(57)【要約】  本発明の小胞体ストレスの測定方法は、遺伝子導入により分泌型アルカリフォスファターゼが分泌されている状態とされた細胞、組織、臓器又は動物個体について所定条件の下で分泌される分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定することにより細胞、組織、臓器又は動物個体における小胞体ストレスを測定することを特徴とする。  本発明の小胞体ストレスの測定方法によれば、試料調整から測定までの手順が簡単で、測定の定量性や感度が高く、生きた状態の細胞、組織における小胞体ストレスを持続的に、さらには種々の細胞、組織、臓器又は動物個体について測定することが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子の導入により分泌型アルカリフォスファターゼが分泌されている状態とされた細胞、組織、臓器又は動物個体について所定条件の下で分泌される分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定することにより前記細胞、前記組織、前記臓器又は前記動物個体における小胞体ストレスを測定することを特徴とする小胞体ストレスの測定方法。
【請求項２】
請求項１に記載の小胞体ストレスの測定方法において、
前記細胞は、遺伝子導入前の細胞に分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子及び薬剤耐性を与える発現遺伝子を導入し、遺伝子導入された細胞を前記薬剤存在下で選択して安定した遺伝子組み換え細胞株を樹立することにより分泌型アルカリフォスファターゼが恒常的に分泌されている状態とされた細胞であることを特徴とする小胞体ストレスの測定方法。
【請求項３】
請求項１に記載の小胞体ストレスの測定方法において、
前記細胞、前記組織、前記臓器又は前記動物個体は、遺伝子導入前の細胞、組織、臓器又は動物個体に分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子を導入することにより分泌型アルカリフォスファターゼが一過的に分泌されている状態とされた細胞、組織、臓器又は動物個体であることを特徴とする小胞体ストレスの測定方法。
【請求項４】
請求項１に記載の小胞体ストレスの測定方法において、
前記細胞、前記組織、前記臓器又は前記動物個体は、受精卵に分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子を導入することにより作製された分泌型アルカリフォスファターゼが恒常的に分泌されている状態とされた遺伝子導入動物の細胞、組織、臓器又は動物個体であることを特徴とする小胞体ストレスの測定方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の小胞体ストレスの測定方法において、
前記細胞若しくは前記組織の培養液、前記臓器の還流液又は前記動物個体の体液にアルカリフォスファターゼの基質を添加した系からの化学発光を測定することにより分泌される分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定することを特徴とする小胞体ストレスの測定方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の小胞体ストレスの測定方法において、
前記細胞、前記組織、前記臓器又は前記動物個体を所定条件の下に置いてから所定時間以上経過した後に、分泌される分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定することを特徴とする小胞体ストレスの測定方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の小胞体ストレスの測定方法において、
前記所定条件として評価対象の条件及び小胞体ストレスを誘導しない条件を選び、前記小胞体ストレスを誘導しない条件の下での分泌型アルカリフォスファターゼの活性を対照として前記評価対象の条件の下での分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定することにより前記評価対象の条件の下での小胞体ストレスを測定することを特徴とする小胞体ストレスの測定方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の小胞体ストレスの測定方法において、
分泌型アルカリフォスファターゼが分泌されている状態とされた前記細胞、前記組織、前記臓器又は前記動物個体について前記所定条件の下で生細胞数、代謝活性又は他の外来遺伝子産物を測定し、この測定結果を対照として小胞体ストレスを測定することを特徴とする小胞体ストレスの測定方法。
【請求項９】
分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子の導入により分泌型アルカリフォスファターゼが分泌されている状態とされた細胞、組織、臓器又は動物個体に評価対象の刺激を与えて分泌される分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定することにより小胞体ストレス誘導刺激の探索を行うことを特徴とする小胞体ストレス誘導刺激の探索方法。
【請求項１０】
分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子の導入により分泌型アルカリフォスファターゼが分泌されている状態とされた細胞、組織、臓器又は動物個体に所定の小胞体ストレス誘導刺激及び評価対象の物質を与えて分泌される分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定することにより小胞体ストレス緩和物質の探索を行うことを特徴とする小胞体ストレス緩和物質の探索方法。
【請求項１１】
分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子の導入により分泌型アルカリフォスファターゼが恒常的に分泌可能な状態とされていることを特徴とする分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子が導入された細胞、組織、臓器又は動物個体。
【請求項１２】
分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子の導入により分泌型アルカリフォスファターゼが一過的に分泌可能な状態とされていることを特徴とする分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子が導入された細胞、組織、臓器又は動物個体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小胞体ストレスの測定方法、小胞体ストレス誘導刺激の探索方法、小胞体ストレス緩和物質の探索方法及び分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子が導入された細胞、組織、臓器又は動物個体に関する。
【背景技術】
【０００２】
小胞体は細胞内の小器官であり、細胞での脂質の合成や分泌タンパクの合成又は修飾に重要な役割を担っている。最近、種々の疾患（虚血性疾患、アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患、糖尿病、ウイルス感染症）や老化において、小胞体ストレスがその病因として注目されている。このため、小胞体ストレスに関わる分子メカニズムを明らかにすべく、多くの医学・生命科学領域の研究者によって活発な研究が行われている（例えば、非特許文献１参照。）。【０００３】
ところで、小胞体ストレスに関わる分子メカニズムを明らかにするためには、細胞や組織内の小胞体ストレスを測定することが必要である。従来、このような小胞体ストレスの測定方法としては、標的となる細胞や組織をバッファーで溶解し、核酸やタンパク質を抽出し、さらにそれらを電気的にゲル上に展開し、フィルタ膜に転写して標識ｃＤＮＡや標識抗体を用いてブロッティングを行い、指標となる特定の遺伝子やタンパク質の発現量を検討するというノーザンブロット法やウェスタンブロット法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。【０００４】
【非特許文献１】細胞工学、第２１巻、３６０−４０１頁（２００２年）
【特許文献１】特開平１１−２４３９５９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記した従来の小胞体ストレスの測定方法においては、試料調整から測定までの手順が煩雑であり手間と時間がかかるという問題がある。また、測定の定量性や感度が低いという問題もある。また、生きた状態の細胞、組織、臓器又は動物個体における小胞体ストレスを測定できないという問題もある。さらにまた、細胞、組織、臓器又は動物個体によっては指標となる遺伝子やタンパク質の発現が検出できないことがあるという問題もある。【０００６】
そこで、本発明は、上記した問題を解決するためになされたもので、試料調整から測定までの手順が簡単で、測定の定量性や感度が高く、生きた状態の細胞、組織、臓器又は動物個体における小胞体ストレスを測定可能で、さらには種々の細胞、組織、臓器又は動物個体について測定可能な小胞体ストレスの測定方法を提供することを目的とする。また、このような小胞体ストレスの測定方法を用いた小胞体ストレス誘導刺激の探索方法及び小胞体ストレス緩和物質の探索方法を提供することを目的とする。さらにまた、これらの小胞体ストレスの測定方法、小胞体ストレス誘導刺激の探索方法又は小胞体ストレス緩和物質の探索方法を行う際に好適に用いることができる細胞、組織、臓器又は動物個体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記した目的を達成すべく鋭意努力を重ねた結果、分泌型アルカリフォスファターゼが分泌されている状態とされた細胞に小胞体ストレスを与えると、分泌される分泌型アルカリフォスファターゼの活性が選択的にかつ顕著に低下するという重要な知見を得た。そして、本発明者は、この知見に基づいて、分泌される分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定すれば、試料調整から測定までの手順が簡単で、測定の定量性及び感度が高く、生きた状態の細胞、組織、臓器又は動物個体における小胞体ストレスを測定可能で、さらには種々の細胞、組織、臓器又は動物個体について測定可能となることに想到し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明は、以下に示す小胞体ストレスの測定方法、小胞体ストレス誘導刺激の探索方法、小胞体ストレス緩和物質の探索方法及び分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子が導入された細胞、組織、臓器又は動物個体である。【０００９】
（１）本発明の小胞体ストレスの測定方法は、分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子の導入により分泌型アルカリフォスファターゼが分泌されている状態とされた細胞、組織、臓器又は動物個体について所定条件の下で分泌される分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定することにより前記細胞、前記組織、前記臓器又は前記動物個体における小胞体ストレスを測定することを特徴とする。【００１０】
（２）本発明の小胞体ストレスの測定方法においては、前記細胞は、遺伝子導入前の細胞に分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子及び薬剤耐性を与える発現遺伝子を導入し、遺伝子導入された細胞を前記薬剤存在下で選択して安定した遺伝子組み換え細胞株を樹立することにより分泌型アルカリフォスファターゼが恒常的に分泌されている状態とされた細胞であることが好ましい。【００１１】
（３）本発明の小胞体ストレスの測定方法においては、前記細胞、前記組織、前記臓器又は前記動物個体は、遺伝子導入前の細胞、組織、臓器又は動物個体に分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子を導入することにより分泌型アルカリフォスファターゼが一過的に分泌されている状態とされた細胞、組織、臓器又は動物個体であることも好ましい。【００１２】
（４）本発明の小胞体ストレスの測定方法においては、前記細胞、前記組織、前記臓器又は前記動物個体は、受精卵に分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子を導入することにより作製された分泌型アルカリフォスファターゼが恒常的に分泌されている状態とされた遺伝子導入動物の細胞、組織、臓器又は動物個体であることもまた好ましい。【００１３】
（５）本発明の小胞体ストレスの測定方法においては、前記細胞若しくは前記組織の培養液、前記臓器の還流液又は前記動物個体の体液にアルカリフォスファターゼの基質を添加した系からの化学発光を測定することにより分泌される分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定することが好ましい。【００１４】
（６）本発明の小胞体ストレスの測定方法においては、前記細胞、前記組織、前記臓器又は前記動物個体を所定条件の下に置いてから所定時間以上経過した後に、分泌される分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定することが好ましい。【００１５】
（７）本発明の小胞体ストレスの測定方法においては、前記所定条件として評価対象の条件及び小胞体ストレスを誘導しない条件を選び、前記小胞体ストレスを誘導しない条件の下での分泌型アルカリフォスファターゼの活性を対照として前記評価対象の条件の下での分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定することにより前記評価対象の条件の下での小胞体ストレスを測定することが好ましい。【００１６】
（８）本発明の小胞体ストレスの測定方法においては、分泌型アルカリフォスファターゼが分泌されている状態とされた前記細胞、前記組織、前記臓器又は前記動物個体について前記所定条件の下で生細胞数、代謝活性又は他の外来遺伝子産物を測定し、この測定結果を対照として小胞体ストレスを測定することが好ましい。【００１７】
（９）本発明の小胞体ストレス誘導刺激の探索方法は、分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子の導入により分泌型アルカリフォスファターゼが分泌されている状態とされた細胞、組織、臓器又は動物個体に評価対象の刺激を与えて分泌される分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定することにより小胞体ストレス誘導刺激の探索を行うことを特徴とする。【００１８】
（１０）本発明の小胞体ストレス緩和物質の探索方法は、分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子の導入により分泌型アルカリフォスファターゼが分泌されている状態とされた細胞、組織、臓器又は動物個体に所定の小胞体ストレス誘導刺激及び評価対象の物質を与えて分泌される分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定することにより小胞体ストレス緩和物質の探索を行うことを特徴とする。【００１９】
（１１）本発明の分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子が導入された細胞、組織、臓器又は動物個体は、分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子の導入により分泌型アルカリフォスファターゼが恒常的に分泌可能な状態とされていることを特徴とする。【００２０】
（１２）本発明の分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子が導入された細胞、組織、臓器又は動物個体は、分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子の導入により分泌型アルカリフォスファターゼが一過的に分泌可能な状態とされていることを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）における分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子の発現（ＳＥＡＰ遺伝子発現）及び分泌型アルカリフォスファターゼの活性（ＳＥＡＰ活性）を示す図である。
【図２】遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）における小胞体ストレス誘導物質ツニカマイシンの濃度依存的効果を示す図である。
【図３】遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）における小胞体ストレス誘導物質タプシガルギンの濃度依存的効果を示す図である。
【図４】ＳＥＡＰ活性の低下が小胞体ストレスに特異的なものであるかどうかについての検討結果を示す図である。
【図５】タプシガルギンで刺激した遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）、遺伝子組み換え細胞株（Ｈｅｐａ１／ＳＥＡＰ）及び遺伝子組み換え細胞株（ＳＭ／ＳＥＡＰ）におけるＳＥＡＰ活性の低下を示す図である。
【図６】ＳＥＡＰ活性の低下が細胞傷害による非特異的な分泌型アルカリフォスファターゼ活性の低下によるものかどうかについての検討結果を示す図である。
【図７】ＳＥＡＰ活性の低下がどのようなメカニズムによって起こるかについての検討結果を示す図である。
【図８】遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）に小胞体ストレスを与えた後４時間毎にＳＥＡＰ活性を測定した結果を示す図である。
【図９】遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）に小胞体ストレスを与えた状態で１５分毎にＳＥＡＰ活性を測定した結果を示す図である。
【図１０】遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＭＬｕｃ）における分泌型ルシフェラーゼの活性（ＭＬｕｃ活性）の測定が小胞体ストレスの測定に有用かどうかについての検討結果を示す図である。
【図１１】遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＥＧＦＰ）における緑色蛍光タンパクＥＧＦＰの蛍光強度の測定が小胞体ストレスの測定に使用できるかどうかについての検討結果を示す図である。
【図１２】分泌型アルカリフォスファターゼが一過的に分泌されている状態の培養腎尿細管細胞（ＬＬＣＰＫ１）におけるＳＥＡＰ活性（タプシガルギンに対する反応）を示す図である。
【図１３】細胞移植マウスの腹腔にタプシガルギンを投与したときにおける血清中のＳＥＡＰ活性を示す図である。
【図１４】野生型マウス及びＥＳ−ＴＲＡＰマウスの各臓器から抽出したタンパク質（１μｇ）中のＳＥＡＰ活性を示す図である。
【図１５】ＥＳ−ＴＲＡＰマウスの腹腔にタプシガルギンを投与したときにおける血清中のＳＥＡＰ活性を示す図である。
【図１６】ＥＳ−ＴＲＡＰマウスの腹腔に細菌由来の病原因子リポポリサッカライドＬＰＳを投与したときの各臓器におけるＧＲＰ７８遺伝子の発現を示す図である。
【図１７】ＥＳ−ＴＲＡＰマウスの腹腔にＬＰＳを投与したときにおける血清中のＳＥＡＰ活性を示す図である。
【図１８】ＥＳ−ＴＲＡＰマウスの脾臓から抽出したタンパク質（１μｇ）中のＳＥＡＰ活性を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明の小胞体ストレスの測定方法、小胞体ストレス誘導刺激の探索方法、小胞体ストレス緩和物質の探索方法及び分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子が導入された細胞、組織、臓器又は動物個体を、実施の形態に基づいて詳細に説明する。【００２３】
［実施形態１］
実施形態１に係る小胞体ストレスの測定方法は、分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子の導入により分泌型アルカリフォスファターゼが恒常的に分泌されている状態とされた細胞について、所定条件の下で分泌される分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定することにより細胞における小胞体ストレスを測定することを特徴とする小胞体ストレスの測定方法である。【００２４】
分泌型アルカリフォスファターゼが恒常的に分泌されている状態とされた細胞は、以下のような遺伝子組み換え方法により作製する。すなわち、遺伝子導入前の細胞に分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子及び薬剤耐性を与える発現遺伝子を導入し、遺伝子導入された細胞を薬剤存在下で選択して安定した遺伝子組み換え細胞株を樹立することにより作製するのである。これにより、分泌型アルカリフォスファターゼが恒常的に分泌されている状態とされた細胞を再現性良く作製することができる。【００２５】
細胞における分泌型アルカリフォスファターゼの活性の測定は、細胞（遺伝子組み換え細胞株）の培養上清にアルカリフォスファターゼの基質を添加した系からの化学発光を測定することにより行う。【００２６】
このため、実施形態１に係る小胞体ストレスの測定方法によれば、遺伝子組み換え細胞株の培養上清に含まれる分泌型アルカリフォスファターゼの活性を、化学発光を測定するという簡単な方法によって測定することができるため、試料調整から測定までの手順を大幅に簡略化することができる。【００２７】
また、実施形態１に係る小胞体ストレスの測定方法によれば、分泌型アルカリフォスファターゼの活性を、定量性が高くかつ高感度の化学発光を用いて測定することができるため、小胞体ストレスを定量的にかつ感度良く測定することができる。また、分泌型アルカリフォスファターゼは熱及びＬ−ホモアルギニンに耐性があるため、測定試料を加熱すること及び／又はＬ−ホモアルギニンを添加することで内因性アルカリフォスファターゼの影響を除外することが可能になり、信頼性の高い測定方法となる。【００２８】
また、実施形態１に係る小胞体ストレスの測定方法によれば、遺伝子組み換え細胞株の培養上清を用いて分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定することができるため、遺伝子組み換え細胞株を生かしたままの状態で小胞体ストレスを持続的に測定することができる。【００２９】
また、実施形態１に係る小胞体ストレスの測定方法によれば、遺伝子組み換え細胞株を用いて小胞体ストレスを測定することができるため、遺伝子導入が可能な種々の細胞について小胞体ストレスを測定することができる。【００３０】
さらにまた、実施形態１に係る小胞体ストレスの測定方法によれば、分泌型アルカリフォスファターゼが恒常的に分泌されている状態とされた遺伝子組み換え細胞株を用いて分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定することとしているため、事前に分泌型アルカリフォスファターゼが恒常的に分泌されている状態とされた遺伝子組み換え細胞株を準備しておけば、測定までの手順をさらに簡略化することができるという効果も得られる。【００３１】
このため、実施形態１に係る小胞体ストレスの測定方法は、試料調整から測定までの手順が簡単で、測定の定量性や感度が高く、生きた状態の細胞における小胞体ストレスを持続的に測定可能で、さらには種々の細胞について測定可能な小胞体ストレスの測定方法となる。【００３２】
実施形態１に係る小胞体ストレスの測定方法において、所定条件には、小胞体ストレスを誘導する薬剤、ウイルス感染、栄養素の過不足、低酸素、虚血、重金属への曝露、酸化ストレス、ｐＨの異常、異常な構造のタンパク質の蓄積などの、小胞体ストレスを誘導する可能性のある刺激が与えられた条件が含まれる。また、所定条件には、上記した小胞体ストレスを誘導する可能性のある刺激が与えられた条件の他に、小胞体ストレスを誘導しない条件も含まれる。【００３３】
なお、実施形態１に係る小胞体ストレスの測定方法において、分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子は、所定のプロモーターの制御下で分泌型アルカリフォスファターゼ（（secreted alkaline phosphatase）以下、ＳＥＡＰということもある。）遺伝子を恒常的に発現させる働きをするものである。また、薬剤耐性を与える遺伝子は、所定のプロモーターの制御下で薬剤耐性遺伝子を恒常的に発現させる働きをするものである。【００３４】
また、実施形態１に係る小胞体ストレスの測定方法においては、分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子としては、環状をした発現プラスミドの他に、これから切り出したＤＮＡ断片、発現遺伝子を含むウイルスベクターやリポソームなどを好ましく用いることができる。【００３５】
また、実施形態１に係る小胞体ストレスの測定方法においては、分泌型アルカリフォスファターゼの活性の測定は、細胞を所定条件の下に置いてから所定時間以上経過した後に行うことが好ましい。【００３６】
本発明者の実験により、分泌型アルカリフォスファターゼの活性は、細胞に小胞体ストレス誘導物質を与えてから所定時間（例えば４時間）以上経過した場合に顕著に低下することが明らかになった（後述する実施例６参照。）。したがって、細胞に所定の刺激を与えてから所定時間（例えば４時間）以上経過した後に培養液を交換し、その後の数時間に分泌される分泌型アルカリフォスファターゼの活性の測定を行うことによって、小胞体ストレスの測定感度を高めることができる。【００３７】
なお、本発明者の実験により、分泌型アルカリフォスファターゼの活性は、小胞体ストレスを与えない他の刺激によっては低下せず、小胞体ストレスを与える刺激によって選択的に低下することが確認されている（後述する実施例２参照。）。【００３８】
また、本発明者の実験により、分泌型アルカリフォスファターゼの活性の低下は、細胞傷害による非特異的な分泌型アルカリフォスファターゼの活性の低下ではなく、小胞体ストレスによる分泌型アルカリフォスファターゼの活性の低下に基づくものであることが確認されている（後述する実施例４参照。）。【００３９】
また、本発明者の実験により、分泌型アルカリフォスファターゼの活性の低下は、産生される分泌型アルカリフォスファターゼの質の異常（翻訳後の修飾異常に基づく活性の異常）、産生された分泌型アルカリフォスファターゼの分解の亢進及び遺伝子組み換え細胞株からの分泌型アルカリフォスファターゼの分泌量の低下が主な原因であることが確認されている（後述する実施例５参照。）。【００４０】
また、本発明者の実験により、リポーター分子として知られている分泌型ルシフェラーゼ（ＭＬｕｃ）は、分泌型アルカリフォスファターゼに比べ小胞体ストレスを感知する感度が低いため、有用な小胞体ストレスの測定方法とはならないことが確認された（後述する実施形態８参照。）。また、蛍光緑色タンパク（ＥＧＦＰ）は、小胞体ストレスによる影響を受けないため、分泌型アルカリフォスファターゼの代わりに使用できないことが確認された（後述する実施例９参照。）。【００４１】
実施形態１に係る小胞体ストレスの測定方法を用いることにより、小胞体ストレスを誘導する刺激の探索や、小胞体ストレスを緩和する物質の探索を、試料調整から測定までの手順が簡単で、測定の定量性や感度が高く、生きた状態の細胞について持続的に、さらには種々の細胞について行うことが可能になる。【００４２】
［実施形態２］
実施形態２に係る小胞体ストレスの測定方法は、実施形態１に係る小胞体ストレスの測定方法と同様に、分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子の導入により分泌型アルカリフォスファターゼが分泌されている状態とされた細胞について、所定条件の下で分泌される分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定することにより細胞における小胞体ストレスを測定することを特徴とする小胞体ストレスの測定方法である。【００４３】
実施形態２に係る小胞体ストレスの測定方法は、分泌型アルカリフォスファターゼが一過的に分泌されている状態とされた細胞について分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定する点で、実施形態１に係る小胞体ストレスの測定方法と異なっている。【００４４】
分泌型アルカリフォスファターゼが一過的に分泌されている状態とされた細胞は、以下のようにして作製する。すなわち、遺伝子導入前の細胞に、薬剤耐性を与える発現遺伝子を導入することなく分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子のみを導入することにより作製するのである。これにより、分泌型アルカリフォスファターゼが一過的に分泌されている状態とされた細胞を簡単な方法かつ比較的短期間（例えば２〜３日）で作製することができる。【００４５】
この場合、作製される細胞は、通常遺伝子導入された細胞と遺伝子導入されていない細胞が混在する形で得られるが、このような場合であっても、遺伝子導入された細胞から分泌される分泌型アルカリフォスファターゼを用いて分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定することが十分可能である。【００４６】
なお、このようにして作製された細胞においては、通常分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子（例えば、分泌型アルカリフォスファターゼ発現プラスミド）が細胞のＤＮＡ鎖には組み込まれていないため、所定時間が経過すると導入された分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子が細胞内から消失し、分泌型アルカリフォスファターゼが分泌されなくなる。このため、小胞体ストレスの測定は、分泌型アルカリフォスファターゼが一過的に分泌されている期間に行う。【００４７】
細胞における分泌型アルカリフォスファターゼの活性の測定は、実施形態１に係る小胞体ストレスの測定方法の場合と同様に、細胞（この場合、一過的遺伝子導入細胞。）の培養上清にアルカリフォスファターゼの基質を添加した系からの化学発光を測定することにより行う。【００４８】
このように実施形態２に係る小胞体ストレスの測定方法は、分泌型アルカリフォスファターゼが一過的に分泌されている状態とされた細胞について分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定する点で、実施形態１に係る小胞体ストレスの測定方法の場合とは異なるが、分泌型アルカリフォスファターゼが分泌されている状態の細胞を用いて所定条件の下で分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定することとしているので、実施形態１に係る小胞体ストレスの測定方法で得られる効果の多くをそのまま有する。【００４９】
すなわち、実施形態２に係る小胞体ストレスの測定方法によれば、細胞（一過的遺伝子導入細胞）の培養上清に含まれる分泌型アルカリフォスファターゼの活性を、化学発光を測定するという簡単な方法によって測定することができるため、試料調整から測定までの手順を大幅に簡略化することができる。【００５０】
また、実施形態２に係る小胞体ストレスの測定方法によれば、分泌型アルカリフォスファターゼの活性を、定量性が高くかつ高感度の化学発光を用いて測定することができるため、小胞体ストレスを定量的にかつ感度良く測定することができる。また、分泌型アルカリフォスファターゼは熱及びＬ−ホモアルギニンに耐性があるため、測定試料を加熱すること及び／又はＬ−ホモアルギニンを添加することで内因性アルカリフォスファターゼの影響を除外することが可能になり、信頼性の高い測定方法となる。【００５１】
また、実施形態２に係る小胞体ストレスの測定方法によれば、細胞（一過的遺伝子導入細胞）の培養上清を用いて分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定することができるため、細胞（一過的遺伝子導入細胞）を生かしたままの状態で小胞体ストレスを測定することができる。【００５２】
このため、実施形態２に係る小胞体ストレスの測定方法は、試料調整から測定までの手順が簡単で、測定の定量性や感度が高く、生きた状態の細胞について、さらには種々の細胞について、小胞体ストレスを測定することが可能な小胞体ストレスの測定方法となる。【００５３】
実施形態２に係る小胞体ストレスの測定方法においては、分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子としては、環状をした発現プラスミドの他に、これから切り出したＤＮＡ断片、発現遺伝子を含むウイルスベクターやリポソームなどを好ましく用いることができる。【００５４】
なお、組織、臓器、動物個体についても、一過的に分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子を導入することができる。この場合、分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子を発現プラスミド、ＤＮＡ断片、ウイルスベクター、リポソームなどの形で血管内や実質臓器等に注入したり、単離した臓器をそれらを含む還流液で還流したりして行うことができる。【００５５】
このため、実施形態２に係る小胞体ストレスの測定方法を上記のような組織、臓器又は動物個体に適用することにより、試料調整から測定までの手順が簡単で、測定の定量性や感度が高く、生きた状態の細胞、組織、臓器又は動物個体における小胞体ストレスを測定可能で、さらには種々の細胞、組織、臓器又は動物個体について測定可能な小胞体ストレスの測定方法を提供することが可能になる。【００５６】
なお、実施形態２に係る小胞体ストレスの測定方法によれば、実施形態１に係る小胞体ストレスの測定方法の場合とは異なり、分泌型アルカリフォスファターゼが恒常的に分泌されている状態とされた細胞、組織、臓器又は動物個体を準備する必要がないため、分泌型アルカリフォスファターゼが分泌されている状態とされた細胞、組織、臓器又は動物個体を準備するのが容易になるという効果も得られる。【００５７】
［実施形態３］
実施形態３に係る小胞体ストレスの測定方法は、分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子の導入により分泌型アルカリフォスファターゼが一過的に分泌されている状態とされた動物個体について所定条件の下で分泌される分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定することにより動物個体における小胞体ストレスを測定することを特徴とする小胞体ストレスの測定方法である。【００５８】
実施形態３に係る小胞体ストレスの測定方法は、分泌型アルカリフォスファターゼが一過的に分泌されている状態とされた試料について分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定する点で、実施形態２に係る小胞体ストレスの測定方法と同様であるが、生きている動物個体における小胞体ストレスを測定する点が異なっている。【００５９】
実施形態３に係る小胞体ストレスの測定方法においては、分泌型アルカリフォスファターゼが恒常的に分泌されている状態とされた細胞を、動物の体内（例えば腹腔）に移植することとしている。これにより、分泌型アルカリフォスファターゼが一過的に（例えば数日間〜１０日間）分泌されている状態とされた遺伝子導入動物を作製することができる。【００６０】
実施形態３に係る小胞体ストレスの測定方法においては、動物を生かしたまま動物の体液（例えば血清）を採取することで、その体液を用いてある程度の期間持続的に分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定することができる。【００６１】
このため、実施形態３に係る小胞体ストレスの測定方法によれば、試料調整から測定までの手順が簡単で、測定の定量性や感度が高く、生きた状態の動物個体における小胞体ストレスを持続的に測定可能で、さらには種々の動物個体について測定可能な小胞体ストレスの測定方法を提供することが可能になる。【００６２】
［実施形態４］
実施形態４に係る小胞体ストレスの測定方法は、分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子の導入により分泌型アルカリフォスファターゼが分泌されている状態とされた細胞、組織、臓器又は動物個体について所定条件の下で分泌される分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定することにより細胞、組織、臓器又は動物個体における小胞体ストレスを測定することを特徴とする小胞体ストレスの測定方法である。【００６３】
実施形態４に係る小胞体ストレスの測定方法は、分泌型アルカリフォスファターゼが恒常的に分泌されている状態とされた試料について分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定する点で、実施形態１に係る小胞体ストレスの測定方法と同様であるが、生きている動物個体における小胞体ストレスを測定する点が異なっている。【００６４】
実施形態４に係る小胞体ストレスの測定方法においては、動物の受精卵について遺伝子組み換えを行うことにより、動物の受精卵に分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子を導入することとしている。これにより、分泌型アルカリフォスファターゼが恒常的に分泌されている状態とされた遺伝子導入動物（トランスジェニック動物）を作製することができる。この場合、全身から分泌型アルカリフォスファターゼが分泌されている状態の遺伝子導入動物を作製することもできるし、特定の細胞、特定の組織又は特定の臓器から分泌型アルカリフォスファターゼが分泌されている状態の遺伝子導入動物を作製することもできる。【００６５】
実施形態４に係る小胞体ストレスの測定方法においては、動物を生かしたまま動物の体液（例えば、血清）を採取することで、その体液を用いて持続的に分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定して、動物個体の小胞体ストレスを測定することができる。【００６６】
また、実施形態４に係る小胞体ストレスの測定方法においては、トランスジェニック動物から細胞、組織又は臓器を採取し、これらの細胞、組織又は臓器についてノーザンブロット法又はウエスタンブロット法を行うことで、これらの細胞、組織又は臓器についての小胞体ストレスを測定することもできる。【００６７】
このため、実施形態４に係る小胞体ストレスの測定方法によれば、試料調整から測定までの手順が簡単で、測定の定量性や感度が高く、生きた状態の細胞、組織、臓器又は動物個体における小胞体ストレスを持続的に測定可能で、さらには種々の細胞、組織、臓器又は動物個体について測定可能な小胞体ストレスの測定方法を提供することが可能になる。【００６８】
［実施例１］
実施例１に係る小胞体ストレスの測定方法は、分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子の導入により分泌型アルカリフォスファターゼが恒常的に分泌されている状態とされた細胞について、所定条件の下で小胞体から分泌される分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定することにより細胞における小胞体ストレスを測定する小胞体ストレスの測定方法である。【００６９】
実施例１に係る小胞体ストレスの測定方法においては、まず、分泌型アルカリフォスファターゼが恒常的に分泌されている状態とされた細胞を準備する。【００７０】
細胞としては、細胞バンクＡＴＣＣ（American Type Culture Collection（米国））より入手した培養腎尿細管細胞（ＬＬＣＰＫ１）を用いた。分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子としては、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社より購入した分泌型アルカリフォスファターゼ発現プラスミド（発現プラスミドｐＳＶ−ＳＥＡＰ）を用いた。薬剤耐性を与える発現遺伝子としては、インビトロジェン株式会社より購入したネオマイシン耐性遺伝子発現プラスミド（発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１）を用いた。発現プラスミドｐＳＶ−ＳＥＡＰは、サル類ウイルス４０（simian virus 40）のプロモーターの制御下で分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子（以下、ＳＥＡＰ遺伝子という。）を恒常的に発現させる働きをするものであり、発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１は、サイトメガロウイルスのプロモーターの制御下でネオマイシン耐性遺伝子を恒常的に発現させる働きをするものである。【００７１】
まず、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）を用いて、３００ｍＶ、９６０μＦの条件の下で、３×１０６個／１０００μｌの培養腎尿細管細胞（ＬＬＣＰＫ１）に発現プラスミドｐＳＶ−ＳＥＡＰ（１０μｇ）及び発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（１μｇ）を導入する。その後、遺伝子導入した細胞をネオマイシン（Ｇ４１８（１ｍｇ／ｍｌ））存在下で選択し、安定な遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）を樹立する。【００７２】
分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子の恒常的な発現は、ノーザンブロット法により確認した。具体的には、細胞よりＲＮＡを抽出し、アガロースゲルで展開し、ナイロン膜に転写し、放射性同位元素でラベルしたｃＤＮＡを用いてハイブリダイゼーションを行い、放射性活性を検出することにより行った。【００７３】
分泌型アルカリフォスファターゼの活性は、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社のＧｒｅａｔ  ＥｓｃＡＰｅ  ＳＥＡＰ  レポーターシステム  ＆  化学発光ディテクションキット（Great EscAPe SEAP Reporter System & Chemiluminescence Detection Kit）による化学発光のシステムを用いることにより測定した。具体的には、５μｌの培養上清に１５μｌの緩衝液を加え、３０分６５℃でインキュベートし、内因性のアルカリフォスファターゼ活性を失活させた後、さらに内因性のアルカリフォスファターゼの阻害剤であるＬ−ホモアルギニンを含む緩衝液を２０μｌ加え５分放置した後、１５μｌの分泌型アルカリフォスファターゼの基質である化学発光試薬ＣＳＰＤ（トロピックス社（Tropix Incorporated）の登録商標）を加えた。３０分暗所にて静置した後、ルミノメータ（マイクロテック・ニチオン社のジーンライト５５）を用いて分泌型アルカリフォスファターゼの活性（以下、ＳＥＡＰ活性ということもある。）を定量した。【００７４】
図１は、遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）における分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子の発現（以下、ＳＥＡＰ遺伝子発現という。）及び分泌型アルカリフォスファターゼの活性（以下、ＳＥＡＰ活性という。）を示す図である。図１（ａ）はＳＥＡＰ遺伝子発現を示す図であり、図１（ｂ）はＳＥＡＰ活性を示す図である。なお、図１（ａ）中、ＧＡＰＤＨは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）であり、ＳＥＡＰの対照として示されている。また、図１（ｂ）中、ＳＥＡＰ活性は、ルミノメータにより測定された化学発光の強度を相対発光強度（ＲＬＵ）で表したものである（特にことわらない限り、以下の図面についても同様である。）。【００７５】
実施例１の結果、図１（ａ）に示すように、親細胞である培養腎尿細管細胞（ＬＬＣＰＫ１）にはＳＥＡＰ遺伝子発現が認められないのに対して、遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）にはＳＥＡＰ遺伝子発現が認められた。これにより、実施例１においては、分泌型アルカリフォスファターゼが恒常的に分泌されている状態とされた遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）が樹立されていることが確認された。なお、実施例１においては、図１（ｂ）に示すように、親細胞である培養腎尿細管細胞（ＬＬＣＰＫ１）の培養上清にはＳＥＡＰ活性が認められないのに対して、遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）の培養上清にはＳＥＡＰ活性が認められることも確認された。【００７６】
次に、樹立した遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）を２４穴培養プレートに播種し（１×１０５ｃｅｌｌｓ／１０００μｌ）、１％牛胎児血清存在下で２４時間培養した後、小胞体ストレスを誘導することが知られているツニカマイシン（tunicamycin）及びタプシガルギン（thapsigargin）をそれぞれ添加し、６時間培養した。その後、細胞及び培養上清を採取し、細胞におけるＧＲＰ７８遺伝子（従来使用されてきた小胞体ストレスのマーカー遺伝子）の発現及び培養上清中のＳＥＡＰ活性を検討した（ツニカマイシン及びタプシガルギンそれぞれについてｎ＝４）。【００７７】
図２は、遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）における小胞体ストレス誘導物質ツニカマイシンの濃度依存的効果を示す図である。図２（ａ）は細胞における小胞体ストレスのマーカー遺伝子ＧＲＰ７８の遺伝子発現を示す図であり（図中、ＧＡＰＤＨはＧＲＰ７８の対照として示されている。）、図２（ｂ）は培養上清中のＳＥＡＰ活性を示す図である。【００７８】
実験の結果、細胞におけるＧＲＰ７８の遺伝子発現は、図２（ａ）に示すように、ツニカマイシン濃度が０．１μｇ／ｍｌ以上の場合に、濃度非依存的にほぼ一定レベルで認められた。
一方、培養上清中のＳＥＡＰ活性は、図２（ｂ）に示すように、ツニカマイシン濃度が高くなるにしたがって濃度依存的に低下することがわかった。すなわち、小胞体ストレスの程度とＳＥＡＰ活性とはリニアな負の相関関係を示すことがわかった。【００７９】
図３は、遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）における小胞体ストレス誘導物質タプシガルギンの濃度依存的効果を示す図である。図３（ａ）は細胞におけるＧＲＰ７８の遺伝子発現を示す図であり、図３（ｂ）は培養上清中のＳＥＡＰ活性を示す図である。【００８０】
実験の結果、細胞におけるＧＲＰ７８の遺伝子発現は、図３（ａ）に示すように、タプシガルギン濃度が５ｎＭ以上の場合に認められた。
また、培養上清中のＳＥＡＰ活性は、図３（ｂ）に示すように、タプシガルギン濃度が高くなるにしたがって濃度依存的に低下することがわかった。すなわち、小胞体ストレスの程度とＳＥＡＰ活性とはリニアな負の相関関係を示すことがわかった。【００８１】
これらのことは、遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）の培養上清中のＳＥＡＰ活性を用いて小胞体ストレスの測定を行うことにより小胞体ストレスの定量化が可能であることを意味する。なお、こうした厳密な定量化は、図２（ａ）及び図３（ａ）に示すようなＧＲＰ７８等の発現を指標とした解析では困難である。【００８２】
［実施例２］
実施例２は、ＳＥＡＰ活性の低下が小胞体ストレスに特異的なものであるかどうかを確認するための実施例である。【００８３】
図４は、ＳＥＡＰ活性の低下が小胞体ストレスに特異的なものであるかどうかについての検討結果を示す図である。図４（ａ）は下記の物質存在下におけるＧＲＰ７８の遺伝子発現を示す図であり、図４（ｂ）は下記の物質存在下における遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）の培養上清のＳＥＡＰ活性を示す図であり、図４（ｃ）は分泌型アルカリフォスファターゼを含む溶液（遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）を含まない。）にツニカマイシンを添加した場合におけるＳＥＡＰ活性を示す図である。なお、図４（ｃ）中、白色はツニカマイシン処理を行っていない場合のＳＥＡＰ活性を示し、灰色はツニカマイシン処理を行った場合のＳＥＡＰ活性を示す。【００８４】
Ｔｕｎ（ツニカマイシン（tunicamycin）１０μｇ／ｍｌ）
Ｔｈａｐ（タプシガルギン（thapsigargin）１μＭ）
Ａ２３１８７（カルシウムイオノフォアＡ２３１８７（calcium ionophore A23187） ２μＭ）
ＤＴＴ（ジチオスレイトール（dithiothreitol） １ｍＭ）
Ｃｏｂａｌｔ（塩化コバルト（cobalt chloride） ５０ｎｇ／ｍｌ）
ＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２（proteasome inhibitor MG132） ５０μＭ）
ＩＬ−１β（インターロイキン１β（IL-1β）２０ｎｇ／ｍｌ)
ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor-alpha）２５０Ｕ／ｍｌ）
ＴＧＦ−β（トランスフォーミング成長因子β（transforming growth factor-beta）２０ｎｇ／ｍｌ） 
ＴＰＡ（１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート（12-Ｏ-tetradecanoylphorbol-13-acetate） ５０ｎｇ／ｍｌ） 【００８５】
実施例２の結果、図４（ａ）に示すように、ＧＲＰ７８の遺伝子発現による検討から、小胞体ストレス誘導性の刺激（ツニカマイシン、タプシガルギン、Ａ２３１８７、ＤＴＴ、Ｃｏｂａｌｔ及びＭＧ１３２）は、遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）においてＧＲＰ７８の発現を誘導し、一方、小胞体ストレス非誘導性の刺激（ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β及びＴＰＡ）は、遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）においてＧＲＰ７８の発現を誘導しないことがわかった。このことは、小胞体ストレス誘導性の刺激（ツニカマイシン、タプシガルギン、Ａ２３１８７、ＤＴＴ、Ｃｏｂａｌｔ及びＭＧ１３２）のみが、遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）に小胞体ストレスを誘導することを意味する。【００８６】
一方、実施例２の結果、図４（ｂ）からは、ＳＥＡＰ活性も小胞体ストレス誘導性の刺激（ツニカマイシン、タプシガルギン、Ａ２３１８７、ＤＴＴ、Ｃｏｂａｌｔ及びＭＧ１３２）のみによって抑制され、小胞体ストレス非誘導性の刺激（ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β及びＴＰＡ）によっては抑制されないことがわかった。このことは、遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）のＳＥＡＰ活性が小胞体ストレスに特異的に反応して低下することを意味する。【００８７】
なお、小胞体ストレス誘導性の刺激が小胞体ストレスを誘起するメカニズムは様々であるが（例えば、タンパク質合成の促進、カルシウム恒常性の撹乱、ジスルフィド結合形成の抑制、低酸素、タンパク質分解の低下など。）、実施例２においては、小胞体ストレス誘導性の各種刺激（ツニカマイシン、タプシガルギン、Ａ２３１８７、ＤＴＴ、Ｃｏｂａｌｔ及びＭＧ１３２）のうちいずれの刺激によってもＳＥＡＰ活性が抑制されることから、ＳＥＡＰ活性を測定すれば、様々なメカニズムによって起こる多様な小胞体ストレスを測定することが可能であると考えられる。【００８８】
また、実施例２の結果、図４（ｃ）からもわかるように、分泌型アルカリフォスファターゼそのものの活性は、例えばツニカマイシンの存在により全く影響を受けないことが確認された。【００８９】
［実施例３］
実施例３は、遺伝子組み換え細胞株（Ｈｅｐａ１／ＳＥＡＰ）及び遺伝子組み換え細胞株（ＳＭ／ＳＥＡＰ）が遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）と同様に小胞体ストレスの測定に用いることができることを示す実施例である。【００９０】
実施例３においては、実施例１の場合と同様な方法によって、遺伝子組み換え細胞株（Ｈｅｐａ１／ＳＥＡＰ）及び遺伝子組み換え細胞株（ＳＭ／ＳＥＡＰ）を樹立した。すなわち、遺伝子組み換え細胞株（Ｈｅｐａ１／ＳＥＡＰ）は、マウス肝臓ガン細胞（Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７（細胞バンクＡＴＣＣより入手した。））にウイルスプロモータの制御下でＳＥＡＰ遺伝子を恒常的に発現させるプラスミドであるｐＳＥＡＰ２−コントロールを導入することにより作製した。また、遺伝子組み換え細胞株（ＳＭ／ＳＥＡＰ）は、ラットメサンギウム細胞（ＳＭ４３（公知の方法（J. Clin. Invest., 94, 497-505）により準備した。））にｐＳＥＡＰ２−コントロールを導入することにより作製した。【００９１】
また、実施例３においては、実施例１の場合と同様な方法によってＳＥＡＰ活性を測定した。すなわち、各遺伝子組み換え細胞株の培養液にタプシガルギンを投与した後（１μＭ、６時間）、培養上清中のＳＥＡＰ活性を測定した。【００９２】
図５は、タプシガルギンで刺激した遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）、遺伝子組み換え細胞株（Ｈｅｐａ１／ＳＥＡＰ）及び遺伝子組み換え細胞株（ＳＭ／ＳＥＡＰ）におけるＳＥＡＰ活性の低下を示す図である。【００９３】
実施例３の結果、図５からわかるように、ＳＥＡＰ活性は、遺伝子組み換え細胞株（Ｈｅｐａ１／ＳＥＡＰ）及び遺伝子組み換え細胞株（ＳＭ／ＳＥＡＰ）においても、遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）の場合と同様に、小胞体ストレス誘導性の刺激（タプシガルギンの投与）によって抑制されることがわかった。このことは、ＳＥＡＰ遺伝子を導入可能な様々な細胞において小胞体ストレスの測定を行うことが可能であることを意味する。【００９４】
［実施例４］
実施例４は、ＳＥＡＰ活性の低下が細胞傷害による非特異的な分泌型アルカリフォスファターゼ活性の低下によるものではないことを確認するための実施例である。【００９５】
まず、 遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）を９６穴培養プレートに２×１０４細胞／穴で播種し（全１２穴）、培養液（１％牛胎児血清）１００μｌ存在下で一晩培養する。その後、培養液を新鮮な１００μｌ／穴の培養液に交換した後、４穴を１μｇ／ｍｌのツニカマイシンで、また別の４穴を１μＭのタプシガルギンで６時間刺激する。【００９６】
その後、 培養上清を５０μｌずつ採取し、分泌型アルカリフォスファターゼ活性を測定する。その後、培養上清採取後の培養プレートに新鮮な培養上清を５０μｌずつ加え、さらに、細胞傷害の存在を確認するためのＷＳＴ−８溶液（同仁化学、Cell Counting Kit-8）を１０μｌずつ加えた後、３７℃で２時間インキュベーションし、ホルマザンの生成による呈色反応を行う。【００９７】
その後、マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍの吸光度を測定する。４５０ｎｍの吸光度は、細胞傷害が存在する場合（例えば、生細胞数の減少や代謝活性の低下がある場合など。）には、その細胞傷害の程度に応じて低下することが知られている。なお、これらの手順は、同仁化学研究所のセルカウンティングキット８（Cell Counting Kit-8）を用いて行った。【００９８】
図６は、ＳＥＡＰ活性の低下が細胞傷害による非特異的な分泌型アルカリフォスファターゼ活性の低下によるものかどうかについての検討結果を示す図である。図６（ａ）はツニカマイシン処理又はタプシガルギン処理を行った場合におけるＳＥＡＰ活性を示す図であり、図６（ｂ）はツニカマイシン処理又はタプシガルギン処理を行った場合におけるＷＳＴアッセイの結果を示す図である。【００９９】
実施例４の結果、図６（ａ）に示すように、ツニカマイシン(Tun）処理を行った場合やタプシガルギン(Thap）処理を行った場合には、分泌される分泌型アルカリフォスファターゼの活性は対照群（Control）の場合に比べて顕著に低下したが、図６（ｂ）に示すように、ＷＳＴアッセイにおける吸光度（生細胞数を反映する。）には変化が認められなかった。このことは、ＳＥＡＰ活性の低下が、細胞傷害による非特異的な分泌型アルカリフォスファターゼ活性の低下によるものではないことを意味する。【０１００】
また、このことは、ＷＳＴアッセイを用いて生細胞数を算定し、得られたＳＥＡＰ活性を生細胞数の割合で補正することにより、ＳＥＡＰ活性の低下における「細胞傷害による非特異的なＳＥＡＰ活性の低下」の寄与分を除去することが可能となり、小胞体ストレスの測定方法の信頼性を高めることが可能となることをも意味する。【０１０１】
［実施例５］
実施例５は、ＳＥＡＰ活性の低下がどのようなメカニズムによって起こるかについて明らかにするための実施例である。【０１０２】
小胞体ストレスによるＳＥＡＰ活性の低下は、（ア）ＳＥＡＰ遺伝子の発現レベルの低下、（イ）産生される分泌型アルカリフォスファターゼの量の減少、（ウ）産生される分泌型アルカリフォスファターゼの質の異常（翻訳後の修飾異常に基づく活性の異常）、（エ）産生された分泌型アルカリフォスファターゼの分解の亢進及び／又は（オ）遺伝子組み換え細胞株からの分泌型アルカリフォスファターゼの分泌量の低下、により引き起こされる可能性がある。実施例５ではこれらの可能性を検討するために小胞体ストレスを与えた遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）について、ＳＥＡＰ遺伝子の発現レベルをノーザンブロット法により検討し、細胞内及び細胞外のＳＥＡＰタンパク量（ＳＥＡＰのタンパク量）をウェスタンブロット法により検討し、細胞内のＳＥＡＰ活性を化学発光を用いた酵素アッセイにより検討し、さらには細胞内のＳＥＡＰタンパク量をプロテアソーム阻害剤存在／非存在の下でウェスタンブロット法により検討した。【０１０３】
まず、遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）を６穴培養プレートに５×１０５細胞／穴で播種し（全６穴×２プレート）、培養液（１％牛胎児血清）２０００μｌ存在下で一晩培養する。その後、培養液を新鮮な培養液に交換した後、３穴を１０μｇ／ｍｌのツニカマイシン及び１μＭのタプシガルギンでそれぞれ６時間刺激する。培養上清を回収した後、細胞をよく洗浄して回収し、１００μｌのリン酸緩衝液に浮遊させ、超音波破砕を行って細胞内のタンパクを遊離させる。【０１０４】
遠心後上清を回収し、化学発光を用いた酵素アッセイを用いて細胞内のＳＥＡＰ活性を検討した（図７（ｃ）参照。）。
また、回収した上清及び培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で展開し、フィルター膜に転写し、サンタクルズ社（Santa Cruz Biotechnology）の抗ヒト胎盤アルカリフォスファターゼ抗体（PLAP(L-19):sc-15065）を用いてウエスタンブロット法を行って細胞内及び細胞外のＳＥＡＰタンパクの量を検討した（図７（ｂ）及び図７（ｅ）参照。）。
また、同様の手順により調整した細胞を用い、ＲＮＡを抽出し、電気的にゲル上に展開し、フィルター膜に転写した後、標識ｃＤＮＡを用いてノーザンブロット法を行ってＳＥＡＰ遺伝子の発現レベルを検討した（図７（ａ）参照。）。
また、上記におけるタプシガルギン処理を、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２（２５μｇ）の存在／非存在の下で行った後、同様の方法で処理して得られる上清を用いてウエスタンブロット法を行い、細胞内のＳＥＡＰタンパク量を検討した（図７（ｄ）参照。）。【０１０５】
図７は、ＳＥＡＰ活性の低下がどのようなメカニズムによって起こるかについての検討結果を示す図である。図７（ａ）はＳＥＡＰ遺伝子の発現レベルをノーザンブロット法により検討したものである。図７（ｂ）は細胞内のＳＥＡＰタンパク量をウエスタンブロット法により検討したものである。図７（ｃ）は細胞内のＳＥＡＰ活性を化学発光を用いた酵素アッセイにより検討したものであり、図７（ｄ）は細胞内のＳＥＡＰタンパク量を、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２存在／非存在の下でウエスタンブロット法を用いて検討したものであり（図中、β−アクチン（β-actin）はＳＥＡＰの対照として示されている。）、図７（ｅ）は細胞外のＳＥＡＰタンパク量をウエスタンブロット法により検討したものである。【０１０６】
実施例５の結果、遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）におけるＳＥＡＰ遺伝子の発現レベルは、図７（ａ）に示すように、ツニカマイシン処理又はタプシガルギン処理によって低下することはなく、むしろ軽度の上昇傾向が見られた。このことは、小胞体ストレスによるＳＥＡＰ活性の低下は、（ア）のＳＥＡＰ遺伝子の発現レベルの低下（例えば、ＳＥＡＰ遺伝子の転写レベルの抑制に起因する。）によるものでないことを意味する。【０１０７】
また、細胞内のＳＥＡＰタンパク量は、図７（ｂ）に示すように、ツニカマイシン処理又はタプシガルギン処理によって変化しなかった。このことは、小胞体ストレスによるＳＥＡＰ活性の低下は、（イ）の産生される分泌型アルカリフォスファターゼの量の減少（例えば、ＳＥＡＰ遺伝子の翻訳（ＳＥＡＰタンパクの産生）レベルの抑制に起因する。）によるものでないことを意味する。
なお、ツニカマイシンは、タンパクの糖化を阻害する薬物であり、図７（ｂ）に示される、ツニカマイシンで処理した細胞におけるＳＥＡＰの分子量の低下は糖化の欠如によるものである。【０１０８】
一方、細胞内のＳＥＡＰ活性は、図７（ｃ）に示すように、細胞外（例えば培養上清）におけるＳＥＡＰ活性（図６（ａ）参照。）の場合と同様に、ツニカマイシン処理により顕著に低下した。また、細胞内のＳＥＡＰタンパク量は、図７（ｄ）に示すように、プロテアソーム阻害剤存在下においてタプシガルギンを投与したときに増加した。また、細胞外のＳＥＡＰタンパク量は、図７（ｅ）に示すように、タプシガルギン処理によって減少した。【０１０９】
これらのことは、小胞体ストレスによるＳＥＡＰ活性の低下は、（ウ）産生される分泌型アルカリフォスファターゼの質の異常（翻訳後の修飾異常に基づく活性の異常）、（エ）産生された分泌型アルカリフォスファターゼの分解の亢進及び（オ）遺伝子組み換え細胞株からの分泌型アルカリフォスファターゼの分泌量の低下により引き起こされていることを強く示唆する。【０１１０】
すなわち、タプシガルギンの投与によって、（ウ）産生される分泌型アルカリフォスファターゼの質の異常（翻訳後の修飾異常に基づく活性の異常）が起こり（それによって細胞内のＳＥＡＰ活性が低下する（図７（ｃ）参照。）。）、その結果、（エ）プロテアソームによって、産生された分泌型アルカリフォスファターゼの分解が亢進され（図７（ｄ）参照。）、さらにその結果、（オ）遺伝子組み換え細胞株からの分泌型アルカリフォスファターゼの分泌量が低下して（図７（ｅ）参照。）、最終的には、細胞外（培養上清）におけるＳＥＡＰ活性の低下が引き起こされるのである。【０１１１】
［実施例６］
実施例６は、細胞に小胞体ストレスを与えてから時間が経過するに従ってＳＥＡＰ活性がどのように変化するかを確認するための実施例である。【０１１２】
図８は、遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）に小胞体ストレスを与えた後４時間毎にＳＥＡＰ活性を測定した結果を示す図である。
実施例６においては、遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）をツニカマイシン（１０μｇ／ｍｌ）で刺激した後、４時間毎に培養液を採取及び交換して、ＳＥＡＰ活性を測定した。【０１１３】
実施例６によれば、図８に示すように、刺激後０時間目〜４時間目のＳＥＡＰ活性の低下は軽度（刺激前の活性に比べて約３０％）であるが、刺激後４時間目〜８時間目までの４時間のＳＥＡＰ活性の低下は高度（刺激後０時間目〜４時間目の活性に比べて約９５％の低下）である。このことから、細胞を事前に刺激して所定時間経過した後に培養液を交換し、所定時間後にＳＥＡＰ活性を測定することにより、小胞体ストレスの測定方法における検出感度を向上させることが可能になる。【０１１４】
［実施例７］
実施例７は、細胞に小胞体ストレスを与えることがＳＥＡＰ活性に対してどの位の速度で影響を与えるかについて検討するための実施例である。【０１１５】
図９は、遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）に小胞体ストレスを与えた状態で１５分毎にＳＥＡＰ活性を測定した結果を示す図である。【０１１６】
実施例７においては、遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）を予めタプシガルギン又はカルシウムイオノフォアＡ２３１８７で３０分処理し、その後、培養液を交換しタプシガルギン又はカルシウムイオノフォアＡ２３１８７の存在下で培養を継続する。ＳＥＡＰ活性の測定は、１５分毎に培養液を採取して行った。【０１１７】
実施例７によれば、図９に示すように、刺激開始後４５分でＳＥＡＰ活性の有意な低下が見られた。【０１１８】
［実施例８］
実施例８及び後述する実施例９は、分泌型アルカリフォスファターゼ以外のリポーター分子（ＭＬｕｃ及びＥＧＦＰ）が、分泌型アルカリフォスファターゼの代わりに小胞体ストレスの測定方法に使用可能かどうかを確認する実施例である。実施例８においては、リポーター分子としてのＭＬｕｃが分泌型アルカリフォスファターゼの代わりに小胞体ストレスの測定方法に使用可能かどうかを検討した。【０１１９】
まず、実施例１において遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）を樹立したのと同様の方法を用いて、培養腎尿細管細胞（ＬＬＣＰＫ１）から分泌型ルシフェラーゼ（ＭＬｕｃ（Metridia luciferase））を恒常的に発現する遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＭＬｕｃ）を樹立する。その後、遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＭＬｕｃ）をツニカマイシン（１０μｇ／ｍｌ）で処理する。処理後８時間の培養上清中のＭＬｕｃ活性をcoelenterazineを基質とした化学発光のシステムにより測定して、小胞体ストレスによる発光強度変化を評価した。  【０１２０】
図１０は、遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＭＬｕｃ）におけるＭＬｕｃ活性の測定が小胞体ストレスの測定に有用かどうかについての検討結果を示す図である。図１０（ａ）は培養腎尿細管細胞（ＬＬＣＰＫ１）及び遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＭＬｕｃ）における分泌型ルシフェラーゼ遺伝子（ＭＬｕｃ遺伝子）の発現を示す図であり、図１０（ｂ）は培養腎尿細管細胞（ＬＬＣＰＫ１）及び遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＭＬｕｃ）の培養上清におけるＭＬｕｃ活性を示す図であり、図１０（ｃ）はＭＬｕｃ活性に対するタプシガルギン又はＡ２３１８７の短時間刺激（１時間）の効果を示す図である。【０１２１】
その結果、図１０（ｃ）に示すように、遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）における結果とは異なり、遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＭＬｕｃ）の培養上清におけるＭＬｕｃ活性は、実施例８の条件下では、タプシガルギン又はＡ２３１８７の処理により影響を受けないことがわかった。このことは、同じ分泌型タンパクであっても、分泌型ルシフェラーゼを指標に用いた高感度な小胞体ストレスの測定方法が成り立たないことを意味する。【０１２２】
［実施例９］
実施例９は、実施例８と同様に、分泌型アルカリフォスファターゼ以外のリポーター分子が、分泌型アルカリフォスファターゼの代わりに小胞体ストレスの測定方法に使用可能かどうかを確認する実施例である。実施例９においては、リポーター分子としてのＥＧＦＰが分泌型アルカリフォスファターゼの代わりに小胞体ストレスの測定方法に使用可能かどうかを検討した。【０１２３】
まず、実施形態１において遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）を樹立したのと同様の方法を用いて、培養腎尿細管細胞（ＬＬＣＰＫ１）から緑色蛍光タンパク（ＥＧＦＰ（enhanced green fluorescence protein））を恒常的に発現する遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＥＧＦＰ）を樹立する。その後、遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＥＧＦＰ）をツニカマイシン（１０μｇ／ｍｌ）で処理する。処理後８時間のＥＧＦＰ蛍光強度を蛍光顕微鏡下で観察することにより、小胞体ストレスによる蛍光強度変化を評価した。  【０１２４】
図１１は、遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＥＧＦＰ）におけるＥＧＦＰ活性の測定が小胞体ストレスの測定に使用できるかどうかについての検討結果を示す図である。図１１（ａ）は培養腎尿細管細胞（ＬＬＣＰＫ１）及び遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＥＧＦＰ）における緑色蛍光タンパク遺伝子（ＥＧＦＰ遺伝子）の発現を示す図であり、図１１（ｂ）は培養腎尿細管細胞（ＬＬＣＰＫ１）及び遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＥＧＦＰ）の蛍光顕微鏡像を示す図であり、図１１（ｃ）は図１１（ｂ）の結果を定量的に示す図である。【０１２５】
その結果、図１１（ｂ）及び図１１（ｃ）に示すように、上記した遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＳＥＡＰ）における結果とは異なり、遺伝子組み換え細胞株（ＬＬ／ＥＧＦＰ）におけるＥＧＦＰの蛍光強度は、ツニカマイシン処理により全く影響を受けないことがわかった。このことは、緑色蛍光タンパクを指標に用いた小胞体ストレス測定方法が成り立たないことを意味する。【０１２６】
なお、実施例９において、ＥＧＦＰの蛍光強度が小胞体ストレスにより影響を受けにくいという事実は、注目に値する。すなわち、この事実より、ＥＧＦＰを用いた測定結果を対照として、「ＳＥＡＰ活性／ＥＧＦＰの蛍光強度」という相対値で小胞体ストレスを測定することによって、実施例４のＷＴＳアッセイを併用する場合と同様に、ＳＥＡＰ活性の低下における「細胞傷害による非特異的なＳＥＡＰ活性の低下」の寄与分を除去することが可能となり、小胞体ストレスの測定方法の信頼性を高めることが可能となる。【０１２７】
［実施例１０］
実施例１０に係る小胞体ストレスの測定方法は、分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子の導入により分泌型アルカリフォスファターゼが一過的に分泌されている状態とされた細胞について、所定条件の下で分泌される分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定することにより細胞における小胞体ストレスを測定する小胞体ストレスの測定方法である。【０１２８】
実施例１０に係る小胞体ストレスの測定方法においては、まず、分泌型アルカリフォスファターゼが一過的に分泌されている状態とされた細胞を準備する。【０１２９】
まず、エレクトロポレーション法を用いて、３００ｍＶ、９６０μＦの条件の下で、培養腎尿細管細胞（ＬＬＣＰＫ１）に、発現プラスミドｐＳＶ−ＳＥＡＰ（１０μｇ）を導入し、１００ｍｍ培養プレートに細胞を播種した後、５％の牛胎児血清存在下で一晩培養する。その後、この細胞を２４穴培養プレートに１×１０５細胞／穴で播種し（全８穴）、培養液（１％牛胎児血清）５００μｌ存在下で２４時間培養する。【０１３０】
次に、培養液を新鮮な５００μｌ／穴の培養液に交換した後、４穴を１μＭのタプシガルギンで６時間刺激する。その後、培養上清を採取し、ＳＥＡＰ活性を測定する。【０１３１】
図１２は、分泌型アルカリフォスファターゼが一過的に分泌されている状態の培養腎尿細管細胞（ＬＬＣＰＫ１）におけるＳＥＡＰ活性（タプシガルギンに対する反応）を示す図である。
図１２に示すように、実施例１０においても、実施例１の場合と同様に、小胞体ストレスを与える処理を行うことにより、ＳＥＡＰ活性は顕著に低下した。このことは、分泌型アルカリフォスファターゼが一過的に分泌されている状態の細胞、組織、臓器又は動物個体によっても、小胞体ストレスの測定が十分に可能であることを示し、本発明の小胞体ストレスの測定方法においては、分泌型アルカリフォスファターゼが恒常的に分泌されている細胞、組織、臓器又は動物個体を準備することが必ずしも必要でないことを示すものである。【０１３２】
［実施例１１］
実施例１１に係る小胞体ストレスの測定方法は、分泌型アルカリフォスファターゼが一過的に分泌されている状態とされた動物個体について、所定条件の下で小胞体から分泌される分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定することにより動物個体における小胞体ストレスを測定する小胞体ストレスの測定方法である。【０１３３】
実施例１１に係る小胞体ストレスの測定方法においては、まず、分泌型アルカリフォスファターゼが一過的に分泌されている状態とされた動物個体を準備する。【０１３４】
動物個体としては、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、体重２５ｇ、８匹）を用いた。そして、マウスの腹腔に遺伝子組み換え細胞株（Ｈｅｐａ１／ＳＥＡＰ）を注射により移植（１匹当たり２．５×１０5細胞）することにより、分泌型アルカリフォスファターゼが一過的に分泌されている状態とされたマウス（以下、細胞移植マウスという。）を作製した。細胞移植マウスは、遺伝子組み換え細胞株（Ｈｅｐａ１／ＳＥＡＰ）の移植後１２〜２４時間経過すると、ＳＥＡＰ活性が高まり、血清中のＳＥＡＰ活性の測定が可能となる。そして、その後数日間〜１０日間は血清中のＳＥＡＰ活性が維持され、その測定が可能となる。【０１３５】
移植後２４〜４８時間経過後に、細胞移植マウスの腹腔にタプシガルギン（１ｍｇ／ｋｇ）を投与した。その後、尾静脈から定期的に血清を採取した（移植後２４時間経過するまで）。【０１３６】
図１３は、細胞移植マウスの腹腔にタプシガルギンを投与したときにおける血清中のＳＥＡＰ活性を示す図である。【０１３７】
細胞移植マウスにおいては、図１３に示すように、血清中のＳＥＡＰ活性は、タプシガルギン投与後２時間で急速にかつ顕著に低下した。血清中のＳＥＡＰ活性は２４時間でもとのレベルに復帰した。【０１３８】
このことは、小胞体ストレスによる急速なＳＥＡＰの抑制は、生体外だけでなく生体内でも起こること、本発明の小胞体ストレスの測定方法は、生きている動物個体に対しても有効な方法であることを意味する。【０１３９】
本発明は、分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子が一過的に導入された組織、臓器又は動物個体をも含むものである。この場合には、分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子が恒常的に導入された組織、臓器又は動物個体よりも組織、臓器又は動物個体の作製が容易になり、その結果、組織、臓器又は動物個体における小胞体ストレスを容易に測定することが可能になる。【０１４０】
［実施例１２］
実施例１２に係る小胞体ストレスの測定方法は、分泌型アルカリフォスファターゼが恒常的に分泌されている状態とされた臓器又は動物個体について、所定条件の下で分泌される分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定することにより臓器又は動物個体における小胞体ストレスを測定する小胞体ストレスの測定方法である。【０１４１】
実施例１２に係る小胞体ストレスの測定方法においては、まず、分泌型アルカリフォスファターゼが恒常的に分泌されている状態とされた動物個体として、受精卵の遺伝子組み換えを行うことにより得られるトランスジェニックマウス（以下、ＥＳ−ＴＲＡＰ（Endoplasmatic reticulium S-Tress Represssive Alkaline Phosphatase）マウスということもある。）を準備する。【０１４２】
ＥＳ−ＴＲＡＰマウスは、以下のようにして作製する。まず、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の受精卵にＳＥＡＰ遺伝子をマイクロインジェクション法により導入する（ｎ＝２４０）。その後、ＳＥＡＰ遺伝子が導入された胚を偽妊娠マウスの子宮に移植し、誕生・離乳した産仔（ｎ＝２６）を用いてＳＥＡＰ遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスをＰＣＲ法によってスクリーニングする（ｎ＝５）。以上の操作によって、種々の臓器で恒常的にＳＥＡＰ遺伝子が発現するＥＳ−ＴＲＡＰマウスを樹立することができる。【０１４３】
次に、種々の臓器におけるＳＥＡＰ活性を評価するために、野生型マウス及びＥＳ-ＴＲＡＰマウスについて、全身をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で還流して血液を洗い流す。そして、脳、心臓、肺、肝臓、腎臓及び脾臓からタンパク質を抽出する。タンパク質の定量は、米ピアース社のタンパク質測定キット（Micro BCA TM Protein Kit （Pierce, Rockford, IL)）によって行った。【０１４４】
図１４は、野生型マウス及びＥＳ−ＴＲＡＰマウスの各臓器から抽出したタンパク質（１μｇ）中のＳＥＡＰ活性を示す図である。図中、白色は野生型マウスにおけるＳＥＡＰ活性を示し、灰色はＥＳ−ＴＲＡＰマウスにおけるＳＥＡＰ活性を示す。【０１４５】
実施例１２の結果、ＥＳ−ＴＲＡＰマウスにおいては、図１４に示すように、検討したすべての臓器（脳、心臓、肺、肝臓、腎臓及び脾臓）で、野生型マウスと比較して高いＳＥＡＰ活性を有することがわかった。なお、ＥＳ-ＴＲＡＰマウスの血清においては、野生型マウスの約１００００倍も高いＳＥＡＰ活性を有することもわかった。【０１４６】
次に、ＥＳ-ＴＲＡＰマウスの腹腔内に、タプシガルギン（１ｍｇ／ｋｇ）を投与した。その後、尾静脈から血清を定期的に２４時間まで採取した。
図１５は、ＥＳ−ＴＲＡＰマウスの腹腔にタプシガルギンを投与したときにおける血清中のＳＥＡＰ活性を示す図である。
その結果、ＥＳ−ＴＲＡＰマウスにおいては、図１５に示すように、血清中のＳＥＡＰ活性は、タプシガルギン投与後８時間で顕著に低下した。また、血清中のＳＥＡＰ活性は、２４時間でもとのレベルに復帰した。【０１４７】
［実施例１３］
実施例１３に係る小胞体ストレスの測定方法は、実施例１２と同様に、分泌型アルカリフォスファターゼが恒常的に分泌されている状態とされた臓器又は動物個体について、所定条件の下で小胞体から分泌される分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定することにより臓器又は動物個体における小胞体ストレスを測定する小胞体ストレスの測定方法である。【０１４８】
実施例１３においては、小胞体ストレス誘導刺激として、細菌由来の病原因子リポポリサッカライドＬＰＳ（lipopolysaccharide）を用いた。【０１４９】
まず、ＥＳ−ＴＲＡＰマウスにＬＰＳを投与したときの各臓器における小胞体ストレス応答を確認するために、ＥＳ−ＴＲＡＰマウスの腹腔にＬＰＳを１匹当たり２００μｇ投与した。【０１５０】
ＬＰＳの投与後８時間経過した後、脳、心臓、肺、肝臓、腎臓及び脾臓について、ノーザンブロット法によってＧＲＰ７８遺伝子の発現の誘導があるかどうか検討した。
図１６は、ＥＳ−ＴＲＡＰマウスの腹腔にＬＰＳを導入したときの各臓器におけるＧＲＰ７８遺伝子の発現を示す図である。
その結果、図１６に示すように、脳以外の各臓器（心臓、肺、肝臓、腎臓及び脾臓）において、小胞体ストレスの誘導が認められた。【０１５１】
次に、ＥＳ−ＴＲＡＰマウスの尾静脈から血清を定期的に採取し（４８時間経過するまで）、採取した血清中のＳＥＡＰ活性を測定した。【０１５２】
図１７は、ＥＳ−ＴＲＡＰマウスの腹腔にＬＰＳを投与したときの血清中のＳＥＡＰ活性を示す図である。
その結果、図１７に示すように、血清中のＳＥＡＰ活性は、ＬＰＳの投与後急速（２時間以内）にかつ顕著（８時間で最低値）に低下し、その後徐々に増加し４８時間でもとのレベルに復帰した。
このことは、動物個体に病的状況を引き起こした後、動物個体を生かしたまま持続的にかつリアルタイムで小胞体ストレスのモニタリングを行うことができることを意味する。【０１５３】
次に、ＥＳ−ＴＲＡＰマウスの全身に小胞体ストレス誘導刺激としてのＬＰＳを与えたとき、特定の臓器（この場合、脾臓）のＳＥＡＰ活性が抑制されることを確認した。【０１５４】
図１８は、ＥＳ−ＴＲＡＰマウスの脾臓から抽出したタンパク質（１μｇ）のＳＥＡＰ活性を示す図である。
その結果、図１８に示すように、脾臓から抽出されたタンパク質中のＳＥＡＰ活性はＬＰＳ投与により顕著に低下することがわかった。【０１５５】
以上、全身の臓器でＳＥＡＰが発現するトランスジェニックマウスを用いて小胞体ストレスを測定する方法を例にとって本発明を説明したが、特定の組織、特定の臓器でのみ分泌型アルカリフォスファターゼが発現する動物個体を作製することで、動物個体の特定組織又は特定臓器における小胞体ストレスを測定することも可能になる。【０１５６】
以上説明したように、本発明の小胞体ストレスの測定方法は、分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子の導入により分泌型アルカリフォスファターゼが分泌されている状態とされた細胞、組織、臓器又は動物個体について、所定条件の下で分泌される分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定することにより細胞、組織、臓器又は動物個体における小胞体ストレスを測定する小胞体ストレスの測定方法であるため、試料調整から測定までの手順が簡単で、測定の定量性や感度が高く、生きた状態の細胞、組織における小胞体ストレスを持続的に測定可能で、さらには種々の細胞、組織、臓器又は動物個体について測定可能な小胞体ストレスの測定方法となる。【０１５７】
このため、本発明の小胞体ストレスの測定方法のような、試料調整から測定までの手順が簡単で、測定の定量性や感度が高く、生きた状態の細胞、組織、臓器又は動物個体について持続的に測定可能で、さらには種々の細胞、組織、臓器又は動物個体について測定可能な測定方法が提供されることにより、現在世界各所の研究機関で行われている小胞体ストレスに関する研究（細胞内分子メカニズムの解析など）が飛躍的に進むと考えられる。本発明の小胞体ストレスの測定方法は、分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子の導入が可能であれば、生体を構成するどのような細胞にも適用でき、さらには、特定の組織、特定の臓器、動物個体全体にも適用できる。【０１５８】
以上、本発明の小胞体ストレスの測定方法を、上記した実施形態に基づいて説明したが、本発明は上記した実施形態に限られるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において種々の態様において実施することが可能であり、例えば次のような変形も可能である。【０１５９】
（１）実施例１２及び実施例１３においては、分泌型アルカリフォスファターゼが恒常的に分泌されている状態のトランスジェニックマウスであるＥＳ-ＴＲＡＰマウスにタプシガルギン又はＬＰＳを投与したときの、臓器中の又は血清中のＳＥＡＰ活性を測定することにより小胞体ストレスの測定を行うこととしているが、本発明はこれに限定されるものではない。例えば、ＥＳ−ＴＲＡＰＳマウスにおける細胞若しくは組織の培養液中又は臓器の還流液中におけるＳＥＡＰ活性を測定することにより小胞体ストレスの測定を行うこととしてもよい。【０１６０】
（２）本発明は、小胞体ストレス誘導刺激の探索方法にも適用可能である。すなわち、本発明は、分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子の導入により分泌型アルカリフォスファターゼが分泌されている状態とされた細胞、組織、臓器又は動物個体に評価対象の刺激を与えて分泌される分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定することにより小胞体ストレス誘導刺激の探索を行う小胞体ストレス誘導刺激の探索方法をも含むものである。【０１６１】
これにより、小胞体ストレスを誘導する薬剤や環境中有害化学物質を含む様々な刺激の広範なスクリーニングが可能になり、医薬品の副作用のモニタリングや生活環境有害物質のモニタリングを通じて、社会への大きな貢献が期待できる。【０１６２】
（３）本発明は、小胞体ストレス緩和物質の探索方法にも適用可能である。すなわち、本発明は、分泌型アルカリフォスファターゼ発現遺伝子の導入により分泌型アルカリフォスファターゼが分泌されている状態とされた細胞、組織、臓器又は動物個体に所定の小胞体ストレス誘導刺激及び評価対象の物質を与えて分泌される分泌型アルカリフォスファターゼの活性を測定することにより小胞体ストレス緩和物質の探索を行う小胞体ストレス緩和物質の探索方法をも含むものである。【０１６３】
これにより、小胞体ストレスを緩和する薬品（循環器疾患・神経変性疾患治療薬、老化抑制薬、糖尿病治療薬、ウイルス感染治療薬）の開発のための広範なスクリーニングが可能になり、有効な医薬品の提供を促すことを通じて、社会への大きな貢献が期待できる。
【図１７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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