(57)【要約】本発明の目的は、医薬組成物、特に、寄生性の原虫感染症に対して高い治療効果及び選択毒性を有し、又、延命効果等を示す治療用及び／又は予防用の医薬組成物を提供するである。本発明は、一般式（１）で表される化合物を含有する医薬組成物、特に、原虫感染症の治療剤及び／又は予防剤、並びに、それに有効成分として含まれる新規化合物に関する。【化１】2006087935.tif 000026
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表される化合物を有効成分として含有する、医薬組成物：
【化１】
2006087935.tif 000021
（式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立にアルキル基、アリ−ル基又はヘテロ環基を表し、同一でも異なっていてもよく、任意にヒドロキシル基、アルコキシ基、ハロゲン、アミノ基、シアノ基、スルホン酸基、カルボキシル基、エステル基、アミド基、若しくはニトロ基で置換されていてもよく、又、Ｒ１とＲ２が縮合して環を形成していてもよく；
Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立にアルキル基、アリ−ル基又はヘテロ環基を表し、同一でも異なっていてもよく、任意にヒドロキシル基、アルコキシ基、ハロゲン、アミノ基、シアノ基、スルホン酸基、カルボキシル基、エステル基、アミド基、若しくはニトロ基で置換されていてもよく、又、Ｒ３とＲ４が縮合して環を形成していてもよく；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、ハロゲン、アルキル基、アリ−ル基、ヘテロ環基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アミノ基、シアノ基、スルホン酸基、カルボキシル基、エステル基、又はニトロ基を表し、同一でも異なっていてもよく、Ｒ５及びＲ６が互いに脂環、芳香環、ヘテロ脂環、又はヘテロ芳香環を形成していてもよく；
ｍ及びｎは、それぞれ独立して、０〜３の整数であり；及び
Ｑは生理学的に許容しうるアニオンを表す）。
【請求項２】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立に炭素数１〜６のアルキル基であることを特徴とする、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
Ｑがハロゲンイオン又は過塩素酸イオンであることを特徴とする、請求項１又は２記載の医薬組成物。
【請求項４】
Ｒ１とＲ２、又は、Ｒ３とＲ４が縮合して環を形成していることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
環がピペラジン環又はモルホリン環である、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
下記構造式で表される化合物の少なくとも一つを有効成分として含有する医薬組成物：
【化５】
2006087935.tif 000022
【請求項７】
原虫寄生感染症の治療用及び／又は予防用である、請求項１から６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項８】
上記原虫寄生感染症がマラリア症、リ−シュマニア症、アフリカ睡眠病、シャ−ガス病、トキソプラズマ症、リンパフィラリア症、バベシア症、又はコクシジウム症であることを特徴とする請求項７記載の原虫寄生感染症の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
【請求項９】
上記原虫寄生感染症がマラリア症、リ−シュマニア症、アフリカ睡眠病、又はシャ−ガス病であることを特徴とする請求項８に記載の原虫寄生感染症の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
【請求項１０】
上記原虫寄生感染症がマラリア症であることを特徴とする請求項９に記載の原虫寄生感染症の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
【請求項１１】
上記一般式（１）で示される化合物が１mg〜１０，０００mg含有されていることを特徴とする請求項１から１０のいずれかに記載の原虫寄生感染症の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載の化合物を含む組成物の形状が、液体状、錠剤状、又はコロイド状であることを特徴とする請求項１から１１のいずれかに記載の原虫寄生感染症の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
【請求項１３】
下記のいずれかの構造式で表される化合物：
【化２】
2006087935.tif 000023
【化３】
2006087935.tif 000024
【化４】
2006087935.tif 000025
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬組成物及びその有効成分である新規化合物に関する。本発明の化合物は、特に、例えば、薬剤耐性マラリアを含むマラリア症、リ−シュマニア症、アフリカ睡眠病やシャ−ガス病を含むトリパノソ−マ症、トキソプラズマ症、及びクリプトスポリジウム症のような寄生虫感染に関連する疾患の治療及び/又は予防に有用である。
【背景技術】
【０００２】
寄生性の原虫感染症は、現在でも特に熱帯や亜熱帯地域を中心に多く知られており、例えばマラリア症、リ−シュマニア症、アフリカ・トリパノソ−マ症（アフリカ睡眠病）、アメリカ・トリパノソ−マ症（シャ−ガス病）、リンパフィラリア症、バベシア症、トキソプラズマ症、クリプトスポリジウム症などが挙げられる。これらには、ヒトのみに感染するもの及び、家畜や小動物にも感染する人畜共通感染症であるものに分類されるが、どちらにおいても重大な経済的かつ社会的損害をもたらす。例えば、これらの疾病の中には、一般的な社会生活を送ることが不可能になるほどの重篤な症状を示すもの、さらには介護必要な寝たきり状態を余儀なくさせるもの、致死性の症状に発展させるものがある。しかし、これらの疾病に有効性を示すワクチンは現在のところ臨床薬としては存在せず、今後も開発が困難とされている。【０００３】
これらの疾病の中には十分な効果を示す治療薬がないもの、治療薬に対する耐性原虫の出現及び拡散、治療薬の重篤な副作用などが問題となっているものもある。例えば、現在、リ−シュマニア治療剤であるペントスタムは分子内にアンチモン原子を有することから、治療の副作用としてアンチモン中毒が避けられない。又、アフリカ・トリパノソ−マ（アフリカ睡眠病）の初期治療に使用されるメラルソプロ−ルは分子内にヒ素原子が含まれており、ヒ素中毒が副作用として起こるという問題点がある。そのような背景のもと、内服や注射、もしくはそれに準じる投与形態で服用できる有効な治療薬または予防薬の早急な開発が切望されている。【０００４】
これまでに、以下の構造式（２）で表される、酸化段階が低いフェノキサジン化合物はトキソプラズマ症の原因となるＴｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ由来のデヒドロ葉酸還元酵素の阻害活性を有することが酵素レベルで知られており（特許文献１）、寄生虫感染症に有効であることが示唆されている。しかしながら、この化合物が実際にトキソプラズマ以外の寄生虫、実際に生きた寄生虫、又は宿主に寄生した状態、即ち細胞レベルや個体レベルで治療効果を示すか否かについて不明である。また、この化合物が原虫感染症に効果を示すか否かの因果関係は全く不明であり、予想できるものではなかった。【０００５】
【化１】
2006087935.tif 000002
【０００６】
又、以下の構造式（３）で表されるＢｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｃｒｅｓｙｌ  Ｂｌｕｅはマラリア症の原因となるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ原虫を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ（細胞）評価系で増殖阻害することが知られている（非特許文献１）。しかしながら、生体動物を用いる         ｉｎ  ｖｉｖｏ試験系では高いマラリア治療効果を示さず、従って、該文献の記載からは、一般式（１）で示される２つの二置換アミノ基を有するフェノキサジン化合物がマラリア症に効果を示すか否かについては予想できるものではない。更に、非特許文献１には、当該化合物がマラリア以外の寄生虫感染症に治療効果を示すか否かいついても全く記載されていない。又、この化合物が原虫感染症に効果を示すか否かの因果関係は全く不明であり、予想できるものではなかった。【０００７】
【化２】
2006087935.tif 000003
【０００８】
上述の非特許文献１には、構造式（３）で表されるフェノキサジン及びそれに類似する以下の各種化合物群のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  Ｗ２）の増殖阻害が示されている。該文献に示されたこれら化合物についての熱帯熱マラリア原虫に対するサンプルのＥＣ５０値を表１に示す。【０００９】
【化３】
2006087935.tif 000004
【００１０】
【表１】
2006087935.tif 000005
【００１１】
更に表２に上記各化合物について、マラリアに感染したマウスに５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの腹腔投与プログラムで連続４日間治療を行った結果、無処置のマウスと比較したときの治癒率（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ：血液中のマラリア感染赤血球の減少比）を示す。尚、完治とはｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎが１００％であることを指す。【００１２】
【表２】
2006087935.tif 000006
【００１３】
これらの結果から、上記非特許文献１に開示される化合物については、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験系では高いマラリア増殖阻害効果が認められず、実際の治療効果は全く期待できないことが判る。また、治療に供したモデル動物は治療をしない動物に比べ、約１〜２日間だけ延命したにすぎず、急性毒性も高いので、大量の投与には適していない為、高い治癒効果を実現することは困難であった。
【特許文献１】ＰＣＴ／ＵＳ００／０１９６８号公報
【非特許文献１】Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ誌、１９９５年、３９巻、２６７１〜２６７７頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、本発明の目的は、医薬組成物、特に、寄生性の原虫感染症に対して高い治療効果及び選択毒性を有し、又、延命効果等を示す治療用及び／又は予防用の医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、上記一般式（１）で表される化合物を含有する医薬組成物において、原虫寄生感染症に対しｉｎ  ｖｉｖｏ試験系でも高い増殖阻害効果が認められる事を見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。【００１６】
即ち、本発明は、以下の各態様に係るものである。
１．  下記一般式（１）で表される化合物を有効成分として含有する医薬組成物：【００１７】
【化４】
2006087935.tif 000007
【００１８】
（式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立にアルキル基、アリ−ル基又はヘテロ環基を表し、同一でも異なっていてもよく、任意にヒドロキシル基、アルコキシ基、ハロゲン、アミノ基、シアノ基、スルホン酸基、カルボキシル基、エステル基、アミド基、若しくはニトロ基で置換されていてもよく、又、Ｒ１とＲ２が縮合して環を形成していてもよく；
Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立にアルキル基、アリ−ル基又はヘテロ環基を表し、同一でも異なっていてもよく、任意にヒドロキシル基、アルコキシ基、ハロゲン、アミノ基、シアノ基、スルホン酸基、カルボキシル基、エステル基、アミド基、若しくはニトロ基で置換されていてもよく、又、Ｒ３とＲ４が縮合して環を形成していてもよく；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、ハロゲン、アルキル基、アリ−ル基、ヘテロ環基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アミノ基、シアノ基、スルホン酸基、カルボキシル基、エステル基、又はニトロ基を表し、同一でも異なっていてもよく、Ｒ５及びＲ６が互いに脂環、芳香環、ヘテロ脂環、又はヘテロ芳香環を形成していてもよく；
ｍ及びｎは、それぞれ独立して、０〜３の整数であり；及び
Ｑは生理学的に許容しうるアニオンを表す）。
２．  Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立に炭素数１〜６のアルキル基であることを特徴とする、上記１記載の医薬組成物。
３．  Ｑがハロゲンイオン又は過塩素酸イオンであることを特徴とする、上記１又は２記載の医薬組成物。
４．  Ｒ１とＲ２、又は、Ｒ３とＲ４が縮合して環を形成していることを特徴とする、上記１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
５．  環がピペラジン環又はモルホリン環である、請求項４記載の医薬組成物。
６．  下記構造式で表される化合物の少なくとも一つを有効成分として含有する医薬組成物：【００１９】
【化５】
2006087935.tif 000008
【００２０】
７．原虫寄生感染症の治療用及び／又は予防用である、上記１から６のいずれかに記載の医薬組成物。
８．  上記原虫寄生感染症がマラリア症、リ−シュマニア症、アフリカ睡眠病、シャ−ガス病、トキソプラズマ症、リンパフィラリア症、バベシア症、又はコクシジウム症であることを特徴とする上記７記載の原虫寄生感染症の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
９．  上記原虫寄生感染症がマラリア症、リ−シュマニア症、アフリカ睡眠病、又はシャ−ガス病であることを特徴とする上記８に記載の原虫寄生感染症の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
１０．  上記原虫寄生感染症がマラリア症であることを特徴とする上記９に記載の原虫寄生感染症の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
１１．  上記一般式（１）で示される化合物が１mg〜１０，０００mg含有されていることを特徴とする上記１から１０のいずれかに記載の原虫寄生感染症の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
１２．  上記１に記載の化合物を含む組成物の形状が、液体状、錠剤状、又はコロイド状であることを特徴とする上記１から１１のいずれかに記載の原虫寄生感染症の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
１３．下記のいずれかの構造式で表される化合物：【００２１】
【化６】
2006087935.tif 000009
【化７】
2006087935.tif 000010
【化８】
2006087935.tif 000011
【発明の効果】
【００２２】
本発明の医薬組成物に有効成分として含まれる化合物は、特に、寄生性の原虫感染症に対して低用量の投与によっても増殖阻害効果を示し、原虫増殖阻害を示す用量より高い用量の投与によっても哺乳類細胞を傷つけない（選択毒性係数が高い）。また、細胞レベルではなく生体に本化合物を投与した場合も、急性毒性などの副作用を示さず原虫の増殖を抑制し、治療効果及び有意な延命効果を示すことがインビボ試験で確認された。更に、本発明化合物には、アンチモン又はヒ素などの有害な原子が含まれていないために、それらに起因する副作用の恐れがない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明による医薬組成物について具体的に説明する。
多種多様な化合物について疾病原因となる原虫の増殖効果を検定し、さらに副作用の指標となる哺乳類細胞に対しての細胞毒性を評価した。さらに、宿主モデルとしてマラリア感染マウスを用いて、多種多様な化合物を任意の量もしくは形態で投与しマラリアの治療効果を評価した。後者の評価系で５〜１０ｍｇ／ｋｇの投与量にて薬剤非投与のものと比較して、５０％以上のマラリア原虫増殖抑制効果を示す化合物を探索した。【００２４】
その結果、上記効果を示す一般式（１）で表される化合物として、一般式（１）で表される化合物を見出した。該化合物について更に詳細に説明する。【００２５】
一般式（１）のＲ１〜Ｒ４で表されるアルキル基としては、炭素数１〜１２のものが好ましく、炭素数１〜６のものがより好ましく、直鎖状でも分岐状でも環状でもよい。具体的なアルキル基としては、メチル、エチル、及びブチル基が挙げられる。かかるアルキル基は置換されてもよく、好ましい置換基の例としては下記の置換基として挙げたものが好ましい。一般式（１）のＲ１〜Ｒ４で表されるアリ−ル基としては、炭素数５〜１５のものが好ましく、炭素数６〜１０のものがより好ましい。【００２６】
一般式（１）のＲ１〜Ｒ４で表されるヘテロ環基としては、好ましくは５〜８員環、より好ましくは５又は６員環である。ヘテロ原子としては、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、セレン原子、テルル原子及びリン原子が挙げられ、窒素原子、酸素原子、硫黄原子及びセレン原子が好ましい。ヘテロ環基の具体例としては、例えば、ピロ−ル環、フラン環、ピペリジン環、モルホリン環、ピペラジン環、ピリジン環、ピロリジン環等が挙げられる。かかるヘテロ環基は置換されてもよい。【００２７】
また、Ｒ１とＲ２、又はＲ３とＲ４は互いに縮合して３〜１２員、好ましくは５〜７員環の飽和又は不飽和環を形成していてもよい。このような飽和又は不飽和環の例として、例えば、ピペリジン環、ピペラジン環、モルホリン環、アゼピン環、ピロール環、及びテトラヒドロピリジン環等ヘテロ環を挙げることが出来る。又、Ｒ５及びＲ６が互いに結合して形成される脂環、芳香環、ヘテロ脂環、又はヘテロ芳香環の例としては、例えば、シクロヘキセン環、シクロペンテン環、ベンゼン環、ナフタレン環、ジヒドロピロール環、テトラヒドロピリジン環、ピロール環、フラン環、ピリジン環、及びインドール環等を挙げることができる。【００２８】
上記の形成された各種環化合物は任意の置換基で置換されていてもよい。このような置換基の好適例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基などのアルキル置換基、フェニル基、ナフチル基などの芳香族基、アミノ基、ジアルキルアミノ基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アシルオキシ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アミノカルボニル基、ニトリル基、スルホン酸基、ニトロ基、クロロ基、フルオロ基、及びブロモ基等を挙げることができる。【００２９】
上記の化合物においてＱは電荷平衡に必要である。Ｑについての「生理学的に許容しうるアニオン」という用語は、Ｑが該化合物を受容者に投与した場合に無毒でかつ上記の化合物を水性系に溶解させるイオンであること意味する。Ｑによって表される生理学的に許容しうるアニオンの好適な例としては、塩素イオン、臭素イオン及びヨウ素イオンの如きハロゲンイオン；例えば、メタンスルホン酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸イオン、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、ナフタレンスルホン酸イオン、２−ヒドロキシエタンスルホン酸イオン等の脂肪族及び芳香族スルホン酸イオンの如きスルホン酸イオン；シクロヘキサンスルファミン酸イオンの如きスルファミン酸イオン；メチル硫酸イオン及びエチル硫酸イオンの如き硫酸イオン；硫酸水素イオン；ホウ酸イオン；ジエチルリン酸イオン及びメチル水素リン酸イオンの如きアルキル及びジアルキルリン酸イオン；トリメチルピロリン酸イオンの如きピロリン酸イオン；カルボン酸イオン（カルボキシ基及び水酸基が置換したカルボン酸イオンが都合よく用いられる）；炭酸イオン；炭酸水素イオン；過塩素酸イオン及び水酸化物イオンが挙げられる。生理学的に許容しうるアニオンＱの特に好ましい例としては塩素イオン、酢酸イオン、プロピオン酸イオン、吉草酸イオン、クエン酸イオン、マレイン酸イオン、フマル酸イオン、乳酸イオン、コハク酸イオン、酒石酸イオン、安息香酸イオン、過塩素酸イオン及び水酸化物イオンが挙げられる。【００３０】
本発明で用い得る一般式（１）の化合物の典型的な例としては、以下の化合物群が挙げられる。しかしながら、本発明はこれらの化合物に限定されるものと解釈されるべきではない。尚、このうち、Ａ−８、Ａ−９及びＡ−１１で示される化合物は新規化合物であり、従って、本発明はこれら化合物自体にも係るものである。【００３１】
【化９】
2006087935.tif 000012
【００３２】
本発明の一般式（１）化合物であるフェノキサジニウム化合物は、当業者に公知の従来技術、例えば、Ｍ．Ｌ．Ｃｒｏｓｓｌｅｙらにより記述された非特許文献１、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ誌、１９５２年、７４巻、５７８〜５８４頁、及び、Ｋ．Ａｎｄｒｅａｓらにより記述された非特許文献Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ誌、１９９９年、４巻、９２３−９３０頁に記載された方法を参考に公知の出発原料から容易に合成することができる。尚、これらの文献における開示内容は本明細書中にその内容の一部として参照されて含まれるものである。【００３３】
上記の一般式（１）の化合物を含有する本発明の医薬組成物は、マラリア症、アフリカ・トリパノソ−マ症（別名；アフリカ睡眠病）、アメリカ・トリパノソ−マ症（別名：シャ−ガス病）、リ−シュマニア症、バベシア症、リンパフィラリア症、トキソプラズマ症（エイズなどの日和見感染症）、クリプトスポリジウム症（熱帯性下痢）、その他寄生性の原虫による感染が原因となる多様なタイプの疾病の治療及び予防に有効に使用できる。【００３４】
本発明の医薬組成物において、有効成分として含有される上記一般式（１）として１又は２種類以上の化合物を含有してもよく、更に、必要に応じて、従来から用いられている抗原虫感染症剤を含む当業者に公知の任意の他の治療薬と組合せて使用しても良い。かかる抗原虫感染症剤の好適な例としては、クロロキン、メフロキン、アルテミシニン、アトバコン、及びピリメサミン（以上、マラリア症の治療薬）；スラミン、ペンタミジン、メラルソプロ−ル、及びアスコフラノン（以上、アフリカ睡眠病の治療薬）ベンズニダゾ−ル（以上、シャ−ガス病の治療薬）、ペントスタム、アンフォテリシンＢ、ミルテフォシン及びフルコナゾール（以上、リ−シュマニア症の治療薬）等が挙げられる。【００３５】
一般式（１）の化合物と組合せて、本発明の医薬組成物に用いることのできる医薬キャリア−又は希釈剤の好適な例としては塩化ナトリウム；塩化マグネシウム；塩化亜鉛、グルコ−ス；サッカロ−ス；ラクト−ス；エチルアルコ−ル；グリセリン；マンニト−ル；ソルビト−ル；ペンタエリスリト−ル；ジエチレングリコ−ル、プロピレングリコ−ル、ジプロピレングリコ−ル、ポリエチレングリコ−ル４００、他のポリエチレングリコ−ル；トリラウリン酸グリセリル、及びジステアリン酸グリセリルの如き脂肪酸のモノ、ジ及びトリグリセリド；ペクチン；でんぷん；アルギニン酸；キシロ−ス；タルク；石松子；オリ−ブ油、ピ−ナツ油、ヒマシ油、コ−ン油、紅花油、小麦麦芽油、ゴマ油、棉実油、ヒマワリ油及びタラ肝油の如きオイル及び油脂；ゼラチン；レシチン；シリカ；セルロ−ス；メチルヒドロキシプロピルセルロ−ス、メチルセルロ−ス、ヒドロキシエチルセルロ−スの如きセルロ−ス誘導体；ステアリン酸カルシウム、ラウリン酸カルシウム、オレイン酸マグレシウム、パルミチン酸カルシウム、ベヘン酸カルシウム及びステアリン酸マグネシウム等の１２〜２２の炭素原子を有する脂肪酸の塩；シクロデキストリン類（例えば、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ジヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチルエチル−β−シクロデキストリン、シクロアワオドリン、及びジメチル−β−シクロデキストリン等）；乳化剤（例えば、２〜２２の炭素原子，特に１０〜１８の炭素原子を有する飽和及び不飽和の脂肪酸とグリコ−ル、グリセリン、ジエチレングリコ−ル、ペンタエリスリト−ル、エチルアルコ−ル、ブチルアルコ−ル、オクタデシルアルコ−ルの如き１〜２０の炭素原子を有する一価の脂肪族アルコ−ル又は多価アルコ−ルとのエステル；及びジメチルポリシロキサンの如きシリコ−ン等が挙げられる。更に、医薬組成物に従来から用いられてきた当業者に公知の任意の追加のキャリア−も本発明の医薬組成物に使用することが出来る。【００３６】
本発明の化合物の薬学的な有効量及び投与方法又は投与手段は、感染症の原因となる寄生原虫の種類、原虫の寄生部位、病状の重さ、治療方針、患者の年齢、体重、性別、全般的な健康状態、及び患者の（遺伝的）人種的背景に応じて、当業者が適宜選択することができる。一般的には、本発明の化合物の投与量は１〜１０，０００ｍｇ／日／体重７０ｋｇ、より一般的には５０〜２０００ｍｇ／日／体重７０ｋｇである。【００３７】
本発明医薬組成物は投与方法・投与経路等に応じて当業者に公知の任意の形状とすることが出来る。それらは適当な方法で投与することが出来る。例えば、形状が、液体状、錠剤状、コロイド状のものを、液状の場合、５％グルコ−ス水溶液に溶かした形で或いは上記のキャリア−又は希釈剤を伴った形で、静脈内、腹腔内、皮下に注射する方法が挙げられる。錠剤状の場合では経口から服用が挙げられ、コロイド状の場合は皮膚に塗布する等の方法が挙げられる。尚、上記一般式（１）で示される化合物は、本発明の医薬組成物の使用目的、対象、及び形状等に応じて、適当な量で含有されることが出来るが、通常、１mg〜１０，０００mg程度、好ましくは、１０mg〜３，０００mg程度含有されている。【００３８】
本発明の一般式（１）の化合物及びそれを有効成分として含有する医薬組成物の有効性を明らかにするために、以下に実施例を示し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。尚、以下の実施例中の各表においてＡ−１（６０％純度）で示される化合物は、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔ社から試薬として購入したものを精製することなくそのまま用いた。その他の化合物は９５％以上の純度を１Ｈ−ＮＭＲ及び元素分析から保証した。
【実施例１】
【００３９】
３−ジブチルアミノ−７−ジエチルアミノフェノキサジニウム  パ−クロレイト（化合物Ａ−８）の合成
室温下、３−ジブチルアミノフェノ−ル（１．０ｍＬ，４．４３ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジエチル−４−ニトロソアニリン（７９０ｍｇ，４．４３ｍｍｏｌ）の混合物をエタノ−ル（５５ｍＬ）に懸濁し、６０％過塩素酸水溶液（０．５ｍＬ）を滴下しながら加えた。その混合物を３時間加熱還流後、室温に冷却した。溶媒量が約半分になるまで減圧下で濃縮し、溶液を０℃に冷却した。沈殿物を濾過により除去し、濾液を濃縮した。濃縮した粗物質をシリカゲルクロマトグラフィ−（溶出液：クロロホルム：酢酸エチル＝９：１）で精製し、粗生成物を得た。この粗生成物をメタノ−ルに溶解し、０℃に冷却後ジエチルエ−テルを若干量滴下することにより、結晶化操作を行った。濃青色の結晶を濾過したところ、３−ジブチルアミノ−７−ジエチルアミノフェノキサジニウム  パ−クロレイトが３３．３ｍｇ得られた（単離収率  ２％）。【００４０】
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ОＤ）  δ：７．７７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．８Ｈｚ），７．３８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．８，２．６Ｈｚ），７．３５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．８，２．６Ｈｚ），３．７７（ｑ，４Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），３．７０（ｑ，４Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），１．７４（ｍ，４Ｈ），１．４６（ｍ，４Ｈ），１．３５（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），１．０２（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）．  ＦＡＢ−ＭＳ  ３８０．
【実施例２】
【００４１】
３−エチルメチルアミノ−７−ジメチルアミノフェノキサジニウム  パ−クロレイト（化合物Ａ−９）の合成
室温下、３−メチルエチルアミノフェノ−ル（３００ｍｇ，１．９８ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジメチル−４−ニトロソアニリン（２９８ｍｇ，１．９８ｍｍｏｌ）の混合物をエタノ−ル（１５ｍＬ）に懸濁し、７０％過塩素酸水溶液（０．５ｍＬ）を滴下しながら加えた。その混合物を６時間加熱還流後、室温に冷却し、減圧下溶媒を留去した。その粗物質をシリカゲルクロマトグラフィ−（溶出液：クロロホルム：酢酸エチル＝９：１）で精製し、２１６ｍｇの粗生成物を得た（粗収量  ２７％）。この粗生成物をメタノ−ルに溶解し０℃に冷却し、結晶化操作を行った。濃青色の結晶を濾過したところ、３−エチルメチルアミノ−７−ジメチルアミノフェノキサジニウム  パ−クロレイトが１３．３ｍｇ得られた（単離収率  ２％）。【００４２】
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ：７．８０（ｓ，１Ｈ），７．７８（ｓ，１Ｈ），７．４１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８，２．８Ｈｚ），７．３９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８，２．８Ｈｚ），６．９６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．８Ｈｚ），６．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．８Ｈｚ），３．８１（ｑ，４Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），３．４１（ｓ，６Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），１．３４（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）．  ＦＡＢ−ＭＳ  ２８２．
【実施例３】
【００４３】
３−ジメチルアミノ−７−（１−ピペラジノ）フェノキサジニウム  クロリド１塩酸塩（化合物Ａ−１１）の合成
室温下、３−（１−ピペラジノ）フェノ−ル（１６５ｍｇ，０．９２ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジメチル−４−ニトロソアニリン（１３９ｍｇ，０．９２ｍｍｏｌ）の混合物をエタノ−ル（５０ｍＬ）に懸濁し、７０％過塩素酸水溶液（０．５ｍＬ）を滴下しながら加えた。その混合物を６時間加熱還流後、室温に冷却し、減圧下溶媒を留去した。その粗物質をシリカゲルクロマトグラフィ−（溶出液：クロロホルム：酢酸エチル＝９：１）で精製し、６５ｍｇの粗生成物を得た。この粗生成物をメタノ−ルに溶解したものをイオン交換樹脂Ａｍｂｅｒｌｙｔｅ  ＩＲＡ−４００（Ｃ１）に混和し室温で２時間放置した。これを濾過し、更に樹脂をメタノールで洗浄した。集めたろ液を減圧下濃縮し、結晶化操作を行った。濃青色の結晶を濾過したところ、３−ジメチルアミノ−７−（１−ピペラジノ）フェノキサジニウム  クロリド１塩酸塩が４９．２ｍｇ得られた（単離収率  １４％）。【００４４】
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ОＤ）  δ：７．９１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），７．８４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），７．５９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６，２．７Ｈｚ），７．４９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．３，２．７Ｈｚ），７．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ），  ７．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ），４．０４（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），３．５２（ｓ，６Ｈ），３．４６（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ）．  ＦＡＢ−ＭＳ  ３０９．【００４５】
尚、上記Ａ−１〜Ａ−２０で示された中の他の化合物も同様な方法で合成した。
【実施例４】
【００４６】
［クロロキン耐性熱帯熱マラリア原虫増殖阻害スクリ−ニング試験（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）］
本実施例では、クロロキン耐性熱帯熱マラリア原虫である、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  Ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  Ｋ１株の原虫を用いた。実験に用いた培地は、ろ過滅菌したＲＰＭＩ−１６４０培地で、ヒト血清を５％となるように添加した。マラリア原虫の培養はＯ２濃度３％、ＣＯ２濃度４％、Ｎ２濃度９３％、温度は３７℃で行った。【００４７】
試験に用いる本発明化合物、または陽性対象薬（クロロキン）はＤＭＳＯに溶解し、所定濃度の試験液とした。培養したマラリア原虫感染赤血球を遠心分離で集め、非感染赤血球で希釈し、初期感染率０．１５％とした。このときのヘマトクリット値は ２．５％とした。
９６穴培養プレ−トのウェルに、２００μＬのマラリア感染培養液を加え、所定濃度の薬剤を含む試験液又は薬剤を含まないＤＭＳОを加え調整した。試験液はｄｕｐｌｉｃａｔｅにとった。
３７℃で４８時間培養した後、０．５μＣｉの放射性のトリチウム（３Ｈ）標識されたヒポキサンチンを各ウェルに加えた。さらに２４時間同条件で培養した後、グラスファイバ−フィルタ−上に採取し蒸留水で洗浄した。ベ−タプレ−ト液体シンチレ−ションカウンタ−（Ｗａｌｌａｃ社製）で放射線強度を計測し、試験液添加群及びコントロ−ルのマラリア原虫感染率を算出した。上記で求めたマラリア原虫感染率から次式によって増殖阻害率を算出し、５０％増殖阻害濃度（ＥＣ５０）を求める。【００４８】
増殖阻害率（％）＝｛１−（ｂ−ａ）／（ｃ−ａ）｝×１００
ａ：初期感染率
ｂ：試験液添加時の感染率
ｃ：コントロ−ルの感染率【００４９】
［ラットＬ６細胞増殖阻害試験（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）］
ラット由来Ｌ６細胞（ｒａｔ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｃｅｌｌ）を用いた。培地はＲＰＭＩ１６４０培地に、Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）が１％、胎児牛血清が１０％となるように添加し、ＣＯ２濃度５％、３７℃で培養した。
試験に用いる本発明化合物または対象薬をＤＭＳＯに溶解し、所定濃度の試験液とした。前培養を行い、対数増殖期に入った細胞を含む培地を９６穴培養プレ−トのウェルにとり、次に所定濃度の薬剤を含む試験液又は薬剤を含まないＤＭＳОを加えた。試験液はｄｕｐｌｉｃａｔｅにとった。
培養プレ−トをインキュベ−タ−中で７２時間培養した後、増殖阻害活性を検定した。検定は以下のように行った。それぞれのウェルに１０μＬのＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ水溶液を加え、さらに２時間培養した。次に、培養プレ−トを蛍光マイクロプレ−トリ−ダ−（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｇｅｍｅｎｉ  ＸＳ；米国モレキュラ−・デバイス社製）に装着し、５３６ｎｍの励起波長で照射し、５８８ｎｍの蛍光強度を測定し、試験液添加群及びコントロ−ルのＬ６細胞の残存率を算出した
上記で求めた細胞残存率から次式によってＬ６細胞に対する増殖阻害率を算出し、５０％増殖阻害濃度（ＥＣ５０）を求めた。【００５０】
増殖阻害率（％）＝｛（Ｃ−Ａ）／（Ｂ−Ａ）｝×１００
Ａ：初期細胞数
Ｂ：３日後のコントロ−ルの細胞数
Ｃ：サンプル添加した３日後の細胞数【００５１】
［クロロキン耐性マラリアに対する薬効判定］
クロロキン耐性熱帯熱マラリア原虫とラットＬ６細胞に対するサンプルのＥＣ５０値からサンプルの抗マラリア作用を評価する。クロロキン耐性マラリア原虫に対する選択毒性の指標として用いられる化学療法係数を下記式により算出し、薬効判定を行った。【００５２】
化学療法係数＝（ラットＬ６細胞に対するサンプルのＥＣ５０値）
÷（クロロキン耐性熱帯熱マラリア原虫に対するサンプルのＥＣ５０値）【００５３】
本発明化合物及び陽性対象薬についてのクロロキン感受性熱帯熱マラリア原虫とラットＬ５細胞に対するサンプルの各ＥＣ５０値、並びに選択毒性係数を表３に示す。
これらの結果から、本発明化合物はクロロキノン耐性熱帯熱マラリア原虫に対して顕著に優れた増殖抑制効果を示し、選択毒性も高いことが示された。【００５４】
【表３】
2006087935.tif 000013
【実施例５】
【００５５】
［マラリア感染マウスの腹腔投与での治療試験（ｉｎ  ｖｉｖｏ）］
本実験は抗マラリア化合物のｉｎ  ｖｉｖｏ活性試験に一般的な４−ｄａｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｔｅｓｔを用いた。
本実験ではロ−デントマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ  ＮＫ６５株）を用いた。感染血液は、ＩＣＲ系雄性マウス５週齢（ＳＰＦ）に腹腔内投与で感染させ継代したものを使用している。マラリア感染マウスの尾静注で採血したものについて感染率を求め適度に感染率（１０〜２０％感染）が上昇していることを確認後、マウスの心臓からマラリア感染血液を採血した。赤血球感染率および赤血球数（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を求め、投与量０．２ｍＬ当たり１．０ｘ１０−４原虫になるようにＰＢＳ緩衝液で希釈した感染赤血球を、未感染のマウス（ＩＣＲ系雄性、５週齢）に尾静注により感染させた。
試験に用いる本発明化合物を生理食塩水（大塚製薬製）に溶解し、所定濃度の試験液とした。生理食塩水に化合物が不溶の場合は、ＤＭＳＯもしくはＴｗｅｅｎ  ２０に溶解し、試験液とした。コントロ−ル群（薬剤非投与群）には生理食塩水（大塚製薬製）のみを用いた。各マウスの体重を求めた後に、体重１ｋｇあたり薬剤が５．０ｍｇとなるように量を算出して、薬剤の投与量を決定した。
マウスは１群５匹とし、所定の濃度を腹腔投与で薬剤投与を行い、マラリア感染の２時間後から連続４日間２４時間おきに治療（薬剤投与）を行った。最後の治療を行った２４時間後にマウスの尾より血液を採取し薄層塗抹標本を作成して、顕微鏡下で試験液添加群及びコントロ−ルのマラリア原虫感染数を計数した。１群５匹のマウスのうち最高と最低の値を示す阻害率を除去し３匹のマウスで平均をとり、マラリア原虫感染率（Ｐａｒａｓｉｔｅｍｉａ）を算出した
上記で求めたマラリア原虫感染率から次式によって、５．０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ投与時の治癒率（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）を算出した。【００５６】
治療率：ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ（％）＝  （ｂ−ａ）／ｂ  ×１００
ａ：試験液添加時の原虫感染率
ｂ：コントロ−ルの原虫感染率
【００５７】
また、マウスの体重変化と毛づやなどのマウスの様子を観察し、薬剤投与による急性毒性などの副作用を評価した。本発明化合物についてのマラリア感染マウスを治療（５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、4日治療、腹腔投与）した後の治癒率（％）を表４に示す。【００５８】
【表４】
2006087935.tif 000014
【００５９】
試験した全ての化合物について、腹腔５ｍｇ／ｋｇ投与では副作用に由来すると思われる体重の減少やマウスの状態変化は観察されなかった。また、薬剤未処置群と比較して、全ての発明化合物に有意な延命効果が認められた。また、非特許文献１に記載された公知の化合物と比較して、顕著に高い治癒率を示した。【００６０】
更に、化合物Ａ−１（６０％純度）、Ａ−４及びＡ−１１について、種々の投与量（腹腔投与）における治癒率を評価した。実験には前述の４−ｄａｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｔｅｓｔを用いて評価した。また、マウスの体重変化と毛づやなどのマウスの様子を観察し、薬剤投与による急性毒性などの副作用を評価した。本発明化合物Ａ−１（６０％純度）、Ａ−４及びＡ−１１についてのマラリア感染マウスを治療（２．５−２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ又は５．０−３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、4日治療、腹腔投与）した後の治癒率（％）を表５に示す。【００６１】
【表５】
2006087935.tif 000015
【００６２】
化合物Ａ−１の２０ｍｇ／ｋｇ投与及びＡ−１１の３０ｍｇ／ｋｇ投与を除く全ての投与量において副作用に由来すると思われる体重の減少やマウスの状態変化は観察されなかった。また、化合物Ａ−１の２０ｍｇ／ｋｇ投与及びＡ−１１の３０ｍｇ／ｋｇ投与においても薬剤投与終了後は、体重増加が認められた。またすべての治療において、マウスの有意な延命効果が観察された。
【実施例６】
【００６３】
［マラリア感染マウスの経口投与での治療試験（ｉｎ  ｖｉｖｏ）］
実施例５に記載の方法に準じて、本発明化合物Ａ−１（６０％純度）を用いてマラリア感染マウスを治療（２５−１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、経口投与）した後の、感染後５日目での治癒率（％）を表６に示す。マラリア感染の2時間後から、薬剤を24時間おきに4回、8時間おきに12回、又は単回投与した。又、本発明化合物Ａ−１（１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、経口投与）を24時間おきに4回又は単回投与した後の、感染後５日目での治癒率（％）を表７に示す。【００６４】
【表６】
2006087935.tif 000016
【００６５】
全ての投与プログラムにおいて副作用に由来すると思われる体重の減少やマウスの状態変化は観察されなかった。また全ての治療において、マウスの有意な延命効果が観察された。特に１００ｍｇ／ｋｇを24時間ごとに4回投与するプログラムでは、１群４匹中３匹は30日後においても生存していた（１匹は21日目に死亡）。生存した3匹について36日後に採血を行い、赤血球中のマラリア原虫の有無を確認したが、マラリア原虫は全く存在しなかった。【００６６】
【表７】
2006087935.tif 000017
【００６７】
全ての投与プログラムにおいて副作用に由来すると思われる体重の減少やマウスの状態変化は観察されなかった。また全ての治療において、マウスの有意な延命効果が観察された。
【実施例７】
【００６８】
［アフリカ・トリパノソ−マ原虫の培養］
本実験では、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ  ｒｈｏｄｅｎｓｉｅｎｓｅ（ＳＴＩＢ９００株）の原虫の血流棲息型トリポマスチゴ−ト体を用いた。実験に用いた培地は、ろ過滅菌したＭＥＭ培地に、２５ｍＭのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−２−エタンスロホン酸（ＨＥＰＥＳ）、１ｇ／Ｌのグルコ−ス、１％のＭＥＭ非必須アミノ酸、０．２ｍＭの２−メルカプトエタノ−ル、２ｍＭのピルビン酸ナトリウム塩、０．１ｍＭのヒポキサンチン及び１５％熱処理ウマ血清を加えたものを用いた。原虫の培養はＣＯ２濃度を５％とした空気中で、温度は３７度で行った。【００６９】
［アフリカ・トリパノソ−マ原虫増殖阻害スクリ−ニング試験（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）］
試験に用いる本発明化合物、または陽性対象薬（メラルソプロ−ル）はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、以下同じ）に溶解し、所定濃度の試験液とした。
９６穴培養プレ−トのウェルに、原虫の個数が８ｘ１０３個を含む培地と、所定濃度の薬剤を含む試験液又は薬剤を含まないＤＭＳОを加え、それぞれ１００μＬになるよう培地を加え調整した。試験液はｄｕｐｌｉｃａｔｅにとった。
培養プレ−トをインキュベ−タ−中で７２時間培養した後、増殖阻害活性を検定した。検定は以下のように行った。それぞれのウェルに１０μＬのＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ水溶液を加え、さらに２時間培養した。次に、培養プレ−トを蛍光マイクロプレ−トリ−ダ−（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｇｅｍｅｎｉ  ＸＳ；米国モレキュラ−・デバイス社製）に装着し、５３６ｎｍの励起波長で照射し、５８８ｎｍの蛍光強度を測定し、試験液添加群及びコントロ−ルのトリパノソ−マ原虫感染率を算出した。上記で求めた原虫感染率から次式によって増殖阻害率を算出し、５０％増殖阻害濃度（ＥＣ５０）を求めた。【００７０】
増殖阻害率（％）＝｛１−（ｂ−ａ）／（ｃ−ａ）｝×１００
ａ：初期感染率
ｂ：試験液添加時の感染率
ｃ：コントロ−ルの感染率【００７１】
［アフリカ・トリパノソ−マ（アフリカ睡眠病）の薬効判定］
アフリカ・トリパノソ−マ原虫に対する選択毒性の指標として用いられる選択毒性係数を下記式により算出し、薬効判定を行った。【００７２】
選択毒性係数＝（ラットＬ６細胞に対するサンプルのＥＣ５０値）
÷（アフリカ・トリパノソ−マ原虫に対するサンプルのＥＣ５０値）【００７３】
本発明化合物及び陽性対象薬についてのアフリカ・トリパノソ−マ原虫とラットＬ６細胞に対するサンプルの各ＥＣ５０値、並びに選択毒性係数を表８に示す。これらの結果から、本発明化合物はアフリカ・トリパノソ−マ原虫に対する治療薬として知られているメラルソプロ−ルと比較してラットＬ６細胞に対する毒性が低いことが示された。【００７４】
【表８】
2006087935.tif 000018
【実施例８】
【００７５】
［アメリカ・トリパノソ−マ原虫の培養］
本実験では、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ  （Ｔｕｌａｈｕｅｎ  Ｃ２Ｃ４株）の原虫のラットＬ６細胞に感染したアマスチゴ−ト体及びトリポマスチゴ−ト体を用いた。実験に用いた培地は、Ｌ６細胞を含むＲＰＭＩ１６４０培地に、Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）が１％、胎児牛血清が１０％となるように添加し、ＣＯ２濃度５％、３７℃で培養した。【００７６】
［アメリカ・トリパノソ−マ原虫増殖阻害スクリ−ニング試験（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）］
試験に用いる本発明化合物、または陽性対象薬（ベンズニダゾ−ル）はＤＭＳＯに溶解し、所定濃度の試験液とした。
９６穴培養プレ−トのウェルに、原虫の個数が５ｘ１０３個を含む培地を加え４８時間前培養を行った。培地を交換後、所定濃度の薬剤を含む試験液又は薬剤を含まないＤＭＳОを加えた。試験液はｄｕｐｌｉｃａｔｅにとった。
培養プレ−トをインキュベ−タ−中で９６時間培養した後、増殖阻害活性を検定した。検定は以下のように行った。それぞれのウェルに５０μＬのＣＰＲＧ／Ｎｏｎｉｄｅｔを加え、さらに２〜６時間放置した。次に、培養プレ−トを吸光マイクロプレ−トリ−ダ−に装着し、５４０ｎｍの吸光度を測定し、試験液添加群及びコントロ−ルのトリパノソ−マ原虫感染率を算出した
上記で求めた原虫感染率から次式によって増殖阻害率を算出し、５０％増殖阻害濃度（ＥＣ５０）を求めた。【００７７】
増殖阻害率（％）＝｛１−（ｂ−ａ）／（ｃ−ａ）｝×１００
ａ：初期感染率
ｂ：試験液添加時の感染率
ｃ：コントロ−ルの感染率【００７８】
［アメリカ・トリパノソ−マ（シャ−ガス病）の薬効判定］
アメリカ・トリパノソ−マ原虫に対する選択毒性の指標として用いられる選択毒性係数を下記式により算出し、薬効判定を行った。【００７９】
選択毒性係数＝（ラットＬ６細胞に対するサンプルのＥＣ５０値）
÷（アメリカ・トリパノソ−マ原虫に対するサンプルのＥＣ５０値）【００８０】
本発明化合物及び陽性対象薬についてのアメリカ・トリパノソ−マ原虫とラットＬ６細胞に対するサンプルの各ＥＣ５０値、並びに選択毒性係数を表９に示す。これらの結果から、本発明化合物はアメリカ・トリパノソ−マ原虫に対する治療薬として知られているベンズニダゾ−ルと比較して顕著に優れた増殖抑制効果を示し、選択毒性も高いことが示された。【００８１】
【表９】
2006087935.tif 000019
【実施例９】
【００８２】
［リ−シュマニア原虫の培養］
本実験では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ  （ＭＨＯＭ／ＥＴ／６７／Ｌ８２株）を用いた。原虫はＳｙｒｉａｎ  Ｇｏｌｄｅｎハムスタ−で継代し、そこからアマスチゴ−ト体を得た。実験には１０％の加熱処理したウシ胎児血清を加えたＳＭ培地を用い、ｐＨ５．４に調整しＣＯ２濃度５％の空気下、３７℃で培養した。【００８３】
［リ−シュマニア原虫増殖阻害スクリ−ニング試験（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）］
試験に用いる本発明化合物、または陽性対象薬（ミルテフォシン）はＤＭＳＯに溶解し、所定濃度の試験液とした。
９６穴培養プレ−トのウェルに所定の個数の原虫を含む培地を加え前処理をほどこした後、ＣＡＳＹセル分析システム（ドイツ・Ｓｃｈａｒｆｅ社製）でアマスチゴ−トの濃度を計測した。その後、所定濃度の薬剤を含む試験液又は薬剤を含まないＤＭＳОを加えた。試験液はｄｕｐｌｉｃａｔｅにとった。
培養プレ−トをインキュベ−タ−中で７２時間培養した後、増殖阻害活性を検定した。検定は以下のように行った。それぞれのウェルに１０μＬのＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ水溶液を加え、さらに２時間培養した。次に、培養プレ−トを蛍光マイクロプレ−トリ−ダ−（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｇｅｍｅｎｉ  ＸＳ；米国モレキュラ−・デバイス社製）に装着し、５３６ｎｍの励起波長で照射し、５８８ｎｍの蛍光強度を測定し、試験液添加群及びコントロ−ルのリ−シュマニア原虫感染率を算出した
上記で求めた原虫感染率から次式によって増殖阻害率を算出し、５０％増殖阻害濃度（ＥＣ５０）を求めた。【００８４】
増殖阻害率（％）＝｛１−（ｂ−ａ）／（ｃ−ａ）｝×１００
ａ：初期感染率
ｂ：試験液添加時の感染率
ｃ：コントロ−ルの感染率【００８５】
［リ−シュマニアの薬効判定］
リ−シュマニア原虫に対する選択毒性の指標として用いられる選択毒性係数を下記式により算出し、薬効判定を行った。【００８６】
選択毒性係数＝（ラットＬ６細胞に対するサンプルのＥＣ５０値）
÷（リ−シュマニア原虫に対するサンプルのＥＣ５０値）【００８７】
本発明化合物及び陽性対象薬についてのリ−シュマニア原虫とラットＬ６細胞に対するサンプルの各ＥＣ５０値、並びに選択毒性係数を表１０に示す。本発明化合物はリ−シュマニア原虫に対する治療薬として知られているミルテフォシンに匹敵するか、又はそれ以上の優れた増殖抑制効果を示し、選択毒性も高いことが示された。【００８８】
【表１０】
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【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明の化合物を活性成分として含有させることにより、優れた原虫感染症の治療剤及び／又は予防剤を提供することが出来る。
【国際調査報告】
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