(57)【要約】  糖尿病の細胞移植治療に用いるためのインスリン分泌細胞を、培養容器内で膵腺房細胞からの誘導により製造する方法が開示されている。当該方法は、哺乳類動物より単離された膵腺房細胞を、増殖因子、好ましくは上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子及び／又は肝細胞増殖因子を含有する培地中で培養してインスリン分泌細胞を誘導することを含んでなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類動物のインスリン非産生細胞からインスリン分泌細胞を製造するための方法であって、哺乳類動物より単離された膵腺房細胞を、増殖因子を含有する培地中で培養してインスリン分泌細胞を誘導することを含む方法。
【請求項２】
培養された細胞中に含まれる誘導されたインスリン分泌細胞を採取することを含む、請求項１の製造方法。
【請求項３】
インスリン分泌細胞の採取が、インスリン分泌細胞を含む細胞コロニーを採取することによりなされるものである、請求項２の製造方法。
【請求項４】
増殖因子が上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子１０及び／又は肝細胞増殖因子である、請求項１ないし３の何れかの製造方法。
【請求項５】
少なくとも１０ｎｇ／ｍｌの濃度の増殖因子の存在下に培養が行われるものである、請求項１ないし４の何れかの製造方法。
【請求項６】
培養が、周囲の細胞より小型の細胞の集団からなる細胞コロニーが形成されるまで行われるものである、請求項１ないし５の何れかの製造方法。
【請求項７】
培養が、ウシ胎児血清濃度０〜２％で行われるものである、請求項１ないし６の何れかの製造方法。
【請求項８】
請求項１ないし７の何れかの方法によって製造されたインスリン分泌細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリン非産生細胞からのインスリン分泌細胞の誘導に関し、詳しくは、膵腺房細胞からのインスリン分泌細胞の誘導に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、１）患者数の増加（日本では糖尿病740万人、予備軍880万人）、２）重篤な合併症（網膜症による失明、腎症による腎不全、糖尿病性動脈硬化症による心筋梗塞、脳梗塞）の進展、３）糖尿病関連医療費の増大など、医学的にも、社会的にも深刻な問題をもたらしており、その根本的解決は緊急性を要する。特に、合併症の進展防止は患者のクオリティー・オブ・ライフ（ＱＯＬ）の改善に不可欠である。【０００３】
糖尿病の終末像は膵β細胞の破壊や機能不全によるインスリン欠乏（依存）状態である。インスリンが発見されて以来インスリン依存状態の糖尿病患者に対し、インスリンの投与が唯一の現実的な治療となっている。しかし、健常者の生体内では膵β細胞が血糖値をリアルタイムで感知し、必要量のインスリンを分泌しているのとは極めて対照的に、インスリン治療は血糖値をリアルタイムで正常にコントロールすることは不可能である。そればかりか、インスリンの投与では、所定量のインスリンを患者血流中に持続的に供給することさえ困難である。このため、インスリンの投与は根本的治療法に成り得ず、合併症を防止することは困難である。これに対し、膵移植や膵島移植は、根治療法の可能性を秘めているものの、ドナー不足から現実性に乏しい。また、幹細胞から分化誘導させたインスリン分泌細胞を患者に移植することは、血糖値をリアルタイムで制御することも可能にすると考えられ、合併症の進展を防止できる極めて有力な治療となり得る。成体の膵臓内にも幹細胞の存在が示唆されており、内分泌細胞の再生現象に関与していると考えられているが（Bonner-Weir and Sharma, J. Pathol., 197:519(2002)）、一方で、成熟膵管細胞や膵腺房細胞が分化転換によって内分泌細胞に変化する可能性についても論じられており(Bouwens, Microsc. Res. Tech., 43:332(1998)) 、実態は明らかではない。【０００４】
現在、既に糖尿病の根治療法として実施されている膵島移植では、平均２〜３人分のドナー膵臓が必要とされている（Ryan et al., Diabetes 51:2148(2002)）が、膵島移植を行うときには膵外分泌組織は不必要として廃棄されている。移植に用いる膵島は膵臓全体の２〜３％程度に過ぎず、残りの大部分は膵腺房細胞を含む外分泌組織である。このように大量に存在し、しかも膵島移植時には必ず入手できる膵腺房細胞を材料としてインスリン分泌細胞を製造できれば、一人分のドナー膵臓から充分量の移植用細胞が確保できる可能性がある。膵腺房細胞は、消化酵素などの産生・分泌に与る細胞であるが、発生上、膵内分泌細胞と同一起源の細胞であり、分化の一定時期までそれらの区別は明確ではない(非特許文献１参照)。膵腺房細胞の可塑性については従来より報告があるものの(非特許文献２参照) 、試験管内では膵導管様の細胞に変化するとの報告があるのみで（非特許文献３〜５参照）、インスリン分泌細胞を作製するには至っていない。従って、移植治療に用いるインスリン分泌細胞を試験管内で膵腺房細胞から誘導可能か否かを確認し、可能であればその方法を見出すことが必要である。
【非特許文献１】Slack, Development, 121:1569(1995)
【非特許文献２】Bouwens, Microsc. Res. Tech., 43:332(1998)
【非特許文献３】Rooman et al., Diabetologia, 43:907(2000)
【非特許文献４】Gmyr et al., Diabetes, 49:1671(2000)
【非特許文献５】Wagner et al., Gastroenterology, 122:1898(2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記背景の下で、本発明の目的は、糖尿病の細胞移植治療に用いるためのインスリン分泌細胞を、培養容器内で膵腺房細胞からの誘導により製造することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、膵腺房細胞を上皮増殖因子等の増殖因子の存在下に培養することにより、インスリン分泌細胞が誘導できることを見出し、更に、糖尿病を発症した動物の膵腺房細胞からも同様にインスリン分泌細胞が誘導できることを見出した。本発明は、これらの発見に基づくものである。【０００７】
すなわち本発明は、以下を提供する。
１．哺乳類動物のインスリン非産生細胞からインスリン分泌細胞を製造するための方法であって、哺乳類動物より単離された膵腺房細胞を、増殖因子を含有する培地中で培養してインスリン分泌細胞を誘導することを含む方法。
２．培養された細胞中に含まれる誘導されたインスリン分泌細胞を採取することを含む、上記１の製造方法。
３．インスリン分泌細胞の採取が、インスリン分泌細胞を含む細胞コロニーを採取することによりなされるものである、上記２の製造方法。
４．増殖因子が上皮増殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子１０（ＦＧＦ１０）及び／又は肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）である、上記１ないし３の何れかの製造方法。
５．少なくとも１０ｎｇ／ｍｌの濃度の増殖因子の存在下に培養が行われるものである、上記１ないし４の何れかの製造方法。
６．培養が、周囲の細胞より小型の細胞の集団からなる細胞コロニーが形成されるまで行われるものである、上記１ないし５の何れかの製造方法。
７．培養が、ウシ胎児血清濃度０〜２％で行われるものである、上記１ないし６の何れかの製造方法。
８．上記１ないし７の何れかの方法によって製造されたインスリン分泌細胞。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、糖尿病治療のために患者へ移植することためのインスリン分泌細胞を、膵β細胞に比して大量に得ることの可能な膵腺房細胞から誘導して取得することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１Ａは、培養初期の膵腺房細胞の光学顕微鏡写真であり、図１Ｂは、培養７日後の膵腺房胞塊の光学顕微鏡写真である。
【図２】図２上段Ａ〜Ｃは、インスリン陽性細胞を示す蛍光顕微鏡写真を示し、下段Ａ〜Ｃは、ＰＣＮＡ、グルカゴン又はサイトケラチン陽性細胞をそれぞれ示す、上段Ａ〜Ｃと同一の細胞塊の蛍光顕微鏡写真である。
【図３】図３は、膵腺房細胞培養３日目及び６日目のインスリン陽性コロニーの割合（％）を示すグラフである。
【図４】図４は、ウシ胎児血清濃度とインスリン陽性細胞の出現との関係を示す蛍光顕微鏡写真を示す。
【図５】図５は、無コート（Ａ）、ラミニンコート（Ｂ）及びポリ−Ｄ−リジンコート（Ｃ）した培養ディッシュにおいて誘導されたインスリン陽性細胞を含む細胞塊の顕微鏡写真（左）及び蛍光顕微鏡写真（右）をそれぞれ示す。
【図６】図６は、正常マウス及びストレプトゾトシン処理マウスの膵島の顕微鏡写真を示す。
【図７】図７は、ストレプトゾトシン処理マウスの膵腺房細胞から誘導されたコロニー（左：核染色）及び該コロニー中のインスリン陽性細胞（右）を示す蛍光顕微鏡写真を示す。
【図８】図８は、細胞の増殖促進（Ａ）及びインスリン陽性細胞誘導効率（Ｂ）についての各増殖因子の効果を示すグラフである。
【図９】図９は、ＥＧＦ濃度と誘導効果との関係を示す顕微鏡写真を示す。
【図１０】図１０は、誘導されたインスリン陽性細胞からの培地中へのインスリンの分泌を示すグラフである。
【図１１】図１１は、マトリゲル（登録商標）マトリックス上で培養された膵腺房細胞集団の培養７日目の顕微鏡写真（Ａ）及び同じ細胞集団内のインスリン陽性細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。
【図１２】図１２は、無処理ディッシュ及びマトリゲル（登録商標）コートディッシュ中で培養された細胞中のインスリン含量の比較を示すグラフである。
【図１３】図１３は、ブタ膵腺房細胞から誘導された細胞塊（Ａ）及びインスリン陽性細胞（Ｂ）を示す蛍光顕微鏡写真を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明において、「哺乳類動物」は、ヒト、ブタ及びマウスを含む。本発明において、後述のとおり、マウスの膵腺房細胞からインスリン分泌細胞を誘導することができたほか、ブタの膵腺房細胞からも同じ条件でインスリン分泌細胞が誘導されることが確認されている。【００１１】
本発明において、「インスリン分泌細胞」とは、インスリンを産生して周囲の媒質中へ放出する能力を有する細胞をいう。
本発明において、「インスリン陽性細胞」とは、適宜の検出手段によりインスリンの含有が検出される細胞をいう。後述のように、インスリン陽性細胞は、収穫したインスリン陽性細胞がインスリンを培地中に分泌することが確認されていることから、インスリン分泌細胞に等しい。【００１２】
本発明において、膵腺房細胞の培養は、好ましくは液体培地でおこなわれる。誘導されたインスリン分泌細胞は、周囲の細胞より小さい細胞の集団よりなるコロニーに含まれており、それらのコロニーを、例えば顕微鏡下にピペッティングにより採取することにより、目的とする細胞を得ることができる。【００１３】
膵腺房細胞の培地中に存在させる増殖因子の例としては、上皮増殖因子（ＥＦＧ）及び繊維芽細胞増殖因子１０（ＦＧＦ１０）が挙げられる。これらのうち、上皮増殖因子が特に好ましい。増殖因子の濃度は、１０ｎｇ／ｍｌ以上とするのが好ましく、例えば、１０、１５又は２０ｎｇ／ｍｌとすることができるが、これ以上の濃度、例えば２００ｎｇ／ｍｌとしてもよい。【００１４】
本発明において、培養はウシ胎児血清の存在下（例えば10％）にも不存在下にも行うことができる。ウシ胎児血清は、哺乳類細胞の維持及び増殖を促進する上では好ましいが、目的とする誘導されたインスリン分泌細胞以外の細胞の増殖も促進する。このため、培養後目的とする細胞の採取を妨げない程度に細胞全体の増殖を止めることが好ましい。培養容器に播く細胞密度に及び培養日数に応じて適宜定めればよい。通常は、ウシ胎児血清濃度は２％以下とすれば取り扱い易く、全く含有させなくてもよい。【００１５】
膵腺房細胞の培養は、通常の哺乳類細胞を培養する際に用いる温度であればよく、例えば37℃とすることができる。この温度において、例えば５〜８日の培養でインスリン分泌細胞を誘導することができる。【００１６】
本発明により得られるインスリン分泌細胞は、例えば門脈に注入することにより、肝臓に生着させてインスリンを分泌させることが可能である。またこの場合、糖尿病患者の自家膵臓から採取された膵腺房細胞より誘導したインスリン分泌細胞を用いるならば、免疫反応のおそれがないため、特に好都合である。
【実施例１】
【００１７】
インスリン陽性細胞の誘導方法
〔膵腺房細胞の単離〕
８週齢の雄性マウス(C57Bl/6Cr Slc)（日本エスエルシー：浜松、日本)をネンブタール（大日本製薬：大阪、日本) 50ｍｇ／ｋｇにて麻酔し開腹した。総胆管の十二指腸開口部付近を結さつし、肝臓側から27ゲージの翼状針（テルモ：東京、日本）を利用して0.05％のコラゲナーゼＰ（ロシュ：バーゼル、スイス）と10％のウシ胎児血清を含むハンクス緩衝液２〜３ｍｌを注入した。膨化した膵臓を摘出し、膵臓１個あたり５ｍｌのハンクス緩衝液中で37℃、18分間消化した。14ゲージの留置針を用い、消化した膵臓を２往復させることにより膵細胞を分散させ、0.1％のウシ血清アルブミン（シグマ：セントルイス、ミズーリ州、米国）を含むハンクス緩衝液で充分洗浄した。得られた膵細胞を8.3％のFicoll 400（アマシャムバイオサイエンス：ウプサラ、スウェーデン）と16.7％のConray 400 （第一製薬：東京、日本）の混合水溶液（Ａ液）に懸濁し、さらにＡ液を87.5％に希釈した溶液とＡ液を50%に希釈した溶液を順に重層し遠心分離（2,000ｒｐｍ、10分）した。最下層の沈殿部分に膵腺房細胞が濃縮されるので、これを回収し、さらに混入した成熟β細胞を取り除くために、滅菌した0.1ｍｇ／ｍｌのジチゾン（1, 5-ジフェニルチオカルバゾン）（ナカライテスク：京都、日本）溶液を加え、37℃で15分間染色した。ジチゾンは亜鉛のキレート剤であるが、成熟β細胞では高濃度のインスリンが亜鉛を介して６量体を形成しているので、成熟β細胞を赤く染めることができる(Latif et al., Transplantation, 45:827(1988))。赤く染まった成熟β細胞を実体顕微鏡下で取り除き、膵腺房細胞が高度に濃縮された画分を得た。【００１８】
〔膵腺房細胞の前培養〕
分離した膵腺房細胞を10％のウシ胎児血清（シグマ）を含む栄養培地（例えばRPMI-1640）に懸濁して膵腺房細胞１匹分当たり１枚の90ｍｍ径細胞培養ディッシュ（旭テクノグラス：船橋、日本）に播種し、温度を37℃、炭酸ガス濃度を５％に調製した培養器内で６時間培養した。この間に接着性の良い繊維芽細胞は接着するが、膵腺房細胞は接着しない。浮遊細胞を回収することにより膵腺房細胞を得た。【００１９】
〔膵腺房細胞の本培養〕
回収した浮遊細胞を0.5％のウシ胎児血清（シグマ）と20ｎｇ／ｍlの上皮増殖因子(Epidermal growth factor: ＥＧＦ)（R&Dシステムズ：ミネアポリス、ミネソタ州、米国）を含む栄養培地（例えばRPMI-1640）に懸濁し、細胞接着性の低い細胞培養ディッシュ（ナルジェヌンク：ロチェスター、ニューヨーク州、米国）に播種して、温度を37℃、炭酸ガス濃度を５％に調製した培養器内で培養した。膵腺房細胞は、培養初期には細胞同士が密集した境界の滑らかな細胞塊を形成して浮遊状態を保ち（図１Ａ）、３日目頃からディッシュ底面に接着し伸展した。約７日後、数十個から数百個の細胞からなる比較的小さな細胞集団（コロニー）を形成した（図１Ｂ）。播種密度は前培養時の１倍から10倍希釈までの範囲で、観察されるコロニーの形態に差はなかった。【００２０】
〔免疫染色〕
細胞培養ディッシュに接着した細胞をリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄し、４％のパラホルムアルデヒド（和光純薬；大阪、日本）で室温、20分間固定した。ＰＢＳで５分間、３回洗浄し、10％の正常ヤギ血清（ケミコン：Temecula、カリフォルニア州、米国）と0.2％のTween-20（ICNバイオメディカルズ：Aurora、オハイオ州、米国）を含むＰＢＳで室温にて、20分間ブロッキングした。１％の正常ヤギ血清を含むＰＢＳで希釈した一次抗体を加え、室温、２時間反応させた。使用した一次抗体は、モルモット抗インスリン抗体（２倍希釈）（ザイメッド：サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州、米国）、マウス抗グルカゴン抗体（1000倍希釈）（シグマ）、ウサギ抗ＰＣＮＡ(proliferating cell nuclear antigen)抗体（200倍希釈）（サンタクルズバイオテクノロジー：サンタクルズ、カリフォルニア州、米国）、または、マウス抗サイトケラチン抗体（50倍希釈）（ダコ：Carpinteria、カリフォルニア州、米国）である。ＰＢＳで５分間、３回洗浄し、１％の正常ヤギ血清を含むＰＢＳで希釈した二次抗体を加え、室温にて１時間反応させた。使用した二次抗体は、Alexa Fluor 488ヤギ抗モルモットＩｇＧ抗体（200倍希釈）（モレキュラープローブズ：ユージーン、オレゴン州、米国）、Alexa Fluor 546ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（200倍希釈）（モレキュラープローブズ）、または、Alexa Fluor 546ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（200倍希釈）（モレキュラープローブズ）である。PBSで５分間、３回洗浄し、2.5μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（4’, 6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）（同仁化学：熊本、日本）で核染色を行った。蛍光顕微鏡（オリンパス：東京、日本）にて観察し、冷却デジタルＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス：浜松、日本）にて画像を取得した。【００２１】
培養後約１週間目のコロニーでは、抗インスリン抗体によって認識される細胞（インスリン陽性細胞）が認められた（図２、上段Ａ〜Ｃ）。インスリン陽性細胞の一部はＰＣＮＡ陽性であった（図２、下段Ａ）ことから、増殖細胞であることが証明された。また、インスリン陽性細胞の一部は他のホルモンであるグルカゴン（図２、下段Ｂ）や、膵管細胞のマーカーであるサイトケラチン（図２、下段Ｃ）も同時に陽性であった。β細胞は発生過程ではインスリン／グルカゴン陽性の時期があり、膵管様構造からβ細胞を含む多くの膵島が分化する(Slack, Development, 121:1569(1995))ことから、ここで観察されたインスリン陽性細胞は混入したβ細胞ではなく、膵腺房細胞から分化途上の細胞であると考えられる。
【実施例２】
【００２２】
〔培養日数の検討〕
最適な培養期間を検討するために、実施例１の方法に従って単離したマウス膵腺房細胞（前培養で回収された浮遊細胞）を、同実施例に記載したのと同様にして本培養に付し、培養後３日目及び６日目にインスリンの免疫染色を行い、インスリン陽性細胞を含むコロニーの割合を計算した。本培養後３日ではインスリン陽性細胞はほとんど認められなかったが、培養６日目では約４０％のコロニーがインスリン陽性細胞を含んだ（図３）。培養後一週間前後の時点で最も多くのインスリン陽性細胞が得られると考えられる。
【実施例３】
【００２３】
実施例１の方法に従って単離したマウス膵腺房細胞を、同実施例に記載したのと同様にして、但しウシ胎児血清の濃度を０％、0.5％、２％、５％又は10％として本培養に付し、インスリン陽性細胞の出現を検討した。血清０％群の培地にはアルブミン（シグマ）を１％添加した。試験した血清いずれの濃度においてもインスリン陽性細胞が誘導された（図４）。ウシ胎児血清の濃度５％及び10％では、インスリン陽性細胞以外の細胞の増殖も比較的多く見られた。このため、インスリン陽性細胞の採取し易さの観点からは、ウシ胎児血清の濃度を余り高くしない方が扱い易い。例えば２％以下等の濃度とすることができる。また、血清を全く含有させないでもよい。
【実施例４】
【００２４】
〔各種コーティングディッシュの検討〕
実施例１に記載した本培養の条件下において、無コートの細胞培養ディッシュ（Ａ）、ラミニンコートした細胞培養ディッシュ（Ｂ）（ベクトンディッキンソン）、ポリ−Ｄ−リジンコートした細胞培養ディッシュ（Ｃ）（ベクトンディッキンソン）の各々に、膵腺房細胞を播種して培養した。各ディッシュにおいてインスリン陽性細胞の誘導が認められた（図５Ａ〜Ｃ：それぞれ、コロニーの顕微鏡写真（左）及びこれに含まれるインスリン陽性細胞の蛍光顕微鏡写真（右））。
【実施例５】
【００２５】
〔１型糖尿病（β細胞破壊）マウス膵腺房細胞からのインスリン陽性細胞の誘導〕
ストレプトゾトシン(STZ)（シグマ）をクエン酸緩衝液(pH 4.5)に溶解し、一晩絶食したマウスの腹腔内に200ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、２日後に、血糖値が400ｍｇ／ｄｌを超えたことを確認して実験に用いた。β細胞が破壊されたことは、膵切片のヘマトキシリン−エオシン染色によって確認した（図６Ａ，Ｂ）。膵腺房細胞の分離、培養は実施例１に記載した通りに行い、免疫染色の結果、健常マウス由来の膵腺房細胞と同様の頻度でインスリン陽性細胞の誘導が認められた（図７）。このことは、本方法で得られるインスリン陽性細胞がβ細胞以外の細胞（すなわち膵腺房細胞）から分化したことを示しているとともに、β細胞が破壊された１型糖尿病患者の膵臓からも作製できることを示しており、自家移植による糖尿病治療の可能性を示唆するものである。
【実施例６】
【００２６】
〔インスリン陽性細胞誘導効率に対する増殖因子の効果〕
インスリン陽性細胞誘導効率に対する増殖因子の効果を、ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ）、肝細胞増殖因子(Hepatocyte Growth Factor: ＨＧＦ)（Ｒ＆Ｄシステムズ）、繊維芽細胞増殖因子７(Fibroblast Growth Factor 7: ＦＧＦ７)（Ｒ＆Ｄシステムズ）、維芽細胞増殖因子１０(ＦＧＦ10)（Ｒ＆Ｄシステムズ）、グルカゴン様ペプチド−１(Glucagon-like Peptide-1: ＧＬＰ−１)（ペプチド研究所：大阪、日本）について検討した。実施例１に記載した方法に準じ、但しこれらの増殖因子の何れかを標準的な使用濃度すなわちＥＧＦは20ｎｇ／ｍｌ、ＨＧＦ、ＦＧＦ７及びＦＧＦ10は10ｎｇ／ｍｌ、ＧＬＰ−１は30ｎｇ／ｍｌ、で加えて、膵腺房細胞の本培養を行った。培養７日目に全細胞数とインスリン陽性細胞の割合を計測した。全細胞数（細胞の生育）については、最も効果的な増殖因子はＥＧＦであり、ＨＧＦがこれに続いた（図８Ａ）。インスリン陽性細胞の割合については、最も効果的な増殖因子はＥＧＦで、他の増殖因子との差は顕著であり、ＦＧＦ10及びＨＧＦがこれに続いた（図８Ｂ）。
【実施例７】
【００２７】
〔ＥＧＦ濃度と誘導効果との関係の検討〕
実施例１に記載した方法に準じ、但しウシ胎児血清濃度を0.5％に固定し且つ増殖因子としてＥＧＦを無添加又は０、２、20又は200ｎｇ／ｍｌの濃度で加えて、膵腺房細胞の本培養を行うことにより、目的とする細胞（図１Ｂに示したようなインスリン陽性細胞を含んだコロニーを形成する細胞）の誘導に対するＥＧＦの効果を評価した。その結果、ＥＧＦ濃度20及び200ｎｇ／ｍｌで顕著な誘導が確認された（図９）。
【実施例８】
【００２８】
〔インスリン分泌反応〕
上記のようにして誘導したインスリン陽性細胞からのインスリン分泌反応を検討した。回収した細胞を0.1％のウシ血清アルブミンを含むクレブス緩衝液５００μｌに懸濁し（試験管あたり約2.5×105個）、グルコース濃度25ｍＭにて37℃で４時間まで刺激した。分泌されたインスリンはシバヤギ社のキットを用いてＥＬＩＳＡ法にて測定した。２時間から４時間で、インスリン分泌の有意な増加が確認された（図１０）。
【実施例９】
【００２９】
〔マトリゲル（登録商標）上での培養によるインスリン陽性細胞分化誘導効率の改善〕
細胞の増殖・分化にはその足場となる細胞外の環境が重要で、生体内においては様々な細胞外マトリクスを含む基底膜が存在し、増殖因子などのリザーバーとしても機能している。試験管内でこの環境を再現するひとつの方法としてマトリゲル（登録商標）マトリクスを用いる方法が知られており、種々の細胞の分化を促進するとの報告がある（Kleinman et al., Biochemistry, 25:312(1986), Hadley et al., J. Cell. Biol., 101:1511(1985), Kubota et al., J. Cell. Biol., 107:1589(1988), McGuire and Orkin, Biotechniques, 5:456(1987)）。マトリゲル（登録商標）マトリクスの主要構成成分はラミニン、コラーゲンＩＶ、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンであり、インスリン様増殖因子１(ＩＧＦ−１)を比較的多く含む。インスリン陽性細胞への分化効率の改善のため、マトリゲル（登録商標）マトリクス上での培養を試みた。【００３０】
実施例１に準じた本培養後１日から４日後に、浮遊している膵腺房細胞塊を回収し、薄層マトリゲル（登録商標）コートディッシュ（ベクトンディッキンソン）に再播種した。細胞塊は翌日には接着、伸展を開始し、盛んな増殖を示した。大きく成長したコロニーの内部に、周囲の細胞と明確に区別できる小型細胞の集団が多数形成された（図１１Ａ）。マトリゲル（登録商標）上で１日から７日目まで培養してインスリンの免疫染色を行ったところ、インスリン陽性細胞は小型細胞集団に限局し、集団内では高頻度にインスリン陽性であった（図１１Ｂ）。【００３１】
無処理ディッシュとの比較において、マトリゲル（登録商標）コートディッシュを用いた場合の、膵腺房細胞のインスリン陽性細胞への分化誘導効率を検討するために、培養後の細胞のインスリン含量を測定した。すなわち、培養後の細胞に酸性エタノール（75％エタノール1000容に対し、濃塩酸15容を加えたもの）を加え、４℃で24時間放置後、上澄を回収して希釈し、シバヤギ社のキットを用いてＥＬＩＳＡ法にてインスリン含量を測定した。マトリゲル（登録商標）上で培養することにより、無処理ディッシュに比してインスリン含量は３倍以上となることが見出された（図１２）。
【実施例１０】
【００３２】
〔ブタ膵腺房細胞からのインスリン陽性細胞の誘導〕
実施例１の方法により、成体ブタ膵腺房細胞を採取して培養することにより、マウスの場合と同様にインスリン陽性細胞が誘導できることが確認された（図１３Ａ核染色、図１３Ｂインスリン陽性細胞）。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明は、従来は僅かにしか採取できなかった膵β細胞に代えて、相対的に多量に得られる膵腺房細胞からインスリン分泌細胞を製造することを可能にする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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