(57)【要約】  分析に要する時間を大幅に短縮することを可能にし、また、観察者により分析結果が左右されることのないようにして信頼性の高い結果を得ることを可能に、また、同一の生体試料上で一度に多数の遺伝子などを分析することができるようにして、作業労力的ならびに時間的な効率を向上するとともに、生体試料に由来するバックグラウンドの差が全く無い条件で複数の遺伝子などの解析を行うことを可能にするものであり、分析の対象である生体試料に超短パルスレーザー光を照射してアブレーションすることにより、生体試料に含まれる分子を構成元素に原子化し、原子化した構成元素をイオン化し、イオン化した構成元素を分析することにより、生体試料中の分析を目的とする分子を分析する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析の対象である生体試料に超短パルスレーザー光を照射してアブレーションすることにより、前記生体試料に含まれる分子を構成元素に原子化し、前記原子化した構成元素をイオン化し、前記イオン化した構成元素を分析することにより、前記生体試料中の分析を目的とする分子を分析する
ことを特徴とするレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法。
【請求項２】
請求項１に記載のレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法において、
前記生体試料中の分析を目的とする分子に対して特異的な結合をする物質を直接的あるいは間接的に標識し、前記標識された物質が結合された分子を分析することにより、前記生体試料中の分析を目的とする分子を分析する
ことを特徴とするレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法。
【請求項３】
請求項２に記載のレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法において、
前記標識された特異的な結合をする物質が、核酸である
ことを特徴とするレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法。
【請求項４】
請求項１、２または３のいずれか１項に記載のレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法において、
前記生体試料中の分析を目的とする分子は、核酸である
ことを特徴とするレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法。
【請求項５】
請求項３に記載のレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法において、
前記標識された特異的な結合をする物質である核酸は、
ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、その他修飾されたものを含むものである
ことを特徴とするレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法。
【請求項６】
請求項２、３、４または５のいずれか１項に記載のレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法において、
前記標識された特異的な結合をする物質が、ハイブリダイゼーションによって結合する
ことを特徴とするレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法。
【請求項７】
請求項２、３、４または５のいずれか１項に記載のレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法において、
前記標識された特異的な結合をする物質がアプタマーである
ことを特徴とするレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法。
【請求項８】
請求項３、４、５，６または７のいずれか１項にに記載のレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法において、
前記核酸の標識は、ＴＵＮＥＬ法による
ことを特徴とするレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法。
【請求項９】
請求項１または２のいずれか１項に記載のレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法において、
前記生体試料中の分析を目的とする分子は、タンパク質である
ことを特徴とするレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法。
【請求項１０】
請求項９に記載のレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法において、
前記タンパク質を分析するための標識された特異的な結合をする物質が、抗原抗体反応によって結合する
ことを特徴とするレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法。
【請求項１１】
請求項２、３、４、５、６、７、８、９または１０のいずれか１項に記載のレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法において、
前記標識は、元素標識である
ことを特徴とするレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載のレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法において、
前記元素標識は、安定同位元素標識である
ことを特徴とするレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法。
【請求項１３】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のいずれか１項に記載のレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法において、
前記イオン化した構成元素の分析は、質量分析である
ことを特徴とするレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載のレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法において、
前記質量分析は、飛行時間法による質量分析である
ことを特徴とするレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法。
【請求項１５】
請求項２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４のいずれか１項に記載のレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法において、
標識として複数種の標識を用いることによりマルチチャンネル化し、分析の目的の分子として同一の生体試料中の少なくとも２種類以上の分子を分析する
ことを特徴とするレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法。
【請求項１６】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５のいずれか１項に記載のレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法において、
前記生体試料を顕微鏡で観察して得られた組織像と、前記アブレーションしたスポットの位置とを対応させることにより、分析の目的とする分子の前記生体試料内局在を分析する
ことを特徴とするレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法。
【請求項１７】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のいずれか１項に記載のレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法において、
前記超短パルスレーザー光は、パルス時間幅が１フェムト秒以上１ピコ秒以下であり、尖頭値出力が１メガワット以上１０ギガワット以下である
ことを特徴とするレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法。
【請求項１８】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７のいずれか１項に記載のレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法において、
前記生体試料は、生体組織切片またはと抹サンプルである
ことを特徴とするレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法。
【請求項１９】
分析の対象である生体試料に照射して、該生体試料をアブレーションすることにより、前記生体試料に含まれる分子を構成元素に原子化し、前記原子化した構成元素をイオン化する超短パルスレーザー光を出射可能な超短パルスレーザー発生装置と、
前記超短パルスレーザー発生装置から出射された超短パルスレーザー光によってイオン化された構成元素を導入して分析する分析器と、
前記分析の対象である生体試料の形状を観察するための顕微鏡装置と
を有することを特徴とするレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析装置。
【請求項２０】
請求項１９に記載のレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析装置において、
前記顕微鏡装置は、正立顕微鏡装置であり、
前記正立顕微鏡装置の対物レンズを前記生体試料の上面に配置するとともに、前記超短パルスレーザー発生装置からの超短パルスレーザー光の照射を前記生体試料の下面から行う
ことを特徴とするレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析装置。
【請求項２１】
請求項１９に記載のレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析装置において、
前記顕微鏡装置は、正立顕微鏡装置であり、
前記正立顕微鏡装置の対物レンズを前記生体試料の上面に配置するとともに、前記超短パルスレーザー発生装置からの超短パルスレーザー光の照射を前記生体試料の上面から行う
ことを特徴とするレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析装置。
【請求項２２】
請求項１９に記載のレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析装置において、
前記顕微鏡装置は、倒立顕微鏡装置であり、
前記倒立顕微鏡装置の対物レンズを前記生体試料の下面に配置するとともに、前記超短パルスレーザー発生装置からの超短パルスレーザー光の照射を前記生体試料の上面から行う
ことを特徴とするレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析装置。
【請求項２３】
請求項１９に記載のレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析装置において、
前記顕微鏡装置は、倒立顕微鏡装置であり、
前記倒立顕微鏡装置の対物レンズを前記生体試料の下面に配置するとともに、前記超短パルスレーザー発生装置からの超短パルスレーザー光の照射を前記生体試料の下面から行う
ことを特徴とするレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析装置。
【請求項２４】
請求項１９、２０、２１、２２または２３のいずれか１項に記載のレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析装置において、
前記超短パルスレーザー発生装置は、パルス時間幅が１フェムト秒以上１ピコ秒以下であり、尖頭値出力が１メガワット以上１０ギガワット以下である超短パルスレーザー光を出射する
ことを特徴とするレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析装置。
【請求項２５】
請求項１９、２０、２１、２２、２３または２４のいずれか１項に記載のレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析装置において、さらに、
前記顕微鏡装置により観察された画像を解析する画像解析装置と
を有することを特徴とするレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析装置。
【請求項２６】
請求項１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５のいずれか１項に記載のレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析装置において、
前記生体試料は、生体組織切片またはと抹サンプルである
ことを特徴とするレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法およびその装置に関し、さらに詳細には、従来と比較すると分析の効率を著しく向上することを可能にしたレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法およびその装置に関し、例えば、生体試料として生体組織切片を用い、当該生体組織切片中の核酸の質量分析に用いて好適なレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法およびその装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、生体組織切片などの生体試料の分析の手法としては、種々の化学染色方法や核酸プローブのハイブリダイゼーションを利用した方法（ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法）などが主に使用されている。
ここで、化学染色方法は、組織内に含まれる物質の種類によって染色のされ方が異なることを利用し、組織、細胞の形態、解析対象となる物質の存在の有無や局在を顕微鏡下で観察するという手法である。
一方、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法は、標識した核酸プローブと組織内に存在する核酸をハイブリダイゼーションさせて、細胞内で転写されているｍＲＮＡの検出や遺伝子の転写活性を観測することを可能とした手法である。
また、生体組織切片などの生体試料の分析には、上記した手法と同様に、標識抗体を用いた組織切片の解析などもよく使われている。【０００３】
しかしながら、上記した従来の各種の生体試料の分析の手法においては、染色や発色にかかる工程が煩雑で、分析に要する時間が長時間におよぶという問題点があった。
また、上記した従来の各種の生体試料の分析の手法においては、処理後の生体組織切片などを人が顕微鏡下で観察して解析する必要があるため、定性的な解析が主であるとともに、同じ切片を観察しても観察者の熟練度や主観により結果が異なるという問題点があった。
さらに、上記した従来の各種の生体試料の分析の手法においては、同じ生体組織切片では一度に２種類の遺伝子しか測定することができないため、生体組織切片に由来するバックグラウンドの差が全く無い条件で複数遺伝子の解析を行うことが困難であるという問題点があった。【０００４】
なお、本願出願人が特許出願時に知っている先行技術は、上記において説明したようなものであって文献公知発明に係る発明ではないため、記載すべき先行技術情報はない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記したような従来の技術の有する種々の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、従来の技術と比較すると分析に要する時間を大幅に短縮することを可能にしたレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法およびその装置提供しようとするものである。
また、本発明の目的とするところは、観察者により分析結果が左右されることのないようにして、信頼性の高い結果を得ることを可能にしたレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法およびその装置提供しようとするものである。
また、本発明の目的とするところは、同一の生体試料上で一度に多数の遺伝子などを分析することができるようにして、作業労力的ならびに時間的な効率を向上するとともに、生体試料に由来するバックグラウンドの差が全く無い条件で複数の遺伝子などの解析を行うことを可能にしたレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法およびその装置提供しようとするものである。
また、本発明の目的とするところは、生体試料中の分子の質量分析を行う場合には、質量スペクトルの解析が困難になる恐れを排除するとともに、質量分析器に高分解能を要しないようにしたレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法およびその装置を提供しようとするものである。
また、本発明の目的とするところは、生体試料中の分子を構成する構成原子の原子化とイオン化とを１台のレーザー源で同時に実現することを可能にして、レーザーの照射制御を大幅に簡潔にすることを可能にしたレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法およびその装置を提供しようとするものである。
また、本発明の目的とするところは、多種類の標識同位体が混入した状況においても、効率の良い分析を行うことを可能にしたレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法およびその装置を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明によるレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法およびその装置は、生体試料を超短パルスレーザー光でアブレーションすることにより、生体試料中の分子を原子イオン化して原子イオンを生成し、生成した原子イオンを分析するようにしたものである。これにより、生体試料中の分子の化学分析を行うことができるものである。
即ち、本発明のレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法およびその装置においては、生体試料を超短パルスレーザー光でアブレーションすることにより、生体試料中の分子をバラバラに分解して当該分子を構成する各原子毎に原子化すると同時に、原子化した原子を１価のイオンにイオン化するものであり、このイオン化により生成された原子イオンを分析することにより、定量分析が可能となるものである。
従って、本発明のレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法およびその装置によれば、例えば、核酸プローブをハイブリダイザーションするまでの工程（約２時間程度の工程である。）は従来のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションと同じであるが、その後の発色や増感にかかる時間（約２４時間程度）を必要とせず、そのまま分析器にかけることができるため、分析に要する時間を大幅に短縮することが可能となる。
また、本発明のレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法およびその装置によれば、分析結果は、定量的なデータとして産出されるため、観察者によるバラツキがなく信頼性の高い結果を得ることが可能となる。
さらに、上記した従来の技術による手法では、同じ生体試料では一度に２〜３種類の遺伝子しか測定することができないが、本発明のレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法およびその装置によれば、標識として使用できる種類が非常に多いため同一生体試料上で一度に多数の遺伝子などを測定することができ、これにより労力的ならびに時間的な効率を向上することができるようになるとともに、同一生体試料上で分析できるために、生体試料に由来するバックグラウンドの差が全く無い条件で複数遺伝子などの解析を行うことが可能となる。
また、本発明のレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法およびその装置により質量分析を行う場合には、低質量の原子イオンを質量分析することになり、質量スペクトルの解析が困難になる恐れを排除することができるのみならず、高分解能を備えた質量分析器を用いる必要がなくなる。
また、本発明のレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法およびその装置によれば、一種類の超短パルスレーザー光で生体試料をアブレーションすることにより、生体試料中の分子の原子化と同時に、原子化された原子の一価のイオンへのイオン化を効率良く行うことが可能となる。従って、レーザーの照射制御が簡潔になるとともに、例えば、化学分析に際して多種類の標識元素を同時に使用することが可能となるため、解析効率を著しく向上することができる。
つまり、本発明のレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法およびその装置においては、標識元素の原子化とイオン化とを一種類の超短パルスレーザー光で同時に行うことができるため、分析作業を大幅に簡略化することが可能となり、従来と比較すると分析の効率を著しく向上することができるようになる。
さらに、上記したイオン化は、超短パルスレーザー光の高い尖頭値強度によって非共鳴過程によって行われるイオン化（非共鳴イオン化）であるので、多種類の標識同位体が混入した状況においても各標識原子をそれぞれイオン化することができ、多標識系への応用が容易であり、高精度かつ高効率な高分子の分析を行うことができるようになる。【０００７】
即ち、本発明は、分析の対象である生体試料に超短パルスレーザー光を照射してアブレーションすることにより、上記生体試料に含まれる分子を構成元素に原子化し、上記原子化した構成元素をイオン化し、上記イオン化した構成元素を分析することにより、上記生体試料中の分析を目的とする分子を分析するようにしたものである。
また、本発明は、上記生体試料中の分析を目的とする分子に対して特異的な結合をする物質を直接的あるいは間接的に標識し、上記標識された物質が結合された分子を分析することにより、上記生体試料中の分析を目的とする分子を分析するようにしたものである。
また、本発明は、上記標識された特異的な結合をする物質が核酸であるようにしたものである。
また、本発明は、上記生体試料中の分析を目的とする分子が核酸であるようにしたものである。
また、本発明は、上記標識された特異的な結合をする物質である核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、その他修飾されたものを含むものである。
また、本発明は、上記核酸を分析するための標識された特異的な結合をする物質を、ハイブリダイゼーションによって結合するようにしたものである。
また、本発明は、上記核酸を分析するための標識された特異的な結合をする物質がアプタマーである。
また、本発明は、上記核酸を分析するための上記核酸の標識は、ＴＵＮＥＬ法によるようにしたものである。
また、本発明は、上記生体試料中の分析を目的とする分子をタンパク質としたものである。
また、本発明は、上記タンパク質を分析するための標識された特異的な結合をする物質を、抗原抗体反応によって結合するようにしたものである。
また、本発明は、上記標識を元素標識としたものである。
また、本発明は、上記元素標識を安定同位元素標識としたものである。
また、本発明は、上記イオン化した構成元素の分析を質量分析としたものである。
また、本発明は、上記質量分析を飛行時間法による質量分析としたものである。
また、本発明は、標識として複数種の標識を用いることによりマルチチャンネル化し、分析の目的の分子として同一の生体試料中の少なくとも２種類以上の分子を分析するようにしたものである。
また、本発明は、上記生体試料を顕微鏡で観察して得られた組織像と、上記アブレーションしたスポットの位置とを対応させることにより、分析の目的とする分子の上記生体試料内局在を分析するようにしたものである。
また、本発明は、上記超短パルスレーザー光は、パルス時間幅が１フェムト秒以上１ピコ秒以下であり、尖頭値出力が１メガワット以上１０ギガワット以下であるようにしたものである。
また、本発明は、上記生体試料を生体組織切片またはと抹サンプルとしたものである。
また、本発明は、分析の対象である生体試料に照射して、該生体試料をアブレーションすることにより、上記生体試料に含まれる分子を構成元素に原子化し、上記原子化した構成元素をイオン化する超短パルスレーザー光を出射可能な超短パルスレーザー発生装置と、上記超短パルスレーザー発生装置から出射された超短パルスレーザー光によってイオン化された構成元素を導入して分析する分析器と、上記分析の対象である生体試料の形状を観察するための顕微鏡装置とを有するようにしたものである。
また、本発明は、上記顕微鏡装置を正立顕微鏡装置とし、上記正立顕微鏡装置の対物レンズを上記生体試料の上面に配置するとともに、上記超短パルスレーザー発生装置からの超短パルスレーザー光の照射を上記生体試料の下面から行うようにしたものである。
また、本発明は、上記顕微鏡装置を正立顕微鏡装置とし、上記正立顕微鏡装置の対物レンズを上記生体試料の上面に配置するとともに、上記超短パルスレーザー発生装置からの超短パルスレーザー光の照射を上記生体試料の上面から行うようにしたものである。
また、本発明は、上記顕微鏡装置を倒立顕微鏡装置とし、上記倒立顕微鏡装置の対物レンズを上記生体試料の下面に配置するとともに、上記超短パルスレーザー発生装置からの超短パルスレーザー光の照射を上記生体試料の上面から行うようにしたものである。
また、本発明は、上記顕微鏡装置を倒立顕微鏡装置とし、上記倒立顕微鏡装置の対物レンズを上記生体試料の下面に配置するとともに、上記超短パルスレーザー発生装置からの超短パルスレーザー光の照射を上記生体試料の下面から行うようにしたものである。
また、本発明は、上記超短パルスレーザー発生装置を、パルス時間幅が１フェムト秒以上１ピコ秒以下であり、尖頭値出力が１メガワット以上１０ギガワット以下である超短パルスレーザー光を出射するようにしたものである。
また、本発明は、さらに、上記顕微鏡装置により観察された画像を解析する画像解析装置とを有するようにしたものである。
また、本発明は、上記生体試料を生体組織切片またはと抹サンプルとしたものである。【０００８】
ここで、本発明において超短パルスレーザー光により生体試料をアブレーションする際には、生体試料に超短パルスレーザー光を１ショット（１パルス）照射すれば十分である。しかしながら、生体試料に超短パルスレーザー光を複数ショット（複数パルス）照射してもよく、生体試料へ照射する超短パルスレーザー光のショット数（パルス数）は適宜に選択すればよい。
また、超短パルスレーザー光とは、パルス時間幅が１０ピコ秒以下であることが好ましく、例えば、パルス時間幅が１フェムト秒以上１ピコ秒以下の通常はフェムト秒レーザーと称されるレーザーから照射されるフェムト秒レーザー光を用いるのが適当である。
また、超短パルスレーザー光の尖頭値出力としては、１メガワット以上が好ましく、さらに詳細には、１メガワット以上１０ギガワット以下が好ましい。
その理由は、超短パルスレーザー光の尖頭値出力が１０ギガワットより大きいと、多価イオンが生成されて質量スペクトルの解析が困難となる恐れがあり、超短パルスレーザー光の尖頭値出力が１メガワットより小さいと、原子化・イオン化の効率が低下して原子イオン信号を観測することが困難となる恐れがあるからである。
なお、後述する本願発明者による実験によれば、例えば、パルス時間幅が１００フェムト秒、レーザーパワー０．２ｍＪの場合には、極めて良好な結果を得ることができた。【０００９】
また、本発明によれば、原子化と同時にイオン化を効率良く行うことのできるフェムト秒レーザー光などの超短パルスレーザー光を、同位元素などで標識した核酸に照射するようにしている。このため、標識元素を選択的にイオン化する必要が無くなり、種々様々な標識元素を使用することが可能となる。その上、レーザー照射の繰り返しレートを数ｋＨｚまで上げることが可能であるため、高速解析に適している。【００１０】
また、本発明では、生体試料中の分子をアブレーションする超短パルスレーザー光と当該分析の対象である生体試料とは、少なくともいずれか一方を移動させることにより、当該短パルスレーザー光により当該分析の対象である生体試料を遺漏、重複なくアブレーションして分析を行うようにしている。即ち、本発明においては、例えば、超短パルスレーザー光のスポットと試料として分析の対象である生体試料との相対的な移動により、広い面積にわたって生体試料を遺漏・重複することなくアブレーションすることを可能にしている。
本発明によれば、これらの特徴から、解析速度が従来と比較して格段に早くなる。【００１１】
また、本発明によれば、標識として元素標識を用いることが可能となる。さらに詳細には元素標識として、多種類の同位元素を用いることが可能となり、元素標識として、例えば、安定同位元素を用いれば、標識の種類は多種類の安定同位体の数（２７０種類）にも増やすことができる。これは、従来の標識法である蛍光法（２〜６種類）や放射性同位元素（約１０種類）と比較して、飛躍的に情報量を増やすことができることを意味している。
より詳細には、生体試料中の分析を目的とする分子の標識として、例えば、周期律表において１族の安定同位体である３９Ｋ、４１Ｋなど、周期律表において１６族の安定同位体である３２Ｓ、３５Ｓなど、周期律表において１７族の安定同位体である３５Ｃｌ、３７Ｃｌなど、周期律表において遷移金属の安定同位体である１１８Ｓｎ、１２０Ｓｎなど、さらには、周期律表において８族Ｆｅ、周期律表において１２族Ｈｇ、周期律表において１５族Ｉ、Ｅｕ、Ｔｂ、ＳｍおよびＤｙなどのランタノイドの安定同位元素で使うことが可能となる。
ここで、現在利用されている標識と比較すると例えば、安定同位元素を使えば、標識の種類を２７０種にも増やすことができる。
さらに、標識として複数種の標識を用いることによりマルチチャンネル化すると、分析の目的の分子として同一の生体試料中の少なくとも２種類以上の分子を分析することができる。
このように、本発明によって、多種類の安定同位元素標識による高感度・高速質量分析法を確立することができるものであり、従って、本発明は、蛍光色素や放射性同位元素で標識を行っている全ての研究分野へ応用可能である。
また、本発明によれば、標識元素に放射性同位元素を用いることなく、安定同位元素を用いることができるので、その場合には使用される施設に制限を受けないため、医療施設や民間企業への設置も可能となる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、従来の技術と比較すると、分析に要する時間を大幅に短縮化することができるという優れた効果を奏する。
また、本発明は、観察者により分析結果が左右されることのない、信頼性の高い結果を得ることができるという優れた効果を奏する。
また、本発明は、同一の生体試料上で一度に多数の遺伝子などを分析することができ、作業労力的ならびに時間的な効率を向上することができるとともに、生体試料に由来するバックグラウンドの差が全く無い条件で複数の遺伝子などの解析を行うことができるという優れた効果を奏する。
また、本発明は、生体試料中の分子の質量分析を行う場合に、質量スペクトルの解析が困難になる恐れを排除することができ、質量分析器に高分解能を必要とすることがないという優れた効果を奏する。
また、本発明は、生体試料中の分子を構成する構成原子の原子化とイオン化とを１台のレーザー源で同時に実現することが可能となり、システム構成ならびにレーザーの照射制御を大幅に簡潔にすることができるという優れた効果を奏する。
また、本発明は、多種類の標識同位体が混入した状況においても、効率の良い分析を行うことができるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明によるレーザーアブレーションを用いた生体組織切片の分析装置の一例の概念構成説明図であり、生体組織切片中の分子の質量分析を行う質量分析システムとして構成した本発明によるレーザーアブレーションを用いた生体組織切片の分析装置の概念構成説明図である。
【図２】図２は、ＴＡＳ増感法による標識遺伝子の染色によるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの原理の説明図である。
【図３】図３は、同時多数プローブを用いたハイブリダイゼーションの原理の説明図である。
【図４】図４は、単一プローブ増感法によるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの原理の説明図である。
【図５】図５は、実験に用いた生体組織切片を顕微鏡で観察した状態を示す説明図である。
【図６】図６は、領域１に超短パルスレーザー光を照射した際の質量スペクトルを示すグラフである。
【図７】図７は、領域２に超短パルスレーザー光を照射した際の質量スペクトルを示すグラフである。
【図８】図８は、領域３に超短パルスレーザー光を照射した際の質量スペクトルを示すグラフである。
【図９】図９は、領域４に超短パルスレーザー光を照射した際の質量スペクトルを示すグラフである。
【図１０】図１０は、図６〜９に示す質量スペクトルからそれぞれの標識原子に由来するピークに基づいて標識原子量を算出したものを示す図表である。
【図１１】図１１は、領域１における顕微鏡で観察した状態を示す説明図上に、図１０に示す領域１における遺伝子の強度の高い領域を破線で囲んで示した説明図である。
【図１２】図１２は、領域２における顕微鏡で観察した状態を示す説明図上に、図１０に示す領域２における遺伝子の強度の高い領域を破線で囲んで示した説明図である。
【図１３】図１３は、領域３における顕微鏡で観察した状態を示す説明図上に、図１０に示す領域３における遺伝子の強度の高い領域を破線で囲んで示した説明図である。
【図１４】図１４は、領域４における顕微鏡で観察した状態を示す説明図上に、図１０に示す領域４における遺伝子の強度の高い領域を破線で囲んで示した説明図である。
【図１５】図１５は、実施例２について、発現している遺伝子をアンチセンスプローブとネガティブコントロールのセンスプローブを用いて検出した組織を示す説明図と、レーザーを照射して得られたスペクトルを示すグラフおよび比較のために隣接した断面での同遺伝子の発現を定法のニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）で発色させた結果を示す説明図である。
【符号の説明】
【００１４】
１０        分析装置
１２        真空槽
１４        ターゲット
１６        飛行時間型質量分析器（ＴＯＦ質量分析器）
１８        回転導入端子
２０        超短パルスレーザー発生装置
２２        顕微鏡装置
２４        画像解析装置
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、添付の図面を参照しながら、本発明によるレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法およびその装置の実施の形態の一例を詳細に説明するものとする。
本発明によるレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法およびその装置によれば、生体試料中の分子を分析することができるものであり、以下の説明においては、分析の対象の生体試料として、生体組織切片を用いた場合について説明する。
なお、本発明によるレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法およびその装置において分析の対象となる生体試料としては、生体組織切片の他に、例えば、血液、唾液、喀痰、尿などのと抹サンプル、培養細胞あるいは感染症検査などがある。【００１６】
図１には、本発明によるレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析装置の実施の形態の一例として、生体組織切片中の分子の質量分析を行う質量分析システムとして構成した本発明によるレーザーアブレーションを用いた生体試料の分析装置（以下、単に「分析装置」と適宜に称する。）の概念構成説明図が示されている。【００１７】
この分析装置１０は、例えば１０−８〜１０−６Ｔｏｒｒの真空度に設定可能な真空槽１２と、この真空槽１２内に配置された分析対象の生体組織切片である試料のターゲット１４と、真空槽１２内に配置された質量分析器としての飛行時間型質量分析器（ＴＯＦ質量分析器）１６と、ターゲット１４を回転する回転導入端子１８と、例えばフェムト秒レーザー光などの超短パルスレーザー光を出射してターゲット１４へ照射する超短パルスレーザー発生装置２０と、ターゲット１４を観察するための顕微鏡装置２２と、顕微鏡装置２２で観察したターゲット１４の像を解析するとともにその解析結果を表示する表示部２４ａを備えた画像解析装置２４とを有している。
なお、超短パルスレーザー発生装置２０から照射された超短パルスレーザー光は、フォーカスレンズ（図示せず。）やミラー（図示せず。）などの光学系を介して、ターゲット１４上へ集光される。【００１８】
ここで、詳細な図示は省略するが、顕微鏡装置２２は、正立型の顕微鏡（正立顕微鏡）装置でも倒立型の顕微鏡（倒立顕微鏡）装置でもよい。
また、顕微鏡装置２２による観察と超短パルスレーザー発生装置２０による超短パルスレーザー光の照射とは、両者をターゲット１４の同一面から行ってよいし、互いに異なる面から行ってもよい。即ち、ターゲット１４の一方の面に超短パルスレーザー発生装置２０から超短パルスレーザー光を照射するとともに、当該一方の面から顕微鏡装置２２によりターゲット１４の状態を観察するようにしてもよいし、また、ターゲット１４の一方の面に超短パルスレーザー発生装置２０から超短パルスレーザー光を照射するとともに、当該一方の面とは異なる他方の面から顕微鏡装置２２によりターゲット１４の状態を観察するようにしてもよいものであり、超短パルスレーザー発生装置２０による超短パルスレーザー光の照射によるターゲット１４の変化の状態をｉｎ  ｓｉｔｕでリアルタイムに観察することができる。
具体的には、顕微鏡装置２２として正立顕微鏡装置を用いた場合には、正立顕微鏡装置の対物レンズをターゲット１４の上面に配置するとともに、超短パルスレーザー発生装置２０からの超短パルスレーザー光の照射をターゲット１４の下面から行うようにすることができる。
同様に、顕微鏡装置２２として正立顕微鏡装置を用いた場合に、正立顕微鏡装置の対物レンズをターゲット１４の上面に配置するとともに、超短パルスレーザー発生装置２０からの超短パルスレーザー光の照射もターゲット１４の上面から行うようにしてもよい。さらに、この場合においては、正立顕微鏡装置の対物レンズを通して超短パルスレーザー光の照射が行われるようにしてもよい。
一方、顕微鏡装置２２として倒立顕微鏡装置を用いた場合には、倒立顕微鏡装置の対物レンズをターゲット１４の下面に配置するとともに、超短パルスレーザー発生装置２０からの超短パルスレーザー光の照射をターゲット１４の上面から行うようにすることができる。
同様に、顕微鏡装置２２として倒立顕微鏡装置を用いた場合に、倒立顕微鏡装置の対物レンズをターゲット１４の下面に配置するとともに、超短パルスレーザー発生装置２０からの超短パルスレーザー光の照射もターゲット１４の下面から行うようにしてもよい。さらに、この場合においては、倒立顕微鏡装置の対物レンズを通して超短パルスレーザー光の照射が行われるようにしてもよい。
即ち、ターゲット１４の一方の面に超短パルスレーザー発生装置２０から超短パルスレーザー光を照射するとともに、当該一方の面から顕微鏡装置２２によりターゲット１４の状態を観察する場合には、顕微鏡装置２２の対物レンズを通して超短パルスレーザー光の照射が行われるように配置してもよい。【００１９】
また、超短パルスレーザー発生装置２０としては、フェムト秒レーザーなどのような、例えば、パルス時間幅が１フェムト秒以上１ピコ秒以下であり、尖頭値出力が１メガワット以上１０ギガワット以下である超短パルスレーザー光を照射可能なものを用いることができる。
より詳細には、こうした超短パルスレーザー発生装置２０は、例えば、チタンサファイアレーザーにより構成され、以下に示すようなパラメータを備えているものを用いることができる。即ち、
ピーク幅（パルス時間幅）：〜１１０ｆｓ（フェムト秒）
出力                    ：５０〜４８０μＪ（マイクロジュール）
（尖頭値出力：０．５〜４ＧＷ（ギガワット））
波長                    ：〜８００ｎｍ（ナノメートル）
繰り返し                ：１ｋＨｚ（キロヘルツ）
である。
また、質量分析器としては、飛行時間型質量分析器に代えて、四重極質量分析器などの各種の質量分析器を用いるようにしてもよいことは勿論である。
また、超短パルスレーザー発生装置２０から出射された超短パルスレーザー光を集光するフォーカスレンズの焦点距離は、例えば、２５ｃｍに設定されている。【００２０】
以上の構成において、上記した分析装置１０を用いて生体組織切片中の分子の質量分析を行う手法について説明する。
ここで、本発明による生体組織切片中の分子の質量分析は、フェムト秒レーザーなどの超短パルスレーザー発生装置２０から出射された超短パルスレーザー光によるアブレーションと、飛行時間型質量分析器１６による分析とを用いて、生体組織切片中の分子の質量分析を行うものである。
即ち、本発明による生体組織切片中の分子の質量分析は、分析の対象である生体組織切片に超短パルスレーザー光を照射して当該生体組織切片をアブレーションすることにより、生体組織切片に含まれる分子を構成元素に原子化し、原子化した構成元素をイオン化し、イオン化した構成元素を分析するものである。
具体的には、生体組織切片をターゲット１４として真空槽１２内に配置し、ターゲット１４たる生体組織切片に超短パルスレーザー発生装置２０から出射されたフェムト秒レーザー光などの超短パルスレーザー光を照射してアブレーションを行い、飛行時間型質量分析器１６により分析するものである。
この際に、分析の対象となる生体組織切片中の分子に元素標識などにより標識を付しておくようにすると、標識を付した分子を含む生体組織切片をターゲット１４として真空槽１２内に配置し、ターゲット１４たる生体組織切片に超短パルスレーザー発生装置２０から出射されたフェムト秒レーザー光などの超短パルスレーザー光を照射してアブレーションを行って、飛行時間型質量分析器１６により標識元素を測定することにより、分析対象となる生体組織切片中の分子を検出して分析することができる。【００２１】
ここで、超短パルスレーザー発生装置２０から出射されたフェムト秒レーザー光などの超短パルスレーザー光の照射位置は、あらかじめ生体組織切片たるターゲット１４を顕微鏡装置２２で観察して決定することができる。
さらに、顕微鏡装置２２により得られた生体組織切片たるターゲット１４上におけるレーザー照射を行った各点での画像を、画像解析装置２４により解析して、画像解析装置２４の表示部２４ａにおいて当該各点での標識元素の強度を色彩表示に変換した形でターゲット１４たる生体組織切片画像上に表示し、生体組織切片の形態的特徴と計測結果を同時に視認することができるような処理を施すことにより、従来のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法と同様の形式でデータを解析することが可能となる。
また、超短パルスレーザー光によるアブレーションを行う分析装置１０にターゲット１４として生体組織切片をセットする前に、あらかじめ生体組織切片を顕微鏡装置２２で観察し、生体組織切片に基準点を設け、これを基準としてレーザー照射位置の位置決めを行うことによって、顕微鏡装置２２による観察画像と超短パルスレーザー光を用いたアブレーションにより計測した分子分析結果とを対応させることもできる。【００２２】
なお、本発明においては、同位体元素で標識した分子それ自体を原子レベルでイオン化し、標識元素を検出することが可能となるから、質量分析可能な対象範囲を飛躍的に広げることができるようになる。例えば、標識として同位体元素を用いることが可能となり、標識の種類をたとえば安定同位体元素の数である２７０にも増やすことができる。これは、従来の標識法である蛍光法（２種類）や放射性同位元素（約１０種類）と比較して、飛躍的に情報量を増やすことができる。
【実施例１】
【００２３】
以下、生体試料の作製の一例として、マウス脳をスライスして形成した生体組織切片の作製の手法について説明する。【００２４】
１．マウス脳の調製
動物：モデル動物として、オリエンタル酵母株式会社から購入した雄の１０〜１１週齢の野生型ＣＤ−１マウスおよびＣ５７ＢＬ／６Ｊを用いた。
こうしたマウスの脳の調製する際の試薬としての固定液は、以下の表１に示す通りである。
【表１】
2005095942.tif 000002
上記試薬を用いて、下記のような方法により、生体組織切片としてマウス脳のパラフィン切片ならびに凍結切片を作製した。
＜方法＞
１）パラフィン切片の作製
マウスにエーテル麻酔し、痛覚反応がなくなった後、開腹し心臓を露出させ、氷冷した中性固定液、酸性固定液を２０ｍｌずつ順に心臓から流入させ灌流固定を行った。その後、脳を摘出し、酸性固定液中において４℃で３日間放置して固定した。
固定した組織を薄切して切片を作製し、スライドグラスに貼付した。ＶＥＮＴＡＮＡ社製自動ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）装置を用いてパラフィン切片を作製した。
２）凍結切片の作製
エーテル麻酔下で脊椎脱臼後に脳を摘出し、ＯＣＴに包埋し液体窒素で凍結し、ライカ社製薄切機で切片を作成した。【００２５】
２．プライマーの設計
目的遺伝子のｃＤＮＡ配列を理研ＦＡＮＴＯＭクローンから検索した。さらに、公共データベースのＬｏｕｃｕｓＬｉｎｋよりｃＤＮＡを参照して、目的となるｃＤＮＡ配列を選択した。選択した塩基配列をアミノ酸配列に変換し、ＮＣＢＩ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＢＬＡＳＴでホモロジー検索した。ホモロジーの低い配列に相当するｃＤＮＡ部分を同定し、鋳型として増幅させるためにプライマーを設計した。さらに、必要に応じて、ゲノムＤＮＡからホモロジーの低い配列を鋳型として増幅させるためにプライマーを設計した。なお、遺伝子のＬｏｕｃｕｓＬｉｎｋ  ＩＤを表２に示す。
【表２】
2005095942.tif 000003
【００２６】
３．プラズミッドの精製
機器として株式会社島津製作所製の分光光度計（Ｂｉｏ  Ｓｐｅｃ−１６００）およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００を用い、試薬として表３に示すものを用いて、以下の方法によりプラズミッドの精製を行った。
【表３】
2005095942.tif 000004
＜方法＞
大腸菌からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いて、添付のプロトコールに従い、プラスミドＤＮＡを精製し、分光光度計で吸光度を測定して、濃度を算出した。プラスミドＤＮＡを鋳型として設計したプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。反応液組成、反応条件は以下に示す。反応産物を２％のアガロースゲルに電気泳動し、確認した。【００２７】
４．プローブの作製
１）安定同位体標識ｓｓＤＮＡプローブの作製
表４に示す反応液および反応条件により、安定同位体標識ｓｓＤＮＡプローブを作製した。標識ｄＮＴＰには、パーキンエルマー社製のＥｕ標識ｄＵＴＰ、Ｓｍ標識ｄＵＴＰ、Ｔｂ標識ｄＵＴＰおよびＤｙ標識ｄＵＰＴを用いた。
【表４】
2005095942.tif 000005
ＰＣＲ産物をフェノール・クロロホルム抽出して、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ（商標）カラムにより精製した。その精製産物をアガロースゲル上で確認した。
２）ＤＩＧ標識ＲＮＡプローブの作製
表５に示す反応液および反応条件により、ＤＩＧ標識ＲＮＡプローブを作製した。
【表５】
2005095942.tif 000006
このＰＣＲ産物とＴ７とＳＰ６ポリメラーゼの認識配列（＊Ｔ７，ＳＰ６  ａｄａｐｔｏｒ）を含むプライマーを用い、再びＰＣＲを行った。反応液組成、反応条件は表６に示す。反応産物を２％のアガロースゲルに電気泳動し、確認した。
＊Ｔ７  ａｄａｐｔｏｒ：ＧＡＧＣＧＣＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ
ＳＰ６  ａｄａｐｔｏｒ：ＴＴＧＴＧＣＧＧＣＣＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡ
【表６】
2005095942.tif 000007
ＰＣＲ産物をフェノール・クロロホルム抽出して、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ（商標）カラムにより精製した。
次に、ＤＩＧ標識ＲＮＡアンチセンスプローブおよびセンスプローブの作製について説明する。
即ち、アンチセンスプローブを作製時にＴ７ポリメラーゼ、センスプローブ作製時にはＳＰ６ポリメラーゼを用い、表７に示す反応液組成で３７℃で２時間インキュベートした。反応産物を１％のアガロースゲルに電気泳動し、確認した。
【表７】
2005095942.tif 000008
確認後、ＤＮＡを除去するためＤＮａｓｅＩ（１０Ｕ／μｌ）を２μｌ加え、３７℃で３０分間インキュベートした。ＤＮＡが除去したかどうかを１％のアガロースゲルに電気泳動し、確認した。除去できていたら０．２Ｍ  ＥＤＴＡ  を２μｌ加え反応を停止させ、ＢＤ  ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ  Ｃｏｌｕｍｎでプローブを精製した。【００２８】
５．ドット・ブロット法によるプローブの定量
プローブ作製の結果、得られた標識ＤＮＡを正確に定量することは、ＩＳＨの結果を最適化し、再現性を持たせるのにきわめて重要である。そこで、既知量のスタンダードを希釈したものと実際にラベルした未知量のプローブの希釈系列と検体の希釈列とを並列にスポットし、レーザー照射法および抗ＤＩＧ抗体を用いた発色法で検討した。
以下、ＤＩＧ標識プローブの定量について説明する。まず、使用する機器ならびに試薬について説明するものとする。
機器として振とう機、ＵＶクロスリンカーおよびナイロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ）を用い、試薬として表８に示すものを用いて、以下の方法によりＤＩＧ標識プローブの定量を行った。
【表８】
2005095942.tif 000009
＜方法＞
９６穴プレートにコントロールＲＮＡと作製したプローブの希釈系列を作り、各穴の希釈溶液を１ｕｌずつナイロンメンブレン上にスポットした。メンブレンを風乾させた後、ＵＶクロスリンカーで処理（１２０ｍＪ／ｃｍ２）した。Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔを加えた溶液にメンブレンを浸し、振とう機で１０分間振とうさせた後、抗体反応を行うため、Ａｎｔｉ−ＤＩＧ−ＡＰ５０００倍希釈液で３０分間振とうさせた。ＴＢＳバッファーでメンブレンを洗浄した後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液を加え振とうさせ発色反応を行った。十分発色させた後、ＭｉｌｌｉＱ水を加え１０分間振とうさせ発色反応を止めた。そして、流水で水洗し、風乾した後、ハイブリパックで密封し、コントロールＲＮＡと作製したプローブのスポットシグナルを比較してプローブの定量を行った。【００２９】
６．ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法
１）マーカー遺伝子のハイブリダイゼーション
図２に示すように、プローブにＤＩＧ標識ＲＮＡプローブを用いて、アルカリフォスファターゼによる発色をＶＥＮＴＡＮＡ社製自動ＩＳＨ装置で行った。
２）同時多数プローブを用いたハイブリダイゼーション
図３に示すように、プローブに同位体元素Ｅｕ，Ｓｍ，Ｔｂ，Ｄｙを標識し、自動ＩＳＨ装置で前処理を行った後、ＳＡＷ  ａｇｉｔａｔｉｏｎ法（Ａｄｖａｌｙｔｉｘ）を用いて短時間でハイブリダイゼーションを行った。
Ｍａｐ２ マーカー遺伝子 ＤＩＧ標識
Ｔｐｈ２ 目的遺伝子１    Ｓｍ標識 ＮＭ＿１７３３９１
ＭａｏＢ 目的遺伝子２ Ｅｕ標識 ＮＭ＿１７２７７８
ＡＡＤＣ 目的遺伝子３ Ｄｙ標識 ＮＭ＿０１６６７２
Ｈｔｒ１Ｂ 目的遺伝子４ Ｔｂ標識 ＮＭ＿０１０４８２
３）高感度ハイブリダイゼーション
図４に示すように、プローブにＤＩＧ標識ＲＮＡプローブを用いて、チラミド増感法とＡｖｉｄｉｎ化Ｅｕを併用した増感法を用いて高感度ハイブリダイゼーションを行った。【００３０】
以下、生体試料として生体組織切片を用い、この生体組織切片に超短パルスレーザー光を照射してアブレーションし、生体組織切片を分析した結果について説明する。
即ち、上記１〜４において説明した手法によって得られたマウス脳の生体組織切片をターゲット１４として用いて、分析装置１０により分析を行った実験結果は、以下に示す通りである。
この実験は、上記のようにして作製した生体組織切片をターゲット１４として超短パルスレーザー発生装置２０からのフェムト秒レーザー光などの超短パルスレーザー光を照射してアブレーションを行い、飛行時間型質量分析器１６により分析するものである。
より詳細には、上記のようにして作製したターゲット１４を真空槽１２内に装着して、真空槽１２内を真空に引いて、真空槽１２内の真空度が１０−６Ｔｏｒｒ以下となるように設定する。
次に、超短パルスレーザー発生装置２０から出射された超短パルスレーザー光を、フォーカスレンズなどの光学系を用いてターゲット１４上に集光して、ターゲット１４上に設定された領域をアブレーションする。
そして、飛行時間型質量分析器１６によって、ターゲット１４への超短パルスレーザー光の照射により発生した一価のイオンの質量を測定する。【００３１】
ここで、図５は実験に用いた生体組織切片を顕微鏡装置２２により観察した状態を示す説明図であり、マーカー遺伝子の局在をＴＳＡ増感ＩＳＨ法を用いて示した。このプローブを用いると神経細胞を選択的に染色することが可能で、そのシグナルはレーザー照射の際のマーカーとなる。
このマーカー遺伝子の位置を基点として、図５において四角形で囲んだ領域１〜４を設定し、超短パルスレーザー発生装置２０により超短パルスレーザー光の照射を行った。
その超短パルスレーザー光の照射する際の条件は、
パルス幅：１００ｆｓ（フェムト秒）
レーザーパワー：０．２ｍＪ（ミリジュール）
である。
上記照射条件により超短パルスレーザー光を領域１〜４にそれぞれ照射し、超短パルスレーザー光の照射によって発生されたイオンを飛行時間型質量分析器１６により測定して、それぞれの領域における標識元素を測定したところ、図６〜９に示す質量スペクトルが得られた。
即ち、上記した領域１に超短パルスレーザー光を照射した際の質量スペクトルが図６に示され、領域２に超短パルスレーザー光を照射した際の質量スペクトルが図７に示され、領域３に超短パルスレーザー光を照射した際の質量スペクトルが図８に示され、領域４に超短パルスレーザー光を照射した際の質量スペクトルが図９に示されている。
上記した図６〜９に示す質量スペクトルから、それぞれの標識原子に由来するピークに基づいて標識原子量を算出したものが、図１０として示す図表にまとめられている。
この図１０に示すように、生体組織切片にフェムト秒レーザー光などの超短パルスレーザー光を照射し、標識原子を計測することにより、生体組織切片中の遺伝子の発現を解析することができた。
また、図１１〜１４には、顕微鏡装置２２および画像解析装置２４を用いて、領域１〜４におけるそれぞれ顕微鏡で観察した状態を示す説明図上に、図１０に示す領域１〜４における遺伝子の強度の高い領域を破線で囲んで示している。なお、画像としてカラー画像を扱うようにすれば、強度分布をより詳細に示すことが可能となる。
これら図１１〜１４に示すように、分析装置１０によれば、顕微鏡装置２２により得られた生体組織切片たるターゲット１４上におけるレーザー照射を行った領域１〜４での画像を、画像解析装置２４により解析して、画像解析装置２４の表示部２４ａにおいて領域１〜４での標識元素の強度を枠線表示や色彩表示に変換した形で領域１〜４の切片画像上に表示し、生体組織切片の形態的特徴と計測結果を同時に視認することができるようになる。
なお、この実施例においては、各領域毎に各遺伝子に関する画像、即ち、領域１〜４の各領域に対して遺伝子１〜４についての４枚の画像を得るようにしたが、これに限られるものではないことは勿論であり、カラー画像を用いて遺伝子の色を変えることにより、各領域毎の画像に複数の遺伝子の発現を示すことができるようにようしてもよい。
【実施例２】
【００３２】
次に、ＰｔラベルＲＮＡプローブを用いた検出について説明する。
樹状突起に多く存在する微小管関連タンパク質ＭＡＰ２の遺伝子について、マウス脳における発現を調べた。
なお、マウスの脳の調整、プライマーの設計、プラスミドの精製については、「実施例１」と同様の方法で行なった。【００３３】
１．プローブの作製
１）ＰｔラベルＲＮＡプローブの作製
表５に示す反応液および反応条件により、鋳型ＤＮＡを作成した。また、ＲＮＡプローブを作製した。
このＰＣＲ産物とＴ７とＳＰ６ポリメラーゼの認識配列（＊Ｔ７，ＳＰ６  ａｄａｐｔｏｒ）を含むプライマーを用い、再びＰＣＲを行った。反応液組成、反応条件は表６の通りである。反応産物を２％のアガロースゲルに電気泳動し、確認した。
＊Ｔ７  ａｄａｐｔｏｒ：ＧＡＧＣＧＣＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ
ＳＰ６  ａｄａｐｔｏｒ：ＴＴＧＴＧＣＧＧＣＣＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡ
ＰＣＲ産物をフェノール・クロロホルム抽出して、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ（商標）カラムにより精製した。
次に、アンチセンスプローブを作製時にＴ７ポリメラーゼ、センスプローブ作製時にはＳＰ６ポリメラーゼを用い、表９に示す反応液組成で３７℃で２時間インキュベートした。反応産物を１％のアガロースゲルに電気泳動し、確認した。
【表９】
2005095942.tif 000010
確認後、ＤＮＡを除去するためＤＮａｓｅＩ（１０Ｕ／μｌ）を２μｌ加え、３７℃で３０分間インキュベートした。ＤＮＡが除去したかどうかを１％のアガロースゲルに電気泳動し、確認した。除去できていたら０．２Ｍ  ＥＤＴＡを２μｌ加え反応を停止させ、ＢＤ  ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ  Ｃｏｌｕｍｎでプローブを精製した。
精製したＲＮＡを、ＵＬＹＳＩＳ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）を用いてラベルした。精製したＲＮＡ１μｇに１０分の１量の３Ｍ  ＮａＡｃＯ（ｐＨ  ５．２）と２倍量のエタノールを加え、−７０℃に３０分間静置した後、１２０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心した。
ペレットを７０％エタノールで洗い、風乾した後、ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｃ）２０μｌに溶かした。これを９５℃で５分間インキュベートし、その後氷上に置いた。スピンダウンして、水滴をチューブの底に集め、ＵＬＳ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｒｅｇｅｎｔ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２）を５μｌ加え、ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｃ）を足して総量を２５μｌにした。９０℃で１０分間インキュベートした後、氷上に置き反応を止め、スピンダウンして、水滴をチューブの底に集めた。ラベルしたサンプルにＴＥ  １００μｌを加え、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｓ−４００を用いて精製し、ＰｔラベルＲＮＡプローブとした。【００３４】
２．ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
実施例１と同様に、ＶＥＮＴＡＮＡ社製自動ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）装置を用いて、ハイブリダイゼーション反応を行なった。
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションには、ＲＮＡプローブを２０μｌを用いた。【００３５】
３．飛行時間型質量分析器を用いたＰｔラベルの検出
実施例１と同様の方法で、分析装置１０により分析を行なった結果を図１５に示す。図１５には、発現している遺伝子を上記で作製したアンチセンスプローブとネガティブコントロールのセンスプローブを用いて検出した組織を示す説明図と、レーザーを照射して得られたスペクトルおよび比較のために隣接した断面での同遺伝子の発現を定法のニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）で発色させた結果が示されている。
Ｐｔラベルアンチセンスプローブを用いた場合には、Ｐｔに由来するピーク（質量数１９４、１９５、１９６）が観察されるのに対し、ネガティブコントロールでは、Ｐｔのピークは検出されなかった。
これは、比較のために示した従来の染色法による結果と良く一致しており、Ｐｔラベルアンチセンスプローブを用いた解析が遺伝子の発現解析に有用であることが判った。【００３６】
［変形例］
なお、上記した実施の形態は、以下の（１）乃至（１２）に示すように変形することができるものである。
（１）上記した実施の形態においては、質量分析器として、原子の飛行時間を測定することにより質量分析を行う飛行時間型質量分析器を用いたが、飛行時間型質量分析器を用いた場合には、一回のレーザー照射で複数の原子の質量分析を同時に行うことができる。また、質量分析器としてイオンサイクロトロン型フーリエ変換質量分析器を用いた場合にも、複数の原子の質量分析を同時に行うことが可能となる。
（２）上記した実施の形態においては、分子の分析方法として質量分析に関して説明したが、これに限られるものではないことは勿論であり、質量分析以外の分析に関して本発明を用いるようにしてもよい。
（３）上記した実施の形態においては、ターゲット１４を移動する移動手段として、ターゲット１４を回転する回転導入端子１８を用いたが、これに限られるものではないことは勿論であり、ターゲット１４を載置可能な移動自在のテーブルなどの適宜の移動手段を用いるようにしてもよい。
（４）上記した実施の形態においては、回転導入端子１８を用いてターゲット１４を回転することにより、ターゲット１４を遺漏・重複なくアブレーションするようにしたが、これに限られるものではないことは勿論であり、超短パルスレーザー光のターゲットへの照射位置を移動する移動手段を設けるようにして、ターゲット１４を遺漏・重複なくアブレーションするようにしてもよい。
（５）上記した実施の形態においては、核酸プローブが特定のターゲットに結合する例としてハイブリターゼーションを示したが、これに限られるものではないことは勿論であり、ハイブリターゼーション以外にアプタマーのような結合をしてもよい。
（６）本発明においては、分析の対象とする目的の核酸を検出するための核酸の標識を、ＴＵＮＥＬ法により標識するようにしてもよい。
（７）本発明においてプローブとする核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、その他修飾されたものを含むものである。
（８）本発明においては、生体組織切片に含まれる特定のタンパク質の検出を行うようにしてもよい。
（９）本発明においては、目的とするタンパク質を検出するための標識された特異的な結合をする物質が、抗原抗体反応によって結合するようにしてもよい。
（１０）本発明においては、核酸を標識とした場合には、ターゲットには核酸は勿論のこと、核酸以外にも、タンパク質やそのほかの低分子物質も含むものである。
（１１）本発明における検出対象としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、低分子化合物、その他の試料中に含まれる物質が考えられる。
（１２）上記した実施の形態ならびに上記した（１）乃至（１１）に示す変形例は、適宜に組み合わせるようにしてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明は、医学や生化学などのライフサイエンスの分野における生体組織の分析に利用されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図５】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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