(57)【要約】簡便かつ、回収率に優れる微生物及び核酸の回収方法を提供する。  本発明の微生物の回収方法は、微粒子と試料とを接触させ、前記試料中の微生物を微粒子に吸着させる微生物吸着工程を含み、前記微粒子の粒子径が６μｍ以下であり、かつ、その比表面積が５０ｍ２／ｇ以下であることを特徴とする。また、本発明の核酸の回収方法は、試料中の微生物を微粒子に吸着させる微生物吸着工程と、前記微粒子に吸着させた微生物から核酸を溶出させる核酸溶出工程とを含み、前記微生物吸着工程が、本発明の微生物回収方法であることを特徴とする。本発明の回収方法によれば、微生物及び核酸を簡便かつ効率よく回収できる。前記微粒子は、磁性シリカ粒子が好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微粒子を用いた微生物の回収方法であって、微粒子と試料とを接触させ、前記試料中の微生物を微粒子に吸着させる微生物吸着工程を含み、前記微粒子の粒子径が６μｍ以下であり、かつ、その比表面積が５０ｍ２／ｇ以下であることを特徴とする微生物回収方法。
【請求項２】
前記微粒子が、その表面に、水酸基を有する微粒子である請求の範囲１記載の微生物回収方法。
【請求項３】
前記微粒子が、シリカ粒子である請求の範囲１記載の微生物回収方法。
【請求項４】
前記微粒子が、磁性粒子である請求の範囲１記載の微生物回収方法。
【請求項５】
前記微粒子が、磁性シリカ粒子である請求の範囲１記載の微生物回収方法。
【請求項６】
前記微粒子が、磁性金属及び磁性金属酸化物の少なくとも一方を含む磁性シリカ粒子である請求の範囲５記載の微生物回収方法。
【請求項７】
前記微粒子を含む微生物回収液を準備し、前記微生物吸着工程において、前記微生物回収液と試料とを接触させる請求の範囲１記載の微生物回収方法。
【請求項８】
前記微生物回収液が、酸性液又は中性液であって、前記酸性液が、ｐＨ２〜３であり、前記中性液が、Ｍｇ塩、Ｎａ塩、Ｃａ塩及びＫ塩からなる群から選択される少なくとも１つの塩を含む中性液である請求の範囲７記載の微生物回収方法。
【請求項９】
前記微生物回収液が、Ｍｇ塩を含む中性液である請求の範囲７記載の微生物回収方法。
【請求項１０】
前記微生物回収液が、タンパク質変性剤を含む液である請求の範囲７記載の微生物回収方法。
【請求項１１】
前記タンパク質変性剤が、グアニジウム塩、エタノール及び酢酸からなる群から選択される少なくとも１つである請求の範囲１０記載の微生物回収方法。
【請求項１２】
前記微生物が、菌体、ウイルス及び細胞からなる群から選択される少なくとも１つである請求の範囲１記載の微生物回収方法。
【請求項１３】
前記微生物が、菌体又は細胞であって、前記微粒子の粒子径が６μｍ以下であり、かつ、その比表面積が２０ｍ２／ｇ以下である請求の範囲１記載の微生物回収方法。
【請求項１４】
前記微生物が、ウイルスであって、前記微粒子の粒子径が２μｍ以下であり、かつ、その比表面積が３０ｍ２／ｇ以下である請求の範囲１記載の微生物回収方法。
【請求項１５】
核酸の回収方法であって、試料中の微生物を微粒子に吸着させる微生物吸着工程と、前記微粒子に吸着させた微生物から核酸を溶出させる核酸溶出工程とを含み、前記微生物吸着工程が、請求の範囲１記載の微生物回収方法である核酸回収方法。
【請求項１６】
前記核酸溶出工程において、微生物を吸着させた微粒子を核酸抽出試薬に接触させることにより、前記微生物から核酸を溶出させる請求の範囲１５記載の核酸回収方法。
【請求項１７】
さらに、液体分離工程を含み、前記微生物吸着工程において、微粒子を含む微生物回収液と、微生物を含む試料とを接触させ、前記液体分離工程において、微生物を吸着させた微粒子と液体とを分離する請求の範囲１５記載の核酸回収方法。
【請求項１８】
請求の範囲１記載の微生物回収方法に使用する微生物回収用キットであって、粒子径が６μｍ以下であり、かつ、その比表面積が５０ｍ２／ｇ以下である微粒子を含む微生物回収用キット。
【請求項１９】
前記微粒子が、磁性シリカ粒子である請求の範囲１８記載の微生物回収用キット。
【請求項２０】
さらに、微生物回収液を含み、前記微生物回収液が、前記微粒子を含む液である請求の範囲１８記載の微生物回収用キット。
【請求項２１】
前記微生物回収液が、酸性液又は中性液であって、前記酸性液が、ｐＨ２〜３であり、前記中性液が、Ｍｇ塩、Ｎａ塩、Ｃａ塩及びＫ塩からなる群から選択される少なくとも１つの塩を含む中性液である請求の範囲２０記載の微生物回収用キット。
【請求項２２】
請求の範囲１５記載の核酸回収方法に使用する核酸回収用キットであって、粒子径が６μｍ以下であり、かつ、その比表面積が５０ｍ２／ｇ以下である微粒子、及び核酸抽出試薬を含む核酸回収用キット。
【請求項２３】
前記微粒子が、磁性シリカ粒子である請求の範囲２２記載の核酸回収用キット。
【請求項２４】
さらに、微生物回収液を含み、前記微生物回収液が、前記微粒子を含む液である請求の範囲２２記載の核酸回収用キット。
【請求項２５】
前記微生物回収液が、酸性液又は中性液であって、前記酸性液が、ｐＨ２〜３であり、前記中性液が、Ｍｇ塩、Ｎａ塩、Ｃａ塩及びＫ塩からなる群から選択される少なくとも１つの塩を含む中性液である請求の範囲２４記載の核酸回収用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、微粒子を用いた微生物及び核酸の回収方法ならびにそれらに用いるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】  核酸の分析は、医療分野において感染症や遺伝子疾患を遺伝子レベルで診断するために重要な役割を果たしており、現在においては、医療分野に限らず、農業あるいは食品分野などの様々な分野において応用され、使用されている。【０００３】  核酸の分析には、試料（例えば、菌体培養液、尿、血液等）から核酸を回収する必要がある。その方法としては、例えば、磁性粒子等の微粒子を用いる方法がある（例えば、特許文献１参照）。この文献の方法は、酸性条件下において磁性粒子に対して菌体が非特異的に結合することから、菌体を磁性粒子とともに磁気的に分離可能であるという知見に基づいている。より具体的には、まず、酸性条件下で磁性粒子と菌体培養液を混合して菌体を磁性粒子に固定化させた後、磁場を作用させて磁性粒子を液体から回収する。ついで、前記磁性粒子を懸濁して磁性粒子から菌体を分離させた後、菌体を溶解してＤＮＡを溶出させる。そして、溶出したＤＮＡを磁性粒子に固定化させることにより目的とするＤＮＡを得る。【０００４】  その他の微粒子を用いた方法としては、細胞を磁性シリカ粒子等の固体支持体に固定化させた後、前記細胞の核酸を溶出させ、前記核酸を前記固体支持体に結合させて核酸を回収する方法がある（例えば、特許文献２参照）。【０００５】  これらの方法は、試料中から菌体を分離するための遠心分離操作が不要であるため、機械による自動化に適するという利点がある。その反面、試料からの菌体や核酸の回収率が十分とは言えず、未だ改善の余地がある。また、菌体や核酸の回収率を向上させるためには、磁性粒子の使用量を増加させる必要があり、コスト的に不利である。【０００６】  このため、簡便、かつ、回収率が高い微生物及び核酸の回収方法が広く求められている。【０００７】
【特許文献１】特表２００３−５２１２２８号公報
【特許文献２】特表２００２−５０７１１６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】  本発明は、このような事情に鑑みなされたもので、簡便かつ回収率が高い微生物及び核酸の回収方法の提供を、その目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】  本発明の微生物回収方法は、微粒子を用いた微生物の回収方法であって、微粒子と試料とを接触させ、前記試料中の微生物を微粒子に吸着させる微生物吸着工程を含み、前記微粒子の粒子径が６μｍ以下であり、かつ、その比表面積が５０ｍ２／ｇ以下であることを特徴とする。【００１０】  また、本発明の核酸回収方法は、試料中の微生物を微粒子に吸着させる微生物吸着工程と、前記微粒子に吸着させた微生物から核酸を溶出させる核酸溶出工程とを含み、前記微生物吸着工程が、本発明の微生物回収方法であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】  本発明者等は、試料からの微生物及び核酸の回収率を向上すべく、鋭意研究を重ねた。その過程で、微粒子を用いて微生物を回収するにあたって、使用する微粒子の粒子径及び比表面積が、微生物の回収率に大きな影響を与えるという知見を得て、さらに研究を重ねた結果、本発明に至った。すなわち、通常、微生物の回収率を向上させるためには、比表面積が大きな微粒子を使用して微粒子の総表面積を大きくすることが考えられる。ところが、比表面積が大きな微粒子を使用した場合、総表面積が大きいにも関わらず、微生物を十分に吸着できないことが分かった。これは、おそらく、以下の理由によると推測される。すなわち、比表面積が大きな微粒子としては、例えば、その表面に多くの細孔を有するものが考えられるが、この場合、微生物と微粒子との接触面積が小さくなるため、十分に微生物を吸着できないと考えられる。これに対し、本発明の微生物回収方法に使用する粒子径６μｍ以下かつ比表面積５０ｍ２／ｇ以下の微粒子であれば、例えば、微生物と微粒子との接触面積が大きくなるため、微生物を十分に吸着でき、微粒子あたりの微生物の吸着量を増加できたと考えられる。このため、本発明の微生物回収方法によれば、微生物の回収率が向上でき、遠心分離等の煩雑な工程を必要としないことから、簡便な回収が可能である。また、このように前記微粒子の使用により回収率が向上するため、例えば、従来より少量の微粒子であっても高い回収率で微生物を回収することも可能である。【００１２】  本発明の核酸回収方法は、本発明の微生物回収方法によって微生物を回収するため、高い回収率で微生物を回収でき、このように高い回収率で回収した微生物から核酸を抽出するため、核酸を効率よく回収できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の実施例７におけるリアルタイムＰＣＲの測定結果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の実施例８−１及び比較例６−１におけるリアルタイムＰＣＲの測定結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施例８−２及び比較例６−２におけるリアルタイムＰＣＲの測定結果を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の実施例９及び比較例７におけるリアルタイムＰＣＲの測定結果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例１０及び比較例８におけるリアルタイムＰＣＲの測定結果を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の実施例１３−１及び１３−２ならびに比較例１１における回収率を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施例１３−３及び比較例１２における回収率を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明の実施例１４−１及び１４−２ならびに比較例１３における回収率を示すグラフである。
【図９】図９は、本発明の実施例１４−３及び１４−４ならびに比較例１４における回収率を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】  本発明において、前記微粒子の粒子径の上限値は、前述のように、６μｍ以下であり、好ましくは４μｍ以下、より好ましくは２μｍ以下、さらに好ましくは１μｍ以下、特に好ましくは０．４μｍ以下である。また、下限値は特に制限されないが、例えば、０．１μｍ以上が好ましい。このような粒子径の微粒子であれば、前述のように高い回収率で微生物を回収できる。また、従来より少量の微粒子であっても、高い回収率で微生物を回収できるため、コスト的に極めて有利である。前記粒子径は、微粒子の外周におけるある点と、その他の点とを結ぶ線であって、かつ、最も長い線の長さのことをいい、例えば、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて前記微粒子を直接観察すること等により求めることができる。使用する微粒子のうち、例えば、５０％以上の微粒子の粒子径が、前記範囲であればよく、好ましくは７０％以上である。【００１５】  前記粒子径の比表面積の上限値は、前述の通り、５０ｍ２／ｇ以下であり、好ましくは３０ｍ２／ｇ以下、より好ましくは２０ｍ２／ｇ以下である。前記比表面積の下限値は、特に制限されないが、１ｍ２／ｇ以上が好ましい。前記比表面積は、例えば、ＪＩＳＫ１１５０「シリカゲル試験方法」で規格化されたＢＥＴ（窒素吸着）法によって算出できる。使用する微粒子のうち、例えば、５０％以上の微粒子の比表面積が、前記範囲であればよく、好ましくは７０％以上である。【００１６】  前記微粒子の粒子径及び比表面積は、例えば、後述する回収対象である微生物の種類等に応じて決定してもよい。回収対象が菌体や細胞である場合、例えば、粒子径０．１〜６μｍ、比表面積１〜５０ｍ２／ｇが好ましく、より好ましくは粒子径０．１〜２μｍ、比表面積１〜２０ｍ２／ｇである。一方、回収対象がウイルスである場合、例えば、粒子径０．１〜６μｍ、比表面積１〜５０ｍ２／ｇが好ましく、より好ましくは粒子径０．１〜２μｍ、比表面積１〜３０ｍ２／ｇである。【００１７】  前記微粒子は、例えば、その表面に水酸基等を有する微粒子が好ましく、中でも、表面に、シリカ化合物や、ｐｏｌｙ（ｅｔｈｌｅｎｅ、ａｌｋｙｌ−ＯＨ、ａｃｒｙｌａｔｅ）及びポリエチレングリコール等の水酸基を有する樹脂等を含む微粒子が好ましい。このような微粒子であれば、例えば、微生物をさらに吸着させ易くなるため、回収率をより一層向上できる。【００１８】  また、前記微粒子は、磁性を有する微粒子であってもよいし、磁性を有さない微粒子であってもよいが、例えば、微粒子と液体との分離がさらに容易となるため、磁性粒子が好ましい。前記磁性粒子は、微粒子の一部が磁性を有していればよく、微粒子全体が磁性を有している必要はない。すなわち、前記磁性粒子としては、例えば、磁性材料により構成された粒子の表面の少なくとも一部を非磁性材料で被覆した磁性粒子や、磁性材料と非磁性材料とを混練して造粒した磁性粒子等があげられる。なお、前記微粒子は、市販の微粒子を使用してもよい。【００１９】  前記磁性材料としては、磁性を有するものであれば特に制限されないが、例えば、鉄、クロム、ニッケル等の金属、酸化鉄や酸化クロム等の金属酸化物、磁性合金等があげられる。前記酸化鉄としては、例えば、Ｆｅ３Ｏ４���磁鉄鉱）、Ｆｅ２Ｏ３（マグヘマイト）、ｒＦｅ２Ｏ３（ｒ型三二鉄）等があげられる。前記非磁性材料としては、例えば、シリカ化合物、水酸基を有する樹脂等があげられる。前記シリカ化合物としては、例えば、ガラス、ゼライト珪藻土、シリカポリマー、珪酸マグネシウム、シリコーン窒素化合物（例えば、ＳｉＮ４）、珪酸アルミニウム、二酸化珪素等があげられる。中でも、ガラス、ゼライト珪藻土、シリカポリマー、ＳｉＮ４、二酸化珪素が好ましく、ガラス、ゼライト珪藻土、ＳｉＮ４、二酸化珪素がより好ましい。前記水酸基を有する樹脂としては、例えば、ｐｏｌｙ（ｅｔｈｌｅｎｅ、ａｌｋｙｌ−ＯＨ、ａｃｒｙｌａｔｅ）、ポリエチレングリコール等があげられる。【００２０】  これらの中でも、前記微粒子は、磁性金属や磁性金属酸化物等の磁性材料を含む磁性シリカ粒子が好ましく、より好ましくは前記磁性材料をシリカ化合物で被覆した磁性シリカ粒子が好ましい。【００２１】  また、前記磁性を有さない微粒子としては、例えば、非磁性材料により構成された粒子等があげられ、前記非磁性材料としては前述と同様である。【００２２】  また、本発明における微粒子は、前述のように回収率に優れることから、従来より少量の微粒子であっても、優れた効率で微生物を回収できる。このように、微粒子の使用量を低減できれば、例えば、微生物を回収した液体から微粒子を十分に分離することも可能である。すなわち、前述のように、従来では、回収率向上のため、微粒子の使用量を増加させる必要があったが、使用量が増加すると、これに伴って微生物や核酸を回収した液体から微粒子を十分に分離することが困難であった。これに対して、本発明においては、前述の微粒子を使用することにより、使用量を低減できるため、回収した液体からの微粒子の分離を十分に行うことも可能となる。さらに、従来のように微粒子が十分に分離できない場合、微生物の回収液から後述するようにして核酸を回収すると、その回収液に微粒子が残存するおそれがある。このように微粒子が残存すると、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法による核酸増幅において、残存微粒子が反応の阻害剤となり、十分に核酸を増幅できないおそれがある。また、光学的手法により核酸に付した標識を測定して検出する場合、回収液の残存微粒子によって測定誤差が生じるおそれもある。しかしながら、本発明であれば、前述のように微生物と微粒子とが十分に分離されるため、例えば、残存微粒子による前記問題を回避することも可能となる。このため、例えば、ＰＣＲの増幅効率の低下や分析精度の低下を抑制することもできる。【００２３】  さらに、本発明の微生物回収方法によれば、従来より小さい微粒子（粒子径６μｍ以下）を使用するため、例えば、不純物を多く含む試料であっても、高い回収率で微生物を回収できる。また、このように粒子径が小さいため、従来より多くの微粒子を試料に添加することも可能であり、これによっても回収率をさらに向上できる。【００２４】  本発明において、微生物とは、例えば、菌体、ウイルス及び細胞を含む。前記菌体は、特に制限されないが、バクテリア及び菌類を含み、例えば、淋菌、クラミジア、抗酸菌、非定型抗酸菌、レジオネラ、マイコプラズマ、スピロヘータ、梅毒スピロヘータ、リケッチア、らい菌、鼠咬症スピリルム、ブドウ球菌、連鎖球菌、大腸菌、緑膿菌及びペスト菌等があげられる。前記ウイルスとしては、例えば、λファージ、免疫不全ウイルス、白血球ウイルス、日本脳炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、成人Ｔ細胞白血病ウイルス（ＡＴＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及びエボラ出血熱ウイルス等があげられる。前記細胞としては、例えば、白血球、上皮細胞、粘膜細胞、体細胞、その他動植物の細胞等があげられる。前記試料は、特に制限されず、例えば、生体由来試料、生活排水や工場排水等から採取された環境試料、化学分析で使用される化学試料等がある。前記生体由来試料としては、例えば、全血、リンパ液、尿、唾液、痰、鼻汁等がある。【００２５】  本発明の微生物回収方法は、前述のように、微粒子を用いた微生物の回収方法であって、微粒子と試料とを接触させ、前記試料中の微生物を微粒子に吸着させる微生物吸着工程を含み、前記微粒子の粒子径が６μｍ以下であり、かつ、その比表面積が５０ｍ２／ｇ以下であることを特徴とする。【００２６】  本発明の微生物回収方法において、予め微粒子を含む微生物回収液を準備し、前記微生物吸着工程において、前記微生物回収液と試料とを接触させ、試料中の微生物を微粒子に吸着させることが好ましい。前記微生物回収液における微粒子の含有量は、特に制限されないが、例えば、回収対象となる微生物の種類や量、使用する微粒子の粒子径や比表面積等に基づき決定できる。試料が尿や血液等である場合、例えば、試料１００μＬに対して０．１〜１０ｍｇの微粒子を使用することが好ましく、より好ましくは１〜５ｍｇである。なお、本発明において、前記微生物回収液は、微粒子に微生物を吸着させるために使用する試薬のことをいう。【００２７】  前記微生物回収液は、例えば、酸性液や中性液等が好ましい。このような液の使用によって、さらに少量の微粒子であっても、より高い回収率を実現でき、コスト的に極めて有利である。前記酸性液は、そのｐＨが、例えば、２〜３であることが好ましく、緩衝液の場合、例えば、ギ酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液及びグリシン−塩酸緩衝液等があげられる。一方、前記中性液が緩衝液の場合、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等があげられる。前記中性液は、例えば、Ｍｇ塩、Ｎａ塩、Ｃａ塩及びＫ塩等の塩を含むことが好ましく、より好ましくはＭｇ塩である。これらの塩は、１種類のみでもよいし、２種類以上でもよい。このような塩を含む中性液の使用により、さらに少量の微粒子であっても、高い回収率を実現できる。前記塩の具体例としては、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ及びＫＣｌ等があげられ、好ましくはＭｇＣｌ２である。前記中性液における塩の濃度は、例えば、０．２５〜２．０Ｍであり、好ましくは０．５〜１．０Ｍである。【００２８】  前記微生物回収液は、例えば、タンパク質変性剤を含むことが好ましい。微生物の回収率をより一層向上させ、さらに少量の微粒子であっても、極めて高い回収率で微生物を回収できるからである。前記タンパク質変性剤としては、例えば、非界面活性剤系変性剤が好���しい。前記非界面活性剤系変性剤としては、例えば、重金属塩、有機溶媒及び尿素等があげられ、具体例としてはグアニジウム塩、エタノール及び酢酸が好ましい。【００２９】  微生物を吸着させた微粒子の回収は、後述するように、例えば、磁石等を用いて行うことができる。また、微粒子に吸着させた微生物と微粒子との分離は、例えば、前記微粒子を生理食塩水や適当な濃度の界面活性剤等に懸濁することによって行うことができる。【００３０】  次に、本発明の核酸回収方法は、前述のように、本発明の微生物回収方法により、試料中の微生物を微粒子に吸着させる微生物吸着工程と、前記微粒子に吸着させた微生物から核酸を溶出させる核酸溶出工程とを含む。【００３１】  前記核酸溶出工程において、前記微粒子を核酸抽出試薬に接触させ、微粒子に吸着させた微生物から核酸を溶出させることが好ましい。前記核酸抽出試薬は、回収対象となる微生物の種類等に応じて決定でき、特に制限されないが、例えば、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン  ソルビタン  アルキル  エステル（Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤等）及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤や、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等があげられる。前記Ｔｒｉｔｏｎ系界面活性剤の具体例としては、商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−１００があげられ、前記Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤の具体例としては、商品名Ｔｗｅｅｎ２０があげられる。また、前記核酸抽出試薬の溶媒としては、特に制限されないが、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液があげられる。【００３２】  本発明の核酸回収方法は、さらに、液体分離工程を含んでもよい。この場合、前記微生物吸着工程において、微粒子を含む微生物回収液と微生物を含む試料とを接触させて前記微粒子に前記微生物を吸着させ、ついで、前記液体分離工程において、前記微粒子と液体（例えば、微生物回収液）とを分離し、前記核酸溶出工程を行うことが好ましい。前記微生物回収液は、前述のとおりである。【００３３】  本発明の核酸回収方法の一例として、微粒子に吸着させた微生物からの核酸の回収方法について説明する。【００３４】  前記微粒子が磁性粒子である場合、例えば、以下のようにして行うことができる。まず、液体分離工程において、容器の外部から磁石等により磁力を作用させて容器の内面に磁性粒子を付着させ、この状態で容器から液体を除去し、前記微生物を吸着させた磁性粒子を回収する。この方法によれば、不要成分（例えば、液体成分）と必要成分（例えば、磁性粒子等の固体成分）とを分離するための遠心分離操作を行う必要がなく、試料から微生物を回収する作業を簡略化できる。【００３５】  ついで、前記核酸溶出工程において、例えば、前記磁性粒子を核酸抽出試薬中に分散させ、加熱する。前記加熱温度及び加熱時間は、特に制限されず、例えば、回収対象である微生物や核酸抽出試薬の種類及び量などによって設定できるが、例えば、加熱温度が８０〜１００℃であり、加熱時間が１〜１０分であることが好ましい。【００３６】  そして、前記液体分離工程と同様に、容器の外部から磁力を作用させて容器の内面に磁性粒子を付着させ、この状態で容器から核酸を含む核酸抽出試薬を採取することによって核酸を回収できる。この方法によれば、不要成分（例えば、磁性粒子）と必要成分（核酸を含む核酸抽出試薬）とを分離するための遠心分離操作を行う必要がなく、核酸を回収する作業を簡略化できる。【００３７】  一方、前記微粒子が磁性粒子でない場合は、例えば、以下のようにして行うことができる。前記液体分離工程において、例えば、微粒子の自重により微粒子を自然沈降させて、微粒子と液体とを分離させる。ついで、前記核酸溶出工程は、前記磁性粒子の場合と同様にして行い、核酸を溶出した後、前記液体分離工程と同様に、例えば、微粒子の自重により微粒子を自然沈降させた後、核酸を含む上清を回収することによって核酸を回収できる。【００３８】  次に、本発明の微生物回収用キットは、本発明の微生物回収方法に使用する微生物回収用キットであって、粒子径が６μｍ以下であり、かつ、その比表面積が５０ｍ２／ｇ以下である微粒子を含む微生物回収用キットである。本発明のキットによれば、このような微粒子の使用により、高い回収率で微生物を回収できる。また、従来より少量の微粒子であっても、高い回収率を実現できるため、コスト的に極めて有利である。前記微粒子は、本発明の微生物の回収方法と同様のものが使用でき、中でも、磁性シリカ粒子が好ましい。なお、前記粒子径及び比表面積の決定方法は、前述の通りである。【００３９】  本発明の微生物回収用キットは、さらに、前記微粒子を含む微生物回収液を含むことが好ましい。前記微生物回収液は、本発明の微生物回収方法に使用するものがあげられる。【００４０】  次に、本発明の核酸回収用キットは、本発明の核酸回収方法に使用する核酸回収用キットであって、粒子径が６μｍ以下であり、かつ、その比表面積が５０ｍ２／ｇ以下である微粒子、及び核酸抽出試薬を含む核酸回収用キットである。本発明のキットによれば、このような微粒子の使用により、高い回収率で核酸を回収できる。また、従来より少量の微粒子であっても、高い回収率を実現できるため、コスト的に極めて有利である。前記微粒子は、本発明の微生物の回収方法と同様のものが使用でき、中でも、シリカ化合物で被覆された磁性シリカ粒子が好ましい。前記核酸抽出試薬は、例えば、本発明の核酸回収方法に使用するものが使用でき、前記粒子径及び比表面積の決定方法は、前述の通りである。【００４１】  本発明の核酸回収用キットは、さらに、前記微粒子を含む微生物回収液を含むことが好ましい。前記微生物回収液は、例えば、本発明の微生物回収方法に使用するものがあげられる。【００４２】  次に、本発明の実施例について、比較例と併せて説明する。ただし、本発明は下記実施例及び比較例により制限されない。なお、下記実施例及び比較例において、粒子径は、外周のある点とその他の点とを結ぶ線であって、最も長い線の長さとし、電子顕微鏡を用いて決定し、前記比表面積は、ＪＩＳＫ１１５０「シリカゲル試験方法」で規格化されたＢＥＴ（窒素吸着）法に基づき決定した。
【実施例１】
【００４３】  本実施例は、酸性条件下において磁性シリカ粒子を用いて菌体（淋菌）を回収し、前記菌体から核酸を回収した例である。【００４４】  （酸性条件下での菌体の回収）
まず、下記表１に示す各磁性シリカ粒子を用い、磁性シリカ粒子含有液（２００ｍｇ／ｍＬ）をそれぞれ調製した。ついで、前記磁性シリカ粒子含有液２０μＬと０．５Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３）１００μＬとを混合し、微生物回収液を調製した。【００４５】
【表１】
2006123781.tif 000002
【００４６】  前記表１において、実施例１−１及び１−２ならびに比較例１の微粒子の表面修飾は、ＳｉＯ２である。実施例１−３の微粒子は、商品名ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（Ｒ）−Ｇｅｎｏｍｅの遺伝子抽出キットに含まれる磁性シリカ粒子である。【００４７】  次に、チョコレート寒天培地（日水製薬製）において培養した淋菌コロニーを採取して生理食塩水に懸濁させ、波長５３０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ５３０）が０．１８となるように、菌体液を調製した。【００４８】  生理食塩水で前記菌体液を１００倍希釈し、この希釈した菌体液１００μＬと前記微生物回収液１２０μＬとを混合し、１０回ピペッティングして磁性シリカ粒子に菌体を吸着させ、磁石で磁性シリカ粒子を集めて上清を除去した。ついで、１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３）２００μＬを添加して１０回ピペッティングした後、前述と同様にして上清を除去することによって前記磁性シリカ粒子を洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した。このようにして不純物を除去し、前記菌体液中の菌体を磁性シリカ粒子に吸着させた状態で回収した。【００４９】  （菌体からの核酸の回収）
回収した磁性シリカ粒子に核酸抽出試薬１００μＬを加えて１０回ピペッティングし、９５℃で５分間加熱し、さらに１０回ピペッティングすることによって前記菌体から核酸を抽出した。磁石で磁性シリカ粒子を集めた状態で核酸の抽出液を採取した。前記核酸抽出試薬は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（ｐＨ８）及び１重量％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名）の混合液を使用した。【００５０】  （核酸の回収率の算出）
下記表２に示す試薬及び商品名ｉ−ＣｙｃｌｅｒＴＭ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を用い、５０℃で２分間、９５℃で２分間加熱し、９５℃で１０秒間及び５６℃で６０秒間を５０サイクル行い、抽出した核酸をＰＣＲにより増幅させつつリアルタイムで蛍光強度を測定した。蛍光強度が１００となるときのサイクル数を測定し、核酸のＣｔ値（Ｃｔ１）を求めた。前記測定は、それぞれについて６回行った。なお、下記表２に示す試薬の量は、核酸の抽出液１．５μＬに対する量である。【００５１】
【表２】
2006123781.tif 000003
【００５２】  一方、コントロールとして、ＯＤ５３０が０．１８である前記菌体液１μＬを前記核酸抽出試薬１００μＬに加え、９５℃で５分間加熱することによって菌体を溶菌させて核酸を抽出した。ついで、ＰＣＲにより核酸を増幅させつつリアルタイムで蛍光強度を測定し、蛍光強度が１００となるときのサイクル数を測定することにより、Ｃｔ値（Ｃｔ２）を求めた。この測定は６回行った。【００５３】  核酸の回収率は、実施例又は比較例のＣｔ値（Ｃｔ１）と前記コントロールのＣｔ値（Ｃｔ２）とを用いて、以下の式より算出した。得られたＣｔ値及び核酸の回収率（いずれも平均値）を下記表３に示す。
回収率（％）＝１００／２（Ｃｔ２−Ｃｔ１）【００５４】
【表３】
2006123781.tif 000004
【００５５】  前記表３に示すように、粒子径６μｍ以下かつ比表面積５０ｍ２／ｇ以下の微粒子を使用した実施例（１−１、１−２及び１−３）では、高い回収率で核酸を回収できた。一方、粒子径が前記範囲を満たさない微粒子を使用した比較例１では、回収率が極めて低く、核酸の回収が不十分であった。したがって、粒子径６μｍ以下かつ比表面積５０ｍ２／ｇ以下の微粒子により、核酸（菌体）を効率良く回収できるといえる。
【実施例２】
【００５６】  磁性シリカ粒子含有液（４０ｍｇ／ｍＬ）の添加量を１０μＬとし、シリカ粒子の使用量を実施例１の１／１０とした以外は、実施例１と同様にして核酸を回収した。この結果を下記表４に示す。【００５７】
【表４】
2006123781.tif 000005
【００５８】  前記表４に示すように、磁性シリカ粒子が少量（実施例１の１／１０）であっても、粒子径６μｍ以下かつ比表面積５０ｍ２／ｇ以下の微粒子を使用した実施例（２−１、２−２及び２−３）では、高い回収率で核酸を回収できた。一方、粒子径が前記範囲を満たさない微粒子を使用した比較例２では、回収率が極めて低く、核酸の回収が不十分であった。したがって、粒子径６μｍ以下かつ比表面積５０ｍ２／ｇ以下の微粒子により、少量の磁性シリカ粒子であっても、核酸（菌体）を効率良く回収できるといえる。
【実施例３】
【００５９】  本実施例は、磁性シリカ粒子と塩とを含む中性液を用いて菌体（淋菌）を回収し、回収菌体から核酸を回収した例である。【００６０】  （中性条件下での菌体の回収）
まず、菌体液及び微生物回収液をそれぞれ調製した。すなわち、下記表６に示す５種類の塩（濃度０．５Ｍ）を含む０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．１）と、塩を含まない前記緩衝液の計６種類の緩衝液を準備した。ついで、前記それぞれの緩衝液１００μＬと下記表５の各磁性シリカ粒子を含む磁性シリカ含有液（４００ｍｇ／ｍＬ）１０μＬとを混合し、前記微生物回収液を調製した。一方、菌体液は、実施例１と同様にして調製した淋菌懸濁液（ＯＤ５３０：０．１８）を、生理食塩水で１００倍希釈して調製した。【００６１】
【表５】
2006123781.tif 000006
【００６２】  次に、前記微生物回収液１１０μＬと希釈した菌体液１００μＬとを混合し、１分間ピペッティングして磁性シリカ粒子に菌体を吸着させた後、前述と同様にして上清を除去した。ついで、蒸留水２００μＬを添加して１０回ピペッティングした後、前述と同様にして蒸留水を除去することによって前記磁性シリカ粒子を洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した。このようにして不純物を除去し、前記菌体液中の菌体を磁性シリカ粒子に吸着させた状態で回収した。【００６３】  （核酸の回収率の算出）
実施例１と同様にして核酸の抽出及びＰＣＲを行い、Ｃｔ値を求め、核酸の回収率（％）を算出した。得られたＣｔ値及び核酸の回収率を下記表６に示す。なお、下記表６の値は６回の測定の平均値であり、括弧内の値がＣｔ値である。また、回収率の算出に使用したコントロールのＣｔ値（Ｃｔ２）は、実施例３−１は２４．０、実施例３−２及び比較例３は２２．２である。【００６４】
【表６】
2006123781.tif 000007
【００６５】  前記表６に示すように、いずれの緩衝液を用いた場合であっても、粒子径６μｍ以下かつ比表面積５０ｍ２／ｇ以下の微粒子を使用した実施例（３−１及び３−２）は、粒子径が前記範囲を満たさない微粒子を使用した比較例３よりも高い回収率で微生物を回収できた。
【実施例４】
【００６６】  本実施例は、磁性シリカ粒子及びタンパク質変性剤を含む緩衝液を用い、血漿中のウイルス（ＨＢＶ）を回収し、前記ウイルスから核酸を回収した例である。【００６７】  （ウイルスの回収）
まず、粒子径０．１〜０．４μｍかつ比表面積２〜１０ｍ２／ｇの磁性シリカ粒子（バンドー化学（株）製；商品名Ｓ−Ｍ−０３）を使用し、磁性シリカ粒子含有液（５００ｍｇ／ｍＬ）を調製した。健常人血漿１００μＬに、ＨＢＶ  Ｐｌａｓｍａ（ＰｒｏＭｅｄＤｘ社製「Ｎｕｍｂｅｒ１０２２２１３６」）１．０μＬを添加した後、下記表８に示すいずれかの緩衝液と前記磁性シリカ粒子含有液１６μＬを添加した。ついで、３０回ピペッティングして前記磁性シリカ粒子にウイルスを吸着させ、前述と同様にして上清を除去した。前記ウイルスを吸着させた磁性シリカ粒子に１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３）１００μＬを添加し、１０回ピペティングした後、前述と同様にして上清を除去することによって前記磁性シリカ粒子を洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した。【００６８】  （核酸の回収）
洗浄した磁性シリカ粒子に核酸抽出試薬を１００μＬ加え、１０回ピペッティングした後、９５℃で５分間加熱し、さらに１０回ピペッティングすることによってウイルスから核酸を抽出した。前述と同様にして核酸の抽出液を採取して核酸を回収した。前記核酸抽出試薬としては、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８）及び０．１重量％ＳＤＳの混合試薬を使用した。【００６９】  なお、コントロールとして、前記ＨＢＶ  Ｐｌａｓｍａ（ＰｒｏＭｅｄＤｘ社製「Ｎｕｍｂｅｒ１０２２２１３６」）１μＬに前記核酸抽出試薬１００μＬを加え、１０回ピペッティングし、９５℃で５分間加熱した後、さらに１０回ピペッティングすることによってＨＢＶ核酸を抽出した。【００７０】  （核酸の回収率の算出）
核酸の抽出液（１．０μＬ）、下記表７に示す試薬及び商品名ｉ−ＣｙｃｌｅｒＴＭ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を使用して、５０℃で２分間、９５℃で２分間加熱した後、９５℃で３０秒間及び５６℃で６０秒間を５０サイクル行い、蛍光強度が２５０となるときのサイクル数を測定してＣｔ値を求めた。なお、前記測定は、それぞれについて３回行った。【００７１】
【表７】
2006123781.tif 000008
【００７２】  実施例１と同様にして、前記Ｃｔ値から回収率を算出した。この結果を、下記表８に示す。なお、下記表８における核酸の回収率は、３回の測定の平均値である。【００７３】
【表８】
2006123781.tif 000009
【００７４】  前記表８に示すように、いずれの実施例においても、高い回収率で核酸を回収できた。中でも、エタノールを含むグリシン−ＨＣｌ緩衝液を使用した場合（実施例４−２）、回収率が極めて高かった。
【実施例５】
【００７５】  本実施例は、磁性シリカ粒子を用いて血漿中のウイルス（ＨＢＶ）を回収し、前記ウイルスから核酸を回収したその他の例である。【００７６】  微生物回収のための緩衝液として２．５Ｍグアニジン塩酸を含む０．５Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ３）を使用し、下記表９に示す微粒子を使用した以外は、実施例４と同様にしてウイルスを回収して核酸を抽出し、核酸の回収率を算出した。得られた核酸の回収率を、コントロールとあわせて下記表９に示す。【００７７】
【表９】
2006123781.tif 000010
【００７８】  前記表９に示すように、粒子径６μｍ以下かつ比表面積５０ｍ２／ｇ以下の微粒子を使用した実施例（５−１及び５−２）では、高い回収率で核酸を回収できた。一方、粒子径が前記範囲を満たさない微粒子を使用した比較例４では回収率が低く、核酸の回収が不十分であった。
【実施例６】
【００７９】  本実施例は、磁性シリカ粒子を用いて血漿中のウイルス（ＨＢＶ）を回収し、前記ウイルスから核酸を回収したさらにその他の例である。【００８０】  微生物回収のための緩衝液として、４０％エタノールを含む０．５Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ３）を使用した以外は、実施例５と同様にして、ウイルスを回収して核酸を抽出し、核酸の回収率を算出した。得られた核酸の回収率を、コントロールとあわせて下記表１０に示す。【００８１】
【表１０】
2006123781.tif 000011
【００８２】  前記表１０に示すように、粒子径６μｍ以下かつ比表面積５０ｍ２／ｇ以下の微粒子を使用した実施例（６−１及び６−２）では、核酸の回収率が高かった。一方、粒子径が前記範囲を満たさない微粒子を使用した比較例５では回収率が低く、核酸の回収が不十分であった。
【実施例７】
【００８３】  本実施例は、磁性シリカ粒子を用いて細胞（白血球）を回収し、前記細胞から核酸を回収した例である。【００８４】  （白血球の回収）
生理食塩水５００μＬにペパリン血５０μＬを添加した後、下記表１１のいずれかの緩衝液１００μＬと５００ｍｇ／ｍＬの磁性シリカ粒子含有液５μＬとを添加した。ついで、ボルテックスで１分間攪拌して前記磁性シリカ粒子に細胞（白血球）を吸着させた。前述と同様にして上清を除去し、細胞（白血球）を吸着させた磁性シリカ粒子を回収した。なお、前記磁性シリカ粒子は、商品名Ｓ−Ｍ−０３（バンドー化学（株）製：粒子径０．１〜０．４μｍ、比表面積２〜１０ｍ２／ｇ、表面修飾ＳｉＯ２）を使用した。【００８５】  前記緩衝液に対応する下記表１１の洗浄液５００μＬを前記磁性シリカ粒子に添加し、ボルテックスを用いて５秒間、前記洗浄液を攪拌した後、前述と同様にして洗浄液を除去することによって前記磁性シリカ粒子を洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した。【００８６】
【表１１】
2006123781.tif 000012
【００８７】  （核酸の回収）
白血球を吸着させた磁性シリカ粒子に核酸抽出試薬を５０μＬ加え、５秒間ボルテックスで攪拌し、９５℃で５分間加熱し、さらに５秒間ボルテックスで攪拌することによって白血球から核酸を抽出した。前述と同様にして核酸の抽出液を採取した。前記核酸抽出試薬としては、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８）及び１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名）の混合試薬を使用した。【００８８】  （核酸の回収能）
核酸の抽出液（１．０μＬ）、下記表１２に示す試薬及び商品名ｉ−ＣｙｃｌｅｒＴＭ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を使用して、９５℃で１分間加熱し、９０℃で１秒間及び５６℃で１５秒間を５０サイクルした。ＰＣＲによる増幅に伴う蛍光強度の変化を経時的に測定した。得られた結果を図１に示す。【００８９】
【表１２】
2006123781.tif 000013
【００９０】  図１は、ＰＣＲのサイクルの増加に伴う蛍光強度の変化を示すグラフである。図１に示すように、実施例７−１及び７−２ともに、一定のサイクル数が経過すると蛍光強度が低下したことから、サンプル中に核酸が存在することが確認された。すなわち、粒子径６μｍ以下かつ比表面積５０ｍ２／ｇ以下の磁性シリカ粒子を用いて、血液中の白血球が回収でき、前記白血球から核酸が回収できたといえる。【００９１】  また、実施例７−１よりも実施例７−２の蛍光強度が低いことから、実施例７−２においてより多くの核酸が検出（回収）されたといえる。すなわち、血液中の白血球を回収する場合、微生物回収液としてＭｇＣｌ２等を含む中性液を使用することにより、さらに効率よく核酸を回収できるといえる。
【実施例８】
【００９２】  本実施例は、磁性シリカ粒子を用いて細胞（白血球）を回収し、前記細胞から核酸を回収したその他の例である。【００９３】  実施例８−１は、粒子径０．１〜０．４μｍかつ比表面積２〜１０ｍ２／ｇの磁性シリカ粒子（商品名Ｓ−Ｍ−０５、バンドー化学（株）製）、緩衝液として１Ｍ  ＭｇＣｌ２を含む０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、洗浄液として０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８）を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）を使用し、下記表１３に示す試薬を使用し、２分間加熱した後、９５℃で２分間加熱し、９５℃で１５秒間及び５６℃で４５秒間を５０サイクルした以外は、前記実施例７と同様に行った。【００９４】  実施例８−２は、粒子径２μｍかつ比表面積２．７ｍ２／ｇの磁性シリカ粒子（商品名Ｍｉｃｒｏｍｅｒ（Ｒ）−Ｍ、Ｍｉｃｒｏｍｏｄ（株）製）を使用した以外は、前記実施例８−１と同様に行った。また、比較例６−１及び６−２として、粒子径が１２μｍで、比表面積が０．４５ｍ２／ｇの磁性シリカ粒子（Ｍｉｃｒｏｍｅｒ（Ｒ）−Ｍ、Ｍｉｃｒｏｍｏｄ（株）製）を用いた以外は、前記実施例８−１及び８−２のそれぞれと同様にして行った。【００９５】
【表１３】
2006123781.tif 000014
【００９６】  図２に、実施例８−１及び比較例６−１におけるリアルタイムＰＣＲの測定結果を示し、図３に、実施例８−２及び比較例６−２におけるリアルタイムＰＣＲの測定結果を示す。図２に示すように、粒子径６μｍ以下かつ比表面積５０ｍ２／ｇ以下の微粒子を使用した実施例８−１では、粒子径が前記範囲を満たさない微粒子を使用した比較例６−１よりも多くの核酸が回収できた。また、図３に示すように、粒子径６μｍ以下かつ比表面積５０ｍ２／ｇ以下の微粒子を使用した実施例８−２では、粒子径が前記範囲を満たさない微粒子を使用した比較例６−２よりも多くの核酸を回収できた。
【実施例９】
【００９７】  本実施例は、磁性シリカ粒子を用いてウイルス（ＨＣＶ）を回収し、回収したウイルスから核酸を回収した例である。【００９８】  まず、下記表１４に示す磁性シリカ粒子を準備した。【００９９】
【表１４】
2006123781.tif 000015
【０１００】  次に、ＨＣＶ  Ｐｌａｓｍａ（ＰｒｏＭｅｄＤｘ社  Ｎｕｍｂｅｒ９９９０９６４）５０μＬに、緩衝液（０．５Ｍグリシン−クエン酸（ｐＨ３）、４０％エタノール）５０μＬと前記いずれかの磁性シリカ粒子の含有液（５００ｍｇ／ｍＬ）８μＬとを加え、３０回ピペッティングして磁性シリカ粒子にＨＣＶを吸着させた。前述と同様にして上清を除去した後、蒸留水（大塚製薬）２００μＬを加え、１０回ピペッティングすることによってＨＣＶを吸着させた磁性シリカ粒子を洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した後、前述と同様にして磁性シリカ粒子を回収した。回収した磁性シリカ粒子に、核酸抽出試薬（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８）及び０．１重量％ＳＤＳ）７０μＬとＲＮＡｓｅｑｕｒｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｂｉｏｎ社製）５μＬとを加え、１０回ピペッティングし、９５℃で５分間加熱し、１０回ピペッティングすることによってＨＣＶの核酸を抽出した。得られた核酸抽出液７５μＬに２０％ノニデットＰ−４０（ナカライテスク（株）製）２５μＬを加え、１０回ピペッティングし、６０℃で１０分間加熱した。【０１０１】  加熱した核酸抽出液５μＬに対し、下記表１５に示す試薬を使用し、標的配列特異的消光プローブを用いたリアルタイムＰＣＲを行ってＨＣＶ  ＲＮＡを検出した。すなわち、商品名ｉ−ＣｙｃｌｅｒＴＭ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を用い、６０℃で３０分加熱した後、９４℃で２分加熱し、９４℃で１５秒及び６０℃で３０秒を６０サイクル行い、６０℃で７分加熱した。この結果を図４に示す。【０１０２】
【表１５】
2006123781.tif 000016
【０１０３】  図４は、ＰＣＲのサイクル数に伴う蛍光強度の変化を示すグラフである。図４に示すように、粒子径６μｍ以下かつ比表面積５０ｍ２／ｇ以下の微粒子を使用した実施例（９−１及び９−２）では、早いサイクルで消光が見られたことから、核酸の回収量が多いといえる。一方、粒子径が前記範囲を満たさない微粒子を使用した比較例７では、ほとんど消光が見られず、回収率が低いといえる。したがって、粒子径６μｍ以下かつ比表面積５０ｍ２／ｇ以下の微粒子の使用により、ウイルスを効率良く回収できるといえる。
【実施例１０】
【０１０４】  本実施例は、磁性シリカ粒子を用いてウイルス（ＨＣＶ）を回収し、前記ウイルスから核酸を回収したその他の例である。【０１０５】  ＨＣＶ  Ｐｌａｓｍａ（ＰｒｏＭｅｄＤｘ社  Ｎｕｍｂｅｒ９９９０９６４）５０μＬに、緩衝液（０．５Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３）及び４０％エタノール）５０μＬと、磁性シリカ粒子（商品名Ｓ−Ｍ−０４；バンドー化学（株）製、粒子径０．１〜０．４μｍ、比表面積２〜１０ｍ２／ｇ）含有液（３７６ｍｇ／ｍＬ）１０．６４μＬとを加え、３０回ピペッティングして磁性シリカ粒子にＨＣＶを吸着させた。前述と同様にして上清を除去し、蒸留水（大塚製薬）１００μＬを加え、１０回ピペッティングすることによってＨＣＶを吸着させた磁性シリカ粒子を洗浄した。この操作を３回繰り返した。前述と同様にして上清を除去し、核酸抽出試薬（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８）、０．１％ＳＤＳ）７０μＬとＲＮＡｓｅｑｕｒｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｂｉｏｎ社製）５μＬとを加え、１０回ピペッティングを行い、９５℃で５分間加熱し、１０回ピペッティングすることによってＨＣＶの核酸を抽出した。前記核酸抽出液７５μＬに２０％ノニデットＰ−４０（Ｒ）（ナカライテスク（株）製）２５μＬを加えて１０回ピペッティングし、６０℃で１０分間加熱した。前記実施例９と同様にして、標的配列特異的消光プローブを用いたリアルタイムＰＣＲを行ってＨＣＶ  ＲＮＡを検出した。この結果を図５に示す。【０１０６】  （比較例８）
比較例８として、商品名ＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ＨＣＶ  Ｐｌａｓｍａ（ＰｒｏＭｅｄＤｘ社  Ｎｕｍｂｅｒ９９９０９６４）５０μＬからＨＣＶ  ＲＮＡを精製し、標的配列特異的消光プローブを用いたリアルタイムＰＣＲを行ってＨＣＶ  ＲＮＡを検出した。この結果を、前記実施例１０とあわせて図５に示す。【０１０７】  図５は、ＰＣＲのサイクル数に伴う蛍光強度の変化を示すグラフである。図５に示すように、粒子径６μｍ以下かつ比表面積５０ｍ２／ｇ以下の磁性シリカ粒子を使用した実施例１０は、従来の微粒子を使用しない方法（比較例８）よりも、早いサイクルで消光が見られ、また、蛍光強度も低かった。したがって、本発明の方法によれば、従来の微粒子を使用しない方法よりもウイルスを効率よく回収できるといえる。
【実施例１１】
【０１０８】  本実施例は、磁性シリカ粒子を用いてウイルス（ＨＩＶ）を回収し、前記ウイルスから核酸を回収したさらにその他の例である。【０１０９】  まず、下記表１６に示す微粒子を準備した。次に、ＨＩＶ  Ｐｌａｓｍａ（ＰｒｏＭｅｄＤｘ社Ｎｕｍｂｅｒ１０４３９０３９）５０μＬに、緩衝液（０．５Ｍグリシン−クエン酸（ｐＨ３）、４０％エタノール）５０μＬと、下記表１６のいずれかの磁性シリカ粒子の含有液（５００ｍｇ／ｍＬ）８μＬとを加え、３０回ピペッティングして磁性シリカ粒子にＨＩＶを吸着させた。前述と同様にして上清を除去し、蒸留水（大塚製薬）を２００μＬ加え、１０回ピペッティングすることによってＨＩＶを吸着させた磁性シリカ粒子を洗浄した。この操作を３回繰り返した。前述と同様にして上清を除去し、核酸抽出試薬（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８）、０．１％ＳＤＳ）７０μＬとＲＮＡｓｅｑｕｒｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ５μＬとを加え、１０回ピペッティングし、９５℃で５分間加熱し、１０回ピペッティングすることによってＨＩＶ核酸を抽出した。前記核酸抽出液７５μＬに２０％ノニデットＰ−４０（Ｒ）（ナカライテスク（株）製）２５μＬを加え、１０回ピペッティングし、６０℃で１０分間加熱した。アンプリコア  ＨＩＶ−１  モニター  ｖ１．５（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を用いて増幅・検出を行った。得られた吸光度（４５０ｎｍ）を下記表１６に示す。【０１１０】
【表１６】
2006123781.tif 000017
【０１１１】  前記表１６に示すように、粒子径６μｍ以下かつ比表面積５０ｍ２／ｇ以下の微粒子を使用した実施例（１１−１、１１−２及び１１−３）では、粒子径が前記範囲を満たさない微粒子を使用した比較例９と比較して、得られた吸光度（４５０ｎｍ）が大きく、これは、より多くの核酸が回収できたことを示す。したがって、粒子径６μｍ以下かつ比表面積５０ｍ２／ｇ以下の微粒子を使用することによって、高い回収率でウイルス（ＨＩＶ）を回収できるといえる。
【実施例１２】
【０１１２】  本実施例は、磁性シリカ粒子を用いてウイルス（ＨＩＶ）を回収し、前記ウイルスから核酸を回収したさらにその他の例である。【０１１３】  実施例１１−２と同様にして核酸を回収し、増幅した。ついで、×１、×１／５及び×１／２５の希釈系列を作成し、核酸を検出した以外は、実施例１１−２と同様に行った。得られた吸光度（４５０ｎｍ）を下記表１７に示す。【０１１４】  （比較例１０）
ＨＩＶ  Ｐｌａｓｍａ（ＰｒｏＭｅｄＤｘ社  Ｎｕｍｂｅｒ１０４３９０３９）を２００μＬ使用し、商品名アンプリコア  ＨＩＶ−１  モニター  ｖ１．５（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を用いて前処理及び増幅した以外は、前記実施例１２と同様にして検出を行った。得られた吸光度（４５０ｎｍ）を下記表１７に示す。【０１１５】
【表１７】
2006123781.tif 000018
【０１１６】  前記表１７に示すように、粒子径６μｍ以下かつ比表面積５０ｍ２／ｇ以下の磁性シリカ粒子を用いた実施例１１のＨＩＶ回収能は、アンプリコア  ＨＩＶ−１  モニター  ｖ１．５による前処理と同等若しくはそれ以上であった。したがって、本発明の微生物回収方法は、極めて効率よくウイルスを回収できるといえる。
【実施例１３】
【０１１７】  本実施例は、微粒子の比表面積及び粒子径が、微生物（菌体）の回収率に与える影響を示す例である。【０１１８】  まず、微粒子の総表面積を一定とし、異なる粒子径を有する磁性シリカ粒子を使用して菌体（淋菌）の回収及び核酸の回収を行った。具体的には、下記表１８の磁性シリカ粒子を使用した以外は、実施例１と同様に、菌体（淋菌）を回収して核酸を抽出し、ＰＣＲにより核酸の回収率を算出した。なお、各微粒子の使用量は、その比表面積（ｍ２／ｇ）から総表面積が７１ｃｍ２となるように調整した。得られた回収率を図６及び下記表１８に示す。【０１１９】
【表１８】
2006123781.tif 000019
【０１２０】  前記表１８に示すように、総表面積が同一であっても、粒子径６μｍ以下かつ比表面積５０ｍ２／ｇ以下の磁性シリカ粒子を用いた実施例（１３−１及び１３−２）は、粒子径が６μｍを超える磁性シリカ粒子を使用した比較例１１よりも高い回収率で核酸を回収できた。【０１２１】  次に、微粒子の粒子径を一定（１μｍ）とし、異なる比表面積を有する磁性シリカ粒子を使用して菌体（淋菌）の回収及び核酸の回収を行った。具体的には、下記表１９の磁性シリカ粒子を使用し、その使用量を０．４ｍｇとした以外は、実施例１と同様に、菌体（淋菌）を回収して核酸を抽出し、ＰＣＲにより核酸の回収率を算出した。得られた回収率を図７及び表１９に示す。【０１２２】
【表１９】
2006123781.tif 000020
【０１２３】  前記表１９に示すように、比表面積５０ｍ２／ｇ以下の磁性シリカ粒子を使用した実施例１３−３は、比表面積が５０ｍ２／ｇを超える磁性シリカ粒子を使用した比較例１２よりも高い回収率で核酸を回収できた。【０１２４】  これらの結果から、微粒子の粒子径及び比表面積の双方が、微生物の回収において重要であることが分かる。
【実施例１４】
【０１２５】  本実施例は、微粒子の比表面積及び粒子径が、微生物（ウイルス）の回収率に与える影響を示す例である。【０１２６】  まず、微粒子の総表面積を一定とし、異なる粒子径を有する磁性シリカ粒子を使用してウイルス（ＨＢＶ）及び核酸の回収を行った。具体的には、下記表２０の磁性シリカ粒子を使用した以外は、実施例６と同様に、ウイルス（ＨＢＶ）を回収して核酸を抽出し、ＰＣＲにより核酸の回収率を算出した。なお、各微粒子の使用量は、その比表面積（ｍ２／ｇ）から総表面積が７１０ｃｍ２となるように調整した。得られた回収率を図８及び下記表２０に示す。【０１２７】
【表２０】
2006123781.tif 000021
【０１２８】  前記表２０に示すように、総表面積が同一であっても、粒子径６μｍ以下かつ比表面積５０ｍ２／ｇ以下の磁性シリカ粒子使用した実施例（１４−１及び１４−２）では、粒子径が６μｍを超える磁性シリカ粒子を使用した比較例１３よりも高い回収率で核酸を回収できた。【０１２９】  次に、微粒子の粒子径を一定（１μｍ）とし、異なる比表面積を有する磁性シリカ粒子を使用してウイルス（ＨＢＶ）及び核酸の回収を行った。具体的には、下記表２１の磁性シリカ粒子を使用し、その使用量を４．０ｍｇとした以外は、実施例６と同様に、ウイルス（ＨＢＶ）を回収して核酸を抽出し、ＰＣＲにより核酸の回収率を算出した。得られた回収率を図９及び下記表２１に示す。【０１３０】
【表２１】
2006123781.tif 000022
【０１３１】  前記表２１に示すように、比表面積５０ｍ２／ｇ以下の磁性シリカ粒子を用いた実施例（１４−３及び１４−４）は、比表面積が５０ｍ２／ｇを超える磁性シリカ粒子を使用した比較例１４よりも高い回収率で核酸を回収できた。【０１３２】  これらの結果から、微粒子の粒子径及び比表面積の双方が、微生物の回収において重要であることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１３３】  以上のように、本発明の微生物回収方法によれば、粒子径６μｍ以下かつ比表面積５０ｍ２／ｇ以下の微粒子を使用するため、微生物を効率よく回収できる。また、本発明の核酸回収方法は、本発明の微生物回収方法により微生物を回収するため、微生物を効率よく回収でき、その結果、効率よく核酸を回収できる。したがって、本発明は、微生物及び核酸等を回収する必要がある全ての分野に適用可能であり、例えば、生体由来試料からの成分抽出に好ましく適用可能であるが、その用途は制限されず広い。
【配列表フリーテキスト】
【０１３４】配列番号１  Ｆ−Ｄ−ＮＧ−Ｒ１−３２：ＴａｑＭａｎプローブ
配列番号２  ＮＧ−Ｆ３４０５−２０：フォワードプライマーのために設計したオリゴヌクレオチドプローブ
配列番号３  ＮＧ−３５２６−２０Ｒ：リバースプライマーのために設計したオリゴヌクレオチドプローブ
配列番号４  Ｔａｑｍａｎ−Ｂ−Ｆ−１−３２：ＴａｑＭａｎプローブ
配列番号５  ＨＢＶ  Ｆ５０−７４：フォワードプライマーのために設計したオリゴヌクレオチドプローブ
配列番号６  ＨＢＶ  Ｒ１３６−１０９：リバースプライマーのために設計したオリゴヌクレオチドプローブ
配列番号７  ３ＦＬ−２７−ｗｔ−Ｆ３−２７：プローブ
配列番号８  ２７Ｆ１−２：フォワードプライマーのために設計したオリゴヌクレオチドプローブ
配列番号９  ２７Ｒ１−２：リバースプライマーのために設計したオリゴヌクレオチドプローブ
配列番号１０  Ｆ−Ｔ−ＩＡＰＰ−Ｆ１−ｗｔ−３４：プローブ
配列番号１１  ＩＡＰＰ  Ｆ２５０−２６７：フォワードプライマーのために設計したオリゴヌクレオチドプローブ
配列番号１２  ＩＡＰＰ  Ｒ３５４−３３１：リバースプライマーのために設計したオリゴヌクレオチドプローブ
配列番号１３  ３ＦＬ−ＨＣＶ−３４７−２７：プローブ
配列番号１４  ＨＣ−Ｆ３０３−２５−３ａ：フォワードプライマーのために設計したオリゴヌクレオチドプローブ
配列番号１５  ＨＣＶ−Ｒ４０２−２８：リバースプライマーのために設計したオリゴヌクレオチドプローブ
【図１】
2006123781.tif 000023
【図２】
2006123781.tif 000024
【図３】
2006123781.tif 000025
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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