(57)【要約】  本発明の目的は、長期腹膜透析（PD）患者などにおける腹膜の機能低下を効果的に抑制することができるような新規な腹膜保護剤を提供することである。本発明によれば、ピリドキシン類又はその塩を有効成分として含む、腹膜保護剤が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピリドキシン類又はその塩を有効成分として含む、腹膜保護剤。
【請求項２】
ピリドキシン類がピリドキサミンである、請求項１に記載の腹膜保護剤。
【請求項３】
腹膜透析患者における腹膜の機能不全又は限外濾過不全を治療及び／又は予防するために使用する、請求項１又は２に記載の腹膜保護剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピリドキサミン等のピリドキシン類を有効成分として含む腹膜保護剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
長期腹膜透析（PD）患者では、腹膜を横断するグルコース依存性の浸透圧勾配の消失の亢進および限外濾過能力の喪失を特徴とする腹膜機能の低下が徐々に起こる [非特許文献１及び２]。このような不全腹膜の機能の特徴の変化を最もよく表すものは、血液と透析液の間での小分子溶質（尿素、クレアチニン、グルコース）の交換の機能的面積（いわゆる「有効腹膜表面積（EPSA）」）の増大である [非特許文献３]。こうした変化は血管新生の亢進、およびおそらく腹膜血管の拡張によるものである [非特許文献４]。【０００３】
腹膜機能不全の基礎となる分子メカニズムはまだ解明されていない。炎症性変化を伴う腹膜炎の再発は、長期間に渡って腹膜に損傷を与えるが [非特許文献１及び５]、限外濾過不全発症の条件ではない [非特許文献４及び６]。最近の研究により、長期PD患者における腹膜機能低下についてメカニズムが推定され明らかになりつつある [非特許文献７〜１４]。慢性尿毒症はそれ自体が腹膜を変化させ、EPSAを増大させる [非特許文献８]。腹膜の生化学的変化は、少なくとも部分的には、尿毒症性循環およびPD液の双方による非常に反応性の高いカルボニル化合物（RCO）の過負荷（「腹膜のカルボニルストレス」）が原因であると思われる [非特許文献９〜１４]。血漿RCOが尿毒症性循環中に蓄積され、腹腔内に徐々に拡散し、後期糖化最終産物（AGE）の修飾を開始する [非特許文献１５〜２１]。PD中は、グルコースPD液の加熱滅菌から生じたRCOが腹膜内に進入する。これらは、透析処置自体による血清RCOの物質移動の増加により補充される。この腹膜のカルボニルストレスが、腹膜タンパク質の不可逆的なAGE修飾を構造的に促進する。このRCOは、サイトカインおよび増殖因子（VEGFなど）の産生をさらに刺激し、腹膜細胞中の一酸化窒素合成酵素（NOS）の発現を調節するとみられる [非特許文献２２から２５]。VEGFと一酸化窒素（NO）が共同して血管新生を刺激し、透過性を増加させ、腹膜毛細血管を拡張させる [非特許文献２３〜２５]。これらの複合的変化によりEPSAが増大し、これにより浸透圧が正常よりも早く消失して、最終的に限外濾過が行われなくなると思われる。FGF-2およびTGF-βのアップレギュレーションも、腹膜の間質の線維化を刺激する [非特許文献２４及び２６]。【０００４】
【非特許文献１】Davies SJ,他、Kidney Int 54: 2207-2217, 1998
【非特許文献２】Krediet RT,他、Perit Dial Bull 6:61-65, 1986
【非特許文献３】Rippr B,他、Peritoneal physiology: Transport of solutions. In: The Textbook of Peritoneal Dialysis, edited by Gokal R, Nolf KD, Dordrecht, The Netherlands, Kluwer Academic Publishers, 1994, 69-113
【非特許文献４】Krediet RT,他、Kidney Int 55: 341-356, 1999
【非特許文献５】Krediet RT,他、Ave Ren Replace Ther 5: 212-217, 1994
【非特許文献６】Struijk SG,他、Kidney Int 45: 1739-1744, 1994
【非特許文献７】Davies SJ,他、Nephrol Dial Transplant 11: 448-506, 1996
【非特許文献８】Combet S,他、J Am Soc Nephrol 12: 2146-2157, 2001
【非特許文献９】Korbet SM,他、Am J Kidney Dis 22: 588-591, 1993
【非特許文献１０】Miyata T, 他、Kidney Int 2002; 61: 375-386
【非特許文献１１】Nakayama M,他、Kidney Int 51: 182-186, 1997
【非特許文献１２】Miyata T,他、Kidney Int 58: 425-435, 2000
【非特許文献１３】Witowski J,他、J Am Soc Nephrol 11: 729-739, 2000
【非特許文献１４】Wieslander A,他、Adv Perit Dial 12:57-60, 1996
【非特許文献１５】Garcia-Lopez E,他、Perit Dial Int 20(Suppl 5): S48-S56, 2000
【非特許文献１６】Krediet RT,他、Perit Dial Int 17:35-41, 1997
【非特許文献１７】Faller B, 他、Kidney Int (Supple 56): S81-S85, 1996
【非特許文献１８】Rippe B,他、Kidney Int 59:348-357, 2001
【非特許文献１９】Topley N、Perit Dial Int 17:42-47, 1997
【非特許文献２０】Feriani M,他、Kidney Int 54: 1731-1738, 1998
【非特許文献２１】Lage C,他、Perit Dial Int 20(Suppl 5): S28-S32, 2000
【非特許文献２２】Papapetropoulos A,他、J Clin Invest 100: 3131-3139, 1997
【非特許文献２３】Vriese AS,他、J Am Soc Nephrol 12: 2029-2039, 2001
【非特許文献２４】Margetts PJ,他、J Am Soc Nephrol 12: 2029-39, 2001
【非特許文献２５】Combet S,他、J Am Soc Nephrol 11: 717-728, 2000
【非特許文献２６】Ogata S,他、J Am Soc Nephrol 12: 2787-2796, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、長期腹膜透析（PD）患者などにおける腹膜の機能低下を効果的に抑制することができるような新規な腹膜保護剤を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、長期腹膜透析（PD）患者における腹膜の機能不全および限外濾過不全は、尿毒症性循環とグルコースPD液の加熱滅菌の双方による反応性のカルボニル化合物（RCO）の過負荷（「腹膜のカルボニルストレス」）が少なくとも部分的に誘発させる、腹膜の生化学的変化と関連付けられる、という仮説を検証するべく、腎亜全摘の尿毒症ラットモデルを用い、これにグルコースベースの一般的な透析液を用いてPDを行い、腹膜の構造的、機能的及び生化学的変化に対するピリドキサミン（最近開発された後期糖化最終産物（AGE）およびカルボニルストレスの強力な阻害薬）の保護的効果を評価した。その結果、ピリドキサミンが腹膜保護作用を示すことを確認し、本発明を完成するに至った。【０００７】
即ち、本発明によれば、ピリドキシン類又はその塩を有効成分として含む、腹膜保護剤が提供される。【０００８】
好ましくは、ピリドキシン類はピリドキサミンである。
好ましくは、本発明の腹膜保護剤は、腹膜透析患者における腹膜の機能不全又は限外濾過不全を治療及び／又は予防するために使用する。【０００９】
本発明の別の側面によれば、ピリドキシン類又はその塩の有効量をヒトを含む哺乳動物に投与する工程を含む、腹膜を保護する方法が提供される。【００１０】
本発明のさらに別の側面によれば、腹膜保護剤の製造のためのピリドキシン類又はその塩の使用が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明の実施に形態について詳細に説明する。
本発明では、腎亜全摘の尿毒症ラットモデルを用い、これにグルコースベースの一般的な透析液を用いてPDを行い、腹膜の構造的、機能的及び生化学的変化に対するピリドキサミン（最近開発された後期糖化最終産物（AGE）およびカルボニルストレスの強力な阻害薬）の保護的効果を評価した。【００１２】
尿毒症時の腹膜は、血液と透析液との間での小分子溶質の機能的交換面積の増大、血管増殖、AGF産生の増加、血管新生を誘導するサイトカイン（すなわちVEGFおよびFGF-2）発現のアップレギュレーションを特徴としていた。PDと関連する腹膜の機能的、構造的及び生化学的変化も同様であるが、PDを受けていない慢性尿毒症患者の場合よりも重症である。PDを行っている尿毒症ラットに投与したピリドキサミンは、小分子溶質の輸送速度および血管密度を有意に低下させたが、この結果は限外濾過不全に対するピリドキサミンの有益な役割を示している。この改善は、AGE蓄積および血管新生を誘導するサイトカイン発現の低下を伴っていた。【００１３】
このように、尿毒症の環境ならびにPD処置により生じる腹膜のカルボニルストレスは、生物活性分子の誘導による血管増殖および小分子溶質の機能的交換面積の増大の一因となり、最終的には限外濾過不全に至る。【００１４】
本発明では、ピリドキサミンを用いる処置により、血漿からの小分子溶質の輸送速度および透析液からのグルコースの吸収速度が有意に低下した。驚くべきことに、ピリドキサミンを用いる処置により、膜透過性に対する尿毒症の影響がほぼ完全に消失した。この腹膜機能の改善は、尿毒症およびPDにより誘導される血管新生の亢進および血管新生を誘導するサイトカイン発現の抑制を伴っていた。実際、ピリドキサミンを用いる介入により組織のペントシジン含量は有意に低下した。したがって、ピリドキサミンは、腹膜の機能的、構造的及び分子生化学的変化を改善することにより、PDを受ける尿毒症患者の腹膜を保護することができる。【００１５】
即ち、本発明は、ピリドキシン類又はその塩を有効成分として含む腹膜保護剤に関するものである。
本発明において有効成分として用いるピリドキシン類としては、ピリドキシン、ピリドキサール、ピリドキサミン又はそれらの塩などが挙げられる。上記の中でも、ピリドキサミン又はその塩を使用することが特に好ましい。上記したピリドキシン、ピリドキサールおよびピリドキサミン は、下記式で表される化合物である。【００１６】
【化１】
2006126523.tif 000002
【００１７】
式中、Ｒは、ＣＨ2ＯＨ（ピリドキシンの場合）、ＣＨＯ（ピリドキサールの場合）またはＣＨ2ＮＨ2（ピリドキサミンの場合 ）を表す。【００１８】
ピリドキシン類の塩としては、ピリドキシン類の塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩またはマレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等の有機酸塩があげられる。塩としては、リン酸ピリドキシン、リン酸ピリドキサール、又はリン酸ピリドキサミンなどが特に好ましい。【００１９】
また、ピリドキシン類又はその塩は、水和物もしくは溶媒和物の形で存在することもある。ピリドキシン類又はその塩は、公知の方法により合成することも可能であり、あるいは市販品として購入することもできる。【００２０】
本発明の腹膜保護剤は、ピリドキシン類を有効成分として含有し、所望により、製剤化のための添加物を含有する医薬組成物の形態で提供することができる。医薬組成物は、有効成分であるピリドキシン類を、薬学的に許容可能な担体と組み合わせて配合することによって調製することができる。【００２１】
薬学的に許容可能な担体としては、生理食塩水、リンゲル液、リン酸緩衝生理食塩水、その他の当業者に既知の担体などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。医薬組成物には、例えば安定化剤、酸化防止剤、着色剤、賦形剤、結合剤、増粘剤、分散剤、再吸着増進剤、緩衝液、界面活性剤、防腐剤、乳化剤、等張化剤、及び希釈剤などから選択される１種以上の添加剤を含めることができる。上記した薬学的に許容可能な担体および添加剤は、有効成分であるピリドキシン類の副作用を最小限にし、かつピリドキシン類の薬効の阻害を小さくなるように選択することが望ましい。なお、ピリドキシン類と薬学的に許容可能な担体および／又は添加剤とを組み合わせて含む医薬組成物の調製法は、当業者に既知である。【００２２】
例えば、本発明の腹膜保護剤を懸濁物として経口投与する場合には、医薬組成物には、微結晶性セルロース、懸濁剤としてのアルギン酸またはアルギン酸ナトリウム、増粘剤としてのメチルセルロース、および香料などを配合することができる。即放性の錠剤を調製する場合には、医薬組成物には、微結晶性セルロース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウムおよび乳糖またはその他の賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、希釈剤および潤滑剤などを配合することができる。【００２３】
本発明の腹膜保護剤を、注射用の溶液または懸濁液として投与する場合には、滅菌済みの合成モノまたはジグリセリドを含む油、並びにオレイン酸を含む脂肪酸のような、適当な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて、注射用の溶液または懸濁液を調製することができる。【００２４】
本発明の腹膜保護剤を座剤として直腸投与する場合には、常温で固体だが直腸腔で溶解して薬剤を放出するココアバター、合成グリセリドエステルまたはポリエチレングリコールのような適当な賦形剤をピリドキシン類と混合することによって座剤を調製することができる。【００２５】
本発明の腹膜保護剤の投与経路は特に限定されず、経口投与、又は非経口投与（例えば、皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、静脈内投与など）の何れでもよい。【００２６】
本発明の腹膜保護剤が固形製剤の場合、該固形製剤に含有されるピリドキシン類の含有量は通常０．０１〜３０重量％であり、好ましくは０．１〜２０重量％である。本発明の腹膜保護剤が液剤の場合、該液剤に含有されるピリドキシン類の含有量は通常、０．１〜２０mg/mLであり、好適には１〜１０mg/mLである。【００２７】
本発明の腹膜保護剤の投与量及び投与回数は、投与の目的、投与形態、剤型、摂取者の年齢、体重又は性別などの条件などを含む種々の要因により適宜設定することができる。一般的には、投与量は、有効成分であるピリドキシン類の投与量として一日当り、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．５〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲である。上記投与量の製剤を一日１〜４回程度に分けて投与することが好ましい。本発明の腹膜保護剤の投与期間は時に限定されず、短期間（例えば、１日〜数週間）の投与でもよいし、長期間（数週間〜１ヶ月以上）の投与でもよい。【００２８】
本発明の腹膜保護剤は、腹膜透析患者における腹膜の機能不全又は限外濾過不全を治療及び／又は予防するために使用することができる。本明細書において治療とは、腹膜の機能不全又は限外濾過不全を治癒すること、改善すること、又は進行を抑制して悪化を緩和することなどを含む。また、本明細書において予防とは、腹膜の機能不全又は限外濾過不全の発生を未然に防止すること、又はその状態の悪化を防止することなどを含む。【００２９】
本発明においては、腹膜の機能不全又は限外濾過不全の治療又は予防のために有効な量のピリドキシン類を患者（例えば、腹膜透析患者）に投与することによって、腹膜を保護することができ、これによって腹膜の機能不全又は限外濾過不全を治療及び／又は予防することができる。【００３０】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３１】
（Ａ）方法
（１）実験動物
動物実験のプロトコルを図１に示す。6週齢で体重200±3 gのSprague-Dawley雄性ラット（CLER Japan, Inc.、東京）を、疑似手術した対照ラット（第1群：n = 6）、腹膜透析を行わない尿毒症ラット（第2群：n = 12）および腹膜透析を行う尿毒症ラット（n = 24）に無作為に割り当てた。腹膜透析を行う尿毒症ラットをさらに、4.25％ダイアニール（登録商標）（3.86％グルコース、2.5 mEq/CAPD液。Baxter Health care Corp.、イリノイ州ラウンドレイク）で透析した群（第3群：n = 12）および1Lの4.25％ダイアニール（登録商標）中ピリドキサミン5 mg（Pridorine、Biostratum Inc.、ノースカロライナ州）含有液で腹膜透析した群（第4群：n = 12）の2群に分割した。【００３２】
尿毒症モデルは、既報のとおり [Lameire N,他、Kidney Int 54: 2194-2206, 1998；及びKleinknecht C,他、Kidney Int 47: S51-S54, 1995] 5/6腎摘により作製した。屠殺前夜まで、1.06％カルシウム、0.9％リン酸塩、21％タンパク質を含有する実験ラット標準餌（CE2：CLER Japan, Inc.、東京）および水道水を自由に摂取させた。13週目に、13.5 cmカテーテルを接続したRat-o-ports（Access Technologies, Norefolk Medical、イリノイ州スコキー）をイソフラン麻酔下で全ラットに埋植した。Rat-o-portsは頚部皮下に埋植し、１週間後に30 mlの透析液で1日2回の腹膜透析を開始し、その後6週間継続した [Zweers MM,他、Nephrol Dial Transplant 16: 651-654, 2001]。腹膜透析開始前に、第2群、第3群、第4群でそれぞれ4匹、5匹、2匹のラットが死亡した。最終的に、疑似手術対照群（第1群：n = 6）、腹膜透析を行わない尿毒症群（第2群：n = 8）、腹膜透析を行う尿毒症群（第3群：n = 7）、ピリドキサミン5 mgを用いて腹膜透析を行う尿毒症群（第4群：n = 10）を得た。【００３３】
（２）組織採取
PDを6週間行った後、アクセスポートから4.25％ダイアニール（登録商標）を注入し、腹膜平衡化試験（60分）を施行した。その後過、麻酔によりラットを安楽死させた。第21週に採取したヘパリン血から血漿を分離した。腸間膜を摘出して、光学顕微鏡検査または免疫組織化学検査により評価した。【００３４】
（３）血漿および腹膜透析液の解析
血漿および腹膜透析液におけるグルコース、クレアチニン、尿素、総コレステロール及びトリグリセリドの濃度は、自動分析機（Hitachi型式736-60、日立電子株式会社）で測定した。【００３５】
（４）HPLCによるペントシジン測定
ラット腹膜中のペントシジン含量はHPLCを用いて既報の方法 [Miyata T, 他、J.Am.Soc.Nephrol 7: 1198-1206, 1996] に従い、下記の通り評価した。腹膜組織（100 mg）を1.5 mlのクロロホルム／メタノール（2:1）、その後メタノール1.0 mlを用いてホモジェナイズして脂質を除去し、真空下で乾燥し、500μlの6N HClで110℃で16時間加水分解した。酸加水分解物を真空中で乾燥し、400μlの10 mM HClで再構成し、孔径0.5μmのフィルターでろ過し、PBSで希釈した。希釈したサンプルをHPLC装置に注入し、C18逆相カラム（5μm、4.6×250 mm：Waters、東京）で分離した。溶出液を蛍光検出器（RF-10A：島津製作所、東京）および励起/発光波長335/385 nmを用いてモニターした。合成ペントシジン [Miyata T, 他、J.Am.Soc.Nephrol 7: 1198-1206, 1996] を用いて標準曲線を作成した。【００３６】
（５）免疫組織化学分析
ホルマリン固定しパラフィン包埋した切片を用いて免疫組織化学分析を行った。パラフィンブロックから4μmの切片を調製し、脱パラフィンして、段階的な濃度のエタノールに浸して脱水した。一次抗体として、抗TGF-β1抗体（1:40、Santa Cruz Biotechnology、カリフォルニア州サンタクルズ）、抗フォン・ビルブラント因子抗体（1:400、Daco、デンマーク、グルストラップ）、抗VEGF抗体（1:100、Santa Cruz Biotechnology）、抗FGF-2抗体（1:400、Santa Cruz Biotechnology）、抗AGE抗体（1:200、株式会社トランスジェニック、熊本）を使用した。切片をキシレンで脱パラフィンし、エタノールにより脱水した。切片を0.3％H２O２を含むメタノール中に室温で10分間漬し、内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害した。加熱による抗原性賦活化を行った。リン酸緩衝生理食塩水（pH7.4）で洗浄後、切片（抗TGF-β1、フォン・ビルブラント因子、FGF2、VEGF抗体）を0.01Mクエン酸緩衝液（pH6.0）中で電子レンジ（500Ｗ）中100℃で10分間加熱した。一次抗体を加えて室温で1時間インキュベートした。その後、切片をリンスし、二次抗体（ニチレイ、東京）とともに45分間インキュベートし、0.2％ 3,3-ジアミノベンジジン四塩酸塩（DAB）に浸漬した後、ヘマトキシリンで対比染色した。免疫標識の特異性を、非免疫ウサギまたはヤギIgGを用いて検討した。【００３７】
（６）血管数の評価
血管数は、フォン・ビルブラント因子について染色した切片において、WinROOFソフトウェア（三谷商事、東京）を用いた画像解析により評価した。皮質領域ごとに無作為に選択した20視野中で、40倍の対物レンズを用いて毛細血管数の平均を概算した。結果は、健常な対照動物の何倍になったかで表した。【００３８】
（７）VEGFおよびFGF-2発現の検出
VEGFまたはFGF2（腸間膜）のmRNA発現を半定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）により定量した。全RNAをISOGEN（ニッポンジーン、東京）を用いて腸間膜から抽出した。ランダムプライマー（LIFE TECHNOLOGIES）を用いて、200単位のMMLV逆転写酵素（BioLabs.Inc.）により2μgのRNAを逆転写した。PCR増幅は既報 [Inagi R,他、FEBS Letters 463: 260-264, 1999] のとおり行った。オリゴヌクレオチドプライマーの配列は以下の通りである。【００３９】
VEGFのプライマー：
5’-ACT GGA CCC TGG CTT TAC TGC-3’（配列番号１）
5’-TTG GTG AGG TTT GAT CCG CAT G-3’ （配列番号２）
増幅断片の全長は310bp【００４０】
FGF2のプライマー
5’-CAA GCA GAA GAG AGA GGA GTT-3’ （配列番号３）
5’-TCA AGC TCT TAG CAG ACA TTG-3’ （配列番号４）
増幅断片の全長は276bp【００４１】
ラットβ-アクチンのプライマー
5’-GTG TGA TGG TGG GTA TGG GTC AGA AGG ACT-3’ （配列番号５）
5’-ATG GCA TGA GGG AGC GCG TAA CCC TCA TAG-3’ （配列番号６）
増幅断片は402 bp【００４２】
異なる試料中のRNA量の比較を可能にする内部標準としてβ−アクチンを用いた。試料はDNAサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus、コネチカット州ノーウォーク）を用い、VEGFまたはFGF2の場合は94℃1分間、58℃1分間、β−アクチンの場合は60℃1分間、72℃１分間の適切なサイクルで増幅した。予備実験では、RNAの量を様々に変えて、逆転写およびPCR増幅を18、21、25、28、31、34、36サイクル行った。この実験から、VEGFまたはFGF2のmRNA増幅では35サイクル、β−アクチンのmRNA増幅では16または21サイクルで増幅させると、PCR産物シグナルの差は、用いたRNAと定量的な関係が保たれることが明らかになった。2％アガロース電気泳動で分離し、エチジウムブロマイドで染色したPCR産物を、定量プログラム（NIH imageソフトウェア）を用いたシグナル強度測定により定量化した。mRNAは3検体測定し、実験ごとに結果を平均した。各実験条件について、合計3〜4回の独立した実験を行った。結果を平均し、平均±SDで表した。【００４３】
（８）統計学的解析
結果はすべて平均±SDで表した。群間の差異の統計学的有意性を、ウィルコクソンのノンパラメトリック検定（平均値が2個の場合）またはクラスカル・ウォリス検定（平均値が3個以上の場合）で評価した。本実施例の統計学的解析では、有意差の検出にSPSSソフトウェア（SPSS Inc、イリノイ州シカゴ）を利用した。0.05未満のＰ値を有意とみなした。【００４４】
（Ｂ）結果
（１）機能解析
腎亜全摘した尿毒症ラットの生化学的データおよび体重を表１に示す。尿毒症ラット（第２〜４群）では、非尿毒症ラット（第１群）と比較して、血漿クレアチニン、尿素、総コレステロール量が有意に増加し、体重は減少していた。尿毒症群のＰＤ及び／又はピリドキサミン処置の有無間の統計学的解析を行ったところ、これらの値に有意差はみとめられなかった。グルコースおよびトリグリセリドの血漿濃度は、全群間で統計学的差はなかった。【００４５】
【表１】
2006126523.tif 000003
【００４６】
腎亜全摘後13週に評価した腹膜（PM）の機能パラメータを評価したところ、血漿からの小分子溶質（すなわちクレアチニン、尿素）の輸送速度（図２Ａ及びＢ）および透析液からのグルコースの吸収速度（図２Ｃ）が、対照ラット（第１群）よりも尿毒症ラット（第２群）で有意に高かった。クレアチニン（図３Ａの黒丸）またはグルコース（図３Ｂ）の透過性増加と腎不全の程度との間に有意の相関が認められた。これらのデータは、慢性尿毒症自体が腹膜を変化させかつEPSAを増大させるというKombetらによる最近の観察結果と一致している [Korbet SM,他、Am J Kidney Dis 22: 588-591, 1993]。【００４７】
腹膜の透過性はPD中に徐々に変化する。通常のグルコースベースの透析液を用いた6週間のPDにより、血漿からの小分子溶質の輸送速度（図２Ａ及びＢの第３群）および透析液からのグルコースの吸収速度（図２Ｃ）は有意に増加した。【００４８】
尿毒症およびPD処置による腹膜機能の変化は、少なくとも部分的には、尿毒症性循環およびPD液の双方に由来する腹膜のカルボニルストレスが原因であるとされている。そこで、尿毒症ラットに、ピリドキサミン（AGEおよびカルボニルストレスの強力な阻害薬として臨床で使用されている）を用いてPDを腹腔内に行った。ピリドキサミン（5 mg/L）による6週間の処置により、血漿からの小分子溶質の輸送速度（図 ２Ａ及びＢの第４群）、および透析液からのグルコースの吸収速度（図２Ｃ）は有意に低下した。図３ＡおよびＢ（白三角）で示すように、ピリドキサミンは、小分子溶質（クレアチニンおよびグルコース）の透過性増加と腎不全の程度の間の回帰直線の傾きを劇的に減少させた。ピリドキサミン処置により、膜透過性に対する尿毒症の影響はほぼ完全に消失した。【００４９】
（２）組織学的分析
EPSAの増大は血管新生の亢進と密接に関係することが知られている。そこで、フォン・ビルブラント因子染色後の腹膜組織中の血管数を測定した（図４Ａ）。尿毒症自体により血管数が1.87倍増加し、PD処置はその値を5.83倍増大させた。この血管新生の亢進は、ピリドキサミン処置により2.68倍まで有意に改善した。クレアチニン（図４Ｂ）またはグルコース（図４Ｃ）の透過性増加と血管数との間に有意の相関が認められた。この結果は、腹膜機能低下時のEPSA増大が尿毒症およびPD処置と関連していることを意味している。【００５０】
（３）分子生物学的分析
腹膜の機能および構造の変化と関連する分子事象について検討した。AGEおよびカルボニルストレスの周知の代用のマーカーであるペントシジンの含量を、腸間膜組織のHPLCアッセイにより測定した。ペントシジン含量は尿毒症により増加し（図５Ａの第２群）、組織中のペントシジン含量と腎不全の程度との間に相関関係が存在する（図５Ｂの黒丸）。PD処置中に、ペントシジンの形成は促進され（図５Ａの第３群）、PDは、ペントシジン含量と腎不全との間の回帰直線の傾きを増加させた（図5Ｂの白四角）。対照的に、ピリドキサミンの介入により組織中のペントシジン含量は有意に低下し（図５Ａの第４群）、回帰直線の傾きは減少した（図５Ｂの白三角）。組織中のペントシジン含量と、クレアチニンの透過性（図６Ａ）および血管数（図６Ｂ）の増加との間に有意の相関が認められた。【００５１】
次に、血管新生を誘導するサイトカインの役割を明らかにするため、腹膜組織中のVEGFおよびFGF-2の遺伝子発現を半定量的PCRにより分析した。尿毒症ラットにおけるVEGF（図７Ｂ）およびFGF-2（図７Ｃ）の発現は、対照ラットの場合よりも高く、PD処置により顕著に増加した。一方、ピリドキサミンは、VEGFおよびFGF-2の両方の発現を、PDを行わない尿毒症ラットと同様のレベルまで低下させた。【００５２】
腹膜の分子生物学的変化は、腸間膜組織切片中のVEGF、FGF-2、vWF、AGE、TGF-β1についての免疫組織化学分析によりさらに裏付けられた（図８）。すなわち、対照ラットの腸間膜血管の内皮では、VEGF、FGF-2、vWF、AGE、TGF-β1の染色を視覚的に検出できなかったが、これらのバイオマーカーは、尿毒症ラットの腹膜にはわずかに存在し、PD処置を行った尿毒症ラットでは顕著に認められた。一方、ピリドキサミン処置を行ったラットの腸間膜の毛細血管では、わずかな染色が検出されたのみであった。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明において有効成分として用いるピリドキサミン等のピリドキシン類は副作用の少ない安全な物質である。本発明によれば、長期腹膜透析（PD）患者などにおける腹膜の機能低下を効果的に抑制することができる安全な腹膜保護剤を提供することが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、動物実験のプロトコルを示す。6週齢のラットを尿毒症の疑似手術群に割付けた。腎亜全摘5週後に、腹腔内カテーテルおよび皮下アクセスポートを配置する外科的埋植を行った。PDは出生後21週まで継続した。
【図２】図２は、PETによる腹膜機能の解析を示す。3.85％グルコース透析液20 mlでの60分の交換中のCr (A) および尿素 (B) の透析液/血漿比（D/P）、ならびに透析液からのグルコース吸収（D/D0）(C) を、対照ラット（第１群）、PDを行わない尿毒症ラット（第２群）、ピリドキサミンなしでPDを受けた尿毒症ラット（第３群）、5 mg/LピリドキサミンありでPDを受けた尿毒症ラット（第４群）において検討した。ａ：第１群に対してp<0.01。b：第２群に対してp<0.01。c：第３群に対してp<0.01。d：第４群に対してp<0.01。e：第３群に対してp<0.05。f：第４群に対してp<0.05。
【図３】図３は、クレアチニン (Ａ) またはグルコース (Ｂ) の透過性の増加と腎不全の程度との相関を示す。黒丸：第１群および第２群（A、y = 0.20x + 0.26、n = 14、r = 0.87、p<0.001。B、y = 0.0538x + 0.49、n = 14、r = 0.63、p<0.05）白四角：第３群（A、y = 0.22x + 0.39、n = 7、r = 0.76、p>0.01。B、y = 0.1350x + 0.45、n = 7、r = 0.93、p<0.05）白三角：第４群（A、y = 0.02x + 0.63、n = 10、r = 0.24、p>0.1。B、y = 0.0015x + 0.29、n = 10、r = 0.025、p>0.1）慢性尿毒症により小分子脂質の透過性が増大する。この増大は通常のグルコースベースの透析液を用いるPDによりさらに増大する。対照的に、ピリドキサミン処置は尿毒症による膜透過性の低下を是正する。
【図４】図４は、フォン・ビルブラント因子についての免疫組織化学分析による腹膜の構造解析を示す。Ａ：ラット腸間膜の血管数。a：第１群に対してp<0.01。b：第２群に対してp<0.01。c：第３群に対してp<0.01。d：第４群に対してp<0.01。クレアチニン（Ｂ、y = 0.052x + 0.434、n = 31、r = 0.65、p<0.001）またはグルコース（Ｃ、y = -0.029x + 0.43、n = 31、r = -0.64、p<0.001）の透過性の増大と血管数ととの間に有意の相関が存在した。慢性尿毒症により血管数が増加し、この増加は通常のグルコースベースの透析液を用いるPDでさらに増大するが、ピリドキサミン処置により減少する。
【図５】図５は、HPLCアッセイによる腹膜のAGE含量を示す。Ａ：ラット腸間膜中のペントシジン含量。a：第１群に対してp<0.01。b：第４群に対してp<0.05。c：第３群に対してp<0.05。Ｂ：腸間膜のペントシジン含量と腎不全によるクレアチニン透過性の程度との間に有意の相関が存在する。黒丸：第１群および第２群（y = 0.0.24x - 0.005、n = 14、r = 0.91、p<0.001。白四角：第３群（y = 0.80x + 0.091、n = 7、r = 0.82、p<0.01）。白三角：第４群（y = 0.006x + 0.0135、n = 10、r = 0.35、p>0.1）。慢性尿毒症により腸間膜のペントシジン含量は増加し、通常のグルコースベースの透析液を用いたPDでさらに増加するが、ピリドキサミン投与により低下する。
【図６】図６は、腸間膜ペントシジン含量とクレアチニン透過性または血管数との相関を示す。腸間膜中のペントシジン含量は、クレアチニン透過性（Ａ、y = 0.066x - 0.018、n = 31、r = 0.65、p<0.001）または血管数（Ｂ、y = 0.004x + 0.001、n = 31、r = 0.46、p<0.01）と相関する。
【図７】図７は、血管新生を誘導するサイトカインの発現の検出を示す。腸間膜でのVEGFまたはFGF2のmRNA発現を半定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）により分析した (Ａ)。実験ごとに、β−アクチンに対するVEGFまたはFGF2のmRNAの比の平均を計算した。VEGF (Ｂ) またはFGF2 (Ｃ) についての2回の実験の平均を示す。a：第１群に対してp<0.05。b：第２群に対してp<0.05。c：第３群に対してp<0.05。d：第４群に対してp<0.05。e：第１群に対してp<0.01。f：第２群に対してp<0.01。g：第３群に対してp<0.01。h：第４群に対してp<0.01。
【図８】図８は、腸間膜のVEGF、FGF2、vWF、AGE、TGFβ1の免疫組織化学的検出を示す。対照ラットの腹膜では、VEGF (A)、FGF2 (B)、vWF (C)、AGE（D）、TGF-β1（D）の染色は視覚的に検出できなかったが、尿毒症ラットにはこれらのバイオマーカーがわずかに存在し、PD処置を受けた尿毒症ラットでは顕著であった。対照的に、ピリドキサミンを投与したラットの腸間膜の毛細血管ではわずかな染色のみが検出された。倍率×400。
【図１】
2006126523.tif 000004
【図２】
2006126523.tif 000005
【図３】
2006126523.tif 000006
【図４】
2006126523.tif 000007
【図５】
2006126523.tif 000008
【図６】
2006126523.tif 000009
【図７】
2006126523.tif 000010
【図８】
2006126523.tif 000011
【配列表】
2006126523000001.app
【国際調査報告】
2006126523.tif 000012
2006126523.tif 000013
2006126523.tif 000014
2006126523.tif 000015