(57)【要約】  反応試薬を含む少なくとも２種類の液体を、マイクロポンプにより送液して微細流路４内で合流させ、各液体を拡散混合した後、微細流路４の下流側端部に設けられた広幅の液溜部５に液体を送り込んでこの液溜部５で反応を行う。この他、各液体の合流液をループ状の微細流路内で循環させるか、微細流路内で合流液を前後動させるようにしてもよい。また、遺伝子増幅反応では、検体が送液される微細流路から分岐した分岐流路から微細流路内へ試薬を徐々に、増幅反応を進行させながら加えていくようにした。【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応試薬を含む少なくとも２種類の液体を、マイクロポンプにより送液して合流させる合流部と、
前記合流部の下流側端部に設けられ、前記各液体が拡散混合される混合流路と、
拡散混合された混合液体の反応を促進する反応促進部とを有す、マイクロリアクタ。
【請求項２】
請求の範囲第１項に記載のマイクロリアクタにおいて、前記反応促進部は前記混合流路の下流側端部に設けられ、該混合流路よりも広幅の空間からなり、該混合流路で拡散混合された混合液体を貯留して反応を行う液溜部である。
【請求項３】
請求の範囲第２項に記載のマイクロリアクタにおいて、前記マイクロポンプにより各液体を前記合流部から前記混合流路へ送液した後、前記液溜部へ送り込む直前に、前記混合流路内の各液体の送液を一時停止するように前記マイクロポンプを制御する制御手段を備える。
【請求項４】
請求の範囲第３項に記載のマイクロリアクタにおいて、前記制御手段による送液停止時間が０．５秒〜１０分である。
【請求項５】
請求の範囲第１項に記載のマイクロリアクタにおいて、前記反応促進部は、前記合流部の下流側端部に設けられ、前記各液体の反応が行われるループ状の混合流路と、前記ループ状の混合流路の上流側および／または下流側に設けられた弁と、前記ループ状の混合流路に設けられ、前記合流部から送液された前記各液体の混合液を、前記ループ状の混合流路内で、前記弁によりループが閉じた状態で循環させる循環用マイクロポンプとを有す。
【請求項６】
請求の範囲第１項に記載のマイクロリアクタにおいて、前記反応促進部は、前記合流部から前記混合流路内に送液された前記各溶液の混合液の送液方向を切り替えて、前記混合液を前記混合流路内で繰り返し前後動させるように前記マイクロポンプを制御する制御手段とを有す。
【請求項７】
請求の範囲第１項に記載のマイクロリアクタにおいて、前記反応促進部は、増幅対象であるＤＮＡを含むＤＮＡ溶液がマイクロポンプにより送液される混合流路と、前記混合流路から分岐し、試薬液体がマイクロポンプにより送液される複数の分岐流路とが設けられ、前記混合流路内を送液される前記ＤＮＡ溶液に対して、前記各分岐流路から前記試薬液体を順次合流させて遺伝子増幅反応を行うように構成されている。
【請求項８】
請求の範囲第７項に記載のマイクロリアクタにおいて、前記ＤＮＡ溶液と前記試薬液体とを合流部で合流させ、この混合液が次の合流部の手前に達した際に、該混合液の送液を一時停止するように前記各マイクロポンプを制御する制御手段を備える。
【請求項９】
請求の範囲第１項に記載のマイクロリアクタにおいて、前記マイクロポンプが、流路抵抗が差圧に応じて変化する第１流路と、差圧の変化に対する流路抵抗の変化割合が第１流路よりも小さい第２流路と、第１流路および第２流路に接続された加圧室と、該加圧室の内部圧力を変化させるアクチュエータと、該アクチュエータを駆動する駆動装置とを備える。
【請求項１０】
請求の範囲第１項に記載のマイクロリアクタにおいて、前記マイクロポンプの駆動装置からの駆動信号で前記アクチュエータの作動を制御することにより、反応試薬を含む少なくとも２種類の液体を所望の比率で混合するように構成されている。
【請求項１１】
請求の範囲第１項に記載のマイクロリアクタにおいて、増幅対象であるＤＮＡを含むＤＮＡ溶液と、試薬液体とを合流させる合流部の上流側の各流路に、前記ＤＮＡ溶液が収容されるＤＮＡ収容部と、前記試薬液体が収容される試薬収容部とが設けられるとともに、これらの各収容部の上流側にポンプ接続部が設けられ、これらのポンプ接続部に前記マイクロポンプを接続し、各マイクロポンプから駆動液を供給することにより前記各収容部内の前記ＤＮＡ溶液および前記試薬液体を押し出してこれらを合流させることによって遺伝子増幅反応を開始するように構成されている。
【請求項１２】
請求の範囲第１項に記載のマイクロリアクタにおいて、検体もしくは検体から抽出したＤＮＡの溶液、または検体から抽出したＲＮＡから逆転写反応により合成したｃＤＮＡの溶液と、反応試薬を含む試薬液体とを混合して遺伝子増幅反応を行う。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロリアクタ、特に２以上の液体を良好に混合し、反応を効率化したマイクロリアクタ、および遺伝子検査に好適に適用できるバイオリアクタに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、マイクロマシン技術および超微細加工技術を駆使することにより、従来の試料調製、化学分析、化学合成などを行うための装置、手段(例えばポンプ、バルブ、流路、センサーなど)を微細化して１チップ上に集積化したシステムが開発されている。これは、μ−ＴＡＳ（Micro total Analysis System）、バイオリアクタ、ラブ・オン・チップ（Lab-on-chips）、バイオチップとも呼ばれ、医療検査・診断分野、環境測定分野、農産製造分野でその応用が期待されている。とりわけ遺伝子検査に見られるように、煩雑な工程、熟練した手技、機器類の操作が必要とされる場合には、自動化、高速化および簡便化されたミクロ化分析システムは、コスト、必要試料量、所要時間のみならず、時間および場所を選ばない分析を可能とすることによる恩恵は多大と言える。【０００３】
場所を選ばず迅速に結果を出すこれらの分析用チップに対しても分析の定量性、解析の精度、経済性などが重要視される。そのためにはシンプルな構成で、高い信頼性の送液システムを確立することが課題である。精度が高く、信頼性に優れるマイクロ流体制御素子が求められている。これに好適なマイクロポンプシステムを本発明者らはすでに提案している（特許文献１および２）。【０００４】
また、試料の必要量が僅少となり、必要とされる試薬量も少なくて済む分析の微量化を図ることは、マイクロリアクタの最大課題である。これを実現するには、混合流路もしくは反応室で液体（検体および試薬）同士を効率よく混合する必要がある。そのための混合手段を別途に付設することも可能であるが、チップのサイズ、形態からの制約を受けやすい。微細流路内での混合および反応は、反応物質の拡散が律速となり、長い流路にしても反応に至るまでの物質の拡散距離が長くなる。特に濃度が大幅に異なる２以上の液体を混合する場合には、混合の巧拙は反応効率にも影響する。したがって、２種類以上の液体を効率良く混合し反応を行わせしめ得て、かつ簡便な流路が求められている。
【特許文献１】特開2001-322099号公報
【特許文献２】特開2004-108285号公報
【非特許文献１】「ＤＮＡチップ技術とその応用」、「蛋白質  核酸  酵素」43巻、13号（1998年）君塚房夫、加藤郁之進、共立出版（株）発行
【発明の開示】
【０００５】
本発明はこれらの実状に鑑みてなされたものであり、２種類以上の液体を高い効率で混合し、効率よく反応を行うことができるマイクロリアクタを提供することを目的とする。
【０００６】
また、ＤＮＡ増幅に好適な流路システムを有する遺伝子検査用マイクロリアクタを提供することを目的とする。
【０００７】
上記目的は次の構成で達成できる。
【０００８】
反応試薬を含む少なくとも２種類の液体を、マイクロポンプにより送液して合流させる合流部と、
前記合流部の下流側端部に設けられ、前記各液体が拡散混合される混合流路と、
拡散混合された混合液体の反応を促進する反応促進部とを有す、マイクロリアクタ。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の第１実施形態におけるマイクロリアクタの流路構成を示した図である。
【図２】図１のマイクロリアクタの送液制御系統を説明する図である。
【図３】合流部から直接液溜部に各液体を送り込む流路構成を示した図である。
【図４】本発明の第２実施形態におけるマイクロリアクタの流路構成を示した図である。
【図５】図４のマイクロリアクタの送液制御系統を説明する図である。
【図６】微細流路の中央部と壁面近傍での流速の違いを説明する図である。
【図７】本発明の第３実施形態におけるマイクロリアクタの流路構成を示した図である。
【図８】図７のマイクロリアクタの送液制御系統を説明する図である。
【図９】本発明の第４実施形態におけるマイクロリアクタの流路構成を示した図である。
【図１０】本発明の第４実施形態におけるマイクロリアクタの変形例を示した図である。
【図１１】合流部から各液体を微細流路に送液して微細流路内で混合および反応を行う流路構成を示した図である。
【図１２】ピエゾポンプを示し、（ａ）は、このポンプの一例を示した断面図、（ｂ）は、その上面図である。（ｃ）は、ピエゾポンプの他の例を示した断面図である。
【図１３】（ａ）、（ｂ）は、Ｙ字の分岐流路の上流から試薬と検体とを送液することにより、これらを合流させる様子を示した図である。
【図１４】疎水性バルブの流路方向に沿った断面図である。
【図１５】流路中に設けられる能動弁の一例を示した断面図であり、（ａ）は開弁状態を、（ｂ）は閉弁状態を示す。
【図１６】（ａ）、（ｂ）は、流路中に設けられる逆止弁の一例を示した断面図である。
【図１７】試薬収容部およびポンプの周辺構成の一例を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のマイクロリアクタは、反応試薬を含む少なくとも２種類の液体を、マイクロポンプにより送液して合流させる合流部と、
前記合流部から先に設けられ、前記各液体が拡散混合される微細流路と、
前記微細流路の下流側端部から先に設けられ、該微細流路よりも広幅の空間からなり、該微細流路で拡散混合された混合液を貯留して反応を行う液溜部とを備えることを特徴としている。【００１１】
上記の発明では、微細流路の幅が狭いために、合流部からの各液体が拡散により迅速に混合される。そして、充分に混合された後に、反応を広幅の液溜部で行っているので、一方の反応試薬への他方の反応試薬の供給、あるいは反応が起こっている部分への反応試薬の供給が、上記の微細流路のような流路に沿った１次元方向のみからの供給ではなく、周囲からの、２次元方向からの供給となる。【００１２】
したがって、反応試薬同士が出会う確率が大幅に高くなり、反応速度を向上させることができる。【００１３】
本発明のマイクロリアクタは、前記マイクロポンプにより前記各液体を前記合流部から前記微細流路へ送液した後、前記液溜部へ送り込む直前に、前記微細流路内の合流液の送液を一時停止するように前記マイクロポンプを制御する制御手段を備えることを特徴としている。【００１４】
前記制御手段による送液停止時間は、好ましくは０．５秒〜１０分である。【００１５】
上記の発明では、微細流路内の合流液を液溜部へ送り込む前に、送液を一時停止して、所定時間の間、微細流路内の各液体を拡散させ、充分に混合された後に混合液を液溜部へ送り込んでいる。したがって、液溜部での反応を効率的に行うことができる。【００１６】
なお、送液を一時停止するようにするためには、具体的にはマイクロポンプの駆動を停止し、所定時間経過後に駆動を再開するようにしてもよく、あるいは、微細流路の下流側端部の近傍に、後述する疎水性バルブを設け、この疎水性バルブで液体が停止してから、ポンプの駆動電圧は止めずに、しばらくは液体が動けない程度の圧力でポンプに定常的に駆動電圧を印加し続け、所定時間が経過後、液圧が疎水性バルブの許容圧以上となるように駆動電圧を上げて、混合液を液溜部に送り込むようにしてもよい。【００１７】
このように疎水性バルブを設けることによって、ポンプの駆動停止時に液体が毛管力で勝手に移動してしまうことを防止することができる。【００１８】
本発明のマイクロリアクタは、反応試薬を含む少なくとも２種類の液体を、マイクロポンプにより送液して合流させる合流部と、
前記合流部の下流側に設けられ、前記反応試薬同士の反応が行われるループ状の微細流路と、
前記ループ状の微細流路の上流側および／または下流側に設けられた弁と、
前記ループ状の微細流路に設けられ、前記合流部から送液された前記各液体の合流液を、前記ループ状の微細流路内で、前記弁によりループが閉じた状態で循環させる循環用マイクロポンプとを備えることを特徴としている。【００１９】
上記の発明では、各液体を合流部からループ状の微細流路内へ導入し、弁によりループを閉じた状態で循環させているので、ループ中の合流液をアクティブに混合することができるとともに、流路の中心部分と壁面近傍との間における液体の流速勾配によって、一方の反応試薬への他方の反応試薬の供給、あるいは反応が起こっている部分への反応試薬の供給を促進することができる。このように、循環によって、各液体の混合および、反応試薬同士の拡散の効率を同時に高めることができ、反応速度を向上させることができる。【００２０】
さらに、検体の濃度に合わせて循環速度や循環時間をコントロールすることにより、反応効率を制御することができる。【００２１】
本発明のマイクロリアクタは、反応試薬を含む少なくとも２種類の液体を、マイクロポンプにより送液して合流させる合流部と、
前記合流部から先に設けられ、前記反応試薬同士の反応が行われる微細流路と、
前記合流部から前記微細流路内に送液された前記各溶液の合流液の送液方向を切り替えて、前記合流液を前記微細流路内で繰り返し前後動させるように前記マイクロポンプを制御する制御手段とを備えることを特徴としている。【００２２】
上記の本発明では、反応試薬を含む各液体を送液するための各ポンプのうち複数もしくはいずれか１つのポンプにより微細流路中の液体を前後動させることにより、微細流路中の合流液をアクティブに混合することができるとともに、流路の中心部分と壁面近傍との間における液体の流速勾配によって、一方の反応試薬への他方の反応試薬の供給、あるいは反応が起こっている部分への反応試薬の供給を促進することができる。このように、微細流路内の合流液を往復動させることによって、各液体の混合および、反応試薬同士の拡散の効率を同時に高めることができ、反応速度を向上させることができる。【００２３】
また、反応試薬を含む液体を送液するマイクロポンプによってアクティブな混合が可能であり、混合用の別途のマイクロポンプを流路に配置する必要が無い。【００２４】
本発明のマイクロリアクタは、増幅対象であるＤＮＡを含むＤＮＡ溶液がマイクロポンプにより送液される微細流路と、
前記微細流路から分岐し、試薬液体がマイクロポンプにより送液される複数の分岐流路とが設けられ、
前記微細流路内を送液される前記ＤＮＡ溶液に対して、前記各分岐流路から前記試薬液体を順次合流させて遺伝子増幅反応を行うように構成されていることを特徴とする。【００２５】
上記の発明では、マイクロリアクタの流路は、特に遺伝子増幅反応のように濃度が低い増幅対象のＤＮＡと、このＤＮＡによる増幅反応で得られる増幅されたＤＮＡとを基点に進む反応の場合に、試薬液体を一度にＤＮＡ溶液へ混合すると反応の基点となるＤＮＡの濃度が下がり過ぎてしまうことを防止するために、試薬液体を徐々に加えて基点となるＤＮＡの濃度を増幅により増やしながら反応を行っているので、反応効率を向上させることができる。【００２６】
本発明のマイクロリアクタは、前記ＤＮＡ溶液と前記試薬液体とを合流部で合流させ、この合流液が次の合流部の手前に達した際に、該合流液の送液を一時停止するように前記各マイクロポンプを制御する制御手段を備えることを特徴としている。【００２７】
上記の発明では、合流部を介して微細流路内でＤＮＡ溶液と試薬液体とを合流させ、この合流液を、その次の合流部の手前まで送液した後、送液を停止して充分に反応を進行させているので、反応効率が向上する。【００２８】
上記の各発明では、マイクロポンプとして、
流路抵抗が差圧に応じて変化する第１流路と、
差圧の変化に対する流路抵抗の変化割合が第１流路よりも小さい第２流路と、
第１流路および第２流路に接続された加圧室と、
該加圧室の内部圧力を変化させるアクチュエータと、
該アクチュエータを駆動する駆動装置とを備えるマイクロポンプを用いることが好適である。【００２９】
上記の各発明におけるマイクロリアクタは、好ましくは、前記マイクロポンプの駆動装置からの駆動信号で前記アクチュエータの作動を制御することにより、反応させる化合物を含む各溶液を所望の比率で混合するように構成されている。【００３０】
上記の各発明のマイクロリアクタは、好ましくは、増幅対象であるＤＮＡを含むＤＮＡ溶液と、試薬液体とを合流させる合流部の上流側の各流路に、前記ＤＮＡ溶液が収容されるＤＮＡ収容部と、前記試薬液体が収容される試薬収容部とが設けられるとともに、これらの各収容部の上流側にポンプ接続部が設けられ、これらのポンプ接続部に前記マイクロポンプを接続し、各マイクロポンプから駆動液を供給することにより前記各収容部内の前記ＤＮＡ溶液および前記試薬液体を押し出してこれらを合流させることによって遺伝子増幅反応を開始するように構成されている。【００３１】
上記した各発明のマイクロリアクタは、検体もしくは検体から抽出したＤＮＡの溶液、または検体から抽出したＲＮＡから逆転写反応により合成したｃＤＮＡの溶液と、反応試薬を含む試薬液体とを混合して遺伝子増幅反応を行う用途に好適である。【００３２】
本発明のマイクロリアクタは、遺伝子検査、薬剤感受性検査、細菌検査、ウイルス検査、血液や尿などの生化学検査、環境中のダイオキシン濃度などの環境検査、創薬、化学反応等の分野で適用可能である。【００３３】
本発明のマイクロリアクタは、２種類以上の液体を高い効率で混合し、効率よく反応を行うことができる。【００３４】
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態を説明する。本発明の構成は特に、濃度が大幅に異なる２液以上を効率よく混合し、さらに濃度が低い側の物質濃度を基点とするか、あるいは濃度が低い側の物質および反応により得られる生成物を基点として進む反応に適しており、とりわけ遺伝子増幅反応に適した構成を有している。本発明のマイクロリアクタは、種々の実施の形態において、本発明の趣旨に沿って任意の変形、変更が可能であり、それらは本発明に含まれる。【００３５】
以下の各実施形態においては、ＩＣＡＮ（Isothermal chimera primer initiated nucleic acid amplification ）法により検体と試薬との遺伝子増幅反応および検出を行う遺伝子検査用のマイクロリアクタを例として説明する。
第１実施形態
図１は、本発明の第１実施形態のマイクロリアクタにおける、検体と試薬との混合および反応を行う流路構成を示した図である。図示したように、検体収容部１からマイクロポンプ（図示せず）により送液される検体と、試薬収容部２からマイクロポンプ（図示せず）により送液される試薬液体は、Ｙ字流路の合流部３で合流され、後続する微細流路４に送液される。【００３６】
微細流路４は、例えば、幅が０．２ｍｍ、深さが０．２ｍｍとされ、ＩＣＡＮ反応が行われる図中破線内の領域の液溜部５までの距離が１２５ｍｍとされる。【００３７】
微細流路内への試薬および検体の送液は、これらの収容部の上流側に設けられたポンプ接続部に接続したマイクロポンプで行っている。図１７に、試薬収容部およびマイクロポンプの周辺構成の一例を示した。試薬収容部２の流路方向両側には、封止液収容部９３が設けられ、使用前における試薬の漏出、汚染などを防止している。ポンプ接続部９１を介して、ポンプ３１が接続され、駆動液収容部９２に収容された駆動液をポンプ３１で下流側へ送液することによって、試薬収容部内の試薬を封止液とともに押し出して送液している。【００３８】
なお、８３は、図１４に示した構造を有する疎水性バルブであり、この疎水性バルブ８３は、正方向への送液圧力が所定圧に達するまで液体の通過を遮断し、所定圧以上の送液圧力を加えることにより液体の通過を許容する。図示したように、疎水性バルブ８３は、流路径を絞った部分からなり、これにより、一端側からこの絞り流路５１に達した液体が、他端側へ通過することを規制している。この絞り流路５１は、例えば、両側に直列に連結された縦横が２００μｍ×２００μｍの流路に対して、縦横が２００μｍ×３０μｍ程度となるように形成される。【００３９】
液体を、細径の絞り流路５１の端部から太径の流路８４へ押し出すには、表面張力のために所定の送液圧力を要する。したがって、マイクロポンプからのポンプ圧により、液体の停止と通過を制御することができるので、例えば流路の所定箇所において液体の移動を一時止めておき、所望のタイミングでこの箇所から先の流路へ送液を再開することができる。【００４０】
必要に応じて、絞り流路５１の内面には、撥水性のコーティング、例えばフッ素系のコーティングを施してもよい。【００４１】
ポンプ接続部９１と、試薬収容部２との間の流路には、空気抜き用の流路９４が設けられている。この空気抜き用の流路９４は、ポンプ接続部９１と試薬収容部２との間の流路から分岐し、その末端が開放されている。この空気抜き用の流路９４から、例えばポンプ接続時などに流路内に存在する気泡を除去するようにしている。【００４２】
マイクロポンプとしては、ピエゾポンプが好ましく用いられる。図１２（ａ）は、このポンプの一例を示した断面図、図１２（ｂ）は、その上面図である。このマイクロポンプには、第１液室４８、第１流路４６、加圧室４５、第２流路４７、および第２液室４９が形成された基板４２と、基板４２上に積層された上側基板４１と、上側基板４１上に積層された振動板４３と、振動板４３の加圧室４５と対向する側に積層された圧電素子４４と、圧電素子４４を駆動するための駆動部（図示せず）とが設けられている。【００４３】
この例では、基板４２として、厚さ５００μｍの感光性ガラス基板を用い、深さ１００μｍに達するまでエッチングを行なうことにより、第１液室４８、第１流路４６、加圧室４５、第２流路４７および第２液室４９を形成している。第１流路４６はその幅を２５μｍ、長さを２０μｍとしている。また、第２流路４７は、その幅を２５μｍ、長さを１５０μｍとしている。【００４４】
ガラス基板である上側基板４１を、基板４２上に積層することにより、第１液室４８、第１流路４６、第２液室４９および第２流路４７の上面が形成される。上側基板４１の加圧室４５の上面に当たる部分は、エッチングなどにより加工されて貫通している。【００４５】
上側基板４１の上面には、厚さ５０μｍの薄板ガラスからなる振動板４３が積層され、その上に、例えば厚さ５０μｍのチタン酸ジルコン酸鉛（ＰＺＴ）セラミックスなどからなる圧電素子４４が積層されている。【００４６】
駆動部からの駆動電圧により、圧電素子４４とこれに貼付された振動板４３が振動し、これにより加圧室４５の体積が増減する。第１流路４６と第２流路４７とは、幅および深さが同じで、長さが第１流路よりも第２流路の方が長くなっており、第１流路４６では、差圧が大きくなると、流路内で渦を巻くように乱流が発生し、流路抵抗が増加する。一方、第２流路４７では、流路幅が長いので差圧が大きくなっても層流になり易く、第１流路に比べて差圧の変化に対する流路抵抗の変化割合が小さくなる。【００４７】
例えば、圧電素子４４に対する駆動電圧により、加圧室４５の内方向へ素早く振動板４３を変位させて大きい差圧を与えながら加圧室４５の体積を減少させ、次いで加圧室４５から外方向へゆっくり振動板４３を変位させて小さい差圧を与えながら加圧室４５の体積を増加させると、液体は同図のＢ方向へ送液される。逆に、加圧室４５の外方向へ素早く振動板４３を変位させて大きい差圧を与えながら加圧室４５の体積を増加させ、次いで加圧室４５から内方向へゆっくり振動板４３を変位させて小さい差圧を与えながら加圧室４５の体積を減少させると、液体は同図のＡ方向へ送液される。【００４８】
なお、第１流路と第２流路における、差圧の変化に対する流路抵抗の変化割合の相違は、必ずしも流路の長さの違いによる必要はなく、他の形状的な相違に基づくものであってもよい。【００４９】
上記のように構成されたピエゾポンプによれば、ポンプの駆動電圧波形、電圧値、および周波数を変えることによって、液体の送液方向、送液速度を制御できるようになっている。図１２（ｃ）に、このポンプの他の例を示した。この例では、ポンプをシリコン基板７１、圧電素子４４、および図示しないフレキシブル配線から構成している。シリコン基板７１は、シリコンウエハを公知のフォトリソグラフィー技術により所定の形状に加工したものであり、エッチングにより加圧室４５、ダイヤフラム４３、第１流路４６、第１液室４８、第２流路４７、および第２液室４９が形成されている。第１液室４８にはポート７２が、第２液室４９にはポート７３がそれぞれ設けられ、このポートを介してマイクロリアクタのポンプ接続部と連通する。例えば、ポートが穿孔された基板７４と、マイクロリアクタのポンプ接続部近傍とを上下に重ね合わせることによって、ポンプをマイクロリアクタに接続することができる。また、１枚のシリコン基板に複数のポンプを形成することも可能である。この場合、マイクロリアクタと接続したポートの反対側のポートには、駆動液タンクが接続されていることが望ましい。ポンプが複数個ある場合、それらのポートは共通の駆動液タンクに接続されていてもよい。【００５０】
検体と試薬溶液との微細流路内への送液は、図１３（ｂ）に示したように、Ｙ字の分岐流路のＡ方向からの試薬８１の送液と、Ｂ方向からの検体８２の送液を、双方のポンプを駆動して同時に行う方式の他、例えば図１３（ａ）に示したように、Ｙ字の分岐流路のＡ方向からの試薬８１の送液と、Ｂ方向からの検体８２の送液を交互に行うことによって、試薬８１と検体８２とが流路８４内で輪切り状に交互に充填されるように送液してもよく、ポンプ送液の切り替え速度を高めることで、この輪切り層の幅が短くなると、試薬８１と検体８２との間の拡散が早くなる。【００５１】
微細流路４内では、微細流路の幅が狭いために、合流部からの各液体が拡散により迅速に混合されるが、液溜部５へ送り込む直前に、試薬と検体とを充分に拡散混合するために、微細流路内の合流液の送液を一時停止するようにしてもよい。マイクロポンプの停止時間は、好ましくは０．５秒〜１０分である。図２は、このポンプの一時停止動作を制御する制御系統を示した図である。図示したように、マイクロポンプ３１は増幅器３２、Ｄ／Ａ変換器３３を介してマイクロコンピュータ３４に接続されている。これらのマイクロポンプ３１、増幅器３２、Ｄ／Ａ変換器３３、マイクロコンピュータ３４などは遺伝子増幅反応を行うチップとは別途の本体に組み込まれている。マイクロコンピュータ３１はタイマー３５を搭載しており、予めプログラムされたタイミングでマイクロポンプ３１の送液停止および再開を制御する。【００５２】
なお、送液を一時停止するようにするためには、具体的にはマイクロポンプの駆動を停止し、所定時間経過後に駆動を再開するようにしてもよく、あるいは、微細流路の下流側端部の近傍に、後述する疎水性バルブ（図１４）を設け、この疎水性バルブで液体が停止してから、ポンプの駆動電圧は止めずに、しばらくは液体が動けない程度の圧力でポンプに定常的に駆動電圧を印加し続け、所定時間が経過後、液圧が疎水性バルブの許容圧以上となるように駆動電圧を上げて、混合液を液溜部に送り込むようにしてもよい。【００５３】
このように疎水性バルブを設けることによって、ポンプの駆動停止時に液体が毛管力で勝手に移動してしまうことを防止することができる。【００５４】
微細流路内で検体と試薬液体とを充分に拡散混合させた後、液溜部５へ混合溶液を送り込んで貯留した状態で、ＩＣＡＮ反応が行われる。【００５５】
液溜部５は、微細流路４よりも広幅に形成された空間からなり、例えば、微細流路の幅が０．２ｍｍ、深さが０．２ｍｍである場合に、直径５．６ｍｍ、深さが０．２ｍｍの空間として形成される。【００５６】
微細流路４では、その幅が狭いために、合流部３からの各液体が拡散により迅速に混合される一方、増幅対象のＤＮＡへの反応試薬の供給が、流路に沿った１次元方向に限定されるため、反応を迅速に行うことができない。すなわち、図１１に示したような、微細流路４内で合流液を止めた状態で反応を行う系では、反応速度が遅く、増幅に寄与しない反応試薬を多数残すことになる。【００５７】
これに対して、反応を広幅の液溜部５で行うことにより、プライマー等の反応試薬が増幅対象のＤＮＡへ２次元方向から供給され、すなわち周囲全体から供給されるようになるので、ＤＮＡと反応試薬とが出会う確率が大幅に高くなり、反応速度が向上する。【００５８】
なお、図３に示したように、検体と試薬液体との合流部３と液溜部５との間に微細流路４を設けない構成とすると、合流部３から液溜部５へ送り込まれた各液体は、充分に拡散せずに界面１０を境に偏在することになるので、拡散に時間を要し反応速度が遅くなる。第２実施形態
図４は、本発明の第２実施形態のマイクロリアクタにおける、検体と試薬との混合および反応を行う流路構成を示した図である。図示したように、検体収容部１からマイクロポンプ（図示せず）により送液される検体と、試薬収容部２からマイクロポンプ（図示せず）により送液される試薬液体は、Ｙ字流路の合流部３で合流され、弁１２を通して後続するループ状の微細流路１１に送液される。【００５９】
ループ状の微細流路１１に充填された検体と試薬液体との合流液は、ループ内に設けられたマイクロポンプ１４により、弁１２と弁１３とによりループが閉じた状態で循環される。循環によって、ループ内を流れる試薬液体と検体とがアクティブに拡散混合される。【００６０】
なお、ループ状の微細流路１１のループを閉じた状態で合流液を循環させるための弁として、本実施形態ではループ状の微細流路１１の上流側および下流側にそれぞれ弁１２、弁１３を設けているが、ループ外への液の流れを抑止し、ループを閉じた状態で合流液を循環させるためには、ループ状の微細流路１１の上流側もしくは下流側のいずれか一方に弁を設けるようにしてもよい。但し、上流側に弁が無いと、循環が長時間になるとループ内の液体成分が上流に拡散してしまうおそれがあるので、図４のように上流側および下流側に弁を設けることが好ましい。【００６１】
ループ状の微細流路１１の寸法は、例えば幅０．３ｍｍ、深さ０．３ｍｍ、ループ直径１６．５ｍｍのものが使用でき、循環用マイクロポンプ１４としては、前述したピエゾポンプを使用できる。このポンプの寸法は、例えば２ｍｍ×０．７ｍｍ×０．３ｍｍである。弁１３に前述した疎水性バルブを使用する場合、その寸法は、例えば幅０．０２５ｍｍ、深さ０．３ｍｍであり、弁１２もしくは弁１３に能動弁を使用する場合、その弁体寸法は、例えば直径０．６ｍｍ程度である。【００６２】
循環によって、ループ内を流れる試薬液体と検体とがアクティブに拡散混合されるとともに、流路の中心部分と壁面近傍との液体の流速勾配によって、ＤＮＡと、プライマー等の反応試薬とが出会う確率が高くなり、反応速度が向上する。【００６３】
図６によりこれを説明すると、流路１７の中央部の液体の流れ１９ａは、壁面１８近傍の液体の流れ１９ｂよりも速いため、この流速勾配によって、ＤＮＡと反応試薬との相対移動が促進されるので、ＤＮＡがループ内の様々な位置の反応試薬と出会う確率が高くなり、反応が促進される。【００６４】
また、検体の濃度に合わせて循環速度や循環時間をコントロールすることにより、反応効率を制御することができる。【００６５】
ループ内の液体の循環は、同一方向に循環し続けてもよく、また循環方向を切り替えてもよい。【００６６】
反応終了後、ループ内の液体は、弁１３を開放して、検体あるいは試薬を送液する上流側のマイクロポンプにより後続する流路へ送液される。ループの上流側の弁１２には、能動弁もしくは逆止弁を使用することができ、ループの下流側の弁１３には、能動弁もしくは前述した疎水性バルブ（図１４）を使用することができる。弁をループ状の微細流路１１の上流側もしくは下流側のいずれか一方に設ける場合にも、弁として同様にこれらのものが使用でき、上流側および下流側の両側に設ける場合には、これらのものを任意の組み合わせで用いることができる。【００６７】
図１５は、能動弁の一例を示した断面図であり、図１５（ａ）は開弁状態を、図１５（ｂ）は閉弁状態を示す。この能動弁では、下方に突出した弁部６４が形成された可撓性基板６３が、開口６５が形成された基板６２の上に積層されている。【００６８】
閉弁時には、図１５（ｂ）に示したように、可撓性基板６３を上側から空気圧、油圧、水圧ピストンや圧電アクチュエータ、形状記憶合金アクチュエータなどの弁体変形手段により押圧することによって、弁部６４を基板６２に対して開口６５を覆うように密着させ、これによりＢ方向への逆流を遮断するようにしている。また、能動弁は外部の駆動装置により作動するものに限らず、弁体が自ら変形して流路を塞ぐ構成でもよい。例えばバイメタルを使用して通電加熱により変形するようにしてもよく、あるいは形状記憶合金を使用して通電加熱により変形するようにしてもよい。【００６９】
図１６（ａ）、（ｂ）は、逆止弁の一例を示した断面図である。図１６（ａ）の逆止弁では、微小球６７を弁体として、基板６２に形成した開口６８をこの微小球６７の移動により開閉することによって、液体の通過を許容および遮断している。すなわち、Ａ方向から液体が送液される際には、液圧によって微小球６７が基板６２から離反して開口６８が開放されるので、液体の通過が許容される。一方、Ｂ方向から液体が逆流した場合には、微小球６７が基板６２に着座して開口６８が閉止されるので、液体の通過が遮断される。【００７０】
図１６（ｂ）の逆止弁では、基板６２上に積層され、その端部が開口６８の上側に延び出した可撓性基板６９が、液圧により開口６８の上側を上下動することにより開口６８を開閉している。すなわち、Ａ方向から液体が送液される際には、液圧によって可撓性基板６９の端部が基板６２から離反して開口６８が開放されるので、液体の通過が許容される。一方、Ｂ方向から液体が逆流した場合には、可撓性基板６９が基板６２に密着して開口６８が閉止されるので、液体の通過が遮断される。【００７１】
図５は、送液用および循環用のマイクロポンプ、および弁の制御系統を示した図である。図示したように、送液用マイクロポンプ３１および循環用マイクロポンプ１４は増幅器３２、Ｄ／Ａ変換器３３を介してマイクロコンピュータ３４に接続されている。【００７２】
さらに、弁１２、弁１３を開閉するためのエアシリンダ３６が、Ｄ／Ａ変換器３３を介してマイクロコンピュータ３４に接続されている。【００７３】
マイクロコンピュータ３１はタイマー３５を搭載しており、予めプログラムされたタイミングで送液用マイクロポンプ３１および循環用マイクロポンプ１４の送液および、弁１２、弁１３の開閉を制御する。
第３実施形態
図７は、本発明の第３実施形態のマイクロリアクタにおける、検体と試薬との混合および反応を行う流路構成を示した図である。図示したように、検体収容部１からマイクロポンプ（図示せず）により送液される検体と、試薬収容部２からマイクロポンプ（図示せず）により送液される試薬液体は、Ｙ字流路の合流部３で合流され、後続する微細流路２１に送液される。【００７４】
微細流路２１は、例えば、幅が０．２ｍｍ、深さが０．２ｍｍとされ、この微細流路２１（図中点線で囲った領域の流路）内でＩＣＡＮ反応が行われる。【００７５】
検体と試薬液体とを微細流路２１内に充填した後、検体を送液するマイクロポンプを、送液方向を繰り返し切り替えるように駆動し、微細流路２１内の合流液を微細流路２１内で前後動させ、ＩＣＡＮ反応を行う。例えば微細流路２１の幅が０．２ｍｍ、深さが０．２ｍｍ、液量が２５μｌである場合、振幅２５ｍｍ、周期５秒程度の往復動をさせればよい。【００７６】
この前後動により、微細流路２１内の試薬液体と検体とがアクティブに拡散混合されるとともに、図６で説明したように、流路の中心部分と壁面近傍との液体の流速勾配によって、ＤＮＡと試薬とが出会う確率が高くなり、反応速度が向上する。【００７７】
また、試薬収容部側の流路に逆流を防止する弁２２を設け、検体を送液するマイクロポンプによって微細流路２１内の合流液を前後動させているので、混合用の別途のマイクロポンプを流路に配置する必要が無い。このマイクロポンプには、図１２に示したようなピエゾポンプが好適である。【００７８】
図７では一方のマイクロポンプだけで合流液を往復動させているが、弁２２を設けずに、検体収容部側のマイクロポンプと試薬収容部側のマイクロポンプとを駆動することにより、微細流路２１内の合流液を往復動させるようにしてもよい。【００７９】
図８は、送液用のマイクロポンプ３１、および弁２２の制御系統を示した図である。図示したように、送液用マイクロポンプ３１は増幅器３２、Ｄ／Ａ変換器３３を介してマイクロコンピュータ３４に接続されている。【００８０】
さらに、弁２２を開閉するためのエアシリンダ３６が、Ｄ／Ａ変換器３３を介してマイクロコンピュータ３４に接続されている。【００８１】
マイクロコンピュータ３１はタイマー３５を搭載しており、予めプログラムされたタイミングで送液用マイクロポンプ３１の送液および弁２２の開閉を制御する。
第４実施形態
図９は、本発明の第４実施形態のマイクロリアクタにおける、検体と試薬との混合および反応を行う流路構成を示した図である。図示したように、検体収容部１からの検体は、マイクロポンプ（図示せず）により微細流路２５（図中点線で囲った流路）内を送液される。この微細流路２５から、試薬液体がマイクロポンプ（図示せず）により送液される複数の分岐流路２７ａ、２７ｂ、２７ｃが分岐されている。試薬液体は、試薬収容部２から幹流路２６を介して分岐流路２７ａ、２７ｂ、２７ｃへ送液される。【００８２】
検体収容部１からの検体は、微細流路２５内を下流側へ進むとともに、合流部２８ａ、２８ｂ、２８ｃで順次試薬液体と合流し、増幅反応が行われる。以下、検体が合流部２８ａ、２８ｂ、２８ｃと進む順に従って、微細流路２５内における検体と試薬液体との混合および反応について説明する。【００８３】
検体収容部１から送液された検体が合流部２８ａに達すると、分岐流路２７ａからの試薬液体と合流される。この際合流される試薬液体の量は、試薬液体全量を各分岐流路２７ａ、２７ｂ、２７ｃに分割した量である。この合流液の先端部が次の合流部２８ｂに達するまでにも検体と試薬との拡散混合および増幅反応が進行するが、合流液の先端部が合流部２８ｂに達する直前に、必要に応じて送液を停止し、増幅反応を充分に進行させる。合流部２８ａと合流部２８ｂとの間の微細流路２５内の混合液中では、ＤＮＡが例えば数倍に増幅される。【００８４】
次いで、検体の送液を再開し、合流部２８ｂの手前から送液された検体が合流部２８ｂで分岐流路２７ｂからの試薬液体と合流される。この合流液の先端部が次の合流部２８ｃに達するまでにも検体と試薬との拡散混合および増幅反応が進行するが、合流液の先端部が合流部２８ｃに達する直前に、必要に応じて送液を停止し、増幅反応を進行させる。合流部２８ｂと合流部２８ｃとの間の微細流路２５内の混合液中では、ＤＮＡが、例えばさらに数倍に増幅される。一方、連続的に後続する検体が合流部２８ａに達すると、分岐流路２７ａからの試薬液体と合流され、上述と同様に、検体と試薬との拡散混合および増幅反応が進行し、合流部２８ａと合流部２８ｂとの間の微細流路２５内の混合液中では、ＤＮＡが例えば数倍に増幅される。【００８５】
次いで、検体の送液を再開し、合流部２８ｃの手前から送液された検体が合流部２８ｃで分岐流路２７ｃからの試薬液体と合流され、上記と同様に検体と試薬との拡散混合および増幅反応が進行し、合流部２８ｃより先の微細流路２５内の混合液中では、ＤＮＡが、例えば、またさらに数倍に増幅される。一方、合流部２８ａと合流部２８ｂとの間、および合流部２８ｂと合流部２８ｃとの間の微細流路２５内の混合液中でも、上述と同様にＤＮＡが増幅される。【００８６】
このように、試薬を分割して、複数の合流部２８ａ、２８ｂ、２８ｃから段階的に合流させ、微細流路２５内でＤＮＡを徐々に増幅しているので、例えば検体と試薬とを一の合流部で一度に合流させて反応を進行させた場合と比べると、本実施形態ではＤＮＡと反応試薬とが流路内の拡散により出会う確率が高くなり、反応効率は大幅に増加する。すなわち、遺伝子増幅反応のように濃度が低い方の反応物質（増幅するＤＮＡ）と、反応により得られる反応物質（増幅されたＤＮＡ）とを基点に進む反応の場合、試薬液体を検体と一度に合流させて混合すると、反応の基点となるＤＮＡの濃度が下がり過ぎてしまうので、これを防止するために、試薬液体を徐々に加えて基点となる反応物質（ＤＮＡ）を増やしながら反応を進行させることによって、全体として反応効率を向上させることができる。【００８７】
図１０は、本実施形態のマイクロリアクタにおける、検体と試薬との混合および反応を行う流路構成の変形例を示した図である。同図の流路構成においても、図９の場合と同様に、検体収容部２５からの検体を微細流路２５に送液して、分岐流路２７ａ〜２７ｄからの試薬液体を合流部２８ａ〜２８ｄから段階的に合流させ、微細流路２５内で効率的にＤＮＡを増幅させながら下流側への送液を行う。この例では、流路幅が０．２ｍｍ、流路深さが０．２ｍｍであり、各合流部間の微細流路２５の長さが３０ｍｍ、分岐流路２７の長さが３ｍｍとしている。【００８８】
本実施形態においても、図２、図５、図８と同様に、マイクロポンプの一時停止動作を制御する制御系統を備えており、マイクロコンピュータ３４によって、各合流部２８の手前で微細流路２５内の液体の送液を一時停止して反応を進行させることができる。【００８９】
以上に、本発明のマイクロリアクタの実施形態について説明したが、本発明は、これらの実施形態に限定されることはなく、本発明の趣旨に沿って任意の変形、変更が可能であり、それらは本発明に含まれる。すなわち、本発明のマイクロリアクタの全体または一部について、構造、構成、配置、形状形態、寸法、材質、方式、方法などを本発明の趣旨に合致する限り、種々のものにすることができる。【００９０】
以下に、本発明の構成が適用可能なマイクロリアクタならびに、遺伝子増幅工程および検出工程に好適な構成とした遺伝子検査用マイクロリアクタについて説明する。【００９１】
マイクロリアクタは、樹脂、ガラス、シリコン、セラミックスなどで作製される一枚のチップからなる。そのチップには、例えば、試薬収容部、流路、ポンプ接続部、試薬定量部、混合部、反応部などの各部が、機能的に適当な位置に超微細加工技術により設置されている。遺伝子検査用マイクロリアクタにあっては、さらにプローブＤＮＡ収容部、コントロール収容部、必要であれば逆転写酵素収容部が設置される。【００９２】
上記マイクロリアクタは、好ましくは試薬が収容された各試薬収容部の上流部にポンプ接続部が設けられ、これらのポンプ接続部にマイクロポンプを接続し、各マイクロポンプから駆動液を供給することにより試薬収容部から試薬を流路へ押し出して所定の反応、合成などを開始するように構成されている。【００９３】
遺伝子検査用マイクロリアクタでは、検体収容部は、検体注入部に連通しており、検体の一時収容および混合部への検体供給を行う。場合によっては血球分離の作用などを担わせてもよい。試薬と試薬との混合、および検体と試薬との混合は、単一の混合部で所望の比率で混合してもよく、あるいは何れかもしくは両方を分割して複数の合流部を設け、最終的に所望の混合比率となるように混合しても構わない。好ましくはマイクロポンプの駆動装置からの駆動信号で、アクチュエータの作動を制御することにより所望の比率で各試薬を混合するように構成される。【００９４】
血液などの検体をマイクロリアクタの上記検体注入部に注入することにより、マイクロリアクタ内で所定の反応、例えば合成反応、化学反応、抗原抗体反応、遺伝子増幅反応およびその検出に必要な処理を自動的に行い、多項目について同時に、且つ短時間で検査ができるように構成されている。本発明のマイクロリアクタを使用する好ましい検査の態様では、必要な試薬類があらかじめ所定の量、封入されており、該マイクロリアクタが検体ごとに使用される。例えば遺伝子検査用のマイクロリアクタは、検体のＤＮＡ（検体から抽出したＲＮＡを逆転写反応により合成したＤＮＡも含む）とＤＮＡ増幅反応用試薬類との増幅反応、ならびに増幅産物の検出を行うユニットとして使用される。【００９５】
本発明に係るマイクロリアクタには、流路等が形成されたチップにマイクロポンプを接続して使用するもの、チップにマイクロポンプが予め接続されたもの、および、チップとともにマイクロポンプ、弁などを制御する制御系統を備えたものが含まれる。また、マイクロポンプなどを備えた別途の装置本体にチップを装着して反応、検出を行うものであってもよく、この装置本体は、送液、温度、反応の各制御に関わる制御系、光学検出、データの収集および処理を受け持つユニットなどにより構成される。遺伝子検査用途では、この装置本体は、これにチップを装着することにより検体サンプルに対して共通で使用されるので、多数の検体があっても効率よく迅速に処理できる。【００９６】
上記のマイクロリアクタは、いずれのコンポーネントも小型化され、持ち運びに便利な形態としているために、使用する場所および時間に制約されず、作業性、操作性が良好である。【００９７】
本発明のマイクロリアクタを用いて、検体もしくは検体から抽出したＤＮＡ、または検体から抽出したＲＮＡから逆転写反応により合成したｃＤＮＡを含む検体と、反応試薬を含む試薬液体とを混合して好適に遺伝子増幅反応を行うことができる。
・検体
測定対象となる検体は、遺伝子検査の場合、増幅反応の鋳型となる核酸として遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡである。このような核酸を含む可能性のある試料から調製または単離したものであってよい。そのような試料から遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡを調製する方法は、特に限定されず、従来技術を使用することができる。最近、ＤＮＡ増幅のために生体試料から遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡを調製する技術が開発され、キットなどの形態でも利用可能である。【００９８】
検体自体にも特に制限はないが、例えば全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、唾液、喀痰など生体由来のほとんどの試料；細胞培養物；ウィルス、細菌、カビ、酵母、植物、動物などの核酸含有試料；微生物などが混入または含有する可能性のある試料、その他核酸が含有されている可能性のあるあらゆる試料などが対象となる。【００９９】
ＤＮＡは、試料から常法に従い、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により、分離精製できる。核酸を遊離するために、飽和濃度に近いグアニジン塩酸塩、イソチオシアン酸塩のような高濃度カオトロピック試薬を使用することは一般的に知られている。【０１００】
ＲＮＡの場合、逆転写反応に使用されるプライマーの作製が可能であれば特に制限はない。例えば試料中の全ＲＮＡのほか、遺伝子として機能しているレトロウィルスのＲＮＡ、発現される遺伝子の直接の情報伝達担体であるｍＲＮＡ、ｒＲＮＡなどのＲＮＡ分子群が対象となる。これらのＲＮＡは、適当な逆転写酵素を利用してｃＤＮＡに変換してから分析すればよい。ｍＲＮＡの調製方法は、公知の技術に基づいて行うことができ、逆転写酵素は容易に入手することができる。【０１０１】
本発明のマイクロリアクタは、従来の装置を使用して行う手作業の場合に比べて、必要とされる検体量は極めて少なくてもよい。例えば、遺伝子の場合、ＤＮＡとして0.001〜100ｎｇである。このため、微量の試料しか得られない場合であっても、本発明のマイクロリアクタでは、前処理として検体の濃度と高めるといったことは、特に必要とされない。
・増幅法
本発明のマイクロリアクタでは、増幅方法を限定されない。例えばＤＮＡ増幅技術は、多方面で盛んに利用されているＰＣＲ増幅法を使用することができる。その増幅技術を実施するための諸条件が詳細に検討され、改良点も含めて各種文献などに記載されている。ＰＣＲ増幅においては、３つの温度間で昇降させる温度管理が必要になるが、マイクロチップに好適な温度制御を可能とする流路デバイスが、すでに本発明者らにより提案されている（特開2004−108285号）。このデバイスシステムを本発明のマイクロリアクタの増幅用流路に適用すればよい。これにより、熱サイクルが高速に切り替えられ、微細流路を熱容量の小さいマイクロ反応セルとしているため、ＤＮＡ増幅は、手作業によりマイクロチューブ、マイクロバイアルなどで行なう従来の方式よりはるかに短時間で行うことができる。【０１０２】
ＰＣＲ反応のように複雑な温度管理を必要としない、最近開発されたＩＣＡＮ（Isothermal chimera primer initiated nucleic acid amplification ）法は、５０〜６５℃における任意の一定温度の下にＤＮＡ増幅を短時間で実施できる特徴を有する（特許第3433929号）。したがって、ＩＣＡＮ法は、本発明のマイクロリアクタでは、簡便な温度管理で済むために好適な増幅技術である。手作業では、１時間かかる本法は、本発明のバイオリアクタにおいては、10〜20分、好ましくは、15分で解析まで終わる。【０１０３】
ＤＮＡ増幅反応は、その他のＰＣＲ変法であってもよく、本発明のマイクロリアクタは、流路の設計変更などによりいずれにも対応できる柔軟性がある。いずれのＤＮＡ増幅反応を使用する場合にも、その技術の詳細は開示されており、当業者は容易に導入することができる。
・試薬類
(ｉ)  プライマー
ＰＣＲプライマーは、増幅したい特定部位のＤＮＡ鎖の両端に相補的な２種のオリゴヌクレオチドである。その設計は、すでに専用のアプリケーションが開発されており、当業者であればＤＮＡシンセザイザー、化学合成などにより容易に作成できる。ＩＣＡＮ法用のプライマーは、ＤＮＡおよびＲＮＡのキメラプライマーであるが、このものの調製法もすでに技術的に確立されている（特許第3433929号）。プライマーの設計、選択は、増幅反応の成否、効率を左右するため最も適切なものを使用することが重要である。【０１０４】
また、プライマーにビオチンを結合させておくと、増幅産物のＤＮＡを、基板上のストレプトアビジンとの結合を介して基板上に固定化でき、増幅産物の定量に供し得る。その他のプライマー標識物質としてジゴキシゲニン、各種蛍光色素などが例示される。
(ii)  増幅反応用試薬類
増幅反応に使用する酵素をはじめとする試薬類は、ＰＣＲ用、ＩＣＡＮ法のいずれも容易に入手できる。【０１０５】
ＰＣＲ法における試薬類として、少なくとも２'−デオキシヌクレオシド５'−三リン酸のほか、Taq ＤＮＡポリメラーゼ、Vent ＤＮＡポリメラーゼまたはPfu ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。【０１０６】
ＩＣＡＮ法における試薬類は、少なくとも２'−デオキシヌクレオシド５'−三リン酸、検出したい遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションできるキメラプライマー、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼのＲＮaseを含む。
(iii)  コントロール
インターナルコントロールは、標的核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）について、増幅のモニタリング、あるいは定量の際の内部標準物質として使用される。インターナルコントロールの配列は、検体とは異なる配列の両側に、検体用プライマーと同じプライマーがハイブリダイズできる配列を有するために検体と同様に増幅できるものである。ポジティブコントロールの配列は、検体を検出する特異的な配列で、プライマーがハイブリダイズする部分とその間の配列が検体と同じものである。コントロールに使用する核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）は、公知技術文献に記載されているものを使用すればよい。ネガティブコントロールは、核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）以外の試薬などをすべて含み、コンタミネーションの有無のチェック、バックグラウンド補正用に用いる。
（iv）  逆転写用試薬
ＲＮＡの試料の場合、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成するための逆転写酵素、逆転写プライマーなどであり、これらも市販され容易に入手できる。【０１０７】
これらの増幅用基質（２'−デオキシヌクレオシド５'−三リン酸）、遺伝子増幅用試薬などは、一枚のマイクロリアクタの上記試薬収容部に、それぞれ予め所定量封入されている。したがって本発明のマイクロリアクタは使用時にその都度、試薬を必要量充填する必要はなく、即使用可能の状態になっている。
・検出工程
増幅された目的遺伝子のＤＮＡを検出する方法は、特に限定されず、必要に応じて好適な方法が使用される。そうした方法には、可視分光側光法、蛍光測定法、発光ルミネッセンス法といった検出方法が主流である。さらに、電気化学的方法、表面プラズモン共鳴、水晶発振子マイクロバランスなどの手法も挙げられる。【０１０８】
上記マイクロリアクタを用いて、一例として以下の工程で増幅および検出を行なうことができる。すなわち、（１）検体もしくは検体から抽出したＤＮＡ、あるいは検体もしくは検体から抽出したＲＮＡから逆転写反応により合成したｃＤＮＡと、ビオチン修飾したプライマーとを、これらの収容部から流路へ送液し、微細流路内で、遺伝子を増幅する工程、（２）微細流路内で増幅された遺伝子を含む増幅反応液と変性液とを混合し、増幅された遺伝子を一本鎖に変性処理する工程、（３）増幅された遺伝子を一本鎖に変性処理した処理液を、ストレプトアビジンを吸着させた微細流路内に送液し、前記の増幅された遺伝子を固定化する工程、（４）増幅された遺伝子を固定化した微細流路内に、末端をＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）で蛍光標識したプローブＤＮＡを流し、これを固定化した遺伝子にハイブリダイゼーションする工程、（５）上記微細流路内にＦＩＴＣに特異的に結合するＦＩＴＣ抗体で表面を修飾した金コロイド液を流し、これにより固定化した遺伝子にハイブリダイズしたＦＩＴＣ修飾プローブに、その金コロイドを吸着させる工程、（６）上記微細流路の金コロイドの濃度を光学的に測定する工程、によって増幅および検出を行なうことができる。【０１０９】
好ましくは、前記各工程の間に、必要に応じてストレプトアビジンを吸着させた前記流路内に洗浄液を送液する工程を含む。そのような洗浄液としては、例えば各種の緩衝液、塩類水溶液、有機溶媒などが好適である。【０１１０】
検出法は、最終的に可視光により、高感度で測定できる方式が好ましい。蛍光測光より、機器が汎用的であり、妨害因子が少なくデータ処理も容易である。好ましくは、そのための光学検出装置が、上記マイクロポンプを含む送液手段およびマイクロリアクタの流路内における各反応の反応温度を制御する温度制御装置とともに組み込まれて、一体化した構成を有している遺伝子検査装置を用いて検出が行われる。【０１１１】
上記工程において、変性液は、遺伝子ＤＮＡを１本鎖にするための試薬で、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどが挙げられる。プローブは、オリゴデオキシヌクレオチドなどが挙げられる。またＦＩＴＣの他に、ＲＩＴＣ（ローダミンイソチオシアネート）などの蛍光物質が挙げられる。【０１１２】
上記の増幅および検出は、予め送液順序、容量、タイミングなどに関して設定された諸条件を、マイクロポンプおよび温度の制御とともにプログラムの内容として有するソフトウェア、前記マイクロポンプ、前記検出装置および温度制御装置とが一体化された装置本体に対し、この装置本体に脱着可能なチップを装着して行われる。検体注入により、好ましくは自動的に分析が開始され、検体および試薬類の送液、混合に基づく遺伝子増幅反応、遺伝子検出反応および光学的測定が、一連の連続的工程として自動的に実施され、測定データが、必要な条件、記録事項とともにファイル内に格納される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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