(57)【要約】本発明は、Ｗｎｔ５ａ及び／又はＷｎｔ１０ａを有効成分とする細胞賦活剤または細胞死抑制剤である。また、本発明は、Ｗｎｔ５ａ及び／又はＷｎｔ１０ａの細胞からの分泌を制御することにより、標的細胞に対して間接的に機能する細胞賦活剤または細胞死抑制剤ないしは細胞死促進剤を含むものである。この細胞賦活剤または細胞死抑制剤として用いる、Ｗｎｔ５ａの細胞からの分泌を促進する物質としては、オレンジなどがあり、抑制する物質としては、エキナセアがあげられる。さらに、本発明は、上記の細胞賦活剤または細胞死抑制剤を有効成分とする発毛・養毛・育毛剤であり、上記の細胞死促進剤を有効成分とする脱毛剤である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｗｎｔ５ａ及び／又はＷｎｔ１０ａを有効成分とする細胞賦活剤。
【請求項２】
Ｗｎｔ５ａ及び／又はＷｎｔ１０ａを有効成分とする細胞死抑制剤。
【請求項３】
Ｗｎｔ５ａ及び／又はＷｎｔ１０ａの細胞からの分泌を促進することにより、標的細胞を賦活する細胞賦活剤。
【請求項４】
Ｗｎｔ５ａ及び／又はＷｎｔ１０ａの細胞からの分泌を促進することにより、標的細胞の細胞死を抑制する細胞死抑制剤。
【請求項５】
Ｗｎｔ５ａ及び／又はＷｎｔ１０ａの細胞からの分泌を抑制することにより、標的細胞の細胞死を促進する細胞死促進剤。
【請求項６】
Ｗｎｔ５ａの細胞からの分泌を促進する物質が、オレンジ、タイム、アルニカ、ホウセンカ、アルギニンから選択される１種または２種以上である、請求項３に記載の細胞賦活剤または請求項４に記載の細胞死抑制剤。
【請求項７】
Ｗｎｔ５ａの細胞からの分泌を抑制する物質が、エキナセアである、請求項５に記載の細胞死促進剤。
【請求項８】
細胞を賦活、細胞死を抑制または促進する対象の細胞が毛乳頭細胞である、請求項１〜４および請求項６のいずれか１項に記載の細胞賦活剤もしくは細胞死抑制剤、または請求項５および請求項７のいずれか１項に記載の細胞死促進剤。
【請求項９】
請求項１〜４および請求項６のいずれか１項に記載の細胞賦活剤または細胞死抑制剤を有効成分とする、発毛・育毛・養毛剤。
【請求項１０】
請求項５または請求項７に記載の細胞死促進剤を有効成分とする、脱毛剤。
【請求項１１】
Ｗｎｔ５ａまたはＷｎｔ５ａの細胞からの分泌を促進する物質を有効成分とする、発毛・育毛・養毛剤。
【請求項１２】
Ｗｎｔ１０ａまたはＷｎｔ１０ａの細胞からの分泌を促進する物質を有効成分とする、発毛・育毛・養毛剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、Ｗｎｔ５ａ及び／又はＷｎｔ１０ａを有効成分とする細胞賦活剤および細胞死抑制剤に関するものである。また、本発明は、Ｗｎｔ５ａ及び／又はＷｎｔ１０ａの細胞からの分泌を促進することによって、標的細胞を賦活または標的細胞の細胞死を抑制する、細胞賦活剤および細胞死抑制剤に関し、さらに本発明は、これらの細胞賦活剤および細胞死抑制剤を有効成分とする発毛剤、育毛剤、または養毛剤に関するものである。【０００２】  また、本発明は、Ｗｎｔ５ａ及び／又はＷｎｔ１０ａの細胞からの分泌を抑制することによって、標的細胞の細胞死を促進する、細胞死促進剤に関し、さらに本発明は、この細胞死促進剤を有効成分とする脱毛剤に関するものである。
【背景技術】
【０００３】  従来、うす毛や脱毛を改善する育毛剤の需要は高く、種々多用な養毛剤が上市されている。かかる育毛剤には、植物抽出物や、ビタミンＥおよびその誘導体、ニコチン酸ベンジル等の血行促進剤、トウガラシチンキ、カンタリスチンキ、カンフル、ノニル酸ワニリルアミド等の局所刺激剤、胎盤抽出物、感光素３０１、パントテン酸等の角質溶解剤、ヒノキチオール、塩化ベンザルコニウム、感光素２０１等の殺菌剤、グリチルレチン酸およびその誘導体、メントール等の消炎剤などが配合されており、さらに、男性型脱毛症の改善の目的には、テストステロン５α−リダクターゼの活性を阻害する種々の植物抽出物が用いられている。これらの育毛剤は、いずれも毛母細胞の機能低下、血流の低下、男性ホルモンに対する感受性の増大、皮脂腺機能の活性化、ストレスの増大などに対して、これらを抑制することにより育毛効果を発現するというものである。【０００４】  また、最近では毛乳頭細胞を活性化したり、毛周期における休止期から成長期への移行を促進したり、成長期から退行期への移行を抑制するような毛周期調整効果を奏するような作用機序を有する養毛剤も提供されている。このような作用を奏するものとしては、例えば、タウリン（特開２００２−９７１１６号公報）、没食子酸誘導体（特開２００３−３２１３３０号公報）、ポリエチレンイミン系水溶性高分子（特開２００２−３７０９８７号公報）などが知られ、さらに毛包細胞に作用する因子やこれらの因子を産生促進する物質として、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）様の活性を有する物質であるマメ科カッシア属などの植物の抽出物（特開２０００−１５４１１８号公報）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）産生を促進する、オランダガラシ、シイタケやプルーン等の植物抽出物（特開２００２−１７３４１６号公報、特開２００４−３５４４４号公報）、繊維芽細胞増殖因子−５Ｓ（ＦＧＦ−５Ｓ）を誘導するモモノハナエキスのような植物抽出物（特開２００２−２９６２６７号公報）が知られている。【０００５】  ところで、毛髪の成長に関与する物質として、胚発生に伴う形態形成を司るシグナル分子である細胞外分泌糖タンパク質のＷｎｔが知られており、このＷｎｔは胎児期の皮膚細胞を毛包に変化させ、その後生涯にわたり、毛包細胞の毛周期を刺激し毛髪を作りだしていることが知られている。このようなＷｎｔを用いたものとして、特表２００４−５００４０７号公報があり、ここではＷｎｔファミリーとして知られるＷｎｔのうち、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ７が好ましいものであることが記載されているが、実際に毛包細胞が賦活され、毛髪の成長が促進されたことは示されてはいない。
【発明の開示】
【０００６】  以上のように、養毛剤、育毛剤ないしは発毛剤には、種々のものが知られているが、Ｗｎｔの場合を除き、これらはいずれもすでにある毛包の活性化を目的とするものである。これに対して、毛包形成自体に直接関与する成分であれば、毛包が萎縮したり失われてしまった場合においても、新たに毛包形成を促すこともできる。このような毛包形成を促す物質として、Ｗｎｔが知られているが、Ｗｎｔは１９種類以上からなる大きなファミリーを形成しており、種々のＷｎｔが、胚発生の段階において、中枢神経系の発生、体軸の決定、四肢パターン形成、内臓器官の形成、表皮および毛包の形成など多くの形態形成に関与することが知られている。しかしながら、どのＷｎｔが毛包の形成や毛包細胞の賦活に関与するのかはいまだ不明の点が多い。
【０００７】  本発明は、毛包細胞の賦活特に毛包細胞死の抑制や、毛包細胞死の促進に関わるＷｎｔを提供するとともに、Ｗｎｔの細胞からの分泌を促進または抑制する物質を提供し、これらを有効成分として含む新規な発毛剤、育毛剤ないしは養毛剤あるいは脱毛剤を提供することを目的とする。
【０００８】  発明者らは、上記の目的を達成するため、毛包細胞の賦活、特に毛包細胞死を抑制するＷｎｔを探求し、その結果Ｗｎｔ５ａおよびＷｎｔ１０ａにその効果があることを見いだし、さらに、このＷｎｔ５ａおよびＷｎｔ１０ａの細胞からの分泌を促進あるいは抑制物質を探求することにより、本発明を完成した。
【０００９】  すなわち、本発明は、毛包形成、発毛、脱毛に関わる種々の因子を探求し、その結果、毛包形成に関与する可能性のあるＷｎｔのうちで、Ｗｎｔ５ａおよびＷｎｔ１０ａが毛包細胞を賦活するとともに細胞死を抑制することを見出したもので、本発明はこの知見に基づいてなされたものである。
【００１０】  すなわち、本発明は、Ｗｎｔ５ａ及び／又はＷｎｔ１０ａを有効成分とする細胞賦活剤または細胞死抑制剤である。また、本発明は、Ｗｎｔ５ａ及び／又はＷｎｔ１０ａの細胞からの分泌を制御することにより、標的細胞に対して間接的に機能する細胞賦活剤または細胞死抑制剤ないしは細胞死促進剤を含むものである。すなわち、細胞賦活剤は、Ｗｎｔ５ａ及び／又はＷｎｔ１０ａの細胞からの分泌を促進することにより、毛包細胞などの標的細胞を賦活する細胞賦活剤である。また、細胞死抑制剤は、Ｗｎｔ５ａ及び／又はＷｎｔ１０ａの細胞からの分泌を促進することにより、毛包細胞などの標的細胞の細胞死を抑制する細胞死抑制剤である。さらに、細胞死促進剤は、Ｗｎｔ５ａ及び／又はＷｎｔ１０ａの細胞からの分泌を抑制することにより、毛包細胞などの標的細胞の細胞死を促進する細胞死促進剤である。なお、作用効果の点からいえば、Ｗｎｔ５ａがより好ましいものである。
【００１１】  また、この細胞賦活剤または細胞死抑制剤に用いる、Ｗｎｔ５ａの細胞からの分泌を促進する物質としては、オレンジ、タイム、アルニカ、ホウセンカ、アルギニンからなる群から選択される１種又は２種以上の物質が挙げられ、本発明は、好ましくはこれらのものを有効成分として含有する細胞賦活剤または細胞死抑制剤である。一方、細胞死促進剤として用いる、Ｗｎｔ５ａの細胞からの分泌を抑制する物質としては、エキナセアが挙げられ、本発明は、好ましくはこれを有効成分として含有する細胞死促進剤である。
【００１２】  さらに、本発明は、細胞を賦活、細胞死を抑制または促進する対象の細胞としては、毛乳頭細胞が好ましく、毛乳頭細胞の細胞賦活剤、細胞死抑制剤または細胞死促進剤でもある。
【００１３】  また、本発明は、上記の細胞賦活剤又は細胞死抑制剤であるＷｎｔ５ａまたはＷｎｔ１０ａを有効成分として含有する発毛剤、育毛剤または養毛剤であり、さらに、Ｗｎｔ５ａまたはＷｎｔ１０ａの細胞からの分泌を促進し、間接的に細胞賦活または細胞死抑制を示す物質である細胞賦活剤又は細胞死抑制剤を有効成分として含有する発毛剤、育毛剤または養毛剤を包含し、間接的に細胞賦活または細胞死抑制を示す物質としては、オレンジ、タイム、アルニカ、ホウセンカ、アルギニンからなる群から選択される１種又は２種以上の物質が好ましいものである。さらに、本発明は、上記のＷｎｔ５ａまたはＷｎｔ１０ａの細胞からの分泌を抑制し、間接的に細胞死促進を示す物質である細胞死促進剤を有効成分として含有する脱毛剤も包含するものであり、間接的に細胞死促進を示す物質としては、エキナセアであることが好ましいものである。
【００１４】  なお、本発明の発毛・育毛・養毛剤とは、発毛剤、育毛剤、ないしは養毛剤を意味するが、この発毛剤、育毛剤および養毛剤の区別は厳密なものではなく、毛髪に対して発毛作用、育毛作用および養毛作用のように、全体としてうす毛や脱毛を改善し、毛髪を正常な状態に維持する効果を奏するものであれば、名称にとらわれることなく、本発明の発毛・育毛・養毛剤すなわち発毛剤、育毛剤および養毛剤に含まれるものである。
【００１５】  本願の開示は、２００５年１月７日に出願された特願２００５−００３１９０号に記載の主題と関連しており、それらの開示内容は引用によりここに援用される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、Ｗｎｔ遺伝子を導入したＷｎｔ安定的発現ＣＨＯ細胞のＷｎｔ発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果であり、図中、「Ｗ１」などは「Ｗｎｔ１」などの場合をそれぞれ示し、「ＮＣ」はネガティブコントロールであって、Ｗｎｔ遺伝子を導入していないＣＨＯ細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。図より、Ｗｎｔ遺伝子を導入したＷｎｔ安定的発現ＣＨＯ細胞は、いずれもＷｎｔを発現していることがわかる。
【図２】図２は、各Ｗｎｔによる毛乳頭細胞の細胞増殖ないしは賦活作用を示すグラフであり、Ｗｎｔを含まない調製培地で培養したときの細胞数を基準として、各Ｗｎｔを含む調製培地で培養したときの細胞数を相対的に示したものである。図中、白カラム、灰色カラム、および黒カラムはそれぞれ濃縮率が５、１０および２０倍の場合を示している。図より、Ｗｎｔ５ａおよびＷｎｔ１０ａが細胞賦活作用を有するものであることがわかる。
【図３】図３は、無血清培地で培養することにより誘導される毛乳頭細胞死に対する、Ｗｎｔ５ａの細胞死抑制効果を示すグラフである。図中、灰色カラムは基準値（１００％）を示し、黒カラムはＦＢＳ含有培地、薄灰色カラムはＢＳＡ含有培地、白カラムは、Ｗｎｔ５ａが０〜５００ｎｇ／ｍｌ添加された培地で培養した場合の細胞数を基準値（灰色カラム）に対する相対比率（％）で示したものである。図より、細胞の生存率がＷｎｔ５ａの添加により高められることがわかる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】  本発明は、Ｗｎｔ５ａおよびＷｎｔ１０ａが、細胞賦活作用および細胞死抑制作用を有することを見出したことに基づくものであって、Ｗｎｔ５ａ及び／又はＷｎｔ１０ａを有効成分とするか、あるいは細胞からのＷｎｔ５ａ及び／又はＷｎｔ１０ａの分泌を制御することにより間接的に細胞賦活作用および細胞死抑制あるいは促進作用を示す細胞賦活剤および細胞死抑制剤または細胞死促進剤と、これらの細胞賦活剤および細胞死抑制剤を含有する発毛・育毛・養毛剤と、細胞死促進剤を含有する脱毛剤である。以下、本発明を詳細に説明する。【００１８】  毛包細胞は真皮由来の毛乳頭細胞と、それを取り巻く上皮由来の毛母細胞とから構成されている。そして、毛乳頭細胞は、毛器官の発生や伸長に関与する線維芽細胞様細胞であり、成長期も毛球部の毛乳頭内で互いに突起を伸ばして接着したネットワークを形成し、何らかのサイトカインを放出し、毛母の機能や増殖を調整するものである。また、毛周期の「成長期→退行期→休止期→成長期」の繰り返しにおいて、休止期から成長期への移行は、バルジ部に引き寄せられ、萎縮していた毛乳頭細胞が再び活動を開始し、毛乳頭細胞からの刺激によって毛包構造が再構築され毛幹が再び伸長し始めることから、毛乳頭細胞は毛母細胞の増殖の調整はもとより、その他の機能についての調整の司令塔として機能しているものである。そして、毛乳頭細胞からの刺激を受けることにより、毛根部に毛母細胞が形成され、毛乳頭細胞に隣接している毛母細胞が生きた細胞として成長し、新たに毛母細胞が形成されるにつれて、毛母細胞は、表皮細胞と同様に核が無くなり角化（ケラチン化）し、毛幹が形成されていくことになる。したがって、毛乳頭細胞に対する賦活作用が、毛母細胞の増殖、ひいては発毛、育毛、養毛の基本となることから、本発明においては、毛乳頭細胞に対する賦活作用および細胞死抑制作用を詳細に検討した。【００１９】  評価に必要なＷｎｔタンパク質は活性型での精製が困難であるため、Ｗｎｔタンパク質をコードするｃＤＮＡを、たとえばＣＨＯ細胞に導入し、Ｗｎｔを発現し、分泌する細胞（Ｗｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＣＨＯ  ｓｔａｂｌｅ  ｃｅｌｌ：Ｗｎｔ安定的発現ＣＨＯ細胞と呼ぶ）を作製した。この細胞を４日間培養し、培地中にＷｎｔが分泌された調製培地（ｃｏｎｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ：ＣＭ）をＷｎｔの作用評価に用いた。【００２０】  毛包細胞の賦活作用および細胞死抑制作用の評価は、それぞれのＷｎｔ安定的発現ＣＨＯ細胞の培養から得られた調製培地を用いた。また、毛乳頭細胞の賦活作用は、毛乳頭細胞を培養し、この培地に各Ｗｎｔ安定的発現ＣＨＯ細胞の培養から得られた培養液上澄（調製培地）を添加し、刺激することにより毛乳頭細胞の賦活作用および細胞死抑制作用を評価することができる。細胞賦活作用および細胞死抑制作用は、例えば、毛乳頭細胞細胞内に蓄積される水溶性ホルマザン量を指標として、あるいは［３Ｈ］−チミジン取り込み量を指標として細胞の増殖性や生存性を求めることにより、細胞賦活化および細胞死抑制性の程度を評価することができる。【００２１】  以上のようにして、毛乳頭細胞の賦活作用を評価したところ、Ｗｎｔ５ａおよびＷｎｔ１���ａが有意に細胞の増殖性、すなわち賦活作用と細胞死抑制作用を示し、これによりＷｎｔ５ａおよびＷｎｔ１０ａは毛乳頭細胞の賦活化作用および細胞死抑制作用を有することが判明し、Ｗｎｔ５ａまたはＷｎｔ１０ａは細胞賦活剤および細胞死抑制剤として使用できるものであることがわかった。さらに、Ｗｎｔ５ａおよびＷｎｔ１０ａは毛包形成に係わる因子であり、Ｗｎｔ５ａまたはＷｎｔ１０ａにより毛乳頭細胞が賦活化され、また毛乳頭細胞死が抑制されることで毛母細胞や毛包細胞も賦活化されるとともに細胞死が抑制され、結果として発毛、育毛ないしは養毛が達成されることがわかった。なお、Ｗｎｔ５ａ及び／又はＷｎｔ１０ａを有効成分とする細胞賦活剤または細胞死抑制剤の剤形や使用形態などには何ら制限はなく、細胞賦活または細胞死抑制の対象となる細胞に対して、適用することができるものであれば、単独の成分であっても混合物の一成分として含有するものであってもよい。【００２２】  本発明の一実施態様は、このようなＷｎｔ５ａ及び／又はＷｎｔ１０ａを有効成分として含有する、発毛、育毛ないしは養毛剤である。本発明の発毛、育毛ないしは養毛剤は、液状、乳剤状、ゲル状、クリーム状、軟膏状、フォーム状、ミスト状など種々の剤型で、ヘアトニック、ヘアジェル、ヘアクリーム、ヘアトリートメントローション、ヘアフォーム、ヘアミスト、ヘアシャンプー、ヘアリンスなどとして提供することができる。また、本発明に係る発毛、育毛ないしは養毛剤には、本発明の作用を損なわない範囲で、油性成分、界面活性剤、保湿剤、紫外線吸収剤、抗酸化剤、血行促進剤、局所刺激剤、毛包賦活剤、抗脂漏剤、抗炎症剤、香料、色素、防菌防黴剤などの一般的な育毛剤用添加剤を含有させることができる。本発明の発毛、育毛ないしは養毛剤の有効成分であるＷｎｔ５ａおよびＷｎｔ１０ａの配合量としては、発毛、育毛ないしは養毛剤全量に対して、それぞれまたは両者を合わせて１０−７〜１０−１重量％、好ましくは１０−７〜１０−４重量％、さらには１０−６〜１０−４重量％程度とするのが好ましい。【００２３】  本発明で用いるＷｎｔ５ａは、そのアミノ酸配列あるいは塩基配列が、例えば、ヒト（Ｃｌａｒｋら、１９９３，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ；１８（２）：２４９−６０）、マウス（Ｇａｖｉｎら，１９９０，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．；４（１２Ｂ）：２３１９−２３３２）、ラット（Ｃａｓｔｅｌｏ−Ｂｒａｎｃｏ、２００３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；１００（２２）：１２７４７−１２７５２などに示されているような、主には形態形成能を有する公知の分泌性のタンパク質であり、特定の生物種に限定されるものではない。【００２４】  本発明で用いるＷｎｔ１０ａは、そのアミノ酸配列あるいは塩基配列が、例えば、ヒト（Ｋｕｒｉｋｏｓｈｉら、２００１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｃｈｉ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ；２８３：７９８−８０５）、マウス（Ｗａｎｇら、１９９６，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ；１３：１５３７−１５４４）などに示されているような、主には形態形成能を有する公知の分泌性のタンパク質であり、特定の生物種に限定されるものではない。【００２５】  そして、本発明で用いることができるＷｎｔ５ａおよびＷｎｔ１０ａとしては、上記のアミノ酸配列で示されるＷｎｔ５ａおよびＷｎｔ１０ａに限らず、毛乳頭細胞の賦活効果があれば、各アミノ酸配列において、数個のアミノ酸が置換、挿入、付加、欠失があるものであっても本発明の毛乳頭細胞、毛母細胞や毛包細胞などに対する賦活剤および細胞死抑制剤および発毛、育毛ないしは養毛剤として使用できる。なお、生物種に由来するＷｎｔ５ａおよびＷｎｔ１０ａとしては、効果効能の点からヒト、マウスに由来するものが好ましい。【００２６】  一方、Ｗｎｔ５ａおよびＷｎｔ１０ａが、細胞賦活作用および細胞死抑制作用を示すことから、生体内で、細胞からのＷｎｔ５ａおよびＷｎｔ１０ａの分泌を促進する物質は、間接的に細胞賦活作用および細胞死抑制作用を奏するものであり、このような物質も細胞賦活剤および細胞死抑制剤として使用することができる。また、このような分泌を促進する物質は、発毛、育毛ないしは養毛剤として使用できる。一方、Ｗｎｔ５ａおよびＷｎｔ１０ａの細胞からの分泌を抑制するものであれば、細胞死を促進することから、毛包を喪失させ、脱毛剤として使用することができる。なお、Ｗｎｔ５ａおよびＷｎｔ１０ａの細胞からの分泌は、例えば、発現するＷｎｔ５ａおよびＷｎｔ１０ａのｍＲＮＡの量を測定することなどにより評価することができる。【００２７】  Ｗｎｔ５ａの細胞からの分泌を促進する物質としては、オレンジ、タイム、アルニカ、ホウセンカ、アルギニンなどがあげられる。また、抑制する物質としては、エキナセアなどがあげられる。【００２８】  オレンジは、ミカン科ミカン属（Ｃｉｔｒｕｓ  Ｌ．）に属する双子葉植物で、ビターオレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ ａｕｒａｎｔｉｕｍ  Ｌ．）、ベルガモット（Ｃｉｔｒｕｓ ｂｅｒｇａｍｉａ  Ｒｉｓｓｏ  ｅｔ  Ｐｏｉｔ．）、スイートオレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ  Ｏｓｂｅｃｋ）、ライム（Ｃｉｔｒｕｓ ａｕｒａｎｔｉｆｏｌｉａ  Ｓｗｉｎｇｌｅ）、ブンタン（Ｃｉｔｒｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ  Ｏｓｂｅｃｋ）、ハッサク（Ｃｉｔｒｕｓ ｈａｓｓａｋｕ  Ｈｏｒｔ．ｅｘ  Ｔａｎａｋａ）、イヨカン（Ｃｉｔｒｕｓ ｉｙｏ  Ｈｏｒｔ．ｅｘ  Ｔａｎａｋａ）、ユズ（Ｃｉｔｒｕｓ ｊｕｎｏｓ  Ｓｉｅｂ．ｅｘ  Ｔａｎａｋａ），キシュウミカン（Ｃｉｔｒｕｓ ｋｉｎｏｋｕｎｉ  Ｈｏｒｔ．ｅｘ  Ｔａｎａｋａ）、レモン（Ｃｉｔｒｕｓ ｌｉｍｏｎ  Ｂｕｒｍ．）、シトロン（Ｃｉｔｒｕｓ ｍｅｄｉｃａ  Ｌ．）、ブシュカン（Ｃｉｔｒｕｓ ｍｅｄｉｃａ  Ｌ．ｖａｒ．ｓａｒｃｏｄａｃｔｙｌｉｓ  Ｓｗｉｎｇｌｅ）、ナツミカン（Ｃｉｔｒｕｓ ｎａｔｓｕｄａｉｄａｉ  Ｈａｙａｔａ）、グレープフルーツ（Ｃｉｔｒｕｓ ｐａｒａｄｉｓｉ  Ｍａｃｆ．）、ポンカン（Ｃｉｔｒｕｓ ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ  Ｂｌａｎｃｏ）、ネーブルオレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ  Ｏｓｂｅｃｋ  ｖａｒ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ  Ｔａｎａｋａ）、カボス（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｐｈａｅｒｏｃａｒｐａ  Ｈｏｒｔ．ｅｘ  Ｔａｎａｋａ）、スダチ（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｕｄａｃｈｉ  Ｈｏｒｔ．ｅｘ  Ｔａｎａｋａ）、サンポウカン（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｕｌｃａｔａ  Ｈｏｒｔ．ｅｘ  Ｔａｋａｈａ��ｈｉ）、タチバナ（Ｃｉｔｒｕｓ ｔａｃｈｉｂａｎａ  Ｔａｎａｋａ）、ウンシュウミカン（Ｃｉｔｒｕｓ ｕｎｓｈｉｕ  Ｍａｒｃｏｖｉｔｃｈ）等を用いることができる。本発明では、花、茎、葉、根、果実、果皮、果汁等の各部位から選択される１種または２種以上を用いるが、本発明の効果の点から花や果汁を用いることが好ましく、生花の抽出物、特に生花の水蒸気蒸留水を用いることが好ましい。【００２９】  本発明で用いられる水蒸気蒸留水は、ミカン属に属する植物の花をそのままあるいは粉砕後、公知の水蒸気蒸留装置を用いて得ることができる。すなわち、植物から精油を得る際に一般的に利用される水蒸気蒸留装置を用いて水蒸気蒸留を行い、精油層部を取り除き、水層部に移行した水溶性成分を含む水蒸気蒸留水を得る。また、オレンジフラワー水Ｋ（香栄興業社製）等の市販品を用いることもできる。【００３０】  また、果汁を得るには、搾汁等の方法をとることができ、特に制限されないが、原料果実をそのまま、若しくはビタミンＣ、エリソルビン酸等の抗酸化剤を添加しながら、破砕や圧搾等により搾出果汁を得、好ましくはペクチン分解酵素処理を行い、次いで、必要に応じて遠心分離や濾過などの分別手段によってパルプ分等の固形成分を除去し、搾汁を得る方法をあげることができる。得られた果汁は、そのままで使用することもできるが、更に濃縮工程に供することによって濃縮果汁、ピューレ若しくはペーストとして、または噴霧乾燥、減圧乾燥若しくは凍結乾燥等の乾燥工程に供することによって果汁乾燥物として使用することもできる。なお、これらの果汁は、いずれも食品若しくは食品原料として商業的に販売されており、簡便にはそれらを用いることもできる。【００３１】  得られた水蒸気蒸留水及び果汁は、そのままでも本発明に係る発毛・育毛・養毛剤に含有させることができるが、濃縮、乾固したものを水や極性溶媒に再度溶解したり、あるいはこれらの生理作用を損なわない範囲で脱色、脱臭、脱塩等の精製処理を行ったり、カラムクロマトグラフィー等による分画処理を行った後に用いてもよい。これらの精製処理物や分画処理物は、これらから溶媒を除去することによって乾固物とすることもでき、さらにアルコールなどの溶媒に可溶化した形態、あるいは乳剤の形態とすることもでき、また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。【００３２】  タイムは、シソ科（Ｌａｂｉａｔａｅ）タイム属（Ｔｈｙｍｕｓ  Ｌ．）に属する植物で、タチジャコウソウ（タイム：Ｔｈｙｍｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ  Ｌ．）、イブキジャコウソウ（Ｔｈｙｍｕｓ ｓｅｒｐｙｌｌｕｍ  Ｌ．）があり、全草もしくは、花、葉、茎、根等の各部位を用いることができるが、全草もしくは葉を用いることが好ましく、これらの抽出物を用いることが特に好ましい。【００３３】  アルニカ（Ａｒｎｉｃａ ｍｏｎｔａｎａ  Ｌ．）は、キク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）に属する多年草で、葉、茎、花、根等の各部位および全草を用いることができるが、根および頭花から選択される１種または２種以上の部位を用いることが好ましく、これらの抽出物を用いることが特に好ましい。【００３４】  ホウセンカは、ツリフネソウ科（Ｂａｌｓａｍｉｎａｃｅａｅ）ツリフネソウ属（Ｉｍｐａｔｉｅｎｓ）に属する双子葉植物で、ホウセンカ（Ｉｍｐａｔｉｅｎｓ Ｂａｌｓａｍｉｎａ  Ｌ．）、アフリカホウセンカ（Ｉｍｐａｔｉｅｎｓ ｓｕｌｔａｎｉ  Ｈｏｏｋ．ｆ．）、ツリフネソウ（Ｉｍｐａｔｉｅｎｓ Ｔｅｘｔｏｒｉ  Ｍｉｑ．）、キツリフネ（Ｉｍｐａｔｉｅｎｓ ｎｏｌｉ−ｔａｎｇｅｒｅ  Ｌ．）、インパチエンス・カペンシス（Ｉｍｐａｔｉｅｎｓ． ｃａｐｅｎｓｉｓ  Ｍｅｅｒｂ．）、インパチエンス・エドゲウォルチイ（Ｉｍｐａｔｉｅｎｓ ｅｄｇｅｗｏｒｔｈｉｉ  Ｈｏｏｋ．ｆ．）、インパチエンス・グランデュリフェラ（Ｉｍｐａｔｉｅｎｓ ｇｌａｎｄｕｌｉｆｅｒａ  Ｒｏｙｌｅ）、インパチエンス・オリベリ（Ｉｍｐａｔｉｅｎｓ． ｏｌｉｖｅｒｉ  Ｃ．Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｘ  Ｗ．Ｗａｔｓ．）、インペチエンス・パリダ（Ｉｍｐａｔｉｅｎｓ ｐａｌｌｉｄａ  Ｎｕｔｔ．）、インパチエンス・パルヴィフローラ（Ｉｍｐａｔｉｅｎｓ ｐａｒｖｉｆｌｏｒａ  ＤＣ．）等を用いることができる。花、茎、葉、根等の各部位から選択される１種または２種以上、もしくは全草を用いることができるが、効果の点から、ホウセンカ（Ｉｍｐａｔｉｅｎｓ Ｂａｌｓａｍｉｎａ  Ｌ．）の葉が好ましく、葉からの抽出物を用いることが特に好ましい。【００３５】  エキナセアは、キク科エキナセア属（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ）に属する多年草で、エキナセア（ムラサキバレンギク：Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）、エキナセア・シムラタ（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｓｉｍｕｌａｔａ）、エキナセア・オパラドクサ（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐａｒａｄｏｘａ）、エキナセア・アトロルベンス（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ａｔｒｏｒｕｂｅｎｓ）、エキナセア・パリダ（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐａｌｌｉｄａ）、エキナセア・アングスティフォリア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ  ａｎｇｓｔｉｆｏｌｉａ）等を用いることができる。葉、茎、花、根等の各部位および全草を用いることができるが、葉、茎および根から選択される１種または２種以上の部位を用いることが好ましく、これらの抽出物を用いることが特に好ましい。【００３６】  上記植物は、採取した生の植物をそのまま、または乾燥させて用いることができるが、抽出物を用いることが好ましい。抽出物の調製は次のようにして行うことができる。【００３７】  抽出物を得る抽出溶媒としては、水；エタノール、メタノール、イソプロパノール、イソブタノール、ｎ−ヘキサノール、メチルアミルアルコール、２−エチルブタノール、ｎ−オクチルアルコールなどのアルコール類；グリセリン、エチレングリコール、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコール、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、トリエチレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ヘキシレングリコールなどの多価アルコールまたはその誘導体；アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、メチル−ｎ−プロピルケトンなどのケトン類；酢酸エチル、酢酸イソプロピルなどのエステル類；エチルエーテル、イソプロピルエーテル、ｎ−ブチルエーテルなどのエーテル類；などの極性溶媒から選択される１���、または２種以上の混合溶媒を好適に使用することができる。また、リン酸緩衝生理食塩水を用いることもでき、抽出溶媒の種類は特に限定はされない。【００３８】  Ｗｎｔ５ａの細胞からの分泌を制御するという作用効果の点からは、極性溶媒を用いることが好ましく、さらには、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチルエステル、１，３−ブチレングリコール、および水からなる群から選択される１種、または２種以上の混合溶媒を用いることが好ましく、特に水を単独であるいは水を含む混合溶媒として用いることが好ましい。【００３９】  抽出方法としては、室温、冷却または加温した状態で浸漬あるいは還流させて抽出する方法、水蒸気蒸留等の蒸留法を用いて抽出する方法、生の植物から圧搾して抽出物を得る圧搾法等が例示され、これらの任意の方法を単独で、または２種以上を組み合わせて、抽出を行うことができる。【００４０】  抽出の際の植物と溶媒との比率は特に限定されるものではないが、植物１に対し、溶媒０．５〜１０００重量倍が好ましく、特に抽出操作、効率の点で０．５〜１００重量倍が好ましい。抽出温度は、常圧下で室温から溶剤の沸点以下の範囲とするのが便利であり、抽出時間は、植物と溶媒との組み合わせや抽出温度などによって異なるため一律には規定できないが、目安としては２時間〜２週間の範囲とするのが好ましい。【００４１】  このようにして得られた植物抽出物は、抽出物をそのまま用いることもできるが、本発明のＷｎｔ５ａの細胞からの分泌を制御するという作用効果を失わない範囲内で、脱臭、脱色、濃縮等の精製操作を加えてもよいし、さらにはカラムクロマトグラフィー等を用いて分画物として用いてもよい。これらの精製処理物や分画処理物は、これらから溶媒を除去することによって乾固物とすることもでき、さらにアルコールなどの溶媒に可溶化した形態、あるいは乳剤の形態とすることもでき、また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。【００４２】  また、本発明で用いるアルギニンは、塩基性のアミノ酸であり、好ましくはＬ−アルギニンである。アルギニンの発毛・育毛・養毛剤全量に対する配合量としては、０．００１〜１０重量％程度とするのが好ましい。【００４３】  上述の植物の抽出物の発毛・育毛・養毛剤全量（エキナセアの場合は脱毛剤全量）に対する配合量としては、用いる植物の種類、抽出溶媒および抽出条件、抽出後の処理などにより異なるが、一般に、植物を粉砕処理後の抽出溶媒に浸漬して抽出して得られる上澄の状態の成分として、０．００１〜１０重量％程度であることが好ましい。【００４４】  なお、発毛・育毛・養毛剤ないしは脱毛剤は、上述したように、液状、乳剤状、ゲル状、クリーム状、軟膏状、フォーム状、ミスト状など種々の剤型で提供することができ、また、発毛・育毛・養毛剤はヘアトニック、ヘアジェル、ヘアクリーム、ヘアトリートメントローション、ヘアフォーム、ヘアミスト、ヘアシャンプー、ヘアリンスなどとして提供することができる。また、本発明に係る発毛・育毛・養毛剤ないしは脱毛剤に、本発明の作用を損なわない範囲で、油性成分、界面活性剤、保湿剤、紫外線吸収剤、抗酸化剤、血行促進剤、局所刺激剤��毛包賦活剤、抗脂漏剤、抗炎症剤、香料、色素、防菌防黴剤などの一般的な育毛剤用添加剤を含有させることもできることは上述したとおりである。なお、ヘアトニックやヘアジェルなどのヘアケア製品については、本発明のＷｎｔ５ａ及び／又はＷｎｔ１０ａまたはＷｎｔ５ａの細胞からの分泌を制御する物質を配合することを除いて、それぞれの製品における公知の配合処方や製造方法に基づいて調製することができる。【００４５】  本発明で用いるＷｎｔ５ａおよびＷｎｔ１０ａは、細胞賦活作用および細胞死抑制作用を示すものであって、特に、毛乳頭細胞の細胞賦活作用および毛乳頭細胞の細胞死抑制作用を示すことから、毛包細胞ないしは毛母細胞の細胞賦活作用および細胞死抑制作用を示すものである。すなわち、これらのＷｎｔ５ａ及び／又はＷｎｔ１０ａを有効成分とするか、あるいはＷｎｔ５ａ及び／又はＷｎｔ１０ａを細胞から分泌を促進する物質を有効成分とする細胞賦活剤または細胞死抑制剤およびこれらを含有する新規な発毛・育毛・養毛剤が提供される。【００４６】  一方、Ｗｎｔ５ａまたはＷｎｔ１０ａは毛乳頭細胞の細胞死を抑制することから、Ｗｎｔ５ａまたはＷｎｔ１０ａの細胞から分泌を抑制することにより毛乳頭細胞の細胞死を促し、これにより毛包細胞ないしは毛母細胞の細胞死を促進することができ、結果として毛包を喪失することができる。すなわち、Ｗｎｔ５ａまたはＷｎｔ１０ａの細胞から分泌を抑制する物質を有効成分とする細胞死促進剤ならびにこれを含有する新規な脱毛剤も提供される。
【実施例】
【００４７】  以下、実験例により、本発明をさらに詳しく説明する。【００４８】（Ａ）Ｗｎｔ５ａおよびＷｎｔ１０ａの細胞賦活効果
発毛、育毛、養毛作用の評価を目的に、各Ｗｎｔ（Ｗｎｔ１、３、３ａ、４、５ａ、１０ａ、１０ｂ、１１）を用いて毛乳頭細胞に対する細胞賦活作用を評価した。【００４９】  １．ＷｎｔのｃＤＮＡ作製
ＷｎｔのｃＤＮＡは、一部のＷｎｔが市販されているのみであったため、評価に必要なＷｎｔの一部は市販品を購入、市販されていないものについては動物組織よりｃＤＮＡを調製した。すなわち、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１についてはＩｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社製）を用いて、マウスの皮膚組織からｍＲＮＡを抽出し、Ｗｎｔの既知のＤＮＡ配列（（Ｇｅｎｅｂａｎｋ：ＮＭ  ００９５１８；Ｗｎｔ１０ａ）、（Ｇｅｎｅｂａｎｋ：ＮＭ  ０１１７１８；Ｗｎｔ１０ｂ）、（Ｇｅｎｅｂａｎｋ：ＸＭ  １２４９６１；Ｗｎｔ１１））をもとに、それぞれのプライマー（約２０塩基程度）を作製し、ＰＣＲ法によりそれぞれのｃＤＮＡを得た。一方、残りのＷｎｔ１、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａのｃＤＮＡについては、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社より購入（カタログ番号２１−１２１、２１−１２３、２１−１２４、２１−１２５、２１−１３３）した。【００５０】  ２．Ｗｎｔ安定的発現ＣＨＯ細胞の作製
Ｗｎｔタンパク質は活性型での精製が困難であり、そのためＷｎｔを安定的に分泌する細胞をまず作製し、その細胞を４日間培養し、培地中にＷｎｔが分泌されたもの（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ：調製培地）をＷｎｔの作用評価に用いた。【００５１】  すなわち、得られた各ＷｎｔのｃＤＮＡを、ネオマイシン耐性を有する発現ベクターであるｐＵＳＥａｍｐに挿入してプラスミド（ｐＵＳＥａｍｐ−Ｗｎｔとする）を調製し、次いで、ｐＵＳＥａｍｐ−Ｗｎｔをリポフェクション法によりＣＨＯ細胞に導入し、５００または７５０μｇ／ｍＬの抗生物質（Ｇ４１８）含有培地にて選別し、Ｗｎｔ安定的発現ＣＨＯ細胞を得た。【００５２】  ３．Ｗｎｔ調製培地の作製
得られたＷｎｔ安定的発現ＣＨＯ細胞を、１０％のＦＢＳ（ウシ胎児血清）と、５００または７５０μｇ／ｍＬのＧ４１８を含むＨａｍ’ｓＦ１２培地中で、直径１０ｃｍの培養皿に２×１０４細胞／ｃｍ２の密度で播種し、３日間培養した。次いで、培地を無血清ＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）に代え、４日間培養した。培地を回収し、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄（調製培地）を得た。一方、親株のＣＨＯ細胞を用いて、同様に培養し、遠心分離し、上澄（調製培地）を得、ネガティブコントロール（ＮＣ）として調製した。【００５３】  得られた上澄（調製培地）を、Ａｍｉｃｏｎ−Ｕｌｔｒａ１５（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて、４０００ｇ×の条件で、５倍、１０倍、２０倍に濃縮した。【００５４】  次に、得られた調製培地中へのＷｎｔの分泌を次のようにしてイムノブロット法により評価し、導入したＷｎｔが発現していることを確認した。【００５５】  各Ｗｎｔの検出に用いた抗体には、パーオキシダーゼ結合抗ＨＡ、高親和性（３Ｆ１０）（Ｒｏｃｈｅ社製、カタログ番号Ｎｏ．２０１３８１９）抗体を用い、これを２０００倍にＰＢＳ−Ｔで希釈して用いた。【００５６】  得られた調製培地を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％アクリルアミドゲル）にかけ、タンパク質を分離し、分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｐａｌｌ  Ｆｌｕｏｒｏ  Ｔｒａｎｓ  Ｗ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｐａｌｌ  Ｃｏｐｏｒａｔｉｏｎ社製）上に転写した。膜を１０％のスキムミルクを含有するＰＢＴ−Ｔで室温下１時間反応させてブロッキングし、２０００倍に希釈したパーオキシダーゼ結合抗ＨＡ、高親和性（３Ｆ１０）（Ｒｏｃｈｅ社製、カタログ番号Ｎｏ．２０１３８１９）抗体とともに室温下で２時間インキュベートし、ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、カタログ番号Ｎｏ．ＲＰＮ２１０９）の試薬を用いた化学発光法により可視化した。その結果、調製した全てのＷｎｔ安定的発現ＣＨＯ細胞が各Ｗｎｔを発現し、培地中に分泌していることが確認された。図１に各Ｗｎｔについて、濃縮率５倍のときのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動の結果を示した。なお、図中、「Ｗ１」などはＷｎｔ１など、それぞれの電気泳動の結果を示し、「ＮＣ」はネガティブコントロールの電気泳動の結果を示している。図１によると、各Ｗｎｔのバンドが約４７．５ｋＤａ付近に検出されていることがわかる。【００５７】  ４．細胞賦活作用の評価
Ｗｎｔの毛乳頭細胞の賦活作用を「生細胞数を維持する或いは高める作用」とみなし、細胞内に蓄積される水溶性ホルマザン量を測定することにより推定した。【００５８】  すなわち、ヒト頭皮毛乳頭細胞（東洋紡社製）を、ヒト頭皮毛乳頭細胞用低血清培地（東洋紡社製）中、Ｉ型コラーゲンコート用９６ウェルマイクロプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に、各ウェルあたり１×１０４細胞となるように播種し、３７℃、５％の二酸化炭素存在下で、２４時間培養した。次いで、培地を、１００μｌのＷｎｔを含む培地に交換し、さらに４８時間培養を続けた。培養終了後、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（同仁化学社製）を用いて、製品マニュアルに従い細胞内の水溶性ホルマザン量を測定した。すなわち、培養終了後、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８溶液を各ウェルに１０μｌずつ添加し、炭酸ガスインキュベーター内で１時間呈色反応を行い、４５０ｎｍで吸光度を測定した。【００５９】  この結果、評価したＷｎｔのうちＷｎｔ５ａおよびＷｎｔ１０ａに顕著な細胞賦活効果が認められた。結果を図２に、また、細胞賦活効果があったＷｎｔ５ａおよびＷｎｔ１０ａについて表１に示した。
【表１】
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【００６０】  図２は、各濃縮率でのＷｎｔを含まない調製培地（ＮＣ、対照）で培養したときの細胞数を基準（１００％）として、各Ｗｎｔを含む調製培地で培養したときの細胞数を相対的に示したものであり、バーは標準偏差を表し、「＊」および「＊＊」は、Ｔ検定において、それぞれｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１で有意であったことを示している。図２によると、Ｗｎｔ５ａは、濃縮率５倍以上で濃度依存的かつ有意な細胞賦活作用を示し、濃縮率２０倍では１４７％と最も高い細胞賦活作用を有していることがわかった。また、Ｗｎｔ１０ａは、濃縮率５倍以上で、約１１０％程度の細胞賦活性を示すとともに、濃縮率１０倍のときには有意な細胞賦活作用を示していることがわかった。【００６１】  なお、本発明の実験に用いたＷｎｔ５ａおよびＷｎｔ１０ａはマウス由来のものではあるが、マウス由来のＷｎｔ５ａはヒトのＷｎｔ５ａとの相同性が９９％以上と高いものであり、また、マウス由来のＷｎｔ１０ａはヒトのＷｎｔ１０ａとの相同性が９５％以上と高いものである。そして、マウス由来のＷｎｔ５ａおよびＷｎｔ１０ａはともにヒトの毛乳頭細胞に対する細胞賦活作用を示すものであることから、マウス由来のＷｎｔ５ａおよびＷｎｔ１０ａの他、本発明にヒト由来のＷｎｔ５ａおよびＷｎｔ１０ａを用いることができることはいうまでもない。また、ヒトあるいはマウス由来のＷｎｔ５ａやＷｎｔ１０ａと相同性の高い他の生物種のＷｎｔ５ａやＷｎｔ１０ａとしては、ラットおよびその他の哺乳類に由来するものがあげられ、これらのＷｎｔ５ａおよびＷｎｔ１０ａも同様に本発明に使用できると思われる。【００６２】（Ｂ）Ｗｎｔ５ａの毛乳頭細胞死抑制効果
この細胞賦活作用の作用機序として、無血清条件で惹き起こされる細胞死を抑制するメカニズムが考えられるため、以下のようにしてこのＷｎｔ５ａの細胞死抑制作用の試験を実施した。【００６３】  １．細胞死抑制の評価
ヒト毛乳頭細胞は、東洋紡から購入し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（コージンバイオ社製）を用いて培養した。継代５回目のヒト毛乳頭細胞を、各ウェルあたり０．５×１０４細胞となるようにＩ型コラーゲンコート９６ウェルマイクロプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に播種し、２４時間培養した。培養液を取り除き血清無添加のＤＭＥＭ（無血清培地）で２回細胞を洗浄した後、無血清培地、またはリコンビナントＷｎｔ５ａ（Ｒ＆Ｄ社製）を添加した（６３〜５００ｎｇ／ｍｌ）無血清培地と交換し、更に２４時間、培養を行った。【００６４】  細胞数はＣｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８（同仁化学社製）を用いて測定した。すなわち、無血清培地で細胞洗浄を行った直後の細胞数および培養終了後の細胞数を測定するために、１／１０量のＣｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８溶液を添加した１％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地に交換し、１時間呈色反応を行い、４５０ｎｍで吸光度を測定した。【００６５】  無血清培地で細胞洗浄を行った直後の細胞数を１００％とし、試験培地に交換し培養終了後の細胞数を測定し、細胞の生存率を求めた。結果を図３に示した。図３に示す各カラムは左から順に、無血清培地で細胞洗浄を行った直後の細胞数（基準値、１００％、灰色カラム）、ＤＭＥＭ培地に、ＦＢＳ（黒カラム）、ＢＳＡ（薄灰色カラム）を添加したもの、Ｗｎｔ５ａを添加しなかったもの（無血清培地そのもの、白カラム）、Ｗｎｔ５ａを６３、１２５、２５０および５００ｎｇ／ｍｌとなるように添加した培地（白カラム）を示している。また、バーは標準偏差を表し、「＊」および「＊＊」は、Ｔ検定において、それぞれｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１で有意であったことを示している。【００６６】  図３によると、無血清培地で細胞洗浄を行った直後の細胞数（左端の灰色カラム）に対し、無血清培地（Ｗｎｔ５ａなし）に交換し、培養終了した細胞数（左から４つ目の白カラム）は細胞死により細胞生存率が６９．６％と低下する（ｐ＜０．０１）。しかしながらＷｎｔ５ａを６３から５００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加することにより生存率は１２５ｎｇ／ｍｌで９６．７％まで回復し（ｐ＜０．０５）、５００ｎｇ／ｍｌで１１１．０％まで上昇する（ｐ＜０．０１）ことがわかった（左から５〜８つ目の白カラム）。【００６７】  以上より、無血清培地にて誘導される細胞死に対し、Ｗｎｔ５ａは細胞死を抑制する作用があることがわかった。【００６８】（Ｃ）Ｗｎｔ５ａの細胞からの分泌を制御する物質の探索
Ｗｎｔ５ａの細胞からの分泌を促進または抑制する物質をリアルタイムＰＣＲを用いて、Ｗｎｔ５ａの発現量を測定することにより探索した。【００６９】  １．試料の調製
オレンジについては、ビターオレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ ａｕｒａｎｔｉｕｍ  Ｌ．）の生花を水蒸気蒸留し、精油を採取した残水を、オレンジフラワー水として使用した。【００７０】  タイム、アルニカ、ホウセンカおよびエキナセア抽出物については、それぞれ、タイム（Ｔｈｙｍｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ  Ｌ．）、アルニカ（Ａｒｎｉｃａ ｍｏｎｔａｎａ  Ｌ．）、ホウセンカ（Ｉｍｐａｔｉｅｎｓ Ｂａｌｓａｍｉｎａ  Ｌ．）、エキナセア（ムラサキバレンギク：Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）を用い、各植物の各使用部位の乾燥物１ｋｇを粉砕し、１０Ｌの溶媒に室温で２週間浸漬し、濾過した濾液を各植物抽出液として用いた。表２に、各植物抽出液について、使用した植物の使用部位および溶媒を示した。
【表２】
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【００７１】  ２．Ｗｎｔ５ａの細胞からの分泌制御の評価
ヒト毛乳頭細胞（ｈＤＰＣ，東洋紡社製）は、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用いて維持培養した。【００７２】  五代目ヒト毛乳頭細胞（ｈＤＰＣ）を６穴プレートに１％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用いて播種し、一晩培養した。サンプル非添加／添加培地と交換し、さらに２４時間培養した。培養終了後、培地を除去し、ＰＢＳ（−）で洗浄後、ＩＳＯＧＥＮ試薬（ＷＡＫＯ社製）を用いて全てのＲＮＡ（総ＲＮＡ）を抽出した。各総ＲＮＡ  １２５０ｎｇをＴａＫａＲａＲＴ−ＰＣＲｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用い、添付のプロトコルに従って全量２５μｌの反応系でＦｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成を行った。この反応液を使用し、リアルタイムＰＣＲを行った。【００７３】  Ｗｎｔ５ａ  ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡは配列番号１および２のプライマー（それぞれ、Ｗｎｔ５ａの６２１〜６４０および７６２〜７８０の塩基配列、表３）を使用して、サイバーグリーン（ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ）法によるリアルタイムＰＣＲで測定した。このときの試料間の誤差補正のために、ＧＡＰＤＨ（グリセリルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを配列番号３および４のプライマー（それぞれ、ＧＡＰＤＨの５０２〜５２２および６２９〜６４８の塩基配列、表３）を使用したサイバーグリーン法によるリアルタイムＰＣＲの測定も行った。
【表３】
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【００７４】  同一の試料毎に３本の反応ウェルを使用して、リアルタイムＰＣＲ反応１反応ウェル当たり、総ＲＮＡ  １００ｎｇに相当する分量を投入して鋳型とした。反応１ウェル当たり、６ｐｍｏｌずつのプライマー、最終濃度１倍のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を加えた。リアルタイムＰＣＲは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７５００  Ｆａｓｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用してサイバーグリーン法の標準的方法（９５℃１５分、９５℃１５秒、６０℃１分×４５サイクル、その後解離曲線を描くために９５℃まで緩やかに上昇）にて行った。なお、プライマー非添加の反応で増幅が検出されないことを確認すると同時に、解離曲線のパターンから、対照配列以外の増幅反応が発生していないことを毎回確認した。測定後、倍数増幅の算出が可能なように演算開始サイクル数および演算終了サイクル数を設定し、倍数増幅範囲における増幅率であるＲ値を求めた。各試料については３ウェルの反応それぞれについて、増幅が一定量に到達するに要したサイクル数をＣＴ値として求め、１／（ＲＣＴ）値を求めることによりｃＤＮＡ量の割合を算出した。その平均およびＳＤ値を求めた後、サンプル非添加時及び添加時におけるＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡとＷｎｔ５ａ  ｃＤＮＡの比を求め、非添加時の値を１００とした相対値をＷｎｔ５ａ  ｍＲＮＡ平均発現率として、表４に示した。
【表４】
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【００７５】  表４によると、アルニカ、オレンジ、タイム、ホウセンカからの抽出物およびＬ−アルギニンにＷｎｔ５ａの発現を促進する効果がある一方、エキナセアの抽出物にはＷｎｔ５ａの発現を抑制する効果があることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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