(57)【要約】インスリン溶液にインスリンの二量体形成面又は六量体形成面と相互作用する物質を添加して、インスリンの二量体形成および／又は六量体形成が阻害された超速効型インスリン製剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン溶液に、インスリンの二量体形成面又は六量体形成面と相互作用する物質を添加することにより、インスリンの二量体形成および／又は六量体形成を阻害する方法。
【請求項２】
インスリンの二量体形成面又は六量体形成面と相互作用する物質が、化合物、ペプチド又はタンパク質であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
インスリンの二量体形成面又は六量体形成面と相互作用する物質が、インスリンとインスリンレセプターとの結合を阻害することなく二量体形成及び／又は六量体形成を阻害するものである、請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法に用いられるインスリンの二量体形成面又は六量体形成面と相互作用する物質からなるインスリン単量体形成促進剤。
【請求項５】
インスリンの二量体および／または六量体形成を阻害する活性を有するペプチドであって、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド：
（ａ）配列番号４記載のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号４記載のアミノ酸配列において、第１，４，５，８，９，１２及び１６位のアミノ酸残基以外の１若しくは数個のアミノ酸残基に置換、欠失、挿入及び／又は付加を有するアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１または２記載のアミノ酸配列、又は
（ｄ）配列番号１または２記載のアミノ酸配列において、第２、３、６、７、１０、１１、１３、１４及び１５位のアミノ酸残基のうちの１若しくは数個のアミノ酸残基に置換、欠失、挿入および／または付加を有するアミノ酸配列。
【請求項６】
配列番号２記載のアミノ酸配列において、第２、３、６、７、１０、１１、１３、１４及び１５位のアミノ酸残基のうちの１若しくは数個のアミノ酸残基に置換、欠失、挿入および／または付加を有し、第１、４、５、８、９、１２及び１６位のアミノ酸残基のうちの少なくとも５残基が保持されてなる、インスリンの二量体および六量体形成を阻害するペプチド。
【請求項７】
請求項５または６記載のペプチド及びインスリンを含む医薬組成物。
【請求項８】
インスリンの二量体形成面又は六量体形成面と相互作用を有し、インスリン単量体形成を促進する物質を選択する方法であって、以下の工程を含む方法：
（ｉ）候補物質を、インスリン二量体又はインスリン六量体と接触せしめ、インスリン単量体形成を測定する工程、
（ii）配列番号２記載の配列を含むペプチドまたはそのアナログとインスリン二量体又はインスリン六量体を接触せしめ、インスリン単量体形成の被検対照とし、前記工程１）のインスリン単量体形成と比較する工程、及び
（iii）候補物質から、配列番号２記載の配列を含むペプチドまたはそのアナログと同程度以上のインスリン単量体形成能を有する物質を選択する工程。
【請求項９】
インスリン含有製剤を製造する方法であって、請求項８に記載の方法を用いてインスリン単量体形成促進能を有する物質を同定する工程、並びに、該物質をインスリンを含有する溶液に添加する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリンの二量体形成及び／又は六量体形成を阻害する方法に関する。さらに、インスリンの二量体形成及び／又は六量体形成を阻害する物質、及び当該物質が添加されてなるインスリン製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は慢性の全身性代謝障害を引き起こす疾患であり、その発症原因はインスリン分泌不全またはインスリン抵抗性によることが知られている。糖尿病疾患者数は、全世界において２００３年の時点で約２億人であるが、２０２５年には３億人を超えると予想されている。また、糖尿病治療薬の市場は、全世界において２０００年の時点で約９０００億円であるが、２００６年には２兆円を超えると予想されている。このように、糖尿病をターゲットした市場規模は非常に大きく、これまで世界各地で盛んに研究が行われてきた。
糖尿病治療薬は、インスリン製剤および経口剤に大別でき、そのうちインスリン製剤は売り上げの約半分を占める。インスリン製剤として以前は野生型インスリンを用いていたが、投与してから薬効を示すまでに３０分以上の時間を要するという難点があった。これは、野生型インスリンが溶液製剤中でまず二量体を形成し、さらに六量体を形成する性質を持っており、毛細血管へ容易に吸収され得る単量体へ解離するまでに時間を要することが原因である。そこで、野生型インスリンに部位特異的変異を導入して六量体化を妨げる試みが行われた。その結果として、短時間で薬効を示す超速効型のインスリン製剤、例えばリスプロインスリン（イーライリリー社）、アスパルトインスリン（ノボ・ノルディスク社）、およびアピドラインスリン（アベンティス・ファーマシューティカルス社）が開発された。このようなインスリンアナログは、製剤中で安定な六量体構造を形成しにくいため、投与後速やかに毛細血管へ吸収されて薬効を示す。しかし、部位特異的変異を導入したインスリンアナログは、野生型インスリンとはアミノ酸配列が異なることから、様々な問題点も生じている。例えば、インスリンアナログは野生型インスリンと比べて凝集しやすい性質があり、不安定であることが挙げられる（特許文献１又は２参照）。これは、二量体あるいは六量体形成により覆い隠されていたインスリンアナログの疎水面が、単量体化することによって溶媒へ露出してしまうことによる。
このような背景の中、より安定なインスリンアナログを開発する試みは今でも行われているが、インスリンの変異体を用いている限り、六量体形成を阻害することは実現できても、変異体の示す未知の副作用や物性に関しては、その危惧が消えることはない。
【特許文献１】Bakaysa, D.L. et al., 米国特許第5,474,978号明細書
【特許文献２】Michael, R. et al., 米国特許公開第20030104983号明細書
【発明の開示】
【０００３】
本発明者らは、野生型インスリンそのものを用いて超速効型インスリン製剤を開発することを目的に研究を開始した。まず、インスリンとインスリン受容体の相互作用を損なうことなく、二量体及び／又は六量体形成を阻害することを試みた。さらに、野生型インスリンに二量体及び／又は六量体形成を阻害する物質を添加することによって、超速効型インスリン製剤を実現することが可能であると考えた。
すなわち、本発明の課題の一つは、野生型インスリンの二量体形成および／又は六量体形成を阻害する方法を提供することである。また、本発明の別の課題は、野生型インスリンの二量体形成および／又は六量体形成を阻害する物質を提供すること、及びそのような物質を用いて超速効型インスリン製剤を製造することである。
【０００４】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討した。その結果、インスリンのレセプター結合活性を損なわずに、インスリンの二量体および六量体形成を阻害できる物質を見出して、本発明を完成させるに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、以下の態様を含むものである。
（１）インスリン溶液に、インスリンの二量体形成面又は六量体形成面と相互作用する物質を添加することにより、インスリンの二量体形成および／又は六量体形成を阻害する方法。
（２）インスリンの二量体形成面又は六量体形成面と相互作用する物質が、化合物、ペプチド又はタンパク質であることを特徴とする、（１）の方法。
（３）インスリンの二量体形成面又は六量体形成面と相互作用する物質が、インスリンとインスリンレセプターとの結合を阻害することなく二量体形成及び／又は六量体形成を阻害するものである、（１）又は（２）のいずれかの方法。
（４）（１）〜（３）のいずれかの方法に用いられるインスリンの二量体形成面又は六量体形成面と相互作用する物質からなるインスリン単量体形成促進剤。
（５）インスリンの二量体および／または六量体形成を阻害する活性を有するペプチドであって、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド：
（ａ）配列番号４記載のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号４記載のアミノ酸配列において、第１，４，５，８，９，１２及び１６位のアミノ酸残基以外の１若しくは数個のアミノ酸残基に置換、欠失、挿入及び／又は付加を有するアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１または２記載のアミノ酸配列、又は
（ｄ）配列番号１または２記載のアミノ酸配列において、第２、３、６、７、１０、１１、１３、１４及び１５位のアミノ酸残基のうちの１若しくは数個のアミノ酸残基に置換、欠失、挿入および／または付加を有するアミノ酸配列。
（６）配列番号２記載のアミノ酸配列において、第２、３、６、７、１０、１１、１３、１４及び１５位のアミノ酸残基のうちの１若しくは数個のアミノ酸残基に置換、欠失、挿入および／または付加を有し、第１、４、５、８、９、１２及び１６位のアミノ酸残基のうちの少なくとも５残基が保持されてなる、インスリンの二量体および六量体形成を阻害するペプチド。
（７）（５）または（６）のペプチド及びインスリンを含む医薬組成物。
（８）インスリンの二量体形成面又は六量体形成面と相互作用を有し、インスリン単量体形成を促進する物質を選択する方法であって、以下の工程を含む方法：
１）候補物質を、インスリン二量体又はインスリン六量体と接触せしめ、インスリン単量体形成を測定する工程、
２）配列番号２記載の配列を含むペプチドまたはそのアナログとインスリン二量体又はインスリン六量体を接触せしめ、インスリン単量体形成の被検対照とし、前記工程１）のインスリン単量体形成と比較する工程、及び
３）候補物質から、配列番号２記載の配列を含むペプチドまたはそのアナログと同程度以上のインスリン単量体形成能を有する物質を選択する工程。
（９）インスリン含有製剤を製造する方法であって、（８）の方法を用いてインスリン単量体形成能を有する物質を同定する工程、並びに、該物質をインスリンを含有する溶液に添加する工程を含む方法。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】設計したペプチドの配列。インスリンB鎖のアミノ酸配列のうち、B鎖αへリックス領域でインスリン二量体界面に存在する残基を一重下線で示した。また、αへリックスを形成しやすいように組み込んだグルタミン酸残基とリジン残基を二重下線で示した。
【図２】ＩＮＨＤ１ペプチドまたはＩＮＤＨ２ペプチドによるインスリン六量体形成の阻害を示したゲル濾過クロマトグラムである。対照として、ＩＮＨＤペプチド非存在下の結果も示している（Ｉｎｓｕｌｉｎ）。５μＭのインスリン溶液の場合、六量体がメインピーク（溶出量約１２〜１３ｍｌのピーク）として観測されるが、ＩＮＨＤ１ペプチドを添加したことにより、インスリン六量体が大幅に減少している。
【図３】BIACORE2000による、インスリンとインスリンレセプターの相互作用解析。Ｆｃ融合ヒトインスリンレセプターを固定化し、インスリン溶液を時間ゼロのときに添加した。全測定においてインスリンの濃度は5μM である。(a) ZnCl2存在下、非存在下におけるインスリンのインスリンレセプター結合実験。インスリンはZnCl2存在下では六量体を形成し、非存在下では単量体として存在する。(b) ＩＮＨＤ１およびＩＮＨＤ２ペプチド存在下、非存在下におけるインスリンのインスリンレセプター結合。溶媒にはZnCl2を添加しているため、ペプチド非存在下ではインスリンは六量体を形成している。ペプチドを添加することにより、六量体形成が阻害され、インスリンとインスリンレセプターの相互作用が向上している。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を具体的に説明する。【０００８】
＜インスリン多量体形成阻害剤＞
本発明のインスリンの二量体形成および／又は六量体形成を阻害する方法に用いる物質は、インスリン二量体又は六量体形成面と相互作用し、該二量体形成および／又は六量体の形成を阻害する物質である。本明細書においては、このような物質を、インスリン多量体形成阻害剤、インスリン二量体および／又は六量体形成阻害剤、またはインスリン単量体形成促進剤などと呼ぶ。
インスリン多量体形成阻害剤は、低分子化合物、ペプチド又はタンパク質から選択される物質であることが好ましい。【０００９】
インスリン二量体および六量体の立体構造についてはすでに報告されており、インスリン同士が相互作用する二量体および六量体形成面が明らかになっている（Blundell, T.L. et al., Nature 231, 506-511 (1971)、Baker, E.N., Philos. Trans. R. Soc. London 319, 369-456 (1998)、Derawenda, U. et al., Nature 338, 594-596 (1989)、Badger, J. Acta Crystallogr., Sect. B 47, 127-136 (1991)）。インスリン二量体形成面とは、B鎖αへリックスとそれに続くβストランドからなる残基から構成され、Ｂ鎖（配列番号３）の第５、８、９、１２、１３、１６、２０−２９位のアミノ酸残基が関与している。一方、インスリン六量体形成面とは、A鎖（配列番号５）の第７、８、９、１０、１３位のアミノ酸残基とB鎖の第３、７、１０、１１、１４、１７位のアミノ酸残基から構成されている。B鎖のαへリックスは二量体形成にも六量体形成にも重要であるが、関与している面は異なる。【００１０】
本発明のインスリン多量体形成阻害剤は、インスリンの二量体形成面と六量体形成面のいずれかと相互作用する物質、または、両方の面と相互作用する物質のいずれであっても良いが、二量体形成面と相互作用することが好ましい。インスリンは六量体を形成する前段階として、まず二量体を形成する。言い換えれば、インスリン同士では、六量体形成面における相互作用よりも二量体形成面おける相互作用の方が強い。つまり、インスリンの二量体形成面に相互作用する物質は、効果的にインスリンの二量体および六量体形成を阻害することができる。【００１１】
インスリン多量体形成阻害剤として、インスリンの六量体形成面と相互作用するものを設計することも可能である。【００１２】
インスリンとインスリンレセプターとの相互作用については、カイネティックス解析によって、インスリンレセプターに対して２分子以上のインスリンが結合すること、および、インスリンはインスリンレセプターに対して２つの結合面（結合面１および２）を持つことが知られている。インスリンのインスリンレセプターに対する結合面については、部位特異的変異法や化学修飾法などを用いて研究されており、結合面１には、Ａ鎖Ｌｅｕ１３とＢ鎖Ｌｅｕ１７の両残基が、結合面２にはＡ鎖Ｇｌｙ1、Ａ鎖Ｉｌｅ２、Ａ鎖Ｖａｌ３、Ａ鎖Ｔｙｒ１９、Ａ鎖Ａｓｎ２１、Ｂ鎖Ｖａｌ１２、Ｂ鎖Ｔｙｒ１６、Ｂ鎖Ｇｌｙ２３、Ｂ鎖Ｐｈｅ２４、Ｂ鎖Ｐｈｅ２５、およびＢ鎖Ｔｙｒ２６の各残基が含まれることが知られている（De Meyts, P. et al. Nat. Rev. Drug. Discov. 1, 769-783 (2002)）。
インスリンは、まず結合面１においてインスリンレセプターと相互作用（一次結合）した後、結合面２において相互作用（二次結合）することによって、生理機能を発現すると考えられている。インスリンの機能発現には結合面２における相互作用が必須であるが、一次結合を形成していない結合面２における単独の相互作用においては非常に微弱なインスリン活性しか示さないことから、インスリンが効果的な機能発現を行うためには、結合面１を介した一次結合が重要であることがわかる。また、インスリンの効果的な機能発現に留まらず、インスリンとインスリンレセプターとの親和性の向上、および他のレセプター、例えばインスリン様成長因子レセプターとインスリンレセプターとの選択性においても、結合面１が重要な役割を果たしていることが明らかとなっている（Schlein, M. et al. Biochemistry 40, 13520-13528 (2001)、Pillutla, R.C. et al. J. Biol. Chem. 277, 22590-22594 (2002)、Schaffer, L. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 4435-4439 (2003)）。【００１３】
そこで、本発明に用いるインスリン多量体形成阻害剤としては、インスリンの二量体形成および六量体形成を阻害し、かつ、インスリンとインスリンレセプターとの相互作用を大きく損なわない物質が好ましい。当該物質が、多量体形成面と同時に、インスリンとインスリンレセプターの結合面にも相互作用を有する場合は、インスリンの結合面１よりも結合面２とより高い相互作用を有する物質であれば、より好ましい。これは、上記で述べたように、インスリンが効果的な機能発現を行うためには、インスリンがインスリンレセプターに対して、まず結合面１において相互作用することが必須であることによる。
当該物質が多量体形成を阻害することはゲルろ過実験などによって分子量を測定することにより判定することができ、また、インスリン受容体結合を阻害しないことはBIACORE等入手可能な市販の装置やキットを用い、インスリンとインスリン受容体の相互作用実験により容易に判定することができる。【００１４】
インスリン二量体の立体構造において、インスリンＢ鎖のαへリックスは、もう一方のインスリンＢ鎖のαへリックスと相互作用し、また、Ｃ末領域もそれぞれβストランドを形成することによって相互作用している。したがって、結合面１と相互作用することなく、インスリンの二量体形成面に対して相互作用する物質は、インスリンＢ鎖αヘリックスおよびそれに続くＣ末端領域に対応するペプチド又は当該ペプチドと類似の構造を有する物質であることが好ましい。【００１５】
＜インスリン多量体形成阻害剤の製造方法＞  
本発明に用いるインスリン多量体形成阻害剤を製造するには、上記の特性を備えた物質を適宜選択、又は、設計すればよい。当該化合物を設計、選択する方法としては、後述するインスリン多量体形成阻害剤のスクリーニング方法に従い、以下に述べるインスリン多量体形成阻害剤の設計方法により設計される化合物をリファレンス化合物とし、インスリン単量体形成能を検定することにより、効率的にスクリーニングを実施することが出来る。
（１）インスリン多量体形成阻害剤の設計
前述のとおり、本発明のインスリン多量体形成阻害剤は、インスリンＢ鎖αヘリックスおよびそれに続くＣ末端領域に対応するペプチド又は当該ペプチドと類似の構造を有する物質であることが好ましい。かかる物質を設計するには、インスリンの立体構造情報をプロテインデータベース（www.rcsb.org/pdb/）等のデータベースから入手し、当該領域の分子座標情報を利用することにより、適切な目的化合物の構造を設計することができる。例えば、二量体界面に含まれるB鎖Ｖａｌ１２のメチル基、Ｂ鎖Ｇｌｕ１３のカルボキシアミド基、およびＢ鎖Ｔｙｒ１６の芳香環の３つの官能基を模倣した化合物を設計する場合、各官能基の原子間距離をインスリン立体構造上において算出する。これら官能基と原子間距離の条件に合致する低分子化合物を、Available Chemical Database（MDL Information System Inc., San Leandro, USA）などの化合物データベースにおいて、Sybyl（Tripos Inc., St. Louis, USA）やIsis/Base（MDL Information System Inc., San Leandro, USA）などの検索ソフトを用いて探索し、候補化合物を抽出する。得られた候補化合物群がインスリンの多量体形成を阻害することをゲルろ過実験などで評価することによって、二量体界面を模した低分子化合物を合理的に得ることができる。二量体界面を模倣した化合物を設計する上で、選択する官能基は上記の組み合わせに限定されるものではなく、例えば、B鎖Ｈｉｓ５、Ｇｌｙ８、Ｓｅｒ９、Ｖａｌ１２、Ｇｌｕ１３、Ｔｙｒ１６、Ｇｌｙ２０の側鎖から選択される任意の３つ、もしくはそれ以上の官能基の組み合わせであっても良い。ただし、用いる官能基は、上記各アミノ酸残基のいずれかに必ずしも限定されるものではない。
（２）インスリン多量体形成阻害活性を有するペプチドの設計
インスリン多量体形成阻害剤として、インスリンＢ鎖αヘリックスおよびそれに続くＣ末端領域に対応するペプチド又は当該ペプチドと類似の構造を有するペプチドを選択する場合、当該ペプチドはインスリンＢ鎖のαへリックスと容易に相互作用させるために、よりαへリックスの構造をとりやすくするように改変されたものでもよい。例えば、αへリックスを形成し易くするために、該ペプチドにおいて３残基間隔でグルタミン酸残基とリジン残基を組み入れることができる。
なお、αへリックスを形成するペプチドを作製する方法としては、ペプチドをリンカーによって環化する方法（Judice, J.K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 13426-13430 (1997)）や、金属イオンをキレートさせる方法（Kelso, M.J. et al., J. Am. Chem. Soc. 122, 10488-10489 (2000)）などが確立されている。また、αへリックスを形成するタンパク質を鋳型として必要な残基を組み込む方法（Zondlo, N.J. et al., J. Am. Chem. Soc. 121, 6938-6939 (1999)、Schepartz, S.A. et al., U.S. Patent Application 20030166240）なども報告されており、いずれもインスリンの二量体および六量体形成を阻害するペプチドを設計する方法として適用することができるが、該方法に限定されるものではない。【００１６】
インスリンB鎖のアミノ酸配列としては配列番号３のアミノ酸配列が挙げられる。このうちのインスリン二量体界面に位置する残基が六量体形成や二量体形成の阻害に重要と考えられる。配列番号３に記したインスリンB鎖では第５、８、９、１２、１３、１６、２０位のアミノ酸残基が二量体界面に対応する。したがって、第５〜２０位のアミノ酸配列（配列番号４）を有するペプチドを本発明のインスリン多量体形成阻害剤として用いることができる。【００１７】
さらに、配列番号４のアミノ酸配列を改変したアミノ酸配列を有するペプチド（配列番号１または２など）を用いることもできる。これらの配列は、配列番号４のアミノ酸配列において、３残基ごとにグルタミン酸残基とリジン残基を導入し、さらに、第９位のグルタミン酸をグルタミンに置換したものである。
この配列番号１または２に記したペプチドでは第１、４、５、８、９、１２、１６位のアミノ酸残基が二量体界面に対応する。
インスリンB鎖（配列番号３）の第１３位はグルタミン酸であるが、静電的な反発のため、六量体形成に好ましくない残基として知られている（Bentley, G.A. et al., J.Mol.Biol.228, 1163-1176 (1992)）。したがって、配列番号３の第13位（配列番号４の第９位）に対応するアミノ酸残基は、本発明において改変し、設計したペプチド（配列番号２）ではグルタミン残基へと置換した（図１）。
なお、配列番号１，２または５のペプチド、それらの改変体などは通常のペプチド合成法に従って作製することができる。また、これらのペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いた遺伝子組換え法によって作製してもよい。遺伝子組換え法を利用する場合、上記ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、インスリンをコードする塩基配列（例えば、GenBank Accession No.J00265などに登録されている塩基配列）に基づいて設計されたプライマーを用いたPCR法によって得ることができる。また、上記ペプチドが野生型の配列に対してアミノ酸置換を含む場合は、そのような置換が生じるように部位特異的変異法によってポリヌクレオチドを改変すればよい。さらに、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、上記ポリペプチドをコードするセンス鎖と、その相補配列を有するアンチセンス鎖をそれぞれ合成し、それらをアニーリングさせることによっても得ることができる。上記のようにして得られたポリヌクレオチドを大腸菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞などの適当な宿主細胞において発現させ、精製することによって目的ペプチドを得ることもできる。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は通常の手段によって行うことができ、例えば、プラスミドを用いる方法やウイルスベクターを用いる方法などが挙げられる（Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., “Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).）。【００１８】
インスリンB鎖（配列番号３）のうち、二量体界面を形成する第５、８、９、１２、１３、１６、２０位（配列番号４の第１、４、５、８、９、１２、１６位）のアミノ酸残基が六量体形成や二量体形成の阻害に重要であると考えられるため、それ以外の残基に１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加を有するアミノ酸配列であっても良い。
また、配列番号３または４の配列はN末端側及び／またはC末端側に1または複数のアミノ酸が付加されたものであってもよい。ただし、二量体形成及び六量体形成阻害剤の分子量が大きくなりすぎるとインスリンとの複合体の分子量が大きくなり、血管へ取り込まれにくくなる恐れがあることから、付加するアミノ酸残基はN末端及び／又はC末端側に合計２０残基以下であることが望ましい。また、より小さい分子とするためには、付加するアミノ酸残基はN末端及び／又はC末端側に合計５残基以下であることがより望ましい。さらに、配列番号３の配列における、第５、８、９、１２、１３、１６、２０位（配列番号４の第１、４、５、８、９、１２、１６位）、および改変したアミノ酸配列を有するペプチドにおけるこれらに対応する部位においても、１乃至は２残基のアミノ酸の置換や類似したアミノ酸への置換があっても良く、該配列に限定されるものではない。
なお、上記置換は保存的置換が好ましく、保存的置換としては、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換などが挙げられる。【００１９】
インスリンB鎖αへリックスに対応するペプチド（配列番号１または２）の場合、二量体界面を形成する第１、４、５、８、９、１２、１６位が六量体形成や二量体形成の阻害に重要であると考えられ、それ以外の部位に１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加を有するアミノ酸配列であっても良い。
また、配列番号１または２の配列はN末端側及び／またはC末端側に1または複数のアミノ酸が付加されたものであってもよい。二量体形成及び六量体形成阻害剤の分子量が大きくなりすぎるとインスリンとの複合体の分子量が大きくなり、血管へ取り込まれにくくなる恐れがあることから、付加するアミノ酸残基はN末端及び／又はC末端側に合計３０残基以下であることが望ましい。また、より小さい分子とするためには、付加するアミノ酸残基はN末端及び／又はC末端側に合計１０残基以下であることがより望ましい。さらに、第１、４、５、８、９、１２、１６位においても、１乃至は２残基のアミノ酸の置換や類似したアミノ酸への置換があっても良く、該配列に限定されるものではない。なお、アミノ酸残基の置換は上述したような保存的置換が好ましい。【００２０】
＜インスリン多量体形成阻害剤のスクリーニング方法＞
インスリン多量体形成阻害剤としては、上述した製造方法以外の方法によっても目的とする物質を得ることができる。
すなわち、候補物質を、インスリン二量体又はインスリン六量体と接触せしめ、インスリン単量体形成を測定する工程、配列番号２記載の配列を含むペプチドまたはそのアナログとインスリン二量体又はインスリン六量体を接触せしめ、インスリン単量体形成の被検対照とし、前記工程１）のインスリン単量体形成と比較する工程、および候補物質から、配列番号２記載の配列を含むペプチドまたは置換・欠失等を有するそのアナログと同程度、好ましくはそれらの１０%以上のインスリン単量体形成能を有する物質を選択する工程を実行することによって、インスリン多量体形成阻害剤をスクリーニングすることもできる。
なお、インスリン単量体、二量体および六量体の形成は、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーなどによって検出することができる。
選択された物質がインスリンの二量体および／または六量体形成面と相互作用するか否かについては、例えば、後述する実施例４に記載の方法に従って、BIACORE等入手可能な市販の装置やキットを用いて評価することができる。【００２１】
インスリン多量体形成阻害剤は、インスリンと弱い相互作用をする物質であっても良い。その場合、インスリンとの解離定数が０．１ｎＭ以上を示す化合物であることが好ましい。これは、生理機能を発現するインスリンの血中濃度が０．１〜１０ｎＭであることによる。解離定数が０．１ｎＭ以上の物質では、インスリンへの結合部位に関わらず、インスリンの受容体結合を阻害することはない。一方で、製剤中のインスリン濃度は、例えば１００Ｕ／ｍＬ（約６００μＭ）と非常に高濃度であり、弱い相互作用をする物質であってもインスリンの六量体形成を阻害し得る。
なお、インスリンは結合面１においてインスリンレセプターと相互作用した際に構造変化を誘起することが知られており、この構造変化に伴ってインスリンの二量体または六量体形成面に相互作用をしていたインスリン多量体形成阻害剤がインスリンと解離することが期待される。【００２２】
なお、インスリン多量体形成阻害剤を作用させる野生型インスリンとしては、ヒトインスリン、ウシインスリン、ブタインスリン、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、およびアピドラインスリンなど、特に限定されるものではないが、ヒトに適用する場合は副作用低減の観点などからヒトインスリンが好ましい。また、プロタミン、亜鉛イオン、コバルトイオンなどが含まれていても良い。【００２３】
本発明のインスリン多量体形成方法を通常のインスリン製剤の製剤工程のいずれかの段階で適用することによって、インスリンの二量体および六量体形成を阻害することが可能となり、結果として、製剤中でインスリンを単量体型で安定化することができる。つまり、本発明のインスリン多量体形成阻害剤をインスリンに配合することによって、インスリンが皮下に投与された後、直ちに作用する、超速攻型インスリン製剤を作製することができる。本発明のインスリン多量体形成阻害剤及びインスリンは、希釈剤、安定剤、保存剤、緩衝剤等の薬学的に許容され得るキャリアと組合わせて配合してもよい。
本発明のインスリン製剤の剤形は、特に限定されるものではないが、例えば、注射剤や、経鼻投与剤、経肺吸収剤、経皮・経粘膜適用製剤として用いることができる。また、肺や皮膚などからインスリンを直接吸収させる場合においてもインスリンは単量体であることが望ましいと報告されており、本発明のインスリン製剤は注射剤以外の剤型として用いることもできる。したがって、本発明には汎用性がある。さらに、インスリン単量体を安定的に保存することにも利用できる。インスリン製剤に関しては、（株）日本臨牀社  日本臨牀  増刊号  「新時代の糖尿病学３」  ２００２年  P１７９−３０９等に詳細が記述されており、本発明のインスリン多量体形成阻害剤が添加された、本発明の超速効型インスリン製剤も同様に製剤化することが可能である。
本発明の超速攻型インスリン製剤は、糖尿病の予防や治療などに用いられる医薬組成物として有用である。本発明の阻害剤をインスリン溶液に添加する場合、インスリンに対し、０．１〜１００００倍の濃度で添加することが好ましい。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００２５】
［実施例１］インスリン二量体及び六量体形成を阻害するペプチドの設計（図１）
インスリン六量体の特徴として、Ｂ鎖αへリックスとそれに続くＣ末領域が二量体形成面を構築していること、およびＢ鎖Ｇｌｕ１３の静電的な反発により六量体形成界面が非常に弱い相互作用をしていること、が挙げられる。そこで、Ｂ鎖第５〜２９位に対応するペプチドを以下に示すように一部改変した。
（１）３残基間隔でグルタミン酸残基とリジン残基を組み込み、αへリックスを形成しやすくした。配列番号１に設計したペプチドのアミノ酸配列、配列番号３にインスリンＢ鎖の配列を示す。インスリンＢ鎖のαへリックス領域の配列のうち、図１で一重下線にて表示したＨｉｓ５、Ｇｌｙ８、Ｓｅｒ９、Ｖａｌ１２、Ｇｌｕ１３、Ｔｙｒ１６、およびＧｌｙ２０が主にインスリン二量体界面に存在している。そこで、これらの残基を除き、３残基間隔でグルタミン残基やリジン残基を導入した。
（２）Ｂ鎖Ｇｌｕ１３に対応する部位に関してはＧｌｎへと置換し、静電的な反発を抑制するようにデザインした。
（３）Ｂ鎖Ｌｅｕ１７に対応する部位に関しては立体障害を生じにくいＡｌａへ、Ｂ鎖Ｃｙｓ１９に関しては酸化されないようにＳｅｒへと置換した。以下、当該ペプチドをＩｎｓｕｌｉｎ  Ｈｅｘａｍｅｒ  Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ（ＩＮＨＤ１）ペプチドと呼ぶ（配列番号１）。さらに、ＩＮＤＨ１ペプチドのうち重要な部位を特定するため、インスリンB鎖のαへリックスに対応する部位（５〜２０番）のみを切り出したペプチドを設計し、ＩＮＤＨ２と名付けた（配列番号２）。【００２６】
［実施例２］インスリンの六量体形成
インスリン六量体と単量体を別々に検出するために、ゲルろ過クロマトグラフィーを行った。当該実験濃度（５μＭ）において六量体を形成させるため、溶媒としてＰＢＳに１００μＭのＺｎＣｌ２を添加したものを用いた。これは、亜鉛イオンがインスリン六量体を安定化することによる。図２に結果を示す。５μＭのインスリン溶液の場合、六量体がメインピークとして観測されており、単量体の比率は極めて低い。【００２７】
［実施例３］ＩＮＤＨペプチドによるインスリン六量体形成の阻害
ＩＮＤＨペプチドによりインスリン六量体形成が阻害されることを示すために、ＩＮＤＨペプチド存在下におけるインスリン溶液のゲルろ過クロマトグラフィーを行った。５μMのインスリン、および５００μＭのＩＮＤＨ１ペプチドを混合した際の実験結果を図２に示す。ＩＮＤＨ１ペプチド存在下においてはインスリン六量体のピークが大幅に減少しており、ＩＮＤＨ１ペプチドによりインスリン六量体形成が阻害されていることが明らかとなった。
さらに、INHD２ペプチドについても、INHD１ペプチドに比べ六量体形成阻害活性が若干低いものの、同様な結果が得られた（図２）。以上の結果、配列番号２に示すペプチド配列のうち、第１、４、５、８、９、１２位のアミノ酸残基が重要であることが示すことができた。【００２８】
［実施例４］ペプチド存在下におけるインスリンとインスリン受容体の相互作用
（１）Ｆｃ融合ヒトインスリンレセプターの構築
Ｆｃ融合ヒトインスリンレセプター（Bass, J. J. Biol. Chem. 271, 19367 (1996)）をコードする遺伝子配列を構築し、ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ（Nucleic Acids Res. 1990 September 11; 18(17): 5322.）へ組み込んだ。哺乳細胞ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３−Ｆ細胞を３７℃において培養し、細胞濃度１×１０６（個／ｍＬ）に調製した。セルフェクチン（Invitrogen）とインキュベートしたインスリンレセプター発現プラスミドを添加し、さらに２日間培養した。得られた培養上清をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、Ｆｃ融合ヒトインスリンレセプターを得た。
（２）相互作用解析
市販のインスリン（シグマ社製）及び（１）の方法により得たＦｃ融合インスリン受容体を用いて、インスリンとインスリンレセプターの相互作用解析を行った（BIACORE2000、BIACORE社製）。まず、PBSに100μM ZnCl2を添加した溶媒と添加していない溶媒を用いて、5μMのインスリン溶液を作成した。ゲルろ過実験により、ZnCl2存在下ではインスリンは主に六量体として存在し（図２）、ZnCl2非存在下では主に単量体として存在することが知られている。それぞれのインスリン溶液を用いて、インスリンレセプターとの相互作用を観測したところ、ZnCl2存在下では相互作用するインスリン量が低下していることが判明した（図３a）。これは、亜鉛イオン存在下においてインスリンが六量体を形成し、インスリンレセプターとの相互作用が抑制されたためと考えられる。
続いて、ZnCl2存在下において六量体を形成しているインスリンに対し、５００μＭのＩＮＤＨ１およびＩＮＤＨ２ペプチドを添加し、インスリンレセプターとの相互作用を観測した。両者ともに受容体結合が大幅に増加し、インスリン単量体とほぼ同レベルになることが明らかとなった（図３b）。ＩＮＨＤ１およびＩＮＨＤ２ペプチドを添加することにより、インスリンの六量体形成が阻害されたためと考えられる。
また、当該ペプチドによってインスリンとインスリンレセプターの結合が阻害されていない。インスリンには２つのレセプター結合部位がそれぞれ独立に存在するため、六量体形成を阻害しても、レセプター結合が損なわれないことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明によれば、インスリンのレセプター結合活性を損なわずに、インスリンの二量体形成および六量体形成を阻害することが可能になる。さらに、野生型インスリンを用いた超速効型インスリン製剤を作製することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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