(57)【要約】【課題】サブユニット蛋白質複合体及びその用途を提供する。【解決手段】シリカ系メソ多孔体の細孔内部にサブユニット蛋白質を備えるサブユニット蛋白質内包複合体であって、前記サブユニット蛋白質は、前記細孔内部で多量体を形成しており、該多量体は、高密度に集積した蛋白質として、前記シリカ系メソ多孔体の細孔内壁に吸着されていて、前記サブユニット蛋白質が蛍光標識されており、該蛍光標識により、メソ多孔体内での蛋白質の状態が観察され得ることを特徴とするサブユニット蛋白質複合体、該複合体を機能性成分として含みサブユニット蛋白質の活性を安定に有する機能性部材。【効果】カタラーゼ等のサブユニット蛋白質の活性を安定に保持した新規サブユニット蛋白質−シリカ系メソ多孔体複合体、及びその機能性部材としての用途を提供することができる。【選択図】図３
2009044963.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリカ系メソ多孔体の細孔内部にサブユニット蛋白質を備えるサブユニット蛋白質内包複合体であって、（１）前記サブユニット蛋白質は、前記細孔内部で多量体を形成している、（２）該多量体は、高密度集積した蛋白質として、前記シリカ系メソ多孔体の細孔内壁に吸着されている、（３）前記サブユニット蛋白質が蛍光標識されている、（４）該蛍光標識により、メソ多孔体内での蛋白質の状態が観察され得る、ことを特徴とするサブユニット蛋白質複合体。
【請求項２】
前記サブユニット蛋白質が、カタラーゼである、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記シリカ系メソ多孔体が、（１）ケイ素原子と酸素原子を必須成分として含む化合物の多孔体である、（２）細孔のサイズがメソ孔であり、その中心細孔直径が２〜５０ｎｍである、（３）細孔容積が０．１〜１．５ｍＬである、（４）比表面積が２００〜１５００ｍ２である、（５）表面にシラノール基（−ＳｉＯＨ基）を有する、請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
シリカ系メソ多孔体において、全細孔容積に占める、中心細孔直径の±４０％の範囲内の直径を有する細孔の全容積の割合が６０％以上である、及び／又は１ｎｍ以上のｄ値に相当する回折角度に１本以上のピークを有するＸ線回折パターンを示す、請求項１に記載の複合体。
【請求項５】
前記シリカ系メソ多孔体に吸着させるカタラーゼの重量が、シリカメソ多孔体１００重量部当たり、０．５〜５０重量部である、請求項１に記載の複合体。
【請求項６】
前記シリカ系メソ多孔体の中心細孔直径が、３〜６ｎｍである、請求項１に記載の複合体。
【請求項７】
前記シリカ系メソ多孔体のｐＫａが、５〜１４である、請求項１に記載の複合体。
【請求項８】
前記シリカ系メソ多孔体の細孔内部に、酸化触媒が更に担持されている、請求項１に記載の複合体。
【請求項９】
１サブユニットあたり蛍光色素により２２％まで修飾されている、請求項１に記載の複合体。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか１項に記載のサブユニット蛋白質複合体を機能性成分として含むことを特徴とするサブユニット蛋白質の活性を安定に有する機能性部材。
【請求項１１】
カタラーゼ複合体を機能性成分として含み、カタラーゼに吸着する酸素、一酸化炭素、又は一酸化窒素を濃縮する作用を有する、請求項１０に記載の機能性部材。
【請求項１２】
カタラーゼ複合体を機能性成分として含み、有機溶媒中での触媒能を有する、請求項１０に記載の機能性部材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サブユニット蛋白質複合体に関するものであり、更に詳しくは、シリカ系メソ多孔体の細孔内部にカタラーゼ等のサブユニット蛋白質を備えるサブユニット蛋白質内包複合体及びその用途に関するものである。本発明は、シリカ系メソ多孔体の細孔内部にカタラーゼ等のサブユニット蛋白質の活性を安定に保持して、その機能を発揮することが可能な新規サブユニット蛋白質−シリカ系メソ多孔体複合体及びその機能性部材としての用途に関する新技術・新製品を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
サブユニット蛋白質の一種であるカタラーゼなどの酸素運搬蛋白質は、合成錯体では得られない特有の酸素、一酸化炭素、及び一酸化窒素を結合させる機能を有しており、また、環境に負荷を与える心配のない安全な蛋白質であることから、その多様な用途が期待される。しかし、蛋白質は、一般的に、光、酸素、熱、ｐＨ、溶媒等に対して敏感であり、それらに晒されるとすぐに変性を起こすなど、生体から取り出し、純粋な化合物にすると、不安定になる傾向がある。
【０００３】
蛋白質は、アミノ酸が連結されてなるポリペプチドが一定の形態に折りたたまれて立体構造を形成し、その立体構造中に活性部位を形成している。例えば、このような構造を有する酵素が不活性化する機構としては、蛋白質分解酵素により、酵素を構成するポリペプチド鎖が切断される場合や、熱、ｐＨ等の外部環境変化により、蛋白質の立体構造が変化し、活性部位が破壊される場合などがある。
【０００４】
これらの酵素の不活性化を防止する方法として、蛋白質分子内に、Ｓ−Ｓ結合や、グルタルアルデヒド等による架橋を新たに導入し、蛋白質分子自身の構造をｒｉｇｉｄにする試みがなされている。しかし、これらの改変は、各酵素ごとにその方法が異なり、十分な安定性が得られない場合も多く、汎用性が低いという問題点がある。
【０００５】
また、様々な蛋白質の安定化に応用される方法として、種々の固定化酵素が提案されている（特許文献１）。しかし、従来の固定化酵素では、蛋白質を直接樹脂等に固定させているため、蛋白質分解酵素により分解されたり、外部環境の変化により立体構造が変化することを防止できない。また、酵素をゲルに封じ込める包括固定化法や半透性のポリマー被膜により被覆するマイクロカプセル法が提案されている。そして、これらの方法によれば、酵素は、蛋白質分解酵素による分解を受けることがなく、安定性の向上が期待される。
【０００６】
しかしながら、これらの方法においては、酵素と外部を覆う構造体とは、一般的に分子サイズに合致した形では固定されていないため、酵素をゲル格子や、カプセル内にしっかりと固定できず、酵素が漏出し、失活するという不具合が生じる。また、これらの方法では、外部環境の変化に伴う酵素の立体構造変化を防止する効果も低い。
【０００７】
一方、ポリエチレングリコール（特許文献２）や、糖脂質（非特許文献１）で、蛋白質の表面を修飾することにより、酵素の安定化を行う方法が提案されている。しかしながら、これらの方法では、酵素を覆う構造体は分子サイズに合致しておらず、構造安定性が不十分であるため、外部環境の変化に伴い酵素の立体構造が変化することを十分に防止することは困難である。
【０００８】
他方、いわゆる人工酵素が提案されており、例えば、金属フタロシアニンを高分子物質に結合させて酵素活性ないし触媒能を発現させたもの（特許文献３、特許文献４）、ポルフィリンにイミダゾール基を導入して配位させ、触媒機能を高めようとするもの（非特許文献２）、等が提案されている。これらの手段によれば、酵素の安定性は向上するが、その特異性は天然の酵素にはるかに及ばない。そこで、当技術分野においては、蛋白質を安定に保持してその活性を有効に利用することが可能な新しい蛋白質高度利用技術の開発が強く要請されていた。
【０００９】
【特許文献１】特開２０００−１３９４５９号公報
【特許文献２】特開平２−２２２６９８号公報
【特許文献３】特公平２−５７６５号公報
【特許文献４】特開平２−５７２６０号公報
【非特許文献１】岡畑ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第６０巻、２２４４頁（１９９５）
【非特許文献２】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５，９４９−９５１（１９９７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、サブユニット蛋白質を安定に担持することが可能なサブユニット蛋白質複合体を開発することを目標として鋭意研究を重ねた結果、特定のシリカ系メソ多孔体の細孔内部に、特定の状態でサブユニット蛋白質を吸着させ、サブユニット蛋白質複合体を形成させることにより所期の目的を達成できことを見出し、更に研究を重ねて、本発明を完成させるに至った。本発明は、上記従来技術の問題点に鑑みてなされたものであり、カタラーゼ等のサブユニット蛋白質を、安定に、高機能性を保持して、且つ大きな吸着量で吸着担持させた新規サブユニット蛋白質複合体及びその用途を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）シリカ系メソ多孔体の細孔内部にサブユニット蛋白質を備えるサブユニット蛋白質内包複合体であって、１）前記サブユニット蛋白質は、前記細孔内部で多量体を形成している、２）該多量体は、高密度集積した蛋白質として、前記シリカ系メソ多孔体の細孔内壁に吸着されている、３）前記サブユニット蛋白質が蛍光標識されている、４）該蛍光標識により、メソ多孔体内での蛋白質の状態が観察され得る、ことを特徴とするサブユニット蛋白質複合体。
（２）前記サブユニット蛋白質が、カタラーゼである、前記（１）に記載の複合体。
（３）前記シリカ系メソ多孔体が、１）ケイ素原子と酸素原子を必須成分として含む化合物の多孔体である、２）細孔のサイズがメソ孔であり、その中心細孔直径が２〜５０ｎｍである、３）細孔容積が０．１〜１．５ｍＬである、４）比表面積が２００〜１５００ｍ２である、５）表面にシラノール基（−ＳｉＯＨ基）を有する、前記（１）に記載の複合体。
（４）シリカ系メソ多孔体において、全細孔容積に占める、中心細孔直径の±４０％の範囲内の直径を有する細孔の全容積の割合が６０％以上である、及び／又は１ｎｍ以上のｄ値に相当する回折角度に１本以上のピークを有するＸ線回折パターンを示す、前記（１）に記載の複合体。
（５）前記シリカ系メソ多孔体に吸着させるカタラーゼの重量が、シリカメソ多孔体１００重量部当たり、０．５〜５０重量部である、前記（１）に記載の複合体。
（６）前記シリカ系メソ多孔体の中心細孔直径が、３〜６ｎｍである、前記（１）に記載の複合体。
（７）前記シリカ系メソ多孔体のｐＫａが、５〜１４である、前記（１）に記載の複合体。
（８）前記シリカ系メソ多孔体の細孔内部に、酸化触媒が更に担持されている、前記（１）に記載の複合体。
（９）１サブユニットあたり蛍光色素により２２％まで修飾されている、前記（１）に記載の複合体。
（１０）前記（１）から（９）のいずれか１項に記載のサブユニット蛋白質複合体を機能性成分として含むことを特徴とするサブユニット蛋白質の活性を安定に有する機能性部材。
（１１）カタラーゼ複合体を機能性成分として含み、カタラーゼに吸着する酸素、一酸化炭素、又は一酸化窒素を濃縮する作用を有する、前記（１０）に記載の機能性部材。
（１２）カタラーゼ複合体を機能性成分として含み、有機溶媒中での触媒能を有する、前記（１０）に記載の機能性部材。
【００１２】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、シリカ系メソ多孔体の細孔内部にサブユニット蛋白質を備えるサブユニット蛋白質内包複合体であって、（１）前記サブユニット蛋白質は、前記細孔内部で多量体を形成している、（２）該多量体は、高密度集積した蛋白質として、前記シリカ系メソ多孔体の細孔内壁に吸着されている、（３）前記サブユニット蛋白質が蛍光標識されている、（４）該蛍光標識により、メソ多孔体内での蛋白質の状態が観察され得る、ことを特徴とするものである。
【００１３】
本発明のサブユニット蛋白質複合体を、カタラーゼ複合体を代表例として説明する。しかし、本発明で用いられるサブユニット蛋白質は、カタラーゼに限定されるものではなく、カタラーゼ複合体に準じて、他のサブユニット蛋白質についても同様に作製及び利用することが可能である。本発明は、シリカ系メソ多孔体の細孔内部にカタラーゼを備えるカタラーゼ複合体であって、前記カタラーゼは前記細孔内部で多量体を形成しており、該多量体は、高密度に集積して前記シリカ系メソ多孔体の細孔内壁に吸着していることを特徴とするものである。
【００１４】
本発明のカタラーゼ複合体は、多孔質で表面積の非常に大きいシリカ系メソ多孔体を使用し、該メソ多孔体の細孔内部にカタラーゼを吸着させたものであるために、カタラーゼの吸着量を増大させることができる。また、このカタラーゼ複合体では、シリカ系メソ多孔体の細孔中でカタラーゼの多量体を形成させ、更に、その立体構造を、メソ多孔体の細孔内壁によって保持できるために、カタラーゼの安定性を顕著に向上させることが可能になる。
【００１５】
本発明のカタラーゼ複合体においては、前記立体構造が、前記シリカ系メソ多孔体の細孔内壁に囲まれる状態で維持されることにより、カタラーゼの安定性をより向上させることができる。カタラーゼは、前記シリカ系メソ多孔体の細孔内に効率よく吸着され、また、その立体構造が、シリカ系メソ多孔体の細孔内で保持されるため、特に安定化される傾向となる。
【００１６】
また、本発明では、シリカ系メソ多孔体における細孔の中心細孔直径は、３〜６ｎｍであることが好ましい。細孔の中心細孔直径を３〜６ｎｍとすることにより、カタラーゼの立体構造の維持が容易となるため、よりカタラーゼを安定化することができる。
【００１７】
また、本発明では、シリカ系メソ多孔体は、ｐＫａ５〜１４のシリカ系メソ多孔体であることが好ましい。シリカ系メソ多孔体のｐＫａが、上記範囲内である場合は、蛋白質の変性が起こらない。
【００１８】
本発明のカタラーゼ複合体においては、前記シリカ系メソ多孔体の細孔内部に酸化触媒が更に担持されていることが好ましい。このように、カタラーゼ複合体に更に酸化触媒を担持せしめることにより、これを、例えば、濃縮された酸素、一酸化炭素、及び一酸化窒素などを効率よく酸化するための反応に用いることができる。更に、本発明のカタラーゼ複合体においては、酸化触媒を担持させることにより、有機溶媒（ベンゼン、トルエン等）中で、過酸化脂質を効率よく酸化する酵素活性を付与することができる。
【００１９】
次に、本発明で使用されるシリカ系メソ多孔体について説明すると、本発明において、シリカ系メソ多孔体とは、ケイ素原子と酸素原子を必須成分として含む化合物の多孔体であり、細孔のサイズがメソ孔であるものを意味するものとして定義される。ここで、メソ孔とは、中心細孔直径が２〜５０ｎｍであるものをいう。なお、中心細孔直径とは、シリカ系メソ多孔体の細孔容積（Ｖ）を細孔直径（Ｄ）で微分した値（ｄＶ／ｄＤ）を細孔直径（Ｄ）に対してプロットした曲線（細孔径分布曲線）の最大ピークにおける細孔直径を意味する。
【００２０】
そして、この細孔分布曲線は、シリカ系メソ多孔体を、液体窒素温度（−１９６℃）に冷却して窒素ガスを導入し、定容量法によりその吸着量を求め、次いで、導入する窒素ガスの圧力を徐々に増加させ、各平衡圧に対する窒素ガス吸着量をプロットして吸着等温線を得た後に、Ｃｒａｎｓｔｏｎ−Ｉｎｋｌａｙ法を適用して求めることができる曲線である。
【００２１】
本発明において、上記シリカ系メソ多孔体の中心細孔直径は、特に、３〜６ｎｍであることが好ましい。中心細孔直径が３ｎｍ未満では、カタラーゼの細孔内への吸着が不充分となる傾向があり、中心細孔直径が６ｎｍを超えると、カタラーゼが効率よく立体構造が保持されない傾向がある。すなわち、シリカ系メソ多孔体の中心細孔直径を上記範囲内にすることにより、カタラーゼの吸着を効率化でき、立体構造の保持も容易となるため、カタラーゼを更に安定化することができる。
【００２２】
本発明において、上記シリカ系メソ多孔体は、０．１〜１．５ｍＬ／ｇの細孔容積を有するものであることが好ましく、また、２００〜１５００ｍ２の比表面積を有するものであることが好ましい。そして、上記シリカ系メソ多孔体は、全細孔容積に占める、中心細孔直径の±４０％の範囲内の直径を有する細孔の全容積の割合が６０％以上の多孔体であることが好ましい。
【００２３】
ここで、全細孔容積に占める、中心細孔直径の±４０％の範囲内の直径を有する細孔の全容積の割合が６０％以上とは、例えば、中心細孔直径が３．００ｎｍである場合、この３．００ｎｍの±４０％、すなわち、１．８０〜４．２０ｎｍの範囲にある細孔の容積の合計が、全細孔容積の６０％以上を占めていることを意味する。
【００２４】
この条件を満たす多孔体は、細孔の直径が非常に均一であることを意味し、このような細孔配列構造を有するシリカ系メソ多孔体にサブユニット蛋白質を吸着させることにより、サブユニット蛋白質の安定性及び吸着量をより向上させることができる。なお、細孔容積は、上述のように、シリカ系メソ多孔体を液体窒素温度に冷却して窒素ガスを導入する方法（窒素吸着法）により算出することができる。
【００２５】
本発明において、上記シリカ系メソ多孔体は、１ｎｍ以上のｄ値に相当する回折角度に１本以上のピークを有するＸ線回折パターンを示す多孔体であることが好ましい。Ｘ線回折パターンでピークが現われる場合は、そのピーク角度に相当するｄ値の周期構造がシリカ系メソ多孔体中にあることを意味する。
【００２６】
したがって、１ｎｍ以上のｄ値に相当する回折角度に１本以上のピークがあることは、細孔が１ｎｍ以上の間隔で規則的に配列していることを意味する。このように、非常に規則的な細孔配列構造を有するシリカ系メソ多孔体にサブユニット蛋白質を吸着させることにより、サブユニット蛋白質の安定性及び吸着量をより向上させることが可能になる。
【００２７】
本発明では、上述のシリカ系メソ多孔体における、細孔の配列状態（細孔配列構造）は、特に制限されない。シリカ系メソ多孔体としては、例えば、ヘキサゴナルの細孔配列構造を有するものや、キュービックやディスオーダの細孔配列構造を有するものが例示される。
【００２８】
ここで、シリカ系メソ多孔体がヘキサゴナルの細孔配列構造を有するとは、シリカ系メソ多孔体の細孔の配置が六方構造であることを意味する（Ｉｎａｇａｋｉ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，６９，１４４９（１９９６）；Ｑ．Ｈｕｏ  ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８，１３２４（１９９５）参照）。ヘキサゴナルの細孔配列構造としては、２ｄ−ヘキサゴナル（２次元ヘキサゴナル）及び３ｄ−ヘキサゴナル（３次元ヘキサゴナル）が挙げられる。本発明において好適に用いることのできる２次元ヘキサゴナルの細孔配列構造を有するシリカ系メソ多孔体は、２次元ヘキサゴナル配列構造に基づいて、六角柱状の細孔が互いに平行に規則的に形成されている。
【００２９】
シリカ系メソ多孔体がキュービックの細孔配列構造を有するとは、シリカ系メソ多孔体中の細孔の配置が立方構造であることを意味する（Ｊ．Ｃ．Ｖａｒｔｕｌｉ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．，６，２３１７，１９９４；Ｑ．Ｈｕｏ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，３１７，１９９４参照）。そして、シリカ系メソ多孔体がディスオーダの細孔配列構造を有するとは、細孔の配置が不規則であることを意味する（Ｐ．Ｔ．Ｔａｎｅｖ  ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６７，８６５，１９９５；Ｓ．Ａ．Ｂａｇｓｈａｗ  ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９，１２４２，１９９５；Ｒ．Ｒｙｏｏ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，１００，１７７１８，１９９６参照）。
【００３０】
シリカ系メソ多孔体が、ヘキサゴナルやキュービック等の規則的細孔配列構造を有する場合は、細孔の全てがこれらの規則的細孔配列構造である必要はない。すなわち、シリカ系メソ多孔体は、ヘキサゴナルやキュービック等の規則的細孔配列構造とディスオーダの不規則的細孔配列構造の両方を有していることが可能である。しかしながら、全ての細孔のうち、８０％以上は、ヘキサゴナルやキュービック等の規則的細孔配列構造となっていることが好ましい。
【００３１】
本発明において、上記シリカ系メソ多孔体としては、有機基を有するシリカ系メソ多孔体、有機基を有しないシリカ系メソ多孔体が例示される。そして、いずれの多孔体の場合においても、ケイ素以外の金属元素（例えば、Ａｌ、Ｚｒ、Ｔｉ等）を更に含むことができる。なお、いずれのシリカ系メソ多孔体であっても、表面にはシラノール基（−ＳｉＯＨ基）が存在している。
【００３２】
有機基を有するシリカ系メソ多孔体とは、シリカ系メソ多孔体を構成するケイ素原子の少なくとも一部に、有機基が、炭素−ケイ素結合を形成することによって結合しているものをいう。有機基としては、例えば、アルカン、アルケン、アルキン、ベンゼン、シクロアルカン等の炭化水素から１以上の水素がとれて生じる炭化水素基や、アミド基、アミノ基、イミノ基、メルカプト基、スルフォン基、カルボキシル基、エーテル基、アシル基、ビニル基等が挙げられる。
【００３３】
シリカ系メソ多孔体は、後記する実施例１に記載されるように、好適には、例えば、乾燥水ガラスを空気中で焼成し、ジケイ酸ソーダに結晶化させ、この結晶を水に分散させ、その後、濾過して固形分を回収することでカネマイトとして合成される。
【００３４】
次に、本発明で使用されるサブユニット蛋白質について説明する。本発明においては、サブユニット蛋白質が使用されるが、ここではカタラーゼを代表例として説明すると、カタラーゼの構造は、図１で表すことができる。シリカ系メソ多孔体に吸着させるカタラーゼの重量は、シリカ系メソ多孔体１００重量部当たり、０．５〜５０重量部であることが好ましく、２０〜５０重量部であることがより好ましい。カタラーゼの吸着量が上記範囲である場合、カタラーゼのシリカ系メソ多孔体への吸着が効率的に生じ、安定化の程度が向上する。
【００３５】
次に、本発明のカタラーゼ複合体について説明すると、本発明のカタラーゼ複合体は、シリカ系メソ多孔体の細孔内部にカタラーゼを備えており、前記カタラーゼは、前記細孔内部で多量体を形成しており、更に、該多量体は、前記シリカ系メソ多孔体の細孔内壁に吸着して複合体を形成している。
【００３６】
ここで、カタラーゼの多量体とは、２以上のサブユニット蛋白質が、直接に又は水などの低分子を介して、結合してなる化合物をいい、結合には、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合が含まれる。しかし、これらの結合の種類は、特に制限されない。
【００３７】
図２は、図１に示すカタラーゼをシリカ系メソ多孔体の細孔内部に備える、カタラーゼ複合体を模式的に示す斜視図である。なお、図２は、シリカ系メソ多孔体の中心部分の細孔のみを拡大して示したものである。
【００３８】
図２に示すカタラーゼ複合体において、シリカ系メソ多孔体の細孔内には、カタラーゼが存在している。それらは、図２の構造に限定されるものではなく、例えば、更に多量体を形成している場合もあり得る。前記サブユニット蛋白質は蛍光標識されており、該蛍光標識により、メソ多孔体内での蛋白質の状態が観察され得る。これまで、メソ多孔体の中に導入された蛋白質を視覚的に捕らえた研究例は存在しない。本発明で、蛋白質を蛍光標識し、その蛋白質をメソポーラスシリカの細孔に導入することで初めて細孔内での蛋白質の３次構造の状態が観測可能となった。
【００３９】
また、本発明のカタラーゼ複合体においては、前記シリカ系メソ多孔体の細孔内部に酸化触媒が更に担持されていることが好ましい。このような酸化触媒としては、酸化ルテニウム、酸化マンガン、酸化鉄、酸化チタン等が挙げられ、これらは、例えば、濃縮された酸素、一酸化炭素、一酸化窒素の酸化反応に用いることができる。
【００４０】
酸化触媒は、０．１〜５重量％程度が一般的である。更に、このような酸化触媒を担持させる方法も、特に制限されないが、例えば、シリカ系メソ多孔体を、酸化触媒又はその前駆体の溶液中に入れて攪拌した後、減圧乾燥し、更に必要に応じて、加熱等により前駆体を酸化させることにより、酸化触媒を担持したカタラーゼ複合体を得ることが可能である。上述のように、本発明では、カタラーゼ複合体を代表例として説明したが、本発明は、上記カタラーゼ複合体に限定されるものではなく、他のサブユニット蛋白質についても同様の手法でサブユニット蛋白質複合体を作製し、提供することが可能である。
【発明の効果】
【００４１】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）カタラーゼを安定に、且つ大きな吸着量で吸着させたカタラーゼ複合体を提供することができる。
（２）カタラーゼ複合体と同様に、他のサブユニット蛋白質を同様の手法で複合化することができる。
（３）サブユニット蛋白質を安定に保持して、その活性を安定、且つ高活性で発揮させることが可能なサブユニット蛋白質の高度利用技術を提供することができる。
（４）サブユニット蛋白質の活性を維持して安定、且つ有効に発揮することが可能な新規機能性部材を提供することができる。
（５）蛋白質を蛍光標識し、その蛋白質をメソポーラスシリカの細孔に導入することで初めて細孔内での蛋白質の状態を観察することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
次に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４３】
本実施例では、シリカ系メソ多孔体の合成を行った。
（１）合成例１
水ガラス１号２７１．５９ｇを水８２８．４１ｇと混合後、８０℃に加熱した。別途、ドコシルトリメチルアンモニウムクロライド８０ｇを７０℃の水１リットルに添加、溶解後、トリイソピルベンゼン７０ｍｌ（６０ｇ）を更に添加し、ホモミキサーで３０分攪拌した。この乳化液を水ガラス溶液に瞬時に添加して、更に５分攪拌した。
【００４４】
これに２規定塩酸を約１時間かけて添加し、ｐＨ８．５の状態で約３時間攪拌した。吸引濾過後、７０℃の熱水に再分散・濾過を繰り返し、濾液の伝導度が１００μＳ／ｃｍ以下であることを確認した。４５℃で３日間乾燥した後、５５０℃で６時間焼成することにより、中心細孔直径６．２ｎｍのシリカ系メソ多孔体を得た。得られたシリカ系メソ多孔体を、以下「大口径ＦＳＭ」と記載する。
【００４５】
ＦＳＭ６．２について、粉末Ｘ線回折及び窒素吸着等温線の測定を行った。粉末Ｘ線回折は、理学ＲＡＤ−Ｂ装置を用いて測定し、窒素吸着等温線は、液体窒素温度において、定容積法により求めた。Ｘ線回折パターンにより、ＦＳＭ６．２は、２次元ヘキサゴナルの細孔配列構造を有していることが分かった。また、窒素吸着等温線からＣｒａｎｓｔｏｎ−Ｉｎｋｌａｙ法で計算した細孔分布曲線によると、全細孔容積に占める、中心細孔直径の±４０％の範囲内の直径を有する細孔の全容積の割合は、６０％以上であることが分かった。
【００４６】
（２）合成例２
乾燥水ガラス（ＳｉＯ２／Ｎａ２Ｏ＝２．００）を７００℃で６時間、空気中で焼成し、ジケイ酸ソーダ（δ−Ｎａ２Ｓｉ２Ｏ５）に結晶化させた。この結晶５０ｇを５００ｍＬの水に分散させ、３時間攪拌した。その後、濾過して固形分を回収してカネマイトを得た。こうして得られたカネマイト５０ｇを０．１Ｍのヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド水溶液１０００ｍＬに分散させ、７０℃で３時間攪拌しながら加熱した。加熱初期の分散液のｐＨは１２．３であった。その後、７０℃で加熱、攪拌しながら２Ｎの塩酸を添加して、分散液のｐＨを８．５に下げた。
【００４７】
そして、更に７０℃で３時間加熱した後、室温まで放冷した。固形生成物をいったん濾過し、再び１０００ｍＬのイオン交換水に分散させ攪拌した。この濾過・分散攪拌を５回繰り返してから風乾した。風乾して得られた試料を、窒素中４５０℃で３時間加熱した後、空気中で５５０℃で６時間焼成することにより、中心細孔直径２．７ｎｍのシリカ系メソ多孔体を得た。得られたシリカ系メソ多孔体を以下「ＦＳＭ−１６」とする。
【実施例２】
【００４８】
本実施例では、サブユニット蛋白質複合体の合成を行った。すなわち、ＦＳＭ６．２の粉末１００ｇと、カタラーゼの水溶液（リン酸バッファｐＨ６．９）５ｍＬ（カタラーゼのモル濃度：４ｍｇ／ｍｌ）とを混合し、２５℃で５時間震盪させた。その後、７０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行い、カタラーゼとＦＳＭ−６．２との複合体（以下、「複合体１」という。）を得た。
【実施例３】
【００４９】
ＦＳＭ６．２に代えて、ＦＳＭ−１６を用いた他は、実施例１と同様にして、カタラーゼとＦＳＭ−１６との複合体（以下「複合体２」という。）を得た。図１に、カタラーゼを模式的に示した説明図を示す。また、図２に、シリカ系メソ多孔体の細孔内部にカタラーゼを備える、カタラーゼ複合体を模式的に示した説明図を示す。
【実施例４】
【００５０】
（１）吸着量の測定
シリカ系メソ多孔体（複合体１と２）に対するカタラーゼの吸着量を測定した。吸着量の測定は、上記遠心分離で得られた上澄みを用いて行った。測定の結果を図３に示す。図３の左の縦軸は、それぞれのシリカ系メソ多孔体１００ｍｇに対するカタラーゼの吸着量、横軸は、吸着平衡濃度を示す。ＡはＦＳＭ６．２であり、ＢはＦＳＭ−１６である。ＡのＦＳＭ６．２では、蛋白質が吸着していく様子が伺えるが、ＦＳＭ−１６では、蛋白質の吸着量がＦＳＭ−６．２に比べて少ないことが分かる。
【００５１】
（２）窒素吸着の測定
シリカ系メソ多孔体の細孔分布を窒素吸着等温線から求めた。すなわち、ＦＳＭ−６．２に対し、カタラーゼを吸着させ（ＦＳＭ−６．２  １００ｍｇに対し、カタラーゼが、２０ｍｇの吸着量）、それぞれについて、窒素吸着特性を調べた。図４に、窒素吸着等温線から求めたＦＳＭ−６．２複合体１の窒素吸着曲線、及び細孔分布曲線を示す。
縦軸は、窒素の吸着量を示し、横軸に、そのときの相対圧力を示す。Ａ（ＦＳＭ−６．２）では、Ｐ／Ｐ０＝０．４付近で急激に立ち上がっている。このことは、規則正しい孔が綺麗に開いていること示している。一方、カタラーゼが吸着したＦＳＭ−６．２では、非表面積及び細孔容量が減少していることが分かる。このことは、孔の中にカタラーゼが導入されていることを示している。
【００５２】
（３）細孔分布の測定
図４の中に示された図に、窒素吸着等温線から求めた細孔分布曲線を示す。ＡはＦＳＭ−６．２、Ｂはカタラーゼが吸着したＦＳＭ−６．２（ＦＳＭ−６．２  １００ｍｇに対し、カタラーゼが、２０ｍｇの吸着量）を示す。Ａでは、６ｎｍ付近にシャープなピークが見られる。一方、カタラーゼが吸着したＦＳＭ−６．２（Ｂ）では、カタラーゼが吸着したことによって、細孔容量が減少していることが分かる。
【００５３】
（４）過酸化水素の分解（カタラーゼ活性測定試験）
図５ａに示すように、カタラーゼ−ＦＳＭ及びＦＳＭをフィルターに置き、上から１％過酸化水素水を通した。図５ｂは、通す前と後の過酸化水素の吸収スペクトルを示している。この図より、カタラーゼ−ＦＳＭに通した場合、過酸化水素が完全に分解していることが分かる。一方、ＦＳＭのみでは、分解が見られなかった。
【００５４】
（５）過酸化水素の分解の繰り返し実験
図６に、１％の過酸化水素を繰り返し通した実験結果を示す。ＡのＦＳＭは、全く反応しないのに対して、Ｂのカタラーゼ−ＦＳＭは、４０回繰り返し使用しても全く活性が落ちないことが分かった。これは、安定にＦＳＭに酵素が固定されていることを示している。
【００５５】
（６）蛍光標識蛋白質のＦＳＭへの導入
図７に、カタラーゼの立体構造とアミノ酸配列を示す。以下により、カタラーゼのリジン（Ｋ）をターゲットにして蛍光色素を導入した。すなわち、カタラーゼ１０ｍｇ、２０ｍＭリン酸バファ４７０μｌ、１４ｍＭ  Ａｌｅｘａ  ｄｙｅ  ジメチルスルホキシド溶液３０μｌ（Ａｌｅｘａ  ｄｙｅ（ＭＷ：３．４１）４２０μｍｏｌ）を４℃１時間遮光攪拌し、ゲルろ過して回収した。
【００５６】
その結果、１サブユニット（リジン２７個）あたり２２％修飾された。図８に、シリカ系メソ多孔体の細孔内部に蛍光標識したカタラーゼを導入したときのカタラーゼ複合体を模式的に示した説明図を示す。
【００５７】
（７）蛍光標識サブユニット蛋白質複合体の合成
ＦＳＭ６．２の粉末１０ｍｇと、蛍光標識カタラーゼの水溶液（リン酸バッファｐＨ６．９）１ｍＬ（カタラーゼのモル濃度：０．１−２ｍｇ／ｍｌ）とを混合し、２５℃で５時間震盪させた。その後、７０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行い、蛍光標識カタラーゼとＦＳＭ−６．２との複合体（以下、「複合体３」という。）を得た。
【００５８】
（８）蛍光ラベル蛋白質−メソポーラスシリカハイブリッドの顕微鏡による観察
蛍光標識タンパク質をシリカ系メソ多孔内部に導入し、蛍光顕微鏡により観察した。図９に、蛍光標識カタラーゼ−ＦＳＭを蛍光顕微鏡で観察した結果を示す。上からメソポーラスシリカに吸着したカタラーゼの吸着量を１ｗ％、１０ｗ％、２０ｗ％と変化させた時の蛍光顕微鏡の観察図である。吸着量が増えれば増えるほどメソポーラスシリカ内部に蛋白質が入っていく様子が伺える。このことにより蛋白質がメソポーラスシリカの細孔に導入されたことが分かる。
【００５９】
（９）エタノール中での酵素活性の測定
エタノール溶液３ｍｌに天然酵素（カタラーゼ）０．８ｍｇ及びカタラーゼ−ＦＳＭ４ｍｇ（タンパク量０．８ｍｇ）を加え、最後に３０％過酸化水素水１００μｌを加え反応を開始した。過酸化水素は２７０ｎｍに吸収があることから、その減少量を酵素活性の指標とした。その結果を図１０に示す。
【００６０】
縦軸は過酸化水素の２７０ｎｍの吸収を示し、横軸は反応時間を示している。Ｃａｔａｌａｓｅ−ＦＳＭはカタラーゼ−ＦＳＭ複合体を示し、ｎａｔｉｖｅは、カタラーゼを示している。過酸化水素を加えると、ｎａｔｉｖｅも複合体も効率よく反応が進行する。しかし、反応が終わって、更に過酸化水素を加えると、ｎａｔｉｖｅはほとんど反応が進まないのに対し、複合体は効率よく反応が進行するのが分かる。これは、カタラーゼは、有機溶媒中で蛋白質が変性してしまうのに対し、ＦＳＭに入ったカタラーゼは、変性せずに活性を維持していることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
以上説明したように、本発明は、カタラーゼ複合体に係るものであり、本発明によれば、カタラーゼを安定的に十分な吸着量で吸着させた、酸素等の吸着剤として十分に活用することが可能なサブユニットタンパク複合体を提供することが可能となる。また、本発明のカタラーゼ複合体の製造方法によれば、カタラーゼを安定的に十分な吸着量で吸着させたカタラーゼ複合体を、効率的且つ確実に製造することができる。本発明は、カタラーゼ等のサブユニット蛋白質の活性を安定、且つ有効に保持して、その多様な機能性を発揮させることが可能な新規機能性部材を提供することができることから、サブユニット蛋白質を利用した新しいサブユニット蛋白質高度利用技術を実現するものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】カタラーゼの構造を模式的に示す説明図である。
【図２】シリカ系メソ多孔体の細孔内部にカタラーゼを備える、カタラーゼ複合体を模式的に示す説明図である。
【図３】シリカ系メソ多孔体に対するカタラーゼの吸着量を示す説明図である。
【図４】カタラーゼが導入されたシリカ系メソ多孔体の、窒素吸着曲線と、細孔分布曲線の図である。
【図５】カタラーゼ活性測定及びその結果を示す。
【図６】過酸化水素の分解の繰り返し実験の結果を示す。
【図７】カタラーゼの立体構造とアミノ酸配列及び有機溶媒（エタノール）中での反応式を示す。
【図８】シリカ系メソ多孔体の細孔内部への蛍光標識カタラーゼの導入を模式的に示す説明図である。
【図９】蛍光標識タンパク質をシリカ系メソ多孔体の細孔内部に導入したときの蛍光顕微鏡による観察像を示す。
【図１０】エタノール中でのカタラーゼ−ＦＳＭのカタラーゼ活性を示す。
【図３】
2009044963.tif 000003
【図５】
2009044963.tif 000004
【図１】
2009044963.tif 000005
【図２】
2009044963.tif 000006
【図４】
2009044963.tif 000007
【図６】
2009044963.tif 000008
【図７】
2009044963.tif 000009
【図８】
2009044963.tif 000010
【図９】
2009044963.tif 000011
【図１０】
2009044963.tif 000012