(57)【要約】微小粒子の配置技術であって、液中で多種類の微小粒子を高精度、高密度、高速に配置することが可能な配置技術の提供。本発明の配置方法は、微小粒子固定面を有し、これに前記微小粒子３が固定化されたソース基板１、及び前記微小粒子３の配置対象となる微小粒子配置面を有するターゲット基板２の２つの基板を準備する基板準備工程と、前記ソース基板１と前記ターゲット基板２とを、前記微小粒子固定面と前記微小粒子配置面とが対面する状態で液層４を介して対置する基板配置工程と、前記微小粒子３を前記微小粒子固定面から分離させる微小粒子分離工程と、微小粒子３にかかるソース基板からターゲット基板方向への力により、分離した前記微小粒子３を前記微小粒子配置面に配置する微小粒子配置工程とを含み、前記微小粒子分離工程において、微小粒子３の固定面からの分離が、レーザー照射５で誘起される物理的な力６や化学的な力により行われる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小粒子の配置方法であって、
微小粒子固定面を有するソース基板であって前記微小粒子固定面に前記微小粒子が固定化されたソース基板、及び、前記微小粒子の配置対象となる微小粒子配置面を有するターゲット基板の２つの基板を準備する基板準備工程と、
前記ソース基板と前記ターゲット基板とを前記微小粒子固定面と前記微小粒子配置面とが対面する状態で液層を介して対置する基板配置工程と、
前記微小粒子を前記微小粒子固定面から分離させる微小粒子分離工程と、
微小粒子にかかるソース基板からターゲット基板方向への力により分離した前記微小粒子を前記微小粒子配置面に配置する微小粒子配置工程とを含み、
前記微小粒子分離工程において、微小粒子の固定面からの分離が、レーザー照射で誘起される物理的な力及び化学的な力の少なくとも一方により行われる微小粒子の配置方法。
【請求項２】
前記微小粒子分離工程において、レーザー照射で誘起される物理的な力又は化学的な力が、レンズを含む光学システムによるレーザーの集光により誘起される物理的な力又は化学的な力である請求項１記載の微小粒子の配置方法。
【請求項３】
前記微小粒子分離工程において、前記レーザーの集光部の位置が、分離させる微小粒子、又は、分離させる微小粒子近傍の前記液層若しくは前記ソース基板である請求項２記載の微小粒子の配置方法。
【請求項４】
前記微小粒子分離工程において、レーザーの集光により誘起される物理的な力が、レーザーアブレーションに基づく力学的な力であり、前記力学的な力を微小粒子に接触させることで、ソース基板から前記微小粒子を分離させる請求項２記載の微小粒子の配置方法。
【請求項５】
前記レーザーアブレーションが、衝撃波、気泡、及び、対流の少なくとも１つの発生を含む請求項４記載の微小粒子の配置方法。
【請求項６】
前記微小粒子分離工程において、レーザー照射で誘起される化学的な力がソース基板の改質及び／又はソース基板に接した微小粒子の部分の改質であり、レーザー照射による前記改質によってソース基板に微小粒子を固定化する力を弱め又は無くすことでソース基板から前記微小粒子を分離させる請求項２記載の微小粒子の配置方法。
【請求項７】
前記微小粒子分離工程において、分離させる微小粒子が、前記配置面の所望の微小粒子配置位置に対向する前記固定化面の位置に固定化された微小粒子である請求項１記載の微小粒子の配置方法。
【請求項８】
前記微小粒子分離工程及び前記微小粒子配置工程を繰り返し、前記配置面に、任意の点及び線の少なくとも一方として、前記微小粒子を配列する請求項１記載の微小粒子の配置方法。
【請求項９】
前記基板準備工程において、異なる種類の微小粒子が固定化されたソース基板を準備し、同一の微小粒子配置面に、異なる種類の微小粒子を配置する請求項１記載の微小粒子の配置方法。
【請求項１０】
前記微小粒子配置工程において、微小粒子にかかる力が、重力、磁力、静電力、光力及び浮力からなる群から選択される力である請求項１記載の微小粒子の配置方法。
【請求項１１】
前記レーザーの光が、赤外光、可視光及び紫外光からなる群から選択される光である請求項１記載の微小粒子の配置方法。
【請求項１２】
前記レーザーが、ナノ秒レーザー、ピコ秒レーザー及びフェムト秒レーザーからなる群から選択されるパルスレーザー、又は、連続発振レーザーである請求項１記載の微小粒子の配置方法。
【請求項１３】
前記微小粒子が、生体分子が固定化された担体、生体分子の結晶、生体分子の集合体、ウイルス粒子、及び細胞からなる群から選択される請求項１記載の微小粒子の配置方法。
【請求項１４】
前記生体分子が固定化された担体の担体が、昆虫ウイルス由来の多角体である請求項１３記載の微小粒子の配置方法。
【請求項１５】
前記生体分子が固定化された担体の担体が、高分子、金属、半導体、生体分子の集合体、これらの結晶及びこれらの組合せからなる群から選択される微粒子である請求項１３に記載の微小粒子の配置方法。
【請求項１６】
微小粒子配置基板の製造方法であって、請求項１に記載の微小粒子の配置方法により、微小粒子を基板に配置する工程を含む微小粒子配置基板の製造方法。
【請求項１７】
請求項１記載の微小粒子の配置方法に用いる微小粒子の配置装置であって、前記ソース基板の設置部と、前記ターゲット基板の設置部と、レーザー照射手段と、レーザー集光手段とを含む微小粒子の配置装置。
【請求項１８】
細胞又は組織の培養方法であって、生理活性を示す生体分子を含む微小粒子を請求項１記載の微小粒子の配置方法で配置して製造される細胞培養基板上で、細胞又は組織を培養することを含む培養方法。
【請求項１９】
請求項１８記載の細胞又は組織の培養方法であって、前記細胞培養基板に配置された前記微小粒子上で細胞を培養することを含み、前記生理活性を示す生体分子が、増殖、分化、移動及び死からなる群から選択されるシグナルを前記細胞に伝達する培養方法。
【請求項２０】
細胞又は組織の製造方法であって、請求項１８記載の培養方法により、細胞又は組織を培養することを含む製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、微小粒子の配置方法に関する。【０００２】  近年、バイオテクノロジーと他の分野の技術との融合により、生体機能を部分的に模した生体デバイス（バイオデバイス、バイオチップともいう）が注目されつつある。ＤＮＡ、タンパク質、糖鎖などの生体分子（バイオ分子ともいう）あるいは細胞を支持体（基板）上に固定化した生体デバイスは、固定化された前記生体分子とその他の生体分子あるいはそれ以外の化合物との特異的な相互作用の検出を大量かつ同時並行的に行うことを可能とする。例えば、基板上に任意の抗原タンパク質を配置したプロテインチップは、病気やアレルギーの早期発見のための新しいツールとなりうる。また、細胞を制御する生理活性タンパク質が基板上に配置された生体デバイスは、細胞培養基板として使用することができ（例えば、特許文献１参照）、例えば、再生医療分野の細胞培養技術への応用が期待されている。【０００３】  これらの生体デバイスの製造のために前述のような生体分子を基板上に配置する方法としては、光リソグラフィー（非特許文献１）、インクジェットプリンティング（特許文献１、非特許文献２及び３）、マイクロコンタクトプリンティング（非特許文献４）、レーザーダイレクトライティング（非特許文献５）、レーザートラッピング（特許文献２、非特許文献６）などの技術が提案されている。【０００４】  光リソグラフィーを応用したタンパク質及び細胞の配置方法は、１μｍという高精度でタンパク質をパターニングできる方法である（非特許文献１）。インクジェットプリンティングを利用したタンパク質の配置方法は、例えば、図１３Ａに示すとおり、インクジェットノズル１３１からタンパク質溶液の微小液滴１３２を基板１３３に塗布してパターニングを行う方法である。この方法では、一般に、複数種類のタンパク質を数１００μｍの精度でパターニングできる（特許文献１、非特許文献２及び３）。マイクロコンタクトプリンティングを利用したタンパク質の配置方法は、例えば、図１３Ｂに示すとおり、針先や微細構造物（マイクロスタンプ）１３４にタンパク質溶液の微小液滴１３２を付着させてそれを基板１３３に転写する方法である（非特許文献４）。レーザーダイレクトライティングを利用したタンパク質の配置方法は、例えば、図１３Ｃに示すとおり、タンパク質試料１３５に直接レーザー１３６を照射してタンパク質溶液１３２を基板１３３に転写する方法である。この方法では、複数種類のタンパク質を５０μｍ程度の精度でパンターニングできる（非特許文献５）。レーザートラッピングを利用したタンパク質の配置方法は、例えば、タンパク質が結晶状態で含まれる昆虫ウイルス由来の多角体をレーザートラッピング技術により配置する方法である（特許文献２、非特許文献６）。
【特許文献１】特開２００２−３５５０２６号公報
【特許文献２】特開２００３−１５５３００号公報
【非特許文献１】Ａ．Ｓ．Ｂｌａｗａｓ  ａｎｄ  Ｗ．Ｍ．Ｒｅｉｃｈｅｒｔ，″Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ．″Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １９，５９５−６０９（１９９８）
【非特許文献２】Ａ．Ｒｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｃｒｏｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｉｎｋ−ｊｅｔ  ｐｒｉｎｔｅｒ″ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２８，４９２−４９６（２０００）
【非特許文献３】Ｂ．Ｔ．Ｈｏｕｓｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｈｉｐｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ″Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，２７０（２００２）
【非特許文献４】Ａ．Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｍｉｃｒｏｃｏｎｔａｃｔ  ｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ″Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．１２１０６７−１０７０（２０００）
【非特許文献５】Ｐ．Ｓｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｌａｓｅｒ  ｄｉｒｅｃｔ  ｗｒｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ，″Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ａ  ７９，９４９−９５２（２００４）
【非特許文献６】Ｙ．Ｈｏｓｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．″Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｂｙ  Ｌａｓｅｒ  Ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｉｐ″Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．９６，２９４５−２９４８（２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  しかしながら、上記技術はいずれも、多種類の生体分子を高精度、高密度、高速で配置するには不利な点がある。光リソグラフィーを利用した方法では、多くの種類の生体分子を配置することは難しい。インクジェットプリンティング、マイクロコンタクトプリンティング、レーザーダイレクトライティングなどの技術を利用した方法では、多種類の生体分子を配置できるが、生体分子を含む微量な液滴１３２が空気中に射出された際、及び基板１３３に転写された際に、前記液滴１３２に含まれる生体分子が乾燥により失活してしまうおそれがある。【０００６】  さらに、上記技術はまた、生体微小粒子（生体分子の微小粒子）を基板上に配置して生体デバイスを製造する場合にも不利な点がある。例えば、生体分子が固定化された担体、生体分子の結晶、生体分子の集合体、ウイルス粒子、細胞などの生体微小粒子は、生体分子の機能を集積した素子としてみなすことができ、このような生体微小粒子が基板上に非破壊的に高精度、高密度、高速で配置・配列された生体デバイスを製造する技術の確立が望まれている。しかしながら、例えば、インクジェットプリンティング技術を微小粒子に適用した場合、高精度に配置しようとするとインクジェットのノズルに微小粒子が詰まるおそれがある。また、マイクロコンタクトプリンティング技術を微小粒子の配置に適用することは、マイクロスタンプ及び基板と微小粒子との吸着特性の高度な制御が必要となるため極めて困難である。一方、前記レーザートラッピング技術を用いると、微小粒子の高精度な配置が可能である。しかしながら、配置速度が極めて遅く、高集積度の生体デバイスを製造するには不利である。【０００７】  そこで、本発明は、微小粒子の配置技術であって、高精度、高密度、高速の配置が可能な微小粒子の配置技術の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  前記目的を達成するために、本発明の微小粒子の配置方法は、微小粒子固定面を有するソース基板であって前記微小粒子固定面に前記微小粒子が固定化されたソース基板及び前記微小粒子の配置対象となる微小粒子配置面を有するターゲット基板の２つの基板を準備する基板準備工程と、前記ソース基板と前記ターゲット基板とを前記微小粒子固定面と前記微小粒子配置面とが対面する状態で液層を介して対置する基板配置工程と、前記微小粒子を前記微小粒子固定面から分離させる微小粒子分離工程と、微小粒子にかかるソース基板からターゲット基板方向への力により分離した前記微小粒子を前記微小粒子配置面に配置する微小粒子配置工程とを含み、前記微小粒子分離工程において、微小粒子の固定面からの分離が、レーザー照射で誘起される物理的な力及び化学的な力の少なくとも一方により行われる微小粒子の配置方法である。
【発明の効果】
【０００９】  本発明者らは、タンパク質の固定化担体などの微小粒子の配置技術について鋭意研究を重ね、レーザー照射により誘起される物理的な力や化学的な力を利用すれば、微小粒子が固定化された基板から前記担体に大きな光化学的・光熱的なダメージを与えることなく分離できること、さらに、分離された微小粒子をそのまま他の基板に配置できれば、例えば、数１０μｍ以下の単一細胞スケールで前記微小粒子のパターニングが可能であることを見出し本発明に到達した。【００１０】  本発明の微小粒子の配置方法によれば、例えば、使用するレーザーの集光部の位置や大きさを調節することで、微小粒子の高密度、高精度、高速の配列が可能となる。また、レーザー照射により誘起される物理的な力や化学的な力を利用した分離は、ダメージが少ないため、例えば、微小粒子を非破壊的に配置することができる。さらに、例えば、配置する微小粒子が生体微小粒子である場合、本発明の微小粒子の配置方法によれば、例えば、水溶液中で配置できるから、タンパク質など生体分子の生理活性の維持が可能である。【００１１】  さらにまた、本発明の微小粒子の配置方法により、例えば、増殖、分化、死などの細胞機能を制御する複数種類を因子含む微小粒子を単一細胞レベルの精度で配置することで、培養する各細胞へのシグナル伝達が可能な細胞培養基板を製造できる。このような細胞培養基板を用いれば、組織形成の基礎をなす細胞配列の最低ユニットを再現し、組織誘導を図ることも可能となると考えられる。その他、本発明の微小粒子の配置方法により製造される微小粒子配置基板は、例えば、プロテインチップ、バイオリアクター、バイオセンサー及びバイオアッセイ用試験片などの用途に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１Ａ〜Ｃは、本発明の微小粒子の配置方法の一例を示す模式図である。
【図２】図２Ａ〜Ｅは、本発明のソース基板の作製例を示す模式図である。
【図３】図３は、本発明におけるソース基板及びターゲット基板の配置の構成例を示す模試図である。
【図４】図４は、本発明における配置装置の構成例を示す模式図である。
【図５】図５は、本発明における電動ステージの構成を示す模式図である。
【図６】図６Ａ〜Ｅは、本発明の配置方法のその他の例を示す模式図である。
【図７】図７Ａ及びＢは、本発明の微小粒子の配置方法により基板上に配列された多角体の顕微鏡写真の一例である（実施例１）。
【図８】図８Ａ及びＢは、本発明の微小粒子の配置方法により基板上に配列された多角体の顕微鏡写真のその他の例である（実施例２）。
【図９】図９Ａ〜Ｃは、本発明の細胞培養基板上で培養された細胞の顕微鏡写真の一例である（実施例３）。
【図１０】図１０は、本発明の微小粒子の配置方法により基板上に配列された多角体の顕微鏡写真のさらにその他の例である（実施例４）。
【図１１】図１１は、パルスレーザーを水中で集光させた場合のレーザーアブレーションに基づく力学的な力の一例の模式図である。
【図１２】図１２Ａは、本発明の微小粒子の配置方法により配置される２種類の多角体の配置の模式図であり、図１２Ｂは、本発明の微小粒子の配置方法により配置された２種類の多角体の顕微鏡写真の透過像の一例であり、図１２Ｃは、その蛍光像の一例である。
【図１３】図１３Ａ〜Ｃは、従来の技術を説明する模式図である。図１３Ａは、インクジェットプリンティング技術の模式図、図１３Ｂは、マイクロコンタクトプリンティング技術の模式図、図１３Ｃは、レーザーダイレクトライティング技術の模式図である。
【符号の説明】
【００１３】  １  ソース基板
２  ターゲット基板
３  微小粒子
４  液層
５  パルスレーザー
６  レーザーアブレーションに基づく力学的な力
７  分散液
８  マイクロピペット
９  ソース基板
１０〜１０’’’  多角体
１１  弱アルカリ液
１２  ターゲット基板
１３  ガラス基板
１４  シリコンゴム基板
１５  スペーサー
１６  液層
２０  ソース基板及びターゲット基板の配置形態
２１  正立顕微鏡
２２  ステージ
２３  コンデンサーレンズ
２４  対物レンズ
２５  光源ランプ
２６  ＣＣＤカメラ
２７  パルスレーザー照射装置
２８  λ／２板
２９  偏光板
３０  コリーメーターレンズ
３１  ダイクロイックミラー
３２  パルスレーザー
４０  配置装置
４１、４２  電動ステージ
４３  ソース基板固定用支持具
４４  ソース基板
４５  ターゲット基板
４６、４７  配置領域
４８、４９  多角体
５０  ソース基板及びターゲット基板の配置形態
５１  液層
６０  対物レンズ法線
１００  パルスレーザー
１０１  集光部
１０３  基板
１３１  インクジェット
１３２  タンパク質溶液の液滴
１３３  基板
１３４  マイクロスタンプ
１３５  タンパク質試料
１３６  レーザー
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】  本発明の微小粒子の配置方法の前記微小粒子分離工程において、レーザー照射で誘起される物理的な力又は化学的な力は、レンズを含む光学システムによるレーザーの集光により誘起される物理的な力又は化学的な力であることが好ましい。前記レーザーの集光部の位置は、分離させる微小粒子、又は、分離させる微小粒子近傍の前記液層若しくは前記ソース基板であることが好ましい。【００１５】  本発明の微小粒子の配置方法の前記微小粒子分離工程において、レーザーの集光により誘起される物理的な力は、レーザーアブレーションに基づく力学的な力であることが好ましい。前記レーザーアブレーションに基づく力学的な力を微小粒子に接触させることで、ソース基板から前記微小粒子を分離させるのである。また、前記レーザーアブレーションは、衝撃波、気泡、及び、対流の少なくとも１つの発生を含むものであることが好ましい。【００１６】  本発明の微小粒子の配置方法の前記微小粒子分離工程において、レーザー照射で誘起される化学的な力は、ソース基板の改質及び／又はソース基板に接した微小粒子の部分の改質であることが好ましい。レーザー照射によるソース基板及び／又は微小粒子の一部の改質によってソース基板に微小粒子を固定化する力を弱め又は無くすことで、ソース基板から前記微小粒子を分離させるのである。【００１７】  本発明の微小粒子の配置方法は、前記微小粒子分離工程及び前記微小粒子配置工程を繰り返すことで、任意の点及び線の少なくとも一方として、前記配置面に微小粒子を配列することができる。また、本発明の配置方法の前記基板準備工程において、異なる種類の微小粒子が固定化されたソース基板を準備することで、同一の微小粒子配置面に、異なる種類の微小粒子を配置することができる。【００１８】  本発明の微小粒子の配置方法の前記微小粒子配置工程において、微小粒子にかかる力が、重力、磁力、静電力、光力及び浮力からなる群から選択される力であることが好ましい。【００１９】  本発明の微小粒子の配置方法は、前記基板配置工程において、前記ソース基板が、前記ターゲット基板の上に位置するように配置することで、前記微小粒子配置工程において、前記微小粒子を、重力により前記微小粒子配置面に配置することが好ましい。【００２０】  本発明において、前記レーザーの光は、赤外光、可視光及び紫外光からなる群から選択される光であることが好ましい。また、前記レーザーは、ナノ秒レーザー、ピコ秒レーザー及びフェムト秒レーザーからなる群から選択されるパルスレーザー、又は、連続発振レーザーであることが好ましい。【００２１】  本発明において、前記微小粒子は、生体分子が固定化された担体、生体分子の結晶、生体分子の集合体、ウイルス粒子及び細胞からなる群から選択されることが好ましい。前記生体分子が固定化された担体の担体は、昆虫ウイルス由来の多角体であってもよく、また、高分子、金属、半導体、生体分子の集合体、これらの結晶及びこれらの組合せからなる群から選択される微粒子であってもよい。【００２２】  本発明の微小粒子配置基板の製造方法は、本発明の微小粒子の配置方法により、微小粒子を基板に配置する工程を含む製造方法である。【００２３】  本発明の���小粒子の配置装置は、本発明の微小粒子の配置方法又は本発明の製造方法に用いる微小粒子の配置装置であって、前記ソース基板の設置部と、前記ターゲット基板の設置部と、レーザー照射手段と、レーザー集光手段とを含む微小粒子の配置装置である。【００２４】  本発明の細胞又は組織の培養方法は、生理活性を示す生体分子を含む微小粒子を本発明の微小粒子の配置方法で配置して製造される細胞培養基板上で、細胞又は組織を培養することを含む培養方法である。本発明の培養方法は、前記細胞培養基板に配置された前記微小粒子上で細胞を培養することを含み、前記生理活性を示す生体分子が、増殖、分化、移動及び死からなる群から選択されるシグナルを前記細胞に伝達する培養方法であることが好ましい。また、本発明の細胞又は組織の製造方法は、本発明の培養方法により、細胞又は組織を培養することを含む製造方法である。【００２５】  次に、本発明の微小粒子の配置方法について説明する。【００２６】  本発明の微小粒子の配置方法において、微小粒子の配置とは、微小粒子の配列を含む。例えば、レーザー照射による微小粒子の１ドットの配置を連続することで、微小粒子を配列できる。【００２７】  本発明の微小粒子の配置方法で配置される微小粒子は、基板に固定化でき、レーザー照射で誘起される物理的な力や化学的な力により分離できるものであれば、特に制限されないが、例えば、生体分子が固定化された担体、生体分子の結晶、生体分子の集合体、ウイルス粒子、及び細胞などが挙げられる。また、前記生体分子は、特に制限されず、例えば、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、脂質、有機化合物、これらの複合体及びこれらの誘導体などが挙げられる。生体分子の集合体とは、例えば、タンパク質やＤＮＡを化学的に凝集させたものをいう。本発明の配置方法により製造される本発明の微小粒子配置基板の用途に応じて適宜１種又は２種類以上の微小粒子を選択できる。【００２８】  本発明の微小粒子の配置方法において、前記微小粒子の大きさは、特に制限されず、また、その大きさは、例えば、球形の場合、直径が、１０ｎｍ〜１００μｍであって、好ましくは、１００ｎｍ〜１０μｍであり、より好ましくは、１００ｎｍ〜１μｍである。また、前記微小粒子の形状は、特に制限されない。【００２９】  前記微小粒子が、生体分子が固定化される担体である場合、前記担体は、特に制限されないが、前記生体分子を固定化でき、基板に固定化できるものが好ましい。前記担体としては、固定化する生体分子に応じて従来公知の担体を使用でき、例えば、昆虫ウイルス由来の多角体、高分子、金属、半導体、生体分子の集合体、これらの結晶及びこれらの組合せからなる群から選択される微粒子などが挙げられる。これらの中でも、タンパク質を固定化する担体としては、後述する従来公知の昆虫ウイルス由来の多角体が好ましい。前記多角体は、タンパク質の生理活性を維持する効果を有するからである。本発明において、多角体とは、本来の意味である昆虫ウイルスが感染細胞内で形成する１辺が１００ｎｍ〜１０μｍの多面体構造物であって、ポリヘドリンが結晶状に会合してできた結晶構造物のほか、公知の遺伝子工学技術を用いて任意のタンパク質をその生��機能を維持したまま前記多角体に取り込ませた、いわゆる結晶性タンパク質封入体を含む（例えば、特許文献２、特開２００３−３１９７７８号公報、ＷＯ２００２／０３６７８５号パンプレット参照）。【００３０】  本発明の微小粒子の配置方法において、レーザー照射で誘起される物理的な力は、例えば、レンズを含む光学システムによるレーザーの集光により誘起される物理的な力を含み、特に限定されないが、好ましくは、レーザーアブレーションに基づく力学的な力である。前記レーザーアブレーションとは、高強度のレーザーを物質に照射して集光させた時に見られる爆発的な侵食現象をいい、例えば、水中にパルスレーザーを集光させたとき、集光部における水の多光子吸収により衝撃波、気泡、対流などが発生する現象をいい、前記気泡の発生には、いわゆる空泡（キャビテーションバブル）の発生が含まれる。本発明において、レーザーアブレーションに基づく力学的な力とは、例えば、前記衝撃波、気泡、対流などの発生による力学的な力を含むが、これらに限定されず、前記爆発的な侵食現象一般に基づく力学的な力を含む。また、前記衝撃波とは、パルスレーザーの集光部で発生する圧力波のことである。図１１に、パルスレーザーを水中で集光させた場合のレーザーアブレーションに基づく力学的な力の一例の模式図を示す。同図に記載のように、例えば、フェムト秒パルスレーザー１００を基板１０３に向けて照射して集光すると、その集光部１０１で水の多光子吸収及びレーザーアブレーションが起こり、それにより矢印方向に衝撃波、気泡、対流などの発生による力学的な力が伝搬し、点線１０２の範囲まで前記力学的な力が及ぶ。また、レーザーアブレーションは、前記水の多光子吸収を利用する他、可視光や紫外光で一光子吸収を有する分子を利用してもよい。例えば、基板中に、可視光や紫外光で一光子吸収を有する分子を添加しておき、可視光や紫外光を発するレーザーを照射して前記基板でレーザーアブレーションを誘起することもできる。【００３１】  本発明の微小粒子の配置方法において、レーザー照射で誘起される化学的な力は、例えば、ソース基板の改質及び／又はソース基板に接した微小粒子の部分の改質を含む。前記ソース基板及び／又は微小粒子の一部の改質とは、レーザーをソース基板に照射した時に見られるソース基板及び／又は微小粒子の一部の化学的状態の変化であって、例えば、ソース基板及び／又は微小粒子の一部の材質や修飾物が光反応性や光分解性の分子を含み、レーザー照射により前記分子の化学的状態が変化することを含む。このような化学的な力は、レンズを含む光学システムによるレーザーの集光により誘起されるものであることが好ましい。【００３２】  したがって、本発明の微小粒子の配置方法で使用するレーザーは、前記物理的な力や化学的な力を誘起できるものであれば特に制限されず、レーザーの光は、例えば、赤外光、可視光又は紫外光を使用できる。また、使用するレーザーは、例えば、連続発振レーザーやパルスレーザーが使用でき、前記パルスレーザーとしては、例えば、ナノ秒レーザー、ピコ秒レーザー及びフェムト秒レーザーなどの従来公知のレーザーが使用できる。具体例としては、フェムト秒チタンサファイア��ーザー、フェムト秒ファイバーレーザー、フェムト秒イットリビウムレーザー、フェムト秒エキシマレーザー、ピコ秒ＹＡＧレーザーなどが挙げられる。【００３３】  本発明の微小粒子の配置方法は、基板準備工程と、基板配置工程と、微小粒子分離工程と、微小粒子配置工程とを含む。次に、各工程について説明する。【００３４】  （基板準備工程）
ソース基板は、微小粒子固定面を有し、ここに、微小粒子が固定化されたものである。固定化される微小粒子は、前述のとおりである。また、前記微小粒子固定面は、ソース基板の片面であっても両面であってもよい。ソース基板の材質は、特に制限されず、ガラス、プラスチック、ゴムなどを使用でき、固定化する微小粒子に応じて適宜選択できる。また、ソース基板は、２つ以上の層を含む積層物であってもよく、例えば、前記微小粒子固定面として、微小粒子の固定に適した層を積層してもよい。また、ソース基板の微小粒子固定面は、微小粒子を固定するための修飾が施されても良い。前記修飾としては、例えば、アビジン修飾などの抗原抗体反応を利用した修飾、アルカンチオール修飾などの化学反応を利用した修飾が挙げられる。また、修飾基に光反応性もしくは光分解性の分子を導入することにより、化学的な力を利用する微小粒子配置面とすることができる。ソース基板の厚み、大きさは、特に制限されない。前記ソース基板は、ソース基板を通して微小粒子を視認する必要がある場合、光学的に透明であることが好ましい。また、ソース基板にレーザーを集光させてアブレーションを誘起する場合には、前述のとおり、照射するレーザー光で一光子吸収を有する分子を含ませてもよい。【００３５】  微小粒子とソース基板との固定化は、化学結合を用いる方法や、物理吸着を用いる方法などの従来公知技術から適宜選択できる。ソース基板と微小粒子との分離が物理的な力により行われる場合には、レーザーアブレーションに基づく力学的な力の物理的衝撃によりその結合が解かれる固定化方法であることが好ましい。ソース基板と微小粒子との分離が化学的な力により行われる場合には、例えば、ソース基板と微小粒子とが、光反応性や光分解性の分子を介して固定化され、レーザー照射によるソース基板の改質及び／又はソース基板に接した微小粒子の部分の改質によりその結合が解かれる固定化方法であることが好ましい。また、後述するように、１つのターゲット基板に複数の微小粒子を配置する場合には、ソース基板に複数の微小粒子を、区分して固定化してもよい。【００３６】  ターゲット基板は、微小粒子の配置対象となる微小粒子配置面を有するものである。ターゲット基板の材質は、特に制限されず、ガラス、プラスチック、ゴムなどを使用でき、配置・固定化する微小粒子に応じて適宜選択できる。また、ターゲット基板は、２つ以上の層を含む積層物であってもよく、例えば、ターゲット基板と微小粒子との固定化が必要な場合は、前記微小粒子配置面として、微小粒子の固定に適した層を積層してもよい。また、ターゲット基板の微小粒子配置面は、微小粒子を固定するための修飾が施されても良い。ターゲット基板の厚み、大きさは、特に制限されない。前記ターゲット基板は、ターゲット基板を通してターゲット基板上の微小粒子などを視認する必要がある場合、光学的に透明であることが好ましい。ターゲット基板は、例えば、微小粒子として多角体を用いる場合には、ガラス基材がポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）でコートされたものを使用できる。ＰＤＭＳによるコーティングは、ジメルチルシロキサン（ＤＭＳ）をコートし、適当な加熱（例えば、約８０℃、１分間��により重合させるなどして行うことができる。【００３７】  （基板配置工程）
本発明の微小粒子の配置方法のおける基板配置工程は、ソース基板及びターゲット基板を、前記ソース基板の微小粒子固定面と前記ターゲット基板の微小粒子配置面とが対面する状態で液層を介して配置する工程である。ソース基板とターゲット基板との距離は、特に制限されないが、ソース基板で分離した微小粒子をターゲット基板上へ精度よく配置できる距離であることが好ましい。その距離は、例えば、１００ｎｍ〜１ｍｍであって、１００ｎｍ〜１００μｍであることが好ましく、より好ましくは１００ｎｍ〜１０μｍである。【００３８】  前記ソース基板と前記ターゲット基板との間には、液層が配置される。これにより、液体のレーザーアブレーションを利用できる。前記液層としては、例えば、水溶液層が挙げられる。前記水溶液は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、各種バッファーなどを適宜使用できる。上述したとおり、生体デバイスにおいて、配置される微小粒子がタンパク質や細胞といった生体分子である場合、これらの生体分子が生体機能を維持したまま配置されることが好ましい。しかしながら、従来のインクジェットプリンティング、マイクロコンタクトプリンティング、レーザーダイレクトライティングなどの技術（図１３参照）では生体分子を射出して固定する際に、生体分子が乾燥する可能性があり、この乾燥により生体機能が失われると考えられる。したがって、乾燥に弱い生体分子の微小粒子を水溶液層中で乾燥させることなる配置できるという本発明のメリットは、非常に大きい。なお、前記液層の液体は、水溶液に制限されず、例えば、有機溶媒や油などであってもよい。【００３９】  （微小粒子分離工程）
本発明の微小粒子の配置方法における微小粒子分離工程の第１の態様として、レーザー照射で誘起される物理的な力により、前記微小粒子固定面から微小粒子を分離させる工程が挙げられる。前記物理的な力には、前述のとおり、例えば、レーザーアブレーションに基づく力学的な力が含まれる。レーザーアブレーションは、ソース基板への集光により誘起してもよいが、前記ソース基板と前記ターゲット基板との間に配置された液層のレーザーアブレーションを利用することが好ましい。レーザーの集光部は、レーザーアブレーションに基づく力学的な力により目的とする微小粒子が分離できる位置であれば、特に制限されず、例えば、直接微小粒子に集光させても良い。しかしながら、前記微小粒子の劣化などを防ぐ点からは集光部を、前記微小粒子に接触させないことが好ましい。すなわち、集光部で生じる衝撃波、気泡、対流などの力学的な力のみを接触させて前記微小粒子を分離することで、与える損傷をより低減できる。また、レーザーアブレーションによって生じる衝撃波などは、パルスとして伝搬するが、集光部からの距離が離れるほど衝撃波のパルス形状は緩和するので、衝撃波などの力は、集光部からの距離の２乗以上の関数に比例して減少する。したがって、レーザーアブレーションに基づく力学的な力影響は、集光部から遠ざかるに従い急速に低下するから、例えば、パルスレーザーの集光部の大きさ、集光位置、レーザー強度及びレーザーの光密度などを適宜選択すれば、一定範囲の微小粒子を、高精度に分離できる。例えば、集光部の大きさが１μｍの場合、その周囲の数１０μｍの範囲にある微小粒子とソース基板との結合を、衝撃波、気泡や対流の衝突などによる力学的な摂動により解くことができる（図１１参照）。【００４０】  本発明の微小粒子の配置方法における微小粒子分離工程の第２の態様として、レーザー照射で誘起される化学的な力、例えば、ソース基板の化学的な改質及び／又はソース基板に接した微小粒子の部分の改質より、前記微小粒子固定面から微小粒子を分離させる工程が挙げられる。前記ソース基板及び／又は微小粒子の一部の改質は、微小粒子が光反応性や光分解性の分子を介してソース基板に固定化されている場合に、レーザー照射により、前記分子の化学的状態を変化させ、固定する力を弱める又は無力化することを含む。前記ソース基板及び／又は微小粒子の一部の改質は、例えば、レーザーをソース基板と微小粒子との境界面に集光することで誘起できる。レーザーの集光部は、ソース基板の改質及び／又は微小粒子の一部により目的とする微小粒子が分離できる位置であれば、特に制限されず、例えば、直接微小粒子に集光させても良いし、分離させる微小粒子の近傍のソース基板であってもよい。前記微小粒子の劣化などを防ぐ点からは集光部を、前記微小粒子に接触させないことが好ましい。【００４１】  なお、本発明の微小粒子の配置方法における微小粒子分離工程は、第３の態様として、レーザー照射で誘起される物理的な力と化学的な力とを共に利用して、前記微小粒子固定面から微小粒子を分離させる工程であってもよい。【００４２】  前記微小粒子分離工程において、分離させる微小粒子のソース基板における位置は、対面するターゲッ��基板の前記微小粒子が配置される位置に相当する。すなわち、ターゲット基板の微小粒子配置面の任意の特定位置に微小粒子を配置する場合、前記配置面の特定位置に対向するソース基板の固定化面の位置に固定化された微小粒子をレーザー照射により分離させればよい。したがって、ソース基板とターゲット基板との相対位置が固定されている場合、前記ソース基板へのレーザー照射のパターニングを、そのまま、微小粒子の配置としてターゲット基板へ転写することができる。【００４３】  前記微小粒子分離工程において、レーザーの集光、集光部の大きさの調整、及び、集光位置の調整する手段としては、特に制限されないが、例えば、レンズや絞りなどの光学系のシステムで調整可能であり、好ましくは、顕微鏡を利用できる。パルスレーザーの集光部は、点状、一定の面積をもった円形又は一定の体積を持った球形などの形状であってよく、前記集光部が円形若しくは球形の場合、その半径は、例えば、０を越え１００μｍ以下であり、好ましくは、０を越え１０μｍ以下であり、より好ましくは、０を越え１μｍ以下である。【００４４】  前記微小粒子分離工程において、パルスレーザーを集光させる集光位置は、前述のとおり、分離させる微小粒子の近傍のソース基板又は液体が好ましく、分離させる微小粒子の範囲に応じて適宜調整できる。パルスレーザーの集光位置と微小粒子との距離としては、例えば、０を超え１ｍｍ以下であって、０を超え１００μｍ以下が好ましく、より好ましくは、０を超え１μｍ以下である。【００４５】  前記微小粒子分離工程の第１の態様において、レーザーアブレーションにより５０μｍ以内の半径領域の微小粒子の配置に使用する場合のパルスレーザーの光密度（光子流量：ｐｈｏｔｏｎ  ｆｌｕｘ）は、例えば、５×１０５〜１×１０１２（ｗａｔｔ）であり、好ましくは、５×１０５〜１×１０９（ｗａｔｔ）であり、より好ましくは５×１０５〜１×１０７（ｗａｔｔ）である。【００４６】  ここで、５０μｍ以内の半径領域の微小粒子の配置についての光密度を示したが、パルスレーザーが影響を及ぼす領域は領域半径の２乗に比例するため、たとえば１０μｍ以内の半径領域の微小粒子を配置したい場合のパルスレーザーの光密度は上記の場合の２５分の１、１００μｍ以内の半径領域の微小粒子を配置したい場合のパルスレーザーの光密度は上記の場合の４００倍となる。また、パルスレーザーのパルス幅をΔｔとした場合、パルスレーザーの強度（Ｉ）とパルスレーザーに光密度（Ｄ）の関係は、下記式で表される。
Ｉ＝Ｄ×Δｔ
このように使用するパルスレーザーの強度は、微小粒子と集光位置との距離、分離させる微小粒子の範囲などに応じて適宜調整できるが、汎用のフェムト秒レーザー（Δｔ＝１００ｆｓ）を用いた場合の例を、下記表１に示す。【００４７】
【表１】
2006104048.tif 000002
【００４８】  前記微小粒子分離工程の第２の態様において、ソース基板の化学的改質により微小粒子を分離させる場合のパルスレーザーの強度は、例えば、１×１０−９〜１０（Ｊ／ｐｕｌｓｅ）であり、好ましくは、１×１０−６〜１（Ｊ／ｐｕｌｓｅ）であり、より好ましくは、１×１０−６〜１×１０−３（Ｊ／ｐｕｌｓｅ）である。また、連続発振レーザーを使用する場合、そのレーザー強度は、例えば、１×１０−６〜１０（ｗａｔｔ）であり、好ましくは、１×１０−４〜１（ｗａｔｔ）であり、より好ましくは、１×１０−４〜１×１０−２（ｗａｔｔ）である。【００４９】  本発明において、パルスレーザーの波長は、例えば、１９０ｎｍ〜２０μｍのレーザーが使用でき、その中でも、例えば、液層で集光させる場合、直接的に強い吸収のある紫外線よりも、赤外光のほうが使用する基板などの材料に関係なくレーザーの集光部で衝撃波を発生できることより、前記波長は、４００ｎｍ〜１１００ｎｍが好ましく、より好ましくは、６００ｎｍ〜１１００ｎｍである。【００５０】  １ドットの微小粒子を前記固定化面から分離させるためのパルスレーザーの照射回数は、特に制限されず、例えば、１発（単発）から１０００万発であり、好ましくは単発から１０００発、より好ましくは単発から１０発であり、さらに好ましくは単発である。ここで、本発明において、１ドットとは、単一集光点へのレーザー照射により、ソース基板の固定面から分離され、ターゲット基板の配置面に配置される微小粒子の領域をいう。また、繰り返し照射する場合のレーザーの繰り返し周波数は、例えば、１Ｈｚ〜１００ＭＨｚであり、好ましくは、１Ｈｚ〜１ＭＨｚであり、より好ましくは、１Ｈｚ〜１ｋＨｚであり、さらにより好ましくは、１Ｈｚ〜２０Ｈｚである。【００５１】  （微小粒子配置工程）
本発明の微小粒子の配置方法における微小粒子配置工程は、微小粒子にかかるソース基板からターゲット基板方向への力により、前記分離工程により分離された微小粒子を、ターゲット基板の配置面に配置する工程である。微小粒子をソース基板からターゲット基板へ移動させる力としては、例えば、重力、磁力、静電力、浮力などが挙げられる。その他の態様として、前記分離工程により分離された微小粒子を、レーザーによる光力（光の放射圧）を利用したレーザートラッピング法を用いて捕捉し、ターゲット基板へ移動させる工程が挙げられる。【００５２】  この工程の好ましい態様としては、微小粒子を、重力により、ソース基板からターゲット基板上へ落下させることがあげられる。この態様の一例を、図１Ａ〜Ｃを用いて具体的に説明する。なお、図１Ａ〜Ｃにおいて、同一箇所には同一の符号を付している。まず、図１Ａの模式図のように、微小粒子３が固定化されたソース基板１を、液層４を介してターゲット基板２上に配置する。次に、図１Ｂの模式図のように、レーザー５を集光させることによりレーザーアブレーションを誘起し、レーザーアブレーションに基づく力学的な力６を生じさせ、それにより、微小粒子３をソース基板１から分離させる。そして、図１Ｃの模式図のように、分離した微小粒子３が、落下してターゲット基板２上に配置される。このように、本発明の配置方法によれば、ソース基板へのレーザー照射のパターニングを、そのまま、ターゲット基板上の前記微小粒子の配列として転写することができる。【００５３】  また、微小粒子の移動させる力のその他の態様として、微小粒子に、例えば、磁性や電荷を持たせることで、ソース基板からターゲット基板へ移動させる方法が挙げられる。さらにその他の態様として、例えば、ソース基板をターゲット基板の下に液層を介して配置し、前記液中における微小粒子の浮力を利用する方法も挙げられる。これらの態様の移動方法は、従来公知の技術により、適宜実施可能である。【００５４】  配置された微小粒子のターゲット基板への固定化は、特に制限されず、必要に応じて、従来公知の化学結合を用いる方法や、物理吸着を用いる方法などを利用して実施できる。また、ＰＤＭＳコーティングされたターゲット基板を使用してこれに多角体を固定化する場合には、そのままでも多角体は固定化されるが、多角体を配置した後に、例えば、３７℃で６時間加熱することでより硬化させることができる。【００５５】  以上の本発明の微小粒子の配置方法において、前記微小粒子分離工程及び前記微小粒子配置工程を繰り返すことで、前記配置面に、任意の点及び／又は線として、前記微小粒子を配列することができる。また、異なる種類の微小粒子が固定化されたソース基板を利用すれば、後述の例で説明するように、同一ターゲット基板に複数種類の微小粒子配置することができる。【００５６】  次に、微小粒子の例として昆虫ウイルス由来の多角体を用いた本発明の多角体の配置方法を具体的に説明する。ここで、昆虫ウイルス由来の多角体は、上述のとおり、ポリヘドリンというウイルスの外殻タンパク質が形成する結晶性の物質であって、任意のタンパク質をその内部に活性を維持したまま取り込ませ、タンパク質の担体と��て利用可能な物質である（例えば、特許文献１、特開２００３−３１９７７８号公報、ＷＯ２００２／０３６７８５号パンプレット参照）。ただし、本発明の微小粒子は、前記多角体に限定されない。【００５７】  （ソース基板の準備）
本発明の多角体の配置方法におけるソース基板の準備工程の一例を、図２Ａ〜Ｄを用いて説明する。なお、同図において、同一箇所には同一の符号を付している。まず、図２Ａの模式図のように、水、生理食塩水、もしくは各種バッファーに多角体を分散させた多角体分散液７を、マイクロピペット８を用いて、ガラス基板９の微小粒子固定面に滴下し、数時間、室温で放置する。すると、図２Ｂの模式図のように、自然乾燥することにより、前記多角体１０が、ガラス基板９の固定化面に吸着する。このように、自然乾燥することにより、多角体１０と基板９とは、静電力により接着し、その後、水などを滴下しても剥離しない。次に、図２Ｃの模式図のように、ガラス基板９の固定化面に吸着させた多角体１０上に、マイクロピペットを用いて弱アルカリ水溶液１１を滴下して数分程度放置して、アルカリ処理する。ポリヘドリンの結晶性多角体は、アルカリ溶液により溶解することがしられており、この処理により、前記乾燥で活性を失った多角体表面のタンパク質を活性化する。最後に、前記弱アルカリ水溶液をマイクロピペットで除去し、図２Ｄの模式図のように、多角体１０が基板９の固定化面に固定化されたソース基板が準備される。前記弱アルカリ水溶液としては、例えば、ｐＨ１０．３のカルボネートバッファーなどがあげられる。なお、前記多角体表面のアルカリ処理による活性化は、例えば、抗原抗体反応、多角体表面からの緑色蛍光タンパク質の発光により判断できる。固定化される領域の大きさは、特に制限されず、例えば、その直径が、１ｍｍ以下である。この場合、基板上に滴下する液滴の数は特に制限されず、例えば、図２Ｅのように、ガラス基板９の固定化面に、複数種類の多角体１０〜１０’’’を固定化してもよい。したがって、例えば、１ｃｍ角の基板を用い、１つの固定化領域の大きさを直径１ｍｍ程度とした場合、１枚の基板上に、約１００種類の異なるタンパク質を含む多角体を配置することができることとなる。【００５８】  （ソース基板及びターゲット基板の配置）
次に、ソース基板及びターゲット基板が、ソース基板の微小粒子固定面とターゲット基板の微小粒子配置面とが対面する状態で液層を介して配置される形態を構築する。図３に、配置形態の一例の模式図を示す。同図のように、ソース基板及びターゲット基板の配置形態２０は、ターゲット基板１２上に、スペーサー１５によって形成される液層１６を介して、前記準備工程で準備した多角体１０が固定化されたソース基板９が配置された構成である。なお、図３に示すターゲット基板１２は、ガラス基板１３に、微小粒子配置面として、シリコンゴムシート１４が積層されたターゲット基板の一例である。後述するように、シリコンゴムシート１４により、分離後に配置された多角体１０のターゲット基板１２への固定化作業を省略できるため、好ましい。前記スペーサー１５の材質は、特に制限されず、例えば、シリコンゴム、プラスチックシート、金属薄板などを使用でき、その厚みは、特に制限されず、例えば、１００μｍである。前記シリコンゴムシート１４の厚みも、特に制限されず、例えば、１００μｍである。【００５９】  （多角体の分離及び配置工程）
多角体の分離工程及び配置工程は、例えば、顕微鏡を利用した本発明の配置装置を用い、前記配置形態２０のように構成されたソース基板及びターゲット基板に対してレーザー照射することにより実施できる。図４に、本発明の多角体の配置方法に使用できる本発明の配置装置の一例を示す。同図のとおり、本発明の配置装置４０は、正立顕微鏡２１及びパルスレーザー照射装置２７を主要構成要素としている。正立顕微鏡２１は、ステージ２２と、コンデンサーレンズ２３と、対物レンズ２４と、光源ランプ２５と、ＣＣＤカメラ２６と、ダイクロックミラー３１とを備えている。前記ステージ２２上には、配置形態２０のようにソース基板及びターゲット基板が配置される。正立顕微鏡２１のステージ２２の下方には、コンデンサーレンズ２３が配置され、その下には、光源ランプ２５が配置され、この光を検出するＣＣＤカメラ２６が顕微鏡２１上部に配置されている。正立顕微鏡２１の外部に、パルスレーザー照射装置２７が配置されており、正立顕微鏡２１及びパルスレーザー照射装置２７との間には、光学システムが配置されている。前記光学システムは、λ／２板２８、偏光子２９及びコリーメーターレンズ３０からなり、この順序で、発射されたパルスレーザー３２が通過する。正立顕微鏡２１内に導入されたパルスレーザー３２は、ダイクロイックミラー３１で反射され、対物レンズ２４を通して、配置形態２０のように構成されたソース基板及びターゲット基板に照射される。この装置では、前記λ／２板２８及び偏光子２９により、パルスレーザー３２の強度を調節でき、また、前記コリーメーターレンズ３０により、パルスレーザー３２を顕微鏡の結像面に集光するように調節でき、ステージ２２により、パルスレーザー３２の集光位置を調節できる。なお、この例では、正立顕微鏡を用いて、ソース基板の上方からレーザーを照射する装置の例を取り上げたが、倒立顕微鏡を用いて、ターゲット基板の下方からレーザーを照射してもよい。【００６０】  この装置４０を使用した多角体の分離及び配置は、例えば、次のようにして行う。まず、正立顕微鏡２１のステージ２２にソース基板とターゲット基板とを図３に示すような配置形態２０のように配置する。そして、ＣＣＤカメラ２６で、前記ソース基板及びターゲット基板の様子を観察し、分離させる多角体を決定する。そして、パルスレーザーの集光位置が適当な位置になるように、ステージ２２で調整する。ついで、パルスレーザー照射装置２７によりパルスレーザー３２を照射し、前記光学システムで強度などを調整して前記ソース基板及びターゲット基板にレーザーを照射する。パルスレーザーの集光部では、レーザーアブレーションが誘起される。この状態を、前述した図１Ｂを用いて説明する。同図のように、ソース基板１とターゲット基板３との間の液層４中にパルスレーザー５が集光し、レーザーアブレーションが誘起され、レーザーアブレーションに基づく力学的な力６が生じると、それにより、集光部近傍の微小粒子（多角体）３が、ソース基板１より分離し、重力によりターゲット基板２に落下する。そして、落下した前記微小粒子（多角体）３は、図１Ｃのように、ターゲット基板２上に着地し、配置されるのである。ここで、前述のように、ターゲット基板２に、微小粒子配置面としてシリコンゴムを使用すると、着地した多角体とシリコンゴムとが静電力によって接着し、その後の固定化作業を省くことができるため、好ましい。【００６１】  本発明の配置装置を用いて、ステージを移動させながらパルスレーザーを連続照射することで、ターゲット基板へ任意の形状に多角体配列を書き込むことが可能となる。書き込む線の幅は、特に制限されず、前述のとおり、パルスレーザーの強度などで調整可能であるが、例えば、１μｍ〜５０ｃｍの範囲であり、好ましくは、１μｍ〜１ｃｍの範囲であり、より好ましくは、１０μｍ〜１ｍｍの範囲とすることができる。また、書き込みスピードは、特に制限されないが、例えば、１μｍ／ｓｅｃ〜１０ｃｍ／ｓｅｃの範囲であり、好ましくは、１μｍ／ｓｅｃ〜１ｍｍ／ｓｅｃの範囲であり、より好ましくは、１０μｍ／ｓｅｃ〜１００μｍ／ｓｅｃの範囲とすることができる。このように、本発明の配置装置を用いた本発明の微小粒子の配置方法によれば、高精度、高密度、高速な微小粒子の配置が可能となる。なお、本発明の配置装置は、ソース基板の設置部と、ターゲット基板の設置部と、レーザー照射手段と、レーザー集光手段とを含む装置であれば、上記の例に制限されない。【００６２】  前述のとおり、多角体には、従来公知の遺伝子操作により、様々なタンパク質を担持させることができる。そこで、前述の図２Ｅのような、異なる種類のタンパク質を担持した多角体１０〜１０’’’が配置されたソース基板を使用して、ターゲット基板上に複数種類の多角体を任意に配列する本発明の配置方法について説明する。この配置方法は、例えば、図５の展開模式図で示すソース基板及びターゲット基板の配置形態５０を利用することで実施できる。同図において、配置形態５０は、２つの電動ステージ４１と４２とを主要構成要素としており、ターゲット基板４５を固定できる電動ステージ４１上に、固定支持具４３を介してソース基板４４を固定できる電動ステージ４２が配置される。配置形態５０において、電動ステージ４１を移動する時は、電動ステージ４２もその相対位置を変化することなく移動し、電動ステージ４２を移動するときは、電動ステージ４２のみが移動するように設定する。【００６３】  前記配置形態５０のように配置されるソース基板及びターゲット基板を用いた多角体の分離及び配置は、例えば、図６Ａ〜Ｅのようにして行う。なお、電動ステージが設置される配置装置は、例えば、図４のような正立顕微鏡でも、倒立顕微鏡でもよく、適宜選択できる。なお、図６において、図５と同一箇所には、同一符号を付す。図６Ａ〜Ｅは、ターゲット基板４５の領域４６に、多角体４８を、領域４７に、多角体４９を、それぞれ、液層５１中で配置する工程を示した模式図である。図示しないが、ターゲット基板４５は、図５の電動ステージ４１に固定され、ソース基板４４及び固定支持具４３は、図５の電動ステージ４２に固定されている。なお、破線６０は、レーザーの照射位置、すなわち、配置装置である顕微鏡の対物レンズの法線を示す。まず、図６Ａのように、領域４６に多角体４８を配置すべく、ターゲット基板４５及びソース基板４４を、それぞれ、レーザ���照射位置の破線６０上に移動させ、図６Ｂのように、レーザー照射により、ターゲット基板４５の領域４６上に多角体４８を配置する。次に、図６Ｃのように、ターゲット基板４５が固定された電動ステージ４１（図５参照）を移動し、領域４７を破線６０上に位置させる。しかし、この状態では、破線６０上のソース基板４４の領域には、多角体４９がない。そこで、図６Ｄのように、電動ステージ４２（図５参照）でソース基板４４のみを移動し、多角体４９を破線６０上に位置させる。これにより、図６Ｅのように、ターゲット基板４５の領域４６及び４７上に、異なる種類の多角体４８及び４９をそれぞれ配置できる。ここで、前記液層５１は、図３のように密閉しても良いが、密閉することなく表面張力によりソース基板４４とターゲット基板４５との間に保持することができる。また、ソース基板４４やターゲット基板４５が移動した際でも前記液層５１により常に試料部が覆われるように維持することが可能である。【００６４】  図６のソース基板４４において、各種類の多角体の固定化領域が１ｍｍ弱であれば、ソース基板４４の１ｃｍ２の領域に、約１００種類のタンパク質が担持された多角体を固定化することができる。また、電動ステージは、数μｍの精度で制御可能である。このように、本発明の多角体の配置方法によれば、異なるタンパク質を担持した多角体を、同一ターゲット基板上に、任意の位置に、高精度、高密度、高速で配置することが可能である。【００６５】  以上、本発明の多角体の配置方法の一例を説明したが、この例における本発明のソース基板及びターゲット基板の配置形態、配置装置、配置方法は、多角体に限定されず、他の微小粒子についての本発明の微小粒子の配置方法にも使用できる。【００６６】  次に、本発明の微小粒子配置基板について説明する。本発明の微小粒子配置基板は、微小粒子が、本発明の微小粒子の配置方法を用いて基板上に配列されたものであり、その製造方法は、本発明の微小粒子の配置方法を用いる他は、特に制限されない。本発明の微小粒子配置基板は、固定化する微小粒子を、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、脂質、有機化合物などとすることで、例えば、細胞培養基板、プロテインチップ、ＤＮＡチップ、バイオリアクター、バイオセンサー、バイオアッセイ用試験片など、従来公知の様々な用途に、特に制限されることなく、使用できる。【００６７】  これらの中でも、本発明の細胞培養基板について説明する。本発明の細胞培養基板は、生理活性物質が基板上に配列された細胞培養基板であって、本発明の配置方法により生理活性物質又は生理活性物質固定化担体を含む微小粒子が基板に配列されて製造されたものである。前記生理活性物質としては、例えば、増殖、分化、死などの機能を制御する従来公知のタンパク質などが挙げられる。これらを複数種類配列することにより、様々なタンパク質性細胞間シグナル伝達物質を、個々の細胞レベルで作用させることができる。このように、本発明の細胞培養基板の配置された微小粒子上で細胞を培養することで、細胞ごとに増殖・分化などのコントロールが可能になる。前記生理活性物質の具体例としては、サイトカイン、ホルモン、増殖因子などが挙げられるが、これらに限定されない。なお、本発明の細胞培養基板には、加えて、生理活性を有さない微小粒子が配列されてもよい。【００６８】  本発明の細胞又は組織の培養方法は、本発明の細胞培養基板を用いて細胞や組織を培養する方法あり、本発明の細胞又は組織の製造方法は、本発明の細胞又は組織の培養方法よって培養して細胞又は組織を得る方法である。本発明の細胞又は組織の培養・製造方法において培養する細胞は、特に制限されない。本発明の細胞又は組織の培養・製造方法によれば、従来方法では困難であった、組織化を誘導する高度な細胞の配列と制御が可能となり、組織形成の基礎をなす細胞配列の最低ユニットの再現が可能となる。【００６９】  以下に、実施例を用いて本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【００７０】  （多角体の調製）
昆虫ウイルス由来のタンパク質（ポリヘドリン）が形成する結晶性媒体である多角体のみからなるタンパク質固定化担体を、以下のようにして作製した。まず、カイコ細胞質多角体病ウイルス（ＢｍＣＰＶ）の立方体の多角体を形成するために、昆虫ウイルスベクターＡｃＮＰＶにポリヘドリン遺伝子を組み込んだ組換えウイルスベクターＡｃＣＰ−Ｈ（Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７４，９９−１０２）を、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来のＩＰＬＢ−Ｓｆ２１−ＡＥ（Ｓｆ２１）細胞に感染させた。次に、４日目の感染細胞から立方体の多角体を回収し、ＰＢＳ（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で洗浄した後、ホモジナイザーを用いて氷中で磨砕した。前記磨砕液を１％のＴｗｅｅｎ２０で洗浄した後、遠心により多角体を回収し、さらに１．５Ｍ〜２．２Ｍのショ糖密度勾配で５０，０００×Ｇで４５分間遠心し、多角体の分画を抽出した。そして、抽出したサンプルをＰＢＳで洗浄した後、１５，０００×Ｇで１０分間遠心することにより、結晶性ポリヘドリン封入体のみからなる多角体を回収した。【００７１】  （ソース基板の作製）
多角体を水に分散させ、１ｍｍ程度の液滴となるように、マイクロピペットを用いてガラス基板（厚み１００μｍ）上に滴下し、２４℃で、数時間放置し、自然乾燥させた。その後、弱アルカリ性水溶液（ｐＨ１０．３）を多角体表面に滴下して数分程度放置し、多角体表面を溶解し、前記アルカリ水溶液を、ピペットを用いて除去することにより、ソース基板を作製した。【００７２】  （多角体の配列）
ターゲット基板としてガラス基板上にシリコンゴムシート（厚み１００μｍ）を積層したものを用いた。ターゲット基板上に、シリコンゴムシート（厚み１００μｍ）をくり抜いた作製したスペーサーを配置し、そのくり抜いた部分に水を充填し、さらにその上に、多角体を接着させた面が下方となるように前記ソース基板を配置し、密閉し、配列用プレートを作製した。これを、図４に示すような正立顕微鏡２１のステージ２２に配置し、多角体の配列過程および配列後の様子を、ＣＣＤカメラ２６により観察した。なお、レーザー照射装置２７として、高出力フェムト秒レーザー照射装置（１２０ｆｓ、８００ｎｍ、２０Ｈｚ、１０ｍＷ）を使用した。【００７３】  配列用プレートの上部から、強度１５０ｎＪ／ｐｕｌｓｅでフェムト秒レーザー照射し、集光部の大きさを約１μｍとして、水層で集光させ（ソース基板表面から５μｍ付近）、多角体をターゲット基板上に配列した。その結果、速度約１μｍ／ｓｅｃで、多角体を配列できた。配列した多角体は、その後、ソース基板および水層を取り除いても、ターゲット基板上から剥離しなかった。【００７４】  多角体を配列した結果の一例を、図７に示す。図７ＡおよびＢは、多角体を配列したターゲット基板の顕微鏡写真であり、図７Ｂは、図７Ａの四角で囲った部分を拡大したものである。図７Ａにおいて、線状に見えている部分が配列した多角体であり、図７Ｂにおいて、四角に見える各々が多角体である。この結果により、本発明の方法によれば、極めて速い速度で、多角体１つの大きさに相当する線幅で配列できるといえる。
【実施例２】
【００７５】  フェムト秒レーザーの強度を、３００ｎＪ／ｐｕｌｓｅとした以外は、実施例１と同様にして、多角体を配列した。その結果を図８ＡおよびＢに示す。図８ＡおよびＢは、多角体を配列したターゲット基板の顕微鏡写真であり、図８Ｂは、図８Ａの四角で囲った部分を拡大したものである。この「ＪＳＴ」の３文字の配列に要した時間は、約１分であり、速度約１０μｍ／ｓｅｃで、多角体を配列できた。また、この線幅は動物細胞の大きさとほぼ同じである。したがって、この多角体の配列上に動物細胞を培養することにより、特定の個々の細胞に対して多角体を作用させることができるといえる。
【実施例３】
【００７６】  実施例２で作製した細胞培養基板を培養液（培地：Ｄｕｌｂｅｃｃ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ５％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）に浸漬し、そこにＮＩＨ３Ｔ３株を添加した。数分後、添加した細胞は細胞培養基板上に着床し、ＣＯ２インキュベーター中で細胞を２４時間培養した。その結果を、図９Ａ〜Ｃに示す。図９Ａ〜Ｃは、細胞培養基板の顕微鏡写真であり、図９Ｂは、図９Ａにおいて下方の四角で囲った部分を拡大したものであり、図９Ｃは、同図において上方の四角で囲った部分を拡大したものである。これら図において、液滴状の模様が増殖した細胞であり、細胞培養基板上と比較して多角体上において、細胞が顕著に増殖した。これは、細胞培養基板（ターゲット基板）上よりも、タンパク質で構成されている多角体上の方が、細胞にとって増殖しやすい環境であるためと考えられる。このように、本発明によれば、細胞の増殖を制御できるといえる。
【実施例４】
【００７７】  （ＥＧＦＰが固定化された多角体の調製）
ＢｍＣＰＶの外殻タンパク質の１つであるＶＰ３タンパク質とＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）タンパク質との融合タンパク質を発現可能な組換えウイルスベクターＡｃＶＰ３／ＥＧＦＰと、実施例１用いた多角体タンパク質を発現する組換えウイルスベクターＡｃＣＰ−Ｈとを、Ｓｆ２１細胞にダブル感染させた他は、実施例１と同様にして、ＥＧＦＰタンパク質が包埋された結晶性ポリヘドリン封入体を回収した。【００７８】  （ソース基板の準備）
ポリヘドリンのみからなる多角体と、ＥＧＦＰタンパク質が固定化された多角体とが同一の微小粒子固定面に固定化されたソース基板（図２Ｅ参照）を、実施例１と同様にして準備した。【００７９】  （２種類の多角体の配列）
前記ソース基板と、実施例１と同様のターゲット基板を、図５の配置形態５０のように配置されるソース基板及びターゲット基板を備えた本発明の配置装置で、図６のようにして、ＥＧＦＰ固定化多角体及びポリヘドリンのみの多角体の２種類の多角体をターゲット基板上に配置した。その結果を図１０に示す。同図は、ターゲット基板の蛍光顕微鏡写真であり、同図において、円で囲った部分が、ＥＧＦＰを導入させた多角体を配置した箇所であり、四角で囲った部分が、ＥＧＦＰを導入させなかった多角体を配置した箇所である。ＥＧＦＰを導入させた多角体から、ＥＧＦＰに起因する発光が観察されたことから、本発明の配置方法によれば、タンパク質の活性を維持したままタンパク質固定化担体を配置できることが示された。
【実施例５】
【００８０】  （ソース基板及びターゲット基板の準備）
実施例４と同様にして、ＥＧＦＰを含む多角体とＥＧＦＰを含まない多角体とが同一の微小粒子固定面に固定化されたソース基板を準備した。また、ガラス基板にジメルチルシロキサン（ＤＭＳ）をコートし、その後８０℃で１分間加熱して厚さ約２０μｍのポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）コートを形成させることによりターゲット基板を準備した。【００８１】  （２種類の多角体の市松模様のパターニング）
レーザー周波数を１ｋＨｚ、強度を３１ｎＪ／ｐｕｌｓｅ、集光部をソース基板表面から約２μｍ、及び、配置速度を９０μｍ／ｓｅｃとした以外は、実施例４と同様にして本発明の配置装置により市松模様のパターニングをした。すなわち、４０μｍ×４０μｍのブロックを、ＥＧＰＦ含有多角体及びＥＧＦＰ非含有多角体を交互に使用して配置した。各ブロックは、５μｍの間隔の直線でレーザー走査することにより配置した。各ブロックの間隔は、５μｍとした。この配置の模式図を図１２Ａに示し、実際に配置したターゲット基板の透過像の一例を図１２Ｂに示す。図１２Ｂに示すような配置は、約３０分で行うことができた。このターゲット基板を蛍光顕微鏡観察したところ、図１２Ｃに示すとおり、市松模様の蛍光像を得ることができた。
【産業上の利用可能性】
【００８２】  以上説明したように、本発明の微小粒子の配置方法は、レーザーアブレーションを利用する配置方法である。本発明によれば、例えば、生理活性因子が固定化した担体を、高精度、高密度、高速で、さらに、配列するタンパク質などの生理活性の維持も可能な配列技術が提供できるから、様々なバイオチップを利用する分野で有用である。その中でも、本発明は、例えば、再生医療分野で有用である。すなわち、本発明の配置方法により作製される細胞培養基板を用いれば、固定化された様々な細胞シグナル伝達因子を、単一細胞レベルで作用させることが可能となり、組織化と誘導するような高度な細胞の配列や制御が可能となる。このように、本発明は、組織形成の基礎をなす細胞配列の最低ユニットを再現し、組織誘導を図ることにより、組織や臓器の再生技術に寄与しようとするものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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