(57)【要約】フィトステロール（β−シトステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、エルゴステロール、エルゴスタディエノールなど）を含んだリポソームの新規な用途。フィトステロールを含んだリポソームが癌転移抑制作用を有することが新たに見出された。フィトステロールを含んだリポソームを経口投与することによって、癌転移が抑制され、癌の予防又は治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィトステロールを含んだリポソームを含有する抗癌用経口組成物。
【請求項２】
フィトステロールが、β−シトステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、エルゴステロール及びエルゴスタディエノールからなる群から選択される少なくとも１種である請求項１に記載の経口組成物。
【請求項３】
リポソームにおけるフィトステロール含有量が１〜３３重量％である請求項１に記載の経口組成物。
【請求項４】
抗癌作用が癌転移抑制である請求項１〜３のいずれかに記載の経口組成物。
【請求項５】
経口組成物が食品組成物である請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
経口組成物が医薬組成物である請求項１〜４のいずれかに記載の経口組成物。
【請求項７】
フィトステロールを含んだリポソームの癌転移抑制に有効な量を対象者に経口投与することを特徴とする癌を予防又は治療する方法。
【請求項８】
フィトステロールが、β−シトステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、エルゴステロール及びエルゴスタディエノールからなる群から選択される少なくとも１種である請求項７に記載の癌を予防又は治療する方法。
【請求項９】
経口投与されるリポソームの量が、成人一人１日あたり、１０ｍｇ〜１００００ｍｇである請求項７又は８に記載の癌を予防又は治療する方法。
【請求項１０】
癌を予防又は治療するための、フィトステロールを含んだリポソームの使用。
【請求項１１】
フィトステロールが、β−シトステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、エルゴステロール及びエルゴスタディエノールからなる群から選択される少なくとも１種である請求項１０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィトステロールを含んだリポソームを含有する、癌を抑制するための経口組成物、及び該リポソームによる癌の予防又は治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、剤型修飾を施す方法の一つとして微粒子製剤を薬物キャリアーとして利用する研究が精力的になされている。そのような研究の一つとして、リポソームを経口投与の薬物キャリアーとして利用する検討がなされている。そして、リポソームは水溶性薬物をその内水層に、脂溶性薬物を脂質二重層へ取り込むことができるため、薬物のターゲティング、徐放化、副作用の軽減などを目的としたＤＤＳ製剤の薬物運搬体としてその応用が試みられている。また、リポソームは生体膜の成分から構成されているため生体に対する安全性が高いことも知られている。また、通常、経口投与では薬効をほとんど示さなかったインスリンを、修飾したリポソームに封入することによって、経口投与時のインスリンの薬効が向上することが認められている（非特許文献１〜３）。また、エリスロポエチンをリポソームに封入することによりそのバイオアベイラビリティーが上昇することも報告されている（非特許文献４）。しかしながら、これらの技術において、薬効はリポソームに内包される成分によるものであり、リポソームは単にキャリアーとして利用されているだけであった。したがって、リポソームそのものの薬効についてはあまり注目されていなかった。【０００３】
また、ステロールは動植物細胞の構成成分の一つであり、動物植物に含まれるものを動物ステロール、植物細胞に含まれるものをフィトステロール（植物ステロールとも称される）という。コレステロールは動物ステロールの代表的な例であり、過剰に摂取すると健康に悪影響を与えることが知られている。一方、最近になって、フィトステロールについての研究が盛んになり、血漿コレステロール低下作用、大腸癌の発生を抑制する作用などが報告されている。
【非特許文献１】Hirofumi Takeuchi et al. ，”Enteral Absorption of Insulin in Rats from Mucoadhesive Chitosan-Coated Liposomes”， Pharmaceutical Research，13(6)，896-901，1996
【非特許文献２】Muramatsu K et al.，”Dipalmitoylphosphatidylcholine Liposomes with Soybean-Derived Sterols and Cholesterol as a Carrier for the Oral Administration of Insulin in Rats”，Biological & Pharmaceutical Bulletin， 19(8), 1055-1058, 1996
【非特許文献３】Kazunori Iwanaga et al.，” Application of surface-coated liposomes for oral delivery of peptide: Effects of coating the liposome's surface on the GI transit of insulin”，Journal of Pharmaceutical Sciences，88, 248-252, 1999
【非特許文献４】Yoshie Maitani et al.，” Oral administration of recombinant human erythropoietin in liposomes in rats: Influence of lipid composition and size of liposomes on bioavailability”， Journal of Pharmaceutical Sciences，85, 440-445，1996
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、フィトステロールは水に不溶性又は難溶性であることから投与方法やキャリアーの開発が困難であった。そこで、本発明は、フィトステロールを含んだ癌を抑制する経口組成物、及び該リポソームによる癌の予防又は治療方法などの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、リポソーム膜構成成分としてフィトステロールを利用したリポソームが癌の転移を抑制する作用を有すること、特にレシチン及びβ−シトステロールをリポソーム膜構成成分として含有するリポソームのその作用が強いことを見出した。したがって、本発明はフィトステロールを含んだリポソームの癌の予防又は治療の用途に関する。【０００６】
即ち、本発明は、下記の各項に係る組成物、予防又は治療方法及び使用を提供するものである。
項１．フィトステロールを含んだリポソームを含有する抗癌用経口組成物。
項２．フィトステロールが、β−シトステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、エルゴステロール及びエルゴスタディエノールからなる群から選択される少なくとも１種である項１に記載の経口組成物。
項３．リポソームにおけるフィトステロール含有量が１〜３３重量％である項１に記載の経口組成物。
項４．抗癌作用が癌転移抑制である項１〜３のいずれかに記載の経口組成物。
項５．経口組成物が食品組成物である項１〜４のいずれかに記載の組成物。
項６．経口組成物が医薬組成物である項１〜４のいずれかに記載の経口組成物。
項７．フィトステロールを含んだリポソームの癌転移抑制に有効な量を対象者に経口投与することを特徴とする癌を予防又は治療する方法。
項８．フィトステロールが、β−シトステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、エルゴステロール及びエルゴスタディエノールからなる群から選択される少なくとも１種である項７に記載の癌を予防又は治療する方法。
項９．経口投与されるリポソームの量が、成人一人１日あたり、１０ｍｇ〜１００００ｍｇである項７又は８に記載の癌を予防又は治療する方法。
項１０．癌を予防又は治療するための、フィトステロールを含んだリポソームの使用。
項１１．フィトステロールが、β−シトステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、エルゴステロール及びエルゴスタディエノールからなる群から選択される少なくとも１種である項１０に記載の使用。【０００７】
本発明の経口組成物は癌の転移を抑制する作用を有し、膜構成成分としてフィトステロールを含んだリポソームを有効成分として含有する。なお、本発明において、癌転移抑制とは、発生した癌が他の組織や器官に転移することを抑制することを包含する。また、本発明の癌を予防又は治療する方法は、フィトステロールを含んだリポソームの癌転移抑制に有効な量を対象者に経口投与することを特徴とする。さらに、本発明は、癌を予防又は治療するための、フィトステロールを含んだリポソームの使用に関する。ここで、癌の種類に制限はなく、例としては、頭頚部癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌、肝臓癌、胆のう・胆管癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、口腔癌、咽頭癌、咽喉癌、舌癌、食道癌、腎癌、卵巣癌等が挙げられる。特に粘膜部位の癌に対して有効であり、大腸癌、口腔癌、舌癌、咽喉癌、肺癌、に対して高い効果が期待できる。【０００８】
リポソームはリン脂質を主体とした脂質を十分量の水で水和することにより形成される二分子膜を有する脂質小胞体である。現在、リポソームは脂質二重層の数に基づいて分類され、多重膜リポソーム(ＭＬＶ)と一枚膜リポソームに分類される。一枚膜リポソームは、そのサイズに応じて、更にＳＵＶ（small unilamella vesicle）、ＬＵＶ(large unilamella vesicle)、ＧＵＶ(giant unilamella vesicle)に分類される。本発明のリポソームは、これらのいずれであってもよい。好ましいのはＭＬＶである。本発明では、リポソームの大きさは、通常３０〜１０００ｎｍ、好ましくは３０〜６００ｎｍ、より好ましくは５０〜４００ｎｍ、より一層好ましくは５０〜２００ｎｍである。【０００９】
リポソームは、従来の方法により製造することができる。例えば、所定量のレシチン及びステロールを、例えばエタノールなどの適当な有機溶媒で可溶化し、減圧下に溶媒を除去し、膜脂質を作成後、これに種々の緩衝液などを含む水溶液を添加して、例えば、１０００〜３０００rpm程度で２〜５分間程度撹拌して、リポソーム懸濁液を調製することにより得ることができる。【００１０】
得られた懸濁液に対しては、必要に応じて、リポソーム外液中の生理活性物質を除去する操作、例えば懸濁液を濾過後得られた濾液を透析する操作を行ってもよい。【００１１】
本発明では、ステロールとしてフィトステロールを使用する。フィトステロールは主として植物細胞の構成成分として存在することが知られている。フィトステロールとしては、β−シトステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、エルゴステロール、エルゴスタディエノールなどが例示され、１種単独又は２種以上組み合わせて使用することができる。好ましくは、β−シトステロールである。リポソームにおけるフィトステロールの含有量は、通常１〜３３重量％、好ましくは１０〜３３重量％、より好ましくは１０〜２５重量％である。【００１２】
また、本発明では、レシチンとして、例えば、卵黄レシチン、大豆レシチン、ナタネレシチン、コーンレシチン、ひまわりレシチン、ピーナッツレシチンなどを１種単独で又は２種以上組み合わせて使用することができるがこれらに限定されない。本発明では、これらの水素添加物を用いることもできる。レシチンはホスファチジルコリン又は１，２−ジアシルグリセロール ３−ホスホコリンとも称され、一般的に、グリセロールの１位及び２位に脂肪酸が結合している。本発明では、上記例示のレシチンに加えて、１位及び２位の両方又は片方に炭素数１２〜２４の不飽和脂肪酸が結合しているレシチンを使用することが好ましく、１位に炭素数１２〜２４の飽和脂肪酸、２位に炭素数１２〜２４の不飽和脂肪酸が結合しているレシチンを使用することが特に好ましい。ここで、飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸は直鎖状及び分枝状のいずれでもよい。このようなレシチンを使用することにより、リポソームに封入された生理活性物質の腸吸収性が向上する。好ましい不飽和脂肪酸としては、炭素数１６〜１８の不飽和脂肪酸を使用でき、特に２位にオレイン酸、リノール酸が多く結合したレシチンを使用することにより、より腸吸収性の向上が期待できる。本発明では、卵黄レシチン、大豆レシチン、ひまわりレシチン、ナタネレシチンが好ましい。リポソームにおけるレシチンの含有量は、通常６７〜９９重量％、好ましくは６７〜９０重量％、より好ましくは７５〜９０重量％である。【００１３】
さらに、本発明では、リポソーム中のレシチンとフィトステロールのモル比は、５０：５０〜９０：１０程度が好ましく、５５：４５〜８５：１５がより好ましく、６０：４０〜７０：３０が最も好ましい。モル比がこれらの範囲にあるとリポソーム膜の安定性が向上する。【００１４】
レシチン又はステロールの含有量は既知の方法で測定できる。例えば、レシチンの含有量はFiske-Subbarow法など、ステロールの含有量はHPLC、比色法などによって定量できる。【００１５】
さらに、リポソームの表面をコーティングすることができ、このコーティング物も有効成分として利用できる。好ましいコーティングとしては、硫酸基を含有する多糖類によるコーティングがあげられる。硫酸基含有多糖類としては、フコイダン、カラギーナン、寒天、ヘパリンなどが挙げられる。また、該硫酸基含有多糖類としては、硫酸基を含まない多糖を硫酸化したものも包含され、例えば、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸などであってもよい。【００１６】
硫酸基含有多糖類としては、分子量が5000〜300000程度のものが好ましく用いられる。これらの硫酸基含有多糖類の中でもフコイダン及びカラギーナンを好ましく用いることができ、特にフコイダンが好ましい。【００１７】
硫酸基含有多糖類の使用量は、例えば、リポソームに含有されるレシチン100重量部に対して、10〜500重量部程度が好ましく、20〜200重量部程度がより好ましい。【００１８】
コーティングは、例えば、フィトステロールを含んだリポソームの懸濁液に、硫酸基含有多糖類を加え、1000〜3000rpm程度で2〜5分間程度撹拌することにより行うことができる。なお、１つのコーティング膜の中に複数のリポソームが含まれていてもよい。【００１９】
リポソームが硫酸基含有多糖類でコーティングされていることは、例えば、リポソーム溶液のゼータ電位が、硫酸基含有多糖類を添加して撹拌することにより変化することにより確認できる。【００２０】
リポソームにはレシチン、フィトステロール以外にも必要に応じて、α−トコフェロール、アスコルビン酸などの抗酸化剤、乳酸、クエン酸などの有機酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミンなどの脂質、キトサン、フコイダン、ヒアルロン酸などの天然高分子、ポリエチレングリコール、カルボキシビニルポリマーなどの合成高分子、トレハロース、ラクチュロース、マルチトールなどの糖質、グリセリンなどのポリオール等を加えることができる。【００２１】
本発明において利用されるリポソームには必要に応じて様々な物質を内容物として封入することができる。例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シスプラチン、タキソールなどの薬効成分、β−グルカン、多糖類などの制癌効果を有する成分などである。内容物を封入したリポソームは、従来の方法により製造することができる。例えば、所定量のレシチン及びフィトステロールを、例えばエタノールなどの適当な有機溶媒で可溶化し、減圧下に溶媒を除去し、膜脂質を作成後、これに内容物を含む水溶液を添加して、例えば、１０００〜３０００rpm程度で２〜５分間程度撹拌して、リポソーム懸濁液を調製することにより得ることができる。リポソームに包含される内容物の量は、リポソーム中の脂質に対して通常１〜１０００重量％、好ましくは１０〜５００重量％である。【００２２】
得られた懸濁液に対しては、必要に応じて、リポソーム外液中の内容物を除去する操作、例えば懸濁液を濾過後、得られた濾液を透析する操作を行ってもよい。【００２３】
本発明の経口組成物を食品組成物として利用する場合には、リポソームを必要に応じてその食品の形態に応じた可食性担体、食品素材、食品添加物などと組み合わせて、通常の方法により調製することができる。食品の形態としては、飲料などの液状の食品、錠剤、顆粒、チュアブルタブレットなどの固形の食品等として利用することができる。また、ヨーグルトなどの半固形の食品としても利用することができる。具体的な食品の形態としては、ジュース、清涼飲料水、ティー等の液体飲料；粉末ジュース、粉末スープ等の粉末飲料；チョコレート、キャンディー、チューインガム、アイスクリーム、ゼリー、クッキー、ビスケット、コーンフレーク、チュアブルタブレット、フィルムシート、ウエハース、グミ、煎餅、饅頭等の菓子類；ドレッシング、ソース等の調味料；パン類、麺類、こんにゃく、練り製品（かまぼこ等）、ふりかけ、口腔用スプレー、トローチ等が挙げられる。また、添加物として、乳酸菌などの生菌又は死菌、その他のプロバイオティクス素材、ビタミン、生薬、ハーブ等の植物そのものまたは抽出物を配合しても良い。【００２４】
食品組成物の担体として例えば、マルチトール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール等の糖アルコール類、結晶セルロース、乳糖、白糖、ブドウ糖、デンプン、炭酸塩類、リン酸塩類等の賦形剤、ゼラチン、アルギン酸、キサンタンガム、セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、カラギーナン、プルラン、ペクチン等の粘結剤、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、酵素処理レシチン、酵素分解レシチン、サポニン等の乳化剤、アスコルビン酸、トコフェロール等の抗酸化剤、乳酸、クエン酸、グルコン酸、グルタミン酸等の酸味料、ビタミン類、アミノ酸類、乳酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩などの強化剤、二酸化ケイ素等の流動化剤、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸塩類等の滑沢剤、ラクチュロース、ラフィノース、フルクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、キシロオリゴ糖、大豆オリゴ糖等のオリゴ糖、難消化性デキストリン、サイリウム、ビートファイバー等の食物繊維、スクラロース、アセスルファムカリウム、アスパルテーム、グリシルリチン等の甘味料、ハッカ油、ユーカリ油、ケイヒ油、ウイキョウ油、チョウジ油、オレンジ油、レモン油、ローズ油、フルーツフレーバー、ミントフレーバー、ペパーミントパウダー、ｄｌ−メントール、ｌ−メントール等の香料を使用することができる。また、添加物として、乳酸菌などの生菌又は死菌、その他のプロバイオティクス素材、プレバイオティクス素材、ビタミン、生薬、ハーブ等の植物そのものまたは抽出物を配合しても良い。【００２５】
本発明の経口食品組成物は、癌の転移を抑制する作用、癌の予防作用、癌の治療作用などを有する健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養機能食品、病者用食品等の用途に用いることができる。【００２６】
本発明の経口食品組成物において経口食品組成物全量に対するリポソーム含有量は組成物の剤型等に応じて適宜設定されるが、通常０．５〜９５重量％、好ましくは０．８〜８０重量％、より好ましくは１〜５０重量％である。また、本発明の組成物が飲料の場合、リポソーム含有量のより一層好ましい範囲は１〜４重量％である。【００２７】
また、本発明の経口組成物は、フィトステロールを含んだリポソーム及び必要に応じて薬学的に許容される担体を含有し、液剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、粉剤などの固形剤或いは当該液剤又は固形剤を封入したカプセル剤等の経口投与可能な医薬組成物として使用できる。薬学的に許容される担体としては、賦形剤、希釈剤等が挙げられる。また、経口医薬組成物は香料等の各種添加剤を含むこともできる。【００２８】
担体及び添加剤としては、例えば、糖アルコール類（マルチトール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなど）、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸塩類（炭酸カルシウムなど）、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、メチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム、タルク、リン酸塩類（リン酸一水素カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素カルシウム、リン酸二水素ナトリウムなど）、硫酸カルシウム、乳酸カルシウム、カカオ脂等の賦形剤、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、クロスポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、結晶セルロース、粉末セルロース、結晶セルロース・カルメロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、エチルセルロース、リン酸カリウム、アラビアゴム末、プルラン、ペクチン、デキストリン、トウモロコシデンプン、アルファー化デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、ゼラチン、キサンタンガム、カラギーナン、トラガント、トラガント末、マクロゴール等の結合剤、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン酸、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、酵素処理レシチン、酵素分解レシチン、サポニン等の乳化剤、アスコルビン酸、トコフェロール等の抗酸化剤、乳酸、クエン酸、グルコン酸、グルタミン酸等の酸味料、ビタミン類、アミノ酸類、乳酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩などの強化剤、二酸化ケイ素等の流動化剤、スクラロース、アセスルファムカリウム、アスパルテーム、グリシルリチン等の甘味料、ハッカ油、ユーカリ油、ケイヒ油、ウイキョウ油、チョウジ油、オレンジ油、レモン油、ローズ油、フルーツフレーバー、ミントフレーバー、ペパーミントパウダー、ｄｌ−メントール、ｌ−メントール等の香料等が挙げられる。【００２９】
更に錠剤等の固形剤には必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠等とすることができる。また、硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセル等にリポソームを充填してカプセル剤とすることもできる。【００３０】
液体製剤は水性又は油性の懸濁液、溶液、シロップ、エリキシル剤であってもよく、通常の担体、添加剤等を用いて常法に従い、調製することができる。【００３１】
また、医薬組成物は抗癌剤、癌転移抑制剤、癌予防剤として用いることができる。【００３２】
本発明の経口医薬組成物において経口医薬組成物全量に対するリポソーム含有量は、組成物の剤型等に応じて適宜設定されるが、通常０．５〜９５重量％、好ましくは０．８〜８０重量％、より好ましくは１〜５０重量％である。また、本発明の組成物が液体製剤の場合、リポソーム含有量のより一層好ましい範囲は１〜４重量％である。【００３３】
本発明の経口組成物の摂取量は、成人一人１日あたり、摂取されるリポソームの重量が、通常１０ｍｇ〜１００００ｍｇ、好ましくは２０ｍｇ〜２０００ｍｇ、より好ましくは５０ｍｇ〜２０００ｍｇとなる量である。
【発明の効果】
【００３４】
フィトステロールを含んだリポソームは癌の転移を有意に抑制する効果を有する。本発明は、癌の転移の抑制、癌の予防又は治療に有用である。本発明の経口組成物は、特に食品組成物、医薬組成物として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】NK活性の試験結果を示すグラフである。縦軸はNK活性（％）を示し、横軸はエフェクター細胞：ターゲット細胞の比（E/T比  50：1、25：1）を示し、●はコントロール群、▲はコレステロール群、■はフィトステロール群を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
以下に実施例及び試験例を示して、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
実施例１
β−シトステロール及び卵黄レシチンを膜構成成分とするリポソームの調製
薄膜水和法によりリポソームを調製した。卵黄レシチンとβ−シトステロールのモル比が２：１となるように、クロロホルムで５００ｍMの濃度に溶解した卵黄レシチンを１６０μｌ、２５０ｍMの濃度に溶解したβ−シトステロールを１６０μｌ量りとり、両溶液を混合し、クロロホルムを加えた。ロータリーエバポレーターにてクロロホルムを減圧下留去し、真空乾燥させて薄膜を作成した。この薄膜に卵黄レシチン濃度が２０ｍMとなるようにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を４ｍｌ加え、ボルテックスミキサーで処理し、液体窒素による凍結融解を３回行うことによりリポソーム懸濁液を得た。この懸濁液をプローブ型ソニケーターで１０分間処理し、リポソーム組成物を得た。【００３８】
比較例１
コレステロール及び卵黄レシチンを膜構成成分とするリポソームの調製
β−シトステロールをコレステロールに代えた以外は実施例１と同様にしてリポソーム組成物を得た。【００３９】
試験例１
リポソーム組成物によるB16BL6メラノーマ細胞の転移抑制作用
５週齢のC57BL6/Jマウス２０匹を４群に分けた。コントロール群には１日１回0.2mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を飼育６日目まで強制的に経口投与した。同様に、リポソーム化β−シトステロール群にはPBSに代えて実施例１のリポソーム組成物を経口投与し、β−シトステロール群にはPBSに代えてリポソーム化されていない通常のβ−シトステロールの水懸濁液（リポソーム化β−シトステロール群に投与されたリポソーム化β−シトステロールと同重量のβ−シトステロールを含有する）を経口投与し、リポソーム化コレステロール群にはPBSに代えて比較例１のリポソーム組成物を経口投与した。飼育７日目に無血清培地に懸濁したB16BL6メラノーマ細胞（3×10４個／0.2mL／匹）を静脈内投与した。飼育２１日目にマウスを解剖して肺を摘出し、肺表面を観察してコロニーの数を数えた。各群マウスのコロニー数の平均値を表１に示す。【００４０】
【表１】
2006095798.tif 000002
【００４１】
β−シトステロールを膜構成成分とするリポソームは、リポソーム化されていないβ−シトステロール、コレステロールを膜構成成分とするリポソームと比較して腫瘍細胞の転移を有意に抑制した。これにより、フィトステロールを含んだリポソームが大腸癌、口腔癌、胃癌、咽頭癌、肺癌等の固形癌に対して有効であることが示された。したがって、フィトステロールを含んだリポソームは抗癌用経口組成物の有効成分として有用である。【００４２】
試験例２
リポソーム組成物によるNK細胞に対する作用
５週齢のC57BL6/Jマウス３匹を３群に分けた。コントロール群には１日１回0.2mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を飼育６日目まで強制的に経口投与した。同様に、フィトステロール群にはPBSに代えて実施例１のリポソーム組成物を投与し、コレステロール群にはPBSに代えて比較例１のリポソーム組成物を経口投与した。飼育７日目にマウスを解剖して無菌状態で脾臓を摘出し、単一の脾臓細胞懸濁液を作成した。YAC-1細胞（ターゲット細胞）をNa２５１CrO４で標識した（3.7MBq／10６個）。96ウェルタイタープレートに100μLの標識されたYAC-1細胞（1×10４／well）を入れ、このウェルに脾臓細胞（エフェクター細胞、NK細胞）とYAC-1細胞の比（E/T比）が50：1、25：1となるように100μLのNK細胞を加えた（NK細胞添加ウェル）。また、NK細胞を加えないウェル（NK細胞非添加ウェル）も用意した。さらに、NK細胞添加ウェルと同じ細胞種、細胞量及び細胞比であるウェルにトリトンX-100を添加した（トリトン添加ウェル）。このプレートを5％CO２雰囲気中37℃で4時間インキュベートした後、200gで5分間遠心分離した。遠心分離により得られた上清において遊離された放射能をガンマカウンターで計測した。５１Crの遊離比（NK活性）は下記の式で算出した。【００４３】
【化１】
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【００４４】
なお、トリトン添加ウェル計測値は、ターゲット細胞（YAC-1細胞）及びエフェクター細胞（NK細胞）にトリトンX-100を添加することで得られた最大遊離値で、全ての癌細胞が破壊された時に遊離するCr標識の量であり、総癌細胞数に相当する。また、NK細胞添加ウェル計測値は、NK細胞を加えることで遊離したCr標識の量であり、NK細胞によって殺された癌細胞数に相当する。NK細胞非添加ウェル計測値は、コントロールであり、YAC-1細胞単独の状態で遊離したCr標識の量である。【００４５】
結果を図１に示す。コレステロール群はコントロール群より高いNK活性を示したが、フィトステロール群はそのコレステロール群よりさらに有意に高いNK活性を示した。【００４６】
処方例１：錠剤
卵黄レシチンとフィトステロールを用いてリポソームを調製し、該リポソームとその他の成分を用い、常法により下記の組成の錠剤を製造した。【００４７】
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処方例２：顆粒
卵黄レシチンとフィトステロールを用いてリポソームを調製し、該リポソームとその他の成分を用い、常法により下記の組成の顆粒を製造した。【００４８】
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処方例３：飲料
卵黄レシチンとフィトステロールを用いてリポソームを調製し、該リポソームとその他の成分を用い、常法により下記の組成の飲料を製造した。【００４９】
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【図１】
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【国際調査報告】
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