(57)【要約】  Ｃペプチド特異的結合分子及びその利用方法を提供する。新規に同定された二種類のＣペプチド特異的結合分子（配列番号１、配列番号３）を用いたＣペプチド結合剤が提供される。また、これらのタンパク質の量を指標とした、Ｃペプチドの作用状態を評価する方法が提供される。さらには、これらのタンパク質を利用した、Ｃペプチドの作用状態を調節する化合物のスクリーニング方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を有する第１タンパク質と、配列番号３のアミノ酸配列を有する第２タンパク質と、及び前記第１タンパク質又は前記第２タンパク質と実質的に相同なタンパク質と、からなる群より選択される１以上のタンパク質を含むＣペプチド結合剤。
【請求項２】
以下のステップを含む、サンプル中のＣペプチドの作用状態を評価する方法：
配列番号１のアミノ酸配列を有する第１タンパク質と、配列番号３のアミノ酸配列を有する第２タンパク質と、及び前記第１タンパク質又は前記第２タンパク質と実質的に相同なタンパク質と、からなる群より選択される１以上のタンパク質をサンプル中で検出するステップ。
【請求項３】
以下のステップを含む、サンプル中のＣペプチドの作用状態を評価する方法：
配列番号１のアミノ酸配列を有する第１タンパク質をコードする核酸と、配列番号３のアミノ酸配列を有する第２タンパク質をコードする核酸と、及び前記第１タンパク質又は前記第２タンパク質と実質的に相同なタンパク質をコードする核酸と、からなる群より選択される１以上の核酸をサンプル中で検出するステップ。
【請求項４】
以下のステップを含む、サンプル中のＣペプチドの作用状態を評価する方法：
配列番号１のアミノ酸配列を有する第１タンパク質をコードする遺伝子の多型と、配列番号３のアミノ酸配列を有する第２タンパク質をコードする遺伝子の多型と、及び前記第１タンパク質又は前記第２タンパク質と実質的に相同なタンパク質をコードする遺伝子の多型と、からなる群より選択される１以上の多型をサンプル中で解析するステップ。
【請求項５】
以下のステップを含む、Ｃペプチドの作用状態を調節する化合物をスクリーニングする方法：
配列番号１のアミノ酸配列を有する第１タンパク質と、配列番号３のアミノ酸配列を有する第２タンパク質と、及び前記第１タンパク質又は前記第２タンパク質と実質的に相同なタンパク質と、からなる群より選択される１以上のタンパク質と、Ｃペプチドとを、試験化合物の存在下（試験群）及び非存在下（対照群）においてそれぞれ接触させるステップ；
Ｃペプチドに非特異的に結合している成分を除去するステップ；
Ｃペプチドと前記タンパク質との複合体を検出するステップ；及び
試験群の検出結果と、対照群の検出結果とを比較するステップ。
【請求項６】
以下のステップを含む、Ｃペプチドの作用状態を調節する化合物をスクリーニングする方法：
試験化合物の存在下（試験群）及び非存在下（対照群）において、細胞を所定時間培養するステップ；
配列番号１のアミノ酸配列を有する第１タンパク質と、配列番号３のアミノ酸配列を有する第２タンパク質と、及び前記第１タンパク質又は前記第２タンパク質と実質的に相同なタンパク質と、からなる群より選択される１以上のタンパク質の、培養後の前記細胞内おける発現量を測定するステップ；
試験群の発現量と、対照群の発現量とを比較するステップ。
【請求項７】
Ｃペプチド又は配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質に対して特異的結合性を有し、且つＣペプチドと前記タンパク質との結合を阻害する抗体。
【請求項８】
Ｃペプチド又は配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質に対して特異的結合性を有し、且つＣペプチドと前記タンパク質との結合を阻害する抗体。
【請求項９】
配列番号１のアミノ酸配列を有する第１タンパク質と、配列番号３のアミノ酸配列を有する第２タンパク質と、及び前記第１タンパク質又は前記第２タンパク質と実質的に相同なタンパク質と、からなる群より選択される１以上のタンパク質を標的細胞に導入するステップを含む、標的細胞内のＣペプチドの作用状態を調節する方法。
【請求項１０】
Ｃペプチドと、配列番号１のアミノ酸配列を有する第１タンパク質又は配列番号３のアミノ酸配列を有する第２タンパク質との結合を阻害する化合物とを標的細胞に導入するステップを含む、標的細胞内のＣペプチドの作用状態を調節する方法。
【請求項１１】
配列番号１のアミノ酸配列を有する第１タンパク質と、配列番号３のアミノ酸配列を有する第２タンパク質と、及び前記第１タンパク質又は前記第２タンパク質と実質的に相同なタンパク質と、からなる群より選択される１以上のタンパク質の発現を、標的細胞内において阻害するステップを含む、標的細胞内のＣペプチドの作用状態を調節する方法。
【請求項１２】
前記ステップが、アンチセンス法、RNA干渉、又はリボザイムの使用によって実施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
配列番号１のアミノ酸配列を有する第１タンパク質又は配列番号３のアミノ酸配列を有する第２タンパク質に特異的結合性を有する試薬を含む、Ｃペプチドの作用状態評価用又はＣペプチドの作用量の異常によって特徴づけられる疾患診断用のキット。
【請求項１４】
前記疾患が、糖尿病又は代謝異常症候群（Metabolic syndrome）である、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記試薬が、前記第１タンパク質又は前記第２タンパク質に特異的結合性を有する抗体を含む、請求項１３又は１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃペプチド特異的結合分子及びその用途に関する。詳しくは、Ｃペプチド特異的結合分子を用いたＣペプチド結合剤、Ｃペプチドの作用状態の評価方法、Ｃペプチドの作用状態を調節する化合物のスクリーニング方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
インスリン製剤は、糖尿病患者の治療において無くてはならないものであり、現在、超速効型、速効型、中間型、超長時間型など、様々な作用時間のものが開発され、糖尿病患者の治療に寄与している。しかしながら、特にインスリンの枯渇する１型糖尿病においては、糖尿病合併症の発症・進展が早く、患者の生活の質、及び予後に大きな影響を及ぼしている。また、２型糖尿病においても、インスリン抵抗性と同様にＣペプチド抵抗性が存在する可能性が指摘されている。
Ｃペプチドは、膵ランゲルハンス島においてプロインスリンがインスリンに分解される際に生成される３１アミノ酸よりなるペプチドであるが、長い間、生理学的活性はないと考えられてきた。近年になってＣペプチドが血管拡張作用、神経保護作用などの生理学的活性をもつことが証明され、その作用が注目されている。しかしながら、Ｃペプチドの作用機構は明らかではなかった。【０００３】
【非特許文献１】Biochem Cell Biol. 1990 Dec; 68(12):1428-32.
【非特許文献２】Acta Physiol Hung. 1995; 83(4):333-42.
【非特許文献３】Diabetes Metab Res Rev. 2003 Sep-Oct; 19(5):375-85.
【非特許文献４】Comment in: Diabetes Metab Res Rev. 2003 Sep-Oct; 19(5):345-7.
【非特許文献５】Int J Exp Diabetes Res. 2002 Oct-Dec; 3(4):241-5.
【非特許文献６】Nitric Oxide. 2003 Sep; 9(2):95-102.
【非特許文献７】J. Biol. Chem. 2003, 278(23) 20915-24
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
Ｃペプチドの作用機構が明らかとなれば、Ｃペプチドを薬剤として使用する場合の実験的エビデンスが得られるとともにＣペプチド又はその結合分子を標的とした具体的な創薬が可能となることから、Ｃペプチドを臨床応用する途が拓かれる。
Ｃペプチドの作用機序を明らかにするためには第一にＣペプチドのレセプター分子、即ちＣペプチドに対して特異的に結合する分子（Ｃペプチド特異的結合分子）を同定することが必須且つ最重要となる。
一方、Ｃペプチド特異的結合分子は、Ｃペプチドがその作用を発揮する上で必須の要素となることから、Ｃペプチド特異的分子の発現状態（発現量、局在など）はＣペプチドの作用状態（作用量など）に直接影響する。従って、Ｃペプチド特異的結合分子の発現状態を制御することによってＣペプチドの作用状態を調節することができる。このことは、Ｃペプチド特異的結合分子が、Ｃペプチドが関与する疾患に対する薬剤を開発する上での標的になることを意味する。一方、Ｃペプチド特異的結合分子の発現状態からＣペプチドの作用状態を間接的に評価することが可能であることから、Ｃペプチド特異的結合分子を利用して、Ｃペプチドが関与する疾患の病態の把握や罹患リスクの評価などを行うこともできると考えられる。即ち、Ｃペプチド特異的結合分子の診断分野への応用も期待される。
以上のように、Ｃペプチド特異的結合分子は、Ｃペプチドの作用機序を解明するためのキー分子であることに加え、それ自体が創薬及び診断分野での標的分子となる。本発明は、このように利用価値の高いＣペプチド特異的結合分子を提供することを第一の目的とする。また、Ｃペプチド特異的分子の医療用途ないし診断用途などを提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
以上の目的を達成するために、本発明者らはＣペプチド特異的結合分子を同定することを試みた。その結果、細胞からの抽出条件の設定に主眼をおいて種々の検討を行うことで、Ｃペプチドに特異的結合性を有する二種類のタンパク質を同定することに成功した。本発明は以上の知見に基づき完成されたものであり、以下の構成を提供する。
本発明の第一の局面は、同定に成功した上記タンパク質（Ｃペプチド特異的結合タンパク質）を用いたＣペプチド結合剤に関する。本発明のＣペプチド結合剤は、配列番号１のアミノ酸配列を有する第１タンパク質と、配列番号３のアミノ酸配列を有する第２タンパク質と、及び第１タンパク質又は第２タンパク質と実質的に相同なタンパク質と、からなる群より選択される１以上のタンパク質を含む。当該Ｃペプチド結合剤は、Ｃペプチドの作用状態を調節することに用いることができる。また、Ｃペプチドの検出、測定又は定量、Ｃペプチドの分離・精製などにも利用できる。【０００６】
本発明の他の局面は、上記タンパク質（Ｃペプチド特異的結合タンパク質又はそれと実質的に相同なタンパク質）を検出することによってＣペプチドの作用状態を評価する方法に関する。本発明の評価方法では、配列番号１のアミノ酸配列を有する第１タンパク質と、配列番号３のアミノ酸配列を有する第２タンパク質と、及び前記第１タンパク質又は前記第２タンパク質と実質的に相同なタンパク質と、からなる群より選択される１以上のタンパク質をサンプル中で検出するステップが実施される。検出（測定）結果を用いてＣペプチドの作用状態を評価する。Ｃペプチドの作用状態を基にＣペプチドが関与する疾患の診断を行うことができる。当該局面の他の態様では、サンプル中の核酸が検出対象となる。即ち、配列番号１のアミノ酸配列を有する第１タンパク質をコードする核酸と、配列番号３のアミノ酸配列を有する第２タンパク質をコードする核酸と、及び前記第１タンパク質又は前記第２タンパク質と実質的に相同なタンパク質をコードする核酸と、からなる群より選択される１以上の核酸をサンプル中で検出するステップを実施し、検出結果に基づいてサンプル中のＣペプチドの作用状態を評価する。或いは、配列番号１のアミノ酸配列を有する第１タンパク質をコードする遺伝子の多型と、配列番号３のアミノ酸配列を有する第２タンパク質をコードする遺伝子の多型と、及び前記第１タンパク質又は前記第２タンパク質と実質的に相同なタンパク質をコードする遺伝子の多型と、からなる群より選択される１以上の多型をサンプル中で解析するステップを実施し、解析結果に基づいてサンプル中のＣペプチドの作用状態を評価する。【０００７】
本発明のさらに他の局面は、上記タンパク質（Ｃペプチド特異的結合タンパク質又はそれと実質的に相同なタンパク質）を利用したスクリーニング方法に関する。即ち、当該局面ではＣペプチドの作用状態を調節できる化合物を見出すための手段が提供される。本発明のスクリーニング方法では、試験化合物の存在下（試験群）及び非存在下（対照群）において、Ｃペプチドと上記タンパク質とを接触させるステップが実施される。そして、試験化合物の存在による、Ｃペプチドと上記タンパク質との結合態様（結合量、結合力など）の変化を調べる。このような手順に従って、Ｃペプチドとその特異的結合分子との結合状態を変化させる化合物、即ちＣペプチドの作用状態を調節することができる化合物を選抜することができる。選抜された化合物は、Ｃペプチドが関与する疾患に対する薬剤の有力な候補、又はそのような薬剤を開発する際の有益な材料となる。当該局面の他の態様では、細胞ベースのスクリーニング方法が提供される。この態様では、試験化合物の存在下（試験群）及び非存在下（対照群）において、細胞を所定時間培養するステップを実施した後、培養後の前記細胞内における、上記タンパク質の発現量を測定する。そして、試験群の発現量と、対照群の発現量と比較することで、Ｃペプチドの作用状態を調節する能力を試験化合物が有するか否か（有する場合にはその程度も）を評価する。【０００８】
本発明のさらに他の局面は、Ｃペプチドの作用状態を調節することができる化合物に関する。具体的には一態様として、Ｃペプチド又は上記タンパク質に対して特異的結合性を有し、且つＣペプチドと上記タンパク質との結合を阻害する抗体が提供される。当該抗体は例えば、その特異的結合性を利用して、Ｃペプチドと上記タンパク質との結合アッセイに用いることができる。また、当該抗体は、Ｃペプチドの作用を抑制ないし阻害する活性を有することから、Ｃペプチドの高発現が原因となる疾患に対する薬剤として利用され得る。【０００９】
本発明はさらに、標的細胞内においてＣペプチドの作用状態を調節する方法を提供する。この局面の一態様では、上記タンパク質（Ｃペプチド特異的結合タンパク質又はそれと実質的に相同なタンパク質）を人為的に標的細胞に導入するステップが実施され、これによってＣペプチドの作用量の増加が促される。他の態様では、Ｃペプチドと上記タンパク質との結合を阻害する化合物を標的細胞に導入するステップが実施され、これによってＣペプチドの作用量の低下が促される。さらに他の態様では、アンチセンス法、ＲＮＡ干渉、リボザイムの使用などによって標的細胞内の上記タンパク質の発現を阻害し、Ｃペプチドの作用量を低下させる。この局面の方法によれば、Ｃペプチドの作用量の増加又は低下が標的細胞に及ぼす影響を調べることができる。また、生体を構成する細胞を標的細胞とすれば、Ｃペプチドの高発現又は低発現が原因となる疾患に罹患した対象を治療するために本発明の方法を利用することができる。【００１０】
本発明はさらに、上記本発明の方法を簡便に実施するためのキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ヒト大動脈平滑筋細胞から調製した細胞抽出液を電気泳動で分離した結果（染色後のゲル）を示す。左レーン：上記手順で調製したサンプル溶液の泳動結果（Ｃペプチド(+)）、右レーン：Ｃペプチド結合カラムの代わりに、Ｃペプチドを結合させていないNHS-activated Sepharose 4 Fast Flowを用い、それ以外は同様の手順で調製した対照サンプルの泳動結果（Ｃペプチド(-)）である。尚、下段では、バンド位置を線（１、２）で示している。
【図２】図２は、Ｃペプチドによる競合実験の結果（染色後のゲル）を示す。Ａ：対照１（Ｃペプチド(-)カラム）、Ｂ：対照２（Ｃペプチド(+)カラム、競合阻害なし）、Ｃ：サンプルレーン（Ｃペプチド(+)カラム、競合阻害）である。
【図３】ヒト血管内皮細胞（HUVEC）、ヒト胎児腎臓細胞（HEK）、及びHeLa細胞から調製したcDNAを鋳型とし、HSPA5又はHSPA9B特異的プライマーでPCRを実施した結果である。
【図４】HSPA5発現ベクター又はHSPA9B発現ベクターで形質転換した大腸菌から調製したサンプルをウエスタンブロットで分析した結果である。(1)は大腸菌可溶化後の遠心処理によって得られた沈殿画分をアプライしたレーン、(2)は大腸菌可溶化後の遠心処理によって得られた上清画分をアプライしたレーン、(3)は大腸菌可溶化後の遠心処理によって得られた上清をGlutachione-Sepharose 4Bで精製したものをアプライしたレーン。
【図５】HSPA5発現ベクター又はHSPA9B発現ベクター形質転換したHEK細胞から調製したサンプルをウエスタンブロットで分析した結果である。左欄の(1)は細胞破砕液をアプライしたレーン、(2)はCo-beads抽出液をアプライしたレーン。右欄の(1)は細胞破砕液をアプライしたレーン、(2)は細胞破砕液を遠心処理した後の上清をアプライしたレーン、(3)はCo-beads抽出液をアプライしたレーン。
【図６】HSPA5発現ベクター又はHSPA9B発現ベクターで形質転換したHEK細胞の蛍光免疫染色像である。上段はコントロール、中段はHSPA5発現ベクターで形質転換したHEK細胞、下段はHSPA9B発現ベクターで形質転換したHEK細胞。
【図７】HSPA5とCペプチドとの結合実験の実験プロトコールである。
【図８】HSPA5とCペプチドとの結合実験（ウエスタンブロット）の結果である。(1)はHSPA5発現ベクターで形質転換した細胞から調製した細胞破砕液、(2)は空ベクターで形質転換した細胞から調製した細胞破砕液、(3)はHSPA5発現ベクターで形質転換した細胞から調製した細胞破砕液の上清画分の中でCペプチドビーズに結合した成分、(4)はCペプチドビーズの代わりにペプチド未結合ビーズ（Noペプチドbeads）を反応させて得られたサンプル、(5)は空ベクターで形質転換した細胞から調製した細胞破砕液の上清画分の中でCペプチドビーズに結合した成分、(6)は空ベクターで形質転換した細胞から調製した細胞破砕液の上清画分の中でペプチド未結合ビーズに結合した成分、(7)はHSPA5発現ベクターで形質転換した細胞から調製した細胞破砕液の上清画分をまずCペプチドと反応させた後、Cペプチドビーズと反応させた場合にCペプチドに結合した成分、(8)は空ベクターで形質転換した細胞から調製した細胞破砕液の上清画分をまずCペプチドと反応させた後、Cペプチドビーズと反応させた場合にCペプチドに結合した成分。
【図９】Cペプチドで刺激したHUVEC細胞の免疫染色像である。右欄は抗HSPA5抗体及びFITC抗ヤギ抗体を反応させて得た染色像。左欄はコントロール。
【図１０】HSPノックダウン実験のプロトコールである。
【図１１】HSPノックダウン実験の結果である。No.1（センス鎖導入、Cペプチド刺激なし）、No.2（センス鎖導入、Cペプチド刺激あり）、No.3（アンチセンス鎖導入、Cペプチド刺激なし）、No.4（アンチセンス鎖導入、Cペプチド刺激あり）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（Ｃペプチド結合剤）
本発明の第１の局面はＣペプチド結合剤に関する。ここで「Ｃペプチド」とは、膵ランゲルハンス島においてプロインスリンがインスリンに分解される際に生成される、３１アミノ酸（配列番号５）からなるペプチドである。Ｃペプチドは糖尿病に関する診断マーカーとして利用されてきた。最近になって、Ｃペプチド自体に特有の生理学的活性があることが報告されている。
本発明のＣペプチド結合剤は、Ｃペプチド特異的結合分子であると同定されたタンパク質、又はそれと実質的に相同なタンパク質（以下、これらをまとめて「本タンパク質」ともいう）を含む。後述の実施例に示すように本発明者らは、Ｃペプチド特異的結合分子として二種類のタンパク質の取得に成功した。アミノ酸配列解析の結果、これらのタンパク質はそれぞれ70kDaタンパク質9B前駆体（以下、「HSPA9B」ともいう。また、当該タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に、それをコードする塩基配列を配列番号２にそれぞれ示す）及び熱ショック70kDaタンパク質5（以下、「HSPA5」ともいう。また、当該タンパク質のアミノ酸配列を配列番号３に、それをコードする塩基配列を配列番号４にそれぞれ示す）であると同定された。尚、本明細書では前者を第１タンパク質、後者を第２タンパク質と呼称することがある。
ここで、比較される二種類のタンパク質に対して本明細書で使用される用語「実質的に相同な」とは、Ｃペプチドに対する結合性を利用した用途において同等に使用され得る程度にＣペプチドに対する結合性を当該二種類のタンパク質がともに保有している状態をいう。ここでの「実質的な相同性」に関しては、Ｃペプチドとの結合に関与しない領域は重要度が低い。従って、Ｃペプチドとの結合に関与しない領域が改変（一部又は全部のアミノ酸の欠失や置換、或いは他のアミノ酸の付加など）されていても実質的な相同性を認めることができる。また、他の分子ないし物質が付加された場合においても、付加前後において実質的な相同性が保持される場合がある。一方、比較される二種類のタンパク質が構成アミノ酸や分子量の点で相違していたとしても、両者の間に実質的な相同性を認めることができる場合がある。但し、一般に、アミノ酸配列に高い相同性が認められれば、機能面においても相同である場合が多い。尚、片方のＣペプチドに対する結合性を１００％としたときに他方のそれが少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、一層好ましくは９０％以上、最も好ましくは約１００％である場合に、二種類のタンパク質間に実質的な相同性を認めることができる。
例えば、HSPA9Bに実質的に相同なタンパク質として、配列番号１のアミノ酸配列の一部を改変した配列を有しＣペプチドに対して特異的結合性を有するタンパク質を挙げることができる。同様に、HSPA5に実質的に相同なタンパク質として、配列番号３のアミノ酸配列の一部を改変した配列を有しＣペプチドに対して特異的結合性を有するタンパク質を挙げることができる。ここでのアミノ酸配列の改変とは、アミノ酸配列を構成する１〜数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは１〜数個のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの組合せによりアミノ酸配列に変化を生じさせることをいうが、このような改変は、Ｃペプチドに対する特異的結合性という性質が高度に保持される限りにおいて行うことができる。ここでの「高度に保持される」とは、改変前のＣペプチドに対する特異的結合性を１００％としたときに改変後のそれが５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、一層好ましくは９０％以上、最も好ましくは約１００％である場合をいう。
このような高度の保持が認められる限り、アミノ酸配列の変化の位置は特に限定されない。また、複数の位置（連続した位置でもよい）で変化を生じていてもよい。改変にかかるアミノ酸の数は、例えば改変前のアミノ酸配列を構成する全アミノ酸の１０％以内に相当する数、好ましくは全アミノ酸の５％以内に相当する数、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内に相当する数である。但し、5'末端又は3'末端へのアミノ酸の付加など、場合によってはこの範囲を超える大幅な改変が許容されることもある。【００１３】
HSPA9B（又はHSPA5）に実質的に相同なタンパク質の他の例として、天然に存在する変異型のHSPA9B（又はHSPA5）を挙げることができる。さらに他の例として、ヒト以外の種のHSPA9B（又はHSPA5）を挙げることができる。ここでの「ヒト以外の種」とは、例えばヒト以外の霊長類（サル、チンパンジーなど）、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ等である。このようなヒト以外の種由来のHSPA9B（又はHSPA5）を含むＣペプチド結合剤は、ヒト以外の種に対して好適に適用（in vivo又はex vivo）することができる。或いは、in vitroでの実験用として好適に利用することができる。【００１４】
本発明のＣペプチド結合剤は、本タンパク質の少なくとも一種を含んで構成される。換言すれば、本発明のＣペプチド結合剤は、本タンパク質の二種以上を含んでいてもよい。
典型的には、本発明のＣペプチド結合剤は、HSPA9B又はHSPA5を単独で、又はこれら両者を含む。本発明のＣペプチド結合剤を構成するタンパク質にメチル化、グリコシル化などの修飾が施されていてもよい。【００１５】
本発明のＣペプチド結合剤は、Ｃペプチドの作用状態の調節に用いることができる。例えば、本発明のＣペプチド結合剤を生体に投与すればこれにＣペプチドが結合し、それによってＣペプチド結合剤を介してＣペプチドの作用が発揮されることを期待できる。従って、Ｃペプチドの作用が低減した結果ある病態を呈している個体に適用すれば病態の改善を図ることができる。
一方、本発明のペプチド結合剤をＣペプチドの検出、測定又は定量に用いることもできる。このようなＣペプチドの検出等に本発明のペプチド結合剤を利用する場合には、本発明のペプチド結合剤を検出可能な標識物質で標識化しておくことが好ましい。但し、本発明のペプチド結合剤を検出可能な他の物質を併用することにすれば、このような標識化は不要となる。
尚、ここでの検出等は、生体内において実施しても、又は生体から分離された細胞又は組織内において実施してもよい。【００１６】
本発明のＣペプチド結合剤をＣペプチドの分離・精製などに利用してもよい。例えば、本発明のＣペプチド結合剤を支持体に結合して適当な容器に充填することによって、Ｃペプチド親和性カラムを構築することができる。このようなカラムは、生体試料などからのＣペプチドの検出や分取に利用することができる。【００１７】
本発明のＣペプチド結合剤を構成する本タンパク質（HSPA9B、HSPA5、又はこれらの中のいずれかに相同なタンパク質）は例えば、それが存在すると予想される動物（例えば、ヒト、サル、チンパンジーなど）の細胞ないし組織等から、抽出、精製等の手段を利用して得ることができる（抽出方法の詳細については後述の実施例を参照されたい）。また、本タンパク質を、遺伝子工学的手法を用いて調製することもできる。即ち、目的のタンパク質をコードするDNAを適当な宿主細胞に導入し、形質転換体内で発現されたタンパク質を回収することにより調製することができる。回収されたタンパク質は、目的に応じて適宜精製される。組換えタンパク質として調製する場合は、種々の修飾が可能である。例えば、目的のタンパク質をコードするDNAと他の適当なDNAとを保持させたベクターを用いて形質転換を行うことにより、目的のタンパク質に、当該他のDNAがコードするペプチドないしタンパクが連結した組換えタンパク質を得ることができる。他のDNAを予めベクター内に組込んでおくこともできる。このような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化、又は生物学的機能の付加が可能である。【００１８】
（Ｃペプチド特異的結合分子を利用した検出・評価・診断方法）
本発明の他の局面は、上記の本タンパク質を検出することによってＣペプチドの作用状態を評価する方法に関する。本明細書において用語「Ｃペプチドの作用状態」とは、本タンパク質を介して発揮されるＣペプチドの作用量をいい、本タンパク質の存在量に依存する。また、本明細書において用語「評価」は、判定及び判別と交換可能に用いられる。【００１９】
本発明の方法では、サンプル中に存在する本タンパク質（好ましくはHSPA9B又はHSPA5）の量を検出するステップが実施される。そして検出結果を用いてサンプル中のＣペプチドの作用状態が評価される。本発明においてサンプルとしては例えば、対象（被験者）の生体より採取した細胞、組織、又は血液などや、或いは培養細胞、株化細胞などを用いることができる。【００２０】
本タンパク質の量は例えば、本タンパク質に対して特異的に結合する化合物を用いて検出（測定）することができる。検出方法（又は測定方法）は、これに限定されるものではないが、免疫学的手法によることが好ましい。免疫学的手法では上記本タンパク質に対する抗体（具体的には抗HSPA9B抗体又は抗HSPA5抗体など）が使用され、当該抗体の結合性（結合量）を指標として本タンパク質が検出される。ここでの用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、CDRグラフト抗体、ヒト化抗体、又はこれらの断片（但し、HSPA9B等に対する特異的結合能を有するもの）等を含む。本発明における抗体は、免疫学的手法、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法などを利用して調製することができる。
免疫学的染色法によれば、迅速で感度のよい検出が可能となる。従ってサンプル量が少なくてよく、生体試料を用いる場合には被験者（患者）への負担も小さくなる。また、操作も簡便である。尚、検出方法としては例えば、ELISA法、ラジオイムノアッセイ、FACS、免疫沈降法、イムノブロッティング等の定性的又は定量的な方法が挙げられる。【００２１】
ポリクローナル抗体の調製は次の手順で行うことができる。抗原（HSPA9B等）を調製し、これを用いてマウス、ラット、ウサギ、ヤギ等の動物に免疫を施す。抗原としてはHSPA9B若しくはその相同タンパク質、HSPA5若しくはその相同タンパク質、又はこれらの中のいずれかの一部を使用することができる。低分子量のために有効な免疫惹起作用を期待できない場合には、キャリアタンパク質を結合させた抗原を用いることが好ましい。キャリアタンパク質としてはKLM（Keyhole Light Hemocyanin）、BSA（Bovine Serum Albumin）、OVA（Ovalbumin）などが使用される。また、キャリアタンパク質の結合にはカルボジイミド法、グルタルアルデヒド法、ジアゾ縮合法、MBS（マレイミドベンゾイルオキシコハク酸イミド）法などを使用できる。
必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で採血し、遠心処理などによって血清を得る。得られた抗血清をアフィニティー精製する。このようにしてポリクローナル抗体を得ることができる。一方、モノクローナル抗体については次の手順で調製することができる。まず上記と同様の手順で免疫操作を実施する。必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で免疫動物から抗体産生細胞を摘出する。次に、得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合してハイブリドーマを得る。続いて、このハイブリドーマをモノクローナル化した後、目的タンパク質に対して高い特異性を有する抗体を産生するクローンを選択する。選択されたクローンの培養液を精製することによって目的の抗体が得られる。一方、ハイブリドーマを所望数以上に増殖させた後、これを動物（例えばマウス）の腹腔内に移植し、腹水内で増殖させて腹水を精製することにより目的の抗体を取得することもできる。上記培養液の精製又は腹水の精製には、プロテインG、プロテインA等を用いたアフィニティークロマトグラフィーが好適に用いられる。また、抗原を固相化したアフィニティークロマトグラフィーを用いることもできる。更には、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、硫安分画、及び遠心分離等の方法を用いることもできる。これらの方法は単独ないし任意に組み合わされて用いられる。尚、抗体の作製方法に関してKohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497;Brown et al. (1981) J. Immunol. 127:539-46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255:4980-83; Yeh et al. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:2927-31; Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75; Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4:72; Kenneth, R.H. in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); Lerner, E.A. (1981) Yale J. Biol. Med. 54:387-402; Gefter, M.L. et al. (1977) Somatic Cell Genet. 3:231-36等を参照することができる。【００２２】
ファージディスプレイ法に関しては種々の文献、例えばHuse et al. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982; Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4133-4137; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; PCT国際公開第 WO 90/02809号; PCT国際公開第 WO 92/20791号; PCT国際公開第 WO 92/15679号; PCT国際公開第 WO 92/09690号等を参照することができる。また、ファージディスプレイライブラリの作製及びスクリーニング用のキットが市販されており、それらを好適に利用することができる。【００２３】
標識化した抗体を用いることにより、上記の検出等を容易に実施することが可能である。抗体の標識化には例えばフルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、オレゴングリーン等の蛍光色素、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等の酵素、ルミノール、アクリジン色素等の化学又は生物発光化合物、32P、131I、125I等の放射性同位体、及びビオチン等を用いることができる。【００２４】
本タンパク質自体を検出対象とするのではなく、本タンパク質をコードする核酸（好ましくはHSPA9B又はHSPA5をコードする核酸）を検出対象として本タンパク質の量を求めることもできる。具体的には例えば、本タンパク質をコードするmRNAの量を検出する。また、本タンパク質の量の変化に伴って、本タンパク質をコードする遺伝子のコピー数に変動が認められる場合にはゲノムDNAを検出対象とすることもできる。例えば、検出の結果、本タンパク質の遺伝子のコピー数の増加が認められれば本タンパク質の発現量が増大していると予測できる。
尚、特定の核酸の量を測定する方法は当該分野で公知であって、例えばサザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、in situハイブリダイゼーション法、RT-PCT法等を用いることができる。【００２５】
本発明の他の態様は、本タンパク質をコードする遺伝子の多型を利用して対象におけるＣペプチドの作用状態を評価する方法に関し、対象において本タンパク質をコードする遺伝子の多型（好ましくはHSPA9B又はHSPA5をコードする遺伝子の多型）を解析するステップを含む。
一般に、遺伝子はそれを構成しているＤＮＡ配列に個体差が存在する。この個体差は遺伝子多型と呼ばれる。遺伝子多型には、１個の塩基が他の塩基に置き換わっているもの（ＳＮＰ（single nucleotide polymorphism））、通常１〜数十塩基が欠失や挿入されているもの（挿入／欠失型多型）、２〜数個の塩基からなる繰り返し配列における繰り返し数が異なるもの（ＶＮＴＲ（variable number of tandem repeat）及びマイクロサテライト多型）等が知られている。これらの遺伝子多型は、当該遺伝子の発現状態を規定したり、当該遺伝子がコードするタンパク質中のアミノ酸を変化させてその機能に影響を及ぼしたりする場合がある。従って、ある遺伝子の多型を解析することによって、当該遺伝子がコードするタンパク質の潜在的機能を評価することができる。そこで、本タンパク質をコードする遺伝子の多型を調べることによって、本タンパク質の発現状態及び／又は作用状態の予測が行える。このようにして得られる予測結果はＣペプチドの作用状態を把握・評価することに利用できる。具体的には例えば、ある対象における本タンパク質の遺伝子多型を解析した結果、本タンパク質が高発現すると考えられたとき又はＣペプチドとの相互作用が良好に行われる状態で本タンパク質が発現すると考えられたときには、Ｃペプチドがその作用を発揮しやすいと予測されることから、当該対象はＣペプチドの作用が高まることによって引き起こされる疾患に罹患するリスクが高いと判定することができる。また、当該対象にＣペプチドを投与した場合に高い作用が得られると判定することができる。このようにして得られた情報は、Ｃペプチドを用いた医療的処置（治療又は予防）における投与計画（Ｃペプチドの投与を中止し、他の治療手段に変更する場合も含む）を立てる際に有用である。【００２６】
上記各方法によって得られた、Ｃペプチドの作用状態に関する評価結果は、Ｃペプチドの作用量の異常によって特徴づけられる疾患（以下、「本発明の対象疾患」ともいう）の診断に利用できる。従って、本発明は以下の診断方法も提供する。
本発明の診断方法の一態様は、Ｃペプチドの作用量の異常によって特徴づけられる疾患の診断方法であって、配列番号１のアミノ酸配列を有する第１タンパク質と、配列番号３のアミノ酸配列を有する第２タンパク質と、及び前記第１タンパク質又は前記第２タンパク質と実質的に相同なタンパク質と、からなる群より選択される１以上のタンパク質を、対象（被験者）から採取されたサンプル中で検出するステップと、及び検出結果を用いてサンプル中のＣペプチドの作用状態を評価するステップとを含む。
また、本発明の他の態様は、Ｃペプチドの作用量の異常によって特徴づけられる疾患の診断方法であって、配列番号１のアミノ酸配列を有する第１タンパク質をコードする核酸と、配列番号３のアミノ酸配列を有する第２タンパク質をコードする核酸と、前記第１タンパク質又は前記第２タンパク質と実質的に相同なタンパク質をコードする核酸とからなる群より選択される１以上の核酸を、対象（被験者）から採取されたサンプル中で検出するステップと、及び検出結果を用いてサンプル中のＣペプチドの作用状態を評価するステップとを含む。
本発明の更に他の態様は、Ｃペプチドの作用量の異常によって特徴づけられる疾患の診断方法であって、配列番号１のアミノ酸配列を有する第１タンパク質をコードする遺伝子の多型と、配列番号３のアミノ酸配列を有する第２タンパク質をコードする遺伝子の多型と、及び前記第１タンパク質又は前記第２タンパク質と実質的に相同なタンパク質をコードする遺伝子の多型と、からなる群より選択される１以上の多型を、対象から採取されたサンプル中で解析するステップと、及び解析結果を用いてサンプル中のＣペプチドの作用状態を評価するステップとを含む。【００２７】
本明細書において「Ｃペプチドの作用量の異常によって特徴づけられる疾患」とは、少なくとも一つの特徴としてＣペプチドの高発現又は低発現を伴う疾患をいう。従って、Ｃペプチドの高発現又は低発現が直接的原因となる疾患は勿論のこと、他の原因によって引き起こされる疾患であっても結果としてＣペプチドの高発現状態又は低発現状態が認められるのであれば当該疾患に含まれる。
ここで、本タンパク質の一つであるHSPA5（別名glucose regulated protein 78kDa (GRP78)）と、糖尿病との間に関連性のあることが報告されている（Biochem Cell Biol. 1990 Dec;68(12):1428-32.；  Acta Physiol Hung. 1995;83(4):333-42.）。また、HSPA5にはアポトーシス抑制作用も確認されている（J. Biol. Chem. 2003, 278(23) 20915-24）。一方、Ｃペプチドにもアポトーシス抑制作用があることが報告されている（Diabetes Metab Res Rev. 2003 Sep-Oct;19(5):375-85.； Comment in: Diabetes Metab Res Rev. 2003 Sep-Oct;19(5):345-7.；  Int J Exp Diabetes Res. 2002 Oct-Dec;3(4):241-5.）。Ｃペプチドに関しては更に、細胞内カルシウムを増加させeNOSを活性化することによる血管拡張作用があることが報告されている（Nitric Oxide. 2003 Sep;9(2):95-102.）また、本発明者らの研究の成果として、(1)インスリンと同様にp42/p44  MAPキナーゼによるリン酸化を促進すること、(2)インスリンと異なりAktによるリン酸化を抑制すること、(3)Rhoの膜へのトランスロケーションを促進してRhoキナーゼを活性化することが判明し、これらの作用を通じて(4)血管平滑筋細胞の機能にＣペプチドが関与することが明らかとなった。
以上の事実を考慮すれば、Ｃペプチドの作用量は、アポトーシスや血管拡張作用が原因となる疾患、例えば糖尿病性合併症（大血管障害、細小血管障害）及び代謝異常症候群（Metabolic syndrome）等に関連性を有すると考えられる。従って、本発明の方法はこれらの疾患の診断に有効な手段であると期待される。また、特にＣペプチドの作用が異常に高い場合にこれを抑えること、又はＣペプチドの作用が異常に低い場合にこれを増加させることで、これらの疾患の治療（症状の改善）又は予防することができると期待される。【００２８】
ここで、Ｃペプチドの作用量は第一にＣペプチドの発現量に依存する。即ち、Ｃペプチドの発現量が異常であれば通常Ｃペプチドの作用量も異常となる。このことを考慮して、本明細書における用語「Ｃペプチドの作用量の異常によって特徴づけられる疾患」は、用語「Ｃペプチドの発現量の異常によって特徴づけられる疾患」と交換可能に用いられるものとする。従って、Ｃペプチドの発現量の異常によって特徴づけられる疾患も、本発明がその対象とする疾患に該当する。
尚、本明細書において用語「疾患」は、疾病、病気、又は病態など、正常でない状態を表す用語と交換可能に用いられる。【００２９】
Ｃペプチドの作用量は、本発明の対象疾患に関する有益な情報を与える。即ち、Ｃペプチドの作用量と本発明の対象疾患との間には関連性が認められることから、対象（ヒトなど）におけるＣペプチドの作用量を調べることによって、本発明の対象疾患への罹患の有無、罹患するおそれの程度、及び／又は病態等を把握ないし評価できる。また、Ｃペプチドの作用量の変化を経時的に測定することによって病態の変動（改善或いは悪化）をモニターすることもできる。
尚、上述のように、Ｃペプチドには抗アポトーシス作用、血管拡張作用、神経保護作用等が認められている。従って、Ｃペプチドの有するこれらの作用の程度を把握ないし評価することに本タンパク質の発現状態等を利用することもできる。即ち、これらの作用の結果として生ずる疾患の判定指標としてのみならず、これらの作用を直接把握する手段としても本タンパク質は有効である。【００３０】
（Ｃペプチドの作用状態を調節する化合物のスクリーニング方法）
本発明のさらに他の局面は、本タンパク質を利用したスクリーニング方法に関する。本発明のスクリーニング方法では、本タンパク質（好ましくはHSPA9B又はHSPA5）とＣペプチドとを、試験化合物の存在下（試験群）及び非存在下（対照群）においてそれぞれ接触させるステップ（接触ステップ）が実施される。具体的には例えば、プレートや膜、或いはビーズ等の不溶性支持体に固定したＣペプチドに反応用溶液内で本タンパク質を接触させる。試験群では、試験化合物が反応溶液内に存在した状態（即ち、試験化合物を添加した状態）でこのような接触を実施し、一方の対照群では試験化合物が反応溶液内に存在しない状態で同様の接触を実施する。次に、所定時間経過した後、適当な溶液で洗浄することで非特異的結合成分を除去する。続いて、Ｃペプチドと本タンパク質との複合体を検出し、試験群と対照群との間で検出量を比較する（検出量比較ステップ）。複合体の検出は例えば、本タンパク質に特異的結合性を有する抗体を用いた免疫学的手法等で実施することができる。【００３１】
本タンパク質とＣペプチドとを接触させる際に用いる反応用溶液は特に限定されず、公知又は市販の緩衝液、生理食塩水などを用いることができる。反応条件（反応用溶液の組成及びpH等、並びに反応温度、反応時間等）は、Ｃペプチドと本タンパク質との結合性を指標とした実験を基に容易に設定することが可能である。例えば、反応用溶液としてはリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、トリス酢酸緩衝液などを用いることができ、そのpHは例えばpH6.0〜pH8.0、好ましくはpH6.5〜pH7.5とする。また、反応温度は例えば4℃〜45℃、好ましくは4℃〜40℃とすることができる。反応時間については例えば１分〜２４時間の範囲で設定できる（具体的には例えばオーバーナイトで反応させる）。【００３２】
不溶性支持体に固定したＣペプチドに対して本タンパク質を接触させるのではなく、本タンパク質を不溶性支持体に固定し、これにＣペプチドを接触させることにしてもよい。この場合には、固相の本タンパク質に結合したＣペプチドを検出することで複合体の量を求めることができる。【００３３】
検出量比較ステップの結果を用いて、試験化合物の存在による、Ｃペプチドと本タンパク質との結合態様（結合量、結合力など）の変化を調べる。具体的には例えば、試験化合物が存在することによってＣペプチドと本タンパク質との結合量が減少すれば、当該試験化合物にはこれら両分子間の結合を阻害ないし抑制する作用があると判断することができる。これとは逆に、試験化合物が存在することによってＣペプチドと本タンパク質との結合量が増加すれば、当該試験化合物にはこれら両分子間の結合を促進ないし増強する作用があると判断することができる。このようにして、Ｃペプチドと本タンパク質との結合性を変化させる化合物、即ちＣペプチドの作用状態を調節することができる化合物を選抜することができる。選抜された化合物は、Ｃペプチドが関与する疾患（即ち、Ｃペプチドの作用量の異常によって特徴づけられる疾患）の医療措置に対して有効である。例えば、Ｃペプチドと本タンパク質の結合を阻害ないし抑制する作用が認められた化合物は、Ｃペプチドの作用を抑えることに用いられることが期待される。従って、当該化合物は、Ｃペプチドの高発現が原因となる疾患の治療・予防への応用が期待される。一方、Ｃペプチドと本タンパク質の結合を促進ないし増強する作用が認められた化合物は、Ｃペプチドの作用を高めることに用いられ得る。従って、当該化合物は、Ｃペプチドの低発現が原因となる疾患の治療・予防への応用が期待される。
以上のように、本発明のスクリーニング方法によって選抜された化合物は、Ｃペプチドが関与する疾患に対する薬剤の有力な候補、又はそのような薬剤を開発する際の有益な材料となる。【００３４】
本発明の他の態様では、細胞ベースのスクリーニング方法が提供される。この態様では、試験化合物の存在によって、本タンパク質（好ましくはHSPA9B又はHSPA5）の細胞内発現量が変化するか否かが調べられる。例えば、試験化合物の存在下で細胞を所定時間培養するステップ（培養ステップ）と、培養後の細胞内の本タンパク質の発現量を測定するステップ（発現量測定ステップ）と、前記ステップで得られた本タンパク質の発現量を、試験化合物の非存在下で同様に細胞を培養した後の細胞内の本タンパク質の発現量と比較するステップ（発現量比較ステップ）とを順に実施する。
具体的には例えば、まず試験化合物の存在下で培養する細胞群（試験群）と、同種の細胞からなり試験化合物の非存在下で培養する細胞群（対照群）とを用意し、試験化合物の有無以外は同条件でそれぞれ培養する。培養後、各群について本タンパク質の細胞内発現量を測定する。最後に測定結果を比較する。尚、試験化合物の非存在下での本タンパク質の細胞内発現量が予め判明している場合には、これを対照群における本タンパク質の細胞内発現量として試験化合物を評価してもよい。この場合には、試験化合物の非存在下での培養を省略することができることになる。【００３５】
細胞内発現量は例えば、本タンパク質に特異的結合性を有する抗体を使用する免疫学的手法を用いて本タンパク質を直接検出することによって測定できる。或いは、本タンパク質をコードするmRNAを検出することにしてもよい。この場合には、本タンパク質をコードするmRNAの量を指標として本タンパク質の発現量が把握される。mRNAの検出には、特異的なプローブを用いた各種ハイブリダイゼーション法（例えばサザンブロット法）など、常法を採用できる。【００３６】
試験群と対照群との比較結果に基づいて、試験化合物の存在が本タンパク質の細胞内発現量に影響するか否か、及び影響する場合にはその程度を求める。その結果、試験化合物が存在することによって、本タンパク質の細胞内発現量に変化がみられれば、本タンパク質の発現量を調節する作用を試験化合物が有すると判断することができる。ここで、本発明者らの検討の結果、本タンパク質は生体におけるＣペプチドの結合物質であり、Ｃペプチドの作用が発揮されるキー分子であることが判明した。即ち、生体におけるＣペプチドの作用状態（作用量）は本タンパク質の発現量（及びアフィニティー）に依存する。このことから、本タンパク質の発現量を調節する作用を有する試験化合物は、生体においてＣペプチドの作用状態を調節することができるといえる。以上のように、細胞ベースのスクリーニング方法によってもＣペプチドの作用状態を調節し得る化合物を選抜することができる。【００３７】
本発明のスクリーニング方法において試験群と対照群を同一の細胞（細胞群）で構成してもよい。例えば、まず試験化合物の非存在下で細胞を培養して本タンパク質の発現量を測定した後（対照群の測定）、培養液に試験化合物を添加し、更に所定時間培養をする。培養終了後、本タンパク質の細胞内発現量を測定する（試験群の測定）。【００３８】
本タンパク質を発現可能であるという条件を満たす限り、使用する細胞の種類は問わない。例えば、HeLa細胞、COS細胞、CHO細胞等、株化された細胞を使用することができる。これらの細胞はＡＴＣＣなどの細胞バンクから容易に入手可能である。また、生体より分離された細胞を直接用いることもできる。例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ等から採取した細胞を本発明のスクリーニング方法に供することができる。
さらには、ヒト以外の動物細胞（例えばマウス、ラット、ウサギ、ニワトリなど）であることを条件として、生体から分離されていない状態（即ち生体を構成している状態）の細胞を使用してもよい。この場合には例えば、個体に対して試験化合物を経口又は非経口投与し、所定時間経過した後に、特定の細胞内（例えば血管平滑筋細胞、神経系細胞など）における本タンパク質の量を測定する。そして測定量を、本タンパク質を投与しない場合の本タンパク質の量と比較する。【００３９】
分散した状態の細胞ではなく、細胞間にネットワークの形成が認められる細胞群（例えば特定の組織を形成した細胞）をスクリーニングに使用することもできる。また、異なる二種類以上の細胞を併用して本発明のスクリーニング方法を実施してもよい。【００４０】
使用する細胞の数は特に限定されず、本タンパク質の検出量、実験設備等を考慮して定めることができる。例えば、1〜105個、好ましくは10〜104個、更に好ましくは102〜103個の細胞を用いることができる。【００４１】
（Ｃペプチドの作用状態を調節する化合物）
本発明のさらに他の局面は、Ｃペプチドの作用状態を調節することができる化合物に関する。具体的には一態様として、Ｃペプチド又は配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質に対して特異的結合性を有し、且つＣペプチドと前記タンパク質との結合を阻害する抗体が提供される。他の態様として、Ｃペプチド又は配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質に対して特異的結合性を有し、且つＣペプチドと前記タンパク質との結合を阻害する抗体が提供される。これらの抗体は例えば、その特異的結合性を利用して、Ｃペプチドと本タンパク質との結合アッセイに用いることができる。また、当該抗体は、Ｃペプチドの作用を阻害する活性を有することから、Ｃペプチドの高発現が原因となる疾患に対する薬剤として利用され得る。尚、抗体の作製方法については、上記本発明の検出方法の欄に記載した方法を採用できる。【００４２】
（Ｃペプチドの作用状態を調節する方法）
本発明のさらに他の局面は、標的細胞内においてＣペプチドの作用状態を調節する方法に関する。この局面の一態様では、標的細胞に本タンパク質（好ましくはHSPA9B又はHSPA5）を人為的に導入するステップが実施される。これによって、Ｃペプチドの特異的結合分子である本タンパク質の標的細胞内存在量が増加し、それに伴いＣペプチドの作用量が増強される。従って、Ｃペプチドの作用量の増加が標的細胞に及ぼす影響を調べることができる。換言すれば、Ｃペプチドの生理学的作用を調べるために好適な実験系が提供される。ここで、標的細胞が生体を構成する細胞（後に生体に移植される細胞を含む）であれば、生体におけるＣペプチドの作用量を増大させることができる。従って、Ｃペプチドの低発現が原因となる疾患に罹患した対象を治療するために本発明の方法を利用することができる。
本発明の他の態様では、標的細胞に対して、Ｃペプチドと本タンパク質との結合を阻害する化合物を投与するステップが実施される。これによって、標的細胞内における、Ｃペプチドの作用量を低下させることができる。従って、Ｃペプチドの作用量の低下が標的細胞に及ぼす影響を調べることができる。換言すれば、この態様においてもＣペプチドの生理学的作用を調べるために好適な実験系が提供される。ここで、標的細胞が生体を構成する細胞（後に生体に移植される細胞を含む）であれば、生体におけるＣペプチドの作用量を低下させることができる。従って、Ｃペプチドの高発現が原因となる疾患に罹患した対象を治療するために本発明の方法を利用することができる。【００４３】
本発明の更に他の態様では、標的細胞において本タンパク質（好ましくはHSPA9B又はHSPA5）の発現を阻害ないし抑制することによって、Ｃペプチドの作用状態を調節する方法が提供される。本タンパク質の発現の阻害ないし抑制は、アンチセンス法やRNA干渉によって、或いはリボザイムの使用によって行うことができる。【００４４】
アンチセンス法による発現阻害を行う場合には例えば、標的細胞内で転写されたときに、本タンパク質をコードするmRNAの固有の部分に相補的なRNAを生成するアンチセンス・コンストラクトが使用される。このようなアンチセンス・コンストラクトは例えば、発現プラスミドの形態で標的細胞に導入される。一方、アンチセンス・コンストラクトとして、標的細胞内に導入されたときに、本タンパク質をコードするmRNA／又はゲノムDNA配列とハイブリダイズしてその発現を阻害するオリゴヌクレオチド・プローブを採用することもできる。このようなオリゴヌクレオチド・プローブとしては、好ましくは、エキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼなどの内因性ヌクレアーゼに対して抵抗性であるものが用いられる。
アンチセンス核酸としてDNA分子を使用する場合、本タンパク質をコードするmRNAの翻訳開始部位（例えば-10〜+10の領域）を含む領域に由来するオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。【００４５】
アンチセンス核酸と、標的核酸との間の相補性は厳密であることが好ましいが、多少のミスマッチが存在していてもよい。標的核酸に対するアンチセンス核酸のハイブリダイズ能は一般に、両核酸の相補性の程度及び長さの両方に依存する。通常、使用するアンチセンス核酸が長いほど、ミスマッチの数が多くても、標的核酸との間に安定な二重鎖（又は三重鎖）を形成することができる。当業者であれば、標準的な手法を用いて、許容可能なミスマッチの程度を確認することができる。【００４６】
アンチセンス核酸はDNA、RNA、若しくはこれらのキメラ混合物、又はこれらの誘導体や改変型であってもよい。また、一本鎖でも二本鎖でもよい。塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格部分を修飾することで、アンチセンス核酸の安定性、ハイブリダイゼーション能等を向上させることなどができる。また、アンチセンス核酸に、細胞膜輸送を促す物質（例えば Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648-652; PCT Publication No. W088/09810, published December 15, 1988を参照されたい)や、特定の細胞に対する親和性を高める物質などを付加してもよい。
アンチセンス核酸は例えば市販の自動ＤＮＡ合成装置（例えばアプライド・バイオシステムズ社等）を使用するなど、常法で合成することができる。核酸修飾体や誘導体の作製には例えば、Stein et al.(1988), Nucl. Acids Res. 16:3209やSarin et al., (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451等を参照することができる。【００４７】
標的細胞内におけるアンチセンス核酸の作用を高めるために、pol IIやpol IIIといった強力なプロモーターを利用することができる。即ち、このようなプロモーターの制御下に配置されたアンチセンス核酸を含むコンストラクトを標的細胞に導入すれば、当該プロモーターの作用によって十分な量のアンチセンス核酸の転写を確保できる。
アンチセンス核酸の発現は、哺乳動物細胞（好ましくはヒト細胞）で機能することが知られている任意のプロモーター（誘導性プロモーター又は構成的プロモーター）によって行うことができる。例えば、SV40初期プロモーター領域 (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310)、ラウス肉腫ウィルスの3'末端領域由来のプロモーター(Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797)、疱疹チミジン・キナーゼ・プロモーター(Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445)等のプロモーターを使用することができる。【００４８】
本発明の一態様では、RNA干渉（RNAi）により本タンパク質の発現阻害を行う。RNAiは、真核細胞内で引き起こすことが可能な、配列特異的な転写後遺伝子抑制のプロセスである。RNA干渉では、標的mRNAの配列に対応する配列を有する二本鎖RNA（dsRNA）が使用される。哺乳動物細胞は、dsRNAの影響を受ける２つの経路（配列特異的経路及び配列非特異的経路）を有することが知られている。配列特異的経路においては、比較的長いdsRNAが短い干渉性のRNA（siRNA）に分割される。このsiRNAは、それぞれが3'末端に突出部を有する約19ヌクレオチドのsiRNAを形成する約21ヌクレオチドのセンス及びアンチセンス鎖を有する。他方、配列非特異的経路は、所定の長さ以上であれば配列に関係なく、任意のdsRNAによって惹起されると考えられている。この経路では、dsRNAが二つの酵素、即ち、活性型となり翻訳開始因子eIF2をリン酸化することでタンパク質合成のすべてを停止させるPKRと、RNAase L活性化分子の合成に関与する2',5'オリゴアデニル酸シンターゼが活性化される。本発明の方法では、この非特異的経路の進行を最小限に留めるために、約30塩基対より短いdsRNAを使用することが好ましい(Hunter et al. (1975) J Biol Chem 250: 409-17; Manche et al. (1992) Mol Cell Biol 12: 5239-48; Minks et al. (1979) J Biol Chem 254: 10180-3; 及び Elbashir et al. (2001) Nature 411: 494-8を参照されたい）。
尚、RNAiは様々な細胞種（例えば、HeLa細胞、NIH/3T3細胞、COS 細胞、293細胞等）において遺伝子発現を減少させる効果的な手段であることが確認されている。また、通常は、アンチセンス法よりも効果的に発現阻害を行える。【００４９】
RNAiに使用するdsRNAは、化学合成によって、又は適当な発現ベクターを用いてin vitro又はin vivoで調製することができる。後者の方法は、比較的長いdsRNAの調製を行うことに特に有効である。dsRNAの設計には通常、標的核酸に固有の配列（連続配列）が利用される。尚、適当な標的配列を選択するためのプログラム及びアルゴリズムが開発されている。【００５０】
本発明の他の一態様ではリボザイムにより本タンパク質の発現阻害を行う。部位特異的認識配列でmRNAを開裂させるリボザイムを用いて、本タンパク質をコードするmRNAを破壊することもできるが、好ましくはハンマーヘッド・リボザイムを使用する。ハンマーヘッド・リボザイムの構築方法については例えばHaseloff and Gerlach, 1988, Nature, 334:585-591を参考にすることができる。
アンチセンス法の場合と同様に、例えば安定性やターゲット能を向上させることを目的として、修飾されたオリゴヌクレオチドを用いてリボザイムを構築してもよい。効果的な量のリボザイムを標的細胞内で生成させるために、例えば、強力なプロモーター（例えばpol IIやpol III）の制御下に、当該リボザイムをコードするDNAを配置した核酸コンストラクトを使用することが好ましい。【００５１】
（本発明の方法に使用されるキット）
上記本発明の各方法（本タンパク質を検出対象とした検出方法、本タンパク質を利用したスクリーニング方法など）を、キット化した試薬等を用いて実施してもよい。本発明の他の局面はこのような目的に使用されるキットを提供する。例えば、本タンパク質を検出対象とした検出方法に使用されるキットの場合、その構成要素（成分）として、本タンパク質に特異的結合性を有する試薬（第１試薬）を含む。第１試薬は好ましくは抗体又は抗体断片である。また、第１試薬として、検出可能な標識物質が結合したものを用いれば、当該標識物質の量を指標として直接的な検出（測定）が可能となる。他方、当該試薬に対して特異的に結合する試薬（第２試薬）であって、標識物質が結合したもの（例えば標識化二次抗体）を用いれば、第１試薬を介して結合した第２試薬から得られる標識量を指標として、第１試薬の結合量を間接的に検出することが可能である。以上の試薬に加えて本発明のキットには、第１試薬等を使用する反応に必要な希釈液、反応液、反応容器等を含めることができる。
一方、本発明のスクリーニング方法に使用されるキットの場合、典型的には、その構成要素（成分）として、Ｃペプチドを含む第１試薬と、本タンパク質（例えば、HSPA9B又はHSPA5）を含む第２試薬とを含む。Ｃペプチド又は本タンパク質が不溶性支持体に結合した状態であってもよい。第１試薬又は第２試薬を予め標識化しておけば、Ｃペプチドと本タンパク質との結合量を直接検出可能なキットとなる。一方、Ｃペプチド又は本タンパク質に対して特異的結合性を有し、標識化された化合物（例えば抗体）をキットに同梱することにしてもよい。かかるキットを使用した場合には、標識化化合物の量（標識量）を指標にしてＣペプチドと本タンパク質の結合量が間接的に検出される。
尚、本発明のキットには通常、使用説明書が添付される。
【実施例１】
【００５２】
＜Ｃペプチドに特異的結合性を有するタンパク質の分離・精製、及び同定＞
１．Ｃペプチド結合カラムの作製
約1mlのNHS-activated Sepharose 4 Fast Flow（アマシャムバイオサイエンス、71-5000-14）にＣペプチド2mgを製造元より供与された所定の方法に従い結合させた。【００５３】
２．Ｃペプチド特異的結合タンパク質の分離・精製
以下の手順で、Ｃペプチドに特異的結合性を有するタンパク質の分離・精製を試みた。
(1)10%FCS添加DMEM、5%CO2、37℃の条件で培養したヒト大動脈平滑筋細胞を15cmシャーレ10枚より回収した（細胞数約1×108個）。
(2)回収した細胞を、Lysis buffer 1.5ml：25mM Tris-HCl(pH7.5)、1% NP40、インヒビター（Complete Mini、ロッシュ、1 836 153）に懸濁し、4℃で30min放置した。この処理によって細胞を可溶化した。
(3)上記処理後、15,000×g、10minの条件で遠心処理し、上清を回収した（細胞抽出液、約1ml）。
(4)細胞抽出液と、１．で作製したＣペプチド結合カラム（1ml）とを室温で反応させた。
(5)反応終了後、Lysis buffer（1ml）で洗浄し（3回）、Ｃペプチド結合カラムに非特異的に結合した成分を除去した。
(6) 0.1M グリシン(pH3.0) 1mlによって、洗浄処理後のＣペプチド結合カラムから結合成分を溶出させた（1回）。尚、溶出液は直ちにグリシン(pH 3.0)で中和させた。
(7)中和後の溶出液を、ポリエチレングリコールを用いて約100μl（約10倍濃縮）になるまで濃縮した（サンプル溶液）。
(8)以上の手順で得られたサンプル溶液をSDS-PAGEにて分離した後、銀染色に供した。【００５４】
染色後のゲルを図１上段に示す。左レーン：上記手順で調製したサンプル溶液の泳動結果（Ｃペプチド(+)）、右レーン：Ｃペプチド結合カラムの代わりに、Ｃペプチドを結合させていないNHS-activated Sepharose 4 Fast Flowを用い、それ以外は同様の手順で調製した対照サンプルの泳動結果（Ｃペプチド(-)）である。尚、図１下段では、バンド位置を線（１、２）で示している。図１から明らかなように、左レーン（Ｃペプチド(+)）では二つのバンドが認められる。即ち、Ｃペプチド結合カラムに特異的に結合する二種類のタンパク質が得られた。泳動度より、これらのタンパク質の分子量はそれぞれ約70kDa及び約68kDaと推定された。【００５５】
３．Ｃペプチド特異的結合タンパク質の同定
次に、分離に成功した二種類のタンパク質の同定を試みた。まず、上記と同様の手順（(1)〜(7)）でサンプル溶液を調製した後、SDS-PAGEによる分離及びPVDF膜への転写を行い、MALDI-TOF/MS解析（PMF解析）を実施した。その結果、SDS-PAGEで約70kDaのバンドとして観察されたタンパク質は熱ショック70kDaタンパク質9B前駆体（ACCESSION: NP_004125, DEFINITION: heat shock 70kDa protein 9B precursor; heat shock 70kD protein 9; stress-70 protein, mitochondrial; 75 kDa glucose regulated protein; peptide-binding protein 74; mortalin, perinuclear; p66-mortalin; heat shock 70kD protein 9B (mortalin-2) [Homo sapiens], Entrez Protein, NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）であることが判明した。他方、SDS-PAGEで約68kDaのバンドとして観察されたタンパク質は熱ショック70kDaタンパク質5（ACCESSION: NP_005338, DEFINITION: heat shock 70kDa protein 5 (glucose-regulated protein, 78kDa); Heat-shock 70kD protein-5 (glucose-regulated protein, 78kD); heat shock 70kD protein 5 (glucose-regulated protein, 78kD) [Homo sapiens], Entrez Protein, NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）であることが判明した。
【実施例２】
【００５６】
＜同定された二種類のタンパク質の機能確認＞
同定された二種類のタンパク質のＣペプチドに対する結合能を確認するために、以下の手順で競合実験を実施した。
(1) 10%FCS添加DMEM、5%CO2、37℃の条件で培養したヒト大動脈平滑筋細胞を15cmシャーレ10枚より回収した（細胞数約1×108個）。
(2)回収した細胞を、Lysis buffer 1.5ml：25mM Tris-HCl(pH7.5)、1% NP40、インヒビター（Complete Mini、ロッシュ、1 836 153）に懸濁し、4℃で30min放置した。この処理によって細胞を可溶化した。
(3)上記処理後、15,000×g、10minの条件で遠心処理し、上清を回収した（細胞抽出液、約1ml）。
(4)細胞抽出液とＣペプチド結合カラム（実施例１の１．を参照、1ml）とを、Ｃペプチドの存在下、室温で反応させた。対照１（Ｃペプチド(-)カラム）として、細胞抽出液を、Ｃペプチドを結合させていないNHS-activated Sepharose 4 Fast Flowと同様の条件で反応させた。また、対照２（競合阻害なし）として、細胞抽出液とＣペプチド結合カラムとをＣペプチドの非存在下で同様に反応させた。
(5)反応終了後、Lysis buffer（1ml）で洗浄した（3回）。
(6) 0.1M グリシン(pH3.0) 1mlによって溶出させた（1回）。尚、溶出液は直ちにグリシン(pH 3.0)で中和させた。
(7)中和後の溶出液を、ポリエチレングリコールを用いて約100μl（約10倍濃縮）になるまで濃縮した（サンプル溶液）。
(8)以上の手順で得られたサンプル溶液をSDS-PAGEにて分離した後、銀染色に供した。【００５７】
染色後のゲルを図２に示す。Ａ：対照１（Ｃペプチド(-)カラム）、Ｂ：対照２（Ｃペプチド(+)カラム、競合阻害なし）、Ｃ：サンプルレーン（Ｃペプチド(+)カラム、競合阻害）である。図２から明らかなように、Ｃペプチドの競合阻害によって、70kDa付近に認められた2種類のバンド（約70kDa、約68kDa）が消失した。このことから、過剰のフリーのＣペプチドが、カラムとこれら2種類のタンパク質の結合を競合的に阻害したことが分かる。すなわち、Ｃペプチド結合カラムで精製されてきた2種類のタンパク質はＣペプチドに対して特異的結合性を有すると言える。
【実施例３】
【００５８】
＜同定されたタンパク質の発現実験及び機能の検証＞
１．ヒト由来細胞におけるHSPA5及びHSPA9Bの存在確認
ヒト血管内皮細胞（HUVEC）、ヒト胎児腎臓細胞（HEK）、HeLa細胞からTotal RNAを抽出した後、cDNAに変換し、HSPA5又はHSPA9B特異的プライマーを用いてPCRを実施した。PCR後の反応液を電気泳動に供した。電気泳動の結果を図３に示す。図３の上段にはHSPA5特異的プライマーによる増幅産物が示され、同下段にはHSPA9B特異的プライマーによる増幅産物が示される。PCRに使用した鋳型は次の通りである。左のレーンから順に(1)HUVEC cDNA、(2)HUVEC Total RNA、(3)HEK cDNA、(4)HEK Total RNA、(5)HeLa cDNA、(6)HeLa Total RNA、(7)鋳型なし。
図３から明らかなように、HUVEC細胞、HEK細胞及びHeLa細胞においてHSPA5及びHSPA9Bが発現していることが確認された。【００５９】
２．HSPA5及びHSPA9Bのクローニング
まず、HEK細胞からPCRにてHSPA5及びHSPA9Bをクローニングした。次に、Gatewayシステム（インビトロジェン）を利用するため、クローニングしたcDNAを組み込んだエントリークローンを作製した。得られたエントリークローンを用いて大腸菌発現用及び哺乳類発現用ベクターをそれぞれ作製した。尚、大腸菌発現用としてcDNAクローンのC末端側にGST-tagが付加されるようにし、哺乳類発現用としてcDNAクローンのC末端側にHis-tag、GFP-tagが付加されるようにした。【００６０】
３．大腸菌での発現
２．で得た大腸菌発現用ベクター（HSPA5発現ベクター、HSPA9B発現ベクター）で大腸菌を形質転換した。IPTGで発現誘導させた後、菌体破砕液よりGST融合タンパク質を精製し、ウエスタンブロットに供した。ウエスタンブロットの結果を図４に示す。左側のレーン（(1)〜(3)）は、HSPA5発現ベクターで形質転換した大腸菌から得たサンプルについての結果、右側のレーン（(1)〜(3)）はHSPA9B発現ベクターで形質転換した大腸菌から得たサンプルについての結果である。また、(1)は大腸菌可溶化後の遠心処理によって得られた沈殿画分をアプライしたレーン、(2)は大腸菌可溶化後の遠心処理によって得られた上清画分をアプライしたレーン、(3)は大腸菌可溶化後の遠心処理によって得られた上清をGlutachione-Sepharose 4Bで精製したものをアプライしたレーンである。
図４からわかるように、予想される位置（矢印）より低い位置にバンドが観察される。また、HSPA9Bについては、GSPビーズで抽出される量の減少が認められる。これらの結果より、目的のタンパク質（HSPA5及びHSPA9B）が完全長の状態で発現されていないと推測された。【００６１】
４．哺乳類細胞での発現
(1)ウエスタンブロットによる発現確認
２．で得た哺乳類発現用ベクター（HSPA5発現ベクター、HSPA9B発現ベクター）でHEK細胞を形質転換した。形質転換にはEffecteneを利用した。細胞破砕液よりCo beadsを利用してHis-tag融合タンパク質を抽出し、ウエスタンブロットに供した。ウエスタンブロットの結果を図５に示す。左欄及び右欄ともに、左から順に空ベクターで形質転換したHEK細胞から得たサンプルレーン（コントロール）、HSPA5発現ベクターで形質転換したHEK細胞から得たサンプルレーン（HSPA5）、HSPA9B発現ベクターで形質転換したHEK細胞から得たサンプルレーン（HSPA9B）である。左欄において、(1)は細胞破砕液をアプライしたレーン、(2)はCo-beads抽出液をアプライしたレーンである。同様に右欄において、(1)は細胞破砕液をアプライしたレーン、(2)は細胞破砕液を遠心処理した後の上清をアプライしたレーン、(3)はCo-beads抽出液をアプライしたレーンである。
図５に示すように、Co beadsで抽出されたサンプルをアプライしたレーンにおいて、予想される位置にバンドが観察され、HSPA5、HSPA9Bともに完全長の状態で発現されていることがわかる。【００６２】
(2)蛍光免疫染色による発現確認
まず、35mm dishにHEK細胞を播いた。続いて、２．で得た哺乳類発現用ベクター（HSPA5発現ベクター、HSPA9B発現ベクター）でHEK細胞を形質転換した（HSPA5-His（0.4ug）、HSPA9B-His（0.4ug））。形質転換にはEffecteneを利用した。形質転換後の細胞を回収し、1×1ガラスチャンバーに播種した。Anti-V5（Alexa 488 mouse）、ヘキストを用いた蛍光免疫染色を行った。染色結果を図６に示す。図６の上段はコントロール（空ベクターで形質転換したHEK細胞の染色結果）である。中段はHSPA5発現ベクターで形質転換したHEK細胞の染色結果であり、蛍光が観察される。同様に、下段はHSPA9B発現ベクターで形質転換したHEK細胞の染色結果であり、蛍光が観察される。これらの結果から明らかなように、哺乳類細胞においてHSPA5-His及びHSPA9B-Hisを強制発現させることに成功した。【００６３】
５．Cペプチドとの結合実験
ウエスタンブロットでHSPA5のCペプチド結合性を検証した。図７に示すプロトコールに従ってサンプルを調製し、ウエスタンブロットに供した。ウエスタンブロットの結果を図８に示す。各レーンにアプライしたサンプルは次の通りである。即ち、(3)はHSPA5発現ベクターで形質転換した細胞から調製した細胞破砕液の上清画分の中でCペプチドビーズに結合した成分、(4)はCペプチドビーズの代わりにペプチド未結合ビーズを反応させて得られたサンプルである。また、(1)はHSPA5発現ベクターで形質転換した細胞から調製した細胞破砕液、(2)は空ベクターで形質転換した細胞から調製した細胞破砕液、(5)は空ベクターで形質転換した細胞から調製した細胞破砕液の上清画分の中でCペプチドビーズに結合した成分、(6)は空ベクターで形質転換した細胞から調製した細胞破砕液の上清画分の中でペプチド未結合ビーズに結合した成分、(7)はHSPA5発現ベクターで形質転換した細胞から調製した細胞破砕液の上清画分をまずCペプチドと反応させた後、Cペプチドビーズと反応させた場合にCペプチドに結合した成分、(8)は空ベクターで形質転換した細胞から調製した細胞破砕液の上清画分をまずCペプチドと反応させた後、Cペプチドビーズと反応させた場合にCペプチドに結合した成分である。
図８から明らかなように、(3)のレーンに明確なバンドが認められる。また、(4)のレーンにもかすかにバンドが観察される。また、その他のレーンではバンドが認められない。これらの結果より、非特異的な結合が僅かに認められものの、強制発現させたHSPA5がCペプチドに結合することが確認された。【００６４】
６．細胞膜表面での発現確認
HUVEC細胞を1×1ガラスチャンバーに播き、Cペプチド（0.3nM、10min）及びTG（トリグリセリド1uM、5hr）で刺激した後、抗HSPA5抗体（２次抗体としてFITC抗ヤギ抗体を使用）を用いて免疫染色し、蛍光を観察した。免疫染色の結果を図９に示す。図９の右欄は抗HSPA5抗体及びFITC抗ヤギ抗体を反応させて得た染色像である。一方、左欄はFITC抗ヤギ抗体のみを反応させた場合（コントロール）の染色結果である。図９から明らかなように、HSPA5が膜表面に存在していることが示唆された。【００６５】
７．HSPノックダウン時のCペプチドに対する反応
Cペプチド刺激による細胞応答の指標としてERK活性化を解析した。もし、HSPがこの反応に関与しているのであれば、HSPノックダウンによりERK活性化が抑制されることになる。
実験手順の概要は次の通りである（詳細を図１０に示す）。まず、HSPA5に対するモルフォリノオリゴで構成されるセンス鎖、アンチセンス鎖をEndo-PorterによりHUVEC細胞に導入した。所定の時間後Cペプチド刺激を行い、ERK活性化を抗リン酸化ERK抗体によるウエスタンブロッティングにて評価した。
結果を図１１に示す。センス鎖を導入したHUVEC細胞ではCペプチド刺激によりERKの活性化が認められたが（図１１のNo.2）、アンチセンス鎖を導入したHUVEC細胞ではERK活性化が有意に抑制された（図１１のNo.4）。この結果より、Cペプチド刺激によるERK活性化の機序の一つとしてHSPを介した経路の存在が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明によって、Ｃペプチド特異的結合分子が明らかとなり、その医療・診断分野への応用が図られる。また、Ｃペプチドの作用機序の解明などにとっても有益な手段が提供される。
本発明におけるＣペプチド特異的結合分子は、インスリン抵抗性のみならずＣペプチド抵抗性がある場合に特に有効な治療ターゲットになると予想される。また、Ｃペプチドの枯渇する１型糖尿病については、当該分子のアゴニストなど、当該分子の活性化を制御する薬剤によって抗アポトーシス作用や血管拡張作用を発揮させることによって、糖尿病性合併症の発症（大血管障害、及び細小血管障害）を抑制できる可能性がある。
現在、ペプチドに関連して糖尿病の範疇で特に注目されているのは血管拡張作用と神経保護作用による神経障害の治療効果である。これらについて、本発明におけるＣペプチド特異的結合分子が関与している可能性は高い。従って、Ｃペプチドの作用機構の解明に必須であるのみならず、この分子そのものが今後の創薬ターゲットになると考えられる。【００６７】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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