(57)【要約】トランスポゾンの機能を用いる等の手段により、カイコフィブロインＨ鎖遺伝子を損なうことなく、高強度、高伸度といった所望の性質を持つクモ糸タンパク質をコードする遺伝子を導入した遺伝子組換えカイコを用い、遺伝子組換えカイコの作る絹糸の強度および伸度を低下させることなく、所望の性質を持つクモ糸タンパク質を遺伝子組換えカイコに産生させ、所望の性質を有したクモ糸と絹糸のハイブリッドシルクを産生させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一対のフィブロインＨ鎖遺伝子を持つ遺伝子組換えカイコにより作られることを特徴とするクモ糸タンパク質を含む絹糸。
【請求項２】
該絹糸が絹糸のフィブロインＨ鎖タンパク質の基本的な構造を本質的に保持することを特徴とする請求項１に記載のクモ糸タンパク質を含む絹糸。
【請求項３】
クモ糸タンパク質がフィブロインタンパク質中に分散して存在することを特徴とする請求項１または２に記載の絹糸。
【請求項４】
クモ糸タンパク質がフィブロインＨ鎖タンパク質に含まれるポリペプチドと融合していることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の絹糸。
【請求項５】
クモ糸タンパク質が、フィブロインＨ鎖タンパク質のＮ末端部分とＣ末端部分の間に挿入されており、Ｃ末端部分に含まれるシステインを介してフィブロインＬ鎖タンパク質とジスルフィド結合していることを特徴とする請求項４に記載の絹糸。
【請求項６】
クモ糸タンパク質の含量が０．１〜２５重量％である請求項１〜５のいずれか１項に記載の絹糸。
【請求項７】
クモ糸タンパク質の含量が１〜１５重量％である請求項６に記載の絹糸。
【請求項８】
クモ糸タンパク質の含量が１〜１０重量％である請求項７に記載の絹糸。
【請求項９】
クモ糸タンパク質が、配列番号１のペプチドまたは配列番号１において１もしくはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されかつクモ糸タンパク質の特性を有するペプチドを含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の絹糸。
【請求項１０】
請求項９に記載のペプチドが３〜３０回繰り返したクモ糸タンパク質を含むことを特徴とする請求項９に記載の絹糸。
【請求項１１】
請求項９に記載のペプチドが４〜１６回繰り返したクモ糸タンパク質を含むことを特徴とする請求項１０に記載の絹糸。
【請求項１２】
クモ糸タンパク質が、配列番号２のペプチドまたは配列番号２において１もしくはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されかつクモ糸タンパク質の特性を有するペプチドを含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の絹糸。
【請求項１３】
請求項１２に記載のペプチドが３〜３０回繰り返したクモ糸タンパク質を含むことを特徴とする請求項１２に記載の絹糸。
【請求項１４】
請求項１２に記載のペプチドが４〜１６回繰り返したクモ糸タンパク質を含むことを特徴とする請求項１３に記載の絹糸。
【請求項１５】
クモ糸タンパク質が請求項９記載のペプチドおよび請求項１２記載のペプチドの両方を含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の絹糸。
【請求項１６】
クモ糸タンパク質と融合するフィブロインＨ鎖タンパク質のＣ末端部分が配列番号３のペプチドまたは配列番号３において１もしくはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されかつ２または３個のシステインを有するペプチドであることを特徴とする請求項５〜１５のいずれか１項に記載の絹糸。
【請求項１７】
クモ糸タンパク質と融合するフィブロインＨ鎖タンパク質のＮ末端部分が配列番号４のペプチドまたは配列番号４において１もしくはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたペプチドであって、該ペプチドをコードする遺伝子がプロモーターによる外来タンパク質の発現を増強する機能を保持するペプチドであることを特徴とする請求項５〜１６のいずれか１項に記載の絹糸。
【請求項１８】
クモ糸タンパク質が選択マーカーとなるタンパク質と融合していない請求項１〜１７のいずれか１項に記載の記載の絹糸。
【請求項１９】
一対のフィブロインＨ鎖遺伝子を有し、クモ糸タンパク質をコードする遺伝子が一対のフィブロインＨ鎖遺伝子以外の領域に導入された請求項１〜１８のいずれか１項に記載の絹糸を作る遺伝子組換えカイコ。
【請求項２０】
遺伝子組換えカイコにおけるクモ糸タンパク質を発現させるため、フィブロインＨ鎖遺伝子プロモーターを有することを特徴とする請求項１９に記載の遺伝子組換えカイコ。
【請求項２１】
遺伝子組換えカイコにおけるクモ糸タンパク質を発現させるため、フィブロインＨ鎖遺伝子プロモーター及びその上流領域を有することを特徴とする請求項１９に記載の遺伝子組換えカイコ。
【請求項２２】
フィブロインＨ鎖プロモーター下流に、フィブロインＨ鎖遺伝子第一エキソン・第一イントロン・第二エキソン領域の全長またはその一部が連結されていることを特徴とする請求項２０または２１に記載の遺伝子組換えカイコ。
【請求項２３】
トランスポゾンを利用する請求項１９〜２２のいずれかに記載の遺伝子組換えカイコの製造法。
【請求項２４】
トランスポゾンがｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンであることを特徴とする請求項２３に記載の遺伝子組換えカイコの製造法。
【請求項２５】
請求項１９〜２２のいずれか１項記載の遺伝子組換えカイコにより作らせることを特徴とする絹糸の製造方法。
【請求項２６】
請求項１〜１８のいずれか１項記載の絹糸を用いた織物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、遺伝子組換えカイコにより作られるクモ糸タンパク質を含む絹糸、該遺伝子組換えカイコ、ならびに該遺伝子組換えカイコによる絹糸の製造方法に関する。
【背景技術】  強度および耐久性を損なうことなく、軽量かつしなやかさの両方を兼ね備える材料および布についての需要は常に増加しており、クモ糸が数々の所望される特性を有することが示されている。円網を作る種類のクモは、６本の異なる種類の腺組織からシルクを産生することができ、６本の繊維の各々は異なる機械的特性を有することが知られている。Ｍａｊｏｒ  ａｍｕｌｌａｔｅ  ｇｌａｎｄ（大嚢状腺）とＭｉｎｏｒ  ａｍｕｌｌａｔｅ  ｇｌａｎｄ（小嚢状腺）から作り出されるクモ糸（スパイダーシルク）は、牽引糸、ドラグラインと呼ばれている。牽引糸は高い引っ張り強度と高い伸度を示す（非特許文献１）ことから、幅広い産業用途への展開が期待されている（非特許文献２）。また、Ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ  ｇｌａｎｄ（鞭毛状腺）、Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  ｇｌａｎｄ（聚状腺）から作られるクモ糸は、一般に横糸となり、粘着性と高い伸度を示す（非特許文献３）。
このようにクモ糸は、鋼鉄よりも強い引張強さを示すものおよび羊毛よりも強い耐屈曲性を有するものがあり、さらにＫＥＶＬＡＲ（登録商標）よりも大きなエネルギー対ブレーク限界を特徴とするものも知られている。特に牽引糸は２００ｋｓｉを越える引張強さを有し、ほぼ３５％の耐屈曲性を伴う。これらの特徴が付与されるとすると、クモ糸を様々な織物用適用のための軽量高強度繊維として使用することができる。
またクモ糸は、最高１００℃まで安定であるため、これらの繊維を使用して熱注入化プラスチックを補強することができる。これらのタンパク質はフィルムもしくはコーティングの形態でも価値がある可能性がある。さらに、クモ糸はアミノ酸を構成成分とするタンパク質でもあり、自然界において分解されるという利点も兼ね備えている。
天然のクモ糸タンパク質としては、ｓｐｉｄｒｏｉｎ１（ＭａＳｐＩ）やｓｐｉｄｒｏｉｎ２（ＭａＳｐＩＩ）（非特許文献４）、ＡＤＦ−３、ＡＤＦ−４などが知られている。これらクモ糸タンパク質の持つ特徴的な配列として、アラニン、セリン、およびグリシンにより大半が占められるアミノ酸でできており、かつグルタミン、チロシン、ロイシン、およびバリンのような他のアミノ酸の相当な量を有することが挙げられる。ｓｐｉｄｒｏｉｎ１は反復配列を有しており、反復単位は最大３４アミノ酸長であり、そして厳密には保存されない。この反復単位は２つの異なるセグメント、つまり（ｉ）５〜７残基のポリアラニン配列により大半が占められる１０アミノ酸セグメント、（ｉｉ）配列内で保存されるが、ただし多くの反復単位中に複数回の３アミノ酸の欠損を有する２４アミノ酸セグメント、からなる。後者の配列は主にＧｌｙ−Ｘａａ−Ｇｌｙモチーフからなり、Ｘａａはアラニン、チロシン、ロイシン、もしくはグルタミンである。Ｓｐｉｄｒｏｉｎ２も反復配列を有し、反復単位は最大５１アミノ酸長であり、そしてやはり厳密には保存されない。この反復配列は２つの異なるセグメント、つまり（ｉ）６〜９残基のポリアラニン配列により大半が占められるセグメント、（ｉｉ）ＧｌｙＧｌｙＴｙｒＧｌｙＰｒｏＧｌｙもしくはＧｌｙＰｒｏＧｌｙＧｌｎＧｌｎといったアミノ酸配列を含むセグメント、からなる。
天然のクモ糸タンパク質とくに牽引糸の主要構成タンパク質であるｓｐｉｄｒｏｉｎ１は、グリシン、セリン、グルタミン、アラニン、チロシン、ロイシン、アルギニン、イソロイシン、バリンを構成成分とするポリペプチドからなることが知られている。マイナー成分であるｓｐｉｄｒｏｉｎ２の配列中には、ｓｐｉｄｒｏｉｎ１と比較してプロリンが多く含まれることが知られており、プロリンはターンおよびよじれ構造に寄与すると考えられている。
これらの特徴を保持した人工的に合成、デザインされた遺伝子として、それぞれＤＰ−１Ｂ、ＤＰ−２Ａ（非特許文献４）が知られている。
しかしクモは集団で飼育することが困難であり、直接クモから大量の糸を調製することは困難である。また、天然のクモ糸を可溶化および精製することもまた困難で、クモ糸は例えばＬｉＳＣＮ、ＬｉＣｌＯ４、もしくは８８％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のギ酸のような非常に苛酷な試薬以外では不溶性である。いったん溶解しても、透析する場合、もしくは典型的な緩衝液で希釈する場合にクモ糸を構成しているクモ糸タンパク質は沈殿してしまう。さらに、クモにより作られるクモ糸は、クモ糸の種類に応じて糸の性質が異なっており、所望の性質を持つクモ糸を分離することはなお困難である。こうした要因により、商業的に有用な量のクモ糸タンパク質を天然の源から適度なコストで入手することを不可能なものとしている。
そこで近年は遺伝子組換え技術を用いて、いくつかの生物を、クモ糸タンパク質を作るように改変する試みがなされている。例えば大腸菌や酵母といった微生物にクモ糸タンパク質を作らせる試み（非特許文献４）（特許文献１）や、タバコやポテトといった植物を用いる試み（非特許文献５）、ほ乳類細胞を用いる手法や、遺伝子組換えヤギを用いて乳中や尿中に産生させる手法（特許文献２）が行われている。しかしこれら遺伝子組換え体を用いたクモ糸タンパク質の産生では、産生されたクモ糸タンパク質を抽出、精製し、人工的に紡糸する必要があり（非特許文献１）、人工的な紡糸には手間やコストがかかり、各種溶媒を用いることによる環境負荷の課題もある。
そうした中、精製および／または人工的な紡糸工程を必要とせず、クモ糸を構成するタンパク質を含む繊維を直接生産するための方法として、遺伝子組換えカイコを用いた緑色蛍光タンパク質とクモ糸タンパク質の融合タンパク質を含んだ絹糸を生産する手法が開示されている（特許文献３）。この手法は、カイコ卵へ、エレクトロポレーションにより緑色蛍光タンパク質とクモ糸タンパク質を模したタンパク質の融合タンパク質をコードする遺伝子を導入し、相同組換えにより組換え体を取得するものである。しかしこの手法では、遺伝子を組換えていないカイコの作る絹糸と比較して、強度および伸度が低下した絹糸しか生産することができない。
この原因として、１．相同組換えにより遺伝子を導入することから、カイコの持つ本来の一対のフィブロインＨ鎖遺伝子の少なくとも一方が破壊されてしまう、２．組換え体選抜のため、緑色蛍光タンパク質を融合タンパク質として発現させる必要があり、クモ糸タンパク質の性質を損なう可能性がある、３．デザインされたクモ糸タンパク質が高強度、高伸度といった性質を持ち得ない配列であった、などの可能性が考えられる。
【特許文献１】特表平８−５１１４２６号公報
【特許文献２】特表２００２−５０６６４２号公報
【特許文献３】国際公開第０２／４０５２８号パンフレット
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２年、第２９５巻、ｐ４７２−４７６
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ、２００１年、第４１０巻，ｐ５４１−５４８
【非特許文献３】大崎茂芳、クモの糸の化学、有機合成化学、（日本）、１９８５年、第４巻，第９号，ｐ８２８−８３５
【非特許文献４】Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０００年、第７４号、ｐ１０５−１１９
【非特許文献５】Ｎａｔｕｒｅ、２００１年、第１９巻，ｐ５７３−５７７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】  本発明では、高強度、高伸度といったクモ糸の持つ所望の性質を有する絹糸を、各種溶媒を用いることなく、また人工的な紡糸工程を必要としない手法により提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】  本発明者らは、上記課題を解決できる手段を鋭意検討した結果、トランスポゾンの機能を用いることでクモ糸タンパク質をコードする遺伝子を導入した遺伝子組換えカイコが、高強度、高伸度といった所望の性質を持つ、クモ糸タンパク質を含む絹糸を産生することを見出し本発明に至った。
すなわち本発明は、以下の（１）〜（２６）の発明を提供するものである。
（１）一対のフィブロインＨ鎖遺伝子をもつ遺伝子組換えカイコにより作られる、クモ糸タンパク質を含む絹糸。
（２）一対のフィブロインＨ鎖遺伝子をもつ遺伝子組換えカイコにより作られ、絹糸のフィブロインＨ鎖タンパク質の基本的な構造を本質的に保持することを特徴とするクモ糸タンパク質を含む絹糸。
（３）クモ糸タンパク質がフィブロインタンパク質中に分散して存在することを特徴とする前記発明（１）または（２）に記載の絹糸。
（４）クモ糸タンパク質がフィブロインＨ鎖タンパク質に含まれるポリペプチドと融合していることを特徴とする前記発明（１）〜（３）のいずれかに記載の絹糸。
（５）クモ糸タンパク質が、フィブロインＨ鎖タンパク質のＮ末端部分とＣ末端部分の間に挿入されており、Ｃ末端部分に含まれるシステインを介してフィブロインＬ鎖タンパク質とジスルフィド結合していることを特徴とする前記発明（４）に記載の絹糸。
（６）クモ糸タンパク質の含量が０．１〜２５重量％である前記発明（１）〜（５）のいずれかに記載の絹糸。
（７）クモ糸タンパク質の含量が１〜１５重量％である前記発明（６）に記載の絹糸。
（８）クモ糸タンパク質の含量が１〜１０重量％である前記発明（７）に記載の絹糸。
（９）クモ糸タンパク質が、配列番号１のペプチドまたは配列番号１において１もしくはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されかつクモ糸タンパク質の特性を有するペプチドを含むことを特徴とする前記発明（１）〜（８）のいずれかに記載の絹糸。
（１０）前記発明（９）に記載のペプチドが３〜３０回繰り返したクモ糸タンパク質を含むことを特徴とする前記発明（９）に記載の絹糸。
（１１）前記発明（９）に記載のペプチドが４〜１６回繰り返したクモ糸タンパク質を含むことを特徴とする前記発明（１０）に記載の絹糸。
（１２）クモ糸タンパク質が、配列番号２のペプチドまたは配列番号２において１もしくはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されかつクモ糸タンパク質の特性を有するペプチドを含むことを特徴とする前記発明（１）〜（８）のいずれかに記載の絹糸。
（１３）前記発明（１２）に記載のペプチドが３〜３０回繰り返したクモ糸タンパク質を含むことを特徴とする前記発明（１２）に記載の絹糸。
（１４）前記発明（１２）に記載のペプチドが４〜１６回繰り返したクモ糸タンパク質を含むことを特徴とする前記発明（１３）に記載の絹糸。
（１５）クモ糸タンパク質が前記発明（９）記載のペプチドおよび前記発明（１２）記載のペプチドの両方を含むことを特徴とする前記発明（１）〜（８）のいずれかに記載の絹糸。
（１６）クモ糸タンパク質と融合するフィブロインＨ鎖タンパク質のＣ末端部分が配列番号３のペプチドまたは配列番号３において１もしくはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されかつ２または３個のシステインを有するペプチドであることを特徴とする前記発明（５）〜（１５）のいずれかに記載の絹糸。
（１７）クモ糸タンパク質と融合するフィブロインＨ鎖タンパク質のＮ末端部分が配列番号４のペプチドまたは配列番号４において１もしくはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されされたペプチドであって、該ペプチドをコードする遺伝子がプロモーターによる外来タンパク質の発現を増強する機能を保持するペプチドであることを特徴とする前記発明（５）〜（１６）のいずれかに記載の絹糸。
（１８）クモ糸タンパク質が選択マーカーとなるタンパク質と融合していない前記発明（１）〜（１７）のいずれかに記載の絹糸。
（１９）一対のフィブロインＨ鎖遺伝子を有し、クモ糸タンパク質をコードする遺伝子が一対のフィブロインＨ鎖遺伝子以外の領域に導入された前記発明（１）〜（１８）のいずれかに記載の絹糸を作る遺伝子組換えカイコ。
（２０）遺伝子組換えカイコにおけるクモ糸タンパク質を発現させるため、フィブロインＨ鎖遺伝子プロモーターを有することを特徴とする前記発明（１９）に記載の遺伝子組換えカイコ。
（２１）遺伝子組換えカイコにおけるクモ糸タンパク質を発現させるため、フィブロインＨ鎖遺伝子プロモーター及びその上流領域を有することを特徴とする前記発明（１９）に記載の遺伝子組換えカイコ。
（２２）フィブロインＨ鎖プロモーター下流に、フィブロインＨ鎖遺伝子第一エキソン・第一イントロン全長またはその一部・第二エキソン領域の一部が連結されていることを特徴とする前記発明（２０）または（２１）に記載の遺伝子組換えカイコ。
（２３）トランスポゾンを利用する前記発明（１９）〜（２２）のいずれかに記載の遺伝子組換えカイコの製造法。
（２４）トランスポゾンがｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンであることを特徴とする前記発明（２３）に記載の遺伝子組換えカイコの製造法。
（２５）前記発明（１９）〜（２２）のいずれかに記載の遺伝子組換えカイコにより作らせることを特徴とする絹糸の製造方法。
（２６）前記発明（１）〜（１８）のいずれかに記載の絹糸を用いた織物。
【発明の効果】  本発明により、強度、伸度及び／またはタフネスが向上するといった、優れた特性を有するクモ糸タンパク質を含む絹糸が得られた。また、該絹糸を用いた織物は、その優れた特性から、産業用途例えば、航空、宇宙用途、被服製造、ロープ、外科手術用縫合糸のような所定の種類の高強度使用のため、ならびに移植術（例えば、人工靭体もしくは大動脈用包帯）用の生物材料としてさえ適用可能である可能性がある。
【図面の簡単な説明】図１は、ＨＰ・ＤＰ１６・ＨＣ、ＨＰ・ＤＰ１２・ＨＣ、ＨＰ・ＤＰ８・ＨＣ、ＨＰ・ＤＰ４・ＨＣおよびＨＰ・ＡＥＸ・ＨＣ遺伝子構造の作製手法を示す図である。
図２は、ＨＵＰ・ＤＰ８・ＨＣおよびＨＵＰ・ＤＰ４・ＨＣ遺伝子構造の作製手法を示す図である。
図３は、ＨＰ・ＤＰ８・ＨＣ（レーン１〜５）、ＨＰ・ＤＰ４・ＨＣ（レーン６〜１０）遺伝子構造をもつ遺伝子組換えカイコをランダムに選抜し、そのゲノムをＥｃｏＲＩで制限酵素処理したものに対し、クモ糸タンパク質遺伝子ＤＰを標識して行ったサザンハイブリダイゼーションの結果を示した写真図である。
図４は、ＨＰ・ＤＰ１６・ＨＣ、ＨＰ・ＤＰ８・ＨＣ、ＨＰ・ＤＰ４・ＨＣ、ＨＰ・ＡＥＸ・ＨＣ、ＨＵＰ・ＤＰ８・ＨＣ、ＨＵＰ・ＤＰ４・ＨＣ遺伝子構造を導入したカイコの作る繭を、可溶化し、銀染色および抗体を用いたウエスタン解析により分析した結果を示した写真図である。
図５は、非組換えカイコの作る絹糸と、ＨＰ・ＤＰ８・ＨＣ遺伝子を導入した組換えカイコの作る絹糸の精練前および精練後の状態を走査電子顕微鏡（１５００倍）により撮影した結果を示す写真図である。
図６は、非組換えカイコの作る絹糸をサンプルとし、繊維軸方向に切片を切り、クモ糸タンパク質ＤＰに対する抗体を用いて行った免疫電子顕微鏡観察写真の結果を示す写真図である（倍率１５０００倍）。
図７は、ＨＰ・ＤＰ８・ＨＣ遺伝子を導入した組換えカイコの作る絹糸をサンプルとし、繊維軸方向に切片を切り、クモ糸タンパク質ＤＰに対する抗体を用いて行った免疫電子顕微鏡観察写真の結果を示す写真図である（倍率１５０００倍）。
【符号の説明】
１：  セリシン層
２：  フィブロイン層
３：  クモ糸タンパク質
【発明を実施するための最良の形態】  この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ，１９９５等に記載されている。
本発明における絹糸とは、カイコガ（ボンビクス・モリ）により吐糸される繭を構成するタンパク質を主な主成分とする繊維を示す。好ましくは繭から調製された生糸を示し、さらに好ましくは生糸を精練して得られた絹糸を示し、もっとも好ましくは２粒以上の複数の繭からマルチフィラメントとして操糸された絹糸を示す。カイコの作る絹糸は、フィブロイン層とそれを取り囲むセリシン層から構成されている。
本発明における「クモ」とは、クモ目に分類される動物、好ましくは造網性のクモ目に分類される動物を示す。さらに好ましくはオニグモもしくはジョロウグモを示す。
本発明における「クモ糸」とは、「クモ」が作る糸すなわち繊維状のタンパク質であり、具体的には造網性のクモの作る糸すなわち牽引糸、枠糸、繋留糸、卵嚢糸、横糸、捕獲帯、付着盤、しおり糸などが挙げられるが、より好ましくは縦糸、横糸、枠糸、牽引糸を示す。
本発明におけるクモ糸タンパク質とは、クモ糸を構成するタンパク質もしくはクモ糸を構成するタンパク質の特徴を持つタンパク質のことである。天然のクモ糸タンパク質と全く同じ配列である必要はなく、人工的にデザイン、合成されたタンパク質であっても良い。天然のクモ糸タンパク質は分子量が巨大であることから、天然のクモ糸タンパク質を作る遺伝子も同様に巨大である。効率的に取り扱うためには、遺伝子の短縮、欠失、置換を行うことが望ましい。また、天然のクモ糸タンパク質の持つ特徴的な配列を持つ人工的な類似タンパク質を作るように設計、デザインされた人工的な遺伝子であっても良い。
好ましくは、ＤＰ−１Ｂ、ＤＰ−２Ａに含まれる少なくともアミノ酸５残基以上の配列を持つタンパク質をクモ糸タンパク質として用いることができる。さらに好ましくは、クモ糸索引糸のもつ強度、伸度といった所望の性質を絹糸に付与するには、主要構成タンパク質であるｓｐｉｄｒｏｉｎ１のアミノ酸配列を模倣することが望ましい。つまり本発明におけるクモ糸タンパク質は、グリシン、セリン、グルタミン、アラニン、チロシン、ロイシン、アルギニン、イソロイシン、バリンを構成成分とすることが望ましく、さらに好ましくはＤＰ−１Ｂによりコードされる配列番号１に記載の配列、または「クモ糸タンパク質に特有の反復配列」・「ＤＰ−２Ａのコンセンサス配列」・「絹糸に特有の反復配列」の順で構成された配列番号２に記載の配列を含むクモ糸タンパク質が用いられる。
実質的に同等の機能を有する範囲における、配列番号１または２または３または４に記載の配列において１またはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加を有するものも含まれる。すなわち、タンパク質は、種々の方法により改変されても、その基本的な特徴を保持することが十分に認識されている。このことは、基本となるポリペプチド配列に比較して１またはそれ以上のアミノ酸の欠失、置換または付加といった変異が存在するが、基本となる無変位配列と同等の機能すなわち所望の性質を保持していることを意味する。
また遺伝子組換えカイコを用いて効率的にクモ糸タンパク質を作らせるためには、カイコ絹糸腺で発現する遺伝子のコドン利用頻度に近い遺伝子であることが望ましい。カイコ絹糸腺で発現する遺伝子の例としては、フィブロインＨ鎖遺伝子、フィブロインＬ鎖遺伝子、Ｐ２５タンパク質遺伝子などが挙げられる。カイコ絹糸腺で発現する遺伝子のコドン利用頻度に近づくよう改変、変異させることができ、その手段は公知である。具体的にはタンパク質を作る遺伝子を改変する手法が用いられる。例えば、ランダム変異導入法、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、またはポリメラーゼ連鎖増幅法（ＰＣＲ）を単独または適宜組み合わせて行うことができる。例えば亜硫酸水素ナトリウムを用いた化学的な処理によりシトシン塩基をウラシル塩基に置換する方法や、マンガンを含む反応液中でＰＣＲを行い、ＤＮＡ合成時のヌクレオチドの取り込みの正確性を低くする方法、部位特異的変異導入のための市販されている各種キットを用いることもできる。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等編［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版］Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９、村松正實編［ラボマニュアル遺伝子工学］丸善株式会社、１９８８、エールリッヒ、ＨＥ．編［ＰＣＲテクノロジー、ＤＮＡ増幅の原理と応用］ストックトンプレス、１９８９等の成書に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができる。
本発明において、クモ糸タンパク質は、絹糸構成タンパク質であるフィブロインＨ鎖に含まれるポリペプチドと融合していることが望ましい。好ましくは、クモ糸タンパク質はフィブロインＨ鎖のＣ末端部分と融合している。特に好ましくは、クモ糸タンパク質はフィブロインＨ鎖のＮ末端部分とフィブロインＨ鎖のＣ末端部分の間に挿入されている。この様に構成されたクモ糸タンパク質を含む融合タンパク質は、フィブロインＨ鎖タンパク質のＣ末端部分に含まれるシステインを介して、フィブロインＬ鎖タンパク質とジスルフィド結合を形成する。
本発明において用いられるクモ糸タンパク質の分子量に関しては、特に制限はない。クモ糸の持つ所望の性質を付与するためには分子量は高いことが望ましいが、同時にクモ糸タンパク質を作る遺伝子の取り扱いを困難にする。したがってクモ糸タンパク質は、好ましくは分子量３０ｋＤａ〜３００ｋＤａの範囲、さらに好ましくは３０ｋＤａ〜１６０ｋＤａの範囲であることが望ましい。
本発明の絹糸は、クモ糸の持つ優れた性質によって改良された性質を持つ。より具体的には遺伝子を組換えていない同種カイコの作る絹糸と比較して高い引張強度や高伸度、高弾性率や伸縮性に優れる点、耐屈曲性、大きなエネルギー対ブレーク限界すなわち高いタフネス性、粘着性、含水時の収縮性、耐候性や耐光性に優れる点などから選ばれる少なくとも一つの特徴を示すが、それら全てを満たすことを意味するものではない。好ましくは高い引っ張り強度や高伸度、高いタフネス性の中から選ばれる少なくとも一つの性質を示す。
本発明において、クモ糸タンパク質を含む絹糸をカイコに産生させるために用いるプロモーターは特に限定されないが、転写活性の高いものが好ましい。例えば、特開平６−２６１７７０や特開昭６２−２８５７８７に記載されているショウジョウバエの熱ショックタンパク質遺伝子のプロモーターやカイコアクチン遺伝子のプロモーター（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８，８１−８４，２０００）などが挙げられるが、フィブロインＨ鎖遺伝子のプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号  Ｖ０００９４の塩基番号２５５〜５７４番目、ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号  ＡＦ２２６６８８の塩基番号６２１１８〜６２４３７番目）、フィブロインＬ鎖遺伝子のプロモーター（Ｇｅｎｅ，１００：１５１−１５８：ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号  Ｍ７６４３０）、セリシン遺伝子のプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号  ＡＢ００７８３１の塩基番号５９９〜１６５６番目）などカイコ絹糸腺細胞中で高い転写促進活性を有するプロモーターが好適である。また、フィブロインＨ鎖遺伝子プロモーターおよびその上流領域（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号  ＡＦ２２６６８８の塩基番号５７４４４〜６２４３７番目）を用いることで高い転写促進がみられる。
フィブロインＨ鎖遺伝子の５’末端部分は、プロモーターによる外来タンパク質の発現を増強する作用を有するＤＮＡ配列である。このＤＮＡ配列は、フィブロインＨ鎖遺伝子の第１エキソンと第１イントロン全長またはその一部および第２エキソンの一部を含む。また、フィブロインＨ鎖遺伝子の５’末端部分は配列番号４記載のフィブロインＨ鎖タンパク質Ｎ末端部分のポリペプチドをコードする。
カイコの形質転換のためには、昆虫細胞を遺伝子組換えすることのできる昆虫用のベクターであれば特段の制限なく使用することができる。例えば、カイコ核多角体ウイルス（ＢｍＮＰＶ）ベクターや、昆虫由来ＤＮＡ型トランスポゾンを組み込んだプラスミドベクター等であるが、特に後者が好ましい。昆虫由来ＤＮＡ型トランスポゾンとしては、ｐｉｇｇｙＢａｃ、ｍａｒｉｎｅｒ（Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９，１４５−１５５，２０００）、およびＭｉｎｏｓ（Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９，２７７−２８１，２０００）等が知られているが、本発明においてはｐｉｇｇｙＢａｃが好ましい。
ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンとは、両端に１３塩基対の逆位配列と、内部に約２．１ｋ塩基対のＯＲＦを有するＤＮＡの転位因子である。本発明において使用されるＰｉｇｇｙＢａｃトランスボゾンは特に限定されないが、例えばＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ＴＮ−３６８、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶ（ＡｃＮＰＶ）、Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｍｅｌｌｏｎｅａ  ＮＰＶ（ＧｍＭＮＰＶ）由来のものを用いることができる。好ましくはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ＴＮ−３６８由来ＰｉｇｇｙＢａｃの一部を持つプラスミドｐＨＡ３ＰＩＧとｐＰＩＧＡ３ＧＦＰ（Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８，８１−８４，２０００）を、トランスポゼースタンパク質を産生するヘルパープラスミドとして用いることができる。
ヘルパープラスミドによって産生されるこれらのトランスポゾンは、カイコ細胞内で転移活性を示すことから、これらのＤＮＡ型トランスポゾンをもとに作製した遺伝子導入用ベクターによりカイコを形質転換させることが可能である。特にｐｉｇｇｙＢａｃをもとに作製した遺伝子導入用プラスミドベクターは、カイコ卵に微量注入することにより、実際にカイコを形質転換させることに成功している（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，８１−８４，２０００）。
例えばｐｉｇｇｙＢａｃの性質を利用して、以下の方法により遺伝子組換えカイコを作出することができる。まず、カイコ・ゲノム配列内にクモ糸タンパク質を含む絹糸を産生するようにデザインされた遺伝子を挿入する。このためには、田村らの方法（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，８１−８４，２０００）と同様な方法によって行うことができる。即ち、ｐｉｇｇｙＢａｃの一対の逆向き反復配列を適当なプラスミドベクターに組み込み、クモ糸タンパク質を含む絹糸を産生するようにデザインされた遺伝子を一対の逆向き反復配列で夾むように挿入する。そしてこの遺伝子導入用プラスミドベクターを、ｐｉｇｇｙＢａｃのトランスポゼース発現ベクター（ヘルパープラスミド）と共にカイコ卵へ微量注入する。このヘルパープラスミドは、ｐｉｇｇｙＢａｃの逆向き反復配列の片方または両方を欠いた、実質的にはｐｉｇｇｙＢａｃのトランスポゼース遺伝子領域のみが組み込まれている組換えプラスミドベクターである。このヘルパープラスミドにおいて、トランスポゼースを発現させるためのプロモーターは、内在性のトランスポゼースプロモーターをそのまま利用しても良いし、あるいは、カイコ・アクチンプロモーターやショウジョウバエ  ＨＳＰ７０  プロモーター等を利用してもよい。次世代カイコのスクリーニングを容易にするために、クモ糸タンパク質を含む絹糸を産生するようにデザインされた遺伝子を付加したクモ糸タンパク質発現ベクター内に同時にマーカー遺伝子を組み込んでおくこともできる。この場合、マーカー遺伝子の上流に例えばカイコ・アクチンプロモーターやショウジョウバエ  ＨＳＰ７０  プロモーター等のプロモーター配列を組み込み、その作用によりマーカー遺伝子を発現させるようにする。
クモ糸タンパク質発現ベクターを微量注入したカイコ卵から、孵化した幼虫（Ｇ０世代）を飼育する。このＧ０世代のカイコのうち一部カイコには、クモ糸タンパク質を含む絹糸を産生するようにデザインされた遺伝子が組み込まれている。しかし、この世代のカイコでは、カイコ体内の全細胞のうちの一部分の細胞にのみクモ糸タンパク質を含む絹糸を産生するようにデザインされた遺伝子が組み込まれており、全細胞にクモ糸タンパク質を含む絹糸を産生するようにデザインされた遺伝子が組み込まれたカイコを得るためには、Ｇ０カイコを交配し、生殖細胞を通じて、クモ糸タンパク質を含む絹糸を産生するようにデザインされた遺伝子が伝達された遺伝子組換えカイコを得なければならない。即ち、得られた全Ｇ０世代のカイコを非組換えカイコと、あるいはＧ０カイコ同士で交配し、次世代（Ｇ１世代）のカイコからクモ糸タンパク質を含む絹糸を産生するようにデザインされた遺伝子を有した遺伝子組換えカイコを選抜する必要がある。Ｇ１世代のカイコからの遺伝子組換えカイコの選抜は、例えばＰＣＲ法やサザンブロット法を用いて行う。また、マーカー遺伝子を組み込んだ場合には、その表現形質を利用して選抜することも可能である。例えばマーカー遺伝子としてＧＦＰ等の蛍光タンパク質遺伝子を利用した場合には、Ｇ１世代のカイコ卵や幼虫に励起光を照射し、蛍光タンパク質の発する蛍光を検出することにより行うことができる。
このようにして選抜されたカイコは、その染色体内にクモ糸タンパク質を含む絹糸を産生するようにデザインされた遺伝子が組み込まれている遺伝子組換えカイコである。加えて、こうして得られた遺伝子組換えカイコは、ＷＯ０２／４０５２８Ａ１（特許文献３）に記載された相同組換えによって得られた遺伝子組換えカイコと異なり、正常なカイコフィブロインＨ鎖遺伝子が残されたままであり、つまり、一対のフィブロインＨ鎖遺伝子を持つ遺伝子組換えカイコである。
本発明において、絹糸に含まれるクモ糸タンパク質の含量は特に制限されるものではなく、重量比で０．１％〜３０％の範囲であればよい。このとき、カイコの吐糸行動による繊維化を妨げない範囲であることが望ましい。しかし３０％以上の含量であることにより、強度が低下してしまう可能性がある。そこで強度および／または伸度を保ち、かつクモ糸の持つ所望の性質を付与するためには、より好ましくは０．１〜２５％、より好ましくは１〜１５％、さらに好ましくは１〜１０％の範囲で含まれることが望ましい。
クモ糸タンパク質を重量比０．１％から２５％の範囲内で含む絹糸は、たとえば、フィブロインＨ鎖上流プロモーター・フィブロインＨ鎖遺伝子第一エキソン・第一イントロン領域・第２エキソン領域の一部（ＧｅｎｅＢａｎｋ  登録番号  ＡＦ２２６６８８の塩基番号５７４４４〜６３５１３番目）の下流、またはフィブロインＨ鎖プロモーター・フィブロインＨ鎖遺伝子第一エキソン・第一イントロン・第二エキソン領域（ＧｅｎｅＢａｎｋ  登録番号  ＡＦ２２６６８８の塩基番号６２１１８〜６３５１３番目）の下流に、配列番号１で示されるペプチドを複数回繰り返したペプチド配列をコードした塩基を連結し、さらにその下流にフィブロインＨ鎖Ｃ末端領域遺伝子・フィブロインＨ鎖ポリＡシグナル領域（ＧｅｎｅＢａｎｋ  登録番号  ＡＦ２２６６８８の塩基番号７９０９９〜７９９９５番目）を、フレームが合うように連結した遺伝子構造を、ＸｈｏＩ処理後平滑化したｐｉｇＡ３ＧＦＰプラスミドに連結する。この遺伝子導入用ベクターおよびピギーバックトランスポゼースタンパク質を生産するＤＮＡを含むヘルパープラスミド（ｐＨＡ３ＰＩＧ）を各２００μｇ／ｍｌ含んだ０．５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）・５ｍＭＫＣｌ溶液を調製し、３〜２０ｎｌを産卵後４時間以内のカイコ卵に対してマイクロインジェクションし、遺伝子組換えカイコを作る。このように作成した組換えカイコは、クモ糸タンパク質を含む絹糸を産生する。
このとき、遺伝子の導入された染色体上の位置の違いにより、含まれるクモ糸タンパク質の含量には差異が生じる。
さらに、導入するクモ糸タンパク質のペプチド配列の繰り返しの回数に特に制限はないが、好ましくは３〜３０回、さらに好ましくは４〜１６回である。
クモ糸タンパク質の含量は、繭を可溶化後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、銀染色キット（第一化学薬品株式会社製）を用い、添付のプロトコールに従ってクモ糸タンパク質の検出を行い、その結果をモレキュラーイメージャー（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてシグナル強度を測定し、濃度既知のタンパク質例えばネコインターフェロンのシグナル強度と比較することでタンパク質含量を測定することができる。
本発明において使用されるＤＮＡを取得する方法に特に制限はない。既知の遺伝子情報に基づき、ＰＣＲ法を用いて必要な遺伝子領域を増幅取得する方法、既知の遺伝子情報に基づきゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーより相同性を指標としてスクリーニングする方法などが挙げられる。本発明においては、これらの遺伝子は遺伝的多型性や変異剤などを用いた人為的変異処理による変異型も含む。遺伝的多型性とは遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化しているものをいう。
クモ糸タンパク質を絹糸腺細胞の外に大量に分泌させる場合、フィブロインＬ鎖タンパク質とジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含むフィブロインＨ鎖タンパク質のＣ末端部分をクモ糸タンパク質と融合させることにより、絹糸中にクモ糸タンパク質を産生することが可能となる。また、フィブロインＨ鎖遺伝子のＣ末端部分は、クモ糸タンパク質のＮ末端側、Ｃ末端側、クモ糸タンパク質中のいずれに存在してもよい。この部分には、少なくともシステイン残基が一つ存在している。フィブロインＨ鎖タンパク質においては、フィブロインＬ鎖とジスルフィド結合で結合する役割を有しているシステイン残基はフィブロインＨ鎖タンパク質のＣ末端から２０番目に位置することになる。クモ糸タンパク質と融合させるフィブロインＨ鎖タンパク質のＣ末端部分の長さは、フィブロインＬ鎖とのジスルフィド結合の形成を阻害することがない限り特に制限はない。
同じくクモ糸タンパク質を絹糸腺細胞の外に大量に分泌させる場合、フィブロインＨ鎖タンパク質とジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含むフィブロインＬ鎖タンパク質と融合させることで、絹糸中にクモ糸タンパク質を産生することも可能である。しかし、高伸度、高強度といった所望の性質をクモ糸タンパク質を含む絹糸に付与するためには、フィブロインＨ鎖タンパク質のＣ末端部分を融合させる方が好ましい。
本発明における「フィブロインＨ鎖タンパク質に含まれるポリペプチド」とは、フィブロインＬ鎖タンパク質とジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含むフィブロインＨ鎖タンパク質のＣ末端部分のポリペプチドおよび／またはフィブロインＨ鎖遺伝子の第１エキソンと第２エキソンの一部にコードされるポリペプチドを示す。フィブロインＬ鎖タンパク質とジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含むフィブロインＨ鎖タンパク質のＣ末端部分のポリペプチドとして、好ましくは配列番号３に記載のポリペプチドが用いられる。また、フィブロインＨ鎖遺伝子の第１エキソンと第２エキソンの一部にコードされるポリペプチドとして、好ましくは配列番号４に記載のポリペプチドが用いられる。このとき、実質的に同等の機能を有する範囲において、１またはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加を有するものも用いることができる。
ポリＡ付加領域についても特に制限はないが、フィブロインＨ鎖、フィブロインＬ鎖、セリシンなど絹糸腺で大量に発現しているタンパク質遺伝子のポリＡ付加領域が好適に使用できる。
本発明における遺伝子組換えカイコとは、クモ糸タンパク質を含む絹糸を産生するようにデザインされた遺伝子構造を有するカイコを示す。組換え体の選抜を容易にする目的で、抗生物質耐性遺伝子、クラゲ由来蛍光緑色タンパク質遺伝子などマーカー遺伝子を組み込んでおくこともできる。
本発明におけるクラゲ由来緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とは、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質を示し、励起光により緑色の蛍光を発することが特徴である。蛍光強度や蛍光波長が改良された類縁体を用いることも可能である。
しかし、クモ糸タンパク質のもつ高強度、高伸度といった特徴を発揮するには、こうした選択マーカーとなるタンパク質をコードする遺伝子と、クモ糸タンパク質をコードする遺伝子とをフレームが一続きとなるように連結し、選択マーカーとなるタンパク質との融合タンパク質として発現させることは好ましくない。結晶性の高い繊維タンパク質としての性質を持つクモ糸タンパク質に、結晶性が低く、非繊維性のＧＦＰを融合させることは、絹糸の結晶化を阻害し、繭の重量低下、絹糸の強度低下を引き起こす可能性があるからである。従って、「クモ糸タンパク質が、選択マーカーとなるタンパク質と融合していない」ことは、ＷＯ０２／４０５２８Ａ１（特許文献３）において開示されている実施例と異なり、強度、伸度および／あるいはタフネスを低下させないために重要な現象である。ＷＯ０２／４０５２８Ａ１（特許文献３）に記載の手法では、ＧＦＰなどの選択マーカーとなるタンパク質と融合させることが実質的に必須であるが、本発明においては選択マーカーとなるタンパク質を融合させる必要はない。
本発明における「一対のフィブロインＨ鎖遺伝子を持つ遺伝子組換えカイコ」とは、内在性のカイコフィブロインＨ鎖遺伝子に、クモ糸タンパク質をコードする遺伝子やＧＦＰなどの蛍光タンパク質遺伝子といった外来遺伝子が挿入されておらず、正常なフィブロインＨ鎖遺伝子を持っており、かつフィブロインＨ鎖遺伝子以外の領域に、カイコが本来有していない外来遺伝子が導入されている遺伝子組換えカイコを示す。好ましくは、相同染色体上の同一遺伝子座に存在する一対のフィブロインＨ鎖遺伝子をもつ遺伝子組換えカイコを示す。
一対のフィブロインＨ鎖遺伝子以外に外来遺伝子が導入されたことを確認するには、まず、遺伝子組換えカイコゲノムから外来遺伝子が挿入された断片を、インバースＰＣＲや、カイコゲノムを種々の制限酵素で処理し外来遺伝子をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション法を用い、常法によるクローニングを行うといった手法により取得する。こうして得られた断片の塩基配列を確認することで、フィブロインＨ鎖遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋ  登録番号  ＡＦ２２６６８８の塩基番号５７４４４〜７９９９５）以外に外来遺伝子が導入されたことを確認することができる。
カイコの絹糸は主としてフィブロインＨ鎖タンパク質が繊維化することにより形成される。したがって、一対のフィブロインＨ鎖遺伝子を有することは、遺伝子組換えカイコの作る絹糸において、強度や伸度といった物性を低下させない上で重要な現象である。
本発明において、フィブロインＨ鎖タンパク質の構造を基本的に保持することとは、フィブロインＨ鎖タンパク質を主要な構成成分とするフィブロイン層の構造が、非遺伝子組換えカイコの吐糸する絹糸のフィブロイン層と同様の形態であることを示し、光学もしくは電子顕微鏡観察により確認することができる。フィブロインＨ鎖タンパク質の構造が本質的に保持されることも、遺伝子組換えカイコの作る絹糸において、強度や伸度といった物性を低下させない上で重要な現象である。
これらのカイコを非組換えカイコまたは遺伝子組換えカイコどうしで交配させた場合、子孫においてもクモ糸タンパク質を含む絹糸を産生するようにデザインされた遺伝子は消失することなく伝達され、世代を通じてクモ糸タンパク質を含む絹糸を産生させることができる。
従って、組換えカイコを継代し頭数を増やすことで、クモ糸タンパク質を含む絹糸の生産量を容易にスケールアップすることが可能である。交配において、商業用蚕品種のカイコと交配させることで、クモ糸タンパク質を含む絹糸の産生量を向上させることも可能である。この場合、目的のクモ糸タンパク質を含む絹糸を産生するようにデザインされた遺伝子が導入されたカイコを適宜選抜しながら継代していく必要が生じる。この場合、任意の組織から得られた細胞のＤＮＡを用いて、組換えカイコ選抜に使用したマーカー遺伝子やクモ糸タンパク質を含む絹糸を産生するようにデザインされた遺伝子の存在や構造を、ＰＣＲ、サザンブロッティング法などで解析することで、容易に組換えカイコの遺伝子を継承した子孫を判別することが可能である。また、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質遺伝子を利用した場合には、カイコ卵や幼虫に励起光を照射し、蛍光タンパク質の発する蛍光を検出することにより選抜を行うことができる。
カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の卵に含まれる細胞に遺伝子を導入する場合には、マイクロインジェクションする方法が好適である。ここで卵にマイクロインジェクションを行う場合、卵中の細胞に直接マイクロインジェクションする必要はなく、卵中にマイクロインジェクションするだけで遺伝子を導入することが可能である。
本発明における「遺伝子を組換えていない同種カイコにより作られる絹糸と比較して、強度が向上している」とは、クモ糸の持つ所望の性質である高強度性が反映されたことを示す。具体的には絹糸に加重を加え、破断するまでの破断強度が向上したことを示す。
強度の測定には引張り試験機（テンシロン）を用いて測定することができる。破断強度は、破断点までの最大点荷度（ｇ）／繊度（ｄ）として表される。繊度の測定は単位長さにおける重量から算出することができる。遺伝子を組換えたカイコが作る繭から得られた絹糸と、遺伝子を組換えていない同種カイコが作る繭から得られた絹糸との強度を比較することで向上したか否かを判定することができる。好ましくは遺伝子を組換えていない同種カイコにより作られる絹糸と比較して、強度が１％以上向上していることが望ましい。より好ましくは強度が１０％以上向上し、さらに好ましくは２０％以上向上していることが望ましい。
本発明における「遺伝子を組換えていない同種カイコにより作られる絹糸と比較して、伸度が向上している」とはクモ糸の持つ所望の性質である高伸度性が反映されたことを示す。具体的には絹糸に加重を加え、破断するまでの破断伸度が向上したことを示す。伸度の測定には引張り試験機（テンシロン）を用いて測定することができる。遺伝子を組換えたカイコが作る繭から得られた絹糸と、遺伝子を組換えていない同種カイコが作る繭から得られた絹糸との破断伸度を比較することで向上したか否かを判定することができる。好ましくは遺伝子を組換えていない同種カイコにより作られる絹糸と比較して、伸度が１％以上向上していることが望ましい。より好ましくは伸度が１０％以上向上し、さらに好ましくは伸度が３０％以上向上していることが望ましい。
強度×（伸度）１／２として算出されるタフネスを、遺伝子を組換えていない同種カイコにより作られる絹糸と比較した場合、好ましくは遺伝子を組換えていない同種カイコにより作られる絹糸と比較して、タフネスが１％以上向上していることが望ましい。より好ましくはタフネスが１０％以上向上し、さらに好ましくはタフネスが４０％以上向上していることが望ましい。
本発明において「クモ糸タンパク質を含む絹糸を用いた織物」とは、クモ糸タンパク質がたて糸および／または横糸に用いられた織物を表す。クモ糸タンパク質を含む絹糸のみから構成される織物であっても良く、非組換えカイコの絹糸との混紡糸が用いられても良く、絹糸ではない繊維との混紡糸が用いられても良く、加工され表面処理剤として用いられても良く、加工され不織布として用いられても良い。また、編み物であるニットに用いられても良い。織物の作製方法として、特に制限されるものではないが、具体的には平織り、綾織り、朱子織り、からみ織りなどが挙げられる。
絹糸中でのクモ糸タンパク質の存在形態としては、分散と局在が予測される。局在とはフィブロイン層において、組換えタンパク質が一部分に集合して存在していることをしめす。局在している場合、酢酸ウラニルと鉛の二重染色による電子顕微鏡観察において、染色性の異なる領域として観察される。もしくは、絹糸をグルタルアルデヒドで固定、エポキシ樹脂で包埋し作成した切片箔に対し、組換えタンパク質に対する抗体を用いた免疫電子顕微鏡観察を行うことで、組換えタンパク質由来のシグナルが、フィブロイン層中で偏っていることで判定できる。組換えタンパク質が絹糸中に分散している場合、同じく免疫電子顕微鏡観察でフィブロイン層中での組換えタンパク質由来のシグナルが偏ることなく存在していることを示す。
クモ糸タンパク質が絹糸中に分散していることを特徴とする本発明における絹糸は、絹糸を構成するフィブロインタンパク質と、クモ糸タンパク質との複数のタンパク質（ポリマー）からなるアロイである。一般に２種類のポリマーをブレンドしても、両者の性質の違いにより分離し、諸物性が低下する。絹糸において、絹糸を構成するフィブロインタンパク質と、フィブロイン以外の組換えタンパク質を混合して、人工的に繊維化させる場合、両者の結晶性の違いによりフィブロインタンパク質と組換えタンパク質は均一に混合されず、強伸度といった諸物性は低下する。本発明において示した手法により、絹糸を構成するフィブロインタンパク質と、フィブロイン以外の組換えタンパク質を均一に混合させることができ、組換えタンパク質が絹糸中に分散していることを特徴とする組換えタンパク質を含む絹糸を得ることができる。該絹糸はフィブロインのもつ強伸度を低下させることなく、組換えタンパク質の持つ所望の性質を該絹糸に付与することが可能となる。
以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例の記載に限定されるものではない。
【実施例】［実施例１］  カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のゲノムＤＮＡの調製
５齢３日目のカイコを解剖し、後部絹糸腺組織を取り出した。１×ＳＳＣで洗浄した後、ＤＮＡ抽出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０，１００ｍＭ  ＮａＣｌ）２００μｌを加えた。Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（ｆｉｎａｌ  ２００μｇ／ｍｌ）を加えて組織をグラインダーで充分すりつぶし、更にＤＮＡ抽出バッファーを３５０μｌ、１０％ＳＤＳ  ６０μｌを加えて混合した。５０℃２時間保温した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ飽和フェノール（ｐＨ８．０）５００μｌを加え１０分混合後、１０，０００ｒｐｍ５分４℃にて遠心分離し上清を回収した。上清をフェノール／クロロホルム処理し、ゲノムＤＮＡをエタノール沈殿した。ＲＮａｓｅ入り滅菌水で１００μｇ／ｍｌとなるように溶解、希釈しゲノムＤＮＡ溶液を調製した。
［実施例２］  遺伝子の調製
用いた遺伝子は既知の配列を利用して、その両端配列のプライマーを作製し、適当なＤＮＡソースを鋳型としてＰＣＲを行うことにより取得した。プライマーの端には後の遺伝子操作のために制限酵素切断部位を付加した。
フィブロインＨ鎖プロモーター・フィブロインＨ鎖遺伝子第一エキソン・第一イントロン・第二エキソン領域（ＧｅｎｅＢａｎｋ  登録番号  ＡＦ２２６６８８の塩基番号６２１１８〜６３５１３番目：以下ＨＰ領域）は、カイコガのゲノムＤＮＡを鋳型に、プライマー５（配列番号５）とプライマー６（配列番号６）の２種類のプライマーを用いたＰＣＲにより取得した。
フィブロインＨ鎖上流プロモーター・フィブロインＨ鎖遺伝子第一エキソン・第一イントロン領域（ＧｅｎｅＢａｎｋ  登録番号  ＡＦ２２６６８８の塩基番号５７４４４〜６２９２７番目：以下ＨＵＰ領域）は、カイコガのゲノムＤＮＡを鋳型に、プライマー７（配列番号７）とプライマー８（配列番号８）の２種類のプライマーを用いたＰＣＲにより取得した。
フィブロインＨ鎖Ｃ末端領域遺伝子・フィブロインＨ鎖ポリＡシグナル領域（ＧｅｎｅＢａｎｋ  登録番号  ＡＦ２２６６８８の塩基番号７９０９９〜７９９９５番目：以下ＨＣ領域）は、カイコガのゲノムＤＮＡを鋳型に、プライマー９（配列番号９）とプライマー１０（配列番号１０）の２種類のプライマーを用いたＰＣＲにより取得した。
ＰＣＲはＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡（株）製）を用いて添付のプロトコールに従って行った。すなわち、カイコガのゲノムＤＮＡを鋳型とする場合にはこれを１００ｎｇ加え、各プライマーを５０ｐｍｏｌ、添付の１０×ＰＣＲバッファーを１０μｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、２単位ＫＯＤｐｌｕｓとなるように各試薬を加え、全量１００μｌとする。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１５秒、プライマーのアニーリング条件を５５℃，３０秒、伸長条件を６８℃，６０秒〜３００秒の条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３０サイクル反応させた。
これらの反応液を１％アガロースゲルにて電気泳動し、それぞれＨＰ領域では約１．４ｋｂｐ．、ＨＵＰ領域では約５．５ｋｂｐ．、ＨＣ領域では約０．８ｂｐのＤＮＡ断片を常法に従って抽出、調製した。これらのＤＮＡ断片をポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造（株）製）によりリン酸化した後、ＢａｍＨＩで切断後、Ｔ４ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い定法により平滑化し、さらに脱リン酸化処理したｐＵＣ１９ベクターに宝酒造（株）のＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２を用いて１６℃、終夜反応を行い、連結した。これらを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体にＰＣＲ断片が挿入されていることを、得られたコロニーを前述と同じ条件でＰＣＲすることによって確認し、ＰＣＲ断片の挿入されたプラスミドを常法によって調製した。これらのプラスミドをシークエンスすることにより、得られた断片がそれぞれの遺伝子の塩基配列であることを確認した。
クモ糸遺伝子の取得は、ＡＴＣＣから以下の株として入手可能である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＰ３２２７  ６９３２６  １９９３年６月１５日、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＦＰ２１９３  ６９３２７  １９９３年６月１５日、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＦＰ３３５０  ６９３２８  １９９３年６月１５日。
または、Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７４（２０００）１０５−１０９やＡｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４７（１９９７）２３−３９に開示されている手法により、人工合成したオリゴヌクレオチドを元に作成することが可能である。すなわち人工合成したオリゴヌクレオチドの両端に、ＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩの制限酵素認識部位を、同じフレームになるようデザインし、両者を順次連結することで種々のサイズのクモ糸遺伝子を作製することが可能である。本実施例では配列番号１記載のＤＰ−１Ｂ．３３ポリペプチドを４回繰り返したＤＰ４、ＤＰ−１Ｂ．３３を８回繰り返したＤＰ８、ＤＰ−１Ｂ．３３を１２回繰り返したＤＰ１２、ＤＰ−１Ｂ．３３を１６回繰り返したＤＰ１６遺伝子断片を作製した。
同様の手法により、配列番号２に記載のポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを作製し、これを連結することで配列番号２記載のポリペプチドが８回繰り返したタンパク質をコードするプラスミドを構築し、これをＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩで切断し、ＡＥＸ遺伝子断片を作製した。
［実施例３］  遺伝子導入用プラスミドの作製
遺伝子導入用プラスミドにはｐｉｇＡ３ＧＦＰ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８，８１−８４，２０００）を利用した。すなわち、米国特許第６２１８１８５号に開示されるプラスミドｐ３Ｅ１．２よりｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅをコードする領域を取り除き、その部分にＡ３プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号  Ｕ４９８５４の塩基番号１７６４〜２５９５番目）およびｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）由来のＧＦＰおよびＳＶ４０由来ポリＡ付加配列（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号  Ｕ５５７６２の塩基番号６５９〜２５７８番目）を挿入したベクターがｐｉｇＡ３ＧＦＰであり、このベクターは独立行政法人農業生物資源研究所から分与可能である。そのＡ３プロモーターの上流側にあるＸｈｏＩ部位を平滑化しクモ糸タンパク質を含む絹糸を産生するようにデザインされた遺伝子を挿入した。
本実施例における、クモ糸タンパク質を含む絹糸を産生するようにデザインされた遺伝子の構成は、ＨＰ・ＤＰ１６，１２，８，４・ＨＣおよびＨＰ・ＡＥＸ・ＨＣ、さらにはＨＵＰ・ＤＰ８，４・ＨＣである。
以下に具体的な方法を示す。
図１には、ＨＰ・ＤＰ１６，１２，８，４・ＨＣおよびＨＰ・ＡＥＸ・ＨＣの作製ストラテジーを示した。実施例２にて調製したＨＰ領域を持つプラスミドとＨＣ領域を持つプラスミドをＢａｍＨＩとＳａｌＩで処理し、それぞれ約１．４ｋｂｐ断片と３．６ｋｂｐ断片を連結した。これをＢａｍＨＩで処理後、脱リン酸化したプラスミドと、実施例２で取得した両端がＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩ付着末端を持つＤＰ１６断片、ＤＰ１２断片、ＤＰ８断片、ＤＰ４断片およびＡＥＸ断片を連結した。連結部の塩基配列を確認し、連結部が同一フレームでの読み枠であること、順向きであることを確認した。各プラスミドをＡｓｃＩで処理し、クモ糸タンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を、ＸｈｏＩ処理後平滑化したｐｉｇＡ３ＧＦＰプラスミドに連結し、各種遺伝子構造ＨＰ・ＤＰ１６・ＨＣ、ＨＰ・ＤＰ１２・ＨＣ、ＨＰ・ＤＰ８・ＨＣ、ＨＰ・ＤＰ４・ＨＣ、ＨＰ・ＡＥＸ・ＨＣをもった各種遺伝子導入ベクターを作製した。
図２にはＨＵＰ・ＤＰ８，４・ＨＣの作製ストラテジーを示した。実施例２にて調製したＨＵＰ領域を持つプラスミドをＳｐｈＩとＸｈｏＩで処理し、約５．５ｋｂｐ断片を得た。これを、図２に示したように、ＨＰ・ＤＰ８・ＨＣ、ＨＰ・ＤＰ４・ＨＣ作製の過程で得られたプラスミドをＳｐＨＩとＸｈｏＩで処理し得られた断片と連結した。連結部の塩基配列を確認し、塩基の欠失、挿入が起きていないことを確認した。各プラスミドをＡｓｃＩで処理し、クモ糸タンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を、ＸｈｏＩ処理後平滑化したｐｉｇＡ３ＧＦＰプラスミドに連結し、各種遺伝子構造ＨＵＰ・ＤＰ８・ＨＣ、ＨＵＰ・ＤＰ４・ＨＣを持った各種遺伝子導入ベクターを作製した。
［実施例４］  遺伝子組換えカイコの作製
実施例３に記載の遺伝子導入用ベクターとピギーバックトランスポゼースタンパク質を生産するヘルパープラスミドＤＮＡ（ｐＨＡ３ＰＩＧ）（Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８，８１−８４，２０００  農業生物資源研究所より分与可能）を、各２００μｇ／ｍｌ含んだ０．５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）・５ｍＭＫＣｌ溶液に調製し、３〜２０ｎｌを産卵後４時間以内のカイコ卵５００個に対してマイクロインジェクションした。ｐＨＡ３ＰＩＧは、ピギーバックトランスポゾンの一方の逆位反復配列と５’フランキング領域、トランスポゼース遺伝子のリーダー配列を欠いており、その代わりにカイコアクチン遺伝子の５’フランキング領域とリーダー配列が組み込まれている。ｐＨＡ３ＰＩＧはアクチンプロモーターの働きによりピギーバックトランスポゼースタンパク質を作る機能を持つが、ピギーバックトランスポゾンの一方の逆位反復配列が欠損しているため自身のＤＮＡは転移しない。そのカイコ卵より孵化した幼虫を飼育し、得られた成虫（Ｇ０）を群内で掛け合わせ得られた次世代（Ｇ１）をクラゲ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の蛍光を観察することにより、クラゲ緑色蛍光タンパク質遺伝子が染色体へ導入されたカイコをスクリーニングした。その結果、クラゲ緑色蛍光タンパク質の働きにより蛍光を発する遺伝子組換えカイコが得られた。遺伝子組換体の選抜は、内部交配により得られたＧ１幼虫でのＧＦＰの蛍光を指標にスクリーニングした。後部絹糸腺組織におけるアクチンプロモーター制御化での遺伝子発現はきわめて低く、また、絹糸腺組織から絹糸中に分泌される上で重要なフィブロインＬ鎖タンパク質との結合を形成することはない。つまり、本発明においては、クモ糸タンパク質を含む絹糸には、ＧＦＰは含まれず、本発明において、遺伝子組換えカイコの選抜には、繭および絹糸でのＧＦＰによる蛍光を指標として用いない。遺伝子組換えカイコの作製結果を表１に示す。
【表１】
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［実施例５］  サザンハイブリダイゼーションによるクモ糸タンパク質遺伝子導入の確認
ＨＰ・ＤＰ８・ＨＣ、ＨＰ・ＤＰ４・ＨＣ遺伝子を導入したＧ１カイコのうち、ＧＦＰの蛍光を示すカイコをランダムに選抜し、実施例１に記載の方法でゲノムＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩで制限酵素処理を行い、電気泳動後メンブレンにブロットした。プローブはアマシャムファルマシア社製  Ｇｅｎｅ−ＩｍａｇｅＴＭ  Ｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｍｏｄｕｌｅをもちいて、ＤＰ８／ＢｇｌＩＩ，ＢａｍＨＩ断片をラベリングし用いた。添付のプロトコルに従いクモ糸タンパク質をコードする遺伝子の検出を行った。その結果を図３に示す。調べた全てのＧＦＰ蛍光を示すカイコにおいて、クモ糸タンパク質をコードする遺伝子が検出された（矢印で示す）。また、シグナルのサイズが異なることから、染色体上にランダムに挿入されたと考えられる。
［実施例６］  遺伝子組換えカイコの作製する繭の解析
次に絹糸に含まれるクモ糸タンパク質の検出、含量の測定を行った。
遺伝子を組換えていないカイコ（ＷＴ）および遺伝子組換えカイコ（ＨＰ・ＤＰ１６・ＨＣ、ＨＰ・ＤＰ１２・ＨＣ、ＨＰ・ＤＰ８・ＨＣ、ＨＰ・ＤＰ４・ＨＣ、ＨＰ・ＡＥＸ・ＨＣ、ＨＵＰ・ＤＰ８・ＨＣ、ＨＵＰ・ＤＰ４・ＨＣ遺伝子を導入したカイコ）の繭を各１０ｍｇ量り採り、６０％ＬｉＳＣＮ４ｍｌを加え攪拌後、終夜室温に静置し繭を溶解した。これを８Ｍ尿素・２％ＳＤＳ・５％２−メルカプトエタノールで１０培希釈したものをサンプルとし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した後、銀染色キット（第一化学薬品株式会社製）を用い、添付のプロトコールに従ってクモ糸タンパク質の検出を行った。その結果をモレキュラーイメージャー（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてシグナル強度を測定し、濃度既知のタンパク質としてはネコインターフェロンを用いてそのシグナル強度と比較しタンパク質含量を測定した。シグナルの比較には、ＢｉｏＲａｄ社製モレキュラーイメージャーＦＸＰｒｏを用いた。
さらに、ＥＣＬ  ＰｌｕｓＴＭＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社製）を用い、添付のプロトコールに従ってクモ糸タンパク質の検出を行った。ＤＰの検出には配列番号１１に示したＣＧＡＧＱＧＧＹＧＧＬＧＳＱＡＧＲＧペプチドに対する十分な抗体価を有する特異的なペプチド抗体を、ＡＥＸの検出には配列番号１２に示したＣＧＰＧＱＱＧＰＧＧＹＧＰＧＱＱＧＰＳペプチドに対する十分な抗体価を有する特異的なペプチド抗体を、共にラビットを用いて作製し、これらの抗体を用いて添付のプロトコルに従って検出した。すなわち、ブロッティングしたメンブレンをブロッキング溶液（５％スキムミルク・０．１％Ｔｗｅｅｎ２０・ＰＢＳ）中で４℃終夜ブロッキングした。メンブレンをＴＰＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０・ＰＢＳ）で２回洗浄し、ＴＰＢＳで１０００倍希釈した抗クモ糸タンパク質抗体で室温１時間処理した。メンブレンをＴＰＢＳで２回洗浄し、更にＴＰＢＳで５分間３回洗浄した。その後ＴＰＢＳで１００００倍希釈した後、ＨＲＰラベル抗ラビットＩｇＧ抗体で室温１時間処理した。メンブレンをＴＰＢＳで２回洗浄し、更にＴＰＢＳで５分間３回洗浄した後、ＥＣＬ  ＰｌｕｓＴＭ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシア社製）の検出試薬（溶液Ａ＋溶液Ｂ）を加えた。発光をＨｙｐｅｒｆｉｌｍＴＭＥＣＬＴＭに露光、現像した。ＨＰ・ＤＰ１６・ＨＣ、ＨＰ・ＤＰ８・ＨＣ、ＨＰ・ＤＰ４・ＨＣ、ＨＰ・ＡＥＸ・ＨＣ、ＨＵＰ・ＤＰ８・ＨＣ、ＨＵＰ・ＤＰ４・ＨＣ遺伝子構造を導入したカイコの作る繭を分析した結果を図４に示す。クモ糸タンパク質の分子量は、遺伝子構造から予測される分子量と一致していた。また、クモ糸タンパク質の占める割合は、重量比で約０．１％〜１５％であった。さらに、フィブロインＬ鎖タンパク質の分子量相当のサイズが増加した、フィブロインＬ鎖タンパク質とジスルフィド結合した状態のシグナル（星印で示す）が検出された。ＨＵＰ遺伝子構造を持つもの（ＨＵＰ・ＤＰ８・ＨＣ、ＨＵＰ・ＤＰ４・ＨＣ）は、ＨＰ遺伝子構造を持つもの（ＨＰ・ＤＰ８・ＨＣ、ＨＰ・ＤＰ４・ＨＣ）と比較して、クモ糸タンパク質の含量が増大していた。絹糸にＧＦＰが含まれているかを、ＧＦＰに対する抗体（コスモバイオ社製）をもちいたウエスタン解析により判定したが、ＧＦＰは検出されなかった。
ＨＰ・ＤＰ１６・ＨＣ、ＨＰ・ＤＰ１２・ＨＣ、ＨＰ・ＤＰ８・ＨＣ、ＨＰ・ＤＰ４・ＨＣ、ＨＰ・ＡＥＸ・ＨＣ、ＨＵＰ・ＤＰ８・ＨＣ、ＨＵＰ・ＤＰ４・ＨＣ遺伝子構造を導入したカイコの作る繭（繭糸＋蛹）の平均重量を雄１０粒雌１０粒用い測定、比較した。さらに、クモ糸タンパク質の含量（重量％）を測定した。これらの結果を表２に示す。ＨＰ・ＡＥＸ・ＨＣを除き、繭重量に大きな変化は見られなかった。これはＤＰクモ糸タンパク質がカイコフィブロインの繊維化を阻害しなかったことを示す。これは、遺伝子の導入を、相同組換えではなくトランスポゾンにより行うことで、カイコフィブロインＨ鎖遺伝子に変異が起きなかった結果であると考えられる。
【表２】
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［実施例７］  絹糸の調製
コントロールとして非遺伝子組換えカイコの作る繭、サンプルとしてＨＰ・ＤＰ８・ＨＣ遺伝子構造を導入したカイコの作る繭を、重量が４０％になるまで８０℃にて乾燥させた。３％Ｎａ２ＣＯ３溶液中で９５℃２分、次いで６０℃３分、次いで９５℃３分煮繭した。４０℃の温水で洗浄した後、座繰り操糸器（斉藤機料）を用い、常時４０粒の繭から操糸した。非組換えカイコの絹糸は約１１００ｍ、組換えカイコ（ＨＰ・ＤＰ８・ＨＣ）の絹糸は約１２００ｍ得られた。
得られた絹糸を、０．１％Ｎａ２ＣＯ３溶液中で６０℃に加温し、次いで１％マルセル石鹸水溶液中で１時間煮沸し、０．１％Ｎａ２ＣＯ３溶液で洗浄後、水洗して絹糸の精練を行った。６０℃にて乾燥し、精練された非組換え絹糸と精練されたＨＰ・ＤＰ８・ＨＣ絹糸を得た。精練前の絹糸と、精練後の絹糸の走査電子顕微鏡写真を図５（１５００倍）に示した。表面のセリシン除去が認められる。また、精練前後の重量を比較した結果、非組換え絹糸とＨＰ・ＤＰ８・ＨＣ絹糸共に、減練率が１６％であり、セリシンは除去されたと考えられる。
［実施例８］  絹糸の物性の測定
物性の測定に、クモ糸タンパク質を含む絹糸として、実施例７に記載の手法により調製したＨＰ・ＤＰ８・ＨＣ遺伝子構造を導入したカイコの作る絹糸（ＨＰ・ＤＰ８・ＨＣ）と、非組換えカイコの絹糸を用い、それぞれの精練前、および精練後において、物性を測定した。ここで、絹糸中に含まれるクモ糸タンパク質の含量は、ＨＰ・ＤＰ８・ＨＣでは５％、非組換え絹糸では０％である。
繊度の測定は９０ｍあたりの重量をもとに算出した。機械物性の測定は引張試験機（テンシロン）をもちい、つかみ間隔２０ｃｍ、引っ張り速度２０ｃｍ／分、各１０検体の平均から算出した。物性の比較を表３に示す。
【表３】
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全ての試験項目において、ＨＰ・ＤＰ８・ＨＣ絹糸は非組換え絹糸と比較して物性が向上していた。特に精練のための加温処理を経ても、強度は３０％以上、伸度は４０％以上、タフネスは６０％以上向上していた。これは精練後も残るフィブロイン層に含まれるクモ糸タンパク質の効果によると考えられる。
［実施例９］  クモ糸タンパク質を含む絹糸を用いた織物の作製
ＨＰ・ＤＰ８・ＨＣ絹糸を用いて布を調製した。ＨＰ・ＤＰ８・ＨＣ絹糸２本を２００Ｔ／ｍでかたよりにし、綾織りにて織物を作製した。
［実施例１０］  免疫電子顕微鏡観察
ＨＰ・ＤＰ８・ＨＣ遺伝子を導入した遺伝子組換えカイコと、非組換えカイコのつくる繭をサンプルとし、オリゴペプチドＣＧＡＧＱＧＧＹＧＧＬＧＳＱＡＧＲＧに対する十分な抗体価を有する特異的なペプチド抗体（ＤＰ抗体）を用いて、免疫電子顕微鏡観察を行った。サンプルを２％グルタルアルデヒド−０．１％カコジル酸緩衝液を用いて室温にて１時間固定し、次にエポキシ樹脂ＥＰＯＮ８１２を用いて６０℃４８時間重合させ包埋した。ウルトラミクロトームにより超箔切片を調製した。１％ＢＳＡ／ＰＢＳ＋１．５％ヤギ血清を用い、室温にて３０分ブロッキングした。一次抗体として５０００倍希釈したＤＰ抗体を用いて４℃一晩抗体処理した。１％ＢＳＡ／ＰＢＳにて室温１０分３回洗浄した。２次抗体としてａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  Ｇｏａｔ−Ｐｏｌｙ  １０ｎｍ（Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｂｉｏｃｅｌｌ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＬＴＤ製）を用いて室温にて１時間処理した。１％ＢＳＡ／ＰＢＳにて室温１０分３回洗浄した。酢酸ウラニルと鉛の二重染色を室温で各５分行い、電子顕微鏡観察を行った。非組換えカイコのつくる絹糸の縦断面切片を用いた結果を図６に示す。絹糸中のフィブロイン層およびセリシン層に、クモ糸タンパク質の存在は確認できない。そして、ＨＰ・ＤＰ８・ＨＣ遺伝子を導入した遺伝子組換えカイコのつくる絹糸の縦断面切片を用いた結果を図７に示す。ＨＰ・ＤＰ８・ＨＣ遺伝子を導入した遺伝子組換えカイコのつくる絹糸の縦断面切片を用いた場合において、絹糸中のフィブロイン層に、黒色のドットとしてクモ糸タンパク質が分散して存在していることが確認される。一部に偏って存在している様子は観察されない。
【産業上の利用可能性】本件発明によって作られるクモ糸と絹糸のハイブリッドシルクは、高強度、高伸度といったクモ糸タンパク質の性質を保持しているため、航空、宇宙開発、被服製造、牽引ロープ、医療用糸などとして種々の産業において利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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