(57)【要約】  （１）分析対象酵素を含有する可能性のある被検試料と、前記分析対象酵素により切断可能な酵素基質を不溶性担体に結合させた固定化基質とを液中で接触させる工程、（２）前記液と不溶性担体とを分離する工程、並びに（３）不溶性担体に残存する基質又基質断片、及び／又は、不溶性担体から遊離した液中の基質断片を分析する工程を含む、酵素分析方法、並びに、分析対象酵素により切断可能な酵素基質を不溶性担体に結合させた固定化基質を少なくとも含む、酵素分析用キットを開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）分析対象酵素を含有する可能性のある被検試料と、前記分析対象酵素により切断可能な酵素基質を不溶性担体に結合させた固定化基質とを液中で接触させる工程、
（２）前記液と不溶性担体とを分離する工程、並びに
（３）不溶性担体に残存する基質又は基質断片、及び／又は、不溶性担体から遊離した液中の基質断片を分析する工程
を含むことを特徴とする、酵素の分析方法。
【請求項２】
不溶性担体に結合する前記酵素基質が、分析対象酵素の切断により不溶性担体から遊離する基質断片側において、標識物質で標識されている、請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記酵素基質が前記分析対象酵素で切断されて生じるネオアンチゲンと特異的に結合し、且つ、標識物質で標識されている標識化パートナーを用いて、前記工程（３）の分析を実施する、請求項１に記載の分析方法。
【請求項４】
標識化パートナーが標識化抗体である、請求項３に記載の分析方法。
【請求項５】
標識物質が、蛍光物質、発光物質、発色物質、又は酵素である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項６】
不溶性担体が粒子である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項７】
粒子がラテックス粒子又は磁性粒子である、請求項６に記載の分析方法。
【請求項８】
分析対象酵素により切断可能な酵素基質を不溶性担体に結合させた固定化基質であって、且つ、前記酵素基質が、前記分析対象酵素の切断により前記不溶性担体から遊離する基質断片側において、標識物質で標識されている標識化固定化基質
を含むことを特徴とする、酵素分析用キット。
【請求項９】
分析対象酵素により切断可能な酵素基質を不溶性担体に結合させた固定化基質と、
前記酵素基質が前記分析対象酵素で切断されて生じるネオアンチゲンと特異的に結合し、且つ、標識物質で標識されている標識化パートナーと
を含むことを特徴とする、酵素分析用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれる酵素の分析方法に関する。更に詳しくは、例えば、酵素活性を測定する酵素測定法において、不溶性担体に測定対象酵素の基質を結合した固相化基質を試料と反応させ、酵素によって切断された基質断片の量を検出する酵素の分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床診断検査の現場では、多数の検体について疾病診断の指標となる生体成分を短時間且つ高精度に測定し、その結果を迅速・正確に治療現場にフィードバックすることが求められており、それにより適切な薬剤・治療法の選択、治療経過の観察、再発症の予見等が効果的に行なうことができる。【０００３】
疾病を診断するための指標となる生体成分（いわゆる診断マーカー）はタンパク質、核酸、酵素、多糖類、脂質等と多岐に渡っており、また、疾病を早期に把握するために、極めて微量濃度の生体成分を測定可能な手段が重要になっている。【０００４】
生体成分の大部分は化学反応における触媒とその阻害活性であり、その代表が酵素とその阻害剤である。生体内における酵素反応は、その活性化物質やその反応を阻害する阻害物質により制御・調整され、機能の調節が図られている。例えば、生体内における血液の凝固、線溶系には数多くの酵素とその阻害剤が関係しており、これらの因子を測定することは臨床上重要になってきている。【０００５】
特に酵素については、目的の酵素によって合成基質を用いる測定法や免疫測定法が行われている。このうち合成基質法では、目的の酵素が作用することによって遊離してくる色素や蛍光物質を検出することで、活性型因子を検出、定量することができる。【０００６】
例えば、トロンビンは血液凝固に関係するエンドプロテアーゼの一種で、フィブリノーゲンに働いてフィブリンを生成する重要な酵素で、その合成基質としてＢｚ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（非特許文献１）、Ｔｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（特許文献１）、Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（特許文献２）等が知られている。酵素反応を受けてパラニトロアニリン（ｐＮＡ）を遊離して黄色の発色が得られるので、これを４０５ｎｍで比色することによりトロンビンの因子活性を測定することができ、凝固線溶能力を酵素活性で表すことができる。【０００７】
また、組織因子（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ：以下、ＴＦと称する）も発色性合成基質［非特許文献２及び非特許文献３］で活性測定することができる。【０００８】
トロンビンやＴＦ以外にも、凝固線溶系においてはプラスミン、アンチトロンビンIII（ＡＴIII）、フォン・ヴィルブラント因子切断酵素（別称：ＡＤＡＭＴＳ１３）、第Ｘ因子、第XI因子、第XII因子、プロテインＣ、血漿カリクレイン、組織カリクレイン、組織プラスミノゲンアクチベータ、ウロキナーゼ等の活性因子が合成基質を用いて活性測定されている。【０００９】
このように、生体成分の微量測定法として、酵素測定法は複雑な組成の混合物の中から酵素基質反応で特異的に選別することができることから、通常の定量法に必要な対象物を試料から分離する前処理が不要であり、しかも高感度・高精度に定量することができる特徴を持つ。また、酵素測定法のうち、蛍光又は酵素標識を特徴とする酵素測定法は、放射性同位元素を用いる放射酵素測定法に比べて廉価で危険な廃棄物を伴わず、測定の感度と精度の面で遜色ないことから汎用されている。【００１０】
このようにして、多くの活性因子（酵素）は、その基質特異性を利用して種々の分析系が開発されてきた。一方では、より特異性の高い基質物質を得るための検討も行われており、中でも合成基質の開発によって、より正確な（基質特異性の向上）測定が可能となってきた。しかし、これらの合成基質は、そこに結合された色素や蛍光色素が遊離して初めて発色したり蛍光を生じることを基本としているが、どのような条件下でもシグナルを発現するものではなく、特定の物質を色素や蛍光色素の特定部位に結合することが必要であり、新規な合成基質の開発はけっして容易ではない。【００１１】
また液相中で酵素反応を行い、そのまま発色を検出する場合には、試料液の濁りや着色の影響を受けやすく、また、蛍光を検出する場合も、試料液に蛍光を発する共雑物質があるとその影響を受け不正確になる。【００１２】
【特許文献１】特開昭５２−３４９２号公報
【特許文献２】特開昭５２−２４５９０号公報
【非特許文献１】「トロンボーシス・リサーチ（Thrombosis Research）」（アイルランド），1972年，1巻，p. 267-278
【非特許文献２】「クリニカル・ケミストリー（Clinical Chemistry）」（米国），1989年，35巻，p.1897
【非特許文献３】「臨床病理」，1995年，43巻，p. 137
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、本発明の課題は、基質を用いる酵素分析法において、操作性及び感度に優れた酵素分析法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記課題は、本発明による、（１）分析対象酵素を含有する可能性のある被検試料と、前記分析対象酵素により切断可能な酵素基質を不溶性担体に結合させた固定化基質とを液中で接触させる工程（以下、接触工程と称する）、
（２）前記液と不溶性担体とを分離する工程（以下、分離工程と称する）、並びに
（３）不溶性担体に残存する基質又は基質断片、及び／又は、不溶性担体から遊離した液中の基質断片を分析する工程（以下、分析工程と称する）
を含むことを特徴とする、酵素の分析方法により解決することができる。【００１５】
本発明の分析方法の好ましい態様によれば、不溶性担体に結合する前記酵素基質が、分析対象酵素の切断により不溶性担体から遊離する基質断片側において、標識物質で標識されている。
また、本発明の分析方法の別の好ましい態様によれば、前記酵素基質が前記分析対象酵素で切断されて生じるネオアンチゲンと特異的に結合し、且つ、標識物質で標識されている標識化パートナーを用いて、前記工程（３）の分析を実施する。本発明の分析方法の更に好ましい態様によれば、標識化パートナーが標識化抗体である。ここで「ネオアンチゲン」とは、酵素基質が対象酵素で切断された後に生じる、不溶性担体に結合した基質断片、あるいは、遊離した基質断片の酵素基質切断部位を意味する。酵素基質切断部位としては、ペプチド配列や切断されることで変化した酵素基質の立体構造が含まれる。【００１６】
本発明の分析方法の更に別の好ましい態様によれば、標識物質が、蛍光物質、発光物質、発色物質、又は酵素である。
本発明の分析方法の更に別の好ましい態様によれば、不溶性担体が粒子である。本発明の分析方法の更に好ましい態様によれば、粒子がラテックス粒子又は磁性粒子である。【００１７】
また、本発明は、分析対象酵素により切断可能な酵素基質を不溶性担体に結合させた固定化基質であって、且つ、前記酵素基質が、前記分析対象酵素の切断により前記不溶性担体から遊離する基質断片側において、標識物質で標識されている標識化固定化基質
を含むことを特徴とする、酵素分析用キットに関する。
更に、本発明は、分析対象酵素により切断可能な酵素基質を不溶性担体に結合させた固定化基質と、
前記酵素基質が前記分析対象酵素で切断されて生じるネオアンチゲンと特異的に結合し、且つ、標識物質で標識されている標識化パートナーと
を含むことを特徴とする、酵素分析用キットに関する。【００１８】
なお、本明細書における用語「分析」には、分析対象物質の存在の有無を判定する「検出」と、分析対象物質の量又は活性を定量的又は半定量的に決定する「測定」とが含まれる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、酵素量を測定する酵素測定法において、簡便で迅速に高感度に、測定対象酵素を検出する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の酵素分析方法による血漿中トロンビン活性の測定結果を示すグラフである。横軸は、血漿希釈列の希釈率であり、縦軸は発光量（単位＝カウント）である。
【図２】本発明の酵素分析方法による血漿中ＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定結果を示すグラフである。横軸は、血漿希釈列の希釈率であり、縦軸は発光量（単位＝カウント）である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の酵素分析方法は、分析対象酵素により切断可能な酵素基質を不溶性担体に結合させた固定化基質を少なくとも用いる。本発明の酵素分析方法には、用いる標識物質の標識化の態様に基づいて、例えば、
（１）不溶性担体に結合させた酵素基質が、標識物質で標識化されている態様（以下、非免疫分析法と称することがある）、あるいは、
（２）酵素基質が分析対象酵素で切断されて生じるネオアンチゲンと特異的に結合し、且つ、標識物質で標識されている標識化パートナーを用いる態様（以下、免疫分析法と称することがある）
が含まれる。【００２２】
本発明の酵素分析方法によって分析可能な分析対象酵素は、基質を特異的部位で切断可能な酵素である限り、特に限定されるものではなく、例えば、臨床診断において酵素検査の対象となる各種酵素、すなわち、ヒトに対する各種の疾患において上昇又は減少する酵素、あるいは、ヒトにおける疾病に関連しない各種酵素、又はヒト以外の各種動物の酵素を挙げることができる。【００２３】
被検試料としては、分析対象酵素を含む可能性のある試料であれば特に限定されないが、例えば、生物学的液体試料、特には、血液、血清、血漿、尿、又は髄液等を挙げることができる。【００２４】
本発明で用いる酵素基質は、分析対象酵素で特異的に切断可能な物質である限り、特に限定されるものではなく、分析対象酵素に応じて適宜選択することができる。前記酵素基質は、周知方法により調製することができ、例えば、寄生生物の粗抽出品又は精製品をヒトや動物の体液より採集する方法、生物由来の粗抽出品又は精製品を人工的に養殖した生物から取得する方法、核酸又はタンパク質を遺伝子組換え技術や細胞培養技術により生産する方法、あるいは、ポリペプチドやハプテンを化学合成技術で合成する方法などが挙げられる。【００２５】
例えば、合成基質を用いる場合、トロンビン用として、例えば、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇを含むペプチドを用いることができる。第XII因子用としては、例えば、Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを、プラスミン用としては、例えば、Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓを、第Ｘ因子用としては、例えば、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを、組織プラスミノゲンアクチベータインヒビター用としては、例えば、Ｐｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを含むペプチドを、ＡＤＡＭＴＳ１３としては、例えば、フォン・ヴィルブラント因子（von
Willebrand Factor；ｖＷＦ）の第１５９６番〜第１６６８番のアミノ酸からなる断片（Koichi Kokame, Masanori
Matsumoto, Yoshihiro Fujimura, and Toshiyuki Miyata, VWF73, a region from D1596
to R1668 of von Willebrand factor, provides a minimal substrate for ADAMTS-13.
Blood, Jan 2004; 103: 607 - 612）を用いることができる。【００２６】
本発明において使用する固定化担体としては、酵素基質を固定化することができるものであればいかなる形態の不溶性担体でも利用可能であり、例えば、基質を物理的に吸着可能な材質（例えば、ポリスチレン製）からなるプレート、チュ−ブ、ビーズ、チップ、あるいは、基質固定化用の適当な官能基を有するガラス、磁性担体、ラテックス粒子、又は膜などを利用することができる。固定化基質を反応系から分離する際の操作が簡便な点で、粒子を用いることが好ましく、前記分離操作を機械を用いて行なうことができるため、不溶性磁性粒子を用いることが好ましい。【００２７】
不溶性磁性粒子の粒径は、通常０．０５μｍ〜５μｍのものが用いられ、０．３μｍ〜３μｍの範囲の粒径を有する不溶性磁性粒子が好ましい。物理的に吸着させる方法としては、不溶性磁性粒子に、基質を直接固定化する方法が挙げられる。化学的に担持させる方法としては、例えば、磁性粒子の表面に存在するアミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、エポキシ基などを化学的に修飾することにより基質と結合させることができる官能基を利用して、直接粒子上に固定化する方法や粒子と基質分子の間にスペーサー分子を化学結合で導入して固定化する方法が挙げられる。ここでスペーサー分子として、アビジン又はストレプトアビジンを不溶性磁性粒子上に化学的に固定化し、これにビオチン化基質を結合させて固定化基質を調製することが可能である。更には、アルブミンなどの他のタンパク質に抗体又は抗原を化学結合させた後、そのタンパク質を粒子に化学結合させる方法が挙げられる。一般的に担持される基質の量は、用いる不溶性担体粒子の表面積、官能基量等により適宜決定することができるが、通常担体粒子１ｇ当たり１ｍｇ〜５００ｍｇ、好ましくは１０ｍｇ〜１００ｍｇである。【００２８】
本発明方法における免疫分析法で使用するパートナー物質は、酵素基質が分析対象酵素で切断されて生じるネオアンチゲンと特異的に結合可能な物質である限り、特に限定されるものではなく、例えば、抗体や、あるいは、基質に糖鎖が付加されている場合には特定の糖鎖を認識するコンカナバリンＡ又はレクチンを挙げることができる。前記ネオアンチゲンは、遊離した基質断片側に生じるネオアンチゲンであっても、不溶性担体に残存する基質断片側に生じるネオアンチゲンであっても構わないが、不溶性担体に残存する基質断片側に生じるネオアンチゲンが好ましい。パートナー物質として抗体を使用する場合、前記抗体は、分析対象酵素により適宜選択することができ、予めヒト、マウス、ウサギ、ラット、ヤギ、ヒツジなどに基質又はその断片を免疫して得られた抗血清、アフィニティー精製されたポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体などを利用することができる。非特異的結合を避けるため、モノクローナル抗体を用いることが好ましい。【００２９】
本発明で用いる標識物質としては、公知の各種標識物質を用いることができ、例えば、蛍光物質（例えば、ユーロピウム）、発光物質（例えば、ルシフェリン）、発色物質［例えば、パラニトロアニリン（ｐＮＡ）］、又は酵素（例えば、ペルオキシダーゼ）を挙げることができ、試薬の安定性、感度の点で酵素が好ましい。酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、又はルシフェラーゼ等が挙げられる。特に、１，２−ジオキセタンを基質とするアルカリホスファターゼによる活性測定法は、非常に強いシグナルを示すことから、高い検出感度が得られるため、微量成分の測定には好適である。【００３０】
本発明においては、非免疫分析法では、不溶性担体に固定化した酵素基質（固定化基質）を標識物質で標識し、免疫分析法では、パートナー物質（特には抗体）を標識物質で標識する。固定化基質への標識の場合、酵素による切断部位とは異なる部位で、且つ、分析対象酵素により切断されることで不溶性担体から遊離する部位（例えば、固定化末端と逆の末端）に、標識物質を結合させる。標識化基質（好ましくは酵素標識基質）又は標識化パートナー（好ましくは酵素標識パートナー物質、特には酵素標識抗体）の調製方法は周知であり、任意の方法を選択することができる。例えば、酵素にマレイミド基を導入して、基質又は抗体にチオール基を導入して、両者を反応させれば酵素標識を行うことができる。マレイミド基導入用試薬としては、Ｎ−ヒドロキシスルフォスクシニミドエステル等が好適に用いられる。またチオール基の導入用試薬としては、例えば、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物等が好適に用いられる。次に、導入したマレイミド基とチオール基とをｐＨ７以下で４℃にて一夜反応させることにより、酵素標識基質又は酵素標識抗体を作成することができる。【００３１】
標識物質由来のシグナル強度の変化を検出する手段としては、標識物質の種類及び測定機器の特性によって適宜選択され、周知の方法、例えば、比色法、蛍光法、又は発光法などを利用することができる。例えば、標識物質としてペルオキシダーゼを用いた場合、ルミノールを基質として化学発光法で検出することも可能で、特に微量測定に好適である（例えば、田中弘一郎、石川榮治：西洋ワサビペルオキシダーゼを標識とする酵素免疫測定法における蛍光法と発光法の比較、臨床検査機器・試薬、１１：５６７−５６９，１９８８)。また、標識物質としてアルカリホスファターゼを用いた場合、ＡＭＰＰＤ［3-(2’-spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3”phosphoroxy)phenyl-1,2-dioxetane］、１，２−ジオキセタン［1,2-dioxetane（ＣＤＰ−Ｓｔａｒ；トロピックス社）］等の公知基質を用いると、より好感度に検出することができるため、好ましい。【００３２】
以下、本発明の酵素分析方法について、実施態様毎に、具体的な測定手順を示すことにより、更に詳細に説明する。
本発明の酵素分析方法の一態様である非免疫分析法では、以下の工程に限定されるものではないが、例えば、目的とする酵素に対する特異的な基質の一端を標識化し、別の一端で不溶性担体（例えば、不溶性磁性粒子）と固相化した固定化基質と、酵素を含む検体とを一定時間反応させた後、固定化基質を洗浄して、固定化基質上の切断された標識化基質断片及び検体と、固定化基質とを分離する。次に、不溶性磁性粒子上に残存している切断されなかった基質の標識物質量を測定することで、検体に含まれている酵素活性を分析することができる。【００３３】
本発明における非免疫分析法は、例えば、
（Ａ１）（ａ）分析対象酵素を含有する可能性のある被検試料と、
（ｂ）分析対象酵素により切断可能な酵素基質を不溶性担体に結合させた固定化基質であって、且つ、前記酵素基質が、前記分析対象酵素の切断により前記不溶性担体から遊離する基質断片側において、標識物質で標識されている標識化固定化基質と
を液中で接触させる工程、
（Ａ２）前記液と不溶性担体とを分離する工程、並びに
（Ａ３）切断されずに不溶性担体に残存する基質、及び／又は、不溶性担体から遊離した液中の基質断片を分析する工程
を含む。【００３４】
前記工程（Ａ１）で用いる標識化固定化基質は、不溶性担体に結合され、更に、標識物質で標識された酵素基質である。前記標識化固定化基質における酵素基質部分は、分析対象酵素の特異的切断部位を有しており、前記切断部位とは異なる部位であって、且つ、分析対象酵素により切断されることで不溶性担体から遊離する部位（例えば、固定化末端と逆の末端）が標識物質で標識されている。従って、工程（Ａ１）において、分析対象酵素を含有する被検試料と、標識化固定化基質とを接触させると、分析対象酵素が標識化固定化基質の特異的切断部位で基質を切断するため、基質断片の内、標識化基質断片は不溶性担体から遊離する一方、分析対象酵素によって切断されなかった固定化基質は不溶性担体に残存する。本工程における前記接触時間は、被検試料に含有される可能性のある分析対象酵素と、固定化基質との反応が実施可能である限り、特に限定されるものではなく、反応条件（例えば、試薬及び試料の使用量、温度、ｐＨ等）に応じて適宜決定することができるが、通常、３分〜２４時間であり、好ましくは１５分〜１時間である。【００３５】
前記工程（Ａ２）では、前記工程（Ａ１）を実施した後の不溶性担体を、それ以外の画分（すなわち、遊離基質断片及び被検試料を含む液画分）と分離する。前記分離操作は、常法により実施することができ、例えば、不溶性担体として磁性粒子を用いる場合には、例えば、磁石を使用することにより、あるいは、遠心操作により分離することができ、不溶性担体としてラテックス粒子を用いる場合には、例えば、遠心操作又は濾過により分離することができる。次の工程（Ａ３）で不溶性担体に含まれる標識物質を分析する場合には、前記分離後に不溶性担体を洗浄することにより、遊離基質断片を充分に除去することが好ましい。【００３６】
前記工程（Ａ３）では、不溶性担体に残存する基質断片、若しくは、不溶性担体から遊離した液中の基質断片のいずれか一方を、又はその両方を分析することができる。
不溶性担体から遊離した液中の基質断片を分析する場合には、遊離基質断片に含まれる標識物質の量を測定することにより、遊離基質断片の量を決定することができ、更に、例えば、検量線を作成することにより、被検試料中に含有される分析対象酵素の量又は活性を決定することができる。被検試料中に分析対象酵素が含まれる場合、その酵素量又は活性に応じて、遊離基質断片の量が増加する。
一方、不溶性担体に切断されずに残存する固定化基質を分析する場合、残存する標識物質の量を測定することにより、残存標識基質（すなわち、固定化標識基質）の量を決定することができ、更に、例えば、検量線を作成することにより、被検試料中に含有される分析対象酵素の量又は活性を決定することができる。被検試料中に分析対象酵素が含まれる場合、その酵素量又は活性に応じて、固定化標識基質の量が減少する。【００３７】
本発明の酵素分析方法の別の一態様である免疫分析法では、以下の工程に限定されるものではないが、例えば、固定化基質と検体とを一定時間反応させた後、切断された断片と特異的に結合する標識化抗体を添加し、一定時間反応させて、洗浄の後、固定化基質に結合する標識化抗体量を測定することで、検体に含まれている酵素活性を分析することができる。【００３８】
本発明における免疫分析法は、前記酵素基質が前記分析対象酵素で切断されて生じるネオアンチゲンと特異的に結合し、且つ、標識物質で標識されている標識化パートナーを用いて、分析工程を実施する。以下、ネオアンチゲンが、不溶性担体に残存する基質断片側に生じるネオアンチゲンである場合を主として、本発明の免疫分析法を説明するが、当業者であれば、ネオアンチゲンが、遊離した基質断片側に生じるネオアンチゲンである場合も、適宜実施することが可能である。反応系に標識化パートナーを添加する時期は、例えば、接触工程、分離工程、又は分析工程のいずれであることもできる。【００３９】
例えば、接触工程において標識化パートナーを添加する場合には、被検試料と固定化基質との接触の前（すなわち、被検試料又は固定化基質のいずれか一方と標識化パートナーとを接触させた後、被検試料又は固定化基質の残る一方を更に接触させる）、接触と同時（すなわち、被検試料、固定化基質、及び標識化パートナーの三者を同時に接触させる）、あるいは、接触後（すなわち、被検試料及び固定化基質を接触させた後、標識化パートナーを更に接触させる）に添加することができる。標識化パートナーは、酵素基質が分析対象酵素で切断されて生じるネオアンチゲンと特異的に結合するため、酵素切断前の固定化基質とは結合せず、接触工程における酵素反応は、標識化パートナーの存在の有無と無関係に進行する。接触工程において標識化パートナーを添加する場合、被検試料に分析対象酵素が含有され、且つ、前記酵素により固定化基質が切断されて、初めて、基質断片（固定化基質断片又は遊離基質断片）と標識化パートナー（好ましくは標識化抗体）との複合体（好ましくは免疫複合体）を形成する。【００４０】
分離工程において標識化パートナーを添加する場合には、分離操作の前に、あるいは、分離操作の後に、添加することができる。例えば、分離操作の後に標識化パートナーを添加する場合であって、標識化パートナーが、不溶性担体に残存する基質断片側に生じるネオアンチゲンを認識するパートナーである場合には、分離操作で得られた不溶性担体に添加した後、不溶性担体を洗浄することにより、未反応の標識化パートナーを除去することができる。【００４１】
分析工程において標識化パートナーを添加する場合には、例えば、前記分離工程で得られた不溶性担体に標識化パートナーを添加した後、不溶性担体を洗浄して未反応の標識化パートナーを除去し、標識物質の分析を実施することができる。【００４２】
反応した標識化パートナーと未反応の標識化パートナーとの分離操作を省略することができる点で、接触工程において、あるいは、分離工程における分離操作の前に、標識化パートナーを添加することが好ましい。【００４３】
免疫分析法における分析工程では、例えば、標識化パートナーが、不溶性担体に残存する基質断片側に生じるネオアンチゲンを認識するパートナーである場合、不溶性担体に残存する基質断片に特異的に結合した標識化パートナーを分析することにより、被検試料中に含有される分析対象酵素の量又は活性を決定することができる。すなわち、不溶性担体に残存する基質断片に特異的に結合した標識化パートナーの標識物質の量を測定することにより、固定化基質断片の量を決定することができ、更に、例えば、検量線を作成することにより、被検試料中に含有される分析対象酵素の量又は活性を決定することができる。被検試料中に分析対象酵素が含まれる場合、その酵素量又は活性に応じて、固定化基質断片の量が増加するため、基質断片に特異的に結する標識化パートナーの量も増加する。【００４４】
本発明の酵素分析用キットは、少なくとも、分析対象酵素により切断可能な酵素基質を不溶性担体に結合させた固定化基質を含む。本発明の酵素分析用キットには、本発明の非免疫分析法に用いることのできるキット（以下、非免疫分析用キットと称する）と、本発明の免疫分析法に用いることのできるキット（以下、免疫分析用キットと称する）とが含まれる。【００４５】
本発明における非免疫分析用キットは、少なくとも、分析対象酵素により切断可能な酵素基質を不溶性担体に結合させた固定化基質であって、且つ、前記酵素基質が、前記分析対象酵素の切断により前記不溶性担体から遊離する基質断片側において、標識物質で標識されている標識化固定化基質を含む。
また、本発明における免疫分析用キットは、少なくとも、分析対象酵素により切断可能な酵素基質を不溶性担体に結合させた固定化基質と、前記酵素基質が前記分析対象酵素で切断されて生じるネオアンチゲンと特異的に結合し、且つ、標識物質で標識されている標識化パートナーとを含む。【００４６】
本発明の酵素分析用キットは、標識物質及び検出系などに応じて、例えば、酵素基質、洗浄液、検体希釈液、及び／又は反応増幅剤を更に含むことができる。例えば、第一試薬に固定化基質、第二試薬に基質に標識した物質の信号を発現させる物質を含ませることができる。具体的には、非免疫分析用キットとしては、例えば、
第一試薬：固定化基質溶液（標識をアルカリホスファターゼ）
第二試薬：化学発光用基質（例えばＡＭＰＰＤ）
からなる試薬構成、あるいは、免疫分析用キットとしては、例えば、
第一試薬：固定化基質溶液
第二試薬：切断断片を特異的に認識する標識化抗体（標識をアルカリホスファターゼ）
第三試薬：化学発光用基質（例えばＡＭＰＰＤ）
からなる試薬構成を挙げることができ、標識物質、検出系により、適宜組成を変更し、種々の構成とすることが可能である。【００４７】
これらの分析用キットを用いた具体的な測定方法の例を以下に説明する。まず測定しようとする酵素を含むと考えられる試料溶液を、前記酵素により切断される部位を含有し、酵素標識を行った基質を担持させた不溶性磁性粒子からなる第１試薬と共に、反応容器の液体媒体中で反応させる。あるいは、測定しようとする酵素を含むと考えられる試料溶液と、前記第１試薬と、測定しようとする不溶性磁性粒子上の基質の切断部位に対する酵素標識抗体からなる第２試薬とを反応容器の液体媒体中で反応させる。第１試薬、第２試薬を反応容器の液体媒体中に加える際、同時に加えても構わないし、別々に加えても構わない。また、加える順番についてはどの試薬から加えても構わない。【００４８】
各試薬添加後の混合は充分に行う必要があるが、均一に混合された後は混合を止め放置して反応させてもよい。反応は一般の免疫化学反応と同様に通常ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜７にて行う。温度については、通常２〜５０℃の範囲で実施可能であるが、望ましくは室温乃至は３７〜４５℃で反応させる。反応時間は、反応直後から１昼夜まで任意であるが、感度、操作性を考慮して、通常３〜６０分の範囲で設定される。【００４９】
目的のｐＨを維持するために、通常緩衝液が用いられる。緩衝液としては、例えば、ＭＥＳ（2-Morpholinoethansulphonic Acid）、リン酸等が用いられるが、弱酸性から中性で常用される殆どの緩衝液が使用可能である。多くの場合、非特異反応を避けるために、塩化ナトリウム等の塩類及び牛血清アルブミン等のタンパク質が添加される。【００５０】
不溶性磁性粒子は、反応液に対して通常０．０００１〜１重量％、好ましくは０．００１〜０．１重量％、酵素標識抗体は反応液に対して通常０．００００１〜０．１ｍＡｂｓ、好ましくは０．０００１〜０．０１ｍＡｂｓとなるように使用される。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。【００５２】
《実施例１：トロンビン活性の測定》
（１）基質の標識化
Ｃ末端ビオチン標識ペプチド基質の合成ペプチド基質（Ｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ビオチン）は、１，２−ジアミノエタントリチル樹脂と、ペプチドのＮ−末端アミノ酸残基としてＮ−α−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルグリシンとを用いるＦｍｏｃケミストリーに従い、自動ペプチド合成機を用いて合成した。ペプチドのＣ末端アミノ酸を樹脂から除去した後、５−（Ｎ−スクシンイミジロキシカルボニル）ペンチルＤ−ビオチンアミドを用いて、１，２−ジアミノエタンを介しビオチン標識した。ビオチン標識ペプチドの側鎖の全ての保護基をトルフルオロ酢酸と反応させることによって除去した。得られたＮ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ビオチンを、市販のアルカリホスファターゼ標識キット（同仁品コード：LK12）を用いて、Ｎ末のアミノ基をアルカリホスファターゼ標識した。【００５３】
（２）磁性粒子への基質の結合
ストレプトアビジン標識磁性粒子（ダイナルバイオテック社、粒径２．８μｍ）の１％懸濁液と、前項（１）で調製した標識基質（０．５ｍｇ／ｍＬ）とを５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）中で１時間反応させ、前記緩衝液で洗浄後、０．３％牛アルブミン／０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８）によるブロッキングを行い、標識基質結合磁性粒子を調製した。【００５４】
（３）血漿中のトロンビン測定
小型自動免疫測定装置（ＰＡＴＨＦＡＳＴ；三菱化学ヤトロン社製）を用いて測定を行った。詳細には、トロンビン含有量既知（０．１ＩＵ／ｍＬ）の血漿の希釈列６０μＬと標識基質結合磁性粒子の懸濁液１００μＬとを３７℃で５分間反応させ、０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８）／０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣＬ／０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００で磁性粒子を洗浄した後、ケミルミネッセンス基質溶液としてＣＤＰ−Ｓｔａｒ（トロピックス社）溶液１００μＬを混合し、３７℃で４分間反応させ、発光量をカウントした。ブランクとして、血漿に変えて生理食塩水を用いて同様の操作を行った。結果を図１に示す。【００５５】
グラフのように、トロンビンの濃度が高いほど、固定化基質が分解されて、酵素を標識した部位（基質断片）が遊離し、粒子上に残存する基質量が減少するため、発光カウントが濃度依存的に減少することがわかる。トロンビン既知濃度（又は活性）の血漿又は標準試薬を用いて検量線を作成することにより、試料中のトロンビン濃度（又は活性）を定量することができる。【００５６】
《実施例２：ＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定》
（１）基質の調製
ＡＤＡＭＴＳ１３［別称：フォン・ヴィルブラント因子（ｖＷＦ）切断プロテアーゼ（von
Willebrand Factor cleaving protease）］の基質として、ｖＷＦの部分断片（第１５９６番〜第１６６８番のアミノ酸からなる断片。以下、ｖＷＦ７３と称する）を、Koichi
Kokame, Masanori Matsumoto, Yoshihiro Fujimura, and Toshiyuki Miyata, VWF73, a
region from D1596 to R1668 of von Willebrand factor, provides a minimal
substrate for ADAMTS-13. Blood, Jan 2004; 103: 607 - 612に記載の方法に従って、調製した。【００５７】
（２）磁性粒子への基質の結合
２．４μｍの粒径の磁性ラテックス（ＪＳＲ製）の１％溶液と（１）で調製したｖＷＦ７３（５００μｇ）とを、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）中で室温にて１時間反応させ、前記緩衝液で洗浄後、０．３％牛アルブミン／０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８）によるブロッキングを行い、基質結合磁性粒子を調製した。【００５８】
（３）ｖＷＦモノクローナル抗体のアルカリホスファターゼ標識
ｖＷＦ７３のＡＤＡＭＴＳ１３による切断部位を特異的に認識するモノクローナル抗体は、Cruz
MA, Whitelock J, Dong JF. Evaluation of ADAMTS-13 activity in plasma using
recombinant von Willebrand Factor A2 domain polypeptide as substrate. Thromb
Haemost. 2003;90(6):1204-9の記載に従って作成した。プロテインＧカラムにより、抗血清からＩｇＧを精製し、更に０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．９）溶液中、４％ペプシン消化を３７℃一夜行い、Ｆ（ａｂ’）２の調製を行った。更に２−メルカプトエチルアミン溶液を添加し、３７℃で９０分間反応後、UltrogelAcA44カラムにて、Ｆａｂ’の分離を行った。アルカリホスファターゼを５０ｍｍｏｌ／Ｌホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシム、及び０．１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化亜鉛緩衝液にて透析した。この透析液にＮ−（６−マレイミドカプロイロキシ）サクシミドを添加して３０℃にて３０分間インキュベートした。セファデックスＧ−２５カラムにてゲルろ過して濃縮し、マレイミド導入アルカリホスファターゼを調製した。マレイミド導入アルカリホスファターゼ１０ｎｍｏｌ／０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７）（１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシム、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化亜鉛を含む）とＦａｂ’５０ｎｍｏｌ／０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）（５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡを含む）を混合し、４℃で２０時間インキュベートした。１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ２−メルカプトエチルアミン溶液を添加して、UltrogelAcA44カラムにて、０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ６．８）（０．１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシム、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化亜鉛を含む）でゲルろ過し、酵素標識Ｆａｂ’を得た。【００５９】
（４）ＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定
小型自動免疫測定装置（ＰＡＴＨＦＡＳＴ；三菱化学ヤトロン社製）を用いて測定を行った。詳細には、健常ヒト血漿の希釈列６０μＬと（２）で調製した基質結合磁性粒子の懸濁液１００μＬとを３７℃で５分間反応させ、更に（３）で調製したアルカリホスファターゼ標識抗ｖＷＦモノクローナル抗体を１ｍＡｂｓ．添加し、３７℃で４分間反応させた。０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８）／０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣＬ／０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００で磁性粒子を洗浄した後、ケミルミネッセンス基質溶液としてＣＤＰ−Ｓｔａｒ（トロピックス社）溶液１００μＬを混合し、３７℃で２分間反応させ、発光量をカウントした。ブランクとして、血漿に変えて生理食塩水を用いて同様の操作を行った。結果を図２に示す。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明の酵素分析方法は、例えば、臨床診断検査の用途に適用することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表フリーテキスト】
【００６１】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Artificial Sequence」の説明を記載する。配列番号１の配列で表されるアミノ酸配列は、合成基質である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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