(57)【要約】本発明によれば、γ−グルタミルシステインシンセターゼ（γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、好ましくは微生物由来のγ−グルタミルシステインシンセターゼまたは該酵素を有する細胞の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源に用いて、グルタミル供与体とアミン化合物とからγ−グルタミルアミド化合物を生成することを特徴とするγ−グルタミルアミド化合物の製造方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ−グルタミルシステインシンセターゼ（γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）または該酵素を有する細胞の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源に用いて、グルタミル供与体とアミン化合物とから下式（Ｉ）
【化４】
2006121055.tif 000007
（式中、Ｒ１およびＲ２は同一または異なって、水素原子、置換若しくは非置換の低級アルキル、置換若しくは非置換の低級アルケニル、または置換若しくは非置換の低級アルキニルを表すが、Ｒ１およびＲ２は同時に水素原子にはならない）で表されるγ−グルタミルアミド化合物を生成することを特徴とするγ−グルタミルアミド化合物の製造方法。
【請求項２】
γ−グルタミルシステインシンセターゼが微生物由来の酵素である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
微生物が腸内細菌、酵母または糸状菌のいずれかである、請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
微生物がエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物である、請求項２記載の製造方法。
【請求項５】
γ−グルタミルシステインシンセターゼが以下の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質である、請求項１記載の製造方法。
［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつγ−グルタミルシステインシンセターゼ活性を有する蛋白質
［３］配列番号１で表されるアミノ酸と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質
【請求項６】
細胞が微生物である、請求項１記載の製造方法。
【請求項７】
微生物が腸内細菌、酵母または糸状菌のいずれかである、請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
微生物がエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物である、請求項６記載の製造方法。
【請求項９】
γ−グルタミルシステインシンセターゼを有する細胞がγ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドを導入された細胞である、請求項１および６〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１０】
γ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドが以下の［１］〜［３］のいずれかに記載のポリヌクレオチドである、請求項９記載の製造方法。
［１］請求項５の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質をコードするポリヌクレオチド
［２］配列番号２で表される塩基配列を有するポリヌクレオチド
［３］配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつγ−グルタミルシステインシンセターゼ活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、γ−グルタミルシステインシンセターゼまたは該酵素を有する細胞の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源に用いたγ−グルタミルアミド化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  γ−グルタミルシステインシンセターゼ（γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）はγ−グルタミルペプチドの合成酵素として知られている（非特許文献１参照）。γ−グルタミルシステインシンセターゼは基質特異性が比較的広く、Ｌ−グルタミン酸と各種アミノ酸とから、種々のγ−グルタミルアミノ酸を生成する活性を有することが知られている（特許文献１参照）。【０００３】  また、γ−グルタミルシステインシンセターゼは、アミノ酸以外にも４−ヒドロキシアニリンとＬ−グルタミン酸とからγ−グルタミル−４−ヒドロキシアニリドを生成する活性を有することも知られている（特許文献２参照）。
しかしながら、γ−グルタミルシステインシンセターゼがＬ−グルタミン酸のようなグルタミル供与体とエチルアミンのようなアミン化合物とからγ−グルタミルアミド化合物を生成する活性を有することは知られていない。【０００４】  γ−グルタミルアミド化合物の１種であるテアニンは、玉露の旨味の主要成分として知られており、茶をはじめとする食品の香味物質として重要な物質である。また、テアニンは、リラックス効果、睡眠障害改善、血圧抑制、冷え性改善、てんかん予防、集中力向上などの種々の生理的効果を有することが示唆されており、健康食品素材としても有望視されている。【０００５】  テアニンの酵素的製造法としてはグルタミナーゼを用いる方法（特許文献３参照）、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ）を用いる方法（特許文献４参照）シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌由来のｉｐｕＣ（γ−グルタミルアミドシンセターゼ：γ−ｇｌｕｔａｍｙｌａｍｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）を用いる方法（特許文献５参照）などが知られている。グルタミナーゼを用いる方法は唯一、実用化されている方法であるが、該方法は本来の酵素反応の逆反応を利用するために高アルカリ条件で高いエチルアミン濃度で反応する必要があること、グルタミナーゼの加水分解反応によって基質のグルタミンがグルタミン酸に変換されるため収率が悪いなどの問題があり、より効率の良い製造方法が望まれている。
【非特許文献１】生命工学研究レポート、熊谷ら、Ｖｏｌ．１４、Ｎｏ．４、８−１７（１９８５）
【特許文献１】特開昭５７−１３２８９６号公報
【特許文献２】特開昭５７−９９１９７号公報
【特許文献３】特開平１１−２２５７８９号公報
【特許文献４】特開平８−８９２６６号公報
【特許文献５】国際公開第０１／７３０３８号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  本発明の目的は、グルタミルアミド化合物、好ましくはテアニンの簡便で効率のよい製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  本発明は、以下の（１）〜（１０）に関する。
（１）γ−グルタミルシステインシンセターゼ（Ｅ．Ｃ．６．３．２．２）または該酵素を有する細胞の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源に用いて、グルタミル供与体とアミン化合物とから下式（Ｉ）【０００８】
【化１】
2006121055.tif 000002
【０００９】  （式中、Ｒ１およびＲ２は同一または異なって、水素原子、置換若しくは非置換の低級アルキル、置換若しくは非置換の低級アルケニル、または置換若しくは非置換の低級アルキニルを表すが、Ｒ１およびＲ２は同時に水素原子にはならない）で表されるγ−グルタミルアミド化合物を生成することを特徴とするγ−グルタミルアミド化合物の製造方法。
（２）γ−グルタミルシステインシンセターゼが微生物由来の酵素である、上記（１）の製造方法。
（３）微生物が腸内細菌、酵母または糸状菌のいずれかである、上記（２）の製造方法。
（４）微生物がエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物である、上記（２）の製造方法。
（５）γ−グルタミルシステインシンセターゼが以下の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質である、上記（１）の製造方法。
［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつγ−グルタミルシステインシンセターゼ活性を有する蛋白質
［３］配列番号１で表されるアミノ酸と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質
（６）細胞が微生物である、上記（１）の製造方法。
（７）微生物が腸内細菌、酵母または糸状菌のいずれかである、上記（６）の製造方法。
（８）微生物がエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物である、上記（６）の製造方法。
（９）γ−グルタミルシステインシンセターゼを有する細胞がγ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドを導入された細胞である、上記（１）および（６）〜（８）のいずれか１つの製造方法。
（１０）γ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドが以下の［１］〜［３］のいずれかに記載のポリヌクレオチドである、上記（９）の製造方法。
［１］上記（５）の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質をコードするポリヌクレオチド
［２］配列番号２で表される塩基配列を有するポリヌクレオチド
［３］配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつγ−グルタミルシステインシンセターゼ活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド
【発明の効果】
【００１０】  本発明により、γ−グルタミルアミド化合物、好ましくはテアニンを簡便かつ効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１はエシェリヒア・コリＷ３１１０株由来のγ−グルタミルシステインシンセターゼ遺伝子発現プラスミドｐＧＳＫ１の構造を示す図である。
【符号の説明】
【００１２】ｇｓｈ  Ｉ：エシェリヒア・コリＷ３１１０株由来のγ−グルタミルシステインシンセターゼ遺伝子
Ｐｌａｃ：ラクトースオペロンプロモーター領域
Ｔｌｐｐ：エシェリヒア・コリ由来リポプロテインのターミネーター配列
Ａｐ：アンピシリン耐性遺伝子
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】１．本発明の方法で製造されるγ−グルタミルアミド化合物
本発明の方法で製造されるγ−グルタミルアミド化合物としては、式（Ｉ）（式中、Ｒ１およびＲ２は同一または異なって、水素原子、置換若しくは非置換の低級アルキル、置換若しくは非置換の低級アルケニル、または置換若しくは非置換の低級アルキニルを表すが、Ｒ１およびＲ２は同時に水素原子にはならない）で表されるγ−グルタミルアミド化合物をあげることができる。【００１４】  式（Ｉ）の定義において、低級アルキルとしては、例えば炭素原子数１から１０の直鎖、分枝鎖状、環状またはこれらの組み合わせからなるアルキルがあげられ、より具体的には直鎖、分枝鎖状のアルキルとしては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシルなどがあげられ、環状のアルキルとしては、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロデシル、ノルアダマンチル、アダマンチルなどがあげられ、直鎖または分枝状と環状との組み合わせからなるアルキルとしては、例えばシクロプロピルメチル、シクロペンチルメチル、シクロオクチルエチルなどがあげられる。【００１５】  低級アルケニルとしては、例えば炭素原子数２から１０の直鎖または分枝鎖状のアルケニルがあげられ、より具体的にはビニル、アリル、１−プロペニル、１−ブテニル、３−ブテニル、２−ペンテニル、４−ペンテニル、２−ヘキセニル、５−ヘキセニル、１−ヘプテニル、４−ヘプテニル、６−ヘプテニル、２−デセニル、１−オクテニル、９−デセニル、１−ノネニル、６−ノネニルなどがあげられる。【００１６】  低級アルキニルとしては、例えば炭素原子数２から１０の直鎖または分枝鎖状のアルケニルがあげられ、より具体的にはエチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニルなどがあげられる。
置換低級アルキル、置換低級アルケニルおよび置換低級アルキニルにおける置換基としては、同一または異なって置換数１〜置換可能な数の、好ましくは置換数１〜３、より好ましくは置換数１の、例えばハロゲン、ニトロ、ヒドロキシなどがあげられる。【００１７】  本発明の方法で製造される、より好ましいγ−グルタミルアミド化合物としては、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２がメチル、エチル、プロピル、シクロプロピルまたはブチルである化合物、さらに好ましくは下式（ＩＩ）【００１８】
【化２】
2006121055.tif 000003
【００１９】で表されるテアニンをあげることができる。
２．本発明で用いられるγ−グルタミルシステインシンセターゼ
本発明で用いられるγ−グルタミルシステインシンセターゼは、γ−グルタミルシステインシンセターゼであれば、その由来は問わないが、好ましくは腸内細菌、酵母または糸状菌由来の該酵素をあげることができる。具体的には、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のｓｗｉｓｓ−ｐｒｏｔ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｐ４６３０９に登録されているアミノ酸配列を有する蛋白質（以下、同様に生物名の後の番号はｓｗｉｓｓ−ｐｒｏｔ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒを表し、該ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒに登録されているアミノ酸配列を有する蛋白質であることを意味する）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ由来のＱ７ＷＥＳ２、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来のＱ７Ｗ３Ｆ２、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ由来のＯ２３７３６、Ｂｕｃｈｎｅｒａ ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ由来のＰ５７４８５、Ｐ５８９９４およびＱ８９ＡＤ８、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ由来のＱ２０１１７、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＱ９ＨＦ７８、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のＱ９７ＩＶ１、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来の、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ由来のＱ９Ｗ３Ｋ５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＱ８Ｘ９００、Ｐ０６９８０、１５０１１９８ＡおよびＣＡＡ２７５８３、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ由来のＱ８２ＺＧ８、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ由来のＱ８Ｆ４Ｄ５、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ由来のＱ９２６Ｘ７、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来のＱ８Ｙ３Ｒ３、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ由来のＯ２２４９３、Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ由来のＱ９ＺＮＸ６、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ由来のＱ８Ｘ０Ｘ０、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ ｖｏｌｖｕｌｕｓ由来のＱ９ＮＦＮ６、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ由来のＱ９ＣＭ００、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ由来のＱ７Ｎ７Ａ４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＱ９ＨＴＹ６、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来のＱ８８Ｒ９０、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ由来のＱ８８ＡＲ１およびＰ６１３７９、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ由来のＱ８Ｚ４Ｄ６、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来のＯ６８８３８、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ由来のＱ０９７６８、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ由来のＱ８ＥＢＦ９、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ由来のＱ８Ｅ３９９、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ由来のＱ８ＤＸＭ９、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ由来のＱ８ＤＷ１５、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ由来のＱ９ＫＵＧ５、Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ由来のＱ８７ＬＳ２、Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ由来のＱ８ＤＣ３８、Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ由来のＱ７ＭＨＳ５、Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈｉａ ｇｌｏｓｓｉｎｉｄｉａ由来の��８Ｄ２Ｖ５、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＰ３２４７７、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ由来のＱ８ＺＢＵ２、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ由来のＰ４８５０７およびＰ４８５０６、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ由来のＰ９７４９４、並びにＲａｔｔｕｓｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由来のＰ４８５０８およびＰ１９４６８など
をあげることができる。【００２０】  また、本発明で用いられるγ−グルタミルシステインシンセターゼとして、より好ましくは上記酵素中の微生物由来の該酵素、さらに好ましくは腸内細菌、酵母、または糸状菌由来の該酵素、特に好ましくはエシェリヒア・コリ由来の該酵素、最も好ましくは配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をあげることができる。
また、本発明で用いられるγ−グルタミルシステインシンセターゼとしては、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつγ−グルタミルシステインシンセターゼ活性を有する蛋白質をあげることができる。【００２１】  上記において、１個以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつγ−グルタミルシステインシンセターゼ活性を有する蛋白質は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。【００２２】  欠失、置換または付加されるアミノ酸残基の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１個または複数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されていてもよい。【００２３】  置換が可能なアミノ酸残基としては、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列と上記した各種生物由来のγ−グルタミルシステインシンセターゼのアミノ酸配列とを公知のアライメントソフトウェアを用いて比較したときに、すべてのアミノ酸配列において保存されていないアミノ酸をあげることができる。公知のアライメントソフトウェアとしては、例えば遺伝子解析ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ（ソフトウェア開発株式会社）に含まれるアライメント解析ソフトをあげることができる。該解析ソフトの解析パラメータとしては、デフォルト値を用いることができる。【００２４】  また、アミノ酸残基の欠失または付加が可能なアミノ酸の位置としては、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端側およびＣ末端側をあげることができる。
欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。【００２５】  以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
また、本発明で用いられる蛋白質としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつγ−グルタミルシステインシンセターゼ活性を有する蛋白質をあげることができる。【００２６】  アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。【００２７】  配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質が、γ−グルタミルシステインシンセターゼ活性を有する蛋白質であることを確認する手段としては、例えばＤＮＡ組換え法を用いて活性を確認したい蛋白質を発現する形質転換体を作製し、該形質転換体を用いて該蛋白質を製造した後、該蛋白質、Ｌ−グルタミン酸、およびＬ−システインを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にγ−グルタミルシステインが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法をあげることができる。
３．本発明で用いられる細胞
本発明で用いられる細胞としては、γ−グルタミルシステインシンセターゼを有する細胞であれば、微生物および動植物細胞等のいずれの細胞も用いることができ、好ましくはγ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドを有する該細胞などをあげることができる。【００２８】  該細胞としては、上記２のγ−グルタミルシステインシンセターゼを有する各種生物の細胞、好ましくは該細胞のうちの微生物、より好ましくは該微生物のうちの腸内細菌、酵母および糸状菌、さらに好ましくはエシェリヒア・コリをあげることができる。
また、本発明で用いられる細胞としては、好ましくはγ−グルタミルシステインシンセターゼ活性が増強された細胞をあげることができる。【００２９】  γ−グルタミルシステインシンセターゼ活性が増強された細胞としては、上記２のγ−グルタミルシステインシンセターゼを有する細胞を変異剤、例えばＮ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ’−ｎｉｔｒｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ（ＮＴＧ）等を用いて、公知の方法により細胞を処理し、変異前の細胞に比べてγ−グルタミルシステインシンセターゼ活性が上昇している細胞株を選択することにより得られる変異株、遺伝子組換え法によりγ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入して得られる組換え株などをあげることができる。【００３０】  また、本発明で用いられる細胞としては、好ましくはγ−グルタミルシステインシンセターゼを有し、かつグルタミル供与体、例えばＬ−グルタミン酸を生産する能力を有する細胞、さらに好ましくはγ−グルタミルシステインシンセターゼを有し、かつグルタミル供与体、例えばＬ−グルタミン酸を生産する能力が強化された細胞をあげることができる。該細胞としては、例えば公知の方法によりＬ−グルタミン酸を生産する能力を人為的に強化した微生物、好ましくは原核生物、より好ましくはエシェリヒア・コリなどをあげることができる。
４．本発明で用いられるγ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチド
本発明におけるポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡであり、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。【００３１】  本発明で用いられるγ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドとしては、γ−グルタミルシステインシンセターゼコードするポリヌクレオチドであればその由来は問わないが、好ましくは上記２のγ−グルタミルシステインシンセターゼを有する細胞由来のγ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドをあげることができ、具体的には、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ  Ｚ２９４９０に登録されている塩基配列を有するポリヌクレオチド（以下、生物名の後の番号はＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒを表し、該ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒに登録されている塩基配列を有するポリヌクレオチドを意味する）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ由来のＢＸ６４０４５０、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来のＢＸ６４０４３５、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ由来のＹ１０８４８、Ｂｕｃｈｎｅｒａ ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ由来のＢＡ０００００３、ＡＥ０１４１１５およびＡＥ０１４０１７、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ由来のＺ５４２１８、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＡＦ１７６６７７、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のＡＥ００７６６４、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来のＢＡ００００１６、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ由来のＡＦ２４４３５１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＡＥ００５４９７、ＡＥ０１６７６５およびＸ０３９５４、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ由来のＡＥ０１６９５６、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ由来のＡＥ０１１３８２、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ由来のＡＬ５９６１７４、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来のＡＬ５９１９８４、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ由来のＡＦ０１７９８３、Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ由来のＡＦ０４１３４０、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ由来のＡＬ６７０００９、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ ｖｏｌｖｕｌｕｓ由来のＡＦ０４２１６８、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ由来のＡＥ００６１４６、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ由来のＢＸ５７１８６３、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＡＥ００４９３３、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来のＡＥ０１６７７４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ由来のＡＥ０１６８５７およびＡＹ３７４３２６、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ由来のＡＬ６２７２７６、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来のＡＦ０５５３５２、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍ���ｅ由来のＸ８５０１７、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ由来のＡＥ０１５７９２、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ由来のＡＬ７６６８５４、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ由来のＡＥ０１４２７４、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ由来のＡＥ０１４８７６、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ由来のＡＥ００４１４１、Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ由来のＢＡ００００３１、Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ由来のＡＥ０１６８０２、Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ由来のＢＡ００００３７、Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈｉａ ｇｌｏｓｓｉｎｉｄｉａ由来のＢＡ００００２１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＤ９０２２０、Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ由来のＡＪ４１４１５６、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のＬ３５５４６および１４９０８５６、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ由来のＵ８５４１４、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由来のＳ６５５５５およびＪ０５１８１などをあげることができる。【００３２】  また、本発明で用いられるγ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドとしては、より好ましくは上記の微生物由来の該ポリヌクレオチド、さらに好ましくは該微生物中の腸内細菌、酵母、または糸状菌由来の該ポリヌクレオチド、特に好ましくは該腸内細菌中のエシェリヒア属に属する微生物由来の該ポリヌクレオチド、特に好ましくはエシェリヒア・コリ由来の該ポリヌクレオチド、最も好ましくは配列番号２で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドをあげることができる。【００３３】  また、本発明で用いられるγ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつγ−グルタミルシステインシンセターゼ活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドをあげることができる。【００３４】  ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの一部にポリヌクレオチドがハイブリダイズすることである。したがって、該特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドまたはその一部は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして用いることができ、またＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できるポリヌクレオチドである。プローブとして用いられるポリヌクレオチドとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のポリヌクレオチドをあげることができ、プライマーとして用いられるポリヌクレオチドとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のポリヌクレオチドをあげることができる。【００３５】  ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えば当業者であれば本願明細書に従い、ハイブリダイゼーションの条件を決定することができる。該ハイブリダイゼーションの条件は、モレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｇｙ，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｍａｎｕａｌ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従っておこなうことができる。【００３６】  上記のストリンジェントな条件とは、ポリヌクレオチド、好ましくはＤＮＡを固定化したフィルターとプローブ、好ましくはプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件が好ましいが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば６×ＳＳＣＥ（２０×ＳＳＣＥは、３ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、０．２ｍｏｌ／ｌのリン酸二水素ナトリウム、０．０２ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベートした後、５０℃の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば５×ＳＳＣ）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。【００３７】  上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、例えば上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号２で表される塩基配列と少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。【００３８】  配列番号２で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが、γ−グルタミルシステインシンセターゼ活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドであることは、例えば上記したように、遺伝子組換え法を用いて該ポリヌクレオチドにコードされる蛋白質を製造し、該蛋白質の活性を測定することにより確認することができる。
５．本発明で用いるγ−グルタミルシステインシンセターゼの調製法
本発明で用いるγ−グルタミルシステインシンセターゼは、上記３の細胞を培地に培養し、培養物中にγ−グルタミルシステインシンセターゼを生成、蓄積させ、公知の蛋白質の精製方法に従い、該培養物中からγ−グルタミルシステインシンセターゼを分離、精製することにより取得することができ、好ましくはγ−グルタミルシステインシンセターゼを有する細胞として、γ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドを遺伝子組換え法により細胞に導入して得られるγ−グルタミルシステインシンセターゼ活性が増強された組換え細胞を用い、該組換え細胞の培養物から取得する方法をあげることができる。
（１）γ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドの調製法
本発明に用いられるγ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドは、例えば上記４のγ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いた、各生物の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、または該塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、上記２の各生物などの染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ［ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］により取得することができる。【００３９】  また、各種の遺伝子配列データベースに対して上記４のγ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドの塩基配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する生物の染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等から上記した方法によりγ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドを取得することもできる。【００４０】  取得したポリヌクレオチドをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー（パーキン・エルマー社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ポリヌクレオチドの塩基配列を決定することができる。【００４１】  塩基配列を決定した結果、取得されたポリヌクレオチドが部分長であった場合は、該部分長ポリヌクレオチドをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ポリヌクレオチドを取得することができる。
更に、決定されたポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするポリヌクレオチドを調製することもできる。【００４２】  上記のようにして取得されるポリヌクレオチドとして、例えば、配列番号２で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドをあげることができる。
γ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドを組み込むベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＤＩＲＥＣＴ［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，６０６９（１９９０）］、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐ  ＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）、ｐＣＲＩＩ（インビトロジェン社製）およびｐＣＲ−ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）などをあげることができる。【００４３】  宿主細胞としては、エシェリヒア属に属する微生物などをあげることができる。エシェリヒア属に属する微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＸＬ２−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＤＨ１、エシェリヒア・コリＭＣ１０００、エシェリヒア・コリＡＴＣＣ１２４３５、エシェリヒア・コリＷ１４８５、エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＮｏ．４９、エシェリヒア・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリＮＹ４９、エシェリヒア・コリＭＰ３４７、エシェリヒア・コリＮＭ５２２、エシェリヒア・コリＢＬ２１、エシェリヒア・コリＭＥ８４１５等をあげることができる。【００４４】  組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等をあげることができる。
上記方法によって得られる形質転換体としては、例えば配列番号２で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドを含有する組換え体ＤＮＡを保有する微生物であるエシェリヒア・コリＢＬ２１／ｐＧＳＫ１をあげることができる。
（２）γ−グルタミルシステインシンセターゼを有する形質転換体の調製法
上記（１）の方法で得られるγ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドをもとにして、必要に応じて、γ−グルタミルシステインシンセターゼをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、γ−グルタミルシステインシンセターゼをコードする部分の塩基配列を、宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、生産率が向上した形質転換体を取得することができる。【００４５】  該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。
該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、γ−グルタミルシステインシンセターゼを生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等、目的とするポリヌクレオチドを発現できるものであればいずれも用いることができる。【００４６】  発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、γ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、γ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、γ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。【００４７】  発現ベクターとしては、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、ｐＨｅｌｉｘ１（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、ｐＫＫ２３３−２（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＥＴ−３（ノバジェン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＰＡＣ３１（ＷＯ９８／１２３４３）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）等を例示することができる。【００４８】  プロモーターとしては、エシェリヒア・コリ等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。【００４９】  さらにバチルス属に属する微生物中で発現させるためのｘｙｌＡプロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３５，５９４−５９９（１９９１）］やコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物中で発現させるためのＰ５４−６プロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，６７４−６７９（２０００）］なども用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。【００５０】  γ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするＤＮＡを発現ベクターに結合させた組換え体ＤＮＡにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
このような組換え体ＤＮＡとしては、例えばｐＧＳＫ１をあげることができる。
原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、バチルス属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂｅｎａ）属、アナシスティス（Ａｎａｃｙｓｔｉｓ）属、アスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、フォルミディウム（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ）属、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドスピリウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、シネコッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｃｕｓ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属等に属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＸＬ２−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＤＨ１、エシェリヒア・コリＤＨ５α、エシェリヒア・コリＭＣ１０００、エシェリヒア・コリＫＹ３２７６、エシェリヒア・コリＷ１４８５、エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＮｏ．４９、エシェリヒア・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリＮＹ４９、エシェリヒア・コリＭＰ３４７、エシェリヒア・コリＮＭ５２２、エシェリヒア・コリＢＬ２１、バチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ３３７１２、バチルス・メガテリウム（Ｂａｔｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・イマリオフィルム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６８、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６６、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４２９７、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１３８７０、ミクロバクテリウム・アンモニアフィルム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１５３５４、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ）、セラチア・フォンチコラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌ���）、セラチア・リケファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）Ｄ−０１１０、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・リゾジーンズ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、アグロバクテリウム・ルビ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｕｂｉ）、アナベナ・シリンドリカ（Ａｎａｂａｅｎａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ）、アナベナ・ドリオルム（Ａｎａｂａｅｎａ ｄｏｌｉｏｌｕｍ）、アナベナ・フロスアクア（Ａｎａｂａｅｎａ ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅ）、アースロバクター・オーレッセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ）、アースロバクター・シトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ）、アースロバクター・グロブフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｆｏｒｍｉｓ）、アースロバクター・ヒドロカーボグルタミカス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ）、アースロバクター・ミソレンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｍｙｓｏｒｅｎｓ）、アースロバクター・ニコチアナ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、アースロバクター・パラフィネウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ）、アースロバクター・プロトフォルミエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｔｏｐｈｏｒｍｉａｅ）、アースロバクター・ロセオパラフィナス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｓｅｏｐａｒａｆｆｉｎｕｓ）、アースロバクター・スルフレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｅｕｓ）、アースロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）、クロマチウム・ブデリ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｂｕｄｅｒｉ）、クロマチウム・テピダム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ）、クロマチウム・ビノサム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ）、クロマチウム・ワーミンギ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｗａｒｍｉｎｇｉｉ）、クロマチウム・フルビアタティレ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｆｌｕｖｉａｔｉｌｅ）、エルビニア・ウレドバラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）、エルビニア・カロトバラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、エルビニア・アナス（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｎａｎａｓ）、エルビニア・ヘリコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）、エルビニア・パンクタタ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｐｕｎｃｔａｔａ）、エルビニア・テレウス（Ｅｒｗｉｎｉａ ｔｅｒｒｅｕｓ）、メチロバクテリウム・ロデシアナム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｏｄｅｓｉａｎｕｍ）、メチロバクテリウム・エクソトルクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、フォルミディウム・エスピー（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）ＡＴＣＣ２９４０９、ロドバクター・カプスラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドシュードモナス・ブラスチカ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅ��ｄｏｍｏｎａｓ ｂｌａｓｔｉｃａ）、ロドシュードモナス・マリナ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｒｉｎａ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドスピリウム・リブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ）、ロドスピリウム・サレキシゲンス（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ）、ロドスピリウム・サリナラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓａｌｉｎａｒｕｍ）、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイセス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトマイセス・フンジシディカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・グリセオクロモゲナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ、ストレプトマイセス・オリボグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖｏｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・ラメウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｅｕｓ）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・ビナセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｎａｃｅｕｓ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）等をあげることができる。【００５１】  より好ましい原核生物としてはエシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物をあげることができ、さらに好ましくはエシェリヒア・コリおよびコリネバクテリウム・グルタミカムをあげることができる。
また、より好ましい微生物としてはグルタミル供与体の生産性が強化された微生物をあげることができ、さらに好ましくはＬ−グルタミン酸の生産性が強化された微生物をあげることができる。【００５２】  具体的には、公知の方法によりＬ−グルタミン酸を生産する能力を人為的に付与した微生物、好ましくは原核生物、より好ましくはエシェリヒア属、またはコリネバクテリウム属に属する微生物、さらに好ましくはエシェリヒア・コリおよびコリネバクテリウム・グルタミカムなどをあげることができる。
当該公知の方法としては、
（ａ）Ｌ−グルタミン酸の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和または解除する方法、
（ｂ）Ｌ−グルタミン酸の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、
（ｃ）Ｌ−グルタミン酸の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、
（ｄ）Ｌ−グルタミン酸の生合成経路からＬ−グルタミン酸以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化または遮断する方法、および
（ｅ）野生型株に比べ、Ｌ−グルタミン酸のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独または組み合わせて用いることができる。【００５３】  上記（ａ）の具体的な方法は、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４３，１０５−１１１（１９７９）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１１０，７６１−７６３（１９７２）およびＡｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３９，３１８−３２３（１９９３）などに記載されている。上記（ｂ）の具体的な方法は、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４３，１０５−１１１（１９７９）およびＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１１０，７６１−７６３（１９７２）などに記載されている。上記（ｃ）の具体的な方法は、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３９，３１８−３２３（１９９３）およびＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３９，３７１−３７７（１９８７）などに記載されている。上記（ｄ）の具体的な方法は、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．，３８，１８１−１９０（１９７９）およびＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４２，１７７３−１７７８（１９７８）などに記載されている。上記（ｅ）の具体的な方法は、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３６，１６７５−１６８４（１９７２）、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４１，１０９−１１６（１９７７）、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７，２０１３−２０２３（１９７３）およびＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，２０８９−２０９４（１９８７）などに記載されている。上記文献等を参考にＬ−グルタミン酸を生産する能力を有する微生物を調製することができる。【００５４】  さらに上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかまたは組み合わせた方法によるＬ−グルタミン酸を生産する能力を有する微生物の調製方法については、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｖｏｌ．６，Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｏｆ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，１９９６）ｓｅｃｔｉｏｎ  １４ａ，１４ｂやＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７９，１−３５（２００３）、アミノ酸発酵、学会出版センター、相田  浩ら（１９８６）に記載されており、上記文献等を参照することによりＬ−グルタミン酸を生産する能力を有する微生物を調製することができる。【００５５】  Ｌ−グルタミン酸を生産する能力を有する微生物は、数多く報告されており、例えばＦＥＲＭ  ＢＰ−５８０７およびＡＴＣＣ１３０３２などをあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等をあげることができる。【００５６】  酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を用いることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ  １プロモーター、ｇａｌ  １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターをあげることができる。【００５７】  宿主細胞としては、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、シワニオマイミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、またはキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、シワニオマイセス・アルビウス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、キャンディダ・ウティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）等をあげることができる。【００５８】  組換え体ＤＮＡの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７（特開平３−２２９７９）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ等を用いることができる。【００５９】  プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）の遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。【００６０】  宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞またはナマルバＫＪＭ−１細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、ＳＰ２／０、ＮＳＯ等、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０等、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７等をあげることができる。【００６１】  組換え体ＤＮＡの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法等をあげることができる。【００６２】  昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、蛋白質を生産することができる。【００６３】  即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を生産させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（いずれもインビトロジェン社製）等をあげることができる。【００６４】  バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の卵巣細胞、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）の卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。【００６５】  スポドプテラ・フルギペルダの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ  ア・ラボラトリー・マニュアル）等、トリコプルシア・ニの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ  ５、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはボンビクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）Ｎ４等をあげることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］等をあげることができる。【００６６】  植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。【００６７】  宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等をあげることができる。
（３）γ−グルタミルシステインシンセターゼの調製法
上記３の細胞、または上記（１）および（２）で得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中にγ−グルタミルシステインシンセターゼを生成、蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取することにより、γ−グルタミルシステインシンセターゼを製造することができる。【００６８】  上記γ−グルタミルシステインシンセターゼを有する細胞および形質転換体を培地に培養する方法は、細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
エシェリヒア・コリ等の原核生物あるいは酵母等の真核生物、およびそれらを宿主として得られた形質転換体などの細胞を培養する培地としては、該細胞が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該細胞の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。【００６９】  炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。【００７０】  無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。【００７１】  また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。【００７２】  動物細胞、および動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ＤＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）］またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。【００７３】  培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファーミンジェン社製）、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（ライフ・テクノロジーズ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５［いずれもＪＲＨバイオサイエンシーズ社製］、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ［Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）］等を用いることができる。【００７４】  培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。【００７５】  培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
γ−グルタミルシステインシンセターゼの生産方法としては、細胞内に生産させる方法、細胞外に分泌させる方法、あるいは細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する細胞や、生産させる蛋白質の構造を変えることにより、該方法を適用することができる。【００７６】  γ−グルタミルシステインシンセターゼが細胞内あるいは細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、または特開平５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を細胞外に積極的に分泌させることができる。【００７７】  すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、γ−グルタミルシステインシンセターゼの活性部位を含むアミノ酸配列の手前にシグナルペプチドを付加した形で生産させることにより、γ−グルタミルシステインシンセターゼを細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。【００７８】  さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いてγ−グルタミルシステインシンセターゼを製造することもできる。
γ−グルタミルシステインシンセターゼを有する形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該蛋白質を生成、蓄積させ、該動物個体または植物個体より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。【００７９】  動物個体を用いてγ−グルタミルシステインシンセターゼを製造する方法としては、例えば公知の方法［Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，６３，６３９Ｓ（１９９６）、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，６３，６２７Ｓ（１９９６）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８３０（１９９１）］に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に該蛋白質を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、γ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、γ−グルタミルシステインシンセターゼを該動物中に生成、蓄積させ、該動物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。該動物中の生成、蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で機能するものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。【００８０】  植物個体を用いてγ−グルタミルシステインシンセターゼを製造する方法としては、例えばγ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドを導入したトランスジェニック植物を公知の方法［組織培養，２０（１９９４）、組織培養，２１（１９９５）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，４５（１９９７）］に準じて栽培し、該蛋白質を該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を生産する方法があげられる。【００８１】  γ−グルタミルシステインシンセターゼを生産する細胞または形質転換体を用いて製造されたγ−グルタミルシステインシンセターゼを単離、精製する方法としては、通常の酵素の単離、精製法を用いることができる。
例えば、γ−グルタミルシステインシンセターゼが、細胞内に溶解状態で生産された場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。【００８２】  該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。【００８３】  また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して生産された場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該蛋白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。
該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。【００８４】  γ−グルタミルシステインシンセターゼあるいはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋白質あるいはその糖付加体等の誘導体を回収することができる。
即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。【００８５】  このようにして取得されるγ−グルタミルシステインシンセターゼとして、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をあげることができる。
また、γ−グルタミルシステインシンセターゼを他の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合した蛋白質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。例えば、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、特開平５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１に記載の方法に準じて、本発明のポリペプチドをプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。【００８６】  また、γ−グルタミルシステインシンセターゼをＦｌａｇペプチドとの融合蛋白質として生産し、抗Ｆｌａｇ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］。また、γ−グルタミルシステインシンセターゼに対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。【００８７】  γ−グルタミルシステインシンセターゼのアミノ酸情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法により、γ−グルタミルシステインシンセターゼを製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ社、パーキン・エルマー社、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ社、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
６．本発明で用いられるγ−グルタミルシステインシンセターゼを有する細胞の培養物および該培養物の処理物の調製法
本発明で用いられるγ−グルタミルシステインシンセターゼを有する細胞の培養物は、上記３の細胞、または上記５（１）および（２）で得られる形質転換体を上記５（３）の方法により培養し、培養物中にγ−グルタミルシステインシンセターゼを生成、蓄積させることにより取得することができる。【００８８】  また、本発明で用いられるγ−グルタミルシステインシンセターゼを有する細胞の培養物の処理物としては、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の固定化物などの生菌体、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の蛋白質分画物、あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品などの粗酵素抽出物をあげることができ、それぞれ本発明の製造法の酵素源として使用できる限り、すなわちγ−グルタミルシステインシンセターゼ活性を有する限り、公知の方法によって調製することができる。
７．本発明のγ−グルタミルアミド化合物の製造法
（１）酵素的製造法
γ−グルタミルシステインシンセターゼを酵素源に用いて、グルタミル供与体とアミン化合物とから式（Ｉ）（式中、Ｒ１およびＲ２は同一または異なって、水素原子、置換若しくは非置換の低級アルキル、置換若しくは非置換の低級アルケニル、または置換若しくは非置換の低級アルキニルを表すが、Ｒ１およびＲ２は同時に水素原子にはならない）で表されるγ−グルタミルアミド化合物を生成することにより、γ−グルタミルアミド化合物を製造することができる。【００８９】  より具体的には、γ−グルタミルシステインシンセターゼ、グルタミル供与体、アミン化合物およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にγ−グルタミルアミド化合物を生成、蓄積させ、該媒体からγ−グルタミルアミド化合物を採取する方法をあげることができる。
上記本発明の製造法において、基質に用いられるグルタミル供与体としては、γ−グルタミルシステインシンセターゼの基質となり、アミン化合物と反応してγ−グルタミルアミド化合物を与える化合物であれば特に制限はないが、例えばＬ−グルタミン酸、Ｄ−グルタミン酸、２−オキソグルタル酸、およびそれらの塩などをあげることができ、好ましくはＬ−グルタミン酸、およびその塩をあげることができる。【００９０】  アミン化合物としては、下式（ＩＩＩ）【００９１】
【化３】
2006121055.tif 000004
【００９２】（式中、Ｒ１およびＲ２は前記と同義である）で表されるアミン化合物をあげることができる。
式（ＩＩＩ）で表されるアミン化合物としては、好ましくはメチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、シクロプロピルアミン、ブチルアミンなどをあげることができ、より好ましくはエチルアミンをあげることができる。【００９３】  上記の製造法において、γ−グルタミルシステインシンセターゼは、基質として用いるグルタミル供与体１ｇあたり通常０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇ添加する。
上記の製造法において、基質として用いるグルタミル供与体とアミン化合物は、通常０．１〜５００ｇ／Ｌ、好ましくは０．２〜２００ｇ／Ｌの濃度になるように水性媒体中に初発または反応途中に添加する。【００９４】  上記の製造法において、エネルギー源として用いるＡＴＰは、通常０．５ｍｍｏｌ〜１０ｍｏｌ／Ｌの濃度で用いる。
本発明の製造法で用いられる水性媒体としては、γ−グルタミルアミド化合物の生成反応を阻害しない限り、いかなる成分、組成の水性媒体であってもよく、例えば、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などをあげることができる。【００９５】  γ−グルタミルアミド化合物の生成反応は水性媒体中、通常ｐＨ５〜１１、好ましくはｐＨ６〜１０、２０〜５０℃、好ましくは２５〜４５℃の条件で２〜１５０時間、好ましくは６〜１２０時間行う。
上記方法で製造されるγ−グルタミルアミド化合物としては、式（Ｉ）（式中、Ｒ１およびＲ２は前記と同義である）で表される化合物、好ましくは式（Ｉ）において、Ｒ１が水素原子でありＲ２がメチル、エチル、プロピル、シクロプロピルまたはブチルである化合物、より好ましくは式（ＩＩ）で表されるテアニンをあげることができる。
（２）細胞の培養物等を酵素源として用いる製造法
γ−グルタミルシステインシンセターゼを有する細胞の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用いて、グルタミル供与体とアミン化合物とから式（Ｉ）（式中、Ｒ１およびＲ２は前記と同義である）で表されるγ−グルタミルアミド化合物を生成することにより、γ−グルタミルアミド化合物を製造することができる。【００９６】  より具体的には、［１］γ−グルタミルシステインシンセターゼを有する細胞の培養物または該培養物の処理物、およびアミン化合物を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にγ−グルタミルアミド化合物を生成、蓄積させ、該媒体からγ−グルタミルアミド化合物を採取する方法、および［２］γ−グルタミルシステインシンセターゼを有する細胞の培養物または該培養物の処理物、グルタミル供与体、およびアミン化合物を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にγ−グルタミルアミド化合物を生成、蓄積させ、該媒体からγ−グルタミルアミド化合物を採取する方法をあげることができる。【００９７】  上記製造法で用いられるγ−グルタミルシステインシンセターゼを有する細胞の培養物または該培養物の処理物としては、上記６の方法により調製することができる培養物等をあげることができる。
上記製造法において、基質の種類とその使用濃度、および生産されるγ−グルタミルアミド化合物は、上記７（１）の酵素的製造法と同様である。【００９８】  また、上記製造法において用いられる水性媒体としては、上記７（１）の酵素的製造法に用いられる水性媒体に加え、酵素源として用いる細胞の培養液も水性媒体として用いることができる。
また上記製造法においては、必要に応じて、ＡＴＰの供給源として、細胞が代謝してＡＴＰを生産し得る化合物、例えばグルコースのような糖類、エタノールのようなアルコール類、酢酸のような有機酸類などを水性媒体中に加えることができる。【００９９】  さらに必要に応じて、水性媒体中に界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンＦ２−４０Ｅ、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンＦＢ、日本油脂社製）などの三級アミン類など、ガラクトース含有複合糖質の生成を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどが挙げられ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。【０１００】  培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いる場合、該酵素源の量は、当該酵素源の比活性等により異なが、例えば、基質であるグルタミル供与体１ｍｇあたり通常５〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜４００ｍｇ添加する。
γ−グルタミルアミド化合物の生成反応は水性媒体中、通常ｐＨ５〜１１、好ましくはｐＨ６〜１０、通常２０〜５０℃、好ましくは２５〜４５℃の条件で、通常２〜１５０時間、好ましくは６〜１２０時間行う。【０１０１】  水性媒体中に生成、蓄積したγ−グルタミルアミド化合物の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
以下に、実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０１０２】γ−グルタミルシステインシンセターゼ発現株の造成
エシェリヒア・コリはグルタチオンを生成する能力を有しており、グルタチオン生合成に関わる酵素として、γ−グルタミルシステインシンセターゼをコードする遺伝子が同定されている［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４，４３９３−４００（１９８６）］。
よって、以下の方法によりγ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドをクローニングし、γ−グルタミルシステインシンセターゼ発現株を造成した。【０１０３】  まず、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の飽和フェノールを用いる方法により、エシェリヒア・コリＷ３１１０株の染色体ＤＮＡを単離精製した。
パーセプティブ・バイオシステムズ（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号３〜６で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、プライマーＡ、プライマーＢ、プライマーＣ、プライマーＤと呼ぶ）を合成した。プライマーＡは、公知であるエシェリヒア・コリのγ−グルタミルシステインシンセターゼ遺伝子の開始コドンを含む領域の５’側にＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。なお本遺伝子の開始コドンはＴＴＧで始まるため、翻訳効率の向上を期待してＡＴＧに変更した。プライマーＢは、γ−グルタミルシステインシンセターゼ遺伝子の終始コドンを含む配列と相補的な塩基配列の５’側にＢａｍＨＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。またプライマーＣは、発現ベクターｐＵＣ１９のｌａｃプロモーター領域の塩基配列の５’側にＥｃｏＲＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマーＤは、発現ベクターｐＵＣ１９のｌａｃプロモーター領域の配列と相補的な配列の５’側にＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。【０１０４】  γ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチド断片の増幅には上記のプライマーＡおよびプライマーＢ、鋳型としてエシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０株の染色体ＤＮＡを用い、ｌａｃプロモーター領域の断片の増幅にはプライマーＣおよびプライマーＤ、鋳型としてｐＵＣ１９を用いたＰＣＲを行った。
ＰＣＲは、鋳型として０．１μｇの染色体ＤＮＡまたは１００ｎｇのｐＵＣ１９、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）、４μＬのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（ストラタジーン社製）、各２００μｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびＴＴＰ）を含む反応液４０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。【０１０５】  該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、プライマーＡおよびプライマーＢを用いたＰＣＲではγ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチド断片に相当する約１．６ｋｂ、プライマーＣおよびプライマーＤを用いた反応ではｌａｃプロモーター領域に相当する約０．３ｋｂのポリヌクレオチド断片がそれぞれ増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ［１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ］飽和フェノール／クロロホルム（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）を添加して混合した。該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離し、得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。【０１０６】  該溶液それぞれ５μＬを用い、γ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチド断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで、またｌａｃプロモーター領域のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキット（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩ  ｋｉｔ、ＢＩＯ  １０１社製）により、γ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドを含む１．６ｋｂおよびｌａｃプロモーター領域を含む０．３ｋｂのＤＮＡ断片をそれぞれ回収した。【０１０７】  ０．２μｇの発現ベクターｐＴｒＳ３３（特許２９２８２８７号）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断後、Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅにて処理してアガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により３．１６ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｌａｃプロモーター領域を含む０．３ｋｂ断片と３．１６ｋｂのベクター断片とをライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて、１６℃で１６時間反応させ連結した。【０１０８】  該反応液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株（東洋紡社製）を、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕によって形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｌａｃプロモーターが挿入された発現ベクターが取得されていることを確認し、該発現ベクターをｐＴｒＳ３３Ｌと命名した。【０１０９】  ｐＴｒＳ３３Ｌを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断後、Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅにて処理してアガロースゲル電気泳動によりポリヌクレオチド断片を分離し、上記と同様の方法により２．５ｋｂのポリヌクレオチド断片を回収した。
上記で得られたを含む１．６ｋｂ断片および２．５ｋｂのベクター断片をライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて、１６℃で１６時間反応させ連結した。【０１１０】  該反応液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株（東洋紡社製）を、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕によって形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｌａｃプロモーター下流に配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする配列番号２で表される塩基配列を有するγ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドが連結したプラスミドＤＮＡが取得されていることを配列決定および制限酵素消化により確認し、該プラスミドＤＮＡをｐＧＳＫ１と命名した。ｐＧＳＫ１の構造を図１に示す。また、該プラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αをＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＧＳＫ１と命名した。
【実施例２】
【０１１１】培養物の処理物を酵素源に用いたγ−グルタミルアミド化合物の製造（１）
実施例１で作製した組換えＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＧＳＫ１を、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含有する４０ｍｌのＬＢ培地［バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）１０ｇ／ｌ、イーストエキス（Ｄｉｆｃｏ社製）５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／ｌ］に各々植菌し、３００ｍｌ容三角フラスコで３０℃一晩振盪培養した。培養終了後、培養物を遠心分離することにより回収した菌体を、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、分光光度計の測定でＯＤ６６０が７０になるように菌体濃度を調整し、菌体含有溶液とした。【０１１２】  該菌体含有溶液にキシレンを１０ｍｌ／Ｌになるように添加し、１５分間ボルテックスすることにより処理菌体を取得した。１００μｌの処理菌体に表１に示す濃度になるよう各物質を添加し、総量２００μｌにした反応液を３７℃で６０分間反応した。【０１１３】
【表１】
2006121055.tif 000005
【０１１４】  反応終了後、以下の条件で反応液をＨＰＬＣ分析することにより、反応液中に生成したテアニンを検出、定量した。結果を表２に示す。
ＨＰＬＣ分析条件：
移動相：２ｇ／Ｌのアセトニトリルを含む３．５％水溶液に１−ヘプタンスルホン酸ナトリウム（リン酸でｐＨ２．０に調製）
カラム：Ｎｕｃｒｅｏｓｉｌ（ＧＬサイエンス社製）４．６×１５０ｍｍを２本連結カラム温度：４０℃
流速：０．９ｍｌ／分
検出：２１０ｎｍの吸収【０１１５】
【表２】
2006121055.tif 000006
【０１１６】  上記にあるとおり、γ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドを導入して得られたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＧＳＫ１株の培養物の処理物を酵素源に用いることにより、テアニンが製造できることがわかった。また、基質としてＬ−グルタミン酸を添加しなくてもテアニンの生成が確認されたことから、特にグルタミル供与体となるＬ−グルタミン酸等の生産能が強化されていない細胞であっても、基質としてアミン化合物を添加するのみで、テアニンのようなγ−グルタミルアミド化合物を生成する能力があることがわかった。
【実施例３】
【０１１７】培養物の処理物を酵素源に用いたγ−グルタミルアミド化合物の製造（２）
γ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするポリヌクレオチドが挿入された組換えプラスミドｐＧＳＫ１をＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１株（宝酒造製）に常法に従って導入して取得し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ｐＧＳＫ１株を取得した。
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ｐＧＳＫ１株を１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で１晩静置培養した。生育してきた菌を３００ｍｌの前培養培地［コーンスティープリカー６％、グルタミン酸ナトリウム１．１５％、乳酸０．２％、カザミノ酸２００ｍｇ／Ｌ、ビタミンＢ１５ｍｇ／Ｌ（ｐＨ７．２）］が入った２Ｌ容の三角フラスコに植菌し、２８℃、２２０ｒｐｍで２０時間培養した。得られた培養物２．２５ｍｌを１Ｌのシード培地［コーンスティープリカー２％、大豆ペプチド（ＳＭＳ：不二精油製）０．５％、リン酸水素２カリウム１．５％、塩化ナトリウム０．１％、硫酸アンモニウム０．６％、グリシン０．１％、アルギニン塩酸塩０．０６％、硫酸第一鉄４．９５ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛４．４ｍｇ／Ｌ、硫酸銅１．９７ｍｇ／Ｌ、塩化マンガン３６０μｇ／Ｌ、ほう酸ナトリウム４４０μｇ／Ｌ、モリブデン酸アンモニウム１８５μｇ／Ｌ、ビタミンＢ１  ５ｍｇ／Ｌ、ニコチン酸５ｍｇ／Ｌ、ロイシン２０ｍｇ／Ｌ、スレオニン２０ｍｇ／Ｌ、トリプトファン２０ｍｇ／Ｌ、ＬＧ１０９（旭電化工業社製）０．０１％、グルコース１％、硫酸マグネシウム０．０５％、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ（ｐＨ６．５）］が入った２Ｌ−Ｊａｒに植菌し、通気１Ｌ／分、攪拌速度８００ｒｐｍ、３０℃で８時間培養した。【０１１８】  得られた培養物２８ｍｌを１Ｌの生産培地［コーンスティープリカー２．２５％、大豆ペプチド（ＳＭＳ：不二精油製）０．５５％、リン酸水素２カリウム１．６８％、塩化ナトリウム０．１１５％、硫酸アンモニウム０．６８％、硫酸第一鉄５．５７ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛４．９５ｍｇ／Ｌ、硫酸銅２．２１ｍｇ／Ｌ、塩化マンガン４０５μｇ／Ｌ、ほう酸ナトリウム４９５μｇ／Ｌ、モリブデン酸アンモニウム２０８μｇ／Ｌ、ビタミンＢ１  ５．６ｍｇ／Ｌ、ニコチン酸５．６ｍｇ／Ｌ、ロイシン２２ｍｇ／Ｌ、スレオニン２２ｍｇ／Ｌ、トリプトファン２２ｍｇ／Ｌ、ＬＧ１０９  ０．０１８％、グルコース１．２６％、硫酸マグネシウム０．０８％アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ（ｐＨ６．５）］が入った２Ｌ−Ｊａｒに植菌し、通気１Ｌ／分、攪拌速度８００ｒｐｍ、３０℃、２８％アンモニア水でｐＨ６．５にコントロールしながら培養した。培養中、３４０ｍｌのフィード糖液（グルコース５７．７％、塩化カルシウム０．１８８ｇ／Ｌ）を一定流速で添加した。【０１１９】  ３０時間後に培養を終了し、キシレンを７．５ｍｌ／Ｌ添加して１０分間攪拌することにより培養物の処理物を取得した。７００ｍｌの該処理物に硫酸マグネシウム３．５ｇ、硫酸カリウム２．４５ｇ、ＡＴＰ３５０ｍｇ、ＮＡＤ５０ｍｇ、ＦＭＮ２２ｍｇ、グルコース６５ｇ、エチルアミン塩酸塩２８ｇ、グルタミン酸ナトリウム５６ｇを添加し、３４℃、通気０．７ｍｌ／分、撹拌速度９５０ｒｐｍ、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．２にコントロールしながら１８時間、反応を行った。反応生成物を実施例２と同様の分析条件で分析し、２．１ｇ／Ｌのテアニンが生成していることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】  γ−グルタミルアミド化合物、好ましくはテアニンを簡便かつ効率よく製造することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１２１】配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【図１】
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【国際調査報告】
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