(57)【要約】  本発明は、血管再狭窄などの血管閉塞性疾患に対する優れた予防又は治療を提供することを目的とする。この目的のため、本発明では、血管閉塞性疾患用医薬組成物を、RNA干渉によりミッドカイン遺伝子の発現を抑制する核酸コンストラクトと、コラーゲン分子と、を含有するものとする。コラーゲン分子の存在下にＲＮＡ干渉によりMKタンパク質の発現を抑制する核酸コンストラクトを用いることで、血管内膜肥厚に対して優れた抑制結果を得ることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
RNA干渉によりミッドカイン遺伝子の発現を抑制する核酸コンストラクトと、
コラーゲン分子と、
を含有する、血管閉塞性疾患用医薬組成物。
【請求項２】
前記核酸コンストラクトはsiRNAである、請求の範囲１に記載の血管閉塞性疾患用医薬組成物。
【請求項３】
前記コラーゲン分子は、アテロコラーゲン分子を含有する、請求の範囲１又は２に記載の血管閉塞性疾患用組成物。
【請求項４】
前記コラーゲン分子は、繊維化したコラーゲン分子を含む、請求の範囲１〜３のいずれかに記載の血管閉塞性疾患用組成物。
【請求項５】
粉末状、繊維状、溶液状、ゲル状、ぺレット状、フィルム状、スポンジ状及びチューブ状のいずれかである、請求の範囲１〜４のいずれかに記載の血管閉塞性疾患用組成物。
【請求項６】
血管再建術後の再狭窄、心臓の冠動脈、脳血管、腎血管、末梢の血管を含む血管の閉塞性疾患の予防又は治療用である、請求の範囲１〜５のいずれかに記載の血管閉塞性疾患用組成物。
【請求項７】
前記核酸コンストラクトは、配列番号：１１〜１４のいずれかに記載の配列をターゲット配列とする、請求の範囲１〜６のいずれかに記載の血管閉塞性疾患用組成物。
【請求項８】
血管治療用担体と、
該血管治療用担体の表面の少なくとも一部に保持される請求の範囲１〜７のいずれかに記載の血管閉塞性疾患用医薬組成物と、
を備える、血管閉塞性疾患用医療用材。
【請求項９】
前記担体はステントである、請求の範囲８に記載の血管閉塞性疾患用医療用材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管形成術後の血管再狭窄など血管の閉塞性疾患の予防・治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、心臓、血管病変が増加の一途をたどっている。なかでも、冠状動脈硬化を始めとする動脈硬化症などに起因する血管狭窄性の病変が増大している。例えば、冠状動脈における血管狭窄性病変に対しては、1977年に経皮的冠状動脈血管形成術（Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty；ＰＴＣＡ）が初めて行われてから、この方法は血管再生方法として普及した。経皮的冠状動脈血管形成術は、カテーテルの先端に装着したバルーンを狭窄部位で膨張させて血管を拡張し血流を再生する方法である。しかしながら、30〜60％の患者が6ヶ月以内に再生部位において再狭窄を起こし、経皮的冠状動脈血管形成術の有効性を低下させていた。ＰＴＣＡに、さらに狭窄部位に拡張した血管を維持するためのステントを留置するステント留置術を併用することで、再狭窄の発生率を低減することはできるが、ステント留置部位における再狭窄率は依然として15〜20％程度であり、複合的な疾患を有する患者については30〜60％を超える場合もあった。さらに末梢動脈の閉塞性疾患に対しては静脈グラフト術を施すが、これに関しても再狭窄が20％程度の割合で起こる。【０００３】
また、増殖・分化因子であるミッドカイン(MK)の発現をリポソームを用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドによって抑制することなども試みられている（Hayashi et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2005 May;288(5):H2203-9. Epub 2005 Jan 6.）。同様に、リポソームを用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドをイヌのグラフトモデルに適用することも試みられている（Matsumoto T, Komori K, Yonemitsu Y, Morishita R, Sueishi K, Kaneda Y, Sugimachi K. Hemagglutinating virus of Japan-liposome-mediated gene transfer of endothelial cell nitric oxide synthase inhibits intimal hyperplasia of canine vein grafts under conditions of poor runoff. J Vasc Surg. 1998; 27: 135-144：論文の49）。さらに、哺乳動物の体温付近でゲル化するpluronic gel（BASF株式会社）を用いて各種のアンチセンスオリゴヌクレオチドやアスピリンをウサギなど各種の動物によるグラフトモデルに適用したことも開示されている（Fulton GJ, Davies MG, Koch WJ, Dalen H, Svendsen E, Hagen PO. Antisense oligonucleotide to proto-oncogene c-myb inhibits the formation of intimal hyperplasia in experimental vein grafts. J Vasc Surg. 1997; 25: 453-463、Fulton GJ, Davies MG, Barber L, Svendsen E, Hagen PO. Locally applied antisense oligonucleotide to proliferating cell nuclear antigen inhibits intimal thickening in experimental vein grafts. Ann Vasc Surg. 1998; 12: 412-417、Suggs WD, Olson SC, Madnani D, Patel S, Veith FJ. Antisense oligonucleotides to c-fos and c-jun inhibit intimal thickening in a rat vein graft model. Surgery. 1999; 126: 443-449、Torsney E, Mayr U, Zou Y, Thompson WD, Hu Y, Xu Q. Thrombosis and neointima formation in vein grafts are inhibited by locally applied aspirin through endothelial protection. Circ Res. 2004; 94: 1466-1473：論文の14,15,23,24）。また、アデノウイルスを用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドをグラフトモデルに適用したことも記載されている（Yamashita A, Hanna AK, Hirata S, Dardik A, Sumpio BE. Antisense basic fibroblast growth factor alters the time course of mitogen-activated protein kinase in arterialized vein graft remodeling. J Vasc Surg. 2003; 37: 866-873）。
【発明の開示】
【０００４】
こうした血管再狭窄は、上記の施術等により血管壁、特に内皮が傷つけられることによる炎症を起因として血管平滑筋細胞が増殖、遊走し、それによって血管内膜が肥厚することによって生じるとされている。しかしながら、上記した薬剤徐放性ステントによれば、薬剤の非特異的細胞毒性のため特に内皮細胞の再生が困難になり正常な血管壁に復帰しにくいという問題や、心臓の冠動脈の再狭窄に効果があっても末梢動脈狭窄には効果が確立されていないなどの問題があるが、これらについては必ずしも解決されているわけではない。また、MKのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる抑制（コントロールの約６０％に抑制）でも十分とはいえなかった。さらに、上記した他の方法でも、せいぜいコントロールの６０％程度までしか抑制することができなかった。したがって、依然として血管再狭窄などの血管閉塞性疾患に対する優れた予防又は治療が要望されている。
【０００５】
本発明者らは、コラーゲン分子の存在下にＲＮＡ干渉によりMKタンパク質の発現を抑制する核酸コンストラクトを用いることを検討したところ、こうした核酸コンストラクトとコラーゲン分子とを組み合わせることにより、従来、MKアンチセンスオリゴヌクレオチドによって見出されている血管内膜肥厚の抑制結果からは予想できない程度の優れた抑制効果を見出し、本発明を完成した。本発明によれば以下の手段が提供される。
【０００６】
本発明によれば、RNA干渉によりミッドカイン遺伝子の発現を抑制する核酸コンストラクトと、コラーゲン分子と、を含有する、血管閉塞性疾患用医薬組成物が提供される。        
【０００７】
前記核酸コンストラクトはsiRNAとすることができる。また、前記コラーゲン分子は、アテロコラーゲン分子を含有することができる。さらに、前記コラーゲン分子は、繊維化したコラーゲン分子を含むことができる。さらに、こうした血管閉塞性疾患用組成物は、粉末状、繊維状、溶液状、ゲル状、ぺレット状、フィルム状、スポンジ状及びチューブ状のいずれかの形態を採ることができる。また、こうした血管閉塞性疾患用組成物は、血管再建術後の再狭窄、心臓の冠動脈、脳血管、腎血管、末梢の血管を含む血管の閉塞性疾患の予防又は治療用とすることができる。また、こうした組成物は、は、ヒト用の血管閉塞性疾患の予防又は治療用とすることもできる。さらに、前記核酸コンストラクトは、配列番号：１１〜１４のいずれかに記載の配列をターゲット配列とすることができる。
【０００８】
本発明によれば、血管治療用担体と、該血管治療用担体の表面の少なくとも一部に保持される上記いずれかに記載の血管閉塞性疾患用医薬組成物と、を備える、血管閉塞性疾患用医療用材が提供される。前記血管治療用担体はステントとすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】rMKのmRNAに対するsiRNAの標的部位配列を示す図。
【図２】各siRNAの構造を示す図である。
【図３】ウエスタンブロットによるRK１3細胞におけるrMKタンパク質の発現レベルを示す図である。
【図４】図３のウエスタンブロットにより検出したバンド濃度をデンシトメータ解析によって数値化したグラフ図である。
【図５】対照グラフトについてのウエスタンブロットによるrMKタンパク質の発現の経時変化を示す図である。
【図６】rMKを発現するウサギ腎臓由来細胞RK13に対する効果（トランスフェクション後24時間後のrMK発現レベル）を示す図である。
【図７】siRNA #2-STを用いたグラフトと対照グラフトの術後７日におけるウエスタンブロットにおけるrMKタンパク質とβ−アクチンタンパク質とのバンド濃度比をデンシトメータ解析によって数値化したグラフ図である。
【図８】術後１４日の対照のグラフトモデルから摘出したグラフトの免疫組織染色による観察結果を示す図である。
【図９】術後７日のsiRNA #2-ST を導入したグラフトモデルから摘出したグラフトの凍結切片の共焦点レーザー顕微鏡観察像を示す図である。
【図１０】術後４週のsiRNA #2-ST を導入したグラフトモデル（ａ）と対照のグラフトモデル（ｂ）の組織標本を示す図である。
【図１１】図１０（ａ）及び（ｂ）における血管内膜の厚みを比較するグラフ図である。
【図１２】図１０（ａ）及び（ｂ）における血管中膜に対する血管内膜の厚みの比を比較するグラフ図である。
【図１３】ヒトＭＫの発現をRNA干渉により抑制する各siRNAの構造例を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の血管閉塞性疾患用医薬組成物は、RNA干渉によりミッドカイン遺伝子の発現を抑制する核酸コンストラクトと、コラーゲン分子と、を含有することを特徴とし、また、本発明の血管閉塞性疾患用医療用材は、血管治療用担体と、該血管治療用担体の表面の少なくとも一部に保持される前記血管閉塞性疾患用医薬組成物とを備えることを特徴としている。【００１１】
血管閉塞性疾患用医薬組成物及び血管閉塞性疾患用治療用材は、いずれもRNA干渉によりミッドカイン遺伝子の発現を抑制する核酸コンストラクトと、コラーゲン分子とを備えている。こうした核酸コンストラクトとコラーゲン分子との組み合わせによれば、核酸コンストラクトによってMKタンパク質の発現が効果的に抑制され、傷害による血管内膜肥厚が有効に抑制される。なお、コラーゲン分子は、従来より種々の医薬の担体として用いられているが、血管閉塞性疾患に対してコラーゲン分子とMKのRNA干渉を意図した核酸コンストラクトとの組み合わせを用いることの利点は示唆されてはいない。本発明を拘束することを意図するものではないが、血管組織に対するコラーゲン分子の親和性、コラーゲン分子による核酸コンストラクトの安定的保持性及び徐放性並びに核酸コンストラクトによるMK発現抑制により、予想を超えた血管内膜肥厚抑制効果が得られたものと推論される。さらに、上記核酸コンストラクトとコラーゲン分子との組み合わせによれば、血管内皮への障害などが発生後比較的初期の一定期間、上記核酸コンストラクトをコラーゲンマトリックスによって障害部位近傍に保持させることで障害後初期のミッドカインの発現を効果的に抑制し、これにより血管内皮肥厚を顕著に抑制できるものと考えられる。すなわち、上記核酸コンストラクトをコラーゲン分子と組み合わせることで血管内皮肥厚を抑制するのに適したタイミングでミッドカインの発現を抑制することができた結果、予想を超えた血管内膜肥厚抑制効果が得られたものと考えられる。【００１２】
元来MKのヒト成人での発現は極めて限られていて弱く、内皮細胞でのMKタンパク質の発現の抑制が細胞死をもたらすことは考えにくいからである。また、心臓の冠動脈の再狭窄のみならず、末梢動脈狭窄への効果も期待できる。【００１３】
以下、本発明を実施するための最良の形態について、血管閉塞性疾患用医薬組成物及び医療用材の順に説明する。なお、本発明の医薬組成物及び医療用材は、ヒト及び非ヒト哺乳動物に適用することができる。【００１４】
（血管閉塞性疾患用医薬組成物）
（核酸コンストラクト）
本発明における核酸コンストラクトは、RNA干渉によりミッドカイン遺伝子の発現を抑制するように構築されている。ここに、本明細書において「核酸」とは、デオキシリボ核酸及びリボ核酸のようなポリヌクレオチドを意味している。また、この用語には、一本鎖（センス又はアンチセンス）又は二本鎖ポリヌクレオチドが包含され、また、ポリヌクレオチドには天然あるいは人工的な修飾が施されていてもよい。本明細書において「RNA干渉」とは、二本鎖RNAによってその配列特異的に標的遺伝子のmRNAを分解する現象を意味するものとする。RNA干渉によれば、結果として標的遺伝子の発現を抑制することができる。ここでミッドカイン遺伝子の発現を抑制するとは、ミッドカインをコードするｍRNAがポリペプチドに翻訳されるのを抑制し又はタンパク質であるミッドカインの発現量が低下することを意味している。【００１５】
ミッドカイン （ｍｉｄｋｉｎｅ：ＭＫ）は、胚性腫瘍細胞（ＥＣ）のレチノイン酸による分化誘導の過程で一過性に発現する遺伝子の産物として発見された増殖・分化因子で、塩基性アミノ酸とシステインに富む分子量１３ｋＤａのポリペプチドである。（Ｋａｄｏｍａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５１：１３１２−１３１８；Ｔｏｍｏｍｕｒａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１０７６５−１０７７０，１９９０）。ＭＫはヒトからアフリカツメガエルまで見出されているが、種間でのタンパク質の保存度は高く、ヒトとマウスのＭＫでは、アミノ酸配列において、８７％の相同性がある。ＭＫは、様々な生物活性を有する。すなわち、神経突起の伸長、神経細胞の生存を促進し、神経系の構築に関与すると考えられる。損傷時の組織、多くのヒト癌、そしてアルツハイマー病の老人斑にも発見され、組織の修復、線溶系活性化能、そして病態の関連でも注目される。ことにＭＫは多くのヒト癌で発現が上昇し（Ａｒｉｄｏｍｅ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．：Ｊａｐ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，８６：６５５−６６１，１９９５），またＭＫ ｃＤＮＡの導入と発現により細胞が癌化する（Ｋａｄｏｍａｔｓｕ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．：Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７５：３５４−３５９，１９９７）ことからヒト癌の発生と進展に深く関与すると想定される。またＭＫ遺伝子を欠くノックアウトマウスではバルーン障害モデルにおいて新生内膜の形成が著しく低下することから、ＭＫは血管病変の生起にも関与すると考えられる（Ｈｏｒｉｂａ，Ｍ．ｅｔａｌ．：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０５：４８９−４９５，２０００）。【００１６】
核酸コンストラクトは、ミッドカインタンパク質をコードするｍRNAの少なくとも一部を標的としてミッドカイン遺伝子の発現を抑制可能に構築されている。こうした核酸コンストラクトの一つの態様は、互いにハイブリダイズするオリゴリボヌクレオチドの二本鎖構造を有するRNAコンストラクトである。具体的には、突出した3'末端をそれぞれ有する比較的短い二本鎖オリゴリボヌクレオチド（small interference RNA : siRNA）と、ヘアピン構造を形成する（又は有する）単一のオリゴリボヌクレオチド（short hairpin RNA : shRNA）とが挙げられる。【００１７】
siRNAは、ターゲット配列に対応するセンス配列及びアンチセンス配列を有しており、これらセンス配列及びアンチセンス配列が一定長さでハイブリダイズして二本鎖構造を形成している。なお、センス配列とアンチセンス配列は互いにハイブリダイズするが、一部において不対合部分を有していてもよい。例えば、センス配列において１又は数個のミスマッチ塩基及び／又は塩基欠損を有していてもよい。また、siRNAにおけるセンス配列及びアンチセンス配列は、それぞれ所定長さで対合する二重鎖部分と突出する3'末端を有しているが、オーバーハングする3'末端側はｍRNA上の標的配列に対するセンス配列の一致性及びアンチセンス配列の相補性は必ずしも必要ではない。【００１８】
shRNAは、siRNAと同様にターゲット配列に対応するセンス配列を5'側に、アンチセンス配列を3'側に有し、これらは一定長さで対合してステムを形成し、これらの配列間にヌクレアーゼによるプロセッシング部位を有するループ部位を有している。このため、shRNAは、細胞内においてプロセッシングを受けてsiRNAとなる。siRNAについて説明したように、shRNAから誘導されるsiRNAのオーバーハング部位に相当するセンス配列及びアンチセンス配列においても標的配列との一致性及び相補性は必須ではない。【００１９】
本態様の核酸コンストラクトにおけるセンス配列及びアンチセンス配列が対合する二重鎖の長さは、典型的には１３〜２８塩基対であることが好ましく、より好ましくは１３〜２７塩基対の範囲であり、さらに好ましくは１９〜２１塩基対である。最も好ましくは、１９又は２０塩基対である。また、二重鎖を形成しない3'側構造を含めたセンス配列及びアンチセンス配列は、典型的には１５〜３０ｎｔであることが好ましく、より好ましくは１５〜２９ｎｔの範囲であり、さらに好ましくは２１〜２３ｎｔである。最も好ましくは、２１又は２２ｎｔである。また、siRNAにおいて突出する３'末端は、２〜４ｎｔであることが好ましく、より好ましくは２ｎｔである。さらに、shRNAにおけるループ部位は、こうした態様の二重鎖（shRNAにおいてはステム）及び３’末端構造を形成し維持するのを妨げない程度のループ部位の長さを備えていればよい。【００２０】
この態様の核酸コンストラクトが標的とするMKのｍRNA配列は、例えば、以下のようなルールを適宜適用して決定し、適当なsiRNAを設計することができる。
（１）標的する遺伝子のCDSにおいてAA（N19）TT、AA（N21）、NA（N２１）等となる配列をターゲットとする（siRNAとしては第３〜２１塩基の１９塩基を使用する）、
（２）転写因子の結合部位を避けるためスタートコドンから下流５０〜１００塩基以上下流側とする、
（３）5'-UTR近傍を避ける、
（４）ホモロジーサーチによって他の遺伝子と相同性のない配列を選択する、
（５）GC含量を50％前後とする、等である。
なお、この他ターゲット配列の決定方法を含むsiRNAの設計方法は、http://design.rnai.jp/sidirect/index.php、http://www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/sirna.htmlやRational siRNA design for RNA interference （Nature Biotechnology , vol. 22, 326- 330 (2004), Angela Reynolds, Devin Leake, Queta Boese, Stephen Scaringe, William S Marshall & Anastasia Khvorova）、Improved and automated prediction of effective siRNA (Biochem Biophys Res Commun. 2004 Jun 18;319(1):264-74、Chalk AM, Wahlestedt C, Sonnhammer EL.)等公開された各種のルールを適宜適用して行うことができる。【００２１】
例えば、ヒトのMKのmRNAは既に報告されており（Tsutsui, J. et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 176：792-797, 1990、GenBankアクセッション番号:NM_001012334）、こうした配列に基づいてヒトMKのmRNAの発現を抑制することができるsiRNAなどの核酸コンストラクトを設計及び構築できる。例えば、特開2004-275169に開示される標的部位1〜4をターゲット配列とすることができる。これらのターゲット配列に対応してＲＮＡ干渉を発現可能な核酸コンストラクトとして利用できるヒトMKsiRNAの一例を図１３に示す。MKsiRNAにおいては、センス配列及びアンチセンス配列はそれぞれ３’末端側に２ntのオーバーハング部位を有することができる。ヒトMKの発現を抑制することができるsiRNAなどの核酸コンストラクトによれば、ヒトにおいても有効に血管閉塞性疾患を予防し治療することができる。なお、好ましい標的部位は標的部位４である。【００２２】
ｍＲＮＡ標的部位１：gaaggaguuuggagccgac；ＧＣ含有量５２％）（配列番号：１１）
ｍＲＮＡ標的部位２： gaaggcgcgcuacaaugcu；ＧＣ含有量５２％）（配列番号：１２）
ｍＲＮＡ標的部位３： gcaaaggccaaagccaaga；ＧＣ含有量４７％）（配列番号：１３）
ｍＲＮＡ標的部位４： guuuggagccgacugcaag；ＧＣ含有量５２％）（配列番号：１４）【００２３】
このような核酸コンストラクトは、ホスホアミダイト法など公知のポリリボヌクレオチドの化学合成方法により合成することができる。また、in vitro転写法を用いて合成してもよい。例えば、こうしたポリリボヌクレオチドをコードするDNAを合成し、このDNAに対して、PCR法を利用してT7RNAプロモータなどのRNAプロモータ配列を有するプライマーを用いるとともにDNAポリメラーゼを用いて転写用二本鎖DNAテンプレートを合成し、この転写用二本鎖DNAテンプレートに対してRNAポリメラーゼを利用してin vitro転写反応を実施することもできる。こうすることで、所望の一本鎖RNAを得ることが出来る。siRNAの場合には、こうして得たアンチセンスRNAとセンスRNAとをハイブリダイズさせて二本鎖RNAを作製し、適宜末端をRNase等で分解して、得られた二本鎖RNAを精製することによりsiRNAを得ることができる。また、shRNAの場合には、センス配列とアンチセンス配列と、さらにこれらの配列間に各種の塩基特異的RNaseによってトリミングされるループ配列とを備える一本鎖ＲＮＡを作製し、センス配列とアンチセンス配列とをアニールさせて得ることができる。こうして得たshRNAのループ配列を塩基特異的ヌクレアーゼで処理してsiRNAを得ることもできる。なお、in vitro転写法はこれに限らず各種の方法が知られているとともに、商業的に入手可能な各種のin vitro転写キットを用いて実施することができる。こうした核酸コンストラクトにおいては、ヌクレアーゼ耐性のための各種公知の修飾基を備えることもできる。【００２４】
核酸コンストラクトのもう一つの態様は、上記の態様のRNAコンストラクト、すなわち、siRNAやshRNAを発現可能にコードするベクターの態様である。この態様において、shRNA発現ベクターは、アンチセンス配列及びセンス配列の他ループ配列を、細胞内転写によりshRNAを構築可能な連続した一本鎖ＲＮＡが転写されるように構成することができる。また、siRNA発現ベクターは、所定のセンス配列及びアンチセンス配列を有するRNAが転写されるように構成すればよい。siRNA発現ベクターにおいては、センス配列及びアンチセンス配列は単一のベクターによって発現されるようにしてもよいし、また、それぞれ異なるベクターから発現されるようにしてもよい。【００２５】
こうした発現ベクターに用いるプロモータとしては、上記各DNAより対応するRNAを産生し得るものであれば、polII系、polIII系のいずれであってもよい。このpolIII系のプロモータとしては、例えば、U6プロモータ、tRNAプロモータ、レトロウイルス性LTRプロモータ、アデノウイルスva1プロモータ、5S rRNAプロモータ、7SK RNAプロモータ、7SL RNAプロモータ、H1 RNAプロモータなどが挙げられる。polII系プロモータとしては、サイトメガロウイルスプロモータ、T7プロモータ、T3プロモータ、SP6プロモータ、RSVプロモータ、EF-1αプロモータ、β−アクチンプロモータ、γ−グロブリンプロモータ、ＳＲαプロモータなどを挙げることができる。【００２６】
発現ベクターは、プラスミドベクターやウイルスベクターの形態を採ることができる。ベクターの種類は特に問わないで、導入したい細胞などに対応して選択することができる。例えば、哺乳動物細胞では、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ＥＢウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、フォーミーウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。【００２７】
こうした発現ベクターの態様を採る核酸コンストラクトは、商業的に入手可能なsiRNAやshRNA作製用に構築されたベクターやそれらのプロトコールや実験医学別冊改訂ＲＮＡｉ実験プロトコール（羊土社、2004年10月1日発行）等に基づいて容易に構築することができる。【００２８】
（コラーゲン分子）
本発明の医薬組成物は、コラーゲン分子を含有している。コラーゲン分子は、可溶性コラーゲン又は可溶化コラーゲンを用いることができる。「可溶性コラーゲン」としては、酸性あるいは中性の水または塩を含有する水に可溶であるもの等が挙げられる。「可溶化コラーゲン」としては、例えば、酵素により可溶化される酵素可溶化コラーゲン、アルカリにより可溶化されるアルカリ可溶化コラーゲン等が挙げられる。【００２９】
コラーゲンの由来は特に問わないで、脊椎動物から抽出されたものまたはそれらの遺伝子組換え体を用いることができる。例えば、哺乳類、鳥類、魚類から抽出されたものまたはそれらの遺伝子組換体を用いることができる。コラーゲンはＩ型〜Ｖ型までの種類があるが特に限定しないで用いることができる。なかでも、哺乳動物の真皮から酸抽出したＩ型コラーゲンまたはそれらの遺伝子組換体が挙げられる。より望ましくは、例えば、仔牛の真皮から酸抽出した１型コラーゲン、遺伝子工学的に生産される１型コラーゲンなどが挙げられる。遺伝子工学的に生産される１型コラーゲンとしては仔牛の真皮由来またはヒトの真皮由来のものが好ましい。また、安全性の面から抗原性の高いテロペプチドを酵素的に除去したアテロコラーゲンあるいは遺伝子工学的に生産されるアテロコラーゲンが望ましく、１分子あたりチロシン残基が３以下であるアテロコラーゲンがより好ましい。【００３０】
本医薬組成物におけるコラーゲン分子は、少なくとも本医薬組成物が生体内に投与されるのに先立って繊維化されているか又は所定の投与部位に投与されたとき当該部位の生理条件下にただちにあるいはその後速やかに（遅くとも数十分以内、好ましくは数分以内に）（以下、投与後のこのようなタイミングを投与時と総称するものとする。）繊維化されるものであることが好ましい。コラーゲン分子の繊維化は、温度、ｐＨ及び／又は塩濃度に応じてコラーゲン分子が分子長軸に沿って会合することにより生じる。コラーゲン分子が繊維化されることで、生体内における核酸コンストラクトの安定性が高まると考えられる。また、投与部位においてコラーゲン分子が繊維化されることで、投与部位である血管内壁及び／又は血管外壁若しくは血管内留置用医用材料に繊維化コラーゲン分子が安定的に保持されるとともに核酸コンストラクトの安定性も高まると考えられる。【００３１】
投与時に繊維化するコラーゲン分子を含有する医薬組成物は、繊維化前のコラーゲン分子と核酸コンストラクトとを含有し、投与直前にコラーゲン分子を繊維化可能な条件を付与する液剤と混合してコラーゲン分子を繊維化するように構成されていてもよい。また、こうした液剤を用いることなく、投与した部位の生理的条件下において繊維化するように構成されていてもよい。さらに、既に繊維化したコラーゲン分子と核酸コンストラクトとを含有する医薬組成物とすることもできる。この場合、コラーゲン分子の繊維化に先立って予めコラーゲン分子と核酸コンストラクトとを均一に混合した上、コラーゲン分子を繊維化することが好ましい。なお、コラーゲン分子の繊維化後は、そのまま必要に応じ、乾燥等することにより、後述するように粉末状、ペレット状、フィルム状、スポンジ状等各種の形態とすることができる。【００３２】
繊維化したコラーゲン分子は、適宜架橋されていてもよい。架橋構造の導入により生体内における分解を遅延化して核酸コンストラクトの放出を遅延化させると考えられる。架橋構造は、紫外線などの照射、トランスグルタミナーゼ処理などに本医薬組成物の有効性を維持できる範囲で公知の各種手法より導入することができる。さらに、繊維化したあるいは繊維化していないコラーゲン分子には、抗血栓性を付与するためにスクシニル基が導入されていてもよい。【００３３】
本医薬組成物は、粉末状、繊維状、溶液状、ゲル状、ぺレット状、フィルム状、スポンジ状，チューブ状等の各種の形態を採ることができる。こうした製剤形態は、コラーゲン分子自体の存在形態によって構築することができるが、当該分野において従来公知の添加剤や賦型剤によって構築されていてもよい。【００３４】
例えば、本医薬組成物が溶液状〜ゲル状の場合、０．００１％以上１０％以下程度とすることができる。好ましくは、０．１％以上５％以下程度であり、より好ましくは、１．５％以上３．７５％以下程度である。また、本医薬組成物が粉末状、繊維状、ペレット状、フィルム状、スポンジ状、チューブ状等の場合には、５％以上９９％以下程度とすることができ、好ましくは１０％以上７０％以下程度、より好ましくは２５％以上５０％以下とすることができる。さらに、本医薬組成物には、コラーゲン分子の繊維化条件を形成するのに寄与する塩などを含むことができる。【００３５】
本医薬組成物は、血栓閉塞性疾患が生じた部位あるいは生じる可能性のある部位（以下、このような部位を血管閉塞性疾患部位等という。）に対してその剤型に適した形態で局所適用される。なお、血管閉塞性疾患部位等とは、実際に閉塞が生じる血管内の閉塞部位の他、当該閉塞部位における血管の外壁側を含む当該閉塞部位の血管全体を意味している。溶液状あるいはゲル状の本医薬組成物を、血栓閉塞性疾患部位等の血管外壁に注入、塗布したり、粉末状、繊維状の本医薬組成物を血栓閉塞性疾患部位等の血管外壁に散布したり、チューブ状、ペレット状、フィルム状及びスポンジ状等の本医薬組成物を、血栓閉塞性疾患部位等の血管内外壁に配置、貼付したりすることができる。例えば、本医薬組成物を血管閉塞性疾患部位等の血管内壁又は外壁に追従あるいは適合するようなチューブ状、フィルム状、スポンジ状とすることで、本医薬組成物を容易に血管閉塞性疾患部位等に保持させることができるようになる。なお、本発明の医薬組成物を局所適用するには、カテーテルやバルーン等を用いて注入する経皮的手法のほか、マイクロサージェリーを含む外科的手法を用いることができる。【００３６】
本医薬組成物のコラーゲン分子が投与時に繊維化しやすい程度に含有されているか予め繊維化されている場合、投与時に血管閉塞性疾患部位等において本医薬組成物を容易にゲル化させることができる。これにより、血管内膜肥厚に対する有効成分である核酸コンストラクトを局所に安定してかつ意図した濃度で保持することができる。【００３７】
以上説明したように、上記核酸コンストラクトとコラーゲン分子とを含有する本医薬組成物を血管閉塞性疾患部位等へ適用することにより、予想を超える血管内膜肥厚の抑制効果を得ることができる。特に、本医薬組成物は、血管再建術後の再狭窄、動脈硬化症等に起因する心臓の冠動脈、脳血管、腎血管、末梢の血管を含む血管の閉塞性疾患の予防又は治療用に好ましく用いることができる。【００３８】
（血管閉塞性疾患用医療用材）
本発明の血管閉塞性疾患用医療用材は、本医薬組成物を血管治療用担体の表面の少なくとも一部に備えている。こうした血管閉塞性疾患用医療用材によれば、血管閉塞性障害部位等に安定的に本医薬組成物を供給することができる。また、血管内挿入可能な血管治療用担体を用いる場合には、外科的手法によらないで経皮的に本医薬組成物を血管閉塞性疾患部位等に供給することができる。【００３９】
血管治療用担体とは、生体内の血管の少なくとも一部を補強、補綴、維持及び／又は代替する材料等の血管再構成材料のほか、血管内に挿入される用具を包含している。具体的には、血管再構成材料としては、人工血管や血管補綴材が挙げられ、血管内挿入用具としては、ステントなどの血管内留置用材及びカテーテル、バルーンが挙げられる。血管再構成材料やステントなどの血管内留置用材を用いることで、血管閉塞性疾患部位への本医薬組成物の長期留置が可能となるとともに、これらを配置する際の障害に起因する再狭窄などの血管閉塞も予防することができる。また、カテーテルやバルーンを用いる場合には、ステント等の留置材を配することが困難な末梢血管にも本医薬組成物を容易に供給することができる。さらに、カテーテルやバルーンを用いる場合、ステント等の留置材や血管再構成材料に対して本医薬組成物を供給するのにも用いることができる。なお、こうした血管内挿入用材の形態及び材料は、従来公知のものを用いることができる。【００４０】
血管治療用担体としては、ステントを用いることが好ましい。ステント留置等に伴う再狭窄を効果的に予防できるからである。ステントは、コイル状、網筒状等の形態を採ることができ、また、バルーン拡張タイプであってもよいし、自己拡張タイプであってもよい。【００４１】
血管治療用担体の表面の少なくとも一部には本医薬組成物が備えられている。本医薬組成物は、好ましくは血管内壁又は血管外壁に相当する部位あるいは当該部位に当接する部位に備えられている。血管治療用担体が生体グラフト、人工血管、血管補綴材の場合には、その血管内壁であってもよいしまた外壁であってもよい。また、ステント等の血管内留置用材やカテーテルやバルーンの場合には、血管内壁に当接可能な部位（伸長部や拡張部等）に本医薬組成物を備えている。【００４２】
使用前の状態における本医療用材においては、本医薬組成物は粉状、繊維状、ゲル状、フィルム状、スポンジ状等の形態で担体表面に保持されている。本医薬組成物を担体表面に保持させる方法は特に限定しない。溶液状あるいはゲル状の本医薬組成物に治療用担体を浸漬又はこうした本医薬組成物を塗布したあと、ゲル化させあるいはそのまま乾燥して保持させることができる。また、必要に応じコラーゲン繊維化してもよい。また、治療用担体の外表面形状及び／又は内表面形状に対応させて形状を有するゲル状、フィルム状、スポンジ状等の本医薬組成物を当該治療用担体に適当な接着層を介してあるいは介在させずに密着させてもよい。この場合、コラーゲン分子を架橋させてもよい。【００４３】
本医療用材は、その血管治療用担体の形態に応じて外科的手法あるいは経皮的に血管閉塞性部位等に供給される。本医療用材上の本医薬組成物は、コラーゲン分子を含有しているため、血管閉塞性部位等に到達時又は遅くともその後数十分の間には、生体内の水分を吸収してゲル化（好ましくはコラーゲン分子が繊維化）した状態で血管治療用担体表面に保持される。【００４４】
以上説明したように、本医療用材によれば、血管治療用担体に本医薬組成物を保持しているため、本医薬組成物の効果を血管治療用担体の配置部位において安定的に発揮させることができる。したがって、本医療用材は、血管再狭窄の起因となる血管治療用担体表面に本医薬組成物を備えるため、血管の再構成と再狭窄の予防とを同時に実現できるものとなっている。特に、本医療用材は、血管再建術後の再狭窄、動脈硬化症等に起因する心臓の冠動脈、脳血管、腎血管、末梢の血管を含む血管の閉塞性疾患の予防又は治療用に好ましく用いることができる。【００４５】
なお、本発明によれば、上記のように本医薬組成物又は本医療用材を用いて血管閉塞性疾患の予防又は治療する方法も提供される。
【実施例】
【００４６】
（実施例１）
本実施例では、ウサギMK（以下，rMK、GenBankアクセッション番号AY553907）の遺伝子配列に基づいて5種類のsiRNAを作製し、in vitroでそのノックダウン効果を検討した。
＜siRNAの作製＞
作製した５種類（#1〜#5）のsiRNAのrMKのｍRNAに対する標的部位を図１に示す。なお、図１における配列は、ＣＤＳ（ＤＮＡ）を含む形態で表記してある。また、合成したsiRNAのセンス配列を配列番号：１〜５にそれぞれ示し、図２に、合成した各siRNAの構造を示す。【００４７】
（siRNAの評価）
siRNAのトランスフェクション前日に、ウサギ腎臓細胞に由来しMKを発現しているRK13細胞を3cmディッシュに播種して50%弱confluentになるように前培養した。作製した5種類のsiRNAの20μM濃度の溶液を各5μLと95μLのoptiMEMとの各混液を、予め混合し室温で5分間インキュベートしておいた3ml LipofectAMINE2000と95ml optiMEMとの混液と混合した。この混合液を室温で20分間インキュベートし、予め800mlの10%FCS/DMEMに交換したRK13細胞の培養ディッシュに加えた。48時間後、培地をヘパリン含有DMEM(無血清)に交換し、24時間経過後に培養上清を採取した。回収した培養上清についてＳＤＳゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（１５％ゲル）の後、抗ＭＫ抗体を用いたウエスタンブロットを村松らの方法（Muramatsu,H.et :Dev.Biol.159:392-402,1993）によって行った。ウエスタンブロットの結果を図３に示し、ウエスタンブロットにより検出したバンド濃度をデンシトメータ解析によって数値化したグラフを図４に示す。なお、Mockは、siRNAを含まない以外は上記混合液と同一組成とした。【００４８】
図３及び図４に示すように、未処理のバンドを１００％とすると、＃１は約１８％、＃２は約８％、＃３及び＃４では、それぞれ約１０％であった。したがって、最も抑制効果の高いsiRNAであるsiRNA#2を選択した。さらに、siRNA#2のアンチセンス鎖をスクランブル配列とし、それに相補的な二本鎖RNA（scramblesiRNA、以下、単にsiRNA-SCRという。）を合成するとともに、siRNA#2及びsiRNA-SCRの２種類の二重鎖RNAに対しsiSTABLE（商標）化学修飾（Dharmacon社、invito用）を行い、siRNA#2 siSTABLE（以下、siRNA#２-STという。）及びsiRNA-SCR siSTABLE（以下、scranble siRNA -SCR-STという。）を合成した。【００４９】
（実施例２）
本実施例では、MKをターゲットとしたsiRNAが静脈グラフトの閉塞を予防するかどうかを確認した。
（静脈グラフトモデルの作製）
全身麻酔下にウサギの外頚静脈を採取し，総頚動脈に間置バイパス術を施行した。その後、外頚動脈の第一分枝を除くすべての末梢血管（内頚動脈も含む）を結紮し，低血流モデルを作製した。なお、こうした処置により末梢血管床を減少させ血流を低下させることで静脈グラフトの内膜肥厚が増強することが報告されている（Am J Physiol Heart Circ Physiol 2004;286:240-245）。【００５０】
（siRNA溶液）
実施例１で作製したsiRNA#2、siRNA-SCR、siRNA #2-ST及びsiRNA-SCR-STの各500μM溶液並びに生理食塩水のそれぞれ12mlを等量の3.5%アテロコラーゲン溶液（高研）と混合した。最終的なコラーゲン濃度は1.75％であり、siRNA濃度は10μMであった。これらの各溶液を作製した静脈グラフトモデルの吻合後の静脈グラフトの全外周に塗布し、ゲル化するのを待って閉創した。なお、静脈グラフト壁内への導入効率の検討にはCy3標識したsiRNA#2-STを用いた。【００５１】
＜評価＞
術後所定日数経過後、各種の静脈グラフトモデルから、静脈グラフトを採取して以下の項目について試験した。
（rMKタンパク質の発現）
rMKタンパク質の発現は、静脈グラフトモデルから摘出したグラフトの全組織をホモゲナイズしウェスタンブロット法（一次抗体：goat anti-human MK，二次抗体：rabbit anti-goat IgG）によって評価した。また、rMKタンパク質の発現を、β-アクチンの発現量と対比した。siRNAを含まずに生理食塩液のみを含むアテロコラーゲン溶液を塗布した対照のグラフトについてのウエスタンブロットによるrMKタンパク質の発現の経時変化を図５に示し、rMKを発現するウサギ腎臓由来細胞RK13に対する効果（トランスフェクション後24時間後のrMK発現レベル）を図６に示し、術後７日のsiRNA #2-STを用いたグラフトと対照グラフトのウエスタンブロットにおけるrMKタンパク質とβ−アクチンタンパク質とのバンド濃度比をデンシトメータ解析によって数値化したグラフを図７に示す。【００５２】
（rMKタンパク質の局在）
rMKタンパク質の局在は、静脈グラフトモデルから摘出したグラフトのパラフィン切片を一次抗体chicken anti-mouse MK，二次抗体biotin標識rabbit anti-chicken IgGで免疫組織染色をすることにより評価した。術後１４日の対照のグラフトモデルから摘出したグラフトにおける観察結果を図８に示す。【００５３】
（siRNAの局在）
Cy３標識したsiRNA #2-ST を導入したグラフトモデルから摘出したグラフトの凍結切片をそのまま共焦点レーザー顕微鏡で観察した。術後７日のモデルから摘出したグラフトの凍結切片の共焦点レーザー顕微鏡観察像を図９に示す。【００５４】
（組織標本の形態学的解析）
摘出した各グラフトのパラフィン切片をelastica Van-Gieson染色して行った。術後４週のsiRNA #2-ST を導入したグラフトモデルと対照のグラフトモデルの組織標本を図１０に示し、血管内膜の厚み及び血管中膜に対する血管内膜の厚みの比の比較図を図１１及び図１２にそれぞれ示す。【００５５】
図５に示す対照のグラフトモデルにおけるrMKタンパク質の発現の時間経過からは、rMKは術後数日より発現し始め、7〜14日後にピークを迎えることがわかった。また、図８に示す免疫組織学的染色による観察像によれば、術後14日の新生内膜内にはrMKの強い発現（濃色部）が認められており、図５に示す結果を支持した。【００５６】
図６に示す各種siRNA導入グラフトモデルにおけるrMKタンパク質のウエスタンブロットからは、MKsiRNA#2とsiRNA #2-STとがそれぞれ特異的にかつ同等にrMKタンパク質の発現を抑制していることがわかった。また、図７に示す、術後７日におけるsiRNA #2-ST導入モデルと対照モデルにおけるβ-アクチンに対するrMKタンパク質のバンド濃度比のグラフによれば、siRNA #2-ST導入グラフトにおいては、rMKの発現が対照グラフトの約４分の１に抑制されたことがわかった。すなわち、rMKの発現ピークである術後７日において、効果的にrMKの発現が抑制されていたことがわかった。【００５７】
また、図９に示すCy3標識をしたsiRNA #2-STを用いたグラフトにおける共焦点レーザー顕微鏡観察像によれば、術後７日のグラフト壁内全層にcy3標識を認め、siRNAがグラフト壁内全層の細胞に導入されたことがわかった。【００５８】
図１０に示す術後４週のsiRNA #2-STを塗布したグラフトと対照グラフトの組織標本によれば、siRNA #2-STを塗布したグラフトでは、顕著に血管内膜肥厚が抑制されていることがわかった。図１１及び図１２に示すように、これらの組織標本に基づけば、siRNA #2-STを塗布したグラフトでは血管内膜の厚み／血管中膜の厚みの比が対照グラフトの６％程度、内膜の厚みそのものが対照グラフトの１０％程度に抑制されたことがわかった。【００５９】
以上のことから、MKに対するsiRNAは、コラーゲン分子とともに投与されることにより、投与部位に保持されるとともに血管内膜又はその近傍に到達してMKタンパク質の発現を抑制することがわかった。また、こうした処置により血管内膜の肥厚を効果的に抑制できることがわかった。【００６０】
本出願は、２００５年５月２５日に出願された日本国特許出願第２００５−１５２３４６号を優先権主張の基礎としており、その内容の全てが本明細書に含まれる。
【産業上の利用の可能性】
【００６１】
本発明は、血管閉塞性疾患の治療や予防に利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００６２】
配列番号1〜５：ウサギミッドカインのsiRNAのターゲット配列
配列番号６〜１０：siRNAのセンス鎖
配列番号１１〜１４：ヒトミッドカインのsiRNAのターゲット配列
【図１】
2006126600.tif 000002
【図２】
2006126600.tif 000003
【図１３】
2006126600.tif 000004
【図３】
2006126600.tif 000005
【図４】
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【図５】
2006126600.tif 000007
【図６】
2006126600.tif 000008
【図７】
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【図８】
2006126600.tif 000010
【図９】
2006126600.tif 000011
【図１０】
2006126600.tif 000012
【図１１】
2006126600.tif 000013
【図１２】
2006126600.tif 000014
【配列表】
2006126600000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年4月13日(2007.4.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ干渉によりミッドカイン遺伝子の発現を抑制する核酸コンストラクトと、
コラーゲン分子と、
を含有する、血管閉塞性疾患用医薬組成物。
【請求項２】
前記核酸コンストラクトはｓｉＲＮＡである、請求の範囲１に記載の血管閉塞性疾患用医薬組成物。
【請求項３】
前記コラーゲン分子は、アテロコラーゲン分子を含有する、請求の範囲１又は２に記載の血管閉塞性疾患用医薬組成物。
【請求項４】
前記コラーゲン分子は、繊維化したコラーゲン分子を含む、請求の範囲１〜３のいずれかに記載の血管閉塞性疾患用医薬組成物。
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
血管内膜肥厚抑制剤である、請求の範囲１〜４のいずれかに記載の血管閉塞性医薬組成物。
【請求項１１】
グラフトにおける血管内膜肥厚抑制剤である、請求の範囲１〜４及び１０に記載の血管閉塞性疾患用医薬組成物。
【請求項１２】
血管閉塞性疾患部位においてゲル化するように前記コラーゲン分子を含有する、請求の範囲１〜４、１０及び１１のいずれかに記載の閉塞性疾患用医薬組成物。
【請求項１３】
投与部位が血管閉塞性疾患部位の血管外壁である、請求の範囲１〜４、１０、１１及び１２のいずれかに記載の血管閉塞性疾患用医薬組成物。
【請求項１４】
前記組成物を血管閉塞性疾患部位の血管外壁においてゲル化させることにより投与する、請求の範囲１３に記載の血管閉塞性疾患用医薬組成物。
【請求項１５】
粉末状、繊維状、溶液状、ゲル状、ペレット状、フィルム状、スポンジ状及びチューブ状のいずれかである、請求の範囲１〜４、１０、１１、１２、１３及び１４のいずれかに記載の血管閉塞性疾患用医薬組成物。
【請求項１６】
血管再建手術後の再狭窄、心臓の冠動脈、脳血管、腎血管、抹消の血管を含む血管の閉塞性疾患の予防又は治療用である、請求の範囲１〜４、１０、１１、１２、１３、１４及び１５のいずれかに記載の血管閉塞性疾患用医薬組成物。
【請求項１７】
前記核酸コンストラクトは、配列番号：１１〜１４のいずれかに記載の配列をターゲット核酸とする、請求の範囲１〜４、１０、１１、１２、１３、１４、１５及び１６のいずれかに記載の血管閉塞性疾患用医薬組成物。
【請求項１８】
血管治療用担体と、
該血管治療用担体の表面の少なくとも一部に血管閉塞性疾患部位においてゲル化可能に保持される請求の範囲１〜４、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６及び１７のいずれかに記載の血管閉塞性医薬組成物と、
を備える、血管閉塞性疾患用医療用材。
【請求項１９】
前記担体はステントである、請求の範囲１８に記載の血管閉塞性疾患用医療用材。
【請求項２０】
前記担体は、前記血管閉塞性疾患用医薬組成物を血管外壁に相当する部位に備える、請求の範囲１９に記載の血管閉塞性疾患用医療用材。
【国際調査報告】
2006126600.tif 000015
2006126600.tif 000016
2006126600.tif 000017
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