(57)【要約】【課題】バックグランドにある標識物によるノイズを低減した高感度なイムノクロマトグラフ方法を提供すること。【解決手段】被験物質と、該被験物質に対する第一の結合物質で修飾した標識化物質又は該被験物質の類似部位を持つ化合物で修飾した標識化物質とを、これらを混合させた状態で第一の不溶性担体上において展開し、該被験物質に対する第二の結合物質、または被験物質に対する第一の結合物質への結合性がある物質、を有する第一の不溶性担体上の反応部位において該被験物質と該標識化物質を捕捉して該被験物質を検出することを含むイムノクロマトグラフ方法において、該被験物質を展開した後に、該被験物質の展開方向と洗浄液の展開方向との成す角が45度から170度となるように洗浄液を展開し洗浄を行い、被験物質の検出を行うことを特徴とする、イムノクロマトグラフ方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質と、該被験物質に対する第一の結合物質で修飾した標識化物質又は該被験物質の類似部位を持つ化合物で修飾した標識化物質とを、これらを混合させた状態で第一の不溶性担体上において展開し、該被験物質に対する第二の結合物質、または被験物質に対する第一の結合物質への結合性がある物質、を有する第一の不溶性担体上の反応部位において該被験物質と該標識化物質を捕捉して該被験物質を検出することを含むイムノクロマトグラフ方法において、該被験物質を展開した後に、該被験物質の展開方向と洗浄液の展開方向との成す角が45度から170度となるように洗浄液を展開し洗浄を行い、被験物質の検出を行うことを特徴とする、イムノクロマトグラフ方法。
【請求項２】
該第一の結合物質及び／又は第二の結合物質が抗体である、請求項１に記載のイムノクロマトグラフ方法。
【請求項３】
該第一の不溶性担体が多孔性担体である、請求項１または２に記載のイムノクロマトグラフ方法。
【請求項４】
該標識化物質が金属コロイドを含む、請求項１から３の何れか１項に記載のイムノクロマトグラフ方法。
【請求項５】
該金属コロイドが金コロイドである、請求項４に記載のイムノクロマトグラフ方法。
【請求項６】
洗浄時間が10秒から300秒である、請求項１から５の何れか１項に記載のイムノクロマトグラフ方法。
【請求項７】
洗浄液には標識化物質を含まない、請求項１から６の何れか1項に記載のイムノクロマトグラフ方法。
【請求項８】
銀を含む化合物、及び銀のための還元剤を用いた増幅液で増感することを含む、請求項１から７の何れか１項に記載のイムノクロマトグラフ方法。
【請求項９】
増幅液が2価の鉄イオンを含むことを特徴とする、請求項１から８の何れか1項に記載のイムノクロマトグラフ方法。
【請求項１０】
洗浄液が、銀のための還元剤、または銀を含む化合物を含む、請求項８又は９に記載のイムノクロマトグラフ方法。
【請求項１１】
（ａ）第一の不溶性担体、（ｂ）被験物質に対する第一の結合物質または該被験物質の類似部位を持つ化合物で修飾した標識化物質、（ｃ）被験物質に対する第二の結合物質または該被験物質の類似部位を持つ化合物で修飾した標識化物質、 (d)洗浄液、(e)第一の不溶性担体に重なる第二の不溶性担体、とを少なくとも含む、請求項１から１０の何れか1項に記載のイムノクロマトグラフ方法を行うための免疫検査用キット。
【請求項１２】
（ａ）洗浄液の添加部位をもち、この添加部位と第二の結合物質または該被験物質の類似部位を持つ化合物で修飾した標識化物質を有する反応部位とを結ぶ直線が、該被験物質が展開される直線と該反応部位で交差する形状を持つ第一の不溶性担体、（ｂ）被験物質に対する第一の結合物質または該被験物質の類似部位を持つ化合物で修飾した標識化物質で修飾した標識化物質、（ｃ）被験物質に対する第二の結合物質または該被験物質の類似部位を持つ化合物で修飾した標識化物質、 及び(d)洗浄液、とを少なくとも含む、請求項１から１０の何れか1項に記載のイムノクロマトグラフ方法を行うための免疫検査用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イムノクロマトグラフ方法においてのバックグラウンドとなる標識化物質の洗浄方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然物、毒素、ホルモン、又は農薬等の生理活性物質又は環境汚染物質の中には、極微量で作用するものが非常に多い。従って、これらの物質の定性的及び定量的測定には、従来、高感度分析が可能な機器分析法が広く用いられてきた。しかし、機器分析法は、特異性が低く、試料の前処理工程を含め、分析に時間を要する上、操作が煩雑なため、近年要求されている迅速簡便測定目的には不都合である。一方、免疫学的測定法は、特異性も高く、操作も機器分析よりはるかに簡便であることから、生理活性物質又は環境汚染物質の測定分野に徐々に普及してきた。しかし、９６穴プレ−トを用いた酵素免疫測定法やラテックス凝集法のような従来の免疫学的測定法は、必ずしも測定の迅速簡便性又は検出感度を満たすものではなかった。
【０００３】
また他のニーズとしては、現在スワブ液や血液と言った比較的侵襲的な検体を用いている検査においても、高感度化が達成されることで、鼻水やうがい液、尿、といった比較的低侵襲的な検体中にごく少量含まれる被験試料を検出することができるようになることで、患者の負担の少ない検査方法が可能となることも期待できる。
【０００４】
近年、特に迅速な診断が求められる感染症の検査に、イムノクロマトグラフ法を用いた検査キット（以後の説明において、イムノクロマトグラフキットと記す。）が多く使用されるようになってきている。これらキットの普及により、患者の感染を迅速・簡便な方法で特定することができ、その後の診断、治療を素早く的確に行うことが可能となってきている。例えば、サンドイッチ法を利用したイムノクロマトグラフ法では、被験物質（例えば、抗原）に特異的に結合する第2の抗体を特定の領域に固定した第一の不溶性担体（例えば、ニトロセルロース膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜など）中に、被験物質と特異的に結合する標識化第1の抗体と、被験物質を含む可能性のある検体溶液とを展開し、第一の不溶性担体の第2抗体を固定した領域上で、被験物質との免疫複合体を形成させ、標識の着色又は発色などの信号を検出し、被験物質を測定することができる。なお、前記標識としては、例えば、酵素を含むタンパク質、着色ラテックス粒子、金属コロイド、又は炭素粒子を使用することができる。
【０００５】
イムノクロマトグラフ法は、その判定・測定に重厚な設備・機器を必要とせず、操作が簡便であり、被験物質を含む可能性のある検体溶液を滴下した後、約５分〜１０分間静置するだけで測定結果が得られるように迅速であるので、簡便・迅速・特異性の高い判定・測定手法として、多くの場面、例えば病院における臨床検査、研究室における検定試験等に広く使われている。
【０００６】
また、天然物、毒素、ホルモン、又は農薬等の生理活性物質又は環境汚染物質は、従来の一般的イムノクロマトグラフ法では検出できない極微量で作用する物質が多く、それらの迅速、簡便、且つ高感度なイムノクロマトグラフ法の開発が求められている。
【０００７】
シグナル増幅を行い、高感度化するイムノクロマトグラフィー法としては、酵素による増幅法（特許文献１及び２）や、化学増幅による方法（特許文献３）、銀増幅による方法（特許文献４）が知られている。シグナルを増幅する際には、同時にバックグランドにある標識物によるノイズも増幅してしまうため、最終的に検出感度を上げるためには、バックグランドにある標識物によるノイズを低減する必要が特にある。特許文献２では酵素増幅イムノグラフィー法において、洗浄液を流すことで、バックグランドの標識物を洗浄しているが、本系の目指すような、一般的酵素増幅イムノクロマトグラフィー法よりもさらに高感度な検査を行うには、十分な洗浄とは言えない。
【０００８】
金属コロイドを標識として用いたイムノクロマトグラフィー法の、高感度化の方法としては銀増幅法が知られている（特許文献４）。特許文献４では、溶液を流した後に、銀増幅のための溶液を検出ライン部に滴下することで、増幅を行い高感度化を行っているが、ある程度以上の高感度化を実現しようとするとバックグランドの標識物によるノイズの増大が問題となる。
本系のように特許文献４で開示されているような銀増幅のための溶液よりもさらに高増幅可能な銀増幅のための増幅液を用いてシグナル増幅を行うような場合には、検出感度を上げようとした場合、さらなるノイズの低減が必要となってくる。
いずれの場合においても、高増幅可能な銀増幅のための増幅液を用いてシグナル増幅する際に必要な、十分なノイズ低減技術が導入されていないのが現状である。
【０００９】
【特許文献１】特許３２３７５４０号公報
【特許文献２】特許３３０９９７７号公報
【特許文献３】特許３８８６０００号公報
【特許文献４】特開２００２−２０２３０７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
免疫学的測定方法において高感度化が求められており、銀増幅により高感度化が達成されてきたが、一般的に感染症の感染初期の披検試料の濃度が非常に低い場合や、鼻水やうがい液、尿、といった比較的低侵襲的な検体中にごく少量含まれる被験試料を検出するためには、さらなる高感度化が求められている。シグナルを増幅する際には、同時にバックグランドにある標識物によるノイズも増幅してしまうため、最終的に検出感度を上げるためには、バックグランドにある標識物によるノイズを低減する必要がある。本発明は、バックグランドにある標識物によるノイズを低減した高感度なイムノクロマトグラフ方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明では、非特異的に担体内に残存する標識化物質を該被験物質の展開方向と洗浄液の展開方向との成す角が45度から170度となるように洗浄液を展開し洗浄を行うことによ
って、非特異的な標識物によるノイズを低減した高感度なイムノクロマトグラフ方法を提供できることを見出した。本発明は、上記知見に基づいて完成したものである。
【００１２】
即ち、本発明によれば、被験物質と、該被験物質に対する第一の結合物質で修飾した標識化物質又は該被験物質の類似部位を持つ化合物で修飾した標識化物質とを、これらを混合させた状態で第一の不溶性担体上において展開し、該被験物質に対する第二の結合物質、または被験物質に対する第一の結合物質への結合性がある物質、を有する第一の不溶性担体上の反応部位において該被験物質と該標識化物質を捕捉して該被験物質を検出することを含むイムノクロマトグラフ方法において、該被験物質を展開した後に、該被験物質の展開方向と洗浄液の展開方向との成す角が45度から170度となるように洗浄液を展開し洗浄を行い、被験物質の検出を行うことを特徴とする、イムノクロマトグラフ方法が提供される。
洗浄液の展開方向は、好ましくは45から170度であり、より好ましくは60から170度であり、さらにより好ましくは60から150度である。
【００１３】
好ましくは、第一の結合物質及び／又は第二の結合物質は抗体である。
好ましくは、第一の不溶性担体は多孔性である。
好ましくは、標識化物質が金属コロイドを含む。
好ましくは、金属コロイドが金コロイドである。
洗浄時間が10秒から300秒である、請求項１から５の何れか１項に記載のイムノクロマトグラフ方法。
【００１４】
好ましくは、洗浄液には標識化物質を含まない。
好ましくは、銀を含む化合物、及び銀のための還元剤を用いた増幅液で増感する。
好ましくは、増幅液は2価の鉄イオンを含む。
好ましくは、洗浄液は、銀のための還元剤、または銀を含む化合物を含む。
【００１５】
本発明によればさらに、（ａ）第一の不溶性担体、（ｂ）被験物質に対する第一の結合物質または該被験物質の類似部位を持つ化合物で修飾した標識化物質、（ｃ）被験物質に対する第二の結合物質または該被験物質の類似部位を持つ化合物で修飾した標識化物質、 (d)洗浄液、(e)第一の不溶性担体に重なる第二の不溶性担体、とを少なくとも含む、上記した本発明のイムノクロマトグラフ方法を行うための免疫検査用キットが提供される。
【００１６】
本発明によればさらに、（ａ）洗浄液の添加部位をもち、この添加部位と第二の結合物質または該被験物質の類似部位を持つ化合物で修飾した標識化物質を有する反応部位とを結ぶ直線が、該被験物質が展開される直線と該反応部位で交差する形状を持つ第一の不溶性担体、（ｂ）被験物質に対する第一の結合物質または該被験物質の類似部位を持つ化合物で修飾した標識化物質で修飾した標識化物質、（ｃ）被験物質に対する第二の結合物質または該被験物質の類似部位を持つ化合物で修飾した標識化物質、 及び(d)洗浄液、とを少なくとも含む、上記した本発明のイムノクロマトグラフ方法を行うための免疫検査用キットが提供される。
【発明の効果】
【００１７】
本発明では、イムノクロマトグラフ法において、該被験物質を展開した後に、該被験物質の展開方向と洗浄液の展開方向との成す角が45度から170度となるように洗浄液を展開し洗浄を行うことによってノイズを低減し、高感度での検出が可能になった。特に、この洗浄後に増幅液を用い検出ライン部の標識物のシグナルを増幅させることによって、高感度での検出が可能になった。なお、本発明では、洗浄液と増幅液は、別々に送液してもかまわないが、同時に同一の液体として送液することもできる。
【００１８】
また、本発明の別の効果としては、該被験物質の展開方向と洗浄液の展開方向との成す角が45度から170度となるように洗浄液を展開し洗浄することにより、例えば０度の角度から洗浄した場合に比べ、洗浄液が不溶性担体が通過する時間が短くなること、および単位時間当たりの洗浄効果が高いことから、必要なレベルまでの洗浄に要する洗浄時間が短時間ですみ、よって結果的に検査時間を短くすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
１．イムノクロマト
一般に、イムノクロマトグラフ方法とは以下のような手法で被験物質を簡便・迅速・特異的に判定・測定する手法である。すなわち、被験物質と結合可能な固定化試薬（抗体、抗原等）を含む少なくとも１つの反応部位を有するクロマトグラフ担体を固定相として用いる。このクロマトグラフ担体上で、被験物質結合可能な試薬によって修飾された検出用標識物が分散されてなる分散液を移動層として前記クロマトグラフ担体中をクロマトグラフ的に移動させると共に、前記被験物質と検出用標識物とが特異的に結合しながら、前記反応部位まで到達する。前記反応部位において、前記被験物質と検出用標識物の複合体が前記固定化試薬に特異的結合することにより、被分析液中に被験物質が存在する場合にのみ、前記固定化試薬部に検出用標識物が濃縮されることを利用し、それらを目視または適当な機器を用いて被分析液中に被験物質が存在することを定性および定量的に分析する手法である。
【００２０】
本発明におけるイムノクロマトグラフ方法を行う装置は、銀を含む化合物及び銀イオンのための還元剤を内蔵していてもよく、前記固定化試薬に結合した前記被験物質と検出用標識物の複合体を核として増幅反応によって、シグナルを増幅し、結果として高感度化を達成することができる。本発明によれば、迅速な高感度イムノクロマトグラフを行うことができる。
【００２１】
２．被験試料
本発明のイムノクロマトグラフ方法で分析することのできる被験試料としては、被験物質を含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物（特にヒト）の体液（例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、又は喀痰）若しくは排泄物（例えば、糞便）、臓器、組織、粘膜や皮膚、それらを含むと考えられる搾過検体（スワブ）、うがい液、又は動植物それ自体若しくはそれらの乾燥体を挙げることができる。
【００２２】
３．被験試料の前処理
本発明のイムノクロマトグラフ方法では、前記被験試料をそのままで、あるいは、前記被験試料を適当な抽出用溶媒を用いて抽出して得られる抽出液の形で、更には、前記抽出液を適当な希釈剤で希釈して得られる希釈液の形、若しくは前記抽出液を適当な方法で濃縮した形で、用いることができる。前記抽出用溶媒としては、通常の免疫学的分析法で用いられる溶媒（例えば、水、生理食塩液、又は緩衝液等）、あるいは、前記溶媒で希釈することにより直接抗原抗体反応を実施することができる水混和性有機溶媒を用いることもできる。
【００２３】
４．構成
図１に、本発明の洗浄を行うイムノクロマトグラフキットの平面図を模式的に示す。
イムノクロマトグラフ用ストリップ10には、洗浄液の添加部位6が予め、または披検試
料展開後に装着され、所望により洗浄液の吸水パッド7を設けることも可能である。Bは洗浄液の展開方向である。
図2にイムノクロマトグラフ用ストリップ10の詳細な構成の模式的な平面図を示す。本
発明のイムノクロマトグラフ方法において使用することのできるイムノクロマトグラフ用ストリップとしては、通常のイムノクロマトグラフ法に用いることができるイムノクロマトグラフ用ストリップである限り、特に限定されるものではない。
図3は、図2で示されたイムノクロマトグラフ用ストリップの縦断面を模式的に示す縦断面図である。
【００２４】
イムノクロマトグラフ用ストリップ１０は、被験物質の展開方向（図１において矢印Ａで示す方向）の上流から下流に向かって、試料添加パッド５、標識化物質保持パッド（例えば金コロイド抗体保持パッド）２、クロマトグラフ担体（例えば抗体固定化メンブレン）３、及び吸収パッド４がこの順に、粘着シート1上に配置されている。
【００２５】
前記クロマトグラフ担体３は、補足部位３ａを有し、被験物質と特異的に結合する抗体又は抗原を固定化した領域である検出ゾーン（検出部、検出ラインと記載することもある）３１を有し、所望により、コントロール用抗体又は抗原を固定化した領域であるコントロールゾーン（コントロール部、コントロールラインと記載することもある）３２を更に有する。検出ゾーンは、1つのクロマトグラフ担体に2つ以上設けることも可能である。
【００２６】
前記標識化物質保持パッド２は、標識化物質を含む懸濁液を調製し、その懸濁液を適当なパッド（例えば、グラスファイバーパット）に塗布した後、それを乾燥することにより調製することができる。
【００２７】
前記試料添加パッド１としては、例えばグラスファイバーパットを用いることができる。
【００２８】
４−１．検出用標識物
標識化物質を作成するための検出用標識物としては、一般的なイムノクロマトグラフ法で用いられるような金属微粒子、着色ラテックス粒子、酵素など、有色で視認できる、または、反応により検出できるようになる標識物であればなんでも良い。
本発明においては、検出用標識物として金属コロイド又は金属硫化物、その他金属合金、また金属を含むポリマー粒子標識を用いることができる。担体粒子（又はコロイド）の平均粒径は、０．０２〜１０μｍの範囲が好ましい。例えば、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、鉄コロイド、水酸化アルミニウムコロイド、およびこれらの複合コロイドなどが挙げられ、好ましくは、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、およびこれらの複合コロイドである。特に、金コロイドと銀コロイドが適当な粒径において、金コロイドは赤色、銀コロイドは黄色を示し視認度が高い点で好ましい。金属コロイドの平均粒径としては、約１ｎｍ〜５００ｎｍが好ましく、１〜５０ｎｍがさらに好ましい。
【００２９】
金属コロイドと第一の結合物質または該被験物質の類似部位を持つ化合物との結合は、従来公知の方法（例えばＴｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．７，ｐｐ６９１−６９６，（１９８２））に従い、行うことができる。すなわち、金属コロイドと第一の結合物質を適当な緩衝液中で室温下５分以上混合する。反応後、遠心分離により得た沈殿を、ポリエチレングリコ−ル等の分散剤を含む溶液中に分散させることにより、目的の金属コロイド標識物質を得ることができる。金属コロイドとして金コロイド粒子を用いる場合には、市販のものを用いてもよい。あるいは、常法、例えば塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｈｙｓ．  Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．２４１，２０，（１９７３）等）により金コロイド粒子を調製することができる。
【００３０】
本発明によれば、検出用標識物として金属コロイド標識又は金属硫化物標識、その他金属合金標識、また金属を含むポリマー粒子標識を用いるイムノクロマトグラフにおいて、前記金属系標識の信号を増幅させることができる。具体的には、前記被験物質と検出用標識物の複合体の形成後に、無機銀塩、有機銀塩などの銀を含む化合物から供給される銀イオンおよび銀イオンのために還元剤を接触させ、還元剤によって銀イオンを還元して銀粒子を生成させると、その銀粒子が前記金属系標識を核として前記金属系標識上に沈着するので、前記金属系標識が増幅され、被験物質の分析を高感度に実施することができる。従って、本発明のイムノクロマトグラフ方法においては、還元剤による銀イオンの還元作用により生じた銀粒子を用いて、免疫複合体の標識に沈着させる反応を実施し、こうして増幅された信号を分析することを除けば、それ以外の点では従来公知のイムノクロマトグラフ法をそのまま適用することができる。
【００３１】
４−２．結合物質
本発明では、標識物質は、被験物質に対する第一の結合物質で修飾されている。第一の結合物質とは、例えば該被験物質（抗原）に対する抗体、該被験物質（抗体）に対する抗原、該被験物質（たんぱく質、低分子化合物等）に対するアプタマーなど、該被験物質に対して親和性を持つ化合物であればなんでもよい。
【００３２】
本発明では、多孔性担体は、（ａ）被験物質に対する第二の結合物質、又は（ｂ）第一の結合物質への結合性を有する物質を有している。 該被験物質に対する第二の結合物質とは、例えば該被験物質（抗原）に対する抗体、該被験物質（抗体）に対する抗原、該被験物質（たんぱく質、低分子化合物等）に対するアプタマーなど、該被験物質に対して親和性を持つ化合物であればなんでもよい。また、第二の結合物質と第一の結合物質とは異なるものでも良いし、同一のものでもよい。
【００３３】
被験物質に対する第一の結合物質への結合性を有する物質とは、被験物質そのものでも良いし、第一の結合物質が認識する部位を持つ化合物でもよく、たとえば被験物質の誘導体とタンパク質（例えばＢＳＡなど）とを結合させたような化合物などがそれにあたる。
【００３４】
好ましくは、第一の結合物質が抗体であり、及び／または第二の結合物質が抗体である。
本発明のイムノクロマトグラフ方法においては、被験物質に対して特異性を有する抗体として、特に限定されるものではないが、例えば、その被験物質によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その被験物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］を用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。
【００３５】
４−３．第一の不溶性担体
第一の不溶性担体とは、被験物質と結合可能な第二の結合物質を含む少なくとも１つの反応部位を有するクロマトグラフ担体のことで、このクロマトグラフ担体としては、多孔性担体が好ましい。特に、ニトロセルロース膜、セルロース膜、アセチルセルロース膜、ポリスルホン膜、ポリエーテルスルホン膜、ナイロン膜、ガラス繊維、不織布、布、または糸等が好ましい。
【００３６】
通常クロマトグラフ担体の一部に第二の抗体を固定化させて検出ゾーンを作製する。第二の抗体は、第二の抗体をクロマトグラフ担体の一部に物理的または化学的結合により直接固定化させてもいいし、第二の抗体をラテックス粒子などの微粒子に物理的または化学的に結合させ、この微粒子をクロマトグラフ担体の一部にトラップさせて固定化させてもいい。なお、クロマトグラフ担体は、第二の抗体を固定化後、不活性蛋白による処理等により非特異的吸着防止処理をして用いるのが好ましい。
【００３７】
４−４．試料添加パッド
試料添加パッドの材質は、セルロース濾紙、ガラス繊維、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、及び綿布等の均一な特性を有するものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。試料添加部は、添加された被験物質を含む試料を受入れるだけでなく、試料中の不溶物粒子等を濾過する機能をも兼ねる。また、分析の際、試料中の被験物質が試料添加部の材質に非特異的に吸着し、分析の精度を低下させることを防止するため、試料添加部を構成する材質は、予め非特異的吸着防止処理して用いることもある。
【００３８】
４−５．標識化物質保持パッド
標識化物質保持パッドの素材としては、例えば、セルロース濾紙、グラスファイバー、及び不織布等が挙げられ、前述のように調製した検出用標識物を一定量含浸し、乾燥させて作製する。
【００３９】
４−６．吸収パッド
吸収パッドは、添加された試料がクロマト移動により物理的に吸収されると共に、クロマトグラフ担体の検出部に不溶化されない未反応標識化物質等を吸収除去する部位であり、セルロ−ス濾紙、不織布、布、セルロースアセテート等吸水性材料が用いられる。添加された試料のクロマト先端部が吸収部に届いてからのクロマトの速度は、吸収材の材質、大きさなどにより異なるので、その選定により被験物質の測定に合った速度を設定することができる。
【００４０】
５．免疫検査の方法
以下、本発明のクロマトグラフ方法について、その具体的な実施態様であるサンドイッチ法及び競合法について説明する。
（サンドイッチ法）
サンドイッチ法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により被験物質の分析を実施することができる。まず、被験物質（抗原）に対して特異性を有する第１抗体及び第２抗体を、先に述べた方法により予め調製しておく。また、第1抗体を、予め標識化しておく。第2抗体を、適当な第一の不溶性担体（例えば、ニトロセルロ−ス膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜等）上に固定し、被験物質（抗原）を含む可能性のある被験試料（又はその抽出液）と接触させると、その被験試料中に被験物質が存在する場合には、抗原抗体反応が起きる。この抗原抗体反応は、通常の抗原抗体反応と同様に行なうことができる。前記抗原抗体反応と同時又は反応後に、過剰量の標識化第1抗体を更に接触させると、被験試料中に被験物質が存在する場合には、固定化第2抗体と被験物質（抗原）と標識化第1抗体とからなる免疫複合体が形成される。
【００４１】
サンドイッチ法では、固定化第2抗体と被験物質（抗原）と第1抗体との反応が終了した後、前記免疫複合体を形成しなかった標識化第1抗体を除去し、続いて、例えば、第一の不溶性担体における固定化第2抗体を固定した領域をそのまま観察しその標識物を検出、または定量し、被験試料中の被験物質の有無判定または量を測定することができる。また、金属イオン及び還元剤を供給することにより、前記免疫複合体を形成した標識化第1抗体の標識からの信号を増幅し検出することもできる。
【００４２】
（競合法）
競合法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により被験物質の分析を実施することができる。競合法は、サンドイッチ法でアッセイすることができない低分子化合物の抗原を検出する手法として知られている。
【００４３】
まず、被験物質（抗原）に対して特異性を有する第１抗体を予め調製しておく。また、第1抗体を、予め金属コロイドなどで標識化しておく。第一抗体に対して結合性を有する、被験物質そのもの、または被験物質と類似な部位を持ち被験物質と同様の第一抗体に対するエピトープを持つ化合物を、適当な第一の不溶性担体（例えば、ニトロセルロ−ス膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜等）上に固定しておく。被験物質（抗原）を含む可能性のある被験試料（又はその抽出液）と接触させると、その被験試料中に被験物質が存在しない場合には、標識化された第一抗体と、第一抗体に対して結合性を有する、被験物質そのもの、または被験物質と同様の第一抗体に対するエピトープを持つ化合物とにより、第一の不溶性担体上の抗原抗体反応が起きる。一方、被験物質が存在する場合には、標識された第1抗体に被験物質（抗原）が結合するため、その後の第一抗体に対して結合性を有する、被験物質そのもの、または被験物質と類似な部位を持ち被験物質と同様の第一抗体に対するエピトープを持つ化合物との、第一の不溶性担体上の抗原抗体反応が阻害され、抗原抗体反応による結合が起こらない。
【００４４】
第一抗体に対して結合性を有する固定化物と標識化された第1抗体との反応が終了した後、前記免疫複合体を形成しなかった標識化第1抗体を除去し、続いて、例えば、第一の不溶性担体における第一抗体に対して結合性を有する物質をそのまま観察しその標識物量を検出、または定量し、被験試料中の被験物質の有無判定または量を測定することができる。固定した領域に、金属イオン及び還元剤を供給することにより、前記免疫複合体を形成した標識化第1抗体の標識からの信号を増幅して検出することもできる。
【００４５】
６．洗浄
6-1.洗浄液
本発明では、洗浄液として1％BSA入りのPBSバッファーを用いているが、洗浄液は抗原抗体反応以外でメンブレン内に残存している、つまり非特異的に残存している標識化物質を洗浄するための液体であれば何でも良い。
【００４６】
残存する金を洗浄するだけであれば、水で十分であると考えられる。しかし、メンブレンやメンブレンに固定された第二の結合物質と非特異的な相互作用をしてしまっている標識化合物も可能な限り洗浄する必要があり、この場合には、洗浄効果を上げる為にpHを調整したり、界面活性剤成分やBSAなどのタンパク質、ポリエチレングリコールなどの高分子化合物を加えた洗浄液を用いても良い。
【００４７】
洗浄液のｐＨは、酸又は塩基（好ましくは酸）を用いて調整することができる。本発明で用いることができる酸としては、クエン酸、アスコルビン酸、酢酸などの有機酸でもよいし、塩酸、硝酸又は硫酸などの無機酸でもよい。また、ｐＨを一定に保つ為に、緩衝液となっていてもよい。  なお、洗浄液は、以下に説明する増幅液と同一の液であってもよく、その場合は、以下に説明する増幅液のｐＨは、１から1.5となっている。
非特異的な吸着を洗浄する洗浄液としては、第一の結合物質及び、または、第二の結合物質の等電点よりも離れていることが好ましい。また、一般的な抗体の等電点は中性付近なので、第一及びまたは第二結合物質として抗体を用いる場合の好ましいpHは、pH0.5から9、さらに好ましくはｐＨ0.5から5、さらに好ましくはpH0.5から3、である。
【００４８】
洗浄液中に含む界面活性剤としては、例えば、ノニオン系、アニオン系、及びカチオン系の界面活性剤の何れでもよいか、好ましくはノニオン系界面活性剤である。
【００４９】
本発明で用いる界面活性剤としては、具体的には、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ＴｗｅｅｎTM２０） 、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ＴｗｅｅｎTM８０） 、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎTMＸ−１００）、ノニルフェノールエチレンオキサイド、ポリエチレンオキサイド、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリエチレングリコールモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、グリセリンモノラウレート、グリセリンモノパルミテート、グリセリンモノステアレート、グリセリンモノオレエート、ベンタエリスリトールモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノベヘネート、ソルビタンジステアレート、ジグリセリンモノオレエート、トリグリセリンジオレエート、ナトリウムラウリルサルフェート、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ブチルナフタレンスルホン酸ナトリウム、セチルトリメチルアンモニウムクロライド、ドデシルアミン塩酸塩、ラウリル酸ラウリルアミドエチルリン酸塩、トリエチルセチルアンモニウムイオダイド、オレイルアミノジエチルアミン塩酸塩、ドデシルピリジニウム塩酸塩等の塩基性ピリジニウム塩等が挙げられる。
なお、洗浄液は、以下に説明する増幅液と同一の液であってもよく、その場合は、以下に説明する増幅液が、界面活性剤を含むことになる。
【００５０】
洗浄液は展開途中に非特異的に残存した標識化物質を洗浄しながら展開するので標識化物質を含みながら展開されることになるが、展開される前の洗浄液は洗浄効果を高めるために、標識化物質を含んでいない液を用いる。
【００５１】
洗浄液は、増幅液の成分の一部を含むものであってもよい。増幅液は銀イオンを含む成分と銀に対する還元剤成分とを含むが、これらのうちの片方の成分のみを含む液を用いて洗浄を行っても良い。
【００５２】
6-2.洗浄時間
洗浄の時間は、10秒以上300秒以下が好ましい。抗原抗体反応以外でメンブレン内に残存している、つまり非特異的に残存している標識化物質は、洗浄液の先端が来た時点で大部分が洗浄されると考えられるが、それでも洗浄時間が１０秒に満たないとハ゛ックク゛ラント゛の標識物を必要なレベルまで下げることができない。また、洗浄時間が300秒を超えると洗浄による特異的に結合している標識物が流されてしまい、シグナルの低下、つまり検出感度の低下を招くことがある。また、感染症の診断等でこの方法を用いる際、患者が控え室で別の患者に病気をうつしてしまう二次感染の危険を減らすためにも、診察室で患者のいる前で診断を下すことが求められている。洗浄に300秒を超えて洗浄を行った場合、トータルの検査時間として20分を要してしまうことなり、患者のいる前で診断を下すには時間がかかりすぎてしまう。この観点からも300秒を超える洗浄は好ましくない。
ここでいう洗浄時間とは、洗浄液が洗浄を行いたい部位に到達した時点を洗浄開始と定義した際の洗浄液が流れている時間を表す。
【００５３】
6-3.洗浄液の流速
展開させる洗浄液の流速は、抗原抗体反応以外でメンブレン内に残存している、つまり非特異的に残存している標識化物質の洗浄の洗浄度合いに密接に関係する。洗浄液の流速は、 0.1μL/分・ｍｍよりも大きいことが好ましい。0.1μL/分・ｍｍ未満であると、洗浄効果が十分に得られない。
【００５４】
洗浄液の流速は、洗浄後の吸水パットの含水量を測定し、吸水パットの幅が流路の幅だとした際の流路幅あたり１分間当たりに換算した流量として求めることができる。
流速は、洗浄液送液の為の洗浄液添加パット及び吸水パットの、材質、ファイバー径、密度、繊維の太さ、表面処理の仕方、界面活性剤等の添加剤、により決まる。また洗浄液送液の為の洗浄液添加パットの組み合わせ、及びイムノクロマトグラフ用ストリップとの重なり具合、重ねる際の圧縮度合いによっても決まってくる。グラスファイバーを含む素材の洗浄液添加パット及び吸水パットを用いることにより、流速を早く送液することができる。
【００５５】
6-4.洗浄液の展開、その方向
洗浄液は、検体液を展開した後に、イムノクロマトグラフ用ストリップに添加しイムノクロマトグラフ用ストリップに残存する抗原抗体反応で結合した以外の標識物を洗浄する。洗浄液の送液方法としては、検体液を展開した後にそのまま試料滴下部に添加する方法や、予めストリップに洗浄液送液の為の洗浄液添加パット、吸水パットを付着させておき、その洗浄液添加パットに添加し吸水パット方向へ送液する方法、予めストリップに洗浄液の添加部位を備えておき、検体液の展開後にその洗浄液の添加部位に洗浄液を添加する方法、または、検体液をストリップに展開した後に洗浄液送液の為の洗浄液添加パット、吸水パットをストリップに付着させても良い。
【００５６】
本明細書中では、該被験物質の液の展開方向とは、試料添加パッドと吸収パッドとを結ぶ方向と定義し、洗浄液の展開方向とは、洗浄液送液の為の洗浄液添加パットと吸水パットとを結ぶ方向と定義する。
【００５７】
被験物質の液の展開方向と洗浄液の展開方向との成す角が45度から170度の場合、洗浄
効果が大きくなる。さらに、該被験物質の液の展開方向と洗浄液の展開方向との成す角は、好ましくは60度から170度、さらに好ましくは60度から150度である。
洗浄液添加パット（第二の不溶性担体とも標記する）は、洗浄液を添加できればなんでもよく、グラスファイバーパッドやセルロースメンブレン、ニトロセルロースメンブレンなどを用いることができる。
吸水パットは、吸水することができる物質ならばなんでもよく、セルロース、ニトロセルロース、グラスファイバー、それらの混合体などを用いることができる。
【００５８】
通常、多孔質体を洗浄する方法としては、洗浄液に浸漬して洗浄する方法、多孔質内を液体を通過させて洗浄する方法があるが、浸漬する方法は多孔質内の液置換が十分に起こらないため、洗浄に時間がかかる。一方本系で用いているような、洗浄液をメンブレン内を通過させて洗浄する方法では、液置換が良いため、短時間に洗浄を行うことができる。
本系では、このように、多孔質内の非特異的に残存している標識物を、よく洗浄できかつ短時間で洗浄できるような方法を鋭意検討した結果、先述べたような展開方向から洗浄液を展開させて洗浄する方法を見出すに至った。
【００５９】
７．増幅液
本発明において、使用することのできる増幅液とは、写真化学の分野での一般書物（例えば、「改訂写真工学の基礎-銀塩写真編-」（日本写真学会編、コロナ社）、「写真の化学」（笹井明、写真工業出版社）、「最新処方ハンドブック」（菊池真一他、アミコ出版社））に記載されているような、いわゆる現像液のことである。
本発明では、液中に銀イオンを含み、液中の銀イオンが現像の核となるような金属コロイド等を中心に還元される、いわゆる物理現像液であれば、どんなものでも増幅液として用いることができる。
【００６０】
８．銀を含む化合物
本発明で用いる銀含有化合物としては、有機銀塩、無機銀塩、もしくは銀錯体を用いることができる。
本発明に用いられる有機銀塩は、還元可能な銀イオンを含む有機化合物である。本発明で用いられる、還元可能な銀イオンを含む化合物としては、有機銀塩、無機銀塩、もしくは銀錯体など何でも良い。例えば、硝酸銀、酢酸銀、乳酸銀、酪酸銀などが知られている。
また還元剤の存在下で５０℃以上まで加熱されると、光に比較的に安定な金属銀を形成する銀塩または配位化合物であってもよい。
【００６１】
本発明に用いられる有機銀塩は、アゾ−ル化合物の銀塩およびメルカプト化合物の銀塩より選ばれる化合物であってもよい。好ましくは、アゾ−ル化合物としては含窒素ヘテロ環化合物であり、より好ましくはトリアゾ−ル化合物およびテトラゾ−ル化合物である。メルカプト化合物は、メルカプト基またはチオン基を分子内に少なくとも１つ有する化合物である。
【００６２】
本発明における窒素含有ヘテロ環化合物の銀塩は、好ましくはイミノ基を有する化合物の銀塩である。代表的な化合物としては次にあげるものであるが、これらの化合物に限定されることはない。１，２，４−トリアゾ−ルの銀塩、又はベンゾトリアゾ−ルおよびその誘導体の銀塩（例えば、メチルベンゾトリアゾ−ル銀塩又は５−クロロベンゾトリアゾ−ル銀塩）、米国特許第４，２２０，７０９に記載されているフェニルメルカプトテトラゾ−ルのような１Ｈ−テトラゾ−ル化合物、米国特許第４，２６０，６７７に記載のイミダゾ−ルおよびイミダゾ−ル誘導体。この種の銀塩のうち、特に好ましい化合物はベンゾトリアゾ−ル誘導体の銀塩、又はこれらの２つ以上の混合物である。
本発明に用いられる窒素含有ヘテロ環化合物の銀塩として最も好ましくは、ベンゾトリアゾ−ル誘導体の銀塩である。
【００６３】
本発明におけるメルカプト基またはチオン基を持つ化合物は、好ましくは５つまたは６つの原子を含むヘテロ環化合物である。この場合に環中の原子の少なくとも１つは窒素原子であり、その他の原子は炭素、酸素、硫黄原子である。このようなヘテロ環化合物としてはトリアゾ−ル類オキサゾ−ル類、チアゾ−ル類、チアゾリン類、イミダゾ−ル類、ジアゾ−ル類、ピリジン類、およびトリアジン類が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００６４】
メルカプト基またはチオン基を持つ化合物の銀塩のうち代表的な化合物を以下に挙げるが、これらに限定されるわけではない。
３−メルカプト−４−フェニル−１，２，４−トリアゾ−ルの銀塩、２−メルカプト−ベンズイミダゾ−ルの銀塩、２−メルカプト−５−アミノチアゾ−ルの銀塩、メルカプトトリアジンの銀塩、２−メルカプトベンゾオキサゾ−ルの銀塩、および米国特許第４，１２３，２７４記載の化合物の銀塩。
【００６５】
本発明におけるメルカプト基またはチオン基を持つ化合物としては、ヘテロ環を含まない化合物を用いることも出来る。ヘテロ環を含まないメルカプトまたはチオン誘導体としては、総炭素数が１０以上の脂肪族または芳香族炭化水素化合物が好ましい。
ヘテロ環を含まないメルカプトまたはチオン誘導体のうち有用な化合物としては以下に挙げるものがあるが、これらに制限されるわけではない。
チオグリコ−ル酸銀塩（例えば炭素原子数１２から２２までのアルキル基を持つＳ−アルキルチオグリコ−ル酸の銀塩）、ジチオカルボン酸の銀塩（たとえばジチオ酢酸の銀塩又はチオアミドの銀塩）
【００６６】
カルボン酸の銀塩を持つ有機化合物もまた好ましく用いられる。例えば、直鎖のカルボン酸である。具体的には、Ｃ数６〜２２のカルボン酸が好ましく用いられる。加えて芳香族カルボン酸の銀塩である。芳香族カルボン酸とその他のカルボン酸の例として、以下の化合物が挙げられるが、これらに限定されることはない。
置換または無置換の安息香酸銀（例えば３，５−ジヒドロキシ安息香酸銀、ｏ−メチル安息香酸銀、ｍ−メチル安息香酸銀、ｐ−メチル安息香酸銀、２，４−ジクロロ安息香酸銀、アセタミド安息香酸銀、およびｐ−フェニル安息香酸銀）、タンニン酸銀、フタル酸銀、テレフタル酸銀、サリチル酸銀、フェニル酢酸銀、又はピロメリット酸銀。
【００６７】
本発明においては米国特許第３，３３０，６６３に記載されたようなチオエ−テル基を含む脂肪酸銀もまた好ましく用いられる。エ−テルまたはチオエ−テル結合を含む炭化水素鎖を有するか、α−位（炭化水素基の上）またはオルト位（芳香族基の上）に立体的に遮蔽された置換基を有する可溶性のカルボン酸銀も用いることができる。これらは、塗布溶媒中で溶解性が向上し、光散乱が少ない塗布物になる。
そのような銀のカルボン酸塩は、米国特許第５，４９１，０５９に記載されている。ここで記載されている銀塩の混合物はどれでも、本発明においては必要に応じて使うことができる。
米国特許第４，５０４，５７５に記載のスルホン酸塩の銀塩もまた、本発明の態様においては使用することが出来る。
【００６８】
さらに、本発明においては例えば米国特許第４，７６１，３６１と米国特許第４，７７５，６１３に記載のアセチレンの銀塩も使用することが出来る。米国特許第６，３５５，４０８に記載のコア−シェル型銀塩として提供されることもできる。これらの銀塩は、一つ以上の銀塩から成るコアと一つ以上の異なる銀塩からなるシェルで構成される。
【００６９】
本発明中において、非感光性銀源としてもう一つ有用なものは米国特許６４７２１３１に記載の２つの異なった銀塩から構成される銀の二量体合成物である。そのような非感光性の銀の二量体合成物は２つの異なる銀塩から成る。前記二種の銀塩が直鎖の飽和炭化水素基を銀の配位子として含む場合にはそれら配位子の炭素原子数の差が６以上である。
有機銀塩は、銀として一般に０．００１モル／ｍ2〜０．２モル／ｍ2、好ましくは０．００１モル／ｍ2〜０．０５モル／ｍ2含有される。
【００７０】
本発明に用いられる無機銀塩、もしくは銀錯体は、還元可能な銀イオンを含む化合物である。好ましくは、還元剤の存在下で５０℃以上まで加熱されると、光に比較的に安定な金属銀を形成する無機銀塩、もしくは銀錯体である。
本発明に用いられる無機銀塩は、例えば、ハロゲン化銀（塩化銀、臭化銀、塩臭化銀、ヨウ化銀、塩ヨウ化銀、塩ヨウ臭化銀、およびヨウ臭化銀等）、チオ硫酸塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、又はアンモニウム塩等）の銀塩、チオシアン酸塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、又はアンモニウム塩等）の銀塩、および亜硫酸塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、又はアンモニウム塩等）の銀塩等が挙げられる。
【００７１】
本発明に用いられる無機銀塩は、好ましくはハロゲン化銀、硝酸銀である。
本発明に用いられるハロゲン化銀の粒子形成方法は、写真業界でよく知られており、例えば、リサーチディスクロージャー１９７８年６月の第１７０２９号、及び米国特許第３，７００，４５８号に記載されている方法を用いることができるが、具体的にはゼラチンあるいは他のポリマー溶液中に銀供給化合物（例えば、硝酸銀）及びハロゲン供給化合物を添加することにより調製される。
【００７２】
ハロゲン化銀の粒子サイズは、検査ノイズを小さくする上で微細であることが好ましく、具体的には０．２０μｍ以下、より好ましくは０．１０μｍ以下、更に好ましくはナノ粒子の範囲がよい。ここでいう粒子サイズとは、ハロゲン化銀粒子の投影面積（平板粒子の場合は主平面の投影面積）と同面積の円像に換算したときの直径をいう。
【００７３】
チオ硫酸銀、チオシアン酸銀、および亜硫酸銀等もハロゲン化銀と同様の粒子形成方法により銀供給化合物（例えば、硝酸銀）及びチオ硫酸塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、又はアンモニウム塩等）の銀塩、チオシアン酸塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、又はアンモニウム塩等）の銀塩、および亜硫酸塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、又はアンモニウム塩等）を混合することにより調製される。
【００７４】
また、一般に増幅液中の銀イオン濃度が高すぎると、増幅液中で銀イオンが還元されてしまうので、それを防ぐ為に錯化剤を用いて銀イオンが錯体を形成するようにしてもよい。このような錯化剤としては、グリシン、ヒスチジンのようなアミノ酸及び複素環式塩基や、イミダゾール、ベンズイミダゾール、ピラゾール、プリン、ピリジン、アミノピリジン、ニコチンアミド、キノリン、その他類似の芳香族複素環式系が知られており、例えばヨーロッパ特許第0293947号中に記載されている。また、錯塩形成剤としては、チオ硫酸塩やチオシアン酸塩なども用いることができる。本発明に用いられる銀錯体の具体例としては、例えば、チオ硫酸塩と銀イオンの錯体、チオシアン酸塩と銀イオンの錯体、またはこれらの複合銀錯体、および、シュガーチオン誘導体と銀イオンの錯体、環状イミド化合物（例えば、ウラシル、ウラゾール、５−メチルウラシル、バルビツール酸など）と銀イオンの錯体、１，１−ビススルホニルアルカン類と銀イオンの錯体である。本発明に用いられる好ましい銀錯体は、環状イミド化合物（例えば、ウラシル、ウラゾール、５−メチルウラシル、バルビツール酸など）と銀イオンの錯体である。
【００７５】
本発明に用いられる銀錯体は、通常知られている塩形成反応により調製することができる。例えば、水もしくは水混和性溶媒中で水溶性銀供給体（例えば、硝酸銀）と銀錯体に対応する配位子化合物とを混合することにより調製される。調製された銀錯体は、透析法もしくは限外濾過法などの公知の脱塩方法により副成する塩類を除去して用いることが出来る。
【００７６】
無機銀塩、もしくは銀錯体は、銀として一般に０．００１モル／ｍ2〜０．２モル／ｍ2、好ましくは０．０１モル／ｍ2〜０．０５モル／ｍ2含有される。
【００７７】
また、無機銀塩または銀錯体を使用する場合は、無機銀塩もしくは銀錯体の溶剤を含有することが好ましい。本発明に用いられる溶剤としては、上記の銀錯体の項で説明した銀錯体を形成する配位子として用いられる化合物が好ましく用いられる。例えば、チオ硫酸塩、チオシアン酸塩、シュガーチオン誘導体、環状イミド化合物、および１，１−ビススルホニルアルカン類糖である。本発明に用いられる溶剤として、より好ましくは、ウラシル、ウラゾール、５−メチルウラシル、バルビツール酸などの環状イミド化合物である。本発明に用いられる溶剤は、銀イオンに対してモル比で０．１モル〜１０モルの範囲で好ましく用いられる。
【００７８】
９．銀のための還元剤
銀イオンのための還元剤は、銀（Ｉ）イオンを銀に還元することができる無機・有機のいかなる材料、またはその混合物でも用いることができる。
無機還元剤としては、Fe2+、V2+、Ti3+、などの金属イオンで原子価の変化し得る還元
性金属塩、還元性金属錯塩が知られており、本発明に用いることができる。無機還元剤を用いる際には、酸化されたイオンを錯形成するか還元して、除去するか無害化する必要がある。例えば、Fe+2を還元剤として用いる系では、クエン酸やEDTAを用いて酸化物であるFe3+の錯体を形成し、無害化することができる。
本系ではこのような無機還元剤を用いることが好ましく、より好ましくはFe2+の金属塩が好ましい。
【００７９】
また、湿式のハロゲン化銀写真感光材料に用いられる現像主薬（例えばメチル没食子酸塩、ヒドロキノン、置換ヒドロキノン、３−ピラゾリドン類、ｐ−アミノフェノール類、ｐ−フェニレンジアミン類、ヒンダードフェノール類、アミドキシム類、アジン類、カテコール類、ピロガロール類、アスコルビン酸（またはその誘導体）、およびロイコ色素類）、および本分野での技術に熟練しているものにとって明らかなその他の材料は、たとえば米国特許第６，０２０，１１７号（バウアーほか）で記述されるように、本発明において用いることができる。
【００８０】
「アスコルビン酸還元剤」はアスコルビン酸、その誘導体との複合体を意味する。アスコルビン酸還元剤は下記のように多くの文献において記載されており、例えば米国特許第５，２３６，８１６号（Ｐｕｒｏｌほか）とその中で引用されている文献が挙げられる。
【００８１】
本発明における還元剤として、アスコルビン酸還元剤が好ましい。有用なアスコルビン酸還元剤は、アスコルビン酸と類似物、異性体とその誘導体を含む。そのような化合物は以下にあげるものであるが、これらに限定されるわけではない。
Ｄ−またはＬ−アスコルビン酸とその糖誘導体（例えばγ−ラクトアスコルビン酸、グルコアスコルビン酸、フコアスコルビン酸、グルコヘプトアスコルビン酸、マルトアスコルビン酸）、アスコルビン酸のナトリウム塩、アスコルビン酸のカリウム塩、イソアスコルビン酸（またはＬ−エリスロアスコルビン酸）、その塩（例えばアルカリ金属塩、アンモニウム塩または当技術分野において知られている塩）、エンジオールタイプのアスコルビン酸、エナミノールタイプのアスコルビン酸、チオエノ−ルタイプのアスコルビン酸）、たとえば米国特許第５，４９８，５１１、ＥＰ−Ａ−０５８５，７９２、ＥＰ−Ａ−０５７３７００、ＥＰ−Ａ−０５８８４０８、米国特許第５，０８９，８１９、米国特許第５，２７８，０３５、米国特許第５，３８４，２３２、米国特許第５，３７６，５１０、ＪＰ７−５６２８６、米国特許第２，６８８，５４９、およびＲｅｓｅａｃｈ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ３７１５２（１９９５年３月）に記載されているような化合物。
【００８２】
これらの化合物のうち、好ましくは、Ｄ、ＬまたはＤ，Ｌ−アスコルビン酸（そして、そのアルカリ金属塩）若しくはイソアスコルビン酸（またはそのアルカリ金属塩）であり、ナトリウム塩が好ましい塩である。必要に応じてこれらの還元剤の混合物を用いることができる。
【００８３】
ヒンダードフェノール類も単独で、または一つ以上の硬調化還元剤とコントラスト強化剤と組み合わせて好ましく用いられる。
ヒンダードフェノールは、ベンゼン環上に一つだけの水酸基を有し、少なくとも一つの置換基を水酸基に対してオルト位に有する化合物である。ヒンダードフェノール還元剤は複数の水酸基を別々のベンゼン環に持っていれば、複数の水酸基を有していて構わない。
ヒンダードフェノール還元剤は、たとえば、ビナフトール類（すなわちジヒドロキシビナフトール類）、ビフェノール類（すなわちジヒドロキシビフェノール類）、ビス（ヒドロキシナフチル）メタン類、ビス（ヒドロキシフェニル）メタン類（すなわちビスフェノール類）、ヒンダ−ドフェノール類、およびヒンダードナフトール類が挙げられ、これらは置換されていて構わない。
【００８４】
代表的なビナフトール類は以下に挙げられる化合物であるが、これらに制限されることはない。
１，１’−ビ−２−ナフトール、１，１’−ビ−４−メチル−２−ナフトール、および米国特許第３，０９４，４１７号と米国特許第５，２６２，２９５号に記載されている化合物。
【００８５】
代表的なビフェノール類は以下に挙げられる化合物であるが、これらに制限されることはない。
２−（２−ヒドロキシ−３−ｔ−ブチル−５−メチルフェニル）−４−メチル−６−ｎ−ヘキシルフェノール、４，４’−ジヒドロキシ−３，３’，５，５’−テトラ−ｔ−ブチルビフェニル、４，４’−ジヒドロキシ−３，３’，５，５’−テトラメチルビフェニル、および米国特許第５，２６２，２９５号に記載の化合物。
【００８６】
代表的なビス（ヒドロキシナフチル）メタン類は以下に挙げられる化合物であるが、これらに制限されることはない。
４，４’−メチレンビス（２−メチル−１−ナフト−ル）、米国特許第５，２６２，２９５号に記載の化合物。
【００８７】
代表的なビス（ヒドロキシフェニル）メタン類は以下に挙げられる化合物であるが、これらに制限されることはない。
ビス（２−ヒドロキシ−３−ｔ−ブチル−５−メチルフェニル）メタン（ＣＡＯ−５）、１，１’−ビス（２−ヒドロキシ−３，５−ジメチルフェニル）−３，５，５−トリメチルヘキサン（ＮＯＮＯＸまたはＰＥＲＭＡＮＡＸ  ＷＳＯ）、１，１’−ビス（３，５−ｄｉ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）メタン、２，２’−ビス（４−ヒドロキシ−３−メチルフェニル）プロパン、４，４’−エチリデン−ビス（２−ｔ−ブチル−６−メチルフェノ−ル）、２，２’−イソブチリデン−ビス（４，６−ジメチルフェノ−ル）（ＬＯＷＩＮＯＸ  ２２１Ｂ４６）、２，２’−ビス（３，５−ジメチル−４−ヒドロキシフェニル）プロパン、および米国特許第５，２６２，２９５号に記載の化合物。
【００８８】
代表的なヒンダードフェノールは以下に挙げられる化合物であるが、これらに制限されることはない。
２，６−ジ−ｔ−ブチルフェノール、２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルフェノール、２，４−ジ−ｔ−ブチルフェノール、２，６−ジクロロフェノール、２，６−ジメチルフェノール、および２−ｔ−ブチル−６−メチルフェノール。
【００８９】
代表的なヒンダードナフトールは以下に挙げられる化合物であるが、これらに制限されることはない。
１−ナフトール、４−メチル−１−ナフトール、４−メトキシ−１−ナフトール、４−クロロ−１−ナフトール、２−メチル−１−ナフトール、および米国特許第５，２６２，２９５号に記載の化合物。
【００９０】
その他、下記の化合物の還元剤として開示されている。
アミドキシム類（例えばフェニルアミドキシム）、２−チエニルアミドキシム、ｐ−フェノキシフェニルアミドキシム、脂肪族カルボン酸アリルヒドラジドとアスコルビン酸の組み合わせ（例えば２，２’−ビス（ヒドロキシメチル）−プロピオニル−β−フェニルヒドラジドとアスコルビン酸の組み合わせ）、ポリヒドロキシベンゼンとヒドロキシルアミン、レダクトンおよびヒドラジンの少なくとも一方の組み合わせ（たとえばヒドロキノンとビス（エトキシエチル）ヒドロキシルアミンの組み合わせ）、ピペリジ−４−メチルフェニルヒドラジン、ヒドロキサム酸（例えばフェニルヒドロキサム酸、ｐ−ヒドロキシフェニルヒドロキサム酸、およびｏ−アラニンヒドロキサム酸）、アジンとスルホンアミドフェノール類の組合せ（たとえばフェノチアジンと２，６−ジクロロ−４−ベンゼンスルホンアミドフェノール）、α−シアノフェニル酢酸誘導体（例えばエチル−α−シアノ−２−メチルフェニル酢酸、エチル−α−シアノフェニル酢酸）、ビス−ｏ−ナフトール（例えば２，２’−ジヒドロキシ−１−ビナフチル、６，６’−ジブロモ−２，２’−ジヒドロキシ−１，１’−ビナフチル、ビス（２−ヒドロキシ−１−ナフチル）メタン）、
【００９１】
ビス−ナフト−ルと１，３−ジヒドロキシベンゼン誘導体の組み合わせ（例えば２，４−ジヒドロキシベンゾフェノン、２，４−ジヒドロキシアセトフェノン）、５−ピラゾロン（例えば３−メチル−１−フェニル−５−ピラゾロン）、レダクトン類（例えばジメチルアミノヘキソ−スレダクトン、アンヒドロジヒドロ−アミノヘキソ−スレダクトン、またはアンヒドロジヒドロ−ピペリドン−ヘキソースレダクトン）、インダン−１，３−ジオン類（例えば２−フェニルインダン−１，３−ジオン）、クロマン類（例えば２，２−ジメチル−７−ｔ−ブチル−６−ヒドロキシクロマン）、１，４−ジヒドロキシピリジン類（例えば２，６−ジメトキシ−３，５−ジカルベトキシ−１，４−ジヒドロピリジン）、アスコルビン酸誘導体（１−アスコルビン酸パルミテ−ト、アスコルビン酸ステアレ−ト）、不飽和アルデヒド（ケトン）、３−ピラゾリドン類。
【００９２】
本発明に用いることのできる還元剤として、米国特許第５，４６４，７３８に記載されるようなスルホニルヒドラジンを含む置換ヒドラジンがある。この他の有用な還元剤は、例えば、米国特許第３，０７４，８０９、米国特許第３，０９４，４１７、米国特許第３，０８０，２５４および米国特許第３，８８７，４１７に記載されている。米国特許第５，９８１，１５１に記載の補助還元剤もまた有用である。
【００９３】
還元剤として、ヒンダードフェノール還元剤とその他以下に挙げるような様々な補助還元剤から選ばれる化合物と組み合わせて用いられる場合もある。さらにコントラスト強化剤を加えた３成分の還元剤の混合物もまた有用である。補助還元剤としては米国特許第５，４９６，６９５に記載のトリチルヒドラジド、ホルミル−フェニルヒドラジドを用いることができる。
【００９４】
コントラスト強化剤を還元剤とともに用いることができる。コントラスト強化剤としては例えば、下記の化合物が有用であるが、これらに限定されるわけではない。
ヒドロキシルアミン（ヒドロキシルアミンとアルキルとアリ−ル置換誘導体を含む）、米国特許第５，５４５，５０５に記載のアルカノールアミンとフタル酸アンモニウム、米国特許第５，５４５，５０７に記載のヒドロキサム酸化合物、米国特許第５，５５８，９８３に記載のＮ−アシルヒドラジン化合物、米国特許第５，６３７，４４９に記載の水素原子ドナー化合物。
【００９５】
全ての還元剤と有機銀塩の組み合わせが等しく効果があるわけではない。好ましい組合せの一つは、有機銀塩としてベントリアゾ−ルの銀塩又はその置換化合物、又はその混合物と、還元剤としてアスコルビン酸型還元剤である。
【００９６】
本発明における還元剤は、有機銀中の銀に対して１質量％〜１０質量％（乾燥質量）含まれる。多層構造において、還元剤が有機銀塩を含む層以外の層に加えられるならば、わずかに割合は高く、およそ２質量％〜１５質量％がより望ましい。補助還元剤は、およそ０．００１質量％〜１．５質量％（乾燥重）含まれる。
【００９７】
１０．その他の助剤
増幅液のその他の助剤としては、緩衝剤、防腐剤、例えば酸化防止剤または有機安定剤、速度調節剤を含む場合がある。緩衝剤としては、例えば、酢酸、クエン酸、水酸化ナトリウムまたはこれらのどれかの塩、またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いた緩衝剤、その他一般的化学実験に用いられる緩衝剤を用いることができる。これら緩衝剤を適宜用いて、その増幅液に最適なｐＨに調整することができる。
【００９８】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００９９】
（１）インフルエンザA型B型検出イムノクロマトキットの作成
（1-1）抗インフルエンザA型B型抗体修飾金コロイドの作成
（1-1-1）抗インフルエンザA型抗体修飾金コロイドの作成
直径50 nm金コロイド溶液（EM.GC50、BBI社）9 mLに50 mM KH2PO4バッファー（pH 7.5）1mLを加えることでpHを調整した金コロイド溶液に、90 μg / mLの抗インフルエンザA型モノクローナル抗体（Anti-Influenza A SPTN-5 7307、Medix Biochemica社）溶液1 mLを加え攪拌した。10分間静置した後、1%ポリエチレングリコール（PEG Mw.20000、品番168-11285、和光純薬）水溶液を550 μL加え攪拌し、続いて10 %牛血清アルブミン（BSA FractionV、品番A-7906、SIGMA）水溶液を1.1 mL加え攪拌した。この溶液を8000×ｇ、４ ℃、30分遠心（himacCF16RX、日立）した後、1 mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散した。この後、20 mLの金コロイド保存液（20 mM Tris-HClバッファー(pH 8.2), 0.05 % PEG（Mw.20000）, 150 mM NaCl, 1 % BSA, 0.1 % NaN3）に分散し、再び8000×ｇ、４℃、30分間遠心した後、1 mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散し、抗体修飾金コロイド（50 nm）溶液を得た。
【０１００】
（1-1-2）抗インフルエンザB型抗体修飾金コロイドの作成
直径50 nm金コロイド溶液（EM.GC50、BBI社）9 mLに50 mM KH2PO4バッファー（pH 8.0 ）1mLを加えることでpHを調整した金コロイド溶液に、80 μg / mLの抗インフルエンザB型モノクローナル抗体（MONOTOPE aby Influenza B Virus (nuclear) Purified 1131、ViroStat, Inc.）溶液1 mLを加え攪拌した。10分間静置した後、1%ポリエチレングリコール（PEG Mw.20000、品番168-11285、和光純薬）水溶液を550 μL加え攪拌し、続いて10 %牛血清アルブミン（BSA FractionV、品番A-7906、SIGMA）水溶液を1.1 mL加え攪拌した。この溶液を8000×ｇ、４ ℃、30分遠心（himacCF16RX、日立）した後、1 mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散した。この後、20 mLの金コロイド保存液（20 mM Tris-HClバッファー(pH 8.2), 0.05 % PEG（Mw.20000）, 150 mM NaCl, 1 % BSA, 0.1 % NaN3）に分散し、再び8000×ｇ、４℃、30分間遠心した後、1 mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散し、抗体修飾金コロイド（50 nm）溶液を得た。
【０１０１】
（1-2）金コロイド抗体保持パットの作成
（1-1）で作成したインフルエンザA型、B型抗体修飾金コロイドを、ODの比で1:1となるように混合し、金コロイド塗布液（20 mM Tris-Hclバッファー(pH 8.2), 0.05 % PEG（Mw.20000）, 5 % スクロース）及び水により希釈し、520 nmのODが3.0となるように希釈した。この溶液を、8 mm×150 mmに切ったグラスファイバーパッド（Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社）1枚あたり0.8 mLずつ均一に塗布し、一晩減圧乾燥し、金コロイド抗体保持パッドを得た。
【０１０２】
（1-3）抗体固定化メンブレン（クロマトグラフ担体）の作成
25 mm×200 mmに切断したニトロセルロースメンブレン（プラスチックの裏打ちあり,膜厚約0.13 mm、HiFlow Plus HF120、ミリポア社）に関し以下のような方法により抗体を固定し抗体固定化メンブレンを作成した。メンブレンの長辺を下にし、下から７ mmの位置に、1.5 mg / mLとなるように調製した固定化用抗インフルエンザA型モノクローナル抗体（Anti-Influenza A SPTN-5 7307、Medix Biochemica社）溶液をインクジェット方式の塗布機（BioDot社）を用いて幅0.7mm程度のライン状に塗布した。同様に、下から10 mmの位置に、1.5 mg / mLとなるように調製した固定化用抗インフルエンザB型モノクローナル抗体（MONOTOPE aby Influenza B Virus (nuclear) Purified 1131、ViroStat, Inc.）溶液を幅0.7mm程度のライン状に塗布した。さらに同様に、下から13 mmの位置に、0.5 mg / mLとなるように調製したコントロール用抗マウスIgG抗体（抗マウスIgG(H+L),ウサギF(ab')2, 品番566-70621、和光純薬）溶液をライン状に塗布した。塗布したメンブレンは、温風式乾燥機で50℃、30分間乾燥した。ブロッキング液（0.5 w%カゼイン（乳由来、品番030-01505、和光純薬）含有50 mMホウ酸バッファー(pH 8.5)）500 mLをバットに入れ、そのまま30分間静置した。その後、同様のバットに入れた洗浄・安定化液（0.5 w%スクロースおよび0.05 w%コール酸ナトリウムを含む50 mM Tris-HCl（pH 7.5）バッファー）500 mLに移して浸し、そのまま30分間静置した。メンブレンを液から取り出し、室温で一晩乾燥し、抗体固定化メンブレンとした。
【０１０３】
（1-4）イムノクロマトグラフキットの組み立て
バック粘着シート（ARcare9020、ニップンテクノクラスタ社）に、（1-3）で作成した抗体固定化メンブレンを貼り付けた。その際メンブレン長辺側のうち、抗インフルエンザA型抗体ライン側を下側とする。抗体固定化メンブレンの下側に約2 mm重なるように2で作成した金コロイド抗体保持パッドを貼り付け、約4 mm重なるようにして金コロイド抗体保持パッド下側に試料添加パッド（18 mm×150 mmに切ったグラスファイバーパッド（GlassFiber Conjugate Pad、ミリポア社））を重ねて貼り付けた。さらに、抗体固定化メンブレンの上側には約5 mm重なるように吸収パッド（80 mm×150 mmに切ったセルロース・グラス膜（CF6、ワットマン社））を重ねて貼り付けた。これら重ね張り合わせた部材（イムノクロマト本体部材）を、部材の長辺側を15 mm幅になるように短辺に平行にギロチン式カッター（CM4000、ニップンテクノクラスタ社）切断していくことで、15 mm×55 mmのイムノクロマト用ストリップを作成した。これらを試験用イムノクロマトキットとした。
【０１０４】
（1-5）洗浄液
ＰＢＳバッファー（和光純薬）に1重量％のBSA（シグマ社）を溶解した1％BSA入りPBSバッファーを洗浄液とした。
【０１０５】
（1-6）銀増幅液の作成
（1-6-1）増幅液Ａの作成
（1-6-1-1)増幅液A-1の作成
水325gに、硝酸鉄（III）九水和物（和光純薬、095-00995）を水に溶解して作成した1mol/Lの硝酸鉄水溶液40mL、クエン酸（和光純薬、038-06925）10.5g、ドデシルアミン（和光純薬、123-00246）0.1g、界面活性剤Ｃ9Ｈ19-Ｃ6Ｈ4-Ｏ-（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）50Ｈ  0.44gを溶解させる。全て溶解したら、スターラーで攪拌しながら硝酸（10重量%,）を40mL加える。この溶液80mLを測りとり、硫酸アンモニウム鉄（II）六水和物（和光純薬、091-00855）を11.76g加えこれを増幅液A-1とした。
【０１０６】
（1-6-1-2）増幅液A-2の作成
硝酸銀溶液10ｍＬ（10ｇの硝酸銀を含む）に水を加えて全体量が100gとなるようにし、増幅液A-2（10重量%硝酸銀水溶液）を作成した。
【０１０７】
（1-6-1-3）増幅液Ａの作成
増幅液A-1 40mLを測りとり、増幅液A-2を4.25mL加え攪拌し、増幅液Ａとした。
【０１０８】
（２）評価
＜比較例1＞  0度方向からの洗浄
（2-1）洗浄液による洗浄
検体液として、クイックS-インフルA・B「生研」陰性/陽性コントロール（品番322968、デンカ生研）を使用した。１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳバッファーでこの陽性コントロール液を希釈し、市販イムノクロマト検出キット「キャピリアFluA+B」（アルフレッサファーマ）による検出限界はA型B型とも1/40であった。今回は１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳバッファーで、この陽性コントロールを希釈し、1/200に希釈し、これを検体液として用いた。
【０１０９】
（1-4）で作成した試験用イムノクロマトグラフキットの試料添加パットに、検体液を300μＬ均一になるように滴下し、１０分静置した。この際、今回の濃度では検出限界濃度（本キットの場合も同液1/40希釈液）以下であり、目視で検出ラインを確認することはできない。このメンブレンをケースから取り出し、サンプルパット、吸水パットをはずした。2本の捕捉部位（TL）の間のエリアのうちストリップの両端から真ん中になる点を、洗浄液添加用パットと吸水用パットとを結ぶ直線が通るようにし、この洗浄液展開方向と検体液展開方向とのなす角が0度となるようにして、洗浄液展開の上流端となる端に洗浄液添加用パット（18 mm×8mmに切ったグラスファイバーパッド（Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社）に13mm×8mmのバック粘着シート（ARcare9020、ニップンテクノクラスタ社）を貼ったもの）をテーフ゜で貼り付け、下流端となる端に吸水用パット（100mm×8mmに切ったセルロースメンブレン（CF6、ワットマン社）に95mm×8mmに切ったバック粘着シート（ARcare9020、ニップンテクノクラスタ社）を貼ったもの）を貼り付け、洗浄液を10mL入れた直方体の入れ物（縦9mm×横64mm×高25mm）に洗浄液添加用パットが液に漬かるように立てかけ、このまま10分間洗浄した。この際の吸水用パットを外し、重量を測定し、その後このパットを１時間真空乾燥し、水分を完全に乾燥させた。乾燥後に再び重量を測定し、乾燥前の重量から乾燥後の重量を差し引くことで、吸水パットの含水量を測定した。その結果、パットの洗浄液吸水量は96mgであった。洗浄液の比重を1とし、洗浄液吸水量は96mμLであった。この量が洗浄液の流れた量と見積もった。流路の幅は、吸水パット及び洗浄液添加パットの全面に洗浄液が添加されているとし、吸水パットの幅8ｍｍの流路で流れているとした。そこで、1分間あたり、展開流路1mmあたりの流速は、96/（10×8）＝1.2μL/分・ｍｍと求められ、このようにして求められた流速を洗浄液の流速とした。
【０１１０】
本実験において、洗浄時の洗浄液入れ物の形状に依存する液面の高さ、及びイムノクロマトグラフキットの試料添加パッドの形状・材質、実験環境（温度、湿度）、吸収パットの材質・厚み、吸収パットとニトロセルロースメンブレンとの接合、などは洗浄液の吸水スピード・量を変化させる要因であり、実験において、一定に保つことが必要である。この洗浄液の吸水スピード・量は、最終的な洗浄の効果（金微粒子の残存量の減少）を左右する要因である。今回の実験は、気温22±3℃、湿度50±15%にて行った。
【０１１１】
（2-2）増幅液によるシグナル増幅、バックグランド評価
吸水パットを取り除き、（1-6）で作成した増幅液Aを40mL入れたプラスチックトレイに浸漬し、振とう器で振とうしながら、２分間銀増幅を行った。このメンブレンを増幅液から取り出し、3分間よく水洗した。これをイムノクロマトグラフ用濃度測定器（ICA-1000、浜松ホトニクス）を用いて測定し、リファレンス白板に対する反射光学濃度を測定した。2回測定し、その平均を小数点以下第4位を四捨五入し、バックグランド測定結果とした。測定位置は、2本の捕捉部位（TL）の中心、かつメンブレンの２本の捕捉部位で囲まれるエリアのうちメンブレンの両端から真ん中になる点を測定した。これの濃度をバックグランド濃度として表１に示す。
【０１１２】
また、全く金コロイドを流さなかったメンブレンでの増幅後の濃度、および、（2-1）
において洗浄操作を行わなかったメンブレンの増幅後の濃度も共に示した。この値を各測定したバックグランッド濃度から引いたものを、残存金によるバックグランド金に起因するバックグランドと考え、表１にあわせて示した。
【０１１３】
（2-3）ラインの見えやすさの評価
（2-2）で増幅した際の検出ラインの見やすさをバックグランドとのコントラストが取
れて見やすいほうから順に、◎、○、△、×、××（見えない）、で評価した。結果を表１に示す。
【０１１４】
＜実施例１＞  30度方向からの洗浄
（2-1）で、洗浄液展開方向と検体液展開方向とのなす角が30度となるようにした。他
は（2-1）から（2-3）と同様に実験を行った。洗浄液の流速は1.2μL/分・mmであった。
【０１１５】
＜実施例２＞  45度方向からの洗浄
（2-1）で、洗浄液展開方向と検体液展開方向とのなす角が45度となるようにした。他
は（2-1）から（2-3）と同様に実験を行った。洗浄液の流速は1.3μL/分・mmであった。
【０１１６】
＜実施例3＞  60度方向からの洗浄
（2-1）で、洗浄液展開方向と検体液展開方向とのなす角が60度となるようにした。他
は（2-1）から（2-3）と同様に実験を行った。洗浄液の流速は1.3μL/分・mmであった。
【０１１７】
＜実施例4＞  90度方向からの洗浄
（2-1）で、洗浄液展開方向と検体液展開方向とのなす角が90度となるようにした。他
は（2-1）から（2-3）と同様に実験を行った。洗浄液の流速は1.6μL/分・mmであった。
【０１１８】
＜実施例5＞  120度方向からの洗浄
（2-1）で、洗浄液展開方向と検体液展開方向とのなす角が120度となるようにした。他は（2-1）から（2-3）と同様に実験を行った。洗浄液の流速は1.4μL/分・mmであった。
【０１１９】
＜実施例6＞  135度方向からの洗浄
（2-1）で、洗浄液展開方向と検体液展開方向とのなす角が135度となるようにした。他は（2-1）から（2-3）と同様に実験を行った。洗浄液の流速は1.4μL/分・mmであった。
【０１２０】
＜実施例7＞  150度方向からの洗浄
（2-1）で、洗浄液展開方向と検体液展開方向とのなす角が150度となるようにした。他は（2-1）から（2-3）と同様に実験を行った。洗浄液の流速は1.3μL/分・mmであった。
【０１２１】
＜実施例8＞  170度方向からの洗浄
（2-1）で、洗浄液展開方向と検体液展開方向とのなす角が170度となるようにした。他は（2-1）から（2-3）と同様に実験を行った。洗浄液の流速は1.2μL/分・mmであった。
【０１２２】
＜実施例9＞  180度方向からの洗浄
（2-1）で、洗浄液展開方向と検体液展開方向とのなす角が180度となるようにした。他は（2-1）から（2-3）と同様に実験を行った。洗浄液の流速は1.2μL/分・mmであった。
【０１２３】
＜結果＞
0度洗浄に比べ、異なった角度から洗浄した実施例1〜9すべてで洗浄後のバックグランドノイズが下がった。洗浄によりバックグランドに非特異的に存在する標識の金が洗い流され、増幅後のバックグランドノイズが下がったと考えられる。洗浄の角度と非特異的に残存する標識化物質によるバックグランドとの関係を図４に示す。
特に45度から170度、その中でもさらに60度から170度、さらには60度から135度において大きくバックグランドノイズが下がった。バックグランドノイズが下がったサンプルでは、検出ラインとバックグランドとのコントラストが向上し、視認度が上がった。
【０１２４】
還元剤液での洗浄
＜実施例10＞90度方向からの増幅液の還元剤での洗浄
（2-1）で、洗浄液展開方向と検体液展開方向とのなす角が90度となるようにした。洗浄液として、（1-6-1-1)で示した還元剤成分を増幅液の一液である増幅液A-1を用いた。他は（2-1）から（2-3）と同様に実験を行った。洗浄液の流速は1.4μL/分・mmであった。
【０１２５】
＜比較例2＞90度方向からのバッファーでの洗浄
（2-1）で、洗浄液展開方向と検体液展開方向とのなす角が0度となるようにした。他は（2-1）から（2-3）と同様に実験を行った。洗浄液の流速は1.6μL/分・mmであった。
【０１２６】
＜結果＞
洗浄後のバックグランドの金量は、所定の洗浄を行った後、抗体固定メンブレンの抗体を塗布した部位（補足部位）のメンブレンの下流側２mm幅を切り出し、王水により金を抽出した後、高分解能ICP質量分析装置（HR-ICP-MS）を用いて金の絶対量を定量した。その金量から、金コロイドの粒子径を50nmとして、金コロイド個数に換算し示した。結果を図５に示す。９０度から洗浄し、さらに洗浄液を、増幅液の一液である還元剤液で洗浄したところ、さらにバックグランド金量を低減させられることができた。
【０１２７】
洗浄時間と洗浄
＜実施例１１＞
（2-1）で、洗浄液展開方向と検体液展開方向とのなす角が90度となるようにした。洗浄時間を0秒、5秒、10秒、30秒、60秒、180秒、300秒、420秒、600秒、とした。
【０１２８】
＜比較例3＞
（2-1）で、洗浄液展開方向と検体液展開方向とのなす角が0度となるようにした。洗浄時間を0秒、5秒、10秒、30秒、60秒、180秒、300秒、420秒、600秒、とした。
【０１２９】
＜結果＞
洗浄後のバックグランドの金量は、所定の洗浄を行った後、抗体固定メンブレンの抗体を塗布した部位（補足部位）のメンブレンの下流側２mm幅を切り出し、王水により金を抽出した後、高分解能ICP質量分析装置（HR-ICP-MS）を用いて金の絶対量を定量した。その金量から、金コロイドの粒子径を50nmとして、金コロイド個数に換算し示した。結果を図６に示す。比較例３に比べ、実施例１１では洗浄が早く行え、10秒で残存金量を1/8以下にできた。
【０１３０】
また、実施例11に関しては、（2-2）で示した方法により増幅を行い、その後のテストラインを目視で評価し、見やすいほうから順に、◎、○、××（見えない）、で評価した。結果を表２に示す。420秒以上の洗浄においては、感度の低下が起こり始めており、洗浄過剰による特異的にテストラインにトラップされた金の流出が起こってしまっていると考えられる。
【０１３１】
【表１】
2009216695.tif 000002
【０１３２】
【表２】
2009216695.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】図１は、本発明の洗浄を行うイムノクロマトグラフキットの平面図を模式的に示す。
【図２】図２は、イムノクロマトグラフ用ストリップの詳細な構成の模式的な平面図を示す。
【図３】図３は、図２で示されたイムノクロマトグラフ用ストリップの縦断面を模式的に示す縦断面図である。
【図４】図４は、洗浄の角度と非特異的に残存する標識化物質によるバックグランドとの関係を示す。
【図５】図５は、増幅液の還元剤による洗浄を行った場合と、バッファーによる洗浄を行った場合のバックグランド金量を測定した結果を示す。
【図６】図６は、洗浄時間を変化させた場合の洗浄効果を測定した結果を示す。
【図１】
2009216695.tif 000004
【図２】
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【図３】
2009216695.tif 000006
【図４】
2009216695.tif 000007
【図５】
2009216695.tif 000008
【図６】
2009216695.tif 000009