザウイルス感染抑制剤は、宿主細胞の受容体をブロックするため、インフルエンザウイルス感染前の被験体に投与しても、その後のインフルエンザウイルスの感染を抑制することができるので、効果的な感染予防剤として用いることができる。また、本発明のインフルエンザウイルス感染抑制剤は、細胞のインフルエンザウイルスが認識する受容体をブロックするため、インフルエンザウイルスの型を問わず、感染を抑制することができ、Ａ型やＢ型のヒトから分離されたインフルエンザウイルスだけでなく、トリから分離されたインフルエンザウイルス等の感染抑制にも用いることができる。さらに、インフルエンザウイルスが感染した後も、出芽により増殖したインフルエンザウイルスが再び細胞に感染するのを抑制することができるので、インフルエンザ治療薬としても効果的に用いることができる。本発明のインフルエンザウイルス抑制剤の有効成分はアミノ酸十数個からなるペプチドであるため、合成も製剤も容易であり、種々の形態の医薬組成物として利用することが可能である。
本明細書に引用されたすべての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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