(57)【要約】  【課題】    炎症性大腸炎、過敏性腸症候群及びその他の要因で起こる各種下痢の予防・治療剤の提供。  【解決手段】  CRAC/SOCチャンネルが消化管上皮細胞において水分泌あるいは吸収において生理的に重要な役割を担っていること、並びにCRAC/SOCチャンネル阻害剤が種々の要因によって発生する下痢の予防並びに治療に有用であることを初めて知見し、カルシウム遊離活性型カルシウム・チャンネルを阻害する化合物を有効成分とする下痢の予防並びに治療剤、殊に、炎症性腸疾患に伴う下痢症状の治療剤並びに過敏性腸症候群治療剤を提供する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシウム遊離活性型カルシウム・チャンネルを阻害する化合物を有効成分とする下痢の予防若しくは治療剤
【請求項２】
炎症性腸疾患に伴う下痢症状の予防若しくは治療剤である請求の範囲１記載の下痢の予防若しくは治療剤。
【請求項３】
過敏性腸症候群の予防若しくは治療剤である請求の範囲１記載の下痢の予防若しくは治療剤。
【請求項４】
カルシウム遊離活性型カルシウム・チャンネルを阻害する化合物が、下記一般式（Ｉ）で示されるピラゾール誘導体又はその製薬学的に許容される塩である請求の範囲１〜４のいずれかに記載の下痢の予防若しくは治療剤。
【化２】
2006115140.tif 000003
（式中の記号は以下の意味を表す。
D：１つのトリフルオロメチル基で置換され、更に、低級アルキル、ハロゲノ低級アルキル、-CO2H及び-CO2-低級アルキルからなる群から選択される置換基１乃至２個を有していてもよい、1H-ピラゾール-5-イル又は1H-ピラゾール-1-イル基、
X：-NHCO-又は-CONH-、
A：ハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル基、又は低級アルキル基で置換されていてもよい、チアゾリル、チアジアゾリル、チエニル及びピリジル基からなる群から選択される単環ヘテロアリール基、及び
B：フェニレン基。）
【請求項５】
カルシウム遊離活性型カルシウム・チャンネルを阻害する化合物が、4,6-ジメチル-4'-[3,5-ビス(トリフルオロメチル)-1H-ピラゾール-1-イル]ニコチンアニリド又はその塩である、請求の範囲４に記載の下痢の予防若しくは治療剤。
【請求項６】
4,6-ジメチル-4'-[3,5-ビス(トリフルオロメチル)-1H-ピラゾール-1-イル]ニコチンアニリド又はその塩を有効成分として含有する炎症性腸疾患の予防若しくは治療剤。
【請求項７】
炎症性腸疾患が下痢症状を伴う炎症性腸疾患である請求の範囲６記載の予防若しくは治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルシウム遊離活性型カルシウム・チャンネルを阻害する化合物を有効成分とする腸疾患の予防若しくは治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
下痢としては、ウイルス、細菌あるいは寄生虫の感染によって誘発される感染性下痢 (非特許文献１及び非特許文献２参照)、ストレス (非特許文献３及び非特許文献４参照)、抗生物質 (非特許文献５参照)、乳糖不耐症 (非特許文献６参照) あるいはアレルギー反応 (非特許文献７参照) などで惹起される非感染性下痢がよく知られている。近年、炎症性腸疾患に伴う下痢や過敏性腸症候群による下痢が問題となっている。
炎症性腸疾患は、腹痛を伴う下痢症状を主徴とする腸疾患である。炎症性腸疾患は大きくクローン病及び潰瘍性大腸炎に大別され、クローン病では全層性の深い炎症が起きるが、潰瘍性大腸炎の炎症は粘膜と粘膜下層に限局することが特徴として知られている。クローン病は、病変の分布が非連続性で病変と病変の間に正常の部分が存在し、炎症が深いために瘻孔の形成がみられる炎症性疾患である。クローン病の病変部位では、Tリンパ球，好中球，単球及び活性化マクロファージの浸潤が認められ、これらの浸潤した炎症細胞から産生されるサイトカイン、ケモカイン及び活性酸素により消化管上皮組織が傷害を受けると考えられている (非特許文献８参照)。また、潰瘍性大腸炎は、大腸粘膜のほぼ全体に均一に炎症が発現し、病変部位では陰窩膿瘍が存在する。潰瘍性大腸炎においては、T細胞，抗体産生細胞，好中球，好酸球，単球及びマクロファージの浸潤が認められ、浸潤細胞からのサイトカイン、ケモカイン、活性酸素及び抗体産生を介して大腸粘膜組織が傷害を受けると考えられている (非特許文献９及び非特許文献１０参照)。【０００３】
また、過敏性腸症候群は、炎症性腸疾患と同様に腹痛を伴う下痢症状を主徴とする腸疾患であるが、現在では主にセロトニンをはじめとする知覚神経伝達物質を介した消化管神経叢の異常に起因する疾患と考えられている。具体的には、消化管神経叢におけるセロトニン等の知覚神経伝達物質の分泌亢進により、消化管運動の恒常性異常及び消化管上皮組織からの過剰分泌が起こって、腹痛を伴う下痢症状が惹起されると考えられている(非特許文献１１〜１３参照)。【０００４】
一方、カルシウム遊離活性型カルシウム・チャンネル（Ca2+ release-activated Ca2+ (CRAC) channel）は、別名ではカルシウム・ストア作動性カルシウム・チャンネル (store-operated Ca2+ (SOC) channel) あるいはカルシウム・ストア枯渇活性化型カルシウム・チャンネル (depletion-activated Ca2+ channel) と言われ、細胞内伝達物質である細胞内カルシウム濃度を制御するとともに、細胞活性化時の容量性カルシウム流入 (capacitative Ca2+ entry)、あるいは細胞内カルシウム周期変動 (intracellular Ca2+ oscillation) に関与するチャンネルである。CRAC あるいは SOC チャンネル (以下、CRAC/SOC チャンネル又はCRACチャンネル) はその分子本体は未だ同定されていないが、CRAC/SOC チャンネル特異的なカルシウム流入電流である CRAC 電流 (CRAC current (ICRAC)) を指標にした研究から現在までに多くの炎症性細胞をはじめとして内皮細胞あるいは上皮細胞等の幾つかの組織に分布することが報告されている(非特許文献１４参照)。また、CRAC/SOC チャンネルは細胞活性化時の持続的なカルシウム流入において重要な役割を果たしている。特に、免疫・炎症細胞において、CRAC/SOC チャンネルを介した持続的なカルシウム流入はサイトカイン産生に関与する転写因子、活性化T細胞核因子 (Nuclear factor of activated T cells (NF-AT)) (非特許文献１５〜１６参照)あるいはカッパーB核因子 (nuclear factor-κB (NFκB)) (非特許文献１７参照)の活性化を制御していることが知られており、その阻害剤は免疫・炎症性細胞の活性化を顕著に抑制し、広範な抗炎症作用を発揮することから、接触性皮膚炎、喘息、関節リウマチ等に対し動物病態モデルで有効であることが報告されている (特許文献１、特許文献２及び非特許文献１８参照)。【０００５】
CRAC/SOC チャンネルは、腸管をはじめとする上皮細胞にも発現することが報告されている (非特許文献１９〜２２及び非特許文献１４参照)。また、CRAC/SOC チャンネル活性化の誘導に用いられるカルシウム−ＡＴＰアーゼ(Ca2+-ATPase)阻害剤タプシガージン(thapsigargin)によって、上皮細胞の細胞内カルシウム濃度上昇に伴うクロライド分泌あるいは短絡電流 (short circuit current (Isc))の亢進が起こることが報告されている(非特許文献２３及び非特許文献２４参照)。しかし、CRAC/SOC チャンネル阻害剤が、下痢の予防若しくは治療作用を有するか否かについては、現在まで何ら報告は無い。
また、4,6-ジメチル-4'-[3,5-ビス(トリフルオロメチル)-1H-ピラゾール-1-イル]ニコチンアニリド（以下「化合物A」と略記する）又はその塩は、特許文献１に開示されるCRACチャンネルを阻害するピラゾール誘導体に包含される化合物である。特許文献２には化合物Aの好ましい結晶が開示され、化合物Aが、CRACチャンネルやIL-2の関与するアレルギー性、炎症性若しくは自己免疫疾患の予防又は治療剤として有用であること、そしてアレルギー性、炎症性若しくは自己免疫疾患として、具体的に気管支喘息等の多数の疾患とともに、クローン病を含む炎症性腸疾患が挙げられている。しかしながら、その具体的作用を開示する薬理試験結果の開示は全くない。一方、化合物Aを包含する特許文献１には、CRACチャンネル阻害作用及びIL-2産生抑制作用等のin vitroの試験、更に気管支喘息の代表的疾患モデルである抗原誘発気道内好酸球浸潤モデル、マウスTNCB誘発接触性過敏症モデル、マウスConA誘発肝障害モデル及びマウスコラーゲン関節炎モデルを用いた各種試験の結果が開示されているが、炎症性腸疾患に関与する薬理試験並びにその結果の開示はない。【０００６】
【非特許文献１】Gut 53, 296-305 (2004)
【非特許文献２】New Eng. J. Med. 350, 38-47 (2004)
【非特許文献３】Pharmacol. Toxicol. 90, 109-120 (2002)
【非特許文献４】Dig Dis 19, 201-211 (2001)
【非特許文献５】New Eng. J. Med. 346, 334-339 (2002)
【非特許文献６】Gastroenterol. 76, 365-74 (1979)
【非特許文献７】Minerva Med. 93, 403-412 (2002)
【非特許文献８】Lancet 359, 62-69 (2002)
【非特許文献９】N Eng. J Med. 347, 417-429 (2002)
【非特許文献１０】Curr. Opin. Gastroenterol. 20, 345-50 (2004)
【非特許文献１１】Br. J. Pharmacol. 141, 1285-1293 (2004)
【非特許文献１２】New Eng. J. Med. 349, 2136-2146 (2003)
【非特許文献１３】Lancet 360, 555-564 (2002)
【非特許文献１４】Physiol. Rev. 77, 901-30 (1997)
【非特許文献１５】J. Cell. Biol. 131, 655-67 (1995)
【非特許文献１６】J. Immunol. 159, 1628-38 (1997)
【非特許文献１７】J. Immunol., 157, 5277-5283 (1996)
【非特許文献１８】J. Immunol. 170, 4441-9 (2003)
【非特許文献１９】J. Biol. Chem. 270, 29169-29175 (1995)
【非特許文献２０】Am. J. Physiol. 277, L1089-L1095 (1999)
【非特許文献２１】Cell. Calcium 33, 357-373 (2003)
【非特許文献２２】J. Gen. Physiol. 122, 207-223 (2003)
【非特許文献２３】J. Clin. Invest. 98, 2066-2075 (1996)
【非特許文献２４】Am. J. Physiol. 275, C484-C495 (1998)
【特許文献１】国際公開WO99/19303号パンフレット
【特許文献２】国際公開WO04/020433号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
炎症性腸疾患及び下痢、殊に腹痛を伴う下痢の予防若しくは治療は、患者にとって生活上の質(クオリティ・オブ・ライフ、QOL)を向上させる意味で重要である。今なお、有効な治療剤の開発が切望されている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、CRAC/SOC チャンネル阻害剤の薬理作用を鋭意研究した結果、CRAC/SOCチャンネルが消化管上皮細胞において水分泌あるいは吸収において生理的に重要な役割を担っていること、更にCRAC/SOCチャンネル阻害剤が各種の下痢の動物モデルにおいても良好な治療作用を発現し、臨床的にも種々の要因によって発生する下痢の予防並びに治療に有用であること、更に、CRAC/SOCチャンネル阻害剤は抗炎症作用と下痢症状の直接的改善作用を併せ持つことから、炎症性腸疾患、殊に下痢症状を伴う炎症性腸疾患の予防若しくは治療剤として有用であることを知見して、本発明を完成した。
即ち、本発明は、CRAC/SOCチャンネルを阻害する化合物を有効成分とする下痢の予防若しくは治療剤、殊に、炎症性腸疾患に伴う下痢症状並びに過敏性腸症候群の下痢の予防若しくは治療剤、並びに炎症性腸疾患の予防若しくは治療剤に関する。
また、ここに、CRAC/SOCチャンネルを阻害する化合物としては、下記一般式（Ｉ）で示されるピラゾール誘導体又はその製薬学的に許容される塩が好ましく、特に、4,6-ジメチル-4’-[3,5-ビス(トリフルオロメチル)-1H-ピラゾール-1-イル]ニコチンアニリド又はその塩が好ましい。
【化１】
2006115140.tif 000002
（式中の記号は以下の意味を表す。
D：１つのトリフルオロメチル基で置換され、更に、低級アルキル、ハロゲノ低級アルキル、-CO2H及び-CO2-低級アルキルからなる群から選択される置換基１乃至２個を有していてもよい、1H-ピラゾール-5-イル又は1H-ピラゾール-1-イル基、
X：-NHCO-又は-CONH-、
A：ハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル基、又は低級アルキル基で置換されていてもよい、チアゾリル、チアジアゾリル、チエニル及びピリジル基からなる群から選択される単環ヘテロアリール基、及び
B：フェニレン基。以下同様。）
【発明の効果】
【０００９】
本発明の予防若しくは治療剤は、良好な抗炎症作用を有し、更に消化管上皮細胞におけるCRAC/SOC チャンネルに直接作用して水分泌を抑制することから、炎症性腸疾患及び／又は下痢の予防若しくは治療剤、殊に腹痛を伴う下痢症状を主徴とする腸疾患である炎症性腸疾患の予防若しくは治療として有用である。下痢としては、ウイルス、細菌あるいは寄生虫の感染によって誘発される感染性下痢、ストレス、抗生物質、乳糖不耐症あるいはアレルギー反応などで惹起される非感染性下痢、炎症性腸疾患に伴う下痢症状、並びに過敏性腸症候群における下痢が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、実施例２における化合物A（Comp A）並びにエコナゾール（Econ）のクロライド依存的な短絡電流(Isc)(μA/cm2)の上昇に対する作用を示すグラフである。(a)はタプシガージン(1μM)誘発Isc上昇に対するComp Aの作用を、(b)はタプシガージン(1μM)誘発Isc上昇に対するEconの作用を、(c)はフォルスコリン(10μM)誘発Isc上昇に対するComp Aの作用を、並びに(d)はフォルスコリン(10μM)誘発Isc上昇に対するEconの作用を、それぞれ示す。なお、各グラフの縦軸はクロライド依存的な短絡電流(Isc)(μA/cm2)を示す。
【００１１】
【図２】図２は、実施例３におけるマウス・コレラ毒素誘発腸管過分泌モデルに対する各被験化合物の抑制作用を示すグラフである。(a)は化合物A（Comp A）投与群の結果を、(b)はロペラミド（Lop）並びにグラニセトロン（Gra）投与群の結果を、(c)は抗炎症・免疫調節薬、５−アミノサリチル酸(5ASA)、スルファサラジン(SSZ)、サイクロスポリン A(CsA)及びプレドニゾロン(Pred)投与群の結果を、それぞれ示す。各グラフの縦軸は単位あたりの回腸ループ重量(mg/cm)を、示す。# 及び ## は 0.9%生理食塩水(saline)処置群に対する有意差 (p<0.05 及びp<0.01)を、* 及び ** は、コントロール(Control)群に対する有意差(p<0.05及びp<0.01)をそれぞれ示す。
【図３】図３は、実施例４における化合物A(Comp A)投与群のラット・ストレス誘発下痢モデルに対する作用を示す。縦軸はコントロール群を100％とした発症率 (Control %) を示す。また、** はコントロール(Control)群に対する有意差 (p<0.01) を示す。
【００１２】
【図４】図４は、実施例５における化合物A(Comp A)投与群 、サイクロスポリンA(CsA)投与群及びプレドニゾロン (Pred) 投与群のマウス・抗原誘発下痢モデルに対する作用を示すグラフである。縦軸は下痢惹起 Day 27〜 38の下痢反応スコアの総和を示す。## は 0.9%生理食塩水(Saline)処置群に対する有意差(p<0.01)を、＋ 及び $ は、コントロール (Control)群に対する有意差(p<0.05及びp<0.1)をそれぞれ示す。
【図５】図５は、実施例６における化合物A（Comp A）投与群及びサイクロスポリンA(CsA)投与群のラット・オキサゾロン誘発急性腸炎モデルに対する作用を示すグラフである。(a) の縦軸は疾患活動性インデックス(Disease activity index) のスコアを、(b) は便性状のスコアを示す。また、## は 未処置 (Naive) 群に対する有意差 (p<0.01) を、** 及び ++ は、コントロール (Control) 群に対する有意差 (ともに p<0.01) をそれぞれ示す。
【００１３】
【図６】図６は、実施例７における化合物A（Comp A）投与群及びスルファサラジン(SSZ)投与群のラットTNBS誘発慢性腸炎モデルに対する作用を示すグラフである。(a)の縦軸は疾患活動性インデックス(Disease activity index) のスコアを、(b) は便性状のスコアを、及び(c)はMPO活性（mU/cm tissue）をそれぞれ示す。また、## は 未処置 (Naive) 群に対する有意差 (p<0.01) を、*及び** は、コントロール (Control) 群に対する有意差 (p<0.05及びp<0.01) をそれぞれ示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
CRAC/SOC チャンネル阻害剤としては、好ましくは、エコナゾール(Br. J. Pharmacol. 119: 647-54 1996)、SK&F-96365（Br. J. Pharmacol. 113: 861-8 1994）及び前記特許文献１に開示のピラゾール誘導体が挙げられる。これらのCRAC/SOC チャンネル阻害剤は市販されているか、文献記載の方法により容易に入手できる。例えば、本発明の好ましいCRAC/SOC チャンネル阻害剤である前記一般式（Ｉ）の化合物、並びに4,6-ジメチル-4’-[3,5-ビス(トリフルオロメチル)-1H-ピラゾール-1-イル]ニコチンアニリド（以下、化合物Ａ）は前記特許文献１若しくは２に記載の方法で容易に入手することができる。更に、本発明のCRAC/SOC チャンネル阻害剤としては、前記CRAC/SOCチャンネル阻害活性を有する化合物の２種以上を併用するものをも包含する。
前記一般式（Ｉ）で示される化合物において、「低級アルキル」とは、炭素数１乃至６個を有する直鎖又は分岐状のアルキルであり、メチル、エチル、プロピルが好ましい。「ハロゲン原子」としては、Ｉ、Ｂｒ、Ｆ及びＣｌである。「ハロゲノ低級アルキル」としては、１以上のハロゲン原子で置換された低級アルキルであり、特に好ましくはフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチルである。Aの「ハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル基」とは、未置換若しくは１〜５個のハロゲン原子で置換されたフェニル基を、「低級アルキル基で置換されていてもよい、チアゾリル、チアジアゾリル、チエニル及びピリジル基からなる群から選択される単環ヘテロアリール基」とは、未置換若しくは１〜３個の低級アルキル基（複数の場合は同一若しくは異なっていてもよい）で置換された、チアゾリル、チアジアゾリル、チエニル又はピリジル基を意味する。Dとしては、２つのトリフルオロメチル基で置換された1H-ピラゾール-1-イル基が、Xとしては-NHCO-が、Aとしては、未置換若しくは1〜2個のメチル基で置換されたピリジル基が、Bとしては、1,4-フェニレンが、それぞれ好ましい。【００１５】
また、本発明の好ましいCRAC/SOC チャンネル阻害剤である前記一般式（Ｉ）のピラゾール誘導体や化合物Ａは、酸付加塩又は塩基との塩を形成する場合もあり、かかる塩が製薬学的に許容され得る塩である限りにおいて本発明のCRAC/SOC チャンネル阻害剤に包含される。具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸や、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マイレン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の有機酸との酸付加塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム等の無機塩基、メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン、リジン、オルニチン等の有機塩基との塩やアンモニウム塩等が挙げられる。また、これらの化合物は、各種の水和物や溶媒和物であってもよく、更に、それらの結晶多形の物質をも包含する。また、これらの化合物の薬理学的に許容されるプロドラッグも本願CRAC/SOC チャンネル阻害剤に含まれる。薬理学的に許容されるプロドラッグとは、加溶媒分解により又は生理学的条件下で本発明のNH2、OH、CO2H等に変換できる基を有する化合物である。プロドラッグを形成する基としては、Prog. Med., 5, 2157-2161 (1985)や「医薬品の開発」（廣川書店、1990年）第７巻  分子設計163-198に記載の基が挙げられる。【００１６】
本発明のCRAC/SOC チャンネル阻害剤を有効成分として含有する医薬の製剤は通常製剤化に用いられる担体や賦形剤、その他の添加剤を用いて常法により調製される。
投与は錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤等による経口投与、あるいは静注、筋注等の注射剤、坐剤、経皮剤、経鼻剤、吸入剤あるいは膀胱内注入剤等による非経口投与のいずれの形態であってもよい。投与量は症状、投与対象の年齢、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定されるが、通常、経口投与の場合、成人１日当たり0.001mg/kg乃至100mg/kg、好ましくは0.01mg/kg乃至10mg/kgであり、これを１回で、あるいは２〜４回に分けて投与する。また、症状によって静脈投与される場合は、通常、成人１回当たり0.0001 mg/kg乃至10 mg/kg、好ましくは0.001 mg/kg乃至1 mg/kgの範囲で１日に１回乃至複数回投与される。また、吸入の場合は、通常、成人１回当たり0.0001 mg/kg乃至1 mg/kgの範囲で１日に１回乃至複数回投与される。【００１７】
経口投与のための固体組成物としては、錠剤、散剤、顆粒剤等が用いられる。このような固体組成物においては、一つ又はそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な賦形剤、例えば乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等と混合される。組成物は、常法に従って、不活性な添加剤、例えばステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤やカルボキシメチルスターチナトリウム等の崩壊剤、溶解剤、溶解補助剤を含有していてもよい。錠剤又は丸剤は必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性コーティング剤で被膜してもよい。
経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含み、一般的に用いられる不活性な溶剤、例えば精製水、エタノールを含む。この組成物は不活性な溶剤以外に可溶化剤、湿潤剤、懸濁化剤のような補助剤、甘味剤、矯味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。【００１８】
非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性又は非水性の液剤、懸濁剤、乳剤を含む。水性の溶剤としては、例えば注射用蒸留水及び生理食塩水が含まれる。非水性の溶剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート80（局方品）等がある。このような組成物は、さらに等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解剤、溶解補助剤を含んでもよい。これらは例えばバクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。また、これらは無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解、懸濁して使用することもできる。【００１９】
吸入剤や経鼻剤等の経粘膜剤は固体、液体、半固体状のものが用いられ、従来公知の方法に従って製造することができる。例えば、ラクトースや澱粉のような賦形剤や、更に、pH調整剤、防腐剤、界面活性剤、滑沢剤、安定剤や増粘剤等が適宜添加されていてもよい。投与は、適当な吸入又は吹送のためのデバイスを使用することができる。例えば、計量投与吸入デバイス等の公知のデバイスや噴霧器を使用して、化合物を単独で又は処方された混合物の粉末として、もしくは医薬的に許容し得る担体と組み合わせて溶液又は懸濁液として投与することができる。乾燥粉末吸入器等は、単回又は多数回の投与用のものであってもよく、乾燥粉末又は粉末含有カプセルを利用することができる。あるいは、適当な駆出剤、例えば、クロロフルオロアルカン、ヒドロフルオロアルカン又は二酸化炭素等の好適な気体を使用した加圧エアゾールスプレー等の形態であってもよい。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１  CRAC/SOC チャンネル阻害作用
カルシウム蛍光指示色素 fura-2 (1μM) をロードしたジャーカットT 細胞 (Jurkat T cells、6 × 106 細胞/mL）懸濁液 100μL を 96 ウエル・マイクロプレートの各ウエル中に分注した。タプシガージン刺激細胞内カルシウム濃度上昇は、被験薬剤ならびにタプシガージン (最終濃度、1μM) を各ウエルに添加することで惹起し，添加30分後に励起波長340 nm／500 nm及び励起波長380 nm／500 nmによって得られた2つの蛍光強度の比より算出した。求められた各濃度被験薬存在下の細胞内カルシウム濃度ならびに溶媒単独により求められた対照群の細胞内カルシウム濃度より，各濃度被験薬による細胞内へのカルシウム流入阻害(CRAC/SOCチャンネル阻害)率を求め50%のCRAC/SOCチャンネル阻害を示す濃度（IC50値）を算出した（詳細は前記特許文献１参照）。
エコナゾール及び化合物Ａは、タプシガージン誘発持続的カルシウム流入を濃度依存的に抑制し、その阻害活性はそれぞれ 14 及び 0.3 μM であった。【００２１】
実施例２  ヒト腸管上皮細胞分泌に対する抑制作用
上皮細胞の水分泌はクロライドイオン分泌と相関することが知られ、クロライド依存性電流を測定することで上皮細胞の水分泌に対する作用を評価できる。
ヒト大腸上皮細胞由来細胞株T84細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション (American Type Culture Collection (ATCC)、米国) より購入した。T84 細胞 (3 × 105 細胞／ウェル)を6ウェル・マイクロプレートに設置したポリエチレン性メッシュ・インサート(Transwell (登録商標)、コーニング社、米国)上で10〜12日間培養した。培養液は5%ウシ胎児血清を含むDMEM/F-12 培地(ギブコ、米国)を用いた。培養したT84細胞単層標本はウッシング式短絡電流測定装置 (Ussing short-circuit current measuring system) の測定用チャンバーに装着して、クロライド依存的な短絡電流(short circuit current (Isc))を測定した。Isc はタプシガージン(thapsigargin、1μM)あるいはフォルスコリン(forskolin、10μM)をT84細胞単層標本の頂端膜側に添加することで惹起した。また、これらのIsc上昇は非選択的クロライド・チャンネル阻害剤、ジフェニルアラニン−２−カルボン酸 (diphenylamine-2-carboxylic acid (DPC)、1mM)によって完全に阻害された。各試験においてDPC添加によって得られた値をクロライド依存性Iscベースライン値として、各被験化合物の作用を補正した。
結果を図１に示す。CRAC/SOCチャンネル阻害剤であるエコナゾール（Econ）及び化合物A（Comp A）は、その骨格は全く異なるものの、両者ともタプシガージン誘発持続的Isc上昇を抑制した。このとき、持続的Isc上昇に先立って見られる一過性のIsc上昇に対しては影響を与えなかった。また、両化合物はフォルスコリン誘発Isc上昇を濃度依存的に阻害した。
以上の結果より、化合物Aは消化管上皮細胞において水分泌を抑制する作用を有することが示された。【００２２】
実施例３  マウス・コレラ毒素誘発腸管過分泌モデルに対する抑制作用
バルブ／C(Balb/c)系雌性マウスを用いて実験を行った。動物はケタミン(50 mg/kg)及びキシラジン(0.3 mg/kg)腹腔内投与麻酔下に、開腹して回腸−盲腸を体外に引き出した。盲腸側の回腸を二カ所結紮して約3cm長のループを作成し、ループ内にコレラ毒素(1 mg/mL)を0.1 mL注入することで腸管過分泌を惹起した。なお、生理食塩水(saline)群はコレラ毒素に代えて0.9%生理食塩水を同様に注入した。回腸ループを腹腔内に戻した後、手術用ステープラーを用いて閉腹した。コレラ毒素処置6時間後に、動物をジメチルエーテル過麻酔により致死して、腹腔内の回腸ループを摘出した。ループ内への分泌液量は、ループ長及びループ重量を測定することで単位長さあたりの重量増加から算出した。CRAC/SOCチャンネル阻害剤である化合物A（Comp A）は、コレラ毒素処置の24時間前及び1時間前に経口投与(po)した。コントロール（control）群は溶媒0.5% メチルセルロース溶液を同様に投与した。また、比較化合物として、過敏性腸症候群治療薬であるセロトニン拮抗薬グラニセトロン(granisetron：Gra) 1 mg/kg 静脈内投与(iv)、並びにオピオイド作動薬ロペラミド(loperamide：Lop) 1 mg/kg iv、炎症性腸疾患治療剤として用いられる抗炎症・免疫調節薬、５−アミノサリチル酸(5ASA) 100 mg/kg po、スルファサラジン(sulfasalazine：SSZ) 30 mg/kg po、サイクロスポリンA (cyclosporine A：CsA) 10 mg/kg po及びプレドニゾロン(prednisolone：Pred) 10 mg/kg poをそれぞれ同様に試験した。
結果を図２に示す。コレラ毒素処置したcontrol群は、saline群に比してループ内水分量の有意な増加を示し、腸管過分泌が亢進した。CRAC/SOCチャンネル阻害剤である化合物A投与(Comp A)群では当該コレラ毒素誘発腸管過分泌が濃度依存的に抑制され、0.3 mg/kg以上の経口投与においてその作用は有意であった。比較化合物であるセロトニン拮抗薬投与(Gra)群やオピオイド作動薬投与(Lop)群は、本モデルにおいても有効であった。一方、既存の抗炎症・免疫調節薬はいずれも本モデルの腸管過分泌に対して影響しなかったことから、本発明のCRAC/SOC チャンネル阻害剤の腸管過分泌抑制作用は、既知の抗炎症・免疫調節の作用メカニズムにより発現しているものではなく、直接的な消化管上皮細胞への水分泌抑制作用を介して発現していることが推察された。【００２３】
実施例４  ラット・ストレス誘発下痢モデルに対する作用
ウィスター(Wistar)系雄性ラットを用いて実験を行った。動物は個別拘束ケージ内に4時間拘束してストレスを与え、下痢反応を惹起した。下痢症状は、拘束 4 時間後の便性状が軟便以上のものを下痢症状有りと判定した。化合物A（Comp A）1.0又は10 mg/kgを、拘束の24 時間及び1時間前に経口投与した。各群19−20例。被験化合物の統計学的薬効解析は、カイ２乗検定により有意差検定し，ボンフェロニ法により多重性を調整した。
結果を図３に示す。化合物A（Comp A）は拘束ストレス誘発による下痢発症率を用量依存的に抑制し、10mg/kgの経口投与群においては有意な抑制を示した。【００２４】
実施例５  マウス・抗原誘発下痢モデルに対する作用
バルブ／Ｃ (Balb/c) 系雌性マウスを用いて実験を行った。動物は、卵白アルブミン (OVA) 50μg及びアルミニウムゲル(alum) 1mgを腹腔内投与することで免疫し、最初の免疫から2週間後に再度同条件にて免疫した。2回目の免疫から2週間後(Day 27)から1日おきに10 日間 OVA 10mg を経口投与することで下痢を発症させた。下痢の評価はOVA投与1時間後に行った。OVA投与1時間前に被験化合物である、化合物A(Comp A) 3又は10 mg/kg、サイクロスポリンA(CsA) 10 mg/kg及びプレドニゾロン(Pred) 10 mg/kgを経口投与した。
結果を図４に示す。化合物A（Comp A）投与群は抗原誘発による下痢発症率を用量依存的に抑制した。Pred投与群はほぼ完全に下痢を抑制した。一方、CsA投与群は下痢症状を悪化させた。
以上の実施例３〜５の結果は、生体内において、CRAC/SOC チャンネル阻害剤は、消化管上皮細胞における水分泌を直接的に抑制することを示しており、よって、臨床的に良好な下痢の予防・治療剤になり得ることを初めて確認したものである。【００２５】
実施例６  ラット・オキサゾロン誘発急性腸炎モデルに対する作用
ダーク・アゴーチ(dark agouti (DA))系雌性ラットを用いて実験を行った。動物は腹部体毛を刈った後に4%オキサゾロン(oxazolone)を0.3mLずつ腹部表皮に塗布することで感作した。なお、非感作（Normal）群はオキサゾロンに代えて、5%アセトン＋95%エタノールを塗布した。オキサゾロン感作1週間後に、ケタミン(50mg/kg)及びキシラジン(0.3mg/kg)腹腔内投与麻酔下に、ポリエチレン性チューブを用いて肛門から約8cm位置の結腸内に3%オキサゾロンを0.2mL注入することで腸炎を惹起した。Normal群及び非処置 (Naive) 群はオキサゾロンに代えて、0.5%メチルセルロース＋ピーナッツ油を注入した。腸炎惹起から24時間後に、動物をジメチルエーテル過麻酔により致死して、肛門−遠位結腸6.5cm を摘出し便性状及び潰瘍症状を臨床指数で評価してスコア化した。結腸組織は重量測定後に凍結保存してMPO活性測定に供した。被験化合物を、オキサゾロン処置の24時間前及び1時間後に経口投与した。コントロール(Control)群は溶媒0.5% メチルセルロース溶液を同様に投与した。なお、比較化合物として、サイクロスポリンA(CsA) 15 mg/kgを同様に経口投与した。
結果を図５に示す。本試験において、オキサゾロンにより腸炎を惹起したControl群は、有意な下痢症状の亢進とともに、腸組織重量増加及びMPO活性を指標とした炎症症状の亢進を示した。一方化合物A（Comp A）をそれぞれ0.1 mg/kg、1.0 mg/kg並びに10 mg/kg経口投与した群では、疾患活動性インデックス (Disease activity index) の有意な改善作用が確認され、下痢症状の改善、腸組織重量増加の抑制、及びMPO 活性亢進の抑制が見られた。これらの結果からCRAC/SOC チャンネル阻害剤である化合物A（Comp A）は、下痢症状並びに炎症症状の両方について改善作用を有することが確認された。一方、代表的な免疫調節剤であるCsAも本モデルに対する改善作用を示したが、その作用は化合物A（Comp A）に比して50倍弱いものであった。また、化合物A（Comp A）は0.1 mg/kg 経口投与からほぼ完全に下痢症状を抑制し、その下痢抑制作用は腸炎症状改善作用より約100倍近く低用量で発現することが観察された。【００２６】
実施例７  ラット TNBS 誘発慢性腸炎モデルに対する作用
ウィスター(Wistar)系雌性ラットを用いて実験を行った。動物はケタミン(50mg/kg)及びキシラジン(0.3 mg/kg)腹腔内投与麻酔下に、ポリエチレン性チューブを用いて肛門から約 8cm 位置の結腸内にトリニトロベンゼン・スルホン酸 (2,4,6-trinitrobenzene sulphonic acid (TNBS)、30mg/0.25mL 50% EtOH)を0.25 mL注入することで腸炎を惹起した。なお、未処置（Naive）群は50% エタノール(EtOH)を注入した。腸炎惹起から15日後に、動物をジメチルエーテル過麻酔により致死して、遠位結腸を摘出し便性状及び腸組織性状を臨床指数で評価してスコア化した。結腸組織は長さ及び重量測定後に凍結保存してミエロペルオキシダーゼ (myeloperoxidase (MPO))活性測定に供した。被験化合物を、TNBS処置の24時間前及び1時間前に経口投与するとともに、解剖の前日まで一日一回経口的に連投した。コントロール(Control)群は溶媒0.5% メチルセルロース溶液を同様に投与した。なお、代表的な炎症性腸疾患治療剤であるスルファサラジン(SSZ) 100 mg/kgを比較化合物として同様に経口投与した。
結果を図６に示す。Control群は、有意な下痢症状の亢進とともに、腸組織重量増加及びMPO活性を指標とした炎症症状の亢進を示した。一方、本発明のCRAC/SOC チャンネル阻害剤である化合物A(Comp A)を0.3mg/kg経口投与した群では、疾患活動性インデックス (Disease activity index)の有意な改善作用が確認され、下痢症状の改善、腸組織重量増加の抑制、及びMPO活性亢進の抑制が見られた。これらの結果からCRAC/SOC チャンネル阻害剤である化合物A（Comp A）は、下痢症状並びに炎症症状の両方について改善作用を有することが確認された。一方、代表的な炎症性腸疾患治療剤であるSSZも本モデルに対する改善作用を示したが、その作用は化合物A（Comp A）に比して500倍以上弱いものであった。【００２７】
前記実施例６並びに７の結果より、CRAC/SOC チャンネル阻害剤は、オキサゾロン誘発急性腸炎モデル並びにTNBS誘発慢性腸炎モデルの双方において、良好な下痢症状の改善作用に加えて腸炎症状に対しても改善を示した。よって、CRAC/SOCチャンネルは炎症性腸疾患において、下痢症状と炎症症状の両者に重要な役割を果たしており、本チャンネルを制御する薬剤は、既存の炎症性腸疾患治療剤に比して格段に優れた炎症性腸疾患治療剤になり得ることが示唆された。殊に化合物A、即ち、4,6-ジメチル-4’-[3,5-ビス(トリフルオロメチル)-1H-ピラゾール-1-イル]ニコチンアニリドは既存の炎症性腸疾患治療剤や下痢治療剤に比しても格段に優れた炎症性腸疾患治療剤／下痢治療作用を有していた。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明の予防若しくは治療剤は、良好な抗炎症作用を有し、更に消化管上皮細胞におけるCRAC/SOC チャンネルに直接作用して水分泌を抑制することから、炎症性腸疾患及び／又は下痢の予防若しくは治療剤、殊に腹痛を伴う下痢症状を主徴とする腸疾患である炎症性腸疾患の予防若しくは治療として有用である。下痢としては、ウイルス、細菌あるいは寄生虫の感染によって誘発される感染性下痢、ストレス、抗生物質、乳糖不耐症あるいはアレルギー反応などで惹起される非感染性下痢、炎症性腸疾患に伴う下痢症状、並びに過敏性腸症候群における下痢が挙げられる。
【図１】
2006115140.tif 000004
【図２】
2006115140.tif 000005
【図３】
2006115140.tif 000006
【図４】
2006115140.tif 000007
【図５】
2006115140.tif 000008
【図６】
2006115140.tif 000009
【国際調査報告】
2006115140.tif 000010
2006115140.tif 000011
2006115140.tif 000012
2006115140.tif 000013