(57)【要約】  本発明は、ＭＩＴＦ−Ｍの転写活性化能を低減させてＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生を阻害し、それによりメラノーマの治療および／または防止を可能にすることを課題とし、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍの結合を阻害することを特徴とする、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生阻害方法および産生阻害剤；メラノーマ細胞の細胞死誘導方法および細胞死誘導剤；ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生増加を伴う疾患（メラノーマ等）の防止剤および／または治療剤；該疾患の防止方法および／または治療方法、並びに下記化合物の同定方法；前記結合を阻害する化合物；ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生を阻害する化合物；メラノーマ治療剤に対するメラノーマの感受性を増強させる化合物、並びに試薬キットを提供した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の群より選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍ（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ＭＩＴＦ−Ｍ）との結合を阻害することを特徴とする、ＢＣＬ２（Ｂ−ｃｅｌｌ  ＣＬＬ／Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ２）遺伝子の遺伝子産物の産生阻害方法；
（ｉ）ＨＬＦ（ｈｅｐａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｆａｃｔｏｒ）、
（ｉｉ）ＥＬＫ４（ＥＴＳ−ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｌｋ−４）、
および
（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ（ｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｌｏｃｏｍｏｔｅｒ  ｏｕｔｐｕｔ  ｃｙｃｌｅｓ  ｋａｐｕｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）。
【請求項２】
以下の群より選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍ（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ＭＩＴＦ−Ｍ）との結合阻害剤を用いることを特徴とする、ＢＣＬ２（Ｂ−ｃｅｌｌ  ＣＬＬ／Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ２）遺伝子の遺伝子産物の産生阻害方法；
（ｉ）ＨＬＦ（ｈｅｐａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｆａｃｔｏｒ）、
（ｉｉ）ＥＬＫ４（ＥＴＳ−ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｌｋ−４）、
および
（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ（ｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｌｏｃｏｍｏｔｅｒ  ｏｕｔｐｕｔ  ｃｙｃｌｅｓ  ｋａｐｕｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）。
【請求項３】
以下の群より選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍ（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ＭＩＴＦ−Ｍ）との結合を阻害することを特徴とする、メラノーマ細胞の細胞死誘導方法；
（ｉ）ＨＬＦ（ｈｅｐａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｆａｃｔｏｒ）、
（ｉｉ）ＥＬＫ４（ＥＴＳ−ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｌｋ−４）、
および
（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ（ｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｌｏｃｏｍｏｔｅｒ  ｏｕｔｐｕｔ  ｃｙｃｌｅｓ  ｋａｐｕｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）。
【請求項４】
以下の群より選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍ（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ＭＩＴＦ−Ｍ）との結合阻害剤を用いることを特徴とする、メラノーマ細胞の細胞死誘導方法；
（ｉ）ＨＬＦ（ｈｅｐａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｆａｃｔｏｒ）、
（ｉｉ）ＥＬＫ４（ＥＴＳ−ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｌｋ−４）、
および
（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ（ｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｌｏｃｏｍｏｔｅｒ  ｏｕｔｐｕｔ  ｃｙｃｌｅｓ  ｋａｐｕｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）。
【請求項５】
以下の群より選ばれる蛋白質（蛋白質Ａ）とＭＩＴＦ−Ｍ（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ＭＩＴＦ−Ｍ）との結合を阻害する化合物の同定方法であって、ある化合物と蛋白質Ａおよび／またはＭＩＴＦ−Ｍとの相互作用を可能にする条件下で、該化合物と蛋白質Ａおよび／またはＭＩＴＦ−Ｍとを接触させ、次いで、蛋白質ＡとＭＩＴＦ−Ｍの結合により生じるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、該シグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、該化合物が蛋白質ＡとＭＩＴＦ−Ｍの結合を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法；
（ｉ）ＨＬＦ（ｈｅｐａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｆａｃｔｏｒ）、
（ｉｉ）ＥＬＫ４（ＥＴＳ−ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｌｋ−４）、
および
（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ（ｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｌｏｃｏｍｏｔｅｒ  ｏｕｔｐｕｔ  ｃｙｃｌｅｓ  ｋａｐｕｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）。
【請求項６】
ＢＣＬ２（Ｂ−ｃｅｌｌ  ＣＬＬ／Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ２）遺伝子の遺伝子産物の産生を阻害する化合物の同定方法であって、以下の群より選ばれる蛋白質（蛋白質Ａ）とＭＩＴＦ−Ｍ（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ＭＩＴＦ−Ｍ）との結合並びにある化合物と蛋白質Ａおよび／またはＭＩＴＦ−Ｍとの相互作用を可能にする条件下で、該化合物と蛋白質Ａおよび／またはＭＩＴＦ−Ｍとを接触させることによりＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生が阻害されるか否かを決定することを特徴とする同定方法；
（ｉ）ＨＬＦ（ｈｅｐａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｆａｃｔｏｒ）、
（ｉｉ）ＥＬＫ４（ＥＴＳ−ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｌｋ−４）、
および
（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ（ｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｌｏｃｏｍｏｔｅｒ  ｏｕｔｐｕｔ  ｃｙｃｌｅｓ  ｋａｐｕｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）。
【請求項７】
メラノーマ細胞の細胞死を誘導する化合物の同定方法であって、以下の群より選ばれる蛋白質（蛋白質Ａ）とＭＩＴＦ−Ｍ（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ＭＩＴＦ−Ｍ）との結合並びにある化合物と蛋白質Ａおよび／またはＭＩＴＦ−Ｍとの相互作用を可能にする条件下で、該化合物と蛋白質Ａおよび／またはＭＩＴＦ−Ｍとを接触させることによりメラノーマ細胞の細胞死が誘導されるか否かを決定することを特徴とする同定方法；
（ｉ）ＨＬＦ（ｈｅｐａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｆａｃｔｏｒ）、
（ｉｉ）ＥＬＫ４（ＥＴＳ−ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｌｋ−４）、
および
（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ（ｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｌｏｃｏｍｏｔｅｒ  ｏｕｔｐｕｔ  ｃｙｃｌｅｓ  ｋａｐｕｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）。
【請求項８】
以下の群より選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍ（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ＭＩＴＦ−Ｍ）との結合阻害剤；
（ｉ）ＨＬＦ（ｈｅｐａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｆａｃｔｏｒ）、
（ｉｉ）ＥＬＫ４（ＥＴＳ−ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｌｋ−４）、
および
（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ（ｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｌｏｃｏｍｏｔｅｒ  ｏｕｔｐｕｔ  ｃｙｃｌｅｓ  ｋａｐｕｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）。
【請求項９】
以下の群より選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍ（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ＭＩＴＦ−Ｍ）との結合を阻害することを特徴とする、ＢＣＬ２（Ｂ−ｃｅｌｌ  ＣＬＬ／Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ２）遺伝子の遺伝子産物の産生阻害剤；
（ｉ）ＨＬＦ（ｈｅｐａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｆａｃｔｏｒ）、
（ｉｉ）ＥＬＫ４（ＥＴＳ−ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｌｋ−４）、
および
（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ（ｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｌｏｃｏｍｏｔｅｒ  ｏｕｔｐｕｔ  ｃｙｃｌｅｓ  ｋａｐｕｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）。
【請求項１０】
以下の群より選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍ（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ＭＩＴＦ−Ｍ）との結合阻害剤を有効量含んでなる、ＢＣＬ２（Ｂ−ｃｅｌｌ  ＣＬＬ／Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ２）遺伝子の遺伝子産物の産生阻害剤；
（ｉ）ＨＬＦ（ｈｅｐａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｆａｃｔｏｒ）、
（ｉｉ）ＥＬＫ４（ＥＴＳ−ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｌｋ−４）、
および
（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ（ｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｌｏｃｏｍｏｔｅｒ  ｏｕｔｐｕｔ  ｃｙｃｌｅｓ  ｋａｐｕｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）。
【請求項１１】
以下の群より選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍ（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ＭＩＴＦ−Ｍ）との結合を阻害することを特徴とする、メラノーマ細胞の細胞死誘導剤；
（ｉ）ＨＬＦ（ｈｅｐａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｆａｃｔｏｒ）、
（ｉｉ）ＥＬＫ４（ＥＴＳ−ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｌｋ−４）、
および
（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ（ｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｌｏｃｏｍｏｔｅｒ  ｏｕｔｐｕｔ  ｃｙｃｌｅｓ  ｋａｐｕｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）。
【請求項１２】
以下の群より選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍ（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ＭＩＴＦ−Ｍ）との結合阻害剤を有効量含んでなる、メラノーマ細胞の細胞死誘導剤；
（ｉ）ＨＬＦ（ｈｅｐａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｆａｃｔｏｒ）、
（ｉｉ）ＥＬＫ４（ＥＴＳ−ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｌｋ−４）、
および
（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ（ｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｌｏｃｏｍｏｔｅｒ  ｏｕｔｐｕｔ  ｃｙｃｌｅｓ  ｋａｐｕｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）。
【請求項１３】
以下の群より選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍ（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ＭＩＴＦ−Ｍ）との結合を阻害することを特徴とする、ＢＣＬ２（Ｂ−ｃｅｌｌ  ＣＬＬ／Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ２）遺伝子の遺伝子産物の産生亢進を伴う疾患の防止剤および／または治療剤；
（ｉ）ＨＬＦ（ｈｅｐａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｆａｃｔｏｒ）、
（ｉｉ）ＥＬＫ４（ＥＴＳ−ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｌｋ−４）、
および
（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ（ｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｌｏｃｏｍｏｔｅｒ  ｏｕｔｐｕｔ  ｃｙｃｌｅｓ  ｋａｐｕｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）。
【請求項１４】
以下の群より選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍ（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ＭＩＴＦ−Ｍ）との結合阻害剤を有効量含んでなる、ＢＣＬ２（Ｂ−ｃｅｌｌ  ＣＬＬ／Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ２）遺伝子の遺伝子産物の産生亢進を伴う疾患の防止剤および／または治療剤；
（ｉ）ＨＬＦ（ｈｅｐａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｆａｃｔｏｒ）、
（ｉｉ）ＥＬＫ４（ＥＴＳ−ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｌｋ−４）、
および
（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ（ｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｌｏｃｏｍｏｔｅｒ  ｏｕｔｐｕｔ  ｃｙｃｌｅｓ  ｋａｐｕｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）。
【請求項１５】
請求項８から１０のいずれか１項に記載の阻害剤、および／または請求項１１若しくは１２に記載の細胞死誘導剤を含有してなる、ＢＣＬ２（Ｂ−ｃｅｌｌ  ＣＬＬ／Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ２）遺伝子の遺伝子産物の産生亢進を伴う疾患の防止剤および／または治療剤。
【請求項１６】
ＢＣＬ２（Ｂ−ｃｅｌｌ  ＣＬＬ／Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ２）遺伝子の遺伝子産物の産生亢進を伴う疾患がメラノーマである請求項１３から１５のいずれか１項に記載の防止剤および／または治療剤。
【請求項１７】
以下の群より選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍ（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ＭＩＴＦ−Ｍ）との結合を阻害することを特徴とする、ＢＣＬ２（Ｂ−ｃｅｌｌ  ＣＬＬ／Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ２）遺伝子の遺伝子産物の産生亢進を伴う疾患の防止方法および／または治療方法；
（ｉ）ＨＬＦ（ｈｅｐａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｆａｃｔｏｒ）、
（ｉｉ）ＥＬＫ４（ＥＴＳ−ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｌｋ−４）、
および
（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ（ｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｌｏｃｏｍｏｔｅｒ  ｏｕｔｐｕｔ  ｃｙｃｌｅｓ  ｋａｐｕｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）。
【請求項１８】
以下の群より選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍ（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ＭＩＴＦ−Ｍ）との結合阻害剤を用いることを特徴とする、ＢＣＬ２（Ｂ−ｃｅｌｌ  ＣＬＬ／Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ２）遺伝子の遺伝子産物の産生亢進を伴う疾患の防止方法および／または治療方法；
（ｉ）ＨＬＦ（ｈｅｐａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｆａｃｔｏｒ）、
（ｉｉ）ＥＬＫ４（ＥＴＳ−ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｌｋ−４）、
および
（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ（ｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｌｏｃｏｍｏｔｅｒ  ｏｕｔｐｕｔ  ｃｙｃｌｅｓ  ｋａｐｕｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）。
【請求項１９】
請求項８から１０のいずれか１項に記載の阻害剤、および／または請求項１１若しくは１２に記載の細胞死誘導剤を用いることを特徴とする、ＢＣＬ２（Ｂ−ｃｅｌｌ  ＣＬＬ／Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ２）遺伝子の遺伝子産物の産生亢進を伴う疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項２０】
ＢＣＬ２（Ｂ−ｃｅｌｌ  ＣＬＬ／Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ２）遺伝子の遺伝子産物の産生亢進を伴う疾患がメラノーマである請求項１７から１９のいずれか１項に記載の防止方法および／または治療方法。
【請求項２１】
請求項１６に記載の治療剤とダカルバジン（Ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ、ＤＴＩＣ）を併用することを特徴とするメラノーマの治療方法。
【請求項２２】
以下の群より選ばれる蛋白質（蛋白質Ａ）、蛋白質Ａをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび該組換えベクターを含有する形質転換体のうち少なくともいずれか１つと、ＭＩＴＦ−Ｍ（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ＭＩＴＦ−Ｍ）、ＭＩＴＦ−Ｍをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび該組換えベクターを含有する形質転換体のうち少なくともいずれか１つとを含有してなる試薬キット；
（ｉ）ＨＬＦ（ｈｅｐａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｆａｃｔｏｒ）、
（ｉｉ）ＥＬＫ４（ＥＴＳ−ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｌｋ−４）、
および
（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ（ｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｌｏｃｏｍｏｔｅｒ  ｏｕｔｐｕｔ  ｃｙｃｌｅｓ  ｋａｐｕｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＬＦ（ｈｅｐａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｆａｃｔｏｒ）、ＥＬＫ４（ＥＴＳ（ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）−ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｌｋ−４）およびＣＬＯＣＫ（ｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｌｏｃｏｍｏｔｅｒ  ｏｕｔｐｕｔ  ｃｙｃｌｅｓ  ｋａｐｕｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）からなる群より選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍ（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ＭＩＴＦ−Ｍ）との結合を阻害することを特徴とする、ＢＣＬ２（Ｂ−ｃｅｌｌ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ／ｌｙｍｐｈｏｍａ  ２）遺伝子の遺伝子産物の産生阻害方法および産生阻害剤に関する。また、前記結合の阻害剤を用いることを特徴とするＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生阻害方法および該阻害剤を含む該遺伝子産物の産生阻害剤に関する。さらに、前記結合を阻害することを特徴とするメラノーマ細胞の細胞死誘導方法および細胞死誘導剤に関する。また、前記結合の阻害剤を用いることを特徴とするメラノーマ細胞の細胞死誘導方法および該阻害剤を含むメラノーマ細胞の細胞死誘導剤に関する。さらに、前記結合を阻害する化合物の同定方法に関する。また、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生を阻害する化合物の同定方法に関する。さらに、メラノーマ細胞の細胞死を誘導する化合物の同定方法に関する。また、前記結合の阻害剤に関する。さらに、前記結合を阻害することを特徴とする、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生亢進を伴う疾患、例えばメラノーマの治療方法および／または防止方法並びに治療剤および／または防止剤に関する。また、前記結合の阻害剤および／または前記細胞死誘導剤を用いることを特徴とする、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生亢進を伴う疾患、例えばメラノーマの治療方法および／または防止方法、並びに該阻害剤および／または該細胞死誘導剤を含んでなる該疾患の治療剤および／または防止剤に関する。さらに、前記結合を阻害することを特徴とするメラノーマ治療剤のうち少なくとも１種以上のメラノーマ治療剤とダカルバジン（Ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ、ＤＴＩＣ）とを併用することを特徴とするメラノーマの治療方法に関する。また、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫからなる群より選ばれる蛋白質、該蛋白質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび該組換えベクターを含有する形質転換体のうち少なくともいずれか１つと、ＭＩＴＦ−Ｍ、ＭＩＴＦ−Ｍをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび該組換えベクターを含有する形質転換体のうち少なくともいずれか１つとを含有してなる試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
メラノーマ（悪性黒色腫）は、メラノサイト（メラニン色素産生細胞）が癌化して生じる悪性腫瘍である。早期のうちから転移を生じやすく、化学療法や放射線療法にも抵抗性で、悪性度の高い腫瘍として知られている（非特許文献１および２）。【０００３】
メラノーマが化学療法や放射線療法に抵抗性である理由として、メラノーマにおけるＢＣＬ２遺伝子の発現の亢進が挙げられている（非特許文献３−５）。ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物であるＢＣＬ２はミトコンドリア膜を調節することにより抗アポトーシス活性を示す蛋白質である（非特許文献６）。すなわち、ＢＣＬ２はアポトーシスによる細胞死を防止する。【０００４】
具体的には、化学療法によりメラノーマのＢＣＬ２遺伝子の発現が亢進したこと、および化学療法に対して抵抗性を示す病巣部分でＢＣＬ２遺伝子の発現がより亢進していたことが報告されている（非特許文献５）。また、メラノーマをＢＣＬ２遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理してＢＣＬ２量を低下させることによりメラノーマのアポトーシスが亢進したことや化学療法に対する感受性が亢進したことが報告されている（非特許文献３および４）。メラノーマ以外の癌についても、ＢＣＬ２遺伝子の発現あるいはＢＣＬ２遺伝子との係わりが報告されている（非特許文献７−１６）。【０００５】
ＭＩＴＦ−Ｍは、ＭＩＴＦ（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）のアイソフォームの１つであり、メラノサイトの分化およびその生存に必要な転写因子として知られている（非特許文献１７）。ＭＩＴＦ−Ｍをコードする遺伝子はメラノサイトおよびメラノーマで特異的に発現している（非特許文献１８）。ＭＩＴＦ−ＭはメラノサイトおよびメラノーマでＢＣＬ２遺伝子の発現を正に調節していることが明らかになっている（非特許文献１９）。【０００６】
ＨＬＦは、ＰＡＲ（ｐｒｏｌｉｎｅ  ａｎｄ  ａｃｉｄｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ−ｒｉｃｈ）サブファミリーに属する転写因子であり、肝臓で高発現していることが報告されている。細胞内においてＨＬＦは、ホモダイマーまたはＰＡＲサブファミリーに属する他の転写因子とのヘテロダイマーを形成する。また、急性Ｂ細胞白血病（ａｃｕｔｅ  Ｂ−ｌｉｎｅａｇｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）患者由来のＢ細胞において、転座によるＨＬＦとＥ２Ａとの融合蛋白質が存在していることが報告されている。【０００７】
ＥＬＫ４は、ＥＴＳ（ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）ドメインを有する転写因子であり、様々なヒト組織において発現していることが知られている。細胞内においてＥＬＫ４は、転写因子であるＳＲＦ（ｃ−ｆｏｓ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）のダイマーと複合体を形成する。本複合体は、ｃ−ｆｏｓ遺伝子のプロモーター領域にあるＳＲＥ（ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）に結合し、ｃ−ｆｏｓ遺伝子の転写を活性化する。【０００８】
ＣＬＯＣＫは、ｂＨＬＨ（ｂａｓｉｃ  ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ）ドメインをもつ転写因子であり、サーカディアンリズムに関与することが知られている。細胞内においてＣＬＯＣＫは、同様にサーカディアンリズムに関与するＢＭＡＬ１（ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｒｙｌｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）とヘテロダイマーを形成し、ｐｅｒｉｏｄ遺伝子の１つであるＰｅｒ１遺伝子の転写を制御している。その他、ＣＬＯＣＫとｂＨＬＨファミリーに属する他の転写因子とのヘテロダイマーの形成も知られている。【０００９】
しかしながら、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫと、メラノーマ、ＭＩＴＦ−ＭまたはＢＣＬ２との関連は知られていなかった。【００１０】
以下に本明細書において引用した文献を列記する。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ０１／６７２９９号パンフレット。
【非特許文献１】「化学療法の領域」、２００３年、Ｓ−１、第１９巻、ｐ．２２４−２３１。
【非特許文献２】「オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）」、２００３年、第２２巻、ｐ．３１３８−３１５１。
【非特許文献３】「ネイチャー  メディシン（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、１９９８年、第４巻、ｐ．２３２−２３４。
【非特許文献４】「ザ  ランセット（Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ）」、２０００年、第３５６巻、ｐ．１７２８−１７３３。
【非特許文献５】「キャンサー  イムノロジー、イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）」、２００３年、第５２巻、ｐ．２４９−２５４。
【非特許文献６】「最新医学」、２００２年、第１５巻、ｐ．２４４７−２４５３。
【非特許文献７】「セル（Ｃｅｌｌ）」、１９８６年、第４７巻、ｐ．１９−２８。
【非特許文献８】「キャンサー  リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９５年、第５５巻、ｐ．２３７−２４１。
【非特許文献９】「キャンサー  リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９５年、第５５巻、ｐ．４４３８−４４４５。
【非特許文献１０】「オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）」、１９９８年、第１６巻、ｐ．９３３−９４３。
【非特許文献１１】「インターナショナル  ジャーナル  オブ  キャンサー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ）」、１９９７年、第７３巻、ｐ．３８−４１。
【非特許文献１２】「オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）」、２００２年、第２１巻、ｐ．７６１１−７６１８。
【非特許文献１３】「インターナショナル  ジャーナル  オブ  キャンサー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ）」、１９９５年、第６０巻、ｐ．５４−６０。
【非特許文献１４】「ヒューマン  パソロジー（Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）」、１９９８年、第２９巻、ｐ．９６５−９７１。
【非特許文献１５】「セミナーズ  イン  オンコロジー（Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）」、１９９９年、第２６巻、ｐ．１１２−１１６。
【非特許文献１６】「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」、１９９７年、第８９巻、ｐ．６０１−６０９。
【非特許文献１７】「生化学」、２００３年、第７５巻、ｐ．１４４４−１４４８。
【非特許文献１８】「オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）」、２００３年、第２２巻、ｐ．３０３５−３０４１。
【非特許文献１９】「セル（Ｃｅｌｌ）」、２００２年、第１０９巻、ｐ．７０７−７１８。
【非特許文献２０】ウルマー（Ｋ．Ｍ．Ｕｌｍｅｒ）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１。
【非特許文献２１】「ペプチド合成」、丸善株式会社、１９７５年。
【非特許文献２２】「ペプチド  シンテシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、インターサイエンス（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９９６年。
【非特許文献２３】村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社。
【非特許文献２４】エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．）編、「ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用」、１９８９年、ストックトンプレス。
【非特許文献２５】マディン（Ｍａｄｉｎ，Ｋ．）ら、「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、２０００年、第９７巻、ｐ．５５９−５６４。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ＭＩＴＦ−ＭによるＢＣＬ２遺伝子の発現調節機構を明らかにし、該機構を調節することによりＢＣＬ２遺伝子の発現を減弱させることは、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生亢進を伴う疾患、具体的にはメラノーマ等の解明並びに治療および／または防止に繋がると考える。【００１２】
本発明の課題は、ＭＩＴＦ−Ｍの転写活性化能の調節に関与する蛋白質を見出し、該蛋白質および該蛋白質のＭＩＴＦ−Ｍに対する作用を調節することによりＭＩＴＦ−Ｍの転写活性化能を減弱させ、それによりＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生を阻害し得る手段を提供することである。さらに、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生を阻害することにより、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生亢進を伴う疾患、例えばメラノーマを治療および／または防止し得る手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意努力し、ＭＩＴＦ−ＭがＨＬＦ、ＥＬＫ４またはＣＬＯＣＫと相互作用することをインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）で予測した。さらに、ＭＩＴＦ−ＭがＨＬＦ、ＥＬＫ４またはＣＬＯＣＫと結合することをインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）結合試験により実証した。そして、ＢＣＬ２遺伝子のプロモーターを用いたレポーターアッセイにおいて、ＨＬＦ遺伝子、ＥＬＫ４遺伝子およびＣＬＯＣＫ遺伝子からなる群より選ばれるいずれか１の遺伝子とＭＩＴＦ−Ｍ遺伝子とを共発現させたときに、ＭＩＴＦ−Ｍ遺伝子のみを発現させたときと比較して、レポーター遺伝子の発現が亢進することを実証した。【００１４】
これらから、ＭＩＴＦ−ＭがＨＬＦ、ＥＬＫ４またはＣＬＯＣＫと結合することにより、その転写活性化能が亢進し、その結果、ＭＩＴＦ−Ｍが転写因子として作用するＢＣＬ２遺伝子の発現が亢進すると発明者らは考えている。したがって、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫからなる群より選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害することにより、ＭＩＴＦ−Ｍの転写活性化能を減弱でき、その結果、ＢＣＬ２遺伝子の発現の亢進を阻害できると発明者らは考えている。ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物であるＢＣＬ２は抗アポトーシス活性を示す蛋白質である。また、ＢＣＬ２遺伝子の発現と癌、例えばメラノーマとの係わりが報告されている。これらから、ＢＣＬ２遺伝子の発現を阻害することにより、細胞死を誘導することができ、さらに癌、例えばメラノーマを防止および／または治療できると発明者らは考えている。【００１５】
本発明はこれら知見により完成した。【００１６】
すなわち、本発明は、以下の群より選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害することを特徴とする、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生阻害方法に関する；（ｉ）ＨＬＦ、（ｉｉ）ＥＬＫ４、および（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ。【００１７】
本発明はまた、以下の群より選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合阻害剤を用いることを特徴とする、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生阻害方法に関する；（ｉ）ＨＬＦ、（ｉｉ）ＥＬＫ４、および（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ。【００１８】
本発明はさらに、以下の群より選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害することを特徴とする、メラノーマ細胞の細胞死誘導方法に関する；（ｉ）ＨＬＦ、（ｉｉ）ＥＬＫ４、および（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ。【００１９】
本発明はさらにまた、以下の群より選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合阻害剤を用いることを特徴とする、メラノーマ細胞の細胞死誘導方法に関する；（ｉ）ＨＬＦ、（ｉｉ）ＥＬＫ４、および（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ。【００２０】
本発明はまた、以下の群より選ばれる蛋白質（蛋白質Ａ）とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害する化合物の同定方法であって、ある化合物と蛋白質Ａおよび／またはＭＩＴＦ−Ｍとの相互作用を可能にする条件下で、該化合物と蛋白質Ａおよび／またはＭＩＴＦ−Ｍとを接触させ、次いで、蛋白質ＡとＭＩＴＦ−Ｍの結合により生じるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、該シグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、該化合物が蛋白質ＡとＭＩＴＦ−Ｍの結合を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法に関する；（ｉ）ＨＬＦ、（ｉｉ）ＥＬＫ４、および（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ。【００２１】
本発明はさらに、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生を阻害する化合物の同定方法であって、以下の群より選ばれる蛋白質（蛋白質Ａ）とＭＩＴＦ−Ｍとの結合並びにある化合物と蛋白質Ａおよび／またはＭＩＴＦ−Ｍとの相互作用を可能にする条件下で、該化合物と蛋白質Ａおよび／またはＭＩＴＦ−Ｍとを接触させることによりＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生が阻害されるか否かを決定することを特徴とする同定方法に関する；（ｉ）ＨＬＦ、（ｉｉ）ＥＬＫ４、および（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ。【００２２】
本発明はさらにまた、メラノーマ細胞の細胞死を誘導する化合物の同定方法であって、以下の群より選ばれる蛋白質（蛋白質Ａ）とＭＩＴＦ−Ｍとの結合並びにある化合物と蛋白質Ａおよび／またはＭＩＴＦ−Ｍとの相互作用を可能にする条件下で、該化合物と蛋白質Ａおよび／またはＭＩＴＦ−Ｍとを接触させることによりメラノーマ細胞の細胞死が誘導されるか否かを決定することを特徴とする同定方法に関する；（ｉ）ＨＬＦ、（ｉｉ）ＥＬＫ４、および（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ。【００２３】
本発明はまた、以下の群より選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合阻害剤に関する；（ｉ）ＨＬＦ、（ｉｉ）ＥＬＫ４、および（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ。【００２４】
本発明はさらに、以下の群より選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害することを特徴とする、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生阻害剤に関する；（ｉ）ＨＬＦ、（ｉｉ）ＥＬＫ４、および（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ。【００２５】
本発明はさらにまた、以下の群より選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合阻害剤を有効量含んでなる、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生阻害剤に関する；（ｉ）ＨＬＦ、（ｉｉ）ＥＬＫ４、および（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ。【００２６】
本発明はまた、以下の群より選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害することを特徴とする、メラノーマ細胞の細胞死誘導剤に関する；（ｉ）ＨＬＦ、（ｉｉ）ＥＬＫ４、および（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ。【００２７】
本発明はさらに、以下の群より選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合阻害剤を有効量含んでなる、メラノーマ細胞の細胞死誘導剤に関する；（ｉ）ＨＬＦ、（ｉｉ）ＥＬＫ４、および（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ。【００２８】
本発明はさらにまた、以下の群より選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害することを特徴とする、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生亢進を伴う疾患の防止剤および／または治療剤に関する；（ｉ）ＨＬＦ、（ｉｉ）ＥＬＫ４、および（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ。【００２９】
本発明はまた、以下の群より選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合阻害剤を有効量含んでなる、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生亢進を伴う疾患の防止剤および／または治療剤に関する；（ｉ）ＨＬＦ、（ｉｉ）ＥＬＫ４、および（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ。【００３０】
本発明はさらに、前記いずれかの阻害剤および／または前記いずれかの細胞死誘導剤を含有してなる、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生亢進を伴う疾患の防止剤および／または治療剤に関する。【００３１】
本発明はさらにまた、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生亢進を伴う疾患がメラノーマである前記いずれかの防止剤および／または治療剤に関する。【００３２】
本発明はまた、以下の群より選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害することを特徴とする、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生亢進を伴う疾患の防止方法および／または治療方法に関する；（ｉ）ＨＬＦ、（ｉｉ）ＥＬＫ４、および（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ。【００３３】
本発明はさらに、以下の群より選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合阻害剤を用いることを特徴とする、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生亢進を伴う疾患の防止方法および／または治療方法に関する；（ｉ）ＨＬＦ、（ｉｉ）ＥＬＫ４、および（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ。【００３４】
本発明はさらにまた、前記いずれかの阻害剤および／または前記いずれかの細胞死誘導剤を用いることを特徴とする、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生亢進を伴う疾患の防止方法および／または治療方法に関する。【００３５】
本発明はまた、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生亢進を伴う疾患がメラノーマである前記いずれかの防止方法および／または治療方法に関する。【００３６】
本発明はさらに、前記治療剤とダカルバジン（Ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ、ＤＴＩＣ）を併用することを特徴とするメラノーマの治療方法に関する。【００３７】
本発明はさらにまた、以下の群より選ばれる蛋白質（蛋白質Ａ）、蛋白質Ａをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび該組換えベクターを含有する形質転換体のうち少なくともいずれか１つと、ＭＩＴＦ−Ｍ、ＭＩＴＦ−Ｍをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび該組換えベクターを含有する形質転換体のうち少なくともいずれか１つとを含有してなる試薬キットに関する；（ｉ）ＨＬＦ、（ｉｉ）ＥＬＫ４、および（ｉｉｉ）ＣＬＯＣＫ。
【発明の効果】
【００３８】
本発明は、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害することを特徴とする。本発明により、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質によるＭＩＴＦ−Ｍの転写活性化能の亢進を阻害できるため、ＭＩＴＦ−Ｍが転写因子として作用する遺伝子であるＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生を阻害できる。【００３９】
ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物は抗アポトーシス活性を示す蛋白質である。したがって、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生を阻害することにより、抗アポトーシス活性を低減でき、細胞のアポトーシスを誘導することができる。また、ＢＣＬ２遺伝子の発現の亢進が、メラノーマの化学療法や放射線療法に対する抵抗性の原因の１つであると考えられている。したがって、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生を阻害することにより、メラノーマの化学療法や放射線療法に対する感受性を増強できる。【００４０】
このように、本発明を利用して、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の亢進を伴う疾患の治療および／または防止を実施できる。具体的には例えば、メラノーマのアポトーシスの誘導、あるいはメラノーマの化学療法や放射線療法に対する感受性の増強を実施できる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１−Ａ】ＭＩＴＦ−ＭとＨＬＦの相互作用をインシリコで予測した結果を示す図である。ＭＩＴＦ−ＭとＨＬＦの間でローカルアライメントを行い、高いスコア（ｓｃｏｒｅ）を示した領域を図示した。アミノ酸配列は１文字表記した。ＭＩＴＦ−ＭとＨＬＦの各部分配列の間に示した配列は、ＭＩＴＦ−ＭおよびＨＬＦの部分配列において同一のアミノ酸とその位置を示す。図中の数字は、ＭＩＴＦ−ＭまたはＨＬＦの各アミノ酸配列における、図示した各領域のＮ末端アミノ酸の位置を意味する。（実施例１）
【図１−Ｂ】ＭＩＴＦ−ＭとＥＬＫ４の相互作用をインシリコで予測した結果を示す図である。ＭＩＴＦ−ＭとＥＬＫ４の間でローカルアライメントを行い、高いスコア（ｓｃｏｒｅ）を示した領域を図示した。アミノ酸配列は１文字表記した。ＭＩＴＦ−ＭとＥＬＫ４の各部分配列の間に示した配列は、ＭＩＴＦ−ＭおよびＥＬＫ４の部分配列において同一のアミノ酸とその位置を示す。図中の数字は、ＭＩＴＦ−ＭまたはＥＬＫ４の各アミノ酸配列における、図示した各領域のＮ末端アミノ酸の位置を意味する。（実施例１）
【図１−Ｃ】ＭＩＴＦ−ＭとＣＬＯＣＫの相互作用をインシリコで予測した結果を示す図である。ＭＩＴＦ−ＭとＣＬＯＣＫの間でローカルアライメントを行い、高いスコア（ｓｃｏｒｅ）を示した領域を図示した。アミノ酸配列は１文字表記した。ＭＩＴＦ−ＭとＣＬＯＣＫの各部分配列の間に示した配列は、ＭＩＴＦ−ＭおよびＣＬＯＣＫの部分配列において同一のアミノ酸とその位置を示す。図中の数字は、ＭＩＴＦ−ＭまたはＣＬＯＣＫの各アミノ酸配列における、図示した各領域のＮ末端アミノ酸の位置を意味する。（実施例１）
【図２】ＭＩＴＦ−ＭがＨＬＦ、ＥＬＫ４またはＣＬＯＣＫと結合することを示す図である。ＨＬＦ、ＥＬＫ４またはＣＬＯＣＫとＧＳＴ−ＭＩＴＦ−Ｍ（グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合蛋白質として調製したＭＩＴＦ−Ｍ）を反応させた後に、ＧＳＴ−ＭＩＴＦ−Ｍと結合する蛋白質を電気泳動により検出する系において、かかる蛋白質としてＨＬＦ、ＥＬＫ４またはＣＬＯＣＫの各蛋白質の分子量に相当する位置にバンドが検出されたことを示す図である。ＨＬＦ、ＥＬＫ４またはＣＬＯＣＫとＧＳＴとを反応させたときには、かかるバンドは検出されなかった。（実施例２）
【図３−Ａ】ＢＣＬ２遺伝子のプロモーターを用いたレポーターアッセイにおいて、ＭＩＴＦ−Ｍ遺伝子発現プラスミドとＥＬＫ４遺伝子発現プラスミドを共にトランスフェクションした細胞では、ＥＬＫ４遺伝子発現プラスミドをトランスフェクションしなかった細胞と比較してルシフェラーゼ活性が約１．４倍に増加したことを示す図である（黒カラム）。一方、ＭＩＴＦ−Ｍ遺伝子発現プラスミドをトランスフェクションしなかった細胞では、ＥＬＫ４遺伝子発現プラスミドをトランスフェクションしても、ルシフェラーゼ活性は変化しなかった（白カラム）。（実施例３）
【図３−Ｂ】ＢＣＬ２遺伝子のプロモーターを用いたレポーターアッセイにおいて、ＭＩＴＦ−Ｍ遺伝子発現プラスミドとＨＬＦ遺伝子発現プラスミドを共にトランスフェクションした細胞では、ＨＬＦ遺伝子発現プラスミドをトランスフェクションしなかった細胞と比較してルシフェラーゼ活性が約１．８倍に増加したことを示す図である（黒カラム）。一方、ＭＩＴＦ−Ｍ遺伝子発現プラスミドをトランスフェクションしなかった細胞では、ＨＬＦ遺伝子発現プラスミドをトランスフェクションしても、ルシフェラーゼ活性は変化しなかった（白カラム）。（実施例３）
【図３−Ｃ】ＢＣＬ２遺伝子のプロモーターを用いたレポーターアッセイにおいて、ＭＩＴＦ−Ｍ遺伝子発現プラスミドとＣＬＯＣＫ遺伝子発現プラスミドを共にトランスフェクションした細胞では、ＣＬＯＣＫ遺伝子発現プラスミドをトランスフェクションしなかった細胞と比較してルシフェラーゼ活性が約１．５倍に増加したことを示す図である（黒カラム）。一方、ＭＩＴＦ−Ｍ遺伝子発現プラスミドをトランスフェクションしなかった細胞では、ＣＬＯＣＫ遺伝子発現プラスミドをトランスフェクションしても、ルシフェラーゼ活性は変化しなかった（白カラム）。（実施例３）
【図４】メラノーマ細胞Ａ３７５およびＧＩ−１０５由来のそれぞれのｃＤＮＡにおいて、ＨＬＦ遺伝子、ＥＬＫ４遺伝子およびＣＬＯＣＫ遺伝子の発現が検出されたことを示す図である。（実施例４）
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
以下、本発明について発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。
本明細書においては単離された若しくは合成の完全長蛋白質；単離された若しくは合成の完全長ポリペプチド；または単離された若しくは合成の完全長オリゴペプチドを意味する総称的用語として「蛋白質」という用語を使用することがある。ここで蛋白質、ポリペプチド若しくはオリゴペプチドはペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合している２個以上のアミノ酸を含むものである。以降、アミノ酸を表記する場合、１文字または３文字にて表記することがある。【００４３】
本発明においては、ＭＩＴＦ−ＭがＨＬＦ、ＥＬＫ４またはＣＬＯＣＫと相互作用することを、特許文献１に記載の方法に従ってインシリコで予測した。そして、ＨＬＦ、ＥＬＫ４またはＣＬＯＣＫとＭＩＴＦ−Ｍが結合することをインビトロ結合試験により実証した。さらに、ＨＬＦ、ＥＬＫ４またはＣＬＯＣＫとＭＩＴＦ−Ｍが結合することにより、ＭＩＴＦ−Ｍが転写因子として作用するＢＣＬ２遺伝子プロモーターの転写活性が増大することを初めて見出した。【００４４】
これらから、ＭＩＴＦ−ＭがＨＬＦ、ＥＬＫ４またはＣＬＯＣＫと結合することにより、その転写活性化能が亢進し、その結果、ＭＩＴＦ−Ｍが転写因子として作用するＢＣＬ２遺伝子の発現が亢進すると発明者らは考えている。【００４５】
ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物は抗アポトーシス活性を示す蛋白質である。また、ＢＣＬ２遺伝子の発現と癌、例えばメラノーマとの係わりが報告されている。例えばメラノサイトおよびメラノーマでＭＩＴＦ−ＭがＢＣＬ２遺伝子の発現を正に調節していることが報告されている（非特許文献１９）。これらから、ＢＣＬ２遺伝子の発現を阻害することにより、細胞死を誘導することができる。したがって、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害することにより、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生量を低下／減少させることができ、さらに、細胞、例えばメラノーマ細胞の細胞死を誘導することができる。また、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の亢進を伴う疾患、例えばメラノーマの治療および／または防止を実施できる。【００４６】
ＢＣＬ２遺伝子の発現亢進は、例えばメラノーマの化学療法に対する抵抗性の原因であることが報告されている（非特許文献３−５）。また、メラノーマにおいてＢＣＬ２遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてＢＣＬ２量を低下させると、メラノーマのアポトーシスが亢進したことやダカルバジン（Ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ、ＤＴＩＣ）を用いた化学療法に対する感受性が亢進したことが報告されている（非特許文献３および４）。したがって、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害して、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生を阻害することにより、メラノーマの化学療法に対する感受性を増強できる。例えば、メラノーマのダカルバジンに対する感受性を増強できる。【００４７】
本発明はこれら知見に基づいて達成した。本発明の一態様は、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害することを特徴とする、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生を阻害する方法および産生阻害剤に関する。【００４８】
本発明の一態様はまた、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害することを特徴とする、メラノーマ細胞の細胞死誘導方法および細胞死誘導剤に関する。【００４９】
本発明の一態様はさらに、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害することを特徴とする、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の亢進を伴う疾患、例えばメラノーマの治療および／または防止方法並びに治療および／または防止剤に関する。【００５０】
また、本発明においては、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害することを特徴とする、メラノーマ治療剤に対するメラノーマの感受性を増強させる方法および感受性増強剤を提供することができる。【００５１】
本発明に係るＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生阻害剤、メラノーマ細胞の細胞死誘導剤、およびＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の亢進を伴う疾患の治療および／または防止剤はいずれも、メラノーマ治療剤に対するメラノーマの感受性を増強させることができるため、メラノーマ治療剤と組み合わせることにより、メラノーマ治療剤のみを適用した時と比較して、メラノーマ治療において格段の効果が得られる。このように、本発明においては、本発明に係るＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生阻害剤、メラノーマ細胞の細胞死誘導剤、またはＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の亢進を伴う疾患の治療および／または防止剤とメラノーマ治療剤とを組み合わせることを特徴とするメラノーマ治療剤を提供できる。また、本発明に係るＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生阻害剤、メラノーマ細胞の細胞死誘導剤、またはＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の亢進を伴う疾患の治療および／または防止剤とメラノーマ治療剤とを併用することを特徴とするメラノーマ治療方法を提供できる。かかるメラノーマ治療剤として公知のメラノーマ治療剤を例示できる。本メラノーマ治療剤には、単剤または併用される２種以上のメラノーマ治療剤のいずれをも含む。好ましくは、メラノーマにおけるＢＣＬ２量の低下に伴い該メラノーマが示す感受性が増強される公知のメラノーマ治療剤を例示できる。より好ましくは、かかるメラノーマ治療剤であって、該ＢＣＬ２量の低下が、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合阻害によるＢＣＬ２量の低下である、メラノーマ治療剤を例示できる。最も好ましくは、ダカルバジン（Ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ、ＤＴＩＣ）を例示できる。【００５２】
ＭＩＴＦ−Ｍ、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫは、動物、好ましくは哺乳動物、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、ウシおよびサル等のあらゆる組織または細胞等に由来する蛋白質のいずれであってもよい。より好ましくは、ヒトのメラノーマ、肝臓若しくは脳、またはそれらの細胞等に由来する蛋白質を例示できる。具体的には、ＭＩＴＦ−Ｍをコードする遺伝子および該遺伝子によりコードされる蛋白質として、それぞれ配列表の配列番号１および配列番号２に記載の各配列で表わされるヒト由来のポリヌクレオチドおよび蛋白質が好ましく例示できる。ＨＬＦをコードする遺伝子および該遺伝子によりコードされる蛋白質として、それぞれ配列表の配列番号３および配列番号４に記載の各配列で表わされるヒト由来のポリヌクレオチドおよび蛋白質が好ましく例示できる。ＥＬＫ４をコードする遺伝子および該遺伝子によりコードされる蛋白質として、それぞれ配列表の配列番号５および配列番号６に記載の各配列で表わされるヒト由来のポリヌクレオチドおよび蛋白質が好ましく例示できる。ＣＬＯＣＫをコードする遺伝子および該遺伝子によりコードされる蛋白質として、それぞれ配列表の配列番号７および配列番号８に記載の各配列で表わされるヒト由来のポリヌクレオチドおよび蛋白質が好ましく例示できる。ＭＩＴＦ−Ｍ、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫ並びにそれらをコードする遺伝子はそれぞれ上記各配列で表わされる蛋白質およびポリヌクレオチドに限らず、一般に知られているＭＩＴＦ−Ｍ、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫの機能を有する蛋白質および該蛋白質をコードするポリヌクレオチドである限りにおいて、上記各配列で表わされる蛋白質およびポリヌクレオチドにおいて１乃至数個のアミノ酸またはヌクレオチドの変異を有する蛋白質およびポリヌクレオチドであることができる。また、該機能を促進するあるいは欠失させるといった所望の目的のために、上記各配列で表わされる蛋白質およびポリヌクレオチドに１乃至数個のアミノ酸またはヌクレオチドの変異を導入した蛋白質およびポリヌクレオチドであることができる。【００５３】
「ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質」とは、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる１種または２種以上の蛋白質を意味し、好ましくは、ＨＬＦ、ＥＬＫ４またはＣＬＯＣＫである。【００５４】
「ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合」とは、該蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍが複合体を形成するように、水素結合、疎水結合および静電的相互作用等の非共有結合により、該蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍが相互作用することを意味する。ここでの結合とは、該蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍがそれら分子の一部分において結合すれば足りる。例えば、該蛋白質またはＭＩＴＦ−Ｍを構成するアミノ酸の中に、該蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合に関与しないアミノ酸が含まれていてもよい。ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合は、免疫沈降法、ツーハイブリッド法、ウエスタンブロッティングおよび蛍光共鳴エネルギー転移法等の自体公知の方法またはこれらの方法を組合わせることにより検出され得る。例えば、ＨＬＦ、ＥＬＫ４またはＣＬＯＣＫと、ＧＳＴ融合蛋白質として調製したＭＩＴＦ−Ｍ（ＧＳＴ−ＭＩＴＦ−Ｍ）とを反応させた後に、グルタチオンセファロースにＧＳＴ−ＭＩＴＦ−Ｍを吸着させて回収し、回収画分に存在する蛋白質を検出することにより両蛋白質の結合を確認できる（実施例２参照）。蛋白質の検出は、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥにより蛋白質を分離し、該蛋白質の分子量に相当するバンドを検出することにより実施できる。【００５５】
「ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物」とは、ＢＣＬ２遺伝子にコードされた情報に基づき、転写、翻訳等の過程を経て発現され、かつ機能を有するＢＣＬ２を意味する。かかる機能として、抗アポトーシス活性が例示される。好ましくはメラノーマ細胞に存在するＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物である。より好ましくは、かかる遺伝子産物であって、抗アポトーシス活性を有する遺伝子産物である。【００５６】
「メラノーマ細胞」とは、悪性黒色腫細胞を意味する。「メラノーマ細胞の細胞死」とは、メラノーマ細胞のアポトーシスを意味する。好ましくは、メラノーマ細胞に存在するＢＣＬ２の抗アポトーシス活性の減弱または消失によるメラノーマ細胞のアポトーシスを意味する。【００５７】
「メラノーマ治療剤に対するメラノーマの感受性」とは、メラノーマがメラノーマ治療剤に反応して退縮する、消失する、あるいは増大しないことを意味する。かかる感受性の増強とは、該退縮の程度および／または該退縮若しくは該消失の速度が増加することを意味する。かかるメラノーマ治療剤として、公知のメラノーマ治療剤を例示できる。本メラノーマ治療剤には、単剤または併用される２種以上のメラノーマ治療剤のいずれをも含む。好ましくは、メラノーマにおけるＢＣＬ２量の低下に伴い該メラノーマが示す感受性が増強される公知のメラノーマ治療剤を例示できる。より好ましくは、かかるメラノーマ治療剤であって、該ＢＣＬ２量の低下が、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合阻害によるＢＣＬ２量の低下である、メラノーマ治療剤を例示できる。最も好ましくは、ダカルバジン（Ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ、ＤＴＩＣ）を例示できる。具体的には、単剤であるメラノーマ治療剤として、ニトロソウレア系薬剤（Ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａｓ）、窒素マスタード系薬剤（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｍｕｓｔａｒｄ）、トリアジン系薬剤（Ｔｒｉａｚｅｎｅｓ）、アンスラサイクリン系薬剤（Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、ビンカアルカロイド系薬剤（Ｖｉｎｃａ  ａｌｉｋａｒｏｉｄｓ）、エピポドフィロトキシン系薬剤（Ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎｓ）、タキサン系薬剤（Ｔａｘａｎｅｓ）、ホルモン類似体（Ｈｏｒｍｏｎａｌ  ａｎａｌｏｇｓ）および白金製剤（Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ｄｒｕｇｓ）等を例示できる。ニトロソウレア系薬剤として、カルムスチン（Ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ、ＢＣＮＵ）、ロムスチン（Ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ、ＣＣＮＵ）、セムスチン（Ｓｅｍｕｓｔｉｎｅ）、フォテムスチン（Ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ、ＦＴＭ）およびニムスチン（Ｎｉｍｕｓｔｉｎｅ、ＡＣＮＵ）等を例示できる。窒素マスタード系薬剤として、シクロホスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ、ＣＰＡ）を例示できる。トリアジン系薬剤として、ダカルバジン（Ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ、ＤＴＩＣ）およびテモゾロミド（Ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ、ＴＭＺ）等が例示される。アンスラサイクリン系薬剤として、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ、ＤＸＲ）およびブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ、ＢＬＭ）を例示できる。ビンカアルカロイド系薬剤として、ビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ、ＶＣＲ）、ビンデシン（Ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ、ＶＤＳ）およびビンブラスチン（Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ、ＶＬＢ）等を例示できる。エピポドフィロトキシン系薬剤として、エトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）を例示できる。タキサン系薬剤として、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ、ＰＴＸ）、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ、ＴＸＴ）を例示できる。ホルモン類似体として、抗エストロゲン剤（Ａｎｔｉｅｓｔｒｏｇｅｎ）、タモキシフェン（Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ、ＴＡＭ）を例示できる。白金製剤として、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、ＣＤＤＰ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ、ＣＢＤＣＡ）を例示できる。好ましくは、トリアジン系薬剤を例示できる。最も好ましくは、ＤＴＩＣを例示できる。２種���上の単剤からなるメラノーマ治療剤として、ＤＴＩＣを含む少なくとも２種以上の単剤からなるメラノーマ治療剤を挙げることができる。好ましくは、ＶＤＳまたはＶＬＢ、ＣＤＤＰおよびＤＴＩＣからなるメラノーマ治療剤；ＢＬＭ、ＶＣＲ、ＣＣＮＵおよびＤＴＩＣからなるメラノーマ治療剤；ＤＴＩＣ、ＢＣＮＵ、ＣＤＤＰおよびＴＡＭからなるメラノーマ治療剤；ＣＤＤＰ、ＡＣＮＵ、ＤＴＩＣおよびＴＡＭからなるメラノーマ治療剤を例示できる。さらに、インターロイキン２（ＩＬ−２）またはインターフェロンαを併用してもよい。最も好ましくは、ＤＴＩＣ、ＢＣＮＵ、ＣＤＤＰおよびＴＡＭからなるメラノーマ治療剤を例示できる。最も好ましくメラノーマが示す感受性が増強されるメラノーマ治療剤として、ＤＴＩＣを例示できる。【００５８】
ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合の阻害は、例えば、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合阻害剤を用いることにより実施できる。本明細書においては、ある機能に対して阻害効果を奏する化合物（後述する例として競合阻害効果を有する蛋白質類、抗体および低分子化合物等が挙げられる）あるいは該化合物を含む組成物を阻害剤と称する。ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合阻害剤とは、該蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害する機能を有する化合物あるいは該化合物を含む組成物を意味する。【００５９】
ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害する効果を有する化合物として、後述するような競合阻害効果を有する蛋白質類、抗体および低分子化合物等が挙げられる。好ましくはＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を特異的に阻害する化合物、より好ましくは該結合を特異的に阻害する低分子量化合物が用いられる。ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を特異的に阻害するとは、該結合を強く阻害するが、他の蛋白質間結合は阻害しないか、弱く阻害することを意味する。【００６０】
ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害する効果を有する化合物として、より具体的には、該蛋白質およびＭＩＴＦ−Ｍのアミノ酸配列上の該結合部位のアミノ酸配列で表わされる蛋白質が例示できる。このような蛋白質は、ＨＬＦ、ＥＬＫ４、ＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質およびＭＩＴＦ−Ｍのアミノ酸配列から設計し、自体公知のペプチド合成法により合成した蛋白質から、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害するものを選択することにより取得できる。選択は、後述するＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害する化合物の同定方法を利用して実施できる。このように特定された蛋白質に１乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入した蛋白質も本発明の範囲に包含される。このような変異を導入した蛋白質は、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害するものが好ましい。変異を有する蛋白質は天然に存在するものであってよく、また変異を導入したものであってよい。欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマーの技術（非特許文献２０）を利用できる。このような変異の導入において、当該蛋白質の基本的な性質（物性、機能または免疫学的活性等）を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。さらに、これら蛋白質は、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度に改変できる。また、上記特定された蛋白質および変異を導入した蛋白質を含む蛋白質であって、該結合を阻害する効果を有する蛋白質も本発明の範囲に包含される。このような蛋白質は後述する蛋白質の製造方法により取得できる。【００６１】
ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害する効果を有する化合物としてまた、ＨＬＦ、ＥＬＫ４、ＣＬＯＣＫまたはＭＩＴＦ−Ｍを認識する抗体であって、該蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害する抗体を例示できる。このような抗体は、ＨＬＦ、ＥＬＫ４、ＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質またはＭＩＴＦ−Ｍの各蛋白質自体、またはこれらの断片、好ましくはＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合部位のアミノ酸配列で表わされる蛋白質を抗原として自体公知の抗体作製法により取得できる。【００６２】
本発明の一態様はまた、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害する化合物の同定方法に関する。本同定方法は、ＨＬＦ、ＥＬＫ４、ＣＬＯＣＫまたはＭＩＴＦ−Ｍ、これらのいずれかをコードする遺伝子、該遺伝子を組込んだベクター、該ベクターをトランスフェクションした形質転換体、あるいは該遺伝子を発現している細胞等を単独でまたは組合わせて用い、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して構築できる。【００６３】
上記同定方法の例として、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合並びに調べようとする化合物（被験化合物）と該蛋白質および／またはＭＩＴＦ−Ｍとの相互作用を可能にする条件を選択し、該条件下で、被験化合物と該蛋白質および／またはＭＩＴＦ−Ｍとを接触させた後に該蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を検出することにより、被験化合物が該蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法が挙げられる。被験化合物がＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害するか否かを決定することは、被験化合物を接触させたときの該結合の測定結果を、被験化合物を接触させなかったときの測定結果と比較して、変化、例えば低減または消失を検出することにより実施できる。ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合の測定は、免疫沈降法、プルダウン法およびウエスタンブロッティング等の自体公知の方法またはこれらの方法を組合わせることにより実施できる。また、被験化合物がＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害するか否かを決定することは、該結合により生じるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより実施できる。シグナルおよび／またはマーカーが、被験化合物をＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質および／またはＭＩＴＦ−Ｍと接触させたときに消失する、あるいは低減する等の変化を示した場合、該被験化合物は該蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害するものであると判定できる。【００６４】
ここでシグナルとは、そのもの自体がその物理的または化学的性質により直接検出され得るものを指す。シグナルとして、タグペプチド、放射性同位体、ビオチン、酵素および蛍光色素等を例示できる。タグペプチドとして、ＧＳＴ−ｔａｇ、ＭＢＰ（ｍａｌｔｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇおよびＨｉｓ−ｔａｇ等を例示できる。マーカーとはそのものの自体は物理的または化学的性質により検出されないが、化学的反応を経ることにより前記シグナルを生成させるものであって、そのものの物理的、化学的または生物学的性質を指標として間接的に検出され得るものを指す。マーカーとして、レポーター遺伝子、ＢＲＥＴ（バイオルミネッセンス共鳴エネルギー転移アッセイ）またはＦＲＥＴ（蛍光エネルギー移動）による発光を生じさせる標識等を例示できる。レポーター遺伝子として、例えばＢＣＬ２、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等を例示できる。シグナルおよびマーカーはこれらの例示に限らず、化合物の同定方法において一般的に用いられているシグナルおよびマーカーをいずれも利用できる。これらシグナルまたはマーカーの検出方法は当業者には周知である。【００６５】
上記同定方法において被験化合物は、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合反応の前に、該蛋白質および／またはＭＩＴＦ−Ｍと予め接触させることができる。または、被験化合物は、該結合反応に共存させることにより、該蛋白質および／またはＭＩＴＦ−Ｍと接触させることができる。ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を可能にする条件は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の条件およびインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の条件のいずれであってもよい。例えば、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとを共発現させた細胞を用いることができる。細胞における共発現は、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターとＭＩＴＦ−Ｍをコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターとを用いて慣用の遺伝子工学的方法でこれらを細胞にトランスフェクションすることにより達成できる。【００６６】
具体的には上記同定方法は、例えばＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質またはＭＩＴＦ−Ｍの一方を固相化し、他方をシグナルで標識化して用いて結合反応を行い、標識シグナルを定量的に測定するといった当業者に知られた一般的なインビトロにおける結合実験系を利用して実施できる。このような結合実験系に被験化合物を加えて評価することにより、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害する化合物を同定できる。【００６７】
上記同定方法はまた、例えば遺伝子工学的手法によりＧＳＴ−ｔａｇ融合蛋白質として発現させたＧＳＴ−ＭＩＴＦ−Ｍを用いて実施できる。具体的には、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＧＳＴ−ＭＩＴＦ−Ｍを用いて結合反応を行い、その後グルタチオンセファロースによりＧＳＴ−ＭＩＴＦ−Ｍを回収し、回収されたＧＳＴ−ＭＩＴＦ−Ｍに結合した該蛋白質を検出するといった結合実験系を利用する（実施例２参照）。このような結合実験系に被験化合物を加えて評価することにより、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害する化合物を同定できる。グルタチオンセファロースにより回収されたＧＳＴ−ＭＩＴＦ−Ｍに結合した上記蛋白質の検出は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより該蛋白質自体を展開し、ＧＳＴ−ＭＩＴＦ−Ｍに結合した蛋白質に対する抗体を用いて実施できる。あるいは、上記蛋白質を、酵素類、放射性同位元素、蛍光物質、ビオチン、タグプチド等の標識物質で標識して用い、該標識物質を測定することにより、ＧＳＴ−ＭＩＴＦ−Ｍに結合した上記蛋白質を定量的に検出できる。これら標識物質の測定方法は周知である。例えば、ビオチンで標識した上記蛋白質を用いれば、ホースラディッシュパーオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを用いて該蛋白質を直接検出できる（実施例２参照）。また、タグペプチドを融合した上記蛋白質を用いれば、抗タグ抗体を用いて該蛋白質を定量できる。上記蛋白質の定量に用いる抗体は、定量を容易に行なうために、例えばホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）やアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）等の酵素、放射性同位元素、蛍光物質またはビオチン等で標識した抗体であることが好ましい。あるいは、一次抗体として標識していない抗体を用い、二次抗体としてＨＲＰやＡＬＰ等の酵素、放射性同位元素、蛍光物質、ビオチン等で標識した抗体を用いて定量することもできる。【００６８】
上記同定方法は、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質をコードする遺伝子およびＭＩＴＦ−Ｍをコードする遺伝子を共発現させた細胞を用いて、細胞内における結合反応を検出する試験系を利用して実施できる。このような試験系において細胞に被験化合物を作用させ、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を免疫沈降法、プルダウン法またはウェスタンブロッティング等の公知方法で検出することにより、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）において該蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害する化合物を取得できる。【００６９】
上記同定方法はまた、いわゆるレポーターアッセイ系を利用して実施できる。レポーターアッセイ系として、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質をコードする遺伝子、ＭＩＴＦ−Ｍをコードする遺伝子、およびＢＣＬ２遺伝子プロモータ領域にルシフェラーゼ遺伝子を接続したレポーター遺伝子をそれぞれ含むプラスミドをトランスフェクションした細胞を用いたレポーターアッセイ系が例示できる（実施例３参照）。このような細胞に被験化合物を作用させ、ルシフェラーゼ活性を測定し、被験化合物を作用させなかったときと比較して、該活性が低減または消失した場合は、該化合物が上記蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害すると判定できる。【００７０】
上記同定方法に、公知のツーハイブリッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）法を利用することもできる。例えば、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＤＮＡ結合蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、ＭＩＴＦ−Ｍと転写活性化蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、および適切なプロモーター遺伝子に接続したレポーター遺伝子を含有するプラスミドを酵母または真核細胞等にトランスフェクションする。次いで、被験化合物を共存させた場合のレポーター遺伝子の発現量と、被験化合物非存在下でのレポーター遺伝子の発現量との比較により、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害する化合物を同定できる。被験化合物を共存させた場合のレポーター遺伝子の発現量が被験化合物非存在下でのレポーター遺伝子の発現量と比較して消失または減少した場合には、該被験化合物にはＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害する作用があると判定できる。レポーター遺伝子は、レポーターアッセイで一般的に用いられている遺伝子を使用できるが、例えばルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ等の酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子が例示できる。レポーター遺伝子の発現の検出は、その遺伝子産物の活性、例えば、上記例示したレポーター遺伝子の場合は酵素活性を検出することにより実施できる。【００７１】
上記同定方法は、ビアコアシステム（ＢＩＡＣＯＲＥ  ｓｙｓｔｅｍ）等の表面プラズモン共鳴センサーを用いて実施することもできる。【００７２】
上記同定方法は、シンチレーションプロキシミティアッセイ法（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ、ＳＰＡ）や蛍光共鳴エネルギー転移（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）を応用した方法を用いて、実施することもできる。【００７３】
本発明の一態様はまた、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生を阻害する化合物の同定方法に関する。本同定方法は、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫからなる群より選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合並びに被験化合物と該蛋白質および／またはＭＩＴＦ−Ｍとの相互作用を可能にする条件を選択し、該条件下で該蛋白質および／またはＭＩＴＦ−Ｍと被験化合物を接触させ、次いで、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生が阻害されるか否かを決定することを特徴とする。【００７４】
このような同定方法として具体的には、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質をコードする遺伝子、ＭＩＴＦ−Ｍをコードする遺伝子、およびＢＣＬ２遺伝子をそれぞれ含むプラスミドをトランスフェクションした細胞を用いる同定方法を挙げることができる。このような細胞に被験化合物を作用させた後に、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物を検出し、被験化合物を作用させなかったときと比較して該遺伝子産物が低減または消失した場合は、該被験化合物がＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生を阻害すると判定できる。あるいは、このような同定方法は、ＢＣＬ２遺伝子を含むプラスミドの代わりに、ＢＣＬ２遺伝子のプロモータ領域に接続したレポーター遺伝子を含むプラスミド用い、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の代わりに、レポーター遺伝子産物を検出することによっても同様に実施できる（実施例３参照）。【００７５】
本発明の一態様は、メラノーマ細胞の細胞死を誘導する化合物の同定方法である。本同定方法は、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫからなる群より選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合並びに被験化合物と該蛋白質および／またはＭＩＴＦ−Ｍとの相互作用を可能にする条件を選択し、該条件下で被験化合物と該蛋白質および／またはＭＩＴＦ−Ｍとを接触させることによりメラノーマ細胞の細胞死が誘導されるか否かを決定することを特徴とする。【００７６】
このような同定方法として、例えば、ＢＣＬ２遺伝子およびＭＩＴＦ−Ｍ遺伝子の発現の亢進が確認されたメラノーマ細胞を用いる同定方法を挙げることができる。このようなメラノーマ細胞に被験化合物を作用させた後に、細胞死または細胞死のシグナルを検出し、被験化合物を作用させなかったときと比較して、細胞死の誘導若しくは亢進または細胞死のシグナルが増強、促進または発生した場合には、該化合物はメラノーマ細胞の細胞死を誘導すると判定できる。【００７７】
細胞死のシグナルとは、アポトーシスを起こした細胞の形態学的または生化学的な特徴的変化を意味する。形態学的な特徴的変化として、細胞核の染色体凝集、ＤＮＡの断片化、細胞表面微絨毛の消失、細胞質の凝集およびアポトーシス小体の形成等が挙げられる。生化学的な特徴的変化として、ＤＮＡラダー、ホスファチジルセリンが細胞膜の外側に露出することによる細胞膜構造の変化、ミトコンドリア膜電位の消失およびシトクロームＣ（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ）のミトコンドリアから細胞質への移動等が挙げられる。これらはいずれも自体公知の方法により検出され得る。例えば、ＤＮＡの断片化は、自体公知のＩＳＥＬ法またはＴＵＮＥＬ法等により検出し得る。また、例えば、ＤＮＡラダーは、自体公知の方法により細胞から断片化したＤＮＡを抽出し、アガロース電気泳動等により検出し得る。さらに、例えば、細胞核の染色体凝集、細胞表面微絨毛の消失、細胞質の凝集およびアポトーシス小体の形成等は、電子顕微鏡による細胞形態の観察により検出し得る。細胞死の誘導若しくは亢進は、自体公知の方法に従い、培養したメラノーマ細胞の生存率の低下により検出し得る。このような同定方法において、メラノーマ細胞にＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質をコードする遺伝子を含むプラスミドをトランスフェクションした細胞を用いることもできる。【００７８】
また、本発明により、メラノーマ治療剤に対するメラノーマの感受性を増強させる化合物の同定方法を実施できる。本同定方法は、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合並びに被験化合物と該蛋白質および／またはＭＩＴＦ−Ｍとの相互作用を可能にする条件を選択し、該条件下で該蛋白質および／またはＭＩＴＦ−Ｍと被験化合物を接触させ、次いで、メラノーマ治療剤に対するメラノーマの感受性が増強されるか否かを決定することを特徴とする。【００７９】
このような同定方法として具体的には、例えばＢＣＬ２遺伝子およびＭＩＴＦ−Ｍ遺伝子の発現の亢進が確認されたメラノーマ細胞を用い、該メラノーマ細胞と被験化合物を接触させ、次いである公知のメラノーマ治療剤を作用させた後にメラノーマ細胞の細胞死を検出することにより、該メラノーマ治療剤に対するメラノーマの感受性を増強させる化合物を取得するといった同定方法が挙げられる。公知のメラノーマ治療剤として好ましくはダカルバジン（Ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ、ＤＴＩＣ）を使用できる。被験化合物を接触させなかったときと比較してメラノーマ細胞の細胞死が誘導された場合、該メラノーマ治療剤に対するメラノーマの感受性を該被験化合物が増強したと判定できる。このような同定方法において、メラノーマ細胞にＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質をコードする遺伝子を含むプラスミドをトランスフェクションした細胞を用いることもできる。【００８０】
ＨＬＦ、ＥＬＫ４、ＣＬＯＣＫおよびＭＩＴＦ−Ｍは、これらを遺伝子工学的手法で発現させた細胞や生体試料から調製したもの、無細胞系合成産物または化学合成産物であってよく、あるいはこれらからさらに精製されたものであってもよい。また、ＨＬＦ、ＥＬＫ４、ＣＬＯＣＫおよびＭＩＴＦ−Ｍのうち少なくとも１を遺伝子工学的手法で発現させた細胞を使用することもできる。これら蛋白質は、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合、およびその機能に影響がない限りにおいて、その一部を欠損していてもよい。また、この限りにおいて、そのＮ末側やＣ末側に標識物質が付加されていてもよい。標識物質として、別の蛋白質等、例えばＧＳＴ、β−ガラクトシダーゼ、ＩｇＧ等の免疫グロブリンＦｃ断片、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、またはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類、ビオチン、放射性同位体等が例示できる。これら標識物質は、直接的に、またはリンカーペプチド等を介して間接的に、遺伝子工学的手法等を用いて付加できる。【００８１】
ＢＣＬ２は、ＢＣＬ２遺伝子を遺伝子工学的手法で発現させた細胞や生体試料から調製したもの、無細胞系合成産物または化学合成産物であってよく、あるいはこれらからさらに精製されたものであってもよい。また、ＢＣＬ２遺伝子を遺伝子工学的手法で発現させた細胞を使用することもできる。ＢＣＬ２は、その機能、例えばＭＩＴＦ−Ｍとの相互作用や抗アポトーシス活性等に影響がない限りにおいて、その一部を欠損していてもよい。また、この限りにおいて、そのＮ末側やＣ末側に標識物質が付加されていてもよい。標識物質として、別の蛋白質等、例えばＧＳＴ、β−ガラクトシダーゼ、ＩｇＧ等の免疫グロブリンＦｃ断片、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、またはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類、ビオチン、放射性同位体等が例示できる。これら標識物質は、直接的に、またはリンカーペプチド等を介して間接的に、遺伝子工学的手法等を用いて付加できる。【００８２】
具体的には、本発明において用いる蛋白質の製造は、該蛋白質の発現が確認されている動物由来の組織や細胞から、公知の蛋白質精製方法に従って精製することにより実施できる。このような方法においては、まず、動物由来の組織や細胞をホモジナイズした後に、酸や有機溶媒等で蛋白質の抽出を行なう。次いで、得られた抽出液から、公知の精製法を利用して所望の蛋白質を単離精製する。単離精製方法として、例えば硫酸アンモニウム沈殿、限外ろ過、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、透析法等を単独でまたは適宜組合わせて使用できる。好ましくは、該蛋白質またはその断片を用いて該蛋白質に対する特異的抗体を公知の抗体作製法により作製し、該抗体を用いて特異的に吸着する方法が推奨される。具体的には、該抗体を結合させたカラムを利用するアフィニティクロマトグラフィーを用いることが好ましい。あるいは、該蛋白質は、ペプチド化学において知られる一般的な化学合成方法により製造できる。または市販のアミノ酸合成装置を用いて製造できる。蛋白質の化学合成方法として、成書（非特許文献２１および２２）に記載の方法が例示されるが、これらに限らず公知の方法が広く利用できる。具体的には、固相合成方法、液相合成方法等が知られており、いずれも利用できる。かかる蛋白質合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていくいわゆるステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメントコンデンセーション法とを包含する。該蛋白質の合成は、そのいずれによっても実施できる。上記蛋白質合成法において利用される縮合法も常法に従うことができる。縮合法として、例えば、アジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等）法、ウッドワード法等が例示できる。化学合成により得られる蛋白質はさらに、上記のような慣用の各種精製方法により適宜精製を行うことができる。あるいは、該蛋白質は、該蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列情報に基づいて一般的遺伝子工学的手法（非特許文献２０、２３および２４等を参照）により取得できる。例えば、所望の蛋白質をコードする遺伝子を含有しかつ該蛋白質を宿主細胞中で発現できる組換えベクターを作成し、該組換えベクターをトランスフェクションした形質転換体を用いて該遺伝子の発現誘導を行い、その後該形質転換体から該蛋白質を回収することにより、該蛋白質を取得できる。該遺伝子を含有する組換えベクターをトランスフェクションした形質転換体において、該遺伝子によりコードされる蛋白質が形質転換体の細胞内あるいは細胞膜上に発現する場合には、形質転換体を破砕して該蛋白質を抽出する。該蛋白質が形質転換体外に分泌される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離処理等により形質転換体を除去した培養液を用いる。さらに、所望により、形質転換体を培養した培養液または形質転換体から、上記精製方法により該蛋白質を精製することができる。また、該蛋白質をコードする遺伝子を導入した組換えベクターを用いて、公知の無細胞蛋白質発現系を用いて、該蛋白質を得ることもできる（非特許文献２５）。【００８３】
本発明において用いる蛋白質をコードする遺伝子は、その発現が確認されている適当な起源から、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ｃＤＮＡライブラリーから所望のクローンを選択することにより取得できる。ｃＤＮＡの起源として、該蛋白質の発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞を例示できる。好ましくは、メラノーマ、肝臓、脳またはこれらに由来する培養細胞等が例示できる。例えば、ＭＩＴＦ−Ｍ  ｃＤＮＡの起源としてメラノーマまたはメラノーマ細胞を、ＢＣＬ２  ｃＤＮＡの起源としてメラノーマまたはメラノーマ細胞を、ＨＬＦ  ｃＤＮＡの起源として肝臓若しくはメラノーマまたはこれらに由来する細胞を、ＥＬＫ４  ｃＤＮＡの起源としてメラノーマまたはメラノーマ細胞を、ＣＬＯＣＫ  ｃＤＮＡの起源として脳または脳由来の細胞を、それぞれ最も好ましく例示できる。また、ヒトの脳、胎児脳および脳海馬由来の市販されているｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを構築してＣＬＯＣＫ  ｃＤＮＡを取得することもできる。これら起源からｃＤＮＡライブラリーを調製するための全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等はいずれも常法に従って実施できる。ｃＤＮＡライブラリーから所望のクローンを選択する方法も特に制限されず、慣用の方法を利用できる。例えば、該蛋白質をコードする遺伝子に選択的にハイブリダイゼーションするプローブやプライマー等を用いて所望のクローンの選択を実施できる。具体的には、該遺伝子に選択的にハイブリダイゼーションするプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法等やこれらを組合わせた方法等を例示できる。ここで用いるプローブやプライマーとして、該遺伝子の配列情報に基づいて化学合成したポリヌクレオチド等が一般的に使用できる。該蛋白質をコードする遺伝子を含有する組換えベクターは、上記方法により取得した該遺伝子を適当なベクターＤＮＡに挿入することにより構築できる。ベクターＤＮＡは宿主中または宿主ゲノムにインテグレートされた後で複製でき、かつ該遺伝子を発現し得るベクターＤＮＡであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターＤＮＡは、天然に存在するＤＮＡを抽出して得られたベクターＤＮＡの他、複製に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているベクターＤＮＡでもよい。代表的なベクターＤＮＡとして例えば、プラスミド、バクテリオファージおよびウイルス由来のベクターＤＮＡが挙げられる。プラスミドＤＮＡとして、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド等を例示できる。バクテリオファージＤＮＡとして、λファージ等が挙げられる。ウイルス由来のベクターＤＮＡとして例えばレトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルス等の動物ウイルス由来のベクター、あるいはバキュロウイルス等の昆虫ウイルス由来のベクターが挙げられる。その他、トランスポゾン由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来のベクターＤＮＡ等を例示できる。あるいは、これらを組合���せて作成したベクターＤＮＡ、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメントを組合わせて作成したベクターＤＮＡ（コスミドやファージミド等）を例示できる。ベクターＤＮＡには、該遺伝子の機能が発揮されるように遺伝子を組込むことが必要であり、少なくとも該遺伝子とプロモーターとをその構成要素とする。これら要素に加えて、所望によりさらに、複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列を組合わせて自体公知の方法によりベクターＤＮＡに組込むことができる。かかる遺伝子配列として、例えば、リボソーム結合配列、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、および選択マーカー（ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等）等を例示できる。これらから選択した１種類または複数種類の遺伝子配列をベクターＤＮＡに組込むことができる。ベクターＤＮＡに該遺伝子を組込む方法は、自体公知の方法を適用できる。例えば、該遺伝子を適当な制限酵素により処理して特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターＤＮＡと混合し、リガーゼにより再結合する方法が用いられる。あるいは、該遺伝子に適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組換えベクターが得られる。該遺伝子を組込んだベクターＤＮＡにより、宿主を形質転換して得られる形質転換体は、該遺伝子がコードする蛋白質の製造に有用である。宿主として、原核生物および真核生物のいずれも用いることができる。原核生物として、例えば大腸菌〔エシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）〕等のエシェリヒア属、枯草菌等のバシラス属、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウムメリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられる。真核生物として、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞等の動物細胞を例示できる。酵母は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等が挙げられる。昆虫細胞は、Ｓｆ９細胞やＳｆ２１細胞等を例示できる。哺乳動物細胞は、サル腎由来細胞（ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞等）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒトＦＬ細胞や２９３ＥＢＮＡ細胞等が例示できる。好ましくは哺乳動物細胞を用いる。ベクターＤＮＡの宿主細胞へのトランスフェクションは、自体公知の手段が応用され、例えば成書に記載されている標準的な方法（非特許文献２３）により実施できる。より好ましい方法として、遺伝子の安定性を考慮するならば染色体内へのインテグレート法が挙げられるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系を使用できる。具体的には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、スクレープ負荷（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄ���ｎｇ）、バリスティック導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）および感染等が挙げられる。【００８４】
被験化合物として、例えば化学ライブラリーや天然物由来の化合物、またはＨＬＦ、ＥＬＫ４、ＣＬＯＣＫまたはＭＩＴＦ−Ｍの一次構造や立体構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等が挙げられる。あるいは、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合部位のアミノ酸配列で表わされる蛋白質の構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等も被験化合物として好適である。【００８５】
上記同定方法で得られた化合物は、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合を阻害することを特徴とする。すなわち、上記同定方法で得られた化合物は、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合阻害剤として使用できる。このような結合阻害剤は、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生阻害剤、メラノーマ細胞の細胞死誘導剤、およびメラノーマ治療剤に対するメラノーマの感受性増強剤として利用できる。また、このような結合阻害剤は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することにより、医薬組成物として調製できる。医薬組成物の調製において、これら結合阻害剤は、単独で使用することもできるし、複数を組み合わせて使用することもできる。また、このような結合阻害剤を用いて、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生阻害方法、メラノーマ細胞の細胞死誘導方法、およびメラノーマ治療剤に対するメラノーマの感受性を増強させる方法を実施できる。【００８６】
本発明に係る疾患の治療剤および／または防止剤は、上記化合物、上記阻害剤、上記細胞死誘導剤および上記メラノーマ治療剤に対するメラノーマの感受性増強剤のうち少なくともいずれか１つを含有してなる疾患の治療剤および／または防止剤であり得る。本発明に係る疾患の治療方法および／または防止方法は、上記化合物、上記阻害剤、上記細胞死誘導剤および上記メラノーマ治療剤に対するメラノーマの感受性増強剤のうち少なくともいずれか１つを用いることを特徴とする疾患の治療方法および／または防止方法であり得る。【００８７】
本発明に係る疾患の治療剤および／または防止剤は、上記化合物、上記阻害剤、上記細胞死誘導剤および上記メラノーマ治療剤に対するメラノーマの感受性増強剤のうち少なくともいずれか１つを有効成分としてその有効量を含む医薬として製造できる。通常は、該有効成分に加えて１種または２種以上の医薬用担体を含む医薬組成物として製造することが好ましい。【００８８】
本発明に係る医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択される。通常、約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲とするのが適当である。【００８９】
医薬用担体は、製剤の使用形態に応じて一般的に使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤および賦形剤等を例示できる。これらは製剤の投与形態に応じて適宜選択して使用される。【００９０】
より具体的には、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等が挙げられる。これらは、本発明に係る剤形に応じて適宜１種類または２種類以上を組合わせて使用される。【００９１】
所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、界面活性剤、およびｐＨ調整剤等を適宜使用することもできる。【００９２】
安定化剤は、例えばヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体等を例示できる。これらは単独でまたは界面活性剤等と組合わせて使用できる。特にこの組合わせによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。Ｌ−アミノ酸は、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸等のいずれでもよい。糖類も特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等およびそれらの誘導体等のいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のいずれでもよい。【００９３】
界面活性剤も特に限定はなく、イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。界面活性剤には、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が包含される。【００９４】
緩衝剤は、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）等を例示できる。【００９５】
等張化剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン等を例示できる。【００９６】
キレート剤は、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸等を例示できる。【００９７】
本発明に係る医薬および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生理的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することもできる。【００９８】
本発明に係る医薬および医薬組成物は、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生亢進を伴う疾患の治療剤および／または防止剤として用いることができる。また、このような疾患の治療方法および／または防止方法に使用することができる。より好ましくは、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫから選ばれる蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの結合によるＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生亢進を伴う疾患に用いることが適当である。このような疾患として、具体的にはメラノーマが例示できる。【００９９】
前記のように、ＢＣＬ２は、様々な癌でその高発現が認められている。したがって、ＢＣＬ２の発現および／またはその活性阻害を薬理機序とする抗癌剤は、メラノーマのみならず様々な癌の改善を図ることができる可能性がある。一方、ＢＣＬ２は、様々な健常組織においてもその発現が認められている。したがって、メラノーマの改善または治療を目的としたこのような抗癌剤の服用は、メラノサイト以外の健常組織に副作用をもたらす可能性がある。しかし、本発明に係るメラノーマ治療剤および／または防止剤は、ＭＩＴＦ−ＭとＨＬＦ、ＥＬＫおよびＣＬＯＣＫからなる群より選ばれる蛋白質との結合を阻害することにより、ＭＩＴＦ−ＭのＢＣＬ２遺伝子の転写活性化を阻害する新たな薬理機序を有する薬剤である。また、ＭＩＴＦ−Ｍは、メラノーマおよびメラノサイトで特異的に発現している。したがって、本発明に係るメラノーマ治療剤および／または防止剤は、既知のメラノーマ治療剤と比較し、副作用が低減された薬剤である。【０１００】
医薬および医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ乃至１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。上記投与量は１日１〜数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。【０１０１】
本発明に係る医薬または医薬組成物を投与するときには、該医薬または該医薬組成物を単独で使用してもよく、あるいは目的の疾患の防止および／または治療に必要な他の化合物または医薬と併用してもよい。好ましくは、併用する。例えば、本医薬または医薬組成物をメラノーマの治療方法および／または防止方法に用いるときに、該医薬または該医薬組成物とはそれぞれ異なる別のメラノーマ治療剤および／または防止剤を併用することができる。本医薬または医薬組成物は、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生を阻害することにより、例えばメラノーマのアポトーシスを促進し、ひいては該医薬または該医薬組成物とはそれぞれ異なる別のメラノーマ治療剤に対するメラノーマの感受性を増強させることができる。すなわち本医薬または医薬組成物は、該医薬または該医薬組成物とはそれぞれ異なる別のメラノーマ治療剤の補助剤として用いることができる。本医薬または医薬組成物と併用するメラノーマ治療剤は特に制限されず公知の薬剤がいずれも使用できる。例えば前記公知のメラノーマ治療剤が挙げられる。好ましくは、本医薬または医薬組成物によりＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生を阻害したときに、本医薬または医薬組成物を使用しないときと比較して、メラノーマが高い感受性を示すメラノーマ治療剤を用いる。このようなメラノーマ治療剤の選択は、上記同定方法のうち、メラノーマ治療剤に対するメラノーマの感受性を増強させる化合物の同定方法を利用して実施できる。ＢＣＬ２遺伝子産物の発現阻害によりダカルバジン（Ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ、ＤＴＩＣ）に対するメラノーマの感受性が増強されたことが報告されていることから（非特許文献４）、ダカルバジンと併用することが好ましい。上記のような併用により、メラノーマの治療において多大な効果が得られる。【０１０２】
投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択できる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内等への投与が挙げられる。あるいは経口による投与も実施できる。さらに、経粘膜投与または経皮投与も実施できる。癌疾患に用いる場合は、腫瘍に注射等により直接投与することが好ましい。【０１０３】
投与形態は、各種の形態が目的に応じて選択できる。その代表的なものは、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リポソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらはさらに投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。【０１０４】
さらに本発明の一態様は、試薬キットに関する。本試薬キットは、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫからなる群より選ばれる蛋白質、該蛋白質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび該組換えベクターを含有する形質転換体のうち少なくともいずれか１つと、ＭＩＴＦ−Ｍ、ＭＩＴＦ−Ｍをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび該組換えベクターを含有する形質転換体のうち少なくともいずれか１つとを含有してなる。本試薬キットは、例えば本発明に係る同定方法に使用できる。蛋白質は、上記蛋白質の製造方法により、またポリヌクレオチド、組換えベクターおよび形質転換体は、上記遺伝子工学的手法により調製できる。本試薬キットは、上記同定方法において用いるシグナルおよび／またはマーカー、緩衝液、並びに塩等、必要とされる物質を含むことができる。さらに、安定化剤および／または防腐剤等の物質を含んでいてもよい。製剤化にあたっては、使用する各物質それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。【０１０５】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。
【実施例１】
【０１０６】
（ＭＩＴＦ−Ｍと相互作用する機能を有する蛋白質のインシリコでの探索）
ＭＩＴＦ−Ｍと相互作用する機能を有する蛋白質の予測を、特許文献１に記載のインシリコでの予測方法に従って次のように予測した：ｉ）ＭＩＴＦ−Ｍのアミノ酸配列をある長さのオリゴペプチドに分解し、ｉｉ）各オリゴペプチドのアミノ酸配列あるいはそのアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を持った蛋白質をデータベース中で検索し、ｉｉｉ）得られた蛋白質とＭＩＴＦ−Ｍとの間でローカルアライメントを行い、ｉｖ）ローカルアライメントのスコアの高いものをＭＩＴＦ−Ｍと相互作用する蛋白質であると予測する。【０１０７】
解析の結果、ＭＩＴＦ−Ｍと相互作用する機能を有すると予測される蛋白質として、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫを見出した。ＭＩＴＦ−Ｍ由来のアミノ酸残基からなるオリゴペプチド〔ＬＥＮＰＴＫＹ（配列番号２１）〕と相同性のあるオリゴペプチド〔ＬＥＮＰＬＫＬ（配列番号２２）〕がＨＬＦのアミノ酸配列中に存在する（図１−Ａ）。ＭＩＴＦ−Ｍ由来のアミノ酸残基からなるオリゴペプチド〔ＰＧＡＳＫＴＳＳＲ（配列番号２３）〕と相同性のあるオリゴペプチド〔ＰＧＡＫＴＳＳＲ（配列番号２４）〕がＥＬＫ４のアミノ酸配列中に存在する（図１−Ｂ）。ＭＩＴＦ由来のアミノ酸残基からなるオリゴペプチド〔ＩＫＥＬＧＴ（配列番号２５）およびＳＳＲＲＳＳ（配列番号２６）〕と相同性のあるオリゴペプチド〔ＩＫＥＬＧＳ（配列番号２７）およびＳＳＲＫＳＳ（配列番号２８）〕がＣＬＯＣＫのアミノ酸配列中に存在する（図１−Ｃ）。
【実施例２】
【０１０８】
（ＭＩＴＦ−ＭとＨＬＦ、ＥＬＫ４またはＣＬＯＣＫとの結合解析）
ＭＩＴＦ−ＭがＨＬＦ、ＥＬＫ４またはＣＬＯＣＫと結合するか否かを、下記方法により検討した。【０１０９】
本実施例においてはＭＩＴＦ−Ｍとして、ＧＳＴ融合蛋白質として作製したＧＳＴ−ＭＩＴＦ−Ｍを用いた。【０１１０】
ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫはそれぞれ、Ｔｒａｎｓｃｅｎｄ  Ｂｉｏｔｉｎ−Ｌｙｓｙｌ−ｔＲＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用い、ＴＮＴ  ｑｕｉｃｋ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてインビトロ合成した。まず、各蛋白質をコードする遺伝子を含むプラスミドを作製した。プラスミドはＴ７プロモーターをもつ発現プラスミドを使用した。【０１１１】
ＭＩＴＦ−Ｍ遺伝子は、Ｈｕｍａｎ  ＸＧ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ（Ａ３７５）ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）をテンプレートに用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅して取得した。ＰＣＲに用いるフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして、それぞれ配列番号９および１０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを使用した。増幅産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）へクローニングした。取得したクローンの塩基配列はＧｅｎＢａｎｋの公開配列（アクセッション番号：ＮＭ＿０００２４８）と完全に一致した。【０１１２】
ＥＬＫ４遺伝子は、Ｈｕｍａｎ  ＸＧ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ  Ａ３７５  ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）をテンプレートに用いて、ＰＣＲにより増幅して取得した。ＰＣＲに用いるフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして、それぞれ配列番号１１および１２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを使用した。増幅産物をｐＣＲ  ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）へクローニングした。取得したクローンの塩基配列はＧｅｎＢａｎｋの公開配列（アクセッション番号：ＮＭ＿０２１７９５．２）と完全に一致した。【０１１３】
ＨＬＦ遺伝子は、Ｈｕｍａｎ  Ｌｉｖｅｒ  ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）をテンプレートに用いて、ＰＣＲにより増幅して取得した。ＰＣＲに用いるフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして、それぞれ配列番号１３および１４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを使用した。増幅産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）へクローニングした。取得したクローンの塩基配列はＧｅｎＢａｎｋの公開配列（アクセッション番号：ＮＭ＿００２１２６．３）と完全に一致した。【０１１４】
ＣＬＯＣＫ遺伝子は、かずさディー・エヌ・エー研究所から購入し、取得した。なお、本遺伝子は、本研究所のヒト長鎖ｃＤＮＡ解析情報データベース（ＨＵＧＥ）で公開されている（ＫＩＡＡ番号：ＫＩＡＡ０３３４）。また、取得した本遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋに登録され、公開されている（アクセッション番号：ＡＢ００２３３２）。【０１１５】
ＭＩＴＦ  ｃＤＮＡをｐＧＥＸ−４Ｔ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に組込み、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にトランスフェクションした。陰性コントロールとしてｐＧＥＸ−４Ｔ−１ベクターを同様にトランスフェクションした。トランスフェクションしたＢＬ２１株を３７℃で培養後、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  １−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を添加して２６℃で３時間培養し、蛋白質の発現誘導を行った。菌体を破壊後、グルタチオンセファロース４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてＧＳＴ−ＭＩＴＦ−ＭおよびＧＳＴを精製した。【０１１６】
ＨＬＦ遺伝子はｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＥＬＫ４遺伝子はｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５・Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、およびＣＬＯＣＫ遺伝子はｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ・Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にそれぞれ組み込んだ。得られた各プラスミドについて、表１に示す組成のＴＮＴ反応液を調製した。【０１１７】
【表１】
2006013889.tif 000002
【０１１８】
ＧＳＴ−ＭＩＴＦ−Ｍ、各ＴＮＴ反応液およびバインディングバッファー〔４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸、１ｍＭ  ＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）および０．５％  ノニデットＰ−４０〕を表２に示すように混合し、氷上で１時間静置した。【０１１９】
【表２】
2006013889.tif 000003
【０１２０】
陰性コントロールとして精製ＧＳＴを使用し、各ＴＮＴ反応液およびバインディングバッファーを表３に示すように混合し、氷上で１時間静置した。【０１２１】
【表３】
2006013889.tif 000004
【０１２２】
静置後の混合液５００μｌにグルタチオンセファロース４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）２０μｌを添加し、４℃で一晩回転しながら撹拌した。グルタチオンセファロース４Ｂは予め、バインディングバッファーで０．１％とした牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いてブロッキングした後、バインディングバッファーで平衡化して用いた。【０１２３】
レジンを遠心処理（１０ｋｒｐｍで４℃にて１分間）により回収し、バインディングバッファー０．５ｍｌで４回洗浄した。次いで、２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（１０％  β−メルカプトエタノールを含む）を２０μｌ加え、３分間煮沸した。その後、遠心処理によりレジンを沈殿させ、その上清を５−２０％ポリアクリルアミドゲルで展開して該上清中に含まれる蛋白質を分離した。ポリアクリルアミドゲルからＰＶＤＦ膜へ蛋白質を転写後、ホースラディッシュパーオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ）とＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、共沈蛋白質の検出を行なった。一方、ポリアクリルアミドゲルで展開されるＨＬＦ、ＥＬＫ４またはＣＬＯＣＫの位置を明らかにすること、およびこれら３種の蛋白質の発現量が結合試験を行なうのに充分な量であることを確認するために、各ＴＮＴ反応液をポリアクリルアミドゲルで展開し上記同様に各発現蛋白質の検出を行なった。【０１２４】
結果を図２に示す。ＧＳＴ−ＭＩＴＦ−Ｍと結合する蛋白質として、ＨＬＦ、ＥＬＫ４またはＣＬＯＣＫの各蛋白質の分子量に相当する位置にバンドが検出された。一方、ＧＳＴと反応させたときには、かかるバンドは検出されなかった。このことから、ＭＩＴＦ−ＭがＨＬＦ、ＥＬＫ４またはＣＬＯＣＫと結合することが明らかになった。
【実施例３】
【０１２５】
（ＭＩＴＦ−ＭとＨＬＦ、ＥＬＫ４またはＣＬＯＣＫの結合がＭＩＴＦ−Ｍの転写活性化能に及ぼす影響の解析）
ＭＩＴＦ−ＭとＨＬＦ、ＥＬＫ４またはＣＬＯＣＫの結合がＭＩＴＦ−Ｍの転写活性化能に及ぼす影響を、ＢＣＬ２遺伝子のプロモーターを用いたレポーターアッセイにより検討した。【０１２６】
＜レポーターアッセイ系の構築＞
レポーターアッセイ系の構築に用いたＭＩＴＦ−Ｍ遺伝子発現プラスミドは、ｐＣＩ哺乳動物発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にＭＩＴＦ−Ｍ遺伝子を常法に従って組込むことにより作製した。レポーター遺伝子発現プラスミドは、ホタルルシフェラーゼレポーターベクターであるｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にＢＣＬ２遺伝子のプロモーター領域を常法に従って組込むことにより作製した。また、内部コントロールとして、レニーラルシフェラーゼレポーターベクターであるｐｈＲＬ−ｎｕｌｌベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いた。【０１２７】
作製した３種類のプラスミドを様々な割合で混合し、ＤＮＡの総量をベクター（ｐＣＩ）を用いて３．６μｇ／ｗｅｌｌの用量に調整した。このプラスミド混合液をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。ＨＥＫ２９３細胞は、６ウェルプレートに細胞数４×１０５／ｗｅｌｌ播種し、３７℃で５時間培養した後に用いた。トランスフェクションは、上記プラスミド混合液をトランスフェクション溶液〔ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ社製）１０μｌと無血清Ｄ−ＭＥＭ９０μｌからなる〕に添加して室温で２０分間放置した後に上記細胞に滴下し、３７℃で４２〜４８時間培養することにより実施した。培養終了後、細胞を回収し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてルシフェラーゼ活性の測定を行なった。ルシフェラーゼ活性は、ホタルルシフェラーゼ活性（Ｆ）をレニーラルシフェラーゼ活性（Ｒ）で徐した値として算出した。【０１２８】
その結果、ＢＣＬ２遺伝子プロモーターの転写活性はＭＩＴＦ−Ｍ遺伝子発現プラスミドの用量依存的に上昇し、ルシフェラーゼ活性は該プラスミドを２．５μｇ／ｗｅｌｌの用量で細胞にトランスフェクションしたときに該プラスミドをトランスフェクションしないときと比較して約２．５倍に増加した。また、ルシフェラーゼ活性はレポーター遺伝子発現プラスミドの用量依存的に上昇したが、レポーター遺伝子発現プラスミドの用量はＭＩＴＦ−Ｍ遺伝子発現プラスミドの転写活性化能には影響しなかった。【０１２９】
これら結果から、レポーターアッセイ系の構築に用いるＭＩＴＦ−Ｍ遺伝子発現プラスミド、レポーター遺伝子発現プラスミドおよび内部コントロール用ベクターの用量はそれぞれ、２．５μｇ／ｗｅｌｌ、０．５μｇ／ｗｅｌｌおよび１ｎｇ／ｗｅｌｌに決定した。【０１３０】
＜レポーターアッセイによる検討＞
ＨＬＦ、ＥＬＫ４、ＣＬＯＣＫの各蛋白質をコードする遺伝子を含むプラスミドを作製した。ＨＬＦ遺伝子はＨＬＦ蛋白質のカルボキシ末端にＦＬＡＧ配列が付加されるようにして、ｐＣＩ哺乳類細胞発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に組込んだ。ＥＬＫ４遺伝子はＥＬＫ４蛋白質のカルボキシ末端にＦＬＡＧ配列が付加されるようにして、ｐＣＩ哺乳類細胞発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に組込んだ。ＣＬＯＣＫ遺伝子発現プラスミドはＣＬＯＣＫ遺伝子をｐＣＩ哺乳類細胞発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に組込むことにより作製した。【０１３１】
ＨＥＫ２９３細胞を、細胞数４×１０５／ｗｅｌｌの用量で６ウェルプレートに播種し、３７℃で５時間培養した。次いで、ＨＬＦ、ＥＬＫ４またはＣＬＯＣＫの各遺伝子発現プラスミド、ＭＩＴＦ−Ｍ遺伝子発現プラスミド、レポーター遺伝子発現プラスミドおよび内部コントロール用ベクターをそれぞれ、２．５μｇ／ｗｅｌｌ、２．５μｇ／ｗｅｌｌ、０．５μｇ／ｗｅｌｌおよび１ｎｇ／ｗｅｌｌの用量になるように混合し、細胞にトランスフェクションした。また、ＨＬＦ、ＥＬＫ４またはＣＬＯＣＫの遺伝子発現プラスミドを含むがＭＩＴＦ−Ｍ遺伝子発現プラスミドを含まないプラスミド混合液を同様に調製し、該プラスミド混合液でトランスフェクションした細胞をコントロールとして用いた。さらに、ＨＬＦ、ＥＬＫ４またはＣＬＯＣＫの各遺伝子発現プラスミドを含まないプラスミド混合液、ＭＩＴＦ−Ｍ、ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫの各遺伝子発現プラスミドをいずれも含まないプラスミド混合液を同様に調製し、該各プラスミド混合液でそれぞれトランスフェクションした細胞をコントロールとして用いた。ＤＮＡの総量は、いずれもベクターｐＣＩを用いて５．５μｇ／ｗｅｌｌの用量に調整した。【０１３２】
細胞へのプラスミドのトランスフェクションは、上記プラスミド混合液をトランスフェクション溶液〔ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ社製）１６．５μｌと無血清Ｄ−ＭＥＭ  ８３．５μｌからなる〕に添加して室温で２０分間放置した後に細胞に滴下し、３７℃で４２〜４８時間培養することにより実施した。培養終了後、細胞を回収し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてルシフェラーゼ活性の測定を行なった。ルシフェラーゼ活性は、ホタルルシフェラーゼ活性（Ｆ）をレニーラルシフェラーゼ活性（Ｒ）で徐した値として算出した。【０１３３】
結果を図３−Ａ、図３−Ｂおよび図３−Ｃに示す。ＭＩＴＦ−Ｍ遺伝子発現プラスミドとＥＬＫ４遺伝子発現プラスミドを共にトランスフェクションした細胞では、ＭＩＴＦ−Ｍ遺伝子発現プラスミドのみをトランスフェクションした細胞と比較して、ルシフェラーゼ活性が約１．４倍に増加した（図３−Ａの黒カラム）。また、ＭＩＴＦ−Ｍ遺伝子発現プラスミドとＨＬＦ遺伝子発現プラスミドを共にトランスフェクションした細胞では、ＭＩＴＦ−Ｍ遺伝子発現プラスミドのみをトランスフェクションした細胞と比較して、ルシフェラーゼ活性が約１．８倍に増加した（図３−Ｂの黒カラム）。ＭＩＴＦ−Ｍ遺伝子発現プラスミドとＣＬＯＣＫ遺伝子発現プラスミドを共にトランスフェクションした細胞では、ＭＩＴＦ−Ｍ遺伝子発現プラスミドのみをトランスフェクションした細胞と比較して、ルシフェラーゼ活性が約１．５倍に増加した（図３−Ｃの黒カラム）。これらの増加は統計学的に有意差を示した（ｎ＝３、ｔ検定でｐ＜０．０５またはｐ＜０．０１）。一方、ＭＩＴＦ−Ｍ遺伝子発現プラスミドをトランスフェクションしなかった細胞では、ＥＬＫ４、ＨＬＦまたはＣＬＯＣＫの各遺伝子のトランスフェクションはルシフェラーゼ活性に影響しなかった（図３−Ａ、図３−Ｂおよび図３−Ｃの各白カラム）。【０１３４】
このように、ＢＣＬ２遺伝子プロモーターを用いたレポーターアッセイにおいて、ＨＬＦ、ＥＬＫ４またはＣＬＯＣＫとＭＩＴＦ−Ｍとを発現させることにより、ＭＩＴＦ−Ｍのみを発現させたときと比較して、ＢＣＬ２遺伝子プロモーターの転写活性が増大することが判明した。ＨＬＦ、ＥＬＫ４およびＣＬＯＣＫがいずれもＭＩＴＦ−Ｍと結合することは実施例２の結果から明らかである。一方、ＨＬＦ、ＥＬＫ４またはＣＬＯＣＫのみを発現させても、ＢＣＬ２遺伝子プロモーターの転写活性の増大は観察されなかった。【０１３５】
これら結果から、ＨＬＦ、ＥＬＫ４またはＣＬＯＣＫとＭＩＴＦ−Ｍとの結合により、ＢＣＬ２遺伝子プロモーターの転写活性が増大すると考えられる。すなわち、ＨＬＦ、ＥＬＫ４またはＣＬＯＣＫとＭＩＴＦ−Ｍとの結合により、ＭＩＴＦ−Ｍが転写因子として作用するＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の産生が促進されることが判明した。
【実施例４】
【０１３６】
メラノーマ細胞における内在性のＣＬＯＣＫ、ＥＬＫ４、ＨＬＦの発現確認を行った。具体的には、Ｈｕｍａｎ  ＸＧ  ｍａｌｉｇｎａｍｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ  Ａ３７５およびＧＩ−１０５  Ｑｕｉｃｋ−ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）をテンプレートとし、以下のプライマーおよびポリメラーゼとしてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液の組成およびＰＣＲ反応条件をそれぞれ表４および表５に示す。その後、１％アガロースゲル電気泳動を行って、ｍＲＮＡの発現の有無を調べた。また、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡの塩基配列の解析を行い、遺伝子配列の確認を行った。【０１３７】
＜プライマー＞
ＣＬＯＣＫ遺伝子増幅用フォワードプライマー：配列番号１５
ＣＬＯＣＫ遺伝子増幅用リバースプライマー：配列番号１６
ＥＬＫ４遺伝子増幅用フォワードプライマー：配列番号１７
ＥＬＫ４遺伝子増幅用リバースプライマー：配列番号１８
ＨＬＦ遺伝子増幅用フォワードプライマー：配列番号１９
ＨＬＦ遺伝子増幅用リバースプライマー：配列番号２０【０１３８】
【表４】
2006013889.tif 000005
【０１３９】
【表５】
2006013889.tif 000006
【０１４０】
＜結果＞
メラノーマ細胞Ａ３７５およびＧＩ−１０５由来のｃＤＮＡにおいて、ＨＬＦ遺伝子、ＥＬＫ４遺伝子およびＣＬＯＣＫ遺伝子が検出された（図４）。また、ＰＣＲにより増幅されたＨＬＦ遺伝子、ＥＬＫ４遺伝子およびＣＬＯＣＫ遺伝子塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋの公開配列（それぞれアクセッション番号：ＮＭ＿００２１２６．３、ＮＭ＿０２１７９５．２およびＡＢ００２３３２）と完全に一致した。これら結果から、メラノーマ細胞において、ＨＬＦ遺伝子、ＥＬＫ４遺伝子およびＣＬＯＣＫ遺伝子が発現していることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
本発明は、ＢＣＬ２遺伝子の遺伝子産物の増加を伴う疾患、例えばメラノーマ等の解明並びに治療および／または防止のために利用できるため、医薬分野において非常に有用性が高い。
【配列表フリーテキスト】
【０１４２】
配列番号１：ＭＩＴＦ−Ｍ（配列番号２）をコードする遺伝子。
配列番号３：ＨＬＦ（配列番号４）をコードする遺伝子。
配列番号５：ＥＬＫ４（配列番号６）をコードする遺伝子。
配列番号７：ＣＬＯＣＫ（配列番号８）をコードする遺伝子。
配列番号９：ＭＩＴＦ−Ｍ遺伝子を増幅するために用いるプライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１０：ＭＩＴＦ−Ｍ遺伝子を増幅するために用いるプライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１１：ＥＬＫ４遺伝子を増幅するために用いるプライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１２：ＥＬＫ４遺伝子を増幅するために用いるプライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１３：ＨＬＦ遺伝子を増幅するために用いるプライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１４：ＨＬＦ遺伝子を増幅するために用いるプライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１５：ＣＬＯＣＫ遺伝子を増幅するために用いるプライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１６：ＣＬＯＣＫ遺伝子を増幅するために用いるプライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１７：ＥＬＫ４遺伝子を増幅するために用いるプライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１８：ＥＬＫ４遺伝子を増幅するために用いるプライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１９：ＨＬＦ遺伝子を増幅するために用いるプライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号２０：ＨＬＦ遺伝子を増幅するために用いるプライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号２１：ＨＬＦの部分配列（配列番号２２）と高い相同性を有する、ＭＩＴＦ−Ｍ（配列番号２）の部分配列。
配列番号２２：ＭＩＴＦ−Ｍの部分配列（配列番号２１）と高い相同性を有する、ＨＬＦ（配列番号４）の部分配列。
配列番号２３：ＥＬＫ４の部分配列（配列番号２４）と高い相同性を有する、ＭＩＴＦ−Ｍ（配列番号２）の部分配列。
配列番号２４：ＭＩＴＦ−Ｍの部分配列（配列番号２３）と高い相同性を有する、ＥＬＫ４（配列番号６）の部分配列。
配列番号２５：ＣＬＯＣＫの部分配列（配列番号２７）と高い相同性を有する、ＭＩＴＦ−Ｍ（配列番号２）の部分配列。
配列番号２６：ＣＬＯＣＫの部分配列（配列番号２８）と高い相同性を有する、ＭＩＴＦ−Ｍ（配列番号２）の部分配列。
配列番号２７：ＭＩＴＦ−Ｍの部分配列（配列番号２５）と高い相同性を有する、ＣＬＯＣＫ（配列番号８）の部分配列。
配列番号２８：ＭＩＴＦ−Ｍの部分配列（配列番号２６）と高い相同性を有する、ＣＬＯＣＫ（配列番号８）の部分配列。
配列番号２９：ＨＬＦの部分配列（配列番号３１）と高い相同性を有する、ＭＩＴＦ−Ｍ（配列番号２）の部分配列。
配列番号３０：ＭＩＴＦ−Ｍの部分配列（配列番号２９）およびＨＬＦの部分配列（配列番号３１）と相同性を有する配列。（５）．．（５）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。
配列番号３１：ＭＩＴＦ−Ｍの部分配列（配列番号２９）と高い相同性を有する、ＨＬＦ（配列番号４）の部分配列。
配列番号３２：ＭＩＴＦ−Ｍの部分配列（配列番号２３）およびＥＬＫ４の部分配列（配列番号２４）と相同性を有する配列。（４）．．（４）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよく、または欠失していてもよい。
配列番号３３：ＣＬＯＣＫの部分配列（配列番号３５）と高い相同性を有する、ＭＩＴＦ−Ｍ（配列番号２）の部分配列。
配列番号３４：ＭＩＴＦ−Ｍの部分配列（配列番号３３）およびＣＬＯＣＫの部分配列（配列番号３５）と相同性を有する配列。（２）．．（２）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（３）．．（３）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（４）．．（４）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（６）．．（６）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（７）．．（７）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（８）．．（８）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（９）．．（９）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（１０）．．（１０）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（１１）．．（１１）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（１２）．．（１２）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（１４）．．（１４）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（１５）．．（１５）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（１８）．．（１８）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（１９）．．（１９）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（２０）．．（２０）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（２２）．．（２２）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（２３）．．（２３）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（２９）．．（２９）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（３０）．．（３０）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（３１）．．（３１）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（３３）．．（３３）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよく、または欠失していてもよい。（３４）．．（３４）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（３６）．．（３６）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（３７）．．（３７）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（３８）．．（３８）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（４０）．．（４０）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよく、または欠失していてもよい。（４１）．．（４１）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよく、または欠失していてもよい。（４２）．．（４２）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（４４）．．（４４）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（４６）．．（４６）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（４８）．．（４８）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（４９）．．（４９）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（５１）．．（５１）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（５３）．．（５３）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（５４）．．（５４）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。
配列番号３５：ＭＩＴＦ−Ｍの部分配列（配列番号３３）と高い相同性を有する、ＣＬＯＣＫ（配列番号８）の部分配列。
配列番号３６：ＣＬＯＣＫの部分配列（配列番号３８）と高い相同性を有する、ＭＩＴＦ−Ｍ（配列番号２）の部分配列。
配列番号３７：ＭＩＴＦ−Ｍの部分配列（配列番号３６）およびＣＬＯＣＫの部分配列（配列番号３８）と相同性を有する配列。（２）．．（２）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（３）．．（３）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（５）．．（５）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（８）．．（８）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（９）．．（９）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。（１３）．．（１３）：Ｘａａはいずれのアミノ酸残基でもよい。
配列番号３８：ＭＩＴＦ−Ｍの部分配列（配列番号３６）と高い相同性を有する、ＣＬＯＣＫ（配列番号８）の部分配列。
【図１−Ａ】
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【図１−Ｂ】
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【図１−Ｃ】
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【図３−Ａ】
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【図３−Ｂ】
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【図３−Ｃ】
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【図２】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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