(57)【要約】この発明は、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるべく該所望の蛋白質をコードする外来ＤＮＡを含む、非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞であって、該特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子由来のプロモーター／５’非翻訳領域の一部もしくは全部／リーダー配列コード領域を含む核酸断片が該外来ＤＮＡに結合されていること、および該外来ＤＮＡのゲノムへの導入のために使用された１もしくは複数の薬剤耐性マーカー遺伝子が除去されていること、を特徴とする細胞、この細胞を用いて作製されたかつ所望の蛋白質を高発現するキメラ非ヒト動物またはその子孫、ならびにこれらの動物を用いて所望蛋白質を製造する方法および遺伝子の生体内機能を解析する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるべく該所望の蛋白質をコードする外来ＤＮＡを含む、非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞であって、該特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子由来のリーダー配列コード領域を含む核酸断片が該外来ＤＮＡに結合されていることを特徴とする前記細胞。
【請求項２】
前記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子が免疫グロブリン遺伝子である請求項１記載の細胞。
【請求項３】
前記免疫グロブリン遺伝子が免疫グロブリン軽鎖遺伝子である請求項２記載の細胞。
【請求項４】
前記核酸断片が、前記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のプロモーターをさらに含む請求項１記載の細胞。
【請求項５】
前記核酸断片が、前記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のプロモーターとリーダー配列コード領域との間の５’非翻訳領域の一部もしくは全部をさらに含む請求項４記載の細胞。
【請求項６】
前記核酸断片が、前記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のプロモーター／５’非翻訳領域の一部もしくは全部／リーダー配列コード領域を含む請求項１記載の細胞。
【請求項７】
前記核酸断片が、前記非ヒト動物由来の免疫グロブリン遺伝子のプロモーター／５’非翻訳領域の一部もしくは全部／リーダー配列コード領域を含む請求項６記載の細胞。
【請求項８】
前記核酸断片の長さが３００塩基対より大きい請求項１記載の細胞。
【請求項９】
前記所望の蛋白質をコードする外来ＤＮＡの下流にポリＡシグナル領域をコードする配列が結合されている、請求項１〜８のいずれか一項記載の細胞。
【請求項１０】
前記分化多能性を有する細胞において前記外来ＤＮＡのゲノムへの導入のために使用された１もしくは複数の薬剤耐性マーカー遺伝子が除去されている請求項１記載の細胞。
【請求項１１】
前記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の対立遺伝子が不活性化されている請求項１記載の細胞。
【請求項１２】
前記分化多能性を有する細胞が胚性幹（ＥＳ）細胞である請求項１記載の細胞。
【請求項１３】
前記非ヒト動物がマウスである請求項１記載の細胞。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項記載の非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞を作製し、宿主胚に導入し、キメラ胚を得る工程、該キメラ胚を同種の仮親非ヒト動物に移植する工程、移植したのち得られた仔動物の中から、所望の蛋白質をコードする外来ＤＮＡを発現するキメラ非ヒト動物を選抜する工程を含む、該所望の蛋白質をコードする外来ＤＮＡを過剰発現するキメラ非ヒト動物の作製方法。
【請求項１５】
前記キメラ非ヒト動物がマウスである請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記分化多能性を有する細胞がＥＳ細胞である請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法によって作製された、かつ所望の蛋白質をコードする外来ＤＮＡが過剰発現することを特徴とするキメラ非ヒト動物。
【請求項１８】
請求項１７記載のキメラ非ヒト動物同士、または該キメラ非ヒト動物とそれと同種の非ヒト動物、を交配することにより作製された、かつ所望の蛋白質をコードする外来ＤＮＡが過剰発現することを特徴とする子孫非ヒト動物。
【請求項１９】
請求項１７記載のキメラ非ヒト動物または請求項１８記載の子孫非ヒト動物、あるいは該動物由来の細胞、組織またはハイブリドーマのいずれかを用いて所望の外来ＤＮＡを発現し、産生される該遺伝子によってコードされる蛋白質を回収することを含む、蛋白質の製造方法。
【請求項２０】
請求項１７記載のキメラ非ヒト動物または請求項１８記載の子孫非ヒト動物の表現型を、所望の蛋白質をコードする外来ＤＮＡを含まない対応の野生型非ヒト動物の表現型と比較し、それらの表現型の違いを決定することを含む、所望の蛋白質または所望の蛋白質をコードするＤＮＡの生体内機能を解析する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外来ＤＮＡの発現能が増強されたキメラ非ヒト動物及びその子孫、並びにその使用に関する。具体的には、そのようなキメラ非ヒト動物及びその子孫を用いて、所望の蛋白質または該蛋白質をコードする遺伝子の機能を解析する方法、および／または有用物質を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノム全塩基配列決定という歴史的な研究成果（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｎａｔｕｒｅ，４０９：８６０−９２１，２００１）は、同時に膨大な数の新規遺伝子の機能解明という新たな研究課題をもたらした。例えば２４本のヒト染色体中２番目に小さく、最初に全塩基配列が決定されたヒト２２番染色体（Ｄｕｎｈａｍら、Ｎａｔｕｒｅ，４０２：４８９−４９５，１９９９）を例にとれば、合計５４５個の遺伝子（偽遺伝子を除く）の存在が推定された。その内訳は、塩基配列およびアミノ酸配列が既知の遺伝子が２４７個、既知遺伝子と相同性を示す新規遺伝子が１５０個、Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｓｅ  Ｔａｇ（ＥＳＴ）データベースに登録されている機能未知の配列と相同な新規遺伝子が１４８個であった。加えてゲノム配列から遺伝子を直接予測するソフトウェア（ＧＥＮＥＳＣＡＮ）による解析では、さらに３２５個の転写産物未確認の新規遺伝子が予測された（Ｄｕｎｈａｍら、前記）。遺伝子とその産物である蛋白質の生体内における機能を明らかにすることは、生命活動のプログラムを理解する上で重要なばかりでなく、様々なヒト疾患を克服するための新たな医薬品の開発につながる可能性がある。すなわち、新規遺伝子の効率的な機能解析のための技術開発は、ポストゲノム時代の生命科学、医学研究における大きな課題である。
胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）は、胚盤胞の内部細胞塊より樹立される未分化な株化細胞を言い、生殖細胞を含む様々な体組織に分化する能力を保持する、例えばマウスの場合、ＥＳ細胞をマウス初期胚（宿主胚）に注入することにより体組織の細胞がＥＳ細胞由来、及び宿主胚由来の細胞の混合物からなるキメラマウスが誕生する。特にＥＳ細胞由来の生殖細胞を保持し、ＥＳ細胞の遺伝情報を子孫に伝達できるキメラマウスをジャームラインキメラと呼ぶ。ジャームラインキメラ同士あるいはジャームラインキメラと適当なマウス系統を交配することによりＥＳ細胞由来の遺伝情報を保持するＦ１マウスが生まれる。このことを利用して、あらかじめＥＳ細胞において特定の遺伝子を改変もしくは挿入しておくと、任意のノックアウト（ＫＯ）マウス、トランスジェニック（Ｔｇ）マウスおよびノックイン（ＫＩ）マウスを作製することができる。これまでに多くの研究者によって多数のＫＯマウスが作製されてきたが、その解析結果は基礎生物学から臨床医学に至る広範な分野に重要な情報をもたらしてきただけでなく、多数のヒト疾患モデル動物を提供してきた。ＫＯマウスは今日においても遺伝子の生体内機能解明のために最も広く用いられている手法である。一方、特定の外来ＤＮＡが特定の遺伝子内に相同組換え（Ｌｅ  Ｍｏｕｅｌｌｉｃら、２００２年、日本国特許３２９８８４２号）あるいはランダム挿入（Ｇｏｓｓｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：４６３−４６５，１９８９）により挿入されたマウスを一般的にＫＩマウスと呼ぶが、さらに特定のプロモーター、外来ＤＮＡ、ポリＡ付加部位からなる発現ユニットを特定の染色体領域に挿入することにより作製されるマウスは多数の遺伝子の生体内機能解明に適している（富塚ら、２００３年、ＷＯ０３／０４１４９５）という報告もある。
しかしながらＴｇマウス、ＫＩマウスおよびＫＯマウスは共に１つの遺伝子を扱うだけでも多大な時間と労力を必要とする。相同組換えの効率は、通常ランダム挿入クローン１万個から１００個に１個程度とされている。ランダム挿入体に対する相同組換え体の比率を向上させるために、これまで様々な検討がなされてきた。例えばベクターに含まれる相同領域ゲノムＤＮＡの長さが長いほど好ましいこと（Ｄｅｎｇ  ＆  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２：３３６５−７１，１９９２）、あるいはターゲティングを行うマウスＥＳ細胞の系統と同じマウス系統のゲノムＤＮＡ（アイソジェニックＤＮＡ）を用いることが好ましいことなどが報告された（Ｄｅｎｇ  ＆  Ｃａｐｅｃｃｈｉ、前記）。さらに現在最も広く用いられている方法は、上記選択マーカーに加えて、相同領域ゲノムＤＮＡの外側にネガティブ選択マーカーを含むＫＯベクターを用いることである。この方法は、ランダム挿入体においては有毒なネガティブマーカーが発現して細胞が死ぬが、相同組換え体ではそれが起こらないという現象を利用している。ネガティブ選択マーカーとしてはＭａｎｓｏｕｒらにより報告（Ｎａｔｕｒｅ，３３６：３４８−３５２，１９８８）されたＨＳＶ−ｔｋ遺伝子（培地中にガンシクロビル、ＦＩＡＵなどのチミジンアナログを入れる必要がある）、またはＹａｇｉら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１４：７７−８６，１９９３）により報告されたＤＴ−Ａ（ジフテリア毒素Ａ鎖）などが知られている。このネガティブ選択法が理論通りに機能した場合、全てのコロニーが相同組換え体という結果が予想されるが、実際には報告により大きなばらつきがあり、その濃縮効果は一般的に数倍程度とされている。
変異型ＥＳ細胞からのマウス作製だけでなく、相同組換えにより遺伝子改変、破壊が施された哺乳動物細胞株は、それ自体が該遺伝子の機能を解明する上で重要な材料となる。さらに、相同組換えは遺伝子欠損や変異に起因する疾患（遺伝性疾患）の究極的な治療法と考えられてきた。しかし、哺乳動物細胞株または初代培養細胞における相同組換え体とランダム挿入体の比率は、マウスＥＳにおける比率と同等か、さらに低いものであり、細胞レベルの遺伝子機能解析や遺伝子治療での応用は、上記比率の改善が望まれていた（Ｙａｎｅｚ  ＆  Ｐｏｔｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，５：１４９−１５９，１９９８）。
ヒトゲノム全塩基配列が決定した現在、望まれるのは、多数の新規遺伝子について網羅的な生体内機能解析を行うことができるようなシステムである。そのためには導入遺伝子を高レベルで発現する動物個体を確実、容易、かつ多種類同時に作製できることが必要である。ヒトゲノム情報がもたらす新規遺伝子のうち、サイトカイン、増殖因子、ホルモンなどと相同性を持つ分泌性の蛋白質をコードするものは、そのものが医薬品となり得る点で非常に興味深い研究対象といえる。すなわち、分泌性蛋白質をコードする遺伝子とその産物の生体内機能解析のための新たな効率的手法の開発は、ヒト疾患治療のための医薬品開発を大きく進展させることができると想像される。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、特定の染色体領域における相同組換え効率が向上した、かつ導入されたＤＮＡによってコードされる蛋白質の発現量が向上した、胚性幹（ＥＳ）細胞を提供することを目的とする。
本発明はまた、遺伝子改変されたＥＳ細胞を用いて所望の蛋白質を発現する遺伝子組換え非ヒト動物を作製する方法を提供することを目的とする。
本発明はさらに、遺伝子組換え非ヒト動物およびその子孫を用いて対象遺伝子の機能を解析するため、および／または有用物質を生産するためのの簡便かつ再現性の高い方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、特定の染色体領域、すなわちＲＳエレメント領域に薬剤耐性マーカー遺伝子発現ユニットが挿入されたＥＳ細胞を用いることで、ＲＳエレメント領域より約２５ｋｂ上流の免疫グロブリン遺伝子Ｃκエクソン領域を含む遺伝子ターゲティングベクターのランダム挿入体に対する相同組換え体の比率が大きく改善されることを見出した。染色体上の特定の領域にあらかじめ施された改変が同領域の配列を含まないターゲティングベクターを利用した遺伝子ターゲティングにおける相同組換え効率に影響を与えることは今までに知られておらず、驚くべきことであった。
本発明者らはさらに、遺伝子改変されたＥＳ細胞をＢ細胞欠損宿主胚に注入することによりキメラマウスを作製することに成功し、この方法により作製されたキメラ動物において、毛色のキメラ率に関わらず、導入された構造遺伝子由来の産物の過剰発現効果を観察した。このシステムの利用により、従来法と比較して効率良くかつ確実に導入遺伝子を高発現するキメラ動物を得ることができることが確認された。
このように、本発明者らは、所望の蛋白質を発現するキメラ非ヒト動物の作製方法、ならびに所望の蛋白質を発現するキメラ非ヒト動物またはその子孫、あるいは該動物由来の細胞、組織またはハイブリドーマに関して、所望の蛋白質の発現量を従来と比較してさらに飛躍的に高める方法を見出した。
本出願人によって出願されたＰＣＴ国際出願ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット（２０００年３月２日国際公開）に記載された発明の目的の一つである、分泌性機能未知遺伝子の生体内における機能同定を考慮した場合、キメラ非ヒト動物における発現量（血清中濃度）を更に向上させることによって、該遺伝子の機能同定の効率が高まると考えられる。例えば機能未知遺伝子を発現させた非ヒト動物において何ら変化が認められなかった場合には、該遺伝子のＢ細胞からの分泌量が十分でないために、該遺伝子のターゲットとなる組織周辺で作用に必要な臨界濃度に達していない可能性を考えなければならない。こうしたケースの場合、より高いレベルの発現が可能となれば、臨界濃度を超える該遺伝子産物が供給され、表現型が観察される可能性がある。また医療用を含む有用蛋白質を動物の体液中に生産させるために、様々なトランスジェニック動物が作製されてきたが、十分な発現量を達成するためには多数のトランスジェニック個体を得た上で選抜する必要があり、導入遺伝子が高発現する個体を得ることは容易ではなかった。それゆえ、本発明による高レベルの外来ＤＮＡ発現を可能にするシステムは産業上利用価値が高い。
本発明者らは、本出願人によって出願されたＰＣＴ国際出願（ＷＯ  ０３／０４１４９５号パンフレット（２０００年３月２日国際公開））に記載されたキメラ非ヒト動物における導入遺伝子の発現量（血清中濃度）のさらなる向上を目的として鋭意努力を重ねた結果、既に開示された方法よりさらに発現量を高める方法を見出した。本発明には上記目的を達成するための、以下Ａ、Ｂの２種の異なる方法が含まれる。Ａは、導入遺伝子発現カセットに含まれる、プロモーター／５’非翻訳領域／リーダー配列コード領域を含む遺伝子断片に関する、また、Ｂは、導入遺伝子近傍に存在する薬剤耐性遺伝子マーカーを除去することに関する。さらに驚くべきことに、Ａ、Ｂの方法を同時に実施することによる相乗的な効果により、従来のＴｇマウス作製法と比較して非常に高いレベルの外来ＤＮＡ発現が可能であることを示した。
以下に方法Ａ、Ｂの概要について記載する。
Ａ：導入遺伝子発現カセットに含まれるプロモーター／５’非翻訳領域／リーダー配列コード領域を含む遺伝子断片についてＷＯ  ０３／０４１４９５号パンフレットに開示された方法と比較し以下の変更を加えた。
（１）Ｉｇκプロモーターについて上記開示と同じＩｇκ可変領域に由来するプロモーターに加えて、異なるＩｇκ可変領域に由来するプロモーターも用いて比較を行った。
（２）Ｉｇκプロモーターについて上記開示（約３００塩基対）より上流側に長いゲノム断片（約４５０塩基対）を用いた。
（３）（１）、（２）に示したプロモーターから転写開始点、イントロンを経てリーダー配列コード領域に至る配列を、マウス免疫グロブリンκ遺伝子ゲノムより取得して用いた。
（４）上記開示においては導入遺伝子本来のリーダー配列コード領域を使用していたが、本発明では（３）に示した断片に含まれるＩｇκ可変領域のリーダー配列コード領域と、本来のリーダー配列コード領域部分を除去した導入遺伝子と人為的に結合して用いた。
Ｂ：ＷＯ  ０３／０４１４９５号パンフレットに開示された方法に加えて、取得されたノックインＥＳ細胞について以下の処理を実施した。
（１）導入遺伝子下流域に存在するピューロマイシン耐性遺伝子カセットをＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムにより除去した。
（２）導入遺伝子下流域に存在するピューロマイシン耐性遺伝子カセット、及びＲＳ領域に存在するネオマイシン耐性遺伝子カセットをＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムにより除去した。
ＷＯ  ０３／０４１４９５号パンフレットに開示された方法に加えて、上記Ａに示された方法を実施した結果、従来の開示と比較して１０倍以上の発現量（血清中濃度）向上が観察された。従来の開示と同じプロモーター領域と、今回新たに検討した異なるプロモーター領域の比較では、後者の方がその効果は大きかった。また、ＷＯ  ０３／０４１４９５号パンフレットに開示された方法に加えて上記Ｂに示された方法を実施しても、従来の開示と比較して１０倍以上の発現量（血清中濃度）向上が観察された。さらに驚くべきことに、ＡとＢを同時に実施することにより、従来の開示と比較して１００倍以上の発現量（血清中濃度）向上が観察された。
本発明における方法Ａ、方法Ｂ、及びこの２種を組み合わせた方法ＡＢによる例示的ノックインキメラマウスにおいて観察されたヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）の血清中濃度は、従来のトランスジェニック（Ｔｇ）動物作製法あるいはウイルスベクター投与による外来ＤＮＡ強制発現システムと比較して驚くべき高いレベルであった。正常動物の血清中における内在性ＥＰＯ濃度は１０ｐｇ／ｍｌ以下であると考えられているが、それが外来ＤＮＡの発現により１００ｐｇ／ｍｌ以上に高められることにより、赤血球増加の表現型が現われる。例えば初めて作製されたｈＥＰＯ−Ｔｇマウスにおいては、１００−１５０ｐｇ／ｍｌの血清中ｈＥＰＯが検出されるとともに、赤血球増加の表現型が観察された（Ｓｅｍｅｎｚａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：２３０１−２３０５、１９８９）。さらに最近になって作製されたより高いレベルのｈＥＰＯを発現するＴｇマウスにおいては約１２５０ｐｇ／ｍｌの血清中ｈＥＰＯが検出され、髄外造血を伴う脾臓の肥大や０．９以上のヘマトクリット値など、前記Ｔｇマウスと比較してよりシビアな表現型が観察された（Ｒｕｓｃｈｉｔｚｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７：１１６０９−１１６１３）。一方、ＷＯ  ０３／０４１４９５号パンフレットに開示されたＩｇκプロモーターを含むｈＥＰＯ発現ユニットがＣκエクソンポリＡ付加部位下流に挿入されたノックインキメラマウスにおいては、数ｎｇ／ｍｌの血清中ｈＥＰＯ濃度が検出され、前記した従来法によるＴｇマウスより高い発現量であることが示された。ｈＥＰＯ遺伝子発現カセットを含むアデノ随伴ウイルス、あるいはレトロウイルスのマウスへの投与による強制発現において検出された血清中ｈＥＰＯ濃度は概ね数ｎｇ／ｍｌ程度であった（Ｖｉｌｌｅｖａｌら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、６：１０７−１１５、１９９２；Ｋｅｓｓｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：１４０８２−１４０８７、１９９６）。
後述の実施例に記載するように、ＷＯ  ０３／０４１４９５号パンフレットに開示された方法に加えて、方法Ａのみを実施した場合４５ｎｇ／ｍｌ以上、また方法Ｂのみを実施した場合にも５０ｎｇ／ｍｌ以上の血清中ｈＥＰＯが検出された。さらに方法Ａ、Ｂを同時に実施した場合には１０００ｎｇ／ｍｌ以上という驚くべきレベルの血清中ｈＥＰＯが検出された。この値は、従来法により作製されたｈＥＰＯ発現Ｔｇマウスの最も高発現な例と比較して実に数百倍以上のレベルであった。すなわち、本発明の方法はトランスジェニック動物における外来ＤＮＡ発現のために有用であることが示された。
発明の概要
上記の知見に基づく本発明は、要約すると以下のとおりである。
本発明は、その第１の態様において、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるべく該所望の蛋白質をコードする外来ＤＮＡを含む、非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞であって、該特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子由来のリーダー配列コード領域を含む核酸断片が該外来ＤＮＡに結合されていることを特徴とする前記細胞を提供する。
あるいは、本発明は、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるべく該所望の蛋白質をコードする外来ＤＮＡをゲノム上に含む、非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞であって、該特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子由来のリーダー配列コード領域を含む核酸断片が該外来ＤＮＡに結合されていることを特徴とする前記細胞を提供する。
このような構成のために、本発明は、前記細胞に由来するキメラ非ヒト動物またはその子孫において前記所望の蛋白質をコードする外来ＤＮＡが有意に過剰発現するという利点を提供する。
本発明の一実施形態において、前記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子は、免疫グロブリン遺伝子、好ましくは免疫グロブリン軽鎖遺伝子、さらに好ましくは免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子である。
本発明の別の実施形態において、前記核酸断片は、前記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のプロモーターをさらに含むことができる。核酸断片はさらに、プロモーターに加えて、前記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のプロモーターとリーダー配列コード領域との間の５’非翻訳領域の一部もしくは全部をさらに含むことができる。
本発明の別の実施形態において、前記核酸断片は、前記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のプロモーター／５’非翻訳領域の一部もしくは全部／リーダー配列コード領域を含む核酸配列からなる。このような核酸断片は、本発明において特に好ましいものである。その一具体例が、前記非ヒト動物由来の免疫グロブリン遺伝子のプロモーター／５’非翻訳領域の一部もしくは全部／リーダー配列コード領域を含む核酸断片である。ここで、５’非翻訳領域は全体からなることがさらに好ましい。
本発明の別の実施形態において、前記核酸断片は３００塩基対より大きい長さを有する。核酸断片の長さは、例えば３５０〜５００塩基対、４００〜４５０塩基対などであるが、これに限定されない。
本発明の別の実施形態において、前記所望の蛋白質をコードする外来ＤＮＡの下流にポリＡシグナル領域をコードする配列が結合されている。
本発明の別の実施形態において、前記分化多能性を有する細胞において前記外来ＤＮＡのゲノムへの導入のために使用された１もしくは複数の薬剤耐性マーカー遺伝子が除去されている。好ましくは、すべての該薬剤耐性マーカー遺伝子が除去されている。例えば後述の実施例では、外来ＤＮＡをゲノム上に相同的に組み換える際に非ヒト動物、具体的にはマウスのゲノム免疫グロブリン遺伝子（特に免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子）の下流に存在するＲＳエレメントまたはそれと同等の機能を有する領域に薬剤耐性マーカー遺伝子を挿入するが、外来ＤＮＡを相同的に組み込んだあとに、この薬剤耐性マーカー遺伝子が除去される。
本発明においては、前記核酸断片が特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のプロモーターとリーダー配列コード領域との間の５’非翻訳領域の一部もしくは全部をさらに含むこと、ならびに前記外来ＤＮＡのゲノムへの導入のために使用された１もしくは複数の薬剤耐性マーカー遺伝子が除去されていること、を特徴とする分化多能性を有する細胞が特に好ましい。
本発明の別の実施形態において、前記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の対立遺伝子は不活性化されている。
本発明の別の実施形態において、前記分化多能性を有する細胞は胚性幹（ＥＳ）細胞である。ＥＳ細胞は、例えばマウスＥＳ細胞である。
本発明はまた、その第２の態様において、上記の非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞を作製し、宿主胚に導入し、キメラ胚を得る工程、該キメラ胚を同種の仮親非ヒト動物に移植する工程、移植したのち得られた仔動物の中から、所望の蛋白質をコードする外来ＤＮＡを発現するキメラ非ヒト動物を選抜する工程を含む、該所望の蛋白質をコードする外来ＤＮＡを過剰発現するキメラ非ヒト動物の作製方法を提供する。
一実施形態において、前記キメラ非ヒト動物はマウスである。
別の実施形態において、前記分化多能性を有する細胞はＥＳ細胞である。
本発明はさらに、その第３の態様において、上記の方法によって作製された、かつ所望の蛋白質をコードする外来ＤＮＡが過剰発現することを特徴とするキメラ非ヒト動物を提供する。
本発明はさらに、その第４の態様において、上記のキメラ非ヒト動物同士、または該キメラ非ヒト動物とそれと同種の非ヒト動物、を交配することにより作製された、かつ所望の蛋白質をコードする外来ＤＮＡが過剰発現することを特徴とする子孫非ヒト動物を提供する。
本発明はまた、その第５の態様において、上記のキメラ非ヒト動物または子孫非ヒト動物、あるいは該動物由来の細胞、組織またはハイブリドーマのいずれかを用いて所望の外来ＤＮＡを発現し、産生される該ＤＮＡによってコードされる蛋白質を回収することを含む、蛋白質の製造方法を提供する。
本発明はまた、その第６の態様において、上記のキメラ非ヒト動物または子孫非ヒト動物の表現型を、所望の蛋白質をコードする外来ＤＮＡを含まない対応の野生型非ヒト動物の表現型と比較し、それらの表現型の違いを決定することを含む、所望の蛋白質または所望の蛋白質をコードするＤＮＡの生体内機能を解析する方法を提供する。
本発明に関わる用語の定義は以下の通りである。
本明細書中で使用される「ゲノム」という用語は、生物細胞の核に含まれる、遺伝情報を担う染色体ＤＮＡをいう。
本明細書中で使用される「非ヒト動物」という用語は、ヒトを含まない動物を意味し、一般に魚類、爬虫類、両生類、鳥類、哺乳類からなる脊椎動物、好ましくは哺乳類から選ばれる。本発明ではキメラ非ヒト動物の作製において、分化多能性を有する細胞として胚性幹細胞を利用することが好ましいため、胚性幹細胞の樹立が可能な非ヒト動物（たとえばマウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、ハムスター、サル、ヤギ、ウサギ、ラットなど）、および将来的に胚性幹細胞の樹立が可能であろうその他の非ヒト動物のすべてが、本発明の意図する非ヒト動物に包含される。
「キメラ非ヒト動物」とは、分化多能性を有する細胞（後述）に由来する分化した細胞と、宿主胚に由来する分化した細胞の両者から成り立つ動物を意味する（Ｂｒａｄｌｅｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３０９：２５５−６，１９８４）。実験的には、すべての細胞が宿主胚に由来する動物（０％キメラ）や、すべての細胞が分化多能性を有する細胞に由来する動物（１００％キメラ）も誕生しうるものであり、厳密にはこれらの動物は「キメラ」ではないが、便宜上「キメラ非ヒト動物」に包含されるものとする。
本明細書中で使用される「分化多能性を有する細胞」とは、上述したキメラ非ヒト動物を作製するにあたり、宿主胚への注入、あるいは集合胚形成によって、キメラ非ヒト動物の２種類以上の細胞または組織に分化可能な細胞を意味する。具体的には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）などが挙げられる。
本明細書中で使用される「胚性幹細胞」とは、ＥＳ細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）とも称され、未分化性（全能性）を維持したまま増殖可能なことを特徴とする初期胚由来の培養細胞を意味する。すなわち胚性幹細胞は、動物の初期胚中の胚盤胞の内部に存在する未分化幹細胞である内部細胞塊の細胞を培養し、未分化状態を保ったままで増殖し続けるように樹立された細胞株である。また「胚性生殖細胞」とは、ＥＧ細胞とも称され、上記胚性幹細胞とほぼ同等の能力を有することを特徴とする始原生殖細胞由来の培養細胞を意味する。胚性生殖細胞は、受精後数日〜数週間、例えばマウスの場合には約８．５日経過した胚から得た始原生殖細胞を培養し、未分化状態を保ったままで増殖し続けるように樹立された細胞株である。
本明細書中で使用される「所望の蛋白質」とは、本発明の方法により作製されるキメラ非ヒト動物の少なくとも１種類の細胞および／または組織において発現させることが試みられる蛋白質であり、その機能については既知である場合も、未知である場合もある。前記所望の蛋白質は、哺乳動物由来の機能性分泌蛋白質、機能性膜蛋白質、機能性細胞内または核内蛋白質、分泌シグナルが付加された機能性膜蛋白質の可溶性部分などとすることができる。ここで「機能性」とは、生体内において特定の働き、作用または機能をもつことを意味する。機能既知の蛋白質の場合は、当該蛋白質がキメラ非ヒト動物の少なくとも１種類の細胞および／または組織における高発現の影響を観察することによって、蛋白質の機能の相互的関連について新たな知見を得られる可能性がある。機能未知の蛋白質の場合は、同じく高発現の影響を観察することによって、当該蛋白質の機能解明につながる知見を得られる可能性がある。本発明において「所望の蛋白質」は、導入するキメラ非ヒト動物において発現するが、発現させる対象となる特定の細胞および／または組織においては発現しないかもしくはわずかにしか発現しないものあってもよいし、または異種動物由来のものであってもよく、関心のあるものであればその種類を問わないものとする。
本明細書中で使用される「所望の蛋白質をコードする核酸配列」は、内因性または外因性ＤＮＡのいずれでもよく、また外因性ＤＮＡにはヒト由来ＤＮＡが包含される。また本明細書においては、「所望の蛋白質をコードする構造遺伝子」という用語も同義として用いる。
本明細書中で使用される、蛋白質の「発現」とは、その蛋白質をコードする遺伝子の発現と同等の意味を有する。
本明細書中で使用される「リーダー配列コード領域」は、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の翻訳開始コドンの５’上流の領域であって、いわゆる前駆体蛋白質配列から成熟蛋白質配列部分を除いたＮ末端側配列部分をコードする核酸配列を含む領域を指し、「分泌シグナル配列」または「シグナルペプチドコード領域」（ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）を含む。
本明細書中で使用される「制御領域」とは、「制御配列」、「調節配列」、「調節領域」などの総称を意味し、遺伝子発現（転写、翻訳または蛋白質合成）を制御または調節する機能を有する領域を指す。そのような制御領域としては、限定するものではないが、プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなどが含まれる。また、本発明において「制御領域」とは、１つの機能的なエレメント（例えば１つのプロモーター配列）を含むものであってもよいし、または複数のエレメントを含むもの（例えば、１つのプロモーター配列と１つのエンハンサー配列など）であってもよい。さらに「プロモーター配列」とは、当業者に周知の制御領域の１種であり、転写開始時にＲＮＡポリメラーゼが結合する構造遺伝子上流の塩基配列を指す。
本明細書中で使用する「インターナルリボゾーマルエントリーサイト」とは、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）と略称され、ポリシストロニックな発現を可能にするエレメントとして知られており、特殊なＲＮＡ二次構造を形成し、その下流にある開始コドンからのリボソームによる翻訳開始を可能にする部位を指す。哺乳動物の場合、ＩＲＥＳはリボゾームのデコードサブユニットに結合し、これにより隣接する蛋白質コード領域をデコード部位に引き込むような立体構造変化を起こして、翻訳および蛋白質合成を開始する事象に関わると推定されている（Ｓｐａｈｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１：１９５９，２００１）。
本明細書中で使用する「ポリＡシグナル領域」とは、転写領域の終わりの部分に位置し、転写後ｍＲＮＡ前駆体の３’非翻訳領域へポリアデニル酸鎖付加を指令する塩基配列部分を指す。
本明細書中で使用する「上流」および「下流」とは、ゲノム、ポリヌクレオチドなどの核酸配列において、それぞれ５’末端及び３’末端への方向を指す。
本明細書中で使用する「ｂｐ（塩基対）」及び「Ｋｂ（キロ塩基対）」とは、核酸配列の長さ及び距離を指し、１ｂｐが１つの塩基対を表し、１Ｋｂは１０００ｂｐに相当する。
本明細書中で使用する「対立遺伝子」とは、倍数体のゲノムを有する生物において、相同染色体の相同な領域に位置し、機能的にも相同な遺伝子をいう。対立遺伝子は通常全てが発現される。また「対立遺伝子排除」とは、生物個体で考えた場合、対立遺伝子の両方に由来する形質が表現されているにもかかわらず、個々の細胞では対立遺伝子のどちらかのみがランダムに発現し、他方の発現が排除されていることをいう。例えば抗体やＴ細胞受容体の遺伝子に見られ、一方の可変領域遺伝子の組換えが信号となって完全な遺伝子が１つしか完成されないことによる。
本明細書中で使用する「分泌シグナルを付加された膜蛋白質の可溶性部分」という用語は、膜蛋白質分子のうち、分泌シグナル（またはシグナル配列）が結合した細胞外ドメインを意味する。
本明細書中で使用する「免疫グロブリン軽鎖遺伝子」という用語は、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の軽鎖（またはＬ鎖）をコードしている遺伝子を指す。軽鎖にはκ鎖とλ鎖が含まれており、可変（Ｖ）領域と定常（Ｃ）領域から構成されている。また軽鎖遺伝子は、１個のＣ領域遺伝子、複数のＶ領域遺伝子、および複数の結合（Ｊ）領域遺伝子から構成されている。本発明では軽鎖定常領域遺伝子が好ましく、特にマウスの分化多能性を有する細胞を使用する場合κ軽鎖定常領域遺伝子がさらに好ましい。哺乳動物の中でも特にヒトやマウスのゲノム解析はほぼ終了しており、ゲノム情報は入手可能な状態にあること、また解析の結果、ゲノムにおける配列の相同性比較から、ヒトとマウスの間では約８５％の相同率であり、かなり類似していることを考慮するならば、動物種としてマウスの分化多能性を有する細胞を使用するのが好ましいといえる。しかし、本発明では、マウス以外の動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ハムスター、サル、ヤギ、ウサギ、ラットなど）の使用も可能であり、免疫グロブリン遺伝子の配列決定がすでになされているものについては文献又はＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）、ＥＭＢＬ（欧州ＥＢＩ）などのデータベースからその情報を入手することができるし、配列が不明の場合には、制限酵素によるゲノムＤＮＡの断片化、マッピング、ゲノムライブラリーの作成、クローニング、（自動）シークエンシングなどの慣用技術を組み合わせることによって遺伝子の配列を決定できる（Ｓ．Ｂ．プリムローズ著、藤山秋佐夫監訳、ゲノム解析ベーシック、１９９６年、シュプリンガー・フェアラーク東京）。免疫グロブリン遺伝子の配列情報は、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＧ００４０５１（マウスＩｇＧλ）、Ｖ０１５６９（マウスＩｇＧκ定常領域）として記載されており利用可能である。
本明細書中で使用する「特定の細胞および／または組織が欠損した非ヒト動物系統の宿主胚」または「欠損宿主胚」という用語は、分化多能性を有する細胞を注入するための宿主非ヒト動物胚であって、当該細胞および／または組織を欠損する胚を意味する。
本明細書中で使用するキメラ非ヒト動物の「子孫」とは、本発明のキメラ非ヒト動物同士、あるいは本発明のキメラ非ヒト動物とそれと同種の非ヒト動物、の交配により得られ、少なくとも特定の細胞および／または組織において所望の蛋白質を発現する非ヒト動物を意味する。
本明細書中で使用する「表現型」とは、動物が本来持つ形質、または導入遺伝子の結果現れる動物の形質を指す。
本明細書中で使用する「増殖可能な腫瘍細胞」とは、腫瘍化することにより永続的な増殖能を有する細胞を意味し、例えば免疫グロブリンを産生する形質細胞腫細胞（ミエローマ細胞など）が挙げられる。
本明細書中で使用する「ハイブリドーマ」という用語は、本発明のキメラ非ヒト動物またはその子孫からの組織または細胞に由来する細胞と、上記増殖可能な腫瘍細胞とを融合させてできる雑種細胞を指す。
本明細書中で使用する「ターゲティングベクター」とは、相同組換えにより目的とする染色体領域に所望の蛋白質をコードする遺伝子の発現ユニットを導入し、該所望の蛋白質を発現させるために用いるベクターを指す。本明細書中で使用する「ノックアウトベクター」とは、相同組換えにより非ヒト動物の目的とする遺伝子を破壊または不活性化するためのベクターを指す。また「ノックアウト」もしくは「遺伝子ノックアウト」とは、目的とする遺伝子座位に相同組換えにより当該遺伝子の発現を阻害する構造を導入し、該目的の遺伝子を破壊または不活性化することを意味する。
本明細書中で使用する「ＲＳ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｅｇｍｅｎｔ）エレメント」という用語は、６番染色体上のマウス免疫グロブリンκ軽鎖定常領域遺伝子の約２５Ｋｂ下流に位置し、ｎｏｎａｍｅｒ及びｈｅｐｔａｍｅｒ  ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（下線部分）を持つ以下の配列（ａｇｔｔｔｃｔｇｃａｃｇｇｇｃａｇｔｃａｇｔｔａｇｃａｇｃａｃｔｃａｃｔｇｔｇ（配列番号６５））を指す（Ｄａｉｔｃｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４９：８３２−８４０，１９９２）。λ鎖発現Ｂ細胞の多くは解析の結果、ＣκエクソンないしはＪκ−Ｃκ領域が欠失しているが、これらの欠失はマウス６番染色体上のＣκエクソン下流２５Ｋｂに位置するＤＮＡ配列（Ｒｅｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｒ  ＲＳエレメント）との組み換えによるものであることが報告されている（Ｄｕｒｄｉｋら、Ｎａｔｕｒｅ，３０７，７４９−７５２，１９８４；Ｍｏｏｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）。マウス以外の哺乳動物にもゲノム免疫グロブリン遺伝子の下流にＲＳエレメントと同等の機能を有する領域があり、外来ＤＮＡをゲノムに相同的に組み込む際に、ＲＳエレメントと同様にこの領域に薬剤耐性マーカー遺伝子を組み込むことによって、外来ＤＮＡの相同組換え率を向上させることができる。
本発明は、本発明のキメラ非ヒト動物またはその子孫、あるいは該動物由来の細胞、組織またはハイブリドーマは、従来と比べて有意に高いレベル、例えば数百倍高いレベル、の外来ＤＮＡ発現を可能にするという利点を付与する。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００５−０１４８２６号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ｐＰＳｓ  ｈＥＰＯ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用ベクターの構造を示す。５’エンハンサー：マウスＩｇκの５’エンハンサー領域、ＰＳプロモーター：マウスＩｇκプロモーター領域ＰＳ、シグナルペプチドコード領域（Ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｒｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）：ＰＳプロモーター下流のマウスＩｇκシグナルペプチドコード領域、イントロン：マウスＩｇκシグナルペプチドコード領域にはさまれたイントロン領域、ｈＥＰＯ（−ＳＰ）：固有のシグナルペプチドコード領域を持たないヒトＥＰＯ遺伝子、ｐｏｌｙＡ：マウスＩｇκポリＡシグナル領域、３’エンハンサー：マウスＩｇκの３’エンハンサー領域、Ａｍｐ：アンピシリン耐性遺伝子。
図２は、ｐＮＰｓ  ｈＥＰＯ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用ベクターの構造を示す。５’エンハンサー：マウスＩｇκの５’エンハンサー領域、ＮＰプロモーター：マウスＩｇκプロモーター領域ＮＰ、シグナルペプチドコード領域：ＮＰプロモーター下流のマウスＩｇκシグナルペプチドコード領域、イントロン：マウスＩｇκシグナルペプチドコード領域にはさまれたイントロン領域、ｈＥＰＯ（−ＳＰ）：固有のシグナルペプチドコード領域を持たないヒトＥＰＯ遺伝子、ポリＡ：マウスＩｇκポリＡシグナル領域、３’エンハンサー：マウスＩｇκの３’エンハンサー領域、Ａｍｐ：アンピシリン耐性遺伝子。
図３は、ｐＣｋｓ  ｈＥＰＯ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用ベクターの構造を示す。５’エンハンサー：マウスＩｇκの５’エンハンサー領域、Ｐ２プロモーター：マウスＩｇκプロモーター領域２、ｈＥＰＯ：ヒトＥＰＯ遺伝子、ポリＡ：マウスＩｇκポリＡシグナル領域、３’エンハンサー：マウスＩｇκの３’エンハンサー領域、Ａｍｐ：アンピシリン耐性遺伝子。
図４は、ミエローマ細胞にｐＮＰｓ  ｈＥＰＯ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用ベクター、ｐＰＳｓ  ｈＥＰＯ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用ベクター、ｐＣｋｓ  ｈＥＰＯ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用ベクターを導入後、取得されたＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ解析実施結果を示す。ｈＥＰＯ：ヒトＥＰＯ、ＲＴ（−）：逆転写反応を行わずＰＣＲを実施。
図５は、ミエローマ細胞にｐＣｋｓ  ｈＥＰＯ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用ベクター、ｐＮＰｓ  ｈＥＰＯ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用ベクター、ｐＰＳｓ  ｈＥＰＯ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用ベクターを導入後、ＥＬＩＳＡを用いて培養上清中のヒトＥＰＯ濃度を測定した値を示す。図５Ａは測定値の棒グラフを、図５Ｂは測定値の平均値をそれぞれ示す。
図６は、マウスＲＳエレメントターゲティング用ベクターｐＢｌｕｅＲＳ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ−３’ＫＯ−５’ＫＯの構造を示す。５’ＫＯ：マウスＲＳエレメント５’上流領域、Ｎｅｏｒ：ｌｏｘＰ配列をその両端に持つネオマイシン耐性遺伝子、３’ＫＯ：マウスＲＳエレメント３’下流領域、ＤＴ−Ａ：ジフテリアトキシンＡ鎖遺伝子、およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ：クローニングベクター。
図７は、マウスＲＳエレメントの代わりにネオマイシン耐性遺伝子が挿入されたアレル構造（図７Ａ）およびサザン解析用プローブの位置（図７Ｂ）を示す。５’ゲノム：マウスＲＳエレメント５’上流領域，３’ゲノム：マウスＲＳエレメント３’下流領域，５’プローブ：ターゲティングベクターの５’側挿入確認用サザン解析プローブ，３’プローブ：ターゲティングベクターの３’側挿入確認用サザン解析プローブ，ｌｏｘＰ−Ｎｅｏ−ｌｏｘＰ：ｌｏｘＰ配列をその両端に持つネオマイシン耐性遺伝子。
図８は、ｐＣκＰ２  ＫＩベクターの構造を示す。プロモーター２：マウスＩｇκプロモーター領域２、ＭＣＳ：マルチクローニング部位、Ｃκ：マウスＩｇκ遺伝子定常領域、完全長ＣκポリＡ：Ｃκ終止コドン下流４３６ｂｐからなるマウスＩｇκポリＡシグナル領域、部分長ＣκポリＡ：Ｃκ終止コドン下流３０９ｂｐからなるマウスＩｇκポリＡシグナル領域、ｌｏｘＰ−Ｐｕｒｏ：ｌｏｘＰ配列をその両端に持つピューロマイシン耐性遺伝子、ＤＴ−Ａ：ジフテリアトキシンＡ鎖遺伝子、およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ：クローニングベクター。
図９は、ヒトＥＰＯ遺伝子がクローニングサイトに挿入されたｐＣκＰ２  ｈＥＰＯ  ＫＩベクター構造を示す。プロモーター２：マウスＩｇκプロモーター領域２、ｈＥＰＯ：ヒトＥＰＯ遺伝子、Ｃκ：マウスＩｇκ遺伝子定常領域、完全長ＣκポリＡ：Ｃκ終止コドン下流４３６ｂｐからなるマウスＩｇκポリＡシグナル領域、部分長ＣκポリＡ：Ｃκ終止コドン下流３０９ｂｐからなるマウスＩｇκポリＡシグナル領域、ｌｏｘｐ−Ｐｕｒｏ：ｌｏｘＰ配列をその両端に持つピューロマイシン耐性遺伝子、ＤＴ−Ａ：ジフテリアトキシンＡ鎖遺伝子、およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ：クローニングベクター。
図１０は、薬剤耐性遺伝子（ｌｏｘｐ−ｎｅｏ）がターゲティングされたアレル構造、ヒトＥＰＯ遺伝子＋薬剤耐性遺伝子（ｌｏｘｐ−ｐｕｒｏ）がｐＣｋ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターを用いてターゲティングされたアレル構造、２種の薬剤耐性遺伝子（ｌｏｘｐ−ｎｅｏ，ｌｏｘｐ−ｐｕｒｏ）が同時に除去されたアレル構造およびサザン解析用プローブの位置を示す。ｈＥＰＯ：ヒトＥＰＯ遺伝子、Ｃκ：マウスＩｇκ遺伝子定常領域、ｌｏｘｐ−ｐｕｒｏ：ｌｏｘＰ配列をその両端に持つピューロマイシン耐性遺伝子、ｌｏｘｐ−ｎｅｏ：ｌｏｘＰ配列をその両端に持つネオマイシン耐性遺伝子、Ｃｋ３’プローブ：ｈＥＰＯ＋ｌｏｘｐ−ｐｕｒｏ遺伝子導入およびｌｏｘｐ−ｐｕｒｏ遺伝子除去クローン選別用サザン解析プローブ、ＲＳ３’プローブ：ｌｏｘｐ−ｎｅｏ遺伝子導入および除去クローン選別用サザン解析プローブ、Ｅ：ＥｃｏＲＩ制限酵素サイト
図１１は、固有のシグナルペプチドコード領域を持たないヒトＥＰＯ遺伝子がクローニングサイトに挿入されたｐＮＰ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターの構造を示す。ＮＰプロモーター：マウスＩｇκプロモーター領域ＮＰ、シグナルペプチドコード領域：ＮＰプロモーター下流のマウスＩｇκシグナルペプチドコード領域、ｈＥＰＯ（−ＳＰ）：固有のシグナルペプチドコード領域を持たないヒトＥＰＯ遺伝子、完全長ＣκポリＡ：Ｃκ終止コドン下流４３６ｂｐからなるマウスＩｇκポリＡシグナル領域、部分長ＣκポリＡ：Ｃκ終止コドン下流３０９ｂｐからなるマウスＩｇκポリＡシグナル領域、Ｃκ：マウスＩｇκ遺伝子定常領域、ｌｏｘｐ−Ｐｕｒｏ：ｌｏｘＰ配列をその両端に持つピューロマイシン耐性遺伝子、ＤＴ−Ａ：ジフテリアトキシンＡ鎖遺伝子、およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ：クローニングベクター。
図１２は、ヒトＥＰＯ遺伝子＋薬剤耐性遺伝子（ｌｏｘｐ−ｐｕｒｏ）がｐＮＰ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターを用いてターゲティングされたアレル構造およびサザン解析用プローブの位置を示す。ｈＥＰＯ（−ＳＰ）：固有のシグナルペプチドコード領域を持たないヒトＥＰＯ遺伝子、Ｃκ：マウスＩｇκ遺伝子定常領域、ｌｏｘｐ−ｐｕｒｏ：ｌｏｘＰ配列をその両端に持つピューロマイシン耐性遺伝子、Ｃｋ３’プローブ：ｈＥＰＯ（−ＳＰ）＋ｌｏｘｐ−ｐｕｒｏ遺伝子導入クローン選別用サザン解析プローブ、Ｅ：ＥｃｏＲＩ制限酵素サイト。
図１３は、固有のシグナルペプチドコード領域を持たないヒトＥＰＯ遺伝子がクローニングサイトに挿入されたｐＰＳ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターの構造を示す。ＰＳプロモーター：マウスＩｇκプロモーター領域ＰＳ、シグナルペプチドコード領域：ＰＳプロモーター下流のマウスＩｇκシグナルペプチドコード領域、ｈＥＰＯ（−ＳＰ）：固有のシグナルペプチドコード領域を持たないヒトＥＰＯ遺伝子、完全長ＣκポリＡ：Ｃκ終止コドン下流４３６ｂｐからなるマウスＩｇκポリＡシグナル領域、部分長ＣκポリＡ：Ｃκ終止コドン下流３０９ｂｐからなるマウスＩｇκポリＡシグナル領域、Ｃκ：マウスＩｇκ遺伝子定常領域、ｌｏｘｐ−Ｐｕｒｏ：ｌｏｘＰ配列をその両端に持つピューロマイシン耐性遺伝子、ＤＴ−Ａ：ジフテリアトキシンＡ鎖遺伝子、およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ：クローニングベクター。
図１４は、薬剤耐性遺伝子（ｌｏｘｐ−ｎｅｏ）がターゲティングされたアレル構造、ヒトＥＰＯ＋薬剤耐性遺伝子（ｌｏｘｐ−ｐｕｒｏ）がｐＰＳ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターを用いてターゲティングされたアレル構造、薬剤耐性遺伝子（ｌｏｘｐ−ｎｅｏ，ｌｏｘｐ−ｐｕｒｏ）が除去されたアレル構造およびサザン解析用プローブの位置を示す。ｈＥＰＯ（−ＳＰ）：固有のリーダー配列コード領域を除去したヒトＥＰＯ遺伝子、Ｃκ：マウスＩｇκ遺伝子定常領域、ｌｏｘｐ−ｐｕｒｏ：ｌｏｘＰ配列をその両端に持つピューロマイシン耐性遺伝子、ｌｏｘｐ−ｎｅｏ：ｌｏｘＰ配列をその両端に持つネオマイシン耐性遺伝子、Ｃｋ３’プローブ：ｈＥＰＯ（−ＳＰ）＋ｌｏｘｐ−ｐｕｒｏ遺伝子導入およびｌｏｘｐ−ｐｕｒｏ遺伝子除去クローン選別用サザン解析プローブ、ＲＳ３’プローブ：ｌｏｘｐ−ｎｅｏ遺伝子導入および除去クローン選別用サザン解析プローブ、Ｅ：ＥｃｏＲＩ制限酵素サイト
図１５は、薬剤耐性遺伝子（ｌｏｘｐ−ｎｅｏ）がターゲティングされたアレル構造、ヒトＥＰＯ＋薬剤耐性遺伝子（ｌｏｘｐ−ｐｕｒｏ）がｐＣｋＰ２  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターを用いてターゲティングされたアレル構造、薬剤耐性遺伝子（ｌｏｘｐ−ｎｅｏ，ｌｏｘｐ−ｐｕｒｏ）が除去されたアレル構造およびサザン解析用プローブの位置を示す。ｈＥＰＯ：ヒトＥＰＯ遺伝子、Ｃκ：マウスＩｇκ遺伝子定常領域、ｌｏｘｐ−ｐｕｒｏ：ｌｏｘＰ配列をその両端に持つピューロマイシン耐性遺伝子、Ｃｋ３’プローブ：ｈＥＰＯ＋ｌｏｘｐ−ｐｕｒｏ遺伝子導入およびｌｏｘｐ−ｐｕｒｏ遺伝子除去クローン選別用サザン解析プローブ、Ｅ：ＥｃｏＲＩ制限酵素サイト。
図１６は、ＣｋＰ２  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞、ＮＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞、ＰＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞、ＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞より作製されたキメラマウス（１週齢から４週齢）の脾臓より調製されたＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ解析実施結果（アガロースゲル電気泳動のバンドを示す）。ＣｋＰ２：ＣｋＰ２  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞より作製されたキメラマウスの脾臓から得られたサンプルの結果、ＮＰ：ＮＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞より作製されたキメラマウスの脾臓から得られたサンプルの結果、ＰＳ：ＰＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞より作製されたキメラマウスの脾臓から得られたサンプルの結果、ＲＳｅ：ＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞より作製されたコントロールキメラマウスの脾臓から得られたサンプルの結果、ＥＰＯ：ヒトＥＰＯ、ＧＡＰＤＨ：マウスグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ＲＴ＋：逆転写反応後にＰＣＲの実施、ＲＴ−：逆転写反応を行わずＰＣＲの実施。
図１７は、ＣｋＰ２  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、ＮＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、ＰＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、ＣｋＰ２  ΔＰ  ＥＰＯマウスＴＴ２Ｆ細胞由来キメラマウス、ＣｋＰ２  ｌｏｘＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、ＰＳ  ｌｏｘＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウスにおける１週齢から８週齢までの血清中ヒトＥＰＯ濃度を示す。図１７Ａは測定値のグラフを、図１７Ｂは測定値をそれぞれ示す。（数字）：測定検体数を示す。
図１８は、ｐＣｋ  ｌｏｘＰＶ  ＫＩベクターの構造を示す。プロモーター２：マウスＩｇκプロモーター領域２、ＭＣＳ：マルチクローニング部位、Ｃκ：マウスＩｇκ遺伝子定常領域、完全長ＣκポリＡ：Ｃκ終止コドン下流４３６ｂｐからなるマウスＩｇκポリＡシグナル領域、部分長ＣκポリＡ：Ｃκ終止コドン下流３０９ｂｐからなるマウスＩｇκポリＡシグナル領域、ｌｏｘＰＶ−Ｐｕｒｏ：変異型ｌｏｘＰ配列をその両端に持つピューロマイシン耐性遺伝子、ＤＴ−Ａ：ジフテリアトキシンＡ鎖遺伝子、およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ：クローニングベクター。
図１９は、薬剤耐性遺伝子（ｌｏｘｐ−ｎｅｏ）がターゲティングされたアレル構造、薬剤耐性遺伝子（ｌｏｘｐｖ−ｐｕｒｏ）がｐＣｋ  ｌｏｘＰＶ  ＫＩベクターを用いてターゲティングされたアレル構造、薬剤耐性遺伝子（ｌｏｘｐ−ｎｅｏ，ｌｏｘｐｖ−ｐｕｒｏ）が除去されたアレル構造およびサザン解析用プローブの位置を示す。Ｃκ：マウスＩｇκ遺伝子定常領域、ｌｏｘｐｖ−ｐｕｒｏ：ｌｏｘＰ配列の一部変異配列であるｌｏｘＰＶ配列をその両端に持つピューロマイシン耐性遺伝子、ｌｏｘｐ−ｎｅｏ：ｌｏｘＰ配列をその両端に持つネオマイシン耐性遺伝子、Ｃｋ３’プローブ：ｌｏｘｐｖ−ｐｕｒｏ遺伝子導入およびｌｏｘｐｖ−ｐｕｒｏ遺伝子除去クローン選別用サザン解析プローブ、ＲＳ３’プローブ：ｌｏｘｐ−ｎｅｏ遺伝子導入および除去クローン選別用サザン解析プローブ、Ｅ：ＥｃｏＲＩ制限酵素サイト。
図２０は、ヒトＥＰＯ遺伝子がクローニングサイトに挿入されたｐＣｋ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯＫＩベクター構造を示す。プロモーター２：マウスＩｇκプロモーター領域２、ｈＥＰＯ：ヒトＥＰＯ遺伝子、Ｃκ：マウスＩｇκ遺伝子定常領域、完全長ＣκポリＡ：Ｃκ終止コドン下流４３６ｂｐからなるマウスＩｇκポリＡシグナル領域、部分長ＣκポリＡ：Ｃκ終止コドン下流３０９ｂｐからなるマウスＩｇκポリＡシグナル領域、ｌｏｘＰＶ−Ｐｕｒｏ：ｌｏｘＰ配列の一部変異配列であるｌｏｘＰＶ配列をその両端に持つピューロマイシン耐性遺伝子、ＤＴ−Ａ：ジフテリアトキシンＡ鎖遺伝子、およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ：クローニングベクター。
図２１は、薬剤耐性遺伝子（ｌｏｘｐ−ｎｅｏ）がターゲティングされたアレル構造、ヒトＥＰＯ遺伝子＋薬剤耐性遺伝子（ｌｏｘｐｖ−ｐｕｒｏ）がｐＣｋ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターを用いてターゲティングされたアレル構造、薬剤耐性遺伝子（ｌｏｘｐ−ｎｅｏ，ｌｏｘｐｖ−ｐｕｒｏ）が除去されたアレル構造およびサザン解析用プローブの位置を示す。ｈＥＰＯ：ヒトＥＰＯ遺伝子、Ｃκ：マウスＩｇκ遺伝子定常領域、ｌｏｘｐｖ−ｐｕｒｏ：ｌｏｘＰ配列の一部変異配列であるｌｏｘＰＶ配列をその両端に持つピューロマイシン耐性遺伝子、ｌｏｘｐ−ｎｅｏ：ｌｏｘＰ配列をその両端に持つネオマイシン耐性遺伝子、Ｃｋ３’プローブ：ｈＥＰＯ＋ｌｏｘｐｖ−ｐｕｒｏ遺伝子導入およびｌｏｘｐｖ−ｐｕｒｏ遺伝子除去クローン選別用サザン解析プローブ、ＲＳ３’プローブ：ｌｏｘｐ−ｎｅｏ遺伝子導入および除去クローン選別用サザン解析プローブ、Ｅ：ＥｃｏＲＩ制限酵素サイト。
図２２は、ヒトＥＰＯ遺伝子がクローニングサイトに挿入されたｐＮＰ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクター構造を示す。ＮＰプロモーター：プロモーター２よりも約３００ｂｐ長い上流配列を持つマウスＩｇκプロモーター領域、シグナルペプチドコード領域：ＮＰプロモーター下流のマウスＩｇκシグナルペプチドコード領域、ｈＥＰＯ（−ＳＰ）：固有のシグナルペプチドコード領域を持たないヒトＥＰＯ遺伝子、完全長ＣκポリＡ：Ｃκ終止コドン下流４３６ｂｐからなるマウスＩｇκポリＡシグナル領域、部分長ＣκポリＡ：Ｃκ終止コドン下流３０９ｂｐからなるマウスＩｇκポリＡシグナル領域、ｌｏｘＰＶ−Ｐｕｒｏ：ｌｏｘＰ配列の一部変異配列であるｌｏｘＰＶ配列をその両端に持つピューロマイシン耐性遺伝子、ＤＴ−Ａ：ジフテリアトキシンＡ鎖遺伝子、およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ：クローニングベクター。
図２３は、薬剤耐性遺伝子（ｌｏｘｐ−ｎｅｏ）がターゲティングされたアレル構造、ヒトＥＰＯ遺伝子＋薬剤耐性遺伝子（ｌｏｘｐｖ−ｐｕｒｏ）がｐＮＰ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターを用いてターゲティングされたアレル構造、薬剤耐性遺伝子（ｌｏｘｐ−ｎｅｏ，ｌｏｘｐｖ−ｐｕｒｏ）が除去されたアレル構造およびサザン解析用プローブの位置を示す。ｈＥＰＯ（−ＳＰ）：固有のシグナルペプチドコード領域を持たないヒトＥＰＯ遺伝子、Ｃκ：マウスＩｇκ遺伝子定常領域、ｌｏｘｐｖ−ｐｕｒｏ：ｌｏｘＰ配列の一部変異配列であるｌｏｘＰＶ配列をその両端に持つピューロマイシン耐性遺伝子、ｌｏｘｐ−ｎｅｏ：ｌｏｘＰ配列をその両端に持つネオマイシン耐性遺伝子、Ｃｋ３’プローブ：ｈＥＰＯ＋ｌｏｘｐｖ−ｐｕｒｏ遺伝子導入およびｌｏｘｐｖ−ｐｕｒｏ遺伝子除去クローン選別用サザン解析プローブ、ＲＳ３’プローブ：ｌｏｘｐ−ｎｅｏ遺伝子導入および除去クローン選別用サザン解析プローブ、Ｅ：ＥｃｏＲＩ制限酵素サイト
図２４は、ヒトＥＰＯ遺伝子がクローニングサイトに挿入されたｐＵＳ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクター構造を示す。ＰＳプロモーター：マウスＩｇκプロモーター領域ＰＳ、シグナルペプチドコード領域：ＰＳプロモーター下流のマウスＩｇκシグナルペプチドコード領域、ｈＥＰＯ（−ＳＰ）：固有のシグナルペプチドコード領域を持たないヒトＥＰＯ遺伝子、Ｃκ：マウスＩｇκ遺伝子定常領域、完全長ＣκポリＡ：Ｃκ終止コドン下流４３６ｂｐからなるマウスＩｇκポリＡシグナル領域、部分長ＣκポリＡ：Ｃκ終止コドン下流３０９ｂｐからなるマウスＩｇκポリＡシグナル領域、ｌｏｘＰＶ−Ｐｕｒｏ：ｌｏｘＰ配列の一部変異配列であるｌｏｘＰＶ配列をその両端に持つピューロマイシン耐性遺伝子、ＤＴ−Ａ：ジフテリアトキシンＡ鎖遺伝子、およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ：クローニングベクター。
図２５は、薬剤耐性遺伝子（ｌｏｘｐ−ｎｅｏ）がターゲティングされたアレル構造、ヒトＥＰＯ＋薬剤耐性遺伝子（ｌｏｘｐｖ−ｐｕｒｏ）がｐＰＳ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターを用いてターゲティングされたアレル構造、薬剤耐性遺伝子（ｌｏｘｐ−ｎｅｏ，ｌｏｘｐｖ−ｐｕｒｏ）が除去されたアレル構造およびサザン解析用プローブの位置を示す。ｈＥＰＯ（−ＳＰ）：固有のシグナルペプチドコード領域を持たないヒトＥＰＯ遺伝子、Ｃκ：マウスＩｇκ遺伝子定常領域、ｌｏｘｐｖ−ｐｕｒｏ：ｌｏｘＰ配列の一部変異配列であるｌｏｘＰＶ配列をその両端に持つピューロマイシン耐性遺伝子、ｌｏｘｐ−ｎｅｏ：ｌｏｘＰ配列をその両端に持つネオマイシン耐性遺伝子、Ｃｋ３’プローブ：ｈＥＰＯ＋ｌｏｘｐｖ−ｐｕｒｏ遺伝子導入およびｌｏｘｐｖ−ｐｕｒｏ遺伝子除去クローン選別用サザン解析プローブ、ＲＳ３’プローブ：ｌｏｘｐ−ｎｅｏ遺伝子導入および除去クローン選別用サザン解析プローブ、Ｅ：ＥｃｏＲＩ制限酵素サイト。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．特定の染色体領域に薬剤耐性マーカー遺伝子発現ユニットが挿入された分化多能性を有する細胞の作製
本発明のキメラ非ヒト動物の作製方法では、まず、所望の蛋白質をコードする核酸配列（例えば、構造遺伝子）を含む（あるいは、ゲノム上に含む）、非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞を作製する。この核酸配列は、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるように配置されたものである。
本発明において分化多能性を有する細胞としては、上記定義に挙げたものを利用することができるが、マウス由来の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）が好ましい。改変される染色体領域としては、ＲＳエレメントが好ましく、特にマウス６番染色体上の免疫グロブリンκ軽鎖定常領域遺伝子の約２５Ｋｂ下流に位置するＲＳエレメントが好ましい。
また、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子は、組織特異的に発現するものであってもよいし、または構成的に発現するものであってもよい。
本発明においては、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の近傍に、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のプロモーターと連結されたｃＤＮＡを含む発現ユニットを挿入することにより、該ｃＤＮＡが特定の細胞および／または組織において発現する。ここで特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子としては、非ヒト動物ゲノム上の内因性遺伝子だけでなく、非ヒト動物個体の染色体外で維持され得る外来遺伝因子、例えばプラスミドベクター（Ｅｌｂｒｅｃｈｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７：１２７６−１２７９，１９８７）、ヒト染色体あるいはその断片（Ｔｏｍｉｚｕｋａら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１６  １３３−１４３，１９９７；Ｔｏｍｉｚｕｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，７２２−７２７，２０００）、またはヒト人工染色体ベクター（Ｋｕｒｏｉｗａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，９，７０８−７１２，２００２）などに含まれる遺伝子を用いることができる。さらに、非ヒト動物個体の染色体に挿入された外来遺伝子断片上の遺伝子を用いることもできる（Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１５，１４６−１５６，１９９７）。例えば、富塚らはヒト１４番染色体断片（ＳＣ２０）を保持し、子孫伝達するトランスクロモソミックマウス系統について報告している（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，７２２−７２７，２０００）。ＳＣ２０断片はヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座全長を含み、該トランスクロモソミックマウスにおいては、ヒトで観察されるのと同様に多様なヒト免疫グロブリン重鎖が、Ｂリンパ球特異的に発現することが示されている。すなわち、ＳＣ２０断片上のヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座近傍に、免疫グロブリン重鎖プロモーターとｃＤＮＡが連結されている発現ユニットを挿入することにより、Ｂリンパ球特異的な該ｃＤＮＡの発現が可能となる。
例えば組織特異的に発現する遺伝子としては、免疫グロブリン軽鎖または重鎖遺伝子、Ｔ細胞受容体遺伝子、ミオグロビン遺伝子、クリスタリン遺伝子、レニン遺伝子、リパーゼ遺伝子、アルブミン遺伝子などが挙げられる。また構成的に発現する遺伝子としては、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子などが挙げられる。当該遺伝子がキメラ非ヒト動物において組織特異的に発現する遺伝子の場合には、後述する宿主胚として、当該遺伝子の発現する細胞および／または組織が欠損した系統の胚を採用する。当該遺伝子が構成的に発現する遺伝子の場合は、後述する宿主胚として、任意の細胞および／または組織が欠損した系統の胚を採用する。
所望の蛋白質をコードする核酸配列の配置（すなわち、連結または挿入）は、少なくとも特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるような形態である必要がある。従って、該核酸配列は、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の制御領域の下流に配置される。
あるいは、該所望の蛋白質をコードする核酸配列は、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の終止コドンとポリＡシグナル領域をコードする配列の間に、インターナルリボゾーマルエントリーサイト（ＩＲＥＳ）を配置し、そのＩＲＥＳの下流に配置される。すなわち、該核酸配列は、ゲノム上において、ＩＲＥＳと機能的に連結された状態で、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の終止コドンとポリＡシグナル領域をコードする配列との間に存在する。ターゲティングベクターの構築に際して、ポリＡシグナル領域は上記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のポリＡシグナル領域を用いることができるが、これに限定されるものではない。例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のポリＡシグナル領域などの当技術分野で公知の他のポリＡ配列を用いることもできる。
また該所望の蛋白質をコードする核酸配列は、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の終止コドンとポリＡシグナル領域をコードする配列の間に、第２のポリＡシグナル領域をコードする配列、そのポリＡシグナル領域の下流にプロモーター配列を配置し、さらに該プロモーター配列の下流に配置される。すなわち、該核酸配列は、ゲノム上において、プロモーター配列およびポリＡシグナル領域をコードする配列と機能的に連結された状態で存在し、かつもともとゲノム上に存在する特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子もまたそのプロモーター配列およびポリＡシグナル領域をコードする配列と機能的に連結された状態で存在する。ターゲティングベクターの構築に際して、ここで使用されるプロモーター配列は、上記特定の細胞および／または組織において発現を制御するものであれば特に限定されることはないが、好ましくは上記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のプロモーターが用いられる。またターゲティングベクターにプロモーターが２つ存在する場合には、その２つのプロモーターは、同じ細胞および／または組織において発現を制御するものであれば、同じものであってもよいし異なるものであってもよい。さらにターゲティングベクターの構築において使用されるポリＡシグナル領域をコードする配列としては、当技術分野で公知のポリＡシグナル領域であれば特に限定されるものではなく、例えばプロモーターと同じ由来のポリＡシグナル領域やシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のポリＡシグナル領域などが挙げられる。またプロモーターの場合と同様に、ターゲティングベクターに２つのポリＡシグナル領域をコードする配列が存在する場合には、その２つは同じものであってもよいし異なるものであってもよい。
さらにまた前記所望の蛋白質をコードする核酸配列は、上記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のポリＡシグナル領域の下流に、プロモーター配列、核酸配列、およびポリＡシグナル領域をコードする配列の順に配置することもできる。すなわち、該核酸配列は、プロモーターおよびポリＡシグナル領域をコードする配列と機能的に連結された状態（例えば、カセット形式）で、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のポリＡシグナルの下流に存在する。ターゲティングベクターの構築に際して、ここで使用されるプロモーター配列は、上記特定の細胞および／または組織において発現を制御するものであれば特に限定されることはないが、好ましくは上記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のプロモーターが用いられる。さらにターゲティングベクターの構築においてポリＡシグナル領域をコードする配列としては、当技術分野で公知のポリＡシグナル領域であれば特に限定されるものではなく、例えばプロモーターと同じ由来のポリＡシグナル領域やシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のポリＡシグナル領域などが挙げられる。またターゲティングベクターに２つのポリＡシグナル領域をコードする配列が存在する場合には、その２つは同じものであってもよいし異なるものであってもよい。前記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のポリＡシグナル領域の３’端と、所望の蛋白質をコードする核酸配列の発現を制御するプロモーター配列の５’端の距離は、上記特定の細胞および／または組織において該核酸配列の発現が可能であれば特に限定されるものではないが、距離が離れるに従い、転写産物であるｍＲＮＡの安定性に好ましくない影響が生じる可能性があり、またターゲッティングベクターの構造が大きくなることからそのような構成のベクターの作製が困難になる。これらの理由からポリＡシグナル領域の３’端と、所望の蛋白質をコードする核酸配列の発現を制御するプロモーター配列の５’端の距離は１Ｋｂ以内であることが好ましい。
また前記所望の蛋白質をコードする核酸配列は、上記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のポリＡシグナル領域の下流に、上記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子由来のプロモーター／５’非翻訳領域／リーダー配列コード領域からなる配列、所望のタンパク質をコードする核酸配列よりリーダー配列コード領域を除去した配列、およびポリＡシグナル領域をコードする配列の順に配置することもできる。すなわち、該所望のタンパク質をコードする核酸配列よりリーダー配列コード領域を除去した核酸配列は、プロモーター／５’非翻訳領域／リーダー配列コード領域からなる配列およびポリＡシグナル領域をコードする配列と機能的に連結された状態（例えば、カセット形式）で、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のポリＡシグナルの下流に存在する。ターゲティングベクターの構築に際して、ここで使用されるプロモーター／５’非翻訳領域／リーダー配列コード領域からなる配列は、上記特定の細胞および／または組織において発現を制御するものであれば特に限定されることはないが、好ましくは上記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のプロモーター／５’非翻訳領域／リーダー配列コード領域からなる配列が用いられる。また、プロモーター／５’非翻訳領域／リーダー配列コード領域からなる配列は、ゲノム上に存在する一続きの配列のままであってもよいし、プロモーター、５’非翻訳領域、リーダー配列コード領域、の各機能領域を人工的に連結させることにより作製されたものであってもよい。また、ここで使用される５’非翻訳領域及びリーダー配列コード領域にはイントロンが含まれてもよいし、含まれなくてもよい。本発明における好ましい様態として、プロモーター／５’非翻訳領域／リーダー配列コード領域はマウス免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子由来のものである。マウス免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子においては、ゲノム上に多数の可変（Ｖ）領域セグメントが存在し、それぞれが固有のプロモーター／５’非翻訳領域／リーダー配列コード領域を伴っている。マウス免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子由来のプロモーター／５’非翻訳領域／リーダー配列コード領域としては、多数存在する可変（Ｖ）領域のいずれに付随するプロモーター／５’非翻訳領域／リーダー配列コード領域を使用してもよい。マウス免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子由来のプロモーター／５’非翻訳領域／リーダー配列コード領域として好ましくは、実施例記載のＮＰ型であり、さらに好ましくは実施例記載のＰＳ型である。
さらにターゲティングベクターの構築においてポリＡシグナル領域をコードする配列としては、当技術分野で公知のポリＡシグナル領域であれば特に限定されるものではなく、例えばプロモーターと同じ由来のポリＡシグナル領域やシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のポリＡシグナル領域などが挙げられる。またターゲティングベクターに２つのポリＡシグナル領域をコードする配列が存在する場合には、その２つは同じものであってもよいし異なるものであってもよい。ポリＡシグナル領域をコードする配列として好ましい様態はマウス免疫グロブリンκ鎖遺伝子Ｃκエクソン下流に位置するポリＡシグナルである。前記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のポリＡシグナル領域の３’端と、所望の蛋白質をコードする核酸配列の発現を制御するプロモーター配列の５’端の距離は、上記特定の細胞および／または組織において該核酸配列の発現が可能であれば特に限定されるものではないが、距離が離れるに従い、転写産物であるｍＲＮＡの安定性に好ましくない影響が生じる可能性があり、またターゲッティングベクターの構造が大きくなることからそのような構成のベクターの作製が困難になる。これらの理由からポリＡシグナル領域の３’端と、所望の蛋白質をコードする核酸配列の発現を制御するプロモーター配列の５’端の距離は１Ｋｂ以内であることが好ましい。
所望の蛋白質をコードする核酸配列（例えば、構造遺伝子など）を前記制御領域の近傍に配置する場合には、核酸配列を該制御領域の近傍に挿入してもよいし、または、ＥＳ細胞の片側のアレルについて、単に当該細胞および／または組織において発現する遺伝子の制御配列の直下に、本来の構造遺伝子を置換するような態様で配置することもできる。所望の蛋白質をコードする核酸配列に置換された本来の構造遺伝子は、もう片側のアレルによって発現されるので、細胞および／または組織は正常な状態を保ちうる。
免疫グロブリンκ鎖遺伝子の発現は、前述した通り多数のＶおよびＪ遺伝子断片が、組換えにより結合することより起こる。この結合の結果、各Ｖ遺伝子断片の上流近傍にあるプロモーター配列はＪ断片下流に存在するエンハンサー配列の近傍に配置される。このような状況において、エンハンサー配列は初めて該プロモーターを活性化することができる（Ｐｉｃａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ，３０７：８０−２，１９８４）。すなわち、前記所望の蛋白質をコードする核酸配列は、人為的に免疫グロブリンκ鎖遺伝子のプロモーター配列と連結した形で、前記エンハンサー配列の近傍に配置することもできる。また所望のタンパク質をコードする核酸配列よりリーダー配列コード領域を除去した配列は、人為的に免疫グロブリンκ鎖遺伝子由来のプロモーター／５’非翻訳領域／リーダー配列コード領域からなる配列と連結した形で、前記エンハンサー配列の近傍に配置することもできる。免疫グロブリンκ鎖遺伝子座には前記エンハンサー配列以外にもさらに下流にエンハンサー配列が存在することが知られており（Ｍｅｙｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．８：１９５９−６４，１９８９）、該遺伝子はこのように複数のエンハンサーの影響のもとＢ細胞において高発現することができる。
上述したような所望の蛋白質をコードする核酸配列をゲノム上に含む非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞を、以下遺伝子導入細胞または遺伝子導入ＥＳ細胞とも呼び、これらの細胞は、限定するものではないが、例えば以下に記載するように得ることができる。
１−１．遺伝子導入ＥＳ細胞の取得
（１）ＲＳエレメント・ターゲティングベクターの構築
マウスＲＳエレメント配列の上流及び下流領域にゲノム配列を持ち、ＲＳエレメント配列の位置に選択マーカーが代わりに挿入されたＲＳエレメント・ターゲティングベクターを構築する。
マウスＲＳエレメント配列の上流及び下流ゲノム領域の配列は、ある一定以上の塩基数で構成されていればよく、例えばそれぞれ２Ｋｂ以上、上流及び下流合わせて７Ｋｂ以上の配列で構成されるのが望ましい。
更に、ベクターにはＲＳエレメント配列の位置に選択マーカーが代わりに挿入されるが、例えばネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ＧＦＰ遺伝子などを用いることが出来る。
更に、ターゲティングベクターの構造に、相同組換えの効率を上げるための改変を施すことができる。すなわち、ゲノム中にターゲティングベクターがランダム挿入された細胞を排除するためのネガティブセレクションマーカーが、ターゲティングベクターが線状化された際にベクターの端部に露出しないように操作することによって、相同組換えの効率を上げることができる。
具体的には、線状化されたターゲティングベクターにおいて、ネガティブセレクションマーカーとして機能する遺伝子構造の５’端および３’端が、ターゲティングベクターのそれぞれ５’および３’端から少なくとも１Ｋｂ、好ましくは２Ｋｂ以上離れるよう操作することが望ましい。通常、ネガティブセレクションマーカーの５’端または３’端の一方には、ゲノムとの相同組換えのための領域（相同組換え領域）が位置するため、ベクター端からの距離は３Ｋｂ以上となることがほとんどである。一方、ネガティブセレクションマーカーのもう一方の端は、ベクター端に近接している場合が多い。本発明では、ネガティブセレクションマーカーの、相同組換え領域と隣接していない端に、線状化ベクターの末端から少なくとも１ｋｂの距離を設けるよう操作し、それにより相同組換えの効率を上昇させる。ベクター端からの距離を確保するための配列としては、ターゲティングベクター構築の際に使用するｐＵＣなどのプラスミドの配列をそのまま残して（すなわち線状化する際に削除しない）利用することもできるし、また、目的とするターゲティング領域に非相同な任意の新たなノンコーディング配列をネガティブセレクションマーカーの隣に配置することも可能である。ベクターの線状化は、使用しているターゲティングベクターの制限酵素認識部位を精査し、ベクター端とネガティブセレクションマーカーの端とが距離を確保できるような適当な制限酵素部位を選択してベクターを線状化することによって、相同組換え効率を改善させるという効果を達成することができる。また、そのような適当な制限酵素部位が見つからない場合であっても、ＰＣＲを用いた手法（Ａｋｉｙａｍａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．１６，Ｅ７７．）により、適当な制限酵素認識配列をターゲティングベクターの所望の位置に導入することができる。
上述したようなターゲティングベクター構造をとることにより、ネガティブセレクションマーカーが細胞中でヌクレアーゼの攻撃を受ける頻度が低下し、相同組換えの効率が上昇するものと考えられる。
すなわち、本発明は、ターゲティングベクターにおいて、ネガティブセレクションマーカーとして機能する遺伝子構造の５’端および３’端が、線状化したターゲティングベクターのそれぞれ５’端および３’端から少なくとも１Ｋｂ、好ましくは３Ｋｂ以上離れていることを特徴とする遺伝子ターゲティングベクター、ならびに該ターゲティングベクターを用いた遺伝子ターゲティング方法を提供する。前記ターゲティングベクターにおいて、ネガティブセレクションマーカーとしては公知のものであればいずれのものも利用可能であるが、好ましくはジフテリアトキシンＡ遺伝子である。
（２）ＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞の取得
マウスＥＳ細胞は通常以下に記すような方法で樹立することができる。雌雄マウスを交配することにより得られる受精後２．５日の胚を採取し、ＥＳ細胞用培地中でインビトロ培養し、該培養胚のうち胚盤胞まで発生が進んだ胚を分離し、そして該胚を、フィーダー細胞培地中に播種して培養し、該培養胚からＥＳ様形態で生育しているものの細胞塊をトリプシンを含有するＥＳ細胞用培地を用いて分散処理、及び、フィーダー細胞培地を用いて培養し、更にはＥＳ細胞用培地を用いて継代培養し増殖する細胞を単離する。
ターゲティングベクターを用いた、ＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞の取得は、当技術分野で公知の手法、例えば相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８  ジーンターゲティング、１９９５年、羊土社（日本国）等に記載された方法によって行うことができる。例えば、上記作製したターゲティングベクターを、エレクトロポレーション、リポフェクション法などによりマウスＥＳ細胞に導入し、ＲＳエレメントを欠失し、かつその領域に耐性遺伝子が挿入されたマウスＥＳ細胞を取得することが出来る。上記操作によって、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子下流の染色体領域における相同組み換え効率が向上したマウスＥＳ細胞が取得される。
（３）ターゲティングベクターの構築
最初に、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の下流に、所望の蛋白質をコードする核酸配列よりリーダー配列コード領域を除去した配列がプロモーター／５’非翻訳領域／リーダー配列コード領域からなる配列およびポリＡシグナル領域をコードする配列と機能的に連結された状態（例えば、カセット形式）で挿入されたターゲティングベクターを構築する。
導入する核酸配列は、分泌タンパク質のリーダー配列検定用のコンピュータープログラムであるシグナルＰ等により予測されるリーダーアミノ酸配列と成熟タンパク質産物の境界点から終止コドンまでを含んでいればｃＤＮＡでもイントロンを含むゲノムＤＮＡであってもよく、該核酸配列によってコードされる蛋白質の種類はいかなるものでもよい。本発明で使用される核酸配列は、それによってコードされる蛋白質の高発現・分泌のために使用されてもよいし、該蛋白質の機能を解明するために使用されてもよい。したがって、導入する核酸配列はその塩基配列が特定されるならば、いずれの種類のものでも使用可能である。核酸配列（構造遺伝子）の例としては、哺乳動物、好ましくはヒト、由来の機能性蛋白質をコードする遺伝子、たとえば分泌蛋白質をコードする遺伝子、膜蛋白質をコードする遺伝子、細胞内または核内蛋白質をコードする遺伝子、などが挙げられる。
特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の下流に、所望の蛋白質をコードする核酸配列よりリーダー配列コード領域を除去した配列がプロモーター／５’非翻訳領域／リーダー配列コード領域からなる配列およびポリＡシグナル領域をコードする配列と機能的に連結された状態（例えば、カセット形式）で挿入されるように動物のゲノムを改変するために、ターゲティングベクターを準備し、このベクターＤＮＡに所望の蛋白質をコードする核酸配列よりリーダー配列コード領域を除去した配列がプロモーター／５’非翻訳領域／リーダー配列コード領域からなる配列およびポリＡシグナル領域をコードする配列と機能的に連結された状態（例えば、カセット形式）の核酸配列を挿入する。この目的のために使用可能なベクターの例は、プラスミド、ウイルスなどであり、当業者であればターゲティングベクターとして使用可能なベクターを容易に選択し、入手することができる。ベクターの具体例は、限定するものではないが、ｐＣｋ  ｌｏｘＰＶ  ＫＩベクター（後述の実施例参照）である。ターゲティングベクターは、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のポリＡシグナル領域の下流に、前記カセットの挿入部位として適当な制限酵素切断部位が配置される。更に、ベクターには、必要に応じて選択マーカー、たとえばピューロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ＧＦＰ遺伝子等を含むことができる。
（４）非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞へのターゲティングベクターの導入、および相同組換え体の選択
ターゲティングベクターによる非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞の形質転換は、当技術分野で公知の手法、例えば相沢慎一（上記）等に記載された方法によって行うことができる。例えば、上記作製したターゲティングベクターを、エレクトロポレーション、リポフェクション法などにより分化多能性を有する細胞に導入することができる。
さらに、ターゲティングベクターの構造に、相同組換えの効率を上げるための改変を施すことができる。すなわち、ゲノム中にターゲティングベクターがランダム挿入された細胞を排除するためのネガティブセレクションマーカーが、ターゲティングベクターが線状化された際にベクターの端部に露出しないように操作することによって、相同組換えの効率を上げることができる。
具体的には、線状化されたターゲティングベクターにおいて、ネガティブセレクションマーカーとして機能する遺伝子構造の５’端および３’端が、ターゲティングベクターのそれぞれ５’および３’端から少なくとも１Ｋｂ、好ましくは２Ｋｂ以上離れるよう操作することが望ましい。通常、ネガティブセレクションマーカーの５’端または３’端の一方には、ゲノムとの相同組換えのための領域（相同組換え領域）が位置するため、ベクター端からの距離は３Ｋｂ以上となることがほとんどである。一方、ネガティブセレクションマーカーのもう一方の端は、ベクター端に近接している場合が多い。本発明では、ネガティブセレクションマーカーの、相同組換え領域と隣接していない端に、線状化ベクターの末端から少なくとも１ｋｂの距離を設けるよう操作し、それにより相同組換えの効率を上昇させる。ベクター端からの距離を確保するための配列としては、ターゲティングベクター構築の際に使用するｐＵＣなどのプラスミドの配列をそのまま残して（すなわち線状化する際に削除しない）利用することもできるし、また、目的とするターゲティング領域に非相同な任意の新たなノンコーディング配列をネガティブセレクションマーカーの隣に配置することも可能である。ベクターの線状化は、使用しているターゲティングベクターの制限酵素認識部位を精査し、ベクター端とネガティブセレクションマーカーの端とが距離を確保できるような適当な制限酵素部位を選択してベクターを線状化することによって、相同組換え効率を改善させるという効果を達成することができる。また、そのような適当な制限酵素部位が見つからない場合であっても、ＰＣＲを用いた手法（Ａｋｉｙａｍａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．１６，Ｅ７７．）により、適当な制限酵素認識配列をターゲティングベクターの所望の位置に導入することができる。
上述したようなターゲティングベクター構造をとることにより、ネガティブセレクションマーカーが細胞中でヌクレアーゼの攻撃を受ける頻度が低下し、相同組換えの効率が上昇するものと考えられる。
すなわち、本発明は、ターゲティングベクターにおいて、ネガティブセレクションマーカーとして機能する遺伝子構造の５’端および３’端が、線状化したターゲティングベクターのそれぞれ５’端および３’端から少なくとも１Ｋｂ、好ましくは３Ｋｂ以上離れていることを特徴とする遺伝子ターゲティングベクター、ならびに該ターゲティングベクターを用いた遺伝子ターゲティング方法を提供する。前記ターゲティングベクターにおいて、ネガティブセレクションマーカーとしては公知のものであればいずれのものも利用可能であるが、好ましくはジフテリアトキシンＡ遺伝子である。
ポジティブセレクションマーカーとしては、本出願人によって出願されたＰＣＴ国際出願ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット（２０００年３月２日国際公開）に記載されたｐＬｏｘＰ−Ｐｕｒｏ由来のピューロマイシン耐性カセットを用いることができる。この薬剤耐性カセットは、その両端に順方向にＬｏｘ−Ｐ配列を含んでいる。よってＷＯ  ００／１０３８３号パンフレットに記載された方法により、同耐性遺伝子をターゲティングベクターが挿入された分化多能性を有する細胞から除去することができる。
さらに、前記ＲＳ配列を除去する際に用いるポジティブセレクションマーカーとしては、本出願人によって出願されたＰＣＴ国際出願ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット（２０００年３月２日国際公開）に記載されたｐＬｏｘＰ−ＳＴｎｅｏ由来のＮｅｏ耐性カセットを用いることができる。この薬剤耐性カセットは、その両端に順方向にＬｏｘＰ配列を含んでいる。よってＷＯ  ００／１０３８３号パンフレットに記載された方法により、同耐性遺伝子をターゲティングベクターが挿入された分化多能性を有する細胞から除去することができる。
さらにまたターゲティングベクターに含まれるポジティブセレクション用薬剤耐性マーカー（例えばピューロマイシン耐性カセット）あるいはＲＳ配列を除去するために挿入されたポジティブセレクション用薬剤耐性マーカー（例えばＮｅｏ耐性カセット）のいずれかについて、該薬剤耐性カセットの両端に順方向で存在するＬｏｘＰ配列として、変異型ＬｏｘＰ配列（Ｌｅｅら，Ｇｅｎｅ、２１６：５５−６５、１９９８）を用いることができる。この方法により、ＣκポリＡ部位直下、ターゲティングベクターに含まれるピューロマイシン耐性カセット両端のＬｏｘＰ配列と約２５ｋｂ下流に存在するＲＳ配列領域に存在するＮｅｏ耐性カセット両端のＬｏｘＰ配列間ゲノム配列の組換えによる欠失を防ぐことが可能であり、上記２種の薬剤耐性カセットのみを同時に除去したい場合に有用である。
これまでの研究で免疫グロブリンκ鎖遺伝子座内のイントロンエンハンサー部位（Ｘｕら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、４：３７７−３８５、１９９６）、あるいはＣκエクソン下流約９ｋｂの３’エンハンサー領域（Ｇｏｒｍａｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、５：２４１−２５２、１９９６）に挿入された薬剤耐性カセットが、免疫グロブリンκ鎖遺伝子のＶＤＪ組換えを阻害し、κ鎖の発現量が低下する現象が報告されていた。これらの報告においては、Ｃｒｅ／ＬｏｘＰシステムの利用により、薬剤耐性カセットを除去した結果、いずれの場合もその発現がある程度回復することから、薬剤耐性カセットの存在がκ鎖の発現に影響を与えていることが示唆されていた。一方、マウスＣκ領域をヒトＣκ領域と置換した実験（Ｚｏｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６２：１２７１−１２７４、１９９３）においては、Ｃκ下流域に付随する薬剤耐性マーカーの存在に関わらず、高いレベルのマウス／ヒトキメラＩｇκ鎖の発現が観察された。すなわち、Ｉｇκ近傍領域に挿入された薬剤耐性カセットの存在が、Ｉｇκ鎖の発現に与える影響については、結論は得られていなかった。さらに、Ｉｇκの制御領域を利用しているが、内在性Ｉｇκ遺伝子とは独立した発現ユニットに含まれる遺伝子の発現への影響についても良く分かっていない状況であった。
更に、マウスＥＳ細胞として免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子の下流約２５ＫｂのＲＳエレメント領域に薬剤耐性マーカーが挿入された胚性幹細胞を用いることでＩｇκ定常領域下流に目的とする遺伝子を、ターゲティングベクターを用いて挿入する効率を上げることが出来る。
相同組換え体を簡便に同定するために、外来ＤＮＡがターゲティングされる位置に薬剤耐性遺伝子マーカーをあらかじめ挿入しておくこともできる。例えば、本明細書中実施例で用いられているマウスＥＳ細胞ＴＴ２Ｆは、Ｃ５７ＢＬ／６系統とＣＢＡ系統との間のＦ１個体由来の細胞である。先述したように（Ｄｅｎｇ  ＆  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２：３３６５−７１，１９９２）、ターゲティングベクターに含まれるゲノム相同領域の配列がＣ５７ＢＬ／６に由来する場合、ＴＴ２Ｆ細胞においてはＣ５７ＢＬ／６由来のアレルにおいてより高率に相同組換えが起こると想像される。すなわち、あらかじめＣ５７ＢＬ／６由来ゲノムＤＮＡを含むターゲティングベクターを用いてＣ５７ＢＬ／６由来のアレルに例えばＧ４１８耐性マーカーを挿入することができる。次に得られたＧ４１８耐性株について、ピューロマイシン耐性マーカーを含み、かつＣ５７ＢＬ／６由来ゲノムＤＮＡを含むターゲティングベクターを導入してピューロマイシン耐性かつＧ４１８感受性株を取得することができる。この株においては、ターゲティングベクターと、前記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子との相同組換えによりＧ４１８耐性遺伝子が除去され、代わりに所望の蛋白質をコードする核酸配列（例えば、構造遺伝子など）とピューロマイシン耐性マーカーが挿入されている。このような方法により、相同組み換え体同定におけるサザン解析等の手間を省くことができる。
本出願人によって出願されたＰＣＴ国際出願ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット（２０００年３月２日国際公開）に記載された方法と同様に、ピューロマイシン耐性クローンをピックアップし、ゲノムＤＮＡを調製し、サザン解析法により相同組換え体を同定することが可能である。ターゲティングベクター中のピューロマイシン耐性遺伝子は、ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレットに記載されたＬｏｘ−Ｐ  Ｐｕｒｏプラスミドに由来し、その両端に順方向にＬｏｘ−Ｐ配列を含んでいる。よってＷＯ  ００／１０３８３号パンフレットに記載された方法により、同耐性遺伝子をターゲティングされた分化多能性を有する細胞から除去することができる。
上述したターゲティングベクター、ならびに相同組換え効率を向上させる技術および手段は、遺伝子導入可能な細胞すべてに応用が可能であり、キメラ動物の作製に限定されない。例えば、ヒトおよびヒト細胞（例えば血液細胞や免疫細胞など）を対象とした遺伝子治療において、本明細書に記載のターゲティングベクターおよび相同組換え効率を向上させる技術を所望の遺伝子を破壊または導入するために使用することができる。
２．特定の細胞および／または組織が欠損した宿主胚
本発明のキメラ非ヒト動物の作製方法では、次に、前記特定の細胞および／または組織が欠損した非ヒト動物系統の宿主胚（以下、欠損宿主胚ともいう）を用意する。そのような欠損宿主胚としては、免疫グロブリン軽鎖遺伝子を制御領域として利用する場合には、免疫グロブリン重鎖遺伝子ノックアウトによるＢ細胞欠損胚（Ｔｏｍｉｚｕｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１８：７２２−７２７，２０００）、Ｔ細胞受容体遺伝子を制御領域として利用する場合には、Ｔ細胞受容体β鎖欠損によるＴリンパ球細胞欠損胚（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３６０：２２５−２２７，１９９２）、ミオグロビン遺伝子を制御領域として利用する場合には、マイオゲニン遺伝子ノックアウトによる筋肉組織の欠損胚（Ｎａｂｅｓｈｉｍａら、Ｎａｔｕｒｅ，３６４：５３２−５３５，１９９３）、クリスタリン遺伝子を制御領域として用いる場合には、水晶体を欠損するマウスの突然変異体であるａｐｈａｋｉａ（ａｋ）系統由来の胚（Ｌｉｅｇｅｏｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９３：１３０３−１３０７，１９９６）、レニン遺伝子を制御領域として利用する場合には、Ｓａｌｌ１遺伝子ノックアウトによる腎臓組織の欠損胚（Ｎｉｓｈｉｎａｋａｍｕｒａら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２８：３１０５−３１１５，２００１）、アルブミン遺伝子を制御領域として利用する場合には、ｃ−Ｍｅｔ遺伝子欠損による肝臓組織の欠損胚（Ｂｌａｄｔら、Ｎａｔｕｒｅ，３７６：７６８−７７０，１９９５）、リパーゼ遺伝子を制御領域として用いる場合には、Ｐｄｘ１遺伝子ノックアウトによる膵臓組織欠損胚（Ｊｏｎｓｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３７１：６０６−９，１９９４）などが挙げられる。好ましい欠損宿主胚を上記例示したが、本発明で使用可能な欠損宿主胚は上記のものに限定されない。
また、効率的なキメラ非ヒト動物作製を行うための宿主胚の発生時期、遺伝的背景等の選択については、それぞれのＥＳ細胞株について既に検討された条件を用いることが望ましい。例えばマウスの場合、ＣＢＡ×Ｃ５７ＢＬ／６Ｆ１由来のＴＴ２細胞またはＴＴ２Ｆ細胞（野性色、Ｙａｇｉら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２１４：７０−７６，１９９３）からのキメラ作製については宿主胚がＢａｌｂ／ｃ（白色、日本国日本クレア社）、ＩＣＲ（白色、日本国日本クレア社）、またはＭＣＨ（ＩＣＲ）（白色、日本国日本クレア社）の遺伝的背景であることが望ましい。よって前記特定の細胞および／または組織が欠損した非ヒト動物系統とこれらの系統の戻し交配により得られる非ヒト動物の胚（例えば８細胞期胚）を欠損宿主胚として用いるのが望ましい。
宿主胚において欠損する細胞および／または組織は、ブラストシスト・コンプリメンテーション（ＢＣ）によって、分化多能性を有する細胞により補填されるため、前記宿主欠損胚は、キメラ動物を作製するための胚盤胞期まで発生しうるものであれば、胚性致死のものであってもかまわない。このような胚性致死胚は、遺伝子の欠損がヘテロである動物同士の交配によって原理的には４分の１の確率で生じるため、交配により得られた胚を複数取得して下記手順に従ってキメラ動物を作製し、その中から宿主胚が欠損胚であるものを選抜する。この選抜は、キメラ動物の体組織より抽出したＤＮＡを用いたサザン解析、ＰＣＲ解析等により行うことができる。
３．キメラ胚の作製および仮親への移植
上記「１．分化多能性を有する細胞の作製」の項目で得られた遺伝子導入（ＥＳ）細胞株からのキメラ非ヒト動物の作製は、相沢慎一（前記）等に記載された方法で行うことができる。具体的に説明すると、作製した遺伝子導入分化多能性細胞を、上記「２．特定の細胞および／または組織が欠損した宿主胚」の項目に記載の欠損宿主胚の胚胎盤胞または８細胞期胚に毛細管などを用いて注入する。この胚胎盤胞または８細胞期胚を、直接同種の仮親非ヒト動物の卵管に移植するか、一日培養して胚盤胞まで発生したものを該仮親の子宮に移植する。その後、仮親を飼育出産させることにより、仔動物を得る。
４．キメラ非ヒト動物における導入遺伝子の発現
上記「３．キメラ胚の作製および仮親への移植」の項目に従って作製される遺伝子導入分化多能性細胞注入胚に由来する仔動物における分化多能性細胞の貢献率は、その毛色により大まかに判定することができる。例えば、ＴＴ２Ｆ細胞（野生色）由来の遺伝子導入細胞株をＭＣＨ（ＩＣＲ）（白色）バックグラウンドの宿主マウス胚に注入した場合、野生色（濃茶）の割合が分化多能性細胞の貢献率を示している。ここで毛色における貢献率は、前記欠損する細胞および／または組織以外の細胞および／または組織における遺伝子導入分化多能性細胞の貢献率と相関があるが、組織によっては毛色の貢献率と一致しない場合もある。一方、上記キメラ非ヒト動物においては、宿主胚由来の前記欠損する細胞および／または組織は存在せず、遺伝子導入分化多能性細胞由来のもののみ存在する。遺伝子導入分化多能性細胞の貢献による、キメラ非ヒト動物における欠損細胞および／または組織の回復は、ＦＡＣＳ解析（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ）、ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）等によって検出可能である。遺伝子導入分化多能性細胞由来の細胞および／または組織において挿入した核酸配列（構造遺伝子）が発現するかどうかは、当該細胞および／または組織由来のＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ法（Ｋａｗａｓａｋｉら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，８５：５６９８−５７０２，１９８８）、ノーザンブロット法（Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９４）などにより検出される。蛋白質レベルの発現は、導入した核酸配列がコードする所望の蛋白質に対する特異的抗体が既にある場合は、キメラマウス血清を用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ；富山・安東、単クローン抗体実験マニュアル、１９８７、講談社サイエンティフィク（日本国））、ウエスタンブロット法（Ａｕｓｕｂｅｌら，前記）等を利用して検出できる。また、導入される核酸配列（例えば、構造遺伝子）をコードするＤＮＡを適当に改変し、抗体で検出可能なタグペプチドを付加しておけば、該タグペプチドに対する抗体等で導入した遺伝子の発現を検出できる（ＰＯＤ標識抗Ｈｉｓ６、ロシュ・ダイアグノスティックス（日本国））。
上述のようにして作製されたキメラ非ヒト動物は、少なくとも特定の細胞および／または組織において、導入した核酸配列（例えば、構造遺伝子）が高発現する。発現した所望の蛋白質が、血液、乳などの分泌されるような系であれば、有用蛋白質の生産系として利用することができる。また、機能未知の蛋白質を高発現させた場合には、前記高発現に伴う所見から、当該蛋白質の機能を解明していくことができる。
さらに近年、体細胞核移植胚からの動物個体作製法と体細胞におけるジーンターゲティングとを組み合わせて、マウス以外の動物種（ウシ、ヒツジ、ブタ等）でもマウス同様の遺伝子改変が可能になった（ＭｃＣｒｅａｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ，４０５：１０６６−１０６９，２０００）。例えば免疫グロブリン重鎖のノックアウトによりＢ細胞を欠損するウシを作製可能である。さらにマウス、ウシ、ヒツジ、ブタなどのＩｇ遺伝子あるいはその近傍に導入遺伝子を挿入し、線維芽細胞の核を移植した未受精卵を発生させ、胚盤胞期胚よりＥＳ細胞を調製可能である。このＥＳ細胞と上記Ｂ細胞欠損宿主胚との間でキメラ非ヒト動物が作製可能であり（Ｃｉｂｅｌｌｉら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：６４２−６４６，１９９８）、マウスだけでなくその他の動物種においても同様の発現系を利用した分泌蛋白質の高発現が可能である。大動物の利用により、遺伝子機能解析だけでなく有用物質生産への適用も考えられる。本明細書に記載の方法に従って、マウスあるいはウシ免疫グロブリン遺伝子の制御領域により制御されるべく構築された外来ＤＮＡ発現ユニットをＫｕｒｏｉｗａら（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３６：７７５−８０，２００４）に記された方法によってウシ胎児由来繊維芽細胞の内在性免疫グロブリン遺伝子座近傍に挿入することができる。得られる遺伝子改変ウシ繊維芽細胞から前記Ｋｕｒｏｉｗａら（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３６：７７５−８０，２００４）に記された方法に従って作製されたクローンウシ個体の血清中には該外来ＤＮＡが高発現することが期待される。
５．キメラ非ヒト動物の子孫の作製
本発明のキメラ非ヒト動物の作製方法は、さらに、それと同種の非ヒト動物と交配させて導入した核酸配列をヘテロにもつトランスジェニック（Ｔｇ）動物を選択して得、このＴｇ動物の雄と雌を交配させて導入遺伝子をホモにもつＴｇ動物子孫を得ることを含む。
６．キメラ非ヒト動物またはその子孫に由来する組織または細胞
本発明においては、前記いずれかのキメラ非ヒト動物またはその子孫に由来する組織または細胞を得ることができる。該細胞または組織は、該細胞または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるべく該所望の蛋白質をコードする核酸配列をゲノム上に含み、所望の蛋白質を発現することができるものである。
前記組織および細胞には、キメラ非ヒト動物またはその子孫に由来し、かつ所望の蛋白質を発現することができるものであればいずれの組織および細胞も含まれ、例えば、Ｂ細胞、脾臓、リンパ組織などが挙げられる。
前記組織および細胞は、当技術分野で公知の手法により採取・培養することができ、該組織および細胞が所望の蛋白質を発現しているかどうかも慣例的な手法に従って確認することができる。このような組織および細胞は、以下で記載するハイブリドーマの作製、蛋白質の製造などに有用である。
７．ハイブリドーマの作製
本発明においては、導入した所望の蛋白質をコードする核酸配列を発現するキメラ非ヒト動物の細胞、特にＢ細胞もしくはＢ細胞を含む脾臓、リンパ節などのリンパ組織からの細胞と、増殖可能な腫瘍細胞（たとえばミエローマ細胞）とを融合することによって、ハイブリドーマを得ることができる。ハイブリドーマの作製法は、たとえば安東・千葉（単クローン抗体実験操作法入門、１９９１、講談社サイエンテフィク（日本国））に記載される手法に基くことができる。
ミエローマとしては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物に由来する自己抗体産生能のない細胞を用いることができるが、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）ミエローマ株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３−Ｕ１）［Ｙｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ｅ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１：１−７（１９７８）］、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）［Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ら，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６：５１１−５１９（１９７６）］、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）［Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，２７６：２６９−２７０（１９７８）］、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（６５３）［Ｋｅａｒｎｅｙ，Ｊ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３：１５４８−１５５０（１９７９）］、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８（Ｘ６３）［Ｈｏｒｉｂａｔａ，Ｋ．ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，Ａ．Ｗ．Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）］などを用いることが好ましい。これらの細胞株は、適当な培地、例えば８−アザグアニン培地［グルタミン、２−メルカプトエタノール、ゲンタマイシンおよびウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」という）を加えたＲＰＭＩ−１６４０培地に８−アザグアニンを加えた培地］、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＩＭＤＭ」という）、またはダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＤＭＥＭ」という）で継代培養するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地（例えば、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地）で継代培養し、融合当日に２×１０７以上の細胞数を確保しておく。
導入した核酸配列がコードする所望の蛋白質を発現する細胞として使用可能なものは、プラズマ細胞（すなわち、形質細胞）、およびその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体のいずれの部位から得てもよく、一般には脾臓、リンパ節、骨髄、扁桃、末梢血、またはこれらを適宜組み合わせたもの等から得ることができるが、脾細胞が最も一般的に用いられる。
導入した核酸配列がコードする所望の蛋白質を発現する脾細胞をミエローマと融合させる手段として現在最も一般的に行われているのは、細胞毒性が比較的少なく融合操作も簡単なポリエチレングリコールを用いる方法である。具体的には次のように行うことができる。脾細胞とミエローマとを無血清培地（例えばＤＭＥＭ）、またはリン酸緩衝生理食塩液（一般にＰＢＳと呼ばれる）でよく洗浄し、脾細胞とミエローマの細胞数の比が通常約５：１〜約１０：１になるように混合し、遠心分離する。上清を除去し、沈澱した細胞群をよくほぐした後、撹拌しながら１ｍｌの５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（分子量１０００〜４０００）を含む無血清培地を滴下する。その後、１０ｍｌの無血清培地をゆっくりと加えた後遠心分離する。再び上清を捨て、沈澱した細胞を適量のヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン液およびヒトインターロイキン−６を含む正常培地（一般にＨＡＴ培地と呼ばれる）中に懸濁して培養用プレートの各ウェルに分注し、５％炭酸ガス存在下、３７℃で２週間程度培養する。培養途中に適宜ＨＡＴ培地を補う。
ミエローマ細胞が８−アザグアニン耐性株である場合、すなわち、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損株である場合には、融合しなかった該ミエローマ細胞、およびミエローマ細胞どうしの融合細胞は、ＨＡＴ含有培地中では生存できない。一方、脾臓細胞どうしの融合細胞、あるいは、脾臓細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマは生存することができるが、脾臓細胞どうしの融合細胞には寿命がある。従って、ＨＡＴ含有培地中での培養を続けることによって、脾臓細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマのみが生き残る。
得られたハイブリドーマは、前記の導入した核酸配列がコードする所望の蛋白質に対して特異的な抗体によるＥＬＩＳＡでスクリーニングすることにより、導入した核酸配列がコードする所望の蛋白質を産生するハイブリドーマを選択することができる。
８．蛋白質の製造方法
本発明はさらに、上記のキメラ非ヒト動物またはその子孫、あるいは上記の組織または細胞、あるいは上記のハイブリドーマのいずれかを用いて所望の蛋白質を産生させた後、該蛋白質を回収することを含む、所望の蛋白質を製造する方法を提供する。具体的に説明すると、キメラ非ヒト動物またはその子孫の個体を、導入した所望の蛋白質をコードする核酸配列が発現しうる条件下で飼育し、その後発現産物である蛋白質を動物の血液、腹水などから回収することができる。あるいはまた、キメラ非ヒト動物またはその子孫に由来する組織または細胞、あるいはそれを不死化したもの（例えば、ミエローマ細胞との融合により不死化したハイブリドーマ）などを、導入した所望の蛋白質をコードする核酸配列が発現しうる条件下で培養し、その後発現産物である蛋白質を培養物、培養上清などから回収することができる。発現産物は、遠心分離などの公知の方法に従って回収することができ、さらに硫安分画、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー（例えばイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーなど）、分取薄層クロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどの公知の方法の１種または複数の組み合わせによって精製することができる。
９．生体内機能の解析方法
本発明はさらにまた、上記のキメラ非ヒト動物またはその子孫の表現型を、所望の蛋白質をコードする核酸配列を含まない対応の野生型ＥＳ細胞より作製されたキメラ非ヒト動物などの表現型と比較し、それらの表現型の違いを決定することを含む、所望の蛋白質または所望の蛋白質をコードする遺伝子の生体内機能を解析する方法を提供する。
本方法では、遺伝子導入に対応して生体内に現れる任意の形質を物理化学的方法によって検出し、これによって導入した核酸配列または蛋白質の生体内機能を同定することができる。たとえば、所望の蛋白質をコードする核酸配列を含むＥＳ細胞より作製されたキメラ非ヒト動物またはその子孫、および前記所望の蛋白質をコードする核酸配列を含まない対応の野生型のＥＳ細胞より作製されたキメラ非ヒト動物の血液を採取し、血球数測定機によって分析する。測定された白血球、赤血球、血小板などの血中濃度を前記２種のキメラ非ヒト動物間で比較することによって、導入した核酸配列によってコードされる該所望の蛋白質の血球系細胞の増殖・分化に対する作用を検討することができる。後述の実施例では、導入した核酸配列としてエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードするＤＮＡを用いたが、この場合、キメラマウスにおいて顕著な赤血球増加（形質）が観察された。
以下に、本発明の好ましい実施形態として、免疫グロブリン軽鎖遺伝子を利用したシステムを例に挙げて記載する。
免疫グロブリン（Ｉｇ）は血清中に分泌される蛋白質の中でも最も大量に生産されるものの一つである。例えばヒトにおいては血清蛋白質の１０〜２０％を占め、その濃度は１０〜１００ｍｇ／ｍｌに達する。ＩｇはＢ細胞、主にその終末分化型であるプラズマ細胞において多量に生産されるが、Ｉｇ遺伝子座における高い転写活性、ｍＲＮＡの安定性、蛋白質の分泌生産に特化したプラズマ細胞の機能など、様々な要因がそのＩｇの高レベルの発現に寄与している。さらに、成体において、Ｂ細胞は骨髄で発生し、成熟すると共に脾臓、小腸パイエル板、リンパ節など全身のリンパ組織に移行することから、Ｂ細胞のＩｇ遺伝子の制御領域下で産生された導入遺伝子産物はＩｇ同様に血中またはリンパ液中に放出され、全身に速やかに行き渡る。本発明においては、このような高発現をもたらすＩｇの発現系を利用して所望の蛋白質をコードする核酸配列（例えば、構造遺伝子）を発現させることに利点を有する。
導入遺伝子の効率的な発現のための導入遺伝子挿入箇所は、Ｉｇ軽鎖、好ましくはκ軽鎖が望ましいと考えられる。例えば、マウス免疫グロブリンの９５％はκ軽鎖を含み、その定常領域遺伝子は１つしか存在しない。一方で、軽鎖λは５％であり、４種の異なる遺伝子が存在してそのいずれかが使用される。また、重鎖においても定常領域はμ、γ（４種）、αおよびεの計７種あり、通常、導入遺伝子の挿入は１箇所であることを考慮すると、κ鎖の利用が好ましい。
発現形態としては、機能的なＩｇ軽鎖が産生される条件でさらに導入した核酸配列が発現することが望ましい。本発明のキメラ非ヒト動物またはその子孫は、免疫グロブリン軽鎖遺伝子近傍に上記遺伝子のプロモーター部分を含み、さらにその下流に所望の蛋白質をコードする核酸配列（すなわち、導入遺伝子）が配置されてなる遺伝子発現ユニットをゲノム上に含むことが好ましい。免疫グロブリン軽鎖遺伝子近傍に上記遺伝子のプロモーター部分を含み、さらにその下流に所望の蛋白質をコードする核酸配列（すなわち、導入遺伝子）を含むように動物のゲノムを改変するために、ターゲティングベクターを準備し、このベクターＤＮＡに該所望の蛋白質をコードする核酸配列を挿入する。このベクターとしては、ＣκＰ２ターゲティングベクター（後述の実施例１２参照）が好ましい。ターゲティングベクターは、免疫グロブリン軽鎖遺伝子近傍に上記遺伝子のプロモーター部分を含み、さらにその下流に所望の蛋白質をコードする核酸配列（例えば、導入遺伝子）を導入する核酸配列の挿入部位として適当な制限酵素切断部位が挿入され、該制限酵素切断部位には導入する核酸配列の開始コドンから終止コドンまでを含むＤＮＡ（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ）が挿入される。また、好ましくは開始コドンの上流にコザック配列等の翻訳促進配列を配置することができる。さらに、相同組換え体を簡便に同定するために、外来ＤＮＡが挿入される位置に薬剤耐性遺伝子マーカー、好ましくはピューロマイシン耐性遺伝子をあらかじめ挿入しておくこともできる。
更に、マウスＥＳ細胞として免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子の下流約２５ＫｂのＲＳエレメント領域に薬剤耐性マーカーが挿入された胚性幹細胞を用いることでＩｇκ定常領域近傍に目的とする遺伝子を、ターゲティングベクターを用いて挿入する効率を上げることが出来る。
ターゲティングベクターによる非ヒト動物ＥＳ細胞の形質転換は、相沢慎一（前記）等に記載された方法によって行うことができる。本出願人によって出願されたＰＣＴ国際出願ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット（２０００年３月２日国際公開）に記載された方法と同様に、ピューロマイシン耐性クローンをピックアップし、ゲノムＤＮＡを調製し、サザン解析法により相同組換え体を同定する。ターゲティングベクター中のピューロマイシン耐性遺伝子はＷＯ  ００／１０３８３号パンフレットに記載されたＬｏｘ−Ｐ  Ｐｕｒｏプラスミドに由来し、その両端に順方向にＬｏｘ−Ｐ配列を含んでいる。よってＷＯ  ００／１０３８３号パンフレットに記載された方法で同耐性遺伝子を遺伝子導入されたＥＳ細胞から除去することができる。
本発明において、免疫グロブリン軽鎖遺伝子を利用する場合、ＥＳ細胞注入のための欠損宿主胚としては、ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレットに記載された免疫グロブリン重鎖遺伝子破壊についてホモである非ヒト動物系統を用いることが好ましい。
作製した遺伝子導入ＥＳ細胞を、上記欠損宿主胚の胚胎盤胞または８細胞期胚に毛細管などを用いて注入する。この胚胎盤胞または８細胞期胚を、直接同種の仮親非ヒト動物の卵管に移植するか、一日培養して胚盤胞まで発生したものを該仮親の子宮に移植する。その後、仮親を飼育出産させることにより、仔動物を得る。
キメラ非ヒト動物においては、宿主胚由来の成熟Ｂリンパ球は存在せず、遺伝子導入ＥＳ細胞由来のもののみ存在する。これは、宿主胚として用いる免疫グロブリン重鎖ノックアウト非ヒト動物は、成熟Ｂリンパ球（Ｂ２２０陽性）を欠損し、血中に免疫グロブリンが検出されないことによる（Ｔｏｍｉｚｕｋａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：７２２−７２７，２０００）。遺伝子導入ＥＳ細胞の貢献による、キメラ非ヒト動物における成熟Ｂリンパ球および抗体産生の回復は、ＦＡＣＳ解析、ＥＬＩＳＡ法等によって検出可能である。ターゲティングＥＳ細胞由来Ｂ細胞において挿入した核酸配列が発現するかどうかは、挿入したアレル（対立遺伝子ともいう）のＩｇ軽鎖遺伝子において、部位特異的組換え反応が起こるかどうかに依存している。すなわち挿入アレルのＩｇ軽鎖遺伝子の組換えが成功し、そのｍＲＮＡが機能的な軽鎖をコードする場合、ｍＲＮＡ上に同時に存在する挿入核酸配列（例えば、構造遺伝子）もＩＲＥＳの働きにより蛋白質に翻訳される。さらに、挿入アレルのκ鎖遺伝子の組換えが失敗し、もう一方のアレルのκ鎖あるいはλ鎖が機能的な軽鎖をコードする場合でも、非機能的なκ鎖および導入核酸配列をコードするｍＲＮＡの転写は起こるため、挿入核酸配列由来の蛋白質は発現する。挿入核酸配列の発現が起こらないのは、もう一つのアレルのκ鎖あるいはλ鎖が先に機能的な組換えに成功し、挿入アレルのＩｇκ鎖の組換えが対立遺伝子排除の機構によりシャットオフされる場合である。非ヒト動物においてＢ細胞は胎生１２日目頃より胎児肝組織に出現するが、出生と共に発生の場は骨髄に移動する。胎児期においては、Ｂ細胞は発生の初期段階、すなわち膜型免疫グロブリン受容体を発現する細胞が主体である。成体と比較してＢ細胞自体の数が少ないことおよび膜型Ｉｇを主に発現する細胞では免疫グロブリンをコードするｍＲＮＡ量自体が少ないことによって、挿入核酸配列の発現も成体と比較して非常に少ないと考えられる。抗体産生は離乳期（３週齢）より増加するが、終末分化段階であるプラズマ細胞の増加によるものと想像される。以後、Ｂ細胞は、脾臓、リンパ節、小腸パイエル板などのリンパ組織に移動して抗体および挿入核酸配列を発現する。挿入核酸配列がコードする所望の蛋白質は免疫グロブリン同様、血液やリンパ液中に分泌され、全身に行き渡る。
導入核酸配列のＢ細胞における発現は以下のようにして確認される。導入遺伝子によるｍＲＮＡの発現は例えば脾臓、末梢血有核細胞など、Ｂ細胞を含む組織や細胞集団由来ＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロット法などにより検出される。蛋白質レベルの発現は、導入核酸配列がコードする所望の蛋白質に対する特異的抗体が既にある場合は、キメラマウス血清を用いた酵素免疫測定法、ウエスタンブロット法等を利用して検出できる。また、導入核酸配列をコードするＤＮＡを適当に改変して抗体で検出可能なタグペプチドを付加すれば、該タグペプチドに対する抗体等で導入核酸配列の発現を検出できる。
上述のようにして得られたキメラ非ヒト動物は、効率よくかつ確実に導入した所望の蛋白質をコードする核酸配列を高発現する。この効率の高さは、前述したが、主として以下の点に基づく：
（１）Ｂリンパ球欠損宿主胚の利用によって、キメラ動物のＢリンパ球がキメラ率に関わらず全てＥＳ細胞に由来する。
（２）マウスＥＳ細胞として免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子の下流約２５ＫｂのＲＳエレメント領域に薬剤耐性マーカーが挿入された胚性幹細胞を用いることでＩｇκ遺伝子近傍における相同組換え効率が３０％以上の効率で起こる。
（３）免疫グロブリンの発現系を利用している。
（４）免疫グロブリンの発現は発生初期には非常に少なく、離乳期以降に爆発的な増加を示すため、高発現が胚性致死をもたらすような遺伝子を導入する場合でも、成体における機能を検討することができる。
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されるものでない。
【実施例１】
【０００６】
ｐＰＳｓ  ｈＥＰＯ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用ベクターの構築
１−１．ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ間へのＰａｃＩ−ＦｓｅＩ−ＮｈｅＩサイト導入・・・・・ｐＢＳ＋ＰＦＮ
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）（米国ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を制限酵素ＳａｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）で消化し、以下の合成オリゴをアニールさせてｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を使用したライゲーション反応により導入した。それを大腸菌ＤＨ５αに導入して得られた形質転換体よりＤＮＡを調整し、挿入断片のシーケンスを行った。
Ｓ／ＰＦＮ／Ｈｄ−Ｓ：ＴＣＧＡＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧＣＣＧＧＣＣＣＴＡＧＣＴＡＧＣＡ（配列番号１）
Ｓ／ＰＦＮ／Ｈｄ−ＡＳ：ＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＣＴＡＧＧＧＣＣＧＧＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧ（配列番号２）
１−２．プロモーター、シグナル配列の持つ小ベクターの構築・・・・・・ｐＰＳｓ３．８
ＧｅｎＢａｎｋより取得したＭＵＳＩＧＫＶＲ１（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｋ０２１５９）をもとに、その上流のゲノム配列をＵＣＳＣマウスゲノムデータベースより取得した。プロモータ領域と、イントロンを含むシグナル配列を増幅するＰＣＲプライマーを設計した。
ＰｓｅｃＳＰ  ＦＷ１：
ＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＡＧＴＴＡＴＧＴＧＴＣＣＴＡＧＡＧＧＧＣＴＧＣＡＡＡＣＴＣＡＡＧＡＴＣ（配列番号３、ＰａｃＩサイト含む）
ＰｓｅｃＳＰ  ＲＶ：
ＴＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＴＧＧＣＧＣＣＡＧＴＧＧＡＡＣＣＴＧＧＡＡＴＧＡＴＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＡＴＴＡＴＴＧ（配列番号４、ＳｆｏＩ・ＦｓｅＩ含む）
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μｌ反応液中に上記２種のプライマー各１０ｐｍｏｌ、ＭｇＳＯ４  １．６ｍＭ、鋳型としてマウスＥＳ細胞由来のＤＮＡを添加し、９４℃２分保温した後、９４℃１５秒および６８℃１分を１サイクルとして３０サイクル増幅し、得られた０．８Ｋｂの増幅断片を０．８％ゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって増幅断片（ＰＳプロモーター断片）を回収した。回収されたＰＣＲ増幅断片をＦｓｅＩおよびＰａｃＩ（ＮＥＢ）で酵素消化し、０．８％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。
上記１−１のｐＢＳ＋ＰＦＮをＦｓｅＩおよびＰａｃＩ（ＮＥＢ）消化した後、反応液をフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿し、上記回収されたＤＮＡ断片を挿入し、それを大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調整し、挿入断片のシーケンスを行った。ＰＣＲに起因する変異が無いクローンを選択した。
１−３．κ５’ｉｎｔｒｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｒ領域ＤＮＡ断片の取得
ＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）より取得したマウスＩｇκ遺伝子近傍ゲノムＤＮＡ配列より以下のＤＮＡ（プライマー）を合成した。
５’ｅｎｈａｎｃｅｒＦＷ  Ｋｐ：
ＧＧＧＧＴＡＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧＴＧＴＴＴＧＡＣＣＣＴＴＣＣＣＴＡ（配列番号５、ＫｐｎＩサイト付加）
５’ｅｎｈａｎｃｅｒＲＶ  Ｘｈ：
ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴＡＡＡＣＣＴＡＣＴＧＴＡＴＧＧＡＣＡＧＧＧ（配列番号６、ＸｈｏＩサイト付加）
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μｌ反応液中に上記２種のプライマー各１０ｐｍｏｌ、鋳型としてＢＡＣクローンＲＰ２３−４３５Ｉ４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：ＡＣ０９０２９１）由来のＤＮＡを添加し、９４℃３分保温した後、９４℃１５秒および６８℃４０秒を１サイクルとして３０サイクル増幅し、得られた約０．４８ｋｂの増幅断片を０．８％ゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。回収されたＰＣＲ増幅断片をＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで酵素消化し、０．８％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）（米国ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）をＫｐｎＩおよびＸｈｏＩ消化し、０．８％アガロースゲルより分離精製した後に仔牛小腸由来アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、上記回収されたＤＮＡ断片を挿入し、それを大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、挿入断片のシーケンスを行った。ＰＣＲによる変異の無いクローンを選択しＫｐｎＩおよびＸｈｏＩ消化した後、０．８％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって酵素処理断片（５’エンハンサー断片）を回収した。
１−４．κ３’エンハンサー領域ＤＮＡ断片の取得
ＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）より取得したマウスＩｇκ遺伝子近傍ゲノムＤＮＡ配列より以下のＤＮＡ（プライマー）を合成した。
３’エンハンサーＦＷ  Ｈｄ：
ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＧＣＴＣＡＡＡＣＣＡＧＣＴＴＡＧＧＣＴＡＣＡＣＡ（配列番号７、ＨｉｎｄＩＩＩサイト付）
３’エンハンサーＲＶ  Ｂｍ−２：
ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＡＧＡＡＣＧＴＧＴＣＴＧＧＧＣＣＣＣＡＴＧＡＡ（配列番号８、ＢａｍＨＩサイト付）
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μｌ反応液中に上記２種のプライマー各１０ｐｍｏｌ、鋳型としてＢＡＣクローンＲＰ２３−４３５Ｉ４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：ＡＣ０９０２９１）由来のＤＮＡを添加し、９４℃３分保温した後、９４℃１５秒および６８℃４０秒を１サイクルとして３０サイクル増幅し、得られた約０．８ｋｂの増幅断片を０．８％ゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。回収されたＰＣＲ増幅断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで酵素消化し、０．８％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）（米国ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ消化し、０．８％アガロースゲルより分離精製した後に仔牛小腸由来アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、上記回収されたＤＮＡ断片を挿入し、それを大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、挿入断片のシーケンスを行った。ＰＣＲによる変異の無いクローンを選択しＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ消化した後、０．８％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって酵素処理断片（３’エンハンサー断片）を回収した。
１−５．κｐｏｌｙＡ断片の取得
ＣｋＰ２  ＫＩベクターをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで酵素消化し、約４４０ｂｐの断片を０．８％ゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した後、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて末端平滑を行い、κｐｏｌｙＡ断片を取得した。
１−６．κ５’エンハンサーを含むベクターの構築・・・・・ｐＰＳｓＥ１
上記１−２のｐＰＳｓ３．８をＸｈｏＩ及びＫｐｎＩで酵素消化し、０．８％アガロースゲルより分離精製した後に仔牛小腸由来アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、上記１−３で回収された５’イントロンエンハンサー断片を挿入し、それを大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、連結部分のシーケンスを行った。
１−７．κ５’と３’エンハンサーを含むベクターの構築・・・・・ｐＰＳｓＥ２
上記１−６のｐＰＳｓＥ１をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで酵素消化し、０．８％アガロースゲルより分離精製した後に仔牛小腸由来アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、上記１−４で回収された３’エンハンサー断片を挿入し、それを大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調整し、連結部分のシーケンスを行った。
１−８．ＰＳ型ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用ベクターの構築・・・・・ｐＰＳｓ５．５
上記１−７のｐＰＳｓＥ２をＨｉｎｄＩＩＩで酵素消化し、０．８％アガロースゲルより分離精製した後、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて末端平滑化を行った。大腸菌Ｃ７５由来アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、上記１−５で回収されたκポリＡ断片を挿入し、それを大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、連結部分のシーケンスを行って、順方向に挿入されているクローンを選択した。
１−９．ヒトｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ＤＮＡ断片（シグナル配列無し）の作製
ＥＰＯ（−ＳＰ）ＦＷ：
ＣＡＧＴＣＣＴＧＧＧＣＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＣＴ（配列番号９、ＥＰＯのＳｆｏＩサイトをそのまま利用）
ＥＰＯ（−ＳＰ）ＲＶ：
ＴＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＣＡＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣ（配列番号１０、ＦｓｅＩサイト含む）
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μｌ反応液中に上記２種のプライマー各１０ｐｍｏｌ、鋳型としてヒトＥＰＯ  ｃＤＮＡを添加し、９４℃２分保温した後、９４℃１５秒および６８℃１分を１サイクルとして３０サイクル増幅し、得られた５００ｂｐの増幅断片を０．８％ゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。回収されたＰＣＲ増幅断片をＳｆｏＩおよびＦｓｅＩ（ＮＥＢ）で酵素消化し、０．８％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。回収されたＰＣＲ増幅断片をＳｆｏＩおよびＦｓｅＩ（ＮＥＢ）で酵素消化し、０．８％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。
１−１０．ｐＰＳｓ  ｈＥＰＯ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用ベクターの構築・・・・・ｐＰＳｓ  ｈＥＰＯ
上記１−８のｐＰＳｓ５．５をＳａｌＩおよびＦｓｅＩで消化後、大腸菌由来アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、１−９で作製したＤＮＡ断片を挿入した後、ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、連結部分の塩基配列を確認して、ｐＰＳｓ  ｈＥＰＯ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用ベクター（図１）を取得した。
【実施例２】
【０００７】
ｐＮＰｓ  ｈＥＰＯ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用ベクターの構築
２−１．プロモーター、シグナル配列を持つ小ベクターの構築・・・・・・ｐＮＰｓ３．７
ＧｅｎＢａｎｋより取得したＭＭＵ２３１２２５（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＪ２３１２２５）をもとに、その上流のゲノム配列をＵＣＳＣマウスゲノムデータベースより取得。プロモータ領域とイントロンを含むシグナル配列を増幅するＰＣＲプライマーを設計した。
Ｐ２ＳＰ  ＦＷ１：
ＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＡＴＡＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴＡＣＣＡＧＴＡＣＣＣＡＣＴＣＴＴ（配列番号１１、ＰａｃＩサイト含む）
Ｐ２ＳＰ  ＲＶ：
ＴＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＴＧＧＣＧＣＣＴＣＴＧＧＡＣＡＧＴＡＴＧＡＣＴＡＧＡＡＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＡＧ（配列番号１２、ＳｆｏＩ・ＦｓｅＩサイト含む）
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μｌ反応液中に上記２種のプライマー各１０ｐｍｏｌ、ＭｇＳＯ４  １．６ｍＭ、鋳型としてマウスＥＳ細胞由来のＤＮＡを添加し、９４℃２分保温した後、９４℃１５秒および６８℃１分を１サイクルとして３０サイクル増幅し、得られた０．５Ｋｂの増幅断片を０．８％ゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。回収されたＰＣＲ増幅断片をＦｓｅＩおよびＰａｃＩ（ＮＥＢ）で酵素消化し、０．８％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。
上記１−１のｐＢＳ＋ＰＦＮをＦｓｅＩおよびＰａｃＩ（ＮＥＢ）消化した後、反応液をフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿し、上記回収されたＤＮＡ断片を挿入し、それを大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、挿入断片のシーケンスを行った。ＰＣＲに起因する変異が無いクローンを選択した。
２−２．κ５’エンハンサーを含むベクターの構築・・・・ｐＮＰｓＥ１
上記１−９のベクターをＸｈｏＩ及びＫｐｎＩで酵素消化し、０．８％アガロースゲルより分離精製した後に仔牛小腸由来アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、上記１−３で回収された５’イントロンエンハンサー断片を挿入し、それを大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調整し、連結部分のシーケンスを行った。
２−３．κ５’と３’エンハンサーを含むベクターの構築・・・・・ｐＮＰｓＥ２
上記２−２のｐＮＰｓＥ１をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで酵素消化し、０．８％アガロースゲルより分離精製した後に仔牛小腸由来アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、上記１−４で回収された３’エンハンサー断片を挿入し、それを大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、連結部分のシーケンスを行った。
２−４．ＮＰ型ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用ベクターの構築・・・・・・ｐＮＰｓ５．４
上記２−１のｐＮＰｓ３．７をＨｉｎｄＩＩＩで酵素消化し、０．８％アガロースゲルより分離精製した後、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて末端平滑化を行った。大腸菌Ｃ７５由来アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、上記１−５で回収されたκポリＡ断片を挿入し、それを大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調整し、連結部分のシーケンスを行って、順方向に挿入されているクローンを選択した。
２−５．ｐＮＰｓ  ｈＥＰＯ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用ベクターの構築
上記２−４のｐＮＰｓ５．４をＳａｌＩおよびＦｓｅＩで消化後、大腸菌由来アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、上記１−９で作製したＤＮＡ断片を挿入した後、ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、連結部分の塩基配列の確認して、ｐＮＰｓ  ｈＥＰＯ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用ベクター（図２）を取得した。
【実施例３】
【０００８】
ｐＣｋｓ  ｈＥＰＯ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用ベクターの構築
３−１．Ｐ２プロモーターＤＮＡ断片の取得
ＣｋＰ２  ＫＩベクターをＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩ酵素消化し、約２１０ｂｐの断片を０．８％ゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した後、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて末端平滑化を行った。
３−２．Ｃｋ型ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用ベクターの構築・・・・・ｐＣｋｓ４．９
上記２−４のｐＮＰｓ５．４をＰａｃＩおよびＳｆｏＩで酵素消化し０．８％アガロースゲルより分離精製した後、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて末端平滑化を行った。大腸菌Ｃ７５由来アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、上記３−１のＰ２プロモーター断片を挿入し、それを大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調整し、連結部分のシーケンスを行って、順方向に挿入されているクローンを選択した。
３−３．ヒトｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ＤＮＡ断片（シグナル配列有り）の作製
ｈＥＰＯ−ＢＩ  ＦＷ：
ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＡＴＧＴＣＣＴＧＣＣＴ（配列番号１３、ＢａｍＨＩサイト含む）
ｈＥＰＯ−Ｘｈ  ＲＶ：
ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＣＴＡＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣ（配列番号１４、ＸｈｏＩサイト含む）
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μｌ反応液中に上記２種のプライマー各１０ｐｍｏｌ、ＭｇＳＯ４  １．６ｍＭ、鋳型としてマウスＥＳ細胞由来のＤＮＡを添加し、９４℃３分保温した後、９４℃１５秒および６８℃１分を１サイクルとして３０サイクル増幅し、得られた０．６８Ｋｂの増幅断片を０．８％ゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。回収されたＰＣＲ増幅断片をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ（Ｒｏｃｈｅ）で酵素消化し、０．８％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した後、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて末端平滑化を行った。
３−４．ｐＣｋｓ  ｈＥＰＯ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用ベクターの構築・・・・・ｐＣｋｓ  ｈＥＰＯ
上記３−２のｐＣｋｓ４．９をＦｓｅＩで酵素消化し、０．８％アガロースゲルより分離精製した後、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて末端平滑化を行った。大腸菌Ｃ７５由来アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、上記３−３のヒトエリスロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）ＤＮＡ断片を挿入し、それを大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調整し、連結部分のシーケンスを行って、順方向に挿入されているクローンを選択し、ｐＣｋｓ  ｈＥＰＯ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用ベクター（図３）を取得した。
【実施例４】
【０００９】
ミエローマ細胞へのベクター導入
３７℃、６．５％ＣＯ２下でＲＰＭＩ１６４０  １０％ＦＢＳ培地を用いて４回から５回継代し、１ｘ１０６程度まで培養したＰ３−Ｘ６３．Ａｇ６５３細胞を一度ＰＢＳでＷａｓｈしたのち、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で６ｘ１０５／ｍｌに懸濁して６ｗｅｌｌプレートに１ｍｌずつ播種した。ＧｅｎｅＪａｍｍｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（米国ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）６ｕｌを無血清ＲＰＭＩ１６４０培地１００ｕｌと混合した後、室温で５分インキュベートし、滅菌水で２００ｎｇ／ｕｌに調製したｐＰＳｓ  ｈＥＰＯ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用ベクター、ｐＮＰｓ  ｈＥＰＯ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用ベクター、ｐＣｋｓ  ｈＥＰＯ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用ベクターを５ｕｌ添加して室温で１０分インキュベートして複合体を形成させた。トランスフェクション試薬−ベクター複合体を、６ウエルプレートに播種した細胞に滴下して加え、３７℃、６．５％ＣＯ２下で４時間培養した後、ＲＰＭＩ１６４０、２０％ＦＢＳを１．１ｍｌ加えた。２４時間後、ＲＮＡ回収のため、培養細胞１ｍｌを回収した。トランスフェクションから４８時間後の培養上清を回収し、ヒトＥＰＯ  ＥＬＩＳＡに供した。トランスフェクション用導入試薬としてＤＩＭＲＩＥ−Ｃ  Ｒｅａｇｅｎｔ（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）も同様に用いることが出来た。
【実施例５】
【００１０】
導入ヒトＥＰＯ遺伝子の転写レベルの比較
上記実施例４で行った、トランスフェクション２４時間後の培養細胞１ｍｌを回収し、Ｉｓｏｇｅｎ（日本国ニッポンジーン）を用いて添付のプロトコールに従い全ＲＮＡを精製した。ＤＮａｓｅ処理をした後、ＲＮａｓｅを含まない滅菌水に溶解した。５０ｎｇの全ＲＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて添付のプロトコールに従い、逆転写反応を行った。逆転写反応後、以下のプライマーを用いて、ｈＥＰＯのＲＴ−ＰＣＲを行った。
ｈＥＰＯ−ＲＴ  ＦＷ５：ＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＴＴＧＧＴＣＡＡＣＴＣＴＴＣ（配列番号１５）
ＣｋｐｏｌｙＡ  Ｒ２：ＣＧＣＴＴＧＴＧＧＧＧＡＡＧＣＣＴＣＣＡＡＧＡＣＣ（配列番号１６）
内部標準として、Ｍｏｕｓｅ  β−ａｃｔｉｎ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ（日本国東洋紡）を用いてβ−ａｃｔｉｎのＲＴ−ＰＣＲを行った。
ＬＡ−Ｔａｑ（日本国タカラバイオ）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μｌ反応液中に上記２種のプライマー各１０ｐｍｏｌ、ｃＤＮＡを添加し、９４℃３分保温した後、９４℃１５秒および６８℃１分を１サイクルとして２６、２９、３２サイクル増幅し、２％アガロースゲルにて電気泳動した（図４）。得られた結果から、ベクター構造がｐＣｋｓタイプよりも、ｐＮＰｓやｐＰＳｓタイプのほうが転写レベルで発現に有利であることが示された。
【実施例６】
【００１１】
培養上清中のヒトＥＰＯ濃度の比較
トランスフェクション４８時間後の培養上清を回収し、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＩＶＤ  Ｈｕｍａｎ  ＥＰＯ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（米国Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ）を用いて添付のプロトコールに従い、培養上清中のヒトエリスロポエチンを定量した（図５、ＴａｂｌｅＩ）。得られた結果はベクター構造がｐＣｋｓタイプ、ｐＮＰｓタイプ、ｐＰＳｓタイプの順番に培養上清中のヒトＥＰＯ分泌量が増加することを示した。また、実施例５の転写レベルの比較実験においてｐＮＰｓタイプ、ｐＰＳｓタイプ両者で優位な差が認められなかったことから、転写後段階の差によってｐＮＰｓタイプとｐＰＳｓタイプの培養上清中ヒトＥＰＯ濃度の顕著な違いが生じたと考えられた。
【実施例７】
【００１２】
マウスＲＳエレメントターゲティング用ベクター
（１）ＫＯ基本ベクターの構築
ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット（前掲）に記載されたｐＬｏｘＰ−ＳＴｎｅｏプラスミドをＸｈｏＩ消化し、両端にＬｏｘＰ配列を持つＮｅｏ耐性遺伝子（ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ）を取得した。ＬｏｘＰ−Ｎｅｏの両末端をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化し、ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−Ｂを取得した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（日本国東洋紡）に新たな制限酵素サイトを付加するため以下のＤＮＡを合成した。
ＬｉｎｋＡ１：ＴＣＧＡＧＴＣＧＣＧＡＣＡＣＣＧＧＣＧＧＧＣＧＣＧＣＣＣ（配列番号１７）
ＬｉｎｋＡ２：ＴＣＧＡＧＧＧＣＧＣＧＣＣＣＧＣＣＧＧＴＧＴＣＧＣＧＡＣ（配列番号１８）
ＬｉｎｋＢ１：ＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧＣＣＧＧＣＣＧＴＣＧＡＣＧ（配列番号１９）
ＬｉｎｋＢ２：ＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＧＧＣＣＧＧＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＣ（配列番号２０）
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）を制限酵素ＳａｌＩおよびＸｈｏＩで処理した反応液をフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿した。プラスミドに新たな制限酵素サイトＮｒｕＩ、ＳｇｒＡＩおよびＡｓｃＩを付加するため、ＬｉｎｋＡ１およびＬｉｎｋＡ２を合成した。この２つのオリゴＤＮＡからなるリンカーを制限酵素処理したプラスミドに挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、プラスミドｐＢｌｕｅＬＡを取得した。
続いて、ｐＢｌｕｅＬＡを制限酵素ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩで処理した反応液をフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿した。プラスミドに新たな制限酵素サイトＰａｃＩ、ＦｓｅＩおよびＳａｌＩを付加するため、ＬｉｎｋＢ１およびＬｉｎｋＢ２を合成した。この２つのオリゴＤＮＡからなるリンカーを制限酵素処理したプラスミドに挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、プラスミドｐＢｌｕｅＬＡＢを取得した。ＢｌｕｅＬＡＢをＥｃｏＲＶ消化後、反応液をフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿し、ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−Ｂを挿入した後、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、プラスミドｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏを取得した。
ｐＭＣ１ＤＴ−Ａ（日本国ライフテックオリエンタル株式会社）をＸｈｏＩおよびＳａｌＩ消化後、０．８％アガロースゲルにアプライし、約１Ｋｂのバンドを分離回収し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがってＤＴ−Ａフラグメントを回収した。
ｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−ＮｅｏをＸｈｏＩ消化後、反応液をフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿し、ＤＴ−Ａフラグメントを挿入した後、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、ＫＯ基本ベクターｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａを取得した。
（２）マウスＲＳエレメント５’上流ゲノム領域断片の取得
ＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）より取得したマウスＲＳエレメント遺伝子近傍ゲノムＤＮＡ配列より以下のＤＮＡ（プライマー）を合成した。
ＲＳ５’ＦＷ３：
ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＧＴＴＡＡＧＡＣＴＡＴＣＴＣＧＴＧＡＡＧＴＧ（配列番号２１）
ＲＳ５’ＲＶ３：
ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＣＡＣＡＧＧＴＴＧＧＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＴＧＴＧＴＧＧＴＴＧＣＴＧＴ（配列番号２２）
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μｌ反応液中に上記２種のプライマー各１０ｐｍｏｌ、鋳型としてＢＡＣクローンＲＰ２３−４３５Ｉ４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：ＡＣ０９０２９１）由来のＤＮＡを添加し、９４℃２分保温した後、９４℃１５秒および６８℃５分を１サイクルとして３３サイクル増幅し、得られた５ｋｂの増幅断片を０．８％ゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。回収されたＰＣＲ増幅断片をＮｏｔＩおよびＳａｌＩで酵素消化し、０．８％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。
ｐＢｌｕｅＬＡＢをＮｏｔＩおよびＳａｌＩ消化した後、反応液をフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿し、上記回収されたＤＮＡ断片を挿入し、それを大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調整し、挿入断片のシーケンスを行った。ＰＣＲに起因する変異が無いクローンを選択しＮｏｔＩおよびＳａｌＩ消化して得られる５ｋｂの断片を、０．８％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。
（３）マウスＲＳエレメント３’下流ゲノム領域断片の取得
ＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）より取得したマウスＲＳエレメント遺伝子近傍ゲノムＤＮＡ配列より以下のＤＮＡ（プライマー）を合成した。
ＲＳ３’ＦＷ２：ＴＴＧＧＣＧＣＧＣＣＣＴＣＣＣＴＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＴＴＧＡＧＣＴＣＡＧＡＴＴＴＧＡ（配列番号２３）
ＲＳ３’ＲＶ３：ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＴＴＡＣＴＧＴＣＴＣＡＧＣＡＡＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＡＡＣＡＧＧＧＧ（配列番号２４）
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μｌ反応液中に上記２種のプライマー各１０ｐｍｏｌ、鋳型としてＢＡＣクローンＲＰ２３−４３５Ｉ４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：ＡＣ０９０２９１）由来のＤＮＡを添加し、９４℃２分保温した後、９４℃１５秒および６８℃２分を１サイクルとして３３サイクル増幅し、得られた２ｋｂの増幅断片を０．８％ゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。回収されたＰＣＲ増幅断片をＡｓｃＩおよびＸｈｏＩで酵素消化し、０．８％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。
ｐＢｌｕｅＬＡＢをＡｓｃＩおよびＸｈｏＩ消化した後、反応液をフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿し、上記回収されたＤＮＡ断片を挿入し、それを大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調整し、挿入断片のシーケンスを行った。ＰＣＲに起因する変異が無いクローンを選択しＡｓｃＩおよびＸｈｏＩ消化して得られる２ｋｂの断片を、０．８％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。
（４）基本ベクターへのマウスＲＳエレメント３’下流ゲノム領域断片の挿入
ｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＤＴ−ＡをＡｓｃＩおよびＸｈｏＩで消化後、得られる約７．６ＫｂのＤＮＡ断片を０．８％アガロースゲルより分離精製したものに、（３）で作製したゲノム断片を挿入した後、大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ  Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（米国ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）に導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、連結部分の塩基配列の確認を行った。
（５）マウスＲＳエレメント３’下流ゲノム領域断片を持つＫＯ基本ベクターへのマウスＲＳ領域５’上流ゲノム領域断片の挿入
（４）で得られたプラスミドをＮｏｔＩおよびＳａｌＩ消化後、得られる９．６ｋｂのＤＮＡ断片を０．８％アガロースゲルより分離精製したものに、（２）で作製したゲノム断片を挿入した後、大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ  Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（米国ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）に導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、連結部分の塩基配列を確認して、マウスＲＳエレメントターゲティング用ベクターｐＢｌｕｅＲＳ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ−３’ＫＯ−５’ＫＯ（図６）を取得した。
【実施例８】
【００１３】
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ用マウスＲＳエレメントターゲティングベクターの調製
ｐＢｌｕｅＲＳ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ−３’ＫＯ−５’ＫＯ６０μｇを、スペルミジン添加（１ｍＭ  ｐＨ７．０米国シグマ）バッファー（日本国ロシュ・ダイアグノスティックス、制限酵素用Ｈバッファー）を用い、ＮｏｔＩを用いて３７℃で５時間消化し、フェノール／クロロホルム抽出後、２．５容量の１００％エタノール、および０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、−２０℃で１６時間保存した。ＮｏｔＩで一本鎖化されたベクターを遠心して回収後、７０％エタノールを加えて滅菌した。クリーンベンチ内で７０％エタノールを除き、１時間風乾させた。０．５μｇ／μＬのＤＮＡ溶液となるようにＨＢＳ溶液を加え、１時間室温で保存し、エレクトロポレーション用マウスＲＳエレメントターゲティング用ベクターｐＢｌｕｅＲＳ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ−３’ＫＯ−５’ＫＯ−ＮｏｔＩの調製を行なった。
【実施例９】
【００１４】
ゲノムサザン解析用プローブの調製
ＢＡＣクローンＲＰ２３−４３５Ｉ４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：ＡＣ０９０２９１）を用いた塩基配列情報を基に、５’ＫＯの上流域５７３ｍｅｒを含むオリゴＤＮＡを取得するため以下のＤＮＡを合成した。
ＲＳ５’Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ＦＷ１：ＣＡＴＡＣＡＡＡＣＡＧＡＴＡＣＡＣＡＣＡＴＡＴＡＣ（配列番号２５）
ＲＳ５’Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ＲＶ２：ＧＴＣＡＴＴＡＡＴＧＧＡＡＧＧＡＡＧＣＴＣＴＣＴＡ（配列番号２６）
Ｔａｋａｒａ  Ｚ  Ｔａｑ（日本国宝酒造）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μＬ反応液中に上記２種のプライマー各１０ｐｍｏｌ、鋳型としてクローン番号ＲＰ２３−４３４ＩのＢＡＣ由来ＤＮＡを添加し、９４℃２分保温したのち、９４℃３０秒、６０℃２０秒、および７２℃１分を１サイクルとして２５サイクル増幅し、得られた５７３ｍｅｒの増幅断片を０．８％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって５’側ゲノムサザン用プローブ、５’ＫＯ−プローブを回収した。
ＢＡＣクローンＲＰ２３−４３５Ｉ４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：ＡＣ０９０２９１）を用いた塩基配列情報を基に、３’ＫＯの下流域６００ｍｅｒを含むオリゴＤＮＡを取得するため以下のＤＮＡを合成した。
ＲＳ３’Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ＦＷ１：ＴＣＴＴＡＣＴＡＧＡＧＴＴＣＴＣＡＣＴＡＧＣＴＣＴ（配列番号２７）
ＲＳ３’Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ＲＶ２：ＧＧＡＡＣＣＡＡＡＧＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＴＴ（配列番号２８）
Ｔａｋａｒａ  Ｚ  Ｔａｑ（日本国宝酒造）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μＬ反応液中に上記２種のプライマー各１０ｐｍｏｌ、鋳型としてクローン番号ＲＰ２３−４３４ＩのＢＡＣ由来ＤＮＡを添加し、９４℃２分保温したのち、９４℃３０秒、６０℃２０秒、および７２℃１分を１サイクルとして２５サイクル増幅し、得られた６００ｍｅｒの増幅断片を０．８％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって３’側ゲノムサザン用プローブ、３’ＫＯ−プローブを回収した。
【実施例１０】
【００１５】
ＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞の取得
マウスＥＳ細胞は通常以下に記すような方法で樹立することができる。雌雄マウスを交配することにより得られる受精後２．５日の胚を採取し、ＥＳ細胞用培地中でインビトロ培養し、該培養胚のうち胚盤胞まで発生が進んだ胚を分離し、そして該胚を、フィーダー細胞培地中に播種して培養し、該培養胚からＥＳ様形態で生育しているものの細胞塊をトリプシンを含有するＥＳ細胞用培地を用いて分散処理、及び、フィーダー細胞培地を用いて培養し、更にはＥＳ細胞用培地を用いて継代培養し増殖する細胞を単離する。
相同組換えにより、ＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞の取得のため、実施例７において作製したｐＢｌｕｅＲＳ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ−３’ＫＯ−５’ＫＯを制限酵素ＮｏｔＩ（日本国宝酒造）で線状化し、確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、１９９５、羊土社、日本国）に従ってマウスＥＳ細胞ＴＴ２Ｆ（Ｙａｇｉら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１４：７０，１９９３）へ導入した。
ＴＴ２Ｆ細胞の培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシンＣ（米国シグマ）処理したＧ４１８耐性初代培養細胞（日本国インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させたＴＴ２Ｆ細胞をトリプシン処理し、３×１０７個／ｍｌとなるようにＨＢＳに懸濁した。その後、０．５ｍｌの細胞懸濁液を１０μｇのベクターＤＮＡと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離：０．４ｃｍ、米国バイオラッド）にてエレクトロポレーションを行った（容量：９６０μＦ、電圧：２４０Ｖ、室温）。エレクトロポレーションした細胞を１０ｍｌのＥＳ培地に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞を播種した１００ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）１枚に播種した。２４時間後に２００μｇ／ｍｌのネオマイシン（米国シグマ）を含むＥＳ培地と置き換えた。７日後に生じたコロニーをピックアップし、それぞれを２４穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その２／３を０．２ｍｌの保存用培地（ＦＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ、米国シグマ）に懸濁し、−８０℃にて保存した。残りの１／３は１２穴ゼラチンコートプレートに播種し、２日間培養して１０６〜１０７個の細胞からゲノムＤＮＡをＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（米国Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ社）により調製した。これらネオマイシン耐性ＴＴ２Ｆ細胞ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（日本国宝酒造）で消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ターゲティングベクター３’相同領域の下流に位置するＤＮＡ断片（３’ＫＯ−プローブ、実施例９参照）をプローブとして相同組換え体を検出した。野生型ＴＴ２Ｆ細胞ではＥｃｏＲＩ消化により、１本のバンド（約５．７Ｋｂ）が検出された。相同組換え体においては，２本のバンド（約５．７Ｋｂと約７．４Ｋｂ）が検出されることが予想されたが、ネオマイシン耐性株において約７．４Ｋｂの新たなバンドが確認された（図７）。更に、３’ＫＯ−プローブによるサザン解析で相同組換えが確認されたクローンのゲノムＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩ（日本国宝酒造）で消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ターゲティングベクター５’相同領域の上流に位置するＤＮＡ断片（５’ＫＯ−プローブ、実施例９参照）をプローブとして相同組換え体を検出した。野生型ＴＴ２Ｆ細胞ではＰｓｔＩ消化により、１本のバンド（約６．１Ｋｂ）が検出された。相同組換え体においては，２本のバンド（約６．７Ｋｂと約６．１Ｋｂ）が検出されることが予想されたが、ネオマイシン耐性株において約６．７Ｋｂの新たなバンドが確認された（図７）。すなわち、これらのクローンはマウスＲＳエレメントを含む近傍染色体領域を欠失し、代わりにネオマイシン耐性遺伝子（両端にはターゲティングベクター由来の制限酵素サイト部位を含む）が挿入されたものである。３’および５’ＫＯ−プローブによるサザン解析の結果、ｐＢｌｕｅＲＳ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ−３’ＫＯ−５’ＫＯを制限酵素ＮｏｔＩで線状化した場合には７２株中９株（１２．５％）が相同組換え体であるという結果を��た。
取得されたＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞の核型解析を記載（相沢慎一、前記）の方法に従い実施し、取得されたＥＳ細胞に異常核型が検出されないことを確認した。
【実施例１１】
【００１６】
ＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞株およびＢリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を用いたキメラマウスの作製
免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトのホモ接合体においては、機能的なＢリンパ球が欠損し、抗体が産生されない（Ｋｉｔａｍｕｒａら，Ｎａｔｕｒｅ，３５０：４２３−４２６，１９９１）。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。この場合、キメラマウスにおいて機能的なＢリンパ球は、大部分が注入したＥＳ細胞に由来する。本実施例では富塚らの報告（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：７２２−７，２０００）に記載された免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトマウスについてＭＣＨ（ＩＣＲ）（日本国日本クレア社）系統への戻し交配を３回以上行った個体を宿主胚調製用として用いた。
上記実施例１０で得られたピュローマイシン耐性マウスＥ８細胞株（＃３２）を凍結ストックより立ち上げ、それらを、上記免疫グロブリンμ鎖ノックアウトマウスホモ接合体の雌雄マウスの交配により得られた８細胞期胚に、それぞれ胚１つあたり８〜１０個注入した。ＥＳ培地（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、１９９５、羊土社、日本国）で一晩培養して胚盤胞まで発生させた後、偽妊娠処理後２．５日の仮親ＭＣＨ（ＩＣＲ）マウス（日本国日本クレア社）の子宮に、片側の子宮あたりそれぞれ約１０個のインジェクション胚を移植した。実施例１０の＃３２を用いて作製されたインジェクション胚を計４８０個移植した結果、８０匹の子キメラマウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において、宿主胚由来の白色の中にＥＳ細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかによって判定される。誕生した８０匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわちＥＳ細胞の貢献の認められる個体は４８匹であった。下記実施例３２で行われたヒトＥＰＯ遺伝子転写レベルの比較実験、下記実施例３３で行われた血清中のＥＰＯ濃度比較実験及び下記実施例３４で行われた末梢血液の血球解析実験において、実施例１１で得られたキメラマウスはコントロール個体として用いられた。
【実施例１２】
【００１７】
ｐＣκＰ２  ＫＩベクターの作製
（１）クローニング部位近傍断片の作製
マウス免疫グロブリンカッパ鎖（Ｉｇκ）定常領域遺伝子下流にマウス免疫グロブリンκ鎖プロモーター（Ｐ２プロモーター）、制限酵素認識配列（ＳａｌＩ，ＦｓｅＩ，ＮｈｅＩ認識配列）、マウス免疫グロブリンκ鎖ポリＡシグナル領域およびピューロマイシン耐性遺伝子発現ユニットが上に記載された順番に導入されたゲノム断片を作製した。以下にその方法を具体的に記す。
（１．１）クローニング部位上流の断片の調製
ＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）より取得したマウスＩｇＧκ遺伝子配列より以下のＤＮＡを合成した。
ｉｇｋｃ１：ａｔｃｔｃｇａｇｇａａｃｃａｃｔｔｔｃｃｔｇａｇｇａｃａｃａｇｔｇａｔａｇｇ（配列番号２９）
ｉｇｋｃ２：ａｔｇａａｔｔｃｃｔａａｃａｃｔｃａｔｔｃｃｔｇｔｔｇａａｇｃｔｃｔｔｇａｃ（配列番号３０）
５’側プライマーであるｉｇｋｃ１の末端にはＸｈｏＩ認識配列を、３’側プライマーであるｉｇｋｃ２にはＥｃｏＲＩ認識配列を付加した。ＴａｋａＬａ  ＬＡ−Ｔａｑ（日本国宝酒造）の添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μＬ反応液中にプライマー各１０ｐｍｏｌおよび鋳型としてＩｇ軽鎖Ｃκ−Ｊκを含むλクローン由来ＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫＩＩ（＋）（日本国東洋紡）クローニングしたもの（ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット）２５ｎｇを添加し、９４℃で１分保温したのち、９４℃３０秒および６８℃３分を１サイクルとして２５サイクル増幅した。得られた反応液をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した後、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動にてＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国Ｂｉｏ１０１）を用いて目的の断片を回収して増幅断片Ａを得た。ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ２  ＫＳ−ベクター（米国ストラタジーン）に該増幅断片Ａを挿入し、それを大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、塩基配列を確認し、プラスミドｐＩｇＣκＡを取得した。
（１．２）クローニング部位下流の断片の調製
ＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）より取得したマウスＩｇＧκ遺伝子配列より以下のＤＮＡを合成した。
ｉｇｋｃ３：ａｔｇａａｔｔｃａｇａｃａａａｇｇｔｃｃｔｇａｇａｃｇｃｃａｃｃ（配列番号３１）
ｉｇｋｃ４：ａｔｇｇａｔｃｃｔｃｇａｇｔｃｇａｃｔｇｇａｔｔｔｃａｇｇｇｃａａｃｔａａａｃａｔｔ（配列番号３２）
５’側プライマーであるｉｇｋｃ３の末端にはＥｃｏＲＩ認識配列を、３’側プライマーであるｉｇｋｃ４にはプライマーの５’側からＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩおよびＳａｌＩ認識配列を付加した。ＴａｋａＬａ  ＬＡ−Ｔａｑ（日本国宝酒造）の添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μＬ反応液中にプライマー各１０ｐｍｏｌおよび鋳型としてＩｇ軽鎖Ｃκ−Ｊκを含むλクローン由来ＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫＩＩ（＋）（日本国東洋紡）クローニングしたもの（ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット）２５ｎｇを添加し、９４℃で１分保温したのち、９４℃３０秒、５５℃３０秒および７２℃１分を１サイクルとして２５サイクル増幅した。得られた反応液をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した後、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動にてＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国Ｂｉｏ１０１）を用いて目的の断片を回収して増幅断片Ｂを得た。ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したｐＩｇＣκＡベクターに得られた増幅断片Ｂを挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、塩基配列を確認し、プラスミドｐＩｇＣκＡＢを取得した。
（２）ピュ−ロマイシン耐性遺伝子の導入
Ｌｏｘ−Ｐ  Ｐｕｒｏプラスミド（ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット）をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて末端を平滑化した。０．８％アガロースゲル電気泳動にてＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国Ｂｉｏ１０１）を用いてｌｏｘＰ−ピューロマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を回収した。ｐＩｇＣκＡＢをＳａｌＩで消化して末端平滑化したプラスミドに、得られたｌｏｘＰ−ピューロマイシン耐性遺伝子断片を挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、連結部分の塩基配列を確認し、プラスミドｐＩｇＣκＡＢＰを取得した。
（３）ＩＲＥＳ遺伝子の導入
ＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）より取得したｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ（脳心筋炎ウイルス）由来のＩＲＥＳ遺伝子配列より以下のＤＮＡを合成した。
ｅＩＲＥＳＦＷ：ａｔｇａａｔｔｅｇｃｃｃｃｔｃｔｃｃｃｔｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｔａ（配列番号３３）
ｅｓＩＲＥＳＲＶ：ａｔｇａａｔｔｃｇｔｃｇａｃｔｔｇｔｇｇｃａａｇｃｔｔａｔｃａｔｃｇｔｇｔｔ（配列番号３４）
５’側プライマーであるｅＩＲＥＳＦＷの末端にはＥｃｏＲＩ認識配列を、３’側プライマーであるｅｓＩＲＥＳＲＶにはプライマーの５’側からＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ認識配列を付加した。ＴａｋａＬａ  ＬＡ−Ｔａｑ（日本国宝酒造）の添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μＬ反応液中にプライマー各１０ｐｍｏｌおよび鋳型としてｐＩＲＥＳｈｙｇプラスミド（米国クロンテック）１５０ｎｇを添加し、９４℃で１分保温したのち、９４℃３０秒、５５℃３０秒および７２℃１分を１サイクルとして２５サイクル増幅した。得られた反応液を０．８％アガロースゲル電気泳動にかけてＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国Ｂｉｏ１０１）を用いて目的の断片を回収した。ｐＧＥＭ−Ｔベクター（米国プロメガ）に得られたＤＮＡ断片を挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、塩基配列を確認し、プラスミドＩＲＥＳ−Ｓａｌ／ｐＧＥＭを取得した。このプラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動にてＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国Ｂｉｏ１０１）を用いて目的の断片を回収した。ｐＩｇＣκＡＢＰをＥｃｏＲＩで消化したプラスミドに、得られたＩＲＥＳ遺伝子を挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、連結部分の塩基配列を確認し、プラスミドｐＩｇＣκＡＢＰＩＲＥＳを取得した。
（４）ｐΔＣκＳａｌプラスミドの作製
ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレットに記載されている免疫グロブリン遺伝子軽鎖κターゲティング用ターゲティングベクタープラスミドをＳａｃＩＩで消化した後、ＥｃｏＲＩを用いて部分消化した。０．８％アガロースゲル電気泳動にてＬｏｘＰ−ＰＧＫＰｕｒｏ部分を切り出した残りの１４．６ＫｂのＤＮＡを分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国Ｂｉｏ１０１）を用いて回収した。得られたＤＮＡに以下の合成ＤＮＡを挿入することにより、ＳａｌＩ認識配列を導入した。
Ｓａｌ１ｐｌｕｓ：ａｇｔｃｇａｃａ（配列番号３５）
Ｓａｌ１ｍｉｎｕｓ：ａａｔｔｔｇｔｃｇａｃｔｇｃ（配列番号３６）
得られたプラスミドを大腸菌ＤＨ５αに導入し、得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、プラスミドｐΔＣκＳａｌを取得した。
（５）ｐＫＩκプラスミドの作製
上記（３）で得られたｐＩｇＣκＡＢＰＩＲＥＳプラスミドをＸｈｏＩで消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動にてＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国Ｂｉｏ１０１）を用いてＣκ−ＩＲＥＳ−ｌｏｘＰ−ピューロマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を回収した。上記（４）で作製されたｐΔＣｋＳａｌをＳａｌＩで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、前記ＤＮＡ断片を挿入し、それを大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、連結部分の塩基配列を確認して、プラスミドｐＫＩκを取得した。
（６）ｐＩｇＣκΔＩＲＥＳ断片の作製
上記（３）で得られたｐＩｇＣκＡＢＰＩＲＥＳプラスミドをＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩで部分消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動にてＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国Ｂｉｏ１０１）を用いてＩＲＥＳ部分を削除したＤＮＡ断片（ｐＩｇＣκΔＩＲＥＳ断片）を回収した。
（７）Ｐ２プロモーター断片の調製
ＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）より取得したマウスＩｇκプロモーター領域遺伝子配列より以下のＤＮＡを合成した。
Ｐ２Ｆ：ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＧＧＴＧＡＴＴＡＴＴＣＡＧＡＧＴＡＧＴＴＴＴＡＧＡＴＧＡＧＴＧＣＡＴ（配列番号３７）
Ｐ２Ｒ：ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＴＧＴＣＴＴＴＧＡＡＣＴＴＴＧＧＴＣＣＣＴＡＧＣＴＡＡＴＴＡＣＴＡ（配列番号３８）
５’側プライマーであるＰ２ＦにはＨｉｎｄ  ＩＩＩ認識配列を、３’側プライマーであるＰ２ＲにはＳａｌＩ認識配列を付加した。マウスゲノムＤＮＡを鋳型として、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ（日本国東洋紡）により増幅されたＤＮＡ断片をフェノールクロロフォルム抽出後、エタノール沈殿で回収した。回収されたＤＮＡ断片をＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＳａｌＩで消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動にてＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国Ｂｉｏ１０１）を用いて回収した。Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＳａｌＩで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＫＳ−ベクター（米国Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に回収された増幅断片を挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、塩基配列を確認し、Ｉｇκプロモーター領域遺伝子配列を含むプラスミドを取得した。得られたプラスミドをＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＳａｌＩで消化した後、０．８％アガロースゲル電気泳動にてＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国Ｂｉｏ１０１）を用いてＰ２プロモーター断片を回収した。
（８）部分長ＣκｐｏｌｙＡ断片の作製
ＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）より取得したマウスＩｇＣκｐｏｌｙＡ領域遺伝子配列より以下のＤＮＡを合成した。
ＰＰＦ：
ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＣＧＣＴＡＧＣＡＧＡＣＡＡＡＧＧＴＣＣＴＧＡＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＣＣ（配列番号３９）
ＰＰＲ：
ＧＡＡＧＡＴＣＴＣＡＡＧＴＧＣＡＡＡＧＡＣＴＣＡＣＴＴＴＡＴＴＧＡＡＴＡＴＴＴＴＣＴＧ（配列番４０号）
５’側プライマーであるＰＰＦにはＳａｌＩ，ＦｓｅＩ，ＮｈｅＩ認識配列を、３’側プライマーであるＰＰＲにはＢｇｌＩＩ認識配列を付加した。マウスゲノムＤＮＡを鋳型として、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ（日本国東洋紡）により増幅されたＤＮＡ断片をフェノールクロロフォルム抽出後、エタノール沈殿で回収した。回収されたＤＮＡ断片をＳａｌＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動にてＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国Ｂｉｏ１０１）を用いて回収した。ＳａｌＩおよびＢｇｌＩＩで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したｐＳＰ７２ベクター（米国Ｐｒｏｍｅｇａ社）に回収された増幅断片を挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、塩基配列を確認し、部分長ＣκｐｏｌｙＡ領域遺伝子配列を含むプラスミドを取得した。得られたプラスミドをＳａｌＩおよびＢｇｌＩＩで消化した後、０．８％アガロースゲル電気泳動にてＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国Ｂｉｏ１０１）を用いて部分長ＣκｐｏｌｙＡ断片を回収した。
（９）完全長ＣκｐｏｌｙＡ断片の作製
ＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）より取得したマウスＩｇＣκｐｏｌｙＡ領域遺伝子配列より以下のＤＮＡを合成した。
ＴＰＦ：ＧＧＡＡＴＴＣＡＧＡＣＡＡＡＧＧＴＣＣＴＧＡＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＣＣ（配列番号４１）
ＴＰＲ：ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＴＣＣＴＣＡＡＡＣＣＴＡＣＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＡＧＡＡＡＴＡＡＧ（配列番号４２）
５’側プライマーであるＴＰＦにはＥｃｏＲＩ認識配列を、３’側プライマーであるＴＰＲにはＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を付加した。マウスゲノムＤＮＡを鋳型として、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ（日本国東洋紡）により増幅されたＤＮＡ断片をフェノールクロロフォルム抽出後、エタノール沈殿で回収した。回収されたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動にてＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国Ｂｉｏ１０１）を用いて回収した。ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＫＳ−ベクター（米国Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に回収された増幅断片を挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、塩基配列を確認し、完全長ＣκポリＡ領域遺伝子配列を含むプラスミドを取得した。得られたプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、０．８％アガロースゲル電気泳動にてＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国Ｂｉｏ１０１）を用いて完全長ＣκポリＡ断片を回収した。
（１０）完全長ＣκポリＡ断片、Ｐ２プロモーター断片、部分長ＣκポリＡ断片から構成されるＤＮＡ断片Ａの作製
ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＫＳ−ベクター（米国Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に完全長ＣκｐｏｌｙＡ断片、Ｐ２プロモーター断片、部分長ＣκｐｏｌｙＡ断片を挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、完全長ＣκｐｏｌｙＡ断片、Ｐ２プロモーター断片、部分長ＣκｐｏｌｙＡ断片の順番にＤＮＡ断片が挿入されていることを塩基配列のレベルで確認し、ＤＮＡ断片Ａ遺伝子配列を含むプラスミドを取得した。得られたプラスミドをＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩで消化した後、０．８％アガロースゲル電気泳動にてＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国Ｂｉｏ１０１）を用いてＤＮＡ断片Ａを回収した。
（１１）ｐＩｇＣκΔＩＲＥＳ  ＰｒｏＡプラスミドの作製
大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したｐＩｇＣκΔＩＲＥＳ断片にＤＮＡ断片Ａを挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、ＤＮＡ断片Ａが挿入されていることを塩基配列のレベルで確認し、ＤＮＡ断片Ａ遺伝子配列を含むｐＩｇＣκΔＩＲＥＳ  ＰｒｏＡプラスミドを取得した。
（１２）ＣκＰ２Ｈプラスミドの作製
ｐＩｇＣκΔＩＲＥＳ  ＰｒｏＡプラスミドをＸｈｏＩで消化した後、０．８％アガロースゲル電気泳動にてＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国Ｂｉｏ１０１）を用いてＩｇＣκ上流ゲノム領域、ＩｇＣκ、ＤＮＡ断片Ａ、Ｌｏｘ−Ｐ  Ｐｕｒｏ断片より構成されるＤＮＡ断片を回収した。ＳａｌＩで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したｐΔＣκＳａｌＩに回収したＤＮＡ断片を挿入し、大腸菌ＸＬ１０−ＧＯＬＤ（米国Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、ＩｇＣκ上流ゲノム領域、ＩｇＣκ、ＤＮＡ断片Ａ、Ｌｏｘ−Ｐ  Ｐｕｒｏ断片より構成されるＤＮＡ断片が挿入されていることを塩基配列のレベルで確認し、ＣκＰ２Ｈプラスミドを取得した。
（１３）Ｃκ５’ｇｅｎｏｍｉｃプラスミドの作製
ＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）より取得したマウスＩｇＣκ及び上流ゲノム領域遺伝子配列より以下のＤＮＡを合成した。
５ＧＦ：
ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＣＡＧＡＧＣＡＡＡＴＧＧＧＴＴＣＴＡＣＡＧＧＣＣＴＡＡＣＡＡＣＣＴ（配列番号４３）
５ＧＲ：
ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧＡＣＡＡＴＧＧ（配列番号４４）
５’側プライマーである５ＧＦにはＮｏｔＩ認識配列を、３’側プライマーである５ＧＲにはＥｃｏＲＩ認識配列を付加した。マウスゲノムＤＮＡを鋳型として、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ（日本国東洋紡）により増幅されたＤＮＡ断片をフェノールクロロフォルム抽出後、エタノール沈殿で回収した。回収されたＤＮＡ断片をＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動にてＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国Ｂｉｏ１０１）を用いて回収した。ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＫＳ−ベクター（米国Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に回収された増幅断片を挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、塩基配列を確認し、Ｃκ５’ゲノム領域遺伝子配列を含むＣκ５’ゲノムプラスミドを取得した。
（１４）ＣκＰ２ＫＩΔＤＴプラスミドの作製
ＣκＰ２ＨプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化した後、０．８％アガロースゲル電気泳動にて１１ＫｂのＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国Ｂｉｏ１０１）を用いて５’末端にＥｃｏＲＩサイトを３’末端にＸｈｏＩサイトを持つＤＮＡ断片を回収した。ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したＣκ５’ゲノムプラスミドに回収したＤＮＡ断片を挿入し、大腸菌ＸＬ１０−ＧＯＬＤ（米国Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、回収された断片がＣκ５’ゲノムプラスミドに挿入されていることを塩基配列のレベルで確認し、ＣκＰ２ＫＩΔＤＴプラスミドを取得した。
（１５）ＤＴ−Ａ断片の調製
ｐＫＩκプラスミドをＸｈｏＩおよびＫｐｎＩで消化した後、０．８％アガロースゲル電気泳動にて約１ＫｂのＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国Ｂｉｏ１０１）を用いてＤＴ−Ａ断片を取得した。
（１６）ｐＣκＰ２ＫＩベクターの作製
ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したＣκＰ２ＫＩΔＤＴプラスミドにＤＴ−Ａ断片を挿入し、大腸菌ＸＬ１０−ＧＯＬＤ（米国Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、ＤＴ−Ａ断片がＣκＰ２ＫＩΔＤＴプラスミドに挿入されていることを塩基配列のレベルで確認し、ｐＣκＰ２ＫＩベクター（図８）を取得した。
【実施例１３】
【００１８】
ｐＣκＰ２ＫＩベクターへのヒトＥＰＯ遺伝子の挿入
（６．１）ヒトＥｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ＤＮＡ断片の作製
ｈＥＰＯ  Ｎｐ：ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＡＴＧＴＣＣＴＧ（配列番号４５）
ｈＥＰＯ  Ｒｐ：ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＣＡＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡ（配列番号４６）
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μｌ反応液中に上記２種のプライマー各１０ｐｍｏｌ、鋳型としてヒトＥＰＯ  ｃＤＮＡを添加し、９４℃２分保温した後、９４℃１５秒および６８℃１分を１サイクルとして３０サイクル増幅し、得られた５８０ｂｐの増幅断片を０．８％ゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。回収されたＰＣＲ増幅断片をＸｈｏＩで酵素消化し、０．８％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）（米国ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）をＸｈｏＩ消化し、０．８％アガロースゲルより分離精製した後に仔牛小腸由来アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、上記回収されたＤＮＡ断片を挿入し、それを大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調整し、挿入断片のシーケンスを行った。ＰＣＲによる変異の無いクローンを選択しＸｈｏＩ消化した後、０．８％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがってヒトエリスロポエチンＤＮＡ断片を回収した。
（６．２）ｐＣｋＰ２  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターの構築
ｐＣκＰ２ＫＩベクターをＳａｌＩで消化後、仔牛小腸由来アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、（６．１）で作製したヒトエリスロポエチンＤＮＡ断片を挿入した後、大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ  Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（米国ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）に導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、連結部分の塩基配列を確認して、ｐＣｋＰ２  ｈＥＰＯ  ＫＩベクター（図９）を取得した。
【実施例１４】
【００１９】
エレクトロポレーション用ｐＣｋＰ２  ｈＥＰＯＫＩベクターの調製
ｐＣｋＰ２  ｈＥＰＯ  ＫＩベクター６０μｇを、スペルミジン添加（１ｍＭ  ｐＨ７．０米国シグマ）バッファー（日本国ロシュ・ダイアグノスティックス、制限酵素用Ｈバッファー）を用い、ＮｏｔＩを用いて３７℃で５時間消化し、フェノール／クロロホルム抽出後、２．５容量の１００％エタノール、および０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、−２０℃で１６時間保存した。ＮｏｔＩで一本鎖化されたベクターを遠心して回収後、７０％エタノールを加えて滅菌した。クリーンベンチ内で７０％エタノールを除き、１時間風乾させた。０．５μｇ／μＬのＤＮＡ溶液となるようにＨＢＳ溶液を加え、１時間室温で保存し、エレクトロポレーション用ｐＣｋＰ２  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターの調製を行なった。
【実施例１５】
【００２０】
ｐＣｋＰ２  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターとＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞株を用いたＣｋＰ２  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株の取得
ヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが相同組換えにより免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子下流に挿入されたマウスＥＳ細胞株取得のため、実施例１３で作製したｐＣｋＰ２  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターを制限酵素ＮｏｔＩ（日本国宝酒造）で線状化し、確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、１９９５、羊土社、日本国）に従ってＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞へ導入した。
ＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞の培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシンＣ（米国シグマ）処理したＧ４１８耐性初代培養細胞（日本国インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させたＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞をトリプシン処理し、３×１０７個／ｍｌとなるようにＨＢＳに懸濁してから、０．５ｍｌの細胞懸濁液を１０μｇのベクターＤＮＡと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離：０．４ｃｍ、米国バイオラッド）にてエレクトロポレーションを行った（容量：９６０μＦ、電圧：２５０Ｖ、室温）。エレクトロポレーションした細胞を１０ｍｌのＥＳ培地（相沢慎一、前記）に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞を播種した１００ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）１枚に播種した。３６時間後に０．８μｇ／ｍｌのピューロマイシン（米国シグマ）を含むＥＳ培地と置き換えた。７日後に生じたコロニーのうち計２４個をピックアップし、それぞれを２４穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その２／３を０．２ｍｌの保存用培地（ＦＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ、米国シグマ）に懸濁し、−８０℃にて保存した。残りの１／３は１２穴ゼラチンコートプレートに播種し、２日間培養して１０６〜１０７個の細胞からゲノムＤＮＡをＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（米国Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ社）により調製した。これらのピューロマイシン耐性ＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（日本国宝酒造）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット（実施例４８参照）に記載の発明で使用された、Ｉｇ軽鎖Ｊκ−ＣκゲノムＤＮＡの３’端のＤＮＡ断片（ＸｈｏＩ〜ＥｃｏＲＩ、約１．４ｋｂ、図５）をプローブとして相同組換え体を検出した。その結果、２４株中１５株（６２．５％）が相同組換え体であるという結果を得た。野生型ＴＴ２Ｆ細胞ではＥｃｏＲＩ消化により、１本のバンドが検出された。相同組換え体においては、このバンドに加えてその下部に新たなバンドが出ることが予想される（図１０）が、ピューロマイシン耐性株においてこの新たなバンドが確認された。すなわち、これらのクローンは一方のアレルの免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されたものである。
【実施例１６】
【００２１】
ＣｋＰ２  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株およびＢリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を用いたキメラマウスの作製
免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトのホモ接合体においては、機能的なＢリンパ球が欠損し、抗体が産生されない（Ｋｉｔａｍｕｒａら，Ｎａｔｕｒｅ，３５０：４２３−４２６，１９９１）。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。この場合、キメラマウスにおいて機能的なＢリンパ球は、大部分が注入したＥＳ細胞に由来する。本実施例では富塚らの報告（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：７２２−７，２０００）に記載された免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトマウスについてＭＣＨ（ＩＣＲ）（日本国日本クレア社）系統への戻し交配を３回以上行った個体を宿主胚調製用として用いた。
上記実施例１５で得られ、免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されていることが確認されたＣｋＰ２  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株（＃５７，６９）を凍結ストックより立ち上げ、それらを、上記免疫グロブリンμ鎖ノックアウトマウスホモ接合体の雌雄マウスの交配により得られた８細胞期胚に、それぞれ胚１つあたり８〜１０個注入した。ＥＳ培地（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、１９９５、羊土社、日本国）で一晩培養して胚盤胞まで発生させた後、偽妊娠処理後２．５日の仮親ＭＣＨ（ＩＣＲ）マウス（日本国日本クレア社）の子宮に、片側の子宮あたりそれぞれ約１０個のインジェクション胚を移植した。実施例１５の＃５７，６９を用いて作製されたインジェクション胚をそれぞれ計１００個移植した結果、２３匹、３６匹それぞれ子キメラマウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において、宿主胚由来の白色の中にＥＳ細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかによって判定される。誕生した２３匹、３６匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわちＥＳ細胞の貢献の認められる個体はそれぞれ１５匹、２９匹であった。これらの結果より、免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されているＣｋ  ＥＰＯマウスＥＳ細胞株＃５７，６９はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。
【実施例１７】
【００２２】
ｐＮＰ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターの構築
１．上記実施例１２のｐＣｋＰ２  ＫＩベクターに一本鎖化サイトＡｓｃＩを加えたベクター作製・・・ｐＣｋＰ２＋Ａｓ  ＫＩ
以下の合成オリゴをアニールさせて、ＡｓｃＩリンカーを合成した。
ＡｓｃＩ  ｔｏｐ  ｌｉｎｋｅｒ：ＧＧＣＣＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＧＣ（配列番号４７）
ＡｓｃＩ  ｂｏｔｔｏｍ  ｌｉｎｋｅｒ：ＧＧＣＣＧＣＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴ（配列番号４８）
ｐＣｋＰ２  ＫＩベクターを制限酵素ＮｏｔＩ（Ｒｏｃｈｅ）で消化し、０．８％アガロースゲルより分離精製した後にｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を使用したライゲーション反応によりＡｓｃＩリンカーを導入した。それを大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ  Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（米国ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）に導入して得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、挿入断片の塩基配列を確認した。
２．ｐＢｌｕｅＬＡＢのＰａｃＩ・ＦｓｅＩ間にＮｈｅＩサイト導入・・・・・ｐＢｌｕｅＬＡＢ＋Ｎｈの構築
ｐＢｌｕｅＬＡＢを制限酵素ＰａｃＩ（ＮＥＢ）で消化後、核酸精製用マイクロスピンカラムＳ−２００ＨＲ（アマシャム）を用いてバッファー置換し、続いて制限酵素ＦＳｅＩ（ＮＥＢ）で消化。０．８％アガロースゲルより分離精製した後に以下の合成オリゴをアニールさせて、ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（日本国タカラバイオ）を使用したライゲーション反応により導入した。それを大腸菌ＤＨ５αに導入して得られた形質転換体よりＤＮＡを調整し、挿入断片のシーケンスを行った。
Ｐａｃ−Ｎｈｅ−Ｆｓｅ  Ｓ：ＴＡＡＧＧＧＣＴＡＧＣＴＡＧＧＧＣＣＧＧ（配列番号４９）
Ｐａｃ−Ｎｈｅ−Ｆｓｅ  ＡＳ：ＣＣＣＴＡＧＣＴＡＧＣＣＣＴＴＡＡＴ（配列番号５０）
３．ｐＢｌｕｅＬＡＢ＋ＮｈのＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ間にＨｐａＩサイト導入・・・・・ｐＢｌｕｅＬＡＢ＋ＮｈＨｐの構築
ｐＢｌｕｅＬＡＢ＋Ｎｈを制限酵素ＳａｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）で消化し、０．８％アガロースゲルより分離精製した後に以下の合成オリゴをアニールさせて、ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（日本国タカラバイオ）を使用したライゲーション反応により導入した。それを大腸菌ＤＨ５αに導入して得られた形質転換体よりＤＮＡを調整し、挿入断片のシーケンスを行った。
Ｓ／ＨｐａＩ／Ｈｄ−Ｓ：ＴＣＧＡＧＴＴＡＡＣ（配列番号５１）
Ｓ／ＨｐａＩ／Ｈｄ−ＡＳ：ＡＧＣＴＧＴＴＡＡＣ（配列番号５２）
４．ｐＣｋＰ２＋Ａｓ  ＫＩよりＣｋ−ｐｏｌｙＡを含むＰ２プロモーター部分除いたベクター・・・・ｐＣｋｐＡＰ２の構築
ｐＣｋＰ２＋Ａｓ  ＫＩを制限酵素ＨｐａＩ−ＮｈｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）で消化して生じる９５２ｂｐの断片を０．８％アガロースゲルより分離精製し回収した。ｐＢｌｕｅＬＡＢ＋ＮｈＨｐを制限酵素ＨｐａＩおよびＮｈｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）消化し、０．８％アガロースゲルより分離精製した後に仔牛小腸由来アルカリフォスファターゼ（日本国タカラバイオ）を用いて末端脱リン酸化した。上記９５２ｂｐの断片をｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（日本国タカラバイオ）を使用したライゲーション反応により導入した。それを大腸菌ＤＨ５αに導入して得られた形質転換体よりＤＮＡを調整し、連結部分のシーケンスを行った。
５．Ｐ２プロモーターを除去してマルチクローニングサイト（ＳａｌＩ、ＦｓｅＩ、ＰａｃＩ）を導入したベクター・・・ｐＣｋｐＡＭＣＳ
上記４のｐＣｋｐＡＰ２を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｈｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）消化。０．８％アガロースゲルより約４ｋｂの断片を回収した。以下の合成オリゴをアニールさせて、ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（日本国タカラバイオ）を使用したライゲーション反応により導入した。
ＳＰＦＮｌｉｎｋｅｒ−Ｓ：ＡＧＣＴＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧＣＣＧＧＣＣＧ（配列番号５３）
ＳＰＦＮｌｉｎｋｅｒ−ＡＳ：ＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＧＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＴＣＧＡＣ（配列番号５４）
６．ＫＩ大ベクターの構築・・・・・ｐＣｋＰ２ΔＰ
上記５のｐＣｋｐＡＭＣＳを制限酵素ＨｐａＩ、ＮｈｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）で消化し、０．８％アガロースゲルよりＣｋ−ｐｏｌｙＡ−ＭＣＳを含む約７００ｂｐ断片を回収した。ｐＣｋＰ２＋ＡｓＫＩを制限酵素ＨｐａＩ−ＮｈｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）で消化し、１９．６ｋｂを０．８％アガロースゲルより回収した後、大腸菌由来アルカリフォスファターゼ（日本国タカラバイオ）を用いて末端脱リン酸化した。前述の約７００ｂｐ断片をｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（日本国タカラバイオ）を使用したライゲーション反応により導入した。それを大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ  Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（米国ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）に導入して得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、連結部分の塩基配列を確認した。
７．ｐＮＰ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターの構築
上記実施例２のｐＮＰｓｈＥＰＯ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用ベクターをＳａｌＩ及びＦｓｅＩで酵素消化し、０．８％アガロースゲルより約１．２ｋｂの断片を分離精製した後、上記６のｐＣｋＰ２ΔＰをＳａｌＩおよびＦｓｅＩで酵素消化後、大腸菌Ｃ７５由来アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに挿入。それを大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ  Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（米国ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）に導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、連結部分の塩基配列を確認して、ｐＮＰ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクター（図１１）を取得した。
【実施例１８】
【００２３】
エレクトロポレーション用ｐＮＰ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターの調製
ｐＮＰ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクター６０μｇを、スペルミジン添加（１ｍＭ  ｐＨ７．０米国シグマ）バッファー（日本国ロシュ・ダイアグノスティックス、制限酵素用Ｈバッファー）を用い、ＮｏｔＩを用いて３７℃で５時間消化し、フェノール／クロロホルム抽出後、２．５容量の１００％エタノール、および０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、−２０℃で１６時間保存した。ＮｏｔＩで一本鎖化されたベクターを遠心して回収後、７０％エタノールを加えて滅菌した。クリーンベンチ内で７０％エタノールを除き、１時間風乾させた。０．５μｇ／μＬのＤＮＡ溶液となるようにＨＢＳ溶液を加え、１時間室温で保存し、エレクトロポレーション用ｐＮＰ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターの調製を行なった。
【実施例１９】
【００２４】
ｐＮＰ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターとＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞株を用いたＮＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株の取得
ヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが相同組換えにより免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子下流に挿入されたマウスＥＳ細胞株取得のため、実施例１８で作製したｐＮＰ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターを制限酵素ＮｏｔＩ（日本国宝酒造）で線状化し、確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、１９９５、羊土社、日本国）に従ってＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞へ導入した。
ＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞の培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシンＣ（米国シグマ）処理したＧ４１８耐性初代培養細胞（日本国インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させたＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞をトリプシン処理し、３×１０７個／ｍｌとなるようにＨＢＳに懸濁してから、０．５ｍｌの細胞懸濁液を１０μｇのベクターＤＮＡと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離：０．４ｃｍ、米国バイオラッド）にてエレクトロポレーションを行った（容量：９６０μＦ、電圧：２５０Ｖ、室温）。エレクトロポレーションした細胞を１０ｍｌのＥＳ培地（相沢慎一、前記）に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞を播種した１００ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）１枚に播種した。３６時間後に０．８μｇ／ｍｌのピューロマイシン（米国シグマ）を含むＥＳ培地と置き換えた。７日後に生じたコロニーのうち計２４個をピックアップし、それぞれを２４穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その２／３を０．２ｍｌの保存用培地（ＦＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ、米国シグマ）に懸濁し、−８０℃にて保存した。残りの１／３は１２穴ゼラチンコートプレートに播種し、２日間培養して１０６〜１０７個の細胞からゲノ厶ＤＮＡをＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（米国Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ社）により調製した。これらのピューロマイシン耐性ＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（日本国宝酒造）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット（実施例４８参照）に記載の発明で使用された、Ｉｇ軽鎖Ｊκ−ＣκゲノムＤＮＡの３’端のＤＮＡ断片（ＸｈｏＩ〜ＥｃｏＲＩ、約１．４ｋｂ．ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット、特に図２５）をプローブとして相同組換え体を検出した。その結果、２４株中１１株（４５．８％）が相同組換え体であるという結果を得た。野生型ＴＴ２Ｆ細胞ではＥｃｏＲＩ消化により、１本のバンドが検出された。相同組換え体においては、このバンドに加えてその下部に新たなバンドが出ることが予想される（図１２）が、ピューロマイシン耐性株においてこの新たなバンドが確認された。すなわち、これらのクローンは一方のアレルの免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されたものである。
【実施例２０】
【００２５】
ＮＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株およびＢリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を用いたキメラマウスの作製
免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトのホモ接合体においては、機能的なＢリンパ球が欠損し、抗体が産生されない（Ｋｉｔａｍｕｒａら，Ｎａｔｕｒｅ，３５０：４２３−４２６，１９９１）。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。この場合、キメラマウスにおいて機能的なＢリンパ球は、大部分が注入したＥＳ細胞に由来する。本実施例では富塚らの報告（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：７２２−７，２０００）に記載された免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトマウスについてＭＣＨ（ＩＣＲ）（日本国日本クレア社）系統への戻し交配を３回以上行った個体を宿主胚調製用として用いた。
上記実施例１９で得られ、免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されていることが確認されたＮＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株（＃１０）を凍結ストックより立ち上げ、それらを、上記免疫グロブリンμ鎖ノックアウトマウスホモ接合体の雌雄マウスの交配により得られた８細胞期胚に、それぞれ胚１つあたり８〜１０個注入した。ＥＳ培地（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、１９９５、羊土社、日本国）で一晩培養して胚盤胞まで発生させた後、偽妊娠処理後２．５日の仮親ＭＣＨ（ＩＣＲ）マウス（日本国日本クレア社）の子宮に、片側の子宮あたりそれぞれ約１０個のインジェクション胚を移植した。実施例１９の＃１０を用いて作製されたインジェクション胚をそれぞれ計１００個移植した結果、１８匹それぞれ子キメラマウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において、宿主胚由来の白色の中にＥＳ細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかによって判定される。誕生した２３匹、３６匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわちＥＳ細胞の貢献の認められる個体は１３匹であった。これらの結果より、免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されているＮＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株＃１０はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。
【実施例２１】
【００２６】
ｐＰＳ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターの構築
上記実施例１のｐＰＳｓ  ｈＥＰＯ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用ベクターをＳａｌＩ及びＦｓｅＩで酵素消化し、０．８％アガロースゲルより約１．３ｋｂの断片を分離精製した後、上記実施例１７のｐＣｋＰ２ΔＰをＳａｌＩおよびＦｓｅＩで酵素消化後、大腸菌Ｃ７５由来アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに挿入。それを大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ  Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（米国ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）に導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、連結部分の塩基配列を確認して、ｐＰＳ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクター（図１３）を取得した。
【実施例２２】
【００２７】
エレクトロポレーション用ｐＰＳ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターの調製
ｐＰＳ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクター６０μｇを、スペルミジン添加（１ｍＭ  ｐＨ７．０米国シグマ）バッファー（日本国ロシュ・ダイアグノスティックス、制限酵素用Ｈバッファー）を用い、ＮｏｔＩを用いて３７℃で５時間消化し、フェノール／クロロホルム抽出後、２．５容量の１００％エタノール、および０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、−２０℃で１６時間保存した。ＮｏｔＩで一本鎖化されたベクターを遠心して回収後、７０％エタノールを加えて滅菌した。クリーンベンチ内で７０％エタノールを除き、１時間風乾させた。０．５μｇ／μＬのＤＮＡ溶液となるようにＨＢＳ溶液を加え、１時間室温で保存し、エレクトロポレーション用ｐＰＳ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターの調製を行なった。
【実施例２３】
【００２８】
ｐＰＳ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターとＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞株を用いたＰＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株の取得
ヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが相同組換えにより免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子下流に挿入されたマウスＥＳ細胞株取得のため、実施例２１で作製したｐＰＳ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターを制限酵素ＮｏｔＩ（日本国宝酒造）で線状化し、確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、１９９５、羊土社、日本国）に従ってＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞へ導入した。
ＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞の培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシンＣ（米国シグマ）処理したＧ４１８耐性初代培養細胞（日本国インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させたＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞をトリプシン処理し、３×１０７個／ｍｌとなるようにＨＢＳに懸濁してから、０．５ｍｌの細胞懸濁液を１０μｇのベクターＤＮＡと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離：０．４ｃｍ、米国バイオラッド）にてエレクトロポレーションを行った（容量：９６０μＦ、電圧：２５０Ｖ、室温）。エレクトロポレーションした細胞を１０ｍｌのＥＳ培地（相沢慎一、前記）に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞を播種した１００ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）１枚に播種した。３６時間後に０．８μｇ／ｍｌのピューロマイシン（米国シグマ）を含むＥＳ培地と置き換えた。７日後に生じたコロニーのうち計２４個をピックアップし、それぞれを２４穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その２／３を０．２ｍｌの保存用培地（ＦＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ、米国シグマ）に懸濁し、−８０℃にて保存した。残りの１／３は１２穴ゼラチンコートプレートに播種し、２日間培養して１０６〜１０７個の細胞からゲノムＤＮＡをＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（米国Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ社）により調製した。これらのピューロマイシン耐性ＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（日本国宝酒造）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット（実施例４８参照）に記載の発明で使用された、Ｉｇ軽鎖Ｊκ−ＣκゲノムＤＮＡの３’端のＤＮＡ断片（ＸｈｏＩ〜ＥｃｏＲＩ、約１．４ｋｂ、００／１０３８３号パンフレット、特に図２５）をプローブとして相同組換え体を検出した。その結果、２４株中９株（３７．５％）が相同組換え体であるという結果を得た。野生型ＴＴ２Ｆ細胞ではＥｃｏＲＩ消化により、１本のバンドが検出された。相同組換え体においては、このバンドに加えてその下部に新たなバンドが出ることが予想される（図１４）が、ピューロマイシン耐性株においてこの新たなバンドが確認された。すなわち、これらのクローンは一方のアレルの免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されたものである。
【実施例２４】
【００２９】
ＰＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株およびＢリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を用いたキメラマウスの作製
免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトのホモ接合体においては、機能的なＢリンパ球が欠損し、抗体が産生されない（Ｋｉｔａｍｕｒａら，Ｎａｔｕｒｅ，３５０：４２３−４２６，１９９１）。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。この場合、キメラマウスにおいて機能的なＢリンパ球は、大部分が注入したＥＳ細胞に由来する。本実施例では富塚らの報告（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：７２２−７，２０００）に記載された免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトマウスについてＭＣＨ（ＩＣＲ）（日本国日本クレア社）系統への戻し交配を３回以上行った個体を宿主胚調製用として用いた。
上記実施例２３で得られ、免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されていることが確認されたＰＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株（＃６）を凍結ストックより立ち上げ、それらを、上記免疫グロブリンμ鎖ノックアウトマウスホモ接合体の雌雄マウスの交配により得られた８細胞期胚に、それぞれ胚１つあたり８〜１０個注入した。ＥＳ培地（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、１９９５、羊土社、日本国）で一晩培養して胚盤胞まで発生させた後、偽妊娠処理後２．５日の仮親ＭＣＨ（ＩＣＲ）マウス（日本国日本クレア社）の子宮に、片側の子宮あたりそれぞれ約１０個のインジェクション胚を移植した。実施例２３のＰＳ  ＥＰＯマウスＥＳ細胞株（＃６）を用いて作製されたインジェクション胚を計１６０個移植した結果、５３匹の子キメラマウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において、宿主胚由来の白色の中にＥＳ細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかによって判定される。誕生した５３匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわちＥＳ細胞の貢献の認められる個体は２６匹であった。これらの結果より、免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されているＰＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株＃６はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。
【実施例２５】
【００３０】
ｐＣｋＰ２  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターとマウスＴＴ２Ｆ細胞株を用いたＣｋＰ２  ｈＥＰＯマウスＴＴ２Ｆ細胞株の取得
ヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが相同組換えにより免疫グロブリンＫ軽鎖遺伝子下流に挿入されたマウスＥＳ細胞株取得のため、実施例１３で作製したｐＣｋＰ２  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターを制限酵素ＮｏｔＩ（日本国宝酒造）で線状化し、確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、１９９５、羊土社、日本国）に従ってマウスＥＳ細胞ＴＴ２Ｆ（Ｙａｇｉら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１４：７０，１９９３）へ導入した。
マウスＴＴ２Ｆ細胞の培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシンＣ（米国シグマ）処理したＧ４１８耐性初代培養細胞（日本国インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させたＴＴ２Ｆ細胞をトリプシン処理し、３×１０７個／ｍｌとなるようにＨＢＳに懸濁してから、０．５ｍｌの細胞懸濁液を１０μｇのベクターＤＮＡと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離：０．４ｃｍ、米国バイオラッド）にてエレクトロポレーションを行った（容量：９６０μＦ、電圧：２４０Ｖ、室温）。エレクトロポレーションした細胞を１０ｍｌのＥＳ培地（相沢慎一、前記）に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞を播種した１００ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）１枚に播種した。３６時間後に０．８μｇ／ｍｌのピューロマイシン（米国シグマ）を含むＥＳ培地と置き換えた。７日後に生じたコロニーのうち計９６個をピックアップし、それぞれを２４穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その２／３を０．２ｍｌの保存用培地（ＥＳ培地＋１０％ＤＭＳＯ、米国シグマ）に懸濁し、−８０℃にて保存した。残りの１／３は１２穴ゼラチンコートプレートに播種し、２日間培養して１０６〜１０７個の細胞からゲノムＤＮＡをＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（米国Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ社）により調製した。これらのピューロマイシン耐性マウスＥＳ細胞ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（日本国宝酒造）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット（実施例４８参照）に記載の発明で使用された、Ｉｇ軽鎖Ｊκ−ＣκゲノムＤＮＡの３’端のＤＮＡ断片（ＸｈｏＩ〜ＥｃｏＲＩ、約１．４ｋｂ、ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット、特に図２５）をプローブとして相同組換え体を検出した。その結果、９６株中１１株（１１．５％）が相同組換え体であるという結果を得た。野生型ＴＴ２Ｆ細胞ではＥｃｏＲＩ消化により、１本のバンドが検出された。相同組換え体においては、このバンドに加えてその下部に新たなバンドが出ることが予想される（図１５）が、ピューロマイシン耐性株においてこの新たなバンドが確認された。すなわち、これらのクローンは一方のアレルの免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されたものである。
【実施例２６】
【００３１】
ＣｋＰ２  ｈＥＰＯマウスＴＴ２Ｆ細胞株より薬剤耐性遺伝子を除去したＣｋＰ２  ΔＰ  ｈＥＰＯマウスＴＴ２Ｆ細胞株の取得
ＣｋＰ２  ｈＥＰＯマウスＴＴ２Ｆ細胞株より薬剤耐性遺伝子（Ｐｕｒｏｒ）を除去したＣｋＰ２  ΔＰ  ｈＥＰＯ遺伝子導入ＴＴ２Ｆ細胞株取得のため、ｐＣＡＧＧＳ−Ｃｒｅベクター（Ｓｕｎａｇａら、Ｍｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｅｖ．，４６：１０９−１１３，１９９７）を確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、１９９５、羊土社、日本国）に従ってＣｋＰ２  ｈＥＰＯマウスＴＴ２Ｆ細胞へ導入した。
ＣｋＰ２  ｈＥＰＯマウスＴＴ２Ｆ細胞の培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシンＣ（米国シグマ）処理したＧ４１８耐性初代培養細胞（日本国インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させたＣｋＰ２  ｈＥＰＯマウスＴＴ２Ｆ細胞をトリプシン処理し、３×１０７個／ｍｌとなるようにＨＢＳに懸濁してから、０．５ｍｌの細胞懸濁液を１０μｇのベクターＤＮＡと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離：０．４ｃｍ、米国バイオラッド）にてエレクトロポレーションを行った（容量：９６０μＦ、電圧：２５０Ｖ、室温）。エレクトロポレーションした細胞を１０ｍｌのＥＳ培地（相沢慎一、前記）に懸濁し、それより２．５ｍｌ分を、あらかじめフィーダー細胞を播種した６０ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）１枚に播種した。３０時間後にＥＳ細胞１０００個をあらかじめフィーダー細胞を播種した１００ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）１枚に播種した。６日後に生じたコロニーのうち計４８個をピックアップし、それぞれを２４穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その２／３を０．２ｍｌの保存用培地（ＦＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ、米国シグマ）に懸濁し、−８０℃にて保存した。残りの１／３は１２穴ゼラチンコートプレートに播種し、２日間培養して１０６〜１０７個の細胞からゲノムＤＮＡをＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（米国Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ社）により調製した。これらマウスＥＳ細胞ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（日本国宝酒造）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット（実施例４８参照）に記載の発明で使用された、Ｉｇ軽鎖Ｊκ−ＣκゲノムＤＮＡの３’端のＤＮＡ断片（ＸｈｏＩ〜ＥｃｏＲＩ、約１．４ｋｂ、図５）をプローブとしてＬｏｘＰ配列で挟まれたＰｕｒｏｒ遺伝子のみが除去されたＥＳ細胞株を検出した。Ｐｕｒｏｒ遺伝子を保持したＥＳ細胞ではＥｃｏＲＩ消化により、２本のバンド（１５．６Ｋと１３．１Ｋ）が検出され、Ｐｕｒｏｒ遺伝子のみが除去されたＥＳ細胞株ではＥｃｏＲＩ消化により、２本のバンド（１５．６Ｋと１０．２Ｋ）が検出される（図１５）。その結果、４８株中４株（８．３％）がＣｋＰ２  ｈＥＰＯマウスＴＴ２Ｆ細胞株より薬剤耐性遺伝子（Ｐｕｒｏｒ）が除去されたＴＴ２Ｆ細胞株（ＣｋＰ２  ΔＰ  ｈＥＰＯマウスＴＴ２Ｆ細胞株）であるという結果を得た。
【実施例２７】
【００３２】
ＣｋＰ２  ΔＰ  ｈＥＰＯマウスＴＴ２Ｆ細胞株およびＢリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を用いたキメラマウスの作製
免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトのホモ接合体においては、機能的なＢリンパ球が欠損し、抗体が産生されない（Ｋｉｔａｍｕｒａら，Ｎａｔｕｒｅ，３５０：４２３−４２６，１９９１）。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。この場合、キメラマウスにおいて機能的なＢリンパ球は、大部分が注入したＥＳ細胞に由来する。本実施例では富塚らの報告（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：７２２−７，２０００）に記載された免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトマウスについてＭＣＨ（ＩＣＲ）（日本国日本クレア社）系統への戻し交配を３回以上行った個体を宿主胚調製用として用いた。
上記実施例２６で得られ、免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されていることが確認されたＣｋＰ２  ΔＰ  ｈＥＰＯマウスＴＴ２Ｆ細胞株（＃８）を凍結ストックより立ち上げ、それらを、上記免疫グロブリンμ鎖ノックアウトマウスホモ接合体の雌雄マウスの交配により得られた８細胞期胚に、それぞれ胚１つあたり８〜１０個注入した。ＥＳ培地（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、ｌ９９５、羊土社、日本国）で一晩培養して胚盤胞まで発生させた後、偽妊娠処理後２．５日の仮親ＭＣＨ（ＩＣＲ）マウス（日本国日本クレア社）の子宮に、片側の子宮あたりそれぞれ約１０個のインジェクション胚を移植した。実施例２６の＃８を用いて作製されたインジェクション胚を計８０個移植した結果、１４匹の子キメラマウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において、宿主胚由来の白色の中にＥＳ細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかによって判定される。誕生した１４匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわちＥＳ細胞の貢献の認められる個体は１０匹であった。これらの結果より、免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されているＣｋＰ２  ΔＰ  ｈＥＰＯマウスＴＴ２Ｆ細胞株（＃８）はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。
【実施例２８】
【００３３】
ＣｋＰ２  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株より薬剤耐性遺伝子を除去したＣｋＰ２  ｌｏｘＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株の取得
ＣｋＰ２  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株より２種の薬剤耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ，Ｐｕｒｏｒ）を除去したＣｋＰ２  ｌｏｘＰ  ｈＥＰＯ遺伝子導入ＥＳ細胞株取得のため、ｐＣＡＧＧＳ−Ｃｒｅベクター（Ｓｕｎａｇａら、Ｍｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｅｖ．，４６：１０９−１１３，１９９７）を確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、１９９５、羊土社、日本国）に従ってＣｋＰ２  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞（＃３０）へ導入した。
ＣｋＰ２  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞の培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシンＣ（米国シグマ）処理したＧ４１８耐性初代培養細胞（日本国インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させたＣｋＰ２  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞をトリプシン処理し、３×１０７個／ｍｌとなるようにＨＢＳに懸濁してから、０．５ｍｌの細胞懸濁液を１０μｇのベクターＤＮＡと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離：０．４ｃｍ、米国バイオラッド）にてエレクトロポレーションを行った（容量：９６０μＦ、電圧：２５０Ｖ、室温）。エレクトロポレーションした細胞を１０ｍｌのＥＳ培地（相沢慎一、前記）に懸濁し、それより２．５ｍｌ分を、あらかじめフィーダー細胞を播種した６０ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）１枚に播種した。３０時間後にＥＳ細胞１０００個をあらかじめフィーダー細胞を播種した１００ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）１枚に播種した。６日後に生じたコロニーのうち計４６個をピックアップし、それぞれを２４穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その２／３を０．２ｍｌの保存用培地（ＦＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ、米国シグマ）に懸濁し、−８０℃にて保存した。残りの１／３は１２穴ゼラチンコートプレートに播種し、２日間培養して１０６〜１０７個の細胞からゲノムＤＮＡをＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（米国Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ社）により調製した。これらマウスＥＳ細胞ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（日本国宝酒造）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット（実施例４８参照）に記載の発明で使用された、Ｉｇ軽鎖Ｊκ−ＣκゲノムＤＮＡの３’端のＤＮＡ断片（ＸｈｏＩ〜ＥｃｏＲＩ、約１．４ｋｂ、図５）をプローブとしてＬｏｘＰ配列で挟まれたＰｕｒｏｒ遺伝子のみが除去されたＥＳ細胞株を検出した。Ｐｕｒｏｒ遺伝子を保持したＥＳ細胞ではＥｃｏＲＩ消化により、２本のバンド（１５．６Ｋと１３．１Ｋ）が検出され、Ｐｕｒｏｒ遺伝子のみが除去されたＥＳ細胞株ではＥｃｏＲＩ消化により、２本のバンド（１５．６Ｋと１０．２Ｋ）が検出される（図１０）。また、上記と同様の操作で得られたサザンブロット膜を用い、実施例１０で用いられた３’ＫＯ−ｐｒｏｂをプローブとしてＬｏｘＰ配列で挟まれたＮｅｏｒ遺伝子のみが除去されたＥＳ細胞株を検出した。Ｎｅｏｒ遺伝子を保持したＥＳ細胞ではＥｃｏＲＩ消化により、２本のバンド（７．４Ｋと５．７Ｋ）が検出され、Ｎｅｏｒ遺伝子のみが除去されたＥＳ細胞株ではＥｃｏＲＩ消化により、２本のバンド（５．７Ｋと４．４Ｋ）が検出される（図１０）。その結果、４６株中１株（２．２％）がＣｋＰ２ヒトＥＰＯ遺伝子導入ＥＳ細胞株より２種の薬剤耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ，Ｐｕｒｏｒ）が同時に除去されたＥＳ細胞株（ＣｋＰ２  ｌｏｘＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株）であるという結果を得た。
【実施例２９】
【００３４】
ＣｋＰ２  ｌｏｘＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株およびＢリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を用いたキメラマウスの作製
免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトのホモ接合体においては、機能的なＢリンパ球が欠損し、抗体が産生されない（Ｋｉｔａｍｕｒａら，Ｎａｔｕｒｅ，３５０：４２３−４２６，１９９１）。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。この場合、キメラマウスにおいて機能的なＢリンパ球は、大部分が注入したＥＳ細胞に由来する。本実施例では富塚らの報告（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：７２２−７，２０００）に記載された免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトマウスについてＭＣＨ（ＩＣＲ）（日本国日本クレア社）系統への戻し交配を３回以上行った個体を宿主胚調製用として用いた。
上記実施例２８で得られ、免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されていることが確認されたＣｋＰ２  ｌｏｘＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株（＃１８）を凍結ストックより立ち上げ、それらを、上記免疫グロブリンμ鎖ノックアウトマウスホモ接合体の雌雄マウスの交配により得られた８細胞期胚に、それぞれ胚１つあたり８〜１０個注入した。ＥＳ培地（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、羊土社、１９９５）で一晩培養して胚盤胞まで発生させた後、偽妊娠処理後２．５日の仮親ＭＣＨ（ＩＣＲ）マウス（日本国日本クレア社）の子宮に、片側の子宮あたりそれぞれ約１０個のインジェクション胚を移植した。実施例２８の＃１８を用いて作製されたインジェクション胚を計２４０個移植した結果、８０匹の子キメラマウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において、宿主胚由来の白色の中にＥＳ細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかによって判定される。誕生した８０匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわちＥＳ細胞の貢献の認められる個体は５２匹であった。これらの結果より、免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されているＣｋＰ２  ｌｏｘＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株（＃１８）はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。
【実施例３０】
【００３５】
ＰＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株より薬剤耐性遺伝子を除去したＰＳ  ｌｏｘＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株の取得
ＰＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株より２種の薬剤耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ，Ｐｕｒｏｒ）を除去したＰＳ  ｌｏｘＰ  ｈＥＰＯ遺伝子導入ＥＳ細胞株取得のため、ｐＣＡＧＧＳ−Ｃｒｅベクター（Ｓｕｎａｇａら、Ｍｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｅｖ．，４６：１０９−１１３，１９９７）を確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、１９９５、羊土社、日本国）に従ってＰＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞（＃６）へ導入した。
ＰＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞の培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシンＣ（米国シグマ）処理したＧ４１８耐性初代培養細胞（日本国インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させたＰＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞をトリプシン処理し、３×１０７個／ｍｌとなるようにＨＢＳに懸濁してから、０．５ｍｌの細胞懸濁液を１０μｇのベクターＤＮＡと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離：０．４ｃｍ、米国バイオラッド）にてエレクトロポレーションを行った（容量：９６０μＦ、電圧：２５０Ｖ、室温）。エレクトロポレーションした細胞を１０ｍｌのＥＳ培地（相沢慎一、前記）に懸濁しそれより２．５ｍｌ分を、あらかじめフィーダー細胞を播種した６０ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）１枚に播種した。３０時間後にＥＳ細胞１０００個をあらかじめフィーダー細胞を播種した１００ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）１枚に播種した。６日後に生じたコロニーのうち計１９２個をピックアップし、それぞれを２４穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その２／３を０．２ｍｌの保存用培地（ＦＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ、米国シグマ）に懸濁し、−８０℃にて保存した。残りの１／３は１２穴ゼラチンコートプレートに播種し、２日間培養して１０６〜１０７個の細胞からゲノムＤＮＡをＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（米国Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ社）により調製した。これらマウスＥＳ細胞ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（日本国宝酒造）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット（実施例４８参照）に記載の発明で使用された、Ｉｇ軽鎖Ｊκ−ＣκゲノムＤＮＡの３’端のＤＮＡ断片（ＸｈｏＩ〜ＥｃｏＲＩ、約１．４ｋｂ、ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット図２５）をプローブとしてＬｏｘＰ配列で挟まれたＰｕｒｏｒ遺伝子のみが除去されたＥＳ細胞株を検出した。Ｐｕｒｏｒ遺伝子を保持したＥＳ細胞ではＥｃｏＲＩ消化により、２本のバンド（１５．６Ｋと１２．７Ｋ）が検出され、Ｐｕｒｏｒ遺伝子のみが除去されたＥＳ細胞株ではＥｃｏＲＩ消化により、２本のバンド（１５．６Ｋと９．８Ｋ）が検出される（図１４）。また、上記と同様の操作で得られたサザンブロット膜を用い、実施例１０で用いられた３’ＫＯ−ｐｒｏｂをプローブとしてＬｏｘＰ配列で挟まれたＮｅｏｒ遺伝子のみが除去されたＥＳ細胞株を検出した。Ｎｅｏｒ遺伝子を保持したＥＳ細胞ではＥｃｏＲＩ消化により、２本のバンド（７．４Ｋと５．７Ｋ）が検出され、Ｎｅｏｒ遺伝子のみが除去されたＥＳ細胞株ではＥｃｏＲＩ消化により、２本のバンド（５．７Ｋと４．４Ｋ）が検出される（図１４）。その結果、１９２株中２株（１．０％）がＰＳＥＰＯマウスＥＳ細胞株より２種の薬剤耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ，Ｐｕｒｏｒ）が同時に除去されたＥＳ細胞株（ＰＳ  ｌｏｘＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株）であるという結果を得た。
【実施例３１】
【００３６】
ＰＳ  ｌｏｘＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株およびＢリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を用いたキメラマウスの作製
免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトのホモ接合体においては、機能的なＢリンパ球が欠損し、抗体が産生されない（Ｋｉｔａｍｕｒａら，Ｎａｔｕｒｅ，３５０：４２３−４２６，１９９１）。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。この場合、キメラマウスにおいて機能的なＢリンパ球は、大部分が注入したＥＳ細胞に由来する。本実施例では富塚らの報告（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：７２２−７，２０００）に記載された免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトマウスについてＭＣＨ（ＩＣＲ）（日本国日本クレア社）系統への戻し交配を３回以上行った個体を宿主胚調製用として用いた。
上記実施例３０で得られ、免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されていることが確認されたＰＳ  ｌｏｘＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株（＃４８）を凍結ストックより立ち上げ、それらを、上記免疫グロブリンμ鎖ノックアウトマウスホモ接合体の雌雄マウスの交配により得られた８細胞期胚に、それぞれ胚１つあたり８〜１０個注入した。ＥＳ培地（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、１９９５、羊土社、日本国）で一晩培養して胚盤胞まで発生させた後、偽妊娠処理後２．５日の仮親ＭＣＨ（ＩＣＲ）マウス（日本国日本クレア社）の子宮に、片側の子宮あたりそれぞれ約１０個のインジェクション胚を移植した。実施例３０の＃４８を用いて作製されたインジェクション胚を計２４０個移植した結果、７０匹の子キメラマウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において、宿主胚由来の白色の中にＥＳ細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかによって判定される。誕生した７０匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわちＥＳ細胞の貢献の認められる個体は３４匹であった。これらの結果より、免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されているＰＳ  ｌｏｘＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株＃４８はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。
【実施例３２】
【００３７】
ＣｋＰ２  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、ＮＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、ＰＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウスにおける、ヒトＥＰＯ遺伝子転写レベルの比較
キメラマウス脾臓よりｍＲＮＡサンプルの調製：
コントロールとして上記実施例１１で作製されたＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞株＃３２由来のキメラマウス計３匹、上記実施例１６で作製されたＣｋＰ２  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株＃５７由来のキメラマウス計３匹（キメラ率１００−７０％）、上記実施例２０で作製されたＮＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株＃１０由来のキメラマウス計３匹（キメラ率１００％）、上記実施例２４で作製されたＰＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株＃６由来のキメラマウス計３匹（キメラ率１００％）より、１週齢、２週齢、４週齢それぞれで各群１匹より脾臓サンプルを摘出し、その直後に脾臓約５０ｍｇを液体窒素で凍結した。得られた各凍結サンプルにＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン、日本国）１ｍｌを加え、ホモジナイザーを用いてサンプルを破砕後、添付されたマニュアルに従いＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡサンプルに３７℃、１５分間、ＤＮａｓｅ処理（日本国ＷＡＫＯ  Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＲＴ等級）を行った。更に、ＲＮａｓｙ  Ｍｉｎｉ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用いて、精製ＲＮＡサンプルを取得した。
ヒトＥＰＯ遺伝子転写レベルの比較：
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、得られた精製ＲＮＡサンプル２５０ｎｇよりｃＤＮＡを合成した。その後、３７℃、２０分間ＲＮａｓｅ処理を行い、ＲＮａｓｅフリーの滅菌水による１０倍希釈液２．０μｌをその後のＰＣＲに用いた。
ヒトＥＰＯ遺伝子発現確認用プライマーとして、以下のオリゴＤＮＡを合成した。
ｈＥＰＯ−ＲＴ  ＦＷ５：ＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＴＴＧＧＴＣＡＡＣＴＣＴＴＣ（配列番号５５）
ＣｋｐｏｌｙＡＲ２：ＣＧＣＴＴＧＴＧＧＧＧＡＡＧＣＣＴＣＣＡＡＧＡＣＣ（配列番号５６）
ヒトＥＰＯ遺伝子発現を確認するためのＰＣＲを以下のような条件で実施した。ＬＡｔａｑ（日本国宝酒造）を用い、９４℃、１０秒インキュベート後６８℃、１分間インキュベートの２段階反応を３５サイクル行った。その結果、コントロール群では１週齢から４週齢全てで増幅バンドが検出されなかったが、ヒトＥＰＯ遺伝子が導入されたマウスＥＳ細胞を用いて作製された全てのキメラマウスの脾臓組織では、１週齢から増幅バンドが検出された。ＮＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウスとＰＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウスの増幅バンド濃度は２週齢、４週齢とほぼ等しく、ＣｋＰ２ｈ  ＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウスの増幅バンド濃度はこれらと比較するとやや低いことが確認された（図１６）。
また、各サンプル群で用いられているｍＲＮＡ量に偏りが生じていないかを確認する為、マウスＧｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子発現確認用プライマーとして、以下のオリゴＤＮＡを合成した。
ｍＧＡＰＤＨ５：ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣＣＡＣ（配列番号５７）
ｍＧＡＰＤＨ３：ＡＴＣＡＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＧＴＴＴＣＴＣＣＡＧＧ（配列番号５８）
マウスＧＡＰＤＨ遺伝子発現を確認するためＰＣＲを以下のような条件で実施した。ＬＡ  ｔａｑ（日本国宝酒造）を用い、（９４℃、３０秒）→（６５℃、３０秒）→（７２℃、３０秒）３段階のインキュベート反応を２５サイクル行った。その結果、全てのサンプルでマウスＧＡＰＤＨの発現がほぼ等しいレベルで検出され、ヒトＥＰＯ遺伝子発現確認用プライマーを用いて検出された各サンプル間のバンドの濃度差がキメラマウス脾臓組織におけるヒトＥＰＯ遺伝子発現レベルの差を反映していることが示された（図１６）。これらの結果は、ベクター構造がｐＣｋＰ２タイプよりも、ｐＮＰやｐＰＳタイプのほうが転写レベルで発現に有利であることを示し、上記実施例５のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験で得られた結果との相関が認められた。
【実施例３３】
【００３８】
ＣｋＰ２  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、ＮＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、ＰＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、Ｃｋ  ΔＰ  ｈＥＰＯマウスＴＴ２Ｆ細胞由来キメラマウス、ＣｋＰ２  ｌｏｘＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、ＰＳ  ｌｏｘＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウスにおける血清中ヒトＥＰＯ濃度の比較
コントロールとして上記実施例１１で作製されたＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞株＃３２由来のキメラマウス計１０匹（キメラ率８０〜２０％）、上記実施例１６で作製されたＣｋＰ２  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株＃６９由来のキメラマウス計６匹（キメラ率８０〜２０％）、上記実施例２０で作製されたＮＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株＃１０由来のキメラマウス計４匹（キメラ率１００％）、上記実施例２４で作製されたＰＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株＃６由来のキメラマウス計１０匹（キメラ率８０〜２０％）、上記実施例２７で作製されたＣｋＰ２  ΔＰ  ｈＥＰＯマウスＴＴ２Ｆ細胞由来キメラマウス計９匹（キメラ率６０〜１０％）、上記実施例２９で作製されたＣｋＰ２  ｌｏｘＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株＃１８由来キメラマウス計２０匹（キメラ率９０〜１０％）、上記実施３１で作製されたＰＳ  ｌｏｘＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株＃４８由来キメラマウス計１３匹（キメラ率９０〜１０％）より８週齢の時点で眼窩採血し得られた血清中のヒトＥＰＯ濃度をＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＩＶＤ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｈｕｍａｎ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ．Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いて測定した。その結果、コントロールとして上記実施例１１で作製されたＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞株＃３２由来のキメラマウス計１０匹（キメラ率８０〜２０％）由来の血清中ヒトＥＰＯ濃度は全て検出限界（１２．５ｐｇ／ｍｌ）以下であったが、上記実施例１６で作製されたＣｋＰ２  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株＃６９由来のキメラマウス計６匹（キメラ率８０〜２０％）由来の血清中ヒトＥＰＯ濃度の平均値は５．３ｎｇ／ｍｌ、上記実施例２０で作製されたＮＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株＃１０由来のキメラマウス計４匹（キメラ率１００％）由来の血清中ヒトＥＰＯ濃度の平均値は１４．７ｎｇ／ｍｌ、上記実施例２４で作製されたＰＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株＃６由来のキメラマウス計１０匹（キメラ率８０〜２０％）由来の血清中ヒトＥＰＯ濃度の平均値は４７．９ｎｇ／ｍｌ、上記実施例２７で作製されたＣｋＰ２  ΔＰ  ｈＥＰＯマウスＴＴ２Ｆ細胞由来キメラマウス計９匹（キメラ率６０〜１０％）由来の血清中ヒトＥＰＯ濃度の平均値は６３．４ｎｇ／ｍｌ、上記実施例２９で作製されたＣκＰ２  ｌｏｘＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株＃１８由来キメラマウス計２０匹（キメラ率９０〜１０％）由来の血清中ヒトＥＰＯ濃度の平均値は２１１ｎｇ／ｍｌ、上記実施３１で作製されたＰＳ  ｌｏｘＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株＃４８由来キメラマウス計１３匹（キメラ率９０〜１０％）由来の血清中ヒトＥＰＯ濃度の平均値は１１０３ｎｇ／ｍｌであった。更に、図１７及びＴａｂｌｅＩＩに、上記実施例で作製されたキメラマウスの血清を用い、１、２、４、６、８週齢で測定したヒトＥＰＯ濃度値を示す。これらの結果から、ＣｋＰ２  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、ＮＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、ＰＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、ＣｋＰ２  ΔＰ  ｈＥＰＯマウスＴＴ２Ｆ細胞由来キメラマウス、ＣｋＰ２  ｌｏｘＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、ＰＳ  ｌｏｘＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウスの順に血清中ヒトＥＰＯ濃度の増加が認められた。
これらの結果はベクター構造がｐＣκＰ２タイプ、ｐＮＰタイプ、ｐＰＳタイプの順番にキメラマウス血中のヒトＥＰＯ量が増加することを示し、上記実施例６のｉｎ  ｖｉｔｒｏで得られた結果との相関が認められた。実施例６の結果との相関が認められたことから、ミエローマ細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ系によって、本発現システムを用いて作製されるキメラマウス血清中の導入遺伝子発現量が推測されうることが示された。また、ＣｋＰ２  ｈＥＰＯマウスＥＳ（ＴＴ２Ｆ）細胞より薬剤耐性遺伝子を除去（ＣｋＰ２  ｌｏｘＰ  ｈＥＰＯタイプ、ＣｋＰ２  ΔＰ  ｈＥＰＯタイプ）することによっても、血清中ヒトＥＰＯ濃度が増加することが示された。更にＰＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞より薬剤耐性遺伝子を除去したＥＳ細胞を用いキメラマウスを作製した場合、その血清中濃度はそれぞれ単独の操作で得られた増加量に比べ相乗的に増加し、極めて興味深い結果が得られた。すなわち、用いるＩｇκプロモーター領域の変更と導入遺伝子固有のリーダー配列コード領域からイントロン領域を含むＩｇｋ由来のリーダー配列コード領域への変更ないし導入遺伝子の近傍に位置する薬剤耐性遺伝子の除去操作はそれぞれ単独であってもキメラマウスにおける導入遺伝子発現量の向上に有用であることを示しているが、更に用いるＩｇκプロモーター領域の変更と導入遺伝子固有のリーダー配列コード領域からイントロン領域を含むＩｇκ由来のリーダー配列コード領域への変更及び導入遺伝子の近傍に位置する薬剤耐性遺伝子の除去操作を全て行うことによって、キメラマウスにおける導入遺伝子発現量がそれぞれ単独の操作によって向上した発現量に比べ相乗的に向上することを示し、本発明に記載された方法が遺伝子およびその産物の生体内における機能解析に極めて有用であることを示している。
【実施例３４】
【００３９】
ＣｋＰ２  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、ＮＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、ＰＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、ＣｋＰ２  ΔＰ  ｈＥＰＯマウスＴＴ２Ｆ細胞由来キメラマウス、ＣｋＰ２  ｌｏｘＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、ＰＳ  ｌｏｘＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウスにおける末梢血血球解析
コントロールとして上記実施例１１で作製されたＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞株＃３２由来のキメラマウス計１０匹（キメラ率８０〜２０％）、上記実施例１６で作製されたＣｋＰ２  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株＃６９由来のキメラマウス計６匹（キメラ率８０〜２０％）、上記実施例２０で作製されたＮＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株＃１０由来のキメラマウス計４匹（キメラ率１００％）、上記実施例２４で作製されたＰＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株＃６由来のキメラマウス計１０匹（キメラ率８０〜２０％）、上記実施例２７で作製されたＣｋＰ２  ΔＰ  ｈＥＰＯマウスＴＴ２Ｆ細胞由来キメラマウス計９匹（キメラ率６０〜１０％）、上記実施例２９で作製されたＣｋＰ２  ｌｏｘＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株＃１８由来キメラマウス計２０匹（キメラ率９０〜１０％）、上記実施３１で作製されたＰＳ  ｌｏｘＰ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株＃４８由来キメラマウス計１３匹（キメラ率９０〜１０％）より８週齢の時点で眼窩採血し、血球測定装置（日本国Ｂａｙｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ（株）製、ＡＤＶＩＡ  １２０  ＨＥＭＡＴＯＬＯＧＹ  ＳＹＳＴＥＭ）を用いて末梢血血球解析を実施した。コントロールマウス群にくらべ、ヒトＥＰＯ遺伝子が導入されたキメラマウスは上記全ての群において平均１．６４倍以上の赤血球数増加が認められた。しかしながら各群間の赤血球数には有意な差は認められなかった。また、コントロール群のヘマトクリット値は平均５８％であったが、ヒトＥＰＯ遺伝子が導入されたキメラマウスは上記全ての群において平均９０％以上の値を示し、ヒトＥＰＯ遺伝子導入により有意なヘマトクリット値の増加が認められた。しかしながら赤血球数と同様各群間に有意な差は認められなかった。上記実施例３３の各群間で血清中ヒトＥＰＯ濃度の有意な差が認められるにも係わらず、血球解析において有意な差が認められない理由として、最も発現量の少ないＣｋＰ２  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞より作製されたキメラマウスのヒトＥＰＯ発現量においても既に増加の上限値に達していることが原因と考えられる。従って、本発明に記載された方法が遺伝子およびその産物の生体内における機能解析に有用であることを示している。
【実施例３５】
【００４０】
ｐＣｋ  ｌｏｘＰＶ  ＫＩベクターの構築
ＬｏｘＰ配列の一部に変異が導入（３４ｂｐで構成されるｌｏｘＰ配列の５’側から１５番目のＴがＡに、２０番目のＧがＣに置換。Ｌｅｅら、Ｇｅｎｅ，２１６：５５−６５，１９９８）されたｌｏｘＰＶを薬剤耐性遺伝子（Ｐｕｒｏｒ）の両端に持つｐＣｋＰ２  ＫＩベクターであるｐＣｋ  ｌｏｘＰＶ  ＫＩベクター（図１８）の構築を行った。
３５−１．ＰＧＫ−Ｐｕｒｏ断片の調製
Ｌｏｘ−Ｐ  Ｐｕｒｏプラスミド（ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット）を制限酵素ＢａｍＨＩ消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離した。１．７ｋｂの断片を含むゲルよりＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがってＰＧＫ−Ｐｕｒｏ断片を回収した。
３５−２．Ｃｋ  ｐｏｌｙＡ  ｐａｒｔｉａｌ断片の調製
上記実施例１２のｐＣｋＰ２  ＫＩベクターを元に、以下のＤＮＡ（プライマー）を設計した。
Ｃｋ  ｐＡ  ＮｈｅＩ  Ｆ：ＣＣＴＡＧＣＴＡＧＣＡＧＡＣＡＡＡＧＧＴＣＣＴＧＡＧＡＣＧＣＣＡＣ（配列番号５７）
Ｃｋ  ｐＡ  ＰａｃＩ  Ｒ：ＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＧＧＡＴＴＴＣＡＧＧＧＣＡＡＣＴＡＡＡＣ（配列番号５８）
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製した。５０μｌ反応液中に上記２種のプライマー各７．５ｐｍｏｌ、鋳型としてＴＴ２ＦマウスＥＳゲノムを添加し、９４℃２分保温した後、９４℃１５秒／５８℃３０秒／６８℃３０秒を１サイクルとして３２サイクル増幅した。得られた約３００ｂｐの増幅断片を２％ゲルで分離回収した。回収したゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い、添付文書にしたがって増幅断片を回収した。回収されたＰＣＲ増幅断片を制限酵素ＮｈｅＩ／ＰａｃＩで消化し、２％アガロースゲルでサイズ分画した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い添付文書にしたがって、ゲルから酵素処理断片を回収した。この断片を上記実施例１のｐＢＳ＋ＰＦＮのＮｈｅＩ／ＰａｃＩサイトにサブクローニングし、大腸菌Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈ  ＤＨ５（日本国東洋紡）に導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、シークエンスを確認した。ＣｋＰ２  ＫＩベクターの完全長ＣｋポリＡと比較して、増幅エラーの見られなかったｐ（部分長ＣｋポリＡ）をＰａｃＩ／ＮｈｅＩ消化した。２％ゲルで３０３ｂｐの断片を分離、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い添付文書にしたがって部分長ＣｋポリＡ断片を回収した。
３５−３．ｐＣｋＰ２  ＫＩベクターに一本鎖化サイトＡｓｃＩを加えたベクター・・・ｐＣｋＰ２＋Ａｓ  ＫＩ
以下の合成オリゴをアニールさせて、ＡｓｃＩリンカーを合成した。
ＡｓｅＩ  ｔｏｐ  ｌｉｎｋｅｒ：ＧＧＣＣＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＧＣ（配列番号４７）
ＡｓｅＩ  ｂｏｔｔｏｍ  ｌｉｎｋｅｒ：ＧＧＣＣＧＣＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴ（配列番号４８）
ｐＣｋＰ２  ＫＩベクターを制限酵素ＮｏｔＩ（Ｒｏｃｈｅ）で消化し、０．８％アガロースゲルより分離精製した後にｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（日本国タカラバイオ）を使用したライゲーション反応によりＡｓｃＩリンカーを導入した。それを大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ  Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（米国ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）に導入して得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、挿入断片の塩基配列を確認した。
３５−４．Ｃｋ３’ゲノム断片の調製
上記３５−３のｐＣｋＰ２＋Ａｓ  ＫＩを制限酵素Ｈｐｙ９９Ｉで消化し、０．８％アガロースゲルで８８２０ｂｐの断片を分離した。この目的断片を含むゲルを切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い添付文書にしたがってＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡはＢｌｕｎｔｉｎｇ  ｈｉｇｈ（日本国東洋紡）を用いて、添付文書にしたがって末端の平滑化を行った。フェノール抽出によってＤＮＡ精製後、制限酵素ＸｈｏＩで消化した。０．８％アガロースゲルで８２８０ｂｐの断片を分離し、この目的断片を含むゲルを切り出してＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い添付文書にしたがってＣｋ３’ゲノム断片を回収した。
３５−５．ｌｏｘＰＶ  ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ断片の調製
上記実施例１のｐＢＳ＋ＰＦＮを制限酵素ＳａｌＩで消化し、仔牛小腸由来アルカリフォスファターゼを用いて末端の脱リン酸化を行った後に、以下のオリゴＤＮＡより合成したｌｏｘＰ−ＢｇｌＩＩ−ＰｍｅＩ−ＨｐａＩリンカーを挿入した。
変異型ｌｏｘＰ  Ｆ：
ＴＣＧＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＡＧＴＡＴＣＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＡＧＡＴＣＴＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＡＧＴＡＴＣＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＴＴＡＡＡＣＧＴＴＡＡＣＧ（配列番号５９）
変異型ｌｏｘＰ  Ｒ：
ＴＣＧＡＣＧＴＴＡＡＣＧＴＴＴＡＡＡＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＧＡＴＡＣＴＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＡＧＡＴＣＴＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＧＡＴＡＣＴＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡ（配列番号６０）
大腸菌Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈ  ＤＨ５αに導入し、得られた形質転換体よりＤＮＡを調製した。連結部分の塩基配列を確認し、リンカーが目的の方向に挿入されていたｐＢＳ２２７２を取得した。
ｐＢＳ２２７２を制限酵素ＢｇｌＩＩ消化し、仔牛小腸由来アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化した後、上記３５−１で調製したＰＧＫ−Ｐｕｒｏ断片を連結した。大腸菌Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈ  ＤＨ５αに導入し、得られた形質転換体よりＤＮＡを調製した。連結部分の塩基配列を確認し、ＰＧＫ−Ｐｕｒｏ断片が目的の方向にクローニングされていたプラスミドｐｌｏｘＰＶ−ｐｕｒｏを得た。
このプラスミドを制限酵素ＮｈｅＩ／ＰａｃＩで消化し、末端を仔牛小腸由来アルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化した。ここに上記３５−２で調製した部分長ＣｋポリＡ断片を挿入した。ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ  Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（米国ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）に形質転換し、得られたクローンよりプラスミドＤＮＡを調製して塩基配列の確認を行った。つなぎ目及び内部の配列を確認し、エラーの無いプラスミドｐｌｏｘＰＶ−Ｐｕｒｏ−ポリＡを取得した。
続いて制限酵素ＨｐａＩ／ＸｈｏＩで消化し、末端を仔牛小腸由来アルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化した後に上記３５−４で調製したＣｋ３’ゲノム断片を導入した。ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ  Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓに形質転換し、得られたクローンよりプラスミドＤＮＡを調製して塩基配列の確認を行った。つなぎ目の塩基配列を確認して、予定通りの連結をしていたプラスミドｐｌｏｘＰＶ  ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩを得た。このプラスミドを制限酵素ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ消化し、約１０．５ｋｂのｌｏｘＰＶ  ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ断片を回収した。
３５−６．ｐＣｋ  ｌｏｘＰＶ  ＫＩベクターの構築
上記３５−３のｐＣｋＰ２＋Ａｓ  ＫＩをＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ消化し、９９６８ｂｐの断片を０．８％アガロースゲル分画によって回収した。末端を仔牛小腸由来アルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化し、上記３５−５で調製したｌｏｘＰＶ  ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ断片と連結した。連結部分の塩基配列を確認し、ｐＣｋ  ｌｏｘＰＶ  ＫＩベクター（図１８）を得た。
【実施例３６】
【００４１】
エレクトロポレーション用ｐＣｋ  ｌｏｘＰＶ  ＫＩベクターの調製
ｐＣｋ  ｌｏｘＰＶ  ＫＩベクター６０μｇを、スペルミジン添加（１ｍＭ  ｐＨ７．０米国シグマ）バッファー（日本国ロシュ・ダイアグノスティックス、制限酵素用Ｈバッファー）を用い、ＮｏｔＩを用いて３７℃で５時間消化し、フェノール／クロロホルム抽出後、２．５容量の１００％エタノール、および０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、−２０℃で１６時間保存した。ＮｏｔＩで一本鎖化されたベクターを遠心して回収後、７０％エタノールを加えて滅菌した。クリーンベンチ内で７０％エタノールを除き、１時間風乾させた。０．５μｇ／μＬのＤＮＡ溶液となるようにＨＢＳ溶液を加え、１時間室温で保存し、エレクトロポレーション用ｐＣｋ  ｌｏｘＰＶ  ＫＩベクターの調製を行なった。
【実施例３７】
【００４２】
ｐＣｋ  ｌｏｘＰＶ  ＫＩベクターとＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞株を用いたＣｋ  ｌｏｘＰＶマウスＥＳ細胞株の取得
変異ｌｏｘＰ配列を両端に持つ薬剤耐性遺伝子（ｌｏｘＰＶ  Ｐｕｒｏｒ）が相同組換えにより免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子下流に挿入されたＣｋ  ｌｏｘＰＶマウスＥＳ細胞株取得のため、実施例３５で作製したｐＣｋ  ｌｏｘＰＶ  ＫＩベクターを制限酵素ＮｏｔＩ（日本国宝酒造）で線状化し、確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、１９９５、羊土社、日本国）に従ってＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞へ導入した。
ＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞の培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシンＣ（米国シグマ）処理したＧ４１８耐性初代培養細胞（日本国インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させたＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞をトリプシン処理し、３×１０７個／ｍｌとなるようにＨＢＳに懸濁してから、０．５ｍｌの細胞懸濁液を１０μｇのベクターＤＮＡと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離：０．４ｃｍ、米国バイオラッド）にてエレクトロポレーションを行った（容量：９６０μＦ、電圧：２５０Ｖ、室温）。エレクトロポレーションした細胞を１０ｍｌのＥＳ培地（相沢慎一、前記）に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞を播種したｌ００ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）１枚に播種した。３６時間後に０．８μｇ／ｍｌのピューロマイシン（米国シグマ）を含むＥＳ培地と置き換えた。７日後に生じたコロニーのうち計２４個をピックアップし、それぞれを２４穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その２／３を０．２ｍｌの保存用培地（ＦＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ、米国シグマ）に懸濁し、−８０℃にて保存した。残りの１／３は１２穴ゼラチンコートプレートに播種し、２日間培養して１０６〜１０７個の細胞からゲノムＤＮＡをＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（米国Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ社）により調製した。これらのピューロマイシン耐性ＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（日本国宝酒造）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット（実施例４８参照）に記載の発明で使用された、Ｉｇ軽鎖Ｊκ−ＣκゲノムＤＮＡの３’端のＤＮＡ断片（ＸｈｏＩ〜ＥｃｏＲＩ、約１．４ｋｂ、ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット、特に図２５）をプローブとして相同組換え体を検出した。その結果、２４株中６株（２５％）が相同組換え体であるという結果を得た。野生型ＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞ではＥｃｏＲＩ消化により、１本のバンドが検出された。相同組換え体においては、このバンドに加えてその下部に新たなバンドが出ることが予想される（図１９）が、ピューロマイシン耐性株においてこの新たなバンドが確認された。すなわち、これらのクローンは一方のアレルの免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流に薬剤耐性遺伝子（ｌｏｘＰＶ  Ｐｕｒｏｒ）が挿入されたものである。
【実施例３８】
【００４３】
Ｃｋ  ｌｏｘＰＶマウスＥＳ細胞株より薬剤耐性遺伝子を除去したΔＧＰマウスＥＳ細胞株の取得
Ｃｋ  ｌｏｘＰＶマウスＥＳ細胞株より２種の薬剤耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ，Ｐｕｒｏｒ）を除去したΔＧＰマウスＥＳ細胞株取得のため、ｐＣＡＧＧＳ−Ｃｒｅベクター（Ｓｕｎａｇａら、Ｍｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｅｖ．，４６：１０９−１１３，１９９７）を確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、１９９５、羊土社、日本国）に従ってＣｋ  ｌｏｘＰＶマウスＥＳ細胞株（＃１６）へ導入した。
Ｃｋ  ｌｏｘＰＶマウスＥＳ細胞の培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシンＣ（米国シグマ）処理したＧ４１８耐性初代培養細胞（日本国インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させたＣｋ  ｌｏｘＰＶマウスＥＳ細胞をトリプシン処理し、３×１０７個／ｍｌとなるようにＨＢＳに懸濁してから、０．５ｍｌの細胞懸濁液を１０μｇのベクターＤＮＡと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離：０．４ｃｍ、米国バイオラッド）にてエレクトロポレーションを行った（容量：９６０μＦ、電圧：２５０Ｖ、室温）。エレクトロポレーションした細胞を１０ｍｌのＥＳ培地（相沢慎一、前記）に懸濁し、それより２．５ｍｌ分を、あらかじめフィーダー細胞を播種した６０ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）１枚に播種した。３０時間後にＥＳ細胞１０００個をあらかじめフィーダー細胞を播種した１００ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）１枚に播種した。６１後に生じたコロニーのうち計２４個をピックアップし、それぞれを２４穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その２／３を０．２ｍｌの保存用培地（ＦＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ、米国シグマ）に懸濁し、−８０℃にて保存した。残りの１／３は１２穴ゼラチンコートプレートに播種し、２日間培養して１０６〜１０７個の細胞からゲノムＤＮＡをＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（米国Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ社）により調製した。これらマウスＥＳ細胞ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（日本国宝酒造）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット（実施例４８参照）に記載の発明で使用された、Ｉｇ軽鎖Ｊκ−ＣκゲノムＤＮＡの３’端のＤＮＡ断片（ＸｈｏＩ〜ＥｃｏＲＩ、約１．４ｋｂ、ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット、特に図２５）をプローブとしてＬｏｘＰ配列で挟まれたＰｕｒｏｒ遺伝子のみが除去されたＥＳ細胞株を検出した。Ｐｕｒｏｒ遺伝子を保持したＥＳ細胞ではＥｃｏＲＩ消化により、２本のバンド（１５．６Ｋとｌ２．５Ｋ）が検出され、Ｐｕｒｏｒ遺伝子のみが除去されたＥＳ細胞株ではＥｃｏＲＩ消化により、２本のバンド（１５．６Ｋと９．６Ｋ）が検出される（図１９）。また、上記と同様の操作で得られたサザンブロット膜を用い、実施例１０で用いられた３’ＫＯ−ｐｒｏｂをプローブとしてＬｏｘＰ配列で挟まれたＮｅｏｒ遺伝子のみが除去されたＥＳ細胞株を検出した。Ｎｅｏｒ遺伝子を保持したＥＳ細胞ではＥｃｏＲＩ消化により、２本のバンド（７．４Ｋと５．７Ｋ）が検出され、Ｎｅｏｒ遺伝子のみが除去されたＥＳ細胞株ではＥｃｏＲＩ消化により、２本のバンド（５．７Ｋと４．４Ｋ）が検出される（図１９）。その結果、２４株中２３株（９６％）という極めて高い効率でＣｋ  ｌｏｘＰＶマウスＥＳ細胞株より２種の薬剤耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ，Ｐｕｒｏｒ）が同時に除去されたＥＳ細胞株（ΔＧＰマウスＥＳ細胞株）が取得された（図１９）。上記実施例２８、３０においても２種の薬剤耐性遺伝子をＣｒｅ酵素によって同時に除去する操作を実施したが、２種の薬剤耐性遺伝子のみが同時に除去された細胞株が取得された効率はそれぞれ２．２％，１％と極めて低くかった。これらの結果から、同じｌｏｘＰ配列を両端に持つ２種の薬剤耐性遺伝子のみをゲノム上から同時かつ特異的に除去することは困難であるが、変異配列を持つｌｏｘＰ（ｌｏｘＰＶ）を用いることで、２種の薬剤耐性遺伝子のみを同時かつ特異的に除去することが極めて容易に達成されることが示された。
【実施例３９】
【００４４】
ｐＣｋ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターの構築
３９−１．ＣｋＰ２  ｖｅｒ．３．１ベクターの構築
上記実施例３５で構築されたｐＣｋ  ｌｏｘＰＶ  ＫＩのＰａｃＩ認識サイトをなくすため、ＰａｃＩ消化を行い、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｈｉｇｈを用いて平滑化反応を行った。次いで自己環状化を行ってシークエンスによりＰａｃＩ認識サイトがなくなった事を確認し、ＣｋＰ２  ｖｅｒ．３．１．ベクターを得た。
３９−２．ヒトｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ＤＮＡ断片の作製
ｈＥＰＯ  Ｎｐ：ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＡＴＧＴＣＣＴＧ（配列番号４５）
ｈＥＰＯ  Ｒｐ：ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＣＡＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡ（配列番号４６）
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μｌ反応液中に上記２種のプライマー各１０ｐｍｏｌ、鋳型としてヒトＥＰＯ  ｃＤＮＡを添加し、９４℃２分保温した後、９４℃１５秒および６８℃１分を１サイクルとして３０サイクル増幅し、得られたシグナル配列を含む５８０ｂｐの増幅断片を０．８％ゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。回収されたＰＣＲ増幅断片をＸｈｏＩで酵素消化し、０．８％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（米国ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）をＸｈｏＩ消化し、０．８％アガロースゲルより分離精製した後に仔牛小腸由来アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、上記回収されたＤＮＡ断片を挿入し、それを大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調整し、挿入断片のシーケンスを行った。ＰＣＲによる変異の無いクローンを選択しＸｈｏＩ消化した後、０．８％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツＱＩＡＧＥＮ）を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。
３９−３．ｐＣｋｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターの構築
上記３９−１のＣｋＰ２  ｖｅｒ．３．１ベクターをＳａｌＩで消化後、仔牛小腸由来アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、３９−２で作製したＤＮＡ断片を挿入した後、大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ  Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（米国ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）に導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、連結部分の塩基配列を確認して、ｐＣｋ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクター（図２０）を取得した。
【実施例４０】
【００４５】
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ用ｐＣｋ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターの調製
ｐＣｋ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクター６０μｇを、スペルミジン添加（１ｍＭ  ｐＨ７．０米国シグマ）バッファー（日本国ロシュ・ダイアグノスティックス、制限酵素用Ｈバッファー）を用い、ＮｏｔＩを用いて３７℃で５時間消化し、フェノール／クロロホルム抽出後、２．５容量の１００％エタノール、および０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、−２０℃で１６時間保存した。ＮｏｔＩで一本鎖化されたベクターを遠心して回収後、７０％エタノールを加えて滅菌した。クリーンベンチ内で７０％エタノールを除き、１時間風乾させた。０．５μｇ／μＬのＤＮＡ溶液となるようにＨＢＳ溶液を加え、１時間室温で保存し、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ用ｐＣｋ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターの調製を行なった。
【実施例４１】
【００４６】
ｐＣｋ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターとＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞株を用いたＣＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株の取得
ヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが相同組換えにより免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子下流に挿入されたＣＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株取得のため、実施例３９で作製したｐＣｋ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯＫＩベクターを制限酵素ＮｏｔＩ（日本国宝酒造）で線状化し、確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、１９９５、羊土社、日本国）に従ってＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞へ導入した。
ＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞の培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシンＣ（米国シグマ）処理したＧ４１８耐性初代培養細胞（日本国インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させたＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞をトリプシン処理し、３×１０７個／ｍｌとなるようにＨＢＳに懸濁してから、０．５ｍｌの細胞懸濁液を１０μｇのベクターＤＮＡと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離：０．４ｃｍ、米国バイオラッド）にてエレクトロポレーションを行った（容量：９６０μＦ、電圧：２５０Ｖ、室温）。エレクトロポレーションした細胞を１０ｍｌのＥＳ培地（相沢慎一、前記）に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞を播種した１００ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）１枚に播種した。３６時間後に０．８μｇ／ｍｌのピューロマイシン（米国シグマ）を含むＥＳ培地と置き換えた。７日後に生じたコロニーをピックアップし、それぞれを２４穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その２／３を０．２ｍｌの保存用培地（ＦＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ、米国シグマ）に懸濁し、−８０℃にて保存した。残りの１／３は１２穴ゼラチンコートプレートに播種し、２日間培養して１０６〜１０７個の細胞からゲノムＤＮＡをＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（米国Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ社）により調製した。これらのピューロマイシン耐性ＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（日本国宝酒造）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット（実施例４８参照）に記載の発明で使用された、Ｉｇ軽鎖Ｊκ−ＣκゲノムＤＮＡの３’端のＤＮＡ断片（ＸｈｏＩ〜ＥｃｏＲＩ、約１．４ｋｂ、ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット、特に図２５）をプローブとして相同組換え体を検出した。野生型ＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞ではＥｃｏＲＩ消化により、１本のバンドが検出された。相同組換え体においては、このバンドに加えてその下部に新たなバンドが出ることが予想される（図２１）が、ピューロマイシン耐性株においてこの新たなバンドが確認される。すなわち、これらのクローンは−方のアレルの免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されたものである。
【実施例４２】
【００４７】
ＣＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株およびＢリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を用いたキメラマウスの作製
免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトのホモ接合体においては、機能的なＢリンパ球が欠損し、抗体が産生されない（Ｋｉｔａｍｕｒａら，Ｎａｔｕｒｅ，３５０：４２３−４２６，１９９１）。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。この場合、キメラマウスにおいて機能的なＢリンパ球は、大部分が注入したＥＳ細胞に由来する。本実施例では富塚らの報告（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：７２２−７，２０００）に記載された免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトマウスについてＭＣＨ（ＩＣＲ）（日本国日本クレア社）系統への戻し交配を３回以上行った個体を宿主胚調製用として用いた。
上記実施例４１で得られ、免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが入されていることが確認されたＣＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株を凍結ストックより立ち上げ、それらを、上記免疫グロブリンμ鎖ノックアウトマウスホモ接合体の雌雄マウスの交配により得られた８細胞期胚に、それぞれ胚１つあたり８〜１０個注入した。ＥＳ培地（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、１９９５、羊土社、日本国）で一晩培養して胚盤胞まで発生させた後、偽妊娠処理後２．５日の仮親ＭＣＨ（ＩＣＲ）マウス（日本国日本クレア社）の子宮に、片側の子宮あたりそれぞれ約１０個のインジェクション胚を移植した。実施例４１のＣＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株を用いて作製されたインジェクション胚を移植した結果、子キメラマウスが誕生する。キメラ個体は、毛色において、宿主胚由来の白色の中にＥＳ細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかによって判定される。誕生した子キメラマウスのうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわちＥＳ細胞の貢献の認められる個体が得られる。これらの結果より、免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されているＣＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示される。
【実施例４３】
【００４８】
ｐＮＰ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターの構築
４３−１．ｐＣｋ  ｌｏｘＰＶ  ΔＰの構築（ｍｕｔａｎｔ  ｌｏｘＰ大ベクター）
上記実施例３９−１で作製されたＣｋＰ２  ｖｅｒ．３．１ベクターを制限酵素ＨｐａＩ／ＮｈｅＩで消化し、約１９．５ｋｂの断片を０．８％アガロースゲル分画によって回収した。末端は仔牛小腸由来アルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化した。このベクターに上記実施例１７の５のｐＣｋｐＡＭＣＳを制限酵素ＨｐａＩ、ＮｈｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）で消化し、０．８％アガロースゲルより回収したＣｋ−ｐｏｌｙＡ−ＭＣＳを含む約７００ｂｐの断片を導入した。連結部分及び内部の塩基配列を確認し、ｐＣｋ  ｌｏｘＰＶΔＰを得た。
４３−２．ｐＮＰ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターの構築
上記実施例２で作製されたｐＮＰｓ  ｈＥＰＯ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用ベクターをＳａｌＩ及びＦＳｅＩで酵素消化し、０．８％アガロースゲルより約１．２ｋｂの断片を分離精製した後、上記４３−１のｐＣｋ  ｌｏｘＰＶΔＰをＳａｌＩおよびＦｓｅＩで酵素消化後、大腸菌Ｃ７５由来アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに挿入。それを大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ  Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（米国ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）に導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、連結部分の塩基配列を確認して、ｐＮＰ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクター（図２２）を取得した。
【実施例４４】
【００４９】
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ用ｐＮＰ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターの調製
ｐＮＰ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクター６０μｇを、スペルミジン添加（１ｍＭ  ｐＨ７．０米国シグマ）バッファー（日本国ロシュ・ダイアグノスティックス、制限酵素用Ｈバッファー）を用い、ＮｏｔＩを用いて３７℃で５時間消化し、フェノール／クロロホルム抽出後、２．５容量の１００％エタノール、および０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、−２０℃で１６時間保存した。ＮｏｔＩで一本鎖化されたベクターを遠心して回収後、７０％エタノールを加えて滅菌した。クリーンベンチ内で７０％エタノールを除き、１時間風乾させた。０．５μｇ／μＬのＤＮＡ溶液となるようにＨＢＳ溶液を加え、１時間室温で保存し、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ用ｐＮＰ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターの調製を行なった。
【実施例４５】
【００５０】
ｐＮＰ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターとＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞株を用いたＮＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株の取得
ヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが相同組換えにより免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子下流に挿入されたＮＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株取得のため、実施例４３で作製したｐＮＰ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターを制限酵素ＮｏｔＩ（日本国宝酒造）で線状化し、確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、１９９５、羊土社、日本国）に従ってＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞へ導入した。
ＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞の培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシンＣ（米国シグマ）処理したＧ４１８耐性初代培養細胞（日本国インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させたＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞をトリプシン処理し、３×１０７個／ｍｌとなるようにＨＢＳに懸濁してから、０．５ｍｌの細胞懸濁液を１０μｇのベクターＤＮＡと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離：０．４ｃｍ、米国バイオラッド）にてエレクトロポレーションを行った（容量：９６０μＦ、電圧：２５０Ｖ、室温）。エレクトロポレーションした細胞を１０ｍｌのＥＳ培地（相沢慎一、前記）に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞を播種した１００ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）１枚に播種した。３６時間後に０．８μｇ／ｍｌのピューロマイシン（米国シグマ）を含むＥＳ培地と置き換えた。７日後に生じたコロニーをピックアップし、それぞれを２４穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その２／３を０．２ｍｌの保存用培地（ＦＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ、米国シグマ）に懸濁し、−８０℃にて保存した。残りの１／３は１２穴ゼラチンコートプレートに播種し、２日間培養して１０６〜１０７個の細胞からゲノムＤＮＡをＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（米国Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ社）により調製した。これらのピューロマイシン耐性ＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（日本国宝酒造）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット（実施例４８参照）に記載の発明で使用された、Ｉｇ軽鎖Ｊκ−ＣκゲノムＤＮＡの３’端のＤＮＡ断片（ｘｈｏＩ〜ＥｃｏＲＩ、約１．４ｋｂ、ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット、特に図２５）をプローブとして相同組換え体を検出した。野生型ＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞ではＥｃｏＲＩ消化により、１本のバンドが検出された。相同組換え体においては、このバンドに加えてその下部に新たなバンドが出ることが予想される（図２３）が、ピューロマイシン耐性株においてこの新たなバンドが確認される。すなわち、これらのクローンは一方のアレルの免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されたものである。
【実施例４６】
【００５１】
ＮＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株およびＢリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を用いたキメラマウスの作製
免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトのホモ接合体においては、機能的なＢリンパ球が欠損し、抗体が産生されない（Ｋｉｔａｍｕｒａら，Ｎａｔｕｒｅ，３５０：４２３−４２６，１９９１）。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。この場合、キメラマウスにおいて機能的なＢリンパ球は、大部分が注入したＥＳ細胞に由来する。本実施例では富塚らの報告（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：７２２−７，２０００）に記載された免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトマウスについてＭＣＨ（ＩＣＲ）（日本国日本クレア社）系統への戻し交配を３回以上行った個体を宿主胚調製用として用いた。
上記実施例４５で得られ、免疫グロブリンＫ鎖遺伝子下流にヒトＥＰＯ−ＣＤＮＡが挿入されていることが確認されたＮＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株を凍結ストックより立ち上げ、それらを、上記免疫グロブリンμ鎖ノックアウトマウスホモ接合体の雌雄マウスの交配により得られた８細胞期胚に、それぞれ胚１つあたり８〜１０個注入した。ＥＳ培地（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、１９９５、羊土社、日本国）で一晩培養して胚盤胞まで発生させた後、偽妊娠処理後２．５日の仮親ＭＣＨ（ＩＣＲ）マウス（日本国日本クレア社）の子宮に、片側の子宮あたりそれぞれ約１０個のインジェクション胚を移植した。実施例４５のＮＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株を用いて作製されたインジェクション胚を移植した結果、子キメラマウスが誕生する。キメラ個体は、毛色において、宿主胚由来の白色の中にＥＳ細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかによって判定される。誕生した子キメラマウスのうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわちＥＳ細胞の貢献の認められる個体が得られる。これらの結果より、免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されているＮＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示される。
【実施例４７】
【００５２】
ｐＵＳ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターの構築
上記実施例１のｐＰＳｓ  ｈＥＰＯ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用ベクターをＳａｌＩ及びＦｓｅＩで酵素消化し、０．８％アガロースゲルより約１．３ｋｂの断片を分離精製した後、上記実施例４３で作製されたｐＣｋ  ｌｏｘＰＶ  ΔＰをＳａｌＩおよびＦｓｅＩで酵素消化後、大腸菌Ｃ７５由来アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに挿入。それを大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ  Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（米国ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）に導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、連結部分の塩基配列を確認して、ｐＵＳ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクター（図２４）を取得した。
【実施例４８】
【００５３】
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ用ｐＵＳ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターの調製
ｐＵＳ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクター６０μｇを、スペルミジン添加（１ｍＭ  ｐＨ７．０米国シグマ）バッファー（日本国ロシュ・ダイアグノスティックス、制限酵素用Ｈバッファー）を用い、ＮｏｔＩを用いて３７℃で５時間消化し、フェノール／クロロホルム抽出後、２．５容量の１００％エタノール、および０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、−２０℃で１６時間保存した。ＮｏｔＩで一本鎖化されたベクターを遠心して回収後、７０％エタノールを加えて滅菌した。クリーンベンチ内で７０％エタノールを除き、１時間風乾させた。０．５μｇ／μＬのＤＮＡ溶液となるようにＨＢＳ溶液を加え、１時間室温で保存し、エレクトロンポレーション用ｐＵＳ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターの調製を行なった。
【実施例４９】
【００５４】
ｐＵＳ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターとＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞株を用いたＰＬ  ｈＥＰＯ  マウスＥＳ細胞株の取得
ヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが相同組換えにより免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子下流に挿入されたＰＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株取得のため、実施例４７で作製したｐＵＳ  ｈＥＰＯ  ＫＩベクターを制限酵素ＮｏｔＩ（日本国宝酒造）で線状化し、確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、１９９５、羊土社、日本国）に従ってＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞へ導入した。
ＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞の培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシンＣ（米国シグマ）処理したＧ４１８耐性初代培養細胞（日本国インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させたＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞をトリプシン処理し、３×１０７個／ｍｌとなるようにＨＢＳに懸濁してから、０．５ｍｌの細胞懸濁液を１０μｇのベクターＤＮＡと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離：０．４ｃｍ、米国バイオラッド）にてエレクトロポレーションを行った（容量：９６０μＦ、電圧：２５０Ｖ、室温）。エレクトロポレーションした細胞を１０ｍｌのＥＳ培地（相沢慎一、前記）に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞を播種した１００ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）１枚に播種した。３６時間後に０．８μｇ／ｍｌのピューロマイシン（米国シグマ）を含むＥＳ培地と置き換えた。７日後に生じたコロニーをピックアップし、それぞれを２４穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その２／３を０．２ｍｌの保存用培地（ＦＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ、米国シグマ）に懸濁し、−８０℃にて保存した。残りの１／３は１２穴ゼラチンコートプレートに播種し、２日間培養して１０６〜１０７個の細胞からゲノムＤＮＡをＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（米国Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ社）により調製した。これらのピューロマイシン耐性ＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（日本国宝酒造）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット（実施例４８参照）に記載の発明で使用された、Ｉｇ軽鎖Ｊκ−ＣκゲノムＤＮＡの３’端のＤＮＡ断片（ＸｈｏＩ〜ＥｃｏＲＩ、約１．４ｋｂ、ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット  図２５）をプローブとして相同組換え体を検出した。野生型ＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞ではＥｃｏＲＩ消化により、１本のバンドが検出された。相同組換え体においては、このバンドに加えてその下部に新たなバンドが出ることが予想される（図２５）が、ピューロマイシン耐性株においてこの新たなバンドが確認される。すなわち、これらのクローンは一方のアレルの免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されたものである。
【実施例５０】
【００５５】
ＰＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株およびＢリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を用いたキメラマウスの作製
免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトのホモ接合体においては、機能的なＢリンパ球が欠損し、抗体が産生されない（Ｋｉｔａｍｕｒａら，Ｎａｔｕｒｅ，３５０：４２３−４２６，１９９１）。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。この場合、キメラマウスにおいて機能的なＢリンパ球は、大部分が注入したＥＳ細胞に由来する。本実施例では富塚らの報告（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：７２２−７，２０００）に記載された免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトマウスについてＭＣＨ（ＩＣＲ）（日本国日本クレア社）系統への戻し交配を３回以上行った個体を宿主胚調製用として用いた。
上記実施例４９で得られ、免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されていることが確認されたＰＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株を凍結ストックより立ち上げ、それらを、上記免疫グロブリンμ鎖ノックアウトマウスホモ接合体の雌雄マウスの交配により得られた８細胞期胚に、それぞれ胚１つあたり８〜１０個注入した。ＥＳ培地（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、１９９９５、羊土社、日本国）で一晩培養して胚盤胞まで発生させた後、偽妊娠処理後２．５日の仮親ＭＣＨ（ＩＣＲ）マウス（日本国日本クレア社）の子宮に、片側の子宮あたりそれぞれ約１０個のインジェクション胚を移植した。実施例４９のＰＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株を用いて作製されたインジェクション胚を移植した結果、子キメラマウスが誕生する。キメラ個体は、毛色において、宿主胚由来の白色の中にＥＳ細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかによって判定される。誕生した子キメラマウスのうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわちＥＳ細胞の貢献の認められる個体が得られる。これらの結果より、免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されているＰＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示される。
【実施例５１】
【００５６】
ＣＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株より薬剤耐性遺伝子を除去したＣｋ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株の取得
ＣＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株より２種の薬剤耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ，Ｐｕｒｏｒ）を除去したＣｋ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯ遺伝子導入ＥＳ細胞株取得のため、ｐＣＡＧＧＳ−Ｃｒｅベクター（Ｓｕｎａｇａら、Ｍｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｅｖ．，４６：１０９−１１３，１９９７）を確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、１９９５、羊土社、日本国）に従ってＣＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞へ導入する。
ＣＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞の培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシンＣ（米国シグマ）処理したＧ４１８耐性初代培養細胞（日本国インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させたＣＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞をトリプシン処理し、３×１０７個／ｍｌとなるようにＨＢＳに懸濁してから、０．５ｍｌの細胞懸濁液を１０μｇのベクターＤＮＡと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離：０．４ｃｍ、米国バイオラッド）にてエレクトロポレーションを行った（容量：９６０μＦ、電圧：２５０Ｖ、室温）。エレクトロポレーションした細胞を１０ｍｌのＥＳ培地（相沢慎一、前記）に懸濁し、それより２．５ｍｌ分を、あらかじめフィーダー細胞を播種した６０ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）１枚に播種した。３０時間後にＥＳ細胞１０００個をあらかじめフィーダー細胞を播種した１００ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）１枚に播種した。６日後に生じたコロニーをピックアップし、それぞれを２４穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その２／３を０．２ｍｌの保存用培地（ＦＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ、米国シグマ）に懸濁し、−８０℃にて保存した。残りの１／３は１２穴ゼラチンコートプレートに播種し、２日間培養して１０６〜１０７個の細胞からゲノムＤＮＡをＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（米国Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ社）により調製した。これらマウスＥＳ細胞ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（日本国宝酒造）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット（実施例４８参照）に記載の発明で使用された、Ｉｇ軽鎖Ｊκ−ＣκゲノムＤＮＡの３’端のＤＮＡ断片（ＸｈｏＩ〜ＥｃｏＲＩ、約１．４ｋｂ、ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット、特に図２５）をプローブとしてＬｏｘＰ配列で挟まれたＰｕｒｏｒ遺伝子のみが除去されたＥＳ細胞株を検出した。Ｐｕｒｏｒ遺伝子を保持したＥＳ細胞ではＥｃｏＲＩ消化により、２本のバンド（１５．６Ｋと１３．１Ｋ）が検出され、Ｐｕｒｏｒ遺伝子のみが除去されたＥＳ細胞株ではＥｃｏＲＩ消化により、２本のバンド（１５．６Ｋと１０．２Ｋ）が検出される（図２１）。また、上記と同様の操作で得られたサザンブロット膜を用い、実施例１０で用いられた３’ＫＯ−ｐｒｏｂをプローブとしてＬｏｘＰ配列で挟まれたＮｅｏｒ遺伝子のみが除去されたＥＳ細胞株を検出した。Ｎｅｏｒ遺伝子を保持したＥＳ細胞ではＥｃｏＲＩ消化により、２本のバンド（７．４Ｋと５．７Ｋ）が検出され、Ｎｅｏｒ遺伝子のみが除去されたＥＳ細胞株ではＥｃｏＲＩ消化により、２本のバンド（５．７Ｋと４．４Ｋ）が検出される（図２１）。これらの結果から、ＣＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株より２種の薬剤耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ，Ｐｕｒｏｒ）が同時に除去されたＥＳ細胞株（Ｃｋ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株）が得られた。
【実施例５２】
【００５７】
Ｃｋ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株およびＢリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を用いたキメラマウスの作製
免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトのホモ接合体においては、機能的なＢリンパ球が欠損し、抗体が産生されない（Ｋｉｔａｍｕｒａら，Ｎａｔｕｒｅ，３５０：４２３−４２６，１９９１）。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。この場合、キメラマウスにおいて機能的なＢリンパ球は、大部分が注入したＥＳ細胞に由来する。本実施例では富塚らの報告（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：７２２−７，２０００）に記載された免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトマウスについてＭＣＨ（ＩＣＲ）（日本国日本クレア社）系統への戻し交配を３回以上行った個体を宿主胚調製用として用いた。
上記実施例５１で得られ、免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されていることが確認されたＣｋ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株を凍結ストックより立ち上げ、それらを、上記免疫グロブリンμ鎖ノックアウトマウスホモ接合体の雌雄マウスの交配により得られた８細胞期胚に、それぞれ胚１つあたり８〜１０個注入した。ＥＳ培地（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、１９９５、羊土社、日本国）で一晩培養して胚盤胞まで発生させた後、偽妊娠処理後２．５日の仮親ＭＣＨ（ＩＣＲ）マウス（日本国日本クレア社）の子宮に、片側の子宮あたりそれぞれ約１０個のインジェクション胚を移植した。実施例５１のＣｋ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株を用いて作製されたインジェクション胚を移植した結果、子キメラマウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において、宿主胚由来の白色の中にＥＳ細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかによって判定された。誕生した子キメラマウスのうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわちＥＳ細胞の貢献の認められる個体が得られた。これらの結果より、免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されているＣｋ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。
【実施例５３】
【００５８】
ＮＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株より薬剤耐性遺伝子を除去したＮＰ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株の取得
ＮＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株より２種の薬剤耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ，Ｐｕｒｏｒ）を除去したＮＰ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯ遺伝子導入ＥＳ細胞株取得のため、ｐＣＡＧＧＳ−Ｃｒｅベクター（Ｓｕｎａｇａら、Ｍｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｅｖ．，４６：１０９−１１３，１９９７）を確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、１９９５、羊土社、日本国）に従ってＮＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞へ導入する。
ＮＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞の培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシンＣ（米国シグマ）処理したＧ４１８耐性初代培養細胞（日本国インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させたＮＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞をトリプシン処理し、３×１０７個／ｍｌとなるようにＨＢＳに懸濁してから、０．５ｍｌの細胞懸濁液を１０μｇのベクターＤＮＡと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離：０．４ｃｍ、米国バイオラッド）にてエレクトロポレーションを行った（容量：９６０μＦ、電圧：２５０Ｖ、室温）。エレクトロポレーションした細胞を１０ｍｌのＥＳ培地（相沢慎一、前記）に懸濁し、それより２．５ｍｌ分を、あらかじめフィーダー細胞を播種した６０ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）１枚に播種した。３０時間後にＥＳ細胞１０００個をあらかじめフィーダー細胞を播種した１００ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）１枚に播種した。６日後に生じたコロニーをピックアップし、それぞれを２４穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その２／３を０．２ｍｌの保存用培地（ＦＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ、米国シグマ）に懸濁し、−８０℃にて保存した。残りの１／３は１２穴ゼラチンコートプレートに播種し、２日間培養して１０６〜１０７個の細胞からゲノムＤＮＡをＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（米国Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ社）により調製した。これらマウスＥＳ細胞ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（日本国宝酒造）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット（実施例４８参照）に記載の発明で使用された、Ｉｇ軽鎖Ｊκ−ＣκゲノムＤＮＡの３’端のＤＮＡ断片（ＸｈｏＩ〜ＥｃｏＲＩ、約１．４ｋｂ、ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット、特に図２５）をプローブとしてＬｏｘＰ配列で挟まれたＰｕｒｏｒ遺伝子のみが除去されたＥＳ細胞株を検出した。Ｐｕｒｏｒ遺伝子を保持したＥＳ細胞ではＥｃｏＲＩ消化により、２本のバンド（１５．６Ｋと１２．９Ｋ）が検出され、Ｐｕｒｏｒ遺伝子のみが除去されたＥＳ細胞株ではＥｃｏＲＩ消化により、２本のバンド（１５．６Ｋと１０．０Ｋ）が検出される（図２３）。また、上記と同様の操作で得られたサザンブロット膜を用い、実施例１０で用いられた３’ＫＯ−ｐｒｏｂをプローブとしてＬｏｘＰ配列で挟まれたＮｅｏｒ遺伝子のみが除去されたＥＳ細胞株を検出した。Ｎｅｏｒ遺伝子を保持したＥＳ細胞ではＥｃｏＲＩ消化により、２本のバンド（７．４Ｋと５．７Ｋ）が検出され、Ｎｅｏｒ遺伝子のみが除去されたＥＳ細胞株ではＥｃｏＲＩ消化により、２本のバンド（５．７Ｋと４．４Ｋ）が検出された（図２３）。これらの結果から、ＣＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株より２種の薬剤耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ，Ｐｕｒｏｒ）が同時に除去されたＥＳ細胞株（ＮＰ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株）が得られた。
【実施例５４】
【００５９】
ＮＰ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株およびＢリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を用いたキメラマウスの作製
免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトのホモ接合体においては、機能的なＢリンパ球が欠損し、抗体が産生されない（Ｋｉｔａｍｕｒａら，Ｎａｔｕｒｅ，３５０：４２３−４２６，１９９１）。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。この場合、キメラマウスにおいて機能的なＢリンパ球は、大部分が注入したＥＳ細胞に由来する。本実施例では富塚らの報告（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：７２２−７，２０００）に記載された免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトマウスについてＭＣＨ（ＩＣＲ）（日本国日本クレア社）系統への戻し交配を３回以上行った個体を宿主胚調製用として用いた。
上記実施例５３で得られ、免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されていることが確認されたＮＰ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株を凍結ストックより立ち上げ、それらを、上記免疫グロブリンμ鎖ノックアウトマウスホモ接合体の雌雄マウスの交配により得られた８細胞期胚に、それぞれ胚１つあたり８〜１０個注入した。ＥＳ培地（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、１９９５、羊土社、日本国）で一晩培養して胚盤胞まで発生させた後、偽妊娠処理後２．５日の仮親ＭＣＨ（ＩＣＲ）マウス（日本国日本クレア社）の子宮に、片側の子宮あたりそれぞれ約１０個のインジェクション胚を移植した。実施例５３のＮＰ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株を用いて作製されたインジェクション胚を移植した結果、子キメラマウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において、宿主胚由来の白色の中にＥＳ細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかによって判定される。誕生した子キメラマウスのうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわちＥＳ細胞の貢献の認められる個体が得られる。これらの結果より、免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されているＮＰ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示される。
【実施例５５】
【００６０】
ＰＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株より薬剤耐性遺伝子を除去したＵＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株の取得
ＰＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株より２種の薬剤耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ，Ｐｕｒｏｒ）を除去したＵＳ  ｈＥＰＯ遺伝子導入ＥＳ細胞株取得のため、ｐＣＡＧＧＳ−Ｃｒｅベクター（Ｓｕｎａｇａら、Ｍｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｅｌ．，４６：１０９−１１３，１９９７）を確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、１９９５、羊土社、日本国）に従ってＰＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞へ導入する。
ＰＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞の培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシンＣ（米国シグマ）処理したＧ４１８耐性初代培養細胞（日本国インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させたＰＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞をトリプシン処理し、３×１０７個／ｍｌとなるようにＨＢＳに懸濁してから、０．５ｍｌの細胞懸濁液を１０μｇのベクターＤＮＡと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離：０．４ｃｍ、米国バイオラッド）にてエレクトロポレーションを行った（容量：９６０μＦ、電圧：２５０Ｖ、室温）。エレクトロポレーションした細胞を１０ｍｌのＥＳ培地（相沢慎一、前記）に懸濁し、それより２．５ｍｌ分を、あらかじめフィーダー細胞を播種した６０ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディンキンソン）１枚に播種した。３０時間後にＥＳ細胞１０００個をあらかじめフィーダー細胞を播種した１００ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）１枚に播種した。６日後に生じたコロニーをピックアップし、それぞれを２４穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その２／３を０．２ｍｌの保存用培地（ＦＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ、米国シグマ）に懸濁し、−８０℃にて保存した。残りの１／３は１２穴ゼラチンコートプレートに播種し、２日間培養して１０６〜１０７個の細胞からゲノムＤＮＡをＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（米国Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ社）により調製した。これらマウスＥＳ細胞ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（日本国宝酒造）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット（実施例４８参照）に記載の発明で使用された、Ｉｇ軽鎖Ｊκ−ＣκゲノムＤＮＡの３’端のＤＮＡ断片（ＸｈｏＩ〜ＥｃｏＲＩ、約１．４ｋｂ、ＷＯ  ００／１０３８３号パンフレット、特に図２５）をプローブとしてＬｏｘＰ配列で挟まれたＰｕｒｏｒ遺伝子のみが除去されたＥＳ細胞株を検出した。Ｐｕｒｏｒ遺伝子を保持したＥＳ細胞ではＥｃｏＲＩ消化により、２本のバンド（１５．６Ｋと１２．７Ｋ）が検出され、Ｐｕｒｏｒ遺伝子のみが除去されたＥＳ細胞株ではＥｃｏＲＩ消化により、２本のバンド（１５．６Ｋと９．８Ｋ）が検出された（図２５）。また、上記と同様の操作で得られたサザンブロット膜を用い、実施例１０で用いられた３’ＫＯ−ｐｒｏｂをプローブとしてＬｏｘＰ配列で挟まれたＮｅｏｒ遺伝子のみが除去されたＥＳ細胞株を検出した。Ｎｅｏｒ遺伝子を保持したＥＳ細胞ではＥｃｏＲＩ消化により、２本のバンド（７．４Ｋと５．７Ｋ）が検出され、Ｎｅｏｒ遺伝子のみが除去されたＥＳ細胞株ではＥｃｏＲＩ消化により、２本のバンド（５．７Ｋと４．４Ｋ）が検出された（図２５）。これらの結果から、ＰＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株より２種の薬剤耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ，Ｐｕｒｏｒ）が同時に除去されたＥＳ細胞株（ＵＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株）が得られた。
【実施例５６】
【００６１】
ＵＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株およびＢリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を用いたキメラマウスの作製
免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトのホモ接合体においては、機能的なＢリンパ球が欠損し、抗体が産生されない（Ｋｉｔａｍｕｒａら，Ｎａｔｕｒｅ，３５０：４２３−４２６，１９９１）。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。この場合、キメラマウスにおいて機能的なＢリンパ球は、大部分が注入したＥＳ細胞に由来する。本実施例では富塚らの報告（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：７２２−７，２０００）に記載された免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトマウスについてＭＣＨ（ＩＣＲ）（日本国日本クレア社）系統への戻し交配を３回以上行った個体を宿主胚調製用として用いた。
上記実施例５５で得られ、免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されていることが確認されたＵＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株を凍結ストックより立ち上げ、それらを、上記免疫グロブリンμ鎖ノックアウトマウスホモ接合体の雌雄マウスの交配により得られた８細胞期胚に、それぞれ胚１つあたり８〜１０個注入した。ＥＳ培地（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、１９９５、羊土社、日本国）で一晩培養して胚盤胞まで発生させた後、偽妊娠処理後２．５日の仮親ＭＣＨ（ＩＣＲ）マウス（日本国日本クレア社）の子宮に、片側の子宮あたりそれぞれ約１０個のインジェクション胚を移植した。実施例５５のＵＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株を用いて作製されたインジェクション胚を移植した結果、子キメラマウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において、宿主胚由来の白色の中にＥＳ細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかによって判定される。誕生した子キメラマウスのうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわちＥＳ細胞の貢献の認められる個体が得られる。これらの結果より、免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＥＰＯ−ｃＤＮＡが挿入されているＵＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞株はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示される。
【実施例５７】
【００６２】
ＣＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、ＮＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、ＰＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウスにおける、ヒトＥＰＯ遺伝子転写レベルの比較
（１）キメラマウス脾臓よりｍＲＮＡサンプルの調製
コントロールとして上記実施例１１で作製されたＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞株由来のキメラマウス、上記実施例４２で作製されたＣＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、上記実施例４６で作製されたＮＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、上記実施例５０で作製されたＰＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウスより、１週齢、２週齢、４週齢それぞれで各群１匹より脾臓サンプルを摘出し、その直後に脾臓約５０ｍｇを液体窒素で凍結する。得られた各凍結サンプルにＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン）１ｍｌを加え、ホモジナイザーを用いてサンプルを破砕後、添付されたマニュアルに従いＲＮＡを抽出する。得られたＲＮＡサンプルに３７℃、１５分間、ＤＮａｓｅ処理（ＷＡＫＯ  Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＲＴ  ｇｒａｄｅ）を行った。更に、ＲＮａｓｙ  Ｍｉｎｉ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、精製ＲＮＡサンプルを取得する。
ヒトＥＰＯ遺伝子転写レベルの比較：
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、得られた精製ＲＮＡサンプル２５０ｎｇよりｃＤＮＡを合成した。その後、３７℃、２０分間ＲＮａｓｅ処理を行い、滅菌水による１０倍希釈液２．０μｌをその後のＰＣＲに用いる。
ヒトＥＰＯ遺伝子発現確認用プライマーとして、以下のオリゴＤＮＡを合成した。
ｈＥＰＯ−ＲＴ  ＦＷ５：ＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＴＴＧＧＴＣＡＡＣＴＣＴＴＣ（配列番号６１）
ＣｋｐｏｌｙＡＲ２：ＣＧＣＴＴＧＴＧＧＧＧＡＡＧＣＣＴＣＣＡＡＧＡＣＣ（配列番号６２）
ヒトＥＰＯ遺伝子発現を確認するためのＰＣＲを以下のような条件で実施した。ＬＡｔａｑ（日本国宝酒造）を用い、９４℃、１０秒インキュベート後６８℃、１分間インキュベートの２段階反応を３５サイクル行った。その結果、コントロール群では１週齢から４週齢全てで増幅バンドが検出されなかったが、ヒトＥＰＯ遺伝子が導入されたマウスＥＳ細胞を用いて作製された全てのキメラマウスの脾臓組織では、１週齢から増幅バンドが検出された。ＮＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウスとＰＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウスの増幅バンド濃度は２週齢、４週齢とほぼ等しく、ＣＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウスの増幅バンド濃度はこれらと比較するとやや低いことが確認される。
また、各サンプル群で用いられているｍＲＮＡ量に偏りが生じていないかを確認する為、マウスＧｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子発現確認用プライマーとして、以下のオリゴＤＮＡを合成した。
ｍＧＡＰＤＨ５：ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣＣＡＣ（配列番号６３）
ｍＧＡＰＤＨ３：ＡＴＣＡＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＧＴＴＴＣＴＣＣＡＧＧ（配列番号６４）
マウスＧＡＰＤＨ遺伝子発現を確認するためＰＣＲを以下のような条件で実施した。ＬＡｔａｑ（日本国宝酒造）を用い、（９４℃、３０秒）→（６５℃、３０秒）→（７２℃、３０秒）３段階のインキュベート反応を２５サイクル行った。その結果、全てのサンプルでマウスＧＡＰＤＨの発現がほぼ等しいレベルで検出され、ヒトＥＰＯ遺伝子発現確認用プライマーを用いて検出された各サンプル間のバンドの濃度差がキメラマウス脾臓組織におけるヒトＥＰＯ遺伝子発現レベルの差を反映していることが示される。これらの結果から、ベクター構造がｐＣｋ  ｌｏｘＰＶタイプよりも、ｐＮＰ  ｌｏｘＰＶやｐＰＳ  ｌｏｘＰＶタイプのほうが転写レベルで発現に有利であることが示され、上記実施例５および上実施例３２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験で得られた結果との相関も認められる。また、これらの結果は、ＥＳ細胞ゲノムより薬剤耐性遺伝子（Ｐｕｒｏｒ）を選択的に除去するため両末端に付加されたｌｏｘＰ配列の配列構造を一部変更することが導入遺伝子の発現になんら影響を及ぼさないことを示唆している。
【実施例５８】
【００６３】
ＣＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、ＮＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、ＰＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、Ｃｋ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、ＮＰ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、ＵＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウスにおける、血清中ヒトＥＰＯ濃度の比較
コントロールとして上記実施例１１で作製されたＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞株由来のキメラマウス、上記実施例４２で作製されたＣＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、上記実施例４６で作製されたＮＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、上記実施例５０で作製されたＰＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、上記実施例５２で作製されたＣｋ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、上記実施例５４で作製されたＮＰ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、上記実施例５６で作製されたＵＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウスより８週齢の時点で眼窩採血し得られた血清中のヒトＥＰＯ濃度をＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＩＶＤ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｈｕｍａｎ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ．Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いて測定した。その結果、コントロールとして上記実施例１１で作製されたＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞株由来のキメラマウス由来の血清中ヒトＥＰＯ濃度は全て検出限界（１２．５ｐｇ／ｍｌ）以下であったが、全てのヒトＥＰＯ遺伝子導入キメラマウスでは有意な発現が認められた。また、ＣＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、ＮＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、ＰＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、Ｃｋ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、ＮＰ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、ＵＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウスの順に血清中ヒトＥＰＯ濃度の増加が認められる。
これらの結果はベクター構造がｐＣｋ  ｌｏｘＰＶタイプ、ｐＮＰ  ｌｏｘＰＶタイプ、ｐＵＳタイプの順番にキメラマウス血中のヒトＥＰＯ量が増加することを示し、薬剤耐性遺伝子（Ｐｕｒｏｒ）を選択的に除去するため両末端に付加されたｌｏｘＰ配列の配列構造が一部変更されたにも係わらず、上記実施例６のｉｎ  ｖｉｔｒｏで得られた結果や上記実施例３３のｉｎ  ｖｉｖｏで得れらた結果との相関が認められる。実施例６の結果との相関が認められたことから、ミエローマ細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ系によって、本発現システムを用いて作製されるキメラマウス血清中の導入遺伝子発現量が推測されうることが示される。また、ＣＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞より薬剤耐性遺伝子を除去（Ｃｋ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞）することによっても、血清中ヒトＥＰＯ濃度が増加することが示される。更にＮＬ  ｈＥＰＯやＰＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞より薬剤耐性遺伝子を除去したＥＳ細胞を用いキメラマウスを作製した場合、その血清中濃度はそれぞれ単独の操作で得られた増加量に比べ相乗的に増加し、極めて興味深い結果が得られる。すなわち、用いるＩｇκプロモーター領域の変更と導入遺伝子固有のリーダー配列コード領域からイントロン領域を含むＩｇκ由来のリーダー配列コード領域への変更ないし導入遺伝子の近傍に位置する薬剤耐性遺伝子の除去操作はそれぞれ単独であってもキメラマウスにおける導入遺伝子発現量の向上に有用であることを示しているが、更に用いるＩｇκプロモーター領域の変更と導入遺伝子固有のリーダー配列コード領域からイントロン領域を含むＩｇκ由来のリーダー配列コード領域への変更及び導入遺伝子の近傍に位置する薬剤耐性遺伝子の除去操作を全て行うことによって、キメラマウスにおける導入遺伝子発現量がそれぞれ単独の操作によって向上した発現量に比べ相乗的に向上することを示し、本発明に記載された方法が遺伝子およびその産物の生体内における機能解析に極めて有用であることを示している。
【実施例５９】
【００６４】
ＣＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、ＮＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、ＰＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、Ｃｋ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、ＮＰ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、ＵＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウスにおける末梢血血球解析
コントロールとして上記実施例１１で作製されたＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞株由来のキメラマウス、上記実施例４２で作製されたＣＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、上記実施例４６で作製されたＮＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、上記実施例５０で作製されたＰＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、上記実施例５２で作製されたＣｋ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、上記実施例５４で作製されたＮＰ  ｌｏｘＰＶ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウス、上記実施例５６で作製されたＵＳ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞由来キメラマウスより８週齢の時点で眼窩採血し、血球測定装置（Ｂａｙｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ（株）製、ＡＤＶＩＡ１２０  ＨＥＭＡＴＯＬＯＧＹ  ＳＹＳＴＥＭ）を用いて末梢血血球解析を実施した。コントロールマウス群にくらべ、ヒトＥＰＯ遺伝子が導入されたキメラマウスは上記全ての群において有意な赤血球数増加が認められる。しかしながら各群間の赤血球数には有意な差は認められない。また、コントロール群のヘマトクリット値は平均５８％であったが、ヒトＥＰＯ遺伝子が導入されたキメラマウスは上記全ての群において有意な増加を示し、ヒトＥＰＯ遺伝子導入により有意なヘマトクリット値の増加が認められる。しかしながら赤血球数と同様各群間に有意な差は認められない。上記実施例５８の各群間で血清中ヒトＥＰＯ濃度の有意な差が認められるにも係わらず、血球解析において有意な差が認められない理由として、最も発現量の少ないＣＬ  ｈＥＰＯマウスＥＳ細胞より作製されたキメラマウスのヒトＥＰＯ発現量においても既に増加の上限値に達していることが原因と考えられる。従って、本発明に記載された方法が遺伝子およびその産物の生体内における機能解析に有用であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明は、本発明のキメラ非ヒト動物またはその子孫、あるいは該動物由来の細胞、組織またはハイブリドーマは、従来と比べて有意に高いレベル、例えば数百倍高いレベル、の外来ＤＮＡ発現を可能にするため、所望蛋白質の高生産法として利用できるし、また機能未知の外来遺伝子が導入されたキメラ非ヒト動物またはその子孫を用いることによって、表現型の違いなどから、その遺伝子の生体内機能を解析するために利用することができる。
本明細書で引用された全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【配列表フリーテキスト】
【００６６】
配列番号１：プライマー
配列番号２：プライマー
配列番号３：プライマー
配列番号４：プライマー
配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー
配列番号７：プライマー
配列番号８：プライマー
配列番号９：プライマー
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配列番号１４：プライマー
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配列番号１７：プライマー
配列番号１８：プライマー
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配列番号２１：プライマー
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配列番号２３：プライマー
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配列番号３４：プライマー
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配列番号５７：プライマー
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配列番号６２：プライマー
配列番号６３：プライマー
配列番号６４：プライマー
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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