(57)【要約】本発明は、血流障害に起因する虚血時または虚血後の再灌流時に生じる心筋細胞のネクローシスを防御する方法、ならびに当該ネクローシスをインビトロおよび／またはインビボで評価する方法に関するものである。さらに本発明は、心室筋の細胞死を抑制するための薬学的組成物、心臓の外科手術および移植手術において心筋を保護するための薬学的組成物およびネクローシスに起因する疾患を予防するための薬学的組成物に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
体温維持のための保温器具、結紮保持具および持続的薬剤注入器具を備えていることを特徴とするＣＦＴＲ活性化剤をインビボでスクリーニングするためのシステム。
【請求項２】
上記保温器具が、恒温槽を利用した保温手術台であることを特徴とする請求の範囲１に記載のシステム。
【請求項３】
上記結紮保持具が留置針の外套部分であることを特徴とする請求の範囲１に記載のシステム。
【請求項４】
上記持続的薬剤注入器具が経頚静脈的注入器具であることを特徴とする請求の範囲１に記載のシステム。
【請求項５】
心臓の外環境維持、温度維持および乾燥防止のために加温生理食塩水を胸腔内で灌流させる器具がさらに備えられていることを特徴とする請求の範囲１に記載のシステム。
【請求項６】
請求の範囲１〜５に記載のシステムを使用してＣＦＴＲ活性化剤をインビボでスクリーニングするための方法であって、
再灌流開始時または再灌流開始直前もしくは直後にＣＦＴＲ活性化剤としての候補因子を被験体に投与する工程；ならびに
被験体に生じた梗塞巣サイズを測定する工程
を包含することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項７】
上記投与する工程が経頚静脈的に行われることを特徴とする請求の範囲６に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
上記被験体に生じた梗塞巣サイズと、上記投与する工程において上記候補因子の代わりにＰＫＡ活性化剤およびＰＫＣ活性化剤を同時に投与して生じた梗塞巣サイズとを比較する工程を包含する請求の範囲６に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
上記ＰＫＡ活性化剤がｍｉｌｒｉｎｏｎｅであることを特徴とする請求項８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
上記被験体に生じた梗塞巣サイズと、上記投与する工程において上記候補因子の代わりに単独でＣＦＴＲ活性化剤を投与して生じた梗塞サイズとを比較する工程を包含することを特徴とする請求の範囲６に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
上記被験体として野生型マウスを用いて測定された梗塞巣サイズと、上記被験体としてＣＦＴＲノックアウトマウスを用いて測定された梗塞巣サイズとを比較する工程を包含する請求の範囲６に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
ＣＦＴＲチャネル活性化剤を含むことを特徴とする心室筋の細胞死を抑制するための薬学的組成物。
【請求項１３】
上記細胞死が、ネクローシスであることを特徴とする請求の範囲１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
上記細胞死が、虚血または虚血後の再灌流によって生じる細胞死であることを特徴とする請求の範囲１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
上記ＣＦＴＲチャネル活性化剤がＰＫＡ活性化剤とＰＫＣ活性化剤との混合物であることを特徴とする請求の範囲１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
上記ＰＫＡ活性化剤が、ジブチリルサイクリックＡＭＰであることを特徴とする請求の範囲１５に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
上記ＰＫＣ活性化剤が、ホルボール１２−ミリスチン酸エステル１３酢酸塩であることを特徴とする請求の範囲１５に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
上記ＣＦＴＲチャネル活性化剤としてホスホジエステラーゼＩＩＩインヒビターおよびＰＫＣ活性化剤を含むことを特徴とする請求の範囲１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
上記ホスホジエステラーゼＩＩＩインヒビターが、１，６−ｄｉｈｙｄｒｏ−２−ｍｅｔｈｙｌ−６−ｏｘｏ［３，４’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ］−５−ｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅであることを特徴とする請求の範囲１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
上記細胞死が、心筋組織において虚血中に生じる異常によって誘発されることを特徴とする請求の範囲１２に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
上記細胞死が、ミトコンドリア脱水素酵素の活性低下を伴うことを特徴とする請求の範囲１２に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
心室筋初代培養細胞のネクローシス性細胞死を抑制するための請求の範囲１２に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
心室筋梗塞域を低減することを特徴とする請求の範囲１２に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
ＣＦＴＲチャネル活性化剤を含むことを特徴とする心臓外科手術および心臓移植手術において心筋を保護するための薬学的組成物。
【請求項２５】
ネクローシスを生じる心臓の外科手術および移植手術において用いられることを特徴とする請求の範囲２４に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
上記ＣＦＴＲチャネル活性化剤がＰＫＡ活性化剤とＰＫＣ活性化剤との混合物であることを特徴とする請求の範囲２４に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
上記ＰＫＡ活性化剤が、ジブチリルサイクリックＡＭＰであることを特徴とする請求の範囲２６に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
上記ＰＫＣ活性化剤が、ホルボール１２−ミリスチン酸エステル１３酢酸塩であることを特徴とする請求の範囲２６に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
上記ＣＦＴＲチャネル活性化剤としてホスホジエステラーゼＩＩＩインヒビターおよびＰＫＣ活性化剤を含むことを特徴とする請求の範囲２４に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
上記ホスホジエステラーゼＩＩＩインヒビターが、１，６−ｄｉｈｙｄｒｏ−２−ｍｅｔｈｙｌ−６−ｏｘｏ［３，４’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ］−５−ｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅであることを特徴とする請求の範囲２９に記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
ＣＦＴＲチャネル活性化剤を含むことを特徴とするネクローシスに起因する疾患を予防するための薬学的組成物。
【請求項３２】
上記ＣＦＴＲチャネル活性化剤がＰＫＡ活性化剤とＰＫＣ活性化剤との混合物であることを特徴とする請求の範囲３１に記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
上記ＰＫＡ活性化剤が、ジブチリルサイクリックＡＭＰであることを特徴とする請求の範囲３２に記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
上記ＰＫＣ活性化剤が、ホルボール１２−ミリスチン酸エステル１３酢酸塩であることを特徴とする請求の範囲３２に記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
上記ＣＦＴＲチャネル活性化剤としてホスホジエステラーゼＩＩＩインヒビターおよびＰＫＣ活性化剤を含むことを特徴とする請求の範囲３１に記載の薬学的組成物。
【請求項３６】
上記ホスホジエステラーゼＩＩＩインヒビターが、１，６−ｄｉｈｙｄｒｏ−２−ｍｅｔｈｙｌ−６−ｏｘｏ［３，４’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ］−５−ｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅであることを特徴とする請求の範囲３５に記載の薬学的組成物。
【請求項３７】
ＣＦＴＲチャネル活性化剤を投与する工程を包含する心室筋の細胞死を抑制する方法。
【請求項３８】
ＣＦＴＲチャネル活性化剤を投与する工程を包含する心臓外科手術および心臓移植手術において心筋を保護する方法。
【請求項３９】
ＣＦＴＲチャネル活性化剤を投与する工程を包含するネクローシスに起因する疾患を予防する方法。
【請求項４０】
体温維持のための保温器具を備えることを特徴とするインビボでの虚血および虚血後再灌流のためのシステム。
【請求項４１】
結紮保持具および持続的薬剤注入器具をさらに備えることを特徴とする請求の範囲４０に記載のインビボでの虚血および虚血後再灌流のためのシステム。
【請求項４２】
上記保温器具が恒温槽を利用した保温手術台であることを特徴とする請求の範囲４０に記載のインビボでの虚血および虚血後再灌流のためのシステム。
【請求項４３】
心臓の細胞外環境維持、温度維持および乾燥防止のために加温生理食塩水を胸腔内で灌流させる器具をさらに備えることを特徴とする請求の範囲４０に記載のインビボでの虚血および虚血後再灌流のためのシステム。
【請求項４４】
上記結紮保持具が、留置針の外套部分であることを特徴とする請求の範囲４０に記載のインビボでの虚血および虚血後再灌流のためのシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、血流障害に起因する虚血時または虚血後の再灌流時に生じる心筋細胞のネクローシスを防御する方法、ならびに当該ネクローシスをインビトロおよび／またはインビボで評価する方法に関するものである。さらに本発明は、心室筋の細胞死を抑制するための薬学的組成物、心臓の外科手術および移植手術において心筋を保護するための薬学的組成物およびネクローシスに起因する疾患を予防するための薬学的組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  虚血または虚血後の再灌流によって惹起される心筋細胞死には、ネクローシスおよびアポトーシスが混在する。ネクローシスは、不可逆的な傷害が残る４５分間以上の虚血によって生じる。虚血状態の時間が長いほどネクローシスの範囲が広がり、その結果、傷害部位が悪化する。ネクローシスを伴う傷害の悪化を防ぐためには、できるだけ早急に再灌流しなければならない。しかし、心筋機能の回復が可能とされる虚血後２０分間以内に再灌流した場合であっても、心筋細胞は再灌流によって急激に膨潤して心筋傷害が引き起こされるということが知られている（例えば、非特許文献１を参照のこと）。【０００３】  虚血後の再灌流によって生じる上記傷害は、心筋細胞におけるイオン環境が虚血によって異常をきたすことに起因すると考えられているが、その機序については十分には理解されていない。以下、虚血に起因して心筋組織において生じる異常（例えば、細胞腫脹、組織浮腫および組織破壊）によって誘発される傷害を「虚血傷害（例えば、細胞死、心筋梗塞および心収縮力低下）」と称する。【０００４】  虚血傷害を防ぐために、主に心臓外科の領域において心筋保護液の開発および心筋保護法の工夫に関する研究が進んでいる。とりわけ、術中の心停止下または心臓移植時における心筋保護の方法は、基本的には以下の３つにより確立されている：（１）急速心停止；（２）心筋表面および局所冷却；ならびに（３）Ｓｔ．Ｔｈｏｍａｓ液を代表とする心筋保護液の利用（例えば、非特許文献２を参照のこと）。【０００５】  Ｓｔ．ＴｈｏｍａｓのＮｏ．２液の心筋保護効果には、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）およびチロシンキナーゼ（ＴＫ）が関与すると考えられている。しかし、ＴＫが保護的に機能するであろうという考えに反して、非特許文献３において、ＴＫ阻害剤であるｇｅｎｉｓｔｅｉｎおよびＰＫＣ活性化剤ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ）の両方をＳｔ．ＴｈｏｍａｓのＮｏ．２液に加えることによって、梗塞巣の大きさが著しく減少する結果が示されたが、その理由については明らかにされていない。また、心筋保護液の効果を改善して虚血傷害をより軽減するために、ＡＴＰ感受性Ｋ＋チャネル（ＫＡＴＰ  ｃｈａｎｎｅｌ）オープナー（例えば、非特許文献４および５を参照のこと）、またはＮａ＋／Ｈ＋交換体（Ｎａ／Ｈ  ｅｘｃｈａｎｇｅｒ：ＮＨＥ）ブロッカー（例えば、非特許文献６を参照のこと）などが心筋保護液に付加されている。【０００６】  さらに、ＫＡＴＰ  ｃｈａｎｎｅｌオープナーおよびＮＨＥブロッカーを組み合わせた虚血心筋保護薬剤の開発もまた行われている。【０００７】  虚血プレコンディショニング（ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）と呼ばれる処置によって、短時間の心筋の虚血および虚血後の再灌流を繰り返すことによって心筋が虚血耐性を獲得することが知られている。ＫＡＴＰ  ｃｈａｎｎｅｌオープナーは、虚血傷害に対して防御的に機能する因子の１つであり、虚血プレコンディショニングに効果的である。しかし、ＫＡＴＰ  ｃｈａｎｎｅｌオープナーは、虚血時または虚血後の再灌流時に投与しても効果がなく、すなわち、生じてしまった虚血部��に対する傷害防御効果を有さない。近年、ＫＡＴＰ  ｃｈａｎｎｅｌオープナーの代表的な薬剤であるｎｉｃｏｒａｎｄｉｌについて、急性心筋梗塞後の心機能の改善（例えば、細胞死を生じていない部位またはその周囲の部位の回復）を目的とした心筋保護剤として適用するための大規模な試験が行われつつある（例えば、非特許文献７を参照のこと）。しかし、その作用部位および／または作用機序は未だに不明である。【０００８】  Ｎａ＋／Ｈ＋交換体（ＮＨＥ）は、虚血傷害に関与する因子の１つである。ＮＨＥが関与する虚血傷害は、虚血によって細胞内イオン環境が異常をきたすことに起因してＮＨＥが作動し、その結果として誘発される。ＮＨＥブロッカーは、虚血後の再灌流時および再灌流前に投与することによってその効果を得ることができる。しかし、ＮＨＥブロッカーであるｃａｒｉｐｏｒｉｄｅは、長時間（４５分間）に及ぶ虚血の後の再灌流によって生じる傷害には効果を示さない（例えば、非特許文献８を参照のこと）。【０００９】  また、ホスホジエステラーゼＩＩＩ（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅｓ  ＩＩＩ：ＰＤＥ  ＩＩＩ）阻害剤であるｍｉｌｒｉｎｏｎｅおよびその同族体のａｍｒｉｎｏｎｅもまた、虚血前に投与することによって虚血心筋（すなわち、虚血を生じた心筋）の梗塞巣の大きさを低減させ、心筋保護効果を有することが報告されている（例えば、非特許文献９、１０および１１を参照のこと）。しかし、これらの報告にはこの心筋保護効果の原因については全く言及されていない。しかも、虚血心発作に対してこれらの物質を虚血後に投与しても何ら効果を奏することはなく、発生を予測することができない虚血心発作に対して事前投与でしか効果を得られないこれらの物質はその適用が大きく限定されるという問題点を有する。【００１０】  このように虚血傷害を防御するための因子がいくつか知られているものの、虚血傷害の根本的な機序は未だ不明であり、その結果、決定的な虚血傷害防御法を得るには至っていない。【００１１】  本発明者らは、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）の活性化剤およびＰＫＣの活性化剤の両方を虚血中に投与していることにより再灌流後の細胞の回復が改善されることをインビトロにて示し、その一方で、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）クロライドチャネルブロッカーの投与が細胞の回復を著しく悪化させることにより、ＰＫＡとＰＫＣの活性化による効果はＣＦＴＲチャネルの活性化によるものであると推測した（例えば、非特許文献１２を参照のこと）。【００１２】
【非特許文献１】Ｊ．Ｌ．Ｐａｒｋ  ＆  Ｂ．Ｒ．Ｌｕｃｃｈｅｓｉ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ．Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ  ６８，１９０５−１９１２，１９９９
【非特許文献２】Ｈ．Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｍ．Ｈａｃｈｉｄａ  ＆  Ｋ．Ｙａｓｕｍｏｔｏ．Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｔｒｅｎｄｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．Ｌｏｗ  Ｔｅｍｐ  Ｍｅｄ  ２６，９３−９８，２０００
【非特許文献３】Ｎ．Ｈｅｄａｙａｔｉ，Ｓ．Ｊ．Ｓｃｈｏｍｉｓｃｈ，Ｊ．Ｌ．Ｃａｒｉｎｏ，Ｊ．Ｔ．Ｓｈｅｒｗｏｏｄ，Ｅ．Ｊ．Ｌｅｓｎｅｆｓｋｙ  ＆  Ｂ．Ｌ．Ｃｍｏｌｉｋ．Ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｔ．Ｔｈｏｍａｓ’  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  ａｎｄ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ．Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｂｅｓ  １１３，１２１−１２７，２００３
【非特許文献４】  Ｔ．Ｓｔｅｅｎｓｒｕｄ，Ｄ．Ｎｏｒｄｈａｕｇ，Ｏ．Ｐ．Ｅｌｖｅｎｅｓ，Ｃ．Ｋｏｒｖａｌｄ  ＆  Ｄ．Ｇ．Ｓｏｒｌｉｅ．Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｎｉｃｏｒａｎｄｉｌ  ｃａｒｄｉｏｐｌｅｇｉａ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｒｄｊｏｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ  ２３，６７０−６７７，２００３
【非特許文献５】  Ｔ．Ｓｔｅｅｎｓｒｕｄ，Ｄ．Ｎｏｒｄｈａｕｇ，Ｋ．Ｖ．Ｈｕｓｎｅｓ，Ｅ．Ａｇｈａｊａｎｉ  ＆  Ｄ．Ｇ．Ｓｏｒｌｉｅ．Ｒｅｐｌａｃｉｎｇ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ｎｉｃｏｒａｎｄｉｌ  ｉｎ  ｃｏｌｄ  Ｓｔ．Ｔｈｏｍａｓ’  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｃａｒｄｉｏｐｌｅｇｉａ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｉｇ  ｈｅａｒｔｓ．Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ，１３９１−１３９７，２００４
【非特許文献６】Ｗ．Ｊ．Ｌｉｎｚ  ＆  Ａ．Ｅ．Ｂｕｓｃｈ．ＮＨＥ−ｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ：ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｃｕｔｅ  ｉｓｃｈａｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｔｏ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ／ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ．Ｎａｕｎｙｎ  Ｓｃｈｍｉｅｄｅｈｅｒｇｓ  Ａｒｃｈ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３６８，２３９−２４６，２００３
【非特許文献７】Ｔ．Ｍｉｎａｍｉｎｏ，Ｋ．Ｊｉｙｏｏｎｇ，Ｍ．Ａｓａｋｕｒａ，Ｙ．Ｓｈｉｎｔａｎｉ，Ｈ．Ａｓａｎｕｍａ  ＆  Ｍ．Ｋｉｔａｋａｚｅ．Ｒａｔｉｏｎａｌｅ  ａｎｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｔｒｉａｌ  ｕｓｉｎｇ  ｎｉｃｏｒａｎｄｉｌ  ａｓ  ａｎ  ａｄｊｕｎｃｔ  ｔｏ  ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ＳＴ−ｓｅｇｍｅｎｔ  ｅｌｅｖａｔｉｏｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｊａｐａｎ−ｗｏｒｋｉｎｇ  ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｄａｍａｇｅ  ｂｙ  ａ  Ｋ−ＡＴＰ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｏｐｅｎｅｒ（Ｊ−ＷＩＮＤ−ＫＡＴＰ）Ｃｉｒｃ  Ｊ  ６８，１０１−１０６  ２００４
【非特許文献８】Ｎ．Ｎ．Ａｙｅ，Ｓ．Ｋｏｍｏｒｉ  ＆  Ｋ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ，ｏｆ  ｃａｒｉｐｏｒｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｏｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ａｒｒｈｙｔｈｍｉａｓ  ａｎｄ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｌｍａｃｏｌ  １２７，１０４８−１０５５，１９９９
【非特許文献９】Ｓ．Ｓａｎａｄａ，Ｍ．Ｋｉｔａｋａｚｅ，Ｐ．Ｊ．Ｐａｐｓｔ，Ｈ．Ａｓａｎｕｍａ，Ｋ．Ｎｏｄｅ，Ｓ．Ｔａｋａｓｈｉｍａ，Ｍ．Ａｓａｋｕｒａ，Ｈ．Ｏｇｉｔａ，Ｙ．Ｌｉａｏ，Ｙ．Ｓａｋａｔａ，Ａ．Ｏｇａｉ，Ｔ．Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，Ｊ．Ｙａｍａｄａ，Ｙ．Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ，Ｔ．Ｋｕｚｕｙａ，Ｈ．Ｍｏｒｉ，Ｎ．Ｔｅｒａｄａ  ＆  Ｍ．Ｈｏｒｉ．Ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ａｆｆｏｒｄｅｄ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ＩＩＩ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０４，７０５−７１０  ２００１
【非特許文献１０】Ｍ．Ｐ．Ｒｅｃｈｔｍａｎ，Ａ．Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｚｙｐｐ  ＆  Ｈ．Ｍａｊｅｗｓｋｉ．Ａｍｒｉｎｏｎｅ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｉｓｃｈａｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｒａｔ  ｈｅａｒｔ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４０２，２５５−２６２，２０００
【非特許文献１１】Ａ．Ｆ．Ｒｕｍｐ，Ｄ．Ａｃａｒ，Ｗ．Ｋｌａｕｓ．Ａ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｉｓｃｈａｅｍｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ａｍｒｉｎｏｎｅ，ｍｉｌｒｉｎｏｎｅ  ａｎｄ  ｌｅｖｏｓｉｍｅｎｄａｎ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｈｅａｒｔｓ．Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １１２，７５７−７６２，１９９４
【非特許文献１２】Ｈ．Ｕｒａｍｏｔｏ，Ｓ．Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ，Ｙ．Ａｎｄｏ−Ａｋａｔｓｕｋａ，Ｙ．Ｎａｇａｓａｋｉ，Ｎ．Ｈａｇｉｗａｒａ  ａｎｄ  Ｙ．Ｏｋａｄａ．Ａ  ｒｏｅ  ｏｆ  ＣＦＴＲ  Ｃｌ￣  ｃｈａｎｎｅｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｒａｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ．Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５２，Ｓ３５，２００２。
【００１３】  上述した虚血プレコンディショニングは、虚血傷害を低減させるために有効な手段である。しかし、心筋に対して予め短時間の虚血および虚血後の再灌流を繰り返す必要があるので、虚血プレコンディショニングは、現実的であるとはいえない。実験的に薬物プレコンディショニング（ニコランジル）が行われているが、その効果は術前投与に引き続く術中の投与によって得られ、術中以後および再灌流後での投与では得られない。しかも、適用患者は、予防のために日常的に内服している場合が多い。このように、プレコンディショニングは、術前投与を原則としており、虚血に陥ってしまった患者に対する処置法としては何ら役に立たない。従って、予測することができずに虚血に陥った患者に対する虚血傷害防御に有効な因子を同定することが非常に望まれている。【００１４】  心疾患は日本国内の死因の上位に位置するので、心筋梗塞等を引き起こす虚血または虚血後の再灌流による心筋細胞の細胞死の防御法および／または救済法を開発することは、きわめて重要かつ緊急な課題である。また、臨床上の具体的な心筋保護として、心臓外科領域における心筋保護、すなわち、開心術中の心筋保護液による心筋保護は重要である。心筋保護液の投与方法はいくつかあるが、特に「常温血液併用心筋保護液を用いた心停止法」（ｗａｒｍ  ｂｌｏｏｄ  ｃａｒｄｉｏｐｌｅｇｉａ）は、低体温法の欠点を防止し、心筋を生理的、機能的に早期に回復させることを可能にする方法として注目されている。しかし、常温であるために心筋の灌流不均等により浮腫が生じ心筋傷害が重大となる可能性があることから、この方法は短時間で終了できる手術症例に限り適用されている。従って、この開心術における虚血中の傷害を防止する方法の開発はこの心筋保護法に更なる進歩をもたらすものと考えられる。【００１５】  本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、虚血時または虚血後の再灌流時に生じる心筋細胞の細胞死の防御法および／または救済法、特に、現行の開心術における虚血傷害に対する心筋保護法を改善する方法、ならびに虚血傷害抑制剤を開発することを実現することにある。本発明は、内科領域での治療に対して、狭心症等における虚血開始（発作）後の適用で虚血傷害による心筋細胞死を防御する方法、および心筋保護剤としての治療薬剤を提供することを目的とする。また、本発明は、心臓の外科手術および移植手術において必然的に伴われる虚血および虚血後の再灌流による傷害に対して心筋を保護する方法を提供することを目的とする。
【発明の開示】
【００１６】  本発明に係るＣＦＴＲ活性化剤をインビボでスクリーニングするためのシステムは、体温維持のための保温器具、結紮保持具および持続的薬剤注入器具を備えていることを特徴としている。
【００１７】  本発明に係るシステムにおいて、上記保温器具は恒温槽を利用した保温手術台であることが好ましい。
【００１８】  本発明に係るシステムにおいて、上記結紮保持具は留置針の外套部分であってもよく、当該保持具の結紮部分に接触する部分が適度な柔軟性を持つ素材であること、ならびに結紮部分との間に０．５ｍｍ厚の小さな布を挟んで固定することが好ましい。
【００１９】  本発明に係るシステムにおいて、上記持続的薬剤注入器具は経頚静脈的注入器具であることが好ましい。
【００２０】  本発明に係るシステムにおいて、心臓の外環境維持、温度維持および乾燥防止のために加温生理食塩水を胸腔内で灌流させる器具がさらに備えられていることが好ましい。
【００２１】  本発明に係るスクリーニング方法は、上記システムを使用してＣＦＴＲ活性化剤をインビボでスクリーニングするために、再灌流開始時または再灌流開始直前もしくは直後にＣＦＴＲ活性化剤としての候補因子を被験体に投与する工程（すなわち、再灌流開始時での患部における候補因子濃度を効用濃度に到達させる工程）；ならびに、被験体に生じた梗塞巣サイズを測定する工程を包含することを特徴としている。
【００２２】  本発明に係るスクリーニング方法は、上記投与する工程が経頚静脈的に行われることが好ましい。
【００２３】  本発明に係るスクリーニング方法は、上記被験体に生じた梗塞巣サイズと、上記投与する工程において上記候補因子の代わりにＰＫＡ活性化剤およびＰＫＣ活性化剤を同時に投与して生じた梗塞巣サイズとを比較する工程を包含することが好ましい。
【００２４】  本発明に係るスクリーニング方法は、上記ＰＫＡ活性化剤がｍｉｌｒｉｎｏｎｅであることが好ましい。
【００２５】  本発明に係るスクリーニング方法は、上記被験体として野生型マウスを用いて測定された梗塞巣サイズと、上記被験体としてＣＦＴＲノックアウトマウスを用いて測定された梗塞巣サイズとを比較する工程を包含することが好ましい。
【００２６】  本発明に係るＣＦＴＲ活性化剤をインビボでスクリーニングするためのシステムは、上述したインビボでの虚血および虚血後再灌流のためのシステムであってもよく、ＣＦＴＲ活性化剤としての候補因子を再灌流開始時または再灌流開始直前もしくは直後に被験体に投与する手段を有していることを特徴としている。
【００２７】  本発明に係るＣＦＴＲ活性化剤をインビボでスクリーニングするためのシステムにおいて、上記手段は、持続的薬剤注入器具であることが好ましい。
【００２８】  本発明に係るＣＦＴＲ活性化剤をインビボでスクリーニングするためのシステムは、被験体に生じた梗塞巣サイズを測定する手段をさらに有していることが好ましい。
【００２９】  本発明に係る薬学的組成物は、心室筋の細胞死を抑制するために、ＣＦＴＲチャネル活性化剤を含むことを特徴としている。
【００３０】  本発明に係る薬学的組成物において、上記細胞死がネクローシスであることが好ましい。
【００３１】  本発明に係る薬学的組成物において、上記細胞死が、虚血または虚血後の再灌流によって生じる細胞死であることが好ましい。
【００３２】  本発明に係る薬学的組成物において、上記ＣＦＴＲチャネル活性化剤がＰＫＡ活性化剤とＰＫＣ活性化剤との混合物であることが好ましい。
【００３３】  本発明に係る薬学的組成物において、上記ＰＫＡ活性化剤が、ジブチリルサイクリックＡＭＰであることが好ましい。
【００３４】  本発明に係る薬学的組成物において、上記ＰＫＣ活性化剤が、ホルボール１２−ミリスチン酸エステル１３酢酸塩であることが好ましい。
【００３５】  本発明に係る薬学的組成物において、上記ＣＦＴＲチャネル活性化剤がホスホジエステラーゼＩＩＩインヒビターとＰＫＣ活性化剤との混合物であることが好ましい。
【００３６】  本発明に係る薬学的組成物において、上記ホスホジエステラーゼＩＩＩインヒビターが、１，６−ｄｉｈｙｄｒｏ−２−ｍｅｔｈｙｌ−６−ｏｘｏ［３，４’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ］−５−ｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅであることが好ましい。
【００３７】  本発明に係る薬学的組成物において、上記細胞死が、心筋組織において虚血中に生じる異常によって誘発されることが好ましい。
【００３８】  本発明に係る薬学的組成物において、上記細胞死が、ミトコンドリア脱水素酵素の活性低下を伴うことが好ましい。
【００３９】  本発明に係る薬学的組成物は、心室筋初代培養細胞の細胞死を抑制するために使用されることが好ましい。
【００４０】  本発明に係る薬学的組成物において、上記細胞死がネクローシスであることが好ましい。
【００４１】  本発明に係る薬学的組成物は、心室筋梗塞域を低減することが好ましい。
【００４２】  本発明に係る薬学的組成物は、心臓外科手術および心臓移植手術において心筋を保護するために、ＣＦＴＲチャネル活性化剤を含むことを特徴としている。
【００４３】  本発明に係る薬学的組成物は、ネクローシスを生じている心臓の外科手術および移植手術において用いられることが好ましい。
【００４４】  本発明に係る薬学的組成物において、上記ＣＦＴＲチャネル活性化剤がＰＫＡ活性化剤とＰＫＣ活性化剤との混合物であることが好ましい。
【００４５】  本発明に係る薬学的組成物において、上記ＰＫＡ活性化剤が、ジブチリルサイクリックＡＭＰであることが好ましい。
【００４６】  本発明に係る薬学的組成物において、上記ＰＫＣ活性化剤が、ホルボール１２−ミリスチン酸エステル１３酢酸塩であることが好ましい。
【００４７】  本発明に係る薬学的組成物において、上記ＣＦＴＲチャネル活性化剤がホスホジエステラーゼＩＩＩインヒビターとＰＫＣ活性化剤との混合物であることが好ましい。
【００４８】  本発明に係る薬学的組成物において、上記ホスホジエステラーゼＩＩＩインヒビターが、１，６−ｄｉｈｙｄｒｏ−２−ｍｅｔｈｙｌ−６−ｏｘｏ［３，４’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ］−５−ｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅであることが好ましい。
【００４９】  本発明に係る薬学的組成物は、ネクローシスに起因する疾患を予防するために、ＣＦＴＲチャネル活性化剤を含むことを特徴としている。
【００５０】  本発明に係る薬学的組成物において、上記ＣＦＴＲチャネル活性化剤がＰＫＡ活性化剤とＰＫＣ活性化剤との混合物であることが好ましい。
【００５１】  本発明に係る薬学的組成物において、上記ＰＫＡ活性化剤が、ジブチリルサイクリックＡＭＰであることが好ましい。
【００５２】  本発明に係る薬学的組成物において、上記ＰＫＣ活性化剤が、ホルボール１２−ミリスチン酸エステル１３酢酸塩であることが好ましい。
【００５３】  本発明に係る薬学的組成物において、上記ＣＦＴＲチャネル活性化剤がホスホジエステラーゼＩＩＩインヒビターとＰＫＣ活性化剤との混合物であることが好ましい。
【００５４】  本発明に係る薬学的組成物において、上記ホスホジエステラーゼＩＩＩインヒビターが、１，６−ｄｉｈｙｄｒｏ−２−ｍｅｔｈｙｌ−６−ｏｘｏ［３，４’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ］−５−ｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅであることが好ましい。
【００５５】  本発明に係る心室筋の細胞死を抑制する方法は、ＣＦＴＲチャネル活性化剤を投与する工程を包含することを特徴としている。
【００５６】  本発明に係る心臓外科手術において心筋を保護する方法は、ＣＦＴＲチャネル活性化剤を投与する工程を包含することを特徴としている。
【００５７】  本発明に係るネクローシスに起因する疾患を予防する方法は、ＣＦＴＲチャネル活性化剤を投与する工程を包含することを特徴としている。
【００５８】  本発明に係るインビボでの虚血および虚血後再灌流のためのシステムは、体温維持のための保温器具を備えることを特徴としている。
【００５９】  本発明に係るインビボでの虚血および虚血後再灌流のためのシステムは、結紮保持具および持続的薬剤注入器具をさらに備えることが好ましい。
【００６０】  本発明に係るインビボでの虚血および虚血後再灌流のためのシステムは、上記保温器具が恒温槽を利用した保温手術台であることが好ましい。
【００６１】  本発明に係るインビボでの虚血および虚血後再灌流のためのシステムは、心臓の外環境維持、温度維持および乾燥防止のために加温生理食塩水を胸腔内で灌流させる器具をさらに備えることが好ましい。
【００６２】  本発明に係るインビボでの虚血および虚血後再灌流のためのシステムは、上記結紮保持具が、留置針の外套部分であることが好ましい。
【００６３】  本発明に係る細胞死を評価する方法は、虚血および虚血後の再灌流によって生じる細胞死をインビトロでの培養細胞系において評価するために、
評価対象となる細胞を調製する工程、
グルコースを含まない培地中にて当該細胞を無酸素条件下で培養する虚血処理工程、
グルコースを含む培地中にて有酸素条件下で当該虚血処理に供した細胞を培養する再灌流処理工程、および、
細胞死を検出する工程
を包含することを特徴としている。
【００６４】  本発明に係る細胞死を評価する方法において、上記評価の対象となる細胞は、心筋細胞、脳神経細胞、または脳グリア細胞であることが好ましい。
【００６５】  本発明に係る細胞死を評価する方法において、上記細胞死を評価する工程は、核の形態変化を指標とすることが好ましい。
【００６６】  本発明に係るスクリーニング方法は、虚血および虚血後の再灌流によって生じる細胞死を抑制する因子をインビトロでスクリーニングするために、
細胞を調製する工程、
グルコースを含まない培地中にて当該細胞を無酸素条件下で培養する虚血処理工程、
グルコースを含む培地中にて有酸素条件下で当該虚血処理に供した細胞を培養する再灌流処理工程、および、
細胞死を検出して細胞死の評価結果を得る工程
を包含し、
当該虚血処理工程時もしくは当該再灌流処理工程時またはこれらの前後に候補因子を培地中に添加することにより得られた細胞死の評価結果を、当該候補因子を添加することなく得られた細胞死の評価結果と比較する工程
をさらに包含することを特徴としている。
【００６７】  本発明に係るスクリーニング方法において、上記細胞は、心筋細胞、脳神経細胞、または脳グリア細胞であることが好ましい。
【００６８】  本発明に係るスクリーニング方法において、上記細胞死を測定する工程は、ミトコンドリア脱水素酵素の活性、核内ＤＮＡの断片化、カスパーゼ活性、ミトコンドリアから細胞質へのチトクロームｃの放出、または核の形態変化を指標とすることが好ましい。
【００６９】  本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】（Ａ）は、Ｃｌ−チャネルブロッカー５−ｎｉｔｒｏ−２−２（３−ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｏ）−ｂｅｎｚｏａｔｅ（ＮＰＰＢ）を虚血処理時に培地に添加した場合のラット培養心室筋細胞の生存率を示すグラフである。（Ｂ）は、ＮＰＰＢを虚血処理時、虚血処理前１時間、再灌流開始後より１８時間にわたって培地に添加した場合のラット培養心室筋細胞の生存率を示すグラフである。
【図２】虚血処理時にＣＦＴＲチャネル活性化剤（Ｎ６，２’−Ｏ−ｄｉｂｕｔｙｒｉｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ−３’：５’−ｃｙｃｌｉｃ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｄｂｃＡＭＰ）もしくはＰＭＡまたはその両者（ＤＰ））および／またはＣＦＴＲチャネルブロッカー（ＮＰＰＢ、ｇｌｉｂｅｎｃｌａｍｉｄｅ、ｇｅｍｆｉｂｒｏｚｉｌまたはＡｎｔｈｒａｃｅｎｅ−９−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（９ＡＣ））を培地に添加した場合のラット培養心室筋細胞の生存率を示すグラフである。
【図３】虚血処理時にＣＦＴＲチャネル活性化剤（ｍｉｌｒｉｎｏｎｅ、ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ、ＰＭＡを併用（ＭＩＰ））および／またはＣＦＴＲチャネルブロッカー（ＮＰＰＢ、ｇｌｉｂｅｎｃｌａｍｉｄｅ、ｇｅｍｆｉｂｒｏｚｉｌまたは９ＡＣ）を培地に添加した場合のラット培養心室筋細胞の生存率を示すグラフである。
【図４】（Ａ）は、虚血処理時にＣＦＴＲチャネルブロッカー（ＮＰＰＢ）を培地に添加したラット培養心室筋細胞をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２および／またはＰｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）によって染色した写真である。（Ｂ）は、（Ａ）の細胞におけるＰＩ染色率を示すグラフである。
【図５】（Ａ）は、虚血処理時にＣＦＴＲチャネル活性化剤（ｄｂｃＡＭＰとＰＭＡとを併用）またはＣＦＴＲチャネルブロッカー（ＮＰＰＢ）を培地に添加したラット培養心室筋細胞における、虚血終了直後の核ＤＮＡ断片化率を示すグラフである。（Ｂ）は、虚血処理時にＣＦＴＲチャネル活性化剤（ｄｂｃＡＭＰとＰＭＡとを併用）またはＣＦＴＲチャネルブロッカー（ＮＰＰＢ）を培地に添加したラット培養心室筋細胞における、虚血後の再灌流９６時間後の核ＤＮＡ断片化率を示すグラフである。
【図６】（Ａ）は、手術中のマウスに対する保温システムの全景を示す写真である。（Ｂ）は、温めた生理的食塩水を胸腔内に供給／吸引している様子を示す写真である。
【図７】（Ａ）は、手術中のマウスにおいて結紮保持具を使い左冠状動脈左前下行枝を結紮している様子を示す写真である。（Ｂ）は、結紮による虚血前の心臓像を示す写真である。（Ｃ）は、結紮による虚血後の心臓像を示す写真である。
【図８】（Ａ）は、マウスに薬剤を持続投与するためのマイクロフィルが右頚静脈に刺し込まれて固定された状態を示す写真である。（Ｂ）は、（Ａ）の部分の拡大写真である。
【図９】（Ａ）は、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＣＦＴＲチャネル活性化剤（ｍｉｌｒｉｎｏｎｅもしくはＰＭＡまたはその両者）を投与する時期を示す模式図である。（Ｂ）は、ＣＦＴＲチャネル活性化剤を虚血処理開始１０分前に１ショット投与（ｍｉｌｒｉｎｏｎｅ  ５０μｇ／ｋｇ＋ＰＭＡ  ４．８μｇ／ｋｇ）した後、さらに虚血処理時から虚血終了時まで持続投与（ｍｉｌｒｉｎｏｎｅ  １７μｇ／ｋｇ／ｈ＋ＰＭＡ  １．６μｇ／ｋｇ／ｈ）した場合の、虚血領域に対する梗塞巣領域の割合を示すグラフである。（Ｃ）は、マウス心臓切片における細胞生存部位（２，３，５−ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｃｈｌｏｒｅｉｄｅ（ＴＴＣ）染色）を示す写真である。
【図１０】（Ａ）は、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＣＦＴＲチャネル活性化剤（ｍｉｌｒｉｎｏｎｅ＋ＰＭＡ）を投与する時期を示す模式図（図中Ａ、Ｂは１ショット投与に引き続く持続投与、Ｃ，Ｄは１ショット投与）である。（Ｂ）は、虚血領域に対する梗塞巣領域の割合を示すグラフである。１ショット投与は、ｍｉｌｒｉｎｏｎｅ  ５０μｇ／ｋｇ＋ＰＭＡ  ４．８μｇ／ｋｇの用量で行い、持続投与は、ｍｉｌｒｉｎｏｎｅ  １７μｇ／ｋｇ／ｈ＋ＰＭＡ  １．６μｇ／ｋｇ／ｈの用量で行った。
【図１１】（Ａ）は、ＣＦＴＲノックアウトマウス（＋／−または＋／＋）を用いた実験における虚血・再灌流時間を示す模式図である。（Ｂ）は、ＣＦＴＲノックアウトマウス（＋／−または＋／＋）を用いた実験における虚血領域に対する梗塞巣領域の割合を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７１】  本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行なった。具体的には、本発明者らは、新生仔ラットの心室筋細胞の初代培養系（インビトロ実験系）でこれまでに得ている結果、すなわち、ＰＫＡ活性化剤およびＰＫＣ活性化剤を虚血中に投与していることによって再灌流後の細胞の回復が改善されることに基づき、同インビトロ実験系に加えＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスによるインビボ実験系を用いて、
（ｉ）インビトロでのＰＫＡおよびＰＫＣの同時活性化により得られた心筋細胞の虚血傷害に対する保護メカニズムがＣＦＴＲの機能によるものなのか；
（ｉｉ）心筋細胞の虚血傷害を防御するメカニズムにおけるＣＦＴＲの機能はネクローシスとアポトーシスのいずれの細胞死の防御に関与するのか；
（ｉｉｉ）インビボでＣＦＴＲチャネル活性化剤をマウスに投与することによって、虚血または再灌流によって惹起される心筋傷害、特にネクローシス性心筋細胞死を抑制することができるのか；
（ｉｖ）インビボでＣＦＴＲチャネル活性化剤を虚血開始後に投与しても虚血または再灌流によって惹起される心筋傷害、特にネクローシス性心筋細胞死を抑制することができるのか；および
（ｖ）のインビボでＣＦＴＲの発現レベルが心筋の虚血傷害の程度に影響を与えるのか、について検討を行なった。【００７２】  多くの上皮組織において、Ｃｌ−を含む液の分泌（汗腺の場合は再吸収）に関与することが知られているＣＦＴＲ（ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ：嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子）は、Ｃｌチャネルの１つであり、嚢胞性線維症（ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）の原因遺伝子として知られている。ＣＦＴＲは、ＡＴＰ結合部位を２箇所有するＡＢＣ輸送体（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ：ＡＴＰ結合カセット輸送タンパク質）の１つであり、ｃＡＭＰ依存的に制御されるＣｌ−チャネルとして機能するとともに、他の複数のチャネルを調節するレギュレーターとしても機能する。【００７３】  ＣＦＴＲは、消化管、気管、および汗腺など全身の外分泌腺に発現しており、その機能異常は、汗のＣｌ−濃度の上昇として検出される。最近、ＣＦＴＲ遺伝子は嚢胞性線維症だけでなく、慢性膵炎、慢性下部気管支炎、副鼻腔炎、先天性男性不妊症などの遺伝性の原因因子であることがわかってきており、広範な疾患に関与していると考えられている（Ｎａｒｕｓｅ，Ｓ．，Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｍ．，Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｈ．，Ｆｕｊｉｋｉ，Ｋ．  ＆  Ｈａｙａｋａｗａ，Ｔ．：Ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｉｓ−ｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ．Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１６：５１１−５２６，２００２）。【００７４】  ＣＦＴＲはまた、上皮以外では心筋に発現している。従って、虚血または再灌流によって惹起される心筋細胞死（特に、ネクローシス）の発生機序には、ＣＦＴＲが関与している可能性がある。しかし、ＣＦＴＲを標的とした虚血傷害性の心筋細胞死の防御法の開発は未だ行われていない。【００７５】  上述した検討の結果、本発明者らは、これまでにインビトロでの虚血・再灌流実験系で得られているＰＫＡ活性化剤およびＰＫＣ活性化剤の同時投与（ジブチリルサイクリックＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）およびホルボール１２−ミリスチン酸エステル１３酢酸塩（ＰＭＡ）の併用）による細胞生存率の改善がＣＦＴＲチャネルの活性化によるものであることを薬理学的検討から見出し、この効果は虚血前あるいは虚血後だけの投与では効果は得られず、インビトロ実験系では虚血中のＣＦＴＲチャネル活性化剤の投与が重要であることを見出した。【００７６】  ＰＭＡは、単独でプレコンディショニング様効果を示すことが知られている。プレコンディショニング効果を有する物質は、虚血を生じる前に予め短時間の虚血および虚血後の再灌流を繰り返しておくことによって虚血耐性を心筋に付与することができるが、虚血に陥っている患者の心筋に適用しても何ら効果をもたらさない。プレコンディショニング効果によって心筋に虚血耐性を付与し得る物質はいくつか知られているが、虚血後の投与が効果的である物質は未だ知られていない。【００７７】  本発明者らは、ＣＦＴＲチャネル活性化剤を虚血中の心筋細胞にインビトロで適用し、��ＦＴＲチャネルを活性化した場合に、虚血傷害（例えば、細胞死）が抑制されることを見出した。このような細胞生存率の変化は死細胞率と一致したが、アポトーシスの関与はなく、ネクローシスであると判断された。さらに、インビボでの虚血・再灌流実験系に適用することによっても、虚血前から虚血終了時まで持続投与した場合、および再灌流開始時に投与した場合において、梗塞巣領域の著しい減少が見られた。これらのことは、虚血前から虚血終了時までの持続投与、または再灌流開始時の投与によって、ＣＦＴＲチャネル活性化剤が再灌流直後の血流を介して患部に供給されて、虚血傷害を抑制することを示している。【００７８】  以上の知見に基いて、本発明者らは、ＣＦＴＲチャネル活性化剤の投与による心筋細胞の虚血性ネクローシスの防御法を開発し、本発明を完成するに至った。【００７９】  本明細書中で使用される場合、「ＣＦＴＲ」は「ＣＦＴＲチャネル」または「ＣＦＴＲクロライドチャネル」と交換可能に使用される。【００８０】  本明細書中で使用される場合、「心筋細胞」は、生体内における心筋細胞であっても、心筋由来の市販の培養細胞であっても、生体から取り出した心臓由来の初代培養心筋細胞であってもよい。【００８１】  本明細書中で使用される場合、用語「虚血・再灌流実験系」は、培養細胞を用いるインビトロ系またはマウスを用いるインビボ系において、培養細胞またはマウスを虚血（または酸素除去およびグルコース除去）処理した後に再灌流（または再酸素化およびグルコース再投与）処理することを可能にした実験系が意図される。【００８２】  （１）薬学的組成物
本発明は、ネクローシス性細胞死を抑制するための薬学的組成物を提供する。ネクローシス性細胞死は生体内の各所で起こり、種々の疾患の原因となるため、このような細胞死を抑制する手段を開発することができれば、当該細胞死が原因で生じる種々の疾患に対する有効な治療薬剤または予防薬剤を得ることができ、非常に有益であるといえる。【００８３】  本発明に係る薬学的組成物は、ＣＦＴＲチャネル活性化剤を含むことを特徴とする。一実施形態において、ＣＦＴＲチャネル活性化剤は、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）の活性化剤および／またはタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化剤が好ましく、ＰＫＡの活性化剤とＰＫＣの活性化剤との併用がより好ましい。好ましいＰＫＡ活性化剤としては、ｄｂｃＡＭＰが挙げられ、好ましいＰＫＣ活性化剤としては、ＰＭＡが挙げられる。また、ＰＫＡ活性化剤の代わりに、ホスホジエスエテラーゼＩＩＩインヒビターを用いてもよい。好ましいホスホジエスエテラーゼＩＩＩインヒビターとしては、ｍｉｌｒｉｎｏｎｅが挙げられる。【００８４】  好ましい実施形態において、本発明に係る薬学的組成物は、虚血または虚血後の再灌流によって生じる心室筋の細胞死を抑制するために使用され得る。虚血または虚血後の再灌流によって生じる心室筋の細胞死としては、心移植の際に起こる心筋細胞死、心筋梗塞が原因で生じる心筋細胞死などが挙げられ、ネクローシス（壊死）による細胞死（本明細書中で使用される場合、「ネクローシス」または「ネクローシス性細胞死」と交換可能に使用される）またはアポトーシスによる細胞死（本明細書中で使用される場合、「アポトーシス」または「アポトーシス性細胞死」と交換可能に使用される）であることが知られている。本実施形態に係る薬学的組成物は、虚血または虚血後の再灌流によって生じる心室筋のネクローシスを抑制するために使用されることが好ましい。より好ましくは、本実施形態に係る薬学的組成物は、心筋組織において虚血中に生じる異常によって誘発されるネクローシスを抑制するために使用され得る。虚血中に生じる異常としては、細胞腫脹、組織浮腫および組織破壊が挙げられるがこれらに限定されない。【００８５】  本明細書中で使用される場合、用語「虚血」は、局所性の乏血が意図される。虚血が生じると、その周辺組織は、虚血の持続時間、虚血に対する組織の感受性、またはその部位での血管吻合の有無に応じて、種々の変化（例えば、ネクローシス）を生じる。本明細書中で使用される場合、用語「虚血傷害」は、虚血に起因して心筋組織において生じる異常が誘発する傷害が意図される。「虚血中に生じる異常」または「虚血によって心筋組織では種々の異常」とは、例えば、細胞腫脹、組織浮腫および組織破壊が意図される。通常、虚血によって心筋組織では種々の異常が生じるが、虚血傷害としては、心筋細胞死および心収縮能減退が挙げられ、虚血後の再灌流によって生じる傷害もまた虚血傷害に含まれる。本発明に係る薬学的組成物の処置標的となる疾患（障害）は、上記虚血障害のうち１種であっても、複数が併発したものであっても、さらに別の疾患と合併したものであってもよい。【００８６】  細胞死を評価する場合、ミトコンドリア脱水素酵素の活性���指標にすることができる。評価細胞が死滅するとミトコンドリア脱水素酵素の活性が低下することが知られているので、当該酵素活性が低下すれば細胞の死滅率が高いと判断できる。【００８７】  なお、本明細書を読んだ当業者は、ＣＦＴＲチャネル活性化剤が、虚血または虚血後の再灌流によって生じる細胞死に対してのみ有効であるのではなく、他の原因によるネクローシス性の細胞死にも有効であることを、容易に理解する。【００８８】  本発明はまた、心臓外科手術において心筋を保護するための薬学的組成物を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「心筋を保護する」こと、または「心筋の保護」は、心臓外科領域における心筋保護、すなわち、開心術中または心移植中の心筋保護液による心筋保護が意図される。本発明に係る薬学的組成物は、ネクローシスの発生が伴われる可能性のある心臓の外科手術および移植手術において用いることが好ましい。【００８９】  本発明はさらに、ネクローシスに起因する疾患を予防するための薬学的組成物を提供する。「ネクローシスに起因する疾患」としては、心筋梗塞が挙げられるがこれらに限定されない。【００９０】  本発明に係る薬学的組成物は、哺乳動物（ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、およびサルなど）に対して適用することができる。【００９１】  本発明に係る薬学的組成物は、ＣＦＴＲチャネル活性化剤（好ましくは、ＰＫＡ活性化剤およびＰＫＣ活性化剤との併用）をそのまま用いてもよいが、薬学的に受容可能なキャリアを含んでもよい。本発明に係る薬学的組成物は、医薬組成物の製造法として公知の手段に従って製造することができる。【００９２】  一実施形態において、本発明に係る薬学的組成物は、医薬組成物であり得る。医薬組成物中に使用される薬学的に受容可能なキャリアは、医薬組成物の投与形態および剤型に応じて選択することができる。【００９３】  本明細書中で使用される場合、薬理学的に受容可能なキャリアとしては、製剤素材として使用可能な各種有機または無機のキャリア物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、または崩壊剤、あるいは、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁剤、等張化剤、緩衝剤、または無痛化剤などとして配合される。【００９４】  賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、デンプン、結晶セルロースなどが挙げられ、滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。【００９５】  結合剤としては、例えば、α化デンプン、メチルセルロース、結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、トレハロース、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。【００９６】  崩壊剤としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウムなどが挙げられる。【００９７】  溶剤としては、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコー���、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、トリカプリリンなどが挙げられる。【００９８】  溶解補助剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。【００９９】  懸濁剤としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤、あるいは、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子が挙げられる。【０１００】  等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールなどが挙げられる。【０１０１】  緩衝剤としては、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。【０１０２】  無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコールなどが挙げられる。【０１０３】  防腐剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。【０１０４】  抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。【０１０５】  本実施形態に係る医薬組成物は、製剤技術分野において慣用的な方法に従って製造することができる。本実施形態に係る医薬組成物におけるＣＦＴＲチャネル活性化剤の含有量は、投与形態、投与方法などを考慮し、当該医薬組成物を用いて後述の投与量範囲でＣＦＴＲチャネル活性化剤を投与できるような量であれば特に限定されない。【０１０６】  本実施形態に係る医薬組成物の剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口剤、あるいは、注射剤、坐剤、ペレット、点滴剤などの非経口剤が挙げられる。本発明に係る薬学的組成物は、毒性を有するものもあるので、それらに対する毒性の低い代替薬剤が開発されれば経口的または非経口的に投与することができる。用語「非経口」は、本明細書中で使用される場合、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下、および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。【０１０７】  本実施形態に係る医薬組成物の投与量は、投与対象、投与経路、症状などによっても異なるが、当業者は、これら投与対象、投与経路、症状などに応じて、最適な条件を適宜設定することができる。【０１０８】  本実施形態に係る医薬組成物は、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与できる。投与方法も特に限定はなく、内用、外用および注射によって適用することができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与することができる。【０１０９】  本実施形態に係る医薬組成物の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的および当該医薬の投与対象である患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではない。一���には、製剤中に含有される有効成分の投与量で、好ましくは成人１日当り５〜４００μｇ／ｋｇである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。投与は、所望の投与量範囲内において、１日内において単回で、または数回に分けて行ってもよい。また、本実施形態に係る医薬組成物はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。【０１１０】  このように、本発明に係る薬学的組成物は、少なくとも、ＣＦＴＲチャネル活性化剤を含めばよいといえる。そして、ＣＦＴＲチャネル活性化剤は、ＰＫＡ活性化剤（またはホスホジエステラーゼＩＩＩインヒビター）とＰＫＣ活性化剤を併せて用いればよいといえる。すなわち、複数のＰＫＡ活性化剤（またはホスホジエステラーゼＩＩＩインヒビター）またはＰＫＣ活性化剤を含有する薬学的組成物もまた、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。【０１１１】  本発明に係る薬学的組成物を投与することによって、心室筋の細胞死を抑制することができる。また、本発明に係る薬学的組成物を投与することによって、心臓外科手術および心臓移植手術において心筋を保護することができる。さらに、本発明に係る薬学的組成物を投与することによって、ネクローシスに起因する疾患を処置することができる。【０１１２】  （２）虚血および虚血後の再灌流によって生じる細胞死の評価方法（インビトロ系）
本発明は、インビトロでの培養細胞系において虚血および虚血後の再灌流によって生じる細胞死を評価するための方法を提供する。【０１１３】  本発明に係るインビトロでの細胞死の評価方法は、評価対象となる培養細胞を調製する工程、グルコースを含まない緩衝液（培地）中にて当該細胞を無酸素条件下で培養する虚血処理工程、グルコースを含む培地中にて有酸素条件下で当該虚血処理に供した細胞を培養する再灌流処理工程、および、細胞死を検出する工程を包含する。本発明に係るインビトロでの細胞死の評価方法を用いることによって、評価対象となる細胞は虚血後の再灌流を経験する。従って、本発明に係るインビトロでの細胞死の評価方法を用いれば、虚血処理前後、または虚血後に再灌流処理を行なう前後において、細胞の生存率などの細胞死の評価を行ない、これらを比較することによって、再灌流性細胞死の評価を簡便に行なうことができる。【０１１４】  本発明に係るインビトロでの細胞死の評価方法において、評価の対象となる細胞としては、特に限定されず、心筋細胞、脳神経細胞、脳グリア細胞を好適に用いることができる。心筋細胞を用いることによって、心筋梗塞などが原因となる虚血または虚血後の再灌流によって生じる細胞死を評価することができる。脳神経細胞または脳グリア細胞を用いることによって、脳梗塞などに原因となる虚血または虚血後の再灌流によって生じる細胞死を評価することができるものといえる。また、上記の細胞は、市販の培養細胞が用いられても、初代培養細胞が用いられてもよい。【０１１５】  上記の虚血処理工程において使用する緩衝液は、グルコースを含まない緩衝液であれば特に限定されない。上記緩衝液の組成としては、例えば、１０８ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳにＮａＨＣＯ３を加えてｐＨ７．４に調整したものが好適である。【０１１６】  また、上記虚血処理工程において細胞を無酸素条件下で培養を行なうが、本明細書中で使用される場合、用語「無酸素条件下」は、酸素濃度が１％以下の雰囲気下であることが意図され、酸素がほとんど〜全く含まれていないこと（０．０１％以下）が好ましい。従って、当業者は、本明細書中に記載される「無酸素条件下」が、炭酸ガス、窒素ガス、アルゴンガス下にて行なう細胞培養であり、例えば、９５％アルゴンガス＋５％炭酸ガスの条件下もまた無酸素条件下であることを容易に理解する。なお、細胞培養に用いる器具および／または培養方法は、当該分野において公知のものを適宜選択すればよいことも、当業者には明白である。【０１１７】  上記虚血処理工程における培養温度については、通常の細胞培養に好適な温度条件を採用すればよく、２８〜４０℃が好ましく、３７℃が最も好ましい。【０１１８】  上記虚血処理工程における培養時間（処理時間）については、細胞が虚血状態になるまで行なえばよく、例えば、６時間〜１０時間が好ましく、８時間が最も好ましい。【０１１９】  再灌流処理工程において使用される培地（緩衝液）は、グルコースを含むものであれば特に限定されるものではなく、当該分野において公知の培地を適宜選択すればよい。好ましい培地としては、例えば、１０％  Ｆ���Ｓを添加したＭ１９９培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ培地、ＭＥＭ培地、ＥＭ培地などが挙げられる。【０１２０】  再灌流処理工程における上記有酸素条件とは、酸素が５％以上の雰囲気下をいい、１０％以上がより好ましく、１５％以上がさらに好ましい。再灌流処理工程における上記有酸素条件としては、９５％空気（酸素約２０％）＋５％炭酸ガスという慣用的な条件が最も好ましい。【０１２１】  また、上記再灌流処理工程における培養時間については、少なくとも細胞が虚血状態から灌流状態になるために必要な時間以上培養すればよく、７２時間〜１２０時間が好ましく、８４時間〜１０８時間がさらに好ましく、９６時間が最も好ましい。なお、再灌流処理工程における培養温度は、上記虚血処理工程と同様でよい。好ましい培養温度および培養時間は、３７℃での９６時間培養である。【０１２２】  本発明に係るインビトロでの細胞死の評価方法において、細胞死を検出する工程としては、特に限定されないが、例えば、ミトコンドリア脱水素酵素の活性を指標に行なう方法（ＭＴＴ法またはＭＴＳ法）、核内ＤＮＡの断片化を指標に行なう方法（ＤＮＡラダー試験など）、細胞死を引き起こす細胞内タンパク質分解酵素（カスパーゼ）の活性を指標とする方法、ミトコンドリアから細胞質へのシトクロームｃの放出を指標とする方法、および核の形態変化（例えば、核の濃縮または細片化）を指標とする方法などが挙げられる。【０１２３】  細胞が死滅するとミトコンドリア脱水素酵素の活性が低下するので、ミトコンドリア脱水素酵素の活性を指標にして当該酵素活性が低下すれば細胞の死滅率が高いと判断することができる。【０１２４】  ネクローシスによって細胞が死滅する際には、当該細胞は膜傷害を生じるので、ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）によって染色される。この際、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を用いて全ての細胞の核を染色すれば、ネクローシス性の細胞死を生じた細胞の割合を算出することができる。【０１２５】  また、アポトーシスによって細胞が死滅する際には、核内ＤＮＡが断片化するので、電気泳動などでラダー上の核内ＤＮＡの状態を観察すれば簡便にアポトーシス性の細胞死であるか否かを判定することができる。【０１２６】  さらに、アポトーシスによって細胞が死滅する際には、カスパーゼが活性化（活性が上昇）することがわかっているので、カスパーゼ活性を指標にして当該酵素活性が上昇すればアポトーシス性の細胞死滅率が高いと判断することができる。【０１２７】  また、ミトコンドリア刺激によるアポトーシスによって細胞が死滅する際には、ミトコンドリアから細胞質へのシトクロームｃが放出するので、ミトコンドリアから細胞質へのシトクロームｃの放出を指標としてシトクロームｃの放出量を測定すれば簡便にアポトーシス性の細胞死であるか否かを判定することができる。【０１２８】  また、アポトーシスによって細胞が死滅する際には、核の濃縮や細片化といった核の形態変化が起こるので、核の形態変化を指標にして電子顕微鏡などで核の形態変化を観察すれば簡便にアポトーシス性の細胞死であるか否かを判定することができる。【０１２９】  本発明に係るインビトロでの細胞死の評価方法を用いれば、虚血また���虚血後の再灌流によって生じる細胞死を抑制するための薬剤、特に、虚血または虚血後の再灌流によって生じるネクローシスを抑制するための薬剤をスクリーニングするのに有効である。すなわち、上記の処理工程時（虚血処理工程時または再灌流処理工程時、あるいはこれらの前後）に被検物を添加した場合の細胞死の評価結果と、上記の処理工程時（虚血処理工程または再灌流処理工程時）に被検物を添加していない場合の細胞死の評価結果とを比較することによって被検物の虚血または虚血後の再灌流によって生じる細胞死に対する抑制効果を評価することができ、その結果、虚血または虚血後の再灌流によって生じる細胞死に対する抑制効果を有する物質を得ることができる。【０１３０】  （３）虚血および虚血後の再灌流によって生じる細胞死の評価方法（インビボ系）
本発明は、インビボでの動物を用いる系において虚血および虚血後の再灌流によって生じる細胞死を評価するための方法を提供する。【０１３１】  マウスを用いる虚血および虚血後の再灌流を、当該分野において慣用的な手順で行なう。具体的には、マウスをエーテルで麻酔導入した後手術台に固定して気管挿入し、麻酔ガスを人工呼吸器にてマウスに吸入させて、呼吸管理および麻酔を維持する。左冠状動脈左前下行枝を縫合糸で結紮して、マウスの虚血処理を行い、虚血処理の一定時間後に結紮を解いて再灌流を行う。虚血および再灌流後に閉胸し、麻酔から覚醒させたマウスを通常通り飼育する。【０１３２】  このような従来の手順に従ってマウスの虚血および虚血後の再灌流を行なうと、胸腔内温および直腸温の低下、ならびに開胸中の体水分の蒸発が生じるために、インビボでの実験が首尾よくいかない場合が多い。そこで、本発明者らは、マウスの虚血および虚血後の再灌流を首尾よく行なうためのシステムを構築した。【０１３３】  本発明に係るマウスの虚血および虚血後の再灌流を首尾よく行なうためのシステムは、体温維持のための保温器具を備える。具体的には、本発明に係るシステムは、恒温槽によって４０℃に温められた水が循環する構造を有する手術台、および、ポンプとヒーターを用いることによって温められた生理食塩水を胸腔内に送りかつ一方で吸引して回収することを特徴とする心臓の温度を維持しかつ乾燥を防止するための装置を備える。これらを備えることによって、実験に供するマウスの胸腔内温および直腸温を３５．８〜３６．４℃に維持すると同時に開胸中の体水分の蒸発を防ぐことができた。【０１３４】  さらに本発明に係るシステムは、左冠状動脈左前下行枝を結紮するための結紮保持具を備えることが好ましい。結紮保持具としては、留置針の外套部分を用いることが好ましい。このような結紮保持具を用いることによって、縫合糸を誤って切ることなく、実験の成功率が数段向上した。また、上記結紮保持具の結紮部に接触する部分が適度な柔軟性をもつ素材であること、および結紮部との間に０．５ｍｍ厚の小さな布を挟んで固定することにより組織を押し潰して血管を損傷することを防ぎ、再灌流をより確実に実施した。【０１３５】  さらに本発明に係るシステムは、経頚静脈薬剤注入器具を備えることが好ましい。経頚静脈薬剤注入器具としては、長さ７０ｍｍ、外径０．１６４ｍｍ、内径０．１ｍｍのニードルが好ましい。このような静脈薬剤注入器具を用いることによって、頚静脈に留置することが可能になり、当該器具を留置した状態で頚静脈を傷つけることなく長時間安全に薬剤を注入することが可能になった。【０１３６】  このように、本発明に係るインビボでの細胞死の評価方法は、上述した本発明に係るマウスの虚血および虚血後の再灌流を首尾よく行なうためのシステムを用いればよいといえる。そして、本発明に係るマウスの虚血および虚血後の再灌流を首尾よく行なうためのシステムは、体温維持のための保温器具を備えればよく、結紮保持具および経頚静脈薬剤注入器具をさらに備えればより好ましいといえる。さらに、本発明に係るインビボでの虚血および虚血後の再灌流を首尾よく行なうためのシステムにおいて、再灌流をより確実に実現するために、ヘパリンナトリウム（虚血開始前に１５０単位／ｋｇ体重、再灌流開始前に１００単位／ｋｇ（体重）を投与容量が１００μＬ以内になるように希釈して用いる）と硫酸プロタミン（再灌流開始２分後にヘパリン１０００単位に対して１０ｍｇを投与容量が１００μＬ以内になるように希釈して用いる）を頚静脈から投与することが好ましい。【０１３７】  本発明に係るシステムを用いれば、ＣＦＴＲ活性化剤をインビボでスクリーニングすることができる。すなわち、本発明に係るシステムは、ＣＦＴＲ活性化剤をインビボでスクリーニングするためのシステムでもあり得る。好ましい実施形態において、本発明に係るシステムは、体温維持のための保温器具、結紮保持具および持続的薬剤注入器具を備えている。一実施形態に係るシステムにおいて、上記保温器具は恒温槽を利用した保温手術台であることが好ましい。また、一実施形態に係るシステムにおいて、上記結紮保持具は留置針の外套部分であってもよい。一実施形態に係るシステムにおいて、上記持続的薬剤注入器具は経頚静脈的注入器具であることが好ましい。また、一実施形態に係るシステムにおいて、心臓の外環境維持、温度維持および乾燥防止のために加温生理食塩水を胸腔内で灌流させる器具がさらに備えられていることが好ましい。別の実施形態において、本発明に係るシステムは、ＣＦＴＲ活性化剤をインビボでスクリーニングするために、ＣＦＴＲ活性化剤としての候補因子を再灌流開始時または再灌流開始直前もしくは直後に被験体に投与する手段を有している。上記手段は、持続的薬剤注入器具であることが好ましい。本実施形態に係るシステムは、被験体に生じた梗塞巣サイズを測定する手段をさらに有し得る。【０１３８】  本発明はさらに、本発明に係るシステムを使用して実施される、ＣＦＴＲ活性化剤をインビボでスクリーニングするための方法を提供する。本発明に係るスクリーニング方法は、再灌流開始時または再灌流開始直前もしくは直後にＣＦＴＲ活性化剤としての候補因子を被験体に投与する工程；ならびに、被験体に生じた梗塞巣サイズを測定する工程、を包含することを特徴としている。本発明に係るスクリーニング方法は、上記投与する工程が経頚静脈的に行われることが好ましい。【０１３９】  上述したように、ＰＫＡ活性化剤およびＰＫＣ活性化剤の同時投与は、ＣＦＴＲ活性化剤として好ましい効果を奏する。よって、本発明に係るスクリーニング方法は、上記被験体に生じた梗塞巣サイズと、上記投与する工程において上記候補因子の代わりにＰＫＡ活性化剤およびＰＫＣ活性化剤を同時に投与して生じた梗塞巣サイズとを比較する工程を包含することが好ましい。好ましくは、上記ＰＫＡ活性化剤がｍｉｌｒｉｎｏｎｅであり得る。なお、上記「候補因子」は、単独でＣＦＴＲの活性化をもたらし得るＣＦＴＲ活性化剤もまた含み得る。【０１４０】  ＣＦＴＲノックアウトマウスを用いれば、候補因子の効果がＣＦＴＲ依存的であるか否かを判定することができる。よって、本発明に係るスクリーニング方法は、上記被験体として野生型マウスを用いて測定された梗塞巣サイズと、上記被験体としてＣＦＴＲノックアウトマウスを用いて測定された梗塞巣サイズとを比較する工程を包含してもよい。【０１４１】  本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求の範囲に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これに限定されるべきではない。【０１４２】  〔実施例〕
本実施例では、新生仔ラットの心室筋細胞の初代培養系をインビトロ実験として用い、インビボ実験としてマウスを用いた。これらのインビトロおよび／またはインビボでの実験において、本発明者らは以下の事項を検討した：
（ｉ）インビトロでＰＫＡおよびＰＫＣを同時活性化することにより得られた心筋細胞の虚血傷害に対する保護メカニズムがＣＦＴＲの機能に起因するものなのか；
（ｉｉ）心筋細胞の虚血傷害を防御するメカニズムにおけるＣＦＴＲの機能はネクローシスとアポトーシスのいずれの細胞死の防御に関与するのか；
（ｉｉｉ）ＣＦＴＲチャネル活性化剤をインビボでマウスに投与することによって、虚血または再灌流によって惹起される心筋傷害、特にネクローシス性心筋細胞死を抑制することができるのか；
（ｉｖ）ＣＦＴＲチャネル活性化剤をインビボで虚血開始後に投与しても虚血または再灌流によって惹起される心筋傷害、特にネクローシス性心筋細胞死を抑制することができるのか；および
（ｖ）ＣＦＴＲの発現レベルがインビボで心筋の虚血傷害の程度に影響を与えるのか。【０１４３】  ［実施例１］
本発明者らは、ＣＦＴＲがラット心室筋細胞に発現しており、虚血を誘導することによってＣＦＴＲの発現が当該細胞の形質膜上で一過性に亢進することを既に報告している（Ｈ．Ｕｒａｍｏｔｏ，Ｎ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ａ．Ｋ．Ｄｕｔｔａ，Ｒ．Ｚ．Ｓａｂｉｒｏｖ，Ｙ．Ａｎｄｏ−Ａｋａｔｓｕｋａ，Ｓ．Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ  ＆  Ｙ．Ｏｋａｄａ．Ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＣＦＴＲ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｉｎ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｒａｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ．Ｊｐｎ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ５３，３５７−３６５  ２００３）。また、ＣＦＴＲチャネルブロッカー、またはＰＫＡ活性化剤とＰＫＣ活性化剤とを虚血中に投与していることにより、再灌流後の細胞の回復が前者では悪化し、後者では改善されることを既に報告している（Ｈ．Ｕｒａｍｏｔｏ，Ｓ．Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ，Ｙ．Ａｎｄｏ−Ａｋａｔｓｕｋａ，Ｙ．Ｎａｇａｓａｋｉ，Ｎ．Ｈａｇｉｗａｒａ  ａｎｄ  Ｙ．Ｏｋａｄａ．Ａ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＣＦＴＲ  Ｃｌ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｒａｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ．Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５２，Ｓ３５，２００２）。そこで、ＣＦＴＲチャネル活性化剤による虚血傷害の改善効果がＣＦＴＲチャネルの活性化によるものなのか、そして上記改善効果がＣＦＴＲチャネルの活性化によるのであれば、ＣＦＴＲチャネルがラット心筋細胞の虚血傷害に対してどのように関与しているかを調べた。【０１４４】  新生仔ラットの心臓から酵素処理により初代培養心室筋細胞を調製した。培地には、Ｍ１９９液＋１０％ＦＢＳを用いた。培養中、心筋細胞以外の増殖性細胞の増殖を防ぐために１００μＭ  ＢｒｄＵを培地に添加した。【０１４５】  初代培養ラット心筋細胞に対する虚血処理（グルコースの除去かつ無酸素）および虚血後の再灌流を、以下のように行なった。培地を、グルコースを含有しない溶液（１０８ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳにＮａＨＣＯ３を加えてｐＨ７．４に調整した溶液）に置換し、外気を無酸素（９５％アルゴンガス＋５％炭酸ガス）として、３７℃で８時間培養した。その後、直ちにグルコース含有正常培地（Ｍ１９９液＋１０％ＦＢＳ）に置換し、酸素（約２０％）を含むＣＯ２インキュベータ（９５％空気＋５％炭酸ガス、３７℃）中で９６時間培養した（再灌流：グルコース再投与／再酸素供給）。【０１４６】  Ｃｌ−チャネルブロッカー（ＮＰＰＢ）を虚血処理１時間前または虚血処理時にラット初代培養心室筋細胞に投与した後８時間にわたって虚血させるか、あるいは虚血後の再灌流開始後より１８時間にわたって投与し、ＭＴＴ法を用いて細胞生存率を測定した。生存している細胞の数をできるだけ正確に把握するために、細胞生存率の測定を、虚血後の再灌流９６時間後の細胞を用いて行った（図１）。【０１４７】  これまでに確認しているように、ＣＦＴＲチャネルブロッカーによる細胞の生存率の有意な減少は、虚血処理時にＣＦＴＲチャネルブロッカー（５０μＭ  ＮＰＰＢ）を投与した場合にのみ観察され、虚血１時間前、または虚血後の再灌流開始後より１８時間にわたって投与した場合には観察されなかった。これらの結果は、ＣＦＴＲの虚血に対する耐性が虚血中に発揮されていることを示す。【０１４８】  ［実施例２］
実施例１と同様にラット初代培養心室筋細胞を調製した後培養した。実施例１と同様に初代培養ラット心筋細胞に対する虚血処理（グルコースの除去かつ無酸素）および虚血後の再灌流を行なった。【０１４９】  ＣＦＴＲチャネル活性化剤（ＰＫＡ活性化剤であるｄｂｃＡＭＰ（１ｍＭ）もしくはＰＫＣ活性化剤であるＰＭＡ（１００ｎＭ）またはこれら両方（ＤＰ））、またはＣＦＴＲチャネル活性化剤＋ＣＦＴＲチャネルブロッカー（ＮＰＰＢ（５０μＭ）、ｇｌｉｂｅｎｃｌａｍｉｄｅ（５００μＭ）、ｇｅｍｆｉｂｒｏｚｉｌ（２ｍＭ）または９ＡＣ（２ｍＭ））を、虚血処理時にラット初代培養心室筋細胞に投与した後８時間にわたって虚血させ、９６時間の再灌流を行った後に、ＭＴＴ法を用いて細胞生存率を測定した（図２）。【０１５０】  図２に示すように、ＰＫＡ活性化剤であるｄｂｃＡＭＰとＰＫＣ活性化剤であるＰＭＡを同時に投与することで生存率は有意に上昇したが、この効果はＣＦＴＲチャネルブロッカーを同時に投与することによって完全に消去された。【０１５１】  この結果は、ｄｂｃＡＭＰおよびＰＭＡの同時投与によって観察された効果がＣＦＴＲチャネルの活性化によるものであること、および、ＣＦＴＲチャネルが心筋細胞の虚血傷害に対して救済することを示す。【０１５２】  また、ｄｂｃＡＭＰおよびＰＭＡの同時投与による効果は、ｄｂｃＡＭＰまたはＰＭＡの単独投与では有意には生じなかった。このことは、プレコンディショニング様効果を示すことが知られているＰＭＡの単独効果によるものではないことを示す。【０１５３】  ［実施例３］
心筋において、虚血によってカテコールアミンが細胞間隙に放出され、その結果、内因性にｃＡＭＰが増加する。ホスホジエステラーゼＩＩＩはｃＡＭＰの分解を阻害する酵素であり、心臓に分布することが知られている。ｍｉｌｒｉｎｏｎｅは、この酵素の阻害剤である（Ｒ．Ｍ．Ｗａｌｌｉｓ，Ｊ．Ｄ．Ｃｏｒｂｉｎ，Ｓ．Ｈ．Ｆｒａｎｃｉｓ  ＆  Ｐ．Ｅｌｌｉｓ．Ｔｉｓｓｕｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ  ｏｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｔｒａｂｅｃｕｌａｅ  ｃａｒｎｅａｅ  ａｎｄ  ａｏｒｔｉｃ  ｒｉｎｇｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ８３，３Ｃ−１２Ｃ，１９９９）。ｍｉｌｒｉｎｏｎｅは、ＣＦＴＲチャネルを活性化することも示されている（Ｂ．Ｒ．Ｃｏｂｂ，Ｌ．Ｆａｎ，Ｔ．Ｅ．Ｋｏｖａｃｓ，Ｅ．Ｊ．Ｓｏｒｓｃｈｅｒ  ＆  Ｊ．Ｐ．Ｃｌａｎｃｙ．Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  Ｃｌ−  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃａｌｕ−３  ｃｅｌｌｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９，４１０−４１８，２００３）。また、ｍｉｌｒｉｎｏｎｅは、その半減期が２時間であり、血中では約７０％がタンパクと結合して循環しており、代謝されることなくそのまま尿中に排泄される（Ｌ．Ａ．Ｌｅｈｔｏｎｅｎ  Ｓ．Ａｎｔｉｌａ  ＆  Ｐ．Ｊ．Ｐｅｎｔｉｋａｉｎｅｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｉｎｏｔｒｏｐｉｃ  ａｇｅｎｔｓ．Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ  ４３，１８７−２０３，２００４）。臨床では、急性心不全の治療に用いられており、血管拡張作用、および強心作用が期待されている（Ｙ．Ｏｈｉｚｕｍｉ．Ｎｏｖｅｌ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｔｏｎｉｃ  ｄｒｕｇｓ．Ｆｏｌｉａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｊａｐｏｎ  １００，２５９−２６９，１９９２）。【０１５４】  本発明者らは、ホスホジエステラーゼＩＩＩインヒビターであるｍｉｌｒｉｎｏｎｅが、ＰＫＡ活性化剤であるｄｂｃＡＭＰと同様に、ＣＦＴＲチャネル活性化剤として虚血傷害抑制効果を示すのかどうかを調べた。【０１５５】  実施例１と同様にラット初代培養心室筋細胞を調製した後培養した。実施例１と同様に初代培養ラット心筋細胞に対する虚血処理（グルコースの除去かつ無酸素）および虚血後の再灌流を行なった。【０１５６】  ＣＦＴＲチャネル活性化剤（ｍｉｌｒｉｎｏｎｅ（０．７３μｇ、１ｍｌ）、ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ（１０ｎＭ）、およびＰＭＡ（１００ｎＭ）を併用（ＭＩＰ））、またはＣＦＴＲチャネル活性化剤＋ＣＦＴＲチャネルブロッカー（ＮＰＰＢ（５０μＭ）、ｇｌｉｂｅｎｃｌａｍｉｄｅ（５００μＭ）、ｇｅｍｆｉｂｒｏｚｉｌ（２ｍＭ）または９ＡＣ（２ｍＭ））を、虚血処理時にラット初代培養心室筋細胞に投与した後８時間にわたって虚血させ、９６時間の再灌流を行った後に、ＭＴＴ法を用いて細胞生存率を測定した（図３）。【０１５７】  図３に示すように、ｄｂｃＡＭＰと同様に、ｍｉｌｒｉｎｏｎｅとＰＭＡとを同時投与した細胞において生存率が改善され、この効果はいずれのＣＦＴＲチャネルブロッカーによっても抑制された。また、ｍｉｌｒｉｎｏｎｅはＣＦＴＲチャネルの活性化を介して心筋の虚血傷害に対して防御効果を示すことが明らかになった。【０１５８】  ［実施例４］
実施例１と同様にラット初代培養心室筋細胞を調製した後培養した。実施例１と同様に初代培養ラット心筋細胞に対する虚血処理（グルコースの除去かつ無酸素）を行なった。【０１５９】  虚血部位において生じる細胞死が虚血傷害に起因する細胞死であることを確認するために、ＣＦＴＲチャネルブロッカー（ＮＰＰＢ（５０μＭ））を、虚血処理時にラット初代培養心室筋細胞に投与した後８時間にわたって虚血させ、当該分野において公知の方法に従ってＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２とｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）とを用いて虚血終了直後の細胞を二重染色して、ネクローシス性の死細胞率を調べた。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２は、全ての細胞の核を染色し、ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）は、膜傷害を生じたネクローシス性の死細胞のみを染色する。【０１６０】  ８時間にわたる虚血によって、何も投与しない場合は４４．４％の細胞がＰＩで染色されたが、ＮＰＰＢを投与することによって９０．３％の細胞がＰＩ染色された（図４）。この結果は、再灌流の９６時間後にＭＴＴ法を用いて観察した細胞生存率低下がネクローシスに起因することを示す。【０１６１】  ［実施例５］
ＣＦＴＲチャネルが関与する虚血傷害に、アポトーシスが関与しているかを調べた。【０１６２】  実施例１と同様にラット初代培養心室筋細胞を調製した後培養した。実施例１と同様に初代培養ラット心筋細胞に対する虚血処理（グルコースの除去かつ無酸素）および虚血後の再灌流を行なった。【０１６３】  ＣＦＴＲチャネル活性化剤（ＰＫＡ活性化剤であるｄｂｃＡＭＰ（１ｍＭ）＋ＰＫＣ活性化剤であるＰＭＡ（１００ｎＭ））、またはＣＦＴＲチャネルブロッカー（ＮＰＰＢ（５０μＭ））を、虚血処理時にラット初代培養心室筋細胞に投与した後８時間にわたって虚血させ、虚血終了直後または虚血後の再灌流９６時間後の細胞における核ＤＮＡ断片化率を調べた（図５）。具体的には、アポトーシスに陥った細胞で特徴的に見られるモノヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドを特異的に検出する方法（ＤＮＡ断片化検出法（細胞死検出ＥＬＩＳＡキットＰＬＵＳ、ロシュ・ダイアグノスティックス社））を用いて、ＤＮＡ断片化を測定し、その結果を、ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒとして、以下の式を用いて求めた：
ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒ（核ＤＮＡ断片化率）＝試料（死んだ細胞）の吸光度／コントロール（未処理細胞）の吸光度。【０１６４】  図５に示すように、虚血直後では、未投与群、ＣＦＴＲチャネルブロッカー投与群、またはＣＦＴＲチャネル活性化剤投与群のいずれの細胞においても、ＤＮＡ断片化の発生程度（非虚血細胞の値を１とした）は、非虚血細胞と同レベルを示した。この結果は、ＮＰＰＢ投与によって観察された虚血直後の細胞死はアポトーシスとは関係なく、すなわち、ＣＦＴＲはアポトーシスではなくネクローシスの防御に機能していることを示す。【０１６５】  また、再灌流９６時間後においても、ＤＮＡ断片化の発生程度は３倍に増加したが、未投与群、ＣＦＴＲチャネルブロッカー投与群、またはＣＦＴＲチャネル活性化剤投与群の間で有意差はなかった。この結果は、ＣＦＴＲチャネルが再灌流後のアポトーシスに関与しないことを示す。【０１６６】  ［実施例６］
９週齢雄マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、クレア社）を、インビボ実験に用いた。麻酔導入をエーテルを用いて行った。手術台に固定して気管挿入した後、酸素と亜酸化窒素の混合ガス（酸素２０％）に１％セボフランを混合したガスを人工呼吸器にてマウスに吸入させて、呼吸管理および麻酔を維持した。左冠状動脈左前下行枝を縫合糸で結紮して、マウスの虚血処理を行った。虚血処理３０分後に、結紮を解いて再灌流を行った。薬剤の投与を、経頚静脈的に行った。虚血および再灌流後、結紮に用いた縫合糸をマウス胸腔内に残したまま閉胸した。マウスを麻酔から覚醒させた後、通常通り飼育した。飼育開始２日後にエーテル麻酔下で開胸した後、再び結紮してｅｖａｎｓ  ｂｌｕｅを心尖部より左心室に注入した後、直ちに心臓を摘出し、１ｍｍの厚さにスライスした。切片中の細胞生存部位を、ｔｒｉｐｈｅｎｙｌ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＴＴＣ）溶液によって染色した。虚血心筋傷害の程度の判定を、虚血域に対する梗塞域（ＴＴＣ非染色域）の割合として求めた。【０１６７】  なお、インビボ実験を実行する際に、以下のシステムを用いた。
（ａ）体温維持のための保温システム（図６）
（ｉ）手術台：恒温槽によって４０℃に温められた水が循環する構造
（ｉｉ）心臓の温度維持と乾燥防止システム：ポンプとヒーターを用いることによって温められた生理食塩水を胸腔内に送り、かつ一方で吸引して回収する
（ｉ）および（ｉｉ）によって、胸腔内温および直腸温を３５．８〜３６．４℃に維持すると同時に開胸中の体水分の蒸発を防ぎ、実験を可能にした。
（ｂ）結紮保持具：図７に示すように、留置針の外套部分を用いて、左冠状動脈左前下行枝を結紮する。この道具を用いることによって、縫合糸を誤って切ることなく、実験の成功率を高めた。また、０．５ｍｍ厚の小さな布を併用することにより結紮部組織の損傷を抑えて再灌流をより確実に実施した。
（ｃ）経頚静脈薬剤注入システム：図８に示すようにマイクロフィル（ＭｉｃｒｏＦｉｌＴＭ，Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＩＮＣ社：長さ７０ｍｍ、外径０．１６４ｍｍ、内径０．１ｍｍのニードル）を用いることによって、マイクロフィルを頚静脈に留置すること、およびマイクロフィルを留置した状態で頚静脈を傷つけることなく長時間安全に薬剤を注入することが可能になった。【０１６８】  ［実施例７］
一般に、インビトロ実験において、ＰＫＡの活性化剤として、ジブチリルサイクリックＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）、ホルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）、イソプロテレノール（ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ）等が用いられる。しかし、インビボ実験でこれら薬剤を用いることによる悪影響が懸念される。ｍｉｌｒｉｎｏｎｅは、ＣＦＴＲチャネルを活性化すること、および、実際に臨床で用いられていることから、インビボでの実験に適したＰＫＡ活性化剤と考えられる。【０１６９】  マウスを用いるインビボ実験を実施例６に従って行なった。図９Ａに示すように、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、図９Ｂに示す濃度でｍｉｌｒｉｎｏｎｅとＰＭＡの両方を含む生理食塩水を虚血開始１０分前に１ショットで投与した後、１ショットの１／３量が１時間で投与される速度で虚血終了まで持続投与した。【０１７０】  上記の投与プロトコルによって、著しい梗塞巣サイズの減少が観察された。このことは、ＣＦＴＲ活性化剤が心筋における虚血傷害をインビボにおいても抑制することを示す。【０１７１】  さらに、薬剤の投与時期を検討した。マウスを用いるインビボ実験を実施例６に従って行なった。図１０Ａに示す時期に薬剤を投与した後、虚血領域に対する梗塞巣領域の割合を調べた（図１０Ｂ）。３０分間の虚血では再灌流開始時１ショット投与でも虚血前から再灌流直前までの持続投与の場合と同程度に梗塞巣サイズを減少させる効果が見られた。【０１７２】  また、ＣＦＴＲ活性化剤投与による虚血傷害の抑制効果がＣＦＴＲの機能に起因するか否かを、ＣＦＴＲノックアウトマウス（ＣｆｔｒｔｔｍｌＵｎｃ）を用いて検討した。ただし、−／−マウスは生存率が極めて低かったので実験に供することができなかった。実験には、＋／−（ヘテロ）マウスまたは＋／＋（ＷＴ）マウスを供した。マウスを用いるインビボ実験を、実施例６に従って行った。虚血・再灌流を図１１Ａに示すように行った後、生じた梗塞巣サイズを調べた。ＣＦＴＲ発現量の少ないヘテロマウスにおいて、虚血・再灌流によって生じた梗塞巣サイズはＷＴマウスと比較して大きくなり、虚血傷害が悪化していた。【０１７３】  本発明は、虚血時、および不可逆性の傷害に陥る前の比較的短時間の虚血条件下での再灌流開始時または再灌流直前もしくは直後におけるＣＦＴＲチャネルの活性化が、心筋細胞のネクローシスに起因する様々な虚血性心筋細胞傷害の保護に効果的であることを初めて示す。【０１７４】  培養心室筋細胞にグルコース除去・無酸素処理後にグルコース再投与・再酸素化処理を行うという虚血・再灌流モデル実験を行い、ＭＴＴ法による細胞生存率の測定、ＤＮＡ断片化のＥＬＩＳＡ検出法によるアポトーシス判定法、そしてＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２とヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ））との二重染色によるネクローシスの判定を行うことで虚血傷害による心筋細胞死に対する治療・防御薬剤の効果判定法をインビトロで確立し、更にインビボ虚血・再灌流システム（薬剤の持続投与システムを含む）を確立した。これらを用い、虚血傷害による細胞死を虚血前〜虚血中または再灌流開始時にＣＦＴＲチャネル活性化剤を投与することによって抑制できることが明らかとなった��【０１７５】  β−アドレナリン刺激によるＣＦＴＲチャネルの活性化が浸透圧的に膨張した心筋細胞の調節性容積減少（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｖｏｌｕｍｅ  ｄｅｃｒｅａｓｅ（ＲＶＤ））をもたらすことが報告されている（Ｚ．Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｍｉｔｕｉｙｅ，Ｓ．Ａ．Ｒｅｅｓ  ＆  Ａ．Ｎｏｍａ．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｖｏｌｕｍｅ  ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  β−ａｄｒｅｎｒｇｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｌ−  ｃｈａｎｎｅｌ  ｉｎ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １０，７３−８２，１９９７）。従って、本発明によるネクローシス防御のメカニズムは、虚血傷害で生じるネクローシスの原因である異常な細胞膨潤に対してＣＦＴＲが抑制的に機能して、容積を元のレベルに回復させることによるものと考えられる。【０１７６】  尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用可能性】
【０１７７】  上記構成を採ることによって、本発明に係る薬学的組成物は、心室筋の細胞死を抑制することができる。また、本発明に係る薬学的組成物は、心臓外科手術において心筋を保護することができる。さらに、本発明に係る薬学的組成物は、ネクローシスに起因する疾患を予防する処置として用いることができる。【０１７８】  また、本発明に係るインビボでの虚血および虚血後再灌流のためのシステムは、上記構成を採ることによって、実験に供するマウスの胸腔内温および直腸温を３５．８〜３６．４℃に維持すると同時に開胸中の体水分の蒸発を防ぎ、その結果、実験を首尾よく行なうことができる。【０１７９】  本発明は、これまで虚血傷害の防御因子として考えられていなかったＣＦＴＲを標的とする虚血性心筋傷害に対する新規の防御策である。本発明を用いれば、心臓外科手術および心臓移植手術で虚血傷害が問題となっている外科手術症例における心筋保護法に適用することで改善効果を得ることができる。また、本発明を用いれば、再灌流時での投与においても効果が見られるので、虚血発作を生じた後の投与、すなわち内科的治療においても適用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年7月13日(2006.7.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】請求の範囲
【請求項１】体温維持のための保温器具、結紮保持具および持続的薬剤注入器具を備えている、ＣＦＴＲ活性化剤をインビボでスクリーニングするためのシステムであって、
心臓の外環境維持、温度維持および乾燥防止のために加温生理食塩水を胸腔内で灌流させる器具がさらに備えられていることを特徴とするシステム。
【請求項２】上記保温器具が、恒温槽を利用した保温手術台であることを特徴とする請求の範囲１に記載のシステム。
【請求項３】上記結紮保持具が留置針の外套部分であることを特徴とする請求の範囲１に記載のシステム。
【請求項４】上記持続的薬剤注入器具が経頚静脈的注入器具であることを特徴とする請求の範囲１に記載のシステム。
【請求項５】請求の範囲１〜４に記載のシステムを使用してＣＦＴＲ活性化剤をインビボでスクリーニングするための方法であって、
再灌流開始時または再灌流開始直前もしくは直後にＣＦＴＲ活性化剤としての候補因子を被験体に投与する工程；ならびに
被験体に生じた梗塞巣サイズを測定する工程
を包含することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項６】上記投与する工程が経頚静脈的に行われることを特徴とする請求の範囲５に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】上記被験体に生じた梗塞巣サイズと、上記投与する工程において上記候補因子の代わりにＰＫＡ活性化剤およびＰＫＣ活性化剤を同時に投与して生じた梗塞巣サイズとを比較する工程を包含する請求の範囲５に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】上記ＰＫＡ活性化剤がホスホジエステラーゼＩＩＩインヒビターであることを特徴とする請求の範囲７に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】上記ＰＫＣ活性化剤が、ホルボール１２−ミリスチン酸エステル１３酢酸塩であることを特徴とする請求の範囲７に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】上記被験体に生じた梗塞巣サイズと、上記投与する工程において上記候補因子の代わりに単独でＣＦＴＲ活性化剤を投与して生じた梗塞サイズとを比較する工程を包含することを特徴とする請求の範囲５に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】上記被験体として野生型マウスを用いて測定された梗塞巣サイズと、上記被験体としてＣＦＴＲノックアウトマウスを用いて測定された梗塞巣サイズとを比較する工程を包含する請求の範囲５に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】虚血または虚血後の再灌流によって生じる心室筋の細胞死を抑制するための薬学的組成物であって、
該ＣＦＴＲチャネル活性化剤は、ＰＫＡ性化剤とＰＫＣ活性化剤との混合物であるＣＦＴＲチャネル活性化剤を含み、
該再灌流を開始した際に該心室筋に適用するために処方されている
ことを特徴とする薬学的組成物。
【請求項１３】上記ＰＫＡ活性化剤が、ジブチリルサイクリックＡＭＰまたはホスホジエステラーゼＩＩＩインヒビターであることを特徴とする請求の範囲１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】上記ホスホジエステラーゼＩＩＩインヒビターが、１，６−ｄｉｈｙｄｒｏ−２−ｍｅｔｈｙｌ−６−ｏｘｏ［３，４’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ］−５−ｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅであることを特徴とする請求の範囲１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】上記ＰＫＣ活性化剤が、ホルボール１２−ミリスチン酸エステル１３酢酸塩であることを特徴とする請求の範囲１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】上記細胞死が、ネクローシスであることを特徴とする請求の範囲１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】上記細胞死が、心筋組織において虚血中に生じる異常によって誘発されることを特徴とする請求の範囲１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】上記細胞死が、ミトコンドリア脱水素酵素の活性低下を伴うことを特徴とする請求の範囲１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】心室筋初代培養細胞のネクローシス性細胞死を抑制するための請求の範囲１２に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】心室筋梗塞域を低減することを特徴とする請求の範囲１２に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】再灌流を行う心臓外科手術または心臓移植手術において心筋を保護するための薬学的組成物であって、
該ＣＦＴＲチャネル活性化剤は、ＰＫＡ活性化剤とＰＫＣ活性化剤との混合物であるＣＦＴＲチャネル活性化剤を含み、
該再灌流を開始した際に該心筋に適用するために処方されている
ことを特徴とする薬学的組成物。
【請求項２２】上記ＰＫＡ活性化剤が、ジブチリルサイクリックＡＭＰまたはホスホジエステラーゼＩＩＩインヒビターであることを特徴とする請求の範囲２１に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】上記ホスホジエステラーゼＩＩＩインヒビターが、１，６−ｄｉｈｙｄｒｏ−２−ｍｅｔｈｙｌ−６−ｏｘｏ［３，４’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ］−５−ｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅであることを特徴とする請求の範囲２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】上記ＰＫＣ活性化剤が、ホルボール１２−ミリスチン酸エステル１３酢酸塩であることを特徴とする請求の範囲２１に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】ネクローシスを生じる心臓の外科手術および移植手術において適用するために処方されていることを特徴とする請求の範囲２１に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】ＣＦＴＲチャネル活性化剤を投与する工程を包含する心室筋の細胞死を抑制する方法。
【請求項２７】ＣＦＴＲチャネル活性化剤を投与する工程を包含する心臓外科手術および心臓移植手術において心筋を保護する方法。
【請求項２８】ＣＦＴＲチャネル活性化剤を投与する工程を包含するネクローシスに起因する疾患を予防する方法。
【請求項２９】非ヒト哺乳動物において虚血または虚血後の再灌流によって生じる心室筋の細胞死を抑制する方法であって、
再灌流を開始した際に、ＣＦＴＲチャネル活性化剤を該心室筋に適用する工程
を包含することを特徴とする方法。
【請求項３０】上記ＣＦＴＲチャネル活性化剤が、ＰＫＡ活性化剤とＰＫＣ活性化剤との混合物であることを特徴とする請求の範囲２９に記載の方法。
【請求項３１】上記ＰＫＡ活性化剤が、ホスホジエステラーゼＩＩＩインヒビターであることを特徴とする請求の範囲３０に記載の方法。
【請求項３２】上記ホスホジエステラーゼＩＩＩインヒビターが、１，６−ｄｉｈｙｄｒｏ−２−ｍｅｔｈｙｌ−６−ｏｘｏ［３，４’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ］−５−ｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅであることを特徴とする請求の範囲３１に記載の方法。
【請求項３３】上記ＰＫＣ活性化剤が、ホルボール１２−ミリスチン酸エステル１３酢酸塩であることを特徴とする請求の範囲３０に記載の方法。
【請求項３４】上記細胞死が、ネクローシスであることを特徴とする請求の範囲３０に記載の方法。
【請求項３５】再灌流を行う、非ヒト哺乳動物の心臓外科手術または心臓移植手術において心筋を保護する方法であって、
再灌流を開始した際に、ＣＦＴＲチャネル活性化剤を該心筋に適用する工程
を包含することを特徴とする方法。
【請求項３６】上記心臓外科手術または心臓移植手術が、ネクローシスを生じる心臓の外科手術または移植手術であることを特徴とする請求の範囲３５に記載の方法。
【請求項３７】上記ＣＦＴＲチャネル活性化剤が、ＰＫＡ活性化剤とＰＫＣ活性化剤との混合物であることを特徴とする請求の範囲３５に記載の方法。
【請求項３８】上記ＰＫＡ活性化剤が、ホスホジエステラーゼＩＩＩインヒビターであることを特徴とする請求の範囲３７に記載の方法。
【請求項３９】上記ホスホジエステラーゼＩＩＩインヒビターが、１，６−ｄｉｈｙｄｒｏ−２−ｍｅｔｈｙｌ−６−ｏｘｏ［３，４’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ］−５−ｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅであることを特徴とする請求の範囲３８に記載の方法。
【請求項４０】上記ＰＫＣ活性化剤が、ホルボール１２−ミリスチン酸エステル１３酢酸塩であることを特徴とする請求の範囲３７に記載の方法。
【請求項４１】体温維持のための保温器具を備えている、インビボでの虚血および虚血後再灌流のためのシステムであって、
心臓の外環境維持、温度維持および乾燥防止のために加温生理食塩水を胸腔内で灌流させる器具がさらに備えられていることを特徴とするシステム。
【請求項４２】結紮保持具および持続的薬剤注入器具をさらに備えることを特徴とする請求の範囲４１に記載のインビボでの虚血および虚血後再灌流のためのシステム。
【請求項４３】上記保温器具が恒温槽を利用した保温手術台であることを特徴とする請求の範囲４１に記載のインビボでの虚血および虚血後再灌派のためのシステム。
【請求項４４】上記結紮保持具が、留置針の外套部分であることを特徴とする請求の範囲４２に記載のインビボでの虚血および虚血後再灌流のためのシステム。
【国際調査報告】
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