(57)【要約】この発明は、顆粒球コロニー刺激因子を有効成分として含む、虚血関連腎障害および腎虚血−再灌流に伴う腎障害の予防または治療剤に関する。この発明により、虚血あるいは虚血−再灌流による腎疾患の治療や腎不全の進行の抑制、あるいは腎移植時等の虚血または虚血−再灌流障害の予防または治療、慢性虚血病態の軽減を通して移植腎の長期的腎機能の温存を実現することが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
顆粒球コロニー刺激因子を有効成分として含む、虚血関連腎障害または腎虚血−再灌流に伴う腎障害の予防または治療剤。
【請求項２】
腎障害が慢性腎障害であることを特徴とする請求項１に記載の予防または治療剤。
【請求項３】
慢性腎障害が腎間質の線維化もしくは慢性虚血であることを特徴とする請求項２に記載の予防または治療剤。
【請求項４】
顆粒球コロニー刺激因子が配列番号１または２で示されるアミノ酸配列、あるいはそのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し且つＧ−ＣＳＦと同様の活性を付与するアミノ酸配列、を有するポリペプチドであることを特徴とする請求項１項に記載の予防または治療剤。
【請求項５】
顆粒球コロニー刺激因子がＰＥＧ化誘導体であることを特徴とする請求項１または４に記載の予防または治療剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の予防または治療剤を、虚血関連腎障害または腎虚血−再灌流に伴う腎障害をもつ患者に投与することを含む、前記腎障害を予防または治療するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、顆粒球コロニー刺激因子（以下、Ｇ−ＣＳＦと略記する）を有効成分とする虚血関連腎障害および腎虚血−再灌流に伴う腎障害の治療剤に関する。
【背景技術】  腎不全は腎機能不全、すなわち腎臓の障害により、正常な腎臓が行っている体液あるいは腎から分泌・排泄される各種生理活性物質の量的・質的恒常性に変調を来たしたり、あるいは維持することが困難になった状態である。腎不全は通常数日以内に発症する急性腎不全と、数ヶ月から数年以上の経過をたどり、徐々に腎不全に至る慢性腎不全に大別される。
急性腎不全の一部は可逆性であり、治癒可能な症例と、その他の不可逆性へ移行する症例があり、その一部では血液浄化療法（血液透析や腹膜透析等）を導入しなければならない場合もある。一方、慢性腎不全（保存期腎不全）は非可逆性で、進行性の疾患であり、腎機能の低下が著しくなると血液浄化療法の対象となる。このような代替療法により腎不全が直接の死因となることは少ないが、患者の生活や労働時間の制限を受ける血液浄化療法に至らないことが切望されている。また、透析患者数は日本で２０万人超、人口の１０％強が早期の腎疾患に罹患しており、医療費は全体医療費約１２兆円のうちの１兆円を占めている。従って医療経済的側面からも進行性腎障害のコントロールが切望されている。
腎不全の原因としては、循環動態・血行動態的な原因（たとえば高血圧、動脈硬化、血管炎、血管の過収縮などによる腎組織への血流量の低下、過剰な圧負荷）、炎症・免疫的な原因（たとえば自己抗体、免疫グロブリンの沈着、補体の活性化、炎症細胞の浸潤）、薬物による障害（たとえば抗がん剤や抗生物質、造影剤による直接的な腎組織の障害）などが知られている。このように腎不全の原因は様々であるが、進行性腎障害に共通な主な現象（ｆｉｎａｌ  ｃｏｍｍｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ）として、組織の酸素分圧の低下（即ち虚血）の関与があり、例えば、急性腎不全の一つである造影剤による腎障害は虚血が原因であることが報告されている（非特許文献１参照）。また、慢性腎不全においても同様に腎障害に虚血が関係することが報告されている（非特許文献２及び３参照）。すなわち、虚血による腎組織障害をコントロールできれば、種々の腎疾患の治療あるいは腎不全の進行の抑制ができる可能性が考えられる。
一方、著しく腎機能が低下した末期腎不全の治療には、血液浄化療法以外には腎移植が施されている。腎移植は生体腎移植及び死体腎移植が行われているが、死体腎移植は、生体腎移植と比較して、ドナーから腎臓が摘出されてから移植されるまでの時間が一般的に長い。したがって、死体腎移植ではドナーの死亡後、腎への血流が途絶えるため、腎臓が虚血状態となり、虚血による腎組織の障害が生じる。さらに、虚血になった腎臓をレシピエントに移植した後、腎臓に血液が再灌流することにより生じる虚血−再灌流による障害も生じることとなる。これらの虚血障害あるいは虚血−再灌流障害は腎臓の生着率の低下を招くとともに、移植直後からの腎機能の発現低下を生じる（非特許文献４及び５参照）。
ところで、Ｇ−ＣＳＦに関して、シスプラチン誘発マウス急性尿細管性腎不全モデルにおいて、Ｇ−ＣＳＦの投与が腎機能の改善傾向を示したことが報告されている（非特許文献６）。また、Ｇ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子を有効成分とする腎疾患治療剤が開示されている（特許文献１）が、ここでは虚血−再灌流による急性の腎障害に対する治療効果しか確認されていない。
【非特許文献１】リス（Ｐ  Ｌｉｓｓ）等、「キドニー  インターナショナル（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）」（米国）１９９８年、第５３巻、ｐｐ．６９８−７０２
【非特許文献２】ナンガク（Ｍ  Ｎａｎｇａｋｕ）、「インターナル  メディシン（Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．）」２００４年、第４３巻、ｐｐ．９−１７
【非特許文献３】エカート（ＫＵ  Ｅｃｋａｒｄｔ）等、「ブラッド  ピューリフィケイション（Ｂｌｏｏｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」（スイス）２００３年、第２１巻、ｐｐ．２５３−２５７
【非特許文献４】シャウン（Ｄ  Ｓｔ  Ｐｅｔｅｒ  Ｓｈａｗｎ）等、「ザ  ランセット（Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ）」（米国）２００２年、第３５９巻、ｐｐ．６０４−６１３
【非特許文献５】アイカワ（Ａ  Ａｉｋａｗａ）、「腎と透析」（日本）２０００年、第４９巻、Ｎｏ３  増刊号、ｐｐ．４７２−４７７
【非特許文献６】西田  眞佐志等、第４７回日本腎臓学会誌２００４年第４６巻、Ｎｏ．３  ｐ２７０
【特許文献１】国際公開ＷＯ  ２００５／０３４９８６
【発明の開示】
虚血あるいは虚血−再灌流による障害に対する保護効果を有する新規薬剤の開発によって、種々の腎疾患の治療あるいは腎不全の進行の抑制が期待できる。また、腎移植時の虚血あるいは虚血−再灌流障害を予防することにより、移植機会の増加、初期腎機能低下の軽減が実現でき、結果的に移植数の増加や成功率を上げることができ、さらには長期的には移植グラフトにおけるネフロン機能の保持に必要な尿細管周囲血流の確保が、移植腎の生着率の上昇に直接的に関与すると考えられる。またこれは、慢性腎障害の病態に総じて関連したｆｉｎａｌ  ｃｏｍｍｏｎ  ｐａｔｈｗａｙであるといっても過言ではない。
Ｇ−ＣＳＦは好中球を増加させる薬剤として臨床適用されているが、腎臓において、虚血あるいは虚血−再灌流による障害に対して保護作用のあることは知られていない。また上記のような薬剤性の腎不全モデルは必ずしも虚血による腎障害あるいは虚血−再灌流に伴う腎障害を反映しているとは言えず、こうした腎障害に対する効果についてはまったく未知であった。
本発明者等は、虚血および虚血−再灌流による腎障害を反映したラットモデルにおいて、その腎機能が改善されるかどうかを検討したところ、Ｇ−ＣＳＦの投与によって腎不全期における腎機能が改善することを確認した。また、Ｇ−ＣＳＦが葉酸による慢性腎障害モデルにおいて、組織障害を軽減することを見出し、本発明を完成するに到った。
すなわち、本発明は、その一の態様において、顆粒球コロニー刺激因子を有効成分として含む、虚血関連腎障害または腎虚血−再灌流に伴う腎障害の予防または治療剤を提供する。
本発明において、好ましい腎障害は慢性腎障害である。
本明細書書中、慢性腎障害とは、腎間質の線維化および慢性虚血の少なくともいずれかを呈した状態をいう。また、ここでいう慢性腎障害には、急性の腎障害から慢性の腎障害に進行していく過程の進行性腎障害も含まれる。
慢性虚血とは、例えば、尿細管周囲血管網の減少等で特徴付けられる状態であり、抗ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ）抗体を用いて検出される。その結果が間質の線維化として組織学的に評価されうる。
本発明は更に、別の態様において、本発明の予防または治療剤を、虚血関連腎障害または腎虚血−再灌流に伴う腎障害をもつ患者に投与することを含む、前記腎障害を予防または治療するための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】  図１は、腎間質の線維化の組織学的評価を示す。原図（Ｏｒｉｇｉｎａｌ  ｐｉｃｔｕｒｅ）は、マッソン−トリクロム（Ｍａｓｓｏｎ／Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色で線維化部分が青染されている原写真を示す。解析図（Ａｎａｌｙｚｅｄ  ｐｉｃｔｕｒｅ）は、これを、画像解析ソフトで解析した図を示す。
発明の詳細な説明
以下に本発明をより詳細に説明するが、本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００４−２３８５７３号の明細書および／または図面に記載される内容を包含するものとする。
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は好中球前駆細胞に作用し、その分化・増殖を促進させるほか、骨髄からの成熟好中球の放出促進及び好中球機能を亢進させる作用を有することから、造血幹細胞移植後の好中球数の増加促進、あるいはがん化学療法後の好中球減少症治療剤として既に臨床応用されているタンパク質である。また、骨髄中の造血幹細胞を末梢血中へ動員する作用を有することから、同種及び自家末梢血幹細胞採取時における造血幹細胞の末梢血中への動員剤としても臨床応用されている。
本発明者等は、驚くべきことに、Ｇ−ＣＳＦが腎虚血−再灌流によるラット腎障害モデルおよび葉酸によるマウス腎不全モデルにおける腎機能を改善することを見出した。
腎虚血−再灌流によるラット腎障害モデルとしてＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット、１８０〜２００ｇ、６週齢程度を使用する場合には、全身麻酔下に左腎動脈をクリップで挟み４５分間の腎虚血を起こし、クリップを外す直前に右腎を摘出したのちにクリップを外し、左腎を再灌流させる。なお、再灌流直前に右腎を摘出することで虚血腎の再灌流障害の程度を腎機能の推移として直接とらえることが容易になると考えられる。
上記モデルは虚血−再灌流による腎障害の病態を代表するモデルであり、再灌流後およそ２４時間をピークとする血清クレアチニン濃度、尿素窒素濃度の上昇を示す急性腎不全である。組織学的には腎皮髄境界部周辺を中心に尿細管上皮の脱落、変性と腎間質への炎症細胞浸潤を呈する急性尿細管壊死であり、再灌流後２４時間から９６時間において最も強く現れ、その後数週間に渡って尿細管上皮の修復、再生所見が認められる。
また、Ｇ−ＣＳＦが葉酸による慢性腎障害モデルにおける組織障害を軽減することを見出した。
上記モデルでの有効性が証明されたＧ−ＣＳＦは、虚血あるいは虚血−再灌流による腎組織の障害が関与している急性腎不全、慢性腎不全、各種腎炎、腎移植などに使用できる。これらの疾患に対して、Ｇ−ＣＳＦは、発症防止のために予防的にあるいは発症後の進行を抑制するために治療的に投与するものである。ここで「予防的に」とは、急性症状、腎炎などの非慢性症状から慢性症状に移行することを防止することを意味する。
本発明に用いることができるＧ−ＣＧＦとして、特に好ましいものはヒトＧ−ＣＧＦである。ヒトＧ−ＣＳＦの例としては、例えば配列番号１〜３のアミノ酸配列、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列、で表されるヒトＧ−ＣＳＦ活性（すなわち、好中球増加活性、および虚血関連のまたは腎虚血−再灌流に伴う腎障害に対する予防または治療活性）を有するポリペプチド、又はこれに糖鎖が付された糖タンパク質を挙げることができる。更に、同配列のアミノ酸配列の一部が改変（置換、欠失、挿入、および／または付加）されたＧ−ＣＳＦ活性を有するＧ−ＣＳＦ誘導体も本発明におけるＧ−ＣＳＦに含まれる。このようなＧ−ＣＳＦ誘導体は、好ましくは、配列番号１または２で示されるアミノ酸配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。上記改変は、例えば公知の部位特異的突然変異誘発法（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用する方法を含む）によって行うことができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ＵＳＡ）。改変には、保存的アミノ酸置換が含まれる。すなわち、このような置換は、電気的または構造的に類似した性質をもつアミノ酸間の置換であり、例えば塩基性アミノ酸間、酸性アミノ酸間、疎水性アミノ酸間、あるいは極性アミノ酸間でのアミノ酸置換である。
これらのＧ−ＣＳＦは天然由来のもの、および遺伝子組換えによって得られたものを含むが、遺伝子組換えで得られたものが好ましい。この場合、宿主細胞としては大腸菌、哺乳動物細胞（Ｃ１２７、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３細胞等）を挙げることができる。これらの詳細な製造方法については、例えば、特表昭６３−５００６３６号、特開昭６２−２３６４９７号、特開昭６２−２３６４８８号、及び特開昭６３−２６７２９２号等に開示されている。
また、上記の配列番号１〜３のアミノ酸配列で示されるポリペプチドまたは糖タンパク質およびＧ−ＣＳＦ誘導体に、さらにポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール等の水溶性ポリマーを少なくとも１分子結合させたもの（例えば、ＷＯ９０／０６９５２、ＷＯ９６／１１９５３、特開平１−３１６４００）も含まれる。特に好ましい水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコールであり、例えば分子量２，０００〜１００，０００程度、好ましくは６，０００〜２５，０００程度のポリエチレングリコールである。ポリエチレングリコールの付加は、一般にＰＥＧ（ペグ）化と呼ばれているが、Ｇ−ＣＳＦのアミノ末端アミノ基および／またはリシン残基のεアミノ基に、アシル基やアルデヒド基などのアミノ基と反応性の基を介して結合することによって行うことができる。市販品としては、例えばＡｍｇｅｎ社がＮｅｕｌａｓｔａ（登録商標）として販売しているＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦが挙げられる。
更にまた、Ｇ−ＣＳＦの糖鎖結合部位を改変することにより、糖鎖の構造を変えたり、糖鎖を付加あるいは欠失させたようなＧ−ＣＳＦ糖鎖改変体、あるいは、アルブミン、ビタミンＢ１２、または免疫グロブリン等と融合させたタンパク質も含まれる。Ｇ−ＣＳＦ糖鎖改変体は、例えばＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列にＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ配列（ここで、ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸である。）を新たに付加したり、Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸配列から該Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ配列を欠失したりすることによって得ることができる。このような付加や欠失は、例えばＰＣＲを利用する部位特異的突然変異誘発法（Ａｕｓｕｂｅｌら，上記）を用いることによって容易に実施可能である。また、融合タンパク質は、一般的な遺伝子組換え技術を用いて、Ｇ−ＣＳＦをコードするＤＮＡと、これに融合させるタンパク質をコードするＤＮＡとを融合したＤＮＡを合成し、プロモーターの調節下にある適当なベクターに該融合ＤＮＡを挿入し、該ベクターを適当な宿主細胞に導入し、該融合ＤＮＡを発現させることを含む手法によって得ることができる。
本発明の虚血関連腎障害および腎虚血−再灌流に伴う腎障害に対する予防または治療剤は、単独で、あるいは薬学的に許容される担体、賦形剤、安定化剤等を含む医薬組成物として患者に投与することができる。
すなわち、本発明はまた、上記の医薬組成物を、虚血関連腎障害および腎虚血−再灌流に伴う腎障害をもつ患者に投与することを含む、前記腎障害を予防または治療するための方法を提供する。
このような医薬組成物は、注射製剤、経口製剤、経粘膜投与製剤等、徐放性製剤の形態をとることができ、当分野で通常用いられている形態のいずれを用いることもできるが、特に注射製剤が好ましい。注射製剤における投与経路としては、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、腎動脈内投与、あるいは徐放化ゲルを用いた投与があるが、特に皮下投与、静脈内投与が好ましい。
本発明の虚血関連腎障害および腎虚血−再灌流に伴う腎障害に対する治療剤において、Ｇ−ＣＳＦの投与量、投与回数は患者の状態に応じて決めることができ、特に限定するものではないが、通常０．１〜２００μｇ／ｋｇ／日、好ましくは１〜１００μｇ／ｋｇ／日であり、投与回数は、１〜７日間／週投与することができる。
本発明の虚血関連腎障害および腎虚血−再灌流に伴う腎障害に対する予防または治療剤はまた、生理食塩水やマンニトール、リンゲル液等の補液、あるいは、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、血圧降下薬、利尿薬、抗血小板薬、血栓溶解剤、糖尿病治療薬、高脂血症治療薬、抗炎症薬、ステロイド、免疫抑制薬等の従来から腎疾患または原疾患に付随した合併症としての腎疾患に使用されている薬剤１種以上との併用も可能であり、同時に、あるいは別々に投与したり、これらを併せて含有する医薬組成物として投与することもできる。腎疾患に対して単独では効果が認められないこれらの薬剤も、Ｇ−ＣＳＦによって腎機能が保護された状態に対して投与することで、有効に作用させることができる。
腎疾患に対する治療効果は、例えば、血清クレアチニン濃度や血中尿素窒素濃度上昇の軽減、尿中蛋白量や尿中アルブミン量の減少、組織学的な尿細管障害スコアの改善等によって確認することができる（ＪＤ  Ｃｏｎｇｅｒ等、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、１９９４年、第４６巻、ｐ．３１８；ＳＰ  Ｋｅｌｌｅｈｅｒ等、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、１９８７年、第３１巻、ｐ．７２５参照）。
本発明の腎虚血−再灌流に伴う腎障害に対する治療剤は、腎臓移植等の処置前に補助療法として行うこともできる。
以下、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】〔実施例１〕
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット、１８０〜２００ｇ（埼玉実験動物社製、埼玉、日本）において、麻酔下（塩酸ケタミン）、左腎動脈をクリップで挟み４５分間の腎虚血を起こした。クリップを外す直前に右腎を摘出したのち、クリップを外し、左腎を再灌流した。
再灌流直後にヒトＧ−ＣＳＦ（キリンビール社製（東京、日本）のＦｉｌｇｒａｓｔｉｍＴＭ、配列番号１のアミノ酸配列で示されるペプチド）１００μｇ／ｋｇを皮下に投与し、その後２４時間ごとにＧ−ＣＳＦの同用量を２回皮下に投与した。Ｇ−ＣＳＦ最終投与２４時間後、すなわち、虚血−再灌流後７２時間に採血および腎臓を摘出し、血清クレアチニン濃度と血中尿素窒素濃度を測定した（表１および表２参照）。また、摘出した腎臓の組織標本を作製し、顕微鏡下で尿細管障害を、ＪＤ  Ｃｏｎｇｅｒら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、１９９４年、第４６巻、ｐ．３１８及びＳＰ  Ｋｅｌｌｅｈｅｒら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、１９８７年、第３１巻、ｐ．７２５に記載された方法に準じて評価し、スコア化した（表３参照）。具体的には、各組織ともに対物２００倍で異なる２０視野について尿細管障害スコアの各項目を０，０．５，１．０，１．５，２．０の五段階に評価し、その合計を比較した。障害が高度なほど高値となる。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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その結果、コントロール群（生理食塩水投与）では腎虚血−再灌流により血清クレアチニン濃度と血中尿素窒素濃度が増加し、腎機能の低下を示したが、Ｇ−ＣＳＦ投与によりそれらの増加は抑えられ、Ｇ−ＣＳＦによる腎機能の改善が認められた。さらに、腎虚血−再灌流７２時間後の尿細管の障害もＧ−ＣＳＦにより改善されていることが示された。
〔実施例２〕
既に葉酸による腎不全のモデルはＷｉｓｔａｒ系ラットやＩＣＲ（ＣＤ１）系マウスで確立されている（ＤＡＶＩＤ  Ａ．ＬＯＮＧら，Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １２：２７２１−２７３１，２００１、Ｈａｉ−Ｔａｏ  Ｙｕａｎら，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１６３，Ｎｏ．６，２２８９−２３０１，２００３）。葉酸２５０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与から１４日後には、慢性腎障害の特徴の一つである腎間質の線維化を呈するとともに、慢性腎障害のｆｉｎａｌ  ｃｏｍｍｏｎ  ｐａｔｈｗａｙである慢性虚血を来すことが示されている（Ｈａｉ−Ｔａｏ  Ｙｕａｎら，上記）。
そこで、慢性腎障害に対するＧ−ＣＳＦの効果を評価するためにこのモデルを作製して以下の検討を行った。
ＩＣＲ系マウス（埼玉実験動物（株）（埼玉、日本）より購入、６週齢、２０〜２５ｇ）に０．３ｍｏｌ／Ｌ炭酸水素ナトリウム溶液で溶解した葉酸２５０ｍｇ／ｋｇを単回腹腔内投与し、葉酸投与後７日目よりｒｈＧ−ＣＳＦ５０μｇ／ｋｇを隔日皮下投与し（計４回）、１４日目にと殺して組織学的評価を行ったところ、腎間質の線維化は対照である生理食塩水投与群（Ｎ＝５）に比較してｒｈＧ−ＣＳＦ群（Ｎ＝６）で有意に軽減していた（図１参照）。
また、経時的に血中尿素窒素を測定し、１４日目にはやはりｒｈＧ−ＣＳＦ群で有意に改善していた（表４参照）。更に、間質線維化の評価については線維化領域が青染されるＭａｓｓｏｎ／Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色標本に対して専用画像解析ソフト、ＡＩＳ（イメージングリサーチ社製）により解析した（１標本各１０視野ずつ検討）。具体的には２０×対物レンズで取り込んだ画像全体に対する線維化部分の割合を示すものである（表５参照）。さらに追加実験として、上記と同様の葉酸投与モデルに対して、７日目よりｒｈＧ−ＣＳＦ５０μｇ／ｋｇを隔日皮下投与し（計１１回）２８日目にと殺して組織学的評価を行ったところ、腎間質の線維化は対照である生理食塩水投与群（Ｎ＝２）に比較してｒｈＧ−ＣＳＦ群（Ｎ＝２）で有意に軽減していた。上記と同様に間質線維化の評価を行なった結果を表６に示す。また、尿細管・間質の虚血、低酸素について、１０ｍｍＨｇ以下の組織酸素分圧低下を検出するＨｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ−１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）による免疫染色を行い、ＡＩＳにて解析したところ、生理食塩水投与群（Ｎ＝２）に比較してｒｈＧ−ＣＳＦ群（Ｎ＝２）で有意に軽減していた（表７参照）。また、尿細管周囲毛細血管網の評価についてはＣＤ３１による免疫染色を行いＡＩＳにより解析したところ、生理食塩水投与群に比較してｒｈＧ−ＣＳＦ群で有意に保たれていた（表８参照）。以上から、慢性腎障害に対してもＧ−ＣＳＦの有効性が示された。
【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【産業上の利用可能性】  現在、虚血あるいは虚血−再灌流による腎組織障害に対しての保護を主な薬理作用として持つ腎疾患治療薬はない。また、慢性腎不全の進行を緩やかにする薬剤は現存するが、進行を止めるまでには至らず、さらに強力な腎不全進行抑制薬が待ち望まれている。したがって、本発明により単独あるいは現存の他薬剤との併用により急性腎不全の防止あるいは、慢性腎不全の進行抑制の向上が達成できる薬剤を提供できる。さらに、本薬剤を腎移植時の生着率の向上、移植機会の増加のために使用することも可能となる。
【配列表フリーテキスト】  配列番号１：  天然型ヒトＧ−ＣＳＦに関して−１位にＭｅｔ残基を含むアミノ酸配列。
配列番号３：  天然型ヒトＧ−ＣＳＦに関して−１位にＭｅｔ残基を含み、かつ、天然型ヒトＧ−ＣＳＦ中の＋１位のＴｈｒ残基、＋３位のＬｅｕ残基、＋４位のＧｌｙ残基、＋５位のＰｒｏ残基及び＋１７位のＣｙｓ残基がそれぞれＡｌａ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ及びＳｅｒに置換されているアミノ酸配列。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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