(57)【要約】  本発明は、以下の（１）から（５）の理化学的性質を有するポリペプチドを提供する：（１）作用：ＮＡＤＨを補酵素として、１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンを立体選択的に還元して（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを生成する、（２）分子量：ゲル濾過分析において約３４０，０００、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約４３，０００、（３）至適温度：６０℃〜７０℃、（４）還元至適ｐＨ：６．０、（５）酸化至適ｐＨ：９．０。  また本発明は、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチ、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、及び、該ポリペプチドを高生産する形質転換体を提供する。  更に本発明は、上記ポリペプチド又は上記形質転換体を用いて、医薬等の原料として有用な（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを製造する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）から（５）の理化学的性質を有するポリペプチド：
（１）作用：ＮＡＤＨを補酵素として、１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンに作用して、（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを生成する、
（２）分子量：ゲル濾過分析において約３４０，０００、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約４３，０００、
（３）至適温度：６０℃〜７０℃、
（４）還元至適ｐＨ：６．０、
（５）酸化至適ｐＨ：９．０。
【請求項２】
１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンに耐性である請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
セルロモナス・スピーシーズ（Cellulomonas sp.）ＫＮＫ０１０２株由来である請求項１または２記載のポリペプチド。
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド：
（ａ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンを立体選択的に還元して（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを生成する酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項６】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号２に示した塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンを立体選択的に還元して、（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを生成する酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項５または６に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項８】
図２に示すプラスミドｐＴＳＣＳである請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項９】
請求項７または８に記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換して得られた形質転換体。
【請求項１０】
前記宿主細胞が大腸菌である請求項９記載の形質転換体。
【請求項１１】
Escherichia coli HB101(pTSCS)(FERM BP-10024)である請求項１０記載の形質転換体。
【請求項１２】
請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチド、または、請求項９から１１のいずれかに記載の形質転換体の培養物を、カルボニル基を有する化合物と反応させることを特徴とする、光学活性アルコールの製造方法。
【請求項１３】
１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンから（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを製造する請求項１２記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ポリペプチド、該ポリペプチドをコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター、該ベクターを含む形質転換体、及び該形質転換体を用いた光学活性アルコールの製造方法に関する。【０００２】
より詳細には、本発明は、１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンを立体選択的に還元して（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを生成する酵素活性を持つ微生物より単離された、該酵素活性を有するグリセロール脱水素酵素、該酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む発現ベクター、及び該発現ベクターで形質転換された形質転換体に関する。本発明はまた、医薬品等の中間体として有用な（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールの製造方法に関する。【０００３】
グリセロール脱水素酵素は、酸化型ニコチンアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ+）または酸化型ニコチンアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰ）を補酵素として、グリセロールからジヒドロキシアセトンを生成する反応、及び、還元型ニコチンアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨ）または還元型ニコチンアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰＨ）を補酵素として、α−ヒドロキシケトン類のカルボニル基を立体選択的に還元する反応を触媒する酵素である。【０００４】
グリセロール脱水素酵素は、グリセロール等の定量に利用し得るほか、医薬等の合成原料として有用な光学活性１，２−ジオール類を生成する際の触媒としても利用し得る産業上有用な酵素である。
【背景技術】
【０００５】
グリセロール脱水素酵素は、緑藻、酵母、カビ、細菌、放線菌などにおいてその存在が知られており、具体的には、キャンディダ・バリダ（Candida valida：非特許文献１）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe：非特許文献２）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger：非特許文献３）、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans：非特許文献３）、バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus：非特許文献４）、セルロモナス・スピーシーズ（Cellulomonas sp.）  ＮＴ３０６０（非特許文献５）、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli：非特許文献６）、及びラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum：特許文献１）に由来する酵素などが報告されている。【０００６】
これらのうち、シゾサッカロマイセス・ポンベ、バシラス・ステアロサーモフィラス、エシェリヒア・コリ由来のグリセロール脱水素酵素については全アミノ酸配列が明らかとされているものの、本発明の酵素のアミノ酸配列とは明らかに異なる。【０００７】
一方、セルロモナス属微生物由来のグリセロール脱水素酵素については、前記セルロモナス・スピーシーズ  ＮＴ３０６０由来の酵素について、Ｎ末端の１アミノ酸とＣ末端の２アミノ酸が決定されているものの、全アミノ酸配列については報告されていない。【０００８】
また、（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールの製造方法としては、１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンをＳＩＧＭＡ社製のセルロモナス・スピーシーズ由来グリセロール脱水素酵素（特許文献２）、または、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）  ＩＦＯ１２４６８由来のグリセロール脱水素酵素遺伝子を導入した組換え大腸菌（特許文献３）を用いて立体選択的に還元する方法が知られている。しかしながら、前者は高価な市販酵素を用いなければならず、後者は基質である１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンに対する安定性が低いことから、基質仕込み濃度及び基質から生成物への変換率が低いなど、工業的な利用において大きな問題を抱えている。
【特許文献１】特開平１０−１１３１７０
【特許文献２】ＷＯ０３／０１８５２３
【特許文献３】特開平１５−６１６６８
【非特許文献１】J. Gen. Microbiol., 130, 3225 (1984)
【非特許文献２】J. Gen. Microbiol., 131, 1581 (1985)
【非特許文献３】J. Gen. Microbiol., 136, 1043 (1990)
【非特許文献４】Biochim. Biochem. Acta, 994, 270 (1989)
【非特許文献５】Agric. Biol.Chem., 48, 1603 (1982)
【非特許文献６】J. Bacteriol., 140, 182 (1979)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンを立体選択的に還元し、（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを生成し得るポリペプチドを提供することを課題とする。また、本発明は、遺伝子組換え技術を利用して該ポリペプチドを効率よく生産することを課題とする。さらに、本発明は、該形質転換体を用いた実用的な（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンを立体選択的に還元し、（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを生成し得る新規なポリペプチドを見出た。また、当該ポリペプチド、又は、当該ポリペプチドを生産し得る形質転換体を用いることにより、（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを効率良く製造することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち本発明は、以下の（１）から（５）の理化学的性質を有するポリペプチドである：
（１）作用：ＮＡＤＨを補酵素として、１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンを立体選択的に還元して（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを生成する、
（２）分子量：ゲル濾過分析において約３４０，０００、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約４３，０００、
（３）至適温度：６０℃〜７０℃、
（４）還元至適ｐＨ：６．０、
（５）酸化至適ｐＨ：９．０。【００１２】
また本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドである：
（ａ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンを立体選択的に還元して（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを生成する酵素活性を有するポリペプチド。【００１３】
さらに本発明は、これらポリペプチドをコードするＤＮＡである。【００１４】
また本発明は、配列表の配列番号２で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンを立体選択的に還元して（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを生成する酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。【００１５】
また本発明は、配列表の配列番号２で示される塩基配列と少なくとも６０％の配列同一性を有し、かつ、１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンを立体選択的に還元して（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを生成する酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡでもある。【００１６】
さらに本発明は、これらＤＮＡを含む発現ベクター、及び当該発現ベクターを含む形質転換体でもある。【００１７】
また本発明は、上記ポリペプチド又は上記形質転換体の培養物を、カルボニル基を有する化合物と反応させる工程、並びに、生成した光学活性アルコールを採取する工程からなる光学活性アルコールの製造方法でもある。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、新規なグリセロール脱水素酵素、該酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを有する形質転換体を提供する。また、該酵素、該形質転換体を用いることにより、カルボニル基を有する化合物からの光学活性なアルコール類、なかでも（Ｓ）−３−クロロー１，２−プロパンジオールの効率的な製造が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＲＣＧをコードする遺伝子の塩基配列及びＲＣＧの推定アミノ酸配列。
【図２】組換えベクターｐＴＳＣＳ、ｐＴＳＣＳＧ１の構築。
【図３】ＲＣＧの１−クロロ−３−ヒドロキシアセトン、３−クロロ−１，２−プロパンジオールに対する安定性。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明について詳述する。【００２１】
本発明のポリペプチドは、１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンを立体選択的に還元して、（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを生成する活性を有する微生物から取得することができる。ポリペプチドの起源として用いられる微生物としては、例えば、セルロモナス・スピーシーズ（Cellulomonas sp.）ＫＮＫ０１０２株があげられる。上記ＫＮＫ０１０２株は、本発明者らによって土壌から分離された微生物である。【００２２】
以下に、セルロモナス・スピーシーズ（Cellulomonas sp.）ＫＮＫ０１０２株の菌学的性質を示す。【００２３】
Ａ．形態
（１）細胞の大きさは０．５〜０．７×１．５〜２．０μｍの不規則な桿状。
（２）１本の鞭毛を有し運動性がある。
（３）胞子はない。
（４）グラム染色：陽性
（５）コロニーの形態：円形、凸状、全縁滑らか、黄色
Ｂ．生理学的性質
（１）ゼラチンの加水分解：陽性
（２）デンプンの加水分解：陽性
（３）硝酸塩の還元：陽性
（４）カタラーゼ活性：陽性
（５）オキシダーゼ活性：陰性
（６）ウレアーゼ活性：陰性
（７）ＤＮＡｓｅ活性：陽性
（８）アミノペプチダーゼ活性：陰性
（９）セルロース分解性：陰性
（１０）Ｖｏｇｅｓ−Ｐｒｏｓｋａｕｅｒ試験：陰性
（１１）メチルレッド試験：陰性
（１２）Ｏ−Ｆ試験：発酵
（１３）炭水化物の分解：果糖、ガラクトース、ブドウ糖、グリコーゲン、マルトース、デンプン、ショ糖、キシロースからは嫌気条件で酸を生成し、グリセリン、乳糖、マンニトール、マンノースからは酸を生成しない。【００２４】
本発明のポリペプチドを生産する微生物は、野生株または変異株のいずれでもあり得る。あるいは、細胞融合または遺伝子操作などの遺伝学的手法により誘導された微生物も用いられ得る。遺伝子操作された本発明のポリペプチドを生産する微生物は、例えば、これらの酵素を単離及び／または精製して酵素のアミノ酸配列の一部または全部を決定する工程、このアミノ酸配列に基づいてポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を決定する工程、この塩基配列に基づいてポリペプチドをコードするＤＮＡを得る工程、このＤＮＡを適当な宿主微生物に導入して組換え微生物を得る工程、及びこの組換え微生物を培養して本発明の酵素を得る工程、を包含する方法により得らる。【００２５】
本発明のポリペプチドとしては、例えば、以下の（１）〜（５）の理化学的性質を有するポリペプチドを挙げることができる：
（１）作用：ＮＡＤＨを補酵素として、１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンを立体選択的に還元して（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを生成する、
（２）分子量：ゲル濾過分析において約３４０，０００、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約４３，０００、
（３）至適温度：６０℃〜７０℃、
（４）還元至適ｐＨ：６．０、
（５）酸化至適ｐＨ：９．０。【００２６】
酵素の還元活性は、例えば、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質２０ｍＭ、補酵素ＮＡＤＨ  ０．１６７ｍＭ、及び酵素溶液を添加し、３０℃で波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより行ない得る。【００２７】
酵素の酸化活性は、例えば、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、基質０．１Ｍ、補酵素ＮＡＤ+  ２ｍＭ、及び酵素溶液を添加し、３０℃で波長３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行ない得る。【００２８】
酵素の分子量の測定は、例えばSuperdex 200HR10/30（Pharmacia Biotech社製）カラムを用いたゲル濾過分析により、標準タンパク質の相対溶出時間から算出することにより決定し得る。また、サブユニットの分子量は、２０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、標準タンパク質の相対移動度から算出することにより決定し得る。【００２９】
酵素の至適ｐＨ、至適温度は、例えば、上記還元活性測定系において反応ｐＨ、反応温度を変えて活性を測定することによって決定し得る。【００３０】
本発明のポリペプチドは、１−クロロ−３−ヒドロキシアセトン及び３−クロロ−１，２−プロパンジオールに対し耐性を有する。すなわち、本発明のポリペプチドは、１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンを立体選択的に還元して（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを生成する反応において、基質阻害及び／又は生成物阻害を受けにくく、（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールの製造に好適である。【００３１】
ここで、「１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンに対して耐性を有する」とは、本発明のポリペプチド（酵素）溶液に１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンを０．２５％となるように添加し、３０℃で２０Ｈｒインキュベートした後に、上記条件で１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンの還元活性を測定した場合に、前処理を行わずに測定した場合に比べて、８０％以上、好ましく８５％以上、より好ましくは９０％以上の活性を示すことを意味する。【００３２】
同様に、「３−クロロ−１，２−プロパンジオールに対して耐性を有する」とは、１％の３−クロロ−１，２−プロパンジオールの存在下に３０℃で２０Ｈｒインキュベートした後に１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンの還元活性を測定した場合に、前処理を行わずに測定した場合に比べて、８０％以上、好ましく９０％以上、より好ましくは９５％以上の活性を示すことを意味する。【００３３】
また、本発明のポリペプチドとしては、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよく、または、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンを立体選択的に還元して（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを生成する酵素活性を有するポリペプチドであってもよい。【００３４】
配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列中において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Current Protocols in Molecular Biology（John Wiley and Sons, Inc., 1989）等に記載の公知の方法に準じて調製することができ、１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンを立体選択的に還元して（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを生成する酵素活性を有する限り本発明のポリペプチドに包含される。【００３５】
配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において、アミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加される場所は特に制限されないが、高度保存領域を避けるのが好ましい。ここで、高度保存領域とは、由来の異なる複数のデヒドロゲナーゼついて、アミノ酸配列を最適に整列させて比較した場合に、複数の配列間でアミノ酸が一致している位置を表す。高度保存領域は、配列番号１に示したアミノ酸配列と、前述した他のバシラス・ステアロサーモフィラスやエシェリヒア・コリ由来のグリセロール脱水素酵素のアミノ酸配列とを、ＧＥＮＥＴＹＸ等のツールを用いて比較することにより確認することができる。【００３６】
置換、挿入、欠失及び／又は付加により改変されたアミノ酸配列としては、１種類のタイプ（例えば置換）の改変のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。【００３７】
また、置換の場合には、置換後のアミノ酸はもとのアミノ酸の同族アミノ酸であるのが好ましい。ここでは、以下に挙げる各群の同一群内のアミノ酸を同族アミノ酸とする。
（第１群）Leu, Ile, Val, Met, His, Trp, Tyr, Phe
（第２群）Glu, Gln, Asp, Asn
（第３群）Ser, Thr, Cys, Gly, Ala, Pro
（第４群）Lys, Arg【００３８】
置換、挿入、欠失及び／または付加されるアミノ酸の数としては、改変後のポリペプチドが１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンを立体選択的に還元して（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを生成する酵素活性を有する限り、特に制限されないが、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と、配列同一性が８０％であることが好ましい。配列同一性９０％以上がより好ましく、９５％以上が更に好ましく、９９％以上がより最も好ましい。配列同一性は、前記の高度保存領域の確認と同様にして、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列と改変されたアミノ酸配列とを比較し、両方の配列でアミノ酸が一致した位置の数を比較総アミノ酸数で除し、さらに１００を乗じた値で表される。【００３９】
本発明のポリヌクレオチドとしては、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであればいずれも用いることができる。例えば、配列表の配列番号２に示した塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は、配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドをあげることができる。【００４０】
ここで、「配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味する。【００４１】
ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning, A laboratory manual, second edition （Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより取得できるポリヌクレオチドをあげることができる。好ましくは６５℃で０．５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、より好ましくは６５℃で０．２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、更に好ましくは６５℃で０．１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄することにより取得できるポリヌクレオチドである。【００４２】
上記の条件にてハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、配列番号２に示されるポリヌクレオチドと、配列同一性が６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のポリヌクレオチドをあげることができ、コードされるポリペプチドが１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンを立体選択的に還元して（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを生成する活性を有する限り、本発明のポリヌクレオチドに包含される。【００４３】
ここで、「配列同一性（％）」とは、対比される２つのポリヌクレオチドを最適に整列させ、核酸塩基(例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ)が両方の配列で一致した位置の数を比較塩基総数で除し、そして、この結果に１００を乗じた数値で表される。【００４４】
配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る：GCG Wisconsin Package（Program Manual for The Wisconsin Package, Version8, 1994年9月, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Medison, Wisconsin, USA 53711; Rice, P. (1996) Program Manual for EGCG Package, Peter Rice, The Sanger Centre, Hinxton Hall, Cambridge, CB10 1RQ, England）、及び、the ExPASy World Wide Web分子生物学用サーバー（Geneva University Hospital and University of Geneva, Geneva, Switzerland）。【００４５】
以下に、セルロモナス・スピーシーズ（Cellulomonas sp.）ＫＮＫ０１０２株より、本発明のポリペプチド（酵素）を取得する方法の例を記載するが、本発明はこれに限定されない。【００４６】
まず、１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンを立体選択的に還元して（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールを生成する酵素を有する微生物を適切な培地で培養する。培養方法としては、その微生物が増殖する限り、通常の炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地が用いられ得る。培養は、例えば、温度２５℃から３７℃、ｐＨ４〜８で振とうもしくは通気することで行い得る。【００４７】
培養液から菌体を遠心分離した後、菌体を適当な緩衝液中に懸濁し、該菌体をグラスビーズ等の物理的手法、酵素などの生化学的手法などを用いて破砕または溶解し、更に遠心分離により該溶液中の固形物を除去することにより、酵素の粗酵素液を得ることができる。また、粗酵素液を当業者が通常用いる手法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、透析、クロマトグラフィー等の方法を単独でまたは組み合わせて更に精製することができる。クロマトグラフィーは、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーを単独で、または組み合わせて用いることもできる。【００４８】
以下に、本発明の酵素をコードするＤＮＡを取得する方法の例を記載するが、本発明はこれに限定されない。【００４９】
様々なグリセロール脱水素酵素に共通して存在するアミノ酸の保存配列をもとにして、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）プライマーを合成する。次に、該ＤＮＡの起源となる微生物より、通常のＤＮＡ単離法、例えばHereford法（Cell, 18, 1261 (1979)）により、該微生物の染色体ＤＮＡを調製する。この染色体ＤＮＡを鋳型として、先述のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅（コア配列）し、塩基配列の決定を行う。塩基配列の決定はジデオキシ・チェイン・ターミネーション法等により決定し得る。例えば、ABI 373A DNA Sequencer（Applied Biosystems社製）等を用いて行われ得る。【００５０】
コア配列の周辺領域の塩基配列を明らかにするためには、該微生物の染色体ＤＮＡを、コア配列中にその認識配列が存在しない制限酵素により消化し、生成したＤＮＡ断片をＴ４リガーゼにより自己環化させることにより逆ＰＣＲ（Inverse PCR: Nucleic Acids Res., 16, 8186 (1988)）用の鋳型ＤＮＡを調製する。次に、コア配列をもとに、コア配列の外側に向かうＤＮＡ合成の開始点となるプライマーを合成し、逆ＰＣＲによりコア配列の周辺領域を増幅する。こうして得られたＤＮＡの塩基配列を明らかにすることにより、目的グリセロール脱水素酵素の全コード領域のＤＮＡ配列を明らかにし得る。【００５１】
本発明の酵素のＤＮＡを宿主微生物内に導入し、それをその導入された宿主微生物内で発現させるために用いられるベクターＤＮＡとしては、適切な宿主微生物内で該酵素遺伝子を発現できるものであればいずれもが用いられ得る。このようなベクターＤＮＡとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられる。また、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用され得る。【００５２】
このようなベクターは、作動可能に連結されたプロモーター（ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等）の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に用いられ得る。例えば、ｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３）等が好適に用いられ得る。【００５３】
本明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。【００５４】
本明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子が発現するように、ＤＮＡが、その発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントとが宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。【００５５】
本発明のＤＮＡを有するベクターを導入する宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などが挙げられるが、大腸菌が特に好ましい。本発明のＤＮＡは定法により宿主細胞に導入し得る。宿主細胞として大腸菌を用いた場合、例えば塩化カルシウム法により、本発明のＤＮＡを導入することができる。【００５６】
本発明の酵素もしくは該酵素の生産能を有する組換え体を用いて、カルボニル基を有する化合物を立体選択的に還元して光学活性アルコールを取得する場合、補酵素としてＮＡＤＨが必要となる。反応系にＮＡＤＨを必要な量だけ添加しても実施し得る。しかし、酸化された該補酵素（ＮＡＤ+）を還元型（ＮＡＤＨ）に変換する能力（以後補酵素再生能力と呼ぶ）を有する酵素をその基質と共に、つまり、補酵素再生系を本発明の酵素と組み合わせて反応を行うことにより、高価な補酵素の使用量を大幅に削減することができる。補酵素再生能力を有する酵素としては、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素及びグルコース脱水素酵素等を用いることができる。好適には、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素が用いられる。このような反応は、補酵素再生系を不斉還元反応系内に添加することによっても行われ得るが、本発明の酵素をコードするＤＮＡ及びグルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡの両者により形質転換された形質転換体を触媒とした場合は、補酵素再生能を有する酵素を別に調製し反応系内に添加しなくても、効率的に反応を行うことができる。このような形質転換体は、本発明の酵素をコードするＤＮＡ及びグルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡを、同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られる他、これら２種類のＤＮＡを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それらを同一の宿主細胞に導入することによっても得られ得る。【００５７】
本発明の酵素又は形質転換体の培養物を用いたカルボニル基を有する化合物からの光学活性アルコールの生産は以下のように実施され得る。但し、以下の方法に限定されるわけではない。【００５８】
まず最初に、適当な溶媒中に基質となるカルボニル基を有する化合物、ＮＡＤ+等の補酵素、及び該形質転換体の培養物を添加し、ｐＨ調整下、攪拌して反応させる。この反応は１０〜７０℃の温度で行われ、反応中反応液のｐＨは４〜１０に維持する。反応はバッチ式あるいは連続方式で行われ得る。バッチ方式の場合は、反応基質は０．１％〜７０％（ｗ／ｖ）の仕込み濃度で添加され得る。【００５９】
本明細書で用いられる用語「培養物」は、微生物の菌体、菌体を含む培養液または菌体の処理物を表す。菌体の処理物としては、例えば、アセトンや五酸化二リンによる脱水処理またはデシケーターや扇風機を利用した乾燥によって得られる乾燥菌体、界面活性剤処理物、溶菌酵素処理物、固定化菌体または菌体を破砕した無細胞抽出標品などをあげることができる。更に、培養物より不斉還元反応を触媒する酵素を精製し、これを使用してもよい。【００６０】
また、本反応を行う際、形質転換体として本発明の酵素とグルコース脱水素酵素の両者を生産するものを用いる場合、反応系に更にグルコースを添加することによって、補酵素の使用量を大幅に減らすことが可能となる。【００６１】
上記のいずれかの方法で得られる光学活性なアルコール類の採取は、特に限定されないが、反応液から直接、あるいは菌体等を分離後、酢酸エチル、トルエン、ｔ−ブチルメチルエーテル、ヘキサン等の溶剤で抽出し、脱水後、蒸留、晶析あるいはシリカゲルカラムクロマトグラフィー等により精製すれば高純度の光学活性なアルコール類を容易に得ることが出来る。
【実施例】
【００６２】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。なお、以下の記載において、「％」は特に断らない限り「重量％」を意味する。【００６３】
（実施例１）新規グリセロール脱水素酵素のクローニング
グリセロール脱水素酵素に共通して存在するアミノ酸の保存配列をもとに、そのアミノ酸配列から予測されるＤＮＡ配列を考慮して、プライマー１（５’−ＡＣＮＧＡＹＧＡＲＧＧＮＧＭＮＴＴＹＧＡ−３’：配列番号３）及びプライマー２（５’−ＧＧＣＡＴＮＴＫＲＴＧＤＡＴＮＧＴＹＴＣ−３’：配列番号４）を合成した。プライマー２種（プライマー１及びプライマー２）各２００ｐｍｏｌ、セルロモナス・スピーシーズ（Cellulomonas sp.）ＫＮＫ０１０２株の染色体ＤＮＡ１．２μｇ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）２．５Ｕを含む ＥｘＴａｑ用緩衝液５０μｌを調製し、熱変性（９７℃、０．５分）、アニーリング（４５℃、１分）、伸長反応（７２℃、１分）を３０サイクル行い、４℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。【００６４】
本反応に用いたセルロモナス・スピーシーズＫＮＫ０１０２株の染色体ＤＮＡの調製は、分子生物学実験プロトコール１（丸善）Ｐ．３６に記載されている細菌ゲノムＤＮＡの少量調製法により行なった。増幅ＤＮＡをｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｖｅｃｔｏｒ（Novagen社製）にサブクローニングし、その塩基配列を決定した。その結果、増幅ＤＮＡはプライマー配列を除いて５８６塩基からなっていた。その配列は、図１に示したＤＮＡ配列において、二重下線を引いたＤＮＡ配列部分である。以後この配列を「コア配列」と記す。【００６５】
コア配列の５’−側に近い部分の塩基配列をもとに、その相補配列となるプライマー３（５’−ＴＴＣＴＣＣＣＡＧＡＧＧＡＴＧＴＣＣＣＡＣＧＡＧ−３’：配列番号５）を作成し、更に３’−側に近い部分の塩基配列をもとに、プライマー４（５’−ＡＧＡＴＣＧＡＧＧＡＧＴＴＣＧＴＧＣＧＣＴＴＣＡ−３’：配列番号６）を作製した。逆ＰＣＲの鋳型として、まずセルロモナス・スピーシーズＫＮＫ０１０２株の染色体ＤＮＡを制限酵素ＸｍａＩにより消化し、その消化物をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて自己閉環した。この自己閉環物３８５ｎｇ、プライマー２種（プライマー３及びプライマー４）各５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）２．５Ｕを含む ＥｘＴａｑ用緩衝液５０μｌを調製し、熱変性（９７℃、０．５分）、アニーリング（７０℃、１分）、伸長反応（７２℃、５分）を３５サイクル行い、４℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。【００６６】
増幅ＤＮＡをｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｖｅｃｔｏｒ（Novagen社製）にサブクローニングし、その塩基配列を決定した。この結果とコア配列の結果より、セルロモナス・スピーシーズ  ＫＮＫ０１０２株由来のグリセロール脱水素酵素（以後、本酵素をＲＣＧと呼ぶ）をコードする遺伝子の全塩基配列を決定した。全塩基配列及び該遺伝子がコードする推定アミノ酸配列を図１にまとめた。【００６７】
（実施例２）ＲＣＧ遺伝子を含む組換えベクターの作製
大腸菌においてＲＣＧを発現させるために、形質転換に用いる組換えベクターを作製した。まず、ＲＣＧ遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加し、かつ終始コドンの直後に新たな終始コドンとＥｃｏＲＩ部位を付加した二本鎖ＤＮＡを以下の方法により取得した。【００６８】
実施例１で決定した塩基配列に基づき、ＲＣＧ遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加したプライマー５（５’−ＧＡＴＣＡＴＡＴＧＴＣＣＧＡＧＧＴＴＣＣＣＧＴＣＣＧＣ−３’：配列番号７）、及びＲＣＧ遺伝子の終始コドンの直後に新たな終始コドン（ＴＡＡ）とＥｃｏＲＩ部位を付加したプライマー６（５’−ＣＴＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＣＡＧＴＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＣＴＴＧＡＣ−３’：配列番号８）を合成した。プライマー２種（プライマー５及びプライマー６）各５０ｐｍｏｌ、セルロモナス・スピーシーズＫＮＫ０１０２株の染色体ＤＮＡ  ９５０ｎｇ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）２．５Ｕを含む ＥｘＴａｑ用緩衝液５０μｌを調製し、熱変性（９７℃、０．５分）、アニーリング（６５℃、１分）、伸長反応（７２℃、１分）を３５サイクル行い、４℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。この増幅断片をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより、組換えベクターｐＮＴＣＳを得た。【００６９】
（実施例３）ＲＣＧ遺伝子上流へのＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列の付加
ＲＣＧ遺伝子を大腸菌内で高発現させるため、実施例２で調製したプラスミドｐＮＴＣＳ中の同遺伝子の開始コドンの上流に大腸菌のＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（９塩基）を新たに付加したプラスミドを以下の方法により取得した。【００７０】
まず、ＰＣＲ法により実施例２で使用した大腸菌発現ベクターｐＵＣＮＴのＮｄｅＩ部位中のＧをＴに変換し、プラスミドｐＵＣＴを構築した。次に、実施例１で決定した塩基配列に基づき、ＲＣＧ遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（９塩基）を、さらにその直前にＥｃｏＲＩ部位を付加したプライマー７（５’−ＧＣＣＧＡＡＴＴＣＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＡＡＣＡＡＴＧＴＣＣＧＡＧＧＴＴＣＣＣＧＴＣＣＧ−３’：配列番号９）、及びＲＣＧ遺伝子の終始コドンの直後に新たな終始コドン（ＴＡＡ）とＢａｍＨＩ部位を付加したプライマー８（５’−ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＡＧＴＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＣＴＴＧＡ−３’：配列番号１０）を合成した。プライマー２種（プライマー７及びプライマー８）各５０ｐｍｏｌ、セルロモナス・スピーシーズＫＮＫ０１０２株の染色体ＤＮＡ  ９５０ｎｇ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）２．５Ｕを含む ＥｘＴａｑ用緩衝液５０μｌを調製し、熱変性（９７℃、０．５分）、アニーリング（６５℃、１分）、伸長反応（７２℃、１分）を３５サイクル行い、４℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。この増幅断片をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、プラスミドｐＵＣＴのｌａｃプロモーターの下流のＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ部位に挿入することにより、組換えベクターｐＴＳＣＳを得た。ｐＴＳＣＳの作製法及び構造を図２に示す。【００７１】
（実施例４）ＲＣＧ遺伝子及びグルコース脱水素酵素遺伝子の両者を同時に含む組換えベクターの作製
バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ＩＡＭ１０３０株由来のグルコース脱水素酵素（以後ＧＤＨと記す）の遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（９塩基）を、更にその直前にＢａｍＨＩ部位を、また、終始コドンの直後にＰｓｔＩ部位を付加した二本鎖ＤＮＡを、以下の方法により取得した。【００７２】
ＧＤＨ遺伝子の塩基配列情報を基に、ＧＤＨの構造遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（９塩基）を、更にその直前にＢａｍＨＩ部位を付加したプライマー９（５’−ＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＡＡＣＡＡＴＧＴＡＴＡＡＡＤＡＴＴＴＡＧＡＡＧＧ−３’：配列番号１１）と、終始コドンの直後にＰｓｔＩ部位を付加したプライマー１０（５’−ＧＣＧＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＣＣＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴＴＧＧＡ−３’：配列番号１２）を常法に従って合成した。これら２つのプライマーを用いて、プラスミドｐＧＤＫ１（Eur. J. Biochem., 186, 389 (1989)）を鋳型としてＰＣＲによる二本鎖ＤＮＡを合成した。得られたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで消化し、実施例３において構築したｐＴＳＣＳのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ部位に挿入し、組換えベクターｐＴＳＣＳＧ１を得た。ｐＴＳＣＳＧ１の作製法及び構造を図２に示す。【００７３】
（実施例５）組換え大腸菌の作製
実施例３で得た組換えベクターｐＴＳＣＳ及び実施例４で得た組換えベクターｐＴＳＣＳＧ１を用いて大腸菌ＨＢ１０１（宝酒造社製）を形質転換し、組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＴＳＣＳ）及びＨＢ１０１（ｐＴＳＣＳＧ１）を得た。こうして得られた形質転換体である大腸菌ＨＢ１０１（ｐＴＳＣＳ）は、受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２４として２００４年５月１２日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。【００７４】
（実施例６）組換え大腸菌におけるＲＣＧの発現
実施例５で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＴＳＣＳ）、ＨＢ１０１（ｐＴＳＣＳＧ１）、及びベクタープラスミドのみの形質転換体である大腸菌ＨＢ１０１（ｐＵＣＴ）のそれぞれを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（バクト・トリプトン  １．６％、バクト・イーストエキス  １．０％、ＮａＣｌ  ０．５％、ｐＨ７．０）で培養し、集菌後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁し、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて超音波破砕し無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のＲＣＧ活性の測定は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質１−クロロ−３−ヒドロキシアセトン  ２０ｍＭ、補酵素ＮＡＤＨ  ０．１６７ｍＭ及び酵素溶液を添加し、３０℃で波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより行った。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨをＮＡＤ+に酸化する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。【００７５】
またＧＤＨ活性の測定は、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、基質グルコース  ０．１Ｍ、補酵素ＮＡＤＰ+  ２ｍＭ及び酵素を添加し、２５℃で波長３４０ｍＭの吸光度の増加を測定することにより行った。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰ+をＮＡＤＰＨに還元する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。【００７６】
表１に示すように、大腸菌ＨＢ１０１（ｐＴＳＣＳ）及びＨＢ１０１（ｐＴＳＣＳＧ１）では、ベクタープラスミドのみの形質転換体である大腸菌ＨＢ１０１（ｐＵＣＴ）と比較してＲＣＧ活性の増加が認められた。【００７７】
【表１】
2005123921.tif 000002
【００７８】
（実施例７）組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＴＳＣＳ）からのＲＣＧの精製
バクト・トリプトン  １．６％、バクト・イーストエキス  １．０％、ＮａＣｌ  ０．５％の組成からなる液体培地（ｐＨ７．０）６０ｍｌを坂口フラスコに分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。この液体培地に１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加し、組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＴＳＣＳ）を植菌後、３７℃で３０時間振とう培養を行った。得られた培養液６０ｍｌについて、遠心分離により菌体を集め、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１２０ｍｌで洗浄し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）６０ｍｌに懸濁した。そして、菌体をＳＯＮＩＦＩＲＥ２５０（ＢＲＡＮＳＯＮ社製）を用いて超音波破砕し、遠心分離にて菌体残渣を除き、無細胞抽出液６０ｍｌを取得した。これを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）であらかじめ平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  Ｓｕｐｅｒ−Ｑ  ６５０Ｓ（東ソー社製）カラム（１２５ｍｌ）に供して酵素を吸着させた後、塩化ナトリウム濃度のリニアグラジエント（０ｍＭから４００ｍＭまで）により溶出を行い、１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンの還元活性を有する画分を取得した。本精製操作により、電気泳動的に単一な精製酵素標品を得た。ＳＤＳ電気泳動におけるバンドの分子量は約４３，０００であった。【００７９】
（実施例８）ＲＣＧの性質の測定
得られたＲＣＧの酵素化学的性質について調べた。【００８０】
（１）作用
ＮＡＤＨを補酵素として、１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンに作用して、光学純度９９．３％ｅ．ｅ．の（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールへ還元した。【００８１】
（２）分子量
溶離液として１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用い、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ＨＲ１０／３０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）による精製酵素のゲル濾過クロマトグラフィー分析を行なった結果、標準タンパク質との相対保持時間から算出した本酵素の分子量は約３４０，０００であった。【００８２】
（３）至適温度
ＲＣＧの作用至適温度を調べるため、１０〜７０℃におけるグリセロール酸化活性を測定した。活性測定は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、基質グリセロール  ０．１Ｍ、補酵素ＮＡＤ+  ２ｍＭ及び酵素溶液を添加し、１０〜７０℃で３分間反応させ、波長３４０ｍＭの吸光度の増加を測定することにより行った。その結果、至適温度は６０〜７０℃であった。【００８３】
（４）還元至適ｐＨ
ＲＣＧの還元至適ｐＨを調べるため、ｐＨ４〜９におけるジヒドロキシアセトン還元活性を測定した。酵素活性は、緩衝液に基質ジヒドロキシアセトン  １０ｍＭ、補酵素ＮＡＤＨ  ０．１６７ｍＭ、ＫＣｌ  ５０ｍＭ、ＮＨ4Ｃｌ  ５０ｍＭ及び酵素溶液を添加し、３０℃で３分間反応させ、波長３４０ｍＭの吸光度の減少を測定することにより行った。緩衝液として１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０〜６．０）、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）、及び１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０〜９．０）を用いて、ｐＨ４〜９の範囲で活性を測定した。その結果、還元至適ｐＨは６．０であった。【００８４】
（５）酸化至適ｐＨ
ＲＣＧの酸化至適ｐＨを調べるため、ｐＨ６〜１１におけるグリセロール酸化活性を測定した。酵素活性は、緩衝液に基質グリセロール  ０．１Ｍ、補酵素ＮＡＤ+  ２ｍＭ、ＫＣｌ  ５０ｍＭ、ＮＨ4Ｃｌ  ５０ｍＭ及び酵素溶液を添加し、３０℃で３分間反応させ、波長３４０ｍＭの吸光度の増加を測定することにより行った。緩衝液として１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）、１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０〜９．０）、及び１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０〜１１．０）を用いて、ｐＨ６〜１１の範囲で活性を測定した。その結果、酸化至適ｐＨは９．０であった。【００８５】
（実施例９）ＲＣＧの基質特異性
酸化活性の測定は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に補酵素ＮＡＤ+  ２ｍＭ、表２に示した化合物１０ｍＭ及び酵素溶液を添加し、３０℃で３分間反応させ波長３４０ｍＭの吸光度の増加を測定することにより行った。表２にグリセロールに対する活性を１００とした場合の相対活性をまとめた。【００８６】
【表２】
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【００８７】
（実施例１０）ＲＣＧ遺伝子を導入した組換え大腸菌を用いた１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンからの（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールの合成
実施例６で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＴＳＣＳ）の無細胞抽出液１ｍｌに、グルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）１００ｕｎｉｔｓ、１−クロロ−３−ヒドロキシアセトン  １０ｍｇ、ＮＡＤ+  １ｍｇ、グルコース  ２０ｍｇを添加し、３０℃で５時間振とうした。反応終了後、反応液を硫安飽和にし、酢酸エチルを加えて抽出を行ない、生成した（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールをキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。
［分析条件］
カラム：ＨＰ−５  ３０ｍ×０．３２ｍｍＩ．Ｄ．（Agilent Technologies社製）
検出：ＦＩＤ
カラム初期温度：５０℃、カラム最終温度：２００℃、昇温速度：６℃／ｍｉｎ
注入温度：１５０℃
検出温度：３００℃
キャリアーガス：ヘリウム（７０ｋＰａ）
スプリット比：１００／１
検出時間：１−クロロ−３−ヒドロキシアセトン  ８．２分、３−クロロ−１，２−プロパンジオール  １０．２分。【００８８】
また、生成した３−クロロ−１，２−プロパンジオールの光学純度は、トシル化後、高速液体クロマトクロマトグラフィー分析することにより測定した。
［分析条件］
カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ（ダイセル化学工業社製）
溶離液：ヘキサン／イソプロパノール＝９／１
流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ
検出：２３５ｎｍ
カラム温度：３０℃
溶出時間：Ｓ体２９分、Ｒ体３４分。
光学純度（％ｅ．ｅ．）＝（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）ｘ１００
（Ａ及びＢは対応する鏡像異性体量を表わし、Ａ＞Ｂである）。【００８９】
その結果、（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールの生成量は７．６ｍｇ、光学純度は９９．４％ｅ．ｅ．であった。【００９０】
（実施例１１）ＲＣＧ及びグルコース脱水素酵素を同時発現させた組換え大腸菌を用いた１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンからの（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールの合成
実施例６で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＴＳＣＳＧ１）の無細胞抽出液５０ｍｌに、グルコース１０ｇ、ＮＡＤ５ｍｇ、１−クロロ−３−ヒドロキシアセトン５ｇを添加した。この反応液を、５Ｍの水酸化ナトリウムの滴下によりｐＨ６．５に調整しつつ、３０℃で２４時間攪拌した。反応終了後、反応液を硫安飽和にし、酢酸エチルを加えて抽出を行ない、実施例１０と同様の方法で分析を行った。その結果、（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールの生成量は４．３ｇ、光学純度は９９．３％ｅ．ｅ．であった。【００９１】
（実施例１２）ＲＣＧの１−クロロ−３−ヒドロキシアセトン及び３−クロロ−１，２−プロパンジオールに対する安定性の評価
ＲＣＧの１−クロロ−３−ヒドロキシアセトン及び３−クロロ−１，２−プロパンジオールに対する安定性を調べるために、酵素溶液に１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンを０．２５％となるように添加して、３０℃でインキュベート後、その酵素溶液を用いて１−クロロ−３−ヒドロキシアセトン還元活性を測定した。また、３−クロロ−１，２−プロパンジオールについては１％となるように酵素溶液に添加して、３０℃でインキュベート後、１−クロロ−３−ヒドロキシアセトン還元活性を測定した。その結果、図３に示すように、１−クロロ−３−ヒドロキシアセトンをＳ体選択的に還元することが知られているセラチア・マルセセンス由来のグリセロール脱水素酵素ＲＳＧ（ＷＯ０３／０１８５２３）と比較して、ＲＣＧは１−クロロ−３−ヒドロキシアセトン及び３−クロロ−１，２−プロパンジオールに対して非常に安定であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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