(57)【要約】  本発明は、検出対象物に対して、Ｅ型肝炎ウイルスの遺伝子のＯＲＦ２領域とＯＲＦ３領域の重複部分に相当する塩基配列である、配列番号１に示す塩基配列に相応する配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列の核酸の検出を行い、当該核酸が検出された場合に、前記検出対象物がＥ型肝炎ウイルス陽性であるとする、ウイルスの検出方法、及びこの検出方法を行うための検出用キットを提供する。本発明により、包括的あるいは選択的なＨＥＶ高感度検出系の確立が可能である。本発明の検出方法は、輸血用血液、血液製剤、食品、環境検査等にも使用可能であり、また、ゲノタイプ特異的検出系は感染ルートの解明、疫学研究などに用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出対象物に対して、配列番号１に示す塩基配列に相応する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列の核酸の検出を行い、当該核酸が検出された場合に、前記検出対象物がＥ型肝炎ウイルス陽性であるとする、ウイルスの検出方法。
【請求項２】
配列番号１に示す塩基配列に相応する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列の核酸の検出が、当該核酸と検出対象物中の核酸とのハイブリダイズを検出することにより行われる、請求項１記載のウイルスの検出方法。
【請求項３】
検出対象物中の核酸を、配列番号１に示す塩基配列に相応する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列の核酸の増幅処理を行って得られる核酸として用いる、請求項１記載のウイルスの検出方法。
【請求項４】
配列番号１に示す塩基配列に相応する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列の核酸の検出が、当該核酸と検出対象物中の核酸とのハイブリダイズを検出することにより行われ、かつ、当該核酸が増幅処理を行って得られる核酸である、請求項１記載のウイルスの検出方法。
【請求項５】
前記増幅処理を行って得られる核酸が、配列番号４９に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列の核酸と、配列番号５０に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列の核酸と、配列番号５１に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列の核酸からなる群から選ばれる２種を増幅用プライマーの組として用いる核酸の増幅処理により得られる核酸である、請求項３又は４記載のウイルスの検出方法。
【請求項６】
前記増幅処理を行って得られる核酸が、配列番号４９に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列の核酸と、配列番号５０に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列の核酸と、配列番号５１に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する核酸からなる群から選ばれる２種を増幅用プライマーの組として用いる、核酸の増幅処理により得られる核酸である、請求項５記載のウイルスの検出方法。
【請求項７】
配列番号５１に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列を有する核酸をプローブとして用いて、当該プローブと検出対象物中の核酸（その増幅産物を含む）とのハイブリダイズを検出することにより、Ｅ型肝炎ウイルスを検出する、請求項１〜６のいずれかに記載のウイルスの検出方法。
【請求項８】
配列番号５２に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列を有する核酸をプローブとして用いて、当該プローブと検出対象物中の核酸（その増幅産物を含む）とのハイブリダイズを検出することにより、Ｅ型肝炎ウイルス（ＧＩ株）を検出する、請求項１〜６のいずれかに記載のウイルスの検出方法。
【請求項９】
前記ウイルスの検出方法において、検出対象となる核酸が、配列番号４９に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列の核酸と、配列番号５０に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列の核酸と、配列番号５２に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列の核酸からなる群から選ばれる２種を増幅用プライマーの組として用いる核酸の増幅処理により得られる核酸である、請求項８記載のウイルスの検出方法。
【請求項１０】
配列番号５３に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列を有する核酸をプローブとして用いて、当該プローブと検出対象物中の核酸とのハイブリダイズを検出することにより、Ｅ型肝炎ウイルス（ＧII株）を検出する、請求項１〜６のいずれかに記載のウイルスの検出方法。
【請求項１１】
前記ウイルスの検出方法において、検出対象となる核酸が、配列番号４９に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列の核酸と、配列番号５０に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列の核酸と、配列番号５３に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列の核酸からなる群から選ばれる２種を増幅用プライマーの組として用いる核酸の増幅処理により得られる核酸である、請求項１０記載のウイルスの検出方法。
【請求項１２】
配列番号５４に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列を有する核酸をプローブとして用いて、当該プローブと検出対象物中の核酸とのハイブリダイズを検出することにより、Ｅ型肝炎ウイルス（ＧIII株）を検出する、請求項１〜６のいずれかに記載のウイルスの検出方法。
【請求項１３】
前記ウイルスの検出方法において、検出対象となる核酸が、配列番号４９に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列の核酸と、配列番号５０に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列の核酸と、配列番号５４に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列の核酸からなる群から選ばれる２種を増幅用プライマーの組として用いる核酸の増幅処理により得られる核酸である、請求項１２記載のウイルスの検出方法。
【請求項１４】
配列番号５５に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列を有する核酸をプローブとして用いて、当該プローブと検出対象物中の核酸とのハイブリダイズを検出することにより、Ｅ型肝炎ウイルス（ＧIV株）を検出する、請求項１〜６のいずれかに記載のウイルスの検出方法。
【請求項１５】
前記ウイルスの検出方法において、検出対象となる核酸が、配列番号４９に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列の核酸と、配列番号５０に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列の核酸と、配列番号５５に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列の核酸からなる群から選ばれる２種を増幅用プライマーの組として用いる核酸の増幅処理により得られる核酸である、請求項１４記載のウイルスの検出方法。
【請求項１６】
配列番号４９に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列の核酸と、配列番号５０に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列の核酸、からなるＥ型肝炎ウイルス遺伝子増幅用プライマーセット。
【請求項１７】
配列番号４９に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列の核酸と、配列番号５０に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列の核酸、からなるＥ型肝炎ウイルス遺伝子増幅用プライマーセット。
【請求項１８】
配列番号５１に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列を有する核酸。
【請求項１９】
配列番号５２に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列を有する核酸。
【請求項２０】
配列番号５３に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列を有する核酸。
【請求項２１】
配列番号５４に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列を有する核酸。
【請求項２２】
配列番号５５に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列を有する核酸。
【請求項２３】
下記の要素を含有するＥ型肝炎ウイルス検出用キット。
１）配列番号４９に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列の核酸と、配列番号５０に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列の核酸、からなるＥ型肝炎ウイルス遺伝子増幅用プライマーセット。
２）配列番号５１に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列を有するプローブ核酸、及び／又は、配列番号５２〜５５に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列を有するプローブ核酸セット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスの検出方法、特に、Ｅ型肝炎ウイルスの検出方法に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
Ｅ型肝炎ウイルス(Hepatitis E virus : ＨＥＶ)はE型肝炎を誘発するウイルスで、family Hepeviridae, genus Hepevirus, に分類され、約7.2kbのプラス鎖ＲＮＡゲノムを持つ、小型（直径27-30nm）ウイルスである。ＨＥＶは1990年にReyes等により、はじめて遺伝子がクローニングされた(Reyes, G. R., M. A. Purdy, J. P. Kim, K. C. Luk, L. M. Young, K. E. Fry, and D. W. Bradley. 1990. Isolation of a cDNA from tＨＥＶirus responsible for enterically transmitted non-A, non-B hepatitis. Science,vol.247:1335-9)。その後、多くの株の全塩基配列が明らかになり、現在はゲノム塩基配列の類似性から、ＨＥＶは４つの型（遺伝子型I〜IV型）に分類されている(Schlauder, G. G., and I. K. Mushahwar. 2001. Genetic heterogeneity of hepatitis E virus. J Med Virol, vol.65:282-92)。E型肝炎の発生の多くは、ウイルスに汚染された水を飲むことにより起こり、特に開発途上国ではＨＥＶに汚染された飲料水などを介したＥ型肝炎がしばしば発生している(Grimm, A. C., and G. S. Fout. 2002. Development of a molecular method to identify hepatitis E virus in water. J Virol Methods, vol.101:175-88)。【０００３】
先進国では、開発途上国への旅行者の感染事例が多く「輸入感染症」として認識されて来たが、こうした地域への渡航歴がなくても、Ｅ型肝炎を発症する「国内発症例」も散見されるようになり、しかも、そのような例から採取されたＨＥＶ株は、それぞれの地域に特有の「土着株」であることが明らかになった(Erker, J. C., S. M. Desai, G. G. Schlauder, G. J. Dawson, and I. K. Mushahwar. 1999. A hepatitis E virus variant from the United States: molecular characterization and transmission in cynomolgus macaques. J Gen Virol, vol.80 (Pt 3):681-90; Schlauder, G. G., G. J. Dawson, J. C. Erker, P. Y. Kwo, M. F. Knigge, D. L. Smalley, J. E. Rosenblatt, S. M. Desai, and I. K. Mushahwar. 1998. The sequence and phylogenetic analysis of a novel hepatitis E virus isolated from a patient with acute hepatitis  reported in the United States. J Gen Virol, vol.79 (Pt 3):447-56; Takahashi, K., K. Iwata, N. Watanabe, T. Hatahara, Y. Ohta, K. Baba, and S. Mishiro. 2001. Full-genome nucleotide sequence of a hepatitis E virus strain that may be indigenous to Japan. Vir ology, vol.287:9-12; Yamamoto, T., H. Suzuki, T. Toyota, M. Takahashi, and H. Okamoto. 2004. Three male patients with sporadic acute hepatitis E in Sendai, Japan, who were domestically infected with hepatitis E virus of genotype III or IV. J Gastroenterol, vol.39:292-8)。【０００４】
このウイルスは経口感染により感染し、潜伏期間15日から60日を経て発症する。不顕性感染が多いとされており、感染しても発症しない人もいる。典型的な症状は腹痛、発熱、嘔吐など消化器症状を伴う急性肝炎であり、褐色尿を伴った強い黄疸が現れる。黄疸が12〜15日間続いたのちに、発症から1カ月を経て通常は完治する。なお、ＨＥＶのウイルス血症は黄疸に先立って出現し、ウイルスは便にも排泄される。A型肝炎と同様に、E型肝炎は慢性化しないが、便中への排泄を伴う長期間ウイルス血症状態が続く例も見られる。発症した場合の致死率は0.5-4.0％であるが、妊婦の場合は劇症肝炎の割合が高く、致死率も17-33％と高い。【０００５】
最近、わが国でも、イノシシの生レバーの摂食が原因と見られる急性E型肝炎での死亡例が報告されるなど、これまでに動物由来、特に豚のＨＥＶがヒトに感染することを間接的に証明する症例がいくつか報告されている(Meng, X. J., R. H. Purcell, P. G. Halbur, J. R. Lehman, D. M. Webb, T. S. Tsareva, J. S. Haynes, B. J. Thacker, and S. U. Emerson. 1997. A novel virus in swine is closely related to the human hepatitis E virus. Proc Natl Acad Sci U S A, vol.94:9860-5; Nishizawa, T., M. Takahashi, H. Mizuo, H. Miyajima, Y. Gotanda, and H. Okamoto. 2003. Characterizati on of Japanese swine and human hepatitis E virus isolates of genotype IV with 99 % identity over the entire genome. J Gen Virol, vol.84:1245-51; Okamoto, H., M. Takahashi, T. Nishizawa, K. Fukai, U. Muramatsu, and A. Yoshikawa. 2001. Analysis of the comple te genome of indigenous swine hepatitis E virus isolated in Japan. Biochem Biophys Res Commun, vol.289:929-36)。北海道では市販されていた豚レバーの一部から、Ｅ型肝炎ウイルスの遺伝子が検出され(Yazaki, Y., H. Mizuo, M. Takahashi, T. Nishizawa, N. Sasaki, Y. Gotanda, and H. Okamoto. 2003. Sporadic acute or fulminant hepatitis E in Hokkaido, Japan, may be food-borne, as suggested by the presence of hepatitis E virus in pig liver as food. J Gen Virol,vol.84:2351-7)、また、生シカ肉を介した集団Ｅ型肝炎ウイルス食中毒事例も報告されていることから(Tei, S., N. Kitajima, K. Takahashi, and S. Mishiro. 2003. Zoonotic transmission of hepatitis E virus from deer to human beings. Lancet, vol.362:371-3)、E型肝炎は人獣共感染症である可能性が高い事が示唆されている。【０００６】
なお、これまでに豚由来ＨＥＶで発見されたのはIII型及びIV型のみで、アカゲザル、チンパンジーにも感染が成立し、ウイルス血症、糞便へのウイルス排出も認められる(Meng, X. J., P. G. Halbur, M. S. Shapiro, S. Govindarajan, J. D. Bruna, I. K. Mushahwar, R. H. Purcell, and S. U. Emerson. 1998. Genetic and experimental evidence for cross-species infection by swine hepatitis E virus. J Virol,vol.72:9714-21)。また、ヒト由来ＨＥＶは豚にも感染する事が分かっている(Meng, X. J., P. G. Halbur, M. S. Shapiro, S. Govindarajan, J. D. Bruna, I. K. Mushahwar, R. H. Purcell, and S. U. Emerson. 1998. Genetic and experimental evidence for cross-species infection by swine hepatitis E virus. J Virol, vol.72:9714-21; Halbur, P. G., C. Kasorndorkbua, C. Gilbert, D. Guenette, M. B. Potters, R. H. Purcell, S. U. Emerson, T. E. Toth, and X. J. Meng. 2001. Comparative pathogenesis of infection of pigs with hepatitis E viruses recovered from a pig and a human. J Clin Microbiol, vol.39:918-23)。【０００７】
カナダオンタリオのある農場では、６ヶ月令の豚の80%以上がＨＥＶ抗体陽性であったことが2001年に報告された(Yoo, D., P. Willson, Y. Pei, M. A. Hayes, A. Deckert, C. E. Dewey, R. M. Friendship, Y. Yoon, M. Gottshalk, C. Yason, and A. Giulivi. 2001. Prevalence of hepatitis E virus antibodies in Canadian swine berds and identification of a novel variant of swine hepatitis E virus. Clin Diagn Lab Immunol, vol.8:1213-1219)。アメリカ、オーストラリアなどでも、豚の高いＥ型肝炎ウイルス抗体保有率が報告されている(Chandler, J. D., M. A. Riddell, F. Li, R. J. Love, and D. A. Anderson. 1999. Serological evidence for swine hepatitis E virus infection in Australian pig herds. Vet Microbiol, vol.68:95-105; Huang, F. F., G. Haqshenas, D. K. Guenette, P. G. Halbur, S. K. Schommer, F. W. Pierson, T. E. Toth, and X. J. Meng. 2002. Detection by reverse transcription-PCR and genetic characteri zation of field isolates of swine hepatitis E virus from pigs in different geographic regions of the United States. J Clin Microbiol, vol.40:1326-32)。日本での調査では、肥育初期の２〜３ヶ月令の豚でウイルスが検出される傾向が強いが、ほ乳期や6ヶ月令を越えるものからは検出できないと報告されている。このことから、感染後一過性にウイルス血症がおき、抗体出現と共にウイルスが体内から消失されると考えられている。【０００８】
また、ＨＥＶは非土着地域の汚水からも発見され、ＨＥＶの海洋および貝類への汚染も懸念されている(Pina, S., J. Jofre, S. U. Emerson, R. H. Purcell, and R. Girones. 1998. Characterization of a strain of infectious hepatitis E virus isolated from sewage in an area where hepatitis E is not endemic. Appl Environ Microbiol,vol.64:4485-8)。【０００９】
近年のＨＥＶゲノム核酸配列情報の蓄積により、これを基にしたＨＥＶ検出法が様々な研究グループにていくつも構築されてきた。しかしながら、ＨＥＶを、効率的に様々な側面から検出可能な手段が十分に確立されているとはいえず、ＨＥＶの検出の実用化に向けての課題が未だに認められる。
【発明の開示】
【００１０】
本発明者は、ＨＥＶの実用的な検出手段について検討を行い、ＨＥＶの遺伝子の特定の領域において、突然変異株同士であっても非常に高度に保存されている部分と、逆に突然変異の影響が非常に多く顕れる部分が存在しており、当該遺伝子領域をＨＥＶの検出指標とすることで、ＨＥＶを様々な側面から効率的に検出可能なことを見出して本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、検出対象物に対して、配列番号１に示す塩基配列に相応する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列の核酸の検出を行い、当該核酸が検出された場合に、前記検出対象物がＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）陽性であるとする、ウイルスの検出方法（以下、本検出方法ともいう）を提供する発明である。
【００１２】
ＨＥＶの遺伝子型は、現在、ＧＩ〜ＧIV型の４種に分類され、配列番号１に示す塩基配列は、ＨＥＶ（ＧＩ）株である「M73218：Genbank No.」［以下、本株を基準株（プロトタイプ）ということもある］の５２５３〜５４３４ntのｃＤＮＡの塩基配列である。この領域は、ＨＥＶの「ORF２領域とORF３領域が重複した領域」の一部をなす領域である。
【００１３】
本検出方法は、検出対象物中のＨＥＶを検出するにあたって、全ての遺伝子型のＨＥＶにおいて存在する特定の遺伝子領域の塩基配列を検出指標とすることにより、ＨＥＶの遺伝子型の相違を超えた検出と、遺伝子型毎のＨＥＶの検出、の両者を行うことが可能であることを特徴とするウイルスの検出方法である。
【００１４】
なお、本明細書において、ＨＥＶの遺伝子の塩基配列（配列番号１〜４８）における個々の塩基の番号は、図３に示されたGenbank No.に従う。例えば、上記プロトタイプであるM73218株の第５２５３番目の塩基であるグアニン（Ｇ）は、配列番号１の第１番目の塩基であるグアニン（Ｇ）に該当する。
【００１５】
この「全ての遺伝子型のＨＥＶにおいて存在する特定の遺伝子領域の塩基配列」が、本発明に係る「配列番号１に相応する塩基配列」に相当する。すなわち、検出対象物中における、配列番号１に相応する塩基配列の存在、及び／又は、その内容を把握することにより、検出対象物における、ＨＥＶの定性検出、定量検出、さらには、その原因ウイルスの遺伝子型までを把握して、検出対象物提供者の治療方針の確立、ウイルス汚染源の特定等を行うことができる。
【００１６】
上記の「相応する塩基配列」とは、１）ＨＥＶの各株における、プロトタイプの上記配列番号１に相当する配列のことを意味し、さらに、２）当該配列のアンチセンス配列を意味するものとする。また、当該塩基配列を構成する核酸には、オリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチドが含まれるが、これらに限定せず、ペプチド核酸、メチルフォスフォネート核酸、S-オリゴ核酸、モルホリル核酸などの人工合成核酸も含む。
【００１７】
検出対象となる核酸は、配列番号１に相応する塩基配列から選ばれる、少なくとも１０塩基以上連続するオリゴヌクレオチドであることが必要であり、１８０塩基程度を最大限とする。一般的には、１５〜３０塩基程度連続するオリゴヌクレオチドであることが好適である。
【００１８】
また、配列番号１で表される塩基配列（相補鎖を含む）に対する塩基の相違は１０％以内であることが必要である。ＨＥＶの「ORF２領域とORF３領域が重複した領域」における保存領域の全ての遺伝子型間での塩基同士の相違は１０％以内であり、準保存領域（異なる遺伝子型間では保存されているとはいえないが、同一の遺伝子型では十分に保存されている遺伝子領域）における同一遺伝子型のＨＥＶ間の塩基同士の相違も１０％以内に止まっている。
【００１９】
本検出方法の検出対象物としては、生物個体、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ等を含む任意の哺乳動物、あるいは、カキ、アサリ、ハマグリ、シジミ、ムール貝等を含む海産物から採取した、体液、血液、血清、リンパ液、糞便、組織などの生物試料、さらには、海水、河川水、湖水、下水、排水、水道水、井戸水などを含む環境水等が挙げられる。また、食品や食品生産設備においては、食品そのもの、食品生産設備における調理器具等の付着物、食品生産者の衣類等の付着物、それらを拭った紙、布等も検出対象物となり得る。各検出対象物は、必要に応じて、ホモジェネート処理、濃縮処理、抽出処理等、適切な前処理を行うことが可能であり、そうして得た試料も検査対象物とすることが可能である。これらの検出対象物からの遺伝子の入手方法は、用いる検出対象物の種類に応じて適切な方法を選択することが可能であるが、概ね用いる検出対象物を水等に浸漬または懸濁して、これらの水から得られる上清画分から、酸フェノール法(AGPC法:Acid Guanidin Phenol Chroloform method)などの常法により、ウイルスＲＮＡを抽出することにより行うことができる。かかるウイルスＲＮＡに対して、例えば、逆転写酵素を用いたウイルスＲＮＡに相補的なｃＤＮＡの調製などを行い、この核酸試料を直接用いるか、遺伝子増幅用プライマーを用いた遺伝子増幅を行って得た遺伝子増幅産物を用いることができる（所望する遺伝子増幅産物の確認は、一般的には、電気泳動により、目的となる大きさの遺伝子増幅産物が認められるか否かにより行われる）。
【００２０】
遺伝子増幅法としては、例えば、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、SDA(strand displacement amplification)法、NASBA(Nucleic Acid Sequence Based Amplification)法、LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)法等が挙げられる。核酸増幅産物の検出には、電気泳動法、核酸検出用チップ等の電気化学的センサー、水晶振動子を用いる遺伝子センサー、あるいは蛍光標識したプライマー、プローブまたは蛍光インタカレーション剤を用いて、蛍光センサーにより蛍光強度を測定する等により、核酸増幅産物をＨＥＶ由来ゲノム断片として検出することが可能である。また、プローブに蛍光標識、化学修飾、蛋白質修飾、放射性同位体標識等を施し、ドットハイブリダイゼーション、スロットハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション法等により、あるいは各種増幅法と組み合わせ、TaqMan Probe、Molecular Beacon Probe、ハイブリダイゼーションプローブ、LUX (Light Upon eXtension) プライマー等を用いたリアルタイム定量法等による解析にて、ＨＥＶ由来ゲノム断片を検出することが可能である。さらに、インベーダー法など標的遺伝子の増幅を必要としない方法でも、前記のオリゴヌクレオチドを用い、ＨＥＶゲノム断片を検出する事も可能である。
【００２１】
また、本検出方法における目的とする核酸の検出は、核酸同士のハイブリダイズをポジティブ又はネガティブに検出することにより行われることが主であり、その具体的な手法は、公知の検出手法を用いることができる。例えば、ドットハイブリダイゼーション、スロットハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション法等により、あるいは各種増幅法と組み合わせ、タック−マン  プローブ（TaqMan Probe）、モレキュラー  ビーコン  プローブ（Molecular Beacon Probe）、ハイブリダイゼーションプローブ、LUX (Light Upon eXtension) プライマー等を用いたリアルタイム定量法等による解析にて、目的とするＨＥＶ由来ゲノム断片を検出することが可能である。さらに、インベーダー法など標的遺伝子の増幅を必要としない方法でも、目的とするＨＥＶゲノム断片を検出することも可能である。
【００２２】
これらの手法における具体的な必要に応じて、本発明に関する核酸（プローブ、プライマー等として用いる）には、必要な修飾を付加することが可能であり、これらの修飾核酸も、その塩基配列が本発明の範囲内である限り、同様に本発明の範囲内であるとする。付加要素としては、酵素修飾（パーオキシダーゼ等）、蛍光標識（ルシフェリン等）、化学修飾、蛋白質修飾（ビオチン等）、放射線同位元素標識等を例示することができる。
【００２３】
特に、汚染などの危険を回避し、さらに、検出操作に費やす時間を可能な限り短縮するために、遺伝子増幅操作の過程において、遺伝子増幅産物中の特定の塩基配列の存在をモニタリングすることが可能な手段を用いることが好適である。このような方法の代表的なものとして、例えば、上記のモレキュラー  ビーコン  プローブ(Molecular beacon Probe)を用いた検出方法、タック−マン  プローブ(Taq-Man Probe)を用いた検出方法、LUX (Light Upon Extension) プライマーを用いた検出方法等を挙げることができる。
【００２４】
モレキュラー  ビーコン  プローブ(Molecular beacon Probe)を用いた検出方法は、ＰＣＲ法などによる遺伝子増幅産物の形成を、増幅過程中または増幅過程終了後に、蛍光でモニターするために使用できる、ヘアピン型のハイブリダイゼーションプローブ（モレキュラー  ビーコン  プローブ）を用いる遺伝子の検出方法である(Nature Biotechnology 1998 16:49-53)。モレキュラー  ビーコン  プローブを構成する核酸の末端は、互いに相補的になっており、通常は、これらの末端同士が結合して、いわゆるステム構造を形成し、かかるステム構造におけるループ部分は、遺伝子増幅産物の目的とする領域に対して相補的となるように設計されている。さらに、蛍光体と非蛍光の消光剤が、核酸の両端にそれぞれ結合しており、溶液中で遊離しているときは、ヘアピン構造を形成するため、蛍光剤と消光剤はお互いに作用して蛍光は消えている。しかし、核酸に相補的な塩基配列を有する遺伝子増幅産物が存在する場合には、ループ部分が、その相補的な塩基配列に結合し、その結果、プローブ全体の構造が変化して、蛍光体と消光剤が離れて、消光剤の蛍光体に対する消光効果が解消するために、蛍光体が本来の蛍光を発するようになる。この消光効果の解消による蛍光強度の増加は、核酸に相補的な塩基配列を有する遺伝子増幅産物の増加に比例する。そして、この蛍光強度の増加をモニタリングすることにより、遺伝子の増幅過程終了後のみならず、遺伝子の増幅過程においても、目的の塩基配列を検出することができる。つまり、上記の蛍光強度の増加を指標に、検出試料中の標的核酸を検出することができる。
【００２５】
なお、モレキュラー  ビーコン  プローブにおける、上述した蛍光標識と消光剤の標識は、通常、核酸の５’末端に、6-carboxyfluorescein(6-FAM)や6-carboxy-4,7,2',7'-tetrachlorofluorescein(TET)などのフルオレセイン系蛍光色素や、5-carboxytetramethylrhodamine(TAMARA)などのローダミン系蛍光色素を標識し、さらに、同３’末端に、4-(4'-dimethylaminophenylazo)benzoic acid(DABCYL)などの消光剤を標識することにより行うことができる(例えば、Nature Biotechnology 1996 14:303-308など)。
【００２６】
タック−マン  プローブ(Taq-Man Probe)を用いた検出方法は、ＰＣＲ法などによる遺伝子増幅産物の形成を、増幅過程中に、蛍光でモニターするために使用できる、ハイブリダイゼーションプローブ(Taq-Man Probe)を用いる、遺伝子の検出方法である〔実験医学 Vol.15 No.7(増刊)p46〜51,1997など〕。タック−マン  プローブは、５’末端には、フルオレセイン系の蛍光色素（レポーター色素）が、３’末端には、ローダミン系の蛍光色素（クエンチャー色素）が、それぞれ標識された核酸である。レポーター色素とクエンチャー色素が、核酸を介して結合している状態では、ホエルスター(Forster)共鳴エネルギーにより、レポーター色素の蛍光は、クエンチャー色素により抑制されている。これに対して、プライマーおよびタック−マン  プローブが、遺伝子増幅産物のタック−マン  プローブの核酸に相補的な核酸をアニーリングして、伸長反応が進むと、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エンドヌクレアーゼ活性により、タック−マン  プローブの５’末端から加水分解が起こり、５’末端のレポーター色素が、３’末端のクエンチャー色素から離脱すると、抑制されていたレポーター色素の蛍光強度が増加する。レポーター色素による蛍光強度の増加は、核酸に相補的な塩基配列を有する遺伝子増幅産物の増加に比例する。そして、この蛍光強度の増加をモニタリングすることにより、遺伝子の増幅過程終了後のみならず、遺伝子の増幅過程においても、目的の塩基配列を検出することができる。つまり、上記の蛍光強度の増加を指標に、検出試料中の標的核酸を検出することができる。
【００２７】
なお、タック−マン  プローブにおける、上述した蛍光標識は、通常、核酸の５’末端に、６−ＦＡＭやＴＥＴなどのフルオレセイン系の蛍光色素を、同３’末端に、ＴＡＭＡＲＡなどのローダミン系の色素を、常法(例えば、Nucleic Acids Research 1993 21(16):3761-3766など)に従って行うことができる。
【００２８】
LUX (Light Upon Extension) プライマーを用いた検出方法は、PCR法などによる遺伝子増副産物の形成を、増幅過程中の蛍光をモニターすることにより、目的遺伝子の増幅を検出する方法である。LUX プライマーは、3'末端付近に単一フルオロフォアを標識し、5'末端との間でヘアピン構造を取るように設計した核酸である。長さは通常20〜30塩基で、プライマーがヘアピン構造を取っている時は消光能力があり蛍光を発しないが、プライマーが2本鎖PCR産物に取り込まれると、消光が解かれ、蛍光シグナルが増大し、このシグナルの増大を測定することで、増幅した目的の遺伝子産物の定量分析をする(Nazarenko,I.et al. (2002) Nucleic Acids Research 30: e37.)。
【００２９】
上述した全ての検出用核酸プローブ又はプライマーは、後述する本検出用キットの構成要素として用いることができる検出用核酸プローブとして用いることができる。
【００３０】
本検出方法におけるＨＥＶの検出は、目的とする塩基配列を有する遺伝子増幅産物などの検出は、上述した手段により、目的とする核酸を定量して検出することも可能であり、定量を伴わずに、例えば、陽性若しくは陰性という定性情報として検出することも可能である。この遺伝子増幅産物などの検出情報（定量値や定性情報）を指標に、これと検体中のＨＥＶの存在・非存在、さらには存在量と関連付けることによって、ＨＥＶの検出を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＨＥＶゲノムの多様性を調べた結果を示す図面である。
【図２】ＨＥＶゲノムにおける変異の系統を示す図面である。
【図３】本発明において検出領域として用いる、ＨＥＶの遺伝子領域の各株における塩基配列を並列比較した図面である。図３中、第２行目の３つの塩基配列は、左から、配列番号４９、５１及び５７の塩基配列である。図３中第３行目〜第３０行目の塩基配列は、上からそれぞれ、配列番号１、１５、１３、１０、１２、１７、１６、１１、７、８、６、４、３、２、５、９、１４、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８及び５８の塩基配列であり、第３２行目及び第３３行目の塩基配列は、それぞれ、配列番号１８及び５３の塩基配列であり、第３５行目〜第４５行目の塩基配列は、上からそれぞれ、配列番号２１、２７、２６、２５、２４、２８、２３、２２、１９、５６及び５４の塩基配列であり、第４７行目〜第５７行目の塩基配列は、上からそれぞれ、配列番号３７、３１、３２、３６、３３、３４、３５、３０、２９、３８及び５５の塩基配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
ここで、配列番号１に示す塩基配列の意義を明らかにするために、ＨＥＶの遺伝子解析について記載する。【００３３】
ＨＥＶ株の遺伝子型決定
既存のほぼ全長塩基配列が明らかになっている37種のＨＥＶ株(アクセッションナンバーは下記参照)について、全塩基配列をアライメントし近隣結合法による系統樹解析を行い、各株の遺伝子型を既存の分類に従い決定した。【００３４】
＜既存のほぼ全長配列が明らかになっているＨＥＶ株の遺伝子型＞
遺伝子型 I (GI)
M80581（配列番号２）,L25595（配列番号３）, L25547（配列番号４）, M94177（配列番号５）, L08816（配列番号６）, D11092（配列番号７）, D11093（配列番号８）, X98292（配列番号９）, AF185822（配列番号１０）, M73218（配列番号１）, D10330（配列番号１１）, AF459438（配列番号１２）, AF076239（配列番号１３）, X99441（配列番号１４）, AF051830（配列番号１５）, AY230202（配列番号１６）, AY204877（配列番号１７）
遺伝子型 II (GII)
M74506（配列番号１８）
遺伝子型 III (GIII)
AF455784（配列番号１９）, AY115488（配列番号２０）*, AF082843（配列番号２１）*, AF060669（配列番号２２）, AF060668（配列番号２３）, AB089824（配列番号２４）, AB074920（配列番号２５）, AB074918（配列番号２６）, AB073912（配列番号２７）*, AB091394（配列番号２８）
遺伝子型 IV (GIV)
AJ272108（配列番号２９）, AB108537（配列番号３０）, AB074917（配列番号３１）, AB080575（配列番号３２）, AB097811（配列番号３３）*, AB097812（配列番号３４）, AB099347（配列番号３５）, AB091395（配列番号３６）, AB074915（配列番号３７）
* は豚由来、それ以外はヒト由来のＨＥＶ株である。【００３５】
＜オリゴヌクレオチドの作製＞
次に、可能な限り短いＨＥＶの遺伝子の塩基配列内(具体的には、250nt以内程度)に、１）5’-側ＨＥＶ共通プライマー、２）ＨＥＶ共通プローブ、又は、３）各遺伝子型ＨＥＶ特異的プローブ、４）各遺伝子型ＨＥＶ特異的プローブ又は５）ＨＥＶ共通プローブ、６）3’側ＨＥＶ共通プライマー、を設計出来る領域を見出すために、全長ゲノムが判明している37株の塩基配列を用いて、Sliding Window Analysis(Proutski, V., and E. Holmes. 1998. SWAN: sliding window analysis of nucleotide sequence variability. Bioinformatics,vol.14:467-8)を行った(Window size:30, shift:6)(図２)。その結果、ＨＥＶゲノムの中で最もその条件に合致した場所が、図１のグレー(M73218で5250-5440ntに相当)で示す領域に存在し、その範囲はおよそ180ntであることが判明した。これに相当する領域が明らかになっているＨＥＶ株(ほぼ全長塩基配列が明らかになっている37株、及び、部分配列が判明している下記11株)の塩基配列を用いて、遺伝子型毎に配列をアライメントして示した図面が図３である。図３において、白抜きのボックス領域は全ての株に共通の配列を有した領域で、ここに共通プライマー及び共通プローブとなるオリゴヌクレオチドを設計した。また、グレーボックス領域は、各遺伝子型のみに共通の配列を有した領域で、ここに各遺伝子型特異的なプローブとなるオリゴヌクレオチドを設計した。この各遺伝子特異的なプローブを選別する条件としては、「配列番号１に相応する塩基配列の核酸において、少なくとも連続する１４塩基のうち１１塩基が遺伝子型毎に保存され、かつ、他の遺伝子型の相応塩基配列とは５塩基以上が相違する領域」であることとした。設計したオリゴヌクレオチド配列は下記に示した。【００３６】
＜部分塩基配列の分かっている株(11株)＞
AB075971（配列番号３８）, AF051349（配列番号３９）, AF051350（配列番号４０）, AF051351（配列番号４１）, AF051352（配列番号４２）, AF058684（配列番号４３）, AF065061（配列番号４４）, AF124406（配列番号４５）, AF124407（配列番号４６）, M32400（配列番号４７）, U22532（配列番号４８）【００３７】
＜設計したオリゴヌクレオチド＞
ＨＥＶ共通センスプライマー：
(GI_M73218 5257-5276 nt に相当)
HECOM-S プライマー (5’-CGGCGGTGGTTTCTGGRGTG-3’：配列番号４９)
ＨＥＶ共通アンチセンスプライマー：
(GI_M73218 5427-5399 nt に相当)
HECOM-AS プライマー (5’-GGGCGCTKGGMYTGRTCNCGCCAAGNGGA-3’：配列番号５０)
ＨＥＶ共通プローブ：
(GI_M73218 5305-5334 nt に相当)
TP-HECOM プローブ(5’- (FAM)-CCCCYATATTCATCCAACCAACCCCTTYGC-(TAMRA)-3’：配列番号５１)
ＨＥＶ 遺伝子型 I 特異的プローブ:
(GI_M73218 5332-5350 nt に相当)
TP-HEG1 プローブ(5’- (FAM)-CGCCCCSRATGTCACCGCT-(TAMRA)-3’：配列番号５２)
ＨＥＶ 遺伝子型 II 特異的プローブ:
(GI_M73218 5329-5352 nt に相当、かつ、GII_M74506 5229-5332 nt に該当)
TP-HEG2 プローブ(5’- (FAM)-CTTTGCCCCAGACGTTGCCGCTGC-(TAMRA)-3’：配列番号５３)
ＨＥＶ 遺伝子型 III 特異的プローブ:
(GI_M73218 5343-5365 ntに相当、かつ、GIII_AF082843 5367-5389 nt に該当)
TP-HEG3 プローブ(5’- (FAM)-TCGTTTCACAAYCCGGGGCTGGA-(TAMRA)-3’：配列番号５４)
ＨＥＶ 遺伝子型 IV 特異的プローブ:
(GI_M73218 5330-5352 nt に相当、かつ、GIV_AB097811 5371-5393 nt に該当)
TP-HEG4 プローブ(5’- (FAM)-TTCGCATCTGACATWCCARCCGC-(TAMRA)-3’：配列番号５５)【００３８】
＜各遺伝子型スタンダードの作製＞
次に、この領域を有する各遺伝子型のスタンダードコントロールを作製した。GI : M73218の5253-5432 nt に該当、GII：M74506の5223-5402 nt に該当、GIII：AF082843の5277-5456 nt に該当、GVI：AB097811の5294-5473 nt に該当する配列(180nt)を有するプラスミド(pT7Blueベクター)を作製し、ＨＥＶの各遺伝子型のスタンダードとした。【００３９】
［本検出方法における使用態様］
既に述べたように、配列番号４９〜５５に示す塩基配列のオリゴヌクレオチド（相補鎖を含む）において、各塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列のオリゴヌクレオチドは、本発明の範囲内のオリゴヌクレオチドである。このことを前提に、本検出方法における配列番号４９〜５５の使用態様について説明する。【００４０】
（１）遺伝子型を超えてＨＥＶを検出する場合
この場合は、上記の態様では、各遺伝子型のＨＥＶにおいて保存されている保存領域の核酸を検出することが必要であり、上記の例では、配列番号５１のＨＥＶ共通プローブ（当該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列から選ばれる１０塩基以上連続する塩基配列の核酸）に相応する核酸を検出することを意味する。【００４１】
まず、核酸の増幅を行わずにハイブリダイズ反応により、標的核酸を検出する場合には、プローブとして配列番号５１のオリゴヌクレオチドを、検出対象物由来の核酸試料に対してハイブリダイズ反応を行い、当該ハイブリダイズ反応が陽性の場合には、検出対象物においてＨＥＶ陽性（遺伝子型は未確定）とすることが可能である。なお、上記の配列番号５１の塩基配列のオリゴヌクレオチドのプローブには、検出の態様に応じて適切な標識を施すことも可能である。【００４２】
また、検出対象物由来の核酸試料における核酸の増幅物を、核酸のハイブリダイズ反応を行わずに、直接的に電気泳動上に現れる遺伝子断片の分子量等を指標として検出し、目的とする遺伝子領域の増幅物が検出される場合には、検出対象物においてＨＥＶ陽性（遺伝子型は未確定）とすることが可能である。この場合、核酸の増幅反応に用いるプライマーとしては、配列番号４９又は５０のプライマーを用いることが可能であるのは勿論であるが、配列番号５１のプローブとして記載されている配列をプライマーとして用いることも可能である。すなわち、この態様において用い得るプライマーオリゴヌクレオチドの組は、配列番号４９と５０の塩基配列のオリゴヌクレオチドの組、配列番号４９と５１の塩基配列の組、配列番号５０と５１の塩基配列の組が該当する。なお、上記の配列番号４９〜５１の塩基配列のオリゴヌクレオチドのプライマーには、検出の態様に応じて適切な標識を施すことも可能である。【００４３】
さらに、検出対象物由来の核酸試料における核酸の増幅物に対して、核酸のハイブリダイズ反応を行って、当該ハイブリダイズ反応を指標としてＨＥＶを検出する場合には、プローブとして配列番号５１のオリゴヌクレオチドを、検出対象物由来の増幅反応を行った核酸試料に対してハイブリダイズ反応を行い、当該ハイブリダイズ反応が陽性の場合には、検出対象物においてＨＥＶ陽性（遺伝子型は未確定）とすることが可能である。この場合、核酸の増幅反応に用いるプライマーとしては、配列番号４９又は５０のプライマーを用いることが可能であるのは勿論であるが、配列番号５１のオリゴヌクレオチドをプライマーとしても用いることが可能である。すなわち、この態様において用い得るプローブは配列番号５１の塩基配列のオリゴヌクレオチドであり、かつ、プライマー核酸の組は、配列番号４９と５０の塩基配列のオリゴヌクレオチドの組、配列番号４９と５１の塩基配列の組、配列番号５０と５１の塩基配列の組が該当する。なお、上記の配列番号５１のプローブ、及び、配列番号４９〜５１の塩基配列のオリゴヌクレオチドのプライマーには、検出の態様に応じて適切な標識を施すことも可能である。【００４４】
（２）遺伝子型毎にＨＥＶを検出する場合
一方、遺伝子型毎のＨＥＶの検出必要性も、例えば、汚染源の特定を行う場合には極めて重要になる。この場合は、上記のＨＥＶ共通プローブに代えて、ＧＩ〜ＧIVの遺伝子型毎に特異的であり、かつ、同一の遺伝子型内においては保存性の高い塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた個別プローブを用いる。上記の例においては、ＨＥＶ（ＧＩ）が配列番号５２のプローブであり、ＨＥＶ（ＧII）が配列番号５３のプローブであり、ＨＥＶ（ＧIII）が配列番号５４のプローブであり、ＨＥＶ（ＧIV）が配列番号５５のプローブである。【００４５】
まず、核酸の増幅を行わずにハイブリダイズ反応により、標的核酸を検出する場合には、検出目的とするＨＥＶの遺伝子型（ＧＩ〜ＧIV）に応じて、配列番号５２〜５５のオリゴヌクレオチドを個別にプローブとして用い、検出対象物由来の核酸試料に対してハイブリダイズ反応を行い、当該ハイブリダイズ反応が、いずれかの遺伝子型のプローブにおいて陽性の場合には、検出対象物においてＨＥＶが当該遺伝子型において陽性とすることが可能である。なお、上記の配列番号５２〜５５の塩基配列のオリゴヌクレオチドのプローブには、検出の態様に応じて適切な標識を施すことも可能である。【００４６】
また、検出対象物由来の核酸試料における核酸の増幅物を、核酸のハイブリダイズ反応を行わずに、直接的に電気泳動上に現れる遺伝子断片の分子量等を指標として検出し、目的とする遺伝子領域の増幅物が検出される場合には、検出対象物において、検出目的とする遺伝子型のＨＥＶ陽性とすることが可能である。この場合、核酸の増幅反応に用いるプライマーとしては、配列番号４９又は５０と、配列番号５２〜５５のプローブとして記載されているオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることが好適である。すなわち、この態様において用い得るプライマーオリゴヌクレオチドの組は、配列番号４９若しくは５０と配列番号５２の塩基配列のオリゴヌクレオチドの組（ＧＩ）、配列番号４９若しくは５０と配列番号５３の塩基配列のオリゴヌクレオチドの組（ＧII）、配列番号４９若しくは５０と配列番号５４の塩基配列のオリゴヌクレオチドの組（ＧIII）、配列番号４９若しくは５０と配列番号５５の塩基配列のオリゴヌクレオチドの組（ＧVI）が該当する。なお、上記の配列番号４９〜５０、５２〜５５の塩基配列のオリゴヌクレオチドのプライマーには、検出の態様に応じて適切な標識を施すことも可能である。【００４７】
さらに、検出対象物由来の核酸試料における核酸の増幅物に対して、核酸のハイブリダイズ反応を行って、当該ハイブリダイズ反応を指標としてＨＥＶを遺伝子型別に検出する場合には、検出目的とするＨＥＶの遺伝子型に応じ、プローブとして配列番号５２〜５５のオリゴヌクレオチドを用いて、検出対象物由来の増幅反応を行った核酸試料に対してハイブリダイズ反応を行い、当該ハイブリダイズ反応が陽性の場合には、検出対象物において、検出目的とする遺伝子型のＨＥＶ陽性とすることが可能である。この場合、核酸の増幅反応に用いるプライマーとしては、配列番号４９又は５０のプライマーを用いることが可能であるのは勿論であるが、配列番号５２〜５５のオリゴヌクレオチドをプライマーとしても用いることが可能である。すなわち、この態様において用い得るプローブは、検出遺伝子型がＧＩの場合、配列番号５２の塩基配列のオリゴヌクレオチドであり、かつ、プライマー核酸の組は、配列番号４９と５０の塩基配列のオリゴヌクレオチドの組、配列番号４９と５２の塩基配列のオリゴヌクレオチドの組、配列番号５０と５２の塩基配列のオリゴヌクレオチドの組が該当する。また、検出遺伝子型がＧIIの場合、配列番号５３の塩基配列のオリゴヌクレオチドがプローブであり、かつ、プライマー核酸の組は、配列番号４９と５０の塩基配列のオリゴヌクレオチドの組、配列番号４９と５３の塩基配列のオリゴヌクレオチドの組、配列番号５０と５３の塩基配列のオリゴヌクレオチドの組が該当する。また、検出遺伝子型がＧIIIの場合、配列番号５４の塩基配列のオリゴヌクレオチドがプローブであり、かつ、プライマー核酸の組は、配列番号４９と５０の塩基配列のオリゴヌクレオチドの組、配列番号４９と５４の塩基配列のオリゴヌクレオチドの組、配列番号５０と５４の塩基配列のオリゴヌクレオチドの組が該当する。また、検出遺伝子型がＧIVの場合、配列番号５５の塩基配列のオリゴヌクレオチドがプローブであり、かつ、プライマー核酸の組は、配列番号４９と５０の塩基配列のオリゴヌクレオチドの組、配列番号４９と５５の塩基配列のオリゴヌクレオチドの組、配列番号５０と５５の塩基配列のオリゴヌクレオチドの組が該当する。【００４８】
〔本検出用キット〕
本発明は、本検出方法を行うための、検出用キット（本検出用キット）を提供する発明でもある。【００４９】
本検出用キットには、ＨＥＶの配列番号１の塩基配列に相応する塩基配列の全体又は一部を増幅するための、１）増幅用プライマー［前記の例において、典型的には、配列番号４９〜５０の塩基配列のオリゴヌクレオチド、ただし、配列番号５１の共通プローブとして示されているオリゴヌクレオチド（遺伝子型を超えた検出を行う場合）や、配列番号５２〜５５の特異的プローブとして示されているオリゴヌクレオチド（遺伝子型毎の検出を行う場合）も、プライマーとして用い得ることは、前述した通りである］、又は、２）検出対象とする特定のＨＥＶの核酸にハイブリダイズさせて、当該核酸を検出するためのプローブ（遺伝子型を超えた検出をする場合は、配列番号５１の共通プローブ、遺伝子型毎の検出をする場合には、配列番号５２〜５５の特異的プローブ）が、具体的な検出手法に応じて含まれる。【００５０】
これに加えて、例えば、検出に用いる具体的な物、例えば、核酸検出用の器具（ＤＮＡチップ、複数のウエルが設けられている基盤）、用いる検出手法において用いる試薬、標識物質、酵素等と組み合わせて、さらには、反応容器、反応緩衝液等、必要な試薬類を組み合わせて、キットを形成してもよい。しかしながら、本検出用キットは、以上のような組み合わせに限定されるものでなく、必要に応じて種々のものと組み合わせて提供され得るものである。【００５１】
最も典型的と考えられる、本検出用キットは、以下のような最小限の構成をとるものである。【００５２】
１）配列番号４９に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列の核酸と、配列番号５０に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列の核酸、からなるＨＥＶ遺伝子増幅用プライマーセット。【００５３】
２）配列番号５１に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列を有するプローブ核酸、及び／又は、配列番号５２〜５５に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列を有するプローブ核酸セット。
【実施例】
【００５４】
以下、本発明の実施例を記載するが、本発明の範囲は、この実施例により制限されるべきものではない。【００５５】
［ＨＥＶ共通プローブを用いた検出法］
各遺伝子型のスタンダードを用いて、共通プローブを用いた検出法ついて検討した。まず、配列番号４９のＨＥＶ共通センスプライマー、配列番号５０のＨＥＶ共通アンチセンスプライマーのセットおよび配列番号５１のＨＥＶ共通プローブを用いて、各遺伝子型スタンダードに対する検出感度を求めた。具体的には、TaqMan Universal Buffer Kit (ABI, USA)を用い、反応液(Buffer 25μl, HECOM-S プライマー 500nM、HECOM-AS プライマー500nM、TP-HECOM プローブ5〜20pmol、各スタンダード DNA ５〜５×107copy、全量50μlになるよう滅菌蒸留水で調整)を調製し、ABI7900(ABI, USA)で、PCR反応時(PCRサイクルは、50℃ 2分間 → 95℃ 10分間 → (95℃ 15秒間 → 56℃ 1分間) x 50 サイクル)の蛍光強度を経時的に測定した。なお、スタンダード DNA は遺伝子型毎に別々に用意した。その結果、全ての遺伝子型スタンダード DNAは５copy/反応より検出が可能であり、またCt値(threshold cycle number)を参照することで、遺伝子型に関係なく全ての遺伝子型のＨＥＶ スタンダードが定量的に検出可能であることが明らかとなった。【００５６】
［ＨＥＶ各遺伝子型特異的プローブを用いた検出法の検討］
各遺伝子型のスタンダードを用いて、各遺伝子型特異的プローブを用いた検出法ついて検討した。まず、配列番号４９のＨＥＶ共通センスプライマー、配列番号５０のＨＥＶ共通アンチセンスプライマーのセット、および、配列番号５２〜５５のＨＥＶ各遺伝子型特異的プローブを個別に用いて、各遺伝子型スタンダードに対する検出感度を求めた。具体的には、TaqMan Universal Buffer Kit (ABI, USA)を用い、反応液(Buffer 25μl, HECOM-S プライマー 500nM、HECOM-AS プライマー 500nM、TP-HEG1(TP-HEG2, TP-HEG3またはTP-HEG4) プローブ5〜20pmol、各スタンダード DNA ５〜５×107copy、全量50μlになるよう滅菌蒸留水で調整)を調製し、ABI7900(ABI, USA)で、PCR反応時(PCRサイクルは、50℃ 2分間 → 95℃ 10分間 → (95℃ 15秒間 → 56℃ 1分間) x 50 サイクル)の蛍光強度を経時的に測定した。なお、スタンダード DNA は遺伝子型毎に別々に用意した。その結果、遺伝子型特異的プローブにTP-HEG1を用いた場合は、遺伝子型GIのスタンダードのみを、TP-HEG2を用いた場合は、遺伝子型GIIのスタンダードのみを、TP-HEG3を用いた場合は、遺伝子型GIIIのスタンダードのみを、TP-HEG4を用いた場合は、遺伝子型GIVのスタンダードのみを特異的に認識し(それぞれ他の遺伝子型スタンダードには交差反応しない)、それぞれ遺伝子型特異的にスタンダード ５copy/反応より検出が可能であり、Ct値(threshold cycle number)を参照することで、各遺伝子型のＨＥＶ スタンダードが定量的に検出可能であることが明らかになった。【００５７】
すなわち、プローブとして、配列番号５１のＨＥＶ共通プローブを用いた場合は、遺伝子型に関係なく全てのＨＥＶの高感度定量的検出が可能になる。また、プローブとして、配列番号５２の特異的プローブTP-HEG1を用いた場合はGI ＨＥＶのみ、プローブとして、配列番号５３の特異的プローブTP-HEG2を用いた場合はGII ＨＥＶのみ、プローブとして、配列番号５４の特異的プローブTP-HEG3を用いた場合はGIII ＨＥＶのみ、プローブとして、配列番号５５の特異的プローブTP-HEG4を用いた場合はGIV ＨＥＶのみを定量的に検出することができることが、上記の実施例により実証された。この場合、用いたプローブが認識する遺伝子型以外には全く反応しないので、それぞれ遺伝子型特異的に高感度定量的検出が可能となる。なお、全ての反応で用いたプライマーセット(HECOM-S、HECOM-AS)は共通である。【００５８】
［ニホンザルＨＥＶ感染モデルより得られた糞便及び血清検体を用いた検討］
1998年にインドでE型肝炎に罹患した患者の糞便より、感染性ＨＥＶを調製し、ニホンザルにそれを静脈注射した。ＨＥＶに感染10日後の糞便、ＨＥＶ感染前の血清およびＨＥＶ感染10日以降60日までのシリーズ血清(最初の感染後10〜30日間は約5日ごとに合計6ポイント、残りの31〜60日間は約8日ごとに計4ポイント)を採取し、本方法を用いたＨＥＶの検出を行った。まず、糞便検体は10％(w/v)になるように10mM Phosphate buffered saline (PBS)にて調製した。糞便検体、血清検体からのＲＮＡの抽出はQIA Viral ＲＮＡ Kit (QIAGEN, USA)により行った。次に各ＲＮＡ試料について逆転写反応を行った。逆転写反応は各ＲＮＡ試料(8μl)と、逆転写反応液12μl (10ｍＭ dNTP 溶液 1μl、75pmolのrandom hexamer、3 0unitsのＲＮＡsin(Promega, USA)、200unitsのSuperScript II ＲＮＡseH(-)Reverse-transcriptase (Invitrogen, USA)、100mM DTT 1μl および5倍逆転写バッファー(250mM Tris-Hcl(pH8.3)、375mM KCl、15mM MgCl2)で全量が12μlとなるように、滅菌蒸留水で希釈)を混合し、42℃ 1時間以上反応させた後、酵素失活を99℃ 5分間行うことにより、各ＲＮＡ試料に対するcDNA(RT Products)を調製した。PCR反応はTaqMan Universal Buffer Kit (ABI, USA)を用い、反応液(Buffer 25μl, HECOM-S プライマー 500nM、HECOM-AS プライマー 500nM、TP-HECOM プローブ5〜20pmol、全量45μlになるよう滅菌蒸留水で調整)に5μlのRT Productsを混合し、先述した条件にてPCR反応時の蛍光強度を経時的に測定した。その結果、糞便および感染後10〜30日間の6ポイントで、ＨＥＶが検出され、ＨＥＶ感染前の血清および感染後31日以降の血清からは検出されなかった。この結果は他の領域でのnested-PCRの結果（Li, T. C., Y. Suzaki, Y. Ami, T. N. Dhole, T. Miyamura, and N. Takeda. 2004. Protection of cynomolgus monkeys against HEV infection by oral administration of recombinant hepatitis E virus-like particles. Vaccine,vol.22:370-7)と同様で、ＨＥＶウイルス血症期間中の血清から、あるいは糞便から、非常に高感度かつ特異的なＨＥＶ検出が可能であることが明らかとなった。なお、各遺伝子型特異的プローブを用いた場合、反応液(Buffer 25μl, HECOM-S プライマー 500nM、HECOM-AS プライマー 500nM、（TP-HEG1,TP-HEG2, TP-HEG3またはTP-HEG4)プローブ5〜20pmol、RT Products 2μl 全量50μlになるよう滅菌蒸留水で調整)を調製し、先述した条件にてPCR反応時の蛍光強度を経時的に測定した結果、各検体は全てTP-HEG1プローブを用いた時にしか反応しなかった。すなわち、これらのＨＥＶの遺伝子型は全てGIと判定された。【００５９】
［完全長GIおよびGIV ＨＥＶ ゲノム配列を有するプラスミドを用いた検討］
前述した、各遺伝子型スタンダードより長い配列を用いて、配列が長くても本検出系で正しくＨＥＶを検出できるのか否か、また、遺伝子型特異的に検出できるか否かの検討を行った。完全長GIおよびGIV ＨＥＶゲノム配列を有するプラスミドを用いて本検出方法を検討した結果、どちらも共通プローブTP-HECOM を用いた場合は定量的に５copy/反応から検出可能であった。また遺伝子型特異的検出では、GIプラスミドには、ＨＥＶ 遺伝子型 I 特異的プローブであるTP-HEG1に、GIVプラスミドにはＨＥＶ 遺伝子型 IV 特異的プローブであるTP-HEG4を用いた場合しか反応せず、この場合もそれぞれの遺伝子型特異的、かつ、５copy/反応より定量的に検出可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明により、包括的あるいは選択的なＨＥＶ高感度検出系の確立が可能である。本発明のＨＥＶ検出法は、輸血用血液、血液製剤、食品、環境検査等にも使用可能であり、また、ゲノタイプ特異的検出系は感染ルートの解明、疫学研究などに用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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