(57)【要約】  細胞抽出液を用いてサンプル中のｍＲＮＡを翻訳し、このとき、少なくとも１種の終止コドンを読み飛ばして、ｍＲＮＡとそれが翻訳されて生じるタンパク質との結合体を含む複合体を得る工程を含むタンパク質の表示方法。細胞抽出液を用いてサンプル中のｍＲＮＡを翻訳するに際して、アミノ酸のｔＲＮＡのアンチコドンを終止コドンに対応するアンチコドンに置換した少なくとも１種の変異ｔＲＮＡを加えることにより、少なくとも１種の終止コドンを読み飛ばすことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞抽出液を用いてサンプル中のｍＲＮＡを翻訳し、このとき、少なくとも１種の終止コドンを読み飛ばして、ｍＲＮＡとそれが翻訳されて生じるタンパク質との結合体を含む複合体を得る工程を含むタンパク質の表示方法。
【請求項２】
細胞抽出液を用いてサンプル中のｍＲＮＡを翻訳するに際して、アミノ酸のｔＲＮＡのアンチコドンを終止コドンに対応するアンチコドンに置換した少なくとも１種の変異ｔＲＮＡを加えることにより、少なくとも１種の終止コドンを読み飛ばす請求項１に記載の方法。
【請求項３】
全ての終止コドンに対応するように変異ｔＲＮＡを加えることにより、全ての終止コドンを読み飛ばす請求項２に記載の方法。
【請求項４】
変異ｔＲＮＡが、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素によりアミノアシル化されるものである請求項２に記載の方法。
【請求項５】
変異ｔＲＮＡは、アンチコドン部位を認識サイトとしないアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素と対をなすものである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
変異ｔＲＮＡとして、ロイシンｔＲＮＡのアンチコドンを終止コドンに対するアンチコドンに置換した変異ｔＲＮＡ、セリンｔＲＮＡのアンチコドンを終止コドンに対するアンチコドンに置換した変異ｔＲＮＡ、システインｔＲＮＡのアンチコドンを終止コドンに対するアンチコドンに置換した変異ｔＲＮＡ、及びアラニンｔＲＮＡのアンチコドンを終止コドンに対するアンチコドンに置換した変異ｔＲＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１種を用いる請求項２〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
細胞抽出液として、少なくとも1種の終結因子が機能しない細胞抽出液を用いる請求項２に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも1種の終結因子が機能しない細胞抽出液が、少なくとも1種の終結因子を含まない再構築された細胞抽出液、少なくとも１種の終結因子が不活性化された細胞抽出液、又は過剰量のｔＲＮＡを含む細胞抽出液である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
細胞抽出液を用いてサンプル中のｍＲＮＡを翻訳するに際して、細胞抽出液として、少なくとも１種の終結因子が機能しない細胞抽出液を用いることにより、少なくとも１種の終止コドンを読み飛ばす請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１種の終結因子が機能しない細胞抽出液が、少なくとも１種の終結因子を含まない再構築された細胞抽出液、少なくとも１種の終結因子を不活性化した細胞抽出液、又は過剰量のｔＲＮＡを含む細胞抽出液である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
全ての終結因子が機能しない細胞抽出液を用いる請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ｍＲＮＡ翻訳工程の前に、さらに、サンプルからｍＲＮＡを抽出する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ｍＲＮＡ抽出工程の後であってｍＲＮＡ翻訳工程の前に、さらに、抽出されたｍＲＮＡの３’末端に任意の核酸配列を付加する工程を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞抽出液と、アミノ酸のｔＲＮＡのアンチコドンを終止コドンに対応するアンチコドンに置換した少なくとも１種の変異ｔＲＮＡとを備えるタンパク質表示用キット。
【請求項１５】
さらに、少なくとも１種の終結因子が機能しない細胞抽出液を備える請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
少なくとも１種の終結因子が機能しない細胞抽出液を備えるタンパク質表示用キット。
【請求項１７】
以下の(1)、(2)、又は(3)の変異ｔＲＮＡ
(1)  セリンｔＲＮＡのアンチコドンをＣＵＡに置換した終止コドンＵＡＧ読み飛ばし用の変異ｔＲＮＡ。
(2)  セリンｔＲＮＡのアンチコドンをＵＣＡに置換した終止コドンＵＧＡ読み飛ばし用の変異ｔＲＮＡ。
(3)  セリンｔＲＮＡのアンチコドンをＵＵＡに置換した終止コドンＵＡＡ読み飛ばし用の変異ｔＲＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の表示方法、及びそれに用いるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
リボソームディスプレイは、ｍＲＮＡとリボソームとの複合体において合成されるポリペプチドをｍＲＮＡと結合させておくことにより、各ポリペプチドにｍＲＮＡのタグが付いた状態とし、ｍＲＮＡによりポリペプチドを表示する方法である。これは、ｍＲＮＡは、ポリペプチドと異なりシークエンサーなどを用いて容易に配列を決定できること、及び核酸は増幅が容易であるため微量しか存在しなくても配列を決定し易いことを利用したものである。【０００３】
例えば、ヒトサンプルに含まれる全タンパク質にｍＲＮＡのタグを付したものを被験タンパク質又は被験物質と反応させると、被験タンパク質又は被験物質とサンプル中の特定タンパク質とが結合して、分離される。このとき、タンパク質の同定は手間がかかるが、それに結合したｍＲＮＡの塩基配列を読み取ることにより、対応するタンパク質を簡単に同定できる。このようにして、被験タンパク質又は被験物質と特異的に結合するタンパク質をスクリーニングすることができる。【０００４】
このような目的タンパク質の表示ないしはスクリーニング方法として、特許文献１は、
(a)  ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、リボソーム結合部位、及び翻訳開始シグナルを含む５'非翻訳領域を含むin vitro発現ユニットであってｍＲＮＡを合成できるものを構築し、
(b)  ランダムな核酸配列をこの発現ユニットに付着させ、
(c)  この発現ユニット及びランダムな核酸配列と関連した配列を転写又は複製してＲＮＡを生産し、
(d)  このＲＮＡを翻訳して、ポリソームを維持できる条件下でポリソームを生産し、
(e)  このポリソームに被験物質を結合させ、
(f)  被験物質に結合したポリソームを単離し、
(g)  単離したポリソームを破壊し、
(h)  ｍＲＮＡを回収し、
(i)  回収したｍＲＮＡからｃＤＮＡを構築し、
(j)  ｃＤＮＡを発現させて新規ポリペプチドを生産する
方法を開示している。【０００５】
しかし、特許文献１の方法では、様々な長さのポリペプチドが提示されたポリソームが単離できるが、全長ポリペプチドが表示されるわけではない。【０００６】
また、非特許文献１は、
(a)  抗体のｓｃＦｖをコードするＤＮＡライブラリーをＰＣＲで増幅して、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合部位、ステム-ループ、及び３末端人工リンカーを有し、かつ、終止コドンを含まないＤＮＡテンプレートを生産し、それをＲＮＡに転写する工程と、
(b)  ｍＲＮＡをin  vitroでリボソーム複合体を安定化させる因子の存在下に翻訳し、リボソーム上でのｓｃＦｖ抗体の折り畳みを改善する工程と、
(c)  天然ｓｃＦｖを固定化抗原に結合させることにより、翻訳混合物から所望のリボソーム複合体を選択する工程と、
(d)  ＥＤＴＡで結合したリボソーム複合体を乖離させ、全複合体を抗原で特異的に溶出する工程と、
(e)   複合体からＲＮＡを単離する工程と、
(f)  単離したｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡとし、ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅する工程と
を含む方法を開示している。この方法は、スクリーニングの対象が、抗体のｓｃＦｖをコードするＤＮＡライブラリーに限定され、ヒトの全タンパク質をスクリーニングできるものではない。また、３'末端に人工のリンカーを添加し、さらに終止コドンを除去する必要があるため、天然のｍＲＮＡを直接利用することができない。【０００７】
また、非特許文献２は、
(a)  ランダムＮＮＫコドン領域を含む合成ＤＮＡライブラリーをin  vitroで転写・翻訳する工程と、
(b)  クロラムフェニコールでタンパク合成を停止させて、ポリソームを分離する工程と、
(c)  アフィニティ選択できる固定化されたレセプターが存在するウェルにポリソームを入れる工程と、
(d)  結合したポリソームをＥＤＴＡで乖離させて、ｍＲＮＡを回収する工程と、
(f)  ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する工程と、
(g)  ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅する工程と
を含む方法を開示している。しかし、この方法では、終止コドンに到達する前にクロラムフェニコールでタンパク合成を停止させるため、全長タンパク質が表示されず、全長タンパク質についてアフィニティ選択を行えない。【０００８】
また、非特許文献３は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス由来のエステラーゼをコードするｍＲＮＡのセリンコドンを終止コドンのＵＡＧに置換したｍＲＮＡを用いて、翻訳システムの抑制メカニズムを解明する方法を開示している。さらに、リボソームとポリペプチド鎖とを分離させる開放因子ＲＦ１に対する抗体を用いてＲＦ１を失活させることにより、ｍＲＮＡの翻訳を一層効果的に抑制できることを教えている。【０００９】
しかし、非特許文献３では、翻訳システムの抑制メカニズムの解明を行っているにすぎず、全長ポリペプチドと対応するｍＲＮＡとが連結したものが得られたことは記載されていない。
【特許文献１】ＷＯ  ９１／０５０５８
【非特許文献１】Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.94,4937-4942,1997
【非特許文献２】Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.91,9022-9026,1994
【非特許文献３】FEBS Letters,Vol.579,2156-2160,2005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、サンプル中に含まれるタンパク質をそれらをコードするｍＲＮＡと物理的に連結した状態にすることにより表示する方法、及びそれに用いるキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ね、以下の知見を得た。
(i)  サンプル中のｍＲＮＡを、細胞抽出液を用いてin vitroで翻訳するに際して、アミノ酸のｔＲＮＡのアンチコドンを終止コドンに対応するアンチコドンに置換した変異ｔＲＮＡを翻訳系に加えることにより、終止コドンが読み飛ばされて、合成されたタンパク質がｍＲＮＡから離れない。これにより、ｍＲＮＡと対応タンパク質との結合物が得られる。
(ii)   サンプルから抽出されたｍＲＮＡを、細胞抽出液を用いてin vitroで翻訳するに際して、終結因子が機能しない細胞抽出液を用いることにより、終止コドンが読み飛ばされて、合成されたタンパク質がｍＲＮＡから離れない。これにより、ｍＲＮＡと対応タンパク質との結合物が得られる。
(iii)  ｍＲＮＡはリボソームと複合した状態でポリペプチド鎖を伸長するため、ポリペプチド鎖の伸長途中の部分、及びｍＲＮＡのポリペプチド鎖伸長途中の部分はリボソームトンネルに覆われていて、外部に表示されない。終止コドンを読み飛ばすことにより、コード配列を越えて終止コドン及び３’−ＵＴＲに対してペプチド鎖が伸長するため、天然ｍＲＮＡの少なくともコード配列に対応するタンパク質の全長がリボソームトンネルから押し出されるようにして外部に表示される。このようにして、タンパク質とｍＲＮＡとの結合物からリボソームを分離しなくても、少なくとも天然ｍＲＮＡのコード配列に対応するタンパク質の全長を表示することができる。【００１２】
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、下記のタンパク質の表示方法及びキットを提供する。【００１３】
項１．  細胞抽出液を用いてサンプル中のｍＲＮＡを翻訳し、このとき、少なくとも１種の終止コドンを読み飛ばして、ｍＲＮＡとそれが翻訳されて生じるタンパク質との結合体を含む複合体を得る工程を含むタンパク質の表示方法。【００１４】
項２．  細胞抽出液を用いてサンプル中のｍＲＮＡを翻訳するに際して、アミノ酸のｔＲＮＡのアンチコドンを終止コドンに対応するアンチコドンに置換した少なくとも１種の変異ｔＲＮＡを加えることにより、少なくとも１種の終止コドンを読み飛ばす項１に記載の方法。【００１５】
項３．  全ての終止コドンに対応するように変異ｔＲＮＡを加えることにより、全ての終止コドンを読み飛ばす項２に記載の方法。【００１６】
項４．  変異ｔＲＮＡが、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素によりアミノアシル化されるものである項２又は３に記載の方法。【００１７】
項５．  変異ｔＲＮＡは、アンチコドン部位を認識サイトとしないアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素と対をなすものである項４に記載の方法。【００１８】
項６．  変異ｔＲＮＡとして、ロイシンｔＲＮＡのアンチコドンを終止コドンに対するアンチコドンに置換した変異ｔＲＮＡ、セリンｔＲＮＡのアンチコドンを終止コドンに対するアンチコドンに置換した変異ｔＲＮＡ、システインｔＲＮＡのアンチコドンを終止コドンに対するアンチコドンに置換した変異ｔＲＮＡ、及びアラニンｔＲＮＡのアンチコドンを終止コドンに対するアンチコドンに置換した変異ｔＲＮＡからなる群より選ばれる少なくとも１種を用いる項２〜５のいずれかに記載の方法。【００１９】
項７．  細胞抽出液として、少なくとも1種の終結因子が機能しない細胞抽出液を用いる項２〜６のいずれかに記載の方法。【００２０】
項８．  少なくとも1種の終結因子が機能しない細胞抽出液が、少なくとも1種の終結因子を含まない再構築された細胞抽出液、少なくとも１種の終結因子が不活性化された細胞抽出液、又は過剰量のｔＲＮＡを含む細胞抽出液である項７に記載の方法。【００２１】
項９．  細胞抽出液を用いてサンプル中のｍＲＮＡを翻訳するに際して、細胞抽出液として、少なくとも１種の終結因子が機能しない細胞抽出液を用いることにより、少なくとも１種の終止コドンを読み飛ばす項１に記載の方法。【００２２】
項１０．  少なくとも１種の終結因子が機能しない細胞抽出液が、少なくとも１種の終結因子を含まない再構築された細胞抽出液、少なくとも１種の終結因子を不活性化した細胞抽出液、又は過剰量のｔＲＮＡを含む細胞抽出液である項９に記載の方法。【００２３】
項１１．  全ての終結因子が機能しない細胞抽出液を用いる項９又は１０に記載の方法。【００２４】
項１２．  ｍＲＮＡ翻訳工程の前に、さらに、サンプルからｍＲＮＡを抽出する工程を含む項１〜１１のいずれかに記載の方法。【００２５】
項１３．  ｍＲＮＡ抽出工程の後であってｍＲＮＡ翻訳工程の前に、さらに、抽出されたｍＲＮＡの３’末端に任意の核酸配列を付加する工程を含む項１２に記載の方法。【００２６】
項１４．  細胞抽出液と、アミノ酸のｔＲＮＡのアンチコドンを終止コドンに対応するアンチコドンに置換した少なくとも１種の変異ｔＲＮＡとを備えるタンパク質表示用キット。【００２７】
項１５．  さらに、少なくとも１種の終結因子が機能しない細胞抽出液を備える項１４に記載のキット。【００２８】
項１６．  少なくとも１種の終結因子が機能しない細胞抽出液を備えるタンパク質表示用キット。【００２９】
項１７．  以下の(1)、(2)、又は(3)の変異ｔＲＮＡ
(1)  セリンｔＲＮＡのアンチコドンをＣＵＡに置換した終止コドンＵＡＧ読み飛ばし用の変異ｔＲＮＡ。
(2)  セリンｔＲＮＡのアンチコドンをＵＣＡに置換した終止コドンＵＧＡ読み飛ばし用の変異ｔＲＮＡ。
(3)  セリンｔＲＮＡのアンチコドンをＵＵＡに置換した終止コドンＵＡＡ読み飛ばし用の変異ｔＲＮＡ。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の方法によれば、サンプル中のｍＲＮＡをin vitroで翻訳するに際して終止コドンを読み飛ばすことによりさらなるポリペプチドの伸長が進行し、天然ｍＲＮＡの少なくともコード配列に対応するタンパク質の全長をリボソームトンネルから露出させることができる。さらに、合成された全長タンパク質がｍＲＮＡから離脱せず、タンパク質とそれをコードするｍＲＮＡとの結合物が得られる。【００３１】
タンパク質がリボソームトンネルから外部に全長表示されることにより、リボソームの除去などの特別な操作を行うことなく、所望の性質を有するタンパク質をスクリーニングすることができる。例えば、特定化合物や特定タンパク質と相互作用するタンパク質をスクリーニングすることができるようになる。また、特定化合物と相互作用するタンパク質を検出することにより、その化合物による副作用の原因となる蛋白質を予測できる可能性がある。【００３２】
また、ｍＲＮＡのタンパク質コード領域の塩基配列を読み取ることにより、対応タンパク質のアミノ酸配列を読み取ることができる。ｍＲＮＡは塩基配列の読み取りが簡単であり、またＲＴ−ＰＣＲなどの方法で簡単に増幅できるため読み取り感度が高い。【００３３】
このように、本発明方法では、タンパク質にそれをコードするｍＲＮＡのタグを結合することによりタンパク質を表示する。３種の終止コドンを全て読み飛ばすことにより、サンプル中に含まれる全てのタンパク質を表示することができる。【００３４】
タンパク質とｍＲＮＡとの結合物は、通常リボソームとの複合体として得られる。従って、ｍＲＮＡの少なくともコード配列に対応するタンパク質の全長を提示するためには、コード配列を越えてペプチド鎖を伸長するか、又は、タンパク質とｍＲＮＡとの結合物からリボソームを分離する操作が必要になる。本発明のように終止コドンを読み飛ばすことにより複雑かつ特別な操作をすることなく、少なくとも天然ｍＲＮＡのコード配列に対応するタンパク質の全長を表示することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】tRNALeu5CUA、又は／及びＲＦ（Δ）細胞抽出液の使用により、終止コドンUAGの読み飛ばしが行われたことを示す図である。
【００３６】
【図２】ｍＲＮＡのタンパク質コード領域の全長表示のために必要な３’−ＵＴＲの長さを示す図である。
【００３７】
【図３】tRNASerUUUA、tRNASerUUCA、tRNASerCUAと、ＲＦｓ（Δ）細胞抽出液との使用により、それぞれ終止コドンＵＡＡ、ＵＧＡ、ＵＡＧの読み飛ばしが行われたことを示し、かつ、天然ＤＨＦＲの３'−ＵＴＲ配列でも全長タンパク質提示が実施可能であることを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）タンパク質の表示方法【００３９】
本発明のタンパク質の表示方法は、細胞抽出液を用いてサンプル中のｍＲＮＡを翻訳し、このとき、少なくとも１種の終止コドンを読み飛ばして、ｍＲＮＡとそれが翻訳されて生じるタンパク質との結合体を含む複合体を得る第２工程とを含む方法である。
ｍＲＮＡの抽出【００４０】
ｍＲＮＡは、血液のような被験サンプルに含まれたままで翻訳に供することもできるが、被験サンプルから抽出したｍＲＮＡを用いることが好ましい。ｍＲＮＡの抽出方法は周知であり、例えばQiagen社RNeasy Kitにより抽出することができる。また、ｍＲＮＡを、その他のＲＮＡを含むｔｏｔａｌＲＮＡとして抽出し、そのまま第２工程でのin vitro翻訳に供することもできるが、夾雑ＲＮＡが翻訳を阻害する可能性を避けるため、ｍＲＮＡのみ抽出することが好ましく、ｍＲＮＡを精製することがより好ましい。ｔｏｔａｌＲＮＡの抽出方法は周知であり、例えばNucleic Acids Res. 1997 Sep 1;25(17):3465-70.に記載の方法に従えばよい。【００４１】
後述する実施例において示されるように、原核細胞のリボソームは、細胞種によって異なるが、ｍＲＮＡのタンパク質コード領域の３’隣接領域の長さが７５塩基以上であれば、タンパク質コード配列の全領域がリボソームトンネルから外に出る。原核細胞の３’−ＵＴＲは、通常１００〜３００塩基程度であるため、天然のｍＲＮＡをそのまま用いても、ほとんどは、少なくとも天然ｍＲＮＡのコード配列に対応するタンパク質の全長がリボソームトンネルから外部に出る。【００４２】
また、真核細胞のリボソームは、細胞種によって異なるが、ｍＲＮＡのタンパク質コード領域の３’隣接領域の長さが７０〜８０塩基以上であれば、タンパク質コード領域の全長がリボソームトンネルから外に出ると考えられる。真核細胞の３’−ＵＴＲは、通常２００〜１０００塩基程度であるため、天然のｍＲＮＡをそのまま用いても、通常は、少なくとも天然ｍＲＮＡのコード配列に対応するタンパク質の全長がリボソームトンネルから外部に出る。【００４３】
従って、抽出したｍＲＮＡをそのままin vitro翻訳に供してもよいが、抽出したｍＲＮＡの３’末端にさらに任意のヌクレオチド配列を付加してもよく、これにより一層確実に、ｍＲＮＡの全長タンパク質コード領域をリボソームの外部に押し出すことができる。付加するヌクレオチド配列としては、例えばポリアデニル化酵素によるポリＡなどが挙げられる。
in vitro翻訳
細胞抽出液を用いてｍＲＮＡを翻訳するに当たっては、ｍＲＮＡと細胞抽出液とを混合し、細胞抽出液に含まれる翻訳系によりｍＲＮＡをタンパク質に翻訳する。本発明では、ｍＲＮＡ上の終止コドンを読み飛ばすことにより、合成されたタンパク質が終止コドンの位置でｍＲＮＡから離脱しないようにする。【００４４】
通常のタンパク質合成においては、伸長しつつあるポリペプチド鎖の終止コドンに対応する位置にアミノ酸が導入されず、さらに終結因子の働きによりタンパク質がリボソームとｍＲＮＡとの複合体から離脱する。【００４５】
本発明において「終止コドンを読み飛ばす」とは、終止コドンの位置でポリペプチドの伸長が終止せず引き続き伸長することにより全長タンパク質がリボソームトンネルから押し出されるとともに、終止コドンのシグナルによりタンパク質（ポリペプチド鎖）がｍＲＮＡとリボソームとの複合体から離脱しないことをいう。例えば、ｍＲＮＡ上で伸長しているポリペプチド鎖の終止コドンに対応する位置にアミノ酸又は修飾されたアミノ酸を導入すること、又は終結因子が機能しないことにより、ポリペプチド合成の停止、及びｍＲＮＡとリボソームとの複合体からのポリペプチド鎖の離脱が妨げられる。【００４６】
本発明では、終止コドンのシグナルによるポリペプチド合成の停止、及びポリペプチド鎖の脱離が完全に妨げられる場合だけでなく、概ね５０％以上妨げられる場合に、「終止コドンが読み飛ばされた」と判断する。【００４７】
真核細胞及び原核細胞の双方において、ＵＡＡ、ＵＡＧ、及びＵＧＡの３種のコドンが終止コドンとして機能する。３種全ての終止コドンを読み飛ばすことができるようにして、各３’ＵＴＲに存在する終止コドンを読み飛ばすことにより、サンプル中の総タンパク質にｍＲＮＡのタグを付けて表示することができる。【００４８】
細胞抽出液は、サンプルｍＲＮＡが真核細胞由来のものであれば真核細胞の抽出液を用いればよく、サンプルｍＲＮＡが原核細胞由来のものであれば原核細胞の抽出液を用いればよい。サンプルｍＲＮＡが由来する生物種と近縁の生物種、特に同じ生物種の細胞抽出液を用いることが好ましい。
変異ｔＲＮＡ【００４９】
例えば、アミノ酸を結合して運搬するｔＲＮＡのアンチコドンを終止コドンに対応するアンチコドンに置換した変異ｔＲＮＡを、ｍＲＮＡと細胞抽出液との混合物に加えれば、伸長しているポリペプチド鎖の終止コドンに対応する位置にこの変異ｔＲＮＡがアミノ酸を結合する。これにより、終結因子が機能せず、ポリペプチド鎖はｍＲＮＡから離れない。この変異ｔＲＮＡは、内在性若しくは人為的に変異させたアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素によりアミノアシル化されるものであればよい。例えば、アンチコドン部位を認識サイトとしないアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素と対をなすｔＲＮＡを用いることができる。この場合、アンチコドン変異した変異ｔＲＮＡもアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素に効率よくアシル化されることが可能である。具体的にはロイシンｔＲＮＡ合成酵素（中でも、ロイシン５ｔＲＮＡ合成酵素）、セリンｔＲＮＡ合成酵素（中でも、セリン３ｔＲＮＡ合成酵素）、システインｔＲＮＡ合成酵素、アラニンｔＲＮＡ合成酵素等が挙げられる。【００５０】
本発明方法では、変異ｔＲＮＡとして、アミノ酸を結合するｔＲＮＡにおいて、アンチコドンがＵＵＡ（終止コドンＵＡＡのアンチコドン）であるもの、アンチコドンがＣＵＡ（終止コドンＵＡＧのアンチコドン）であるもの、及びアンチコドンがＵＣＡ（終止コドンＵＧＡのアンチコドン）ものの１種以上を使用すればよい。また、アンチコドンがＵＵＡであるもの、ＣＵＡであるもの、及びＵＣＡであるものの全てを用いることにより、全ての終止コドンを読み飛ばすことができる。【００５１】
変異ｔＲＮＡは、いずれのアミノ酸を結合するものであってもよい。中でも、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンのような電荷を有さないアミノ酸を運搬するものを用いることにより、終止コドンを効率的に読み飛ばすことができる。特に、ロイシンｔＲＮＡ（中でも、ロイシン５ｔＲＮＡ）、セリンｔＲＮＡ（中でも、セリン３ｔＲＮＡ）、システインｔＲＮＡ、アラニンｔＲＮＡのアンチコドンを改変した変異ｔＲＮＡが、読み飛ばし効率の点で好ましい。【００５２】
変異ｔＲＮＡは、１種のアミノ酸を運ぶもののみを使用してもよく、複数種のアミノ酸を運ぶものを混合して用いてもよい。【００５３】
変異ｔＲＮＡは、例えばラン−オフin vitro転写法により作製することができ、具体的には実施例に記載の方法に準じて作製することができる。【００５４】
また、変異ｔＲＮＡは、アミノ酸を運搬する天然ｔＲＮＡの変異体に限らず、アミノ酸のホモログを運搬するものであってもよい。ミスアシル化ｔＲＮＡとして、例えば、３’末端にナフチルアラニンが結合したｔＲＮＡが挙げられる。但し、天然のアミノ酸を運搬する変異ｔＲＮＡは、そのアミノ酸をペプチド鎖に移した後は再利用できるというメリットがある。
終結因子が機能しない細胞抽出液【００５５】
細胞抽出液として、終結因子が機能しないものを用いることによっても、終止コドンを読み飛ばすことができる。【００５６】
終結因子が機能しない細胞抽出液としては、例えば、再構築細胞抽出液が挙げられる。終結因子を除去し翻訳に必要なその他の成分を添加した再構築細胞抽出液は例えばポストゲノム社（Post Genome Institute）から市販されている。【００５７】
また、終結因子に対するアプタマー又は抗体等を加えて終結因子を失活させた細胞抽出液を用いることもできる。終結因子に結合するアプタマーは、例えばAnnu Rev Biochem. 1999;68:611-47.に記載のin vitroセレクション法により作製することができる。また、終結因子に対する抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。これらは、周知の方法で作製することができる（例えばCurrent protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al.(1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12〜11.13；Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al.(1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11）。【００５８】
さらに、終結因子が欠損又は変異した細胞株の細胞抽出液を用いることもできる。原核細胞では、例えばＥ．ｃｏｌｉ  ＸＡＣ３０株が、終結因子１（ＲＦ１）欠損株として知られている。【００５９】
また、終結因子が少ない細胞抽出液にさらにｔＲＮＡを添加して終結因子に対して過剰量のｔＲＮＡを含むようにすれば、ミスリーディングが起こり、結果として終結因子が機能しない細胞抽出液となる。【００６０】
本発明方法では、終結因子の１種以上が機能しない細胞抽出液を用いればよいが、全ての種類の終結因子が機能しない細胞抽出液を用いることにより、全ての終止コドンを読み飛ばすことができる。【００６１】
終結因子は、原核細胞の代表例としての大腸菌(Ｅ．ｃｏｌｉ)では、ＲＦ１、ＲＦ２、及びＲＦ３の３種が知られている。ＲＦ１は終止コドンのＵＡＧ及びＵＡＡを認識し、ＲＦ２は終止コドンのＵＧＡ及びＵＡＡを認識する。従って、ＲＦ１が機能しない細胞抽出液を用いればＵＡＧを読み飛ばすことができ、ＲＦ２が機能しない細胞抽出液を用いれば、ＵＧＡを読み飛ばすことができ、双方が機能しない細胞抽出液を用いれば、全ての終止コドンを読み飛ばすことができる。なお、ＲＦ３の機能は解明されていない。【００６２】
また、真核細胞では、ｅＲＦと呼ばれる終結因子が、３種全ての終止コドンを認識する。従って、ｅＲＦが機能しない細胞抽出液を用いれば、全ての終止コドンが読み飛ばされる。【００６３】
終止コドンを読み飛ばすために、少なくとも１種の変異ｔＲＮＡを用いるとともに、少なくとも１種の終結因子が機能しない細胞抽出液を用いることもでき、これにより一層確実に終止コドンを読み飛ばすことができる。この場合、特定の終止コドンを読み飛ばす変異ｔＲＮＡを用いるとともに、その終止コドンを認識する終結因子が機能しない細胞抽出液を用いることが望ましい。
翻訳工程【００６４】
ｍＲＮＡの翻訳は、ｍＲＮＡと細胞抽出液とタンパク質を構成するアミノ酸とを混合してインキュベートすることにより行う。アミノ酸としては、通常タンパク質を構成する２０種のアミノ酸を用いればよいが、市販の細胞抽出液には通常これらのアミノ酸が添加されている。前述したように、この混合物にさらに変異ｔＲＮＡを添加する方法、終結因子が機能しない細胞抽出液を用いる方法などにより、終止コドンを読み飛ばすことができる。【００６５】
インキュベートは、例えば２５〜５０℃程度で、１０〜２４０分間程度行えばよい。これにより、通常、全てのタンパク質の全長が合成される。
ｍＲＮＡの読み取り【００６６】
本発明方法により、通常、ポリソームを構成するリボソームの一部又は全部にタンパク質が結合したものが得られる。これを、ＥＤＴＡ処理することにより、ポリソーム中の各タンパク質−ｍＲＮＡ−リボソーム複合体を互いに分離し、ｍＲＮＡの配列をシークエンサーを用いて読み取ればよい。複合体を分離した場合には全長配列を読み取ることも可能である。なお、ｍＲＮＡの部分配列の読み取りによりそれがコードするタンパク質を同定できる場合は、必ずしもポリソームからｍＲＮＡを分離しなくてよい。
実施例【００６７】
以下、本発明を実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜試薬・酵素・細胞抽出液＞【００６８】
以下の実施例において、ゲル電気泳動はMini Protein SPR300 system（Bio-Rad）を用い、ブロッティングはTrans-Blot SD system (Bio-Rad)を用いた。酵素は市販品を購入した。【００６９】
再構築された２種の原核生物の細胞フリーの翻訳システムClassic 1は、Post Genome Instituteから購入した。RF1(+)細胞抽出液は、十分量のRF1を含み、RF2量が少ないものである。RF1(Δ)細胞抽出液はRF1 及びRF2の双方が少ないものである。
＜鋳型ＤＮＡの調製＞
実施例１の鋳型ＤＮＡの調製【００７０】
E. coli DHFRをコードするpDHFRは、Post Genome InstituteのドクターY.Shimizuから分与された。１回目のPCRは、4pmolのフォワードプライマー及びリバースプライマー、20ngのpDHFR、1.25UのPfu Ultra HF DNAポリメラーゼ（Stratagene）の4nmol、各dNTPs (TOYOBO)の４nmol、及び10× Pfu Ultra HF反応バッファーの2μLを含む20μLの反応混合物を用いて行った。PCR反応の後、増幅産物のアガロースゲル電気泳動を行った。【００７１】
２回目のPCRを、4 pmolのT7プロモーター（下線部）を有するプライマー（5’-d(GAA ATT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ACC ACA ACG GTT TCC CTC TAG AAA TAA TTT TGT TTA ACT TTA AGA AGG AGA TAT ACC A)-3’：配列番号３）、 4 pmolのリバースプライマー、20 fmol以下の１回目のPCR産物、1.25 UのPfu Ultra HF DNAポリメラーゼ, 4 nmolの各dNTPs、2μLの10× Pfu Ultra HF反応バッファーを含む20μLの反応混合物を用いて行った。これらのPCRに用いたプライマーを以下に示す。
T7(+)UAG(+)Stop(-)テンプレート
1回目のPCR
フォワードプライマー: 5'-AAGGAGATATACCAATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTTAGATCAGTCTGATTGC-3'（配列番号１）
リバースプライマー: 5'-CCGCCGCTCCAGAATCTC-3'（配列番号２）
2回目の PCR
フォワードプライマー: 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCA-3'（配列番号３）
リバースプライマー: 5'-CCGCCGCTCCAGAATCTC-3'（配列番号４）
UAG(+)T7(+)Stop(-)テンプレート
1回目のPCR
フォワードプライマー: 5'-AAGGAGATATACCAATGTAGATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTATCAGTCTGATTGCGGCGTTAG-3'（配列番号５）
リバースプライマー: 5'-CCGCCGCTCCAGAATCTC-3'（配列番号６）
2回目の PCR
フォワードプライマー: 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCA-3'（配列番号７）
リバースプライマー: 5'-CCGCCGCTCCAGAATCTC-3'（配列番号８）
T7(+)UAG(+)UAA(+)テンプレート
１回目の PCR
フォワードプライマー: 5'-AAGGAGATATACCAATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTTAGATCAGTCTGATTGC-3'（配列番号９）
リバースプライマー: 5'-TATTCATTACCGCCGCTCCAGAATCTCA-3'（配列番号１０）
2回目の PCR
フォワードプライマー: 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCA-3'（配列番号１１）
リバースプライマー: 5'-TATTCATTACCGCCGCTCCAGAATCTCA-3'（配列番号１２）
UAG(+)T7(+)UAA(+)テンプレート
1回目のPCR
フォワードプライマー: 5'-AAGGAGATATACCAATGTAGATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTATC AGTCTGATTGCGGCGTTAG-3'（配列番号１３）
リバースプライマー: 5'-TATTCATTACCGCCGCTCCAGAATCTCA-3'（配列番号１４）
２回目のPCR
フォワードプライマー: 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCA-3'（配列番号１５）
リバースプライマー: 5'-TATTCATTACCGCCGCTCCAGAATCTCA-3'（配列番号１６）
T7(+)UAG(-)UAA(+)テンプレート
１回目のPCR
フォワードプライマー: 5'-AAGGAGATATACCAATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTATCAGTCTGATTGCGGCGTTAG-3'（配列番号１７）
リバースプライマー: 5'-TATTCATTACCGCCGCTCCAGAATCTCA-3'（配列番号１８）
２回目のPCR
フォワードプライマー: 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGA AATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCA-3'（配列番号１９）
リバースプライマー: 5'-TATTCATTACCGCCGCTCCAGAATCTCA-3'（配列番号２０）
実施例２の鋳型ＤＮＡの調製【００７２】
実施例２で用いた天然に存在する配列の3’-UTRを含むmRNAの合成のためのDNAの鋳型は、さらに３回目のPCR( 75ヌクレオチドのため)、４回目のPCR (147ヌクレオチドのため)、又は５回目のPCR(219ヌクレオチドのため)で増幅した。これらのPCRに用いたプライマーを以下に示す。
T7(+)UAG(+)UAG(+)テンプレート
１回目のPCR
フォワードプライマー: 5'-AAGGAGATATACCAATGATCAGTCTGATTG-3'（配列番号２１）
リバースプライマー: 5'-CCGCCGCTCCAGAATCTC-3'（配列番号２２）
２回目のPCR
フォワードプライマー: 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCA-3'（配列番号２３）
リバースプライマー: 5'-GCATCCGGCGCTAGCCGTAAATTCTATACAAAACTAACCCATTTGCTGTCCACCAGTCATGCTAGCCATCCGCCGCTCCAGAATCTCAAAGC-3'（配列番号２４）
３回目のPCR
フォワードプライマー: 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG-3'（配列番号２５）
リバースプライマー: 5'-AACACAGCCTGATATAGGAAGGCCGGATAAGACGCGACCGGCGTCGCATCCGGCGCTAGCCGTAAATTC-3'（配列番号２６）
４回目のPCR
フォワードプライマー: 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG-3'（配列番号２７）
リバースプライマー: 5'-CTGGGAAGATAAACAGTATTTTGTCCAGCCGTCGAACCGGCATAAGGATTTGGGCGAAGCGGCGGCGTCCTAAACACAGCCTGATATAGGAAG-3'（配列番号２８）
５回目のPCR
フォワードプライマー: 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG-3'（配列番号２９）
リバースプライマー: 5'-CAAAGGTACGCCGGAAGGTATATACGCGCTGGATACCGGCTGCTGCTGGGGTGGTACATTAACCTGCCTGCGCTGGGAAGATAAACAGTATTTTGTC-3'（配列番号３０）
T7(+)UAG(-)Leu(+)テンプレート
１回目のPCR
フォワードプライマー: 5'-AAGGAGATATACCAATGATCAGTCTGATTG-3'（配列番号３１）
リバースプライマー: 5'-CCGCCGCTCCAGAATCTC-3'（配列番号３２）
２回目のPCR
フォワードプライマー: 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCA-3'（配列番号３３）
リバースプライマー: 5'-GCATCCGGCGCTAGCCGTAAATTCTATACAAAAACCCATTTGCTGTCCACCAGTCATGCTAGCCATCCGCCGCTCCAGAATCTCAAAGC-3'（配列番号３４）
３回目のPCR
フォワードプライマー: 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG-3'（配列番号３５）
リバースプライマー: 5'-AACACAGCCTGATATAGGAAGGCCGGATAAGACGCGACCGGCGTCGCATCCGGCGCTAGCCGTAAATTC-3'（配列番号３６）
４回目のPCR
フォワードプライマー: 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG-3'（配列番号３７）
リバースプライマー: 5'-CTGGGAAGATAAACAGTATTTTGTCCAGCCGTCGAACCGGCATAAGGATTTGGGCGAAGCGGCGGCGTCTAAAACACAGCCTGATATAGGAAG-3'（配列番号３８）
５回目のPCR
フォワードプライマー: 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG-3'（配列番号３９）
リバースプライマー: 5'-CAAAGGTACGCCGGAAGGTATATACGCGCTGGATACCGGCTGCTGCTGGGGTGGTACATTAACCTGCCTGCGCTGGGAAGATAAACAGTATTTTGTC-3'（配列番号４０）
実施例３の鋳型ＤＮＡの調製
実施例３で用いた鋳型ＤＮＡを調製するために用いたPCRプライマーを以下に示す。T7プロモーター及びT7タグ配列には下線を付している。また、アンチコドン配列には２重下線を付している。
T7(+)UAA(+)UAA(+)(222)テンプレート
１回目のPCR
フォワードプライマー: 5'-AAGGAGATATACCAATGATCAGTCTGATTG-3'（配列番号４１）
リバースプライマー: 5'-CCGCCGCTCCAGAATCTC-3'（配列番号４２）
2回目のPCR
フォワードプライマー: 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCA-3'（配列番号４３）
リバースプライマー: 5'-GCATCCGGCGCTAGCCGTAAATTCTATACAAAATTAACCCATTTGCTGTCCACCAGTCATGCTAGCCATCCGCCGCTCCAGAATCTCAAAGC-3'（配列番号４４）
３回目のPCR
フォワードプライマー: 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG-3'（配列番号４５）
リバースプライマー: 5'-AACACAGCCTGATATAGGAAGGCCGGATAAGACGCGACCGGCGTCGCATCCGGCGCTAGCCGTAAATTC-3'（配列番号４６）
４回目のPCR
フォワードプライマー: 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG-3'（配列番号４７）
リバースプライマー: 5'-CTGGGAAGATAAACAGTATTTTGTCCAGCCGTCGAACCGGCATAAGGATTTGGGCGAAGCGGCGGCGTCTTAAACACAGCCTGATATAGGAAG-3'（配列番号４８）
５回目のPCR
フォワードプライマー: 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG-3'（配列番号４９）
リバースプライマー: 5'-CAAAGGTACGCCGGAAGGTATATACGCGCTGGATACCGGCTGCTGCTGGGGTGGTACATTAACCTGCCTGCGCTGGGAAGATAAACAGTATTTTGTC-3'（配列番号５０）
T7(+)UGA(+)UGA(+)(222) テンプレート
１回目のPCR
フォワードプライマー: 5'-AAGGAGATATACCAATGATCAGTCTGATTG-3'（配列番号５１）
リバースプライマー: 5'-CCGCCGCTCCAGAATCTC-3'（配列番号５２）
2回目のPCR
フォワードプライマー: 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCA-3'（配列番号５３）
リバースプライマー: 5'-GCATCCGGCGCTAGCCGTAAATTCTATACAAAATCAACCCATTTGCTGTCCACCAGTCATGCTAGCCATCCGCCGCTCCAGAATCTCAAAGC-3'（配列番号５４）
３回目のPCR
フォワードプライマー: 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG-3'（配列番号５５）
リバースプライマー: 5'-AACACAGCCTGATATAGGAAGGCCGGATAAGACGCGACCGGCGTCGCATCCGGCGCTAGCCGTAAATTC-3'（配列番号５６）
４回目のPCR
フォワードプライマー: 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG-3'（配列番号５７）
リバースプライマー: 5'-CTGGGAAGATAAACAGTATTTTGTCCAGCCGTCGAACCGGCATAAGGATTTGGGCGAAGCGGCGGCGTCTCAAACACAGCCTGATATAGGAAG-3'（配列番号５８）
５回目のPCR
フォワードプライマー: 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG-3'（配列番号５９）
リバースプライマー: 5'-CAAAGGTACGCCGGAAGGTATATACGCGCTGGATACCGGCTGCTGCTGGGGTGGTACATTAACCTGCCTGCGCTGGGAAGATAAACAGTATTTTGTC-3'（配列番号６０）
T7(+)UAG(+)UAG(+)(222) テンプレート
１回目のPCR
フォワードプライマー: 5'-AAGGAGATATACCAATGATCAGTCTGATTG-3'（配列番号６１）
リバースプライマー: 5'-CCGCCGCTCCAGAATCTC-3'（配列番号６２）
2回目のPCR
フォワードプライマー: 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCA-3'（配列番号６３）
リバースプライマー: 5'-GCATCCGGCGCTAGCCGTAAATTCTATACAAAACTAACCCATTTGCTGTCCACCAGTCATGCTAGCCATCCGCCGCTCCAGAATCTCAAAGC-3'（配列番号６４）
３回目のPCR
フォワードプライマー: 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG-3'（配列番号６５）
リバースプライマー: 5'-AACACAGCCTGATATAGGAAGGCCGGATAAGACGCGACCGGCGTCGCATCCGGCGCTAGCCGTAAATTC-3'（配列番号６６）
４回目のPCR
フォワードプライマー: 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG-3'（配列番号６７）
リバースプライマー: 5'-CTGGGAAGATAAACAGTATTTTGTCCAGCCGTCGAACCGGCATAAGGATTTGGGCGAAGCGGCGGCGTCCTAAACACAGCCTGATATAGGAAG-3'（配列番号６８）
５回目のPCR
フォワードプライマー: 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG-3'（配列番号６９）
リバースプライマー: 5'-CAAAGGTACGCCGGAAGGTATATACGCGCTGGATACCGGCTGCTGCTGGGGTGGTACATTAACCTGCCTGCGCTGGGAAGATAAACAGTATTTTGTC-3'（配列番号７０）
＜鋳型ｍＲＮＡのIn vitro転写＞【００７３】
鋳型mRNAsを、T7-MEGAshortscript Kit (Ambion)を用いて、鋳型DNAのラン−オフ転写により得た。簡単に説明すると、3 μL の最終PCR産物を含む溶液をT7-転写混合物10μLに加え、これを37 ℃で2時間インキュベートした。この反応混合物に1 Uの DNase Iを加え、混合物をさらに15分間インキュベートした。 Poly A tailing kit (Ambion)を用いたポリアデニル化を行ったmRNAs及びこのようなアデニル化を行わなかったmRNAsをRNeasy MinElute Cleanup Kit (QIAGEN)を用いて精製した。【００７４】
精製したmRNAsの濃度を260nmの吸収を測定することにより決定した。
＜mRNA鋳型の翻訳・ウェスタンブロッティング解析＞
＜実施例１＞【００７５】
T7(+)UAG(+)UAA(+), UAG(+)T7(+)UAA(+), 又は T7(+)UAG(-)UAA(+)の1μgの翻訳を、2.5 μgのtRNAを含む12.5μLのRF1(+) 翻訳システム又はRF1(Δ)翻訳システムを用いて37 ℃で10分間行った。反応溶液の１μLを2.5 μLのサンプルローディングバッファー(125 mM Tris-HCl (pH 6.8)、 4% (w/v) SDS、 20% (w/v)グリセロール、0.002% (w/v)ブロモフェノールブルー、10% (v/v) 2-メルカプトエタノール、及び1.5μLの水と混合した。混合溶液を95℃で５分間インキュベートし、15% SDS-PAGEに供した。【００７６】
ウェスタンブロッティングをPVDFメンブレン(HybondTM-P, Amersham)を用いて行った。T7タグを結合したタンパク質は、抗T7-HRP 複合体抗体 (Novagen)、及びECL PlusTM Western Blotting Detection Reagent (Amersham)を用いて可視化した【００７７】
サプレッション、即ち読み飛ばし（リードスルー）効率は、T7(+)UAG(-)UAA(+) 鋳型の全長DHFRの段階希釈物(10, 20, 40, 60, 80, 100%) を内部標準とし、 Image J software (NIH)を用いてバンドの濃さを評価することにより行った。
＜PRM（ポリソーム）複合体の形成・T7タグによる選択＞【００７８】
鋳型mRNAの２μgの翻訳を、上記のようにして、25μLのRF1(+)翻訳システム又はRF1(Δ)翻訳システムを用い、サプレッサーtRNAの5μgとともに、37 ℃で10分間行った。この溶液に、92.2 mM のK+、 300 mM の Na+、50 mM のMg2+、0.05 % のTween20 (WAKO)、及び 2% のBlock Ace (大日本製薬社)を含む455μLの氷冷した選択バッファー (リン酸カリウム、 pH 7.3) を加え、次いで20μLの抗T7-タグ抗体(Novagen)を添加した。この混合物を4 ℃で30分間穏やかに上下反転させ、空のフィルターカラム(Microspin Columns, Amersham)に移し、遠心によりろ過した。フィルター上に残ったアガロースを200 μLの氷冷選択バッファー（合計1,000μL)で5回洗い、最後に、92.2 mMのK+、 300 mM のNa+、 30 mMのEDTA、 0.05 % のTween20、及び2% のBlock Aceを含む 200μLの溶出バッファー (Phosphate-K, pH 7.2) に再懸濁した。得られた懸濁液を穏やかに、室温で10分間上下反転させた。PRM複合体又はポリソームから脱離したmRNAsを遠心により溶出させた。【００７９】
溶出したmRNAsをRNeasy MinElute Cleanup Kitを用いて精製した。収率は260nmにおけるUV吸光度を測定することにより決定した。これらの回収したmRNAのRT-PCRによる増幅はQIAGEN One-Step RT-PCR キット(QIAGEN)を用いて行った。プライマーは下記のものを用いた。
フォワードプライマー：
5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCA-3'（ユニバーサル）（配列番号７１）
リバースプライマー：5'-CCGCCGCTCCAGAATCTC-3'（配列番号７２）
＜tRNALeu5CUAの調製＞【００８０】
E. coli のサプレッサーtRNALeu5CUAは、ラン−オフin vitro 転写により調製した。鋳型DNAは、20 pmol のフォワードプライマー（5’-d(TAA TAC GAC TCA CTA TAG CCC GGA TGG TGG AAT CGG TAG ACA)-3’ （配列番号７３））、20 pmolのリバースプライマー（5’-d(TGG TAC CCG GAG CGG GAC TTG AAC CCG CAC AGC GCG AAC)-3’（配列番号７４））、100 fmolの鋳型DNA（5’-d(TG GTA CCC GGA GCG GGA CTT GAA CCC GCA CAG CGC GAA CGC CGA GGG ATT TAG AAT CCC TTG TGT CTA CCG ATT CCA CCA TCC GGG C)-3’（配列番号７５））、1.25 U のPfu Ultra HF DNAポリメラーゼ(Stratagene)、10 nmol の各dNTPs (TOYOBO)、及び2μLの10× Pfu Ultra HF 反応バッファーを含む20 μLの反応混合物を用いたPCRにより行った。得られたPCR 溶液は精製せずに転写反応に用いた。【００８１】
In vitro 転写は、2,500 UのT7 RNAポリメラーゼ(TOYOBO)、2μmol の各NTPs (Fermentas)、5μmolのGMP (Sigma)、1Uの無機ピロフォスフェイト(Calbiochem-Novabiochem)、80 UのRNase阻害剤(TOYOBO)、鋳型DNAの18μLのPCR溶液、及び50μLの10×反応バッファー (37 ℃で18時間）を含む500μLの反応混合物を用いて行った。転写されたtRNAを変性PAGE (8%)を用いて精製し、次いでエタノール沈殿を行い、500μLの水に溶解させた。得られたtRNAをさらに連続的にMicrocon YM-30 (Millipore)及びG-25 Microspin Columns (Amersham)に通すことにより精製した。
＜tRNASerUUUAの調製＞【００８２】
前述したtRNALeu5CUAの調製方法において、フォワードプライマーとして、5’-G TAA TAC GAC TCA CTA TA GGA GAG ATG CCG GAG CGG CTG AAC-3’(配列番号７６),リバースプライマーとして5’-TGG CGG AGA GAG GGG GAT TTG AAC CCC CGG TAG AGT TGC C-3’(配列番号７７),鋳型DNAとして5’-GGA GAG ATG CCG GAG CGG CTG AAC GGA CCG GTC TTT AAA ACC GGA GTA GGG GCA ACT CTA CCG GGG GTT CAA ATC CCC CTC TCT CCG CCA-3’(配列番号７８)を用いた他は、tRNALeu5CUAの調製と同様にして, E.coliサプレッサーtRNASerUUUAを調製した。
＜tRNASerUUCAの調製＞【００８３】
前述したtRNALeu5CUAの調製方法において、フォワードプライマーとして、5’-G TAA TAC GAC TCA CTA TA GGA GAG ATG CCG GAG CGG CTG AAC-3’(配列番号７９),リバースプライマーとして5’-TGG CGG AGA GAG GGG GAT TTG AAC CCC CGG TAG AGT TGC C-3’(配列番号８０),鋳型DNAとして5’-GGA GAG ATG CCG GAG CGG CTG AAC GGA CCG GTC TTC AAA ACC GGA GTA GGG GCA ACT CTA CCG GGG GTT CAA ATC CCC CTC TCT CCG CCA-3’(配列番号８１)を用いた他は、tRNALeu5CUAの調製と同様にして, E.coliサプレッサーtRNASerUUCAを調製した。
＜tRNASerUCUAの調製＞【００８４】
前述したtRNALeu5CUAの調製方法において、フォワードプライマーとして、5’-G TAA TAC GAC TCA CTA TA GGA GAG ATG CCG GAG CGG CTG AAC-3’(配列番号８２),リバースプライマーとして5’-TGG CGG AGA GAG GGG GAT TTG AAC CCC CGG TAG AGT TGC C-3’(配列番号８３),鋳型DNAとして5’-GGA GAG ATG CCG GAG CGG CTG AAC GGA CCG GTC TCT AAA ACC GGA GTA GGG GCA ACT CTA CCG GGG GTT CAA ATC CCC CTC TCT CCG CCA-3’(配列番号８４)を用いた他は、tRNALeu5CUAの調製と同様にして, E.coliサプレッサーtRNASerUCUAを調製した。
＜Napでミスアシル化された酵母tRNAPheCUAの調製＞【００８５】
酵母のtRNAPheCUA-CAをコードするプラスミドは、大阪大学のドクターM. Endoから分与された。110μLの1×反応バッファーに溶解した30μgのプラスミドに20 unitsのFokI (NEB)を添加した。この反応溶液を37 ℃で6時間インキュベートし、次いで65 ℃で20分間インキュベートした。翻訳反応は、55μLのFokI 直線化プラスミドの溶液、2μmolの各NTPs (Fermentas)、5μmolのGMP (Sigma)、80 Uの RNase阻害剤 (TOYOBO)、1 Uの無機ピロフォスフェイト(Calbiochem-Novabiochem)、 2,200 UのT7 RNA ポリメラーゼ (TOYOBO)、及び10μLの10×反応バッファー (400 mM Tris-HCl (pH 8.0)、200 mM MgCl2、50 mM DTTを含む、500μLの反応溶液を用いて行った。混合物を37 ℃で8時間インキュベートし、転写された酵母tRNAPheCUA-CAをQIAGEN DNA/RNA キットを用いて精製した。連結反応は、10μgのtRNAPheCUA-CA、12 pmolのLナフチルアラニルpdCpA（DMSOに溶解させたもの）、及び50 UのT4 RNAリガーゼ (Takara)を含む20μLの反応溶液 (55 mM Hepes-Na (pH 7.5)、15 mM MgCl2、3.3 mM DTT、1 mM ATP) を用いて行った。混合物を4 ℃で2時間インキュベートし、次いで40μLの0.45 M 酢酸カリウム水溶液 (pH 5.0)で希釈した。この溶液をフェノール／クロロフォルム／イソアミリアルコール (25/24/1)で抽出し、再度クロロフォルムで抽出し、さらにエタノール沈殿した。精製したNap-tRNAPheCUAを、使用するまで、1 mM酢酸カリウム水溶液 (pH 5.0)に懸濁した。【００８６】
サプレッサーｔＲＮＡLeu5CUA(図１ｂ）、サプレッサーｔＲＮＡPheCUA（図１ｂ）、及び３種のサプレッサーｔＲＮＡSer（図３ｂ）の塩基配列を、それぞれ配列番号８５、８６、及び８７に示す。
実施例１（tRNALeu5CUAを用いた終止コドンの読み飛ばし）【００８７】
大腸菌のジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする天然ｍＲＮＡから、以下の５つの変異ｍＲＮＡを作製した。この天然ｍＲＮＡの終止コドンは、ＵＡＡである。【００８８】
第１、第２の変異ｍＲＮＡは、開始コドンとＤＨＦＲコード領域との間にＴ７タグを挿入し、さらにその前、又は後に終止コドンのＵＡＧを挿入したものである。ＵＡＧは、終結因子のＲＦ１により認識される。ＤＨＦＲの後の終止コドンは削除した（図１ａの上から１番目、２番目）。【００８９】
第３、第４の変異ｍＲＮＡは、開始コドンとＤＨＦＲコード領域との間にＴ７タグを挿入し、さらにその前、又は後に終止コドンのＵＡＧを挿入し、ＤＨＦＲコード領域の後ろの終止コドンＵＡＡはそのまま存在させたものである（図１ａの上から３番目、４番目）。ＵＡＡは、終結因子ＲＦ２により認識される。【００９０】
第５の変異ｍＲＮＡは、ＤＨＦＲの天然ｍＲＮＡの開始コドンとＤＨＦＲコード領域との間にＴ７タグを挿入したものである（図１ａの上から５番目）。ＤＨＦＲコード領域の後ろの終止コドンＵＡＡはそのまま存在する。【００９１】
これらの鋳型ｍＲＮＡを、ＲＦ１を含む細胞抽出液（ＲＦ＋）、及びＲＦ１が減少した再構築細胞抽出液（ＲＦΔ）をそれぞれ用いてin vitro翻訳を行った。【００９２】
また、翻訳系に、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のロイシン５ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＬｅｕ５ＣＵＡ）、又は酵母由来のｔＲＮＡであって、フェニルアラニンに代えてナフチルアラニンが結合したもの（Ｎａｐ−ｙｅａｓｔ−ｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ）を添加した。これらは、アンチコドンを、終止コドンのＵＡＧに対合できるＣＵＡに置換した変異ｔＲＮＡである。これらのｔＲＮＡを図１ｂに示す。【００９３】
終止コドンの読み飛ばし効率は、終止コドン位置に導入されるアミノ酸の種類と終結因子のレベルに依存すると考えられる。また、疎水性のナフチルアラニンを運搬するｔＲＮＡを用いることにより読み飛ばし効率が向上すると考えられる。【００９４】
得られたタンパク質溶液からＴ７抗体を用いてタンパク質を単離し、ウェスタンブロットを行った結果を図１ｃに示す。レーン１０及び１４は、変異ｔＲＮＡであるＮａｐ−ｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡを用い、レーン１１及び１５は変異ｔＲＮＡのｔＲＮＡＬｅｕ５ＣＵＡを用いた結果である。その他のレーンは、このような変異ｔＲＮＡを用いない場合の結果である。【００９５】
ＲＦ１が減少した細胞抽出液を用いた場合、ＤＨＦＲの上流に終止コドンＵＡＧが存在せず、ＤＨＦＲの下流に終止コドンＵＡＡが存在する鋳型ｍＲＮＡ（Ｔ７（＋）ＵＡＧ（−）ＵＡＡ（＋）では、鋳型ｍＲＮＡの用量依存的にタンパク質量が増大しており、ＤＨＦＲが生成している（レーン１〜７）。また、この鋳型ｍＲＮＡでは、終結因子ＲＦ１の有無（量の多少）にかかわらず同様にＤＨＦＲが生成した（レーン７と１７とを比較）。このことは、ＵＡＡ終止コドンを認識してタンパク質合成を終結させるのに十分な量のＲＦ１及びＲＦ２が細胞抽出液中に存在することを示している。【００９６】
また、終止コドンのＵＡＧがＤＨＦＲコード領域の上流に存在するＴ７（＋）ＵＡＧ（＋）ＵＡＡ（＋）及びＵＡＧ（＋）Ｔ７（＋）ＵＡＡ（＋）では、ＲＦ１（＋）の細胞抽出液を用いた場合は、ＤＨＦＲは合成されていない（レーン１８，１９）。このように、ＲＦ１（＋）の条件下では、終止コドンＵＡＧが認識されている。【００９７】
また、ＤＨＦＲの上流に終止コドンＵＡＧが存在する場合は、ＲＦ１が減少した細胞抽出液を用い、かつ変異ｔＲＮＡを用いることにより、終止コドンＵＡＧが効率良く読み飛ばされて、ＤＨＦＲ合成量が増大した（レーン９とレーン１０，１１との比較；レーン１３とレーン１４，１５との比較）。【００９８】
全長タンパク質量の回復は、Ｎａｐ−ｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡの存在下で、Ｔ７（＋）ＵＡＧ（＋）ＵＡＡ（＋）では３４％（レーン１０）、ＵＡＧ（＋）Ｔ７（＋）ＵＡＡ（＋）では３５％（レーン１４）である。また、ロイシンを運搬するｔＲＮＡＬｅｕ５ＣＵＡの存在下では、Ｔ７（＋）ＵＡＧ（＋）ＵＡＡ（＋）では６１％（レーン１１）、ＵＡＧ（＋）Ｔ７（＋）ＵＡＡ（＋）では８６％（レーン１５）である。【００９９】
このように、これらのサプレッサーｔＲＮＡは、ＵＡＧ終止コドンを読み飛ばし、その下流のＤＨＦＲ配列が翻訳された。【０１００】
次に、末端にＵＡＡ終止コドンが存在しない鋳型を用いた翻訳について説明する。図１ｄは、翻訳の際に形成したポリソームをＴ７タグ抗体を用いてセレクション後、回収したｍＲＮＡ量を示す図である。Ｔ７（＋）ＵＡＧ（＋）ＳＴＯＰ（−）及びＵＡＧ（＋）Ｔ７（＋）ＳＴＯＰ（−）の鋳型では、サプレッサーｔＲＮＡのｔＲＮＡＬｅｕ５ＣＵＡを用いたとき、ＲＦ１（Δ）の条件下で、Ｔ７タグの付いたＤＨＦＲｍＲＮＡが回収された。【０１０１】
これらの回収量は、全ｍＲＮＡ量に対して、Ｔ７（＋）ＵＡＧ（＋）ＳＴＯＰ（−）では約２８％、ＵＡＧ（＋）Ｔ７（＋）ＳＴＯＰ（−）では約２６％であった（レーン４，６）。ＤＨＦＲの上流にＵＡＧが存在せず、通常の細胞抽出液を用い、かつ変異ｔＲＮＡを用いないポシティブコントロール（レーン１）では収量約３５％であった。この対照に対して、Ｔ７（＋）ＵＡＧ（＋）ＳＴＯＰ（−）の読み飛ばし効率は約８０％、ＵＡＧ（＋）Ｔ７（＋）ＳＴＯＰ（−）の読み飛ばし効率は約７１％であった。【０１０２】
ＲＦ（Δ）の細胞抽出液を用い、かつサプレッサーｔＲＮＡを用いることにより、ＵＡＧ読み飛ばしが極めて効率的に行われたことが分かる。
上記の結果は、ＵＡＧ終止コドンの読み飛ばしによりＴ７タグは、抗体がアクセスできる程度にリボソームトンネルから押し出されたこと、及びＤＨＦＲタンパク質とｍＲＮＡ鋳型とは共に存在したことを示している。
実施例２
（tRNALeu5CUA、を用いた擬天然ｍＲＮＡを鋳型とする全長タンパク質の表示）【０１０３】
図２ａに示すように、大腸菌のジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする天然ｍＲＮＡから、２種の擬天然ｍＲＮＡを作製した。【０１０４】
図２ａの上段は天然のＤＨＦＲｍＲＮＡである。これは、終止コドンがＵＡＡであり、３’−ＵＴＲ中にもＵＡＡ配列が存在する。【０１０５】
図２ａの中段に示すのが、第１の擬天然ｍＲＮＡであり、Ｔ７タグ配列を、ＤＨＦＲコード領域の直後であって終止コドンの直前に挿入した。Ｔ７タグにアクセス可能なときは、先行するＤＨＦＲにもアクセス可能であり、即ち表示されていることを示す。また、読み飛ばしを容易にするために、２つある終止コドン配列をＵＡＡからＵＡＧに置き換えた。３’−ＵＴＲの長さは２１９ｎｔである。【０１０６】
図２ａの下段に示すのが第２の擬天然ｍＲＮＡであり、第１の終止コドン配列を削除し、３’−ＵＴＲ中に存在する第２の終止コドン配列ＵＡＡをロイシンをコードするＵＵＡに置き換えた。これは、変異ｔＲＮＡを用いなくても終止コドンがないため、ｍＲＮＡとＤＨＦＲタンパク質との結合物が得られるポジティブコントロールである。【０１０７】
さらに、第２の擬天然ｍＲＮＡについて、３’−ＵＴＲの長さを７５ｎｔ（ヌクレオチド）（２５アミノ酸に対応）、１４７ｎｔ（４９アミノ酸に対応）、及び２１９ｎｔ（７３アミノ酸に対応）に変化させたものをそれぞれ作製した。これは、リボソームトンネルから外部にＤＨＦＲコード領域を表示するために必要なスペーサーである３’−ＵＴＲの長さを調べるためである。【０１０８】
さらに、第２の擬天然ｍＲＮＡのうち、３’−ＵＴＲの長さが２１９ｎｔであるものに代えて、ポリＡを付加することにより２１９ｎｔ以上の長さにしたものを作製した。ポリＡの付加は、Ｅ．ｃｏｌｉのポリＡポリメラーゼを使用して行った。【０１０９】
これらの鋳型ｍＲＮＡについて、サプレッサーｔＲＮＡの非存在下、及びｔＲＮＡＬｅｕ５ＣＵＡの存在下のそれぞれで翻訳を行った。また、ＲＦ（＋）及びＲＦ（Δ）細胞抽出液をそれぞれ用いた翻訳を行った。【０１１０】
Ｔ７タグに対する抗体でｍＲＮＡ鋳型を単離し、電気泳動した後、ＵＶ照射によりｍＲＮＡを定量した。結果を図２ｂに示す。【０１１１】
Ｔ７（＋）ＵＡＧ（−）ＬＥＵ（＋）では終止コドンが存在しないため、ＲＦ１（＋）の条件下でもＤＨＦＲは生成する。ＤＨＦＲコード領域の３’−ＵＴＲの長さが７５ｎｔの場合は、ＤＨＦＲは検出されなかった（レーン１）。これは、Ｔ７タグがリボソームトンネルから外に押し出されておらず、Ｔ７抗体によって鋳型ｍＲＮＡが釣り上げられなかったためと考えられる。Ｔ７抗体がリボソームトンネルから押し出されていないため、その上流のＤＨＦＲがリボソームトンネルから押し出されているか否かは不明である。【０１１２】
これに対して、３’−ＵＴＲの長さが１４７ｎｔ以上の場合は、ＤＨＦＲは検出された（レーン３，５，７）。これはＴ７タグがリボソームトンネルから外に押し出されているからと考えられる。このことは、Ｔ７タグの上流に存在するＤＨＦＲの全長がリボソームトンネルから外に押し出されていることを示している。【０１１３】
ｍＲＮＡの収量は、全添加ｍＲＮＡ量に対して、３’−ＵＴＲの長さが１４７ｎｔの場合は１．５％、２１９ｎｔの場合は４％、ポリＡの２１９ｎｔの場合は２．５％であった。【０１１４】
次に、Ｔ７（＋）ＵＡＧ（＋）ＵＡＧ（＋）（２１９ｎｔ）は、終止コドンを２個有するが、この鋳型は、サプレッサーｔＲＮＡであるｔＲＮＡＬｅｕ５ＣＵＡの存在下で、かつＲＦ１（Δ）の条件下で、終止コドンを読み飛ばした（図２ｂのレーン１０）。鋳型ｍＲＮＡの収率は４．３％であった。３’−ＵＴＲの２１９ｎｔの長さは、２個の終止コドンが存在する場合にも十分な長さであることが分かる。
実施例３
（tRNASerUUUA、tRNASerUUCA、及びtRNASerUCUAを用いた終止コドンの読み飛ばし）【０１１５】
E.coliの天然DHFRのmRNA上の終止コドンはUAA（オーカー）である。また、DHFRの3'−UTR中には、さらにもう一つのUAAが存在する。本実施例では、図３ａに示す３種の鋳型mRNAを用いて、tRNASerUのアンチコドンを終止コドンに対応するものに置換したサプレッサーtRNAが、UAA 、UGA（オパール）、及びUAG（アンバー）の全ての終止コドンを読み飛ばすことが可能であること、また、天然DHFR  mRNAの3'−UTRを利用した全長蛋白質ディスプレーが可能であることを示した。【０１１６】
図３ａ中のT7(+)UAA(+)UAA(+)(222)は、野生型のDHFRにT7プロモーターとT7タグを挿入したものである。また、T7(+)UGA(+)UGA(+)(222)は、このT7(+)UAA(+)UAA(+)(222)において、２つの終止コドンUAAをUGAに置換したものである。また、T7(+)UAG(+)UAG(+)(222)は、このT7(+)UAA(+)UAA(+)(222)において、２つの終止コドンUAAをUGAに置換したものである。いずれの鋳型mRNAも5’−UTRの長さは222ヌクレオチド(nt)である。【０１１７】
また、鋳型T7(+)UAA(+)UAA(+)(222)の翻訳はサプレッサーtRNASerUUAの存在下で行い、鋳型T7(+)UGA(+)UGA(+)(222)の翻訳はサプレッサーtRNASerUCAの存在下で行い、鋳型T7(+)UAG(+)UAG(+)(222)の翻訳はサプレッサーtRNASerCUAの存在下で行った。【０１１８】
図３ｃに示すように、mRNAに対するタンパク質の回収率は、終止コドンUAAでは2.6%、終止コドンUGAでは3.7%、終止コドンUAGでは3.1%であった(図３ｃ、レーン２，４，６）。【０１１９】
また、対照として、E.coli DHFRにＴ７プロモーター、T7タグを挿入し、かつ2つの終止コドンUAAを欠失させた鋳型mRNAを構築し、このmRNAに対して、RF1及びRF2を含む再構築された翻訳システムを用いて、上記と同様にして翻訳を行った。この終止コドンを有さない鋳型T7(+)Stop(-)の3'-UTRの長さは222ヌクレオチドである。mRNAの回収率は、図３ｄに示すように４％であった。【０１２０】
このように、サプレッサーtRNASerの、３種の終止コドンの読み飛ばし効率は、終止コドンがない場合とほぼ同程度であった。また、ターミネーターとして機能する第１の終止コドンだけでなく、第２の終止コドンも効率的に読み飛ばされたと考えられる。これは、両者の間が81ヌクレオチド（27アミノ酸に相当）離れているところ、26アミノ酸の長さではORF領域に続いてT7タグの全体が十分に表示されないからである。【０１２１】
一方、サプレッサーtRNAの非存在下では、RF1及びRF2の減少下においても、いずれの鋳型も回収されなかった（図３ｄ、レーン２）。
【図３】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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