(57)【要約】【課題】  宿主細胞に対する毒性を示さない抗ＥＢウイルス薬の候補化合物のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】  抗ＥＢウイルス薬の候補化合物のスクリーニング方法であって、相互に近接した分子間距離に置かれて励起光を照射されることにより蛍光を発する蛍光タンパク質プローブの第一部分と第二部分のうち第一部分を結合したＥＢウイルスの第一膜タンパク質を細胞膜上に発現する第一の発現ベクターと、第二部分を結合したＥＢウイルスの第二膜タンパク質を細胞膜上に発現する第二の発現ベクターとを構築し、前記第一及び第二の発現ベクターを細胞に形質導入して組換え細胞を作成し、前記組換え細胞を前記抗ＥＢウイルス薬の候補化合物の存在下で培養し、そして培養された細胞に前記励起光を照射して前記蛍光の有無を検出する工程を含む。【選択図】  図１
2009044989.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＥＢウイルス薬の候補化合物のスクリーニング方法であって、
相互に近接した分子間距離に置かれて励起光を照射されることにより蛍光を発することができる蛍光タンパク質プローブの第一部分と第二部分のうち第一部分を結合したＥＢウイルスの第一膜タンパク質を細胞膜上に発現することができる第一の発現ベクターと、第二部分を結合したＥＢウイルスの第二膜タンパク質を細胞膜上に発現することができる第二の発現ベクターとを構築する工程、
前記第一及び第二の発現ベクターを細胞に形質導入して組換え細胞を作成する工程、
前記組換え細胞を前記抗ＥＢウイルス薬の候補化合物の存在下で培養する工程、そして
培養された細胞に前記励起光を照射して前記蛍光の有無を検出し、前記蛍光が検出される場合、候補化合物は抗ＥＢウイルス薬ではないと判断し、一方、前記蛍光が検出されない場合、候補化合物は抗ＥＢウイルス薬であると判断する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記蛍光タンパク質プローブの第一部分及び第二部分が緑色蛍光タンパク質を構成する二つの単量体であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＥＢウイルスの第一膜タンパク質及び第二膜タンパク質がともに潜伏性膜タンパク質１（ＬＭＰ１）であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＥＢウイルスの第一膜タンパク質及び第二膜タンパク質がともに潜伏性膜タンパク質２ａ（ＬＭＰ２ａ）であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＥＢウイルスの第一膜タンパク質がＬＭＰ１であり、前記ＥＢウイルスの第二膜タンパク質がＬＭＰ２ａであることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜タンパク質の自己凝集を阻害することができる化合物をスクリーニングすることにより、宿主細胞に対する毒性を示さない実用的な抗ＥＢウイルス薬の候補化合物を見い出すことができるスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＢウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス）は、伝染性単核球症、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、免疫不全関連リンパ球増殖疾患及び上咽頭癌等の癌疾患に関与する癌原性ウイルスである（非特許文献１参照）。従来、これらの癌疾患の効果的な治療方法を提供するため、ＥＢウイルスの活動を抑える抗ＥＢウイルス薬をスクリーニングする試みが行われている。
【０００３】
抗ＥＢウイルス薬のスクリーニング方法としては、ＥＢウイルス由来のタンパク質と宿主細胞との相互作用を阻害する化合物をスクリーニングする方法が知られている。しかし、この方法は、宿主細胞とウイルスタンパク質との相互作用を阻害する化合物をスクリーニング対象とするため、この方法によってスクリーニングされた化合物は宿主細胞に対して強い毒性を示す可能性が高い。従って、宿主細胞に対して毒性を示さない抗ＥＢウイルス薬の候補化合物をスクリーニングできる方法が求められていた。
【非特許文献１】ウイルス、第５６巻、第２号、第２０１頁〜第２０８頁、２００６年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、宿主細胞に対する毒性を示さない抗ＥＢウイルス薬の候補化合物のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、かかる目的を達成するためにＥＢウイルス感染による発癌機構について研究を進めたところ、ＥＢウイルスの膜タンパク質である潜伏性膜タンパク質（Ｌａｔｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ＬＭＰ）が宿主細胞の細胞膜領域を介して自己凝集（会合）することにより細胞活性化（癌化）シグナルを供給して宿主細胞を癌細胞に形質転換させること、従って、このＬＭＰの自己凝集を阻害することができる化合物をスクリーニングできれば宿主細胞に対して毒性を示さない抗ＥＢウイルス薬の候補化合物を見つけることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明によれば、抗ＥＢウイルス薬の候補化合物のスクリーニング方法であって、
相互に近接した分子間距離に置かれて励起光を照射されることにより蛍光を発することができる蛍光タンパク質プローブの第一部分と第二部分のうち第一部分を結合したＥＢウイルスの第一膜タンパク質を細胞膜上に発現することができる第一の発現ベクターと、第二部分を結合したＥＢウイルスの第二膜タンパク質を細胞膜上に発現することができる第二の発現ベクターとを構築する工程、
前記第一及び第二の発現ベクターを細胞に形質導入して組換え細胞を作成する工程、
前記組換え細胞を前記抗ＥＢウイルス薬の候補化合物の存在下で培養する工程、そして
培養された細胞に前記励起光を照射して前記蛍光の有無を検出し、前記蛍光が検出される場合、候補化合物は抗ＥＢウイルス薬ではないと判断し、一方、前記蛍光が検出されない場合、候補化合物は抗ＥＢウイルス薬であると判断する工程
を含むことを特徴とする方法が提供される。
【０００７】
本発明の好ましい実施態様によれば、前記蛍光タンパク質プローブの第一部分及び第二部分は緑色蛍光タンパク質を構成する二つの単量体であり、前記ＥＢウイルスの第一膜タンパク質及び第二膜タンパク質はともに潜伏性膜タンパク質１（ＬＭＰ１）であるか、又は前記ＥＢウイルスの第一膜タンパク質及び第二膜タンパク質はともに潜伏性膜タンパク質２ａ（ＬＭＰ２ａ）であるか、又は前記ＥＢウイルスの第一膜タンパク質はＬＭＰ１であり、前記ＥＢウイルスの第二膜タンパク質はＬＭＰ２ａである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のスクリーニング方法では、ＥＢウイルスの膜タンパク質同士の会合を阻害する化合物を特異的にスクリーニングしているので、従来の方法のように宿主細胞に悪影響を与える毒性化合物をスクリーニングすることがない。従って、本発明のスクリーニング方法によれば、宿主細胞に対する毒性を示さない抗ＥＢウイルス薬の候補化合物をスクリーニングすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、抗ＥＢウイルス薬の候補化合物のスクリーニングする方法であり、その特徴は、ＥＢウイルスによる宿主細胞の癌化に必須の段階であるＥＢウイルスの膜タンパク質同士の会合を阻害することができる化合物を特異的にスクリーニングすることにある。
【００１０】
抗ＥＢウイルス薬は、癌原性ウイルスであるＥＢウイルスにより宿主細胞が癌細胞に形質転換されることを阻害、緩和、遅延又は予防することができる薬剤であるが、従来、そのスクリーニングは、ＥＢウイルス由来のタンパク質と宿主細胞との相互作用を阻害する化合物をスクリーニングすることによって行われていた。しかし、この方法では、宿主細胞とウイルス由来タンパク質との間の相互作用を阻害する化合物をスクリーニング対象としているため、この方法によって得られた化合物は、ウイルスに対してのみならず宿主細胞に対しても強い毒性を有する可能性が高く、抗ＥＢウイルス薬として実際に使用できない可能性が高かった。
【００１１】
本発明の方法は、ＥＢウイルス感染により宿主細胞が癌化されるためにはＥＢウイルスの膜タンパク質同士の自己凝集（会合）が生じることが必須であるという知見に基づいてなされたものであり、ＥＢウイルスの膜タンパク質同士の会合が生じているかどうかを検出する系を確立することにより、膜タンパク質同士の会合を阻害する化合物を特異的にスクリーニングするものである。従って、本発明によれば、従来の抗ＥＢウイルス薬スクリーニング方法と異なり、宿主細胞と相互作用する抗ＥＢウイルス薬をスクリーニングしていないので、宿主細胞に対して毒性を示さない抗ＥＢウイルス薬を得ることができる。
【００１２】
本発明の方法では、抗ＥＢウイルス薬の候補化合物のスクリーニングは、蛍光タンパク質プローブを使用してＥＢウイルスの膜タンパク質同士の会合の有無を検出することによって行われる。蛍光タンパク質プローブは、生化学の分野で従来公知の他の相互作用検出用プローブ（アビジン−ビオチン対など）と比べて検出方法が簡単であり、しかも検出感度が高い。従って、本発明のスクリーニング方法では、簡便にかつ高感度でスクリーニングを行うことができる。
【００１３】
本発明の方法で使用する蛍光タンパク質プローブは、相互作用して蛍光を発することができる第一部分と第二部分の二つの部分からなるプローブであり、具体的には第一部分及び第二部分が相互に距離を置かれた状態では励起光を照射されても蛍光を発さないが、相互に近接した分子間距離に置かれて励起光を照射されると蛍光を発することができるように構成されているものを使用する。このような蛍光タンパク質プローブは、従来公知のプローブから適宜選択することができるが、例えば緑色蛍光タンパク質を構成する二つの単量体を使用することができる。
【００１４】
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、オワンクラゲ由来の蛍光タンパク質であり、細胞生物学等の分野でレポーター遺伝子として広く使用されている蛍光タンパク質である。天然のＧＦＰは二量体の形で発現され恒常的に蛍光活性を有するので、そのままでは本発明の蛍光タンパク質プローブとして使用できない。本発明では、天然のＧＦＰ遺伝子の会合ドメイン中の２０７番目のアミノ酸アラニンをリジンに置換する遺伝子改変を行うことにより、二つの単量体（天然のＧＦＰの１番目〜１５８番目のアミノ酸からなる第一単量体及び第１５９番目〜２３９番目のアミノ酸からなる第二単量体）に分割された態様で発現されるようにした変異型ＧＦＰを使用する。これらの二つの単量体はそれぞれ単独では励起光を照射されても蛍光を発さないが、相互に近接した分子間距離に置かれると擬似的に天然ＧＦＰと同様の立体構造配置をとり、天然ＧＦＰと同様に励起光の照射により蛍光を発する性質を有する。従って、かかる性質を利用すれば、ＥＢウイルスの膜タンパク質同士の会合の有無を容易に検出することができる。なお、この態様で使用することができる蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質に限られるものではなく、例えば造礁サンゴ由来の赤色蛍光タンパク質も同様の態様で使用することができる。
【００１５】
本発明の方法では、上述の蛍光タンパク質プローブの二つの部分をＥＢウイルスの二つの膜タンパク質にそれぞれ結合させたものを細胞膜上で発現させるため、まず上述の蛍光タンパク質プローブの二つの部分のうち第一部分を結合したＥＢウイルスの第一膜タンパク質を細胞膜上に発現することができる第一の発現ベクターと、第二部分を結合したＥＢウイルスの第二膜タンパク質を細胞膜上に発現することができる第二の発現ベクターを構築する。
【００１６】
本発明の方法では、蛍光タンパク質プローブの各部分が結合されるＥＢウイルスの二つの膜タンパク質の組合せとしては、それらの会合がＥＢウイルスによる宿主細胞の癌化において必須であるかもしくは重要な役割を果たしていることが既に判明している膜タンパク質の組合せ、又は癌化において必須であるかもしくは重要な役割を果たしている可能性がある膜タンパク質の組合せを対象とすることができ、例えば癌化において必須であることが既に判明しているＬＭＰ１とＬＭＰ１の組合せ、癌化において必須ではないものの癌化において重要な役割を果たしていることが判明しているＬＭＰ２ａとＬＭＰ２ａの組合せ、及び癌化において必須又は重要な役割を果たしている可能性があるＬＭＰ１とＬＭＰ２ａの組合せを挙げることができる。これらの膜タンパク質としては、天然のタンパク質の全長を使用する必要は必ずしもなく、検出ノイズを減少させるため、膜タンパク質同士の会合に必須である領域を含む部分配列を使用することもできる。
【００１７】
なお、上述のような発現ベクターの構築は、遺伝子工学の手法を利用して、蛍光タンパク質プローブの各部分のＤＮＡ配列とＥＢウイルスの各膜タンパク質のＤＮＡ配列を増幅し、これらの配列を制限酵素消化及びライゲーションによって適切な発現ベクターに導入することによって容易に行うことができる。
【００１８】
次に、これらの発現ベクターを細胞に形質導入して組換え細胞を作成する。形質導入される細胞はヒト細胞には限定されず、細胞膜上でＥＢウイルスの二つの膜タンパク質が会合することができる細胞であればいかなる細胞も対象とすることができ、例えば大腸菌であることもできる。
【００１９】
次に、このように作成された組換え細胞を候補化合物の存在下で培養する。培養は、組換え細胞の培養培地に候補化合物を常法に従って添加することによって行うことができる。なお、この工程での培養条件は、次の蛍光検出工程で使用する検出方法によって異なるので、検出方法に応じて適切な条件を設定すればよい。
【００２０】
最後に、このように培養された細胞に蛍光タンパク質プローブの励起光を照射して、相互に近接した分子間距離に置かれた蛍光タンパク質プローブの第一部分と第二部分により発される蛍光の有無を検出する。励起光の照射条件や蛍光の検出条件は、使用した蛍光タンパク質プローブの種類や検出方法によって異なるので、個別に適切な条件を設定すればよい。
【００２１】
この工程で蛍光が検出される場合、蛍光タンパク質プローブの第一部分と第二部分は相互に近接した分子間距離に置かれており、つまりＥＢウイルスの第一膜タンパク質と第二膜タンパク質は細胞膜上で会合しており、候補化合物は第一膜タンパク質と第二膜タンパク質との会合を阻害することができないと判断される。従って、この場合、候補化合物は抗ＥＢウイルス薬ではないとみなされる。一方、この工程で蛍光が検出される場合、蛍光タンパク質プローブの第一部分と第二部分は相互に離れた分子間距離にあり、つまりＥＢウイルスの第一膜タンパク質と第二膜タンパク質は細胞膜上で会合しておらず、候補化合物は第一膜タンパク質と第二膜タンパク質との会合を阻害することができると判断される。従って、この場合、候補化合物は抗ＥＢウイルス薬であるとみなされる。
【００２２】
このようにして本発明の方法によりスクリーニングされた抗ＥＢウイルス薬の候補化合物は、ＥＢウイルスの膜タンパク質同士の会合を阻害する作用を有し、宿主細胞に対して非毒性である可能性が極めて高い。従って、かかる候補化合物に基づいて抗ＥＢウイルス薬の開発を行えば、宿主に対して安全で実用的な抗ＥＢウイルス薬を効率良く得ることができる。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明の方法に基づいてＥＢウイルスの膜タンパク質同士の会合を検出する検出系を確立する実験を以下に示す。
【００２４】
実験目的
本実験は、緑色蛍光タンパク質を構成する二つの単量体を蛍光タンパク質プローブとし、ＥＢウイルスのＬＭＰ１同士の会合、ＬＭＰ２ａ同士の会合、又はＬＭＰ１とＬＭＰ２ａの会合を検出する検出系を確立することを目的とする。
【００２５】
実験方法
１．発現ベクターの構築
（１）ＮｍＥＧＦＰ（天然の緑色蛍光タンパク質の１番目〜１５８番目のアミノ酸からなる緑色蛍光タンパク質の変異体単量体）を結合したＥＢウイルスのＬＭＰ１を細胞膜上に発現することができる発現ベクター（ｐＣＭＶ７．１  ＬＭＰ１＿ＮｍＥＧＦＰ）を以下の手順（ｉ）〜（ｉｉｉ）に基づいて構築した。
【００２６】
（ｉ）ＰＣＲ反応による導入遺伝子の増幅
ＬＭＰ１遺伝子は、ＬＭＰ１ｃＤＮＡを鋳型とし、プライマーｔｙ１０５１（配列番号１）及びプライマーｔｙ１０５２（配列番号２）を使用してＰＣＲ反応により増幅させた。ＰＣＲ反応サイクルは、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、及び７２℃で１分３０秒を１サイクルとして３５サイクル行った。予測されるＰＣＲ増幅産物のサイズは１１７０ｂｐであった。
ＮｍＥＧＦＰ遺伝子は、ｍＥＧＦＰｃＤＮＡを鋳型とし、プライマーｔｙ１０４６（配列番号３）及びプライマーｔｙ１０４８（配列番号４）を使用してＰＣＲ反応により増幅させた。ＰＣＲ反応サイクルはＬＭＰ１遺伝子の場合と同一条件であり、予測されるＰＣＲ増幅産物のサイズは５２７ｂｐであった。
【００２７】
（ｉｉ）ライゲーションのための制限酵素消化
上記（ｉ）で増幅したＬＭＰ１遺伝子を常法に従い、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで制限酵素消化して、ＬＭＰ１遺伝子のＰＣＲ増幅物のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩフラグメントを調製した。
同様に、上記（ｉ）で増幅したＮｍＥＧＦＰ遺伝子を常法に従い、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで制限酵素消化して、ＮｍＥＧＦＰ遺伝子のＰＣＲ増幅物のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを調製した。
さらに、Ｓｉｇｍａ社から購入したプラスミドｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ７．１を常法に従い、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで制限酵素消化して、ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ７．１のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを調製した。
【００２８】
（ｉｉｉ）ライゲーションによる発現ベクターの構築
上記（ｉｉ）で調製したＬＭＰ１遺伝子のＰＣＲ増幅物のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩフラグメント、ＮｍＥＧＦＰ遺伝子のＰＣＲ増幅物のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメント及びｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ７．１のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを常法に従いライゲーションして、配列番号６に示される４７１７ｂｐのｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ７．１の配列のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ挿入部位に配列番号５に示される１６８７ｂｐの配列（ＬＭＰ１＿ＮｍＥＧＦＰ）が挿入された発現ベクター（ｐＣＭＶ７．１  ＬＭＰ１＿ＮｍＥＧＦＰ）を構築した。
【００２９】
（２）ＣｍＥＧＦＰ（天然の緑色蛍光タンパク質の１５９番目〜２３９番目のアミノ酸からなる緑色蛍光タンパク質の変異体単量体）を結合したＥＢウイルスのＬＭＰ１を細胞膜上に発現することができる発現ベクター（ｐＣＭＶ７．１  ＬＭＰ１＿ＣｍＥＧＦＰ）を以下の手順（ｉ）〜（ｉｉｉ）に基づいて構築した。
（ｉ）ＰＣＲ反応による導入遺伝子の増幅
ＬＭＰ１遺伝子は上記（１）で記述した手順で増幅させた。
ＣｍＥＧＦＰ遺伝子は、ｍＥＧＦＰｃＤＮＡを鋳型とし、プライマーｔｙ１０４９（配列番号７）及びプライマーｔｙ１０５０（配列番号８）を使用してＰＣＲ反応により増幅させた。ＰＣＲ反応サイクルはＬＭＰ１遺伝子の場合と同一条件であり、予測されるＰＣＲ増幅産物のサイズは２９４ｂｐであった。
【００３０】
（ｉｉ）ライゲーションのための制限酵素消化
上記（ｉ）で増幅したＬＭＰ１遺伝子、ＣｍＥＧＦＰ遺伝子、及びＳｉｇｍａ社製のプラスミドｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ７．１を上記（１）（ｉｉ）と同様にして制限酵素消化して、ＬＭＰ１遺伝子のＰＣＲ増幅物のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩフラグメント、ＣｍＥＧＦＰ遺伝子のＰＣＲ増幅物のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメント及びｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ７．１のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを調製した。
【００３１】
（ｉｉｉ）ライゲーションによる発現ベクターの構築
上記（ｉｉ）で調製したＬＭＰ１遺伝子のＰＣＲ増幅物のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩフラグメント、ＣｍＥＧＦＰ遺伝子のＰＣＲ増幅物のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメント及びｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ７．１のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを常法に従いライゲーションして、配列番号６に示される４７１７ｂｐのｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ７．１の配列のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ挿入部位に配列番号９に示される１４５５ｂｐの配列（ＬＭＰ１＿ＣｍＥＧＦＰ）が挿入された発現ベクター（ｐＣＭＶ７．１  ＬＭＰ１＿ＣｍＥＧＦＰ）を構築した。
【００３２】
（３）ＮｍＥＧＦＰを結合したＥＢウイルスのＬＭＰ２ａを細胞膜上に発現することができる発現ベクター（ｐＣＭＶ７．１  ＬＭＰ２ａ＿ＮｍＥＧＦＰ）を以下の手順（ｉ）〜（ｉｉｉ）に基づいて構築した。
（ｉ）ＰＣＲ反応による導入遺伝子の増幅
ＬＭＰ２ａ遺伝子は、ＬＭＰ２ａｃＤＮＡを鋳型とし、プライマーｔｙ１０５３（配列番号１０）及びプライマーｔｙ１０５４（配列番号１１）を使用してＰＣＲ反応により増幅させた。ＰＣＲ反応サイクルはＬＭＰ１遺伝子の場合と同一条件であり、予測されるＰＣＲ増幅産物のサイズは１４８５ｂｐであった。
ＮｍＥＧＦＰ遺伝子は上記（１）で記述した手順で増幅させた。
【００３３】
（ｉｉ）ライゲーションのための制限酵素消化
上記（ｉ）で増幅したＬＭＰ２ａ遺伝子、ＮｍＥＧＦＰ遺伝子、及びＳｉｇｍａ社製のプラスミドｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ７．１を上記（１）（ｉｉ）と同様にして制限酵素消化して、ＬＭＰ２ａ遺伝子のＰＣＲ増幅物のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩフラグメント、ＮｍＥＧＦＰ遺伝子のＰＣＲ増幅物のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメント及びｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ７．１のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを調製した。
【００３４】
（ｉｉｉ）ライゲーションによる発現ベクターの構築
上記（ｉｉ）で調製したＬＭＰ２ａ遺伝子のＰＣＲ増幅物のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩフラグメント、ＮｍＥＧＦＰ遺伝子のＰＣＲ増幅物のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメント及びｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ７．１のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを常法に従いライゲーションして、配列番号６に示される４７１７ｂｐのｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ７．１の配列のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ挿入部位に配列番号１２に示される２００４ｂｐの配列（ＬＭＰ２ａ＿ＮｍＥＧＦＰ）が挿入された発現ベクター（ｐＣＭＶ７．１  ＬＭＰ２ａ＿ＮｍＥＧＦＰ）を構築した。
【００３５】
（４）ＣｍＥＧＦＰを結合したＥＢウイルスのＬＭＰ２ａを細胞膜上に発現することができる発現ベクター（ｐＣＭＶ７．１  ＬＭＰ２ａ＿ＣｍＥＧＦＰ）を以下の手順（ｉ）〜（ｉｉｉ）に基づいて構築した。
（ｉ）ＰＣＲ反応による導入遺伝子の増幅
ＬＭＰ２ａ遺伝子は上記（３）で記述した手順で増幅された。
ＣｍＥＧＦＰ遺伝子は上記（２）で記述した手順で増幅させた。
【００３６】
（ｉｉ）ライゲーションのための制限酵素消化
上記（ｉ）で増幅したＬＭＰ２ａ遺伝子、ＣｍＥＧＦＰ遺伝子、及びＳｉｇｍａ社製のプラスミドｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ７．１を上記（１）（ｉｉ）と同様にして制限酵素消化して、ＬＭＰ２ａ遺伝子のＰＣＲ増幅物のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩフラグメント、ＣｍＥＧＦＰ遺伝子のＰＣＲ増幅物のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメント及びｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ７．１のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを調製した。
【００３７】
（ｉｉｉ）ライゲーションによる発現ベクターの構築
上記（ｉｉ）で調製したＬＭＰ２ａ遺伝子のＰＣＲ増幅物のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩフラグメント、ＣｍＥＧＦＰ遺伝子のＰＣＲ増幅物のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメント及びｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ７．１のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを常法に従いライゲーションして、配列番号６に示される４７１７ｂｐのｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ７．１の配列のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ挿入部位に配列番号１３に示される１７７３ｂｐの配列（ＬＭＰ２ａ＿ＣｍＥＧＦＰ）が挿入された発現ベクター（ｐＣＭＶ７．１  ＬＭＰ２ａ＿ＣｍＥＧＦＰ）を構築した。
【００３８】
（５）コントロールの発現ベクターの構築
コントロールの発現ベクターとして、配列番号１４に示される５２５ｂｐのＮｍＥＧＦＰ配列、配列番号１５に示される２９４ｂｐのＣｍＥＧＦＰ配列、及び配列番号１６に示される１４８８ｂｐのＬＭＰ２ａ配列がそれぞれプラスミドｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ７．１のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ挿入部位、ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ挿入部位、及びＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ挿入部位に挿入された発現ベクター（ｐＣＭＶ７．１＿ＮｍＥＧＦＰ、ｐＣＭＶ７．１＿ＣｍＥＧＦＰ、及びｐＣＭＶ７．１＿ＬＭＰ２ａ）を構築した。
【００３９】
２．組換え細胞の作成
上記１．発現ベクターの構築で作成した発現ベクターを細胞に形質導入して組換え細胞を作成した。なお、本実験では、細胞としてヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞株を使用し、細胞培養培地としてＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ：ＧＩＢＣＯ１１９６５）に１０％ウシ胎児血清、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭペニシリン、及び１０ｍＭストレプトマイシンを添加した培地（Ｄ１０）を使用した。本実験の具体的な手順は以下の通りである。
【００４０】
（１）細胞の播種
培地Ｄ１０にＨＥＫ２９３細胞を培地１ｍｌ当り３×１０５個になるように懸濁し、この懸濁液を６ウェル培養ディッシュ（Ｎｕｎｃ  １４０６７５）に２ｍｌずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で１６時間培養した。
【００４１】
（２）発現ベクターによる形質導入
（ｉ）上記１．発現ベクターの構築で作成した発現ベクターを以下の表１及び表２のように組合せて１２．５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ＤＭＥＭで希釈し、それぞれ１９４μｌのＤＮＡ希釈液を調製した。
【００４２】
表１．  ＬＭＰ同士の会合を検出する検出系を構築するための
発現ベクターの組合せ
2009044989.tif 000003
【００４３】
表２．  ドミナントネガティブ効果を検証するための発現ベクターの組合せ
2009044989.tif 000004
【００４４】
（ｉｉ）次に、これらのＤＮＡ希釈液に６ｍｌ  Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ，４７０９７０５）を添加し、均一に混和した後、１５分間室温でインキュベートしてトランスフェクション溶液を調製した。
【００４５】
（ｉｉｉ）次に、これらのトランスフェクション溶液を上記（１）で培養した６ウェル培養ディッシュの細胞上に滴下し、混和させて３７℃、５％ＣＯ２存在下でさらに４８時間培養して発現ベクターを細胞に形質導入させ、組換え細胞を作成した。
【００４６】
３．ＬＭＰ同士の会合によって発される蛍光の検出
上記２．で作成した組換え細胞を培養し、ＬＭＰ同士の会合によって蛍光が発されるかどうかを確認した。本実験の具体的な手順は以下の通りである。
【００４７】
（１）上記２．組換え細胞の作成で作成した組換え細胞のうち、表１に示される発現ベクター組合せ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）（このうち、（ｄ）はコントロールである）をそれぞれ有する組換え細胞を２５℃、５％ＣＯ２の存在下で２４時間培養した。
【００４８】
（２）培養後、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を洗浄し、次に１ｍｌ  ＰＢＳ／０．１％  ＥＤＴＡ溶液中に細胞を回収した。
【００４９】
（３）回収した細胞を１ｍｌ  ＦＡＣＳ緩衝液（１％ウシ血清アルブミン、ＰＢＳ中の０．１％  ＮａＮ３）に懸濁し、ＦＡＣＳ溶液を調製した。
【００５０】
（４）このＦＡＣＳ溶液を使用し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）装置を使用して蛍光強度を検出し、ＦＡＣＳ解析を行った。
【００５１】
実験結果
ＦＡＣＳ解析の結果を図１（ａ）〜（ｃ）に示す。図１（ａ）〜（ｃ）中の白色で示される画分は、表１の発現ベクター組合せ（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）をそれぞれ有する組換え細胞の蛍光強度をそれぞれ示し、図１（ａ）〜（ｃ）中の灰色で示される画分はコントロールの発現ベクター組合せ（ｄ）を有する組換え細胞（緑色蛍光タンパク質の二つの単量体ＮｍＧＦＰ及びＣｍＧＦＰのみを発現する組換え細胞）の蛍光強度を示す。図１（ａ）〜（ｃ）の各画分の細胞数のピーク位置での蛍光強度の対比から、コントロールの発現ベクター組合せ（ｄ）を有する組換え細胞は弱い蛍光強度しか示さないのに対し、発現ベクター組合せ（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）をそれぞれ有する組換え細胞はコントロールより有意に強い蛍光強度を示すことが理解できる。従って、本実験で確立した検出系は、ＬＭＰ同士の会合の有無を検出するのに利用することができると考えられる。
【００５２】
４．ドミナントネガティブ効果の検証
上記３．ＬＭＰ同士の会合によって発される蛍光の検出で検出した発現ベクター組合せ（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）をそれぞれ有する組換え細胞での蛍光強度の増大がたしかにＬＭＰ同士の会合によるものであることを、ドミナントネガティブ効果の測定により検証した。具体的には、上記２．組換え細胞の作成で作成した組換え細胞のうち、表２に示される発現ベクター組合せ（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）をそれぞれ有する組換え細胞を上記３．ＬＭＰ同士の会合によって発される蛍光の検出と同様にして培養し、洗浄し、回収し、懸濁してＦＡＣＳ溶液を調製し、蛍光強度を検出してＦＡＣＳ解析を行った。
【００５３】
実験結果
ＦＡＣＳ解析の結果を図２に示す。図２から、ＮｍＧＦＰ及びＣｍＧＦＰのみを発現する組換え細胞（図２中の灰色で示される画分）と比較して、ＮｍＧＦＰを結合されたＬＭＰ２ａ及びＣｍＧＦＰを結合されたＬＭＰ２ａを発現する組換え細胞では蛍光強度の有意な増大が認められた。一方、ＮｍＧＦＰ及びＣｍＧＦＰのいずれも結合されていないＬＭＰ２ａ（ドミナントネガティブＬＭＰ２ａ）を、ＮｍＧＦＰを結合されたＬＭＰ２ａ及びＣｍＧＦＰを結合されたＬＭＰ２ａと共に共発現する組換え細胞では、ＮｍＧＦＰを結合されたＬＭＰ２ａ及びＣｍＧＦＰを結合されたＬＭＰ２ａを発現する組換え細胞と同様に、細胞数のピークでの蛍光強度が有意に増大していたが、増大した蛍光強度を示す細胞の数は明らかに減少していた。この結果から、上記実験３．ＬＭＰ同士の会合によって発される蛍光の検出で観察された蛍光強度の増大は、たしかにＬＭＰ同士の会合によるものであることが明らかである。
【００５４】
考察
以上の実験結果から、本実験で構築した検出系はＬＭＰ同士の会合を検出するのに好適であり、この検出系を使用すれば宿主細胞に対して毒性を示さない抗ＥＢウイルス薬の候補化合物を特異的にスクリーニングすることができると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の方法は、宿主細胞に対して毒性を示さない抗ＥＢウイルス薬の候補化合物を特異的にスクリーニングすることができるので、有力な制癌剤の開発に極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】実験３の実験結果を示すグラフである。
【図２】実験４の実験結果を示すグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【００５７】
配列番号１は、プライマーｔｙ１０５１の配列である。
配列番号２は、プライマーｔｙ１０５２の配列である。
配列番号３は、プライマーｔｙ１０４６の配列である。
配列番号４は、プライマーｔｙ１０４８の配列である。
配列番号５は、ＬＭＰ１＿ＮｍＥＧＦＰの配列である。
配列番号６は、ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ７．１の配列である。
配列番号７は、プライマーｔｙ１０４９の配列である。
配列番号８は、プライマーｔｙ１０５０の配列である。
配列番号９は、ＬＭＰ１＿ＣｍＥＧＦＰの配列である。
配列番号１０は、プライマーｔｙ１０５３の配列である。
配列番号１１は、プライマーｔｙ１０５４の配列である。
配列番号１２は、ＬＭＰ２ａ＿ＮｍＥＧＦＰの配列である。
配列番号１３は、ＬＭＰ２ａ＿ＣｍＥＧＦＰの配列である。
配列番号１４は、ＮｍＥＧＦＰの配列である。
配列番号１５は、ＣｍＥＧＦＰの配列である。
配列番号１６は、ＬＭＰ２ａの配列である。
【図１】
2009044989.tif 000005
【図２】
2009044989.tif 000006
【配列表】
2009044989000001.app