(57)【要約】  被検組織又は被検細胞における発現量に基づいてＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性を予測するために用いる、ｐ１６遺伝子、ｐ１８遺伝子及びｐ２７遺伝子からなる群より選択される薬剤感受性予測用遺伝子を提供する。また、被検組織又は被検細胞における上記遺伝子の発現量を指標にＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性の予測方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検組織又は被検細胞における発現量に基づいてＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性を予測するために用いる、ｐ１６遺伝子、ｐ１８遺伝子及びｐ２７遺伝子からなる群より選択される薬剤感受性予測用遺伝子。
【請求項２】
前記ｐ１６遺伝子、ｐ１８遺伝子及びｐ２７遺伝子からなる群より選択される遺伝子が、ｐ１８遺伝子である、請求項１記載の薬剤感受性予測用遺伝子。
【請求項３】
前記薬剤感受性が薬剤耐性である、請求項１又は２に記載の薬剤感受性予測用遺伝子。
【請求項４】
ｐ１６遺伝子、ｐ１８遺伝子及びｐ２７遺伝子からなる群より選択される遺伝子のアンチセンス核酸、又は、該遺伝子が発現してなるタンパク質を特異的に認識する抗体、を含有する、ＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性検出試薬。
【請求項５】
ｐ１６遺伝子、ｐ１８遺伝子及びｐ２７遺伝子からなる群より選択される遺伝子のアンチセンス核酸からなる、ＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性検出用プローブ。
【請求項６】
ｐ１６遺伝子、ｐ１８遺伝子及びｐ２７遺伝子からなる群より選択される遺伝子が発現してなるタンパク質を特異的に認識する抗体からなる、ＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性検出用抗体。
【請求項７】
被検組織又は被検細胞における、ｐ１６遺伝子、ｐ１８遺伝子及びｐ２７遺伝子からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量を測定する工程と、
該遺伝子の発現量と健常組織又は健常細胞における該遺伝子の発現量とを比較する工程と、を含む、ＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性の予測方法。
【請求項８】
発現量の比較の結果、健常組織又は健常細胞における前記遺伝子の発現より被検組織又は被検細胞における前記遺伝子の発現が低い場合に、前記被検組織又は被検細胞はＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性が高いと判断する工程をさらに含む、請求項７記載の予測方法。
【請求項９】
被検組織又は被検細胞における、ｐ１６遺伝子、ｐ１８遺伝子及びｐ２７遺伝子からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を検出する工程を含む、ＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性の予測方法。
【請求項１０】
検出の結果、前記遺伝子が発現している場合に、前記被検組織又は被検細胞はＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性が低いと判断する工程をさらに含む、請求項９に記載の予測方法。
【請求項１１】
前記遺伝子がｐ１８遺伝子である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の予測方法。
【請求項１２】
被検組織又は被検細胞における発現量に基づいてＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性を予測するための、ｐ１６遺伝子、ｐ１８遺伝子及びｐ２７遺伝子からなる群より選択される遺伝子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検組織又は被検細胞におけるＣＤＫ４阻害剤に対する感受性を分子レベルで測定・予測する方法に関する。また、当該測定・予測に用いる分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒトゲノム計画の進展により、薬物感受性の個人差を遺伝子レベルで理解し、医薬の開発に応用する薬理ゲノミクス（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）が急速に進展している。薬物感受性の個人差を遺伝子レベルで判断できるようになれば、副作用の強い医薬を真に薬効の期待できる患者だけに投与することや、試行錯誤的な投薬を実施することなく、治療の初期から適切な投薬を実施する、いわゆるオーダーメイド医療が可能となる。その結果、患者に無用の肉体的負担を負わせることもなくなり、また、近年高騰する傾向にある医療費の削減にも寄与することとなる。中でも、抗癌剤は非常に強い副作用を有する場合が多く、オーダーメイド医療が強く望まれている。【０００３】
一方、癌が生じる一因として細胞周期の異常が挙げられる。細胞周期は細胞分裂の基本的なシステムで、細胞増殖制御におけるシグナル伝達の最終段階を担う。細胞周期は細胞の増殖が停止している状態をＧ０期として、順にＧ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期と進行する。Ｓ期ではＤＮＡの複製が行われ、Ｍ期では細胞の分裂が行われる。細胞周期の制御には種々のタンパク質が関与するが、中でも、サイクリン−ＣＤＫ(Ｃｙｃｌｉｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ)複合体が中心的な役割を果たす。すなわち、サイクリンＤがＣＤＫ４（又はＣＤＫ6）と、また、サイクリンＥ及びサイクリンＡがＣＤＫ2とそれぞれ複合体を形成し活性化される。活性化された複合体はＲｂ(Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ)タンパク質をリン酸化してシグナル伝達を進行せしめ、Ｅ２Ｆ等の転写因子を活性化することにより細胞をＧ１期からＳ期へと誘導する。【０００４】
ここで、ＣＤＫ４（ヒトＣＤＫ４遺伝子のアクセッションナンバー：Ｕ３７０２２：配列番号１）は、３０３アミノ酸からなる３４ｋＤのタンパク質であり、サイクリンＤによって活性化され、Ｒｂタンパク質をリン酸化することでその増殖抑制活性を中和する遺伝子として知られており、ある種の癌細胞で高発現しているとの報告がある（Ａｄｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９９６年、６８巻、６７頁)。【０００５】
また、ＣＤＫインヒビターとしては複数種が知られており、ｐ２１と相同性のあるＣｉｐ／Ｋｉｐファミリーと、ｐ１６と相同性のあるＩＮＫ４ファミリーに大別される。いずれも、サイクリン−ＣＤＫ複合体のリン酸化活性を阻害し、Ｒｂタンパク質のリン酸化を抑制することによって細胞周期の進行を阻害するが、Ｃｉｐ／Ｋｉｐファミリーが複数のサイクリン−ＣＤＫ複合体に結合しそれらを阻害するのに対し、ＩＮＫ４ファミリーはＣＤＫ４又はＣＤＫ6にのみ結合しこれらを阻害するなど、作用機序については違いがある。【０００６】
Ｃｉｐ／Ｋｉｐファミリーの一つとしてｐ２７（ヒトｐ２７遺伝子のアクセッションナンバー：ＮＭ＿００４０６４：配列番号２）が挙げられる。ｐ２７は、増殖を停止した細胞において、サイクリンＥ・ＣＤＫ２複合体に結合し、その活性を阻害する約２７ｋＤａのタンパク質として同定された（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１９９４年、８巻、９頁）。【０００７】
また、ＩＮＫ４ファミリーの例としてｐ１６（ヒトｐ１６遺伝子のアクセッションナンバー：ＮＭ＿００００７７：配列番号３）やｐ１８（ヒトｐ１８遺伝子のアクセッションナンバー：ＮＭ＿００１２６２：配列番号４）が挙げられる。ｐ１６はＣＤＫ４と結合し、その活性を阻害するＣＤＫインヒビターとしてｃＤＮＡが単離された(Ｎａｔｕｒｅ、１９９３年、３６６巻、７０４頁)。ｐ１６は１５６アミノ酸からなる１６ｋＤａのタンパク質である。一方、ｐ１８は、ＣＤＫ６と相互作用するタンパク質を酵母Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍにより探索することによりクローニングされた(Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１９９４年、８巻、２９３９頁)。Ｇｕａｎらは、ｐ１８がＣＤＫ６とは強力に、ＣＤＫ４とは緩やかに相互作用するが、他のＣＤＫとは全く相互作用しないことを見出した。【０００８】
ところで、上述したように、薬物感受性の個人差を遺伝子レベルで判断できればオーダーメイド医療等が著しく進展する。このような試みはすでになされており、癌領域においても、ＤＮＡマイクロアレイを用いて多くの遺伝子の発現を指標に抗癌剤に対する感受性や耐性を検討した報告があった(Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００１年、６１巻、６４７４頁：非特許文献１)。また、Ｊｏｈｎ  Ｍ．  Ｍａｒｉａｄａｓｏｎらは、５−ＦＵ(５−Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ)及びＣＰＴ(Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ)に対する癌細胞の薬剤感受性を各種遺伝子の発現量を指標に検討している(Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００３年、６３巻、８７９１頁：非特許文献２)。
【非特許文献１】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００１年、６１巻、６４７４頁
【非特許文献２】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００３年、６３巻、８７９１頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、非特許文献１及び２には、ｐ１６、ｐ１８又はｐ２７の発現量を指標に薬剤に対する感受性や耐性を予測できる旨の記載はなく、これらの遺伝子の発現量とＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性や薬効との関係についても全く示唆はなかった。【００１０】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、ＣＤＫ４阻害剤の薬剤感受性の程度を予測するに際して、指標となる遺伝子を提供することを目的とする。また、かかる遺伝子の発現量を指標にＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性の予測方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＣＤＫ４阻害剤として細胞周期を制御する分子として知られているｐ１６、ｐ１８又はｐ２７の発現量がＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性の有無、又はその程度を予測する際の指標となることを見出し、本発明を完成した。【００１２】
すなわち、本発明は、被検組織又は被検細胞における発現量に基づいてＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性を予測するために用いるｐ１６遺伝子、ｐ１８遺伝子及びｐ２７遺伝子からなる群より選択される薬剤感受性予測用遺伝子を提供する。ＣＤＫ４阻害剤は、Ｒｂタンパク質のリン酸化を抑制することにより細胞増殖を抑制する作用があるために、癌などの増殖性疾患の治療薬として有用であるが、反面、健常な細胞の増殖をも抑制する副作用も有している。しかしながら、ＣＤＫ４阻害剤を患者に投薬する前に、上記薬剤感受性予測用遺伝子を用いて薬剤感受性を予測すれば、ＣＤＫ４阻害剤が効かない患者への投薬を避けることができ、副作用を大幅に軽減できる。【００１３】
上記の薬剤感受性予測用遺伝子は、ｐ１８遺伝子であることが好ましい。ｐ１８遺伝子は、ＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性と顕著に相関するため、より正確な予測ができる。【００１４】
また、本発明は、被検組織又は被検細胞における発現量に基づいてＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤耐性を予測するために用いるｐ１６遺伝子、ｐ１８遺伝子及びｐ２７遺伝子からなる群より選択される薬剤感受性予測用遺伝子を提供する。ＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤過感受性のみならず、薬剤耐性を予測する場合においても、これらの薬剤感受性予測用遺伝子を好適に使用することができる。【００１５】
さらに、本発明は、ｐ１６遺伝子、ｐ１８遺伝子及びｐ２７遺伝子からなる群より選択される遺伝子のアンチセンス核酸、又は、該遺伝子が発現してなるタンパク質を特異的に認識する抗体を含有するＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性検出試薬を提供する。上記薬剤感受性検出用試薬を用いれば、ＣＤＫ４阻害剤を患者に投薬する前に、この薬剤に対する感受性を予測することができる。なお、ｐ１６遺伝子が発現してなるタンパク質は配列番号８、ｐ１８遺伝子が発現してなるタンパク質は配列番号９、ｐ２７遺伝子が発現してなるタンパク質は配列番号１０で表される。【００１６】
上記のＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性の予測には、ｐ１６遺伝子、ｐ１８遺伝子及びｐ２７遺伝子からなる群より選択される遺伝子のアンチセンス核酸からなる薬剤感受性検出用プローブや、上記遺伝子が発現してなるタンパク質を特異的に認識する薬剤感受性検出用抗体を用いることが好ましい。【００１７】
また、本発明は、被検組織又は被検細胞におけるｐ１６遺伝子、ｐ１８遺伝子及びｐ２７遺伝子からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量を測定する工程（測定工程）と、該遺伝子の発現量と健常組織又は健常細胞における該遺伝子の発現量とを比較する工程（比較工程）とを含むＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性の予測方法を提供する。この方法を用いれば、ＣＤＫ４阻害剤を患者に投薬する前に、この薬剤に対する感受性を予測することができる。【００１８】
上記予測方法において、発現量の比較の結果、健常組織又は健常細胞における上記遺伝子の発現より被検組織又は被検細胞における上記遺伝子の発現が低い場合に、上記被検組織又は被検細胞はＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性が高いと判断する工程（高感受性判断工程）をさらに含むようにすると、上記遺伝子の発現が、健常組織又は健常細胞と比較して被検組織又は被検細胞において低い場合に、ＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性が高いと予測できる。【００１９】
また、本発明は、被検組織又は被検細胞におけるｐ１６遺伝子、ｐ１８遺伝子及びｐ２７遺伝子からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を検出する工程（検出工程）を含むＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性の予測方法を提供する。この方法を用いれば、測定工程及び比較工程が不要であるため、簡易にＤＫ４阻害剤に対する感受性を予測することができる。【００２０】
上記予測方法において、検出の結果、上記遺伝子が発現している場合に、上記被検組織又は被検細胞はＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性が低いと判断する工程（低感受性判断工程）をさらに含むようにすると、被検組織又は被検細胞において、上記遺伝子の発現が検出された場合に、ＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性が低いと予測できる。【００２１】
さらに、上記の薬剤感受性の予測方法において、その発現を検出する遺伝子がｐ１８遺伝子であることが好ましい。ｐ１８遺伝子は、ＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性と顕著に相関するため、上記予測方法においてより正確な予測ができる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明のＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性の予測方法によれば、ＣＤＫ４阻害剤の薬剤感受性の程度を予測するに際して、指標となる遺伝子、すなわち、ｐ１６、ｐ１８又はｐ２７の用途（薬剤感受性予測用遺伝子）が提供される。また、これらの遺伝子の発現量を指標にＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性を予測する方法が提供される。【００２３】
なお、ｐ１６、ｐ１８又はｐ２７は、それぞれが細胞周期を負に制御する因子であって、対応するCDKのキナーゼ活性を阻害する作用を有する癌抑制遺伝子の産物であるため、その遺伝子自体を抗癌剤のターゲットにする試みはなされてきたが、これらの遺伝子がCDKインヒビターと同じ作用を発揮するCDK４阻害剤の感受性を予測するために利用できるとは、これまで予想することができなかった。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】化合物Ａ処理によるＲｂタンパク質のリン酸化のレベルの変化を確認した図である。
【図２】各種組織由来の培養細胞について化合物Ａによる細胞増殖の阻害とアポトーシスの誘導を比較した図である。
【図３】各種組織由来の培養細胞について、これらの細胞において発現量が変化する遺伝子をマイクロアレイにより検出し、クラスタリングした状態を示す図である。
【図４】各種組織由来の培養細胞について、ｐ１８、ｐ１６、ｐ２７及びリン酸化Ｒｂタンパク質（ｐＲＢ）の発現量を確認した図である。
【図５】ｐ１８の発現が誘導されたＨｅＬａ細胞において、ｐ１８の発現誘導を確認した図である。
【図６】ｐ１８の発現とアポトーシス誘導との関係を示す図である。
【図７】ｐ１６及びｐ２７の過剰発現によって発現量が変化する遺伝子を２４、３６、４８及び７２hrの４つのタイムポイントにおいて調べ、プロットした図である。
【図８】ｐ１６及びｐ２７の過剰発現によって発現量が変化する遺伝子を２４、３６、４８及び７２hrの４つのタイムポイントにおいて確認した図である。
【図９】ｐ１６及びｐ２７の過剰発現によって発現量が変化する遺伝子を２４、３６、４８及び７２hrの４つのタイムポイントにおいて検出し、クラスタリングした図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。【００２６】
まず、本発明において用いられる用語について説明する。【００２７】
「被検組織」とは、ＣＤＫ４阻害剤に対する感受性を測定すべき検体（主としてヒト）由来の組織であればその種類は特に限定されないが、分離・抽出が容易であるとの観点から、血液であることが好ましい。血液は、血球を細胞成分、線維素原を含む血漿を細胞外基質と考えることができため、１つの支持組織と捉えることができる。また、ＣＤＫ４阻害剤の標的疾患は主として増殖性疾患（癌・腫瘍、慢性関節リウマチなど）であるため、かかる疾患が生じた臓器由来の組織であることが好ましい。【００２８】
また、「被検細胞」についても、ＣＤＫ４阻害剤に対する感受性を測定すべき検体（主としてヒト）由来の細胞であればその種類は特に限定されないが、分離・抽出が容易であるとの観点から、血液細胞（赤血球、白血球等の血球細胞のみならず、これらの混合物であってもよい）であることが好ましい。また、ＣＤＫ４阻害剤の標的疾患は主として増殖性疾患（癌・腫瘍、慢性関節リウマチなど）であるため、かかる疾患が生じた組織由来の細胞であることが好ましい。【００２９】
「ＣＤＫ４阻害剤」とは、ＣＤＫ４の活性を阻害する物質であればその種類は特に限定されず、低分子又は高分子の化合物であってもよく、タンパク質やペプチドであってもよい。また、低分子の生理活性物質であってもよい。このようなＣＤＫ４阻害剤としては、具体的には、例えば、Ｆｌａｖｏｐｉｒｉｄｏｌ、ＢＭＳ３８７０３２、Ｒ−Ｒｏｓｃｏｖｉｔｉｎｅが挙げられる。【００３０】
「薬剤感受性」は、本来、性別、年齢、栄養状態、病態によって相違するものであり、組織内の薬物濃度にも影響を受けるが、これらの要因に係わらず、薬剤を投与する価値があるかないかを基準として感受性の程度を判断すればよい。すなわち、ｐ１６、ｐ１８又はｐ２７遺伝子の発現量を測定し、その発現量に応じて薬剤の投与をすべきか否かを検討することとなる。【００３１】
また、薬剤感受性が変化した場合に、薬剤耐性や薬剤過感受性を示す場合がある。薬剤耐性とは、通常、薬剤を持続的にあるいは短時間に頻回投与することによって薬剤に対する反応性の低下が起こる現象をいう。薬剤耐性が生じる原因としては、例えば、受容体数の減少、受容体の結合親和性の減少、情報伝達系の活性低下などが知られている。一方、薬剤過感受性とは、例えば、作用部位でのアゴニスト濃度を減少させておいた場合に、その後に与えられたアゴニストに対する反応性が著しく亢進する現象をいう。薬剤過感受性が生じる原因としては、受容体の増加や受容体からの情報伝達系の活性亢進などが知られている。【００３２】
「薬剤感受性予測用遺伝子」とは、被検組織又は被検細胞における発現量に基づいてＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性を予測するために用いる、ｐ１６、ｐ１８又はｐ２７遺伝子をいう。【００３３】
ｐ１６、ｐ１８又はｐ２７遺伝子は、背景技術の欄において説明したとおり、生体内においてＣＤＫのリン酸化活性を阻害する作用を有する因子として知られている。これらの遺伝子はいずれも、サイクリン−ＣＤＫ複合体に結合することにより、サイクリン−ＣＤＫがＲｂタンパク質をリン酸化することを阻害する。すなわち、これらの遺伝子はＲｂ経路の調節因子として機能している。これらの事実より、ｐ１６、ｐ１８又はｐ２７遺伝子の発現が低い細胞では、ＣＤＫの活性が高く、Ｒｂ経路が活性化されていると予想され、これらの遺伝子とＣＤＫの活性との間には相関関係があると予想されるが、ＣＤＫ４阻害剤に対する感受性とｐ１６、ｐ１８又はｐ２７遺伝子の発現量との間に如何なる関係があるかについてはこれまで知見がなかった。本発明者らは、ＣＤＫ４阻害剤に対する感受性の相違に従って細胞レベル又は組織レベルで分類することにより、ＣＤＫ４阻害剤とｐ１６、ｐ１８又はｐ２７遺伝子の発現量との相関関係を明らかにし、薬剤感受性予測する上記遺伝子の用途を見出した。【００３４】
ＣＤＫ４、ｐ１６、ｐ１８及びｐ２７のそれぞれの遺伝子の由来となる動物種については、ヒト又は非ヒト動物が挙げられ、例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ウサギが例示できるが、中でも、ヒトであることが好ましい。【００３５】
本発明においては、ｐ１６、ｐ１８又はｐ２７遺伝子の用途を開示しているが、ＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性を調べる用途に特に好ましいのは、ｐ１８遺伝子である。その発現量と薬剤感受性との関係が顕著だからである。【００３６】
ＣＤＫ４阻害剤に対する「薬剤感受性検出用プローブ」は、ｐ１６遺伝子、ｐ１８遺伝子及びｐ２７遺伝子からなる群より選択される遺伝子のアンチセンス核酸のことであって、その用途がＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性を調べるために用いるものである。【００３７】
上記アンチセンス核酸は、被検組織又は被検細胞で発現するｐ１６遺伝子、ｐ１８遺伝子及びｐ２７遺伝子のｍRNAをそれぞれ特異的に認識することができれば、遺伝子の全長又はその一部の配列のアンチセンス核酸であってもよく、ＤＮＡとＲＮＡのいずれであってもよい。ノーザンブロッティングやｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション等のハイブリダイゼーション法により上記遺伝子のmＲＮＡを検出する場合は、通常、1００  ｂｐ以上の長さのアンチセンス核酸を用いる。しかし、好ましくは、５００  ｂｐ以上であり、さらに好ましくは１０００  ｂｐ以上である。但し、対応するｍRNAを特異的に認識することができれば、数十bp程度のオリゴヌクレオチドであってもよい。【００３８】
なお、アンチセンス核酸は、ＤＮＡであれば上記遺伝子を鋳型にしてＰＣＲ法により合成することができ、ＲＮＡの場合は、上記遺伝子を鋳型にｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ法により合成できる。オリゴヌクレオチドの場合は、DNA合成機により合成できる。【００３９】
また、ｐ１６、ｐ１８及びｐ２７を特異的に認識する抗体は、被検組織又は被検細胞で発現するｐ１６、ｐ１８及びｐ２７をそれぞれ特異的に認識することができれば、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。なお、上記抗体は、例えば、上記タンパク質又はその合成ペプチドをウサギに免疫したり、ハイブリドーマ法により調製できる。【００４０】
「薬剤感受性検出試薬」は、上記アンチセンス核酸又は上記抗体を必須成分とするＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性を調べるために調製された試薬であり、上記アンチセンス核酸又は上記抗体のみからなるものであってもよいが、上記アンチセンス核酸又は上記抗体と他の成分との混合物であることが好ましい。このような薬剤感受性検出試薬は、通常、中性付近の緩衝液中に、上記アンチセンス核酸又は抗体をこれらの分解を防ぐ酵素阻害剤や還元剤と共に溶解し、その他用途によって必要な構成成分を含有させて製造できる。【００４１】
次に、本発明の第一実施形態に係る「ＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性の予測方法」について説明する。【００４２】
第一実施形態に係る「ＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性の予測方法」は、被検組織又は被検細胞におけるｐ１６、ｐ１８及びｐ２７からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量を測定する測定工程と、前記遺伝子の発現量と健常組織又は健常細胞における前記遺伝子の発現量とを比較する比較工程とを含むことを特徴とする。【００４３】
測定工程では、被検体から分離された被検組織又は被検細胞において、ｐ１６、ｐ１８又はｐ２７遺伝子のうちの少なくとも一つの遺伝子の発現量を測定するが、ここで、「少なくとも一つ」とは、ｐ１６、ｐ１８又はｐ２７のうち、いずれか一つの遺伝子に着目して発現量を測定してもよいし、２つ又は３つの遺伝子に着目して発現量を測定してもよい。２つ又は３つの遺伝子に着目する場合であっても、より正確な予測を行うためには、少なくともｐ１８を含んで発現量を測定することが好ましい。また、測定の方法としては特に制限はないが、例えば、被検組織又は被検細胞を可溶化した後、ＤＮＡマイクロアレイ等で分析することによりこれらの遺伝子の発現量を測定することができる。また、上記遺伝子の翻訳産物を検出する場合には、例えば、ウエスタンブロッティングにより翻訳産物の発現量を調べることができる。【００４４】
比較工程では、測定工程で測定した被検組織又は被検細胞におけるｐ１６、ｐ１８又はｐ２７遺伝子の発現量と、健常人から分離した健常組織又は健常細胞におけるｐ１６、ｐ１８又はｐ２７遺伝子の発現量とを比較する。比較の方法としては特に制限はないが、具体的には、例えば、ＤＮＡマイクロアレイであればアレイ上の蛍光強度を定量したり、ウエスタンブロッティングであれば、検出されたバンドをデンシトメーター等で数値化することにより比較すればよい。【００４５】
第一実施形態においては、前記の測定工程及び比較工程に加え、さらに高感受性判断工程を含んでいてもよい。高感受性判断工程は、発現量の比較の結果、健常組織又は健常細胞におけるｐ１６、ｐ１８又はｐ２７遺伝子の発現より被検組織又は被検細胞における当該遺伝子の発現が低い場合に、被検組織又は被検細胞はＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性が高いと判断する工程である。【００４６】
高感受性判断工程では、比較工程で遺伝子の発現量を比較した結果、被検組織又は被検細胞における遺伝子の発現が健常組織又は健常細胞と比較して低い場合に、当該被検組織又は被検細胞を分離した被検体はＣＤＫ４阻害剤に対して感受性が高いと予測できる。【００４７】
次に、本発明の第二実施形態に係る「ＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性の予測方法」について説明する。【００４８】
第二実施形態に係る「ＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性の予測方法」は、被検組織又は被検細胞におけるｐ１６、ｐ１８及びｐ２７からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を検出する検出工程を含むことを特徴とする。【００４９】
本発明の第一実施形態に係るＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性の予測方法は、被検組織又は被検細胞と、健常組織又は健常細胞とにおけるｐ１６、ｐ１８及びｐ２７遺伝子の発現量を比較することにより、ＣＤＫ４阻害剤に対する感受性の程度を予測するものである。しかしながら、これらの遺伝子は健常組織との比較のみならず、単に発現の有無を確認するだけでＣＤＫ４阻害剤に対する感受性の程度を判断することができる。すなわち、第二実施形態に係る予測方法においては、感受性の高い組織・細胞は上記遺伝子（特にｐ１８）の発現が低いか、全く発現していない傾向にある。従って、上記遺伝子の発現を調べた結果、全く発現が検出できなかった場合あるいは発現が検出できたが、その発現量が著しく低い場合には、ＣＤＫ４阻害剤に対する感受性が高いものと予測できる。【００５０】
ここで、ｐ１６、ｐ１８及びｐ２７遺伝子の発現を検出する方法としては特に制限はないが、具体的には、例えば、被検組織又は被検細胞を可溶化した後、ＤＮＡマイクロアレイ等で検出することができる。また、上記遺伝子の翻訳産物を検出する場合には、例えば、ウエスタンブロッティングにより翻訳産物の発現の有無を調べることができる。【００５１】
第二実施形態では、被検体から分離された被検組織又は被検細胞において、ｐ１６、ｐ１８又はｐ２７遺伝子のうちの少なくとも一つの遺伝子の発現を検出するが、ここで、「少なくとも一つ」とは、ｐ１６、ｐ１８又はｐ２７のうち、いずれか一つの遺伝子に着目して発現量を測定してもよいし、２つ又は３つの遺伝子に着目して発現量を測定してもよい。２つ又は３つの遺伝子に着目する場合であっても、より正確な予測を行うためには、少なくともｐ１８を含んで発現量を測定することが好ましい。【００５２】
第二実施形態においては、前記の検出工程に加え、さらに低感受性判断工程を含んでいてもよい。低感受性判断工程は、検出の結果、前記遺伝子が発現している場合に、前記被検組織又は被検細胞はＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性が低いと判断する工程である。【００５３】
低感受性判断工程を実施することにより、検出工程で遺伝子の発現が検出された場合に、当該被検組織又は被検細胞を分離した被検体はＣＤＫ４阻害剤に対して感受性が低いと予測できる。【００５４】
以上説明したような本発明の薬剤感受性予測用遺伝子及び薬剤感受性の予測方法により、ＣＤＫ４阻害剤に対する感受性、中でも薬剤耐性に関する知見をｐ１６、ｐ１８又はｐ２７遺伝子の発現量に基づいて予測することが可能となる。これは、被検体から分離された血液等の被検組織・被検細胞中のｐ１６、ｐ１８又はｐ２７遺伝子の発現を測定するだけで、投与しようと考えるＣＤＫ４阻害剤に対する感受性や薬効を予測することが可能となり、いわゆるオーダーメイド医療が可能となることを意味するものである。
【実施例】
【００５５】
実施例１：ＣＤＫ４阻害剤耐性実験
（プラスミドの構築）
ｐ１８遺伝子はＨｅＬａ細胞のｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により増幅した。増幅したｐ１８遺伝子はＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ社製)によりｐＣＲ  ２．１−ＴＯＰＯ  ｖｅｃｔｏｒに挿入し、発現ベクターを構築した。【００５６】
また、ｐＴＲＥ２ｈｙｇ  ＦＬＡＧ−ｐ１８  ｖｅｃｔｏｒは、ＦＬＡＧ遺伝子とｐ１８遺伝子をｐＴＲＥ２ｈｙｇ  ｖｅｃｔｏｒに挿入することにより構築した。【００５７】
（細胞培養の方法）
全ての臨床分離癌細胞株は３７℃で５％ＣＯ２存在下、飽和水蒸気の環境にて培養した。また、ＨＣＴ１１６、ＳＣＣ−２５、ＰＡ−１及びＵ−１１８ＭＧは１０％牛胎児血清添加Ｄ−ＭＥＭ培地(ＧＩＢＣＯ社製)を用いて培養した。また、ＰＣ１３、ＭＳＴＯ−２１１Ｈ、ＢｘＰＣ−３及びＮＣＩ−Ｈ６９は１０％牛胎児血清添加ＲＰＭＩ１６８０(ＩＷＡＫＩ社製)を用いて培養した。また、ＳＫ−ＯＶ−３は１０％牛胎児血清添加ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５ａ  ｍｅｄｉｕｍ  (ＧＩＢＣＯ社製)を用いて培養した。さらに、Ｊ８２は１０％牛胎児血清添加ＭＥＭ  ｍｅｄｉｕｍ(ＧＩＢＣＯ社製) を用いて培養した。また、ＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ  ｃｅｌｌｓはＣｌｏｎｔｅｃｈ社より購入し、１０％  Ｔｅｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ (Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製)添加ＤＭＥＭ  ｍｅｄｉｕｍ(ＧＩＢＣＯ社製)を用いて培養した。【００５８】
（Ｃｄｋ４阻害作用）
（１）サイクリンＤ２−Ｃｄｋ４の精製
まず、Ｃｄｋ４及びその活性化因子サイクリンＤ２とグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合体のｃＤＮＡをバキュロウイルス発現ベクタ−に組み込み、組み換えバキュロウイルスを作製した。作製したバキュロウイルスを昆虫細胞Ｓｆ９に感染させてサイクリンＤ２とグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合体−Ｃｄｋ４活性複合体として高発現させた。その細胞を回収して可溶化した後、活性複合体をグルタチオンセファロースに吸着させ、サイクリンＤ２−Ｃｄｋ４複合体をプレシジョンプロテアーゼにて回収し、ＨＰＬＣカラムクロマトグラフィ−で精製した（ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９９６年、第１５巻、７０６０−７０６９頁）。【００５９】
（２）サイクリンＤ２−Ｃｄｋ４の活性測定
サイクリンＤ２−Ｃｄｋ４の活性測定において、基質はＲＢタンパク質のアミノ酸７７５番から７８７番に相当する合成ペプチド（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ：配列番号５）を用いた（ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９９６年、第１５巻、７０６０−７０６９頁）。【００６０】
反応は北川らの方法（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１９９２年、第７巻、１０６７−１０７４頁）を一部改変して行った。反応液量は２１．１μｌで、反応バッファ−（Ｒバッファー）の組成は２０ｍＭ  トリス−塩酸バッファ−（ｐＨ７．４）／１０ｍＭ  塩化マグネシウム／４．５ｍＭ  ２−メルカプトエタノ−ル／１ｍＭ  エチレングリコールビス（ベータ−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラアセチックアシッド（ＥＧＴＡ）とした。Rバッファーに精製したサイクリンＤ２−Ｃｄｋ４、１００μｍｏｌの基質ペプチド、５０μｍｏｌの非標識アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及び１μＣｉの［ガンマ−３３Ｐ］標識ＡＴＰ（２０００−４０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ：第一化学薬品社製）を添加して、３０℃で４５分間反応させた。その後、１０μｌの３５０ｍＭリン酸バッファ−を反応系に添加して反応を停止させた。基質ペプチドをＰ８１ペ−パ−フィルター９６ウエルプレートに吸着させた後、７５ｍＭリン酸バッファ−で数回洗浄し、その放射活性を液体シンチレ−ションカウンタ−で測定した。【００６１】
被検化合物の反応系への添加は、まず化合物のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）希釈系列を調製し、それを１．１μｌ加えることで行った。反応系へＤＭＳＯを１．１μｌ加えたものを対照とした。【００６２】
（Ｃｄｋ６阻害作用）
（１）サイクリンＤ２−Ｃｄｋ６の精製
Ｃｄｋ６及びその活性化因子サイクリンＤ２とグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合体のｃＤＮＡをバキュロウイルス発現ベクタ−に組み込み、組み換えバキュロウイルスを作製した以外は、サイクリンＤ２−Ｃｄｋ４の場合と同様の方法で行った。【００６３】
（２）サイクリンＤ２−Ｃｄｋ６の活性測定【００６４】
サイクリンＤ２−Ｃｄｋ４に代えてサイクリンＤ２−Ｃｄｋ６を用いた以外はサイクリンＤ２−Ｃｄｋ４の場合と同様の方法で行った。【００６５】
（Ｃｄｋ２阻害作用）
（１）サイクリンＡ−Ｃｄｋ２の精製
Ｃｄｋ2及びその活性化因子サイクリンＡとグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合体のｃＤＮＡをバキュロウイルス発現ベクタ−に組み込み、組み換えバキュロウイルスを作製した以外はサイクリンＤ２−Ｃｄｋ４の場合と同様の方法で行った。【００６６】
（２）サイクリンＡ−Ｃｄｋ２の活性測定
サイクリンＡ−Ｃｄｋ２の活性測定は、基質として合成ペプチド（Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ：配列番号６）を用い、サイクリンＤ２−Ｃｄｋ４に代えてサイクリンＡ−Ｃｄｋ２を用いた以外は、サイクリンＤ２−Ｃｄｋ４の活性測定の場合と同様の方法で行った。【００６７】
（Ｃｄｋ1阻害作用）
（１）サイクリンＢ−Ｃｄｋ1の精製
Ｃｄｋ1とグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合体及びその活性化因子サイクリンＢのｃＤＮＡをバキュロウイルス発現ベクタ−に組み込み、組み換えバキュロウイルスを作製した以外はサイクリンＤ２−Ｃｄｋ４と同様の方法で行った。【００６８】
（２）サイクリンＢ−Ｃｄｋ1の活性測定
サイクリンＡ−Ｃｄｋ２に代えてサイクリンＢ−Ｃｄｋ1を用いた以外はサイクリンＡ−Ｃｄｋ２の活性測定と同様の方法で行った。【００６９】
（Ｃｄｋ７阻害作用）
（１）サイクリンＨ−Ｃｄｋ７の精製
Ｃｄｋ７及びその活性化因子サイクリンＨとグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合体のｃＤＮＡをバキュロウイルス発現ベクタ−に組み込み、組み換えバキュロウイルスを作製した以外はサイクリンＤ２−Ｃｄｋ４と同様の方法で行った。【００７０】
（２）サイクリンＨ−Ｃｄｋ７の活性測定
サイクリンＨ−Ｃｄｋ７の活性測定において、基質として合成ペプチド（Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ：配列番号７）を用い、サイクリンＤ２−Ｃｄｋ４に代えてサイクリンＨ−Ｃｄｋ７を用いた以外はサイクリンＤ２−Ｃｄｋ４の活性測定と同様の方法で行った。【００７１】
（細胞増殖抑制作用の測定）
細胞増殖抑制作用は、ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ  ｄｙｅ−ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄにより測定した。それぞれの細胞を生細胞数として２×１０３個含むそれぞれの細胞の培養用培地１００μｌずつを９６ウエル細胞培養用ディッシュに分注し、一晩培養した。翌日、化合物のＤＭＳＯ溶液からＤＭＳＯによる希釈系列を調製した。次いでその希釈系列をあるいは薬剤非添加対照用としてＤＭＳＯのみをそれぞれの細胞の培養用培地に添加した。最後に、９６ウエルディッシュで培養した細胞に、各薬剤の希釈系列あるいはＤＭＳＯのみを添加した培養用培地を１００μｌずつ添加し、さらに３日間培養した。【００７２】
各ウエルにＷＴＳ−8（キシダ化学（株）社製）を２０μｌずつ加えてさらに２時間培養したのち、６５０ｎｍを参照波長として４５０ｎｍにおける光学濃度を測定して、対照群と比較した。化合物Ａにより細胞増殖が５０％阻害される濃度をＩＣ５０として値を求めた。【００７３】
本実施例で使用したＣＤＫインヒビター (以下化合物Ａと記す）のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける阻害活性を表１に示す。表１より、化合物ＡはＣＤＫ  ｆａｍｉｌｙのキナーゼ活性を低濃度で阻害することが確認できた。それに対して、ＣＤＫ  ｆａｍｉｌｙ以外のキナーゼに対しては低濃度では阻害活性を持たないことが明らかとなった。従って、化合物ＡはＣＤＫ選択的な阻害剤であると考えられた。【００７４】
【表１】
2006013862.tif 000002
【００７５】
また、ＣＤＫの細胞内の基質であるＲｂタンパク質のリン酸化に対する化合物Ａの効果についても検討した。【００７６】
すなわち、薬剤処理時のＲｂタンパク質のリン酸化状態を、リン酸化Ｒｂタンパク質を特異的に認識する抗体を用いたウエスタンブロッティングにより調べた。【００７７】
まず、細胞を６ウエル細胞培養用ディッシュに分注し、一晩培養した。翌日、化合物Ａ（最終濃度：３、１０、３０、１００ｎＭ）と薬剤非添加対照用としてＤＭＳＯをそれぞれの細胞の培養用培地に添加した。２４時間薬剤処理した後、細胞を回収した。細胞の破砕液を７．５％  ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離後、ゲルからＩｍｍｏｂｉｌｏｎ  ＰＶＤＦ膜(Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製)へ転写した。このＰＶＤＦ膜を、リン酸化Ｒｂタンパク質の特異的抗体であるａｎｔｉ−Ｓｅｒ７８０(ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製)を含む一次抗体液に浸し、４度で一昼夜浸透した。浸透後、ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧを含む二次抗体液に浸し、４度で１時間浸透した。浸透後、ＴＢＳ−Ｔ  ｂｕｆｆｅｒにより洗浄した。その後、ＥＣＬ(Ａｍｅｒｓｈａｍ社製)を用いて化学発光をＸ線フィルムに感光させて、目的抗原の存在量を調べた。【００７８】
その結果は、図１に示したとおりである。ゲル中のバンドは、リン酸化したＲｂタンパク質（ｐＲＢ）を示す。これより、薬剤非添加対照用のＤＭＳＯ処理した細胞中のＲｂタンパク質と比較して、化合物Ａ処理時には濃度依存的にＲｂタンパク質のリン酸化が低下した。従って、化合物Ａは細胞内でもＣＤＫを阻害する活性を持つことが明らかとなった。【００７９】
（アポトーシスの検出方法）
アポトーシスの誘導はフローサイトメトリーを用いて解析し、ＳｕｂＧ１分画の増加により調べた。それぞれの細胞を６ウエル細胞培養用ディッシュに分注し、一晩培養した。翌日、化合物Ａと薬剤非添加対照用としてＤＭＳＯをそれぞれの細胞の培養用培地に添加した。３日間の薬剤処理後、細胞を回収した。細胞のＤＮＡをＣｙｃｌｅ  ＴＥＳＴＴＭ  ＰＬＵＳ  ＤＮＡ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  (Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製)により染色し、フローサイトメトリーを用いて解析した。【００８０】
化合物Ａの細胞増殖阻害活性、及びアポトーシス誘導活性を調べた結果を図２に示す。細胞増殖阻害活性は化合物Ａにより細胞増殖が５０％阻害される濃度をＩＣ５０として値を求めた。また、アポトーシスの誘導はフローサイトメトリーを用いて解析し、ＳｕｂＧ１分画の増加により調べた。図中のＩＣ５０は、上記の細胞増殖阻害活性を示し、ｓｕｂＧ１  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎは、アポトーシスの誘導の割合を示す。【００８１】
化合物ＡのＩＣ５０は様々な細胞に対して同程度であった。それに対して、化合物Ａによるアポトーシスの誘導は細胞ごとに異なる値を示した。このことから、化合物Ａは幅広い細胞に対して同様な増殖阻害活性を持つが、増殖阻害後にアポトーシスを誘導される細胞とされない細胞があることが明らかとなった。【００８２】
（マイクロアレイによる遺伝子発現解析）
各細胞株から、ＲNｅａｓｙトータルＲＮＡアイソレーション・キット（キアゲン社製）を用いてトータルＲＮＡを精製し、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（エンゾ・ダイアグノスティクス社製）でビオチン・ラベルをした。ラベルしたＲＮＡを、ヒト遺伝子プローブセット約１２，０００個を含むＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ（アフィメトリクス社製）ＨＧ−Ｕ９５Ａチップにハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション及びチップ洗浄の方法は、アフィメトリクス・フルイディクス・ステーションのプロトコールに従った。【００８３】
ＣＤＫ阻害剤に対する耐性の予測に有用な遺伝子を発見するため、ＣＤＫ阻害剤によるアポトーシスを起こしやすい細胞株と起こしにくい細胞株の間で、発現量に違いのある遺伝子を探索した。薬剤感受性株５種（ＢｘＰＣ  ＩＩＩ、ＭＳＴＯ−２１１Ｈ、ＰＡ−１、ＳＣＣ−２５、及びＰＣ１３）と薬剤耐性株４種（ＳＫ−ＯＶ−ＩＩＩ、ＮＣＩ−Ｈ６９、Ｕ１１８−ＭＧ、及びＪ８２）の間で２０通りの総当り比較を行い、次の基準を満たす遺伝子を、感受性株と耐性株で発現量に差のある遺伝子として抜き出した。それぞれの組み合わせでの比較には、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｕｉｔｅ（マイクロアレイ・アナリシス・スィート：アフィメトリクス社製）を用いた。遺伝子の選択の基準として、以下の基準１を設けた。【００８４】
基準1：  ２０通りの比較のうち１６通り以上で感受性株での発現が耐性株より高い遺伝子、又は１６通り以上で耐性株での発現が感受性株より高い遺伝子。【００８５】
この基準を満たす遺伝子は８７個あり、これらの遺伝子を使ってクラスタリングを行った（図３）。クラスタリングは、ジーンスプリング（シリコン・ジェネティクス社製）を用いて行った。縦に細胞株が、横に遺伝子がクラスタリングされている。クラスタリングは、パターンを分類する方法で、パターンの似ている細胞株どうし、遺伝子どうしが樹形図上で近くに並んで表示される。このクラスタリングでは、細胞株が、感受性の強いグループと弱いグループに分類されていることがわかる。このことから、これらの遺伝子の発現量で、ＣＤＫ阻害剤に対する耐性を予測することが可能であると考えられる。【００８６】
しかし、この条件だけでは、感受性株と耐性株で発現量に差のある遺伝子でなく、組織特異的に発現している遺伝子が選ばれる可能性がある。例えば、耐性株に胃由来の細胞が多く、感受性株に肺由来の細胞が多いと、薬剤耐性に関連のある遺伝子でなく、組織特異的に発現している遺伝子が選ばれる。そこで、８７個のうちさらに次の基準２を満たす遺伝子を選んだ。【００８７】
基準2：  肺組織由来の感受性株対耐性株の比較：ＰＣ１３対ＮＣＩ−Ｈ６９、ＭＳＴＯ−２１１Ｈ対ＮＣＩ−Ｈ６９、及び、卵巣由来の細胞株の比較：ＰＡ−１対ＳＫ−ＯＶ−ＩＩＩの3通りの比較全てにおいて感受性株での発現が耐性株より高い遺伝子、又は耐性株での発現が感受性株より高い遺伝子。【００８８】
その結果、感受性株で耐性株より高い発現を示す遺伝子が１５個、耐性株の方が感受性株より高い発現を示す遺伝子が２７個見出された（表２）。これらの中には、細胞周期・伸長、シグナル伝達、転写制御などに関与する遺伝子が含まれており、これらの発現の違いが、薬剤耐性の違いの原因になっていることが考えられる。特に、CDKとの関連が深い遺伝子として、p18（CDKインヒビターの１つ）遺伝子の発現が、感受性株より耐性株で高いことが明らかとなった。【００８９】
【表２】
2006013862.tif 000003
【００９０】
（ウエスタンブロッティング）
各培養細胞の抽出液を１２．５％  ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離後、ゲルからＩｍｍｏｂｉｌｏｎ  ＰＶＤＦ膜(ミリポア社製)へ転写した。このＰＶＤＦ膜をａｎｔｉ−ｐ１８(サンタクルーツ  バイオテクノロジー社製)を含む一次抗体液に浸し、４℃で一昼夜浸透した。浸透後、ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧを含む二次抗体液に浸し、４℃で一時間浸透した。浸透後、ＴＢＳ−Ｔ  ｂｕｆｆｅｒにより洗浄し、その後、ＥＣＬ(アマシャム社製)を用いて化学発光をＸ線フィルムに感光させて、目的抗原の存在位置を検出した。【００９１】
化合物Ａによりアポトーシスが誘導される細胞とされない細胞の中における、ＣＤＫインヒビター及びリン酸化Ｒｂタンパク質の発現量を調べた結果を図４に示す。図中のｐＲＢは、リン酸化Ｒｂタンパク質を示し、β−ａｃｔｉｎは、解析に用いた各細胞から抽出したタンパク量の内部標準である。【００９２】
ここで、ＣＤＫインヒビターは癌抑制遺伝子である。これらの発現低下により細胞は過増殖を起こし、発癌に至ることが知られている。ＣＤＫ阻害タンパクの発現低下により癌化した細胞は、ＣＤＫ阻害剤に対して感受性が高いと考えられている。【００９３】
この結果から、ＣＤＫ阻害剤によりアポトーシスが誘導される細胞に共通して、ｐ１８の発現量が低いことが分かる。このことから、ｐ１８の発現量が低い細胞はＣＤＫ阻害剤に感受性が高く、ｐ１８の発現量が高い細胞はＣＤＫ阻害剤に感受性が低いことが明らかとなった。【００９４】
（プラスミド安定保持株の作成）
化合物Ａに対する感受性とｐ１８の発現量の相関を調べることを目的に、Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎによりｐ１８の発現が誘導できる細胞（ｐ１８  ＩＮＤ  ＨｅＬａ）を樹立した。すなわち、ＨｅＬａ細胞にｐＴＲＥ２ｈｙｇ  ＦＬＡＧ−ｐ１８  ｖｅｃｔｏｒをＦｕｎｅｇｅ  ６を用いて導入した。導入した細胞を２４時間培養後、細胞数が約５０分の１になるように培養し、０．３  ｍｇ／ｍｌ  ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ(インビトロジェン社製)存在下で約２週間培養した。コロニーを形成した細胞を、シリンダークローニング法により単離した。【００９５】
こうして樹立した組換え細胞を用いて、化合物Ａに対する感受性とｐ１８の発現量の相関を調べた結果を図５に示す。図中のｖｅｃｔｏｒは、ｐ１８遺伝子を挿入していないｐＴＲＥ２ｈｙｇ  ＦＬＡＧ−ｖｅｃｔｏｒを導入したコントロール細胞を示し、ｐ１８  ＩＮＤ  ＨｅＬａは、ＨｅＬａ細胞にｐＴＲＥ２ｈｙｇ  ＦＬＡＧ−ｐ１８  ｖｅｃｔｏｒを導入し、Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎによりｐ１８の発現を誘導できる細胞を示す。【００９６】
コントロール細胞（Ｖｅｃｔｏｒ）ではＤｏｘｙｃｙｃｌｉｎによりｐ１８の発現量が変わらなかった。それに対して、ｐ１８  ＩＮＤ  ＨｅＬａ細胞では３μｇ／μｌ Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎ添加時に、ｐ１８の発現が誘導されている。従って、ｐ１８の発現が誘導できる細胞（ｐ１８  ＩＮＤ  ＨｅＬａ）を樹立できたことが確認された。【００９７】
次に、化合物Ａに対する感受性とｐ１８の発現量の相関を調べた。その結果は、図６に示したとおりである。左側の２つのグラフは、Ｄｅｏｘｙｃｙｃｌｉｎを添加していない細胞についての結果であり（−Ｄｅｏｘｙｃｙｃｌｉｎ）、右側の２つのグラフは、Ｄｅｏｘｙｃｙｃｌｉｎを３μｇ／ｍｌの濃度で添加した細胞についての結果である（＋３μｇ／ｍｌ  Ｄｅｏｘｙｃｙｃｌｉｎ）。コントロール細胞（Ｖｅｃｔｏｒ）ではＤｏｘｙｃｙｃｌｉｎによりｐ１８の発現量が変わらず、また、化合物Ａにより誘導されるアポトーシスも変わっていない。それに対して、ｐ１８  ＩＮＤ  ＨｅＬａ細胞では３μｇ／μｌ Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎ添加によりｐ１８の発現を誘導した時に、アポトーシス誘導が１８％から１０％に抑制されていることが分かる。このことから、化合物Ａに対する感受性とｐ１８の発現量の間に相関があることが明らかとなった。【００９８】
以上より、ＣＤＫ阻害剤に対する感受性とｐ１８の発現量の間に相関があることが明らかとなった。従って、ｐ１８の発現量を調べることは、ＣＤＫ阻害剤が治療効果を発揮する疾患（特に、癌の種類）の探索に非常に有用であることが明らかとなった。【００９９】
実施例２：ＣＤＫ阻害蛋白質発現実験
（マイクロアレイ解析）
全ての実験にはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ９５  Ａｖ２  ＧｅｎｅＣｈｉｐを使用した。【０１００】
まず、ｐ１６又はｐ２７遺伝子を組み込んだウィルスベクターをＨＣＴ１１６細胞にトランスフェクションさせ、ｌａｃＺを組み込んだウィルスベクターをトランスフェクションさせた細胞（コントロール）と比較することで、ｐ１６及びｐ２７過剰発現により発現を変化させる遺伝子を２４、３６、４８及び７２hrの４つのタイムポイントにおいて調べた。Ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅを測定するために、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０  (ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＭＡＳ−５．０)のＣｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓを用いた。ここで、マイクロアレイによって遺伝子の発現量を測定する際にＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いると、”Ｓｉｇｎａｌ”と”Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｃａｌｌ” という情報がそれぞれのプローブセットに対して算出される。パーフェクトマッチのプローブセットで検出された発現量がそれと対になっているミスマッチプローブセットで検出された発現量をｐ−ｖａｌｕｅ０．０４未満で上回っている場合には”Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｃａｌｌ”に”ｐｒｅｓｅｎｔ”(Ｐ)の値がつけられる。一方、ｐ−ｖａｌｕｅが０．０４から０．０６の間である場合には”ｍａｒｇｉｎａｌ” （Ｍ）が、０．０６以上である場合には”ａｂｓｅｎｔ” （Ａ）の値がつけられる。ＧｅｎｅＣｈｉｐ  ＳｏｆｔｗａｒｅのＣｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓを用いると、２つのサンプル間での遺伝子発現量の違いを測定し、”Ｓｉｇｎａｌ  Ｌｏｇ  Ｒａｔｉｏ” (ｌｏｇ２  ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ)と”Ｃｈａｎｇｅ  ｃａｌｌ”という値が算出される。”Ｃｈａｎｇｅ  ｃａｌｌ”の値として”Ｉｎｃｒｅａｓｅ”（Ｉ）,“Ｄｅｃｒｅａｓｅ”（Ｄ）,“Ｍａｒｇｉｎａｌ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ／Ｄｅｃｒｅａｓｅ”（ＭＩ／ＭＤ）及び”Ｎｏ  Ｃｈａｎｇｅ”（ＮＣ）の５つの値が与えられる。【０１０１】
今回の実験では、まずＣＤＫ４阻害の影響によって発現を変化させる遺伝子を抽出するために、次の基準を使用した。【０１０２】
（ａ）：  ４つのタイムポイントのうち、いずれか一つ以上のポイントにおいて、ｐ１６及びｐ２７過剰発現細胞とコントロールを比較した際の”Ｓｉｇｎａｌ  Ｌｏｇ  Ｒａｔｉｏ”が０．６以上で、”Ｃｈａｎｇｅ  ｃａｌｌ”が“Ｉ”又は“ＭＩ”、若しくは、”Ｓｉｇｎａｌ  Ｌｏｇ  Ｒａｔｉｏ”が０．６以下で、”Ｃｈａｎｇｅ  ｃａｌｌ”が“Ｄ”又は“ＭＤ”である。【０１０３】
（ｂ）：  ｐ１６を過剰発現させた細胞と、ｌａｃＺをトランスフェクトした細胞での“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｃａｌｌ”が総て“Ａ” ではない。【０１０４】
（ｃ）：  ｐ２７を過剰発現させた細胞と、ｌａｃＺをトランスフェクトした細胞での“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｃａｌｌ”が全てのタイムポイントにおいて“Ａ”のものは除く。【０１０５】
次に、ＣＤＫ２阻害の影響によって発現を変化させる遺伝子を抽出するために、次の基準を使用した。【０１０６】
（ａ）：  ｐ２７を過剰発現させた細胞とコントロールを比較した際の“Ｓｉｇｎａｌ  Ｌｏｇ  Ｒａｔｉｏ”が、いずれか一箇所のタイムポイントにおいて、０．６以上で”Ｃｈａｎｇｅ  ｃａｌｌ”が“Ｉ”又は“ＭＩ”、若しくは０．６以下で、”Ｃｈａｎｇｅ  ｃａｌｌ”が“Ｄ”又は“ＭＤ”である。【０１０７】
（ｂ）：  p１６を過剰発現させた細胞とコントロールを比較した際の“Ｓｉｇｎａｌ  Ｌｏｇ  Ｒａｔｉｏ”が全てのタイムポイントにおいて、−０．３以上、０．３以下である。【０１０８】
（ｃ）：  ｐ２７を過剰発現させた細胞と、ｌａｃＺをトランスフェクトした細胞での“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｃａｌｌ”が全てのタイムポイントにおいて“Ａ”のものは除く。【０１０９】
（主成分分析(Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：ＰＣＡ)）
統計解析ソフトウェアパッケージＳＡＳ  ｒｅｌｅａｓｅ  ８．２を用いて、ＣＤＫ４阻害の影響によって発現を変化させている遺伝子として抽出されてきた遺伝子に対して主成分分析を行なった。解析結果をグラフィカルディスプレイ上に表示させるためにＧｅｎｅＳｐｉｒｎｇ  ６を用いた。計算にはｌｏｇ２  ｒａｔｉｏをそのまま使用し、ノーマライズは行なわなかった。【０１１０】
ＣＤＫ４の阻害によって１．５倍以上の発現変化が観察された遺伝子に対して主成分分析を適用した結果、選ばれてきた遺伝子が、発現パターンによってどのようにグループ分類されるのかを調べた。【０１１１】
その結果を図７に示す。図７のグラフ中、４８〜７２ｈｒにおいて発現が増加している遺伝子が第一象限に（ｘ，ｙともに正の値）、２４〜３６ｈｒにおいて発現が減少している遺伝子が第二象限に（ｘが負で、ｙが正）、４８〜７２ｈｒにおいて発現が減少している遺伝子が第三象限に（ｘ,ｙともに負の値）、２４〜３６ｈｒにおいて発現が増加している遺伝子が第四象限に集まっていた。すなわち、ＣＤＫ４阻害によって発現変化を起こす遺伝子を、その発現変化パターンによって４つのグループに分類することができたことを示している。【０１１２】
また、ＣＤＫ４の阻害（ｐ１６、ｐ２７の過剰発現）によって２．０倍以上に発現を変化させている遺伝子のリスト（但し、第一象限の遺伝子のみ、１．５倍以上）を表３〜６に示す。
【表３】
2006013862.tif 000004
【０１１３】
【表４】
2006013862.tif 000005
【０１１４】
【表５】
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【０１１５】
【表６】
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【０１１６】
第一象限において(４８〜７２ｈｒで発現が増加している遺伝子群)５つのアポトーシス誘導関連遺伝子が観察された。ＣＤＫ４阻害による細胞周期の停止と、アポトーシス誘導の関連は未だに明かにされていないが、これらの遺伝子が関係している可能性がある。第二・第三象限においては、予想通り細胞周期関連の遺伝子が多く集まっていた。すなわち、ＣＤＫ４阻害による細胞周期停止と、それによって誘導されるアポトーシスに関連している遺伝子が抽出されていることが明らかとなった。【０１１７】
また、表３〜６中に挙げた遺伝子の中で、第２象限と第３象限に含まれている合計４１個の遺伝子のｌｏｇ２  ｒａｔｉｏ(ｌａｃＺ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  をトランスフェクションした細胞と、ｐ１６又はｐ２７を含むｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒをトランスフェクションした細胞を比較した際の発現変化)を図８に示す。図８より、選択された遺伝子の発現減少がｐ１６よりもｐ２７の方が大きいことがわかる。すなわち、ｐ１６とｐ２７では遺伝子発現に与える影響が異なることが明らかとなった。【０１１８】
（階層的クラスタリング）
ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ６を用いて、階層的クラスタリングの計算とグラフィカルディスプレイ上への表示を行なった。ｐ１６又はｐ２７を過剰発現させた細胞と、ｌａｃＺを過剰発現させた細胞を比較した際に算出されたｌｏｇ２  ｒａｔｉｏの値を、遺伝子ごとに平均０、分散１になるようにノーマライズを行い、その値を階層的クラスタリングの計算に用いた。距離関数にはピアソンの相関係数を適用した。【０１１９】
ＣＤＫ2の阻害によって１．５倍以上の発現減少がみられた遺伝子に対して、階層的クラスタリングを適用した結果を図８に示す。図８より、ｐ２７を過剰発現させた細胞内でのみ、時系列にそった発現変化を確認できた。また、ｐ１６を過剰発現させた細胞では、その一部において発現変化が全く起こっていないのに対して、ｐ２７を過剰発現させた細胞では２４、３６、４８及び７２ｈｒ全てのタイムポイントにおいて、発現が減少しているクラスターが確認された(図９のｃｌｕｓｅｔｅｒ  ｎｏ．１２５)。このクラスター内に含まれている遺伝子を詳細に見たところ、Ｍ−ｐｈａｓｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｐｒｏｃｅｓｓ関連の遺伝子が多く含まれていた。これらの遺伝子の詳細を表７に示す。【０１２０】
【表７】
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【産業上の利用可能性】
【０１２１】
本発明の遺伝子及び薬剤感受性の予測方法により、ＣＤＫ４阻害剤に対する感受性、中でも薬剤耐性に関する知見を、ｐ１６、ｐ１８又はｐ２７遺伝子の発現量に基づいて予測可能となる。これは、被検体から分離された血液等の被検組織・被検細胞中のｐ１６、ｐ１８又はｐ２７遺伝子の発現を測定するだけで、投与しようと考えるＣＤＫ４阻害剤に対する感受性や薬効を予測することが可能となり、いわゆるオーダーメイド医療に利用することが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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