(57)【要約】  DIs株の対DI株欠損部位を挟む領域の中央に挿入されるトランスファーベクターを構築し、相同組換えによって目的外来遺伝子と大腸菌由来の薬剤耐性遺伝子XGPRTが挿入されるようなウイルスベクターを設計した。DIs株ウイルスベクターはCPEが観察されず、感染細胞で増殖せず、細胞傷害性も殆ど見られず、ウイルスベクターとして極めて有用であることが示唆された。外来遺伝子としてHCVタンパク質の全部もしくは一部をコードするDNAを挿入したところ、CTLが誘導されたため、C型肝炎に対する効果的な生ワクチンとなる可能性が考えられた。【特許請求の範囲】
【請求項１】
HCVウイルスタンパク質の全部もしくは一部のタンパク質をコードするDNAをゲノムDNA上に保有し、該タンパク質を発現し得る組換えワクチニアウイルスDIs株。
【請求項２】
HCVウイルスタンパク質がHCV非構造タンパク質である、請求項１に記載の組換えワクチニアウイルスDIs株。
【請求項３】
前記タンパク質をコードするDNAが、ゲノムDNAの非必須領域上に保有されたものである、請求項１または２に記載の組換えワクチニアウイルスDIs株。
【請求項４】
非必須領域が対ＤＩ株欠損領域もしくは該領域の近傍領域である、請求項３に記載の組換えワクチニアウイルスDIs株。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株のゲノムDNA。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株を有効成分として含む、Ｃ型肝炎ウイルスワクチン。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株を有効成分として含む、ウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答誘導剤。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株の、C型肝炎ウイルスワクチンの製造における使用。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株の、ウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答誘導剤の製造における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、HCVウイルスタンパク質の全部もしくは一部のタンパク質をコードするDNAをゲノムDNA上に保有し、該タンパク質を発現し得る組換えワクチニアウイルスDIs株に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチニアウイルスは、種痘として多数の人に接種され、天然痘の撲滅に貢献してきたウイルスである。200以上のウイルス蛋白をコードする遺伝子を持つ大きな2本鎖DNAウイルスで、ゲノムの全長は約200kBpにおよび、細胞質で複製するためにDNAとmRNA合成に関与する酵素群を自らがコードしているという特徴がある。【０００３】
しかしながら、コードする遺伝子のかなりの部分はウイルス複製には必須ではなく、欠損させてもウイルスは増殖することができる。また、ワクチニアウイルスは、ほとんどすべての哺乳類由来培養細胞に感染し、増殖することができる（非特許文献１参照)。更に、高い発現量を持つ、目的蛋白質が培養細胞により正しく翻訳後修飾されるなど、外来遺伝子導入、発現ベクターとしてワクチニアウイルスは分子生物学や免疫学の研究に広く応用されるようになってきている。また、長年にわたり種痘として用いられてきた歴史を持つため、ヒトに投与された場合の安全性に関する研究結果も蓄積されている。そのため、組換えワクチニアウイルスを生ワクチンとして用いようという研究も数多くの研究室で進められている。【０００４】
しかしながら、組換えワクチニアウイルスを生ワクチンとして用いるためには、その副作用についても十分な注意を払う必要がある。種痘の最も重篤な副作用の例が種痘後脳炎である。最も安全といわれ世界中で広く使用されたリスター株でも、その発症率は百万人あたり数人と低いとはいえ、発症した場合の致死率は10％から40％にも及ぶ。このような重篤な副作用を除くため、世界中で高度弱毒化ワクチニア株の開発研究がなされた。1950年代に国立予防衛生研究所（現在の国立感染症研究所）において北村敬らによって行われたワクチニアウイルスの弱毒化研究はその先駆けである。日本で用いられていたワクチン株、大連株(DI株)を一日卵継代を用いて長期にわたり継代培養し、確立された弱毒株がDIs株である。一日卵技術は発生開始24時間目のニワトリ胎児に直接ウイルスを接種する方法で、当時、国立予防衛生研究所の吉野亀三郎により開発されたものである。これによりヘルペスウイルスや狂犬病ウイルスなど広い範囲のウイルスを培養、増殖させることができた。この最新技術で得られたDI株の変異株は親株より小さなポックを漿尿膜上に示し、DIs株と名付けられた。DIs株は、親株であるDI株とは異なり、孵化鶏卵やニワトリ胎児繊維芽細胞(CEF)では増殖するが、他のほとんどの哺乳類細胞には感染はしても細胞内で増殖しないというユニークな性質を示した（非特許文献２参照)。従って人に接種しても善感せず、実用的な弱毒化ワクチニア株となることはできなかった(非特許文献３参照)。【０００５】
近年に樹立された類似の弱毒ワクチニアウイルスは、その強い細胞性免疫の誘導能から感染性疾患に対する組換え生ワクチンとして利用しようという研究が急速に進展しつつある。特に、1975年にMayrらによって樹立されたMVA(modified vaccinia Ankara)株（非特許文献４参照）は、HIVの一部の蛋白を組み込んだ組換えウイルスが強い細胞性免疫を誘導することが確かめられ、AIDSに対する組換え生ワクチンとして臨床治験の段階に達しようとしている(非特許文献５参照)。また、Paolettiらにより1992年に樹立されたNYVACは、ワクチニアウイルスのゲノムから18の遺伝子を人工的に欠損させて弱毒化したもので(非特許文献６参照)、同様の組換え生ワクチンとしての応用研究が進展している(非特許文献７参照)。【０００６】
C型肝炎ウイルス（HCV）は、従来非A非B型肝炎ウイルスと呼ばれていたウイルスで、1989年に米国のカイロン社によって遺伝子がクローニングされた、プラス一本鎖RNAをゲノムとするウイルスである（非特許文献８参照）。その後、カイロン社を含む複数のグループにより全塩基配列が決定され、３種類の構造蛋白と６種類の非構造蛋白が存在することが明らかにされてきた。【０００７】
現在ウイルスキャリアは、我が国では150万人以上いるといわれている。HCV感染者は高い確率で慢性肝炎から肝硬変、肝細胞癌へと移行するため、感染防御ばかりでなく既感染者の発症予防やウイルス排除のための効果的なワクチン開発の確立が社会的に強く求められている。
C型肝炎の治療には従来インターフェロンが用いられているが、治療効果が患者によってまちまちである点や、発熱などの副作用が強い点が問題となっている。【０００８】
ウイルス感染においては、ウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞（CTL）がウイルス排除に重要な役割を果たしているが、HCV感染者においても、血中および肝組織中にHCV特異的CTLが存在することが明らかにされている（非特許文献９および１０参照）。しかしながらHCVはCTL応答が弱く、CTL応答からのエスケープがHCV感染の慢性化に関与していると考えられる。従ってHCV感染者の体内で、HCVに対する強いCTLを誘導することが、ウイルスの生体からの排除に極めて有効であることが示唆された。【０００９】
しかしながら、弱毒ワクチニアウイルスをC型肝炎治療に応用した例はこれまでのところ知られていなかった。さらに、HCVに対して強くCTLを誘導し得る有用なワクチンも知られていなかった。【００１０】
【非特許文献１】Moss, B.著、「Poxviridae. In "Fields Virology" (B. N. Fields, D. M. KnipeおよびP. M. Howley, 編)」、第4版、Philadelphia、Lippincott-Raven Publishers、2001年、pp. 2849-2883
【非特許文献２】Tagaya, I.外２名著、「A new mutant of dermovaccinia virus.」、Nature、1961年、Vol.192、p.381-382
【非特許文献３】北村敬  著、中公新書「天然痘が消えた」、中央公論社、1982年
【非特許文献４】Mayr, A.外２名著、「 Abstammung, Eigenschaften und Verwendung des attenuierten Vaccinia-Stammes MVA.」、Infection、1975年、Vol. 3、p.6-14.
【非特許文献５】Hanke, T.外８名著、「Development of a DNA-MVA/HIVA vaccine for Kenya.」、Vaccine、2002年、Vol.20、p.1995-1998.
【非特許文献６】Tartaglia, J.外１１名著、「 NYVAC: a highly attenuated strain of vaccinia virus.」、Virology、1992年、Vol.188、p.217-232.
【非特許文献７】Kazanji, M.外７名著、「Immunogenicity and protective efficacy of recombinant human T-cell leukemia/lymphoma virus type 1 NYVAC and naked DNA vaccine candidates in squirrel monkeys (Saimiri sciureus).」、J. Virol.、2001年、Vol.75、p.5939-5948.
【非特許文献８】Science、1989年、Vol. 244、p.359-362
【非特許文献９】Hepatology、1993年、Vol.18、p.1039-1044
【非特許文献１０】J. Immunol.、1992年、Vol.149、p.3339-3344
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は上記状況に鑑みて為されたものであり、その目的は、HCVに対して感染予防もしくはウイルス排除のための効果的なワクチンの提供を課題とする。より詳しくは、HCVに対して強くCTLを誘導し得る有用なワクチンの提供を課題とし、より具体的には、HCVウイルスタンパク質の全部もしくは一部のタンパク質をコードするDNAをゲノムDNA上に保有し、該タンパク質を発現し得る組換えワクチニアウイルスDIs株の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。まず、本発明者らは、DIs株の遺伝子構造の解析を行い、DIs株のゲノムDNAの左端に１箇所の大きな欠損があることを見出した。そして、該欠損部位を挟む領域の中央に挿入されるトランスファーベクターを構築し、相同組換えによって目的外来遺伝子と大腸菌由来の薬剤耐性遺伝子XGPRTが挿入されるようなウイルスベクターを設計した。【００１３】
このようにして設計されたDIs株のウイルスベクターとしての有用性を確認するため、外来遺伝子としてT7 polymeraseを組み込んだウイルスを細胞に感染させ、T7 promoterの下流にルシフェラーゼ遺伝子をつないだプラスミドをトランスフェクトしたところ、強いルシフェラーゼ活性が観察された。またいずれの細胞でもCPE（cytopathic effects）は観察されず、さらに感染細胞で増殖せず、細胞傷害性も殆ど見られないことから、ウイルスベクターとして極めて有用であることが示唆された。
またDIs株に外来遺伝子としてHCVタンパク質の全部もしくは一部のタンパク質をコードするDNAを挿入したところ、CTLが誘導されることが分かった。【００１４】
CTL応答が弱いためにウイルスを完全に生体から排除することが困難であったHCVだが、ワクチニアウイルスの強い免疫誘導能を応用し、HCVがコードする蛋白の全部または一部をDIsに組み込み、これらの組換えウイルスを投与することによって、HCVがコードする蛋白に対する強いCTL応答を誘導することができると考えられる。また、本発明の組換えウイルスは、C型肝炎に対する効果的な生ワクチンとなる可能性が考えられる。
さらに本発明者らは、両末端の一部の配列を除くDIsの全塩基配列を決定することに成功した。これにより、より効率的な組換えDIsの作製が可能となった。【００１５】
即ち本発明は、HCVウイルスタンパク質の全部もしくは一部のタンパク質をコードするDNAをゲノムDNA上に保有し、該タンパク質を発現し得る組換えワクチニアウイルスDIs株に関し、より詳しくは、
〔１〕  HCVウイルスタンパク質の全部もしくは一部のタンパク質をコードするDNAをゲノムDNA上に保有し、該タンパク質を発現し得る組換えワクチニアウイルスDIs株、
〔２〕  HCVウイルスタンパク質がHCV非構造タンパク質である、〔１〕に記載の組換えワクチニアウイルスDIs株、
〔３〕  前記タンパク質をコードするDNAが、ゲノムDNAの非必須領域上に保有されたものである、〔１〕または〔２〕に記載の組換えワクチニアウイルスDIs株、
〔４〕  非必須領域が対ＤＩ株欠損領域もしくは該領域の近傍領域である、〔３〕に記載の組換えワクチニアウイルスDIs株、
〔５〕  〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株のゲノムDNA、
〔６〕  〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株を有効成分として含む、Ｃ型肝炎ウイルスワクチン、
〔７〕〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の組換えワクチンウイルスDIs株を有効成分として含む、ウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答誘導剤、
を提供するものである。
さらに本発明は、以下の〔８〕〜〔１１〕を提供するものである。
〔８〕前記組換えワクチニアウイルスDIs株の、C型肝炎ウイルスワクチンの製造における使用、
〔９〕前記組換えワクチニアウイルスDIs株の、ウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答誘導剤の製造における使用、
〔１０〕前記組換えワクチニアウイルスDIs株を個体（対象者、被検者、患者等）へ投与する工程を含む、ウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導する方法、
〔１１〕前記組換えワクチニアウイルスDIs株を個体へ投与する工程を含む、C型肝炎を予防もしくは治療する方法。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ワクチニアウイルスDIs株のゲノムの解析と同定された欠損部位を示す図である。ゲノムの右端に近い部位15.4kbpが欠損していた。欠損部分を挟む1.9kbpのフラグメントを増幅し、トランスファーベクターの相同組換え領域として使用した。
【図２】DIsトランスファーベクターpDIsmH5の構造を示す図である。mH5プロモーターの下流のマルチクローニングサイト(MCS)に目的の外来遺伝子を挿入する。
【図３】相同組換えによる組換えDIs作成の模式図：DIsをCEFに感染させた後トランスファーベクターを感染細胞内にトランスフェクションすると、低い確率ではあるがウイルス複製の過程でウイルスのDNAポリメラーゼがベクター側に組み込まれたDIsの領域を複製するため、目的遺伝子が組み込まれたDIsが生成する。この際に薬剤耐性遺伝子XGPRTも同時に組み込まれるため、MPA存在下でプラークアッセイを行うと目的とするDIsのみが増幅する。
【図４】HCVの構造領域を発現する組換えDIs/J228を投与したマウスにおける液性免疫の誘導を示すグラフである。上段はHCVのcore、下段はHCVのE2を用いた結果を示す。左列は静脈へのウイルス注入、右列は腹腔へのウイルス注入の結果を示す。
【図５】HCVの構造、非構造領域を発現する組換えDIsを投与したマウスにおける細胞性免疫誘導の結果を示すグラフである。縦軸はELISPOT法によるIFN-γ陽性T細胞数を示す。構造領域は４つに、NS5A領域は２つに分割し、それぞれの領域に対応するoverlappingペプチドで刺激したT細胞でIFN-γを分泌する細胞数を測定した。なお、構造領域は１がcoreに、２がE1に、３、４がE2に対応している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、HCVウイルスタンパク質の全部もしくは一部のタンパク質をコードするDNA（本明細書において「HCVウイルスDNA」と記載する場合あり）をゲノムDNA上に保有し、該タンパク質を発現し得る組換えワクチニアウイルスDIs株を提供する。【００１８】
HCVウイルス（C型肝炎ウイルス）は、一般的に、種々のタイプ（遺伝子型）が知られている（例えば、1b,2a,2b等）。本発明におけるHCVウイルスは、特定のタイプに属するウイルスに制限されず、これら全てのタイプに属するウイルスを指す。【００１９】
本発明の組換えウイルス株は、その特徴として、ワクチニアウイルスDIs株ゲノム上へHCVタンパク質をコードするDNAが挿入された（組み込まれた）ゲノム構造を有するワクチニアウイルスDIs株である。【００２０】
本発明において用いられる、HCVタンパク質とは、HCVゲノム上に存在する遺伝子によってコードされるタンパク質（本明細書において「HCVタンパク質」と記載する場合あり）、もしくは該タンパク質の部分ペプチドを指す。本発明の上記タンパク質には、例えば、構造タンパク質、調節タンパク質、およびアクセサリータンパク質等が含まれる。【００２１】
本発明において、DIs株ゲノムDNA上に保有されるHCVタンパク質をコードするDNAとしては、CTL活性を有するHCV由来のタンパク質をコードするDNAであることが好ましい。上記DNAとしては、例えば、コアタンパク質を発現する領域、構造タンパク質全体（コアタンパク質および２つのエンベロープタンパク質; core、E1、E2）を発現する領域、プロテアーゼタンパク質（非構造タンパク質(NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5B)）を発現する領域、およびNS5Aと呼ばれるインターフェロン感受性を規定している領域に含まれるDNAを挙げることができる。【００２２】
上記の構造タンパク質、および非構造タンパク質に分類させる各タンパク質のアミノ酸配列および該アミノ酸配列をコードする塩基配列に関する情報は、当業者においては、それぞれのタンパク質の名称を基に、公知の文献あるいは公共のデータベースから容易に取得することができる。これら情報を基に上記タンパク質もしくは該タンパク質の部分ペプチドをコードするDNAについて、適宜クローニングし、本発明のDIs株の作製に用いることは可能である。【００２３】
本発明において用いられるHCVウイルスタンパク質としては、後述の実施例に示すように、好ましくは、非構造タンパク質であり、より好ましくはNS5A（配列番号：１２に記載の塩基配列によってコードされるタンパク質）である。その他、上記NS5A以外にも、例えば、本発明において用いられるHCVウイルスタンパク質として、NS2（配列番号：１３に記載の塩基配列によってコードされるタンパク質）、NS3（配列番号：１４に記載の塩基配列によってコードされるタンパク質）、NA4A（配列番号：１５に記載の塩基配列によってコードされるタンパク質）、NS4B（配列番号：１６に記載の塩基配列によってコードされるタンパク質）、または、NS5B（配列番号：１７に記載の塩基配列によってコードされるタンパク質）等を挙げることができる。【００２４】
本発明の好ましい態様においては、上記タンパク質をコードするDNAもしくは該DNAの断片をゲノムDNA上に保有し、該タンパク質を発現し得る組換えワクチニアウイルスDIs株である。【００２５】
本発明においてDIsウイルス株ゲノムDNAにおける、HCVウイルスタンパク質をコードするDNAを挿入する領域としては、特に制限されないが、例えば、DIs株と親株のワクチニアウイルス株とのゲノムを比較した際に、DIs株において欠損しているゲノム領域を好適に挙げることができる（該領域を「対DI株欠損領域」と記載する場合あり）。本発明における「対DI株欠損領域」は、例えば、DIs株のゲノムDNAの制限酵素切断パターンを親株のDI株と比較することにより、ゲノム上のどの領域が上記領域であるかを調べることができる。該領域は通常、DIs株の複製には不必要である。なお、DIsウイルス株ゲノムDNAとしては、より具体的には、配列番号：１１に記載された塩基配列を好適に示すことができる。ワクチニアウイルスのコペンハーゲン株のゲノムDNA（GenBankアクセッション番号：M35027）における該「欠損領域」は判明している。該「欠損領域」は、具体的には、コペンハーゲン株のゲノムDNAにおいて、5’側から数えて17145-32562位に相当する領域（配列番号：１８）である。当業者においては、本明細書において開示された情報を基に、上記「欠損領域」が親株（大連株）のゲノムDNA上のどの領域に相当するかについて、適宜知ることが可能である。【００２６】
本発明の好ましい態様においては、HCVウイルスDNAが、上記の対DI株欠損領域もしくは該領域の近傍領域上に保存された（挿入された）組換えワクチニアウイルスDIs株を提供する。【００２７】
本発明における「欠損」領域の一例としては、例えば、図１において黒線で示された15.4 kbpの領域を挙げることができる。この「欠損」領域には、ウイルス増殖に必須と考えられている遺伝子は存在せず、宿主域遺伝子(host range genes)と呼ばれるもののうち2つ(K1LとC7L)が存在している。例えば、K1Lを欠損させると、この欠損ウイルスは例えばRK13等の細胞における増殖能を失う。【００２８】
また、上記「欠損」領域は、図１で示される15.4kbpの領域に、厳格に制限されるものではない。例えば、この「欠損」領域を含むさらに広い領域の「欠損」、あるいは、上記15.4kbp未満の「欠損」であっても、本発明の上記「欠損」に含まれる。【００２９】
本発明において上記「欠損」領域へのDNAの「挿入」とは、上記「欠損」領域に対応するDNAが、本発明のHCVウイルスDNAによって置換された状態であってもよく、また、「欠損」領域に対応するDNA上へHCVウイルスDNAが挿入（付加）された状態であってもよい。【００３０】
本発明における「組換えワクチニアウイルス」とは、通常、組換え弱毒化ワクチニアウイルスを指す。組換え弱毒化ウイルスとは、例えば、遺伝子の改変がなされる（特定の遺伝子を欠失する）ことによって、もしくは、長期に継代することによって、野生型より毒性が弱められたウイルスを指す。本発明においては、ワクチニアウイルス大連株（DI株）を高度に弱毒化したDIs株が好適に用いられる。【００３１】
また、DIs株以外にも、弱毒株として例えば、MVA弱毒株が知られている（上記非特許文献４参照）。DIs株は、該MVA弱毒株と比較して、例えば、以下の点で優れているものと考えられる。
（１）MVAは一部の哺乳類細胞で増殖するが、DIsは殆ど増殖しない。
（２）MVAには複数の領域の欠損および重複があるため、野生株には存在しない新たな蛋白が複数生成しており、これらの因子が何らかの未知の影響を宿主に与える可能性が否定できないが、DIsでは欠損は1箇所のみであり、このような影響を考慮する必要がない。【００３２】
また本発明において、HCVウイルスタンパク質の全部もしくは一部のタンパク質をコードするDNA（「HCVウイルスDNA」と記載する場合あり）を、DIs株ゲノム上へ挿入する（組み込む）際の該ゲノム上の部位は、特に制限されないが、該ゲノム上の「非保存領域」であることが好ましい。即ち、本発明の好ましい態様においては、HCVウイルスDNAが、ゲノムDNAの非保存領域上に保存された（挿入された）組換えワクチニアウイルスDIs株を提供する。【００３３】
上記「非保存領域」とは、ウイルスの増殖に必須と考えられている遺伝子が存在しない領域を指す。前述のように、ワクチニアウイルスは、ゲノムの全長が約200 kbpであり、コードする遺伝子のかなりの部分はウイルス複製には必須ではなく、欠損させてもウイルスは増殖することができる。本発明者らは、DIs株の全塩基配列を決定し、DIs株ゲノムの左端に１ヶ所大きな15.4 kbpに及ぶ欠損（単に「DIs株欠損領域」と記載する場合あり）があることを明らかにした。なお、この15.4kbpに及ぶ欠損領域は、通常のワクチニアウイルスには存在するが、配列番号：１１に記載されたDIs株のゲノムDNAには存在しない領域である。【００３４】
本発明において「非保存領域」とは、例えば、DIs株ゲノム上の上記「欠損」領域（例えば、上記15.4 kbpの欠損領域、もしくは該領域の近傍領域）を好適に示すことができる。尚、本発明において「該領域の近傍領域」とは、通常、該領域の近傍の染色体上の領域を指す。本発明において「近傍」とは特に制限されるものではないが、通常、当該領域の末端から、5 kbp以内の領域、より好ましくは1 kbp以内の領域を指す。【００３５】
本発明の組換えウイルスは、例えば、以下のような方法で作製することができる。本発明の組換えウイルスの作製の際には、例えば、配列番号：１１に記載のDIsのゲノム配列に関する情報を適宜利用することができる。DIs株ゲノムの非保存領域もしくは該領域の近傍DNA領域からなるDNA断片へ、HCVウイルスDNAが挿入された構造を含むベクター（トランスファーベクター）を作製する。次いで、該ベクターをDIs株へ導入し、相同組換え機構を利用し、該ウイルスDNAをDIsゲノム上へ挿入させる。上記方法においては、適宜、選択マーカーを保有させたトランスファーベクターを用いることができる。選択マーカーとしては、公知の種々のマーカーを利用することができる。例えば、選択マーカーの一例として、XGPRT遺伝子、LacZ遺伝子等が挙げられる。これらマーカー遺伝子を利用した組換えウイルス(DNA)体の選択方法もまた公知である。また、ウイルスの相同組換え体の選択には、DIs株が唯一増殖可能なCEFを好適に使用することにより効率よく行うことができる。【００３６】
上記HCVウイルスDNA（HCV遺伝子）の塩基配列および該遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は既に公知であり、当業者においては、該配列に関する情報について、例えば、文献データベース、または公共の遺伝子（ゲノム）データベースを利用して容易に取得することができる。HCV遺伝子（ゲノム）の情報は、NCBIの提供するデータベースから、アクセッション番号：D89815（http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=2943783）によって、適宜取得することができる。【００３７】
所望のゲノム上の領域に対して、外来DNAを挿入させる方法は、これまでに種々の方法が知られている。当業者においては、これらの方法を利用して、組換えウイルスを適宜作製することができる。本発明の組換えDIs株の作製方法として、より具体的には、後述の実施例に記載された方法を例示することができる。【００３８】
また本発明によって提供される組換えワクチニアウイルスDIs株のゲノムDNAまたは該ゲノムDNAの部分断片DNAもまた、本発明に含まれる。該部分断片DNAとは、好ましくは、HCVウイルスDNAが挿入されたDNA領域を含む部分断片DNAである。【００３９】
さらに本発明は、本発明の組換えワクチニアウイルスDIs株を有効成分として含む、C型肝炎ウイルスワクチンを提供する。
本発明におけるワクチンは、通常、C型肝炎ウイルスの排除またはC型肝炎の治療のために使用される。ワクチンは抗原を含んでいるか、または抗原を発現可能であり、これにより抗原に対する免疫応答を誘導することができる。C型肝炎ウイルスの排除またはC型肝炎の治療のために、本発明のワクチンは、所望の形態で用いることができる。【００４０】
本発明のワクチンには、有効成分である本発明の組換えワクチニアウイルスDIs株以外に、例えば、担体等が含まれていてもよい。担体の種類は、通常、投与の形態に応じて決めることができる。本発明のワクチンは、例えば、局所、経口、鼻腔内、静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内投与を含む、投与に適当な方法で製剤化することができる。皮下注射のような非経口投与については、担体として、好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックス又は緩衝液等を挙げることができる。経口投与のためには、前述の担体又は固形担体、例えばマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウム等を、適宜使用することができる。【００４１】
また本発明のワクチンを、本発明の組換えワクチニアウイルスDIs株、およびアジュバントを含む組成物として製剤化することも可能である。アジュバントとしては、例えば、アルミニウム塩、菌体内毒素、カルメット‐ゲラン杆菌（BCG）、リポソーム、ミクロスフィア（例えば、経口投与ワクチンに使用されるマイクロカプセル化ポリマー等）、およびフロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバント等が挙げられるが、これらに限定されない。「アジュバント」とは、抗原の免疫原性を上昇させる物質を指す。【００４２】
本発明のワクチンの個体への投与は、特に制限されるものではないが、例えば、局所、経口、鼻腔内、静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内投与で行うことができる。投与量は、個体（患者）の年齢、体重、症状等を考慮して、当業者（医師・獣医師等）においては、適宜、決定することができる。【００４３】
本発明のワクチンが接種可能な動物としては、免疫系を有し、かつHCVに感染し得るあらゆる宿主生物が挙げられ、例えば、ヒトおよび一部の霊長類を挙げることができる。【００４４】
また、本発明の組換えワクチニアウイルスDIs株は、個体へ導入されると、ウイルス特異的細胞傷害性T細胞(CTL)の応答を誘導する作用を有する。従って本発明は、本発明の組換えワクチニアウイルスDIs株を有効成分として含む、ウイルス特異的細胞傷害性T細胞(CTL)応答誘導剤を提供する。【００４５】
細胞傷害性T細胞（CTL；cytotoxic T lymphocyte）とは、細胞溶解性（キラー）T細胞、細胞傷害性Tリンパ球ともいわれ、標的細胞を破壊する能力をもち、ウイルス感染細胞や腫瘍細胞の排除に役立っていると考えられている。【００４６】
本発明の上記CTL応答誘導剤も、有効成分である本発明の組換えDIs株以外に、上述の担体等を適宜、含有させることが可能である。【００４７】
また本発明は、本発明の組換えワクチニアウイルスDIs株、もしくは本発明の薬剤を個体（例えば、患者等）へ投与することを特徴とする、ウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導する方法、並びに、C型肝炎を予防もしくは治療する方法に関する。
本発明の予防もしくは治療方法における個体とは、好ましくはヒトであるが、特に制限されず、免疫系を有する非ヒト動物であってもよい。
個体への投与は、一般的には、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射など当業者に公知の方法により行うことができる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。【００４８】
さらに本発明は、本発明の組換えワクチニアウイルスDIs株のC型肝炎ウイルスワクチンの製造における使用、並びに、本発明の組換えワクチニアウイルスDIs株のウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答誘導剤の製造における使用に関する。【００４９】
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００５０】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって制限されるものではない。
〔実施例１〕DIs株の遺伝子構造の解析
ワクチニアウイルスDIs株を用いて組換えウイルスを作成するため、DIs株のゲノム上に存在する変異の同定を行った。親株のDIE株およびDIs株よりゲノムDNAを精製し、HindIIIで消化してできる断片をアガロースゲル電気泳動で比較した結果、ゲノムの5'端付近に約15kbpの欠損が存在することが明らかとなった。この欠損の付近を増幅するため、２本のPCRプライマー
Vac H-C [5’-ATAATGTAGCTCCTTCATCAATCATACATT]／配列番号：１
Vac H-F [5’-AGGAGGTGGTGTAATAGACGAAGATTATAG]／配列番号：２
を合成した。DIsのゲノムDNAをテンプレートとしてPCR増幅を行い、プラスミドpUC19のEcoRI部位に挿入して増幅されたフラグメントの配列決定を行い、親株と比較して5'端より17.1kbpと32.5kbpの間の部分が欠損していることを明らかにした（Ishii K., Ueda Y., Matsuo K., Matsuura Y., Kitamura T., Kato K., Izumi Y., Someya K., Ohsu T., Honda M. and Miyamura T. (2002) Structural analysis of vaccinia virus DIs strain: Application as a new replication-deficient viral vector. Virology in press)（図１）。なお、ここで作成したベクターをpUc/DIsと呼ぶ。【００５１】
この15.4kbpの欠損領域には、ウイルス増殖に必須と考えられている遺伝子は存在しないが、host range genes（宿主域遺伝子）と呼ばれるもののうち２つ（K1LとC7L）が存在している。宿主域遺伝子は、その機能は未だ明らかではないが、ワクチニアウイルスが感染、増殖できる培養細胞の範囲を規定していることが明らかとなっている(Perkus, M. E., Goebel, S. J., Davis, S. W., Johnson, G. P., Limbach, K., Norton, E. K., and Paoletti, E. (1990). Vaccinia virus host range genes. Virology 179, 276-286.)。例えば、K1Lを欠損させると、この欠損ウイルスはRK13細胞での増殖能を失う。従って、これらの宿主域遺伝子の欠損が、DIs株がほとんどの哺乳類細胞で増殖できない理由であると考えられる。実際、後に述べる組換えウイルス作成の手法を用いてこれらの宿主域遺伝子をDIs株に組み込んだところ、組換えウイルスはHeLa、RK13、CV-1細胞など、調べた哺乳類細胞のいずれでも増殖能を回復していた(Ishii K., Ueda Y., Matsuo K., Matsuura Y., Kitamura T., Kato K., Izumi Y., Someya K., Ohsu T., Honda M. and Miyamura T. (2002) Structural analysis of vaccinia virus DIs strain: Application as a new replication-deficient viral vector.. Virology 302 (2002) 433-444)。【００５２】
〔実施例２〕組換えDIs株作成手法の確立
DIs株をウイルスベクターとして、あるいは組換え生ワクチンとして用いるためには、同ウイルスへ外来遺伝子を組み込む手法を確立することが必須である。ワクチニアウイルスはゲノムのみでは感染性がなく、またゲノムサイズが約200kbpあり、外来遺伝子をゲノム中に直接挿入することは現在の遺伝子工学技術では非常に困難である。そのため、トランスファーベクターを使用し、感染細胞内で相同組換えをおこさせることにより外来遺伝子を挿入する方法が一般に用いられる（ウイルスゲノムの一部と同じ配列を持つプラスミドが感染細胞内に存在する場合、ゲノム複製の際に一定の頻度で、プラスミド上の配列と、それに対応するゲノム上の配列の交換がおこる。この現象が相同組換えである。）。従って、DIsゲノムの一部をプラスミドにサブクローニングし、このDIs配列内に目的の外来遺伝子を挿入することで、このプラスミドをDIsに外来遺伝子を挿入するトランスファーベクターとして用いることができる。【００５３】
DIsに外来遺伝子を挿入する場合には、挿入することによりDIsの感染、増殖に影響の出ない場所を選択する必要がある。そのためには、先に決定した欠損部位に外来遺伝子を挿入する方法が、DIsに影響を及ぼさない部位として好適であると考えられる。以上の理由から上記のpUc/DIsをトランスファーベクターとして用いることとした。pUc/DIs中のDIs由来の配列の内部に、ワクチニアウイルス由来のプロモーターとその下流に目的の外来遺伝子を挿入することにより、この外来遺伝子をDIsに組み込むトランスファーベクターとして使用することができる。そのため、ワクチニアウイルスのプロモーター配列のpUc/DIsのDIs由来配列への挿入を行った。pBluescript SK(-)ベクターのHindIII〜SmaI部位に、ワクチニアウイルスのH5R遺伝子のプロモーター配列[5’-AAAAATTGAAAATAAAATACAAAGGTTCTTGAGGGTTGTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATA／配列番号：３]を合成して挿入し、生成したベクターをBssHIIで切断した。240bpのフラグメントを精製した後に末端をHindIIIに変換し、pUC19に挿入したDIs由来配列中に存在するHindIII部位に挿入した。このワクチニアウイルスプロモーターmH5の下流に存在するSmaI、BamHI、NotI、SacI、SacIIを外来遺伝子の挿入部位（マルチクローニングサイト）として使用できる。【００５４】
上記のプラスミドに薬剤選択マーカーを挿入するため、E.coli由来の酵素XGPRT(hypoxantine-guanine phosphoribosyl transferase)遺伝子の上流にワクチニアウイルスプロモーターp7.5を付加し、pUC19に挿入したDIsフラグメント中に存在するMluI部位に挿入した。挿入した配列を配列番号：４に示す。この手法は、プリン合成の阻害剤であるMPA (mycophenolic acid)存在下ではGMP合成が阻害され、ワクチニアウイルスのDNA合成も阻害されるためにウイルス増殖ができないが、培地中にMPA(micophenoic acid)、xantine、hypoxantineをそれぞれ25μg/ml、250μg/ml、15μg/ml添加してある場合、XGPRT遺伝子をゲノム内に持つウイルスのみが増殖するため、この３種の薬剤を含有する培地でウイルスを培養することにより目的の組換えウイルスを取得することができる(小島朝人  「ワクシニアウイルスベクター」  ウイルス実験プロトコール  (1995)  343-353  メジカルビュー社)。ウイルスの相同組換えおよび組換えウイルスの選択には、DIsが唯一増殖することができるCEFを用いる点が肝心である。【００５５】
本発明者らは、ワクチニアウイルスのp7.5 promoterの下流にXGPRT遺伝子を挿入し、更にmH5 promoterの下流にマルチクローニングサイトをつないで外来遺伝子を容易に挿入できるようにしたユニットを作成した。このユニットを、DIsの遺伝子が欠損している部分を挟む領域の中央に挿入したトランスファーベクターを構築し、相同組換えをおこすと、目的とする外来遺伝子と共にXGPRT遺伝子が挿入されるように設計した（図２）。完成したトランスファーベクターを、pDIsgptmH5と名付けた。【００５６】
上記のpDIsgptmH5のマルチクローニングサイトに、HCVの種々の蛋白領域を挿入したトランスファーベクターを作成した。例えば、HCV 1bのcDNAより構造蛋白領域約2.4kbpをPCRにより増幅して挿入することにより、HCV 1bのcore、E1、E2を発現する組換えDIsを作成することができる。また、非構造領域であるNS3、NS5Aに相当する1.9kbp、1.3kbpのフラグメントをPCRにより増幅して挿入することにより、HCV 1bのNS3、NS5Aを発現する組換えDIsを作成することができる。増幅に用いたプライマーのリストを以下に示す。【００５７】
core/E1/E2
Forward: AAAGATCTCATGAGCACGAATCCTAAACCTCAAAGA（配列番号：５）
Reverse: AAAGATCTTTACAGACCTACAAGAACCGCACCCCCG（配列番号：６）【００５８】
NS3
Forward: AAAGATCTCATGGCGCCCATCACGGCCTACTCCCAA（配列番号：７）
Reverse: AAAGATCTTTAAGTGACGACCTCCAGGTCAGCCGAC（配列番号：８）【００５９】
NS5A
Forward: AAAGATCTCATGTCCGGCTCGTGGCTAAGGGATGTT（配列番号：９）
Reverse: AAAGATCTTTAGCAGCAGACGACGTCCTCACTAGCC（配列番号：１０）【００６０】
ワクチニアウイルスDIs株約106pfu(plaque forming unit)を含む500μlのウイルス液を、CEF(chick embryo fibroblast)細胞約107個が播かれた80mmシャーレに接種し、15分ごとに8回震盪することによりウイルスを細胞に感染させた。その後、1mlの10%FCS(fetal calf serum)を含むDMEM(Dalbecco-modified Eagle培地)を加え、37℃、5%CO2条件下にて2時間培養した。培地を取り除き、PBS(phosphate-buffered serine)で洗浄してから0.05%トリプシン溶液0.5mlを加え、細胞を遊離させた後、細胞懸濁液を2000rpmで3分遠心して細胞を回収し、400μlのPBSに懸濁した。この細胞懸濁液にトランスファーベクター10μgを溶解し、Gene Pulser II(Bio Rad社)を用いて0.4cmキュベット中、250v、500μFDで１回電圧をかけ電気穿孔法を行った。細胞を10%FCSを含むDMEM 2mlに懸濁し、35mmシャーレに播いて37℃、5%CO2条件下にて７日間培養した。感染細胞を培地とともに回収し、凍結乾燥３回、超音波処理２分行った後、同じ培地で10、100、1000倍希釈した。35mmシャーレに106個の細胞を播き、培地（10%FCSを含むDMEM）にMPA、xantine、hypoxantineをそれぞれ25μg/ml、250μg/ml、15μg/ml添加して一晩培養した後、上記の希釈細胞液を接種した。15分ごとに8回震盪することによりウイルスを細胞に感染させ、希釈細胞液を除いてから、１％軟寒天添加培地（10%FCSを含むDMEM。MPA、xantine、hypoxantineを含む）2mlを加え、固化させてから37℃、5%CO2条件下にて７日間培養した。形成されたプラーク部分をパスツールピペットでピックアップし、200μlの10%FCSを含むDMEMに懸濁し、２分間超音波処理を行ってウイルスを寒天より放出させた。この培養液を同じ培地で10、100、1000倍希釈し、上記と同様のプラークアッセイ操作をさらに２回繰り返して組換えウイルスを純化した後、CEF細胞に感染させてスケールアップを行った。このウイルスには外来遺伝子も同時に組み込まれているため、目的とする組換えウイルスを効率良く選別することができる（図３）。【００６１】
〔実施例３〕DIs株のウイルスベクターとしての応用
上記の手法を用いて、外来遺伝子としてバクテリオファージのT7 polymeraseを組み込んだ組換えDIsを作成した。このウイルスを各種の哺乳類細胞(HeLa、BHK、CHO、CV-1、HepG2)に感染させ、その後T7 promoterの下流にルシフェラーゼ遺伝子をつないだプラスミドをトランスフェクトしたところ、いずれの細胞でも強いルシフェラーゼ活性が観察された。また、いずれの細胞でも、数日間培養してもCPEは観察されなかった(Ishii K., Ueda Y., Matsuo K., Matsuura Y., Kitamura T., Kato K., Izumi Y., Someya K., Ohsu T., Honda M. and Miyamura T. (2002) Structural analysis of vaccinia virus DIs strain: Application as a new replication-deficient viral vector.. Virology 302 (2002) 433-444)。【００６２】
さらに、各種哺乳類細胞に、DIE及びDIsをmoi=0.05で感染させ、48時間後に感染細胞を回収した。超音波破砕後に段階希釈し、CEF細胞上でプラークを作らせることにより、それぞれのウイルスの各種哺乳類細胞での増殖能を測定した。表１の数値は、感染させたウイルス量を１とした場合に48時間後に何倍にウイルスが増殖したかを示す。【００６３】
【表１】
2006013815.tif 000002
【００６４】
表１から明らかなように、DIsはCEF細胞でのみ増殖し、他の哺乳類細胞では増殖能を持たなかった。
これらの結果から、組換えDIsに組み込まれた外来遺伝子は感染細胞中で効率よく発現すること、一方親株同様、組換えDIsは感染細胞で増殖せず、細胞傷害性もほとんど見られないことが確認され、ウイルスベクターとして極めて有用であることが示唆された。【００６５】
〔実施例４〕DIs株の組換え生ワクチンとしての可能性
ワクチニアウイルスはそれ自体強い細胞性免疫誘導能を持ち、組換えウイルスの外来遺伝子産物に対しても細胞性免疫を誘導する。従って、弱毒株であるDIsも外来遺伝子産物に対する免疫を誘導できる可能性は高いと考えられる。DIsを難治性感染症に対する組換え生ワクチンとして応用しようという試みも進みつつある。【００６６】
本発明者らは、感染症研究所エイズセンターの本多グループと共同し、HIV-1のgagを組み込んだ組換えDIsを作成した。このウイルスの細胞性免疫誘導能が調べられ、106pfuの組換えウイルスをマウスに２回尾静注し、CTLを測定したところ、２回目の静注の２週間後から強いCTL活性が観察された(Ishii K., Ueda Y., Matsuo K., Matsuura Y., Kitamura T., Kato K., Izumi Y., Someya K., Ohsu T., Honda M. and Miyamura T. (2002) Structural analysis of vaccinia virus DIs strain: Application as a new replication-deficient viral vector.. Virology 302 (2002) 433-444)。この結果は、組換えDIsが外来遺伝子産物に対する細胞性免疫を誘導できることを示している。【００６７】
〔実施例５〕HCVの構造領域を発現する組換えDIsを投与されたマウスでの抗体価の上昇
5週令のBalb/cマウスに106pfuのHCVの構造領域を発現する組換えDIsを投与し、抗体値を上昇させるかどうか確認した。同量のウイルスを、初回投与から２週後と６週後の合計３回投与し、７週目に採血して血中の抗体価を測定した。抗原は、組換えバキュロウイルスを用いて発現させたHCVのcoreとE2を用いた（相崎他、バキュロウイルス発現系を用いたHCV遺伝子の発現、日本臨床平成7年増刊号、80-84）。それぞれを発現する組換えバキュロウイルスをmoi=1でSf-9細胞107個に感染させ、72時間後に回収して１％NP-40に懸濁し、２分間超音波処理を行い16000rpm、５分遠心して上清を抗原とした。各溶液を0.05M炭酸バッファー(pH9.6)で1000倍に希釈してELISAプレート（住友ベークライト）に固定し、採血した血清を希釈したものを一次抗体、horse radish peroxidaseが結合した抗マウス抗体を二次抗体として常法に従いELISAを行い抗体価を測定した（図４）。図４に示すように、ウイルス投与方法が静脈からの注入（i.v.）及び腹腔への注入（i.p.）いずれでも抗体価が上昇していることが確認され、組換えウイルスの投与により目的蛋白に対する液性抗体を誘導できることが確認された。【００６８】
〔実施例６〕HCVの構造、非構造領域を発現する組換えDIsを投与されたマウスでの細胞性免疫誘導能
5週令のBalb/cマウスに106pfuのHCVの構造、非構造領域を発現する組換えDIsを投与し、細胞性免疫を誘導するかどうか確認した。同量のウイルスを、初回投与から２週後と６週後の合計３回投与し、７週目に脾臓を摘出し、脾細胞を分離した。細胞のペレットにlysis buffer (重炭酸カリウム1.0mM、塩化アンモニウム0.15M、EDTA-2Na 0.1mM)３mlを加え、マイルドに混和して溶血させた。5x10-5Mの２−メルカプトエタノールを含むRPMI1640培地で洗浄し、5x10-5Mの２−メルカプトエタノール、1ng/mlのPMA、500ng/mlのイオノマイシン、10％FCSを含むRPMI1640に懸濁し、生細胞数を測定して5x104/mlに濃度を調整した。抗インターフェロン−γ抗体をコートした96well plateで一晩培養した後、細胞液を捨て、インターフェロン−γを分泌する細胞数をDIACLONE社のELISPOTキットを用いて測定した（図５）。その結果、組換えDIs投与により目的蛋白に対する細胞性免疫を誘導できること、誘導能は構造領域よりも非構造領域であるNS5Aを発現する組換えDIsの方が強いことが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
ワクチニアウイルスには、強い免疫誘導能という利点と、神経病原性という欠点が共存していたが、DIs株の病原性は親株のワクチニアウイルスと比べ非常に低い。また、DIs株が弱毒化されている理由は、15kbp以上にも及ぶ大きなゲノムの欠損であるため、ウイルス培養中あるいはワクチンとして接種後に欠損を回復し毒性が復帰した株が出現する可能性はまず考えられない。
また本発明の組換えワクチニアウイルスDIs株は、強い免疫誘導能を有し、HCVウイルスタンパク質に対する強いCTL応答を誘導することができ、組換えワクチンとして非常に有用である。
【図１】
2006013815.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2006013815.tif 000008
2006013815.tif 000009
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