(57)【要約】  プロモーター領域を付加したプライマーの提供。プロモーター領域を付加したプライマーをＲＮＡの増幅、生物の遺伝子発現解析及び／又は同定解析に用いる方法の提供。  ＲＮＡに相補性の高い部分に結合するランダムプライマー又は特定の遺伝子に相補的な塩基配列を含むプライマーに、プロモーター領域を付加したプライマーを作製し、これを用いることでＲＮＡの増幅、生物の遺伝子発現解析及び／又は同定解析を行う。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ランダムプライマーにプロモーター領域が付加されたことを特徴とするプライマー。
【請求項２】
特定の遺伝子に相補的な塩基配列を含むプライマーにプロモーター領域が付加されたことを特徴とするプライマー。
【請求項３】
プロモーター領域が、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーターから選ばれるいずれか１つである請求項１又は２に記載のプライマー。
【請求項４】
原核生物のＲＮＡの増幅に用いる請求項１〜３のいずれかに記載のプライマー。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のプライマーを用いて、ＲＮＡを増幅する方法。
【請求項６】
ｎｇ単位のＲＮＡを増幅できる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＲＮＡを増幅する方法が、ＩＶＴ法である請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
ＩＶＴ法を２サイクル行うことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
１サイクルＩＶＴ法によって得られたａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡ  （ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ＲＮＡ）に請求項１〜４のいずれかに記載のプライマーを用いてさらにＩＶＴ法を行うことにより、ｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡを増幅する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
１サイクルＩＶＴ法によって得られたａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡに請求項１〜４のいずれかに記載のプライマーを用いてＲＴ反応を行った後、さらに請求項１〜４のいずれかに記載のプライマーを用いてＩＶＴ法を行うことにより、ｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡ及びａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡを同時に増幅する請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
１サイクルＩＶＴ法によって得られたａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡにランダムプライマーを用いてＲＴ反応を行った後、さらに請求項１〜４のいずれかに記載のプライマーを用いてＩＶＴ法を行うことにより、ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡを増幅する請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれかに記載のプライマーを用いてＳＭＡＲＴ法によりＤＮＡを増幅する方法。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれかに記載のプライマーを用いて増幅したａＲＮＡ及び／又はａＤＮＡ  （ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ）を用いて、生物の遺伝子発現解析及び／又は同定解析を行う方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロモーター領域を付加したプライマーに関する。更に詳しくは、プロモーター領域を付加したランダムプライマー及びプロモーター領域を付加した特定の遺伝子に相補的な塩基配列を含むプライマーに関する。そして、これらのプライマーをＲＮＡの増幅、生物遺伝子の発現解析及び／又は同定解析に用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物感染で発症する疾病の診断において、患者より分離された微生物の生化学的検査や１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列に着目したＰＣＲ法により、病原微生物を同定する検査方法が行なわれてきた。しかしながら近年、同一微生物であっても株の違いによって病原性が異なる事が明らかになっており、更に、その微生物の病原性は患者個々のおかれている環境によって刻々と変化することもわかってきた。従って、これらの検査方法では、患者から分離された微生物のありのままの病原性の強さを的確に捕らえることは不可能であり、試料採取時における様々な病原性遺伝子の発現を的確に捕捉可能な検査方法の確立が必要になってきている。【０００３】
その新たな検査方法の一つとして、マイクロアレイやノーザンブロット法を用いた解析が盛んに行われており、このような解析では試料として組織・細胞から得られるＲＮＡが用いられる。しかし、患者由来の試料から得られる病原微生物の全ＲＮＡは極微量であるため、μｇオーダーの全ＲＮＡを必要とするマイクロアレイやノーザンブロット法等による解析には量的に不十分であった。
この問題の解決にあたり、採取された微生物を培養・増殖させた後、ＲＮＡを抽出する方法が考えられるが、その時の培養条件やＲＮＡ抽出の際の菌体増殖時期によって病原性遺伝子のＲＮＡ発現が大きく変動する可能性が高く、そこから得られる解析結果からは、生体内における病原微生物のありのままの病原性を掌握することができない。
従って、病原微生物のありのままの病原性を解析するためには、臨床的に採取可能な極微量の病原微生物ＲＮＡを効率良くリニア増幅する方法の確立が望まれている。【０００４】
真核生物におけるＲＮＡの増幅はＩＶＴ法（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ法）によって行われるのが一般的である。真核生物は、遺伝子発現解析の対象とするｍＲＮＡの末端にｐｏｌｙＡ構造が存在するため、この構造にチミン（Ｔ）塩基の繰り返し構造にＴ７プロモーター配列をつけたプライマーを結合させて、ＩＶＴ法を行うことにより、極少量の試料から大量のｍＲＮＡを増幅することができる。
一方、病原微生物のような原核生物においては、ｐｏｌｙＡ構造が存在しないことから、前記真核生物と同様なＲＮＡの増幅はできない。原核生物の遺伝子の増幅は、原核生物のＲＮＡを鋳型として、ランダムプライマーや増幅の対象とする遺伝子に相補的な塩基配列を含むプライマーを用いて増幅することでＲＮＡ情報を検出する方法が一般的である。また、近年では、原核生物のＲＮＡ断片にｐｏｌｙＡポリメラーゼを用い、ｐｏｌｙＡ構造を付加することで、これにチミン（Ｔ）塩基の繰り返し構造をプライマーとして結合させ、ＲＴ−ＰＣＲを行う方法も開発されている（例えば、特許文献１参照）。しかし、この特許文献１の方法では、分解し易いＲＮＡの状態でｐｏｌｙＡ付加、精製等の様々な処理を行うためＲＮＡが分解する可能性が高く、効率的ではない。特に、極微量のＲＮＡを試料とし、その全ＲＮＡのわずが数％にすぎないｍＲＮＡを増幅させるために全ＲＮＡにｐｏｌｙＡ付加をするのは、コストパフォーマンスが悪く不向きである。このように、ＲＮＡを安定かつ安価で増幅できる方法の提供が望まれていた。
【特許文献１】特開２００４−１８０５６１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＲＮＡを安定して増幅することができるプライマー及びこれを用いてＲＮＡの増幅を行う方法の提供を課題とする。そして、これらのプライマーをＲＮＡの増幅、生物の遺伝子発現解析及び／又は同定解析に用いる方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、５’末端側にＴ７、Ｔ３又はＳＰ６等のプロモーター領域を付加したランダムプライマー及びこれらのプロモーター領域を付加した特定の遺伝子に相補的な塩基配列を含むプライマーを作製し、これらのプライマーを用いることにより生物のＲＮＡを増幅できることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明のプロモーター領域を付加したランダムプライマーは、鋳型となるＲＮＡにランダムプライマー領域が結合し、二本鎖ＤＮＡ合成後プロモーター領域にＲＮＡポリメラーゼが結合することによって、ＲＮＡを増幅することができる。
また、プロモーター領域を付加した特定の遺伝子に相補的な塩基配列を含むプライマーでは、原核生物の特定の遺伝子に、相補的な塩基配列を含むプライマー領域が結合し、二本鎖ＤＮＡ合成後プロモーター領域にＲＮＡポリメラーゼが結合することによって、原核生物のＲＮＡを増幅することができる。【０００７】
すなわち、本発明は、次の（１）〜（７）に関する。
（１）  ランダムプライマーにプロモーター領域が付加されたことを特徴とするプライマー。
（２）  特定の遺伝子に相補的な塩基配列を含むプライマーにプロモーター領域が付加されたことを特徴とするプライマー。
（３）  プロモーター領域が、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーターから選ばれるいずれか１つである前記（１）又は（２）に記載のプライマー。
（４）  原核生物のＲＮＡの増幅に用いる前記（１）〜（３）のいずれかに記載のプライマー。
（５）  前記（１）〜（４）のいずれかに記載のプライマーを用いて、ＲＮＡを増幅する方法。
（６）  ｎｇ単位のＲＮＡを増幅できる前記（５）に記載の方法。
（７）  ＲＮＡを増幅する方法が、ＩＶＴ法である前記（５）又は（６）に記載の方法。
（８）  ＩＶＴ法を２サイクル行うことを特徴とする前記（７）に記載の方法。
（９）  １サイクルＩＶＴ法によって得られたａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ＲＮＡ）に前記（１）〜（４）のいずれかに記載のプライマーを用いてさらにＩＶＴ法を行うことにより、ｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡを増幅する前記（８）に記載の方法。
（１０）  １サイクルＩＶＴ法によって得られたａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡに前記（１）〜（４）のいずれかに記載のプライマーを用いてＲＴ反応を行った後、さらに前記（１）〜（４）のいずれかに記載のプライマーを用いてＩＶＴ法を行うことにより、ｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡ及びａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡを増幅する前記（８）に記載の方法。
（１１）  １サイクルＩＶＴ法によって得られたａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡにランダムプライマーを用いてＲＴ反応を行った後、さらに前記（１）〜（４）のいずれかに記載のプライマーを用いてＩＶＴ法を行うことにより、ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡを増幅する前記（８）に記載の方法。
（１２）  前記（１）〜（４）のいずれかに記載のプライマーを用いてＳＭＡＲＴ法によりＤＮＡを増幅する方法。
（１３）  前記（１）〜（４）のいずれかに記載のプライマーを用いて増幅したａＲＮＡ及び／又はａＤＮＡを用いて、生物の遺伝子発現解析及び／又は同定解析を行う方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のプロモーター領域を付加したプライマーは、極微量の全ＲＮＡを試料としてＤＮＡ又はＲＮＡを増幅することができる。さらに、標的となる遺伝子のｍＲＮＡを増幅させることができる汎用性のある高いプライマーである。本発明のプライマーにより増幅されたＤＮＡ又はＲＮＡは、マイクロアレイやノーザンブロット等により解析することができる。従って、本発明のプライマーを用いたＲＮＡの増幅により、試料採取時の病原微生物のありのままの病原性を解析することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の「プロモーター領域を付加したプライマー」とは、鋳型ＲＮＡを増幅するために、ランダムプライマー又は特定の遺伝子に相補的な塩基配列を含むプライマーに、ＲＮＡポリメラーゼが結合し得るプロモーターの塩基配列を付加したプライマーのことをいう。本発明のプロモーター領域を付加したプライマーは、増幅の対象とするＲＮＡ又はその特定の遺伝子を増幅できるプライマーであれば、いずれのものを用いてもよく、例えばプロリゴジャパン社等の合成業者によって合成したプライマーを用いることもできる。
本発明のプライマーの合成は、ホスホアミダイド法に従って行うことができる。この方法では３’末端から５’末端側に合成が進むため、ランダムプライマー領域又は特定の遺伝子に相補的な塩基配列を含むプライマー領域が作製された後、引き続きプロモーター領域が作製されて、本発明のプライマーが合成される。これらの合成されたプライマーは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等で精製することができる。【００１０】
下記に本発明のプロモーター領域を付加したプライマーのうち、９つの塩基からなるランダムプライマー領域を有する５’末端側にＴ７プロモーター領域を付加したランダムプライマーを例示した。
2006041159.tif 000002
【００１１】
本発明の「プロモーター領域」とは、ＲＮＡの増幅にあたり、ＲＮＡポリメラーゼが結合し得るプロモーターの塩基配列からなる領域のことをいう。プロモーターとしては、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーターなどが挙げられる。これらのプロモーターは、いずれもＲＮＡポリメラーゼが結合し得るプロモーターであればよく、最も安定した増幅が得られるＴ７プロモーターを用いることが特に望ましい。【００１２】
本発明の「ランダムプライマー」とは、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）の４つの塩基がランダムに並んだ塩基配列からなるプライマーのことをいい、増幅の対象とするＲＮＡに結合し得るプライマーであれば、いずれのものも用いることができる。本発明のランダムプライマーは合成機等で作製することができ、「Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのミックスされたアミダイドを用いてカップリングを合成末端から順次行う方法」や、「同時にＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃを反応相に流す方法」あるいは「順次流す方法」のいずれの方法によっても作製することができる。特に増幅の対象とする生物の全ゲノム配列が決定されている場合においては、その全塩基配列を遺伝子解析ソフトで検索することにより、必要なランダムプライマーのみを選択することができるため、「Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃを反応相に順次流す方法」によって、１本１本決められた塩基配列を作製し、最後に各プライマーを混合調整することで、対象とするＲＮＡへの結合の精度がより高いプライマーを合成することができる。【００１３】
本発明の「特定の遺伝子に相補的な塩基配列を含むプライマー」とは、特定の遺伝子が発現しているｍＲＮＡまたは特定の遺伝子の塩基配列に相補的に結合し得るプライマーであれば、いずれのものも用いることができる。また、「特定の遺伝子」とは、生物の遺伝子発現解析及び／又は同定解析などに用いるために増幅の対象とする特定の遺伝子のことをいう。具体的には、病原微生物の特定の病原遺伝子や、病原微生物を同定するための１６Ｓ  ｒＲＮＡなどが挙げられるが、対象とする生物の遺伝子発現解析及び／又は同定解析などに用いることができ、これらの解析にあたり、その塩基配列がわかっている遺伝子であれば、いずれのものも用いることができる。なお、真核生物のｍＲＮＡを網羅的に増幅できるチミン（Ｔ）塩基の繰り返し構造にＴ７プロモーター配列をつけたプライマーは含まない。
本発明の特定の遺伝子に相補的な塩基配列を含むプライマーは合成機等で作製することができ、増幅の対象とする遺伝子の塩基配列より、必要な塩基配列を選択することができるため、「Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃを反応相に順次流す方法」によって、１本１本決められた塩基配列を作製することができる。【００１４】
本発明のプライマーにおける「特定の遺伝子に相補的な塩基配列」の設定は、増幅の対象とする遺伝子に特異的な領域で、他の遺伝子と相同性を持たない領域を選出することで設定することができる。選出した領域がその遺伝子に特異的かどうかは、遺伝子配列検索ソフトや、ＢＬＡＳＴサーチ等を利用して、網羅的に判定することができる。また、プライマーの設計はｐｒｉｍｅｒ３等のプライマー設計サイトを利用することもできる。
本発明のプライマーは鋳型となるＲＮＡに結合し得るプライマーであれば、長さは特に問わないが、プライマーが安定して利用できる長さであることが好ましい。本発明のプライマーは、変更不可能なおよそ３０塩基の塩基配列からなるプロモーター領域と最低６塩基以上からなるランダムプライマー領域又は特定の遺伝子に相補的な塩基配列を含むプライマー領域からなることが好ましい。特定の遺伝子に相補的な塩基配列を含むプライマー領域の塩基配列は２０塩基前後が扱いやすく好ましい。【００１５】
本発明の「増幅」とは、ＲＮＡを鋳型として、本発明のプロモーター領域を付加したプライマーを用い、ＳＭＡＲＴ法又はＩＶＴ法などで鋳型ＲＮＡを増幅することをいう。本発明の増幅は、１．ＲＮＡを鋳型としてＲＴ反応によりｃＤＮＡを得た後に、２．既存の方法により２本鎖ｃＤＮＡを得て、３．それを鋳型に、ＳＭＡＲＴプライマーと本発明のプロモーター領域を付加したプライマーに挟まれた領域をＰＣＲによって増幅する（ＳＭＡＲＴ法）又は本発明のプライマーに付加されたプロモーター領域に、ＲＮＡポリメラーゼを結合させてＲＮＡを増幅する（ＩＶＴ法）という１．〜３．のステップによって行うことができる。
本発明のプロモーター領域を付加したプライマーによる増幅では、直ちに本発明のプライマーによって分解され易いＲＮＡを安定なＤＮＡに変換することからＲＮＡの分解・消失の可能性が低い。従って、ＲＮＡ試料の採取が難しく、極微量のＲＮＡを試料とする場合でも安定して増幅することができる。【００１６】
本発明のプライマーを用いてＳＭＡＲＴ法により鋳型ＲＮＡを増幅する場合、前記１．のステップで本発明のプロモーター領域を付加したプライマーを用い、ＲＴ酵素によってＲＮＡから１本鎖  ｃＤＮＡを合成すると同時に、使用したＲＴ酵素によって、ｃＤＮＡの３’末端にヌクレオチド残基（Ｃ）が付加され、そこに前記２．のステップで相補的なオリゴ（Ｇ）配列を３’末端に持つＳＭＡＲＴプライマーをアニールさせて、２本鎖ｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ法によって鋳型ＲＮＡを複製・増幅させる方法であり（参考文献１等参照）、本発明においては、このようにして得られた２本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、プロモーター領域を付加したプライマーとＳＭＡＲＴプライマーで挟まれた領域を指数対数的に増幅することができる。ここで増幅された２本鎖ｃＤＮＡに結合しているプライマーのプロモーター領域にＲＮＡポリメラーゼが結合することで、転写によりａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ＲＮＡ）を得ることもできる。
参考文献１：Ｃｈｅｎｃｈｉｋ，Ａ．，Ｚｈｕ，Ｙ．Ｙ．，Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏ，Ｌ．，Ｌｉ，Ｒ．，Ｈｉｌｌ，Ｊ．＆Ｓｉｅｂｅｒｔ，Ｐ．Ｄ．（１９９８）  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｑｕａｌｉｔｙ  ｃＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｓｍａｌｌ  ａｍｏｕｎｔｓ  ｏｆ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｂｙ  ＳＭＡＲＴ  ＰＣＲ．  Ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ＲＴ−ＰＣＲ  （ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｂｏｏｋｓ，  ＭＡ），  ｐｐ．３０５−３１９．【００１７】
ＳＭＡＲＴ法は既存のキットを用いて行うことができ、ＢＤ  Ａｔｌａｓ  ＳＭＡＲＴ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＡＲＴ  ｍＲＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）又はＢＤ  Ａｔｌａｓ  ＳＭＡＲＴ  ｃＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）などを用いることができる。ＢＤ  Ａｔｌａｓ  ＳＭＡＲＴ  ｃＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）では微量のＲＮＡ材料においても純粋なｍＲＮＡから作製したプローブに匹敵する結果が得られている（参考文献２，３等参照）。
参考文献２：Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｐ．，Ｚｉｇｌｅｒ，Ｊ．Ｓ．Ｊｒ，Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ｌ．＆Ｂｏｒｒａｓ  Ｔ．（１９９９）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｖｅｒｙ  ｓｍａｌｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｓａｍｐｌｅｓ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２６：８８４−８９２．
参考文献３：Ｌｉｖｅｓｅｙ，Ｆ．Ｊ．，Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｔ．，Ｓｔｅｆｆｅｎ，Ｍ．Ａ．，Ｃｈｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．＆Ｃｅｐｋｏ，Ｃ．Ｌ．（２０００）  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  ｇｅｎｅ  Ｃｒｘ．  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．１０：３０１−３１０．【００１８】
また、本発明のプライマーを用いてＩＶＴ法によりＲＮＡを増幅した場合、前記１．のステップにおいてＲＮＡを鋳型として本発明のプロモーター領域を付加したプライマーを用い、ＲＴ酵素によって１本鎖  ｃＤＮＡを合成し、前記２．のステップでＲＮａｓｅＨによって鋳型としたＲＮＡを分解すると同時に、ＤＮＡ  ポリメラーゼ  Ｉ及びＴ４  ＤＮＡ  ポリメラーゼによって２本鎖ｃＤＮＡを合成し、前記３．のステップで合成した２本鎖ｃＤＮＡにｄＮＴＰ  ＭｉｘとＴ７ポリメラーゼ酵素を加えてｉｎ  ｖｉｔｒｏ  翻訳を行い、ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡを合成・増幅する方法である。真核生物由来の微量試料においては、ＩＶＴ法によって各ｍＲＮＡに対するａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡが数百倍コピーされて合成されることが確認されている（参考文献４等参照）。なお、ＩＶＴ法は既存のキットを用いて行うことができ、ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ  ａＲＮＡ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）、ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、ＭＥＧＡｓｐｒｉｐｔ  Ｔ７  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ  社）又はＭＥＧＡｓｐｒｉｐｔ  ＳＰ６  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）などを用いることができる。
参考文献４：Ｖａｎ  Ｇｅｌｄｅｒ  ＲＮ，ｖｏｎ  Ｚａｓｔｒｏｗ  ＭＥ，Ｙｏｏｌ  Ａ，Ｄｅｍｅｎｔ  ＷＣ，Ｂａｒｃｈａｓ  ＪＤ，Ｅｂｅｒｗｉｎｅ  ＪＨ．  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｆｒｏｍ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｃＤＮＡ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  １９９０  Ｍａｒ；８７（５）：１６６３−７．【００１９】
更に本発明のプライマーを用いると、ＩＶＴ法を２サイクル続けて行うことによりａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡの増幅と、それと同コピー数のｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡの増幅を同時に行うことができる。これは１サイクル目でＲＮＡを鋳型として本発明のプロモーター領域を付加したプライマーを用い、２本鎖ｃＤＮＡを合成し、ＩＶＴ法によってａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡを増幅する。更に続けて２サイクル目で、１サイクル目で増幅したａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡを鋳型として本発明のプロモーター領域を付加したプライマーを用い、逆転写反応を行い、ＲＮＡを分解後、市販のランダムプライマーを添加しながら２本鎖ｃＤＮＡを合成し、この二本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてＩＶＴ法を行うことでｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡおよび  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡを同時にかつ同コピー数増幅することができる。基本的に、この方法では使用するプライマーは１サイクル目と２サイクル目で同じプロモーター領域を有するプライマーを用いてもよく、異なったプロモーター領域を有するプライマーを組み合わせることで目的に応じた方向の鎖を合成してもよい。【００２０】
なお、ＲＮＡの増幅過程における、合成された二本鎖ｃＤＮＡの精製には従来知られているフェノール・クロロホルム法の他、Ａｍｉｎｏ  Ａｌｌｙｌ  ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ  ａＲＮＡ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）中の精製用カラムやＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）等の精製カラムを用いて行うことができる。
これらのＲＮＡの増幅はＲＮＡ  ポリメラーゼ活性が一般的には混合試料中の各鋳型（テンプレート）の濃度や転写における鋳型の塩基配列に影響されないことから（参考文献５，６等参照）、混合試料中の個々のｍＲＮＡ塩基配列に依存せずに概ねリニアに全てのＲＮＡを増幅することができる。
参考文献５：Ｂａｕｇｈ  ＬＲ，Ｈｉｌｌ  ＡＡ，Ｂｒｏｗｎ  ＥＬ，Ｈｕｎｔｅｒ  ＣＰ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００１  Ｍａｒ１；２９（５）：Ｅ２９．
参考文献６：Ｐａｂｏｎ  Ｃ，Ｍｏｄｒｕｓａｎ  Ｚ，Ｒｕｖｏｌｏ  ＭＶ，Ｃｏｌｅｍａｎ  ＩＭ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｓ，Ｙｕｅ  Ｈ，Ａｒｎｏｌｄ  ＬＪ  Ｊｒ．  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ｔ７  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．  ２００１  Ｏｃｔ；３１（４）：８７４−９．【００２１】
更に、本発明のプライマーを用いたＲＮＡの増幅では、対象とする生物の全ＲＮＡ  （ｒＲＮＡ＋ｍＲＮＡ）を増幅することができる。従って、このＲＮＡの増幅は目的に応じて行うことができ、例えば、生物の遺伝子発現解析にあたり、ｒＲＮＡが不要な場合には、研究キット（ＭＩＣＲＯＢ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：Ａｍｂｉｏｎ社）等によって試料のＲＮＡからｒＲＮＡを除いた後に、本発明のプライマーによってｍＲＮＡのみを増幅することができる。また、生物の同定解析にあたり、１６Ｓ  ｒＲＮＡを増幅することもでき、これらを組み合わせることで、生物の遺伝子発現解析及び同定解析を同時に行うこともできる。更に、生物の遺伝子発現解析にあたり、特定の遺伝子の塩基配列がわかっている場合には、特定の遺伝子に相補的な塩基配列を含むプライマーを設計し、プロモーター領域を付加することで特定の遺伝子の発現を解析することもできる。【００２２】
本発明の「生物の遺伝子発現解析及び／又は同定解析」とは、本発明のプロモーター領域を付加したランダムプライマー又はプロモーター領域を付加した特定の遺伝子に相補的な塩基配列を含むプライマーを用いて増幅したＲＮＡを使用し、マイクロアレイやノーザンブロット等を行い、微生物の病原遺伝子の発現を解析したり、１６Ｓ  ｒＲＮＡよりその生物を同定したりすることをいう。生物の遺伝子発現解析及び／又は同定解析には、本発明において、ＩＶＴ法により増幅されたａＲＮＡ又はＳＭＡＲＴ法により増幅されたａＤＮＡ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ）又は転写されたｃＤＮＡは、いずれも使用することができる。特にマイクロアレイ上のＰＣＲ産物や合成オリゴヌクレオチドからなるＤＮＡプローブへの結合にはＤＮＡに比較しＲＮＡの方が強いことから、ＲＮＡを用いることがより好ましい。また、ＩＶＴ法を２サイクル続けて行うことにより増幅されたａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡと、それと同コピー数のｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡを検出用の試料として用いることで、ＰＣＲ産物等２本鎖ＤＮＡプローブがスポットされているマイクロアレイでは更に検出感度を向上することができる。また、ノーザンブロット解析においても、通常ＰＣＲ法により特定遺伝子の２本鎖ＤＮＡ標識プローブを作成・使用する場合が多いことから、ｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡおよびａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡの両方を同時に増幅し、メンブレンに転写することで、解析のターゲットとなる遺伝子の検出感度を向上することができる。
以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれらによって制限されない。
【実施例１】
【００２３】
＜プロモーター領域を付加したランダムプライマーの作製＞
Ｔ７プロモーターの配列（３３塩基）に６つの塩基からなるランダム配列（以下、Ｎ６と示す）、又は９つの塩基からなるランダム配列（以下、Ｎ９と示す）に付加することで、３９ｍｅｒ又は４２ｍｅｒのプロモーター領域を付加したランダムプライマー（以下、Ｎ６−Ｔ７ｐｒｉｍｅｒ又はＮ９−Ｔ７ｐｒｉｍｅｒと示す。）を設計し、合成業者（プロリゴジャパン社）にて作製した。Ｎ６−Ｔ７ｐｒｉｍｅｒを配列表配列番号１に、Ｎ９−Ｔ７ｐｒｉｍｅｒを配列番号２にそれぞれ示した。【００２４】
＜プロモーター領域を付加したランダムプライマーを用いるＲＮＡの増幅＞
１．試料の調製
ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より購入したＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  Ｗ８３株（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＢＡＡ−３０８）を用い、ＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）培地に０．５％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ＨＣｌ，ｈｅｍｉｎ及びｍｅｎａｄｉｏｎを添加した培地にて嫌気装置内でｍｉｄ−ｌｏｇ  ｐｈａｓｅになるまで培養した。培養後の菌体を集菌し、直ちにＴｒｉｚｏｌ溶液（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を加えて菌体破砕器（ＦａｓｔＰｒｅｐ，  ＢＩＯ１０１社）にて破砕を行った。遠心で得られた水層をフェノールクロロホルムで精製し、エタノール沈殿させたのちＭｉｌｌｉＱ（ＤＮａｓｅ−，ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で溶解したものをＲＮＡ試料とした。【００２５】
２．ＲＮＡの増幅
１）変性（Ｄｅｎａｔｕｒｅ）
前記１．で調製した試料をそれぞれ２．０μｇ、０．２μｇ、０．０２μｇ用い、実施例１において作製した配列表配列番号１及び２に記載のＮ６−Ｔ７ｐｒｉｍｅｒ（２．５μＭ）又はＮ９−Ｔ７ｐｒｉｍｅｒ（２．５μＭ）を２．０μＬ加え、ＭｉｌｌｉＱ  で全量が１０．０μＬになるように調製し、７０℃に５分間保ち変性（Ｄｅｎａｔｕｒｅ）した後、氷上で４℃に保った。【００２６】
２）ＲＴ反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）
前記１）で得られたそれぞれの変性ミックス（Ｄｅｎａｔｕｒｅ  ｍｉｘｔｕｒｅ）に、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて表１の組成になるように記載の酵素、試薬をそれぞれ加えた後、３７℃に１時間保ちＲＴ反応を行った。ＲＴ反応後、７０℃に１０分間保ち酵素の失活を行い、４℃に３分間保った。【００２７】
【表１】
2006041159.tif 000003
【００２８】
３）二本鎖ｃＤＮＡ合成（ｄｓ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）
前記２）で得られたそれぞれのＲＴ反応ミックス（ＲＴ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅ）に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、表２に記載の酵素、試薬をそれぞれ加えた後、１６℃に２時間保ち二本鎖ｃＤＮＡ合成ミックス（ｄｓ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｍｉｘｔｕｒｅ）を得た。得られた二本鎖ｃＤＮＡ合成ミックス１５０．０μＬにＴ４  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２．０μＬを加え、１６℃に５分間保った後、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ社）１０．０μＬを加えて反応を終了した。【００２９】
【表２】
2006041159.tif 000004
【００３０】
４）ｃＤＮＡの精製（ｃＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）
Ａ．フェノール−クロロホルム処理
前記３）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ合成ミックス（ｄｓ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｍｉｘｔｕｒｅ）５２．０μＬに同量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール混合液（ｐｈｅｎｏｌ：  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ：  ｉｓｏａｍｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ＝２５：２４：１（ｐＨ７．９））を加え、２０秒間ボルテックスした溶液を全量Ｐｈａｓｅ  ｌｏｃｋ  Ｇｅｌ  Ｈｅａｖｙ（Ｅｐｐｅｎｎｄｏｒｆ社）チューブに入れ、遠心分離（１５，０００ｘｇ、２分間）を行い、得られた上清を新しいチューブに移した。
Ｂ．クロロホルム処理
前記Ａ．にて得られた上清に、同量のクロロホルムを加え、２０秒間ボルテックスした溶液を全量Ｐｈａｓｅ  ｌｏｃｋ  Ｇｅｌ  Ｈｅａｖｙ（Ｅｐｐｅｎｎｄｏｒｆ社）チューブに入れ、遠心分離（１５，０００ｘｇ、２分間）を行った後の上清を新しいチューブに移した。
Ｃ．エタノール沈殿
前記Ｂ．にて得られた上清に、０．５μＬのグリコーゲンと上清１／１０量の７．５Ｍ  ＮＨ４Ａｃ（ｐＨ  ５．２）を加えて混合後、−２０℃に冷却された１００％エタノールを２．５倍量添加・混合し、−８０℃で３０分間インキュベートした。これを遠心分離（１５，０００ｘｇ、５分間）して上清を除き、残ったペレットを５〜１０分間自然乾燥させた後、８．０μＬのＭｉｌｌｉＱ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に溶かして、精製二本鎖ｃＤＮＡ溶液（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｃＤＮＡ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得た。【００３１】
５）ＩＶＴ法  （Ｉｎ  ＶｉｔｒｏＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）
前記４）で得られた精製二本鎖ｃＤＮＡ溶液８．０μＬを鋳型としてＩＶＴ法によりａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡを得た。本ＩＶＴ法は精製二本鎖ｃＤＮＡ溶液に表３に記載の酵素、試薬（ＭＥＧＡｓｐｒｉｐｔ  Ｔ７  Ｋｉｔ：Ａｍｂｉｏｎ社）をそれぞれ加えた後、３７℃で一昼夜インキュベートして行った。【００３２】
【表３】
2006041159.tif 000005
【００３３】
前記５）で得られたａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡをＣｈｒｏｍａ  Ｓｐｉｎ−３０  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて精製した後、更に前記４）に記載のエタノール精製を行い得られたペレットを１０．０μＬのＭｉｌｌｉＱに溶かして精製ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡを得た。【００３４】
結果
ＩＶＴ法の実施によって増幅されたａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡ量（ＩＶＴ（＋））及びＩＶＴを行わなかった場合のＲＮＡ量（ＩＶＴ（−））を吸光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ３１００  ｐｒｏ：アマシャムバイオサイエンス社）にて測定・算出し表４に示した。ＩＶＴ増幅によりＮ６−Ｔ７  ｐｒｉｍｅｒとＮ９−Ｔ７  ｐｒｉｍｅｒによるＩＶＴ増幅倍率に優位な差はなく、約２０倍から５０倍の全ＲＮＡの増幅が認められた。なお、特に結果は示さないが、増幅前の同濃度の全ＲＮＡ量を用いたものは、ＩＶＴ後にどれもほぼ同様の増幅効率を示した。【００３５】
【表４】
2006041159.tif 000006
【実施例２】
【００３６】
＜プロモーター領域を付加した特定の遺伝子に相補的な塩基配列を含むプライマーを用いる原核生物のＲＮＡの増幅＞
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  外膜タンパク質をコードするｈｔｐ３５遺伝子のｍＲＮＡの増幅を行った。ｍｉｄ−ｌｏｇ  ｐｈａｓｅにおけるＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  Ｗ８３株より抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡ２．０μｇを試料として用いた。Ｔ７プロモーター領域をｈｔｐ３５遺伝子の特定の配列に付加した配列表配列番号３に記載のＨｔｐ３５  ｇｅｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ−Ｔ７ｐｒｉｍｅｒ（２．５μＭ）を用い、前記実施例２、１）〜５）に記載の方法でＩＶＴ法により増幅を行った。【００３７】
増幅により得られたａＲＮＡを鋳型として、配列表配列番号４（ｈｔｐ３５−ｕｐ）及び５（ｈｔｐ３５−ｄｏｗｎ）に記載の増幅確認用リアルタイムＰＣＲプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、得られたｈｔｐ３５遺伝子のｍＲＮＡのコピー数を測定した。対照としてＩＶＴ法を行わなかったｍＲＮＡについても測定を行った。各グループはそれぞれ４サンプルずつ実験に供した。Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの染色体ＤＮＡを用いて作製した検量線を用い、各サンプル内に含有するｈｔｐ３５に対するｍＲＮＡコピー数を計算し、その平均値より増幅倍率を計算した。
検量線はＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの染色体の大きさを基に、核酸溶液１  ｍｌあたりに含まれる染色体ＤＮＡの分子量（ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｍｌ）を算出し（換算式：１μｇ  ｏｆ  １０００ｂｐ  ＤＮＡ  ＝１．５２ｐｍｏｌ  ＝９．１×１０１１ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、これを１０倍ずつ段階的に希釈した試料を作製して、リアルタイム実験の装置と試薬で、リアルタイムＰＣＲを行い、既知の濃度の核酸サンプルが何サイクルで検出可能になるかを調べて作製した。測定結果を表５に示した。【００３８】
【表５】
2006041159.tif 000007
【００３９】
結果
ｍＲＮＡコピー数が多い程、リアルタイムＰＣＲでは少ないｃｙｃｌｅ数で立ち上がってくる。ＩＶＴ法により増幅した試料（ＩＶＴ（＋））は増幅しなかった試料（ＩＶＴ（−））より少ないサイクルでの立ち上がりが確認された。ｈｔｐ３５遺伝子に対するｍＲＮＡコピー数を計算したところ、ＩＶＴ（−）が２．０×１０６コピーに対してＩＶＴ  （＋）が９．１×１０７コピーであった。これにより増幅倍率は約４５と計算され、Ｔ７プロモーター領域をｈｔｐ３５遺伝子の特定の配列に付加したプライマーにおいても原核生物のＲＮＡが増幅されることが確認された。
【実施例３】
【００４０】
実施例１のプロモーター領域を付加したランダムプライマーを用いるＲＮＡの増幅により、ｎｇオーダーの細菌ＲＮＡより、マイクロアレイやＮｏｒｔｈｅｒｎ−ｂｌｏｔ解析等に有用なμｇオーダーのＲＮＡ増幅ができることを検討した。【００４１】
１．試料の調製
ニューヨーク州立大学バッファロウ校のＨ．  Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ教授から分与されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ  ＧＳ５株を用い、ｂｒａｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）培地（Ｄｉｆｃｏ社）にて簡易嫌気装置内でｍｉｄ−ｌｏｇ  ｐｈａｓｅになるまで培養した。培養後の菌体を集菌し、直ちにＴｒｉｚｏｌ溶液  （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を加えて菌体破砕器（ＦａｓｔＰｒｅｐ，ＢＩＯ１０１社）にて破砕を行った。遠心で得られた水層をフェノールクロロホルムで精製し、エタノール沈殿させたのちＭｉｌｌｉＱを加えたものをＲＮＡ試料とした。【００４２】
２．ＲＮＡの増幅
１）変性  （Ｄｅｎａｔｕｒｅ）
前記１．で調製した３．０ｎｇ／μＬ又は３０．０ｎｇ／μＬの各試料（ｎ＝３）を１．０μＬ用い、配列表配列番号１に記載のＮ６−Ｔ７ｐｒｉｍｅｒ（２．５μＭ）を２．０μＬ加え、ＭｉｌｌｉＱ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で総量が１０．０μＬになるように調製し、ＲＮＡ溶液とした。調製したＲＮＡ溶液を７０℃に１０分間保ち変性  （Ｄｅｎａｔｕｒｅ）した後、氷上で２分間以上保った。【００４３】
２）ＲＴ反応  （Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）
前記２．１）で得られた変性ミックス（Ｄｅｎａｔｕｒｅ  ｍｉｘｔｕｒｅ）に、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて表６に記載の組成になるように酵素、試薬をそれぞれ加えた後、２５℃で１０分間インキュベートした。これにキット中のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２．０μｌを加え、４２℃で１時間保ちＲＴ反応を行った。ＲＴ反応後、７０℃に１０分間保ち酵素の失活を行い、４℃に３分間保った。【００４４】
【表６】
2006041159.tif 000008
【００４５】
３）二本鎖ｃＤＮＡ合成（ｄｓ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）
前記２．２）で得られたそれぞれのＲＴ反応ミックス（ＲＴ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅ）に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、表７に記載の組成になるように酵素、試薬をそれぞれ加えた後、１６℃に２時間保った。これにさらにＴ４  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２．０μＬを加え、１６℃に５分間保った後、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ社）１０．０μＬを加えて反応を終了した。【００４６】
【表７】
2006041159.tif 000009
【００４７】
４）二本鎖ｃＤＮＡの精製  （ｃＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）
Ａ．カラム処理
前記２．３）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ合成ミックス（ｄｓ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｍｉｘｔｕｒｅ）は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）のカラムを用いて精製した。精製した二本鎖ｃＤＮＡは５０μＬのＭｉｌｌｉＱで２回溶解した。
Ｂ．エタノール精製
前記Ａ．にて得られたｃＤＮＡ溶液１００．０μＬに、０．５μＬのグリコーゲンと１０．０μＬの７．５Ｍ  ＮＨ４Ａｃを加えた後、さらに−２０℃に冷却された１００％エタノールを２５０．０μＬを加え、−８０℃で３０分間インキュベートした。これを遠心分離（１５，０００ｘｇ、５分間）して上清を除き、残ったペレットを５〜１０分間自然乾燥させて、精製された二本鎖ｃＤＮＡペレットを得た。【００４８】
５）１サイクルＩＶＴ法  （Ｉｎ  ＶｉｔｒｏＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）
前記２．４）で得られた二本鎖ｃＤＮＡペレットにＭＥＧＡｓｐｒｉｐｔ  Ｔ７  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて、表８に記載の組成の酵素、試薬を直接加えた後、実施例１と同様の手法でＩＶＴ法を行った。【００４９】
【表８】
2006041159.tif 000010
【００５０】
前記２．５）で得られたａＲＮＡをＡｍｉｎｏ  Ａｌｌｙｌ  ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ  ａＲＮＡ  Ｋｉｔ中の精製用カラムを用いて精製し、５０．０μＬのＭｉｌｌｉＱで２回溶解し、続けて前記２．４）に記載のエタノール精製を行って精製ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡを得た。ここで得られたａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡを１サイクルＩＶＴ法によって得られたａＲＮＡとした。
【実施例４】
【００５１】
実施例３で示した１サイクルＩＶＴ法に加え、ＩＶＴ増幅を２サイクル行った場合の増幅効率を調べた。また、２サイクルＩＶＴ法において、本発明のプロモーター領域を付加したランダムプライマーと市販のランダムプライマーを組み合わせて用いることにより、マイクロアレイの標識用色素であるＣｙ３／Ｃｙ５  Ｄｙｅをカップリングさせるためのａｍｉｎｏ−ａｌｌｙｌ  標識のｓｅｎｓｅ鎖、ａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖及びｓｅｎｓｅ／ａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖ａＲＮＡを合成し、それぞれの増幅倍率を検討した。さらに１サイクルＩＶＴ法と２サイクルＩＶＴ法のそれぞれで得られるａＲＮＡのサイズレンジを調べた。【００５２】
具体的には、（１）ａＲＮＡからｓｅｎｓｅ鎖のみを合成する方法、（２）ｓｅｎｓｅ／ａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖を同時に合成する方法又は（３）ａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖のみを合成する方法の３つ方法を用いて、それぞれの鎖を増幅し、ａＲＮＡを合成させた。
方法（１）：ＲＮＡからｓｅｎｓｅ鎖のみを合成する方法として、１サイクルＩＶＴ法で得られたａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡに、配列表配列番号１に記載のＮ６−Ｔ７ｐｒｉｍｅｒを加えてＲＴ反応をした後、二本鎖ｃＤＮＡ合成をし、ＩＶＴ法を実施することでｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡのみを得た。方法の概要を図１に示した。
方法（２）：ＲＮＡからｓｅｎｓｅ／ａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖を同時に合成する方法では、１サイクルＩＶＴ法で得られたａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡに、配列表配列番号１に記載のＮ６−Ｔ７ｐｒｉｍｅｒを加えてＲＴ反応をした後、鋳型となったＲＮＡを分解・除去し、精製を行った。続いて市販のＮが６個結合したランダムプライマーを加えて二本鎖ｃＤＮＡ合成をし、ＩＶＴ法を実施することでｓｅｎｓｅ／ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡを得た。方法の概要を図２に示した。
方法（３）：ＲＮＡからａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖のみを合成する方法では、１サイクルＩＶＴ法で得られたａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡに、市販のＮが６個結合したランダムプライマーを加えてＲＴ反応をした後、鋳型となったＲＮＡを分解・除去し、精製を行った。続いて配列表配列番号１に記載のＮ６−Ｔ７ｐｒｉｍｅｒを加えて二本鎖ｃＤＮＡ合成をし、ＩＶＴ法を実施することでａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡのみを得た。方法の概要を図３に示した。【００５３】
１．ＲＮＡの増幅
１）変性  （Ｄｅｎａｔｕｒｅ）
前記実施例３の１サイクルＩＶＴ法で得られたａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡ溶液８．０μＬ（４３５  ｎｇ）に、増幅の目的とするａＲＮＡの種類である、（１）ｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡのみ、（２）ｓｅｎｓｅ／ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡ又は（３）ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡのみに応じて配列表配列番号１に記載のＮ６−Ｔ７ｐｒｉｍｅｒ（２５μＭ）又はランダムヘキサマー（２５μＭ）を３．０μＬ加え、全量が１１．０μＬの溶液を調製した（ｎ＝３）。（１）及び（２）ではＮ６−Ｔ７ｐｒｉｍｅｒ、（３）ではランダムヘキサマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。調製した溶液を７０℃に１０分間保ち変性（Ｄｅｎａｔｕｒｅ）した後、氷上で４℃に２分間以上保った。【００５４】
２）ＲＴ反応  （Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）
前記１．１）で得られた変性ミックス（Ｄｅｎａｔｕｒｅ  ｍｉｘｔｕｒｅ）に、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて表９に記載の組成になるように酵素、試薬をそれぞれ加えた後、２５℃で１０分間インキュベートした。これにキット中のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を１．０μｌを加え、４２℃で１時間ＲＴ反応を行った。ＲＴ反応後７０℃で１０分間インキュベートし、酵素の失活を行い、４℃に３分間保った。続いて２Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ  Ｈを１．０μＬ加え３７℃で２０分間、９５℃で５分間、最後に４℃で３分間おくことにより、１本鎖ｃＤＮＡ（ｓｓ  ｃＤＮＡ）を得た。
得られた１本鎖ｃＤＮＡはＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。精製した１本鎖ｃＤＮＡは５０μＬのＭｉｌｌｉＱで溶解した。【００５５】
【表９】
2006041159.tif 000011
【００５６】
２．二本鎖ｃＤＮＡ合成（ｄｓ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）
３）変性  （Ｄｅｎａｔｕｒｅ）
前記１．２）で得られた１本鎖ｃＤＮＡ溶液４７．０μＬを用い、（１）ｓｅｎｓｅ鎖のみを合成する方法ではＭｉｌｌｉＱを３．０μＬ、（２）ｓｅｎｓｅ／ａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖を同時に合成する方法ではランダムヘキサマーを３．０μＬを、又は（３）ａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖のみを合成する方法では、配列表配列番号１に記載のＮ６−Ｔ７ｐｒｉｍｅｒを３．０μｌを加えた。これを７０℃に１０分間保ち変性（Ｄｅｎａｔｕｒｅ）した後、氷上で３分間以上保った。【００５７】
４）二本鎖ｃＤＮＡ合成
前記１）で得られた変性１本鎖ｃＤＮＡ溶液を２５℃に１０分間保つことでプライマーを結合させ後、表１０に記載の酵素、試薬を加え総量を１００．０μＬとし、１６℃で２時間インキュベートした。さらにＴ４  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を２．０μＬを加え、１６℃で５分間保った。得られた二本鎖ｃＤＮＡはＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ内のカラムを用いて精製し、５０μＬのＭｉｌｌｉＱで２回溶解したのち、前記２．４）に記載のエタノール精製を行い１４．０μＬのＭｉｌｌｉＱで溶解した。【００５８】
【表１０】
2006041159.tif 000012
【００５９】
５）ＩＶＴ法（Ｉｎ  ＶｉｔｒｏＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）
それぞれの方法で得られた二本鎖ｃＤＮＡ溶液１４．０μＬを、Ａｍｉｎｏ  Ａｌｌｙｌ  ｅｓｓａｇｅＡｍｐ  ａＲＮＡ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）及びＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて、表１１に記載の酵素、試薬を加えた後、実施例１と同様の手法でＩＶＴ法を行った。（１）ｓｅｎｓｅ鎖のみを合成する方法ではｓｅｎｓｅ鎖のみが、（２）ｓｅｎｓｅ／ａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖を同時に合成する方法ではｓｅｎｓｅ／ａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖が、又は（３）ａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖のみを合成する方法ではａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖のみを合成した。【００６０】
【表１１】
2006041159.tif 000013
【００６１】
前記２．５）で得られた各種ａＲＮＡをＡｍｉｎｏ  Ａｌｌｙｌ  ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ  ａＲＮＡ  Ｋｉｔ中の精製カラムを用いて精製し、５０．０μＬのＭｉｌｌｉＱ  で２回溶解したのち、前記２．４）に記載のエタノール精製を行った。最終的にペレットを２１．０μＬのＭｉｌｌｉＱ  に溶かしてａＲＮＡ溶液を得た。調製したａＲＮＡ溶液のうち１μＬをＲＮＡ量測定のための試料とし、吸光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ３１００  ｐｒｏ：アマシャムバイオサイエンス社）にて測定・算出されるＲＮＡ総量の結果を表１２に示した。【００６２】
【表１２】
2006041159.tif 000014
【００６３】
結果
表１２で示すように、３ｎｇ又は３０ｎｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡから、１サイクルＩＶＴ法で得られたａＲＮＡ量（ｎ＝３）の平均増幅効率は４４．４倍と５２．８倍であった。また、１サイクルＩＶＴ法で得られたａＲＮＡを４３５  ｎｇのａＲＮＡから２サイクルＩＶＴ法のｓｅｎｓｅ鎖のみを合成する方法、ｓｅｎｓｅ／ａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖を同時に合成する方法又はａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖を合成する方法で得られたａＲＮＡ量（ｎ＝３）の平均増幅効率は、３８．４倍、８０．３倍又は９．９倍であった。従って、原核生物のｎｇオーダーの微量ＲＮＡ試料を基にＩＶＴ法を２サイクル行うことにより、マイクロアレイ等への使用に必要なμｇオーダーに増幅できることが確認された。【００６４】
これらの結果より、Ｔ７プロモーター配列付きのランダムプライマーの使用により、極微量の微生物ＲＮＡ増幅が可能になることが判明した。１サイクル目及び２サイクル目の増幅効率に大きな差はなく各々４０から５０倍であった。方法（２）のｓｅｎｓｅ及びａｎｔｉｓｅｎｓｅを同時に作らせる方法では予想されるようにｄｓ  ｃＤＮＡの両端のプロモーターが同時に働いたために８０．３倍の増幅効率であった。
これらの増幅により最終的には約１０ｎｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡが方法（１）のｓｅｎｓｅのみを増幅する方法又は方法（３）のａｎｔｉｓｅｎｓｅのみを増幅する方法で約１６μｇに、方法（２）のｓｅｎｓｅ及びａｎｔｉｓｅｎｓｅを同時に増幅する方法で約３５μｇに増幅されることから、いずれの方法においても、マイクロアレイのみでなくノーザンブロット解析等、様々なトランスクリプトーム解析が微量の原核生物ＲＮＡで可能であると考えられた。【００６５】
実施例３の１サイクルＩＶＴ法及び実施例４の２サイクルＩＶＴ法で得られたＩＶＴ生成物のフラグメントサイズ分布を調べるために、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈ．社）で測定したところ、図５に示すように、１サイクルＩＶＴ法では９５０ｂｐ付近のサイズを中心におよそ１００ｂｐから３，０００ｂｐの範囲に増幅産物が分布していた。また、２サイクルＩＶＴ法によって合成されたａＲＮＡのサイズ分布は、図６に示したようにおよそ１００ｂｐから２，０００ｂｐであり、サイズのピークは４５０ｂｐ付近に存在していた。比較として、増幅材料であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓから精製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡのサイズ分布を図４に示した。
【実施例５】
【００６６】
＜ＩＶＴ生成物のＧｅｎｅＣｈｉｐ遺伝子発現マイクロアレイの検討＞
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅＣｈｉｐ遺伝子発現マイクロアレイを用いてグローバルなトランスクリプトーム解析を行い、各増幅ＲＮＡ試料の相関を調べた。ＧｅｎｅＣｈｉｐはｓｅｎｓｅ鎖の遺伝子プローブがアレイ上にスポットされているため、アレイと結合させるための試料は最終的にａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖のみからなるａＲＮＡの合成をおこなう必要があり、かつ結合したＲＮＡ試料にストレプトアビジンー蛍光色素を間接的に染色することで蛍光させることから、ストレプトアビジンに結合するビオチンにて試料を標識する必要がある。従って、試料作成にはビオチン標識のａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡを合成した。
１．１）ビオチン標識
ＧｅｎｅＣｈｉｐによる解析のためにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（以下、Ｅ．ｃｏｌｉとする）から抽出した全ＲＮＡを基に、前記実施例３の方法２．に準じて１サイクルＩＶＴ法で得られたａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡに、市販のＮが６個結合したランダムプライマー  （ランダムヘキサマー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を加えてＲＴ反応をした後、鋳型となったＲＮＡを分解・除去し、精製を行った。続いて配列表配列番号１に記載のＮ６−Ｔ７ｐｒｉｍｅｒを加えて二本鎖ｃＤＮＡ合成をし、ＩＶＴ法をすることでａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖のみのａＲＮＡを合成した（ｎ＝２）。ビオチン標識を伴うＩＶＴ法は２サイクル目のＩＶＴ中に行い、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）にＢｉｏ−１１−ＣＴＰおよびＢｉｏ−１６−ＵＴＰ（Ｅｎｚｏ社）を添加して行った（表１３）。３７℃で１６時間インキュベートすることで、ビオチン標識を行った。最後に２Ｕ／μＬのＤＮａｓｅ  Ｈを１．０μＬ加え３７℃で３０分間インキュベートすることで、完全に鋳型ｃＤＮＡの分解を行った。【００６７】
【表１３】
2006041159.tif 000015
【００６８】
１．２）ａＲＮＡの精製（ａＲＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）
Ａ．カラム処理
前記１）でビオチンラベルされた各ａＲＮＡを、Ａｍｉｎｏ  Ａｌｌｙｌ  ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ  ａＲＮＡ  Ｋｉｔ中の精製用カラムを用いて精製した。ａＲＮＡはカラムに５０μＬのＭｉｌｌｉＱを２回通して溶解した。
Ｂ．エタノール沈澱
前記Ａ．にて得られたｃＤＮＡ溶液１００．０μＬに、０．５μＬのグリコーゲンと５０．０μＬ（上清の０．５倍）の７．５Ｍ  ＮＨ４Ａｃ（ｐＨ５．２）を加えて混ぜた後、更に−２０℃に冷却された１００％エタノールを２５０．０μＬ（上清の２．５倍）を加えて混ぜ、−８０℃で３０分間インキュベートした。これを遠心分離  （１５，０００ｘｇ、５分間）して上清を除き、残ったペレットを５〜１０分間自然乾燥させて、ペレットを得た。このペレットを２１．０μＬのＭｉｌｌｉＱに溶かして精製  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡ溶液を得た。
調製したａＲＮＡ溶液１μＬは吸光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ３１００  ｐｒｏ：アマシャムバイオサイエンス社）を用いた濃度測定のための試料とした。【００６９】
３）ＩＶＴ生成物の断片化処理（Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）
精製されたＩＶＴ生成物はＧｅｎｅＣｈｉｐ上の２５ｍｅｒからなる短い遺伝子プローブに結合させるために断片化処理を行った。それぞれのａＲＮＡ（２−４μｇ）に５ｘＦｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を１０．０μＬを加え、ＭｉｌｌｉＱで全量５０．０μＬとした。これを９４℃に３５分間インキュベートすることでａＲＮＡ断片は３５〜２００ｂｐ前後の大きさに断片化した。
【実施例６】
【００７０】
＜１サイクルＩＶＴ法及び２サイクルＩＶＴ法で増幅されるａＲＮＡの相関性の検討＞
Ｅ．ｃｏｌｉのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを試料として、１サイクルＩＶＴ法又は２サイクルＩＶＴ法により、ビオチン標識ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡプローブのみを合成し、これをＥ．ｃｏｌｉ用ＧｅｎｅＣｈｉｐアレイ（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｏｍｅ２．０  Ａｒｒａｙ；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）にて解析し、１サイクル増幅と２サイクル増幅試料でのＧｅｎｅＣｈｉｐ結果にあたえる相関を検討した。  原核生物におけるＧｅｎｅＣｈｉｐアレイ用のＴａｒｇｅｔ  ｌａｂｅｌｉｎｇにおいては、通常、全ＲＮＡからランダムプライマーによるｃＤＮＡ合成後、断片化を行ない、各断片の３’末端にビオチンを標識することでプローブを合成する。しかし、この方法では全ＲＮＡ試料中に含有される２−３％のｍＲＮＡと同コピー数のｃＤＮＡが逆転写反応で合成されることから、本プロトコールに準じて研究を進めていくためには試料として１０．０μｇもの全ＲＮＡを必要とする。そこでこの問題を解決するにあたり、本Ｔ７配列付加プライマーを使用し、鋳型ＲＮＡを増幅する事で、ｎｇオーダーの極微量のＲＮＡを用いてＧｅｎｅＣｈｉｐ解析が遂行可能かを検証した。
ＧｅｎｅＣｈｉｐの解析に際して試料を最終的にビオチン標識する必要がある。そこで原核生物に対するビオチン標識試料作製方法として１）１サイクルＩＶＴ法と、２）２サイクルＩＶＴ法を行い、鋳型ＲＮＡを増幅した後、断片化処理を行ない、プローブを作成した。そして、これらのプローブを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ用ＧｅｎｅＣｈｉｐアレイにおける各遺伝子の発現レベルを調べ、１サイクルＩＶＴ法と２サイクルＩＶＴ法で増幅されるａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡの相関性を検証した。【００７１】
１．試料の調製
本研究室保管のＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株を用い、ＬＢ培地にて好気状態でｍｉｄ−ｌｏｇ  ｐｈａｓｅになるまで培養した。培養後の菌体を集菌し、直ちにＴｒｉｚｏｌ溶液（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を加えて菌体破砕器（ＦａｓｔＰｒｅｐ，ＢＩＯ１０１社）にて破砕を行った。遠心で得られた水層をフェノールクロロホルムで精製し、エタノール沈殿させたのちＭｉｌｌｉＱを加えたものをＲＮＡ試料とした。【００７２】
２．ＲＮＡの増幅
１）１サイクルＩＶＴ法
前記１．で調製した５００ｎｇ／μＬの試料（ｎ＝２）を１．０μＬ用い、配列表配列番号１に記載のＮ６−Ｔ７ｐｒｉｍｅｒ（２．５μＭ）を２．０μＬ加え、ＭｉｌｌｉＱ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で全量が１０．０μＬになるように調製し、ＲＮＡ-プライマー混合液とした。このＲＮＡ-プライマー混合液を用い、前記実施例３に記載のＲＴ反応と同様に、ＲＴ反応を行った。さらに前記実施例３に記載の二本鎖ｃＤＮＡ合成と同様に、二本鎖ｃＤＮＡ合成を行い、このｃＤＮＡを精製した。ビオチン標識を伴うＩＶＴ法はＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）にＢｉｏ−１１−ＣＴＰおよびＢｉｏ−１６−ＵＴＰ（Ｅｎｚｏ社）を添加して（表１３）３７℃で１６時間インキュベートしたのち、２Ｕ／μＬのＤＮａｓｅ  Ｈを１．０μＬ加え３７℃で３０分間インキュベートし、鋳型ｃＤＮＡの分解を行った。これを精製することで精製されたビオチン標識ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡ溶液を２１μＬ得た。うち１μＬを使用し、比色値を測定することで合成されたａＲＮＡ総量を算出した。
２）２サイクルＩＶＴ法
前記１で調製した５０ｎｇ／μＬの試料（ｎ＝２）を用い、前記実施例３の方法（３）に準じて１サイクルＩＶＴ法で得られた非ビオチン標識ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡに、市販のＮが６個結合したランダムプライマー（ランダムヘキサマー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を加えてＲＴ反応をした後、鋳型となったＲＮＡを分解・除去し、精製を行った。続いて配列表配列番号１に記載のＮ６−Ｔ７ｐｒｉｍｅｒを加えてｄｓ  ｃＤＮＡ合成をし、ＩＶＴ法をすることでａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖のみのａＲＮＡを合成した（ｎ＝２）。２サイクル目のＩＶＴ中にビオチン標識を行った。ビオチン標識を伴うＩＶＴ法はＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）にＢｉｏ−１１−ＣＴＰおよびＢｉｏ−１６−ＵＴＰ（Ｅｎｚｏ社）を添加して（表１３）３７℃で１６時間インキュベートしたのち、２Ｕ／μＬのＤＮａｓｅ  Ｈを１．０μＬ加え３７℃で３０分間インキュベートし、鋳型ｃＤＮＡの分解を行った。これを精製することで精製されたビオチン標識ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡ溶液を２１μＬ得た。
３）ＩＶＴ生成物の増幅効率の検討
１サイクルＩＶＴ法及び２サイクルＩＶＴ法で得られたそれぞれのａＲＮＡ溶液を用い、実施例４に記載の方法と同様に、精製されたビオチン標識ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡ溶液のうち、１μＬを使用し吸光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ３１００  ｐｒｏ：アマシャムバイオサイエンス社）にて比色値を測定することで合成されたａＲＮＡ総量を算出した。結果を表１４に示した。【００７３】
【表１４】
2006041159.tif 000016
【００７４】
表１４で示すように、５００ｎｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡから、１サイクル  ＩＶＴ法で得られたａＲＮＡ量（ｎ＝２）の平均増幅効率は２８倍であった。また、５０ｎｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡから、２サイクル  ＩＶＴ法で得られたａＲＮＡ量（ｎ＝２）の平均増幅効率は約８０倍であった。従って、原核生物のｎｇオーダーの微量ＲＮＡ試料を基にＩＶＴ法を２サイクル行うことにより、マイクロアレイ等への使用に必要なμｇオーダーに増幅できることが確認された。【００７５】
３）ＩＶＴ生成物の断片化処理（Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）
精製されたＩＶＴ生成物はＧｅｎｅＣｈｉｐ上の２５ｍｅｒからなる短い遺伝子プローブに結合させるためにａＲＮＡ試料の断片化処理を行った。それぞれのａＲＮＡ（２−４μｇ）に５ｘ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を１０．０μＬを加え、ＭｉｌｌｉＱで全量５０．０μＬとし、これを９４℃に５分間インキュベートすることで行われた。得られたａＲＮＡ断片は３５〜２００ｂｐ前後の大きさに断片化された。
次に表１５に従い、各試薬を加えてハイブリダイゼーションカクテルを作成し、そのハイブリダイゼーションカクテル８０．０μＬとチップとのハイブリダイゼーションを４５℃で１６時間行なった。チップを洗浄後、ストレプトアビジンー蛍光（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）標識による染色を行った。さらにチップの再洗浄を行ったのち、スキャナー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）にて蛍光強度を測定した。  【００７６】
【表１５】
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【００７７】
４）遺伝子のＦｌａｇ情報の解析
前記２．で調製した１サイクルＩＶＴ法及び２サイクルＩＶＴ法で得られたそれぞれのａＲＮＡ断片を使用してＧｅｎｅＣｈｉｐを行なった結果を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子解析ソフトにて解析し、各遺伝子の発現の有無を調べた。表１６に示すように、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ解析ソフトにおいて、遺伝子発現が認められると判定されるものはＦｌａｇ情報が”Ｐｒｅｓｅｎｔ”、また偽陽性と判定されるものは”Ｍａｒｇｉｎａｌ”と表示される。１サイクル  ＩＶＴ  法にて増幅したＲＮＡを基に行なった場合、発現が認められる遺伝子の割合はチップ上の総遺伝子数の約４０％であった。一方、２サイクル  ＩＶＴ  法を基に行なった場合、発現が認められる遺伝子の割合はチップ上の総遺伝子数の約２７％であった。【００７８】
【表１６】
2006041159.tif 000018
【００７９】
図７に１サイクル  ＩＶＴ法及び２サイクル  ＩＶＴ法を行なった各グループ２試料間のばらつきをＳｃａｔｔｅｒ  ｐｌｏｔで示した。１サイクル  ＩＶＴ法に比較して、２サイクル  ＩＶＴ法では若干ばらつきが増大した。これは、少量の試料から２サイクルの増幅を行なっていることが原因と推察された。
また、１サイクルＩＶＴ法と２サイクルＩＶＴ法での遺伝子発現結果の相関関数を調べた。図８に示したように双方の増幅法で０．８７（Ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ，ｔｗｏ−ｔａｉｌ，ｐ＜０．０１）と高い相関が認められた。
これらの結果より、Ｔ７プロモーター配列付きのランダムプライマーをＩＶＴ法に応用することにより、極微量の微生物ＲＮＡ増幅をマイクロアレイ解析に必要な量まで増幅する事が可能であることが示された。
総括すると、２サイクルＩＶＴ法の増幅では１サイクルＩＶＴ法の増幅と比較し、多少のばらつきが認められ、また２サイクルＩＶＴ法の増幅ではＦｌａｇ情報が“Ｐｒｅｓｅｎｔ”と表示される遺伝子数に若干の減少が認められるものの１サイクルＩＶＴ法及び２サイクル法の両方法間で得られる解析結果には高い相関が認められることが判明した。また、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ，Ｓ．ｍｕｔａｎｓ及びＥ．ｃｏｌｉのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを材料として本プライマーを併用したＩＶＴ増幅を行なったところ、どの増幅効率にも大きな差異は認められないことから原核生物の種を問わず一定の増幅効率が期待できることが示唆された。
【実施例７】
【００８０】
＜ＩＶＴ法とＧｅｎｅ  ｃｈｉｐマニュアルに基づく方法の相関性の検討＞
実施例６のＩＶＴ法を用いて解析した方法とＲＮＡ試料増幅を施さない原核生物用ＧｅｎｅＣｈｉｐマニュアルに準じて解析した方法との相関を検討した。【００８１】
１．Ｇｅｎｅ  ｃｈｉｐマニュアルによる遺伝子発現
１）ＲＴ反応および一本鎖ｃＤＮＡ合成
実施例６で調製したＥ．ｃｏｌｉのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ試料（１０．０μｇ）に１０．０μＬのランダムヘキサマー（７５．０  ｎｇ／μＬ；  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と２．０μＬのＤｉｌｕｔｅｄ  ｐｏｌｙ−Ａ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を加え、ＭｉｌｌｉＱで総量３０．０μＬとなるように調製した。これを７０℃に１０分間保ち、さらに２５℃に１０分間保った後、氷上に置いた。これに表１７に記載の酵素、試薬を加え、２５℃に１０分間、３７℃で６０分間、４２℃で６０分間、さらに７０℃で１０分間保った後に、４℃におき、２０μＬの１Ｎ  ＮａＯＨを加え、６５℃で３０分間保った。これに１Ｎ  ＨＣｌを２０μＬ加えた後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。
生成物をキットに含まれているＥＢ  ｂｕｆｆｅｒ  １２μＬで溶出した。うち１μＬを一本鎖ｃＤＮＡ濃度測定のために用いた。解析の際にはチップ間でのシグナル標準化を施すため、チップに反応させる標識試料（ｓｓ  ｃＤＮＡ）の量は少なくとも１．５μｇ含まれていればよく、特に揃える必要はない。本実験ではｓｓ  ｃＤＮＡを４．５μｇ生成されたことを確認し、次の断片化処理の過程に進んだ。【００８２】
【表１７】
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【００８３】
２）一本鎖ｃＤＮＡの断片化処理（Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）
前記１．１）で調製した一本鎖ｃＤＮＡ  １０μＬ（２−７μｇ）を試料として用いた。これを９４℃に１０分間保ち変性させた後、氷上で保った。これに、表１８に記載の酵素、試薬を加え、３７℃で１０分間インキュベートした後、９８℃で１０分間保ち、フラグメントを得た。【００８４】
【表１８】
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【００８５】
前記１．２）にて得られたフラグメントの末端に、表１９に記載の酵素、試薬をそれぞれ加え、３７℃で６０分間インキュベートすることでラベルした。ラベル後は２．０μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを加え反応を停止したのち−２０℃で貯蔵した。【００８６】
【表１９】
2006041159.tif 000021
【００８７】
表２０に従い、各試薬を加えてハイブリダイゼーションカクテルを作成し、そのハイブリダイゼーションカクテル８０．０  μＬとチップとのハイブリダイゼーションを４５℃で１６時間行なった。チップを洗浄後、ストレプトアビジンー蛍光（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）標識による染色を行った。さらにチップの再洗浄を行ったのち、スキャナー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）にて蛍光強度を測定した。【００８８】
【表２０】
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【００８９】
３）遺伝子のＦｌａｇ情報の解析
前記によって得られたａＲＮＡ断片を使用してＧｅｎｅＣｈｉｐを行なった結果を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子解析ソフトにて解析し、各遺伝子の発現の有無を調べた。表２１に示すように、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ解析ソフトにおいて遺伝子発現が認められると判定される割合はチップ上の総遺伝子数の約３５．２％であった。【００９０】
【表２１】
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【００９１】
さらに、ＧｅｎｅＣｈｉｐマニュアルに準じたサンプル調整で得られた遺伝子発現のパターンを、前記で得られた１サイクルＩＶＴ法での遺伝子発現又は２サイクルＩＶＴ法での遺伝子発現と比較し、それぞれの相関関係を調べた。
マニュアル法と１サイクルＩＶＴ法での遺伝子発現結果の相関係数は図９に示すように、０．７５（Ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ，ｔｗｏ−ｔａｉｌ，ｐ＜０．０１）と有意な相関が認められた。また、マニュアル法と２サイクルＩＶＴ法での遺伝子発現結果の相関係数も図１０に示すように０．６９（Ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ，ｔｗｏ−ｔａｉｌ，ｐ＜０．０１）と統計学的に有意な相関が認められた。
以上の結果から、ＩＶＴ法によりＲＮＡ増幅された試料はマニュアル法でのＲＮＡ増幅を伴わない方法で得られたオリジナルの試料に含まれるｍＲＮＡの混合比を保持していたことが示された。【００９２】
今回行なったＧｅｎｅＣｈｉｐ１枚に反応させた試料がＩＶＴ法で１．１μｇのａＲＮＡであるのに対して、マニュアル法では倍量の２．２μｇのｃＤＮＡを使用した。しかしながら、発現が認められると判定された遺伝子発現シグナルの平均値が１サイクルＩＶＴ法（１３５．７，ｎ＝２）および２サイクルＩＶＴ法（１１０．５，ｎ＝２）に比較してマニュアル法（５２．５，ｎ＝２）では約半分に減少した。本結果はマニュアル法に比較してＩＶＴ法ではビオチン標識が４倍以上高い事を示すことから、ＩＶＴ法により微量の試料から抽出したＲＮＡをさらに高感度に標識するのに有効である事が示された。特にシグナル全体を高めることで、コピー数の少ないすなわちシグナル強度が低い遺伝子のばらつきを減少させることでより多くの解析対象となる遺伝子数を増加させることが可能となることが示唆された。【００９３】
ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析により遺伝子発現が認められるもの（Ｆｌａｇ情報が”Ｐｒｅｓｅｎｔ”または”Ｍａｒｇｉｎａｌ”と示されるもの）の数はマニュアル法で２，９５１遺伝子、１サイクルＩＶＴ法で３，５８１遺伝子、また２サイクルＩＶＴ法で２，１９１遺伝子であった（図１１）。マニュアル法での２，９５１遺伝子のうち１サイクルＩＶＴ法とは７８．６％が重複し、２サイクルＩＶＴ法とは６０．０％が重複していた。また１サイクルＩＶＴ法と２サイクルＩＶＴ法で重複する遺伝子は２，１０４存在し、この数は１サイクルＩＶＴ法の５８．８％、２サイクルＩＶＴ法の９６．０％を占める。本結果は２サイクルＩＶＴ法により得られる結果の大部分は１サイクルＩＶＴ法で得られる結果に包括されることを示している。また各方法で得られる遺伝子群のうち他の方法との間に重複を示さない遺伝子群の大部分は遺伝子発現のシグナル強度の低い側に集中して現れている事が判明した。反対に、どの方法においても重複する１，６６１遺伝子はシグナル強度の高い側に集中していることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明のプロモーター領域を付加したプライマーはＲＮＡを増幅することができる。本発明のプライマーによって、微生物感染症患者から得られた微生物ＲＮＡを増幅し、得られたｍＲＮＡ情報をマイクロアレイやノーザンブロット等によって解析することで、病原微生物のありのままの病原性を調べ、臨床的診断、予後・治療法の選択に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】ＲＮＡからｓｅｎｓｅ鎖のみを合成する方法の概要を示した図である（実施例４）。
【図２】ＲＮＡからｓｅｎｓｅ／ａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖を同時に合成する方法の概要を示した図である（実施例４）。
【図３】ＲＮＡからａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖のみを合成する方法の概要を示した図である（実施例４）。
【図４】Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓから精製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡのフラグメントサイズを示した図である（実施例４）。
【図５】１サイクルＩＶＴ法によって合成されたａＲＮＡのフラグメントサイズを示した図である（実施例４）。
【図６】２サイクルＩＶＴ法によって合成されたａＲＮＡのフラグメントサイズを示した図である（実施例４）。
【図７】１サイクル  ＩＶＴ  法及び２  サイクル  ＩＶＴ法を行なった各グループ２試料間のばらつきを示した図である（実施例６）。
【図８】１サイクルＩＶＴ法及び２サイクル  ＩＶＴ法での遺伝子発現結果の相関関数を示した図である（実施例６）。
【図９】ＧｅｎｅＣｈｉｐ法と１サイクルＩＶＴ法での遺伝子発現結果の相関係数を示した図である（実施例７）。
【図１０】ＧｅｎｅＣｈｉｐ法と２サイクルＩＶＴ法での遺伝子発現結果の相関係数を示した図である（実施例７）。
【図１１】ＧｅｎｅＣｈｉｐ法と１サイクル  ＩＶＴ  法及び２  サイクル  ＩＶＴ法で発現が有ると判定された遺伝子数を示した図である（実施例７）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年2月24日(2006.2.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】請求の範囲
【請求項１】原核生物のＲＮＡ増幅に用いるランダムプライマーにプロモーター領域が付加されたことを特徴とするプライマー。
【請求項２】（削除）
【請求項３】プロモーター領域が、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーターから選ばれるいずれか１つである請求項１に記載のプライマー。
【請求項４】（削除）
【請求項５】請求項１又は３に記載のプライマーを用いて、原核生物のＲＮＡを増幅する方法。
【請求項６】ｎｇ単位のＲＮＡを増幅できる請求項５に記載の方法。
【請求項７】ＲＮＡを増幅する方法が、ＩＶＴ法である請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】ＩＶＴ法を２サイクル行うことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】１サイクルＩＶＴ法によって得られたａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ＲＮＡ）に請求項１又は３に記載のプライマーを用いてさらにＩＶＴ法を行うことにより、ｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ＲＮＡ）を増幅する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】１サイクルＩＶＴ法によって得られたａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ＲＮＡ）に請求項１又は３に記載のプライマーを用いてＲＴ反応を行った後、さらに請求項１又は３に記載のプライマーを用いてＩＶＴ法を行うことにより、ｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ＲＮＡ）及びａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ＲＮＡ）を増幅する請求項８に記載の方法。
【請求項１１】１サイクルＩＶＴ法によって得られたａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ＲＮＡ）にランダムプライマーを用いてＲＴ反応を行った後、さらに請求項１又は３に記載のプライマーを用いてＩＶＴ法を行うことにより、ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａＲＮＡ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ＲＮＡ）を増幅する請求項８に記載の方法。
【請求項１２】請求項１又は３に記載のプライマーを用いてＳＭＡＲＴ法により原核生物のＲＮＡを増幅する方法。
【請求項１３】請求項１又は３に記載のプライマーを用いて原核生物のＲＮＡを基に増幅したａＲＮＡ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ＲＮＡ）及び／又はａＤＮＡ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ）を用いて、原核生物の遺伝子発現解析及び／又は同定解析を行う方法。
【国際調査報告】
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