(57)【要約】  アミロイドβペプチド（以下、Ａβという）に結合し、Ａβ分子の凝集を阻害するヒト抗Ａβ抗体および該抗体フラグメントを提供する。本発明の抗体および抗体フラグメントは、ヒト抗Ａβ抗体の可変領域を有し、Ａβと強く反応して、その凝集の阻害作用を示す。本発明の抗体および抗体フラグメントは、Ａβの検出試薬、アルツハイマー痴呆症の予防・治療薬、または診断薬として使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミロイドβペプチド（Ａβ）に結合性を有するヒト抗Ａβ抗体。
【請求項２】
Ｈ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）が以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、Ｌ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）が以下の（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のヒト抗Ａβ抗体：
（ａ）ＣＤＲ１として配列番号２、１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２または９２のいずれか一つ、ＣＤＲ２として配列番号３、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３または９３のいずれか一つ、およびＣＤＲ３として配列番号４、１４、２４、３４、４４、５４、６４、７４、８４または９４のいずれか一つによりそれぞれ示されるアミノ酸配列； 
（ｂ）ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列として、それぞれ、配列番号２〜４、１２〜１４、２２〜２４、３２〜３４、４２〜４４、５２〜５４、６２〜６４、７２〜７４、８２〜８４、または９２〜９４、またはこれらアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、Ａβに対するＨ鎖の相補性決定領域となりうるもの；
（ｃ）ＣＤＲ１として配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７または１０２のいずれか一つ、ＣＤＲ２として配列番号８、１８、２８、３８、４８、５８、６８、７８、８８、９８または１０３のいずれか一つ、およびＣＤＲ３として配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９または１０４のいずれか一つによりそれぞれ示されるアミノ酸配列； 
（ｄ）ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列として、それぞれ、配列番号７〜９、１７〜１９、２７〜２９、３７〜３９、４７〜４９、５７〜５９、６７〜６９、７７〜７９、８７〜８９、９７〜９９、または１０２〜１０４、またはこれらアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、Ａβに対するＬ鎖の相補性決定領域となりうるもの。
【請求項３】
Ｈ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、配列番号２〜４、１２〜１４、２２〜２４、３２〜３４、４２〜４４、５２〜５４、６２〜６４、７２〜７４、８２〜８４、または９２〜９４の組み合わせから選択されるアミノ酸配列であり、Ｌ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、配列番号７〜９、１７〜１９、２７〜２９、３７〜３９、４７〜４９、５７〜５９、６７〜６９、７７〜７９、８７〜８９、９７〜９９、または１０２〜１０４の組み合わせから選択されるアミノ酸配列である、請求項２に記載のヒト抗Ａβ抗体。
【請求項４】
Ｈ鎖のＣＤＲ１〜３とＬ鎖のＣＤＲ１〜３との組み合わせのアミノ酸配列が、配列番号２〜４と配列番号７〜９、配列番号１２〜１４と配列番号１７〜１９、配列番号２２〜２４と配列番号２７〜２９、配列番号３２〜３４と配列番号３７〜３９、配列番号４２〜４４と配列番号４７〜４９、配列番号５２〜５４と配列番号５７〜５９、配列番号６２〜６４と配列番号６７〜６９、配列番号７２〜７４と配列番号７７〜７９、配列番号８２〜８４と配列番号８７〜８９、または配列番号９２〜９４と配列番号９７〜９９とのいずれか一つの組み合わせである、請求項３に記載のヒト抗Ａβ抗体。
【請求項５】
Ｈ鎖可変領域が以下の（ｅ）または（ｆ）のアミノ酸配列を有し、Ｌ鎖可変領域が以下の（ｇ）または（ｈ）のアミノ酸配列を有する、請求項１から４のいずれかに記載のヒト抗Ａβ抗体：
（ｅ）配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１または９１のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１または９１に示されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、Ａβに対するＨ鎖可変領域となりうるもの；
（ｇ）配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７７、８６、９６または１０１のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７７、８６、９６または１０１に示されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、Ａβに対するＬ鎖可変領域となりうるもの。
【請求項６】
Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域との組み合わせのアミノ酸配列が、配列番号１と配列番号６、配列番号１１と配列番号１６、配列番号２１と配列番号２６、配列番号３１と配列番号３６、配列番号４１と配列番号４６、配列番号５１と配列番号５６、配列番号６１と配列番号６６、配列番号７１と配列番号７６、配列番号８１と配列番号８６、または配列番号９１と配列番号９６との組み合わせにより示されるアミノ酸配列である、請求項１から５のいずれかに記載のヒト抗Ａβ抗体。
【請求項７】
当該Ａβが繊維化したＡβである請求項１から６のいずれかに記載のヒト抗Ａβ抗体。
【請求項８】
アミロイドβペプチド（Ａβ）に結合性を有するヒト抗Ａβ抗体のＨ鎖可変領域フラグメント。
【請求項９】
相補性決定領域（ＣＤＲ）が以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有する、請求項８に記載のヒト抗Ａβ抗体のＨ鎖可変領域フラグメント：
（ａ）ＣＤＲ１として配列番号２、１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２または９２のいずれか一つ、ＣＤＲ２として配列番号３、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３または９３のいずれか一つ、およびＣＤＲ３として配列番号４、１４、２４、３４、４４、５４、６４、７４、８４または９４のいずれか一つによりそれぞれ示されるアミノ酸配列； 
（ｂ）ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列として、それぞれ、配列番号２〜４、１２〜１４、２２〜２４、３２〜３４、４２〜４４、５２〜５４、６２〜６４、７２〜７４、８２〜８４、または９２〜９４、またはこれらアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、Ａβに対するＨ鎖の相補性決定領域となりうるもの。
【請求項１０】
ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、配列番号２〜４、１２〜１４、２２〜２４、３２〜３４、４２〜４４、５２〜５４、６２〜６４、７２〜７４、８２〜８４、または９２〜９４の組み合わせから選択されるアミノ酸配列である、請求項９に記載のヒト抗Ａβ抗体のＨ鎖可変領域フラグメント。
【請求項１１】
以下の（ｅ）または（ｆ）のアミノ酸配列を有する、請求項８から１０のいずれかに記載のヒト抗Ａβ抗体のＨ鎖可変領域フラグメント：
（ｅ）配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１または９１のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１または９１に示されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、Ａβに対するＨ鎖可変領域となりうるもの。
【請求項１２】
当該Ａβが繊維化したＡβである請求項８から１１のいずれかに記載のヒト抗Ａβ抗体のＨ鎖可変領域フラグメント。
【請求項１３】
アミロイドβペプチド（Ａβ）に結合性を有するヒト抗Ａβ抗体のＬ鎖可変領域フラグメント。
【請求項１４】
相補性決定領域（ＣＤＲ）が以下の（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載のヒト抗Ａβ抗体のＬ鎖可変領域フラグメント：
（ｃ）ＣＤＲ１として配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７または１０２のいずれか一つ、ＣＤＲ２として配列番号８、１８、２８、３８、４８、５８、６８、７８、８８、９８または１０３のいずれか一つ、およびＣＤＲ３として配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９または１０４のいずれか一つによりそれぞれ示されるアミノ酸配列； 
（ｄ）ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列として、それぞれ、配列番号７〜９、１７〜１９、２７〜２９、３７〜３９、４７〜４９、５７〜５９、６７〜６９、７７〜７９、８７〜８９、９７〜９９、または１０２〜１０４、またはこれらアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、Ａβに対するＬ鎖の相補性決定領域となりうるもの。
【請求項１５】
ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、配列番号７〜９、１７〜１９、２７〜２９、３７〜３９、４７〜４９、５７〜５９、６７〜６９、７７〜７９、８７〜８９、９７〜９９、または１０２〜１０４の組み合わせから選択されるアミノ酸配列である、請求項１４に記載のヒト抗Ａβ抗体のＬ鎖可変領域フラグメント。
【請求項１６】
以下の（ｇ）または（ｈ）のアミノ酸配列を有する、請求項８から１０のいずれかに記載のヒト抗Ａβ抗体のＬ鎖可変領域フラグメント：
（ｇ）配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７７、８６、９６または１０１のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７７、８６、９６または１０１に示されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、Ａβに対するＬ鎖可変領域となりうるもの。
【請求項１７】
当該Ａβが繊維化したＡβである請求項１３から１６のいずれかに記載のヒト抗Ａβ抗体のＬ鎖可変領域フラグメント。
【請求項１８】
請求項８から１２のいずれかに記載のヒト抗Ａβ抗体のＨ鎖可変領域フラグメントと、請求項１３から１７のいずれかに記載のヒト抗Ａβ抗体のＬ鎖可変領域フラグメントとを連結してなる、Ａβに対するヒト由来の抗体の一本鎖可変領域フラグメント。
【請求項１９】
請求項８から１２のいずれかに記載のヒト抗Ａβ抗体のＨ鎖可変領域フラグメント、および／または請求項１３から１７のいずれかに記載のヒト抗Ａβ抗体のＬ鎖可変領域フラグメントに、ヒト由来の抗体定常領域を連結してなる、Ａβに対するヒト由来の抗体またはその抗体フラグメント。
【請求項２０】
当該抗体フラグメントが、Ｆab、Ｆab'、Ｆ(ab')2、scAb、またはscFv-Fcである請求項１９に記載の抗体フラグメント。
【請求項２１】
配列番号１０１のアミノ酸配列を有するヒト抗Ａβ抗体のＬ鎖可変領域フラグメントとヒト由来の抗体定常領域を連結してなるＡβに対するヒト由来の抗体またはそのフラグメント。
【請求項２２】
請求項１から２１のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントとペプチド或いは他のタンパク質とを融合させた融合抗体またはそのフラグメント。
【請求項２３】
請求項１から２２のいずれかに記載の抗体もしくは融合抗体またはそのフラグメントに修飾剤が結合されてなる修飾抗体またはそのフラグメント。
【請求項２４】
請求項１から２２のいずれかに記載の抗体もしくは融合抗体またはそのフラグメントをコードする遺伝子。
【請求項２５】
請求項２４に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
【請求項２６】
請求項２４に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項２７】
請求項２４に記載の遺伝子を宿主に発現させることによって、ヒト抗Ａβ抗体またはその断片を生産する方法。
【請求項２８】
請求項２４に記載の遺伝子を含む遺伝子治療剤。
【請求項２９】
請求項１から２１のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または請求項２２に記載の融合抗体またはそのフラグメント、または請求項２３に記載の修飾抗体またはそのフラグメントを用いたＡβの検出試薬。
【請求項３０】
請求項１から２１のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または請求項２２に記載の融合抗体またはそのフラグメント、または請求項２３に記載の修飾抗体またはそのフラグメントを用いたアルツハイマー痴呆症の診断薬。
【請求項３１】
請求項１から２１のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または請求項２２に記載の融合抗体またはそのフラグメント、または請求項２３に記載の修飾抗体またはそのフラグメントを用いたＡβ凝集阻害剤。
【請求項３２】
請求項１から２１のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または請求項２２に記載の融合抗体またはそのフラグメント、または請求項２３に記載の修飾抗体またはそのフラグメントを用いたアルツハイマー痴呆症の予防、治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミロイドβペプチド（以下、Ａβという）に結合し、Ａβ分子の凝集を阻害するヒト抗Ａβ抗体および該抗体フラグメントに関する。当該抗体および抗体フラグメントは、Ａβ分子の凝集体の生成とその細胞毒性が一因と考えられるアルツハイマー痴呆症の診断および治療薬として期待される。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー痴呆症の発症機構の全貌は未だ不明であるが、Ａβ分子の凝集体によるニューロン細胞への毒性が重要な役割を果たしていると考えられている。Ａβ分子凝集体の生成の問題は、Ａβ分子のコンホメーションの問題でもある。【０００３】
Ａβ分子はニューロンアミロイド前駆体タンパクからβセクレターゼなどによる切断で生じる分解物で、Ａβ1-40とＡβ1-42（以下、Ａβ42という）の２種が生成するが、Ａβ42の方がより凝集性を有し、疾患および神経毒性と相関していることが報告されている。また脳内のＡβプラークにはミクログリアやアストロサイトが局在化し、このことが神経毒性とも相関していることが示唆されている。【０００４】
Ａβの蓄積は、見方を変えれば、個体の加齢プロセスとも考えられ、クリアランスのバランスが崩れて、その敷居値を越えた蓄積が発病に繋がるとの仮説が提唱されている。これらの仮説に基づきＡβの産生そのものを抑制する目的で前駆体タンパクの切断に関与するβセクレターゼの低分子阻害剤などの開発が試みられている。しかし、Ａβの生成メカニズムは単純ではなく、必ずしも十分な成績が得られているわけではない。【０００５】
一方、B. Solomonら（非特許文献１）のin vitroにおける抗Ａβ抗体（Ｎ末端側の抗体）によるＡβの凝集抑制効果の報告や、Schenkらによる凝集前のＡβ42をマウスにアジュバントと共に投与することにより、脳アミロイド沈着の減少を見いだした報告は新たな免疫療法への道を開いた（非特許文献２）。実際、Ａβを用いたアルツハイマー痴呆症のワクチン治療法が試みられ、脳アミロイド沈着の減少など一定の発症阻止活性が明らかにされた(非特許文献３および非特許文献４)。しかし、ワクチン療法では、効果が認められる一方、Ｔ細胞の活性化による炎症反応の誘導による深刻な副作用が出現し、未だ安全で有効な予防治療方法として確立できていない。【０００６】
Ａβワクチン療法の効果は、局所で活性化したミクログリア細胞がＦｃ受容体を介して、抗体沈着したＡβ抗原複合体を取り込み、分解する作用と、可溶性のＡβと結合して、局所での沈着を防ぐ効果が推定されている。【０００７】
一方、McLaurinらはＡβ分子の末端Ａβ4-10に対する抗体の受動免疫が、発症を阻止もしくは遅延を誘導する成果をマウスの実験で明らかにしている（非特許文献５）。抗体を移入する受動免疫の場合、Ｔ細胞の活性化による炎症反応の誘導の可能性は少ないが、血清中に存在する抗Ａβ抗体の0.1％以下しか脳血管関門を通過しないとされており、多量、頻回の投与が必要になると考えられている。【０００８】
【非特許文献１】Solomon, B.ら、(1996) Pro. Natl. Acad. Sci., 93, 452-455
【非特許文献２】Schenk, D.ら、(1999) Nature, 400, 173
【非特許文献３】Nicoll, J. A.ら、(2003) Nature Medicine, 9, 448
【非特許文献４】Monsonego, A.ら、(2003) Science, 302, 834-838
【非特許文献５】McLaurinら、(2002) Nature Medicine, 8, 1263-1269
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
副作用の危険性が少なく、多量、頻回の投与に対応するためには、抗体自体の免疫原性が低いことが重要となる。また更に、血液脳関門の通過には低分子化抗体が有利であることが報告されており、Ａβ分子に特異的でかつ低分子化可能な完全ヒト抗体が開発できれば、アルツハイマー痴呆症の治療薬として極めて有効であると考えられる。【００１０】
さらに、Ａβ分子凝集体の生成の問題は、Ａβ分子のコンホメーションの問題でもある。従って、構造変換を抑制する或いは制御するような分子、即ちＡβ特異的なシャペロン様分子が共存すれば、十分にＡβ分子凝集体生成を制御できる可能性が考えられる。シャペロン様活性を持つ抗体が報告されており、抗Ａβ抗体にこのような活性を併せ持つことも十分に期待できる。【００１１】
さらにアルツハイマー痴呆症の診断では異常Ａβ分子の生成や蓄積を早期に検出するアミロイドイメージング法が注目され、プローブ技術の開発が必須であるが、異常Ａβ分子を高感度でかつ特異的に検出する脳内の画像化技術が開発されていない。脳血管関門を通過でき脳内の異常Ａβ分子の沈着をきわめて早期に発見することができれば、すぐれた診断法となる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明では以上の知見にもとづき、ヒト抗体ファージディスプレイライブラリーを用いることにより、Ａβ42に特異的に結合するヒト抗体の単離を行い、Ａβ42に特異的に結合するヒト一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）を６種類、また更に通常のｓｃＦｖと異なり抗体の軽（Ｌ）鎖可変領域（ＶＬ鎖またはＶＬ）のみでＡβへの結合特異性を有するＶＬ鎖の単離に成功した。さらに、これらのｓｃＦｖおよびＶＬ鎖が、Ａβの凝集を阻害することを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１３】
すなわち、本発明は、医学上または産業上有用な方法・物質として下記１）〜３２）の発明を含むものである。【００１４】
１）アミロイドβペプチド（Ａβ）に結合性を有するヒト抗Ａβ抗体。【００１５】
２）Ｈ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）が以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、Ｌ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）が以下の（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列を有する、上記１）に記載のヒト抗Ａβ抗体：
（ａ）ＣＤＲ１として配列番号２、１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２または９２のいずれか一つ、ＣＤＲ２として配列番号３、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３または９３のいずれか一つ、およびＣＤＲ３として配列番号４、１４、２４、３４、４４、５４、６４、７４、８４または９４のいずれか一つによりそれぞれ示されるアミノ酸配列； 
（ｂ）ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列として、それぞれ、配列番号２〜４、１２〜１４、２２〜２４、３２〜３４、４２〜４４、５２〜５４、６２〜６４、７２〜７４、８２〜８４、または９２〜９４、またはこれらアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、Ａβに対するＨ鎖の相補性決定領域となりうるもの；
（ｃ）ＣＤＲ１として配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７または１０２のいずれか一つ、ＣＤＲ２として配列番号８、１８、２８、３８、４８、５８、６８、７８、８８、９８または１０３のいずれか一つ、およびＣＤＲ３として配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９または１０４のいずれか一つによりそれぞれ示されるアミノ酸配列； 
（ｄ）ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列として、それぞれ、配列番号７〜９、１７〜１９、２７〜２９、３７〜３９、４７〜４９、５７〜５９、６７〜６９、７７〜７９、８７〜８９、９７〜９９、または１０２〜１０４、またはこれらアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、Ａβに対するＬ鎖の相補性決定領域となりうるもの。【００１６】
３）Ｈ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、配列番号２〜４、１２〜１４、２２〜２４、３２〜３４、４２〜４４、５２〜５４、６２〜６４、７２〜７４、８２〜８４、または９２〜９４の組み合わせから選択されるアミノ酸配列であり、Ｌ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、配列番号７〜９、１７〜１９、２７〜２９、３７〜３９、４７〜４９、５７〜５９、６７〜６９、７７〜７９、８７〜８９、９７〜９９、または１０２〜１０４の組み合わせから選択されるアミノ酸配列である、上記２）に記載のヒト抗Ａβ抗体。【００１７】
４）Ｈ鎖のＣＤＲ１〜３とＬ鎖のＣＤＲ１〜３との組み合わせのアミノ酸配列が、配列番号２〜４と配列番号７〜９、配列番号１２〜１４と配列番号１７〜１９、配列番号２２〜２４と配列番号２７〜２９、配列番号３２〜３４と配列番号３７〜３９、配列番号４２〜４４と配列番号４７〜４９、配列番号５２〜５４と配列番号５７〜５９、配列番号６２〜６４と配列番号６７〜６９、配列番号７２〜７４と配列番号７７〜７９、配列番号８２〜８４と配列番号８７〜８９、または配列番号９２〜９４と配列番号９７〜９９とのいずれか一つの組み合わせである、上記３）に記載のヒト抗Ａβ抗体。【００１８】
５）Ｈ鎖可変領域が以下の（ｅ）または（ｆ）のアミノ酸配列を有し、Ｌ鎖可変領域が以下の（ｇ）または（ｈ）のアミノ酸配列を有する、上記１）から４）のいずれかに記載のヒト抗Ａβ抗体：
（ｅ）配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１または９１のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１または９１に示されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、Ａβに対するＨ鎖可変領域となりうるもの；
（ｇ）配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７７、８６、９６または１０１のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７７、８６、９６または１０１に示されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、Ａβに対するＬ鎖可変領域となりうるもの。【００１９】
６）Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域との組み合わせのアミノ酸配列が、配列番号１と配列番号６、配列番号１１と配列番号１６、配列番号２１と配列番号２６、配列番号３１と配列番号３６、配列番号４１と配列番号４６、配列番号５１と配列番号５６、配列番号６１と配列番号６６、配列番号７１と配列番号７６、配列番号８１と配列番号８６、または配列番号９１と配列番号９６との組み合わせにより示されるアミノ酸配列である、上記１）から５）のいずれかに記載のヒト抗Ａβ抗体。【００２０】
７）当該Ａβが繊維化したＡβである上記１）から６）のいずれかに記載のヒト抗Ａβ抗体。【００２１】
８）アミロイドβペプチド（Ａβ）に結合性を有するヒト抗Ａβ抗体のＨ鎖可変領域フラグメント。【００２２】
９）相補性決定領域（ＣＤＲ）が以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有する、上記８）に記載のヒト抗Ａβ抗体のＨ鎖可変領域フラグメント：
（ａ）ＣＤＲ１として配列番号２、１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２または９２のいずれか一つ、ＣＤＲ２として配列番号３、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３または９３のいずれか一つ、およびＣＤＲ３として配列番号４、１４、２４、３４、４４、５４、６４、７４、８４または９４のいずれか一つによりそれぞれ示されるアミノ酸配列； 
（ｂ）ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列として、それぞれ、配列番号２〜４、１２〜１４、２２〜２４、３２〜３４、４２〜４４、５２〜５４、６２〜６４、７２〜７４、８２〜８４、または９２〜９４、またはこれらアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、Ａβに対するＨ鎖の相補性決定領域となりうるもの。【００２３】
１０）ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、配列番号２〜４、１２〜１４、２２〜２４、３２〜３４、４２〜４４、５２〜５４、６２〜６４、７２〜７４、８２〜８４、または９２〜９４の組み合わせから選択されるアミノ酸配列である、上記９）に記載のヒト抗Ａβ抗体のＨ鎖可変領域フラグメント。【００２４】
１１）以下の（ｅ）または（ｆ）のアミノ酸配列を有する、上記８）から１０）のいずれかに記載のヒト抗Ａβ抗体のＨ鎖可変領域フラグメント：
（ｅ）配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１または９１のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１または９１に示されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、Ａβに対するＨ鎖可変領域となりうるもの。【００２５】
１２）当該Ａβが繊維化したＡβである上記８）から１１）のいずれかに記載のヒト抗Ａβ抗体のＨ鎖可変領域フラグメント。【００２６】
１３）アミロイドβペプチド（Ａβ）に結合性を有するヒト抗Ａβ抗体のＬ鎖可変領域フラグメント。【００２７】
１４）相補性決定領域（ＣＤＲ）が以下の（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列を有する、上記１３）に記載のヒト抗Ａβ抗体のＬ鎖可変領域フラグメント：
（ｃ）ＣＤＲ１として配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７または１０２のいずれか一つ、ＣＤＲ２として配列番号８、１８、２８、３８、４８、５８、６８、７８、８８、９８または１０３のいずれか一つ、およびＣＤＲ３として配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９または１０４のいずれか一つによりそれぞれ示されるアミノ酸配列； 
（ｄ）ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列として、それぞれ、配列番号７〜９、１７〜１９、２７〜２９、３７〜３９、４７〜４９、５７〜５９、６７〜６９、７７〜７９、８７〜８９、９７〜９９、または１０２〜１０４、またはこれらアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、Ａβに対するＬ鎖の相補性決定領域となりうるもの。【００２８】
１５）ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、配列番号７〜９、１７〜１９、２７〜２９、３７〜３９、４７〜４９、５７〜５９、６７〜６９、７７〜７９、８７〜８９、９７〜９９、または１０２〜１０４の組み合わせから選択されるアミノ酸配列である、上記１４）に記載のヒト抗Ａβ抗体のＬ鎖可変領域フラグメント。【００２９】
１６）以下の（ｇ）または（ｈ）のアミノ酸配列を有する、上記８）から１０）のいずれかに記載のヒト抗Ａβ抗体のＬ鎖可変領域フラグメント：
（ｇ）配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７７、８６、９６または１０１のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７７、８６、９６または１０１に示されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、Ａβに対するＬ鎖可変領域となりうるもの。【００３０】
１７）当該Ａβが繊維化したＡβである上記１３）から１６）のいずれかに記載のヒト抗Ａβ抗体のＬ鎖可変領域フラグメント。【００３１】
１８）上記８）から１２）のいずれかに記載のヒト抗Ａβ抗体のＨ鎖可変領域フラグメントと、上記１３）から１７）のいずれかに記載のヒト抗Ａβ抗体のＬ鎖可変領域フラグメントとを連結してなる、Ａβに対するヒト由来の抗体の一本鎖可変領域フラグメント。【００３２】
１９）上記８）から１２）のいずれかに記載のヒト抗Ａβ抗体のＨ鎖可変領域フラグメント、および／または上記１３）から１７）のいずれかに記載のヒト抗Ａβ抗体のＬ鎖可変領域フラグメントに、ヒト由来の抗体定常領域を連結してなる、Ａβに対するヒト由来の抗体またはその抗体フラグメント。【００３３】
２０）当該抗体フラグメントが、Ｆab、Ｆab'、Ｆ(ab')2、scAb、またはscFv-Fcである上記１９）に記載の抗体フラグメント。【００３４】
２１）配列番号１０１のアミノ酸配列を有するヒト抗Ａβ抗体のＬ鎖可変領域フラグメントとヒト由来の抗体定常領域を連結してなるＡβに対するヒト由来の抗体またはそのフラグメント。【００３５】
２２）上記１）から２１）のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントとペプチド或いは他のタンパク質とを融合させた融合抗体またはそのフラグメント。【００３６】
２３）上記１）から２２）のいずれかに記載の抗体もしくは融合抗体またはそのフラグメントに修飾剤が結合されてなる修飾抗体またはそのフラグメント。【００３７】
２４）上記１）から２２）のいずれかに記載の抗体もしくは融合抗体またはそのフラグメントをコードする遺伝子。【００３８】
２５）上記２４）に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。【００３９】
２６）上記２４）に記載の遺伝子が導入された形質転換体。【００４０】
２７）上記２４）に記載の遺伝子を宿主に発現させることによって、ヒト抗Ａβ抗体またはその断片を生産する方法。【００４１】
２８）上記２４）に記載の遺伝子を含む遺伝子治療剤。【００４２】
２９）上記１）から２１）のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または上記２２）に記載の融合抗体またはそのフラグメント、または上記２３）に記載の修飾抗体またはそのフラグメントを用いたＡβの検出試薬。【００４３】
３０）上記１）から２１）のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または上記２２）に記載の融合抗体またはそのフラグメント、または上記２３）に記載の修飾抗体またはそのフラグメントを用いたアルツハイマー痴呆症の診断薬。【００４４】
３１）上記１）から２１）のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または上記２２）に記載の融合抗体またはそのフラグメント、または上記２３）に記載の修飾抗体またはそのフラグメントを用いたＡβ凝集阻害剤。【００４５】
３２）上記１）から２１）のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または上記２２）に記載の融合抗体またはそのフラグメント、または上記２３）に記載の修飾抗体またはそのフラグメントを用いたアルツハイマー痴呆症の予防、治療剤。【００４６】
これらの抗Ａβ抗体および抗体フラグメントはｓｃＦｖやＶＬという小さな分子形態であるにも関わらず、in vitroでＡβの凝集を抑制する効果があることが確認された。この抗体は分子量がきわめて小さいので脳血管関門を通過できるように抗体エンジニアリングすることができる。例えば、トランスフェリン受容体を介して脳血管関門を通過できるようにするトランスフェリンとの融合体や二重特異性抗体などもこの範疇に入る。【００４７】
また、Ｐ糖蛋白に対する抗体や脳血管関門の薬剤輸送に関わる受容体と相互作用し得るタンパク質や低分子との融合体とすることも可能である。また、さらにMcCaffertyら（J. McCaffertyら、Nature, 348:552-554,1990）が報告したように、膜透過性に優れ、抗原性の少ない繊維状ファージの上にこれらの抗体フラグメントを提示させ、脳内に移行させることも可能である。【００４８】
さらに、これらの分子にＦｃ受容体との相互作用領域を付加し、脳内でのミクログリアとの相互作用により、蓄積したＡβ凝集体の除去に用いることも可能である。【００４９】
本発明による抗体は完全ヒト抗体であるので、診断の画像化を可能にするとともに、Ａβ分子の凝集プロセスを阻害する治療法の開発ができる。従って、アルツハイマー痴呆症の医療への本発明の貢献は多大である。
【発明の効果】
【００５０】
本発明のヒトモノクローナル抗体および該抗体フラグメント分子は、ヒト由来抗Ａβ抗体の可変領域を有し、Ａβと強く反応して、その凝集の阻害作用を示す。このことから本発明の抗体および該抗体フラグメントはアルツハイマー痴呆症の予防または治療薬として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】分離クローンのｓｃＦｖのＡβ42ペプチドへの特異性を評価したＥＬＩＳＡの結果を示す図。
【００５２】
【図２】分離クローンのｓｃＦｖの可溶性及び繊維化されたＡβ42ペプチドへの特異性を評価したＥＬＩＳＡの結果を示す図。
【００５３】
【図３】発現scFv-His6およびVL-D1-D2-Hisの発現を抗His6抗体を用いてウエスタンブロットで確認した図。
【００５４】
【図４】VL-D1-D2-HisのＡβ42ペプチドへの特異性を評価したＥＬＩＳＡの結果を示す図。
【００５５】
【図５】精製ｓｃＦｖのＡβ42ペプチド繊維化抑制活性を蛍光チオフラビン試験で評価した結果を示す図。
【００５６】
【図６】精製ｓｃＦｖ（Ｆｖ１Ｅ４）のＡβ42ペプチド凝集阻害能の濃度依存性を示す図。
【００５７】
【図７】精製ｓｃＦｖ（Ｂ７）のＡβ42ペプチド凝集阻害能の濃度依存性を示す図。
【００５８】
【図８】繊維化したＡβ42ペプチドに対するｓｃＦｖ提示ファージの結合性を示す図。
【００５９】
【図９】繊維化したＡβ42ペプチドに対するｓｃＦｖの結合性を示す図。
【００６０】
【図１０】精製ｓｃＦｖのＡβ42ペプチド繊維化抑制活性を蛍光チオフラビン試験で評価した結果を示す図。
【００６１】
【図１１】精製ｓｃＦｖのＡβ42ペプチド凝集阻害能の濃度依存性を示す図。
【００６２】
【図１２】Ａβ42ペプチドに対する精製ｔａｔペプチド融合ＶＬ鎖の結合性を示す図。
【００６３】
【図１３】精製ｔａｔペプチド融合ＶＬ鎖のＡβ42ペプチド凝集阻害能の濃度依存性を示す図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６４】
本発明の抗体および抗体フラグメントに使用されるｓｃＦｖ等は以下のようにして得られた。【００６５】
健常者２０名分の末梢血Ｂリンパ球より、ＲＴ−ＰＣＲ法にて、免疫グロブリン重（Ｈ）鎖、軽（Ｌ）鎖ｃＤＮＡを増幅、更に両者をlinker DNAで結合し、健常者リンパ球由来のＨ鎖可変領域（ＶＨ鎖またはＶＨ）とＶＬ鎖のランダムな組み合わせによるｓｃＦｖ ＤＮＡを作製した。【００６６】
このｓｃＦｖ ＤＮＡをファージミドベクターpCANTAB5Eに組込み、109クローンからなる健常者由来ｓｃＦｖディスプレイファージライブラリーを作製した。このライブラリーを、固相に固定化されたＡβと結合させて回収、濃縮し、抗Ａβ ｓｃＦｖディスプレイファージクローンをスクリーニングした。その結果、スクリーニングされた各クローンは、Ａβと結合するｓｃＦｖ抗体もしくはＶＬフラグメントを産生した。【００６７】
ｓｃＦｖやＶＬフラグメントの発現方法としては、例えば、大腸菌で発現させることができる。大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列等、発現させるｓｃＦｖを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーターとしては、lacZプロモーター、araBプロモーター等を挙げることができる。ｓｃＦｖの分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに発現させる場合、pelBシグナル配列（Lei, SP.ら、J. Bacteriol., 1987, 169 : 4379-4383）を用いるとよい。培養上清中に分泌させるにはＭ１３ファージのｇ３蛋白のシグナル配列を用いることもできる。【００６８】
またＶＬフラグメントの場合は、同様に単独で或いは他のペプチドやタンパク質との融合蛋白の形で発現させることができる。【００６９】
前記のように発現されたｓｃＦｖは細胞内外、宿主から分離し均一にまで精製することができる。本発明で発現されるｓｃＦｖは、そのＣ末端にE tag配列が付加されているので、抗E tag抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて、容易に短時間で精製することができる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を組み合わせて精製することも可能である。例えば、限外濾過、塩析、ゲル濾過／イオン交換／疎水クロマト等のカラムクロマトグラフィーを組み合わせれば抗体を分離・精製することができる。【００７０】
本発明により得られたｓｃＦｖ蛋白やＶＬ鎖は、Ａβに対する結合活性を有することが明らかになった。本発明で使用される抗Ａβ抗体の抗原結合活性を測定する方法として、ＥＬＩＳＡ、BIAcore等の方法がある。例えばＥＬＩＳＡを用いる場合、Ａβを固相化した９６穴プレートに目的の抗Ａβ抗体や抗体フラグメントを含む試料、例えば大腸菌の培養上清や精製抗体を加える。次にパーオキシダーゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベーション、洗浄した後、発色基質ＴＭＢＺを加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。【００７１】
このようにして得られたｓｃＦｖやＶＬフラグメントを用いて、Ａβの凝集抑制が可能か評価した結果、Ａβの凝集体の形成を十分に抑制することが可能であることが明らかになった。【００７２】
これは、本発明の抗Ａβ抗体フラグメントが、正常型Ａβに結合し、凝集型への構造変換を抑制したためと考えられる。このような効果は生体内で、これらの抗体および抗体フラグメントが、凝集型に構造変換することを十分に抑制可能であることを示している。従って、これらの低分子化抗体はＡβの構造変換を抑制する予防薬として、さらには症状の進展を抑制する薬剤としても十分に効果が期待できる。更に、本発明の抗Ａβ抗体フラグメントは正常型Ａβよりも、凝集型に強く反応する性質を有する配列を含んでいることが明らかになった。脳内に沈着したアミロイドは大部分が凝集型、あるいはそれらが繊維化したものと考えられており、先駆的なワクチン療法の試みで認められた患者脳内の脳アミロイド沈着の減少は、局所で活性化したミクログリア細胞がＦｃ受容体を介して抗体−沈着したＡβ抗原複合体を取り込み、分解する作用の結果と推定されている。従って、本発明の抗Ａβ抗体フラグメント（Ｆｖ１Ｅ１、Ｆｖ１Ｅ４、Ｆｖ１Ｅ７、Ｆｖ２Ａ７、Ｆｖ２Ａ８、Ｆｖ２Ｂ６、Ｂ７、Ｂ６、Ｆ１０、Ｄ１、およびＶＬＡ２）およびこれらの抗体可変領域にＦｃ領域を結合させた抗体分子や融合蛋白は、
（１）正常型Ａβのみに結合し、凝集型への構造変換を抑制するもの（ＶＬＡ２）；
（２）凝集型および繊維化したＡβのみに結合し、凝集型Ａβの除去、繊維化したＡβの増加抑制、さらには正常型Ａβの凝集型への変換抑制に効果を発揮するもの（Ｂ６、Ｆ１０、Ｄ１）；または
（３）（１）及び（２）の両特性を有するもの（Ｆｖ１Ｅ１、Ｆｖ１Ｅ４、Ｆｖ１Ｅ７、Ｆｖ２Ａ７、Ｆｖ２Ａ８、Ｆｖ２Ｂ６、Ｂ７）
であり、いずれもアルツハイマー型治療薬として有望である。【００７３】
上記阻害活性を有する１０種類のｓｃＦｖ（Ｆｖ１Ｅ１、Ｆｖ１Ｅ４、Ｆｖ１Ｅ７、Ｆｖ２Ａ７、Ｆｖ２Ａ８、Ｆｖ２Ｂ６、Ｂ７、Ｂ６、Ｆ１０、Ｄ１）のＶＨ鎖およびＶＬ鎖、並びにＶＬ鎖（ＶＬＡ２）のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列は、下記の通りである。【００７４】
（１）クローンＦｖ１Ｅ１
クローンＦｖ１Ｅ１のＶＨ鎖のアミノ酸配列を配列番号１に示した。当該ＶＨ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号２〜４に示した。すなわち、配列番号１に示すＶＨ鎖のアミノ酸配列において、３０番目〜３５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号２）、５０番目〜６６番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号３）、９９番目〜１０７番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号４）に対応している。また、当該ＶＨ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号５に示した。【００７５】
また、クローンＦｖ１Ｅ１のＶＬ鎖のアミノ酸配列を配列番号６に示した。当該ＶＬ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号７〜９に示した。すなわち、配列番号６に示すＶＬ鎖のアミノ酸配列において、２３番目〜３５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号７）、５１番目〜５７番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号８）、９０番目〜１００番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号９）に対応している。また、当該ＶＬ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１０に示した。【００７６】
（２）クローンＦｖ１Ｅ４
クローンＦｖ１Ｅ４のＶＨ鎖のアミノ酸配列を配列番号１１に示した。当該ＶＨ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号１２〜１４に示した。すなわち、配列番号１１に示すＶＨ鎖のアミノ酸配列において、３０番目〜３５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号１２）、５０番目〜６６番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号１３）、９９番目〜１１２番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号１４）に対応している。また、当該ＶＨ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１５に示した。【００７７】
また、クローンＦｖ１Ｅ４のＶＬ鎖のアミノ酸配列を配列番号１６に示した。当該ＶＬ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号１７〜１９に示した。すなわち、配列番号１６に示すＶＬ鎖のアミノ酸配列において、２３番目〜３６番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号１７）、５２番目〜５８番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号１８）、９１番目〜１００番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号１９）に対応している。また、当該ＶＬ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２０に示した。【００７８】
（３）クローンＦｖ１Ｅ７
クローンＦｖ１Ｅ７のＶＨ鎖のアミノ酸配列を配列番号２１に示した。当該ＶＨ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号２２〜２４に示した。すなわち、配列番号２１に示すＶＨ鎖のアミノ酸配列において、３０番目〜３５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号２２）、５０番目〜６６番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号２３）、９９番目〜１１１番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号２４）に対応している。また、当該ＶＨ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２５に示した。【００７９】
また、クローンＦｖ１Ｅ７のＶＬ鎖のアミノ酸配列を配列番号２６に示した。当該ＶＬ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号２７〜２９に示した。すなわち、配列番号２６に示すＶＬ鎖のアミノ酸配列において、２３番目〜３３番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号２７）、４９番目〜５５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号２８）、８８番目〜９９番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号２９）に対応している。また、当該ＶＬ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号３０に示した。【００８０】
（４）クローンＦｖ２Ａ７
クローンＦｖ２Ａ７のＶＨ鎖のアミノ酸配列を配列番号３１に示した。当該ＶＨ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号３２〜３４に示した。すなわち、配列番号３１に示すＶＨ鎖のアミノ酸配列において、３０番目〜３５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号３２）、５０番目〜６６番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号３３）、９９番目〜１１２番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号３４）に対応している。また、当該ＶＨ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号３５に示した。【００８１】
また、クローンＦｖ２Ａ７のＶＬ鎖のアミノ酸配列を配列番号３６に示した。当該ＶＬ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号３７〜３９に示した。すなわち、配列番号３６に示すＶＬ鎖のアミノ酸配列において、２４番目〜３５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号３７）、５１番目〜５７番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号３８）、９０番目〜９８番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号３９）に対応している。また、当該ＶＬ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号４０に示した。【００８２】
（５）クローンＦｖ２Ａ８
クローンＦｖ２Ａ８のＶＨ鎖のアミノ酸配列を配列番号４１に示した。当該ＶＨ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号４２〜４４に示した。すなわち、配列番号４１に示すＶＨ鎖のアミノ酸配列において、３０番目〜３５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号４２）、５０番目〜６８番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号４３）、１０１番目〜１１２番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号４４）に対応している。また、当該ＶＨ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号４５に示した。【００８３】
また、クローンＦｖ２Ａ８のＶＬ鎖のアミノ酸配列を配列番号４６に示した。当該ＶＬ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号４７〜４９に示した。すなわち、配列番号４６に示すＶＬ鎖のアミノ酸配列において、２０番目〜３２番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号４７）、４８番目〜５４番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号４８）、８７番目〜９７番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号４９）に対応している。また、当該ＶＬ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号５０に示した。【００８４】
（６）クローンＦｖ２Ｂ６
クローンＦｖ２Ｂ６のＶＨ鎖のアミノ酸配列を配列番号５１に示した。当該ＶＨ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号５２〜５４に示した。すなわち、配列番号５１に示すＶＨ鎖のアミノ酸配列において、３０番目〜３５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号５２）、４９番目〜６６番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号５３）、９８番目〜１１０番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号５４）に対応している。また、当該ＶＨ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号５５に示した。【００８５】
また、クローンＦｖ２Ｂ６のＶＬ鎖のアミノ酸配列を配列番号５６に示した。当該ＶＬ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号５７〜５９に示した。すなわち、配列番号５６に示すＶＬ鎖のアミノ酸配列において、２３番目〜３６番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号５７）、５２番目〜５８番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号５８）、９１番目〜９９番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号５９）に対応している。また、当該ＶＬ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号６０に示した。【００８６】
（７）クローンＢ７
クローンＢ７のＶＨ鎖のアミノ酸配列を配列番号６１に示した。当該ＶＨ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号６２〜６４に示した。すなわち、配列番号６１に示すＶＨ鎖のアミノ酸配列において、３１番目〜３５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号６２）、５０番目〜６６番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号６３）、９９番目〜１１２番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号６４）に対応している。また、当該ＶＨ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号６５に示した。【００８７】
また、クローンＢ７のＶＬ鎖のアミノ酸配列を配列番号６６に示した。当該ＶＬ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号６７〜６９に示した。すなわち、配列番号６６に示すＶＬ鎖のアミノ酸配列において、２３番目〜３３番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号６７）、４９番目〜５５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号６８）、８８番目〜９８番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号６９）に対応している。また、当該ＶＬ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号７０に示した。【００８８】
（８）クローンＢ６
クローンＢ６のＶＨ鎖のアミノ酸配列を配列番号７１に示した。当該ＶＨ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号７２〜７４に示した。すなわち、配列番号７１に示すＶＨ鎖のアミノ酸配列において、３１番目〜３５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号７２）、５０番目〜６６番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号７３）、９９番目〜１１２番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号７４）に対応している。また、当該ＶＨ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号７５に示した。【００８９】
また、クローンＢ６のＶＬ鎖のアミノ酸配列を配列番号７６に示した。当該ＶＬ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号７７〜７９に示した。すなわち、配列番号７６に示すＶＬ鎖のアミノ酸配列において、２３番目〜３３番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号７７）、４９番目〜５５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号７８）、８８番目〜９８番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号７９）に対応している。また、当該ＶＬ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号８０に示した。【００９０】
（９）クローンＦ１０
クローンＦ１０のＶＨ鎖のアミノ酸配列を配列番号８１に示した。当該ＶＨ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号８２〜８４に示した。すなわち、配列番号８１に示すＶＨ鎖のアミノ酸配列において、３１番目〜３５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号８２）、５０番目〜６６番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号８３）、９９番目〜１１４番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号８４）に対応している。また、当該ＶＨ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号８５に示した。【００９１】
また、クローンＦ１０のＶＬ鎖のアミノ酸配列を配列番号８６に示した。当該ＶＬ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号８７〜８９に示した。すなわち、配列番号８６に示すＶＬ鎖のアミノ酸配列において、２３番目〜３３番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号８７）、４９番目〜５５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号８８）、８８番目〜９８番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号８９）に対応している。また、当該ＶＬ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号９０に示した。【００９２】
（１０）クローンＤ１
クローンＤ１のＶＨ鎖のアミノ酸配列を配列番号９１に示した。当該ＶＨ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号９２〜９４に示した。すなわち、配列番号９１に示すＶＨ鎖のアミノ酸配列において、３１番目〜３５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号９２）、５０番目〜６６番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号９３）、９９番目〜１０６番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号９４）に対応している。また、当該ＶＨ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号９５に示した。【００９３】
また、クローンＤ１のＶＬ鎖のアミノ酸配列を配列番号９６に示した。当該ＶＬ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号９７〜９９に示した。すなわち、配列番号９６に示すＶＬ鎖のアミノ酸配列において、２３番目〜３３番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号９７）、４９番目〜５５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号９８）、８８番目〜９８番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号９９）に対応している。また、当該ＶＬ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１００に示した。【００９４】
（１１）クローンＶＬＡ２
ＶＬ鎖のみからなるクローンＶＬＡ２のアミノ酸配列を配列番号１０１に示した。当該ＶＬ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号１０２〜１０４に示した。すなわち、配列番号１０１に示すＶＬ鎖のアミノ酸配列において、２４番目〜４０番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号１０２）、５６番目〜６２番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号１０３）、９５番目〜１０３番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号１０４）に対応している。また、当該ＶＬ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１０５に示した。【００９５】
本発明により得られたクローン毎にアミノ酸配列および塩基配列について上述したが、配列表に記載された各アミノ酸配列情報（ＶＨ鎖、ＶＬ鎖、各ＣＤＲ１〜３）をもとに、単独または複数の配列を適宜組み合わせて使用することも可能である。【００９６】
本発明の抗体およびその抗体フラグメントは、上記ＶＨ鎖およびＶＬ鎖、並びにそれらのＣＤＲとして、上記配列番号に示される配列に限定されるものではなく、それらの一部が改変された変異ポリペプチドであってもよい。【００９７】
すなわち、各配列番号に記載されたアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミロイドβペプチドに対するＨ鎖またはＬ鎖の相補性決定領域、Ｈ鎖またはＬ鎖の可変領域となるポリペプチドも含まれる。【００９８】
ここで、「１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、および／または付加できる程度の数、例えば、１ないし６程度の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されることを意味する。このような「変異」としては、主として、公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然（例えば、ヒト）に存在する同様の変異ポリペプチドを単離精製したものであってもよい。【００９９】
なお、上記「変異」は、本発明の抗体またはその抗体フラグメントを、治療薬として利用する場合（ヒトに投与する場合）には、ヒト由来の構造を保持またはヒトが免疫反応を起こさない範囲で行い、検出器具や診断キットなどとして使用する場合（ヒトに投与しない場合）には、その範囲は特に制限されない。【０１００】
本発明で開示されるＶＨ鎖および／またはＶＬ鎖は、ファージ抗体法を用いて主としてｓｃＦｖの形で得られたものであるが、原則としてその適用はｓｃＦｖに限定されることはない。例えば、開示したＶＨ鎖および／またはＶＬ鎖をヒト免疫グロブリンの定常領域と連結した完全分子型、またヒト免疫グロブリンの定常領域の一部と組み合わせたＦab、Ｆab'またはＦ(ab')２、さらにｓｃＦｖをヒト免疫グロブリンのＨ鎖またはＬ鎖の定常領域の一部のドメインと結合させた一本鎖抗体（ｓｃＡｂ）や、ｓｃＦｖをヒト免疫グロブリンのＨ鎖およびＬ鎖の全定常領域と結合させたｓｃＦｖＦｃなどの他の抗体フラグメントもその適用範囲に含まれる。【０１０１】
また、本発明の抗体またはそのフラグメントは、当該抗体またはフラグメントにペプチド或いは他のタンパク質と融合させた融合抗体またはそのフラグメントとすることもできる。【０１０２】
また、これらの抗体および抗体フラグメントあるいは上記融合抗体またはそのフラグメントに、ポリエチレングリコールなどの高分子修飾剤を結合させた修飾抗体またはそのフラグメントとすることもできる。【０１０３】
Ｈ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたｓｃＦｖを調製する場合、ペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１０〜２５残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。【０１０４】
上記の抗体またはそのフラグメント、上記の融合抗体もしくはそのフラグメント、または上記の修飾抗体もしくはそのフラグメントは、Ａβの検出試薬、Ａβ凝集阻害剤、Ａβが関与するアルツハイマー痴呆症の予防、治療剤、または診断薬として利用できる。【０１０５】
本発明の抗体または抗体フラグメントは、配列番号５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、または１０５に示した本発明により得られた各クローンのＶＨ鎖およびＶＬ鎖をコードする遺伝子配列情報をもとに、適当な宿主（例えば、細菌、酵母）に導入して、本発明の抗体またはそのフラグメントを発現させることができる。【０１０６】
また本発明の遺伝子は、Ａβが関与するアルツハイマー痴呆症の遺伝子治療薬としても利用できる。【０１０７】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【０１０８】
《実施例１：健常者からのファージライブラリーの構築》
ファージライブラリーの構築は、J. D. Marks ら（J. Mol. Biol., 222: 581-597, 1991）により報告されている方法を参考に、健常者２０名由来末梢血由来リンパ球を出発材料に、構築した。構築したＶＨ(γ)−Ｖκ、ＶＨ(γ)−Ｖλ、ＶＨ(μ)−Ｖκ、ＶＨ(μ)−Ｖλの各サブライブラリーはそれぞれ1.1×108、2.1×108、8.4×107、5.3×107クローンの多様性を有すると評価された。【０１０９】
《実施例２：パンニング》
125μg/mlのDSS 100μLで活性化したCova-link plate（Nunc）に0.1Ｍ炭酸バッファーpH9.6に溶解した１μg Ａβ42ペプチドを加え、４℃で一晩静置した。【０１１０】
0.1％Tween20を含むＰＢＳで１回洗浄後、１回目の選択用には0.5％のゼラチンで２回目の選択用には0.25％のＢＳＡでプレートをブロック処理した。【０１１１】
これに健常人由来の抗体ファージライブラリー（一本鎖抗体提示ファージ液）をＶＨ(γ)−ＶκとＶＨ(γ)−Ｖλの混合物、ＶＨ(μ)−ＶκとＶＨ(μ)−Ｖλの混合物の２種の場合に分けて、100μL（5×1011tu/mL）ずつ加え、室温で１時間反応させた。【０１１２】
0.1％Tween20-PBSで１０回洗浄した後、100μLのグリシン緩衝液（pH2.2）を加え、IL-18と結合する一本鎖抗体提示ファージを溶出させた。溶出したファージは１Ｍ Tris (hydroxymethyl)aminomethane-HCl, pH9.1を加えてpHを調整した後、対数増殖期の大腸菌ＴＧ１に感染させた。感染後のＴＧ１は3000×g,１０分で遠心分離して、上清を除き、200μLの２×ＹＴ培地で懸濁し、ＳＯＢＡＧプレート（２％グルコース、100μg/mlのアンピシリン含有SOBプレート）に播き、３０℃のふ卵器中で一晩培養した。生じたコロニーは適量の２×ＹＴ培地を加えスクレイパー（Costar）を使って懸濁、回収した。【０１１３】
このＴＧ１液５０μLを、３０mLの２×ＹＴＡＧ培地に植え、ヘルパーファージを用いてレスキューし、スクリーニング後のファージライブラリーを調製した。健常人由来ファージライブラリーＶＨ(γ)−ＶκとＶＨ(γ)−Ｖλ由来、ＶＨ(μ)−ＶκとＶＨ(μ)−Ｖλ由来、それぞれについて前述のＡβ42ペプチド固定化プレートを用いてパンニングを計２回行った。２回目のパンニング後に、ＳＯＢＡＧプレートから任意にクローンを抽出し、ｓｃＦｖの発現の確認およびＡβ42ペプチドＥＬＩＳＡによる特異性の確認と塩基配列の解析を行った。【０１１４】
《実施例３：スクリーニングAβ42ペプチドＥＬＩＳＡ》
分離したクローンのスクリーニングのためのＥＬＩＳＡは以下のように行った。Ａβ42ペプチドをＥＬＩＳＡプレートに固定化してスクリーニングに用いた。1.25μg/mLのＡβ42ペプチド、2.5μg/mLのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を４０μL/well ＥＬＩＳＡプレート（Nunc）に入れ、４℃で１６時間静置し、固定化した。固定化プレートは、0.5％ＢＳＡ、0.5％ゼラチンおよび５％スキムミルクを含むＰＢＳ溶液400μL/wellをＥＬＩＳＡプレートに入れ、４℃で２時間静置し、ブロッキングを行った。【０１１５】
ｓｃＦｖ提示ファージを含む試料液を４０μL/well入れて反応させた後、試料液を捨て洗浄液で５回洗った。ビオチン標識した抗M13モノクローナル抗体（Pharmacia biotech）と反応させ、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識した抗マウスIgＧ抗体と反応させた。洗浄液で５回洗った後、発色基質液（１g/mL p-nitrophenyl phosphate（Wako）、10％ジエタノールアミン（Wako）を含むＰＢＳ溶液）を５０μL/well入れ、遮光し、室温〜３７℃で、５〜１０分発色させた。マルチプレートオートリーダーNJ-2001（Inter Med）で405nmの吸光度を測定した結果、評価したクローン全てが、Ａβ42ペプチドに特異的であることが確認できた。【０１１６】
《実施例４：クローンの配列分析》
単離したクローンのｓｃＦｖ遺伝子のＶＨおよびＶＬのＤＮＡ塩基配列をDye terminator cycle sequencing FS Ready Reaction kit（Applied Biosystems）を用いて決定した。ＥＬＩＳＡおよび配列分析の結果、単離したクローンは６種のｓｃＦｖと１種のＶＬに分類された。【０１１７】
《実施例５：ヒト由来抗Ａβ42ペプチドｓｃＦｖの発現と精製》
前記実施例２、３で単離したＡβ42ペプチドに反応するｓｃＦｖクローンからプラスミドＤＮＡを回収して、常法に従って大腸菌HB1251を形質転換した。２％グルコースおよび100μg/mLのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地でこれらの大腸菌を一夜前培養後、グルコースフリーの２×ＹＴ培地に一部移植し、終濃度１mM IPTG、100μg/mLのアンピシリンを加えて更に一夜培養してｓｃＦｖの発現誘導を行った。培養終了後菌体を遠心回収し、１mM ＥＤＴＡを含むＰＢＳに懸濁して氷中に３０分菌体を放置した。次いで8,900×gで３０分間遠心し、上清を回収して0.45μmフィルター濾過後、ペリプラズム画分からのｓｃＦｖの精製出発材料とした。【０１１８】
このようにして調製した精製の出発材料を、抗E tag抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで常法に従って精製した。ＰＢＳで透析後、エンドトキシン除去カラムDetoxi-gel（PIERCE社）で添付のプロトコルに従いエンドトキシンを除去した。分子量カット10,000のCentricon（Amicon社）で濃縮後、0.45μmフィルター濾過して精製標品とした。【０１１９】
《実施例６：精製ｓｃＦｖのＡβ42ペプチドとの結合性》
次に精製ｓｃＦｖのＡβ42ペプチドとの結合性をＥＬＩＳＡ法で測定した。ＰＢＳで1.25μg/mLに調整したＡβ42ペプチドを固相化した９６穴プレート（NUNC. MAXISORP）に、精製抗体を100μL加えて３７℃で１時間反応させた。0.05％Tween-PBS（以下PBSTと省略することもある）で５回洗浄後、抗E tag抗体と３７℃１時間反応させた。さらに、PBSTで５回洗浄後、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識した抗マウスIgＧ抗体と３７℃１時間反応させた。PBSTで５回洗浄後、発色基質液を加えて呈色させ、405nmの吸光度を測定して結合性を評価した。結果を図１に示す。十分な発現を示し、評価できた５種のｓｃＦｖは全てＡβ42ペプチドと特異的に結合した。また、データには示していないが、その他のｓｃＦｖとしてＢ７もＡβ42ペプチドと特異的に結合した。【０１２０】
《実施例７：精製ｓｃＦｖの特異性解析》
ｓｃＦｖの繊維化したＡβ42ペプチドとの結合性をＥＬＩＳＡ法で測定した。ＰＢＳで1.25μg/mLに調製した繊維化したＡβ42ペプチド、可溶性Ａβ42ペプチド、５μg/mLマウスIgＧ及び0.5％ゼラチンのみを固相化した９６穴プレート（NUNC. MAXISORP）に、大腸菌ペリプラズム画分から精製したｓｃＦｖを100μL加えて３７℃で１時間反応させた。0.05％Tween-PBS（以下PBSTと省略することもある）で５回洗浄後、ビオチン化抗E tag抗体と３７℃１時間反応させた。さらに、PBSTで５回洗浄後、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識したストレプトアビジンと３７℃３０分反応させた。PBSTで５回洗浄後、発色基質液を加えて呈色させ、405nmの吸光度を測定して結合性を評価した。結果を図２に示す。評価した６種のｓｃＦｖは全て可溶性のＡβ42ペプチドと同様に繊維化したＡβ42ペプチドとも強く結合することが明らかになった。【０１２１】
《実施例８：ヒト由来抗Ａβ42ペプチドＶＬ鎖の発現と精製》
前記実施例２および３で単離したＡβ42ペプチドに反応するクローンの内、１クローンはＪＨ鎖の一部とＶＬ鎖のみから構成されていた。このクローンのＤＮＡのうちＶＫ鎖の部分のみをＰＣＲ法でリクローニングして、5’末端に制限酵素SfiIの認識サイトを、さらに3’末端に制限酵素NotIの認識サイトを付加した。両制限酵素で切断、アガロースゲル電気泳動で精製後、このクローンのＶＬ鎖をpTrc99A-D1+D2-His（繊維状ファージのｇ３タンパクのＤ１およびＤ２ドメインの末端にHis6がついたタンパク質と融合タンパク質の形で発現できるようにした発現ベクター）に組み込み、大腸菌JM83を形質転換した。この形質転換体を実施例５と同様に培養し、大腸菌ペリプラズム画分よりVL-D1-D2-His6タンパク質を回収した。ウエスタンブロットで解析した結果、設計通りの４７Kdaのバンドを示す融合タンパクの発現が確認できた（図３）。【０１２２】
《実施例９：ＶＬ鎖のＡβ42ペプチドとの結合性》
実施例８で回収したＶＬ鎖40μl/ウエルをＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温で６時間静置した。0.1％Tween20を含むＰＢＳで１回洗浄後、0.25％のＢＳＡでプレートをブロック処理した。処理後のプレートに100ng/ウエルのＡβ42ペプチド、MCP-1、IL-5、ヒトプリオン或いはウシプリオン（PrPc102-241 InPro BioTech）を加え、３７℃で１時間反応させた。PBSTで５回洗浄後、それぞれの抗原に対応した二次抗体（抗Ａβ42モノクローナル抗体、抗MCP-1モノクローナル抗体、抗IL-5モノクローナル抗体、抗プリオンモノクローナル抗体）をさらに反応させた。PBSTで５回洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗マウス抗体と更に３７℃１時間反応させた。PBSTで５回洗浄後、発色基質液を加えて呈色させ、405nmの吸光度を測定して結合性を評価した。結果を図４に示す。評価したＶＬはＡβ42ペプチドと特異的に結合した。【０１２３】
《実施例１０：精製ｓｃＦｖのＡβ42ペプチド凝集阻害能の評価》
実施例５で調製した精製ｓｃＦｖを用いて、Ａβ42ペプチドの凝集阻害能の評価を行った。凝集阻害能の評価はアミロイド繊維形成の進展を蛍光チオフラビン試験で行った。サンプル220nMを10μMのチオフラビンを含有する0.1Mリン酸カリウムバッファー、pH6.5で４nMに希釈し、室温で２分間攪拌した。このときに１％wt/wtの種の凝集体（予め巨大分子生成を抑制するため、超音波処理したもの）を同時に添加した。チオフラビン色素の励起光450nmでの蛍光482nmを測定し（日立、F-3000）、凝集の生成を評価した。その結果、評価した４クローン全てで凝集抑制活性が確認できた（図５）【０１２４】
《実施例１１：精製ｓｃＦｖのＡβ42ペプチド凝集阻害能の濃度依存性評価》
実施例５で調製した精製ｓｃＦｖを用いて、Ａβ42ペプチドの凝集阻害能の濃度依存性の評価を行った。凝集阻害能の評価は実施例１０と同様にアミロイド繊維形成の進展を蛍光チオフラビン試験で行った。20μMのAβ42にコントロールｓｃＦｖおよび精製ｓｃＦｖ（Ｆｖ１Ｅ４およびＢ７、０〜40μg/ml）を加えて、24時間37℃で静置した。Ａβ42の濃度が２μMになるように調整後、10μMになるようにチオフラビンＴを加え、室温で２分間攪拌した。チオフラビン色素の励起光450nmでの蛍光482nmを測定し（日立、F-3000）、凝集の生成を評価した。その結果、評価した２クローンはｓｃＦｖ濃度依存的に凝集抑制活性を有することが確認できた（図６および図７）。【０１２５】
《実施例１２：繊維化したＡβ42ペプチドに対するｓｃＦｖ提示ファージの結合性》
繊維化したＡβ42ペプチドに対するｓｃＦｖ提示ファージの結合性をＥＬＩＳＡ法で測定した。ＰＢＳで50ng/mLに調整した繊維化したＡβ42ペプチド、可溶性Ａβ42ペプチド、1000倍希釈したＡβ血清を４０μL/wellずつＥＬＩＳＡプレート（Nunc）に入れ、４℃で６時間静置し、固定化した。固定化プレートは、0.25％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を400μL/wellずつＥＬＩＳＡプレートに入れ、４℃で一晩静置し、ブロッキングを行った。【０１２６】
ｓｃＦｖ提示ファージを含む試料液40μL/wellを入れて反応させた後、試料液を捨て洗浄液で５回洗った。ビオチン標識した抗M13モノクローナル抗体（Pharmacia biotech）と反応させ、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識した抗マウスIgＧ抗体と反応させた。洗浄液で５回洗った後、発色基質液（１g/mL p-nitrophenyl phosphate（Wako）、10％ジエタノールアミン（Wako）を含むＰＢＳ溶液）を50μL/well入れ、遮光し、マルチプレートオートリーダーNJ-2001（Inter Med）で405nmの吸光度を測定した。その結果、評価したクローン全てが、繊維化したＡβ42ペプチドに特異的であることが確認できた（図８）。【０１２７】
《実施例１３：繊維化したＡβ42ペプチドに対するｓｃＦｖの結合性》
繊維化したＡβ42ペプチドに対するｓｃＦｖの結合性をＥＬＩＳＡ法で測定した。実施例５と同様に精製したｓｃＦｖを３μg/mL含む試料液を40μL/wellずつ、実施例１２と同様に調製したプレートに入れて反応させた後、試料液を捨て洗浄液で５回洗った。anti-Etag mAb（1:1000）と反応させ、アルカリフォスファターゼを結合させたgoat mouse IgG（1:1000）と反応させた。発色基質液以降は実施例１２と同様に測定した。その結果、評価したＢ６とＦ１０は、繊維化したＡβ42ペプチドに特異的であることが確認できた（図９）。【０１２８】
《実施例１４：精製ｓｃＦｖのＡβ42ペプチド凝集阻害能の評価》
実施例１３で調製した精製ｓｃＦｖを用いて、Ａβ42ペプチドの凝集阻害能の評価を行った。凝集阻害能の評価はアミロイド繊維形成の進展を蛍光チオフラビン試験で行った。サンプル20μMに終濃度40μg/mlになるようにｓｃＦｖを加えて放置した。各時間ごとにサンプルを回収し、Ａβの濃度を２μＭに調整後、10μMになるようにチオフラビンＴを加え、室温で２分間静置した。チオフラビン色素の励起光450nmでの蛍光482nmを測定し（日立、F-3000）、凝集の生成を継時的に評価した。その結果、評価した３クローン全てで凝集抑制活性が確認できた（図１０）【０１２９】
《実施例１５：精製ｓｃＦｖのＡβ42ペプチド凝集阻害能の濃度依存性評価》
実施例１３で調製した精製ｓｃＦｖを用いて、Ａβ42ペプチドの凝集阻害能の濃度依存性の評価を行った。凝集阻害能の評価は実施例１４と同様にアミロイド繊維形成の進展を蛍光チオフラビン試験で行った。20μMのＡβ42にコントロールｓｃＦｖおよび精製ｓｃＦｖ（終濃度０〜40μg/ml）を加えて、24時間37℃で静置した。Ａβ42の濃度が２μMになるように調整後、10μMになるようにチオフラビンＴを加え、室温で２分間攪拌した。チオフラビン色素の励起光450nmでの蛍光482nmを測定し（日立、F-3000）、凝集の生成を評価した。その結果、評価した３クローンはｓｃＦｖ濃度依存的に凝集抑制活性を有することが確認できた（図１１）。【０１３０】
《実施例１６：tatペプチド融合ヒト由来抗Ａβ42ペプチドＶＬ鎖の発現調製》
実施例８で構築したＡβ42ペプチド特異的VL鎖遺伝子の5’末端にHIV tatペプチド配列（Met Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly）（配列番号１０６）をPCRを用いて付加し、制限酵素サイトNdeI, NotIを用いてpET-29b ベクター（Novagen社）に組み込んだ。大腸菌BL21 (DE3) starに形質転換後、IPTG誘導により、tat-VL鎖をinclusion bodyとして発現させた。菌体を回収後、超音波破砕し、遠心分離後、上清を除去し、不溶性画分を6M塩酸グアニジンを用いて可溶化した。可溶化画分を、6M塩酸グアニジン存在下、Ni-NTAカラムにアプライし、洗浄後、カラムに結合した蛋白質をイミダゾールを用いて溶出し、tat-VL鎖精製画分とした。tat-VL鎖精製画分は段階透析法によるリフォールディングを以下の様に行った。 50mM Tris-HCl(pH 8.0), 10mM β-ME, 1mM EDTA, 200mM NaCl, 6M GdnHCl溶液で7.5 uM tat-VL鎖溶液になるように調整、β-MEを除いた前記の溶液で２時間透析した。更に、6M GdnHClで3時間、3M GdnHClで6時間、2M GdnHClで12時間、1M GdnHCl/375uM GSSG/200mM L-Arginineで12時間、0.5M GdnHCl/375uM GSSG/200mM L-Arginine で12時間、PBSで12時間透析を行い、最終的なリフォールディングしたtat-VL鎖を調製した。【０１３１】
《実施例１７：tatペプチド融合ＶＬ鎖のＡβ42ペプチド結合能評価》
実施例１６で回収したtatペプチド融合ＶＬ鎖40μl/ウエルをＥＬＩＳＡプレートに添加し、4℃で12時間静置した。0.1％tweenを含むＰＢＳで１回洗浄後、0.5％ゼラチンでプレートをブロック処理した。処理後のプレートに100ng/ウエルのＡβ42ペプチド、MCP-1、マウスIgG或いはヤギIgGを加え、３７℃で１時間反応させた。PBSTで５回洗浄後、それぞれの抗原に対応した二次抗体（抗Ａβ42モノクローナル抗体、抗MCP-1モノクローナル抗体、抗ヤギIgG抗体）をさらに反応させた（マウスIgG抗体は洗浄せずそのまま反応させた）。PBSTで５回洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗マウス抗体と更に３７℃で１時間反応させた。PBSTで５回洗浄後、発色基質液を加えて呈色させ、405nmの吸光度を測定して結合性を評価した。結果を図１２に示す。評価した精製tatペプチド融合ＶＬはＡβ42ペプチドと特異的に結合した。【０１３２】
《実施例１８：tatペプチド融合ＶＬ鎖のＡβ42ペプチド凝集阻害能の濃度依存性評価》
実施例１６で調製した精製tatペプチド融合ＶＬ鎖を用いて、Ａβ42ペプチドの凝集阻害能の評価を行った。凝集阻害能の評価はアミロイド繊維形成の進展を実施例１０と同様の蛍光チオフラビン試験で行った。その結果、評価した精製tatペプチド融合ＶＬ鎖が凝集抑制活性を有することが確認できた（図１３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年2月27日(2006.2.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】アミロイドβペプチド１−４２（Ａβ４２）に結合性を有するヒト抗Ａβ４２抗体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】Ｈ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）が以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、Ｌ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）が以下の（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のヒト抗Ａβ４２抗体：
（ａ）ＣＤＲ１として配列番号２、１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２または９２のいずれか一つ、ＣＤＲ２として配列番号３、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３または９３のいずれか一つ、およびＣＤＲ３として配列番号４、１４、２４、３４、４４、５４、６４、７４、８４または９４のいずれか一つによりそれぞれ示されるアミノ酸配列；
（ｂ）ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列として、それぞれ、配列番号２〜４、１２〜１４、２２〜２４、３２〜３４、４２〜４４、５２〜５４、６２〜６４、７２〜７４、８２〜８４、または９２〜９４、またはこれらアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、Ａβ４２に対するＨ鎖の相補性決定領域となりうるもの；
（ｃ）ＣＤＲ１として配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７または１０２のいずれか一つ、ＣＤＲ２として配列番号８、１８、２８、３８、４８、５８、６８、７８、８８、９８または１０３のいずれか一つ、およびＣＤＲ３として配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９または１０４のいずれか一つによりそれぞれ示されるアミノ酸配列；
（ｄ）ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列として、それぞれ、配列番号７〜９、１７〜１９、２７〜２９、３７〜３９、４７〜４９、５７〜５９、６７〜６９、７７〜７９、８７〜８９、９７〜９９、または１０２〜１０４、またはこれらアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、Ａβ４２に対するＬ鎖の相補性決定領域となりうるもの。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３】Ｈ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、配列番号２〜４、１２〜１４、２２〜２４、３２〜３４、４２〜４４、５２〜５４、６２〜６４、７２〜７４、８２〜８４、または９２〜９４の組み合わせから選択されるアミノ酸配列であり、Ｌ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、配列番号７〜９、１７〜１９、２７〜２９、３７〜３９、４７〜４９、５７〜５９、６７〜６９、７７〜７９、８７〜８９、９７〜９９、または１０２〜１０４の組み合わせから選択されるアミノ酸配列である、請求項２に記載のヒト抗Ａβ４２抗体。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４】Ｈ鎖のＣＤＲ１〜３とＬ鎖のＣＤＲ１〜３との組み合わせのアミノ酸配列が、配列番号２〜４と配列番号７〜９、配列番号１２〜１４と配列番号１７〜１９、配列番号２２〜２４と配列番号２７〜２９、配列番号３２〜３４と配列番号３７〜３９、配列番号４２〜４４と配列番号４７〜４９、配列番号５２〜５４と配列番号５７〜５９、配列番号６２〜６４と配列番号６７〜６９、配列番号７２〜７４と配列番号７７〜７９、配列番号８２〜８４と配列番号８７〜８９、または配列番号９２〜９４と配列番号９７〜９９とのいずれか一つの組み合わせである、請求項３に記載のヒト抗Ａβ４２抗体。
【手続補正５】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５】Ｈ鎖可変領域が以下の（ｅ）または（ｆ）のアミノ酸配列を有し、Ｌ鎖可変領域が以下の（ｇ）または（ｈ）のアミノ酸配列を有する、請求項１から４のいずれかに記載のヒト抗Ａβ４２抗体：
（ｅ）配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１または９１のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１または９１に示されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、Ａβ４２に対するＨ鎖可変領域となりうるもの；
（ｇ）配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７７、８６、９６または１０１のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７７、８６、９６または１０１に示されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、Ａβ４２に対するＬ鎖可変領域となりうるもの。
【手続補正６】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項６】Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域との組み合わせのアミノ酸配列が、配列番号１と配列番号６、配列番号１１と配列番号１６、配列番号２１と配列番号２６、配列番号３１と配列番号３６、配列番号４１と配列番号４６、配列番号５１と配列番号５６、配列番号６１と配列番号６６、配列番号７１と配列番号７６、配列番号８１と配列番号８６、または配列番号９１と配列番号９６との組み合わせにより示されるアミノ酸配列である、請求項１から５のいずれかに記載のヒト抗Ａβ４２抗体。
【手続補正７】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項７】当該Ａβ４２が繊維化したＡβ４２である請求項１から６のいずれかに記載のヒト抗Ａβ４２抗体。
【手続補正８】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項８】アミロイドβペプチド１−４２（Ａβ４２）に結合性を有するヒト抗Ａβ４２抗体のＨ鎖可変領域フラグメント。
【手続補正９】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項９】相補性決定領域（ＣＤＲ）が以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有する、請求項８に記載のヒト抗Ａβ４２抗体のＨ鎖可変領域フラグメント：
（ａ）ＣＤＲ１として配列番号２、１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２または９２のいずれか一つ、ＣＤＲ２として配列番号３、１３、２３、３８、４３、５３、６３、７３、８３または９３のいずれか一つ、およびＣＤＲ３として配列番号４、１４、２４、３４、４４、５４、６４、７４、８４または９４のいずれか一つによりそれぞれ示されるアミノ酸配列；
（ｂ）ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列として、それぞれ、配列番号２〜４、１２〜１４、２２〜２４、３２〜３４、４２〜４４、５２〜５４、６２〜６４、７２〜７４、８２〜８４、または９２〜９４、またはこれらアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、Ａβ４２に対するＨ鎖の相補性決定領域となりうるもの。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１０】ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、配列番号２〜４、１２〜１４、２２〜２４、３２〜３４、４２〜４４、５２〜５４、６２〜６４、７２〜７４、８２〜８４、または９２〜９４の組み合わせから選択されるアミノ酸配列である、請求項９に記載のヒト抗Ａβ４２抗体のＨ鎖可変領域フラグメント。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１１】以下の（ｅ）または（ｆ）のアミノ酸配列を有する、請求項８から１０のいずれかに記載のヒト抗Ａβ４２抗体のＨ鎖可変領域フラグメント：
（ｅ）配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１または９１のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１または９１に示されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、Ａβ４２に対するＨ鎖可変領域となりうるもの。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１２】当該Ａβ４２が繊維化したＡβ４２である請求項８から１１のいずれかに記載のヒト抗Ａβ４２抗体のＨ鎖可変領域フラグメント。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１３】アミロイドβペプチド１−４２（Ａβ４２）に結合性を有するヒト抗Ａβ４２抗体のＬ鎖可変領域フラグメント。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１４】相補性決定領域（ＣＤＲ）が以下の（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載のヒト抗Ａβ４２抗体のＬ鎖可変領域フラグメント：
（ｃ）ＣＤＲ１として配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７または１０２のいずれか一つ、ＣＤＲ２として配列番号８、１８、２８、３８、４８、５８、６８、７８、８８、９８または１０３のいずれか一つ、およびＣＤＲ３として配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９または１０４のいずれか一つによりそれぞれ示されるアミノ酸配列；
（ｄ）ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列として、それぞれ、配列番号７〜９、１７〜１９、２７〜２９、３７〜３９、４７〜４９、５７〜５９、６７〜６９、７７〜７９、８７〜８９、９７〜９９、または１０２〜１０４、またはこれらアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、Ａβ４２に対するＬ鎖の相補性決定領域となりうるもの。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１５】ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、配列番号７〜９、１７〜１９、２７〜２９、３７〜３９、４７〜４９、５７〜５９、６７〜６９、７７〜７９、８７〜８９、９７〜９９、または１０２〜１０４の組み合わせから選択されるアミノ酸配列である、請求項１４に記載のヒト抗Ａβ４２抗体のＬ鎖可変領域フラグメント。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１６】以下の（ｇ）または（ｈ）のアミノ酸配列を有する、請求項８から１０のいずれかに記載のヒト抗Ａβ４２抗体のＬ鎖可変領域フラグメント：
（ｇ）配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７７、８６、９６または１０１のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７７、８６、９６または１０１に示されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、Ａβ４２に対するＬ鎖可変領域となりうるもの。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１７】当該Ａβ４２が繊維化したＡβ４２である請求項１３から１６のいずれかに記載のヒト抗Ａβ４２抗体のＬ鎖可変領域フラグメント。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１８】請求項８から１２のいずれかに記載のヒト抗Ａβ４２抗体のＨ鎖可変領域フラグメントと、請求項１３から１７のいずれかに記載のヒト抗Ａβ４２抗体のＬ鎖可変領域フラグメントとを連結してなる、Ａβ４２に対するヒト由来の抗体の一本鎖可変領域フラグメント。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１９】請求項８から１２のいずれかに記載のヒト抗Ａβ４２抗体のＨ鎖可変領域フラグメント、および／または請求項１３から１７のいずれかに記載のヒト抗Ａβ４２抗体のＬ鎖可変領域フラグメントに、ヒト由来の抗体定常領域を連結してなる、Ａβ４２に対するヒト由来の抗体またはその抗体フラグメント。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２１】配列番号１０１のアミノ酸配列を有するヒト抗Ａβ４２抗体のＬ鎖可変領域フラグメントとヒト由来の抗体定常領域を連結してなるＡβ４２に対するヒト由来の抗体またはそのフラグメント。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】請求項２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２７】請求項２４に記載の遺伝子を宿主に発現させることによって、ヒト抗Ａβ４２抗体またはその断片を生産する方法。
【国際調査報告】
2005105998.tif 000015
2005105998.tif 000016
2005105998.tif 000017
2005105998.tif 000018