(57)【要約】【課題】本発明は、血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の増殖方法を提供することを課題とする。また、本発明は血管に優しい血液の浄化方法を提供することを課題とする。さらには、血管に優しい血液浄化用デバイスを提供することを課題とする。【解決手段】血液と特定の高分子材料を接触させることにより、ＥＰＣマーカーであるＣＤ３４抗原やＶＥ-カドヘリンが細胞表面にあらわれたＣＤ３４＋細胞やＶＥ-カドヘリン＋細胞の割合が増加する。即ち、ＥＰＣが刺激されて、血管内皮細胞に分化することで、血管の損傷を修復するため、血管に優しい血液の浄化方法を提供することができる。つまり、特定の高分子材料を用いた血液浄化用デバイス、即ち体外循環材料を用いて血液を浄化することによる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液を合成高分子材料と接触させることを特徴とする血液中の血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の増殖方法。
【請求項２】
血液の浄化方法において、血液と合成高分子材料を接触させることにより血液中に含まれる血管内皮前駆細胞を増殖させる工程を含む、血液の浄化方法。
【請求項３】
血管内皮前駆細胞の増殖が、ＣＤ３４抗原陽性細胞の増加を指標とする、請求項２に記載の血液の浄化方法。
【請求項４】
血管内皮前駆細胞の増殖が、ＶＥ-カドヘリン陽性細胞の増加を指標とする、請求項２又は３に記載の血液の浄化方法。
【請求項５】
血液の浄化に使用するデバイスであって、該デバイスにおいて血液との接触面部分に合成高分子材料が付与されていることを特徴とする血液浄化用デバイス。
【請求項６】
前記血液浄化用デバイスが、体外循環材料である請求項５に記載の血液浄化用デバイス。
【請求項７】
前記合成高分子材料が、ポリメチルメタクリレート、ポリスルホン酸、ポリアクリロニトリル膜、エチレン-ビニルアルコール共重合体、ポリエステル系ポリマーアロイ、ポリエーテルスルホン及びセルローストリアセテートからなる群から選択されるいずれかである請求項５又は６に記載の血液浄化用デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管内皮前駆細胞（endothelial progenitor cell: EPC）の増殖方法に関する。より詳しくは、体外循環材料（透析膜）を用いて体外に取り出した血液を処理することにより、血液中の血管内皮前駆細胞を増殖させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性腎不全患者に対してその血液を体外循環させ、透析器にて血液浄化する血液透析装置は広く利用される。血液透析装置には、体外循環材料（透析膜）が備えられており、患者の身体から抜き出した血液を体外循環材料に通し、同時に該体外循環材料に別の装置で作製された透析液を通過させ、血液と透析液とを血液透析装置を介して接触させる仕組みになっている。かかる血液透析装置を用いることにより、血液中の老廃物である尿素、クレアチン、尿酸などの低分子代謝物を透析液中に拡散させ、同時に水分を限外濾過によって取り除き、結果として血液が浄化される。
【０００３】
慢性腎不全の透析患者には虚血性疾患が多く、末梢血中の血管内皮前駆細胞（以下単に「ＥＰＣ」ともいう。）が減少し機能低下していることが報告されている。動脈などの血管は内膜、中膜、外膜の３層構造からなる。内膜と中膜は内弾性板により、中膜は外弾性板により外膜と隔てられている。弾性板は膠原線維や弾性線維から成り立ち動脈の弾力性や強靱さを維持する。内膜には血液と接して重要な役割を果たす血管内皮細胞（ＥＣ）があり、中膜には血管の収縮、弛緩を調節する血管平滑筋細胞がある。血管障害として、血管内皮細胞が傷害を受けている場合が多い。
【０００４】
血管内皮細胞層は、正常な血管壁の重要な構成成分であり、血流と血管壁の周囲組織との間の界面を提供する。血管内皮細胞はまた、血管新生、炎症、及び血栓予防を含む生理学的事象にも関与している。脈管構造を構成する血管内皮細胞に加え、最近の研究では血管内皮細胞及びＥＰＣが、出生後に末梢血中を循環することが明らかになっている（非特許文献１〜５）。生体の血管再生は、周囲の既存血管から血管内皮細胞が増殖・遊走する血管新生(angiogenesis)の他に、末梢血中に循環するＥＰＣが、新たに血管が形成されつつある局所に取り込まれ、分化・増殖し、新規血管を形成(vasculogenesis)するメカニズムがある事も明らかになってきた。また、ＥＰＣは心筋虚血モデルや下肢虚血モデルにおいて血管の新規形成を促進するともいわれている。
【０００５】
従って、透析患者の場合は、血管障害を伴う患者も多く含まれることから、血管に優しい体外循環材料（透析膜）が必要とされる。
【非特許文献１】Science 275: 964-7 (1997)
【非特許文献２】Blood 90: 5002-5012 (1997)
【非特許文献３】Blood 92: 362-367 (1998)
【非特許文献４】Blood 95: 3106-3112 (2000)
【非特許文献５】J Clin Invest. 105: 71-77 (2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の増殖方法を提供することを課題とする。また、血管に優しい血液の浄化方法を提供することを課題とする。さらには、血管に優しい血液浄化用デバイスを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、血液と特定の高分子材料を接触させることにより、ＥＰＣマーカーであるＣＤ３４抗原やＶＥ-カドヘリンが細胞表面にあらわれたＣＤ３４＋細胞やＶＥ-カドヘリン＋細胞の割合が増加することを見出した。即ち、増加したＥＰＣが刺激されて、血管内皮細胞に分化することで、血管の損傷を修復するため、血管に優しい血液の浄化方法を提供することができ、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は以下よりなる。
１．血液を合成高分子材料と接触させることを特徴とする血液中のＥＰＣの増殖方法。
２．血液の浄化方法において、血液と合成高分子材料を接触させることにより血液中に含まれるＥＰＣを増殖させる工程を含む、血液の浄化方法。
３．ＥＰＣの増殖が、ＣＤ３４抗原陽性細胞の増加を指標とする、前項２に記載の血液の浄化方法。
４．ＥＰＣの増殖が、ＶＥ-カドヘリン陽性細胞の増加を指標とする、前項２又は３に記載の血液の浄化方法。
５．血液の浄化に使用するデバイスであって、該デバイスにおいて血液との接触面部分に合成高分子材料が付与されていることを特徴とする血液浄化用デバイス。
６．前記血液浄化用デバイスが、体外循環材料である前項５に記載の血液浄化用デバイス。
７．前記合成高分子材料が、ポリメチルメタクリレート、ポリスルホン酸、ポリアクリロニトリル膜、エチレン-ビニルアルコール共重合体、ポリエステル系ポリマーアロイ、ポリエーテルスルホン及びセルローストリアセテートからなる群から選択されるいずれかである前項５又は６に記載の血液浄化用デバイス。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のＥＰＣの増殖方法により、血液を合成高分子材料と接触させない場合に比べて、有意にＥＰＣの増殖を認めた。このＥＰＣの増殖方法は、例えば透析処理を行うなどの通常の血液浄化方法において適用することができる。通常の透析処理の際に、血液を合成高分子材料と接触させることにより達成することができる。増殖したＥＰＣが血管内皮細胞に分化し、浄化した血液を生体内に戻した際に、血管の損傷を軽減化できる。又は、ＥＰＣを刺激することにより、ＥＰＣが血管内皮細胞に分化し、浄化した血液を生体内に戻した際に、血管の損傷を軽減化できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のＥＰＣの増殖方法は、血液と高分子材料を接触させることを特徴とすることにより達成される。本発明の血液浄化方法において、ＥＰＣの増殖方法を適用することができる。具体的には、例えば透析処理を行うなどの通常の血液浄化方法において、血液と高分子材料を接触させることを特徴とする。
【００１１】
本発明において、ＥＰＣの増殖は、ＣＤ３４抗原陽性細胞及び／又はＶＥ-カドヘリン陽性細胞の増加を指標とすることができる。
ここでＣＤ３４抗原陽性（ＣＤ３４＋）細胞とは細胞表面にＣＤ３４抗原を表現している細胞をいう。ＣＤ３４抗原は、分子量約１１０ｋＤａの短鎖膜貫通型リン酸化糖タンパク質であり、細胞外部に大きさの異なる２つのドメインを有する。そのうち、膜近傍領域（Ｃ末端領域）は、アミノ酸が約１１０個の大きさで、球状構造からなる。もう一方のＮ末端領域は、アミノ酸約１４０個の大きさで、Ｎ−結合型糖鎖とシアル酸を含むＯ−結合型糖鎖が数多く付加している。ＣＤ３４抗原は、最も未分化な多能性幹細胞と全細胞系統の造血前駆細胞に発現するといわれている。本発明において、ＣＤ３４＋細胞を指標とするのは、ＥＰＣの増加によりＣＤ３４＋細胞が増加すると判断されるからである。ＥＰＣの増加により、浄化した血液を生体内に戻した際に、ＥＰＣが血管内皮細胞へ分化し、傷害を受けた血管を修復するものと考えられる。
また、カドヘリン (Cadherin) とは細胞表面に表現される糖タンパク質の一群で、細胞接着をつかさどる分子であり、動物の胚発生に重要な役割を果たす。
【００１２】
本発明における高分子材料は、人工透析治療において使用しうる血液浄化用デバイスの一部又は全部を構成することができる。特に高分子材料が血液浄化用デバイスの一部を構成する場合には、該デバイスにおいて血液との接触面に合成高分子材料が付与されていることを特徴とする。本発明において血液浄化用デバイスとは、即ち体外循環材料（透析膜）であってもよい。
【００１３】
本発明は、前記血液浄化用デバイスにも及ぶ。人工透析治療は、人体の血液を体外に誘導し、半透膜である体外循環材料を介して血液と透析液を接触させ、血液中の血球や有用タンパク質等は透過せずに、本来尿中に排出させるべき尿素、クレアチン、尿酸等の老廃物を除去して、浄化された血液を体内に戻す療法である。本発明のＥＰＣの増殖方法は、人工透析治療の際に人体の血液を体外に誘導したものについて、高分子材料と接触させることにより達成することができる。
【００１４】
本発明における合成高分子材料として、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリスルホン酸（ＰＳＰＴ）、ポリアクリロニトリル膜、エチレン-ビニルアルコール共重合体、ポリエステル系ポリマーアロイ、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）及びセルローストリアセテート（ＣＴＡ）を例示することができる。特に好適には、ポリメチルメタクリレート、ポリスルホン酸、ポリエーテルスルホンが挙げられる。
【実施例】
【００１５】
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００１６】
（実施例１）体外循環材料による末梢血のＥＰＣ増加について１
本実施例では、血液浄化方法に使用する体外循環材料の末梢血でのＥＰＣ増加を、ＣＤ３４抗原陽性（ＣＤ３４＋）細胞を指標とし、in vitroにて確認した。
【００１７】
１）ラット
ＳＤラットで１０週齢の雌を使用した。これらのラットから、ネンブタール麻酔下で、ＩＶＣ（個別換気ケージシステム）より約７ｍＬ／匹の血液を採取した。
体外循環材料として、以下を使用した。
【００１８】
２）体外循環材料（透析膜）
i)   ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）中空糸膜（カバー付）：ＧＢ−Ｕ（東レの透析用人工腎臓製品：製品名“フィルトライザー”）の膜
ii)  ＰＭＭＡ中空糸膜（カバーなし）
iii) ポリスルホン（ＰＭＰＴ）中空糸膜：ＴＳ−ＵＬ（東レの透析用人工腎臓製品：製品名“トレスルホン”）の膜
【００１９】
３）血液と体外循環材料との接触
約５ｍＬの血液を５０ｍＬのポリプロピレンチューブを用いて、各体外循環材料（ＰＭＭＡ（カバー付・カバーなし）やポリスルホンと接触させ、３７℃の温浴槽にて１時間振盪混和し、インキュベーションした。対照として、２ｍＬの血液のみも同様にインキュベーションした。
【００２０】
４）処置血液のラットへの静注
インキュベーション後の各体外循環材料と接触させた血液及び対照を、ネンブタール麻酔下でラットの大腿骨静脈に、２ｍＬ静脈投与した。
【００２１】
５）ＣＤ３４＋細胞の検出
末梢血と体外循環材料を接触してインキュベーションした前後での、ＥＰＣマーカーの一つであるＣＤ３４＋細胞の変動を調べた。体外循環材料との接触全血をラットに静注した後、２４時間及び６５時間後に尾静脈より採取したラット末梢血中のＣＤ３４＋細胞の変動を調べた。
ＣＤ３４＋細胞の測定は、血液をACK lysing buffer (Ammonium Chloride Potassium)処理にて赤血球を破壊した後、抗ＣＤ３４抗体及びウサギ−抗ラット-FITC 抗体を用いて染色し、フローサイトメーターセルソーター（ＦＡＣＳシステム）にて末梢血中のＣＤ３４＋発現細胞の割合を調べた。
【００２２】
６）結果
ラット末梢血と体外循環材料との接触１時間後のＣＤ３４＋の割合（％）を図１に示した。ラット血液をＰＭＭＡやポリスルホンなどの体外循環材料と共に、３７℃で１時間インキュベーションすると、体外循環材料を加えなかった対照コントロールの血液と比べ、接触血液中のＣＤ３４＋細胞の割合が有意に増加した。また、ＰＭＭＡのカバーなしの方が、ＰＭＭＡのカバー付に比べ、接触血液中のＣＤ３４＋細胞の増加を有意に促進させた。
【００２３】
（実施例２）体外循環材料による末梢血のＣＤ３４＋細胞の増加について
本実施例では、図２に示す方法に従い、血液浄化方法に使用する体外循環材料の末梢血でのＥＰＣ増加能をＣＤ３４＋細胞の増加を指標として確認した。本実施例では、死細胞染色用蛍光色素PI(Propidium Iodide)で染色された死細胞を除去して解析した点で、実施例１とは相違する。
【００２４】
１）ラット
ＳＤラットで８週齢又は１６週齢の雌を使用した。これらのラットから、ネンブタール麻酔下で、ＩＶＣより約７ｍＬ／匹の血液を採取した。
体外循環材料として、以下を使用した。
【００２５】
２）体外循環材料（透析膜）
i)   ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）中空糸膜（カバー付）：ＢＧ−Ｕ（東レの透析用人工腎臓製品：製品名“フィルトライザー”）の膜
ii)  ＰＭＭＡ中空糸膜（カバーなし）
iii)   ポリスルホン（ＰＳＰＴ）中空糸膜（カバー付）：ＴＳ−ＵＬ（東レの透析用人工腎臓製品：製品名“トレスルホン”）の膜
iv)  ＰＳＰＴ中空糸膜（カバーなし）
v)  エチレン-ビニルアルコール共重合体（ＥＶＡＬ(R)−Ｄ）中空糸膜（クラレメディカル株式会社）
vi)  ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）中空糸膜
vii)  セルローストリアセテート（ＣＴＡ）中空糸膜
【００２６】
３）血液と体外循環材料との接触
約８ｍＬの血液を５０ｍＬのポリプロピレンチューブ内で、上記各体外循環材料と接触させ、３７℃の温浴槽にて１時間振盪混和し、インキュベーションした。対照として、２ｍＬの血液のみも同様にインキュベーションした。
【００２７】
４）処置血液のラットへの静注
インキュベーション後の各体外循環材料と接触させた血液及び対照を、ネンブタール麻酔下でラットの大腿骨静脈に、２ｍＬ静脈投与した。
【００２８】
５）ＣＤ３４＋細胞の検出
末梢血と体外循環材料を接触してインキュベーションした前後での、ＣＤ３４＋細胞の変化を調べた。体外循環材料との接触全血をラットに静注にて返血後、２４時間、４８時間及び７２時間後に尾静脈より採取したラット末梢血についてＣＤ３４＋細胞の変化を調べた。
【００２９】
血液をACK lysing buffer処理にて赤血球を破壊した後、ウサギ-抗ラット-ＣＤ３４-FITC抗体及びアイソタイプ対照抗体にて染色し、フローサイトメーターセルソーター（ＦＡＣＳシステム）にて末梢血細胞中のＣＤ３４＋発現の割合を調べた。死細胞除去のため、ＰＩ色素で染色されなかった細胞を集めて、ＣＤ３４＋発現の割合を調べた。
【００３０】
６）結果
ラット末梢血と体外循環材料との接触１時間後のＣＤ３４＋細胞の割合（％）を図３に示した。その結果、ＣＴＡに接触したときＣＤ３４＋細胞の割合はごくわずかに増加したが、その他は殆ど増加しなかった。実施例１と本実施例の結果の違いは、ＰＩ染色により死細胞を除去したことによる非特異反応が除去されたものと考えられる。
本実験結果より、末梢血と体外循環材料とを接触させてもすぐにＣＤ３４＋細胞が生じるわけではないことが確認された。
【００３１】
（実施例３）ＣＤ３４＋細胞の末梢血中への誘導
本実施例では、実施例２及び図２に示す方法に従い、ラットに返血後１日目、２日目、３日目でのＣＤ３４＋細胞の誘導割合（％）を測定し、その結果を図４に示した。その結果、ＰＥＳについてラットに返血後１日で有意にＣＤ３４＋細胞の割合が増加することが確認されたが、２日以降はＣＤ３４＋細胞の割合が低下し、対照との差が認められなかった。ＰＳＰＴ(カバー付)、ＰＭＭＡ(カバー付)についても、同様の傾向が認められた。
【００３２】
（実施例４）ＣＤ３４＋細胞の割合
本実施例では、実施例２及び図２に示す方法に従い、ラットに返血後１日目でのＣＤ３４＋の分布（％）を図５に示した。本結果では、ＰＥＳ及びＰＳＰＴについてラットに返血後１日で有意にＣＤ３４＋細胞の割合が増加し、ＰＭＭＡについても若干増加することが確認された。
【００３３】
（実施例５）ＶＥ-カドヘリン＋細胞の末梢血中への誘導
本実施例では、実施例２及び図２に示す方法に従い、ＥＰＣマーカーのひとつであるＶＥ-カドヘリンについてラットに返血後１日目、２日目、３日目での陽性細胞の割合（％）を図６に示した。本結果では、ＰＭＭＡ、ＰＳＰＴについてラットに返血後１日及び２日目で有意にＶＥ-カドヘリン＋細胞の割合が増加することが確認されたが、３日以降はＶＥ-カドヘリン＋細胞の割合が低下し、対照との差が認められなかった。
【００３４】
（実施例６）ＶＥ-カドヘリン＋細胞の割合
本実施例では、実施例２及び図２に示す方法に従い、ラットに返血後１日目でのＶＥ-カドヘリン＋細胞の分布（％）を図７に示した。本結果では、ＰＳＰＴ（カバー付）についてラットに返血後１日で有意にＶＥ-カドヘリン＋細胞の割合が増加し、ＰＳＰＴ（カバーなし）、ＰＭＭＡ（カバーなし）についても若干増加することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
上記詳述したように、ＰＭＭＡ等の合成高分子材料を血液に接触させることにより、ＥＰＣマーカーであるＣＤ３４抗原やＶＥ-カドヘリンが細胞表面に表現されたＣＤ３４＋細胞やＶＥ-カドヘリン＋細胞の割合が増加することが確認された。これにより、特定の合成高分子材料、例えばＰＭＭＡ透析膜などの体外循環材料を用いて透析処理を行うなどの血液浄化処理を行うと、得られた血液においてＥＰＣの増加が認められ、血管に優しい血液の浄化方法を提供することができる。したがって、血管に優しい血液浄化用デバイス、すなわち透析膜を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】各種高分子材料を用いて処理したときのＣＤ３４＋細胞の分布を示す図である。（実施例１）
【図２】各種高分子材料を用いて処理するときの処理方法を示す図である。（実施例２）
【図３】各種高分子材料を用いて処理したときのＣＤ３４＋細胞の分布を示す図である。（実施例２）
【図４】各種高分子材料を用いて処理したときの末梢血におけるＣＤ３４＋細胞の誘導を示す図である。（実施例３）
【図５】各種高分子材料を用いて処理したときの末梢血におけるＣＤ３４＋細胞の分布を示す図である。（実施例４）
【図６】各種高分子材料を用いて処理したときの末梢血におけるＶＥ-カドヘリン＋細胞の誘導を示す図である。（実施例５）
【図７】各種高分子材料を用いて処理したときの末梢血におけるＶＥ-カドヘリン＋細胞の分布を示す図である。（実施例６）
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図２】
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