(57)【要約】本発明は、過興奮性の細胞傷害（例えば、神経細胞傷害）を防御または救済して過興奮性の細胞傷害によって生じる疾患（例えば、虚血性脳血管疾患）を治療するための薬剤および方法に関するものである。さらに本発明は、過興奮性の細胞傷害を評価する方法および当該細胞傷害を抑制する因子をスクリーニングする方法に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
容積感受性Ｃｌ−チャネルのブロッカーを含むことを特徴とする過興奮性の細胞傷害を呈する血管疾患の治療剤。
【請求項２】
上記疾患が虚血性脳血管疾患であることを特徴とする請求の範囲１に記載の治療剤。
【請求項３】
上記細胞が神経細胞であることを特徴とする請求の範囲１または２に記載の治療剤。
【請求項４】
上記細胞傷害が、脳組織腫張（脳浮腫）、てんかん、脳梗塞、心筋梗塞、または心移植時もしくは脳血管吻合術時において生じることを特徴とする請求の範囲１〜３のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項５】
上記細胞傷害が、細胞の著しい膨張を伴うことを特徴とする請求の範囲１〜４のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項６】
上記細胞傷害が、ネクローシスを伴うことを特徴とする請求の範囲１〜５のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項７】
上記細胞傷害が、形質膜におけるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）透過性の著しい増加を伴うことを特徴とする請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項８】
上記細胞傷害が、細胞質からのラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）漏出の著しい増加を伴うことを特徴とする請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項９】
上記ブロッカーがＮＰＰＢまたはｐｈｌｏｒｅｔｉｎであることを特徴とする請求の範囲１〜８のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項１０】
容積感受性Ｃｌ−チャネルのブロッカーを細胞に投与する工程を包含することを特徴とする過興奮性の細胞傷害を呈する疾患の治療方法。
【請求項１１】
上記疾患が虚血性脳血管疾患であることを特徴とする請求の範囲１０に記載の治療方法。
【請求項１２】
上記細胞が神経細胞であることを特徴とする請求の範囲１０または１１に記載の治療剤。
【請求項１３】
上記細胞傷害が、脳組織腫張（脳浮腫）、てんかん、脳梗塞、心筋梗塞、または心移植時もしくは脳血管吻合術時において生じることを特徴とする請求の範囲１０〜１２のいずれか１項に記載の治療方法。
【請求項１４】
上記細胞傷害が、細胞の著しい膨張を伴うことを特徴とする請求の範囲１０〜１３のいずれか１項に記載の治療方法。
【請求項１５】
上記細胞傷害が、ネクローシスを伴うことを特徴とする請求の範囲１０〜１４のいずれか１項に記載の治療方法。
【請求項１６】
上記細胞傷害が、形質膜におけるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）透過性の著しい増加を伴うことを特徴とする請求の範囲１０〜１５のいずれか１項に記載の治療方法。
【請求項１７】
上記細胞傷害が、細胞質からのラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）漏出の著しい増加を伴うことを特徴とする請求の範囲１０〜１５のいずれか１項に記載の治療方法。
【請求項１８】
上記ブロッカーがＮＰＰＢまたはｐｈｌｏｒｅｔｉｎであることを特徴とする請求の範囲１０〜１７のいずれか１項に記載の治療方法。
【請求項１９】
インビトロでの培養細胞系において過興奮によって生じる細胞死を評価するための評価方法であって、
培養細胞における細胞死を測定する第１の測定工程；
当該細胞に過興奮刺激を供する刺激工程；
過興奮刺激を供した細胞の細胞死を測定する第２の測定工程；および
第１の測定工程によって得た第１の測定値と第２の測定工程によって得た第２の測定値とを比較する比較工程
を包含することを特徴とする評価方法。
【請求項２０】
上記細胞が神経細胞であることを特徴とする請求の範囲１９に記載の評価方法。
【請求項２１】
上記第１および第２の測定工程において、ミトコンドリア脱水素酵素の活性を指標にして細胞死を測定することを特徴とする請求の範囲１９または２０に記載の評価方法。
【請求項２２】
上記第１および第２の測定工程において、核内ＤＮＡの断片化を指標にすることを特徴とする請求の範囲１９〜２１のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項２３】
上記第１および第２の測定工程において、上記細胞の樹状突起瘤の形成を指標にすることを特徴とする請求の範囲１９〜２１のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項２４】
樹状突起瘤にてＣｌ−電流を検出する工程をさらに包含することを特徴とする請求の範囲１９〜２３のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項２５】
第１の測定工程の後に、細胞に容積感受性Ｃｌ−チャネルのブロッカーを適用する工程をさらに包含することを特徴とする請求の範囲１９〜２４のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項２６】
インビトロでの培養細胞系において過興奮によって生じる細胞傷害を抑制する因子をスクリーニングするためのスクリーニング方法であって、
培養細胞における細胞死を測定する第１の測定工程；
当該細胞に候補因子を適用する工程；
候補因子を適用した細胞に過興奮刺激を供する刺激工程；
過興奮刺激を供した細胞の細胞死を測定する第２の測定工程；および
第１の測定工程によって得た第１の測定値と第２の測定工程によって得た第２の測定値とを比較する比較工程
を包含することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２７】
上記細胞が神経細胞であることを特徴とする請求の範囲２５に記載のスクリーニング方法。
【請求項２８】
第１の測定工程の後に、細胞に容積感受性Ｃｌ−チャネルのブロッカーを適用する工程をさらに包含することを特徴とする請求の範囲２６または２７に記載のスクリーニング方法。
【請求項２９】
インビトロでの培養細胞系において過興奮によって生じる神経細胞膨張を評価するための評価方法であって、
培養神経細胞に過興奮刺激を供する刺激工程；
当該神経細胞の樹状突起を可視化する工程；；および
神経細胞の樹状突起瘤の形成を検出する工程
を包含することを特徴とする評価方法。
【請求項３０】
上記可視化する工程において、ＥＧＦＰの遺伝子のトランスフェクションを用いることを特徴とする請求の範囲２９に記載の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、過興奮性の細胞傷害（例えば、神経細胞傷害）を防御または救済して過興奮性の細胞傷害によって生じる疾患（例えば、虚血性脳血管疾患）を治療するための薬剤および方法に関するものである。さらに本発明は、過興奮性の細胞傷害を評価する方法および当該細胞傷害を抑制する因子をスクリーニングする方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  脳組織腫張（脳浮腫とも呼ばれる）は、神経細胞またはグリア細胞から放出される過剰量のグルタミン酸に起因する神経細胞の過興奮が成因の１つであると考えられている虚血性脳血管疾患である。脳浮腫をもたらす神経細胞の膨張は、過興奮性であり、脳虚血および／またはてんかんなどの脳障害において観察される。神経細胞の膨張が持続すると、周囲の細胞および／または脳組織全体を圧迫し、頭蓋内圧を亢進する。その結果、非常に重篤な傷害（例えば、脳ヘルニア）を個体にもたらす（非特許文献１および非特許文献２を参照のこと）。【０００３】  脳浮腫を軽減することによって損傷領域を縮小することができる。実際に、現在の臨床において、脳浮腫軽減のために高浸透圧溶液の投与が広く行われている。しかし、この高浸透圧療法は、脱水、電解質異常、うっ血性心不全、または重篤な腎障害などの副作用を引き起こすことがあるので、より副作用の少ない脳浮腫軽減方法の開発が望まれている。【０００４】  神経細胞の膨張は、グルタミン酸受容体チャネルを介する大量のナトリウム（Ｎａ＋）の流入と、電気的中性則に従ってナトリウム流入に付随するクロライド（Ｃｌ−）の流入によって引き起こされる。過興奮に起因する神経細胞の膨張が持続すると、頭蓋内圧亢進によって生じる傷害以外に、細胞破裂による不可逆的な細胞死（ネクローシス）という細胞傷害が生じる。【０００５】  これまで、過興奮に起因する神経細胞死の研究においては、グルタミン酸レセプターチャネルを介するナトリウムとカルシウムの細胞内流入の役割のみが長年にわたって注目されてきたが、最近、クロライド流入の重要性が指摘されてきている（非特許文献３〜６を参照のこと）。これまでに臨床応用が試みられた脳虚血および／またはてんかんにおける神経細胞過興奮を抑制する薬剤は、グルタミン酸受容体を直接ブロックする薬剤であったが、これらはいずれも精神の異常をもたらし、動揺および／または幻覚などの重篤な副作用を示した（非特許文献７を参照のこと）。よって、新たな神経細胞過興奮抑制剤の開発が切望されている。【０００６】〔非特許文献１〕
Ｋｉｍｅｌｂｅｒｇ  ＨＫ．「Ｃｕｎｅｎｔ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｏｆ  ｂｒａｉｎ  ｅｄｅｍａ」Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．８３：１０５１−１０５９（１９９５）
〔非特許文献２〕
Ｇｒｉｅｓｄａｌｅ  ＤＥＧ，Ｈｏｎｅｒ  ＣＲ．「Ａｑｕａｐｏｒｉｎｓ  ａｎｄ  ｂｒａｉｎ  ｅｄｅｍａ」Ｓｕｒｇ．Ｎｅｕｒｏｌ．６１：４１８−４２１（２００４）
〔非特許文献３〕
Ｃｈｅｎ  Ｑ，Ｏｌｎｅｙ  ＪＷ，Ｌｕｋａｓｉｅｗｉｃｚ  ＰＤ，Ａｌｍｌｉ  Ｔ，Ｒｏｍａｎｏ  Ｃ．「Ｃａ２＋−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｒｅｔｉｎａ，ａｎ  ｉｎｔａｃｔ  ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔ：ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  Ｃｌ−  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｓ」Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５３：５６４−５７２（１９９８）
〔非特許文献４〕
Ｃｈｅｎ  Ｑ，Ｍｏｕｌｄｅｒ  Ｋ，Ｔｅｎｋｏｖａ  Ｔ，Ｈａｒｄｙ  Ｋ，Ｏｌｎｅｙ  ＪＷ，Ｒｏｍａｎｏ  Ｃ．「Ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１６０：２１５−２２５（１９９９）
〔非特許文献５〕
Ｂｕｒｇｏｓ  ＪＳ，Ｂａｒａｔ  Ａ，Ｒａｍｉｒｅｚ  Ｇ．「Ｃｌ−−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ３Ｈ２Ｏ  ｉｎｆｌｕｘ  ｉｎ  ｃｈｉｃｋ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｒｅｔｉｎａ」ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ  １１：３７７９−３７８２（２０００）
〔非特許文献６〕
Ｄａｍｍｅ  ＰＶ，Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ  Ｇ，Ｅｇｇｅｒｍｏｎｔ  Ｊ，Ｒｏｂｂｅｒｅｃｈｔ  Ｗ，Ｂｏｓｃｈ  ＶＤ．「Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｉｎｆｌｕｘ  ａｇｇｒａｖａｔｅｓ  Ｃａ２＋−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＡＭＰＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎ  ｄｅａｔｈ」Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：４９４２−４９５０（２００３）
〔非特許文献７〕
Ｌｏｅｓｃｈｅｒ  Ｗ，Ｗｌａｚ  Ｐ，Ｓｚａｂｏ  Ｌ．「Ｆｏｃａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ」Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２４０：３３−３６（１９９８）。【０００７】  過興奮に起因する神経細胞傷害は、脳組織腫張（脳浮腫）のような脳血管疾患だけでなく、虚血および／またはてんかんなど種々の脳疾患において共通して観察される。過興奮性神経細胞傷害の初期に見られる神経細胞の膨張および／またはネクローシスを抑制することは、脳疾患に罹患する患者の予後を改善するために非常に重要である。【０００８】  本発明者らは、過興奮に起因する神経細胞の膨張によって容積感受性Ｃｌ−チャネルが活性化されること、および、この容積感受性Ｃｌ−チャネルの活性が、過興奮刺激を除去した後に見られる神経細胞容積の正常復帰に関与していることを見出した。また一方で、神経細胞の過興奮時に活性化された容積感受性Ｃｌ−チャネルがクロライドイオンの流入経路を提供することによって細胞膨張を悪化させ、その結果、細胞破裂による急性のネクローシス性神経細胞死を引き起こすということが考えられた。しかし、このような観点から、過興奮に起因する神経細胞の膨張および／またはネクローシスを抑制（すなわち、防御および／または救済）するための治療法の開発は、未だ行われていない。【０００９】  本発明は、以上のような新知見に基づく、過興奮性の神経細胞傷害（例えば、過興奮に起因する神経細胞の膨張および／またはネクローシス）を防御または救済する方法、ならびに過興奮性の神経細胞傷害を防御または救済することによって当該神経細胞傷害に起因する脳血管疾患を治療するための薬剤を提供することを目的とする。具体的には、神経過興奮時に活性化される容積感受性Ｃｌ−チャネルの活性を、Ｃｌ−チャネルブロッカーを用いて制御して、過興奮性の神経細胞傷害を防御および／または救済する方法ならびに薬剤を提供することを目的とする。
【発明の開示】
【００１０】  本発明に係る治療剤は、過興奮性の細胞傷害を呈する疾患を治療するために、容積感受性Ｃｌ−チャネルのブロッカーを含むことを特徴としている。
【００１１】  本発明に係る治療剤において、上記疾患は虚血性脳血管疾患であることが好ましい。
【００１２】  本発明に係る治療剤において、上記細胞は神経細胞であることが好ましい。
【００１３】  本発明に係る治療剤において、上記細胞傷害は、脳組織腫張（脳浮腫）、てんかん、脳梗塞、心筋梗塞、または心移植時もしくは脳血管吻合術時において生じることが好ましい。
【００１４】  本発明に係る疾患の治療剤において、上記細胞傷害は、細胞の著しい膨張を伴うことが好ましい。
【００１５】  本発明に係る治療剤において、上記細胞傷害は、ネクローシスを伴うことが好ましい。
【００１６】  本発明に係る治療剤において、上記細胞傷害は、形質膜におけるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）透過性の著しい増加を伴うことが好ましい。
【００１７】  本発明に係る治療剤において、上記細胞傷害は、細胞質からのラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）漏出の著しい増加を伴うことが好ましい。
【００１８】  本発明に係る治療剤において、上記ブロッカーは、ＮＰＰＢまたはｐｈｌｏｒｅｔｉｎであることが好ましい。
【００１９】  本発明に係る治療方法は、過興奮性の細胞傷害を呈する疾患を治療するために、容積感受性Ｃｌ−チャネルのブロッカーを細胞に投与する工程を包含することを特徴としている。
【００２０】  本発明に係る治療方法において、上記疾患は虚血性脳血管疾患であることが好ましい。
【００２１】  本発明に係る治療方法において、上記細胞は神経細胞であることが好ましい。
【００２２】  本発明に係る治療方法において、上記細胞傷害は、脳組織腫張（脳浮腫）、てんかん、脳梗塞、心筋梗塞、または心移植時もしくは脳血管吻合術時において生じることが好ましい。
【００２３】  本発明に係る治療方法において、上記細胞傷害は、細胞の著しい膨張を伴うことが好ましい。
【００２４】  本発明に係る治療方法において、上記細胞傷害は、ネクローシスを伴うことが好ましい。
【００２５】  本発明に係る治療方法において、上記細胞傷害は、形質膜におけるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）透過性の著しい増加を伴うことが好ましい。
【００２６】  本発明に係る治療方法において、上記細胞傷害は、細胞質からのラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）漏出の著しい増加を伴うことが好ましい。
【００２７】  本発明に係る治療方法において、上記ブロッカーは、ＮＰＰＢまたはｐｈｌｏｒｅｔｉｎであることが好ましい。
【００２８】  本発明に係る細胞死を評価するための方法は、インビトロでの培養細胞系において過興奮によって生じる細胞死を評価するために、
培養細胞における細胞死を測定する第１の測定工程；
当該細胞に過興奮刺激を供する刺激工程；
過興奮刺激を供した細胞の細胞死を測定する第２の測定工程；および
第１の測定工程によって得た第１の測定値と第２の測定工程によって得た第２の測定値とを比較する比較工程
を包含することを特徴としている。
【００２９】  本発明に係る細胞死を評価するための方法は、上記細胞が神経細胞であることが好ましい。
【００３０】  本発明に係る細胞死を評価するための方法は、上記第１および第２の測定工程において、ミトコンドリア脱水素酵素の活性を指標にして細胞死を測定することが好ましい。
【００３１】  本発明に係る細胞死を評価するための方法は、上記第１および第２の測定工程において、核内ＤＮＡの断片化を指標にすることが好ましい。
【００３２】  本発明に係る細胞死を評価するための方法は、上記第１および第２の測定工程において、上記細胞の樹状突起瘤（ｖａｒｉｃｏｓｉｔｙ）の形成を指標にすることが好ましい。
【００３３】  本発明に係る細胞死を評価するための方法は、樹状突起瘤にてＣｌ−電流を検出する工程をさらに包含することが好ましい。
【００３４】  本発明に係る細胞死を評価するための方法は、第１の測定工程の後に、細胞に容積感受性Ｃｌ−チャネルのブロッカーを適用する工程をさらに包含することが好ましい。
【００３５】  本発明に係る細胞傷害を抑制する因子をスクリーニングする方法は、インビトロでの培養細胞系において過興奮によって生じる細胞傷害を抑制する因子をスクリーニングするために、
培養細胞における細胞死を測定する第１の測定工程；
当該細胞に候補因子を適用する工程；
候補因子を適用した細胞に過興奮刺激を供する刺激工程；
過興奮刺激を供した細胞の細胞死を測定する第２の測定工程；および
第１の測定工程によって得た第１の測定値と第２の測定工程によって得た第２の測定値とを比較する比較工程
を包含することを特徴としている。
【００３６】  本発明に係るスクリーニング方法は、上記細胞が神経細胞であることが好ましい。
【００３７】  本発明に係るスクリーニング方法は、第１の測定工程の後に、細胞に容積感受性Ｃｌ−チャネルのブロッカーを適用する工程をさらに包含することが好ましい。
【００３８】  本発明に係る神経細胞膨張を評価するための方法は、インビトロでの培養細胞系において過興奮によって生じる神経細胞膨張を評価するために、
培養神経細胞に過興奮刺激を供する刺激工程；
当該神経細胞の樹状突起を可視化する工程；；および
神経細胞の樹状突起瘤の形成を検出する工程
を包含することを特徴としている。
【００３９】  本発明に係る神経細胞膨張を評価するための方法は、上記可視化する工程において、ＥＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）の遺伝子のトランスフェクションを用いることが好ましい。
【００４０】  本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】大脳皮質神経細胞での容積感受性Ｃｌ−チャネルの発現を示すグラフである。Ａは、ホールセルパッチクランプ法により、初代培養大脳皮質神経細胞に容積感受性Ｃｌ−チャネルが存在することを示すグラフである。Ｂは、Ａにて示した電流が高いプラス電位で不活性となることを示すグラフである。Ｃは、Ａにて示した電流が電流−電圧曲線から外向き整流性でありかつ逆転電位がＣｌ−の平衡電位付近であることを示すグラフである。Ｄは、大脳皮質神経細胞に発現する容積感受性Ｃｌ−チャネルの薬理学的性質を示すグラフである。
【図２】容積感受性Ｃｌ−チャネルが大脳皮質神経細胞の容積調節へ関与することを示す図である。Ａは、培養５〜８日目の初代培養神経細胞にｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭを負荷して可視化した様子を二光子レーザー顕微鏡にてＸＹ断面像を経時的に撮影した写真である。Ｂは、種々の薬剤の存在下における細胞の大きさを、細胞体部分の断面積の変化によって評価したグラフである。
【図３】過興奮刺激により容積感受性Ｃｌ−チャネルが活性化する様子を示す図である。Ａは、過興奮刺激を与えた大脳皮質神経細胞において、樹状突起上に樹状突起瘤（ｖａｒｉｃｏｓｉｔｙ）が形成され、アゴニスト除去後に電流の活性化が見られたことを示すグラフおよび写真である。Ｂは、活性化された電流が高いプラス電位で不活性化することを示すグラフである。Ｃは、Ａにて示した電流が電流−電圧曲線から外向き整流性でありかつ逆転電位がＣｌ−の平衡電位付近であることを示すグラフである。
【図４】Ａは、過興奮刺激によって形成された樹状突起瘤が、刺激除去後に回復する様子を示すグラフである。Ｂは、過興奮刺激によって形成された樹状突起瘤が、刺激除去後に回復する様子を示す写真である。
【図５】樹状突起瘤からの回復過程に関与する分子を薬理学的に同定した結果を示すグラフである。
【図６】神経細胞に対する過興奮刺激の効果、および容積感受性Ｃｌ−チャネルによる調節を概念化した図である。
【図７】容積感受性Ｃｌ−チャネルブロッカーによって過興奮性神経細胞膨張が抑制されることを示す図である。Ａは、グルタミン酸レセプターアゴニストによる過興奮性神経細胞膨張を示すの顕微鏡写真である。Ｂは、Ｃｌ−チャネルブロッカーによる樹状突起瘤形成の抑制効果を示すグラフである。
【図８】Ａは、樹状突起瘤膜上でのパッチクランプ実験の様子を示す写真である。Ｂは、当該容積感受性Ｃｌ−チャネルの単一チャネル電流記録を示すグラフである（ａはコントロール、ｂはＮＰＰＢ投与３分後、ｃはＮＰＰＢ除去３分後の結果を表す）。Ｃは、当該容積感受性Ｃｌ−チャネルの単一電流−電圧曲線を示すグラフである。
【図９】容積感受性Ｃｌ−チャネルブロッカーによって過興奮性神経細胞死が抑制されることを示すグラフである。Ａは、ＮＭＤＡ曝露３時間後のＰＩ染色による死細胞判定結果を示すグラフである。Ｂは、ＮＭＤＡ曝露３時間後のＬＤＨ漏出による細胞死判定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】  マウス大脳皮質初代培養神経細胞をグルタミン酸レセプターのアゴニストに曝露することによって神経細胞を病的な過興奮状態に誘導し、この病的な過興奮状態において神経細胞に生じる過興奮性の傷害および／またはネクローシスを形態学的観察、形質膜破損の検討、またはＬＤＨ漏出量の測定によって評価し、これらの測定に対する各種薬剤の効果を調べることによって、脳虚血および／またはてんかんの際に生じる過興奮性の神経細胞傷害の治療または防御に効果的な薬剤のスクリーニング法を確立した。【００４３】  上述した検討の結果、本発明者らは、容積感受性Ｃｌ−チャネルのブロッカーを病的な過興奮状態に誘導した神経細胞に適用した際に、病的な過興奮によってもたらされる神経細胞のネクローシスが有意に抑制されることを見出した。このネクローシス救済メカニズムは、過興奮刺激時に生じる持続的な神経細胞膨張に関与する容積感受性Ｃｌ−チャネルの活性が抑制されたことによるものであると考えられる。【００４４】  以上の知見に基づいて、本発明者らは、過興奮性の神経細胞傷害における初期の反応である容積感受性Ｃｌ−チャネル活性化を標的とした新規脳血管疾患防御方法を開発し、本発明を完成するに至った。【００４５】  本明細書中で使用される場合、用語「神経細胞」は、生体内における神経細胞であっても、神経細胞由来の市販の培養細胞であっても、生体から取り出した脳由来の初代培養神経細胞であってもよい。【００４６】  本明細書中で使用される場合、用語「脳血管疾患」は、脳血管の支配域組織および／または細胞への血液（酸素、栄養素など）の供給が途絶えているかまたは不足している脳血栓、脳栓塞、脳出血などが包含される。用語「神経細胞傷害」は、脳梗塞、脳浮腫、てんかん時において、神経細胞の興奮性機能に障害がもたらされ、その結果、ネクローシスまたはアポトーシスによる細胞死を呈する現象の過程をいう。用語「過興奮」は、神経細胞またはグリア細胞から放出されるグルタミン酸によって、神経細胞膜に存在するグルタミン酸レセプターチャネルの働きが活性化されて、神経細胞の興奮性が異常に亢進する現象をいう。【００４７】  （１）治療剤および治療方法
１つの局面において、本発明は、過興奮性の細胞傷害を呈する疾患を治療するための治療剤を提供する。本明細書中において使用される場合、用語「過興奮性」は、「過興奮に起因する」と置換可能に用いられる。また、本明細書中において使用される場合、用語「治療」は、疾患、疾病、障害などを標的とし、疾患、疾病、障害などの治癒だけでなく、予防、防御もしくは救済、または疾患、疾病、障害などの症状もしくは状態の悪化の抑制、軽減もしくは改善が包含される。【００４８】  本実施形態において、上記疾患は、虚血性脳血管疾患であることが好ましい。また本実施形態において、上記細胞は神経細胞であることが好ましい。本発明に係る治療剤は、Ｃｌ−チャネルブロッカーを含むことが好ましい。好ましい実施形態において、上記Ｃｌ−チャネルは容積感受性Ｃｌ−チャネルである。さらに好ましい実施形態において、Ｃｌ−チャネルブロッカーは、ＮＰＰＢまたはｐｈｌｏｒｅｔｉｎである。【００４９】  上述したように、神経細胞が過興奮すると、神経細胞の膨張が生じる。その結果、（１）膨張した神経細胞が周辺細胞または脳全体を圧迫することによる頭蓋内圧の亢進、および（２）神経細胞自体の破壊（すなわち、ネクローシス）が生じる。本発明者らは、このような過興奮性の神経細胞傷害における初期の反応が容積感受性Ｃｌ−チャネル活性化であることをつきとめ、Ｃｌ−チャネルブロッカーによって当該初期反応を抑制することによって過興奮性の神経細胞傷害を防御および／または救済することに成功した。【００５０】  過興奮性の神経細胞傷害を呈する脳血管疾患としては、脳組織腫張（脳浮腫）、てんかん、脳梗塞、または心筋梗塞などが挙げられるが、これらに限定されない。【００５１】  「細胞死」は、ネクローシスとアポトーシスとに分類されるが、本明細書中において使用される場合、用語「ネクローシス」は、「ネクローシスによる細胞死」または「ネクローシス性細胞死」と交換可能に使用され、用語「アポトーシス」は、「アポトーシスによる細胞死」または「アポトーシス性細胞死」と交換可能に使用される。細胞死の評価方法については、本明細書中の以下に詳述する。【００５２】  本発明に係る治療剤は、哺乳動物（ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、およびサルなど）に対して適用することができる。【００５３】  本発明に係る治療剤は、Ｃｌ−チャネルブロッカーをそのまま用いてもよいが、薬学的に受容可能なキャリアを含んでもよい。本発明に係る治療剤は、医薬組成物の製造法として公知の手段に従って製造することができる。医薬組成物中に使用される薬学的に受容可能なキャリアは、医薬組成物の投与形態および剤型に応じて選択することができる。【００５４】  本明細書中で使用される場合、薬理学的に受容可能なキャリアとしては、製剤素材として使用可能な各種有機または無機のキャリア物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、または崩壊剤、あるいは、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁剤、等張化剤、緩衝剤、または無痛化剤などとして配合される。【００５５】  賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、キシリトール、ソルビトール、エリスリト��ル、デンプン、結晶セルロースなどが挙げられ、滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。【００５６】  結合剤としては、例えば、α化デンプン、メチルセルロース、結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、トレハロース、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。【００５７】  崩壊剤としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウムなどが挙げられる。【００５８】  溶剤としては、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、トリカプリリンなどが挙げられる。【００５９】  溶解補助剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。【００６０】  懸濁剤としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤、あるいは、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子が挙げられる。【００６１】  等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールなどが挙げられる。【００６２】  緩衝剤としては、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。【００６３】  無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコールなどが挙げられる。【００６４】  防腐剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。【００６５】  抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。【００６６】  本実施形態に係る医薬組成物は、製剤技術分野において慣用的な方法に従って製造することができる。本実施形態に係る医薬組成物におけるＣｌ−チャネルブロッカーの含有量は、投与形態、投与方法などを考慮し、当該医薬組成物を用いて後述の投与量範囲でＣｌ−チャネルブロッカーを投与できるような量であれば特に限定されない。【００６７】  本実施形態に係る医薬組成物の剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口剤、あるいは、注射剤、坐剤、ペレット、点滴剤などの非経口剤が挙げられる。本発明に係る治療剤は、毒性が低いので経口的または非経口的に投与することができる。用語「非経口」は、本明細書中で使用される場合、脳室内、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下、および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。【００６８】  本実施形態に係る医薬組成物の投与量は、投与対象、投与経路、症状などによっても異なるが、当業者は、これら投与対象、投与経路、症状などに応じて、最適な条件を適宜設定することができる。【００６９】  本実施形態に係る医薬組成物は、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与できる。投与方法も特に限定はなく、内用、外用および注射によって適用することができる。注射剤は、例えば、脳室内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与することができる。【００７０】  本実施形態に係る医薬組成物の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的および当該医薬の投与対象である患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではない。一般には、製剤中に含有される有効成分の投与量で、好ましくは成人１日当り５〜４００μｇ／ｋｇである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。投与は、所望の投与量範囲内において、１日内において単回で、または数回に分けて行ってもよい。また、本実施形態に係る医薬組成物はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。【００７１】  他の局面において、本発明は、過興奮性の神経細胞傷害を呈する脳血管疾患を治療するための治療方法を提供する。本発明に係る治療方法は、Ｃｌ−チャネルブロッカーを神経細胞に投与する工程を包含することが好ましい。また、本発明に係る治療方法は、上述した本発明に係る薬剤をＣｌ−チャネルブロッカーをして用いればよい。本発明に係る治療剤を投与することによって、過興奮性の神経細胞傷害における初期の反応を抑制することができる。【００７２】  このように、本発明に係る治療剤は、少なくとも、Ｃｌ−チャネルブロッカーを含めばよいといえる。すなわち、複数のＣｌ−チャネルブロッカーを含有する治療剤もまた、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。また、本発明に係る治療方法は、少なくとも、Ｃｌ−チャネルブロッカーを投与すればよいといえる。すなわち、複数のＣｌ−チャネルブロッカーを投与する治療方法もまた、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。【００７３】  また、本発明は、容積感受性Ｃｌ−チャネルのブロッカーが、過興奮に起因する神経細胞のネクローシスを抑制することを見出したことに基づいているので、容積感受性Ｃｌ−チャネルのブロッカーを含むネクローシス抑制剤、容積感受性Ｃｌ−チャネルのブロッカーを用いるネクローシス抑制方法、および容積感受性Ｃｌ−チャネルのブロッカーを備えるネクローシス抑制キットもまた本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。【００７４】  （２）過興奮によって生じる細胞死の評価方法
本発明は、インビトロでの培養細胞系において過興奮によって生じる細胞死を評価するための評価方法を提供する。【００７５】  本発明に係る細胞死の評価方法は、培養細胞における細胞死を測定する測定工程、および当該細胞に過興奮刺激を供する刺激工程を包含する。一実施形態において、上記細胞死を測定する工程は、上記刺激工程の前後に行うことが好ましく、上記刺激工程の前に行う第１の測定工程によって得た第１の測定値と上記刺激工程の後に行う第２の測定工程によって得た第２の測定値とを比較する比較工程をさらに包含することがより好ましい。本実施形態において、上記刺激工程は、上記培養細胞に過興奮刺激をもたらす緩衝液（培地）を添加することが好ましい。【００７６】  本発明に係る細胞死の評価方法を用いることによって、評価対象となる細胞は過興奮刺激を被る。従って、本発明に係るインビトロでの細胞死の評価方法を用いれば、過興奮刺激を行う前後において、細胞生存率などの細胞死の評価を行い、これらを比較することによって、過興奮性細胞死の評価を簡便に行うことができる。【００７７】  本発明に係る細胞死の評価方法において、評価の対象となる細胞としては、特に限定されないが、心筋細胞、脳神経細胞、脳グリア細胞が挙げられる。これらの細胞は、市販の培養細胞が用いられても、初代培養細胞が用いられてもよいが、初代培養大脳皮質神経細胞が最も好ましい。初代培養大脳皮質神経細胞を用いることによって、過興奮刺激によって生じる神経細胞死（好ましくは、ネクローシス）を評価することができる。【００７８】  上記の刺激工程において使用する緩衝液の組成としては、例えば、３０μＭ  Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）と３０μＭ  グリシンを含む２ｍＭ  ＣａＣｌ２および０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を添加したＥＢＳＳが好適である。【００７９】  上記刺激工程における刺激時間については、細胞膨張の評価に対して、１０分〜２０分が好ましく、２０分が最も好ましい。また、細胞死の評価に対して、９０分〜２４０分が好ましく、１８０分が最も好ましい。なお、培養工程および刺激工程において好ましい培養温度は、３７℃である。【００８０】  細胞死を検出する工程としては、特に限定されないが、例えば、ミトコンドリア脱水素酵素の活性を指標に行う方法（ＭＴＴ法またはＭＴＳ法）、核内ＤＮＡの断片化を指標に行う方法（ＤＮＡラダー試験など）、細胞死を引き起こす細胞内タンパク質分解酵素（カスパーゼ）の活性を指標とする方法、ミトコンドリアから細胞質へのシトクロームｃの放出を指標とする方法、および核の形態変化（例えば、核の濃縮または細片化）を指標とする方法などが挙げられる。【００８１】  細胞が死滅するとミトコンドリア脱水素酵素の活性が低下するので、ミトコンドリア脱水素酵素の活性を指標にして当該酵素活性が低下すれば細胞の死滅率が高いと判断することができる。【００８２】  ネクローシスによって細胞が死滅する際には、当該細胞は膜傷害を生じるので、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）によって染色される。この際、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を用いて全ての細胞の核を染色すれば、ネクローシス性の細胞死を生じた細胞の割合を算出することができる。【００８３】  また���アポトーシスによって細胞が死滅する際には、核内ＤＮＡが断片化するので、電気泳動などでラダー上の核内ＤＮＡの状態を観察すれば簡便にアポトーシス性の細胞死であるか否かを判定することができる。【００８４】  さらに、アポトーシスによって細胞が死滅する際には、カスパーゼが活性化（活性が上昇）することがわかっているので、カスパーゼ活性を指標にして当該酵素活性が上昇すればアポトーシス性の細胞死滅率が高いと判断することができる。【００８５】  また、ミトコンドリア刺激によるアポトーシスによって細胞が死滅する際には、ミトコンドリアから細胞質へのシトクロームｃが放出するので、ミトコンドリアから細胞質へのシトクロームｃの放出を指標してシトクロームｃの放出量を測定すれば簡便にアポトーシス性の細胞死であるか否かを判定することができる。【００８６】  また、アポトーシスによって細胞が死滅する際には、核の濃縮や細片化といった核の形態変化が起こるので、核の形態変化を指標にして電子顕微鏡などで核の形態変化を観察すれば簡便にアポトーシス性の細胞死であるか否かを判定することができる。【００８７】  また、神経細胞を用いる場合、神経細胞の樹状突起には過興奮によって樹状突起瘤（ｖａｒｉｃｏｓｉｔｙ）が生じる。当該樹状突起瘤の形成を指標にして過興奮依存的な細胞死を検出することもできる。さらに、上記樹状突起瘤にてＣｌ−電流を検出することによって、上記過興奮依存的な細胞死にＣｌ−チャネル（好ましくは、容積感受性Ｃｌ−チャネル）が関与することを調べることができる。この際、細胞にＣｌ−チャネルブロッカーを予め適用しておけば、上記過興奮依存的な細胞死にＣｌ−チャネルが関与することをより明確に調べることができる。【００８８】  このような種々の細胞死検出工程を単独または組み合わせて用いることによって、もたらされた細胞死がネクローシスであるかアポトーシスであるかを判定することができる。【００８９】  （３）過興奮によって生じる細胞傷害を抑制する因子をスクリーニングするための方法
上述した本発明に係る細胞死の評価方法を用いれば、過興奮によって生じる細胞死を抑制するための薬剤、特に、過興奮によって生じる細胞死を抑制するための薬剤をスクリーニングするのに有効である。すなわち、上記の刺激工程の前に行う細胞死の評価結果と、上記の刺激工程の後に行う細胞死の評価結果とを比較することによって、過興奮によって生じる細胞死に対する当該候補因子の抑制効果を評価することができ、その結果、過興奮によって生じる細胞死に対する抑制効果を有する物質を得ることができる。【００９０】  本発明は、インビトロでの培養細胞系において過興奮によって生じる細胞傷害を抑制する因子をスクリーニングするためのスクリーニング方法を提供する。【００９１】  本発明に係るスクリーニング方法は、上述した評価方法と同様に、培養細胞における細胞死を測定する測定工程、および当該細胞に過興奮刺激を供する刺激工程を包含する。一実施形態において、上記細胞死を測定する工程は、上記刺激工程の前後に行うことが好ましく、上記刺激工程の前に行う第１の測定工程によって得た第１の測定値と上記刺激工程の後に行う第２の測定工程によって得た第２の測定値とを比較する比較工程をさらに包含することがより好ましい。本実施形態において、上記刺激工程は、上記培養細胞に過興奮刺激をもたらす緩衝液（培地）を添加することが好ましい。本実施形態に係るスクリーニング方法は、第１の測定工程の後（刺激工程の前）に、当該細胞に候補因子を適用する工程をさらに包含する。【００９２】  本発明に係るスクリーニング方法は、第１の測定工程の後に、細胞にＣｌ−チャネルブロッカーを適用する工程をさらに包含することによって、Ｃｌ−チャネル（好ましくは、容積感受性Ｃｌ−チャネル）が関与する細胞傷害を抑制する標的因子をスクリーニングすることができる。【００９３】  本発明に係るスクリーニング方法を用いることによって、過興奮刺激によって生じる細胞傷害を抑制する因子を簡便にスクリーニングすることができる。【００９４】  （４）過興奮によって生じる神経細胞膨張の評価方法
本発明は、インビトロでの培養細胞系において過興奮によって生じる神経細胞膨張を評価するための方法を提供する。【００９５】  本発明に係る神経細胞膨張の評価方法は、培養した神経細胞に過興奮刺激を供する刺激工程、神経細胞の樹状突起を可視化する工程、および、神経細胞の樹状突起瘤の形成を検出する工程を包含する。【００９６】  神経細胞の樹状突起を可視化する工程としては、当該分野において公知の種々の手法（例えば、細胞へのＥＧＦＰの遺伝子のトランスフェクション）が適用可能である。【００９７】  本発明に係る神経細胞膨張の評価方法を用いることによって、評価対象となる細胞は過興奮刺激を被る。従って、本発明に係る神経細胞膨張の評価方法を用いれば、過興奮刺激を行う前後において、樹状突起瘤の形成を比較することによって、過興奮性神経細胞膨張の評価を簡便に行うことができる。【００９８】  本発明に係る神経細胞膨張の評価方法において使用する細胞、刺激工程において使用する緩衝液は、上述した細胞死の評価方法において用いるものと同じでもよい。【００９９】  本発明に係る神経細胞膨張の評価方法を用いれば、過興奮によって生じる神経細胞膨張を抑制するための薬剤をスクリーニングするのに有効である。すなわち、上記の刺激工程の前に行う細胞死の評価結果と、上記の刺激工程の後に行う細胞死の評価結果とを比較することによって、過興奮によって生じる神経細胞膨張に対する当該候補因子の抑制効果を評価することができ、その結果、過興奮によって生じる神経細胞膨張に対する抑制効果を有する物質を得ることができる。【０１００】  以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。【０１０１】  〔実施例１：大脳皮質神経細胞での容積感受性Ｃｌ−チャネルの発現〕
パパインにより分散した胎生１６日目マウス大脳皮質をカバーグラス上に播種し、培養２日目にＡｒａＣ（４μＭ）を添加してグリア等の増殖性細胞の増殖を抑えて神経細胞に富む（＞９５％）培養系を作製した。【０１０２】  ホールセルパッチクランプ法を初代培養大脳皮質神経細胞（培養５〜８日目）に適用した。パッチクランプ実験溶液は、細胞内液（３００ｍＯｓｍ、ｐＨ７．４）が、ＮＭＤＧ−Ｃｌ  ２４ｍＭ、ＮＭＤＧ−ａｓｐａｒｔａｔｅ  １００ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ、Ｎａ２ＡＴＰ  ５ｍＭ、Ｎａ３ＧＴＰ  ０．３ｍＭ、ＥＧＴＡ  １ｍＭ、ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭであり、細胞外液（等浸透圧溶液３００ｍＯｓｍ、低浸透圧溶液２７０ｍＯｓｍ、ｐＨ７．４）が、ＮＭＤＧ−Ｃｌ  １２４ｍＭ、ＮａＣｌ  １０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ４ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４  ０．３３ｍＭ、ＥＧＴＡ  ０．５ｍＭ、４−ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ（４−ＡＰ）２ｍＭ、ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ、ｇｌｕｃｏｓｅ  ５．５ｍＭである。浸透圧を、マンニトールを加えることによって調整した。保持電位−４０ｍＶから１５秒に一度の割合で５００ミリ秒ずつ±６０ｍＶの電位をふり、電流の活性化を経時的に観察した。電流のキネティクスを観察するために、−１００ｍＶから２０ｍＶ刻みに＋１００ｍＶまでのステップパルス（０．５秒間）を与えて電流応答を観察し、また電流−電圧曲線を作成した。結果を図１に示す。【０１０３】  ホールセルパッチクランプ法により、初代培養大脳皮質神経細胞に容積感受性Ｃｌ−チャネルが存在することを示した。低浸透圧刺激によって徐々に活性化される電流の存在を大脳皮質神経細胞に認めた（Ａ）。この活性化された電流は高いプラス電位で不活性化を示し（Ｂ）、電流−電圧曲線から外向き整流性でありかつ逆転電位がＣｌ−の平衡電位付近であることがわかる（Ｃ）。また、この電位がＮＰＰＢ（８０μＭ）、ＤＩＤＳ（４００μＭ）、ｐｈｌｏｒｅｔｉｎ（１００μＭ）によって抑制されることから（Ｄ）、大脳皮質神経細胞には低浸透圧刺激によって活性化されるＣｌ−チャネル、すなわち、容積感受性Ｃｌ−チャネルが発現していることが明らかとなった。【０１０４】  〔実施例２：容積感受性Ｃｌ−チャネルの大脳皮質神経細胞の容積調節への関与〕
培養５〜８日目の初代培養神経細胞にｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭを負荷して可視化し、二光子レーザー顕微鏡にてＸＹ断面像を経時的に撮影した。細胞の大きさを、細胞体部分の断面積の変化によって評価した。実験開始時の面積を１として、各時点での面積比を算出しグラフ上にプロットした（図２Ｂ）。実験溶液組成は、ＮａＣｌ  ９０ｍＭ、ＫＣｌ  ２．５ｍＭ、ＨＥＰＥＳ  ５ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ、ＣａＣｌ２  ２ｍＭ、ｇｌｕｃｏｓｅ  １０ｍＭである。浸透圧を、ｍａｎｎｉｔｏｌを加えることによって調整し、等浸透圧溶液を３１５ｍＯｓｍ、低浸透圧溶液を２００ｍＯｓｍとした。結果を図２に示す。【０１０５】  大脳皮質神経細胞には低浸透圧によって膨張した後に容積を元に戻す能力がある（ＡおよびＢ黒線）。この容積調節はｑｕｉｎｉｎｅ（５００μＭ）とＮＰＰＢ（８０μＭ）によって抑制されるので、ｑｕｉｎｉｎｅ感受性を示すＫ＋チャネルとＮＰＰＢ感受性を示す容積感受性Ｃｌ−チャネルが関与することがわかる（Ｂ）。【０１０６】  〔実施例３：過興奮刺激による容積感受性Ｃｌ−チャネルの活性化〕
培養５〜８日目の初代培養神経細胞にホールセルパッチクランプ法を適用した。ホールセルクランプ下にある細胞を、ＮＭＤＡ（３０μＭ）を含む低マグネシウム緩衝液（組成：ＮａＣｌ  １４２ｍＭ、４−ＡＰ  ２ｍＭ、ＥＧＴＡ  ０．５ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ０．５ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４  ０．３３ｍＭ、ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ、ｇｌｕｃｏｓｅ  ５．５ｍＭ、ｇｌｙｃｉｎｅ  ０．０３ｍＭ）に１０分間曝露して過興奮刺激を与え、過興奮刺激前後の電流を比較した。細胞内液に５μＭ  ｃａｌｃｅｉｎを添加して、記録中の細胞の形を観察しながら電流を記録した。結果を図３に示す。【０１０７】  大脳皮質神経細胞に過興奮刺激を与えると、樹状突起上に樹状突起瘤（ｖａｒｉｃｏｓｉｔｙ）が形成され（Ａ写真右）、アゴニスト除去後に電流の活性化が見られた（Ａ）。活性化された電流は高いプラス電位で不活性化を示し（Ｂ）、電流−電圧曲線は外向き整流性を示し、逆転電位がＣｌ−の平衡電位付近であった。これらのことから、このチャネルは容積感受性Ｃｌ−チャネルと同じ性質を示すことが明らかになった。【０１０８】  〔実施例４：過興奮刺激によって形成されたｖａｒｉｃｏｓｉｔｙは刺激除去後に回復する〕
培養３日目の初代培養大脳皮質神経細胞に、リン酸カルシウム法を用いて緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰ遺伝子を含有するプラスミドをトランスフェクションした。翌日、１％未満の神経細胞において、ＧＦＰの発現が認められた。トランスフェクション後２〜６日目の細胞を実験に用いた。【０１０９】  ＮＭＤＡ（３０μＭ）を含む低マグネシウムＨＥＰＥＳ緩衝液（組成：ＮａＣｌ  １４２ｍＭ、ＫＣｌ  ２．５ｍＭ、ＥＧＴＡ  ０．５ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ０．５ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４  ０．３３ｍＭ、ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ、ｇｌｕｃｏｓｅ  ５．５ｍＭ、ｇｌｙｃｉｎｅ  ０．０３ｍＭ）に２０分間曝露することによって、過興奮刺激を行なった。刺激後、ｎｏｒｍａｌ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（組成：ＮａＣｌ  １４０ｍＭ、ＫＣｌ  ２．５ｍＭ、ＣａＣｌ２  ２ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ、ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ、ｇｌｕｃｏｓｅ  ５．５ｍＭ、ｍａｎｎｉｔｏｌ  ３５ｍＭ、）で３回洗浄し、同緩衝液中にて３７℃でインキュベーションし、０分、１５分、３０分、６０分後に４％パラホルムアルデヒドによって細胞を固定した。固定後、蛍光顕微鏡でＧＦＰを発現している細胞の形態を観察し、樹状突起上に樹状突起瘤（直径＞３μｍ）を形成しているものを樹状突起瘤保持細胞としてカウントし、全体に対する割合（％）を算出した。【０１１０】  〔実施例５：樹状突起瘤からの回復過程に関わる分子の薬理学的同定〕
実施例４と同様に、ＥＧＦＰをトランスフェクトした初代培養大脳皮質神経細胞を用いた。【０１１１】  実施例４と同様の方法で細胞を過興奮刺激した後に、様々な薬剤を含むｎｏｒｍａｌ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中にてインキュベーションした。６０分後に４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、蛍光顕微鏡下で樹状突起瘤保持細胞数をカウントし、全体に対する割合（％）を算出した。結果を図５に示す。【０１１２】  図４に示した樹状突起瘤からの回復過程に、どのようなチャネルまたはトランスポータが関与するのかを、薬理学的に調べた。容積感受性Ｃｌ−チャネルブロッカーであるＮＰＰＢ、ｐｈｌｏｒｅｔｉｎによって、樹状突起瘤からの回復は著しく抑制された。またＫ＋チャネルブロッカーによってもまた、樹状突起瘤からの回復は抑制された。【０１１３】  以上の結果より、過興奮刺激後の樹状突起瘤からの回復には容積感受性Ｃｌ−チャネルとＫ＋チャネルとの並列的な活性化が必要であると考えられる。【０１１４】  図６に概念的に示すように、グルタミン酸による過興奮刺激は、グルタミン酸受容体を介するＮａ＋の流入、および未知の経路（この図ではＧＡＢＡＡチャネルおよび容積感受性Ｃｌ−チャネルを候補として挙げている）を介するＣｌ−の流入による膨張を、神経細胞にもたらす。刺激が持続すれば神経細胞はネクローシスによって死んでしまうが、刺激が短時間で除去されれば細胞容積は回復され、この回復過程に容積感受性Ｃｌ−チャネルが重要な役割を果たしている。【０１１５】  続いて、以下の実施例では、マウス大脳皮質初代培養神経細胞を用いて
（１）過興奮に起因する神経細胞の膨張に対して容積感受性Ｃｌ−チャネルブロッカーが効果を示すかどうか、
（２）過興奮に起因して膨張した神経細胞の樹状突起上に容積感受性Ｃｌ−チャネルの活性化が検出されるかどうか、
（３）過興奮に起因する神経細胞のネクローシスが容積感受性Ｃｌ−チャネルブロッカー投与によって抑制され得るかどうか
という３点について検討した。【０１１６】  なお、過興奮に起因する神経細胞の膨張またはネクローシスに対する容積感受性Ｃｌ−チャネルブロッカーの効果を検討するため、本研究では、妊娠１６日目の胎仔マウスから単離・培養した初代培養大脳皮質神経細胞を用いた。得られた初代培養大脳皮質神経細胞は、１０％ウシ胎仔血清、ストレプトマイシン、ペニシリンを添加したダルベッコ培地にて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養した。神経細胞樹状突起の可視化のために、培養３日目の大脳皮質神経細胞にリン酸カルシウム法によりＥＧＦＰの遺伝子をトランスフェクションした。過興奮刺激には３０μＭ  Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）と３０μＭ  グリシンを含む２ｍＭ  ＣａＣｌ２および０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を添加したＥａｒｌｅ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＥＢＳＳ；市販品、ＧＩＢＣＯ  ＃１４１５５−０６３）を用いた。容積感受性Ｃｌ−チャネルの活性化確認実験には、穿孔ベシクルパッチクランプ法を適応した。過興奮刺激により形成させた神経細胞の樹状突起瘤（ｖａｒｉｃｏｓｉｔｙ）の膜上にギガオームジール形成後、記録電極を持ち上げることにより単一樹状突起瘤パッチ膜からの電流記録を行った。パッチクランプ実験には、次のような組成の溶液を使用した。細胞外液：１２４ｍＭ  Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＮＭＤＧ）、１２４ｍＭ  ＨＣｌ、２０ｍＭ  ＴＥＡ−Ｃｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．３３ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２ｍＭ  ４−アミノピリジン（４−ＡＰ）、５．５ｍＭ  グルコース、２７０ｍＯｓｍ、ｐＨ７．４。細胞内液：１４５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．３ｍｇ／ｍｌ  ニスタチン（ｎｙｓｔａｔｉｎ）、３００ｍＯｓｍ、ｐＨ７．４。【０１１７】  神経細胞膨張は樹状突起瘤の形成がみられる細胞の全細胞に対する割合にて評価した。２０分間の過興奮刺激後、４％パラホルムアルデヒドにて固定し、蛍光顕微鏡下で、各細胞群のカウントを行った。【０１１８】  ネクローシス性神経細胞死は、形質膜の破損した部位から細胞内に浸入した核染料ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）によって染色されるＰＩ法、または死細胞から漏出するラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の細胞外量の測定によって評価した。【０１１９】  〔実施例６：大脳皮質神経細胞の過囲奮性細胞膨張は容積感受性Ｃｌ−チャネルブロッカーにより抑制される〕
図７Ａは、グルタミン酸レセプターアゴニスト（３０μＭ  ＮＭＤＡ）による過興奮性神経細胞膨張の顕微鏡像を示す。大脳皮質の初代培養神経細胞を、ＥＧＦＰを発現させて可視化した。図中、ａはコントロール、ｂはＮＭＤＡ曝露２０分後の神経細胞を示す。図７Ｂは、Ｃｌ−チャネルブロッカーによる樹状突起瘤形成の抑制効果を示す。図中、＊は、ＮＭＤＡ（ブロッカー投与前）のデータに対する有意差レベル（ｐ＜０．０５）を示す。【０１２０】  過興奮性神経細胞膨張にはグルタミン酸レセプター（カチオンチャネル内蔵）からのナトリウムの流入のみならず電気的中性則によって追随するクロライドの流入が必須である。２０分間の病的過興奮刺激では、約７０％の大脳皮質神経細胞の樹状突起（図７Ａａ）に細胞膨張の指標である樹状突起瘤（図７Ａｂ）の形成が認められる（図７Ｂ：第１棒グラフ）。このような過興奮刺激中に、容積感受性Ｃｌ−チャネルブロッカー（４０μＭ  ＮＰＰＢまたは１００μＭ  ｐｈｌｏｒｅｔｉｎ）を投与すると神経細胞膨張の指標である樹状突起瘤を呈する神経細胞の数が有意に減少した（図７Ｂ：第２、３棒グラフ）。また、通常、神経細胞での主なＣｌ−経路になっているＧＡＢＡＡレセプター（Ｃｌ−チャネル内蔵）のブロッカー（１０μＭ  ｂｉｃｕｃｕｌｌｉｎｅまたは１００μＭ  ｐｉｃｒｏｔｏｘｉｎ）の投与では、やや抑制の傾向はあったものの有意な抑制効果は見られなかった（図７Ｂ：第４、５棒グラフ）。【０１２１】  このように、神経細胞をＮＭＤＡに曝露することによって、樹状突起の局所的膨張（樹状突起瘤）を伴う神経細胞の著しい膨張が観察された。また、ＮＭＤＡ曝露時に容積感受性Ｃｌ−チャネルブロッカー（４０μＭ  ＮＰＰＢまたは１００μＭ  ｐｈｌｏｒｅｔｉｎ）を投与すると、樹状突起瘤を指標とした神経細胞膨張が有意に抑制された。また、ＧＡＢＡＡレセプターＣｌ−チャネルブロッカー（１０μＭ  ｂｉｃｕｃｕｌｉｎｅまたは１００μＭ  ｐｉｃｒｏｔｏｘｉｎ）の効果には統計的有意差は認められなかった。【０１２２】  〔実施例７：過興奮によって膨張した大脳皮質神経細胞の樹状突起瘤膜上には容積感受性Ｃｌ−チャネルの活性化が認められる〕
病的過興奮によって形成された樹状突起部の局所的膨張である樹状突起瘤膜上に、容積感受性α−チャネルの活性化が見られるかどうかを確認した（図８）。【０１２３】  図８Ａは、樹状突起瘤上でのパッチピペットのギガオームシール形成の顕微鏡写真である。細胞体（右上）から伸びた樹状突起に形成された樹状突起瘤上にパッチピペット（左上の影）をギガシールした後にパッチピペットを持ち上げ、穿孔ベシクルパッチを形成した。図８Ｂは、ＮＭＤＡ曝露によって形成された樹状突起瘤からの容積感受性Ｃｌ−チャネルの単一チャネル電流記録を示す。穿孔ベシクルパッチ法により樹状突起瘤の膜を単離して記録した。図中、ａはコントロール、ｂはＮＰＰＢ投与３分後、ｃはＮＰＰＢ除去３分後の結果を表す。最上段パネルは印加電圧ステップのプロトコールである。図８Ｃは、樹状突起瘤上の容積感受性Ｃｌ−チャネルの単一電流−電圧曲線を示す。【０１２４】  過興奮刺激によって形成された樹状突起瘤膜上にギガオームシールを形成（図８Ａ）した後、記録電極を持ち上げて単一の樹状突起瘤を切り出して容積感受性Ｃｌ−電流の電流の記録を行った（図８Ｂ）。樹状突起瘤上にみられたシングルチャネルイベントは高いプラス電位で不活性化を示し（図８Ｂａ）、８０μＭＮＰＰＢの添加によってブロックされる（図８Ｂｂ）。すなわち、高いプラス電位（＋１４０ｍＶ）で不活性化を示し、８０μＭ  ＮＰＰＢによって抑制された。このＮＰＰＢのブロックの効果は除去後に消失し（図８Ｂｃ）、可逆的であることが判明した。またこの単一チャネル電流（ｉ）は外向き整流性を示し（図８Ｃ）、シングルチャネルコンダクタンス（γ）は中間型コンダクタンス（３５ｐＳ  ａｔ  ＋１００ｍＶ）を示した（図８Ｃ）。記録された電流のこれらの性質はすべて容積感受性Ｃｌ−チャネルのそれと一致した。このことから、過興奮によって膨張した神経細胞の樹状突起上に、容積感受性Ｃｌ−チャネルが発現しており活性化されていることが明らかとなった。【０１２５】  〔実施例９：過興奮性神経細胞死はＣｌ−チャネルフロッカーによって救済される〕
過興奮刺激による持続的な神経細胞膨張は、細胞破裂というネクローシス性の細胞死をもたらす。過興奮刺激中に、細胞膨張を抑制した容積感受性Ｃｌ−チャネルブロッカーを投与することにより、ネクローシス性の神経細胞死も抑制し得るかどうかを検討した（図９）。【０１２６】  図９Ａは、ＮＭＤＡ曝露３時間後のＰＩ染色による死細胞判定結果を示す。図９Ｂは、ＮＭＤＡ曝露３時間後のＬＤＨ漏出による細胞死判定結果を示す。【０１２７】  ３時間の過興奮刺激により、形質膜の破損の指標であるＰＩによって核染色される細胞が全体の約４０％にまで増加する（図９Ａ：第２棒グラフ）。この際に容積感受性Ｃｌ−チャネルブロッカー（４０μＭ  ＮＰＰＢまたは１００μＭ  ｐｈｌｏｒｅｔｉｎ）を同時に添加すると、ＰＩ陽性細胞数が有意に減少することが明らかになった（図９Ａ：第３、４棒グラフ）。一方、ＧＡＢＡＡレセプターＣｌ−チャネルのブロッカー（１０μＭ  ｂｉｃｕｃｕｌｌｉｎｅまたは１００μＭ  ｐｉｃｒｏｔｏｘｉｎ）の投与では、やや抑制の傾向はあったものの有意な抑制効果は見られなかった（図９Ａ：第５、６棒グラフ）。ネクローシス性細胞死のもうひとつの指標として細胞外へのＬＤＨ漏出量の測定を行った（図９Ｂ）。容積感受性Ｃｌ−チャネルブロッカー（４０μＭ  ＮＰＰＢまたは１００μＭ  ｐｈｌｏｒｅｔｉｎ）を、過興奮刺激時に同時投与した神経細胞では、ＬＤＨ漏出が、非投与（図９Ｂ：第２棒グラフ）に比べて有意に抑制された（図９Ｂ：第３、４棒グラフ）。一方、ＧＡＢＡＡレセプターＣｌ−チャネルのブロッカー（１０μＭ  ｂｉｃｕｃｕｌｌｉｎｅまたは１００μＭ  ｐｉｃｒｏｔｏｘｉｎ）の投与では、抑制効果は見られなかった（図９Ｂ：第５、６棒グラフ）。【０１２８】  図９Ｂに示すように、ＮＭＤＡ曝露により死細胞から細胞外へと漏出したＬＤＨ量はコントロールの約４倍に増加した。容積感受性Ｃｌ−チャネルブロッカー（４０μＭ  ＮＰＰＢまたは１００μＭ  ｐｈｌｏｒｅｔｉｎ）の投与により、この細胞死は有意に抑制された。またＧＡＢＡＡレセプターＣｌ−チャネルブロッカー（１０μＭ  ｂｉｃｕｃｕｌｌｉｎｅまたは１００μＭ  ｐｉｃｒｏｔｏｘｉｎ）の投与では抑制は認められなかった。図中、＊はＮＭＤＡ（ブロッカー投与前）のデータに対する有意差レベル（ｐ＜０．０５）を示す。【０１２９】  これらの結果は、病的過興奮時における容積感受性Ｃｌ−チャネルブロッカーの投与が、ネクローシス性神経細胞死を著しく抑制することを示している。【０１３０】  尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する特許請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用可能性】
【０１３１】  本発明を用いれば、容積感受性Ｃｌ−チャネルの活性化を抑制することによって、過興奮性の細胞傷害（特に、神経細胞傷害）を抑制（すなわち、防御および／または救済）することができる。【０１３２】  本発明は、神経伝達に関わる受容体を標的としていないので正常な神経伝達に影響を与えず、しかも脳浮腫を防ぐので頭蓋内圧亢進による二次的な神経細胞傷害を抑制することができるという多角的な効果を有する。よって、本発明は、臨床的治療への適用が比較的容易である。【０１３３】  また、てんかん、脳梗塞、心筋梗塞、または心臓移植時もしくは脳血管吻合術時の脳虚血時または虚血後の再灌流時などのような神経過興奮が観察される脳疾患の全てに対して、本発明は適用可能であり、そして本発明の適用によって、このような疾患を有する患者の予後を飛躍的に改善することができる。【０１３４】  本発明は、正常な神経伝達に影響を与えることなく過興奮性の細胞傷害を抑制（すなわち、防御および／または救済）するので、臨床的治療への適用が比較的容易であり、てんかん、脳梗塞、心筋梗塞、または心臓移植時もしくは脳血管吻合術時の脳虚血時または虚血後の再灌流時などのような神経過興奮が観察される脳疾患を有する患者の予後を改善するための医療の開発に大いに役立つ。
【図１】
2006059423.tif 000002
【図２】
2006059423.tif 000003
【図３】
2006059423.tif 000004
【図４】
2006059423.tif 000005
【図５】
2006059423.tif 000006
【図６】
2006059423.tif 000007
【図７】
2006059423.tif 000008
【図８】
2006059423.tif 000009
【図９】
2006059423.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成18年7月31日(2006.7.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
容積感受性Ｃｌ−チャネルのブロッカーを含むことを特徴とする過興奮性の神経細胞傷害の治療剤。
【請求項２】
上記神経細胞傷害が、脳組織腫張（脳浮腫）、てんかん、脳梗塞、心筋梗塞、または心移植時もしくは脳血管吻合術時において生じることを特徴とする請求の範囲１に記載の治療剤。
【請求項３】
上記神経細胞傷害が、細胞の著しい膨張を伴うことを特徴とする請求の範囲１または２に記載の治療剤。
【請求項４】
上記神経細胞傷害が、ネクローシスを伴うことを特徴とする請求の範囲１〜３のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項５】
上記神経細胞傷害が、形質膜におけるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）透過性の著しい増加を伴うことを特徴とする請求の範囲１〜４のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項６】
上記神経細胞傷害が、細胞質からのラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）漏出の著しい増加を伴うことを特徴とする請求の範囲１〜４のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項７】
上記ブロッカーがＮＰＰＢまたはｐｈｌｏｒｅｔｉｎであることを特徴とする請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項８】
容積感受性Ｃｌ−チャネルのブロッカーを神経細胞に投与する工程を包含することを特徴とする過興奮性の神経細胞傷害の治療方法。
【請求項９】
上記神経細胞傷害が、脳組織腫張（脳浮腫）、てんかん、脳梗塞、心筋梗塞、または心移植時もしくは脳血管吻合術時において生じることを特徴とする請求の範囲８に記載の治療方法。
【請求項１０】
上記神経細胞傷害が、細胞の著しい膨張を伴うことを特徴とする請求の範囲８または９に記載の治療方法。
【請求項１１】
上記神経細胞傷害が、ネクローシスを伴うことを特徴とする請求の範囲８〜１０のいずれか１項に記載の治療方法。
【請求項１２】
上記神経細胞傷害が、形質膜におけるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）透過性の著しい増加を伴うことを特徴とする請求の範囲８〜１１のいずれか１項に記載の治療方法。
【請求項１３】
上記神経細胞傷害が、細胞質からのラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）漏出の著しい増加を伴うことを特徴とする請求の範囲８〜１１のいずれか１項に記載の治療方法。
【請求項１４】
上記ブロッカーがＮＰＰＢまたはｐｈｌｏｒｅｔｉｎであることを特徴とする請求の範囲８〜１３のいずれか１項に記載の治療方法。
【請求項１５】
インビトロでの培養神経細胞において過興奮によって生じる神経細胞死を評価するための評価方法であって、
培養神経細胞における細胞死を測定する第１の測定工程；
培養神経細胞に過興奮刺激を供する刺激工程；
過興奮刺激を供した神経細胞の細胞死を測定する第２の測定工程；および
第１の測定工程によって得た第１の測定値と第２の測定工程によって得た第２の測定値とを比較する比較工程
を包含することを特徴とする評価方法。
【請求項１６】
上記第１および第２の測定工程において、ミトコンドリア脱水素酵素の活性を指標にして細胞死を測定することを特徴とする請求の範囲１５に記載の評価方法。
【請求項１７】
上記第１および第２の測定工程において、核内ＤＮＡの断片化を指標にすることを特徴とする請求の範囲１５または１６に記載の評価方法。
【請求項１８】
上記第１および第２の測定工程において、上記神経細胞の樹状突起瘤の形成を指標にすることを特徴とする請求の範囲１５または１６に記載の評価方法。
【請求項１９】
樹状突起瘤にてＣｌ−電流を検出する工程をさらに包含することを特徴とする請求の範囲１５〜１８のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項２０】
第１の測定工程の後に、神経細胞に容積感受性Ｃｌ−チャネルのブロッカーを適用する工程をさらに包含することを特徴とする請求の範囲１５〜１９のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項２１】
インビトロでの培養神経細胞において過興奮によって生じる神経細胞傷害を抑制する因子をスクリーニングするためのスクリーニング方法であって、
培養神経細胞における細胞死を測定する第１の測定工程；
培養神経細胞に候補因子を適用する工程；
候補因子を適用した神経細胞に過興奮刺激を供する刺激工程；
過興奮刺激を供した神経細胞の細胞死を測定する第２の測定工程；および
第１の測定工程によって得た第１の測定値と第２の測定工程によって得た第２の測定値とを比較する比較工程
を包含することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２２】
第１の測定工程の後に、神経細胞に容積感受性Ｃｌ−チャネルのブロッカーを適用する工程をさらに包含することを特徴とする請求の範囲２１に記載のスクリーニング方法。
【請求項２３】
インビトロでの培養神経細胞において過興奮によって生じる神経細胞膨張を評価するための評価方法であって、
培養神経細胞に過興奮刺激を供する刺激工程；
当該神経細胞の樹状突起を可視化する工程；および
神経細胞の樹状突起瘤の形成を検出する工程
を包含することを特徴とする評価方法。
【請求項２４】
上記可視化する工程において、ＥＧＦＰの遺伝子のトランスフェクションを用いることを特徴とする請求の範囲２５に記載の評価方法。
【請求項２５】
容積感受性Ｃｌ−チャネルのブロッカーを含むことを特徴とする過興奮によってもたらされる神経細胞のネクローシスを抑制するネクローシス抑制剤。
【請求項２６】
容積感受性Ｃｌ−チャネルのブロッカーを神経細胞に投与する工程を包含することを特徴とする過興奮によってもたらされる神経細胞のネクローシスを抑制する方法。
【国際調査報告】
2006059423.tif 000011
2006059423.tif 000012
2006059423.tif 000013
2006059423.tif 000014
2006059423.tif 000015
2006059423.tif 000016
2006059423.tif 000017
2006059423.tif 000018