(57)【要約】  細胞内で発現可能なレポーター遺伝子と、前記レポーター遺伝子の３’非翻訳領域内の位置で該遺伝子と連結され、かつその転写産物が前記細胞内でスプライシングされるＤＮＡ断片とを含む発現ベクターを提供する。さらに前記発現ベクターを含む形質転換細胞と候補化合物とをインキュベートすることにより、前記レポーター遺伝子の発現を指標としてナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊（ＮＭＤ）のみを標的とした薬剤をスクリーニングする。当該方法により見出されたＮＭＤ阻害剤は、ＮＭＤによって引き起こされる障害を抑制し、又は重篤化する症状を緩和することができると考えられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内で発現可能なレポーター遺伝子と、
前記レポーター遺伝子の３’非翻訳領域内の位置で該遺伝子と連結され、かつその転写産物が前記細胞内でスプライシングされるＤＮＡ断片と、
を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項２】
前記ＤＮＡ断片が、真核生物ゲノム由来の少なくとも１つのイントロン及び少なくとも２つのエクソンを含む請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記真核生物が、線虫、哺乳動物、植物、酵母及び昆虫からなる群より選択されるいずれかである請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
前記ＤＮＡ断片が、ヒトβ−グロビン遺伝子のエクソン２からポリＡシグナル部位までの配列からなるＤＮＡ、又は前記ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつスプライシング機能を有するＤＮＡからなる請求項１〜３のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項５】
前記ＤＮＡ断片中のエクソン−イントロン接合部位が、前記レポーター遺伝子の終止コドンから５０ヌクレオチド以上離れた位置に存在する請求項１〜４のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項６】
前記ＤＮＡ断片の細胞内における転写、及びスプライシング産物が、前記レポーター遺伝子の翻訳終止コドンから５０ヌクレオチド以上離れた下流領域にエクソン−エクソン接合部位を有する請求項５に記載の発現ベクター。
【請求項７】
前記ＤＮＡ断片中のエクソン−イントロン接合部位が、前記レポーター遺伝子の終止コドンから５０ヌクレオチド以内に存在する請求項１〜４のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項８】
前記ＤＮＡ断片の細胞内における転写、及びスプライシング産物が、前記レポーター遺伝子の翻訳終止コドンから５０ヌクレオチド以内の下流領域にエクソン−エクソン接合部位を有する請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項９】
前記レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子である請求項１〜８のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
請求項５又は６に記載の発現ベクターを含む形質転換細胞。
【請求項１１】
請求項７又は８に記載の発現ベクターを含む形質転換細胞。
【請求項１２】
請求項１０に記載の形質転換細胞と候補化合物とを接触させる工程、及び前記細胞内におけるレポーター遺伝子の発現量を測定する工程、を含むことを特徴とするナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊（ＮＭＤ）の阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項１３】
候補化合物の存在又は非存在下において請求項１０に記載の形質転換細胞をインキュベートする工程と、
前記各条件における細胞内のレポーター遺伝子の発現量を測定する工程と、を含み、
前記候補化合物の非存在下に比べて、存在下におけるレポーター遺伝子の発現量が増加する場合に前記候補化合物がナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊（ＮＭＤ）の阻害剤であることを示すＮＭＤ阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項１４】
前記レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子である請求項１２又は１３に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＭＤ阻害剤のスクリーニング方法並びにそのために用いる組換えベクター及び形質転換細胞等に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核生物には、異常なｍＲＮＡを積極的に分解し、ｍＲＮＡの品質管理を行う現象が存在する。この現象は、ナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊（ＮＭＤ；Nonsense-mediated mRNA decay）やｍＲＮＡサーベイランス(mRNA surveillance)と呼ばれている。ＮＭＤによって分解されるｍＲＮＡは、ＰＴＣ(premature termination codon)とも呼ばれる異常な位置の終止コドンを有するが、このようなｍＲＮＡ（以下、「ＰＴＣ−ｍＲＮＡ」と呼ぶ。）は、以下のような状況で生じると考えられる。第一に、ゲノムに変異が存在する場合、第二に、異常なスプライシングがおきた場合、第三に、ＲＮＡポリメラーゼによる転写のミスが起きた場合、及び第四としてリボソームによる翻訳中にコドンフレームの読み取りミスをした場合などである。【０００３】
ＰＴＣ−ｍＲＮＡは、Ｃ−末端領域を欠いたり、異なった配列を有したりした異常タンパク質をコードしており、もしも実際にタンパク質が発現した場合、細胞に対し毒性を持つ可能性がある。したがって、ＮＭＤの一つの役割は、ＰＴＣ−ｍＲＮＡを積極的に分解することにより、異常タンパク質断片の蓄積を防ぎ、疾患症状の重篤化を防ぐことにあると考えられる。実際、重篤な貧血症状を示す遺伝性疾患β−サラセミアでは、原因遺伝子であるβ−グロビン遺伝子にナンセンス変異を持つ家系での発症がＮＭＤにより緩和されていることが詳細な家系調査から明らかとなっている。【０００４】
一方で、ＮＭＤは疾患症状の重篤化を引き起こしていることも最近になって分かってきた（例えば、非特許文献１参照）。先天性筋ジストロフィーの一つであるUllrich's diseaseの疾患患者では、コラーゲンＩＶα２遺伝子に異常終止コドンが存在する。その結果、ＮＭＤによりコラーゲンＩＶα２の発現抑制が起き、それに伴って、コラーゲンＩＶα１、３の発現が抑制された結果、細胞外マトリクス（ＥＣＭ；extracellular matrix）の形成に異常が生じる。この患者由来の細胞に、ＮＭＤ阻害剤を処理するとトランケート型のコラーゲンＩＶα２が発現し、さらには、コラーゲンＩＶα１、３、ＥＣＭの形成が回復する。この結果は、ＮＭＤが機能を保持した異常タンパク質の発現を抑制してしまい、その結果疾患症状の重篤化を引き起こしている場合のあることを明確に示している。さらにこのような場合には、ＮＭＤを抑制することにより、機能を保持したタンパク質の発現を促し、疾患症状の緩和及び改善を図ることができる可能性を示唆している。【０００５】
これまで、ナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊の抑制剤や促進剤をスクリーニングする方法が報告されているが（例えば、特許文献１及び２参照）、これらは、ＮＭＤに関与する１つのタンパク質、ヒトＵＰＦ１をリン酸化するプロテインキナーゼ、ヒトＳＭＧ−１（ｈＳＭＧ−１）やこれと結合するＳＭＧＢＰ１などのタンパク質をターゲットとしたものである。哺乳類細胞におけるＮＭＤには、ＵＰＦ１，ＵＰＦ２、ＵＰＦ３及びＵＰＦ３Ｘなどのような種々のタンパク質に加え、ｍＲＮＡとタンパク質との複合体である、エクソン−エクソン複合体（ＥＪＣ）のような他の多くのタンパク質、核酸等が関与していることも知られている。したがって、ＮＭＤという細胞内の現象を包括的に、かつ的確にとらえ、これを調節するような化合物を迅速にスクリーニングするシステムの構築が求められている。【０００６】
【特許文献１】特開２００３−３８１８９
【特許文献２】特開２００４−９７０２９
【非特許文献１】Usuki, F, et al., Annals of Neurology 2004, Vol. 55, No. 5, pp.740-744
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記背景技術を踏まえると、ＮＭＤを特異的に抑制する阻害剤は、ＮＭＤによって引き起こされる障害を抑制し、又は重篤化する症状を緩和することができると考えられるが、現在のところＮＭＤのみを標的とした薬剤、また、それらをスクリーニングする方法は存在しない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題に鑑みて、本発明者らは、ＮＭＤ、特にナンセンス変異が生じた位置とｍＲＮＡの不安定性について詳細に研究されているグロビン遺伝子のＤＮＡ断片を用い、ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として、細胞内におけるＮＭＤによって前記レポーター遺伝子の発現が抑制されるような発現ベクター及び形質転換細胞等の発現系を構築した。この発現系は、多くの候補化合物を用いたＮＭＤ阻害剤のハイスループットなスクリーニングに適しており、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は、以下の具体的な発明を提供するものである。
（１）細胞内で発現可能なレポーター遺伝子と、前記レポーター遺伝子の３’非翻訳領域内の位置で該遺伝子と連結され、かつその転写産物が前記細胞内でスプライシングされるＤＮＡ断片と、を含むことを特徴とする発現ベクター。
（２）前記ＤＮＡ断片が、真核生物ゲノム由来の少なくとも１つのイントロン及び少なくとも２つのエクソンを含む（１）に記載の発現ベクター。
（３）前記真核生物が、線虫、哺乳動物、植物、酵母及び昆虫からなる群より選択されるいずれかである（２）に記載の発現ベクター。
（４）前記ＤＮＡ断片が、ヒトβ−グロビン遺伝子のエクソン２からポリＡシグナル部位までの配列からなるＤＮＡ、又は前記ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつスプライシング機能を有するＤＮＡからなる（１）〜（３）のいずれかに記載の発現ベクター。
（５）前記ＤＮＡ断片中のエクソン−イントロン接合部位が、前記レポーター遺伝子の終止コドンから５０ヌクレオチド以上離れた位置に存在する（１）〜（４）のいずれかに記載の発現ベクター。
（６）前記ＤＮＡ断片の細胞内における転写、及びスプライシング産物が、前記レポーター遺伝子の翻訳終止コドンから５０ヌクレオチド以上離れた下流領域にエクソン−エクソン接合部位を有する（５）に記載の発現ベクター。
（７）前記ＤＮＡ断片中のエクソン−イントロン接合部位が、前記レポーター遺伝子の終止コドンから５０ヌクレオチド以内に存在する（１）〜（４）のいずれかに記載の発現ベクター。
（８）前記ＤＮＡ断片の細胞内における転写、及びスプライシング産物が、前記レポーター遺伝子の翻訳終止コドンから５０ヌクレオチド以内の下流領域にエクソン−エクソン接合部位を有する（７）に記載の発現ベクター。
（９）前記レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子である（１）〜（８）のいずれかに記載の発現ベクター。
（１０）（５）又は（６）に記載の発現ベクターを含む形質転換細胞。
（１１）（７）又は（８）に記載の発現ベクターを含む形質転換細胞。
（１２）（１０）に記載の形質転換細胞と候補化合物とを接触させる工程、及び前記細胞内におけるレポーター遺伝子の発現量を測定する工程、を含むことを特徴とするナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊（ＮＭＤ）の阻害剤のスクリーニング方法。
（１３）候補化合物の存在又は非存在下において（１０）に記載の形質転換細胞をインキュベートする工程と、前記各条件における細胞内のレポーター遺伝子の発現量を測定する工程と、を含み、前記候補化合物の非存在下に比べて、存在下におけるレポーター遺伝子の発現量が増加する場合に前記候補化合物がナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊（ＮＭＤ）の阻害剤であることを示すＮＭＤ阻害剤のスクリーニング方法。
（１４）前記レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子である請求項１２又は１３に記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の発現ベクター、及びこれを用いるＮＭＤ阻害剤のスクリーニング方法によれば、ｍＲＮＡサーベイランス現象をレポーター遺伝子の発現によって捉えることができ、簡便かつ効率的なＮＭＤ阻害剤のスクリーニングを行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の発現ベクターを構築するための中間産物を示す。
【図２】本発明の発現ベクターの１つの実施形態を示す。
【図３】本発明の種々の発現ベクターを用いて形質転換されたＨｅｌａ細胞におけるレポーター遺伝子の発現量を示す。
【図４】本発明の種々の発現ベクターを用いて形質転換されたＨｅｌａ細胞において、ＲＮＡ干渉により特定の遺伝子の発現を抑制した場合のレポーター遺伝子の発現量を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の実施において、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡ技術等の一般的方法及び従来技術について、実施者は、特に示されなければ、当該分野の標準的な参考書籍を参照し得る。これらには、例えば、Molecular Cloning：A Laboratory Manual 第3版（Sambrook & Russell、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2001）；Current Protocols in Molecular biology（Ausubelら編、John Wiley & Sons、1987）；Methods in Enzymologyシリーズ（Academic Press）；PCR Protocols: Methods in Molecular Biology（Bartlett & Striling編、Humana Press、2003）；Animal Cell Culture: A Practical Approach 第３版（Masters編、Oxford University Press、2000）を参照のこと。また、本明細書において参照される細胞培養、細胞生物学実験のための試薬及びキット類はSigma社やAldrich社、Invitrogen/GIBCO社、プロメガ社、タカラバイオ株式会社等の市販業者から入手可能である。【００１３】
[本発明の組換えベクター]
１つの実施形態において、本発明の発現ベクターは、細胞内で発現可能なレポーター遺伝子と、前記レポーター遺伝子の３’非翻訳領域内の位置で該遺伝子と連結され、かつその転写産物が前記細胞内でスプライシングされるＤＮＡ断片と、を含む。本明細書において、「スプライシング」とは、真核生物の核内における遺伝子の直接の転写産物（ｈｎＲＮＡ）からイントロンを切り出し、残ったエクソンをつなぎ合わせて成熟したｍＲＮＡがつくられる過程をいう。現在のところ、スプライシング機構は核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）が複数の核内タンパク質とスプライセオソーム(spliceosome)という複合体を形成し、イントロンの切り出しとエクソン間の結合を行っていると考えられている。このスプライシングを経験したｍＲＮＡにはエクソン接合複合体（ＥＪＣ：exon junction complex)というスプライシングの目印となるタンパク質複合体が結合している。このＥＪＣよりも５’側に存在する翻訳終止コドンはリボソームに翻訳依存的にその位置関係が把握され、ＮＭＤの対象となる異常な翻訳終止コドンか否かが認識される。【００１４】
したがって、好ましい実施形態において、前記ＤＮＡ断片は、真核生物ゲノム由来の少なくとも１つのイントロン及び少なくとも２つのエクソンを含む。このような真核生物のイントロン、エクソンとしては、特に限定されるものではないが、例えば、線虫、哺乳動物、植物、酵母及び昆虫などのゲノム由来のイントロン、エクソンを用いることができる。これらの中のいくつかはすでに全ゲノム配列が解読されて多くの遺伝子の構造が明らかとなっている。特に好ましくは哺乳動物由来のイントロン、エキソンであり、例えば、ヒトβ−グロビン遺伝子、ｐ５３遺伝子、及びコラーゲンＶＩα２遺伝子などのイントロン、エクソンが挙げられる。【００１５】
本発明の好ましい実施形態において、ヒトβ−グロビン遺伝子のエクソン２からポリＡシグナル部位までの配列からなるＤＮＡ、又は前記ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつスプライシング機能を有するＤＮＡからなるＤＮＡが、レポーター遺伝子の３’非翻訳領域内に挿入された組換えベクターが提供される。「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは当業者において周知のハイブリダイゼーションの実験条件である。具体的には、「ストリンジェントな条件」とは約４５℃にて６．０×ＳＳＣ（クエン酸ナトリウムと塩化ナトリウムとの塩溶液）でハイブリダイゼーションを行った後に、５０℃で２．０×ＳＳＣで洗浄することを指す。ストリンジェンシーの選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジェンシーとしての約２．０×ＳＳＣ、５０℃から、高ストリンジェンシーとしての約０．２×ＳＳＣ、５０℃まで選択すること、ができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェエンシー条件の室温、約２２℃から、高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで増大させることができる。なお、当業者であれば、ＳＳＣの希釈率、ホルムアミド濃度、温度などの諸条件を適宜選択することで、上記の条件と同様のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を実現することができる。【００１６】
β−グロビン遺伝子を用いたＮＭＤに関する詳細な解析の結果、上記スプライシングの目印であるＥＪＣよりも５’側に５０ヌクレオチド以上離れてナンセンスコドン（翻訳終止コドン）が存在する場合はＮＭＤが起きるが、ＥＪＣよりも５’側の５０ヌクレオチド以内にナンセンスコドンが存在する場合にはＮＭＤが起きないことが知られている。したがって、細胞内で転写、及びスプライシングされて生じたｍＲＮＡが、前記レポーター遺伝子の翻訳終止コドンから５０ヌクレオチド以上離れた下流領域にエクソン−エクソン接合部位を有する場合に、ＮＭＤにより分解され、その結果レポーター遺伝子の発現が抑制される。一方、細胞内で転写、及びスプライシングされて生じたｍＲＮＡが、前記レポーター遺伝子の翻訳終止コドンから５０ヌクレオチド以内にエクソン−エクソン接合部位を有する場合にはＮＭＤが起こらず、その結果レポーター遺伝子の発現は抑制されない。【００１７】
したがって、１つの実施形態において、細胞内で発現可能なレポーター遺伝子と、前記レポーター遺伝子の３’非翻訳領域内の位置で該遺伝子と連結され、かつその転写産物が前記細胞内でスプライシングされるＤＮＡ断片とを含む発現ベクターであって、前記ＤＮＡ断片中のエクソン−イントロン接合部位が、前記レポーター遺伝子の終止コドンから５０ヌクレオチド以上離れた位置に存在する発現ベクターが提供される。この発現ベクターを細胞内で発現させた場合に、細胞内で転写、及びスプライシングされて生じたｍＲＮＡが、前記レポーター遺伝子の翻訳終止コドンから５０ヌクレオチド以上離れた下流領域にエクソン−エクソン接合部位を有し、ＮＭＤのターゲットとなって急速に分解され、その結果、レポーター遺伝子はほとんど発現されない。【００１８】
他の１つの実施形態において、細胞内で発現可能なレポーター遺伝子と、前記レポーター遺伝子の３’非翻訳領域内の位置で該遺伝子と連結され、かつその転写産物が前記細胞内でスプライシングされるＤＮＡ断片とを含むことを特徴とする発現ベクターであって、前記ＤＮＡ断片中のエクソン−イントロン接合部位が、前記レポーター遺伝子の終止コドンから５０ヌクレオチド以内に存在する発現ベクターが提供される。本実施形態の発現ベクターを細胞内で発現させた場合は、前記ＤＮＡ断片の細胞内における転写、及びスプライシング産物が、前記レポーター遺伝子の翻訳終止コドンから５０ヌクレオチド以内の下流領域にエクソン−エクソン接合部位を有することからＮＭＤのターゲットにはならず、レポーター遺伝子の発現は抑制されない。本形態の発現ベクターは、ＮＭＤ阻害剤のスクリーニングにおいて、作用点がＮＭＤではない薬剤を排除するために、コントロール実験用に用いることができる。【００１９】
本発明において用いられるレポーター遺伝子は、細胞内で発現し検出が容易なものであれば特に限定されるものではないが、例えば、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びエクオリン等を挙げることができる。大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子(lac Z)は種々の細胞の形質転換におけるレポーター遺伝子としてよく使用されている。この酵素の生体内での基質はラクトースであるが、ほぼあらゆるβガラクトシドを加水分解することができ、例えば無色の基質であるＯＮＰＧを加水分解して４２０ｎｍの光を吸収する黄色のo-nitrophenolを生成する。また、ｘ−ｇａｌはこの酵素により分解されてインディゴブルーの呈色反応を示す。【００２０】
アルカリフォスファターゼは、分子触媒活性の極めて高い酵素であり、種々の蛍光及び発光基質も開発されているため高感度測定に好適である。ホタルルシフェラーゼはＡＴＰの存在下でルシフェリンの酸化を触媒し、光子を生成する化学ルミネッセンス反応を触媒する。ルシフェラーゼは単量体のタンパク質で翻訳後の修飾を必要としないから、遺伝子発現のレポーター遺伝子として適している。遺伝子発現の速度変化を迅速に検出し、感度を向上させるためにルシフェラーゼタンパク質の安定性を低下させたり、また、測定再現性を上げるために内部標準酵素とのデュアルレポーターシステム等が開発されている。ＧＦＰはオワンクラゲ（Aequorea victoria）等から発見された蛍光タンパク質であり、共存する発光タンパク質であるエクオリンの青色化学発光をエネルギー変換して緑色にすることが知られている(Prasher, D., et al., Gene 11, 229-233, 1992)。このＧＦＰは上記エクオリンやルシフェラーゼのように特殊な蛍光団を必要とせず、自らのアポタンパク質上で自動的に蛍光団を形成する。このため、クローン化されたＧＦＰのｃＤＮＡを用いてこれまでに細菌、酵母、カビ、植物、昆虫及び動物細胞等で発現されて、遺伝子発現の指標として用いられている。また、ＧＦＰ遺伝子に種々の方法により変異を導入して多くのＧＦＰ誘導体が作製され、これらの中には野生型GFPよりも強い蛍光強度を示したり、異なる波長の蛍光を発する誘導体があることが報告されている（Ehrig,T., O'Kane,D., and Prendergast,F. FEBS Lett. 367, 163-166, 1995及びCrameri,A., Whitehom, E., Tate,E., and Stemmer,W. Nature Biotech. 14, 315-319, 1996参照）。
【００２１】
また、本発明の発現ベクターは、前記レポーター遺伝子を発現させるための発現調節領域を含む。このような発現調節領域には、プロモーターのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカーなどを含有するものを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。【００２２】
[形質転換細胞]
本発明の発現ベクターは、宿主細胞を形質転換することができ、得られた形質転換細胞を培養することによって本発明の発現ベクターによってコードされるレポーター遺伝子産物を検出することができる。ここで、宿主としては、本発明の発現ベクター複製及び維持できるものであれば特に限定されるものではないが、例えば、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）等の細菌や、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等の酵母、さらにＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞、或いはＳｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞を用いることができる。【００２３】
大腸菌は本発明の発現ベクターを調製するための宿主細胞として好ましく、形質転換細胞を培養して本発明の発現ベクターの複数のコピーを自律複製させた後に、当該形質転換細胞を破砕して本発明の発現ベクターを回収、精製することができる。細菌や酵母に本発明の発現ベクターを導入する方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、及び酢酸リチウム法等が挙げられる。【００２４】
本発明の発現ベクターを用いてＮＭＤ阻害剤のスクリーニングを行うための宿主細胞としては、特に、哺乳動物細胞が好ましく、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウス３Ｔ３細胞やＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒト２９３、及びＨｅＬａ細胞等が用いられるがこれらに限定されない。また、動物細胞への本発明の発現ベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等がある。【００２５】
動物細胞を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地が用いられる。培養は、通常５％ＣＯ２存在下、３７℃で１〜３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。また、血清の共存が望ましくない場合には目的に応じた無血清培地を使用してもよい。【００２６】
[ＮＭＤ阻害剤のスクリーニング方法]
１つの実施形態において、本発明のＮＭＤ阻害剤のスクリーニング方法は、上記形質転換細胞と候補化合物とを接触させる工程、及び前記細胞内におけるレポーター遺伝子の発現量を測定する工程を含む。本実施形態において用いられる形質転換細胞は、ＮＭＤによってレポーター遺伝子の発現が抑制されるような発現系（組換えベクター及び宿主細胞）である。前記細胞内におけるレポーター遺伝子の発現量の測定方法は特に限定されないが、用いるレポーター遺伝子の性質に基づいて種々の方法から選択することができる。例えば、細胞をそのままの状態(in situ)で観察する方法や、あるいは細胞抽出液を調製し、これを用いて前記レポーター遺伝子産物の活性を測定する方法等である。ｍＲＮＡサーベイランスの分子機構としては、現在、リボソームがｍＲＮＡをスキャンしてタンパク質合成する際に、ＥＪＣを目印にＰＴＣの有無を検出し、ＰＴＣがある場合にはＮＭＤを起こしてｍＲＮＡを分解し、ＰＴＣがない場合には通常のタンパク質合成を行うことが明らかになっている。このとき、ＵＰＦ−１／ＳＭＧ−２というＤＮＡ／ＲＮＡヘリカーゼが重要な役割を果たしており、他のタンパク質（ＵＰＦ−２／ＳＭＧ−３、ＵＰＦ−３／ＳＭＧ−４）との複合体が、ｍＲＮＡサーベイランス複合体を構成し、これがマークタンパク質（ＥＪＣ）と翻訳終止コドンとの位置関係、つまりＰＴＣの有無を検出していると考えられている。したがって、本発明のスクリーニング方法は、このようなｍＲＮＡサーベイランス機構の本質的な分子機構を含み、ＮＭＤを起こす様々な段階における阻害剤をスクリーニングすることができる。【００２７】
最近、ヒトＮＭＤ機構において、ｈＳＭＧ−１が重要なリン酸化酵素であり、ｈＵＰＦ−１の２つのセリン残基をリン酸化して、ＰＴＣを認識するｍＲＮＡサーベイランス複合体の構造変化を誘導することが本発明者らにより明らかにされている。本発明のスクリーニング方法によれば、このようなｍＲＮＡサーベイランス複合体の構造変化を抑制するような阻害剤を取得することも可能である。【００２８】
本発明の好ましい実施形態において、候補化合物の存在又は非存在下において上記形質転換細胞をインキュベートする工程と、前記各条件における細胞内のレポーター遺伝子の発現量を測定する工程と、を含むＮＭＤ阻害剤のスクリーニング方法が提供される。本実施形態において用いられる形質転換細胞は、ｍＲＮＡサーベイランスによってＮＭＤが起こるような発現系（組換えベクター及び宿主細胞）である。前記候補化合物の非存在下に比べて、存在下におけるレポーター遺伝子の発現量が増加する場合に前記候補化合物がナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊（ＮＭＤ）の阻害剤であることが示される。一方、レポーター遺伝子の翻訳終止コドンと、前記レポーター遺伝子の３’非翻訳領域にあるエクソン−イントロン接合部位との距離を調節することにより、ＮＭＤが働く場合と働かない場合の両方の発現系を作製することができる。したがって、ＮＭＤ阻害剤としての候補化合物をこのような両方の発現系でスクリーニングすることにより、得られた化合物がＮＭＤ特異的に作用しているか否かを確認することができる。【００２９】
本発明のスクリーニング方法に用いることのできる候補化合物は、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアルケミストリー技術、又は通常の合成技術によって得られた化合物群、あるいは、ファージディスプレイ法などを応用して作成されたランダムペプチド群を用いることができる。また、微生物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然物質又は動物組織抽出物などもスクリーニングの候補化合物として用いることができる。さらには、本発明のスクリーニング方法により得られた化合物を化学的又は生物学的に修飾した化合物も用いることができる。【００３０】
[ＮＭＤ阻害剤を含む医薬組成物]
本発明のスクリーニング方法により選択することのできるＮＭＤ阻害剤は、ＮＭＤにより機能を保持した異常タンパク質の発現が抑制され、その結果疾患症状の重篤化を引き起こしている病態の治療及び／又は予防剤の候補物質として有用である。このようなＮＭＤ阻害剤は、それ単独で、あるいは、薬剤学的又は獣医学的に共用される通常の担体又は希釈剤と共に、そのような治療の必要な被験者、例えば、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）に、経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる。【００３１】
本発明の医薬組成物を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等の何れのものであってもよく、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。また、本発明の医薬組成物を非経口投与する場合は、静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐剤等の製剤形態を選択することができ、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。【００３２】
これらの各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等を適宜選択し、常法により製造することができる。【００３３】
さらに、薬理的に許容される担体又は添加物を含むことができる。このような担体又は添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物は、本発明の剤型に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。【００３４】
本発明の医薬組成物の投与量は、投与対象の年齢、投与経路、投与回数により異なり、一概に規定することはできないが、本発明の発現ベクターによって生産される生理活性物質の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体との組合せとして投与される有効量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲の投与量を選ぶことができ、好ましくは１日１回から数回に分けて１日以上投与される。
【実施例】
【００３５】
[実施例１]発現ベクターの構築
pGL3 R2.1 SV40（中間産物）
pGL3R2.1ベクター（プロメガ社製Cat.No.E6431、図１ａ参照）をHindIIIとXhoIで消化し、脱リン酸化処理し、それをベクターとした。pGL3 promoter(プロメガ社製Cat.No.E1761)をHindIIIとXhoIで消化し、ＳＶ４０プロモーター領域を切り出し、それをインサートとした。上記のベクターとインサートを連結し大腸菌ＤＨ５にトランスフォームした。形質転換された大腸菌よりプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素チェックを行い正しい構造をしているプラスミドを獲得し、それをpGL3 R2.1 SV40（図２ｂ参照）と名付けた。pGL3 R2.1 SV40をＨｅｌａ細胞にトランスフェクションし、２４時間後に細胞を回収し、抗ルシフェラーゼ抗体を用いてウエスタンブロッティングを行い、ルシフェラーゼが予想分子量に発現していることを確認した。【００３６】
pGL3R2.1SV40NMD+(223,207,203,93)
pGL3 R2.1 SV40をXbaIとSalIで消化し、脱リン酸化処理し、それをベクターとした。ヒトβ−グロビンゲノムをサブクローニングしたプラスミドpTRE BGG WTを鋳型とし、以下のプライマーの組合せにより、ヒトβ−グロビン遺伝子のエクソン２からポリＡ部位までの領域をＰＣＲ法により増幅した。なお、上記pTRE BGG WTは、ヒトゲノムライブラリー(Clontech社)からＰＣＲにより、5'-GTACGGCTGTCATCACTTAGACCT-3'（beta-globin genome F、配列番号１７）及び5'-AAGGAACACTTCAGGGGAAAGG-3'(beta-globin genome R、配列番号１８)のプライマーを用いてβ−グロビン遺伝子断片を増幅し、pTREベクターにクローン化したものである（Yamashita,A., et al. GENES & DEVELOPMENT, 2001;15(17):2215-28参照）。【００３７】
正方向プライマー（４種類）
NMD+223:5'-AAATCTAGACCCTTGGACCCAGAGGTTC-3'（配列番号１）
NMD+207:5'-AAATCTAGATTCTTTGAGTCCTTTGGGGATC-3'（配列番号２）
NMD+203:5'-AAATCTAGATTGAGTCCTTTGGGGATCTGT-3'（配列番号３）
NMD+93:5'-AAATCTAGAGACAACCTCAAGGGCACCTT-3'（配列番号４）【００３８】
逆方向プライマー（１種類）
Beta globin 3' poly A site primer:5'-AAACTCGAGAAGGAACACTTCAGGGGAAAGG-3'（配列番号５）【００３９】
ＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片を、XbaIとXhoIで消化し、それらをインサートとした。上記のベクターとインサートを連結し、大腸菌ＤＨ５にトランスフォームした。形質転換された大腸菌よりプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素チェックを行い正しい構造をしているプラスミドを獲得し、それらをそれぞれpGL3 R2.1 SV40 NMD+(223,207,203,93)と名付けた（図２参照）。【００４０】
pGL3 R2.1 CONT-(20,28,31,39,46)
pGL3 R2.1 SV40をXbaI とSalIで消化し、脱リン酸化処理し、それをベクターとした。ヒトβ−グロビンゲノムをサブクローニングしたSRD beta globin genomeを鋳型とし、以下のプライマーの組合せにより、ヒトβ−グロビン遺伝子のエクソン２からポリＡ部位までの領域をＰＣＲ法により増幅した。【００４１】
正方向プライマー（５種類）
CONT-20:5'-AAATCTAGAAACTTCAGGGTGAGTCTATGGGA-3'（配列番号６）
CONT-28:5'-AAATCTAGATGAGAACTTCAGGGTGAGTCTATGG-3'(配列番号７)
CONT-31:5'-AAATCTAGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAGT-3'（配列番号８）
CONT-39:5'-AAATCTAGACACGTGGATCCTGAGAACTTCA-3'（配列番号９）
CONT-46:5'-AAATCTAGACAAGCTGCACGTGGATCC-3'（配列番号１０）【００４２】
逆方向プライマー（１種類）
Beta globin 3' poly A site primer：5'-AAACTCGAGAAGGAACACTTCAGGGGAAAGG-3'（配列番号５）【００４３】
ＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片を、XbaIとXhoIで消化し、それをインサートとした。上記のベクターとインサートを連結し、大腸菌ＤＨ５にトランスフォームした。形質転換された大腸菌よりプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素チェックを行い正しい構造をしているプラスミドを獲得し、それらをそれぞれ、pGL3 R2.1 SV40 CONT-(20,28,31,39,46)と名付けた（図２参照）。【００４４】
[実施例２]Ｈｅｌａ細胞での各種発現ベクターを用いたルシフェラーゼ遺伝子の発現
１２ウェルの細胞培養皿に、Ｈｅｌａ細胞（ＡＴＣＣから購入）を５×１０４個／ウェルの細胞密度で蒔き、２４時間後に０．３μｇのpGL3 R2.1 SV40 NMD+(223,207,203,93)又は、pGL3 R2.1 CONT-(20,28,31,39,46)と０．１μｇのphRL-TK（ウミシイタケルシフェラーゼを発現するインターナルコントロール）を、Polyfect（キアゲン社製）を用いてトランスフェクションした。４８時間培養した後に各細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄した後、４００μＬの１×Passive lysis bufferを加え、室温で１５分間インキュベートした。ライセートを試験管に移し、遠心分離により不溶物を除いた。このようにして調製したＨｅｌａ細胞抽出液について、Dual Luciferase Reporter Assay System (プロメガ社)を用いて、ＴＤ−２０／２０ルミノメーターによりルシフェラーゼ活性を測定した。
測定条件は以下のとおりである。【００４５】
Mode:DLR
Delay Time: (sec)                2
Integrate Time: (sec)            10
Sensitivity Level %:            51.9
Standard Reading:                0.026
Injection Volume #1, LARII: 100μｌ
Injection Volume #2, Stop&Glo:            100μｌ
【００４６】
その結果を図３及び以下の表１に示した。ルシフェラーゼアッセイに用いた発現ベクターは、ＮＭＤにより分解されうる遺伝子の構造をとるpGL3 R2.1 SV40 NMD+ 223, 207, 203, 93、又はＮＭＤによる分解から回避しうる遺伝子の構造をとるpGL3 R2.1 SV40 CONT- 20, 28, 31, 46である。ＮＭＤ＋シリーズの発現ベクター由来のｍＲＮＡはＮＭＤによって急速に分解され、よってそのｍＲＮＡがコードしていたホタルルシフェラーゼの発現レベルが下がり、ＮＭＤ＋はＮＭＤ−に比べ非常に低い発光強度(Relative light unit, RLU)値になった。ＮＭＤ＋のＲＬＵはＮＭＤ−のＲＬＵの１／８から１／１０の差が出た。上記の結果は、この実験系が目的の用途に使用できることを示している。【００４７】
【表１】
2006043598.tif 000002
【００４８】
[実施例３]ＲＮＡｉによるＮＭＤ構成要素の抑制と発現ベクター由来のルシフェラーゼ活性への影響
実施例１で作製した各種発現ベクターが、ＮＭＤの阻害を観察できるか否かを確認するため、ＲＮＡｉ法を用いてＮＭＤ構成要素をノックダウンした際の発現ベクター由来のルシフェラーゼ活性を測定した。ＮＭＤ構成要素の１つであるｈＳＭＧ−１及び対照実験としてラミニンＡ／Ｃの発現を抑制するために用いたｓｉＲＮＡは以下の配列である。【００４９】
非干渉コントロール用ｓｉＲＮＡ（キアゲン社、カタログNo.1022076）
センス鎖：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3'（配列番号１１）
アンチセンス鎖：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3'（配列番号１２）【００５０】
ラミニンＡ／Ｃ干渉用ｓｉＲＮＡ（キアゲン社、カタログNo.1022050）
センス鎖：5'-CUGGACUUCCAGAAGAACAdTdT-3'（配列番号１３）
アンチセンス鎖：5'-UGUUCUUCUGGAAGUCCAGdTdT-3'（配列番号１４）【００５１】
ｈＳＭＧ−１干渉用として以下の配列を有するｓｉＲＮＡを合成した。
センス鎖：5'-AAGUGUAUGUGCGCCAAAGUAdTdT-3'（配列番号１５）
アンチセンス鎖：5'-UACUUUGGCGCACAUACACUUdTdT-3'（配列番号１６）【００５２】
これらのｓｉＲＮＡと実施例１で作製した種々のプラスミドを混合し、リポフェクション２０００を用いてＨｅｌａ細胞を形質転換した。形質転換方法及びルシフェラーゼの発光強度の検出方法は実施例２と同様である。【００５３】
その結果を図４及び以下の表２に示した。コントロールとして用いたラミニンＡ／ＣをＲＮＡｉ法によりノックダウンした場合、ＮＭＤの基質となるpGL3 R2.1 SV40 NMD+ 223, 207, 203, 93は、ＮＭＤによる分解から回避しうる遺伝子の構造をとるpGL3 R2.1 SV40 CONT- 20, 28, 31, 46の発光強度に比べ１／１０以下となった。一方、ｈＳＭＧ−１をＲＮＡｉ法によりノックダウンした場合、ＮＭＤの基質となるpGL3 R2.1 SV40 NMD+ 223, 207, 203, 93はの発光強度は、ラミニンＡ／Ｃをノックダウンしたときに比べ１５〜４０倍高くなり、pGL3 R2.1 SV40 CONT- 20, 28, 31, 46の発光強度とほぼ同じ程度であった。ｈＳＭＧ−１はＮＭＤの引き金であるｈＵＰＦ１のリン酸化を引き起こす。そのｈＳＭＧ−１をノックダウンすることで、ＮＭＤの引き金であるｈＵＰＦ１のリン酸化を抑制し、ＮＭＤは起こらない。その結果、ＮＭＤの基質となるｍＲＮＡ（pGL3 R2.1 SV40 NMD+ 223, 207, 203, 93によって転写されるｍＲＮＡ）が安定化し、それら由来のタンパク質（ルシフェラーゼ）が合成されたと考えられる。以上の結果は、このアッセイシステムがＮＭＤの阻害効果を観察できることを示している。【００５４】
【表２】
2006043598.tif 000003
【図１】
2006043598.tif 000004
【図２】
2006043598.tif 000005
【図３】
2006043598.tif 000006
【図４】
2006043598.tif 000007
【配列表】
2006043598000001.app
【国際調査報告】
2006043598.tif 000008
2006043598.tif 000009