(57)【要約】本発明は、多種類のウィルスを捕捉することのできる、シアル酸含有の複合体、及びそれを用いた天然物由来のウィルス捕捉体を提供する。本発明は、シアル酸、又はシアル酸を含む糖鎖の還元末端がキトサンのアミノ基に還元縮合してなるキトサン複合体、及びこれを用いたウィルス捕捉体に関する。本発明のシアル酸を含む糖鎖として、好ましくは乳、例えばウシの乳、特に初乳、又はそれらの加工物から得られるシアル酸を含む糖鎖の混合物を用いることで、多種類のウィルスを同時に捕捉することのできるウィルス捕捉体を、簡便かつ安価に製造することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シアル酸、又はシアル酸を含む糖鎖の還元末端が、キトサンのアミノ基に還元縮合してなるキトサン複合体。
【請求項２】
シアル酸、又はシアル酸を含む糖鎖が、シアリルオリゴ糖である請求項１に記載のキトサン複合体。
【請求項３】
シアル酸、又はシアル酸を含む糖鎖が、シアリルラクトースである請求項１に記載のキトサン複合体。
【請求項４】
シアル酸、又はシアル酸を含む糖鎖が、乳又はその加工物に由来するものである請求項１〜４のいずれかに記載のキトサン複合体。
【請求項５】
乳が、ウシの乳である請求項４に記載のキトサン複合体。
【請求項６】
ウシの乳が、初乳である請求項５に記載のキトサン複合体。
【請求項７】
シアル酸、又はシアル酸を含む糖鎖と、キトサンとを還元条件下で反応さることからなるシアル酸、又はシアル酸を含む糖鎖とキトサンが直接結合したキトサン複合体を製造する方法。
【請求項８】
シアル酸、又はシアル酸を含む糖鎖が、これらの混合物である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
還元条件下の反応が、金属水素化物の存在下の反応である請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれかに記載のキトサン複合体を含有してなるウィルス捕捉剤。
【請求項１１】
キトサン複合体が、シアル酸、又はシアル酸を含む糖鎖の混合物を含有するものである請求項１０に記載のウィルス捕捉剤。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載のウィルス捕捉剤を含有してなる繊維製品。
【請求項１３】
繊維製品が、フィルター若しくはマスク、又はそれらの加工原料である請求項１２に記載の繊維製品。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれかに記載のキトサン複合体、及び製薬上許容される担体を含有してなる医薬組成物。
【請求項１５】
医薬組成物が、抗ウィルス剤又はウィルス捕捉剤である請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれかに記載のキトサン複合体、及び食品製造上許容される担体を含有してなる食品組成物。
【請求項１７】
食品組成物が、抗ウィルス作用又はウィルス捕捉作用を有するものである請求項１６に記載の食品組成物。
【請求項１８】
食品組成物が、サプリメントである請求項１６又は１７に記載の食品組成物。
【請求項１９】
請求項１〜６のいずれかに記載のキトサン複合体を含有してなる食品添加剤。
【請求項２０】
食品添加剤が、抗ウィルス剤又はウィルス捕捉剤としての作用を有するものである請求項１９に記載の食品添加剤。
【請求項２１】
請求項１〜６のいずれかに記載のキトサン複合体、及び飼料用担体を含有してなる飼料組成物。
【請求項２２】
飼料組成物が、抗ウィルス剤又はウィルス捕捉剤である請求項２１に記載の飼料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、シアル酸、又はシアル酸を含む糖鎖（以下、これらをまとめてシアル酸等という。）とキトサンとが直接共有結合した複合体、その製造方法、及び当該複合体を含有してなるウィルス捕捉剤に関する。また、本発明は本発明のウィルス捕捉剤を含有してなる繊維製品に関する。さらに、本発明は、本発明のキトサン複合体を含有してなる医薬組成物、食品組成物、及び飼料組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】  シアル酸は、狭義にはＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）などノイラミン酸のアシル誘導体の酸性糖の総称である。さらに、シアル酸のデアミノ化物、アセチル化物、硫酸化物、メチル化物、ラクチル化物あるいはラクトン形成体などのシアル酸の誘導体も自然界に多種存在しており、また人工的にも多くのシアル酸誘導体が合成されており、広義にはこれらのシアル酸の誘導体もシアル酸に含まれる。したがって、本明細書に於いては、シアル酸とは狭義のシアル酸だけでなくこれらのシアル酸の誘導体も含むものと解される。【０００３】  これらのシアル酸は、糖蛋白、グルコサミノグリカン、糖脂質の糖鎖非還元末端に結合し、陰性荷電の発現に寄与するとともに、生体の細胞表面に分布し、糖タンパク、糖脂質の糖鎖を構成する糖として重要な生物学的機能を担っている。例えば、癌細胞の転移、炎症作用、神経細胞の進展などに関与する糖鎖の先端には、多くの場合シアル酸が存在していることが報告されている。【０００４】  また、インフルエンザウィルスを代表とする幾つかのウィルスの感染は、先端にシアル酸が存在する標的細胞表面の複合糖質糖鎖（レセプター）をウィルス側の特定分子（リガンド）が認識して、特異的な吸着を起こすことにより進行する。例えば、ある種のインフルエンザウィルスは、その外膜にシアリダーゼと赤血球凝集素を有しており、３’シアリルラクトサミン（Ｎ−アセチルノイラミン酸α２→３−Ｄ−ガラクトースβ１→４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）で表される３糖構造を認識し、感染する。【０００５】  このウィルスによるシアル酸を含んだ複合糖鎖の認識能を利用して、シアル酸を適当な高分子に固定した構造からなる、ウィルス除去フィルターの開発が進められている。例えば、シアル酸とスチレンあるいはアクリルアミドとを結合させたウィルス捕捉体（特許文献１）、またリンカー分子を介してシアル酸をキトサンに結合させた複合体（特許文献２、非特許文献１、非特許文献２）などが報告されている。例えば、ホルミル基を有するアグリコン部分を含有するアスパラギン結合型糖蛋白質糖鎖をキトサンのアミノ基に結合させたアスパラギン結合型糖蛋白質糖鎖含有キトサンが報告されている（特許文献２参照）。これらのキトサン誘導体においては、キトサン自体が抗菌性物質であることに加え、複合体を構成する成分が何れも天然素材であることから、環境汚染のおそれがないという利点も有している。【０００６】  しかし、これらはいずれも、実質上精製されたシアル酸等を用いて調製されるために製造コスト的に不利である他、捕捉可能なウィルスの範囲が狭く、特定のウィルスしか効率的に捕捉する事ができないのが現状である。また、リンカー分子を介したシアル酸とキトサンとの複合体は、リンカーを介して両成分を結合させる操作それ自体が煩雑であり、操作性ならびに製造コストの面で不利である。【０００７】
【特許文献１】特開平９−２３４３１７号公報
【特許文献２】特開２００３−３０１００２号公報
【非特許文献１】フルイケら、ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイエティ、２０００年、第１巻、第３０００−第３００５頁
【非特許文献２】オータら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．，２００３年、第４２巻、第５１８６−第５１８９頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】  本発明は上記した従来の問題点を解決して、より多種類のウィルスを捕捉することのできる、より簡便に調製可能なウィルス捕捉体を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】  本発明は、シアル酸等、特に天然素材である乳、特にウシの乳、より好ましくはウシの初乳由来の、シアリルラクトースを含む種々の構造を有するシアル酸等とキトサンとをリンカーを介さずに直接結合させることで、上記の課題を解決するものである。【００１０】  すなわち本発明は、シアル酸、又はシアル酸を含む糖鎖（以下、シアル酸等という。）の還元末端（還元性の末端）がキトサンのアミノ基に還元縮合してなるキトサン複合体に関する。特に、シアル酸等がシアリルオリゴ糖、好ましくはシアリルラクトース、より具体的には乳もしくはその加工物由来のシアル酸等、特にウシの乳に由来するシアル酸等とキトサンとの複合体に関する。また、本発明は、前記キトサン複合体を原料とするフィルター、マスクなどのウィルス捕捉体として有用なウィルス捕捉剤を提供する。本発明は、前記した本発明のキトサン複合体、及びウィルス捕捉用担体を含有してなるウィルス捕捉用組成物に関する。
また本発明は、シアル酸、又はシアル酸を含む糖鎖と、キトサンとを還元条件下で反応さることからなるシアル酸、又はシアル酸を含む糖鎖とキトサンが直接結合したキトサン複合体を製造する方法に関する。
さらに本発明は、前記した本発明のキトサン複合体を含有してなるウィルス捕捉剤を含有してなる繊維製品に関する。
また、本発明は、本発明のキトサン複合体を含有してなる抗ウィルス剤又はウィルス捕捉剤として有用な医薬組成物、食品組成物、及び飼料組成物に関する。より詳細には、本発明は、本発明のキトサン複合体を含有してなる医療用の抗ウィルス剤又はウィルス捕捉剤、食品添加剤、及び飼料添加剤に関する。
さらに、本発明は、前記してきた本発明のキトサン複合体を用いたウィルスの不活方法又はウィルスの捕捉方法に関する。また本発明は、ウィルスの不活化又はウィルスを捕捉するための、前記してきた本発明のキトサン複合体の使用に関する。
さらに、本発明は、抗ウィルス剤又はウィルス捕捉剤としての医薬製剤の製造のための本発明のキトサン複合体の使用に関する。【００１１】  より詳細には、本発明は、次の（１）〜（１６）のとおりである。
（１）シアル酸、又はシアル酸を含む糖鎖の還元末端が、キトサンのアミノ基に還元縮合してなるキトサン複合体。
（２）シアル酸、又はシアル酸を含む糖鎖が、シアリルオリゴ糖である前記（１）に記載のキトサン複合体。
（３）シアル酸、又はシアル酸を含む糖鎖が、シアリルラクトースである前記（１）に記載のキトサン複合体。
（４）シアル酸、又はシアル酸を含む糖鎖が、乳又はその加工物に由来するものである前記（１）〜（４）のいずれかに記載のキトサン複合体。
（５）乳が、ウシの乳である前記（４）に記載のキトサン複合体。
（６）ウシの乳が、初乳である前記（５）に記載のキトサン複合体。
（７）シアル酸、又はシアル酸を含む糖鎖と、キトサンとを還元条件下で反応さることからなるシアル酸、又はシアル酸を含む糖鎖とキトサンが直接結合したキトサン複合体を製造する方法。
（８）シアル酸、又はシアル酸を含む糖鎖が、これらの混合物である前記（７）に記載の方法。
（９）シアリルオリゴ糖又はその混合物が、乳由来のものである前記（８）に記載の方法。
（１０）乳が、ウシの乳又はその加工品である前記（９）に記載の方法。
（１１）還元条件下の反応が、金属水素化物の存在下の反応である前記（７）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）前記（１）〜（６）のいずれかに記載のキトサン複合体を含有してなるウィルス捕捉剤。
（１３）キトサン複合体が、シアル酸、又はシアル酸を含む糖鎖の混合物を含有するものである前記（１２）に記載のウィルス捕捉剤。
（１４）前記（１２）又は（１３）に記載のウィルス捕捉剤を含有してなる繊維製品。
（１５）繊維製品が、フィルター若しくはマスク、又はそれらの加工原料である前記（１４）に記載の繊維製品。【００１２】（１６）前記（１）〜（６）のいずれかに記載のキトサン複合体、及びウィルス捕捉用担体を含有してなるウィルス捕捉用組成物。
（１７）前記（１）〜（６）のいずれかに記載のキトサン複合体、及び製薬上許容される担体を含有してなる医薬組成物。
（１８）医薬組成物が、抗ウィルス剤又はウィルス捕捉剤である前記（１７）に記載の医薬組成物。
（１９）前記（１）〜（６）のいずれかに記載のキトサン複合体、及び食品製造上許容される担体を含有してなる食品組成物。
（２０）食品組成物が、抗ウィルス作用又はウィルス捕捉作用を有するものである前記（１９）に記載の食品組成物。
（２１）食品組成物が、サプリメントである前記（１９）又は（２０）に記載の食品組成物。
（２２）前記（１）〜（６）のいずれかに記載のキトサン複合体を含有してなる食品添加剤。
（２３）食品添加剤が、抗ウィルス剤又はウィルス捕捉剤としての作用を有するものである前記（２２）に記載の食品添加剤。
（２４）前記（１）〜（６）のいずれかに記載のキトサン複合体、及び飼料用担体を含有してなる飼料組成物。
（２５）飼料組成物が、抗ウィルス剤又はウィルス捕捉剤である前記（２４）に記載の飼料組成物。
（２６）前記（１）〜（６）のいずれかに記載のキトサン複合体を含有してなる飼料添加剤。
（２７）飼料添加剤が、抗ウィルス剤又はウィルス捕捉剤としての作用を有するものである前記（２６）に記載の飼料添加剤。【００１３】  本発明は、シアル酸を含有し、かつケト基、アルデヒド基、それらのケタール、アセタール、ヘミケタール、ヘミアセタールなどのカルボニル基又はその誘導体基を含有してなる糖、糖類、又はそれらのオリゴマー類を用いて、これらのカルボニル基又はその誘導体基をキトサンのアミノ基と還元的に反応させて両者が直接結合した複合体を形成させることを特徴とするものである。
本発明における「シアル酸」としては、ノイラミン酸のアシル誘導体としてのシアル酸だけでなく、それらの各種の誘導体を包含するものであり、例えば、デアミノ化物、アセチル化物、硫酸化物、メチル化物、ラクチル化物、これらのラクトン形成体などのノイラミン酸の誘導体が包含される。また、本発明のシアル酸等としては、前記したシアル酸の１種又は２種以上を含有する糖類であって、前記したカルボニル基又はその誘導体基を含有する単糖類、二糖類、若しくはオリゴ糖類、又はこれらの糖誘導体などが挙げられる。好ましいシアル酸等としては、還元性末端を有する糖類、例えばシアリルオリゴ糖が挙げられる。シアリルオリゴ糖のなかでも、天然界に多量に分布しているシアリルラクトースが、ウィルスの捕捉性や反応性だけでなく、入手のしやすさからも特に好ましいが、これらに限定されるものではない。本発明のシアル酸等は、化学的に純粋な単一物質として使用してもよいが、入手の容易性や価格の点から、天然から分離された濃縮物としての混合物を使用することもできる。このようなシアル酸等の混合物を使用することにより、多種類のウィルスを同時に捕捉することが可能となることから、本発明のウィルス捕捉体として有用なウィルス捕捉剤が、特定のウィルスを標的としない場合には、天然界特に、乳、より好ましくはウシの乳から得られるシアリルラクトースに代表されるシアル酸等の混合物を、本発明のシアル酸等として使用することが好ましい。【００１４】  本発明のキトサン複合体は、シアル酸等の還元性官能基、好ましくは還元性末端とキトサン中のアミノ基とを直接反応させて生成させるものである。具体的には、ヤルパニ（Ｙａｌｐａｎｉ）らの方法（Ｍ．ＹａｌｐａｎｉとＬａｕｒａｎｃｅ  Ｄ．Ｈａｌｌ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，第１７巻、２７２−２８１頁、１９８４年）に準じて、酢酸／メタノールなどのキトサンを溶解することのできる適当な溶媒にキトサンを溶解し、ＮａＣＮＢＨ３などの還元剤の存在下で、シアル酸等を加え、キトサンのアミノ基と糖鎖中のカルボニル基と反応させ、還元的アルキル化を行うことで、所望のキトサン複合体を得る。【００１５】  ここで、キトサンとシアル酸等との複合体は、キトサンとシアル酸、あるいはキトサンとシアル酸を含む糖鎖とから、それぞれ調製することもできるが、シアル酸等を含む混合物とキトサンを反応させて調製することが望ましい。かかる混合物としては、乳、又は動物、例えばウシの乳、特にウシの初乳由来のシアリルラクトースを代表とするシアル酸等を使用することが望ましい。【００１６】  乳にはラクトースなど中性糖鎖の他、遊離シアル酸やシアル酸が結合したシアリルラクトースなどシアル酸を含む糖鎖、特にウシの初乳には糖含有量の５〜１０％に相当する量のシアル酸等が含まれており、かつそれらは多種多様な構造を有している（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｇ．ＪｅｎｓｅｎとＭａｒｖｉｎ  Ｐ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ編、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｌｋ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ、１９９５年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ刊、ＩＳＢＮ：０１２３８４４３０４。浦島  匡、乳業技術、５３巻５６−６８項、２００３年。Ｐａｕｌ  ＭａｃＪａｒｒｏｗとＪａｎｎｅｋｅ  ｖａｎ  Ａ��ｅｌｓｆｏｒｔ−Ｓｃｈｏｏｎｂｅｅｋ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄａｉｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１４巻５７１−５７９項、２００４年）。
一般に、ウィルスは、その種類によって認識し結合するシアル酸を含む糖鎖構造を異にすることが知られていることから、多種多様な構造を有する乳、好ましくはウシの乳由来のシアル酸等を使用してウィルスの捕捉体を調製することによって、より多くの種類のウィルスを捕捉することが可能となる。ウシの乳由来のシアル酸等以外にも、ヒトの初乳を含む種々の起源から精製したそれぞれ異なる構造を有する複数種のシアル酸等を用いても、本発明のキトサン複合体を調製することができるが、入手の容易さあるいは精製操作等を考慮すれば、ウシの乳、好ましくはウシの初乳中のシアル酸等の利用が好適である。ウシ常乳（牛乳）中にもウシの初乳に比べて含有量は少ないもののシアル酸等は含まれ、ウシ初乳より入手が容易であることから牛乳中のシアル酸等の利用も好適である。ウシ初乳及び牛乳は生乳としての他、バター、チーズ、調整乳、加工乳、粉乳、脱脂粉乳、ウシ初乳タンパク質等加工して食品、健康食品、動物医薬品等として利用される。これら既存商品の加工製造工程において生じる、商品の他チーズホエーなど副産物も含めた加工物にはシアル酸等が精製若しくは濃縮された状態となる物があり、これらも本発明のシアル酸等の原料として好適である。【００１７】  この様にして調製された本発明のキトサン複合体は、後述する実施例５及び６の試験例からも明らかなように、シアル酸等が単独で存在する場合に比べて、本発明の方法に従ってキトサンとの複合体とすることにより極めて強力なウィルス抑制作用を発揮する。特に近年話題となっているトリインフルエンザウィルスＨ５Ｎ１をはじめヒトインフルエンザウィルスなどに対する抗ウィルス作用は、キトサン複合体とすることにより、シアル酸等が単独での場合に比べて極めて強力となっている。この理由は現在のところ必ずしも明確ではないが、シアル酸等とキトサンが直接化学結合することにより、ウィルスを捕捉し、これを不活化するために極めて有利な３次元構造が形成されているためと考えられる。
このように、本発明のキトサン複合体は、これを単独でウィルスを捕捉するためのウィルス捕捉体として有用なウィルス捕捉剤とすることもできるが、各種の担体と混合してウィルス捕捉体として有用なウィルス捕捉用組成物とすることもできる。本発明のウィルス捕捉剤は、本発明のキトサン複合体単独からなるもの、及び前記したように水などの溶剤のような担体と混合又は溶解させてなるウィルス捕捉用組成物を包含するものである。本発明のウィルス捕捉用担体としては、ウィルスの不活化又はウィルスの捕捉において障害とならないものであれば特に制限はなく、例えば水などの溶媒、繊維材料、セルロースなどの製剤材料などが挙げられる。
また、本発明は本発明のウィルス捕捉剤を含有してなる繊維製品を提供するものである。本発明の繊維製品は、本発明のウィルス捕捉剤を物理的又は化学的な方法により繊維材料に含有させたものであればよく、例えば、本発明のキトサン複合体を不織布などに噴霧や含浸させる、繊維に練り込むなどの方法により製造することができる。本発明の繊維製品としては、例えば、フィルター、マスク、タオル、ハンカチ、又はこれらの加工原料としての繊維製品などが挙げられる。本発明のウィルス捕捉剤は、繊維材料などの各種の材料に含有させることにより、各種の製品のウィルス捕捉体として使用することができる。
さらに、本発明のキトサン複合体は、水又は適当な溶媒と混合又は溶解して、本発明のウィルス捕捉剤としてのウィルス捕捉用組成物の形態で、空気清浄用フィルター、マスクなどの各種の繊維製品だけでなく、医療施設、医療設備、備品、用具、用品などや、ウィルスの汚染に晒される家畜類、その畜舎などに塗付、噴霧あるいは混入等することによって、これらを介したウィルスの感染を予防材料として使用することも可能である。【００１８】  さらには、本発明のキトサン複合体は、これを構成する成分が何れも天然物由来であり、かつヒトや家畜等に対して非毒性であることから、本発明のウィルス捕捉剤は環境にもやさしく、家庭用あるいは家畜舎、特に養鶏場用の洗浄剤、あるいはウィルス防除剤として利用することもできる。また、植物病原性ウィルスの防除を目的とした農薬に利用することも可能である。【００１９】  本発明のキトサン複合体は抗ウィルス活性又はウィルス捕捉活性を有することから、当該複合体を有効成分として、製薬上許容される担体を含有する医薬組成物、特に抗ウィルス剤又はウィルス捕捉剤として利用することができる。特に、ヒト、トリなどの動物における抗インフルエンザウィルス剤として利用することができる。本発明の医薬組成物、特に抗ウィルス剤としての医薬組成物は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、液剤等として経口的に、または注射剤、坐剤、経皮吸収剤、吸入剤、鼻スプレー、洗眼剤、粘膜及び表皮の消毒剤及び洗浄剤等として非経口的に投与することができる。また、本発明の医薬組成物は、賦形剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤等の医薬用添加剤を必要に応じて混合し、医薬製剤とすることができる。注射剤の場合には、適当な担体と共に滅菌処理を行って製剤とする。投与量は疾患の状態、投与ルート、患者の年齢、又は体重によっても異なるが、成人に経口で投与する場合、通常１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０ｇ／ｋｇ／日、好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ／日〜１ｇ／ｋｇ／日である。また、うがい薬およびうがい薬、鼻スプレー、洗眼剤、表皮消毒剤等への添加剤として、ウィルス、特にインフルエンザウィルスに対する予防や治療のために利用することもできる。【００２０】  本発明のキトサン複合体は、抗ウィルス活性又はウィルス捕捉活性を有し、これを構成する成分が何れも天然物由来であり、かつヒトや家畜等に対して非毒性であることから、ヒト用、ペット用、家畜用、魚類用、または猛禽類用の食品組成物、食品添加剤、及び飼料組成物とすることができる。
本発明の食品組成物は、本発明のキトサン複合体、及び食品用の担体、又は食品製造上許容される担体を含有してなるものである。本発明の食品用担体、又は食品製造上許容される担体としては、食品用として使用されてきている天然又は非天然の食品用の各種の材料又は素材などが挙げられる。本発明の食品組成物は、前記してきた本発明のキトサン複合体を単独で使用することもできる。また、本発明のキトサン複合体は、これを単独又は適当な食品用担体と共に食品添加剤として使用することもできる。
さらに、本発明の食品組成物は、適当な剤型に製剤化してサプリメントとして利用することができる。好ましくは、ヒト、ブタ、トリ（特にニワトリ、）、観賞魚へ利用することができる。サプリメント（食物サプリメント）は、ゲル、カプセル、タブレット、シロップ、飲料又は粉末に処方することができる。そのような製剤の製造方法は、当業者に周知である。他の態様においては、サプリメントは、更に、ビタミン、ミネラル、補酵素、繊維又はその組合わせからなる群より選ばれた追加の添加剤を含むことができる。ビタミンは、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＢ１２、リボフラビン、ナイアシン、パントテン酸、チアミン、コリン、葉酸、ビオチン、ビタミンＫ、ビタミンＣ、又はＣｏＱ１０からなる群より選ぶことができる。ミネラルは、コバルト、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレン、ドロマイト、カルシウム、ミネラル酵母、海藻粉末、モリブデン、マグネシウム、カリウム、クロム、カルシウムおよびリンより選ぶことができる。サプリメント中の各ビタミンおよび各ミネラルの量は、当業者によって適切に設定され得る。本発明のサプリメントは、任意の剤形であり得る。本発明のサプリメントが採り得る剤形の例としては、錠剤、顆粒剤、液剤、カプセル剤、散剤、乳剤および懸濁剤が挙げられる。本発明のサプリメントは好ましくは錠剤またはカプセル剤であり、より好ましくはカプセル剤である。本発明のサプリメントは、その剤形に応じて、当該分野で周知の方法に従って製造され得る。例えば、本発明のサプリメントがカプセル剤である場合、成分を液状、懸濁状、のり状、粉末状または顆粒状などの形でカプセルに充填するかまたはカプセル基材で被包成型することによって製造され得る。カプセル剤は、硬カプセル剤であっても軟カプセル剤であってもよい。本発明のサプリメントが錠剤である場合、従来の錠剤製造に用いられている手法および設備をそのまま利用して製造することができる。例えば、主成分と添加剤などとを混合して直接打錠する方法、成分を湿式または乾式で顆粒化した後に打錠する方法などが採用できる。本発明のサプリメントが液剤である場合、従来の液剤製造に用いられている手法および設備をそのまま利用して製造することができる。例えば、液体状の成分をそのまま用いるか、または成分を溶剤に溶解することによって製造し得る。本発明のサプリメントが散剤である場合、成分をそのまま、または成分に賦形剤、結合剤、崩壊剤または他の適切な添加剤を加え、適切な方法で粉末または微粒状とすることによって製造され得る。本発明のサプリメントが乳剤である場合、固形の成分に懸濁化剤または他の適切な添加剤と精製水または油を加え、適切な方法で懸濁して全質を均等にすることによって製造され得る。本発明のサプリメントが懸濁剤である場合、液状の成分に乳化剤と精製水を加え、適切な方法で乳化し、全質を均等にすることによって製造され得る。本発明のサプリメントがこれら以外の形態であっても、当業者は、当該分野で公知の方法に従って適切な形態のサプリメントを製造し得る。サプリメントの摂取量は、摂取ルート、患者の年齢、または体重によっても異なるが、成人に経口で投与する場合、通常１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０ｇ／ｋｇ／日、好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ／日〜１ｇ／ｋｇ／日である。【００２１】  本発明のキトサン複合体は、抗ウィルス活性又はウィルス捕捉活性を有し、これを構成する成分が何れも天然物由来であり、かつヒトや家畜等の動物に対して非毒性であることから、ペットまたは家畜用の飼料に配合することができる（前記サプリメントを飼料に配合してもよい）。したがって、本発明は、本発明のキトサン複合体、及び飼料用担体又は飼料製造上許容される担体を含有してなる飼料組成物を提供するものである。また、本発明の飼料組成物は、本発明のキトサン複合体を単独又は前記した飼料用の担体と共に飼料添加剤として使用することもできる。本発明の飼料組成物や飼料添加剤は、前記してきた食品のサプリメントなどと同様な方法で製造し、使用することができる。本発明の飼料組成物は、通常用いられているペットまたは家畜用飼料を用いることがでる。これら飼料組成物は、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ダイズなどの穀物、コーンサイレージ、グラスサイレージ、アルファルファサイレージ、乾草サイレージ等を含んでいてもよい。本発明の飼料は、当該分野で周知の方法に従って製造され得る。
【発明の効果】
【００２２】  本発明のキトサン複合体は、簡便かつ安価に製造することができるとともに、多種類のウィルスを効率よく捕捉することができる。また、天然物由来の原料からなる本発明のキトサン複合体は、環境ならびに人体等に対して安全であり、幅広い適用範囲を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】  本発明で使用可能なキトサンとしては、食品素材や試薬などとして販売されているキトサン、あるいは従来公知の種々の方法によって天然資源から調製されるキトサンなどを含め、広く一般に入手可能であるものをそのまま使用することができ、その由来等に格別の制限はない。【００２４】  本発明で使用可能なシアル酸等としては、シアリルラクトース、シアリルラクトサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、デアミノノイラミン酸、それらのアセチル化物、硫酸化物、メチル化物、デオキシ体、デヒドロ体、ラクチル化物あるいはラクトン体など、シアル酸を含み、その還元末端などにカルボニル基を含む糖化合物を挙げることができる。これらは単独でも使用できるが、２以上のシアル酸等の混合物の使用が好ましく、乳、例えばウシの乳、特にウシの初乳又は牛乳由来のシアル酸等の使用が好ましい。【００２５】  キトサンとシアル酸等との反応は、ヤルパニ（Ｙａｌｐａｎｉ）らの方法（Ｍ．ＹａｌｐａｎｉとＬａｕｒａｎｃｅ  Ｄ．Ｈａｌｌ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，第１７巻、２７２−２８１頁、１９８４年）に準じて行うことができる。ここで、キトサンを溶解する溶媒としては、酢酸などの酸性溶媒またはそれらと有機溶媒との混合液などが使用される。また、還元剤としては、シアノトリヒドロホウ酸ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、水素化ホウ素リチウム（ＬｉＢＨ４）、水素化ホウ素カリウム（ＫＢＨ４）、ボランジメチルアミン錯体（ＤＭＡＢ、（ＣＨ３）２ＮＨ・ＢＨ３）、ボラントリメチルアミン錯体（ＴＭＡＢ、（ＣＨ３）３Ｎ・ＢＨ３）、Ｂ−イソピノカンフェニル−９−ボロビシクロ［３，３，１］ノナン（Ｂ−ｉｓｏｐｉｎｏｃａｍｐｈｅｎｙｌ−９−ｂｏｒａｂｉｃｙｃｌｏ［３．３．１］ｎｏｎａｎｅ）（Ａｌｄｒｉｃｈ社、商標名Ａｌｐｉｎｅ−Ｂｏｒａｎｅ）、又は、Ｂ−クロロジイソピノカンフェニルボラン（Ｂ−ｃｈｌｏｒｏｄｉｉｓｏｐｉｎｏｃａｍｐｈｅｎｙｌｂｏｒａｎｅ）（Ａｌｄｒｉｃｈ社、商標名ＤＩＰ−ｃｈｌｏｒｉｄｅ）などを、いずれも利用することができる。【００２６】  以下、実施例を示して、本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【００２７】  キトサン（ＰＳＨ−８０、焼津水産化学工業株式会社）５．６ｍｇを、０．７ｍｌの１％酢酸／メタノール（１：１）に溶解した。これに、シアリルラクトース（Ｓｉｇｍａ社）２５ｍｇ、及びＮａＣＮＢＨ３１２．４ｍｇを予め溶解した水溶０．５ｍｌを加え、２５℃で、４８時間反応させた。反応液を透析チューブ（透過分子量約１４，０００）に移し、蒸留水に対して透析（２回交換／日）を５日間行い、最終液を凍結乾燥して、シアリルラクトース・キトサン複合体１５．７ｍｇを得た。構造は、１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、Ｂｒｕｋｅｒ社、５００ＭＨｚ）により確認を行った。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、５００ＭＨｚ）δ：
４．５５６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ−１  ｏｆ  Ｇａｌ  ｉｎ  ＳｉａＬａｃ），４．０１−３．４７（２７．６Ｈ，Ｈ−３，４，５，６  ｏｆ  ＳｉａＬａｃ  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ  ａｎｄ  ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｍａｉｎｃｈａｉｎ，Ｈ−２  ｏｆ  ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｍａｉｎ  ｃｈａｉｎ  ＧｌｃＮＡｃ  ａｎｄ  ＳｉａＬａｃ  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ），２．８５（１．３６Ｈ，ｂｒ，Ｈ−２  ｏｆ  ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｍａｉｎ  ｃｈａｉｎ  ＧｌｃＮ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ＧｌｃＮ），２．６３（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−３ｅｑ  ｏｆ  Ｓｉａ），１．９４（３．６９Ｈ，ｍ，ＣＯＣＨ３），１．６６（１Ｈ，ｔ，Ｈ−３ａｘ  ｏｆ  Ｓｉａ）。【００２８】  この１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの１．６６付近のシアル酸３位由来のピークと２．８５付近のキトサングルコサミン由来のピークの積分値から、キトサンのグルコサミン残基に対して、シアリルラクトースが７３．５％の割合でキトサン主鎖に導入されたことが判明された（グルコサミン残基に対する置換度（ＤＳ）＝７３．５％）。
【実施例２】
【００２９】  北海道上川郡清水町の牧場より回収したウシの初乳８００ｍｌに、８００ｍｌのクロロホルムを加えて攪拌して脱脂した。これを２回繰り返して水相画分を回収後、エタノールを加えて８０％エタノール溶液とし、沈殿する蛋白質を遠心分離で除去して上清を回収し、さらにこれを凍結乾燥して初乳の糖鎖画分１６．４ｇを得た。得られた初乳の糖鎖画分を質量分析器（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ，ＵｌｔｒａＦＬＥＸ，Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社）により解析したところ、ラクトース（Ｌａｃ，Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ）、６’ＳＬＮ（Ｓｉａα２→６Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮａｃ）、６’ＳＬ（Ｓｉａα２→６Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ）又は３’ＳＬ（Ｓｉａα２→３Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ）、及びＤＳＬ（Ｓｉａα２→８Ｓｉａα２→３Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ）に相当する質量スペクトルが確認された。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  ［Ｍ＋Ｎａ］＋：
Ｌａｃ（Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１）として、        計算値：３６５．１、
実測値：３６４．８；
６’ＳＬ又は３’ＳＬ（Ｃ２３Ｈ３９ＮＯ１９）として、計算値：６５６．２、
実測値：６５６．０；
６’ＳＬＮ（Ｃ２５Ｈ４２Ｎ２Ｏ１９）として、計算値：６９７．２、
実測値：６９８．０：
ＤＳＬ（Ｃ３４Ｈ５６Ｎ２Ｏ２８）として、    計算値：９６３．８、
実測値：９６３．１。【００３０】  続いて、キトサン（ＰＳＨ−８０、焼津水産化学工業株式会社）３１９ｍｇを３０ｍｌの１％酢酸／メタノール（１：１）に溶解し、これに、前記で得られた７７０ｍｇの初乳の糖鎖画分を加え、この混合物に７０６ｍｇのＮａＣＮＢＨ３を予め溶解した水溶液１０ｍｌを加え、２５℃で、４８時間反応させた。反応液を透析チューブ（透過分子量約１４，０００）に移し、蒸留水に対して透析（２回交換／日）を５日間行い、最終液を凍結乾燥して、初乳の糖鎖−キトサン複合体４７１ｍｇを得た。構造は、１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、Ｂｒｕｋｅｒ社、５００ＭＨｚ）により確認を行った。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、Ｂｒｕｋｅｒ社、５００ＭＨｚ）δ：
４．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｈ−１  ｏｆ  Ｇａｌ  ｉｎ  Ｌａｃ），４．０７−３．４８（７．４９Ｈ，Ｈ−３，４，５，６  ｏｆ  Ｌａｃ  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ  ａｎｄ  ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｍａｉｎ  ｃｈａｉｎ，Ｈ−２  ｏｆ  ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｍａｉｎ  ｃｈａｉｎ  ＧｌｃＮＡｃ  ａｎｄ  Ｌａｃ  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ），２．７２（０．７１Ｈ，ｂｒ，Ｈ−２  ｏｆ  ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｍａｉｎ  ｃｈａｉｎ  ＧｌｃＮ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ＧｌｃＮ），１．９５（０．６１Ｈ，ｓ，ＣＯＣＨ３）。【００３１】  この初乳の糖鎖−キトサン複合体の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルから、キトサンのグルコサミン残基に対する糖類の置換度（ＤＳ）は約１００％と算定され、ラクトース構造は確認されたがシアル酸及びシアル酸を含む糖鎖の明確なピークはＮＭＲでは確認することができなかった。そこで、酵素法で初乳糖鎖・キトサン複合体中のシアル酸の定量を行った。シアリダーゼ（Ｓｉｇｍａ社）でシアル酸をキトサン複合体から切り出し、さらにアルドラーゼ（Ｓｉｇｍａ社）で処理して生成させたピルビン酸を、ＮＡＤＨを用いたラクトースデヒドロゲナーゼ反応系を用い、３４０ｎｍの吸光度変化として定量した。【００３２】  その結果、複合体中に、キトサンのグルコサミン残基６０個に対して約１個のシアル酸又はシアル酸を含む糖鎖が結合していることが確認された（グルコサミン残基に対するシアル酸及びシアル酸を含む糖鎖の置換度（ＤＳ）＝約１．６％）。確認された置換度は１．６％であるが、これは酵素によりシアル酸を遊離させているため、実際にはこの数倍のシアル酸及びシアル酸を含む糖鎖が結合していると考えられる。
【実施例３】
【００３３】  実施例２で調製した初乳からの糖鎖画分２０ｍｇを、水を溶媒としてゲル濾過（ＢｉｏＧｅｌＰ−４、Ｂｉｏｒａｄ社）を行い、シアル酸及びシアル酸を含む酸性糖鎖よりなる画分１（３．６ｍｇ）とラクトースを主成分とする中性糖鎖画分２（１６．４ｍｇ）を得た。画分１中には、６’ＳＬＮ、６’ＳＬ又は３’ＳＬ、及びＤＳＬに相当する質量ピークが、それぞれ質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ，ＵｌｔｒａＦＬＥＸ，Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社）にて確認された。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  ［Ｍ＋Ｎａ］＋：
画分１：６’ＳＬ又は３’ＳＬ
（Ｃ２３Ｈ３９ＮＯ１９）として、計算値：６５６．２、
実測値：６５６．５；
６’ＳＬＮ
（Ｃ２５Ｈ４２Ｎ２Ｏ１９）として、計算値：６９７．２、
実測値：６９７．８：
ＤＳＬ
（Ｃ３４Ｈ５６Ｎ２Ｏ２８）として、計算値：９６３．８，
実測値：９６３．８。
画分２：Ｌａｃ
（Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１）として、計算値：３６５．１，
実測値：３６５．１。【００３４】  続いて、キトサン（ＰＳＨ−８０、焼津水産化学工業株式会社）５．６ｍｇを０．７ｍｌの１％酢酸／メタノール（１：１）に溶解した。これに、２５ｍｇの画分１、及び１２．４ｍｇのＮａＣＮＢＨ３を予め溶解した水溶液１０ｍｌを加え、２５℃で、２４時間反応させた。反応液を透析チューブ（透過分子量約１４，０００）に移し、蒸留水に対して透析（２回交換／日）を５日間行い、最終液を凍結乾燥して、シアル酸等−キトサン複合体１９．３ｍｇを得た。構造は、１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、Ｂｒｕｋｅｒ社、５００ＭＨｚ）により確認を行った。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、５００ＭＨｚ）δ：
４．５６，４．４４，４．５０（Ｈ−１  ｏｆ  Ｇａｌ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｉｎ  Ｓｉａｌｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ），４．００−３．４９（２５．５Ｈ，Ｈ−３，４，５，６  ｏｆ  ＳｉａＬａｃ  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ  ａｎｄ  ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｍａｉｎｃｈａｉｎ，Ｈ−２  ｏｆ  ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｍａｉｎ  ｃｈａｉｎ  ＧｌｃＮＡｃ  ａｎｄ  ＳｉａＬａｃ  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ），２．８５（１．６１Ｈ，ｂｒ，Ｈ−２  ｏｆ  ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｍａｉｎ  ｃｈａｉｎ  ＧｌｃＮ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ＧｌｃＮ），２．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−３ｅｑ  ｏｆ  Ｓｉａ），１．９５（４．２１Ｈ，ｍ，ＣＯＣＨ３），１．７０（１Ｈ，ｔ，Ｈ−３ａｘ  ｏｆ  Ｓｉａ）。【００３５】  この１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの１．７０付近のシアル酸の３位由来のピークと２．８５付近のキトサングルコサミン由来のピークの積分値から、キトサンのグルコサミン残基に対してシアル酸及びシアル酸を含む糖鎖（シアル酸等）が、６１．８％の割合でキトサン主鎖に導入されたことが判明した（グルコサミン残基に対する置換度（ＤＳ）＝６１．８％）。
【実施例４】
【００３６】  北海道上川郡清水町の牧場より回収した牛乳２００ｍｌに、２００ｍｌのクロロホルムを加えて攪拌して脱脂した。これを２回繰り返して水相画分を回収後、エタノールを加えて８０％エタノール溶液とし、沈殿する蛋白質を遠心分離で除去して上清を回収し、さらにこれを凍結乾燥して牛乳糖鎖画分３．９ｇを得た。牛乳糖鎖は９５％以上がラクトース（Ｌａｃ，Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ）であるが多様な中性糖鎖やシアリル糖鎖を含むことが知られている（浦島  匡、乳業技術、５３巻５６−６８項、２００３年。Ｐａｕｌ  ＭａｃＪａｒｒｏｗとＪａｎｎｅｋｅ  ｖａｎ  Ａｍｅｌｓｆｏｒｔ−Ｓｃｈｏｏｎｂｅｅｋ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄａｉｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１４巻５７１−５７９項、２００４年）。今回精製したものが糖鎖類であることは、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ，ＵｌｔｒａＦＬＥＸ，Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社）及び１Ｈ−ＮＭＲ解析（Ｂｒｕｋｅｒ社、５００ＭＨｚ）により主成分のラクトースを分析することで確認した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＡＳＳ（ｍ／ｓ）；［Ｍ＋Ｎａ］＋：
Ｌａｃ（Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１）として、計算値：３６５．１、
実測値：３６５．１。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ：
５．１３（０．４Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，αＨ−１  ｏｆ  Ｇｌｃ  ｉｎ  Ｌａｃ），４．５８（０．６Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，βＨ−１  ｏｆ  Ｇｌｃ  ｉｎ  Ｌａｃ），４．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，Ｈ−１  ｏｆ  Ｇａｌ  ｉｎ  Ｌａｃ），３．８６−３．４６（１１．４Ｈ，ｍ，Ｐｒｏｔｏｎｓ  ｏｆ  ｓｕｇａｒ  ｒｉｎｇ），３．１９（０．６Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，βＨ−２  ｏｆ  Ｇｌｃ  ｉｎ  Ｌａｃ）．【００３７】  続いて、キトサン（ＰＳＨ−８０、焼津水産化学工業株式会社）４０７ｍｇを３０ｍｌの１％酢酸／メタノール（１：１）に溶解した。これに１ｇの牛乳糖鎖画分、及び９９４ｍｇのＮａＣＮＢＨ３を予め溶解した水溶液１５ｍｌを加え、２５℃で、４８時間反応させた。反応液を透析チューブ（透過分子量約１４，０００）に移し、蒸留水に対して透析（２回交換／日）を５日間行い、最終液を凍結乾燥して、牛乳糖鎖−キトサン複合体９８５ｍｇを得た。構造は、１Ｈ−ＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ社、５００ＭＨｚ）により確認を行い、ラクトースなど糖鎖・キトサン複合体が形成していることを確認した。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ：
４．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｈ−１  ｏｆ  Ｇａｌ），４．０７−３．４８（７．５０Ｈ，Ｐｒｏｔｏｎｓ  ｏｆ  ｓｕｇａｒ  ｒｉｎｇ），２．９８（０．７１Ｈ，ｂｒ，Ｈ−２  ｏｆ  ＧｌｃＮ），２．７７（２Ｈ，ｂｒ，ＮＣＨ２），１．９９（０．６５Ｈ，ｓ，ＣＯＣＨ３）。【００３８】  本複合体中におけるラクトースなど糖鎖残基のグルコサミン残基に対する置換度（ＤＳ）は、１Ｈ−ＮＭＲの測定結果によると１００％である。
【実施例５】
【００３９】  実施例３で製造したウシ初乳からのシアル酸等−キトサン複合体の抗ウィルス活性をＭＴＴ法（Ｔｉｍ  Ｍｏｓｍａｎｎ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、６５巻５５−６３項、１９８３年）を用いて測定した。実施例３で製造したウシ初乳由来シアル酸等−キトサン複合体、及びその対照化合物（化学反応処理をしていないキトサンとウシ初乳シアル酸等の混合物）を、それぞれエタノールで懸濁後、培地にて４０倍希釈した物について５倍段階希釈系列を作製し、試験区として使用した。同時に培地に２〜５ＴＣＩＤ５０のＷＳＮ（Ｈ１Ｎ１）ウィルスとＭＤＢＫ細胞２００００細胞／ウエル播種することにより抗ウィルス活性を測定した。３７℃、５％ＣＯ２環境下にて７２時間インキュベート後、ＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍｌの３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイド（３−（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）（ＭＴＴ）−ＰＢＳ溶液）２０μｌを加え２時間インキュベートした。培地を除去後、ＭＴＴ溶解液（イソプロピルアルコールに１００分の１容量の４０ｍＭ  塩酸水溶液、１０分の１量のトリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を加えたもの）を２００μｌ添加した。マイクロプレートミキサーにて細胞溶解後、マイクロプレートリーダーで５６０ｎｍの吸収を測定した。
その結果、ウシ初乳シアル酸等−キトサン複合体のＥＣ５０は、３９μｇ／ｍｌであり、対照化合物は１０００μｇ／ｍｌ以上と測定され、本発明の複合体による抗ウィルス活性を確認することができた。
【実施例６】
【００４０】  実施例２及び４で製造したウシ初乳糖鎖−キトサン複合体及び牛乳糖鎖−キトサン複合体の抗ウィルス活性をそれぞれ測定した。ＭＤＣＫ細胞を前培養後、培養液に溶かした各試料（糖鎖−キトサン複合体及びその化学合成反応を行っていないもの）とウィルス（ヒト由来Ａ型インフルエンザウィルスＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）又は、高病原性鳥インフルエンザウィルスＡ／Ｃｈｉｋｅｎ／Ｙａｍａｇｕｃｈｉ／７／０４（Ｈ５Ｎ１））を加え、３５℃にて４８時間培養後、細胞を顕微鏡下で細胞変性効果を観察した。
その結果、５ｍｇ／ｍｌの濃度でウシ初乳糖鎖−キトサン複合体及び牛乳糖鎖−キトサン複合体はそれぞれ細胞変性抑制効果が認められたが、対照化合物では認められなかった。
【実施例７】
【００４１】  本発明の医薬組成物、サプリメントなどの食品組成物、又は飼料組成物における製剤化の例を以下に示す。【００４２】製剤例１
以下の成分を含有する顆粒剤を製造する。
成分      キトサン複合体                          １０ｍｇ
乳糖                                ７００ｍｇ
コーンスターチ                          ２７４ｍｇ
ＨＰＣ−Ｌ                            １６ｍｇ
合計                              １０００ｍｇ
キトサン複合体と乳糖を６０メッシュのふるいに通す。コーンスターチを１２０メッシュのふるいに通す。これらをＶ型混合機にて混合する。混合末にＨＰＣ−Ｌ（低粘度ヒドロキシプロピルセルロース）水溶液を添加し、練合、造粒（押し出し造粒  孔径０．５〜１ｍｍ）したのち、乾燥する。得られた乾燥顆粒を振動ふるい（１２／６０メッシュ）で櫛過し顆粒剤を得る。【００４３】製剤例２
以下の成分を含有するカプセル充填用散剤を製造する。
成分      キトサン複合体                    １０ｍｇ
乳糖                            ７９ｍｇ
コーンスターチ                    １０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム              １ｍｇ
合計                            １００ｍｇ
キトサン複合体、乳糖を６０メッシュのふるいに通す。コーンスターチは１２０メッシュのふるいに通す。これらとステアリン酸マグネシウムをＶ型混合機にて混合する。１０倍散１００ｍｇを５号硬ゼラチンカプセルに充填する。【００４４】製剤例３
以下の成分を含有するカプセル充填用顆粒剤を製造する。
成分      キトサン複合体                  １５ｍｇ
乳糖                          ９０ｍｇ
コーンスターチ                  ４２ｍｇ
ＨＰＣ−Ｌ                    ３ｍｇ
合計                      １５０ｍｇ
キトサン複合体、乳糖を６０メッシュのふるいに通す。コーンスターチを１２０メッシュのふるいに通す。これらを混合し、混合末にＨＰＣ−Ｌ溶液を添加して練合、造粒、乾燥する。得られた乾燥顆粒を整粒後、その１５０ｍｇを４号硬ゼラチンカプセルに充填する。【００４５】製剤例４
硬質ゼラチンカプセルは次の成分を用いて製造する：
用量
成分                （ｍｇ／カプセル）
キトサン複合体                ２５０
デンプン（乾燥）              ２００
ステアリン酸マグネシウム            １０
合計                          ４６０【００４６】製剤例５
活性成分８０ｍｇを含むカプセル剤は次のように製造する。
キトサン複合体                            ８０ｍｇ
デンプン                                ５９ｍｇ
微結晶性セルロース                          ５９ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                      ２ｍｇ
合計                                  ２００ｍｇ
キトサン複合体、デンプン、セルロース、およびステアリン酸マグネシウムを混合し、Ｎｏ．４５メッシュＵ．Ｓ．のふるいに通して硬質ゼラチンカプセルに２００ｍｇずつ充填する。【００４７】製剤例６
以下の成分を含有する錠剤を製造する。
成分      キトサン複合体                    １０ｍｇ
乳糖                            ９０ｍｇ
微結晶セルロース                    ３０ｍｇ
ＣＭＣ−Ｎａ                      １５ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム              ５ｍｇ
合計                            １５０ｍｇ
キトサン複合体、乳糖、微結晶セルロース、ＣＭＣ−Ｎａ（カルボキシメチルセルロース  ナトリウム塩）を６０メッシュのふるいに通し、混合する。混合末にステアリン酸マグネシウム混合し、製錠用混合末を得る。本混合末を直打し、１５０ｍｇの錠剤を得る。【００４８】製剤例７
錠剤は下記の成分を用いて製造する：
成分                        用量
（ｍｇ／錠剤）
キトサン複合体                ２５０
セルロース（微結晶）          ４００
二酸化ケイ素（ヒューム）        １０
ステアリン酸                  ５
合計                    ６６５
成分を混合し、圧縮して各重量６６５ｍｇの錠剤にする。【００４９】製剤例８
活性成分６０ｍｇを含む錠剤は次のように製造する：
キトサン複合体                        ６０ｍｇ
デンプン                            ４５ｍｇ
微結晶性セルロース                      ３５ｍｇ
ポリビニルピロリドン（水中１０％溶液）    ４ｍｇ
ナトリウムカルボキシメチルデンプン          ４．５ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム              ０．５ｍｇ
滑石                              １ｍｇ
合計                          １５０ｍｇ
キトサン複合体、デンプン、およびセルロースはＮｏ．４５メッシュＵ．Ｓ．のふるいにかけて、十分に混合する。ポリビニルピロリドンを含む水溶液を得られた粉末と混合し、ついで混合物をＮｏ．１４メッシュＵ．Ｓ．ふるいに通す。このようにして得た顆粒を５０℃で乾燥してＮｏ．１８メッシュＵ．Ｓ．ふるいに通す。あらかじめＮｏ．６０メッシュＵ．Ｓ．ふるいに通したナトリウムカルボキシメチルデンプン、ステアリン酸マグネシウム、および滑石をこの顆粒に加え、混合した後、打錠機で圧縮して各重量１５０ｍｇの錠剤を得る。
【産業上の利用可能性】
【００５０】  本発明は、簡便な方法で天然物由来の原料のみを使用したキトサン複合体を提供するものであり、本発明のキトサン複合体は、各種のウィルスに対する抗ウィルス活性、ウィルス捕捉活性を有し、ウィルスの不活化や捕捉するための材料として有用である。
本発明のキトサン複合体は、ヒトや動物に対して安全であり、環境にもやさしく、しかも低コストであり、ウィルスに対する強い活性を有することから、各種のウィルスに起因する汚染や疾患の防御や予防のための新規な材料として産業上の利用可能性を有している。
【国際調査報告】
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