(57)【要約】  細胞の大きさに依存しないエレクトロポレーションにより、高効率の外来物質の導入を実現することができる細胞内物質導入装置、細胞を多くの部位でクランプすることが可能な細胞クランプ装置、流路を効率よく形成することができる流路の形成方法を提供する。  細胞内物質導入装置１０ａは、小孔１を有する絶縁性薄膜２と、小孔１に対向して絶縁性薄膜２の両側に配置された一対の電極６，７とを備える。小孔１に細胞９を固定するとともに、空間５に細胞９内に導入したい物質４を含む流体を満たした状態で、電極６，７間にパルス電圧を印加することによって、小孔部分への電界集中を利用して細胞膜を破壊して、細胞９内に物質４を導入する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
小孔を有する絶縁性薄膜と、
前記小孔に対向して前記絶縁性薄膜の両側に配置された一対の電極とを備え、
前記絶縁性薄膜に関して一方の領域において前記小孔に細胞を固定するとともに、前記絶縁性薄膜に関して他方の領域において前記小孔に連続する空間に前記細胞内に導入したい物質を含む流体を満たした状態で、前記一対の電極間にパルス電圧を印加することによって生ずる小孔部分への電界集中を利用して、前記細胞の細胞膜を破壊して前記細胞内に前記物質を導入することを特徴とする、細胞内物質導入装置。
【請求項２】
前記絶縁性薄膜の厚さをｄ、誘電率をε、前記一対の電極の間隔をＬ、流体の抵抗率をρとした時、系の時定数τ=ερＬ／ｄが１０ミリ秒以下となるように、前記絶縁性薄膜の厚さｄ、前記誘電率ε、前記一対の電極の間隔Ｌ、前記流体の抵抗率ρが選ばれたことを特徴とする、請求項２に記載の細胞内物質導入装置。
【請求項３】
前記一対の電極のうち、前記絶縁性薄膜の細胞が存在する側に置かれた電極が、前記小孔より、前記小孔直径の１０倍以上離れた位置に置かれていることを特徴とする、請求項１又は２に記載の細胞内物質導入装置。
【請求項４】
前記小孔の直径が、前記細胞の直径の１／３以下であることを特徴とする、請求項１、２又は３に記載の細胞内物質導入装置。
【請求項５】
前記一対の電極間に印加する前記パルス電圧が１０Ｖ以下であることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか一つに記載の細胞内物質導入装置。
【請求項６】
前記絶縁性薄膜に関して前記他方の領域において、前記小孔に連続する前記空間が、前記小孔の部分を除いて密閉されることを特徴とする、請求項１ないし５のいずれか一つに記載の細胞内物質導入装置。
【請求項７】
前記絶縁性薄膜の前記小孔周辺に、前記細胞に接着する表面修飾を施したことを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか一つに記載の細胞内物質導入装置。
【請求項８】
光硬化性樹脂からなる樹脂膜を備え、
該樹脂膜は、
該樹脂膜の一方の主面に形成された、細胞を固定するための開口と、
該開口に連続する小孔と、
該小孔に連通する連通孔とを複数組有することを特徴とする、細胞クランプ装置。
【請求項９】
前記樹脂膜を支持する基板を備え、
該基板に、前記開口に対向する前記小孔の底面から前記連通孔に沿って延在する導電膜が形成されたことを特徴とする、請求項８に記載の細胞クランプ装置。
【請求項１０】
前記一方の主面に沿って配置されるベース部と、
前記ベースを介して前記開口に対向し、前記ベース部から前記開口とは反対側に突出する突起部と、
前記突起部の先端と前記開口との間を連通する貫通孔とを有する、柱状支持部材をさらに備えたことを特徴とする、請求項８又は９に記載の細胞クランプ装置。
【請求項１１】
透明な基板の少なくとも一方の主面に、光の透過を阻止する遮光パターンを形成する第１のステップと、
前記基板の前記一方の主面又は他方の主面に光硬化性樹脂を塗布する第２のステップと、
前記基板に関して前記光硬化性樹脂とは反対側から、前記基板に対して異なる角度で光を照射し、前記光硬化性樹脂内において、前記遮光パターンに沿って延在する非透過領域以外の領域を前記光が透過するようにして、前記光硬化性樹脂の前記光が透過した部分を硬化させる第３のステップと、
前記前記光硬化性樹脂の前記非透過領域を除去する第４のステップとを備え、
前記第１のステップにおいて、前記遮光パターンは、細長い第１部分と、該第１部分に連続しかつ該第１部分の延在方向に対して略直角方向に広がった第２部分との少なくとも一方を含み、
前記第３のステップにおいて、前記非透過領域は、前記遮光パターンの前記第１部分に対応する第１領域と、前記遮光パターンの前記第２部分に対応する第２領域との少なくとも一方を含み、
前記第１領域は、前記光硬化性樹脂内の前記基板側に延在し、
前記第２領域は、前記光硬化性樹脂内の前記基板側から前記光硬化性樹脂の前記基板とは反対側の主面まで延在し、
前記第４のステップにおいて、
前記非透過領域の前記第１領域を除去して、前記基板に沿って延在する横孔を形成し、
前記非透過領域の前記第２領域を除去して、前記前記光硬化性樹脂の前記基板とは反対側の前記主面に開口を有する縦孔を形成することを特徴とする、流路の形成方法。
【請求項１２】
前記第１のステップにおいて、前記基板の一方の主面に、導電材料を用いて前記遮光パターンを形成し、
前記第２のステップにおいて、前記基板の前記一方の主面に前記光硬化性樹脂を塗布することを特徴とする、請求項１１に記載の流路の形成方法。
【請求項１３】
透明な基板の一方の主面に光硬化性樹脂を塗布する第１のステップと、
前記基板の他方の主面に沿って、遮光パターンを有するマスク部材を配置する第２のステップと、
前記マスク部材側から、前記マスク部材に対して異なる角度で光を照射し、前記光硬化性樹脂内において、前記遮光パターンに沿って延在する非透過領域以外の領域を前記光が透過するようにして、前記光硬化性樹脂の前記光が透過した部分を硬化させる第３のステップと、
前記前記光硬化性樹脂の前記非透過領域を除去する第４のステップとを備え、
前記第１のステップにおいて、前記遮光パターンは、細長い第１部分と、該第１部分に連続しかつ該第１部分の延在方向に対して略直角方向に広がった第２部分との少なくとも一方を含み、
前記第３のステップにおいて、前記非透過領域は、前記遮光パターンの前記第１部分に対応する第１領域と、前記遮光パターンの前記第２部分に対応する第２領域との少なくとも一方を含み、
前記第１領域は、前記光硬化性樹脂内の前記基板側に延在し、
前記第２領域は、前記光硬化性樹脂内の前記基板側から前記光硬化性樹脂の前記基板とは反対側の主面まで延在し、
前記第４のステップにおいて、
前記非透過領域の前記第１領域を除去して、前記基板に沿って延在する横孔を形成し、
前記非透過領域の前記第２領域を除去して、前記前記光硬化性樹脂の前記基板とは反対側の前記主面に開口を有する縦孔を形成することを特徴とする、流路の形成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内物質導入装置、細胞クランプ装置及び流路の形成方法に関し、詳しくは、細胞の内部に外来物質を導入するための細胞内物質導入装置、細胞の機能を評価するための細胞クランプ装置及びそれらの装置の形成に特に好適な流路の形成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞内に遺伝子等の外来物質を導入するための手法としては、ガラスキャピラリーにより細胞１つ１つに注入するマイクロインジェクション法や、細胞懸濁液に電界を印加して細胞膜を可逆的に破壊・透過化することによるエレクトロポレーション法が用いられる。【０００３】
マイクロインジェクション法は、１つ１つの細胞に確実に外来物質を導入できるが、煩雑な微細操作を伴うため、大量の細胞を処理することは困難である。これに対し、エレクトロポレーション法は、大量の細胞を処理するのには向いている。例えば、特許文献１には、エレクトロポレーション法のための細胞用薬液注入器が開示されている。【０００４】
また、細胞の持つ電気的特性や機械的特性や力学的刺激に対する応答を計測する手法として、パッチクランプ法が一般的である。例えば、ガラス管を熱間で引き抜いて作製したマイクロピペットを細胞表面に接触させて、細胞表面の電気特性の変化を計測する。【０００５】
また、非特許文献２には、高アスペクト比の構造物を作製できるレジストＳＵ−８（ｍｉｃｒｏｈｅｍ社製）を用いて、網目状などのマイクロ構造を形成する技術が開示されている。
【特許文献１】特開平１０−３３７１７７号公報
【非特許文献１】U.Zimmermann, "Electrical breakdown, electropermeabilization and electrofusion", Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 15, p.175-345 (1986)
【非特許文献２】Hironobu Sato, Takayuki Kakinuma, Jeung Sang Go and Shuichi Shoji , "In-channel 3-D micromesh structures using maskless multi-angle exposures and their microfilter application", Sensors and Actuators A: Physical, Volume 111, Issue 1, 1 March 2004, Pages 87-92
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
エレクトロポレーション法には、以下のような問題点がある。【０００７】
一様電界Ｅの中に置かれた半径ａの細胞の細胞膜にかかる膜電圧Ｖｍ（θ）は、【０００８】
Ｖｍ（θ）＝１.５×ａ×Ｅ×cosθ      （１）
で与えられる。ただし、θは、電気力線と半径のなす角である。（非特許文献１参照）【０００９】
式（１）は、細胞膜にかかる電圧の大きさは、電気力線の最上流側（北極：θ＝０）の位置および最下流側（南極：θ＝π）の位置で最大となり、その値は細胞の半径ａに比例することを述べている。従って、細胞に一様な電界パルスを印加すると、北極および南極の位置での膜がまず破壊されることになる。【００１０】
膜電圧が約１Ｖとなるような適度なパルス電圧が印加された場合は、この破壊はいわゆる可逆的破壊となり、膜は自復することが知られている。この可逆的破壊の過程で、膜の透過性が上昇するので、細胞周囲におかれた外来物質が細胞膜内へと取り込まれることになる。【００１１】
しかしながら、過度の電圧が印加された場合は、膜の破壊は非可逆的で自復できず、破壊が膜全体に伝搬する結果、細胞自体が破壊され、細胞は死滅することになる。【００１２】
ところで、この膜電圧は式（１）に示すように細胞の半径ａに比例する。一方、細胞は、その直径は一様ではなく、ある広がりをもった分布を持つのが通常である。従って、多数の細胞の懸濁液に一様なパルス電界を印加した場合には、ａ）大きい細胞には過大な膜電圧が発生し細胞自体が破壊されてしまう、ｂ）小さい細胞にかかる膜電圧は低すぎて膜の透過化が生じず、外来物質が導入されないということになる。すなわち、ある範囲の大きさの細胞のみにしか外来物質が導入できない。【００１３】
本発明は、斯かる実情に鑑み、細胞の大きさに依存しないエレクトロポレーションにより、高効率の外来物質の導入を実現することができる細胞内物質導入装置を提供しようとするものである。【００１４】
また、パッチクランプ法では、多くて２から３個のガラス管を細胞に接続することが限界であり、細胞内の物質移動や細胞間の物質移動およびより小さな細胞内・細胞間の作用を計測することは困難である。【００１５】
本発明は、斯かる実情に鑑み、細胞を多くの部位でクランプすることが可能な細胞クランプ装置を提供しようとするものである。【００１６】
さらに、細胞内物質導入装置や細胞クランプ装置では、流路を形成する必要がある。一般には、主面に溝を形成した基板に他の基板を接合する方法で流路が形成される。しかし、この方法では、基板の反りなどにより接合不良が生じやすく、流路を効率よく形成することが困難である。【００１７】
本発明は、斯かる実情に鑑み、流路を効率よく形成することができる流路の形成方法を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、上記課題を解決するために、以下のように構成した細胞内物質導入装置を提供する。【００１９】
細胞内物質導入装置は、小孔を有する絶縁性薄膜と、前記小孔に対向して前記絶縁性薄膜の両側に配置された一対の電極とを備える。細胞内物質導入装置は、前記絶縁性薄膜に関して一方の領域において前記小孔に細胞を固定するとともに、前記絶縁性薄膜に関して他方の領域において前記小孔に連続する空間に前記細胞内に導入したい物質を含む流体を満たした状態で、前記一対の電極間にパルス電圧を印加することによって前記細胞の細胞膜を破壊して前記細胞内に前記物質を導入する。【００２０】
上記構成において、一対の電極間にパルス電圧を印加すると、絶縁性薄膜に設けた小孔に電界が集中するので、小孔に接した細胞膜を可逆的あるいは非可逆的に破壊して、小孔に連続する空間に満たした流体中に含まれる物質を、細胞内に導入することができる。【００２１】
エレクトロポレーションに実際に用いられるパルス幅の電圧に対して小孔部分に電界集中が生じるためには、絶縁性薄膜の厚さをｄ、誘電率をε、前記一対の電極の間隔をＬ、流体の抵抗率をρとした時、系の時定数τ=ερＬ／ｄが１０ミリ秒以下となるように、前記絶縁性薄膜の厚さｄ、前記誘電率ε、前記一対の電極の間隔Ｌ、前記流体の抵抗率ρを選ぶことが、好ましい。【００２２】
好ましくは、前記絶縁性薄膜の細胞が存在する側に置かれた電極が、前記小孔より、前記小孔直径の１０倍以上離れた位置に置く。これにより、小孔に十分な電界を集中することができる。【００２３】
好ましくは、前記小孔の直径が、前記細胞の直径の１／３以下である。この場合、細胞膜の小孔に接する部分に十分に電界を集中し、細胞膜の小孔に接する部分のみを透過化することができる。【００２４】
好ましくは、前記一対の電極間に印加する前記パルス電圧が１０Ｖ以下である。１０Ｖ以下のパルス電圧を用いれば、細胞膜の他の部分にダメージを与えることなく、小孔に集中した電界を用いて、小孔部分の膜のみを透過化することができる。【００２５】
小孔への細胞の固定は、吸引固定、もしくは重力による沈降、誘電泳動，電気泳動を利用することも可能である【００２６】
好ましくは、前記絶縁性薄膜に関して前記他方の領域において、前記小孔に連続する前記空間が、前記小孔の部分を除いて密閉される。上記構成によれば、小孔に連続する空間が、前記小孔の部分を除いて密閉されているので、空間に満たされる流体を吸引することにより、小孔での細胞の固定を安定化することができる。【００２７】
好ましくは、前記絶縁性薄膜の前記小孔周辺に、前記細胞に接着する表面修飾を施す。上記構成によれば、細胞膜の小孔部分で発生した破壊が周囲に伝搬することを、積極的に防止することができる。【００２８】
本発明は、上記課題を解決するために、以下のように構成した細胞クランプ装置を提供する。【００２９】
細胞クランプ装置は、光硬化性樹脂からなる樹脂膜を備える。該樹脂膜は、該樹脂膜の一方の主面に形成された、細胞を固定するための開口と、該開口に連続する小孔と、該小孔に連通する連通孔とを複数組有する。【００３０】
上記構成において、小孔及び連通孔を介して細胞を吸引することにより、細胞を開口に固定することができる。複数の開口を備えるので、細胞を多くの部位でクランプすることが可能である。細胞クランプ装置は、細胞をクランプした状態で、外来物質を細胞内に導入するなどの操作や、刺激に対する機械的、電気的、化学的な応答などの細胞機能の測定などに用いることができる。【００３１】
好ましくは、前記樹脂膜を支持する基板を備える。該基板に、前記開口に対向する前記小孔の底面から前記連通孔に沿って延在する導電膜が形成される。【００３２】
上記構成によれば、導電膜は、電極や電気配線として用いることができる。例えば、細胞内に導入したい物質を含む流体を小孔及び連通孔に満たした状態で、細胞側に配置した電極と導電膜との間にパルス電圧を印加し、細胞内に物質を導入するために用いることができる。また、細胞側に配置した電極と導電膜との間の電位や電流を計測するために用いることもできる。【００３３】
好ましくは、柱状支持部材をさらに備える。前記柱状支持部材は、前記一方の主面に沿って配置されるベース部と、前記ベースを介して前記開口に対向し、前記ベース部から前記開口とは反対側に突出する突起部と、前記突起部の先端と前記開口との間を連通する貫通孔とを有する。【００３４】
上記構成において、柱状支持部材の突起部の先端により、細胞を、柱状支持部材のベース部から浮いた状態で支持することができる。このとき、樹脂膜の貫通孔及び小孔と柱状支持部材の連通孔とを介して、細胞を吸引固定することができる。【００３５】
上記構成によれば、柱状支持部材の突起部の先端から細胞内に外来物質を瞬時に導入したときの応答（細胞内濃度ジャンプ）以外に、細胞の周囲に、一定濃度の試薬や分子などを瞬時に導入したときの応答（細胞外濃度ジャンプ）を測定することができる。応答は、柱状支持部材の突起部ごとの電位や電流値のほか、応答に伴う突起部の撓み（変形、変位）を測定することができる。【００３６】
また、本発明は、上記課題を解決するために、以下のように構成した流路の形成方法を提供する。【００３７】
流路の形成方法は、第１ないし第４のステップを備える。前記第１のステップにおいて、透明な基板の少なくとも一方の主面に、光の透過を阻止する遮光パターンを形成する。前記第２のステップにおいて、前記基板の前記一方の主面又は他方の主面に光硬化性樹脂を塗布する。前記第３のステップにおいて、前記基板に関して前記光硬化性樹脂とは反対側から、前記基板に対して異なる角度で光を照射し、前記光硬化性樹脂内において、前記遮光パターンに沿って延在する非透過領域以外の領域を前記光が透過するようにして、前記光硬化性樹脂の前記光が透過した部分を硬化させる。前記第４のステップにおいて、前記前記光硬化性樹脂の前記非透過領域を除去する。前記第１のステップにおいて、前記遮光パターンは、細長い第１部分と、該第１部分に連続しかつ該第１部分の延在方向に対して略直角方向に広がった第２部分との少なくとも一方を含む。前記第３のステップにおいて、前記非透過領域は、前記遮光パターンの前記第１部分に対応する第１領域と、前記遮光パターンの前記第２部分に対応する第２領域との少なくとも一方を含む。前記第１領域は、前記光硬化性樹脂内の前記基板側に延在する。前記第２領域は、前記光硬化性樹脂内の前記基板側から前記光硬化性樹脂の前記基板とは反対側の主面まで延在する。前記第４のステップにおいて、前記非透過領域の前記第１領域を除去して、前記基板に沿って延在する横孔を形成し、前記非透過領域の前記第２領域を除去して、前記前記光硬化性樹脂の前記基板とは反対側の前記主面に開口を有する縦孔を形成する。【００３８】
上記方法において、遮光パターンは、第１部分のみ又は第２部分のみであっても、第１部分が複数であっても、第２部分が複数であってもよい。さらには、複数組の第１部分及び第２部分を備えてもよい。また、横孔又は縦孔のいずれか一方のみの流路を形成してもよい。上記方法によれば、主面に溝を形成した基板に他の基板を接合する場合に比べ、流路の形成が簡単である。【００３９】
好ましくは、前記第１のステップにおいて、前記基板の一方の主面に、導電材料を用いて前記遮光パターンを形成する。前記第２のステップにおいて、前記基板の前記一方の主面に前記光硬化性樹脂を塗布する。この場合、小孔の開口に対向する部分から流路に沿って延在する導電パターンを同時に形成することができる。この導電パターンは、電極や電気配線として用いることができる。【００４０】
また、本発明は、上記課題を解決するために、以下のように構成した流路の形成方法を提供する。【００４１】
流路の形成方法は、第１ないし第４のステップを備える。前記第１のステップにおいて、透明な基板の一方の主面に光硬化性樹脂を塗布する。前記第２のステップにおいて、前記基板の他方の主面に沿って、遮光パターンを有するマスク部材を配置する。前記第３のステップにおいて、前記マスク部材側から、前記マスク部材に対して異なる角度で光を照射し、前記光硬化性樹脂内において、前記遮光パターンに沿って延在する非透過領域以外の領域を前記光が透過するようにして、前記光硬化性樹脂の前記光が透過した部分を硬化させる。前記第４のステップにおいて、前記前記光硬化性樹脂の前記非透過領域を除去する。前記第１のステップにおいて、前記遮光パターンは、細長い第１部分と、該第１部分に連続しかつ該第１部分の延在方向に対して略直角方向に広がった第２部分との少なくとも一方を含む。前記第３のステップにおいて、前記非透過領域は、前記遮光パターンの前記第１部分に対応する第１領域と、前記遮光パターンの前記第２部分に対応する第２領域との少なくとも一方を含む。前記第１領域は、前記光硬化性樹脂内の前記基板側に延在する。前記第２領域は、前記光硬化性樹脂内の前記基板側から前記光硬化性樹脂の前記基板とは反対側の主面まで延在する。前記第４のステップにおいて、前記非透過領域の前記第１領域を除去して、前記基板に沿って延在する横孔を形成し、前記非透過領域の前記第２領域を除去して、前記前記光硬化性樹脂の前記基板とは反対側の前記主面に開口を有する縦孔を形成する。
【発明の効果】
【００４２】
本発明の細胞内物質導入装置によれば、細胞の大きさに関係なくエレクトロポレーションが行えるため、高効率の外来物質の導入が実現される。また、絶縁性薄膜の上に多数の小孔を配列することにより、大量の細胞に同時並列的に外来物質を導入することができる。【００４３】
また、本発明の細胞クランプ装置によれば、細胞を多くの部位でクランプすることが可能である。【００４４】
さらに、本発明流路の形成方法によれば、流路を効率よく形成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】細胞内物質導入装置の構成を示す断面図である。（実施例１）
【図２】細胞内物質導入装置の構成を示す断面図である。（実施例２）
【図３】細胞クランプ装置の最小構成単位を示す説明図である。（実施例３）
【図４】照射の説明図である。（実施例３）
【図５】細胞クランプ装置の構成を示す断面図である。（実施例４）
【図６】細胞クランプ装置の構成を示す平面図である。（実施例５）
【図７】柱状支持部材の構成を示す斜視図である。（実施例６）
【図８】細胞クランプ装置に柱状支持部材を用いたときの構成を示す要部断面である。（実施例６）
【図９】細胞クランプ装置に柱状支持部材を用いた計測の説明図である。（実施例６）
【図１０】柱状支持部材の製作方法の説明面である。（実施例６）
【符号の説明】
【００４６】
１  小孔
２  絶縁性薄膜
６，７  電極
９  細胞
１０ａ，１０ｂ  細胞内物質導入装置
１１  絶縁性薄膜
１２  小孔
１４，１５  電極
２０  細胞クランプ装置
２１  基板
２２，２２ａ，２２ｂ  導電膜
２３  樹脂膜
２４ｓ  開口
２４ａ，２４ｂ，２４ｔ  小孔（縦孔）
２５ａ，２５ｂ，２５ｔ  連通孔（横孔）
３０  細胞クランプ装置
３２  基板
３３  樹脂膜
３４ａ〜３４ｈ  小孔（縦孔）
３５ａ〜３５ｈ  連通孔（横孔）
５０  柱状支持部材
５２  ベース部
５４  突起部
５４ａ  先端
５６  貫通孔
８０  細胞
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
以下、本発明の実施の形態として実施例について図１〜図１０を参照しながら説明する。【００４８】
まず、細胞内物質導入装置について、図１及び図２を参照しながら説明する。【００４９】
図１に示すように、細胞内物質導入装置１０ａは、小孔１を持つ絶縁性薄膜２の両側に、バッファー（例えば生理食塩水）を満たしたチャンバー３および外来物質４の水溶液を満たしたチャンバー５があり、各々に電極６および７が接触している。８は電極を保持するためのスペーサで、電極とともにチャンバー壁を兼ねている。小孔１のバッファーを満たしたチャンバー３の側に、細胞９を吸引固定し、電極６と７の間にパルス電圧を印加する。なお、絶縁性薄膜２は、電極６，７間の流体を分離する必要があるが、特にチャンバー５が小孔１の部分を除いて密閉されている場合には、細胞９を小孔１に吸引固定することが容易になる上、チャンバー５からの液漏れもなくなる。【００５０】
絶縁性薄膜２は、例えば、ＳｉＯ２膜である。具体的には、Ｓｉ基板を熱酸化することにＳｉＯ２膜を形成し、ＳｉＯ２膜にフォトレジストを塗布してマスクパターンを転写した後、現像を行い、ＳｉＯ２膜の小孔１となる部分をエッチングし、最後に、Ｓｉ基板をエッチング等により除去することにより、ＳｉＯ２膜の絶縁性薄膜２が得られる。Ｓｉ基板を全部除去するのではなく一部を残し、残したＳｉ基板で絶縁性薄膜２を支持するようにしてもよい。【００５１】
または、有機薄膜に、レーザーまたはフォトリソグラフィーによって小孔を開口したものを、絶縁性薄膜２として用いることも可能である。【００５２】
図１において点線で示したように、絶縁性薄膜２の厚さをｄ、誘電率をε、一対の電極６，７の間隔をＬ、チャンバー３，５内の流体の抵抗率をρとした時、系の時定数τ=ερＬ／ｄが１０ミリ秒以下となるように、絶縁性薄膜２の厚さｄ、誘電率ε、一対の電極６，７の間隔Ｌ、チャンバー３，５内の流体の抵抗率ρを選んだ条件下では、電気力線１０は絶縁性薄膜２を通過することができないので、小孔１を通ることになる。すなわち、電気力線１０が収束するため、小孔の位置での電界強度が、溶液中での電界強度に比べて極めて強くなる。これにより、細胞膜の小孔に接している部分にのみ、エレクトロポレーションすなわち膜の透過化が生じ、チャンバー５の中にある外来物質４が、拡散または電気泳動により、細胞内へと導入されることになる。【００５３】
十分な電界の集中を得て、細胞膜の小孔に接する部分のみを透過化するためには、小孔が細胞直径に比して十分小さいこと、特に細胞直径の１／３以下であることが望ましい。この時、小孔に接する部分の細胞膜にかかる膜電圧は、小孔部分の電界集中によってのみ決まり、細胞の直径に依存しない。すなわち、本装置を用いれば、細胞の直径に依存しない外来物質の導入が可能になる。【００５４】
ここで、一対の電極６，７間に１０Ｖ以下の適度なパルス電圧を選択すれば、小孔１に接した部分の膜が可逆的に破壊され、自復するため、細胞に大きなダメージを与えることなく外来物質の導入が可能になる。溶液中に懸濁された細胞にパルス電圧を印加する通常のエレクトロポレーションの場合には、細胞膜の部分的破壊が細胞全体に伝搬して、細胞全体の破壊・死滅につながるが、本装置の場合には、細胞膜が絶縁性薄膜に固定されているので、小孔部分から発生する破壊の伝搬が生じにくい。さらに積極的にこの伝搬を防止するためには、小孔周辺の薄膜に細胞接着性の表面修飾を施すことが有効で、それを行うための物質としては、たとえば細胞付着性修飾剤ＢＡＭ（Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  Ａｎｃｈｏｒ  ｆｏｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ；日本油脂株式会社）、ポリ−Ｄ−リジン（ｐｏｌｙ−Ｄ−ｌｙｓｉｎｅ）、リン酸塩（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ）、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）が例示される。このことにより、本法は、通常のエレクトロポレーションに比して、細胞を死滅させずに印加できる電圧の許容範囲が広く、ひいては高い効率での外来物質導入が行える。【００５５】
なお、本発明の細胞内物質導入装置は図１に示した構造に限定されるものではなく、小孔を持つ絶縁性薄膜の両側に２つの電極と接するあるいは電極を浸漬した溶液がありさえすれば、スペーサ８や電極６，７によってチャンバー壁を構成する必要もなく、チャンバー３とチャンバー５が電気的に絶縁されていない構造でも、電気力線の集中は生ずるので、適用可能である。細胞の固定も吸引に限定されるものではなく、重力による沈降、電気泳動、誘電泳動を利用することも可能である。【００５６】
図２は、本発明による、外来物質の細胞への同時並列導入の例である。絶縁性薄膜１１多数の小孔１２を設け、各々に細胞１３を固定して、電極１４と１５の間にパルス電圧を印加することにより、外来物質１６をすべての細胞内に同時に導入することができる。したがって、大量並列測定や、細胞膜電位の同時計測が可能である。【００５７】
本発明の細胞内物質導入装置によれば、細胞の直径に依存しないエレクトロポレーションが実現されるので、細胞が広い粒径分布を持つ場合にも、高い効率での外来物質の導入が行える。また、細胞内外の溶液組成が任意にとれ、コンダクタンスが大きく、膜透過性がない物質や、ｃａｇｅｄ物質（光などで励起・分離し発現する物質）以外の物質に対する測定が可能である。【００５８】
次に、細胞クランプ装置について、図３〜図１０を参照しながら説明する。【００５９】
図３に、細胞クランプ装置の最小構成単位２０ｓの要部構成を示す。【００６０】
細胞クランプ装置は、透明な基板２１の上面２１ａに、絶縁性の樹脂からなる樹脂膜２３が配置されている。【００６１】
基板２１の上面２１ａには、光の透過を阻止するとともに導電性を有する導電膜２２が形成されている。導電膜２２は、細長い第１部分２２ｙと、第１部分２２ｙの両端に連続しかつ第１部分２２ｙの延在方向に対して略直角方向に広がった略長円形状の第２部分２２ｘ，２２ｚとを含む。導電膜２２は、第１部分２２ｙ又は第２部分２２ｘ，２２ｚに接続された他の部分を含んでもよい。【００６２】
樹脂膜２３の上面２３ａには、開口２４ｓ，２６ｓが形成され、例えば、一方の開口２４ｓに細胞を固定し、他方の開口２６ｓからシリンジポンプや真空ポンプなどで吸引を行う。樹脂膜２３には、開口２４ｓ，２６ｓに連続する小孔２４ｔ，２６ｔと、小孔２４ｔ，２６ｔに連通する連通孔２５ｔとが形成されている。小孔２４ｔ，２６ｔは、それぞれ、導電膜２２の第２部分２２ｘ，２２ｚに対応して形成され、導電膜２２の第２部分２２ｘ，２２ｚは小孔２４ｔ，２６ｔの底面となる。連通孔２５ｔは、導電膜２２の第１部分２２ｙに対応して形成され、導電膜２２の第１部分２２ｙは連通孔２５ｔの底面となる。【００６３】
次に、製造方法について、図４を参照しながら説明する。図４は、大略、導電膜２２の細長い第１部分２２ｙが延在する方向に見た断面図である。【００６４】
まず、透明な基板２１の上面２１ａに、所定パターンの導電膜２２を形成する。具体的には、基板２１にはガラス基板を用いる。基板２１にＳｉ基板や樹脂基板を用いてもよい。導電膜２２は、基板２１にフォトレジストを塗布し、マスクパターンを転写した後、現像し、Ａｌを蒸着することにより形成する。Ｐｔ、Ａｕ、Ａｇなど、Ａｌ以外の金属を蒸着してもよい。また、蒸着以外の方法によってもよい。【００６５】
次いで、基板２１の上面２１ａに光硬化性の樹脂膜２３（具体的には、ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ社製のネガレジストであるＳＵ−８）を塗布する。【００６６】
次いで、矢印４４ａ，４４ｂで示すように、基板２１の下面２１ｂ側（すなわち、基板２１に関して樹脂膜２３とは反対側）から、基板２１の下面２１ｂに対して異なる角度で光を照射し、樹脂膜２３の光が透過した部分を硬化させる。【００６７】
このとき、光を照射する方向４４ａ，４４ｂは、導電膜２２の細長い第１部分２２ｙが延在する方向から見ると、基板２１の下面２１ｂに対して斜めに傾き、かつ、互いに略対称となる２方向である。矢印４４ａで示す方向から光を照射したとき、樹脂膜２３内には、導電膜２２によって影となり、光が透過しない領域４４ｔが形成される。一方、矢印４４ｂで示す方向から光を照射したとき、樹脂膜２３内には、導電膜２１ｓによって影となり、光が透過しない領域４４ｓが形成される。２つの影の領域４４ｓ，４４ｔが重なり合う領域４４ｋは、光が全く透過しない非透過領域となる。樹脂膜２３は、非透過領域４４ｋ以外の部分が硬化する。【００６８】
具体的には、紫外線の照射方向に対して基板２１を±４５°傾けて配置した状態で、露光装置を用いて紫外線の平行光を、基板２１側から樹脂膜２３に照射した後、樹脂膜２３のＳＵ−８が硬化を開始する温度よりも高い温度（例えば、９５℃）まで加熱する。【００６９】
次いで、樹脂膜２３の非透過領域４４ｋを除去する。樹脂膜２３がＳＵ−８の場合には、現像液に浸して、樹脂膜２３の非透過領域４４ｋを溶出させる。【００７０】
非透過領域４４ｋは、導電膜２２に沿って延在する。非透過領域４４ｋは、導電膜２２の第１部分２２ｙに対応する第１領域と、導電膜２２の第２部分２２ｘ，２２ｚに対応する第２領域と含む。【００７１】
導電膜２２の第１部分２２ｙの幅が狭いので、非透過領域４４ｋの第１領域は、樹脂膜２３内において断面三角形となり、樹脂膜２３内のガラス基２１板側にのみ延在する。そのため、非透過領域４４ｋの第１領域に対応して断面三角形のトンネル状の連通孔（横孔）２５ｔが形成される。【００７２】
一方、導電膜２２の第２部分２２ｘ，２２ｚの幅が広いので、非透過領域４４ｋの第２領域は、樹脂膜２３内において樹脂膜２３の上面２３ａにまで達する断面台形となり、樹脂膜２３内の基板２１側から反対側の上面２３ａまで延在する。そのため、樹脂膜２３の上面２３ａに開口２４ｓ，２６ｓが形成され、非透過領域４４ｋの第２領域に対応して、大略、円錐台状の小孔（縦孔）２４ｔ，２６ｔが形成される。【００７３】
例えば、基板２１にガラス基板を用い、樹脂膜２３にＳＵ−８を用い、導電膜２２としてＡｌを蒸着することにより、樹脂膜２３の膜厚が１０μｍ、連通孔２５ｔの幅が５μｍ、開口２４ｓの直径が３μｍ、開口２６ｓの直径が６μｍとなる細胞クランプ装置を製作することができる。【００７４】
上記の製造方法は、基板を化学的、物理的にエッチングしたり、溝を形成した基板を接合したりする一般的なマイクロチャネル（流路）の形成方法に比べ、大規模な製造装置が不要であり、製造工程が簡単であり、製造コストも少なくてすむ。したがって、流路を効率よく形成することができる。また、流路の形成と同時に、電極や電気配線も形成することができる。【００７５】
細胞クランプ装置は、複数の小孔及び連通孔を備えることにより、細胞の複数の部位を小孔で固定した状態で、種々の用途に用いることができる。【００７６】
図５に示すように、細胞クランプ装置２０が、第１組の小孔２４ａ，２６ａ及び連通孔２５ａと、第２組の小孔２４ｂ，２６ｂ及び連通孔２５ｂとを備える場合、小孔２６ａ，２６ｂに設けたシリンジポンプ２８ａ，２８ｂで矢印２９ａ，２９ｂで示すように吸引し、細胞８０の２つの部位を小孔２４ａ，２４ｂに固定し、小孔２４ａ，２４ｂを通る電流を、導電膜２２ａ，２２ｂ、外部端子２２ｐ，２２ｑを介して電流計３０ａ，３０ｂで計測する。【００７７】
細胞クランプ装置２０は、細胞の上方に電極を配置すれば、細胞内物質導入装置として用いることもできる。例えば、細胞の一方の部位から外来物質を導入し、細胞の他方の部位での応答を検知すれば、ギャップ結合を有する物質輸送（イオン、小分子（ｃＡＭＰ，ｃＧＭＰ他）の通過）を測定することができる。【００７８】
図６に、多数の小孔３４ａ〜３４ｈを設けた細胞クランプ装置３０の構成を示す。【００７９】
細胞クランプ装置３０は、最小構成単位の細胞クランプ装置２０ｓと同様に、透明なガラス基板３２に、ガラス基板３２より小さい絶縁性樹脂の樹脂膜３３が配置されている。樹脂３３には、複数組の細胞固定用の小孔３４ａ〜３４ｈ、連通孔３５ａ〜３５ｈ、吸引用の小孔３６ａ〜３６ｈが形成されている。ガラス基板３２上に形成される導電膜は、細胞固定用の小孔３４ａ〜３４ｈ、連通孔３５ａ〜３５ｈ、吸引用の小孔３６ａ〜３６ｈを形成する部分のほか、これらの部分から延長された延長部分３２ａ〜３２ｈと、延長部分３２ａ〜３２ｈの端部に設けられた外部端子３１ａ〜３１ｈとを含む。【００８０】
細胞クランプ装置３０は、光硬化性樹脂の樹脂膜３３に異なる角度で光を照射することによって、細胞固定用の小孔３４ａ〜３４ｈ、連通孔３５ａ〜３５ｈ、吸引用の小孔３６ａ〜３６ｈが形成されるが、同時に、ガラス基板３２上に形成される導電膜の延長部分３２ａ〜３２ｈに対応して流路が形成される。そのため、延長部分３２ａ〜３２ｈはできるだけ幅を狭くすることが好ましい。また、延長部分３２ａ〜３２ｈに対応して形成される流路は、例えばクリップ等で樹脂膜３３を押さえて塞ぐことが好ましい。【００８１】
細胞クランプ装置３０は、細胞８０の複数の部位をクランプした状態で、種々の計測や細胞８０に対する操作のために用いることができる。【００８２】
細胞クランプ装置は、図７〜図１０に示すように、柱状支持部材５０とともに用いることもできる。【００８３】
図７に示すように、柱状支持部材５０は、板状のベース部５２と、ベース部５２の上面５２ａから突出した複数の柱状の突起部５４と、各突起部５４の先端５４ａからベース部５２の下面５２ｂまで貫通する貫通孔５６とを有する。【００８４】
柱状支持部材５０は、例えば図１０に示す方法で作製することができる。すなわち、図１０（ａ）に示すように、透明なガラス基板６０の一方の主面６０ａに、リング状の遮光パターン６２を形成する。次いで、図１０（ｂ）に示すように、ガラス基板６０の上面６０ａに光硬化性樹脂６４（例えば、ネガレジストＳＵ−８）をスピンコートした後、矢印６１で示すように、ガラス基板６０の下面６０ｂ側から、ガラス基板６０の下面６０ｂに垂直方向に、平行光を露光し、樹脂６４内の光が透過した部分を硬化させる。次いで、図１０（ｃ）に示すように、樹脂６４の未露光部分を除去し、筒状の空間６５を形成する。次いで、図１０（ｃ）に示すように、樹脂６４の上面６４ａに、所定厚さで樹脂６６（例えば、ＰＤＭＳ；Ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）を塗布し、樹脂６６を筒状の空間６５に充填した後、樹脂６６を硬化させる。そして、図１０（ｄ）に示すように、樹脂６６を樹脂６４から分離する。このとき、樹脂６６には、筒状の突起部６７が形成されるが、突起部６７の中心孔６８は非貫通の状態であるので、最後に、中心孔６８底をレーザーで加工し、中心孔６８を貫通させる。【００８５】
図８に示すように、柱状支持部材５０は、細胞クランプ装置３０の樹脂膜３３に沿って配置される。このとき、柱状支持部材５０の各突起部５４は、それぞれ、ベース部５２を介して、樹脂膜３３の上面に形成された小孔３４の開口に対向し、柱状支持部材５０の貫通孔５６は、細胞クランプ装置３０の小孔３４と連通する。細胞クランプ装置３０の小孔３６からシリンジポンプ３８により矢印３９で示すように吸引し、連通孔３５、小孔３４、貫通孔５６を介して、柱状支持部材５０の突起部５４の先端５４ａに、細胞を吸着することができる。【００８６】
このとき、図９に示すように、細胞８０は、柱状支持部材５０のベース部５２から浮いた状態で、複数の部位が柱状支持部材５０の突起部５４で支持される。柱状支持部材５０の突起部５４が適宜な剛性を有するように構成し、突起部５４の先端の変位を、カメラ５８で撮影し、撮影画像を分析することによって、細胞８０の各部位の変位を計測する。あるいは、導電膜３７、外部端子３１を介して、細胞８０の支持部位を通る電流を計測する。例えば、細胞８０の周囲に一定濃度の試薬や分子などを瞬時に導入し、このときの細胞８０の応答（細胞外濃度ジャンプ）を計測する。【００８７】
柱状支持部材５０と細胞クランプ装置３０とを組み合わせることによって、細胞８０の複数の部位を安定して支持することができる。また、柱状支持部材５０の突起部５４の先端５４に細胞を吸着することにより、細胞８０の支持部位がずれないように支持することができる。また、柱状支持部材５０の突起部５４のたわみによって、細胞８０に対する拘束が少なく、細胞８０は高い自由度で動くことができる。したがって、細胞８０の各部位の状態を正確に計測することができる。【００８８】
以上に説明したように、細胞内物質導入装置は、細胞の大きさに関係なくエレクトロポレーションが行えるため、高効率の外来物質の導入が実現される。また、絶縁性薄膜の上に多数の小孔を配列することにより、大量の細胞に同時並列的に外来物質を導入することができる。【００８９】
また、細胞クランプ装置は、細胞を多くの部位でクランプすることが可能である。【００９０】
さらに、細胞クランプ装置を製作する流路の形成方法は、流路を効率よく形成することができる。この流路の形成方法は、細胞クランプ装置に限らず、種々の分野に広く適用することができる。【００９１】
なお、本発明は、上記した実施の形態に限定されるものではなく、種々変更を加えて実施することができる。【００９２】
例えば、光硬化性樹脂に、ネガレジストの代わりに、ポジレジストを用いてもよい。この場合、遮光パターンは反転すればよい。遮光パターンは、導電膜以外でもよく、流路形成後に除去するようにしてもよい。【００９３】
また、流路の形成を行うための遮光パターンを、一方の主面に光硬化性樹脂を塗布した透明な基板の他方の主面に形成し、遮光パターンを介して光硬化性樹脂に異なる角度で光を照射してもよい。また、遮光パターンを有するマスク部材を、一方の主面に光硬化性樹脂を塗布した透明な基板の他方の主面に沿って配置し、マスク部材の遮光パターンを介して光硬化性樹脂に異なる角度で光を照射してもよい。いずれの場合も、照射した光が透過しない非透過領域は、遮光パターンから離れた状態で、遮光パターンに沿って延在する。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明の細胞内物質導入装置及び細胞クランプ装置は、分子生物学をはじめ、生理学・再生医科学・医療・創薬の分野の研究方法を一新するものであると同時に、ポイントオブケアーやテーラーメード医療をより簡便かつ低侵襲に行うことを可能にするデバイスである。また、本発明の流路の形成方法は、細胞クランプ装置、μＴＡＳ（Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）など、ＭＥＭＳ技術を利用したマイクロデバイスやマイクロ構造物などの製作に用いることができる。
【図１】
2006098430.tif 000002
【図２】
2006098430.tif 000003
【図３】
2006098430.tif 000004
【図４】
2006098430.tif 000005
【図５】
2006098430.tif 000006
【図６】
2006098430.tif 000007
【図７】
2006098430.tif 000008
【図８】
2006098430.tif 000009
【図９】
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【図１０】
2006098430.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成19年6月29日(2007.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
小孔を有する絶縁性薄膜の両側に一対の電極を配置し、前記絶縁性薄膜に関して一方の領域において前記小孔に細胞を固定するとともに、前記絶縁性薄膜に関して他方の領域において前記小孔に連続する空間に前記細胞内に導入したい物質を含む流体を満たす、第１のステップと、
前記一対の電極間に１０Ｖ未満のパルス電圧を印加することによって生ずる前記小孔の部分への電界集中を利用して、前記小孔に固定されている前記細胞の細胞膜のうち前記小孔に接する部分のみを破壊して、前記小孔に連続する前記空間から前記細胞内に前記物質を導入する、第２のステップと、
を備えたことを特徴とする、細胞内への物質導入方法。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞内への物質導入方法に用いる細胞内物質導入装置であって、
小孔を有する絶縁性薄膜と、
前記絶縁性薄膜に関して一方の領域において前記小孔に連続し、細胞を含むバッファーを満たすための第１のチャンバーと、
前記絶縁性薄膜に関して他方の領域において前記小孔に連続し、前記細胞内に導入したい物質を含む流体を満たすための第２のチャンバーと、
前記小孔に対向して前記絶縁性薄膜の両側に、それぞれ前記第１のチャンバー内のバッファーと前記第２のチャンバー内の流体とに接するように配置された一対の電極とを備え、
前記絶縁性薄膜は、前記絶縁性薄膜に関して一方の領域において前記第１のチャンバー内の細胞を前記小孔に固定するとともに、前記絶縁性薄膜に関して他方の領域において前記小孔に連続する前記第２のチャンバーに前記細胞内に導入したい物質を含む流体を満たした状態で、前記一対の電極間に１０Ｖ未満のパルス電圧を印加すると、前記小孔の位置での電界強度が、前記バッファー及び前記流体中での電界強度に比べて極めて強くなり、前記小孔に固定されている前記細胞の細胞膜のうち前記小孔に接する部分のみを破壊して、前記小孔に連続する前記第２のチャンバーから前記細胞内に前記物質を導入するのに十分な電界集中が生ずるように構成されたことを特徴とする、細胞内物質導入装置。
【請求項３】
前記絶縁性薄膜の厚さをｄ、誘電率をε、前記一対の電極の間隔をＬ、流体の抵抗率をρとした時、系の時定数τ＝ε  ρＬ／ｄが１０ミリ秒以下となるように、前記絶縁性薄膜の厚さｄ、前記誘電率ε、前記一対の電極の間隔し、前記流体の抵抗率ρが選ばれたことを特徴とする、請求項２に記載の細胞内物質導入装置。
【請求項４】
前記一対の電極のうち、前記細胞が存在する前記絶縁性薄膜に関して前記一方の領域側に置かれた電極が、前記小孔より、前記小孔直径の１０倍以上離れた位置に置かれていることを特徴とする、請求項２又は３に記載の細胞内物質導入装置。
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
前記小孔の直径が、前記小孔に固定される前記細胞の直径の１／３以下であることを特徴とする、請求項２、３又は４に記載の細胞内物質導入装置。
【請求項７】
前記絶縁性薄膜に関して前記他方の領域において、前記小孔に連続する前記第２のチャンバーが、前記小孔の部分を除いて密閉されることを特徴とする、請求項２ないし６のいずれか一つに記載の細胞内物質導入装置。
【請求項８】
前記絶縁性薄膜の前記小孔周辺に、前記細胞に接着する表面修飾を施したことを特徴とする、請求項２ないし７のいずれか一つに記載の細胞内物質導入装置。
【請求項９】
光硬化性樹脂からなる樹脂膜と、
前記樹脂膜を支持する基板と、
を備え、
前記樹脂膜は、
前記樹脂膜の一方の主面に形成された、細胞を固定するための開口と、
前記開口に連続し、前記樹脂膜の他方の主面に達する小孔と、
前記小孔に連通し、かつ、前記樹脂膜の前記他方の主面に隣接する連通孔と、
を複数組有し、
前記基板は、前記樹脂膜を支持する面に、前記小孔及び前記連通孔の底面となる導電膜が形成されていることを特徴とする、細胞クランプ装置。
【請求項１０】
（１）光硬化性樹脂からなる樹脂膜を備え、
該樹脂膜は、
該樹脂膜の一方の主面に形成された、細胞を固定するための開口と、
該開口に連続する小孔と、
該小孔に連通する連通孔とを複数組有し、
（２）前記樹脂膜を支持する基板を備え、
該基板に、前記開口に対向する前記小孔の底面から前記連通孔に沿って延在する導電膜が形成され、
（３）前記樹脂膜の前記一方の主面に沿って配置されるベース部と、
前記ベース部を介して前記樹脂膜の前記開口に対向し、前記ベース部から前記樹脂膜の前記開口とは反対側に突出する突起部と、
前記突起部の先端と前記樹脂膜の前記開口との間を連通する貫通孔と、
を有する柱状支持部材をさらに備え、
前記突起部の前記先端に細胞を吸着することにより、前記細胞の複数の部位が支持されたとき、前記突起部のたわみによって前記細胞が動くことができることを特徴とする、細胞クランプ装置。
【請求項１１】
透明な基板の少なくとも一方の主面に、光の透過を阻止する遮光パターンを形成する第１のステップと、
前記基板の少なくとも前記一方の主面に光硬化性樹脂を塗布する第２のステップと、
前記基板に関して前記光硬化性樹脂とは反対側から、前記基板に対して異なる角度で光を照射し、前記光硬化性樹脂内において、前記遮光パターンに沿って延在する非透過領域以外の領域を前記光が透過するようにして、前記光硬化性樹脂の前記光が透過した部分を硬化させる第３のステップと、
前記光硬化性樹脂の前記非透過領域を除去する第４のステップとを備え、
前記第１のステップにおいて、前記遮光パターンは、その延在方向の長さがその延在方向に直角な方向の幅よりも大きい第１部分と、該第１部分に連続しかつ該第１部分の延在方向に対して略直角方向に広がった第２部分とを含み、
前記第３のステップにおいて、
前記非透過領域は、前記遮光パターンの前記第１部分に対応する第１領域と、前記遮光パターンの前記第２部分に対応する第２領域とを含み、
前記遮光パターンの一つの前記第１部分に対応して一つの前記第１領域のみが形成され、
前記第１領域は、前記光硬化性樹脂内の前記基板側に延在し、前記第１部分の延在方向に直角な断面が前記遮光パターンを一辺とする三角形であり、
前記第２領域は、前記光硬化性樹脂内の前記基板側から前記光硬化性樹脂の前記基板とは反対側の主面まで延在し、
前記第４のステップにおいて、
前記非透過領域の前記第１領域を除去して、前記基板に沿って延在し、かつ、内面に前記遮光パターンが露出する、断面三角形のトンネル状の横孔を形成し、
前記非透過領域の前記第２領域を除去して、前記光硬化性樹脂の前記基板とは反対側の前記主面に開口を有する縦孔を形成することを特徴とする、流路の形成方法。
【請求項１２】
前記第１のステップにおいて、前記基板の一方の主面に、導電材料を用いて前記遮光パターンを形成し、
前記第２のステップにおいて、前記基板の前記一方の主面に前記光硬化性樹脂を塗布することを特徴とする、請求項１１に記載の流路の形成方法。
【請求項１３】
透明な基板の一方の主面に光硬化性樹脂を塗布する第１のステップと、
前記基板の他方の主面に沿って、遮光パターンを有するマスク部材を配置する第２のステップと、
前記マスク部材側から、前記マスク部材に対して異なる角度で光を照射し、前記光硬化性樹脂内において、前記遮光パターンに沿って延在する非透過領域以外の領域を前記光が透過するようにして、前記光硬化性樹脂の前記光が透過した部分を硬化させる第３のステップと、
前記光硬化性樹脂の前記非透過領域を除去する第４のステップとを備え、
前記第１のステップにおいて、前記遮光パターンは、その延在方向の長さがその延在方向に直角な方向の幅よりも大きい第１部分と、該第１部分に連続しかつ該第１部分の延在方向に対して略直角方向に広がった第２部分とを含み、
前記第３のステップにおいて、
前記非透過領域は、前記遮光パターンの前記第１部分に対応する第１領域と、前記遮光パターンの前記第２部分に対応する第２領域とを含み、
前記遮光パターンの一つの前記第１部分に対応して一つの前記第１領域のみが形成され、
前記第１領域は、前記光硬化性樹脂内の前記基板側に延在し、前記第１部分の延在方向に直角な断面が三角形であり、
前記第２領域は、前記光硬化性樹脂内の前記基板側から前記光硬化性樹脂の前記基板とは反対側の主面まで延在し、
前記第４のステップにおいて、
前記非透過領域の前記第１領域を除去して、前記基板に沿って延在する、断面三角形のトンネル状の横孔を形成し、
前記非透過領域の前記第２領域を除去して、前記光硬化性樹脂の前記基板とは反対側の前記主面に開口を有する縦孔を形成することを特徴とする、流路の形成方法。
【請求項１４】
透明な基板の少なくとも一方の主面に、光の透過を阻止する遮光パターンを形成する第１のステップと、
前記基板の少なくとも前記一方の主面に光硬化性樹脂を塗布する第２のステップと、
前記基板に関して前記光硬化性樹脂とは反対側から、前記基板に対して異なる角度で光を照射し、前記光硬化性樹脂内において、前記遮光パターンに沿って延在する非透過領域以外の領域を前記光が透過するようにして、前記光硬化性樹脂の前記光が透過した部分を硬化させる第３のステップと、
前記光硬化性樹脂の前記非透過領域を除去する第４のステップとを備え、
前記第１のステップにおいて、前記遮光パターンは、その延在方向の長さがその延在方向に直角な方向の幅よりも大きい第１部分を含み、
前記第３のステップにおいて、
前記非透過領域は、前記遮光パターンの前記第１部分に対応する第１領域を含み、
前記遮光パターンの一つの前記第１部分に対応して一つの前記第１領域のみが形成され、
前記第１領域は、前記光硬化性樹脂内の前記基板側に延在し、前記第１部分の延在方向に直角な断面が前記遮光パターンを一辺とする三角形であり、
前記第４のステップにおいて、
前記非透過領域の前記第１領域を除去して、前記基板に沿って延在し、かつ、内面に前記遮光パターンが露出する、断面三角形のトンネル状の横孔を形成することを特徴とする、流路の形成方法。
【請求項１５】
前記第１のステップにおいて、前記基板の一方の主面に、導電材料を用いて前記遮光パターンを形成し、
前記第２のステップにおいて、前記基板の前記一方の主面に前記光硬化性樹脂を塗布することを特徴とする、請求項１４に記載の流路の形成方法。
【請求項１６】
透明な基板の一方の主面に光硬化性樹脂を塗布する第１のステップと、
前記基板の他方の主面に沿って、遮光パターンを有するマスク部材を配置する第２のステップと、
前記マスク部材側から、前記マスク部材に対して異なる角度で光を照射し、前記光硬化性樹脂内において、前記遮光パターンに沿って延在する非透過領域以外の領域を前記光が透過するようにして、前記光硬化性樹脂の前記光が透過した部分を硬化させる第３のステップと、
前記光硬化性樹脂の前記非透過領域を除去する第４のステップとを備え、
前記第１のステップにおいて、前記遮光パターンは、その延在方向の長さがその延在方向に直角な方向の幅よりも大きい第１部分を含み、
前記第３のステップにおいて、
前記非透過領域は、前記遮光パターンの前記第１部分に対応する第１領域を含み、
前記遮光パターンの一つの前記第１部分に対応して一つの前記第１領域のみが形成され、
前記第１領域は、前記光硬化性樹脂内の前記基板側に延在し、前記第１部分の延在方向に直角な断面が三角形であり、
前記第４のステップにおいて、
前記非透過領域の前記第１領域を除去して、前記基板に沿って延在する、断面三角形のトンネル状の横孔を形成することを特徴とする、流路の形成方法。
【請求項１７】
前記連通孔は、前記連通孔に沿って前記小孔に向かう方向に直角な断面が前記導電膜を一辺とする三角形であることを特徴とする、請求項９又は１０に記載の細胞クランプ装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
より、高効率の外来物質の導入を実現することができる細胞内物質導入装置を提供しようとするものである。
［００１４］
また、パッチクランプ法では、多くて２から３個のガラス管を細胞に接続することが限界であり、細胞内の物質移動や細胞間の物質移動およびより小さな細胞内・細胞間の作用を計測することは困難である。
［００１５］
本発明は、斯かる実情に鑑み、細胞を多くの部位でクランプすることが可能な細胞クランプ装置を提供しようとするものである。
［００１６］
さらに、細胞内物質導入装置や細胞クランプ装置では、流路を形成する必要がある。一般には、主面に溝を形成した基板に他の基板を接合する方法で流路が形成される。しかし、この方法では、基板の反りなどにより接合不良が生じやすく、流路を効率よく形成することが困難である。
［００１７］
本発明は、斯かる実情に鑑み、流路を効率よく形成することができる流路の形成方法を提供しようとするものである。
課題を解決するための手段
［００１８］
本発明は、上記課題を解決するために、以下のように構成した細胞内への物質導入方法を提供する。
［００１９］
細胞内への物質導入方法は、（１）小孔を有する絶縁性薄膜の両側に一対の電極を配置し、前記絶縁性薄膜に関して一方の領域において前記小孔に細胞を固定するとともに、前記絶縁性薄膜に関して他方の領域において前記小孔に連続する空間に前記細胞内に導入したい物質を含む流体を満たす、第１のステップと、（２）前記一対の電極間に１０Ｖ未満のパルス電圧を印加することによって生ずる前記小孔の部分への電界集中を利用して、前記小孔に固定されている前記細胞の細胞膜のうち前記小孔に接する部分のみを破壊して、前記小孔に連続する前記空間から前記細胞内に前記物質を導入する、第２のステップと、を備える。
［００２０］
また、本発明は、上記課題を解決するために、上記方法に用いる、以下のように構成した細胞内物質導入装置を提供する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
［００２１］
細胞内物質導入装置は、上記の細胞内への物質導入方法に用いる細胞内物質導入装置であって、（ａ）小孔を有する絶縁性薄膜と、（ｂ）前記絶縁性薄膜に関して一方の領域において前記小孔に連続し、細胞を含むバッファーを満たすための第１のチャンバーと、（ｃ）前記絶縁性薄膜に関して他方の領域において前記小孔に連続し、前記細胞内に導入したい物質を含む流体を満たすための第２のチャンバーと、（ｄ）前記小孔に対向して前記絶縁性薄膜の両側に、それぞれ前記第１のチャンバー内のバッファーと前記第２のチャンバー内の流体とに接するように配置された一対の電極とを備える。前記絶縁性薄膜は、次のように構成されている。すなわち、前記絶縁性薄膜に関して一方の領域において前記第１のチャンバー内の細胞を前記小孔に固定するとともに、前記絶縁性薄膜に関して他方の領域において前記小孔に連続する前記第２のチャンバーに前記細胞内に導入したい物質を含む流体を満たした状態で、前記一対の電極間に１０Ｖ未満のパルス電圧を印加すると、前記小孔の位置での電界強度が、前記バッファー及び前記流体中での電界強度に比べて極めて強くなり、前記小孔に固定されている前記細胞の細胞膜のうち前記小孔に接する部分のみを破壊して、前記小孔に連続する前記第２のチャンバーから前記細胞内に前記物質を導入するのに十分な電界集中が生ずるように構成されている。
［００２２］
上記構成において、一対の電極間にパルス電圧を印加すると、絶縁性薄膜に設けた小孔に電界が集中するので、小孔に接した細胞膜を可逆的あるいは非可逆的に破壊して、小孔に連続する第２のチャンバーに満たした流体中に含まれる物質を、細胞内に導入することができる。１０Ｖ未満のパルス電圧を用いれば、細胞膜の他の部分にダメージを与えることなく、小孔に集中した電界を用いて、小孔部分の膜のみを透過化することができる。
［００２３］
エレクトロポレーションに実際に用いられるパルス幅の電圧に対して小孔部分に電界集中が生じるためには、絶縁性薄膜の厚さをｄ、誘電率をε、前記一対の電極の間隔をし、流体の抵抗率をρとした時、系の時定数τ＝ε  ρＬ／ｄが１０ミリ秒以下となるように、前記絶縁性薄膜の厚さｄ、前記誘電率ε、前記一対の電極の間隔し、前記流体の抵抗率ρを選ぶことが、好ましい。
［００２４］
好ましくは、前記一対の電極のうち、前記細胞が存在する前記絶縁性薄膜に関して前記一方の領域側に置かれた電極が、前記小孔より、前記小孔直径の１０倍以上離れた位置に置かれている。これにより、小孔に十分な電界を集中することができる。
［００２５］
好ましくは、前記小孔の直径が、前記小孔に固定される前記細胞の直径の１／３以下である。この場合、細胞膜の小孔に接する部分に十分に電界を集中し、細胞膜の小孔に接する部分のみを透過化することができる。
［００２６］
小孔への細胞の固定は、吸引固定、もしくは重力による沈降、誘電泳動，電気泳動を利用することも可能である。
［００２７］
好ましくは、前記絶縁性薄膜に関して前記他方の領域において、前記小孔に連続する前記第２のチャンバーが、前記小孔の部分を除いて密閉される。上記構成によれば、小孔に連続する第２のチャンバーが、前記小孔の部分を除いて密閉されているので、第２のチャンバーに満たされる流体を吸引することにより、小孔での細胞の固定を安定化することができる。
［００２８］
好ましくは、前記絶縁性薄膜の前記小孔周辺に、前記細胞に接着する表面修飾を施す。上記構成によれば、細胞膜の小孔部分で発生した破壊が周囲に伝搬することを、積極的に防止することができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
［００２９］
また、本発明は、上記課題を解決するために、以下のように構成した細胞クランプ装置を提供する。すなわち、細胞クランプ装置は、光硬化性樹脂からなる樹脂膜と、前記樹脂膜を支持する基板と、を備える。前記樹脂膜は、（ｉ）前記樹脂膜の一方の主面に形成された、細胞を固定するための開口と、（ｉｉ）前記開口に連続し、前記樹脂膜の他方の主面に達する小孔と、（ｉｉｉ）前記小孔に連通し、かつ、前記樹脂膜の前記他方の主面に隣接する連通孔と、を複数組有する。前記基板は、前記樹脂膜を支持する面に、前記小孔及び前記連通孔の底面となる導電膜が形成されている。
［００３０］
上記構成において、小孔及び連通孔を介して細胞を吸引することにより、細胞を開口に固定することができる。複数の開口を備えるので、細胞を多くの部位でクランプすることが可能である。細胞クランプ装置は、細胞をクランプした状態で、外来物質を細胞内に導入するなどの操作や、刺激に対する機械的、電気的、化学的な応答などの細胞機能の測定などに用いることができる。
［００３１］
上記構成によれば、導電膜は、電極や電気配線として用いることができる。例えば、細胞内に導入したい物質を含む流体を小孔及び連通孔に満たした状態で、細胞側に配置した電極と導電膜との間にパルス電圧を印加し、細胞内に物質を導入するために用いることができる。また、細胞側に配置した電極と導電膜との間の電位や電流を計測するために用いることもできる。
［００３２］
また、本発明は、上記課題を解決するために、以下のように構成した他の細胞クランプ装置を提供する。すなわち、細胞クランプ装置は、光硬化性樹脂からなる樹脂膜と、前記樹脂膜を支持する基板と、柱状支持部材とを備える。光硬化性樹脂からなる前記樹脂膜は、前記樹脂膜の一方の主面に形成された、細胞を固定するための開口と、該開口に連続する小孔と、該小孔に連通する連通孔とを複数組有する。前記樹脂膜を支持する前記基板に、前記開口に対向する前記小孔の底面から前記連通孔に沿って延在する導電膜が形成されている。前記柱状支持部材は、前記樹脂膜の前記一方の主面に沿って配置されるベース部と、前記ベース部を介して前記樹脂膜の前記開口に対向し、前記ベース部から前記樹脂膜の前記開口とは反対側に突出する突起部と、前記突起部の先端と前記樹脂膜の前記開口との間を連通する貫通孔と、を有する。前記突起部の前記先端に細胞を吸着することにより、前記細胞の複数の部位が支持されたとき、前記突起部のたわみによって前記細胞が動くことができる。
［００３３］
上記構成において、柱状支持部材の突起部の先端により、細胞を、柱状支持部材のベース部から浮いた状態で支持することができる。このとき、柱状支持部材の貫通孔を介して、細胞を吸引固定することができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
［００３４］
上記構成によれば、柱状支持部材の突起部の先端から細胞内に外来物質を瞬時に導入したときの応答（細胞内濃度ジャンプ）以外に、細胞の周囲に、一定濃度の試薬や分子などを瞬時に導入したときの応答（細胞外濃度ジャンプ）を測定することができる。応答は、柱状支持部材の突起部ごとの電位や電流値のほか、応答に伴う突起部の撓み（変形、変位）を測定することができる。
［００３５］
好ましくは、上記各構成の細胞クランプ装置において、前記連通孔は、前記連通孔に沿って前記小孔に向かう方向に直角な断面が前記導電膜を一辺とする三角形である。
［００３６］
また、本発明は、上記課題を解決するために、以下のように構成した流路の形成方法を提供する。
［００３７］
流路の形成方法は、第１ないし第４のステップを備える。前記第１のステップにおいて、透明な基板の少なくとも一方の主面に、光の透過を阻止する遮光パターンを形成する。前記第２のステップにおいて、前記基板の少なくとも前記一方の主面に光硬化性樹脂を塗布する。前記第３のステップにおいて、前記基板に関して前記光硬化性樹脂とは反対側から、前記基板に対して異なる角度で光を照射し、前記光硬化性樹脂内において、前記遮光パターンに沿って延在する非透過領域以外の領域を前記光が透過するようにして、前記光硬化性樹脂の前記光が透過した部分を硬化させる。前記第４のステップにおいて、前記光硬化性樹脂の前記非透過領域を除去する。前記第１のステップにおいて、前記遮光パターンは、その延在方向の長さがその延在方向に直角な方向の幅よりも大きい第１部分と、該第１部分に連続しかつ該第１部分の延在方向に対して略直角方向に広がった第２部分との少なくとも一方を含み、かつ、少なくとも前記第１部分を含む。前記第３のステップにおいて、ａ）前記非透過領域は、前記遮光パターンの前記第１部分に対応する第１領域と、前記遮光パターンの前記第２部分に対応する第２領域との少なくとも一方を含み、かつ、少なくとも前記第１領域を含み、ｂ）前記遮光パターンの一つの前記第１部分に対応して一つの前記第１領域のみが形成され、ｃ）前記第１領域は、前記光硬化性樹脂内の前記基板側に延在し、前記第１部分の延在方向に直角な断面が前記遮光パターンを一辺とする三角形であり、ｄ）前記第２領域は、前記光硬化性樹脂内の前記基板側から前記光硬化性樹脂の前記基板とは反対側の主面まで延在する。前記第４のステップにおいて、前記非透過領域の前記第１領域を除去して、前記基板に沿って延在し、かつ、内面に前記遮光パターンが露出する、断面三角形のトンネル状の横孔を形成し、前記非透過領域の前記第２領域を除去して、前記光硬化性樹脂の前記基板とは反対側の前記主面に開口を有する縦孔を形成する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
［００３８］
上記方法において、遮光パターンは、第１部分のみであっても、第１部分と第２部分の両方を含んでいてもよい。また、第１部分が複数であっても、第２部分が複数であってもよい。さらには、複数組の第１部分及び第２部分を備えてもよい。また、横孔のみの流路を形成しても、横孔と縦孔が連通した流路を形成してもよい。上記方法によれば、主面に溝を形成した基板に他の基板を接合する場合に比べ、流路の形成が簡単である。
［００３９］
好ましくは、前記第１のステップにおいて、前記基板の一方の主面に、導電材料を用いて前記遮光パターンを形成する。前記第２のステップにおいて、前記基板の前記一方の主面に前記光硬化性樹脂を塗布する。この場合、小孔の開口に対向する部分から流路に沿って延在する導電パターンを同時に形成することができる。この導電パターンは、電極や電気配線として用いることができる。
［００４０］
また、本発明は、上記課題を解決するために、以下のように構成した流路の形成方法を提供する。
［００４１］
流路の形成方法は、第１ないし第４のステップを備える。前記第１のステップにおいて、透明な基板の一方の主面に光硬化性樹脂を塗布する。前記第２のステップにおいて、前記基板の他方の主面に沿って、遮光パターンを有するマスク部材を配置する。前記第３のステップにおいて、前記マスク部材側から、前記マスク部材に対して異なる角度で光を照射し、前記光硬化性樹脂内において、前記遮光パターンに沿って延在する非透過領域以外の領域を前記光が透過するようにして、前記光硬化性樹脂の前記光が透過した部分を硬化させる。前記第４のステップにおいて、前記光硬化性樹脂の前記非透過領域を除去する。前記第１のステップにおいて、前記遮光パターンは、その延在方向の長さがその延在方向に直角な方向の幅よりも大きい第１部分と、該第１部分に連続しかつ該第１部分の延在方向に対して略直角方向に広がった第２部分との少なくとも一方を含み、かつ、少なくとも前記第１部分を含む。前記第３のステップにおいて、ａ）前記非透過領域は、前記遮光パターンの前記第１部分に対応する第１領域と、前記遮光パターンの前記第２部分に対応する第２領域との少なくとも一方を含み、かつ、少なくとも前記第１領域を含み、ｂ）前記遮光パターンの一つの前記第１部分に対応して一つの前記第１領域のみが形成され、ｃ）前記第１領域は、前記光硬化性樹脂内の前記基板側に延在し、前記第１部分の延在方向に直角な断面が三角形であり、ｄ）前記第２領域は、前記光硬化性樹脂内の前記基板側から前記光硬化性樹脂の前記基板とは反対側の主面まで延在する。前記第４のステップにおいて、前記非透過領域の前記第１領域を除去して、前記基板に沿って延在する、断面三角形のトンネル状の横孔を形成し、前記非透過領域の前記第２領域を除去して、前記光硬化性樹脂の前記基板とは反対側の前記主面に開口を有する縦孔を形成する。
発明の効果
［００４２］
本発明の細胞内物質導入装置によれば、細胞の大きさに関係なくエレクトロポレーションが行えるため、高効率の外来物質の導入が実現される。また、絶縁性薄膜の上に多数の小孔を配列することにより、大量の細胞に同時並列的に外来物質を導入することができる。
［００４３］
また、本発明の細胞クランプ装置によれば、細胞を多くの部位でクランプすることが可能である。
［００４４］
さらに、本発明の流路の形成方法によれば、トンネル状の細長い流路を効率よく形成することができる。
図面の簡単な説明
［００４５］
［図１］細胞内物質導入装置の構成を示す断面図である。（実施例１）
【国際調査報告】
2006098430.tif 000012
2006098430.tif 000013
2006098430.tif 000014
2006098430.tif 000015
2006098430.tif 000016
2006098430.tif 000017
2006098430.tif 000018