(57)【要約】  【課題】    無脊椎動物（イトマキヒトデ）の生殖腺刺激ホルモンの構造を解明した。  【解決手段】    この生殖腺刺激ホルモンは、２つのサブユニットから成る分子量４５００〜４９００のペプチドであり、これら２つのサブユニットに含まれるシステインのＳＨ基間でＳＳ架橋が生成して結合した構造を持つ。この２つのサブユニットを合成して混合し酸化することにより生殖腺刺激活性を有するペプチド（生殖腺刺激ホルモン）を得ることができる。  【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の２つのペプチドから成り、６個のシステインの間でＳＳ結合による架橋が形成された無脊椎動物由来の生殖腺刺激ホルモン。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列から成るペプチド又はこのアミノ酸配列において４及び１６番目のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り生殖腺刺激活性を有するペプチド
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列から成るペプチド又はこのアミノ酸配列において１０、１１、１５及び２４番目のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り生殖腺刺激活性を有するペプチド
【請求項２】
以下の２つのペプチドを混合し酸化して得られる無脊椎動物由来の生殖腺刺激ホルモン。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列から成るペプチド又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り生殖腺刺激活性を有するペプチド
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列から成るペプチド又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り生殖腺刺激活性を有するペプチド
【請求項３】
前記２つのペプチドが、無脊椎動物から摘出した神経組織又は生殖腺刺激活性を持つことが報告されている組織を、無脊椎動物の生殖腺刺激活性を指標として精製して得られた請求項１又は２に記載の無脊椎動物由来の生殖腺刺激ホルモン。
【請求項４】
以下の２つのペプチドのいずれかをコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列から成るペプチド又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り生殖腺刺激活性を有するペプチド
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列から成るペプチド又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り生殖腺刺激活性を有するペプチド
【請求項５】
以下の２つのペプチドをコードするＤＮＡを含み、配列番号３の塩基配列と相同性が７０％以上であるＤＮＡ。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列から成るペプチド又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り生殖腺刺激活性を有するペプチド
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列から成るペプチド又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り生殖腺刺激活性を有するペプチド
【請求項６】
請求項４に記載の２つのＤＮＡ又は請求項５に記載のＤＮＡを含んでなるベクターにより形質転換された宿主を培養し又は生育させることから成る生殖腺刺激活性を有するペプチドの製法。
【請求項７】
更に前記該宿主又は前記宿主の培養液から採取したペプチドを混合し酸化することから成る請求項６に記載の製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、イトマキヒトデ等の無脊椎動物由来の生殖腺刺激ホルモン及びその製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊椎動物の生殖腺刺激ホルモンには２種類のホルモンがあり、生殖腺の発達、卵・精子の発達・成熟・放出などを制御する。魚類等の脊椎動物の生殖腺刺激ホルモンについては解明が進んでいる。それらの構造の類似性は魚からヒトまでよく保存されており、それぞれ、一つずつのαサブユニットとβサブユニットから成るhetero dimer構造の蛋白質ホルモンである。
脊椎動物の生殖腺刺激ホルモンは種を超えて脊椎動物間で生殖腺刺激効果が確認されているが（非特許文献１、特許文献１、２）、無脊椎動物には効果を示さない。
無脊椎動物の生殖腺刺激ホルモンは、脊椎動物の生殖腺刺激ホルモン程には解明されていない。無脊椎動物であるイトマキヒトデの放射神経から生殖腺刺激ホルモン（ＧＳＳ）が抽出されて、卵巣片の放卵を誘起することが確認されている（非特許文献２、３）。この生殖腺刺激ホルモンは、卵巣内の卵を取り巻く濾胞細胞に働きかけて、卵に直接作用する卵成熟誘起ホルモン（1-メチルアデニン）を新たに合成させ分泌させることが知られている（非特許文献４）。【０００３】
【特許文献１】特許第2967945号
【特許文献２】特開平06-107689
【非特許文献１】日本比較内分泌学会編「ホルモンの生物科学５  ホルモンと(II)」学会出版センター、４１〜４７ページ、１９７９
【非特許文献２】日本動物学会編「現代動物学の課題４  卵と精子」東京大学出版会、２１〜３７ページ、１９７５
【非特許文献３】Shirai H., Gonad-Stimulating and Maturation-Inducing Substance, "Method in Cell Biology" Academic Press, vol.27, pp.73-88, 1986
【非特許文献４】Mita M. & Nagahama Y., Involvement of G-proteins and adenylate cyclase in the action of gonad-stimulating substance on starfish ovarian follicle cells., Developmental Biology, 1991, 144, 262-8
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
生殖腺刺激ホルモンは、成熟促進効果を有するため、その由来する生物の養殖等に用いることができるため重要である。本発明は無脊椎動物の生殖腺刺激ホルモンの構造を初めて解明した結果であり、えび、カニ、貝等の無脊椎動物の養殖等への応用が期待される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、イトマキヒトデの神経細胞から分泌される生殖腺刺激ホルモンの構造を解析することに成功した。本発明者らは、この生殖腺刺激ホルモンは、分子量がそれぞれ２０００〜２４００及び２４００〜２６００からなるサブユニットから成る分子量４５００〜４９００のペプチドであり、これら２つのサブユニットに含まれるシステインのＳＨ基間でＳＳ架橋が生成して結合した構造を持つことをはじめて明らかにし、この２つのサブユニットを合成して混合し酸化することにより得られたペプチドが生殖腺刺激活性を有することを確認した。本発明者らによるこのような解析結果は、当該ホルモンの大量生産を可能にする等幅広い応用への道を開くものである。【０００６】
即ち、本発明は、以下の２つのペプチドから成り、６個のシステインの間でＳＳ結合による架橋が形成された無脊椎動物由来の生殖腺刺激ホルモンである。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列から成るペプチド又はこのアミノ酸配列において４及び１６番目のアミノ酸（Ｃｙｓ）を除く１若しくは数個（例えば、２〜３個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り生殖腺刺激活性を有するペプチド
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列から成るペプチド又はこのアミノ酸配列において１０、１１、１５及び２４番目のアミノ酸（Ｃｙｓ）を除く１若しくは数個（例えば、２〜３個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り生殖腺刺激活性を有するペプチド【０００７】
また、本発明は、以下の２つのペプチドを混合し酸化して得られる無脊椎動物由来の生殖腺刺激ホルモンである。
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列から成るペプチド又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個（例えば、２〜３個）のアミノ酸（好ましくはＣｙｓ以外のアミノ酸）が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り生殖腺刺激活性を有するペプチド
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列から成るペプチド又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個（例えば、２〜３個）のアミノ酸（好ましくはＣｙｓ以外のアミノ酸）が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り生殖腺刺激活性を有するペプチド
この２つのペプチドが、無脊椎動物から摘出した神経組織又は生殖腺刺激活性を持つことが報告されている組織を、無脊椎動物の生殖腺刺激活性を指標として精製して得られたものであってもよい。
また本発明は、上記２つのペプチドを混合し酸化することから成る無脊椎動物由来の生殖腺刺激ホルモンの製法である。この２つのペプチドはいかなる方法で得たものでもよく、即ち、化学的に合成してもよいし、下記のように遺伝子工学を利用して得てもよい。【０００８】
本発明は、上記２つのペプチド（（ｃ）と（ｄ））のいずれかをコードするＤＮＡである。この２つのＤＮＡを含んでなるベクターにより形質転換された宿主を培養し又は生育させ、該宿主又は該宿主の培養液からペプチドを採取する。得られたペプチドを混合して酸化することにより生殖腺刺激活性を有するペプチドを製造することができる。
また本発明は、上記２つのペプチド（（ｃ）と（ｄ））をコードするＤＮＡを含み、配列番号３の塩基配列と相同性が７０％以上であるＤＮＡである。このＤＮＡを含んでなるベクターにより形質転換された宿主を培養し又は生育させることにより、生殖腺刺激活性を有するペプチドを製造することができる。また、この宿主又は宿主の培養液からペプチドを採取し、得られたペプチドを混合して酸化してもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の無脊椎動物の生殖腺刺激ホルモン遺伝子のＤＮＡ塩基配列は、配列番号３に示す塩基配列（351塩基）又は上記２つのペプチド（（ｃ）と（ｄ））をコードするＤＮＡを含み配列番号３の塩基配列と相同性が７０％以上である塩基配列から成る。
ヒトゲノムコンソーシアムによるヒトゲノム解析プロジェクトの報告論文中（Science 2001, 291(5507), 1304-1351）で、ゲノム配列中の遺伝子をコンピュータプログラム（Ottoシステム）で自動遺伝子注釈する時の判断基準として、既知遺伝子情報がある場合、その配列情報との相同性からゲノム中の遺伝子領域を特定する基準をポリヌクレオチドの相同性で92％以上としている。また同じ論文中で、遺伝子重複で複数に増えた遺伝子（その後の進化の過程で変異が入り、塩基配列に部分的な違いが生じている）を探す場合のポリヌクレオチドの相同性基準を70％においている。従って、本発明において配列番号３の塩基配列と相同性が70%以上、好ましくは92%以上であれば、近縁ではあるが異なる動物種への適用される無脊椎動物の生殖腺刺激ホルモンの遺伝子として機能するものと考えられる。【００１０】
本発明の無脊椎動物の生殖腺刺激ホルモンのアミノ酸配列は、配列番号４に示す116アミノ酸、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個（例えば、２〜３個）のアミノ酸（好ましくはＣｙｓ以外のアミノ酸）が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列よりなる。この配列（配列番号４）中、1番目のメチオニン（M)から29番目のグリシン(G)までがシグナル配列、30番目のグルタミン酸(E)から48番目のセリン(S)までがサブユニットＡ（GSS-A）、49番目のリジン(K)から92番目のアルギニン(R)までがサブユニットＣ（GSS-C）、93番目のセリン(S)から116番目のシステイン(C)までがサブユニットＢ（GSS-B）である。
本発明の無脊椎動物の生殖腺刺激ホルモンは、GSS-AとGSS-Bとが、それぞれのペプチドに含まれるシステイン（配列番号１のアミノ酸配列の４及び１６番目、配列番号２のアミノ酸配列の１０、１１、１５及び２４番目）間に酸化的にＳＳ結合を形成し、１対１で結合して形成されるペプチドを含む。GSS-AとGSS-Bとの間のＳＳ結合の組み合わせは最大１２通りが存在する。
上記遺伝子から合成されたペプチド鎖から、上記シグナル配列が切断され、GSS-AとGSS-Bとのペプチド間での架橋構造を形成し、最後にGSS-C部分が切断され、生殖腺刺激ホルモンのホルモン分子として、GSS-AとGSS-Bの両ペプチド間に架橋構造を持つヘテロ二量体構造を持つに至ると考えられる。また近年の研究成果を参照すれば、GSS-C部分も生理活性を持つものと考えられる。【００１１】
本発明の無脊椎動物の生殖腺刺激ホルモンはいずれも神経系からの分泌によるところから、無脊椎動物の（ヒトデ以外の）他の種類における生殖腺刺激ホルモンの抽出源としては、その動物種における神経組織を主たる対象とした。これ以外にも、動物種によって生殖腺刺激ホルモン作用を持つことが報告されている組織・器官があれば、それらを抽出源としてもよい。
無脊椎動物には、サンゴなどの腔腸動物、ウニ、ナマコなどの棘皮動物、タコやイカなどの軟体動物、エビ・カニなどの甲殻類など、水産上の多くの有用種が含まれる。【００１２】
上記の抽出源から生殖腺刺激活性を指標として精製してペプチドを得ることができる。
精製はいかなる方法で行ってもよく、液体クロマトグラフィー法や水性二層分配法などで行ってもよいが、高度の精製を行う為には高速液体クロマトグラフィーを行うことが望ましい。カラムとして、サイズ排除クロマトグラフィーカラム、イオン交換クロマトグラフィーカラム、逆相クロマトグラフィーカラム等を用いることができる。
このような精製法により分離して得られる画分を、生殖腺刺激活性を指標として選択する。【００１３】
生殖腺刺激活性は、以下のような方法で測定することができる。
成熟した無脊椎動物の雌個体の中から、卵成熟誘起ホルモンに対する感受性の高い卵を持つ個体を選び、検定用個体として分けておく。
検定用個体から卵巣を海水中に摘出し、その卵巣を小断片に切断し分け揃える。
多検体用アッセイ板に200μＬずつ海水を用意しておく。生殖腺刺激活性を測定する試料2μLを398μLの海水と混ぜ200倍希釈する。そのうちの半量200μLをアッセイ板の200μLと混ぜ2倍に希釈する。その半量の200μLを次の200μＬと混ぜさらに2倍希釈する。これを繰り返して、2倍ずつの希釈系列を200倍希釈から10万2400倍まで用意する。これに卵巣小断片を一つずつ入れ25℃で静置し、1時間後に卵巣小断片が収縮し成熟した卵が放卵されることをもって生殖腺刺激活性があると判断する。また、その時の希釈度から生殖腺刺激活性の相対的強度を判定する。【００１４】
生殖腺刺激ホルモンには長期・短期の複数の機能がある（長期：生殖腺の発達、短期：産卵の誘発）。検定用の個体は、この短期の機能を利用するため、産卵可能な程に発達した卵を持っていることが必要条件となる。検定に用いる個体は産卵期初期に採集して、実験室の水槽で生かして維持することが好ましい。採集してきた個体すべてが、産卵できるほどに成熟した個体というわけではない。また、産卵はできるが、その成熟の度合いが微妙に異なり、通常個体によってホルモンに対する感度に差がある。そこで、生殖腺刺激活性を検定するためには、成熟した個体（産卵可能な卵をもっている個体）をあらかじめ探し、さらにホルモンに対する感度がある程度揃った個体を複数準備しておく必要がある。
生殖腺刺激ホルモンは卵巣中の濾胞細胞を刺激し、この濾胞細胞は別のホルモン「卵成熟誘起ホルモン」を分泌し、これが卵に作用し、その結果放卵が起きる。この卵成熟誘起ホルモンは卵に直接働くホルモンであるが、生殖腺刺激ホルモンの短期の機能の一つは、この卵成熟誘起ホルモンを作らせることにある。感受性を調べる際には市販の卵成熟誘起ホルモンを用いてもよい。【００１５】
上記の精製は複数回繰り返してもよい。その結果、分子量4500〜4900の単一のペプチドを得ることができる。
このペプチドは、実施例でも示すように、２つのサブユニット（GSS-AとGSS-B）から構成される。各サブユニットの分子量はそれぞれ2000〜2400及び2400〜2600である。これらのサブユニットは上記高分子量のペプチドを還元することにより得ることができる。この還元は種々の還元剤を用いて行うことができるが、ジチオスレイトール、2-メルカプトエタノール、チオグリコール酸、ベンゼンチオール、パラチオクレゾール等の比較的に穏やかな還元剤を用いて行うことが好ましい。【００１６】
一方、これら２つのペプチドを混合して酸化することにより上記より高分子量のペプチド（即ち、本発明の生殖腺刺激ホルモン）を得ることができる。
２つのサブユニットにはそれぞれシステインが含まれているため、酸化によりそれぞれのサブユニットに含まれるシステインのＳＨ基間でＳＳ架橋が生成し、これら２つのサブユニットが結合する。【００１７】
この酸化のために、実施例で示す方法以外に下記の試薬を用いて行うことができる。
− o-ヨードソ安息香酸、ヨウ素
− 二酸化マンガン、過マンガン酸カリウム
− 過酸化水素
− 分子状酸素（実施例において用いた試薬であるが、分子状酸素による酸化反応は、微量の鉄、銅イオンの添加により反応をさらに加速することができる）【００１８】
また、合成ペプチドの酸化反応時に、タンパク質のＳＳ架橋構造の至適化（リフォールディング）に用いられる以下の試薬を、ペプチドと同時に存在させてペプチド間の正しいSS架橋の生成効率を上昇させることができる。
− チオレドキシン（生体内で酸化還元作用に関わる蛋白質）
− プロテインジスルフィドイソメラーゼ（生体内の蛋白質ジスルフィド交換酵素）
− BMC, (±)-trans-1,2-bis(2-mercaptoacetamido)cyclohexane
− 4-mercaptobenzenacetate【００１９】
本発明のペプチドは、遺伝子組み換え法によっても製造することができる。例えば、配列番号１及び２のアミノ酸、又はこれらのアミノ酸配列においてＣｙｓを除く１若しくは数個（例えば、２〜３個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号３の88〜144番目及び277〜348番目）を組み込んだベクター、又は配列番号３の塩基配列と相同性が70%以上であるDNAを組み込んだベクターを作成し、当該ベクターによって宿主の形質転換を行った後、該宿主を培養又は生育させ、該宿主又は該宿主の培養液から目的のペプチドを精製する。得られたペプチドは２つのサブユニット（GSS-AとGSS-B）が結合したペプチドである場合もあるが、得られたペプチド（２つのサブユニット）を上記の酸化剤で酸化することにより、目的の生殖腺刺激活性を有するペプチドを得ることができる。【００２０】
得られた生殖腺刺激活性を有するペプチドを用いて無脊椎動物の成熟促進や排卵誘発を行う方法として、このペプチドを、これら無脊椎動物の体腔内や卵巣に直接注射等により注入する、これらの飼育槽の海水に混合する、えさに混合して与えるなどの方法が挙げられる。【００２１】
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。
以下の実施例において、生殖腺刺激活性は次のようにして調べた。
成熟したイトマキヒトデ（又はキヒトデ）雌個体十数匹の中から、卵成熟誘起ホルモン（1−メチルアデニン）に対する感受性の高い卵を持つ個体を2-3匹選択し、検定用個体として分けておく。
この選択は以下のようにして行った。卵成熟誘起ホルモンを10-6M、3x10-7M、10-7M、3x10-8M、10-8M、3x10-9Mの6段階の濃度に海水に溶かし、これに、卵巣の小片を入れて60分間、室温で静置して置く。60分後、顕微鏡で、卵が成熟（卵細胞の中の核の構造が、次なる受精への準備のために崩壊する）しているかどうかを調べた。その時の卵成熟誘起ホルモンの濃度を調べ、10-7Mの濃度又はそれ以下の濃度で成熟する個体を検定用個体とした。【００２２】
検定用個体から卵巣（房状の形態を持つ）を海水中に摘出し、その卵巣を5mm長の小断片に切断し分け揃えた。
多検体用アッセイ板に200μＬずつ海水を用意しておく。生殖腺刺激活性を調べる試料2μLを398μLの海水と混ぜ200倍希釈する。そのうちの半量200μLをアッセイ板の200μLと混ぜ2倍に希釈する。その半量の200μLを次の200μＬと混ぜさらに2倍希釈する。これを繰り返して、2倍ずつの希釈系列を200倍希釈から10万2400倍まで用意する。これに卵巣小断片を一つずつ入れ25℃で静置し、1時間後に卵巣小断片が収縮し成熟した卵が放卵されることをもって生殖腺刺激活性があると判断した（図１）。また、その時の希釈度から生殖腺刺激活性の相対的強度を判定した。
【実施例１】
【００２３】
イトマキヒトデから放射神経組織をピンセットで剥離し、ドライアイス上にて急速凍結し、保存した。5550匹のヒトデより湿重量で126.3ｇの神経組織を採取した。
乳鉢内に液体窒素を満たし、その中で冷凍保存していた放射神経を粉状になるまですり潰した。粉状にした神経組織に600ｍLの10mＭ酢酸アンモニウム（タンパク質分解酵素阻害剤の1μMのpepstatin, 0.5mg/Lのleupeptin, 0.2ｍＭの4-(2-aminoethyl)benzenesulfonyl fluorideを含む）水溶液を3回に分けて加えて、電動ホモゲナイザ（ヒスコトロン）にてさらに細かくホモゲナイズした。ホモゲナイズした抽出液を遠心加速度2万2500ｘｇで4℃、30分間遠心して上清を回収した。沈殿を再度200ｍLの10mＭ酢酸アンモニウム水溶液に懸濁しホモゲナイズし、2万2500ｘｇで4℃、30分間遠心して上清を回収し、先の上清と合わせた。2万2500ｘｇの遠心上清を、さらに10万ｘｇ、4℃、1時間の条件で超遠心し、上清を回収した。この上清は生殖腺刺激活性を示した。【００２４】
得られた上清を凍結乾燥した後、100ｍLの0.15M炭酸水素アンモニウムで溶解した。27500ｘｇ、4℃、30分間遠心して不溶物を除いた後、同溶液で平衡化したPD-10脱塩カラム（Amersham Biotech社製）にかけ、生殖腺刺激活性を示す高分子溶出画分（PD-10画分）を回収した。
この高分子溶出画分（PD-10画分）を凍結乾燥した後、10mＭ燐酸ナトリウム（pH7.0）150ｍLに溶解した。同溶液で平衡化したSephadexG-50カラム（500cm3）に50mＬずつ３回に分けてかけ、生殖腺刺激活性画分（高分子たんぱく質を除いた部分）を回収した。（G-50画分、回収量約600ｍＬ）
このG-50画分約415ｍLを26回に分けて高速液体クロマトグラフィー（島津製作所LC-6AD型）にかけた。
次に、Develosil RP-Aqueous AR5 カラム(10x250mm、野村科学製)を用いて、10mM燐酸ナトリウム(pH7.0)から30％アセトニトリル/10mM燐酸ナトリウムへの直線濃度勾配法で溶出した。生殖腺刺激活性を示す画分はアセトニトリル濃度18-19％付近に溶出された（1st HPLC画分、図２）。【００２５】
この1stHPLC画分を減圧濃縮した後の45mＬを９回に分けて高速液体クロマトグラフィー（島津製作所LC-6AD型）にかけた。
次に、Develosil RP-Aqueous AR5 カラム(10x250mm、野村科学製)を用いて、20％アセトニトリル/10mM酢酸トリメチルアミン(pH4.0)から25％アセトニトリル/10mM酢酸トリエチルアミンへの直線濃度勾配法で溶出した。生殖腺刺激活性を示す画分はアセトニトリル濃度21-22％付近に溶出された（2nd HPLC画分、図３）。
2ndHPLC画分を減圧濃縮した後、Develosil RP-Aqueous AR3 カラム(2x250mm、野村科学製)を用いて、16.5％アセトニトリル/10mM燐酸ナトリウム(pH6.0)から17.5％アセトニトリル/10mM燐酸ナトリウム(pH6.0)への直線濃度勾配法で溶出した。生殖腺刺激活性を示す画分はアセトニトリル濃度17％付近に溶出された。（3rd SMART画分、図４）
Develosil RP-Aqueous AR3 カラム(1.5x150mm、野村科学製)を用いて、15％アセトニトリル/10mM燐酸ナトリウム(pH6.0)から30％アセトニトリル/10mM燐酸ナトリウム(pH6.0)への直線濃度勾配法で溶出した。生殖腺刺激活性を示す画分はアセトニトリル濃度18％付近に溶出された（4th SMART画分、図５）。【００２６】
最終精製画分（4thSMART画分）の一部をZiptip（ミリポア社）を用いて脱塩処理した後、MALDI-TOF型質量分析計（Bruker Daltonics社、ReflexIII型）で分析すると4737の分子量成分が検出された。さらに50mＭジチオスレイトールを用いて室温で1時間還元処理し、再度、質量分析計で分析すると、4737のシグナルが消失し2236と2507の２つのシグナルが現れた。また、還元剤処理の後、0.2Ｍヨードアセトアミドを用いた室温24時間のアルキル化処理により、ＳＨ基が特異的にアルキル化されたと考えられる57mass（SH１個に対応）及び114mass（SH２個に対応）の質量増加が、2236と2507のそれぞれに対して生じた。
4thSMART画分をプロテインシーケンサー（ABI社、Procise 494HT型）で分析すると、2本のペプチドの混在を示すシグナルが得られた。この結果から、最終画分に含まれる生殖腺刺激活性成分は、分子量4737のポリペプチドで、さらに、還元処理で２つの成分に分かれることから、それぞれ2236と2507の分子量のペプチド1つずつから成るhetero dimer構造を持つこと、その架橋は還元剤感受性であることなどからシステイン残基間のＳＳ結合に拠ることが分かった。【００２７】
２成分のそれぞれのアミノ酸配列解析は、分子量4737のポリペプチドの還元処理後
の分子量2236と2507のペプチドの混合物をQ-TOF型質量分析計（Micromass社）を用い
たMS/MS解析法により行った（図６、図７）。
得られた二つのペプチドのアミノ酸配列は
GSS-A:  EKYCDDDFHMAVFRTCAVS（配列番号1）(19 アミノ酸残基、分子量2236)
GSS-B:  SEYSGIASYCCLHGCTPSELSVVC（配列番号２）(24 アミノ酸残基、分子量2507)
であった。
質量分析及びプロテインシーケンサーの解析結果から、これらのペプチドは、ヒトデ神経内で生合成された後、アミノ酸の側鎖やペプチドの末端には何の化学的修飾（細胞内でのたんぱく質・ペプチドの翻訳後修飾作用）を受けていないこともわかった。【００２８】
GSS-A及びGSS-Bのアミノ酸配列情報を基に、GSS遺伝子をクローニングした。
GSS-A及びGSS-Bのアミノ酸配列より、それぞれ、5'-primerDF1（配列番号５）及び5'-primerDF2（配列番号６）、3'-primerDR1（配列番号７）及び3'-primerDR2（配列番号８）を合成した。
イトマキヒトデ精巣よりゲノムDNAをQIAGEN(R) Genomic-tipを用いて分離・精製した。
ゲノム標品をtemplateとして、合成したdegenerate primerを用い、nested PCR法にてGSS遺伝子配列の一部を増幅し、DNAシーケンサーにて配列を解読した。
得られた配列を基に、新たに5'-primerGR（配列番号９）と3'-primerGF（配列番号１０）を合成した。
これらのprimerと、先のゲノムDNA、及び、CLONTECH GenomeWalker(TM) Kitsを用いて、DNAの5'上流域と3'下流域の配列を解読した。
新たに得られた配列より、改めて5'-primerMF1（配列番号１１）及び5'-primerMF2（配列番号１２）と、3'-primerMR1（配列番号１３）及び3'-primerMR2（配列番号１４）を合成した。
イトマキヒトデの神経、管足、肝膵臓、精巣、卵巣より、NIPPON GENE ISOGENまたはQIAGEN(R) QIAzol(TM)を用いトータルRNAを分離・精製した。
精製したトータルRNAからQIAGEN(R) Omniscript(TM) RTを用いてcDNAを合成した。
このcDNAをtemplateとし、先に合成したprimer（5'-primerMF1、5'-primerMF2、3'-primerMR1、3'-primerMR2）を用いて、nested PCR法にてGSS cDNAの配列を増幅し、DNAシーケンサーにて配列を解読した。【００２９】
その結果、配列番号３に示すGSS遺伝子が得られた。
この塩基配列をアミノ酸に翻訳し、配列番号４のアミノ酸配列を得た。
質量分析及びプロテインシーケンサーで解析したGSS-A及びGSS-Bの配列は、このアミノ酸配列（配列番号４）の30-48番目(GSS-A)と93-116番目（GSS-B）に位置する。
このアミノ酸配列（配列番号４）の1-29番目の部分は、分泌蛋白質特有のシグナル配列であり、49-92番目は、116個よりなる上記アミノ酸が生合成された後に、切出される配列（GSS-Cと呼ぶ）である。GSS-C配列の両端には、生合成後に特異的に酵素切断を受けるKR配列がある。
【実施例２】
【００３０】
実施例１の結果を基に、２つのペプチド鎖（GSS-A, GSS-B）を合成した（純度99.5％以上）。
合成ペプチドを各々0.4ｍＭ又は1ｍＭ濃度（等モル数）となるように20ｍＭトリス緩衝液に溶解し、酸化剤の存在下、室温で3日間又は20日間攪拌し反応させた。酸化剤には、99.999％酸素ガス又は0.1Ｍ酸化型グルタチオンを用いた。反応後、微量高速液体クロマトグラフィー装置で分離し、各ピーク画分の生殖腺刺激活性を測定した。
ピーク面積4.2％の比較的小さいピークに生殖腺刺激活性が検出された。また、各ピークの質量分析により、生殖腺刺激活性が検出されたピークのみ、天然のホルモン(natural)と同じ4737の複合体構造を示す分子量が検出された（GSS-A/B）。生殖腺刺激活性を示さないその他のピークは、2236又は2507の分子量を示した（図８）。【００３１】
得られたペプチドの生殖腺刺激活性を調べた。その結果を表１に示す。
【表１】
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合成ペプチド（GSS-A, GSS-B）は各々単独では生殖腺刺激活性を示さず、酸化反応により形成される4737の複合体（GSS-A/B）のみが生殖腺刺激活性を示した。酸化反応により生じる合成ホルモン（GSS-A/B）は、イトマキヒトデのみならず、近縁他種のキヒトデにおいてもホルモン作用を示した。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明により無脊椎動物生殖腺刺激ホルモンの大量生産が可能になり、水産上重要である、カニ類、エビ類、ウニ類、ナマコ類、貝類などの水棲無脊椎動物に対し生産量の向上と新規の有用種の開発が可能になった。
また、イトマキヒトデ・キヒトデの受精卵の放流又は人工増殖等により、水産養殖が行われている海域でのヒトデ個体数の人為的管理を行い、海底堆積飼料の生物分解を促進させ水質改善を図ることができる。これら二種は水産養殖海域での優先種で、その生息域は北海道から九州までの全域に及ぶので、相当の応用効果が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】生殖腺刺激活性の判断の基準を示す写真である。右は、卵が放卵され、生殖腺刺激活性のあることを示す。
【図２】生殖腺刺激ホルモン精製の高速液体クロマトグラフィーを示す図である。
【図３】生殖腺刺激ホルモン精製の高速液体クロマトグラフィーを示す図である。
【図４】生殖腺刺激ホルモン精製の微量高速液体クロマトグラフィーを示す図である。
【図５】生殖腺刺激ホルモン精製の微量高速液体クロマトグラフィーを示す図である。
【図６】精製した生殖腺刺激ホルモン（heterodimer）の質量分析計による測定結果を示す図である。
【図７】生殖腺刺激ホルモンのサブユニットの質量分析計による測定結果を示す図である。
【図８】合成した生殖腺刺激ホルモン精製の高速液体クロマトグラフィーを示す図である。を示す図である。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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