(57)【要約】【課題】  本発明はエピグリカニンに関連するムチン様糖タンパク質及び該タンパク質をコードする核酸の単離について初めて記述する。また、本発明は当該マウスタンパク質のヒト相同体の存在を初めて明らかにする。【解決手段】  一般式：Ａ−Ｂｎ−Ｃ−Ｄ−Ｅで示されるアミノ酸配列を有するムチン様糖タンパク質（ここで、Ａはシグナル配列を含むＮ末端領域；ＢｎはＯ−グリコシル化部位を提供するセリン／スレオニンに富み約１１乃至約１５アミノ酸残基から成るアミノ酸配列（Ｂ）が繰り返される（ｎ＝２０〜１５０）タンデムリピート領域；Ｃは潜在的酵素切断部位含有領域；Ｄはマウス−ヒト間で高い相同性を示す細胞膜貫通領域；及びＥは細胞質内領域）が提供される。【選択図】図１４【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたムチン様糖タンパク質であって、該タンパク質は、
（１）Ｎ末端からＣ末端方向に、以下の一般式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列：
Ａ−Ｂｎ−Ｃ−Ｄ−Ｅ      （Ｉ）
［式中、
Ａは、
ＭＲＲＲＳＳＬＷＣＷＬＬＬＱＩＬＬＬＧＳＧＹＡ（配列番号：１）又は
ＭＫＭＱＫＧＮＶＬＬＭＦＧＬＬＬＨＬＥＡＡ（配列番号：２）
から選択されるＮ末端領域であり、
Ｂは、Ｏ−グリコシル化部位を有するタンデムリピート領域のリピート単位であって、以下の配列番号３乃至５で示され：
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５（配列番号：３）
但し、上記配列中、
Ｘａａ１はアラニン、バリン、グルタミン酸、スレオニン、イソロイシン、プロリン、セリン、グリシン及びヒスチジンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ２はセリン、イソロイシン、リジン、フェニルアラニン及びロイシンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ３はセリン、アルギニン及びアスパラギンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ４はスレオニン、セリン、イソロイシン、リジン及びアルギニンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ５はアラニン、グリシン、スレオニン及びバリンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ６はセリン及びスレオニンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ７はグリシン、アルギニン、アスパラギン酸、スレオニン、セリン及びアラニンから成る群から独立に選択されるか不明アミノ酸であり、
Ｘａａ８はセリン、スレオニン及びチロシンから成る群から独立に選択されるか不明アミノ酸であり、
Ｘａａ９はスレオニン、メチオニン、セリン、バリン、アラニン、アスパラギン、グルタミン酸、リジン及びイソロイシンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ１０はプロリン、スレオニン、セリン及びロイシンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ１１はスレオニン、セリン、アスパラギン及びイソロイシンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ１２はプロリン、ロイシン、スレオニン、トリプトファン、アルギニン、グルタミン及びセリンから成る群から独立に選択され
Ｘａａ１３はスレオニン、プロリン及びグルタミン酸から成る群から独立に選択されるか又は存在せず、
Ｘａａ１４はスレオニン及びセリンから成る群から独立に選択されるか又は存在せず、及び
Ｘａａ１５はスレオニン、アラニン、プロリン及びアスパラギンから成る群から独立に選択されか又は存在しない；
Ｘａａ２１−Ｘａａ２２−Ｓｅｒ−Ｘａａ２３−Ｘａａ２４−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｘａａ２８−Ｘａａ２９−Ｘａａ３０−Ｘａａ３１−Ｘａａ３２（配列番号：４）
但し、上記配列中、
Ｘａａ２１はアルギニン、メチオニン及びグリシンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ２２はスレオニン及びプロリンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ２３はイソロイシン、リジン及びスレオニンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ２４はアラニン及びスレオニンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ２５はセリン及びフェニルアラニンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ２６はアラニン及びバリンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ２７はセリン、フェニルアラニン及びロイシンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ２８はスレオニン及びアスパラギンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ２９はプロリン及びセリンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ３０はスレオニン及びアラニンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ３１はセリン及びスレオニンから成る群から独立に選択され、及び
Ｘａａ３２はイソロイシン及びセリンから成る群から独立に選択される；又は
Ｘａａ４１−Ｘａａ４２−Ｘａａ４３−Ｘａａ４４−Ｘａａ４５−Ｘａａ４６−Ｘａａ４７−Ｘａａ４８−Ｘａａ４９−Ｘａａ５０−Ｘａａ５１−Ｘａａ５２−Ｘａａ５３−Ｘａａ５４−Ｘａａ５５（配列番号：５）
但し、上記配列中、少なくとも１個以上のセリン又はスレオニンを含むことを条件として、
Ｘａａ４１はセリン、フェニルアラニン及びスレオニンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ４２はセリン、アスパラギン、ヒスチジン及びアルギニンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ４３はスレオニン、バリン及びセリンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ４４はスレオニン、バリン、プロリン、アラニン、イソロイシン及びアスパラギンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ４５はセリン及びグルタミン酸から成る群から独立に選択され、
Ｘａａ４６はセリン、アスパラギン、スレオニン及びアラニンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ４７はグリシン及びセリンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ４８はアラニン、イソロイシン、バリン、スレオニン及びセリンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ４９はセリン、グリシン及びアスパラギンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ５０はスレオニン、イソロイシン及びアラニンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ５１はアラニン、バリン及びアスパラギンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ５２はスレオニンであるか又は存在せず、
Ｘａａ５３はアスパラギン、グリシン、イソロイシン及びスレオニンから成る群から独立に選択されるか又は存在せず、
Ｘａａ５４はセリンであるか又は存在せず、及び
Ｘａａ５５はグルタミン酸、グリシン及びアスパラギン酸から成る群から独立に選択されか又は存在しない、
ｎは２０乃至１５０の整数であり、
Ｃは、
ＲＴＳＴＧＳＳＳＳＬＳＡＴＨＴＳＳＳＬＴＶＳＴＧＴＨＴＴＳＮＨＴＧＴＰＶＭＥＶＫＰＳＧＳＬＫＰＷＥ（配列番号：６）又は
ＡＬＴＧＭＨＴＴＳＨＳＡＳＴＡＶＳＥＡＫＰＧＧＳＬＶＰＷＥ（配列番号：７）
から選択される潜在的酵素切断部位含有領域であり、
Ｄは、
ＩＦＬＩＴＬＡＳＶＩＶＶＭＧＬＳＡＧＬＦＩＹＶ（配列番号：８）又は
ＩＦＬＩＴＬＶＳＶＶＡＡＶＧＬＦＡＧＬＦＦＣＶ（配列番号：９）
から選択される細胞膜貫通領域であり、
Ｅは、
ＲＲＹＬＳＬＲＮＡＡＤＧＩＦＹＮＳＨＰＤＰＧＧＳＡＭＴＰＧＳＰＴＣＳＷＲＲＰＲＴＦＮＶＶＥＭＴＲＩ（配列番号：１０）又は
ＲＮＳＬＳＬＲＮＴＦＮＴＡＶＹＨＰＨＧＬＮＨＧＬＧＰＧＰＧＧＮＨＧＡＰＨＲＰＲＷＳＰＮＷＦＷＲＲＰＶＳＳＩＡＭＥＭＳＧＲＮＳＧＰ（配列番号：１１）
から選択される細胞質内領域である。］
を有するか、或いは
（２）上記一般式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加された配列を有することを特徴とする、前記ムチン様糖タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載の一般式（Ｉ）において、Ａが配列番号:１であり、Ｂが配列番号：３及び配列番号：４から成る群から独立に選択され、Ｃが配列番号：６であり、Ｄが配列番号：８であり、Ｅが配列番号：１０であり、及びｎが１００乃至１５０の整数である、請求項１に記載のムチン様糖タンパク質。
【請求項３】
Ｂが配列番号：１２〜配列番号：１３８から成る群から独立に選択される請求項２に記載のムチン様糖タンパク質。
【請求項４】
マウス由来である請求項３に記載のムチン様糖タンパク質。
【請求項５】
配列番号：１３９で示されるか、又は配列番号:１３９で示されるアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加された配列を有することを特徴とする請求項３に記載のムチン様糖タンパク質。
【請求項６】
請求項１に記載の一般式（Ｉ）において、Ａが配列番号:２であり、Ｂが配列番号：５であり、Ｃが配列番号：７であり、Ｄが配列番号：９であり、Ｅが配列番号：１１であり、及びｎが２０乃至５０の整数である、請求項１に記載のムチン様糖タンパク質。
【請求項７】
Ｂが配列番号：１４０〜配列番号：１７０から成る群から独立に選択される請求項６に記載のムチン様糖タンパク質。
【請求項８】
ヒト由来である請求項７に記載のムチン様糖タンパク質。
【請求項９】
配列番号：１７１で示されるか、又は配列番号:１７１で示されるアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加された配列を有することを特徴とする請求項７に記載のムチン様糖タンパク質。
【請求項１０】
請求項１に記載のムチン様糖タンパク質をコードする核酸又は該核酸に相補的な核酸。
【請求項１１】
配列番号：１７２で示されることを特徴とする請求項１０に記載の核酸。
【請求項１２】
配列番号：１７４で示されることを特徴とする請求項１０に記載の核酸。
【請求項１３】
宿主細胞において遺伝子の発現を指揮し得る調節配列に作動可能に結合した請求項１０に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載の発現ベクターを含有する遺伝子組換宿主細胞。
【請求項１５】
真核生物由来である請求項１４に記載の遺伝子組換宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１に記載のムチン様糖タンパク質の製造方法であって、該方法は、請求項１５に記載の宿主細胞を、該宿主細胞に導入された遺伝子の発現を許容し得る条件下で培養し、該細胞において発現された組換遺伝子産物を分離することを特徴とする、前記方法。
【請求項１７】
請求項１に記載のムチン様糖タンパク質に対する抗体。
【請求項１８】
ヒト由来のムチン様糖タンパク質に特異的である、請求項１７に記載の抗体。
【請求項１９】
前記ムチン様糖タンパク質の細胞外ドメインに対して特異的である、請求項１７又は１８に記載の抗体。
【請求項２０】
試料中における請求項１に記載のムチン様糖タンパク質発現の検出及び／又は定量方法であって、該方法は、以下の、
（１）請求項１０に記載の核酸の全部又は一部から成るプローブを準備する工程；
（２）前記工程（１）のプローブと試料からのＲＮＡ又は該ＲＮＡの逆転写産物とを緊縮条件下でハイブリダイズさせる工程、及び
（３）前記工程（２）において形成されたプローブ−ＲＮＡ複合体又はプローブ−逆転写産物複合体を検出する工程を含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項２１】
前記プローブが、請求項１０に記載の核酸中の連続した少なくとも２０ヌクレオチドを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記プローブが配列番号：１７６で示されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１に記載のムチン様糖タンパク質発現の検出及び／又は定量に用いるためのキットであって、該キットは、請求項１０に記載の核酸の全部又は一部から成るプローブ又はプライマーを含むことを特徴とする、前記キット。
【請求項２４】
請求項１に記載のムチン様糖タンパク質発現の検出及び／又は定量に用いるためのキットであって、該キットは、請求項１７乃至１９のいずれか一項に記載の抗体を含むことを特徴とする、前記キット。
【請求項２５】
細胞又は組織における請求項１に記載のムチン様糖タンパク質発現のｅｘ  ｖｉｖｏ検出方法であって、該方法は、当該タンパク質の細胞質内領域に特異的な抗体を用いて前記細胞または組織を免疫染色することを含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項２６】
前記組織が甲状腺癌組織である請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規ムチン様糖タンパク質に関する。また、本発明は当該糖タンパク質をコードする核酸、当該核酸を含むベクター及び該ベクターを保有する宿主細胞、当該宿主細胞を使用した前記糖タンパク質の製造方法、該糖タンパク質に対する抗体、並びに前記糖タンパク質をコードする遺伝子発現の検出方法及び当該方法に使用するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ムチンは、慣用的には、上皮細胞ルーメンから分泌されるか又はそこで発現する高度にＯ−グリコシル化された糖タンパク質として定義されてきた。また、近年のムチン・コアポリペプチドのｃＤＮＡクローニングの結果から、ヒトにおいては１９のメンバーから成るムチンファミリーの存在が明らかになっている。それらのムチンは、一般にセリン、スレオニン及びプロリンのアミノ酸残基を豊富に含み、高度にＯ−グリコシル化されたタンデムリピート領域を含んでいることも知られているが、当該領域内でのタンデムリピート単位の繰り返し数や、該単位のアミノ酸組成に関しては、そのメンバー間での多様性が報告されており、そのような多様性に起因すると思われる各種ムチンの独特な生物学的機能は、今日の生化学分野での極めて興味深い研究対象及び可能な医薬用途を提供している。【０００３】
例えば、ヒト・ムチンの一種であるＭＵＣ１の発現及びグリコシル化における変化は、ある種の腫瘍細胞の悪性進行度と相関していることが観察されている。故に当該ムチンは腫瘍に対する免疫療法のターゲットの１つとして捉えられているのみならず、該ムチンの患者血清レベルは乳癌の診断マーカーとして最も広く利用されている臨床的指標の１つである。また、ＭＵＣ１６についても、血清中の当該ムチンのレベルが卵巣腫瘍の指標として検査の対象となっている。その他のムチンに関する興味深い知見としては、ＭＵＣ２のノックアウトマウスが幾つかの消化器官において自発性腫瘍を形成した事実から、該ムチンが腫瘍抑制効果を有しているとみなされ、また、別のムチンであるＭＵＣ６は主に胃において発現しており、これはヘリコバクター・ピロリ感染に対する保護作用を付与すると考えられている。更に、ＭＵＣ１とＭＵＣ４の細胞質領域は細胞分化及び増殖の制御に関与することが判明している。【０００４】
一方で、これまでにマウスにおいてエピグリカニンと呼称されるムチン様糖タンパク質の存在が示唆されていた。このタンパク質は、透過型電子顕微鏡によるグルタルアルデヒド−四酸化オスミウム固定細胞像の観察から、マウス腹水乳癌細胞株ＴＡ３−Ｈａ細胞の表面に存在することが目視されており、該細胞の細胞質膜から外側に２００乃至３００ｎｍ、時として４００ｎｍほど突き出したフィラメントとして観測され得ると言われてきたが、当該タンパク質を単離したという報告はない。つまり、非特許文献１において記述されているように、当該タンパク質は全体で約５０万の分子量を有し、約１３００アミノ酸残基から成る１本鎖ポリペプチドで構成され且つ当該ポリペプチド鎖に５００以上の糖鎖が結合していると見積もられてきた。更に該文献は、それらの糖鎖構造の解明を試み、該タンパク質における数種のＯ−結合型糖鎖の存在を示唆したが、該実験は、十分に分離された糖タンパク質に対してではなく、前記ＴＡ３−Ｈａ細胞のトリプシン消化物をＢｉｏ−Ｇｅｌ（商標）  Ｐ−１００カラムに付した後、その空隙容量（Ｖｉｏｄ  Ｖｏｌｕｍｅ）に回収された粗精製画分に対して成されたに過ぎない。また、非特許文献２も、エピグリカニンと呼称された糖タンパク質が約５０万の分子量を有し、約１３００アミノ酸残基から成る１本鎖ポリペプチドで構成され且つ当該ポリペプチド鎖に５００以上の糖鎖が結合しているとの推定を採用した上で、該糖鎖の結合様式が２−アセトアミド−２−デオキシガラクトース残基とセリン又はスレオニン残基との間のＯ−グリコシル結合を含んでいると同定したが、やはり該研究も非特許文献１と同様な粗精製画分について行われており、とりわけエピグリカニンのコア・ポリペプチド鎖についての確実な物理化学的性状を与え得る該糖タンパク質の完全な単離には言及していない。更に、非特許文献３は、別のＴＡ３乳癌細胞株からのＴＡ３−ＭＭエピグリカニンと称された糖タンパク質が、約５０万の分子量を有し、電子顕微鏡観察により２．５ｘ４５０〜５００ｎｍの伸長した悍状体として観測されたことを記載するが、ここでも当該糖タンパク質を、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ（商標）  Ｐ−１００カラム等に付した際の空隙容量付近に溶出される粗精製画分として得ているのみであり、該エピグリカニンの単離及び正確な物理化学的性状を決定的には開示していない。【０００５】
上記エピグリカニンの生物学的機能における興味深い知見は、当該タンパク質を発現するＴＡ３−Ｈａ細胞の他家移植性と符合するであろう組織適合性抗原に対する遮蔽作用と密接に関連しているようである（非特許文献１参照）。ＴＡ３−ＭＭエピグリカニンに関しても、それを発現するＴＡ３−ＭＭ乳癌細胞の他家移植性が当該糖タンパク質の細胞表面での存在度に相関しているとされ、それは該糖タンパク質が細胞表面の組織適合性抗原をマスキングするという仮説により説明され得るとしている（非特許文献３参照）。また、他家移植性とも関係付けられる腫瘍の悪性度と関連して、非特許文献４は、ほんの１０個の細胞により約１７日以内で同系マウスを死亡させ得るような上記ＴＡ３−Ｈａ細胞を移植されたマウスの保護について記載している。該文献において、シクロフォスファミドによる先行処理をともなったエピグリカニンでの免疫によって約９０％の長期延命効果（ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）が観察された。関連する文献（非特許文献５）は、エピグリカニンが多数のＴｎエピトープ（ＧａｌＮＡｃ−α−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を有することに着目して、同じく当該Ｔｎ抗原を多量に含む脱アシル化羊下顎由来のムチンによるＴＡ３−Ｈａ細胞からの保護を記述している。また、非特許文献６は、Ｔｎ抗原の腫瘍マーカーとしての利用について記載している（ＴＡ３−Ｈａ細胞におけるＴｎ及びＴ抗原の特異的発現については非特許文献７を参照されたい）。【０００６】
しかして、エピグリカニンは、組織適合性抗原との関連において組織の他家移植性を説明し、或いは腫瘍の存在及びその悪性度の指標となるとともに当該腫瘍に対する保護を提供することが知られてきた。【０００７】
しかしながら、エピグリカニンの存在を示唆する最初の報告からおよそ３０年が経過しているにも拘わらず、何れの先行文献も、当該タンパク質の正確なキャラクタリゼーションを可能とするようなエピグリカニンの明確な物理化学的性状を決定的には開示しておらず、況や、当該タンパク質の単離を記述するところはない。【０００８】
更に、先行技術は、エピグリカニンのヒト相同体の存在について示唆すらしない。
【非特許文献１】Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎ，Ｄ．Ｈ．，Ｅｖａｎｓ，Ｎ．Ａ．，Ｃｏｄｉｎｇｔｏｎ，Ｊ．Ｆ．，Ｒｅｉｎｈｏｌｄ，Ｖ．，Ｓｉｌｂｅｒ，Ｃ．，  ａｎｄ  Ｊｅａｎｌｏｚ，Ｒ．Ｗ．（１９７９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２５４，Ｎｏ．２３，ｐ．１２１５３−１２１５９
【非特許文献２】Ｃｏｄｉｎｇｔｏｎ，Ｊ．Ｆ．，Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｋ．Ｂ．，Ｊｅａｎｌｏｚ，Ｒ．Ｗ．，Ｉｒｉｍｕｒａ，Ｔ．，  ａｎｄ  Ｏｓａｗａ，Ｔ．（１９７５）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．４０，ｐ．１７１−１８２
【非特許文献３】Ｃｏｄｉｎｇｔｏｎ，Ｊ．Ｆ．，Ｃｏｏｐｅｒ，Ａ．Ｇ．，Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｋ．Ｍ．，Ｓｌａｙｔｅｒ，Ｈ．Ｓ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｓｉｌｂｅｒ，Ｃ．，  ａｎｄ  Ｊｅａｎｌｏｚ，Ｒ．Ｗ．（１９７９）ＪＮＣＩ，Ｖｏｌ．６３，Ｎｏ．１，ｐ．１５３−１６１
【非特許文献４】Ｆｕｎｇ，Ｐ．Ｙ．Ｓ．，Ｍａｄｅｊ，Ｍ．，Ｋｏｇａｎｔｙ，Ｒ．Ｒ．，  ａｎｄ  Ｌｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒ，Ｍ．（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．５０，ｐ．４３０８−４３１４
【非特許文献５】Ｓｉｎｇｈａｌ，Ａ．，Ｆｏｈｎ，Ｍ．，  ａｎｄ  Ｈａｋｏｍｏｒｉ，Ｓ．（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．５１，ｐ．１４０６−１４１１
【非特許文献６】Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｇ．Ｆ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｃ．Ｒ．，Ｈｏｗａｒｄ，Ｄ．Ｒ．，Ｔｅｇｔｍｅｙｅｒ，Ｈ．，Ｄｅｓａｉ，Ｐ．Ｒ．，Ｍｕｒｔｈｙ，Ｓ．Ｍ．，Ｆｅｌｄｅｒ，Ｂ．，  ａｎｄ  Ｓｃａｎｌｏｎ，Ｅ．Ｆ．（１９８５）Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．５５，Ｎｏ．３，ｐ．５６１−５６９
【非特許文献７】Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｇ．Ｆ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２２４，ｐ．１１９８−１２０６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明はエピグリカニンに関連するムチン様糖タンパク質及び該タンパク質をコードする核酸の単離について初めて記述する。また、本発明は当該マウスタンパク質のヒト相同体の存在を初めて明らかにする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
マウス腹水乳癌細胞株ＴＡ３−Ｈａ細胞から得られた本発明のムチン様糖タンパク質は約２０００以上のアミノ酸残基を含んでおり、当該コア・ポリペプチド鎖だけでも約１９０ｋＤａの分子量を与える。また、更なる該タンパク質のアミノ酸配列の解析からは、それが主に５つのドメイン、すなわち、シグナル配列を含むＮ末端領域；Ｏ−グリコシル化部位を提供するセリン／スレオニンに富み１２乃至１５アミノ酸残基から成るアミノ酸配列が約１００回以上繰り返されるタンデムリピート領域；潜在的酵素切断部位含有領域；ヒト相同体との間で高いホモロジーを示す細胞膜貫通領域；及び細胞質内領域から構成されることが判明し、従って、上記タンデムリピート領域に糖鎖が付加したタンパク質全体の最大分子量は約１０００ｋＤａを超えると見積もられる。【００１１】
してみれば、本発明のムチン様糖タンパク質に関する上記の特徴は従来技術のそれと有意に異なり、故に両者は一見して異なるタンパク質を示しているが、そうであるにも拘わらず、該タンパク質のＴＡ３−Ｈａ細胞における特徴的な発現及び膨大なＯ−グリコシル化部位の存在から、本発明のムチン様糖タンパク質がエピグリカニンに密接に関連すると結論するのは極めて合理的であるように思われる。つまり、上述の従来技術において、エピグリカニンは約５０万の分子量を有する分子であって、約１３００アミノ酸残基から成り且つそこには５００程度の糖鎖が結合していると定義されていたが、それらの研究は必ずしも単離されたエピグリカニンを対象としていなかったこと、或いは単なる電子顕微鏡像の解析に依拠していたことに由来する不確実性を含んでいたために、エピグリカニン分子の物理化学的性状に関して正確でない結論を導いたというのはありそうなことである。【００１２】
しかして、本発明のエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質は、その最も広義な態様において、以下の一般式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列：
Ａ−Ｂｎ−Ｃ−Ｄ−Ｅ      （Ｉ）
［式中、
Ａは、
ＭＲＲＲＳＳＬＷＣＷＬＬＬＱＩＬＬＬＧＳＧＹＡ（配列番号：１）又は
ＭＫＭＱＫＧＮＶＬＬＭＦＧＬＬＬＨＬＥＡＡ（配列番号：２）
から選択されるＮ末端領域であり、
Ｂは、Ｏ−グリコシル化部位を有するタンデムリピート領域のリピート単位であって、以下の配列番号３乃至５で示され：
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５（配列番号：３）
但し、上記配列中、
Ｘａａ１はアラニン、バリン、グルタミン酸、スレオニン、イソロイシン、プロリン、セリン、グリシン及びヒスチジンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ２はセリン、イソロイシン、リジン、フェニルアラニン及びロイシンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ３はセリン、アルギニン及びアスパラギンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ４はスレオニン、セリン、イソロイシン、リジン及びアルギニンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ５はアラニン、グリシン、スレオニン及びバリンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ６はセリン及びスレオニンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ７はグリシン、アルギニン、アスパラギン酸、スレオニン、セリン及びアラニンから成る群から独立に選択されるか不明アミノ酸であり、
Ｘａａ８はセリン、スレオニン及びチロシンから成る群から独立に選択されるか不明アミノ酸であり、
Ｘａａ９はスレオニン、メチオニン、セリン、バリン、アラニン、アスパラギン、グルタミン酸、リジン及びイソロイシンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ１０はプロリン、スレオニン、セリン及びロイシンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ１１はスレオニン、セリン、アスパラギン及びイソロイシンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ１２はプロリン、ロイシン、スレオニン、トリプトファン、アルギニン、グルタミン及びセリンから成る群から独立に選択され
Ｘａａ１３はスレオニン、プロリン及びグルタミン酸から成る群から独立に選択されるか又は存在せず、
Ｘａａ１４はスレオニン及びセリンから成る群から独立に選択されるか又は存在せず、及び
Ｘａａ１５はスレオニン、アラニン、プロリン及びアスパラギンから成る群から独立に選択されか又は存在しない；
Ｘａａ２１−Ｘａａ２２−Ｓｅｒ−Ｘａａ２３−Ｘａａ２４−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｘａａ２８−Ｘａａ２９−Ｘａａ３０−Ｘａａ３１−Ｘａａ３２（配列番号：４）
但し、上記配列中、
Ｘａａ２１はアルギニン、メチオニン及びグリシンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ２２はスレオニン及びプロリンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ２３はイソロイシン、リジン及びスレオニンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ２４はアラニン及びスレオニンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ２５はセリン及びフェニルアラニンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ２６はアラニン及びバリンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ２７はセリン、フェニルアラニン及びロイシンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ２８はスレオニン及びアスパラギンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ２９はプロリン及びセリンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ３０はスレオニン及びアラニンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ３１はセリン及びスレオニンから成る群から独立に選択され、及び
Ｘａａ３２はイソロイシン及びセリンから成る群から独立に選択される；又は
Ｘａａ４１−Ｘａａ４２−Ｘａａ４３−Ｘａａ４４−Ｘａａ４５−Ｘａａ４６−Ｘａａ４７−Ｘａａ４８−Ｘａａ４９−Ｘａａ５０−Ｘａａ５１−Ｘａａ５２−Ｘａａ５３−Ｘａａ５４−Ｘａａ５５（配列番号：５）
但し、上記配列中、少なくとも一個以上のセリン又はスレオニンを含むことを条件として、
Ｘａａ４１はセリン、フェニルアラニン及びスレオニンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ４２はセリン、アスパラギン、ヒスチジン及びアルギニンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ４３はスレオニン、バリン及びセリンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ４４はスレオニン、バリン、プロリン、アラニン、イソロイシン及びアスパラギンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ４５はセリン及びグルタミン酸から成る群から独立に選択され、
Ｘａａ４６はセリン、アスパラギン、スレオニン及びアラニンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ４７はグリシン及びセリンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ４８はアラニン、イソロイシン、バリン、スレオニン及びセリンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ４９はセリン、グリシン及びアスパラギンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ５０はスレオニン、イソロイシン及びアラニンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ５１はアラニン、バリン及びアスパラギンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ５２はスレオニンであるか又は存在せず、
Ｘａａ５３はアスパラギン、グリシン、イソロイシン及びスレオニンから成る群から独立に選択されるか又は存在せず、
Ｘａａ５４はセリンであるか又は存在せず、及び
Ｘａａ５５はグルタミン酸、グリシン及びアスパラギン酸から成る群から独立に選択されか又は存在しない、
ｎは２０乃至１５０の整数であり、
Ｃは、
ＲＴＳＴＧＳＳＳＳＬＳＡＴＨＴＳＳＳＬＴＶＳＴＧＴＨＴＴＳＮＨＴＧＴＰＶＭＥＶＫＰＳＧＳＬＫＰＷＥ（配列番号：６）又は
ＡＬＴＧＭＨＴＴＳＨＳＡＳＴＡＶＳＥＡＫＰＧＧＳＬＶＰＷＥ（配列番号：７）
から選択される潜在的酵素切断部位含有領域であり、
Ｄは、
ＩＦＬＩＴＬＡＳＶＩＶＶＭＧＬＳＡＧＬＦＩＹＶ（配列番号：８）又は
ＩＦＬＩＴＬＶＳＶＶＡＡＶＧＬＦＡＧＬＦＦＣＶ（配列番号：９）
から選択される細胞膜貫通領域であり、
Ｅは、
ＲＲＹＬＳＬＲＮＡＡＤＧＩＦＹＮＳＨＰＤＰＧＧＳＡＭＴＰＧＳＰＴＣＳＷＲＲＰＲＴＦＮＶＶＥＭＴＲＩ（配列番号：１０）又は
ＲＮＳＬＳＬＲＮＴＦＮＴＡＶＹＨＰＨＧＬＮＨＧＬＧＰＧＰＧＧＮＨＧＡＰＨＲＰＲＷＳＰＮＷＦＷＲＲＰＶＳＳＩＡＭＥＭＳＧＲＮＳＧＰ（配列番号：１１）
から選択される細胞質内領域である。］或いはその機能的誘導体を含むものとして定義される。【００１３】
本発明の別の態様では、本発明のエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質が、マウスに由来するムチン様糖タンパク質に対応して、上記一般式（Ｉ）中、Ａが配列番号:１であり、Ｂが配列番号：３及び配列番号：４から成る群から独立に選択され、Ｃが配列番号：６であり、Ｄが配列番号：８であり、Ｅが配列番号：１０であり、及びｎが１００乃至１５０の整数であるものとして定義される。【００１４】
特に、上記Ｂは、マウスにおいて見出されるアミノ酸配列、すなわち配列番号：１２乃至配列番号：１３８から独立に選択され得る。
ＨＩＳＳＴＴＴＳＮＰＳＳＥ    （配列番号：１２）
ＴＫＳＩＡＴＤＹＥＴＴＰＴＴＴ（配列番号：１３）
ＩＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：１４）
ＡＳＳＩＡＳＤＳＫＰＴＬＴＴＴ（配列番号：１５）
ＡＳＳＴＡＳＧＳＭＳＴＰＴＴＰ（配列番号：１６）
ＡＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＴＴＴＴ（配列番号：１７）
ＡＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＰＴＴＴ（配列番号：１８）
ＡＳＳＫＡＳＲＳＶＰＴＴ      （配列番号：１９）
ＶＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＰＴＴＴ（配列番号：２０）
ＡＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：２１）
ＰＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＰＴＴＰ（配列番号：２２）
ＡＳＳＴＡＳＳＳＳＰＴＰＴＴＰ（配列番号：２３）
ＶＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＰＴＴＴ（配列番号：２４）
ＡＳＳＫＡＳＧＳＶＰＴＴ      （配列番号：２５）
ＶＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：２６）
ＶＳＳＴＶＳＤＳＴＰＴＰＴＴＴ（配列番号：２７）
ＡＳＳＴＡＳＧＳＡＰＴＰＴＴＴ（配列番号：２８）
ＡＳＳＴＡＳＧＳＭＰＴＬＴＴＮ（配列番号：２９）
ＡＳＳＴＡＳＧＳＳＰＴＬＴＴＴ（配列番号：３０）
ＡＳＳＳＡＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：３１）
ＥＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＷＴＴＴ（配列番号：３２）
ＴＳＳＴＡＳＲＳＴＰＴＰＴＴＴ（配列番号：３３）
ＡＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＰＴＴＴ（配列番号：３４）
ＶＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：３５）
ＡＳＲＲＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：３６）
ＥＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：３７）
ＡＳＳＳＧＳＧＳＴＰＴＬＰＴＴ（配列番号：３８）
ＥＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＲＴＴＴ（配列番号：３９）
ＴＳＳＴＡＳＲＳＴＰＴＰＴＴＴ（配列番号：４０）
ＡＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＰＴＴＴ（配列番号：４１）
ＶＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：４２）
ＡＳＲＳＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：４３）
ＥＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＰＴＴＴ（配列番号：４４）
ＡＳＳＴＡＳＧＳＡＰＮＰＴＴＴ（配列番号：４５）
ＶＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：４６）
ＡＳＳＳＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：４７）
ＥＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：４８）
ＡＳＳＳＡＳＧＳＭＰＴＰＴＴＴ（配列番号：４９）
ＶＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：５０）
ＡＳＳＳＡＳＧＳＭＰＴＰＴＴＴ（配列番号：５１）
ＡＳＳＴＡＳＧＳＳＰＴＬＴＴＴ（配列番号：５２）
ＡＳＳＳＡＳＧＳＡＰＮＰＴＴＴ（配列番号：５３）
ＶＳＳＴＧＳＸＸＴＰＴＰＴＴＴ（配列番号：５４）
ＡＳＳＫＡＳＧＳＶＰＴＴ      （配列番号：５５）
ＶＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：５６）
ＶＳＳＴＶＳＤＳＴＰＴＰＴＴＴ（配列番号：５７）
ＡＳＳＴＡＳＧＳＡＰＴＰＴＴＴ（配列番号：５８）
ＡＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：５９）
ＡＳＳＳＧＳＧＳＴＰＴＬＰＴＴ（配列番号：６０）
ＥＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＲＴＴＴ（配列番号：６１）
ＴＳＳＴＡＳＲＳＴＰＴＰＴＴＴ（配列番号：６２）
ＡＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＰＴＴＴ（配列番号：６３）
ＶＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：６４）
ＡＳＲＳＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：６５）
ＥＳＳＴＡＳＧＳＳＰＴＬＴＴＴ（配列番号：６６）
ＡＳＳＳＡＳＧＳＭＰＴＰＴＴＴ（配列番号：６７）
ＡＳＳＴＡＳＧＳＳＰＴＬＴＴＴ（配列番号：６８）
ＡＳＳＳＡＳＧＳＭＰＴＬＴＴＴ（配列番号：６９）
ＡＳＳＳＡＳＧＳＳＰＴＬＴＴＴ（配列番号：７０）
ＡＳＳＳＡＳＧＳＭＰＴＰＴＴＴ（配列番号：７１）
ＶＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：７２）
ＥＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＷＴＴＴ（配列番号：７３）
ＴＳＳＴＡＳＲＳＴＰＴＰＴＴＴ（配列番号：７４）
ＡＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＰＴＴＴ（配列番号：７５）
ＶＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：７６）
ＡＳＲＳＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：７７）
ＥＳＳＴＡＳＧＳＩＰＴＬＴＴＡ（配列番号：７８）
ＡＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＰＴＴＴ（配列番号：７９）
ＡＳＳＴＡＳＧＳＭＰＴＰＴＴＴ（配列番号：８０）
ＡＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：８１）
ＡＳＳＳＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：８２）
ＥＳＳＴＡＳＧＳＩＰＴＬＴＳＡ（配列番号：８３）
ＡＳＳＳＡＳＧＳＭＰＴＰＴＴＴ（配列番号：８４）
ＶＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：８５）
ＡＳＳＳＡＳＧＳＭＰＴＰＴＴＴ（配列番号：８６）
ＡＳＳＴＡＳＧＳＳＰＴＬＴＴＴ（配列番号：８７）
ＡＳＳＳＡＳＧＳＡＰＮＰＴＴＴ（配列番号：８８）
ＶＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：８９）
ＡＳＳＳＧＳＧＳＴＰＴＬＰＴＴ（配列番号：９０）
ＥＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＲＴＴＴ（配列番号：９１）
ＴＳＳＴＡＳＲＳＴＰＴＰＴＴＴ（配列番号：９２）
ＡＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＰＴＴＴ（配列番号：９３）
ＶＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：９４）
ＡＳＲＳＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：９５）
ＥＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＰＴＴＴ（配列番号：９６）
ＡＳＳＴＡＳＧＳＡＰＮＰＴＴＴ（配列番号：９７）
ＶＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＬＰＴＴ（配列番号：９８）
ＡＳＳＳＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：９９）
ＥＳＳＴＡＳＧＳＳＰＴＬＴＴＴ（配列番号：１００）
ＡＳＳＳＡＳＧＳＭＰＴＰＴＴＴ（配列番号：１０１）
ＡＳＳＴＡＳＧＳＳＰＴＬＴＴＴ（配列番号：１０２）
ＡＳＳＳＡＳＧＳＭＰＴＬＴＴＴ（配列番号：１０３）
ＡＳＳＳＡＳＧＳＳＰＴＬＴＴＴ（配列番号：１０４）
ＡＳＳＳＡＳＧＳＭＰＴＰＴＴＴ（配列番号：１０５）
ＶＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：１０６）
ＥＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＷＴＴＴ（配列番号：１０７）
ＴＳＳＴＡＳＲＳＴＰＴＰＴＴＴ（配列番号：１０８）
ＡＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＰＴＴＴ（配列番号：１０９）
ＶＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：１１０）
ＡＳＲＲＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：１１１）
ＥＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：１１２）
ＡＳＳＳＧＳＧＳＴＰＴＬＰＴＴ（配列番号：１１３）
ＥＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＲＴＴＴ（配列番号：１１４）
ＴＳＳＴＡＳＲＳＴＰＴＰＴＴＴ（配列番号：１１５）
ＡＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＰＴＴＴ（配列番号：１１６）
ＶＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：１１７）
ＡＳＲＳＧＳＧＳＴＰＩＬＴＴＴ（配列番号：１１８）
ＥＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＬＴＴＡ（配列番号：１１９）
ＡＳＳＳＡＳＧＳＴＰＴＰＴＴＴ（配列番号：１２０）
ＶＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：１２１）
ＡＳＳＳＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：１２２）
ＥＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＱＴＴＴ（配列番号：１２３）
ＴＳＳＴＡＳＲＳＴＰＴＰＴＴＴ（配列番号：１２４）
ＡＳＳＴＡＳＧＳＩＰＴＰＴＴＴ（配列番号：１２５）
ＡＳＳＩＡＳＧＴＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：１２６）
ＥＳＳＴＡＳＧＳＳＰＴＰＴＴＡ（配列番号：１２７）
ＳＳＳＳＡＳＤＳＫＰＴＳＴＴＴ（配列番号：１２８）
ＡＳＳＴＶＳＤＳＴＰＴＰＴＴＮ（配列番号：１２９）
ＡＳＳＳＡＳＧＳＴＰＴＱＴＴＴ（配列番号：１３０）
ＡＳＲＳＡＳＧＳＶＰＴＬＴＴＩ（配列番号：１３１）
ＡＦＳＴＡＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴ（配列番号：１３２）
ＡＳＮＳＡＳＳＳＳＰＴＰＴＴＴ（配列番号：１３３）
ＧＬＳＫＴＳＡＳＳＬＳＬＴＳＴ（配列番号：１３４）
ＭＴＳＩＴＳＡＳＴＦＴＰＡＳＩ（配列番号：１３５）
ＲＴＳＫＡＳＡＳＴＳＴＳＡＳＩ（配列番号：１３６）
ＲＴＳＩＡＦＡＳＴＳＴＰＴＴＳ（配列番号：１３７）
ＧＰＳＴＡＳＶＳＴＬＮＳＴＳＩ（配列番号：１３８）
（上記配列中、Ｘは不確定のアミノ酸を示す。）
本発明の特定の実施態様は、マウス腹水乳癌細胞株ＴＡ３−Ｈａ細胞において同定されたムチン様糖タンパク質に関し、以下のアミノ酸配列：ＭＲＲＲＳＳＬＷＣＷＬＬＬＱＩＬＬＬＧＳＧＹＡＨＩＳＳＴＴＴＳＮＰＳＳＥＴＫＳＩＡＴＤＹＥＴＴＰＴＴＴＩＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＡＳＳＩＡＳＤＳＫＰＴＬＴＴＴＡＳＳＴＡＳＧＳＭＳＴＰＴＴＰＡＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＴＴＴＴＡＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＰＴＴＴＡＳＳＫＡＳＲＳＶＰＴＴＶＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＰＴＴＴＡＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＰＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＰＴＴＰＡＳＳＴＡＳＳＳＳＰＴＰＴＴＰＶＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＰＴＴＴＡＳＳＫＡＳＧＳＶＰＴＴＶＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＶＳＳＴＶＳＤＳＴＰＴＰＴＴＴＡＳＳＴＡＳＧＳＡＰＴＰＴＴＴＡＳＳＴＡＳＧＳＭＰＴＬＴＴＮＡＳＳＴＡＳＧＳＳＰＴＬＴＴＴＡＳＳＳＡＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＥＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＷＴＴＴＴＳＳＴＡＳＲＳＴＰＴＰＴＴＴＡＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＰＴＴＴＶＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＡＳＲＲＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＥＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＡＳＳＳＧＳＧＳＴＰＴＬＰＴＴＥＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＲＴＴＴＴＳＳＴＡＳＲＳＴＰＴＰＴＴＴＡＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＰＴＴＴＶＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＡＳＲＳＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＥＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＰＴＴＴＡＳＳＴＡＳＧＳＡＰＮＰＴＴＴＶＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＡＳＳＳＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＥＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＡＳＳＳＡＳＧＳＭＰＴＰＴＴＴＶＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＡＳＳＳＡＳＧＳＭＰＴＰＴＴＴＡＳＳＴＡＳＧＳＳＰＴＬＴＴＴＡＳＳＳＡＳＧＳＡＰＮＰＴＴＴＶＳＳＴＧＳＸＸＴＰＴＰＴＴＴＡＳＳＫＡＳＧＳＶＰＴＴＶＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＶＳＳＴＶＳＤＳＴＰＴＰＴＴＴＡＳＳＴＡＳＧＳＡＰＴＰＴＴＴＡＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＡＳＳＳＧＳＧＳＴＰＴＬＰＴＴＥＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＲＴＴＴＴＳＳＴＡＳＲＳＴＰＴＰＴＴＴＡＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＰＴＴＴＶＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＡＳＲＳＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＥＳＳＴＡＳＧＳＳＰＴＬＴＴＴＡＳＳＳＡＳＧＳＭＰＴＰＴＴＴＡＳＳＴＡＳＧＳＳＰＴＬＴＴＴＡＳＳＳＡＳＧＳＭＰＴＬＴＴＴＡＳＳＳＡＳＧＳＳＰＴＬＴＴＴＡＳＳＳＡＳＧＳＭＰＴＰＴＴＴＶＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＥＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＷＴＴＴＴＳＳＴＡＳＲＳＴＰＴＰＴＴＴＡＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＰＴＴＴＶＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＡＳＲＳＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＥＳＳＴＡＳＧＳＩＰＴＬＴＴＡＡＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＰＴＴＴＡＳＳＴＡＳＧＳＭＰＴＰＴＴＴＡＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＡＳＳＳＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＥＳＳＴＡＳＧＳＩＰＴＬＴＳＡＡＳＳＳＡＳＧＳＭＰＴＰＴＴＴＶＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＡＳＳＳＡＳＧＳＭＰＴＰＴＴＴＡＳＳＴＡＳＧＳＳＰＴＬＴＴＴＡＳＳＳＡＳＧＳＡＰＮＰＴＴＴＶＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＡＳＳＳＧＳＧＳＴＰＴＬＰＴＴＥＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＲＴＴＴＴＳＳＴＡＳＲＳＴＰＴＰＴＴＴＡＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＰＴＴＴＶＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＡＳＲＳＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＥＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＰＴＴＴＡＳＳＴＡＳＧＳＡＰＮＰＴＴＴＶＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＬＰＴＴＡＳＳＳＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＥＳＳＴＡＳＧＳＳＰＴＬＴＴＴＡＳＳＳＡＳＧＳＭＰＴＰＴＴＴＡＳＳＴＡＳＧＳＳＰＴＬＴＴＴＡＳＳＳＡＳＧＳＭＰＴＬＴＴＴＡＳＳＳＡＳＧＳＳＰＴＬＴＴＴＡＳＳＳＡＳＧＳＭＰＴＰＴＴＴＶＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＥＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＷＴＴＴＴＳＳＴＡＳＲＳＴＰＴＰＴＴＴＡＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＰＴＴＴＶＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＡＳＲＲＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＥＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＡＳＳＳＧＳＧＳＴＰＴＬＰＴＴＥＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＲＴＴＴＴＳＳＴＡＳＲＳＴＰＴＰＴＴＴＡＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＰＴＴＴＶＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＡＳＲＳＧＳＧＳＴＰＩＬＴＴＴＥＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＬＴＴＡＡＳＳＳＡＳＧＳＴＰＴＰＴＴＴＶＳＳＴＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＡＳＳＳＧＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＥＳＳＴＡＳＧＳＴＰＴＱＴＴＴＴＳＳＴＡＳＲＳＴＰＴＰＴＴＴＡＳＳＴＡＳＧＳＩＰＴＰＴＴＴＡＳＳＩＡＳＧＴＴＰＴＬＴＴＴＥＳＳＴＡＳＧＳＳＰＴＰＴＴＡＳＳＳＳＡＳＤＳＫＰＴＳＴＴＴＡＳＳＴＶＳＤＳＴＰＴＰＴＴＮＡＳＳＳＡＳＧＳＴＰＴＱＴＴＴＡＳＲＳＡＳＧＳＶＰＴＬＴＴＩＡＦＳＴＡＳＧＳＴＰＴＬＴＴＴＡＳＮＳＡＳＳＳＳＰＴＰＴＴＴＧＬＳＫＴＳＡＳＳＬＳＬＴＳＴＭＴＳＩＴＳＡＳＴＦＴＰＡＳＩＲＴＳＫＡＳＡＳＴＳＴＳＡＳＩＲＴＳＩＡＦＡＳＴＳＴＰＴＴＳＧＰＳＴＡＳＶＳＴＬＮＳＴＳＩＲＴＳＴＧＳＳＳＳＬＳＡＴＨＴＳＳＳＬＴＶＳＴＧＴＨＴＴＳＮＨＴＧＴＰＶＭＥＶＫＰＳＧＳＬＫＰＷＥＩＦＬＩＴＬＡＳＶＩＶＶＭＧＬＳＡＧＬＦＩＹＶＲＲＹＬＳＬＲＮＡＡＤＧＩＦＹＮＳＨＰＤＰＧＧＳＡＭＴＰＧＳＰＴＣＳＷＲＲＰＲＴＦＮＶＶＥＭＴＲＩ（配列番号：１３９）を有する（上記配列中、Ｘは不確定のアミノ酸を示す。）。【００１５】
本発明は、更に、マウス・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質のヒト相同体に関する。発明者等の知る限りにおいて、これまでに、エピグリカニンのヒト相同体の存在は示唆されることすらなかった。更に発明者等は、本発明において明らかになったマウス・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質のｃＤＮＡ配列を元にＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔによってホモロジー検索を行ったが、当該マウス・エピグリカニン関連ムチンの全配列に高い相同性を示すヒト由来のＥＳＴや遺伝子が全く存在しないことも明らかとなった。【００１６】
そこで、発明者等は、本発明のマウス・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質のうちで、タンデムリピート領域以外の領域内からの種々のフラグメントに着目したホモロジー検索を試みた。その結果、驚くべきことに、当該マウス・エピグリカニン関連ムチンの細胞膜貫通領域のアミノ酸配列に対してのみ非常に高い相同性（同一性４７％、陽性率５５％：プログラムのデフォルトパラメータ（マトリクス＝Ｂｌｏｓｕｍ６２；ギャップ存在コスト＝１１、ギャップ拡張コスト＝１）を用いた検索で、インターネットサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎ／ｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｇｉ−ｇｉｎ／ＢＬＡＳＴで実装可能なｔＢＬＡＳＴｎアルゴリズムによる）を示す「理論上」の分泌タンパク質をコードするｃＤＮＡ（約２.５ｋｂ）が検索された。【００１７】
つまり、当該「理論上」の分子は、その実際の発現についてこれまでに全く確認されていなかったが、（ｉ）当該分子においても、上記のユニークな細胞膜貫通領域の上流に、やはりセリン及びスレオニンに富み、故に膨大な数のＯ−グリコシル化部位を提供する大規模なタンデムリピート領域の存在が確認されたこと、（ｉｉ）この分子の遺伝子はヒト第６番目染色体のＭＨＣ領域に存在しており、これは本発明のマウス・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質の位置する領域と対応すること、（ｉｉｉ）後に示す実施例により、この分子が特定の腫瘍組織において特異的に発現していたことなどの事実は、当該分子が本発明のマウス・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質のヒト相同体であるという結論を導くための強力な根拠と思われた。【００１８】
なお、報告された該「理論上」の分泌タンパク質のアミノ酸配列は、本発明で実際に得られたものと少なくとも３７アミノ酸残基において一致していなかった。【００１９】
従って、本発明の別の局面では、ヒト型のエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質が提供され、該ヒト型エピグリカニン関連ムチンは、上記一般式（Ｉ）において、Ａが配列番号:２であり、Ｂが配列番号：５であり、Ｃが配列番号：７であり、Ｄが配列番号：９であり、Ｅが配列番号：１１であり、及びｎが２０乃至５０の整数であるものとして定義され得る。【００２０】
特に、上記Ｂは、ヒト相同体において見出され、セリン／スレオニンに富んだ１１乃至１５アミノ酸残基から成るアミノ酸配列、すなわち配列番号：１４０乃至配列番号：１７０から独立に選択され得る。
ＴＮＳＮＥＴＳＴＳＡＮＴＧ    （配列番号：１４０）
ＳＳＶＩＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＧ（配列番号：１４１）
ＳＳＶＴＳＳＧＶＳＴＡＴＩＳＧ（配列番号：１４２）
ＳＳＶＴＳＮＧＶＳＩＶＴＮＳＥ（配列番号：１４３）
ＦＨＴＴＳＳＧＩＳＴＡＴＮＳＥ（配列番号：１４４）
ＦＳＴＡＳＳＧＩＳＩＡＴＮＳＥ（配列番号：１４５）
ＳＳＴＴＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＥ（配列番号：１４６）
ＳＳＴＰＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＤ（配列番号：１４７）
ＳＳＴＴＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＤ（配列番号：１４８）
ＳＳＴＴＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＥ（配列番号：１４９）
ＳＳＴＴＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＥ（配列番号：１５０）
ＳＳＴＡＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＥ（配列番号：１５１）
ＳＳＴＴＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＥ（配列番号：１５２）
ＳＳＴＴＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＥ（配列番号：１５３）
ＳＳＴＴＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＥ（配列番号：１５４）
ＳＲＴＴＳＮＧＡＧＴＡＴＮＳＥ（配列番号：１５５）
ＳＳＴＴＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＥ（配列番号：１５６）
ＳＳＴＰＳＳＧＡＧＴＡＴＮＳＥ（配列番号：１５７）
ＳＳＴＴＳＳＧＡＧＴＡＴＮＳＥ（配列番号：１５８）
ＳＳＴＶＳＳＧＩＳＴＶＴＮＳＥ（配列番号：１５９）
ＳＳＴＰＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＥ（配列番号：１６０）
ＳＳＴＴＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＤ（配列番号：１６１）
ＳＳＴＴＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＥ（配列番号：１６２）
ＳＳＴＴＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＥ（配列番号：１６３）
ＳＳＴＴＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＧ（配列番号：１６４）
ＳＳＴＴＳＳＧＴＳＴＡＴＮＳＥ（配列番号：１６５）
ＳＳＴＶＳＳＧＡＳＴＡＴＴＳＥ（配列番号：１６６）
ＳＳＴＴＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＥ（配列番号：１６７）
ＳＳＴＶＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＥ（配列番号：１６８）
ＳＳＴＴＳＳＧＡＮＴＡＴＮＳＧ（配列番号：１６９）
ＳＳＶＴＳＡＧＳＧＴＡ        （配列番号：１７０）
より特定の態様では、当該ヒト・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質は以下のアミノ酸配列：ＭＫＭＱＫＧＮＶＬＬＭＦＧＬＬＬＨＬＥＡＡＴＮＳＮＥＴＳＴＳＡＮＴＧＳＳＶＩＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＧＳＳＶＴＳＳＧＶＳＴＡＴＩＳＧＳＳＶＴＳＮＧＶＳＩＶＴＮＳＥＦＨＴＴＳＳＧＩＳＴＡＴＮＳＥＦＳＴＡＳＳＧＩＳＩＡＴＮＳＥＳＳＴＴＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＥＳＳＴＰＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＤＳＳＴＴＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＤＳＳＴＴＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＥＳＳＴＴＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＥＳＳＴＡＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＥＳＳＴＴＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＥＳＳＴＴＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＥＳＳＴＴＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＥＳＲＴＴＳＮＧＡＧＴＡＴＮＳＥＳＳＴＴＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＥＳＳＴＰＳＳＧＡＧＴＡＴＮＳＥＳＳＴＴＳＳＧＡＧＴＡＴＮＳＥＳＳＴＶＳＳＧＩＳＴＶＴＮＳＥＳＳＴＰＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＥＳＳＴＴＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＤＳＳＴＴＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＥＳＳＴＴＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＥＳＳＴＴＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＧＳＳＴＴＳＳＧＴＳＴＡＴＮＳＥＳＳＴＶＳＳＧＡＳＴＡＴＴＳＥＳＳＴＴＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＥＳＳＴＶＳＳＧＡＳＴＡＴＮＳＥＳＳＴＴＳＳＧＡＮＴＡＴＮＳＧＳＳＶＴＳＡＧＳＧＴＡＡＬＴＧＭＨＴＴＳＨＳＡＳＴＡＶＳＥＡＫＰＧＧＳＬＶＰＷＥＩＦＬＩＴＬＶＳＶＶＡＡＶＧＬＦＡＧＬＦＦＣＶＲＮＳＬＳＬＲＮＴＦＮＴＡＶＹＨＰＨＧＬＮＨＧＬＧＰＧＰＧＧＮＨＧＡＰＨＲＰＲＷＳＰＮＷＦＷＲＲＰＶＳＳＩＡＭＥＭＳＧＲＮＳＧＰ（配列番号：１７１）を有し、その推定される最大分子量は２６０ｋＤａにおよぶことが可能であり、また、少なくとも約５７ｋＤａのコア・ポリペプチド鎖を含むことが理解される。【００２１】
本発明の別の側面において、上記エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質をコードする核酸／該核酸に対して相補的な核酸が提供される。該核酸は上記タンパク質の組換生産に利用することができる。或いは該核酸の全部又は一部の配列は上記タンパク質をコードする遺伝子の発現検出に有利に利用することができる。【００２２】
つまり、当該核酸は、以下の一般式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列：
Ａ−Ｂｎ−Ｃ−Ｄ−Ｅ      （Ｉ）
［式中、
Ａは、
ＭＲＲＲＳＳＬＷＣＷＬＬＬＱＩＬＬＬＧＳＧＹＡ（配列番号：１）又は
ＭＫＭＱＫＧＮＶＬＬＭＦＧＬＬＬＨＬＥＡＡ（配列番号：２）
から選択されるＮ末端領域であり、
Ｂは、Ｏ−グリコシル化部位を有するタンデムリピート領域のリピート単位であって、以下の配列番号３乃至５で示され：
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５（配列番号：３）
但し、上記配列中、
Ｘａａ１はアラニン、バリン、グルタミン酸、スレオニン、イソロイシン、プロリン、セリン、グリシン及びヒスチジンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ２はセリン、イソロイシン、リジン、フェニルアラニン及びロイシンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ３はセリン、アルギニン及びアスパラギンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ４はスレオニン、セリン、イソロイシン、リジン及びアルギニンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ５はアラニン、グリシン、スレオニン及びバリンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ６はセリン及びスレオニンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ７はグリシン、アルギニン、アスパラギン酸、スレオニン、セリン及びアラニンから成る群から独立に選択されるか不明アミノ酸であり、
Ｘａａ８はセリン、スレオニン及びチロシンから成る群から独立に選択されるか不明アミノ酸であり、
Ｘａａ９はスレオニン、メチオニン、セリン、バリン、アラニン、アスパラギン、グルタミン酸、リジン及びイソロイシンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ１０はプロリン、スレオニン、セリン及びロイシンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ１１はスレオニン、セリン、アスパラギン及びイソロイシンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ１２はプロリン、ロイシン、スレオニン、トリプトファン、アルギニン、グルタミン及びセリンから成る群から独立に選択され
Ｘａａ１３はスレオニン、プロリン及びグルタミン酸から成る群から独立に選択されるか又は存在せず、
Ｘａａ１４はスレオニン及びセリンから成る群から独立に選択されるか又は存在せず、及び
Ｘａａ１５はスレオニン、アラニン、プロリン及びアスパラギンから成る群から独立に選択されか又は存在しない；
Ｘａａ２１−Ｘａａ２２−Ｓｅｒ−Ｘａａ２３−Ｘａａ２４−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｘａａ２８−Ｘａａ２９−Ｘａａ３０−Ｘａａ３１−Ｘａａ３２（配列番号：４）
但し、上記配列中、
Ｘａａ２１はアルギニン、メチオニン及びグリシンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ２２はスレオニン及びプロリンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ２３はイソロイシン、リジン及びスレオニンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ２４はアラニン及びスレオニンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ２５はセリン及びフェニルアラニンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ２６はアラニン及びバリンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ２７はセリン、フェニルアラニン及びロイシンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ２８はスレオニン及びアスパラギンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ２９はプロリン及びセリンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ３０はスレオニン及びアラニンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ３１はセリン及びスレオニンから成る群から独立に選択され、及び
Ｘａａ３２はイソロイシン及びセリンから成る群から独立に選択される；又は
Ｘａａ４１−Ｘａａ４２−Ｘａａ４３−Ｘａａ４４−Ｘａａ４５−Ｘａａ４６−Ｘａａ４７−Ｘａａ４８−Ｘａａ４９−Ｘａａ５０−Ｘａａ５１−Ｘａａ５２−Ｘａａ５３−Ｘａａ５４−Ｘａａ５５（配列番号：５）
但し、上記配列中、少なくとも一個以上のセリン又はスレオニンを含むことを条件として、
Ｘａａ４１はセリン、フェニルアラニン及びスレオニンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ４２はセリン、アスパラギン、ヒスチジン及びアルギニンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ４３はスレオニン、バリン及びセリンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ４４はスレオニン、バリン、プロリン、アラニン、イソロイシン及びアスパラギンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ４５はセリン及びグルタミン酸から成る群から独立に選択され、
Ｘａａ４６はセリン、アスパラギン、スレオニン及びアラニンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ４７はグリシン及びセリンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ４８はアラニン、イソロイシン、バリン、スレオニン及びセリンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ４９はセリン、グリシン及びアスパラギンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ５０はスレオニン、イソロイシン及びアラニンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ５１はアラニン、バリン及びアスパラギンから成る群から独立に選択され、
Ｘａａ５２はスレオニンであるか又は存在せず、
Ｘａａ５３はアスパラギン、グリシン、イソロイシン及びスレオニンから成る群から独立に選択されるか又は存在せず、
Ｘａａ５４はセリンであるか又は存在せず、及び
Ｘａａ５５はグルタミン酸、グリシン及びアスパラギン酸から成る群から独立に選択されか又は存在しない、
ｎは２０乃至１５０の整数であり、
Ｃは、
ＲＴＳＴＧＳＳＳＳＬＳＡＴＨＴＳＳＳＬＴＶＳＴＧＴＨＴＴＳＮＨＴＧＴＰＶＭＥＶＫＰＳＧＳＬＫＰＷＥ（配列番号：６）又は
ＡＬＴＧＭＨＴＴＳＨＳＡＳＴＡＶＳＥＡＫＰＧＧＳＬＶＰＷＥ（配列番号：７）
から選択される潜在的酵素切断部位含有領域であり、
Ｄは、
ＩＦＬＩＴＬＡＳＶＩＶＶＭＧＬＳＡＧＬＦＩＹＶ（配列番号：８）又は
ＩＦＬＩＴＬＶＳＶＶＡＡＶＧＬＦＡＧＬＦＦＣＶ（配列番号：９）
から選択される細胞膜貫通領域であり、
Ｅは、
ＲＲＹＬＳＬＲＮＡＡＤＧＩＦＹＮＳＨＰＤＰＧＧＳＡＭＴＰＧＳＰＴＣＳＷＲＲＰＲＴＦＮＶＶＥＭＴＲＩ（配列番号：１０）又は
ＲＮＳＬＳＬＲＮＴＦＮＴＡＶＹＨＰＨＧＬＮＨＧＬＧＰＧＰＧＧＮＨＧＡＰＨＲＰＲＷＳＰＮＷＦＷＲＲＰＶＳＳＩＡＭＥＭＳＧＲＮＳＧＰ（配列番号：１１）
から選択される細胞質内領域である。］或いはその機能的誘導体をコードするか、該コード化核酸に対して相補的である。【００２３】
好適な態様としては、マウス由来のムチン様糖タンパク質に対応して、上記一般式（Ｉ）において、Ａが配列番号:１であり、Ｂが配列番号：３及び配列番号：４から成る群から独立に選択され、Ｃが配列番号：６であり、Ｄが配列番号：８であり、Ｅが配列番号：１０であり、及びｎが１００乃至１５０の整数であるムチン様糖タンパク質、又は更にそこにおいて、Ｂが配列番号：１２〜配列番号：１３８から成る群から独立に選択されるムチン様糖タンパク質をコードするか、該核酸に対して相補的であるものを挙げることができる。【００２４】
或いは、ヒト由来のムチン様糖タンパク質に対応して、上記一般式（Ｉ）において、Ａが配列番号:２であり、Ｂが配列番号：５であり、Ｃが配列番号：７であり、Ｄが配列番号：９であり、Ｅが配列番号：１１であり、及びｎが２０乃至５０の整数であるムチン様糖タンパク質、又は更にそこにおいて、Ｂが配列番号：１４０〜配列番号：１７０から成る群から独立に選択されるムチン様糖タンパク質をコードするか、該核酸に対して相補的であるものを挙げることができる。【００２５】
上記核酸に関連するいっそう特定の態様において、該核酸は、配列番号：１７２（マウス）又は配列番号：１７４（ヒト）に対応する。
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ＧＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＡＣＡＴＴＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＡＡＣＣＣＡＧＧＣＡＴＣＣＡＧＣＴＧＣＣＣＡＣＧＣＣＴＧＡＧＴＣＣＡＡＧＡＴＴＣＴＴＣＣＣＡＧＧＡＡＣＡＣＡＡＡＣＧＴＡＧＧＡＧＡＣＣＣＡＣＧＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＣＡＣＣＡＧＣＣＴＴＴＡＴＣＴＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＣＣＴＴＴＣＴＣＡＡＧＡＡＴＣＣＴＣＴＧＴＴＣＴＴＴＧＣＣＣＴＣＴＡＡＡＧＴＣＴＴＧＧＴＡＣＡＴＣＴＡＧＧＡＣＣＣＡＧＧＣＡＴＣＴＴＧＣＴＴＴＣＣＡＧＣＣＡＣＡＡＡＧＡＧＡＣＡＧＡＴＧＡＡＧＡＴＧＣＡＧＡＡＡＧＧＡＡＡＴＧＴＴＣＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＴＧＧＴＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＡＴＴＴＡＧＡＡＧＣＴＧＣＡＡＣＡＡＡＴＴＣＣＡＡＴＧＡＧＡＣＴＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＣＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＴＧＴＧＡＴＣＴＣＣＡＧＴＧＧＡＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＧＧＧＴＣＣＡＧＴＧＴＧＡＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＧＧＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＣＴＣＡＧＧＧＴＣＣＡＧＣＧＴＧＡＣＣＴＣＣＡＡＴＧＧＧＧＴＣＡＧＣＡＴＡＧＴＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＧＡＧＴＴＣＣＡＴＡＣＡＡＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＧＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＧＡＧＴＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＧＴＣＣＡＧＴＧＧＧＡＴＣＡＧＣＡＴＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＧＡＧＴＣＣＡＧＣＡＣＡＡＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＧＡＧＴＣＣＡＧＣＡＣＡＣＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＧＡＣＴＣＣＡＧＣＡＣＡＡＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＧＧＣＴＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＧＡＣＴＣＣＡＧＣＡＣＡＡＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＧＡＧＴＣＣＡＧＣＡＣＡＡＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＧＡＧＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＧＡＧＴＣＣＡＧＣＡＣＡＡＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＧＡＧＴＣＣＡＧＣＡＣＧＡＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＧＡＧＴＣＣＡＧＣＡＣＡＡＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＧＡＧＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＣＣＴＣＣＡＡＴＧＧＧＧＣＴＧＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＧＡＧＴＣＣＡＧＣＡＣＧＡＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＧＡＧＴＣＣＡＧＣＡＣＡＣＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＧＧＣＣＧＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＧＡＧＴＣＣＡＧＣＡＣＧＡＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＧＧＣＣＧＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＧＡＧＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＧＧＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＴＣＡＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＧＴＣＣＡＧＣＡＣＡＣＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＧＡＧＴＣＣＡＧＴＡＣＧＡＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＧＡＣＴＣＣＡＧＣＡＣＡＡＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＧＡＧＴＣＣＡＧＣＡＣＧＡＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＧＡＧＴＣＣＡＧＣＡＣＡＡＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＧＧＧＴＣＣＡＧＣＡＣＧＡＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＧＡＧＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＴＧＡＧＴＣＣＡＧＣＡＣＧＡＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＧＡＧＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＣＡＣＴＧＣＣＡＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＧＴＣＣＡＧＣＡＣＡＡＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＧＧＣＣＡＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＧＧＧＴＣＣＡＧＴＧＴＧＡＣＣＴＣＴＧＣＡＧＧＣＴＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＡＧＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＴＧＣＡＣＡＣＡＡＣＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＧＣＡＴＣＴＡＣＴＧＣＡＧＴＧＡＧＴＧＡＧＧＣＧＡＡＧＣＣＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＣＴＧＧＴＧＣＣＧＴＧＧＧＡＡＡＴＣＴＴＣＣＴＣＡＴＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＴＣＧＧＴＴＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＴＧＧＧＧＣＴＣＴＴＴＧＣＴＧＧＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＴＧＴＧＡＧＡＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＴＡＡＣＡＣＡＧＣＴＧＴＣＴＡＣＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＧＣＣＴＣＡＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＧＴＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＧＡＡＴＣＡＴＧＧＡＧＣＣＣＣＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＡＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＡＡＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＣＣＡＧＴＡＴＣＡＴＣＧＡＴＡＧＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＧＡＧＣＧＧＧＡＧＧＡＡＣＡＧＣＧＧＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＧＧＡＡＧＣＡＡＧＴＧＣＣＧＣＡＴＴＣＴＴＣＡＧＧＡＡＧＧＡＡＧＡＧＡＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＡＧＡＣＣＴＧＧＴＴＴＣＣＴＴＴＣＡＴＴＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＴＴＴＧＴＴＴＧＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＧＡＡＧＡＡＧＧＴＡＴＴＣＣＴＣＡＣＣＴＴＴＣＴＴＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＡＣＡＣＴＧＧＡＡＡＧＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＡＴＴＧＣＴＣＡＴＴＴＡＧＣＴＡＡＧＡＡＡＴＡＡＡＴＡＣＡＴＣＴＣＡＴＣＴＡＡＣＡＣＡＣＡＣＧＡＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＣＴＧＴＧＣＴＴＧＣＣＣＣＧＧＧＧＴＧＧＧＴＡＴＣＴＡＧＣＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＡＧＴＴＡＴＡＧＧＡＧＡＡＡＡＣＣＴＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＡＴＣＴＧＧＣＡＴＴＣＡＡＡＡＴＣＴＣＣＡＣＡＧＴＡＡＡＡＴＣＣＡＡＡＧＡＣＣＴＣ（配列番号：１７４）
しかして、上記核酸を含む発現ベクター、好ましくはプラスミド又はウイルスベクターも本発明の範囲であり、当該ベクターを保有する組換宿主細胞、好ましくは真核宿主細胞も本発明において意図される。【００２６】
更に、本発明は上記エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質に対して特異的な抗体を包含する。特に、ヒト由来のエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質に対する抗体が興味深く、好ましくは、当該抗体は上記エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質の細胞外ドメインに対して特異的である。そのような抗体は、キットとして、本発明のエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質の発現を検出するために利用することができる。【００２７】
或いは、ヒト由来のエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質の細胞質内領域に特異的な抗体もまた、当該タンパク質発現細胞及び組織の免疫染色に好適に利用できることも示された。【００２８】
これに関連する本発明の更なる局面では、本発明のエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質の遺伝子発現を検出する方法が提供される。ここに示されたように、当該遺伝子発現の検出は、腫瘍細胞の存在やその悪性度の診断において有利に利用できる。【００２９】
特定の態様において、当該検出方法は、上記エピグリカニン関連糖タンパク質をコードする核酸／相補的核酸のヌクレオチド配列の全部又は一部、好ましくは前記核酸中の連続した２０ヌクレオチドを含む配列、より好ましくは配列番号：１７６で示される配列をプローブ等として利用するがこれに限定されない。５’−ＣＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＧＣＡＴＣＴＡＣＴＧＣＡＧＴＧＡＧＴＧＡＧＧＣＡＡＡＧＣＣＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＣＴＧＧＴＧＣＣＧＴＧＧＧＡＡＡＴＣＴＴＣＣＴＣＡＴＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＴＣＧＧＴＴＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＴＧＧＧＧＣＴＣＴＴＴＧＣＴＧＧＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＴＧＴＧＡＧＡＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＴＡＡＣＡＣＡＧＣＴＧＴＣＴＡＣＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＧＣＣＴＣＡＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＧＴＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＧＡＡＴＣＡＴＧＧＡＧＣＣＣＣＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＡＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＡＡＣＴＧＧＴＴＣ−３’（配列番号：１７６）
そのような核酸の全部又は一部は、特定の腫瘍マーカーとしても有用な上記エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質遺伝子の発現を検出する方法に用いるためのキットに含まれ得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
上記のとおり、本発明のエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質は、一般式：Ａ−Ｂｎ−Ｃ−Ｄ−Ｅ  （Ｉ）で示される共通配列により特徴付けられる。ここにおいて、Ａはシグナル配列を含むＮ末端領域；ＢｎはＯ−グリコシル化部位を提供するセリン／スレオニンに富み約１１乃至約１５アミノ酸残基から成るアミノ酸配列（Ｂ）が繰り返される（ｎ＝２０〜１５０）タンデムリピート領域；Ｃは潜在的酵素切断部位含有領域；Ｄはマウス−ヒト間で高い相同性を示す細胞膜貫通領域；及びＥは細胞質内領域を示す。【００３１】
好ましくは、Ａは配列番号：１（マウス型）又は配列番号：２（ヒト型）から選択され、Ｃは配列番号：６（マウス型）又は配列番号：７（ヒト型）から選択され、Ｄは配列番号：８（マウス型）又は配列番号：９（ヒト型）から選択され、Ｅは配列番号：１０（マウス型）又は配列番号：１１（ヒト型）から選択され得るが、当該各領域の特定の機能とエピグリカニン様糖タンパク質に要求されるであろう構造的な特徴に照らして、上記の何れの組み合わせも可能であることを当業者は容易に理解するであろう。【００３２】
ここで、上記Ｂはタンデムリピート領域（Ｂｎ）内のリピート単位に相当するが、それについては多数のＯ−グリコシル化部位を提供し且つ特定の間隔で繰り返されるという構造的特徴を満たしさえすればよいこともまた当業者は理解するであろう。従って、該リピート単位は、セリン又はスレオニンをその配列中に有し且つ少なくとも約１０以上、好ましくは約１１乃至１５のアミノ酸残基を含むという最低限の条件により規定され得、いっそう特定的には配列番号：３乃至配列番号：５により定義され得る。より好ましくは配列番号：１２〜配列番号：１３８（マウス型）或いは配列番号：１４０〜配列番号：１７０（ヒト型）から選択される。【００３３】
しかしながら、ここで注目すべき点は、当該リピート単位の機能的特徴及びタンデムリピート領域全体としての生化学的作用に鑑みて、該リピート単位の前記領域内での構成及び繰り返しパターン自体を必ずしも本発明の天然型エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質と一致させなくてよく、例えば特定のリピート単位を優先して使用したり、特定のリピート単位或いはリピート単位群どうしを入れ替えたり、特定のリピート単位を他のリピート単位で完全に置換したり、或いは特定のリピート単位を削除したりすることもできるということである。従って本発明のムチン様糖タンパク質においてはそのようなリピート単位の変更、入れ替え、置換、或いは削除等を含む配列も含まれる。また、当該リピート単位の繰り返し数（ｎ）は約２０乃至約１５０とすることができ、好ましくは約１００乃至約１５０（マウス型）であるか約２０乃至約５０（ヒト型）であり、いっそう好ましくは約１２０乃至約１３０（マウス型）であるか約２５乃至約３５（ヒト型）である。【００３４】
更に本発明は上記のムチン様糖タンパク質の機能的誘導体も包含する。ここで、当該機能的誘導体とは、本発明のエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質の生物活性に実質的に類似の生物活性（機能的又は構造的）を有する化合物である。すなわち、「機能性誘導体」という用語は、上記エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質のアミノ酸配列から誘導された配列を有する任意のフラグメント、変異体、アナログ及び同族体、又は化学的誘導体を含むものとする。「フラグメント」という用語はエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質の任意のポリペプチドサブセットを指すものとする。「変異体」という用語は、完全なエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質分子又はそのフラグメントに構造的、機能的及び実質的に類似の分子を指すものとする。両方の分子が実質的に類似の構造を有するか、両方の分子が類似の生物活性を有するならば、その分子は実質的に類似である。そのため、その２つの分子が実質的に類似の活性を有するならば、それらの分子の一方の構造が他方に無くとも、又は２つのアミノ酸配列が完全に同一でなくとも、それらの分子は変異体と考えられる。例えば、ロイシンをバリンに、リシンをアルギニンに、グルタミンをアスパラギンに置換してもポリペプチドの機能を変化させないこともありうる。「アナログ」という用語は、完全なエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質分子又はそのフラグメントに機能的に実質的に類似の分子を指す。【００３５】
好ましい機能的誘導体の例は、本発明の天然型エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性、より好ましくは８０％、特に好ましくは９０％以上のアミノ酸配列相同性を示すものである。なお、ここでいうアミノ酸配列の相同性は、プログラムのデフォルトパラメータ（マトリクス＝Ｂｌｏｓｕｍ６２；ギャップ存在コスト＝１１、ギャップ拡張コスト＝１）を用いた検索で、インターネットサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎ／ｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｇｉ−ｇｉｎ／ＢＬＡＳＴで実装可能なＢＬＡＳＴＰアルゴリズムによって示される陽性のパーセンテージとして定義できる。また、天然型エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も好適である。【００３６】
本発明のエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質のタンデムリピート領域には、引用することによってここに援用するＣｏｄｉｎｇｔｏｎ，Ｊ．Ｆ．，Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｋ．Ｂ．，Ｊｅａｎｌｏｚ，Ｒ．Ｗ．，Ｉｒｉｍｕｒａ，Ｔ．，  ａｎｄ  Ｏｓａｗａ，Ｔ．（１９７５）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．４０，ｐ．１７１−１８２において同定されたような、２−アセトアミド−２−デオキシガラクトース残基とセリン又はスレオニン残基との間のＯ−グリコシル結合により膨大な数の糖鎖が付加し得る。当該糖鎖の構造は、引用することによってここに援用するＶａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎ，Ｄ．Ｈ．，Ｅｖａｎｓ，Ｎ．Ａ．，Ｃｏｄｉｎｇｔｏｎ，Ｊ．Ｆ．，Ｒｅｉｎｈｏｌｄ，Ｖ．，Ｓｉｌｂｅｒ，Ｃ．，  ａｎｄ  Ｊｅａｎｌｏｚ，Ｒ．Ｗ．（１９７９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２５４，Ｎｏ．２３，ｐ．１２１５３−１２１５９において詳細に述べられている。したがって、本発明のエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質には、α−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）、β−Ｄ−Ｇａｌ−（１→３）−α−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）、（２  Ｇａｌ，１  ＧｌｃＮＡｃ）−α−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）、α−ＮｅｕＮＡｃ−（２→３）−β−Ｄ−Ｇａｌ−（１→３）−α−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）、及び【００３７】
【化１】
2006082851.tif 000002
を含む糖鎖構造が付与され得る。【００３８】
これらの情報とタンデムリピート領域のアミノ酸配列の解析から、マウス型エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質での糖鎖分子量は最大で約８３０ｋＤａと見積もられ、コア・ポリペプチドと合計した該エピグリカニン関連ムチン分子全体の分子量は最大で約１０２０ｋＤａと概算される。また、ヒト型エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質での解析は、付加する糖鎖の最大分子量として約２００ｋＤａを与え、それ故分子全体で約２６０ｋＤａの最大値を与えるとの推定を導く。しかしながら、実際の糖鎖の結合量等は個々の細胞の状態やその培養条件等により影響を受けることが知られているので、分離された本発明のエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質のゲル電気泳動解析が上記最大分子量付近からより低分子側のスメアを与え得る。そのような糖鎖組成や結合量が相違するタンパク質も本発明の範囲である。【００３９】
本発明は、エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質をコードする核酸又は該核酸に相補的な核酸を含む。特に好ましい核酸は、配列番号：１７２又は配列番号：１７４で示される配列を包含する。ここで「核酸」の用語は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成（たとえば化学合成又は修飾）ＤＮＡやＲＮＡを意図する。また、場合によっては、当該核酸がホースラデッシュペルオキシダーゼ等の酵素や放射性同位体、Ｃｙ３やＣｙ５等の蛍光物質、化学発光物質等により標識されていてもよい。更に本発明の核酸分子は、ホスホロチオエート又はメチルホスホネート等の安定なＤＮＡ誘導体、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡ等の安定なＲＮＡ誘導体、或いは他のエピグリカニン関連ムチンヌクレオチド類似物であり得、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し得る。【００４０】
特定のアミノ酸をコードする種々のコドンには余分のコドン（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）が存在することが知られている。そのため本発明は同一のアミノ酸に最終的に翻訳されることになる代替コドンを含むＤＮＡ配列に関する。つまり、遺伝子コードは縮重しているので、ある特定のアミノ酸をコードするのに複数のコドンを使用でき、そのためアミノ酸配列は任意の１セットの類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドでコードされ得る。そのセットの唯一のメンバーだけが天然型エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質配列に同一であるが、ミスマッチのあるＤＮＡオリゴヌクレオチドでさえ適切な緊縮条件下（例えば、３ｘＳＳＣ、６８℃でハイブリダイズし、２ｘＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ及び６８℃で洗浄）で天然型配列にハイブリダイズでき、天然型配列をコードするＤＮＡを同定、単離でき、従ってそのようなオリゴヌクレオチドも本発明の範囲である。【００４１】
本発明のＤＮＡをＤＮＡライブラリーから得る例としては、適当なゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをハイブリダイゼーションによるスクリーニング法や、抗体を用いたイムノスクリーニング法等でスクリーニングし、目的のＤＮＡを有するクローンを増殖させ、そこから制限酵素等を用いて切り出す方法がある。ハイブリダイゼーション法によるスクリーニングは、配列番号１７２又は配列番号：１７４に記載の塩基配列若しくはその一部を有するＤＮＡを３２Ｐ等でラベルしてプローブとし、任意のｃＤＮＡライブラリーに対して、公知の方法、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）に従って行うことができる。イムノスクリーニング法で用いる抗体は、後述する本発明の抗体を使用することができる。本発明のＤＮＡはまた、ゲノムＤＮＡライブラリー若しくはｃＤＮＡライブラリーを鋳型とするＰＣＲによっても得ることができる。ＰＣＲは、配列番号：１７２又は配列番号：１７４に記載の塩基配列をもとに、センスプライマー、アンチセンスプライマーを作成し、任意のＤＮＡライブラリーに対し、公知の方法、例えば、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ａ．Ｉ．等、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）等を行って、本発明のＤＮＡを得ることもできる。上記各種方法で使用するＤＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを有するＤＮＡライブラリーを選択して使用する。当該ＤＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを有するライブラリーであればいかなるものも使用可能であり、市販のＤＮＡライブラリーを使用したり、本発明のＤＮＡを有する細胞からｃＤＮＡライブラリーを作成するのに適した細胞を選び公知の方法、例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）に従って、ｃＤＮＡライブラリーを作製し、利用することができる。【００４２】
また、本明細書に開示された配列を基にホスホアミダイト法などの化学合成的手法により本発明のＤＮＡを調製することも可能である。【００４３】
本発明のそのような核酸を含むベクターも本発明の範囲内に含まれる。例えば、本明細書に記載された方法で得られたクローン化エピグリカニン関連ムチンＤＮＡは、調節配列、すなわち適切なプロモーターと他の適切な転写制御要素を含む発現ベクターへの分子クローニングにより組換え的に発現させることができ、原核宿主細胞又は真核宿主細胞に移入されて組換エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質を産生できる。このような操作の技術はＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  等（前掲）に十分に記載され、当業界で公知である。【００４４】
つまり、発現ベクターは、適切な宿主での遺伝子のクローン化コピーの転写と得られたｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列を含み、このようなベクターを使用して、細菌、藍藻類、植物細胞、昆虫細胞、菌類細胞、動物細胞等の種々の宿主で真核遺伝子を発現させることができる。特別に設計されたベクターは、宿主間、例えば細菌−酵母、細菌−動物細胞、細菌−真菌細胞、又は細菌−無脊椎動物細胞間でＤＮＡのシャトリングをすることができる。【００４５】
適切に構築された発現ベクターは、宿主細胞での自律複製のための複製起点、選択マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、高コピー数のための可能要素、活性なプロモーターを含むべきである。プロモーターは、構造性プロモーターであるか調節プロモーターであるかに拘わらず、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させ、ＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列と定義される。強いプロモーターとはｍＲＮＡを高頻度で開始させるプロモーターである。また、発現ベクター中の他の調節配列としては、転写エンハンサ及びターミネータ、並びに転写抑制因子の結合、アテニエーション又はアンチアテニエーション等の既知の機構によってタンパク質の発現を調節するような他の配列が含まれる。ＳＶ４０又はアデノウイルスの初期及び後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ又はＴＲＣ系、λファージの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、解糖系酵素（例えば、３−ホスホグリセレートキナーゼ）に対するプロモーター、Ｐｈｏ５プロモーター、酵母α接合系プロモーター等が、その宿主細胞の性質等に応じて利用可能である。なお、発現ベクターにはクローニングベクター、改変クローニングベクター、特別に設計されたプラスミド又はウイルスがあるが、それらに限定されない。【００４６】
種々の哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物宿主細胞で本発明のエピグリカニン関連ムチンＤＮＡを発現させることができる。また、種々の細菌の発現ベクターを使用して細菌宿主細胞でエピグリカニン関連ムチンＤＮＡを発現させることができる。同じく、種々の菌類宿主細胞発現ベクターを使用して菌類細胞でエピグリカニン関連ムチンＤＮＡを発現させることができ、更に、種々の昆虫細胞発現ベクターを使用して昆虫宿主細胞でエピグリカニン関連ムチンＤＮＡを発現させることができる。発現のための様々な宿主・ベクター系が知られており、例えば、細菌宿主に対してはコリシンＥ１型複製開始機構を有するｐＢＲ３２２やｐＵＣ系ベクター、Ｍ１３等のλファージ派生体、酵母細胞においては２μプラスミド、真核宿主にはＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルス、アデノウイルス及びサイトメガロウイルスから得られる発現制御配列からなるベクター、昆虫においてはｐＶＬ９４１等があげられる。【００４７】
宿主細胞としては大腸菌、シュードモナス属及びバチルス属細菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属やＰｉｃｈｉａ属酵母、ＳＦ９等の昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ７等の動物細胞があげられる。特に好ましい宿主は真核細胞由来、より好ましくは哺乳動物由来宿主細胞である。ベクターを宿主細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈澱法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、ウイルス粒子を用いる方法等の公知方法（実験医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック１９９１年３月２０日発行、羊土社、参照）があるが、いずれの方法を用いても構わない。【００４８】
また、本発明の蛋白質を他のタンパク質やタグ、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡ、ヘキサヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ等との融合タンパク質として発現させることも可能である。発現させた融合型は、適当なプロテアーゼ、例えばトロンビン等を用いて切り出すことが可能であり、ときとしてタンパク質の調製をより有利に行うことが可能となる。【００４９】
宿主細胞でのエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質或いはその融合タンパク質の発現の後、該タンパク質を回収して該タンパク質を精製型で得ることができる。幾つかの精製方法が利用でき、例えば、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーの種々の組合せ、又は個々の適用により、細胞溶解液及び細胞抽出液から、組換エピグリカニン関連ムチン様糖タンパクを精製できる。【００５０】
更に、本発明のエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質に特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体で製造した免疫親和性カラムを使用して、組換エピグリカニン関連ムチン様糖タンパクを他の細胞タンパク質から分離できる。【００５１】
しかして、本発明はエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質に特異的な抗体も意図する。そのような抗体の製造は当業者に周知のいかなる方法に従ってもよく、例えば、まずアジュバントを含む免疫原、つまり本発明のエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質又はその部分ペプチドを免疫動物に皮下投与し、それを適当な間隔（例えば１週間）で所定の回数（例えば５回）繰り返して最終免疫後に全血を採集し、これを分離することで抗血清を得る。そのような方法は、例えば、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、第２．４章、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ等に記載されている。次いで、前記抗血清からのポリクローナル抗体の精製は、動物の免疫に用いたエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質又はその部分ペプチドをクロマトグラフィー用の樹脂、例えば、ＣＮＢｒ活性化セファロースやＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ（ともにＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に共有結合で固相化し、該固相化樹脂に上記抗血清を供して当該抗血清中の抗体を特異的に樹脂上に吸着させ、ついで、該樹脂上に吸着した抗体を適切な緩衝液やカオトロピックイオン等を用いて溶出させて回収することでも達成できるが、これに限定されない。【００５２】
好適な免疫原は、本発明のエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質の膜貫通領域乃至細胞外ドメインに関連するエピトープを含有する部分ペプチドから構成し得、その場合、生成する抗体は本発明のエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質の細胞外ドメインに対して特異的である。当該部分ペプチドの非限定的な例示として、マウスタンパク質のタンデムリピート領域内のＳＳＳＴＰＴＰＴＴＴＡＳＳＴ(配列番号：１７７）、或いは膜貫通領域のすぐ外側に位置するＮＨＴＧＴＰＶＭＥＶＫＰＳＧＳ(配列番号：１７８）内に存在するエピトープを含むフラグメントを挙げることができるが、これに限定されない。【００５３】
また、本発明の抗体をモノクローナル抗体として得る場合は、当業者に周知の手法を用いて、上記のような本発明のエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質或いはその部分ペプチドで免疫した実験動物、好ましくはマウス・ラット・ハムスター等のげっ歯類動物の脾細胞とミエローマ細胞株等の細胞融合用のペアレントセルを融合させ、得られたハイブリドーマの中から好適なものを選択してクローン化し、次いで、その融合細胞を生体外又は生体内で培養し、この培養混合物より特異性の高いモノクローナル抗体を採取する。【００５４】
また、本発明の抗体には上記の抗体を酵素消化処理して得られるような当該抗体の抗原結合性フラグメントも含まれる。当該フラグメントの例には、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ｖ）フラグメント、Ｈ鎖モノマー又はダイマー、Ｌ鎖モノマー又はダイマー、１個のＨ鎖及び１個のＬ鎖からなるダイマー等が含まれる。該フラグメントは、例えばペプシンやパパイン等のプロテアーゼにより完全な抗体を消化するか、消化後、必要に応じて還元剤で処理することにより得ることができる。Ｈ鎖及びＬ鎖モノマーは、完全な抗体をジチオスレイトール等の還元剤で処理した後、精製した鎖状体を分離することにより得ることもできる。【００５５】
上記抗体は、検査対象者から採取した生物学的試料、例えば細胞若しくは組織又は血液等の体液中のエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質の検出にも有利に利用できる。すなわち、本明細書に示されるように、本発明のエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質は甲状腺腫瘍細胞や精巣腫瘍細胞において特異的に発現することが確認され、しかして、限定的ではないが、これらの腫瘍マーカーとして有用である。従って、本発明のエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質の存在は、それらの臓器における腫瘍の診断指標となり得る。【００５６】
当該検出のための代表的な手法の１つであるサンドウイッチアッセイを例にとれば、まず標識化された上記抗体が用意される。例えば、抗体を放射性物質、金コロイド等の着色粒子、蛍光又は化学発光標識、或いは酵素（ＥＬＩＳＡ用）で標識することができる。抗体の標識の方法としては当業者にとって周知のいかなる方法も採用することができ、例えば、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｖｏｌ．１１、３９５〜３９９頁（１９７９）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｖｏｌ．１４、４１〜５７頁（１９８２）、Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ  Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ、２１５〜２２５頁（１９７８）に記載の方法を利用することができる。また、サンドウイッチアッセイにおいては、上記の抗体が固体支持体に固相化されることが好ましく、固相化は、例えば、炭酸緩衝液（ｐＨ８.６前後）に抗体を溶解し、該溶液をマイクロプレートのウェルに添加して所定時間インキュベートすることで達成できる。要すれば、上記の抗体の一方がウェル底面等の固相支持体のコーティングに用いられてキャプチャー側抗体を提供し、もう一方の抗体が放射性物質や着色粒子又は酵素で標識されて検出側抗体を提供する。キャプチャー側抗体を有するウェル内に検査対象者からの生物学的試料が添加され所定時間インキュベートされた後、該試料がウェルから取り除かれる。好適な緩衝液等によりウェル内を充分に洗浄後、検出側の抗体がウェルに添加される。所定のインキュベーションの後、ウェル内を洗浄し、キャプチャー側抗体−測定対象物−検出側抗体複合体の生成を検出する。検出は、検出側抗体に標識された標識物質の性質に依存し、放射性標識であれば放射線量が、着色粒子標識であれば発色量や吸光度が、また酵素標識（ＥＬＩＳＡ法）であれば、更に適当な基質をウェルに添加し、所定のインキュベーション後の吸光度が検出される。なお、ＥＬＩＳＡ法の例において、用いる酵素には特に制限がなく、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリ性フォスファターゼ等の酵素が有利に使用される。西洋ワサビペルオキシダーゼで標識する場合は、当該酵素の基質として３,３’,５,５’−テトラメチルベンチジン等が利用可能である。アルカリ性フォスファターゼを使用する場合は、基質としてｐ−ニトロフェニル燐酸があげられる。【００５７】
検査対象者から採取した生物学的試料中のエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質の発現検出、特に腫瘍マーカーとしての当該タンパク質の発現検出に好適な別の方法では、当該試料中のｍＲＮＡの存在及び量を測定する。【００５８】
すなわち、当該検出法は、典型的にはノザンブロッティング法に対応し、まず、本発明の核酸、好ましくは配列番号:１７２又は配列番号：１７４で示される核酸の全部又は一部を基にしたプローブを準備し、当該プローブと試料からのＲＮＡを緊縮条件下でハイブリダイズさせ、及び形成されたプローブ−ＲＮＡ複合体を検出することを含む。他の典型例は、ハイブリダイズに先立って目的ＲＮＡを逆転写後にＰＣＲ増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）することを含み、或いはＮＡＳＢＡに代表される転写ベースの増幅を利用することを含むが、その場合は増幅産物をサザンブロッティング法に準じて検出してよい。また、ＲＴ−ＰＣＲに関して言えば、いわゆる競合ＲＴ−ＰＣＲも利用可能である。【００５９】
更に、そのような増幅の目的のためにも本発明の核酸、好適には配列番号:１７２又は配列番号：１７４で示される核酸の全部又は一部或いはそれらの相補鎖の配列に基づいて増幅用プライマーを設計し得、そのような設計は当業者において容易であろう。従って、好ましいプローブ及びプライマーは配列番号:１７２又は配列番号：１７４で示される核酸配列の連続した１０個以上、より好ましくは１５個以上、いっそう好ましくは２０個以上の連続したヌクレオチドを含む。いっそう好ましくは、当該プライマーが本発明のユニークな膜貫通領域を増幅し得、またプローブが当該領域を認識し得る。そのようなプローブの非限定的な例としては：ＣＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＧＣＡＴＣＴＡＣＴＧＣＡＧＴＧＡＧＴＧＡＧＧＣＡＡＡＧＣＣＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＣＴＧＧＴＧＣＣＧＴＧＧＧＡＡＡＴＣＴＴＣＣＴＣＡＴＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＴＣＧＧＴＴＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＴＧＧＧＧＣＴＣＴＴＴＧＣＴＧＧＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＴＧＴＧＡＧＡＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＴＡＡＣＡＣＡＧＣＴＧＴＣＴＡＣＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＧＣＣＴＣＡＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＧＴＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＧＡＡＴＣＡＴＧＧＡＧＣＣＣＣＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＡＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＡＡＣＴＧＧＴＴＣ(配列番号：１７６)を挙げることができる。【００６０】
本発明のエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質発現検出のためのキットの使用は、測定者が検査を実施する際に好都合である。当該キットには、上記配列番号:１７２又は配列番号：１７４で示される核酸の全部又は一部或いはそれらの相補鎖の配列に基づいて設計されたプローブやプラーマ−が含まれ得る。キットには、その他、ＲＮａｓｅＨ阻害剤や、逆転写酵素、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ等が含まれてよく、そのようなキットの構成や作製方法は当業者によく知られている。【００６１】
更に説明せずとも、これまでの説明を与えられた当業者は、本発明を充分に活用し得る。以下、説明のみの目的で実施例を与える。なお、本明細書において、特にことわりのない限り、アミノ酸配列はＮ末端からＣ末端方向に、ヌクレオチド配列は５’末端から３’末端方向に向けて記載される。
【実施例１】
【００６２】
実施例１：マウス・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質の同定
１−１．  レクチンによる新規ムチン様糖タンパク質の存在確認
ＴＡ３−Ｈａ細胞及びＴＡ３−Ｓｔ細胞をＡ／Ｊマウス（６週齢、雌；ＳＬＣ社より購入し、東京大学薬学部動物施設ＳＰＦ条件下で飼育。実験には購入後１週間予備飼育したマウスを用いた。）の腹腔内或いはシャーレで培養した。なお、ＴＡ３−Ｈａ細胞及びＴＡ３−Ｓｔ細胞はＢｅｒｇｅｎ大学  Ｃｏｄｉｎｇｔｏｎ博士より御供与頂き、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  Ｐｌｕｓ（商標）ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔによりマイコプラズマ感染のないことを確認して使用した。具体的に、ＴＡ３−Ｈａ細胞及びＴＡ３−Ｓｔ細胞は、Ｄ／Ｆ−１０％  ＦＣＳ培地で、３７℃、５％  ＣＯ２存在下で培養した。ＴＡ３−Ｈａ細胞は３〜４日おきに回収して、新たな培地に懸濁して継代した。ＴＡ３−Ｓｔ細胞は３〜４日おきにＰＢＳにて洗浄後、Ｔｒｐ−ＥＤＴＡ溶液（０．０５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ／０．０２％  ＥＤＴＡ−ＰＢＳ）を加えてはがし、３７℃、５分間インキュベートし、培養シャーレからはがし継代した。また、実験によっては、ＴＡ３−Ｈａ細胞は、約２×１０６個をＨＡＮＫＳ’液に懸濁してＡ／Ｊマウスに腹腔内投与し、その１週間後に腹腔から細胞を回収した。２ｍｌの０．１５Ｍ  ＰＢＳに懸濁後、６ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水を加え、約２０秒サスペンドしすぐに２ｍｌの３．５Ｍ  ＮａＣｌを加えた。この操作により赤血球を除き実験に用いた。【００６３】
次いで、このように培養した細胞に、新規ムチン様糖タンパク質が発現しているかどうかを確認した。すなわち、ＴＡ３−Ｈａ細胞にはＴ抗原、Ｔｎ抗原が豊富であることが報告されていたので（例えば、非特許文献７：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｇ．Ｆ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２２４，ｐ．１１９８−１２０６）、それぞれの糖鎖を認識するレクチンである、ｂｉｏｔｉｎ−ＶＶＡ（Ｔ抗原を認識）、ｂｉｏｔｉｎ−ＰＮＡ（Ｔｎ抗原を認識）を用いて該細胞の染色を行った。なお、測定においては、細胞０．５〜１×１０６個をＦＣＭ  ｂｕｆｆｅｒにて洗浄後、そこにＦＣＭ  ｂｕｆｆｅｒで希釈したｂｉｏｔｉｎ−ＰＮＡ（１／１００：ＶＥＣＴＯＲ）或いはｂｉｏｔｉｎ−ＶＶＡ（１／２００：ＶＥＣＴＯＲ）を１００μｌ加え、氷冷下３０分間反応させた。次いで、ＦＣＭ  ｂｕｆｆｅｒにて細胞を洗浄後、ＦＣＭ  ｂｕｆｆｅｒで１００倍に希釈したＦＩＴＣ−ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＺＹＭＥＤ社製）を１００μｌ加え、氷冷下３０分間反応させた。更に細胞をＦＣＭ  ｂｕｆｆｅｒにて洗浄後、再度ＦＣＭ  ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、ナイロンメッシュを通した後、フローサイトメーターにて蛍光強度を測定した。図１に示されたように、Ｈａ細胞にはＶＶＡもＰＮＡも高い結合が見られ、Ｔ抗原、Ｔｎ抗原が多数付加していることが確認できた。一方、Ｓｔ細胞ではどちらのレクチンの結合も見られなかった。これらのことから、Ｈａ細胞には糖鎖が多数結合するムチンが発現しており、逆にＳｔ細胞にはそのような分子が発現していないことが示唆された。【００６４】
引き続いて、ウェスタンブロッティング法を用い、Ｔ抗原或いはＴｎ抗原が付加しているタンパク質の分子量を見積もった。詳細には、Ｈａ細胞及びＳｔ細胞を回収し、ＰＢＳで１回洗浄後、更にｄｅｓａｌｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｕｃｒｏｓｅ（和光純薬）  ４２．７９ｇ、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．２  ５ｍｌ、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２（和光純薬）  ５００μｌ、０．１Ｍ  ＰＭＳＦ（イソプロピルアルコール中）  ５００μｌをＭｉｌｌｉＱ水  ５００ｍｌ中に含む）で２回洗浄した。０．５％  ＮＰ−４０（ＳＩＧＭＡ社製）／ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ中を加え、よく攪拌し４℃で１時間以上可溶化し、１５，０００ｒｐｍにて４℃、５分遠心して上清を細胞抽出液とした。なお、抽出液のタンパク濃度は、ＢＣＡ蛋白定量試薬（Ｐｉｅｒｃｅ社製）で測定した。【００６５】
得られた細胞抽出液を２−ＭＥ存在下ＳＤＳ変性４％ポリアクリルアミド電気泳動してＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｌｏｎ(商標）；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）にセミドライブロッティングした。その後、２％  ＢＳＡ（ＰＢＳ中）で該ブロッティング後の膜を一晩ブロッキングをし、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０及び２％  ＢＳＡ（ＰＢＳ中）で２，０００倍希釈したｂｉｏｔｉｎ−ＰＮＡ、ｂｉｏｔｉｎ−ＶＶＡと２時間反応させた。反応後、ＰＶＤＦ膜を０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ中）で４回洗浄後、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０及び２％  ＢＳＡ（ＰＢＳ中）で５，０００倍希釈したＨＲＰ−ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＺＹＭＥＤ社製）と１時間反応させた。更に該膜を０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ中）で４回洗浄後、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（商標）Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）により発色させ、Ｈｙｐｅｒ  ｆｉｌｍ  ＥＣＬ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）に感光した。【００６６】
Ｈａ細胞では、３００ｋＤａ超の部分がＰＮＡ及びＶＶＡ（データは示さず。）によってスメアに染色された。一方でＳｔ細胞に関しては、高分子量の部分は全く染色されなかった。これらのことから、Ｈａ細胞にはＴ抗原或いはＴｎ抗原が付加している高分子量のタンパク質が発現していることが示唆され、それはムチンであると考えられた。【００６７】
１−２．  各マウスムチンの発現確認
上記の実験により、ＴＡ３−Ｈａ細胞にはＴＡ３−Ｓｔ細胞にないムチンが発現していることが予想されたため、このムチンが新規であるかどうかを、これまでにクローニングされた各種マウスムチンのＲＴ−ＰＣＲを行うことにより確認した。【００６８】
具体的に、ＴＡ３−Ｈａ細胞及びＴＡ３−Ｓｔ細胞から、ＵＬＴＲＡＳＰＥＣ  ＲＮＡ（商品名、ＢＩＯＴＥＣＸ社製）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、クロロフォルムでフェノールを除いた後、イソプロパノールで沈殿させ、その後ＭｉｌｌｉＱ水に溶解して吸光度２６０ｎｍ／２８０ｎｍを測定してＲＮＡ量及び純度を見積もった。次に、抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡの１μｇを鋳型とし、通常の方法により一本鎖ｃＤＮＡを作製した後、各ＲＴ産物のＰＣＲを行った。なお、この実験では、あらかじめ、内部コントロールとしてβ−アクチンのＰＣＲによって見られたバンドの濃さがＨａ細胞とＳｔ細胞の間で同じであることを確認し、また各マウスムチンについて以下のプライマー及び条件を適用した。【００６９】
マウスβ−アクチン
センス：５’−ＧＣＴＣＣＴＣＧＴＴＧＣＣＧＧＴＣＣＡＣＡ−３’（配列番号：１７９）
アンチセンス：５’−ＴＡＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＧＴＡＡＴＣＴＣＣＴ−３’（配列番号：１８０）
マウスＭｕｃ１
センス：５’−ＡＧＧＣＴＣＣＧＴＧＧＴＧＧＴＡＧＡＡＴ−３’（配列番号：１８１）
アンチセンス：５’−ＧＧＣＡＴＧＡＡＣＡＧＡＡＴＡＣＣＡＧＡ−３’（配列番号：１８２）
マウスＭｕｃ２
センス：５’−ＣＡＡＴＧＡＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＴＧＣＣ−３’（配列番号：１８３）
アンチセンス：５’−ＧＴＧＣＴＣＴＣＣＡＡＡＣＴＣＴＣＴＧＧ−３’（配列番号：１８４）
マウスＭｕｃ３
センス：５’−ＣＣＧＡＴＧＴＣＡＣＣＡＣＴＴＣＴＧＣＴＧ−３’（配列番号：１８５）
アンチセンス：５’−ＧＣＡＧＡＧＣＡＡＧＧＣＧＴＧＡＴＡＣＡＧ−３’（配列番号：１８６）
マウスＭｕｃ４
センス：５’−ＴＧＡＴＧＧＡＡＣＡＡＣＣＡＣＣＴＣＡＣ−３’（配列番号：１８７）
アンチセンス：５’−ＧＧＡＴＧＣＡＧＧＴＧＡＧＧＴＡＴＴＣ−３’（配列番号：１８８）
マウスＭｕｃ５ＡＣ
センス：５’−ＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＴＡＴＡＣＡＡＣＣ−３’（配列番号：１８９）
アンチセンス：５’−ＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＴＣＴＣＴＣＴＣＣ−３’（配列番号：１９０）
マウスＭｕｃ９
センス：５’−ＣＡＴＣＣＣＡＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣＡＴＡＣ−３’（配列番号：１９１）
アンチセンス：５’−ＧＡＴＴＣＴＧＴＣＴＧＣＡＣＣＡＡＧＡＧＣ−３’（配列番号：１９２）
マウスＭｕｃ１０
センス：５’−ＧＣＡＡＣＡＡＣＴＧＡＣＴＧＴＴＣＣＡＡＡ−３’（配列番号：１９３）
アンチセンス：５’−ＧＣＧＡＣＴＧＡＴＣＡＧＣＡＴＴＡＡＧＧＴ−３’（配列番号：１９４）
つまり、上記の実験では、βアクチンＰＣＲと同様にして各反応液を調製した後、５倍希釈したテンプレートの１μｌを用いて、９５℃、９分で熱変性させた後、ｍＭｕｃ９は９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で１分を４５〜５５サイクル、７２℃で１０分の反応を行った。ｍＭｕｃ９以外のムチンは、９５℃で３０秒、アニーリング  １分、７２℃で１分３０秒を３５〜５５サイクルで行い、アニーリングの温度はｍＭｕｃ１：５６℃、ｍＭｕｃ２：５８℃、ｍＭｕｃ３：４９℃、ｍＭｕｃ４：５８℃、ｍＭｕｃ５ＡＣ：５４℃、ｍＭｕｃ９：５０℃、ｍＭｕｃ１０：４８℃で行った。反応産物のうち１０μｌを０．５μｇ／ｍｌエチレンブロマイド含有１％  Ｓｅａｋｅｍ  ＭＥ  ａｇａｒｏｓｅにて泳動し、バンドを確認した。【００７０】
結果を図２に示した。ｍＭｕｃ１、ｍＭｕｃ２及びｍＭｕｃ５ＡＣはＳｔ細胞において多量に発現していることが示された。またｍＭｕｃ３及びｍＭｕｃ１０は両者において発現していなかった。一方で、ｍＭｕｃ４及びｍＭｕｃ９についてもＨａ細胞において高頻度に発現していることが判明した。それにも拘わらず、これらのムチンの分子量は文献において予想されたエピグリカニンのものと異なっているなどの理由から、Ｈａ細胞において更に別のムチン様糖タンパク質が特異的に発現していることを否定できなかった。【００７１】
１−３．  サブトラクション法によるｃＤＮＡ断片の取得と解読
ｍＭｕｃ４及びｍＭｕｃ９についてのＴＡ３−Ｈａ細胞とＴＡ３−Ｓｔ細胞の間で発現量の相違に拘わらず、仮に本発明のムチン様糖タンパク質の発現量がなお両者において更に顕著に異なるのであれば、当該発現量の差異を利用してサブトラクション法により、ＴＡ３−Ｈａ細胞に多く発現するｃＤＮＡの断片を取得することも可能であると予想された。【００７２】
そこで、Ｈａ細胞及びＳｔ細胞からそれぞれｍＲＮＡを精製し、逆転写反応により２本鎖ｃＤＮＡライブラリーを作製した。【００７３】
詳細には、ＴＡ３−Ｈａ細胞、ＴＡ３−Ｓｔ細胞から、ｍＭＡＣＳ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（第一化学社製）を用いて、ｍＲＮＡを抽出した後、ＥｔＯＨ沈殿させ、その後ＭｉｌｌｉＱ水に溶解して吸光度２６０ｎｍ／２８０ｎｍを測定してｍＲＮＡ量及び純度を見積もった。二本鎖ｃＤＮＡライブラリーは、得られたｍＲＮＡ  ５μｇを鋳型とし、Ｔｉｍｅｓａｖｅｒ（商標）  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用い、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒからＲＴ反応を行い、二本鎖ｃＤＮＡを作製した。ＮＩＣＫ（商標）  ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）によって、短いＤＮＡ断片などを除去してからＥｔＯＨ沈殿させ、ＭｉｌｌｉＱ水に溶解して０．５  μｇ／ｍｌエチレンブロマイド含有０．７％  Ｓｅａｋｅｍ  ＭＥ  ａｇａｒｏｓｅにて泳動し、２ｋｂｐ以上の部分と１．１〜２ｋｂｐの部分を分けて切り出し、ＱＩＡＥＸ（商標）ＩＩ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）によって、ゲルからｃＤＮＡを抽出した。フェノール（和光純薬）：クロロフォルム＝１：１で３回タンパク質を除き、さらにＥｔＯＨ沈殿の後、ＭｉｌｌｉＱ水に溶解して２本鎖ｃＤＮＡライブラリーを得た。【００７４】
サブトラクション法の次の段階は、上記のライブラリーをＳａｕ３ＡＩで制限酵素消化し、約１００ｂｐの２本鎖ｃＤＮＡ断片を作製した後、Ｈａ細胞由来のｃＤＮＡ断片の両端にアダプター／プライマーを結合させた物をテスターアンプリコン、一方でＳｔ細胞由来のｃＤＮＡ断片にはアダプター／プライマーを結合させずにドライバーアンプリコンとし、それぞれ変性させ、お互いにハイブリダイズしてＰＣＲを行う工程を含んでいた。これにより、Ｈａ細胞に過剰に存在するｃＤＮＡだけが増幅され、スメアの中にわずかにバンドの様に濃い部分が認められた。このアンプリコンのＰＣＲを、それぞれアダプター／プライマーを変え、３回行った。回を重ねる毎に濃縮が進み、３回の反応の後には、一本のバンドが検出された（データは示さず）。【００７５】
具体的には、ＴＡ３−Ｈａ細胞及びＴＡ３−Ｓｔ細胞のｍＲＮＡから合成した上記二本鎖ｃＤＮＡライブラリーをそれぞれＳａｕ３ＡＩ処理し、得られた断片にＴＡＫＡＲＡ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（商品名、ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて、Ｒ  Ｂｇｌ  ２４：５’−ＡＧＣＡＣＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＴＣＡＣＣＧＣＡ−３’（配列番号：１９５）、及びＲ  Ｂｇｌ  １２：５’−ＧＡＴＣＴＧＣＧＧＴＧＡ−３’（配列番号：１９６）をライゲーションした。【００７６】
上記ライゲーション産物をテンプレートとして３０等分し、１０μｌの１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０μｌ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（各２ｍＭ）、６０ｐｍｏｌ／μｌのＲ  Ｂｇｌ  ２４、０．５μｌ  ＡｍｐｌｉＴａｑ（商標）  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社製）含有）にＭｉｌｌｉＱ水を加えて１００μｌにしてＰＣＲ用チューブにいれ、サーマルサイクラーを用い、７２℃で５分の後、９５℃で１分、７２℃で３分を２０サイクル、７２℃で１０分の反応を行った。反応産物のうち５μｌを０．５μｇ／ｍｌエチレンブロマイド含有３％  Ｎｕｓｉｅｖｅ  ａｇａｒｏｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ社製）にて泳動し、ＰＣＲ反応が成功しているかどうかを確認した。【００７７】
上記のＰＣＲ産物をフェノール：クロロフォルムで処理し、ＥｔＯＨ沈殿の後、ＴＥ（１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解した。該ＰＣＲ産物からＳａｕ３ＡＩ処理してＲ  Ｂｇｌ  ２４アダプターをはずし、ＥｔＯＨ沈殿の後ＴＥに溶解し、３％  Ｎｕｓｉｅｖｅ  ａｇａｒｏｓｅにて泳動し、１００〜１５００ｂｐの部分を切り出し、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔでＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡをフェノール：クロロフォルムで処理し、ＥｔＯＨ沈殿の後ＭｉｌｌｉＱ水に溶解し、吸光度を測定し、ＤＮＡ量を見積もった。ＴＡ３−Ｓｔ細胞については、これをドライバーアンプリコンとし、今後のＲＤＡに用いた。【００７８】
ＴＡ３−Ｈａ細胞については、さらにＴＡＫＡＲＡ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２を用いて、Ｊ  Ｂｇｌ  ２４：５’−ＡＣＣＧＡＣＧＴＣＧＡＣＴＡＴＣＣＡＴＧＡＡＣＡ−３’（配列番号：１９７）とＪ  Ｂｇｌ  １２：５’−ＧＡＴＣＴＧＴＴＣＡＴＧ−３’（配列番号：１９８）をライゲーションし、テスターアンプリコンとした。テスターアンプリコンの１００倍量のドライバーアンプリコンを加え、まとめてフェノール：クロロフォルムで処理し、更にクロロフォルム処理した後、ＥｔＯＨ沈殿し、その後沈殿物をＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（１Ｍ  ＥＰＰＳ  ｐＨ８．２５（ＳＩＧＭＡ社製）  ３ｍｌ及び０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８  ０．６ｍｌをＭｉｌｌｉＱ水  １００ｍｌに含む。）の１２μｌに溶解した。３０μｌのミネラルオイル（ＳＩＧＭＡ社製）を重層し、１００℃で３分処理した後、あらかじめ６７℃にあたためておいた５Ｍ  ＮａＣｌの１μｌを加えて水層と攪拌した。その後６７℃で１晩ハイブリダイゼーションを行った。翌日、４５μｌの氷冷ＴＥを加え、クロロフォルムで処理してミネラルオイルを除いた。これを１０等分したものをテンプレートとし、１０μｌの１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０μｌ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（各２ｍＭ）、６０ｐｍｏｌ／μｌのＪ  Ｂｇｌ  ２４、０．５μｌ  ＡｍｐｌｉＴａｑ（商標）  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ含有）にＭｉｌｌｉＱ水を加えて１００μｌにしてＰＣＲ用チューブにいれ、サーマルサイクラーを用い、７２℃で５分の後、９３℃で１分、７０℃で３分を２０サイクル、７０℃で１０分の反応を行った。反応産物を１０本分まとめてＥｔＯＨ沈殿した後、３０Ｕ  ｍｕｎｇ−ｂｅａｎヌクレアーゼ（ＴＡＫＡＲＡ社製）で３７℃、３０分間処理した。２００μｌの０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ８．９）を加え、９５℃で５分インキュベートした後、これを５等分したものをテンプレートとし、上記と同様にＰＣＲ反応溶液を調製し、ＰＣＲ反応を行った。サイクルは３０回おこなった。ＰＣＲ産物のうち５μｌを０．５μｇ／ｍｌエチレンブロマイド含有３％  Ｎｕｓｉｅｖｅ  ａｇａｒｏｓｅにて泳動し、ＤＮＡの濃縮が起こっているかどうかを確認した（１ｓｔ  ｒｏｕｎｄ  ＲＤＡ後の濃縮状態：データは示さず）。ＰＣＲ産物をまとめて、フェノール：クロロフォルム処理した後、ＥｔＯＨ沈殿し、ＴＥに溶解した。Ｓａｕ３ＡＩ処理してＪ  Ｂｇｌ  ２４アダプターをはずし、ＥｔＯＨ沈殿の後ＴＥに溶解し、３％  Ｎｕｓｉｅｖｅ  ａｇａｒｏｓｅにて泳動し、１００〜１５００ｂｐの部分を切り出し、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔでＤＮＡを抽出した。フェノール：クロロフォルムで処理し、ＥｔＯＨ沈殿の後ＭｉｌｌｉＱ水に溶解し、吸光度を測定し、ＤＮＡ量を見積もった。１ｓｔ  ｒｏｕｎｄ  ＲＤＡの場合と同様に、１ｓｔ  ｒｏｕｎｄ  ＲＤＡ産物にＴＡＫＡＲＡ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２を用いて、Ｎ  Ｂｇｌ  ２４：５’−ＡＧＧＣＡＡＣＴＧＴＧＣＴＡＴＣＣＧＡＧＧＧＡＡ−３’（配列番号：１９９）とＮ  Ｂｇｌ  １２：５’−ＧＡＴＣＴＴＣＣＣＴＣＧ−３’（配列番号：２００）をライゲーションし、テスターアンプリコンとし、２ｎｄ  ｒｏｕｎｄ  ＲＤＡを行った。更に、再びＪ  Ｂｇｌ  ２４とＪ  Ｂｇｌ  １２を用いて、３ｒｄ  ｒｏｕｎｄ  ＲＤＡを行った。３ｒｄ  ｒｏｕｎｄ  ＲＤＡ後は、バンドを切り出し、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いてＤＮＡを抽出した。【００７９】
引き続くサブトラクション法による工程では、上記のバンドを切り出してベクター内にサブクローニングし、その中から約２００クローンを拾って、その全ての塩基配列を解読した。【００８０】
つまり、３ｒｄ  ｒｏｕｎｄ  ＲＤＡ反応後に精製したバンドＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（商品名、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にライゲーションし、得られたライゲーション産物５μｌを大腸菌ＪＭ１０９（ＴＡＫＡＲＡ社製）の６０μｌと混合して氷上で２０分インキュベートした後、４２℃の湯浴に５０秒つけ、その後再び氷上に２分以上戻した。これを、ＳＯＣ  ｍｅｄｉｕｍ（ＴＡＫＡＲＡ社製）の１００μｌにて３７℃、１時間培養後、５μｌのＩＰＴＧ（ＴＡＫＡＲＡ社製、２ｇ／１０ｍｌ−ＭｉｌｌｉＱ水、０．２２μｍのフィルターで濾過滅菌）と５０μｌのＸ−ｇａｌ（ＴＡＫＡＲＡ社製、１００ｍｇ／５ｍｌ−ジメチルホルムアミド）を塗布した５μｇ／ｍｌ  Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ含有ＬＢプレート（ｂａｃｔｏ  ｔｒｙｐｔｏｎ  ５ｇ、ｂａｃｔｏ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ２．５ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ及びｂａｃｔｏ  ａｇａｒ（ナカライテスク）  ７ｇをＭｉｌｌｉＱ水５００ｍｌ中に含む、高圧蒸気滅菌）２枚にまき、３７℃で１晩培養した。培養後、増殖した白のシングルコロニーを爪楊枝で拾い、３ｍｌの５μｇ／ｍｌ  Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ含有ＬＢ培地で３７℃  ８時間以上培養した。培養後、Ｎｕｃｌｅｏ  Ｓｐｉｎ（商標）  Ｐｌａｓｍｉｄ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社製）にてプラスミドＤＮＡを抽出した。ＥｃｏＲＩ（ＴＯＹＯＢＯ製）処理し、０．５μｇ／ｍｌエチレンブロマイド含有１．５％  Ｓｅａｋｅｍ  ＭＥ  ａｇａｒｏｓｅで泳動し、インサートがあるかどうかを確認した。【００８１】
確認された上記インサートの塩基配列の解読は、ＡＢＩ（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＲ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ(商品名））による解析及びＡｌｏｋａ（ＬＩ−ＣＯＲ  ｄＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ４２００（商品名））による解析に基づいた。ＡＢＩにおけるシークエンス反応はＢｉｇＤｙｅ（商標）  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｖ２．０  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を用いて行った。プラスミドＤＮＡをテンプレートとし、２μｌの１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４μｌ  Ｐｒｅｍｉｘ、３．２ｐｍｏｌ  ｐｒｉｍｅｒ含有）にＭｉｌｌｉＱ水を加えて２０μｌにしてＰＣＲ用チューブにいれ、サーマルサイクラーを用い、９６℃で１０秒の後、９６℃で１０秒、５０℃で５秒、６０℃で４分を２５サイクルの反応を行った。Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）  Ｇ５０  Ｆｉｎｅ  ＤＮＡ  Ｇｒａｄｅ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いてゲル濾過精製し、９５℃で２分熱変性させてから、塩基配列の解析を行った。【００８２】
Ａｌｏｋａによる解析でのシークエンス反応はＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて行った。プラスミドＤＮＡ  ３００〜６００ｆｍｏｌをテンプレートとし、２μｌの１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２μｌ  ＩＲＤ８００−ｌａｂｅｌｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒ（１．０ｐｍｏｌ／μｌ：Ａｌｏｋａ社製）又はＩＲＤ７００−ｌａｂｅｌｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒ（１．０ｐｍｏｌ／μｌ：Ａｌｏｋａ社製）、１μｌ  ２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、２μｌ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ含有）にＭｉｌｌｉＱ水を加えて１７μｌにしてＰＣＲ用チューブにいれ、サーマルサイクラーを用い、９５℃で５分の後、９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、７０℃で１分を３０サイクルの反応を行った。反応終了後、Ｓｔｏｐ／Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂａｓｉｃ  Ｆｕｃｈｓｉｎ（和光純薬社製）  １．５μｌ、Ｂｒｏｍｏ  Ｐｈｅｎｏｌ  Ｂｌｕｅ（和光純薬社製）を少量（０．０１％）、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  １０μｌ及び脱イオンホルムアミド（和光純薬借製）  ４７５μｌをＭｉｌｌｉＱ水５００μｌに含有）を各チューブに４μｌずつ加えた。９５℃で２分熱変性させた後、それぞれ１．２μｌを電気泳動用ゲル（５０％  Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅｒ（商標）  Ｇｅｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ４．５ｍｌ（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社製）、１０×ＴＢＥ  ６ｍｌ、Ｕｒｅａ（和光純薬社製）  ２５．２ｇ及び過硫酸アンモニウム（和光純薬社製）  ４０ｍｇをＭｉｌｌｉＱ水６０ｍｌに含む溶液を約１時間攪拌し、脱気した後、ＴＥＭＥＤ（ナカライテスク社製）４０μｌを加えゲル板に流し込んだ。４時間以上放置させてから使用した。）にアプライした。なお、上記１０×ＴＢＥは、Ｔｒｉｓ  １０８ｇ、ホウ酸（和光純薬社製）５５ｇ及びＥＤＴＡ・２Ｎａ  ８．３ｇをＭｉｌｌｉＱ水１Ｌに溶解し、高圧蒸気滅菌したものを用いた。【００８３】
上記で拾ったクローン中には、約１００ｂｐで、ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔを検索してもホモロジーの高い分子がないものが存在し、これは新規の分子に由来すると考えられた（データは示さず）。この塩基配列からアミノ酸配列を予想したところ、終止コドンの入らない読み枠では、ほぼ全てのアミノ酸がセリン、スレオニン、プロリンであり、このｃＤＮＡ断片が、ムチンのタンデムリピートの一部分である可能性が示された。【００８４】
１−４．  ノザンブロッティングによる解析
更に、上記サブトラクション法によって取得したｃＤＮＡ断片のＴＡ３−Ｈａ細胞における発現が、実際にＴＡ３−Ｓｔ細胞における発現よりも高いかどうかを、ノザンブロッティングを行って検討した。【００８５】
ＴＡ３−Ｈａ細胞及びＴＡ３−Ｓｔ細胞のｍＲＮＡを、１％ホルムアルデヒドアガロースゲルにてｍＲＮＡ  １μｇ／ｌａｎｅずつ電気泳動し、泳動後のゲルを０．０５Ｎ  ＮａＯＨで２０分処理し、ＭｉｌｌｉＱ水ですすいだ後、２０×ＳＳＣ（ＮａＣｌ  １７５．３ｇ及びＴｒｉｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ・２Ｈ２Ｏ（和光純薬）  ８８．２ｇをＭｉｌｌｉＱ水１Ｌに含有）に２０分間、２回浸した。ナイロンメンブレン（ＰＡＬＬ社製）に１晩キャピラリーブロッティングし、メンブレンを８０℃で２時間処理してＲＮＡを固定した。【００８６】
次に、上記のようにナイロンメンブレン上に固定化されたＲＮＡに対して、サブトラクション法によって取得した新規配列ｃＤＮＡ断片をそれぞれプローブとして３２Ｐラベルして、ハイブリダイゼーションを行った。【００８７】
より詳細には、上記のｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒに組み込んだプローブを用いた。つまりは、当該ベクターを含有する大腸菌を５μｇ／ｍｌ  Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ含有５  ｍｌのＬＢ培地で３７℃、８時間以上培養し、該培養物からＱＩＡＧＥＮ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（商品名、ＱＩＡＧＥＮ社製）にてプラスミドＤＮＡを抽出し、ＥｃｏＲＩで該プラスミドＤＮＡを一晩処理した後に０．５μｇ／ｍｌエチレンブロマイド含有２％  Ｓｅａｋｅｍ  ＭＥ  ａｇａｒｏｓｅで泳動し、当該ゲルからインサート部分を切り出してＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）にて該インサートのＤＮＡを抽出し、プローブとした。ハイブリダイゼーションは、上記のメンブレンを３×ＳＳＣにてしめらせた後、Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｈｙｂｒｉ（商標、ＴＯＹＯＢＯ社製）の２ｍｌにて６８℃、約２時間プレハイブリダイズを行った。プローブをＲｅｄｉｐｒｉｍｅ（商品名、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社製）によりα−３２Ｐ−ｄＣＴＰにてラベルした後、ＮＩＣＫ  ｃｏｌｕｍｎで分離し、カウントを測定して１０６ｃｐｍ／ｍｌになるように計算し、９５℃、１０分変性させた後、６８℃で１晩ハイブリダイズした。翌日、２×ＳＳＣ  ０．１％  ＳＤＳ溶液にて６８℃、５分洗浄を二回行い、その後カウントが高ければ、二次洗浄として、０．１×ＳＳＣで０．０１％ＳＤＳ溶液にて６８℃、１５分洗浄を二回行った。イメージングプレート（富士フィルム社製）に感光し、ＢＡＳ２０００又はＢＡＳ１８００（富士フィルム社製）にて現像を行った。【００８８】
Ｇ３ＰＤＨを内部コントロールプローブとしてｍＲＮＡ量の比較に用いた解析の結果、Ｈａ細胞に高発現している配列が見出されたので、以後、この配列を元に、全長を取得することに決定し、このｃＤＮＡ断片をｅｐｉ１−１：ＣＣＣＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＣＡＴＣＣＡＧＣＡＣＴＧＧＣＴＣＡＡＧＣＴＣＴＡＣＣＣＣＣＡＣＣＣＣＡＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＣＡＴＣＴＡＧＣＡＣＴＧＣＣＴＣＡＧ（配列番号：２０１）と名付けた。【００８９】
次に、当該ｃＤＮＡ断片が由来する分子の大きさを正確に見積もるために、ｍＲＮＡをラージゲルで泳動してノザンブロッティングを行った。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡをマーカーとして泳動した時のｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡの位置、及びＧ３ＰＤＨをプローブとした時のバンドの位置を元に、ｅｐｉ１−１がハイブリしたｍＲＮＡの大きさを計算した。ラージゲルで泳動して分離度を高めた結果、ミニゲルではスメアだったハイブリダイゼーションパターンの一部が、バンドになるまで分離された（図３）。大きい方を８．８ｋｂ、小さい方を６ｋｂと見積もった。【００９０】
１−５．  ｒａｃｅ反応によるｃＤＮＡの伸長と解読
Ｍａｒａｔｈｏｎ法を用いて、ｅｐｉ１−１から５’ｒａｃｅ及び３’ｒａｃｅ反応を行い、伸長することを試みた。【００９１】
具体的に、Ｍａｒａｔｈｏｎ（商標）  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、３’−ｍａｒａｔｈｏｎ  ｒａｃｅ及び５’−ｍａｒａｔｈｏｎ  ｒａｃｅを行った。ＴＡ３−Ｈａ細胞から精製したｍＲＮＡからＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（商標）ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、修飾Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒから逆転写反応を行った。その後、二本鎖ｃＤＮＡを合成し、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  ａｄａｐｔｏｒを結合させ、このａｄａｐｔｏｒ部分に結合するｐｒｉｍｅｒと、遺伝子特異的ｐｒｉｍｅｒによってＰＣＲを行った。【００９２】
５’側は条件を様々に改善しても全く伸長が見られなかった。一方で、３’側はスメアの中に少し強いバンドのような部分が得られたため、その部分を切り出し、既述の方法に準じてｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒにサブクローニングし、塩基配列を解読した。このｒａｃｅ産物はｐｏｌｙ  Ａ付加シグナル及びｐｏｌｙ  Ａ  ｔａｉｌを含んでおり、アミノ酸配列に変換すると、数回のタンデムリピート、疎水性アミノ酸に富んだ膜貫通部位と考えられる部分、及びその部分に続く細胞内部位を含んでおり、終止コドンも確認できた（データは示さず）。このことから、３’ｒａｃｅ産物は、ＴＡ３−Ｈａ細胞に高発現する新規マウスムチン様糖タンパク質の３’側であると考えられ、この配列を３’ｒａｃｅ３と名付けた。【００９３】
１−６．  マウス遺伝子のＰＣＲ
ところで、上記マウスムチン様糖タンパク質における５’側の解明に先立ち、この糖タンパク質のｃＤＮＡだけでなく遺伝子も取得するために、Ａ系統以外のマウスにも当該ムチン様糖タンパク質の遺伝子があるかどうかをＰＣＲによって確認した。すなわち、これまでに、マウス・エピグリカニンはＡ系統のマウス由来のＴＡ３−Ｈａ細胞に発現していることが報告されていたが、本発明のマウスムチン様糖タンパク質遺伝子がＡ系統以外のマウスにも存在することを確認することは、その未解明の５’側の解析にも有効であると考えられた。【００９４】
具体的に、Ａ系統マウスに比べて動物実験でよく用いられ、遺伝子ライブラリーやＢＡＣクローンなどが整備されている、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス、或いは１２９ＳＶＪマウスの遺伝子をテンプレートとし、ｅｐｉｎｔｍＦ：５’−ＴＴＣＴＣＡＴＣＡＣＣＣＴＡＧＣＣＴＣＴＧ−３’（配列番号：２０２）とｅｐｉｎｔｍＲ：５’−ＴＡＴＣＣＴＣＣＴＴＣＧＣＧＴＧＴＣＴＧＧ−３’（配列番号：２０３）、或いはｅｐｉ１−５：５’−ＴＣＴＧＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＣＡＴＣＣＡＧＣＡＣＴ−３’（配列番号：２０４）とｅｐｉｎｔｍＲをプライマーとしてＰＣＲを行った（図４）。ＴＡ３−Ｈａ細胞のＲＴ−ＰＣＲで増幅するバンドと比べ、大きい位置にバンドが得られたため、イントロンが含まれていると考え、塩基配列を読んだところ、ＡＧ／ＧＴ規則に合ったイントロンが一カ所含まれていた。【００９５】
１−７．  １２９ＳＶＪ遺伝子ライブラリーのスクリーニングと解析
上記の遺伝子を取得するために、１２９ＳＶＪ遺伝子のファージライブラリー（ｌＦＩＸＩＩ−１２９／ＳＶＪ  Ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｌｉｂｒａｒｙ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社））を用いて、スクリーニングを行った。【００９６】
まず、上記のファージライブラリーをプレート何枚かにまいてファージプラークをプレート全面に作製し、そこからファージを溶出して変性させＰＣＲを行うことにより、始めのＰＣＲスクリーニングを行った。具体的には、上記ｌＦＩＸＩＩ  ファージ感染用大腸菌として、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＡを２×ＹＴプレート（ｂａｃｔｏ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ  １６ｇ、ｂａｃｔｏ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  １０ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ及びｂａｃｔｏ  ａｇａｒ  １４ｇをＭｉｌｌｉＱ水１Ｌに溶解後、高圧蒸気滅菌し、直径１０ｃｍシャーレに固めて使用）にまき、３７℃、１晩インキュベートした。翌日コロニーを拾い、１０ｍｌの２×ＹＴ培地（ｂａｃｔｏ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ  １６ｇ、ｂａｃｔｏ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  １０ｇ及びＮａＣｌ  ５ｇをＭｉｌｌｉＱ水１Ｌに溶解後、高圧蒸気滅菌して使用）中に１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４（和光純薬）及び０．２％  Ｍａｌｔｏｓｅ（和光純薬）を含む培地内で更に３７℃、１晩培養した。翌日、培養物を３，０００ｒｐｍで５分間遠心し、ペレット状の大腸菌体を５ｍｌの１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４に懸濁し、このＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＡ溶液を５μｌとファージ溶液１μｌ以上をチューブ内で混合し、３７℃、２０分インキュベートした。その後、混合物をＴｏｐ  ａｇａｒｏｓｅ（ｂａｃｔｏ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ  ３．２ｇ、ｂａｃｔｏ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ２ｇ、ＮａＣｌ  １ｇ及びｂａｃｔｏ  ａｇａｒ  １．４ｇをＭｉｌｌｉＱ水１Ｌに溶解後、高圧蒸気滅菌）約４ｍｌに加えて２×ＹＴプレート上にまき、３７℃で１晩培養し、プラークを作製した。形成されたプラークからのファージの溶出は、全面にプラークが生じたプレート（約３，０００個のプラークが含まれている）にＳＭ  ｂｕｆｆｅｒ（ＮａＣｌ  ５．８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２．０ｇ、１Ｍ  Ｔｒｉｓ  （ｐＨ７．５）  ５０ｍｌ及びｂａｃｔ  ｇｅｌａｔｉｎ（ナカライテスク社）  ０．１ｇをＭｉｌｌｉＱ水１Ｌに溶解後、高圧蒸気滅菌して使用）５ｍｌを加え、室温で２時間以上振とうした。Ｂｕｆｆｅｒをチューブに回収し、４℃で３，０００ｒｐｍ、５分遠心して、上清をファージ溶液とし、クロロフォルム２ｍｌを加えて激しく攪拌して保存した。ファージＤＮＡのＰＣＲは、２μｌの１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２μｌ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（各２ｍＭ）、１μｌの５μＭ  ｐｒｉｍｅｒ−ｓｅｎｓｅ、１μｌの５μＭ  ｐｒｉｍｅｒ−ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ、０．５μｌ  ＡｍｐｌｉＴａｑ（商標）  Ｇｏｌｄ（Ｒｏｃｈｅ社）及び１μｌのテンプレート（１／１０希釈後１００℃で５分処理）を含む）にＭｉｌｌｉＱ水を加えて２０μｌにしてＰＣＲ用チューブにいれ、サーマルサイクラーを用いＰＣＲ反応を行った。用いたプライマーは、ｅｐｉｎｔｍＦ、ｅｐｉｎｔｍＲ又はｅｐｉ１−５であった。ｅｐｉｎｔｍＦとｅｐｉｎｔｍＲで反応を行った場合は、９４℃、１０分で熱変性させた後、９４℃で３０秒、５１℃で３０秒、７２℃で１分を４５サイクル、７２℃で１０分の反応を行った。また、ｅｐｉ１−５とｅｐｉｎｔｍＲで反応を行った場合は、９４℃で３０秒、５７℃で３０秒、７２℃で１分を４５サイクルにした。反応産物のうち１０μｌを０．５μｇ／��ｌエチレンブロマイド含有１％  Ｓｅａｋｅｍ  ＭＥ  ａｇａｒｏｓｅにて泳動し、バンドを確認した。その後も引き続き、ＰＣＲにより本発明のムチン様糖タンパク質遺伝子を持つファージを含んでいることがわかったプレートから溶出したファージを新たなプレート何枚かにまいて、再びプラークをプレート全面に作製し、同様にＰＣＲを行った。この作業を何回か行うことにより、陽性ファージを濃縮した。【００９７】
このようにして、ある程度濃縮したファージを用いて、プラークハイブリダイゼーションを行った。すなわち、一つ一つのプラークが識別できる濃度で新たなプレート何枚かにまき、ナイロンメンブレンにプラークＤＮＡをトランスファーして、サザンブロッティングを行った。また、その後も、陽性プラークからファージクローンを回収し、新たなプレート何枚かにまいて同様にサザンブロッティングを行った。この作業を何回か行うことにより、陽性ファージのクローンを取得した。具体的には、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＡ溶液を５μｌとファージ溶液をチューブ内で混合し、３７℃で２０分インキュベートした。その後、Ｔｏｐ  ａｇａｒｏｓｅ約４ｍｌを混合して２×ＹＴプレートにまき、３７℃で１晩培養し、シングルプラークを作製した。翌日、ナイロンメンブレンフィルターＢＩＯＤＹＮＥ（商標）  Ａ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＭＥＭＢＲＡＮＥ（ＰＡＬＬ社製）を密着させてプラークを写し取り、針を３カ所さして、プレートとメンブレンを対応できるようにマークした後にはがした。はがしたメンブレンをアルカリ溶液（０．５Ｍ  ＮａＯＨ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ）、中和液（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１．５Ｍ  ＮａＣｌ）、洗浄液（２×ＳＳＣ）で順に約１０分ずつ処理し、風乾した後、８０℃で２時間処理してファージＤＮＡをフィルターに固定した。サザンブロッティングに用いるプローブは「１−４．  ノザンブロッティングによる解析」の項に準じて作製した。メンブレンを３×ＳＳＣ  ０．５％ＳＤＳａ（和光純薬）溶液に６５℃で３０分浸した後、Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｈｙｂｒｉ（商標）  ２ｍｌにて６８℃、約２時間プレハイブリを行った。プローブをＲｅｄｉｐｒｉｍｅによりα−３２Ｐ−ｄＣＴＰにてラベルした後、ＮＩＣＫ  ｃｏｌｕｍｎによって分離し、カウントを測定して３×１０６ｃｐｍ／ｍｌになるように計算し、６８℃で１晩ハイブリした。翌日、２×ＳＳＣ  ０．１％ＳＤＳ溶液にて６８℃、５分洗浄を二回行い、その後、カウントが高ければ、二次洗浄として、０．１×ＳＳＣ  ０．０１％ＳＤＳ溶液にて６８℃で１５分洗浄を二回行った。Ｋｏｄａｋ  Ｓｃｅｉｎｔｉｆｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｆｉｌｍ  Ｘ−ＯＭＡＴ（商標）  ＡＲ（３５×４３ｃｍ：Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａより）に感光し、自動現像機にて現像した。現像したフィルムとファージを作製したプレートを対応させ、陽性プラークを含むＴｏｐ  ａｇａｒｏｓｅ部分を爪楊枝で拾い、ＳＭ  ｂｕｆｆｅｒ  １００μｌ中にいれ、４℃で３，０００ｒｐｍ、５分遠心した後、上清をファージ溶液とし、クロロフォルム１０μｌを加えて混合して保存した。【００９８】
上記の手法により、６個の陽性ファージクローン（ａ〜ｆ）を取得し、それぞれのクローンを大量にまいてプラークを作製し、ＤＮＡを回収した。詳細には、それぞれのファージクローンのプラークを大量に作製した後に、ＳＭ  ｂｕｆｆｅｒ  ５ｍｌを加え、室温で２時間以上振とうしてからチューブに回収し、４℃で３，０００ｒｐｍ、５分遠心し、上清を新しいチューブに移した。さらにここに２ｍｌクロロフォルムを加えて激しく攪拌した後、４℃で３，０００ｒｐｍ、５分遠心し、その上層をファージ溶液とした。このファージ溶液を新たなチューブに移し、ＱＩＡＧＥＮ  Ｌａｍｄａ  ｋｉｔ（商品名、ＱＩＡＧＥＮ製）にてＤＮＡを精製した。【００９９】
精製したＤＮＡをＮｏｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩでそれぞれ処理して電気泳動し、ナイロンメンブレンにブロッティングしてサザンブロッティングを行い、このムチンの遺伝子が実際に含まれているかどうかを確認した。具体的には、ＤＮＡを上記の各制限酵素で消化し、０．６％  Ｓｅａｋｅｍ  ＭＥ  ａｇａｒｏｓｅで電気泳動した。ゲルを、０．２Ｎ  ＨＣｌ中で１０分酸処理し、ＭｉｌｌｉＱ水ですすいだ後に、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  ＮａＯＨ中に１５分間、２回浸した。続いて、３Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４中に３０分浸し、ナイロンメンブレンに１晩キャピラリートランスファーした。翌日、メンブレンを風乾し、８０℃で２時間処理し、ＤＮＡをメンブレンに固定した。該メンブレンを上記の手順によるサザンブロッティングに付した。結果を図５に示す。クローンｃとｆにはプローブが結合しなかったことから、プラークハイブリダイゼーションでプラークが結合したように見えたのは疑陽性であると判断し、以後の実験にはクローンａ、ｂ、ｄ、ｅを用いた。【０１００】
これらのクローンのＤＮＡを制限酵素処理して得たバンドのうち、サザンブロッティングでプローブが結合したバンドを切り出し、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔでＤＮＡを抽出した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｐｉｔ  ＩＩ  ＳＫ＋  ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）をインサートの両端の制限酵素サイトに合わせて制限酵素消化した後、そこに前記のＤＮＡをＴＡＫＡＲＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（ＴＡＫＡＲＡ製）を用いてライゲーションした。ライゲーション産物と大腸菌ＪＭ１０９を混合し、氷上で２０分インキュベートした後、４２℃の湯浴に５０秒つけ、その後再び氷上に２分以上戻した。これを、ＳＯＣ  ｍｅｄｉｕｍにて３７℃で１時間培養後、ＩＰＴＧ  ５μｌとＸ−ｇａｌ  ５０μｌを塗布した５μｇ／ｍｌ  Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ含有ＬＢプレートにまき、３７℃で１晩培養した。白のシングルコロニーを爪楊枝で拾い、５μｇ／ｍｌ  Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ含有３ｍｌのＬＢ培地で３７℃、８時間以上培養した。Ｎｕｃｌｅｏ  Ｓｐｉｎ（商標）  ｐｌａｓｍｉｄにてプラスミドＤＮＡを抽出した。それぞれの制限酵素で処理し、０．５μｇ／ｍｌエチレンブロマイド含有０．６％  Ｓｅａｋｅｍ  ＭＥ  ａｇａｒｏｓｅで泳動し、目的のインサートがあるかどうかを確認した。１０ｋｂ前後のＤＮＡがサブクローニングされているので、両端から少しずつ塩基配列を解読し、本発明のムチン様糖タンパク質遺伝子が含まれているかどうかを検討した。その結果、これまでに得られているｃＤＮＡ配列中に制限酵素サイトが一カ所存在するＢａｍＨＩ処理ＤＮＡについては、本発明のムチン様糖タンパク質遺伝子を含むクローンがいくつか得られた。【０１０１】
１−８．  遺伝子マッピング
取得した遺伝子クローンの配列を含め、これまでに解読できた部分配列を用いてＥｎｓｅｍｂｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒを検索したところ、このムチンの遺伝子がマウス第１７番染色体のＭＨＣ領域に存在することが明らかになった。また、このムチンの遺伝子クローンの全長を含む、更に長大な遺伝子配列が登録されており、この配列を詳しく解析することにより、３’ｒａｃｅ３配列の５’側にあたる遺伝子配列及びｃＤＮＡ配列が明らかになった（図６）。５’側は約４ｋｂ以上に渡り、終止コドンが全く見られず、連続したエキソンであり、アミノ酸１５残基からなるタンデムリピートが６０回以上繰り返されていることがわかった。ただし、タンデムリピートの中間部分に解読されていない領域が含まれていた。取得した遺伝子クローンの長さと登録されている配列とを比較することにより、解読されていない領域は約１．５ｋｂ〜２ｋｂであると予想され、この部分は全てタンデムリピートが続いていると考えられるので、実際はタンデムリピートは１００回以上繰り返されている可能性があった。タンデムリピートの上流約３００ｂｐの部分に終止コドン、及び開始コドンとなるメチオニン、更にはシグナル配列と予想される配列があるが、この部分からこの新規ムチンが翻訳されていると考えると、あらかじめノザンブロッティングによって見積もったｍＲＮＡの大きさと比べ小さいと考えた。そこで、この約３００ｂｐの部分でスプライスが起こると予想した。【０１０２】
１−９．  ５’末端の探索−１
タンデムリピート部分よりも上流の約３００ｂｐの間でスプライスが起きており、更に上流に別のエキソンがあることを予想し、この約３００ｂｐの部分にプライマーを設計して、５’ｒａｃｅ反応により５’末端まで伸長することを試みた。【０１０３】
Ｒａｃｅ反応のプライマーを設計する前に、この約３００ｂｐの部分が実際にｃＤＮＡとなっているかどうかをＴＡ３−Ｈａ細胞のＲＴ−ＰＣＲにより確認した。具体的に、ＴＡ３−Ｈａ細胞のｔｏｔａｌ  ＲＮＡから合成した一本鎖ｃＤＮＡをテンプレートとし、また、プライマーとして以下のものを用いた。
センス：
ｅｐｉｃＤＮＡ１：５’−ＣＡＣＣＣＡＴＧＣＡＡＴＧＡＡＴＴＴＡＡＣＡＡＡＧＧ−３’（配列番号：２０５）
アンチセンス：
ｅｐｉｔｍＲ：ＴＧＧＡＴＧＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡＧＧＧＴＧＧ−３’（配列番号：２０６）
ｅｐｉｒａｃｅｒ１：ＧＴＧＧＣＴＡＴＧＣＴＣＴＴＣＧＴＴＴＣＴＧＡＴＧＡＡＧＧ−３’（配列番号：２０７）
ｅｐｉｒａｃｅｒ２：ＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＡＴＡＴＧＧＧＣＡＴＡＡＣＣ−３’（配列番号：２０８）
２μｌの１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２μｌ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（各２ｍＭ）、１μｌの５μＭ  ｐｒｉｍｅｒ−ｓｅｎｓｅ、１μｌの５μＭ  ｐｒｉｍｅｒ−ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ、０．５μｌ  ＡｍｐｌｉＴａｑ（商標）  Ｇｏｌｄ、１μｌのテンプレート（適度に希釈）を含む）にＭｉｌｌｉＱ水を加えて２０μｌにしてＰＣＲ用チューブにいれ、サーマルサイクラーを用いＰＣＲ反応を行った。９４℃で１０分で熱変性させた後、９４℃で３０秒、５９℃で３０秒、７２℃で１分を５０サイクル、７２℃で１０分の反応を行った。反応産物のうち１０μｌを０．５μｇ／ｍｌエチレンブロマイド含有１％  Ｓｅａｋｅｍ  ＭＥ  ａｇａｒｏｓｅにて泳動し、バンドを確認した。結果を図７に示した。用いたプライマーによって増幅されると予想した大きさにバンドが認められた。【０１０４】
続いて、ＲＴ−ＰＣＲによって確認したｃＤＮＡの部分にｒａｃｅ反応のプライマーを設計し、遺伝子特異的な逆転写反応及びｒａｃｅ反応を行った。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）  ｋｉｔを用いることにより、原理的には５’末端を持たないＲＮＡは伸長しないことになっており、取得したｃＤＮＡは５’末端から始まると考えられるが、本手法によっては、当該５’末端を推定することはできなかった。【０１０５】
１−１０．  ５’末端の探索−２
上記のとおり、関連する技術において最も実行可能な手法の一つである５’ｒａｃｅ反応のみによっては、本発明のマウス・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質の５’末端を確定できないことが判明した。【０１０６】
そこで、タンデムリピート領域の上流末端周辺のマウスゲノムＤＮＡ配列をＮＣＢＩから獲得し、更にこれを精査することにより、推定されるスプライシング  アクセプター配列をタンデムリピート領域上流に見出した。また、この配列より上流の塩基配列を調べると、どの読み枠でも終始コドンが現れるため、この推定されるスプライシング  アクセプター配列で実際にスプライスが起きていることは確からしかった。そこで、この推定されるスプライシング  アクセプター配列より下流で且つタンデムリピート領域より上流に、以下に示すアンチセンスプライマーを新たに２つ設計した。【０１０７】
ＥｐｉＲＥＶ：ＣＴＧＴＧＧＣＴＡＴＧＣＴＣＴＴＣＧＴＴＴＣＴＧＡＴＧＡＡＧＧＡＴＴＴ−３’（配列番号：２０９）、及び
ＥｐｉＡＭＰ：ＧＧＡＴＴＴＧＡＡＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＡＴＡＴＧＧＧＣＡＴＡＡＣ−３’（配列番号：２１０）
次いで、逆転写ＰＣＲ法により、本発明のマウス・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質の上流エキソンを探索した。具体的には、上記プライマーをアンチセンスに用い、センスプライマーは以下のように決定した。【０１０８】
タンデムリピート領域上流１０ｋｂのゲノム配列に対し、推定されるスプライシング  ドナーサイトをチェックした。そこから推定できるエキソン領域について、コードされるアミノ酸配列をすべての読み枠で調べ、ストップコドンがなく、ある程度の長さがある配列をエキソン候補領域とし、その中でセンスプライマーをデザインした。１３領域を選び出し、ＲＴ−ＰＣＲ法によりｃＤＮＡが存在しているかを調べた。その結果、ＥｐｉＲＴ１２０００：５’−ＧＧＡＧＡＡＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＴＧＣ−３’（配列番号：２１１）をセンスプライマーとし、且つ上記のＥｐｉＡＭＰをアンチセンスプライマーとしてＰＣＲを行った時のみ、目的のＰＣＲ産物を得ることが出来た。なお、このときのＰＣＲ反応条件は、ＡｍｐｌｉＴａｑ（商標）  Ｇｏｌｄの標準プロトコルを用いて、９４℃で１０分間の後に、９４℃で３０秒間：６０℃で３０秒間：７２℃で５分間のサイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で５分間とした。【０１０９】
得られたＰＣＲ産物の配列を読んでみると確かに推定した配列でスプライシングが起きていることが確認でき、これによりこの遺伝子のタンデムリピート領域の上流部分に存在するエキソン・イントロンが初めて解明された。すなわち、このエキソンは上流にＴＡＴＡボックスがあり且つメチオニンも読み枠にあったので、本発明のマウス・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質の上流配列としては信頼に足るものであり、これが第一エキソンと十分に推定可能であった。しかし、本当にこの領域が第一エキソンであるか、また本当にこのメチオニンが翻訳開始位置であるかを確定するには、更にＲＡＣＥ法により転写開始位置を同定する必要があった。【０１１０】
そこで、ＴＡ３−Ｈａ細胞から生成したｔｏｔａｌ  ＲＮＡの４．４μｇを原料に、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）  Ｋｉｔを用いて５’ｒｅｃｅ反応を行い、転写開始位置の同定を試みた。この実験では、以下の２点以外はキット製造者の指示に従った：１）ＣＩＰ処理の後のフェーノール・クロロフォルム抽出の前に、フェノール抽出を１回挿入した、２）ヴォルテックスにより攪拌せよと数箇所説明書には書いてあるが、ヴォルテックスは一切行わず、チューブを上下することで攪拌した。このようにしてＣＡＰ構造を有していたＲＮＡのみにｏｌｉｇｏ  ＲＮＡを結合した。タンデムリピート領域に対し、逆転写用のアンチセンス  プライマーを以下のとおり設計し、上記ＲＮＡを鋳型にＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（商標）ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて遺伝子特異的に逆転写した。
ＲＴＧｅｎｅＴａｎｄｅｍ１：ＧＣＴＧＴＣＡＡＣＧＡＴＡＣＧＣＴＡＣＧＴＡＡＣＧＧＣＡＴＧＡＣＡＧＴＧＧＡＴＧＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡＧＧＧＴＧＧＧＴＧＴＡＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＡＧＴＧＣＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＣＧＧＧ−３’（配列番号：２１２）
次いで、生成した一本鎖ｃＤＮＡに対し以下のプライマーを用いてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。センスプライマーにはキットで与えられているＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）５’Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＣＧＡＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＡ−３’（配列番号：２１３）及びＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）５’ＮｅｓｔｅｄＰｒｉｍｅｒ：５’−ＧＧＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＧＧＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＡ−３’（配列番号：２１４）を、アンチセンスには上記ＥｐｉＲＥＶ及びＥｐｉＡＭＰを用いた。また、反応条件は以下のとおりであった。１回目のＰＣＲは、センス及びアンチセンスとして、夫々、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）５’Ｐｒｉｍｅｒ及びＥｐｉＲＥＶを用い、９４℃で１０分間の後に、９４℃で３０秒間：６０℃で３０秒間：７２℃で３分間のサイクルを３０回繰り返し、７２℃で５分間とした。２回目のＰＣＲは、センス及びアンチセンスとして、夫々、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）５’ＮｅｓｔｅｄＰｒｉｍｅｒ及びＥｐｉＡＭＰを利用し、９４℃で１０分間の後に、９４℃で３０秒間：６８℃で３０秒間：７２℃で３分間のサイクルを３０回繰り返し、７２℃で５分間のように行った。得られたＰＣＲ産物の塩基配列を解析し、転写開始位置を４種類同定した。９サンプルのうち、６サンプルは同じ位置から始まっており、この位置を転写開始位置と決定した。このエキソンは先にＲＴ−ＰＣＲで予想した第一エキソンと同一であり、スプライシング  ドナー  サイトもスプライシング  アクセプター  配列も同一箇所であった。【０１１１】
また、先のスプライシング  ドナー  サイトでスプライシングが起きていないスプライシング  バリアントが存在するかどうかを調べるために、この５’ｒａｃｅ反応で作成したｃＤＮＡをテンプレートにして、更なるｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。タンデム上流のスプライシング  ドナー  サイトより上流に次に述べるアンチセンスプライマーを設計した。【０１１２】
ＥｐｉＡＳ１５１３０：５’−ＡＧＡＣＣＡＴＧＡＴＡＡＧＴＡＣＣＣＡＧＧＧＣ−３’（配列番号：２１５）
センスプライマーとして、一回目はＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）５’Ｐｒｉｍｅｒを二回目はＧｅｎｅＲａｃｅｒ(商標）５’ＮｅｓｔｅｄＰｒｉｍｅｒを採用し、アンチセンスプライマーは両反応ともＥｐｉＡＳ１５１３０を用いた。ＫＯＤ−ｐｌｕｓ（商標）の標準プロトコルに従い、９４℃で２分間に続いて、９４℃で１５秒間：５４℃で３０秒間：６８℃で５分間のサイクルを３０回繰り返した後に、６８℃で１０分間という系を両ＰＣＲ反応で用いた。ＰＣＲ産物の塩基配列を解析すると、確かに本発明のＤＮＡであることが分かり、スプライシング  バリアントが確認された。このスプライシング  バリアントの第一エキソンは、先のバリアントと同じであった。転写開始位置は先のバリアントより６１ｂ上流であり、スプライシング  ドナー  サイトは先のバリアントと同様であった。【０１１３】
このようにして、バリアントを含めて配列番号：１７２に示される配列を有する本発明のマウス・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質ｃＤＮＡを単離できた。
【実施例２】
【０１１４】
実施例２：マウス・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質に対するポリクローナル抗体の調製と該抗体による該ムチンの検出及びエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質のマウスによる発現分布同定
２−１．  ポリクローナル抗体の作製
本発明の新規ムチン様糖タンパク質を特異的に認識する抗体を取得する目的で、上記のｃＤＮＡの配列に基づいて、タンデムリピートと考えられる配列の一部分であるｅｐｉｔｍペプチド：ＳＳＳＴＰＴＰＴＴＴＡＳＳＴ(配列番号：１７７）、及び、膜貫通領域のすぐ外側でタンデムリピートではないと考えられる部分の一部分であるｅｐｉｎｔｍペプチド：ＮＨＴＧＴＰＶＭＥＶＫＰＳＧＳ(配列番号：１７８）を作製し、これらに対するウサギポリクローナル抗体を作製した。【０１１５】
具体的に、当該ペプチドは、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｉｏｎｅｅｒ製）を用いてＦ−ｍｏｃ固層合成法により合成した。合成に使用したＦ−ｍｏｃアミノ酸は全てＯＨ体（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用した。合成後、レジンからペプチドを外し、脱保護を行うために、合成ペプチドが結合した状態のレジンに、フェノールを０．７ｇ、ＭｉｌｌｉＱ水を５００μｌ、ＴＦＡ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより）９．５ｍｌを加え、室温で１晩振とうした。グラスフィルターで濾過してレジンを除き、ジエチルエーテルで数回洗浄し、ペプチドを析出させた。析出したペプチドを最小量のＭｉｌｌｉＱ水に溶かした。次いで、逆相ＨＰＬＣ（日本分光社製）を用いてペプチドを精製した。カラムは５Ｃ１８カラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ（商標）、ナカライテスク社製）を用い、カラム温度４０℃、流速２ｍｌ／ｍｉｎで分離を行った。Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ（０．０５％  ＴＦＡ  ｉｎ  ＭｉｌｌｉＱ水）を３０分かけて直線的にｂｕｆｆｅｒ  Ｂ｛０．０５％  ＴＦＡ  ｉｎ  ｐｒｏｐａｎｏｌ：ａｃｅｔｏｎｉｔｏｒｉｌｅ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより）＝７：３｝に５０％まで置換し、その後５分間ｂｕｆｆｅｒ  Ｂによる溶出を行った。続いてｂｕｆｆｅｒ  Ａにより平衡化を２５分間行った。分取した画分をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ（ＶｏｙａｇｅｒＥｌｉｔｅ：ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）にて質量分析を行った。精製したペプチドを凍結乾燥し、−２０℃に保存した。精製したペプチドはＫＬＨと結合した。すなわち、ＫＬＨ  １０ｍｇ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社より）に２ｍｌの１０ｍＭ  ＫＰｉ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ７．０（０．２Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４  ３９ｍｌと０．２Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４  ６１ｍｌを混合）、６３μｌのＭＢＳ溶液｛ＭＢＳ（ＳＩＧＭＡ社）１ｍｇ／６７μｌ  ＤＭＦ（和光純薬）｝を加えて室温で３０分振とうし、ＫＬＨとＭＢＳを結合させた。反応溶液をＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）  Ｇ２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）によって、０．１Ｍ  ＫＰｉ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ６．０（０．２Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４  ８７．７ｍｌと０．２Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４  １２．３ｍｌを混合）を用いてゲル濾過した。各フラクションの吸光度を測定して、ＫＬＨ−ＭＢＳが含まれている画分を取得した。その後、上記で得たペプチドの凍結乾燥物６ｍｇを０．１Ｍ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｂｏｒａｔｅ（和光純薬）  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．０）の１ｍｌに溶解した。そこに、分取したＫＬＨ−ＭＢＳをゆっくりと攪拌しながら加え、ＨＣｌでｐＨ７．０〜７．５に合わせた。そのまま室温で３時間反応させ、ＰＢＳ  １Ｌに対して４℃で１晩透析した。これをペプチド１ｍｇずつ分注して−２０℃に保存した。【０１１６】
免疫動物として使用した日本白色ウサギ（２．５ｋｇ、雌）は、日本医科学動物資材研究所より購入し、東京大学薬学部動物施設で飼育した。実験には購入後１週間予備飼育したウサギを用いた。当該免疫動物に対し、上記ＫＬＨと共有結合させたペプチド１ｍｇ溶液とＦｒｅｕｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ（ＮＡＫＡＲＡＩ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ，ＬＴＤ製）を混合してエマルジョンを作製し、それを皮下投与した。免疫は２週間毎に行い、２回目以降はＦｒｅｕｎｄ  ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ（ＮＡＫＡＲＡＩ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ，ＬＴＤ製）と混合してエマルジョンを作製し、免疫した。免疫の度にウサギ耳静脈より採血を行い、該血液を３７℃で３０分間インキュベートした後に、４℃で１晩静置して凝固させ、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、その上清を抗血清とした。上記ペプチドを抗原としたＥＬＩＳＡによって抗体価を測定した。詳細には、９６穴ＥＬＩＳＡプレートに、抗原として０．０５Ｍ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．６）に溶解した２０μｇ／ｍｌ合成ペプチドを加え、４℃にて２４時間以上静置した。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳ中）にて２回洗浄後、３％  ＢＳＡ（ＰＢＳ中）にて室温にて２時間ブロッキングを行った。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳ中）にて３回洗浄後、１％  ＢＳＡ（ＰＢＳ中）にて希釈したウサギ抗血清を加え、室温にて２時間反応させた。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳ中）にて３回洗浄後、１％  ＢＳＡ（ＰＢＳ中）にて１，０００倍希釈したＨＲＰ−Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ  Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ抗体（ＺＹＭＥＤ社）を二次抗体として室温で１時間反応させた。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳ中）にて５回洗浄後、１ｍＭのＡＢＴＳ  １μｌ／ｍｌ  Ｈ２Ｏ２で発色させ、吸光度４０５ｎｍを測定した。結果を図８に示した。【０１１７】
Ｅｐｉｔｍペプチドに対する抗体価も、ｅｐｉｎｔｍペプチドに対する抗体価も、免疫の回数を増加するにつれて増加したが、３回免疫を行ったところで、あまり抗体価の増加が認められなくなったため、免疫を終了した。また、抗ｅｐｉｎｔｍペプチド抗体の方が、抗ｅｐｉｔｍ抗体に比べて抗体価が高い傾向にあった。【０１１８】
２-２.  ポリクローナル抗体によるマウスムチン様糖タンパク質の検出
上記で作製したウサギポリクローナル抗体がペプチドに結合することは確認できた。続いて、このポリクローナル抗体をフローサイトメトリー法或いはウェスタンブロッティングで利用できるかどうかを確認した。【０１１９】
まず、ＴＡ３−Ｈａ細胞及びＴＡ３−Ｓｔ細胞をポリクローナル抗体で染色し、フローサイトメーターにて蛍光を測定した。具体的にＴＡ３−Ｈａ細胞及びＴＡ３−Ｓｔ細胞０．５〜１×１０６個を、ＦＣＭ  ｂｕｆｆｅｒにて洗浄後、そこにＦＣＭ  ｂｕｆｆｅｒで希釈したウサギ抗血清を１００μｌ加え、氷冷下３０分間反応させた。ＦＣＭ  ｂｕｆｆｅｒにて反応した細胞を洗浄後、今度はＦＣＭ  ｂｕｆｆｅｒで１００倍に希釈したＦＩＴＣ−ｇｏａｔ  ａｎｔｉ  ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（ＺＹＭＥＤ社）を１００μｌ加え、氷冷下３０分間反応させた。ＦＣＭ  ｂｕｆｆｅｒにて細胞を洗浄後、ＦＣＭ  ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、ナイロンメッシュを通した後、フローサイトメーターにて蛍光強度を測定した。【０１２０】
図９に示したとおり、どちらの抗体もＳｔ細胞に対する結合と比べ、Ｈａ細胞に対しては高い結合を示し、Ｈａ細胞表面に発現するタンパク質を認識していることが確認された。また、抗ｅｐｉｔｍ抗体の方が、抗ｅｐｉｎｔｍペプチド抗体に比べて結合が低くなる傾向が認められた。【０１２１】
次に、Ｈａ細胞及びＳｔ細胞の細胞溶解液を電気泳動して、ＰＶＤＦ膜にブロッティングし、ポリクローナル抗体で染色を行った。ポリクローナル抗体で染色すると、どちらの細胞にも非特異的な結合が非常に多く認められたため、ポリクローナル抗体を粗精製してから染色を行った。詳細には、上記ウサギ抗血清の液量をはかり、５０％飽和になるように、硫酸アンモニウムを加え、４℃で６０分以上激しく攪拌した。１０，０００ｒｐｍ、４℃で１０分遠心し、ペレットを最小量のＰＢＳに懸濁し、ＰＢＳ  １Ｌに対して４℃で４時間透析し、更に新しいＰＢＳ  １Ｌに対して４℃で１晩透析した。硫安沈殿後に、１ｍｌあたり１００μｌのＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）  ４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を加え、４℃で２時間以上攪拌した。１３，０００ｒｐｍ、４℃で１分間遠心し、その上清を粗精製ポリクローナル抗体とし、ＥＬＩＳＡで活性を調べた上で、その後の実験に用いた。次いで、「１−１．  レクチンによる新規ムチン様糖タンパク質の存在確認」の項に記載したウェスタンブロッティング法に準じ、ウェスタンブロッティングを行った。簡単に説明すると、各細胞抽出液を２−ＭＥ存在下ＳＤＳ変性４％或いは１５％ポリアクリルアミド電気泳動を行い、ＰＶＤＦ膜にセミドライブロッティングした。１％  ＮＧＳ−２％  ＢＳＡ（ＰＢＳ中）で一晩ブロッキングをし、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０−１％  ＮＧＳと２％  ＢＳＡ（ＰＢＳ中）で５００倍希釈した上記粗精製ウサギ抗体と上記ＰＶＤＦ膜を９０分反応させた。反応後の膜を０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ中）で４回以上洗浄後、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０−１％  ＮＧＳと２％  ＢＳＡ（ＰＢＳ中）で２，０００倍希釈したｂｉｏｔｉｎ−ｇｏａｔ  ａｎｔｉ  ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（ＺＹＭＥＤ社）と４５分反応させた。更に当該膜を０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ中）で４回以上洗浄後、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０−１％  ＮＧＳと２％  ＢＳＡ（ＰＢＳ中）で３，０００倍希釈したＨＲＰ−ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎと３０分反応させた。ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔにより発色させ、Ｈｙｐｅｒ  ｆｉｌｍ  ＥＣＬに感光した。【０１２２】
図１０に示されるとおり、特に抗ｅｐｉｎｔｍペプチド抗体によっては、Ｈａ細胞の分子量の大きい部分がスメアに染色された。これらのことから、作製した抗ペプチド抗体により、本発明のエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質を検出できることが示された。【０１２３】
２−３.  マウス正常組織における本発明のエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質の発現確認
マウスの全身における本発明のエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質の発現をノザンブロッティングによって解析した。【０１２４】
具体的にＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスの全身の臓器を分離し、それぞれから定法によりｔｏｔａｌ  ＲＮＡを分離した。簡単に説明すると、解剖日前日から絶食させたマウスの全身の臓器を分離し、液体窒素で凍結させた。ＵＬＴＲＡＳＰＥＣ  ＲＮＡを加え、ホモジナイズしてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。ＰＣＩでタンパク質を除いてから、クロロフォルムでフェノールを除き、その後イソプロパノールで沈殿させ、水に溶解して吸光度２６０ｎｍ／２８０ｎｍを測定してＲＮＡ量及び純度を見積もった。【０１２５】
次いで、上記ｅｐｉ１−１をプローブとして既述の実験手法に準じてノザンブロッティングを行った（図１１）。多くの組織でプローブが結合し、このムチンの発現が確認されたが、特に、脾臓、盲腸、大腸、リンパ節では比較的大きい位置に強い結合が認められ、更に胸腺、心臓、肝臓、大脳、筋肉、皮膚でも比較的強い結合が見られた。一方、腎臓ではまったく結合が見られず、この分子が発現していない可能性が示された。この結果から、このムチンは消化管や気管などの上皮系組織だけでなく、免疫系の組織にも強い発現が認められ、非常に特徴的であると考えられた。【０１２６】
２−４.  マウス癌細胞株及び、乳癌組織における本発明のエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質の発現
次にＴＡ３−Ｈａ細胞以外の癌細胞に、この新規マウスムチンが発現していないかどうかを解析した。ＴＡ３−Ｈａ細胞が乳癌細胞であることから、主に乳癌細胞にこの新規マウスムチンが発現しているのではないかと考え、様々な乳癌細胞株、及び自然発癌によって生じた乳癌組織から樹立した細胞株について検討を行った。また、Ｃ５７ＢＬ／６ＮマウスやＢａｌｂ／ｃマウスのような、一般的に用いられているマウス由来の上皮系癌細胞についても検討した。【０１２７】
マウス癌細胞株の培養に用いた実験動物であるＩＣＲマウス（５週齢、雌）はオリエンタル酵母より購入し、東京大学薬学部動物施設ＳＰＦ条件下で飼育した。実験には購入後１週間予備飼育したマウスを用いた。培養に用いた培地は、Ｍｉｎｉｍｕｎ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ：ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）９．４ｇを１ＬのＭｉｌｌｉＱ水に溶解し、高圧蒸気滅菌し、無菌的に調製された３％  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ５ｍｌ、１０％  ＮａＨＣＯ３  １０ｍｌ、０．１ｍＭ  ＮＥＡＡ  ５ｍｌを加えて調製した。さらに非動化したＦＣＳを最終濃度１０％になるように加えて使用した（ＭＥＭ−ＮＥＡＡ−１０％  ＦＣＳ培地）。また、ＥＳ培地は日水製薬より購入し、最終濃度が１０％になるようにＦＣＳを加えて使用した（ＥＳ−１０％  ＦＣＳ培地）。その他ＲＰＭＩ１６４０−１０％  ＦＣＳ培地及びＤ／Ｆ−１０％  ＦＣＳ培地を同様に調製して用いた。実験に用いたマウス大腸癌細胞株Ｃｏｌｏｎ３８、２６細胞は、東京大学分子生物学研究所の鶴尾隆博士より御供与頂いた。マウスリンパ腫細胞株ＲＭＡ細胞は、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ大学のＯｌｉｖｅｒａ  Ｊ．  Ｆｉｎｎ博士より御供与頂いた。マウス腎癌細胞株Ｒｅｎｃａ細胞は、富山医科薬科大学の済木育夫博士より御供与頂いた。マウス乳癌細胞株ＭＭ２、４６、４８、１０２細胞、Ｅｈｒｉｃｈ細胞、ＦＭ３Ａ細胞、及びＦＭ３ＡＲ細胞、また肺扁平上皮細胞株ＫＬＮ２０５細胞は東北大学加齢医学研究所より御供与頂いた。Ｍｅｌ−１８＋／−マウスにできた乳癌組織から樹立した細胞株ＭＭＫ３〜７細胞のペレットは広島大学の管野雅元博士より御供与頂いた。これらのマウス癌細胞株の継代法に関して、Ｃｏｌｏｎ３８、Ｃｏｌｏｎ２６、ＲｅｎｃａはＤ／Ｆ−１０％  ＦＣＳ培地で、３７℃、５％  ＣＯ２存在下で培養した。これらは３〜４日おきにＰＢＳにて洗浄後、そこにＴｒｐ−ＥＤＴＡ溶液（０．０５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ／０．０２％  ＥＤＴＡ−ＰＢＳ中）を加えて、３７℃、５分間インキュベートし、培養シャーレからはがし継代した。ＲＭＡ、ＭＭ２、ＭＭ４６、ＭＭ４８はＲＰＭＩ１６４０−１０％  ＦＣＳ培地で、３７℃、５％  ＣＯ２存在下で培養し、３〜４日おきに継代した。ＭＭ１０２はＲＰＭＩ１６４０−１０％  ＦＣＳ培地で、３７℃、５％  ＣＯ２存在下で培養した。これは３〜４日おきにＰＢＳにて洗浄後、そこにＴｒｐ−ＥＤＴＡ溶液を加えて３７℃で５分間インキュベートし、培養シャーレからはがし継代した。ＫＬＮ２０５はＭＥＭ−ＮＥＡＡ−１０％  ＦＣＳ培地で、３７℃、５％  ＣＯ２存在下で培養し、３〜４日おきに継代した。ＦＭ３Ａ、ＦＭ３Ａ／ＲはＥＳ−１０％  ＦＣＳ培地で、３７℃、５％  ＣＯ２存在下で培養し、３〜４日おきに継代した。Ｅｈｒｌｉｃｈは、約２×１０６個の当該細胞をＨＡＮＫＳ’液に懸濁してＩＣＲマウスに腹腔内投与し、その１週間後に腹腔から細胞を回収した。回収した細胞を２ｍｌの０．１５Ｍ  ＰＢＳに懸濁後、そこに６ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水を加え、約２０秒サスペンドし、すぐに２ｍｌの３．５Ｍ  ＮａＣｌを加えた。この操作により赤血球を除き以後の実験に用いた。上記マウス癌細胞株からのｍＲＮＡは、μＭＡＣＳ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（商品名）を用いてｍＲＮＡを抽出し、それをＥｔＯＨ沈殿させ、その後沈殿物を水に溶解して吸光度２６０ｎｍ／２８０ｎｍを測定し、ＲＮＡ量及び純度をみつもることで調製した。最後に「１−４．  ノザンブロッティングによる解析」の項に準じ、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １００μｇ或いはｍＲＮＡ  １μｇを電気泳動し、ノザンブロッティングを行った。【０１２８】
結果を図１２に示した。いくつかの乳癌細胞でプローブが結合し、このムチンの発現が確認されたが、特に、乳癌細胞株ＦＭ３Ａ細胞、同じくＦＭ３ＡＲ細胞、また自然発癌によって生じた乳癌組織から樹立した細胞株ＭＭＫ５細胞、ＭＭＫ７細胞では比較的強い結合が認められた。また、肺扁平上皮癌細胞であるＫＬＮ２０５細胞にも、非常に強い結合が見られた。しかし、ＴＡ３−Ｈａ細胞よりも強い発現の見られる細胞はなかった。
【実施例３】
【０１２９】
実施例３：ヒト・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質の同定
３−１.  ＲＴ−ＰＣＲ法によるヒト・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現解析
まず、複数のヒト細胞株からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した後、ＲＴ反応により各ｔｏｔａｌ  ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを作製した。次いで、マウス・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質の膜貫通領域に関連する部分を含む３’側配列から設計されたプライマーを用いて、上記により得られたｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、該ＰＣＲ産物をサブクローン後に配列の解析と確認を行った。これにより、各ヒト細胞株における本発明のヒト・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現解析を行った。以下、具体的に説明する。【０１３０】
（１）細胞・継代
実験には９種類の細胞株、ＭＲＫ−ｎｕ−１、ＳＫ−ＢＲ−３（以上乳癌細胞株）、ＨｅｐＧ２（肝臓癌細胞株）、ＥＢＣ−１（肺癌細胞株）、ＫＡＴＯＩＩＩ（胃癌細胞株）、８５０５Ｃ、８３０５Ｃ（以上甲状腺癌細胞株）、ＭＥ−１８０（子宮頸癌細胞株）、Ｕ−９３７（単球系リンパ腫細胞株）を用いた。各細胞はＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  Ｐｌｕｓ（商標）  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）によりマイコプラズマ感染の無い事を確認した。これらの内、ＥＢＣ−１、８５０５Ｃ、８３０５Ｃ、ＭＥ−１８０は東北大学加齢医学研究所より御供与頂いた。【０１３１】
ＭＲＫ−ｎｕ−１、ＳＫ−ＢＲ−３、ＥＢＣ−１、ＫＡＴＯＩＩＩ、８３０５Ｃ、ＭＥ−１８０、Ｕ−９３７はＲＰＭＩ１６４０−１０％ＦＣＳ培地で、ＨｅｐＧ２はＤＭＥＭ−ＨＧ−１０％ＦＣＳ−５００Ｕ／ｍｌ  ｐｅｎｙｃｉｌｉｎ，１ｍｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ培地で、８５０５ＣはＥａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ−１０％ＦＣＳ培地で、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。ＭＲＫ−ｎｕ−１、ＫＡＴＯＩＩＩ、Ｕ−９３７は３〜４日おきに回収して、新たな培地に懸濁して継代した。ＳＫ−ＢＲ−３、ＨｅｐＧ２、ＥＢＣ−１は３〜４日おきにＰＢＳにて洗浄後、Ｔｒｐ−ＥＤＴＡ溶液（０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ／０．０２％  ＥＤＴＡ−ＰＢＳ中）を加え、３７℃、５分間インキュベートし、培養シャーレからはがし継代した。８５０５Ｃ、８３０５Ｃ、ＭＥ−１８０は３〜４日おきにＰＢＳにて洗浄後、０．０２％ＥＤＴＡ−ＰＢＳ溶液を加え、３７℃、５分間インキュベートし、培養シャーレからはがし継代した。【０１３２】
（２）ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出とＲＴ
上記９種の細胞から、ＳＶ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（商品名、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １μｇを鋳型とし、ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ａｍｂｉｏｎ社より）存在下でＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（商標）ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）から逆転写反応を行い、そこからＲＮａｓｅＨ（ＴＯＹＯＢＯ社）によりＲＮＡを除き、一本鎖ｃＤＮＡを作製した。【０１３３】
（３）ＰＣＲ
対照のヒト・Ｇ３ＰＤＨについては、２μｌの１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２μｌ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（各２ｍＭ）、１μｌの５μＭ  ｐｒｉｍｅｒ−ｓｅｎｓｅ、１μｌの５μＭ  ｐｒｉｍｅｒ−ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ、０．１μｌ  ＡｍｐｌｉＴａｑ（商標）  Ｇｏｌｄ、１μｌのｃＤＮＡテンプレートを含む）にＭｉｌｌｉＱ水を加えて２０μｌにしてＰＣＲ用チューブにいれ、サーマルサイクラーを用い、９５℃で１分で熱変性させた後、９５℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で４５秒を３０サイクル、７２℃で１０分の反応を行った。反応産物のうち１０μｌを０．５μｇ／ｍｌエチレンブロマイド含有１．５％  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｓにて泳動し、バンドを確認した。【０１３４】
本発明のヒト・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質については、上記Ｇ３ＰＤＨ  ＰＣＲと同様に反応液を調製した。９５℃、１０分で熱変性させた後、９５℃で１分、５２℃で３０秒、７２℃で１分を４５サイクル、７２℃で１０分の反応を行った。反応産物のうち１０μｌを０．５μｇ／ｍｌエチレンブロマイド含有１．５％  Ｓｅａｋｅｍ  ＭＥ  ａｇａｒｏｓｅにて泳動した。なお、用いた各プライマーは以下のとおりであった。
ヒト・Ｇ３ＰＤＨ：
センス  ｈＧ３ＰＤＨ−Ｆ：５’−ＧＡＣＣＣＣＴＴＣＡＴＴＧＡＣＣＴＣＡＡＣＴＡＣ−３’（配列番号：２１６）
アンチセンス  ｈＧ３ＰＤＨ−Ｒ：５’−ＣＡＧＴＧＡＴＧＧＣＡＴＧＧＡＣＴＧＴＧＧＴ−３’（配列番号：２１７）
ヒト・エピグリカニン関連ムチン
センス  ｈｅｐｉｎｔｍ−Ｆ：５’−ＣＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＧＣＡＴＣＴＡＣＴＧＣ−３’（配列番号：２１８）
アンチセンス  ｈｅｐｉｎｔｍ−Ｒ：５’−ＧＡＡＣＣＡＧＴＴＡＧＧＡＣＴＣＣＡＣＣＴＧＧＧＣＣ−３’（配列番号：２１９）
（３）ＰＣＲ産物のシークエンス確認
上記で確認されたバンドを切り出しＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（商品名、ＱＩＡＧＥＮ社）にてＰＣＲ産物を回収した。回収したＰＣＲ産物を、定法によりｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ（商品名、Ｐｒｏｍｅｇａ社）にサブクローニングし、ＡＢＩ（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）によりシークエンスを解析した。このシークエンス反応はＢｉｇＤｙｅ（商標）  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｖ１．１  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて行った。プラスミドＤＮＡをテンプレートとし、２μｌの１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４μｌ  Ｐｒｅｍｉｘ、３．２  ｐｍｏｌのｐｒｉｍｅｒ（Ｔ７、ＳＰ６）を含む）にＭｉｌｌｉＱ水を加えて２０μｌにしてＰＣＲ用チューブにいれ、サーマルサイクラーを用い、９６℃で１分の後、９６℃で１０秒、５０℃で５秒、６０℃え４分を２５サイクルの反応を行った。ＰＣＲ反応物をＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）  Ｇ５０  Ｆｉｎｅ  ＤＮＡ  Ｇｒａｄｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いてゲル濾過精製し、９５℃で２分熱変性させてから塩基配列の解析を行い、当該ＰＣＲ産物のシークエンスを確認した。【０１３５】
図１３に示したように、乳癌細胞株や肺癌細胞株、単球系リンパ腫細胞株、そして殊に子宮頸癌細胞株において、２７０ｂｐ付近に明瞭なバンドを観測した。【０１３６】
（４）正常ヒト組織での発現確認
上記ＰＣＲにより、ヒトの各種臓器由来のｃＤＮＡパネル（商品名：ｈｕｍａｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃＤＮＡ  ｐａｎｅｌ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、正常ヒト組織での本発明のエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質の発現についても確認した。当該ｃＤＮＡパネルは、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、甲状腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、大腸及び白血球組織から調製した標準化第一鎖ｃＤＮＡを含んでいた。図１５に示すとおり、当該遺伝子が肺、甲状腺及び大腸の正常組織でも発現していることが示唆された。【０１３７】
３−２.  Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法によるヒト・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質をコードするｃＤＮＡの単離
上記において目的遺伝子を高発現していることが判明した子宮頸癌細胞株ＭＥ−１８０のｍＲＮＡから、当該遺伝子の３’領域に対応する特異的プライマーを用いたＲＴ反応によりｃＤＮＡを調製し、次に得られたｃＤＮＡを鋳型とするＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲにより、本発明のヒト・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質をコードするｃＤＮＡを単離した。手順で以下のとおりであった。【０１３８】
（１）ｍ  ＲＮＡの抽出とＲＴ
ＭＥ−１８０株細胞から、μＭＡＣＳ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて、ｍＲＮＡを抽出した。抽出したｍＲＮＡ  ０．３５μｇを鋳型とし、ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ａｍｂｉｏｎ社）存在下でＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（商標）ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、本発明のヒト・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質の３’領域に対応するプライマー：ＣＣＴＡＴＡＡＣＴＧＡＧＴＴＣＡＴＣＴＣＡＧＡＧＣ（配列番号：２２０）から逆転写反応を行い、ＲＮａｓｅＨ（ＴＯＹＯＢＯ社）によりＲＮＡを除き、一本鎖ｃＤＮＡを作製した。【０１３９】
（２）Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法によるヒト・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質をコードする領域の増幅
２μｌの１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ、２μｌ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（各２ｍＭ）、１．２μｌの５μＭ  ｐｒｉｍｅｒ−ｓｅｎｓｅ−１、１．２μｌ  ５μＭ  ｐｒｉｍｅｒ−ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ−１、０．５μｌ  ＫＯＤ−ｐｌｕｓ（商標）、０．４８μｌの２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１μｌのｃＤＮＡテンプレートにＭｉｌｌｉＱ水を加えて２０μｌにしてＰＣＲ用チューブにいれ、サーマルサイクラーを用い、９５℃、５分で熱変性させた後、９５℃で３０秒、６８℃で３分を２５サイクル、６８℃で１０分の反応を行った。得られたＰＣＲ産物の内１０μｌをエタノールで沈殿させ、１１．３μｌ  ＭｉｌｌｉＱ水を加えて溶解し、その全量を鋳型として２μｌの１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ、２μｌ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（各２ｍＭ）、１．２μｌの５μＭ  ｐｒｉｍｅｒ−ｓｅｎｓｅ−２、１．２μｌの５μＭ  ｐｒｉｍｅｒ−ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ−２、０．５μｌ  ＫＯＤ−ｐｌｕｓ（商標）、０．８μｌの２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４を加え２０μｌにし、ＰＣＲ用チューブにいれ、サーマルサイクラーを用い、９５℃、５分で熱変性させた後、９５℃で３０秒、６８℃で３分を２５サイクル、６８℃で１０分の反応を行った（ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ）。反応産物の全量を０．５μｇ／ｍｌエチレンブロマイド含有０．７％  Ｓｅａｋｅｍ  ＭＥ  ａｇａｒｏｓｅにて泳動し、約２ｋｂｐ付近に確認されたバンドを切り出しＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（商品名、ＱＩＡＧＥＮ社）にて回収した。回収したＰＣＲ産物を、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングし、ＡＢＩ（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）によりシークエンスを解析した。このシークエンス反応はＢｉｇＤｙｅ（商標）  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｖ１．１  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて行った。プラスミドＤＮＡをテンプレートとし、２μｌの１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４μｌ  Ｐｒｅｍｉｘ、３．２ｐｍｏｌのｐｒｉｍｅｒ（Ｔ７、Ｔ３、ｈｅｐｉｓｅｑ５−Ｆ、ｈｅｐｉｓｅｑ３−Ｒ）を含む）にＭｉｌｌｉＱ水を加えて２０μｌにしてＰＣＲ用チューブにいれ、サーマルサイクラーを用い、９６℃で１分の後、９６℃で１０秒、５０℃で５秒、６０℃で４分を２５サイクルの反応を行った。Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）  Ｇ５０  Ｆｉｎｅ  ＤＮＡ  Ｇｒａｄｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いてゲル濾過精製し、９５℃で２分間熱変性させてから、塩基配列の解析を行った。なお、上記の各プライマーは以下のとおりであった。
ヒト・エピグリカニン関連ムチン
センス−１  ｃｌｏｎｅｓｔ５−１  Ｆ：５’−ＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＡＡＣＣＣＡＧＧＣＡＴＣＣＡＧＣＴＧＣＣＣＡＣＧＣＣ−３’（配列番号：２２１）
アンチセンス−１  ｃｌｏｎｅｓｔ３−１  Ｒ：５’−ＧＴＴＣＡＴＣＴＣＡＧＡＧＣＴＡＧＡＴＡＣＣＣＡＣＣＣＣＧＧＧＧＣ−３’（配列番号：２２２）
センス−２  ｃｌｏｎｅｓｔ５−２  Ｆ：５’−ＣＣＣＡＧＧＡＡＣＡＣＡＡＡＣＧＴＡＧＧＡＧＡＣＣＣＡＣＧＣＴＣＣＴＧ−３’（配列番号：２２３）
アンチセンス−２  ｃｌｏｎｅｓｔ３−２  Ｒ：５’−ＣＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＴＣＣＴＧＧＧ−３’（配列番号：２２４）
シークエンス解析用プライマー
ｈｅｐｉｓｅｑ５−Ｆ：５’−ＧＧＴＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＡＴＴＴＡＧＡＡＧＣＴＧＣ−３’（配列番号：２２５）
ｈｅｐｉｓｅｑ３−Ｒ：５’−ＴＴＧＴＧＴＧＣＡＴＴＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＣ−３’（配列番号：２２６）
解析の結果、配列番号：１７４に示される配列を有する本発明のヒト・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質ｃＤＮＡを単離できた。
【実施例４】
【０１４０】
実施例４：腫瘍組織におけるヒト・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質遺伝子の特異的発現
ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社からのＣａｎｃｅｒ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ＡｒｒａｙＩＩ（商品名）を用いて、本発明のヒト・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質ｃＤＮＡからの膜貫通領域セグメント（約２７０ｂｐ）をもとに設計したプローブにより、ヒト正常組織及び腫瘍組織間での該遺伝子発現プロフィールを分析した。なお、このメンブレン・ベース・アレイ上には、各個体からの数種類の腫瘍組織及びそれらに対応する正常組織において発現する総ｍＲＮＡを並行してスポットしてあり、それと特定のプローブのハイブリダイゼーションを観察することにより、該特定の遺伝子の特異的発現プロフィールを解析することができる。詳細は以下のとおりであった。【０１４１】
（１）プローブの作製
ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（前出）に組み込んで増幅したプローブを用いた。すなわち、該ベクターを含有する大腸菌を５μｇ／ｍｌ  Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ含有３  ｍｌのＬＢ培地で３７℃、８時間以上培養した。次いで、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ（商品名、Ｍａｃｈｅｒｅｙ  −Ｎａｇｅｌ社）にて培養物からプラスミドＤＮＡを抽出してＥｃｏＲＩで３時間処理し、０．５μｇ／ｍｌエチレンブロマイド含有１．５％  Ｓｅａｋｅｍ  ＭＥ  ａｇａｒｏｓｅで泳動し、インサート部分を切り出した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （商品名、ＱＩＡＧＥＮ社）にて目的のプローブＤＮＡを抽出した。【０１４２】
該プローブのシークエンス（２６９ｂｐ）は、
５’−ＣＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＧＣＡＴＣＴＡＣＴＧＣＡＧＴＧＡＧＴＧＡＧＧＣＡＡＡＧＣＣＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＣＴＧＧＴＧＣＣＧＴＧＧＧＡＡＡＴＣＴＴＣＣＴＣＡＴＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＴＣＧＧＴＴＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＴＧＧＧＧＣＴＣＴＴＴＧＣＴＧＧＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＴＧＴＧＡＧＡＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＴＡＡＣＡＣＡＧＣＴＧＴＣＴＡＣＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＧＣＣＴＣＡＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＧＴＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＧＡＡＴＣＡＴＧＧＡＧＣＣＣＣＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＡＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＡＡＣＴＧＧＴＴＣ−３’（配列番号：１７６）
であった（下線部は、ｈｅｐｉｎｔｍ−Ｆ、Ｒに対応する配列）。【０１４３】
（２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ＡｒｒａｙＩＩを用いた解析
Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ＡｒｒａｙＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、ハイブリダイゼーションを行った。具体的に、９５℃で５分間変性させた１ｍｇ  ｓｈｅａｒｅｄ  ｓａｌｍｏｎ  ｔｅｓｔｉｓ  ＤＮＡ（ＳＩＧＭＡ社）を添加したＥｘｐｒｅｓｓ  Ｈｙｂ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（商品名、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）の１０ｍｌに対して６８℃で３０分間以上アレイのメンブレンをプレハイブリダイゼーションした。一方、上記のプローブをＲｅｄｉｐｒｉｍｅ（商品名、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社）によりα−３２Ｐ−ｄＣＴＰにてラベルした後、ＮＩＣＫ  ｃｏｌｕｍｎ（商品名、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社）で分離した。分離物のカウントを測定してそれが２×１０６ｃｐｍ／ｍｌになるように調整すべく０．１５ｍｇ  ｓｈｅａｒｅｄ  ｓａｌｍｏｎ  ｔｅｓｔｉｓ  ＤＮＡ（ＳＩＧＭＡ社）と共に新たなＥｘｐｒｅｓｓ  Ｈｙｂ  ｓｏｌｕｔｉｏｎの５ｍｌに混合し、９５℃で１０分変性させた後、これを上記メンブレンと６８℃で１晩ハイブリダイゼーションした。翌日、２×ＳＳＣ−０．５％ＳＤＳ溶液にて６８℃で３０分洗浄を三回行い、二次洗浄として、０．２×ＳＳＣ−０．５％ＳＤＳ溶液にて６８℃で３０分洗浄を一回行った。２×ＳＳＣ溶液にてＳＤＳを除いた後、イメージングプレート（富士フィルム社製）に感光し、ＢＡＳ１８００（富士フィルム社製）にて現像を行った。【０１４４】
図１４に示されるように、各腫瘍組織と正常組織間の比較において、子宮体部及び子宮頸部の正常組織における発現が最も顕著であったが、そのレベルは個体間で一定していなかった。当該組織において特筆すべきことは、固体ごとの腫瘍及び正常組織のペアを比較すると、腫瘍組織において発現が顕著であるときには正常組織にける発現が低下しており、また、逆も真であった。【０１４５】
殊に、甲状腺及び精巣においては腫瘍組織において常に正常組織を上回る発現が観察された。肺、胃、外陰、直腸及び皮膚に関しては数固体からの腫瘍組織或いは正常組織において発現が見られた。乳腺腫瘍組織において本発明のヒト・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質の発現は観察されなかった。【０１４６】
このことから、本発明のエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質は、少なくともこれら甲状腺腫瘍細胞や精巣腫瘍細胞の腫瘍マーカーとして有用であることが確認された。
【実施例５】
【０１４７】
実施例５：形質転換宿主細胞におけるヒト・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質の発現
Ｎ末端側にＦＬＡＧエピトープ・タグを付加した前記ヒト・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質のコード配列を哺乳動物発現用ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入した。また、当該コード配列を含まないプラスミドを対照とした。これらのプラスミドをＡＴＣＣより入手したヒト骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２にエレクトロポレーションによって導入した。ジェネティシン（Ｇ４１８硫酸塩；ＣａｌｂｉｏＣｈｅｍ社）により選択した後、限界希釈法によって形質転換細胞をクローニングした。エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質の当該細胞上での発現を検出するためのフローサイトメトリーは、抗ＦＬＡＧ−Ｍ２抗体（シグマ社）とＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を組み合わせて、Ｅｐｉｃｓ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＸＬ（商品名）フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を用いて行った。一方、当該細胞表面上のムチン様糖タンパク質特異的糖鎖エピトープ検出のために、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのビオチン化Ｖｉｃｉａ  ｖｉｌｌｏｓａ(ビロードフジクサ)アグルチニン−Ｂ４（：ＶＶＡ−Ｂ４）及び生化学工業社製のビオチン化Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ（ピーナッツ）アグルチニン（：ＰＮＡ）をフィコエリスリン標識ストレプトアビジン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）と共に用いた。なお、死細胞は除外した。【０１４８】
ウエスタン・ブロットのため、細胞を回収しＰＢＳで２回洗浄した。洗浄後、細胞を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４；０．５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、０．２５Ｍ  Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．０５ｍＭ  塩化カルシウム、  ２ｍＭ  ＥＤＴＡ及びｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（１／１０００希釈、シグマ社）含有）で溶解し、１４，０００ｒｐｍ、４℃、２０分間遠心分離した。上清を回収して、ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙｓ（Ｐｉｅｒｃｅ社）で定量することにより２５μｇタンパク質に相当する細胞溶解物を得た。該細胞溶解物は、緩衝液（０．２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ６．８）、４０％  グリセロール、８％  ＳＤＳ、０．００１％  ブロムフェノールブルー）中、１％（ｖ/ｖ）２−メルカプトエタノールとともに煮沸し、８％ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動の後にポリビニリデン・フルオライド膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（商標）、ミリポア社）に写した。０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０含有ＰＢＳ中の３％ＢＳＡにより該膜をブロッキングした後、３％ＢＳＡ及び０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０含有Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で希釈したビオチン化抗ＦＬＡＧ−Ｍ２抗体（シグマ社、１／１０００希釈）、２．５μｇ／ｍｌのビオチン化ＶＶＡ−Ｂ４、又は２．５μｇ／ｍｌのビオチン化ＰＮＡとともに室温で２時間インキュベートした。同一の条件で抗マウスＩｇＧ1抗体（Ｚｕｍｅｄ社）を使用して抗体染色の陰性対照とした。３％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０含有Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水で１０００倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ−ストレプトアビジン・コンジュゲート（Ｚｙｍｅｄ社）をウエスタン・ブロットで、アルカリフォスファタ−ゼ−ストレプトアビジン・コンジュゲート（Ｖｅｃｔｏｒ社）をレクチン・ブロットで、夫々、用いて、結合を調べた。結合した抗体及びレクチンは、夫々、ＥＣＬ検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）及びアルカリフォスファターゼ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ社）により可視化した。【０１４９】
図１６に示すように、前記抗ＦＬＡＧ抗体は本発明のヒト・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質で形質転換した細胞（Ｋ５６２／ＭＵＣ２１）にのみ結合し、対照プラスミドによる形質転換細胞（Ｋ５６２／Ｍｏｃｋ）には結合しなかった。このことは、当該遺伝子産物が細胞表面に遍在して発現することを示す。更に、ＶＶＡ−Ｂ４及びＰＮＡは対照プラスミド形質転換細胞よりも本発明のヒト・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質で形質転換した細胞に対して顕著に結合することが判り、これは当該遺伝子による形質転換細胞の表面に多くのＯ−結合型糖鎖が提示されたことを示している（図１６Ａ）。本発明の形質転換細胞の溶解物に関するＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、約２００−２３０ｋＤａに移動する分子に対して抗ＦＬＡＧ抗体が顕著に結合したが、対照件質転換細胞において当該結合は観察されなかった。ＶＶＡ−Ｂ４及びＰＮＡのレクチン・ブロットでも同じ結果が得られたが、但しＣｏｎＡによるブロットでは結合が観測されなかった（図１６Ｂ）。このことは、Ｏ−結合型糖鎖が本発明の遺伝子産物に結合することを実証する。また、少なくともこの発現系において当該遺伝子産物の見掛けの分子量はおよそ２３０ｋＤａと見積もられ、ペプチド部分の分子量約５７ｋＤａより極めて大きなことが判明した。
【実施例６】
【０１５０】
実施例６：ヒト・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質特異的抗血清を用いた細胞及び組織染色
６−１．合成ペプチドを免疫原としたヒト・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質特異的抗血清の作製
（１）合成ペプチドの作製
本発明のヒト・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質の細胞質内領域に位置する部分配列１７アミノ酸残基（配列番号：１７１のアミノ酸配列の第５８０−５９６位から成る１７アミノ酸残基）のN末にシステインを付加した合成ペプチドを作成した。該ペプチド合成は、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｉｏｎｅｅｒ社）を用いてＦ−ｍｏｃ固層合成法により行った。合成に使用したＦ−ｍｏｃアミノ酸は、全てＯＨ体（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）をそれぞれ０．４ｍｍｏｌ使用した。合成後、ペプチド脱離試薬（０．７ｇ  ｐｈｅｎｏｌ、０．３ｍｌ  ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌ、０．２ｍｌ  ｅｔｈａｎｅｄｉｔｈｉｏｌ、９．５ｍｌ  ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）と共にレジンを室温で２時間反応させてペプチドを外し、脱保護を行った。グラスフィルターで濾過してレジンを除き、ジエチルエーテルで数回洗浄し、ペプチドを析出させた。析出したペプチドを最小量のＭｉｌｌｉＱ（商標）水に溶かした。【０１５１】
（２）精製
逆層ＨＰＬＣ（日本分光社製）を用いて上記合成ペプチドを精製した。カラムは５Ｃ１８カラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ（商標）、ナカライテスク社）を用い、カラム温度４０℃、流速２ｍｌ／ｍｉｎで分離を行った。４ｍｇの精製前合成ペプチドをカラムにアプライ後、Ｊａｓｃｏ  ＰＵ−１５８０ポンプ（商品名、日本分光社）を用いて溶媒Ａ（０．０５％  ＴＦＡ／ＭｉｌｌｉＱ（商標）水）を３０分かけて溶媒Ａ：溶媒Ｂ（０．０５％  ＴＦＡ／プロパノール）：アセトニトリル（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）＝５０％：３５％：１５％に置換し、その後３５分かけて溶媒Ｂ：溶媒Ｃ＝７０：３０に段階的に置換しながら溶出を行った。その後、５分間同組成で溶出後、続いて溶媒Ａにより平衡化を１５分間行った。分取した画分をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ（ＶｏｙａｇｅｒＥｌｉｔｅ（商品名）、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）にて質量分析を行い、目的の画分を回収した。精製したペプチドを凍結乾燥し、−２０℃に保存した。【０１５２】
（３）キャリアータンパク質との共有結合
ＫＬＨ  ２０ｍｇ（ＣａｌｂｉｏＣｈｅｍ社）を１ｍｌの０．０１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解し、同緩衝液に対して一晩透析を行った。透析した溶液にＭＢＳ溶液（５ｍｇ  ＭＢＳ（ＳＩＧＭＡ社）／１７ｍｌ  ＤＭＦ（和光純薬社））を加えて室温で３０分振とうし、ＫＬＨとＭＢＳを結合させた。反応溶液をｅｃｏｎｏ−ｐａｃ  ＧＤ１０カラム（商品名、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）によって、０．０５Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いてゲル濾過した。各フラクションの吸光度を測定して、ＫＬＨ−ＭＢＳが含まれている画分を取得した。上記の凍結乾燥した合成ペプチド１ｍｇを０．６ｍｌの０．０１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解し、そこに前記で分取したＫＬＨ−ＭＢＳをゆっくりと攪拌しながら加え、ＨＣｌでｐＨ７．０〜７．５に合わせた。そのまま室温で３時間反応させ、該反応液をＰＢＳ（１Ｌ）に対して４℃で１晩透析した。これを分注し、−２０℃に保存した。ＢＳＡに対しても、同様に共有結合体を作成した。【０１５３】
（４）免疫と血清採取
日本白色ウサギ（２〜２．５ｋｇ、雌）は日本医科学動物資材研究所より購入し、東京大学薬学部動物施設で飼育した。実験には購入後１週間予備飼育したウサギを用いた。ＫＬＨと共有結合させたペプチド０．２ｍｇ分の溶液とＦｒｅｕｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ（ＮＡＫＡＲＡＩ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ社）を混合してエマルジョンを作製し、ウサギに皮下投与した。免疫は２週間毎に行い、２回目以降の追加免疫はＦｒｅｕｎｄ  ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔとＫＬＨと共有結合させたペプチド０．１ｍｇ分の溶液を混合してエマルジョンを作製し、免疫した。追加免疫一週間後、ウサギ耳静脈より採血をおこなった。３７℃で１時間インキュベートした後に、４℃で１晩静置して血液凝固させ、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、その上清を血清とした。【０１５４】
（５）ＥＬＩＳＡ法による抗体価の測定
９６穴ＥＬＩＳＡプレートに、抗原として０．０５Ｍ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．６）に溶解した１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ結合合成ペプチド及び２０ｍｇ／ｍｌのＫＬＨと２０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡをそれぞれ加え、４℃にて一晩静置した。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳ中）にて３回洗浄後、３％  ＢＳＡ（ＰＢＳ中）にて室温にて２時間ブロッキングを行った。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳ中）にて３回洗浄後、１％  ＢＳＡ（ＰＢＳ中）で希釈した上記のウサギ血清を加え、室温にて２時間反応させた。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳ中）にて３回洗浄後、１％  ＢＳＡ（ＰＢＳ中）にて１０００倍希釈したＨＲＰ−Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ  Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ社）を二次抗体として室温で１時間反応させた。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳ中）にて５回洗浄後、１ｍＭ  ＡＢＴＳの１μｌ／ｍｌ  Ｈ２Ｏ２溶液で発色させ、吸光度４０５／４９２ｎｍを測定した。【０１５５】
６−２．ヒト・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質特異的抗血清を用いた細胞染色
ヒト・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質強発現細胞株（Ｋ５６２／ＭＵＣ２１）の１×１０４ｃｅｌｌを、５０μｌのＦＣＳと共にスライドガラスに固定化されたｃｙｔｏ  ｆｕｎｎｅｌ  ｄｏｕｂｌｅ（商品名、Ｔｈｅｒｍｏ社）に加え、Ｃｙｔｏｓｐｉｎ３（商品名、Ｔｈｅｒｍｏ社）を用いてｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｂｒｏｍｉｄｅ  １ｍｇ／ｍｌ（和光純薬）を塗布したスライドガラス上に貼り付けた。１時間以上室温で風乾後、アセトンで１０分間固定・透過処理し再び風乾した。細胞の周りをｐａｐ  ｐｅｎ（商品名、大同産業社）で囲んでから、ＰＢＳに５分間浸し、膨潤させた。２％  ＮＧＳ及び３％  ＢＳＡのＰＢＳ溶液１００μｌを加え、室温で３０分間ブロッキングを行った。その後、一次抗体として、２％  ＮＧＳ及び３％  ＢＳＡのＰＢＳ溶液にて５０００倍に希釈した前記ヒト・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質特異的ウサギ血清１００μｌを加え、４℃で１晩反応させた。ＰＢＳで５分間、３回洗浄した後、二次抗体として、ＡＰ−ｇｏａｔ  ａｎｔｉ  ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｚｙｍｅｄ社）を２％  ＮＧＳ及び３％  ＢＳＡのＰＢＳ溶液で１００倍希釈した溶液１００μｌで、室温３０分間反応させた。ＰＢＳで５分間、１回；ＴＢＳで５分間、２回洗浄した後、切片にＨｉｓｔＭａｒｋ  ＲＥＤ（Ｋｉｒｋｅｇａａｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．製）１００μｌで１０分間程反応させた。ＰＢＳに浸し酵素反応停止後、Ａｑｕａ  Ｐｏｌｙ  Ｍｏｕｎｔ（ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅ社）で封入した。対照細胞はＫ５６２／Ｍｏｃｋを用いた。【０１５６】
結果を図１７に示す。本発明のヒト・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質特異的ウサギ血清により当該糖タンパク質を発現する細胞が特異的に染色された。【０１５７】
６−３．ヒト・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質特異的抗血清を用いた組織染色
（１）検体サンプル
東京大学医学部付属病院病理部より借用した甲状腺乳頭癌のパラフィン包埋ブロックを検体サンプルとした。
（２）切片作製
ミクロトームで５μｍの切片を作製し、ＭＡＳコートスライドガラス（マツナミガラス社）上に接着させた。組織切片は１晩、３７℃で乾燥させてから染色に使用した。
（３）
脱パラフィン操作のため、キシレンに１０分間、３回、１００％  エタノールに２分、２回、１００％、９０％、８０％及び７０％のエタノールにそれぞれ２分、１回浸した後、１０分以上水洗した。抗原の賦活化のため、電子レンジで沸騰させた１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に１５分間浸し、その後２０分間室温で放冷した。ＰＢＳで５分間、３回洗浄した後、内在性のペルオキシダーゼを不活化するため、１％  Ｈ２Ｏ２（ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水中）に３０分間浸した。ＰＢＳで５分間、３回洗浄した後、細胞の周りをｐａｐ  ｐｅｎ（大同産業社）で囲み、ａｖｉｄｉｎ／ｂｉｏｔｉｎ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ社）のａｖｉｄｉｎ  Ｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ４ｄｒｏｐｓ／ｍｌを加えた２％  ＮＧＳ及び３％  ＢＳＡのＰＢＳ溶液５００ｍｌを加え、室温で３０分間ブロッキングを行った。その後、一次抗体として、ａｖｉｄｉｎ／ｂｉｏｔｉｎ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ社）のｂｉｏｔｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ４ｄｒｏｐｓ／ｍｌを加えた２％  ＮＧＳ及び３％  ＢＳＡのＰＢＳ溶液にて２０００倍に希釈したウサギ血清３００μｌを加え、４℃で１晩反応させた。ＰＢＳで５分間、３回洗浄した後、二次抗体として、ｂｉｏｔｉｎ−ｇｏａｔ  ａｎｔｉ  ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｚｙｍｅｄ社）を２％  ＮＧＳ及び３％  ＢＳＡのＰＢＳ溶液で２００倍希釈した溶液３００μｌで、室温３０分間反応させた。ＰＢＳで５分間、３回洗浄した後、三次抗体として、ＺｙＭａｘＴＭ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｚｙｍｅｄ社）を２％  ＮＧＳ及び３％  ＢＳＡのＰＢＳ溶液で１００倍希釈した溶液３００μｌで、室温３０分間反応させた。ＰＢＳで５分間、４回洗浄した後、ＡＥＣ−Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｅｄ社）の２００μｌで５分間程反応させた。ＰＢＳで５分間、１回洗浄した後、Ｍａｙｅｒ’ｓ  Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（武藤純化学社）で室温２分間核染色を行い、１０分以上水洗した。Ａｑｕａ  Ｐｏｌｙ  Ｍｏｕｎｔ（ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅ社）で封入した。結果を図１８に示した。
【産業上の利用可能性】
【０１５８】
本発明のエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質は、組織適合性抗原との関連において組織の他家移植性を説明し、或いは腫瘍の存在及びその悪性度の指標となるとともに当該腫瘍に対する保護を提供し得るので、そのような用途において診断及び医薬産業において有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】ＴＡ３−Ｈａ細胞及びＴＡ３−Ｓｔ細胞の表面糖鎖の確認を示す。ＴＡ３−Ｈａ細胞及びＴＡ３−Ｓｔ細胞をＰＮＡ及びＶＶＡで、夫々、染色しフローサイトメーターで蛍光を検出した。
【図２】ＴＡ３−Ｈａ細胞及びＴＡ３−Ｓｔ細胞における各種ムチンの発現を示す。ＴＡ３−Ｈａ細胞及びＴＡ３−Ｓｔ細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲにより該細胞での各種ムチンの発現の有無を確認した。
【図３】ＴＡ３−Ｈａ細胞及びＴＡ３−Ｓｔ細胞における本発明のムチン様糖タンパク質の発現を示す。ＴＡ３−Ｈａ細胞及びＴＡ３−Ｓｔ細胞からｍＲＮＡを抽出し、ノザンブロッティング法により本発明のムチン様糖タンパク質の発現の有無を確認した。ａ：ミニゲルでの泳動。ｂ：ラージゲルでの泳動。
【図４】マウスＤＮＡのＰＣＲによる本発明のムチン様糖タンパク質遺伝子の検出を示す。Ｃ５７ＢＬ/６Ｎマウス及び１２９ＳＶＪマウスの尾から、夫々、ＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによって本発明のムチン様糖タンパク質遺伝子を増幅した。
【図５】ファージクローンのＤＮＡのサザンブロッティングによる本発明のムチン様糖タンパク質遺伝子の検出を示す。プラークハイブリダイゼーション法により取得したファージクローン（ａ〜ｆ）のＤＮＡを抽出し、各種制限酵素で処理後、サザンブロッティング法により本発明のムチン様糖タンパク質遺伝子を検出した。
【図６】クローニングした本発明のマウス・ムチン様糖タンパク質の構造を示す。
【図７】ＴＡ３−Ｈａ細胞における本発明のムチン様糖タンパク質の発現を示す。ＴＡ３−Ｈａ細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲにより本発明のムチン様糖タンパク質のｃＤＮＡを確認した。
【図８】被免疫ウサギ血清中の抗ｅｐｉｔｍ抗体及び抗ｅｐｉｎｔｍ抗体の検出を示す。ｅｐｉｔｍペプチド或いはｅｐｉｎｔｍペプチドで数回免疫したウサギ血清中の特異的抗体を、当該ペプチドを抗原としたＥＬＩＳＡにて検出した。塗りつぶした菱形及び円は免疫後の、空白の菱形及び円は免疫前の血清からの結果を示す。
【図９】抗ｅｐｉｔｍ及び抗ｅｐｉｎｔｍポリクローナル抗体によるＴＡ３−Ｈａ細胞及びＴＡ３−Ｓｔ細胞のフローサイトメトリー分析結果を示す。ＴＡ３−Ｈａ細胞及びＴＡ３−Ｓｔ細胞を各ポリクローナル抗体で染色し、フローサイトメトリーで蛍光を検出した。
【図１０】抗ｅｐｉｔｍ及び抗ｅｐｉｎｔｍポリクローナル抗体によるＴＡ３−Ｈａ細胞及びＴＡ３−Ｓｔ細胞のウエスタンブロッティングを示す。ＴＡ３−Ｈａ細胞及びＴＡ３−Ｓｔ細胞からの各細胞抽出液を電気泳動し、ウエスタンブロッティング法により、ポリクローナル抗体で染色を行った。
【図１１】Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの組織における本発明のムチン様糖タンパク質の発現を示す。Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの各組織からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、ノザンブロッティング法により本発明のムチン様糖タンパク質の発現の有無を確認した。
【図１２】マウス癌細胞株における本発明のムチン様糖タンパク質の発現を示す。各マウス癌細胞株からｍＲＮＡを抽出し、ノザンブロッティング法により本発明のムチン様糖タンパク質の発現の有無を確認した。
【図１３】９種類のヒト細胞株における本発明のヒト・ムチン様糖タンパク質の発現を示す。各ヒト細胞株からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、ＲＴ-ＰＣＲにより本発明のヒト・ムチン様糖タンパク質の発現の有無を確認した。
【図１４】ヒトの正常及び腫瘍組織における本発明のヒト・ムチン様糖タンパク質の発現解析結果を示す。各臓器において、Ｎは正常組織、Ｔは腫瘍組織を示す。
【図１５】正常ヒト組織における本発明のエピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質の発現を示す。上段が本発明遺伝子のためのプローブ、下段はＧ３ｐｄｈプローブによる。
【図１６】形質転換宿主細胞におけるヒト・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質の発現を示す。Ａ：フローサイトメトリー解析結果（縦軸は細胞数、横軸は蛍光強度）。Ｂ：ウエスタン及びレクチン・ブロット解析結果（数値はｋＤａ）。Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  ｍＡｂ：抗ＦＬＡＧ−Ｍ２抗体。ＶＶＡ−Ｂ４：Ｖｉｃｉａ  ｖｉｌｌｏｓａアグルチニン−Ｂ４。ＰＮＡ：Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａアグルチニン。Ｋ５６２／ＭＵＣ２１（ＭＵＣ２１）：本発明のヒト・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質で形質転換した細胞。Ｋ５６２／Ｍｏｃｋ（Ｍｏｃｋ）：対照プラスミドによる形質転換細胞。
【図１７】ヒト・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質強発現細胞株における特異的抗体染色を示す。Ａ：免疫前のウサギ血清による陰性対照細胞（Ｋ５６２／Ｍｏｃｋ）の染色結果。Ｂ：免疫前のウサギ血清によるヒト・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質強発現細胞株（Ｋ５６２／ＭＵＣ２１）の染色結果。Ｃ：ヒト・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質特異的ウサギ抗血清による陰性対照細胞の染色結果。Ｄ：ヒト・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質特異的ウサギ抗血清による強発現細胞株の染色結果。発現が検出された部位のうち、代表的なものを矢印で示した。
【図１８】甲状腺乳頭癌における特異的抗体染色を示す。Ａ：免疫前のウサギ血清による当該組織の染色結果。Ｂ：ヒト・エピグリカニン関連ムチン様糖タンパク質特異的ウサギ抗血清による当該組織の染色結果。発現が検出された部位のうち、代表的なものを矢印で示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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