(57)【要約】  リン脂質の残基と蛍光プローブ化合物の残基とがリンカーを介して結合した化合物（例えば以下の式で表される化合物）からなる膜アンカー型蛍光プローブ。2006093252.tif 000006
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質の残基と蛍光プローブ化合物の残基とがリンカーを介して結合した化合物からなる膜アンカー型蛍光プローブ。
【請求項２】
以下の式で表される請求項１に記載の膜アンカー型蛍光プローブ。
【化１】
2006093252.tif 000005
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞膜に固定化可能な膜アンカー型の蛍光プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞や組織中の一酸化窒素や亜鉛イオンなどを測定可能な蛍光プローブが各種開発されている。現在までに開発された蛍光プローブは細胞内物質の捕捉や電位の変化により蛍光を発するように設計されているが、蛍光プローブ自体が細胞の内外や細胞間を自由移動できるため、細胞内から外への測定対象物質の移動や細胞間情報伝達物質の移動を観察することはできないという問題を有している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の課題は、細胞内から外への測定対象物質の移動や細胞間情報伝達物質の移動を観察することができる蛍光プローブを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行なった結果、細胞膜内に埋没可能なアンカー部分をリンカーを介して蛍光プローブに結合させた化合物が細胞膜に効率的に固定されること、及び細胞膜に固定化された上記化合物の蛍光プローブ部分の特性が損なわれずに、細胞膜固定型（以下、本明細書において「膜アンカー型」と呼ぶ。）の蛍光プローブとして極めて良好に機能することを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成された。【０００５】
すなわち、本発明により、リン脂質の残基と蛍光プローブ化合物の残基とがリンカーを介して結合した化合物からなる膜アンカー型蛍光プローブが提供される。
別の観点からは、上記の膜アンカー型蛍光プローブを用いて、細胞内から細胞外への測定対象物質の移動を測定する方法、及び上記の膜アンカー型蛍光プローブを用いて、細胞間情報伝達物質である測定対象物質の移動を測定する方法が本発明により提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】DAF-PIPAに一酸化窒素溶液を加えたときのHPLCチャート（左図）及び蛍光変化（右図）を示した図である。
【図２】DAF-PIPAに一酸化窒素放出剤であるNOC13を添加してNOとの反応の時間変化を測定した結果を示した図である。
【図３】DAF-PIPA-TのpHプロファイルを示した図である。
【図４】FL-PIP-DPPEを負荷したHeLa細胞の様子を示した写真である。左の写真は共焦点顕微鏡写真であり、右の写真は透過光像との重ねあわせを示した写真である。
【図５】FL-PIP-DPPEを負荷したHeLa細胞における細胞外pH変化による蛍光強度変化を示した写真及び図である。左の写真はt=0 (sec.)における顕微鏡写真であり、右図は蛍光強度時間変化 t=90 (sec.), t=230 (sec.)においてpHを7.4→6.7→6.4に変化させたときの結果を示した図である。
【図６】DAF-PIP-DPPEのHeLa細胞膜上での一酸化窒素用蛍光プローブとしての機能を示した写真及び図である。a)及びb)は蛍光顕微鏡写真を示す（（a）はt=0 sec. (b)はt=2800 sec.）。c)は蛍光強度時間変化 t=120 (sec.)、1800 (sec.)にそれぞれ100μmol/L及び1μmol/LとなるようにNOC13を加えた結果を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の膜アンカー型蛍光プローブは、リン脂質の残基と蛍光プローブ化合物の残基とがリンカーを介して結合したことを特徴としている。
蛍光プローブ化合物としては、測定対象物質の測定のための蛍光プローブとして用いられるものであれば特に限定されない。測定対象物質の種類は特に限定されず、タンパク質、酵素（例えば、β−ラクタマーゼ、チトクロームＰ４５０酸化酵素、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ、ラクターゼ、アルカリホスファターゼなどの還元酵素、酸化酵素、加水分解酵素など）、金属イオン（例えば、ナトリウムイオンやリチウムイオンなどのアルカリ金属イオン、カルシウムイオンなどのアルカリ土類金属イオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオンなど）、非金属イオン（炭酸イオンなど）、活性酸素種（例えば、一酸化窒素、ヒドロキシラジカル、一重項酸素、及びスーパーオキシドなど）などのいずれであってもよい。例えば、一酸化窒素などが好ましい例として挙げられる。【０００８】
蛍光プローブ化合物は、測定対象物質を捕捉する基、測定対象物質と反応可能な基、あるいは測定対象物質との接触により切断される基など、測定対象物質の存在を検出できる基を有しており、測定対象物質の検出後に蛍光強度が高まるなど蛍光強度が変化する性質を有するものであれば、その構造は特に限定されない。蛍光プローブ化合物としては、従来、フルオレセイン、ローダミン、又は4,4-ジフルオロ-1,3,5,7-テトラメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン(BODIPY、登録商標、505/515, モレキュラー・プローブス社製)などを母核として種々提案されているが、これらに限定されることなく、多様な種類の蛍光プローブが利用可能である。また、測定対象物質の存在を検出可能な基としては、3,4-ジアミノフェニル基（一酸化窒素測定用試薬）などのほか、極めて多様な基が知られている。【０００９】
例えば、特開平10-226688号公報、国際公開WO 99/1447、国際公開WO 99/51586、特開2000-239272号公報、国際公開WO 01/62755、国際公開WO 01/64664、国際公開WO 02/18362、国際出願PCT/JP2004/13185、国際出願PCT/JP2005/2753、Analyst, 128, 719-723（2003）などに記載された蛍光プローブ化合物を本発明のために用いることができる。また、モレキュラープローブス社のカタログ（Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Ninth Edition）の第20章（カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、及び他の金属イオン）、第21章（pHインディケーター）、及び第23章（ナトリウムイオン、カリウムイオン、塩素イオン、及び他の無機イオン）に記載された測定対象物を捕捉するための置換基を用いることもできる。これらの刊行物の開示の全てを参照により本明細書の開示として含める。一酸化窒素の測定用の蛍光プローブ化合物として、例えばジアミノフルオレセイン(DAF)（特開平10-226688号公報）などを用いることが好ましい。【００１０】
本明細書において、「蛍光プローブ化合物の残基」とは、蛍光プローブ化合物から水素原子などの適宜の原子又は水酸基やハロゲン原子などの適宜の官能基を除いてできる残基のことであり、好ましくは１価の基を意味している。例えば、フルオレセインやフルオレセイン誘導体の2-カルボキシフェニル基のカルボキシル基から水酸基を除いた残基などが好ましい。【００１１】
リン脂質の種類は特に限定されないが、例えば、リン脂質が、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファリジルコリン類、ホスファチジルセリン類、ホスファチジルイノシトール類、ホスファチジルグリセロール類、カルジオリピン類、スフィンゴミエリン類、セラミドホスホリルエタノールアミン類、セラミドホスホリルグリセロール類、セラミドホスホリルグリセロールホスファート類、1,2-ジミリストイル-1,2-デオキシホスファチジルコリン類、プラスマロゲン類、又はホスファチジン酸類などを用いることができる。
これらのリン脂質における脂肪酸残基は特に限定されない。例えば、炭素数12〜20個程度の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を１個又は２個有するリン脂質を用いることができ、具体的には、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸等の脂肪酸由来のアシル基を１個又は２個有するリン脂質を用いることができる。これらのうち、ホスファチジルエタノールアミン類が好ましく、特に好ましいのはジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)である。【００１２】
リン脂質の残基とは、上記のリン脂質又は化学修飾されたリン脂質から水素原子などの適宜の原子又は水酸基やハロゲン原子などの適宜の官能基を除いて得られる基を意味しており、好ましくは１価の基を意味している。例えば、リン脂質のリン酸部分の水酸基から水素原子を除いて得られる残基、リン脂質のリン酸部分の水酸基を除いて得られる残基、リン脂質の炭素原子に結合する水素原子を除いて得られる残基、あるいはリン脂質中にアミノ基が存在する場合には、そのアミノ基から水素原子を除いてできる残基などを例示できるが、これらに限定されることはない。【００１３】
リンカーの種類は特に限定されないが、例えば、リンカーを構成する最短原子数が4〜6個程度のリンカーを用いることが好ましい。 本明細書において、リンカーについて「最短原子数」という用語は、リン脂質の残基又は蛍光プローブ化合物の残基との結合に関与するリンカー中の２個の原子のうちの１個の原子と他の１個の原子とを結ぶ原子の数のうちの最小の数を意味している。例えば、1,3-プロペニレン基の場合には最短原子数は３であり、1,2-プロペニレン基の場合には２であり、1,5-（4-ブトキン-3- ペンテニレン）基の場合には５である。また、1,3-フェニレン基の場合には３であり、1,2-フェニレン基の場合には２であり、2,4-キノリンジイル基の場合には３であり、1,5-ナフチレンの場合には４である。エチレンジオキシ基では４であり、マロニル基では３であり、フタロイル基では４である。【００１４】
本発明の膜アンカー型蛍光プローブの一例として、一酸化窒素測定用の蛍光プローブを下記に示すが、本発明の範囲は特定の測定対象物に限定されることはない。蛍光プローブ化合物は、ジアミノフルオレセイン（DAF）などを用いることが好ましく、下記にその構造を示すが、本発明の範囲は下記の特定の化合物に限定されることはない。下記式中、蛍光プローブ化合物の残基はDAFのカルボキシル基から水酸基を除いた残基であり、リン脂質残基はジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)の末端アミノ基から水素原子を除いた残基であり、4-カルボニルピペリジン部分がリンカー部分に相当する。
【化１】
2006093252.tif 000002
【００１５】
本発明の膜アンカー型蛍光プローブは、それ自体は強い蛍光を発する性質を有していないが測定対象物質の存在下で強い蛍光を発するようになるなど、測定対象物質の検出後に蛍光強度が変化する性質を有するものである。また、この膜アンカー型蛍光プローブは、生細胞の細胞膜の外側にアンカー部分（リン脂質部分）を埋没させることにより、細胞膜の外側に固定される性質を有している。従って、本発明の膜アンカー型蛍光プローブは、細胞内から外への測定対象物質の移動や細胞間情報伝達物質である測定対象物質の移動を測定するための蛍光プローブとして有用である。一方、本発明の膜アンカー型蛍光プローブをマイクロインジェクション等の手段により細胞内に投与すれば、生細胞の細胞内の膜組織にアンカー部分（リン脂質部分）を埋没させることができる。従って、細胞内の膜組織に膜アンカー型プローブが固定されるため、本発明の膜アンカー型蛍光プローブは、細胞内の膜近傍の測定対象物質の移動や細胞間情報伝達物質である測定対象物質の移動を測定するための蛍光プローブとして有用である。特に、一酸化窒素(NO)やグルタミン酸など細胞から細胞外に放出された細胞間情報伝達物質や、細胞内の膜近傍で機能する物質が測定対象物質として好ましい。本明細書において用いられる「測定」という用語については、定量及び定性を含めて最も広義に解釈すべきものである。【００１６】
本発明の膜アンカー型蛍光プローブの使用方法は特に限定されず、従来公知の蛍光プローブと同様に用いることが可能である。通常は、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに膜アンカー型蛍光プローブを溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、蛍光スペクトルを測定すればよい。本発明の膜アンカー型蛍光プローブを適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、pH調節剤などの添加物と組み合わせることができる。また、本発明の膜アンカー型蛍光プローブをリポソームなどの脂質微粒子の構成脂質として用いて蛍光プローブ結合リポソームなどを調製し、これを水性懸濁液などの形態で生細胞に接触させたり、あるいはヒトを含む哺乳類動物にインビボ測定用試薬として投与するなども可能である。
【実施例】
【００１７】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１：本発明の膜アンカー型蛍光プローブの製造
【化２】
2006093252.tif 000003
2006093252.tif 000004
【００１８】
(a)化合物2の合成
化合物1(30 mg, 0.068 mmol)を蒸留ジメチルスルホキシド(DMSO) 2 mLに溶解し、氷浴中、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（NHS） (9.4 mg, 0.081 mmol), １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（WSCD） (15.6 mg, 0.081 mmol)を加え、アルゴン雰囲気下0 ℃にて30 分,室温にて30 分 攪拌した。その後、NHS (5 mg, 0.043 mmol), WSCD (10 mg, 0.052 mmol)を加え、室温にてさらに1 時間攪拌した。溶媒を減圧溜去後、シリカゲルクロマトグラフィー(メタノール 5% / ジクロロメタン 95%)により精製して化合物２を得た(12 mg, 収率33%)。
1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6)  δ(ppm)  1.30 (br, 2H), 1.79 (br, 2H), 2.54 (br, 1H), 2.70 (br, 1H), 2.79 (s, 4H), 2.97 (br, 1H), 3.54 (br, 1H), 3.92 (br, 1H), 6.56 (d, 4H, J = 8.4 Hz), 6.94 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.43 (m, 1H), 7.57 (m, 1H), 7.66 (m, 2H)
MS (ESI+) 540(M+H)【００１９】
(b)化合物3 (FL-PIP-DPPE)の合成
ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン(DPPE) (14 mg, 0.020 mmol) を溶媒(蒸留クロロホルム/蒸留メタノール = 2 / 1)に溶解しジイソプロピルエタノールアミン(DIEA) (3.4 μL, 0.020 mmol)を加えた。メタノールに溶解した化合物2 (10 mg, 0.019 mmol)を1 時間かけてゆっくりと滴下した。その後室温にて4.5 時間攪拌した。反応溶液にクロロホルムを加え、塩酸酸性水により洗浄した。溶媒を減圧溜去し、逆相シリカゲルクロマトグラフィー(メタノール 30% /水 70% -メタノール 90% /水 10%)により精製して化合物3を得た(14.5 mg, 収率70%)。
1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6)  δ(ppm)  0.88 (t, 6H, J = 6.8), 1.27 (br, 50H), 1.60 (br, 4H), 1.80 (br, 2H), 2.32 (m, 5H), 2.61 (br, 1H), 3.10 (br, 1H), 3.46 (br, 2H), 3.51 (br, 2H), 3.95 (br, 1H), 4.02 (br, 2H), 4.22 (br, 2H), 4.43 (br, 1H), 5.24 (br, 1H), 7.00 (d, 4H, J = 8.6 Hz), 7.41 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.45 (m, 1H), 7.66 (m, 1H), 7.75 (m, 2H)
HRMS (ESI+) calcd for C63H94N2O13P1 1117.6494 (M+H). found 1117.6504【００２０】
(c)化合物6の合成
化合物4 (200 mg, 0.51 mmol), NHS (117 mg, 1.0 mmol), N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC） (210 mg, 1.0 mmol)を蒸留ジメチルホルムアミド 1 mLに溶解し、アルゴン雰囲気下80 ℃で50 分攪拌した。室温に戻し、イソニペコチン酸メチルエステル (206 μL, 1.53 mmol), DIEA (252 μL, 15.3 mmol)を加え室温にて3 時間攪拌した。溶媒を溜去後、シリカゲルクロマトグラフィー(メタノール 7% / ジクロルメタン 93%)により分離して得られた粗精製物を、溶媒 20 mL(メタノール / 水 = 1 / 1)に懸濁した。2 mLの2 mol/L 水酸化ナトリウム水溶液を加え室温にて1.5 時間攪拌した。反応終了後2 mol/L塩酸にて中和後、溶媒を溜去し、シリカゲルクロマトグラフィー(メタノール7% / ジクロルメタン 93% - メタノール 25% / ジクロロメタン 75%)にて精製して化合物6を得た(220 mg,収率86%)
1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6)  δ(ppm)  1.23 (br, 2H), 1.68 (d, 2H, J = 12.4 Hz), 2.34 (br, 1H), 3.83 (d, 2H, J = 12.6 Hz), 4.10 (br, 2H), 6.44 (s, 2H), 6.50 (d, 2H, J = 9.5 Hz), 6.99 (s, 1H), δ7.05 (d, 2H, J = 9.5 Hz), 7.80 (br, 2H), 8.06 (s, 1H) 
MS (ESI+) 504(M+H)【００２１】
(d)化合物7 DAF-ピペリジン酸（DAF-PIPA）の合成
化合物6 (20 mg, 0.040 mmol)を4 mLの溶媒(メタノール / ジクロロメタン = 8 / 2)に溶解し、ここへパラジウムカーボン（Pd-C）(2%)を加え水素 (1気圧)雰囲気下で30 分攪拌した。反応溶液をセライト濾過してPd-Cを除き、母液を濃縮して化合物7を得た(15 mg, 収率80%)。
1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6)  δ(ppm)  1.22 (br, 2H), 1.65 (d, 2H, J = 12.0 Hz), 2.30 (br, 1H), 3.80 (d, 2H, J = 12.0 Hz), 4.09 (br, 2H), 5.04 (br, 4H), 6.46 (s, 2H), 6.47 (d, 2H, J = 2.1 Hz), 6.51 (dd, 2H, J = 9.2 Hz, 2.1 Hz), 6.66 (s, 1H), 7.12 (d, 2H, J = 9.2 Hz)
HRMS (ESI+) calcd for C26H24N3O6 474.1665 (M+H). found 474.1714【００２２】
(e)化合物8の合成
化合物7(20 mg, 0.042 mmol)を塩酸酸性水に溶解し、ここへ亜硝酸ナトリウム(3 mg, 0.042 mmol)の水溶液を氷浴下ゆっくり滴下し、室温にて30 分攪拌した。2 mol/L水酸化ナトリウム水溶液により中和後、溶媒を溜去し、逆相シリカゲルクロマトグラフィー(水 100%)により精製した。純度はODSカラムHPLCにより確認した(12 mg, 収率59%)
HRMS (ESI-) calcd for C26H19N4O6 483.1305 (M+H). found 483.1329
HPLC(eluent A / B = 80 / 20 (0 分), 60 / 40 (10 分))
溶媒A = 水 (0.1%トリフルオロ酢酸含有), B = アセトニトリル / 水 (0.1%トリフルオロ酢酸) = 80 / 20【００２３】
(f)化合物10の合成
まず化合物1から化合物2を合成した時と同様に、化合物6を用いて化合物9を合成した。続いて化合物2から化合物3を合成した時と同様に、化合物9を用いて化合物10を合成した。精製はシリカゲルクロマトグラフィー(メタノール 15% / ジクロルメタン 85%)により行なった(化合物6より収率 18%)。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3 / CD3OD = 1 / 1)  δ(ppm)  0.89 (t, 6H, J = 6.8 Hz), 1.27 (br, 50H), 1.60 (br, 4H), 1.76 (d, 2H, J = 11.9 Hz), 2.32 (m, 5H), 3.41 (br, 2H), 3.67 (br, 2H), 3.89 (br, 2H), 3.98 (t, 2H, J = 5.7 Hz), 4.17 (br, 2H), 4.18 (dd, 1H, J = 12.1 Hz, 5.7 Hz), 4.41 (dd, 1H, J = 12.1 Hz, 3.5 Hz), 5.25 (br, 1H), 6.72 (s, 2H), 6.81 (br, 2H), 7.02 (s, 1H), 7.25 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 8.26 (s, 1H)
HRMS (ESI-) calcd for C63H92N4O15P1 1175.6297 (M-H). found 1175.6265【００２４】
(g)化合物11 (DAF-PIP-DPPE)の合成
化合物10(14 mg, 0.012 mmol)を4 mLの溶媒(メタノール / ジクロロメタン = 1 / 1)に溶解し、Pd-C(2%)を加え水素 (1気圧)雰囲気下30 分攪拌した。反応溶液をセライト濾過してPd-Cを除き、母液から目的物を濃縮して化合物11を得た(9 mg, 収率 68%)
1H-NMR (300 MHz, CDCl3 / CD3OD = 1 / 1)  δ(ppm)  0.88 (t, 6H, J = 7.0 Hz), 1.27 (br, 50H), 1.61 (br, 4H), 1.80 (d, 2H, J = 12.9 Hz), 2.32 (m, 5H), 3.41 (br, 2H), 3.67 (br, 2H), 3.96 (br, 2H), 4.03 (t, 2H,  J = 5.9 Hz), 4.18 (dd, 3H, J = 12.1 Hz, 5.9 Hz), 4.43 (dd, 1H, J = 12.1 Hz, 3.5 Hz), 5.25 (br, 1H), 6.73 (s, 2H), 6.95 (s, 2H), 7.17 (s, 2H), 7.27 (br, 2H), 7.77 (d, 2H, J = 9.4 Hz)
HRMS (ESI+) calcd for C63H94N4O13P1 1145.6555 (M-H). found 1145.6555【００２５】
例２
DAF-PIPA を2 mmol/Lになるように溶解した水溶液に一酸化窒素（NO）溶液をNO濃度がそれぞれ0.38 mmol/L, 0.76 mmol/Lになるように加えたときの反応をHPLCにより確認した。またその水溶液をナトリウムリン酸バッファーにより1000倍希釈し蛍光(励起波長 498 nm, 測光波長 521 nm)を測定した。HPLCにおいてDAF-PIPAの保持時間は17.3分である。DAF-PIPAがNOと反応した後に保持時間20.3分の物質が生成したが、このものはESI-MSより、DAF-PIPAのジアミノ部分がNOと反応してトリアゾールとなったDAF-PIPA-Tであることを確認した(図１)。【００２６】
37℃のDAF-PIPA 1.27μmol/LのPBS(-)溶液にそれぞれ5μmol/L, 50μmol/L, 100μmol/L, 500μmol/Lになるように徐放性のNO放出剤であるNOC13を加え、NOとの反応の時間変化を測定した。NO濃度依存的に蛍光強度が大きくなることがわかった(図２)。
NOとの反応生成物である蛍光物質DAF-PIPA-Tの蛍光強度のpH プロファイルを示す。蛍光強度はキサンテン部位のフェノール性水酸基に依存しpKaは約6.3であった(図３)。【００２７】
例３
(a)膜アンカー型蛍光プローブが膜に存在していることの確認
DAF-PIP-DPPEの蛍光強度はNOと反応前は弱い。このため、観察の容易性を考慮し、強い蛍光強度が得られるフルオレセインが結合したFL-PIP-DPPEを用いて確認を行なうこととした。 HeLa細胞に対して10μmol/LのFL-PIP-DPPEのDMEM溶液(無血清、1% DMSO含)を細胞培養液として用い、22℃で10分間静置した。その後、細胞培養液をpH 7.4 PBS(+)溶液に交換し、細胞を光軸方向に輪切りにして蛍光観察できる共焦点レーザー顕微鏡(×60)を用いて観察した。細胞膜にFL-PIP-DPPEの蛍光が分布し、FL-PIP-DPPEが細胞膜に局在していることが確認できた(図４)【００２８】
(b)細胞膜内外に存在する蛍光色素部位の量の検証
FL-PIP-DPPE を負荷した細胞の細胞外液pH 7.4 PBS(+)（1 mL）にpH 4.5 PBS(+)を500μLずつ加えることにより、細胞外液のpHを7.4 → 6.7 → 6.4と変化させ、その蛍光強度変化を蛍光顕微鏡で観察した(図５)。 フルオレセインの蛍光強度は図３と同様に、pH依存的に変化する。従って細胞外に蛍光色素部分があるならば、FL-PIP-DPPEの蛍光強度もpH変化に応じて図３とほぼ同様に変化し、蛍光が減少するはずである。実際、その予測どおりに確かに減少が認められ、細胞外液pHの変化に伴い蛍光強度は40%減少した。この値は、図３のpH プロファイルでの蛍光強度変化において見られる減少量40%と合致する。【００２９】
一方、対照実験として、細胞膜を透過し、細胞質のエステラーゼにより加水分解されることで、細胞内部にフルオレセインを分布させることができるフルオレセインエステル誘導体（fluorescein diacetate）を細胞に負荷して同様の操作を試みたところ、pHの変化に伴う蛍光強度の変化は認められなかった。細胞内pHは細胞外液pHの変化の影響を受けにくいと言える。先のFL-PIP-DPPEが細胞膜の外側に負荷した後に、そのフルオレセイン部分が細胞内に取り込まれているならば、蛍光強度はpHプロファイルに合致する40％も減少しないはずである。従って、FL-PIP-DPPEのフルオレセイン部分は細胞膜の外側にあることが確認できた。【００３０】
以上の検討から、膜アンカー型蛍光プローブのフルオレセイン部分は細胞膜を透過しないことが確認できた。従って、細胞外液に溶解させる等の方法で細胞膜の外側に負荷した場合は細胞膜の外側の、マイクロインジェクション等の方法で細胞膜の内側に負荷した場合は細胞膜の内側の測定対象物の観察が可能であることが確認できた。【００３１】
(c)細胞膜でのNO プローブとしての機能
DAF-PIP-DPPE （7.5μmol/L）を負荷した細胞の細胞外液（pH 7.4 PBS(+)） 1 mLに、直前に調製したNOC13溶液500μLを観察開始120秒後にに100μmol/L、1800秒後にに1 mmol/Lになるように加え、そのときの蛍光強度の変化を蛍光顕微鏡で観察した。細胞膜上の蛍光強度の著しい増加が確認され、HeLa細胞膜上においてNOプローブとして機能することが確認された(図６)。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明の蛍光プローブを用いて細胞内から外への測定対象物質の移動や細胞間情報伝達物質の移動などを観察することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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