(57)【要約】【課題】新規抗原特異的Ｔ細胞誘導剤、新規抗体産生誘導剤、新規免疫増強剤、及び新規ワクチン、並びに新規抗原特異的Ｔ細胞誘導方法、抗体産生誘導方法、新規免疫増強方法、新規腫瘍治療方法、及び新規病原体治療方法を提供すること。【解決手段】単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus; HSV）を不活性化し、不完全アジュバントに添加して作製した完全アジュバントを抗原特異的Ｔ細胞誘導剤、抗体産生誘導剤、または免疫増強剤とし、抗原にこれら抗原特異的Ｔ細胞誘導剤、抗体産生誘導剤、または免疫増強剤を併用してワクチンとする。その際、抗原として、癌特異的抗原や病原体特異的抗原を用いることにより、腫瘍治療方法及び病原体感染治療方法とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus; HSV）を有効成分として含有する、HSV以外の抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞誘導剤。
【請求項２】
抗原特異的細胞障害性Ｔ細胞誘導剤であることを特徴とする請求項１に記載の抗原特異的Ｔ細胞誘導剤
【請求項３】
前記単純ヘルペスウイルスが、不活性化されていることを特徴とする請求項１または２に記載の抗原特異的Ｔ細胞誘導剤。
【請求項４】
前記単純ヘルペスウイルスが、加熱、ＵＶ照射、放射線照射、固定、または遺伝子組み換えによって不活性化されていることを特徴とする請求項３に記載の抗原特異的Ｔ細胞誘導剤。
【請求項５】
不完全フロイントアジュバント(Incomplete Freund adjuvant; IFA)をさらに含有することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の抗原特異的Ｔ細胞誘導剤。
【請求項６】
単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus; HSV）を有効成分として含有する、HSV以外の抗原に対する抗体産生誘導剤。
【請求項７】
抗原特異的細胞障害性Ｔ細胞誘導剤であることを特徴とする請求項６に記載の抗体産生誘導剤。
【請求項８】
前記単純ヘルペスウイルスが、不活性化されていることを特徴とする請求項６または７に記載の抗体産生誘導剤。
【請求項９】
前記単純ヘルペスウイルスが、加熱、ＵＶ照射、放射線照射、固定、または遺伝子組み換えによって不活性化されていることを特徴とする請求項８に記載の抗体産生誘導剤。
【請求項１０】
不完全フロイントアジュバント(Incomplete Freund adjuvant; IFA)をさらに含有することを特徴とする請求項６〜９のいずれかに記載の抗体産生誘導剤。
【請求項１１】
単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus; HSV）を有効成分として含有する、HSV以外の抗原に対する免疫増強剤。
【請求項１２】
前記単純ヘルペスウイルスが不活性化されていることを特徴とする請求項１１に記載の免疫増強剤。
【請求項１３】
前記単純ヘルペスウイルスが、加熱、ＵＶ照射、放射線照射、固定、または遺伝子組み換えによって不活性化されていることを特徴とする請求項１２に記載の免疫増強剤。
【請求項１４】
不完全フロイントアジュバント(Incomplete Freund adjuvant; IFA)をさらに含有することを特徴とする請求項１１〜１３のいずれかに記載の免疫増強剤。
【請求項１５】
単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus; HSV）以外の抗原に対するワクチンであって、
単純ヘルペスウイルスを有効成分として含む免疫増強剤及び前記抗原を含有するワクチン。
【請求項１６】
前記単純ヘルペスウイルスが、不活性化されていることを特徴とする請求項１５に記載のワクチン。
【請求項１７】
前記単純ヘルペスウイルスが、加熱、ＵＶ照射、放射線照射、固定、または遺伝子組み換えによって不活性化されていることを特徴とする請求項１６に記載のワクチン。
【請求項１８】
不完全フロイントアジュバント(Incomplete Freund adjuvant; IFA)をさらに含有することを特徴とする請求項１５〜１７のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１９】
癌ワクチンであることを特徴とする請求項１５〜１８のいずれかに記載のワクチン。
【請求項２０】
病原体の感染に対する予防ワクチンであることを特徴とする請求項１５〜１８のいずれかに記載のワクチン。
【請求項２１】
脊椎動物に対して投与した、HSV以外の抗原に対して抗原特異的なＴ細胞を誘導する方法であって、
前記抗原と併用して請求項１〜５のいずれかに記載の抗原特異的Ｔ細胞誘導剤、または請求項１５〜２０のいずれかに記載のワクチンを投与することを特徴とする方法。
【請求項２２】
前記Ｔ細胞が細胞障害性Ｔ細胞であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
脊椎動物に対して投与した、HSV以外の抗原に対して抗原特異的な抗体産生を誘導する方法であって、
前記抗原と併用して請求項６〜１０のいずれかに記載の抗体産生誘導剤、または請求項１５〜２０のいずれかに記載のワクチンを投与することを特徴とする方法。
【請求項２４】
ヒト以外の脊椎動物において免疫を増強する方法であって、
請求項１１〜１４のいずれかに記載の免疫増強剤、または請求項１５〜２０のいずれかに記載のワクチンを投与することを特徴とする方法。
【請求項２５】
ヒト以外の脊椎動物における腫瘍の治療方法であって、
請求項１５〜１９のいずれかに記載のワクチンを接種することを特徴とする方法。
【請求項２６】
ヒト以外の脊椎動物における病原体の感染に対する治療方法であって、
請求項１５〜１８，２０のいずれかに記載のワクチンを接種することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus; HSV）を含有する抗原特異的Ｔ細胞誘導剤、抗体産生誘導剤、免疫増強剤、及びワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体に免疫反応を起こさせる物質（抗原）を接種する際、その免疫反応を増強させるために、抗原にアジュバントと呼ばれる免疫増強剤と混合して接種するということが行われてきた。アジュバントとしては、動物実験でよく使用される、フロインド完全アジュバント（Freund Complete Adjuvant）やフロインド不完全アジュバント（Freund Incomplete Adjuvant）など（Broderson, J. A.,  Lab. Anim. Sci. 39 (1989), 400-406）、様々なものが知られている。例えば、フロインド完全アジュバントは、鉱油に熱殺菌したマイコバクテリアを含む乳濁液であり、フロインド不完全アジュバントは、フロインド完全アジュバントにおいてマイコバクテリアを添加していない乳濁液である。フロインド完全アジュバント中、マイコバクテリアが免疫増強活性を有する有効成分である。【０００３】
動物に、ワクチンを投与する際も、ワクチンの効果を増強させるためアジュバントが添加される。ワクチンには、生ワクチン、不活性化ワクチン、コンポーネントワクチン等があるが、アジュバントは特に不活性化ワクチンやコンポーネントワクチンに添加され、免疫原性の弱い抗原を用いたときでも効果的に抗体を作らせることができるようになる。【０００４】
近年、コンポーネントワクチンや癌ワクチンなどの新しいワクチンが開発され、臨床的にもアジュバントの重要性が高まる中、新しいタイプのアジュバントが開発されてきた（Jin H, et al., Vaccine 22 (2004), 2925-2935; Flarend,R et al., Vaccine 15 (1997), 1314-1318; Villacres-Eriksson M, et al.,  Cytokine 9 (1997), 73-82; Weeratna, R, et al., Vaccine 18 (2000),1755-1762）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、以上のような技術を背景とし、新規抗原特異的Ｔ細胞誘導剤、新規免疫増強剤、新規抗体産生誘導剤、及び新規ワクチンを開発することを目的としてなされた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明にかかる抗原特異的Ｔ細胞誘導剤は、単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus; HSV）を有効成分として含有する、HSV以外の抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞誘導剤である。従って、ヒト及びヒト以外の脊椎動物に対して投与した、HSV以外の抗原に対して前記抗原特異的なＴ細胞を誘導する方法であって、前記抗原と併用して前記抗原特異的Ｔ細胞誘導剤を投与することを特徴とする方法も、本発明の技術的範囲に属する。この抗原特異的Ｔ細胞誘導剤は、抗原特異的細胞障害性Ｔ細胞誘導剤であることが好ましい。また、前記単純ヘルペスウイルスが、不活性化されていることが好ましく、例えば、加熱、ＵＶ照射、放射線照射、固定、または遺伝子組み換えによって不活性化されていてもよい。さらに、前記抗原特異的Ｔ細胞誘導剤が、不完全フロイントアジュバント(Incomplete Freund adjuvant; IFA)を含有してもよい。【０００７】
本発明にかかる抗体産生誘導剤は、単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus; HSV）を有効成分として含有する、HSV以外の抗原に対する抗体産生誘導剤である。従って、ヒト及びヒト以外の脊椎動物に対して投与した、HSV以外の抗原に対して抗体産生を誘導する方法であって、前記抗原と併用して前記抗体産生誘導剤を投与することを特徴とする方法も、本発明の技術的範囲に属する。また、前記単純ヘルペスウイルスが、不活性化されていることが好ましく、例えば、加熱、ＵＶ照射、放射線照射、固定、または遺伝子組み換えによって不活性化されていてもよい。さらに、前記抗体産生誘導剤が、不完全フロイントアジュバント(Incomplete Freund adjuvant; IFA)を含有してもよい。【０００８】
本発明にかかる免疫増強剤は、単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus; HSV）を有効成分として含有する、HSV以外の抗原に対する免疫増強剤である。従って、ヒト及びヒト以外の脊椎動物において、HSV以外の抗原に対する免疫を増強する方法であって、前記免疫増強剤を投与することを特徴とする方法も、本発明の技術的範囲に属する。また、前記単純ヘルペスウイルスが、不活性化されていることが好ましく、例えば、加熱、ＵＶ照射、放射線照射、固定、または遺伝子組み換えによって不活性化されていてもよい。さらに、前記免疫増強剤が、不完全フロイントアジュバントを含有してもよい。ここで、免疫増強剤とは、一般に生体における免疫反応を増強させる薬剤のことをいう。この免疫反応には、抗原特異的Ｔ細胞誘導、抗体産生誘導、ナチュラルキラー細胞の活性化誘導、樹状細胞の活性化誘導、抑制性Ｔ細胞誘導の阻害なども含まれる。【０００９】
本発明にかかるワクチンは、単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus; HSV）以外の抗原に対するワクチンであって、単純ヘルペスウイルスを有効成分として含む免疫増強剤及び前記抗原を含有するワクチンである。前記ワクチンは、癌ワクチンであっても、病原体の感染に対するワクチンであってもよい。従って、ヒト及びヒト以外の脊椎動物における腫瘍の治療方法または病原体の感染に対する治療方法であって、前記ワクチンを接種することを特徴とする方法も、本発明の技術的範囲に属する。前記単純ヘルペスウイルスが、不活性化されていることが好ましく、例えば、加熱、ＵＶ照射、放射線照射、固定、または遺伝子組み換えによって不活性化されていてもよい。さらに、前記ワクチンが、不完全フロイントアジュバントを含有してもよい。本明細書でいう治療方法には、疾病の治療方法のみならず、疾病以前の予防方法も含むものとする。【００１０】
−関連文献とのクロスリファレンス−
なお、本出願は、２００５年１月２７日出願の日本国出願番号特願２００５−２０３９３の優先権の利益を主張し、これを引用することにより本明細書に含める。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の一実施例において、ＧＡＲＣ−１変異型ペプチドと不活性化ＨＳＶとを含むワクチンを投与されたマウスから得られたＴ細胞の、ＧＡＲＣ−１ペプチド（変異型及び野生型）を提示する細胞に対する反応性を、ＩＦＮ−γの産生量で表したグラフである。
【図２】本発明の一実施例において、ＧＡＲＣ−１変異型ペプチドと不活性化ＨＳＶとを含むワクチンを投与されたマウスから得られたＴ細胞の、ＧＬ２６１細胞に対する反応性を、ＩＦＮ−γの産生量で表したグラフである。
【図３】本発明の一実施例において、ＧＡＲＣ−１変異型ペプチドと不活性化ＨＳＶとを含むワクチンを投与されたマウスから得られたＣＤ８陽性Ｔ細胞の、ＧＬ２６１細胞に対する反応性を、ＩＦＮ−γの産生量で表したグラフである。
【図４】本発明の一実施例において、腫瘍細胞が移植され、ＡＨ１ペプチドと不活性化ＨＳＶとを含むワクチンを投与されたマウスにおいて、（Ａ）及び（Ｂ）は、マウスに移植した腫瘍細胞の体積の変化で、癌ワクチンの抗腫瘍効果を評価した図であり、（Ｃ）は、そのマウスから得られたＣＤ８陽性Ｔ細胞の、ＣＴ２６細胞に対する細胞障害活性を評価した図であり、（Ｄ）は、ＡＨ１ペプチドと不活性化ＨＳＶとを含むワクチンを投与されたマウスから得られたＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞の、ＡＨ１抗原に反応して産生されるＩＦＮ−γ量を表したグラフである。
【図５】本発明の一実施例において、インフルエンザウイルスＨＡ蛋白質と不活性化ＨＳＶとを含むワクチンを投与されたマウスにおいて、（Ａ）は、そのマウスから得られたＣＤ８陽性Ｔ細胞の、Ｋｄ拘束性ＨＡペプチド（ＭＨＣクラスＩ）を認識して反応する細胞障害活性を評価した図であり、（Ｂ）は、そのマウスから得られたＣＤ４陽性Ｔ細胞の、Ｉ−Ｅｄ拘束性ＨＡペプチド（ＭＨＣクラスＩI）を認識して反応する増殖活性を評価した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。【００１３】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。【００１４】
＝＝抗原特異的Ｔ細胞誘導剤、抗体産生誘導剤、免疫増強剤及び抗原混合物の作製＝＝
本発明にかかる抗原特異的Ｔ細胞誘導剤、抗体産生誘導剤、免疫増強剤またはワクチンに含まれるＨＳＶの種類は、特に限定しないが、実施例ではタイプＩの野性株であるＫＯＳ株を用いた。ＨＳＶは、Ｖero細胞などを用いて、常法に従って増殖させることができる。【００１５】
本発明に用いるＨＳＶは、生体内で増殖することがないように、加熱、ＵＶ照射、放射線照射、固定、遺伝子組替えなどを用いて、不活性化することが好ましい。以下、各操作の典型的な条件例を挙げると、ＨＳＶを加熱する場合、例えば、５６℃にて、３０分間程度処理する。ＵＶ照射 の場合、UV lamps (wavelength, 253.7 nm)を１０から１５ cmの距離で、計１２０から６５０J/m2照射する（De Roda Husman AM,.et al., Appl Environ Microbiol. 70 (2004): 5089-5093.）。また、放射線照射の場合は、γ線を0.96 Gy/sで計200-800Ｇｙ照射する（De Roda Husman AM,.et al., Appl Environ Microbiol. 70 (2004): 5089-5093）。また、固定する場合、ホルムアルデヒド溶液、ホルマリン、グルタールアルデヒドなど、公知の組織固定剤を使用すればよい。遺伝子組換えによる不活性化は、例えば、遺伝子操作によってウイルスの複製を制御したり（ウイルスゲノムを、腫瘍細胞中でのみ複製し、正常細胞中では複製しないように遺伝子組換えを行う）（Mineta T, et al. Attenuated multi-mutated herpes simplex virus-1 for the treatment of malignant gliomas. Nat Med.9 (1995), 938-943.）、または、遺伝子操作によってウイルスを複製させないようにしたりする（Lim F, et al. Biotechniques.20 (1996):460-469.）ことが考えられる。なお、上記条件は典型的な条件例であり、具体的な操作では、上記の条件以外でも構わないし、場合によっては不活性化しなくてもかまわない。【００１６】
このようなＨＳＶを抗原特異的Ｔ細胞誘導剤、抗体産生誘導剤、あるいは免疫増強剤とし、抗原特異的Ｔ細胞誘導、抗体産生誘導、または免疫増強の対象である抗原と混合して抗原混合物として用いる。これら抗原特異的Ｔ細胞誘導剤、抗体産生誘導剤、免疫増強剤及び抗原混合物の剤形は特に限定されず、液状、乳液状、ゲル状、固形状、乾燥粉末状など、いずれでもかまわない。また、ＨＳＶの他に、薬理上許容される担体や、乳化剤・界面活性剤・防腐剤・不完全アジュバントなどの添加剤を含有しても構わない。例えば、ＨＳＶを、予めフロインド不完全アジュバントと混合して、抗原特異的Ｔ細胞誘導剤、抗体産生誘導剤、あるいは免疫増強剤とし、抗原と混合して抗原混合物としてもよい。また、抗原混合物中の抗原は複数種類含まれていても構わない。【００１７】
本発明で対象となる抗原はHSV（HSV由来の抗原も含む）以外であれば特に限定されず、最終的に生体内で抗原性を有するものであれば何でもよいが、例えば、抗原として、腫瘍の治療に用いるための癌抗原（癌特異的タンパク質やその一部となるペプチドなど）や、マイコプラズマ、ウイルス（エイズウイルス、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳ（severe acute respiratory syndrome）コロナウイルスなど）、細菌（病原性大腸菌、緑濃菌、結核菌など）、原虫（マラリア、トキソプラズマなど）、寄生虫（線虫など）などの病原体の感染の予防などに用いるためには、不活性化した病原体やその一部（細胞壁、多糖類、タンパク質などの菌体成分、ウイルスを構成するタンパク質など）などの病原体抗原を用いれば、抗原混合物の一形態としてのワクチンを作製することができる。即ち、上記抗原特異的Ｔ細胞誘導剤、抗体産生誘導剤、あるいは上記免疫増強剤をワクチンに含有させ、癌抗原や病原体抗原と併用することにより、ワクチンの抗原性を増強することができる。ここで、ワクチンは、生ワクチン（弱毒化ワクチン）、死菌ワクチン、不活性化ワクチン、トキソイド、コンポーネントワクチン（成分ワクチン）、遺伝子組替えワクチン（ペプチドワクチンなども含む）、癌ワクチン等、どのようなものでも構わないが、不活性化ワクチン、コンポーネントワクチン、遺伝子組替えワクチン、癌ワクチンなどの、比較的抗原性の弱いワクチンが好ましい。また、ワクチン中の抗原が複数種類含まれる混合ワクチンとしてもよい。【００１８】
＝＝抗原混合物の接種方法＝＝
こうして作製された抗原特異的Ｔ細胞誘導剤、抗体産生誘導剤、あるいは免疫増強剤と抗原との抗原混合物を、生体に接種する。抗原混合物の接種方法は特に限定されず、経口投与でも非経口投与でもよい。非経口投与としては、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内への注射、直腸内投与、粘膜投与、経皮投与あるいは粘膜投与などが挙げられるが、通常、皮下または腹腔内注射によって接種されることが多い。抗原が癌抗原の場合であっても、その癌抗原を有する腫瘍に直接接種する必要がなく、腫瘍以外の部位に接種すればよい。【００１９】
なお、接種回数や接種場所も特に限定されず、同時に他の医薬品と併用してもよい。また、同時に異なる抗原混合物を接種してもよい。【００２０】
＝＝疾病の治療方法（予防方法を含む）＝＝
以上のように本発明による抗原混合物を生体に接種すると、抗原混合物に添加された抗原特異的なＴ細胞の分化・増殖や抗原特異的な抗体の産生が誘導される。抗原が癌抗原やその一部のペプチドであるような場合、典型的には、抗原特異的に誘導されたＴ細胞が、抗原を組織適合性抗原と共に細胞表面に提示した癌細胞を攻撃するため、抗原混合物によって腫瘍の治療をすることができる。また、抗原が病原体抗原である場合、典型的には、抗原特異的に産生誘導された抗体が病原体を攻撃するため、感染に先立って予め抗原混合物を生体に接種しておくことにより、病原体の感染に対する予防が可能となる。また、感染後においても抗原混合物を生体に接種することにより、病原体感染症を治療したり、病原体感染症の再発を予防したりすることができる。【００２１】
なお、接種する抗原に対する疾病の治療方法の原理はここで述べた場合に限られず、例えば、本発明の方法により、腫瘍の予防を行ったり、癌抗原が細胞表面抗原である場合には、産生誘導された抗体で腫瘍の治療を行ったりしてもよい。
【実施例】
【００２２】
＜実施例１＞  ＧＡＲＣ−１ペプチドを用いた癌ワクチン
（１）ＨＳＶの調製
ＨＳＶとしてＨＳＶタイプＩの野性株であるＫＯＳ株を用い、常法に従って、Ｖero細胞に感染させて、その培養上清中に放出されたウイルスを回収した。なお、この時の培地は、無血清培地（血清を含まないＤＭＥＭ）を用いた。ウイルス濃度を計測した後、１５分のＵＶ処理および５６℃で３０分の熱処理を行うか、または０．１％ホルマリンで１週間４℃で処理することにより、ウイルスを完全に不活性化して、以下の実験に用いた（以下、ＨＳＶのウイルス濃度は不活性化する前の値を示す）。なお、ウイルスなしのＶero細胞の培養上清を上記と同様の処理をして、コントロール（Mock）として用いた。【００２３】
（２）ＧＡＲＣ−１抗原（腫瘍抗原）を用いたワクチン
マウスグリオーマ細胞株ＧＬ２６１（Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来）には、ＧＡＲＣ−１遺伝子に、正常細胞には存在しない変異が存在するため、この変異を有するペプチド（ＡＡＬＬＮＫＬＹＡ、配列番号１）（MHC class IであるH-2Db上に提示される）は、腫瘍特異的な抗原としてＴ細胞に認識される。そこで、本実施例において用いる抗原として、このＧＡＲＣ−１変異型ペプチドを用い、コントロールとして、正常細胞に存在するＧＡＲＣ−１の野生型ペプチド（ＡＡＬＬＤＫＬＹＡ、配列番号２）を用いて、癌ワクチンの生成を行った。【００２４】
ワクチンは、
（１）１０ｍｇ／ｍｌのＧＡＲＣ−１変異型ペプチドあるいはＧＡＲＣ−１野生型ペプチドを１０μｌ（１００μｇ）、
（２）不活化ＨＳＶ (2×108pfu相当)を含む溶液あるいは含まない溶液（Mock）を５０μｌ、
（３）ＰＢＳを４０μｌ、
以上を混合した混合液（１００μｌ）を、各組み合わせに対して４種類準備し、等量の不完全フロイントアジュバント（BACTO ADJUVANT INCOMPLETE FREUND、DIFCO社：263910)（１００μｌ）と混合して作製した（計２００μｌ）。【００２５】
ＧＬ２６１の由来となるマウス系統であるＣ５７ＢＬ／６マウスの両手足皮内にワクチン（２００μｌ）を接種し、さらに５日後に再度、同じ各ワクチンを接種した。【００２６】
ワクチン投与開始から２週間後、マウスのリンパ節及び脾臓より得た混合浮遊細胞を２×１０６個／ｍｌに調整した。一方、ＧＬ２６１細胞をマイトマイシンＣ（２００μｇ／ｍｌ）で６０分処理した後、３×１０５個／ｍｌに調整し、刺激細胞（stimulator cell）とした。これらの混合浮遊細胞と刺激細胞をそれぞれ１ｍｌずつ混合し、２４穴プレート（142575 NUNC）にて１週間共培養した。【００２７】
その後、以下の３つの実験系において、Ｔ細胞の抗原特異的な反応性の解析（ＩＦＮ−γ放出量解析）を行った。【００２８】
［１．ＧＡＲＣ−１ペプチド（変異型及び野生型）を提示する細胞に対するリンパ球反応性］
上記のように、１週間共培養した得られた混合浮遊細胞を１×１０６個／ｍｌに調整してエフェクター細胞とした。一方、２９３ＴKbDb細胞（MHC class I分子KbおよびDbを発現している２９３Ｔ細胞）を、ＧＡＲＣ−１変異型ペプチドあるいはＧＡＲＣ−１野生型ペプチドのパルス処理（細胞培養液中に各ペプチドを１０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、１時間培養後、ＰＢＳで２回洗浄）を行った後、１×１０６個／ｍｌに調整し、ターゲット細胞とした。これらのエフェクター細胞及びターゲット細胞を、それぞれ１００μｌずつ混合して、９６穴プレート（167008 NUNC）にて２日間共培養した。その後、培養上清中のＩＦＮ−γ放出量 をELISA kit （KM-IFNG  Endogen社）を用いて解析した。【００２９】
その結果、図１に示すように、腫瘍抗原であるＧＡＲＣ−１変異型ペプチドとmockとを含むワクチンを投与されたマウスのリンパ節及び脾臓から、ＧＡＲＣ−１変異型ペプチドを提示する細胞特異的に反応してＩＦＮ−γを産生するＴ細胞が誘導されたが、このＧＡＲＣ−１変異型ペプチドとmockとを含むワクチン投与と比較して、ＧＡＲＣ−１変異型ペプチドと不活性化ＨＳＶとを含むワクチンを投与されたマウスでは、ＧＡＲＣ−１変異型ペプチドを提示する細胞特異的なリンパ球の反応性が増強された。一方、コントロールにおいては、自己抗原ＧＡＲＣ−１野生型ペプチドを用いたワクチンによって、不活性化ＨＳＶを加えても、ＧＡＲＣ−１野生型ペプチドを提示する細胞に特異的に反応してＩＦＮ−γを産生するリンパ球は誘導されなかった。【００３０】
以上から、アジュバントとしてのＨＳＶは、腫瘍抗原に対する抗原特異的な免疫を増強させるが、自己抗原に対しては、明らかな免疫増強効果を示さず、安全性の面からも有用であることが明らかとなった。従って、ＨＳＶを含有する組成物は、生体に投与された抗原に対する免疫増強剤として有用であることが結論された。【００３１】
［２．ＧＬ２６１細胞に対するリンパ球反応性Ｉ］
上記のように、１週間共培養した得られた混合浮遊細胞を１×１０６個／ｍｌに調整してエフェクター細胞とした。一方、ＧＬ２６１細胞およびコントロールのＥＬ４細胞をマイトマイシンＣ（２００μｇ／ｍｌ）で６０分処理した後、１×１０６個／ｍｌに調整し、ターゲット細胞とした。これらのエフェクター細胞及びターゲット細胞を、それぞれ１００μｌずつ混合して、９６穴プレート（167008 NUNC）にて２日間共培養した。その後、培養上清中のＩＦＮ−γ放出量をELISA kit（KM-IFNG  Endogen社）を用いて解析した。【００３２】
その結果、図２に示すように、ＧＬ２６１グリオーマ細胞の腫瘍抗原であるＧＡＲＣ−１変異型ペプチドを投与したマウスでは、不活性化ＨＳＶを含有させたワクチンを投与した時にのみ、ＧＬ２６１細胞に特異的に反応してＩＦＮ−γを産生するリンパ球が誘導された。【００３３】
以上から、腫瘍抗原に加えＨＳＶをアジュバントとして用いることにより、その腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞に特異的な免疫を増強できることが示された。従って、ＨＳＶをワクチンに含有させることは、腫瘍免疫を増強させたり、病原体感染を予防したりするのに有用であることが結論された。【００３４】
［３．ＧＬ−２６１細胞に対するリンパ球反応性ＩＩ］
上記のように、１週間共培養した得られた混合浮遊細胞よりＣＤ８陽性Ｔ細胞（主として細胞障害性Ｔ細胞）を精製した後、５×１０５個／ｍｌに調整してエフェクター細胞とした。一方、ＧＬ２６１細胞を５６℃で３０分間熱処理した後、５×１０５個／ｍｌに調整し、ターゲット細胞とした。これらのエフェクター細胞及びターゲット細胞を、それぞれ１００μｌずつ混合して、９６穴プレート（167008 NUNC）にて１日間共培養した。その後、培養上清中のＩＦＮ−γ放出量 をELISA kit（KM-IFNG  Endogen社）を用いて解析した。【００３５】
その結果、図３に示すように、ＧＬ２６１グリオーマ細胞の腫瘍抗原であるＧＡＲＣ−１変異型ペプチドとＨＳＶとを含有するワクチンを用いてマウスに免疫した場合、それぞれを単独で免疫したマウスと比較して、ＧＬ２６１細胞に対してIFN-γを産生するＣＤ８陽性Ｔ細胞の反応性が増強された（図３）。【００３６】
以上から、腫瘍抗原に加えＨＳＶをアジュバントとして用いることにより、腫瘍に反応するＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導を増強することが示された。従って、ＨＳＶを含有する免疫増強剤は、それを併用した抗原に対し抗原特異的Ｔ細胞誘導剤として有用であることが結論された。【００３７】
＜実施例２＞  ＡＨ１ペプチド（腫瘍抗原）を用いた癌ワクチン
ＨＳＶの調製は実施例１と同様に行った。  
抗原には、マウス大腸癌細胞株ＣＴ２６（ＢＡＬＢ／ｃマウス由来）の腫瘍抗原であり、MHC class I (H-2Ld)上に提示されるペプチドＡＨ１（ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ、配列番号３）（Huang A et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93. 9730-9735, 1996）と、同じMHC class I (H-2Ld)上に提示されるコントロールペプチドとして、マウス肥満細胞腫細胞株Ｐ８１５の腫瘍抗原であるペプチドＰ８１５Ａ（ＬＰＹＬＧＷＬＶＦ、配列番号４）（Lethe B, et al, Eur. J. Immunol 22, 1992）を用いた。【００３８】
ワクチンは、
（１）ＡＨ１ペプチド(１００μｇ)あるいはＰ８１５Ａペプチド(１００μｇ)
（２）不活化ＨＳＶ(2×108pfu相当)あるいはMock
（３）ＰＢＳ
の混合液（１００μｌ）を、各組み合わせに対して４種類準備し、等量の不完全フロイントアジュバント（１００μｌ）と混合した（計２００μｌ）。ＣＴ２６の由来となるマウス系統であるＢＡＬＢ／ｃマウスの両手足皮内にワクチン（２００μｌ）を投与し、さらに７日後に再度、同じ各ワクチンを投与した。２回目のワクチン投与の１週間後に、ＢＡＬＢ／ｃマウスの背部にＣＴ２６腫瘍細胞を５×１０５個移植し、経時的に腫瘍径を計測して、腫瘍体積を解析した。結果を表１に示す。【００３９】
2006080420.tif 000002
【００４０】
Ｐ８１５Ａ＋ＨＳＶ（３個体）、Ｐ８１５Ａ＋Mock（４個体）のワクチンが投与されたマウスでは、腫瘍移植後８日目にそれぞれ全例でＣＴ２６腫瘍の生着が確認され、その後腫瘍体積は増加して、拒絶されることはなかった。一方、ＡＨ１＋Mockのワクチンが投与されたマウス（４個体）では、腫瘍移植後８日目に全例でＣＴ２６腫瘍の生着が確認されたが、その後、腫瘍は縮小し、腫瘍移植２２日目では１例を除き、３例で腫瘍は拒絶された。さらにＡＨ１＋ＨＳＶのワクチンが投与されたマウス（３個体）では、観察期間内に腫瘍生着は見られず、全例で完全拒絶された。【００４１】
以上から、ＨＳＶは、実際に大腸癌細胞ＣＴ２６の抗原特異的な免疫反応を増強することが示され、癌ワクチンとしての効果を増強するためのアジュバントとしての有用性が示された。従って、ＨＳＶを含有する免疫増強剤を含有するワクチンは、癌ワクチンとして有効であることが結論された。【００４２】
＜実施例３＞ＡＨ１ペプチド（腫瘍抗原）を用いた腫瘍の治療
ＨＳＶの精製は実施例１と同様に行った。また、腫瘍抗原は、実施例２と同様にＡＨ１ペプチドを用い、その標的腫瘍細胞にＣＴ２６（マウス大腸癌）を、コントロール腫瘍細胞にＭｅｔｈ  Ａ(マウス線維肉腫)を用いた。【００４３】
まず、ＣＴ２６細胞（５×１０５個）をＢａｌｂ／ｃマウスの背側部に移植し、移植５日目に第１回目の免疫を開始した。【００４４】
１回目の免疫には、
（１）ＡＨ１ペプチド（５０μｇ）あるいはＤＭＳＯ
（２）不活化ＨＳＶ（1×108 Pfu相当）あるいはＭｏｃｋ
（３）ＰＢＳ
の混合液（１００μｌ）を３種類（ＡＨ１／ＨＳＶ、及びネガティブコントロールとしてＡＨ１／ＭｏｃｋとＤＭＳＯ／Ｍｏｃｋ）準備し、等量の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）（１００μｌ）と混合した（それぞれ、ＡＨ１／ＨＳＶ（ＩＦＡ）、及びネガティブコントロールとしてＡＨ１／ＩＦＡとＤＭＳＯ／ＩＦＡと記す；各２００μｌ）。また、ポジティブコントロールとして、ＡＨ１ペプチドとＰＢＳの混合液（１００μｌ）を等量の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）（１００μｌ）と混合した（ＡＨ１／ＣＦＡと記す；２００μｌ）。このようにして調製した抗原（１００μｌずつ）をＢａｌｂ／ｃマウスの両足フットパッドに投与した。【００４５】
７日後の２回目の免疫には、
（１）ＡＨ１ペプチド（ＡＨ１／ＨＳＶ（ＩＦＡ）、ＡＨ１／ＩＦＡ、及びＡＨ１／ＣＦＡに対して）あるいはＤＭＳＯ（ＤＭＳＯ／ＩＦＡに対して）
（２）ＰＢＳ
の混合液（１００μｌ）を各組み合わせに対して調製し、等量の不完全フロイントアジュバントＩＦＡ（１００μｌ）と混合し（計２００μｌ）、同様に両足フットパッドに抗原（１００μｌずつ）を投与した。【００４６】
その後、以下の３つの実験系において、Ｔ細胞の抗原特異的な反応性の解析を行った。【００４７】
１．抗腫瘍効果の評価
マウスに移植した腫瘍の体積を、１４日までは２日ごとに、２１日までは４日ごとに計測し、その腫瘍体積の変化で免疫効果を評価した。図４Ａに、マウスごとの実験結果を、図４Ｂに、２１日目の腫瘍体積の平均値を示す。【００４８】
腫瘍体積の経時変化（図４Ａ）からは、ＤＭＳＯ／ＩＦＡ及びＡＨ１／ＩＦＡを用いた場合に比べ、ＡＨ１／ＣＦＡ（ポジティブコントロール）を用いた場合、腫瘍体積の増加が抑制されているが、ＡＨ１／ＨＳＶを用いた場合、さらに腫瘍体積の増加が抑制されていることがわかる。また、２１日目の平均腫瘍体積を（図４Ｂ）比較すると、ＤＭＳＯ／ＩＦＡ及びＡＨ１／ＩＦＡを用いた場合に比べ、ＡＨ１／ＣＦＡを用いた場合は、統計学的に有意ではないが腫瘍体積の増加に抑制傾向が見られ、一方、ＡＨ１／ＨＳＶを用いた場合は、有意に（p<0.05）腫瘍体積の増加が抑制されていた。【００４９】
このように、ＨＳＶは、ＡＨ１とともに投与することにより、大腸癌細胞ＣＴ２６の腫瘍増殖の抑制効果を示すことが明らかになった。【００５０】
２．細胞障害活性の評価
腫瘍細胞移植２１日後、各マウスの脾臓及びリンパ節より混合浮遊細胞を単離し、３〜５×１０６／ｍｌに調製した。一方、抗原提示細胞として、正常マウスより調製した脾臓細胞にＸ線を照射（６０Ｇｙ）し、ペプチド抗原ＡＨ１（１０μＭ）で９０分間反応させ、１×１０６／ｍｌに調製した。これらの混合浮遊細胞と抗原提示細胞を、それぞれ１ｍｌずつ混合し、２４穴プレート(NUNC 142475)にて５日間共培養した。その後、共培養した浮遊細胞より精製したＣＤ８陽性Ｔ細胞（Ｅ：Ｔ−ｒａｔｉｏ：  ６０，３０，１５；  ３×１０５，１．５×１０５，０．７５×１０５）を５１Ｃｒ（Amersham社）でラベルしたＣＴ２６細胞（５×１０３個）と混合して、９６穴プレート（U-bottom:BD35 3077）で４時間共培養した後、５１Ｃｒ放出アッセイにより、細胞傷害活性を評価した。なお、コントロール細胞としては、Ｍｅｔｈ  Ａ細胞（５×１０３個）を用いた。また、ＣＴ２６細胞には、１．８５ＭＢｑの５１Ｃｒを１ｍｌの細胞浮遊液（１×１０６個）に加え、１〜２時間、３７℃で振とうすることによりラベルを取り込ませた。【００５１】
その結果、図４Ｃに示すように、ＡＨ１／ＨＳＶを用いた場合、ＤＭＳＯ／ＩＦＡ及びＡＨ１／ＩＦＡを用いた場合に対して、有意に（p<0.05）ＣＴ２６細胞に対する特異的障害性が増強された。【００５２】
このように、ＨＳＶは、ＡＨ１ペプチドとともに投与することにより、抗原特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞（主に細胞傷害性Ｔ細胞と考えられる）を強力に誘導し、ＣＴ２６細胞に対する細胞障害活性を増強することが示された。【００５３】
３．サイトカインＩＦＮ−γ産生の評価
BD Cytofix/Cytoperm kit（Pharmingen社）を使用して、上記により共培養した混合浮遊細胞内におけるＩＦＮ−γ産生細胞を解析した。【００５４】
まず、共培養した混合浮遊細胞に対し、細胞内タンパク輸送を阻害するため、monensinの含有するBD GolgiStopを２４穴プレートのウエルに１．５μｌ／２ｍｌ加え、８時間後、非特異的反応を抑制するためにFc レセプターに対する抗体Fc-Block (ｍＡｂ  ２．４Ｇ２：  １００倍希釈）を添加し、さらにＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４抗体（ｍＡｂ  ＧＫ１．５  e-Bioscience社  ４００倍希釈）またはＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８抗体（ｍＡｂ  ５３-６．７  e-Bioscience社  ４００倍希釈）で染色した。その後、BD Cytofix/Cytoperm solutionを１００μｌ加えて４℃で２０分間細胞を固定し、BD Perm/Wash solutionで２回洗浄し、ＰＥ（フィコエリスリン）標識抗ＩＦＮ-γ抗体（ｍＡｂ  ＸＭＧ１．２：  e-Bioscience社  ２００倍希釈）を含むBD Perm/Wash solution ５０μｌで３０分４℃で反応させ、ＦＡＣＳ解析を行った。【００５５】
その結果、ＡＨ１／ＨＳＶ免疫群において、ＡＨ１ペプチド共培養によって増加するＩＦＮ−γ産生細胞のほとんどはＣＤ４陽性Ｔ細胞ではなく、ＣＤ８陽性Ｔ細胞によることが判明した（図４Ｄ）。【００５６】
以上から、癌抗原を用いた腫瘍の治療において、癌抗原とともにアジュバントとしてＨＳＶを用いることにより、癌抗原特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞が強く誘導され、癌免疫が増強されることが示された。従って、癌抗原とともにＨＳＶを含有する免疫増強剤を含有するワクチンは、癌抗原を用いた腫瘍の治療に有効であることが結論された。【００５７】
＜実施例４＞ヘマグルチニン抗原（ＨＡ）を用いたインフルエンザウイルスワクチン
ＨＳＶの精製は実施例１と同様に行った。なお、ここで用いた動物はＢａｌｂ／ｃマウス（♀：ｎ＝４／群）である。【００５８】
１回目の免疫には、ヘマグルチニン抗原タンパク質（ＨＡ）（Ｈ１Ｎ１：IFA-055-B0522）(１０μｇ)を用い、
（１）ＨＡ(１０μｇ/１０μｌ)あるいはＤＭＳＯ（１０μｌ）
（２）不活化ＨＳＶ（ｌｏｗ）：1×107 Pfu, 不活化ＨＳＶ（ｈｉｇｈ）: 1×108 Pfu、あるいはＭｏｃｋ
（３）ＰＢＳ
の混合液（１００μｌ）を各組み合わせに対して以下の５種類準備し、等量の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）（１００μｌ）と混合し（計２００μｌ）、Ｂａｌｂ／ｃマウスの両足フットパッドに上記ワクチン（１００μｌずつ）を投与した。  
（１）ＤＭＳＯ／ＩＦＡ
（２）ＤＭＳＯ／ＨＳＶ
（３）ＨＡ／ＩＦＡ
（４）ＨＡ／ＨＳＶ（ｌｏｗ）
（５）ＨＡ／ＨＳＶ（ｈｉｇｈ）【００５９】
２回目の免疫には、ヘマグルチニン抗原のＣＤ４エピトープ又はＣＤ８エピトープに対する免疫応答を増強させる目的で、ペプチド抗原として、Ｉ−Ｅｄ拘束性ＨＡペプチド（ＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫ  配列番号５、アミノ酸番号１２４-１３６に対応）とＫｄ拘束性ＨＡペプチド（ＩＹＳＴＶＡＳＳＬ  配列番号６、アミノ酸番号５３３-５４１に対応）の混合ペプチド(各５０μｇ)を用いた。すなわち、
７日後の２回目ワクチンは、
（１）Ｉ−Ｅｄ拘束性ＨＡペプチド(５０μｇ)およびＫｄ拘束性ＨＡペプチド(５０μｇ)、あるいはＤＭＳＯ
（２）ＰＢＳ
の混合液（５０μｌ）を、等量の不完全フロイントアジュバント（５０μｌ）と混合した（１００μｌ）、各組み合わせに対して下記の通り、Ｂａｌｂ／ｃマウスの両足フットパッドにワクチン（５０μｌずつ）を投与した。  
（１）ＤＭＳＯ／ＩＦＡ
（２）〜（５）ＨＡペプチド／ＩＦＡ【００６０】
その後、以下の２つの実験系でＴ細胞の抗原特異的な反応性の解析を行い、さらに、誘導された抗体の抗体価を測定した。【００６１】
１．細胞障害活性の評価
２回目のワクチン投与の１週間後、各マウスの脾臓及びリンパ節より混合浮遊細胞を単離し、３〜５×１０６／ｍｌに調製した。一方、抗原提示細胞として、正常マウスより調製した脾臓細胞にＸ線を照射（６０Ｇｙ）し、Ｉ−Ｅｄ拘束性ＨＡペプチド又はＫｄ拘束性ＨＡペプチド（１０μＭ）で９０分間処理し、１×１０６／ｍｌに調製した。これらの混合浮遊細胞と抗原提示細胞を、それぞれ１ｍｌずつ混合し、２４穴プレート(NUNC 142475)にて５日間共培養した。その後、共培養した浮遊細胞より精製したＣＤ８陽性Ｔ細胞（Ｅ：Ｔ-ｒａｔｉｏ：  ６０，３０，１５；  ３×１０５，１．５×１０５，０．７５×１０５）を５１Ｃｒで上述のようにラベルしたＣＴ２６細胞（１０μＭのＫｄ拘束性ＨＡペプチドで処理）（５×１０３個）と混合して、９６穴プレート（U-bottom:BD35 3077）で４時間共培養した後、５１Ｃｒ放出アッセイにより、細胞傷害活性を評価した。なお、コントロール細胞としては、ＣＴ２６細胞（Ｐ８１５Ａペプチド１０μＭで処理)（５×１０３個）を用いた。【００６２】
その結果、図５Ａに示すように、（１）ＤＭＳＯ／ＩＦＡ，  ＤＭＳＯ／ＩＦＡ、（３）ＨＡ／ＩＦＡ，  ＨＡペプチド／ＩＦＡの組み合わせに比べて、（５）ＨＡ／ＨＳＶ（ｈｉｇｈ），  ＨＡペプチド／ＩＦＡの組み合わせは有意に（p<0.05）抗原特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞を強力に誘導し、ＣＴ２６細胞（１０μＭのＫｄ拘束性ＨＡペプチドで処理）に対する細胞障害活性を増強することが示された。【００６３】
２．増殖応答の評価
共培養した混合浮遊細胞より精製したＣＤ４陽性Ｔ細胞（１×１０５個）を、Ｘ線照射（６０Ｇｙ）後の上記抗原提示細胞（Ｉ−Ｅｄ拘束性ＨＡペプチドで処理した脾臓細胞）  （５×１０４個または１×１０５個）と３日間共培養し、培養終了の５時間前に培地に[3H]-thymidine(18.5kBq/well)を添加し、培養終了後、取り込み量([3H]のカウント値cpm)で増殖応答を評価した。【００６４】
結果は、図５Ｂに示すように、（１）ＤＭＳＯ／ＩＦＡ、ＤＭＳＯ／ＩＦＡの組み合わせで免疫したマウスのＣＤ４陽性Ｔ細胞に対し、（４）ＨＡ／ＨＳＶ（ｌｏｗ）、ＨＡペプチド／ＩＦＡの組み合わせおよび（５）ＨＡ／ＨＳＶ（ｈｉｇｈ）、ＨＡペプチド／ＩＦＡの組み合わせで免疫したマウスのＣＤ４陽性Ｔ細胞は抗原提示細胞の数に依存して有意な（p<0.05）増殖促進効果を示した。【００６５】
このように、インフルエンザワクチンを投与する際、インフルエンザ抗原とともにアジュバントとしてＨＳＶを用いることにより、抗原特異的なＣＤ４陽性Ｔ細胞を誘導することができることが明らかになった。【００６６】
３．抗体価の測定
抗体価は、（１）〜（４）のマウス各４匹に対し、２回目ワクチンの１週間後、末梢血より血清を回収し、赤血球凝集抑制試験（ＨＩ）により測定した。【００６７】
具体的には、インフルエンザウイルスＨＩ試薬「生研」（デンカ生研（株））のキットを用いて、Ａ型インフルエンザウイルスＨＡ抗原に対する抗体価を調べた。検体０．１ｍｌにＲＤＥ(Receptor Destroying Enzyme)０．３ｍｌを加え、３７℃で一晩培養することにより非特異的インヒビターを除去し、５６℃で３０分間加熱してＲＤＥ処理の反応を止め、生理食塩水０．６ｍｌ加えた。そのＲＤＥ処理検体に５０％（v／v）のニワトリ赤血球浮遊液５０μｌずつ加え、混和後、４℃６０分間静置し、遠心後、上清を１：１０からスタートして段階希釈を作った。それぞれにＨＡ抗原を加え十分混和後、さらに０．５％（v／v）のニワトリ赤血球浮遊液を加え、赤血球凝集が何倍希釈で抑制されたかを調べてＨＩ抗体価を測定した。【００６８】
この赤血球凝集抑制試験の結果、（１）ＤＭＳＯ／ＩＦＡ，ＤＭＳＯ／ＩＦＡの組み合わせ、及び（２）ＤＭＳＯ／ＨＳＶ，ＨＡペプチド／ＩＦＡの組み合わせでは、何れもＨＩ抗体価は１０未満であった。一方、（３）ＨＡ／ＩＦＡ，ＨＡペプチド／ＩＦＡの組み合わせによりＨＩ抗体価が検出されたが（６５±６４．０３）、（４）ＨＡ／ＨＳＶ（ｌｏｗ），ＨＡペプチド／ＩＦＡの組み合わせによりＨＩ抗体価は有意に（p<0.05）増加した（１４０±４０）。（ただし、カッコ内は、平均値±標準偏差）
この結果から、インフルエンザ抗原とともにアジュバントとしてＨＳＶを同時に投与することにより、インフルエンザ抗原に対する血清抗体価を有意に上昇させることが明らかになった。【００６９】
４．結論
以上より、ＨＳＶは、インフルエンザ抗原の抗原特異的な免疫反応を増強することが示され、インフルエンザワクチンとしての効果を増強するためのアジュバントとしての有用性が示された。従って、インフルエンザ抗原とともにＨＳＶを含有する免疫増強剤を含有するワクチンは、インフルエンザワクチンとして有効であることが結論された。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明によって、単純ヘルペスウイルスを含有する新規免疫増強剤、新規抗体産生誘導剤、及びそれらを含有するワクチンを提供することが可能になった。
【図１】
2006080420.tif 000003
【図２】
2006080420.tif 000004
【図３】
2006080420.tif 000005
【図４】
2006080420.tif 000006
【図４】
2006080420.tif 000007
【図４】
2006080420.tif 000008
【図４】
2006080420.tif 000009
【図５】
2006080420.tif 000010
【図５】
2006080420.tif 000011
【配列表】
2006080420000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年6月6日(2006.6.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus; HSV）以外の抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞誘導剤であって、
単純ヘルペスウイルスを有効成分として含有し、
前記抗原と併用して投与されることを特徴とする抗原特異的Ｔ細胞誘導剤。
【請求項２】
単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus; HSV）以外の抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞誘導剤であって、
単純ヘルペスウイルス及び前記抗原を有効成分として含有することを特徴とする抗原特異的Ｔ細胞誘導剤。
【請求項３】
抗原特異的細胞障害性Ｔ細胞誘導剤であることを特徴とする請求項１または２に記載の抗原特異的Ｔ細胞誘導剤
【請求項４】
前記単純ヘルペスウイルスが、不活性化されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の抗原特異的Ｔ細胞誘導剤。
【請求項５】
前記単純ヘルペスウイルスが、加熱、ＵＶ照射、放射線照射、固定、または遺伝子組み換えによって不活性化されていることを特徴とする請求項４に記載の抗原特異的Ｔ細胞誘導剤。
【請求項６】
不完全フロイントアジュバント(Incomplete Freund adjuvant; IFA)をさらに含有することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の抗原特異的Ｔ細胞誘導剤。
【請求項７】
単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus; HSV）を有効成分として含有する、単純ヘルペスウイルス以外の抗原に対する抗体産生誘導剤。
【請求項８】
前記抗原と併用して投与することを特徴とする、請求項７に記載の抗体産生誘導剤。
【請求項９】
前記抗原を含有することを特徴とする、請求項７に記載の抗体産生誘導剤。
【請求項１０】
前記単純ヘルペスウイルスが、不活性化されていることを特徴とする請求項７〜１０のいずれかに記載の抗体産生誘導剤。
【請求項１１】
前記単純ヘルペスウイルスが、加熱、ＵＶ照射、放射線照射、固定、または遺伝子組み換えによって不活性化されていることを特徴とする請求項１０に記載の抗体産生誘導剤。
【請求項１２】
不完全フロイントアジュバント(Incomplete Freund adjuvant; IFA)をさらに含有することを特徴とする請求項７〜１１のいずれかに記載の抗体産生誘導剤。
【請求項１３】
単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus; HSV）以外の抗原に対する免疫増強剤であって、
単純ヘルペスウイルスを有効成分として含有し、
前記抗原と併用して投与することを特徴とする免疫増強剤。
【請求項１４】
単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus; HSV）以外の抗原に対する免疫増強剤であって、
単純ヘルペスウイルス及び前記抗原を有効成分として含有する、単純ヘルペスウイルス以外の抗原に対する免疫増強剤。
【請求項１５】
前記単純ヘルペスウイルスが不活性化されていることを特徴とする請求項１３または１４に記載の免疫増強剤。
【請求項１６】
前記単純ヘルペスウイルスが、加熱、ＵＶ照射、放射線照射、固定、または遺伝子組み換えによって不活性化されていることを特徴とする請求項１３〜１５のいずれかに記載の免疫増強剤。
【請求項１７】
不完全フロイントアジュバント(Incomplete Freund adjuvant; IFA)をさらに含有することを特徴とする請求項１３〜１６のいずれかに記載の免疫増強剤。
【請求項１８】
請求項１３〜１７に記載の免疫増強剤を含有するワクチン。
【請求項１９】
癌ワクチンであることを特徴とする請求項１８に記載のワクチン。
【請求項２０】
病原体の感染に対する予防ワクチンであることを特徴とする請求項１８に記載のワクチン。
【請求項２１】
ヒト以外の脊椎動物において、単純ヘルペスウイルス以外の抗原に対して抗原特異的なＴ細胞を誘導する方法であって、
請求項１〜６のいずれかに記載の抗原特異的Ｔ細胞誘導剤を投与することを特徴とする方法。
【請求項２２】
前記Ｔ細胞が細胞障害性Ｔ細胞であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ヒト以外の脊椎動物において、単純ヘルペスウイルス以外の抗原に対して抗原特異的な抗体産生を誘導する方法であって、
請求項８〜１２のいずれかに記載の抗体産生誘導剤を投与することを特徴とする方法。
【請求項２４】
ヒト以外の脊椎動物において免疫を増強する方法であって、
請求項１３〜１７のいずれかに記載の免疫増強剤を投与することを特徴とする方法。
【請求項２５】
ヒト以外の脊椎動物における腫瘍の治療方法であって、
請求項１８または１９に記載のワクチンを接種することを特徴とする方法。
【請求項２６】
ヒト以外の脊椎動物における病原体の感染に対する治療方法であって、
請求項１８または２０に記載のワクチンを接種することを特徴とする方法。
【請求項２７】
単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus; HSV）以外の抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞誘導剤、抗体産生誘導剤、免疫増強剤、またはワクチンの製造方法であって、
単純ヘルペスウイルスを不活性化し、前記抗原と混合することを特徴とする製造方法。
【請求項２８】
不活性化した前記単純ヘルペスウイルスをフロインド不完全アジュバント(Incomplete Freund adjuvant; IFA)と混合した後、前記抗原と混合することを特徴とする請求項２７に記載の製造方法。
【手続補正書】
【提出日】平成19年1月15日(2007.1.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus; HSV）以外の抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞誘導剤であって、
単純ヘルペスウイルスを有効成分として含有し、
該単純ヘルペスウイルスと前記抗原との混合物として投与されることを特徴とする抗原特異的Ｔ細胞誘導剤。
【請求項２】
単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus; HSV）以外の抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞誘導剤であって、
単純ヘルペスウイルスと前記抗原の混合物を有効成分として含有することを特徴とする抗原特異的Ｔ細胞誘導剤。
【請求項３】
抗原特異的細胞障害性Ｔ細胞誘導剤であることを特徴とする請求項１または２に記載の抗原特異的Ｔ細胞誘導剤
【請求項４】
前記単純ヘルペスウイルスが、不活性化されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の抗原特異的Ｔ細胞誘導剤。
【請求項５】
前記単純ヘルペスウイルスが、加熱、ＵＶ照射、放射線照射、固定、または遺伝子組み換えによって不活性化されていることを特徴とする請求項４に記載の抗原特異的Ｔ細胞誘導剤。
【請求項６】
不完全フロイントアジュバント(Incomplete Freund adjuvant; IFA)をさらに含有することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の抗原特異的Ｔ細胞誘導剤。
【請求項７】
単純ヘルペスウイルス以外の抗原に対する抗体産生誘導剤であって、
単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus; HSV）を有効成分として含有し、
該単純ヘルペスウイルスと前記抗原との混合物として投与されることを特徴とする抗体産生誘導剤。
【請求項８】
単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus; HSV）以外の抗原に対する抗体産生誘導剤であって、
単純ヘルペスウイルスと前記抗原の混合物を有効成分として含有することを特徴とする抗体産生誘導剤。
【請求項９】
前記単純ヘルペスウイルスが、不活性化されていることを特徴とする請求項７または８に記載の抗体産生誘導剤。
【請求項１０】
前記単純ヘルペスウイルスが、加熱、ＵＶ照射、放射線照射、固定、または遺伝子組み換えによって不活性化されていることを特徴とする請求項９に記載の抗体産生誘導剤。
【請求項１１】
不完全フロイントアジュバント(Incomplete Freund adjuvant; IFA)をさらに含有することを特徴とする請求項７〜１０のいずれかに記載の抗体産生誘導剤。
【請求項１２】
単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus; HSV）以外の抗原に対する免疫増強剤であって、
単純ヘルペスウイルスを有効成分として含有し、
該単純ヘルペスウイルスと前記抗原との混合物として投与されることを特徴とする免疫増強剤。
【請求項１３】
単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus; HSV）以外の抗原に対する免疫増強剤であって、
単純ヘルペスウイルスと前記抗原の混合物を有効成分として含有することを特徴とする単純ヘルペスウイルス以外の抗原に対する免疫増強剤。
【請求項１４】
前記単純ヘルペスウイルスが不活性化されていることを特徴とする請求項１２または１３に記載の免疫増強剤。
【請求項１５】
前記単純ヘルペスウイルスが、加熱、ＵＶ照射、放射線照射、固定、または遺伝子組み換えによって不活性化されていることを特徴とする請求項１２〜１４のいずれかに記載の免疫増強剤。
【請求項１６】
不完全フロイントアジュバント(Incomplete Freund adjuvant; IFA)をさらに含有することを特徴とする請求項１２〜１５のいずれかに記載の免疫増強剤。
【請求項１７】
請求項１２〜１６に記載の免疫増強剤を含有するワクチン。
【請求項１８】
癌ワクチンであることを特徴とする請求項１７に記載のワクチン。
【請求項１９】
病原体の感染に対する予防ワクチンであることを特徴とする請求項１７に記載のワクチン。
【請求項２０】
ヒト以外の脊椎動物において、単純ヘルペスウイルス以外の抗原に対して抗原特異的なＴ細胞を誘導する方法であって、
請求項１〜６のいずれかに記載の抗原特異的Ｔ細胞誘導剤を投与することを特徴とする方法。
【請求項２１】
前記Ｔ細胞が細胞障害性Ｔ細胞であることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ヒト以外の脊椎動物において、単純ヘルペスウイルス以外の抗原に対して抗原特異的な抗体産生を誘導する方法であって、
請求項８〜１１のいずれかに記載の抗体産生誘導剤を投与することを特徴とする方法。
【請求項２３】
ヒト以外の脊椎動物において免疫を増強する方法であって、
請求項１２〜１６のいずれかに記載の免疫増強剤を投与することを特徴とする方法。
【請求項２４】
ヒト以外の脊椎動物における腫瘍の治療方法であって、
請求項１７または１８に記載のワクチンを接種することを特徴とする方法。
【請求項２５】
ヒト以外の脊椎動物における病原体の感染に対する治療方法であって、
請求項１７または１９に記載のワクチンを接種することを特徴とする方法。
【請求項２６】
単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus; HSV）以外の抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞誘導剤、抗体産生誘導剤、免疫増強剤、またはワクチンの製造方法であって、
単純ヘルペスウイルスを不活性化し、前記抗原と混合された混合物を含有させることを特徴とする製造方法。
【請求項２７】
不活性化した前記単純ヘルペスウイルスをフロインド不完全アジュバント(Incomplete Freund adjuvant; IFA)と混合した後、前記抗原と混合された混合物を含有させることを特徴とする請求項２６に記載の製造方法。
【国際調査報告】
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