(57)【要約】副生成物によって組織を刺激することなく、バックグラウンドのノイズを低減し、放出量と放出組織を対応させて測定できるガンマアミノ酪酸放出量の測定システムおよびそれに用いる反応促進物質を提供する。ガンマアミノ酪酸を特異的に酸化してニコチンアミドジヌクレオチドリン酸の還元を行う酵素と反応促進剤であるジカルボン酸を用いることにより、副生成物が測定結果に影響を与えないように構成した。また閉鎖系反応チャンバー２０を工夫し、反応チャンバー２０表面に設けた半透膜２４により、脳内で放出されたガンマアミノ酪酸が直接反応チャンバー２０内に浸透するように工夫し、どの部位の細胞が放出したガンマアミノ酪酸であるかを知ることができるようにした。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体組織から放出されるガンマアミノ酪酸の放出量の測定システムにおいて、
ガンマアミノ酪酸分解酵素を使用するガンマアミノ酪酸を酸化してニコチンアミドジヌクレオチドリン酸を還元する酵素反応では、該ガンマアミノ酪酸の反応モル量と生成する還元ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸の生成モル量の間に一対一の関係があることを利用し、該酵素反応で生成する還元型ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸が発する蛍光を検出してガンマアミノ酪酸の放出量を測定することを特徴とするガンマアミノ酪酸放出量の測定システム。
【請求項２】
請求項１記載のガンマアミノ酪酸放出量の測定システムにおいて、ガンマアミノ酪酸を酸化してニコチンアミドジヌクレオチドリン酸を還元する酵素反応を促進する物質としてジカルボン酸を反応場へ添加して行うことを特徴とするガンマアミノ酪酸放出量の測定システム。
【請求項３】
請求項２記載のガンマアミノ酪酸放出量の測定システムにおいて、前記ジカルボン酸がαケトグルタル酸、αケトブチル酸、オキザロ酢酸のいずれか、もしくはこれらの混合物であることを特徴とするガンマアミノ酪酸放出量の測定システム。
【請求項４】
請求項１、２又は３記載のガンマアミノ酪酸放出量の測定システムを用いて、還元型ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸が発する蛍光を撮像素子により検出した発光像をもって生体組織から放出されたガンマアミノ酪酸の濃度分布を二次元的に表示することを特徴とするガンマアミノ酪酸放出量の測定システム。
【請求項５】
請求項４記載のガンマアミノ酪酸放出量の測定システムにおいて、前記撮像素子が電荷結合素子もしくは相補型金属酸化膜半導体であることを特徴とするガンマアミノ酪酸放出量の測定システム。
【請求項６】
生体組織から放出されるガンマアミノ酪酸放出量の測定システムで用いる反応促進物質であって、ガンマアミノ酪酸分解酵素を使用するガンマアミノ酪酸を酸化してニコチンアミドジヌクレオチドリン酸を還元する酵素反応で、該酵素反応を促進する物質としてジカルボン酸を含むことを特徴とする反応促進物質。
【請求項７】
請求項６記載の反応促進物質において、前記ジカルボン酸がαケトグルタル酸、αケトブチル酸、オキザロ酢酸の何れかもしくはこれらの混合物である反応促進物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経組織から放出されるガンマアミノ酪酸（γ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ）を定量して、その濃度分布を二次元画像として表現する新しい方法に関するものである。この方法は生体組織から放出されたガンマアミノ酪酸放出量を短時間に、かつこのガンマアミノ酪酸を放出した放出細胞を特定しながら測定することができる。さらにこの方法による測定では、測定時に生じる副生成物が測定結果に影響を及ぼすことがないため、再生組織における組織の状態の判定や、病理検査などに有用である。
【背景技術】
【０００２】
神経組織は特定の分子を細胞外へ放出して情報伝達しており、この分子を神経伝達物質と呼ぶ。その中でもガンマアミノ酪酸は多くの高次脳組織から放出され、痴呆、アルツハイマー症の発症および脳の機能発達に深く関わる重要な指標となる物質である。【０００３】
従来、ガンマアミノ酪酸放出量の測定は、組織周辺の溶液を採取して蛍光性の担体、例えばオルトーフタルジアルデヒドを付加し、高速液体クロマトグラフィで定量する方法がほとんどであった。さらに、従来のガンマアミノ酪酸放出量を酵素で測定する方法では、測定中に生理活性を持つ副生成物グルタミン酸が発生する恐れがあることが知られている。組織近傍でこの従来法を用いると、副生されるグルタミン酸によって組織が二次的に刺激される。すなわち、測定行為自身によって測定結果が信頼できないものになってしまう。【０００４】
また、従来のガンマアミノ酪酸放出量の測定法では組織周辺溶液を用いるため、採取時に周辺の溶液が混入してどの細胞種が放出したガンマアミノ酪酸かを知ることができない。すなわち、採取時に周辺の溶液が混入すると、その部位の正確なガンマアミノ酪酸濃度を測定することが難しい。しかも、濃度の低いガンマアミノ酪酸を測定するためには、極めて感度が鋭敏で高価な蛍光性担体を付加する必要があるので、一回の測定が大変高価なものになっている。
【特許文献１】なし
【発明の開示】
【０００５】
上記したように、従来のガンマアミノ酪酸放出量を酵素で一次元的に測定する方法では、測定中に生理活性を持つ副生成物、例えばグルタミン酸が発生する。組織近傍でこの測定方法を用いると、測定時の反応によって生成するこのような副生成物によって組織が二次的に刺激され、正確な測定を行うことができない。そのため、測定に用いる反応物質を改良し、組織を刺激しない反応系を構成する必要がある。
【０００６】
さらに、ガンマアミノ酪酸の濃度分布を二次元的に表現できれば、どの部位の細胞がガンマアミノ酪酸を放出したかが特定できることになる。二次元的にガンマアミノ酪酸放出量を測定するためには、バックグラウンドのノイズを低減し、かつガンマアミノ酪酸放出量とその放出組織とを対応させて測定できる条件を設定し、測定部位を特定できるように反応チャンバーを構成した適切なシステムを考える必要がある。
【０００７】
本発明は、上記状況に鑑みて、副生成物によって組織を刺激することなく、バックグラウンドのノイズを低減し、放出量と放出組織を対応させて測定できるガンマアミノ酪酸放出量の測定システムおよびそれに用いる反応促進物質を提供することを目的とする。
【０００８】
本発明は、上記目的を達成するために、
〔１〕生体組織から放出されるガンマアミノ酪酸放出量の測定システムにおいて、ガンマアミノ酪酸分解酵素を使用するガンマアミノ酪酸を酸化してニコチンアミドジヌクレオチドリン酸を還元する酵素反応では、このガンマアミノ酪酸の反応モル量と生成する還元ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸の生成モル量の間に一対一の関係があることを利用し、この酵素反応で生成する還元型ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸が発する蛍光を検出してガンマアミノ酪酸の放出量を測定することを特徴とする。
【０００９】
〔２〕上記〔１〕記載のガンマアミノ酪酸放出量の測定システムにおいて、ガンマアミノ酪酸を酸化してニコチンアミドジヌクレオチドリン酸を還元する酵素反応を促進する物質としてジカルボン酸を反応場へ添加して行うことを特徴とする。
【００１０】
〔３〕上記〔２〕記載のガンマアミノ酪酸放出量の測定システムにおいて、前記ジカルボン酸がαケトグルタル酸、αケトブチル酸、オキザロ酢酸のいずれか、もしくはこれらの混合物であることを特徴とする。
【００１１】
〔４〕上記〔１〕、〔２〕又は〔３〕記載のガンマアミノ酪酸放出量の測定システムを用いて、還元型ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸が発する蛍光を撮像素子により検出した発光像をもって生体組織から放出されたガンマアミノ酪酸の濃度分布を二次元的に表示することを特徴とする。
【００１２】
〔５〕上記〔４〕記載のガンマアミノ酪酸放出量の測定システムにおいて、前記撮像素子が電荷結合素子もしくは相補型金属酸化膜半導体であることを特徴とする。
【００１３】
〔６〕生体組織から放出されるガンマアミノ酪酸放出量の測定システムで用いる反応促進物質であって、ガンマアミノ酪酸分解酵素を使用するガンマアミノ酪酸を酸化してニコチンアミドジヌクレオチドリン酸を還元する酵素反応で、この酵素反応を促進する物質としてジカルボン酸を含むことを特徴とする。
【００１４】
〔７〕上記〔６〕記載の反応促進物質において、前記ジカルボン酸がαケトグルタル酸、αケトブチル酸、オキザロ酢酸の何れか、もしくはこれらの混合物であることを特徴とする。
【００１５】
このように、本発明では、生体内にもともと存在する物質によって反応系を構成するようにしている。すなわち、生体の神経組織から放出されたガンマアミノ酪酸と特異的に反応してニコチンアミドジヌクレオチドリン酸の還元を行う酵素を用いることにより、その際に生成する還元ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸が発する蛍光量を測定してガンマアミノ酪酸放出量を定量する。ここでニコチンアミドジヌクレオチドリン酸ならびに還元型ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸は生体内に存在するビタミンの一種であるので、生体組織を二次的に刺激することが避けられる。
【００１６】
特定の組織近傍で測定する場合には、閉鎖系反応チャンバーを用いる。すなわち、閉鎖系反応チャンバー表面に半透膜を置き、神経伝達物質ガンマアミノ酪酸をこの半透過膜から浸透させる。励起光をＵＶ発光素子で導入し、画像撮影を人工網膜ＬＳＩなどの撮像素子を用いて行う。
【００１７】
前記還元型ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸の発する特定波長の蛍光を撮像素子（例えばＣＣＤカメラ）で撮影して画像処理することにより、ガンマアミノ酪酸の二次元的な放出量を得る。すなわち、ガンマアミノ酪酸放出量の二次元測定システムを構成する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の第１実施例を示す神経組織から放出されるガンマアミノ酪酸放出量を生体外で測定する測定システムの構成図である。
【図２】本発明で使用する酵素反応を示した図である。
【図３】本発明で使用する反応促進物質を変えた場合の蛍光の発生挙動の違いを示した図である。
【図４】本発明の第２実施例を示す神経組織から放出されるガンマアミノ酪酸放出量を測定する測定システムの構成図である。
【図５】本発明の実施例を示すプルキンエ層近傍における発光の様子を示す図である。
【図６】本発明にかかるガンマアミノ酪酸濃度と光強度の関係を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
生体組織から放出されるガンマアミノ酪酸放出量の測定システムにおいて、ガンマアミノ酪酸分解酵素を使用するガンマアミノ酪酸を酸化してニコチンアミドジヌクレオチドリン酸を還元する酵素反応では、このガンマアミノ酪酸の反応モル量と生成する還元ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸の生成モル量の間に一対一の関係があることを利用し、この酵素反応で生成する還元型ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸が発する蛍光を検出してガンマアミノ酪酸の放出量を測定する。よって、副生成物によって組織を刺激することなく、バックグラウンドのノイズを低減し、放出量と放出組織を対応させて測定することができる。
【実施例】
【００２０】
以下、本発明を実施するための最良の形態を図を参照しながら詳細に説明する。【００２１】
図１は本発明の第１実施例を示す神経組織から放出されるガンマアミノ酪酸放出量を生体外で測定する測定システムを示す図であり、図１（ａ）はその全体構成図、図１（ｂ）はその反応チャンバーの斜視図である。【００２２】
図１において、１はガラス容器、２はチャンバーブロック、３はサンプル（ガンマアミノ酪酸を放出する神経組織片）、４は反応チャンバー（サンプル３及び酵素溶液を投入する室）、５はＵＶ光源、６は１次フィルター及びレンズ、７は励起ＵＶ光、８は反射ミラー、９は２次フィルター、１０は冷却機能付きＣＣＤカメラ（すなわち光量検出器）、１１はマイクロピペット、１２はチャンバー２の上面に設けられた開口部である。【００２３】
すなわち、倒立培養顕微鏡（ＵＶ光源５〜２次フィルター９）と冷却機能付きＣＣＤカメラ１０を用いて組織が放出したガンマアミノ酪酸放出量を測定するように構成されている。チャンバーブロック２は、例えばパテでガラス容器１のガラス面に接着する。チャンバーブロック２の厚みは０．５〜２ｃｍ、望ましくは０．８〜１．２ｃｍであり、反応チャンバー４の容積は１００〜６００μｌ、望ましくは２００〜４００μｌである。【００２４】
測定は、サンプル３を反応チャンバー４内に供給した後、放出されたガンマアミノ酪酸と特異的に反応してニコチンアミドジヌクレオチドリン酸の還元を行う酵素、すなわちガンマアミノ酪酸分解酵素（例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ）とニコチンアミドジヌクレオチドリン酸の溶液をマイクロピペット１１で反応チャンバー４に供給して行う。なお、チャンバーブロック２の材料としてはテフロン（登録商標）を用いることができる。【００２５】
このように、神経組織から放出されるガンマアミノ酪酸の二次元測定において、生体外で測定する場合には、本発明は、図１に示すような開放系チャンバーを用い、倒立培養顕微鏡（ＵＶ光源５〜２次フィルター９）と冷却機能付きＣＣＤカメラ１０を用いて神経組織が放出したガンマアミノ酪酸量を測定するように構成される。【００２６】
次に、本発明で用いる酵素反応について、図２に基づいて説明する。本発明で使用する反応は酵素反応で反応チャンバー４内で起きる。ガンマアミノ酪酸分解酵素（略称、ＧＡＢＡａｓｅ）の存在下で、ガンマアミノ酪酸（略称；ＧＡＢＡ）とニコチンアミドジヌクレオチドリン酸（略称；ＮＡＤＰ）が共存すると、ＧＡＢＡは酸化されてコハク酸に変化し、ＮＡＤＰは還元されて還元型ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸（略称；ＮＡＤＰＨ）に変化する。この時ＧＡＢＡの反応モル量とＮＡＤＰＨの生成モル量との間には、一対一の関係が成り立っている。そのため、ＮＡＤＰＨの発する蛍光強度を測定すれば、ＧＡＢＡ濃度が明らかになる。ここで、ＮＡＤＰは酵素の働きを補う補酵素の一種であり、ガンマアミノ酪酸から電子を受け取ってＮＡＤＰＨに変化する。したがって、ガンマアミノ酪酸から電子を受け取って還元され蛍光を発するものであれば他の補酵素もしくは基質を使うこともできる。ＮＡＤＰＨは特定波長（４８０ｎｍ）の蛍光を発するので、このＮＡＤＰＨが発する蛍光を撮像素子、例えばＣＣＤカメラ１０で検出する。励起光としては、波長３４０ｎｍの紫外線（ＵＶ光）を用いることができる。【００２７】
この際、ガンマアミノ酪酸分解酵素（ＧＡＢＡａｓｅ）に反応促進物質を加えると、蛍光を検出できるまでに要する時間が１０分の１以下、望ましくは１００分の１以下になる。この反応促進物質としては、ジカルボン酸、特にαケトグルタル酸、αケトブチル酸、オキザロ酢酸のいずれか、もしくは混合物を用いることができる。反応促進物質を変えた場合の蛍光挙動の違い（同じ濃度のガンマアミノ酪酸溶液の反応の際に発生する蛍光強度の反応促進物質による違い）を図３に示す。この図において、図３（ａ）は反応促進物質がαケトグルタル酸の場合の、図３（ｂ）は反応促進物質がαケトブチル酸の場合、図３（ｃ）は反応促進物質がオキザロ酢酸の場合をそれぞれ示している。これらの図において、横軸は時間（秒）、縦軸は主蛍光の強度を表している。【００２８】
次に、本発明の第２実施例を示す神経組織から放出される生体内でガンマアミノ酪酸放出量を測定する測定システムを図４に基づいて説明する。図４（ａ）はその正面図、図４（ｂ）はその側面図である。【００２９】
生体内でガンマアミノ酪酸放出量を測定する場合は、閉鎖系反応チャンバー２０を用いる。閉鎖系反応チャンバー２０の容積は、酵素反応が短時間で行われる大きさが１００〜６００μｌ、望ましくは２００〜４００μｌである。閉鎖系反応チャンバー２０表面には分子量１００以下の物質に透過性を持つ半透膜２４を置き、神経伝達物質であるガンマアミノ酪酸を浸透させる。【００３０】
励起光は紫外光発光ダイオード２３で導入し、画像撮影は撮像素子（人工網膜ＬＳＩ）２６を用いて行う。２１は撮像素子２６の出力ケーブル、２２は電源ケーブル、２５は酵素の入った反応チャンバーを示している。なお、撮像素子としては、電荷結合素子もしくは相補型金属酸化膜半導体を用いることにより、安価で、コンパクトに構成することもできる。【００３１】
（１）測定は以下の手順で行う。
閉鎖系反応チャンバー２０内にニコチンアミドジヌクレオチドリン酸と反応促進物質（望ましくは、α−ケトグルタル酸）および緩衝液を封入する。
（２）分子量１００以下の物質に透過性を持つ半透膜２４からガンマアミノ酪酸の浸透を受ける（３０秒間）。
（３）撮像素子２６で反応前の光強度を測定する（この時の光強度の測定値をＦ０とする）。
（４）図２に示したものと同じ酵素を閉鎖系反応チャンバー２０内に定量注入し反応させる（１０秒間）。
（５）ＵＶ光で励起し、撮像素子２６で反応後の光強度を測定する（この時の光強度の測定値をＦ１とする）。
（６）ｄＦ／Ｆ０（ここで、ｄＦ＝Ｆ１−Ｆ０）がガンマアミノ酪酸濃度に比例するので、これを用いてガンマアミノ酪酸放出量を算出する。【００３２】
更に、本発明の具体的な実施の形態（実験結果）について詳細に説明する。【００３３】
マウスの小脳組織から放出されたガンマアミノ酪酸を、図４に示す本発明の第２実施例を示す閉鎖系反応チャンバーを用いて測定したところ、プルキンエ層近傍に特異的なガンマアミノ酪酸の放出を確認した。その際の発光の様子を図５に示す。この図において、図５（ａ）は、ハロゲンランプ光源で撮影したガンマアミノ酪酸を放出する部位の形状を表す反応前の写真であり、図５（ｂ）はその部位近傍の発光（＝ガンマアミノ酪酸が放出されていること）を示すもので、白い部分がＵＶ光照射により発現したＮＡＤＰＨの蛍光像である。【００３４】
また、図６はＧＡＢＡ濃度と光強度の関係を示す図であり、μＭは溶液１リットル中に存在するガンマアミノ酪酸のマイクロモル量を表す。この図より明らかなように、図５（ｂ）に示す蛍光の強度とガンマアミノ酪酸の濃度には一義的な関連がある。この関係を利用することで、上述したように光強度の測定値からガンマアミノ酪酸放出量を測定することができる。【００３５】
なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づき種々の変形が可能であり、これらを本発明の範囲から排除するものではない。【００３６】
本発明によれば、酵素反応と撮像素子（例えばＣＣＤカメラ）を利用して、患者の脳組織から放出されたガンマアミノ酪酸量を測定することができる。上記のガンマアミノ酪酸放出量の測定システムにおいて、測定時に添加するニコチンアミドジヌクレオチドリン酸ならびに生成する還元型ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸は、もともと生体内に存在する物質（ビタミンの一種）であるので、生体組織を二次的に刺激・損傷する恐れがないという特徴を有する。これにより、測定操作自体が測定に影響を与えるという弊害がなくなり、外傷や脳梗塞を発症した患者の脳内での神経活動の状態を的確に予測しながら治療に当たることが可能になる。【００３７】
また、脳組織から放出されるガンマアミノ酪酸は、痴呆やアルツハイマー症など現代の神経病変に中心的な働きをする神経伝達物質であり、病変の進行や脳の発達の有力な指標である。従来の方法では、ガンマアミノ酪酸放出量の分布を知ることは不可能であったが、本発明により組織中の特定の細胞からのガンマアミノ酪酸放出量を二次元的に測定し、分布を知ることができる。【００３８】
組織中の特定の細胞からのガンマアミノ酪酸放出量を測定することにより、病変の恐れのある脳組織から放出されるガンマアミノ酪酸量を測定して、神経回路に起因する病変か否かを判定することができる。また、再生された脳組織の機能検査を行うことなどが可能になる。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明のガンマアミノ酪酸放出量の測定システムは、神経回路性の病変か否かを判定するなどのツールとして好適である。
【図１】
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【図２】
2006019111.tif 000003
【図３】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年6月7日(2006.6.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】請求の範囲
【請求項１】生体組織から放出されるガンマアミノ酪酸の放出量の測定システムにおいて、
ガンマアミノ酪酸分解酵素を使用するガンマアミノ酪酸を酸化してニコチンアミドジヌクレオチドリン酸を還元する酵素反応では、該ガンマアミノ酪酸の反応モル量と生成する還元ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸の生成モル量の間に一対一の関係があることを利用し、該酵素反応で生成する還元型ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸が発する蛍光を検出してガンマアミノ酪酸の放出量を測定するとともに、ガンマアミノ酪酸を酸化してニコチンアミドジヌクレオチドリン酸を還元する酵素反応を促進する物質としてαケトグルタル酸、αケトブチル酸、オキザロ酢酸のいずれか、もしくはこれらの混合物からなるジカルボン酸を反応場へ添加して行うことを特徴とするガンマアミノ酪酸放出量の測定システム。
【請求項２】（削除）
【請求項３】（削除）
【請求項４】請求項１記載のガンマアミノ酪酸放出量の測定システムを用いて、還元型ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸が発する蛍光を撮像素子により検出した発光像をもって生体組織から放出されたガンマアミノ酪酸の濃度分布を二次元的に表示することを特徴とするガンマアミノ酪酸放出量の測定システム。
【請求項５】請求項４記載のガンマアミノ酪酸放出量の測定システムにおいて、前記撮像素子が電荷結合素子もしくは相補型金属酸化膜半導体であることを特徴とするガンマアミノ酪酸放出量の測定システム。
【請求項６】生体組織から放出されるガンマアミノ酪酸放出量の測定システムで用いる反応促進物質であって、ガンマアミノ酪酸分解酵素を使用するガンマアミノ酪酸を酸化してニコチンアミドジヌクレオチドリン酸を還元する酵素反応で、該酵素反応を促進する物質としてαケトグルタル酸、αケトブチル酸、オキザロ酢酸のいずれか、もしくはこれらの混合物からなるジカルボン酸を含むことを特徴とする反応促進物質。
【国際調査報告】
2006019111.tif 000009
2006019111.tif 000010
2006019111.tif 000011
2006019111.tif 000012
2006019111.tif 000013
2006019111.tif 000014
2006019111.tif 000015
2006019111.tif 000016