(57)【要約】  本発明は、発光の半値幅が５０ｎｍ〜２００ｎｍであるナノ粒子蛍光体を蛍光物質として含有する試料に紫外領域の励起光を照射し、該試料が発光する可視領域の蛍光を検出する蛍光検出方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
発光の半値幅が５０ｎｍ〜２００ｎｍであるナノ粒子蛍光体を蛍光物質として含有する試料に、紫外領域の励起光を照射し、該試料が発する可視領域の蛍光を検出する、蛍光検出方法。
【請求項２】
前記ナノ粒子蛍光体が、下記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその分解生成物である表面修飾剤によって表面修飾された金属酸化物又は金属硫化物のナノ粒子蛍光体である請求項１に記載の蛍光検出方法。
Ｍ−（Ｒ）4        ［Ｉ］
式中、Ｍはケイ素又はチタン原子を、Ｒは有機性基を示す。Ｒはそれぞれ同一でも異なっていてもよいが、Ｒのうちの少なくとも１つは親和性分子に対する反応性を有する基を示す。
【請求項３】
前記ナノ粒子蛍光体が、他分子と結合する結合部を備えた請求項１に記載の蛍光検出方法。
【請求項４】
前記ナノ粒子蛍光体が、他分子と結合する結合部を備えた請求項２に記載の蛍光検出方法。
【請求項５】
前記蛍光をとおす基板上に保持された前記試料に励起光を照射し、前記基板を透過する蛍光を検出する請求項１に記載の蛍光検出方法。
【請求項６】
前記蛍光をとおす基板上に保持された前記試料に励起光を照射し、前記基板を透過する蛍光を検出する請求項２に記載の蛍光検出方法。
【請求項７】
前記蛍光をとおす基板上に保持された前記試料に励起光を照射し、前記基板を透過する蛍光を検出する請求項３に記載の蛍光検出方法。
【請求項８】
前記基板が励起光を遮断する機能を有する請求項５に記載の蛍光検出方法。
【請求項９】
前記基板が励起光を遮断する機能を有する請求項６に記載の蛍光検出方法。
【請求項１０】
前記基板が励起光を遮断する機能を有する請求項７に記載の蛍光検出方法。
【請求項１１】
前記基板の少なくとも一方の側に励起光を遮断する部材を設ける請求項５に記載の蛍光検出方法。
【請求項１２】
前記基板の少なくとも一方の側に励起光を遮断する部材を設ける請求項６に記載の蛍光検出方法。
【請求項１３】
前記基板の少なくとも一方の側に励起光を遮断する部材を設ける請求項７に記載の蛍光検出方法。
【請求項１４】
前記基板が波長２５０ｎｍ以下の紫外領域に吸収帯を有しない請求項８に記載の蛍光検出方法。
【請求項１５】
前記基板が波長２５０ｎｍ以下の紫外領域に吸収帯を有しない請求項９に記載の蛍光検出方法。
【請求項１６】
前記基板が波長２５０ｎｍ以下の紫外領域に吸収帯を有しない請求項１０に記載の蛍光検出方法。
【請求項１７】
ランプ光源により紫外領域の励起光を照射する請求項１に記載の蛍光検出方法。
【請求項１８】
ランプ光源により紫外領域の励起光を照射する請求項２に記載の蛍光検出方法。
【請求項１９】
ランプ光源により紫外領域の励起光を照射する請求項３に記載の蛍光検出方法。
【請求項２０】
ランプ光源により紫外領域の励起光を照射する請求項５に記載の蛍光検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光検出方法に係り、より詳細には、蛍光物質を含有する試料が発する蛍光を検出する蛍光検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生化学の分野では、蛍光物質を標識物質として使用した画像処理システムが種々知られている。この画像処理システムによれば、蛍光画像を読み取ることによって、遺伝子配列、遺伝子の発現レベル、蛋白質の分離、同定、あるいは分子量、特性の評価などを行うことができる。【０００３】
例えば、電気泳動させるべき複数のＤＮＡ断片を含む溶液の中に蛍光色素を加えた後に、複数のＤＮＡ断片をゲル支持体上で電気泳動させる。あるいは、蛍光色素を含有するゲル支持体上で、複数のＤＮＡ断片を電気泳動させる。そしてこの複数のＤＮＡ断片をゲル支持体上で電気泳動させた後に、ゲル支持体を蛍光色素を含んだ溶液に浸すなどして、電気泳動されたＤＮＡ断片に標識を付す。次いで、励起光により、蛍光色素を励起して、生じた蛍光を検出し、画像を生成することによって、ゲル支持体上のＤＮＡ分布を検出することができる。【０００４】
上述した画像処理システムにおいては、蛍光を検出するために、励起光源とＣＣＤ（Charge Coupled Device）等の撮像素子とを備えた蛍光検出装置を利用し、励起光源から蛍光物質を含む試料に励起光を照射し、この試料から生じた蛍光を撮像素子により撮像して検出している。【０００５】
蛍光物質は、励起光を照射すると励起光の波長より長い波長領域で蛍光を発する。従来は、蛍光波長が異なる蛍光物質では、励起波長も異なっている。従って、複数の蛍光物質を使用する場合は、検出感度を高めるために、複数の蛍光物質の各々をそれに適した波長の励起光で励起する必要がある。【０００６】
一方、生化学的・医科学的研究分野では、複雑な生命現象を正確に検出することが要請されている。このような検出を行うために、複数のナノ粒子蛍光材料を使用した検出システムが開発されている。特に、複数種の蛍光材料の各々に適した励起光光源を使用することによる装置の大型化・複雑化を回避するために、粒径に応じて蛍光波長が変化するという半導体ナノ粒子蛍光材料のサイズ効果を利用した検出システムが開発されている（例えば、特許文献１）。
【特許文献１】特開２００２−２８７９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、ナノ粒子蛍光材料のサイズ効果を利用した検出システムでは、ひとつの励起光光源に対して、異なる粒径を持つ蛍光材料の種類数に応じた数の蛍光選択フィルタを配置させている。このとおり、複数種のナノ粒子蛍光材料に対応して複数の蛍光選択フィルタを設けたのでは、複数種類の標的物質を検出するための装置構成が複雑になり、簡便に蛍光を検出することができない。また、蛍光波長範囲の狭い蛍光ナノ粒子を用いなければならないので、検出感度の低下を招き、フィルタによる蛍光選択の結果、低下の度合いはさらに大きくなる。【０００８】
従って、高価なナノ粒子を多品種用いずに、ひとつの試料中に存在する複数の物質からの蛍光を各々高感度で検出することができる蛍光検出方法が必要とされている。【０００９】
また、励起光と蛍光の分離が容易な透過型装置での蛍光検出を可能とし、一層の安価で簡便な蛍光検出方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、発光の半値幅が５０ｎｍ〜２００ｎｍであるナノ粒子蛍光体を蛍光物質として含有する試料に、紫外領域の励起光を照射し、該試料が発光する可視領域の蛍光を検出する蛍光検出方法を提供する。なお、紫外領域とは４００ｎｍ未満の波長領域をいい、可視領域とは４００ｎｍ〜８００ｎｍの波長領域をいう。【００１１】
発光の半値幅が５０ｎｍ〜２００ｎｍであるナノ粒子蛍光体は、紫外領域の励起光で励起され、可視領域に幅広い発光スペクトルを有する蛍光を発光するので、可視領域において任意の波長の蛍光を効率よく取り出すことができる。従って、本発明では、発光の半値幅が５０ｎｍ〜２００ｎｍであるナノ粒子蛍光体を蛍光物質として用いることで、高価なナノ粒子を多品種用いずに、ひとつの試料中に存在する複数の物質からの蛍光を各々高感度で検出することができ、蛍光検出方法が非常に簡便になる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の蛍光検出方法によれば、高価なナノ粒子を多品種用いずに、ひとつの試料中に存在する複数の物質からの蛍光を各々高感度で検出することができる。また、励起光と蛍光の分離が容易な透過型装置での蛍光検出が可能となり、一層の安価で簡便に蛍光を検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、図面を参照して、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
ナノ粒子蛍光体
本発明におけるナノ粒子蛍光体は蛍光色素として機能し、半値幅が５０〜２００ｎｍの蛍光を発する。そのようなナノ粒子蛍光体としては、表面修飾剤によって表面修飾された金属酸化物又は金属硫化物であるナノ粒子蛍光体が好適に使用される。
［１］表面修飾剤
ナノ粒子蛍光体が表面修飾剤により修飾された表面を有することで、ナノ粒子蛍光体の水や親水性溶媒への分散性が改良でき、体液などによるナノ粒子蛍光体の溶出や蛍光の消光を防止できる。さらに標的分子を検出するための分子プローブをナノ粒子蛍光体に結合しやすくなる。
以下、本発明に用いられる表面修飾剤について説明する。【００１４】
本発明に用いる表面修飾剤は次の一般式［Ｉ］で表される化合物又はその分解生成物である。
Ｍ−（Ｒ）4      一般式［Ｉ］
式中、Ｍはケイ素又はチタン原子を、Ｒは有機性基を示す。Ｒはそれぞれ同一でも異なっていてもよいが、Ｒのうちの少なくとも１つは親和性分子に対する反応性を有する基を示す。【００１５】
親和性分子に対する反応性を有する基は、連結基Ｌを介して本体に結合したビニル基、アリルオキシ基、アクリロイル基、メタクリロイル基、イソシアナト基、ホルミル基、エポキシ基、マレイミド基、メルカプト基、アミノ基、カルボキシル基、又はハロゲンなどを末端に有することができる。親和性分子に対する反応性を有する基は好ましくは末端にアミノ基を有する。【００１６】
連結基Ｌとしては、例えば、アルキレン基（例：メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ヘキサメチレン基、プロピレン基、エチルエチレン基、シクロヘキシレン基など炭素数が１〜１０、好ましくは１〜８の鎖状または環状のもの）が挙げられる。【００１７】
また、連結基Ｌは不飽和結合を有していてもよい。不飽和基としては、アルケニレン基（例：ビニレン基、プロペニレン基、１−ブテニレン基、２−ブテニレン基、２−ペンテニレン基、８−ヘキサデセニレン基、１，３−ブタンジエニレン基、シクロヘキセニレン基など炭素数が１〜１０、好ましくは１〜８の鎖状または環状のもの）、アリーレン基（例：フェニレン基、ナフチレン基、など炭素数が６〜１０、好ましくは６のフェニレン基）が挙げられる。【００１８】
連結基Ｌは１個又は２個以上のヘテロ原子（窒素原子、酸素原子、硫黄原子などの、炭素及び水素原子以外の任意の原子を意味する）を有していてもよい。へテロ原子は酸素原子又は硫黄原子が好ましく、酸素原子がもっとも好ましい。ヘテロ原子の数は特に規定されないが５個以下であることが好ましく、より好ましくは３個以下である。【００１９】
連結基Ｌは上記ヘテロ原子と隣接する炭素原子を含む官能基を部分構造として含んでいてもよい。該官能基としてはエステル基（カルボン酸エステル、炭酸エステル、スルホン酸エステル、スルフィン酸エステルを含む）、アミド基（カルボン酸アミド、ウレタン、スルホン酸アミド、スルフィン酸アミドを含む）、エーテル基、チオエーテル基、ジスルフィド基、アミノ基、イミド基などが挙げられる。上記の官能基はさらに置換基を有していても良く、Ｌはこのような官能基を複数個有してもよい。Ｌが官能基を複数個有する場合には、それらの官能基は同一でも異なっていてもよい。【００２０】
官能基として好ましくは、エステル基、アミド基、エーテル基、チオエーテル基、ジスルフィド基又はアミノ基であり、さらに好ましくはアルケニル基、エステル基、エーテル基である。【００２１】
Ｒで表わされるその他の有機性基としては、任意の基が挙げられるが、好ましくはメトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｔ−ブトキシ基、ｎ−ブトキシ基などのアルコキシ基及びフェノキシ基である。これらのアルコキシ基及びフェノキシ基はさらに置換基を有していてもよいが、各置換基の合計の炭素数は８以下であることが好ましい。本発明に用いられる表面修飾剤は、アミノ基、カルボキシル基などと、酸又は塩基とが形成した塩でもよい。【００２２】
一般式［Ｉ］で表される化合物の分解生成物とは、アルコキシ基が加水分解した水酸化物、水酸基同士間の脱水縮合反応により生成した低分子量のオリゴマー（これはリニア構造、環状構造、架橋構造などいずれであってもよい）、水酸基と未加水分解のアルコキシ基による脱アルコール縮合反応生成物、これらがさらに脱水縮合反応して形成したゾル、及びゲルをいう。【００２３】
表面修飾剤の具体例としては、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、アミノフェニルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、ビス（トリメトキシシリルプロピル）アミン、Ｎ−（３−アミノプロピル）−ベンズアミドトリメトキシシラン、３−ヒドラジドプロピルトリメトキシシラン、３−マレイミドプロピルトリメトキシシラン、（ｐ−カルボキシ）フェニルトリメトキシシラン、３−カルボキシプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルチタニウムトリプロポキシド、３−アミノプロピルメトキシエチルチタニウムジエトキシド、３−カルボキシプロピルチタニウムトリメトキシドが挙げられるが、これらに限定されない。【００２４】
本発明に用いられる表面修飾剤は、末端のＮＨ2基又はＣＯＯＨ基の代わりに、これらの基が酸又は塩基と形成した塩を有していてもよい。また、本発明に使用する表面修飾剤は、ナノ粒子蛍光体の母粒子の表面全体を被覆していても、その一部に結合していてもよい。また、本発明において表面修飾剤は、単独で用いても複数併用してもよく、ナノ粒子表面において合成してもよい。【００２５】
なお、上記表面修飾剤に加えて、公知の表面修飾剤（例えば、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン（１）ラウリルエーテルリン酸、ラウリルエーテルリン酸、トリオクチルホスフィン、トリオクチルホスフィンオキシド、ポリリン酸ナトリウム、ビス（２−エチルヘキシル）スルホこはく酸ナトリウムなど）をナノ粒子合成時、あるいは合成後併用してもよい。【００２６】
［２］金属酸化物又は金属硫化物のナノ粒子蛍光体
金属酸化物又は金属硫化物中の金属としては、ＺｎなどのIIB族、Ｙ、Ｅｕ、ＴｂなどのIIIA族、Ｇａ、ＩｎなどのIIIB族、Ｚｒ、ＨｆなどのIVA族、Ｓｉ、ＧｅなどのIVB族、Ｖ、ＮｂなどのVA族、Ｍｏ、ＷなどのVIA族などの元素が挙げられる。該金属は生体にやさしいＺｎが特に好ましい。また、該金属酸化物はＺｎ2ＳｉＯ4、ＣａＳｉＯ3、ＭｇＷＯ4、ＹＶＯ4、Ｙ2ＳｉＯ5などの複合金属酸化物であってもよい。【００２７】
さらに、これらの金属酸化物又は金属硫化物のナノ粒子蛍光体は、金属酸化物又は金属硫化物中の金属とは異なる金属のイオンを少量含有することも好ましい。該金属イオンとしては、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｅｕ、Ｔｂ、Ｔｍ、Ｃｅ、Ａｌ、Ａｇなどの金属のイオンが挙げられる。これらの金属イオンは、塩化物イオンやフッ化物イオンを組み合わせた化合物として金属酸化物又は金属硫化物中にドープされることも好ましい。ドープする金属イオンは１種類でも、複数種類でもよい。該金属イオンの最適濃度は、金属酸化物又は金属硫化物の金属の種類および、該金属イオンの種類によって異なるが、金属イオンの濃度は０．００１〜１０原子％の範囲が好ましく、０．０１〜１０原子％の範囲がより好ましい。【００２８】
本発明におけるナノ粒子蛍光体の発光の半値幅は５０〜２００ｎｍであるが、簡易な装置で高感度に発光を検出するためには、発光の半値幅が６０〜１８０ｎｍであることが好ましい。更に、蛍光標識材料には発光ピーク波長と吸収ピーク波長が異なることが必要で、高感度に発光を検出するためには、本発明の金属酸化物又は金属硫化物のナノ粒子蛍光体の発光ピーク波長と発光ピークに近い側の吸収端波長との差が２０ｎｍ以上であることが好ましく、５０ｎｍ以上であることがより好ましい。このような発光のピーク波長および半値幅を持つナノ粒子蛍光体は、金属酸化物又は金属硫化物中の金属等を上記条件を満足するように選択することで得ることができる。
本発明におけるナノ粒子蛍光体は、さらに、本発明に用いられる表面修飾剤に修飾されやすいことが好ましい。【００２９】
本発明におけるナノ粒子蛍光体の数平均粒径は、好ましくは０．５〜１００ｎｍであり、より好ましくは０．５〜５０ｎｍであり、さらに好ましくは１〜１０ｎｍである。ナノ粒子蛍光体の粒径分布に関しては、変動係数が好ましくは０〜５０％、より好ましくは０〜２０％、さらに好ましくは０〜１０％である。なお、変動係数は、算術標準偏差を数平均粒径で除した商を百分率で表した値（算術標準偏差×１００／数平均粒径）を意味する。【００３０】
［３］ナノ粒子蛍光体およびその分散液の製造方法
金属酸化物であるナノ粒子蛍光体は、蛍光体に含有されるべき金属を含むアルコキシド、アセチルアセトナートなどの有機金属化合物を加水分解するゾル−ゲル法、前記金属の塩の水溶液にアルカリを加えて金属水酸化物を沈降させた後、これを脱水、アニールする水酸化物沈殿法、前記金属の塩の溶液に超音波を照射する超音波分解法、高温高圧下で前記金属の塩の分解反応を行なうソルボサーマル法、前記金属の塩の溶液を高温で噴霧するスプレーパイロリシスなどの液相合成法により得ることができる。また、有機金属化合物を用いる熱ＣＶＤ法やプラズマＣＶＤ法、前記金属または前記金属の酸化物のターゲットを用いるスパッタ法やレーザーアブレーション法などの気相合成法によってもナノ粒子蛍光体を得ることができる。【００３１】
金属硫化物であるナノ粒子蛍光体は、蛍光体に含有されるべき金属を含むジエチルジチオカルバメート化合物などの熱分解性金属化合物からトリアルキルホスフィンオキシド類、トリアルキルホスフィン類、ω−アミノアルカン類などの高沸点有機溶媒中で金属硫化物の結晶を成長させるホットソープ法、前記金属の塩の溶液に硫化ナトリウムや硫化アンモニウムなどの硫化物溶液を添加して金属硫化物の結晶を成長させる共沈法、前記金属の塩の溶液に界面活性剤を添加し、得られた原料水溶液をアルカン類、エーテル類、芳香族炭化水素などの非極性有機溶媒中に添加して逆ミセルを形成し、該逆ミセル中で金属硫化物の結晶を成長させる逆ミセル法などの液相合成法により得ることができる。また、前記金属酸化物ナノ粒子蛍光体の場合と同様に気相合成法によっても金属硫化物ナノ粒子蛍光体を得ることができる。【００３２】
上述した表面修飾剤は、ナノ粒子蛍光体の合成時に反応系に添加することもできるが、好ましくは合成後に添加し、合成により得られたナノ粒子蛍光体の母粒子の少なくとも一部を加水分解して、該母粒子と結合し、ナノ粒子の表面の少なくとも一部を被覆（表面修飾）する。なお、ナノ粒子蛍光体の母粒子を遠心分離やろ過などの常法により洗浄、精製後、本発明に用いられる表面修飾剤を含有する溶媒（好ましくはメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、２−エトキシエタノールなどの親水性有機溶媒）に該母粒子を分散させて母粒子を表面修飾剤で被覆してもよい。【００３３】
表面修飾剤の添加量は、蛍光体の粒子サイズ、粒子の濃度、表面修飾剤の種類（大きさ、構造）等により変動するが、表面修飾剤のモル数は、金属酸化物又は金属硫化物のそれの好ましくは０．００１〜１０倍、より好ましくは０．０１〜２倍である。【００３４】
前述した通り、公知の表面修飾剤を一般式［Ｉ］で表される表面修飾剤と併用することができる。公知の表面修飾剤のモル数は、特に制限はないが、金属酸化物又は金属硫化物のそれの好ましくは０．０１〜１００倍、より好ましくは０．０５〜１０倍である。【００３５】
表面修飾剤が母粒子に結合したナノ粒子蛍光体の分散液において、ナノ粒子の濃度は、蛍光強度によって異なるので特に限定されないが、０．０１ｍＭ〜１０００ｍＭが好ましく、より好ましくは０．１ｍＭ〜１００ｍＭである。分散媒としては、アルコール類、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＴＨＦなどの親水性有機溶媒や水が好ましい。【００３６】
なお、ナノ粒子蛍光体の表面が表面修飾剤で被覆されていることは、ＦＥ−ＴＥＭ等の高分解性ＴＥＭで蛍光体を観察した際に粒子間に一定の間隔があることを確認することにより、および蛍光体の化学分析により確認することができる。【００３７】
一般式［Ｉ］で表される表面修飾剤の被覆層を有するナノ粒子蛍光体では、その表面修飾剤の末端基であるアミノ基やカルボキシル基などの反応基がアミド化反応等により核酸（単量体やオリゴヌクレオチド等）、抗体（モノクローナルやポリクローナル）や、その他のタンパク質（アミノ酸）や多糖類などの親和性分子と共有結合を形成することができ、前記反応基が結合部として作用することができる。この結果、ナノ粒子蛍光体は特定の生体内分子などに対する蛍光標識物質として作用することが可能になる。【００３８】
標識を付される物質としては、抗体、タンパク、ペプチド、酵素基質、ホルモン、リンフォカイン、代謝産物、レセプター、抗原、ハプテン、レクチン、アビジン、ストレプタビジン、トキシン、炭水化物、多糖類、核酸、デオキシ核酸、誘導核酸、誘導デオキシ核酸、ＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、誘導ＤＮＡフラグメント、誘導ＲＮＡフラグメント、天然薬物、ウイルス粒子、バクテリア粒子、ウイルス成分、イースト成分、血液細胞、血液細胞成分、バクテリア、バクテリア成分、天然若しくは合成脂質、薬物、毒薬、環境汚染物質、重合体、重合体粒子、ガラス粒子、プラスチック粒子、重合体膜などを含む物質を挙げることができる。【００３９】
アミド化反応は、カルボキシル基あるいはその誘導基（エステル、酸無水物、酸ハロゲン化物など）とアミノ基の縮合により行なわれる。酸無水物や酸ハロゲン化物を用いる場合にはこのような化合物と共に塩基を共存させることが好ましい。カルボン酸のメチルエステルやエチルエステルなどのエステルを用いる場合には、生成するアルコールを除去するために反応系の加熱や減圧を行なうことが望ましい。カルボキシル基を直接アミド化する場合には、ＤＣＣ、Ｍｏｒｐｈｏ−ＣＤＩ、ＷＳＣなどのアミド化試薬、ＨＢＴなどの縮合添加剤、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ｐ−ニトロフェニルトリフルオロアセテート、２，４，５−トリクロロフェノールなどの活性エステル剤などのアミド化反応を促進する物質を蛍光体と共存させたり、カルボキシル基を有する粒子又は標識化合物と活性エステル化剤を別途反応させ、その後にアミド化反応を行ってもよい。また、アミド化反応時、アミド化により蛍光体に結合させる親和性分子のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを常法に従って適当な保護基で保護し、反応後脱保護することが望ましい。【００４０】
アミド化反応により親和性分子が結合したナノ粒子蛍光体は、ゲルろ過などの常法により洗浄、精製後、水または親水性溶媒（好ましくはメタノール、エタノール、イソプロパノール、２−エトキシエタノールなど）に分散させて、得られた分散液を蛍光検出に使用する。この分散液中のナノ粒子蛍光体の濃度は、所望の蛍光強度によって異なるので特に限定されないが、１０-1Ｍ〜１０-15Ｍが好ましく、より好ましくは１０-2Ｍ〜１０-10Ｍである。【００４１】
［４］蛍光色素
本発明にかかるナノ粒子蛍光体の表面には、蛍光体に結合可能な他の機能性物質として他の蛍光色素を直接結合させることができる。この場合、ナノ粒子蛍光体が励起することによってエネルギーが蛍光体から蛍光体の表面に結合している他の蛍光色素に移動して蛍光体と他の蛍光色素を同時に発光させることができる。ここで使用可能な蛍光色素は、ナノ粒子蛍光体からの可視域の光で励起して可視域で蛍光発光することができる色素であることが好ましく、４００ｎｍから８００ｎｍの間に蛍光スペクトル極大を有する色素であることがより好ましい。
このような蛍光色素としては、シアニン系色素（例えば、ＣｙＤｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、フルオレセイン系色素、ローダミン系色素、インビトロジェン社のAlexa色素シリーズ、BODIPY色素シリーズ、TexasRed色素シリーズ、ＷＯ０１／０２１６２４号の化合物例Ｉ−１からＩ−７４に記載されたアザシアニン系色素などを挙げることができる。【００４２】
蛍光色素を複数種併用する場合には、同時に蛍光を測定して標的物質を容易に検出するために、これらの蛍光色素の蛍光発光の波長が異なることが好ましい。蛍光色素の蛍光波長を短い順に並べたときに、一つの蛍光色素の蛍光発光のピーク波長と次の蛍光色素の蛍光発光のピーク波長の差が、１５〜２５０ｎｍであることがより好ましく、４０〜１５０ｎｍであることがさらにより好ましい。
また使用する蛍光色素は、エネルギー移動により、波長の短い蛍光から波長の長い蛍光へ順次蛍光を発することが好ましい。このような組み合わせとしては例えばＡｌｅｘａ４８８、５４６、５９４、６４７の組み合わせが挙げられる。本発明はこの組み合わせに限らず、第一の蛍光色素と、この第１の蛍光色素の蛍光スペクトルの極大の波長より１５ｎｍ以上長い波長に吸収帯を有する第二の蛍光色素とを選択することにより同様な測定が可能である。第三、第四の色素を用いる場合も同様にしてこれらの色素を選択することができる。【００４３】
ナノ粒子蛍光体と蛍光色素との結合を形成するための反応方法は、蛍光色素の種類に応じて異なるが、ナノ粒子蛍光体と連結体との結合を形成するためのそれと同様に、当業者が容易に選択することができる。【００４４】
蛍光検出方法
図１は、上述のナノ粒子蛍光体を蛍光物質として含有する試料の蛍光を、本発明の蛍光検出方法により検出するための装置の概略構成を示す図である。
この装置は、試料１０を担持する固相担体としての基板１２、試料１０に紫外領域の励起光１４を照射する励起光源１６、基板１２に対し励起光源１６とは反対側に配置され、且つ試料１０から発生した可視領域の蛍光１８を検出する高感度ＣＣＤカメラ等の撮像素子２０、及び基板１２と撮像素子２０との間に配置されるＵＶカットフィルタ２２を備えている。また、この装置は、パーソナルコンピュータ等で構成された制御装置２８、励起光源１６用のコントローラ２４、及び撮像素子２０用の２６を備え、励起光源１６及び撮像素子２０はそれぞれコントローラ２４、２６を介して制御装置２８に電気的に接続され、制御装置２８により各々駆動、制御されている。【００４５】
基板１２には、試料１０から発生した可視領域の蛍光１８に対して透明な（蛍光１８をとおす）樹脂フィルム、ガラス基板等が使用される。この基板は、波長２５０ｎｍ以下の紫外領域に吸収帯を有していないことが好ましい。また、前記樹脂フィルムとしては、公知の樹脂フィルムを使用することができるが、充分な強度と平滑な表面を有することが好ましい。また、ＤＮＡの解析に蛍光指示薬を使用するためには、樹脂フィルムは無蛍光性であることが好ましい。【００４６】
高強度の樹脂フィルムとしては、一般的にエンジニアリング・プラスチックスと呼ばれる機械的強度の高い樹脂のフィルムを使用することができる。例えば、化学工業日報社発行の「エンジニアリング・プラスチックス（改訂第３版、昭和６０年発行）」に記載の樹脂フィルムをいずれも基板１２として使用することができる。【００４７】
上記高強度の樹脂フィルムの中でも、例えば、セルロースアセテートブチレート、セルローストリアセテート、セルローストリブチレート、ポリアセタール、ポリアミド（脂肪族ポリアミドやアラミドなどの芳香族ポリアミドを含む）、ポリアミドイミド、ポリアリレート、ポリイミド、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエーテルサルフォン（ＰＥＳ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）、ポリカーボネート、ポリサルフォン（ＰＳＦ）、ポリスチレン、ポリセルローストリアセテート、ポリフェニレンサルファイド（ＰＰＳ）、ポリフェニレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリベンゾオキサゾール、非晶ポリアクリレート（ＰＡＲ）等が、基板として特に好適に使用される。【００４８】
また、無蛍光性の樹脂フィルムはポリマー骨格に芳香族基が含まないことが好ましく、具体的には、ポリメチルメタクリレート、セルロースアセテートブチレート、セルローストリアセテート、セルローストリブチレート、ポリアセタール、ポリアミドなどが好ましい。【００４９】
さらに、エポキシ樹脂、アクリル樹脂、ウレタン樹脂、フェノール樹脂、スチレン系樹脂、ビニル系樹脂、ポリエステル樹脂、ポリアミド系樹脂、メラミン系樹脂、フォルマリン樹脂などの合成樹脂も、基板（固相担体）の材料として使用することができる。【００５０】
励起光源１６は紫外領域の励起光１４を射出し、励起光源１６としては、ブロードな発光スペクトルを有する紫外線ランプ等のランプ光源が好適に使用される。紫外線ランプとしては、水銀灯やハロゲンランプ等を用いることができるが、輝度が高い点で、ハロゲンランプが特に好ましい。【００５１】
上記の装置では、制御装置２８からの制御信号に基づいて、コントローラ２４により励起光源１６が駆動され、紫外領域の励起光１４が基板１２上の試料１０に照射される。励起光１４の照射により、試料１０に蛍光物質として含有されるナノ粒子蛍光体が励起され、可視領域の蛍光１８が発生する。発生した蛍光１８は、基板１２及びＵＶカットフィルタ２２を透過して、撮像素子２０によって検出される。一方、照射された励起光１４の一部は、基板１２を透過するが、ＵＶカットフィルタ２２で遮断され、撮像素子２０には到達しない。こうして撮像素子２０で撮像された蛍光画像は、図示しないアナログ／デジタル（Ａ／Ｄ）変換回路によりデジタルデータに変換され、該データはコントローラ２６を介して制御装置２８に入力され、画像処理される。【００５２】
以上の通り、本実施の形態では、ブロードな発光スペクトルを有するナノ粒子蛍光体を用いているため、励起光源に単一波長の光を発生するレーザ光源を用いなくても、可視領域において任意の波長の蛍光を高感度、安価且つ簡便に検出することができる。【００５３】
また、励起光は紫外領域の光であり、検出する蛍光は可視領域の光である。従って、基板の撮像素子側にＵＶカットフィルタ等を配置することにより、蛍光と励起光を容易に分離することができ、バックグラウンド・ノイズの量が低減されて、検出信号のＳ／Ｎ比が向上する。【００５４】
更に、励起光源としてブロードな発光スペクトルを有するランプ光源を使用することで、単一の励起光源で複数の蛍光物質を励起することも可能である。【００５５】
なお、上記の実施の形態では、基板と撮像素子との間にＵＶカットフィルタを配置し、このＵＶカットフィルタにより、基板を透過した励起光を遮断する例について説明したが、基板自体が励起光を遮断する機能を備えていてもよい。また、基板とＵＶカットフィルタとを一体化してもよい。
［実施例］【００５６】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
蛍光検出装置
図２に示すように、暗室３０内に、ＣＣＤカメラ３２とディスプレイ（図示せず）を備えたルミノ・イメージアナライザー「LAS-1000plus（Ｒ）」（富士写真フイルム社製）を設置した。このＣＣＤカメラ３２の真下に紫外線透過トレー３６を設置した。また、紫外線透過トレー３６に向けて紫外線が照射されるように、紫外線透過トレー３６の下方に紫外線イルミネータ３８を設置した。紫外線イルミネータ３８としては「Mini Transilluminatior NTM-10（Ｒ）」（フナコシ社製）を使用した。紫外線透過トレー３６上には紫外線をとおす基板３４が置かれ、基板３４の上面に蛍光物質（酸化亜鉛ナノ粒子）４０が担持された。ＣＣＤカメラ３２の画像データは、画像解析ソフト「Image Gauge（Ｒ）」（富士写真フイルム社製）により解析された。なお、ＣＣＤカメラ３２による撮像画像は、ルミノ・イメージアナライザーのディスプレイに表示された。
【実施例１】
【００５７】
表面修飾された金属酸化物ナノ粒子蛍光体の合成
酢酸亜鉛２水和物８．８ｇを脱水エタノール４００ｍｌに溶解し、得られた溶液を９３℃で２時間還流しながら２４０ｍｌの溶媒を留去した。得られた反応液に脱水エタノール２４０ｍｌを加えて、得られた混合物を室温まで冷却した。水酸化テトラメチルアンモニウムの２５質量％メタノール溶液１８ｍｌを混合物に添加し、得られた系を３０分攪拌した。３−アミノプロピルトリメトキシシラン７．２ｍｌおよび水２．２ｍｌを系に添加して、得られたものを６０℃で４時間攪拌した。生成した白色沈殿を濾別し、エタノールで洗浄し、乾燥した。【００５８】
沈殿物はＸＲＤおよびＴＥＭの解析から平均粒子径約４ｎｍの酸化亜鉛（ＺｎＯ）ナノ粒子であることがわかった。また、ＺｎＯナノ粒子はケイ素（Ｓｉ）およびアミノプロピル基が結合した表面を有していることを元素分析、ＩＲ分光吸収測定法により確認した。【００５９】
沈殿物に水を添加して１．０×１０-4Ｍから１．０×１０-9Ｍまで水分散液中のＺｎＯナノ粒子の濃度の異なる水分散液を調製し、アミノプロピルシランで表面処理したＺｎＯナノ粒子の各分散液を、厚さ１ｍｍの石英基板（２５．４ｍｍ×７６．２ｍｍ）上に滴下した。【００６０】
各水分散液の滴下スポット（２μｌ）を保持した石英基板を基板３４として、図２に示す装置の紫外線透過トレー３６に載置し、基板３４に紫外線イルミネーター３８の紫外光を０．５秒照射しＣＣＤカメラ３２によりスポットの蛍光を撮像した。画像解析の結果、ＺｎＯナノ粒子の濃度が１．２×１０-8Ｍ以上の場合に、高感度で蛍光を検出することができた。即ち、本発明では前記濃度が１．２×１０-8Ｍと希薄な場合でも、蛍光を高感度で検出できた。
【実施例２】
【００６１】
（１）ナノ粒子作成と粒子表面のアミノ化（ZnO-APSの合成）
酢酸亜鉛２水和物（５．４９ｇ、２５ミリモル（ｍｍｏｌ））に脱水エタノール（２５０ミリリットル（ｍｌ））を加え、ディーン・スターク（Dean-Steark）脱水装置にて溶媒を留去しながら穏やかに２時間得られた溶液を加熱還流した。留去された溶媒の量は１５０ｍｌであった。白濁した反応液に脱水エタノール１５０ｍｌ添加して、得られた混合物を加熱還流し、透明になった反応液を室温まで水冷した。【００６２】
該反応液にテトラメチルアンモニウムヒドロキシド（２５％  メタノール溶液、１１．４ｍｌ、２８ｍｍｏｌ）を添加して得られた混合物を室温にて１５分間攪拌した。【００６３】
続いて３−アミノプロピルトリメトキシシラン（４．７ｍｌ、２５ｍｍｏｌ）と水（１．５ｍｌ、８３．３ｍｍｏｌ）を混合物に添加して、得られたブレンドを６０℃にて４時間攪拌した。反応開始７分後に白色固体が析出した。反応液を室温まで水冷した後、固体を吸引ろ過し、エタノールで洗浄した。得られた白色粉末を減圧下で乾燥すると表面がアミノ化された酸化亜鉛ナノ粒子が得られた。収量は６．０ｇであった。
本処方により合成したナノ粒子を溶媒に分散した分散液は分散液中のナノ粒子の含有率が１０質量％（ｗｔ％）の場合でも透明であり、ナノ粒子は分散液中に良好に分散されていた。粉末Ｘ線回折空間群Ｐ６3ｍｃに属する六方昌系（ウルツ鉱型）酸化亜鉛の標品のピークパターンと得られたナノ粒子のそれが一致し、ナノ粒子の粒径は３ｎｍであった。【００６４】
（２）脱塩
上記粒子２００ｍｇを蒸留水１０ｍｌに溶解し、「Sephadex G25（Ｒ）」を充填したカラムを用いて、得られた脱塩水溶液のゲルろ過を行った。以降の反応では全て該脱塩水溶液を使用した。
（３）蛍光強度
上記粒子に水を添加し、３４０ｎｍにおける吸光度が０．５０である水溶液を調製した。実施例１と同様にしてこの水溶液の蛍光を検出し、蛍光スペクトルの面積値を測定した。比較のために、クウォンタム・ドット（Quantum dot）社製の「Q-dot655 biotin conjugate」の水溶液を前記ナノ粒子の水溶液と同様に調製して、この水溶液の蛍光を検出し、蛍光スペクトルの面積値を測定した。結果を表１に示す。【００６５】
【表１】
2006009077.tif 000002
【００６６】
表１から明らかなように、本発明に係るナノ粒子蛍光体を用いる蛍光検出法は、従来知られているナノ粒子を用いた検出法よりも強い蛍光を示す。
【実施例３】
【００６７】
（１）酸化亜鉛ナノ粒子の合成
酢酸亜鉛２水和物（２．２ｇ，１０ｍｍｏｌ）に脱水エタノール（１００ｍｌ）を加え、Dean-Steark脱水装置にて溶媒を留去しながら穏やかに2時間得られた溶液を加熱還流した。留去された溶媒の量は６０ｍlであった。白濁した反応液を脱水した後に、ＥｔＯＨを６０ｍｌ反応液に添加して、得られた混合物を加熱還流を行い、透明になった反応液を室温まで水冷した。該反応液にテトラメチルアンモニウムヒドロキシド（２５％メタノール溶液、４．０５ｍｌ，１０ｍｍｏｌ）を添加して、得られた混合物を室温にて４時間攪拌した。
続いて２−（トリメトキシシリルエチル）ピリジン（２．２７ｇ，１０ｍｍｏｌ）と水（０．５５ｍｌ，３０ｍｍｏｌ）を混合物に添加して、得られたものを６０℃にて４時間攪拌を行い、酸化亜鉛ナノ粒子分散液を得た。【００６８】
（２）化合物１の合成
無水マレイン酸(１．６ｇ，１６．３ｍｍｏｌ）に脱水アセトニトリル（１６ｍｌ）および３−アミノ−１−プロパノールを加え、得られた混合物を６０℃で３時間撹拌した。溶媒を留去後、残査を酢酸エチルで洗浄し、白色結晶（２．６ｇ，収率９３％）を得た。得られた白色結晶をトルエンに溶解し、得られた溶液を５時間加熱還流した。上澄を留去して、無色透明の液体（７６ｍｇ，収率１７％）を得た。この液体をジクロロメタンに溶解し、得られた液を０℃に保ち、トリエチルアミン（５５ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホニルクロリド（９５ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）を該液に加えた。その後、該液を室温に戻し、２１時間撹拌した。得られた反応溶液を水に注ぎ、生成物を酢酸エチルで抽出した。有機相を水および飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより有機層を乾燥後、溶媒を留去した。残査をカラムクロマトグラフィーにより精製し、下記化合物１（７８ｍｇ，収率５６％）を得た。【００６９】
【化１】
2006009077.tif 000003
【００７０】
（３）化合物２の合成
ポリエチレングリコール３５０モノメチルエーテル（５．０ｇ，１４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶解し、得られた溶液にトリエチルアミン（２．４ｍｌ，１７ｍｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホニルクロリド（３．０ｇ，１６ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温で１８時間撹拌した。溶媒を留去後、残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製し、下記化合物２（６．１２ｇ，収率８７％）を得た。【００７１】
【化２】
2006009077.tif 000004
【００７２】
（４）酸化亜鉛ナノ粒子の表面修飾及び色素の粒子への結合
１）化合物１およびブロモ酢酸による表面修飾
上記工程（１）で得られた酸化亜鉛ナノ粒子分散液（３ｍｌ）を容器に入れ分散液からエタノールを留去した後に、脱水アセトニトリル（１ｍｌ）および化合物１（３１ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）を得られた残渣に加え、得られた混合物を６０℃で２時間撹拌した。次に、ブロモ酢酸（２８ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）を系に加え、得られたブレンドを６０℃で１時間撹拌した。溶媒を留去後、残渣をゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより精製し、酸化亜鉛ナノ粒子水溶液を得た。ここで得られた酸化亜鉛ナノ粒子はマレイミド基が結合した表面を有していることを元素分析、ＩＲ分光吸収測定法により確認した。【００７３】
２）マレイミド基への色素１の結合
上述の該ナノ粒子分散液（１ｍｌ）に緩衝液（１ｍｌ，０．１ＭのＭＥＳ，ｐＨ６．６）および下記色素１（１ｍｇ，１．９５μｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温で２時間撹拌した。
次に、得られた系をゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより精製し、下記色素１が結合した酸化亜鉛ナノ粒子分散液を得た。なお、酸化亜鉛ナノ粒子の表面への色素１の結合は、元素分析、ＩＲ分光吸収測定法により確認した。【００７４】
【化３】
2006009077.tif 000005
【００７５】
（５）酸化亜鉛ナノ粒子の化合物１および化合物２による表面修飾
上記工程（１）で得られた酸化亜鉛ナノ粒子分散液（３ｍｌ）を容器に入れ分散液からエタノールを留去した後に、脱水アセトニトリル（１ｍｌ）および化合物１（３１ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）を残渣に加え、得られた混合物を６０℃で２時間撹拌した。次に、化合物２（９９ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）を得られた系に加え、６０℃で３時間撹拌した。溶媒を留去後、残渣をゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより精製し、酸化亜鉛ナノ粒子水溶液を得た。ここで得られた酸化亜鉛ナノ粒子はマレイミド基及び化合物２からメシレート基が離脱したポリエチレングリコール構造が結合した表面を有していることを元素分析、ＩＲ分光吸収測定法により確認した。
【実施例４】
【００７６】
抗テオフィリン抗体連結表面ＰＥＧ化酸化亜鉛ナノ粒子の蛍光検出
（１）表面ＰＥＧ化酸化亜鉛ナノ粒子と抗テオフィリン抗体の連結
ＨＣｌ・ＮＨ2−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（ＭＷ＝５０００：NEKTAR社製）５０ｍｇを０．１Ｍ（ｐＨ８．０）ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解し、５．０ｍｇのＮ−（２−マレイミドエチルオキシ）コハク酸イミドを得られた溶液に添加し室温で６時間反応を行った。平均直径３ｎｍの酸化亜鉛粒子表面をアミノプロピルシランで被覆したナノ粒子を、濃度１４ｍｇ／ｍｌで０．１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）緩衝液に分散した。このナノ粒子分散液１ｍｌに上記マレイミド化ＰＥＧ溶液１００μｌと、５ｍｇのＷＳＣ（１-ethyl−３−（３−dimethylaminopropyl) carbodiimide, hydrochloride）を加えて室温で反応を行った。３０分後、ＣＨ3Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎＣＨ2ＣＯＯＨ（平均分子量３５０）１０ｍｇを反応液に添加して６時間反応を行った。ＰＤ−１０カラム（ファルマシアバイオサイエンス社）で生成物を精製し、マレイミド基を導入した表面ＰＥＧ化酸化亜鉛ナノ粒子分散液を得た。この粒子は４６０ｎｍ（励起：３７３ｎｍ）に蛍光極大を有していた。
抗テオフィリン抗体をペプシン処理、メルカプトエチルアミン還元することにより得た精製したＦａｂ’分画溶液１．５ｍｌ（２５ｍＭ、ｐＨ７．２、ＨＥＰＥＳ緩衝液；１．６ｍｇ／ｍｌ）を、マレイミド化酸化亜鉛ナノ粒子分散液（１０ｍｇ／ｍｌ）２００μｌと混合し、室温で一晩反応を行った。反応系を攪拌した後、生成物をＳｅｐｈａｄｅｘＧ１００（ｐＨ７．４、０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液で溶離）でゲルろ過により精製し、Ｆａｂ’連結ＰＥＧ化酸化亜鉛ナノ粒子を得た。【００７７】
（２）テオフィリン結合石英基板の作成と蛍光ナノ粒子の検出
合成石英基板（信越化学製）を０．１％トリメトキシアミノプロピルシラン（信越化学）水溶液に１時間浸漬した後、表面の水滴を窒素ガスで除去し表面アミノ化石英基板を作成した。Theophylline-8-Butanoic Acid（Sigma社製）３５ｍｇ、ＷＳＣ（同仁化学製）３０ｍｇ、Sulfo-NHS（Pierce社製）３０ｍｇをＤＭＳＯ２０ｍｌに溶解し、この溶液にアミノ化石英基板を浸漬し、室温で一晩反応を行い、表面にテオフィリン部位を共有結合させた。精製水で表面を洗浄し、室温で風乾させた。この基板を、以下の実験に用いた。
Ｆａｂ’連結ＰＥＧ化酸化亜鉛ナノ粒子（ナノ粒子濃度１．０×１０-5Ｍ）分散液と、その１０倍、及び１００倍希釈液のそれぞれ１μｌで石英基板をスポットし、室温で３０分静置後、精製水で洗浄した。表面の水滴を除き、紫外線ＬＥＤ（励起光３６５ｎｍ）を内蔵したＬＡＳ３０００（富士写真フイルム）でスポットの蛍光を測定した。その結果、ナノ粒子濃度に依存した強度の蛍光が観察された。また、紫外線照射（５分間）を繰り返しても、観測される石英基板上の蛍光強度は変化せず、耐光性に優れた蛍光検出試薬であることを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】本発明の蛍光検出方法を実施するための装置の概略構成を示す図である。
【図２】実施例で蛍光検出に使用した装置の概略構成を示す図である。
【図１】
2006009077.tif 000006
【図２】
2006009077.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成19年1月11日(2007.1.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発光の半値幅が５０ｎｍ〜２００ｎｍであるナノ粒子蛍光体を蛍光物質として含有する試料に、紫外領域の励起光を照射し、該試料が発する可視領域の蛍光を検出する、蛍光検出方法であって、前記ナノ粒子蛍光体が、下記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその分解生成物である表面修飾剤によって表面修飾された金属酸化物又は金属硫化物のナノ粒子蛍光体である蛍光検出方法。
Ｍ−（Ｒ）4        ［Ｉ］
式中、Ｍはケイ素又はチタン原子を、Ｒは有機性基を示す。Ｒはそれぞれ同一でも異なっていてもよいが、Ｒのうちの少なくとも１つは親和性分子に対する反応性を有する基を示す。
【請求項２】
前記ナノ粒子蛍光体が、他分子と結合する結合部を備えた請求項1に記載の蛍光検出方法。
【請求項３】
前記蛍光をとおす基板上に保持された前記試料に励起光を照射し、前記基板を透過する蛍光を検出する請求項1に記載の蛍光検出方法。
【請求項４】
前記蛍光をとおす基板上に保持された前記試料に励起光を照射し、前記基板を透過する蛍光を検出する請求項2に記載の蛍光検出方法。
【請求項５】
前記基板が励起光を遮断する機能を有する請求項3に記載の蛍光検出方法。
【請求項６】
前記基板が励起光を遮断する機能を有する請求項4に記載の蛍光検出方法。
【請求項７】
前記基板の少なくとも一方の側に励起光を遮断する部材を設ける請求項3に記載の蛍光検出方法。
【請求項８】
前記基板の少なくとも一方の側に励起光を遮断する部材を設ける請求項4に記載の蛍光検出方法。
【請求項９】
前記基板が波長２５０ｎｍ以下の紫外領域に吸収帯を有しない請求項5に記載の蛍光検出方法。
【請求項１０】
前記基板が波長２５０ｎｍ以下の紫外領域に吸収帯を有しない請求項6に記載の蛍光検出方法。
【請求項１１】
ランプ光源により紫外領域の励起光を照射する請求項1に記載の蛍光検出方法。
【請求項１２】
ランプ光源により紫外領域の励起光を照射する請求項2に記載の蛍光検出方法。
【請求項１３】
ランプ光源により紫外領域の励起光を照射する請求項3に記載の蛍光検出方法。
【国際調査報告】
2006009077.tif 000008
2006009077.tif 000009
2006009077.tif 000010
2006009077.tif 000011