(57)【要約】  移植用臓器の機能低下の抑制に有効である臓器機能維持改善液を提供するとともに、該臓器機能維持改善液を用いた臓器保存方法を提供する。  本発明は、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、又はその薬理的に許容できる塩若しくは誘導体を含む薬理活性物質を臓器保存液中に含んでなる、臓器移植用に提供される臓器の機能を維持又は改善するための臓器機能維持改善液に関する。また、本発明は、ドナーから摘出された臓器に前記臓器機能維持改善液を灌流することによって虚血し、該臓器をレシピエントに移植するまでの期間、該臓器機能維持改善液に浸漬することを含む移植用臓器の保存方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、又はその薬理的に許容できる塩若しくは誘導体を含む薬理活性物質を臓器保存液中に含んでなる、臓器移植用に提供される臓器の機能を維持又は改善するための臓器機能維持改善液。
【請求項２】
グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、又はその薬理的に許容できる塩若しくは誘導体を含む薬理活性物質が甘草から抽出されたものである、請求項１に記載の臓器機能維持改善液。
【請求項３】
前記グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、又はその薬理的に許容できる塩若しくは誘導体が、グリチルリチン酸アンモニウム塩、グリチルリチン酸アルカリ金属塩、グリチルレチン酸の有機塩基の塩、グリチルレチン酸アンモニウム塩、グリチルレチン酸アルカリ金属塩、グリチルレチン酸３β−Ｏ−グルクロニド、及びグリチルレチン酸ステアリルからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の臓器機能維持改善液。
【請求項４】
薬理活性物質が強力ネオミノファーゲンシー（登録商標）又はグリチロン注一号（登録商標）である、請求項１に記載の臓器機能維持改善液。
【請求項５】
臓器移植用に提供される臓器が生体又は死体から摘出された臓器であって、該臓器の保存中及び／又は移植後に臓器の機能を維持又は改善するための請求項１ないし４のいずれか１項に記載の臓器機能維持改善液。
【請求項６】
臓器移植用に提供される臓器が肝臓、心臓、肺、腎臓、又は膵臓である、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の臓器機能維持改善液。
【請求項７】
臓器移植用に提供される臓器が肝臓である、請求項６に記載の臓器機能維持改善液。
【請求項８】
前記臓器保存液が、ＵＷ液、ユーロコリンズ液、セルシオ液、ＨＴＫ液、又はキョウトソリューションである、請求項１ないし７に記載の臓器機能維持改善液。
【請求項９】
臓器移植用に摘出された臓器を保存する方法であって、下記の工程：
（ａ）摘出された臓器に、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の臓器機能維持改善液を灌流することによって虚血すること；そして
（ｂ）該臓器をレシピエントに移植するまでの期間、該臓器機能維持改善液に浸漬すること
を含む、前記臓器保存方法。
【請求項１０】
臓器移植用に摘出される臓器をドナーの生体から摘出する前に、該臓器の機能を維持又は改善するために薬理活性物質をドナーに投与する工程をさらに含む、請求項９に記載の臓器保存方法。
【請求項１１】
前記ドナーが肝疾患である、請求項１０に記載の臓器保存方法。
【請求項１２】
前記肝疾患が脂肪肝である、請求項１１に記載の臓器保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臓器移植用に摘出される臓器の機能を維持又は改善するための臓器機能維持改善液に関する。より具体的には、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、又はその薬理的に許容できる塩若しくは誘導体を含む薬理活性物質を臓器保存液中に含んでなる臓器機能維持改善液に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年における臓器移植の症例増加に伴い、摘出される臓器の機能を維持し又は改善した状態で摘出臓器を保存する技術についてもその重要性が高まっている。例えば、移植用肝臓は、摘出後速やかに臓器受容者（レシピエント）へ移植されることが望ましいが、脳死状態の臓器提供者（ドナー）はレシピエントから遠隔地に現れることが通常であり、このため摘出された肝臓の速やかな空輸等が必要とされる。摘出された臓器は、時として数時間から２４時間の運搬・保存が要求されるのは周知の通りである。また、生体肝移植の場合でも、摘出された肝臓は、鮮度を維持するため冷保存虚血灌流により処理され、レシピエントへの移植前まで冷保存が必要とされる場合がある。【０００３】
摘出された肝臓は、その基質的及び機能的保全を目的として臓器の虚血及び保存液の灌流が行われ、また代謝抑制のために約４℃の冷保存下に置かれる。従来、肝臓の冷保存液としてＵＷ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）液等が公知である（参考文献１及び２）。【０００４】
摘出肝臓の虚血及び保存液の灌流は、当該移植肝にとって基本的に有害であり、これは冷保存虚血再灌流による肝機能障害の問題を引き起こす。一般に冷保存虚血肝臓ではフリーラジカルや炎症誘発物質の介在などによって肝細胞が損傷を受けやすく、これらに起因して移植後の血栓や微小循環障害等といった肝機能不全が引き起こされると説明される。冷保存による移植用肝臓の機能低下の問題は、レシピエントにおける生着率に重大な影響を与える要因であるから、これに対する有効な対処法の出現が強く望まれている。従来、冷保存虚血再灌流により引き起こされる肝機能低下に対する対処法として幾つか提案がなされている（例えば、参考文献３を参照）。しかしながら、冷保存下での肝機能低下が如何なるメカニズムで引き起こされるのかは、未解明な部分が多い。上記の通り移植用摘出肝臓の需要は近年急速に拡大しており、他方で種々の保存法が検討されているが、現在その根本的な解決には至っていない。【０００５】
肝疾患治療薬として知られている肝機能改善剤（例えば、後述する強力ネオミノファーゲンシー（登録商標））は、冷保存下で問題となる肝機能低下の改善に関与することは従来において報告がない。従来、肝機能改善に関与し得る肝臓疾患治療薬について多々報告があるが、それらは対症療法用途における臨床的知見にとどまる。ところで、一般に肝臓検査指標としてＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）やＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）等が臨床上使用されている。この検査法は肝細胞が損傷を受けた結果、血中に見出される成分の濃度を見ているものであって、厳密には肝機能それ自体を直接反映したものではない。【０００６】
また、生体肝移植では、レシピエントに相応しいと考えられるドナーが現われると、その前段階において血液型、ＨＬＡ型、リンパ球交叉試験等の臓器適応性が判断される。しかしながら、これらの適応性が認められても、ドナーの肝臓そのものが健康でなければ移植を成功させることはできない。特に、脂肪肝は、移植後の生着率が低いため、移植の適応基準を満たさないと判断される。一般に、肝臓は、中性脂肪、コレステロールなど多少の脂肪分を有するが、例えば、肥満が進行し肝細胞中に脂肪滴が肝小葉の肝細胞の３分の１以上に現れるような脂肪肝になると、移植を断念せざるを得ないケースは少なくない。現在、脂肪肝の治療に即効性のある医薬や療法はなく、脂肪肝と診断されたドナーから肝臓を提供するには、ドナーが食餌療法や運動療法を行い、肝臓内に溜まった中性脂肪を減らすことが要求される。時には、レシピエントの余命が短いため、ドナーは短期間の激しい減量努力に耐えなければならず、肝臓を提供するために大きな負担が強いられる。それでもドナーの肝脂肪率が充分に低下しなければ、移植に踏み切ることはできない。統計によれば、ドナー候補となる成人の約３０％近くが脂肪肝の兆候を有する。近年の脂肪肝の増大は、肝臓のドナー不足の一因となっている。
【発明の開示】
【０００７】
本発明者らは、冷保存虚血に起因する非壊死性移植片機能不全のメカニズムの解明を目指し、これに関連する胆汁排出量や胆汁構成成分の変化等について研究を重ね、さらに冷保存虚血下での肝機能の維持又は改善に向けた薬理活性物質を臓器保存液中に含んでなる臓器機能維持改善液の適用、並びに臓器保存方法に関して検討を進めてきた。本発明は、例えば、健全肝臓の肝機能を適正に維持することに向けられている。本発明者らの検討によれば、臓器保存に必要とされる期間（典型的には２〜２４時間）の冷保存虚血条件下では、細胞損傷等の所見のない非壊死性機能低下が問題とされる。この点において、従来の単なる肝臓疾患治療とは異なる特有の課題が存在した。また、本発明によれば、薬理活性物質は、後記の実施例で説明する通り、予期せぬことに、冷保存虚血肝臓における胆汁排出能の低下防止、及び胆汁構成成分比の変化の抑制をもたらした。
【０００８】
また、上述したように、現状において脂肪肝は移植に不適応とされ、それでも移植を行うにはドナーは肝脂肪率を下げるための減量努力が強いられる。しかしながら、実際に生着率を左右する要因は、脂肪肝の脂肪率の高さというよりも、本質的には肝機能自体の低下であると考えられる。移植前段階でのドナーへの適切な処置が脂肪肝の移植を可能にするならば、脂肪肝ドナーの負担を著しく軽減することができる。そこで、本発明者らは、脂肪肝を有すると診断されたドナーの療法等の負担を軽減又は解消し、さらにはドナー不足の問題を解消するのに役立つ薬理活性物質を用いた移植前の処置を含む臓器保存方法を検討してきた。
【０００９】
したがって、本発明は、臓器移植用に摘出される臓器の機能を維持又は改善するための臓器機能維持改善液を提供することにより、従来の臓器保存液と比較して、移植後の移植臓器の機能をより効果的に回復することができ、これにより当該技術分野における多様な必要性を満たすのを援助する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、再灌流時間に対する胆汁流量のグラフである。
【００１１】
【図２】図２は、排出された胆汁中の総胆汁酸塩の濃度を示すグラフである。
【００１２】
【図３】図３は、排出された胆汁中のリン脂質の濃度を示すグラフである。
【００１３】
【図４】図４は、排出された胆汁中の胆汁酸塩/リン脂質比を示すグラフである。
【００１４】
【図５】図５は、排出された胆汁中のグルタチオンの濃度を示すグラフである。
【００１５】
【図６】図６は、再灌流時間に対する胆汁流量のグラフである。
【００１６】
【図７】図７は、再灌流開始２０、４０、６０分後に排出された胆汁中の総胆汁酸塩の濃度を示すグラフである。
【００１７】
【図８】図８は、再灌流開始２０、４０、６０分後に排出された胆汁中のリン脂質の濃度を示すグラフである。
【００１８】
【図９】図９は、再灌流開始２０、４０、６０分後に排出された胆汁中のグルタチオンの濃度を示すグラフである。
【００１９】
【図１０】図１０は、実施例の投与スケジュールを示すチャートである。
【００２０】
【図１１】図１１は、再灌流実験における胆汁流量の灌流時間に対する変化を示すグラフである。
【００２１】
【図１２】図１２は、胆汁中の胆汁酸塩/リン脂質比を示すグラフである。
【００２２】
【図１３】図１３は、胆汁中のグルタチオンの濃度を示すグラフである。
【発明の詳細な説明】
【００２３】
本発明者らは、冷保存虚血下での肝機能低下のメカニズムを解明すべく鋭意研究を行った結果、意外なことに、所定の肝臓疾患治療薬が冷保存虚血肝臓における機能低下の抑制に有効であることを見出し、そのような新規な用途に基づき、本発明の臓器機能維持改善及びそれを用いた臓器保存方法を完成させた。さらに、本発明者らは、ドナーが脂肪肝である場合、所定の薬理活性物質の移植前投与が肝臓の機能を改善し、移植後の肝臓の機能を効果的に回復できることを見出し、本発明の臓器保存方法を完成させた。
【００２４】
即ち、本発明によれば、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、又はその薬理的に許容できる塩若しくは誘導体を含む薬理活性物質を臓器保存液中に含んでなる、臓器移植用に提供される臓器の機能を維持又は改善するための臓器機能維持改善液が提供される。
【００２５】
本発明の一態様において、本発明に使用される前記薬理活性物質には、甘草から抽出されたもの、又は、強力ネオミノファーゲンシー（登録商標）若しくはグリチロン注一号（登録商標）が含まれる。
【００２６】
本発明の一態様として、本発明の臓器機能維持改善液は、臓器移植用に提供される臓器が生体（脳死状態を含む）又は死体から摘出された臓器であって、該臓器の保存中及び／又は移植後に臓器の機能を維持又は改善するために使用してもよい。
【００２７】
本発明の一態様において、本発明の臓器機能維持改善液に使用される臓器保存液には、例えば、ＵＷ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）液、ユーロコリンズ（Ｅｕｒｏ−Ｃｏｌｌｉｎｓ）液（参考文献４）、セルシオ（Ｃｅｌｓｉｏｒ）液（参考文献５）、ＨＴＫ（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ−Ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）液（参考文献６）、キョウトソリューソン（参考文献７）が含まれる。
【００２８】
本発明によれば、臓器移植用に摘出された臓器を保存する方法であって、（ａ）摘出された臓器に、本発明の臓器機能維持改善液を灌流することによって虚血すること；及び（ｂ）該臓器をレシピエントに移植するまでの期間、該臓器機能維持改善液に浸漬することを含む臓器保存方法が提供される。
【００２９】
本発明の一態様において、臓器移植用に摘出される臓器をドナーの生体から摘出する前に、該臓器の機能を維持又は改善するために薬理活性物質をドナーに投与する工程をさらに含む臓器保存方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明の臓器機能維持改善液は、体液と同等の浸透圧に調整された生理学的に許容される臓器保存液に、所定の薬理活性物質を必要量添加して製造することができる。より具体的には、本発明は、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、又はその薬理的に許容できる塩若しくは誘導体を含む薬理活性物質を臓器保存液中に含んでなる、臓器移植用に提供される臓器の機能を維持又は改善するための臓器機能維持改善液である。また、本発明は、臓器移植用に摘出された臓器を保存する方法であって、（ａ）摘出された臓器に前記薬理活性物質を灌流することによって虚血すること、及び（ｂ）該臓器をレシピエントに移植するまでの期間、該臓器機能維持改善液に浸漬することを含む臓器保存方法である。
【００３１】
（１）臓器機能維持改善液
本発明によれば、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、又はその薬理的に許容できる塩若しくは誘導体を含む薬理活性物質を臓器保存液中に含んでなる、臓器移植用に提供される臓器の機能を維持又は改善するための臓器機能維持改善液が提供される。
【００３２】
本明細書に使用される「臓器機能維持改善」とは、移植用に提供される臓器に関して、（ａ）ドナーから摘出される前の臓器、（ｂ）ドナーから摘出され移植される前の臓器、及び（ｃ）レシピエントに移植された後の臓器の少なくとも１つにおける臓器の機能の維持、改善、回復、低下の抑制などをいう。例えば、提供される臓器が肝臓である場合には、主として、移植用に単離された冷保存虚血肝臓における胆汁排出能力の低下の抑制；胆汁構成成分の好ましくない変化の抑制、特にグルタチオン抱合物のような重要な胆汁成分の排出能力の低下の抑制（即ち、解毒能の回復）；リン脂質の排出能力の低下の抑制；さらにはリン脂質に対する胆汁酸塩の比率（胆汁酸塩/リン脂質比）の好ましくない上昇の抑制による肝機能改善を意味する。
【００３３】
本発明に使用される「薬理活性物質」には、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、又はその薬理的に許容できる塩若しくは誘導体（以下、「グリチルリチン酸等」と称する場合がある）が含まれる。ここで、前記薬理活性物質として使用されるグリチルリチン酸等は、本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法等は限定されない。即ち、グリチルリチン酸等は、甘草からの抽出、遺伝子工学的手法又は化学合成的手法によって得ることが検討されているが、これらに限定されない。グリチルリチン酸等は、甘草から抽出されたものであることが好ましい。ここで、甘草は、マメ科の植物であり、ヨーロッパ及びアジアを原産地とし、１−２ｍになる地下茎、走出茎（ストロン）をもつ多年草、又は準低木である。甘草の根から抽出されるグリチルリチン酸塩は食品の甘味添加物として利用されているが、鎮痛、解熱、消炎、解毒等の効果を有する。なお、甘草からのグリチルリチン酸の抽出は、例えば参考文献８に記載される方法に従って行うことができる。また、グリチルリチン酸塩等を薬理活性物質として使用する場合は、粗精製の状態であってもよいが、好ましくは、６０％以上の純度を要する。
【００３４】
本明細書で使用される「薬理的に許容できる塩若しくは誘導体」は、一般的に、塩基性塩を作ることにより、又は化合物中に存在する官能基を、当業者にとって周知な操作若しくは生体内において修飾が開裂して親化合物となるような誘導を行うことにより合成される化合物をいう。ここで、グリチルリチン酸又はグリチルレチン酸の薬理的に許容できる塩若しくは誘導体としては、限定されないが、グリチルリチン酸アンモニウム塩、グリチルリチン酸アルカリ金属塩、グリチルレチン酸の有機塩基の塩、グリチルレチン酸アルカリ金属塩、グリチルレチン酸３β−Ｏ−グルクロニド、グリチルレチン酸ステアリルが例示される。好ましくは、グリチルリチン酸アンモニウム塩、グリチルリチン酸カリウム塩、グリチルリチン酸ナトリウム塩、より好ましくは、グリチルリチン酸モノアンモニウム塩である。また、グリチルレチン酸アルカリ金属塩としては、グリチルレチン酸カリウム塩、グリチルレチン酸ナトリウム塩が例示される。
【００３５】
本発明の一態様において、本発明に使用される薬理活性物質には、強力ネオミノファーゲンシー（登録商標）又はグリチロン注一号（登録商標）が含まれる。これらの薬理活性物質は、株式会社ミノファーゲン製薬から入手することができ、粗グリチルリチン酸モノアンモニウム含有注射剤の処方せん医薬品として臨床に使用されている。
【００３６】
強力ネオミノファーゲンシー（STRONGER NEO-MINOPHAGEN C（登録商標）；以下「強ミノＣ」と称する場合がある）に含有される代表的な成分を表１に例示する。
表１  強ミノＣの組成
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【００３７】
ここで、薬理活性物質として強ミノＣを使用した場合、本発明の作用効果は、その有効成分の一つであるグリチルリチン酸塩が関与すると考えられる。この観点から、本発明の臓器機能維持改善液に使用し得る薬理活性物質には、前記強ミノＣと同等の主成分を有する他のグリチルリチン酸含有組成物が含まれる。
【００３８】
一方、グリチロン注一号（GLYCYRON（登録商標）Inj. No.1）は、アレルギー用薬であり、主に薬疹などに効果がある。グリチロン注一号（登録商標）の組成は、本剤２ｍＬ中には、主成分として粗グリチルリチン酸モノアンモニウム（５３ｍｇ）（グリチルリチン酸として４０ｍｇ）が含まれる。
【００３９】
本発明の一態様として、本発明の臓器機能維持改善液は、臓器移植用に提供される臓器が生体（脳死状態を含む）又は死体から摘出された臓器であって、該臓器の保存中及び／又は移植後に臓器の機能を維持又は改善するために使用することができる。本発明の臓器機能維持改善液が適用される臓器は、移植用臓器として提供可能な臓器であれば、限定されない。好ましくは、肝臓、腎臓、膵臓、肺、心臓、より好ましくは、肝臓、腎臓、膵臓、肺、最も好ましくは、肝臓である。
【００４０】
また、移植用臓器は、特に限定されないが、好ましくは哺乳動物由来、好ましくは、ヒト、ブタ、ウシ、ヤギ由来、最も好ましくは、ヒト由来である。
【００４１】
本発明の臓器機能維持改善液に使用される臓器保存液は、既存の臓器保存液として使用可能なものであれば、限定されない。臓器保存液は、好ましくは、ＵＷ液、ユーロコリンズ液、セルシオ液、ＨＴＫ液、キョウトソリューソン、より好ましくは、ＵＷ液、セルシオ液、最も好ましくは、ＵＷ液である。
【００４２】
本発明の臓器機能維持改善液は、所定量の薬理活性物質を臓器保存液に添加することによって調製することができる。臓器保存液中の薬理活性物質の強ミノＣ（注射剤）換算濃度として、好ましくは１〜３０％、より好ましくは２〜２０％、最も好ましくは２〜１０％である。例えば、後述する実施例に具体的に記載されるように、臓器保存液として使用するＵＷ液に薬理活性物質として強ミノＣを添加した臓器機能維持改善液を用いる場合にあっては、ＵＷ液:強ミノＣの容量比にして９８：２〜８０：２０、好ましくは約９５:約５である。本発明の臓器機能維持改善液との適合性が認められる限り、薬理活性物質のほか、抗生物質、ステロイド剤、ホルモン剤、ｐＨ調整剤等の他の成分を任意に含有させてもよい。
【００４３】
本発明の臓器機能維持改善液は、摘出後の臓器を保存するための使用に限定されず、臓器移植という一連の過程において、臓器の機能を維持又は改善することが不可欠な工程で使用することができる。より具体的には、本発明の臓器機能維持改善液は、臓器の保存液、洗浄液、浸漬液、灌流液、リンス液等として使用可能である。
【００４４】
（２）臓器保存方法
上述したように、本発明の臓器機能維持改善液で処置し得る臓器は、生体ドナー（脳死ドナーを含む）又は死体ドナーのいずれから提供されてもよい。本発明の臓器機能維持改善液は、冷保存虚血状態での非壊死性臓器機能低下が危惧される程度の保存時間が必要とされる場合に有効に適用し得る。
【００４５】
本発明によれば、前記臓器機能維持改善液を用いた臓器保存方法が提供される。より具体的には、本発明は、臓器移植用に摘出された臓器を保存する方法であって、（ａ）摘出された臓器に、前記の臓器機能維持改善液を灌流することによって虚血すること、及び（ｂ）該臓器をレシピエントに移植するまでの期間、該臓器機能維持改善液に浸漬することを含む臓器保存方法に関する。
【００４６】
本発明の臓器保存方法は、本明細書に定義される臓器機能維持改善液を使用する限りにおいて、特に限定されてないが、典型的には、ドナーから摘出された臓器に前記の臓器機能維持改善液を用いて灌流することによって虚血すること、及び該臓器をレシピエントに移植するまでの所定期間、該臓器機能維持改善液に浸漬することを含む。
【００４７】
本発明の臓器保存方法において、摘出された臓器を臓器機能維持改善液に浸漬する期間（保存期間）は、限定されないが、一般的には、ドナーから臓器を摘出後からレシピエントに移植するまでの期間である。保存期間は、臓器の種類によって異なり、例えば、肝臓の場合には、好ましくは２４時間以下、より好ましくは２〜２４時間、さらにより好ましくは２〜１６時間である。当業者であれば、臓器の種類や移植時期等を考慮して、臓器の保存期間を適宜調節することができる。また、本発明の臓器保存方法に使用される臓器機能維持改善液は、冷却して使用することが好ましい。なお、本発明の臓器保存方法を用いた臓器保存については、後述する実施例１等に具体的に記載されている。
【００４８】
また、前述のように、肝移植においてドナーが脂肪肝である場合には不適応とされる。そこで、本発明者らは、肝臓の移植灌流時の非壊死性肝機能低下のメカニズムを解明する研究を重ねてきたが、脂肪肝の移植適応性を向上させるにもそのような機能低下に着目して検討を進めてきた。生体肝移植のために摘出された肝臓は、冷保存虚血灌流により処理され、冷保存下に置かれる。冷保存虚血灌流による肝機能低下を見ることは、脂肪肝の移植適応性を評価する上でも重要である。
【００４９】
そこで、本発明の一態様として、前記臓器保存方法に、臓器移植用に摘出される臓器をドナーの生体から摘出する前に、該臓器の機能を維持又は改善するために薬理活性物質をドナーに投与する工程をさらに含んでもよい。前記薬理活性物質の投与工程は、特に限定されず、使用される薬理活性物質に適切な経路を使用することができる。薬理活性物質の投与は、好ましくは、静脈、経口、経皮、筋肉、経鼻、吸入、直腸投与、より好ましくは、静脈、経口投与、最も好ましくは、静脈投与である。また、薬理活性物質の選択、その投与量及び投与期間は、当業者であれば、疾患の程度によって適宜調節することができる。なお、薬理活性物質の投与量は、例えば、強ミノＣ（注射剤）を使用する場合、ドナーの体重１ｋｇ当り、約０．１〜２ｍＬ／日、好ましくは約０．３〜１．７ｍＬ/日、より好ましくは、１ｍＬ／日である。投与回数については、臓器摘出前であれば、特に限定されず、薬理活性物質を連日、隔日等で投与してもよい。また、薬理活性物質のドナーへの投与期間は、好ましくは少なくとも２週間の連日投与であり得る。また、成人への投与量は１日１回当たり２０〜１００ｍＬ、好ましくは４０〜１００ｍＬ、より好ましくは約６０ｍＬである。これら投与量及び投与期間は、ドナーの脂肪肝化の進行度や許容される投与期間（例えば、レシピエントの余命を考慮する）に応じて適宜調整される。
【００５０】
本発明の臓器保存方法が適用される臓器疾患は、薬理活性物質の投与により臓器機能が維持又は改善することが期待される臓器疾患であれば、特に限定されない。好ましくは、肝疾患、腎疾患、膵疾患、肺疾患、より好ましくは、肝疾患、腎疾患、最も好ましくは、肝疾患である。さらに、肝疾患は、好ましくは、脂肪肝、肝炎、より好ましくは、脂肪肝である。
【００５１】
摘出した肝臓を本発明の臓器保存方法を用いて保存した場合に、肝機能が維持され又は改善されたことは、肝臓からの胆汁流量、排出された胆汁中の胆汁酸塩濃度、リン脂質濃度、胆汁酸塩／リン脂質比、及びグルタチオン濃度等を測定することによって判断することができる。
【００５２】
また、上述したように、本発明の臓器機能維持改善液との適合性が認められる限り、薬理活性物質の他、抗生物質、ステロイド剤、ホルモン剤、ｐＨ調整剤等の他の成分を任意に含有させてもよい。
【００５３】
後述する実施例１において示されるように、臓器保存液に強ミノＣ（グリチルリチン酸を含有）を添加した場合と、グリチルリチン酸を添加した場合における肝機能の測定結果より、両添加物は同様の肝機能の回復効果を奏することから、グリチルリチン酸が主な薬理活性物質であることが示唆された。
【００５４】
本発明の効果は、後述する実施例１に示されるように、本発明の臓器機能維持改善液によって保存された肝臓において胆汁流量を測定すると、グリチルリチン酸モノアンモニウムを強ミノＣ又はグリチロン注一号としてＵＷ液に添加した場合は、非保存の肝臓と比較して同程度までに胆汁流量が回復した。一方、ＵＷ液のみで保存した肝臓と比較しても、胆汁流量は顕著に回復した（図１及び６）。また、本発明によって、肝機能の回復の指標となる胆汁酸塩及びリン脂質が顕著に回復し（図２、３、７及び８）、胆汁酸塩／リン脂質比は、非保存の対照と比較して、同程度まで回復することができた（図４）。グルタチオン抱合物の排出量の回復が顕著であることも示唆された（図５及び９）。
【００５５】
また、後記の実施例２で示される通り、摘出手術前の脂肪肝モデル動物への所定の薬理活性物質の投与が、摘出及び冷保存後の再灌流脂肪肝において有意な機能改善、例えば、胆汁排出能力の回復、主要な胆汁成分の濃度の回復をもたらす。所定の薬理活性物質を事前に投与するだけで、投与後に摘出された脂肪肝の機能改善が確認された（図１１−１３）。この結果は、本発明により脂肪肝の移植適用性が高まることを示唆する。
【実施例】
【００５６】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。また、動物実験はすべて東京医科歯科大学のガイドラインに基づいて行った。本実験には、特に指定がない限り、雄性ウィスターラット（２５０〜３００ｇ）から摘出した分離灌流肝臓を用いた。
実施例１  肝移植後の肝臓機能の回復
（１）摘出した肝臓はＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔバッファーを使用し、２．７５ｍＬ／分／ｇ肝臓のファーストパスで灌流処理した。この灌流液中のタウロコール酸ナトリウム（株式会社シグマ）の量は生理的なレベル（３０ｍＭ）とした。【００５７】
８時間冷保存は、ＵＷ液（ビアスパン／藤沢薬品工業株式会社（現アステラス製薬株式会社））１００ｍＬを使用し４℃で行った。保存液は、ＵＷ液９５ｍＬに対し、株式会社ミノファーゲン製薬の強ミノＣを５ｍＬ添加して調製された。再灌流前のリンス（プレコンディショニング）にも上記の組成の保存液を使用した。【００５８】
本実験では、冷保存後の肝臓に３７℃で再灌流を行い、分離肝臓における胆汁流量及び排出胆汁の構成成分を分析した。具体的には、胆汁流量は、カルボキシフルオレセインを取り込ませた肝細胞からの胆管への当該色素量の排出量から求めた。さらに収集した胆汁中に含まれるリン脂質及びグルタチオンを定量した。非保存群（保存時間＝０）をコントロールとし、ＵＷ液１００ｍＬでの８時間保存群を比較例とし、これらにも同様の条件で再灌流実験を行った。【００５９】
図１は再灌流時の胆汁流量の変化を示し、図２〜５はそれぞれ、排出された胆汁流量、胆汁中の胆汁酸塩、リン脂質、グルタチオンの濃度、及び胆汁酸塩／リン脂質比を示す。【００６０】
図１に示すように、８時間冷保存虚血肝臓（白丸）は、２０分ほどの再灌流により冷保存状態から肝機能レベルが復帰し、これに伴い急速に胆汁流量が上昇するが、コンロトールのレベル（黒丸）まで回復することはなかった。これとは対照的に、強ミノＣ含有保存液で処置された８時間冷保存虚血肝臓は、再灌流によりコンロトールのレベルまで胆汁流量が完全に回復した（白四角）。【００６１】
排出胆汁の構成成分について見ると、強ミノＣ含有保存液で処置された８時間冷保存された肝臓からの胆汁酸塩の総排出量とグルタチオンの濃度は、それぞれコントロールに匹敵する（図２及び図５）。それらの排出量及び濃度の差は、従来の８時間冷保存虚血時に起こる機能低下に対する強ミノＣの抑制的効果を示す。このように強ミノＣ含有保存液は、胆汁排出能力、特にグルタチオン抱合物の排出量の低下に対する顕著な予防効果を有する。【００６２】
ＵＷ液での８時間冷保存肝臓では、コントロールと比較して胆汁酸塩濃度の変化は小さいが（図２）、リン脂質濃度は大きく減少する（図３）。ＵＷ液での８時間冷保存虚血によって胆汁酸塩／リン脂質比は非常に高まるが、強ミノＣ含有保存液での８時間冷保存虚血では、胆汁酸塩／リン脂質比の上昇に対し顕著な抑制効果が示される（図４）。【００６３】
以上の結果から、強ミノＣ含有保存液は、冷保存虚血肝臓における機能低下の抑制に有効であることが確認された。【００６４】
（２）本発明の臓器機能維持改善液の作製にグリチロン注一号（以下、「Ｇｌｙ」と称する場合がある）を用いた場合の所定時間保存後の臓器における胆汁流量の変化、胆汁酸塩の総排出量、リン脂質、グルタチオン濃度を測定した。使用したＧｌｙの量は強ミノＣの１０分の１（グリチルリチン酸換算で同量）とした。【００６５】
前記の肝臓の機能回復の指標とした各試験は、上記（１）の測定方法に準じて行った。ただし、摘出した肝臓に対する灌流及び再灌流の流速は、２．７５ｍＬ／分／ｇ肝臓として処理した。
図６は、再灌流時の胆汁流量の変化を示し、ＵＷ液中にＧｌｙを添加した場合（白四角）には、強ミノＣを添加した場合と同程度に胆汁流量の回復が観察された。また、Ｇｌｙを用いることによって対照（黒丸）のレベルまで胆汁流量が完全に回復した。【００６６】
図７は、再灌流開始後、２０、４０、６０分後に排出された胆汁中の胆汁酸塩の総排出量を示す。Ｇｌｙを添加した場合は、対照と同程度の胆汁酸塩の総排出量を誘導することができた。【００６７】
図８は、再灌流開始後、２０、４０、６０分後に排出された胆汁中のリン脂質の濃度を示す。ＵＷ液だけでは、リン脂質濃度を十分に回復することはできないが、Ｇｌｙを添加した場合は、対照と同程度までリン脂質濃度を回復することができた。【００６８】
また、上記（１）と同様に、胆汁酸塩／リン脂質比を算出すると、ＵＷ液での８時間冷保存虚血によって胆汁酸塩／リン脂質比は非常に高まるが、Ｇｌｙを添加した場合では、胆汁酸塩／リン脂質比の上昇を顕著に抑制された（データ示さず）。【００６９】
図９は、再灌流開始後、２０、４０、６０分後に排出された胆汁中のグルタチオン（ＧＳＨ）の濃度を示す。Ｇｌｙを添加した場合は、対照と同程度までＧＳＨ濃度を回復した。【００７０】
以上より、Ｇｌｙを含有した臓器機能維持改善液は、冷保存虚血肝臓における機能低下の抑制に有効であることが確認された。
実施例２  脂肪肝の移植前処置と肝移植後の肝臓機能の回復
ラットは、コリン欠乏飼料（ＣＤＤ）（オリエンタル酵母工業株式会社）を与えることにより脂肪肝を罹患する。図１０に示すようにラットを２つのグループに分け、すべてのラットにコリン欠乏飼料を４週間与え続け、その後半の２週間、１つのグループの各ラットに強ミノＣを０．５ｍＬ／日の用量で毎日静注し、別のグループの各ラットに生理食塩水を同じ用量及び方法で投与した。【００７１】
ラットから摘出した肝臓は灌流実験にかけた。摘出肝臓の灌流処理はＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔバッファーを使用し、２．７５ｍＬ／分／ｇ肝臓のファーストパスで行った。灌流液中のタウロコール酸ナトリウムの量は生理的なレベル（３０ｍＭ）とした。８時間冷保存には４℃でＵＷ液１００ｍＬを使用した。【００７２】
肝機能を測定するため、８時間冷保存後の肝臓を３７℃での再灌流処理し、このときの胆汁流量及び排出された胆汁の構成成分を測定した。胆汁流量は、カルボキシフルオレセインを取り込ませた肝細胞からの胆管への当該色素量の排出量から求め、収集した胆汁中から、そこに含まれる胆汁酸塩及びリン脂質の濃度を測定した。【００７３】
図１１は、８時間保存後の再灌流時における胆汁流量を示す。通常飼料が与えられたラットは、脂肪肝に罹患していない。それらの正常な肝臓は、再灌流時に高いレベルで胆汁を排出する。これとは対照的に、コリン欠乏飼料が与えられたラットの肝臓は、脂肪肝化に起因して正常肝臓よりも低いレベルの胆汁流量を示した。このように脂肪肝では基本的な肝機能低下が認められる。これら脂肪肝グループの中でも、強ミノＣを投与したグループは、生理食塩水を投与したグループよりも高いレベルの胆汁流量が認められた。強ミノＣは、胆汁流量を改善する効果を有することが示された。【００７４】
図１２は、胆汁酸塩／リン脂質比を示す。胆汁酸塩／リン脂質比を見ると、未投与グループでは胆汁酸塩／リン脂質比が非常に高く、投与グループではそのような上昇が抑制された。この結果から、強ミノＣの投与は、胆汁酸塩／リン脂質比を改善することが示された。【００７５】
図１３は、グルタチオンの濃度を示す。グルタチオン濃度からは、グルタチオン抱合物の排出量の回復が顕著であることが示唆された。【００７６】
以上の結果から、強ミノＣの脂肪肝モデルへの摘出前投与は、その後に摘出される肝臓における主要な肝機能の改善に役立つことが確認された。
参考文献
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２．  米国特許第４，７９８，８２４号
３．  特開２００１−３３５４０１号公報
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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