(57)【要約】一般式（Ｉ）：    Ｘ−Ｙ−Ｚ      （Ｉ）［式中、ＸはＨ２Ｎ−またはＨＳ−；Ｙは−Ａ１−、−Ａ１−Ｏ−Ａ２−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ１−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ１−Ｏ−Ａ２−、−Ａ１−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａ２−、−Ａ１−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ａ２−、−Ａ１−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａ２−、−Ａ１−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ａ２−等；および、Ｚは−Ｏ−ＮＨ（Ｒ４）、−ＮＨ−ＯＲ４、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ−Ｒ４、または−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−ＮＨ−Ｒ４（式中、Ｒ４は水素原子、低級アルキル、またはアリール］で表される化合物を含む糖鎖−ペプチド結合剤、および該糖鎖−ペプチド結合剤を用いた糖ペプチドの製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
Ｘ−Ｙ−Ｚ      （Ｉ）
［式中、ＸはＨ２Ｎ−または式：
【化１】
2005095331.tif 000028
で表される基；
Ｙは−Ａ１−、−Ａ１−Ｏ−Ａ２−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ１−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ１−Ｏ−Ａ２−、−Ａ１−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａ２−、−Ａ１−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ａ２−、−Ａ１−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａ２−、−Ａ１−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ａ２−、式：
【化２】
2005095331.tif 000029
で表される基、または式：
【化３】
2005095331.tif 000030
で表される基（式中、Ａ１およびＡ２はそれぞれ独立して、置換されていてもよいＣ１−１５アルキレン、置換されていてもよいＣ２−１５アルケニレンまたは置換されていてもよいＣ２−１５アルキニレン；ｎは１〜５の整数；Ｒ１はヒドロキシまたは−ＮＨ（Ｒ２）（式中、Ｒ２は水素原子、低級アルキル、アリールまたはアラルキル）；Ｒ３は水素原子または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５（式中、Ｒ５は低級アルキル、アリールまたはアラルキル））；および、
Ｚは−Ｏ−ＮＨ（Ｒ４）、−ＮＨ−ＯＲ４、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ−Ｒ４、または−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−ＮＨ−Ｒ４（式中、Ｒ４は水素原子、低級アルキル、またはアリール）］
で表される化合物を含む糖鎖−ペプチド結合剤。
【請求項２】
Ｘが−ＮＨ２およびＺが−Ｏ−ＮＨ（Ｒ４）（式中、Ｒ４は水素原子、低級アルキル、またはアリール）である請求項１記載の糖鎖−ペプチド結合剤。
【請求項３】
Ｘが式：
【化４】
2005095331.tif 000031
で表される基およびＺが−Ｏ−ＮＨ（Ｒ４）（式中、Ｒ４は水素原子、低級アルキル、またはアリール）である請求項１記載の糖鎖−ペプチド結合剤。
【請求項４】
一般式（ＩＩ）：
Ｈ２Ｎ−Ａ１−Ｏ−ＮＨ（Ｒ４）      （ＩＩ）
（式中、Ａ１は置換されていてもよいＣ１−１５アルキレン；Ｒ４は水素原子、低級アルキル、またはアリール）で表わされる化合物またはその塩。
【請求項５】
一般式（ＩＩＩ）：
【化５】
2005095331.tif 000032
（式中、Ａ１は置換されていてもよいＣ１−１５アルキレン；Ｒ４は水素原子、低級アルキル、またはアリール）で表わされる化合物またはその塩。
【請求項６】
以下の工程：
１）一般式（ＩＶ）：
Ｈ２Ｎ−Ｙ−Ｚ      （ＩＶ）
［式中、Ｙは−Ａ１−、−Ａ１−Ｏ−Ａ２−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ１−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ１−Ｏ−Ａ２−、−Ａ１−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａ２−、−Ａ１−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ａ２−、−Ａ１−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａ２−、−Ａ１−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ａ２−、式：
【化６】
2005095331.tif 000033
で表される基、または式：
【化７】
2005095331.tif 000034
で表される基（式中、Ａ１およびＡ２はそれぞれ独立して、置換されていてもよいＣ１−１５アルキレン、置換されていてもよいＣ２−１５アルケニレンまたは置換されていてもよいＣ２−１５アルキニレン；ｎは１〜５の整数；Ｒ１はヒドロキシまたは−ＮＨ（Ｒ２）（式中、Ｒ２は水素原子、低級アルキル、アリールまたはアラルキル）；Ｒ３は水素原子または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５（式中、Ｒ５は低級アルキル、アリールまたはアラルキル））；および、
Ｚは−Ｏ−ＮＨ（Ｒ４）、−ＮＨ−ＯＲ４、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ−Ｒ４、または−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−ＮＨ−Ｒ４（式中、Ｒ４は水素原子、低級アルキル、またはアリール）］
で表される化合物と、
グルタミン残基を有するペプチドを、
トランスグルタミナーゼの存在下で反応させる工程、および
２）１）工程で得られたペプチドと、糖鎖を反応させる工程を包含する、
糖ペプチドの製造方法。
【請求項７】
以下の工程：
１）一般式（Ｖ）：
【化８】
2005095331.tif 000035
［式中、Ｙは−Ａ１−、−Ａ１−Ｏ−Ａ２−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ１−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ１−Ｏ−Ａ２−、−Ａ１−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａ２−、−Ａ１−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ａ２−、−Ａ１−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａ２−、−Ａ１−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ａ２−、式：
【化９】
2005095331.tif 000036
で表される基、または式：
【化１０】
2005095331.tif 000037
で表される基（式中、Ａ１およびＡ２はそれぞれ独立して、置換されていてもよいＣ１−１５アルキレン、置換されていてもよいＣ２−１５アルケニレンまたは置換されていてもよいＣ２−１５アルキニレン；ｎは１〜５の整数；Ｒ１はヒドロキシまたは−ＮＨ（Ｒ２）（式中、Ｒ２は水素原子、低級アルキル、アリールまたはアラルキル）；Ｒ３は水素原子または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５（式中、Ｒ５は低級アルキル、アリールまたはアラルキル））；および、
Ｚは−Ｏ−ＮＨ（Ｒ４）、−ＮＨ−ＯＲ４、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ−Ｒ４、または−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−ＮＨ−Ｒ４（式中、Ｒ４は水素原子、低級アルキル、またはアリール）］
で表される化合物と、
システイン残基を含有するペプチドを反応させる工程、および
２）１）工程で得られたペプチドと、糖鎖を反応させる工程を包含する、
糖ペプチドの製造方法。
【請求項８】
Ｚが−Ｏ−ＮＨ（Ｒ４）（式中、Ｒ４は水素原子、低級アルキル、またはアリール）である請求項６または７記載の製造方法。
【請求項９】
Ｙが−Ａ１−（式中、Ａ１は置換されていてもよいＣ１−１５アルキレン）である請求項６または７記載の製造方法。
【請求項１０】
請求項６または７に記載の製造方法で製造されうる糖ペプチド。
【請求項１１】
請求項６または７に記載の製造方法で製造されうる糖ペプチドを有効成分として含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、均一な組成を有する糖ペプチドおよび糖タンパク質（特記しない限り、本明細書において、これらを総称して「糖ペプチド」と呼ぶ）を簡便に製造するために用いる糖鎖−ペプチド結合剤、および該糖鎖−ペプチド結合剤を用いた糖ペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドおよびタンパク質は、生理活性物質の典型としてこれまで研究が進められている。生物（特に、真核生物）は、遺伝子の転写および翻訳という機構を通じてペプチドおよびタンパク質を生産にした後に、翻訳後修飾することが多く、多くのペプチドおよびタンパク質は、翻訳後修飾により機能を発揮し、調節（例えば、増強または低減）される。翻訳後修飾としては、例えば、アミノ酸レベル（すなわち、シグナルペプチド切断など）のもののほか、例えば、糖鎖、脂質などの他の生体分子による修飾が挙げられる。この中で、糖鎖による修飾は代表的なものであり、真核生物において非常に多くのペプチドおよびタンパク質は、糖鎖を有すると言われている。
このような糖鎖修飾を模倣して、近年、機能を調節した人工的複合ペプチドを生産する試みがなされており（特許文献１〜４）、バイオ医薬にも利用されている。
しかし、ペプチドまたはタンパク質の特定の部位に特定の糖鎖を化学的に導入する方法、とりわけペプチドまたはタンパク質の複数の箇所に複数本の糖鎖を均一に導入する方法は限られている。例えば、非特許文献１には、数段階の合成反応を経て得られる糖修飾体をインスリンに導入する方法が記載されており、非特許文献２には、非天然のペプチドを合成した後に糖鎖を導入する方法が記載されている。しかし、いずれも簡便さや大量生産の観点から適した製造方法とは言い難く、、組成が一定しているバイオ医薬を生産することは困難な状況である。
【特許文献１】特開２０００−３００２８７
【特許文献２】特開２００１−２７８８９９
【特許文献３】ＷＯ９６／０６１８１
【特許文献４】ＷＯ９６／１００８９
【非特許文献１】Ａｎｇｗ．Ｃｈｅｍ，２００４，４３，１５１６
【非特許文献２】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，  ２００３，１２５，  １７０２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の課題は、組成が一定した糖ペプチドを簡便に生産するために用いる糖鎖−ペプチド結合剤、および該糖鎖−ペプチド結合剤を用いて糖ペプチドを製造する方法、を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
すなわち、本発明は、（１）一般式（Ｉ）：
Ｘ−Ｙ−Ｚ      （Ｉ）
［式中、ＸはＨ２Ｎ−または式：
【化１】
2005095331.tif 000002
で表される基；
Ｙは−Ａ１−、−Ａ１−Ｏ−Ａ２−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ１−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ１−Ｏ−Ａ２−、−Ａ１−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａ２−、−Ａ１−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ａ２−、−Ａ１−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａ２−、−Ａ１−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ａ２−、式：
【化２】
2005095331.tif 000003
で表される基、または式：
【化３】
2005095331.tif 000004
で表される基（式中、Ａ１およびＡ２はそれぞれ独立して、置換されていてもよいＣ１−１５アルキレン、置換されていてもよいＣ２−１５アルケニレンまたは置換されていてもよいＣ２−１５アルキニレン；ｎは１〜５の整数；Ｒ１はヒドロキシまたは−ＮＨ（Ｒ２）（式中、Ｒ２は水素原子、低級アルキル、アリールまたはアラルキル）；Ｒ３は水素原子または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５（式中、Ｒ５は低級アルキル、アリールまたはアラルキル））；および、
Ｚは−Ｏ−ＮＨ（Ｒ４）、−ＮＨ−ＯＲ４、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ−Ｒ４、または−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−ＮＨ−Ｒ４（式中、Ｒ４は水素原子、低級アルキル、またはアリール）］
で表される化合物を含む糖鎖−ペプチド結合剤、に関する。
ここで、式（Ｉ）で表される化合物に存在するアミノ基、イミノ基等は、適切な保護基により保護されていてもよい。【０００５】
詳しくは、以下の（２）〜（１１）に関する。
（２）Ｘが−ＮＨ２およびＺが−Ｏ−ＮＨ（Ｒ４）（式中、Ｒ４は水素原子、低級アルキル、またはアリール）である（１）の糖鎖−ペプチド結合剤。
（３）Ｘが式：
【化４】
2005095331.tif 000005
で表される基およびＺが−Ｏ−ＮＨ（Ｒ４）（式中、Ｒ４は水素原子、低級アルキル、またはアリール）である（１）記載の糖鎖−ペプチド結合剤。
（４）一般式（ＩＩ）：
Ｈ２Ｎ−Ａ１−Ｏ−ＮＨ（Ｒ４）      （ＩＩ）
（式中、Ａ１は置換されていてもよいＣ１−１５アルキレン；Ｒ４は水素原子、低級アルキル、またはアリール）で表わされる化合物またはその塩。
（５）一般式（ＩＩＩ）：
【化５】
2005095331.tif 000006
（式中、Ａ１は置換されていてもよいＣ１−１５アルキレン；Ｒ４は水素原子、低級アルキル、またはアリール）で表わされる化合物またはその塩。【０００６】
（６）以下の工程：
１）一般式（ＩＶ）：
Ｈ２Ｎ−Ｙ−Ｚ      （ＩＶ）
［式中、Ｙは−Ａ１−、−Ａ１−Ｏ−Ａ２−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ１−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ１−Ｏ−Ａ２−、−Ａ１−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａ２−、−Ａ１−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ａ２−、−Ａ１−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａ２−、−Ａ１−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ａ２−、式：
【化６】
2005095331.tif 000007
で表される基、または式：
【化７】
2005095331.tif 000008
で表される基（式中、Ａ１およびＡ２はそれぞれ独立して、置換されていてもよいＣ１−１５アルキレン、置換されていてもよいＣ２−１５アルケニレンまたは置換されていてもよいＣ２−１５アルキニレン；ｎは１〜５の整数；Ｒ１はヒドロキシまたは−ＮＨ（Ｒ２）（式中、Ｒ２は水素原子、低級アルキル、アリールまたはアラルキル）；Ｒ３は水素原子または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５（式中、Ｒ５は低級アルキル、アリールまたはアラルキル））；および、
Ｚは−Ｏ−ＮＨ（Ｒ４）、−ＮＨ−ＯＲ４、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ−Ｒ４、または−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−ＮＨ−Ｒ４（式中、Ｒ４は水素原子、低級アルキル、またはアリール）］
で表される化合物と、
グルタミン残基を有するペプチドを、
トランスグルタミナーゼの存在下で反応させる工程、および
２）１）工程で得られたペプチドと、糖鎖を反応させる工程を包含する、
糖ペプチドの製造方法。
該製造方法に関連して、１）一般式（ＩＶ）で表される化合物と糖鎖を反応させる工程、および２）１）工程で得られたペプチドと、グルタミン残基を有するペプチドを、トランスグルタミナーゼの存在下で反応させる工程を包含する、糖ペプチドの製造方法についても行うことができる。【０００７】
（７）以下の工程：
１）一般式（Ｖ）：
【化８】
2005095331.tif 000009
［式中、Ｙは−Ａ１−、−Ａ１−Ｏ−Ａ２−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ１−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ１−Ｏ−Ａ２−、−Ａ１−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａ２−、−Ａ１−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ａ２−、−Ａ１−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａ２−、−Ａ１−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ａ２−、式：
【化９】
2005095331.tif 000010
で表される基、または式：
【化１０】
2005095331.tif 000011
で表される基（式中、Ａ１およびＡ２はそれぞれ独立して、置換されていてもよいＣ１−１５アルキレン、置換されていてもよいＣ２−１５アルケニレンまたは置換されていてもよいＣ２−１５アルキニレン；ｎは１〜５の整数；Ｒ１はヒドロキシまたは−ＮＨ（Ｒ２）（式中、Ｒ２は水素原子、低級アルキル、アリールまたはアラルキル）；Ｒ３は水素原子または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５（式中、Ｒ５は低級アルキル、アリールまたはアラルキル））；および、
Ｚは−Ｏ−ＮＨ（Ｒ４）、−ＮＨ−ＯＲ４、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ−Ｒ４、または−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−ＮＨ−Ｒ４（式中、Ｒ４は水素原子、低級アルキル、またはアリール）］
で表される化合物と、
システイン残基を含有するペプチドを反応させる工程、および
２）１）工程で得られたペプチドと糖鎖を反応させる工程を包含する、
糖ペプチドの製造方法。
該製造方法に関連して、１）一般式（Ｖ）で表される化合物と糖鎖を反応させる工程、および２）１）工程で得られたペプチドと、システイン残基を有するペプチドを反応させる工程、を包含する糖ペプチドの製造方法についても行うことができる。【０００８】
（８）Ｚが−Ｏ−ＮＨ（Ｒ４）（式中、Ｒ４は水素原子、低級アルキル、またはアリール）である（６）または（７）記載の製造方法。
（９）Ｙが−Ａ１−（式中、Ａ１は置換されていてもよいＣ１−１５アルキレン）である（６）または（７）記載の製造方法。
（１０）（６）〜（９）のいずれかに記載の製造方法で製造されうる糖ペプチド。
（１１）（６）〜（９）のいずれかに記載の製造方法で製造されうる糖ペプチドを有効成分として含有する医薬組成物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、天然または非天然のタンパク質と保護されていない糖鎖を利用して、均一な組成を有する糖ペプチドを簡便に製造するために用いる糖鎖−ペプチド結合剤、および該糖鎖−ペプチド結合剤を用いて糖ペプチドを製造する方法に関する。
本発明により、組成が一定している糖ペプチドを提供することが可能となるので、より高品質なバイオ医薬を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
（用語）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。【００１１】
本明細書において「糖鎖」とは、単位糖（単糖および／またはその誘導体）が１つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が２つ以上連なる場合は、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸ならびにそれらの複合体および誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。したがって、本明細書では、糖鎖は、「多糖（ポリサッカリド）」、「糖質」、「炭水化物」と互換可能に使用され得る。また、特に言及しない場合、本明細書において「糖鎖」は、糖鎖および糖鎖含有物質の両方を包含する。
本明細書において「単糖」とは、これより簡単な分子に加水分解されず、一般式ＣｎＨ２ｎＯｎで表される化合物をいう。ここで、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９および１０であるものを、それぞれジオース、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース、オクトース、ノノースおよびデコースという。一般に鎖式多価アルコールのアルデヒドまたはケトンに相当するもので、前者をアルドース，後者をケトースという。【００１２】
本明細書において「単糖の誘導体」とは、単糖上の一つ以上の水酸基が別の置換基に置換され、結果生じる物質が単糖の範囲内にないものをいう。そのような単糖の誘導体としては、カルボキシル基を有する糖（例えば、Ｃ−１位が酸化されてカルボン酸となったアルドン酸（例えば、Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルコン酸）、末端のＣ原子がカルボン酸となったウロン酸（Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルクロン酸）、アミノ基またはアミノ基の誘導体（例えば、アセチル化されたアミノ基）を有する糖（例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンなど）、アミノ基およびカルボキシル基を両方とも有する糖（例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）、Ｎ−アセチルムラミン酸など）、デオキシ化された糖（例えば、２−デオキシ−Ｄ−リボース）、硫酸基を含む硫酸化糖、リン酸基を含むリン酸化糖などがあるがそれらに限定されない。あるいは、ヘミアセタール構造を形成した糖において、アルコールと反応してアセタール構造のグリコシドもまた、単糖の誘導体の範囲内にある。
本明細書において「糖鎖含有物質」とは、糖鎖および糖鎖以外の物質を含む物質をいう。このような糖鎖含有物質は、生体内に多く見出され、例えば、生体中に含有される多糖類の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。【００１３】
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。本発明の遺伝子産物は、通常ポリペプチド形態をとる。このようなポリペプチド形態の本発明の遺伝子産物は、本発明の診断、予防、治療または予後のための組成物として有用である。特に、生理活性を有するペプチドが好ましい。例えば、インスリン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１４、インターロイキン−１５、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＬＰ−１、ステムセルファクター、ｍｐｌ−リガンド、ソマトスタチン、バソプレッシン、グルカゴン、成長ホルモン、レプチン、コレシストキニン、サブスタンスＰ、アドレナリン、ＡＤＦ、副腎皮質刺激ホルモン、βエンドルフィン、ネオエンドルフィンなど人体中で生理的に働いているペプチドおよびこれらを改変したペプチド、動物由来のペプチド、微生物由来のペプチド、植物由来のペプチドなどが挙げられる。
本明細書において「糖タンパク質」としては、例えば、酵素、ホルモン、サイトカイン、抗体、ワクチン、レセプター、血清タンパク質などが挙げられるがそれらに限定されない。【００１４】
本明細書において「糖鎖−ペプチド結合剤」とは、糖ペプチドを形成する際に、糖鎖とペプチドの間に介在する「リンカー」として働く基のことをいう。例えば、一般式（Ｉ）：
Ｘ−Ｙ−Ｚ      （Ｉ）
［式中、ＸはＨ２Ｎ−または式：
【化１１】
2005095331.tif 000012
で表される基；
Ｙは−Ａ１−、−Ａ１−Ｏ−Ａ２−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ１−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ１−Ｏ−Ａ２−、−Ａ１−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａ２−、−Ａ１−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ａ２−、−Ａ１−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａ２−、−Ａ１−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ａ２−、式：
【化１２】
2005095331.tif 000013
で表される基、または式：
【化１３】
2005095331.tif 000014
で表される基（式中、Ａ１およびＡ２はそれぞれ独立して、置換されていてもよいＣ１−１５アルキレン、置換されていてもよいＣ２−１５アルケニレンまたは置換されていてもよいＣ２−１５アルキニレン；ｎは１〜５の整数；Ｒ１はヒドロキシまたは−ＮＨ（Ｒ２）（式中、Ｒ２は水素原子、低級アルキル、アリールまたはアラルキル）；Ｒ３は水素原子または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５（式中、Ｒ５は低級アルキル、アリールまたはアラルキル））；および、
Ｚは−Ｏ−ＮＨ（Ｒ４）、−ＮＨ−ＯＲ４、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ−Ｒ４、または−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−ＮＨ−Ｒ４（式中、Ｒ４は水素原子、低級アルキル、またはアリール）］
で表される化合物を含む糖鎖−ペプチド結合剤、が例示される。【００１５】
特に、
１）式：Ｈ２Ｎ−Ａ１−Ｏ−ＮＨ（Ｒ４）（式中、Ａ１は置換されていてもよいＣ１−１５アルキレン；Ｒ４は水素原子または低級アルキル）、
２）式：Ｈ２Ｎ−Ａ１−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａ２−Ｏ−ＮＨ（Ｒ４）（式中、Ａ１およびＡ２はそれぞれ独立して置換されていてもよいＣ１−１５アルキレン；Ｒ４は水素原子または低級アルキル）、
３）式：Ｈ２Ｎ−Ａ１−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ａ２−Ｏ−ＮＨ（Ｒ４）OLE_LINK3（式中、Ａ１およびＡ２はそれぞれ独立して置換されていてもよいＣ１−１５アルキレン；Ｒ４は水素原子または低級アルキル）OLE_LINK3、
４）式：Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ１−Ｏ−ＮＨ（Ｒ４）（式中、Ａ１は置換されていてもよいＣ１−１５アルキレン；Ｒ４は水素原子または低級アルキル）、
５）式：Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ１−Ｏ−Ａ２−Ｏ−ＮＨ（Ｒ４）（式中、Ａ１およびＡ２はそれぞれ独立して置換されていてもよいＣ１−１５アルキレン；Ｒ４は水素原子または低級アルキル）、
６）式：Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ１−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａ２−Ｏ−ＮＨ（Ｒ４）（式中、Ａ１およびＡ２はそれぞれ独立して置換されていてもよいＣ１−１５アルキレン；Ｒ４は水素原子または低級アルキル）、
７）式：Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ１−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ａ２−Ｏ−ＮＨ（Ｒ４）（式中、Ａ１およびＡ２はそれぞれ独立して置換されていてもよいＣ１−１５アルキレン；Ｒ４は水素原子または低級アルキル）、
８）式：
【化１４】
2005095331.tif 000015
（式中、Ａ１はＣ１−５アルキレン；Ｒ４は水素原子、低級アルキル、またはアリール；およびＲ１は−ＮＨ（Ｒ２）（式中、Ｒ２は水素原子、低級アルキル、アリールまたはアラルキル））、および
９）一般式（ＩＩＩ）：
【化１５】
2005095331.tif 000016
（式中、Ａ１は置換されていてもよいＣ１−１５アルキレン；Ｒ４は水素原子、低級アルキル、またはアリール）、で表される化合物を含む糖鎖−ペプチド結合剤好ましい。
上記１）〜７）および９）において、Ａ１は、Ｃ３−８アルキレンが好ましい。
また、上記１）〜９）において、Ｒ４は水素原子または低級アルキルが好ましい。【００１６】
本明細書において「流体」は、本発明糖鎖−ペプチド結合剤が、糖鎖と相互作用をする環境を提供することができる流体であればどのようなものでも使用することができる。好ましくは、そのような流体はケト基を含む物質は実質的に含まない。なぜなら、ケト基を含む物質が有意に含有されている場合、流体中のアルデヒド基と本発明の物質との反応が充分に進まないからである。したがって、ケト基を含む物質を含まない形態は必須ではないが、好ましい実施形態である。
したがって、本明細書において使用される流体は、糖を環状のヘミアセタール型と非環状のアルデヒド型との平衡にもたらすようなものであることが好ましい。そのような流体としては、例えば、水溶液、有機溶媒およびこれらの混合物などが挙げられるがそれに限定されない。好ましくは、流体は水溶液である。【００１７】
本明細書において「トランスグルタミナーゼ」（時に、ＴＧａｓｅと略す）とは、タンパク質およびペブチド鎖の中のグルタミン残基（Ｇｌｎ）におけるγ−カルボキシアミド基と、リジン残基（Ｌｙｓ）におけるε−アミノ基またはアルキルアミンとの間のアシル転位反応を触媒する酵素をいう。トランスグルタミナーゼは、動物（種々の組織、血球および血漿）および微生物などに広く分布する。従って、トランスグルタミナーゼは、種々の分子形態をとっているが、その分子形態は多岐にわたる。トランスグルタミナーゼは、生体内においてペプチド鎖間または内のε−（γ−グルタミル）リジン−イソペプチド結合による架橋形成反応を触媒する。トランスグルタミナーゼはＧｌｎ残基に対する基質特異性が極めて高いことから、アルキルアミンなどの分子を用いることにより、タンパク質中の特定のＧｌｎ残基のみを改変することができる。トランスグルタミナーゼは、フィブリン分子架橋、表皮細胞の角質化、精液凝固および創傷組織の治癒などに関与するといわれている。
トランスグルタミナーゼの存在下、グルタミン含有ペプチドに糖鎖−ペプチド結合剤を作用させることにより、ペプチドのグルタミン残基に糖鎖−ペプチド結合剤が容易に導入される。
トランスグルタミナーゼの存在下、システイン含有ペプチドに糖鎖−ペプチド結合剤を作用させることにより、ペプチドのシステイン残基に糖鎖−ペプチド結合剤が容易に導入される。【００１８】
本明細書において「転移酵素」とは、基転移反応を触媒する酵素をいう。本明細書において使用される代表的な転移酵素としては、糖転移酵素があり、糖転移酵素は、糖の転移を触媒する。例示的な糖転移酵素としては、例えば、β１，４−ガラクト−ス転移酵素、α−１，３−ガラクト−ス転移酵素，β１，４−ガラクト−ス転移酵素，β１，３−ガラクト−ス転移酵素，β１，６−ガラクト−ス転移酵素、α２，６−シアル酸転移酵素、α１，４−ガラクトース転移酵素、セラミドガラクトース転移酵素、α１，２−フコース転移酵素、α１，３−フコース転移酵素、α１，４−フコース転移酵素、α１，６−フコース転移酵素、α１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、α１，６−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、β１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素、β１，４−Ｎアセチルグルコサミン転移酵素、β１，２−Ｎアセチルグルコサミン転移酵素、β１，３−Ｎアセチルグルコサミン転移酵素、β１，６−Ｎアセチルグルコサミン転移酵素、α１，４−Ｎアセチルグルコサミン転移酵素、β１，４−マンノース転移酵素、α１，２−マンノース転移酵素、α１，３−マンノース転移酵素、α１，４−マンノース転移酵素、α１，６−マンノース転移酵素、α１，２−グルコース転移酵素、α１，３−グルコース転移酵素、α２，３−シアル酸転移酵素、α２，８−シアル酸転移酵素、α１，６−グルコサミン転移酵素、α１，６−キシロース転移酵素、βキシロース転移酵素（プロテオグリカンコア構造合成酵素）、β１，３−グルクロン酸転移酵素およびヒアルロン酸合成酵素が挙げられるがそれらに限定されない。【００１９】
本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。用語「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体であるが、Ｄ体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。用語「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。【００２０】
本明細書において「生物学的活性」および「生理活性」は、本明細書において互換的に使用され、ある因子（例えば、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含される。例えば、２つの因子が相互作用する（例えば、インスリンが肝臓などにおけるインスリンレセプターに作用する）場合、その生物学的活性は、その二分子との間の結合およびそれによって生じる生物学的変化、例えば、一つの分子を抗体を用いて沈降させたときに他の分子も共沈するとき、２分子は結合していると考えられる。したがって、そのような共沈を見ることが一つの判断手法として挙げられる。また、神経突起の伸展を指標にしてある分子と他の分子とが機能的に関連していると関連付けることができる。具体的には、インスリンの血糖低下作用を確認することなどを包含する。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。
本明細書において「生理活性物質」は、上述のような生物学的活性を有する任意の物質をいう。そのような物質としては、例えば、酵素、抗体、ワクチン、血清タンパク質、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、細胞接着分子、レセプター、シグナル伝達因子などが挙げられるがそれに限定されない。【００２１】
本明細書において「活性」は、結合（直接的または間接的のいずれか）を示すかまたは明らかにするか；応答に影響する（すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測定可能な影響を有する）、種々の測定可能な指標をいい、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに直接結合する化合物の親和性、または例えば、いくつかの刺激後または事象後の上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度が、挙げられる。このような活性は、競合阻害のようなアッセイによって測定され得る。
本明細書中で使用される用語「結合」は、２つのタンパク質もしくは化合物または関連するタンパク質もしくは化合物の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。【００２２】
本明細書においては、特に言及がない限り、「置換」は、ある有機化合物または置換基中の１または２以上の水素原子を他の原子または原子団で置き換えることをいう。水素原子を１つ除去して１価の置換基に置換することも可能であり、そして水素原子を２つ除去して２価の置換基に置換することも可能である。
本明細書において「アルキル」とは、メタン、エタン、プロパンのような脂肪族炭化水素（アルカン）から水素原子が一つ失われて生ずる１価の基をいい、一般にＣｎＨ２ｎ＋１−で表される（ここで、ｎは正の整数である）。アルキルは、直鎖または分枝鎖であり得る。本明細書において「置換されたアルキル」とは、以下に規定する置換基によってアルキルのＨが置換されたアルキルをいう。これらの具体例は、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ７アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ９アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１１アルキルまたはＣ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ３置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ４置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ５置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ７置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ８置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ９置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ１０置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ１１置換されたアルキルまたはＣ１〜Ｃ１２置換されたアルキルであり得る。ここで、例えばＣ１〜Ｃ１０アルキルとは、炭素原子を１〜１０個有する直鎖または分枝状のアルキルを意味し、メチル（ＣＨ３−）、エチル（Ｃ２Ｈ５−）、ｎ−プロピル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２−）、イソプロピル（（ＣＨ３）２ＣＨ−）、ｎ−ブチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ペンチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ヘキシル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ヘプチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−オクチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ノニル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−デシル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２などが例示される。また、例えば、Ｃ１〜Ｃ１０置換されたアルキルとは、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルであって、そのうち１または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。【００２３】
本明細書において、「低級アルキル」は、好ましくは、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、より好ましくは、Ｃ１〜Ｃ３アルキルである。
本明細書中、「アルキレン」とは、「アルキル」から導かれる２価の基であって、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、ヘプタメチレン、オクタメチレン、ノナンメチレン、デカンメチレン、ウンデカメチレン、ドデカメチレン等が挙げられる。
本明細書において「アルケニル」とは、エチレン、プロピレンのような、分子内に二重結合を一つ有する脂肪族炭化水素から水素原子が一つ失われて生ずる１価の基をいい、一般にＣｎＨ２ｎ−１−で表される（ここで、ｎは２以上の正の整数である）。「置換されたアルケニル」とは、以下に規定する置換基によってアルケニルのＨが置換されたアルケニルをいう。具体例としては、Ｃ２〜Ｃ３アルケニル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ５アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ７アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ９アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１１アルケニルまたはＣ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ３置換されたアルケニル、Ｃ２〜Ｃ４置換されたアルケニル、Ｃ２〜Ｃ５置換されたアルケニル、Ｃ２〜Ｃ６置換されたアルケニル、Ｃ２〜Ｃ７置換されたアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８置換されたアルケニル、Ｃ２〜Ｃ９置換されたアルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０置換されたアルケニル、Ｃ２〜Ｃ１１置換されたアルケニルまたはＣ２〜Ｃ１２置換されたアルケニルであり得る。ここで、例えばＣ２〜Ｃ１０アルキルとは、炭素原子を２〜１０個含む直鎖または分枝状のアルケニルを意味し、ビニル（ＣＨ２＝ＣＨ−）、アリル（ＣＨ２＝ＣＨＣＨ２−）、ＣＨ３ＣＨ＝ＣＨ−などが例示される。また、例えば、Ｃ２〜Ｃ１０置換されたアルケニルとは、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニルであって、そのうち１または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。【００２４】
本明細書中、「アルケニレン」とは、「アルケニル」から導かれる２価の基であって、例えば、ビニレン、プロペニレン、ブテニレン等が挙げられる。
本明細書において「アルキニル」とは、アセチレンのような、分子内に三重結合を一つ有する脂肪族炭化水素から水素原子が一つ失われて生ずる１価の基をいい、一般にＣｎＨ２ｎ−３−で表される（ここで、ｎは２以上の正の整数である）。「置換されたアルキニル」とは、以下に規定する置換基によってアルキニルのＨが置換されたアルキニルをいう。具体例としては、Ｃ２〜Ｃ３アルキニル、Ｃ２〜Ｃ４アルキニル、Ｃ２〜Ｃ５アルキニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ２〜Ｃ７アルキニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ２〜Ｃ９アルキニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、Ｃ２〜Ｃ１１アルキニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ２〜Ｃ３置換されたアルキニル、Ｃ２〜Ｃ４置換されたアルキニル、Ｃ２〜Ｃ５置換されたアルキニル、Ｃ２〜Ｃ６置換されたアルキニル、Ｃ２〜Ｃ７置換されたアルキニル、Ｃ２〜Ｃ８置換されたアルキニル、Ｃ２〜Ｃ９置換されたアルキニル、Ｃ２〜Ｃ１０置換されたアルキニル、Ｃ２〜Ｃ１１置換されたアルキニルまたはＣ２〜Ｃ１２置換されたアルキニルであり得る。ここで、例えば、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニルとは、例えば炭素原子を２〜１０個含む直鎖または分枝状のアルキニルを意味し、エチニル（ＣＨ≡Ｃ−）、１−プロピニル（ＣＨ３Ｃ≡Ｃ−）などが例示される。また、例えば、Ｃ２〜Ｃ１０置換されたアルキニルとは、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニルであって、そのうち１または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。
本明細書において「アルキニレン」とは、「アルキニル」から導かれる２価の基であって、例えば、プロピニレン、ブチニレン等が挙げられる。【００２５】
本明細書において、「置換されていてもよいＣ１−１５アルキレン」、「置換されていてもよいＣ２−１５アルケニレン」または「置換されていてもよいＣ２−１５アルキニレンの置換基としては、置換基群Ａから選択される置換基により置換されていてもよいアリール、置換基群Ａから選択される置換基により置換されていてもよいヘテロアリール、置換基群Ａから選択される置換基により置換されていてもよい非芳香族炭素環式基、置換基群Ａから選択される置換基により置換されていてもよい非芳香族複素環式基、ヒドロキシ、アルキルオキシ、メルカプト、アルキルチオ、ハロゲン、ニトロ、シアノ、カルボキシ、アルキルオキシカルボニル、ハロアルキル、ハロアルキルオキシ、置換されていてもよいアミノ、置換されていてもよいアミノカルボニル、アシル、アシルオキシ、アリールオキシ（例えば、フェニルオキシ）、アラルキルオキシ（例えば、ベンジルオキシ）、低級アルキルスルホニル、グアニジノ、アゾ基等が挙げられる。これらは、全ての可能な位置で１個以上置換しうる。
本明細書において、「置換基群Ａから選択される置換基により置換されていてもよい」とは、以下の置換基群Ａにより１またはそれ以上置換されていてもよいことを意味する。
置換基群Ａ：アルキル、ヒドロキシ、アルキルオキシ、メルカプト、アルキルチオ、ハロゲン、ニトロ、シアノ、カルボキシ、アルキルオキシカルボニル、ハロアルキル、ハロアルキルオキシ、置換されていてもよいアミノ、置換されていてもよいアミノカルボニル、アシル、アシルオキシ、アリールオキシ（例えば、フェニルオキシ）、アラルキルオキシ（例えば、ベンジルオキシ）、低級アルキルスルホニル、グアニジノ、アゾ基、置換基群Ｂから選択される置換基により置換されていてもよいアリール、置換基群Ｂから選択される置換基により置換されていてもよいヘテロアリール、置換基群Ｂから選択される置換基により置換されていてもよい非芳香族炭素環式基、および置換基群Ｂから選択される置換基により置換されていてもよい非芳香族複素環式基。【００２６】
本明細書において、「置換基群Ｂから選択される置換基により置換されていてもよい」とは、以下の置換基群Ｂにより１またはそれ以上置換されていてもよいことを意味する。
置換基群Ｂ：アルキル、ヒドロキシ、アルキルオキシ、メルカプト、アルキルチオ、ハロゲン、ニトロ、シアノ、カルボキシ、アルキルオキシカルボニル、ハロアルキル、ハロアルキルオキシ、置換されていてもよいアミノ、置換されていてもよいアミノカルボニル、アシル、アシルオキシ、アリールオキシ（例えば、フェニルオキシ）、アラルキルオキシ（例えば、ベンジルオキシ）、低級アルキルスルホニル、グアニジノ、アゾ基、アリール、ヘテロアリール、非芳香族炭素環式基、および非芳香族複素環式基。
本明細書において「アリール」とは、芳香族炭化水素の環に結合する水素原子が１個離脱して生ずる基をいい、本明細書において、「炭素環基」に包含される。例えば、フェニル、α−ナフチル、β−ナフチル、アンスニル、インデニル、フェナンスリル等が挙げられる。「置換されたアリール」とは、下記において選択される置換基で置換されているアリールを意味する。
本明細書において、「保護基」は、アミノ基およびイミノ基の保護基である場合、ベンジル、ベンゾイル、アセチル、ｔ−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルが挙げられる。アセチルが好ましい。保護反応および脱保護反応は、Protective Groups in Organic Synthesis, Theodora W Green (John Wiley & Sons) 等に記載の方法に従って行うことができる。
本明細書において、Ｃ１、Ｃ２、、、Ｃｎは、炭素数を表す。従って、Ｃ１は炭素数１個の置換基を表すために使用される。【００２７】
本明細書においては、特に言及がない限り、置換は、ある有機化合物または置換基中の１または２以上の水素原子を他の原子または原子団で置き換えることをいう。水素原子を１つ除去して１価の置換基に置換することも可能であり、そして水素原子を２つ除去して２価の置換基に置換することも可能である。
置換基としては、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アルコキシ、炭素環基、ヘテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、チオール、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、カルバモイル、アシル、アシルアミノ、チオカルボキシ、アミド、カルボニル、チオカルボニル、スルホニルまたはスルフィニルが挙げられるがそれらに限定されない。置換基が置換された場合は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アルコキシアルキル、ハロゲノアルキル、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アシル、アシルオキシ、ヒドロキシ、メルカプト、カルボキシ、チオカルボキシ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、カルバモイル、置換されていてもよいアミノで置換され得る。この「置換されていてもよいアミノ」は、アルキル、アルケニル、アリールまたはアリールアルキルで１または２ヶ所置換されていてもよいアミノを意味する。【００２８】
（有機化学）
有機化学については、例えば、モリソン  ボイド有機化学（上）（中）（下）第５版（東京化学同人発行（１９８９年））、Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｓｔｒｙ  第４版（Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｉｅｎｃｅ，ＪＯＨＮ  ＷＩＬＥＹ  ＆  ＳＯＮＳ，１９９２）などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
本明細書において「保護反応」とは、Ｂｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）、アセチル、ベンジル、Ｃｂｚ（ベンジルオキシカルボニル）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）のような保護基を、保護が所望される官能基に付加する反応をいう。保護基により官能基を保護することによって、より反応性の高い官能基の反応を抑制し、より反応性の低い官能基のみを反応させることができる。
本明細書において「脱保護反応」とは、上で列挙したような保護基を脱離させる反応をいう。脱保護反応としては、Ｂｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）に対してはトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）による反応およびベンジルエーテルに対してはＨ２、Ｐｄ／Ｃを用いる還元反応のような反応が挙げられる。「保護反応」および「脱保護反応」については、例えば、Ｔ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、第３版（ＪＯＨＮ  ＷＩＬＥＹ＆ＳＯＮＳ，Ｉｎｃ．（１９９９））に詳細に記載され、その内容は、本明細書中に参考として援用される。【００２９】
（本明細書において用いられる一般技術）
本明細書において使用される技術は、そうではないと具体的に指示しない限り、当該分野の技術範囲内にある、分析化学、有機化学、生化学、遺伝子工学、分子生物学、微生物学、遺伝学および関連する分野における周知慣用技術を使用する。そのような技術は、例えば、以下に列挙した文献および本明細書において他の場所おいて引用した文献においても十分に説明されている。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，ＮＹ，１０１５８（２０００）；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ  ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（１９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２３０、２４２、２４７、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９４；別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７；畑中、西村ら、糖質の科学と工学、講談社サイエンティフィク、１９９７；糖鎖分子の設計と生理機能  日本化学会編、学会出版センター、２００１などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。【００３０】
（遺伝子、タンパク質分子などの改変）
あるタンパク質分子（例えば、インスリンなど）において、配列に含まれるあるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。【００３１】
本明細書において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例としては、例えば、親水性指数または疎水性指数が、±２以内のもの同士、好ましくは±１以内のもの同士、より好ましくは±０．５以内のもの同士のものが挙げられるがそれらに限定されない。従って、保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書において、「改変体」とは、もとのペプチドまたはポリペプチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。そのような改変体としては、基準となる核酸分子またはペプチドに対して、１または数個の置換、付加および／または欠失、あるいは１つ以上の置換、付加および／または欠失を含むものが挙げられるがそれらに限定されない。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。そのような対立遺伝子変異体は、通常その対応する対立遺伝子と同一または非常に類似性の高い配列を有し、通常はほぼ同一の生物学的活性を有するが、まれに異なる生物学的活性を有することもある。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。ＢＬＡＳＴなるソフトを用いて相同性を計算することが出来る。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトおよびマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子およびβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用である。オルソログは、通常別の種において、もとの種と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。【００３２】
本明細書において「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。このような塩基配列の改変法としては、制限酵素などによる切断、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＤＮＡリガーゼなどによる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置換法（特定部位指向突然変異法；Ｍａｒｋ  Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４６８−５００（１９８３））が挙げられるが、この他にも通常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、短縮化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、ホスホリル化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。【００３３】
本明細書において使用される用語「ペプチド誘導体」とは、ペプチドとは異なる化合物であるが、ペプチドと少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ペプチドアナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のアミノ酸アナログまたはアミノ酸誘導体が付加または置換されているものが含まれる。ペプチドアナログは、その機能が、もとのペプチドの機能（例えば、ｐＫａ値が類似していること、官能基が類似していること、他の分子との結合様式が類似していること、水溶性が類似していることなど）と実質的に同様であるように、このような付加または置換がされている。そのようなペプチドアナログは、当該分野において周知の技術を用いて作製することができる。したがって、ペプチドアナログは、アミノ酸アナログを含むポリマーであり得る。
本明細書において使用される核酸分子は、発現されるペプチドが天然型のペプチドと実質的に同一の活性を有する限り、上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、５’末端および／または３’末端に他の核酸が結合していてもよい。また、ペプチドをコードする遺伝子をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そのペプチドと実質的に同一の機能を有するペプチドをコードする核酸分子でもよい。このような遺伝子は、当該分野において公知であり、本発明において利用することができる。
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。【００３４】
本明細書において、ペプチドまたはポリペプチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのペプチドまたはポリペプチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ホルモン、サイトカインの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。【００３５】
（遺伝子工学）
本発明において用いられる生理活性ペプチドなどならびにそのフラグメントおよび改変体は、遺伝子工学技術を用いて生産することができる。
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」または「組み換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。そのような制限酵素部位およびマルチプルクローニング部位は、当該分野において周知であり、当業者は、目的に合わせて適宜選択して使用することができる。そのような技術は、本明細書に記載される文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）に記載されている。好ましいベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス粒子またはウイルスおよび組み込み可能なＤＮＡフラグメント（すなわち、相同組換えによって宿主ゲノム中に組み込み可能なフラグメント）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいウイルス粒子としては、アデノウイルス、バキュロウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ワクシニアウイルスおよびレトロウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
ベクターの１つの型は、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状二重鎖ＤＮＡループをいう。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノム中に連結され得る。特定のベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）は、これらが導入される宿主細胞中で自律的に複製し得る。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、これらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書中で、「発現ベクター」といわれる。
従って、本明細書において「発現ベクター」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、動物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。【００３６】
本発明において用いられ得る原核細胞に対する「組み換えベクター」としては、ｐｃＤＮＡ３（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（＋／−）、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰ、ｐＨＡＴ、ｐＵＣ１８、ｐＦＴ−ＤＥＳＴTM４２ＧＡＴＥＷＡＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが例示される。
本発明において用いられ得る動物細胞に対する「組み換えベクター」としては、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（いずれもフナコシより市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３）］、マウス幹細胞ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉｒｕｓ）（ＭＳＣＶ）に基づいたレトロウイルス型発現ベクター、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰなどが例示される。
本明細書において「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、通常ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。したがって、本明細書においてある遺伝子のプロモーターの働きを有する部分を「プロモーター部分」という。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモータ領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在する。【００３７】
本明細書において「複製起点」とは、ＤＮＡ複製が開始する染色体上の特定領域をいう。複製起点は、内因性起点を含むようにそのベクターを構築することによって提供され得るか、または宿主細胞の染色体複製機構により提供され得るかのいずれかであり得る。そのベクターが、宿主細胞染色体中に組み込まれる場合、後者が十分であり得る。あるいは、ウイルス複製起点を含むベクターを使用するよりも、当業者は、選択マーカーと本発明のＤＮＡとを同時形質転換する方法によって、哺乳動物細胞を形質転換し得る。適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼである（米国特許第４，３９９，２１６号を参照）。
例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現することによって、組換え哺乳動物発現ベクターでは、特定の細胞型において核酸の発現を優先的に指向し得る。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、発生的に調節されたプロモーター（例えば、マウスｈｏｘプロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９，３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３，５３７−５４６））、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１，２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３，２３５−２７５）、特にＴ細胞レセプター（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８，７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３，７２９−７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３，７４１−７４８）のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経線維プロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０，９１２−９１６）、および乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願公開番号２６４，１６６）が挙げられるがそれらに限定されない。【００３８】
本明細書において「エンハンサー」とは、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられる配列をいう。そのようなエンハンサーは当該分野において周知である。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．およびその第三版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。【００３９】
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。
本発明において遺伝子操作などにおいて原核生物細胞が使用される場合、原核生物細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属などに属する原核生物細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１、ＢＬ−２１、ＪＭ１０９が例示される。
本明細書において使用される場合、動物細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト白血病細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ヒト結腸癌細胞株などを挙げることができる。マウス・ミエローマ細胞としては、ｐｓ２０、ＮＳＯなど、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０など、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）など、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１など、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ヒト結腸癌細胞株としてはＨＣＴ−１５、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−５Ｙ、マウス神経芽細胞腫Ｎｅｕｒｏ２Ａなどが例示される。
本明細書において使用される場合、組換えベクターの導入方法としては、ＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、リポフェクション法、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法などが例示される。【００４０】
本明細書において、レトロウイルスの感染方法は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  前出（特にＵｎｉｔｓ  ９．９−９．１４）などに記載されるように、当該分野において周知であり、例えば、トリプシナイズして胚性幹細胞を単一細胞懸濁物（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）にした後、ウイルス産生細胞（ｖｉｒｕｓ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）（パッケージング細胞株＝ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ）の培養上清と一緒に１〜２時間共培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）することにより、十分量の感染細胞を得ることができる。
本明細書において使用されるゲノムまたは遺伝子座などを除去する方法において用いられる、Ｃｒｅ酵素の一過的発現、染色体上でのＤＮＡマッピングなどは、細胞工学別冊実験プロトコールシリーズ「ＦＩＳＨ実験プロトコール  ヒト・ゲノム解析から染色体・遺伝子診断まで」松原謙一、吉川  寛  監修  秀潤社（東京）などに記載されるように、当該分野において周知である。
本明細書において遺伝子発現（たとえば、ｍＲＮＡ発現、ポリペプチド発現）の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００２  Ｄｅｃ；３２  Ｓｕｐｐｌ：５２６−３２に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法  ・  中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔  羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。【００４１】
本明細書において「発現量」とは、対象となる細胞などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。
本明細書において「上流」という用語は、特定の基準点からポリヌクレオチドの５’末端に向かう位置を示す。
本明細書において「下流」という用語は、特定の基準点からポリヌクレオチドの３’末端に向かう位置を示す。【００４２】
本明細書において「塩基対の」および「Watson & Crick塩基対の」という表現は、本明細書では同義に用いられ、二重らせん状のDNAにおいて見られるものと同様に、アデニン残基が２つの水素結合によってチミン残基またはウラシル残基と結合し、3つの水素結合によってシトシン残基とグアニン残基とが結合するという配列の正体に基づいて互いに水素結合可能なヌクレオチドを示す（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５を参照）。
本明細書において「相補的」または「相補体」という用語は、本明細書では、相補領域全体がそのまま別の特定のポリヌクレオチドとＷａｔｓｏｎ  ＆  Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成することのできるポリヌクレオチドの配列を示す。本発明の目的で、第１のポリヌクレオチドの各塩基がその相補塩基と対になっている場合に、この第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドと相補であるとみなす。相補塩基は一般に、ＡとＴ（あるいはＡとＵ）、またはＣとＧである。本願明細書では、「相補」という語を「相補ポリヌクレオチド」、「相補核酸」および「相補ヌクレオチド配列」の同義語として使用する。これらの用語は、その配列のみに基づいてポリヌクレオチドの対に適用されるものであり、２つのポリヌクレオチドが事実上結合状態にある特定のセットに適用されるものではない。【００４３】
（ペプチドの製造方法）
本発明で使用するペプチド（例えば、インスリンまたはその改変体もしくはフラグメントなど）をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞などに由来する形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、本発明のポリペプチドを生成蓄積させ、本発明の培養物より本発明のペプチドを採取することにより、本発明に係るペプチドを製造することができる。
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、本発明の生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。【００４４】
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、グリセロール、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸または有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素物質、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫
酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。【００４５】
培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンまたはテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。遺伝子を導入した細胞または器官は、ジャーファーメンターを用いて大量培養することができる。
例えば、動物細胞を用いる場合、本発明の細胞を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７））、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２））、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９））、１９９培地（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０））またはこれら培地にウシ胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％ＣＯ2存在下等の条件下で１〜７日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。【００４６】
本発明に使用するペプチドをコードする核酸配列で形質転換された形質転換体の培養物から、本発明に使用するペプチドを単離または精製するためには、当該分野で周知慣用の通常の酵素の単離または精製法を用いることができる。例えば、本発明に使用するペプチドが本発明のペプチド製造用形質転換体の細胞外に本発明に使用するペプチドが分泌される場合には、その培養物を遠心分離等の手法により処理し、可溶性画分を取得する。その可溶性画分から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学）等樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等の樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等の樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。
本発明に使用するペプチド（例えば、インスリンなど）が本発明に使用するペプチド製造用形質転換体の細胞内に溶解状態で蓄積する場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、その細胞を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモジナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。その無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学）等樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等の樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等の樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用いることによって、精製標品を得ることができる。【００４７】
本発明に使用するペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈澱画分より、通常の方法により本発明のポリペプチドを回収後、そのポリペプチドの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化する。この可溶化液を、ポリペプチド変性剤を含まないあるいはポリペプチド変性剤の濃度がペプチドが変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、本発明に使用するペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
また、通常のタンパク質の精製方法［Ｊ．Ｅｖａｎ．Ｓａｄｌｅｒら：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，８３，４５８］に準じて精製できる。また、本発明に使用するペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる［山川彰夫，実験医学（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），１３，４６９−４７４（１９９５）］。例えば、Ｌｏｗｅらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７−８２３１（１９８９）、ＧｅｎｅｓＤｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］に記載の方法に準じて、本発明に使用するペプチドをプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。【００４８】
また、本発明に使用するペプチドをＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として生産し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］。このような融合タンパク質では、発現ベクターにおいて、タンパク質分解切断部位は、融合タンパク質の精製に続いて、融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にするために、融合部分と組換えタンパク質との接合部に導入される。このような酵素およびこれらの同族の認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼを含む。代表的な融合発現ベクターとしては、それぞれ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合する、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７，３１〜４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。
さらに、本発明に使用するペプチド自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。本発明に使用するペプチドは、公知の方法［Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ，６，１２９−１３４、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，１６６−１６８（１９９１）］に準じて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いてを生産することができる。
本発明に使用するペプチドは、そのアミノ酸情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ、島津製作所等のペプチド合成機を利用し化学合成することもできる。【００４９】
精製した本発明に使用するペプチドの構造解析は、タンパク質化学で通常用いられる方法、例えば遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析（平野久著、東京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法により実施可能である。本発明に使用するペプチドの生理活性は、公知の測定法に準じて測定することができる。
本発明において有用な可溶性ペプチドの産生もまた、当該分野で公知の種々の方法によって達成され得る。例えば、ペプチドは、エキソペプチダーゼ、エドマン分解またはその両方と組み合わせて特定のエンドペプチダーゼを使用することによるタンパク質分解によって、インタクトな膜貫通ｐ７５ポリペプチド分子から誘導され得る。このインタクトなｐ７５ペプチド分子は、従来の方法を使用して、その天然の供給源から精製され得る。あるいは、インタクトなｐ７５ペプチドは、ｃＤＮＡ、発現ベクターおよび組換え遺伝子発現のための周知技術を利用する組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。
好ましくは、本発明において有用な可溶性ペプチドは、直接的に産生され、従って、出発材料としてのｐ７５ペプチド全体の必要性を排除する。これは、従来の化学合成技術によって達成され得るか、または周知の組換えＤＮＡ技術（ここで、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列のみが形質転換された宿主で発現される）によって達成され得る。例えば、所望の可溶性ｐ７５ペプチドをコードする遺伝子は、オリゴヌクレオチド合成機を使用する化学的手段によって合成され得る。このようなオリゴヌクレオチドは、所望の可溶性ｐ７５ペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計される。所望のペプチドをコードする特定のＤＮＡ配列はまた、特定の制限エンドヌクレアーゼフラグメントの単離によってか、またはｃＤＮＡからの特定の領域のＰＣＲ合成によって、全長ＤＮＡ配列から誘導され得る。【００５０】
（改変体ペプチドの製造方法）
本発明に使用するペプチド（例えば、インスリンなど）のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加（融合を含む）は、周知技術である部位特異的変異誘発法により実施することができる。かかる１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，５６６２（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４）、ＰＣＴ  ＷＯ８５／００８１７（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ，３１６，６０１（１９８５）等に記載の方法に準じて調製することができる。【００５１】
（医薬組成物）
別の局面において、本発明は、医薬（例えば、ワクチン等の医薬品、健康食品、タンパク質または脂質は抗原性を低減した医薬品）および化粧品に関する。この医薬および化粧品は、薬学的に受容可能なキャリアなどをさらに含み得る。本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能なキャリアとしては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。
そのような適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバント挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、化合物、またはその改変体もしくは誘導体を、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。
本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、そして以下が挙げられる：リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、α−トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））。
例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。【００５２】
以下に本発明の医薬組成物の一般的な調製法を示す。なお、動物薬組成物、医薬部外品、水産薬組成物、食品組成物および化粧品組成物等についても公知の調製法により製造することができる。
本発明の糖鎖が導入されたペプチドなどは、薬学的に受容可能なキャリアと配合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、座剤等の固形製剤、またはシロップ剤、注射剤、懸濁剤、溶液剤、スプレー剤等の液状製剤として経口または非経口的に投与することができる。薬学的に受容可能なキャリアとしては、上述のように、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、崩壊阻害剤、吸収促進剤、吸着剤、保湿剤、溶解補助剤、安定化剤、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。また、必要に応じ、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を用いることができる。また、本発明の組成物には本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドなど以外の物質を配合することも可能である。非経口の投与経路としては、静脈内注射、筋肉内注射、経鼻、直腸、膣および経皮等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における賦形剤としては、例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、Ｄ−マンニトール、結晶セルロース、デンプン、炭酸カルシウム、軽質無水ケイ酸、塩化ナトリウム、カオリンおよび尿素等が挙げられる。
固形製剤における滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ホウ酸末、コロイド状ケイ酸、タルクおよびポリエチレングリコール等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、白糖、Ｄ−マンニトール、結晶セルロース、デキストリン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、デンプン溶液、ゼラチン溶液、ポリビニルピロリドン、リン酸カルシウム、リン酸カリウム、およびシェラック等が挙げられる。
固形製剤における崩壊剤としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カンテン末、ラミナラン末、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、アルギン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、ステアリン酸モノグリセリド、ラクトースおよび繊維素グリコール酸カルシウム等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における崩壊阻害剤の好適な例としては、水素添加油、白糖、ステアリン、カカオ脂および硬化油等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における吸収促進剤としては、例えば、第四級アンモニウム塩基類およびラウリル硫酸ナトリウム等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における吸着剤としては、例えば、デンプン、ラクトース、カオリン、ベントナイトおよびコロイド状ケイ酸等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における保湿剤としては、例えば、グリセリン、デンプン等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における溶解補助剤としては、例えば、アルギニン、グルタミン酸、アスパラ
ギン酸等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における安定化剤としては、例えば、ヒト血清アルブミン、ラクトース等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤として錠剤、丸剤等を調製する際には、必要により胃溶性または腸溶性物質（白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等）のフィルムで被覆していてもよい。錠剤には、必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーテイング錠あるいは二重錠、多層錠が含まれる。カプセル剤にはハードカプセルおよびソフトカプセルが含まれる。座剤の形態に成形する際には、上記に列挙した添加物以外に、例えば、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、半合成グリセライド等を添加することができるがそれらに限定されない。【００５３】
液状製剤における溶剤の好適な例としては、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油およびトウモロコシ油等が挙げられる。
液状製剤における溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における懸濁化剤の好適な例としては、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩およびクエン酸塩等の緩衝液等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における無痛化剤の好適な例としては、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウムおよび塩酸プロカイン等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における防腐剤の好適な例としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、２−フェニルエチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロールおよびシステイン等が挙げられるがそれらに限定されない。【００５４】
注射剤として調製する際には、液剤および懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であることが好ましい。通常、これらは、バクテリア保留フィルター等を用いるろ過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化する。さらにこれらの処理後、凍結乾燥等の方法により固形物とし、使用直前に無菌水または無菌の注射用希釈剤（塩酸リドカイン水溶液、生理食塩
水、ブドウ糖水溶液、エタノールまたはこれらの混合溶液等）を添加してもよい。
さらに、必要ならば、医薬組成物は、着色料、保存剤、香料、矯味矯臭剤、甘味料等、ならびに他の薬剤を含んでいてもよい。
本発明の医薬は、経口的または非経口的に投与され得る。あるいは、本発明の医薬は、静脈内または皮下で投与され得る。全身投与されるとき、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮することにより、当業者は、容易に行うことができる。本明細書において、投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）であり得る。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。
本発明の医薬は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（日本薬局方第１４版またはその最新版、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０などを参照）と、所望の程度の純度を有する糖鎖組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製され保存され得る。
様々な送達系が公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用いられ得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルなど）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。化合物または組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を通しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬学的化合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および髄腔内注射を包含し；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取り付けられた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入することが望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアロゾル化剤を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。【００５５】
特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物を、処置の必要な領域（例えば、中枢神経、脳など）に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではないが、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み合わせて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のような膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、または膠様材料である）により達成され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する際、タンパク質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければならない。
別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リポソーム中に封入された状態で送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。
さらに別の実施形態において、化合物または組成物は、制御された徐放系中で送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇｅｒ（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、高分子材料が用いられ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ
Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ
Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ，Ｊ．、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）もまた参照のこと）。
さらに別の実施形態において、制御された徐放系は、治療標的、即ち、脳の近くに置かれ得、従って、全身用量の一部のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，（前出），第２巻，１１５〜１３８頁（１９８４）を参照のこと）。
他の制御された徐放系は、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。【００５６】
本発明の処置方法において使用される組成物の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被験体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
本発明の糖鎖が導入されたペプチドなどの投与量は、被験体の年齢、体重、症状または投与方法などにより異なり、特に限定されないが、通常成人１日あたり、経口投与の場合、０．０１ｍｇ〜１０ｇであり、好ましくは、０．１ｍｇ〜１ｇ、１ｍｇ〜１００ｍｇ、０．１ｍｇ〜１０ｍｇなどであり得る。非経口投与の場合、０．０１ｍｇ〜１ｇであり、好ましくは、０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、１ｍｇ〜１００ｍｇ、０．１ｍｇ〜１０ｍｇなどであり得る。
本明細書中、「投与する」とは、本発明の糖鎖が導入されたペプチドなどまたはそれを含む医薬組成物を、単独で、または他の治療剤と組み合わせて、生物の細胞または組織に化合物を取り込むことを意味する。組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療混合物としてともに投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じての場合）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に与えられ、続いて第２に与えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。
異常な状態はまた、生物へのシグナル伝達経路に異常を有する細胞の群に化合物を投与することによって予防または処置され得る。次いで、化合物を投与することの生物機能に対する効果が、モニターされ得る。この生物は、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、またはヤギ、より好ましくは、サル（ｍｏｎｋｅｙまたはａｐｅ）、および最も好ましくは、ヒトである。【００５７】
本明細書において「指示書」は、本発明の医薬などを投与する方法または診断する方法などを医師、患者など投与を行う人、診断する人（患者本人であり得る）に対して記載したものである。この指示書は、本発明の診断薬、医薬などを投与する手順を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ（ウェブサイト）、電子メール）のような形態でも提供され得る。
本発明の方法による治療の終了の判断は、商業的に利用できるアッセイもしくは機器使用による標準的な臨床検査室の結果またはインスリンなどに関連する疾患（例えば、神経疾患）に特徴的な臨床症状の消滅によって支持され得る。治療は、インスリンなどに関連する疾患（例えば、神経疾患）の再発により再開することができる。
本発明はまた、本発明の医薬組成物の１つ以上の成分を満たした１つ以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に任意に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。
本発明が化粧品として使用されるときもまた、当局の規定する規制を遵守しながら化粧品を調製することができる。【００５８】
以下に、本発明の好ましい実施形態について説明する。
本発明糖鎖−ペプチド結合剤は以下の方法で得ることができる。【００５９】
（方法１）
【化１６】
2005095331.tif 000017
（式中、Ａ１は（１）と同意義、Ｐｒｏは保護基、Ｈａｌはハロゲン、Ｐｈ３ＰはトリフェニルホスフィンおよびＡｌｋはアルキル）【００６０】
（方法２）
【化１７】
2005095331.tif 000018
（式中、Ａ１は（１）と同意義、Ｐｒｏは保護基、ＤＥＡＤはジエチルアゾジカルボキシレート）【００６１】
（方法３）
【化１８】
2005095331.tif 000019
（式中、Ｐｒｏは保護基）
（方法４）【００６２】
【化１９】
2005095331.tif 000020
（式中、Ａ１およびＲ４は（１）と同意義、Ｐｒｏは保護基）【００６３】
（ペプチドと該糖鎖−ペプチド結合剤の反応）
１つの局面において、本発明は、グルタミンが糖鎖で修飾された糖ペプチドを提供する。この糖ペプチドでは、生物学的活性を有する形態のペプチドのアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸残基にグルタミンを有することが特徴であり、そのグルタミンが糖鎖で修飾されている。ここで、修飾は、直接的または間接的な結合を意味する。糖鎖で修飾されるグルタミンは、ペプチドに含まれる少なくとも１つのグルタミンであればよく、好ましくは、複数（例えば、２つ、３つ）、あるいは、存在するグルタミンのすべてが糖鎖で修飾されていてもよい。結合は、通常共有結合であるが、それに限定されず、糖鎖が、結合したペプチドと同一の存在物（ｅｎｔｉｔｙ）を構成することができる限り、他の相互作用（例えば、疎水結合、水素結合など）を介していてもよい。【００６４】
１つの実施形態において、使用される生物学的活性を有する形態のペプチドは、トランスグルタミナーゼの酵素活性が発揮される少なくとも１つの条件において水溶性であることが好ましい。そのような条件は、使用されるトランスグルタミナーゼおよび基質などによって変動するが、当業者は、そのような条件を適宜設定することができる。例示的な条件としては、例えば、ｐＨ４〜ｐＨ９、塩濃度０ｍＭ〜１Ｍ、０℃〜４２℃の温度などが挙げられるがそれらに限定されない。使用される緩衝塩もまた、任意のものが使用され得る。そのような緩衝塩としては、用いられる緩衝液としてはｐＨ４〜ｐＨ９のものであればいずれの種類の緩衝液でもよく、例えば、Ｈｅｐｅｓ緩衝液、Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液(ｐＨ８．０)、リン酸緩衝液(ｐＨ６．４〜７．４)等が挙げられる。また、動物由来のトランスグルタミナーゼはカルシウム依存性のタンパク質であることが多いことから、酵素活性を発現させるために、塩化カルシウム、炭酸カルシウム等のカルシウム塩を反応系に添加するのが好ましく、その添加量は通常０．１〜１００ミリモル濃度が好ましい。なお、微生物由来のトランスグルタミナーゼはカルシウム依存性ではないため、カルシウム塩の添加は必要でない。トランスグルタミナーゼとしては、ストレプトベルティシリウム属（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．  Ｓｔｒａｉｎ  ｓ−８１１２）等の微生物の産生するもの、モルモット、ヒト等の動物由来のもの、さらに魚類由来のものなどいずれも用い得る。また汎用食品の増貼剤として市販もされており、本発明ではかかる市販のトランスグルタミナーゼでも用いられる。
より好ましくは、そのような条件は、「穏和な条件」であり得る。そのような穏和な条件とは、分子内ジスルフィド結合が切れない条件、立体構造に変化を与えない条件などが挙げられるがそれらに限定されない。このような穏和な条件を決定する条件としては、例えば、ペプチドまたはタンパク質濃度、基質濃度、カルシウムイオン濃度、ｐＨ、温度、共存する塩の種類および濃度、ＧＳＨの存否、還元剤の存否などが挙げられるがそれらに限定されない。必要に応じて、これらの因子は複数考慮してもよい。そのような条件の具体的な例としては、例えば、インスリン（０．１ｍＭ）、Ｌａｃ．ＡｍｉｎｏＨｅｘ（０．９ｍＭ）、ＣａＣｌ2（５ｍＭ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）、トランスグルタミナーゼ（３．５Ｕ／ｍｌ）；３７℃および３０分間反応などが挙げられるがそれに限定されない。ＧＳＨを加えると、野生型のインスリンでトランスグルタミナーゼの反応が進むが、そのような添加はペプチドの生物学的活性に悪影響があることから、好ましくない。他の穏和な条件の具体例としては、例えば、ペプチドまたはタンパク質（例えば、リジン残基を含むタンパク質（例えば、インスリン））の濃度を０．２ｍＭ以下（好ましくは、０．１ｍＭ以下）にすること、カルシウム濃度を２ｍＭ以上（好ましくは、５ｍＭ以上、より好ましくは１０ｍＭ）とすること、ＧＳＨを加えた場合に３７℃での反応を短く（例えば、３時間以下、好ましくは１時間以下）すること、市販のトランスグルタミナーゼを使用する場合、還元剤の影響がない程度の量または緩衝液交換を行い還元剤を減少させて用いることなどが挙げられるがそれに限定されない。【００６５】
本発明の方法において使用されるトランスグルタミナーゼは、どのような由来のものであってもよく、動物由来のもの（種々の組織、血漿成分由来など）または微生物由来のもの、あるいは人工的に作製したものであってもよい。
トランスグルタミナーゼを用いて糖鎖を導入した場合、反応生成物は、遠心分離法、クロマトグラフィー（例えば、逆相系ＨＰＬＣ、レクチンカラムによるアフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過等）の当該分野において周知の方法により反応混合物から単離精製することができる。あるいは、得られた糖鎖結合型インスリンは、複数種の混合物として単離することができる。また、複数の異なる糖鎖または他の置換基で改変されたものを含んでいてもよい。
反応生成物の分析は、高速液体クロマトグラフィ、核磁気共鳴スペクトル、質量分析（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦマススペクトル分析など）などの各種分光分析法により行なうことができる。
好ましい実施形態において、本発明において生物学的活性を有する形態のペプチドにおいてグルタミンに置換されるアミノ酸残基は、そのペプチドの表面に存在するものであることが好ましい。表面上にあるアミノ酸残基をグルタミンに変化させ、糖鎖を結合させることによって、従来達成できなかった外的な攻撃からペプチド分子を保護することができる。そのような表面上にあるアミノ酸残基の同定は、当該分野において周知の結晶構造分析によって行うことができる。ペプチドの空間的コンフォメーションを決定する方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｘ線結晶学、および２次元核磁気共鳴分光法を含む。表面上に存在する部分を同定する方法には、エピトープを同定する方法が含まれる。所定のタンパク質におけるそのようなエピトープの同定は、当該分野で周知の技術を使用して容易に達成される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８（所定の抗原における免疫原性エピトープの位置を決定するために迅速にペプチドを合成する一般的な方法）；米国特許第４，７０８，８７１号（抗原のエピトープを同定し、そして化学的に合成するための手順）；およびＧｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２３：７０９（所定の抗体に対して高い親和性を有するペプチドを同定するための技術）を参照されたい。【００６６】
別の実施形態において、グルタミンは、生物学的活性を有するペプチドの野生型形態に存在していてもよいし、野生型において存在していない場合、グルタミンを置換または付加してもよい。あるいは、このような付加または置換型のペプチドの生産は、合成または遺伝子工学的に行うことができる。そのような生産方法は、本明細書において上述し、実施例において例示されるように当業者に周知なぎ術を用いて実施することができる。グルタミンが置換または付加される位置は、プロテアーゼ消化を受けやすい部位にあることが好ましい。プロテアーゼ消化を受けやすい部分をグルタミンとし、糖鎖で「マスク」することによって、プロテアーゼ消化を受けにくくすることができるからである。そのようなプロテアーゼ消化を受けやすい部位であるかどうかは、ペプチドを任意のプロテアーゼとインキュベートして消化した部分ペプチドの配列を決定することによって判定することができる。
糖鎖が導入されるグルタミン残基の個数は少なくとも１つであり、２つ以上、３つ以上のグルタミン残基に糖鎖が導入されていてもかまわない。また、複数のグルタミン残基に糖鎖が導入される場合、導入される糖鎖は同一であっても異なっていてもよい。あるいは、１つのグルタミン残基に糖鎖が導入される場合であっても、導入される糖鎖は均一であっても混合物であってもよい。均一であるものが好ましい。
遊離のシステイン残基(チオール基)を持つペプチドと一般式（Ｖ）で表される化合物を含む糖鎖−ペプチド結合剤を緩衝溶液中、混ぜるだけで反応がおこり、目的とするペプチドに糖鎖−ペプチド結合剤が導入された誘導体が得られる。【００６７】
（ペプチドの製造方法）
本発明の糖ペプチドにおいて、ペプチド部分は、当該分野に周知の技術を用いて合成または遺伝子工学的に製造することができ、そのような合成および遺伝子工学的製造の方法は、本明細書において他の場所に詳述されている。また、少なくとも１つのアミノ酸残基にグルタミンを有するようなペプチドの製造もまた、当該分野において周知の合成および／または遺伝子工学の技術を用いて製造することができる。このような場合、野生型のペプチドにおいて、少なくとも１つのアミノ酸残基にグルタミンを有しない場合、その範囲内にグルタミンを有するようにアミノ酸配列を改変することができる。そのような改変方法もまた、当該分野において周知であり、本明細書において他の場所に記載されている。グルタミンの導入位置はどのような位置でもよい。
別の実施形態において、本発明の糖ペプチドは、１または数個のアミノ酸残基の置換、付加および／もしくは欠失、ならびに／または糖鎖および脂質からなる群より選択される少なくとも１つの生体分子をさらに含むことが有利であり得る。このような糖ペプチドのさらなる改変は、所望の機能を付与または消失または調節したい場合に、行うことができる。そのような改変を行うことは、当業者により実施され得る。【００６８】
別の局面において、本発明は糖鎖−ペプチド結合剤を介した機能的糖ペプチドを調製する方法を提供する。このような方法は、Ａ）少なくとも１つのアミノ酸残基にグルタミンを含む、目的とするペプチドを提供する工程；およびＢ）該グルタミンに糖鎖−ペプチド結合剤を導入する工程、を包含する。ここで、目的とするペプチドは、野生型形態のペプチドにおいて、少なくとも１つのグルタミン以外のアミノ酸残基をグルタミンに置換することにより提供されてもよく、あるいは、そのような位置にグルタミンを有する野生型形態のペプチドを直接提供してもよい。このようなグルタミン残基は、上記ペプチドのＣ末端またはＮ末端から１２アミノ酸以内に存在してもよいがそれに限定されない。
好ましい実施形態では、本発明の方法では、目的とするペプチドのアミノ酸配列において、グルタミンに変化させても目的とするペプチドの生物学的活性を喪失しない残基を同定する工程をさらに包含する。このような工程を有することによって、本発明において、着実に機能的糖ペプチドを生産することができる。ここで、グルタミンが置換される少なくとも１つのアミノ酸残基は、このような方法によって同定された残基であるが、このような残基以外の残基が改変されていてもよい。このような同定工程は、例えば、糖ペプチドの表面上のアミノ酸残基を同定することを包含してもよい。目的とするペプチドは、目的とするペプチドの野生型形態においてプロテアーゼ消化を受けやすい部位を同定し、その部位にグルタミンが存在しない場合、プロテアーゼ消化を受けやすい部位をグルタミンに置換することによって提供され得る。
改変されるペプチドは、野生型ペプチドであっても、合成された人工改変ペプチドであってもよい。
グルタミンへの糖鎖の導入は、通常、トランスグルタミナーゼを利用し、前記糖鎖はアミノ基を含むが、それに限定されない。トランスグルタミナーゼは、グルタミンに特異性が高いことから、グルタミン残基のみに糖鎖を導入するために有利に用いられる。アミノ基と糖鎖とは直接結合されていてもよいが、スペーサーを介して結合されていてもよい。【００６９】
（糖鎖）
本発明において使用される糖鎖としては、任意のものが使用され得る。好ましくは、使用される糖鎖は、ラクトースまたはシアル酸を含むことが有利である。より好ましくは、使用される糖鎖は、シアル酸を含むことがさらに有利である。
従って、本発明において使用される糖鎖の例示としては、例えば、Ｌａｃ、Ｓｉａα２，３−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，６−Ｌａｃ、Ｆｕｃα１，２−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，６−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−（Ｆｕｃα１，２−）Ｌａｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａ−α−２，６−（Ｆｕｃ−α−１，２−）Ｌａｃなど、これらを含む３糖、４糖、５糖、６糖、またはｎ糖（ここで、ｎは７以上の任意の整数）などが挙げられるがそれらに限定されない。これらの例示される糖鎖は、直鎖状であっても分枝状であっても樹状であってもよい。糖鎖が分枝状である場合、その糖鎖の形態が、二本鎖型、三本鎖型または四本鎖型であることが好ましい。
導入される糖鎖の大きさもまた、どのようなものであってもよい。好ましくは、使用される糖鎖は、少なくとも２糖の大きさであり、より好ましくは少なくとも３糖の大きさである。このような糖鎖は、直鎖であっても、分岐していてもよく、あるいは環化されていてもよい。【００７０】
好ましい実施形態において、本発明の糖鎖−ペプチド結合剤を介した糖ペプチド生産法では、糖鎖をさらに伸長する工程をさらに包含してもよい。伸長工程を有することによって、原理的には、無限に糖鎖を付加することができる。また、トランスグルタミナーゼを用いる場合に、限界となる導入される糖鎖の大きさの限度を事実上なくすことにもなる。
そのような糖鎖伸長は、β１，４−ガラクト−ス転移酵素、α１，３−ガラクト−ス転
移酵素、β１，４−ガラクト−ス転移酵素、β１，３−ガラクト−ス転移酵素、β１，６−ガラクト−ス転移酵素、α２，６−シアル酸転移酵素、α１，４−ガラクトース転移酵素、セラミドガラクトース転移酵素、α１，２−フコース転移酵素、α１，３−フコース転移酵素、α１，４−フコース転移酵素、α１，６−フコース転移酵素、α１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、α１，６−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、β１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素、β１，４−Ｎアセチルグルコサミン転移酵素、β１，２−Ｎアセチルグルコサミン転移酵素、β１，３−Ｎアセチルグルコサミン転移酵素、β１，６−Ｎアセチルグルコサミン転移酵素、α１，４−Ｎアセチルグルコサミン転移酵素、β１，４−マンノース転移酵素、α１，２−マンノース転移酵素、α１，３−マンノース転移酵素、α１，４−マンノース転移酵素、α１，６−マンノース転移酵素、α１，２−グルコース転移酵素、α１，３−グルコース転移酵素、α２，３−シアル酸転移酵素、α２，８−シアル酸転移酵素、α１，６−グルコサミン転移酵素、α１，６−キシロース転移酵素、βキシロース転移酵素（プロテオグリカンコア構造合成酵素）、β１，３−グルクロン酸転移酵素およびヒアルロン酸合成酵素からなる群より選択される酵素を利用してもよいが、それに限定されない。糖鎖伸長に使用する酵素は、それぞれの適切な条件下で用いることが好ましい。【００７１】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００７２】
次に、実施例により本発明を説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例中、以下の略号を使用する。
Ｂｏｃ：ｔ−ブトキシカルボニル
Ｍｅ：メチル
Ｅｔ：エチル
Ｐｈ：フェニル
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＧａｓｅ：トランスグルタミナーゼ
ＤＴＴ：ジチオスレイトール
Ａｃ：アセチル【００７３】
（実施例１）化合物（１）の合成
【化２０】
2005095331.tif 000021
【００７４】
Ｎ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩（１０ｇ）を約１０倍容量のメタノール（１００ｍｌ）へ溶解し、氷浴で冷却した。トリエチルアミンを１等量（１６．７ｍｌ）添加後、１．１当量の二炭酸ジ-t-ブチル（２８．７ｇ）を滴下した。約１時間攪拌した後、室温まで昇温し、さらに１時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、残渣に酢酸エチルおよび水を添加して抽出を行い、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、酢酸エチルを減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製を行い、目的物を得た（収率６３％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）, δ３．１６（ｓ，３Ｈ），  １．４９（ｓ，９Ｈ）【００７５】
（実施例２）化合物（２）の合成
【化２１】
2005095331.tif 000022
【００７６】
６−アミノ−１−ヘキサノール（１７．７ｇ）を約９倍量の４．４％水酸化ナトリウム水溶液（１６４．４ｇ）へ溶解し、さらに約６倍容量のアセトニトリル（１００ｍｌ）を加えた。氷浴で冷却後、１．２等量の二炭酸ジ−ｔ−ブチル（３９．３ｇ）を滴下した。約１時間攪拌した後、０．２等量の二炭酸ジ−ｔ−ブチル（６．６ｇ）を追加し、さらに1時間攪拌した。反応液を室温まで昇温させ、アセトニトリルを減圧留去した後に酢酸エチルを加えた。有機層を水洗、抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥した後に酢酸エチルを減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製を行って定量的に目的物を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）, δ４．５４（ｂｒ，１Ｈ），３．６３（ｂｔ，２Ｈ），  ３．１５，３．１２，３．１０，３．０７（ｄｄ，２Ｈ），  １．６７−１．２０（ｍ，１７Ｈ）【００７７】
（実施例３）化合物（３）の合成
【化２２】
2005095331.tif 000023
【００７８】
化合物（２）（１０．９ｇ）と１．２等量の四臭化炭素（１９．９ｇ）を約４０倍溶量のジクロロメタン（４００ｍｌ）に溶解した。氷浴で冷却後、１．２等量のトリフェニルホスフィン１５．７ｇを添加し、約１時間攪拌した。反応液を室温まで昇温して、さらに２時間攪拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液へ注ぎ、有機層を水洗、抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製を行って目的物を得た（収率９１％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）, δ４．５３（ｂｒ，１Ｈ），  ３．４２，３．４０，３．３７（ｔ，２Ｈ），  ３．１４，３．１２，３．１０，３．０７（ｄｄ，２Ｈ），  １．９２−１．８０（ｍ，２Ｈ），  １．６０−１．２３（ｍ，１５Ｈ）【００７９】
（実施例４）化合物（４）の合成
【化２３】
2005095331.tif 000024
【００８０】
化合物（１）（３．１ｇ）を約３２倍溶量のＤＭＦ（１００ｍｌ）に溶解し、さらに約３２倍溶量のＴＨＦ（１００ｍｌ）を添加後、約１．１等量の６０〜７２％水素化ナトリウム−油性（０．９６ｇ）を加え攪拌した。０．９５等量の化合物（３）（５．５８ｇ）を加えて５０〜６０℃に加温して１時間攪拌した。反応液を０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸へ注ぎ、さらに酢酸エチルを加えて有機層を水洗、抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥した後に溶媒を減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製を行い、目的物を得た（収率９３％）。OLE_LINK2
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）, δOLE_LINK2４．５２（ｂｒ，１Ｈ），  ３．８４，３．８２，３．７９（ｔ，２Ｈ），  ３．２０−３．００（s，ｍ，５Ｈ），  １．７２−１．２４（ｍ，２６Ｈ）【００８１】
（実施例５）化合物（５）の合成
【化２４】
2005095331.tif 000025
【００８２】
化合物（４）（１．０ｇ）を約１０倍容量の９０％トリフルオロ酢酸ジクロロメタン溶液（１０ｍｌ）へ溶解し、室温で１．５時間攪拌した。その後溶媒を減圧留去して目的物のトリフルオロ酢酸塩を得た。この溶液を水酸化ナトリウム水溶液によってｐＨ６〜８に調整して２００ｍＭ水溶液とした。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）, δ４．０３，４．０１，３．９９（ｔ，２Ｈ），２．９３−２．８５（ｓ，ｍ，５Ｈ），  １．６５−１．５０（ｍ，４Ｈ），  １．４０−１．２５（ｍ，４Ｈ）【００８３】
（実施例６）化合物（５）誘導体のペプチドへの導入
【化２５】
2005095331.tif 000026
【００８４】
１ｍＭのマストパラン及び２０ｍＭのオキシアミンリンカーを含む反応液（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ）にＴＧａｓｅ（和光純薬社製）（５．６Ｕ）を添加し、３７℃、４時間反応した。途中、ＴＧａｓｅ（５．６Ｕ）を追加した。反応液と同溶量の１０％  ＴＦＡを添加し、反応を停止した。逆相ＨＰＬＣにより精製して主生成物を単離し（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）  ＯＤＳ-３  ２０×２５０ｍｍカラム、移動層Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液に対して移動層Ｂ：０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルの１０％から４０％のグラジエント）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによって[Ｍ(ａｖｅｒａｇｅ)＋Ｈ]＋＝１７６４．３、[Ｍ(ａｖｅｒａｇｅ)＋Ｎａ]＋＝１７８６．３、[Ｍ(ａｖｅｒａｇｅ)＋Ｋ]＋＝１８０２．５のピーク(理論値[Ｍ(ａｖｅｒａｇｅ)＋Ｈ]＋＝１７６５．２、[Ｍ(ａｖｅｒａｇｅ)＋Ｎａ]＋＝１７８７．２、[Ｍ(ａｖｅｒａｇｅ)＋Ｋ]＋＝１８０３．３)を確認することによって目的物を確認した。【００８５】
（実施例７）糖の導入
【化２６】
2005095331.tif 000027
【００８６】
１ｍＭのオキシアミンリンカー付加マストパランおよび１００ｍＭのグルコースを含む反応液（５０ｍＭ  ＡｃＯＨ／Ｎａ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ４．５）を３７℃で２４時間反応させた。反応液の逆相ＨＰＬＣ（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）  ＯＤＳ-３  ４．６×２５０ｍｍカラム、移動層Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液に対するＢ：０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルの２０％から４０％のグラジエント）で分取後、OLE_LINK1ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳOLE_LINK1で[Ｍ(ａｖｅｒａｇｅ)＋Ｈ]＋＝１９２７．３のピーク(理論値[Ｍ(ａｖｅｒａｇｅ)＋Ｈ]＋＝１９２７．３)を確認することによって目的物の生成を確認した。【００８７】
実施例７と同様にＮ−アセチルグルコサミン、ラクトース、マルトースに関してもマストパランへの糖鎖導入を実施し、逆相ＨＰＬＣ（実施例７と同条件）およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによってそれぞれ[Ｍ(ａｖｅｒａｇｅ)＋Ｈ]＋＝１９６８．０（Ｎ−アセチルグルコサミン：理論値[Ｍ(ａｖｅｒａｇｅ)＋Ｈ]＋＝１９６８．４）、[Ｍ(ａｖｅｒａｇｅ)＋Ｈ]＋＝２０８８．３（ラクトース：理論値[Ｍ(ａｖｅｒａｇｅ)＋Ｈ]＋＝２０８９．５）、[Ｍ(ａｖｅｒａｇｅ)＋Ｈ]＋＝２０８９．７（マルトース：理論値[Ｍ(ａｖｅｒａｇｅ)＋Ｈ]＋＝２０８９．５）のピークを確認することによって目的物の生成を確認した。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明は、天然または非天然のタンパク質と保護されていない糖鎖を利用して、均一な組成を有する糖ペプチドを簡便に製造するために用いる糖鎖−ペプチド結合剤、および該糖鎖−ペプチド結合剤を用いて糖ペプチドを製造方法に関する。
本発明により、組成が一定している糖ペプチドを提供することが可能となるので、より高品質なバイオ医薬を提供することができる。
【国際調査報告】
2005095331.tif 000038
2005095331.tif 000039
2005095331.tif 000040
2005095331.tif 000041