(57)【要約】  前立腺における正常細胞の過度の増殖を抑制することができ、上皮細胞の増殖による肥大及び間質細胞の増殖による肥大のいずれにも有効であり、副作用が少なく、単独で又は従来の薬物療法に使用される薬物との組合せで使用することができる、新規な前立腺肥大症の予防及び／又は治療剤及び前立腺の正常細胞の増殖阻害剤、ならびにそれらの使用方法を提供する。  アンギオテンシンII受容体拮抗作用を有する化合物、薬学的に許容されうるその塩、又はそのプロドラッグを有効成分とする、前立腺肥大症の治療及び／又は予防剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンギオテンシンII受容体拮抗作用を有する化合物、薬学的に許容されうるその塩、又はそのプロドラッグを有効成分とする、前立腺肥大症の治療及び／又は予防剤。
【請求項２】
前記アンギオテンシンII受容体拮抗作用を有する化合物が、非ペプチド型のアンギオテンシンII受容体拮抗剤化合物である、請求の範囲１記載の治療及び／又は予防剤。
【請求項３】
前記アンギオテンシンII受容体拮抗作用を有する化合物が、イミダゾール系、ベンズイミダゾール系、イミダゾピリジン系、トリアゾール系、ピリジン系、メトキシピリジン系、ピラゾール系、ピロール系、アザインデン系、ピリミドン系、キナゾリン系、キサンチン系、縮合イミダゾール系、ピリミジンジオン系又はチェノピリドン系のいずれかのイミダゾール骨格又はイミダゾール類縁骨格を有する化合物である、請求の範囲１又は２記載の治療及び／又は予防剤。
【請求項４】
前記アンギオテンシンII受容体拮抗作用を有する化合物が、ロサルタン、ロサルタン  カリウム、カンデサルタン、カンデサルタン  シレキセチル、バルサルタン、エプロサルタン、ゾラサルタン、テルミサルタン、イルベサルタン、タソサルタン、オルメサルタン  メドキソミル、及びオルメサルタンからなる群から選択される１以上の化合物である、請求の範囲１〜３のいずれか１項記載の治療及び／又は予防剤。
【請求項５】
α１遮断薬、抗男性ホルモン薬、植物性エキス、漢方薬、抗コリン薬、及びアミノ酸製剤からなる群から選択される１以上の有効成分を含む前立腺肥大症治療及び／又は予防剤と、請求の範囲１〜４のいずれか１項記載の治療及び／又は予防剤との組合せからなる医薬。
【請求項６】
アンギオテンシンII受容体拮抗作用を有する化合物、薬学的に許容されうるその塩、又はそのプロドラッグを有効成分とする、前立腺正常細胞の増殖阻害剤。
【請求項７】
前記前立腺正常細胞が、間質細胞及び／又は上皮細胞である、請求の範囲６記
載の増殖阻害剤。
【請求項８】
アンギオテンシンII受容体拮抗作用を有する化合物、薬学的に許容されうるその塩、又はそのプロドラッグを有効成分とする、前立腺正常細胞におけるＭＡＰＫリン酸化阻害剤。
【請求項９】
前記前立腺正常細胞が、間質細胞及び／又は上皮細胞である、請求の範囲８記載のＭＡＰＫリン酸化阻害剤。
【請求項１０】
前記ＭＡＰＫリン酸化が、アンギオテンシンIIあるいは成長因子又はサイトカインによるものである、請求の範囲８又は９記載のＭＡＰＫリン酸化阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前立腺肥大症の治療及び／又は予防のための化合物及び組成物、前立腺細胞の増殖阻害のための化合物及び組成物、及びそれらの使用方法に関する。本発明は、より一般的には、前立腺正常細胞におけるＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）リン酸化阻害のための化合物及び組成物、及びそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺肥大症は、早い人では４０歳代後半から起こり、６０歳代までにはほとんどの人に起こる疾患である。前立腺の肥大は、前立腺を構成する間質細胞及び／又は上皮細胞の一部が増大することによって起こる。しかし、がんとは異なり、一定のところで増殖が止まるように制御されている。そのため、前立腺肥大症は良性であり、それ自体によって死に至る性質の疾患ではないが、排尿障害等の症状によって患者の生活の質（ＱＯＬ）には大きく影響する。【０００３】
前立腺肥大症の治療法としては、従来は開腹手術、経尿道的前立腺切除術（ＴＵＲ−Ｐ）等の手術が主流であったが、１９９０年代以降、α１受容体遮断薬、抗男性ホルモン薬、生薬・漢方薬等の薬物による治療法が一般的になってきている。【０００４】
α１受容体遮断薬は、前立腺肥大症による排尿障害を、尿道等の筋肉の緊張を緩和することによって改善させる効果を有し、副作用も少ないため、よく利用されているが、前立腺の肥大した腺腫を縮小させることはできない。一方、抗男性ホルモン薬は、肥大した腺上皮を退縮させることによって症状を改善するが、服用を中止すると腺腫がもとの大きさに戻るため、薬を飲み続ける必要がある。さらに、抗男性ホルモン作用による勃起能の低下を起こす。また、生薬・漢方薬は、比較的軽症の場合や他の薬物療法では改善しない場合等に使用を検討されるが、作用メカニズムはよくわかっておらず、偽薬効果の可能性もある。【０００５】
アンギオテンシンIIは、ＡＴ１受容体を介して血管収縮等の生理作用を発現するので、アンギオテンシンII受容体拮抗剤、特にＡＴ１受容体拮抗剤は、降圧剤、心臓疾患等の循環器系疾患治療剤として使用されている。最近、アンギオテンシンII受容体拮抗剤が前立腺がん細胞に対して増殖抑制効果を有することが見出された（非特許文献１：Uemura, H. et al., “Angiotensin II receptor blocker shows antiproliferative activity in prostate cancer cells: A possibility of tyrosine kinase inhibitor of growth factor,” Mol. Cancer Ther., 2003;2:1139-1147;  特許文献１：特開２００４−２２８２）。しかし、これらの文献には、アンギオテンシンII受容体拮抗剤が、がん化していない正常な前立腺の細胞の増殖、又は前立腺肥大症の治療及び／又は予防に関して効果を有するかどうかについては記載がない。
【特許文献１】特開２００４−２２８２
【非特許文献１】Uemura, H. et al., “Angiotensin II receptor blocker shows antiproliferative activity in prostate cancer cells: A possibility of tyrosine kinase inhibitor of growth factor,” Mol. Cancer Ther., 2003;2:1139-1147
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、前立腺における正常細胞の過度の増殖を抑制することができ、上皮細胞の増殖による肥大及び間質細胞の増殖による肥大のいずれにも有効であり、副作用が少なく、単独で又は従来の薬物療法に使用される薬物との組合せで使用することができる、新規な前立腺肥大症の予防及び／又は治療剤及び前立腺の正常細胞の増殖阻害剤、より一般的には前立腺正常細胞におけるＭＡＰＫリン酸化阻害のための化合物及び組成物、ならびにそれらの使用方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、アンギオテンシンII受容体拮抗作用を有する化合物が、がん化していない前立腺の細胞の増殖を抑制することを見出し、本発明を完成した。【０００８】
すなわち、本発明は、
（１）  アンギオテンシンII受容体拮抗作用を有する化合物、薬学的に許容されうるその塩、又はそのプロドラッグを有効成分とする、前立腺肥大症の治療及び／又は予防剤；
（２）  前記アンギオテンシンII受容体拮抗作用を有する化合物が、非ペプチド型のアンギオテンシンII受容体拮抗剤化合物である、前記（１）記載の治療及び／又は予防剤；
（３）  前記アンギオテンシンII受容体拮抗作用を有する化合物が、イミダゾール系、ベンズイミダゾール系、イミダゾピリジン系、トリアゾール系、ピリジン系、メトキシピリジン系、ピラゾール系、ピロール系、アザインデン系、ピリミドン系、キナゾリン系、キサンチン系、縮合イミダゾール系、ピリミジンジオン系又はチェノピリドン系のいずれかのイミダゾール骨格又はイミダゾール類縁骨格を有する化合物である、前記（１）又は（２）記載の治療及び／又は予防剤；
（４）  前記アンギオテンシンII受容体拮抗作用を有する化合物が、ロサルタン、ロサルタン  カリウム、カンデサルタン、カンデサルタン  シレキセチル、バルサルタン、エプロサルタン、ゾラサルタン、テルミサルタン、イルベサルタン、タソサルタン、オルメサルタン  メドキソミル、及びオルメサルタンからなる群から選択される１以上の化合物である、前記（１）〜（３）のいずれか１記載の治療及び／又は予防剤；
（５）  α１遮断薬、抗男性ホルモン薬、植物性エキス又は漢方薬、抗コリン薬、及びアミノ酸製剤からなる群から選択される１以上の有効成分を含む前立腺肥大症治療及び／又は予防剤と、前記（１）〜（４）のいずれか１記載の治療及び／又は予防剤との組合せからなる医薬；
（６）  アンギオテンシンII受容体拮抗作用を有する化合物、薬学的に許容されうるその塩、又はそのプロドラッグを有効成分とする、前立腺正常細胞の増殖阻害剤；
（７）  前記前立腺正常細胞が、間質細胞及び／又は上皮細胞である、前記（６）記載の増殖阻害剤;
（８）  アンギオテンシンII受容体拮抗作用を有する化合物、薬学的に許容されうるその塩、又はそのプロドラッグを有効成分とする、前立腺正常細胞におけるＭＡＰＫリン酸化阻害剤；
（９）  前記前立腺正常細胞が、間質細胞及び／又は上皮細胞である、前記（８）記載のＭＡＰＫリン酸化阻害剤；
（１０）  前記ＭＡＰＫリン酸化が、アンギオテンシンIIあるいは成長因子又はサイトカインによるものである、前記（８）又は（９）記載のＭＡＰＫリン酸化阻害剤、を提供する。【０００９】
なお、本発明に関して「正常」細胞とは、がん化していない細胞を指し、その細胞がその他の点において正常でない点を全く含まないことを意味しない。【００１０】
本発明は、さらに、前記の薬剤の使用方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の前立腺肥大症の治療及び／又は予防剤、前立腺の細胞の増殖阻害剤、及び／又は前立腺正常細胞におけるＭＡＰＫリン酸化阻害のための化合物及び組成物は、前立腺における正常細胞の過度の増殖を抑制することができ、上皮細胞の増殖による肥大及び間質細胞の増殖による肥大のいずれにも有効であり、副作用が少なく、単独で又は従来の薬物療法に使用される薬物との組合せで使用することができる。【００１２】
したがって、本発明の前立腺肥大症の治療及び／又は予防剤、前立腺の細胞の増殖阻害剤、及び／又は前立腺正常細胞におけるＭＡＰＫリン酸化阻害のための化合物及び組成物を使用することにより、従来の薬物療法に存在する副作用の問題等を回避しつつ、外科手術によらずに安全に肥大を縮小させることができる。それによって、前立腺肥大症に伴う不快な症状を、その原因を除去することによって改善させ、患者のＱＯＬを向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】は、正常ヒト前立腺間質細胞由来細胞株ＰｒＳＣ細胞の増殖に対するアンギオテンシンII及びカンデサルタン  シレキセチル（ＣＶ１１９７４；以下「ＣＶ」又は「カンデサルタン」と略称することがある）の効果を示す図である。
【図２】は、ＰｒＳＣ細胞の増殖に対するＴＧＦβ及びＣＶの効果を示す図である。
【図３】は、ＰｒＳＣ細胞の増殖に対するＥＧＦ及びＣＶの効果を示す図である。
【図４】は、ＰｒＳＣ細胞によるＩＬ−６分泌に対するＴＧＦβ、ＴＮＦα及びＣＶの効果を示す図である。
【図５】は、ＰｒＳＣ細胞によるＩＬ−６分泌に対するＥＧＦの濃度依存的効果及びＣＶの効果を示す図である。
【図６】は、初代培養Ｆ−１細胞によるＩＬ−６分泌に対するアンギオテンシンIIの濃度依存的効果及びＣＶの効果を示す図である。
【図７】は、初代培養ＦＴ−ＦＢ細胞によるＩＬ−６分泌に対するＴＮＦα及びＣＶの効果を示す図である。
【図８】は、マウスに移植されたＰＣ−３腫瘍片に対するインビボでのＣＶの効果を示す図である。
【図９】は、マウスに移植されたＰＣ−３細胞及びＰｒＳＣ細胞の混合腫瘍片に対するインビボでのＣＶの効果を示す図である。
【図１０】は、オルメサルタン及びＴＮＦαによるＰｒＳＣ細胞の増殖抑制効果を示す図である。
【図１１】は、テルミサルタン及びＥＧＦ又はＴＮＦαによるＰｒＳＣ細胞の増殖抑制効果を示す図である。
【図１２】は、種々の濃度のロサルタンによる濃度依存的なＰｒＳＣ細胞の増殖抑制効果を示す図である。
【図１３】は、ロサルタンによるＴＮＦαで刺激されたＰｒＳＣ細胞の増殖抑制効果を示す図である。
【図１４】は、ＡIIＲブロッカー（カンデサルタン、ロサルタン）によるＰｒＳＣ細胞からのパラクリン因子の分泌抑制効果及びＰＣ−３細胞におけるＭＡＰＫのリン酸化の抑制効果を示す図である。パネル（Ａ）はｐＭＡＰＫ、パネル（Ｂ）はＭＡＰＫのウエスタン・ブロットの結果をそれぞれ示す。
【図１５】は、ＡIIＲブロッカー（カンデサルタン、ロサルタン）によるＰｒＳＣ細胞におけるＭＡＰＫのリン酸化の抑制効果を示す図である。パネル（Ａ）はｐＭＡＰＫ、パネル（Ｂ）はＭＡＰＫのウエスタン・ブロットの結果をそれぞれ示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明に関して、「アンギオテンシンII受容体拮抗作用」とは、アンギオテンシンII受容体、特にＡＴ１受容体に対するアンギオテンシンIIの結合に干渉することにより、アンギオテンシンIIの生理作用の発現を阻害する性質をいう。【００１５】
アンギオテンシンII受容体拮抗作用を有する化合物（以下、「アンギオテンシンIＩ受容体拮抗剤」ということがある）としては、代表的には以下に説明するものが挙げられる。【００１６】
アンギオテンシンII受容体拮抗剤は、一般にペプチド型及び非ペプチド型に大別され、また、血管のアンギオテンシンII収縮に対する抑制に関して競合型及び非競合型に分類されるが、本発明において使用されるアンギオテンシンII受容体拮抗作用を有する化合物は、それらのいずれであってもよい。【００１７】
たとえば、非ペプチド型アンギオテンシンII受容体拮抗剤としては、ビフェニルテトラゾール系、非ビフェニルテトラゾール系の化合物があり、それぞれの中で、イミダゾール骨格を有するものとイミダゾール類縁骨格を有するものが存在する。【００１８】
具体的には、イミダゾール系、ベンズイミダゾール系、イミダゾピリジン系、トリアゾール系、ピリジン系、メトキシピリジン系、ピラゾール系、ピロール系、アザインデン系、ピリミドン系、キナゾリン系、キサンチン系、縮合イミダゾール系、ピリミジンジオン系、チェノピリドン系等の各種化合物が公知である。【００１９】
さらに具体的には、ロサルタン（Ｄｕｐ７５３）、ロサルタン  カリウム（化学名２−ブチル−４−クロロ−１−［２’−（テトラゾール−５−イル）ビフェニル−４−イルメチル］−１Ｈ−イミダゾール−５−メタノール  カリウム塩）、カンデサルタン、カンデサルタン  シレキセチル（ＴＣＶ−１１６；化学名１−（シクロヘキシルオキシカルボニルオキシ）エチル  ２−エトキシ−１−［［２’−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ビフェニルー４−イル］メチル］−１Ｈ−ベンズイミダゾール−７−カルボキシラート）、バルサルタン（ＣＧＰ−４８９３３；化学名Ｎ−｛４−［２−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）フェニル］ベンジル｝−Ｎ−バレリル−バリン）、エプロサルタン（ＳＫ＆Ｆ１０８５６６）、ゾラサルタン（ＧＲ−１１７２８９）、テルミサルタン（ＢＩＢＲ２７７；化学名４’−｛［４−メチル−６−（１−メチル−２−ベンズイミダゾリル）−２−プロピル−１−ベンズイミダゾリル］メチル｝−２−ビフェニルカルボン酸）、イルベサルタン（ＳＲ４７４３６）、タソサルタン（ＡＮＡ−７３６）、オルメサルタン  メドキソミル（ＣＳ−８６６；化学名２，３−ジヒドロキシ−２−ブテニル  ４−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−２−プロピル−１−［ｐ−（ｏ−１Ｈ−テトラゾール−５−イルフェニル）ベンジル］イミダゾール−５−カルボキシラート，サイクリック２，３−カーボナート）等が挙げられる。【００２０】
上記のような化合物の「薬学的に許容されうる塩」としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等の金属の塩；トリエチルアミン、トリメチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ピリジン、ピコリン等のアミン類；リジン、アルギニン、オルニチン等の塩基性アミノ酸との塩、等が挙げられる。【００２１】
本発明に関して、アンギオテンシンII受容体拮抗剤のプロドラッグは、生体内で、活性代謝物（アンギオテンシンII受容体拮抗剤）に変換される化合物である。たとえば、アミノ基のアシル化、アルキル化、リン酸化、エイコサノイル化、アラニル化、ペンチルアミノカルボニル化、（５−メチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メトキシカルボニル化、テトラヒドロフラニル化、ピロリジルメチル化、ピバロイルオキシメチル化、ｔｅｒｔ−ブチル化等；水酸基のアシル化、アルキル化、リン酸化、ホウ酸化、アセチル化、パルミトイル化、プロパノイル化、ピバロイル化、サクシニル化、フマリル化、アラニル化、ジメチルアミノメチルカルボニル化等；カルボキシル基のエステル化、エチルエステル化、フェニルエステル化、カルボキシメチルエステル化、ジメチルアミノメチルエステル化、ピバロイルオキシメチルエステル化、エトキシカルボニルオキシエチルエステル化、フタリジルエステル化、（５−メチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチルエステル化、シクロヘキシルオキシカルボニルオキシエチルエステル化、メチルアミド化等によって修飾された誘導体等が挙げられる。【００２２】
上記のとおり、本発明に係るアンギオテンシンII受容体拮抗剤は、塩やエステルの形態であってもよい。以下において、アンギオテンシンII受容体拮抗作用を有する化合物、薬学的に許容されうるその塩、及びそのプロドラッグを、総称して「ＡIIＲブロッカー」と呼ぶことがある。【００２３】
本発明の治療及び／又は予防剤は、いずれか１種又は２種以上のＡIIＲブロッカー単独からなるものであってもよいが、ＡIIＲブロッカーに加えて他の成分を含む医薬組成物の形態であってもよい。これらの付加的な成分としては、たとえば、製剤の技術分野で公知の、薬学的に許容されうる各種の担体、賦形剤、希釈剤、安定剤、結合剤、崩壊剤、溶剤、緩衝剤、懸濁剤、乳化剤、防腐剤、香料、甘味料、着色料等が挙げられる。これらの成分は、予定される投与経路、剤型等にしたがって、当業者が適宜選択することができる。【００２４】
投与経路としては、経口又は非経口のいずれでもよく、たとえば経口、経鼻、経皮、経直腸、皮下、皮内、筋内、腹腔内、静脈内等の投与経路が挙げられる。【００２５】
剤型としては、たとえば経口投与のための錠剤、粉末、顆粒、糖衣錠、カプセル剤、シロップ、懸濁液、乳化液等；注射、デポ剤、点滴、点鼻等のための液体；外用のための軟膏、ゲル、液体、坐剤、貼付剤等が挙げられる。これらの各種製剤の製造方法は、当業者には公知である。たとえば、本発明の治療及び／又は予防剤は、降圧剤、心臓疾患等の循環器系疾患治療剤として製造又は使用されている各種のアンギオテンシンII受容体拮抗剤含有製剤及び特許文献１に記載されている各種の製剤と同様にして製造することができる。【００２６】
また、本発明に係るＡIIＲブロッカーは、前立腺肥大を抑制するため又は前立腺肥大症の症状を軽減させるための他の薬剤、又はその他の薬剤と組み合わせてもよい。本発明の治療及び／又は予防剤にはこれらの成分を含有させてもよく、あるいは、別個の薬剤として同時に又は逐次的に同一患者に投与してもよい。組合せることができる薬剤としては、塩酸ブラゾシン、塩酸タムスロシン、ウラピジル等のα１遮断薬；酢酸クロルマジノン、アリルエストレノール等の抗男性ホルモン薬；エビプロスタット等の植物性製剤及びそれらの成分である植物エキス、セルニチン花粉エキス、猪苓湯等の植物性エキス又は漢方薬；その他、前立腺肥大に伴う症状の緩和に用いられる抗コリン薬、アミノ酸製剤等の薬剤が挙げられる。【００２７】
本発明の治療及び／又は予防剤は、ＡIIＲブロッカーを、その医学的な目的を達成するのに有効な量（薬学的有効量）で含む。具体的な量は、適当な動物モデル等を使用して公知の方法によって決定されるが、有効成分であるＡIIＲブロッカーの量として、経口投与の場合、通常、０．０１μｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１μｇ／ｋｇ体重〜５ｍｇ／ｋｇ体重を１〜３回／日程度である。【００２８】
正確な用量及び投与スケジュールは、投与対象の個体の状況（たとえば、年齢、体重、性別、感染又は疾患の程度等）、投与経路、組み合わせて投与される他の薬剤又は治療法、特定の製剤の体内持続時間等に応じて、個別に決定される。
【実施例】
【００２９】
製剤例１：錠剤の製造
カンデサルタン  シレキセチル    ５０ｍｇ
ラクトース                      ３５ｍｇ
コーンスターチ                １３０ｍｇ
微結晶セルロース                ３０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム          ５ｍｇ
合計  ２５０ｍｇ
上記の処方の粉末を混合し、打錠機を用いて打錠して、１錠あたり２５０ｍｇの錠剤とする。【００３０】
例１：アンギオテンシンIIによる前立腺間質細胞の増殖に対する抑制効果
正常ヒト前立腺間質細胞由来の細胞株（ＰｒＳＣ細胞）は、Sanko Junyaku Co. Ltd.より購入し(Normal Human Prostate Stromal Cells，カタログ番号ＣＣ−２５０８）、フェノールレッドフリーＲＰＭＩ培地中で５％ＣＯ２、３７℃の条件下で継代培養して維持した。【００３１】
このＰｒＳＣ細胞（１０４個）を、１２ウェルディッシュに入れ、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを添加したフェノールレッド無含有培養液中で、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で数日間培養した後、アンギオテンシンII（１μＭ又は１０μＭ）を添加した。一部のウェルについては、アンギオテンシンIIを添加する４時間前に、ＡIIＲブロッカーであるＣＶを加えた（１０μＭ；以下、特に示した場合を除き、この濃度で使用した）。各群は、ｎ＝４とした。５％ＣＯ２、３７℃で５日間培養した後、各ウェル内の全細胞数をカウントした。【００３２】
結果を図１に示す。アンギオテンシンIIを添加しなかった対照群（「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）と比較して、アンギオテンシンIIで刺激した群（「ＡII（１μＭ）」及び「ＡII（１０μＭ）」）では濃度依存的に細胞数の増加が見られた。これに対し、アンギオテンシンII刺激の前にＣＶを添加した群（「ＡII（１μＭ）＋ＣＶ」及び「ＡII（１０μＭ）＋ＣＶ」）では、細胞数の増加が対照群と同程度まで抑制され、「ＡII（１μＭ）」と「ＡII（１μＭ）＋ＣＶ」との間及び「ＡII（１０μＭ）」と「ＡII（１０μＭ）＋ＣＶ」との間では、いずれも高い有意差が認められた（Ｐ＜０．０１）。【００３３】
例２：ＴＧＦβによる前立腺間質細胞の増殖に対する抑制効果
アンギオテンシンIIの代わりに１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβを用いて刺激したこと以外は例１と同様にして、ＡIIＲブロッカーの効果を調べた。【００３４】
結果を図２に示す。ＴＧＦβを添加しなかった対照群（「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）と比較して、ＴＧＦβで刺激した群（「ＴＧＦβ」）では細胞数が２倍以上に増加した。これに対し、ＴＧＦβ刺激の前にＣＶ（１０μＭ）を添加した群（「ＴＧＦβ＋ＣＶ」）では、「ＴＧＦβ」と比較して細胞数の増加が有意に抑制された（Ｐ＜０．０５）。【００３５】
例３：ＥＧＦによる前立腺間質細胞の増殖に対する抑制効果
アンギオテンシンIIの代わりに１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを用いて刺激したこと以外は例１と同様にして、ＡIIＲブロッカーの効果を調べた。【００３６】
結果を図３に示す。ＥＧＦを添加しなかった対照群（「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）と比較して、ＥＧＦで刺激した群（「ＥＧＦ」）では細胞数の有意な増加が見られた。これに対し、ＥＧＦ刺激の前にＣＶを添加した群（「ＥＧＦ＋ＣＶ」）では、「ＥＧＦ」と比較して細胞数の増加が有意に抑制され（Ｐ＜０．０５）、対照群と同程度にまで抑えられた。【００３７】
例４：前立腺間質細胞のＩＬ−６分泌に対する抑制効果
前立腺肥大症患者由来の初代培養間質細胞（Ｆ−１細胞）は、以下のようにして調製した。【００３８】
患者から採取した組織を、２０ｍＬの培地（ＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ  １１８３５−０３０）に１０％（Ｖ／Ｖ）ＦＢＳ（ｆｉｌｔｒｏｎ）及びｍｇ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ  １５１４０−１２２）を添加したもの）を分注しておいた５０ｍＬ遠心管に入れ、４℃で１時間以上静置した。その後、組織を１０ｃｍディッシュに取って鋏で１ｍｍ角程度の大きさに切った（血管等は除去した）。この際、血液が多い場合は、２０ｍＬの培地を加えて１０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を吸引除去して洗浄した。【００３９】
得られた組織片を５ｍＬのコラゲナーゼ溶液（上記と同じ組成の培地中、１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ  タイプII（ＳＩＧＭＡ  Ｃ−６８８５）；ただし、ＲＰＭＩ１６４０はＧＩＢＣＯ  ３１８００−０２２を使用）を分注しておいた遠心管に移し、２０ｍＬの培地を加え、１．５〜３時間、３７℃で攪拌した。【００４０】
次に、１０００ｒｐｍで５分間の遠心後、上清を吸引除去した後、同様の操作を２〜３回繰り返してペレットを培地で洗浄した。この際、浮遊物が多い場合はろ過した。【００４１】
得られた細胞を１０ｃｍディッシュに播き、１〜２週間後、増殖してきた段階で初代培養として使用した。【００４２】
別の前立腺肥大症患者の間質細胞由来の初代細胞（ＦＴ−ＦＢ細胞）も、上記と基本的に同じ方法で調製した。【００４３】
例１と同様に用意したＰｒＳＣ細胞又は上記のように調製したＦ−１もしくはＦＴ−ＦＢ細胞を、６ウェルディッシュに１０５個／ウェルずつ入れて５％ＣＯ２、３７℃で１日（２４時間）培養し、ＴＧＦβ（１ｎｇ／ｍＬ）、ＴＮＦα（１ｎｇ／ｍＬ）、ＥＧＦ（２．５又は１０ｎｇ／ｍＬ）又はアンギオテンシンII（１μＭ又は１０μＭ）を添加して刺激した（ｎ＝３）。一部のウェルについては、各試薬を添加する４時間前に、ＡIIＲブロッカーであるＣＶを加えた。各試薬添加後２４時間の時点で培養液を回収し、ＣＬＥＩＡ法でＩＬ−６濃度を測定した。【００４４】
結果を図４〜７に示す。図４は、ＰｒＳＣ細胞をＴＧＦβ又はＴＮＦαで刺激した場合である。ＴＧＦβ又はＴＮＦαを添加しなかった対照群（「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）と比較して、ＴＧＦβ又はＴＮＦαで刺激した群（それぞれ「ＴＧＦβ（１ｎｇ／ｍＬ）」及び「ＴＮＦα（１ｎｇ／ｍＬ）」）ではＩＬ−６の分泌が有意に促進された。しかし、刺激の前にＣＶを添加した群（「ＴＧＦβ＋ＣＶ」及び「ＴＮＦα＋ＣＶ」）では、「ＴＧＦβ（１ｎｇ／ｍＬ）」及び「ＴＮＦα（１ｎｇ／ｍＬ）」とそれぞれ比較してＩＬ−６の分泌が有意に抑制された（それぞれＰ＜０．０４及びＰ＜０．０１）。【００４５】
図５は、ＰｒＳＣ細胞をＥＧＦで刺激した場合である。ＥＧＦを添加しなかった対照群（「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）と比較して、ＥＧＦ（「ＥＧＦ（２．５ｎｇ／ｍＬ）」、「ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）」）で刺激すると、用量依存的にＩＬ−６分泌が増加した。しかし、刺激の前にＣＶを添加した群（「ＥＧＦ（１０）＋ＣＶ（１０）」）では、「ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）」と比較してＩＬ−６の分泌が有意に抑制された（Ｐ＜０．０５）。【００４６】
図６は、Ｆ−１細胞をアンギオテンシンIIで刺激した場合である。アンギオテンシンIIを添加しなかった対照群（「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）と比較して、アンギオテンシンIIで刺激した群（「ＡII（１μＭ）」及び「ＡII（１０μＭ）」）では濃度依存的にＩＬ−６分泌の有意な増加が見られた。しかし、刺激の前にＣＶを添加した群（「ＡII（１０μＭ）」＋ＣＶ」）では、「ＡII（１０μＭ）」と比較してＩＬ−６の分泌が有意に抑制された（Ｐ＜０．０３）。【００４７】
図７は、ＦＴ−ＦＢ細胞をＴＮＦαで刺激した場合である。ＴＮＦαを添加しなかった対照群（「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）と比較して、ＴＮＦαで刺激した群（「ＴＮＦα（１ｎｇ／ｍＬ）」）ではＩＬ−６分泌が約１２〜１５培程度に増加した。しかし、刺激の前にＣＶを添加した群（「ＴＮＦα＋ＣＶ」）では、「ＴＮＦα（１ｎｇ／ｍＬ）」と比較してＩＬ−６の分泌が有意に抑制された（Ｐ＝０．０５１）。【００４８】
以上の各例の結果から、前立腺間質細胞は、細胞成長因子による刺激の結果、ＩＬ−６を分泌するが、ＡIIＲブロッカーはこのＩＬ−６の分泌を抑制することができ、その結果、ＩＬ−６によって引き起こされる前立腺上皮細胞の増殖を抑制することができることが明らかとなった。【００４９】
したがって、ＡIIＲブロッカーは、前立腺の正常な間質細胞及び上皮細胞の両方の増殖を抑制することができる。【００５０】
例５：生体内での前立腺細胞の増殖に対する抑制効果
ＡＴ１受容体の発現が少ないヒト前立腺がん細胞ＰＣ−３（American Type Culture Collection, Rockville, MD, USAより入手）及びＰｒＳＣ細胞を用いて、生体内でのＡIIＲブロッカーの効果を調べた。【００５１】
生後４週の雄ヌードマウスの背部皮下に、ＰＣ−３細胞（５×１０６個）又はＰＣ−３細胞とＰｒＳＣ細胞との混合細胞（各２．５×１０６；合計５×１０６個）のいずれかを注入し、腫瘍を形成させた。１週間後には、径約５ｍｍの腫瘍が形成された。【００５２】
上記のマウスを、ＣＶ（５ｍｇ／ｋｇ／日）投与群、ＣＶ（１０ｍｇ／ｋｇ／日）投与群、投与なし（Ｃｏｎｔｒｏｌ）の３群に分け（各群ｎ＝４）、投与群には、腫瘍注射１週間後から５週間まで毎日、それぞれ所定の用量のＣＶを摂取できるように飲料水に溶かして経口投与した。各マウスの腫瘍（異種移植片）の大きさを毎週測定し、長径×短径×短径÷２の計算式を用いて体積を算出した。この体積を、第１週の体積を１とした相対比として表した。結果を図８（ＰＣ−３細胞を移植）及び９（ＰＣ−３細胞及びＰｒＳＣ細胞の混合物を移植）に示す。【００５３】
ＰＣ−３細胞は、他の前立腺がん細胞（ＤＵ１４５、ＬＮＣａＰ）と比較して発現しているＡＴ１受容体が少ないため、ＡIIＲブロッカーによる増殖抑制効果は低いと予想される。図８によれば、この予想のとおり、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」と比較してＣＶ投与群では増殖抑制が見られたものの、その効果はさほど顕著ではなかった。一方、ＰＣ−３とＰｒＳＣとの混合細胞を移植した場合（図９）には、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」と比較して投与群では用量依存的な増殖抑制が観察され、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」と「ＣＶ：１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ」との間で第４週及び第５週においてそれぞれＰ＜０．０４（「＊」及びＰ＜０．０３（「＊＊」）の有意差が認められた。【００５４】
したがって、生体内においてもＡIIＲブロッカーは間質細胞の増殖を抑制することが明らかになった。さらに、ＡIIＲブロッカーは、前立腺がん細胞の増殖を直接抑制するほかに、間質細胞に対する増殖因子、サイトカイン等の分泌抑制などの影響を通じても前立腺がんの増殖を抑制することが示された。【００５５】
例６：オルメサルタンによる前立腺間質細胞の増殖抑制効果
ＰｒＳＣ細胞を、２０，０００個／ウェルで１２ウェルディッシュに播き、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを添加したフェノールレッド無含有Ｆ１２培養液に、ＴＮＦα（１ｎｇ／ｍＬ）を単独で又はオルメサルタン（１μＭ）と同時に、それぞれ添加して、５日間培養した後、細胞数を測定した。何も添加しない群を対照群とした。各群は、ｎ＝４とした。【００５６】
結果を図１０に示す。対照群（「Ｃｏｎｔｒｏｌ」と比較して、ＴＮＦαで刺激した群（「ＴＮＦα（１）」）は、有意な細胞数の増加を示した（Ｐ＜０．０１）。これに対し、オルメサルタンを同時に加えた群（「ＴＮＦα（１）＋Ｏｌｍ（１）」）では、細胞数の増加が有意に抑制された（Ｐ＜０．０４）。【００５７】
例７：テルミサルタンによる前立腺間質細胞の増殖抑制効果
ＰｒＳＣ細胞を、２５，０００個／ウェルで１２ウェルディッシュに播き、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを添加したフェノールレッド無含有Ｆ１２培養液に、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）又はＴＮＦα（１ｎｇ／ｍＬ）を、それぞれ単独で又はテルミサルタン（５０μＭ）と同時に、添加して、５日間培養した後、細胞数を測定した。何も添加しない群を対照群とした。各群は、ｎ＝４とした。【００５８】
結果を図１１に示す。対照群（「Ｃｏｎｔｒｏｌ」と比較して、ＥＧＦ又はＴＮＦαで刺激した群（それぞれ「ＥＧＦ（１０）」又は「ＴＮＦα（１）」）は、有意な細胞数の増加を示した（Ｐ＜０．０１）。これに対し、テルミサルタンを同時に加えた群（「ＥＧＦ（１０）＋Ｔｅｌ」及び「ＴＮＦα（１）＋Ｔｅｌ」）では、細胞数の増加が有意に抑制された（Ｐ＜０．０１）。【００５９】
例８：ロサルタンによる前立腺間質細胞の増殖抑制効果（１）
ＰｒＳＣ細胞を、２０，０００個／ウェルで１２ウェルディッシュに播き、１０％（Ｖ／Ｖ）ＦＣＳを添加したフェノールレッド無含有Ｆ１２培養液に、ロサルタンを種々の濃度（０、０．１、１．０、１０μＭ）で添加し、５日間培養した後、細胞数を測定した。何も添加しない群を対照群とした。各群は、ｎ＝４とした。【００６０】
結果を図１２に示す。対照群（ロサルタン「−」）と比較して、ロサルタンを添加した群（０．１、１．０、１０μＭ）では用量依存的に細胞増殖が抑制され、１０μＭのロサルタンを添加した群では対照群と比較して有意差が認められた（Ｐ＜０．０５）。【００６１】
例９：ロサルタンによる前立腺間質細胞の増殖抑制効果（２）
ＰｒＳＣ細胞を、２５，０００個／ウェルで１２ウェルディッシュに播き、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを添加したフェノールレッド無含有Ｆ１２培養液に、ＴＮＦα（１ｎｇ／ｍＬ）及びロサルタン（１０μＭ）を、それぞれ単独で又は両方同時に、添加して、５日間培養した後、細胞数を測定した。何も添加しない群を対照群とした。各群は、ｎ＝４とした。【００６２】
結果を図１３に示す。対照群（ＴＮＦα／ロサルタン「−／−」）と比較して、ＴＮＦαで刺激した群（ＴＮＦα／ロサルタン「１．０／−」）は、有意な細胞数の増加を示した（Ｐ＜０．０５）。これに対し、ロサルタンを同時に加えた群（ＴＮＦα／ロサルタン「１．０／１０」）では、細胞数の増加が有意に抑制された（Ｐ＜０．０２）。また、ロサルタンを単独で添加した群（ＴＮＦα／ロサルタン「−／１０」では細胞増殖に変化が認められず、対照群と同等であった。【００６３】
例１０：ＡIIＲブロッカーによる間質細胞からのパラクリン因子分泌の抑制
（１０−１）
間質細胞（ＰｒＳＣ）を、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含有するフェノールレッド無含有Ｆ１２培地中で培養し、アンギオテンシンII（１０μＭ）を単独で又はロサルタン（「Ｌｏｓ」；１０μＭ）と同時に添加して２４時間後、培養液を採取し、コンディションド培地（「０．１％ＢＳＡ−ＣＭ」）とした。
（１０−２）
間質細胞（ＰｒＳＣ）を、１０％（Ｖ／Ｖ）ＦＣＳを含有するフェノールレッド無含有Ｆ１２培地中で培養し、ＣＶ（１０μＭ）又はロサルタン（１０μＭ）を添加して２４時間後、培養液を採取し、コンディションド培地（「１０％ＦＣＳ−ＣＭ」）とした（アンギオテンシンIIは添加しなかった）。同様にして、何も添加しない１０％ＦＣＳ−ＣＭも調製した。【００６４】
１０−１及び１０−２のいずれにおいても、用いたＰｒＳＣ細胞は３００万個であった。【００６５】
前立腺がん細胞ＰＣ３細胞を、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含有するフェノールレッド無含有Ｆ１２培地中で２４時間培養した後、培地を上記で採取した各コンディションド培地に交換し、１０分後に細胞を採取して以下のようにして全細胞タンパクを抽出した。また、同時に、コンディションド培地を添加しないＰＣ−３細胞についても同様の実験を行った（「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）。【００６６】
細胞を、氷冷したリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄した後、２００μＬの氷冷した細胞溶解液（lysis buffer；２０ｍＭ  トリス（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％  グリセロール、０．１％  ＳＤＳ、０．５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（商品名）、１００ｍＭ  フッ化ナトリウム（sodium fluoride）、２００ｍＭ  オルトバナジウム酸ナトリウム（sodium orthovanadate）、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  フェニルメチルスルフォニルフロリド（phenylmethylsulfonyl fluoride）、１ｍｇ／ｎＬ  ロイペプチン及び３ｍｇ／ｍＬ  アプロチニン）中で溶解させ、遠心分離した。上清を回収した。【００６７】
このタンパク試料を常法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、抗ホスホＭＡＰキナーゼ抗体（anti-phospho-MAP kinase antibody）又は抗ＭＡＰキナーゼ抗体（anti-MAP kinase antibody）（いずれもCell Signaling Technology （Beverly, MA）から購入した）を検出用抗体として用いてウェスタン・ブロットによりＭＡＰＫのリン酸化を調べた。
得られた結果から、ＮＩＨ  ｉｍａｇｅ  ソフトウェアによってｐＭＡＰＫ及びＭＡＰＫの各バンドの発現量を測定した。この結果に基づいて各レーンのｐＭＡＰＫ／ＭＡＰＫ比を算出し、次にレーン１（「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）の数値を１として各レーンの測定値のＣｏｎｔｒｏｌに対する比（「ｐＭＡＰＫ比」）を算出した。【００６８】
結果を図１４に示す。前立腺細胞（上皮細胞及び間質細胞）の増殖においては、種々の成長因子及び／又はサイトカインが細胞膜の受容体に結合することにより、細胞内に増殖シグナルが伝達され、その際、増殖系のシグナル伝達系のひとつであるＭＡＰＫのリン酸化が起こり、下流の増殖カスケードに伝わって最終的に増殖系タンパクが作られると考えられている。この実験においては、コンディションド培地を用いずに培養した場合（レーン１）と比較して、何も薬剤を添加せずにＰｒＳＣ細胞を培養して調製したコンディションド培地で培養した場合（レーン４）においてＰＣ−３細胞におけるＭＡＰＫのリン酸化が顕著であることから、間質細胞がＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＭＣＳＦ等の成長因子及び／又はサイトカイン（パラクリン因子）を分泌し、これによってＰＣ−３細胞におけるＭＡＰＫのリン酸化及び細胞増殖が促進されることが確認された。【００６９】
また、アンギオテンシンIIを単独で添加したＰｒＳＣコンディションド培地を添加した場合にはＰＣ−３細胞におけるＭＡＰＫのリン酸化が起こったが（レーン２）、アンギオテンシンIIをロサルタンと同時に添加したコンディションド培地の場合にはこのリン酸化は抑制されていた（レーン３）。さらに、何も薬剤を添加していないコンディションド培地を添加した場合にはＰＣ−３細胞におけるＭＡＰＫのリン酸化が起こったが（レーン４）、ＣＶ又はロサルタンを添加したコンディションド培地の場合にはこのリン酸化は抑制されていた（レーン５及び６）。
これらの結果により、間質細胞からのパラクリン因子の分泌がＡIIＲブロッカーによって抑制され、前立腺の上皮細胞の増殖が抑制されることが示された。【００７０】
例１１：ＡIIＲブロッカーによる前立腺間質細胞のＭＡＰＫリン酸化の抑制
間質細胞（ＰｒＳＣ）を、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含有するフェノールレッド無含有Ｆ１２培地中で２４時間培養し、アンギオテンシンII（１０μＭ）又はＴＮＦα（１ｎｇ／ｍＬ）を単独で、あるいはＣＶ（１０μＭ）又はロサルタン（「Ｌｏｓ」；１０μＭ）と同時に、培地交換により添加して、１０分後に細胞を採取して例１０と同様にして全細胞タンパクを抽出した。また、同時に、何も薬剤を添加しない細胞、及びＣＶ又はＬｏｓを単独で添加した細胞についても同様の実験を行った。それぞれについて、用いたＰｒＳＣ細胞は３００万個であった。
例１０と同様にして、これらの試料を用いてウェスタン・ブロットを行った。【００７１】
結果を図１５に示す。アンギオテンシンIIを単独で添加した場合は、ＭＡＰＫのリン酸化が強く活性化されていたが（レーン２）、ＣＶ又はＬｏｓと同時に添加した場合は、ＭＡＰＫのリン酸化は抑制された（レーン３及び４）。ＴＮＦαについても同様であり、単独で添加した場合は、ＭＡＰＫのリン酸化が強く活性化されていたが（レーン５）、ＣＶ又はＬｏｓと同時に添加した場合は、ＭＡＰＫのリン酸化は抑制された（レーン６及び７）。
また、ＣＶ又はＬｏｓを単独で添加しても、特にＭＡＰＫのリン酸化は起こらなかった（レーン８及び９）。
以上の結果から、ＡIIＲブロッカーは、前立腺間質細胞に作用して、アンギオテンシンII及びＴＮＦαを含む増殖シグナルの伝達を抑制することが示された。【００７２】
この出願は、平成１６年３月１２日出願の日本特許出願、特願２００４−０６９９４６に基づくものであり、特願２００４−０６９９４６の明細書及び特許請求の範囲に記載された内容は、すべてこの出願明細書に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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