(57)【要約】本発明は、生体内の標的細胞または組織に選択的に所望の薬物（例えば生理活性ペプチドまたはそれをコードする遺伝子）を輸送しえる標的指向性運搬体を提供する。具体的には、これは、ＭＡＭドメインもしくはそれを一部に有するポリペプチド、またはＭＡＭドメインもしくはそれを一部に有するポリペプチドをコードする遺伝子を有する核酸であって、所望の薬物を結合させて、該薬物を標的組織に輸送するために用いられる標的指向性運搬体である。さらに、本発明は、上記標的指向性運搬体に、標的組織に輸送するための薬物が結合されてなる標的指向性薬物複合体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＡＭドメイン（ｍｅｐｒｉｎ，５Ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  μ−ｄｏｍａｉｎ）もしくはそれを一部に有するポリペプチド、またはＭＡＭドメインもしくはそれを一部に有するポリペプチドをコードする遺伝子を有する核酸であって、所望の物質を結合させて、該物質を標的組織に輸送するために用いられる標的指向性運搬体。
【請求項２】
下記の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有するＭＡＭドメイン（ｍｅｐｒｉｎ，５Ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  μ−ｄｏｍａｉｎ）もしくはそれを一部に有するポリペプチド、または上記ＭＡＭドメインもしくはそれを一部に有するポリペプチドをコードする遺伝子を有する核酸であって、所望の物質を結合させて、該物質を標的組織に輸送するために用いられる標的指向性運搬体；
（ａ）配列番号１に示される、ネフロネクチンのＭＡＭドメインのアミノ酸配列、
（ｂ）上記ネフロネクチンのＭＡＭドメインのアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつラミニンのα４鎖またはα５鎖に結合性を有するアミノ酸配列。
【請求項３】
上記（ｂ）が、配列番号１に示されるネフロネクチンのＭＡＭドメインのアミノ酸配列と、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である、請求項２記載の標的指向性運搬体。
【請求項４】
上記（ｂ）が、ヒト由来ネフロネクチンのＭＡＭドメインのアミノ酸配列である、請求項２記載の標的指向性運搬体。
【請求項５】
上記（ｂ）が、配列番号３７に示されるアミノ酸配列である、請求項２記載の標的指向性運搬体。
【請求項６】
下記の（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列を有するＭＡＭドメイン（ｍｅｐｒｉｎ，５Ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  μ−ｄｏｍａｉｎ）もしくはそれを一部に有するポリペプチド、または上記ＭＡＭドメインもしくはそれを一部に有するポリペプチドをコードする遺伝子を有する核酸であって、所望の物質を結合させて、該物質を標的組織に輸送するために用いられる標的指向性運搬体；
（ｃ）配列番号１７または１９に示される、ネフロネクチンのアミノ酸配列、
（ｄ）上記ネフロネクチンのアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつラミニンのα４鎖またはα５鎖に結合性を有するアミノ酸配列。
【請求項７】
上記（ｄ）が、配列番号１７または１９に示されるネフロネクチンのアミノ酸配列と、少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列である、請求項６記載の標的指向性運搬体。
【請求項８】
上記（ｄ）が、ヒト由来ネフロネクチンのアミノ酸配列である、請求項６記載の標的指向性運搬体。
【請求項９】
上記（ｄ）が、配列番号５３に示されるアミノ酸配列である、請求項６記載の標的指向性運搬体。
【請求項１０】
腎臓、新生血管、肺、膵臓、または大血管に対して指向性を有することを特徴とする請求項２または６に記載する標的指向性運搬体。
【請求項１１】
下記の（ｅ）または（ｆ）のアミノ酸配列を有するＭＡＭドメイン（ｍｅｐｒｉｎ，５Ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  μ−ｄｏｍａｉｎ）もしくはそれを一部に有するポリペプチド、または上記ＭＡＭドメインもしくはそれを一部に有するポリペプチドをコードする遺伝子を有する核酸であって、所望の物質を結合させて、該物質を標的組織に輸送するために用いられる標的指向性運搬体；
（ｅ）配列番号３に示される、ＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメインのアミノ酸配列、
（ｆ）上記ＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメインのアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつラミニンのα３鎖に結合性を有するアミノ酸配列。
【請求項１２】
上記（ｆ）が、配列番号３に示されるＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメインのアミノ酸配列と、少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列である、請求項１１記載の標的指向性運搬体。
【請求項１３】
上記（ｆ）が、ヒト由来ＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメインのアミノ酸配列である、請求項１１記載の標的指向性運搬体。
【請求項１４】
上記（ｆ）が、配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有するものである、請求項１１記載の標的指向性運搬体。
【請求項１５】
下記の（ｇ）または（ｈ）のアミノ酸配列を有するＭＡＭドメイン（ｍｅｐｒｉｎ，５Ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  μ−ｄｏｍａｉｎ）もしくはそれを一部に有するポリペプチド、または上記ＭＡＭドメインもしくはそれを一部に有するポリペプチドをコードする遺伝子を有する核酸であって、所望の物質を結合させて、該物質を標的組織に輸送するために用いられる標的指向性運搬体；
（ｇ）配列番号２１に示される、ＭＡＥＧ蛋白質のアミノ酸配列、
（ｈ）上記ＭＡＥＧ蛋白質のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつラミニンのα３鎖に結合性を有するアミノ酸配列。
【請求項１６】
上記（ｈ）が、配列番号２１に示されるＭＡＥＧ蛋白質のアミノ酸配列と、少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列である、請求項１５記載の標的指向性運搬体。
【請求項１７】
上記（ｈ）が、ヒト由来ＭＡＥＧ蛋白質のアミノ酸配列である、請求項１５記載の標的指向性運搬体。
【請求項１８】
上記（ｈ）が、配列番号５５に示されるアミノ酸配列である、請求項１５記載の標的指向性運搬体。
【請求項１９】
毛包、皮膚（表皮）、または肺に対して指向性を有することを特徴とする請求項１１または１５に記載する標的指向性運搬体。
【請求項２０】
発現ベクターの形態を有する、請求項１に記載する標的指向性運搬体。
【請求項２１】
請求項１に記載の標的指向性運搬体に、標的組織に輸送するための薬物が結合されてなる標的指向性薬物複合体。
【請求項２２】
標的指向性薬物複合体が、ペプチドまたはタンパクからなる薬物を結合してなるポリペプチド形態を有するか、または核酸（遺伝子を含む）からなる薬物を結合してなるポリヌクレオチド形態を有するものである、請求項２１に記載する標的指向性薬物複合体。
【請求項２３】
請求項２１に記載する標的指向性薬物複合体を有効成分として含む医薬組成物。
【請求項２４】
標的指向性薬物として、請求項２１に記載する標的指向性薬物複合体を用いることを特徴とする、ドラッグデリバリーシステムまたはターゲッティング療法。
【請求項２５】
ＭＡＭドメインもしくはそれを一部に有するポリペプチド、またはＭＡＭドメインもしくはそれを一部に有するポリペプチドをコードする遺伝子を有する核酸の、所望の物質を結合させて該物質を標的組織に輸送するために用いられる標的指向性運搬体の調製のための使用。
【請求項２６】
請求項１記載の標的指向性運搬体の、標的組織に輸送するための薬物が結合されてなる標的指向性薬物複合体の調製のための使用。
【請求項２７】
請求項１記載の標的指向性運搬体に薬物が結合されてなる標的指向性薬物複合体の、標的組織や細胞に局所的に薬物を輸送して治療するドラッグデリバリーシステムまたはターゲッティング療法における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、生理活性ペプチドやそれをコードする遺伝子などの目的物質を、標的細胞または組織に、選択的に輸送ないしは結合させるための運搬体に関する。
本発明の標的指向性運搬体は、医学・薬学分野並びに化粧品分野等において、有用物質の生体内デリバリーシステム（例えば、ドラックデリバリーシステム）に利用可能なバイオマテリアルとして有用である。
【背景技術】  通常、薬物の治療効果は、その薬物若しくはそれから生じる有用物質が特定の標的部位に到着し、そこで作用することによって有効に発現される。その一方で、薬物が不必要な部位に作用することによって副作用が生じることも知られている。よって、薬物を有効かつ安全に使用するために、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の開発が求められている。
一方、サイトカインや細胞成長因子などの生理活性ペプチドの中には医薬品としての用途が期待されているものが多い（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１０９巻、第１号、１〜６頁（１９８９）；Ｒ．Ａ．Ｆ．Ｃｌａｒｋ編、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ、第２版、第６章、２３７〜２４８頁（１９８８）；Ｚｉｅｇｌｅｒら編、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ、第３部、第１２章、２０６〜２２８頁（１９９７），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋなど参照のこと）。しかしながら、一般的に生理活性ペプチドは生体内での安定性が悪く、局所保持や徐放が困難なために標的組織での効果が低く、他部位での副作用もある。このため、実用化がなかなか進んでいないのが現状であり、効率の良いドラッグデリバリーシステムが切望されている。この問題を解決するために、生理活性ペプチドに生体適合性を有する高分子を融合もしくは混合することにより、生体内での標的指向性もしくは徐放性を確保しようとする試みが数多くなされている。また、生理活性ペプチドを他のペプチドと遺伝子工学的にハイブリッド化し、これを生体内で発現させることにより、生理活性ペプチドのターゲッティングを達成しようとする試みもなされている。
これらに関連する技術として、特開平５−１７８８９７号公報には、細胞外マトリックス成分の一つであるフィブロネクチン（ＦＮ）の細胞接着ドメイン配列と、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）とをハイブリッド化した機能性ポリペプチドが開示されている。また、細胞外マトリックスを介しての徐放性をねらったものとして、ウシフォンビルブランド由来のコラーゲン結合性デカペプチドとトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）とのハイブリッドポリペプチドであるコラーゲンターゲッティングＴＧＦ−βが報告されている（Ｔｕａｎら、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｅｒｃｈ，第３４巻、１号、１〜９頁（１９９６）；Ｈａｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、第１１巻、１６９〜１７８頁（１９９７）；Ｇｏｒｄｏｎら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、第８巻、１３８５〜１３９４頁（１９９７）；米国特許第５８００８１１号公報）。また、西らによって、嫌気性のグラム陽性桿菌であるクロストリジウム  ヒストリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）のコラゲナーゼ由来のコラーゲン結合性ポリペプチドとｂＦＧＦまたは上皮増殖因子（ＥＧＦ）とのハイブリッドポリペプチドが、コラーゲン結合性細胞増殖因子として提案されている（Ｎｉｓｈｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．ｏｆ  Ｓｃｉ，ＵＳＡ、第９５巻、７０１８〜７０２３頁（１９９８））。さらに、機能性蛋白質を細胞外マトリックスにターゲッティングする技術として、フィブロネクチン（ＦＮ）分子のＮ末端７０ｋＤａ領域とＣ末端３７ｋＤａ領域との間に異種蛋白質またはペプチドのアミノ酸鎖を挿入してなるキメラ蛋白質の利用も提案されている（特開平８−１４０６７７号公報）。
ところで、細胞と細胞外マトリックス（ＥＣＭ）蛋白質との相互作用は、細胞の生存、増殖、移動や分化において非常に重要である。これらの相互作用は、インテグリンや膜結合型プロテオグリカンのような細胞表面受容体を介して起こり、細胞内にシグナルを伝達する。上皮細胞では、細胞に直接接着しているＥＣＭ蛋白質は基底膜に存在している。基底膜は、上皮・実質細胞の直下に位置し、主にラミニン（ＬＮ）、ＩＶ型コラーゲン、ニドゲン、及びパールカンにより構成され、ここにさらに多様なマトリックス分子が編み込まれる（図１参照）。かかるマトリックス分子の中には、組織発生時一過性に、または組織特異的に発現するものがあり、これらは組織特異的な形態形成の決定や器官形成の制御に関わっていると考えられている。
基底膜を構成する蛋白質の一種であるラミニン（ＬＮ）は、α、β、γ鎖から成るヘテロ三量体の糖蛋白質である。恒常的に基底膜に存在していることから、ラミニンは組織の恒常性と器官形成の制御に重要な役割を果たすと考えられている。現在までに５つのα鎖、３つのβ鎖、及び３つのγ鎖が同定されており、これらの組み合わせで少なくとも１４種類の異なったラミニンアイソフォームが構成されることが示されている（Ｍｉｎｅｒ，Ｊ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｐａｔｔｏｎ，Ｂ．Ｌ．（１９９９）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３１，８１１−８１６）。図２Ａに示すように、ラミニンはα鎖のタイプによって大きく５種類に分類される。これは、ラミニンと細胞の相互作用が主にα鎖のＣ末端領域でおこるからであり、α３β１やα６β１のようなラミニン結合性インテグリンやα−ジストログリカン、シンデカンのような非インテグリン受容体は、ラミニンα鎖のＣ末端領域にある球状ドメインに結合する（図２Ｂ）。また、ラミニンの各α鎖は組織特異的・発生段階特異的な発現を示す。このことから、α鎖の種類に応じて各種ラミニンはそれぞれ組織特異的に発現分布しており、各部位で異なる機能を発揮している（図２Ａ参照）。例えば、α１鎖を有するラミニン（α１鎖ラミニン：α１鎖ＬＮ）は発生段階の組織のみで発現しているため、胚性幹細胞の分化とマトリックス会合に必須だと考えられている（Ｌｉ，Ｓ．，Ｅｄｇａｒ，Ｄ．，Ｆａｓｓｌｅｒ，Ｒ．，Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ，Ｗ．，ａｎｄ  Ｙｕｒｃｈｅｎｃｏ，Ｐ．Ｄ．（２００３）Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  ４，６１３−６２４；Ｌｉ，Ｓ．，Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｄ．，Ｃａｒｂｏｎｅｔｔｏ，Ｓ．，Ｆａｓｓｌｅｒ，Ｒ．，Ｓｍｙｔｈ，Ｎ．，Ｅｄｇａｒ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｙｕｒｃｈｅｎｃｏ，Ｐ．Ｄ．（２００２）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５７，１２７９−１２９０）。α２鎖を有するラミニン（α２鎖ラミニン：α２鎖ＬＮ）は主に骨格筋と心筋で発現しており、筋細胞の生存に必要である（Ｋｕａｎｇ，Ｗ．，Ｘｕ，Ｈ．，Ｖａｃｈｏｎ，Ｐ．Ｈ．，Ｌｉｕ，Ｌ．，Ｌｏｅｃｈｅｌ，Ｆ．，Ｗｅｗｅｒ，Ｕ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．（１９９８）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０２，８４４−８５２；Ｍｉｙａｇｏｅ，Ｙ．，Ｈａｎａｏｋａ，Ｋ．，Ｎｏｎａｋａ，Ｉ．，Ｈａｙａｓａｋａ，Ｍ．，Ｎａｂｅｓｈｉｍａ，Ｙ．，Ａｒａｈａｔａ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｔａｋｅｄａ，Ｓ．（１９９７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４１５，３３−３９）。α３鎖を有するラミニン（α３鎖ラミニン：α３鎖ＬＮ）は主として表皮下の基底膜に局在し、表皮細胞の生存に必須である（Ｒｙａｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｌｅｅ，Ｋ．，Ｍｉｙａｓｈｉｔａ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｃａｒｔｅｒ，Ｗ．Ｇ．（１９９９）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４５，１３０９−１３２３）。α４鎖を有するラミニン（α４鎖ラミニン：α４鎖ＬＮ）は主に血管に局在しており、毛細血管の成熟に必要である（Ｔｈｙｂｏｌｌ，Ｊ．，Ｋｏｒｔｅｓｍａａ，Ｊ．，Ｃａｏ，Ｒ．，Ｓｏｉｎｉｎｅｎ，Ｒ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｉｉｖａｎａｉｎｅｎ，Ａ．，Ｓｏｒｏｋｉｎ，Ｌ．，Ｒｉｓｌｉｎｇ，Ｍ．，Ｃａｏ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｔｒｙｇｇｖａｓｏｎ，Ｋ．（２００２）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２２，１１９４−１２０２）。α５鎖を有するラミニン（α５鎖ラミニン：α５鎖ＬＮ）は成体組織でもっとも幅広く発現しており、それを欠損させたマウスは胎盤の脈管構造、神経管の閉鎖、そして腎糸球体の欠失のために胎生致死となる（Ｍｉｎｅｒ，Ｊ．Ｈ．，Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｓａｎｅｓ，Ｊ．Ｒ．（１９９８）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４３，１７１３−１７２３；Ｍｉｎｅｒ，Ｊ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｉ，Ｃ．（２０００）Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２１７，２７８−２８９）。さらに、最近の報告ではα５鎖ＬＮが毛、肺、そして顎下腺の形態形成にも関わることが示されている（Ｌｉ，Ｊ．，Ｔｚｕ，Ｊ．，Ｃｈｅｎ，Ｙ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ｐ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｎ．Ｔ．，Ｇａｏ，Ｊ．，Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｍ．，Ｋｅｅｎｅ，Ｄ．Ｒ．，Ｏｒｏ，Ａ．Ｅ．，Ｍｉｎｅｒ，Ｊ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｋｏｖｉｃｈ，Ｍ．Ｐ．（２００３）Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２２，２４００−２４１０；Ｎｇｕｙｅｎ，Ｎ．Ｍ．，Ｍｉｎｅｒ，Ｊ．Ｈ．，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒ．Ａ．，ａｎｄ  Ｓｅｎｉｏｒ，Ｒ．Ｍ．（２００２）Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２４６，２３１−２４４；Ｋａｄｏｙａ，Ｙ．，Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ，Ｍ．，Ｎｏｍｉｚｕ，Ｍ．，Ｓｏｒｏｋｉｎ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｙａｍａｓｈｉｎａ，Ｓ．（２００３）Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２６３，１５３−１６４）。
このように、ラミニンの各α鎖が組織特異的・発生段階特異的な発現を示すことは、細胞外環境因子としてのラミニンの役割を考える上で重要である。実際、心臓という一つの器官を取り上げても、それを構成する細胞のタイプの違いによって、基底膜を構築するラミニンのタイプは大きく異なっている。心筋基底膜はα２鎖ＬＮで構築されているが、心筋周囲に張り巡らされている毛細血管基底膜はα４ＬＮ鎖で、また、太い血管の基底膜はα５鎖ＬＮで構築されている。このような各ラミニンアイソフォームの細胞特異的な発現の意義は、ノックアウトマウスなどの解析からも次第に明らかにされつつある。図３に示すように、様々なラミニン構成鎖のノックアウトマウスは特異的な表現型を示す（Ｒ．Ｎｉｓｈｉｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３４，４９７（２００３）；Ｊ．Ｈ．Ｍｉｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．：Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４３，１７１３（１９９８）；Ｂ．Ｌ．Ｐａｔｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．：Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ４，５９７（２００１）；Ｊ．Ｔｈｙｂｏｌｌ，ｅｔ  ａｌ．：Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２２，１１９４（２００２））。また皮膚の基底膜ではα３鎖がβ３鎖とγ２鎖とヘテロ三量体（α３β３γ２）を組んだラミニン−５が強く発現しているが、ヒトにおいてα３鎖や他のラミニン−５の構成鎖遺伝子異常は表皮が基底膜から剥離する表皮水疱症をきたす。筋細胞の基底膜に選択的に発現するα２鎖の変異は、ヒトにおいてもマウスにおいても筋ジストロフィーを起こす。一方、多くの細胞・組織に幅広く発現するα５鎖や多くのラミニンに共通して含まれるγ１鎖のノックアウトマウスは胎生致死となる。胎児期に高い発現が見られるα１鎖のノックアウトマウスも同様に胎生致死となり、その発生・器官形成における重要性が窺われる。
このようなラミニン（ＬＮ）を始めとして、ＩＶ型コラーゲン、ニドゲン及びパールカン等は、細胞や組織の種類によらず、どの基底膜でも構成的に発現している基底膜構成蛋白質であるが、最近の研究によって、基底膜には、これら以外にも組織特異的・発生段階特異的に発現する蛋白質が数多く存在することが知られるようになっている。
その一つが、ネフロネクチン（ＮＮ）である。ネフロネクチンはインテグリン結合に必要なＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）配列（細胞接着モチーフ）の他、５つのＥＧＦ様繰り返し配列とＭＡＭドメインから構成されている（図４参照のこと。但し、ネフロネクチン（ＮＮ）は、ここで示す「ＮＮ−ＦＬＡＧ」のうちＦＬＡＧタグを除く領域から構成される）。ネフロネクチンは基底膜に局在し、しかもα８β１インテグリンと共在していることから、インテグリンとの結合を介して腎の形成において関わっていることが強く示唆されている。事実、発生中の腎臓において選択的に尿管芽上皮細胞に発現されることが報告されている（Ｂｒａｎｄｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｒ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ａ．，Ｌｉｎｔｏｎ，Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｄ．，Ｂａｃｋｕｓ，Ｃ．，Ｄｅｎｄａ，Ｓ．，Ｍｕｌｌｅｒ，Ｕ．，ａｎｄ  Ｒｅｉｃｈａｒｄｔ，Ｌ．Ｆ．（２００１）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５４，４４７−４５８）。また、近年、腎臓以外のさまざまな臓器形成期の基底膜にも発現していることも明らかとなっている（Ｒ．Ｂｒａｎｄｅｎｂｅｒｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．：Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５４，４４７（２００１））。
また、組織特異的・発生段階特異的に基底膜に発現する蛋白質として、ＭＡＥＧ（ＭＡＭ−ａｎｄ  ＥＧＦ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｇｅｎｅ）蛋白質も知られている。これは、ネフロネクチンと同様にＭＡＭドメインを有するなど、ネフロネクチンと分子構造が非常によく似た蛋白質であり、これもまた限定された局在を示す。ＭＡＥＧは発達中の毛胞基底膜へ特異的に存在し、その発現は毛胞が成熟するにつれて減少することもわかっている（長田ら、投稿中につき未発表）。
【図面の簡単な説明】  図１は、基底膜と間質マトリックスの構造を示す模式図である。
図２のＡは、ラミニンアイソフォームの種類とその組織特異性を示す表であり、Ｂはラミニンの構造を示す模式図である。
図３は、ラミニンサブユニット遺伝子ノックアウトマウスの表現径と遺伝性疾患との関係を示す図である。
図４は、組み換えネフロネクチン（ＮＮ）とその欠失変異体（ＮＮ−ΔＭＡＭ−ＦＬＡＧ、ＮＮ−ＲＧＤ−ＦＬＡＧ、及びＮＮ−ＭＡＭ−ＦＬＡＧ）が有するドメイン構造の概略図である。「ＮＮ−ＦＬＡＧ」において、ＥＧＦ様繰り返し配列とＭＡＭドメインに挟まれた領域がＲＧＤリンカー部位である（「ＮＮ−ΔＭＡＭ−ＦＬＡＧ」ではＥＧＦ様繰り返し配列とＦＬＡＧタグに挟まれた領域、また「ＮＮ−ＲＧＤ−ＦＬＡＧ」ではシグナルペプチドとＦＬＡＧタグに挟まれた領域が、それぞれＲＧＤリンカー部位である）。なお、図には示していないが、ＲＧＤリンカー部位は、多くのＯ結合型糖鎖で修飾されている。「ＮＮ−ＦＬＡＧ」はＦＬＡＧ付き全長ネフロネクチン、「ＮＮ−ΔＭＡＭ−ＦＬＡＧ」はＭＡＭドメインを欠失したＦＬＡＧ付き全長ネフロネクチン、「ＮＮ−ＲＧＤ−ＦＬＡＧ」はＦＬＡＧ付きＲＧＤリンカー部位、及び「ＮＮ−ＭＡＭ−ＦＬＡＧ」はＦＬＡＧ付きＭＡＭドメインを示す。
図５は、精製した全長ＮＮ−ＦＬＡＧ（図Ａ中、ＮＮと示す）、ＮＮ−ΔＭＡＭ−ＦＬＡＧ（図Ａ中、ΔＭＡＭと示す）、ＮＮ−ＲＧＤ−ＦＬＡＧ（図Ｂ中、ＲＧＤと示す）、及びＮＮ−ＭＡＭ−ＦＬＡＧ（図Ｂ中、ＭＡＭと示す）の電気泳動像（１５％ゲル）を示す。図５のＡ及びＢにおいて、それぞれ右側は電気泳動後ＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｒ−２５０）染色した結果を、左側は電気泳動後、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体を用いて免疫ブロッティングを行った結果を示す。
図６は、実験例１においてネガティブ染色したネフロネクチン（ＮＮ）の電子顕微鏡写真画像図（Ａ，Ｂ）及びそれから推定されるＮＮの分子構造を示す図（Ｃ）である。図Ａにおいて、三角（▽）印はＮＮの単量体を指し、矢印はＮＮの多量体を指し示す。スケールバーは１００ｎｍを表す。図Ｂの左及び右の図は、図Ａの三角（▽）印の部分を高倍率にした画像である（スケールバーは１００ｎｍ）。
図７は、実験例２において、全長ＮＮ−ＦＬＡＧ（ＮＮ：図Ａ）、ＮＮ−ΔＭＡＭ−ＦＬＡＧ（ΔＭＡＭ：図Ｂ）、ＮＮ−ＲＧＤ−ＦＬＡＧ（ＲＧＤ：図Ｃ）、及びＮＮ−ＭＡＭ−ＦＬＡＧ（ＭＡＭ：図Ｄ）に対するＫＡ８細胞（インテグリンα８鎖を安定に発現する白血病細胞）の接着性及び細胞の伸展を調べた結果を示す図である。
図８は、実験例３において、各種の基底膜蛋白質〔ラミニン（ＬＮ−１、ＬＮ−２／４、ＬＮ−５、ＬＮ−８、ＬＮ−１０／１１）、フィブロネクチン（ＦＮ）、ビトロネクチン（ＶＮ）、コラーゲンＩ型、ＩＩ型、ＩＶ型及びＶ型〕に対するネフロネクチン（ＮＮ−ＦＬＡＧ）の結合性を調べた結果を示す図である。
図９は、ＮＮの結合特異性を、ラミニン（ＬＮ−２／４（α２β１／２γ１））とラミニン（ＬＮ−１０／１１（α５β１／２γ１））を用いた免疫共沈降アッセイで調べた結果を示す図である。
図１０は、ラミニン（ＬＮ−８）、ラミニン（ＬＮ−１０／１１）、及びフィブロネクチン（ＦＮ）に対するＮＮの結合を、それぞれ１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、または１μｇ／ｍｌヘパリン存在下、ならびにこれら非存在下（コントロール）で、固相結合アッセイにより評価した結果を示す図である。
図１１は、実験例４において、ネフロネクチン（全長）（ＮＮ−ＦＬＡＧ）及びその欠損変異体（ＮＮ−ΔＭＡＭ−ＦＬＡＧ、ＮＮ−ＲＧＤ−ＦＬＡＧ、及びＮＮ−ＭＡＭ−ＦＬＡＧ）のラミニン（ＬＮ−１０／１１）に対する結合活性を、固相結合アッセイにより評価した結果を示す図である。
図１２は、実験例５において、成体マウス腎臓の基底膜に対する、ネフロネクチン（全長）（ＮＮ−ＦＬＡＧ）及びその欠損変異体（ＮＮ−ＭＡＭ−ＦＬＡＧ）の結合を調べた結果を示す図である。図ＡはＮＮ−ＦＬＡＧの結果、図ＢはＮＮ−ＭＡＭ−ＦＬＡＧの結果、及び図Ｃはコントロール（ｎｏ−ｐｒｏｂｅ）である。
図１３のＡは、ＧＳＴ融合蛋白質（ＧＳＴ−ＭＡＥＧ−ＭＡＭ）の各種ラミニン（ＬＮ−１、ＬＮ−２／４、ＬＮ−５、ＬＮ−８、ＬＮ−１０／１１）に対する結合性をみた結果であり、図ＢはＧＳＴ融合蛋白質（ＧＳＴ−ＮＮ−ＭＡＭ）の各種ラミニン（上記と同じ）に対する結合性をみた結果を示す図である（実験例６）。
図１４は、実験例７において、全長ＮＮ（ＮＮ−ＦＬＡＧ）とそのＭＡＭドメイン（ＮＮ−ＭＡＭ−ＦＬＡＧ）について、それぞれ組換えＬＮ−１０（ｒＬＮ−１０）とそのＧドメイン欠損変異体（ＬＮ−１０ΔＧ）に対する結合活性を調べた結果を示す図である。
図１５は、実験例８において、マウスの腎臓組織におけるＮＮ及びＬＮ−α５鎖の局在を、免疫組織化学的染色法によって調べた結果を示す図である（原図はカラー図）。図Ａは、抗ＰＯＥＭ／ｎｅｐｈｒｏｎｅｃｔｉｎ抗体（抗ＮＮ抗体）で免疫染色した結果を、図Ｂは、抗ＬＮ−α５鎖抗血清（抗ＬＮ−α５抗体）で免疫染色した結果である。矢印は腎糸球体を示す。
【発明の開示】
本発明は、各種組織に特異的に存在する基底膜蛋白質に対して特異的な結合活性を有するポリペプチドまたはそれをコードする遺伝子から構成される運搬体であって、生体内の標的細胞または組織に選択的に所望の薬物（例えば生理活性ペプチドまたはそれをコードする遺伝子）を輸送しえる標的指向性運搬体を提供することを目的とする。より詳細には、本発明は各種組織に特異的に存在する各種ラミニンに対して選択的結合性を有し、その特性に基づいてラミニンを発現する標的細胞または組織に、選択的に目的物質を輸送ないしは結合させることのできる、組織指向性を備えた運搬体（標的指向性運搬体）を提供することを目的とする。
かかる標的指向性運搬体に、所望の薬物（例えば生理活性ペプチドまたはそれをコードする遺伝子）を結合させて、薬物を運搬体との複合体（例えば、生理活性ペプチド複合体または生理活性ペプチド遺伝子複合体）として調製することにより、組織特異的なドラッグデリバリー、並びにターゲッティング療法が可能となる。よって、本発明はかかるシステムを提供することも目的とする。
本発明者らは、鋭意研究を進める中で、前述するネフロネクチン（ＮＮ）が、基底膜構成蛋白質の各種ラミニンのうち、ＬＮ−１０／１１（α５β１／２γ１）とＬＮ−８（α４β１γ１）には選択特異的に結合するものの、ＬＮ−１０／１１及びＬＮ−８と同じβ鎖とγ鎖を有するＬＮ−２／４（α２β１／２γ１）には結合しないことから、ネフロネクチン（ＮＮ）がラミニンのα５鎖またはα４鎖を特異的に認識して結合することを見いだした（後述する実験例３、図８参照）。さらに、本発明者らは、ネフロネクチンとこれらのラミニンアイソフォームとの結合は、ネフロネクチンのＭＡＭドメインを欠失させることによって消失することから、ネフロネクチンのＭＡＭドメインを介して行われることを見出した（後述する実験例４、図１１参照）。さらに、本発明者らは、ネフロネクチン（ＮＮ）と類似の構造を有するＭＡＥＧ蛋白質は、そのＭＡＭドメインを介して、ラミニン（ＬＮ−５（α３β３γ２））と選択特異的に結合することを見いだした（後述する実験例５、図１２参照）。
前述するように、ラミニンはそれが有するα鎖に応じてそれぞれ異なる組織や部位に発現し局在していることが知られている。具体的には、ネフロネクチン（ＮＮ）及びそのＭＡＭドメインが選択的結合性を示す、ＬＮ−８（α４鎖を有する）は、血管の中でも毛細血管や新生血管に特異的に局在しており、ＬＮ−１０及びＬＮ−１１（α５鎖を有する）は、血管の中でも太い血管（大血管）、腎臓、肺及び膵臓組織に特異的に局在している。またＭＡＥＧ蛋白質及びそのＭＡＭドメインが選択的結合性を示す、ＬＮ−５（α３鎖を有する）は、皮膚（表皮）、毛包及び肺組織に特異的に局在している。
これらの知見から、本発明者らは、ネフロネクチンまたはそのＭＡＭドメイン、並びにＭＡＥＧ蛋白質またはそのＭＡＭドメインが、その特異的ラミニン結合性に基づいて組織特異的に標的指向性を発揮し（後述する実験例７参照）、これにより当該標的部位に有用な薬物（例えば、生理活性ペプチドまたはその遺伝子など）を輸送する運搬体として利用できる可能性を見いだした。本発明はかかる知見に基づいて完成したものである。
すなわち、本発明は下記の態様を包含するものである；
項１．  ＭＡＭドメイン（ｍｅｐｒｉｎ，５Ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  μ−ｄｏｍａｉｎ）もしくはそれを一部に有するポリペプチド、またはＭＡＭドメインもしくはそれを一部に有するポリペプチドをコードする遺伝子を有する核酸であって、所望の物質を結合させて、該物質を標的組織に輸送するために用いられる標的指向性運搬体。
項２．  ＭＡＭドメインが、（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有するものである項１記載の標的指向性運搬体；
（ａ）配列番号１に示される、ネフロネクチンのＭＡＭドメインのアミノ酸配列、
（ｂ）上記ネフロネクチンのＭＡＭドメインのアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつラミニンのα４鎖またはα５鎖に結合性を有するアミノ酸配列。
項３．  上記（ｂ）が、配列番号１に示されるネフロネクチンのＭＡＭドメインのアミノ酸配列と、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である、項２記載の標的指向性運搬体。
項４．  上記（ｂ）が、ヒト由来ネフロネクチンのＭＡＭドメインのアミノ酸配列である、項２または３記載の標的指向性運搬体。
項５．  上記（ｂ）が、配列番号３７に示されるアミノ酸配列であるか、またはそれと少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列である、項２乃至４のいずれかに記載の標的指向性運搬体。
項６．  ＭＡＭドメインを有するポリペプチドが、（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列を有するものである請求項１記載の標的指向性運搬体；
（ｃ）配列番号１７または１９に示される、ネフロネクチンのアミノ酸配列、
（ｄ）上記ネフロネクチンのアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつラミニンのα４鎖またはα５鎖に結合性を有するアミノ酸配列。
項７．  上記（ｄ）が、配列番号１７または１９に示されるネフロネクチンのアミノ酸配列と、少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列である、項６記載の標的指向性運搬体。
項８．  上記（ｄ）が、ヒト由来ネフロネクチンのアミノ酸配列である、項６または７記載の標的指向性運搬体。
項９．  上記（ｄ）が、配列番号５３に示されるアミノ酸配列であるか、またはそれと少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列である、項６乃至８のいずれかに記載の標的指向性運搬体。
項１０．  ＭＡＭドメインをコードする遺伝子を有する核酸が、（Ａ）または（Ｂ）の塩基配列を有するものである項１記載の標的指向性運搬体；
（Ａ）配列番号２に示される、ネフロネクチンのＭＡＭドメインをコードする遺伝子の塩基配列、
（ｂ）上記塩基配列に対して、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上の同一性を有する塩基配列であって、かつ当該塩基配列によってコードされるアミノ酸配列がラミニンのα４鎖またはα５鎖に結合性を有するもの。
項１１．  上記（Ｂ）が、ヒト由来ネフロネクチンのＭＡＭドメインをコードする遺伝子の塩基配列である、項１０記載の標的指向性運搬体。
項１２．  上記（Ｂ）が、配列番号３８に示される塩基配列であるか、またはそれと少なくとも９０％以上の同一性を有する塩基配列である、項１０または１１に記載の標的指向性運搬体。
項１３．  ＭＡＭドメインをコードする遺伝子を有する核酸が、（Ｃ）または（Ｄ）の塩基配列を有するものである項１記載の標的指向性運搬体；
（Ｃ）配列番号１８または２０に示される、ネフロネクチンをコードする遺伝子の塩基配列、
（Ｄ）上記塩基配列に対して、７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上の同一性を有する塩基配列であって、かつ当該塩基配列によってコードされるアミノ酸配列がラミニンのα４鎖またはα５鎖に結合性を有するもの。
項１４．  上記（Ｄ）が、ヒト由来ネフロネクチンをコードする遺伝子の塩基配列である、項１３記載の標的指向性運搬体。
項１５．  上記（Ｄ）が、配列番号５４に示される塩基配列であるか、またはそれと少なくとも９０％以上の同一性を有する塩基配列である、項１３または１４に記載の標的指向性運搬体。
項１６．  腎臓、新生血管、肺、膵臓、または大血管に対して指向性を有することを特徴とする項２乃至１５のいずれかに記載する標的指向性運搬体。
項１７．  ＭＡＭドメインが、（ｅ）または（ｆ）のアミノ酸配列を有するものである項１記載の標的指向性運搬体；
（ｅ）配列番号３に示される、ＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメインのアミノ酸配列、
（ｆ）上記ＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメインのアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつラミニンのα３鎖に結合性を有するアミノ酸配列。
項１８．  上記（ｆ）が、配列番号３に示されるＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメインのアミノ酸配列と、少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列である、項１７記載の標的指向性運搬体。
項１９．  上記（ｆ）が、ヒト由来ＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメインのアミノ酸配列である、項１７または１８記載の標的指向性運搬体。
項２０．  上記（ｆ）が、配列番号３９に示されるアミノ酸配列であるか、またはそれと少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列である、項１７乃至１９のいずれかに記載の標的指向性運搬体。
項２１．  ＭＡＭドメインを有するポリペプチドが、（ｇ）または（ｈ）のアミノ酸配列を有するものである項１記載の標的指向性運搬体；
（ｇ）配列番号２１に示される、ＭＡＥＧ蛋白質のアミノ酸配列、
（ｈ）上記ＭＡＥＧ蛋白質のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつラミニンのα３鎖に結合性を有するアミノ酸配列。
項２２．  上記（ｈ）が、配列番号２１に示されるＭＡＥＧ蛋白質のアミノ酸配列と、少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列である、項２１記載の標的指向性運搬体。
項２３．  上記（ｈ）が、ヒト由来ＭＡＥＧ蛋白質のアミノ酸配列である、項２１または２２記載の標的指向性運搬体。
項２４．  上記（ｈ）が、配列番号５５に示されるアミノ酸配列であるか、またはそれと少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列である、項２１乃至２３のいずれかに記載の標的指向性運搬体。
項２５．  ＭＡＭドメインをコードする遺伝子を有する核酸が、（Ｅ）または（Ｆ）の塩基配列を有するものである項１記載の標的指向性運搬体；
（Ｅ）配列番号４に示される、ＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメインをコードする遺伝子の塩基配列、
（Ｆ）上記塩基配列に対して、７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上の同一性を有する塩基配列であって、かつ当該塩基配列によってコードされるアミノ酸配列がラミニンのα３鎖に結合性を有するもの。
項２６．  上記（Ｆ）が、ヒト由来ＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメインをコードする遺伝子の塩基配列である、項２５記載の標的指向性運搬体。
項２７．  上記（Ｆ）が、配列番号４０に示される塩基配列であるか、またはそれと少なくとも９０％以上の同一性を有する塩基配列である、項２５または２６に記載の標的指向性運搬体。
項２８．  ＭＡＭドメインをコードする遺伝子を有する核酸が、（Ｇ）または（Ｈ）の塩基配列を有するものである項１記載の標的指向性運搬体；
（Ｇ）配列番号２２に示される、ＭＡＥＧ蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列、
（Ｈ）上記塩基配列に対して、７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上の同一性を有する塩基配列であって、かつ当該塩基配列によってコードされるアミノ酸配列がラミニンのα３鎖に結合性を有するもの。
項２９．  上記（Ｈ）が、ヒト由来ＭＡＥＧ蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列である、項２８記載の標的指向性運搬体。
項３０．  上記（Ｈ）が、配列番号５６に示される塩基配列であるか、またはそれと少なくとも９０％以上の同一性を有する塩基配列である、項２８または２９に記載の標的指向性運搬体。
項３１．  毛包、皮膚（表皮）、または肺に対して指向性を有することを特徴とする請求項１７乃至３０のいずれかに記載する標的指向性運搬体。
項３２．  発現ベクターの形態を有する、項１乃至３１のいずれかに記載する標的指向性運搬体。
項３３．  項１乃至３１のいずれかに記載の標的指向性運搬体に、標的組織に輸送するための薬物が結合されてなる標的指向性薬物複合体。
項３４．  標的指向性薬物複合体が、ペプチドまたはタンパクからなる薬物を結合してなるポリペプチド形態を有するか、または核酸（遺伝子を含む）からなる薬物を結合してなるポリヌクレオチド形態を有するものである、請求項３３に記載する標的指向性薬物複合体。
項３５．  項３３または３４に記載する標的指向性薬物複合体を有効成分として含む医薬組成物。
項３６．  標的指向性薬物として、項３３または３４に記載する標的指向性薬物複合体を用いることを特徴とする、ドラッグデリバリーシステムまたはターゲッティング療法。
項３７．  ＭＡＭドメインもしくはそれを一部に有するポリペプチド、またはＭＡＭドメインもしくはそれを一部に有するポリペプチドをコードする遺伝子を有する核酸の、所望の物質を結合させて該物質を標的組織に輸送するために用いられる標的指向性運搬体の調製のための使用。
項３８．  項１乃至項３２のいずれかに記載の標的指向性運搬体の、標的組織に輸送するための薬物が結合されてなる標的指向性薬物複合体の調製のための使用。
項３９．  項１乃至項３２のいずれかに記載の標的指向性運搬体に薬物が結合されてなる標的指向性薬物複合体の、標的組織や細胞に局所的に薬物を輸送して治療するドラッグデリバリーシステムまたはターゲッティング療法における使用。
【発明を実施するための最良の形態】（１）標的指向性運搬体
前述するように、ラミニンは、そのα鎖に基づいて組織特異的・発生段階特異的な発現を示す基底膜主要構成蛋白質である。
本発明は、こうした組織特異的に発現するラミニンのα鎖を選択的に認識して特異的に結合する特性を有し、それがゆえに標的の組織に対して指向性を有する標的指向性運搬体を提供するものである。
具体的には、本発明の標的指向性運搬体には、ＭＡＭドメインまたはそれを一部に有するポリペプチドであって、所望の薬物を結合させて、該薬物を標的組織に輸送するために用いられる標的指向性運搬体が含まれる。
ここでＭＡＭドメインとは、「ｍｅｐｒｉｎ，Ａ５  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  μ−ｄｏｍａｉｎ（メプリン、Ａ５蛋白質、受容体型蛋白質チロシン脱リン酸化酵素ミュードメイン）」の略である。ネフロネクチン（ｎｅｐｈｒｏｎｅｃｔｉｎ）、ＭＡＥＧ蛋白質（ヒトについては「Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６２，ｐ．３０４−３０７，１９９９」、マウスについては「Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６５，ｐ．１６２３，２０００」）、メプリン（ｍｅｐｒｉｎ）α及びメプリンβ（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７６，Ｎｏ．２５，ｐ．２３２０７−２３２１１，２００１）、ニューロピリン（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ）１及びニューロピリン２（Ｎｅｕｒｏｎ，Ｖｏｌ．２１，ｐ．１２８３−１２９０，１９９８）、ＲＰＴＰ（受容体型蛋白質チロシン脱リン酸化酵素：Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）κ及びＲＰＴＰμ（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｐ．１４２４７−１４２５０，１９９５）などは、いずれも共通してＭＡＭドメインを有する蛋白質である（Ｂｅｃｋｍａｎｎ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｂｏｒｋ，Ｐ．；Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．１８，１９９３，ｐ．４０−４１）。なお、ＭＡＭドメインは、メプリン、ニューロピリン（Ａ５  ｐｒｏｔｅｉｎとニューロピリンは同義である）、ＲＰＴＰμなどについて、ＭＡＭドメイン間での相互作用、及び二量体や多量体形成に必要といわれているものの、詳細な機能については知られていない。
ネフロネクチンのＭＡＭドメインのアミノ酸配列を配列番号１；ＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメインのアミノ酸配列を配列番号３；メプリンαのＭＡＭドメインのアミノ酸配列を配列番号５；メプリンβのＭＡＭドメインのアミノ酸配列を配列番号７；ニューロピリン１のＭＡＭドメインのアミノ酸配列を配列番号９：ニューロピリン２のＭＡＭドメインのアミノ酸配列を配列番号１１：ＲＰＴＰκのＭＡＭドメインのアミノ酸配列を配列番号１３：ＲＰＴＰμのＭＡＭドメインのアミノ酸配列を配列番号１５に示す。ここに記載するＭＡＭドメインのアミノ酸配列はその一例であるマウスに由来するものであるが、他の例としては、上記配列が由来する生物種に類似もしくは近似する種（例えば、哺乳類に属する種、好ましくはヒト）に由来する、各種蛋白質のＭＡＭドメインのアミノ酸配列を挙げることができる。
例えば、上記マウス由来の各種ＭＡＭドメインのアミノ酸配列と、ヒト由来の各種ＭＡＭドメインのアミノ酸配列との関係を示すと、下表の通りである。なお、ここでアミノ酸配列の同一性（相同性）は、ゼネティックス社製遺伝子解析ソフトのＧＥＮＥＴＩＸ−Ｍａｃ  ｖｅｒ．１２．２．４の、ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｓｅａｒｃｈ  ｅｎｇｉｎｅに基づくものである〔以下に述べるアミノ酸配列、並びに塩基配列の同一性（相同性）においても同じ。〕。
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ＭＡＭドメインとして、好ましくはネフロネクチンのＭＡＭドメイン及びＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメインを挙げることができる。
マウスに由来するネフロネクチンのＭＡＭドメインのアミノ酸配列を配列番号１に示す。但し、本発明の標的指向性運搬体が有するＭＡＭドメインは、これに限定されることなく、例えば当該ＭＡＭドメインのアミノ酸配列と相同性を有する同等物であってもよい。かかる同等物としては、上記配列番号１のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつラミニンのα４鎖またはα５鎖に結合性を有するアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。なお、相同性の範囲としては、アミノ酸配列が配列番号１に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同等性を有する範囲を挙げることができる。具体的には、マウス以外の動物、好ましくは哺乳類に由来するネフロネクチンのＭＡＭドメインを挙げることができる。特に好ましくはヒト由来のネフロネクチンのＭＡＭドメインである。ヒト由来のネフロネクチンのＭＡＭドメインとしては、配列番号１（マウス由来のネフロネクチンのＭＡＭドメインのアミノ酸配列）に対して９０％以上、好ましくは９５％以上の同一性を有しているものを挙げることができる。上記の表に示すヒト由来のネフロネクチンのＭＡＭドメイン（配列番号３７）はその一例である。
なお、ラミニンのα４鎖またはα５鎖に対する結合性は、後述する実験例３（１）に記載する固相結合アッセイ（酵素結合免疫吸着検定）または実験例３（２）に記載する免疫共沈降アッセイ（酵素結合免疫吸着検定）など、当業者に公知の方法を用いて評価することができる。
マウスに由来するＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメインのアミノ酸配列を配列番号３に示す。上記と同様、本発明の標的指向性運搬体が有するＭＡＭドメインは、これに限定されることなく、例えば当該ＭＡＭドメインのアミノ酸配列と相同性を有する同等物であってもよい。かかる同等物としては、上記配列番号３のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつラミニンのα３鎖に結合性を有するアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。なお、相同性の範囲としては、アミノ酸配列が配列番号３に対して７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上の同等性を有する範囲を挙げることができる。具体的には、マウス以外の動物、好ましくは哺乳類に由来するＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメインを挙げることができる。特に好ましくはヒト由来のＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメインである。ヒト由来のＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメインとしては、配列番号３（マウス由来のＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメインのアミノ酸配列）に対して８０％以上、好ましくは８５％以上の同一性を有しているものを挙げることができる。具体的には上記表に示すヒト由来のＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメイン（配列番号３９）を挙げることができる。
なお、ラミニンのα３鎖に対する結合性は、後述する実験例３（１）に記載する固相結合アッセイ（酵素結合免疫吸着検定）または実験例３（２）に記載する免疫共沈降アッセイ（酵素結合免疫吸着検定）など、当業者に公知の方法を用いて評価することができる。
また本発明の標的指向性運搬体は、ＭＡＭドメインを一部に有するポリペプチドからなるものであってもよい。かかるものとしては、本発明の効果を損なわないことを限度として、ＭＡＭドメインを一部に含むポリペプチドを広く例示することができるが、具体的には、ネフロネクチンの全長蛋白質、ネフロネクチンのＭＡＭドメインとＲＧＤリンカー部位との結合体、ネフロネクチンのＭＡＭドメインとＥＧＦドメインまたはその繰り返し配列との結合体、ＭＡＥＧ蛋白質、メプリンα、メプリンβ、ニューロピリン１、ニューロピリン２、ＲＰＴＰκ、及びＲＰＴＰμなどを例示することができる。
なお、ヒトに由来するネフロネクチン相当物の配列は、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７６，Ｎｏ．４５，ｐｐ．４２１７２−４２１８１，２００１」に、ＭＡＥＧ蛋白質（ヒトではＥＧＦＬ６とも称される）の配列は「ＮＭ＿０１５５０７」に、メプリンαの配列は「ＮＭ＿００５５８８（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ、以下同じ）」に、メプリンβの配列は「ＮＭ＿００５９２５」に、ニューロピリン１の配列は「ＮＭ＿００３８７３」に、ニューロピリン２の配列は「ＡＦ２８１０７４」に、及びＲＰＴＰκの配列は「Ｚ７０６６０」に，ＲＰＴＰμの配列は「ＮＭ＿００２８４５」に、それぞれ記載されている。
ＭＡＭドメインを一部に有するポリペプチドとして、好ましくはネフロネクチン（全長）、及びＭＡＥＧ蛋白質を挙げることができる。
マウス由来のネフロネクチンには、選択的スプライシングによって５６１アミノ酸からなるｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍと６０９アミノ酸からなるｌｏｎｇ  ｆｏｒｍとが存在することが知られている（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５４，Ｎｏ．２，２００１，４４７−４５８）。ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍのネフロネクチン（マウス）のアミノ酸配列を配列番号１７に、ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍのネフロネクチン（マウス）のアミノ酸配列を配列番号１９にそれぞれ示す。なお、ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍのネフロネクチン（マウス）は、その４２０〜５６１アミノ酸領域に「ＭＡＭドメイン」を有しており〔Ｎ末端から順に、「シグナルペプチド」（１−１９ａａ）、「ＥＧＦ繰り返し配列」（「ＥＧＦ様ドメイン１」（５７−８８ａａ）、「ＥＧＦ様ドメイン２」（８９−１２７ａａ）、「ＥＧＦ様ドメイン３」（１２８−１６８ａａ）、「ＥＧＦ様ドメイン４」（１６９−２１２ａａ）、「ＥＧＦ様ドメイン５」（２１３−２５３ａａ））、「ＲＧＤリンカー部位」（２５４−４１９ａａ）、及び「ＭＡＭドメイン」（４２０−５６１ａａ）から構成される〕、ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍのネフロネクチン（マウス）は、その４６８〜６０９アミノ酸領域に「ＭＡＭドメイン」を有している〔Ｎ末端から順に、「シグナルペプチド」（１−１９ａａ）、「ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  １」（５９−７５ａａ）、「ＥＧＦ様ドメイン１」（７６−１０５ａａ）、「ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ２」（１０６−１３６ａａ）、「ＥＧＦ様ドメイン２」（１３７−１７５ａａ）、「ＥＧＦ様ドメイン３」（１７６−２１５ａａ）、「ＥＧＦ様ドメイン４」（２１６−２６０ａａ）、「ＥＧＦ様ドメイン５」（２６１−３０１ａａ）、「ＲＧＤリンカー部位」（３０２−４６７ａａ）、及び「ＭＡＭドメイン」（４６８−６０９ａａ）から構成される〕。
ただし、本発明の標的指向性運搬体が有するポリペプチドは、これに限定されることなく、例えば当該マウス由来のネフロネクチンのアミノ酸配列と相同性を有する同等物であってもよい。かかる同等物としては、上記マウス由来のネフロネクチンのアミノ酸配列を示す配列番号１７（ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ）または配列番号１９（ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍ）において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつラミニンのα４鎖またはα５鎖に結合性を有するアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。なお、相同性の範囲としては、アミノ酸配列が配列番号１７または１９に対して７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上の同等性を有する範囲を挙げることができる。具体的には、マウス以外の動物、好ましくは哺乳類に由来するネフロネクチンを挙げることができる。特に好ましくはヒト由来のネフロネクチンである。ヒト由来のネフロネクチンとしては、配列番号１７〔マウス由来のネフロネクチン（ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ）のアミノ酸配列〕に対して７５％以上、好ましくは８０％以上の同一性を有しているものを挙げることができる。配列番号５３に示すアミノ酸配列は、現在報告されているヒト由来のネフロネクチンのアミノ酸配列である。当該ネフロネクチンは、マウス由来のネフロネクチン（配列番号１７：ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ）に対して、８０％以上（詳細には８２．６％）の同一性を有している。このヒト由来のネフロネクチンは、その３９１〜５０９アミノ酸領域に「ＭＡＭドメイン」を有しており、Ｎ末端から順に「シグナルペプチド」（１−１９ａａ）、「ＥＧＦ繰り返し配列」（「ＥＧＦ様ドメイン１」（５７−８８ａａ）、「ＥＧＦ様ドメイン２」（８９−１２７ａａ）、「ＥＧＦ様ドメイン３」（１２８−１６８ａａ）、「ＥＧＦ様ドメイン４」（１６９−２１２ａａ）、「ＥＧＦ様ドメイン５」（２１３−２５３ａａ））、「ＲＧＤリンカー部位」（２５４−３９０ａａ）、及び「ＭＡＭドメイン」（３９１−５０９ａａ）から構成されている。但し、本発明が対象とするヒト由来のネフロネクチンはこれに限定されず、前述するように、配列番号１７に対して７５％以上、好ましくは８０％以上の同一性を有するヒト由来ネフロネクチンであればよい。
マウス由来のＭＡＥＧ蛋白質のアミノ酸配列を配列番号２１に示す。当該ＭＡＥＧ蛋白質は５５０アミノ酸から構成され、その３９５〜５５０アミノ酸領域にＭＡＭドメインを有している。上記と同様、本発明の標的指向性運搬体が有するポリペプチドは、これに限定されることなく、例えば当該ＭＡＥＧ蛋白質のアミノ酸配列と相同性を有する同等物であってもよい。かかる同等物としては、上記配列番号２１のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつラミニンのα３鎖に結合性を有するアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。なお、相同性の範囲としては、アミノ酸配列が配列番号２１に対して６５％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上の同等性を有する範囲を挙げることができる。具体的には、マウス以外の動物、好ましくは哺乳類に由来するＭＡＥＧ蛋白質を挙げることができる。特に好ましくはヒト由来のＭＡＥＧ蛋白質である。ヒト由来のＭＡＥＧ蛋白質としては、配列番号２１〔マウス由来のＭＡＥＧ蛋白質のアミノ酸配列〕に対して７０％以上、好ましくは７５％以上の同一性を有しているものを挙げることができる。現在報告されているヒト由来のＭＡＥＧ蛋白質のアミノ酸配列を配列番号５５に示すが、当該ＭＡＥＧ蛋白質は、配列番号２１で示されるマウス由来のＭＡＥＧ蛋白質に対して、約７５％以上（詳細には７７．６％）の同一性を有している。
以上のペプチド又はポリペプチドの形態を有する標的指向性運搬体によって、標的細胞または組織に運搬することのできる目的物質としては、アミノ酸、ポリアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、及び蛋白質等の形態を有するものを挙げることができる。
また本発明の標的指向性運搬体は、上記ポリペプチドの形態を有するもの以外に、核酸の形態を有するものであってもよい。すなわち、本発明の標的指向性運搬体には、ＭＡＭドメインもしくはそれを一部に有するポリペプチドをコードする遺伝子を有する核酸であって、所望の薬物を結合させて、該薬物を標的組織に輸送するために用いられる標的指向性運搬体が含まれる。
ＭＡＭドメインをコードする遺伝子としては、ネフロネクチン、ＭＡＥＧ蛋白質、メプリンα、メプリンβ、ニューロピリン１、ニューロピリン２、ＲＰＴＰκ、またはＲＰＴＰμなどの各種蛋白質のＭＡＭドメインをコードする遺伝子を挙げることができる。マウス由来のネフロネクチンのＭＡＭドメイン（ポリペプチド）をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号２；ＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメイン（ポリペプチド）をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号４；メプリンαのＭＡＭドメイン（ポリペプチド）をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号６；メプリンβのＭＡＭドメイン（ポリペプチド）をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号８；ニューロピリン１のＭＡＭドメイン（ポリペプチド）をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号１０：ニューロピリン２のＭＡＭドメイン（ポリペプチド）をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号１２：ＲＰＴＰκのＭＡＭドメイン（ポリペプチド）をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号１４：ＲＰＴＰμのＭＡＭドメイン（ポリペプチド）をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号１６に記載の通りである。なお、これらに限定されることなく、本発明が対象とする核酸には、マウス以外の動物、好ましくは哺乳類に由来する上記各種蛋白質のＭＡＭドメインをコードする遺伝子が含まれる。より好ましくはヒト由来する上記各種蛋白質のＭＡＭドメイン（ポリペプチド）をコードする遺伝子である。
例えば、上記マウス由来の各種ＭＡＭドメインをコードする遺伝子の塩基配列と、ヒト由来の各種ＭＡＭドメインをコードする遺伝子の塩基配列との関係は、下表の通りである。
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ＭＡＭドメインをコードする遺伝子として、好ましくはネフロネクチンのＭＡＭドメインをコードする遺伝子及びＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメインをコードする遺伝子を挙げることができる。
マウスのネフロネクチンのＭＡＭドメインをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２に示すが、本発明の標的指向性運搬体（核酸）が有する遺伝子は、これに限定されることなく、例えば当該ＭＡＭドメイン遺伝子の塩基配列と相同性を有する機能同等物であってもよい。かかる機能同等物としては、上記配列番号２の塩基配列の相補的配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイスする塩基配列を有し、かつその発現産物（ポリペプチド）がラミニンのα４鎖またはα５鎖に結合性を有するものを挙げることができる。なお、相同性の範囲としては、塩基配列が配列番号２に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、更に好ましくは９０％以上の同等性を有する範囲を挙げることができる。具体的には、マウス以外の動物、好ましくは哺乳類に由来するネフロネクチンのＭＡＭドメインをコードする遺伝子を挙げることができる。好ましくはヒトに由来するネフロネクチンのＭＡＭドメインをコードする遺伝子を挙げることができる。ヒト由来のネフロネクチンのＭＡＭドメインをコードする遺伝子としては、配列番号２（マウス由来のネフロネクチンのＭＡＭドメインをコードする塩基配列）に対して８５％以上、好ましくは９０％以上の同一性を有しているものを挙げることができる。上記の表に示すヒト由来のネフロネクチンのＭＡＭドメインの遺伝子をコードする塩基配列（配列番号３８）はその一例である。
マウス由来のＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメインをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号４に示すが、本発明の標的指向性運搬体（核酸）が有する遺伝子は、これに限定されることなく、例えば当該ＭＡＭドメイン遺伝子の塩基配列と相同性を有する機能同等物であってもよい。かかる機能同等物としては、上記配列番号４の塩基配列の相補的配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイスする塩基配列を有し、かつその発現産物（ポリペプチド）がラミニンのα３鎖に結合性を有するものを挙げることができる。なお、相同性の範囲としては、塩基配列が配列番号４に対して７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは８５％以上の同等性を有する範囲を挙げることができる。具体的には、マウス以外の動物、好ましくは哺乳類に由来するＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメインをコードする遺伝子を挙げることができる。好ましくはヒトに由来するＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメインをコードする遺伝子を挙げることができる。ヒト由来のＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメインをコードする遺伝子としては、配列番号４（マウス由来のＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメインをコードする塩基配列）に対して８０％以上、好ましくは８５％以上の同一性を有しているものを挙げることができる。上記の表に示すヒト由来のＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメインの遺伝子をコードする塩基配列（配列番号４０）はその一例である。
また本発明の標的指向性運搬体（核酸）は、ＭＡＭドメインを一部に有するポリペプチドをコードする遺伝子を有するものであってもよい。ＭＡＭドメインを一部に有するポリペプチド（蛋白質を含む）としては前述するように、具体的には、ネフロネクチンの全長蛋白質、ネフロネクチンのＭＡＭドメインとＲＧＤリンカー部位との結合体、ネフロネクチンのＭＡＭドメインとＥＧＦドメインまたはその繰り返し配列との結合体、ＭＡＥＧ蛋白質、メプリンα、メプリンβ、ニューロピリン１、ニューロピリン２、ＲＰＴＰκ、及びＲＰＴＰμなどを例示することができる。
ＭＡＭドメインを一部に有するポリペプチドをコードする遺伝子として、好ましくはネフロネクチン（全長）をコードする遺伝子、及びＭＡＥＧ蛋白質をコードする遺伝子を挙げることができる。
マウスに由来するネフロネクチンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１８（ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ）及び２０（ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍ）に示す。ただし、本発明の標的指向性運搬体が有する核酸は、これに限定されることなく、例えば当該ネフロネクチンの遺伝子の塩基配列と相同性を有する機能同等物であってもよい。かかる機能同等物としては、上記配列番号１８または２０の塩基配列の相補的配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイスする塩基配列を有し、かつその発現産物（ポリペプチド）がラミニンのα４鎖またはα５鎖に結合性を有するものを挙げることができる。なお、相同性の範囲としては、塩基配列が配列番号１８または２０に対して７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上の同等性を有する範囲を挙げることができる。具体的には、マウス以外の動物、好ましくは哺乳類に由来するネフロネクチンをコードする遺伝子を挙げることができる。特に好ましくはヒト由来のネフロネクチンをコードする遺伝子である。ヒト由来のネフロネクチンをコードする遺伝子としては、配列番号１８〔マウス由来のネフロネクチン（ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ）をコードする遺伝子の塩基配列〕に対して７５％以上、好ましくは８０％以上の同一性を有しているものを挙げることができる。配列番号５４に示すアミノ酸配列は、現在報告されているヒト由来のネフロネクチンをコードする遺伝子の塩基配列である。当該塩基配列は、マウス由来の遺伝子の塩基配列（配列番号１８：ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ）に対して、８０％以上（詳細には８２．６％）の同一性を有している。
マウスに由来するＭＡＥＧ蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２２に示す。上記と同様、本発明の標的指向性運搬体が有する核酸は、これに限定されることなく、例えば当該ＭＡＥＧ蛋白質の遺伝子の塩基配列と相同性を有する機能同等物であってもよい。かかる機能同等物としては、上記配列番号２２の塩基配列の相補的配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイスする塩基配列を有し、かつその発現産物（ポリペプチド）がラミニンのα３鎖に結合性を有するものを挙げることができる。なお、相同性の範囲としては、塩基配列が配列番号２２に対して７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上の同等性を有する範囲を挙げることができる。具体的には、マウス以外の動物、好ましくは哺乳類に由来するＭＡＥＧ蛋白質をコードする遺伝子を挙げることができる。特に好ましくはヒト由来のＭＡＥＧ蛋白質をコードする遺伝子である。ヒト由来のＭＡＥＧ蛋白質をコードする遺伝子としては、配列番号２２〔マウス由来のＭＡＥＧ蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列〕に対して７５％以上、好ましくは８０％以上の同一性を有しているものを挙げることができる。配列番号５６に示すアミノ酸配列は、現在報告されているヒト由来のＭＡＥＧ蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列である。当該塩基配列は、マウス由来の遺伝子の塩基配列（配列番号２２）に対して、８０％以上（詳細には８２．６％）の同一性を有している。
以上のポリヌクレオチド（核酸）の形態を有する標的指向性運搬体によって、標的細胞または組織に運搬することのできる目的物質としては、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド等の形態を有するものを挙げることができる。
なお、当該標的指向性運搬体（核酸形態）は、ＭＡＭドメイン若しくはＭＡＭドメインを一部に有するポリペプチドをコードする遺伝子を、発現可能な状態で他の塩基配列に組み込まれてなる、所謂発現ベクター（発現カセット）の形態で有するものであってもよい。
本発明で用いられる発現ベクターは、上記ＭＡＭドメイン若しくはＭＡＭドメインを一部に有するポリペプチド（以下、これらを纏めて「目的のポリペプチド」という）をコードする遺伝子を、標的細胞内（好ましくは哺乳類由来の細胞内、よりこのヒト生体内）で発現・機能可能な状態で含むものであればよい。
一般に発現ベクターは、目的のポリペプチドを、対象とする宿主内で発現させるために、転写の下流方向順に必要に応じて（１）プロモーター機能領域、（２）リポソーム結合部位、（３）翻訳開始コドン、（４）シグナルペプチドをコードする塩基配列をもつＤＮＡ、（５）目的のポリペプチドをコードする塩基配列をもつＤＮＡ、（６）翻訳終始コドン、（７）ターミネーター、（８）宿主中で自己複製可能な自律性複製配列（レプリコン）、（１０）相同領域等を、含むように構築される。
なお、ここで発現可能とは、発現ベクターを所望の細胞若しくは生体内に導入した場合に、発現ベクターが目的のポリペプチドをコードする遺伝子を発現するように機能することを意味する。また、機能可能とは、発現ベクターを生体内に導入した場合に、発現ベクターが目的のポリペプチドをコードする遺伝子を発現し、目的のポリペプチドを産生するように機能することを意味する。かかる発現ベクターは、当業界の遺伝子工学的手法を用いることによって作成することができる。
より好ましくは、哺乳類由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現ベクター（発現カセット）であり、特に好ましくは、ヒト由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットである。発現カセットに用いられる遺伝子プロモーターには、例えばアデノウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、シミアンウイルス４０、ラウス肉腫ウイルス、単純ヘルペスウイルス、マウス白血病ウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、バピローマウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、ＪＣウイルス、バルボウイルスＢ１９、ポリオウイルス等のウイルス由来のプロモーター、アルブミンや熱ショック蛋白等の哺乳類由来のプロモーター、ＣＡＧプロモーター等のキメラ型プロモーター等が含まれる。
遺伝子によってコードされた目的の運搬物質（被運搬物質）を、細胞外に分泌および／または細胞内の局所に滞留させるためのシグナル配列としては、細胞外への分泌を補助するインターロイキン２由来のシグナルペプチド（駒田富佐夫、日本薬学会第１１５年会講演要旨集４，１２，１９９５）や核局在化を促進するアデノウイルスＥ１ａ由来のペプチド、ポリオーマウイルスラージＴ抗原由来のペプチド、ＳＶ４０ラージＴ抗原由来のペプチド、ヌクレオプラスミン由来のペプチド、ＨＴＬＶ１ｐ２４転写後調節蛋白質由来のペプチド（Ｋａｌｄｅｒｏｎ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３９，４９９，１９８４）等を用いることができる。
上記の発現ベクター（発現カセット）は、遺伝子工学的手法に従って、所望の目的の運搬物質（被運搬物質）の遺伝子（例えば、生理活性ペプチドをコードする遺伝子など）（以下、「薬物遺伝子」ともいう）を導入することにより、いわゆる「標的指向性薬物複合体」の形態として、遺伝子治療に使用することができる。発現ベクター（発現カセット）に薬物遺伝子を導入する一つの方法として、発現ベクター（発現カセット）に組み込む上記「（５）目的のポリペプチドをコードする塩基配列をもつＤＮＡ」として、ＭＡＭドメイン若しくはＭＡＭドメインを一部に有するポリペプチドと薬物（生理活性ペプチドなど）とが融合したポリペプチド（目的のポリペプチド）をコードする遺伝子を用いる方法を挙げることができる。
本発明は、患者から標的細胞を体外に取り出し、これに薬物遺伝子を上記「標的指向性薬物複合体」を用いて導入した後に、再びその細胞を患者の体内に戻すという自家移植による遺伝子治療（ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療）に使用可能である。また、薬物遺伝子を上記「標的指向性薬物複合体」を用いて直接患者に投与する遺伝子治療（ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子治療）にも使用可能である。また、遺伝子治療の方法として、異常（原因）遺伝子をそのままにして、新しい（正常）遺伝子を付け加える方法（Ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）と、異常遺伝子を正常遺伝子で置き換える方法（Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）に大別できるが、本発明の発現ベクター（核酸運搬体）はどちらにも使用可能である。
（２）標的指向性薬物複合体
このように、本発明は、前述する標的指向性運搬体に所望の目的物質を結合させたものを予防・治療用組成物または化粧料組成物として提供するものでもある。当該目的物質としては、薬効や生理学的活性を有する物質を挙げることができる。以下、こうした物質を、本明細書中では単に「薬物」と称する。
本発明の標的指向性運搬体に結合して用いられる薬物としては、それに結合できるものであれば特に制限されないが、本発明の標的指向性運搬体がポリペプチドの形態の場合は生理活性ペプチドや抗体などを、また核酸の形態の場合は生理活性ペプチドをコードする遺伝子、ｉＲＮＡ、アンチセンスなどを例示することができる。
ここで生理活性ペプチドとは、種々の生理活性を有するペプチド、ポリペプチド及びタンパク質の総称であり、例えばサイトカイン、細胞成長因子が挙げられる。例えば、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリー、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）ファミリー、上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリー、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）ファミリー、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）等の細胞増殖因子類及び骨形成因子類（ＢＭＰ類）等の細胞分化因子類を含む細胞成長因子並びにインターフェロン（ＩＦＮ）類、インターロイキン（ＩＬ）類、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）類、エリスロポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等を含むサイトカイン類、若しくはインシュリン、パラチロイドホルモン（ＰＴＨ）等の各種ホルモン類またはマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）類等のプロテアーゼ等の酵素類、並びにＴＩＭＰ（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ）等の酵素阻害剤などを挙げることができる。
本発明の標的指向性運搬体が、ポリペプチドの形態である場合、標的指向性薬物複合体は、標的指向性運搬体と例えば上記生理活性ペプチド等とのハイブリッドポリペプチドとして提供される。当該ハイブリッドポリペプチドは、標的指向性運搬体（ポリペプチド）をコードする遺伝子と生理活性ペプチド等をコードする遺伝子とが遺伝子工学的手法により連結された状態の核酸を用いて、バクテリア（好ましくはＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、真核細胞（酵母）、昆虫細胞または動物細胞を利用して工業的に生産することができる。また、本発明の標的指向性運搬体が、核酸の形態である場合、標的指向性薬物複合体は、標的指向性運搬体（核酸）と例えば上記生理活性ペプチドをコードする遺伝子等とのハイブリッド遺伝子として提供され、細胞内もしくは生体内でハイブリッドポリペプチドとして産生される。
本発明のハイブリッドポリペプチド（標的指向性薬物複合体）、もしくは本発明のハイブリッド遺伝子（標的指向性薬物複合体）から生成されるハイブリッドポリペプチドは、標的指向性運搬体（またはその発現物）が有する特定のラミニンに対する特異的な結合活性に基づいて、組織指向性を備えている。
ゆえに本発明の標的指向性薬物複合体は、ドラッグデリバリーシステムまたはターゲッティング療法に有効に利用することができる。特に、標的指向性運搬体としてネフロネクチンのＭＡＭドメインを利用した場合（一部にネフロネクチンのＭＡＭドメインを含むものを含む。例えばネフロネクチンそのものも含まれる。）は、当該標的指向性運搬体が備える新生血管、大血管、腎臓、肺、または膵臓に対する特異的組織結合性に基づいて、所望の薬物をこれらの組織に指向させることができ、その結果、当該臓器における濃度（局所濃度）を高く維持し、薬物の有効性を高めることができる。またそれと同時に、薬物が他部位へ拡散して生じる副作用を防ぐこともできる。具体的には、例えば従来より腎炎治療にＨＧＦが使用されていることから、薬物としてＨＧＦを用いた標的指向性薬物複合体によれば、ＨＧＦ単独よりも腎炎を効果的に治療することが可能となる。また、薬物として抗癌剤を用いた標的指向性薬物複合体によれば、上記臓器（腎臓、肺、または膵臓）に特異的に抗癌剤を指向させることができ、これにより、副作用を抑制しながら、これらの臓器における癌の治療、及び進展予防を行うことが可能である。例えば、従来より腎癌の治療に使用されているインターロイキン−２やインターフェロン−αの有効率は１５％程度に過ぎないが、本発明の標的指向性運搬体を利用することで腎臓への移行性及び局在性を高め、有効率をより向上させることが可能であると期待される。また、肺癌治療剤としてハーセプチン（抗体医薬）などが知られているが、これについても同様である。
また近年、血管の新生を抑制することによって癌の進展や転移を抑制できることが知られている。従って、薬物として血管新生抑制剤（例えば、インテグリンα２阻害剤などが知られている。）を用いた標的指向性薬物複合体によれば、標的指向性運搬体が有する新生血管への特異的結合性に基づいて、血管新生抑制剤を新生血管に指向させることができ、その有効率をより向上させることが可能であると期待される。
また、標的指向性運搬体としてＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメインを利用した場合は（一部にＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメインを含むものを含む。例えばＭＡＥＧ蛋白質そのものも含まれる。）、当該標的指向性運搬体が備える毛包、皮膚（表皮）、肺に対する特異的組織結合性に基づいて、薬物をこれらの組織に指向させることができ、その結果、当該臓器における濃度（局所濃度）を高く維持し、薬物の有効性を高めることができる。またそれと同時に、薬物が他部位へ拡散して生じる副作用を防ぐこともできる。例えば、皮膚癌は、近年増加する傾向にありながらもよい治療薬がない疾患の一つである。従って、これまでに開発された抗癌剤を上記標的指向性運搬体を利用することによって皮膚に特異的に指向させて局在化させることができ、その結果、全身性の副作用を低減しながらも、これらの皮膚における有効な癌の治療を行うことが可能であると期待される。
またこの手法は、癌領域以外の疾患にも適用できる。たとえば、５αリダクターゼ阻害剤は頭髪の育毛剤として知られているが、本発明の標的指向性運搬体を利用して標的指向性薬物複合体の形態にすることで、当該薬剤を頭髪の毛包に特異的に移行させて局在化させることが可能であり、その結果、その効果をより一層高めることが可能であると考えられる。また、薬物としてＥＧＦやＫＧＦ（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）を用いた場合、これを本発明の標的指向性薬物複合体の形態にすることで皮膚創傷部位や切開部位に特異的に移行させることができ、その結果、短時間に治癒させることが可能である。
本発明に係る標的指向性薬物複合体は、このように、好ましくは医薬組成物として生体に投与して使用されるが、生体への投与の方法については、特に制限はない。例えば非経口的投与、例えば注射投与を挙げることができる。かかる医薬組成物中には薬学的に許容できる担体や種々の添加剤を添加することができる。また、本発明に係る医薬組成物の用量は、その使用方法、使用目的等により異なるが、当業者は容易に適宜選択、最適化することが可能である。例えば、注射投与して用いる場合には、標的指向性薬物複合体に含まれる有効成分の量として、１日あたり約０．１μｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇを投与するのが好ましい。より好ましくは、１日あたり約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。
【実施例】  以下、本発明を詳細に説明するために実験例を記載する。但し、本発明はこれらの実験例によって何ら限定されるものではない。なお、下記の実験例において使用される略語の正式名称は、下記の通りである。
ＢＳＡ：ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（ウシ血清アルブミン）
ＣＢＢ：Ｃｏｏｍａｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ（クーマシーブリリアントブルー）
ＥＣＭ：ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ（細胞外マトリックス）
ＥＤＴＡ：ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（エチレンジアミン四酢酸）
ＥＧＦ：ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（上皮増殖因子）
ＧＳＴ：ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（グルタチオン転移酵素）
ｋＤ：ｋｉｌｏ  ｄａｌｔｏｎ（キロダルトン）
ＨＲＰ：ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（西洋ワサビ過酸化酵素）
ｍＡｂ：ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（モノクローナル抗体）
ＭＡＭ  ｄｏｍａｉｎ：ｍｅｐｒｉｎ，Ａ５  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−μ  ｄｏｍａｉｎ（メプリン、Ａ５蛋白質、受容体型蛋白質チロシン脱リン酸化酵素ミュードメイン）
ＭＢＰ：ｍａｌｔｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（マルトース結合蛋白質）
ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（リン酸緩衝化生理食塩水）
ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ポリメラーゼ連鎖反応）
ＰＶＤＦ：ｐｏｌｙｖｉｎｉｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ（ポリビニリデンジフルオリド）
ＰＭＳＦ：ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（フェニルメタンスルホニルフルオリド）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
ＴＢＳ：Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（トリス緩衝化生理食塩水）
実験例１    ＦＬＡＧ付きネフロネクチン（全長）及びその欠損変異体の発現ベクターの構築、並びにその発現産物の精製
（１）発現ベクターの構築
ネフロネクチン（ＮＮ）は、ＥＧＦ様繰り返し配列（ＥＧＦ−ｌｉｋｅ  ｒｅｐｅａｔ）、ＲＧＤ細胞接着モチーフを含むリンカー部位、及びＭＡＭドメイン（ＭＡＭ  ｄｏｍａｉｎ）から構成されている（Ｂｒａｎｄｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５４，４４７−４５８；Ｍｏｒｉｍｕｒａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６，４２１７２−４２１８１）。マウス由来のネフロネクチン（ＮＮ）を用いて、ＮＮ（全長）、ＥＧＦ様繰り返し配列（ＮＮ−ＥＧＦと略）、ＮＮからＭＡＭドメインを欠失させたもの（ＮＮ−ΔＭＡＭと略）、ＲＧＤリンカー部位（ＮＮ−ＲＧＤと略）、及びＭＡＭドメイン（ＮＮ−ＭＡＭと略）の各々について、それぞれＣ末端にＦＬＡＧタグ（Ｓｉｇｍａ社）を付加した発現ベクターを構築した。図１に、Ｃ末端にＦＬＡＧタグを付加した各タンパク質のドメイン構造を示す（但し、ＮＮ−ＥＧＦは示さず）。
（ａ）ＦＬＡＧ付き全長ネフロネクチン（ＮＮ−ＦＬＡＧ）の発現ベクターの構築（図２）
ＮＮ−ＦＬＡＧは、全長ＮＮ（マウス）のｃＤＮＡを、３’末端のＦＬＡＧタグとコドンが合うようにｐＦＬＡＧ−ＣＭＶベクターに挿入することによって作成した。具体的には、まず、ＮＮ（マウス）のｃＤＮＡ配列（５’−非翻訳領域、ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）、及び３’−非翻訳領域の全てを含む２５４１ｂｐ）を、図中矢印で示すプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：−５ｂｐからスタート、Ｅｃｏ  ＲＩ部位付き、ｒｅｖｅｒｓｅ：１６８３ｂｐ（ストップコドン削除）からスタート、Ｎｏｔ  Ｉ部位付き）を用いてＰＣＲ増幅し、得られたＰＣＲ産物を、ｐＣＩ−ｋａｎａベクターのＥｃｏ  ＲＩ／Ｎｏｔ  Ｉ部位に挿入してベタターを作成した。次いで、このベクターをＮｏｔ  Ｉで切断し、Ｔ４  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで平滑末端に処理した後、Ｅｃｏ  ＲＩで切断した。これを、同様に処理したｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ５ａベクター（Ｐｓｔ  Ｉで切断し、Ｔ４  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで平滑末端に処理した後、Ｅｃｏ  ＲＩで切断処理）とライゲーションして、Ｃ末端にＦＬＡＧタグを有する全長ネフロネクチン発現ベクターを構築した。
（ｂ）ＦＬＡＧ付きＭＡＭドメイン欠損ＮＮ（ＮＮ−ΔＭＡＭ−ＦＬＡＧ）の発現ベクターの構築
ＮＮ（マウス）のｃＤＮＡ配列（５’−非翻訳領域、ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）、及び３’−非翻訳領域の全てを含む２５４１ｂｐ）を、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔのｍｕｌｔｉ−ｃｌｏｎｉｎｇ部位（５’−Ｓａｌ  Ｉ／Ｘｈｏ  Ｉ、３’−Ｂａｍ  ＨＩ部位）に挿入して調製したベクターを鋳型として、図中矢印で示す２種類のプライマー〔ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＡＡＴＴＣＧＡＧＡＴＣＣＣＧＧＧＡＣＧＣ−３’（配列番号２３）、ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＴＣＧＡＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＴＣＡＴＴＣＣＴＣ−３’（配列番号２４）〕を用いて、ＰＣＲ法（ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＴＯＹＯＢＯ）により、その−６１〜１２４２ｂｐの領域を増幅した。得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲ  Ｖ  ｃｕｔ／ＢＡＰ処理したｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋にサブクローニングして配列を確認した後、Ｅｃｏ  ＲＩ／Ｓａｌ  Ｉで切断してこれを、同じくＥｃｏ  ＲＩ／Ｓａｌ  Ｉで切断したｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ５ａベクターにライゲーションして、Ｃ末端にＦＬＡＧタグを有するＭＡＭドメイン欠損ネフロネクチン（ＮＮ−ΔＭＡＭ−ＦＬＡＧ）発現ベクターを構築した。
（ｃ）ＦＬＡＧ付きＲＧＤリンカー部位（ＮＮ−ＲＧＤ−ＦＬＡＧ）の発現ベクターの構築
ｉ）ＮＮ（マウス）のｃＤＮＡ配列（５’−非翻訳領域、ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）、及び３’−非翻訳領域の全てを含む２５４１ｂｐ）を、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔのｍｕｌｔｉ−ｃｌｏｎｉｎｇ部位（５’−Ｓａｌ  Ｉ／Ｘｈｏ  Ｉ、３’−Ｂａｍ  ＨＩ部位）に挿入して調製したベクターを鋳型として、図中矢印で示す２種類のプライマー〔ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＡＡＴＴＣＧＡＧＡＴＣＣＣＧＧＧＡＣＧＣ−３’（配列番号２５）、ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＧＧＣＣＣＧＴＣＧＡＡＧＴＣＧＧＣＡＧＣ−３’（配列番号２６）〕を用いて、ＰＣＲ法（ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＴＯＹＯＢＯ）により、その−６１〜６９ｂｐの領域を増幅した。得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲ  Ｖ  ｃｕｔ／ＢＡＰ処理したｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋にサブクローニングして配列を確認した。
ｉｉ）一方、上記ＮＮ（マウス）のｃＤＮＡ配列を含むベクターを鋳型として、図中矢印で示す２種類のプライマー〔ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＧＧＣＣＣＡＡＡＧＴＣＡＴＧＡＴＴＧＡＡＣ−３’（配列番号２７）、ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＴＣＧＡＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＴＡＣＴＴＣＣＴＣ−３’（配列番号２８）を用いて、ＰＣＲ法（ＬＡ  ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＴＡＫＡＲＡ，ＧＣＩ  ｂｕｆｆｅｒ使用）により、その７６９−１２４２ｂｐの領域を増幅した。得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲ  Ｖ  ｃｕｔ／ＢＡＰ処理したｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋にサブクローニングして配列を確認した。
ｉｉｉ）上記ｉ）及びｉｉ）で調製したＰＣＲ産物をそれぞれＥｃｏ  ＲＩ／Ａｐａ  Ｉ及びＡｐａ  Ｉ／Ｓａｌ  Ｉで切断してこれらを、Ｅｃｏ  ＲＩ／Ｓａｌ  Ｉで切断したｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ５ａベクターにライゲーションして、Ｃ末端にＦＬＡＧタグを有するＲＧＤリンカー部位（ＮＮ−ＲＧＤ−ＦＬＡＧ）発現ベクターを構築した。
（ｄ）ＦＬＡＧ付きＭＡＭドメイン（ＮＮ−ＭＡＭ−ＦＬＡＧ）の発現ベクターの構築
ｉ）ＮＮ（マウス）のｃＤＮＡ配列（５’−非翻訳領域、ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）、及び３’−非翻訳領域の全てを含む２５４１ｂｐ）を、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔのｍｕｌｔｉ−ｃｌｏｎｉｎｇ部位（５’−Ｓａｌ  Ｉ／Ｘｈｏ  Ｉ、３’−Ｂａｍ  ＨＩ部位）に挿入して調製したベクターを鋳型として、図中矢印で示す２種類のプライマー〔ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＡＡＴＴＣＧＡＧＡＴＣＣＣＧＧＧＡＣＧＣ−３’（配列番号２９）、ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＧＧＣＣＣＧＴＣＧＡＡＧＴＣＧＧＣＡＧＣ−３’（配列番号３０）〕を用いて、ＰＣＲ法（ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＴＯＹＯＢＯ）により、その−６１〜６９ｂｐの領域を増幅した。得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲ  Ｖ  ｃｕｔ／ＢＡＰ処理したｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋にサブクローニングして配列を確認した。
ｉｉ）一方、上記ＮＮ（マウス）のｃＤＮＡ配列を含むベクターを鋳型として、図中矢印で示す２種類のプライマー〔ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＧＧＣＣＣＧＧＴＡＴＴＣＴＣＡＴＡＣＡＣＡＧＣ−３’（配列番号３１）、５’−ＧＴＣＧＡＣＧＣＡＧＣＧＡＣＣＴＣＴＴＴＴＣＡＡＧ−３’（配列番号３２）を用いて、ＰＣＲ法（ＬＡ  ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＴＡＫＡＲＡ，ＧＣＩ  ｂｕｆｆｅｒ使用）により、その１２４３−１６８３ｂｐの領域を増幅した。得られたＰＣＲ産物を、Ｅｃｏ  ＲＩ／ＢＡＰ処理したｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋にサブクローニングして配列を確認した。
ｉｉｉ）上記ｉ）及びｉｉ）で調製したＰＣＲ産物をそれぞれＥｃｏ  ＲＩ／Ａｐａ  Ｉ及びＡｐａ  Ｉ／Ｓａｌ  Ｉで切断してこれらを、Ｅｃｏ  ＲＩ／Ｓａｌ  Ｉで切断したｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ５ａベクターにライゲーションして、Ｃ末端にＦＬＡＧタグを有するＭＡＭドメイン（ＮＮ−ＭＡＭ−ＦＬＡＧ）発現ベクターを構築した。
（２）発現、及び発現産物の精製
ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の説明書に従って、上記で調製した各発現ベクターをＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に一過的に遺伝子導入した。遺伝子導入から６０時間後、培養上清を集め、細胞や不溶物を取り除くため遠心した。その後Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（終濃度１％）、ＥＤＴＡ（同５ｍＭ）、ＰＭＳＦ（同１ｍＭ）、アジ化ナトリウム（同０．０２％）をそれぞれ上清に添加し、さらに抗ＦＬＡＧ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｂｅａｄｓ（Ｓｉｇｍａ）を添加して４℃で一晩撹拌した。抗ＦＬＡＧ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｂｅａｄｓを空のカラムに移し、ＴＢＳ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）ａｎｄ  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ）でビーズを洗浄した。洗浄後、ビーズに結合した各蛋白質を、１００μｇ／ｍｌのＦＬＡＧペプチドを含むＴＢＳで溶出した。溶出した各蛋白質を、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２ｍＭ  ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ  １１．４）で透析してペプチドを除去し、精製された蛋白質を取得した。
以上の全長ＮＮ−ＦＬＡＧ、ＮＮ−ΔＭＡＭ−ＦＬＡＧ、ＮＮ−ＲＧＤ−ＦＬＡＧ、及びＮＮ−ＭＡＭ−ＦＬＡＧについて予想される分子量は、それぞれ６５ｋＤ、４７ｋＤ、１５ｋＤ、及び１８ｋＤである。しかし、これらの蛋白質を抗ＦＬＡＧ  ａｆｆｉｎｉｔｙカラム〔抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（抗ＦＬＡＧ  ｍＡｂ）はＳｉｇｍａから入手〕で精製し、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開したところ、図５に示すように、ＮＮ−ＭＡＭ以外の全ての蛋白質は予想されたサイズより大きな分子量となって検出された。なお、図５のＡ及びＢにおいて、それぞれ右側は電気泳動後ＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｒ−２５０）染色した結果を、左側は電気泳動後、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体（抗ＦＬＡＧ  ｍＡｂ）を用いて免疫ブロッキングを行った結果を示す。
上記の理由として、以前より報告されているように、ＲＧＤリンカー部位が多量のＯ−結合型糖鎖による修飾を受けている可能性が考えられた（Ｂｒａｎｄｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５４，４４７−４５８；Ｍｏｒｉｍｕｒａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６，４２１７２−４２１８１）。また、これらの蛋白質をシアリダーゼで処理したところ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量が低下した。このことからも、上記に示すように精製した蛋白質の見かけの分子量が予想と大きく異なるのが、シアル酸による翻訳後修飾のためであると考えられた。
（３）ネフロネクチンの分子像（電子顕微鏡）（図６）
精製したＮＮ溶液（７５μｇ／ｍｌ、３μｌ）を等量の２％酢酸ウラン溶液で３０秒間染色し（ネガティブ染色）、その後、透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ−１００ＣＸ，ＪＥＯＬ）で解析した。顕微鏡は加速電圧１００キロボルトで実行し、映像は１４ｂｉｔ  ｄｅｅｐ  ＣＣＤ  ｃａｍｅｒａ（ＴＶＩＰＳ）で、２ｋ  ｘ  ２ｋピクセルの解像度でデジタル映像として記録した。結果を図６Ａに示す。その結果、ＮＮの単量体はＶ字型の構造であることが確認できた。電子顕微鏡写真の解析から推測される全長ＮＮの分子構造を図６Ｃに示す。これに示すように、ＥＧＦ様繰り返し配列とＭＡＭドメインは互いに向き合い、リンカー部位が蝶つがいのようにこれらのドメインを繋いでいると推測された。また、単量体に加えて、多くの凝集した多量体も観察された。これはＮＮがＮＮ自身と相互作用しうる可能性を示唆している。
実験例２    ネフロネクチン（全長）及びその欠損変異体のα８β１インテグリンへの結合活性
ネフロネクチン（全長）及びその欠損変異体のα８β１インテグリンに対する結合活性を調べるために、全長ＮＮ−ＦＬＡＧ、ＮＮ−ΔＭＡＭ−ＦＬＡＧ、ＮＮ−ＲＧＤ−ＦＬＡＧ、及びＮＮ−ＭＡＭ−ＦＬＡＧを用いて、ＫＡ８細胞（インテグリンα８鎖を安定に発現する白血病細胞）及びその親細胞であるＫ５６２細胞に対する細胞接着アッセイを行った。
具体的には、まず、ＫＡ８細胞及びＫ５６２細胞をそれぞれ、予め３０ｎＭのＮＮ−ＦＬＡＧ、ＮＮ−ΔＭＡＭ−ＦＬＡＧ、ＮＮ−ＲＧＤ−ＦＬＡＧ、またはＮＮ−ＭＡＭ−ＦＬＡＧでコーティングしておいた９６穴マイクロタイタープレートに播種し（５．０×１０４細胞／ウェル）、３７℃、５％の二酸化炭素を含む加湿した空気内で２時間静置した。その後、接着した細胞を１５分間、３．７％ホルムアルデヒドで固定化し、接着していない細胞をＰＢＳで４回洗浄することによって除去し、０．１％トルイジンブルー入りＰＢＳで１０分間染色した。
ＫＡ８細胞に関する結果を図７に示す。図に示すように、ＫＡ８細胞は、全長ＮＮ−ＦＬＡＧ（図中、ＮＮと表記）、ＮＮ−ΔＭＡＭ−ＦＬＡＧ（図中、ΔＭＡＭと表記）、及びＮＮ−ＲＧＤ−ＦＬＡＧ（図中、ＲＧＤと表記）をコーティングしたプレート表面に接着し、いずれもよく伸長していた。しかし、図には示さないが、Ｋ５６２細胞は、上記の全長ＮＮ−ＦＬＡＧ、ＮＮ−ΔＭＡＭ−ＦＬＡＧ、及びＮＮ−ＲＧＤ−ＦＬＡＧをコーティングしたプレート表面に接着・伸展しなかった。一方、ＮＮ−ＭＡＭ−ＦＬＡＧ（図中、ＭＡＭと表記）をコーティングしたプレート表面には、ＫＡ８細胞及びＫ５６２細胞のいずれも接着・伸展しなかった。また、図７からわかるように、全長ＮＮ−ＦＬＡＧ（ＮＮ）またはＮＮ−ΔＭＡＭ−ＦＬＡＧ（ΔＭＡＭ）をコーティングしたプレート上の方が、ＮＮ−ＲＧＤ−ＦＬＡＧをコーティングしたプレート上よりも、細胞がよく伸展していることが観察された。
この結果から、全長のネフロネクチン（ＮＮ）は、インテグリンα８β１に対して結合活性と細胞伸展活性を有しており、インテグリンα５β１には結合活性を持たないことがわかる。また、上記の結果は、ネフロネクチン（ＮＮ）の主な接着活性部位は、ＲＧＤリンカー部位であること、そして、細胞伸展活性にはＥＧＦ様繰り返し配列の存在が必要であることを示している。
実験例３    基底膜蛋白質に対するネフロネクチンの結合性
ネフロネクチン（ＮＮ）は、基底膜に分布していることが知られている（Ｂｒａｎｄｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５４，４４７−４５８；Ｍｉｎｅｒ，Ｊ．Ｈ．（２００１）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５４，２５７−２５９）。そこで、ＮＮの基底膜蛋白質（ＥＣＭ蛋白質）との結合性について調べた。基底膜蛋白質として、異なるα鎖をもつ一連のラミニン〔マウスＬＮ−１（α１）、ヒトＬＮ−２／４（α２）、ヒトＬＮ−５（α３）、ヒトＬＮ−８（α４）、ヒトＬＮ−１０／１１（α５）〕、ヒト血漿フィブロネクチン（ＦＮ）、ビトロネクチン（ＶＮ）、及び各種コラーゲン〔ヒトＩ型、ＩＶ型、Ｖ型コラーゲン、ニワトリＩＩ型コラーゲン〕を使用した。
（１）基底膜蛋白質の調製
なお、マウスＬＮ−１はＰａｕｌｓｓｏｎの手法（Ｐａｕｌｓｓｏｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １６６，１１−１９）に従い、マウスＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍組織から精製した。ヒトＬＮ−２／４は、ヒトＬＮ−α２鎖に対するモノクローナル抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーにより、ヒト胎盤より精製した。ヒトＬＮ−５、ＬＮ−８、及びＬＮ−１０／１１はそれぞれ、ヒト胃癌細胞ＭＫＮ４５（ＬＮ−５）、ヒト神経膠腫細胞Ｔ９８Ｇ（ＬＮ−８）、及びヒト肺腺癌細胞Ａ５４９（ＬＮ−１０／１１）の培養上清より、免疫親和性クロマトグラフィーを用いて、既述の通りに精製した（Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６，１７５５０−１７５５８；Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ，（１９９８）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ７６，６３−７２；Ｇｕ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ，（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７，１９９２２−１９９２８）。
ヒト血漿フィブロネクチン（ＦＮ）とビトロネクチン（ＶＮ）は、ヒト血漿から、それぞれゼラチン及びヘパリン親和性クロマトグラフィーによって、過去の文献に記載されている通りに精製した（Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ，（１９８３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５８，１４３５９−１４３６５、Ｙａｔｏｈｇｏ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ，，（１９８８）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｆｕｎｃｔ  １３，２８１−２９２）。  ヒトＩ型、ＩＶ型及びＶ型コラーゲンと、ニワトリＩＩ型コラーゲンはＳｉｇｍａ社より購入した。コラーゲンの分類型はＢｏｒｎｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｕｂの報告（Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ，（１９７９）Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄ．Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｈｉｌｌ，Ｒ．Ｌ．，Ｅｄｓ．），ＩＶ．４ｖｏｌｓ．，ＡＣＡＤＥＭＩＣ  ＰＲＥＳＳ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に従った。
（２）固相結合アッセイ（酵素結合免疫吸着検定）
９６穴プレートに、ＰＢＳにて希釈した各種の基底膜蛋白質（１０ｎＭ）を、各ウェル５０μｌずつ添加して、４℃で一晩静置してコーティングした。その後、各ウェルに２００μｌの１％スキムミルク入りＰＢＳを添加して室温で２時間静置してブロッキングした。その後１％ＢＳＡと０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０入りのＰＢＳで３回ウエルを洗浄して、これに適時希釈したＦＬＡＧ付きネフロネクチン（ＮＮ−ＦＬＡＧ）（０．３ｎＭ、３ｎＭ、及び３０ｎＭ）を添加して１時間静置した。洗浄後、これに洗浄溶液で１０００倍希釈した抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）を各ウェル５０μｌずつ添加して１時間室温で静置した。洗浄後、ＨＲＰを結合させたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（二次抗体）を３０００倍希釈して各ウェルに５０μｌずつ加え、１時間静置した。
これを洗浄した後、オルトフェニレンジアミン溶液を各ウェル５０μｌずつ加えて１０分間静置し発色させ、その後２．５Ｍ硫酸を各ウェル５０μｌ加えて発色を停止した。各基底膜蛋白質に結合したＦＬＡＧ付きネフロネクチン（ＮＮ−ＦＬＡＧ）の量は、４９０ｎｍの吸光度（ＯＤ４９０ｎｍ）を測定することで算出した。結果を図８に示す。尚、図に示す各４９０ｎｍ吸光度値は、ブロッキング後、ＮＮ−ＦＬＡＧを添加したときの値と、ＮＮ−ＦＬＡＧを加えず抗ＦＬＡＧ抗体だけを添加したときの値をそれぞれ差し引いて算出した。図８からわかるように、ネフロネクチン（ＮＮ）は、ＬＮ−８、ＬＮ−１０／１１およびフィブロネクチン（ＦＮ）に特異的に、濃度依存的に結合した。ニワトリＩＩ型コラーゲンにも弱いながら結合が認められた。ＩＩ型コラーゲンは正常軟骨組織に特異的に発現・局在している基底膜蛋白質であり、この結果はＮＮが軟骨形成・骨形成に関係しているという報告と関係しているかもしれない（Ｍｏｒｉｍｕｒａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６，４２１７２−４２１８１）。
このアッセイにおいて、ＮＮは、ＬＮ−８（α４β１γ１）及びＬＮ−１０／１１（α５β１／２γ１）と同じβ鎖及びγ鎖を有するＬＮ−２／４（α２β１／２γ１）に対して結合活性を示さなかったことから、ＮＮのＬＮ−８（α４β１γ１）やＬＮ−１０／１１（α５β１／２γ１）への結合はＬＮのα鎖に依存していると考えられる。
（３）免疫共沈降アッセイ（酵素結合免疫吸着検定）
上記で示された、ＬＮ−８（α４β１γ１）及びＬＮ−１０／１１（α５β１／２γ１）に対するＮＮの結合特異性を、ＬＮ−２／４（α２β１／２γ１）とＬＮ−１０／１１（α５β１／２γ１）を用いた免疫共沈降アッセイでさらに確認した。
具体的には、まず、１．５μｇのＬＮ−２／４もしくはＬＮ−１０／１１と１．８μｇのＦＬＡＧタグ付きＮＮ（ＮＮ−ＦＬＡＧ）を、５００μｌの１％  ＢＳＡと０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳに希釈し、抗ＦＬＡＧ抗体（４．９μｇ）または抗ヒトラミニンγ１鎖抗体（ＭＡＢ１９２０、１μｌ）とＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加して４℃で一晩混和した。その後溶液を遠心してＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズを回収し、ビーズを１％  ＢＳＡと０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、ＰＶＤＦ膜に転写し、得られたＰＶＤＦ膜を５％スキムミルクと０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０入りＴＢＳ（ブロッキング緩衝液）で１時間ブロッキングした。ブロッキング緩衝液で２０００倍希釈した抗ヒトラミニンγ１鎖抗体（ＭＡＢ１９２０）でそのＰＶＤＦ膜を浸し、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０入りＴＢＳで膜を洗浄後、ＨＲＰを付加したウサギ抗マウスＩｇＧ（二次抗体、ＩＣＮ  Ｐａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．社製）をＰＶＤＦ膜と反応させた。その後、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０入りＴＢＳで洗浄し、ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で検出した。
結果を図９に示す。図中、「Ｆ」は抗ＦＬＡＧ抗体（モノクローナル抗体）との結合反応を、「Ｍ」は抗ヒトラミニンγ１鎖抗体（モノクローナル抗体）（ＭＡＢ１９２０）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）との結合反応を意味している。図９からわかるように、ＮＮは、ＬＮ−１０／１１（α５β１／２γ１）と共沈降したが、ＬＮ−２／４（α２β１／２γ１）とは共沈降しなかった。このことから、固相結合アッセイの場合と同様に、ＮＮの結合はＬＮのα鎖に依存していると考えられる。
（４）ネフロネクチンのラミニン（ＬＮ−８、ＬＮ−１０／１１）への結合における二価イオン、ＮａＣｌ及びヘパリンの影響
基底膜蛋白質間の蛋白−蛋白間相互作用は、アミノ酸側鎖の静電的相互作用、または疎水的相互作用（場合によってはその両方）を介して生じる。またある時は、二価金属イオンやヘパリンのような糖鎖も基底膜蛋白間の相互作用に関わっている。上記で得られたＮＮのＬＮ−８、ＬＮ−１０／１１、ＦＮに対する結合を媒介する相互作用はどのようなものかを解析するために、それぞれ１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、または１μｇ／ｍｌヘパリン存在下で、上記（１）と同様の方法によって、ＮＮのＬＮ−８、ＬＮ−１０／１１、及びＦＮに対する固相結合アッセイを行った。なお、コントロールとして、上記成分の非存在下で同様に固相結合アッセイを行った。結果を図１０に示す。図１０からわかるように、ＮＮのＬＮ−８、ＬＮ−１０／１１に対する結合は、０．５Ｍ  ＮａＣｌまたは１μｇ／ｍｌヘパリンの存在で抑制されたが、ＥＤＴＡの依存の有無によっては殆ど変化がなかった。このことから、これらの結合が二価イオンに依存しないことが判明した。
また、０．５Ｍ  ＮａＣｌの存在下では、ＮＮはＬＮ−８やＬＮ−１０／１１には結合しなかった。このことは、ＮＮがＬＮ−８、ＬＮ−１０／１１に対して、静電的相互作用によって結合していることを示唆している。同様の結果は１μｇ／ｍｌヘパリン存在下でも見られた。この結果は、ヘパリンがＮＮのラミニン（ＬＮ）への相互作用に必要なＮＮもしくはＬＮ内部の正電荷を覆っていることを示している。興味深いことに、ＮＮのＦＮへの結合は０．５Ｍ  ＮａＣｌ存在下や１μｇ／ｍｌヘパリン存在下で増加した。これはＮＮがＦＮへ疎水的相互作用で結合していることを示唆している（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，Ｋ．Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ−（Ｊａｎｓｏｎ，Ｊ．−Ｃ．，ａｎｄ  Ｒｙｄｅｎ，Ｌ．，Ｅｄｓ．）．７ｖｏｌｓ．，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）これらの結果から、ＮＮのＬＮへの結合特性は、ＦＮへの結合特性とは全く異なるものであることが示された。
実験例４    ネフロネクチン（全長）及びその欠損変異体のラミニン（ＬＮ−１０／１１）に対する結合活性
ネフロネクチン（全長）及びその欠損変異体のラミニン（ＬＮ−１０／１１）に対する結合活性を調べるために、図４に示すドメイン構造を有する全長ＮＮ−ＦＬＡＧ、ＮＮ−ΔＭＡＭ−ＦＬＡＧ、ＮＮ−ＲＧＤ−ＦＬＡＧ、及びＮＮ−ＭＡＭ−ＦＬＡＧを用いて、ラミニン（ＬＮ−１０／１１）に対する固相結合アッセイを行った。
具体的には、ラミニン（ＬＮ−１０／１１）でコーティングした９６穴プレートを１％スキムミルクでブロッキングし、これに段階希釈したＦＬＡＧ付きネフロネクチン（ＮＮ−ＦＬＡＧ）またはその欠損変異体（ＮＮ−ΔＭＡＭ−ＦＬＡＧ、ＮＮ−ＲＧＤ−ＦＬＡＧ、ＮＮ−ＭＡＭ−ＦＬＡＧ）を添加して１時間静置して反応させた。洗浄後、ラミニンに結合したＮＮ−ＦＬＡＧ及びその欠損変異体を、実験例２の方法に従って、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２  ｍＡｂ（Ｓｉｇｍａ）及びＨＲＰを融合させたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（二次抗体）を用いた酵素結合免疫吸着検定を行い定量化した。結果を図１１に示す。
図１１からわかるように、ＮＮ−ＲＧＤ−ＦＬＡＧの結果から、全長ＮＮ−ＦＬＡＧからＭＡＭドメインとＥＧＦ様繰り返し配列を欠失させることにより、ラミニン（ＬＮ−１０／１１）に対する結合活性が完全に消失することが分かった。一方、ＭＡＭドメインを有するＮＮ−ＭＡＭ−ＦＬＡＧは、全長ＮＮ−ＦＬＡＧより弱いもののラミニン（ＬＮ−１０／１１）に対して結合活性を示し、またＭＡＭドメインを欠損したＮＮ−ΔＭＡＭ−ＦＬＡＧ（ＥＧＦ様繰り返し配列とＲＧＤリンカー部位を有する）もまたＮＮ−ＭＡＭ−ＦＬＡＧより弱いが、ラミニン（ＬＮ−１０／１１）に対して結合活性を示した。
これらのことから、ネフロネクチンのラミニン（ＬＮ−１０／１１）への結合は主にＭＡＭドメインが担っており、ＥＧＦ様繰り返し配列も弱いながらもラミニン（ＬＮ−１０／１１）に対する結合部位であることが判明した。しかし、いずれもドメインも単独ではラミニン（ＬＮ−１０／１１）に対する結合活性は低く、全長のネフロネクチンが最も高い結合活性を示した。
実験例５    ネフロネクチン（全長）及びその欠損変異体（ＮＮ−ＭＡＭ−ＦＬＡＧ）の成体マウス腎臓（髄質）の基底膜に対する結合性
成体マウスの腎臓を７０％エタノール中で固定し、その後パラフィン中に包埋し、６μｍの厚さの切片にした。切片は脱パラフィン操作をした後、ＤＡＫＯ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ  ＵＳＡ）により内在性ペルオキシダーゼをブロッキングし、続いて１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ブロッキングバッファー）で１時間、室温でインキュベートして切片をブロッキングした。その後、ＰＢＳで希釈したＮＮ−ＦＬＡＧ（１２μｇ／ｍｌ）、ＮＮ−ＭＡＭ−ＦＬＡＧ（１６μｇ／ｍｌ）、もしくはブロッキングバッファー（ＰＢＳ）をそれぞれ切片に添加して、１時間、室温でインキュベートした。次いで、得られた切片を、ＰＢＳで洗浄して結合していないＮＮ−ＦＬＡＧ及びＮＮ−ＭＡＭ−ＦＬＡＧを除去した後、ブロッキングバッファーで１：２００に希釈したＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＳＩＧＭＡ）を添加し、１時間、室温でインキュベートした。洗浄後、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）によって発色反応を行い、腎臓組織におけるＮＮ−ＦＬＡＧまたはＮＮ−ＭＡＭ−ＦＬＡＧの結合の有無を顕微鏡にて確認した。結果を図１２に示す。
図１２に示しているのは腎臓の髄質部分の拡大写真である（スケールバー：５０μｍ）。図Ａ及びＢの結果から、尿細管の外側が、それぞれＮＮ−ＭＡＭ−ＦＬＡＧ及びＮＮ−ＦＬＡＧにより、基底膜様に染色されていることが分かる（褐色に染色）。これまでの実験結果から総合すると、ＮＮ−ＭＡＭ−ＦＬＡＧ及びＮＮ−ＦＬＡＧは、腎臓の基底膜に存在するＬＮ−１０／１１もしくはＬＮ−８と結合することによって、基底膜に特異的に結合しているものと考えられる。
この結果は、ネフロネクチンのＭＡＭドメイン及びＭＡＭドメインを有するポリペプチド（ネフロネクチン）は、ＬＮ−１０／１１もしくはＬＮ−８への結合性に基づいて、実際の生体組織の基底膜に対しても配向性及び結合性を有していることを示すものである。また、この結果は、基底膜をターゲットとしたドラッグデリバリーシステムにおいて、ＭＡＭドメイン及びＭＡＭドメインを有するポリペプチドが有用であることを示唆するものである。
実験例６    基底膜蛋白質に対するＭＡＥＧタンパクの結合性
上記実験例４の結果から、ネフロネクチン（ＮＮ）のＭＡＭドメインがラミニン（ＬＮ−１０／１１）に対する主要な結合部位であることが判明した。このことから、同様にＭＡＭドメインを有しＮＮと相同性を有するＭＡＥＧ（ＭＡＭ−ａｎｄ  ＥＧＦ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｇｅｎｅ）蛋白質もまたラミニン（ＬＮ−１０／１１）と結合する能力を有していると考えられた（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５４，Ｎｏ．２，２００１，４４７−４５８；Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６５，１６−２３（２０００））。
そこで、これを確認するために、ＮＮとＭＡＥＧ蛋白質の両方のＭＡＭドメインをＧＳＴ融合蛋白質（ＧＳＴ−ＮＮ−ＭＡＭ、ＧＳＴ−ＭＡＥＧ−ＭＡＭ）として発現精製し、一連のラミニン〔マウスＬＮ−１（α１）、ヒトＬＮ−２／４（α２）、ヒトＬＮ−５（α３）、ヒトＬＮ−８（α４）、ヒトＬＮ−１０／１１（α５）〕に対する結合活性を、抗ＧＳＴモノクローナル抗体（抗ＧＳＴ  ｍＡｂ：Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を用いて、実験例３（２）に記載する固相結合アッセイ（酵素結合免疫吸着検定）に準じて（ブロッキング溶液として、１％スキムミルク入りＰＢＳに代えて、１％ＢＳＡ入りＰＢＳを使用）、測定した。
なお、上記ＧＳＴ融合蛋白質（ＧＳＴ−ＮＮ−ＭＡＭ、ＧＳＴ−ＭＡＥＧ−ＭＡＭ）は、まず、それぞれ５’−ＧＡＡＴＴＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＡＡＴＴＴＴＧＡＣＣＡＴ−３’（ｆｏｒｗａｒｄ）（配列番号３３）と５’−ＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＡＣＣＴＣＴＴＴＴＣＡＡ−３’（ｒｅｖｅｒｓｅ）（配列番号３４）、及び５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＴＴＧＡＣＴＧＣＡＧＣＴＴＴＧＡＴＣ−３’（ｆｏｒｗａｒｄ）（配列番号３５）と５’−ＡＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＣＣＴＴＣＴＡＣＡＧＡＴＡＡＡＡＡＧ−３’（ｒｅｖｅｒｓｅ）（配列番号３６）の各２種類のプライマーを用いて、受精後１３．５日マウス胚のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として増幅したｃＤＮＡ断片（ＰＣＲ増幅産物）を、タグとしてＧＳＴを有するｐＧＥＸ−４Ｔ−１ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に、そのＧＳＴ部位とコドンが合うように挿入して、発現ベクターを作成し、これを大腸菌ＢＬ２１に導入して、グルタチオン−セファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて精製することによって作成した。
結果を図１３に示す。図ＡがＧＳＴ融合蛋白質（ＧＳＴ−ＭＡＥＧ−ＭＡＭ）のラミニンに対する結合性をみた結果であり、図ＢがＧＳＴ融合蛋白質（ＧＳＴ−ＮＮ−ＭＡＭ）のラミニンに対する結合性をみた結果である。この結果、前述の結果で示した通り、ＮＮのＭＡＭドメインはラミニンのうちＬＮ−８とＬＮ−１０／１１に特異的に結合するのに対し、ＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメインはラミニン（ＬＮ−５）に特異的に結合した。このことはＭＡＥＧタンパクのＭＡＭドメインはラミニンに結合するものの、その結合特異性はＮＮのＭＡＭドメインと明らかに異なっていることを示す。
前述するように、ラミニンはα鎖のタイプによって大きく５種類に分類されており、各種が異なる組織に発現し分布していることが知られている（表１）。例えばＬＮ−５（α３β３γ２）は皮膚・肺・その他上皮組織に、ＬＮ−８（α４β１γ１）は血管（毛細血管、新生血管）に、ＬＮ−１０（α５β１γ１）及びＬＮ−１１（α５β２γ１）は大血管（太い血管）、腎臓、肺、膵臓、その他多くの上皮組織に発現し分布している。そして、ＭＡＥＧ蛋白質とＮＮは、互いに異なる組織局在性を示していることが知られている。
こうした事実、並びに上記実験で得られた結果から、ＮＮとＭＡＥＧ蛋白質の特異的な組織局在性は、ＮＮとＭＡＥＧ蛋白質の各々が有するＭＡＭドメインのラミニン結合特異性が関与している可能性が考えられる。すなわち、ＮＮとＭＡＥＧタンパクの組織局在性・結合特異性は、各タンパクが有するＭＡＭドメインによって決められていると推測される。そしてＭＡＭドメインに応じて異なる組織特異性（発現・結合）を有する蛋白質（ＮＮとＭＡＥＧ蛋白質）は、個々に特異的な組織の基底膜で機能し、器官形成や各種現象を制御するものと考えられる。
実験例７    ネフロネクチンとラミニン（ＬＮ−１０）の結合様式
上皮細胞によって発現されたネフロネクチン（ＮＮ）は基底膜に蓄積し、間充織細胞へ何らかの影響を及ぼしていることが知られている（Ｂｒａｎｄｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５４，４４７−４５８）。一方で、ラミニン（ＬＮ−１０）は基底膜に存在しＧドメインを介して上皮細胞へシグナルを伝達していると報告されている（Ｉｄｏ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ）。このことから、ＬＮ−１０におけるＮＮ結合部位の同定は、ＮＮの生理的・分子的機能を解明するための重要な情報を与えてくれると思われる。そこで、組換えＬＮ−１０（ｒＬＮ−１０）とそのＧドメイン欠損変異体（ＬＮ−１０ΔＧ）を用いて、ＬＮ−１０におけるＮＮの結合部位を固相結合アッセイにより解析した。なお、組換えＬＮ−１０（ｒＬＮ−１０）とそのＧドメイン欠損変異体（ＬＮ−１０ΔＧ）は、文献（Ｉｄｏ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ）に記載されている方法に従って調製した。
具体的には、全長ＮＮ（ＮＮ−ＦＬＡＧ）とそのＭＡＭドメイン（ＮＮ−ＭＡＭ−ＦＬＡＧ）について、それぞれ組換えＬＮ−１０（ｒＬＮ−１０）とそのＧドメイン欠損変異体（ＬＮ−１０ΔＧ）に対する結合活性を、実験例３に記載する固相結合アッセイ法に準じて調べた。結果を図１４に示す。
図１４に示すように、全長ＮＮ（ＮＮ−ＦＬＡＧ）のＬＮ−１０ΔＧに対する結合は、ｒＬＮ−１０に対する結合と比較して約４０％まで減少した。一方、ＮＮのＭＡＭドメイン（ＮＮ−ＭＡＭ−ＦＬＡＧ）のＬＮ−１０ΔＧに対する結合とｒＬＮ−１０に対する結合強度はほとんど同じレベルであった。また、ＮＮのＭＡＭドメイン（ＮＮ−ＭＡＭ−ＦＬＡＧ）のｒＬＮ−１０に対する結合は全長ＮＮの結合に比べて弱いレベルの結合であったが、このレベルは全長ＮＮのＬＮ−１０ΔＧに対する結合とほとんど同レベルであった。
これらの結果は、ネフロネクチン（ＮＮ）とラミニン（ＬＮ−１０）の結合には、ラミニン（ＬＮ−１０）のＧドメインが重要であること、すなわち、ＮＮはＬＮ−１０のＧドメインを介してＬＮ−１０に結合すること、そして、Ｇドメインとの結合にＮＮのＭＡＭドメインは寄与していないことを示している。前述する実験例４において、ＮＮはＥＧＦ様繰り返し配列とＭＡＭドメインを介してＬＮ−１０／１１に結合することを示した（図１１）。これらのことから総合すると、ＮＮのＭＡＭドメインはＬＮ−１０のＧドメイン以外の部位、恐らくロッド部位に結合し、一方、ＮＮのＥＧＦ様繰り返し配列はＬＮ−１０のＧドメインと結合していると考えられる。
実験例８  マウス腎臓におけるネフロネクチン（ＮＮ）とＬＮ−α５鎖の局在性
ＬＮ−１０／１１のα鎖であるＬＮ−α５鎖に対するＮＮの生体内での結合性を評価するため、マウスの腎臓組織におけるＮＮ及びＬＮ−α５鎖の局在を、免疫組織化学的染色法によって調べた。なお、ＮＮは成体マウスの腎臓で発現していることが知られている（Ｍｏｒｉｍｕｒａ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６，４２１７２−４２１８１；Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｄａｔａ  ｓｈｅｅｔ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＰＯＥＭ／ｎｅｐｈｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｒａｂｂｉｔ）。
なお、免疫組織化学的染色は次のようにして行った。まず、腎臓を成体マウス個体から採取し、４％  パラホルムアルデヒドで１５分間、室温で固定、ＯＣＴコンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ社）に包埋した。その腎臓の３〜５μｍ凍結切片を１％  ＢＳＡを含むＰＢＳ（ブロッキング緩衝液）でブロッキングし、ブロッキング緩衝液で洗浄した。その後、切片にブロッキング緩衝液で希釈した１２μｇ／ｍｌの抗ＰＯＥＭ／ｎｅｐｈｒｏｎｅｃｔｉｎ抗体（抗ＮＮ抗体：トランスジェニック社）、または同１００倍希釈の抗ＬＮ−α５鎖抗血清（アメリカ・ワシントン大学Ｊ．Ｈ．Ｍｉｎｅｒ博士より譲渡）を添加して、室温で１時間静置した。その後、ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて検出した。
結果を図１５に示す。図Ａは抗ＰＯＥＭ／ｎｅｐｈｒｏｎｅｃｔｉｎ抗体（抗ＮＮ抗体）で免疫染色した結果であり、図Ｂは抗ＬＮ−α５鎖抗血清で免疫染色した結果である。この結果からわかるように、ＮＮは腎糸球体基底膜に局在しており、そこではＬＮ−α５鎖も同様に強く発現していた。このことはＮＮがＬＮ−α５鎖と生体内でも共局在していることを示唆している。
＜考察＞
以上の実験から得られた知見を次のように纏めることができる。
（１）ネフロネクチン（ＮＮ）は、基底膜を構成する主要タンパクであるラミニンＬＮ−８（α４β１γ１）とＬＮ−１０／１１（α５β１／２γ１）に選択的に結合する。一方、これらのラミニンと同じβ鎖とγ鎖を有するＬＮ−２／４（α２β１／２γ１）とは結合しない。
この結果は、ＮＮはラミニンのα４鎖又はα５鎖に結合することを示唆している。また、α５鎖を有するラミニン（ＬＮ−１０とＬＮ−１１）が特異的に発現分布している組織は腎臓であるが、我々は上記知見を裏付ける実験結果として、ＮＮとＬＮ−α５鎖が成体マウス腎臓の同じ部位、つまり腎糸球体基底膜に局在することを確認している。
これらのことから、発生期の腎臓において、ＮＮはラミニンのα４鎖又はα５鎖に対する結合を介して基底膜に選択的に組み込まれると想定できる。なお、ラミニンのα４鎖とα５鎖の発生期腎臓における局在がＮＮの局在と非常に似通っているという報告（Ｍｉｎｅｒ，Ｊ．Ｈ．（２００１）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５４，２５７−２５９：Ｍｉｎｅｒ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３７，６８５−７０１）、並びにＬＮ−α４鎖及びＬＮ−α５鎖が存在しない基底膜にはＮＮの局在も見られないという報告（Ｋａｎｗａｒ，Ｙ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８６，Ｆ２０２−２１５）があるが、これらは上記の見解を支持するものである。
（２）ネフロネクチン（ＮＮ）は、ＭＡＭドメインをｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｓｉｔｅとして、ＥＧＦ様繰り返し配列をｌｏｗ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｓｉｔｅとして、ＬＮ−１０／１１と結合する。但し、これらの各ドメインのＬＮ−１０／１１に対する結合活性は、全長ＮＮが有する結合活性に比して非常に弱いものである。
（３）全長のネフロネクチン（ＮＮ）は、ラミニン（ＬＮ−１０）のＧドメインを介してＬＮ−１０と結合している。しかし、ラミニン（ＬＮ−１０）のＧドメインはＮＮのＭＡＭドメインとは結合しない。このことから、ＮＮの基底膜の組み込みには、基底膜の構成タンパクであるラミニンのＧドメインが必要であると考えられる。
上記（２）と（３）のことから、ＮＮとラミニン（ＬＮのα５又はα４鎖）の結合様式として、まずラミニンのＧドメイン以外の部位にＮＮのＭＡＭドメインが結合し、その後、その結合を安定化させるように、ラミニンのＧドメイン部位にＥＧＦ様繰り返し配列が結合して、全長ＮＮの結合を安定化している可能性が考えられる。また、全長のＮＮは、多量体形成が認められたが、これはＬＮ−１０／１１に結合したＮＮに、さらに他のＮＮが結合することによって形成される可能性が考えられる。
ところで、インテグリンα８β１は、発生期腎臓の間充織で豊富に発現している蛋白質であり、インテグリンα８β１が欠損したマウスは深刻な腎臓発生欠損を示すことが知られている（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｕ．，，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８８，６０３−６１３）。さらに、インテグリンα８β１はネフロネクチン（ＮＮ）の受容体であることがｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ両方の系で示されている（Ｂｒａｎｄｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５４，４４７−４５８）。これらのことから、ＮＮはα８β１インテグリンを介して後腎間充織にシグナルを伝達し、腎臓形態形成の制御に関与していると思われる。さらに、ＬＮ−α５鎖とインテグリンα３β１もまた、腎臓の器官形成に必要不可欠であると報告されている（Ｍｉｎｅｒ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２１７，２７８−２８９；Ｋｒｅｉｄｂｅｒｇ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２，３５３７−３５４７）。
これらのことから、腎臓形態形成に必要不可欠な経路が少なくとも２つあると考えられる。１つはＮＮとα８β１インテグリンを介して後腎間充織の分化誘導を調節する経路であり、もう一つは、ＬＮα５とα３β１インテグリンを介して尿管芽上皮の伸展や分岐を調節する経路である。上記の実験から、これらの経路は互いに独立したものではなく、ＮＮとＬＮ−α５鎖との相互作用によって連結している可能性が考えられる。以上のことから、前述する（１）の見解を補足すると、発生期の腎臓において、ＮＮは、ラミニンのα５鎖（またはα４鎖）に対する結合を介して基底膜に選択的に組み込まれ、その部位にある細胞にα８β１インテグリン及びα３β１インテグリンを介してシグナルを伝達していると推測される。
本発明において、ネフロネクチン（ＮＮ）が基底膜の構成蛋白質であるラミニンのＬＮ−α４鎖とα５鎖に特異的に相互作用することを見いだした。ＮＮはＭＡＭドメインを含む珍しいＥＣＭ蛋白質の１つである。他に知られているＭＡＭドメイン含有蛋白質としては、ＭＡＥＧ、メプリン、ニューロピリン（Ａ５蛋白質）、受容体蛋白質チロシン脱リン酸化酵素μ／κを挙げることができる。
さらに、本発明において、ＮＮのＭＡＭドメインがラミニンへの結合に強く関与していること、ＭＡＭドメインの種類によってラミニン結合特異性が異なることを見いだした。例えば、ＮＮのＭＡＭドメインはＬＮ−８及びＬＮ−１０／１１に選択的に結合するのに対し、ＭＡＥＧのＭＡＭドメインはＬＮ−８及びＬＮ−１０／１１には結合せず、ＬＮ−５に選択的に結合する。
ＭＡＭドメインは蛋白−蛋白間相互作用、特にＭＡＭドメイン間の同種親和的な相互作用に必要であると考えられている。例えば、金属プロテアーゼの一種であるメプリンは、そのＭＡＭドメインを介して巨大な多量体を形成する（Ｉｓｈｍａｅｌ，Ｆ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６，２３２０７−２３２１１）。膜貫通蛋白質でありセマフォリンの受容体であるニューロピリンの場合、そのＭＡＭドメインは細胞表面上で互いに相互作用し二量体を形成する（Ｃｈｅｎ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｎｅｕｒｏｎ  ２１，１２８３−１２９０）。受容体型蛋白質チロシン脱リン酸化酵素μとκは、ＭＡＭドメインを介して細胞−細胞間で同種親和的な相互作用を示す（Ｚｏｎｄａｇ，Ｇ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０，１４２４７−１４２５０）。本発明の結果は、ＭＡＭドメインが、それを含む各蛋白質に結合特異性を与えていることを示唆している。すなわち、上記実験における知見は、ＭＡＭドメイン及びそれを含む蛋白質は、各ＭＡＭドメインの組織特異性に応じて、特定の組織指向性を備えており、これによって、例えば特定の組織に有用な物質を運ぶ運搬体として利用できる可能性を示すものである。
【産業上の利用可能性】  本発明の標的指向性運搬体は、そのラミニンへの選択特異的な結合性に基づいて、組織特異的に標的指向性を発揮し、これにより目的とする標的組織または細胞に有用な薬物（例えば、生理活性ペプチドやその遺伝子、抗体医薬、アンチセンス分子や干渉ＲＮＡ因子）を輸送する運搬体として利用することができる。当該標的指向性運搬体は、通常運搬する目的物質（例えば、薬物）を導入して、標的指向性薬物複合体として用いられる。
かかる標的指向性薬物複合体は、ドラッグデリバリーシステムまたはターゲッティング療法に有効に利用することができる。特に、標的指向性運搬体としてネフロネクチンのＭＡＭドメインを利用した場合（例えばＮＮそのもの）は、当該標的指向性運搬体が備える新生血管、大血管、腎臓、肺、または膵臓に対する特異的組織結合性に基づいて、所望の薬物を当該組織に指向させることで局所濃度を高く維持し、薬物の有効性を高めることができ、またそれと同時に、他部位へ拡散して生じる副作用を防ぐことができる。
また、標的指向性運搬体としてＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメインを利用した場合は（例えばＭＡＥＧ蛋白質そのもの）、当該標的指向性運搬体が備える毛包、皮膚（表皮）、肺に対する特異的組織結合性に基づいて、薬物を当該組織に指向させることで局所濃度を高く維持し、薬物の有効性を高めることができ、またそれと同時に、他部位へ拡散して生じる副作用を防ぐことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年12月22日(2005.12.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】請求の範囲
【請求項１】ＭＡＭドメイン（ｍｅｐｒｉｎ，５Ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  μ−ｄｏｍａｉｎ）からなるポリペプチド、またはＭＡＭドメインをコードする核酸であって、所望の物質を結合させて、該物質を標的組織に輸送するために用いられる標的指向性運搬体。
【請求項２】下記の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有するＭＡＭドメイン（ｍｅｐｒｉｎ，５Ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  μ−ｄｏｍａｉｎ）もしくはそれを一部に有するポリペプチド、または上記ＭＡＭドメインもしくはそれを一部に有するポリペプチドをコードする遺伝子を有する核酸であって、所望の物質を結合させて、該物質をα４鎖またはα５鎖を有するラミニンを発現する標的組織に輸送するために用いられる標的指向性運搬体；
（ａ）配列番号１に示される、ネフロネクチンのＭＡＭドメインのアミノ酸配列、
（ｂ）上記ネフロネクチンのＭＡＭドメインのアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつラミニンのα４鎖またはα５鎖に結合性を有するアミノ酸配列。
【請求項３】  上記（ｂ）が、配列番号１に示されるネフロネクチンのＭＡＭドメインのアミノ酸配列と、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である、請求項２記載の標的指向性運搬体。
【請求項４】  上記（ｂ）が、ヒト由来ネフロネクチンのＭＡＭドメインのアミノ酸配列である、請求項２記載の標的指向性運搬体。
【請求項５】  上記（ｂ）が、配列番号３７に示されるアミノ酸配列である、請求項２記載の標的指向性運搬体。
【請求項６】下記の（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列を有するＭＡＭドメイン（ｍｅｐｒｉｎ，５Ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  μ−ｄｏｍａｉｎ）もしくはそれを一部に有するポリペプチド、または上記ＭＡＭドメインもしくはそれを一部に有するポリペプチドをコードする遺伝子を有する核酸であって、所望の物質を結合させて、該物質をα４鎖またはα５鎖を有するラミニンを発現する標的組織に輸送するために用いられる標的指向性運搬体；
（ｃ）配列番号１７または１９に示される、ネフロネクチンのアミノ酸配列、
（ｄ）上記ネフロネクチンのアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつラミニンのα４鎖またはα５鎖に結合性を有するアミノ酸配列。
【請求項７】  上記（ｄ）が、配列番号１７または１９に示されるネフロネクチンのアミノ酸配列と、少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列である、請求項６記載の標的指向性運搬体。
【請求項８】  上記（ｄ）が、ヒト由来ネフロネクチンのアミノ酸配列である、請求項６記載の標的指向性運搬体。
【請求項９】  上記（ｄ）が、配列番号５３に示されるアミノ酸配列である、請求項６記載の標的指向性運搬体。
【請求項１０】  腎臓、新生血管、肺、膵臓、または大血管に対して指向性を有することを特徴とする請求項２または６に記載する標的指向性運搬体。
【請求項１１】下記の（ｅ）または（ｆ）のアミノ酸配列を有するＭＡＭドメイン（ｍｅｐｒｉｎ，５Ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  μ−ｄｏｍａｉｎ）もしくはそれを一部に有するポリペプチド、または上記ＭＡＭドメインもしくはそれを一部に有するポリペプチドをコードする遺伝子を有する核酸であって、所望の物質を結合させて、該物質をα３鎖を有するラミニンを発現する標的組織に輸送するために用いられる標的指向性運搬体；
（ｅ）配列番号３に示される、ＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメインのアミノ酸配列、
（ｆ）上記ＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメインのアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつラミニンのα３鎖に結合性を有するアミノ酸配列。
【請求項１２】  上記（ｆ）が、配列番号３に示されるＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメインのアミノ酸配列と、少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列である、請求項１１記載の標的指向性運搬体。
【請求項１３】  上記（ｆ）が、ヒト由来ＭＡＥＧ蛋白質のＭＡＭドメインのアミノ酸配列である、請求項１１記載の標的指向性運搬体。
【請求項１４】  上記（ｆ）が、配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有するものである、請求項１１記載の標的指向性運搬体。
【請求項１５】下記の（ｇ）または（ｈ）のアミノ酸配列を有するＭＡＭドメイン（ｍｅｐｒｉｎ，５Ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  μ−ｄｏｍａｉｎ）もしくはそれを一部に有するポリペプチド、または上記ＭＡＭドメインもしくはそれを一部に有するポリペプチドをコードする遺伝子を有する核酸であって、所望の物質を結合させて、該物質をα３鎖を有するラミニンを発現する標的組織に輸送するために用いられる標的指向性運搬体；
（ｇ）配列番号２１に示される、ＭＡＥＧ蛋白質のアミノ酸配列、
（ｈ）上記ＭＡＥＧ蛋白質のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつラミニンのα３鎖に結合性を有するアミノ酸配列。
【請求項１６】  上記（ｈ）が、配列番号２１に示されるＭＡＥＧ蛋白質のアミノ酸配列と、少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列である、請求項１５記載の標的指向性運搬体。
【請求項１７】  上記（ｈ）が、ヒト由来ＭＡＥＧ蛋白質のアミノ酸配列である、請求項１５記載の標的指向性運搬体。
【請求項１８】  上記（ｈ）が、配列番号５５に示されるアミノ酸配列である、請求項１５記載の標的指向性運搬体。
【請求項１９】  毛包、皮膚（表皮）、または肺に対して指向性を有することを特徴とする請求項１１または１５に記載する標的指向性運搬体。
【請求項２０】発現ベクターの形態を有する、請求項２または１１に記載する標的指向性運搬体。
【請求項２１】請求項２または１１に記載の標的指向性運搬体に、標的組織に輸送するための薬物が結合されてなる標的指向性薬物複合体。
【請求項２２】  標的指向性薬物複合体が、ペプチドまたはタンパクからなる薬物を結合してなるポリペプチド形態を有するか、または核酸（遺伝子を含む）からなる薬物を結合してなるポリヌクレオチド形態を有するものである、請求項２１に記載する標的指向性薬物複合体。
【請求項２３】  請求項２１に記載する標的指向性薬物複合体を有効成分として含む医薬組成物。
【請求項２４】  標的指向性薬物として、請求項２１に記載する標的指向性薬物複合体を用いることを特徴とする、ドラッグデリバリーシステムまたはターゲッティング療法。
【国際調査報告】
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