(57)【要約】本発明は、生体外での非接着性成体幹細胞の効率的増幅方法を提供する。より詳細には、本発明は、非接着性成体幹細胞を無血清培地において接着性フィーダー細胞及び非接着性非幹細胞の共存下で培養することを含み、且つ培地中の総細胞数に占める非接着性成体幹細胞数の割合が低く抑えられている、非接着性成体幹細胞の増幅方法；当該増幅方法により得られる、非接着性成体幹細胞およびその分化細胞、並びにそれらを含む組成物；並びに所定の因子を含有する無血清培地、およびその作製用キットなどを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
無血清培地において、非接着性成体幹細胞を接着性フィーダー細胞および非接着性非幹細胞の共存下で培養することを含み、且つ培地中の総非接着性細胞数に占める非接着性成体幹細胞数の割合が４０％以下である、非接着性成体幹細胞の増幅方法。
【請求項２】
非接着性成体幹細胞、接着性フィーダー細胞および非接着性非幹細胞を含む生体試料を、細胞表面マーカーを利用して細胞分画処理することなく無血清培地に供した後、無血清培地において非接着性成体幹細胞を接着性フィーダー細胞および非接着性非幹細胞の共存下で培養することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
培養開始前に、総非接着性細胞数に占める非接着性成体幹細胞数の割合を調節することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
非接着性成体幹細胞の増幅を確認すること、あるいは増幅された非接着性成体幹細胞を単離することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
培地中の総非接着性細胞数に占める非接着性成体幹細胞数の割合が２０％以下である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
非接着性成体幹細胞がＣＤ３４および／またはＣＤ１３３陽性細胞を含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
非接着性成体幹細胞が単核球である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
接着性フィーダー細胞が単核球である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
非接着性成体幹細胞および／または接着性フィーダー細胞が、骨髄、臍帯血又は末梢血由来である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
非接着性成体幹細胞および接着性フィーダー細胞が同種動物に由来する、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
該生体試料が、骨髄液、臍帯血又は末梢血からなる群より選ばれる、請求項２記載の方法。
【請求項１２】
該生体試料がヒト由来である、請求項２記載の方法。
【請求項１３】
無血清培地がインターロイキン３および脂肪酸を含有する、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
非接着性成体幹細胞の培養により増幅された非接着性成体幹細胞を分化させ、分化細胞を得ることをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
分化細胞が、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、リンパ管内皮細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、神経系細胞、血液系細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞および上皮細胞からなる群より選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
請求項１記載の方法により得られる、非接着性成体幹細胞。
【請求項１７】
非接着性成体幹細胞を含み、且つ該非接着性成体幹細胞の由来する動物に対して異種の動物由来の生体成分を実質的に含有しない、組成物。
【請求項１８】
請求項１４記載の方法により得られる、非接着性成体幹細胞の分化細胞。
【請求項１９】
インターロイキン３および脂肪酸を含有する無血清培地。
【請求項２０】
インターロイキン３、脂肪酸および無血清培地（インターロイキン３および脂肪酸の一方または双方が無血清培地中に添加されていない）を含む、インターロイキン３および脂肪酸を含有する無血清培地の作製用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成体幹細胞を生体外で増幅する方法に関する。より詳細には無血清培養条件下で成体幹細胞を数百倍以上増幅する方法、該方法により調製される各種細胞などに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、Ｂｕｅｒｇｅｒ病、慢性閉塞性動脈硬化症等により下肢虚血の症状を示す患者は潜在患者を含め年間約１０万人、年間約２０万人といわれる心筋梗塞を含む虚血性心疾患の罹患者は約１１０万人にのぼる。これらの疾患には細胞移植療法、遺伝子治療、Ｇ−ＣＳＦ療法、バイパス手術やＰＴＣＡ療法が施されている。
虚血性心疾患を対象として行われる細胞移植療法としては、骨髄単核球移植療法や末梢血幹細胞採取による血管内皮前駆細胞（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ；以下、ＥＰＣとも略する）を用いた血管新生療法が知られている。しかしながら、末梢血幹細胞を用いた場合にはアフェレーシス等を行う目的で計算上約１０Ｌ以上の末梢血が必要になり患者負担が大きい。さらに骨髄単核球移植療法においては、全身麻酔下で骨髄液を５００ｍＬ以上採取する必要があるため、同様に患者負担が大きく、繰り返し治療を行うことが困難であった。
このような理由から患者に負担をかけることなく細胞移植に用いることのできる幹細胞をより大量に入手し得る生体外での細胞培養方法が求められてきた。例えば血清を用いた培養方法による造血幹細胞の体外培養法では約４倍（Ｕｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｖｏｌ．１０５，Ｎｏ．７，ｐｐ．１０１３−１０２１（２０００））、フィーダー細胞としてマウスの細胞を用いた造血幹細胞の体外培養法では約１０倍（Ｋａｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．２７，ｐｐ．９０４−９１５（１９９９））と、それぞれ細胞を増幅させることができたが、臨床上十分なものとはいえないものであった。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、効率の良い非接着性成体幹細胞の生体外増幅方法の提供を目的とし、さらに当該培養方法によって得られた幹細胞から分化誘導することによって得られる種々の細胞などの提供を目的とする。
本発明者らは、上記課題に鑑み、生体外において非接着性成体幹細胞が増幅可能な、しかも従来にない高い増幅効率が得られる培養条件を検討した。その結果、予想外なことに、所定の因子等を添加した無血清培地において接着性フィーダー細胞の共存下で非接着性成体幹細胞を培養するに際し、非接着性成体幹細胞の割合を低く抑えることにより、著しくその増幅効率が向上すること等を見出し、さらに所定の因子等を添加することにより増幅細胞を所望の細胞へと分化誘導できることを確認して本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は下記の通りである：
〔１〕無血清培地において、非接着性成体幹細胞を接着性フィーダー細胞および非接着性非幹細胞の共存下で培養することを含み、且つ培地中の総非接着性細胞数に占める非接着性成体幹細胞数の割合が４０％以下である、非接着性成体幹細胞の増幅方法；
〔２〕非接着性成体幹細胞、接着性フィーダー細胞および非接着性非幹細胞を含む生体試料を、細胞表面マーカーを利用して細胞分画処理することなく無血清培地に供した後、無血清培地において非接着性成体幹細胞を接着性フィーダー細胞および非接着性非幹細胞の共存下で培養することを含む、上記〔１〕の方法；
〔３〕培養開始前に、総非接着性細胞数に占める非接着性成体幹細胞の割合を調節することをさらに含む、上記〔１〕の方法；
〔４〕非接着性成体幹細胞の増幅を確認すること、あるいは増幅された非接着性成体幹細胞を単離することをさらに含む、上記〔１〕の方法；
〔５〕培養開始時の培地中の総非接着性細胞数に占める非接着性成体幹細胞数の割合が２０％以下である、上記〔１〕の方法；
〔６〕非接着性成体幹細胞がＣＤ３４および／またはＣＤ１３３陽性細胞を含む、上記〔１〕の方法；
〔７〕非接着性成体幹細胞が単核球である、上記〔１〕の方法；
〔８〕接着性フィーダー細胞が単核球である、上記〔１〕の方法；
〔９〕非接着性成体幹細胞および／または接着性フィーダー細胞が、骨髄、臍帯血又は末梢血由来である、上記〔１〕の方法；
〔１０〕非接着性成体幹細胞および接着性フィーダー細胞が同種動物に由来する、上記〔１〕の方法；
〔１１〕該生体試料が、骨髄液、臍帯血又は末梢血からなる群より選ばれる、上記〔２〕の方法；
〔１２〕該生体試料がヒト由来である、上記〔２〕の方法；
〔１３〕無血清培地がインターロイキン３および脂肪酸を含有する、上記〔１〕の方法；
〔１４〕非接着性成体幹細胞の培養により増幅された非接着性成体幹細胞を分化させ、分化細胞を得ることをさらに含む、上記〔１〕の方法；
〔１５〕分化細胞が、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、リンパ管内皮細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、神経系細胞、血液系細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞および上皮細胞からなる群より選択される、上記〔１４〕の方法；
〔１６〕細胞当たりの培地量が、０．２ｍｌ／１．０×１０５細胞以上である、上記〔１〕の方法；
〔１７〕培地の３／１０容量中に７０％以上の細胞が密集するように培養が行われる、上記〔１〕又は〔１６〕の方法；
〔１８〕上記〔１〕の方法により得られる、非接着性成体幹細胞；
〔１９〕非接着性成体幹細胞を含み、且つ該非接着性成体幹細胞の由来する動物に対して異種の動物由来の生体成分を実質的に含有しない、組成物；
〔２０〕上記〔１４〕の方法により得られる、非接着性成体幹細胞の分化細胞；
〔２１〕インターロイキン３および脂肪酸を含有する無血清培地；
〔２２〕インターロイキン３、脂肪酸および無血清培地（インターロイキン３および脂肪酸の一方または双方が無血清培地中に添加されていない）を含む、インターロイキン３および脂肪酸を含有する無血清培地の作製用キット。
本発明の方法により、体外で少なくとも５００倍に非接着性成体幹細胞を増幅することが可能となり、得られる増幅細胞は、インビボ及びインビトロで種々の細胞へと分化誘導され得る。さらに得られた増幅細胞は虚血モデルと筋肉傷害モデルにおいて血流改善に有効であった。すなわち、成体幹細胞を大量に得ることができる本発明の方法により、潜在患者を含めて約１０万人といわれる下肢虚血患者や約１１０万人といわれる虚血性心疾患患者に対してより患者への負担が少ない治療方法を提供することが可能となる。また、全身麻酔下で５００ｍｌ以上の骨髄液を採取する既存法に対して、本発明の方法によれば、局所麻酔下で骨髄液１ｍｌ程度を採取すればよいことから、患者の負担を著しく軽減できる。さらには、増幅後の細胞は凍結保存できることから、繰り返しの治療、１ロットの複数患者への提供等も可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００４】
本発明は、非接着性（即ち、浮遊性）成体幹細胞の増幅方法を提供する。本発明の増幅方法は、無血清培地において、非接着性成体幹細胞を接着性フィーダー細胞および非接着性非幹細胞の共存下で培養することを含む。
本明細書で用いられる「非接着性成体幹細胞」とは、哺乳動物等の動物体内から取り出される体液中に懸濁している未分化細胞であり、特定の細胞系譜への分化が決定付けられている細胞及び特定の細胞系譜への分化が決定付けられていない細胞の両方を含む。非接着性成体幹細胞が由来する動物種としては、鳥類、哺乳動物等が挙げられるが、哺乳動物が好ましい。哺乳動物としては、例えば、ラット、マウス、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、サル、ヒトが挙げられる。非接着性成体幹細胞の一例は、単核球である。非接着性成体幹細胞の別の例は、多能性幹細胞、中胚葉系幹細胞、血管・造血幹細胞、造血幹細胞、血管幹細胞、血管内皮前駆細胞、血管内皮様前駆細胞、単球である。非接着性成体幹細胞のさらに別の例は、ＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＣＤ９０（Ｔｈｙ−１）およびＡＢＣＧ−２からなる群より選ばれる１以上の細胞表面マーカーに対して陽性の細胞である。
非接着性成体幹細胞はまた、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の細胞であり得る。非接着性成体幹細胞として末梢血由来の細胞を用いる場合、非接着性成体幹細胞を動員可能な物質により動員された末梢血から非接着性成体幹細胞を調製できる。非接着性成体幹細胞を動員可能な物質としては、例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＤＦ−１、エストロゲン、ＶＥＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、アンジオポイエチン１及び２、ＨＧＦ、スタチン類（ｓｔａｔｉｎｓ）、エリスロポエチンが挙げられる。
本明細書で用いられる「接着性フィーダー細胞」とは、本発明の増幅方法で用いられる、非接着性成体幹細胞の増幅を補助する何らかの因子又はリガンド（例えば、Ｎｏｔｃｈリガンド、Ｅｐｈ、Ｅｐｈｒｉｎ等）を分泌又は提示する接着細胞をいう。接着性フィーダー細胞が由来する動物種としては、非接着性成体幹細胞が由来する動物種と同様のものが挙げられる。接着性フィーダー細胞の一例は、単核球である。接着性フィーダー細胞の別の例は、ストローマ細胞、血管内皮様細胞、血管平滑筋様細胞、間葉系細胞、骨髄球、単球、マクロファージ（あるいはそれらに由来する細胞）である。接着性フィーダー細胞のさらに別の例は、ＣＤ４５、Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ−１、Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ−３、Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ−４、Ｊａｇｇｅｄ−１、Ｊａｇｇｅｄ−２、Ｅｐｈ、Ｅｐｈｒｉｎからなる群より選ばれる１以上の細胞表面マーカーに対して陽性の細胞である。接着性フィーダー細胞はまた、ＣＤ４５に対して陰性の細胞であり得る。
接着性フィーダー細胞はまた、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の細胞であり得る。接着性フィーダー細胞として末梢血由来の細胞を用いる場合、接着性フィーダー細胞を動員可能な物質により動員された末梢血から接着性フィーダー細胞を調製できる。接着性フィーダー細胞を動員可能な物質としては、非接着性成体幹細胞を動員可能な物質と同様のものが挙げられる。
本明細書で用いられる「非接着性非幹細胞」とは、本発明の増幅方法で用いられる、非接着性成体幹細胞の増幅を補助する何らかの因子又はリガンド（例えば、ｇｐ１３０（ＣＤ１３０）、Ｄｅｌｔａ−Ｌｉｋｅ−１、Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ−３、Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ−４、Ｊａｇｇｅｄ−１、Ｊａｇｇｅｄ−２、ＳＣＦ、Ｅｐｈ、Ｅｐｈｒｉｎ）を分泌又は提示する非接着細胞をいう。非接着性非幹細胞が由来する動物種としては、非接着性成体幹細胞が由来する動物種と同様のものが挙げられる。非接着性非幹細胞の一例は、単核球である。非接着性非幹細胞の別の例は、骨髄球、単球、マクロファージ、樹状細胞（あるいはそれらに由来する細胞）である。非接着性非幹細胞のさらに別の例は、ＣＤ４５、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＤＲからなる群より選ばれる１以上の細胞表面マーカーに対して陽性の細胞である。非接着性非幹細胞はまた、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＡＢＣＧ−２、ＣＤ３１、ＣＤ１４、ＣＤ９０からなる群より選ばれる１以上の細胞表面マーカーに対して陰性の細胞であり得る。
非接着性非幹細胞はまた、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の細胞であり得る。非接着性非幹細胞として末梢血由来の細胞を用いる場合、非接着性非幹細胞を動員可能な物質により動員された末梢血から非接着性非幹細胞を調製できる。非接着性非幹細胞を動員可能な物質としては、非接着性成体幹細胞を動員可能な物質と同様のものが挙げられる。
本発明の増幅方法は、培養開始時の培地中の総細胞数（非接着性成体幹細胞、接着性フィーダー細胞、非接着性非幹細胞を含む）に占める非接着性成体幹細胞数の割合が低く抑えられていることを特徴の一つとする。従来の培養方法では、培地中の総細胞数に占める幹細胞数の割合が５０％以上であった。しかしながら、この培養方法では、総細胞数は増加するが、幹細胞陽性率が低下するため、幹細胞自体を効率良く増幅することができなかった。一方、本発明者らは、培地中の総細胞数に占める幹細胞数の割合を低く抑え、培地における幹細胞以外の細胞（非接着性細胞、接着細胞の両細胞を含む）の割合を相対的に高めることで、幹細胞を効率良く増幅することに成功した。培地中の総細胞数に占める幹細胞数の割合は、幹細胞を効率良く増幅できる限り特に限定されないが、例えば４０％未満、好ましくは３０％以下、より好ましくは２０％以下、さらにより好ましくは１０％以下、最も好ましくは５％以下又は３％以下であり得る。また、非接着成体幹細胞としてＣＤ３４＋細胞及び／又はＣＤ１３３＋細胞を用いる場合、培地中の総細胞数に占めるＣＤ３４＋細胞数及び／又はＣＤ１３３＋細胞数の割合はそれぞれ、例えば４０％未満、好ましくは３０％以下、より好ましくは２０％以下、さらにより好ましくは１５％以下、最も好ましくは１０％以下、８％以下又は５％以下であり得る。培養開始時の培地中の総細胞数に占める非接着性成体幹細胞数の割合は、例えば、非接着性成体幹細胞の細胞表面マーカーを利用して非接着性成体幹細胞数を測定し、次いで総細胞数で除算することにより算出できる。
効率良い増幅を可能とするような非接着性成体幹細胞数の割合はまた、総非接着性細胞数に対して規定できる。培地中の総非接性着性細胞数に占める幹細胞数の割合は、幹細胞を効率良く増幅できる限り特に限定されないが、例えば５０％未満、好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下、さらにより好ましくは２０％以下、最も好ましくは１０％以下又は５％以下であり得る。また、非接着性成体幹細胞としてＣＤ３４＋細胞及び／又はＣＤ１３３＋細胞を用いる場合、培地中の総非接着性細胞数に占めるＣＤ３４＋細胞数及び／又はＣＤ１３３＋細胞数の割合はそれぞれ、例えば５０％未満、好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下、さらにより好ましくは２０％以下、最も好ましくは１０％以下、５％以下又は３％以下であり得る。培地中の総非接着性細胞数に占める非接着性成体幹細胞数の割合は、例えば、培養開始時から細胞接着に十分な時間（例えば１又は２週間）が経過した後、培養液の一部を採取し、その培養液中に含まれる非接着性成体幹細胞数をその細胞表面マーカーを利用して測定し、次いでその培養液の一部中に含まれる総細胞数で除算することにより算出できる。なお、本発明の増幅方法によれば、培地中の総非接着性細胞数に占める非接着性成体幹細胞数の割合は、培養期間中を通じてほぼ一定であるということが判明している。
本発明の増幅方法はまた、動物から採取された生体試料（非接着性成体幹細胞、接着性フィーダー細胞、非接着性非幹細胞を含む）を、細胞表面マーカーを利用して細胞分画処理することなく無血清培地に供した後、無血清培地において非接着性成体幹細胞を接着性フィーダー細胞および非接着性非幹細胞の共存下で培養することを含む。従来、骨髄単核球等の非接着性成体幹細胞を培養する場合には、該幹細胞を含む生体試料を動物から採取し、この生体試料からの該幹細胞の分画後、それを培地に供して培養を行っていた。このような煩雑な手法を採用していた理由は、従来、幹細胞自体の研究、幹細胞単独の増幅研究に焦点が絞られており、純化することにより詳細な解析が容易であったためである。即ち、幹細胞の純化後、幹細胞マーカーの同定、並びに幹細胞の性質、増幅能、可能な応用等を研究することが世界的標準の常法であったという経緯があった。しかしながら、本発明者らは、骨髄液、臍帯血、末梢血等の生体試料中には非接着性成体幹細胞、接着性フィーダー細胞および非接着性非幹細胞が、非接着性成体幹細胞の効率的増幅に適した比率（即ち、従来法に比し、培地中の総細胞数に占める非接着性成体幹細胞の割合が低く抑えられた状態）で存在すること、従って、動物から採取された生体試料を、細胞表面マーカーを利用して細胞分画処理することなく無血清培地に供し、培養を行うことにより、非接着性成体幹細胞をより効率的に増幅できることを見出した。細胞表面マーカーを利用する事前の細胞分画処理（例えば、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ）、ＭＡＣＳ（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ））を要しないという点より従来法に比し操作が簡便になったにもかかわらず、従来法に比し非接着性成体幹細胞をより効率的に増幅可能となったことからも明らかであるように、本発明の増幅方法は、非常に簡便且つ実用性の高いものである。動物から採取された生体試料は、無血清培地に直接（即ち、処理することなく）供されてもよく、また、所定の処理後に供されてもよい。動物から採取された生体試料を無血清培地に供する前に処理する場合の操作としては、例えば、比重遠心分離法（例えばヒストパック、フィコール等を使用）等の遠心分離法、溶血法（例えばＮＨ４Ｃｌ、低張液等を使用）などの簡便な操作が挙げられる。また、動物から採取された生体試料を無血清培地に供する際、培地に播種される細胞数は、非接着性成体幹細胞の増幅に適切な細胞密度となる限り特に限定されないが、培地における総細胞数（即ち、非接着性成体幹細胞、接着性フィーダー細胞及び非接着性非幹細胞を含む細胞数）が例えば約０．５×１０５〜１０×１０５細胞／ｍｌ、好ましくは約１×１０５〜５×１０５細胞／ｍｌとなるように、細胞が培地に播種される。
動物から採取された生体試料を細胞分画処理することなく無血清培地に供し、培養する場合、細胞移植が意図される個体由来の試料を生体試料として用いることで、同種同系移植に好適な細胞を得ることも可能である。従って、本発明の増幅方法により得られる増幅細胞又はその分化細胞は、細胞移植に際し感染リスク・拒絶反応を回避できるという利点を有する。
本発明の増幅方法はさらに、培養開始前に、総細胞数または総非接着性細胞数に占める非接着性成体幹細胞の割合を調節することを含むことができる。本発明者らは、培地中の総細胞数（又は総非接着性細胞数）に占める非接着性成体幹細胞数の割合が、該幹細胞の増幅効率に非常に重要であることを見出した。従って、非接着性成体幹細胞の割合の調節に際しては、該幹細胞の割合を低くすることが好ましい。達成すべき割合は、例えば非接着性成体幹細胞の効率良い増幅を可能とするような上述の割合であり得る。
非接着性成体幹細胞の割合の調節は、自体公知の方法により行うことできる。例えば、調節は、非接着性成体幹細胞および非幹細胞（接着性フィーダー細胞、非接着性非幹細胞）の単離／精製（分画と同義）後、それらを適切な比率で無血清培地に供し、該非接着性成体幹細胞および該接着性フィーダー細胞を培養することにより行うことができる。細胞の単離／精製は、細胞表面マーカーを利用する自体公知の方法、例えばＦＡＣＳ、ＭＡＣＳにより行われ得る。また、非接着性成体幹細胞、接着性フィーダー細胞、非接着性非幹細胞を別々に単離／精製した場合、非接着性成体幹細胞、接着性フィーダー細胞、非接着性非幹細胞から選ばれる任意の細胞（例えば、非接着性成体幹細胞）を特定の処理（例えばマーキング処理）に付してもよい。
細胞表面マーカーを利用する方法では、細胞表面マーカーに特異的な親和性を有する物質が使用される。このような物質としては、例えばこれらの蛋白質に特異的親和性を有する抗体又はその断片が挙げられ、その特異的親和性とは抗原・抗体反応により該蛋白質を特異的に認識し、結合する能力のことである。該抗体又はその断片は、当該蛋白質と特異的に結合可能なものであれば特に限定されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びそれらの機能的断片のいずれであってもよい。これらの抗体あるいはその機能的断片は、通常当分野で行なわれている方法によって製せられる。例えばポリクローナル抗体を用いる場合であれば、該蛋白質をマウスやウサギといった動物の背部皮下あるいは腹腔内あるいは静脈等に注射して免疫し、抗体価が上昇するのを待った後に抗血清を採取する方法が挙げられ、またモノクローナル抗体を用いる場合であれば、常法に従いハイブリドーマを作製して、その分泌液を採取する方法が挙げられる。抗体断片を製造する方法としてはクローニングした抗体遺伝子断片を微生物等に発現させる方法がよく用いられている。当該抗体、抗体断片等の純度は、当該蛋白質との特異的親和性を保持している限り、特に限定されない。これらの抗体又はその断片は、蛍光物質、酵素やラジオアイソトープ等で標識されていてもよい。
非接着性成体幹細胞の割合を調節する場合、培養に用いられる非接着性成体幹細胞、接着性フィーダー細胞および非接着性非幹細胞は、同種動物に由来するものであり得る。また、非接着性成体幹細胞、接着性フィーダー細胞および非接着性非幹細胞として細胞移植が意図される個体由来の細胞を用いることで、同種同系移植に好適な細胞を得ることも可能である。従って、本発明の増幅方法により得られる増幅細胞又はその分化細胞は、細胞移植に際し感染リスク・拒絶反応を回避できるという利点を有する。
本発明の増幅方法はまた、非接着性成体幹細胞の増幅に際して、組成が明暸な、即ち、化学的に規定された無血清培地を用いることを別の特徴とする。従って、本発明の増幅方法は、品質管理及びバリデーションに優れ、臨床応用及び産業化を可能にする、又はそれらに好ましいという利点を有する。以下、本発明の増幅方法で用いられる無血清培地について詳述する。
本発明の無血清培地に用いられる基礎培地としては、当分野で通常用いられている培地を利用することができ、例えば造血幹細胞の増殖用培地として知られている無血清培地を用いることができる。無血清培地として用いられる基礎培地としては、例えば、ＤＭＥＭ、α−ＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ１６４０等が挙げられるが、ＩＭＤＭが好ましい。
本発明の無血清培地は、例えば、インターロイキン３及び／又は脂肪酸を含有し得る。
インターロイキン３（ＩＬ−３）は、造血幹細胞や各種血球系列の前駆細胞に作用し、その増殖、分化を促進するサイトカインとして知られている。本発明で用いるＩＬ−３は適宜選択されるが、ヒト非接着性成体幹細胞を増幅する場合には、ヒトＩＬ−３が好ましい。また、品質管理及びバリデーションの観点から、組換え体が好ましい。無血清培地中のＩＬ−３の濃度は、用いるＩＬ−３の種類によっても異なり、非接着性成体幹細胞を効率的に増幅できる限り特に限定されないが、ヒト組換えＩＬ−３を用いる場合であれば、約５〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１０〜２００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
脂肪酸としては、飽和又は不飽和脂肪酸、又はそれらの混合物を使用できる。脂肪酸は、非接着性成体幹細胞の培養で用いられる従来の培地に欠けていた栄養因子である。本発明者らは、非接着性成体幹細胞を多能性及び自己複製能を維持しつつ体外で長期にわたり増幅するのにこの因子が重要であることを見出した。このような脂肪酸としては、例えば、アラキドン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸が挙げられる。無血清培地中の脂肪酸の濃度は、用いる脂肪酸の種類によっても異なり、非接着性成体幹細胞を効率的に増幅できる限り特に限定されないが、例えば約１〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約５〜５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１０〜２００ｎｇ／ｍｌである。
本発明の無血清培地はまた、Ｆｌｋ２／Ｆｌｔ３リガンド、幹細胞因子、トロンボポイエチン、インターロイキン６、インシュリン、トランスフェリンおよびアルブミンからなる群より選ばれる１又は２以上の因子、好ましくは３以上の因子、より好ましくは４以上の因子、さらにより好ましくは５以上の因子、最も好ましくは６以上又は全ての因子を含有し得る。
Ｆｌｋ２／Ｆｌｔ３リガンド（ＦＬ）は、造血幹細胞の発達に重要であるシグナルを伝達することが知られているチロシンキナーゼ受容体Ｆｌｋ２／Ｆｌｔ３に対するリガンドである。本発明で用いるＦＬは適宜選択されるが、ヒト非接着性成体幹細胞を増幅する場合には、ヒトＦＬが好ましい。また、品質管理及びバリデーションの観点から、組換え体が好ましい。無血清培地中のＦＬの濃度は、用いるＦＬの種類によっても異なり、非接着性成体幹細胞をより効率的に増幅できる限り特に限定されないが、ヒト組換えＦＬを用いる場合であれば、例えば約５〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１０〜２００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
本発明で用いられる幹細胞因子（ＳＣＦ）は、２４８個のアミノ酸からなる分子量約３０，０００の糖タンパク質である。選択的スプライシングにより可溶型と膜結合型が存在するが、好ましくは可溶型である。本発明で用いるＳＣＦは適宜選択されるが、ヒト非接着性成体幹細胞を増幅する場合には、ヒトＳＣＦが好ましい。また、品質管理及びバリデーションの観点から、組換え体が好ましい。無血清培地中のＳＣＦの濃度は、用いるＳＣＦの種類によっても異なり、非接着性成体幹細胞をより効率的に増幅できる限り特に限定されないが、ヒト組換えＳＣＦを用いる場合であれば、例えば約５〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１０〜２００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
本発明で用いられるトロンボポエチン（ＴＰＯ）は、造血系サイトカインの一種であり、造血幹細胞から巨核球が作られる過程に特異的に作用し、巨核球の産生を促進することが知られている。本発明で用いるＴＰＯは適宜選択されるが、ヒト非接着性成体幹細胞を増幅する場合には、ヒトＴＰＯが好ましい。また、品質管理及びバリデーションの観点から、組換え体が好ましい。無血清培地中のＴＰＯの濃度は、用いるＴＰＯの種類によっても異なり、非接着性成体幹細胞をより効率的に増幅できる限り特に限定されないが、ヒト組換えＴＰＯを用いる場合であれば、例えば約５〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１０〜２００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
本発明で用いられるインターロイキン６（ＩＬ−６）は、Ｂ細胞の抗体産生細胞への最終分化を誘導する因子として単離された分子量２１万の糖タンパク質であり、免疫応答、造血系や神経系細胞の増殖分化、急性期反応等に関与することが知られている。本発明で用いるＩＬ−６は適宜選択されるが、ヒト非接着性成体幹細胞を増幅する場合には、ヒトＩＬ−６が好ましい。また、品質管理及びバリデーションの観点から、組換え体が好ましい。無血清培地中のＩＬ−６の濃度は、用いるＩＬ−６の種類によっても異なり、非接着性成体幹細胞をより効率的に増幅できる限り特に限定されないが、ヒト組換えＩＬ−６を用いる場合であれば、例えば約５〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１０〜２００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
本発明で用いられるインシュリンは適宜選択されるが、ヒト非接着性成体幹細胞を増幅する場合には、ヒトインシュリンが好ましい。また、品質管理及びバリデーションの観点から、組換え体が好ましい。無血清培地中のインシュリンの濃度は、用いるインシュリンの種類によっても異なり、非接着性成体幹細胞をより効率的に増幅できる限り特に限定されないが、ヒト組換えインシュリンを用いる場合であれば、例えば約０．５〜１００μｇ／ｍＬ、好ましくは約２〜５０μｇ／ｍＬ、より好ましくは約１０μｇ／ｍＬである。
本発明で用いられるトランスフェリンは適宜選択されるが、ヒト非接着性成体幹細胞を増幅する場合には、ヒトトランスフェリンが好ましい。また、品質管理及びバリデーションの観点から、組換え体が好ましい。無血清培地中のトランスフェリンの濃度は、用いるトランスフェリンの種類によっても異なり、非接着性成体幹細胞をより効率的に増幅できる限り特に限定されないが、ヒト組換えトランスフェリンを用いる場合であれば、例えば約５〜５０００μｇ／ｍＬ、好ましくは約５０〜１０００μｇ／ｍＬ、より好ましくは約２００μｇ／ｍＬである。
本発明で用いられるアルブミンは、任意のアルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン、ヒトアルブミン）から適宜選択されるが、ヒト非接着性成体幹細胞を増幅する場合には、ヒトアルブミンが好ましい。また、品質管理及びバリデーションの観点から、組換え体が好ましい。無血清培地中のアルブミンの濃度は、用いるアルブミンの種類によっても異なり、非接着性成体幹細胞をより効率的に増幅できる限り特に限定されないが、ヒト組換えアルブミンを用いる場合であれば、例えば約０．５〜１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約２〜５０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約１０ｍｇ／ｍＬである。
本発明で用いられる無血清培地に添加される因子は、その由来する動物種を、非接着性成体幹細胞及び／又は接着性フィーダー細胞の由来する動物種に統一するのが好ましい。動物種の由来を統一することで、増幅細胞又はその分化細胞の移植に際し拒絶反応を回避できるという利点を有する。
本発明の無血清培地はさらに、アミノ酸、ビタミン（例えば、ビタミンＥ）、脂質（例えば、上記脂肪酸以外ではコレステロール）、抗生物質、緩衝剤、界面活性剤（例えば、ＰＬＵＲＯＮＩＣ、ＴＷＥＥＮ）等の成分を補充してもよい。培地のｐＨは、例えば約６〜８、好ましくは約６．５〜７．５である。培養温度は、例えば約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。
上記した各成分は無血清培地で所定の濃度に溶解するか、あるいはあらかじめ各成分の濃縮液（ストック溶液）を調製し、無血清培地で所定の濃度に希釈することによって本発明の無血清培地を調製することができる。例えば市販の無血清培地に必要な成分を所定の濃度となるよう溶解した後、濾過滅菌等により滅菌するか、あるいは濾過滅菌等により滅菌したストック溶液を無菌的に市販の無血清培地に添加、希釈することによって本発明の無血清培を調製することができる。濾過滅菌は当分野で通常実施されている方法に準じて行うことができ、例えば０．２２μｍや０．４５μｍのミリポアフィルター等を用いて行う。
本発明の増幅方法で用いられる培養器は特に限定されるものではないが、接着性フィーダー細胞の効率的な接着という観点から、細胞接着性培養器が好ましい。例えば、細胞外マトリックス等（例えば、ポリＤリジン、ラミニン、フィブロネクチン）の細胞接着を補助する物質によりコーティング処理された培養器を使用してもよい。培養器としてはまた、フラスコ、ディッシュ、プレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ボトルなどが使用できる。
本発明の培養方法によれば、非接着性成体幹細胞をさらに効率的に増幅させるために、細胞が密集するように設定すること、並びに／あるいは細胞当たりの培地を十分な量とすることもまた好ましい。細胞の密集が好ましい理由は、非接着性成体幹細胞のさらに効率的な増幅には細胞間接触が重要なためであり、細胞当たりの培地を十分な量とすることが好ましい理由は、培地の成分や添加因子等が不足しないようにするため、並びに細胞からの分泌因子の濃度が必要以上に高くならないようにするためである。かかる細胞の密集の程度は、非接着性成体幹細胞のさらに効率的な増幅を可能とする限り特に限定されないが、培地の低容量、例えば３／１０容量、好ましくは２．５／１０容量、より好ましくは２／１０容量、さらにより好ましくは１．５／１０容量、最も好ましくは１／１０容量中に、培地に播種された多数の細胞、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の細胞が密集するように培養され得る。細胞当たりの培地量もまた、非接着性成体幹細胞のさらに効率的な増幅を可能とする限り特に限定されないが、例えば約０．１ｍｌ／１．０×１０５細胞以上、好ましくは約０．３ｍｌ／１．０×１０５細胞以上、より好ましくは約０．５ｍｌ／１．０×１０５細胞以上、さらにより好ましくは約１ｍｌ／１．０×１０５細胞以上、最も好ましくは約２ｍｌ／１．０×１０５細胞以上となるような培地量が好ましい。６ウェルプレート（１ウェル直径３５ｍｍ）では、ウェルの中心に細胞が自ずと密集するのでかかる条件の達成は非常に容易である。しかしながら、当業者であれば、他の培養器でも同様の条件を適宜設定できるので、他の培養器も好ましく使用できる。また、他の培養器の場合、培地中の成分、因子が通過可能であり、且つ細胞が通過不能である膜（例えば、孔径（ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ）が約０．１〜１μｍ、好ましくは約０．４μｍである）を使用することで、より容易にかかる条件を達成できる。このような膜としては、例えば、カルチャーインサートが挙げられる。
培養期間は、十分な量の非接着性成体幹細胞が増幅されるように適宜調製され得る。非接着性成体幹細胞の種類などによっても異なるが、細胞数についていえば、２週間後には約２０倍、４週間後には約１００倍、６週間後には約５００倍の増幅が見込まれる。また、本発明の培養方法によれば、培養期間を延長等することで、非接着性成体幹細胞が約１億倍に増幅されることが確認されている。
本発明の増幅方法は、非接着性成体幹細胞の増幅（例えば、増幅率）を確認することをさらに含むことができる。増幅の確認は、所定の細胞表面マーカーを有する細胞数を増幅前後で比較することにより行われ得る。所定の細胞表面マーカーを有する細胞数の測定は、ＦＡＣＳ等の自体公知の方法により行われ得る。
本発明の増幅方法はまた、増幅された非接着性成体幹細胞を単離／精製することをさらに含むことができる。増幅細胞の単離／精製は、自体公知の方法、例えば細胞表面マーカーを利用する細胞選別方法（例えば、上述の方法を参照）により行われ得る。
本発明の増幅方法はさらに、増幅された非接着性成体幹細胞を分化させ、分化細胞を得る（必要に応じてさらに単離／精製する）ことをさらに含むことができる。本発明の増幅方法により増幅された非接着性成体幹細胞は、多能性及び自己複製能を有しているので、種々の細胞に分化させることができる。本発明の増幅方法により増幅された非接着性成体幹細胞が分化可能な細胞は特に限定されるものではないが、例えば、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、リンパ管内皮細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、神経系細胞、血液系細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、上皮細胞（例えば、腸管上皮細胞、皮膚上皮細胞）が挙げられる。これらの細胞は、例えば、インビトロにおいて種々の誘導因子を用いて分化を誘導するのに適した条件下で培養することにより、あるいはインビボにおいて得ることができる。このような方法は公知であるが、例えば、血管内皮細胞を得るための誘導因子としては、例えばＶＥＧＦ−Ａ、ＦＧＦ、ＨＧＦが挙げられ、血管平滑筋細胞を得るための誘導因子としては、例えばＰＤＧＦが挙げられ、リンパ管内皮細胞を得るための誘導因子としては、例えばＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄが挙げられ、骨格筋細胞を得るための誘導因子としては、例えばＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩが挙げられ、心筋細胞を得るための方法としては、例えば心筋細胞との共培養が挙げられ、神経系細胞を得るための誘導因子としては、例えばＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５が挙げられ、造血幹細胞を得るための誘導因子としては、例えばＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬ、ＩＬ−３、ＩＬ−６が挙げられ、肝細胞を得るための誘導因子としては、例えばＨＧＦ、ＥＧＦが挙げられ、膵細胞を得るための誘導因子としては、例えばＨＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦが挙げられ、腎細胞を得るための誘導因子としては、例えばＨＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦが挙げられ、上皮細胞を得るための誘導因子としては、例えばＫＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦが挙げられる。分化細胞は必要に応じて単離／精製することができる。分化細胞の単離／精製は、自体公知の方法、例えば細胞表面マーカーを利用する細胞選別方法（例えば、上述の方法を参照）により行われ得る。
本発明はまた、本発明の方法により得られる細胞を提供する。本発明の方法により得られる細胞としては、例えば、非接着性成体幹細胞及びその分化細胞が挙げられる。
本発明はさらに、本発明の細胞を含む組成物、例えば医薬組成物を提供する。本発明の増幅方法で用いられる非接着性成体幹細胞、接着性フィーダー細胞及び各種因子の由来を統一することで、異種動物由来の生体成分を実質的に含有しない組成物が得られる。ここで、異種動物由来の生体成分を「実質的に」含有しない組成物とは、異種動物由来の細胞及び生体成分を用いずに細胞を培養することで達成可能となった程度の品質を意味するものとする。また、本発明の増幅方法において非接着性成体幹細胞及び接着性フィーダー細胞として細胞移植が意図される個体由来の細胞を用いることで、同種同系移植に好適な組成物を得ることも可能である。従って、本発明の細胞は、移植等に際して感染リスク・拒絶反応を回避できるという利点を有する。本発明の組成物は、医薬上許容され得る担体を含むことができる。
本発明の方法により得られる非接着性成体幹細胞及びその分化細胞は、種々の疾患の治療に用いることができる。例えば、非接着性成体幹細胞並びにその分化細胞である血管内皮細胞及び血管平滑筋細胞は、細胞移植により血管障害の治療に用いることができる。このような血管障害としては、例えば、虚血性疾患（例えば、虚血性心疾患、バージャー病、ＡＳＯ（閉塞性動脈硬化症））、血管損傷、ＰＴＣＡ後再狭窄、ステント内狭窄が挙げられる。また、皮膚潰瘍等の創傷を治癒するため、あるいは人工血管の作製に使用できる。細胞移植後の効果は、自体公知の方法により確認できる。例えば、血管障害が虚血性心疾患である場合には、移植後の心機能を、例えば収縮能と拡張能とを調べることによって評価することができる。心臓の収縮能や拡張能の測定は当分野で実施されている種々の方法によって行うことができる。例えば収縮能の測定は僧帽弁逆流波形から算出される＋ｄｐ／ｄｔ値（収縮能が低下するにつれて値が下がる）や左室駆出率（％ＥＦ、収縮能が低下するにつれて値が下がる）等を、拡張能の測定であれば同様に僧帽弁逆流波形から算出される−ｄｐ／ｄｔ値（拡張能が低下するにつれて値が上がる）や拡張末期内径（ＥＤｄ）等を測定することなどによって行うことができる（例えば、ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１８：１３９２−１３９４（２００４）参照）。
本発明はさらに、上述した因子（例えば、ＩＬ−３、脂肪酸）を含有する無血清培地、及びこの無血清培地を含む非接着性成体幹細胞の培養用試薬を提供する。本発明の無血清培地はまた、接着性フィーダー細胞を含んでいてもよい。
本発明はまた、上述した因子（例えば、ＩＬ−３、脂肪酸）および無血清培地を含むキットを提供する。本発明のキットは、上述した因子のうち少なくとも１つの因子が、無血清培地から隔離された形態（例えば、異なる容器中に格納された形態）で提供される。また、本発明のキットは、接着性フィーダー細胞をさらに含んでいてもよい。接着性フィーダー細胞は、無血清培地中に存在している形態、あるいは無血清培地から隔離された形態で提供される。本発明のキットは、例えば本発明の無血清培地の作製に有用である。
本発明のキットはさらに、非接着性成体幹細胞又はその分化細胞の細胞表面マーカーに特異的な親和性を有する物質（例えば、抗体）、並びに／あるいは非接着性成体幹細胞の分化誘導因子を含んでいてもよい。かかるキットは、本発明の方法に好適に用いられる。
以下実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、実施例は本発明の説明のために記載するものであり、本発明を何ら限定するものではない。
【実施例】
【０００５】
実施例１：各細胞群の増幅倍数の経時的変化
（１）本発明の無血清培地の調製
生体外幹細胞増幅培養用培地は、イスコブ改変ダルベッコ培地（Ｇｉｂｃｏ  １２４４０−０５３）に、１０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、１０μｇ／ｍｌヒト組換えインスリン、２００μｇ／ｍｌヒト非組換え（即ち血漿由来）トランスフェリン、５０ｎｇ／ｍｌヒト組換えＦＬ、５０ｎｇ／ｍｌヒト組換えＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌヒト組換えＴＰＯ、５０ｎｇ／ｍｌヒト組換えＩＬ−３、５０ｎｇ／ｍｌヒト組換えＩＬ−６、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、脂肪酸等（２０ｎｇ／ｍｌアラキドン酸、２．２μｇ／ｍｌコレステロール、７００ｎｇ／ｍｌビタミンＥ（ＤＬ−α−トコフェロールアセテート）、１００ｎｇ／ｍｌリノール酸、１００ｎｇ／ｍｌリノレン酸、１００ｎｇ／ｍｌミリスチン酸、１００ｎｇ／ｍｌオレイン酸、１００ｎｇ／ｍｌパルミトレイン酸、１００ｎｇ／ｍｌパルミチン酸、１００ｎｇ／ｍｌステアリン酸、１ｍｇ／ｍｌ  ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−６８、２２μｇ／ｍｌ  Ｔｗｅｅｎ８０）を添加して調製した。
（２）細胞の生体外増幅
先ず、ヒトから骨髄液１５ｍｌを採取した。採取した骨髄液１５ｍｌをＰＢＳ  １５ｍｌと混合し、５０ｍｌチューブ中のＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ−１０７７（Ｓｉｇｍａ）１５ｍｌに重層し、比重遠心分離（６００×ｇ、３０分間、２０℃）した。次いで、最上層（血漿、血小板、ＰＢＳ）を吸引して捨て、単核球を含む層（ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥの上層）を別のチューブに回収し、これに洗浄のためＰＢＳ−２ｍＭ  ＥＤＴＡ  １０ｍｌを添加、混合し、１０００×ｇ、２０分間、４℃で遠心分離後、上清を捨て、ペレットを再懸濁した。得られたペレットに、溶血のためＮＨ４Ｃｌ  ２０ｍｌを加え、５分間インキュベートし、３７０×ｇ、８分間、４℃で遠心分離後、上清を捨て、ペレットを再懸濁した。得られたペレットに、洗浄のためＰＢＳ  １０ｍｌを加え、２００×ｇ、８分間、４℃で遠心分離後、上清（血小板を含む）を捨てることにより、純度８０〜９０％以上で骨髄単核球を含む画分を得た。
上記の通り調製した画分を、上記の通り調製した生体外幹細胞用増幅用培地に１×１０５細胞／ｍｌとなるように懸濁し、次いでこの懸濁液を組織培養用処理した６ウェルプレート（１ウェル直径３５ｍｍ）に１ウェルあたり２×１０５細胞／２ｍｌとなるように播種した。培養は、３７℃、５％  ＣＯ２、２０％  Ｏ２の条件下で、２、４又は６週間行った。また、１週間毎に１／２希釈で同じウェル内で培地交換した。本培養では、培養開始時の培地中の総細胞数に占めるＣＤ３４＋細胞及びＣＤ１３３＋細胞（非接着性成体幹細胞）の陽性率はそれぞれ、３．９％、７．５％であった。また、培地中に播種した骨髄単核球の一部の細胞が６ウェルプレートに接着し、培養期間を通じて接着性細胞が存在していたので、フィーダー細胞として機能していると考えられた。さらに、培養期間を通じて６ウェルプレートの中心に細胞（非接着性成体幹細胞、接着性フィーダー細胞、非接着性非幹細胞を含む）が密集し、局所的に細胞密度が高められた状態が維持されていた（培地の１／１０容量中に、培地に播種された９５％以上の細胞が存在）。
培養開始から２、４又は６週間後、各細胞数を、細胞表面マーカーを利用してＦＡＣＳにより計測し、各細胞について増幅倍数を算出した。なお、各細胞の細胞表面マーカーは以下の通りである：血管幹細胞（ＣＤ３４＋）；血管・造血幹細胞（ＣＤ１３３＋）；血管内皮様前駆細胞（ＣＤ１４＋）；造血幹細胞（ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−）。また、培養開始時（０）の各細胞数を１とし、２週間後（２）、４週間後（４）、６週間後（６）の細胞数を測定して増幅倍数とした。
結果を表１に示す。
【表１】
2006093172.tif 000002
各細胞を移植する場合、増幅培養前の細胞を使用する場合には５００ｍＬ必要であった骨髄液が、２週間後では２５ｍＬ以下、４週間後には５ｍＬ以下、６週間後には１ｍＬ以下となり、増幅培養後６週間では５００倍以上に増幅され、必要な骨髄液が１／５００、即ち１ｍｌになった。
また、上記と同様に骨髄単核球の増幅培養を継続し、増幅された非接着性成体幹細胞（血管幹細胞、血管・造血幹細胞等を含む）数の増幅効率を算出したところ、増幅培養後８週間では２０００倍、１０週間では８０００倍、１２週間では３２０００倍、１４週間では１３万倍、１６週間では５０万倍、１８週間では２００万倍、２０週間では８００万倍、２２週間では３２００万倍、２４週間では１億倍以上に増幅された。
なお、９０％程度に純化したＣＤ３４＋細胞を上記と同様に培養したところ、培養１週間後には総細胞数が３０倍となるが、ＣＤ３４＋陽性率が５０％以下に減少すること、４０％程度に純化したＣＤ３４＋細胞を上記と同様に培養したところ、培養１週間後には総細胞数が３０倍となるが、ＣＤ３４＋陽性率が２％以下に減少することが確認されている。また、９０％又は４０％程度に純化したＣＤ３４＋細胞を上記と同様に培養したところ、培養１週間後にはＣＤ３４＋陽性率が１％以下になることが確認されている。上述の通り、陽性率は、培養２週間後には殆ど０％になるので、全体の増幅率が５００倍でも、幹細胞自体の増幅率は０〜１０倍程度にしかならない。従って、総細胞数（総非接着性細胞）に占める非接着性成体幹細胞の割合を低く抑えることにより、該幹細胞の増幅効率が著しく向上することが示された。
実施例２：各細胞群の経時的変化
さらに実施例１と同様にして骨髄単核球由来の細胞を増幅培養し、培養開始時（０）、培養２週間後（２）、培養４週間後（４）、培養６週間後（６）における各細胞群の存在割合を調べた。幹細胞ｒｉｃｈ細胞はＣＤ３１陽性であることを指標にして、線維芽細胞・骨幹細胞群はＣＤ４５陰性であることを指標にして、リンパ球を含む細胞群はＣＤ４５陽性であり且つＣＤ３３陰性であることを指標にして同定した。
全細胞数に対する各細胞群の存在率を％で示した。結果を表２に示す。
【表２】
2006093172.tif 000003
培養６週間後には、ＣＤ４５陰性の細胞がほとんど無く、また９０％以上がＣＤ３１陽性であった。このことは本発明の培養方法が血管系幹細胞を特異的に増幅させることができることを意味している。
実施例３：増幅幹細胞の虚血動物モデルへの移植
実施例１と同様にして本発明の方法にて６週間増幅培養した幹細胞を含む増幅骨髄単核球（１×１０６個）を下肢虚血動物への移植に使用した。下肢虚血動物モデルは、免疫不全ラット（Ｆ３４４／Ｎ  Ｊｃｌ−ｒｎｕ、９週齢、雄性）の皮膚を麻酔下で切開し、大腿動静脈を吻合し、末梢側を切除し、皮膚を縫合することにより作製した。この動物モデルの大腿、下腿に幹細胞を含む増幅骨髄単核球を筋肉注射した。細胞移植３週間後に前脛骨筋の組織切片を作成し、抗ＨＬＡ−ｃｌａｓｓ  Ｉ抗原抗体（ヒト細胞特異的）、抗α−ＳＭＣ抗体（血管平滑筋細胞特異的）、抗ＫＤＲ抗体（ヒト血管内皮細胞特異的）で染色した。
その結果、抗ＨＬＡ−ｃｌａｓｓ  Ｉ抗体と抗α−ＳＭＣ抗体、あるいは抗ＨＬＡ−ｃｌａｓｓ  Ｉ抗体と抗ＫＤＲ抗体で共染される血管像が確認され、移植した増幅細胞から血管が形成されたことが確認された。また、下肢虚血において、血流の改善が観察された。
実施例４：増幅幹細胞の筋肉傷害動物モデルへの移植
実施例１と同様にして本発明の方法にて６週間増幅培養した幹細胞を含む増幅骨髄単核球（６×１０５〜３×１０６個）を前脛骨筋傷害動物モデルへの移植に使用した。前脛骨筋傷害動物モデルは、免疫不全ラット（Ｆ３４４／Ｎ  Ｊｃｌ−ｒｎｕ、６〜７週齢、雄性）の皮膚と筋膜を切開し、前脛骨筋の一部をピンセットで取り除くことにより作製した。この前脛骨筋の一部が取り除かれた部位に幹細胞を含む増幅骨髄単核球を移植し、次いで筋膜を皮膚と縫合した。細胞移植４週間後に前脛骨筋の組織切片を作成し、抗ＨＬＡ−ｃｌａｓｓ  Ｉ抗原抗体（ヒト細胞特異的）、抗α−ＳＭＣ抗体（血管平滑筋細胞特異的）で染色した。
その結果、抗ＨＬＡ−ｃｌａｓｓ  Ｉ抗体と抗α−ＳＭＣ抗体で共染される血管像が確認され、移植した増幅細胞から血管が形成されたことが確認された。また、傷害された脛骨筋における血流も回復していた。
【産業上の利用可能性】
【０００６】
本発明の方法により、体外で少なくとも５００倍に非接着性成体幹細胞を増幅することが可能となり、得られる増幅細胞は、インビボ及びインビトロで種々の細胞へと分化誘導され得る。さらに得られた増幅細胞は虚血モデルと筋肉傷害モデルにおいて血流改善に有効であった。即ち、成体幹細胞を大量に得ることができる本発明の方法により、潜在患者を含めて約１０万人といわれる下肢虚血患者や約１１０万人といわれる虚血性心疾患患者に対してより患者への負担が少ない治療方法を提供することが可能となる。また、全身麻酔下で５００ｍｌ以上の骨髄液を採取する既存法に対して、本発明の方法によれば、局所麻酔下で骨髄液１ｍｌ程度を採取すればよいことから、患者の負担を著しく軽減できる。さらには、増幅後の細胞は凍結保存できることから、繰り返しの治療、１ロットの複数患者への提供等も可能となる。
本出願は、日本で出願された特願２００５−０５２９４４（出願日：２００５年２月２８日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【国際調査報告】
2006093172.tif 000004
2006093172.tif 000005
2006093172.tif 000006
2006093172.tif 000007
2006093172.tif 000008
2006093172.tif 000009