(57)【要約】  本発明は、重水中に溶解又は分散した被検タンパク質に冷中性子を照射し、当該冷中性子の散乱から被検タンパク質の形態を測定することを特徴とする、被検タンパク質の形態変化に起因する疾患の診断方法に関する。  本発明によれば、タンパク質に対して無侵襲で自然なまま、水溶液中のタンパク質の形態変化を観察でき、その形態変化と疾患との関係を解明することができた。その結果、タンパク質の形態変化に起因する疾患の診断及び医薬のスクリーニングが可能となった。【特許請求の範囲】
【請求項１】
重水中に溶解又は分散した被検タンパク質に冷中性子を照射し、当該冷中性子の散乱から被検タンパク質の形態を測定することを特徴とする、被検タンパク質の形態変化に起因する疾患の診断方法。
【請求項２】
被検タンパク質の形態変化が、被検タンパク質の形状及び／又は大きさの変化である請求項１記載の診断方法。
【請求項３】
被検タンパク質が、生体由来の遺伝子を使用して合成されたもの又は生体から分離されたものである請求項１又は請求項２記載の診断方法。
【請求項４】
被検物質で処理された対象タンパク質又は被検物質を投与された動物から分離された対象タンパク質を用いる医薬のスクリーニング方法であって、重水中に溶解又は分散した対象タンパク質に冷中性子を照射し、当該冷中性子の散乱から対象タンパク質の形態を測定することを特徴とする、対象タンパク質の形態変化に起因する疾患の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項５】
対象タンパク質の形態変化が、対象タンパク質の形状及び／又は大きさの変化である請求項４記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
対象タンパク質が、生体由来の遺伝子を使用して合成されたもの又は生体から分離されたものである請求項４又は５記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体中に存在するタンパク質の形態変化を、タンパク質に対して無侵襲で自然なまま観察することにより、タンパク質の形態変化に起因する疾患を診断する方法及び医薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、パーキンソン病を初めとして、アルツハイマー病など多くの脳疾患に微小管結合タンパク質タウやシヌクレインの代謝異常や構造異常によるタンパク質の線維化や、細胞内の不要なタンパク質の分解系に関与するプロテオゾームシステムに関与するユビキチンの細胞内リサイクルシステムを司るＵＣＨ−Ｌ１（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）の遺伝子異常に起因するタンパク質凝集体形成と神経原線維細胞変性、細胞死が深く関わっていることが分かってきた。従って、生体中におけるタンパク質の線維化、凝集体形成等の形態変化は、種々の疾患の原因、進展、治癒過程等に深く関与していると考えられている。【０００３】
従来のタンパク質の構造解析に関しては、結晶化したタンパク質の構造を解析しようとする技術が種々開発されているが、この技術によって生体中のタンパク質の実質的な形態変化（例、自己集合によるオリゴマー形成等）を予測することは大変困難である。そこで、水溶液中でナノレベルのタンパク質構造を解析する技術がいくつか開発されている。このうち、Ｘ線小角散乱法によれば、タンパク質の水溶液構造を観察することが可能であるが、特に水中でのＸ線照射によるタンパク質の損傷は免れ得ず、ラジカル生成・重合反応による分子間共有結合形成が生じる。従って、この方法は、分子間相互作用による複合体構造の解析には不向きである。核磁気共鳴法（ＮＭＲ）によれば、分子量が３万程度までの単一タンパク質分子であれば、解析が可能であるが、それ以上の分子量を有するタンパク質や複合体を形成すると、１３Ｃや１５Ｎ等の同位元素を用いて特殊な分子修飾を行わないと解析が困難である。また、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）は、タンパク質を水中でマイカ表面に吸着させ、マイクロプローブでタンパク質表面を走査し、その形状を観察する手法であるが、タンパク質を基盤表面に固定するため、化学修飾が必要となるという問題がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、本発明は、タンパク質に対して無侵襲で自然なまま、水溶液中のタンパク質の形態変化を観察し、その形態変化と疾患との関係を解明し、当該手段を用いた診断方法及び医薬のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで本発明者は、中性子小角散乱法を用いて水溶液中のタンパク質を観察してきたところ、重水中のタンパク質に冷中性子を照射すれば水溶液中でタンパク質に何ら化学修飾や力学的作用を及ぼさずに、無侵襲で自然なままタンパク質構造が観察でき、かつ正常なタンパク質と異常なタンパク質の水溶液中での形態と、疾患との間に相関性があること、さらにこの結果を用いれば医薬のスクリーニングもできることを見出し、本発明を完成した。【０００６】
すなわち、本発明は、重水中に溶解又は分散した被検タンパク質に冷中性子を照射し、当該冷中性子の散乱から被検タンパク質の形態を測定することを特徴とする、被検タンパク質の形態変化に起因する疾患の診断方法を提供するものである。
また、本発明は、被検物質で処理された対象タンパク質又は被検物質を投与された動物から分離された対象タンパク質を用いる医薬のスクリーニング方法であって、重水中に溶解又は分散した対象タンパク質に冷中性子を照射し、当該冷中性子の散乱から対象タンパク質の形態を測定することを特徴とする、対象タンパク質の形態変化に起因する疾患の治療薬のスクリーニング方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明方法によれば、生体中に存在する状態と同様である、水溶液中でのタンパク質の構造、形態変化が無侵襲で自然なまま観察できるため、真に生体中で起こっているタンパク質の形態変化と疾患との関係が観察できることになり、種々の疾患の初期状態、進展状態、治癒過程等が正確に診断でき、かつ医薬がスクリーニングできる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】中性子小角散乱による重水溶媒中の蛋白質構造の観察方法の概念図である。
【図２】コア、シェル型のタンパク質構造の散乱ベクトルｑと散乱強度Ｉ（ｑ）を求める場合の理論式である。
【図３】正常型ＵＣＨ−Ｌ１の結晶構造を示す図である。（ＵＣＨ−Ｌ１と同様にｈｙｄｒｏｌａｓｅ活性（５０％のアミノ酸配列が一致する）を有し、生体に広く分布しているＵＣＨ−Ｌ３の結晶構造解析データからＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬによって解析）
【図４】球状タンパク質ＵＣＨ−Ｌ１の単量体、二量体からの理論曲線と、実際の正常型ＵＣＨ−Ｌ１の測定結果を示す図である。Ｉｅ（ｑ）；測定（●）、Ｉｃ（ｑ）；理論曲線、（−-−）、モノマー；（−−−）、ダイマー。
【図５】ＵＣＨ−Ｌ１回転楕円体とした場合の理論曲線である。ａ．球状の単量体の短径ａを徐々に変化させた回転円盤体（短径；ａ、長径；ｂ、（＝ｃ））の理論曲線、ｂ．球状の二量体の短径ａを徐々に変化させた回転円盤体（短径；ａ、長径；ｂ、（＝ｃ））の理論曲線、ｃ．球状の二量体の短径ａ，（＝ｂ）を徐々に変化させた紡錘体（短径；ａ、（＝ｂ）、長径；ｃ）の理論曲線である。
【図６】正常型ＵＣＨ−Ｌ１及びアミノ酸置換体の中性子散乱曲線及び理論曲線によるフィッティングを示す図である。ａ．正常型ＵＣＨ−Ｌ１、Ｉｅ（ｑ）；測定（●）、Ｉｃ（ｑ）；理論曲線、（−-−）、モノマー（ａ，２９Å，ｂ，（＝ｃ），５２Å）；（−−−）、ダイマー、ｂ．Ｉ９３Ｍ置換、Ｉｅ（ｑ）；測定（●）、Ｉｃ（ｑ）；理論曲線、（−-−）、モノマー（ａ，２０Å，ｂ，（＝ｃ），６２Å）；（−−−）、ダイマー、ｃ．Ｓ１８Ｙ置換、Ｉｅ（ｑ）；測定（●）、Ｉｃ（ｑ）；理論曲線、（−-−）、モノマー（ａ，４３Å，ｂ，（＝ｃ），４３Å）；（−−−）、ダイマー、ｄ．Ｉ９３Ｍ＋Ｓ１８Ｙ置換、Ｉｅ（ｑ）；測定（●）、Ｉｃ（ｑ）；理論曲線、（−-−）、モノマー（ａ，３１Å，ｂ，（＝ｃ），５０Å）；（−−−）、ダイマー。
【図７】正常型ＵＣＨ−Ｌ１及びアミノ酸置換体の円二色性測定による二次構造変化を示す図である。
【図８】正常型ＵＣＨ−Ｌ１及びアミノ酸置換による形態変化と機能変化を示す図である。
【図９】微小管結合タンパク質タウの単分子（自己集合により球状クラスター形成）構造、及び、ＳＳ結合形成による線維化を示す図である。線維化タウ（○）；ＳＳ結合還元・切断によるタウの自己集合体（●）。比較として、黒の実線にタウと同等の分子量を有する球状タンパク質からの理論的散乱曲線を示した。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の診断方法においては、被検タンパク質を重水中に溶解又は分散して用いる。生体中においてタンパク質は、細胞中又は体液中に溶解して存在している。従って、本発明においては、生体中において、そのタンパク質が存在している自然な状態の形態を観察することができる。ここで被検タンパク質としては、種々の疾患に関与していると考えられるすべてのタンパク質、例えば酵素、膜タンパク質、受容体タンパク質、構造蛋白質等が挙げられる。より具体的な例としては、ＵＣＨ−Ｌ１、微小管結合タンパク質タウ等を挙げることができる。【００１０】
これらのタンパク質としては、生体から分離されたタンパク質でもよいし、生体由来の遺伝子を使用して合成されたタンパク質でもよい。遺伝子を使用したタンパク質の合成には、当該遺伝子の構造さえ判明していれば、公知の手法により行うことができる。【００１１】
重水中のタンパク質濃度は、特に限定されないが、１０μＭ以上あれば十分である。好ましくは１０μＭ〜１００ｍＭ、より好ましくは１０μＭ〜１０ｍＭである。【００１２】
冷中性子は、公知の手段により中性子から変換させることができる。すなわち、加速器によって加速された陽子等の粒子線を重元素（例えば、ウラン、タングステン、水銀ｅｔｃ）からなるターゲットにあて、原子核の分裂的崩壊を起こさせ、パルス中性子を得、これを減速材（液体水素、液体重水素、固体メタン等）で冷却することにより得られる。同様に原子炉からウランの崩壊に伴い発生する中性子も同様な方法で冷中性子に変化できる（新高分子実験学６  高分子構造（２）散乱実験と形態観察、ｐ２８２  高分子学会編  共立出版株式会社参照）。ここで冷中性子の波長は、およそ０．５〜１．５ｎｍ前後である。【００１３】
当該冷中性子は、タンパク質の原子核に照射しても、散乱するだけで原子核を破砕しないためタンパク質へのダメージは殆どない。冷中性子の原子に対する散乱能は、原子の散乱長密度によって決まる。特に、重水素（２Ｈ、ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ；Ｄ）は大きな正の散乱長を有するのに対し、軽水素（１Ｈ）のそれは負である。このことを利用すると、冷中性子は相対的に、タンパク質中の水素原子（１Ｈ）に散乱されやすく、溶媒である重水（Ｄ２Ｏ）に吸収されやすい性質を有している。従って、重水中にタンパク質を溶解、分散すると、大きなコントラストが生じ、タンパク質構造が観察できる（中性子小角散乱法）。その解析範囲は、数Åからサブミクロンに及ぶ。この概念図を図１に示す。【００１４】
ここで、中性子小角散乱法について説明する。生成した冷中性子はスリット系の中性子導管を通じて、試料に照射させる。試料から生じた散乱光の検出は、二次元検出器が用いられる。測定したいｑ（運動量変化）範囲に応じて真空チャンバー中を移動してカメラ長を任意に変えることができる。カメラ長に応じてスリット部のコリメーションも調整する必要があるが、この機構により、広いｑ範囲で精度良いデータを得ることができる。異なるカメラ長、すなわちｑ範囲で測定を行い、それらを重ね合わせて１本の合成曲線にすることもできる。セル部分は、温度制御やサンプルチェンジャーなどが組込めるような工夫をするのが好ましい。高温や低温、高圧などの特殊セルユニットも用いることができる。【００１５】
試料セルとしては、角型又は太鼓型の石英製の容器を用いるのが普通である。中性子線は、ホウ素フリーの石英ガラスをほとんど吸収されることなく透過するので、セル容器壁の厚さは１ｍｍ程度の扱いやすいセルを使用できる。１００％  Ｄ２Ｏで１〜１０ｍｍとするのが普通である。セル厚が薄いほど散乱は弱く、長時間の積算を要する。セルは超音波洗浄などで十分に清浄にするのが望ましい。【００１６】
散乱光の測定は、散乱測定と別個に透過率（ｔｒａｎｓｍｉｔｔａｎｃｅ）の測定を行い、その値を用いてセル及び溶媒などによるバックグラウンド散乱を差引くことにより行うのが好ましい。組成が既知であれば計算で差引くこともできるが、十分に広角側まで測定し、このバックグラウンドを実験的に求め差引くことが好ましい。中性子小角散乱法ではポイントビームを用いるので、通常デスメアーの必要はない。等方性試料の場合は、二次元検出器で得られた二次元データのサーキュラーアベレージをとり、一次元データに変換する処理をコンピューターで行う。【００１７】
散乱光のコンピューター処理により、タンパク質の形態が観察できるので、この形態の変化、例えば形状及び／又は大きさの変化を観察することにより、疾患の診断ができる。診断に用いる解析方法とは、表１、２、３に示すように様々なタンパク質の形状を予測して、散乱ベクトル、ｑ＝（４π／λ）ｓｉｎθと散乱強度を計算し、どの形状が最も実験値に相応しいか解析できる。【００１８】
【表１】
2006064819.tif 000002
【００１９】
【表２】
2006064819.tif 000003
【００２０】
【表３】
2006064819.tif 000004
【００２１】
（１）松岡秀樹「コロイド、ミセル、高分子溶液への応用」日本結晶学会誌、４１、２６９（１９９９）．
（２）Ｊ．Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｈ．Ｇ．Ｂｅｎｏｉｔ，“Ｐｏｌｙｍｅｒａｎｄ  Ｎｅｕｔｒｏｎ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ”，Ｏｘｆｏｒｄ，（１９９４）．
（３）Ｏ．Ｋｒａｔｋｙ，Ｏ．Ｇｌａｔｔｅｒ，ｅｄ．“Ｓｍａｌｌ−ａｎｇｌｅ  Ｘ−ｒａｙ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ”，Ｃｈａｐ．１２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  １９８２．
（４）Ｔ．Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ，Ａｎｎ．Ｐｈｙ．，４２，５０９（１９４３）．
（５）Ｐ．Ｄｅｂｙｅ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｃｈｅｍ．，５１，１８（１９４８）．
（６）Ｈ．Ｂｅｎｏｉｔ，Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，１１，５０７（１９５３）．
（７）Ｋ．Ｋａｊｉｗａｒａ，Ｗ．Ｂｕｒｃｈａｒｄ，Ｍ．Ｇｏｒｄｏｎ，Ｂｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．，２，１１０（１９７０）．
その他の参考文献
Ｅ．Ｆ．Ｃａｓａｓｓａ，Ｇ．Ｃ．Ｂｅｒｒｙ，Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，Ａ−２，４，８８１（１９６６）．
Ｅ．Ｆ．Ｃａｓａｓｓａ，Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，Ａ．３，６０５（１９６５）．
Ｏ．Ｂ．Ｐｔｉｙｓｙｎ，Ｚｈｕｒｎａｌ  Ｆｉｚｉｃｈｅｓｋｏｉ  Ｋｈｉｍｉｉ，３１．１０９１（１９５７）．
Ａ．Ｐｅｔｅｒｌｉｎ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，２３，２４６４（１９５５）．【００２２】
また、散乱ベクトル、ｑ、が大きい領域（ｑ〜１／Ｒｇ、Ｒｇは重心回転半径）ではギニエの法則（参考文献：Ａ．Ｇｕｎｉｅｒ，Ｇ．Ｆｏｕｒｎｅｔ，Ｓｍａｌｌ  Ａｎｇｌｅ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｘ−ｒａｙｓ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９５５．）によれば、散乱ベクトルｑと散乱強度Ｉ（ｑ）の関係は、Ｉ（ｑ）＝Ｉ（０）ｅｘｐ（−１／３  Ｒｇ２ｑ２）と表すことができ、表４に示すような計算により、タンパク質の形状を推定することもできる。Ｉ（０）はｑを０外挿して得られる値であり、散乱強度を絶対値換算すると、この値は分子量に依存する値となる（参考文献：Ｊａｃｒｏｔ  ａｎｄ  Ｚａｃｃａｉ（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２０（１９８１），２４１３−２４２６））。【００２３】
【表４】
2006064819.tif 000005
【００２４】
また、タンパク質の中心にコアを形成するような複雑なタンパク質構造についても、図２に示すような解析方法（Ｊ．Ｍａｒｉｇｎａｎ，Ｐ．Ｂａｓｓｅｒａｕ，ａｎｄ  Ｐ．Ｄｅｌｏｒｄ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，９０，６４５（１９８６））によって、形状パラメーターを求めることができる。【００２５】
一方、散乱ベクトルｑが比較的大きな領域では、棒状のタンパク質で、散乱ベクトルｑと断面の重心平均半径Ｒｃとの関係が、ｑ２＊Ｒｃ２＜１である時、すなわち、棒の太さに対応する散乱強度Ｉ（ｑ）ｔｈｉｎが棒の長さＬに対して、Ｌπ/ｑの関係のある時、ｌｎ（Ｉ（ｑ）＝Ｋ＋（−１／２＊Ｒｃ２＊ｑ２）となるため、ｌｎ（Ｉ（ｑ）とｑ２でプロットして得られる直線の傾きよりＲｃを求めることができる。実際の断面半径Ｒは、Ｒ＝Ｒｃ１／２から求めることができる（参考文献；Ｈ．Ｍａｔｓｕｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．，１１８，３８７（１９８７））。【００２６】
ここでは、例えば、パーキンソン病の発症に関わるユビキチンリサイクル機能を有する、ＵＣＨ−Ｌ１について、正常型ＵＣＨ−Ｌ１タンパク質構造と、パーキンソン病危険増幅因子であるＵＣＨ−Ｌ１（Ｉ９３Ｍ置換体）とパーキンソン病危険軽減因子であるＵＣＨ−Ｌ１（Ｓ１８Ｙ置換体）のヒト遺伝子から大腸菌を用いてタンパク質を合成・精製し、重水素中で構造を解析した。その結果、（１）ＵＣＨ−Ｌ１は、水中で二量体として存在する。（２）二量体を形成する単量体の構造は各々異なっており、パーキンソン病危険増幅因子であるＵＣＨ−Ｌ１（Ｉ９３Ｍ置換体）は正常型よりも楕円性が高く、一方、パーキンソン病危険軽減因子であるＵＣＨ−Ｌ１（Ｓ１８Ｙ置換体）は、楕円性が低く、ほぼ球状の二量体であることが判明した。タンパク質の球状性は円二色性計測によるタンパク質内部のβ−ターン（折り返し構造）の増加（球状性増加）・減少（楕円性増加）によっても裏付けられる。【００２７】
ユビキチンリサイクル機能である加水分解活性はＩ９３Ｍ＜正常型＜Ｓ１８Ｙの順に高く、タンパク質の球状性（ｇｌｏｂｕｌａｒｉｔｙ）とは病理学的にも一致することを初めて明らかにした。この手法を用いれば、タンパク質の遺伝子変異による水中での実質的な構造変化が判明するため、病理的な予知と診断が可能となる。【００２８】
正常な微小管結合タンパク質タウの水中での単分子構造と、脳疾患で見られるタウの線維構造（病的状態）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接比較した例はない。中性子小角散乱法で、ＳＳ結合で部分的に架橋されたタウ分子は直径が３６Åの線維状の長線維を形成するが、ＳＳ結合を完全に切断すると、タウは自発的により半径が３５０Åの球状クラスターを形成することが明らかになった。これにより、正常な状態から病的な状態に至るプロセスの解明が容易となり、細胞変性や細胞死を誘発する異常なタンパク質の線維化を抑制する医薬の開発が可能となる。【００２９】
また、被検物質で処理された対象タンパク質又は被検物質を投与された動物から分離された対象タンパク質を試料として、前記同様に中性子小角散乱法により形態を測定すれば、当該被検物質が医薬として有用か否かがスクリーニングできる。ここで、対象タンパク質は、前記被検タンパク質と同様に、合成されたものでも生体から分離されたものでもよい。【００３０】
本発明によれば、病因に関わるタンパク質を直接生体より抽出・精製するか、あるいは、脳のように直接タンパク質の抽出が困難な場合、クローニングした遺伝子からタンパク質を合成・精製した試料に対して本発明により直接タンパク質構造（複合体）を観察し、正常型と比較することで、診断が実施できる。【００３１】
また、ＵＣＨ−Ｌ１のような二量体形成タンパク質に対しては、遺伝子治療により、Ｉ９３Ｍ変異型パーキンソン病患者にＳ１８Ｙ球状タンパク質を発現させ、酵素機能を回復させる可能性への道を開く、また、異常タンパク質の形状を正常に回復させ（球状化）、機能を回復させる薬剤のスクリーニング方法となる。また、タウのような異常なタンパク質会合・凝集に対する抑制剤のスクリーニングが可能となる。【００３２】
疾患患者から抽出した病的因子の候補となる種々のタンパク質と正常人から抽出された正常なタンパク質を比較し、どのタンパク質の形態が変化しているかを検査し、発症原因を明らかにすることができる。また、脳疾患のように被検タンパク質が直接抽出できない場合には、患者から抽出した遺伝子からタンパク質を合成し、正常なタンパク質と比較することにより診断を行うことができる。更には、正常なタンパク質であっても代謝異常によって線維化など、異常な高分子体が認められる疾患では、タンパク質が直接抽出されたものか、あるいは遺伝子から合成されたかに関わらず、正常なタンパクに種々の処理、例えばリン酸化や酸化ストレスを負荷し、負荷前後の形態を比較すれば、どのような代謝過程の異常により正常なタンパクが高分子化するかがわかり、発症原因を明らかにすることができる。また、さらにはこれらの知見に基づき、現状における治療方針の決定、遺伝子治療への展開、タンパク質の異常な会合や凝集を抑制する新規医薬スクリーニング方法への展開や、強いては疾患予防対策法を図ることが可能となる。【００３３】
本発明において、診断又はスクリーニングされる医薬の対象となる疾患は、タンパク質の形状や大きさの変化に起因する疾患であり、例えば脳内タンパク質であるシヌクレインの遺伝子異常が関連する家族性パーキンソン病、特発性パーキンソン病、ユビキチンリサイクル機能を有する、ＵＣＨ−Ｌ１の遺伝子異常に関連する家族性パーキンソン病が挙げられる。また、Ｔａｕｏｐａｔｈｙと称される神経原線維変化型痴呆で、一般的なアルツハイマー病の他、タウ遺伝子の変異が認められる前頭側頭葉痴呆、老人斑が認められない神経原線維優位痴呆がある。一方、電子顕微鏡で観察すると、周期が８０ｎｍで繰り返し構造を有する、タウのＰＨＦ（ｐａｉｒｅｄ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｆｉｌａｍｅｎｔ）が見られる疾患としては、遺伝性疾患や発達異常、炎症性疾患でも認められるが、常染色体劣性遺伝疾患では、Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ  ｔｙｐｅＣ等の代謝疾患、Ｈａｌｌｅｒｖｏｄｅｎ−Ｓｐａｔｚ症候群等の変性疾患、常染色体優性遺伝疾患では、筋ジストロフィー症、家族性プリオン病が揚げられる。また、亜急性硬化性全脳膜炎等の慢性疾患がある。家族性のＰｉｃｋ病では、ＰＨＦ（ｐａｉｒｅｄ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｆｉｌａｍｅｎｔ）の主用な構成要素である異常なタウ（ｔｈｒｅｅ  ｒｅｐｅａｔ  ｔａｕ）凝集体が見られる。正常なタウ（ｆｏｕｒ  ｒｅｐｅａｔ  ｔａｕ）でも、例えば進行性核上性麻痺や皮質基底核変性症では、その凝集体が認められている。更には、ポリグルタミンが蓄積する疾患としては、ハンチントン舞踏病やマシャド・ジョセフ病が挙げられる。本発明は、これらの脳疾患に制限されるものではなく、種々のタンパク質構造異常に起因する細胞死を伴う、癌やエイズ等のウイルス性疾患、感染症、代謝異常病、先天性疾患など生体の広範囲な領域に渡る様々な組織・細胞でのタンパク質構造異常の診断・治療・新薬スクリーニングにも応用できる。
【実施例】
【００３４】
実施例１
中性子散乱法によるＵＣＨ−Ｌ１の遺伝子変異タンパク質の構造解析によるパーキンソン病の診断
ヒト正常型  ＵＣＨ−Ｌ１  ｃＤＮＡ及び、これにＩ９３Ｍ，Ｓ１８Ｙ，Ｉ９３Ｍ＋Ｓ１８Ｙの変異を加えたｃＤＮＡを調製した。各々のｃＤＮＡを大腸菌用の発現ベクターｐＰＲＯｔｅｔＥ２３３にサブクローニングし、大腸菌株ＤＨ５ａＰＲＯへ導入した。得られた形質転換体をＣｉｒｃｌｅ  Ｇｒｏｗ  ｍｅｄｉｕｍでＯＤが約０．５になるまで３７℃で振とう培養し（約２時間）、最終濃度０．１ｍＭになるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加えた後、さらに６時間培養した。菌体を遠心操作（５０００×ｇ、２０分、室温）により回収し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．８に懸濁した。超音波破砕法により菌体を溶解し、Ｃｏ２＋−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＴＡＬＯＮ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、指示に従いＵＣＨ−Ｌ１を精製した。これを凍結乾燥し、−８０℃で保存した（参考文献；Ｋ．Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，ｅｔ．ａｌｌ．，Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．，３０４，１７６−１８３（２００３））。【００３５】
濃度が０．８６ｍｇ／ｍＬとなるように重水を用いた緩衝液（最終的に、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．８，５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ））に溶解し、高エネルギー加速器研究機構に設置された中性子散乱装置（ＷＩＮＫ、０．０３＜ｑ（Å−１）＜０．１５）により中性子散乱測定を室温下で行った。ここで、ｑは、ブラッグ角をθ、とした時にｑ＝（４π／λ）ｓｉｎθと表される運動量変化である。溶媒とＵＣＨ−Ｌ１溶液の透過率を測定し、バックグラウンドを差し引き、標準化して得られた各々の散乱強度を求めた。ＵＣＨ−Ｌ１溶液からの散乱強度から溶媒の散乱強度を差し引いたものを、タンパク質から散乱する中性子の散乱強度とした。【００３６】
次に水溶液中でのタンパク質の形態を解析する。タンパク質の水中での構造から予測される理論的な中性子散乱曲線と、実験で得られたＵＣＨ−Ｌ１の中性子散乱曲線が最も一致するようなタンパク質の形態を求めた。より具体的には、ＵＣＨ−Ｌ１の結晶構造はまだ未知であるが、ＵＣＨ−Ｌ１と同様にｈｙｄｒｏｌａｓｅ活性（５０％のアミノ酸配列が一致する）を有し、生体に広く分布しているＵＣＨ−Ｌ３の結晶構造解析データからＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬによって解析（参考文献；Ｓｃｈｗｅｄｅ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１，３３８１−３３８５（２００３）．、Ｇｕｅｘ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １８，２７１４−２７２３（１９９７）．、Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｍ．Ｃ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３，６５８−６６０（１９９５）．）した結果を用いて、ＵＣＨ−Ｌ１の結晶構造を算定した（図３）。次に結晶構造情報より、タンパク質の回転半径を計算すると（参考文献；Ｓｖｅｒｇｕｎ，Ｄ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｍａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，２２６７−２２７）（１９９８）．、Ｓｖｅｒｇｕｎ，Ｄ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．２８，７６８−７７）（１９９５）．）、重心回転半径Ｒｇが、１６．５Å（実際の回転半径は、【００３７】
【数１】
2006064819.tif 000006
【００３８】
である球状タンパク質であることが想定された。算定された球状タンパク質の半径から、重水中でのＵＣＨ−Ｌ１の単量体の中性子散乱曲線を次式（１）により、理論的に得ることができる。また、二量体についても二分子の中心間距離から求めることができる。【００３９】
【数２】
2006064819.tif 000007
【００４０】
図４に、算定した球状タンパク質ＵＣＨ−Ｌ１の単量体、二量体からの理論曲線と、実際の正常型の測定結果を示す。明らかに単量体ではなく二量体に近いが、更に球状でないことが分かった。そこで、タンパク質の体積はアミノ酸数が一定であれば、変形してもその体積はあまり変化しないので、徐々にタンパク質の形状を回転円盤体（短径；ａ、長径；ｂ、（＝ｃ））もしくは紡錘体（短径；ａ、（＝ｂ）、長径；ｃ）として変形させ、更にこれらの形態として、単量体及び二量体を予測した。これらのタンパク質を全て５Åの立方体に分割し、分割された立方体間の散乱長密度差は水素原子（Ｈ）と重水素（Ｄ）間の差に比べると極めて小さいことを考慮し、タンパク質の全ての部位間の相関を計算することにより、水溶液からの理論的な中性子散乱曲線を次式（２）により求めた。図５ａに単量体もしくは二量体の５Åの立方体間全ての相関を求める場合の概念図を示す。図５ｂは単量体の回転円盤体（短径；ａ、長径；ｂ、（＝ｃ））で短径、ａ、を次第に変化させた場合の散乱ベクトルｑと散乱強度Ｉ（ｑ）との関係を示す。図５ｃは二量体とした場合の回転円盤体（短径；ａ、長径；ｂ、（＝ｃ））で短径、ａ、を次第に変化させた場合の散乱ベクトルｑと散乱強度Ｉ（ｑ）との関係を示す。更に、図５ｄは二量体でも、紡錘体（短径；ａ、（＝ｂ）、長径；ｃ）として、短径、ａ、を次第に変化させた場合の散乱ベクトルｑと散乱強度Ｉ（ｑ）との関係を示す。図５ｂの回転円盤体二量体のみにおいて、０．１＜ｑ（Å−１）＜０．１５の範囲で、特徴的な散乱強度の減衰が見られ、図４のＵＣＨ−Ｌ１の散乱曲線は回転円盤体に最も近いことが分かる。【００４１】
【数３】
2006064819.tif 000008
【００４２】
次に、実験値と理論値の差が最小となるように、次式（３）を用いてフィッティングを行った。【００４３】
【数４】
2006064819.tif 000009
【００４４】
ここで、ｍはスケーリングファクター、ｎはバックグラウンドファクター、Ｉｅ（ｑ）は実際に中性子散乱測定で得られた散乱強度、Ｉｃ（ｑ）は理論的に得られた散乱強度である。Ｒが最も小さくなるようなタンパク質の形態をＵＣＨ−Ｌ１の水溶液中の構造とした。紡錘体では長径が極めて長い紡錘体でなければ、実際の測定曲線と一致しなかったため、回転円盤体を採用した。図６に示すように、正常型ＵＣＨ−Ｌ１、Ｉ９３Ｍ、Ｓ１８Ｙ、Ｉ９３Ｍ＋Ｓ１８Ｙ全ては二量体であるが、二量体を形成する単量体は、正常型［短径、２９Å；長径、５２Å（図６ａ）］、Ｉ９３Ｍ［短径、２０Å；長径、６２Å（図６ｂ）］、Ｓ１８Ｙ［短径、４３Å；長径、４３Å（図６ｃ）］、Ｉ９３Ｍ＋Ｓ１８Ｙ［短径、３１Å；長径、５０Å（図６ｄ）］であった。すなわち、アミノ酸置換によって、水中での単量体の球状性は異なることが判明した。アミノ酸置換によるＵＣＨ−Ｌ１の球状性変化は、タンパク質の二次構造におけるβ−ターン（ペプチド鎖の折り返し）含有率とよく相関することが知られている。図７に円二色性測定結果から、α−へリックス、β−シート、β−ターン、ランダムコイル成分が、アミノ酸置換によってどのように変化したかを示した。正常型と比較して、Ｉ９３Ｍ置換により、β−シートの増加、β−ターンの減少が見られた。一方、正常型と比較して、Ｓ１８Ｙ置換により、β−ターンの増加が見られた。更にＩ９３Ｍ置換体と比較しても、Ｓ１８Ｙ置換により、β−ターンの増加が見られた。すなわち表５に示すように、中性子散乱実験から得られた、アミノ酸置換によるＵＣＨ−Ｌ１の球状性変化と、円二色性測定によるβ−ターンを指標としたＵＣＨ−Ｌ１の球状性変化はよく一致することが確認された。【００４５】
【表５】
2006064819.tif 000010
【００４６】
これらの結果とＵＣＨ−Ｌ１の機能、すなわちユビキチンの細胞内回収機能である加水分解活性から、図８に要約するように、
（１）ＵＣＨ−Ｌ１は水中で二量体を形成している。
（２）アミノ酸置換により、二量体を形成するＵＣＨ−Ｌ１の単量体の球状性は変化し、Ｉ９３Ｍ置換ではより球状から変形した形状となり、一方、Ｓ１８Ｙ置換ではより球状性が高まる。
（３）より変形されたＩ９３Ｍ置換体では、加水分解活性が低下し、パーキンソン病危険増幅因子となる。
（４）より球状性の高いＳ１８Ｙ置換体では、加水分解活性が増加し、パーキンソン病危険軽減因子となって発症を抑制する。【００４７】
以上が明らかになった。このように、中性子散乱法を用いることにより、従来の結晶構造解析からは予測が困難であった、生体に即した水中でのタンパク質の形態を明らかにすることが可能であるばかりではなく、タンパク質の形態を正常なタンパク質と比較すれば、パーキンソン病の診断ができることが判明した。【００４８】
実施例２
中性子散乱法による微小管結合タンパク質タウの構造解析によるアルツハイマー病の診断
大腸菌用の発現ベクターｐＲＫ１７２にヒトＴａｕ  ４０蛋白質（４４１アミノ酸）のｃＤＮＡをサブクローニングし、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳへ導入した。得られた形質転換体をＣｉｒｃｌｅ  Ｇｒｏｗ  ｍｅｄｉｕｍでＯＤが約０．５になるまで３７℃で振とう培養し（約２時間）、最終濃度が０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧを加えた後、さらに６時間培養した。菌体を遠心操作（５０００×ｇ、２０分、室温）により回収し、ＰＣ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ，ｐＨ６．８，０．５ｍＭ  Ｍｇ  Ａｃｅｔａｔｅ，１ｍＭ  ＥＧＴＡ，２ｍＭ  ＰＭＳＦ）に懸濁した。超音波破砕法により菌体を溶解し、１／１５０倍量の２−メルカプトエタノール、最終濃度０．８ｍＭのＮａＣｌを加えた後、９５℃で１５分間処理した。冷却後、遠心（２００００×ｇ、３０分、４℃）して上清を回収し、ＰＣ  ｂｕｆｆｅｒに対して一晩透析した。ＰＣ  ｂｕｆｆｅｒで平衡化したＰＣ１１樹脂と、透析後の蛋白質溶液を混合し、４℃で５時間以上撹拌した。０．１ｍＭ  ＮａＣｌを含むＰＣ  ｂｕｆｆｅｒで樹脂を十分に洗浄した後、０．５ｍＭ  ＮａＣｌを含むＰＣ  ｂｕｆｆｅｒによりＴａｕ  ４０蛋白質画分を溶出した。Ｔａｕ  ４０蛋白質画分をＭｉｌｌｉＱ水に対して一晩透析し、更に５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ  ＥＤＴＡ，１０ｍＭ  ＤＴＴ，ｐＨ７緩衝液に置き換え、凍結乾燥した後、中性子散乱実験に供した。また、タウ精製過程において、空気酸化で一旦タウ分子間にＳＳ結合が形成されると、容易にこれを還元・切断できないため、ＳＳ結合による高分子化現象を解消するため、更に、２０ｍＭ  ＤＴＴを加えて７０℃で加熱し、ＳＳ結合を還元・切断したタウについても同様に中性子散乱測定を行った。高分子化したタウは、日本原子力研究所の中性子散乱装置（ＳＡＮＳ−Ｊ；０．００１３＜ｑ（Å−１）＜０．０１４）、及び高エネルギー加速器研究機構の中性子散乱装置（ＳＷＡＮ；０．００９＜ｑ（Å−１）＜０．９９）で測定した。また、ＳＳ結合を還元・切断し、精製された低濃度のタウについては、日本原子力研究所の中性子散乱装置に４０枚の物質レンズを組み込むことにより、中性子を集光させて測定した。【００４９】
結果を図９に示す。ＳＳ結合を還元・切断する前のタウは、ｑ＜〜０．００８Å−１で見られるように、直線の傾きが、ｑ−２に比例することから、ランダムコイルを形成して水中に溶解・分散しており、鎖の太さは、０．００９＜ｑ（Å−１）＜０．０２５の範囲で横断面解析（参考文献；Ｈ．Ｍａｔｓｕｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．，１１８，３８７（１９８７））を行った結果（図５中の挿入図）、直径が３６Åであることが判明した。一方、ＳＳ結合を還元・切断した後は散乱曲線は処理前と全く異なり、ｑが小さくなるにつれ、散乱強度は増加しなくなり、また、ｑが大きくなるにつれ、散乱強度の減少はｑ−４に比例することから粒子は球状となっていることが判明した。Ｇｕｎｉｅｒ法（参考文献；Ａ．Ｇｕｎｉｅｒ，ｅｔ．ａｌ．，“Ｓｍａｌｌ−ａｎｇｌｅ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｘ−ｒａｙｓ”，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９５５））により、粒子の回転半径は３５０Åであり、数十個のタウ分子が自己集合によって会合し、球状クラスターを形成していることが判明した。正常なタウであっても、種々の脳疾患で凝集体が見つけられている。従って、本解析により、正常なタウ分子は水溶液中で、他のタンパク質と結合するか、あるいは弱い分子間相互作用によって会合体を形成しているが、酸化ストレスが細胞に加わると、分子間にＳＳ結合が導入され、線維化してしまうことが判明した。中性子散乱法を用いる評価系により、脳細胞内で生じる異常なタンパク質の高次構造化現象をｉｎ  ｖｉｔｒｏで再現することができ、これを阻害、抑制するような新規薬剤のスクリーニングが可能となる。
【図１】
2006064819.tif 000011
【図２】
2006064819.tif 000012
【図３】
2006064819.tif 000013
【図４】
2006064819.tif 000014
【図５】
2006064819.tif 000015
【図６】
2006064819.tif 000016
【図７】
2006064819.tif 000017
【図８】
2006064819.tif 000018
【図９】
2006064819.tif 000019
【国際調査報告】
2006064819.tif 000020
2006064819.tif 000021
2006064819.tif 000022
2006064819.tif 000023