(57)【要約】細胞膜に対する透過性、ヌクレアーゼ耐性および二本鎖形成能という３つの特性が優れた３’末端が修飾されたオリゴヌクレオチドであって、その製造が困難であった修飾オリゴヌクレオチドの提供を可能とする。オリゴヌクレオチドの３’末端から１番目と２番目のヌクレオシド間の、５’，３’−リン酸ジエステル結合が、式（Ｉ−１）の結合に置き換えられた修飾オリゴヌクレオチドにより、解決される。−Ｘ１−Ｃ（＝Ｙ１）−Ｚ１−      （Ｉ）前記式中、Ｘ１はＯ、ＮＨ又はＳ，Ｙ１はＯ又はＳ、Ｚ１はＯ、ＮＨ又はＳである。この修飾オリゴヌクレオチドは、式（Ｘ−１）で表される固相合成用ユニット化合物を出発原料として、固相合成により製造することができる。【化１】
2006025154.tif 000065
前記式（Ｘ−１）中、Ｒ２、Ｗ１１、Ｗ２１、Ｂ１、Ｂ２、Ａ、Ｘ２、Ｘ１、Ｙ１、Ｚ１およびＭは、明細書中に定義のとおり。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドの３’末端から１番目と２番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、下記式（Ｉ−１）で表される結合に置き換えられた修飾オリゴヌクレオチド。
−Ｘ１−Ｃ（＝Ｙ１）−Ｚ１−      （Ｉ−１）
前記式（Ｉ−１）中、Ｘ１はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ１はＯまたはＳ、Ｚ１はＯ、ＮＨまたはＳである。
【請求項２】
前記式（Ｉ−１）で表される結合が、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−Ｏ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−Ｓ−および−Ｓ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−からなる群から選択される請求項１に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記式（Ｉ−１）で表される結合が、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−および−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−からなる群から選択される請求項２に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
下記（ｉ）および（ｉｉ）の少なくとも一方を満たす請求項１に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
（ｉ）前記オリゴヌクレオチドの３’末端から２番目と３番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、下記式（Ｉ−２）で表される結合に置き換えられている。
−Ｘ２−Ｃ（＝Ｙ２）−Ｚ２−      （Ｉ−２）
前記式（Ｉ−２）中、Ｘ２はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ２はＯまたはＳ、Ｚ２はＯ、ＮＨまたはＳである。
（ｉｉ）前記オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目と４番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、下記式（Ｉ−３）で表される結合に置き換えられている。
−Ｘ３−Ｃ（＝Ｙ３）−Ｚ３−      （Ｉ−３）
前記式（Ｉ−３）中、Ｘ３はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ３はＯまたはＳ、Ｚ３はＯ、ＮＨまたはＳである。
【請求項５】
前記式（Ｉ−２）で表される結合および前記式（Ｉ−３）で表される結合が、互いに独立して、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−Ｏ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−Ｓ−および−Ｓ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−からなる群から選択される請求項４に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、二本鎖オリゴヌクレオチドである請求項１に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも一方の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端から１番目と２番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、前記式（Ｉ−１）で表される結合に置き換えられている請求項６に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を引き起こすオリゴヌクレオチドであり、前記修飾オリゴヌクレオチドが、エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡの一部と同じ塩基配列を有する請求項６に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）であり、
前記ｍＲＮＡの一部が、
スタートコドンから７５塩基以上上流の、最初のＡＡ配列に続く１９塩基配列であって、
前記ｍＲＮＡの一部が、前記ｍＲＮＡに対して特異的であり、
前記修飾オリゴヌクレオチドが、前記１９塩基配列のセンス鎖とアンチセンス鎖との組み合わせである請求項８に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記センス鎖およびアンチセンス鎖の少なくとも一方が、その３’末端にさらに２つのチミジンを含むヌクレオチドを有する請求項９に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、一本鎖オリゴヌクレオチドである請求項１に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡであり、前記修飾オリゴヌクレオチドが、エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的な配列を有する請求項１１に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドが、ヌクレアーゼ耐性である請求項１に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
オリゴヌクレオチドを含む遺伝子発現抑制剤であって、前記オリゴヌクレオチドが、請求項１に記載の修飾オリゴヌクレオチドである遺伝子発現抑制剤。
【請求項１５】
遺伝子発現に伴う疾患を治療するための医薬組成物であって、
前記医薬組成物が、請求項１４に記載の遺伝子発現抑制剤を含む医薬組成物。
【請求項１６】
さらに細胞導入用賦形剤を含む請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記細胞導入用賦形剤が、トランスフェクション試薬である請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
ＲＮＡｉキットであって、前記キットが、請求項８に記載の修飾オリゴヌクレオチドを含むキット。
【請求項１９】
ＲＮＡｉ研究用試薬であって、前記試薬が、請求項８に記載の修飾オリゴヌクレオチドを含む試薬。
【請求項２０】
オリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を抑制する方法であって、前記オリゴヌクレオチドが、請求項１に記載の修飾オリゴヌクレオチドである方法。
【請求項２１】
オリゴヌクレオチドを用いてＲＮＡｉを引き起こす方法であって、前記オリゴヌクレオチドが、請求項８に記載の修飾オリゴヌクレオチドである方法。
【請求項２２】
下記式（Ｘ−１）で表される固相合成用ユニット化合物を出発原料として、請求項１に記載の修飾オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、
式（Ｘ−１）で表される固相合成用ユニット化合物のＲ２を除去し、
式（Ｘ−１）で表される固相合成用ユニット化合物の５’末端にヌクレオチドを伸長させ、その後、固相担体から切り出して前記修飾オリゴヌクレオチドを得る製造方法。
【化１】
2006025154.tif 000030
前記式（Ｘ−１）中、Ｒ２は、保護基であり、
Ｂ１およびＢ２は、互いに独立して、以下の式で示す基およびその官能基が保護基で保護された基から選択される基であり、
【化２】
2006025154.tif 000031
Ａは、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１およびＲ２１は、互いに独立して、保護基であり、
Ｘ１およびＸ２は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｙ１は、ＯまたはＳであり、
Ｚ１は、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｍは、固相担体である。
【請求項２３】
下記式（ＸＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物を出発原料として、（ｉ）を満たす請求項４に記載の修飾オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、
式（ＸＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物のＲ３を除去し、
式（ＸＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物の５’末端にヌクレオチドを伸長させ、その後、固相担体から切り出して前記修飾オリゴヌクレオチドを得る製造方法。
【化３】
2006025154.tif 000032
前記式中、Ｒ３は、保護基であり、
Ｂ１、Ｂ２およびＢ３は、互いに独立して、以下の式で示す基およびその官能基が保護基で保護された基から選択される基であり、
【化４】
2006025154.tif 000033
Ａは、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
Ｗ３１は、Ｈまたは式ＯＲ３１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１、Ｒ２１およびＲ３１は、互いに独立して、保護基であり、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｙ１およびＹ２は、互いに独立して、ＯまたはＳであり、
Ｚ１およびＺ２は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｍは、固相担体である。
【請求項２４】
下記式（ＸＩＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物を出発原料として、（ｉｉ）を満たす請求項４に記載の修飾オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、
式（ＸＩＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物のＲ４を除去し、
式（ＸＩＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物の５’末端にヌクレオチドを伸長させ、その後、固相担体から切り出して前記修飾オリゴヌクレオチドを得る製造方法。
【化５】
2006025154.tif 000034
前記式中、Ｒ４およびＲは、互いに独立して、保護基であり、
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４は、互いに独立して、以下の式で示す基およびその官能基が保護基で保護された基から選択される基であり、
【化６】
2006025154.tif 000035
Ａは、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
Ｗ３１は、Ｈまたは式ＯＲ３１で表される基であり、
Ｗ４１は、Ｈまたは式ＯＲ４１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１、Ｒ２１、Ｒ３１およびＲ４１は、互いに独立して、保護基であり、
Ｘ１、Ｘ３およびＸ４は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｙ１およびＹ３は、互いに独立して、ＯまたはＳであり、
Ｚ１およびＺ３は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｍは、固相担体である。
【請求項２５】
下記式（ＸＩＩＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物を出発原料として、（ｉ）および（ｉｉ）の両方を満たす請求項４に記載の修飾オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、
式（ＸＩＩＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物のＲ４を除去し、
式（ＸＩＩＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物の５’末端にヌクレオチドを伸長させ、その後、固相担体から切り出して前記修飾オリゴヌクレオチドを得る製造方法。
【化７】
2006025154.tif 000036
前記式中、Ｒ４は、保護基であり、
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４は、互いに独立して、以下の式で示す基およびその官能基が保護基で保護された基から選択される基であり、
【化８】
2006025154.tif 000037
Ａは、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
Ｗ３１は、Ｈまたは式ＯＲ３１で表される基であり、
Ｗ４１は、Ｈまたは式ＯＲ４１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１、Ｒ２１、Ｒ３１およびＲ４１は、互いに独立して、保護基であり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｙ１、Ｙ２およびＹ３は、互いに独立して、ＯまたはＳであり、
Ｚ１、Ｚ２およびＺ３は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｍは、固相担体である。
【請求項２６】
請求項１に記載の修飾オリゴヌクレオチド製造のための、下記式（Ｘ−１）で表される固相合成用ユニット化合物。
【化９】
2006025154.tif 000038
前記式（Ｘ−１）中、Ｒ２は、保護基であり、
Ｂ１およびＢ２は、互いに独立して、以下の式で示す基およびその官能基が保護基で保護された基から選択される基であり、
【化１０】
2006025154.tif 000039
Ａは、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１およびＲ２１は、互いに独立して、保護基であり、
Ｘ１およびＸ２は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｙ１は、ＯまたはＳであり、
Ｚ１は、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｍは、固相担体である。
【請求項２７】
請求項２６に記載の式（Ｘ−１）で表される固相合成用ユニット化合物の製造方法であって、
下記式（ＩＶ−１）で表されるヌクレオシド誘導体と、下記式（ＩＩＩ）で表されるヌクレオシド誘導体とを、下記式（Ｖ−１）で表されるジイミダゾール誘導体と縮合させ、下記式（ＶＩ）で表される二量体（ＶＩ）を得、
【化１１】
2006025154.tif 000040
前記式（ＶＩ）で表される二量体と下記式（ＶＩＩ）で表される無水物とを縮合させ、下記式（ＶＩＩＩ）で表される二量体を得、
【化１２】
2006025154.tif 000041
前記式（ＶＩＩＩ）で表される二量体と下記式（ＩＸ）で表されるアミノ基を有する固相担体とを縮合させ、式（Ｘ−１）で表される固相合成用ユニット化合物を得る製造方法。
【化１３】
2006025154.tif 000042
前記式中、
Ｒ２は、保護基であり、
Ｂ１およびＢ２は、互いに独立して、以下の式で示す基およびその官能基が保護基で保護された基から選択される基であり、
【化１４】
2006025154.tif 000043
Ａは、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１およびＲ２１は、互いに独立して、保護基であり、
Ｘ１およびＸ２は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｙ１は、ＯまたはＳであり、
Ｚ１は、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｍは、固相担体である。
【請求項２８】
請求項４に記載の修飾オリゴヌクレオチド製造のための、下記式（ＸＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物。
【化１５】
2006025154.tif 000044
前記式中、Ｒ３は、保護基であり、
Ｂ１、Ｂ２およびＢ３は、互いに独立して、以下の式で示す基およびその官能基が保護基で保護された基から選択される基であり、
【化１６】
2006025154.tif 000045
Ａは、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
Ｗ３１は、Ｈまたは式ＯＲ３１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１、Ｒ２１およびＲ３１は、互いに独立して、保護基であり、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｙ１およびＹ２は、互いに独立して、ＯまたはＳであり、
Ｚ１およびＺ２は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｍは、固相担体である。
【請求項２９】
請求項２８に記載の前記式（ＸＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物の製造方法であって、
前記式（ＶＩ）で表される二量体のＲ２をＨに置き換え、式（ＶＩ−１）で表される二量体を得、
【化１７】
2006025154.tif 000046
前記式（ＶＩ−１）で表される二量体と、下記式（ＩＶ−２）で表されるヌクレオシド誘導体とを、下記式（Ｖ−２）で表されるジイミダゾール誘導体と縮合させ、式（ＸＩＶ−１）で表される三量体を得、
【化１８】
2006025154.tif 000047
前記式（ＸＩＶ−１）で表される三量体と、下式（ＶＩＩ）で表される無水物とを縮合させ、下記式（ＸＶ−１）で表される三量体を得、
【化１９】
2006025154.tif 000048
前記式（ＸＶ−１）で表される三量体と下記式（ＩＸ）で表されるアミノ基を有する固相担体とを縮合させ、式（ＸＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物を得る製造方法。
【化２０】
2006025154.tif 000049
前記式中、Ｒ２およびＲ３は、互いに独立して、保護基であり、
Ｂ１、Ｂ２およびＢ３は、互いに独立して、以下の式で示す基およびその官能基が保護基で保護された基から選択される基であり、
【化２１】
2006025154.tif 000050
Ａは、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
Ｗ３１は、Ｈまたは式ＯＲ３１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１、Ｒ２１およびＲ３１は、互いに独立して、保護基であり、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｙ１およびＹ２は、互いに独立して、ＯまたはＳであり、
Ｚ１およびＺ２は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｍは、固相担体である。
【請求項３０】
請求項４に記載の修飾オリゴヌクレオチド製造のための、下記式（ＸＩＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物。
【化２２】
2006025154.tif 000051
前記式中、Ｒ４およびＲは、保護基であり、
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４は、互いに独立して、以下の式で示す基およびその官能基が保護基で保護された基から選択される基であり、
【化２３】
2006025154.tif 000052
Ａは、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
Ｗ３１は、Ｈまたは式ＯＲ３１で表される基であり、
Ｗ４１は、Ｈまたは式ＯＲ４１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１、Ｒ２１、Ｒ３１およびＲ４１は、互いに独立して、保護基であり、
Ｘ１、Ｘ３およびＸ４は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｙ１およびＹ３は、互いに独立して、ＯまたはＳであり、
Ｚ１およびＺ３は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｍは、固相担体である。
【請求項３１】
請求項３０に記載の式（ＸＩＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物の製造方法であって、
下記式（ＶＩ−２）で表される二量体のＲ２をＨに置き換え、下記式（ＶＩ−３）で表される二量体を得、
【化２４】
2006025154.tif 000053
前記式（ＶＩ−３）で表される２量体と、下記式（ＩＶ−３）で表されるヌクレオシド誘導体とを、リン酸結合試薬と縮合させ、下記式（ＸＩＶ−２）で表される三量体を得、
【化２５】
2006025154.tif 000054
前記式（ＸＩＶ−２）で表される三量体と、下記式（ＶＩＩ）で表される無水物とを縮合させ、下記式（ＸＶ−２）で表される三量体を得、
【化２６】
2006025154.tif 000055
前記式（ＸＶ−２）で表される三量体と下記式（ＩＸ）で表されるアミノ基を有する固相担体とを縮合させ、下記式（ＸＩＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物を得る製造方法。
【化２７】
2006025154.tif 000056
前記式中、Ｒ２、Ｒ３およびＲは、互いに独立して、保護基であり、
Ｂ１、Ｂ２およびＢ３は、互いに独立して、以下の式で示す基およびその官能基が保護基で保護された基から選択される基であり、
【化２８】
2006025154.tif 000057
Ａは、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
Ｗ３１は、Ｈまたは式ＯＲ３１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１、Ｒ２１およびＲ３１は、互いに独立して、保護基であり、
Ｘ１およびＸ３は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｙ１は、互いに独立して、ＯまたはＳであり、
Ｚ１は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｍは、固相担体である。
【請求項３２】
請求項４に記載の修飾オリゴヌクレオチド製造のための、下記式（ＸＩＩＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物。
【化２９】
2006025154.tif 000058
前記式中、Ｒ４は、保護基であり、
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４は、互いに独立して、以下の式で示す基およびその官能基が保護基で保護された基から選択される基であり、
【化３０】
2006025154.tif 000059
Ａは、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
Ｗ３１は、Ｈまたは式ＯＲ３１で表される基であり、
Ｗ４１は、Ｈまたは式ＯＲ４１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１、Ｒ２１、Ｒ３１およびＲ４１は、互いに独立して、保護基であり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｙ１、Ｙ２およびＹ３は、互いに独立して、ＯまたはＳであり、
Ｚ１、Ｚ２およびＺ３は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｍは、固相担体である。
【請求項３３】
請求項３２に記載の式（ＸＩＩＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物の製造方法であって、
下記式（ＸＩＶ−１）で表される三量体のＲ３をＨに置き換え、式（ＸＩＶ−３）で表される三量体を得、
【化３１】
2006025154.tif 000060
前記式（ＸＩＶ−３）で表される三量体と、下記式（ＩＶ−４）で表されるヌクレオシド誘導体とを、下記式（Ｖ−３）で表されるジイミダゾール誘導体と縮合させ、下記式（ＸＶＩ−１）で表される四量体を得、
【化３２】
2006025154.tif 000061
前記式（ＸＶＩ−１）で表される四量体と、下記式（ＶＩＩ）で表される無水物とを縮合させ、下記式（ＸＶＩＩ−１）で表される四量体を得、
【化３３】
2006025154.tif 000062
前記式（ＸＶＩＩ−１）で表される四量体と、下記式（ＩＸ）で表されるアミノ基を有する固相担体とを縮合させ、式（ＸＩＩＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物を得る製造方法。
【化３４】
2006025154.tif 000063
前記式において、
Ｒ３およびＲ４は、保護基であり、
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４は、互いに独立して、以下の式で示す基およびその官能基が保護基で保護された基から選択される基であり、
【化３５】
2006025154.tif 000064
Ａは、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
Ｗ３１は、Ｈまたは式ＯＲ３１で表される基であり、
Ｗ４１は、Ｈまたは式ＯＲ４１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１、Ｒ２１、Ｒ３１およびＲ４１は、互いに独立して、保護基であり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｙ１、Ｙ２およびＹ３は、互いに独立して、ＯまたはＳであり、
Ｚ１、Ｚ２およびＺ３は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｍは、固相担体である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、修飾オリゴヌクレオチドに関するものである。
【背景技術】
【０００２】  近年、遺伝情報そのものを治療の対象としてとらえるという方法論が普及しつつある。この方法論の一つに、オリゴヌクレオチドを用いたアンチセンス法がある。アンチセンス法とは、化学合成したオリゴヌクレオチド（例えば、１５〜２０の塩基対から成る一本鎖ＤＮＡ）を細胞に加え、標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）とＤＮＡ等／ｍＲＮＡ二本鎖核酸を形成させることにより、標的遺伝子の発現を塩基配列特異的に抑制し、ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳過程を阻害する方法である。アンチセンス法では、病因となるウイルスまたは遺伝子の塩基配列が既知の場合、アンチセンス分子を理論的に設計し、それを合成するのが可能であることから、これまで治癒が困難と考えられてきた様々なウイルスを原因とする疾患および遺伝子疾患に対する有効な治療方法の一つとして期待されている。【０００３】  また、ごく最近、オリゴヌクレオチドを用いた遺伝子発現抑制法として、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｆｅｒｅｎｃｅ、ＲＮＡ干渉）を利用した方法に、注目が集まっている。このＲＮＡｉとは、二本鎖ＲＮＡを細胞に導入することにより、同じ塩基配列を有する細胞の染色体由来のＲＮＡが分解され、切断される現象を指す。このＲＮＡｉの機構は、現在のところ、次のように考えられている。先ず、長鎖二本鎖ＲＮＡが、酵素（Ｄｉｃｅｒと呼ばれる）により３’−ＵＵ型のダングリングエンド構造を持つ２１塩基程度の長さの二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）と呼ばれる）に加水分解される。そのｓｉＲＮＡが、標的ｍＲＮＡとＲＮＡ／ｍＲＮＡ二本鎖核酸を形成し、この二本鎖核酸を認識する細胞内タンパク質（ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）と呼ばれる）と、この二本鎖核酸とが結合し、この結合体により、標的ｍＲＮＡが切断されるというものである。このＲＮＡｉを利用する方法によると、多くの場合、アンチセンス法と比較して１／１００程度の濃度のＲＮＡを用いて同等の効果が得られている。従って、ＲＮＡｉを利用する方法も、これまで治癒が困難と考えられてきた様々なウイルスを原因とする疾患および遺伝子疾患に対する有効な治療方法の一つとして期待が高まっている。【０００４】  アンチセンス法、ＲＮＡｉを利用する方法等、オリゴヌクレオチドを用いる方法では、細胞内にそのオリゴヌクレオチドを導入させる必要がある。また、一旦細胞内に導入されたオリゴヌクレオチドを、安定に存在させる必要もあるが、細胞内外には核酸加水分解酵素（ヌクレアーゼ）が存在し、導入されたオリゴヌクレオチド、特に天然型のオリゴヌクレオチドは容易に分解されてしまうという問題があった。【０００５】  細胞膜に対する透過性向上と、ヌクレアーゼ耐性の向上を目的として、種々の修飾オリゴヌクレオチドが開発されてきた。例えば、チミジン−チミジンのダイマー間の５’，３’−リン酸ジエステル結合を、カルバメート結合に置き換えた修飾ＴＴダイマーを導入した、ＤＮＡオリゴヌクレオチドが知られている（例えば、非特許文献１参照）。このような修飾ＴＴダイマーを含むＤＮＡオリゴヌクレオチドは、わずかにヌクレアーゼ耐性が向上していることが確認されている。しかし、この修飾ＴＴダイマーは、その製造方法の性質上、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端以外の部位に導入することは可能であるが、３’末端部位に導入することは実現されていなかった。【０００６】  また、ヌクレアーゼは、オリゴヌクレオチドをその３’末端から分解していくことが知られている。例えば、前記のような修飾ＴＴダイマーを含むＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端から修飾ＴＴダイマーまでの間は、ヌクレアーゼにより通常分解されていると考えられる。すなわち、若干のヌクレアーゼ耐性を示すものの、前記修飾ＴＴダイマーを含むＤＮＡオリゴヌクレオチドの塩基配列は部分的に分解されており、その配列が保存されているわけではなく、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの作用が低下する恐れがあった。前記のようなヌクレアーゼの反応特性を考えると、オリゴヌクレオチドの３’末端から１番目と２番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合を修飾すれば、ヌクレアーゼ対し耐性を示す修飾オリゴヌクレオチドが期待できる。しかし、固相合成技術を利用したオリゴヌクレオチド合成においては、その部位の修飾は困難であり、そのような修飾オリゴヌクレオチドは実現されていなかった。【０００７】  さらに、アンチセンス法、ＲＮＡｉを利用する方法等、オリゴヌクレオチドを用いる方法では、そのオリゴヌクレオチドに天然のオリゴヌクレオチドとの二本鎖形成能力および、その形成した二本鎖の安定性が要求されるが、化学構造が修飾された非天然型オリゴヌクレオチドには、通常、その二本鎖形成能力は低下するという問題があった。
【非特許文献１】Ａｄｒｉａｎ  Ｗａｌｄｎｅｒ，Ａｌａｉｎ  Ｄｅ  Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ  ａｎｄ  Ｊａｃｑｕｅｓ  Ｌｅｂｒｅｔｏｎ，「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｄｉｍｅｒｓ  ｗｉｔｈ  Ｃａｒｂａｍａｔｅ  Ｍｏｉｅｔｉｅｓ  ａｓ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ  ｌｉｎｋａｇｅ」，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９４年，第４巻，ｐ．４０５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】  そこで、本発明は、細胞膜に対する透過性、ヌクレアーゼ耐性および二本鎖形成能という３つの特性が優れた３’末端が修飾されたオリゴヌクレオチドの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】  本発明は、オリゴヌクレオチドの３’末端から１番目と２番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、下記式（Ｉ−１）で表される結合に置き換えられた修飾オリゴヌクレオチドである。
−Ｘ１−Ｃ（＝Ｙ１）−Ｚ１−      （Ｉ−１）
前記式（Ｉ−１）中、Ｘ１はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ１はＯまたはＳ、Ｚ１はＯ、ＮＨまたはＳである。
【発明の効果】
【００１０】  本発明は、従来製造が困難であった、３’末端から１番目と２番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が修飾されたオリゴヌクレオチドの製造に成功したことに基づき、完成したものである。本発明では、その修飾として、前記式（Ｉ−１）で示す結合での置き換えを選択し、その修飾オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性向上、細胞膜に対する透過性向上および二本鎖形成能の向上を実現した。さらに、本発明の修飾オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性向上は、３’末端が修飾されたことから予想されるものをはるかに超える、優れたものである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの例を示す図である。
【図２】図２は、修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの例および非修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの一例のＲＮａｓｅＬ発現濃度を示すグラフである。
【図３】図３は、修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの例および非修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの一例のＲＮａｓｅＬ発現濃度を示すグラフである。
【図４】図４は、修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの一例および非修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの一例の細胞膜透過性を示す図である。
【図５】図５は、修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの一例および非修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの一例の細胞内ＲＮａｓｅＬ発現濃度を示す図である。
【図６】図６は、修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの一例および非修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの一例のエキソヌクレアーゼ耐性を示すグラフである。
【図７】図７は、修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの例を示す図である。
【図８】図８は、修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの一例のエンドヌクレアーゼ耐性を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】  本発明において、「オリゴヌクレオチド」は、例えばヌクレオシドサブユニットのポリマーをいい、そのサブユニット数は特に限定されないが、例えば、４から１００個である。中でも、本発明の修飾オリゴヌクレオチドがＤＮＡである場合には、それらのサブユニット数は、４〜１００個が好ましく、４〜３０個がより好ましく、ＲＮＡである場合には、４〜５０個が好ましく、４〜３０個がより好ましい。なお、本発明における「オリゴヌクレオチド」は、３’末端から１番目と２番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が修飾されていること以外は、特に限定されない。例えば、オリゴヌクレオチドのサブユニットであるヌクレオシドについては、糖部（例えば、２’置換体）および塩基は、当業者に公知な修飾体であってもよい。【００１３】  本発明の修飾オリゴヌクレオチド中の式（Ｉ−１）で表される結合−Ｘ１−Ｃ（＝Ｙ１）−Ｚ１−は、便宜的に、ヌクレオシドの糖部分の５’位炭素原子に結合する結合手を左に、３’位炭素原子に結合する結合手を右に記載する。例えば、修飾オリゴヌクレオチドの３’末端がＴＴで、そのＴＴ間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が式（Ｉ−１）で表される結合に置き換えられている場合、以下のように表される。【００１４】
【化３６】
2006025154.tif 000002
【００１５】  前記式中、Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１およびＲ２１は、互いに独立して、保護基である。【００１６】  前記式（Ｉ−１）で表される結合は、例えば、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−Ｏ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−等が挙げられる。その中でも、前記式（Ｉ−１）で表される結合は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−が好ましい。【００１７】  本発明の修飾オリゴヌクレオチド中、下記（ｉ）および（ｉｉ）の少なくとも一方を満たすのが好ましい。なお、下記式（Ｉ−２）および下記式（Ｉ−３）で表される結合についても、同様に、便宜的に、ヌクレオシドの糖部分の５’位炭素原子に結合する結合手を左に、３’位炭素原子に結合する結合手を右に記載する。
（ｉ）前記オリゴヌクレオチドの３’末端から２番目と３番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、下記式（Ｉ−２）で表される結合に置き換えられている。
−Ｘ２−Ｃ（＝Ｙ２）−Ｚ２−      （Ｉ−２）
前記式（Ｉ−２）中、Ｘ２はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ２はＯまたはＳ、Ｚ２はＯ、ＮＨまたはＳである。
（ｉｉ）前記オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目と４番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、下記式（Ｉ−３）で表される結合に置き換えられている。
−Ｘ３−Ｃ（＝Ｙ３）−Ｚ３−      （Ｉ−３）
前記式（Ｉ−３）中、Ｘ３はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ３はＯまたはＳ、Ｚ３はＯ、ＮＨまたはＳである。【００１８】  前記式（Ｉ−２）で表される結合および前記式（Ｉ−３）で表される結合は、互いに独立して、例えば、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−Ｏ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−等から選択されるのが好ましい。中でも、前記式（Ｉ−２）で表される結合は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−がより好ましい。また、中でも、前記式（Ｉ−３）で表される結合は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−がより好ましい。【００１９】  前記（ｉ）を満たす場合、式（Ｉ−１）で表される結合と式（Ｉ−２）で表される結合の組み合わせは、特に限定されないが、例えば、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−と−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−と−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−と−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−等である。式（Ｉ−１）で表される結合と式（Ｉ−２）で表される結合とは、同一であっても、異なっていてもよい。また、前記（ｉ）を満たす場合、式（Ｉ−１）で表される結合と式（Ｉ−３）で表される結合の組み合わせは、特に限定されないが、例えば、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−と−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−と−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−と−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−等である。式（Ｉ−１）で表される結合と式（Ｉ−３）で表される結合とは、同一であっても、異なっていてもよい。さらに、前記（ｉ）と（ｉｉ）の両方を満たす場合、式（Ｉ−１）で表される結合と式（Ｉ−２）で表される結合と式（Ｉ−３）で表される結合の組み合わせは、特に限定されないが、例えば、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−と−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−と−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−と−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−と−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−等である。式（Ｉ−１）で表される結合と式（Ｉ−２）で表される結合と式（Ｉ−３）で表される結合は、同一であっても、異なっていてもよい。【００２０】  本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド等であってもよい。本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、二本鎖形成能に優れるので、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ等として用いるのに好ましい。修飾オリゴヌクレオチドが、二本鎖である場合、前記二本鎖オリゴヌクレオチドの一方または両方の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端から１番目と２番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、前記式（Ｉ−１）で表される結合に置き換えられているのが好ましい。前記二本鎖オリゴヌクレオチドの両方の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端から１番目と２番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、前記式（Ｉ−１）で表される結合に置き換えられている場合、双方の式（Ｉ−１）で表される結合は、同一であっても、相違してもよい。【００２１】  前記修飾オリゴヌクレオチドが二本鎖である場合、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を引き起こすオリゴヌクレオチドであり、前記修飾オリゴヌクレオチドが、エンドヌクレアーゼ等をコードするｍＲＮＡの一部と同じ塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドが好ましい。このような修飾オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ研究等に有用だからである。前記エンドヌクレアーゼとしては、例えば、ＲＮａｓｅＬ等が挙げられる。【００２２】  前記修飾オリゴヌクレオチドが二本鎖である場合、前記修飾オリゴヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）であり、前記ｍＲＮＡの一部が、スタートコドンから７５塩基以上上流の、最初のＡＡ配列に続く１９塩基配列であって、前記ｍＲＮＡの一部が、前記ｍＲＮＡに対して特異的であり、前記修飾オリゴヌクレオチドが、前記１９塩基配列のセンス鎖とアンチセンス鎖との組み合わせであるのが好ましい。このようなセンス鎖は、例えば、以下のようにして得ることができる。まず、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、ＥＭＢＬ−ＥＢＩ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）等の公知遺伝子データベースを用いて、例えばエキソヌクレアーゼのｍＲＮＡ配列を取得する。その遺伝子配列中、スタートコドンから７５塩基以上下流の、最初のＡＡ配列を見つける。そのＡＡ配列に続く１９塩基配列、合計２１塩基配列が、再度、公知の遺伝子データベースを用いて、目的とする遺伝子に対して特異的であることを確認する。なお、この１９塩基配列は、ＧＣ含有量が５０％前後であることも確認する。この２つを確認して、得られた１９塩基配列が、前記のようなセンス鎖である。【００２３】  前述のように修飾オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡである場合、前記センス鎖およびアンチセンス鎖の一方またはその両方は、その３’末端にさらに２つのチミジンを含むヌクレオチドを有するのが好ましい。３’末端にこのような配列を有すると、ＲＮＡｉが引き起こされやすくなるからである。また、この修飾オリゴヌクレオチドは、３’末端から１番目と２番目のヌクレオシドである、チミジン−チミジン配列が、前記式（Ｉ−１）で表される結合に置き換えられているので、二本鎖形成能に優れ、ｓｉＲＮＡ機能発揮の点から好ましい。【００２４】  また、前記修飾オリゴヌクレオチドが一本鎖である場合、前記修飾オリゴヌクレオチドは、アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡであり、前記修飾オリゴヌクレオチドが、エンドヌクレアーゼ等をコードするｍＲＮＡの一部または全部と相補的な配列を有するのが好ましい。修飾オリゴヌクレオチドが、このようなｍＲＮＡと二本鎖を形成し、エンドヌクレアーゼ等の発現を抑制可能だからである。【００２５】  本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性であるのが好ましい。本発明の修飾オリゴヌクレオチドが、細胞内に取り込まれた際、ヌクレアーゼで分解されるのを防ぐことができ、��の結果、修飾オリゴヌクレオチドの細胞内での活性を、持続させることが可能だからである。【００２６】  本発明の遺伝子発現抑制剤は、本発明の修飾オリゴヌクレオチドを含む。このような遺伝子発現抑制剤は、修飾オリゴヌクレオチドが、例えば、標的遺伝子のｍＲＮＡを切断したり、標的遺伝子のｍＲＮＡと二本鎖を形成等して、その結果、遺伝子発現を抑制することができる。【００２７】  本発明の医薬組成物は、遺伝子発現に伴う疾患を治療するためであり、前記遺伝子発現抑制剤を含むものである。遺伝子発現に伴う疾患、例えば、あるタンパク質が発現されることにより疾患が引き起こされる場合、この医薬組成物により、その遺伝子発現を抑制し、その遺伝子発現に伴う疾患を治療するのに用いることが可能である。【００２８】  このような医薬組成物は、さらに細胞導入用賦形剤を含むのが好ましい。遺伝子発現に伴う疾患を治療する際、細胞内への導入を容易にすることが可能になるからである。前記細胞導入用賦形剤としては、例えば、トランスフェクション試薬等が挙げられる。前記トランスフェクション試薬とは、例えば、ＤＮＡ分子（前記医薬組成物）を、リン脂質を用いて構成された人工脂質小胞（リポソーム）で包み込み、この人工脂質小胞を細胞懸濁液に加え、細胞表面に付着させ、細胞膜と融合させて、人工脂質小胞中のＤＮＡ分子を細胞内に取り込ませるリポフェクション方法において、用いられる、人工脂質小胞を形成する試薬である。前記トランスフェクション試薬としては、例えば、リポフェクタミン（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製）、リポフェクタミン２０００（インビトロジェン社製）、オリゴフェクタミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎ（インビトロジェン社製））、トランスメッセンジャー（ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（キーゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社製））、ｓｉＲＮＡトランスフェクション・キット・ジェットＳＩ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社製）、ジーンスライサーｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬（ジーン・セラピー・システムズ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）社製）等が、挙げられる。【００２９】  前述のように細胞導入用賦形剤を含むことによる他、本発明の医薬組成物は、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法等を用いて、細胞内に導入することもできる。前記エレクトロポレーション法は、例えば、細胞に電気パルスをかけてその細胞壁に穴をあけ、その穴から本発明の医薬組成物を細胞内へ導入する方法である。前記パーティクルガン法は、金微粒子にＤＮＡ分子（前記医薬組成物）などの分子を付着させ、パーティクルガン（粒子銃）を用いて、圧縮ヘリウムガスを利用し、銃弾を撃ち込むように金微粒子を細胞膜に透過させて、ＤＮＡ分子（前記医薬組成物）を細胞内に導入する方法である。【００３０】  本発明のＲＮＡｉキットは、ｓｉＲＮＡである修飾オリゴヌクレオチドを含む。このようなキットは、他に、ウエルと修飾オリゴヌクレオチド等とが固定されたプレート、ファイバー、バイオチップ等の固定化担体等が挙げられる。このようなキットには、前記修飾オリゴヌクレオチド等のほかに、例えば、薬物、反応して発色する発色試薬、検出を容易にする検出試薬等を含んでもよい。【００３１】  本発明のＲＮＡｉ研究用試薬は、ｓｉＲＮＡである修飾オリゴヌクレオチドを含む。ＲＮＡｉ研究の際、３０ｂｐ以上のｄｓＲＮＡを細胞へ導入すると、細胞固有の防御反応が活性化され、ｍＲＮＡをランダムに分解する反応が生じたりして、細胞内でＲＮＡｉが生じているかどうかが、判断できない場合がある。このｍＲＮＡのランダム分解は、以下のメカニズムで生じると考えられている。まず、ｄｓＲＮＡにより２−５オリゴアデニル酸合成酵素（２−５ＡＳ）が活性化され、それにより生じた２−５Ａが、ＲＮＡａｓｅＬを活性化する。そのＲＮＡａｓｅＬが、ｍＲＮＡをランダムに分解するというものである。ｓｉＲＮＡである修飾オリゴヌクレオチドは、このＲＮＡａｓｅＬの発現を抑制可能であるので、ｍＲＮＡのランダム分解を抑制でき、その結果、例えばＲＮＡｉが細胞内で生じているか否かが判断しやすくなる。【００３２】  本発明の遺伝子発現抑制方法は、修飾オリゴヌクレオチドを用いて、遺伝子の発現を抑制する方法である。この方法では、修飾オリゴヌクレオチドが、例えば、標的遺伝子のｍＲＮＡを切断したり、標的遺伝子のｍＲＮＡと二本鎖を形成等して、その結果、遺伝子発現を抑制することができる。【００３３】  本発明のＲＮＡｉを引き起こす方法は、ｓｉＲＮＡである修飾オリゴヌクレオチドを用いて、ＲＮＡｉを引き起こす方法である。この方法では、修飾オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡであるので、ＲＮＡｉを引き起こすことができる。【００３４】  次に、本発明の修飾オリゴヌクレオチドを製造するための製造方法について、例を挙げて説明する。このような製造方法により、従来製造することができなかった本発明の修飾オリゴヌクレオチドの製造が可能になった。【００３５】  まず、オリゴヌクレオチドの３’末端から１番目と２番目のヌクレオシド間の３’，５’−リン酸ジエステル結合が、下記式（Ｉ−１）（下記式中、Ｘ１はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ１はＯまたはＳ、Ｚ１はＯ、ＮＨまたはＳ）で表される結合に置き換えられた修飾オリゴヌクレオチドの製造例を説明する。【００３６】  −Ｘ１−Ｃ（＝Ｙ１）−Ｚ１−      （Ｉ−１）
例えば、下記式（Ｘ−１）で表される固相合成用ユニット化合物を出発原料とし、式（Ｘ−１）で表される固相合成用ユニット化合物のＲ２を除去し、次いで、式（Ｘ−１）で表される固相合成用ユニット化合物の５’末端にヌクレオチドを伸長させ、その後、固相担体から切り出して前記修飾オリゴヌクレオチドを得ることができる。【００３７】
【化３７】
2006025154.tif 000003
【００３８】  前記式（Ｘ−１）中、Ｒ２は、保護基であり、
Ｂ１およびＢ２は、互いに独立して、以下の式で示す基およびその官能基が保護基で保護された基から選択される基であり、【００３９】
【化３８】
2006025154.tif 000004
【００４０】Ａは、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１およびＲ２１は、互いに独立して、保護基であり、
Ｘ１およびＸ２は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｙ１は、ＯまたはＳであり、
Ｚ１は、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｍは、固相担体である。【００４１】  また、オリゴヌクレオチドの３’末端から１番目と２番目のヌクレオシド間の３’，５’−リン酸ジエステル結合が、前記式（Ｉ−１）（前記式中、Ｘ１はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ１はＯまたはＳ、Ｚ１はＯ、ＮＨまたはＳ）で、かつ、オリゴヌクレオチドの３’末端から２番目と３番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、下記式（Ｉ−２）（下記式中、Ｘ２はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ２はＯまたはＳ、Ｚ２はＯ、ＮＨまたはＳ）表される結合に置き換えられた修飾オリゴヌクレオチドの製造例を説明する。【００４２】  −Ｘ２−Ｃ（＝Ｙ２）−Ｚ２−      （Ｉ−２）
例えば、下記式（ＸＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物を出発原料とし、式（ＸＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物のＲ３を除去し、次いで式（ＸＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物の５’末端にヌクレオチドを伸長させ、その後、固相担体から切り出して前記修飾オリゴヌクレオチドを得ることができる。【００４３】
【化３９】
2006025154.tif 000005
【００４４】  前記式中、Ｒ３は、保護基であり、
Ｂ１、Ｂ２およびＢ３は、互いに独立して、以下の式で示す基およびその官能基が保護基で保護された基から選択される基であり、【００４５】
【化４０】
2006025154.tif 000006
【００４６】Ａは、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
Ｗ３１は、Ｈまたは式ＯＲ３１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１、Ｒ２１およびＲ３１は、互いに独立して、保護基であり、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｙ１およびＹ２は、互いに独立して、ＯまたはＳであり、
Ｚ１およびＺ２は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｍは、固相担体である。【００４７】  また、オリゴヌクレオチドの３’末端から１番目と２番目のヌクレオシド間の３’，５’−リン酸ジエステル結合が、前記式（Ｉ−１）（前記式中、Ｘ１はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ１はＯまたはＳ、Ｚ１はＯ、ＮＨまたはＳ）で、かつ、オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目と４番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、下記式（Ｉ−３）（下記式中、Ｘ３はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ３はＯまたはＳ、Ｚ３はＯ、ＮＨまたはＳ）表される結合に置き換えられた修飾オリゴヌクレオチドの製造例を説明する。【００４８】  −Ｘ３−Ｃ（＝Ｙ３）−Ｚ３−      （Ｉ−３）
例えば、下記式（ＸＩＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物を出発原料とし、式（ＸＩＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物のＲ４を除去し、次いで式（ＸＩＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物の５’末端にヌクレオチドを伸長させ、その後、固相担体から切り出して前記修飾オリゴヌクレオチドを得ることができる。【００４９】
【化４１】
2006025154.tif 000007
【００５０】  前記式中、Ｒ４およびＲは、互いに独立して、保護基であり、
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４は、互いに独立して、以下の式で示す基およびその官能基が保護基で保護された基から選択される基であり、【００５１】
【化４２】
2006025154.tif 000008
【００５２】Ａは、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
Ｗ３１は、Ｈまたは式ＯＲ３１で表される基であり、
Ｗ４１は、Ｈまたは式ＯＲ４１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１、Ｒ２１、Ｒ３１およびＲ４１は、互いに独立して、保護基であり、
Ｘ１、Ｘ３およびＸ４は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｙ１およびｆは、互いに独立して、ＯまたはＳであり、
Ｚ１およびＺ３は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｍは、固相担体である。【００５３】  また、オリゴヌクレオチドの３’末端から１番目と２番目のヌクレオシド間の３’，５’−リン酸ジエステル結合が、前記式（Ｉ−１）（前記式中、Ｘ１はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ１はＯまたはＳ、Ｚ１はＯ、ＮＨまたはＳ）で、かつ、オリゴヌクレオチドの３’末端から２番目と３番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、前記式（Ｉ−２）（前記式中、Ｘ２はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ２はＯまたはＳ、Ｚ２はＯ、ＮＨまたはＳ）表される結合で、かつオリゴヌクレオチドの３’末端から３番目と４番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、前記式（Ｉ−３）（前記式中、Ｘ３はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ３はＯまたはＳ、Ｚ３はＯ、ＮＨまたはＳ）表される結合に置き換えられた修飾オリゴヌクレオチドの製造例を説明する。【００５４】  例えば、下記式（ＸＩＩＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物を出発原料とし、式（ＸＩＩＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物のＲ４を除去し、次いで式（ＸＩＩＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物の５’末端にヌクレオチドを伸長させ、その後、固相担体から切り出して前記修飾オリゴヌクレオチドを得ることができる。【００５５】
【化４３】
2006025154.tif 000009
【００５６】  前記式中、Ｒ４は、互いに独立して、保護基であり、
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４は、互いに独立して、以下の式で示す基およびその官能基が保護基で保護された基から選択される基であり、【００５７】
【化４４】
2006025154.tif 000010
【００５８】Ａは、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
Ｗ３１は、Ｈまたは式ＯＲ３１で表される基であり、
Ｗ４１は、Ｈまたは式ＯＲ４１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１、Ｒ２１、Ｒ３１およびＲ４１は、互いに独立して、保護基であり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｙ１、Ｙ２およびＹ３は、互いに独立して、ＯまたはＳであり、
Ｚ１、Ｚ２およびＺ３は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｍは、固相担体である。【００５９】  前記固相担体とは、固相担体でＤＮＡ、ＲＮＡ等を合成するのに適した固相担体であれば限定されず、例えば、ＣＰＧ（コントロール細孔ガラス）、ＨＣＰ（ｈｉｇｈｌｙ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）等である。【００６０】  Ｒ２、Ｒ３およびＲ４について前記保護基とは、−Ｘ２−Ｈ、−Ｘ３−Ｈおよび−Ｘ４−Ｈの反応性に応じて、従来公知の保護基から選択される。例えば、Ｘ２、Ｘ３またはＸ４がＯであるとき、従来公知の１級アルコールの保護基、例えば、ヌクレオシド化学の分野で公知の、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、４−モノメトキシトリチル（ＭＭＴｒ）、（９−フェニル）キサンテン−９−イル［ピキシル（ｐｉｘｙｌ）］等が、その保護基として用いられうる。【００６１】  また、Ｒ１１、Ｒ２１、Ｒ３１およびＲ４１について前記保護基とは、２’位水酸基の反応性に応じて、従来公知の保護基から選択される。例えば、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル（Ｔｏｍ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）等が、その保護基として用いられうる。【００６２】  また、Ｒについて前記保護基とは、リン酸の反応性に応じて、従来公知の保護基から選択される。例えば、シアノエチル（ＣＥ）、アリル（Ａｌｌｙｌ）、トリメチルシリルエチル（ＴＭＳＥ）、ｐ−ニトロフェネチル（ＮＰＥ）等が、その保護基として用いられうる。【００６３】  また、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４について、官能基が保護されている保護基とは、核酸化学において公知な保護基から選択される。例えば、ベンゾイル（Ｂｚ）、イソブチリル（ｉＢｕ）、フェノキシアセチル（Ｐａｃ）、アリルオキシカルボニル（ＡＯＣ）等が、その保護基として用いられうる。【００６４】  前記固相合成用ユニット化合物の５’末端にヌクレオチドを伸長させるには、オリゴヌクレオチド合成分野で従来公知の技術を用いて、修飾オリゴヌクレオチドの配列に従い、ヌクレオシドを順次カップリングさせて行うことができる。
なお、ヌクレオシド、カップリング試薬、脱保護試薬、洗浄試薬等は、通常核酸固相合成に用いられるものを用いる。得られた固相担体上の修飾オリゴヌクレオチドは、必要であればオリゴヌクレオチド側鎖の脱保護を行った後、固相担体から切り出して、粗修飾オリゴヌクレオチドを得る。切り出しに用いる試薬は、固相担体およびリンカー（固相担体と修飾オリゴヌクレオチドを接続する部分）構造等に応じて、従来公知の試薬から、適宜選択することができる。この粗修飾オリゴヌクレオチドは、必要であれば、ＨＰＬＣ等で精製してもよい。【００６５】  次に、修飾オリゴヌクレオチドが二本鎖である場合の製造について例を挙げて説明する。例えば前記のような方法に従い、一本鎖の修飾オリゴヌクレオチドをまず製造する。その修飾オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有する、一本鎖の天然オリゴヌクレオチドも別途、従来公知の方法に従い、製造する。次いで、得られた一本鎖の修飾オリゴヌクレオチドをアニーリング用緩衝液（例えば、１００ｍＭのＫＯＡｃ水溶液、２ｍＭのＭｇＯＡｃ溶液、および３０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）を含む緩衝液）中に溶解させたものと、一本鎖の天然オリゴヌクレオチドをアニーリング用緩衝液中に溶解させたものとを、例えば混合し、９５℃で５分間処理し、その後、徐々に２５℃まで冷却させて、二本鎖の修飾オリゴヌクレオチドを得ることができる。この二本鎖の修飾オリゴヌクレオチドは、必要に応じて、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿等をさらに行って、単離精製することができる。【００６６】  前記製造方法で用いる式（Ｘ−１）の固相合成用ユニット化合物、式（ＸＩ−１）の固相合成用ユニット化合物、式（ＸＩＩ−１）の固相合成用ユニット化合物および式（ＸＩＩＩ−１）の固相合成用ユニット化合物は、例えば、以下のような方法で製造することができる。【００６７】  まず、ユニット化合物（Ｘ−１）の製造について、スキーム１を参照しながら説明する。式（ＩＶ−１）のヌクレオシド誘導体と、式（ＩＩＩ）のヌクレオシド誘導体とを、式（Ｖ−１）のジイミダゾール誘導体ならびに任意に、塩基（例えば、ピリジン等）、触媒（例えば４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）等）等の存在下に反応させ、二量体（ＶＩ）を得る。式（ＩＶ−１）および式（ＩＩＩ）のヌクレオシドは、市販で入手してもよいし、公知文献を利用して自家製造してもよい。【００６８】  次に、得られた二量体（ＶＩ）に、無水物（ＶＩＩ）を、任意に、塩基（例えば、ピリジン、トリエチルアミン等）、触媒（例えば４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）等）等の存在下に反応させ、二量体（ＶＩＩＩ）を得る。【００６９】  次に、得られた二量体（ＶＩＩＩ）と、アミノ基を有する固相担体（ＩＸ）とをカップリング試薬（例えば、ＷＳＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド・塩酸塩））存在下に縮合させ、ユニット化合物（Ｘ−１）を得る。【００７０】
【化４５】
2006025154.tif 000011
【００７１】  前記式中、
Ｒ２は、保護基であり、
Ｂ１およびＢ２は、互いに独立して、以下の式で示す基およびその官能基が保護基で保護された基から選択される基であり、【００７２】
【化４６】
2006025154.tif 000012
【００７３】Ａは、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１およびＲ２１は、互いに独立して、保護基であり
Ｘ１およびＸ２は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｙ１は、ＯまたはＳであり、
Ｚ１は、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｍは、固相担体である。【００７４】  つぎに、ユニット化合物（ＸＩ−１）の製造例について、スキーム２を参照しながら説明する。例えば、式（ＶＩ）の二量体のＲ２をＲ２の性質に応じた方法により、Ｈに置き換え、５’位が遊離型の式（ＶＩ−１）の二量体を得る。次いで、式（ＶＩ−１）の二量体と、式（ＩＶ−２）のヌクレオシド誘導体とを、式（Ｖ−２）のジイミダゾール誘導体ならびに任意に、塩基（例えば、ピリジン等）、触媒（例えば４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）等）等の存在下に反応させ、三量体（ＸＩＶ−１）を得る。式（ＩＶ−２）のヌクレオシドは、市販で入手してもよいし、公知文献を利用して自家製造してもよい。【００７５】  次に、得られた三量体（ＸＩＶ−１）に、無水物（ＶＩＩ）を、任意に、塩基（例えば、ピリジン、トリエチルアミン等）、触媒（例えば４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）等）等の存在下に反応させ、三量体（ＸＶ−１）を得る。【００７６】  次に、得られた三量体（ＸＶ−１）と、アミノ基を有する固相担体（ＩＸ）とをカップリング試薬（例えば、ＷＳＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド・塩酸塩））存在下に縮合させ、ユニット化合物（ＸＩ−１）を得る。【００７７】
【化４７】
2006025154.tif 000013
【００７８】  前記式中、Ｒ２およびＲ３は、互いに独立して、保護基であり、
Ｂ１、Ｂ２およびＢ３は、互いに独立して、以下の式で示す基およびその官能基が保護基で保護された基から選択される基であり、【００７９】
【化４８】
2006025154.tif 000014
【００８０】Ａは、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
Ｗ３１は、Ｈまたは式ＯＲ３１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１、Ｒ２１およびＲ３１は、互いに独立して、保護基であり
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｙ１およびＹ２は、互いに独立して、ＯまたはＳであり、
Ｚ１およびＺ２は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｍは、固相担体である。【００８１】  つぎに、ユニット化合物（ＸＩＩ−１）の製造例について、スキーム３を参照しながら説明する。例えば、式（ＶＩ−２）の二量体のＲ２をＲ２の性質に応じた方法により、Ｈに置き換え、５’位が遊離型の式（ＶＩ−３）の二量体を得る。次いで、式（ＶＩ−３）の二量体と、式（ＩＶ−３）のヌクレオシド誘導体とを、リン酸結合試薬（例えば、２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト等）の存在下縮合させ、式（ＸＩＶ−２）の三量体を得る。式（ＩＶ−３）のヌクレオシドは、市販で入手してもよいし、公知文献を利用して自家製造してもよい。【００８２】  次に、得られた三量体（ＸＩＶ−２）に、無水物（ＶＩＩ）を、任意に、塩基（例えば、ピリジン、トリエチルアミン等）、触媒（例えば４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）等）等の存在下に反応させ、三量体（ＸＶ−２）を得る。【００８３】  次に、得られた三量体（ＸＶ−２）と、アミノ基を有する固相担体（ＩＸ）とをカップリング試薬（例えば、ＷＳＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド・塩酸塩））存在下に縮合させ、ユニット化合物（ＸＩＩ−１）を得る。【００８４】
【化４９】
2006025154.tif 000015
【００８５】  前記式中、Ｒ２、Ｒ３およびＲは、互いに独立して、保護基であり、
Ｂ１、Ｂ２およびＢ３は、互いに独立して、以下の式で示す基およびその官能基が保護基で保護された基から選択される基であり、【００８６】
【化５０】
2006025154.tif 000016
【００８７】Ａは、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
Ｗ３１は、Ｈまたは式ＯＲ３１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１、Ｒ２１およびＲ３１は、互いに独立して、保護基であり
Ｘ１およびＸ３は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｙ１は、互いに独立して、ＯまたはＳであり、
Ｚ１は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｍは、固相担体である。【００８８】  つぎに、ユニット化合物（ＸＩＩＩ−１）の製造例について、スキーム４を参照しながら説明する。例えば、式（ＸＩＶ−１）の三量体のＲ３をＲ３の性質に応じた方法により、Ｈに置き換え、５’位が遊離型の式（ＸＩＶ−３）の三量体を得る。次いで、式（ＸＩＶ−３）の三量体と、式（ＩＶ−４）のヌクレオシド誘導体とを、式（Ｖ−３）のジイミダゾール誘導体ならびに任意に、塩基（例えば、ピリジン等）、触媒（例えば４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）等）等の存在下に反応させ、四量体（ＸＶＩ−１）を得る。式（ＩＶ−４）のヌクレオシドは、市販で入手してもよいし、公知文献を利用して自家製造してもよい。【００８９】  次に、得られた四量体（ＸＶＩ−１）に、無水物（ＶＩＩ）を、任意に、塩基（例えば、ピリジン、トリエチルアミン等）、触媒（例えば４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）等）等の存在下に反応させ、四量体（ＸＶＩＩ−１）を得る。【００９０】  次に、得られた四量体（ＸＶＩＩ−１）と、アミノ基を有する固相担体（ＩＸ）とをカップリング試薬（例えば、ＷＳＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド・塩酸塩））存在下に縮合させ、ユニット化合物（ＸＩＩＩ−１）を得る。【００９１】
【化５１】
2006025154.tif 000017
【００９２】
【化５２】
2006025154.tif 000018
【００９３】  前記式において、
Ｒ３およびＲ４は、保護基であり、
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４は、互いに独立して、以下の式で示す基およびその官能基が保護基で保護された基から選択される基であり、【００９４】
【化５３】
2006025154.tif 000019
【００９５】Ａは、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
Ｗ３１は、Ｈまたは式ＯＲ３１で表される基であり、
Ｗ４１は、Ｈまたは式ＯＲ４１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１、Ｒ２１、Ｒ３１およびＲ４１は、互いに独立して、保護基であり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｙ１、Ｙ２およびＹ３は、互いに独立して、ＯまたはＳであり、
Ｚ１、Ｚ２およびＺ３は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｍは、固相担体である。【００９６】  なお、スキーム１〜４の各工程において、必要であれば、各官能基に保護基を導入したり、保護基を脱保護したり、保護基を変更してもよい。なお、官能基の種類に応じた保護基の選択、保護基の導入および保護基の除去は、当該分野で公知の方法に従い、行うことができ、例えば、「有機合成における保護基（″Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ″），Ｔ．Ｇｒｅｅｎｅら著、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．出版」等を参照することができる。
【実施例】
【００９７】  本明細書の記載において、以下の略語を使用する。
Ａｒ：アルゴン
ＡＰＳ：アンモニウム  ペルオキソジサルフェート（ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｅｒｏｘｏｄｉｓｕｌｆａｔｅ）
ＣＰＧ：コントロール細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）
ＤＩＡＤ：ジイソプロピルアゾカルボキシレート（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｚｏｃａｒｂｏｘｙｒａｔｅ）
ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン（４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）
ＤＭＴｒＣｌ：４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（４，４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ）
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸・ジナトリウム塩・ｄｅｈｙｄｒａｔｅ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ，ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ，ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）
ＦＡＢ：高速原子衝撃（ｆａｓｔ  ａｔｏｍ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）
ＨＲＭＳ：高分解能質量分析（ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）
Ｉｍ２ＣＯ：１−１’−カルボニルビス−１Ｈ−イミダゾール（１−１’−Ｃａｒｂｏｎｙｌｂｉｓ−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）
ｍＲＮＡ：メッセンジャー  リボ核酸（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
ＮＢＡ：３−ニトロベンジルアルコール（３−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌａｌｃｈｏｌ）
ＰＡＧＥ：ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）
ＴＢＡＦ：トリブチルアンモニウムフルオライド（ｔｒｉｂｕｔｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｆｌｕｏｒｉｄｅ）
ＴＢＥ：Ｔｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡ（Ｔｒｉｓ−ｂｏｒｉｃ  ａｃｉｄ−ＥＤＴＡ）
ＴＥＡＡ：トリエチルアミン−酢酸（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ−ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）
ＴＢＤＭＳＣｌ：ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロライド（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ）
ＴＥＭＥＤ：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−エチレンジアミン（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）
ＴＲＩＳ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）
ＷＳＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド・塩酸塩（１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ，ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）
ＣＰＧ上の化合物の活性は、以下のようにして算出した。【００９８】  乾燥させたＣＰＧ６ｍｇをガラスフィルターにのせ、そこへＨＣｌＯ４およびエタノールの混合物（ＨＣｌＯ４：ＥｔＯＨ＝３：２）を流し込んだ。得られたろ液の吸光度（波長４９８ｎｍ（ＤＭＴｒ基の吸収波長））を測定し、その値を以下の式に代入して算出した。【００９９】
【数１】
2006025154.tif 000020
【０１００】  前記式中、Ａｂｓ．は、波長４９８ｎｍにおけるＣＰＧの吸光度であり、
Ｖｏｌ．は、測定したろ液の容量であり、
ｗｅｉｇｈｔは、測定したＣＰＧの重量である。【０１０１】  １．修飾１本鎖オリゴヌクレオチドまたは修飾２本鎖オリゴヌクレオチド製造のための、モノマー製造【０１０２】（１）５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン（ＩＶ−１１）（５’−Ｏ−（４，４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ）ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）の製造（Ｓ．Ａｇｒａｗａｌら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．２０，３６０−３６６に従い製造。）
チミジン（２．０３ｇ，８．４３ｍｍｏｌ）のピリジン（１６ｍＬ）溶液を、Ａｒ雰囲気下、室温で撹拌した。そこへＤＭＴｒＣｌ（３．０８ｇ，９．１１ｍｍｏｌ，１．１当量）を加えて、さらに室温で攪拌した。１２時間後、その反応混合物へ、さらにＤＭＴｒＣｌを１当量（０．２８ｇ，０．８３ｍｍｏｌ）加えて、さらにその反応混合物を攪拌した。ＴＬＣ分析により、チミジンがこれ以上消費されないことを確認した後、その反応混合物に、氷冷下でメタノールを加えた。その反応混合物から溶媒を減圧下に留去した後、得られた残渣をクロロホルムで希釈した。そのクロロホルム溶液を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２回）および飽和ＮａＣｌ水溶液（１回）で順次洗浄し、その後、硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記クロロホルム溶液から溶媒を減圧下に留去し、得られた残渣をトルエンで共沸した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３＝０〜４％）で精製して、白色の泡状結晶の標題化合物を得た（３．５５ｇ，６．５１ｍｍｏｌ，収率７７％）。【０１０３】 １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１．４７（３Ｈ，ｓ，５−ＣＨ３），２．３２−２．４１（２Ｈ，ｍ，２’−Ｈ），３．３５−３．４９（２Ｈ，ｍ，５’−Ｈ），３．７９（６Ｈ，ｓ，−ＯＣＨ３），４．０６（１Ｈ，ｍ，４’−Ｈ），４．５４（１Ｈ，ｍ，３’−Ｈ），６．４４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１’−Ｈ），６．８３−７．４０（１３Ｈ，ｍ，ＤＭＴｒ），７．５９（１Ｈ，ｓ，６−Ｈ），８．６６（１Ｈ，ｓ，１−ＮＨ）．【０１０４】  （２）３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルチミジン（ＩＩＩ−１２）の製造（Ｓ．Ａｇｒａｗａｌら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．２０，３６０−３６６に従い製造。）【０１０５】  （ｉ）３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン（３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ−５’−Ｏ−（４，４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ）ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）の製造
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン（１．０４ｇ，１．９１ｍｍｏｌ）およびイミダゾール（０．３２ｇ，４．７４ｍｍｏｌ，２．５当量）を、Ａｒ雰囲気下でＤＭＦ（８．０ｍＬ）に溶解させ、得られた溶液をＡｒ雰囲気下で撹拌した。ＴＢＤＭＳＣｌ（０．３６ｇ，２．３７ｍｍｏｌ，１．当量）を前記溶液に加えた後、その反応混合物をＭ雰囲気下で１２時間攪拌した。
ＴＬＣ分析により、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジンがこれ以上消費されないことを確認した後、その反応混合物に氷冷下でメタノール（４ｍＬ）を加えた。その反応混合物から溶媒を減圧下に留去した後、得られた残渣を酢酸エチル希釈した。その酢酸エチル溶液を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２回）および飽和ＮａＣｌ水溶液（１回）で順次洗浄し、その後、硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記酢酸エチル溶液から溶媒を減圧下に留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３＝０〜５％）で精製して、白色の泡状結晶の標題化合物を得た（１．１８ｇ，１．７９ｍｍｏｌ，収率９４％）。【０１０６】 １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：０．０９（６Ｈ，ｓ，ＴＢＤＭＳ−ＣＨ３），０．８１（９Ｈ，ｓ，ｔ−ブチル），１．４７（３Ｈ，ｓ，５−ＣＨ３），２．１６−２．３３（２Ｈ，ｍ，２’−Ｈ），３．２３−３．４６（２Ｈ，ｍ，５’−Ｈ），３．７７（６Ｈ，ｓ，ＯＣＨ３），３．９４−３．９５（１Ｈ，ｍ，４’−Ｈ），４．４９−４．５０（１Ｈ，ｍ，３’−Ｈ），６．３２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１’−Ｈ），６．８０−７．３９（１３Ｈ，ｍ，ＤＭＴｒ），７．６３（１Ｈ，ｓ，６−Ｈ），８．１５（１Ｈ，ｓ，ＮＨ）．【０１０７】  （ｉｉ）３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルチミジン（ＩＩＩ−１２）（３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）の製造
３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン（１．１８ｇ，１．７９ｍｍｏｌ）に８０％酢酸水溶液（２６ｍＬ）を加え、その反応混合物を攪拌した。１時間後、ＴＬＣ分析により３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジンの消失を確認した後、前記反応混合物から溶媒を減圧下に留去した。得られた残渣を酢酸エチルで希釈した。その酢酸エチル溶液を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２回）および飽和ＮａＣｌ水溶液（１回）で順次洗浄し、その後硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記酢酸エチル溶液から溶媒を減圧下に留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３＝０〜３％）で精製して、白色結晶の標題化合物を得た（０．６０ｇ，１．６８ｍｍｏｌ，収率９４％）。【０１０８】 １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：０．０３（６Ｈ，ｓ，ＴＢＤＭＳ−ＣＨ３），０．８１（９Ｈ，ｓ，ｔ−ブチル），１．８３（３Ｈ，ｓ，５−ＣＨ３），２．１０−２．４１（２Ｈ，ｍ，２’−Ｈ），３．６４−３．６９（１Ｈ，ｍ，４’−Ｈ），３．８１−３．８６（２Ｈ，ｍ，５’−Ｈ），４．３９−４．４２（１Ｈ，ｍ，３’−Ｈ），６．０２−６．０５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１’−Ｈ），７．２６（１Ｈ，ｓ，６−Ｈ），８．３４（１Ｈ，ｓ，ＮＨ）．
（３）５’−アミノチミジン（ＩＩＩ−１１）の製造（Ｔ．Ｈａｔａら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ  ｔｒａｎｓ．１，１９８０，３０６−３１０に従い製造。）【０１０９】  （ｉ）５’−アジドチミジン（５’−ａｚｉｄｏｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）の製造
チミジン（２．００ｇ，８．２６ｍｍｏｌ）、Ｐｈ３Ｐ（２．００ｇ，８．２６ｍｍｏｌ，１．０当量）およびＮａＮ３（２．６０ｇ，４１．３ｍｍｏｌ，５．０当量）をＤＭＦ（４０ｍＬ）に溶解させ、その溶液にＣＢｒ４（２．８０ｇ，８．４０ｍｍｏｌ，１．０当量）を加えた。得られた反応混合物を、Ａｒ雰囲気下に８５℃で撹拌した。２５時間後、ＴＬＣ分析によりチミジンの消失を確認した後、前記反応混合物を酢酸エチルで希釈し、水（３回）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１回）、飽和ＮａＣｌ水溶液（１回）で順次洗浄し、その後硫酸ナトリウムで乾燥させた。その酢酸エチル溶液から溶媒を減圧下に留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３＝１：４９〜７：９３）で精製して、白色結晶の標題化合物を得た（収量２．０１ｇ，７．５２ｍｍｏｌ，収率９１％）。【０１１０】 １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１．７８（３Ｈ，ｓ，５−ＣＨ３），２．０６−２．２８（２Ｈ，ｍ，２’−Ｈ），３．５５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，５’−Ｈ），３．８３（１Ｈ，ｍ，４’−Ｈ），４．０８（１Ｈ，ｍ，３’−Ｈ），３．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，３−ＯＨ），６．１９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１’−Ｈ），７．５５（１Ｈ，ｓ，６−Ｈ），１１．３２（１Ｈ，ｓ，ＮＨ）．【０１１１】  （ｉｉ）５’−アミノチミジン（ＩＩＩ−１１）（５’−ａｍｉｎｏｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）の製造
５’−アジドチミジン（０．２３ｇ，０．９４ｍｍｏｌ）および５％Ｐｄ触媒（０．０６５ｇ）を、エタノールと塩化メチレンの混合溶媒（ＥｔＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２＝１：１）（３．１ｍＬ）中、水素雰囲気下で２４時間撹拌した。ＴＬＣ分析により５’−アジドチミジンの消失を確認した後、反応混合物をセライト濾過した。得られたろ液から溶媒を減圧下に留去して、白色結晶の標題化合物を得た（収量０．２２ｇ，０．８９ｎｍｏｌ，収率９５％）。【０１１２】 １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１．７４（３Ｈ，ｓ，５−ＣＨ３），２．００−２．１６（２Ｈ，ｍ，２’−Ｈ），２．４９−２．７７（２Ｈ，ｍ，５’−Ｈ），３．２０−３．４５（１Ｈ，ｂｒ，３’−ＯＨ），３．６３−３．６６．（１Ｈ，ｍ，４’−Ｈ），４．１６−４．２０（１Ｈ，ｍ，３’−Ｈ），６．１３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１’−Ｈ），７．６３（１Ｈ，ｓ，６−Ｈ）．【０１１３】  （４）３’−アミノ−５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルチミジン（ＩＶ−１２）の製造（Ｅ．Ｗ．Ｈａｒｋｉｎｓら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４．７．１５−４．７．１７に従い製造。）【０１１４】  （ｉ）５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルチミジン（５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）の製造
チミジン（２．００ｇ，８．２６ｍｍｏｌ）をＤＭＦで共沸し、ＤＭＦ（１６．５ｍＬ）に溶かした。その溶液に、Ｅｔ３Ｎ（１．３６ｍＬ，９．９１ｍｍｏｌ，１．２当量）、ＤＭＡＰ（０．０５ｇ，０．４１ｍｍｏｌ，０．０５当量）およびＴＢＤＭＳＣｌ（１．３６ｇ，９．０２ｍｍｏｌ，１．１当量）を順次加え、得られた反応混合物をＡｒ雰囲気下に室温で２時間半撹拌した。さらにＴＢＤＭＳＣｌ（０．２５ｇ，１．６６ｍｍｏｌ，０．２当量）を前記反応混合物に加え、さらに３０分間撹拌した。ＴＬＣ分析でチミジンの消失を確認した後、その反応混合物を酢酸エチルで希釈した。得られた酢酸エチル溶液を、水（３回）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１回）、飽和ＮａＣｌ水溶液（１回）で順次洗浄し、その後硫酸ナトリウムで乾燥させた。その酢酸エチル溶液から溶媒を減圧下に留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３＝０：１〜１：２０）で精製して、白色結晶の標題化合物を得た（収量２．４４ｇ，６．８４ｍｍｏｌ，収率８３％）。【０１１５】 １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：０．１２（６Ｈ，ｍ，ＴＢＤＭＳ−ＣＨ３），０．９２（９Ｈ，ｓ，ｔ−ブチル），１．８９（３Ｈ，ｓ，５−ＣＨ３），２．０８−２．３９（３Ｈ，ｍ，２’−Ｈ  ａｎｄ  ３’−ＯＨ），３．８２−３．９２（２Ｈ，ｍ，５’−Ｈ），４．０３（１Ｈ，ｍ，４’−Ｈ），４．４７（１Ｈ，ｍ，３’−Ｈ），６．３７（１Ｈ，ｍ，１’−Ｈ），７．５０（１Ｈ，ｓ，６−Ｈ），８．４４（１Ｈ，ｂｒ，ＮＨ）．【０１１６】  （ｉｉ）２，３’−アンハイドロ−５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルチミジン（２，３’−ａｎｈｙｄｒｏ−５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）の製造
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルチミジン（２．１９ｇ，６．１４ｍｍｏｌ）およびＰｈ３Ｐ（２．６０ｇ，９．９１ｍｍｏｌ，１．６当量）のＤＭＦ（７．０ｍＬ）溶液に、ＤＩＡＤ（３．２ｍＬ，９．００ｍｍｏｌ，１．６当量，４０％トルエン溶液）のＤＭＦ（３．１ｍＬ）溶液を加え、得られた反応混合物をＡｒ雰囲気下に室温で撹拌した。３時間半後、ＴＬＣ分析により５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルチミジンの消失を確認したこの反応混合物を酢酸エチルで希釈し、水（３回）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１回）、飽和ＮａＣｌ水溶液（１回）で順次洗浄し、その後硫酸ナトリウムで乾燥させた。得られた酢酸エチル溶液から溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ＝１：１：０〜０：１０：１）で精製して、白色結晶の標題化合物を得た（収量１．６３ｇ，４．８２ｍｍｏｌ，収率７９％）。【０１１７】 １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：０．０７（６Ｈ，ｓ，ＴＢＤＭＳ−ＣＨ３），０．８８（９Ｈ，ｓ，ｔ−ブチル），１．９５（３Ｈ，ｓ，５−ＣＨ３），２．４３−２．６７（２Ｈ，ｍ，２’−Ｈ），３．７３−３．８３（２Ｈ，ｍ，５’−Ｈ），４．２８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，４’−Ｈ），５．１９（１Ｈ，ｓ，３’−Ｈ），５．４７（１Ｈ，ｓ，１’−Ｈ），６．９５（１Ｈ，ｓ，６−Ｈ）．【０１１８】  （ｉｉｉ）３’−アジド−５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルチミジン（３’−ａｚｉｄｏ−５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）の製造
２，３’−アンハイドロ−５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルチミジン（０．４８ｇ，１．４１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（４．２ｍＬ）溶液に、ＮａＮ３（０．１４ｇ，２．２１ｍｍｏｌ，１．５当量）を加え、その反応混合物をＭ雰囲気下に１２０℃で撹拌した。４８時間後、ＴＬＣ分析により、２，３’−アンハイドロ−５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルチミジンの消失を確認した。この反応混合物を酢酸エチルで希釈し、水（３回）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１回）、飽和ＮａＣｌ水溶液（１回）で順次洗浄し、その後硫酸ナトリウムで乾燥させた。得られた酢酸エチル溶液から溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝０：１）で精製して、油状の標題化合物を得た（収量０．４８ｇ，１．２５ｍｍｏｌ，収率８８％）。【０１１９】 １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：０．０１（６Ｈ，ｍ，ＴＢＤＭＳ−ＣＨ３），０．８０（９Ｈ，ｍ，ｔ−ブチル），１．８０（３Ｈ，ｓ，５−ＣＨ３），２．０７−２．３４（２Ｈ，ｍ，２’−Ｈ），３．６６−３．７０（１Ｈ，ｍ，４’−Ｈ），３．８１−３．８６（２Ｈ，ｍ，５’−Ｈ），４．１２（１Ｈ，ｍ，３’−Ｈ），６．１２（１Ｈ，ｓ，１’−Ｈ），７．３２（１Ｈ，ｓ，６−Ｈ），１０．００（１Ｈ，ｂｒ，ＮＨ）．【０１２０】  （ｉｖ）３’−アミノ−５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルチミジン（ＩＶ−１２）（３’−ａｍｉｎｏ−５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）の製造
３’−アジド−５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルチミジン（１．１５ｇ，３．０２ｍｍｏｌ）および５％Ｐｄ触媒（０．１５ｇ）をメタノール（１０ｍＬ）中、Ａｒ雰囲気下に室温で１９時間撹拌した。ＴＬＣ分析により３’−アジド−５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルチミジンが消失したことを確認した後、反応混合物をセライト濾過した。得られたろ液から溶媒を減圧留去して、白色結晶の標題化合物を得た（収量１．０３ｇ，２．８９ｎｍｍｏｌ，収率９５％）。【０１２１】 １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．０５（６Ｈ，ｍ，ＴＢＤＭＳ−ＣＨ３），０．８６（９Ｈ，ｓ，ｔ−ブチル），１．７５（３Ｈ，ｓ，５’−ＣＨ３），２．０１−２．０９（２Ｈ，ｍ，２’−Ｈ），３．３０（２Ｈ，ｓ，ＮＨ２），３．４１−３．４６（１Ｈ，ｍ，４’−Ｈ），３．６４−３．７７（２Ｈ，ｍ，５’−Ｈ），３．８０−３．８４（１Ｈ，ｍ，３’−Ｈ），６．１１−６．１６（１Ｈ，ｔ，９．４Ｈｚ，１’−Ｈ），７．４５（１Ｈ，ｓ，６−Ｈ）．【０１２２】  ２．修飾１本鎖オリゴヌクレオチドまたは修飾２本鎖オリゴヌクレオチド製造のための、固相担体に結合したユニット化合物の製造【０１２３】（実施例１−０１）
（１）（Ｘ−１１）で表されるユニット化合物の製造【０１２４】
【化５４】
2006025154.tif 000021
【０１２５】  （ｉ）５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−（５’’−アミノチミジリル）カルバモイルチミジン（５’−Ｏ−（４，４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ）−３’−（５’’−ａｍｉｎｏｔｈｙｍｉｄｉｌｙｌ）ｃａｒｂａｍｏｙｌｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）の製造
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン（ＩＶ−１１）（０．７６ｇ，１．４ｍｍｏｌ）のピリジン（８．０ｍＬ）溶液に、ＤＭＡＰ（少量）およびＩｍ２ＣＯ（０．２３ｇ，１．４ｍｍｏｌ，１．０当量）を加え、その反応混合物をＡｒ雰囲気下に室温で撹拌した。２４時間後、５’−アミノチミジン（ＩＩＩ−１１）（０．５０ｇ，２．０７ｍｍｏｌ，１．５当量）のピリジン（６．０ｍＬ）溶液を、前記反応混合物に滴下して加えた。４８時間後、前記反応混合物を酢酸エチルで希釈した。得られた酢酸エチル溶液を、水（１回）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１回）、飽和ＮａＣｌ水溶液（１回）で順次洗浄し、その後、硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記酢酸エチル溶液から溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３＝１：２０〜１：１０）で精製して、白色結晶の標題化合物を得た（収量０．７１ｇ，０．８７ｍｍｏｌ，収率６２％）。【０１２６】 １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１．３８（３Ｈ，ｓ，５−ＣＨ３  ５’Ｔ），１．７５（３Ｈ，ｓ，５−ＣＨ３  ３’Ｔ），１．９８−２．４８（４Ｈ，ｍ，２’−Ｈ），３．１４−３．３３（４Ｈ，ｍ，５’−Ｈ），３．７３（６Ｈ，ｓ，ＯＣＨ３），３．９９−４．０４（２Ｈ，ｍ，４’−Ｈ），４．１２（１Ｈ，ｓ，３’−Ｈ  ５’Ｔ），５．２２（１Ｈ，ｂｒ，ＯＨ），５．２８−５．２９（１Ｈ，ｍ，３’−Ｈ  ３’Ｔ），６．１０−６．１４（１Ｈ，ｍ，１’−Ｈ  ５’Ｔ），６．２０−６．２４（１Ｈ，ｍ，１’−Ｈ  ３’Ｔ），６．２８−７．３８（１３Ｈ，ｍ，ＤＭＴｒ），７．４８（１Ｈ，ｓ，６−Ｈ  ５’Ｔ），７．５１（１Ｈ，ｓ，６−Ｈ  ３’Ｔ），７．６０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，ＮＨ），１１．２８（１Ｈ，ｓ，ＮＨ  ５’Ｔ），１１．３７（１Ｈ，ｓ，ＮＨ  ３’Ｔ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１１．４４，１２．３４，３７．９７，３８．９０，５５．２２，６３．９４，７１．２３，７６．３３，７６．６８，７７．３２，８４．００，８４．３６，８４．８７，８７．１９，１１０．７５，１１１．９６，１１３．２８，１２７．１９，１２８．０１，１２８．１１，１３０．１１，１３５．０４，１３５．２１，１３５．５６，１４４．１６，１５１．１４，１５６．３８，１５８．７０，１６４．０７，１６４．４１．
ＦＡＢ−ＭＳ（ＮＢＡ）ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ４２Ｈ４５Ｎ２Ｏ１２（ＭＨ−），８１０．２９８６７；ｆｏｕｎｄ，８１０．２９９３０．【０１２７】  ユニット化合物（Ｘ−１１）の製造
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−（５’’−アミノチミジリル）カルバモイルチミジン（０．７１ｇ，０．８７ｍｍｏｌ）のピリジン（８．７ｍＬ）溶液に、ＤＭＡＰ（少量）および無水コハク酸（０．２９ｇ，２．８７ｍｍｏｌ，３．３当量）を加え、その反応混合物をＡｒ雰囲気下に室温で１６時間撹拌した。ＴＬＣ分析により５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−（５’’−アミノチミジリル）カルバモイルチミジンの消失を確認した後、前記反応混合物をクロロホルムで希釈した。そのクロロホルム溶液を、水（１回）および飽和ＮａＣｌ水溶液（１回）で順次洗浄し、その後硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記クロロホルム溶液から溶媒を減圧留去した。得られた残渣の一部（０．８０ｇ，０．８７ｍｍｏｌ，４当量）をＤＭＦ（２２ｍＬ）に溶解させた。その溶液にＣＰＧ（１３６μｍｏｌ／ｇ，１．６１ｇ，０．２２ｍｏｌ）を加えてＣＰＧを膨潤させた後、ＷＳＣ（０．１７ｇ，０．８７ｍｍｏｌ，４当量）をその反応混合物に加えた。前記反応混合物を室温で２日間、振とうした。その反応混合物を減圧ろ過した後、得られたろ取物をピリジンで洗浄し、その後乾燥させた。前記ろ取物に、ＤＭＡＰの０．１Ｍピリジンおよび無水酢酸混合物溶液（ピリジン：無水酢酸＝９：１）（１５ｍＬ）を加え、室温で１５時間振とうさせた。その反応混合物を減圧ろ過した後、得られたろ取物をメタノールおよびアセトンで順次洗浄し、その後乾燥させて標題のユニット化合物（ＣＰＧの化合物の活性＝２６．７μｍｏｌ／ｇ）を得た（収量１．５３ｇ）。【０１２８】（実施例１−０２）
（２）（Ｘ−１２）で表されるユニット化合物の製造【０１２９】
【化５５】
2006025154.tif 000022
【０１３０】  （ｉ）５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−アミノ−（３’’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルチミジリル）カルバモイルチミジン（５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ−３’−ａｍｉｎｏ−（３’’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌｔｈｙｍｉｄｉｌｙｌ）ｃａｒｂａｍｏｙｌｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）の製造
３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルチミジン（ＩＩＩ−１２）（２．２７ｇ，６．３７ｍｍｏｌ）のピリジン（３５ｍＬ）溶液に、ＤＭＡＰ（少量）およびＩｍ２ＣＯ（０．７６ｇ，４．７０ｍｍｏｌ，１当量）を加え、その反応混合物を１日間撹拌した。３’−アミノ−５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルチミジン（ＩＶ−１２）（１．７０ｇ，４．７９ｍｍｏｌ，１当量）のピリジン（１２ｍＬ）溶液を滴下して加えた後、その反応混合物を１日間撹拌した。その反応混合物を酢酸エチルで希釈した。その酢酸エチル溶液を、水（１回）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１回）および飽和ＮａＣｌ水溶液（１回）で順次洗浄し、その後硫酸ナトリウムで乾燥させた。その酢酸エチル溶液から溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３＝０：１〜１：１０）で精製して、白色結晶の標題化合物を得た（収量２．４６ｇ，３．３３ｍｍｏｌ，収率７０％）。【０１３１】 １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：０．０８−０．１３（１２Ｈ，ｍ，ＴＢＤＭＳ−ＣＨ３），０．８９  ａｎｄ  ０．９３（１８Ｈ，ｓ，ｔ−ブチル），１．９０（３Ｈ，ｓ，５−ＣＨ３  ５’Ｔ），１．９３（３Ｈ，ｓ，５−ＣＨ３  ３’Ｔ），２．１５−２．３５（４Ｈ，ｍ，２’−Ｈ），３．８５−３．９４（２Ｈ，ｍ，５’−Ｈ  ５’Ｔ），４．０１−４．０３（２Ｈ，ｍ，５’−Ｈ  ３’Ｔ），４．２４−４．３４（２Ｈ，ｍ，４’−Ｈ），６．０４−６．０８（１Ｈ，ｍ，３’−Ｈ  ５’Ｔ），６．３０−６．３７（１Ｈ，ｍ，３’−Ｈ  ３’Ｔ），７．１７（１Ｈ，ｓ，６−Ｈ  ５’Ｔ），７．５６（１Ｈ，ｓ，６−Ｈ  ３’Ｔ），８．８３（１Ｈ，ｓ，ＮＨ  ５’Ｔ），８．９５（１Ｈ，ｓ，ＮＨ  ３’Ｔ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：−５．９８，−４．９１，１２．４２，１８．３０，２５．８８，４０．４６，５２．５１，５５．２１，６１．７０，６３．９７，６６．４５，７１．５２，８３．６７，８４．８２，８６．９６，８７．５６，１１０．８３，１１０．９１，１１１．４２，１３０．０２，１３０．６９，１３５．０５，１３７．０３，１５０．２３，１５５．７２，１６３．８０．
ＦＡＢ−ＨＲＭＳ（ＮＢＡ）ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ３３Ｈ５５Ｎ５Ｏ１０Ｓｉ２（ＭＨ＋），７３８．３５６６；ｆｏｕｎｄ，７３８．３５７９．【０１３２】  （ｉｉ）３’−アミノ−チミジリルカルバモイルチミジン（３’−ａｍｉｎｏ−ｔｈｙｍｉｄｉｌｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）の製造
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−アミノ−（３’’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルチミジリル）カルバモイルチミジン（０．９０ｇ，１．４４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１４ｍＬ）溶液に、ＴＢＡＦ（２ｍＬ，２ｍｍｏｌ，２当量）を加え、その反応混合物を１日間撹拌した。その反応混合物から溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３＝１：２０〜１：５）で精製して、白色結晶の標題化合物を得た（収量０．７２ｇ，１．４３ｍｍｏｌ，収率９９％）。【０１３３】 １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１．７７（６Ｈ，ｓ，５−ＣＨ３），２．００−２．２４（４Ｈ，ｍ，２’−Ｈ），３．４４−３．６４（２Ｈ，ｍ，５’−Ｈ  ５’Ｔ），３．７６−３．９１（２Ｈ，ｍ，５’−Ｈ  ３’Ｔ），４．０１−４．２１（２Ｈ，ｍ，４’−Ｈ），５．００−５．２２（１Ｈ，ｍ，３’−Ｈ  ５’Ｔ），５．３７−５．４３（１Ｈ，ｍ，３’−Ｈ  ３’Ｔ），６．１３−６．２１（２Ｈ，ｍ，１’−Ｈ），７．４４−７９（２Ｈ，ｍ，６−Ｈ），１１．２８（１Ｈ，ｓ，ＮＨ  ５’Ｔ），１１．３１（１Ｈ，ｓ，ＮＨ  ３’Ｔ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１２．２３，１２．２９，３７．１７，５０．８０，６１．２４，６４．５３，７０．７４，８３．４６，８３．８６，８４．１１，８４．８３，１０９．４０，１０９．７２，１３５．００，１３６．１２，１５０．４１，１５０．５０，１５５．５８，１６３．７１，１６３．７６．
ＦＡＢ−ＨＲＭＳ（ＮＢＡ）ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２１Ｈ２７Ｎ５Ｏ１０（ＭＨ＋），５１０．１８４０６；ｆｏｕｎｄ，５１０．１８３５７．【０１３４】  （ｉｉｉ）５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−アミノチミジリルカルバモイルチミジン（５’−Ｏ−（４，４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ）−３’−ａｍｉｎｏｔｈｙｍｉｄｉｌｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）の製造
３’−アミノ−チミジリルカルバモイルチミジン（０．２１ｇ，０．４１ｍｍｏｌ）のピリジン（１．４ｍＬ）溶液に、ＤＭＡＰ（少量）およびＤＭＴｒＣｌ（０．２１ｇ，０．６２ｍｍｏｌ，１．５当量）を加え、その反応混合物を１日間撹拌した。その反応混合物を酢酸エチルで希釈した。その酢酸エチル溶液を、水（１回）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１回）および飽和ＮａＣｌ水溶液（１回）で順次洗浄し、その後硫酸ナトリウムで乾燥させた。得られた酢酸エチル溶液から溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：ＡｃＯＥｔ：ＭｅＯＨ＝９：１：０〜０：１：２０）で精製して、白色結晶の標題化合物を得た（収量０．１９ｇ，０．２２ｍｍｏｌ，５４％）。【０１３５】 １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１．４６（３Ｈ，ｓ，５−ＣＨ３  ５’Ｔ），１．６８（３Ｈ，ｓ，５−ＣＨ３  ３’Ｔ），１．９０−２．３６（４Ｈ，ｍ，２’−Ｈ），３．０５−３．３２（４Ｈ，ｍ，５’−Ｈ），３．７１（６Ｈ，ｓ，ＯＣＨ３），３．８９−３．９２（２Ｈ，ｍ，４’−Ｈ），４．０２−４．３１（４Ｈ，ｍ，３’−Ｈ），５．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，ＯＨ），６．１５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１’−Ｈ  ５’Ｔ），６．２１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１’−Ｈ  ３’Ｔ），６．８４−７．４２（１３Ｈ，ｍ，ＤＭＴｒ），７．５５（１Ｈ，ｓ，６−Ｈ  ５’Ｔ），７．７５−７．５５（１Ｈ，ｍ，６−Ｈ  ３’Ｔ），７．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，ＮＨ），１１．３０（１Ｈ，ｓ，ＮＨ  ５’Ｔ），１１．３３（１Ｈ，ｓ，ＮＨ  ３’Ｔ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１１．７８，１２．１４，３７．０１，３８．６０，５０．６５，５４．９８，５５．００，６３．１１，６４．６３，７０．６８，８２．６８，８３．５６，８３．７７，８４．０６，８５．７６，１０９．５０，１０９．６７，１１３．１７，１２６．７３，１２７．６５，１２７．８４，１２９．６７，１２９．７１，１３５．２４，１３５．３１，１３５．７８，１３５．９１，１４４．６８，１５０．２８，１５０．４７，１５５．４９，１５８．０９，１５８．１２，１６３．６３，１６３．６８．
ＦＡＢ−ＨＲＭＳ（ＮＢＡ）ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ４２Ｈ４５Ｎ５Ｏ１２（ＭＨ＋），８１２．３１４３；ｆｏｕｎｄ，８１２．３１３７．【０１３６】  （ｉｖ）ユニット化合物（Ｘ−１２）の製造
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−アミノチミジリルカルバモイルチミジン（０．５０ｇ，０．６１ｍｍｏｌ）のピリジン（６．１ｍＬ）溶液に、ＤＭＡＰ（少量）および無水コハク酸（０．１８ｇ，１．８３ｍｍｏｌ，３．０当量）を加え、その反応混合物を２日撹拌した。その反応混合物をクロロホルムで希釈した。そのクロロホルム溶液を、水（３回）で洗浄し、その後硫酸ナトリウムで乾燥させた。そのクロロホルム溶液から溶媒を減圧留去した。得られた残渣の一部（０．５５ｇ，０．６１ｍｍｏｌ，４．０当量）を一晩、真空乾燥させた。その残渣のＤＭＦ（１５ｍＬ）溶液に、ＣＰＧ（１．６５ｇ，０．１５ｍｍｏｌ，９０．４μｍｏｌ／ｇ）を加え、ＣＰＧを膨潤させた。３０分間後、その反応混合物に、さらにＷＳＣ（０．１２ｇ，０．６０ｍｍｏｌ，１．０当量）を加え、３日間振とうした。その反応混合物を減圧ろ過した後、得られたろ取物をピリジンで洗浄し、その後乾燥させた。前記ろ取物に、ＤＭＡＰの０．１Ｍピリジンおよび無水酢酸の混合物（ピリジン：無水酢酸＝９：１）溶液（２０ｍＬ）を加え、室温で１日間振とうさせた。その反応混合物を減圧ろ過した後、得られたろ取物をメタノールおよびアセトンで順次洗浄し、その後乾燥させて、標題のユニット化合物を得た（ＣＰＧの化合物の活性＝４４．４μｍｏｌ／ｇ）（収量０．９３ｇ）。【０１３７】（実施例１−０３）
（３）（Ｘ−１３）で表されるユニット化合物の製造【０１３８】
【化５６】
2006025154.tif 000023
【０１３９】  （ｉ）５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−アミノ−（５’’−アミノチミジリル）ウレアチミジン（５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ−３’−ａｍｉｎｏ−（５’’−ａｍｉｎｏｔｈｙｍｉｄｉｌｙｌ）ｕｒｅａｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）の製造
３’−アミノ−５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルチミジン（ＩＶ−１２）（０．２６ｇ，０．７４ｍｍｏｌ）のピリジン（５ｍＬ）溶液に、ＤＭＡＰ（０．０１８ｇ，０．１５ｍｍｏｌ，０．２当量）およびＩｍ２ＣＯ（０．１２ｇ，０．７４ｍｍｏｌ，１当量）を加え、その反応混合物を３．５時間撹拌した。５’−アミノチミジン（ＩＩＩ−１１）（０．２２ｇ，０．８９ｍｍｏｌ，１．２当量）のピリジン（２ｍＬ）溶液を、その反応混合物に滴下して加えた後、その反応混合物を１２時間撹拌した。前記反応混合物を酢酸エチルで抽出した後、その酢酸エチル溶液から溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３：ＣＨ３ＯＨ＝１００：３〜１０：１）で精製して、白色結晶の標題化合物を得た（収量０．２６ｇ，０．４２ｍｍｏｌ，収率５７％）。【０１４０】 １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．０６（６Ｈ，ｓ，ＴＢＤＭＳ−ＣＨ３），０．８７（９Ｈ，ｓ，ｔ−ブチル），１．７７（３Ｈ，ｓ，５−ＣＨ３  ５’Ｔ），１．７９（３Ｈ，ｓ，５−ＣＨ３  ３’Ｔ），２．０５−２．１７（４Ｈ，ｍ，２’−Ｈ），３．１３−３．１６（４Ｈ，ｍ，５’−Ｈ），３．７０−３．８４（２Ｈ，ｍ，４’−Ｈ），４．１０−４．１２（１Ｈ，ｍ，３’−Ｈ  ５’Ｔ），５．２６−５．２７（１Ｈ，ｍ，−ＯＨ），５．９８（１Ｈ，ｔ，１’−Ｈ  ５’Ｔ），６．１２−６．１３（１Ｈ，ｍ，３’−Ｈ  ３’Ｔ），６．４５−６．４７（１Ｈ，ｍ，１’−Ｈ  ３’Ｔ），７．４８−７．５０（２Ｈ，ｓ，６−Ｈ），１１．２９−１１．３２（２Ｈ，ｓ，ＮＨ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：−５．４７，−５．４３，１２．１０，１２．２６，１８．０８，２５．８１，３７．６７，３８．４５，４１．７８，４９．９９，６３．４６，７１．１３，７９．１９，８３．５８，８３．７６，８５．２４，８５．５１，１０９．４１，１０９．７４，１３５．４９，１３６．１０，１５０．３４，１５０．４７，１５７．５３，１６３．６９，１６３．７４．
ＦＡＢ−ＨＲＭＳ（ＮＢＡ）ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２７Ｈ４３Ｎ６Ｏ９Ｓｉ（ＭＨ＋），６２３．２８７０７；ｆｏｕｎｄ，６２３．２８６０６．【０１４１】  （ｉｉ）３’−アミノ−（５’’−アミノチミジリル）ウレアチミジン（３’−ａｍｉｎｏ−（５’’−ａｍｉｎｏｔｈｙｍｉｄｉｌｙｌ）ｕｒｅａｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）の製造
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−アミノ−（５’’−アミノチミジリル）ウレアチミジン（０．９０ｇ，１．４４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１４ｍＬ）溶液に、ＴＢＡＦ（２ｍＬ，２ｍｍｏｌ，１．４当量）を加え、その反応混合物を１０時間撹拌した。その反応混合物から溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３：ＣＨ３ＯＨ＝２０：１〜５：１）で精製して、白色結晶の標題化合物を得た（収量０．７２ｇ，１．４３ｍｍｏｌ，収率９９％）。【０１４２】 １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１．７６（３Ｈ，ｓ，５−ＣＨ３  ５’Ｔ），１．７８（３Ｈ，ｓ，５−ＣＨ３  ３’Ｔ），１．９４−２．２０（４Ｈ，ｍ，２’−Ｈ），３．４２−３．６９（４Ｈ，ｍ，５’−Ｈ），４．１０−４．２４（２Ｈ，ｍ，４’−Ｈ），５．０４−５．０７（１Ｈ，ｍ，ＯＨ  ５’Ｔ），５．２７−５．２８（１Ｈ，ｍ，ＯＨ  ３’Ｔ），６．０２（１Ｈ，ｍ，３’−Ｈ  ５’Ｔ），６．０９−６．１５（２Ｈ，ｍ，１’−Ｈ  ５’Ｔ  ａｎｄ  ３’−Ｈ  ３’Ｔ），６．４３−６．４５（１Ｈ，ｍ，１’−Ｈ  ３’Ｔ），７．４８（１Ｈ，ｓ，６Ｈ  ５’Ｔ），７．７３（１Ｈ，ｓ，６Ｈ  ３’Ｔ），１１．２８（２Ｈ，ｓ，ＮＨ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１２．０７，１２．２５，３７．６６，３８．３５，４９．７８，６１．２３，７１．０８，８３．３３，８３．６９，８５．４３，１０９．２７，１０９．７４，１３６．０５，１５０．３９，１５０．４５，１５７．６３，１６３．７１，１６３．７３．
ＦＡＢ−ＨＲＭＳ（ＮＢＡ）ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２１Ｈ２８Ｎ６Ｏ９（ＭＨ＋），５０９．１９９６；ｆｏｕｎｄ，５０９．１９９６．【０１４３】  （ｉｉｉ）５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−アミノ−（５’’−アミノチミジリル）ウレアチミジン（５’−Ｏ−（４，４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ）−３’−ａｍｉｎｏ−（５’’−ａｍｉｎｏｔｈｙｍｉｄｉｌｙｌ）ｕｒｅａｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）の製造
３’−アミノ−（５’’−アミノチミジリル）ウレアチミジン（０．８０ｇ，１．５７ｍｍｏｌ）のピリジン（１５．７ｍＬ）溶液に、ＤＭＡＰ（少量）およびＤＭＴｒＣｌ（０．６４ｇ，１．９０ｍｍｏｌ，１．２当量）を加え、その反応混合物を１日間撹拌した。その反応混合物を酢酸エチルで希釈した。その酢酸エチル溶液を、水（１回）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１回）および飽和ＮａＣｌ水溶液（１回）で順次洗浄し、その後硫酸ナトリウムで乾燥させた。その酢酸エチル溶液から溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：ＡｃＯＥｔ：ＭｅＯＨ＝９：１：０〜０：１：２０）で精製して、白色結晶の標題化合物を得た（収量０．３０ｇ，０．３７ｍｍｏｌ，収率２４％）。【０１４４】 １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１．４３（３Ｈ，ｓ，５−ＣＨ３  ５’Ｔ），１．７３（３Ｈ，ｓ，５−ＣＨ３  ３’Ｔ），１．９８−２．３２（４Ｈ，ｍ，２’−Ｈ），３．１４−３．２８（４Ｈ，ｍ，５’−Ｈ），３．７２（６Ｈ，ｓ，ＯＣＨ３），３．８６−４．０４（２Ｈ，ｍ，４’−Ｈ），４．０７−４．３６（１Ｈ，ｍ，３’−Ｈ  ５’Ｔ），５．２７（１Ｈ，ｍ，ＯＨ），６．０３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，１’−Ｈ  ５’Ｔ），６．０３−６．１６（１Ｈ，ｍ，３’−Ｈ  ３’Ｔ），６．３８−６．４０（１Ｈ，ｍ，１’−Ｈ  ３’Ｔ），６．８０−７．３０（１３Ｈ，ｍ，ＤＭＴｒ），７．４９（１Ｈ，ｓ，６−Ｈ  ５’Ｔ），７．５３（１Ｈ，ｓ，６−Ｈ  ３’Ｔ），１１．２９（１Ｈ，ｓ，ＮＨ  ５’Ｔ），１１．３４（１Ｈ，ｓ，ＮＨ  ３’Ｔ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１１．７７，１２．０８，１４．１０，２０．７８，３９．９２，４０．１３，４１．８３，４９．７５，５５．０３，５９．７７，６３．３１，７１．１３，８３．３０，８３．５６，８３．７５，８５．５１，８５．７８，１０９．４６，１０９．７６，１１３．２２，１２３．９３，１２６．７６，１２７．７２，１２７．８９，１２９．７７，１３５．２９，１３５．４５，１３５．７１，１３６．０８，１４４．７７，１４９．６３，１５０．３４，１５０．４８，１５７．４４，１５８．１３，１６３．７２．
ＦＡＢ−ＭＳ（ＮＢＡ）ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ４２Ｈ４６Ｎ６Ｏ１１（ＭＨ−），８０９．３１４６８；ｆｏｕｎｄ，８０９．３１３７６．【０１４５】  （ｉｖ）ユニット化合物（Ｘ−１３）の製造
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−アミノ−（５’’−アミノチミジリル）ウレアチミジン（０．７２ｇ，０．８８ｍｍｏｌ）のピリジン（８．８ｍＬ）溶液に、ＤＭＡＰ（少量）および無水コハク酸（０．２９ｇ，２．８７ｍｍｏｌ，３．０当量）を加え、その反応混合物を２日撹拌した。前記反応混合物をクロロホルムで希釈した。そのクロロホルム溶液を、水（３回）で洗浄し、その後硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記クロロホルム溶液から溶媒を減圧留去した。得られた残渣の一部（０．５５ｇ，０．６１ｍｍｏｌ，４．０当量）を一晩、真空乾燥させた。その残渣のＤＭＦ（１５ｍＬ）にＣＰＧ（１．１０ｇ，０．１５ｍｍｏｌ，１３６μｍｏｌ／ｇ）を加えて膨潤させた。３０分後、その反応混合物に、さらにＷＳＣ（０．１２ｇ，０．６０ｍｍｏｌ，１．０当量）を加え、３日間振とうした。その反応混合物を減圧ろ過した後、得られたろ取物をピリジンで洗浄し、その後乾燥させた。前記ろ取物に、ＤＭＡＰの０．１Ｍピリジンおよび無水酢酸混合物（ピリジン：無水酢酸＝９：１）溶液（２０ｍＬ）を加え、室温で１日間振とうさせた。その反応混合物を減圧ろ過した後、得られたろ取物をメタノールおよびアセトンで順次洗浄し、その後乾燥させて、標題のユニット化合物を得た（ＣＰＧの化合物の活性＝３８．４μｍｏｌ／ｇ）（収量１．０９ｇ）。【０１４６】  一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端から１番目と２番目のヌクレオシド間の、３’，５’−リン酸ジエステル結合が、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−で置き換えられた修飾一本鎖オリゴヌクレオチドの製造
標的タンパクはホモサピエンス・リボヌクレアーゼＬ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｌ）（２’，５’−ｏｌｉｇｏｉｓｏａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，ＲＮａｓｅ  Ｌ）［ｇｉ：３０７９５２４６］とし、標的配列は開始コドンから９２番目から１１４番目にあたる配列番号１からなる塩基配列とした。修飾一本鎖オリゴヌクレオチドとして、この配列番号１からなる塩基配列に対し、設計されたｓｉＲＮＡ配列の修飾ＲＮＡセンス鎖（配列番号２、３および４）と、修飾ＲＮＡアンチセンス鎖（配列番号５、６および７）とを製造した。比較として、配列番号１からなる塩基配列に対し、設計されたｓｉＲＮＡ配列のＲＮＡセンス鎖（配列番号８）およびＲＮＡアンチセンス鎖（配列番号９）を製造した。【０１４７】  （参考例１−１ｓ）
なお、配列番号８からなるＲＮＡセンス鎖は、３’末端のＴＴ二量体配列を合成するために、市販のｄＴ樹脂（ＣＰＧ樹脂に結合）（グレンリサーチ社製）を使用した。それ以外は、配列番号８に従い、核酸自動合成機によるホスホロアミダイト法により、ＣＰＧ樹脂に結合した配列番号８のオリゴヌクレオチドを製造した。１μｍｏｌの前記ｄＴ樹脂を使用し、各縮合時間は１５分とした。【０１４８】  前記ＣＰＧ樹脂に結合した配列番号８のオリゴヌクレオチドは、ＤＭＴｒ基を除去した状態で核酸自動合成機による合成を終了した。【０１４９】  前記ＣＰＧ樹脂に結合したオリゴヌクレオチドは、それぞれ、エタノールおよびアンモニア混合（ＥｔＯＨ：ＮＨ３＝１：３）溶液（２ｍＬ）中で５５℃で１２時間反応させた。反応混合物を減圧ろ過し、得られたろ液をエッペンドルフチューブにそれぞれ移し、その後、減圧下で濃縮した。得られた濃縮物に、１ＭのＴＢＡＦのＴＨＦ溶液（１ｍＬ）をそれぞれ加え、１２時間の間、振とうさせた。この反応溶液を、それぞれ０．１ＭのＴＥＡＡ緩衝液で３０ｍＬに希釈した。この希釈溶液を、Ｃ−１８逆相カラム（Ｓｅｐ−Ｐａｋ）（ＣＨ３ＣＮ（１０ｍＬ）および０．１ＭのＴＥＡＡ緩衝液（１０ｍＬ）を予め順次流して、平衡化した）にそれぞれ通し、カラムに吸着させた。このカラムを滅菌水で洗浄して塩を除去し、その後、アセトニトリルと水の混合物（５０％ＣＨ３ＣＮ水（３ｍＬ））でそれぞれ溶出した。得られた溶出液を減圧下にそれぞれ濃縮した。得られた濃縮物を、充填溶液（９０％ホルムアミド中の１×ＴＢＥ溶液）（１００μＬ）にそれぞれ溶解させた。その溶液を、２０％ＰＡＧＥ（２０Ａ，６時間）（泳動用緩衝液は、１×ＴＢＥ緩衝液を用いた）を用いてそれぞれ分離し、目的とするオリゴヌクレオチドのバンドを切り出した。切りだしたバンドに、０．１ＭのＥＤＴＡ水溶液（２０ｍＬ）をそれぞれ加え、一晩放置した。このＥＤＴＡ水溶液の液体部分を、Ｃ−１８逆相カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐ−Ｐａｋ）（溶離液：水中、５０％ＣＨ３ＣＮ（３ｍＬ））によりそれぞれ精製して、目的とするオリゴヌクレオチドを得た。【０１５０】  前記参考例において用いた、以下の溶液の調製方法について説明する。【０１５１】  ０．１ＭのＴＥＡＡ緩衝液は、以下のようにして調製した。まず、２Ｎの酢酸（１１４．３８ｍＬ）およびトリエチルアミン（２７７．６ｍＬ）の混合物に、水を加えて１Ｌにした。その溶液に酢酸を加えて、ｐＨを７．０に調整し、次いでその溶液を２０倍に希釈することにより調製した。【０１５２】  ２０％ＰＡＧＥは、以下のようにして調製した。まず、４０％アクリルアミド（アクリルアミド：Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド＝１９：１）溶液（４５ｍＬ）、尿素（３７．８ｇ）および１０×ＴＢＥ緩衝液（９ｍＬ）を混合して溶解させ、その後水を加えて９０ｍＬとした。その溶液に、ＡＰＳ（６２ｍｇ）を加えて溶解させた後、ＴＥＭＥＤ（４５μＬ）を加えて振り混ぜた。その溶液を、１．５ｍｍスペーサーを挟んで固定した２枚ガラス板の間に流し込み、１時間以上静置して固化させて、２０％ＰＡＧＥを得た。【０１５３】  ０．１ＭのＥＤＴＡ水溶液は、ＥＤＴＡ・４Ｎａ（１．８０ｇ）を水（４０ｍＬ）に溶解させることにより調製した。【０１５４】  ４０％アクリルアミド（アクリルアミド：Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド＝１９：１）溶液は、アクリルアミド（１９０ｇ）およびＮ，Ｎ’−ビスアクリルアミド（１０ｇ）を水に溶解させて、５００ｍＬにすることで調製した。【０１５５】  １０×ＴＢＥ緩衝液は、Ｔｒｉｓ（１０９ｇ）、ホウ酸（５５ｇ）およびＥＤＴＡ・２Ｎａ（７．４３ｇ）を水に溶解させて１Ｌにすることで調製した。【０１５６】  得られたオリゴヌクレオチドを、水（１ｍＬ）に溶解させ、水で１００倍に希釈して希釈液を調製した。その希釈液の吸光度（２６０ｎｍ）を測定し、収量を算出した。その吸光度のε値、２６０ｎｍにおける吸光度および収量を、表１に示す。また、得られたオリゴヌクレオチドの分子量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳにより確認した。その結果も、表１に示す。【０１５７】  （参考例１−１ａ）
配列番号８の代わりに配列番号９を用いた以外は、参考例１−１ｓと同様にして、配列番号９からなるＲＮＡアンチセンス鎖を製造した。【０１５８】  （参考例１−２）
配列番号９からなる修飾一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端に３２Ｐラベルを施した以外は、参考例１−１ａと同様にして、配列番号９からなる一本鎖オリゴヌクレオチドをそれぞれ製造した。【０１５９】  （参考例１−３ａ）
同様に、フルオレセインで５’末端が修飾された、配列番号９からなる修飾一本鎖オリゴヌクレオチドは、５’末端として、フルオレセインホスホロアミダイト（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ  Ｐｈｏｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）（グレン・リサーチ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）社製）を追加する以外は、参考例１−１ｓと同様にして、フルオレセインで５’末端が修飾された、配列番号９からなる一本鎖オリゴヌクレオチドを、製造した。【０１６０】  （参考例１−４）
配列番号８の代わりに配列番号１２を用いた以外は、参考例１−１ｓと同様にして、配列番号１２からなるＲＮＡ一本鎖を製造した。【０１６１】  （実施例１−１ｓ）
また、配列番号２からなる修飾一本鎖オリゴヌクレオチドは、前記ｄＴ樹脂の代わりに、前記（Ｘ−１１）で表されるユニット化合物を用いた以外は、参考例１−１ｓと同様にして、配列番号２からなる修飾一本鎖オリゴヌクレオチドを、製造した。【０１６２】  （実施例１−１ａ）
また、配列番号５からなる修飾一本鎖オリゴヌクレオチドは、前記ｄＴ樹脂の代わりに、前記（Ｘ−１１）で表されるユニット化合物を用いた以外は、参考例１−１ｓと同様にして、配列番号５からなる修飾一本鎖オリゴヌクレオチドを、製造した。【０１６３】  （実施例１−２ｓ）
また、配列番号３からなる修飾一本鎖オリゴヌクレオチドは、前記ｄＴ樹脂の代わりに、前記（Ｘ−１２）で表されるユニット化合物を用いた以外は、参考例１−１ｓと同様にして、配列番号３からなる修飾一本鎖オリゴヌクレオチドを、製造した。【０１６４】  （実施例１−２ａ）
また、配列番号６からなる修飾一本鎖オリゴヌクレオチドは、前記ｄＴ樹脂の代わりに、前記（Ｘ−１２）で表されるユニット化合物を用いた以外は、参考例１−１ｓと同様にして、配列番号６からなる修飾一本鎖オリゴヌクレオチドを、製造した。【０１６５】  （実施例１−３ｓ）
また、配列番号４からなる修飾一本鎖オリゴヌクレオチドは、前記ｄＴ樹脂の代わりに、前記（Ｘ−１３）で表されるユニット化合物を用いた以外は、参考例１−１ｓと同様にして、配列番号４からなる修飾一本鎖オリゴヌクレオチドを、製造した。【０１６６】  （実施例１−３ａ）
また、配列番号７からなる修飾一本鎖オリゴヌクレオチドは、前記ｄＴ樹脂の代わりに、前記（Ｘ−１３）で表されるユニット化合物を用いた以外は、参考例１−１ｓと同様にして、配列番号７からなる修飾一本鎖オリゴヌクレオチドを、製造した。【０１６７】  （実施例１−４ａ）
同様に、フルオレセインで５’末端が修飾された、配列番号６からなる修飾一本鎖オリゴヌクレオチドは、５’末端として、フルオレセインホスホロアミダイト（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ  Ｐｈｏｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）（グレン・リサーチ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）社製）を追加する以外は、実施例１−２ａと同様にして、フルオレセインで５’末端が修飾された、配列番号６からなる修飾一本鎖オリゴヌクレオチドを、製造した。【０１６８】  （実施例１−５ａ）
配列番号６からなる修飾一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端に３２Ｐラベルを施した以外は、実施例１−２ａと同様にして、配列番号６からなる５’末端に３２Ｐラベル修飾一本鎖オリゴヌクレオチドを製造した。【０１６９】  （実施例１−６）
また、配列番号１０からなる修飾一本鎖オリゴヌクレオチドは、前記ｄＴ樹脂の代わりに、前記（Ｘ−１２）で表されるユニット化合物を用いた以外は、参考例１−１ｓと同様にして、配列番号１０からなる修飾一本鎖オリゴヌクレオチドを、製造した。【０１７０】  （実施例１−７）
また、配列番号１１からなる修飾一本鎖オリゴヌクレオチドは、前記ｄＴ樹脂の代わりに、前記（Ｘ−１３）で表されるユニット化合物を用いた以外は、参考例１−１ｓと同様にして、配列番号１１からなる修飾一本鎖オリゴヌクレオチドを、製造した。【０１７１】  なお、参照例１−１ｓおよび１−１ａで得られた配列番号８および９のオリゴヌクレオチドは、以下、それぞれ（ｄＴ−ｓ）および（ｄＴ−ａ）と表記する。参考例１−２で得られた配列番号９からなるオリゴヌクレオチドは、以下、（ＰｄＴ−ａ）と表記する。参考例１−３ａで得られた、フルオレセインで５’末端が修飾された配列番号９からなるオリゴヌクレオチドは、以下、（ＦｄＴ−ａ）と表記する。参考例１−４で得られた配列番号１２のオリゴヌクレオチドは、以下、（ｄ−ｓａ）と表記する。【０１７２】  実施例１−１ｓおよび１−１ａで得られた配列番号２および５からなる修飾一本鎖オリゴヌクレオチドは、以下、それぞれ（１１−ｓ）および（１１−ａ）と表記する。実施例１−２ｓおよび１−２ａで得られた配列番号３および６からなる修飾一本鎖オリゴヌクレオチドは、以下、それぞれ（１２−ｓ）および（１２−ａ）と表記する。実施例１−３ｓおよび１−３ａで得られた配列番号４および７からなる修飾一本鎖オリゴヌクレオチドは、以下、それぞれ（１３−ｓ）および（１３−ａ）と表記する。実施例１−４ａで得られた、フルオレセインで５’末端が修飾された、配列番号６からなる修飾一本鎖オリゴヌクレオチドは、以下、（Ｆ１２−ａ）と表記する。実施例１−５ａで得られた配列番号６からなる修飾一本鎖オリゴヌクレオチドは、以下、（Ｐ１２−ａ）と表記する。実施例１−６および１−７で得られた配列番号１０および１１からなる修飾一本鎖オリゴヌクレオチドは、以下、それぞれ（１６−ｓａ）および（１７−ｓａ）と表記する。【０１７３】
【表１】
2006025154.tif 000024
【０１７４】  前記オリゴヌクレオチドの吸光度および収量は、以下のようにして測定した。【０１７５】  前記オリゴヌクレオチドを水に溶解させて、水溶液を調製し、その水溶液を、波長２６０ｎｍでの吸光度（Ａｂｓ２６０）が、吸光度計の有効範囲になるように希釈した。光路長（ｌ）１ｃｍの吸光度測定用石英セルを用い、室温にてＡｂｓ２６０を測定した。ＯＤ２６０値の計算には以下の式（１）を用いて算出した。
ＯＤ２６０（ε・Ｍ・ｍＬ−１）＝Ａｂｓ２６０（ε・ｃｍ・Ｍ）×Ｖ−１（ｍＬ）×１−１（ｃｍ）    （１）
前記式（１）中、Ａｂｓ２６０は、前記オリゴヌクレオチド溶液の波長２６０ｎｍにおける吸光度を示し、Ｖは溶液の全量を示し、ｌは光路長を示し、Ｍはモル濃度を示す。【０１７６】  前記式（１）中、前記オリゴヌクレオチドのモル吸光係数ε２６０は、以下の式（２）を用いて算出した。
ε＝２｛ε（Ｎ１ｐＮ２）＋ε（Ｎ２ｐＮ３）＋・・・＋ε（Ｎｎ−１ｐＮｎ）｝−｛ε（Ｎ２）＋ε（Ｎ３）＋・・・＋ε（Ｎｎ−１）｝    （２）
前記式（２）中、ε（Ｎｎ）はある核酸Ｎｎのε２６０を示し、ε（Ｎｎ−１ｐＮｎ）はある核酸二量体Ｎｎ−１ｐＮｎのε２６０を示す。なお、（１１−ｓ）、（１１−ａ）、（１２−ｓ）、（１２−ａ）、（１３−ｓ）、（１３−ａ）、（Ｆ１２−ｓ）、（Ｆ１２−ａ）、（Ｐ−１２−ａ）および（Ｐ１３−ａ）については、修飾された３’末端部分のＴＴ配列をＵＵ配列としてε２６０を計算した。【０１７７】  濃度Ｃ（ｍｏｌ／Ｌ）は、以下の式（３）を用いて算出した。
Ｃ＝Ａｂｓ２６０×ε２６０−１×１−１    （３）【０１７８】  前記式（３）中、Ａｂｓ２６０、ε２６０、および１は、前記のとおりである。
修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの製造【０１７９】（実施例２−１）
実施例１−１ｓで製造した、（１１−ｓ）（３５ｎｍｍｏｌ）と実施例１−１ａで製造した（１１−ａ）（３５ｎｍｏｌ）を、アニーリングバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および１００ｍＭのＮａＣｌ）中に溶解させた。その溶液を９０℃で１分間、次いで３７℃で１時間の間、インキュベートして、図１に示すような、配列番号２および配列番号５からなる修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを得た。【０１８０】  （実施例２−２）
（１１−ｓ）および（１１−ａ）の代わりに、（１２−ｓ）および（１２−ａ）を用いた以外は、実施例２−１と同様にして、図１に示すような、配列番号３および配列番号６からなる修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを得た。【０１８１】  （実施例２−３）
（１１−ｓ）および（１１−ａ）の代わりに、（１３−ｓ）および（１３−ａ）を用いた以外は、実施例２−１と同様にして、図１に示すような、配列番号４および配列番号７からなる修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを得た。【０１８２】  （実施例２−４）
（１１−ｓ）および（１１−ａ）の代わりに、（１２−ｓ）および（Ｆ１２−ａ）を用いた以外は、実施例２−１と同様にして、図１に示すような、配列番号３と、配列番号６にさらに５’末端がフルオレセインで修飾された配列とからなる修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを得た。【０１８３】  （実施例２−５）
実施例１−２ｓで製造した、（１２−ｓ）（８０ｐｍｍｏｌ）と実施例１−５ａで製造した（Ｐ１２−ａ）（８０ｐｍｍｏｌ）を、アニーリングバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および１００ｍＭのＮａＣｌ）中に溶解させた。その溶液を９５℃で３分間加熱し、次いで室温で１時間の間、インキュベートして、図１に示すような、配列番号３および５’末端に３２Ｐラベルを有する配列番号６からなる修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを得た。【０１８４】  （実施例２−６）
（１１−ｓ）および（１１−ａ）の代わりに、（１６−ｓａ）および（１６−ｓａ）を用いた以外は、実施例２−１と同様にして、図７に示すような、配列番号１０および配列番号１０からなる修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを得た。【０１８５】  （実施例２−７）
（１１−ｓ）および（１１−ａ）の代わりに、（１７−ｓａ）および（１７−ｓａ）を用いた以外は、実施例２−１と同様にして、図７に示すような、配列番号１１および配列番号１１からなる修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを得た。【０１８６】  （参考例２−１）
（１１−ｓ）および（１１−ａ）の代わりに、（ｄＴ−ｓ）および（ｄＴ−ａ）を用いた以外は、実施例２−１と同様にして、図１に示すような、配列番号８および配列番号９からなる二本鎖オリゴヌクレオチドを得た。【０１８７】  （参考例２−２）
（１１−ｓ）および（１１−ａ）の代わりに、（ｄＴ−ｓ）および（ＰｄＴ−ａ）を用いた以外は、実施例２−１と同様にして、図１に示すような、配列番号８および配列番号９からなる二本鎖オリゴヌクレオチドを得た。【０１８８】  （参考例２−３）
（１１−ｓ）および（１１−ａ）の代わりに、（ｄ−ｓａ）および（ｄ−ｓａ）を用いた以外は、実施例２−１と同様にして、図７に示すような、配列番号１２および配列番号１２からなる二本鎖オリゴヌクレオチドを得た。【０１８９】  （修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの評価）
１．細胞内でのＲＮａｓｅＬ発現の評価
（１）細胞培養
細胞培養１０％ＦＢＳ、ペニシリン（１００ユニット／ｍｌ）およびストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で、３７℃でＨＴ１０８０細胞を増殖させた。指数増殖を維持するため、細胞を定期的に継代した。約２５％コンフルエンシーでのトランスフェクションの２４時間前に、ＨＴ１０８０細胞をトリプシン処理し、抗生物質を含まない新しい培地を用いて希釈し、３５ミリデイッシュに移した（２ｍｌ／デイッシュ）。【０１９０】  （２）修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの細胞へのトランスフェクション
リポフェクタミン２０００試薬（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製）を用いて、接着細胞株に対して以下に記載する方法で修飾二本鎖オリゴヌクレオチドのトランスフェクションを行ったまず、ＲＰＭＩ１６４０培地（抗生物質およびＦＢＳを含まない）に、二本鎖オリゴヌクレオチド（前記培地２５０μｌ当たり５０、１００ｎＭまたは２００ｎＭ）（実施例２−２得られた二本鎖オリゴヌクレオチド）を溶解させ、５分間室温でインキュベートした。その溶液に、５０倍希釈した等量のリポフェクタミン２０００試薬を添加し、その後２０分間室温でインキュベートした。得られた溶液のうち、５００μｌを採取して、前記（１）で調製した３５ミリデイッシュへ移してトランスフェクションを行った。トランスフェクションから２４時間インキュベーション後および４８時間インキュベーション後に、その３５ミリディッシュ中の細胞をインキュベートした。なお、その後、実施例２−３または参考例２−１で得られた二本鎖オリゴヌクレオチドのいずれについても、トランスフェクションされた細胞に対する毒性は確認されなかった。【０１９１】  （３）ウエスタンブロット法によるＲＮａｓｅＬ発現のモニター
トランスフェクションから２４時間インキュベーション後および４８時間インキュベーション後に得られたＨＴ１０８０細胞をトリプシン処理し、冷ＰＢＳ（−）で２回洗浄した。その後、得られた細胞ペレットを２倍量の低浸透圧緩衝液Ａ（０．５％（ｖ／ｖ）のノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＣＨ３ＣＯ２Ｋ、１５ｍＭの（ＣＨ３ＣＯ２）２Ｍｇ、１ｍＭのジチオトレイトール、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン）に懸濁させた。【０１９２】  得られた細胞懸濁液を１０分間氷上でインキュベートした後、タイト・フィッティング・ガラス・ドウース・ホモジナイザー（Ｔｉｇｈｔ−ｆｉｔｔｉｎｇ  ｇｌａｓｓ  ｄｏｕｎｃｅ  ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）を用いて氷上で３０回上下へストロークしてホモゲナイズした。得られたホモジナイズ液を、超遠心機（１００００×ｇ）を用いて４℃で１０分間遠心した。その後、遠心分離された上清液を回収し、その上清液に等量の２×サンプル緩衝液（０．１４ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８、０．２％（ｖ／ｖ）のグリセロール、２．８％（ｖ／ｖ）のＳＤＳ、適量のブロモフェノール・ブルー）を加え、沸騰水中で５分間インキュベートした。インキュベートされた上清液を７．５％のポリアクリルアミドゲル（ＡＴＴＯ）を用いて２０ｍＡ、７０分間、電気泳動により分離し、その後、ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）製）へタンパクを転写した。【０１９３】  前記ＰＶＤＦメンブレンを、５％の牛血清アルブミンで２５℃で１時間の間インキュベートした。その後、前記ＰＶＤＦメンブレンをＴＢＳＴ（２００ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．６、１．３７Ｍの塩化ナトリウム、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）で２回リンスした。そのＰＶＤＦメンブレンを、０．５μｇ／ｍｌの抗ＲＮａｓｅＬモノクローナル抗体で４℃、１６時間インキュベートした。その後、前記ＰＶＤＦメンブレンをＴＢＳＴで１５分間１回、次いで５分間３回、順次洗浄した。そのＰＶＤＦメンブレンを、次いでセイヨウワザビ・ペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）で標識された抗マウスＩｇＧ（５００μｇ／ｍＬを、１０００００倍希釈した）で２５℃で１時間インキュベートした。その後、前記ＰＶＤＦメンブレンをＴＢＳＴで１５分間１回、次いで５分間３回、順次洗浄した。【０１９４】  前記ＰＶＤＦメンブラン上のセイヨウワザビ・ペルオキシダーゼ標識の検出には、ＥＣＬプラス・ウエスタン・ブロッティング検出キット（ｐｒｕｓ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ）（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製）を用いて行った。前記ＰＶＤＦメンブラン上のセイヨウワザビ・ペルオキシダーゼ標識の定量は、デンシトメーター（Ｋｏｄａｋ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＤＣ２９０  Ｚｏｏｍ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｃａｍｅｒａ）を用いて行った。二本鎖オリゴヌクレオチドでの処理を行っていない細胞におけるＲＮａｓｅＬ強度を１として、二本鎖オリゴヌクレオチドでの処理細胞のＲＮａｓｅＬ強度の相対比を求めた。なお、求めた数値はＧＡＰＤＨ強度を１とし標準化した。得ら���た結果を図２（ａ）に示す。【０１９５】  （４）実施例２−２で得られた二本鎖オリゴヌクレオチドの代わりに、実施例２−３および参考例２−１でそれぞれ得られた二本鎖オリゴヌクレオチドを用いる以外は、（１）〜（３）と同様にして、二本鎖オリゴヌクレオチドでの処理細胞のＲＮａｓｅＬ強度の相対比を求めた。その結果は、図２（ｂ）および（ｃ）にそれぞれ示す。【０１９６】  前記図２（ａ）〜（ｃ）に示すように、本発明の修飾二本鎖オリゴヌクレオチドは、非修飾二本鎖オリゴヌクレオチドと比較して、ＲＮａｓｅＬの発現を抑制する効果が著しく向上していることが確認できた。このことは、本発明の修飾二本鎖オリゴヌクレオチドが、細胞膜の透過性に優れ、かつ細胞内での安定性または滞留性が向上したためと考えられる。【０１９７】  ２．細胞毒性の評価
（１）１．（２）に記載のようにして実施例２−２で得られた修飾二本鎖オリゴヌクレオチドをトランスフェクションした細胞について、その数を血球計数板を用いて位相差顕微鏡下で計数した。そのトランスフェクションされた細胞の生存率は、トリパンブルー色素排除試験法によって判定した。その際、細胞膜機能の低下により色素排除ができず、その結果トリパンブルーによって染色される細胞を死細胞とした。なお、生細胞数の総細胞数に対する百分率（％）を生存率とした。その結果、前記修飾二本鎖オリゴヌクレオチドのいずれの濃度（５０ｎＭ、１００ｎＭ、および２００ｎＭ）においても、細胞毒性は観察されなかった。【０１９８】  （２）実施例２−２で得られた二本鎖オリゴヌクレオチドの代わりに、実施例２−１、２−３および参考例２−１でそれぞれ得られた二本鎖オリゴヌクレオチドを用いる以外は、２．（１）と同様にして、細胞毒性を評価した。その結果、前記二本鎖オリゴヌクレオチドのいずれの濃度（５０ｎＭ、１００ｎＭ、および２００ｎＭ）においても、細胞毒性は観察されなかった。【０１９９】  ３．細胞内でのＲＮａｓｅＬに対するＩＣ５０の測定
（１）１．（２）において用いる二本鎖オリゴヌクレオチドの濃度を、前記培地２５０μｌ当たり５０、１００ｎＭまたは２００ｎＭの代わりに１ｎＭ、５ｎＭまたは１０ｎＭを用いる以外は、前記１．（１）〜（４）と同様にして二本鎖オリゴヌクレオチドでの処理細胞のＲＮａｓｅＬ強度の相対比を求めた。その結果を図３に示す。【０２００】  （２）また、実施例２−２で得られた二本鎖オリゴヌクレオチドの代わりに、実施例２−３および参考例２−１でそれぞれ得られた二本鎖オリゴヌクレオチドを用いる以外は、３．（１）と同様にして、二本鎖オリゴヌクレオチドでの処理細胞のＲＮａｓｅＬ強度の相対比を求めた。その結果を図３に示す。【０２０１】  （３）図３のグラフから、ＩＣ５０を求め、表２に示す。【０２０２】
【表２】
2006025154.tif 000025
【０２０３】  前記表２に示すように、本発明の修飾二本鎖オリゴヌクレオチドは、非修飾二本鎖オリゴヌクレオチドと比較して、ＲＮａｓｅＬの発現を抑制する効果が著しく向上していることが確認できた。この著しい向上は、本発明の修飾二本鎖オリゴヌクレオチドが、細胞膜の透過性に優れ、ヌクレアーゼ耐性が向上したことから予想される以上の優れた効果である。【０２０４】  ４．細胞内への修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの導入効果の評価
（１）免疫染色法による細胞内ＲＮａｓｅＬの観察
トランスフェクションを行う２４時間前に、ポリ−Ｌ−リジン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製）によりコートしたカバーガラスを３５ミリディッシュへ入れた。その３５ミリディッシュ内のカバーガラス上へ、容量２ｍＬのＨＴ１０８０細胞溶液を添加し、その後培養することにより、ＨＴ１０８０細胞をカバーガラス上へ予め固定した。【０２０５】  抗生物質およびＦＢＳを含まないＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）で、実施例２−２で得られた二本鎖オリゴヌクレオチドを希釈し、その後５分間室温でインキュベートした（希釈濃度＝培地２５０μｌあたり二本鎖オリゴヌクレオチド１０ｎＭまたは５０ｎＭ）。別途、抗生物質およびＦＢＳを含まないＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）（２５０μｌ）で、リポフェクタミン２０００試薬（インビトロジェン社製）（５μｇ）を希釈し、その後５分間室温でインキュベートした。インキュベート後の二本鎖オリゴヌクレオチド希釈溶液２５０μｌと、インキュベート後のリポフェクタミン２０００試薬溶液２５０μｌとを混合した後、その混合液を２０分間室温でインキュベートした。その混合液５００μｌを、先に調製したＨＴ１０８０細胞を予め固定したカバーガラスへ加え、トランスフェクションを行った。【０２０６】  トランスフェクションから２４時間の間インキュベートした後、前記カバーガラス上のＨＴ１０８０細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄した。その後、前記カバーガラス上の細胞を４％のパラホルムアルデヒドで４℃で１５分間インキュベートした。ＰＢＳ（−）で３回洗浄後、前記カバーガラス上の細胞を０．２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００溶液で室温で５分間インキュベートした。ＰＢＳ（−）で３回洗浄後、前記カバーガラス上の細胞を、０．５％の牛血清アルブミンで室温で３０分間インキュベートした。前記カバーガラス上の細胞をＰＢＳ（−）で３回洗浄後、１μｇ／ｍｌの抗ＲＮａｓｅＬモノクローナル抗体で室温で６０分間インキュベートした。そのカバーガラス上の細胞を、ＰＢＳ（−）で３回洗浄した。１０μｇ／ｍｌの蛍光（Ａｌｅｘａ  ４８８）標識マウスＩｇＧを前記カバーガラス上の細胞に添加し、室温で３０分間インキュベートした。その後、ＰＢＳ（−）で３回洗浄後、前記カバーガラス上の細胞を直ちに蛍光顕微鏡にて観察を行った。その結果を、図５に示す。対照として、実施例２−２で得られた二本鎖オリゴヌクレオチドの代わりに参考例２−１で得られた二本鎖オリゴヌクレオチドを用いた以外は、前記と同様として得られた結果も示す。【０２０７】  前記図５に示すように、本発明の修飾二本鎖オリゴヌクレオチドは、非修飾二本鎖オリゴヌクレオチドと比較して、顕著なＲＮａｓｅＬ蛍光強度の減少、すなわちＲＮａｓｅＬの発現に対する強い抑制効果を示していることが確認できた。【０２０８】  （２）蛍光顕微鏡による修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの細胞内導入効果の算出法
実施例２−２で得られた二本鎖オリゴヌクレオチド（１０ｎＭまたは５０ｎＭ）の濃度を、１０ｎＭの代わりに５０ｎＭまたは２５ｎＭにすること、および実施例２−２で得られた二本鎖オリゴヌクレオチドの代わりに実施例２−４で得られたフルオロセイン標識された二本鎖オリゴヌクレオチドを用いた以外は、４（１）に記載のようにして、二本鎖オリゴヌクレオチドをカバーガラス上のＨＴ１０８０細胞へトランスフェクションした。【０２０９】  トランスフェクションから２４時間の間インキュベートした後、前記カバーガラス上のＨＴ１０８０細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄した。その後、前記カバーガラス上の細胞を４％のパラホルムアルデヒドで４℃で１５分間インキュベートした。ＰＢＳ（−）で３回洗浄後、前記カバーガラス上の細胞を直ちに蛍光顕微鏡にて観察を行った。その結果を、図４に示す。得られた結果から、総細胞数当たりのフルオレセイン標識二本鎖オリゴヌクレオチドポジテイブな細胞数の割合を算出した。その結果を表３に示す。また、コントロールとしては、前記混合液の代わりに、インキュベート後のリポフェクタミン２０００試薬溶液５００μｌのみを先に調製したＨＴ１０８０細胞を予め固定したカバーガラスへ加え、トランスフェクションを行ったＨＴ１０８０細胞で得られた結果も図４に示す。【０２１０】
【表３】
2006025154.tif 000026
【０２１１】  前記図４および前記表３に示すように、本発明の修飾二本鎖オリゴヌクレオチドは、顕著なＲＮＡａｓｅＬ蛍光強度の減少、すなわち、ＲＮＡａｓｅＬの抑制が確認された。【０２１２】  ５．修飾一本鎖および二本鎖オリゴヌクレオチドのエキソヌクレアーゼ耐性の評価
実施例１−５ａで得られた配列番号６からなる修飾一本鎖オリゴヌクレオチド（５’末端を３２Ｐでラベルしたもの）、参考例１−２で得られた配列番号９からなる非修飾一本鎖オリゴヌクレオチド（５’末端を３２Ｐでラベルしたもの）、実施例２−５で得られた修飾二本鎖オリゴヌクレオチド（５’末端を３２Ｐでラベルしたもの）および参考例２−２で得られた非修飾二本鎖オリゴヌクレオチド（５’末端を３２Ｐでラベルしたもの）の、エキソヌクレアーゼ耐性を評価した。エキソヌクレアーゼとしては、ヘビ毒ホスホロジエステラーゼ（ＳＶＰ）を使用した。ＳＶＰは、リン酸ジエステル結合を選択的に切断しオリゴヌクレオチドを５’−モノリン酸ヌクレオチドに分解する。【０２１３】  以下に示す組成の反応溶液から、１、３、５、１０、３０、６０分後に各エッペンドルフチューブに分注しておいた充填溶液（７Ｍ尿素  ＸＣ  ＢＰＢ）（５μｌ）中に、反応液（５μｌ）をサンプリングして反応を停止させた。得られた各時間におけるサンプルを、２０％ポリアクリルアミドゲル（７Ｍ尿素含有）を用いて２０ｍＡ、１８０分間、電気泳動により分離して、修飾オリゴヌクレオチドの完全鎖の残存率（％）をｌｏｇ１０表示したものを縦軸に、反応時間を横軸にとって図６（ａ）および（ｂ）を作成した。そして、図６（ａ）および（ｂ）のグラフより、完全鎖の残存率が５０％になる時間（ｔ５０）を算出した。その結果を表４に示す。【０２１４】
【表４】
2006025154.tif 000027
【０２１５】  修飾一本鎖オリゴヌクレオチド（実施例１−５ａ）の反応溶液の組成
２０μＭ  修飾一本鎖オリゴヌクレオチド水溶液                              ４μＬ
緩衝液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ７．０））６μＬ
２ｕ／ｍＬ  ＳＶＰ水溶液                                                  ４μＬ
水                                                                      ２６μＬ
計                                                                      ４０μＬ【０２１６】  非修飾一本鎖オリゴヌクレオチド（参考例１−２）の反応溶液の組成
２０μＭ  非修飾一本鎖オリゴヌクレオチド水溶液                            ４μＬ
緩衝液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ７．０））６μＬ
２ｕ／ｍＬ  ＳＶＰ水溶液                                                  ４μＬ
水                                                                      ２６μＬ
計                                                                      ４０μＬ【０２１７】  修飾二本鎖オリゴヌクレオチド（実施例２−５）の反応溶液の組成
２０μＭ  修飾二本鎖オリゴヌクレオチド水溶液                              ４μＬ
緩衝液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ７．０））６μＬ
２ｕ／ｍＬ  ＳＶＰ水溶液                                                  ４μＬ
水                                                                      ２６μＬ
計                                                                      ４０μＬ【０２１８】  非修飾二本鎖オリゴヌクレオチド（参考例２−２）の反応溶液の組成
２０μＭ  非修飾二本鎖オリゴヌクレオチド水溶液                            ４μＬ
緩衝液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ７．０））６μＬ
２ｕ／ｍＬ  ＳＶＰ水溶液                                                  ４μＬ
水                                                                      ２６μＬ
計                                                                      ４０μＬ【０２１９】  図６および表４から、修飾一本鎖オリゴヌクレオチドは、非修飾一本鎖オリゴヌクレオチドと比較して、エキソヌクレアーゼ耐性が向上していることが確認された。また、修飾二本鎖オリゴヌクレオチドは、非修飾二本鎖オリゴヌクレオチドと比較して、エキソヌクレアーゼ耐性が著しく向上していることが確認された。特に二本鎖の修飾オリゴヌクレオチドは、一本鎖の修飾オリゴヌクレオチドの結果と比較しても、著しいヌクレアーゼ耐性の向上が確認され、この結果は、予想の範囲を超えるものである。【０２２０】  ６．修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの熱力学的安定性の評価
実施例２−６で得られた配列番号１０からなる修飾二本鎖オリゴヌクレオチド、実施例２−７で得られた配列番号１１からなる修飾二本鎖オリゴヌクレオチド、および参考例２−３で得られた配列番号１２からなる二本鎖オリゴヌクレオチドについて、熱力学的安定性を評価した。【０２２１】  前記オリゴヌクレオチド類について、ＭａｒｋｙとＢｌｅｓｌａｕｒの手法に従い、ｖａｎ’ｔ  Ｈｏｆｆトランジションエンタルピー（△Ｈ°）、エントロピー（△Ｓ°）、２９８Ｋにおける自由エネルギー（△Ｇ°）を算出した。△Ｇ°は標準状態において１ｍｏｌの一本鎖が１ｍｏｌの二本鎖になる場合、ある温度における反応の平衡状態から熱力学的エネルギーとしてどの程度傾いているかを示すもので、この値から二本鎖の熱力学的安定性を評価できる。この値の−符号は一本鎖状態より二本鎖状態が安定であることを表しており、この絶対値が大きいほど二本鎖の状態が安定であることを示している。△Ｈ°は標準状態において１ｍｏｌの一本鎖が１ｍｏｌの二本鎖になるときの熱エネルギー収支の変化を表しており、−の符号は発熱反応を表し、この絶対値が大きいほど二本鎖が熱エネルギー的に安定であることを示している。△Ｓ°は標準状態において１ｍｏｌの一本鎖が１ｍｏｌの二本鎖になるときの乱雑さの変化を表しており、−符号はより秩序ない状態に向かうことを示すものであり、この絶対値が小さいほど二本鎖形成に有利であることを示す。そして△Ｇ°と△Ｈ°および△Ｓ°との関係は、下記式（４）で表される。
△Ｇ°＝△Ｈ°−Ｔ△Ｓ°                ・・・（４）
すなわち、二本鎖の熱力学的安定性は反応の熱エネルギー収支と乱雑さの変化との差によって決まる。【０２２２】  オリゴヌクレオチド類の濃度を数段階に分けてＴｍを測定した。このＴｍ値は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＤＵ  ６４０  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒで測定した。測定に当たっては、ｂｕｆｆｅｒとして１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４，１Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）を用いた。得られたＴｍ値を用い、式（５）に基いて１／Ｔｍ対ｌｎ  Ｃｔ／４（Ｃｔはオリゴヌクレオチド総濃度）のグラフを描き、その傾きと切片から△Ｈ°と△Ｓ°を算出した。そして式（４）から△Ｇ°を求めた。得られた結果を表５に示す。
１／Ｔｍ＝（Ｒ／△Ｈ°）ｌｎＣｔ／４＋（△Ｓ°／△Ｈ°）    ・・・（５）【０２２３】
【表５】
2006025154.tif 000028
【０２２４】  前記表５に示すように、本発明の修飾二本鎖オリゴヌクレオチドは、非修飾のオリゴヌクレオチドと比較して、−△Ｇ０２９８の絶対値の増加および△Ｈの絶対値の増加が確認され、二本鎖としての安定性が向上していることが確認された。また、本発明の修飾二本鎖オリゴヌクレオチドは、非修飾のオリゴヌクレオチドと比較して、△Ｓの絶対値が増加していることから、より秩序ある二本鎖を形成することが確認された。【０２２５】  ７．修飾二本鎖オリゴヌクレオチドのエンドヌクレアーゼ耐性の評価
実施例１−５ａで得られた配列番号５からなる修飾一本鎖オリゴヌクレオチド（５’末端を３２Ｐでラベルしたもの）、参考例１−２で得られた配列番号９からなる非修飾一本鎖オリゴヌクレオチド（５’末端を３２Ｐでラベルしたもの）、実施例２−５で得られた修飾二本鎖オリゴヌクレオチド（５’末端を３２Ｐでラベルしたもの）および参考例２−２で得られた非修飾二本鎖オリゴヌクレオチド（５’末端を３２Ｐでラベルしたもの）の、エンドヌクレアーゼ耐性を評価した。エンドヌクレアーゼとしては、ＲＮａｓｅＡを使用した。【０２２６】  以下に示す組成の反応溶液から、３０分後に各エッペンドルフチューブに分注しておいた充填溶液（８Ｍ尿素  ＸＣ  ＢＰＢ）（１０μｌ）中に、反応液（１０μｌ）をサンプリングして反応を停止させた。得られた各時間におけるサンプルを、２０％ポリアクリルアミドゲル（７Ｍ尿素含有）を用いて２０ｍＡ、１８０分間、電気泳動により分離して、修飾または非修飾一本鎖オリゴヌクレオチドの完全鎖の残存率（％）を測定した。その結果を表６に示す。【０２２７】
【表６】
2006025154.tif 000029
【０２２８】  修飾一本鎖オリゴヌクレオチド（実施例１−５ａ）の反応溶液の組成
２０μＭ  修飾一本鎖オリゴヌクレオチド水溶液                              ２μＬ
緩衝液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ７．０））
１．５μＬ
１０μｇ／ｍＬ  ＲＮａｓｅ水溶液                                      ０．５μＬ
水                                                                        ６μＬ
計                                                                      １０μＬ【０２２９】  非修飾一本鎖オリゴヌクレオチド（参考例１−２）の反応溶液の組成
２０μＭ  非修飾一本鎖オリゴヌクレオチド水溶液                            ２μＬ
緩衝液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ７．０））
１．５μＬ
１０μｇ／ｍＬ  ＲＮａｓｅ水溶液                                      ０．５μＬ
水                                                                        ６μＬ
計                                                                      １０μＬ【０２３０】  また、以下に示す組成の反応溶液から、５、１０、２０、３０、６０、９０分後に各エッペンドルフチューブに分注しておいた充填溶液（８Ｍ尿素  ＸＣ  ＢＰＢ）（１０μｌ）中に、反応液（１０μｌ）をサンプリングして反応を停止させた。得られた各時間におけるサンプルを、２０％ポリアクリルアミドゲル（７Ｍ尿素含有）を用いて２０ｍＡ、１８０分間、電気泳動により分離して、修飾または非修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの完全鎖の残存率（％）を縦軸に、反応時間を横軸にとって図８を作成した。【０２３１】  修飾二本鎖オリゴヌクレオチド（実施例２−５）の反応溶液の組成
２０μＭ  修飾二本鎖オリゴヌクレオチド水溶液                              ２μＬ
緩衝液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ７．０））
１．５μＬ
１０μｇ／ｍＬ  ＲＮａｓｅ水溶液                                      ０．５μＬ
水                                                                        ６μＬ
計                                                                      １０μＬ【０２３２】  非修飾二本鎖オリゴヌクレオチド（参考例２−２）の反応溶液の組成
２０μＭ  非修飾二本鎖オリゴヌクレオチド水溶液                            ２μＬ
緩衝液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ７．０））
１．５μＬ
１０μｇ／ｍＬ  ＲＮａｓｅ水溶液                                      ０．５μＬ
水                                                                        ６μＬ
計                                                                      １０μＬ【０２３３】  表６から、修飾二本鎖オリゴヌクレオチドは、非修飾二本鎖オリゴヌクレオチドと比較して、エンドヌクレアーゼ耐性が著しく向上していることが確認された。また、図８から、修飾二本鎖オリゴヌクレオチドは、非修飾二本鎖オリゴヌクレオチドと比較して、エンドヌクレアーゼ耐性が著しく向上していることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０２３４】  本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、例えば、疾患治療剤として有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０２３５】配列番号１  ＲＮａｓｅＬの標的配列
配列番号２  配列番号１の標的配列に対するｓｉＲＮＡ配列の修飾センス鎖
配列番号３  配列番号１の標的配列に対するｓｉＲＮＡ配列の修飾センス鎖
配列番号４  配列番号１の標的配列に対するｓｉＲＮＡ配列の修飾センス鎖
配列番号５  配列番号１の標的配列に対するｓｉＲＮＡ配列の修飾アンチセンス鎖
配列番号６  配列番号１の標的配列に対するｓｉＲＮＡ配列の修飾アンチセンス鎖
配列番号７  配列番号１の標的配列に対するｓｉＲＮＡ配列の修飾アンチセンス鎖
配列番号８  配列番号１の標的配列に対するｓｉＲＮＡ配列のセンス鎖
配列番号９  配列番号１の標的配列に対するｓｉＲＮＡ配列のアンチセンス鎖
配列番号１０  配列番号１２の標的配列に対するｓｉＲＮＡ配列の修飾鎖
配列番号１１  配列番号１２の標的配列に対するｓｉＲＮＡ配列の別の修飾鎖
配列番号１２  標的配列
【図１】
2006025154.tif 000066
【図２】
2006025154.tif 000067
【図３】
2006025154.tif 000068
【図４】
2006025154.tif 000069
【図５】
2006025154.tif 000070
【図６】
2006025154.tif 000071
【図７】
2006025154.tif 000072
【図８】
2006025154.tif 000073
【手続補正書】
【提出日】平成17年12月27日(2005.12.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】請求の範囲
【請求項１】  オリゴヌクレオチドの３’末端から１番目と２番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−で表される結合に置き換えられた修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項２】  （削除）
【請求項３】  （削除）
【請求項４】  下記（ｉ）および（ｉｉ）の少なくとも一方を満たす請求項１に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
（ｉ）  前記オリゴヌクレオチドの３’末端から２番目と３番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−で表される結合に置き換えられている。
（ｉｉ）  前記オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目と４番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−で表される結合に置き換えられている。
【請求項５】  （削除）
【請求項６】  前記修飾オリゴヌクレオチドが、二本鎖オリゴヌクレオチドである請求項１に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項７】  前記二本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも一方の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端から１番目と２番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−で表される結合に置き換えられている請求項６に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項８】  修飾オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの３’末端から１番目と２番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、下記式（Ｉ−１）で表される結合に置き換えられた修飾オリゴヌクレオチドであり、
前記修飾オリゴヌクレオチドが、二本鎖オリゴヌクレオチドであり、
前記修飾オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡ  Ｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を引き起こすオリゴヌクレオチドであり、前記修飾オリゴヌクレオチドが、エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡの一部と同じ塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチド。
−Ｘ１−Ｃ（＝Ｙ１）−Ｚ１−          （Ｉ−１）
前記式（Ｉ−１）中、Ｘ１はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ１はＯまたはＳ、Ｚ１はＯ、ＮＨまたはＳである。
【請求項９】  前記修飾オリゴヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）であり、
前記ｍＲＮＡの一部が、
スタートコドンから７５塩基以上上流の、最初のＡＡ配列に続く１９塩基配列であって、
前記ｍＲＮＡの一部が、前記ｍＲＮＡに対して特異的であり、
前記修飾オリゴヌクレオチドが、前記１９塩基配列のセンス鎖とアンチセンス鎖との組み合わせである請求項８に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項１０】  前記センス鎖およびアンチセンス鎖の少なくとも一方が、その３’末端にさらに２つのチミジンを含むヌクレオチドを有する請求項９に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項１１】  前記修飾オリゴヌクレオチドが、一本鎖オリゴヌクレオチドである請求項１に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項１２】  修飾オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの３’末端から１番目と２番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、下記式（Ｉ−１）で表される結合に置き換えられた修飾オリゴヌクレオチドであり、
前記修飾オリゴヌクレオチドが、一本鎖オリゴヌクレオチドであり、
前記修飾オリゴヌクレオチドが、アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡであり、前記修飾オリゴヌクレオチドが、エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的な配列を有する修飾オリゴヌクレオチド。
−Ｘ１−Ｃ（＝Ｙ１）−Ｚ１−          （Ｉ−１）
前記式（Ｉ−１）中、Ｘ１はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ１はＯまたはＳ、Ｚ１はＯ、ＮＨまたはＳである。
【請求項１３】  前記オリゴヌクレオチドが、ヌクレアーゼ耐性である請求項１に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項１４】  オリゴヌクレオチドを含む遺伝子発現抑制剤であって、前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの３’末端から１番目と２番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、下記式（Ｉ−１）で表される結合に置き換えられた修飾オリゴヌクレオチドである遺伝子発現抑制剤。
−Ｘ１−Ｃ（＝Ｙ１）−Ｚ１−          （Ｉ−１）
前記式（Ｉ−１）中、Ｘ１はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ１はＯまたはＳ、Ｚ１はＯ、ＮＨまたはＳである。
【請求項１５】  遺伝子発現に伴う疾患を治療するための医薬組成物であって、
前記医薬組成物が、請求項１４に記載の遺伝子発現抑制剤を含む医薬組成物。
【請求項１６】  さらに細胞導入用賦形剤を含む請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】  前記細胞導入用賦形剤が、トランスフェクション試薬である請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】  ＲＮＡｉキットであって、前記キットが、請求項８に記載の修飾オリゴヌクレオチドを含むキット。
【請求項１９】  ＲＮＡｉ研究用試薬であって、前記試薬が、請求項８に記載の修飾オリゴヌクレオチドを含む試薬。
【請求項２０】  オリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を抑制する方法であって、前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの３’末端から１番目と２番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、下記式（Ｉ−１）で表される結合に置き換えられた修飾オリゴヌクレオチドである方法。
−Ｘ１−Ｃ（＝Ｙ１）−Ｚ１−          （Ｉ−１）
前記式（Ｉ−１）中、Ｘ１はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ１はＯまたはＳ、Ｚ１はＯ、ＮＨまたはＳである。
【請求項２１】  オリゴヌクレオチドを用いてＲＮＡｉを引き起こす方法であって、前記オリゴヌクレオチドが、請求項８に記載の修飾オリゴヌクレオチドである方法。
【請求項２２】  下記式（Ｘ−１）で表される固相合成用ユニット化合物を出発原料として、オリゴヌクレオチドの３’末端から１番目と２番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、下記式（Ｉ−１）で表される結合に置き換えられた修飾オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、
式（Ｘ−１）で表される固相合成用ユニット化合物のＲ２を除去し、
式（Ｘ−１）で表される固相合成用ユニット化合物の５’末端にヌクレオチドを伸長させ、その後、固相担体から切り出して前記修飾オリゴヌクレオチドを得る製造方法。
−Ｘ１−Ｃ（＝Ｙ１）−Ｚ１−          （Ｉ−１）
【化１】
2006025154.tif 000074
前記式（Ｉ−１）中、Ｘ１はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ１はＯまたはＳ、Ｚ１はＯ、ＮＨまたはＳである。
前記式（Ｘ−１）中、Ｒ２は、保護基であり、
Ｂ１およびＢ２は、互いに独立して、以下の式で示す基およびその官能基が保護基で保護された基から選択される基であり、
【化２】
2006025154.tif 000075
Ａは、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１およびＲ２１は、互いに独立して、保護基であり、
Ｘ１およびＸ２は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｙ１は、ＯまたはＳであり、
Ｚ１は、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｍは、固相担体である。
【請求項２３】  下記式（ＸＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物を出発原料として、オリゴヌクレオチドの３’末端から１番目と２番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、下記式（Ｉ−１）で表される結合に置き換えられ、かつ、前記オリゴヌクレオチドの３’末端から２番目と３番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、下記式（Ｉ−２）で表される結合に置き換えられている修飾オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、
式（ＸＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物のＲ３を除去し、
式（ＸＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物の５’末端にヌクレオチドを伸長させ、その後、固相担体から切り出して前記修飾オリゴヌクレオチドを得る製造方法。
−Ｘ１−Ｃ（＝Ｙ１）−Ｚ１−          （Ｉ−１）
−Ｘ２−Ｃ（＝Ｙ２）−Ｚ２−          （Ｉ−２）
【化３】
2006025154.tif 000076
前記式（Ｉ−１）中、Ｘ１はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ１はＯまたはＳ、Ｚ１はＯ、ＮＨまたはＳである。
前記式（Ｉ−２）中、Ｘ２はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ２はＯまたはＳ、Ｚ２はＯ、ＮＨまたはＳである。
前記式中、Ｒ３は、保護基であり、
Ｂ１、Ｂ２およびＢ３は、互いに独立して、以下の式で示す基およびその官能基が保護基で保護された基から選択される基であり、
【化４】
2006025154.tif 000077
Ａは、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
Ｗ３１は、Ｈまたは式ＯＲ３１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１、Ｒ２１およびＲ３１は、互いに独立して、保護基であり、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｙ１およびＹ２は、互いに独立して、ＯまたはＳであり、
Ｚ１およびＺ２は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｍは、固相担体である。
【請求項２４】  下記式（ＸＩＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物を出発原料として、オリゴヌクレオチドの３’末端から１番目と２番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、下記式（Ｉ−１）で表される結合に置き換えられ、かつ、前記オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目と４番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、下記式（Ｉ−３）で表される結合に置き換えられている修飾オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、
式（ＸＩＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物のＲ４を除去し、
式（ＸＩＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物の５’末端にヌクレオチドを伸長させ、その後、固相担体から切り出して前記修飾オリゴヌクレオチドを得る製造方法。
−Ｘ１−Ｃ（＝Ｙ１）−Ｚ１−          （Ｉ−１）
−Ｘ３−Ｃ（＝Ｙ３）−Ｚ３−          （Ｉ−３）
【化５】
2006025154.tif 000078
前記式（Ｉ−１）中、Ｘ１はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ１はＯまたはＳ、Ｚ１はＯ、ＮＨまたはＳである。
前記式（Ｉ−３）中、Ｘ３はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ３はＯまたはＳ、Ｚ３はＯ、ＮＨまたはＳである。
前記式中、Ｒ４およびＲは、互いに独立して、保護基であり、
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４は、互いに独立して、以下の式で示す基およびその官能基が保護基で保護された基から選択される基であり、
【化６】
2006025154.tif 000079
Ａは、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
Ｗ３１は、Ｈまたは式ＯＲ３１で表される基であり、
Ｗ４１は、Ｈまたは式ＯＲ４１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１、Ｒ２１、Ｒ３１およびＲ４１は、互いに独立して、保護基であり、
Ｘ１、Ｘ３およびＸ４は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｙ１およびＹ３は、互いに独立して、ＯまたはＳであり、
Ｚ１およびＺ３は、互いに独立して、Ｏ、ＮＭまたはＳであり、
Ｍは、固相担体である。
【請求項２５】  下記式（ＸＩＩＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物を出発原料として、オリゴヌクレオチドの３’末端から１番目と２番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、下記式（Ｉ−１）で表される結合に置き換えられ、前記オリゴヌクレオチドの３’末端から２番目と３番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、下記式（Ｉ−２）で表される結合に置き換えられ、かつ、前記オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目と４番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、下記式（Ｉ−３）で表される結合に置き換えられている修飾オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、
式（ＸＩＩＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物のＲ４を除去し、
式（ＸＩＩＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物の５’末端にヌクレオチドを伸長させ、その後、固相担体から切り出して前記修飾オリゴヌクレオチドを得る製造方法。
−Ｘ１−Ｃ（＝Ｙ１）−Ｚ１−          （Ｉ−１）
−Ｘ２−Ｃ（＝Ｙ２）−Ｚ２−          （Ｉ−２）
−Ｘ３−Ｃ（＝Ｙ３）−Ｚ３−          （Ｉ−３）
【化７】
2006025154.tif 000080
前記式（Ｉ−１）中、Ｘ１はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ１はＯまたはＳ、Ｚ１はＯ、ＮＨまたはＳである。
前記式（Ｉ−２）中、Ｘ２はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ２はＯまたはＳ、Ｚ２はＯ、ＮＨまたはＳである。
前記式（Ｉ−３）中、Ｘ３はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ３はＯまたはＳ、Ｚ３はＯ、ＮＨまたはＳである。
前記式中、Ｒ４は、保護基であり、
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４は、互いに独立して、以下の式で示す基およびその官能基が保護基で保護された基から選択される基であり、
【化８】
2006025154.tif 000081
Ａは、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
Ｗ３１は、Ｈまたは式ＯＲ３１で表される基であり、
Ｗ４１は、Ｈまたは式ＯＲ４１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１、Ｒ２１、Ｒ３１およびＲ４１は、互いに独立して、保護基であり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｙ１、Ｙ２およびＹ３は、互いに独立して、ＯまたはＳであり、
Ｚ１、Ｚ２およびＺ３は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｍは、固相担体である。
【請求項２６】  オリゴヌクレオチドの３’末端から１番目と２番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、下記式（Ｉ−１）で表される結合に置き換えられた修飾オリゴヌクレオチド製造のための、下記式（Ｘ−１）で表される固相合成用ユニット化合物。
−Ｘ１−Ｃ（＝Ｙ１）−Ｚ１−          （Ｉ−１）
【化９】
2006025154.tif 000082
前記式（Ｉ−１）中、Ｘ１はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ１はＯまたはＳ、Ｚ１はＯ、ＮＨまたはＳである。
前記式（Ｘ−１）中、Ｒ２は、保護基であり、
Ｂ１およびＢ２は、互いに独立して、以下の式で示す基およびその官能基が保護基で保護された基から選択される基であり、
【化１０】
2006025154.tif 000083
Ａは、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１およびＲ２１は、互いに独立して、保護基であり、
Ｘ１およびＸ２は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｙ１は、ＯまたはＳであり、
Ｚ１は、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｍは、固相担体である。
【請求項２７】  請求項２６に記載の式（Ｘ−１）で表される固相合成用ユニット化合物の製造方法であって、
下記式（ＩＶ−１）で表されるヌクレオシド誘導体と、下記式（ＩＩＩ）で表されるヌクレオシド誘導体とを、下記式（Ｖ−１）で表されるジイミダゾール誘導体と縮合させ、下記式（ＶＩ）で表される二量体（ＶＩ）を得、
【化１１】
2006025154.tif 000084
前記式（ＶＩ）で表される二量体と下記式（ＶＩＩ）で表される無水物とを縮合させ、下記式（ＶＩＩＩ）で表される二量体を得、
【化１２】
2006025154.tif 000085
前記式（ＶＩＩＩ）で表される二量体と下記式（ＩＸ）で表されるアミノ基を有する固相担体とを縮合させ、式（Ｘ−１）で表される固相合成用ユニット化合物を得る製造方法。
【化１３】
2006025154.tif 000086
前記式中、
Ｒ２は、保護基であり、
Ｂ１およびＢ２は、互いに独立して、以下の式で示す基およびその官能基が保護基で保護された基から選択される基であり、
【化１４】
2006025154.tif 000087
Ａは、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１およびＲ２１は、互いに独立して、保護基であり、
Ｘ１およびＸ２は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｙ１は、ＯまたはＳであり、
Ｚ１は、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｍは、固相担体である。
【請求項２８】  オリゴヌクレオチドの３’末端から１番目と２番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、下記式（Ｉ−１）で表される結合に置き換えられ、下記（ｉ）および（ｉｉ）の少なくとも一方を満たす修飾オリゴヌクレオチド製造のための、下記式（ＸＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物。
（ｉ）  前記オリゴヌクレオチドの３’末端から２番目と３番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、下記式（Ｉ−２）で表される結合に置き換えられている。
（ｉｉ）  前記オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目と４番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、下記式（Ｉ−３）で表される結合に置き換えられている。
−Ｘ１−Ｃ（＝Ｙ１）−Ｚ１−          （Ｉ−１）
−Ｘ２−Ｃ（＝Ｙ２）−Ｚ２−          （Ｉ−２）
−Ｘ３−Ｃ（＝Ｙ３）−Ｚ３−          （Ｉ−３）
【化１５】
2006025154.tif 000088
前記式（Ｉ−１）中、Ｘ１はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ１はＯまたはＳ、Ｚ１はＯ、ＮＨまたはＳである。
前記式（Ｉ−２）中、Ｘ２はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ２はＯまたはＳ、Ｚ２はＯ、ＮＨまたはＳである。
前記式（Ｉ−３）中、Ｘ３はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ３はＯまたはＳ、Ｚ３はＯ、ＮＨまたはＳである。
前記式中、Ｒ３は、保護基であり、
Ｂ１、Ｂ２およびＢ３は、互いに独立して、以下の式で示す基およびその官能基が保護基で保護された基から選択される基であり、
【化１６】
2006025154.tif 000089
Ａは、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
Ｗ３１は、Ｈまたは式ＯＲ３１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１、Ｒ２１およびＲ３１は、互いに独立して、保護基であり、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｙ１およびＹ２は、互いに独立して、ＯまたはＳであり、
Ｚ１およびＺ２は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｍは、固相担体である。
【請求項２９】  請求項２８に記載の前記式（ＸＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物の製造方法であって、
前記式（ＶＩ）で表される二量体のＲ２をＨに置き換え、式（ＶＩ−１）で表される二量体を得、
【化１７】
2006025154.tif 000090
前記式（ＶＩ−１）で表される二量体と、下記式（ＩＶ−２）で表されるヌクレオシド誘導体とを、下記式（Ｖ−２）で表されるジイミダゾール誘導体と縮合させ、式（ＸＩＶ−１）で表される三量体を得、
【化１８】
2006025154.tif 000091
前記式（ＸＩＶ−１）で表される三量体と、下式（ＶＩＩ）で表される無水物とを縮合させ、下記式（ＸＶ−１）で表される三量体を得、
【化１９】
2006025154.tif 000092
前記式（ＸＶ−１）で表される三量体と下記式（ＩＸ）で表されるアミノ基を有する固相担体とを縮合させ、式（ＸＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物を得る製造方法。
【化２０】
2006025154.tif 000093
前記式中、Ｒ２およびＲ３は、互いに独立して、保護基であり、
Ｂ１、Ｂ２およびＢ３は、互いに独立して、以下の式で示す基およびその官能基が保護基で保護された基から選択される基であり、
【化２１】
2006025154.tif 000094
Ａは、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
Ｗ３１は、Ｈまたは式ＯＲ３１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１、Ｒ２１およびＲ３１は、互いに独立して、保護基であり、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｙ１およびＹ２は、互いに独立して、ＯまたはＳであり、
Ｚ１およびＺ２は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｍは、固相担体である。
【請求項３０】  オリゴヌクレオチドの３’末端から１番目と２番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、下記式（Ｉ−１）で表される結合に置き換えられ、下記（ｉ）および（ｉｉ）の少なくとも一方を満たす修飾オリゴヌクレオチド製造のための、下記式（ＸＩＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物。
（ｉ）  前記オリゴヌクレオチドの３’末端から２番目と３番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、下記式（Ｉ−２）で表される結合に置き換えられている。
（ｉｉ）  前記オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目と４番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、下記式（Ｉ−３）で表される結合に置き換えられている。
−Ｘ１−Ｃ（＝Ｙ１）−Ｚ１−          （Ｉ−１）
−Ｘ２−Ｃ（＝Ｙ２）−Ｚ２−          （Ｉ−２）
−Ｘ３−Ｃ（＝Ｙ３）−Ｚ３−          （Ｉ−３）
【化２２】
2006025154.tif 000095
前記式（Ｉ−１）中、Ｘ１はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ１はＯまたはＳ、Ｚ１はＯ、ＮＨまたはＳである。
前記式（Ｉ−２）中、Ｘ２はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ２はＯまたはＳ、Ｚ２はＯ、ＮＨまたはＳである。
前記式（Ｉ−３）中、Ｘ３はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ３はＯまたはＳ、Ｚ３はＯ、ＮＨまたはＳである。
前記式中、Ｒ４およびＲは、保護基であり、
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４は、互いに独立して、以下の式で示す基およびその官能基が保護基で保護された基から選択される基であり、
【化２３】
2006025154.tif 000096
Ａは、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
Ｗ３１は、Ｈまたは式ＯＲ３１で表される基であり、
Ｗ４１は、Ｈまたは式ＯＲ４１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１、Ｒ２１、Ｒ３１およびＲ４１は、互いに独立して、保護基であり、
Ｘ１、Ｘ３およびＸ４は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｙ１およびＹ３は、互いに独立して、ＯまたはＳであり、
Ｚ１およびＺ３は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｍは、固相担体である。
【請求項３１】  請求項３０に記載の式（ＸＩＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物の製造方法であって、
下記式（ＶＩ−２）で表される二量体のＲ２をＨに置き換え、下記式（ＶＩ−３）で表される二量体を得、
【化２４】
2006025154.tif 000097
前記式（ＶＩ−３）で表される２量体と、下記式（ＩＶ−３）で表されるヌクレオシド誘導体とを、リン酸結合試薬と縮合させ、下記式（ＸＩＶ−２）で表される三量体を得、
【化２５】
2006025154.tif 000098
前記式（ＸＩＶ−２）で表される三量体と、下記式（ＶＩＩ）で表される無水物とを縮合させ、下記式（ＸＶ−２）で表される三量体を得、
【化２６】
2006025154.tif 000099
前記式（ＸＶ−２）で表される三量体と下記式（ＩＸ）で表されるアミノ基を有する固相担体とを縮合させ、下記式（ＸＩＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物を得る製造方法。
【化２７】
2006025154.tif 000100
前記式中、Ｒ２、Ｒ３およびＲは、互いに独立して、保護基であり、
Ｂ１、Ｂ２およびＢ３は、互いに独立して、以下の式で示す基およびその官能基が保護基で保護された基から選択される基であり、
【化２８】
2006025154.tif 000101
Ａは、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
Ｗ３１は、Ｈまたは式ＯＲ３１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１、Ｒ２１およびＲ３１は、互いに独立して、保護基であり、
Ｘ１およびＸ３は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｙ１は、互いに独立して、ＯまたはＳであり、
Ｚ１は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｍは、固相担体である。
【請求項３２】  オリゴヌクレオチドの３’末端から１番目と２番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、８２／１（Ｉ−１）で表される結合に置き換えられ、下記（ｉ）および（ｉｉ）の少なくとも一方を満たす修飾オリゴヌクレオチド製造のための、下記式（ＸＩＩＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物。
（ｉ）  前記オリゴヌクレオチドの３’末端から２番目と３番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、下記式（Ｉ−２）で表される結合に置き換えられている。
（ｉｉ）  前記オリゴヌクレオチドの３’末端から３番目と４番目のヌクレオシド間の５’，３’−リン酸ジエステル結合が、下記式（Ｉ−３）で表される結合に置き換えられている。
−Ｘ１−Ｃ（＝Ｙ１）−Ｚ１−          （Ｉ−１）
−Ｘ２−Ｃ（＝Ｙ２）−Ｚ２−          （Ｉ−２）
−Ｘ３−Ｃ（＝Ｙ３）−Ｚ３−          （Ｉ−３）
【化２９】
2006025154.tif 000102
前記式（Ｉ−１）中、Ｘ１はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ１はＯまたはＳ、Ｚ１はＯ、ＮＨまたはＳである。
前記式（Ｉ−２）中、Ｘ２はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ２はＯまたはＳ、Ｚ２はＯ、ＮＨまたはＳである。
前記式（Ｉ−３）中、Ｘ３はＯ、ＮＨまたはＳ、Ｙ３はＯまたはＳ、Ｚ３はＯ、ＮＨまたはＳである。
前記式中、Ｒ４は、保護基であり、
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４は、互いに独立して、以下の式で示す基およびその官能基が保護基で保護された基から選択される基であり、
【化３０】
2006025154.tif 000103
Ａは、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
Ｗ３１は、Ｈまたは式ＯＲ３１で表される基であり、
Ｗ４１は、Ｈまたは式ＯＲ４１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１、Ｒ２１、Ｒ３１およびＲ４１は、互いに独立して、保護基であり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｙ１、Ｙ２およびＹ３は、互いに独立して、ＯまたはＳであり、
Ｚ１、Ｚ２およびＺ３は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｍは、固相担体である。
【請求項３３】  請求項３２に記載の式（ＸＩＩＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物の製造方法であって、
下記式（ＸＩＶ−１）で表される三量体のＲ３をＨに置き換え、式（ＸＩＶ−３）で表される三量体を得、
【化３１】
2006025154.tif 000104
前記式（ＸＩＶ−３）で表される三量体と、下記式（ＩＶ−４）で表されるヌクレオシド誘導体とを、下記式（Ｖ−３）で表されるジイミダゾール誘導体と縮合させ、下記式（ＸＶＩ−１）で表される四量体を得、
【化３２】
2006025154.tif 000105
前記式（ＸＶＩ−１）で表される四量体と、下記式（ＶＩＩ）で表される無水物とを縮合させ、下記式（ＸＶＩＩ−１）で表される四量体を得、
【化３３】
2006025154.tif 000106
前記式（ＸＶＩＩ−１）で表される四量体と、下記式（ＩＸ）で表されるアミノ基を有する固相担体とを縮合させ、式（ＸＩＩＩ−１）で表される固相合成用ユニット化合物を得る製造方法。
【化３４】
2006025154.tif 000107
前記式において、
Ｒ３およびＲ４は、保護基であり、
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４は、互いに独立して、以下の式で示す基およびその官能基が保護基で保護された基から選択される基であり、
【化３５】
2006025154.tif 000108
Ａは、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｗ１１は、Ｈまたは式ＯＲ１１で表される基であり、
Ｗ２１は、Ｈまたは式ＯＲ２１で表される基であり、
Ｗ３１は、Ｈまたは式ＯＲ３１で表される基であり、
Ｗ４１は、Ｈまたは式ＯＲ４１で表される基であり、
ここで、前記Ｒ１１、Ｒ２１、Ｒ３１およびＲ４１は、互いに独立して、保護基であり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｙ１、Ｙ２およびＹ３は、互いに独立して、ＯまたはＳであり、
Ｚ１、Ｚ２およびＺ３は、互いに独立して、Ｏ、ＮＨまたはＳであり、
Ｍは、固相担体である。
【国際調査報告】
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