(57)【要約】【課題】  ＤＮＡチップを用いて、対象とする疾患に関連する遺伝子群を抽出する方法を提供すること、及びその方法により抽出された遺伝子群を備えたＤＮＡチップを提供すること。【解決手段】  （Ａ）非ヒトコントロール動物から調製したコントロールｍＲＮＡと、このコントロール動物に対象とする疾患を発生させた疾患動物から調製した疾患ｍＲＮＡとに基づいて、ＤＮＡチップを利用して発現量の差違が認められる第１の遺伝子群を抽出し、（Ｂ）この疾患を治療または予防できる処置を施した制御動物から調製した制御ｍＲＮＡと、コントロールｍＲＮＡとに基づいて、ＤＮＡチップを利用して発現量の差違が認められる第２の遺伝子群を抽出し、更に（Ｃ）第１の遺伝子群と第２の遺伝子群とにおいて、互いに逆の傾向を示す遺伝子群を抽出することにより、対象とする疾患に関連する遺伝子群を抽出することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）非ヒトコントロール動物から調製したコントロールｍＲＮＡと、前記コントロール動物に対象とする疾患を発生させた疾患動物から調製した疾患ｍＲＮＡとに基づいて、ＤＮＡチップを利用して発現量の比較を行い、疾患ｍＲＮＡにおける発現量がコントロールｍＲＮＡにおける発現量よりも多い第１発現量増加遺伝子群と疾患ｍＲＮＡにおける発現量がコントロールｍＲＮＡにおける発現量よりも少ない第１発現量減少遺伝子群とを含む第１の遺伝子群を抽出する工程、（Ｂ）前記疾患を治療または予防できる処置を施した制御動物から調製した制御ｍＲＮＡと、前記コントロールｍＲＮＡとに基づいて、ＤＮＡチップを利用して発現量の比較を行い、制御ｍＲＮＡにおける発現量がコントロールｍＲＮＡにおける発現量よりも多い第２発現量増加遺伝子群と制御ｍＲＮＡにおける発現量がコントロールｍＲＮＡにおける発現量よりも少ない第２発現量減少遺伝子群とを含む第２の遺伝子群を抽出する工程、（Ｃ）前記第１の遺伝子群と第２の遺伝子群とにおいて、互いに逆の傾向を示す遺伝子群である第１発現量減少遺伝子群と第２発現量増加遺伝子群との間で共通する第３の遺伝子群、及び第１発現量増加遺伝子群と第２発現量減少遺伝子群との間で共通する第４の遺伝子群を抽出する工程を備えたことを特徴とする遺伝子群の抽出方法。
【請求項２】
（Ａ）非ヒトコントロール動物から調製したコントロールｍＲＮＡと、前記コントロール動物に所定の疾患を発生させた疾患動物から調製した疾患ｍＲＮＡとに基づいて、ＤＮＡチップを利用して発現量の比較を行い、疾患ｍＲＮＡにおける発現量がコントロールｍＲＮＡにおける発現量よりも多い第１発現量増加遺伝子群と疾患ｍＲＮＡにおける発現量がコントロールｍＲＮＡにおける発現量よりも少ない第１発現量減少遺伝子群とを含む第１の遺伝子群を抽出する工程、（Ｂ）前記疾患を治療または予防できる処置を施した制御動物から調製した制御ｍＲＮＡと、前記コントロールｍＲＮＡとに基づいて、ＤＮＡチップを利用して発現量の比較を行い、制御ｍＲＮＡにおける発現量がコントロールｍＲＮＡにおける発現量よりも多い第２発現量増加遺伝子群と制御ｍＲＮＡにおける発現量がコントロールｍＲＮＡにおける発現量よりも少ない第２発現量減少遺伝子群とを含む第２の遺伝子群を抽出する工程、（Ｄ）前記第１発現量減少遺伝子群と前記第２発現量増加遺伝子群とを抽出する工程を備えたことを特徴とする遺伝子群の抽出方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２において、前記疾患がパーキンソン病であり、前記コントロールｍＲＮＡ、疾患ｍＲＮＡ、及び制御ｍＲＮＡが脳黒質から調製されたものであることを特徴とする遺伝子群の抽出方法。
【請求項４】
（１）対象とする疾患によって特異的な病変が生じる組織から調製されたｍＲＮＡを使用して前記（Ａ）及び（Ｂ）の工程を経て、（Ｃ）または（Ｄ）の遺伝子群抽出工程を行い、
（２）血液から調製されたｍＲＮＡを使用して前記（Ａ）及び（Ｂ）の工程を経て、（Ｃ）または（Ｄ）の遺伝子群抽出工程を行い、
前記（１）及び（２）の工程によって抽出された遺伝子群のうち重複する血液検出可能遺伝子群を抽出する工程を備えたことを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれかに記載の遺伝子群の抽出方法。
【請求項５】
請求項１〜請求項４のいずれかの方法によって抽出された遺伝子群を主として含むことを特徴とするＤＮＡチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡチップを用いて、対象とする疾患に関連する遺伝子群を抽出する方法およびこの方法によって抽出された遺伝子群を含むＤＮＡチップに関し、特にパーキンソン病の発症に関連する遺伝子群を抽出する方法およびこの方法によって抽出された遺伝子群を含むＤＮＡチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡチップとは、ガラスなどの基板上に、多種類のＤＮＡ断片・合成オリゴヌクレオチドを互いに区画しつつ貼り付けたものであり、これを用いることにより、多種類の遺伝子発現の有無、特定の遺伝子の存在の有無、変異の有無等を一括して調べることが可能である。ＤＮＡチップを用いることにより、ヒト「健常者」から調製したｍＤＮＡと、対象とする疾患を有する者から調製したｍＲＮＡとの発現状態を比較することにより、その疾患に関与すると思われる遺伝子群を検出する技術が知られている。しかしながら、いわゆる「健常者」が、実際に健常者であるのか否かについては疑問の余地がある。すなわち、「健常者」の中には、実際に健常者である者の他に、その疾患になりうる形質を有しているものの、未だに健常である者が含まれている。このため、遺伝的に単一とは言い難いヒトの遺伝子発現状態を把握することは、個々人の個体差を広く認めつつ研究を進めなければならないため、データの解析に際して非常な困難を生じ、確定的な結果を得ることが難しい。このようにＤＮＡチップを用いた研究開発は、飛躍的なスピードで進んでいるものの、未だに疾患関連遺伝子を特定する方法論については、確定的なものは開発されていない。【０００３】
パーキンソン病とは、脳黒質内でのドパミン産生細胞の異常な低下とニューロンの変性を特徴とする脳疾患である。脳の黒質でつくられたドパミンは、線条体に送られ、アセチルコリンと協働して筋肉に運動の指令を送る。パーキンソン病になると、ドパミンをつくる黒質の神経細胞が何らかの原因で障害され、線条体にドパミンを充分に送ることができなくなり、線条体が正常に機能しなくなって、無動、筋硬直、振戦等の運動機能障害が生じる。パーキンソン病の原因は十分に解明されてはいないものの、脱ユビキチン化活性を有するプロテアーゼ、タウ（ｔａｕ）、シヌクレイン（α―ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）等が関与しているとする報告が見られる（特開２００３−１８９８８３号公報）。
また、農薬のロテノン（Ｒｏｔｅｎｏｎｅ）は、実験動物にパーキンソン病を発症させることが知られている。本発明者は、この実験動物を用いて、エゾウコギ（学名：Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｘｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ ｈａｒｍｓ）の抽出物が、実験的パーキンソン病の予防及び治療に効果を有することを見出した（特開２００２−２８４６９５号公報）。【０００４】
【特許文献１】特開２００３−１８９８８３号公報
【特許文献２】特開２００２−２８４６９５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
パーキンソン病に関与する遺伝子の一部は知られているものの、全ての遺伝子群を把握する技術は開発されていなかった。本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＤＮＡチップを用いて、疾患に関連する遺伝子群を抽出する方法を提供すること（特に、その疾患がパーキンソン病である場合に適用することができる方法を提供すること）、及びその方法により抽出された遺伝子群を備えたＤＮＡチップを提供することである。
【課題を解決するための手段、発明の作用、及び発明の効果】
【０００６】
本発明者は、鋭意努力して検討した結果、ＤＮＡチップを用いることにより、パーキンソン病に関与する遺伝子群を抽出する方法を開発することに成功し、更にこの方法が他の疾患（例えば、アルツハイマー病、糖尿病・動脈硬化などの生活習慣病）に関与する遺伝子群を抽出するためにも応用できることに思い至り、基本的には本発明を完成するに至った。すなわち、実験動物として系統が確立されている動物は、遺伝的にはヒトよりも揃った形質を備えている。さらに、同じ飼育環境下で、これらの実験動物を飼育することが容易でもある。このため、実験動物を用いて、対象とする疾患に関与する遺伝子群を効率的に抽出することができれば、その結果はヒトを用いたデータよりもはるかに信頼性が高く、時間の短縮にもつながり、ヒトへの応用も容易であると考えられる。
【０００７】
こうして、第１の発明に係る遺伝子群の抽出方法は、（Ａ）非ヒトコントロール動物から調製したコントロールｍＲＮＡと、前記コントロール動物に対象とする疾患を発生させた疾患動物から調製した疾患ｍＲＮＡとに基づいて、ＤＮＡチップを利用して発現量の比較を行い、疾患ｍＲＮＡにおける発現量がコントロールｍＲＮＡにおける発現量よりも多い第１発現量増加遺伝子群と疾患ｍＲＮＡにおける発現量がコントロールｍＲＮＡにおける発現量よりも少ない第１発現量減少遺伝子群とを含む第１の遺伝子群を抽出する工程、（Ｂ）前記疾患を治療または予防できる処置を施した制御動物から調製した制御ｍＲＮＡと、前記コントロールｍＲＮＡとに基づいて、ＤＮＡチップを利用して発現量の比較を行い、制御ｍＲＮＡにおける発現量がコントロールｍＲＮＡにおける発現量よりも多い第２発現量増加遺伝子群と制御ｍＲＮＡにおける発現量がコントロールｍＲＮＡにおける発現量よりも少ない第２発現量減少遺伝子群とを含む第２の遺伝子群を抽出する工程、（Ｃ）前記第１の遺伝子群と第２の遺伝子群とにおいて、互いに逆の傾向を示す遺伝子群である第１発現量減少遺伝子群と第２発現量増加遺伝子群との間で共通する第３の遺伝子群、及び第１発現量増加遺伝子群と第２発現量減少遺伝子群との間で共通する第４の遺伝子群を抽出する工程を備えたことを特徴とする。
【０００８】
「コントロール動物」とは、対象とする疾患を発生する遺伝的素養を持たない動物を意味している。すなわち、コントロール動物を通常に飼育した場合には、対象とする疾患をほとんど全く発生することなく、ライフサイクルを完了する。このような動物として、実験動物として系統が定まっているものを用いることが好ましい。コントロール動物としては、抽出された遺伝子群をヒトに適用することを考慮すると、遺伝的にヒトに近い動物、つまり哺乳動物（サル、ブタ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウスなど）を用いることが好ましく、更に比較的系統が固定されている哺乳動物（ラット、マウスなど）を用いることが好ましい。
「ｍＲＮＡ」とは、ゲノムＤＮＡが転写された産物のうち、タンパク質に翻訳されるＲＮＡを意味している。
【０００９】
「対象とする疾患を発生させた」とは、コントロール動物に外部から何らかの作用を与える（例えば、（１）低分子化合物、核酸、タンパク質等を投与する、（２）持続的な或いは単発的な刺激（例えば、狭い空間内に閉じこめた状態で飼育する、終日に渡って暗い状態で飼育する、電気刺激を与えるなど）を加える）ことにより、所定の疾患を発生させることを意味している。例えば、コントロール動物に、ロテノン（Rotenene,農薬の一種）を投与することにより、対象とする疾患であるパーキンソン病を発生させることができる。また、コントロール動物に、マンガン（重金属）、ベータアミロイド蛋白質、薬物（ハロぺリドール（ドパミン受容体２遮断薬）、ノメガーニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエーテル（一酸化窒素合成阻害剤）を投与すること、または脳虚血手術を行うことにより、アルツハイマー病を発生させることができる。また、コントロール動物に、高脂肪食を与えることにより、糖尿病・高血圧・動脈硬化などの生活習慣病を発生させることができる。
「基づいて」とは、ｍＲＮＡをそのまま叉はそれを増幅後アミノアリルＲＮＡとしてＤＮＡチップに供する場合を含むほかに、ｍＲＮＡに基づいてｃＤＮＡを調製して、そのｃＤＮＡをＤＮＡチップに供する場合を含む。
【００１０】
疾患ｍＲＮＡには、その疾患の発生の原因または結果として、コントロールｍＲＮＡの発現量とは異なるプロフィールを有する遺伝子群が存在しているはずである。このようにして抽出されたものを第１の遺伝子群とする。この第１の遺伝子群には、疾患によって発現量がコントロールよりも増加した遺伝子群（以下、「第１発現量増加遺伝子群」という）と、疾患によって発現量がコントロールよりも減少した遺伝子群（以下、「第１発現量減少遺伝子群」という）との両者が含まれている。
「ＤＮＡチップ」とは、固体（例えば、シリカ、表面誘導体化ガラス、ポリプロピレン、または活性化ポリアクリルアミドなど）の表面上に多種類のＤＮＡ断片や、複数種類（例えば、数十〜数万個程度）の既知オリゴヌクレオチドプローブを高密度で固定したマイクロアレイを意味しており、ＤＮＡマイクロアレイとも称することがある。ＤＮＡチップ上に標的塩基配列断片（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を置くと、その標的塩基配列断片は塩基配列の相補性に従って、ＤＮＡチップ上のプローブにハイブリダイズする。従って、標的塩基配列断片を予め光学的、電気的、または放射化学的に検出可能なタグで標識しておくことにより、ハイブリダイズした標的塩基配列断片の有無、または発現量を分析することができる。ＤＮＡチップを利用して遺伝子群を抽出する方法としては、例えば競合法を用いることができるが、これに限られるものではない。
【００１１】
「前記疾患を治療または予防できる処置を施し」とは、コントロール動物に外部から何らかの作用を与えることにより、対象とする疾患を治療または予防することを意味している。この作用としては、例えば薬物（低分子化合物、核酸、タンパク質など）を投与することが例示されるが、これには限られない。例えば、ロテノンを投与してパーキンソン病を発生させる試験系において、エゾウコギからの抽出物であるＡＳＨまたはＭＡＳＨ（後に詳述する）を投与することは、ロテノンによるパーキンソン病を治療または予防できる処置を施していることになる。また、アルツハイマー病を発生させる試験系において、エゾウコギ、イチョウ、ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）、Ｌ−アルギニン（一酸化窒素の前駆物質）、医薬品（フルオロキセチン（セロトニン取り込み抑制剤））等を投与することは、アルツハイマー病を治療または予防できる処置を施していることになる。また、生活習慣病を発生させる試験系において、エゾウコギ、マイタケ、アロエ、ニンニク、マメ（イソフラボン）、亜麻仁等を投与することは、生活習慣病を治療または予防できる処置を施していることになる。
「治療または予防」とは、完全に疾患の発生を押さえる他に、疾患を押さえる作用を行わない場合に比べて、より軽減する場合（つまり、コントロール動物に近い状態）を含む。
【００１２】
制御ｍＲＮＡには、対象とする疾患を治療または予防するために、コントロールｍＲＮＡの発現量とは異なるプロフィールを有する遺伝子群が存在しているはずである。このようにして抽出されたものを第２の遺伝子群とする。第２の遺伝子群には、コントロールよりも発現量が増加した遺伝子群（以下、「第２発現量増加遺伝子群」という）と、コントロールよりも発現量が減少した遺伝子群（以下、「第２発現量減少遺伝子群」という）との両者が含まれている。
第１の遺伝子群と第２の遺伝子群とにおいて、互いに逆の傾向を示すもの、すなわち、（ア）第１発現量減少遺伝子群と第２発現量増加遺伝子群の間で共通する遺伝子群（第３の遺伝子群）、或いは（イ）第１発現量増加遺伝子群と第２発現量減少遺伝子群の間で共通する遺伝子群（第４の遺伝子群）には、対象とする疾患に対して、直接または間接に関与する遺伝子が多く含まれているはずである。そこで、第３の遺伝子群または第４の遺伝子群を精査することにより、対象とする疾患の原因を突き止め、治療することが可能となり得る。また、未だに疾患を発症していない「健常者」についても、第３の遺伝子群または第４の遺伝子群の発現状態を確認することにより、その疾患となる可能性を評価するためのデータとして用いることができる。
【００１３】
なお、上記第３の遺伝子群と第４の遺伝子群とでは、第３の遺伝子群を用いることが好ましい。一般的に、家族性疾患と呼ばれる疾患原因を調査すると、多くの場合に特定の遺伝子の変異によって、その遺伝子の発現量が減少することで、その疾患が発生している。つまり、発現量の低下が疾患の原因となることが多いためである。しかしながら、特定の遺伝子の発現量が増加することによって、所定の疾患に罹患することもあり得る。そのような場合には、第４の遺伝子群を用いることが好ましい。
第１の発明において、（Ｃ）の工程は、（Ａ）または（Ｂ）の工程の後に行われることが必要であるが、（Ａ）または（Ｂ）の工程については、順序を問われない。このため、全体としては、（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）、または（Ｂ）（Ａ）（Ｃ）の順に工程を実施することができる。
このように本発明によれば、対象とする疾患の発生または制御に係る遺伝子群を抽出することができる。
【００１４】
また、第３の遺伝子群または第４の遺伝子群に含まれないもの（つまり、第１の遺伝子群と第２の遺伝子群とにおいて、互いに逆の傾向を示すものではないもの）であっても、第１発現量減少遺伝子群あるいは第２発現量増加遺伝子群として抽出された遺伝子の中には、対象とする疾患に関与する可能性が高いものが含まれていることが考え得る。このため、第２の発明に係る遺伝子群の抽出方法は、（Ａ）非ヒトコントロール動物から調製したコントロールｍＲＮＡと、前記コントロール動物に所定の疾患を発生させた疾患動物から調製した疾患ｍＲＮＡとに基づいて、ＤＮＡチップを利用して発現量の比較を行い、疾患ｍＲＮＡにおける発現量がコントロールｍＲＮＡにおける発現量よりも多い第１発現量増加遺伝子群と疾患ｍＲＮＡにおける発現量がコントロールｍＲＮＡにおける発現量よりも少ない第１発現量減少遺伝子群とを含む第１の遺伝子群を抽出する工程、（Ｂ）前記疾患を治療または予防できる処置を施した制御動物から調製した制御ｍＲＮＡと、前記コントロールｍＲＮＡとに基づいて、ＤＮＡチップを利用して発現量の比較を行い、制御ｍＲＮＡにおける発現量がコントロールｍＲＮＡにおける発現量よりも多い第２発現量増加遺伝子群と制御ｍＲＮＡにおける発現量がコントロールｍＲＮＡにおける発現量よりも少ない第２発現量減少遺伝子群とを含む第２の遺伝子群を抽出する工程、（Ｄ）前記第１発現量減少遺伝子群と前記第２発現量増加遺伝子群とを抽出する工程を備えたことを特徴とする。
【００１５】
上記第１の発明または第２の発明においては、ｍＲＮＡを抽出するために使用する組織としては、対象とする疾患において、顕著な病変を示す組織を用いることが好ましい。例えば、パーキンソン病・アルツハイマー病のように脳組織中に特異的な病変を認める場合には、脳あるいは脳の一部（パーキンソン病の場合には黒質、アルツハイマー病の場合には海馬）を用いてｍＲＮＡを抽出することが好ましい。
ここで、第１の発明及び第２の発明のように、非ヒト動物を用いた場合には、対象とする疾患に関与する遺伝子群を抽出する際に、特異的な病変が生じる組織を用いてｍＲＮＡを調製することは比較的容易に行いうる。しかしながら、その結果をヒトに外挿しようとした場合には、そのような組織（例えば、脳組織）を採取することが困難となることが考えられる。特に、ヒトが生存している場合には、更に困難な事態が想起される。非ヒト動物から得られた結果を容易にヒトに外挿できるようにするためには、ヒトにおいて簡単に採取できる血液を用いて、対象とする疾患に関与する遺伝子群を特定できることが好ましい。こうして、第３の発明は、第１の発明または第２の発明において、（１）対象とする疾患によって特異的な病変が生じる組織から調製されたｍＲＮＡを使用して前記（Ａ）及び（Ｂ）の工程を経て、（Ｃ）または（Ｄ）の遺伝子群抽出工程を行い、（２）血液、特に白血球から調製されたｍＲＮＡを使用して前記（Ａ）及び（Ｂ）の工程を経て、（Ｃ）または（Ｄ）の遺伝子群抽出工程を行い、前記（１）及び（２）の工程によって抽出された遺伝子群のうち重複する血液検出可能遺伝子群を抽出する工程を備えたことを特徴とする。
【００１６】
第３の発明によれば、対象とする疾患に関与する特定の遺伝子群のうち、血液中のｍＲＮＡの発現量に反映されるものを抽出することができる。このような遺伝子群を用いることにより、特異的な病変が生じる組織を摘出するまでもなく、ヒトの血液を採取すれば、対象とする疾患に対する情報（将来的な予測、疾患のプロフィールなど）を得ることができる。
現状では、ＤＮＡチップに固定される遺伝子数は、多い方が有効とされている。このため、数千〜数万種類の遺伝子を備えたチップを用いて評価を行うことが多いが、そのデータ解析を行うことは容易ではない。対象とする疾患について、関与する遺伝子群が特定された後には、主としてそのような遺伝子群を備えたＤＮＡチップを用いる方が、データ解析にも経済的にも有利である。このため、第４の発明に係る対象とする疾患に関するプロフィールを検出するためのＤＮＡチップは、第１の発明〜第３の発明に基づいて抽出された遺伝子群を主として含むことを特徴とする。第１の発明〜第３の発明によって抽出された遺伝子群（第３の遺伝子群、第４の遺伝子群、第１発現量減少遺伝子群、第２発現量増加遺伝子群、または血液検出可能遺伝子群）は、対象とする疾患に関与するものであるので、これらの遺伝子群をＤＮＡチップに応用することにより、その疾患に関するプロフィールを検出することが容易に行える。
【００１７】
「疾患に関するプロフィール」とは、将来的に対象とする疾患に罹患する可能性があるか否か、現在罹患している疾患の状態・タイプ・将来的な推移などを意味している。
「主として」とは、ＤＮＡチップに載せられた遺伝子群の大部分が、対象とする疾患に関与する遺伝子群（つまり、第１の発明〜第３の発明によって抽出された遺伝子群）であることを意味しており、少なくともＤＮＡチップ上の遺伝子群の８０％以上（好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上）が、そのような遺伝子群から抽出されたものであることを意味している。
本発明において、ＤＮＡチップ上に載せる遺伝子群としては、全てを用いてもよいが、それらの遺伝子群から選択される１または２以上の遺伝子を用いることもできる。また、ＤＮＡチップに固定するＤＮＡとしては、遺伝子全体を用いる必要はなく、その遺伝子の一部の塩基配列を用いて、被測定者の組織から調製されたｍＲＮＡに基づく塩基配列とハイブリダイズするものであればよい。
本発明のＤＮＡチップを用いる際に、ヒトを対象とする場合には、被測定者の血液から調製されたｍＲＮＡを用いることが好ましい。このため、特に第３の発明によって抽出された遺伝子群（血液検出可能遺伝子群）を用いることが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
次に、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、下記の実施形態によって限定されるものではなく、その要旨を変更することなく、様々に改変して実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
＜ロテノンによるパーキンソン病の誘導＞
農薬であるロテノン（Ｒｏｔｅｎｏｎｅ）を投与することにより、ラットにパーキンソン病の病態を発生できることが知られている。適当な数（例えば、３匹以上）のラットに適当用量（例えば、２ｍｇ／ｋｇ以上）のロテノンを一日一回、数週間に渡って腹腔内投与することにより、パーキンソン病を発症させる。ロテノンを投与したときの遺伝子発現パターンと、コントロール動物の遺伝子発現パターンとをＤＮＡチップを用いて比較する。【００１９】
＜パーキンソン病を予防する処置＞
ロテノンの投与に際して、予め（例えばロテノン投与前、２〜４週間前）ＡＳＨ／ＭＡＳＨと称するエゾウコギ抽出物（実施例中において詳述する）を経口投与しておく。すると、ロテノンを投与しても、パーキンソン病の発生を予防することができる。
そこで、パーキンソン病を治療または予防できる処置として、ＡＳＨまたはＭＡＳＨを投与する。ＡＳＨまたはＭＡＳＨを投与したときの遺伝子発現パターンと、コントロール動物の遺伝子発現パターンとをＤＮＡチップを用いて比較する。【００２０】
＜脳黒質から抽出したｍＲＮＡを用いた解析＞
（１）第１の遺伝子群の抽出
パーキンソン病では、レビュー小体と呼ばれる物質が脳黒質内に確認できる。つまり、パーキンソン病においては、黒質は特異的な病変が生じる組織である。そこで、ロテノンを投与してパーキンソン病を発症したラットの黒質を採取し、このサンプルから疾患ｍＲＮＡを調製する。一方、ロテノンを投与していないラット（コントロール動物）の黒質からコントロールｍＲＮＡを調製する。これら二種類のｍＲＮＡをＤＮＡチップ（多数、例えば２万種類以上の遺伝子の有無を検出可能なもの）にかけて、発現量の差違が認められる第１の遺伝子群を抽出する。【００２１】
ここで、ＤＮＡチップには、例えば競合法を用いることにより、両ｍＲＮＡの発現量の差違を検出することができる。蛍光法を用いる場合には、二種類の蛍光試薬（赤色または緑色）のうち、いずれか一方のｍＲＮＡ（例えば、コントロールｍＲＮＡ）には一方側（例えば、緑色）の試薬を結合させ、他方のｍＲＮＡ（例えば、疾患ｍＲＮＡ）には他方側（例えば、赤色）の試薬を結合させる。両ｍＲＮＡの所定量をＤＮＡチップに供することにより、ｍＲＮＡの発現量の差違によって、蛍光色の異なるＤＮＡを同定することができる。上記例では、両ｍＲＮＡの発現量が同等である場合には黄色の蛍光が、コントロールｍＲＮＡの発現量が多い場合には緑色の蛍光が、疾患ｍＲＮＡの発現量が多い場合には赤色の蛍光が認められる。なお、両ｍＲＮＡにおいて発現が認められない場合には、蛍光がないので黒色となる。
図１には、この結果を模式的に示した。図中の丸印は、それぞれ異なるＤＮＡを固定してある位置を示し、丸印内に大文字（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｅ，Ｈ，Ｋ）を付したものは、疾患ｍＲＮＡの発現量がコントロールｍＲＮＡの発現量に比較して減少した遺伝子（第１発現量減少遺伝子群）を示している。また、丸印内に小文字（ｊ，ｍ，ｎ，ｑ，ｕ）を付したものは、疾患ｍＲＮＡの発現量がコントロールｍＲＮＡの発現量に比較して増加した遺伝子（第１発現量増加遺伝子群）を示している。【００２２】
（２）第２の遺伝子群の抽出
エゾウコギ抽出物を投与したときのラットの黒質を採取し、このサンプルから制御ｍＲＮＡを調製する。前述のコントロールｍＲＮＡと制御ｍＲＮＡとをＤＮＡチップにかけて、発現量の差違が認められる第２の遺伝子群を抽出する。上記（１）と同様にして、ＤＮＡチップに、例えば競合法を用いると、両ｍＲＮＡの発現量の差違を検出することができる。
図２には、この結果を模式的に示した。図中の丸印は、それぞれ異なるＤＮＡを固定してある位置を示し、丸印内に大文字（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｅ，Ｉ，Ｋ）を付したものは、制御ｍＲＮＡの発現量がコントロールｍＲＮＡの発現量に比較して増加した遺伝子群（第２発現量増加遺伝子群）を示している。また、丸印内に小文字（ｄ，ｇ，ｎ，ｐ，ｒ，ｓ，ｕ）を付したものは、制御ｍＲＮＡの発現量がコントロールｍＲＮＡの発現量に比較して減少した遺伝子（第２発現量減少遺伝子群）を示している。【００２３】
（３）第３の遺伝子群または第４の遺伝子群の抽出
上記（１）と（２）との結果より、両者において互いに逆の傾向を示す遺伝子群のうち、第１発現量減少遺伝子群と第２発現量増加遺伝子群との交わりである第３の遺伝子群は、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｅ，Ｋである。また、第１発現量増加遺伝子群と第２発現量減少遺伝子群との交わりである第４の遺伝子群は、ｎ，ｕである。
（４）その他の遺伝子群の抽出
また、第３の遺伝子群には含まれないが、第１発現量減少遺伝子群に含まれるものとしてＨが、第２発現量増加遺伝子群に含まれるものとしてＩがある。【００２４】
＜ＤＮＡチップの作製（１）脳黒質データ由来＞
図３には、パーキンソン病に関するプロフィールを検出するためのＤＮＡチップの模式図を示した。このＤＮＡチップには、上記第３の遺伝子群（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｅ，Ｋ）、第１発現量減少遺伝子群（Ｈ）、及び第２発現量増加遺伝子群（Ｉ）を含む遺伝子の発現を検出できるようにＤＮＡが固定されている。
なお、この場合には、もちろん第３の遺伝子群（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｅ，Ｋ）のみを固定したＤＮＡチップを作製することもできる。また、第４の遺伝子群（ｎ，ｕ）を用いることもできる。なお、ＤＮＡチップには、ポジティブコントロールとして、適当な遺伝子（例えば、βアクチン、ＧＡＰＤＨ、ユビキチンＢ、リボソーマルプロテインＳ１８(Rps18)など）を用いることが好ましい。【００２５】
＜血液から抽出したｍＲＮＡを用いた解析＞
（１）第１の遺伝子群の抽出
ロテノンを投与してパーキンソン病を発症したラットの血液を採取し、このサンプルから疾患ｍＲＮＡを調製する。一方、ロテノンを投与していないラット（コントロール動物）の血液からコントロールｍＲＮＡを調製する。これら二種類のｍＲＮＡをＤＮＡチップにかけて、発現量の差違が認められる第１の遺伝子群を抽出する。
図４には、この結果を模式的に示した。図中の丸印は、それぞれ異なるＤＮＡを固定してある位置を示し、丸印内に大文字（Ａ，Ｂ，Ｈ）を付したものは、疾患ｍＲＮＡの発現量がコントロールｍＲＮＡの発現量に比較して減少した遺伝子（血液中第１発現量減少遺伝子群）を示している。また、丸印内に小文字（ｊ，ｋ，ｍ，ｎ，ｑ，ｕ）を付したものは、疾患ｍＲＮＡの発現量がコントロールｍＲＮＡの発現量に比較して増加した遺伝子（血液中第１発現量増加遺伝子群）を示している。【００２６】
（２）第２の遺伝子群の抽出
エゾウコギ抽出物等を投与したラットの血液を採取し、このサンプルから制御ｍＲＮＡを調製する。前述のコントロールｍＲＮＡと制御ｍＲＮＡとをＤＮＡチップにかけて、発現量の差違が認められる第２の遺伝子群を抽出する。ＤＮＡチップを利用して両ｍＲＮＡの発現量の差違を検出する。
図５には、この結果を模式的に示した。図中の丸印は、それぞれ異なるＤＮＡを固定してある位置を示し、丸印内に大文字（Ａ，Ｂ，Ｅ，Ｉ，Ｋ）を付したものは、制御ｍＲＮＡの発現量がコントロールｍＲＮＡの発現量に比較して増加した遺伝子群（血液中第２発現量増加遺伝子群）を示している。また、丸印内に小文字（ｓ）を付したものは、制御ｍＲＮＡの発現量がコントロールｍＲＮＡの発現量に比較して減少した遺伝子群（血液中第２発現量減少遺伝子群）を示している。【００２７】
（３）第３の遺伝子群または第４の遺伝子群の抽出
上記（１）と（２）との結果より、両者において互いに逆の傾向を示す遺伝子群のうち、血液中第１発現量減少遺伝子群と血液中第２発現量増加遺伝子群との交わりである第３の遺伝子群は、Ａ，Ｂである。また、第１発現量増加遺伝子群と第２発現量減少遺伝子群との交わりである第４の遺伝子群は、この例中には存在しない。
（４）その他の遺伝子群の抽出
また、第３の遺伝子群には含まれないが、血液中第１発現量減少遺伝子群に含まれるものとしてＨが、血液中第２発現量増加遺伝子群に含まれるものとしてＥ，Ｉ，Ｋがある。【００２８】
＜ＤＮＡチップの作製（２）血液データ由来＞
図６には、パーキンソン病に関するプロフィールを検出するためのＤＮＡチップの模式図を示した。このＤＮＡチップには、上記第３の遺伝子群（Ａ，Ｂ）、血液中第１発現量減少遺伝子群（Ｈ）、及び血液中第２発現量増加遺伝子群（Ｅ，Ｉ，Ｋ）を含む遺伝子の発現を検出できるようにＤＮＡが固定されている。
なお、遺伝子数を減少させるために、第３の遺伝子群（Ａ，Ｂ）のみを用いてＤＮＡチップを作製することもできる。
＜血液検出可能遺伝子群の抽出＞
上記工程より、黒質から調製されたｍＲＮＡに基づいて、第３の遺伝子群（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｅ，Ｋ）、第１発現量減少遺伝子群（Ｈ）、及び第２発現量増加遺伝子群（Ｉ）が抽出される。また、血液から調製されたｍＲＮＡに基づいて、第３の遺伝子群（Ａ，Ｂ）、血液中第１発現量減少遺伝子群（Ｈ）、及び血液中第２発現量増加遺伝子群（Ｅ，Ｉ，Ｋ）が抽出される。
次に、これらの工程によって抽出された遺伝子群のうち重複する血液検出可能遺伝子群を抽出する。第３の遺伝子群のうち重複する遺伝子群はＡ、Ｂであり、第１発現量減少遺伝子群のうち重複する遺伝子群はＨであり、第２発現量増加遺伝子群のうち重複する遺伝子群はＥ，Ｉ，Ｋである。こうして、血液検出可能遺伝子群が抽出される。なお、実際のＤＮＡチップを作製するに際しては、これらの遺伝子群（Ａ，Ｂ，Ｈ，Ｅ，Ｉ，Ｋ）を適当に取捨選択して用いることができる。
【実施例】
【００２９】
＜実施例１＞ＡＳＨ／ＭＡＳＨを経口投与したラットにロテノンによるパーキンソン病疾患誘導を行なった場合の効果確認試験
試験方法：農薬であるロテノン（Ｒｏｔｅｎｏｎｅ）を投与することにより、ラットにパーキンソン病の病態を発生させられることが知られている。本試験では、このロテノンをモデル動物作製用に用いた。また、ロテノンによるパーキンソン病を予防するための薬物として、ＡＳＨ（エゾウコギを１００％エタノール、５０％エタノール、蒸留水で順次抽出したエキスを混合した混合エキスであり、商品名リンパザイムとして市販されているもの）、またはＭＡＳＨ（エゾウコギを炭化するまで蒸焼した後に、抽出物を製造したもの。特開平５−１８６３６０号公報に開示の技術に基づいて製造されたものを用いた。）を用いた。【００３０】
ラットＡ１群：予備飼育し、ゾンデを用いて、ＡＳＨ（０.５％）を一日一回、６週間に渡って経口投与した。
ラットＡ２群：予備飼育し、ゾンデを用いて、ＡＳＨ（０.５％）を一日一回、６週間に渡って経口投与した。また、ＡＳＨの投与開始から２週間して、ロテノン（２.５ｍｇ／ｋｇ）を一日一回、４週間に渡って腹腔内注射した。
ラットＢ１群：予備飼育し、ゾンデを用いて、ＭＡＳＨ（０.５％）を一日一回、６週間に渡って経口投与した。
ラットＢ２群：予備飼育し、ゾンデを用いて、ＭＡＳＨ（０.５％）を一日一回、６週間に渡って経口投与した。また、ＭＡＳＨの投与開始から２週間して、ロテノン（２.５ｍｇ／ｋｇ）を一日一回、４週間に渡って腹腔内注射した。
ラットＣ１群（陰性コントロール）：予備飼育し、通常に８週間に渡って飼育した。
ラットＣ２群（陽性コントロール）：予備飼育し、２週間して、ロテノン（２.５ｍｇ／ｋｇ）を一日一回、４週間に渡って腹腔内注射した。【００３１】
上記６群（１群当り７例）の各被験群について、試験開始時点（０）、試験開始後１、４、５、６、７及び８週目にポール試験を行なって運動機能を調べた。
ポール試験は、（１）被験ラットを上端部にグリップの付いた１００ｃｍのポールに上向きに掴ませ、その時点を試験開始時点とし、（２）試験開始時点からラットが下向きに方向転換するまでの時間（Ｔｉｍｅｔｏ ｔｕｒｎ ｄｏｗｎｗａｒｄ）、及び（３）ラットが下向きに方向を転換してからポールを降りて地面に達するまでの時間(Ｔｉｍｅｔｏｒｅａｃｈ ｔｈｅ ｆｌｏｏｒ)を計測した。【００３２】
試験結果：図７は、ラットが試験開始時点から下向きに方向転換するまでの時間を計測した結果を示したグラフである。グラフの縦軸はラットが方向転換に要した秒数（Ｔｉｍｅｔｏ ｔｕｒｎ ｄｏｗｎｗａｒｄ）を、横軸は飼育日数であって各被験群に投与を開始してから経過した日数（週：ｗｅｅｋ）をそれぞれ示している。
図７において、ラットＣ１群（Ｈ２Ｏ）では、試験開始０週目〜６週目までに渡って、方向転換までに要した秒数は、ほぼ同等または学習効果による減少傾向を示した。また、ラットＣ２群（Ｈ２Ｏ＋Ｒｏｔｅｎｏｎｅ（３.５ｍｇ／ｋｇ，ｉｐ））では、試験開始２週目（ロテノンの投与開始週）から秒数が増加し、６週目まで増加し続けた。６週目では、試験開始時（約８秒）の約４倍（約３２秒）まで増加し、パーキンソン病の病態を発症していることが確認された。【００３３】
その他の４群（Ａ１群、Ａ２群、Ｂ１群、Ｂ２群）については、ロテノンの投与を開始した２週目〜６週目のいずれの期間においても、試験開始０週目との間に大きな差違は認められなかった。このことより、ＡＳＨ及びＭＡＳＨのいずれにも、ロテノンが誘導するパーキンソン病を予防する効果があることが示された。
図８は、ラットが試験開始時点からポールを降りて地面に達するまでの時間を計測した結果を示したグラフである。グラフの縦軸はラットが地面に達するまでの秒数（Ｔｉｍｅｔｏ ｒｅａｃｈ ｔｈｅ ｆｌｏｏｒ）を、横軸は飼育日数であって各被験群に投与を開始してから経過した日数（週：ｗｅｅｋ）をそれぞれ示している。図８において、ラットＣ１群（Ｈ２Ｏ）では、試験開始０週目〜６週目までに渡って、やや増減は認められるものの、全体として、ほぼ同等の秒数を示した。また、ラットＣ２群（Ｈ２Ｏ＋Ｒｏｔｅｎｏｎｅ（３.５ｍｇ／ｋｇ，ｉｐ））では、試験開始２週目（ロテノンの投与開始週）から徐々に秒数が増加し、５週目〜６週目まで顕著に増加した。６週目では、試験開始時（約１２秒）の約３倍（約３５秒）まで増加し、パーキンソン病の病態を発症していることが確認された。【００３４】
その他の４群（Ａ１群、Ａ２群、Ｂ１群、Ｂ２群）については、ロテノンの投与を開始した２週目〜６週目のいずれの期間においても、試験開始０週目との間に大きな差違は認められなかった。このことより、ＡＳＨ及びＭＡＳＨのいずれにも、ロテノンが誘導するパーキンソン病を予防する効果があることが示された。
なお、投与開始時（グラフの横軸が０）におけるポールを降りて地面に達するまでの秒数の各被験群間の差は統計学上有意な差ではない。このことから、予備飼育の段階で、個々のラットの運動能力差にかかる各被験群間の運動能力差が生じないように予め調整した後試験がなされていることが示される。【００３５】
＜実施例２＞ＡＳＨ／ＭＡＳＨを経口投与したラットにロテノンによるパーキンソン病疾患誘導を行なった場合のカタレプシーに及ぼす効果確認試験
試験方法：薬物として、ＡＳＨ及びＭＡＳＨを用いた。
実施例１と同様にして飼育された６群のラット（Ａ１群，Ａ２群，Ｂ１群，Ｂ２群，Ｃ１群，Ｃ２群；各群について、Ｎ＝７）を用意した後、各群について、試験開始時点（０）、試験開始後１、２、３、４、５、６及び７週目にカタレプシー（Ｃａｔａｌｅｐｓｙ）試験を行なった。
カタレプシー試験は、不動化状態の試験であって、まず被験ラットの両後足が地面に着いた状態で両前足を箱の上に載せた時点を試験開始時点とし、ラットがその体姿勢をとり続ける不動状態時間（秒数）を計測した。【００３６】
試験結果：図９は、カタレプシー試験の測定結果を示したグラフである。グラフの縦軸はラットの不動状態時間（Ｃａｔａｌｅｐｓｙ）を、横軸は飼育日数であって各被験群に投与を開始してから経過した日数（週：ｗｅｅｋ）をそれぞれ示している。
図９において、ラットＣ１群（Ｈ２Ｏ）では、試験開始０週目〜７週目までに渡って、不動状態時間は、ほとんど０秒に近いままであり、増加または減少は見られなかった（すなわち、被験ラットは、試験開始後、速やかに前足を箱から離して、通常の四足歩行の姿勢に戻った）。また、ラットＣ２群（Ｈ２Ｏ＋Ｒｏｔｅｎｏｎｅ（３.５ｍｇ／ｋｇ，ｉｐ））では、試験開始６週目（ロテノンの投与開始から４週目）から秒数が顕著に増加した。６週目では、試験開始時の約０秒から約１２０秒まで増加し、うつ状態を示すことが確認された。【００３７】
その他の４群（Ａ１群、Ａ２群、Ｂ１群、Ｂ２群）については、ロテノンの投与を開始した２週目〜６週目のいずれの期間においても、試験開始０週目との間に差違は認められなかった。このことより、ＡＳＨ及びＭＡＳＨのいずれにも、ロテノンが誘導するうつ状態を予防する効果があることが示された。また、黒質線条体系とうつ行動との関係が示唆された。【００３８】
＜実施例３＞ＤＮＡチップを利用した遺伝子発現の確認試験−１
試験方法：ロテノン、またはエゾウコギ抽出物（ＡＳＨ、ＭＡＳＨ）を投与したラットを以下のように処理した。
ラットＡ群：予備飼育し、ゾンデを用いて、ＡＳＨ（０.５％）を一日一回、６週間に渡って経口投与した。
ラットＢ群：予備飼育し、ゾンデを用いて、ＭＡＳＨ（０.５％）を一日一回、６週間に渡って経口投与した。
ラットＣ１群（陰性コントロール）：予備飼育し、通常に８週間に渡って飼育した。
ラットＣ２群（陽性コントロール）：予備飼育し、２週間して、ロテノン（３.５ｍｇ／ｋｇ）を一日一回、４週間に渡って腹腔内注射した。
これら４群（Ａ群、Ｂ群、Ｃ１群、及びＣ２群。各群について、Ｎ＝７）について、試験開始から６週間経過後に、ラットの黒質及び血液を採取した。黒質及び血液サンプルを各群毎に４叉は３例づつ混合した後、ｍＲＮＡを抽出し、ＤＮＡチップによって発現遺伝子のプロフィールを検出した。ＤＮＡチップ試験には、競合法を用い、それぞれ（１）Ｃ１群（Ｈ２Ｏ）とＣ２群（ロテノン投与）、（２）Ｃ１群（Ｈ２Ｏ）とＡ群（ＡＳＨ投与）、及び（３）Ｃ１群（Ｈ２Ｏ）とＢ群（ＭＡＳＨ投与）の遺伝子発現プロフィールを比較検討した。【００３９】
なお、ｍＲＮＡの抽出方法及び、ＤＮＡチップの処理方法は、ラットＤＮＡ  ｃｈｉｐ（アジレント社製）に添付された説明書に基づいて行った。また、ＤＮＡチップのデータ読み取りにはマイクロアレイスキャナ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４２８  ｓｃａｎｎｅｒ：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を使用し、データ解析には、ＤＮＡｓｉｓ  ａｒｒａｙ（日立ソフト社製）を使用した。また、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）には、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒ  Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ社製）を用いた。【００４０】
試験結果：表１〜表５には、ＤＮＡチップによる遺伝子発現プロフィールの解析結果を示した。
【表１】
2005087924.tif 000002
【表２】
2005087924.tif 000003
【００４１】
【表３】
2005087924.tif 000004
【００４２】
【表４】
2005087924.tif 000005
【表５】
2005087924.tif 000006
【００４３】
表１には、（１）Ｃ１群（Ｈ２Ｏ）とＣ２群（ロテノン投与）、及び（２）Ｃ１群（Ｈ２Ｏ）とＡ群（ＡＳＨ投与）の結果をまとめたデータを示した。表１中の記号のうち、「Ｒ＜１」はロテノンを投与してパーキンソン病を発生させたときにコントロールと比較して発現量が減少したもの（第１発現量減少遺伝子群）を、「Ｒ＞１」はロテノンを投与してパーキンソン病を発生させたときにコントロールと比較して発現量が増加したもの（第１発現量増加遺伝子群）をそれぞれ意味している。「ＡＳＨ≧１.５」、「ＡＳＨ≧１.２」または「ＡＳＨ＞１」は、ＡＳＨを投与したときにコントロールと比較して発現量が増加したもの（第２発現量増加遺伝子群）のうち、増加量によって区画したもの（１.５倍以上、１.２倍以上、または１倍より大）を意味している。
なお、一般には、コントロール群（本実施例では、Ｈ２Ｏ）の発現量に対して、処置群（本実施例では、ＡＳＨまたはＭＡＳＨ）の発現量が２倍以上のものからリアルタイムＰＣＲ解析を行うことが多い。また、ＤＮＡチップに関する研究者の中には、発現量の差違が２倍以下の場合には、信頼に足りるデータではないとみなす者もいる。しかしながら、本発明者は、ＤＮＡチップ全体の情報を効率的に有用な形にする目的で、コントロール群よりも少しだけ高い発現量を示した遺伝子も見のがしたくないと考え、Ｒ＜１またはＡＳＨ＞１等を含めている。そして、ＵＣＣＲ（処置群において、１より大であるが、１.５以下）のリアルタイムＰＣＲの結果を見ると、今回のＤＮＡチップ解析でのＵＣＣＲの発現量上昇が正確であることを示す一例となっていることから、本発明者の上記目的が達成されていると考える。【００４４】
また、「ＡＳＨ＜１」、「ＡＳＨ≦０.８」または「ＡＳＨ≦０.６」は、ＡＳＨを投与したときにコントロールと比較して発現量が減少したもの（第２発現量減少遺伝子群）のうち、減少量によって区画したもの（１倍より小、０.８倍以下、または０.６倍以下）を意味している。また、表１において、左側３列は、ロテノン投与によって発現量が減少したもの（第１発現量減少遺伝子群）と、ＡＳＨ投与によって発現量が増加したもの（第２発現量増加遺伝子群）との交わりである第３の遺伝子群の数を意味しており、右側３列は、ロテノン投与によって発現量が増加したもの（第１発現量増加遺伝子群）と、ＡＳＨ投与によって発現量が減少したもの（第２発現量減少遺伝子群）との交わりである第４の遺伝子群の数を意味している。また、表１中の「一致」と示した行（３行分）は、黒質と血液とのデータが一致したもの（血液検出可能遺伝子群）を意味している。更に、「一致かつＰＤ関連」と示した行（最下行）は、現在公表されているパーキンソン病（ＰＤ）に関連する遺伝子について、今回の試験結果のうち「一致」中のものと同じものを示している。第３の遺伝子群または第４の遺伝子群の一部には、現在知られているＰＤ関連遺伝子が含まれていることから、本実施形態の方法が有効に疾患関連遺伝子群を抽出できることを示している。【００４５】
表２には、（１）Ｃ１群（Ｈ２Ｏ）とＣ２群（ロテノン投与）、及び（３）Ｃ１群（Ｈ２Ｏ）とＢ群（ＭＡＳＨ投与）の結果をまとめたデータを示した。表２中の記号は、上記表１中の記号の意味と同様である。
表１中の第３列、第４列、表２中の第２列〜第４列の「一致かつＰＤ関連」には、それぞれ６個、３個、２個、９個、及び１個の遺伝子が認められた。表３には、表１及び表２中の「一致かつＰＤ関連」として示した（＊１）〜（＊５）の遺伝子名を示した。これらの遺伝子については、アクセションナンバー（Accession Number）に基づいて、塩基配列等を確認することができる。【００４６】
表４には、（１）ロテノン投与によって発現量が減少したもの（Ｒ＜１，第１発現量減少遺伝子群）とＡＳＨ投与によって発現量が増加したもの（ＡＳＨ＞１，第２発現量増加遺伝子群）との交わりである第３の遺伝子群、及びロテノン投与によって発現量が増加したもの（Ｒ＞１，第１発現量増加遺伝子群）とＡＳＨ投与によって発現量が減少したもの（第２発現量減少遺伝子群）との交わりである第４の遺伝子群（表１における第３列と第４列との合計）と、（２）ロテノン投与によって発現量が減少したもの（Ｒ＜１，第１発現量減少遺伝子群）とＭＡＳＨ投与によって発現量が増加したもの（ＭＡＳＨ＞１，第２発現量増加遺伝子群）との交わりである第３の遺伝子群、及びロテノン投与によって発現量が増加したもの（Ｒ＞１，第１発現量増加遺伝子群）とＭＡＳＨ投与によって発現量が減少したもの（第２発現量減少遺伝子群）との交わりである第４の遺伝子群（表２における第３列と第４列との合計）とを示した。
表５には、表４の最下行に示した「一致かつＰＤ関連」に属する遺伝子名をアクセションコードと共に示した。
なお、表中において、「ｕｎｋｎｏｗｎ」と記載された遺伝子は、現段階において、名前も機能も同定されていない遺伝子であり、ＥＳＴ（expressed sequence tag）の中からＤＮＡチップ用に使用された遺伝子を示している。つまり、「ｕｎｋｎｏｗｎ」は、未知の物質であるものの、パーキンソン病の発症に関連している可能性が高いものであることが予想できるものである。但し、未だクローニングされていないので、名前が存在せず、機能も不明である。しかし、別の方向からこの結果を見ると、パーキンソン病関連新規機能物質をクローニングする優先順位叉はクローニング候補を示していると考えられる。そして、これらのｕｎｋｎｏｗｎは、今後のパーキンソン病の治療のターゲット遺伝子となる可能性を秘めている。
なお、ＥＳＴとは、ｃＤＮＡライブラリーからランダムに選んだクローンの５'末端（あるいは３'末端）から数百塩基の配列を決定したものをデータベースに登録したものであり、遺伝子解析の過程において、断片的なｃＤＮＡしか保持していない場合に、ＥＳＴをＰＣＲ用プライマーとして利用して全長を得ることができる。【００４７】
＜実施例４＞ＤＮＡチップとリアルタイムＰＣＲとを用いた黒質中ＵＣＣＲの発現量比較試験
試験方法：薬物として、ロテノン、ＡＳＨ、及びＭＡＳＨを用いた。実施例１と同様に６群（Ａ１，Ａ２，Ｂ１，Ｂ２，Ｃ１，Ｃ２）を用意し、試験開始から６週間後に、各群のラット黒質中のユビキノールチトクロームＣレダクターゼ複合体コア蛋白２（Ubiquinol-cytochrome C reductase complex core protein 2。以下、「ＵＣＣＲ」という）ｍＲＮＡ量をＤＮＡチップとリアルタイムＰＣＲとで比較した。ＵＣＣＲは、実施例３の結果を示した表１または表２中において、（＊１）または（＊４）の遺伝子群に含まれている。【００４８】
試験結果：図１０には、上記６群中のラット黒質内に発現されたＵＣＣＲ  ｍＲＮＡ量をＤＮＡチップ（マイクロアレイ）及びリアルタイムＰＣＲで測定したときの結果を棒グラフで示した。
図より明らかなように、黒質ＵＣＣＲ  ｍＲＮＡの発現量は、Ｃ１群（Ｈ２Ｏ）を１００％としたときに、Ｃ２群（Ｈ２Ｏ＋ロテノン）では減少し、Ａ１群（ＡＳＨ）及びＢ１群（ＭＡＳＨ）で増加していた。この結果は、実施例３で示した表１及び表２と一致している。また、ＵＣＣＲ  ｍＲＮＡ発現量は、Ａ２群（ＡＳＨ＋ロテノン）及びＢ２群（ＭＡＳＨ＋ロテノン）においては、それぞれＡ１群及びＢ１群よりも多く増加することが判った。
また、６群のいずれにおいても、ＵＣＣＲ  ｍＲＮＡ発現量は、ＤＮＡチップ及びリアルタイムＰＣＲの両者で良好な一致を示していることから、本発明者の試験系が精度良く行われていることが示された。【００４９】
＜実施例５＞ＤＮＡチップを利用した遺伝子発現の確認試験−２
試験方法：ロテノン、セサミン、またはエゾウコギ抽出物（ＡＳＨ、ＭＡＳＨ）を投与したルイス（Ｌｅｗｉｓ）ラットを以下のように処理した。
ラットＡ群：予備飼育し、ゾンデを用いて、ＡＳＨ（５％）を一日一回、６週間に渡って経口投与した。
ラットＢ群：予備飼育し、ゾンデを用いて、セサミン（３０ｍｇ／ｋｇ）を一日一回、６週間に渡って経口投与した。
ラットＣ群：予備飼育し、ゾンデを用いて、ＡＳＨ（０.５％）を一日一回、６週間に渡って経口投与した。
ラットＤ群：予備飼育し、ゾンデを用いて、ＭＡＳＨ（０.５％）を一日一回、６週間に渡って経口投与した。
ラットＥ１群（陰性コントロール）：予備飼育し、通常に８週間に渡って飼育した。
ラットＥ２群（陽性コントロール）：予備飼育し、２週間して、ロテノン（３.５ｍｇ／ｋｇ）を一日一回、４週間に渡って腹腔内注射した。
これら６群（Ａ群、Ｂ群、Ｃ群、Ｄ群、Ｅ１群及びＥ２群について、試験開始から６週間経過後に、ラットの黒質及び血液を採取した。黒質及び血液サンプルを各群毎に４叉は３例づつ混合した後、ｍＲＮＡを抽出し、ＤＮＡチップによって発現遺伝子のプロフィールを検出した。ＤＮＡチップ試験には、競合法を用い、それぞれ（１）Ｅ１群（Ｈ２Ｏ）とＥ２群（ロテノン投与）、（２）Ｅ１群（Ｈ２Ｏ）とＡ群（ＡＳＨ（５％）投与）（３）Ｅ１群とＢ群（セサミン投与：Ｓ３０）、（４）Ｅ１群とＣ群（ＡＳＨ（０.５％）投与）、及び（５）Ｅ１群とＤ群（ＭＡＳＨ投与）の遺伝子発現プロフィールを比較検討した。【００５０】
なお、ｍＲＮＡの抽出方法及び、ＤＮＡチップの処理方法は、ラットＤＮＡ  ｃｈｉｐ（アジレント社製）に添付された説明書に基づいて行った。また、ＤＮＡチップのデータ読み取りにはマイクロアレイスキャナ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４２８  ｓｃａｎｎｅｒ：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を使用し、データ解析には、ＤＮＡｓｉｓ  ａｒｒａｙ（日立ソフト社製）を使用した。また、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）には、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒ  Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ社製）を用いた。【００５１】
試験結果：表６〜表１１には、ＤＮＡチップによる遺伝子発現プロフィールの解析結果を示した。
【表６】
2005087924.tif 000007
【表７】
2005087924.tif 000008
【００５２】
【表８】
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【００５３】
【表９】
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【００５４】
【表１０】
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【００５５】
【表１１】
2005087924.tif 000012
【００５６】
表６には、全群の結果をまとめたデータを示した。表６中、「Ｌｅｗｉｓ０４」及び「Ｌｅｗｉｓ０３」は、それぞれ試験を行った時期と一群当りの個体数（Ｎ）が異なることを示している。すなわち、「Ｌｅｗｉｓ０４」と記載したＡ群、Ｂ群（及び、対応するＥ１群、Ｅ２群）については、２００４年に５匹／群を用いた試験の結果を、「Ｌｅｗｉｓ０３」と記載したＣ群、Ｄ群（及び、対応するＥ１群、Ｅ２群）については、２００３年に６匹／群を用いた試験の結果をそれぞれ示した。
本実施例の解析では、個々の遺伝子発現について、バックグラウンドデータを引くという標準化の操作を行った。表中の記号のうち、グループ（Ｉ）〜グループ（ＶＩ）の意味は次の通りである。
グループ（Ｉ）は、黒質において、各評価物質Ｘ（ＡＳＨ（５％又は０.５％）、Ｓ３０、またはＭＡＳＨ（０.５％））を投与したときにコントロールと比較して発現量が１.３以上に上昇し（第２発現量増加遺伝子群）、かつロテノンを投与してパーキンソン病を発生させたときにコントロールと比較して発現量が１／１.３（＝０.７６９）以下に減少したもの（第１発現量減少遺伝子群）において重複した第３の遺伝子群を意味する。
グループ（ＩＩ）は、黒質において、各評価物質Ｘを投与したときにコントロールと比較して発現量が１／１.３（＝０.７６９）以下に減少したもの（第２発現量減少遺伝子群）、かつロテノンを投与してパーキンソン病を発生させたときにコントロールと比較して発現量が１.３以上に増加したもの（第１発現量増加遺伝子群）において重複した第４の遺伝子群を意味する。【００５７】
グループ（ＩＩＩ）は、グループ（Ｉ）のなかで、血液において、ロテノンを投与してパーキンソン病を発生させたときにコントロールと比較して発現量が１／１.３（＝０.７６９）以下に減少した血液検出可能遺伝子群を意味する。
グループ（ＩＶ）は、グループ（ＩＩ）のなかで、血液において、ロテノンを投与してパーキンソン病を発生させたときにコントロールと比較して発現量が１.３以上に増加した血液検出可能遺伝子群を意味する。
グループ（Ｖ）は、グループ（Ｉ）のなかで、血液において、各評価物質Ｘを投与したときにコントロールと比較して発現量が１.３以上に増加した血液検出可能遺伝子群を意味する。
また、グループ（ＶＩ）は、グループ（ＩＩ）のなかで、各評価物質Ｘを投与したときにコントロールと比較して発現量が１／１.３（＝０.７６９）以下に減少した血液検出可能遺伝子群を意味する。【００５８】
本実施例では、（Ａ）バックグラウンドデータを考慮したデータの標準化操作に加え、（Ｂ）遺伝子のカットオフライン（コントロールと比較して、発現量が増加、または減少）を１.３以上、または１／１.３（＝０.７６９）以下とした。このため、抽出される遺伝子数は減少したものの、その信頼度は向上し、更にリアルタイムＰＣＲによる確認作業後の再現性が高められている。
表７には、上記グループ（ＩＩＩ）〜グループ（ＶＩ）において、評価物質Ｘとして、ＡＳＨ（５％、及び０.５％）、及びセサミン（Ｓ３０）を投与したときに、両物質投与群で共に抽出された遺伝子数（上段）、またはＡＳＨ及びＭＡＳＨを投与したときに、両物質投与群で共に抽出された遺伝子数（下段）を示した。【００５９】
また、表８〜表１１には、表６において、評価物質Ｘ（ＡＳＨ（５％）、Ｓ３０、ＡＳＨ（０.５％）、及びＭＡＳＨ（０.５％））を投与したときに、グループ（Ｉ）〜グループ（ＶＩ）として抽出された既知遺伝子のうち、パーキンソン病関連遺伝子（表中、（  ）内に示す数字）をまとめた。具体的には、表８にはＡＳＨ（５％）投与群での遺伝子を、表９にはＳ３０における遺伝子を、表１１にはＡＳＨ（０.５％）を、表１２にはＭＡＳＨ（０.５％）をそれぞれ示した。なお、これらの遺伝子については、アクセションナンバー（AccessionNumber）に基づいて、塩基配列等を確認することができる。
各遺伝子として、現在知られているＰＤ関連遺伝子が含まれていることから、本実施形態の方法が有効に疾患関連遺伝子群を抽出できることを示している。【００６０】
なお、表中において、「ｕｎｋｎｏｗｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ」と記載された遺伝子数は、現段階において、名前も機能も同定されていない遺伝子である。つまり、「ｕｎｋｎｏｗｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ」は、未知の物質であるものの、パーキンソン病の発症に関連している可能性が高いものであることが予想できるものである。但し、未だクローニングされていないので、名前が存在せず、機能も不明である。しかし、別の方向からこの結果を見ると、パーキンソン病関連新規機能物質をクローニングする優先順位叉はクローニング候補を示していると考えられる。そして、これらの「ｕｎｋｎｏｗｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ」は、今後のパーキンソン病の治療のターゲット遺伝子となる可能性を秘めている。【００６１】
実施例３では、黒質から抽出した遺伝子と血液から抽出した遺伝子との間で一致した遺伝子を評価した。本実施例においても、そのようにするのが良いと考えられた。しかし、その方法を用いると、本実施例のデータでは、数個の遺伝子しか抽出されなかった。そこで、黒質から抽出した遺伝子（実施例３と同じ方法。上記グループ（Ｉ）及びグループ（ＩＩ）に相当する。）の状況を血液から抽出した遺伝子で確認することが出来れば良いと考えた。具体的には、グループ（ＩＩＩ）では、グループ（Ｉ）で抽出された遺伝子のうち、血液で同じ動きをするＲ≦１／１.３の遺伝子数、グループ（ＩＶ）では、グループ（ＩＩ）で抽出された遺伝子のうち、血液で同じ動きをするＲ≧１.３の遺伝子数を示した。これは、ロテノンという農薬が動物（ヒトも含む）の体内に入り、脳の神経機能を障害する効果をグループ（ＩＩＩ）及びグループ（ＩＶ）の遺伝子を用いて末梢から容易に評価する（言い換えると、どれだけ農薬の影響を受けているのかを評価する）ことが可能であることを意味している。【００６２】
グループ（Ｖ）では、グループ（Ｉ）で抽出された遺伝子のうち、血液で同じ動きをするＸ≧１.３の遺伝子数、グループ（ＶＩ）では、グループ（ＩＩ）で抽出された遺伝子のうち、血液で同じ動きをするＸ≦１／１.３の遺伝子数を示した。これは、Ｘという生薬（エゾウコギ（ＡＳＨ）、セサミン（Ｓ）、及び修治加工エゾウコギ（ＭＡＳＨ））の抗パーキンソン病効果をグループ（Ｖ）及びグループ（ＶＩ）で抽出された遺伝子を用いて末梢から容易に評価することが可能であることを示している。
つまり、グループ（ＩＩＩ）〜グループ（ＶＩ）の遺伝子の変動を観察することにより、そのヒトのＰＤの発症度合いとその生薬（機能性食品や医薬品）の効果の度合いを末梢血から評価できることを意味している。
本方法によれば、実施例３では抽出されなかった遺伝子も評価対象となり得るため、より的確な環境中の農薬暴露での脳機能の状況を把握できる。また、この方法では、その状況を改善あるいは予防できる機能性食品が判明することが、まさにテーラーメイド機能性食品であることを意味している。【００６３】
＜まとめ＞
本実施例によれば、非ヒトコントロール動物であるラットを用いて、パーキンソン病を発生させる処置（ロテノン投与）、またはパーキンソン病の発生を押さえる処置（エゾウコギ抽出物の投与）を行ったときの遺伝子発現プロフィールをＤＮＡチップにより検出し、コントロール群と比べて増加または減少している遺伝子群を適宜選択することによって、パーキンソン病に関連する遺伝子群を抽出できた。
この方法は、その他の疾患（例えば、アルツハイマー病、生活習慣病等）に応用することが可能である。
また、この方法によって、抽出された疾患関連遺伝子群をＤＮＡチップに適用することで、対象とする疾患に対する個々人のデータを容易に採取することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】コントロール群とパーキンソン病群とにおいて、ＤＮＡチップを用いて、黒質内の遺伝子発現プロフィールを比較したときの結果を示す模式図である。
【図２】コントロール群とエゾウコギ抽出物投与群とにおいて、ＤＮＡチップを用いて、黒質内の遺伝子発現プロフィールを比較したときの結果を示す模式図である。
【図３】黒質における遺伝子発現プロフィールに関するデータから得られたパーキンソン病関連遺伝子群をまとめたＤＮＡチップの模式図である。
【図４】コントロール群とパーキンソン病群とにおいて、ＤＮＡチップを用いて、血液中での遺伝子発現プロフィールを比較したときの結果を示す模式図である。
【図５】コントロール群とエゾウコギ抽出物投与群とにおいて、ＤＮＡチップを用いて、血液中での遺伝子発現プロフィールを比較したときの結果を示す模式図である。
【図６】血液中における遺伝子発現プロフィールに関するデータから得られたパーキンソン病関連遺伝子群をまとめたＤＮＡチップの模式図である。
【図７】ロテノンによるパーキンソン病疾患誘導を行った場合の運動機能障害に対するエゾウコギ抽出物の効果を示すグラフである。
【図８】ロテノンによるパーキンソン病疾患誘導を行った場合の運動機能障害に対するエゾウコギ抽出物の効果を示すグラフである。
【図９】ロテノンによるパーキンソン病疾患誘導を行った場合のうつ行動に対するエゾウコギ抽出物の効果を示すグラフである。
【図１０】ＵＣＣＲ  ｍＲＮＡ量をＤＮＡチップ及びリアルタイムＰＣＲで測定したときの結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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