(57)【要約】  本発明の目的は、抗原物質を抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩ分子およびクラスII分子に効率良く提示させることができるリポソーム組成物を提供することである。本発明によれば、オリゴ糖被覆リポソームと抗原物質とを含む、抗原ペプチドを抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩ分子およびクラスII分子に提示するためのリポソーム組成物が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴ糖被覆リポソームと抗原物質とを含む、抗原ペプチドを抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩ分子およびクラスII分子に提示するためのリポソーム組成物。
【請求項２】
オリゴ糖がオリゴマンノースである、請求項１に記載のリポソーム組成物。
【請求項３】
オリゴ糖がマンノペンタオース又はマンノトリオースである、請求項１又は２に記載のリポソーム組成物。
【請求項４】
抗原物質が癌抗原である、請求項１から３の何れかに記載のリポソーム組成物。
【請求項５】
腹腔内、皮下または鼻腔内粘膜に投与され、マクロファージなどの抗原提示細胞によって取り込まれ、抗原ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子およびクラスII分子に提示される、請求項１から４の何れかに記載のリポソーム組成物。
【請求項６】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導するために使用される、請求項１から５の何れかに記載のリポソーム組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴ糖被覆リポソームを用いた免疫誘導のためのリポソーム組成物に関する。より詳細には、本発明は、腹腔内に投与した際に腹腔内のマクロファージによって取り込まれて、抗原ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子およびクラスII分子に提示されることを特徴とする、オリゴ糖被覆リポソームを用いたリポソーム組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の死亡者数における胃癌の死亡者数は肺癌に次いで多く、その主要因は、腹腔諸臓器への播種性転移である。従って、その克服には、腹膜転移およびその進展をコントロールできる免疫療法の開発が必須である。【０００３】
免疫系による癌の拒絶の主要エフェクター細胞は細胞傷害性Ｔ細胞（cytotoxic T lymphocytes：ＣＴＬ）であるが、その機能を発揮するためにはヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）の介助が大きな役割を果たしている。従って、両細胞群を同時に活性化することが効率的な免疫反応を惹起するためには必須であると考えられ、ヘルパー（Ｔｈ）エピトープと細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープの両方を抗原として用いた癌の免疫療法が検討されつつある。【０００４】
上記の通り、効率の良い免疫反応を得るには、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）と細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を同時に活性化する必要があるが、そのためにはＴｈエピトープ（ＭHＣクラスＩＩ）とＣＴＬエピトープ（ＭＨＣクラスＩ）の両方を含む抗原で免疫するのが理想である。しかし、タンパク質をそのまま免疫するだけではＣＴＬが効率的に活性化されにくいことが知られている。内在性抗原はＭＨＣクラスＩに提示され、外来性抗原はＭＨＣクラスＩＩに提示されるというのが一般に知られている。しかしマクロファージのような抗原提示細胞に取り込まれた外来性抗原はＭＨＣクラスＩＩにより提示されやすいとされている。つまりワクチンとして抗原を単独で接種して免疫する場合、ＭＨＣクラスＩ分子による抗原提示に依存するＣＴＬは効率よく活性化されにくい。【０００５】
免疫系による癌の拒絶の主要エフェクター細胞はＣＴＬであるので、クラスＩ分子に外来性抗原を提示させるための試みがなされてきた。免疫療法として行われているものでは、（１）患者から抗原提示細胞を採取してきて、培養し、抗原ペプチドを添加した後、患者に戻す方法、もしくは（２）抗原提示細胞に、抗原遺伝子を導入するなどの方法がとられている。上記の方法は何れも技術的、倫理的、金銭的な面で問題が多く、また免疫に適した癌抗原の同定が必要である。しかも、上記（１）の方法で複数のＴｈ／ＣＴＬを同時に活性化するためにはＴｈ／ＣＴＬの両エピトープの同定が必要とされる。【０００６】
また、多糖抱合リポソームについて（プルランおよびマンナン）がマクロファージに取り込まれることが判明しており、かつ、ＭＨＣクラスＩ分子に提示されることが示されている。免疫療法にこれら多糖に抗原を包合して投与する方法が試みられている。しかし、これらの多糖構造には抗原性や毒性が存在し、ヒトへの使用は必ずしも安全であるとは言えない。またＭＨＣクラスＩＩ分子に提示できるという証明はなされていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記した従来技術の問題を解決することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、抗原物質を抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩ分子およびクラスII分子に効率良く提示させることができるリポソーム組成物を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、抗原をオリゴマンノース被覆リポソーム（ＭＣＬ）に封入して投与することにより、マクロファージへ抗原を送達できることを見出した。これは、マクロファージが発現するマンノース受容体を介した反応によるもので、マクロファージは特異的かつ積極的に、腹腔内へ投与されたリポソームを取り込み、活性化する。引き続いて起こる免疫反応では、封入抗原を自身のＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子に提示し、大網や腸間膜の節外性リンパ組織への遊走して細胞性免疫を活性化する。この際、マクロファージは封入抗原に由来するペプチドを自身のＭＨＣクラスＩとＩＩの両方の分子に提示でき、領域リンパ節へも遊走する。マウスを用いた実験では、腹腔内に投与したＭＬＣを取り込んだマクロファージは、活性化して領域のリンパ組織である大網に到達するが、同時に封入抗原に由来するペプチドをＭＨＣクラスＩ分子とＭＨＣクラスＩＩ分子の両方に提示し、ＴｈおよびＣＴＬの両細胞群を活性化してＩＦＮ−γを産生させことができる。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。【０００９】
即ち、本発明によれば、オリゴ糖被覆リポソームと抗原物質とを含む、抗原ペプチドを抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩ分子およびクラスII分子に提示するためのリポソーム組成物が提供される。【００１０】
好ましくは、オリゴ糖はオリゴマンノースである。
好ましくは、オリゴ糖はマンノペンタオース又はマンノトリオースである。
好ましくは、抗原物質は癌抗原である。【００１１】
好ましくは、本発明のリポソーム組成物は腹腔内、皮下または鼻腔内粘膜に投与され、マクロファージなどの抗原提示細胞によって取り込まれ、抗原ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子およびクラスII分子に提示される。【００１２】
好ましくは、本発明のリポソーム組成物は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導するために使用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について具体的に説明する。
本発明者らは、卵白アルブミン（ＯＶＡ）をモデル抗原として使用し、外来性抗原タンパク質をオリゴマンノース被覆リポソーム（ＭＣＬ）に封入して投与した場合に、抗原がＭＨＣクラスIIのみならずＭＨＣクラスＩにも提示できることを明らかにした。マンノース被覆リポソームに卵白アルブミン（ＯＶＡ）やＯＶＡペプチドを封入して、直接腹腔に投与するとすみやかにマクロファージに取り込まれる。その後、マクロファージを腹腔から回収して２４時間培養し、クラスＩ分子に提示されたＯＶＡペプチド特異的Ｔ細胞レセプター遺伝子導入（Ｔｇ）マウスＯＴ−Ｉに由来する脾臓CD8陽性Ｔリンパ球と混合培養すると、ＯＶＡをＰＢＳに溶解して腹腔に注入したマウスから回収した場合にはＩＦＮ−γの産生は殆どみられないが、オリゴマンノース被覆リポソームに封入した場合にはＩＦＮ−γの産生がみられた。この結果は、ＭＣＬに封入したＯＶＡがマクロファージにとりこまれた後、ＯＶＡペプチドがＭＨＣクラスＩ分子上に提示されていることを明確にしている。一方、ＯＶＡをそのまま投与した場合には同様にマクロファージに取り込まれるが、ＩＦＮ−γの産生がみられないので、ＭＨＣクラスＩ分子上には提示されていないと考えられる。従って、ＭＣＬに抗原タンパク質あるいは抗原ペプチドを封入して投与することで、抗原を効率よく抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩ分子上に提示できることが実証された。【００１４】
一方、ＭＨＣクラスＩＩ分子に提示されたＯＶＡペプチド特異的Ｔ細胞レセプター遺伝子導入（Ｔｇ）マウスOT-2に由来する脾臓CD４陽性Ｔリンパ球と混合培養すると、ＭＨＣクラスＩＩ分子に提示されたＯＶＡペプチド特異的ＩＦＮ−γの産生が誘導され、オリゴマンノース被覆リポソームに封入した場合も、直接接種した場合も効率良く提示されていることが示された。【００１５】
さらに、マウスＥＬ４リンパ腫の可溶性タンパク質を封入したＭＣＬを同系マウスに皮下投与した場合、可溶化物を直接投与した際にはほとんど認めなかったＥＬ４に対する強いＣＴＬ活性が観察された。すなわち皮下投与の場合も抗原提示細胞に取り込まれ効率よくＭＨＣクラスＩ分子上に抗原ペプチドが提示されていることを示している。さらにこの結果は、たとえ抗原タンパク質が未知また精製されていなくても、マンノース被覆リポソームに癌細胞の抽出液を封入して投与することにより、ＣＴＬを誘導できるようなペプチドをＭＨＣクラスＩ分子上に提示できることを示しており、癌に対するワクチン効果を得る手段として有効であることが示された。【００１６】
本発明のリポソーム組成物はドラッグデリバリーシステムとしても使用することができる。ここでドラッグデリバリーシステムとは、薬剤送達システムのことを意味する。通常、薬を投与すると薬は全身に広がってしまうが、拡散を防いで効率よく狙った組織や細胞に薬を送達する技術のことを言う。ドラッグデリバリーシステムは、副作用を軽減したり、薬効を向上させる効果がある。【００１７】
本発明で言うリポソームとは、リン脂質で構成される二重膜でできた人工小胞のことを言う。膜の内側は親水性部分、外側は疎水性部分が配向する。内腔には親水性の化合物を封入でき、抗癌剤などのドラッグデリバリーシステムに利用されている。【００１８】
本発明のリポソーム組成物は、オリゴ糖被覆リポソームと抗原物質とを含むことを特徴とするものであり、抗原物質に由来する抗原ペプチドを抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩ分子およびクラスII分子に提示させるために使用される。さらに具体的には、本発明のリポソーム組成物は、腹腔内に投与された場合に、腹腔内のマクロファージなどの抗原提示細胞によって取り込まれ、抗原ペプチドはそのＭＨＣクラスＩ分子およびクラスII分子に提示される。【００１９】
マクロファージは、食作用を有する細胞であり、体に存在しない外来物質や、もはや生体を構成するものとは言えない死にかけ（アポトーシス）の細胞、癌細胞等を認識して取り込み消化する。消化された蛋白質から、特に免疫系の攻撃対象の目印となるペプチド断片を細胞表面に提示し、免疫ネットワークに攻撃対象を知らしめる司令塔としての働きを有する。【００２０】
本発明で用いるオリゴ糖被覆リポソームとしては、例えば、特許第２８２８３９１号公報に記載のリポソームを用いることができる。オリゴ糖を構成する糖成分の種類は特に限定されないが、例えば、Ｄ−マンノース（Ｄ−Ｍａｎ）、Ｌ−フコース（Ｌ−Ｆｕｃ）、Ｄ−アセチルグルコサミン（Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ）、Ｄ−グルコース（Ｄ−Ｇｌｃ）、Ｄ−ガラクトース（Ｄ−Ｇａｌ）、Ｄ−アセチルガラクトサミン（Ｄ−ＧａｌＮＡｃ）、Ｄ−ラムノース（Ｄ−Ｒｈａ）などが挙げられる。【００２１】
オリゴ糖中で、各構成糖は、α１→２結合、α１→３結合、α１→４結合、α１→６結合又はβ１−４結合等あるいはこれらの組合せにより結合している。例えば、マンノースは上記の結合により単鎖を構成してもよく、又はα１→３結合とα１→６結合との組合せにより分枝構造をとってもよい。オリゴ糖中の単糖の数は、好ましくは２〜１１個である。具体的なオリゴ糖として、例えばマンノビオース（Ｍａｎ２）、マンノトリオース（Ｍａｎ３）、マンノテトラオース（Ｍａｎ４）、マンノペンタオース（Ｍａｎ５）、マンノヘキサオース（Ｍａｎ６）、マンノヘプタオース（Ｍａｎ７）、種々の混合オリゴ糖、例えば下記に示すＭ５（化１）及びＲＮ（化２）等を挙げることができる。【００２２】
【化１】
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【００２３】
【化２】
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【００２４】
さらに、グルコースを含有するオリゴ糖として化３に示す構造を有するものを挙げることができ、Ｎ−アセチルグルコサミンを含むオリゴ糖として化４に示すものを挙げることができ、そしてフコースを含むオリゴ糖として化５に示すものを挙げることができる。【００２５】
【化３】
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【００２６】
【化４】
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【００２７】
【化５】
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【００２８】
本発明で用いるオリゴ糖は好ましくは、オリゴマンノースであり、特に好ましくはマンノペンタオース又はマンノトリオースである。【００２９】
上記のオリゴ糖は、いずれも１個の還元末端アルデヒド基を有する。そこで、このアルデヒド基を、オリゴ糖をリポソーム表面に導入するための手段として使用することができる。すなわち、このアルデヒドと、アミノ基を有する脂質との間に反応によりシッフ塩基を形成し、次にこのシッフ塩基を、常法に従って、還元、好ましくは化学還元、例えばＮａＢＨ3ＣＮにより還元することにより、オリゴ糖と、脂質とを結合することができる（水落次男、糖質工学、２２４−２３２頁、産業調査会バイオテクノロジー情報センター、１９９２）。【００３０】
上記のアミノ基を有する脂質は、好ましくはアミノ基を有するリン脂質であり、例えばホスファチジルアミン、例えばジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）等を使用することができる。上記のようにして得られた、オリゴ糖と脂質との結合物を、本発明においては人工糖脂質と称する場合がある。【００３１】
リポソームを構成する脂質としては、リポソームを構成するために知られている任意の常用の脂質を単独で又は複数組み合わせて使用することができる。例えば、天然物、例えば卵黄、大豆、又はその他の動植物から得られる脂質、これらの脂質を修飾したもの、例えば水素添加によって不飽和度を低下したもの、あるいは化学合成したものを使用することができる。具体的には、例えば、ステロール類、例えばコレステロール（Ｃｈｏｌ）；ホスファチジルエタノールアミン類、例えばジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）；ホスファチジルコリン類、例えばジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）；ホスファチジルセリン類、例えばジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）；ホスファチジン酸類、例えばジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、等が挙げられる。【００３２】
リポソームの作製は公知の方法［D.W.Deeamer,P.S.Uster,"Liposome"ed.by M.J.Ostro, Marcel Dekker Inc.,N.Y. Basel, 1983, p27］を用いて行うことができる。ボルテックス法および超音波法が一般的であるが、そのほかにエタノール注入法、エーテル法および逆相蒸発法などが適用でき、これらを組合せて使用することもできる。【００３３】
例えば、ボルテックス法および超音波法においては、所定の脂質を有機溶剤、例えばメタノール、エタノール、クロロホルム又はこれらの混合物、例えばメタノールとクロロホルムとの混合物に溶解した後、該有機溶剤を蒸発除去することにより脂質の薄層を得る。次に、この脂質の薄層に水性媒体を加えてボルテックス処理又は超音波処理することによりリポソームが形成される。この際に、上記水性媒体に、薬物、マーカーまたは造影剤などの投与物質を混入、例えば溶解又は懸濁させておくことにより、該投与物質をリポソームに封入することができる。【００３４】
オリゴ糖をリポソームの表面に導入するためには、例えば、次の２つの方法のいずれかを用いればよい。前記の人工糖脂質が水溶性で有機溶剤に十分溶解しない場合、例えば、前記のＭ５とＤＰＰＥとの結合物（Ｍ５−ＤＰＰＥ）、ＲＮとＤＰＰＥとの結合物（ＲＮ−ＤＰＰＥ）を用いる場合には、これらの水性溶液を調製し、これを形成されたリポソームと混合して、例えば４℃ないし室温において２４〜１２０時間、例えば約７２時間インキュベーションすればよい。【００３５】
他方、人工糖脂質が有機溶剤に溶解する場合には、該人工糖脂質を、リポソーム構成用脂質と共に、リポソーム製造過程において前記のごとき有機溶剤に溶解し、以後、常法に従ってリポソームを形成すればよい。リポソームの量に対するオリゴ糖の量はオリゴ糖の種類、封入しようとする抗原の種類、リポソームの組合せ構造等により異なるが、一般に、リポソームを構成する脂質１mgに対して５μｇ〜５００μｇである。【００３６】
本発明で用いるリポソームは、多重層タイプ（multilamella vesicle）であってもよく、また単層タイプ（unilamella vesicle）であってもよい。これらは既知の常法に従って調製することができ、また常法に従って一方のタイプを他方のタイプに、例えば多重層タイプのリポソームを単層タイプのリポソームに転換することもできる。本発明で用いるリポソームの粒径は特に限定されないが、必要により常法に従って、例えば所望の孔サイズのフィルターにより濾過することにより、粒径を整えることができる。【００３７】
本発明では、オリゴマンノース被覆リポソームを用いることが特に好ましい。オリゴマンノース被覆リポソームは、酵母からヒトまで生物に広く保存されている糖鎖構造の一つである数個のマンノース糖鎖（オリゴマンノース）を脂質化して精製した後、リポソームに抱合したものである。オリゴマンノース被覆リポソームは、ヒトに元々ある構造を用いているので毒性がない。マクロファージに存在する受容体が、オリゴマンノースを特異的に認識すると、オリゴマンノース被覆リポソームは、食作用によって細胞内に速やかに取り込まれる。【００３８】
本発明で用いる抗原物質の種類は特に限定されないが、例えば、サバイビン、リビン、リカバリン、gp110、MART-1、NY-ESO-1、SSX、PBF、HER2、SYT-SSX、CEA、MUC-1などが挙げられる。抗原物質は、好ましくは癌抗原である。【００３９】
リポソームの量に対する抗原物質の量は、投与したリポソーム組成物が腹腔内のマクロファージによって取り込まれて、抗原ペプチドが抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩ分子および／又はクラスII分子に提示されるという本発明の効果が得られる限り特に限定されず、投与物質の種類やリポソームの組成や構造等により適宜設定することがえきる。一般的には、投与物質の量は、リポソームを構成する脂質１mg当たり１μｇ〜１００μｇである。【００４０】
本発明のリポソーム組成物は、所望により薬学的に許容される担体を含んでいてもよい。担体としては，滅菌水、緩衝液又は食塩水を用いることができる。また、本発明のリポソーム組成物は、所望により塩類、糖類、蛋白質、澱粉、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコール等を含んでいてもよい。【００４１】
本発明のリポソーム組成物の投与経路は特に限定されないが、好ましくは腹腔内、腹腔内、皮下または鼻腔内粘膜に投与することができる。本発明のリポソーム組成物の投与量は、投与物質の種類、投与経路、症状の重篤度、患者の年齢および状態、副作用の程度等により変動するが、一般に、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。【００４２】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００４３】
実施例１：オリゴ糖被覆リポソームの製造方法および抗原の封入方法
以下の方法により、マンノトリオース(M3)（Ｍａｎα１→６（Ｍａｎα１→３）Ｍａｎという構造を有するマンノトリオース（Ｍａｎ３））と、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)とを還元アミノ化反応で化学的に結合させM3-DPPEを合成した。【００４４】
先ず、マンノトリオース(M3)２．５ｍｇに６００μｌの蒸留水を加えて攪拌溶解してオリゴ糖溶液を調製した。次に、クロロホルム／メタノール（１：１、体積比）混合液にＤＰＰＥを５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解してＤＰＰＥ溶液を調製した。また、メタノールに、ＮaＢＨ3ＣＮを１０ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解してＮaＢＨ3ＣＮ溶液を調製した。前記オリゴ糖の各溶液６００μｌに前記ＤＰＰＥ溶液９．４ｍｌおよび前記ＮaＢＨ3ＣＮ溶液１mlを加えて攪拌混合した。この反応混合液を６０℃にて１６時間インキュベートし、人工糖脂質を生成せしめた。合成した人工糖脂質はHPLCを用い高純度に精製した。【００４５】
抗原タンパク質（卵白アルブミン（OVA）、又はEL4抗原）を封入したリポソームは、以下のようにして作製した。
先ず、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、コレステロールおよび人工糖脂質（M3-DPPE）を1:1:0.1で混合したクロロホルム／メタノール溶液もしくはエタノール溶液をなし型フラスコにいれ、ロータリーエバポレーターで減圧乾固し脂質フィルムを作製した。次いで、抗原タンパク質を含むPBS溶液（５ mg/ml）0.3 ｍｌを脂質フィルムに加え、ボルテックスミキサーを用いて激しく撹拌し、M3-DPPE被覆リポソームを作製した。【００４６】
その後、リポソームをPBSで数回洗浄し、リポソームに封入されていない可溶性の物質を遠心により取り除いた。さらにこのリポソームの粒径を1μmのフィルターを用いて整えた。封入タンパク質量はタンパク質定量により、またリポソームの脂質組成比および薬物はHPLCによって定量した。【００４７】
実施例２： MHCクラスIとMHCクラスII分子への抗原提示の確認
マンノース被覆リポソームに卵白アルブミン（OVA）やOVAペプチドを封入して、直接C57BL/6マウスもしくはBALB/cマウスの腹腔に投与するとすみやかに、MHCクラスIおよびMHCクラスＩとIIを共に発現するCD11b陽性細胞に取り込まれる。CD11b陽性細胞は抗原提示細胞として働くことが知られているので、OVAを封入したオリゴマンノース(M3)被覆リポソームがCD11b陽性細胞にとり込まれた後に、MHCクラスIとMHCクラスII分子の何れにも提示できることを明らかにする目的で、以下に示す実験を行なった。【００４８】
（１）実験群
Ａ群は、PBSに溶解したOVA50μgが封入されたM3被覆したリポソームを、PBSで合計200μlとしてマウスの腹腔内へ投与した。
Ｂ群は、PBSに5mg/mlの濃度で溶解されたOVA溶液10μlをPBSで合計200μlとしてマウスの腹腔内へ投与した。Ａ群と同じ50μgのOVAを投与したことになる。
Ｃ群は、PBSのみ封入されたM3被覆リポソーム38μlを、PBSで合計200μlとしてマウスの腹腔内に投与した。
Ｄ群は、PBS200μlをマウスの腹腔へ投与した。【００４９】
（２）腹腔から回収したCD11b陽性細胞の前処置
マウスは、生後8週齢のC57BL/6もしくはBALB/cマウスを用いた。腹部を70％エタノールに浸した脱脂綿で消毒した後、各々の群にそれぞれツベルクリン用シリンジを用いて投与した。投与後１時間経過した後、ネンブタール麻酔薬の投与で安楽死させ、すみやかにマウス腹腔内へ5mlのハンクス液を注入して腹腔を洗浄し、腹腔から回収することで腹腔内の遊離細胞を回収した。各群３匹からハンクス液で回収した腹腔内の細胞は、群ごとに一本にまとめてから1,000rpmで5分間遠心した。沈澱した細胞は、10％のウシ胎児血清を含むRPMI液（RPMI-A液）10mlに懸濁したのち、再度1,000rpmで5分間遠心した。同じ操作を２度繰り返し、１μMの２-メルカプトエタノールと10％のウシ胎児血清を含むRPMI液(RPMI-B液)で懸濁して96穴プレートに100μlづつ分注した。CO2インキュベーターで37℃、5％CO2で２時間培養し、CD11b陽性細胞が接着させたのち非付着細胞を洗い流したあと、100μlのRPMI-B液で24時間の培養を行なった。【００５０】
（３）MHCクラスI分子およびクラスII分子に提示された抗原の検出
B6マウスのMHCクラスＩもしくはクラスＩＩ分子に提示されたOVAペプチドの有無は、それぞれB6系統マウスであるOT-１マウス（MHCクラスＩ分子であるH-2Kbに提示されるOVA257ー264を認識）とOT-２マウス(MHCクラスＩＩ分子であるH-2Ab/OVA323-339)を用いて行なった。これらのマウスから脾臓をとり出してきて、ハンクス5ml液に浸しながらスライドガラス2枚で、すりつぶした。そして15mlの遠心管に移して5分間静置することで脾臓組織を構築する繊維性組織を沈澱させて除去したのち、マウスリンパ球比重分離液M-SMF（日本抗体研究所）をもちいて遠心することでリンパ球を得た。また、クラスII分子に提示される効率は、BALB/c系統のマウスであるDO11.10マウス(H-2Ad/OVA323-339に提示されたOVAペプチドを認識する)も用いた実験も行なっている。1x107個のリンパ球をRPMI-B液１mlで混濁し、準備したCD11b陽性細胞（２-d）を含むウェルに100μlづつ混合して培養した。48時間後に培養上清を回収して、その中に含まれているIFN−γ値を定量した。【００５１】
結果を図１及び図２に示す。図１及び図２の結果から、マンノース被覆リポソームに卵白アルブミン（OVA）を封入して投与すると、抗原はＭＨＣクラスＩ分子およびクラスII分子の両方に提示され、IFN−γが効率的に誘導されることが実証された。【００５２】
実施例３：マウスリンホーマEL4に対するCTLの誘導
EL4細胞を同系マウスであるC57BL/6マウスの皮下に投与し、EL4の細胞隗を得た。この細胞塊をPBS中でホモジナイズし、100,000gの上清をEL4抗原として使用した。
EL4抗原をオリゴマンノース被覆リポソームに封入し、タンパク質量として１マイクログラムをC57BL/6マウスの皮下に投与し免疫した（１週間ごとに３回）。
初回免疫から３週後にマウスから脾臓を摘出し、ハンクス5ml液に浸しながらスライドガラス2枚で、すりつぶした。そして15mlの遠心管に移して5分間静置することで脾臓組織を構築する繊維性組織を沈澱させて除去し、マウスリンパ球比重分離液M-SMF（日本抗体研究所）を用いて遠心することでリンパ球を分離し、エフェクター細胞として使用した。その後、エフェクター細胞を可溶化した蛋白質抗原により（100mg EL4 / 107 cells）、3日間stimulationを行った。ターゲット細胞（EL4 cell：104cells/well）に対してエフェクター細胞を以下の比で混合した（E/T Ratio= 50:1, 25:1, 12.5:1, 6.25:1, 3.125:1,1:1）。８時間培養した後、CytoTox96アッセイキット（Promega）によりCitotoxicityを測定した。【００５３】
測定結果を図３に示す。図３の結果から分かるように、EL4抗原をオリゴマンノース被覆リポソームに封入して投与すると、CTLが効率的に誘導できた。【００５４】
実施例４：
腹腔内にOVA封入OML（オリゴマンノース被覆リポソームOML/OVA）、OVA封入未被覆リポソーム（BL/OVA）またはOVAのみをOVAで５μg投与し、１時間後に腹腔内細胞を回収し、培養シャーレに写して１時間培養した。浮遊細胞を取り除いた後、付着細胞に新鮮なRPMI1640培地を加え、24時間後に培地を回収し培地中のサイトカインをELISA法で測定した。結果を図４に示す。OML/0VAのみからIL12の産生が認められた。【００５５】
実施例５：
実施例４と同様にOML/OVAまたはLPS（10ナノグラム）を腹腔内に投与して、１時間後に腹腔内細胞を回収し、マクロファージからのサイトカインの産生を測定した。結果を図５に示す。LPS刺激ではIL1、TNFが優位に産生されたが、OML刺激ではIL12が優位に産生された。【００５６】
実施例６：
OVA257-264 on H-2Kb (MHC class I)を認識するTCRをトランスジェニックしたマウスOT-1およびOVA323-339  on H-2Ab (MHC class II)を認識するTCRをトランスジェニックしたマウスOT-2からそれぞれCD8陽性T細胞およびCD4陽性T細胞を調整し、レスポンダー細胞とした。一方、OVAを封入したOMLをC57/BL6マウスの腹腔に投与し、腹腔内細胞を１時間後に回収、培養し付着細胞をマクロファージとして使用した。前記T細胞とマクロファージを混合培養し、24時間後に培養液を回収し培地のサイトカインを測定した。結果を図６に示す。【００５７】
実施例７：
OVAを単独で投与した場合とOVAをOMLに封入して投与した場合の抗原提示の効率を比較した。方法は実施例６と同様である。結果を図７に示す。OMLに封入されたOVA２μgを投与した場合のサイトカインの産生量はOVA単独1000μgと同程度であるのでMHCクラスIIへの提示はおよそ500倍よいと考えられる。同様にMHCクラスIへの提示は５０倍よいと考えられた。すなわち、OMLに抗原を封入することにより非常に効率よく抗原を提示することができる。【００５８】
実施例８：
OVA/OMLをOVAで１μg相当C57CL/6マウスに免疫（１週間間隔で２回皮下投与）した。腸管免疫の活性化のための免疫スケジュールを図８に示す。最終免疫から１週間後に脾臓細胞を取り出し、抗原で刺激後培地中のサイトカインを測定した（図９）。同時に細胞障害能をEG7細胞（EL4細胞にOVA遺伝子を導入し自身のMHCクラスＩ上にOVAペプチドを抗原提示している細胞）をターゲット細胞として測定した（図９）。顕著なTh1サイトカインの産生がOVA封入OMLで免疫したマウスで観察され、顕著な細胞障害能も観察された。一方親株であるEL4をターゲットとした場合はいずれも細胞障害能は観察されない。従って抗原特異的なCTLが誘導されたといえる。【００５９】
実施例９：
実施例８に記載の通り免疫したマウスに対して最終免疫から１週間後に1×106のEG-7を背中に移植し、３週間後の腫瘍体積を測定した。結果を図１０に示す。OVA/OMLで免疫したマウスでは腫瘍の生着が完全に阻害されていた。【００６０】
実施例１０：
1×106のEG-7を背中に移植し、９日目（およその腫瘍体積が100mm3)にOML/OVAをOVAで1μg接種した。その後腫瘍体積を測定した。結果を図１１に示す。OML/OVA投与群ではほとんどのマウスで腫瘍の退縮が観察され少なくとも３例では完全に退縮していた。また、腫瘍接種マウスの生存率を図１２に示す。OVA/OML投与群では顕著に生存率がのびていた。【００６１】
実施例１１：
OML/OVAを5μgOVAで１週間間隔で３回マウスの鼻腔内に投与し、最終投与から１週間後に鼻腔関連リンパ組織（NALT)および脾臓を採取し、抗原刺激後のサイトカインの産生を測定した。結果を図１３に示す。OML/OVA投与群では顕著なTh1サイトカインの産生がNALTで認められた。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明により、癌抗原などの抗原ペプチドを抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩ分子およびクラスII分子に効率的に提示させることができるリポソーム組成物を提供することが可能になった。本発明によれば、患者から細胞を取り出して戻すという操作を必要としない簡便な免疫法を構築することができる。本発明のリポソーム組成物は、特に、癌抗原となるタンパク質を封入して患者に直接投与することができ、ワクチン療法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、ＭＨＣクラスＩ制限ＯＶＡペプチド特異的ＴＣＲトランスジェニックマウス由来の脾臓細胞のＩＦＮ−γの産生量を示す。
【図２】図２は、ＯＶＡを取り込んだ腹腔内マクロファージに対するＭＨＣクラスＩＩ制限ＯＶＡペプチド特異的ＴＣＲトランスジェニックマウス（ＤＯ１１．１０）由来の脾臓細胞の応答を示す。
【図３】図３は、Man３−リポソームの免疫による細胞障害性Ｔ細胞の誘導を示す。
【図４】図４は、腹腔内にオリゴマンノース被覆リポソーム（OML/OVA）などを投与した後の腹腔内細胞のサイトカイン産生量を示す。
【図５】図５は、腹腔内にOML/OVAまたはLPSを投与した後の腹腔内細胞のサイトカイン産生量を示す。
【図６】図６は、OVA257-264(MHC class I)を認識するTCRトランスジェニックマウスOT-1およびOVA323-339 (MHC class II)を認識するTCRトランスジェニックマウスOT-2からそれぞれCD8陽性T細胞およびCD4陽性T細胞とマクロファージを混合培養した場合のサイトカイン産生量を示す。
【図７】図７は、OVAを単独で投与した場合とOVAをOMLに封入して投与した場合の抗原提示の効率を比較した結果を示す。
【図８】図８は、腸管免疫の活性化のための免疫スケジュールを示す。
【図９】図９は、腸管免疫の活性化免疫の最終免疫から１週間後に脾臓細胞を取り出し、抗原で刺激後の培地中のサイトカイン量を測定した結果、並びに細胞障害能をEG7細胞をターゲット細胞として測定した結果を示す。
【図１０】図１０は、腸管免疫したマウスに対して最終免疫から１週間後にEG-7を背中に移植し、３週間後の腫瘍体積を測定した結果を示す。
【図１１】図１１は、EG-7を背中に移植した９日目にOML/OVAを接種した後の腫瘍体積を測定した結果を示す。
【図１２】図１２は、腫瘍接種マウスの生存率を示す。
【図１３】図１３は、OML/OVAをマウスの鼻腔内に投与し、最終投与から１週間後に鼻腔関連リンパ組織（NALT)および脾臓を採取し、抗原刺激後のサイトカインの産生を測定した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図５】
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【図６】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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