(57)【要約】【課題】精度の良い、ビーズを用いた分析を可能とするコード化粒子及び分析装置を提供する。【解決手段】コード化粒子１００が、各々、直径又は一辺の長さが１〜１００μｍの円形又は多角形からなる外形を有し厚さが１〜３０μｍである二枚の透明平板層１０２及び１０４と、その二枚の透明平板層の間にあって、粒子種識別用コードに応じてパターン化された光反射膜又は光遮蔽膜１１０と、を具備するように構成される。そのコード化粒子１００にバイオ的表面修飾が施されて分析装置に使用される。【選択図】図１
2009174954.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
円形又は多角形からなる外形を有する二枚の透明平板層と、
前記二枚の透明平板層の間にあって、粒子種識別用コードに応じてパターン化された光反射膜又は光遮蔽膜と、
を具備するコード化粒子。
【請求項２】
バイオ的表面修飾が施された、請求項１に記載のコード化粒子。
【請求項３】
請求項１に記載のコード化粒子の製造方法であって、
半導体基板の上に剥離層及び第一の透明平板層を成膜した後、第一のレジスト層を塗布する工程と、
粒子種識別用コードに応じたパターン状に該第一のレジスト層を露光及び現像した後、蒸着膜を成膜する工程と、
該第一のレジスト層を剥離した後、第二の透明平板層を成膜する工程と、
第二のレジスト層を塗布した後、粒子片状に該第二のレジスト層を露光及び現像する工程と、
エッチング又はイオンミリングにより粒子片に分割する工程と、
該剥離層及び該第二のレジスト層を溶解して複数のコード化粒子を得る工程と、
を具備する、コード化粒子の製造方法。
【請求項４】
請求項２に記載のコード化粒子の懸濁液から該コード化粒子を吸着により平面上整列状態で捕捉する捕捉手段と、
前記捕捉手段に捕捉されたコード化粒子に光を照射する照射手段と、
前記照射手段によって光を照射されたコード化粒子からの反射光又は透過光に基づいて、該コード化粒子が有する粒子種識別用コードを読取る読取り手段と、
を具備する分析装置。
【請求項５】
請求項２に記載のコード化粒子の懸濁液から該コード化粒子を吸着により平面上整列状態で捕捉するステップと、
該捕捉されたコード化粒子に光を照射するステップと、
該光を照射されたコード化粒子からの反射光又は透過光に基づいて、該コード化粒子が有する粒子種識別用コードを読取るステップと、
を具備する分析方法。
【請求項６】
分析装置に設けられるコンピュータを、
捕捉部が、請求項２に記載のコード化粒子の懸濁液から該コード化粒子を吸着により整列状態で捕捉するように制御する手段と、
照射部が、前記捕捉部に捕捉されたコード化粒子に光を照射するように制御する手段と、
前記照射部によって光を照射されたコード化粒子からの反射光又は透過光に基づいて、該コード化粒子が有する粒子種識別用コードを読取る手段と、
として機能させるプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビーズ（beads）を用いた分析技術において当該ビーズとして使用されるコード化粒子（coded particles）に関する。また、本発明は、コード化粒子の製造方法並びにコード化粒子を使用する分析装置及び分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビーズを用いた、免疫アッセイ、ＤＮＡ（Deoxyribo Nucleic Acid：デオキシリボ核酸）解析、ＳＮＰｓ（Single Nucleotide Polymorphisms：一塩基多型）解析、創薬探索等の分析技術が知られている。この分析技術では、例えば、バイオ的表面修飾を施したビーズをサンプル中に懸濁し、ビーズと蛍光物質で標識（ラべリング）されたターゲットとを結合反応させる。
【０００３】
ここで、ビーズの種類の認識は、一般的に、複数の蛍光物質の混合比を変えてビーズに混入させ、観測される蛍光波長毎の蛍光強度比を測定することで行われている。しかし、この認識処理はアナログ的かつ統計的な処理であるため、ノイズが大きく、分解能が低いという問題を有している。
【０００４】
また、コードを施したビーズ、すなわちコード化された粒子をビーズとして用いる例も存在する。図６に示される例では、固体支持粒子６０２に貫通孔６０４、窪み６０６、溝６０８又は切欠き６１０によるマークが施されることで粒子６０２の種類が識別される（下記特許文献１参照）。なお、符号６１２で示されるのは、方向づけマークである。
【０００５】
また、図７は、蛍光剤をコード状に漂白することによりコード化された従来の粒子を説明するための図であって、図７（ａ）は、多様な強度に漂白されたコードの共焦点像を略図的に説明するものであり、図７（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）は、コード内の多様な強度をグラフで略図的に説明するものである（下記特許文献２参照）。
【０００６】
また、図８は、従来のコード読取り装置の例を示す図である（下記特許文献１参照）。同図において、符号８０２はコード化粒子、符号８０４はキャピラリー流路、符号８０６は読取りステーション、符号８０８は電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ、符号８１０は計算システム、をそれぞれ示している。この例は、コード化粒子をフローさせて洗浄し、そしてフロー中のコード化粒子を撮影することでコードを読取るものである。
【０００７】
図６、図７及び図８に示される従来技術にあっても、ＳＮ比（signal-to-noise ratio：信号対雑音比）の良い認識が課題であり、ビーズの姿勢によってはコードを読取ることができない、きれいに洗浄することができない、という問題がある。
【０００８】
【特許文献１】特表２０００−５１６１９５号公報
【特許文献２】特表２００２−５４２４８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上述した問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、精度の良い、ビーズを用いた分析を可能とする、コード化粒子、その製造方法、並びにそれを用いた分析装置及び分析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明の第一の面によれば、円形又は多角形からなる外形を有する二枚の透明平板層と、前記二枚の透明平板層の間にあって、粒子種識別用コードに応じてパターン化された光反射膜又は光遮蔽膜と、を具備するコード化粒子が提供される。
【００１１】
また、本発明の第二の面によれば、前記第一の面によるコード化粒子にバイオ的表面修飾が施されたものが提供される。
【００１２】
また、本発明の第三の面によれば、前記第一の面によるコード化粒子の製造方法であって、半導体基板の上に剥離層及び第一の透明平板層を成膜した後、第一のレジスト層を塗布する工程と、粒子種識別用コードに応じたパターン状に該第一のレジスト層を露光及び現像した後、蒸着膜を成膜する工程と、該第一のレジスト層を剥離した後、第二の透明平板層を成膜する工程と、第二のレジスト層を塗布した後、粒子片状に該第二のレジスト層を露光及び現像する工程と、エッチング又はイオンミリングにより粒子片に分割する工程と、該剥離層及び該第二のレジスト層を溶解して複数のコード化粒子を得る工程と、を具備する、コード化粒子の製造方法が提供される。
【００１３】
また、本発明の第四の面によれば、前記第二の面によるコード化粒子の懸濁液から該コード化粒子を吸着により平面上整列状態で捕捉する捕捉手段と、前記捕捉手段に捕捉されたコード化粒子に光を照射する照射手段と、前記照射手段によって光を照射されたコード化粒子からの反射光又は透過光に基づいて、該コード化粒子が有する粒子種識別用コードを読取る読取り手段と、を具備する分析装置が提供される。
【００１４】
さらに、本発明によれば、上述した分析装置の技術的特徴と同一の技術的特徴を有する分析方法と、コンピュータを上述した分析装置の制御部として機能させるためのプログラムと、が提供される。
【発明の効果】
【００１５】
開示のコード化粒子及び分析装置によれば、光反射膜又は光遮蔽膜により生ずる反射光又は透過光によりコードが読取られて認識されるため、ＳＮ比が良い。また、コード化粒子が吸着により平面上整列状態で捕捉されるため、洗浄により流出することがなく、かつ、コードの読取りが容易となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、添付図面を参照して本発明の実施形態について説明する。図１は、一実施形態に係るコード化粒子１００を示す図であって、（ａ）は平面図、（ｂ）は側面図、（ｃ）は底面図である。コード化粒子１００は、直径が２６±１μｍの円形からなる外形を有し厚さが４μｍである二枚の透明平板層１０２及び１０４の間に、粒子種識別用コードに応じてパターン化された光反射膜１１０を配した構造を有している。透明平板層１０２及び１０４は、Ｓｉ、ＳｉＯ2、ＳｉＮ、Ｓｉ3Ｎ4等のガラス質、セラミック質等からなる。光反射膜１１０は、Ａｌ、Ｔｉ等からなる。
【００１７】
光反射膜１１０は、１個の基準マーク１１２と複数個（Ｎ個）のビットマーク１１４とから構成される。基準マーク１１２は、開始点と配列方向を示すものであり、これにより、表面または裏面のいずれの面から見た場合にも正しくコードを識別することが可能となる。すなわち、図１（ａ）及び（ｃ）のいずれの状態でも同一の粒子種と認識することができる。
【００１８】
また、ビットマーク１１４は、その存在の有無により“１”又は“０”の情報を表す。ビットマーク１１４の数Ｎが１４である（Ｎ＝１４）場合には、２N＝１６３８４種類のコードを表示可能な粒子セットを準備することができることとなる。コードの認識は、落射照明光が光反射膜１１０によって反射されることにより生じる強い光を読取ることで実現される。
【００１９】
図１に示される透明平板層１０２及び１０４の各々は、直径が２６±１μｍで厚さが４μｍの円形構造を有しているが、直径は１〜１００μｍ、厚さは１〜３０μｍの範囲で適宜変更することができる。また、更には、円形である必要もなく、一辺の長さが１〜１００μｍの多角形からなる外形を有し厚さが１〜３０μｍである二枚の透明平板層としてもよい。これらの寸法であれば、コード化粒子がそのアスペクト比により平面上に配列することになる。
【００２０】
また、図１に示される例では、粒子種識別用コードを表すために二枚の透明平板層１０２及び１０４の間に光反射膜１１０を配しているが、光反射膜に代えて、コードに応じてパターン化された光遮蔽膜を設けてもよい。この場合には、コード化粒子の一方の側からコード化粒子を照明し、コード化粒子の他方の側にて透過光を観察し、陰影を読取ることでコードを認識することができる。光反射膜又は光遮蔽膜のいずれを採用する場合にも、光強度の強いコントラストでコードを読取ることができる。
【００２１】
図２は、図１に示されるコード化粒子の製造方法の例を示す図である。まず、図２（ａ）に示されるように、半導体（Ｓｉ）基板２０２の上にポリシリコン（Ｐｏｌｙ−Ｓｉ）からなる剥離層２０４とＳｉＯ2からなる第一の（すなわち、下層側の）透明平板層２０６とをＰＥＣＶＤ（Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition：プラズマ化学気相成長法）で成膜した後、第一のレジスト層２０８を塗布する。
【００２２】
次いで、図２（ｂ）に示されるように、粒子種識別用コードに応じたパターン状に第一のレジスト層２０８を露光及び現像した後、Ａｌ又はＴｉからなる蒸着膜２１０を成膜する。
【００２３】
次いで、図２（ｃ）に示されるように、第一のレジスト層２０８を剥離した後、ＳｉＯ2からなる第二の（すなわち、上層側の）透明平板層２１２をＰＥＣＶＤで成膜する。
【００２４】
次いで、図２（ｄ）に示されるように、第二のレジスト層２１４を塗布した後、粒子片状に第二のレジスト層２１４を露光及び現像する。
【００２５】
次いで、図２（ｅ）に示されるように、エッチング又はイオンミリングにより粒子片に分割する。
【００２６】
最後に、図２（ｆ）に示されるように、剥離層２０４及び第二のレジスト層２１４を溶解することにより、複数のコード化粒子１００を半導体（Ｓｉ）基板２０２から剥がす。このようにして、４インチ基板あたり６Ｍ個のコード化粒子を作製することができる。
【００２７】
図３は、図１に示されるコード化粒子に施されるバイオ的表面修飾について説明するための図であって、（ａ）はコーティングされたコード化粒子、（ｂ）は該コーティング後にバイオ的表面修飾を施されたコード化粒子、（ｃ）はそのバイオ的表面修飾済みコード化粒子と蛍光物質で標識（ラべリング）されたターゲットとの結合状態、をそれぞれ模式的に示している。
【００２８】
図３（ａ）に示されるように、コード化粒子１００の表面にシランカップリング剤又はポリマー３０２をコーティングすることで、各種の官能基が導入される。官能基が導入された後には、図３（ｂ）に模式的に示されるように、免疫アッセイ、ＤＮＡ解析、ＳＮＰｓ解析、創薬探索等に関わるバイオ的表面修飾３０４（例えば、免疫アッセイにあっては抗体修飾）を施すことができ、分析用にバイオ的表面修飾を施されたコード化粒子３０６が完成する。
【００２９】
この際、バイオ的表面修飾の種類ごとにコードを割り当てればよく、例えば、図１に示されるように、コードを１４個のビットパターンで配列すれば、２14＝１６３８４種類のバイオ的表面修飾に対応することができることとなる。バイオ的表面修飾済みコード化粒子３０６は、例えば、図３（ｃ）に示されるように、蛍光物質３０８で標識（ラべリング）されたターゲット３１０と結合反応を起こすことができる。分析実験においては、蛍光を発するコード化粒子のコードを判別することでサンプル中における該当ターゲットの存在を検出することが可能となる。
【００３０】
図４は、分析装置の一実施形態の概略構成を示す図である。また、図５は、分析におけるコード化粒子の使用形態について説明するための図であって、（ａ）はコード化粒子がシャーレに捕捉される様子及び可視光下でのコード認識について説明するための図、（ｂ）は蛍光観測について説明するための図である。
【００３１】
図４において、符号４０２は９６穴プレート、符号４０４は電動ピペット、符号４０６は捕捉シャーレ、符号４０８はビーズ捕捉／解放圧力レギュレータ、符号４１０はバッファタンク、符号４１２はシリンジポンプ（syringe pump）、符号４１４はパージ圧力レギュレータ、符号４１６は洗浄水タンク、符号４１８は廃液タンク、符号４２０は顕微鏡、符号４２２は蛍光励起ランプ、符号４２４は蛍光フィルタターレット、符号４２６は冷却ＣＣＤ（Charge Coupled Device：電荷結合素子）カメラ、符号４３０はパーソナルコンピュータ（ＰＣ）、符号４４０はディスプレイ、をそれぞれ示す。
【００３２】
ＰＣ４３０は、分析装置における制御部であって、プロセッサ、メモリ等を備え、メモリにロードされたプログラムをプロセッサに実行させることで、機構制御部４３２、画像処理部４３４、解析処理部４３６等として機能する。
【００３３】
まず、９６穴プレート４０２の各穴において、各種のビーズ（バイオ的表面修飾済みコード化粒子）３０６がサンプル（検体）中で懸濁される。さらに、必要に応じて、検出ターゲット物質を標識（ラベリング）するための蛍光ラベル試薬も懸濁される。ビーズ３０６は、そのバイオ的表面修飾に応じたサンプル中のターゲット（タンパク質、抗原、ＤＮＡ等）と反応して結合する。ターゲットと結合したビーズ３０６は、蛍光性を獲得する。
【００３４】
この懸濁液は、電動ピペット４０４によって、捕捉シャーレ４０６に移される。捕捉シャーレ４０６は、図５（ａ）に示されるように、マトリックス状に約１０００個のザグリ穴（凹部）５０２が設けられている。各ザグリ穴５０２は、ビーズ３０６とほぼ同一の大きさを有し、その穴底に吸引穴５０４を備えている。ＰＣ４３０は、ビーズ捕捉／解放圧力レギュレータ４０８を制御し、バッファタンク４１０、吸引穴５０４等を介して、捕捉シャーレ４０６の裏面から負圧で吸引することで、ビーズ３０６をザグリ穴５０２に導いて吸着する。
【００３５】
次いで、ＰＣ４３０は、かかる吸着状態で、シリンジポンプ４１２及びパージ圧力レギュレータ４１４を制御することで、洗浄水タンク４１６から洗浄水を捕捉シャーレ４０６に流し、シャーレに捕捉されなかったビーズ、ビーズと結合していない成分等を廃液タンク４１８へと流し去る。
【００３６】
かくして、ビーズ（バイオ的表面修飾済みコード化粒子）３０６が吸着により平面上整列状態で捕捉され、かつ、洗浄により余分な成分が除去された状態で、ビーズを観察することが可能となる。
【００３７】
その観察では、まず、捕捉シャーレ４０６の各穴に捕捉されたビーズ３０６のコードが読取られる。ＰＣ４３０は、図５（ａ）に示されるように、落射可視光照明の下で、顕微鏡４２０を介してビーズ３０６のコードを読取り、マトリックス状に設けられた穴５０２ごとに、コードすなわちビーズ種を記憶する。
【００３８】
次いで、ＰＣ４３０は、図５（ｂ）に示される蛍光観測を行う。図５（ｂ）では、蛍光が発している様子を、便宜上、斜線で表している。すなわち、ＰＣ４３０は、蛍光励起ランプ４２２、蛍光フィルタターレット４２４等を使用し、落射蛍光照明の下で、蛍光フィルタごとの輝度測定を行い、ターゲットとの結合反応による輝度を呈しているビーズのマトリックス内位置を判定する。そのマトリック内位置がわかれば、その位置にあるビーズの種類すなわちターゲット成分が予め調査されていることから、ＰＣ４３０は、サンプル中に含有される成分を同定することができる。
【００３９】
以上の実施形態に関し、以下の付記を開示する。
【００４０】
（付記１）  円形又は多角形からなる外形を有する二枚の透明平板層と、
前記二枚の透明平板層の間にあって、粒子種識別用コードに応じてパターン化された光反射膜又は光遮蔽膜と、
を具備するコード化粒子。
【００４１】
（付記２）  バイオ的表面修飾が施された、付記１に記載のコード化粒子。
【００４２】
（付記３）  付記１に記載のコード化粒子の製造方法であって、
半導体基板の上に剥離層及び第一の透明平板層を成膜した後、第一のレジスト層を塗布する工程と、
粒子種識別用コードに応じたパターン状に該第一のレジスト層を露光及び現像した後、蒸着膜を成膜する工程と、
該第一のレジスト層を剥離した後、第二の透明平板層を成膜する工程と、
第二のレジスト層を塗布した後、粒子片状に該第二のレジスト層を露光及び現像する工程と、
エッチング又はイオンミリングにより粒子片に分割する工程と、
該剥離層及び該第二のレジスト層を溶解して複数のコード化粒子を得る工程と、
を具備する、コード化粒子の製造方法。
【００４３】
（付記４）  付記２に記載のコード化粒子の懸濁液から該コード化粒子を吸着により平面上整列状態で捕捉する捕捉手段と、
前記捕捉手段に捕捉されたコード化粒子に光を照射する照射手段と、
前記照射手段によって光を照射されたコード化粒子からの反射光又は透過光に基づいて、該コード化粒子が有する粒子種識別用コードを読取る読取り手段と、
を具備する分析装置。
【００４４】
（付記５）  付記２に記載のコード化粒子の懸濁液から該コード化粒子を吸着により平面上整列状態で捕捉するステップと、
該捕捉されたコード化粒子に光を照射するステップと、
該光を照射されたコード化粒子からの反射光又は透過光に基づいて、該コード化粒子が有する粒子種識別用コードを読取るステップと、
を具備する分析方法。
【００４５】
（付記６）  分析装置に設けられるコンピュータを、
捕捉部が、付記２に記載のコード化粒子の懸濁液から該コード化粒子を吸着により整列状態で捕捉するように制御する手段と、
照射部が、前記捕捉部に捕捉されたコード化粒子に光を照射するように制御する手段と、
前記照射部によって光を照射されたコード化粒子からの反射光又は透過光に基づいて、該コード化粒子が有する粒子種識別用コードを読取る手段と、
として機能させるプログラム。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】一実施形態に係るコード化粒子を示す図であって、（ａ）は平面図、（ｂ）は側面図、（ｃ）は底面図である。
【図２】図１に示されるコード化粒子の製造方法の例を示す図である。
【図３】図１に示されるコード化粒子に施されるバイオ的表面修飾について説明するための図であって、（ａ）はコーティングされたコード化粒子、（ｂ）は該コーティング後にバイオ的表面修飾を施されたコード化粒子、（ｃ）はそのバイオ的表面修飾済みコード化粒子と蛍光物質で標識（ラべリング）されたターゲットとの結合状態、をそれぞれ模式的に示す図である。
【図４】分析装置の一実施形態の概略構成を示す図である。
【図５】分析におけるコード化粒子の使用形態について説明するための図であって、（ａ）はコード化粒子がシャーレに捕捉される様子及び可視光下でのコード認識について説明するための図、（ｂ）は蛍光観測について説明するための図である。
【図６】貫通孔、窪み、溝又は切欠きによりコード化された従来の粒子を示す図である。
【図７】蛍光剤をコード状に漂白することによりコード化された従来の粒子を説明するための図である。
【図８】従来のコード読取り装置の例を示す図である。
【符号の説明】
【００４７】
１００    コード化粒子
１０２、１０４    透明平板層
１１０    光反射膜
１１２    基準マーク
１１４    ビットマーク
２０２    半導体（Ｓｉ）基板
２０４    剥離層
２０６    第一の（下層側）透明平板層
２０８    第一のレジスト層
２１０    蒸着膜
２１２    第二の（上層側）透明平板層
２１４    第二のレジスト層
３０２    シランカップリング剤又はポリマー
３０４    バイオ的表面修飾
３０６    バイオ的表面修飾済みコード化粒子
３０８    蛍光物質
３１０    ターゲット
４０２    ９６穴プレート
４０４    電動ピペット
４０６    捕捉シャーレ
４０８    ビーズ捕捉／解放圧力レギュレータ
４１０    バッファタンク
４１２    シリンジポンプ
４１４    パージ圧力レギュレータ
４１６    洗浄水タンク
４１８    廃液タンク
４２０    顕微鏡
４２２    蛍光励起ランプ
４２４    蛍光フィルタターレット
４２６    冷却ＣＣＤカメラ
４３０    パーソナルコンピュータ（ＰＣ）
４３２    機構制御部
４３４    画像処理部
４３６    解析処理部
４４０    ディスプレイ
５０２    ザグリ穴（凹部）
５０４    吸引穴
６０２    固体支持粒子
６０４    貫通孔
６０６    窪み
６０８    溝
６１０    切欠き
６１２    方向づけマーク
８０２    コード化粒子
８０４    キャピラリー流路
８０６    読取りステーション
８０８    電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ
８１０    計算システム
【図１】
2009174954.tif 000003
【図２】
2009174954.tif 000004
【図３】
2009174954.tif 000005
【図４】
2009174954.tif 000006
【図５】
2009174954.tif 000007
【図６】
2009174954.tif 000008
【図７】
2009174954.tif 000009
【図８】
2009174954.tif 000010