(57)【要約】  被抗原内の生菌を特異的に標識化することによって、抗原としての微生物のうちの生菌を短時間で迅速に検出することができ、加えて検査の確実性をも担保し得る検出方法及び検出装置を提供する。大腸菌などの被検抗原に、その被検抗原内の生菌（標的菌１２）によって酵素分解される標識化物質１３を作用させた標識化抗原１４を生成した後、被検抗原に特異的に結合し得る特異的結合抗体を固定化してなる固定相において、その標識化抗原１４を捕捉することを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検抗原と、前記被検抗原内の生菌によって酵素分解される標識化物質と、の作用によって、前記被検抗原内の生菌を特異的に標識化して検出する検出方法であって、
前記被検抗原に前記標識化物質を作用させて光学的に検出可能な標識化抗原を生成し、
前記被検抗原に特異的に結合しうる特異的結合抗体を固定化してなる固定相において、前記標識化抗原を捕捉することを特徴とする検出方法。
【請求項２】
前記固定相において、増殖培養液によって増殖した前記標識化抗原を捕捉することを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
前記標識化抗原を含む試料溶液を複数回循環させながら、前記固定相において、循環される標識化抗原を捕捉することを特徴とする請求項１又は２記載の検出方法。
【請求項４】
複数種類の前記被検抗原のそれぞれに対応して特異的に結合しうる特異的結合抗体を固定化してなる複数種類の固定相において、前記被検抗原を捕捉することを特徴とする請求項１から３記載の検出方法。
【請求項５】
被検抗原に特異的に結合しうる特異的結合抗体を固体化してなる固定相を設置可能なカラムを有する検出装置であって、
前記固定相が設置されたカラムにおいて、前記被検抗原が標識化された標識化抗原を捕捉することを特徴とする検出装置。
【請求項６】
前記検出装置は、さらに、液体を攪拌する攪拌装置を備え、
前記標識化抗原は、前記攪拌装置において標識化されることを特徴とする請求項５記載の検出装置。
【請求項７】
前記カラムは、複数回使用可能であることを特徴とする請求項５記載の検出装置。
【請求項８】
被検抗原に特異的に結合しうる特異的結合抗体を固体化してなる固定相を設置可能なカラムを複数有する検出装置であって、
前記固定相が設置された複数のカラムにおいて、前記被検抗原が標識化された標識化抗原を捕捉することを特徴とする検出装置。
【請求項９】
被検抗原に特異的に結合しうる特異的結合抗体を固定化してなる固定相が設置されたバイオカラム。
【請求項１０】
被検抗原に特異的に結合しうる特異的結合抗体を固定化してなる固定相が設置されたバイオカラムにおいて、
前記バイオカラム内の圧力変動を利用して、前記固定相を攪拌する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液中の抗原の濃度や数を検出する検出方法及び検出装置に関するものであって、特に、被抗原内の生菌を特異的に標識化することによって検査の迅速化を図ることが可能な検出方法及び検出装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、サルモネラ菌、ブドウ球菌、ボツリヌス菌、病原性大腸菌Ｏ−１５７といった微生物に起因する食中毒の被害が問題になっており、関係企業では、これらの微生物に対する予防・衛生にかかわる講習会や啓蒙活動などを行う一方で、高額な設備投資を通じて事故拡散を未然に防ごうとしている。【０００３】
微生物の検出は、培養した後に種類の同定や定量をすることが一般的である。すなわち、前培養→増菌培養→分離培養といった培養操作を伴うことから、その培養操作に起因して検査結果が出るまで数日程度の期間を要し、かつ、専門の測定技術者を必要とする。この長期間の測定は、迅速性が要求される生鮮食品など、食料品への微生物検査の必要性が生じた場合に非常に問題となる。【０００４】
このようなことから、食中毒病原菌を簡易かつ迅速に検出する様々な試薬や装置が提案されている。例えば、免疫化学反応を応用し、特定の菌（抗原）と特異的に結合する抗体を用いてその特定の菌を凝集させ、抗原濃度を測定・分析する免疫クロマトグラフ法が広く知られている。以下、この免疫クロマトグラフ法について、体表面に固有の抗原決定基を有している病原性大腸菌Ｏ−１５７（Ｏ−１５７という抗体が特異的に結合する抗原決定基を菌体表面に発現した病原性を有する大腸菌）を抗原の一例に採り、詳説する。【０００５】
なお、免疫クロマトグラフ法には、例えば表面プラズモン共鳴法など、抗体に酵素などの標識物質を結合せずに、抗原抗体反応による物理量などの変化を利用して抗原の量を測定する非標識免疫クロマトグラフ法と、ラジオイムノアッセイ法など、抗体に酵素などの標識物質を結合させたものを使用し、標識物質の量を測定することで抗原の量を測定する標識免疫クロマトグラフ法とがあるが、ここでは後者の標識免疫クロマトグラフ法について、特に、測定操作が比較的容易であることから現在主流となっている「サンドイッチ法（サンドイッチＥＬＩＳＡ法）」について詳説する。【０００６】
図１２は、従来のサンドイッチ法の主要工程を示す模式図である。（ａ）は抗体（一次抗体）の固定化工程であり、（ｂ）は標的菌（抗原）の捕捉工程であり、（ｃ）は酵素標識化抗体による染色工程であり、（ｄ）は抗体（二次抗体）の固定化工程であり、（ｅ）は標識化菌体の溶出工程であり、（ｆ）は溶出させた標識化菌体の検出工程である。なお、図１２（ａ）〜（ｆ）には、固定化層表面１００、一次抗体１０１、標的菌１０２、二次抗体１０３、標識化物質１０４、光源１０５、検出器１０６が記載されている。【０００７】
図１２において、まず、非特異的吸着が起こりやすい反応容器に、病原性大腸菌Ｏ−１５７（標的菌１０２）に特異的に結合する一次抗体１０１を含む溶液を注ぎ、反応容器の固定化層表面１００に一次抗体１０１を非特異吸着させて固定化する（図１２（ａ））。そして、反応容器に標的菌１０２を含む試料溶液を注ぎ、標的菌１０２を反応容器内の固定化された一次抗体１０１に抗原抗体反応で特異的に結合させる（図１２（ｂ））。【０００８】
次に、反応容器に、標識化物質１０４によって標識化された二次抗体１０３を含む溶液を注ぎ、二次抗体１０３と標識化物質１０４とからなる酵素標識化抗体を反応容器内の標的菌１０２を介して抗原抗体反応で特異的に結合させる（図１２（ｃ））。これにより、標的菌１０２に比例した量の酵素標識化抗体を反応容器に固定化することができる（図１２（ｄ））。また、発色基質を含む基質溶液を反応容器に添加し、酵素反応によって酵素標識化抗体を発色させておく。【０００９】
最後に、例えば水酸化ナトリウム水溶液などの溶菌抽出液によって、酵素標識化抗体が結合した標的菌１０２を溶出した後（図１２（ｅ））、光源１０５に対向して配置された検出器１０６において、色素が特異的に吸収する波長の光を検出し、抗原濃度を測定する（図１２（ｆ））。【００１０】
以上説明したように、サンドイッチ法によれば、培養操作を必要とする検査と異なり、煩雑な操作や専門的な知識がなくても適切な微生物検出を迅速に行うことができる。【００１１】
一方で、サンドイッチ法による測定操作よりも更に取り扱い易い検査キットを用いて、微生物検出を迅速に行うものもある。例えば、アルカリホスファターゼと特異的に結合して発色し得る発色基質成分を含有する基質液を展開可能な検出キットを用いることで、大腸菌の生菌のみを迅速に検出する技術が提案されている（特許文献１参照）。【００１２】
より具体的には、特許文献１に記載の発明は、大腸菌と特異的に結合し得る特異的結合成分を固定化した固定相を吸水性基材の表面上の任意の領域に形成してなる検出具に、被検液を展開させる工程と、被検液を展開した後の吸水性基材に、アルカリホスファターゼと特異的に結合して発色し得る発色基質成分を含有する基質液を展開させる工程と、を少なくとも有する検出方法及び検出キットである。【００１３】
この検出方法及び検出キットによれば、吸水性基材の吸水性を適宜調節することで、被検液と基質液を展開させるスピードを最適なものとすることができ、ひいては検査の迅速化を図ることができる。また、被検液中に大腸菌の生菌が存在する場合には、特異的結合成分によって固定相に捕捉された生菌が有するアルカリホスファターゼに対し、発色基質成分が特異的に結合して発色することから、被検液中における大腸菌の生菌の有無まで検出することができる、というメリットがある。【００１４】
【特許文献１】特開２００２−１６５５９９（段落番号［００３３］〜［００３７］）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかしながら、上述したサンドイッチ法及び特許文献１記載の検出方法では、以下のような問題が生ずる。【００１６】
まず、サンドイッチ法では、抗原の検出までに２回の抗原抗体反応（図１２（ｂ），（ｃ）参照）が必要となり、各回の抗原抗体反応ともに一定時間を要してしまうことから、検査の更なる迅速化を図ることができないといった問題がある。また、サンドイッチ法では、一般的に、大腸菌の外膜に存在するリポ多糖に特異的に結合する抗体を用いることから、大腸菌が生菌であるか、或いは死菌や菌断片であるか、を区別することができず、死菌や菌断片のみを含み食中毒被害をもたらさない適合品を、食品等の検査段階で排除してしまうといった問題もある。【００１７】
また、特許文献１記載の検出方法では、上述のとおり、検査の迅速化及び大腸菌の生菌の検出は可能になるものの、０．０１ｍｌ〜０．２ｍｌというごく少量の試料しか扱えないことから（特許文献１明細書段落番号［００３４］参照）、検査の確実性を担保することができないといった問題がある。すなわち、検査対象となる試料が少量である場合には、大腸菌の含有確率の低下とともに、大腸菌のうちの生菌含有確率の低下も招いてしまうため、必然的に、検出精度・検出感度が低くなってしまう。【００１８】
特に、食品工場で食中毒が発覚した場合でも、流通経路によってはすでに小売店で販売され、消費者の口の中に入ってから対応するケースが多く、食中毒被害が広がる危険性が高く、検査の更なる迅速化が望まれていた。【００１９】
本発明は以上の点に鑑みてなされたものであり、その目的は、抗原としての微生物のうちの生菌を短時間で迅速に検出することができ、加えて検査の確実性をも担保し得る検出方法及び検出装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
以上のような課題を解決するために、本発明は、大腸菌などの被検抗原に、その被検抗原内の生菌によって酵素分解される標識化物質を作用させた標識化抗原を生成した後、被検抗原に特異的に結合し得る特異的結合抗体を固定化してなる固定相において、その標識化抗原を捕捉することを特徴とする。【００２１】
より具体的には、本発明は、以下のものを提供する。【００２２】
（１）  被検抗原と、前記被検抗原内の生菌によって酵素分解される標識化物質と、の作用によって、前記被検抗原内の生菌を特異的に標識化して検出する検出方法であって、前記被検抗原に前記標識化物質を作用させて光学的に検出可能な標識化抗原を生成し、前記被検抗原に特異的に結合しうる特異的結合抗体を固定化してなる固定相において、前記標識化抗原を捕捉することを特徴とする検出方法。【００２３】
本発明によれば、大腸菌などの被検抗原（生菌・死菌を含む）と、その被検抗原のうちの生菌によって酵素分解される標識化物質と、の作用によって生菌を検出する検出方法であって、被検抗原に標識化物質を作用させて蛍光反応等によって光学的に検出可能な標識化抗原を生成し、抗原抗体反応によって被検抗原に特異的に結合しうる特異的結合抗体を固定化してなる固定相において、その標識化抗原を捕捉することとしたから、捕捉対象は、光学的に検出可能な標識化抗原（生菌）と、標識化されておらず光学的に検出不可能な死菌（菌断片）とになる。【００２４】
従って、従来のサンドイッチ法では必須の二次抗体が不要となり、その結果、従来は２回必要であった抗原抗体反応が１回で済むこととなり、ひいては検査の迅速化を図ることができる。また、捕捉した被検抗原のうち、光学的に検出可能な抗原は、標識化抗原としての生菌のみであることから、生菌／死菌を区別して検出することが可能となり、食中毒被害をもたらす生菌を的確に検出することができる。【００２５】
さらに、従来の特許文献１記載の検出方法で扱う試料の量（０．０１ｍｌ〜０．２ｍｌ）と比較して、本発明に係る検出方法で扱う試料の量は、数十ｍｌ〜数百ｍｌであることから、サンプル抽出に起因した被検抗原の含有確率の低下を防ぐことができ、ひいては検出精度・検出感度の低下を防ぎ、検査の確実性を担保することができる。【００２６】
（２）  前記固定相において、増殖培養液によって増殖した前記標識化抗原を捕捉することを特徴とする検出方法。【００２７】
本発明によれば、上述した固定相において、増殖培養液によって増殖した標識化抗原を捕捉することしたので、増殖培養液を添加する前と比べて標識化抗原濃度を高めることができ、その結果、標識化抗原の捕捉確率が向上し、ひいては検出精度・検出感度を上げることができる。【００２８】
（３）  前記標識化抗原を含む試料溶液を複数回循環させながら、前記固定相において、循環される標識化抗原を捕捉することを特徴とする検出方法。【００２９】
本発明によれば、上述した標識化抗原を含む試料溶液を複数回循環させながら、上述した固定相において、循環される標識化抗原を捕捉することとしたから、一次抗体が固定化された固定相に試料溶液を複数回接触させることができ、標識化抗原の捕捉確率が向上し、検出精度・検出感度を向上することができる。【００３０】
（４）  複数種類の前記被検抗原のそれぞれに対応して特異的に結合しうる特異的結合抗体を固定化してなる複数種類の固定相において、前記被検抗原を捕捉することを特徴とする検出方法。【００３１】
本発明によれば、複数種類の上述した被検抗原のそれぞれに対応して特異的に結合しうる特異的結合抗体を固定化してなる複数種類の固定相において、複数種類の被検抗原を一連の検査フローの中で１度にまとめて捕捉することとしたから、検査の迅速化・効率化を図ることができる。【００３２】
（５）  被検抗原に特異的に結合しうる特異的結合抗体を固体化してなる固定相を設置可能なカラムを有する検出装置であって、前記固定相が設置されたカラムにおいて、前記被検抗原が標識化された標識化抗原を捕捉することを特徴とする検出装置。【００３３】
本発明によれば、大腸菌などの被検抗原（生菌・死菌を含む）に特異的に結合しうる特異的結合体を固定化してなる固定相を設置可能なカラム（バイオカラム）を有する検出装置で、上述した固定相が設置されたカラムにおいて、生菌のみに作用する標識化物質によって被検抗原が標識化された標識化抗原を捕捉することとしたから、標的化抗原捕捉までに１回の抗原抗体反応で足りることなり、検査の迅速化を図るとともに、食中毒被害をもたらす生菌を的確に検出することができる。また、大量の試料を一気に扱うことができることから、サンプル抽出に起因した被検抗原の含有確率の低下を防ぐことができ、ひいては検出精度・検出感度の低下を防ぎ、検査の確実性を担保することができる。【００３４】
（６）  前記検出装置は、さらに、液体を攪拌する攪拌装置を備え、前記標識化抗原は、前記攪拌装置において標識化されることを特徴とする検出装置。【００３５】
本発明によれば、上述した検出装置は、さらに、液体（試料溶液）を機械的に攪拌する攪拌装置を備えており、上述した標識化抗原は、この攪拌装置において標識化されることとしたから、被検抗原の標識化を促進し、ひいては標識化抗原を効率的に生成することができる。【００３６】
（７）  前記カラムは、複数回使用可能であることを特徴とする検出装置。【００３７】
本発明によれば、上述したカラムは、複数回使用可能であることから、複数回の微生物検査を連続して効率的に行うことができる。【００３８】
（８）  被検抗原に特異的に結合しうる特異的結合抗体を固体化してなる固定相を設置可能なカラムを複数有する検出装置であって、前記固定相が設置された複数のカラムにおいて、前記被検抗原が標識化された標識化抗原を捕捉することを特徴とする検出装置。【００３９】
本発明によれば、被検抗原に特異的に結合しうる特異的結合抗体を固体化してなる固定相を設置可能なカラムを複数（複数種類）有する検出装置であって、その固定相が設置された複数のカラムにおいて、被検抗原が標識化された標識化抗原を捕捉することとしたから、検査の迅速化・効率化を図ることができる。【００４０】
（９）  被検抗原に特異的に結合しうる特異的結合抗体を固定化してなる固定相が設置されたバイオカラム。【００４１】
本発明によれば、被検抗原に特異的に結合しうる特異的結合抗体を固定化してなる固定相が設置されたバイオカラムを提供することで、より検査の迅速化・確実化を図ることができる。なお、例えば凍結乾燥法などの保存手段を用いることで、このバイオカラムを長期間安定化状態で保存することができる。【００４２】
（１０）  被検抗原に特異的に結合しうる特異的結合抗体を固定化してなる固定相が設置されたバイオカラムにおいて、前記バイオカラム内の圧力変動を利用して、前記固定相を攪拌する方法。【００４３】
本発明によれば、バイオカラムに急激な圧力変動を生じさせてバイオカラム内を流れる検水の流速が増す結果、バイオカラム内で固定相が攪拌されることになるので、固定相と循環する試料溶液（検水）とを十分に接触させることができ、高い検出精度，検出感度を維持することができる。
【発明の効果】
【００４４】
以上説明したように、本発明は、従来は２回必要であった抗原抗体反応を１回で済むようにしたものであることから検査の迅速化を図ることができ、また、光学的に検出する抗原を標識化抗原（生菌）とするものであることから生菌／死菌の判別が可能になり、さらに、大量の試料を扱えることから検査の確実性を担保することができるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
以下、本発明を実施するための最良の形態について、図面に基づいて説明する。【００４６】
［検出装置］
図１は、本発明の実施の形態に係る検出装置１の外観図である。【００４７】
図１において、本発明の実施の形態に係る検出装置１は、内部にポンプやバルブを有する箱状のコントロールボックスの側面に、標的菌を捕捉する固定相が設置されたバイオカラム２を有している。また、そのバイオカラム２の隣には、捕捉後の標的菌を溶出する溶菌液が入ったＭ−Ｃｅｌｌ３が設置され、検出装置１の上面には、例えばボトルＢ１〜Ｂ５の５個のボトル（数は問わない）が設置されている。【００４８】
ここで、図２は、本発明の実施の形態に係る検出１に設置されたバイオカラム２の拡大図である。図２において、このバイオカラム２は、バイオカラム用ガラス管の内部に、抗原抗体反応によって抗原を捕捉し得るガラスビーズを充填することによって作製される。【００４９】
より具体的には、まず、水酸化ナトリウム水溶液や塩酸によってガラスビーズを前処理した後、一晩これを乾燥させる。そして、このガラスビーズに、焼結処理、シリル化剤によるシリル化処理を施した後、リンスを行い室温で乾燥させることによってシリル化ガラスビーズを作製する。【００５０】
次いで、このシリル化ガラスビーズをバイオカラム用ガラス管の中に約０．５グラム充填する。そして、カップリング剤としてのグルタルアルデヒドを含むグルタルアルデヒド溶液に数十分浸漬し、リン酸緩衝液で洗浄した後、非特異的吸着によって一次抗体固定化処理を行う。この一次抗体固定化処理では、適宜バイオカラム用ガラス管を洗浄することで、未反応であった一次抗体を除去する。【００５１】
次いで、一次抗体固定化処理が完了したら、ブロッキング剤としてのウシアルブミン血清を含むブロッキング溶液を注入し、シリル化ガラスビーズの表面に残存する非特異的吸着面にブロッキング剤を非特異的吸着させ、それ以後、他の有機物質などの非特異的吸着が起こるのを防止する。【００５２】
最後に、リン酸緩衝液などでバイオカラム用ガラス管内を複数回洗浄して、未反応であったブロッキング剤を除去することによってバイオカラム２が作製される。なお、例えば凍結乾燥法などの保存手段を用いることで、このバイオカラム２を長期間安定化状態で保存することができる。【００５３】
なお、本発明の実施の形態ではガラスビーズを用いたバイオカラム２の作製について説明したが、本発明はこれに限られることなく、例えば、シリル化処理やカップリング処理などの各種条件を確立するために比較的扱いの容易な平面系ガラスを用いることとしてもよい。また、本発明の実施の形態では球状のガラスビーズを用いているが、ガラスビーズは抗体を固定化する担体（抗体を固定化する母体）の一つであり、抗体を固定化できるだけの表面積を有し、それをカラムに充填した状態で抗体と検水が十分に接触することができる形態の担体であれば、いかなる形状のものであってもよい。作製工程については、上述したガラスビーズを用いたバイオカラム２の作製工程とほぼ同じであるので、その説明を省略する。また、本発明は、固定化層表面に一次抗体が固定できれば、ビーズの材質、シリル化処理条件、一次抗体固定化方法の如何を問わず適用可能である。【００５４】
［検査工程］
図３は、図１に示す検出装置１を用いて微生物検査を行う際の流路系統図である。また、図４は、図３に示す流路系統図における検査工程の概略を示すフローチャートである。【００５５】
なお、図３において、ボトルＢ１には、染色薬として６−カルボキシルフルオレセイン・ジアセテート、希釈（ＣＦＤＡ希釈）液（標識化物質を含む溶液）を添加し、加水分解によって標識化された生菌（標識化抗原）と、加水分解が行われなかった死菌とが混在する被検抗原を含む検水（例えば１００ｍｌ）が注入されており、ボトルＢ５及びボトルＢ６には、カラム洗浄液としてのリン酸緩衝液が注入されており、Ｍ−Ｃｅｌｌ３には、バイオカラム２において捕捉された標的菌を溶出するアルカリ水溶液が注入されている。また、本実施形態で用いたＣＦＤＡは、生菌を染色することができ、かつ、それらを蛍光発色などで検出できる薬剤で代替可能である。【００５６】
図４において、まず、固定化工程が実行される（ステップＳ１）。より具体的には、図３において、ポンプＰ１を作動させることによって、ボトルＢ１に注入されたＣＦＤＡ希釈液の添加検水が、ボトルＢ１→バルブＶ１→バルブＶ２→ポンプＰ１→バルブＶ３→バイオカラム２→バルブ４→バルブ５→バルブ６→ボトルＢ２の順序で流動する。所要時間はおよそ１５分である。そして、バルブＶ１を切り替えることで、ボトルＢ２に貯留している検水が、ボトルＢ２→バルブＶ１→バルブＶ２→ポンプＰ１→バルブＶ３→バイオカラム２→バルブ４→バルブ５→バルブ６→ボトルＢ３の順序で流動する。この所要時間もおよそ１５分である。以上ステップＳ１の固定化工程によって、バイオカラム２（ガラスビーズ）に固定化された一次抗体に、検水中の被検抗原を抗原抗体反応により特異的に結合させる。なお、ボトルＢ１に増殖培養液を添加しておき、この増殖培養液によって増殖した標識化抗原を捕捉することとしてもよい。これにより、標識化抗原濃度を高めることができ、標識化抗原の捕捉確率を向上することができる。【００５７】
ここで、高い検出精度，検出感度を維持するためには、特異的結合抗体を固定化してなる固定相（ガラスビーズ）と、循環する試料溶液（検水）とを十分に接触させなければならない。そこで、本実施形態では、電磁式ピンチバルブＰＶ（図３参照）を利用して、バイオカラム２内のガラスビーズ（固定相）を効果的に攪拌するようにしている。より具体的には、図５を用いて説明する。図５は、固定相を効果的に攪拌する様子を示す説明図である。【００５８】
図５において、バイオカラム２とバルブＶ３との間に設けられたピンチバルブＰＶが、開状態（ＯＮ状態）から閉状態（ＯＦＦ状態）になると（図５左図→図５中央図）、ピンチバルブＰＶからバイオカラム２へは検水が流動しなくなるとともに、ピンチバルブＰＶのバルブＶ３側の配管圧力が増加する。そして、所定時間経過後、ピンチバルブＰＶが閉状態（ＯＦＦ状態）から開状態（ＯＮ状態）になると（図５中央図→図５右図）、ピンチバルブＰＶからバイオカラム２へ再び検水が流動する。【００５９】
このとき、ピンチバルブＰＶを所定時間閉状態（ＯＦＦ状態）にしていたことに起因して、バイオカラム２内では急激な圧力変動が生じ、バイオカラム２内を流れる検水の流速が増す。その結果、バイオカラム２内でガラスビーズ（固定相）が攪拌されることになる（図５右図参照）。【００６０】
このように、本実施形態では、検水をバイオカラム２に循環させる際に、ピンチバルブＰＶを所定のタイミングで開閉することによって、固定相（ガラスビーズ）が定期的かつ効果的に攪拌されるような構成としている。これにより、固定相（ガラスビーズ）と検水とを十分に接触させることが可能となっている。【００６１】
なお、本実施形態では、電磁式のピンチバルブＰＶを利用することとしたが、本発明はこれに限られず、例えば、手動式・電動式のピンチバルブを利用することとしてもよい。また、バイオカラム２内の固定相が適度に攪拌される効果を奏する手段であれば如何なるものを利用してもよく、特に、ピンチバルブに限定されない。【００６２】
次いで、洗浄工程が実行される（ステップＳ２）。より具体的には、図３において、バルブＶ２を切り替えることで、ボトルＢ５に貯留しているリン酸緩衝液が、ボトルＢ５→バルブ２→ポンプＰ１→バルブＶ３→バイオカラム２→バルブＶ４→バルブＶ５→ボトル４の順序で流動する。その後、ポンプＰ１のスイッチを切る。所要時間はおよそ１５分である。以上ステップＳ２の洗浄工程によって、リン酸緩衝液をバイオカラム２に流し、未反応であった一次抗体などを洗浄し、結果として被検抗原の凝縮化を行う。【００６３】
次いで、溶出工程が実行される（ステップＳ３）。より具体的には、図３において、バルブＶ３及びバルブＶ４を切り替え、被検抗原を溶出する溶菌液が入ったＭ−Ｃｅｌｌ３及びポンプＰ２を作動させることによって、バイオカラム２において捕捉された被検抗原を溶出する。そして、Ｆｌｏｗ  Ｃｅｌｌ（図３中の右下）を備えた蛍光分光光度計において、被検抗原のうち標識化された生菌（標識化抗原）を光学的に検出（スペクトル測定）する。以上ステップＳ３の溶出工程によって、食中毒の被害をもたらす生菌のみの検出を行う。そして、以上ステップＳ１〜ステップＳ３までの一連の工程によって、微生物検査は一応終了する。【００６４】
なお、ボトルＢ４やボトルＢ６に実験数回分の薬液を注入して連続的に微生物検査を行う場合には、図４に示すように、洗浄工程が追加実行される（ステップＳ４）。より具体的には、図３において、ポンプＰ２を作動させ、バルブＶ４及びバルブＶ７を切り替え、ボトルＢ６に貯留しているリン酸緩衝液によってバイオカラム２を洗浄する。【００６５】
以上説明したように、図４に示すステップＳ１〜ステップＳ３（ステップＳ４）の一連の検査工程によれば、抗原としての微生物のうち生菌のみを検出可能であることが分かる。また、本発明の実施の形態に係る検出装置１で検査可能な検水の量は、検査キット等で用いる検水の量（約０．０１ｍｌ〜０．２ｍｌ）とは異なり、数十ｍｌ〜数百ｍｌであることから、試料のサンプル化に伴って生じる大腸菌の含有確率の低下を防ぐことができ、ひいては検出精度・検出感度を向上させることができる。なお、洗浄、溶出、洗浄の各工程で使用される薬品及びその方法については、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で変更可能である。【００６６】
さらに、図４に示すステップＳ１〜ステップＳ３（ステップＳ４）の一連の検査工程によれば、従来のサンドイッチ法よりも短時間で微生物検査を行うことができる。検出装置１を用いた検査の迅速化について、図６の模式図を用いて以下に詳述する。【００６７】
［模式図］
図６は、本発明の実施の形態に係る検出方法の主要工程を示す模式図である。（ａ）は抗体（一次抗体）の固定化工程であり、（ｂ）は被検抗原を含む試料液と蛍光試薬の攪拌工程であり、（ｃ）は標識化抗原を含む被検抗原の捕捉工程であり、（ｄ）は被検抗原の固定化工程であり、（ｅ）は被検抗原の溶出工程であり、（ｆ）は溶出させた被検抗原のうち、標識化抗原のみを検出する検出工程である。なお、図６（ａ）〜（ｆ）には、固定化層表面１０、一次抗体１１、標的菌（生菌）１２、標識化物質１３、標識化抗原１４、光源１５、検出器１６が記載されている。【００６８】
図６において、まず、バイオカラム用ガラス管に充填されたガラスビーズの固定化層表面１０に一次抗体１１を非特異吸着させて固定化する（図６（ａ））。なお、本工程の詳細については、バイオカラム２の作製工程において述べたとおりである。【００６９】
次に、被検抗原を含む試料液の中に蛍光試薬を添加することで、標的菌となる生菌１２を発光させる（図６（ｂ））。より具体的には、ＣＦＤＡ希釈液が試料液の中に添加されると、被検抗原のうちの生菌は、細胞内ｐＨインジケーターたるＣＦＤＡ（標識化物質１３）を吸収し、加水分解によって蛍光を発するようになる。すなわち、ＣＦＤＡは、生菌染色薬としての機能を有することになる。なお、試料液の中にＣＦＤＡ希釈液を添加した後、攪拌装置による攪拌によって、生菌による加水分解を促進することとしてもよい。これにより、より短時間かつ確実に、生菌にＣＦＤＡを吸収させることができ、ひいては検査の迅速化に資することとなる。【００７０】
次に、被検抗原（標識化抗原１４を含む）が存在する試料液を、バイオカラム２の固定化層表面１０に接触させ、一次抗体１１との抗原抗体反応によって被検抗原を捕捉する（図６（ｃ））。そして、被検抗原の捕捉した後、リン酸緩衝液などの洗浄溶液をバイオカラム２に流し込み、不純物や未反応一次抗体等を除去することで、被検抗原の凝縮化（濃縮化）及び被検抗原の固定化を行う（図６（ｄ））。なお、図６（ｂ）に示す攪拌工程と、図６（ｃ）に示す捕捉工程及び図６（ｄ）に示す固定化工程と、を複数回繰り返し実行するのが好ましい。これにより、未反応状態の被検抗原の数が少なくなり、ひいては検査精度・検査感度の向上に寄与することとなる。【００７１】
次に、一次抗体１１によって固定化され、標識化抗原１４を含む被検抗原を、アルカリ水溶液によって溶菌・抽出する（図６（ｅ））。このとき、循環経路内容量やフローセル容量を少なくし、溶菌・抽出に必要なアルカリ水溶液の量を減少させることで、溶菌抽出液中の菌濃度を高めることができ、ひいては検出感度を向上させることができる。なお、本発明の実施の形態では、高濃度アルカリ水溶液を用いたが、例えば酸性緩衝液や界面活性剤などを併用することによって、より迅速かつ確実に被検抗原を溶菌・抽出することができる。【００７２】
最後に、標識化抗原１４を、光源１５に対向して配置された検出器１６によって光学的に検出する（図６（ｆ））。より具体的には、標識化物質１３を含む標識化抗原１４は、光源１５より発せられた紫外線励起光によって蛍光を発し、集光レンズを備える検出器１６においてこれを受光することで、電気信号（クロマト信号）を取り出す。この電気信号を測定・分析することによって、標識化抗原１４（標的菌１２）を光学的に検出することができる。なお、本発明の実施の形態では、蛍光分光光度計を用いることとしたが、例えばパーティクルカウンター等の検出器を用いるなど、検出態様の如何は問わない。【００７３】
以上説明したように、図６（ａ）〜図６（ｆ）に示す一連の工程によれば、従来のサンドイッチ法よりも短時間で微生物検査を行うことができる。すなわち、従来のサンドイッチ法では、被検抗原の検出までに２回の抗原抗体反応が必要であったが（図１２（ｂ），（ｃ）参照）、本発明によれば、標識化抗原１４と一次抗体１１との１回の抗原抗体反応で済むことから（図６（ｃ）参照）、その分検査時間を短縮化することができ、ひいては検査の迅速化を図ることができる。【００７４】
［変形例］
図７は、本発明の他の実施の形態に係る検出装置の外観図である。主な特徴としては、特定の標的菌を捕捉可能なバイオカラム６５，６６を２本設けている点である。なお、図７では、２本のバイオカラム６５，６６を設けることとしたが、本発明はこれに限られず、例えば３本以上のバイオカラムを設けることとしてもよい。複数本のバイオカラムを設けることによって、複数種類の標的菌を同時に検出することができるようになる。【００７５】
図７において、本発明の他の実施の形態に係る検出装置は、各機器・ポンプ・ボトル等が３５±１℃の恒温槽（図中の四角枠）の内部に設置され、各機器やポンプは、流路制御用シーケンサ６９で最適に制御される。恒温槽の内部には、標的菌を含む試験試料供給槽（試料ホッパ）６１、試料を攪拌する攪拌装置（マグネスチックスターラ）６２、不純物を取り除くろ過フィルター６３、流路を適宜切り替える流路切り替えバルブ６４、表面に標的菌抗体を固定化した微粒子ガラスが充填されたバイオカラム６５，６６、試料を流動せしめる循環ポンプ６７、標的菌を光学的に検出する高感度蛍光検出器６８が設置され、また、洗浄液の入ったボトルＢ１１、固定化液の入ったボトルＢ１２、捕捉した染色菌の溶菌抽出液の入ったボトルＢ１３が設置されている。以下、図７に示す検出装置を用いた検査工程について概説する。【００７６】
まず、規定量の試料を定法によってストマッキングし、試験溶液（５０〜１００ｍｌ）を試験試料供給槽６１に入れる。そして、攪拌装置６２で攪拌しながら蛍光染色試薬としてのＣＦＤＡを添加し、生菌を染色する。約１０分間の攪拌の後、ろ過フィルター６３を通して不純物を取り除くとともに、試料流路（バイオカラム６５）へ導入する。なお、流路切り替えバルブ６４をフィルター逆洗浄系に切り替え、ろ過フィルター６３を洗浄しておく。【００７７】
次いで、ろ過ユニット（ろ過フィルター６３）を通過した試験溶液は、バイオカラム６５，６６を通過し、全流路洗浄系流路を循環することで、数回、バイオカラム６５，６６内を通過する。その後、固定化抗体に捕捉された染色菌体（標識化抗原）は、ボトルＢ１３からバイオカラム６５，６６内のリサイクル系流路に少量に添加された溶菌抽出液を数回リサイクルすることによって、高濃度に抽出される。抽出が完了した試験溶液は、バイオカラム６５，６６の下部の切り替えバルブ６４によって、高感度蛍光検出器６８へと導入され、電気信号としてクロマトグラムが描画される。【００７８】
より具体的には、抽出が完了した試験溶液は、高感度蛍光検出器６８のフローセルに導入され、その試料溶液のうちの染色菌体は、光源から発せられた紫外線励起光によって蛍光を発する。そして、その蛍光を集光レンズで受光し、光信号を電気信号に変換することによって、クロマトグラムが描画される。【００７９】
最後に、溶菌・抽出が終了した後に、標的菌抗体を固定化した微粒子ガラスが充填されたバイオカラム６５，６６は、ボトルＢ１１内の洗浄液によって洗浄され、リフレッシュされる。【００８０】
以上概説したように、図７に示す検出装置によれば、２本のバイオカラム６５，６６を設けることで、２種類の標的菌を１回の検査の流れの中で同時に捕捉することが可能となり、ひいては検査の効率化・迅速化に寄与することとなる。【００８１】
なお、抗体の異なる複数のバイオカラムを直列に設置することで、複数の標的菌を同時に検出することができる。また、同じ抗体のバイオカラム複数を並列に設置することで、特定の標的菌における複数検水を同時に検出することができる。さらに、この両者を併用することも可能である。【００８２】
［培養工程］
本発明の実施の形態に係る検出方法では、基本的に培養工程がなくても十分に標的菌を検出することができる。しかし、必要に応じて、標的菌を培養することで、より確実な検査結果を得ることができる。培養工程は、例えば、検出装置にヒータを備えておき、固定化工程前に培養を施すか、或いは、検査工程が組み込まれている検出装置全体を一定温度にして培養を施すことで実行することができる。
【実施例１】
【００８３】
図８は、図３に示す流路系において、バイオカラム２の性能実験を行った際の測定結果を示す図である。より具体的には、大腸菌（E.coli）の注入量（ＣＦＵ／１００ｍｌ）に対するＣＦＤＡ蛍光強度を示している。図８に示す表によれば、大腸菌注入量と、溶菌抽出液中のＣＦＤＡ蛍光強度との間には、高い相関が見られることが分かる。すなわち、図８に示す表の各データを２次元フィールドにプロットした図９によれば、大腸菌の注入量が増加するにつれて、ＣＦＤＡ蛍光強度も増加しており、標的菌が適切に検出できたことが分かる。【００８４】
ここで、図８に示す表において、大腸菌の流入量が最小濃度の１０ＣＦＵ／ｍｌの検水に対しても、比較的強い蛍光スペクトル（平均１．２０５０）が得られていることから、約５ＣＦＵ／ｍｌの検水に対しても適切な標的菌検出が可能であると考えられる。また、循環経路内の容量やミクロフローセル容量を少なくし、溶菌抽出液の必要量を減少させることによって、溶菌抽出液の菌濃度を高め、約約１〜５ＣＦＵ／ｍｌの検水に対しても適切な標的菌検出が可能であると考えられる。【００８５】
図１０は、図３に示す流路系において、バイオカラム２の性能実験を行った際の測定結果を示す表である。特に、図１０（ａ）は、染色処理を施した死菌に対するＣＦＤＡ蛍光強度を示している。図１０（ａ）に示す表によれば、被検抗原のうちの死菌を注入しても、溶菌抽出液中のＣＦＤＡ蛍光強度は非常に微弱であることが分かる。すなわち、実際の検水中に、直接食中毒被害をもたらさない死菌が混在していたとしても、干渉されずに高い精度で生菌を評価することができ、ひいては死菌のみを含む適合品を排除してしまうといった問題を解決できることが分かる。【００８６】
また、図１０（ｂ）は、大腸菌（E.coli）以外の複数種類の菌（大腸菌群：C.freundii、腸内細菌科菌：S.marcescens）の注入量（ＣＦＵ／１００ｍｌ）に対するＣＦＤＡ蛍光強度を示している。図１０に示す表によれば、大腸菌以外の菌に対しては、溶菌抽出液のＣＦＤＡ蛍光強度は弱いことが分かる。すなわち、死菌と同様に、試料溶液の中に標的菌以外の菌が共存している場合であっても、その影響は比較的低くすることができる。【００８７】
図１１は、図３に示す流路系において、繰り返し使用によるバイオカラム２の性能実験を行った際の測定結果を示す表である。より具体的には、バイオカラム２の累積使用回数（回）に対するＣＦＤＡ蛍光強度を示している。図１１によれば、バイオカラム２を累積的に２回使用すると、２回目の使用時には、溶菌抽出液中のＣＦＤＡ蛍光強度が約９８％減少することが分かる。これは、標的菌の抽出に、溶菌作用のある高濃度のアルカリを使用しており、この際に、菌とともにタンパク質である抗体にもダメージを与えていると考えられる。従って、例えば抗体へのダメージが少ない溶菌抽出液を用いることで、バイオカラム２の複数回使用が可能になる。【００８８】
次に、試験材料の種類や量を変えて行った評価試験について、以下に概説する。【００８９】
まず、ＭＰＮ法等によって菌数が推定されている菌液１００ｍｌを試験装置の試料供給瓶に移し、ＣＦＤＡを含む生菌染色液を１ｍｌ加え、その全量を毎分１０ｍｌの流速でバイオカラムに２回循環させた後、排水する。そして、試料液の全量をバイオカラムに適用した後、適量のバイオカラム洗浄液を流し、バイオカラムの内部を洗浄した後、流路を切り替えて、バイオカラム内部に残ったバイオカラム洗浄液をすべて排出する。【００９０】
次いで、上述の工程で生菌染色され、バイオカラムにトラップされた標的菌を全量１０ｍｌの溶菌抽出液を用いて溶菌抽出しながら、蛍光分光光度計のフローセルに導入し、蛍光強度の測定を行う。そして、その測定の終了後、滅菌リン酸緩衝希釈水を用いて全ての流路系を洗浄する。【００９１】
以上が評価試験の概要であるが、要した時間は約１時間である。かかる評価試験において、試料中に標的生菌が約３０ＣＦＵ以上存在すれば、十分に検出する能力があることが分かった。また、大腸菌以外の菌（大腸菌群や腸内細菌）の影響、死菌の影響は極めて軽微であり、実用上問題はないことも分かった。従って、本発明では、対象を大腸菌として例示しているが、抗原抗体反応によって捕集できるものであればいかなるものであってもよく、例えば、カビ類も対象とすることができる。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明に係る検出方法及び検出装置は、被検抗原に、その被検抗原内の生菌によって酵素分解される標識化物質を作用させた標識化抗原を検出することで、試料溶液の生菌を標的菌とすることができ、また、検査の迅速性及び確実性を担保し得るものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】本発明の実施の形態に係る検出装置の外観図である。
【図２】本発明の実施の形態に係る検出装置に設置されたバイオカラムの拡大図である。
【図３】図１に示す検出装置を用いて微生物検査を行う際の流路系統図である。
【図４】図３に示す流路系統図における検査工程の概略を示すフローチャートである。
【図５】固定相を効果的に攪拌する様子を示す説明図である。
【図６】本発明の実施の形態に係る検出方法の主要工程を示す模式図である。
【図７】本発明の他の実施の形態に係る検出装置の外観図である。
【図８】図３に示す流路系において、バイオカラムの性能実験を行った際の測定結果を示す図である。
【図９】図８に示す表の各データを２次元フィールドにプロットした図である。
【図１０】図３に示す流路系において、バイオカラムの性能実験を行った際の測定結果を示す表である。
【図１１】図３に示す流路系において、繰り返し使用によるバイオカラムの性能実験を行った際の測定結果を示す表である。
【図１２】従来のサンドイッチ法の主要工程を示す図である。
【符号の説明】
【００９４】
１  検出装置
２  バイオカラム
３  Ｍ−Ｃｅｌｌ
１０  固定化層表面
１１  一次抗体
１２  標的菌（生菌）
１３  標識化物質
１４  標識化抗原
１５  光源
１６  検出器
【図１】
2005106454.tif 000002
【図２】
2005106454.tif 000003
【図３】
2005106454.tif 000004
【図４】
2005106454.tif 000005
【図５】
2005106454.tif 000006
【図８】
2005106454.tif 000007
【図９】
2005106454.tif 000008
【図１０】
2005106454.tif 000009
【図１１】
2005106454.tif 000010
【図６】
2005106454.tif 000011
【図７】
2005106454.tif 000012
【図１２】
2005106454.tif 000013
【国際調査報告】
2005106454.tif 000014
2005106454.tif 000015
2005106454.tif 000016
2005106454.tif 000017