(57)【要約】  １種類のナノ粒子を用いて２種以上の標的物質を簡便に効率よく検出する。  １の試料中に含まれる２種以上の標的物質を、該標的物質に対応してそれぞれ結合可能であると共に互いに異なる波長で発光する２種以上の蛍光色素で標識化して、これに、前記２種以上の蛍光色素を結合可能なナノ粒子蛍光体を組み合わせ、次いで、該ナノ粒子蛍光体を励起する励起光を照射して発光させ、ナノ粒子蛍光体からの光を励起光として、前記２種以上の蛍光色素を蛍光発光させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
互いに異なる波長で発光する２種以上の蛍光色素と、該２種以上の蛍光色素に結合したナノ粒子蛍光体と、で構成された蛍光体。
【請求項２】
前記ナノ粒子蛍光体が、互いに異なるエネルギーレベルで前記蛍光色素へエネルギーを付与可能であることを特徴とする請求項１記載の蛍光体。
【請求項３】
前記ナノ粒子蛍光体の発光の半値幅が５０〜２００ｎｍであることを特徴とする請求項１又は請求項２記載の蛍光体。
【請求項４】
前記ナノ粒子蛍光体及び前記蛍光色素が、互いに結合可能な結合部をそれぞれ備えたものであることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の蛍光体。
【請求項５】
前記ナノ粒子蛍光体が、下記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその分解生成物である表面修飾剤によって表面修飾された金属酸化物又は金属硫化物のナノ粒子蛍光体であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項記載の蛍光体。
Ｍ−（Ｒ）4        ［Ｉ］
（式中、ＭはＳｉ又はＴｉ原子を、Ｒは有機性基を示す。Ｒはそれぞれ同一でも異なっていてもよいが、Ｒのうちの少なくとも１つは親和性分子と反応性を有する基を示す。）
【請求項６】
互いに異なる波長で発光する２種以上の蛍光色素と、該２種以上の蛍光色素に結合可能なナノ粒子蛍光体と、を含む蛍光体組成物。
【請求項７】
１の試料中に含まれる２種以上の標的物質を、該標的物質に対応してそれぞれ結合可能であると共に互いに異なる波長で発光する２種以上の蛍光色素を用いて蛍光検出するための蛍光検出方法であって、
前記２種以上の蛍光色素を結合可能なナノ粒子蛍光体と前記蛍光色素と前記標的物質とが結合した複合体を形成する工程と、
前記ナノ粒子蛍光体を励起する励起光を照射して、該ナノ粒子蛍光体を発光させる工程と、
前記ナノ粒子蛍光体からの光で該ナノ粒子蛍光体に結合した前記２種以上の蛍光色素を励起して蛍光発光させる工程と、
蛍光色素からの蛍光発光を検出する工程と、
を含む蛍光検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光体、蛍光体組成物及び蛍光検出方法に関し、特に、ナノ粒子蛍光体を含む蛍光体、蛍光体組成物及びこれを用いた蛍光検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノサイズの粒子材料はバルクの材料とは異なる性質を示すことが知られている。例えば半導体であれば、従来材料固有のものと考えられてきたバンドギャップが粒子のサイズによって変化する、いわゆる量子サイズ効果がよく知られている。この効果が顕著になる粒子の大きさは、半導体材料の種類によって異なり、一般的には数十ｎｍ以下である。このため特にシングルナノ粒子は重要である。また、この量子サイズ効果が顕著になると同時に、蛍光の寿命が短くなり、それまで観測されなかった発光が観測できるようになる等の効果が知られている材料もある。このように、ナノサイズ、特にシングルナノサイズの材料は従来知られているバルク材料と異なる性質を有するため、科学的及び工学的に非常に注目されている。【０００３】
例えば、ＣｄＳｅ／ＣｄＳ（コア／シェル）、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ（コア／シェル）等の半導体ナノ粒子を用い、これらの半導体ナノ粒子により作製したビーズ表面に分子プローブを結合することにより標的分子を検出する半導体ナノ粒子蛍光材料が提案されている（例えば、非特許文献１及び２参照）。これらの半導体ナノ粒子は、異なる結晶子サイズにすることにより異なる波長で発光を得ることが可能である。また発光波長と発光強度を組み合わせて標識ビーズをコードすることにより同時多重測定も可能である。半導体ナノ粒子蛍光材料は、高感度、低コスト、自動化が容易等の標識材料として優れた特性を有している。そのため、半導体ナノ粒子蛍光材料を標識材料として用いることにより生体内の特定部位、血漿中の物質等を高感度で高速に検出することが可能となった。【０００４】
また、半導体ナノ粒子の表面を修飾分子で被覆することにより、マトリックスとの親和性を向上させた半導体ナノ粒子蛍光材料が提案されている（例えば、特許文献１〜３、非特許文献３参照）。半導体ナノ粒子を修飾分子で被覆することにより水媒体との親和性を向上させたり、有機高分子や有機溶媒への分散性を向上させたりすることが可能になる。これにより半導体ナノ粒子蛍光材料を標識材料として適用するのが容易になる。このように半導体ナノ粒子蛍光材料は臨床診断及び生化学的・医科学的研究分野等で幅広い応用が期待されている。【０００５】
ところで、生化学的・医科学的研究分野では、複雑な生命現象を正確に検出することが要請されている。２種以上の物質の相互関係を検出する場合や、必要となる試料を大量に用意することができない場合などでは、ひとつの試料中に存在する複数の物質を同時に検出することが要求されることがある。このような試験を行うために、複数のナノ粒子蛍光材料を使用した検出システムが開発されている。特に、多種の蛍光材料それぞれに適した励起光光源を使用することによる装置の大型化・複雑化を回避するために、半導体ナノ粒子蛍光材料のサイズ効果を利用したシステムが開発されている（例えば、特許文献４）。このシステムでは、ひとつの励起光光源に対して、サイズの異なる蛍光材料の種類数に応じた励起フィルタを配置させており、ひとつの励起光源で発生した光を、それぞれの蛍光材料に適した励起光に光源励起フィルタを用いて分光し、照射している。【０００６】
しかしながら、ナノ粒子蛍光材料のサイズ効果を利用したシステムでは、サイズの異なるナノ粒子蛍光材料をそれぞれ用意する必要がある。
また、複数種のナノ粒子蛍光材料に対応してそれぞれ励起フィルタを設けたのでは、複数種類の標的物質を検出するための装置構成が複雑になり、簡便に検出することができない。【０００７】
【特許文献１】米国特許第６，３１９，４２６号明細書
【特許文献２】特開２００２−３８１４５号公報
【特許文献３】特開２００３−６４２７８号公報
【特許文献４】特開２００２−２８７９７号公報
【非特許文献１】「サイエンス(Science)」, 1998年, 第281巻, 第25号, p.2013-2016
【非特許文献２】「ネイチャー バイオテクノロジー(Nature Biotechnology)」, 2001年, 第19巻, p.631-6354
【非特許文献３】「サイエンス(Science)」, 1998年, 第281巻, 第25号, p.2016-2018
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って本発明の目的は、１種類のナノ粒子を用いて２種以上の標的物質を簡便に効率よく検出することができる蛍光体、蛍光体組成物及び蛍光検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の蛍光体は、互いに異なる波長光で励起する２種以上の蛍光色素と、該２以上の蛍光色素に結合したナノ粒子蛍光体と、で構成されたことを特徴とするものである。
ここで、前記ナノ粒子蛍光体が、互いに異なるエネルギーレベルで前記蛍光色素へエネルギーを付与可能であることが好ましい。
また本発明の蛍光体組成物は、互いに異なる波長で発光する２種以上の蛍光色素と、該２種以上の蛍光色素を結合可能なナノ粒子蛍光体と、を含むことを特徴とするものである。【００１０】
さらに本発明の蛍光検出方法は、１の試料中に含まれる２種以上の標的物質を、該標的物質に対応してそれぞれ結合可能であると共に互いに異なる波長で発光する２種以上の蛍光色素を用いて蛍光検出するための蛍光検出方法であって、前記２種以上の蛍光色素を結合可能なナノ粒子蛍光体と前記蛍光色素と前記標的物質とが結合した複合体を形成する工程と、前記ナノ粒子蛍光体を励起する励起光を照射して、該ナノ粒子蛍光体を発光させる工程と、前記ナノ粒子蛍光体からの光で該ナノ粒子蛍光体に結合した前記２種以上の蛍光色素を励起して蛍光発光させる工程と、蛍光色素からの蛍光発光を検出する工程と、を含むことを特徴としている。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ひとつのナノ粒子蛍光体が、互いに異なる波長で発光する２種以上の蛍光色素と結合しているので、ナノ粒子蛍光体をひとつの励起光で励起すれば、ナノ粒子蛍光体の蛍光発光によって、ナノ粒子蛍光体に結合している２種以上の蛍光色素を発光させることができる。この結果、複数の励起光の照射することなく、また複数種のナノ粒子を使用することなく、１種類のナノ粒子蛍光体を用いて複数種の標的物質を簡便に効率よく検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本実施例におけるナノ粒子蛍光体の蛍光スペクトルを示す図である。
【図２】本実施例における多種蛍光色素とナノ粒子蛍光体とで構成された蛍光体の蛍光体スペクトルを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の蛍光体は、互いに異なる波長で発光する２種以上の蛍光色素と、この２種以上の蛍光色素に結合したナノ粒子蛍光体とで構成されたものであり、本発明の蛍光体組成物は、互いに異なる波長で発光する２種以上の蛍光色素と、この２種以上の蛍光色素を結合可能なナノ粒子蛍光体と、を含むものである。【００１４】
このような蛍光体及び蛍光体組成物とすることによって、ナノ粒子蛍光体と蛍光色素とが結合しているときにナノ粒子蛍光体が励起すると、ナノ粒子蛍光体が発光し、ナノ粒子蛍光体から蛍光色素へエネルギーが移動する。この結果、ナノ粒子蛍光体からエネルギーを付与された蛍光色素が励起して互いに異なる波長で発光するので、２種以上の標的物質を蛍光色素で標識化しておけば、ナノ粒子蛍光体をひとつの励起光で励起することによって複数の標的物質を検出することができる。また、吸収スペクトル極大と蛍光スペクトル極大が近接する２種以上の蛍光色素を用いるとナノ粒子蛍光体によって励起される２種以上の蛍光色素の間でもエネルギー移動が起こり、最長波の蛍光色素のみを発光させることができる。このような場合、蛍光色素で標識された標的物質が少なくとも１種欠落するとシーケンシャルなエネルギー移動が阻害されるのでその発光挙動の変化から標的物質の欠落を検出することもできる。
なお、本発明において「蛍光体組成物」と表現する場合、互いに結合している状態に加えて、未だ結合していないナノ粒子蛍光体と蛍光色素とが存在する状態も含まれる。
以下に、本発明を詳細に説明する。【００１５】
［１］ナノ粒子蛍光体
本発明におけるナノ粒子蛍光体は、所定の励起光で蛍光発光する粒子であると共に、その表面の少なくとも表面の一部に、後述する蛍光色素を結合することが可能な粒子である。【００１６】
このようなナノ粒子蛍光体としては、所謂ナノサイズの数平均粒径を有するものであれば、如何なるものも含まれる。数平均粒径としては、好ましくは０．５〜１００ｎｍであり、より好ましくは０．５〜５０ｎｍであり、さらに好ましくは１〜１０ｎｍである。蛍光体ナノ粒子の粒径分布は、変動係数で好ましくは０〜５０％、より好ましくは０〜２０％、さらに好ましくは０〜１０％である。なお、変動係数は、算術標準偏差を数平均粒径で除し、これを百分率で表した値（算術標準偏差×１００／数平均粒径）を意味する。【００１７】
ナノ粒子蛍光体として好ましいものは、金属酸化物又は金属硫化物のナノ粒子蛍光体である。該金属酸化物又は金属硫化物を構成する金属としては、例えば、ＺｎなどのIIＢ族、Ｙ、Ｅｕ、ＴｂなどのIIIＡ族、Ｇａ、ＩｎなどのIIIＢ族、Ｚｒ、ＨｆなどのIVＡ族、Ｓｉ、ＧｅなどのIVＢ族、Ｖ、ＮｂなどのＶＡ族、Ｍｏ、ＷなどのVIＡ族などが挙げられる。これらの中で生体に対して激しい反応性を示さないＺｎが特に好ましい。また、Ｚｎ2ＳｉＯ4、ＣａＳｉＯ3、ＭｇＷＯ4、ＹＶＯ4、Ｙ2ＳｉＯ5などの複合金属酸化物であってもよい。本発明におけるナノ粒子蛍光体としては、安定に製造できること、毒性の懸念が少ないこと、安価に製造できること、粒子の単分散性が高いこと、強い発光が得られること、発光スペクトルの波長域が本目的に合致しやすいこと、の観点から、酸化亜鉛（ＺｎＯ）及び硫化亜鉛（ＺｎＳ）であることが特に好ましく、酸化亜鉛（ＺｎＯ）であることが最も好ましい。【００１８】
さらにこれらの金属酸化物又は金属硫化物のナノ粒子蛍光体は、構成する金属酸化物又は金属硫化物中の金属とは異なる金属イオンを少量含有していることも好ましい。該金属イオンとしてはＭｎ、Ｃｕ、Ｅｕ、Ｔｂ、Ｔｍ、Ｃｅ、Ａｌ、Ａｇなどの金属イオンが挙げられ、発光の視認性が高いことおよび安定に製造できることの観点からＭｎ及びＥｕが好ましい。これらの金属イオンは、塩化物イオンやフッ化物イオンを組み合わせた化合物としてドープされることも好ましい。ドープする金属イオンは１種類の原子も、複数種類の原子からなるものでもよい。従って、このような金属イオンを含むナノ粒子蛍光体としては、ＺｎＳ／Ｍｎ、ＺｎＯ／Ｅｕなどが挙げられる。該金属イオンの濃度は、ナノ粒子蛍光体を構成する金属および、その種類によって最適量が異なるが、０．００１〜１０原子％の範囲が好ましく、０．０１〜１０原子％の範囲がより好ましい。【００１９】
また本発明にかかるナノ粒子蛍光体は、励起光とシグナル蛍光との分離、安価光源の利用、簡便な検出系構築の観点から好ましくは紫外域の光で励起するものであり、より好ましくは２５０ｎｍ〜３８０ｎｍの紫外光を励起光とするものであり、この励起光によって、可視域の光、より好ましくは４００ｎｍ〜７００ｎｍの可視光を発するものであることが好ましい。可視光を発光することによって、可視域の蛍光色素を励起することができ、よりエネルギーが低く、反応性、特に生体に対して激しく反応することなく、蛍光色素を発色させることができる。【００２０】
本発明におけるナノ粒子蛍光体は、その表面に結合している蛍光色素に互いに異なるエネルギーレベルでエネルギーを付与することができる粒子であることが好ましい。これにより、異なるエネルギーレベルで励起する蛍光色素を同時に励起することができる。
また、ナノ粒子蛍光体の発光の半値幅が５０〜２００ｎｍであることが好ましく、簡易な装置で高感度に発光を検出するためには、６０〜１８０ｎｍであることが好ましい。更に、蛍光標識材料としては発光ピーク波長と吸収ピーク波長が異なることが好ましく、高感度に発光を検出するためには、その発光ピーク波長が吸収端波長と２０ｎｍ以上離れていることがより好ましく、５０ｎｍ以上離れていることが特に好ましい。このような発光のピーク波長および半値幅を持つナノ粒子蛍光体は、金属酸化物又は金属硫化物のナノ粒子蛍光体であって、当業者であれば、上記のように、構成する金属等を適宜選択することによって容易に得ることができる。【００２１】
本発明の金属酸化物又は金属硫化物のナノ粒子蛍光体は、さらに、後述する表面修飾剤との被覆性に優れた金属酸化物のナノ粒子蛍光体が好ましい。【００２２】
［２］表面修飾剤
本発明におけるナノ粒子蛍光体は、金属酸化物又は金属硫化物のナノ粒子蛍光体である場合、下記一般式［Ｉ］で表わされる化合物又はその分解生成物を表面修飾剤で表面修飾されたものであることが特に好ましい。このことによりナノ粒子蛍光体の水や親水性溶媒への分散性が改良でき、体液などによるナノ粒子蛍光体の溶出や蛍光の消光を防止して、高感度なものにすることができる。また均一且つ半値幅の広い発光特性を有し、標的分子を検出するための分子プローブを結合するなどの機能性化しやすいという利点も有する。【００２３】
Ｍ−（Ｒ）4        ［Ｉ］
（式中、ＭはＳｉ又はＴｉ原子を、Ｒは有機性基を示す。Ｒはそれぞれ同一でも異なっていてもよいが、Ｒのうちの少なくとも１つは親和性分子と反応性を有する基を示す。）【００２４】
Ｒで表わされる有機性基中、親和性分子と反応性を有する基としては、連結基Ｌを介して、末端にビニル基、アリルオキシ基、アクリロイル基、メタクリロイル基、イソシアナト基、ホルミル基、エポキシ基、マレイミド基、メルカプト基、アミノ基、カルボキシル基、ハロゲンなどが結合したものである。これらの反応性を有する基の中で特に好ましくは末端にアミノ基を有するものである。【００２５】
連結基Ｌとしては、例えば、アルキレン基（例：メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ヘキサメチレン基、プロピレン基、エチルエチレン基、シクロヘキシレン基など炭素数が１〜１０、好ましくは１〜８の鎖状または環状のもの）が挙げられる。
また、連結基Ｌは不飽和結合を有していてもよい。不飽和基としては、アルケニレン基（例：ビニレン基、プロペニレン基、１−ブテニレン基、２−ブテニレン基、２−ペンテニレン基、８−ヘキサデセニレン基、１，３−ブタンジエニレン基、シクロヘキセニレン基など炭素数が１〜１０、好ましくは１〜８の鎖状または環状のもの）、アリーレン基（例：フェニレン基、ナフチレン基、など炭素数が６〜１０、好ましくは６のフェニレン基）が挙げられる。【００２６】
連結基Ｌは１個又は２個以上のヘテロ原子（窒素原子、酸素原子、硫黄原子などの炭素原子以外の任意の原子を意味する）を有していてもよい。へテロ原子は酸素原子又は硫黄原子が好ましく、酸素原子がもっとも好ましい。ヘテロ原子の数は特に規定されないが５個以下であることが好ましく、より好ましくは３個以下である。【００２７】
連結基Ｌは上記ヘテロ原子と隣接する炭素原子を含む官能基を部分構造として含んでいてもよい。該官能基としてはエステル基（カルボン酸エステル、炭酸エステル、スルホン酸エステル、スルフィン酸エステルを含む）、アミド基（カルボン酸アミド、ウレタン、スルホン酸アミド、スルフィン酸アミドを含む）、エーテル基、チオエーテル基、ジスルフィド基、アミノ基、イミド基などが挙げられる。上記の官能基はさらに置換基を有していても良く、これらの官能基はＬにそれぞれ複数個存在してもよい。複数個存在する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。
官能基として好ましくは、エステル基、アミド基、エーテル基、チオエーテル基、ジスルフィド基又はアミノ基であり、さらに好ましくはアルケニル基、エステル基、エーテル基である。【００２８】
Ｒで表わされるその他の有機性基としては、任意の基が挙げられるが、好ましくはメトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｔ−ブトキシ基、ｎ−ブトキシ基などのアルコキシ基及びフェノキシ基である。これらのアルコキシ基及びフェノキシ基はさらに置換基を有していてもよいが、合計の炭素数が８以下のものが望ましい。本発明に用いられる表面修飾剤は、アミノ基、カルボキシル基などが、酸又は塩基と塩を形成したものでもよい。【００２９】
本発明に用いられる表面修飾剤のうち一般式［Ｉ］で表されるものの分解生成物とは、アルコキシ基が加水分解した水酸化物、水酸基同士間の脱水縮合反応により生成した低分子量のオリゴマー（これはリニア構造、環状構造、架橋構造などいずれであってもよい）、水酸基と未加水分解のアルコキシ基による脱アルコール縮合反応生成物、これらがさらに脱水縮合反応して形成したゾル、及びゲルをいう。【００３０】
本発明に用いられる表面修飾剤の具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。
Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、アミノフェニルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、ビス（トリメトキシシリルプロピル）アミン、Ｎ−（３−アミノプロピル）−ベンズアミドトリメトキシシラン、３−ヒドラジドプロピルトリメトキシシラン、３−マレイミドプロピルトリメトキシシラン、（ｐ−カルボキシ）フェニルトリメトキシシラン、３−カルボキシプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルチタニウムトリプロポキシド、３−アミノプロピルメトキシエチルチタニウムジエトキシド、３−カルボキシプロピルチタニウムトリメトキシドなど。【００３１】
本発明に用いられる表面修飾剤は、末端のＮＨ2基又はＣＯＯＨ基が、酸又は塩基と塩を形成したものであってもよい。
本発明に使用可能な表面修飾剤は、ナノ粒子蛍光体の表面全体を被覆していても、その一部に結合していてもよい。また、本発明において表面修飾剤は、単独で用いても複数併用してもよい。【００３２】
本発明においては、上記表面修飾剤に加えて、公知の表面修飾剤（例えば、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン（１）ラウリルエーテルリン酸、ラウリルエーテルリン酸、トリオクチルホスフィン、トリオクチルホスフィンオキシド、ポリリン酸ナトリウム、ビス（２−エチルヘキシル）スルホこはく酸ナトリウムなど）を、ナノ粒子合成時、あるいは合成後に共存させてもよい。【００３３】
［３］ナノ粒子蛍光体の製造方法
本発明にかかる金属酸化物ナノ粒子蛍光体は、該金属のアルコキシド、アセチルアセトナートなどの有機金属化合物を加水分解するゾル−ゲル法、該金属の塩の水溶液にアルカリを加えて水酸化物として沈降させた後、脱水、アニールする水酸化物沈殿法、該金属の上記プレカーサーの溶液を用いて、超音波を照射する超音波分解法、高温高圧下で分解反応を行なうソルボサーマル法、高温下に噴霧するスプレーパイロリシスなどの液相合成法により得ることができる。また、有機金属化合物を用いる熱ＣＶＤ法やプラズマＣＶＤ法、該金属または該金属酸化物のターゲットを用いるスパッタ法やレーザーアブレーション法などの気相合成法によっても得ることができる。【００３４】
本発明にかかる金属硫化物ナノ粒子蛍光体は、該金属のジエチルジチオカルバメート化合物などの熱分解性金属化合物をトリアルキルホスフィンオキシド類、トリアルキルホスフィン類、ω−アミノアルカン類などの高沸点有機溶媒中で結晶成長させるホットソープ法、該金属の塩の溶液に硫化ナトリウムや硫化アンモニウムなどの硫化物溶液を添加して結晶成長させる共沈法、界面活性剤を含む上記原料水溶液をアルカン類、エーテル類、芳香族炭化水素などの非極性有機溶媒中に逆ミセルとして存在させ該逆ミセル中で結晶成長させる逆ミセル法などの液相合成法により得ることができる。また、前記金属酸化物ナノ粒子蛍光体の場合と同様の気相合成法によっても得ることができる。【００３５】
本発明に用いられる表面修飾剤は、ナノ粒子蛍光体の合成時に添加することもできるが、好ましくは合成後に添加し、その少なくとも一部を加水分解することにより該ナノ粒子蛍光体と結合して、ナノ粒子の表面の少なくとも一部を被覆（表面修飾）させる。なお、ナノ粒子蛍光体は遠心分離やろ過などの常法により洗浄、精製後、本発明に用いられる表面修飾剤を含有する溶媒（好ましくはメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、２−エトキシエタノールなどの親水性有機溶媒）に分散させて被覆してもよい。【００３６】
本発明に用いられる表面修飾剤の添加量は、蛍光体の粒子サイズ、粒子の濃度、表面修飾剤の種類（大きさ、構造）等により変動するが、金属酸化物又は金属硫化物に対し、好ましくは０．００１〜１０倍モル、さらに好ましくは０．０１〜２倍モルである。
本発明においては、公知の表面修飾剤を併用することができる。公知の表面修飾剤の添加量は特に制限はないが、一般式（Ｉ）で表される表面修飾剤に対して、好ましくは０．０１〜１００倍モル、さらに好ましくは０．０５〜１０倍モルである。【００３７】
表面修飾剤が結合したナノ粒子蛍光体の分散液において、ナノ粒子蛍光体の濃度は、蛍光強度によって異なるので特に限定されないが、０．０１ｍＭ〜１０００ｍＭが好ましく、より好ましくは０．１ｍＭ〜１００ｍＭである。分散媒としては、上記アルコール類の他、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＴＨＦなどの親水性有機溶媒や水が好ましい。【００３８】
なお、ナノ粒子蛍光体の表面が表面修飾剤で被覆されていることは、ＦＥ−ＴＥＭ等の高分解性ＴＥＭで観察した際に粒子間に一定の間隔が認められること、および化学分析により確認することができる。【００３９】
［４］蛍光色素
本発明における蛍光色素は、互いに異なる波長光で励起する２種以上の蛍光色素である。このように２種以上の蛍光色素とすることによって、蛍光色素の種類に応じた複数の標的物質を効率よく検出することができる。
特に、本発明における蛍光色素は、ナノ粒子蛍光体からの可視域の光で励起して可視域で蛍光発光することができるものであることが好ましく、４００ｎｍから８００ｎｍの間に蛍光スペクトル極大を有するものであることがより好ましい。このような蛍光色素としては、シアニン系色素（例えば、ＣｙＤｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、フルオレッセイン系色素、ローダミン系色素、インビトロジェン社のAlexa色素シリーズ、BODIPY色素シリーズ、TexasRed色素シリーズ、ＷＯ０１／０２１６２４号の化合物例Ｉ−１からＩ−７４に記載されたアザシアニン系色素などを挙げることができる。【００４０】
このような蛍光色素は、後述するようにナノ粒子蛍光体及び標的物質に対して結合可能に処理される（蛍光色素と標的物質との結合は、場合によって、標的物質の標識化と言う）。標的物質の標識化は、後述する蛍光色素とナノ粒子蛍光体との結合と同様であり、標的物質の種類及び蛍光色素の種類に応じて異なるが、当業者であれば、容易に選択することができる。
蛍光色素を複数種同時に使用する場合には、同時に蛍光を測定して標的物質を容易に検出する観点から、蛍光発光の波長が異なることが好ましい。蛍光発光のピークが、２０〜２５０ｎｍ離れていることがより好ましく、４０〜１５０ｎｍ離れていることが特に好ましい。
また使用する蛍光色素は、エネルギー移動の順位から互いに測定可能であることが好ましい。このような組み合わせとしては例えばＡｌｅｘａ４８８、５４６、５９４、６４７が挙げられる。これらに限らず、最も短波な蛍光色素の蛍光スペクトル極大から１５ｎｍ以上長波側に吸収を有する第二の蛍光色素を選択することにより同様な測定が可能である。第三、第四の色素を用いる場合も同様にして色素を選択することができる。【００４１】
［５］結合部
本発明におけるナノ粒子蛍光体及び蛍光色素、また蛍光色素及び標的物質は互いに結合可能になっており、ナノ粒子蛍光体及び蛍光色素、また蛍光色素及び標的物質は、互いに結合可能な結合部をそれぞれ備えていることが好ましい。【００４２】
このような結合部は、ナノ粒子蛍光体及び／又は蛍光色素の表面の一部として存在してもよく、或いは、ナノ粒子蛍光体及び／又は蛍光色素の表面に直接的又は間接的に設けられたものであってもよい。このような結合部を設ける方法は、当業者に利用可能な手段を適宜選択して利用することが可能である。例えば、標的物質やナノ粒子蛍光体中のアミノ基、水酸基などの官能基と蛍光色素中のカルボキシル基、活性エステル基等の反応性置換基をイオン結合的又は共有結合的に直接結合させるか、あるいは標的物質の一部にリンカーを導入するなどの化学修飾を行った後に蛍光色素を反応させればよい。反応後の標識物質は、クロマトグラフィー、電気泳動、再結晶などの汎用の分離技術により精製することができる。
本発明においてナノ粒子蛍光体と蛍光色素との結合は、上述した表面修飾剤の表面を介したものであることが、ナノ粒子の分散性を確保することと蛍光色素を結合することとの双方を同時に実現することができるため、好ましい。例えばその表面修飾剤の末端基であるアミノ基やカルボキシル基などを反応基としてアミド化反応等によってさらに結合された分子を挙げることができる。【００４３】
結合部としては、ナノ粒子蛍光体及び／又は蛍光色素の表面に直接的又は間接的に結合する一対の機能性分子を挙げることができ、互いに相補的な核酸（単量体やオリゴヌクレオチド等）、抗原及び抗体（モノクローナルやポリクローナル）、その他のタンパク質（アミノ酸）や多糖類などの親和性分子、例えば、酵素及び基質、アジビン−ビオチンなどを挙げることができる。【００４４】
アミド化反応を利用した機能性分子の結合は、カルボキシル基あるいはその誘導基（エステル、酸無水物、酸ハロゲン化物など）とアミノ基の縮合により行なわれる。酸無水物や酸ハロゲン化物を用いる場合には塩基を共存させることが望ましい。カルボン酸のメチルエステルやエチルエステルなどのエステルを用いる場合には、生成するアルコールを除去するために加熱や減圧を行なうことが望ましい。カルボキシル基を直接アミド化する場合には、ＤＣＣ、Ｍｏｒｐｈｏ−ＣＤＩ、ＷＳＣなどのアミド化試薬、ＨＢＴなどの縮合添加剤、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ｐ−ニトロフェニルトリフルオロアセテート、２，４，５−トリクロロフェノールなどの活性エステル剤などのアミド化反応を促進する物質を共存させたり、予め反応させておいてもよい。また、アミド化反応時、アミド化により結合させる親和性分子のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを常法に従って適当な保護基で保護し、反応後脱保護することが望ましい。【００４５】
本発明の蛍光体組成物では、上記ナノ粒子蛍光体と蛍光色素とを分散させるための分散媒を含むことができる。このような分散媒には、水、親水性溶媒、好ましくはメタノール、エタノール、イソプロパノール、２−エトキシエタノールなどを挙げることができる。この組成物中のナノ粒子蛍光体の濃度は、蛍光強度によって異なるので特に限定されないが、１０-1Ｍ〜１０-15Ｍが好ましく、より好ましくは１０-2Ｍ〜１０-10Ｍである。また組成物中の蛍光色素の濃度は、蛍光色素の種類及び蛍光強度などによって異なるので特に限定されないが、一般に１０-1〜１０-15Ｍが好ましく、より好ましくは１０-2〜１０-12Ｍである。このような蛍光体組成物は、ナノ粒子蛍光体と蛍光色素とを使用時に組み合わせて使用してもよい。【００４６】
本発明の蛍光検出方法は、上記ナノ粒子蛍光体と上記蛍光色素とを用いて、１の試料中に含まれる２種以上の標的物質を検出する方法であり、２種以上の蛍光色素とナノ粒子蛍光体と標的物質とが結合した複合体を形成させる工程と、ナノ粒子蛍光体を励起する励起光を照射して、該ナノ粒子蛍光体を発光させる工程と、前記ナノ粒子蛍光体からの光で該ナノ粒子蛍光体に結合した前記２種以上の蛍光色素を励起して蛍光発光させる工程と、蛍光色素からの蛍光発光を検出する工程と、を含む。
ここで蛍光色素は該標的物質に対応して結合するものであるので、標的物質の種類の数に応じた２種以上の蛍光色素が用いられる。このため、複数の標的物質を、ナノ粒子蛍光体を励起させるひとつの励起光を照射することによって、同時に検出することができる。【００４７】
ここで蛍光色素からの蛍光発光を測定する際に、標的物質と蛍光色素とナノ粒子蛍光体とが互いに結合して複合体が形成されていれば、前記標識化工程と前記結合工程とは、いずれを先に行ってもよい。従って、標的物質と蛍光色素とを結合した後でナノ粒子蛍光体を結合させてもよく（すなわち標的物質を標識化した後に複合体を形成させる）、また蛍光色素とナノ粒子蛍光体とを結合した後で標的物質と組み合わせてもよい（すなわち、ナノ粒子蛍光体と蛍光色素とを結合した後で標識化する）。またナノ粒子蛍光体の発光は、通常、複合体形成工程の後で行われるが、複合体形成工程の前に行ってもよい。いずれの順序で行うかについては、標的物質の種類や測定条件等に応じて、当業者に容易に選択できる事項である。【００４８】
また標識化試料における標的物質は、液体中に分散された状態のものであってもよく、固相に結合されたものであってもよい。ここで検出対象となる標的物質は、如何なるものであってもよいが、ナノ粒子が生体関連物質よりもサイズが小さく、生体関連物質の作用に影響しないことを考慮すれば、生体関連物質あるいは生体関連物質と相互作用可能な化合物であることが好ましい。【００４９】
このような生体関連物質としては、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、薬物、その他のタンパク質、核酸、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡなどを挙げることができる。また、標的物質を固定するための固相としては、アガロースなどのゲル支持体、ニトロセルロース、ナイロンなどのメンブレン、ガラスなどを挙げることができる。これらへの標的物質の固定は、当業者には周知であり、容易に行うことができる。【００５０】
複合体形成工程において、標識化試料中の蛍光色素とナノ粒子蛍光体とが結合するので、ナノ粒子蛍光体の発光工程により発光したナノ粒子蛍光体から蛍光色素へエネルギーが移動して、蛍光色素が励起する。
ここで、ナノ粒子蛍光体の励起は、可視域のシグナル蛍光を検出する観点から紫外光で行われることが好ましい。このときナノ粒子蛍光体は１種類であるので、照射される紫外光もこのナノ粒子蛍光体を励起する波長の光であればよい。励起光の条件は、上述した通りである。
またナノ粒子蛍光体が発光することによって励起される蛍光色素は、励起光とシグナル蛍光との分離、安価光源の利用、簡便な検出系構築の観点から可視光の蛍光を発光することが好ましい。蛍光色素の発光の条件等は上述した通りである。【００５１】
本発明による検出方法では、蛍光物質を標的物質として使用した蛍光画像検出（fluorescence）システムをそのまま適用することができる。
このシステムでは、電気泳動させるべき複数のＤＮＡ断片を含む溶液中に、対応する２種以上の蛍光色素を加えた後に、複数のＤＮＡ断片をゲル支持体上で電気泳動させ、あるいは、蛍光色素を含有させたゲル支持体上で、複数のＤＮＡ断片を電気泳動させ、あるいは、複数のＤＮＡ断片を、ゲル支持体上で、電気泳動させた後に、ゲル支持体を蛍光色素を含んだ溶液に浸すなどして、電気泳動されたＤＮＡ断片を標識化する。【００５２】
あるいは、複数のＤＮＡ断片を、ゲル支持体上で、電気泳動させた後に、ＤＮＡを変性（denaturation) し、次いで、サザン・ブロッティング法により、ニトロセルロースなどの転写支持体上に、変性ＤＮＡ断片の少なくとも一部を転写し、目的とする２種以上のＤＮＡと相補的なＤＮＡもしくはＲＮＡをそれぞれ２種以上の蛍光色素で標識化して調製したプローブと変性ＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせ、プローブＤＮＡもしくはプローブＲＮＡと相補的なＤＮＡ断片のみを選択的に標識化する。【００５３】
さらに、複数種の標識物質により標識化した目的とする遺伝子を含むＤＮＡと相補的なＤＮＡプローブを調製して、転写支持体上のＤＮＡとハイブリダイズさせ、酵素を、標識物質により標識化された相補的なＤＮＡと結合させた後、対応する複数種の蛍光基質と接触させて、蛍光基質を、異なる波長で発光する蛍光色素にそれぞれ変化させる。【００５４】
上述したそれぞれの場合では、２種以上の標的物質がそれぞれ２種以上の蛍光色素によって標識化されているので、ナノ粒子蛍光体と組み合わせて複合体を形成した後でナノ粒子蛍光体を励起することにより、複数の標的物質を簡便に蛍光検出することができる。蛍光検出は、通常、蛍光色素等の蛍光に基づいて物質を検出する既存の方法をそのまま適用することができる。蛍光を検出することによって画像を生成し、ゲル支持体上又は転写支持体上のＤＮＡの分布を検出することもでき、この蛍光画像検出システムは、放射性物質を使用することなく、簡易に、遺伝子配列などを検出することができるという利点がある。【００５５】
さらに、本発明の蛍光検出方法は、マイクロアレイ画像検出システムにそのまま適用することができる。このシステムでは、スライドガラス板やメンブレンフィルタなどの担体表面上の異なる位置に、生体由来の物質と特異的に結合可能で、かつ、塩基配列や塩基の長さ、組成などが既知の特異的結合物質（ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）を、スポッター装置を用いて、滴下して、多数の独立したスポットを形成し、次いで、抽出、単離などによって、生体から採取され、あるいは、さらに、化学的処理、化学修飾などの処理が施された生体由来の物質（ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなど）であって、２種以上の蛍光色素により標識化された物質をハイブリダイズさせたマイクロアレイに、ナノ粒子蛍光体を組み合わせた後、ナノ粒子蛍光体に対する励起光を照射して、蛍光色素発せられた蛍光を光電的に検出して、生体由来の物質を解析する。マイクロアレイ画像検出システムによれば、スライドガラス板などの担体表面上の異なる位置に、数多くの特異的結合物質のスポットを高密度に形成して、標識物質によって標識化された生体由来の物質をハイブリダイズさせることによって、短時間に、生体由来の物質を解析することが可能になるという利点がある。【００５６】
更に、溶液系で分子間相互作用を解析する際にも本検出方法を利用することができる。例えば、生体分子間の相互作用あるいは特異的結合を、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を用いて解析することができる。複数分子の近接、結合、解離などの状態を蛍光により測定することで、経時的に複数分子間の相互作用を観測することができる。【００５７】
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００５８】
［表面修飾された金属酸化物ナノ粒子蛍光体の合成］
酢酸亜鉛２水和物８．８ｇを脱水エタノール４００ｍｌに溶解し、９３℃で２時間還流しながら２４０ｍｌを留去した。脱水エタノール２４０ｍｌを加えて室温まで冷却した。水酸化テトラメチルアンモニウムの２５質量％メタノール溶液１８ｍｌを添加し３０分攪拌した。３−アミノプロピルトリメトキシシラン７．２ｍｌおよび水２．２ｍｌを添加して６０℃で４時間攪拌した。生成した白色沈殿を濾別し、エタノールで洗浄後乾燥した。
沈殿物はＸＲＤおよびＴＥＭの解析から平均粒子径約４ｎｍのＺｎＯナノ粒子であることがわかった。また、ＺｎＯ粒子の表面にＳｉおよびアミノプロピル基が結合していることを元素分析、ＩＲ分光吸収測定法により確認した。沈殿物に水を添加して２質量％水分散液を調製した。この分散液に３７０ｎｍの光を照射したときの蛍光スペクトルを図１に示す。ピーク波長５４０ｎｍ、半値幅１４５ｎｍのブロードで強い蛍光を示すことがわかった。
【実施例２】
【００５９】
［酸化亜鉛ナノ粒子（ＺｎＯ）のビオチン化反応］
実施例１で作製した表面アミノ化ＺｎＯの１．４％溶液１．２５ｍｌと、０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）１．２５ｍｌとを合せ、室温で攪拌しながら、ビオチン化試薬（同仁化学Ｂｉｏｔｉｎ−（ＡＣ５）２Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ）３０μｇを添加し、２時間反応させる。反応終了後、反応液をゲルクロマトグラフィー（アマシャムバイオサイエンスＰＤ−１０カラム）で精製し、３．５ｍｌのビオチン化ＺｎＯ溶液を得た。
【実施例３】
【００６０】
［蛍光測定］
用いた蛍光色素は、以下の通りである。
ストレプトアビジン結合Texas Red［インビトロジェン社製］
励起波長  ５９７ｎｍ，  蛍光波長  ６１６ｎｍ
ストレプトアビジン結合Alexa633 ［インビトロジェン社製］
励起波長  ６３７ｎｍ，  蛍光波長  ６５１ｎｍ
ストレプトアビジン結合Alexa647 ［インビトロジェン社製］
励起波長  ６５２ｎｍ，蛍光波長６７１ｎｍ
各色素とも１ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解したストックを使用。
蛍光測定は、日本分光FP-750分光蛍光光度計を使用し、励起波長３５０ｎｍで、４００−７００ｎｍの蛍光スペクトルを測定した。
【実施例４】
【００６１】
［多色系蛍光測定］
実施例３の各蛍光色素の混合液にビオチン化ＺｎＯを加え、蛍光スペクトルの変化を測定した。蛍光色素は、３種全てを混合した場合、及び２種ずつ混合の組合せの３通りの測定を行った。手順は以下の通りである。
０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）          ２．２５ｍｌ
ストレプトアビジン結合色素の各溶液                各５μｌ
上記の溶液に、ビオチン化ＺｎＯを０．２５ｍｌ加え、直ちに測定を行った。結果を図２に示す。【００６２】
３種混合の場合、ＺｎＯ固有の蛍光（５４０ｎｍ）以外は、Alexa647由来の蛍光のみが観測される。また、Alexa633と647の組合せではAlexa647の蛍光が、Texas RedとAlexa633の組合せではAlexa633の蛍光のみが観測される。一方、Texas RedとAlexa647の組合せでは両方の蛍光が観察できる。上記の観察から、下記表１で示されるようなエネルギー移動系を推定することができる。【００６３】
【表１】
2005123874.tif 000002
【００６４】
表１に示されるように、ＺｎＯの広い蛍光波長域に励起波長を有する蛍光色素をアビジン−ビオチン等の結合部を通じてＺｎＯナノ粒子近接させた場合、容易にエネルギー移動を受けて蛍光を発する。また、蛍光色素の励起と蛍光の波長域が重なる色素を組み合わせた場合には、色素間のエネルギー移動も可能であることがわかった。
従って、ＺｎＯナノ粒子と２種以上の蛍光色素を組み合わせることにより、単一の紫外励起光を用いて可視域の任意の蛍光を得るシステムを構築することができる。
このシステムを用いれば、複数の標的物質を簡便に効率よく同時に検出することができる。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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