(57)【要約】  誘導可能なプロモーターを用いてERG6、ERG3などのエルゴステロール合成経路の酵素の発現を調節し、該酵素が発現した状態で形質転換を行い、該酵素の発現が抑制された状態で薬剤耐性コロニーのスクリーニングやアッセイを行う。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母の細胞内で蛋白質と化合物を作用させる方法であって、以下の工程を含む方法；
(1)エルゴステロール合成経路の酵素の発現が誘導された状態で、酵母に該蛋白質をコードする遺伝子を導入して蛋白質を発現させる工程、及び
(2)エルゴステロール合成経路の酵素の発現が抑制された状態で、該遺伝子が導入された酵母に該化合物を添加し、酵母の細胞内で蛋白質に化合物を作用させる工程。
【請求項２】
酵母に発現させた蛋白質と化合物を接触させ、該化合物と作用する蛋白質をコードする遺伝子を同定する方法であって、以下の工程を含む方法；
(1)エルゴステロール合成経路の酵素の発現が誘導された状態で、酵母に遺伝子ライブラリーを導入し、蛋白質を発現させる工程
(2)エルゴステロール合成経路の酵素の発現が抑制された状態で、該遺伝子ライブラリーが導入された酵母に該化合物を添加し、該化合物を該蛋白質に接触させる工程
(3)該化合物と蛋白質が作用したことにより表現型が変化した酵母を選択する工程
(4)選択した酵母に導入された遺伝子を同定する工程。
【請求項３】
該化合物による酵母の表現型が致死又は増殖抑制である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵母が、エルゴステロール合成経路の酵素の発現の誘導及び抑制が転写調節によって制御される酵母である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記転写調節が、GAL10プロモーターまたはGAL1プロモーターによる転写調節である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
エルゴステロール合成経路の酵素がERG6、ERG3から選ばれる酵素である請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ERG6、又はERG3を誘導可能に発現する酵母。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エルゴステロール合成酵素を誘導可能に発現する酵母を利用した薬剤ターゲット遺伝子のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母を利用して薬剤のターゲット遺伝子をスクリーニングする方法の一つとしてマルチコピーサプレッサー法がある。マルチコピーサプレッサー法では、マルチコピーで導入された遺伝子によって薬剤による表現型の発現が抑制された場合に、その遺伝子を薬剤のターゲット遺伝子の候補とする。酵母が薬剤に対して致死あるいは増殖抑制などの表現型を示す場合には、遺伝子を導入した酵母を薬剤の存在下で培養し、増殖してくる酵母から薬剤のターゲット遺伝子を探し出すことができる。
しかし、酵母の薬剤排出ポンプの働きで薬剤が効かない場合が多いこと、及び酵母特有の細胞壁のために薬剤透過性が低いことが、酵母を使った薬剤ターゲット遺伝子の探索を困難にしている。
薬剤排出ポンプについては、薬剤排出ポンプPdr5pの発現を誘導する転写因子Pdr1pとPdr3pを欠損させることにより、薬剤感受性を高くできることが報告されている（非特許文献１）。Pdr1pとPdr3pの欠損に加え、更に酵母細胞膜の構成成分であるエルゴステロールを合成する経路の酵素の一つErg6pを欠損させることで薬剤透過性が上がって、薬剤感受性がさらに高くなることが知られているが、該酵素を欠失させたerg6破壊株では形質転換効率が低くなり、遺伝子ライブラリーを導入することが困難であった（非特許文献２）。特に哺乳類の遺伝子ライブラリー等、構成する遺伝子数が多いライブラリーをerg6破壊株に導入する場合、数百万個以上の形質転換体を得なければならないが、そのためには数百リットルの培地で酵母を培養しなければならないと予想されるために実質的には不可能であり、erg6破壊株はマルチコピーサプレッサー法には適さないと考えられていた。
【非特許文献１】Delaveau T., et.al., Mol Gen Genet., 244(5), 501-511, 1994
【非特許文献２】Gaber RF. et.al., Mol Cell Biol., 9(8), 3447-3456, 1989
【発明の開示】
【０００３】
本発明の課題はエルゴステロール合成経路の酵素、特にerg6破壊株の高い薬剤透過性と、高い形質転換効率の両方の性質を併せ持つ、薬剤のターゲット遺伝子のスクリーニングに適した酵母を開発することにある。
【０００４】
本発明者は、薬剤に対して高い感受性を示すエルゴステロール合成経路の酵素の遺伝子破壊株を、薬剤ターゲット遺伝子のスクリーニングに用いるためには、形質転換効率を向上させる必要があると考えた。そしてエルゴステロール合成経路の酵素が欠損すると形質転換効率が低下することから、形質転換の際にのみ、エルゴステロール合成経路の酵素を発現誘導させれば高い形質転換効率を維持することができると考えた。
誘導可能なプロモーターによりエルゴステロール合成経路の酵素の発現を調節し、形質転換の時にはエルゴステロール合成経路の酵素を発現誘導させて高い形質転換効率を保ち、薬剤耐性コロニーのスクリーニングやアッセイの時にはエルゴステロール合成経路の酵素の発現を抑制することにより高い薬剤透過性を示す酵母を作製した。
すなわち本発明は、以下に係る発明である。
（１）  酵母の細胞内で蛋白質と化合物を作用させる方法であって、以下の工程を含む方法；
(i)エルゴステロール合成経路の酵素の発現が誘導された状態で、酵母に該蛋白質をコードする遺伝子を導入して蛋白質を発現させる工程、及び
(ii)エルゴステロール合成経路の酵素の発現が抑制された状態で、該遺伝子が導入された酵母に該化合物を添加し、酵母の細胞内で蛋白質に化合物を作用させる工程。
（２）  酵母に発現させた蛋白質と化合物を接触させ、該化合物と作用する蛋白質をコードする遺伝子を同定する方法であって、以下の工程を含む方法；
(i)エルゴステロール合成経路の酵素の発現が誘導された状態で、酵母に遺伝子ライブラリーを導入し、蛋白質を発現させる工程
(ii)エルゴステロール合成経路の酵素の発現が抑制された状態で、該遺伝子ライブラリーが導入された酵母に該化合物を添加し、該化合物を該蛋白質に接触させる工程
(iii) 該化合物と蛋白質が作用したことにより表現型が変化した酵母を選択する工程
(iv)選択した酵母に導入された遺伝子を同定する工程。
（３）  該化合物による酵母の表現型が致死又は増殖抑制である、（２）の方法。
（４）  前記酵母が、エルゴステロール合成経路の酵素の発現の誘導及び抑制が転写調節によって制御される酵母である、（１）〜（３）のいずれかの方法。
（５）前記転写調節が、GAL10プロモーターまたはGAL1プロモーターによる転写調節である、（４）の方法。
（６）  エルゴステロール合成経路の酵素がERG6、ERG3から選ばれる酵素である（１）から（５）のいずれかの方法。
（７）  ERG6、又はERG3を誘導可能に発現する酵母。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】ガラクトースにより発現誘導されるERG6を持つ酵母の、ガラクトース存在下（B：ガラクトース培地）及び非存在下（A：グルコース培地）でのCycloheximide感受性の比較を示す図。
【図２】ガラクトースにより発現誘導されるERG6を持つ酵母の、ガラクトース存在下（B：ガラクトース培地）及び非存在下（A：グルコース培地）での形質転換の比較を示す図（写真）。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明の主題は、遺伝子導入効率が高いエルゴステロール合成経路の酵素が発現誘導された状態の酵母に遺伝子を導入して蛋白質を発現させ、酵母細胞内への化合物の透過性が高いエルゴステロール合成経路の酵素が発現抑制された状態の酵母に化合物を添加し、導入した遺伝子の遺伝子産物と化合物を作用させる方法にある。【０００７】
本発明に用いることのできる酵母は、遺伝子の導入が可能であり、化合物を取り込むことのできるものであれば特に制限されないが、例えば、サッカロミセス・セレビジエ、シゾサッカロミセス・ポンベなどが挙げられる。【０００８】
本発明に用いることのできる酵母は、エルゴステロール合成経路の酵素を誘導可能に発現するものが好ましい。
エルゴステロール合成経路の酵素としては、発現しないことで致死とならない限りいかなる酵素も選択可能である。酵母がサッカロミセス・セレビジエの場合、好ましくはERG3p、ERG6pであり、更に好ましくはERG6pである。ERG6pとしては、例えば、配列番号５（GenBank Accession No. CAA89944）のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。また、該酵素の活性を有する限りにおいて、配列番号５のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたものであってもよい。この場合、数個とは、例えば、２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個である。また、ERG３pとしては、例えば、配列番号６（GenBank Accession No. CAA97586）のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。また、該酵素の活性を有する限りにおいて、配列番号６のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたものであってもよい。この場合、数個とは、例えば、２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個である。
なお、本発明の用いることのできる酵母は、エルゴステロール合成経路の酵素を誘導可能に発現し、かつ、Pdr1p及びPdr3pをコードする遺伝子が破壊されたものであってもよい。
酵母がシゾサッカロミセス・ポンベの場合、ERG3pに対応する酵素としてSPAC1687.16c（GenBank：CAA22610）が知られ、ERG6pに対応する酵素としてSPBC16E9.05（GenBank：CAB16897）が知られている。【０００９】
誘導可能に発現するとは、発現が抑制された状態と、発現が誘導された状態が調節可能であることをいう。「発現が抑制された状態」とは、薬剤感受性が高まる程度にエルゴステロールの合成が抑制されていればよく、例えば、該酵素の発現量が、野生株または非改変株における発現量の10％以下に低下した状態が好ましい。また、［発現が誘導された状態」とは、遺伝子の導入効率が高まる程度にエルゴステロールの合成が誘導されていればよく、例えば、該酵素の発現量が、野生株または非改変株における発現量と同程度まで誘導された状態が好ましく、野生株又は非改変株における発現量の80％以上に誘導された状態がより好ましい。なお、エルゴステロール合成酵素の発現量は、例えば、ノーザンブロット、RT-PCRによって調べることができる。【００１０】
以下に記載する操作は適当なマニュアル、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY等に記載の方法に従って行うことができる。【００１１】
エルゴステロール合成経路の酵素の発現を調節する方法としては、該酵素をコードする遺伝子の転写を調節する方法が挙げられる。
転写を調節する方法としては、テトラサイクリン遺伝子発現誘導系(Tet System)を用いる方法、及び誘導可能なプロモーターにエルゴステロール合成経路の酵素をコードする遺伝子を連結させて該酵素を発現させる方法が挙げられる。【００１２】
Tet Systemは、大腸菌テトラサイクリン耐性オペロンの転写調節に働くTetリプレッサー（TetRタンパク質）とTetオペレーター配列(tetO配列-Tetオペロン上流のDNA配列)の特性を利用し、真核生物での転写制御システムとして開発された。TetリプレッサーはtetR遺伝子産物でテトラサイクリン非存在時にのみtetO配列に結合し、テトラサイクリンがTetリプレッサーに直接結合するとtetO配列に結合できなくなる。Tet Systemでは、TetRと転写活性化ドメインを融合し転写活性化因子として働かせ、培地中のテトラサイクリンの濃度を調節することにより、TREプロモーター（tetO配列が7回連続したTet応答配列をもつプロモーター）の下流に組み込んだ目的の遺伝子の発現レベルを定量的に調節することができ、このシステムは酵母においても応用されている。（Belli G, et.al., Nucleic Acids Res. 26(4):942-7. 1998）【００１３】
酵母がサッカロミセス・セレビジエの場合、誘導可能なプロモーターとしては、GAL10プロモーター（Johnston M and Davis RW. Mol Cell Biol. 4(8):1440-1448, 1984）、GAL1プロモーター：（Johnston M and Davis RW. Mol Cell Biol. 4(8):1440-1448, 1984）、CUP1 プロモーター（Macreadie IG et.al., Plasmid. 21(2):147-150, 1989）、PHO5プロモーター（Meyhack B, et.al., EMBO J. 1(6):675-680. 1982）が挙げられる。また酵母がシゾサッカロミセス・ポンベの場合、誘導可能なプロモーターとしては、nmt1 プロモーター（Maundrell K., J Biol Chem. 1990 Jul5;265(19):10857-64.）が挙げられる。【００１４】
酵母で働く誘導可能なプロモーターを得る具体的な方法の一つは以下の方法である。誘導可能であることが知られている上記プロモーターの塩基配列情報（Saccharomyces Genome Database（http://www.yeastgenome.org/）から入手可能。GAL10プロモーター：Johnston M and Davis RW. Mol Cell Biol. 4(8):1440-1448, 1984、GAL1プロモーター：Johnston M and Davis RW. Mol Cell Biol. 4(8):1440-1448, 1984、CUP1プロモーター：Macreadie IG et.al., Plasmid. 21(2):147-150, 1989、PHO5プロモーター：Meyhack B, et.al., EMBO J. 1(6):675-680. 1982）を元に、プロモーター領域をはさむようにプライマーを設計し、酵母ゲノムDNAを鋳型としてPCRにより増幅する。プライマーには制限酵素サイトを付加しておき、PCR後制限酵素処理して制限酵素サイトを利用してベクターに連結する。プロモーターの近傍にはマーカー遺伝子、例えばKanMx6遺伝子、his5(S.pombe)遺伝子等を連結しておき、酵母にプロモーターを導入する際に表現型マーカーとして使用することができる（Butt TR, et.al., Proc Natl Acad Sci U S A. 81(11):3332-3336, 1984）。
酵母で使用可能なベクターとして、YEp352はATCC 37673、pRS315はATCC 77144としてATCC（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110, United States of America）から入手可能である。【００１５】
誘導可能なプロモーターの酵母への導入は以下の通り行うことができる。前述のマーカー遺伝子を連結したプロモーター領域を含むプラスミドを鋳型とし、プロモーターとマーカー遺伝子を含む領域の両端にプライマーを設計し、各プライマーの両端に更に誘導可能にしたいエルゴステロール合成経路の酵素のプロモーター領域の両端の配列を50bp程度付加する。これらのプライマーと鋳型プラスミドを用いてPCRを行い、得られたPCR断片を酢酸リチウム法等により酵母に形質転換する。該マーカー遺伝子の形質により選択を行い、染色体上のエルゴステロール合成経路の酵素のプロモーター領域に誘導可能なプロモーターとマーカー遺伝子が組み込まれた酵母を選択する。目的の位置に誘導可能なプロモーターが挿入されたことは挿入断片の中の設計したプライマーと染色体上のエルゴステロール合成経路の酵素遺伝子やその近傍領域に設計したプライマーとを組み合わせてPCRを行うことにより確認できる。【００１６】
本発明の方法においては、まず、エルゴステロール合成経路の酵素の発現が誘導された状態で酵母に遺伝子を導入する。
エルゴステロール合成経路の酵素の発現が誘導された状態で酵母に遺伝子を導入するのは、例えば、以下のようにして行うことができる。すなわち、誘導可能なプロモーターによりエルゴステロール合成経路の酵素を発現する酵母であれば、酵母をエルゴステロール合成経路の酵素を発現誘導する条件、GAL10プロモーターであれば２%のガラクトースを含有する培地にて酵母を培養し、エルゴステロール合成経路の酵素の発現を誘導する。また、CUP1プロモーターであれば、0.5 mMのCuSO4を含む培地で酵母を培養することによりエルゴステロール合成経路の酵素の発現を誘導し、PHO5プロモーターであれば、0.03g/LのKH2PO4を含む低リン酸培地で培養し、エルゴステロール合成経路の酵素の発現を誘導する。また、nmt1 プロモーターの場合は、thiamineを含まない培地で酵母を培養し、エルゴステロール合成経路の酵素の発現を誘導する。【００１７】
遺伝子導入は酵母細胞内で複製可能なプラスミドベクターなどを用いて行うことができる。プラスミドベクターの導入は、エレクトロポレーション法や酢酸リチウム法などによって行うことができる。
導入する遺伝子の種類は特に制限されないが、ｃＤＮＡライブラリーなどの遺伝子ライブラリーを導入することが好ましい。【００１８】
次に、エルゴステロール合成経路の酵素の発現が抑制された状態で酵母に化合物を添加し、前記導入された遺伝子から発現された蛋白質と化合物を作用させる。化合物の種類は特に制限されないが、低分子化合物、ペプチド、天然由来の化合物などを用いることができ、薬剤や毒物などを用いてもよい。
エルゴステロール合成経路の酵素の発現が抑制された状態で化合物を作用させるのは、例えば、以下のようにして行うことができる。すなわち、酵母をエルゴステロール合成経路の酵素を発現しない条件、GAL10プロモーターであればガラクトースを含まない培地にて酵母を培養し、エルゴステロール合成経路の酵素の発現が抑制された条件で酵母を化合物と接触させて、化合物と導入した遺伝子の遺伝子産物を作用させる。また、CUP1プロモーターであれば、CuSO4を含まない培地で酵母を培養し、PHO5プロモーターであれば、0.3g/LのKH2PO4を含む高リン酸培地で培養し、エルゴステロール合成経路の酵素の発現が抑制された条件で酵母を化合物と接触させて、化合物と導入した遺伝子の遺伝子産物を作用させる。また、nmt1 プロモーターの場合は、5mg/mlのthiamineを含む培地で酵母を培養し、エルゴステロール合成経路の酵素の発現が抑制された条件で酵母を化合物と接触させて、化合物と導入した遺伝子の遺伝子産物を作用させる。【００１９】
化合物に作用する蛋白質をコードする遺伝子の同定は、化合物が添加された酵母の中から、化合物と該蛋白質が作用したことにより表現型が変化した酵母を選択し、選択した酵母に導入された遺伝子を同定することにより行うことができる。【００２０】
「蛋白質と化合物を作用させる」とは、化合物と結合を結合させる、蛋白質と化合物を作用させ蛋白質の活性を変化させる、蛋白質と化合物を作用させ化合物の構造を変化させることを含む。例えば、蛋白質とそのアンタゴニストやアゴニストとして機能する化合物と作用させて蛋白質の活性を変化させることなどを含む。【００２１】
酵母の表現型は、コロニーの大きさ、形、色等、識別可能であればいかなる表現型でも許されるが、好ましくは増殖抑制、または致死である。増殖抑制はコロニーの大きさによって、致死は生育の有無によって確認することができる。
例えば化合物が酵母に対して増殖抑制、また致死を起こす化合物の場合、該化合物と蛋白質が作用することにより、増殖してきた酵母を選択する。
また、化合物に結合する蛋白質を同定する場合、下記に示すようなスリーハイブリッド法を用い、蛋白質が化合物に結合したことにより、レポーター遺伝子が示す表現型が呈された酵母を選択する。より具体的には、レポーター遺伝子がLacZの場合青色を呈する酵母を選択し、レポーター遺伝子がHIS３の場合ヒスチジン非含有培地で生育する酵母を選択する。
化合物の構造を変化させる蛋白質を同定する場合、化合物の構造変化に伴う表現型をもとにして酵母を選択する。
次いで、選択した酵母から導入された遺伝子を回収する。プラスミドとして導入していればプラスミドを回収し、塩基配列を決定して、化合物と作用していた蛋白質をコードする遺伝子を同定する。【００２２】
その一つの様態は、本方法のマルチコピーサプレッサー法への応用である。すなわちエルゴステロール合成経路の酵素が発現した状態で酵母に遺伝子ライブラリーを導入し、エルゴステロール合成経路の酵素が発現していない状態で化合物を作用させて、化合物によって引き起こされる酵母の表現型が抑制される酵母を選択し、その酵母に導入された遺伝子を同定して、遺伝子ライブラリー中の、化合物と作用する蛋白質をコードする遺伝子を選択する方法である。【００２３】
この様態は、２種類の蛋白質間の相互作用を検出するツーハイブリッド法を応用した、化合物と蛋白質の相互作用を検出するスリーハイブリッド法(three-hybrid system、Edward J. Licitra and Jun O. Liu, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93(23), 12817-12821, 1996）にも適用が可能である。スリーハイブリッド法では、GAL4などの転写因子の転写活性化領域と検出したい化合物Bの標的蛋白質Xとの融合蛋白質と、該転写因子のDNA結合領域と蛋白質Yとの融合蛋白質を細胞内に発現させ、同時に該DNA結合領域と結合する塩基配列・プロモーター領域およびその下流にレポーター遺伝子をつないだDNAを導入する。さらに、蛋白質Yと相互作用する化合物Aと検出したい化合物Bとを共有結合させた化合物を作用させると、蛋白質Yと化合物Aおよび蛋白質Xと化合物Bの結合により、蛋白質Xと融合した転写活性化領域がレポーター遺伝子の近傍に引き寄せられ、レポーター遺伝子産物の発現が増大する。すなわちエルゴステロール合成経路の酵素が発現した状態で酵母にスリーハイブリッド法の遺伝子ライブラリーを導入し、エルゴステロール合成経路の酵素が発現していない状態で化合物を作用させて、レポーター遺伝子産物を発現している酵母を選択し、その酵母に導入された遺伝子を同定して、化合物の標的蛋白質Xをコードする遺伝子を選択する方法である。【００２４】
また本発明の別の様態は、本方法のバイオコンバージョン法への応用である。すなわちエルゴステロール合成経路の酵素が発現した状態で酵母に遺伝子を導入し、エルゴステロール合成経路の酵素が発現していない状態で化合物を作用させて、導入した遺伝子の遺伝子産物により化合物を変換し、該化合物の誘導体を得る方法である。【００２５】
さらに別の様態は、エルゴステロール合成経路の酵素、好ましくはErg3p、Erg6pを誘導可能に保持する酵母である。
【実施例】
【００２６】
以下に、具体的な例をもって本発明を示すが、本発明はこれに限られるものではない。【００２７】
［実施例１］ERG6誘導発現酵母の作製
（１）GAL10プロモーター鋳型プラスミドの構築：
PCRにより増幅したGAL10プロモーターに、表現型マーカーとしてkanMx6遺伝子を連結し、GAL10プロモーター鋳型プラスミドを構築した。
GAL10プロモーターを酵母ゲノムDNAを鋳型として、GAL10遺伝子と隣接するGAL1遺伝子の間の領域に、BamHI切断部位を付加したプライマーを設計し（配列番号１及び配列番号２）、Pfu DNA Polymerase（Promega）を用いたPCRにより増幅した。
pRS315ベクターのNotI切断部位に、pFA6a-kanMX6(Wach A, et.al., Yeast, 13(11):1065-1075,1997)のNotI切断断片（kanMX6遺伝子を含む）を連結し、BamHIとBglIIにより切断後、前述のPCR増幅したGAL10プロモーター断片をBamHI処理して挿入した。
配列番号１：CGGGATCCCG TATAGTTTTT TCTCCTTGAC
配列番号２：CGGGATCCCG TTATATTGAATTTTCAAAAATT【００２８】
（２）GAL10プロモーターの挿入：
PCRによる効率的遺伝子破壊アレルの作製法（Baudin A. et. al. Nucl. Acid Res. 21:3329-3330, 1993）に従いPDR1とPDR3を破壊した酵母（サッカロミセス・セレビジエ）のERG6プロモーター領域にGAL10プロモーターを挿入した。
前述の鋳型プラスミドのGAL10プロモーターとkanMx6遺伝子の両端の配列にERG6プロモーター領域の両端の配列を50bp程度付加したプライマーを設計した（配列番号３及び配列番号４）。これらのプライマーと鋳型プラスミドを用いてTaKaRa Ex TaqによりPCRを行い、得られたPCR断片を酢酸リチウム法により酵母に形質転換し、Geneticin（シグマ社製）を含む培地で選択して、染色体上のERG6プロモーター領域にGAL10プロモーターとKanMx6遺伝子が組み込まれた酵母を選択した。
目的の位置にGAL10プロモーターが挿入されたことは挿入断片の中の設計したプライマーと染色体上のERG6遺伝子やその近傍領域に設計したプライマーとを組み合わせてPCRを行うことにより確認した。
配列番号３：CTGTCTTTTTCTCAATTCTGTTTCACTCATCTTATGCTGCCTACTATATT-GATATCGAATTCCTGCAGCC
配列番号４：CCTCCAATACTTGCTGTTGCCGATAACTTCTTCATTGCTTTTTATATAGTGCATAGGCCACTAGTGGATCTG【００２９】
［実施例２］誘導発現可能なERG6を持つ酵母の薬剤耐性
エルゴステロールを誘導可能に発現する酵母の薬剤耐性が、誘導の有無で異なることを確認する実験を行った。
実施例1で作製したERG6誘導発現株を、グルコース培地とガラクトース培地に様々な濃度Cycloheximideを加えて30℃で2日間培養し、ERG6誘導発現株のCycloheximide感受性を調べたところ、ガラクトース培地ではpdr1 pdr3破壊株（ERG6株）と同等の感受性を示し、グルコース培地ではpdr1 pdr3 erg6破壊株と同等の感受性を示した（図1）。エルゴステロールの発現を止めることで、薬剤感受性が上昇することが確認された。【００３０】
［実施例３］誘導発現可能なERG6を持つ酵母の形質転換
エルゴステロールを誘導可能に発現する酵母の形質転換効率が、誘導の有無で異なることを確認する実験を行った。形質転換には、YEp352のマルチクローニングサイトにpKT10（Tanaka et al, Mol. Cell Biol., 10:4303-4313, 1990）由来のGAPDHプロモーターおよびGAPDHターミネーターを挿入し、更にマルチクローニングサイトをpUC18マルチクローニングサイトに置き換えて作製したYEp352GAP-IIを用いた。
実施例1で作製したERG6誘導発現株を、グルコース含有液体培地またはガラクトース含有液体培地で培養し、酢酸リチウム法によりYEp352GAP-II vectorを形質転換した。YEp352GAP-II vectorは選択符号としてURA3を持つため、YEp352GAP-II vector が導入された酵母はSD-ura寒天培地でコロニーを形成する。2日間30℃で培養し、コロニー数と計測したところ、ガラクトース含有液体培地で培養して形質転換した場合、グルコース含有液体培地で培養した場合の700倍以上のコロニーが得られた（図2）。エルゴステロールを発現させることで、形質転換効率が高まることが確認された。【００３１】
［実施例４］Methotrexate (MTX)のマルチコピーサプレッサースクリーニング
Methotrexate (MTX)はジヒドロ葉酸の類似物であり、ジヒドロ葉酸還元酵素(dihydrofolate reductase、DHFR)に作用して、葉酸合成を阻害することが知られており、酵母に対しても増殖抑制作用を示す。誘導発現可能なERG6を持つ酵母を用いたマルチコピーサプレッサー法により、MTXのターゲット遺伝子としてジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子が同定されるかを検討した。ヒトcDNA libraryとしては、HeLa cDNAより作製したlibraryを使用した。
実施例1で作製したERG6誘導発現株に、酢酸リチウム法でヒトcDNAライブラリーを形質転換し、得られた約4.5x106個の形質転換体を回収した後、5x107個の細胞を25μMのMTXを含む寒天培地にまき、30℃で3日間培養してMTX耐性コロニーを形成させた。これらの耐性コロニーからプラスミドを回収しシークエンスによりプラスミドに含まれている配列を調べたところ、MTXのターゲット遺伝子であるDHFRのORFが含まれていた。
DHFR（出芽酵母ではDFR1）はマルチコピーでMTX耐性を付与することが報告されており（Lagosky PA. et. al. Nucleic Acids Res. 15(24):10355-10371, 1987）、ERG6誘導発現株を用いたマルチコピーサプレッサースクリーニングによって報告通りDHFRが単離されることが証明された。
【産業上の利用の可能性】
【００３２】
高い形質転換効率を保ちながら、高い薬剤透過性を持った酵母が得られたことから、酵母を用いた薬剤のターゲット遺伝子の探索が容易となった。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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