(57)【要約】【課題】NFATc1の発現を抑制する抑制物質、また、NFATc1の発現に起因する破骨細胞の分化を抑制する分化抑制物質又は活性化を抑制する活性化抑制物質、さらに、NFATc1の発現に起因する疾患を改善することができる改善物質を提供すること。【解決手段】下記式(1)2006022234.tif 000019（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基である。）で表される化合物は、NFATc1の発現を抑制することができる。従って、上記式(1)で表される化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する物質は、NFATc1の発現に起因する破骨細胞の分化又は活性化を抑制することができ、また、NFATc1の発現に起因する疾患を改善することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するNFATc1の発現を抑制する発現抑制剤。
2006022234.tif 000011
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基である。）
【請求項２】
前記化合物が下記の式（２）であることを特徴とする請求項１に記載の発現抑制剤。
2006022234.tif 000012
【請求項３】
NFATc1の発現を抑制することにより、破骨細胞の分化を抑制する分化抑制剤であって、下記式（１）で表される化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする分化抑制剤。
2006022234.tif 000013
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基である。）
【請求項４】
前記化合物が下記の式（２）であることを特徴とする請求項３に記載の分化抑制剤。
2006022234.tif 000014
【請求項５】
NFATc1の発現を抑制することにより、破骨細胞の活性化を抑制する活性化抑制剤であって、下記式（１）で表される化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする活性化抑制剤。
2006022234.tif 000015
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基である。）
【請求項６】
前記化合物が下記の式（２）であることを特徴とする請求項５に記載の活性化抑制剤。
2006022234.tif 000016
【請求項７】
NFATc1の発現を抑制することによりNFATc1の発現に起因する疾患を改善する医薬組成物であって、下記式（１）で表される化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物。
2006022234.tif 000017
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基である。）
【請求項８】
前記化合物が下記の式（２）であることを特徴とする請求項７に記載の医薬組成物。
2006022234.tif 000018
【請求項９】
前記NFATc1の発現に起因する疾患が、破骨細胞分化に起因する疾患であることを特徴とする請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記NFATc1の発現に起因する疾患が、破骨細胞の活性化に起因する疾患であることを特徴とする請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記NFATc1の発現に起因する疾患が、リウマチ、骨腫瘍、歯周病、及び骨粗鬆症からなるグループから選ばれるいずれかの疾患であることを特徴とする請求項７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、NFATc1発現抑制剤、破骨細胞の分化又は活性化の抑制剤、及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫性関節炎（関節リウマチなど）、歯周病、骨粗鬆症、パジェット病、骨腫瘍（多発性骨髄腫など）などの疾患は、破骨細胞の過剰な分化や活性化により骨破壊が生じることにより発症することが知られている。【０００３】
破骨細胞は、分化の最終段階で多核化する。この多核化は、造血幹細胞から分化した破骨細胞前駆細胞（単球やマクロファージなど）が、骨芽細胞から産生されるRANKL（receptor activator of  NF-κB ligand）の作用により起こると考えられている。近年、RANKLの下流にあるNFATc1（Nuclear Factor Activated T-cell c1）が破骨細胞の分化を決定づける転写因子として同定され、この遺伝子を欠損した造血幹細胞においては、RANKLの刺激により破骨細胞への分化が起こらないことが明らかとなっている（Dev. Cell 3, 889-901, 2002参照）。そのため、NFATc1の発現を抑制することができれば、破骨細胞への分化、増殖、活性化を抑制することができ、上記疾患の改善につながると考えられており、NFATc1の発現を抑制する物質の開発が求められている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、NFATc1の発現を抑制する発現抑制物質、NFATc1の発現に起因する破骨細胞の分化を抑制する分化抑制物質又は破骨細胞の活性化を抑制する活性化抑制物質、さらに、NFATc1の発現に起因する疾患を改善することができる医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
破骨細胞の分化過程において、骨芽細胞上に発現するRANKLが、破骨細胞前駆細胞上のRANKと相互作用し、破骨細胞前駆細胞にシグナルを伝達してNF-κBの活性化を誘導することが知られており、NF-κBの転写活性を抑制することができれば、破骨細胞の分化や活性化を抑制することができると考えられている。また、近年においては、NF-κBの遺伝子欠損マウスが、大理石骨病の病体を示すことが明らかになっており、NF-κBが破骨細胞の分化に必須の因子であると考えられている。【０００６】
そこで、本発明者らは、NF-κBの活性化阻害剤である下記式(2)で表される化合物（以下、「(-)-DHMEQ」と称する場合がある。）を用いて、破骨細胞への分化を抑制することができるかどうかを調べるために、マウスマクロファージ様細胞株RAW264.7をRANKLによって破骨細胞へと分化させる際、又はM-CSF（マクロファージコロニー刺激因子）で誘導した骨髄由来のマクロファージをRANKLによって破骨細胞へと分化させる際に(-)-DHMEQで処理し、破骨細胞の分化に対する(-)-DHMEQの影響を調べた。
【化１】
2006022234.tif 000002
【０００７】
その結果、(-)-DHMEQは濃度依存的に破骨細胞の分化を抑制することがわかった。また、(-)-DHMEQの細胞増殖に対する影響を調べたところ、破骨細胞分化を抑制する濃度において、細胞増殖を阻害することはなかった。【０００８】
近年、RANKLによって誘導される破骨細胞の分化において、c-Fos、TRAF6、NFATc1などのタンパク質の発現上昇が重要であることが知られている。そこで、本発明者らは、(-)-DHMEQで破骨細胞を処理することにより、これらのタンパク質の発現が変化するかどうかを調べた。その結果、(-)-DHMEQで処理することにより、(-)-DHMEQの濃度依存的にRANKL によるNFATc1の発現が減少することを見出した。【０００９】
また、本発明者らは、破骨細胞による骨吸収活性を(-)-DHMEQにより抑制することができるかどうかを調べるために、RANKLによって骨髄由来のマクロファージから分化誘導させた破骨細胞に対する(-)-DHMEQの影響を調べた。その結果、(-)-DHMEQは濃度依存的に破骨細胞の活性化を抑制することが明らかになった。以上のことから、(-)-DHMEQは、NFATc1の発現を抑制することで、破骨細胞の分化や活性化を抑制することが示唆された。従って、(-)-DHMEQは、NFATc1の発現に起因する疾患や、NFATc1の発現により分化した破骨細胞や、破骨細胞の活性化により引き起こされる疾患などの改善に有用であると考えられる。【００１０】
また、本発明者らは、破骨細胞による骨破壊が生じる脊椎動物に対して(-)-DHMEQが破骨細胞の分化を抑制し、骨破壊を抑制することを見出した。このようにして、本発明者らは本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明に係るNFATc1の発現を抑制する発現抑制剤は、下記式(1)で表される化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する。
【化２】
2006022234.tif 000003
【００１２】
式(1)中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、例えば、アセチル基、プロピオニル基、若しくはブタノイル基、又はこれらの異性体基などである。なお、前記化合物は、上述の式(2)で表される化合物であることが好ましく、実質的にL体(+)の化合物を含有しないものが特に好ましい。【００１３】
また、本発明に係る分化抑制剤は、NFATc1の発現を抑制することにより、破骨細胞の分化を抑制する分化抑制剤であって、上述の式(1)で表される化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する。式(1)中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、例えば、アセチル基、プロピオニル基、若しくはブタノイル基、又はこれらの異性体基などである。なお、前記化合物は、上述の式(2)で表される化合物であることが好ましく、実質的にL体(+)の化合物を含有しないものが特に好ましい。【００１４】
さらに、本発明に係る活性化抑制剤は、NFATc1の発現を抑制することにより、破骨細胞の活性化を抑制する活性化抑制剤であって、上述の式(1)で表される化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する。式(1)中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、例えば、アセチル基、プロピオニル基、若しくはブタノイル基、又はこれらの異性体基などである。なお、前記化合物は、上述の式(2)で表される化合物であることが好ましく、実質的にL体(+)の化合物を含有しないものが特に好ましい。【００１５】
また、本発明に係る医薬組成物は、NFATc1の発現を抑制することによりNFATc1の発現に起因する疾患を改善（予防、治療、進行抑制などを含む。）する医薬組成物であって、上述の式(1)で表される化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する。式(1)中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、例えば、アセチル基、プロピオニル基、若しくはブタノイル基、又はこれらの異性体基などである。なお、前記化合物は、上述の式(2)で表される化合物であることが好ましく、実質的にL体(+)の化合物を含有しないものが特に好ましい。また、前記NFATc1の発現に起因する疾患としては、例えば、破骨細胞分化に起因する疾患、破骨細胞の活性化に起因する疾患などである。より具体的には、リウマチ、骨腫瘍、歯周病、骨粗鬆症などを挙げることができる。【００１６】
本発明に係るNFATc1の発現を抑制する方法は、上述の式(1)で表される化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する組成物を破骨細胞前駆細胞（例えば、単球、マクロファージなど）又は破骨細胞に接触させることを含有する。式(1)中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、例えば、アセチル基、プロピオニル基、若しくはブタノイル基、又はこれらの異性体基などである。なお、前記化合物は、上述の式(2)で表される化合物であることが好ましく、実質的にL体(+)の化合物を含有しないものが特に好ましい。【００１７】
また、本発明に係る分化抑制方法は、NFATc1の発現を抑制することにより、破骨細胞の分化を抑制する方法であって、上述の式(1)で表される化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する組成物を破骨細胞前駆細胞（例えば、単球、マクロファージなど）に接触させることを含有する。式(1)中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、例えば、アセチル基、プロピオニル基、若しくはブタノイル基、又はこれらの異性体基などである。なお、前記化合物は、上述の式(2)で表される化合物であることが好ましく、実質的にL体(+)の化合物を含有しないものが特に好ましい。【００１８】
さらに、本発明に係る活性化抑制方法は、NFATc1の発現を抑制することにより、破骨細胞の活性化を抑制する方法であって、上述の式(1)で表される化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する組成物を破骨細胞に接触させることを含有する。式(1)中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、例えば、アセチル基、プロピオニル基、若しくはブタノイル基、又はこれらの異性体基などである。なお、前記化合物は、上述の式(2)で表される化合物であることが好ましく、実質的にL体(+)の化合物を含有しないものが特に好ましい。【００１９】
また、NFATc1の発現に起因する疾患の改善（予防、治療、進行抑制などを含む。）方法は、NFATc1の発現を抑制することによりNFATc1の発現に起因する疾患を改善する方法であって、上述の式(1)で表される化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する組成物をヒト又はヒト以外の脊椎動物（例えば、マウス、ラットなど）に投与することを含有する。式(1)中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、例えば、アセチル基、プロピオニル基、若しくはブタノイル基、又はこれらの異性体基などである。なお、前記化合物は、上述の式(2)で表される化合物であることが好ましく、実質的にL体(+)の化合物を含有しないものが特に好ましい。また、前記NFATc1の発現に起因する疾患としては、例えば、破骨細胞分化に起因する疾患、破骨細胞の活性化に起因する疾患などである。より具体的には、リウマチ、骨腫瘍、歯周病、骨粗鬆症などを挙げることができる。【００２０】
関連文献とのクロスリファレンス
本願は、2004年8月23日付けで出願した日本国特願2004-242866号に基づく優先権を主張する。この文献を本明細書に援用する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の一実施例において、(-)-DHMEQが、RANKLによって誘導されるRAW264.7細胞から多核細胞（破骨細胞）への分化を抑制する結果を示す図である。
【図２】本発明の一実施例において、(-)-DHMEQが、RANKLによって誘導されるRAW264.7細胞から多核細胞（破骨細胞）への分化を抑制する結果を示す図である。
【図３】本発明の一実施例において、(-)-DHMEQが、RANKLによって誘導される骨髄由来のマクロファージから多核細胞（破骨細胞）への分化を抑制する結果を示す図である。
【図４】本発明の一実施例において、(-)-DHMEQが、RANKLによって誘導される骨髄由来のマクロファージから多核細胞（破骨細胞）への分化を抑制する結果を示す図である。
【図５】本発明の一実施例において、RANKLにより分化誘導した破骨細胞において発現するc-Fos、TRAF6、及びNFATc1などのタンパク質に対する(-)-DHMEQの影響をウエスタンブロット法により調べた結果を示す図である。
【図６】本発明の一実施例において、RANKLにより分化誘導した破骨細胞において発現するc-Fos、TRAF6、及びNFATc1などのタンパク質に対する(-)-DHMEQの影響を免疫蛍光測定法により調べた結果を示す図である。
【図７】本発明の一実施例において、(-)-DHMEQが、分化した破骨細胞の骨吸収活性を抑制する結果を示す図である。
【図８】本発明の一実施例において、破骨細胞による骨破壊が生じる脊椎動物に対して(-)-DHMEQの効果を調べた結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。【００２３】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。【００２４】
上述したように、(-)-DHMEQは、NFATc1の発現を抑制する作用を有することが明らかになった。また、(-)-DHMEQは、NFATc1の発現によって誘導される破骨細胞の分化を抑制すること、NFATc1の発現によって生じる破骨細胞の活性化を抑制すること、及び破骨細胞の分化を誘導し、骨破壊を起こす脊椎動物に対して破骨細胞の分化を抑制し、骨破壊を抑制することが明らかになった。【００２５】
以上のことから、(-)-DHMEQを用いることにより、NFATc1の発現に起因する疾患、NFATc1の発現によって誘導される破骨細胞の分化に起因する疾患、NFATc1の発現によって生じる破骨細胞の活性化に起因する疾患などの改善（予防、治療、進行抑制などを含む。）を行うことが可能であると考えられる。なお、上記疾患としては、例えば、リウマチ（関節リウマチ）、骨腫瘍（例えば、多発性骨髄腫やがんによる骨転移など）、歯周病、及び骨粗鬆症などが挙げられる。【００２６】
また、 (-)-DHMEQのラセミ体である下記式（1a）で表される化合物（以下、「(±)-DHMEQ」と称する場合がある。）、又はそれに類似する化合物を含む一般式(Ｉ)で表される化合物や、それらの塩も(-)-DHMEQと同様の作用を有し、NFATc1の発現に起因する疾患、NFATc1の発現によって誘導される破骨細胞の分化に起因する疾患、NFATc1の発現によって生じる破骨細胞の活性化に起因する疾患などの改善に有用であると考えられる。なお、本発明に係るNFATc1発現抑制剤、破骨細胞の分化又は活性化の抑制剤、及び医薬組成物において有効成分として含有させる化合物は、(±)-DHMEQであることが好ましく、(-)-DHMEQであることが特に好ましく、実質的に(+)-DHMEQを含有しないものが最も好ましい。また、一般式(Ｉ)で表される化合物は、例えば、第４級アンモニウム塩などの有機塩、あるいはアルカリ金属などの金属塩などの塩を有する形態としてもよい。このような化合物の塩は、公知の方法で製造することができる。
【化３】
2006022234.tif 000004
【化４】
2006022234.tif 000005
【００２７】
式(Ｉ)中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基、及びブタノイル基、並びにこれらの異性体基が挙げられる。Ｒ２は下記の式(A)から(G)のいずれかで表される基である。
【化５】
2006022234.tif 000006
【００２８】
式(D)、(E)及び(G)中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基であり、アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基およびこれらの異性体基が挙げられる。【００２９】
本発明に係る医薬組成物を脊椎動物（特にヒト）に投与する場合には、一般式(Ｉ)で表される化合物又はその薬理学的に許容される塩を、例えば、2〜12 mg/kg（体重）の投与量で投与できるようにすればよいが、その投与量や投与回数は、症状、年齢、体重、治療効果などにより適宜変更してもよい。【００３０】
＝＝一般式(Ｉ)で表される化合物の製造方法＝＝
以下、一般式(Ｉ)で表される化合物の製造方法について説明する。一般式(Ｉ)で表される化合物は、wipfらの合成法（Synthesis, 12号, 1549-561頁, 1995年）に準じて製造することができる。【００３１】
一般式(Ｉ)で表される化合物は、例えば、下記の反応工程式に基づいて製造することができる。【００３２】
下記の反応工程式において、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基、及びブタノイル基、並びにこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基であり、アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基およびこれらの異性体基が挙げられ、メチル基、エチル基が好ましく、メチル基が特に好ましい。また、Ｘはハロゲン原子であり、ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素原子が挙げられ、塩素原子、臭素原子が好ましく、塩素原子が特に好ましい。
【化６】
2006022234.tif 000007
【００３３】
工程(ａ)：Ｎ−（２−アルカノイルオキシベンゾイル）−２，５−ジメトキシアニリンの調製
２，５−ジメトキシアニリンを溶媒（例えば、ピリジンなど）に溶解させ、−７８〜５０℃、好ましくは氷冷下で、式(3)のＯ−アルカノイルサリチロイルハライドの酢酸エチル溶液を加えて、攪拌しながら反応させる。水を加えて反応を停止させた後、酢酸エチルを加え、塩酸、水、重曹水、水で順次洗浄し、乾燥後、減圧濃縮、及び真空乾燥することにより式(4)で示されるＮ−（２−アルカノイルオキシベンゾイル）−２，５−ジメトキシアニリンが得られる。この化合物は精製せず、次の工程に使用できる。【００３４】
工程(ｂ)：３−（Ｏ−アルカノイルサリチロイルアミド）−４，４−ジアルコキシ−２，５−シクロヘキサジエノンの調製
上記で得られた式(4)の化合物をＲ３ＯＨ（例えば、メタノール、エタノールなど）に溶解させ、−２０〜５０℃、好ましくは氷冷下で、ジアセトキシヨードベンゼンを加え、室温で攪拌しながら反応させる。減圧濃縮後、酢酸エチルを加え、重曹水、食塩水で順次洗浄し、酢酸エチル層を減圧濃縮して得られた残渣をカラムクロマトグラフィーにて精製することにより、式(5)で示される３−（Ｏ−アルカノイルサリチロイルアミド）−４，４−ジアルコキシ−２，５−シクロヘキサジエノンが得られる。【００３５】
工程(ｃ)：５，６−エポキシ−４，４−ジアルコキシ−３−アルカノイルサリチロイルアミド−２−シクロヘキセノンの調製
式(5)の化合物を溶剤（例えば、テトラヒドロフラン、メタノールなど）に溶解させ、−２０〜５０℃、好ましくは氷冷下で、過酸化水素水及び水酸化ナトリウムを加え、攪拌しながら反応させる。反応液に酢酸エチルを加え、塩酸溶液、チオ硫酸ナトリウム水溶液、食塩水で順次洗浄し、大気中で乾燥した後、真空乾燥する。残存する原料化合物を除去するため、残渣をアセトンに溶解させ、ｐ−トルエンスルホン酸を加え、室温で攪拌して原料化合物を分解する。溶剤を減圧留去して得られた残渣に酢酸エチルを加え、水で洗浄する。酢酸エチル層を乾燥して得られた残留物をカラムクロマトグラフィーで精製して、式(6)で示される５，６−エポキシ−４，４−ジアルコキシ−３−アルカノイルサリチロイルアミド−２−シクロヘキセノンが得られる。【００３６】
工程(ｄ)：５，６−エポキシ−２−アルカノイルサリチロイルアミド−２−シクロヘキセン−１，４−ジオンの調製
式(6)の化合物を溶剤（例えば、塩化メチレンなど）に溶解させ、氷冷下で無機酸または有機酸（例えば、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体など）を加え、攪拌しながら反応させる。反応液に溶剤（例えば、酢酸エチルなど）を加え、水で洗浄し、溶剤層を濃縮した後、得られた残渣をメタノールで洗浄して式(7)で示される５，６−エポキシ−２−アルカノイルサリチロイルアミド−２−シクロヘキセン−１，４−ジオンが得られる。【００３７】
工程(ｅ)：５，６−エポキシ−４−ヒドロキシ−３−アルカノイルサリチロイルアミド−２−シクロヘキセノンの調製
式(7)の化合物を、溶媒（例えば、メタノール、エタノール、ＴＨＦなど）に懸濁し、−７８〜５０℃、好ましくは氷冷下で、還元剤（例えば、水素化ホウ素ナトリウムなど）を加えて反応させる。反応液に溶剤（例えば、酢酸エチル、塩化メチレンなど）を加え、塩酸、水で順次洗浄し、溶剤層を乾燥後、減圧濃縮して、メタノールで懸濁、攪拌、洗浄して、式(1)で示される５，６−エポキシ−４−ヒドロキシ−３−アルカノイルサリチロイルアミド−２−シクロヘキセノンが得られる。【００３８】
工程(ｆ)：３，３−ジアルコキシ−４，５−エポキシ−６−ヒドロキシ−２−アルカノイルサリチロイルアミドシクロヘキセンの調製
式(6)の化合物をメタノールなどの溶剤と重曹水混合溶媒に溶解し、−７８〜５０℃、好ましくは氷冷下で、還元剤（例えば、水素化ホウ素ナトリウムなど）を加え、攪拌しながら反応させる。反応液に溶剤（例えば、酢酸エチルなど）を加え、塩酸、水で順次洗浄し、溶剤層を乾燥後、減圧濃縮、真空乾燥し、カラムクロマトグラフィーなどで精製して、式(8)で示される３，３−ジアルコキシ−４，５−エポキシ−６−ヒドロキシ−２−アルカノイルサリチロイルアミドシクロヘキセンを得る。【００３９】
工程(ｇ)：５，６−エポキシ−４−ヒドロキシ−２−アルカノイルサリチロイルアミド−２−シクロヘキセノンの調製
式(8)の化合物を溶剤（例えば、アセトンなど）に溶解させ、ｐ−トルエンスルホン酸を加え、室温で攪拌しながら反応させる。反応液に溶剤（例えば、酢酸エチルなど）を加え、水で洗浄し、溶剤層を乾燥し、減圧濃縮して、精製して、式(9)の５，６−エポキシ−４−ヒドロキシ−２−アルカノイルサリチロイルアミド−２−シクロヘキセノンを得ることができる。【００４０】
なお、式(3)のＯ−アルカノイルサリチロイルハライドとして、Ｏ−アセチルサリチロイルクロリドを用い、工程(ｂ)において式(4)の化合物を溶解させる溶媒として、メタノールを用いることにより、上述の(±)-DHMEQ及び下記式(1b)で表される化合物を製造することができる。
【化７】
2006022234.tif 000008
【００４１】
＝＝式(2)で表される化合物の調製＝＝
近年、本発明者らは、(±)-DHMEQより(-)-DHMEQの方がより優れたNF-κBの活性化阻害作用を有することを見出している。従って、(-)-DHMEQは(±)-DHMEQより優れたNFATc1発現抑制作用や、破骨細胞の分化や活性化の抑制作用を有すると考えられる。また、(-)-DHMEQは、(±)-DHMEQより副作用が少ないことも期待できる。以下(-)-DHMEQ（式(2)）の調製について説明する。【００４２】
式(2)で表される化合物は、下記の反応式に示すように、(±)-DHMEQ（式(1a)）のフェノール性水酸基を一旦シリル基で保護し、その化合物(10)をキラルカラムにより式(11)で表される化合物と式(12)で表される化合物とに分割し、次いで式(11)で表される化合物を脱保護することにより式(2)で表される化合物（(-)-DHMEQ）を得ることができる（Bioorg. Med. Chem. Lett. 10, 865-869, 2000）。なお、式(12)で表される化合物も上記と同様に脱保護することにより式(13)で表される化合物（(+)-DHMEQ）を得ることも可能である。
【化８】
2006022234.tif 000009
【００４３】
また、式(2)で表される化合物（(-)-DHMEQ：D体のDHMEQ）と式(13)で表される化合物（(+)-DHMEQ：L体のDHMEQ）は、一般式(14)
【化９】
2006022234.tif 000010
【００４４】
で表される基で置換された多糖の芳香族カルバメート誘導体を有効成分とする分離剤を用いて(±)-DHMEQを直接、光学分割することにより得ることもできる。【００４５】
多糖の芳香族カルバメート誘導体としては、一般式(14)中の置換基（−Ｒ４、−Ｒ５、−Ｒ６、−Ｒ７、及び−Ｒ８）が、水素原子、炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシ基、炭素数６〜１４の芳香族基、ハロゲン原子などにより構成される多糖の芳香族カルバメート誘導体を挙げることができるが、アミローストリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）、セルローストリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）などが好ましく、アミローストリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）が特に好ましい。前記ハロゲン原子は、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、及びヨウ素原子などである。【００４６】
なお、前記(±)-DHMEQの光学分割は、一般式(14)で表される基で置換された多糖の芳香族カルバメート誘導体を有効成分とする分離剤が充填された光学活性カラム、例えば、DAICEL CHIRALPAK AD (10 mm i.d. x 250 mm)を用いた高速液体クロマトグラフィーにより行うことが好ましい。なお、移動相としては、例えば、0.1〜0.9v/v%の酢酸を添加したメタノールを用いることができる。【００４７】
このようにして得られた(-)-DHMEQ及び(+)-DHMEQは、それぞれの施光度をJASCO DIP-360旋光計で測定することにより、光学純度を算出することができる（(-)-DHMEQは[α]20D −241°(c0.1 MeOH)であり、(+)-DHMEQは[α]20D ＋239°(c0.1 MeOH)である。）。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例及び図を用いてより詳細に説明する。【００４９】
［実施例１］
マクロファージ由来RAW264.7細胞は、RANKLで処理すると破骨細胞へと分化する。また、RANKL/RANKシグナルは、NF-κBの活性化を誘導することが知られており、NF-κBが破骨細胞の分化に必須の因子であると考えられている。そこで、NF-κBの活性化阻害剤である(-)-DHMEQを用いて、マクロファージ由来RAW264.7細胞をRANKLで処理した時に誘導される破骨細胞の分化に対する(-)-DHMEQの影響を検討した。【００５０】
10％ fetal bovine serum（JRH Biosciences）、200μg/ml カナマイシン、100units/ml ペニシリンＧ、600μg/ml L-グルタミン、及び2.25g/l NaHCO3を含むダルベッコ改変イーグル培地0.5mlが入った24ウェルプレートにRAW264.7細胞（4×104個/ウェル）を播種し、100ng/ml RANKL（recombinant human RANKL；Wako Chemical）及び0.3、1、又は3μg/ml DHMEQを添加して5日間培養した（なお、コントロールとして、RANKL及びDHMEQを添加しないで培養した細胞と、100ng/ml RANKLのみを添加して培養した細胞を準備した。）。培養後、細胞を5％ パラホルムアルデヒドを含むPBS（リン酸塩緩衝液；8g/l NaCl, 0.2g/l KCl, 0.916g/l Na2HPO4, 0.2g/l KH2PO4）により10分間室温で固定し、PBSですすいだ後、アセトン/エタノール（1:1 v/v）により30秒間室温で処理した。【００５１】
続いて、固定した細胞をTRAP染色液（0.01％ naphtol AS-MX phosphate（ICN biomedicals）、0.05％ fast red violet LB salt（Sigma）、50mM酒石酸ナトリウム、及び90mM 酢酸ナトリウム（pH 5.0））で染色し、水ですすいで、顕微鏡で観察した。その結果を図１に示す。また、TRAP染色液で染色された4以上の核を有する多核細胞（MNC；specialized multinucleated cells）の数を数えた。その結果を図２に示す。【００５２】
図１及び図２に示されるように、DHMEQは、濃度依存的に、RANKLによって誘導されるRAW264.7細胞の破骨細胞への分化を阻害することが明らかになった。また、データは示さないがDHMEQによる細胞増殖の阻害は確認できなかったため、DHMEQの上記分化阻害効果は、非特異的な増殖阻害のためではないことがわかった。【００５３】
［実施例２］
また、M-CSFにより誘導した骨髄由来のマクロファージをRANKLで処理した時に誘導される破骨細胞の分化に対する(-)-DHMEQの影響を検討した。【００５４】
10％ FBS、200μg/ml カナマイシン、100units/ml ペニシリンＧ、2.25g/l NaHCO3、及び10ng/ml M-CSF（recombinant human M-CSF；Genzyme）を含むα-minimum essential medium（Invitrogen）が入った24ウェルプレートに、8週齢のICRマウス（Charles River Japan）由来の骨髄細胞（5×105個/ウェル）を播種して2日間培養し、非付着性細胞を洗浄して取り除き、付着性細胞を骨髄由来のマクロファージとして用いた。この骨髄由来のマクロファージの培養液に100ng/ml RANKL及び0.3、1、又は3μg/ml DHMEQを添加して2日間培養した（なお、コントロールとして、RANKL及びDHMEQを添加しないで培養したものと、100ng/ml RANKLのみを添加して培養したものを準備した。）。培養後、実施例１と同様に骨髄由来のマクロファージを固定し、TRAP染色液で染色して顕微鏡で観察した。また、TRAP染色液で染色した細胞から4以上の核を有する多核細胞を選択し、その細胞の数も数えた。それらの結果を図３及び図４にそれぞれ示す。【００５５】
図３及び図４に示されるように、DHMEQは、濃度依存的に、RANKLより誘導される骨髄由来のマクロファージから破骨細胞への分化を阻害することが明らかになった。また、データは示さないがDHMEQによる細胞増殖の阻害は確認できなかったため、この分化阻害効果も、増殖阻害によるものではないことがわかる。【００５６】
［実施例３］
RANKLによって誘導される破骨細胞の分化において、c-Fos、TRAF6、NFATc1などのタンパク質の発現上昇が重要であることが知られている。そこで、これらのタンパク質に対する(-)-DHMEQの影響を検討した。【００５７】
10％ FBS、200μg/ml カナマイシン、100units/ml ペニシリンＧ、2.25g/l NaHCO3、及び10ng/ml M-CSFを含むα-minimum essential medium（Invitrogen）の入った60 mm dishに、8週齢のICRマウス由来の骨髄細胞（5×106個/ウェル）を播種して2日間培養し、非付着性細胞を洗浄して取り除き、付着性細胞を骨髄由来のマクロファージとして用いた。この骨髄由来のマクロファージの培養液に100ng/ml RANKL及び0.3、1、又は3μg/ml DHMEQを添加して24時間培養した（なお、コントロールとして、RANKL及びDHMEQを添加しないで培養したものと、100ng/ml RANKLのみを添加して培養したものを準備した。）。培養後、骨髄由来のマクロファージを回収し、溶解用溶液（20mM Tris-HCl (pH 8.0)、150mM NaCl、2mM EDTA、100μM NaF、400μM Na3VO4、1％ Nonidet P-40、1μg/ml ロイペプチン、1μg/ml アンチパイン、及び1μM PMSF）で細胞を溶解し、SDS-PAGEを行った。【００５８】
その後、PVDF膜（polyvinilidene difluoride membrane；Amersham Biosciences）を用いてウエスタンブロットを行った。一次抗体は抗NFATc1抗体（Santa Cruz Biotechnology；200倍希釈）、抗c-Fos抗体（Santa Cruz Biotechnology；500倍希釈）、抗TRAF6抗体（Santa Cruz Biotechnology；500倍希釈）、抗tubulin抗体（Sigma；1000倍希釈）を用い、二次抗体はホースラディシュ・ペルオキシダーゼが結合したヒツジ抗ウサギIg抗体又はヒツジ抗マウスIg抗体（Amersham Biosciences；1000倍希釈）を用い、検出はECL（Enhanced Chemiluminescence）により行った。その結果を図５に示す。【００５９】
また、c-Fos、TRAF6、NFATc1などのタンパク質に対する(-)-DHMEQの影響を免疫蛍光測定法により確認した。【００６０】
実施例２に記載の方法と同様にして得られた骨髄由来のマクロファージの培養液に100ng/ml RANKL及び3μg/ml DHMEQを添加して24又は48時間培養した（なお、コントロールとして、100ng/ml RANKLのみを添加して培養したものを準備した。）。培養後、氷冷したPBSで細胞を２回洗浄し、５％ホルムアルデヒド溶液を用いて室温で15分間固定し、その後、1％ Triton Xを含むPBSで5分間処理した。それから、細胞をPBSで3回洗浄し、5％ BSAを含むPBSにより室温で30分間インキュベーションした。【００６１】
次に、細胞と抗NFATc1抗体、抗c-Fos抗体、又は抗TRAF6抗体とを室温で60分間反応させた後、PBSで3回洗浄し、Alexa Fluor 546ヤギ抗ウサギIgG抗体又はAlexa Fluor 488ヤギ抗マウスIgG抗体（Molecular Probe）を用いて染色した。また、細胞においてアポトーシスが誘導されていなかどうかを確認するため、Hoechest 33258を用いて室温で40分間反応させて細胞を染色した。このようにして染色した細胞をそれぞれ、PBSで３回洗浄し、顕微鏡で観察した。その結果を図６に示す。【００６２】
図５及び図６に示すように、(-)-DHMEQは、RANKLによって発現誘導されるTRAF6やc-Fosなどの発現量には影響を及ぼさないものの、RANKLによって発現誘導されるNFATc1の発現量を、濃度依存的に減少させることが明らかになった。このことから、(-)-DHMEQは、NFATc1の発現を抑制することで、破骨細胞の分化を抑制することが示唆された。【００６３】
［実施例４］
また、分化した破骨細胞による骨吸収能に対する(-)-DHMEQの影響を検討した。【００６４】
リン酸カルシウム結晶がコーディングされたOAASプレート（Osteogenic Core Technology）に、実施例３と同様の方法で得られた骨髄由来のマクロファージ（5×104個/ウェル）を播種し、10ng/ml M-CSF及び100ng/ml RANKLを用いて3日間インキュベーションした。その後、細胞を3μg/ml (-)-DHMEQで処理し、さらに2日間培養した（なお、コントロールとして、10ng/ml M-CSFのみでインキュベーションし、さらに(-)-DHMEQで処理しないで培養したものと、10ng/ml M-CSF及び100ng/ml RANKLでインキュベーションし、さらに(-)-DHMEQで処理しないで培養したものを準備した。）。培養後、OAASプレートを5％ 次亜塩素酸ナトリウムで5分間処理し、水で洗浄してプレートを乾燥し、顕微鏡で観察した。その結果、図７に示すように、(-)-DHMEQは、分化した破骨細胞の骨吸収能を抑制することが明らかになった。【００６５】
以上のことから、(-)-DHMEQは、破骨細胞の分化と活性化（骨吸収能）を抑制することが明らかになり、(-)-DHMEQを用いることにより、NFATc1の発現により生じる破骨細胞の過剰分化や活性化を抑制し、これらの現象に起因する疾患を効果的に改善することができることが示唆された。【００６６】
［実施例５］
次に、破骨細胞による骨破壊が生じる脊椎動物に対して(-)-DHMEQが有用であるかどうかを確認するため、骨破壊モデルマウスを作製し、該モデルマウスに対する(-)-DHMEQの効果を調べた。【００６７】
1 mlシリンジ（針は24G）を用いて、1週間飼育した７週齡のC57BLマウス（雌；n=3)に、(-)-DHMEQ溶液を8 mg/kg-体重で腹腔内に投与した。なお、(-)-DHMEQ溶液は、10 mg/mlの濃度になるようにDMSO（dimethyl sulfoxide）で溶解した後、RPMI1640培地で270 μg/mlの濃度になるように希釈することにより調製した。また、対照群のマウス6匹には同量のRPMI1640培地を投与した。【００６８】
各溶液を投与してから1時間後に、シリンジ(Hamilton)を用いて、PBSで溶解した5 mg/ml LPS (lipopolysaccharide；Sigma)を 25 mg/kg-体重で頭頂部に皮下注射した。なお、対照群のマウス6匹のうち3匹に対しては、PBSのみを頭頂部に皮下注射した。その後、24時間おきに等量の(-)-DHMEQ溶液（実験群）又はRPMI1640培地（対照群）を腹腔内に5日間連続して投与した。【００６９】
6日目にマウスを頚椎脱臼により屠殺し、断頭して頭部のみを固定液（10 %ホルムアルデヒド及び0.5% グルタルアルデヒドを含有したPBS）45 mlに浸し、2日間、4 ℃で振盪して固定した。その後、PBSで一昼夜振盪して洗浄し、裁断機を用いて頭部頭蓋冠部位のみを採取した。その後、ピンセットを用いて、頭蓋冠の頭皮部位のみを剥いだ後、ナイロンメッシュで包み、脱灰液 (10 % EDTA-NaOH pH 7.0)に浸して4 ℃で2 週間振盪し、脱灰を行った。なお、脱灰液は5日おきに交換した。【００７０】
脱灰した頭蓋冠をPBSで一昼夜振盪して洗浄した後、80％ エタノール溶液で一昼夜、4 ℃で振盪し、さらに、90％ エタノールに交換して一昼夜振盪し、ついで、100％ エタノールに交換して一昼夜振盪することにより脱水処理を行った。その後、100％ アセトンに頭蓋冠を浸して同様に一昼夜振盪し、脱脂処理を行った。【００７１】
脱脂した頭蓋冠をJB-4 embedding Kit (Polysciences, Inc., Warrington, PA)のJB-4樹脂に浸して4 ℃で4日間振盪した。なお、JB-4樹脂は2日に一回交換した。振盪後、重合開始剤を含むJB-4樹脂に浸し、窒素気流下で2時間静置して固化させた。その後、ミクロトームを用いて厚さ2μmの切片を作製し、TRAP染色液に浸して37℃で1時間染色し、水洗して顕微鏡で観察した（図８Ａ）。【００７２】
また、上記切片を、メチルグリーン染色液を用いて室温で10分間染色し、水洗して風乾した後、エントラニュー封入剤 (Sigma)を用いて封入し、位相差顕微鏡で観察して4以上の核を有する多核細胞（MNC）を破骨細胞として数を数えた（図８Ｂ）。さらに、上記切片の顕微鏡写真を撮影し、画像解析ソフトNIH Imageを用いて骨髄腔の面積を測定し、LPS及び(-)-DHMEQを投与していないマウスの頭蓋冠部位における骨髄腔の面積を「1」として、LPS及びRPMI1640を投与したマウス、並びに、LPS及び(-)-DHMEQを投与したマウスの頭蓋冠部位における骨髄腔の増加率を算出した（図８Ｃ）。【００７３】
図８Ａに示すように、LPS及びRPMI1640を投与したマウスでは、破骨細胞（図８Ａ中の矢印部分などの濃く染まっている部分）が顕著に誘導されていたが、LPS及び(-)-DHMEQを投与したマウスにおいては、破骨細胞はほとんど誘導されていなかった。さらに、図８Ｂに示すように、LPS注入点から500μmの範囲内における破骨細胞の数は、LPS及びRPMI1640を投与したマウスに比べ、LPS及び(-)-DHMEQを投与したマウスでは約30％に減少しており、LPSを投与していないマウスと同程度の破骨細胞数であった。また、骨破壊の程度を骨髄腔の増加率を指標に調べたところ、図８Ｃに示すように、LPS及びRPMI1640を投与したマウスでは、LPSを投与していないマウスに比べ、約70％増加しているにもかかわらず、LPS及び(-)-DHMEQを投与したマウスにおいては、その増加率は約20％まで抑えられていた。【００７４】
以上のことから、(-)-DHMEQは、in vivoにおいても破骨細胞の分化や骨破壊を抑制し、破骨細胞による骨破壊が生じる脊椎動物に対して有用であることが示唆された。また、(-)-DHMEQの連日腹腔投与による毒性は、本実施例では確認できなかった。
【産業上の利用の可能性】
【００７５】
本発明によれば、NFATc1の発現を抑制する抑制物質、また、NFATc1の発現に起因する破骨細胞の分化を抑制する分化抑制物質又は活性化を抑制する活性化抑制物質、さらに、NFATc1の発現に起因する疾患を改善することができる改善物質を提供することができる。
【図２】
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【図４】
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【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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