(57)【要約】  PGC-1β作用を有する物質を有効成分とする糖取り込み活性化剤、並びに、PGC-1β遺伝子プロモーターに被検物質を接触させる工程、及び、PGC-1β遺伝子プロモーター活性を分析する工程を含む、糖取り込み活性化剤スクリーニング方法を開示する。前記糖取り込み活性化剤は、血液中のインスリンレベルに関係なく、高血糖時に筋組織における糖取り込みを促進する新たな糖尿病治療剤である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
PGC-1β作用を有する物質を有効成分とする、糖取り込み活性化剤。
【請求項２】
PGC-1β作用を有する物質を、糖取り込みの活性化が必要な対象に、有効量で投与することを含む、糖取り込みを活性化する方法。
【請求項３】
PGC-1β作用を有する物質の、糖取り込み活性化剤を製造するための使用。
【請求項４】
配列番号１で表される塩基配列若しくはその部分配列からなるか、又は、これらの塩基配列において１〜１０個の塩基が欠失、置換、及び／若しくは付加された塩基配列からなり、PGC-1β遺伝子のプロモーター活性を有している、ポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１で表される塩基配列、又は、配列番号１で表される塩基配列において１〜１０個の塩基が欠失、置換、及び／若しくは付加された塩基配列からなり、PGC-1β遺伝子のプロモーター活性を有している、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項４に記載のポリヌクレオチドの遺伝子のプロモーターとしての使用。
【請求項７】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む、組換えベクター。
【請求項８】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む、形質転換体。
【請求項９】
請求項４に記載のポリヌクレオチドの、糖取り込み活性化剤スクリーニングツールとしての使用。
【請求項１０】
請求項４に記載のポリヌクレオチドの、糖取り込み活性化剤スクリーニングのための使用。
【請求項１１】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに被検物質を接触させる工程、及び、PGC-1β遺伝子プロモーター活性を分析する工程を含む、糖取り込み活性化剤スクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、下流にレポーター遺伝子を保持し、PGC-1β遺伝子プロモーター活性を分析する工程は、前記レポーター遺伝子の発現を分析する工程である、請求項１１に記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに被検物質を接触させる工程、PGC-1β遺伝子プロモーター活性を分析する工程、及び、被検物質の糖取り込み活性を分析する工程を含む、被検物質の糖取り込み活性分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、PGC-1β作用を有する物質を有効成分とする糖取り込み活性化剤、PGC-1β遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを用いた糖取り込み活性化剤のスクリーニング方法、及び糖取り込み活性分析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
“糖尿病”は、インスリン作用の不足による慢性的な高血糖を主徴とする疾患であり、成因から、インスリンの絶対的不足を原因とする１型糖尿病と、インスリン作用不全を原因とする２型糖尿病の２つに分類されている（非特許文献１）。糖尿病は、長い期間無症状であることがほとんどであり、その間、細小血管の障害が進行し、網膜症や腎症、神経症などのいわゆる糖尿病特有の合併症を引き起こしたり、更には、狭心症や心筋梗塞などの虚血性心疾患、脳梗塞など、動脈硬化症発症の重要な危険因子として知られることから、その有効な治療薬や治療法の開発が社会的に強く求められている。【０００３】
成因に基づいて分類される１型糖尿病は、患者全体の約１０％、２型糖尿病は約９０％を占めるといわれ、圧倒的に２型糖尿病の発症率が高いことが判っている。この“２型糖尿病”は、従来、インスリン非依存性糖尿病（NIDDM, Non-Insulin Dependent Diabetes Mellitus）と呼ばれ、これは、血液中のインスリンレベルに関係なく高血糖を呈する状態となることであり、インスリンに対する臓器の感受性低下に基づくものと理解されている。インスリン感受性の低下により、生体は、正常血糖を保つために必要な血中インスリンレベルの上昇を引き起こし、いわゆる“インスリン抵抗性”と呼ばれる状態になる（非特許文献２）。このようなインスリン抵抗性発症の要因として“肥満症”が示唆されている。肥満症といっても、特に内臓脂肪の蓄積、増加を伴う肥満（内臓肥満）が、糖尿病の危険因子であることが知られるようになってきた（非特許文献３）。このような背景から、インスリンが作用する臓器の、インスリンに対する感受性を高めるような薬剤（インスリン抵抗性改善薬）、あるいはその背景にある内臓肥満を改善するような薬剤の開発が求められるが、主薬効と副作用の両面において具体的には満足いくものはないといえる。【０００４】
近年、肥満研究から、核内受容体ファミリーメンバーの一つであるPPARγ（Peroxisome
Proliferator-Activated Receptor γ）が脂肪細胞の分化に重要な役割を担っているという発見があった（非特許文献４）。その後、血糖降下薬として登場したチアゾリジン誘導体（TZD誘導体）が、PPARγを活性化させるアゴニスト作用を有することが明らかとなり、現在臨床において治療薬として使用されている。しかしながら、TZD誘導体には、体液貯留による浮腫や心不全を起こす危険性、脂肪細胞の増加や細胞の肥大に伴う肥満の助長といった副作用、更には薬効が認められないノンレスポンダーの存在といった問題点が指摘されており（FDA
prescribing information）、２型糖尿病に対するインスリン抵抗性改善薬として充分に満足できるものではない。これら副作用のない新しい薬剤の開発が今もなお強く望まれている。【０００５】
PPARγに関する生化学的、分子生物学的研究から、本分子の機能発現には、TZD誘導体に代わる生理的アゴニストによる活性調節に加え、転写コアクチベーターや転写コリプレッサーによる活性調節の重要性が近年明らかになってきた（非特許文献５）。その調節タンパク質の１つとして考えられるPGC-1α（PPARγcoactivator-1α）は、PPARγと相互作用することによって、その転写活性を強力に誘導するコアクチベーターとしての機能を有することが報告された（非特許文献６）。PGC-1αの機能解析研究から、この分子は、PPARγ以外にもPPARαやPPARδ、TRα（Thyroid
Receptor α）やERα（Estrogen Receptor α）など種々の核内受容体のコアクチベーターとしても働き、熱産生やATP合成に関与するミトコンドリアタンパク質や糖輸送タンパク質など、多種多様な分子群の遺伝子発現レベルを調節、制御することが明らかとなり、生理的には、酸素消費量の増加やミトコンドリア数の増加作用によって、糖や脂肪の燃焼によるエネルギー代謝の亢進を引き起こす作用が期待され、２型糖尿病や肥満症の治療に有効となることが示唆された（非特許文献７）。しかし、その後の研究から、PGC-1αは肝臓において、転写因子HNF4α（Hepatocyte
Nuclear Factor 4α）のコアクチベーターとしても機能することにより、糖新生の律速酵素であるグルコース−６−ホスファターゼやPEPCK（phosphoenolpyruvate
carboxykinase）の発現を誘導し、肝の糖新生を促進させることが示されたことから、PGC-1αの増加あるいは活性化は、糖尿病を増悪する方向に機能する可能性が懸念されている（非特許文献８）。【０００６】
最近、PGC-1αと異なる分子として、PGC-1βが報告された（非特許文献９）。PGC-1βは、比較的選択的に核内受容体ERR（Estrogen
Receptor-related Receptor）と結合することにより働き、ERRの発現制御下流にあって脂肪酸β酸化の律速酵素として知られる中鎖脂肪酸脱水素酵素(MCAD,
Medium Chain Acyl-CoA Dehydrogenase)の発現を誘導すること、筋細胞においてミトコンドリア数の増加に起因するエネルギー代謝亢進作用を有すること、PGC-1αと異なる生理的機能を果たすことが報告された（非特許文献１０）。更には、PGC-1βを全身に過剰発現させたトランスジェニックマウスは、エネルギー代謝の亢進による痩せ型を呈し、脂肪組織量の減少や血中のコレステロール、インスリンやレプチン濃度が低下していることが報告された（非特許文献１１）。また、PGC-1βはPGC-1αと異なり、肝細胞において糖新生律速酵素の発現を誘導しないことから、肝の糖新生には影響しないことが示唆された（非特許文献１２）。しかしながら、PGC-1βと糖取り込みとの関係については何ら知られてはいない。【０００７】
また、特許文献１において、初めてヒトPGC-1β遺伝子のコーディング領域の配列が開示されたが、未だPGC-1βプロモーター活性を有するＤＮＡは取得されてはおらず、PGC-1β発現を亢進する物質をスクリーニングするために適したアッセイ系も見出されてはいない。【０００８】
【非特許文献１】日本糖尿病学会編，「糖尿病治療ガイド2002-2003」，文光堂，2002年，6-11頁
【非特許文献２】平田幸正著，「糖尿病の治療」，第2版，文光堂，2003年，821-907頁
【非特許文献３】「メタボリズム（Metabolism）」，（米国），1987年，36巻，54-59頁
【非特許文献４】「セル（Cell）」，（米国），1994年，79巻，1147-1156頁
【非特許文献５】「ネイチャー（Nature）」，（英国），1998年，395巻，137-143頁
【非特許文献６】「セル（Cell）」，（米国），1998年，92巻，829-838頁
【非特許文献７】「セル（Cell）」，（米国），1999年，98巻，115-124頁
【非特許文献８】「ネイチャー（Nature）」，（英国），1998年，413巻，131-138頁
【非特許文献９】「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（TheJournal of Biological Chemistry）」，（米国），2002年，277巻，1645-1648頁
【非特許文献１０】「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（TheJournal of Biological Chemistry）」，（米国），2003年，278巻，26597-26603頁
【非特許文献１１】「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイティッド・ステート・オブ・アメリカ（Proceedings of the national academy of sciences of the United Statesof America）」，（米国），2003年，100巻，12378-12383頁
【非特許文献１２】「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（TheJournal of Biological Chemistry）」，（米国），2003年，278巻，30843-30848頁
【特許文献１】国際公開第０２／２２８１８号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、血液中のインスリンレベルに関係なく、高血糖時に筋組織における糖取り込みを誘導する新たな糖尿病治療剤である糖取り込み活性化剤を見出すためのスクリーニング方法、及び、糖取り込み活性化剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
PGC-1βは、ミトコンドリア機能を活性化し、それによって細胞内のエネルギー代謝活性化に基づく抗肥満効果が期待され、更には糖尿病の危険因子のひとつである肥満を解消する結果として、インスリン抵抗性を改善し、糖尿病治療効果を示すであろうことが示唆されていた。本発明者の鋭意研究によって、意外にも、PGC-1βには、インスリンレベルに関係なく、筋組織における糖取り込み誘導活性があることを見出し、糖取り込み活性化剤を見出すためのスクリーニング方法、及び、糖取り込み活性化剤を提供することに成功した。このようなことから、PGC-1βの活性化作用に基づく糖取り込み活性化剤は、既存のPPARγ作用薬のような肥満を助長する作用に基づくインスリン抵抗性改善剤とはまったく異なるものであり、また、単に抗肥満作用に基づくインスリン抵抗性改善剤ではなく、インスリンレベルに関係なく、インスリン作用臓器に対する糖取り込みを促進させるという薬剤である。また、肝の糖新生作用がなく、インスリン非存在下でも糖取り込みを促進させるという点で、PGC-1β活性化作用はPGC-1α活性化作用とは異なる。これらは、本活性化剤が、既存のインスリン抵抗性改善剤の対象患者とは完全に一致するものではなく、そのアンメットニーズを満たす可能性を有する新規薬剤になり得るものと考える。【００１１】
すなわち、本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、ヒトPGC-1βの組換えアデノウイルスを用いて、筋細胞L6にヒトPGC-1βを過剰発現させることにより、細胞内の糖輸送タンパク質GLUT4（Glucose
Transporter 4）の遺伝子発現を誘導すること（実施例５）、及び、細胞の糖取り込み活性を促進させること（実施例６）を見出した。更に、このPGC-1βによる糖取り込み促進活性は、PGC-1αの促進活性よりも、非常に大きく、かつ、インスリン非存在下でも促進活性があるという顕著な効果を有するものであることを見出した（実施例６）。また、ヒトゲノムＤＮＡより、PGC-1β遺伝子の上流約１ｋｂからなるプロモーター活性を有するプロモーター領域を単離し、単離したプロモーター領域を用いることにより、前記プロモーターの活性を調節する物質のスクリーニング法を確立した（実施例７〜実施例１０）。そして更には、前記スクリーニング方法を用いて、前記プロモーターを活性化する物質を取得し（実施例１１）、前記物質が筋細胞の糖取り込み活性を誘導することを確認し（実施例１２）、本発明を完成した。【００１２】
すなわち本発明は、
［１］PGC-1β作用を有する物質を有効成分とする、糖取り込み活性化剤；
［２］PGC-1β作用を有する物質を、糖取り込みの活性化が必要な対象に、有効量で投与することを含む、糖取り込みを活性化する方法；
［３］PGC-1β作用を有する物質の、糖取り込み活性化剤を製造するための使用；
［４］配列番号１で表される塩基配列若しくはその部分配列からなるか、又は、これらの塩基配列において１〜１０個の塩基が欠失、置換、及び／若しくは付加された塩基配列からなり、PGC-1β遺伝子のプロモーター活性を有している、ポリヌクレオチド；
［５］配列番号１で表される塩基配列、又は、配列番号１で表される塩基配列において１〜１０個の塩基が欠失、置換、及び／若しくは付加された塩基配列からなり、PGC-1β遺伝子のプロモーター活性を有している、前記［４］のポリヌクレオチド；
［６］前記［４］のポリヌクレオチドの遺伝子のプロモーターとしての使用；
［７］前記［４］のポリヌクレオチドを含む、組換えベクター；
［８］前記［４］のポリヌクレオチドを含む、形質転換体；
［９］前記［４］のポリヌクレオチドの、糖取り込み活性化剤スクリーニングツールとしての使用；
［１０］前記［４］のポリヌクレオチドの、糖取り込み活性化剤スクリーニングのための使用；
［１１］前記［４］のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに被検物質を接触させる工程、及び、PGC-1β遺伝子プロモーター活性を分析する工程を含む、糖取り込み活性化剤スクリーニング方法；
［１２］前記［４］のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、下流にレポーター遺伝子を保持し、PGC-1β遺伝子プロモーター活性を分析する工程は、前記レポーター遺伝子の発現を分析する工程である、前記［１１］のスクリーニング方法；並びに
［１３］前記［４］のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに被検物質を接触させる工程、PGC-1β遺伝子プロモーター活性を分析する工程、及び、被検物質の糖取り込み活性を分析する工程を含む、被検物質の糖取り込み活性分析方法
に関する。【００１３】
なお、配列番号１で表される塩基配列中の塩基番号１〜１０２８の塩基配列は、ヒトPGC-1β遺伝子の−９９６〜＋３２に該当する。また、本発明のスクリーニング方法は、PGC-1β遺伝子プロモーター活性を促進する物質を選択する工程を含むことが特に好ましく、「レポーター遺伝子」としては、ルシフェラーゼ遺伝子を用いることが好ましい。「レポーター遺伝子の発現」は、前記遺伝子がコードするポリペプチドの活性（レポーター活性）を分析（特には測定）することによって確認することが可能である。【００１４】
「PGC-1β作用を有する物質」とは、PGC-1β、PGC-1βをコードするポリヌクレオチド、PGC-1β発現量を増加させる物質、又はPGC-1β遺伝子プロモーター活性化作用を有する物質を意味する。本発明のスクリーニング方法により選択された糖取り込み活性化剤は、ヒトPGC-1βプロモーター活性化作用を有する。【００１５】
また、本明細書における「糖取り込み活性化」とは、細胞が取り込むグルコース分子の増加を意味する。
本明細書における「分析」には、分析対象物質の存在の有無を判定する「検出」と、分析対象物質の量を定量的又は半定量的に決定する「測定」とが含まれる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明スクリーニング方法によれば、血液中のインスリンレベルに関係なく、高血糖時に筋組織における糖取り込みを誘導する新たな糖尿病治療剤である糖取り込み活性化剤を提供することができる。また、本発明の糖取り込み活性化剤、あるいは、本発明スクリーニング方法により得られる糖取り込み活性化剤は、単に抗肥満作用に基づくインスリン抵抗性改善剤ではなく、インスリンレベルに関係なく、インスリン作用臓器に対する糖取り込みを促進させるという薬剤であり、既存のインスリン抵抗性改善剤では治療効果が得られないアンメットニーズを満たすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ヒトPGC-1β過剰発現筋細胞でのGLUT4遺伝子発現誘導の結果を示すグラフである。縦軸は「相対的発現量」であり、記号「**」は、p<0.01（Dunnett検定）であることを示す。
【図２】ヒトPGC-1β過剰発現筋細胞の糖取り込み活性測定の結果を、PGC-1αと比較して示すグラフである。右ボックス内の数値は「インスリン濃度」であり、記号「**」及び「***」は、それぞれ、p<0.01及びp<0.001（Dunnett検定）であることを示す。
【図３】ヒトPGC-1βプロモーター活性の測定の結果を示すグラフである。縦軸は「相対活性」であり、記号「***」は、p<0.001（Dunnett検定）であることを示す。また、記号「(+)」は、フォルスコリン及びデキサメサゾン添加の結果であることを示し、記号「(-)」を、フォルスコリン及びデキサメサゾン無添加（溶媒DMSOのみを添加）の結果であることを示す。
【図４】ヒトPGC-1βプロモーター活性化剤のスクリーニングの結果を示すグラフである。縦軸は「相対活性」であり、横軸は「化合物A濃度」である。記号「***」は、p<0.001（Dunnett検定）であることを示す。
【図５】化合物Aの糖取り込み活性の測定の結果を示すグラフである。横軸は「インスリン濃度」であり、右ボックス内の各数値は「化合物A濃度」である。記号「*」及び「***」は、それぞれ、p<0.05及びp<0.001（Dunnett検定）であることを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明について詳述する。
１．PGC-1β作用を有する物質を有効成分とする糖取り込み活性化剤
本発明は、PGC-1β作用を有する物質、すなわち、PGC-1β、PGC-1βをコードするポリヌクレオチド、PGC-1β発現量を増加させる物質、又はPGC-1β遺伝子プロモーター活性化作用を有する物質を有効成分とする糖取り込み活性化剤を含む。本発明には、PGC-1β作用を有する物質（PGC-1β、PGC-1βをコードするポリヌクレオチド、PGC-1β発現量を増加させる物質、又はPGC-1β遺伝子プロモーター活性化作用を有する物質）を、糖取り込みの活性化が必要な対象に、有効量で投与することを含む、糖取り込みを活性化する方法が含まれる。また、本発明には、PGC-1β作用を有する物質（PGC-1β、PGC-1βをコードするポリヌクレオチド、PGC-1β発現量を増加させる物質、又はPGC-1β遺伝子プロモーター活性化作用を有する物質）の、糖取り込み活性化剤を製造するための使用が含まれる。【００１９】
PGC-1βとしては、天然に存在するPGC-1βを、本発明の糖取り込み活性化剤の有効成分として用いることができる。【００２０】
また、PGC-1βとしては、天然に存在する配列と同一であるか否かを問わず
（１）配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるヒトPGC-1βと９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有する配列を含み、かつ、PGC-1β活性を示すポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）、あるいは、
（２）配列番号１１で表されるアミノ酸配列において１又は数個（例えば、１〜１０個）のアミノ酸残基が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、PGC-1β活性を示すポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）
であることが更に好ましく、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるヒトPGC-1βが最も好ましい。
本明細書における「PGC-1β活性」とは、糖取り込みを活性化（すなわち、促進又は誘導）する活性、すなわち、細胞が取り込むグルコース分子の量を増加させる活性を意味する。【００２１】
本明細書における前記「同一性」とは、BLAST (Basic local
alignment search tool; Altschul,S.F.ら, J.Mol.Biol., 215, 403-410, 1990)検索により得られた値を意味し、アミノ酸配列の相同性は、BLAST検索アルゴリズムを用いて決定することができる。具体的には、BLASTパッケージ（sgi32bit版，バージョン2.0.12;
NCBIより入手）のbl2seqプログラム（Tatiana A.Tatusova及びThomas L.Madden,FEMS
Microbiol.Lett.,174,247-250,1999）を用い、デフォルトパラメーターに従って算出することができる。ペアワイズ・アラインメント・パラメーターとして、プログラム名「blastp」を使用し、Gap挿入Cost値を「0」で、Gap伸長Cost値を「0」で、Query配列のフィルターとして「SEG」を、Matrixとして「BLOSUM62」をそれぞれ使用する。【００２２】
PGC-1βをコードするポリヌクレオチドとしては、PGC-1βをコードするポリヌクレオチドであれば特に限定されるものではなく、相同ポリペプチド又は機能的等価改変体をコードするポリヌクレオチドがより好ましく、ヒトPGC-1βをコードするポリヌクレオチド（特には、配列番号１０で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド）が更に好ましい。【００２３】
或るポリペプチド（以下、テストポリペプチドと称する）がPGC-1β活性を示すか否か、すなわち、糖取り込みの活性化作用を有するか否かは、当業者に公知の方法又はそれを改良した方法を用いることができ、例えば、実施例６に記載の方法により確認することができる。より詳細には、テストポリペプチドを発現可能な発現ベクターで適当な細胞（好ましくは、筋細胞）を形質転換した後、前記細胞を標識化グルコース存在下で所定時間（例えば、１０分間）培養し、前記標識を指標として、前記細胞に取り込まれたグルコース量を測定することにより、糖取り込み活性化作用を確認することができる。【００２４】
PGC-1β遺伝子プロモーター活性化作用を有する物質であるか否かは、後述の「３．本発明のスクリーニング方法」の「スクリーニング用ポリヌクレオチドに被検物質を接触させる工程」及び「PGC-1β遺伝子プロモーター活性を分析する工程」に従って確認することができ、実施例１１記載の方法で、被検物質無添加の場合と比較して２倍以上のプロモーター活性化能を有する物質が、特に好ましい。【００２５】
PGC-1β作用を有する物質を有効成分とする糖取り込み活性化剤は、前記有効成分のみからなることもできるし、あるいは、用いる有効成分のタイプに応じて、所望により、それらの製剤化に通常用いられる担体や賦形剤、その他の添加剤を用いて調製することができる。【００２６】
投与は、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注若しくは筋注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与が挙げられる。特に、酵素の影響を受けるポリペプチドにあっては、経皮投与や静注などの非経口投与とするか、あるいは、消化酵素の影響の少ない消化管の下部（例えば、空腸、回腸、結腸、又は大腸）に前記ポリペプチドが分解されずに送達される製剤技術を用いることが好ましい。【００２７】
本発明による経口投与のための固体組成物は、一つ又はそれ以上の有効成分を、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、若しくはメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することにより調製することができる。前記組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。錠剤や丸剤は必要により、糖衣、又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。【００２８】
経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤を含むことができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。【００２９】
非経口のための注射剤は、例えば、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤や懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などが含まれる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、又はポリソルベート８０等を含む。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用に際して無菌水その他の無菌用注射用媒体に溶解し使用することもできる。【００３０】
投与量は、例えば、用いる有効成分の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、性別等を考慮して適宜決定される。例えば、経口投与の場合、その投与量は通常、成人（体重60kgとして）において、１日につき約0.1〜5000mg、好ましくは0.1〜500mgである。非経口投与の場合、注射剤の形では１日につき0.01〜1000mg、好ましくは0.01〜100mgである。【００３１】
２．本発明のポリヌクレオチド、組換えベクター、及び形質転換体
本発明は、配列番号１で表される塩基配列若しくはその部分配列からなるか、又は、これらの塩基配列において１〜１０個の塩基が欠失、置換、及び／若しくは付加された塩基配列からなり、PGC-1β遺伝子のプロモーター活性を有している、ポリヌクレオチドを含む。本発明は、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、及び、前記ポリヌクレオチドを含む形質転換体も含む。【００３２】
或るポリヌクレオチド（以下、テストポリヌクレオチドと称する）がPGC-1β遺伝子のプロモーター活性を有するか否かは、例えば、実施例１０に記載の方法で確認することができる。より詳細には、適当なレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）の上流にテストポリヌクレオチドを連結したレポーターベクターを構築し、構築したレポーターベクターを適当な宿主細胞に遺伝子導入した後、前記細胞におけるレポーター遺伝子の発現が、フォルスコリン及びデキサメサゾン処理により誘導されるか否かを分析することにより、PGC-1β遺伝子のプロモーター活性を有するか否かを確認することができる。前記発現誘導は、フォルスコリン及びデキサメサゾン非存在下におけるレポーター遺伝子の発現と比較して、フォルスコリン及びデキサメサゾン存在下における前記発現が、１．５倍以上であることが好ましく、２倍以上であることがより好ましい。実施例１０に示すとおり、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、PGC-1β遺伝子のプロモーター活性を有するヒトPGC-1βプロモーターである。【００３３】
当業者であれば、天然型のプロモーターの塩基配列の一部を他の塩基への欠失、置換、及び／又は付加などの改変により、天然型のプロモーターと同等のプロモーター活性を有するＤＮＡを調製することが可能である。天然型の塩基配列において塩基が欠失、置換、及び／又は付加した塩基配列を有し、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと同等のプロモーター活性（すなわち、PGC-1β遺伝子のプロモーター活性）を有するポリヌクレオチドもまた本発明のポリヌクレオチドに含まれる。欠失、置換、及び／又は付加する塩基数は、好ましくは１〜１０であり、より好ましくは１〜５である。【００３４】
塩基の改変は、例えば、制限酵素又はＤＮＡエキソヌクレアーゼによる欠失導入、部位特異的変異誘発法による変異導入［Nucleic Acid Res. 10, 6487-6500 (1982)］、変異プライマーを用いＰＣＲ法によるプロモーター配列の改変、あるいは、合成変異ＤＮＡの直接導入などの方法により行うことができる［Maniatis,
T. at al. (1989) : “Molecular Cloning - A Laboratory Manual 2nd Edt.” Cold Spring
Harbor Laboratory, NY］。【００３５】
本発明の組換えベクター及び形質転換体は、本発明のポリヌクレオチドを用い、常法により製造可能である。本発明の形質転換体を調製するための宿主としては、遺伝子工学において使用される宿主を使用することができ、例えば、真核生物［例えば、脊椎動物（好ましくは哺乳動物）、昆虫、又は酵母等］由来の宿主細胞又は原核生物（例えば、大腸菌）由来の宿主細胞を挙げることができる。また、本発明の組換えベクターを調製するための発現ベクターとしては、前記宿主に応じて、適宜選択することができる。【００３６】
３．本発明のスクリーニング方法
本発明には、本発明のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド（以下、スクリーニング用ポリヌクレオチドと称する）に被検物質を接触させる工程、及び、PGC-1β遺伝子プロモーター活性を分析（好ましくは測定）する工程を含む、糖取り込み活性化剤スクリーニング方法が含まれる。【００３７】
本発明のスクリーニング方法の好ましい態様によれば、スクリーニング用ポリヌクレオチドが、下流にレポーター遺伝子を保持し、PGC-1β遺伝子プロモーター活性を分析する工程が、前記レポーター遺伝子の発現を分析する工程である。レポーター遺伝子としては、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子又はβガラクトシダーゼ遺伝子を挙げることができ、ルシフェラーゼ遺伝子が最も好ましい。【００３８】
「スクリーニング用ポリヌクレオチドに被検物質を接触させる工程」は、前記ポリヌクレオチドに被検物質を接触させる工程であれば特に限定されるものではないが、実施例１１に記載の方法がより好ましい。より詳細には、スクリーニング用ポリヌクレオチドを適当なレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）の上流に連結したレポーターベクターを構築し、構築したレポーターベクターを適当な宿主細胞に遺伝子導入した後、被検物質の存在下にて前記細胞を所定時間（例えば、２４時間）培養することにより、前記接触工程を実施することができる。【００３９】
「PGC-1β遺伝子プロモーター活性を分析する工程」は、前記遺伝子のプロモーター活性を分析する工程であれば特に限定されるものではないが、実施例１１に記載の方法がより好ましい。より詳細には、前記接触工程を実施した後、被検物質存在下及び非存在下における前記細胞中のレポーター活性を、用いたレポーター遺伝子に応じて選択可能なアッセイ法に従って分析し、比較することにより、前記分析工程を実施することができる。【００４０】
本発明のスクリーニング法において使用される「被検物質」は、例えば、化合物（タンパク質又はＤＮＡを含む）又は混合物（例えば、組成物又は抽出物若しくは培養物）を含む。前記被検物質は、人工的に合成された物の他に単離された天然物も含まれ、低分子であるか高分子であるか、あるいは有機物であるか無機物であるかを問わない。【００４１】
以下に、本発明のスクリーニング方法の一態様を説明する。
本発明のプロモーター遺伝子の下流に連結したレポーター遺伝子を有する細胞（好ましくは動物細胞あるいは酵母）に被検物質を接触させ、レポーター遺伝子の発現を増加させる物質を選択する。具体的には、例えば、実施例１１に記載したように、本発明のプロモーターの下流にレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）を連結したベクターを作製し、これを適当な宿主細胞（例えば、酵母又は動物細胞）に安定的に（stably）、あるいは一過性に（transiently）発現した細胞を作製する。次いで、これに被検物質を接触させ、レポーター遺伝子の発現を誘導する物質を選択する。この方法により、PGC-1β遺伝子プロモーターを活性化する物質を選択することができ、糖取り込み活性化剤をスクリーニングすることが可能である。【００４２】
具体的なスクリーニング方法としては、実施例１１に記載の方法が好ましく、プロモーター活性を促進する物質としては、被検物質無添加の場合と比較して２倍以上のプロモーター活性化能を有する物質を選択することがより好ましい。【００４３】
なお、糖取り込み活性化作用があることの確認は、当業者に公知の方法又はそれを改良した方法を用いることができる。例えば、糖取り込み活性化作用の確認は実施例６に記載の方法で行うことができる。より詳細には、適当な細胞［好ましくは、筋細胞、例えば、ラット筋芽細胞L6（ATCC, CRL-1458）又はマウス筋芽細胞C2C12細胞（ATCC番号, CRL-1772）］を標識化グルコース存在下で所定時間（例えば、１０分間）培養し、前記標識を指標として、前記細胞に取り込まれたグルコース量を測定することにより、糖取り込み活性化作用を確認することができる。【００４４】
４．本発明の分析方法
本発明は、スクリーニング用ポリヌクレオチドに被検物質を接触させる工程、PGC-1β遺伝子プロモーター活性を分析（好ましくは測定）する工程、及び、被検物質の糖取り込み活性を分析（好ましくは測定）する工程を含む、被検物質の糖取り込み活性分析方法を含む。【００４５】
「スクリーニング用ポリヌクレオチドに被検物質を接触させる工程」及び「PGC-1β遺伝子プロモーター活性を分析する工程」は、「３．本発明のスクリーニング方法」と同様に実施することができる。また、「被検物質の糖取り込み活性を分析する工程」は、「３．本発明のスクリーニング方法」に記載の糖取り込み活性化作用の確認方法と同様に実施することができる。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制限されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法（Maniatis, T. et al. (1989) : “Molecular Cloning - A Laboratory
Manual 2nd Edt.” Cold Spring Harbor Laboratory, NY等）に従って実施可能である。【００４７】
《実施例１：細胞の培養》
生体における最大の糖取り込み組織は筋肉である。従って、本実施例及び以下の実施例では、インビトロ（in vitro）における糖取り込み作用の検出にはラット筋芽細胞L6を用いた。L6細胞（ATCC, CRL-1458）を、10%ウシ胎児血清（JRH
BIOSCIENCES, Cat. No. 12303-500M）を含むダルベッコ改変イーグル培地（GIBCO BRL, USA, 11995-065）で維持し、5%のCO2を含む湿潤大気中で37℃で培養した。分化誘導は、コンフルエントに達したL6細胞の培地を、2%ウマ血清（GIBCO,
Cat. No. 16050）を含むダルベッコ改変イーグル培地に変更し、さらなる5日間の継続培養によって実施した。【００４８】
《実施例２：ヒトPGC-1β遺伝子のクローニング》
ヒトPGC-1β遺伝子（PERC, GenBank Accession No.
NM_133263）のN末端側配列センス鎖25塩基のオリゴヌクレオチド（配列番号２）、及びC末端側配列アンチセンス鎖29塩基のオリゴヌクレオチド（配列番号３）を合成し、PCR用プライマーとして用いた。ヒト骨格筋由来cDNAライブラリー（cDNA
Library Human Skeletal Muscle, TaKaRa, Code No.9514）を鋳型として、PCR用酵素Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene,
Cat No.600135）を用いて添付のマニュアルに従って操作を行った。その結果、ヒトPGC-1β遺伝子を含む約3kbのDNA断片を得ることができた。【００４９】
《実施例３：ヒトPGC-1β過剰発現用組換えアデノウイルスの作製》
実施例２で得られたヒトPGC-1β遺伝子を含む約3kbのDNA断片を、アデノウイルス用シャトルベクターpAdTrack-CMVのKpnＩ-NotＩサイトに導入して、ヒトPGC-1β過剰発現アデノウイルス用シャトルベクターpAdTrack-hPGC-1βを得た。次に、pAdTrack-hPGC-1βをPmeIで切断することにより直線化し、これをアデノウイルスバックボーンベクターpAdEasy-1と一緒に大腸菌BJ5183株へトランスフォームすることにより相同組換えを行わせ、ヒトPGC-1β過剰発現アデノウイルス用ベクターpAdEasy-hPGC-1βを得た。次に、pAdEasy-hPGC-1βをPacIで切断することにより直線化し、これを細胞導入用試薬（FuGENETM6,
Roche, Cat. No. 1815091）を用いて添付のマニュアルに従って293細胞に導入した。その後、常法により293細胞からヒトPGC-1β発現用組換えアデノウイルスAd-hPGC-1βを得た。なお、前記のシャトルベクターpAdTrack-CMV、バックボーンベクターpAdEasy-1、大腸菌BJ5183株、及び293細胞は、Adeasy
System（Johns Hopkins University）に含まれるものを使用した。【００５０】
《実施例４：Ad-hPGC-1β感染によるL6内でのヒトPGC-1β発現誘導の確認》
実施例１に従って、24ウェルコラーゲンコートディッシュ（24-well
collagen coated dish, Asahi Glass Cat. No. 4820-010）を用いて分化L6細胞を調製した。ここに1ウェル当たり5×109
pfuのAd-hPGC-1βを感染させ、24時間培養を継続した。またコントロールとして、GFPのみを過剰発現するAd-GFPを、比較対象としてヒトPGC-1αを過剰発現する組換えアデノウイルスAd-hPGC-1αを同様に感染させた細胞をそれぞれ用意した。なお、Ad-hPGC-1β及びAd-hPGC-1αは、感染効率確認のためにAd-GFPと同じシステムでGFPを発現する。【００５１】
感染から24時間後に、各細胞をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）用サンプルバッファー（EzApply,
ATTO, Cat. No. 2332330）100μLに溶解した。これを10%ポリアクリルアミド濃度のSDS-PAGEで分画し、セミドライ式転写装置［TRANS-BLOT(登録商標)
SD SEMI-DRY TRANSFER CELL, BIO-RAD］を用いてメンブレン（Immobilon, MILLIPORE, Cat. No.
IPVH00010）に転写した。メンブレンを、5%脱脂粉乳を含むTBS-T（Tris-HCl pH7.4, 15mmol/L NaCl, 0.005%
Tween20）中で2時間、室温でインキュベーションし、ブロッキングを行った。その後、メンブレンを5%脱脂粉乳を含むTBS-Tで500倍希釈した抗ヒトPGC-1β抗体（免疫生物研究所）と4℃で10時間反応させ、HRP（Horseradish
peroxidase）による化学発光（ECL Plus Western Blotting Detection Reagents, Amersham, Cat.
No, RPN2132）でサンプル中のヒトPGC-1βを検出した。【００５２】
その結果、Ad-hPGC-1β感染細胞特異的にヒトPGC-1βを示すバンドが検出され、分化L6細胞内でのヒトPGC-1βの過剰発現が確認された。なお、発現量に関する測定は総て4回ずつ行い、それぞれの実験は少なくとも2回繰り返し再現性を確認した。【００５３】
《実施例５：ヒトPGC-1β過剰発現筋細胞での糖輸送タンパク質GLUT4遺伝子発現誘導》
実施例４と同様に調製したヒトPGC-1β過剰発現細胞から、トータルRNAを市販試薬［RNeasy(登録商標)
Micro Kit, QIAGEN, Cat. No. 74004］を用いて添付マニュアルに従って調製した。このRNAを鋳型として市販試薬（SuperScriptTM
III RNaseH- Reverse Transcriptase, Invitrogen, Cat. No. 18080-044）を用いてcDNAを添付マニュアルに従って調製した。このcDNAを鋳型としてリアルタイムPCR（7900HT
Sequence Detection System, Applied Biosystems）を用いてマニュアルに従い各種cDNA量を定量化した。定量化にはそれぞれの遺伝子のセンス鎖及びアンチセンス鎖のプライマー並びに市販試薬［SYBRy(登録商標)
GREEN PCR Master Mix, Applied Biosystems, Cat. No. 4309255］を用いた。定量化した遺伝子はβアクチン及びGLUT4で、βアクチンのセンス鎖及びアンチセンス鎖プライマーの配列は、配列番号４及び配列番号５で表される塩基配列であり、GLUT4のセンス鎖及びアンチセンス鎖プライマーの配列は、配列番号６及び配列番号７で表される塩基配列である。【００５４】
GLUT4の発現量は、同じサンプルのβアクチンの発現量で補正し、コントロールであるAd-GFP感染細胞における発現量を1とした相対値で表した（図１）。その結果、Ad-hPGC-1βの感染、すなわち、ヒトPGC-1βの過剰発現によってL6細胞内在性のGLUT4遺伝子の発現が有意に誘導されていることが初めて明らかとなった。よってヒトPGC-1βの過剰発現により、筋細胞においてGLUT4発現誘導に起因する糖取り込みの活性化が期待されることが示唆された。なお、発現量に関する測定は全て4回ずつ行い、それぞれの実験は少なくとも2回繰り返し再現性を確認した。ちなみに、βアクチン遺伝子の発現レベルには変動は見られなかった。【００５５】
《実施例６：ヒトPGC-1α／β過剰発現筋細胞の糖取り込み活性測定》
実施例４と同様に調製したヒトPGC-1β過剰発現細胞又はヒトPGC-1α過剰発現細胞を用いて糖取り込み活性測定実験を行なった。感染後48時間の細胞をKRPバッファー（136mmol/L
KCl, 4.7mmol/L KCl, 1.25mmol/L CaCl2・2H2O, 1.25mmol/L
MgSO4・7H2O, 5mmol/L Na2HPO4・12H2O）1mLでリンスし、KRP
500μLを添加して1時間培養を継続した。次に、100nmol/Lインスリンを含むKRPに交換して更に20分間培養を継続した。次に、1mmol/L 2-デオキシ-グルコース及びその放射標識体である10kBq
2-デオキシ-D-[U-14C]グルコース（Amersham Bioscience, Cat. No. CFB195）を含むKRPに交換して10分間培養を継続した。その後、細胞を氷冷したPBSバッファー（Phosphate-buffered
saline）で3回洗浄し、0.1% SDS 200μLに溶解した。溶解液を液体シンチレーター（AQUASOL 2, PERKINELMER, Cat.
No. 6NE9529）2mLと混合して、液体シンチレーションカウンター（PACKARD, B2500TR）を用いて細胞が取り込んだ放射標識体量（放射活性量，CPM）を測定した。【００５６】
細胞内に取り込まれた放射標識体量（CPM）の結果を図２に示す。Ad-hPGC-1βの感染、すなわち、ヒトPGC-1βの過剰発現によって分化L6細胞の糖取り込み活性が有意に誘導されることが初めて明らかとなった。また、ヒトPGC-1α過剰発現細胞に比べ、ヒトPGC-1β過剰発現細胞の糖取り込み活性が非常に大きく、ヒトPGC-1α過剰発現細胞が有意な促進活性を示さないインスリン非存在下でも、ヒトPGC-1βの過剰発現細胞は促進活性があることが分かった。なお、全ての発現量測定は4回ずつ行い、それぞれの実験は少なくとも2回繰り返し再現性を確認した。【００５７】
《実施例７：ヒトPGC-1β遺伝子プロモーター領域のクローニング》
ヒトPGC-1β遺伝子（PERC, GenBank Accession No.
NM_133263.1）及び公開ヒトゲノムデータベース（GenBank nucleotide database）を参考に、ヒトPGC-1β遺伝子の上流領域約1kbの取得を目指して、センス鎖29塩基のオリゴヌクレオチド（配列番号８）及びアンチセンス鎖30塩基のオリゴヌクレオチド（配列番号９）を合成し、プライマーとして用いた。プロモーター領域のクローニングには、鋳型としてヒトゲノムDNA（Human
Genomic DNA, CLONTECH, Cat. No. 6550-1）を、酵素としてPfu DNAポリメラーゼ（Stratagene, Cat
No.600135）を用いて添付のマニュアルに従って操作を行った。その結果、約1kbのDNA断片を得ることができた。【００５８】
《実施例８：ヒトPGC-1β遺伝子プロモーターの配列分析》
実施例７で取得したDNA断片を市販キット［TOPOTM TA
Cloning(登録商標) Kit, Invitrogen(登録商標), USA, IV450002］を用いて、添付のマニュアルに従ってpCR(登録商標)2.1-TOPOベクターへサブクローンし、約1kbのDNA断片を含むサブクローンをpCR-hPGCβ(1.0)と名付けた。サブクローニングしたDNAの塩基配列は、市販キット［BigDyeTM
Terminator Cycle Sequencing Kit, ABI PRISM, PE APPLIED Biosystems, USA, 4303125］及びDNAシークエンサー（ABI
PRISMTM 377 DNA Sequencer）を用いて決定した。クローニングした約1kbのDNA断片の塩基配列を配列番号１に示す。【００５９】
《実施例９：ヒトPGC-1β遺伝子プロモーターを保有するレポーターベクターの構築》
実施例８で作製したpCR-hPGCβ(1.0)より、ヒトPGC-1β遺伝子上流領域約1kbを含むKpnＩ-MluＩ断片を制限酵素KpnＩ及びMluＩを用いて切り出し、ピッカジーン（PicaGene）ベーシックベクター2（東洋インキ、日本）のKpnＩ-MluＩサイトへ導入してヒトPGC-1βレポーターベクターを構築し、phPGC1β(1.0)Lucと名付けた。【００６０】
《実施例１０：ヒトPGC-1βプロモーター活性の測定》
実施例９で作製したphPGC1β(1.0)LucをL6細胞へ一過性に（transiently）遺伝子導入した。具体的には、L6細胞を直径10cmの組織培養皿で培養し、80%コンフルエントに達したところで、前記プラスミド5μg、及びβアクチンプロモーターによって調節されるβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を含むプラスミドpCH110（ファルマシア・バイオテク）1μgを、遺伝子導入効率を標準化するために併用し、細胞導入用試薬（FuGENETM6,
Roche, Cat. No. 1815091）を用いて細胞に導入した。24時間後に細胞を96ウェルの組織培養皿へ移し、更に6時間培養した。これまでの報告より、肝細胞においてフォルスコリンとデキサメサゾンの併用が内在性PGC-1βの発現を誘導することが報告されている［J.
Biol. Chem., 278: 30843 (2003)］。よって終濃度10μmol/Lフォルスコリンと1μmol/Lデキサメサゾン［溶媒＝ジメチルスルホキシド（DMSO）］を細胞に添加して、24時間の化合物処理を実施した。化合物処理後、細胞を細胞溶解液LCβ（東洋インキ、日本）で溶解し、そのルシフェラーゼ活性をピッカジーン発光キット（東洋インキ、日本、309-04321）を用いて測定した。なお、全ての活性測定は3回ずつ行い、それぞれの実験は少なくとも2回繰り返し再現性を確認した。【００６１】
その結果を図３に示す。それぞれのレポーター活性はβ-ガラクトシダーゼ活性によって標準化し、化合物無添加（すなわち、溶媒DMSO添加）の値を1とした相対値で表した。L6細胞において、ヒトPGC-1βレポーターはフォルスコリンとデキサメサゾン併用処理により最大約1.6倍に増加し、肝細胞において内在性遺伝子を2倍以上誘導するという論文報告と一致する結果が得られ、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ヒトPGC-1βプロモーター又はそれを含むポリヌクレオチドであることが確認された。【００６２】
《実施例１１：ヒトPGC-1βプロモーター活性化剤のスクリーニング》
実施例１０に示した方法でレポーターベクターphPGC1β(1.0)Lucを用い、市販の化合物を被検物質とし、ヒトPGC-1βプロモーター活性を促進する化合物のスクリーニングを行った。化合物終濃度1μmol/L〜10μmol/Lの条件下において化合物無添加の2倍以上のプロモーター活性化能を有する化合物として、2-(3-アミノフェニル)-5-ベンゾイル-(1H)-ベンゾイミダゾール［2-(3-aminophenyl)-5-benzoyl-(1H)-benzimidazole］（ZELINSKY,
Cat. No. A1773/0075171）（以下、化合物Aと称する）が得られた。化合物A添加時のレポーター活性（ルシフェラーゼ活性）と化合物無添加時のレポーター活性との相対値を図４に示す。【００６３】
《実施例１２：化合物Aの糖取り込み活性の測定》
実施例１に示した方法で分化誘導を実施したL6細胞を用いて、実施例１１で得られたヒトPGC-1βプロモーター活性化能を有した化合物Aの糖取り込み活性への影響を実施例６と同様の方法で検討した。分化誘導後の細胞を、終濃度1μmol/L〜10μmol/Lの化合物Aを含む分化誘導培地で24時間培養し、それぞれの細胞の糖取り込み活性を測定した。その結果、図５に示すように化合物Aは有意に筋細胞における糖取り込みを活性化することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の糖取り込み活性化剤、あるいは、本発明方法により得られる糖取り込み活性化剤は、糖尿病の治療及び／又は予防の用途に適用することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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