(57)【要約】【課題】、発酵乳の生理機能を増強、品質安定化、おいしさを向上させる発酵乳添加剤を提供する。【解決手段】  平均鎖長が３．５以上でありかつキシロビオース含有量が２５％以下であることを特徴とするキシロオリゴ糖を有効成分として含有する発酵乳添加剤。酸性キシロオリゴ糖を有効成分として含有する発酵乳添加剤。酸性キシロオリゴ糖が、１分子中に少なくとも１つ以上のウロン酸残基を側鎖として有する前記発酵乳添加剤。ウロン酸が、グルクロン酸もしくは４−Ｏ−メチル−グルクロン酸である前記発酵乳添加剤。キシロオリゴ糖又は酸性キシロオリゴ糖が、「リグノセルロース材料を酵素的及び／又は物理化学的に処理してキシロオリゴ糖成分及び酸性キシロオリゴ糖成分とリグニン成分の複合体を得、次いで該複合体を酸加水分解処理することによって得られたキシロオリゴ糖混合物を分離して得たもの」である前記発酵乳添加剤。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均鎖長が３．５以上でありかつキシロビオース含有量が２５％以下であることを特徴とするキシロオリゴ糖を有効成分として含有することを特徴とする発酵乳添加剤。
【請求項２】
酸性キシロオリゴ糖を有効成分として含有することを特徴とする発酵乳添加剤。
【請求項３】
酸性キシロオリゴ糖が、１分子中に少なくとも１つ以上のウロン酸残基を側鎖として有することを特徴とする請求項２に記載の発酵乳添加剤。
【請求項４】
ウロン酸が、グルクロン酸もしくは４−Ｏ−メチル−グルクロン酸であることを特徴とする請求項３に記載の発酵乳添加剤。
【請求項５】
キシロオリゴ糖又は酸性キシロオリゴ糖が、「リグノセルロース材料を酵素的及び／又は物理化学的に処理してキシロオリゴ糖成分及び酸性キシロオリゴ糖成分とリグニン成分の複合体を得、次いで該複合体を酸加水分解処理することによって得られたキシロオリゴ糖混合物を分離して得たもの」であることを特徴とする請求項１もしくは請求項２のいずれかに記載の発酵乳添加剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発酵乳に添加することで、発酵乳の持つ生理機能を増強し、同時に発酵乳の品質安定化やおいしさの向上を可能にする発酵乳添加剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、我が国において生活習慣病の増加が問題となっている。生活習慣病の原因の多くは、生活習慣の乱れによるものである。例えば、食生活におけるカロリーの過剰摂取や栄養バランスの不均衡、人体に悪影響を及ぼす種々の環境汚染物質の混入、更には周囲の環境からくる精神的なストレスなどが、生活習慣を悪化させる問題として近年顕著化している。
このような環境の中で、少しでも生活習慣病にかかる時期を遅らせようというのが、予防医学の概念であり、その為には日常の食生活に少なからず工夫を加えることが必要である。
【０００３】
食品の栄養素は、主に生体を構成するタンパク質、脂質、糖質の３つの栄養素に加え、生命活動の基本となる種々の代謝を円滑に行うのに必要なビタミン類、ミネラル類の２つを加えた５大栄養素が基本となっている。また、近年になって認知された食物繊維は、上記栄養素を吸収する腸管機能の調節という重要な役割を担っている。現代の栄養学では、５大栄養素と食物繊維を合わせた６大栄養素を偏り無く摂取することを推奨し、「一日３０品目」といった食生活の指導の基本となっている。しかし、現代人を取り巻く環境は必ずしもこのような理想の食生活を送ることができなくなっている。
そこで提唱されるのが、３次機能（代謝調節、生体防御、疾病予防、疾病回復、老化防止などの体調調節機能）を持つ食品の摂取である。例えば、特定保健用食品の関与成分として広く認知されている発酵乳類（プロバイオティクス）やオリゴ糖類（プレバイオティクス）は、整腸作用に加え、花粉症やアトピー性皮膚炎の症状を緩和する作用等の幅広い分野での利用が期待されている（非特許文献１参照）。
【０００４】
ところで、前記プロバイオティクスやプレバイオティクスのそれぞれの効果を増強することを目的として、両者を配合したシンバイオティクスと定義される商品が開発されている（非特許文献１参照）。
シンバイオティクスは、例えば乳酸菌等の乾燥粉末とオリゴ糖を適当な比率で混合したものがあり、その形態は顆粒、粉末、カプセル錠、タブレット錠、チュアブル錠等が挙げられる。
しかし、代表的なプロバイオティクス食品である発酵乳はｐＨが低いため、プレバイオティクスを配合する場合、低ｐＨ条件下での安定性が必要である。また、添加したプレバイオティクスが、発酵乳中の乳酸菌によって消費されてしまう。
従って、発酵乳にプレバイオティクスを配合した場合、プレバイオティクスの減少や、乳酸菌による過発酵のための品質低下が起きやすい等の問題があった。
【０００５】
以上のような背景から、発酵乳中で安定であり、乳酸菌に影響を与えず、かつ、風味や栄養面での機能を損なわないプレバイオティクスとしての発酵乳添加剤が求められていた。
【０００６】
上記のような発酵乳添加剤としては、ガラクトオリゴ糖やキシロオリゴ糖が挙げられ、これらのオリゴ糖を含有する発酵乳が販売されている。
ガラクトオリゴ糖は酸や熱に比較的安定であり、発酵乳添加剤としては優れた素材である。しかし、ガラクトオリゴ糖は乳酸菌に資化されるため、発酵乳添加剤として使用した場合に、発酵過程や保存期間中にガラクトオリゴ糖が分解されたり、製造過程における過発酵や保存期間中の発酵乳の品質低下などが懸念される
一方、キシロオリゴ糖は、ガラクトオリゴ糖と同様に酸や熱に安定であり、乳酸菌にも資化されないため、発酵乳の品質に影響を与えにくい。
【０００７】
現在市販されているキシロオリゴ糖は、コーンコブ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）をキシラナーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．由来）で酵素反応させて得られた、キシロビオースを主成分(28％以上)とするものである（非特許文献２参照）。キシロビオースはビフィズス菌に対する資化性に優れており、おなかの調子を整える特定保健用食品（個別申請型および規格基準型）の関与成分として広く使われている。しかし、キシロビオースのような重合度の低いオリゴ糖は、重合度の高いキシロオリゴ糖よりも甘みが強く、添加する食品によっては不必要な甘みを付与する等の問題があった。
コーンコブ以外の原料を用いたキシロオリゴ糖の製造方法としては、広葉樹キシランを酸加水分解や飽和水蒸気処理による方法が報告されている。しかし、これらの方法で得られたキシロオリゴ糖は、キシロビオースとキシロトリオースで３０％近くを占めており、前述のコーンコブ由来のキシロオリゴ糖と同様の問題があった（非特許文献３参照）。
【０００８】
【非特許文献１】Curr  Opin  Biotechnol．  2002  Oct；13（５）：490−496．
【非特許文献２】食安発第０７２１００１号  平成１８年７月２１日「特定保健用食品（規格基準型）の成分規格の一部改正等について」
【非特許文献３】ウッドケミカルスの最新技術；第４章「ヘミセルロースの利用技術」  清水一允  、シーエムシー出版（２０００年）
【非特許文献４】日本農芸化学会大会講演要旨集  2005年度大会(札幌)  ：264
【非特許文献５】日本薬学会第127年会(2007年)要旨集4：60
【特許文献１】特開２００１−２２６４０９号公報
【特許文献２】特開２００３−１８３１３３号公報
【特許文献３】特開２００３−２２１３０７号公報
【特許文献４】特開２００７−０４９９５３号公報
【特許文献５】特開２００４−１８２６２１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、発酵乳に添加することで、発酵乳の持つ生理機能を増強し、同時に発酵乳の品質安定化やおいしさの向上を可能にする発酵乳添加剤を提供することである。
【００１０】
本発明者らは前記課題を解決する為、鋭意研究した結果、キシロオリゴ糖または酸性キシロオリゴ糖を発酵乳に添加することで、発酵乳の持つ生理機能を増強し、同時に発酵乳の品質安定化やおいしさの向上を可能にすることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
なお、リグノセルロース材料よりキシロオリゴ糖、酸性キシロオリゴ糖を得る方法、及び、その方法によって得られたキシロオリゴ糖、酸性キシロオリゴ糖は特徴的な構造を有し、多くの生理活性を有することが本出願人らによって明らかになっている(特許文献１〜５参照)。
本発明は、これらのキシロオリゴ糖、酸性キシロオリゴ糖を有効成分として含有する新規な発酵乳添加剤に関するものである。
【００１２】
本発明は以下の構成を採用する。
即ち、本発明の第１は、平均鎖長が３．５以上でありかつキシロビオース含有量が２５％以下であることを特徴とするキシロオリゴ糖を有効成分として含有する発酵乳添加剤である。
【００１３】
本発明の第２は、酸性キシロオリゴ糖を有効成分として含有する発酵乳添加剤である。
【００１４】
本発明の第３は、酸性キシロオリゴ糖が、１分子中に少なくとも１つ以上のウロン酸残基を側鎖として有する本発明の第２に記載の発酵乳添加剤である。
【００１５】
本発明の第４は、ウロン酸が、グルクロン酸もしくは４−Ｏ−メチル−グルクロン酸である本発明の第３に記載の発酵乳添加剤である。
【００１６】
本発明の第５は、キシロオリゴ糖又は酸性キシロオリゴ糖が、「リグノセルロース材料を酵素的及び／又は物理化学的に処理してキシロオリゴ糖成分及び酸性キシロオリゴ糖成分とリグニン成分の複合体を得、次いで該複合体を酸加水分解処理することによって得られたキシロオリゴ糖混合物を分離して得たもの」であることを本発明の第１もしくは第２のいずれかに記載の発酵乳添加剤である。
【００１７】
本発明の発酵乳添加剤は、平均鎖長が３．５以上でありかつキシロビオース含有量が２５％以下であることを特徴とするキシロオリゴ糖、または、酸性キシロオリゴ糖を有効成分として含有するものである。重合度が高く、甘みの少ないキシロオリゴ糖が、本発明の発酵乳添加剤の有効成分として適している。
キシロオリゴ糖とは、キシロースの２量体であるキシロビオース、３量体であるキシロトリオース、あるいは４量体〜２０量体程度の重合体である。
本発明で使用するキシロオリゴ糖の重合度は、単一重合度のキシロオリゴ糖の場合、３．５〜２０が好ましく、５〜１０がより好ましい。
また、本発明においては、異なる重合度を有する複数のキシロオリゴ糖の混合組成物もキシロオリゴ糖と称する。キシロオリゴ糖は、天然物から製造することが一般的であるため、実際にはこのような混合組成物として得られることが多い。該混合組成物の平均重合度は、キシロオリゴ糖のキシロース鎖長の平均値で示される。
本発明で使用するキシロオリゴ糖の平均重合度は、３．５〜２０が好ましく、３．５〜６．５がより好ましい。
なお、キシロオリゴ糖組成物に含まれるキシロース鎖長の上限と下限の差は、２０以下が好ましく、１５以下がより好ましい。
また、キシロオリゴ糖組成物中のキシロビオース含有量は、２５％以下であることが好ましく、１０％以下であることがより好ましい。
【００１８】
また、本発明で発酵乳添加剤の有効成分となる酸性キシロオリゴ糖とは、該キシロオリゴ糖１分子中に、少なくとも１つ以上のウロン酸側鎖を有するものを言う。１分子中のウロン酸側鎖の個数は、平均１〜５個が好ましく、平均１〜２個がより好ましい。
ウロン酸は、天然に存在するものとしてグルクロン酸、４−Ｏ−メチルグルクロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、イズロン酸等が挙げられる。
本発明に使用する酸性キシロオリゴ糖のウロン酸側鎖としては、特に限定されないが、グルクロン酸もしくは４−Ｏ−メチルグルクロン酸が好ましい。
本発明で使用する酸性キシロオリゴ糖の重合度は、単一重合度の酸性キシロオリゴ糖の場合、１〜３０が好ましく、５〜２０がより好ましい。
また、異なる重合度を有する複数の酸性キシロオリゴ糖の混合組成物である酸性キシロオリゴ糖の平均重合度は、４〜２０のものが好ましく、７〜１３がより好ましい。また、多分散度は１〜２が好ましく、１〜１．６がより好ましい。
尚、本発明において、酸性キシロオリゴ糖の分子中のウロン酸の結合位置は特に限定されない。結合の種類も特に限定されないが、キシロースの２位とウロン酸の１位が結合したα−１，２結合のものが好ましい。
【００１９】
キシロオリゴ糖の製造方法としては、（１）加圧加熱、爆砕又はアルカリ処理等の糖化処理を行ない、直接キシロオリゴ糖液を製造する方法、（２）加圧加熱、アルカリ加熱処理や抽出、精製したキシランを出発原料とし、これに酵素を作用させて糖化処理してキシロオリゴ糖液を製造する方法、（３）植物体の原料を細片化し、アルカリ加熱処理後、直接酵素を作用させて糖化処理してから固液分離し、キシロオリゴ糖液を製造する方法、（４）リグノセルロース材料を酵素的及び／又は物理化学的に処理してキシロオリゴ糖成分とリグニン成分の複合体を得、次いで該複合体を酸加水分解処理してキシロオリゴ糖混合物を得、得られるキシロオリゴ糖混合物から、キシロオリゴ糖と１分子中に少なくとも１つ以上のウロン酸残基を側鎖として有する酸性キシロオリゴ糖を分離する方法が挙げられる。
本発明で使用するキシロオリゴ糖および酸性キシロオリゴ糖の製造方法については、特に限定するものではないが、（４）の製造方法が、比較的高い重合度のものを大量に安価に製造することが可能である点で特に好ましい。以下にその概要を示す。
【００２０】
キシロオリゴ糖および酸性キシロオリゴ糖は、化学パルプ由来のリグノセルロース材料を原料とし、加水分解工程、濃縮工程、希酸処理工程、精製工程を経て得ることができる。加水分解工程では、希酸処理、高温高圧の水蒸気（蒸煮・爆砕）処理もしくは、ヘミセルラーゼによってリグノセルロース中のキシランを選択的に加水分解し、オリゴ糖とリグニンからなる高分子量の複合体を中間体として得る。濃縮工程では逆浸透膜等により、オリゴ糖−リグニン様物質複合体が濃縮され、低重合度のオリゴ糖や低分子の夾雑物などを除去することができる。濃縮工程は逆浸透膜を用いることが好ましいが、限外濾過膜、塩析、透析などでも可能である。得られた濃縮液の希酸処理工程により、複合体からリグニン様物質が遊離し、キシロオリゴ糖と酸性キシロオリゴ糖を含む希酸処理液を得ることができる。この時、複合体から切り離されたリグニン様物質は酸性下で縮合し沈殿するのでセラミックフィルターや濾紙などを用いたろ過等により除去することができる。希酸処理工程では、酸による加水分解を用いることが好ましいが、リグニン分解酵素などを用いた酵素分解などでも可能である。
【００２１】
精製工程は、限外濾過工程、脱色工程、吸着工程からなる。一部のリグニン様物質は可溶性高分子として溶液中に残存するが、限外濾過工程で除去され、着色物質等の夾雑物は活性炭を用いた脱色工程によってそのほとんどが取り除かれる。限外濾過工程は限外濾過膜を用いることが好ましいが、逆浸透膜、塩析、透析などでも可能である。こうして得られた糖液中にはキシロオリゴ糖と酸性キシロオリゴ糖が溶解している。イオン交換樹脂を用い、キシロオリゴ糖および酸性キシロオリゴ糖を分離・精製することができる。糖液をまず強陽イオン交換樹脂にて処理し、糖液中の金属イオンを除去する。ついで強陰イオン交換樹脂を用いて糖液中の硫酸イオンなどを除去する。この工程では、硫酸イオンの除去と同時に弱酸である有機酸の一部と着色成分の除去も同時に行っている。強陰イオン交換樹脂で処理された糖液はもう一度強陽イオン交換樹脂で処理し更に金属イオンを除去する。最後に弱陰イオン交換樹脂で処理し、酸性キシロオリゴ糖を樹脂に吸着させる。キシロオリゴ糖は電荷を持たないため、最後の弱陰イオン交換樹脂の非吸着画分から得ることができる。このようにして得られたキシロオリゴ糖溶液から、スプレードライや凍結乾燥処理等により、白色のキシロオリゴ糖組成物の粉末を得ることができる。
【００２２】
弱陰イオン交換樹脂に吸着した酸性キシロオリゴ糖を、低濃度の塩（ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２など）によって溶出させることにより、夾雑物を含まない酸性キシロオリゴ糖溶液を得ることができる。このとき、溶出してきた酸性キシロオリゴ糖溶液を更に強陽イオン交換樹脂で処理することで、塩から遊離の酸に変換することが可能である。また、陽イオン交換樹脂での処理時間を調節することで、塩と遊離の酸の比率を任意に変更することが可能である。このようにして得られた酸性キシロオリゴ糖溶液から、スプレードライや凍結乾燥処理等により、白色の酸性キシロオリゴ糖組成物の粉末を得ることができる。
【００２３】
上記製造方法のメリットは、前述の通り、経済性と平均重合度の高いキシロオリゴ糖及び酸性キシロオリゴ糖が容易に得られる点にある。なお、この方法で得られるキシロオリゴ糖及び酸性キシロオリゴ糖の平均重合度は、例えば、希酸処理条件を調節するか、再度ヘミセルラーゼで処理する等の方法によって変えることが可能である。
【００２４】
本発明は、上記したキシロオリゴ糖、または酸性キシロオリゴ糖を有効成分とする発酵乳添加剤である。発酵乳添加剤は、これらのキシロオリゴ糖および酸性キシロオリゴ糖のみを成分とするものでもよく、これらを任意の他成分と組み合わせた組成物であってもよい。
上記発酵乳添加剤は、単独で用いることが可能である。または、当該分野で公知の固体又は液体の賦形剤とともに用いて、発酵乳添加剤とすることができる。
【００２５】
固体の賦形剤としては、乳糖、ショ糖、ブドウ糖、コーンスターチ、ゼラチン、澱粉等が挙げられる。また、液体の賦形剤としては、水、グリセリン、脂肪油、ソルビトール等が挙げられる。
【００２６】
本発明の発酵乳添加剤が添加される発酵乳とは、乳等省令によって定義される「はつ酵乳」、及び同省令によって定義される「乳酸菌飲料」である。
【００２７】
本発明で用いるキシロオリゴ糖を１日１ｇ摂取することで整腸効果を発揮することが、ヒト介入試験により確認されている(非特許文献4参照)。また、本発明で用いる酸性キシロオリゴ糖を、アトピー性皮膚炎モデルマウスに体重１ｋｇあたり０．１ｇ摂取させることで、皮膚炎症状の悪化を抑制することが確認されている(非特許文献５参照)。本結果から、ヒトにおいては一日あたり０．１〜１ｇの摂取で効果を発揮すると考えられる。よって、キシロオリゴ糖または酸性キシロオリゴ糖の一日あたりの摂取量が０．１〜１ｇ程度になるように発酵乳に添加することが望ましい。添加量としては、発酵乳の種類や形態によってその量を適宜調節することが可能であるが、有効成分であるキシロオリゴ糖、または酸性キシロオリゴ糖を、０．０１〜１０質量％添加することが好ましく、０．１質量％〜５質量％添加することがより好ましい。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
【００２９】
＜分析法の概要＞
本発明におけるキシロオリゴ糖および酸性キシロオリゴ糖の物理化学的性質の分析法を以下に示した。
（１）  全糖量の定量
全糖量は検量線をＤ−キシロース（和光純薬工業（株）製）を用いて作製し、フェノール硫酸法（還元糖の定量法  第２版、学会出版センター発行：ＩＳＢＮ  ４−７６２２−０１０２−２）にて定量した。
（２）  還元糖量の定量
還元糖量は検量線をＤ−キシロース（和光純薬工業（株）製）を用いて作製、ソモジ−ネルソン法（還元糖の定量法  第２版、学会出版センター発行：ＩＳＢＮ  ４−７６２２−０１０２−２）にて定量した。
（３）  ウロン酸量の定量
ウロン酸は検量線をＤ−グルクロン酸（和光純薬工業（株）製）を用いて作製、カルバゾール硫酸法の変法（Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５４，４８４−４８９）にて定量した。酸性キシロオリゴ糖の１分子当たりのウロン酸個数は、下式によって求めた。
１分子当たりのウロン酸個数  ＝  ウロン酸濃度  ÷  還元糖濃度
（４）  平均重合度の決定法
糖液の全糖濃度と還元糖濃度を測定し、下式によって平均重合度を求めた。
平均重合度  ＝  全糖濃度  ÷  還元糖濃度
（５）キシロオリゴ糖の分子量分布分析法
キシロオリゴ糖の重合度分布は、イオンクロマトグラフ（ダイオネクス社製  ＤＸ５００糖分析システム）を使用し、カラムはＣａｒｂｏ  Ｐａｃ  ＰＡ−１０（４．６×２５０ｍｍ）を用いた。溶離液には、Ａ液として０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液を、Ｂ液として０．５Ｍ  ＣＨ３ＣＯＯＮａを含む０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液を用い、流速は１ｍｌ／ｍｉｎとした。Ａ液からＢ液への直線的濃度勾配の溶出条件は以下の通りで行った。尚、検出にはパルスアンペロメトリック電気化学検出器  ＥＤ５０を用いた。
０〜１０ｍｉｎ    Ａ  １００％、Ｂ  ０％
１０〜３０ｍｉｎ  Ａ  ６０％、Ｂ  ４０％
得られたクロマトグラムから各重合度のキシロオリゴ糖の分布と、重合度の上限と下限の差を求めた。
（６）キシロオリゴ糖組成物中のキシロビオース濃度測定法
前述（５）に記載の装置、カラム、溶離液、検出器を用い、溶出条件も同様に設定した上で、サンプルに内部標準としてゲンチオビオース（和光純薬製）を用い、ゲンチオビオースとキシロビオースの面積比から、サンプル中のキシロビオースの含有量を求めた。
（７）酸性キシロオリゴ糖の分子量分布分析法
酸性キシロオリゴ糖の分子量分布は、ゲル濾過クロマトグラフィー法によって分析した。Ｗａｔｅｒｓ製Ａｌｌｉａｎｃｅ  （２６９５  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｍｏｄｕｌｅ）を使用し、カラムはＳＨＯＤＥＸ製ＯＨｐａｋ  ＳＢ−８０３  ＨＱ（８．０×３００ｍｍ）とＯＨｐａｋ  ＳＢ−８０２．５  ＨＱ（８．０×３００ｍｍ）を直列に接続して用いた。カラムオーブンは５０℃に設定した。溶離液には０．２Ｍ  ＮａＣｌ溶液を用い、流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎとした。検出は示差屈折系（２４１４  ＲＩ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を用いた。分子量分布の標準曲線の作成には、プルランの標準品（Ｓｈｏｄｅｘ製ＳＴＡＮＤＡＲＤ  Ｐ−８２）を用いた。尚、低分子のオリゴ糖画分の標準品としてはグルコースＭ．Ｗ．１８０）およびマルトトリオース（Ｍ．Ｗ．５０４）、マルトヘプタオース（Ｍ．Ｗ．１１５２）を用いた。得られた酸性キシロオリゴ糖のクロマトグラフィーと、分子量標準曲線から、酸性キシロオリゴ糖の分子量分布（プルラン換算）および多分散度を求めた。
【００３０】
＜キシロオリゴ糖および酸性キシロオリゴ糖の調製＞
本発明で使用するキシロオリゴ糖及び酸性キシロオリゴ糖の調製方法を以下に示す。
（１）原料として、国内産広葉樹チップ２０％、ユーカリ材８０％からなる混合広葉樹チップをクラフト蒸解、酸素脱リグニンを行ったパルプを用いた。６０℃の高温水を用いて、パルプ濃度を１．６％に希釈し、容積１０ｍ3のタンクに受け入れた。続いて、タンクに濃硫酸を添加、攪拌してｐＨ５．５に調整した後、ドラムフィルター（新菱製作所製：φ2000×600SUF）でパルプを脱水洗浄した。脱水後のパルプ濃度は約２０％であった。この２０％パルプに５０℃の温水を加え、パルプ濃度を１０％に希釈すると同時に、キシラナーゼコンクが対パルプ５０〔ユニット／ｇ〕となるように連続添加して、トランポスクリューで十分に混合した。混合後のパルプを中濃度ポンプ（新菱製作所製：200×RPK）で容積２ｍ3の円筒型反応槽（φ800ｍｍ×4000ｍｍH）に押し込み、反応時間が４０分間となるように連続処理した後、反応後のパルプをスクリュープレス（新菱製作所製：250×1000SPH−EN）で約４０％に脱水して、パルプのキシラナーゼ反応濾液を得た。反応開始から６０分目以降は、５０℃温水ではなく、キシラナーゼ反応濾液の５０質量％をトランポスクリューに戻し、ドラムフィルターで脱水した２０％パルプを１０％に希釈してキシラナーゼ処理を連続的に行った。反応開始１５０分目以降には、キシラナーゼ反応濾液中の全糖濃度は０．９２％に増加しており、このときのキシロオリゴ糖の平均重合度は４．７であった。このようなパルプに対するキシラナーゼ処理を２４時間連続して実施することにより、反応開始１５０分目以降、糖濃度約０．９％の反応濾液を安定して取り出すことができ、最終的に糖濃度０．９％のキシラナーゼ反応濾液を１５ｍ3得ることができた。得られた反応濾液を、ミクロンレート１μｍのバックフィルター（ISPフィルターズ製）、続いてミクロンレート０．２μｍのセラミックフィルター（日本ポール製）で濾過して、清澄な反応濾液を得た。更に逆浸透膜（日東電工製：ＮＴＲ−７４５０）で１５倍に濃縮することにより、全糖濃度１１％の濃縮液を１ｍ3得ることができた。
【００３１】
（２）上記により得られた濃縮糖液１ｍ3を、濃硫酸を用いてｐＨ３．５に調整後、１２１℃で４５分間酸処理した。５０℃まで冷却した後、酸処理後に生成した不溶性残渣をミクロンレート０．２μｍのセラミックフィルター（日本ポール製）で除去して、ＵＦ膜（クラレ製：MU−６０２５）で脱色後、更に活性炭（三倉化成製：PM−SX）を１０ｋｇ添加して、５０℃・２時間処理して、脱色処理した糖液を得た。得られた糖液を、ＳＶ１．５で強カチオン樹脂（三菱化学製：PK−２１８、３００L）→弱アニオン樹脂（三菱化学製：WA３０、３００L）→強カチオン樹脂（三菱化学製：PK−２１８、３００L）→弱アニオン樹脂（三菱化学製：WA３０、３００L）からなる４床４塔式でイオン交換処理して脱塩・脱色することにより、精製済みのキシロオリゴ糖溶液（糖濃度４．３％、１１００L）を得た。得られたキシロオリゴ糖溶液を、スプレードライヤー（大川原化工機製：ODA−２５型）で処理して、４５ｋｇのキシロオリゴ糖粉末を得た。
ここで得られたキシロオリゴ糖の平均重合度は５．１であった。
また、重合度の上限と下限の差は１３であり、キシロビオースの含有量は６．７％であった。
尚、キシロオリゴ糖の重合度分布を示したクロマトグラフを図１に示した。
【００３２】
（３）前項（２）で、精製済みのキシロオリゴ糖溶液を得た後、２塔目及び４塔目の弱アニオン樹脂に７５ｍＭの塩化ナトリウム水溶液をＳＶ１．５で流して、酸性キシロオリゴ糖溶液（糖濃度２．８％、６００Ｌ）を回収した。回収した酸性キシロオリゴ糖溶液を、強カチオン樹脂でｐＨ５に調整後、糖濃度２０％まで濃縮して、スプレードライヤー（大川原化工機製：ODA−２５型）で処理して、１５ｋｇの酸性キシロオリゴ糖粉末を得た。
ここで得られた酸性キシロオリゴ糖の平均重合度は１０．８であった。
また、得られた酸性キシロオリゴ糖の重合度は１０．１、多分散度は１．２８であった。オリゴ糖１分子中のウロン酸個数は１．４個であった。
尚、酸性キシロオリゴ糖の分子量分布を図２に示した。
【００３３】
尚、以降の実施例において、得られたキシロオリゴ糖および酸性キシロオリゴ糖をそれぞれＮＸ５、ＵＸ１０とした。
【００３４】
＜試験1：腸内Bifidobacterium属の増殖促進活性の比較＞
本発明のキシロオリゴ糖、酸性キシロオリゴ糖の、腸内Bifidobacterium属に対する増殖促進活性について、以下の方法で試験した。
被検物質としては、前述の方法により得たＮＸ５、ＵＸ１０、及び、市販のキシロオリゴ糖（サントリー製、以下ＸＯＳ）、ガラクトオリゴ糖（日新製糖製、以下ＧＯＳ）、フラクトオリゴ糖（明治製菓製、以下ＦＯＳ）を用いた。
【００３５】
＜試験方法の概要＞
（１）糞便バッチ培養法の手順
健常な成人男性１名から糞便を採取し、直ちに嫌気グローブボックス（Ｆｏｒｍａ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）内で、予め窒素置換しておいたＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁し、１０％スラリーとした。次に、本１０％スラリーを１００μｌ、最終濃度１％となるように前記ＰＢＳに希釈した被検物質溶液を１００μｌ、前記ＰＢＳを８００μｌ加えて総量を１ｍｌとした。尚、対象にはオリゴ糖を含まないＰＢＳを用いた。次に、嫌気グローブボックス内のインキュベータ中で、３７℃にて４８時間インキュベートした。インキュベート後、懸濁液を１５，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ間遠心して糞便ペレットを回収した。
【００３６】
（２）糞便からのＤＮＡの抽出
前記（１）で得られた糞便ペレットおよび、インキュベート前の糞便からＤＮＡを抽出した。抽出にはＱｉａｇｅｎ社製  ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用い、添付のプロトコールに従って抽出操作を行った。
【００３７】
（３）糞便中の総菌数におけるBifidobacterium属占有率の測定
糞便中の総菌数におけるBifidobacterium属占有率の測定は、前記（２）で抽出した糞便ＤＮＡを用いた定量ＰＣＲ法によって行った。定量ＰＣＲは、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製のＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｏｐｔｉｃｏｎと、本装置に最適化されたＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社製ＤｙＮＡｍｏ  ＨＳ  ＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  ｋｉｔを使用した。ＰＣＲ産物の定量、解析はＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製Ｏｐｔｉｃｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒを用いた。
総菌数の測定には下記のプライマーの組み合わせを用いた。
Forward primer  5'  CGTATTACCGCGGCTGCT  3'
Reverse Primer  5'  CCAGGGTATCTAATCCTGTTTGC  3'
また、Bifidobacterium属の測定には下記のプライマーの組み合わせを用いた。
Forward primer  5'  CTCCTGGAAACGGGTC  3'
Reverse Primer  5'  GGTGTTCTTCCCGATATCTA  3'
【００３８】
ＰＣＲ反応液の組成は、糞便から抽出したＤＮＡ溶液１μｌ、５μＭに調製したプライマーをそれぞれ１μｌ、超純水７μｌ、キットに付属のＰＣＲ反応バッファー１０μｌを加え、２０μｌとした。ＰＣＲ反応条件は、総菌数の測定においては、９５℃、１５分を１サイクル、９４℃で１５秒、６０℃で１５秒、７２℃で３０秒、７５℃で蛍光測定を３０サイクル、５０℃〜９５℃で１℃刻みに蛍光測定を１サイクル行った。
Bifidobacterium属の菌数測定においては、９５℃、１５分を１サイクル、９４℃で１５秒、５５℃で１５秒、７２℃で６０秒、７５℃で蛍光測定を３０サイクル、５０℃〜９５℃で１℃刻みに蛍光測定を１サイクル行った。
なお、総菌数測定用のプライマーを用いた時の増幅領域を領域Ａ、Bifidobacterium属菌数測定用プライマーを用いたときの増幅領域を領域Ｂとする。あらかじめ領域Ａおよび領域ＢのＰＣＲ産物をそれぞれ作成・精製し、２８０ｎｍの吸光度からコピー数を算出したものを検量線用ＤＮＡとした。領域Ａおよび領域ＢそれぞれのＰＣＲ反応において、先に作成した検量線用ＤＮＡのコピー数とＣｔ値から検量線を作成し、糞便から抽出したＤＮＡ１μｌあたりに含まれる、領域Ａ、及びＢのコピー数を算出した。
総菌数におけるBifidobacterium属の占有率は、次式によって表すことができる。
Bifidobacterium属の占有率＝（領域Ｂのコピー数／領域Ａのコピー数）×１００  （％）
【００３９】
（４）腸内Bifidobacterium属の増殖促進活性の比較
糞便バッチ培養試験において、オリゴ糖添加前の糞便におけるBifidobacterium属の占有率と、各種オリゴ糖を添加し、４８時間インキュベートした後の糞便におけるBifidobacterium属の占有率を比較し、腸内Bifidobacterium属の増殖促進活性を評価した。
【００４０】
＜試験結果＞
糞便バッチ培養試験において、被検物質としてＮＸ５を添加したものを実施例１、ＵＸ１０を添加したものを実施例２、ＸＯＳを添加したものを比較例１、ＧＯＳを添加したものを比較例２、ＦＯＳを添加したものを比較例３、オリゴ糖を含まないＰＢＳを用いたものを比較例４とし、各試験区における腸内Bifidobacterium属の増殖促進活性を表１に示した。
表１より、ＮＸ５およびＵＸ１０はBifidobacterium属の増殖促進活性を有し、その活性はＧＯＳ、ＦＯＳよりも高く、市販のキシロオリゴ糖（ＸＯＳ）と同等であることが判明した。
このことから、ＮＸ５およびＵＸ１０はプレバイオティクス作用を有し、その増殖促進活性は、従来より発酵乳添加剤として使用されているＧＯＳより高く、市販のＸＯＳと同等であることから、発酵乳添加剤として適していることが明らかとなった。
【００４１】
＜試験２：ヨーグルトの品質に及ぼす影響の比較＞
本発明のキシロオリゴ糖、酸性キシロオリゴ糖を発酵乳添加剤として配合したヨーグルトを作製し、菌数、ｐＨ、おいしさ、オリゴ糖の残存率を試験した。
発酵乳添加剤とする被検物質としては、試験１と同様、ＮＸ５、ＵＸ１０、及び、ＸＯＳ、ＧＯＳ、ＦＯＳを用いた。
【００４２】
＜試験方法の概要＞
（１）ヨーグルトの作製
水５００ｍｌを５分間煮沸後、約５０℃になるまで室温で放置した。市販のスキムミルクを１００ｇ添加し、更に、被検物質を最終濃度１％になるように添加後、攪拌して均一とした。次に、市販のヨーグルト（プレーンタイプ）を５０ｇ添加し、攪拌して均一にした後、４０℃で７時間インキュベートした。これを６℃の冷蔵庫に移し、３時間冷却後、以下の試験に供した。
【００４３】
（２）ヨーグルト中の乳酸菌数測定
ヨーグルト１ｇを秤量し、ＰＢＳを９ｍｌ加えて均一になるまで攪拌し、更にＰＢＳを用いてヨーグルト希釈液を調製した。
このヨーグルト希釈液を滅菌したシャーレに１００μｌ入れ、５０℃に加温した乳酸菌検出培地を１５ｍｌ加え、３７℃にて４８時間培養した。培養後、黄変したコロニーを計数し、希釈倍率を乗じてヨーグルト１ｇ中の乳酸菌数を求めた。
なお、乳酸菌検出培地としては、ＢＣＰ加プレートカウント培地（極東製薬社製）を用いた。
【００４４】
（３）ヨーグルトのｐＨ測定
ヨーグルト１ｇを秤量し、蒸留水を９ｍｌ加えて均一になるまで攪拌し、ハンディーｐＨメーター（Ｔｗｉｎ  ｐＨ、堀場製作所製）を用いて作製直後、及び２週間冷蔵保存後のｐＨを測定した。
【００４５】
（４）ヨーグルト摂取試験
ヨーグルトについて、作製直後、および２週間冷蔵保存後のものを、任意に選出したパネラー（男性３名、女性３名；年齢２８〜４８歳）に摂取してもらい、おいしさ、酸味の強さ、甘みの強さの尺度をＶＡＳ（Ｖｉｓｕａｌ  Ａｎａｌｏｇ  Ｓｃａｌｅ）法により０〜１０点で評価した。
評価に使用したアンケート表を図３に示した。検定はｔ検定を用いた。
【００４６】
（５）ヨーグルト中のオリゴ糖の定量
ヨーグルト１ｇを秤量し、５００ｐｐｍゲンチオビオースを１ｍｌ、蒸留水を８ｍｌ、加えて均一になるまで攪拌後、１５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心して上清を回収した。得られた上清中のオリゴ糖は、イオンクロマトグラフを用いて測定した。ダイオネクス社製  ＤＸ５００糖分析システムを使用し、カラムはＣａｒｂｏ  Ｐａｃ  ＰＡ−１０（４．６×２５０ｍｍ）を用いた。溶離液には、Ａ液として０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液を、Ｂ液として０．５Ｍ  ＣＨ３ＣＯＯＮａを含む０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液を用い、流速は１ｍｌ／ｍｉｎとした。Ａ液からＢ液への直線的濃度勾配の溶出条件は以下の通りで行った。尚、検出にはパルスアンペロメトリック電気化学検出器  ＥＤ５０を用いた。
０〜１０ｍｉｎ    Ａ  １００％、Ｂ  ０％
１０〜３０ｍｉｎ  Ａ  ６０％、Ｂ  ４０％
内部標準として添加したゲンチオビオースと各オリゴ糖の面積比から、サンプル中のオリゴ糖含有量を求めた。
尚、ＵＸ１０は、分解によって生じる中性のキシロオリゴ糖を測定することにより、ヨーグルト中での安定性を評価した。
オリゴ糖残存率は、添加した濃度（１％）に対し、ヨーグルト中から定量された濃度の比率を百分率で示した。
【００４７】
＜試験結果＞
ヨーグルト作製時に被検物質としてＮＸ５を添加したものを実施例３、ＵＸ１０を添加したものを実施例４、ＸＯＳを添加したものを比較例５、ＧＯＳを添加したものを比較例６、ＦＯＳを添加したものを比較例７、オリゴ糖を添加しないで作製したものを比較例８とした。表２にヨーグルト中の乳酸菌数、表３にヨーグルトのｐＨ、表４にヨーグルトの摂取試験の評価、表５に、ヨーグルト中のオリゴ糖残存率を示した。
表２の結果より、作製直後の乳酸菌数は、実施例、比較例間の差は認められなかった。一方、２週間冷蔵保存後は、比較例６〜８で実施例３および実施例４と比較して低下する傾向が見られた。
表３の結果より、作製直後のヨーグルトのｐＨは、実施例、比較例間の差は認められなかった。一方、２週間冷蔵保存後は、比較例６〜８で実施例３及び実施例４と比較して低下する傾向が見られた。
表４の結果より、作製直後および２週間保存後のヨーグルトにおいて、実施例３および実施例４は、比較例５〜８に対して、おいしさのスコアが有意に高かった。
酸味の強さのスコアについては、２週間保存後のヨーグルトにおいて、実施例３および４、並びに比較例５は、比較例６〜８に対して有意に低かった。
甘みの強さのスコアについては、作製直後のヨーグルトにおいて、実施例３、実施例４および比較例６、比較例８は、比較例５および７に対して有意に低かった。
表５の結果より、比較例６および７において、ヨーグルト作製直後および２週間保存後において、オリゴ糖が減少していた。
以上の結果から、本発明のキシロオリゴ糖および酸性キシロオリゴ糖は、高いプレバイオティクス活性を有しており、ヨーグルトの製造過程や保存期間中に分解を受けにくく、発酵乳に添加した際に、品質の安定化、おいしさの向上と維持に有効であり、現在発酵乳添加剤として用いられているキシロビオースが主成分のキシロオリゴ糖やガラクトオリゴ糖と比較して、発酵乳添加剤として高い性能を有していることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明のキシロオリゴ糖または酸性キシロオリゴ糖を発酵乳添加剤として発酵乳に添加することで、発酵乳の持つ生理機能を増強し、同時に発酵乳の品質安定化やおいしさの向上を可能にする。
【００４９】
【表１】
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【００５０】
【表２】
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【００５１】
【表３】
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【００５２】
【表４】
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【００５３】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】キシロオリゴ糖のクロマトグラムを表す図である。
【図２】酸性キシロオリゴ糖の分子量分布パターンを表す図である。
【図３】ヨーグルト摂取試験のアンケートを表す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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