(57)【要約】  本発明は、アクチノヒビン多量体を含むことを特徴とする抗ＨＩＶ薬、アクチノヒビン多量体であるポリペプチド、それをコードする遺伝子及び抗ＨＩＶ薬の製造方法であり、合胞体形成を阻害することによる抗ＨＩＶ薬であってさらに効果を高めた抗ＨＩＶ薬の提供を目的とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクチノヒビン多量体を含むことを特徴とする抗ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）薬。
【請求項２】
アクチノヒビン多量体が、
(a)配列番号１で表わされるポリペプチド、及び
(b)(a)のアミノ酸配列中の１個または複数のアミノ酸が欠失もしくは置換され、または付加されてなる合胞体形成阻害活性を有するホモログ
から選択される複数のポリペプチド（同一であっても異なっていてもよい）を
５０個以下のアミノ酸からなるリンカーで連結したものである請求項１記載の抗ＨＩＶ薬。
【請求項３】
アクチノヒビン多量体がアクチノヒビン２量体である請求項１または２記載の抗ＨＩＶ薬。
【請求項４】
前記リンカーが配列番号２で表わされるペプチド鎖である請求項１〜３のいずかに記載の抗ＨＩＶ薬。
【請求項５】
さらにＨｉｓタグを含む請求項１〜４のいずかに記載の抗ＨＩＶ薬。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の抗ＨＩＶ薬に対応するポリペプチド。
【請求項７】
請求項６に記載のポリペプチドをコードする塩基配列またはその相補鎖。
【請求項８】
請求項７に記載の塩基配列を宿主細胞に導入した形質転換体。
【請求項９】
宿主細胞が大腸菌または放線菌である請求項８に記載の形質転換体。
【請求項１０】
Escherichia coli BL21（DE3）pLysS/pET30:dAH株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１６１）である請求項９に記載の形質転換体。
【請求項１１】
請求項９〜１０に記載の形質転換体を培養して形質転換体内または培養物中に請求項６に記載のポリペプチドを産生させ、これを単離することを含む請求項１〜５のいずれかに記載の抗ＨＩＶ薬の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ：human immuno deficiency virus）に対する抗ウイルス薬（抗ＨＩＶ薬）、これを構成するポリペプチド、このポリペプチドをコードするＤＮＡ、このＤＮＡを用いて形質転換した形質転換体及び前記抗ＨＩＶ薬の製造方法に関する。特にＨＩＶ−１ウイルスに対する抗ウイルス薬（抗ＨＩＶ薬）、これを構成するポリペプチド、このポリペプチドをコードするＤＮＡ、このＤＮＡを用いて形質転換した形質転換体及び前記抗ＨＩＶ薬の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、ＨＩＶウイルスにより引き起こされる後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に対する治療剤としては、逆転写酵素阻害剤及びプロテアーゼ阻害剤が用いられている。【０００３】
逆転写酵素阻害剤は、ヌクレオチド系阻害剤と非ヌクレオチド系阻害剤に大別されるが、ヌクレオチド系阻害剤の長期投与は重篤な副作用を示し、投与開始後１年程度で耐性株が出現することが知られている。また、非ヌクレオチド系阻害剤は、副作用は少ないが作用の特異性が高いために、耐性株が早期に出現する。一方、プロテアーゼ阻害剤は単独でも良好な抗ウイルス活性を示すが、その効果はおおむね一時的で、ＨＩＶプロテアーゼのアミノ酸配列の変異による感受性の低下が見られる。また、体内での安定性が低いこと及び消化器障害などの副作用の点で問題がある。【０００４】
ＨＩＶの感染は、ＨＩＶ表面蛋白質であるｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ１２０（ｇｐ１２０）と、宿主細胞表面の受容体であるＣＤ４との結合を介して、宿主細胞に接着して細胞内へ侵入することにより成立する。したがって、ｇｐ１２０とＣＤ４の結合を阻害する物質はＨＩＶと細胞の接着を阻害し、ＨＩＶの感染を防御できると期待されるため、ｇｐ１２０とＣＤ４との結合を阻害する試みがなされた。一例として、可溶性のＣＤ４を遺伝子工学的に作成して、ヒトの体内に投与するような試みなども行なわれた。しかしながら、このような方法では試験管内では阻害活性が認められるものの、生体内では半減期が短いなどの理由で、抗ＨＩＶ活性は認められなかった。また、ヒトのＣＤ４をマウスの細胞に発現させても感染が起こらないことが明らかとなり、第２の接着分子の存在が示唆されていた。【０００５】
近年、この第２の受容体が、一群のケモカイン受容体であるとの報告が相次いだ。ＨＩＶは、マクロファージ指向性を示す株（Ｍ−トロピックＨＩＶ）とＴ細胞株指向性を示す株（Ｔ−トロピックＨＩＶ）の２種類に大別されるが、これらのウイルス株間に見られる細胞指向性の差が、第２受容体の分子種の違いによることが示された。すなわち、標的細胞が第２受容体としてＣＣケモカイン受容体５（ＣＣＲ５：Ｍ−トロピックＨＩＶ受容体）またはＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４：Ｔ−トロピックＨＩＶ受容体）のいずれを発現しているかの違いにより、決定されることが明らかとなった。これらの新たな知見から現在、ＨＩＶの標的細胞への侵入様式は次のように考えられている。まず、ｇｐ１２０とＣＤ４が結合し、続いて宿主細胞のＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４と結合する。これによりｇｐ１２０の構造が変化してｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ４１（ｇｐ４１）が裸出し、細胞膜と融合することにより感染が成立する。また、該当するケモカインはＨＩＶのケモカイン受容体への結合を競合的にブロックし、ＨＩＶの感染を抑制する。この一連の発見は感染と発症の機構の解明を加速しただけでなく、抗ＨＩＶ戦略にも新たな視点を提供した。【０００６】
かかる視点の下、本発明者は、微生物の生産する代謝産物の中から探索し、放線菌菌株Ｋ９７−０００３株（１９９８年１２月９日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国，３０５−８５６６，茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６７０として寄託）の培養液が、優れたＨＩＶ阻害活性を有することを見出し、その活性成分が上に概説する機構の合胞体形成を阻害する物質であることを示した（特許文献１：国際公開第００／５２０４３号パンフレット）。【０００７】
【特許文献１】国際公開第００／５２０４３号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、合胞体形成を阻害することによる抗ＨＩＶ薬であってＷＯ００／５２０４３のポリペプチドよりもさらに効果を高めた抗ＨＩＶ薬の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、ＷＯ００／５２０４３で開示する１１４アミノ酸残基のポリペプチド（配列番号１）についてさらに検討を行なった結果、その多量体がより大きな抗ＨＩＶ効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
すなわち、本発明は、以下の抗ＨＩＶ薬、ポリペプチド、塩基配列、形質転換体及び抗ＨＩＶ薬の製造方法を提供する。
１．アクチノヒビン多量体を含むことを特徴とする抗ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）薬。
２．アクチノヒビン多量体が、
(a)配列番号１で表わされるポリペプチド、及び
(b)(a)のアミノ酸配列中の１個または複数のアミノ酸が欠失もしくは置換され、または付加されてなる合胞体形成阻害活性を有するホモログ
から選択される複数のポリペプチド（同一であっても異なっていてもよい）を
５０個以下のアミノ酸からなるリンカーで連結したものである前記１記載の抗ＨＩＶ薬。
３．アクチノヒビン多量体がアクチノヒビン２量体である前記１または２記載の抗ＨＩＶ薬。
４．前記リンカーが配列番号２で表わされるペプチド鎖である前記１〜３のいずかに記載の抗ＨＩＶ薬。
５．さらにＨｉｓタグを含む前記１〜４のいずかに記載の抗ＨＩＶ薬。
６．前記１〜５のいずれかに記載の抗ＨＩＶ薬に対応するポリペプチド。
７．前記６に記載のポリペプチドをコードする塩基配列またはその相補鎖。
８．前記７に記載の塩基配列を宿主細胞に導入した形質転換体。
９．宿主細胞が大腸菌または放線菌である前記８に記載の形質転換体。
１０．Escherichia coli BL21（DE3）pLysS/pET30:dAH株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１６１）である前記９に記載の形質転換体。
１１．前記９〜１０に記載の形質転換体を培養して形質転換体内または培養物中に前記６に記載のポリペプチドを産生させ、これを単離することを含む前記１〜５のいずれかに記載の抗ＨＩＶ薬の製造方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
抗ＨＩＶ薬
本発明の第１の実施形態では、アクチノヒビン多量体を含むことを特徴とする抗ＨＩＶ薬が提供される。ここで、アクチノヒビンは、
(a)配列番号１で表わされるポリペプチド、及び
(b)(a)のアミノ酸配列中の１個または複数のアミノ酸が欠失もしくは置換され、または付加されてなる合胞体形成阻害活性を有するホモログを意味する。【００１２】
上記(b)に挙げるアミノ酸配列の一部が欠損、置換し、若しくは付加されたポリペプチドとは、配列番号１記載のアミノ酸配列と、少なくとも２０％、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上のアミノ酸配列の相同性を有するポリペプチドを意味する。合胞体形成阻害活性が示される限りにおいて、アミノ酸の欠失、置換または付加は、任意の場所で生じ得る。【００１３】
また、配列番号１で表わされるポリペプチドは３つの相同ドメイン（配列番号１中、１〜３８、３９〜７６及び７７〜１１４）から構成されており、アクチノヒビン多量体（ｎ量体）に１または２個の相同ドメインが付加されたものも含まれる。アクチノヒビン多量体（ｎ量体）に含まれるアクチノヒビン単位の数（ｎ）は、合胞体形成阻害活性を示す限りにおいて特に限定されないが、精製時の取扱性等を考慮して通常は６量体以下、好ましくは３量体以下、例えば、２量体である。【００１４】
合胞体形成阻害活性は、適宜、測定され得るが、例えば、
(α)エンベロープ糖タンパク質（ｇｐ１２０、ｇｐ４１）を発現した細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞）と
(β)ＣＤ４、ＨＩＶ−１の侵入に必須なＨＩＶ−１の補助受容体（ＣＸＣＲ４またはＣＣＲ５）遺伝子を発現した細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞）
との融合の有無によって判定できる。実際的には、さらに、上記（α）に転写活性化タンパク質（Ｔａｔ）遺伝子を、上記（β）にＨＩＶのＬＴＲ（末端反復配列）とベータガラクトシダーゼ遺伝子を導入したものを用いる。このような細胞を用いることにより、細胞のＨＩＶ感染に伴いベータガラクトシダーゼが活性化するために、ベータガラクトシダーゼの基質であるＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ベータ−ガラクトシド）の呈色により合胞体形成（ＨＩＶ感染）の有無が判別できる。【００１５】
また、本発明においてアクチノヒビン多量体とは、上記(a)または(b)のアミノ酸配列が直接に、または任意のリンカー配列を介して連結したものを意味し、さらに、ポリペプチドの精製や取扱に有用な配列を含んでもよい。【００１６】
リンカー配列は、多量体の抗ＨＩＶ作用を害しないものであれば特に限定されないが、通常、５０個以下、好ましくは２０個以下、より好ましくは１５個以下のアミノ酸残基からなる配列である。例えば、配列番号２によって示されるポリペプチドが含まれる。従って、本発明のアクチノヒビン多量体には、配列番号１のポリペプチド−配列番号２のリンカー配列−配列番号１のポリペプチドからなるポリペプチド（配列番号３として示す）が含まれる。このポリペプチドは２量体であるが、３量体以上の構造も同様である。【００１７】
また、ポリペプチドの精製や取扱に有用な付加配列の例としては、Ｈｉｓタグが挙げられる。その他、ＧＳＴタグも使用できるが、一般にこれらの修飾配列は抗ＨＩＶ作用を低下させる。Ｈｉｓタグは例えば、Ｈｉｓ６タグである。【００１８】
アクチノヒビン多量体が優れた活性を示す理由は明らかではないが、アクチノヒビンはｇｐ１２０の高マンノース糖鎖に結合することが明らかになっており、クラスターとしての結合が抗ＨＩＶ効果を高めている可能性が考えられる。【００１９】
ポリペプチド
本発明の第２の実施形態では、アクチノヒビン多量体を含むことを特徴とする上記抗ＨＩＶ薬に対応するポリペプチドが提供される。ポリペプチドの詳細は抗ＨＩＶ薬として説明したものと同様である。【００２０】
塩基配列
本発明の第３の実施形態では、上記ポリペプチドをコードする塩基配列またはその相補鎖が提供される。
例えば、本発明により提供される塩基配列には、配列番号３のポリペプチドに対応する配列番号４の塩基配列（終止コドンを含む）が含まれるが、より一般的には、
(a')配列番号１で表わされるポリペプチドをコードする塩基配列、及び
(b')(a')のアミノ酸配列中の１個または複数のアミノ酸が欠失もしくは置換され、または付加されてなる合胞体形成阻害活性を有するホモログをコードする塩基配列
から選択されるアクチノヒビンコード領域（複数個）を、リンカー配列をコードする塩基配列で連結した塩基配列が提供される。【００２１】
ここで、ホモログ、リンカー配列及び合胞体形成阻害活性の意義は上記の通りである。例えば、ホモログは、配列番号１記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列と、少なくとも２０％、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上の相同性を有する。また、前述の通り、アクチノヒビン単量体は３個の相同ドメインからなるが、多量体相当の塩基配列に１または２個の相同ドメインに相当する塩基配列が付加されたものでもよい。塩基配列に含まれるアクチノヒビンコード領域の数（ｎ）は、最終的に得られるアクチノヒビン多量体が合胞体形成阻害活性を示す限りにおいて特に限定されないが、上記の通り、精製時の取扱性等を考慮して通常は６以下、好ましくは３以下、例えば、２である。【００２２】
さらに、本発明による塩基配列は、ポリペプチドの産生に有用な配列も含んでもよい。例えば、生物体内でアクチノヒビン多量体を発現させる際に最初に前駆体ポリペプチドとして形成し、翻訳後修飾してアクチノヒビン多量体を成熟タンパク質として得ることが必要または有利な場合は、そのような塩基配列を含んでもよい。このような塩基配列としては、微生物外への分泌に用いられるシグナルペプチド配列領域が挙げられる。また、ポリペプチドの精製、取扱に有用な配列も含んでもよい。このような塩基配列としては、Ｈｉｓタグに相当する塩基配列が挙げられる。【００２３】
なお、本願において、ポリペプチドをコードする塩基配列とは、縮重コドンのいずれによりコードされるものでもよいが、次項で述べる形質転換体中での発現に適した塩基配列であることが好ましい。また、塩基配列は以上のいずれかの相補鎖であってもよい。【００２４】
形質転換体
本発明の第４の実施形態では、上記塩基配列を宿主細胞に導入した形質転換体が提供される。形質転換体は、アクチノヒビン多量体を安定して発現できるものであればよく、大腸菌、放線菌その他の細菌、真菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等が挙げられ、また、細胞融合、遺伝子操作などの手法により予め細胞工学的に変異させた細胞も、本発明の形質転換体の宿主に含まれる。【００２５】
特に好ましくは、宿主細胞は、大腸菌及び放線菌であり、このような形質転換体の一例としては、Escherichia coli BL21（DE3）pLysS/pET30:dAH株（２００４年１１月１０日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国，３０５−８５６６，茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１６１として寄託された。）が挙げられる。【００２６】
形質転換体は当技術分野で知られている任意の方法により作成できる（例えば、Joseph Sambrook et al., "Molecular Cloning", 3rd Ed.（Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)）参照）。【００２７】
抗ＨＩＶ薬の製造方法
本発明の第４の実施形態では、前記形質転換体を培養して形質転換体内または培養物中に前記ポリペプチドを産生させ、これを単離することを含むアクチノヒビン多量体抗ＨＩＶ薬の製造方法が提供される。【００２８】
本発明の形質転換体の培養に際しては、その形質転換体の培養に用いられる通常の培養方法が適用される。用いる培地は形質転換体の資化し得る炭素源、窒素源、無機物などを程よく含有する培地であれば天然培地、合成培地いずれも用いることができる。【００２９】
炭素源としては、グルコース、マンノース、マルトース、糖蜜などの炭水化物、クエン酸、リンゴ酸、酢酸、フマール酸などの有機酸、メタノール、エタノールなどのアルコール、メタン、エタン、プロパン、ｎ−パラフィンなどの炭化水素、グルタミン酸などのアミノ酸あるいはグリセロールなどが用いられる。【００３０】
窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、アスパラギン酸、グルタミン、シスチン、アラニンなどのアミノ酸、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチープ・リカー、大豆粉、ソルブル・ベジタブル・プロテイン、綿実油、大豆カゼイン、カザミノ酸、ファーマメディアなどが用いられる。無機物としてはリン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、硫酸コバルト、硫酸亜鉛、パントテン酸カルシウム、モリブデン酸アンモニウム、硫酸アルミニウムカリウム、炭酸バリウム、炭酸カルシウム、塩化コバルト、食塩などが用いられる。その他必要に応じて培地に微量の金属塩、ビタミン、サイアミンなど菌体の増殖あるいはアクチノヒビン多量体の生産を促進する物質を加えることができる。また形質転換体が特定の物質を要求する場合は、生育に必要なものを加えることが必要である。これらのものはアクチノヒビン多量体の生産に役立つものであればよく、例えば、形質転換体、特に、大腸菌や放線菌の培養材料として公知のものはすべて用いることができる。【００３１】
形質転換体、特に微生物の大量培養には液体培地を用いた振盪培養法、通気撹拌培養法などが好ましい。培養温度は形質転換体が発育し、アクチノヒビン多量体を生産できる範囲で適用できる。培養は形質転換体の性質に応じて、適宜選択して行なうことができる。培養物中のアクチノヒビン多量体が培養液中に存在する場合には、菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には常法にしたがって、ろ過、遠心分離などにより培養液中のアクチノヒビン多量体と形質転換体とを分離した後のアクチノヒビン多量体溶液が使用される。アクチノヒビン多量体が形質転換体内に存在する場合は、得られた培養物をろ過または遠心分離などの手段により、菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤および／または界面活性剤を添加して形質転換体細胞を可溶化して、水溶液として分離採取する。【００３２】
このようにして得たアクチノヒビン多量体含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に、硫安、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。次いで、この沈殿物を水に溶解し、半透膜にて透析せしめて、より低分子量の不純物を除去することができる。また吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーにより精製してもよい。特にＨｉｓタグを含むアクチノヒビン多量体を産生させる態様では、Ｎｉ、Ｚｎ、Ｃｕ、ＣｏなどＨｉｓタグに対する親和性の高い固定相を有するカラムにより精製可能である。【００３３】
これらの手段を用いて得られるアクチノヒビン多量体含有溶液を、減圧濃縮、凍結乾燥等で処理することより、精製されたアクチノヒビン多量体を得ることができる。また、必要に応じて、アクチノヒビン多量体に付加されたペプチド（例えば、Ｈｉｓタグ）を除去してもよい。
【実施例】
【００３４】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明を制限するものではない。【００３５】
実施例１
（１）アクチノヒビン２量体をコードする遺伝子の構築
図１に示した手順に従って、配列番号３で表わされるアクチノヒビン２量体をコードする遺伝子（配列番号４）を構築した。【００３６】
はじめに、２個のアクチノヒビン遺伝子を連結するための１３アミノ酸残基をコードするリンカー遺伝子を次のようにして作成した。【００３７】
すなわち、合成オリゴヌクレオチドＬｉｎｋ−ｓｅｎ（配列番号５）及びＬｉｎｋ−ａｓｎ（配列番号６）をそれぞれの３’末端側と５’末端側に付加されている１１塩基の相同配列の部位でアニールさせ、プライマーダイマーを形成させた後、これを９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分（３０サイクル）の条件でＰＣＲを行なった。【００３８】
次に、アクチノヒビン２量体のＮ末端側に相当するアクチノヒビン遺伝子（Ｎ−ＡＨ遺伝子）を、アクチノヒビン生産菌よりクローニングされたＡＨ遺伝子を保持するプラスミド２Ａ３Ｋを鋳型として、２種の合成オリゴヌクレオチドプライマーＡＡ−１Ｂａｍ（配列番号７）及びＡＨ−Ｌｉｎｋ（配列番号８）を用いて、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分（３０サイクル）の条件でＰＣＲにより作成した。得られたＮ−ＡＨ遺伝子はアクチノヒビン遺伝子の３’末端にリンカー遺伝子の５’末端側１５塩基対分が付加している。【００３９】
アクチノヒビン２量体のＣ末端側に相当するアクチノヒビン遺伝子（Ｃ−ＡＨ遺伝子）は次のように作成した。すなわち、プラスミド２Ａ３Ｋを鋳型としてＬｉｎｋ−ｄＡＨ（配列番号９）及びＴＧＡＥｃｏ（配列番号１０）を用いて、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分の条件（３０サイクル）でＰＣＲを行なった。得られたＣ−ＡＨ遺伝子は、アクチノヒビン遺伝子の５’末端にリンカー遺伝子の３’末端側１５塩基が付加されている。【００４０】
リンカー遺伝子とＣ−ＡＨ遺伝子を鋳型とし、既出の合成オリゴヌクレオチドであるＬｉｎｋ−ｓｅｎ及びＴＧＡＥｃｏを用いてＳＯＥ法(Horton, R.M., Hunt, H.D., Ho, S.N., Pullen, J.K. and Pease, L.R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene 77, 61〜68 (1989))によるＰＣＲを行ない、アクチノヒビン遺伝子の５’末端にリンカー遺伝子を付加させたＬ−ＡＨ遺伝子を作成した。【００４１】
このようにして得られたＮ−ＡＨ遺伝子とＬ−ＡＨ遺伝子を、それぞれ制限酵素ＢａｍＨ  Ｉ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ及びＨｉｎｄ  ＩＩＩ、ＥｃｏＲ  Ｉで消化した。得られた２つのＤＮＡ断片をＢａｍＨ  ＩとＥｃｏＲ  Ｉで消化した大腸菌クローニングベクターｐＵＣ１９と混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。この溶液で大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、アクチノヒビン２量体遺伝子を含むプラスミドｐＵＣ１９：ｄＡＨを作成した。【００４２】
（２）アクチノヒビン２量体発現プラスミドの構築
ｐＵＣ１９：ｄＡＨを鋳型として、ＡＡ−１  ＬＩＣ（配列番号１１）及びＴＧＡ  １１４  ＬＩＣ（配列番号１２）を用いて９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分の条件（３０サイクル）のＰＣＲを行ない、アクチノヒビン２量体遺伝子を増幅した。得られたＤＮＡ断片をｄＧＴＰ存在下でＴ４ＤＮＡポリメラーゼ反応を行なった後、大腸菌発現ベクターｐＥＴ３０  Ｘａ／ＬＩＣと連結し、アクチノヒビン２量体発現プラスミドｐＥＴ３０：ｄＡＨを構築した。【００４３】
（３）大腸菌によるアクチノヒビン２量体の発現
ＬＡ培地には硫酸カナマイシン（ＫＭ）、クロラムフェニコール（ＣＭ）をそれぞれ終濃度３０μｇ／ｍｌ、３４μｇ／ｍｌとなるように加えたものを使用した。
ＬＡ培地上に形成されたアクチノヒビン２量体発現プラスミドｐＥＴ３０：ｄＡＨで形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ（２００４年１１月１０日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国，３０５−８５６６，茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１６１として寄託した。）のコロニーを２％グルコース、ＫＭ（３０μｇ／ｍｌ）及びＣＭ（３４μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地１ｍｌに植菌し、３７℃で一晩振とう培養した。この菌液８ｍｌをＫＭ（３０μｇ／ｍｌ）及びＣＭ（３４μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地８００ｍｌに加えて３７℃で振とう培養した。Ｏ．Ｄ．６００ｎｍの値が０．３に達したところでイソプロピルβ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度１ｍＭとなるように加え、再び３７℃で２時間振とう培養した。【００４４】
培地を氷水で急冷して大腸菌の増殖を停止させた後、培養液を１２，０００×ｇで１５分間、４℃で遠心分離し、菌体を集めた。得られた菌体をＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、−２０℃で保存した。【００４５】
比較例１
（１）アクチノヒビン（単量体）発現プラスミドの構築
プラスミド２Ａ３Ｋを鋳型として、前記ＡＡ−１  ＬＩＣ（配列番号１１）及び前記ＴＧＡ  １１４  ＬＩＣ（配列番号１２）を用いて９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分の条件（３０サイクル）のＰＣＲを行ない、配列番号１のアクチノヒビン遺伝子を増幅した。得られたＤＮＡ断片をｄＧＴＰ存在下でＴ４ＤＮＡポリメラーゼ反応を行なった後、大腸菌発現ベクターｐＥＴ３０  Ｘａ／ＬＩＣと連結し、アクチノヒビン（単量体）発現プラスミドｐＥＴ３０：ＡＨを構築した。【００４６】
（２）大腸菌によるアクチノヒビン（単量体）の発現
アクチノヒビン２量体発現プラスミドｐＥＴ３０：ｄＡＨに代えてアクチノヒビン（単量体）発現プラスミドｐＥＴ３０：ＡＨを用いたほかは、実施例１の（３）と同様な操作により形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳにアクチノヒビン（単量体）を発現させた。【００４７】
実施例２
以下の手順によりアクチノヒビン融合タンパク質を調製・精製し、その抗ＨＩＶ効果について試験した。【００４８】
（１）大腸菌抽出液の調製【００４９】
実施例１に準じてＨｉｓ−タグ付アクチノヒビン２量体を菌体内に発現させた大腸菌を結合バッファー（５ｍＭイミダゾール、０．５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．９））１０ｍｌに懸濁した。１分毎に３０秒間のインターバルをとり、計５分間超音波をかけて菌体を破壊し、得られた菌抽出液を８，３７０×ｇ、１０分間、４℃で遠心分離を行い、上清と沈澱に分けた。得られた沈殿を６Ｍグアニジン塩酸を含む結合バッファー（以下、結合バッファーＤＮ）に溶解し、８，３７０×ｇ、１０分間、４℃で遠心分離を行い、沈殿を除いた。【００５０】
（２）金属キレートＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂを用いたアフィニティークロマトグラフィー
５ｍｌの金属キレートＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂを１５ｍｌ容プラスチックチューブに入れ、１０ｍｌのｍｉｌｌｉＱ水を加え穏やかに撹拌した後、２６４×ｇ、３分間、室温で遠心分離し、上清を除いた。５ｍｌのチャージバッファー（５０ｍＭＮｉＳＯ４）を加え撹拌して樹脂を活性化し、１０ｍｌのｍｉｌｌｉＱ水で２回洗浄した後、１０ｍｌの結合バッファー（ＤＮ）で樹脂を平衡化した。【００５１】
５０ｍｌ容プラスチックチューブに活性化した樹脂５ｍｌと（１）で調製した試料を混合し、結合バッファー（ＤＮ）で全量を５０ｍｌとし、室温で１時間穏やかに振とうした。樹脂を１０ｍｌの結合バッファー（ＤＮ）で洗浄した後カラムに充填し、５０ｍｌの結合バッファー（ＤＮ）で樹脂を洗浄した。次に、５０ｍｌの６Ｍグアニジン塩酸を含む洗浄バッファー（６０ｍＭイミダゾール、０．５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．９））で樹脂を洗浄した後、５０ｍｌの６Ｍグアニジン塩酸を含む溶出バッファー（５００ｍＭイミダゾール、０．５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．９））で樹脂に吸着したＨｉｓタグ−アクチノヒビン２量体融合タンパク質を溶出した。【００５２】
（３）ＯＤＳカラムクロマトグラフィー
アセトニトリルに懸濁したＯＤＳ樹脂１０ｍｌをカラムに充填し、アセトニトリル：０．０１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の等量混液５０ｍｌでカラムを洗浄した後、アセトニトリル：０．０１％ＴＦＡの５：９５混液５０ｍｌでカラムを平衡化した。金属セファロースＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂで精製したＨｉｓタグ−アクチノヒビン２量体融合タンパク質をカラムの上端に乗せ、アセトニトリル：０．０１％ＴＦＡの５：９５混液５０ｍｌでカラムを洗浄した後、アセトニトリル：０．０１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の等量混液５０ｍｌでカラムに吸着したＨｉｓタグ−アクチノヒビン２量体融合タンパク質を溶出した。得られた溶出液を濃縮乾固した後、ｍｉｌｌｉＱ水に溶解した。【００５３】
（４）ＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣ
ＯＤＳカラムで脱塩した試料溶液を少量のＭｉｌｌｉＱ水に溶解し、高速液体クロマトグラフィー（ＰＥＧＡＳＩＬ−Ｂ  １０φ×２５０ｍｍ、ＳＳＣ  センシュー科学株式会社）にかけ、アセトニトリル：０．０１％ＴＦＡの５：９５混液とアセトニトリル：０．０１％ＴＦＡの７０：３０混液を用いた３０分の直線濃度勾配で、２２０ｎｍの吸収を検出しながら３ｍｌ／分の流速において、１２分と１６分に出現するピ―クを集めた。この各分画を溶液のｐＨが中性付近になるまで凍結乾燥を繰り返した後、ｍｉｌｌｉＱ水に溶解した。【００５４】
（５）合胞体形成阻害活性の測定
ＤＭＥ培地で１．６×１０５細胞／ｍｌに調整したＨｅＬａ／ＣＤ４／ＬＴＲ細胞を９６穴プレートの各穴に５０μｌずつ播種し、ここに、無血清ＤＭＥ培地で各段階に希釈した試料溶液を、各穴に１０μｌずつ添加した。さらに、１．６×１０５細胞／ｍｌに調製したＨｅＬａ１３５／Ｔ−ｅｎｖ（ＴトロピックＨＩＶ−１由来エンベロープ糖タンパク質）／Ｔａｔ細胞を、各穴に５０μｌずつ接種し、５％ＣＯ２気流下、３７℃で２４時間培養した。培養液を除き細胞溶解液２０μｌずつ各穴に加え、室温で約１５分間放置した。発色基質液１００μｌ（ｏ−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド２０μｌとＺ−バッファー（６０ｍＭリン酸水素二ナトリウム、４０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、１０ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭ硫酸マグネシウム、５０ｍＭ２−メルカプトエタノール、ｐＨ７．０）８０μｌの混液）を加えて、３７℃で８０分間反応させた後、反応停止液２ＭＮａ２ＣＯ３を２５μｌずつ各穴に添加し、ＰＡＷＥＲ  ＷＡＶＥ  Ｘ３４０（ＢＩＯ  ＴＥＣ  ＩＮＳＴＲＯＭＥＮＴＳ  ＣＯ．）を用いて４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。得られた吸光度から合胞体形成率を下記の式より求めた。【００５５】
【数１】
2006059638.tif 000002
【００５６】
このようにして得たアクチノヒビン融合タンパク質の合胞体形成に対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を表１に示す。【００５７】
なお、上記のＨｉｓタグ−アクチノヒビン２量体融合タンパク質の調製と同様の操作により、Ｈｉｓタグ−アクチノヒビン単量体融合タンパク質も調製し、合胞体形成率を求めた。この結果も併せて表１に示す。【００５８】
【表１】
2006059638.tif 000003
上記の結果から、本発明によるアクチノヒビン２量体融合タンパク質はアクチノヒビン単量体融合タンパク質に比較して２倍以上の合胞体形成阻害能力を有することがわかる。【００５９】
なお、Ｈｉｓタグは合胞体形成阻害能力を７〜８分の１程度に低下させることが知られており、Ｈｉｓタグなしのアクチノヒビン２量体融合タンパク質の合胞体形成５０％阻害濃度は０．０３μＭ程度と推定される。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明のアクチノヒビン多量体タンパク質は、ＨＩＶ感染におけるクリティカルな経路である合胞体形成を阻害する。これは、アクチノヒビンによる合胞体形成阻害と同様な作用機序によるものと考えられるため、Ｔ−トロピックＨＩＶのみならず、Ｍ−トロピックＨＩＶの感染をも防止すると考えられる。また、例えば、本発明のアクチノヒビン２量体タンパク質の抗ＨＩＶ効果はアクチノヒビン単量体融合タンパク質に比較して２倍以上であり、非常に少量で顕著な効果を示す。このように、本発明によれば、ＡＩＤＳの予防、治療薬として利用することが可能な抗ＨＩＶ薬ポリペプチドが提供される。また、本発明のアクチノヒビン多量体タンパク質をコードする遺伝子は、種々の宿主に導入して組み換えアクチノヒビン多量体タンパク質として生産することが可能であり容易に生産することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】アクチノヒビン２量体の構築方法をまとめた説明図である。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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