(57)【要約】      （修正有）【課題】ウキクサを効果的に形質転換するための方法及び組成物を提供する。【解決手段】衝撃法又はアグロバクテリウムによる形質転換。この方法において、目的のヌクレオチド配列又は遺伝子が誘導されウキクサ植物体に発現する形成転換されたウキクサ植物体、細胞、組織。形成転換されたウキクサ植物体組織培養と形成転換されたウキクサから蛋白とペプチド組換えする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の核酸によりウキクサを安定的に形質転換するための方法において、
（ａ）ウキクサ標的組織を用意するステップと、
（ｂ）前記核酸が前記ウキクサ標的組織の細胞の細胞壁を突き抜けて当該組織の細胞内に配置されるのに十分な速度で、前記ウキクサ標的組織に前記核酸を発射するステップと、
（ｃ）安定的に形質転換された組織を生成するステップと
を含む方法であって、
前記核酸が微小発射体により運搬されるとともに、
前記組織に前記微小発射体を発射することにより前記核酸が前記組織に発射される
ことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は米国環境保護庁から授与された認可番号Ｒ８３２５７０−０１−０１の下に政府の支援によりなされた。米国政府は本発明における一定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明はウキクサの形質転換のための方法および組成物に関し、特に衝撃法（ballistic bombardment）およびアグロバクテリウムを利用した形質転換の方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ウキクサ類は単子葉類科、ウキクサ科（Lemnaceae）の唯一の構成要素である。４属と３４種はすべて小さな自由に流れる淡水植物であり、その地理的範囲は全地球に及ぶ。ランドルト（Landolt）、ウキクサ科に関する生系統的調査：ウキクサ科−形態研究。チューリヒ、ルーベル財団（Stiftung Rubel）、地球植物学研究所ＥＴＨ（１９８６）。形態的に縮小されたこの植物のほとんどは知られているが、ほとんどのウキクサ種はすべて、根、茎、花、種および葉を含めて、はるかに大きな植物の組織や器官を有する。ウキクサ種は広範囲にわたって研究されており、それらの生態学、系統学、生活周期、代謝、疾患およびペスト感受性、それらの生殖生物学、遺伝子構造、および細胞生物学を詳しく述べた重要な文献が存在する。ヒルマン（Hillman）、Rot. Review 27,221(1961); ランドルト、ウキクサ科に関する生系統的調査：ウキクサ科−形態研究。チューリヒ、ルーベル財団、地球植物学研究所ＥＴＨ（１９８６）。
【０００４】
ウキクサの生長習性は微生物培養法に理想的である。植物は酵母内の無性生殖と類似の肉眼的仕方で新しい葉の栄養出芽により急速に増殖する。ウキクサは分裂細胞からの栄養出芽により増殖する。分裂領域は小さく、葉の腹面上に見られる。分裂細胞は２つのくぼみ（pocket）にあり、くぼみは葉の中央脈の両側にある。小さな中央脈領域は根が発する部位であり、それぞれの葉をその母葉に結合する茎が生じる。分裂くぼみは組織弁により保護されている。葉はこれらのくぼみから交互に芽を出す。倍加時間は種により異なり、２０〜２４時間と短い。ランドルト、Ber. Schweiz. Bol. Ges. 67,271（1957); チャングら（Chang et al.）、Bull. Inst. Chem. Acad. Sin. 24, 19（1977); ダトコ（Datko）とムッド（Mudd）、Plant Physiol. 65,16（1980); ヴェンカタラマンら（Venkataraman et al.）、Z. Pflanzenphysiol. 62, 316（1970）。
【０００５】
ウキクサの集中培養により単位時間当たりの最高率のバイオマス蓄積が得られ（ランドルトとキャンデラー（Kandeler）、ウキクサ科−形態研究。第２巻：植物化学、生理学、応用、参考文献、チューリヒ、ルーベル財団、地球植物学研究所ＥＴＨの刊行物（１９８７））、乾燥重量の蓄積率は新鮮重量の６〜１０％である（チルベルクら（Tillberg et al.）、Physiol. Plant. 46,5（1979); ランドルト、Ber. Schweis. Bot. Ges. 67,271（1957); Stomp, 未発表データ）。さまざまな条件下に増殖される多数のウキクサ種のタンパク質含量は１５〜４５乾燥重量であることが報告されている（チャンら（Chang et al.）、Bull. Inst. Chem. Acad. Sin. 24, 19（1977); チャンとチュイ（Chui）、Z. Pflanzenphysiol. 89,91（1978); ポラスら（Porath et al.）、Aquatic Botani 7, 272（1979); アペンロスら（Appenroth et al.）、Biochem. Physiol. Pflanz. 177,251（1982))。これらの値を用いると、ウキクサにおける培地１リットル当たりのタンパク質産生レベルは、酵母遺伝子発現系と同じ程度となる。今までは、特異的ウキクサ系用の培地成分および最大の増殖やタンパク質含量のための培養条件の体系的最適化は行われていない。
【０００６】
ウキクサの有性生殖は、光周期や培養密度を含めて培地成分および培養条件により調節される。同種による通常の実験室手順が開花誘導である。植物は通常、自家受粉し、自殖は培養株を静かに振盪することで実験室において行うことができる。この方法により、イボウキクサ（Lemna gibba）の近交系が開発されている。自然変異が確認される（スロヴィン（Slovin）とコーエン（Cohen）、Plant Physiol. 86,522（1988))とともに、化学的およびガンマ線変異誘発（ＥＭＳまたはＮＭＵを使用）を行って特徴が明確な変異株が得られている。Ｌ．ｇｉｂｂａの異系統交配は冗長であるが、管理受粉により行うことができる。ウキクサのゲノムサイズは０．２５〜１．６３ｐｇＤＮＡ／２Ｃであり、染色体数は２０〜８０であるとともに、ウキクサ科全体の平均は約４０である（ランドルト、ウキクサ科の生系統的調査：ウキクサ科−形態研究。チューリヒ、ルーベル財団、地球植物学研究所ＥＴＨ（１９８６））。倍数性レベルは２〜１２Ｃ．Id.と推計されている。ウキクサ内の遺伝子の多様性については、二次生成物、イソ酵素、およびＤＮＡ配列を用いて調査されている。マククルール（McClure）とアルストン（Alston）、Nature 4916, 311（1964); マククルールとアルストン、Amer. J. Bot. 53, 849（1966); ヴァシュールら（Vasseur et al.）、Pl. Syst. Evol. 177, 139（1991); クロフォード（Crawford）とランドルト、Sys. Bot. 10, 389（1993)。
【０００７】
したがって、上述した特徴により、ウキクサは植物に基づく有効な発現系として開発するための理想的な選択となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明の開示
本発明はウキクサの有効な形質転換のための方法および組成物に関する。該方法は、衝撃法、アグロバクテリウム、または形質転換ウキクサ植物体に目的のヌクレオチド配列を安定に誘導するとともに発現するための電気穿孔法の使用を含む。この方法において、目的の遺伝子または核酸をウキクサ植物体内に誘導することができる。形質転換ウキクサの細胞、組織、植物および種子も提供される。
【０００９】
本発明の一態様として、目的の核酸によりウキクサを安定的に形質転換するための方法において、（ａ）ウキクサ標的組織を用意するステップと、（ｂ）前記核酸が前記ウキクサ標的組織の細胞の細胞壁を突き抜けて当該組織の細胞内に配置されるのに十分な速度で、前記ウキクサ標的組織に前記核酸を発射するステップと、（ｃ）安定的に形質転換された組織を生成するステップとを含む方法であって、前記核酸が微小発射体により運搬されるとともに、前記組織に前記微小発射体を発射することにより前記核酸が前記組織に発射されることを特徴とする方法を提供する。
【００１０】
本発明に関連する態様として、目的の核酸によりウキクサを安定的に形質転換するための方法において、（ａ）前記核酸を含むベクターを含むアグロバクテリウムをウキクサ植物体組織に接種するステップと、（ｂ）前記組織を前記アグロバクテリウムと共生培養するステップと、（ｃ）安定的に形質転換された組織を生成するステップとを含む方法を提供する。
【００１１】
本発明に関連する他の態様として、目的の核酸によりウキクサを安定的に形質転換するための方法において、（ａ）電気穿孔法によりウキクサ組織内に核酸を導入するステップと、（ｂ）安定的に形質転換されたウキクサ組織を生成するステップとを含む方法を提供する。
【００１２】
本発明に関連するさらに他の態様として、上述した方法あるいは他の方法により生成される安定的に形質転換されたウキクサ植物体および安定的に形質転換されたウキクサ組織培養株を提供する。また、そのゲノムに組み込まれた目的の異種核酸を含む安定的に形質転換されたウキクサ細胞、組織または組織培養株を提供する。
本発明に関連するさらに他の態様として、少なくとも一つの組換えタンパク質又はペプチドを生成する方法において、（ａ）少なくとも１つの異種タンパク質又はペプチドを発現する安定的に形質転換されたウキクサ細胞、組織、組織培養株または植物体を培養するステップと、（ｂ）ウキクサ培養株から少なくとも１つのタンパク質又はペプチドを採集するステップとを含む方法を提供する。
【００１３】
ウキクサは植物に基づく理想的な遺伝子発現系を提供する。ウキクサ遺伝子発現系は、多くの研究や商業的応用に有用であろう重要な技術を提供する。植物分子生物学研究全体としては、酵母の実験室便宜品で操作できる分化植物系が、分離遺伝子の発生や生理学上の役割を分析するためにきわめて迅速な系を提供する。この目的のために、タバコやアラビドプシス（Arabidopsis）などモデル植物が現在、植物分子生物学者により用いられている。これらの植物は増殖のために温室や野外施設を必要とする（植物分子生物学者が得るには困難な場合が多い）。代替の遺伝子発現系は細菌または細胞培養株に基づくものであるが、これらは組織や発展的に調節される遺伝子発現効果が失われる。異種の遺伝子発現系も移入前に目的の遺伝子の再構成とともに、高価で時間のかかる工程を必要とする。ウキクサ系はこれらの問題をいずれも克服し、はるかに容易に増殖されるとともに実験室環境下に維持される。発現されたタンパク質またはペプチド（もしくはそれにより生成される分子）を回収することが望ましい場合は、これは細胞の機械的粉砕または敷設（laying）など技術上周知の適切な方法により行うことができる。
【００１４】
有益なタンパク質の商業生産のために、ウキクサに基づく系が現存の細菌または細胞の培養系に対して多くの利点を有する。哺乳動物タンパク質の生産分野では、植物は哺乳動物細胞とほぼ同じ移植後過程を示し、哺乳動物細胞の細菌細胞生成と関係した１つの大きな問題を克服する。ウキクサも哺乳動物細胞培養株よりもはるかに安価に生成される。すでに他の研究者（ヒアット（Hiatt）、Nature 334, 469（1990)）により、植物系は細菌系には欠乏していることが多い能力である、複数サブユニットタンパク質を構成する能力を有することが示されている。治療的タンパク質の植物生成は、哺乳動物細胞培養株や細菌系で生成される動物ウイルスを含めて、汚染物質からのリスクをも制限する。汚染物質は治療的タンパク質生成における主な関心事である。他に提案されている、大豆やタバコなどの植物生成系とは異なり、ウキクサは発酵器／バイオレクタ管で増殖することができ、系が現存するタンパク質生産工業の基本的施設にはるかに容易に統合される。
【００１５】
低コストの工業的な酵素や小分子のための製造標準として、ウキクサは高栄養素廃水を用いた野外条件下に増殖できるため、ほとんどすべての量を容易に測定可能であるという利点を提供する。廃水で増殖する遺伝子工学的に作製されるウキクサ系は有益な生成物を産生すると同時に再利用のために廃水を浄化する。このような系は、正味資本損失（廃水の排出からの改善）を実際的な経済的均衡とともに化学的または酵素の生成に転換することになろう。野外作物における化学的合成に対するウキクサの利点は、世界の増加する人口のために食品生産の増大に必要な耕地に適した作物や灌漑水を必要としないということである。
【００１６】
本発明の以上の態様と他の態様を下記の本発明の説明の中でさらに詳細に開示する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ＧＵＳ遺伝子を含有するｐＢＩ１２１からの３．２ｋｂで放射線同位体標識されたフラグメントを有する系Ｄの形質転換されていないウキクサＤＮＡと形質転換ウキクサＤＮＡのサザンハイブリダイゼイションにより生成されたオートラジオグラフを示す。チャネル：１）分離された、未消化ｐＢＩ１２１ ＤＮＡ。予想される主なバンドは１２．８ｋｂである。低分子量バンドは超らせんプラスミドを示すと考えられる。２）ＨｉｎｄＩＩＩ消化された、ｐＢＩ１２１ ＤＮＡ。この消化はプラスミドを線状にするとともに予想される１２．８ｋｂバンドを示す。低分子量バンドは不完全消化を示す。３）ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲ１で消化されたｐＢＩ１２１ ＤＮＡ。消化は不完全であるが、予想されるバンドを生じた：１２．８ｋｂ（不完全消化から出た）、約９ｋｂバンド、および不鮮明な超らせんバンド。３．２ｋｂバンドはこの曝露で可視のハイブリダイゼイションを示すことはなかった。４）予想される９ｋｂおよび３．２ｋｂバンドを示す二重消化されたｐＢＩ１２１ ＤＮＡの１コピーと等価の形質転換されていないウキクサのＤＮＡ。５）形質転換されていないウキクサＤＮＡ。６）形質転換ウキクサ系Ｄの未消化ＤＮＡ。７）形質転換ウキクサ系ＤのＨｉｎｄＩＩＩ。８）形質転換ウキクサ系ＤのＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲ１消化ＤＮＡ。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明はウキクサを形質転換するための方法に関する。好適実施例において、該方法では衝撃法またはアグロバクテリウムを利用し、ウキクサ細胞を安定に形質転換する。または、該方法では電気穿孔法を用いてウキクサを形質転換する。本発明の方法および形質転換植物は、酵母の利点の多くを有する植物に基づく遺伝子発現系として使用される。
【００１９】
発明人が知る限り、ウキクサの安定した遺伝子導入や形質転換ウキクサ植物体の再生についてはこれまで報告されていない。今回の調査では、トランスジェニックウキクサ植物体の生成には２つの方法が利用されていた。すなわち（１）外来ＤＮＡを分裂葉細胞に直接、導入および挿入した後、無性生殖および自殖によりトランスジェニックウキクサを生成する方法（植物〜植物系）と、（２）未分化カルス細胞の形質転換後、増殖カルスの選択、および葉再生の方法（カルス〜植物系）である。Ｌ．ギッバ（L. gibba）およびＬ．ミノール（L. minor）からカルス生成のための制限組織培養系が以前、チャン（Chan）らのグループ（チャンとチュイ（Chui）、Bot. Bull. Academia Sinic 17, 106（1976); チャンとチュイ、Z. Pflanzenphysiol. Bd. 89.S, 91（1978)）およびフリック（Frick, J. Plant Physiology 137, 397（1991)）によりそれぞれ報告されている。今回の調査は、葉を再生する組織的カルス系を開発することで同分野における研究を大きく拡大した。
【００２０】
好ましくは、本発明ではウキクサを安定に形質転換するために２系、すなわち微小発射体銃を用いた衝撃法とアグロバクテリウム媒介形質転換の１つを用いる。ウキクサは単子葉植物であるためアグロバクテリウム形質転換に対して不応性であることが予想されるが、ウキクサは意外にもアグロバクテリウムを用いて形質転換できることがわかっている。本発明により形質転換されるウキクサ植物体は電気穿孔法でも生成することができる。例えば、デキーサーら（Dekeyser et al.）、Plant Cell 2, 591（1990); デ’ハルインら（D'Halluin et al.）、Plant Cell 4, 1495（1992); デ’ハルインらに対する米国特許第 5,712,135号を参照。電気穿孔法の１つの利点は、人工染色体を含む大部分のＤＮＡがこの方法でウキクサに形質転換できることである。適切なウキクサ細胞または組織型であれば、本発明によりすべて形質転換することができる。例えば、核酸を組織培養株のウキクサ細胞に導入することができる。または、ウキクサ植物体の小さいサイズの水性増殖習性により、核酸を完全な胚、葉、根、および分裂組織など組織化組織のウキクサ細胞に導入することができる。さらに別の代替として、核酸をウキクサカルスに導入することができる。
【００２１】
請求された方法により生成される形質転換ウキクサ植物体は正常な形態を示し、有性生殖により稔性であることが好ましい。好ましくは、本発明の形質転換植物は形質転換された核酸の単一コピーを含み、形質転換された核酸は顕著な転位を示さない。また、形質転換された核酸のコピー数が少ないウキクサ植物体が好ましい（すなわち、５コピーを超えないこと、または３コピーを超えないこと、さらに別の代替として、形質転換細胞当たりの核酸のコピーが３未満であること）。
【００２２】
本明細書中で用いる「ウキクサ」という語は、ウキクサ（Lemanaceae）科の構成要素を指す。４属と３４種のウキクサが、以下の通り知られている。すなわち、アオウキクサ（Lemna）属（Ｌ．エクイノクティアリス（aewuinoctialis）、Ｌ．ジスペルマ（disperma）、Ｌ．エクアドリエンシス（ecuadoriensis）、Ｌ．ギッバ（gibba）、Ｌ．ジャポニカ（japonica）、Ｌ．ミノール（minor）、Ｌ．ミニスキュラ（miniscula）、Ｌ．オブスクラ（obscura）、Ｌ．ペルプシラ（perpusilla）、Ｌ．テネラ（tenera）、Ｌ．トリスルカ（trisulca）、Ｌ．ツリオニフェラ（turionifera）、Ｌ．ヴァルジヴィアナ（valdiviana）；ウキクサ（Spirodela）属（Ｓ．インテルメジア（intermedia）、Ｓ．ポリルヒザ（polyrrhiza）、Ｓ．プンクタタ（punctata）；ミジンコウキクサ（Wolffia）属（Ｗａ．アングスタ（angusta）、Ｗａ．アルヒザ（arrhiza）、Ｗａ．アウストラリナ（australina）、Ｗａ．ボレアリス（borealis）、Ｗａ．ブラジリエンシス（brasiliensis）、Ｗａ．コルンビアーナ（columbiana）、Ｗａ．エロンガータ（elongata）、Ｗａ．グロボーサ（gulobosa）、Ｗａ．ミクロスコピカ（microscopica）、Ｗａ．ネグレクタ（neglecta））およびウォルヒエラ（Wolfiella）属（Ｗｌ．カウダータ（caudata）、Ｗｌ．デンティクラータ（denticulata）、Ｗｌ．グラジアータ（gladiata）、Ｗｌ．ヒアリーナ（hyalina）、Ｗｌ．リングラータ（lingulata）、Ｗｌ．レプンダ（repunda）、Ｗｌ．ロツンダ（rotunda）
、およびＷｌ．ネオトロピカ（neotropica））である。ウキクサの他の属または種も、それらが存在する場合は、本発明の態様である。イボウキクサ、レムナ・ミノール、およびレムナ・ミニスキュラが好ましく、レムナ・ミノールおよびレムナ・ミニスキュラが最も好ましい。アオウキクサ種は、ランドルフ（ウキクサ科に関する生系統的調査：ウキクサ科−形態研究。チューリヒ、ルーベル財団（Stiftung Rubel）、地球植物学研究所ＥＴＨ（１９８６））により報告された分類学的シェーマを用いて分類することができる。
【００２３】
当業者には明らかなように、現在、ウキクサの有効な形質転換のために、本発明の方法で目的の核酸を用いることができる方法が提供されている。例えば、ウキクサ植物体を工学的に作製し、疾患や昆虫耐性遺伝子のほか、栄養価を付与する遺伝子、抗真菌遺伝子、抗細菌遺伝子または抗ウイルス遺伝子等を発現させることができる。または、治療的（例えば、獣医学的または医学的使用）または免疫原性（例えば、ワクチン接種用）のペプチドおよびタンパク質を、本発明による形質転換ウキクサを用いて発現させることができる。
【００２４】
同様に、この方法を用いて遺伝子発現を調節するための核酸も導入することができる。例えば、導入される核酸はアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする。または、ウキクサを１つまたはそれ以上の遺伝子で形質転換し、化学合成（例えば、プラスチック合成）用または他の工業的工程（例えば、ケラチナーゼ）用の酵素経路を再生することができる。核酸はウキクサまたは別の生物（すなわち、異種の）からのものでもよい。さらに、目的の核酸は原核生物または真核生物（例えば、細菌、真菌、酵母、ウイルス、植物、哺乳動物）から得ることができ、または核酸配列を全体的または部分的に合成することができる。特に好ましい実施例において、核酸は分泌されたタンパク質またはペプチドをコードする。
【００２５】
好ましくは、形質転換ウキクサで発現される導入核酸はタンパク質ホルモン、増殖因子、またはサイトカインをコードし、さらに好ましくは、インスリン、成長ホルモン（特に、ヒト成長ホルモン）、およびα−インターフェロンをコードする。または、核酸はβ−グルコセレブロシドを発現することも好ましい。
【００２６】
また、コストまたはロジスティック制約、もしくはその両方のため、現存する遺伝子発現系により有効に商業的生産ができないペプチドまたはタンパク質をコードする核酸が好ましい。例えば、一部のタンパク質はそのタンパク質が哺乳動物における細胞生存率、細胞増殖、細胞分化、またはタンパク質構成を妨害するため、哺乳動物系では発現することができない。このようなタンパク質には、細胞芽腫タンパク質、ｐ５３、アンギオスタチンおよびレプチンが含まれるが、これらに限定されるのではない。本発明は哺乳動物の調節タンパク質を生成するために有利に実施することができ、高等植物と哺乳動物との間に大きな進化的隔たりはあり得ないため、これらのタンパク質はウキクサにおける調節過程を妨害することになる。トランスジェニックウキクサは、現存する発現系の生成利用可能性を促す、血清アルブミン（特に、ヒト血清アルブミン）、ヘモグロビンおよびコラーゲンなど大量のタンパク質を生成するためにも用いることができる。
【００２７】
最後に、以下にさらに詳細に述べるように、高等植物系を工学的に作製し、生物学的に活性の多量体タンパク質（例えば、モノクローン抗体、ヘモグロビン、Ｐ４５酸化酵素、およびコラーゲン等）を哺乳動物系よりもはるかに容易に生成（すなわち、合成、発現、構成）することができる。当業者であれば、「生物学的に活性」の語には、多量体タンパク質であって、該タンパク質が工業的または化学的な工程における使用、または治療、ワクチン、もしくは診断の試薬としての使用に重要である十分な活性を有する限り、生物学的活性が天然タンパク質（例えば、抑制型または増強型）に比べて変化する多量体タンパク質が含まれることを理解するであろう。
【００２８】
ウキクサにおける生物学的に活性な多量体タンパク質を生成するための１つの好適な方法では、ポリペプチドサブユニットのすべてをコードする遺伝子を含有する発現ベクターを使用する。例えば、デュイリングら（During et al.）、（1990）Plant Molecular Biology 15:281; ヴァン・エンゲレンら（van Engelen et al.）、（1994）Plant Molecular Biology 26:1701を参照。次にこのベクターを、遺伝子銃またはアグロバクテリウム媒介形質転換など周知の形質転換法を用いてウキクサ細胞に導入する。この方法により、多量体タンパク質を構成するために必要なポリペプチドのすべてを発現するクローン細胞系が得られる。１つの変法として、各ポリペプチドサブユニットをコードする独立のベクター構造体が作製される。これらのベクターのそれぞれを用いて、必要なポリペプチドの１つのみを発現するトランスジェニック植物の分離クローン系を生成する。次にこれらのトランスジェニック植物を交差して、単一植物内の必要なポリペプチドのすべてを発現する子孫を生成する。ヒアットら（Hiatt et al.）、（1989）Nature 342:76；ヒアットらに対する米国特許第 5,202,422号および第 5,639,947号。
【００２９】
この方法の変形が単一遺伝子構造体を作製し、これらの構造体からのＤＮＡといっしょに、このＤＮＡの混合体を衝撃法またはアグロバクテリウム媒介形質転換、より好ましくは衝撃法を用いて植物細胞に射出する。さらに別の変形として、ベクターの一部またはすべてが多量体タンパク質の１つまたはそれ以上のサブユニットをコードする（すなわち、それにより多量体タンパク質のサブユニット数よりも少ないウキクサクローンが交差される）。最後に、場合により、多量体タンパク質のサブユニットのすべてよりも少なく生成すること、または例えば、工業的または化学的な工程もしくは診断、治療またはワクチン接種の目的のために形質転換ウキクサ植物体における単一タンパク質サブユニットであるが望ましい。
【００３０】
Ａ． 発現カセット。
【００３１】
本発明によれば、導入される核酸は発現カセット内に含まれる。発現カセットは核酸または目的の遺伝子に連鎖された転写開始領域を含有する。この発現カセットは調節領域の転写調節下にある遺伝子または目的の遺伝子（例えば、目的の１つの遺伝子、目的の２つの遺伝子等々）の挿入のための複数の制限部位を備える。好ましくは、発現カセットは目的の単一遺伝子をコードする。本発明の特別な実施例において、導入される核酸は２つまたはそれ以上の発現カセットを含有し、それぞれが少なくとも１つの目的の遺伝子（好ましくは目的の１つの遺伝子）をコードする。
【００３２】
転写開始領域（例えば、プロモーター）は天然または異種もしくは宿主に対して外来または異種であってもよく、または自然配列もしくは合成配列でもあり得る。外来により、これは転写開始領域が該転写開始領域が導入されない野生型宿主に見出されないことが意図される。本明細書中で用いられる通り、キメラ遺伝子がコード配列に対して異種である転写開始領域に操作可能に連鎖されるコード配列を含む。
【００３３】
技術上周知の適切なプロモーターであれば、（細菌、酵母、真菌、昆虫、哺乳動物、および植物のプロモーターを含めて）本発明に従ってすべて用いることができる。植物プロモーターが好ましく、ウキクサプロモーターが最も好ましい。好適なプロモーターとして、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、オパインシンテターゼプロモーター（例えば、ｎｏｓ，ｍａｓ，ｏｃｓ等々）、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、リブロースビスリン酸（ＲｕｂＰ）カルボキシラーゼ小サブユニットプロモーター、およびアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターが挙げられるが、これらに限定されるのではない。ウキクサＲｕｂＰカルボキシラーゼ小サブユニットプロモーターが技術上周知である。シルバートロンら（Silverthorone et al.）、（1999）Plant Mol. Biol. 15:49。植物、好ましくはウキクサに感染するウイルスからの他のプロモーターも適切であり、サトイモモザイクウイルス、クロレラウイルス（例えば、クロレラウイルスアデニンメチルトランスフェラーゼプロモーター；ミトラら（Mitra et al.）（1994）Plant Molecular Biology 26:85）、トマト黄化えそウイルス、タバコ茎えそウイルス、タバコネクロシスウイルス、タバコ輪点ウイルス、トマト輪点ウイルス、キュウリモザイクウイルス、ピーナッツ根株（stump）ウイルス、アルファルファモザイクウイルス、等が含まれるが、これらに限定されるのではない。
【００３４】
最後に、プロモーターは所望の調節レベルを与えるために選択することができる。例えば、場合により、構成的発現を付与するプロモーターを使用することが有利であると考えられる（例えば、ユビキチンプロモーター、ＲｕｂＰカルボキシラーゼ遺伝子ファミリープロモーター、およびアクチン遺伝子ファミリープロモーター）。または、他の条件下には、特異的環境刺激（例えば、熱ショック遺伝子プロモーター、乾燥誘導遺伝子プロモーター、病原誘導遺伝子プロモーター、および明／暗誘導遺伝子プロモーター）または植物増殖調節剤（例えば、アブシジン酸オーキシン、サイトキニン、およびジベレリン酸により誘導される遺伝子からのプロモーター）に反応して活性化するプロモーターを使用することが有利であると考えられる。さらに別の代替として、組織特異的発現を示すプロモーター（例えば、根、葉および花の特異的プロモーター）を選択することができる。
【００３５】
転写カセットは、５’−３’転写方向、転写および翻訳開始領域、目的のヌクレオチド配列、植物の転写および翻訳末端領域機能に含まれる。技術上周知の適切な末端配列であれば、本発明に従ってすべて用いることができる。末端領域は転写開始領域を有する生（native）であっても、目的のヌクレオチド配列を有する生であってもよく、または別の起源に由来してもよい。有利な末端領域は、オクトピンシンテターゼやノパリンシンテターゼなどＡ．ツメフェシエンスのＴｉプラスミドから入手可能である。グエリネオウら（Guerieau et al.）、Mol, Gen. Gent. 262, 141 (1991); プラウドフット（Proudfoot）、Cell 64, 671 (1991); サンファコンら（Sanfacon et al.）、Genes Dey. 5, 141 (1991); モーゲンら（Mogen et al.）、Plant Cell 2, 1261 (1990); ムンローら（Munroe et al.）、Gen 91, 151 (1990); バラスら（Ballas et al.）、Nucleic Acids Res. 17, 7891 (1989); およびジョシら（Joshi et al.）、Nucleic Aids Res. 15, 9627 (1987）も参照。追加の好適な末端配列は、エンドウＲｕｂＰカルボキシラーゼ小サブユニット末端配列およびカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ末端配列である。他の適切な末端配列は当業者には明白であろう。
【００３６】
または、目的の遺伝子を技術上周知の他の適切な発現カセットに供給することができる。必要に応じて、形質転換される植物の発現増大のために最適化することができる。哺乳動物、酵母または細菌もしくは双子葉植物の遺伝子を本発明において用いる場合は、発現の改善のために単子葉植物またはウキクサ優先双子葉植物を用いて、それらの遺伝子を合成することができる。技術上、植物優先遺伝子を合成するための方法が利用可能である。例えば、本明細書中で参考として援用する、米国特許第 5,380,831号、および第 5,436,391号、ならびにムレイら（Murray et al.）、Nucleic Acids. Res. 17, 477 (1989）を参照。
【００３７】
発現カセットは、追加的に５’リーダー配列を含むことができる。このようなリーダー配列が作用して翻訳を強化することができる。翻訳リーダーは技術上周知であり、ピコルナウイルスリーダー、例えば、ＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５’非コード領域；エルロイ−シュタインら（Elroy-Stein et al.）、Proc. Nat. Acad. Sci USA, 86, 6126 (1989)); ポチウイルスリーダー、例えば、ＴＥＶリーダー（タバコエッチウイルス；アリソンら（Allison et al.）、Virology, 154, 9 (1986)); ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ；マカヤック（Macajak）とサルナウ（Sarnow）、Nature 353, 90 (1991)); アルファルファモザイクウイルスの外被タンパク質ｍＲＮＡからの非翻訳リーダー（ＡＭＶ ＲＮＡ４；ジョブリング（Jobling）とゲールケ（Gehrke）、Nature 325, 622 (1987)); タバコモザイクウイルスリーダー（ＴＭＶ；ガリー（Gallie）、MOLECULAR BIOLOGY OF RNA, 237-56 (1989)); およびメイズクロロティックモットルウイルスリーダー（ＭＣＭＶ；ロンメルら（Lommel et al.）、Virology 81, 382 (1991))。デラ−チオッパら（Della-Cioppa et al.）、Plant Physiology 84, 965 (1987）も参照。翻訳を強化することが知られている他の方法、例えば、イントロン等も利用することができる。
【００３８】
目的の外来核酸は、目的のコードペプチドまたはコードタンパク質の発現を特定の細胞コンパートメントに方向づける移行ペプチドをコードする核酸配列と追加的に操作可能に関連づけることができる。高等植物ではクロロプラスト、ミトコンドリア、液胞、および小胞体（細胞外の分泌用）にタンパク質の蓄積をターゲッティングする移行ペプチドが技術上周知である。好ましくは、移行ペプチドは外来核酸から発現されるタンパク質をクロロプラストまたは小胞体にターゲッティングする。タンパク質を小胞体にターゲッティングする移行ペプチドは、分泌タンパク質の正確な処理に望ましい。クロロプラストへの（例えば、ＲｕｂＰカルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子からの移行ペプチドを用いた）ターゲッティングタンパク質の発現は、この細胞器官においてきわめて高濃度の組換えタンパク質の蓄積をもたらすことが明らかにされている。ＲｕｂＰカルボキシラーゼ移行ペプチドをコードするウキクサ核酸はすでにクローン化されている。スティークマら（Stiekma et al.）(1983）Nucl. Asids Res. 11:8051-61; ヘレラ−エストレラら（Herrera-Estrella et al.）に対する米国特許第 5,717,084号および第 5,728,925号も参照。エンドウＲｕｂＰカルボキシラーゼ小サブユニットペプチド配列が、植物に哺乳動物遺伝子を発現するとともにターゲッティングするための用いられている。ヘレラ−エストレラらに対する米国特許第 5,717,084号および第 5,728,925号。または、哺乳動物の移行ペプチドを用いて、例えばミトコンドリアおよび小胞体へ組換えタンパク質発現をターゲッティングすることができる。植物細胞は、標的小胞体をターゲッティングする哺乳動物の移行ペプチドを認識することが明らかにされている。ヒアットらに対する米国特許第 5,202,422号および第 5,639,947号。
【００３９】
発現カセットは、形質転換植物体に導入されて発現されるべき１つまたはそれ以上に遺伝子もしくは核酸配列を含むことができる。このため、各核酸配列は５’および３’調節配列に操作可能に連鎖される。または、複数の発現カセットを備えてもよい。
【００４０】
一般に、発現カセットは形質転換細胞の選択のための選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択可能なマーカー遺伝子は形質転換された細胞または組織の選択のために利用される。選択可能なマーカー遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）やハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードするような抗生物質耐性をコードする遺伝子、および除草剤化合物に対する耐性を付与する遺伝子を含む。除草剤耐性遺伝子は一般に除草剤に対して集中的な修飾標的タンパク質または作用する前に植物体内の除草剤を劣化または解毒する酵素に一般にコードする。デブロックら（DeBlock el al.）、EMBO J. 6, 2523 (1987); デブロックら、Plant Physiol. 91, 691 (1989); フロムら（Fromm et al.）、BioTechnology 8, 833 (1990); ゴールドン−カムら（Gordon-Kamm et al.）、Plant Cell 2, 603 (1999）参照。例えば、グリリン酸またはスルホニル尿素除草剤に対する耐性が、変異標的酵素、５−エノールピルボイルシキミ酸３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）およびアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）の遺伝子コードを用いて得られている。グルホシ酸アンモニウム、ボロモキシニル、および２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）に対する耐性が、それぞれの除草剤を解毒するホスフィノチリシンアセチルトランスフェラーゼ、ニトリラーゼ、または２，４−ジクロロフェノキシ酢酸モノオキシゲナーゼをコードする細菌遺伝子を用いて得られている。
【００４１】
本発明の目的のために、選択可能なマーカー遺伝子は、遺伝子コードすなわち、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（フレイリーら（Frayley et al.）、CRC Critical Reviews in Plant Science 4, 1 (1986)); シアナミドヒドラターゼ（マイアー−グレイナーら（Maier-Greiner et al.）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4250 (1991)); アスパラギン酸キナーゼ；ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（パールら（Perl et al.）、BioTechnology 11, 715 (1993)); ｂａｒ遺伝子（トキら（Toki et al.）、Plant Physiol. 100, 1502 (1992); メアガーら（Meagher et al.）、Crop Sci. 36, 1367 (1996); トリプトファンデカルボキシラーゼ（ゴジンら（Goddijn et al.）、Plant Mol. Biol. 22, 907 (1993)); ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＥＯ；サザンら（Southern et al.）、J. Mol. Appl. Gen. 1, 327 (1982)); ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴまたはＨＹＧ；シミズら（Shimizu et al.）、Mol. Cell. Biol. 6, 1074 (1989)); ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＥＦＲ；クヴォクら（Kwok et al.）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol, 4552 (1986)); ホスフィノチリシンアセチルトランスフェラーゼ（デブロックら（DeBlock et al.）、EMBO J. 6, 2513 (1987)); ２，２−ジクロロプロピオン酸デハロゲナーゼ（ブッハナン−ウォラトロンら（Buchanan-Wollatron et al.）、J. Cell Biochem. 13D, 330 (1989)); アセトヒドロキシアシドシンターゼ（アンダーソンら（Anderson et al.）に対する米国特許第 4,761,373号、ハウンら（Haughn et al.）、Mol, Gen, Genet, 221, 266 (1988)); ５−エノールピルボイルシキミ酸３−リン酸シンターゼ（ａｒｏＡ；コマイら（Comai et al.）、Nature 317, 741 (1988)); ハロアリルニトリラーゼ（スタルカーら（Stalker et al）に対する国際公開WO 87/04181号）；アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（パーカーら（Parker et al.）、Plant Physiol. 92, 1220 (1990)); ジヒドロプテロイン酸シンターゼ（ｓｕｌＩ；ギュエリナウら（Guerineau et al.）、Plant Mol. Bio. 15, 127 (1990)); および３２kＤａ光系ＩＩポリペプチド（ｐｓｂＡ；ヒルシュベルクら（Hirschberg et al.）、Science 222, 1346 (1983)）を含むが、これらに限定されるのではない。
【００４２】
また、クロラムフェニコール（ヘレラ−エステラら、EMBO J. 2, 987 (1983)); メトトレキセート（ヘレラ−エステラら、Nature 303, 209 (1983); メイジャーら、Plant Mol. Biol. 16, 807 (1991)); ヒグロマイシン（ウォルドンら、Plant Mol. Bio. 5, 103 (1985); ジージアンら（Zhijian et al.）、Plant Science 108, 219 (1995); メイジャーら、Plant Mol. Bio. 16, 807 (1991); ストレプトマイシン（ジョーンズら（Jones et al.）、Mol. Gen. Genet. 210, 86 (1987)); スペクチノマイシン（ブレターニュ−サグナードら（Bretagne- Sagnard et al.）、Transgenic Res. 5, 131 (1996)); ブレオマイシン（ヒルら（Hikke et al.）、Plant Mol. Biol. 7, 171 (1986)); スルホンアミド（ギュエリナウら（Guerineau et al.）、Plant Mol. Bio. 15, 127 (1990)); ブロモキシニル（スタルカーら、Science 242, 419 (1988)); ２，４−Ｄ（ステルバーら（Sterber et al.）、Bio/Technology 7, 811 (1989)); ホスフィノチリシン（デブロックら）、EMBO J. 6, 2513 (1987)); スペクチノマイシン（ブレターニュ−サグナードおよびチュポウ（Chupeau）、Transgenic Research 5, 131 (1996)）に対して耐性の遺伝子コードも含まれる。
【００４３】
ｂａｒ遺伝子は、ホスフィノチリシン（ＰＰＴ）またはビアラフォス等のグルフォシネート型除草剤に対して耐性の除草剤を付与する。上述した通り、ベクター構造体に用いられる選択可能な他のマーカーには、ビアラフォスおよびホスフィノチリシン耐性のためのｐａｔ遺伝子、イミダゾリノン耐性のためのＡＬＳ遺伝子、グリフォサーテ耐性のためのＥＰＳＰシンターゼ、Ｈｃトキシンに対して耐性のためのＨｍ１遺伝子、および通常使用され、当業者には周知である選択可能な他の薬剤が含まれるが、これらに限定されるのではない。一般には、ヤラントン（Yarranton）、Curr. Opin. Biotech. 3, 506 (1992); クリストファーソンら（Christpherson et al.）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6341 (1992); ヤオら（Yao et al.)、Cell 71, 63 (1992); レズニコフ（Reznikoff）、Mol, Microbiol. 6, 2419 (1992); バークレイら（BARKLEY ET AL.）、THE OPERON 177-220 (1980); フら（Hu et al.）、Cell 48, 55 555 (1987); ブラウンら（Brown et al.）、Cell 49, 603 (1987); フィッジら（Figge et al.）、Cell 52, 713 (1988); ドイチュレら（Deutschle et al.）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5400 (1989); フューストら（Fuerst et al.）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2549 (1989); ドイチュレら、Science 248, 480 (1990); ラボウら（Labow et al.）、Mol. Cell. Biol. 10, 3343 (1990); ザンブレッティら（Zambretti et al.）、Proc. Natl. Acad. Sci; USA 89, 3952 (1992); バイムら（Baim et al.）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5072 (1991); ヴボロスキーら（Wyborski et al.）、Nuc. Acids Res. 19, 4647 (1991); ヒレナンド−ヴィスマン（Hillenand-Wissman）、Topics in Mol. And Struc. Biol. 10, 143 (1989); デーゲンコルブら（Degenkolb et al.）、Antimicrob. Agents Chemother. 35, 1591 (1991); クラインシュニットら（Kleinschnidt et al.）、Biochemistry 27, 1094 (1988); ガッツら（Gatz et al.）、Plant J. 2, 397 (1992); ゴッセンら（Gossen et al.）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547 (1992); オリーヴァら（Olova et al.）、Antimicrob. Agents Chemother. 36, 913 (1992); フラヴカら（HLAVKA ET AL.）、HANDBOOK OF EXPERIMENTAL PHARMACOLOGY 78 (1985); およびギルら（Gill et al.）、Nature 334, 721 (1988）参照。これらの開示は本明細書中で参考として援用する。
【００４４】
選択可能なマーカー遺伝子の上記リストは限定することを意味するのではない。適切なマーカー遺伝子であれば、本発明においてすべて用いることができる。
【００４５】
必要に応じて、導入される選択可能な遺伝子マーカーおよび他の遺伝子ならびに目的の核酸は、ウキクサにおける最適な発現のために合成することができる。すなわち、遺伝子のコード配列を改変し、ウキクサにおける発現を強化することができる。合成核酸は形質転換された組織や植物において高レベルで発現されるようにデザインされている。最適化された選択可能なマーカー遺伝子の使用により、高い形質転換効率が得られる。
【００４６】
遺伝子の合成最適化の方法は技術上、利用可能である。ヌクレオチド配列はウキクサにおける発現のために最適化することができ、または単子葉類における最適な発現のために改変することができる。植物優先コドンはウキクサにおいて発現されるタンパク質で最高頻度のコドンから決定することができる。ウキクサや他の単子葉類における発現のために最適化されている遺伝子が本発明の方法で使用できることが認められている。例えば、本明細書中で参考として援用される、欧州特許第 0 359 472号、欧州特許 0385 962号、国際公開第WO 91/16432号、パーラックら（Perlak et al.）、proc. natl. Acad. Sci. USA 88, 3324 (1991)、およびムレイら（Murray et al.）、Nuc, Acids Res. 17, 477 (1989)、等を参照。さらに、遺伝子配列のすべてまたは一部が最適化され、または合成されることが認められている。換言すれば、完全に最適化された配列または部分的に最適化された配列も使用することができる。
【００４７】
細胞宿主における遺伝子発現を強化する追加の配列改変法が周知である。これらには、疑似ポリアデニル化シグナル、エキソン−イントロンスプライス部位、トランスポゾン状リピート、および遺伝し発現に対して有害であり得る十分に特徴づけられた他の配列の制限が含まれる。配列のＧ−Ｃ含量は、宿主細胞において発現される周知の遺伝子を参考に計算される所定の細胞宿主に平均レベルに調整することができる。可能な場合は、配列を改変し、予測されるヘアピン二次ｍＲＮＡ構造体を回避する。
【００４８】
Ｂ． 標的組織およびカルス。
【００４９】
本発明の方法はウキクサ植物体の細胞、好ましくは葉および分裂細胞を形質転換するために有用である。これらの細胞には、ウキクサ植物体のいずれかの組織を起源とするカルスも含まれる。好ましくは、カルスの開始で利用される組織は分裂組織である。または、カルスは他の葉細胞のいずれか、または主にカルスの形成能があるウキクサの他の組織を起源とすることができる。または、一定の後続クローン繁殖能のある組織であれば、器官発生または胚子発生によるかに関係なく、本発明に従ってウキクサを形質転換するために用いることができる。本明細書中で用いる「器官発生」という語は、葉と根が連続的に分裂中心から発生する過程を意味する。また、本明細書中で用いる「胚子発生」という語は、葉と根がいっしょに、体細胞か配偶子であるかに関係なく、集中的に（連続的にではなく）発生する過程を意味する。
【００５０】
この方法を用いて細胞浮遊を形質転換することもできる。この細胞浮遊はすべてのウキクサ組織から形成することができる。
【００５１】
ウキクサは３種類のカルスを形成する。すなわち（ａ）緻密な半組織的カルス（Ｉ型と呼ぶ）；（ｂ）破砕性の白色の未分化カルス（ＩＩ型と呼ぶ）；および（ｃ）緑色の分化カルス（ＩＩＩ型と呼ぶ）である。組織培養では、カルスは２つの経路、すなわち胚とシュート（ウキクサでは葉がシュート）形成を介してのみ植物を再生することができる。カルス誘導の方法が技術上周知であり、以下の実施例で明らかにするように、使用される特定の条件を各ウキクサ種および所望のカルス型のために最適化することができる。好ましくは、Ｉ型カルスおよびＩＩ型カルス、さらに好ましくはＩＩＩ型カルスを用いて本発明によるウキクサを形質転換する。
【００５２】
カルスは植物増殖調節剤、すなわちサイトキニンおよびオーキシンを含有する培地中のウキクサを培養することにより誘導することができる。ウキクサ組織からカルス誘導のための好ましいオーキシンには、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）およびナフトキシ酢酸（ＮＡＡ）が含まれる。好ましいオーキシン濃度は１〜３０μＭであり、さらに好ましく５〜２０μＭ、しかしさらに好ましくは５〜１０μＭである。好ましいサイトキニンはベンジルアデニン（ＢＡ）またはチジアズロン（ＴＤＺ）である。好ましいサイトキニン濃度は、０．１〜１０μＭであり、さらに好ましくは０．５〜５μＭ、しかしさらに好ましくは０．５〜１μＭである。別の好ましい実施例では、カルスはＢＡまたはＴＤＺおよび２，４−ＤまたはＮＡＡのいずれかを含有する培地中のウキクサ組織を培養することにより誘導される。一般に、低濃度のオーキシンまたは「弱い」オーキシン（例えば、インドール酢酸）はカルス形成ではなく葉増殖を促進し、高濃度のオーキシンまたは「強い」オーキシン（例えば、２，４−Ｄ）はカルス形成を促進する。カルス形成のための好ましい培地として、Ｎ６培地（チュら（Chu et al.）、Scientia Sinica 18, 659 (1975)）およびムラシゲとスコッグ（Murashige and Skoog）培地（ムラシゲとスコッグ、Physiol. Plant. 15, 473 (1962)）が挙げられ、ムラシゲとスコッグ培地がより好ましい。一般に、カルス形成頻度にはばらつきがある。ウキクサ種では、カルスは培養液中２ないし３週間では不可視であり、カルスが形質転換のために十分な大きさになるまでに４ないし８週間かかるとみられる。好ましくは、カルス誘導は１〜１０週間で行われ、さらに好ましくは２〜８週間であり、しかしさらに好ましくは３〜５週間である。カルス増殖のために、好ましい培地はカルス誘導のためにであるが、オーキシン濃度は低下される。
【００５３】
Ｃ． 衝撃法によるウキクサの形質転換。
【００５４】
本発明の１つの実施例は目的のヌクレオチド配列によりウキクサを形質転換する方法であって、該ヌクレオチド配列は選択剤に対する耐性を付与する遺伝子を保持する少なくとも１つの発現カセットを含む。ヌクレオチド配列は微小発射体により保持される。発明人が知る限り、バリスティック形質転換の手段により安定に形質転換ウキクサを生成する既報は存在しない。
【００５５】
本発明の好適実施例によれば、バリスティック形質転換法は、（ａ）標的としてウキクサ組織を供給するステップと、（ｂ）細胞壁を穿刺し、組織の細胞内のヌクレオチド配列を析出するとともに、組織の細胞内にヌクレオチド配列を蓄積するために十分な速度でウキクサ組織でヌクレオチド配列を保持する微小発射体を射出し、形質転換組織を影響するステップとを含む。本発明の特定の実施例では、この方法は以下に述べるように、選択剤で形質転換組織を培養するステップをさらに含む。さらに別の実施例では、この選択ステップの後に形質転換組織から形質転換ウキクサ植物体を再生するステップを行う。以下に述べるように、方法はヌクレオチド配列を含有する液体溶液の代わりに、沈殿物（湿性または凍結乾燥性）のみとしてのヌクレオチド配列で行うことができる。
【００５６】
すべてのバリスティック細胞形質転換装置を本発明の実施で用いることができる。好適な装置が、サンドフォードら（Sandford et al.）（Particulate Science and Technology 5, 27 (1988)）、クラインら（Klein et al.）（Nature 327, 70 (1987)）、および欧州特許第 0 270 356号により開示されている。このような装置がトウモロコシ細胞（クラインら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4305 (1988)）、ダイズカルス（クリストウら（Christou et al.）、Plant Physiol. 87, 671 (1988)）、マクケイブら（MacCabe et al.）、BioTechnology 6, 923 (1988)、酵母ミトコンドリア（ジョンストン（Johnston et al.）、Science 240, 1538 (1988)）、およびクラミドモナス葉緑体（ボイントンら（Boynton et al.）、Science 240, 1534 (1988)）を形質転換するために用いられている。
【００５７】
本明細書中で開示する調査では、デュポン社により製造された市販のヘリウム遺伝子銃（ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ）を使用した。または、クラインら（Nature 70, 327 (1987)）が報告した通りに構成された装置を利用することができる。
【００５８】
この装置は、調節可能な高さの阻止板により２つの分離区画に分割された衝撃室（bombardment chamber）を含む。加速管が衝撃室の上部に取付けられている。
【００５９】
微小発射体を発射薬装入により阻止板の加速管に射出させる。阻止板には径が微小発射体よりも小さい穿孔が形成されている。大発射体は（複数の）微小発射体を保持するとともに、大発射体は穿孔を目指すとともに発射される。大発射体が阻止板で阻止されると、（複数の）微小発射体は穿孔の中を射出される。標的組織を衝撃室に位置決めされ、穿孔の中を射出される（複数の）微小発射体が標的組織の細胞壁に貫入し、標的組織の細胞内に保持された目的のヌクレオチド配列を蓄積する。衝撃室は部分的にのみ真空排気されるため、標的組織は衝撃中に乾燥しない。約４００〜８００ミリメートル・マーキュリの真空が適切である。
【００６０】
別の実施例では、微小発射体を使用せずにバリスティック形質転換が達成される。例えば、沈殿物としての目的のヌクレオチド配列を含有する水溶液に大発射体を保持させることもでき（例えば、表面張力で行われる、微小発射体のない大発射体の板接触端に直接、水溶液を配置することにより）、水溶液のみが植物の標的組織に射出される（例えば、上述した同じやり方で大発射体を加速管に射出させることにより）。他の方法として、核酸沈殿物そのもの（「湿性」沈殿物）または凍結乾燥ヌクレオチド沈殿物を微小発射体のない大発射体の板接触端に直接、配置することが挙げられる。微小発射体の非存在下に、ヌクレオチド配列は微小発射体により保持される場合には必要よりも大きな速度で標的組織で射出されるか、またはヌクレオチド配列を短距離で標的組織に移動させなければならない（または両方を必要とする）と考えられる。
【００６１】
現在、微小発射体にヌクレオチド配列を保持させることが好ましい。微小発射体は、粒子の速度と粒子が移動すべき距離であれば、細胞壁を射出されるべき十分な速度と粘着性を有するすべての材料から形成することができる。微小発射体を生成するための材料の非限定的例として、金属、ガラス、シリカ、氷、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、および炭素化合物（黒鉛、ダイアモンドなど）が挙げられる。現在では金属粒子が好ましい。適切な金属の非限定的例として、タングステン、金、およびイリジウムが挙げられる。粒子は標的組織内で接触する細胞の過剰な分断を回避するのに十分に小さなサイズであるべきであり、標的組織内の目的の細胞を貫入するのに必要な慣性を供給するのに十分に大きくなくてはならない。粒子の直径範囲は約２分の１マイクロメートルから約３マイクロメートルが適切である。粒子上の表面不規則性がＤＮＡ搬送能を強化し得るため、粒子は球状である必要はない。
【００６２】
ヌクレオチド配列は沈降により粒子状に固定化することができる。使用する精確な沈降パラメータは、技術上周知の通り、使用する粒子加速度手順など各要因によって変動する。担体粒子はポリリシンなど被包性剤で最適に被覆し、欧州特許第 0 270 356号（第８欄）で考察されている通り、粒子状に固定化されるヌクレオチド配列の安定性を向上することができる。
【００６３】
標的組織のバリスティック衝撃後、形質転換体を選択するとともに、以下のＥ節で述べる通り形質転換ウキクサ植物体を再生することができる。
【００６４】
Ｄ． アグロバクテリウム媒介形質転換。
【００６５】
本発明の１つの実施例では、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）、好ましくはアグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いてウキクサが形質転換される。アグロバクテリウム媒介遺伝子導入は、ＤＮＡを植物染色体に移入するＡ．ツメファシエンスおよびＡ．リゾゲネスの自然能力を活用するものである。アグロバクテリウムはＡ．ツメファシエンスおよびＡ．リゾゲネスのＴｉプラスミドおよびＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡと呼ばれる領域にコードされる一連の遺伝子を移入する植物病原体である。Ｔｉプラスミドの移入の典型的な結果は、Ｔ−ＤＮＡが安定に宿主染色体に組込まれるクラウンゴールと呼ばれる腫瘍増殖である。Ｒｉプラスミドの宿主染色体ＤＮＡへの組込みは、「毛根病」として知られる症状の原因となる。宿主植物における疾患誘発能はＤＮＡの移入および組込みを損なうことなくＴ−ＤＮＡ内遺伝子の欠失により除去することができる。導入すべきＤＮＡは組込みＴ−ＤＮＡのエンドポントを規定する境界配列に付着される。
【００６６】
工学的に作製されたアグロバクテリウム株の手段による遺伝子導入は、多くの双子葉耕作植物のためのルーチンとなっている。しかし、アグロバクテリウムを用いて単子葉植物、特に穀類を形質転換するには大きな困難が経験されている。発明人が知る限り、アグロバクテリウム媒介形質転換の手段により形質転換ウキクサを安定に生産することについてこれまで報告されていない。
【００６７】
以下の考察はＡ．ツメファシエンスを用いてウキクサにおける遺伝子導入を達成することを焦点とするが、当業者にはこの考察がＡ．リゾゲネスにも十分等しく適用されることが明らかであろう。Ａ．リゾゲネスを用いた形質転換はＡ．ツメファシエンスの形質転換と類似的に開発され、例えば、アルファルファ、ナス（Salanum nigrum L.）、およびポプラを形質転換するために利用して成功している。リアルスら（Ryals et al.）に対する米国特許第 5,777,200号。ブルゲスら（Burgess et al.）に対する米国特許第 5,773,693号により記載されている通り、安全化されたＡ．ツメファシエンス株を用いることが好ましい（以下に記載）が、野生型Ａ．リゾゲネスを使用してもよい。Ａ．リゾゲネスの実例となる株は１５８３４株である。
【００６８】
本発明の方法で利用されるアグロバクテリウム株は改変され、遺伝子または目的の遺伝子、もしくは形質転換細胞で発現すべき核酸を含有させる。形質転換すべき核酸はＴ領域に組み込まれ、Ｔ−ＤＮＡ境界配列によりフランキングされる。各種のアグロバクテリウム株が特に双子葉植物用に技術上周知である。このようなアグロバクテリウムを本発明の方法に用いることができる。例えば、フーユカース（Hooykaas）、Plant Mol. Biol. 13, 327 (1989); スミスら（Smith et al.）、Crop Science 35, 301 (1995); クリントン（Chrinton）、Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90, 3119 (1993); モロニーら（Mollony et al.）、Monograph Theor. Appl. Genet NY 19, 148 (1993); イシダら（Ishida et al.）、Nature Biotechnol. 14, 745 (1996); およびコマリら（Komari et al.）、The Plant Journal 10, 165 (1996）を参照。これらの開示は、本発明明細書中で参考として援用する。
【００６９】
Ｔ領域のほか、Ｔｉ（またはＲｉ）プラスミドはｖｉｒ領域を含有する。ｖｉｒ領域は有効な形質転換のために重要であり、種特異的であると思われる。外来ＤＮＡおよびｖｉｒ機能を保持する操作された安全化Ｔ−ＤＮＡが個別プラスミド上に存在するバイナリーベクター系が開発されている。このようにして、外来ＤＮＡ配列（導入すべき核酸）を含む改変Ｔ−ＤＮＡ領域が大腸菌（E. coli）で複製する小さなプラスミドにおいて構成される。このプラスミドは、ビルレンス遺伝子配列と親和性のプラスミドを含有するＡ．ツメファシエンスに三親交配または電気穿孔法により共役的に導入される。ｖｉｒ機能はｔｒａｎｓに供給され、Ｔ−ＤＮＡを植物ゲノムに導入する。このようなバイナリーベクターが本発明の実施に有用である。
【００７０】
本発明の好適実施では、Ｃ５８由来ベクターを使用し、Ａ．ツメファシエンスを形質転換する。または、他の実施例では、スーパーバイナリーベクターが使用される。例えば、本明細書中で参考として援用される米国特許第 5,591,615および欧州特許第 0 604 662号を参照。このような、きわめて高い形質転換効率を示すスーパービルレンスＡ．ツメファシエンスに含まれるＡ２８１ＴｉプラスミドｐＴｉＢｏ５４２（ジンら（Jin et al.）、J. Bacteriol. 169, 4417 (1987)）の高ビルレンス領域から発するＤＮＡ領域を含有するスーパーバイナリーベクターが構成されている（フッドら（Hood et al.）、Biotechnol. 2, 702 (1984); フッドら、J. Bacteriol. 168, 1283 (1986); コマリら（Komari et al.）、J. Bacteriol. 166, 88 (1986); ジンら、J. Bacteriol. 169, 4417 (1987); コマリ、Plant Science 60, 223 (1987); ATCC Accession第3794号。
【００７１】
当業者に周知の実例としてのスーパーバイナリーベクターとして、ｐＴＯＫ１６２（本明細書中で参考として援用される、特願平（コカイ（Kokai）4-222527、欧州特許第 504,869号、欧州特許第 604,662号および米国特許第 5,591,616号）およびｐＴＯＫ２３３（本明細書中で参考として援用される、コマリ、Plant Cell Reports 9,303 (1990); イシダら、Nature Biotechnology 14, 745 (1996)）が挙げられる。他のスーパーバイナリーベクターが上記引例により記載された方法により構成することができる。スーパーバイナリーベクターｐＴＯＫ１６２は大腸菌およびＡ．ツメファシエンスにおける複製能がある。また、このベクターはｐＴｉＢｏ５４２のビルレンス領域からのｖｉｒＢ遺伝子、ｖｉｒＣ遺伝子およびｖｉｒＧ遺伝子を含む。プラスミドも抗生物質耐性遺伝子、選択可能なマーカー遺伝子、および植物体に形質転換すべき目的の核酸を含有する。ウキクサゲノムに挿入すべき核酸はＴ領域の２つの境界配列間に位置決めされる。ｐＴＯＫ１６２について上述した特徴を有する本発明のスーパーバイナリーベクターを構成することができる。本発明の使用のためのスーパーバイナリーベクターおよび他のベクターのＴ領域は、射出すべき遺伝子の挿入のための制限部位を有するように構成される。または、生体内（in vivo）同種組換えを利用して形質転換すべきＤＮＡをベクターのＴ−ＤＮＡ領域に挿入することができる。ヘレラ−エステレラら、EMBO J. 2, 987 (1983); ホルヒら（Horch et al.）、Science 223, 496 (1984）を参照。このような同種組換えは、スーパーバイナリーベクターがｐＢＲ３２２または他の同様のプラスミドの領域と同種の領域を有するという事実に依拠するものである。このため、この２つのプラスミドが結合すると、所望の遺伝子が同種領域を介した遺伝子組換えによりスーパーバイナリーベクターに挿入される。
【００７２】
ウキクサを形質転換するために適切なベクターはすべて本発明に従って使用することができる。例えば、目的の異種核酸配列およびフランキングＴ−ＤＮＡをｖｉｒ領域を欠くバイナリーベクターにより搬送することができる。次にｖｉｒ領域は安全化Ｔｉプラスミドまたは二次バイナリープラスミド上に供給される。別の代替として、異種核酸配列およびＴ−ＤＮＡ境界配列を新しいＴ−ＤＮＡが最初のＴｉプラスミドＴ−ＤＮＡを置換することによる二重組換え事象によりＴｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ部位に配置することができる。ｖｉｒ領域はＴｉプラスミドにより、またはバイナリープラスミド上で供給することができる。さらに別の代替では、異種核酸配列およびフランキングＴ−ＤＮＡを、シルパーオールトら（Shilperoort et al.）に対する米国特許第 4,940,838号により記載されている細菌染色体に組込むことができ、ｖｉｒ領域は次にＴｉプラスミドまたはバイナリープラスミド上に供給することができる。
【００７３】
本発明のアグロバクテリウム媒介形質転換法は、いくつかのステップを含むものとして考えることができる。基本的なステップには感染ステップと共生培養が含まれる。一部の実施例では、これらのステップの後に選択ステップを行い、他の実施例では選択と再生のステップを行う。
【００７４】
最適な前培養ステップを感染ステップの前に含めることができる。前培養ステップは、適切な培地で感染ステップの前にカルス、葉、または他の標的組織を培養するステップを含む。前培養期間は約１日ないし２１日であり、好ましくは７日ないし１４日であり得る。このような前培養ステップはトウモロコシ培養の形質転換を予防するために見出された。例えば、欧州特許第 0 672 752号を参照。
【００７５】
感染ステップでは、形質転換すべき細胞をアグロバクテリウムに曝露する。細胞は、典型的に液体培地でアグロバクテリウムと接触させる。上述した通り、アグロバクテリウムは目的の遺伝子または核酸を含有するために改変されている。核酸はベクターのＴ−ＤＮＡ領域に挿入される。本発明でも用いられる一般の分子生物学的方法は当業者には十分に周知である。例えば、サムブロックら（SAMBROOK ET AL.）、MOLECULR CLONING: A LABORATORY MANUAL (1989）。
【００７６】
目的のプラスミドを含有するアグロバクテリウムは、好ましくは約−８０℃で凍結した保存培養株とともにアグロバクテリウムマスタープレート上に維持する。マスタープレートを用いて寒天プレートを培養し、次に感染工程で使用するために培地に懸濁されるアグロバクテリウムを得ることできる。または、マスタープレートからの細菌を用いて、形質転換前の対数期に増殖されるブロス培養株を培養することできる。
【００７７】
感染ステップおよび共生培養ステップで用いられるアグロバクテリウムの濃度は形質転換頻度に影響を及ぼすことがある。同様に、きわめて高い濃度のアグロバクテリウムは形質転換すべき組織に損傷を与え、カルス反応の低下の原因となることがある。このため、本発明の方法で有効なアグロバクテリウムの濃度は利用されるアグロバクテリウム株、形質転換される組織、形質転換されるウキクサ種、等によって変動し得る。特定のウキクサ種または組織の形質転換プロトコールを最適化するために、形質転換すべき組織はさまざまな濃度のアグロバクテリウムで培養することができる。同様に、マーカー遺伝子発現および形質転換効率のレベルをさまざまなアグロバクテリウム濃度について測定することができる。アグロバクテリウムの濃度は変動し得るが、一般に濃度の範囲は約１ｘ１０３ｃｆｕ／ｍｌないし約１ｘ１０１０を用い、好ましくは約１ｘ１０３ｃｆｕ／ｍｌないし約１ｘ１０９ｃｆｕ／ｍｌの範囲であり、さらに好ましくは約１ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌないし約１ｘ１０９ｃｆｕ／ｍｌが用いられる。
【００７８】
形質転換すべき組織は一般に形質転換効率を最適化するための濃度のアグロバクテリウムを含有する液体接触期にアグロバクテリウム浮遊液に添加する。接触期はアグロバクテリウムの浮遊液と形質転換すべき組織の最大の接触を促進する。感染は一般に共生培養ステップ前に１ないし３０分間継続させ、好ましくは１〜２０分間、より好ましくは２ないし１０分間、さらに好ましくは３ないし５分間継続させる。
【００７９】
当業者には、条件を最適化し、アグロバクテリウムによる最高レベルの感染および形質転換を達成できることが明らかであろう。例えば、本発明の好適実施例では、感染および共生培養時に細胞を浸透圧（例えば、０．６Ｍマニトール）にかける。または、形質転換効率を強化するために、ＩＡＡなどオーキシンを含有する培地に組織を培養し、細胞増殖を促進することができる（すなわち、アグロバクテリウムは有糸分裂時にゲノムに組込むと考えられている）。別の代替として、組織創傷、真空圧、またはアセトシリンゴンを含有する培地での培養を用いて形質転換効率を促進することができる。
【００８０】
共生培養ステップでは、形質転換すべき細胞をアグロバクテリウムと共生培養する。典型的に。共生培養は固形培地で行われる。１％スクロースおよび０．６％寒天を含有するシェンクとヒルデブラント（Shenk and Hildebrandt）培地（シェンクとヒルデブラント、Can. J. Bot. 50, 199 (1972)）など適切な培地はいずれも利用することができる。最適な共生培養時間は個別の組織でばらつきがある。葉は約２ないし７日間、好ましくは２ないし７日間、さらに好ましくは３ないし５日間、さらに好ましくは４日間アグロバクテリウムと共生培養される。これに対して、カルスは０．５ないし４日間、さらに好ましくは１ないし３日間、さらに好ましくは２日間アグロバクテリウムと共生培養される。共生培養は暗条件または半暗光条件下で行い、形質転換効率を強化する。または、接種ステップについて上述した通り、共生培養はＩＡＡまたはアセトシリンゴンを含有する培地上で行うことができる。最後に、共生培養ステップは、細胞増殖を強化作用のあるサイトキニンの存在下に実施することができる。
【００８１】
共生培養ステップ後、形質転換組織は最適な休止および脱汚染化ステップの対象とすることができる。休止／脱汚染化ステップでは、形質転換細胞はアグロバクテリウムの増殖抑制能がある抗生物質を含有する第２の培地に移動される。この休止期は異種核酸を含有する形質転換細胞の回復および増殖を可能とする選択的圧力の非存在下に実施される。アグロバクテリウムの増殖を抑制するために抗生物質が添加される。このような抗生物質は技術上周知であり、アグロバクテリウムを抑制するとともに、セホタキシム、チメチン、バンコマイシン、カルベニシリン、等を含む。抗生物質の濃度は各抗生物質の標準に従って変動する。例えば、固形培地中カルベニシリン濃度の範囲は約５０ｍｇ／ｌないし約２５０ｍｇ／ｌカルベニシリン、好ましくは約７５ｍｇ／ｌないし約２００ｍｇ／ｌ、さらに好ましくは約１００〜１２５ｍｇ／ｌとなる。単子葉植物形質転換の当業者は、抗生物質の濃度が不適切な実験なしに特定の形質転換プロトコールのために最適化できることを認めるであろう。
【００８２】
休止期培養株は好ましくは暗所または半暗光下、好ましくは半暗光下で休止させる。技術上周知の培地のうちいずれも休止ステップ用に利用することができる。休止／脱汚染化ステップはアグロバクテリウムの増殖を抑制するとともに、選択前に形質転換細胞の数を増大するために必要な期間、行うことができる。典型的に、休止／脱汚染化ステップは選択ステップ前に１ないし６週間、好ましくは２ないし４週間、さらに好ましくは２ないし３週間行うことができる。さらに好ましい実施例では、選択期間は共生培養後３週間以内に開始する。一部のアグロバクテリウム株は他の株よりも抗生物質耐性である。耐性が低い株については、脱汚染化は典型的に約５日ごとにカルスに新鮮脱汚染化培地を添加することで実施される。耐性が高い株については、強力な抗生物質（バンコマイシンなど）を１日おきにカルスに添加することができる。
【００８３】
共生培養ステップ後、または休止／脱汚染化ステップ後、以下のＥ節に述べる通り、形質転換体を選択するとともにウキクサ植物体を再生することができる。
【００８４】
Ｅ． 形質転換体の選択と形質転換ウキクサ植物体の再生。
【００８５】
ウキクサ組織またはカルスは、上記のＣとＤの節でそれぞれ詳細に述べた通り、例えばバリスティック衝撃法またはアグロバクテリウム媒介形質転換により、本発明に従って形質転換される。形質転換ステップ後、形質転換組織は発現カセットにより誘導される異種核酸からのポリペプチドを受容するとともに発現している細胞を選択するために選択圧がかけられる。形質転換体用の選択剤により、バリスティック衝撃法またはアグロバクテリウムで発現カセット内に位置決めされ、搬送された少なくとも１つの選択可能なマーカー挿入物を含有する細胞の選択的な増殖が選択される。
【００８６】
形質転換体（すべての組織型またはカルス由来）の選択が実施される条件は、本明細書中で開示される方法のうち一般に最も重要な態様である。形質転換工程では細胞にストレスをかけ、選択工程は形質転換体にさえも毒性であり得る。典型的に、この問題に応じて、形質転換組織は最初に弱い選択にかけ、低濃度の選択剤および半暗光（例えば、１〜５μｍｏｌ／ｍ２）を利用し、選択剤濃度の増大および／または光度の増大により適用選択グラジエントを徐々に増大させる。選択圧は一時は完全に除去して組織にストレス状態に見える場合は再び圧力をかけることができる。または、形質転換組織には、選択圧を完全にかける前に、上記のＤ節で述べた通り、「休止」期を与えることができる。選択培地は一般に、１％ないし３％スクロースなど単純な炭水化物を含有するため、細胞は光合成を行うことはない。また、選択は最初に半暗光条件下、または完全な暗所で実施し、相対的に低レベルで細胞の代謝活性を維持するようにする。当業者には選択を実施する特異的条件はウキクサのすべて種または株および不適切な実験をせずに形質転換されるすべての組織型について最適化できることが明らかであろう。
【００８７】
選択ステップには特定の時間制限はない。一般に、選択は非形質転換体を殺傷するとともに、再生ステップ前に十分なカルス量を生成するために非形質転換細胞とほぼ同じ速度で形質転換細胞を増殖させるのに十分に長く行われる。このため、選択期間は低速度で増殖する細胞では長くなる。例えば、Ｉ型ウキクサカルスは相対的に緩徐に増殖し、選択は再生前に８〜１０週間行われる。
【００８８】
形質転換された細胞およびカルスから特定の植物体を再生する方法は技術上周知である。例えば、カモら（Kamo et al.）、Bot. Gaz. 146, 327 (1985); ウェストら（West et al.）、The Plant Cell 5, 1361 (1993); およびダンカンら（Duncan et al.）、Planta 165, 322 (1985）を参照。形質転換および選択後の葉の再生は、ＩＩ型およびＩＩＩ型のカルスで最も確実に達成される。例えば、Ｉ型カルスでの再生は、薄い黄色のカルス表面で出現する葉中心（葉が発生する部位）で確認できる。典型的に、ウキクサの再生はカルスの増殖を支持する同じ培地条件下で生じることはない。栄養分のない固体培地（例えば、水寒天または半強度シェンクとヒルデブラント培地は０．５％スクロールおよび０．８％寒天を含有する）が好ましい。しかし通常は、完全強度培地で短期間にわたって再生ウキクサカルスを断続的に培養し、再生細胞の栄養バランスを維持することが必要である。場合によっては、株または種を緩徐に再生することにより、この工程は葉が再生する前に数回反復する必要もある。典型的に、植物増殖調節剤は葉再生培地に添加しない（葉の組織を抑制するため）が、ＢＡおよびリン酸アデニンなどサイトキニンにより数種での葉再生を増大することができる。カルス培養株はカルス培養の長期間にわたって葉の再生能を失うことはない。
【００８９】
再生工程時、技術上周知の方法をすべて利用し、再生植物体が実際に導入された目的の核酸で形質転換されていることを確認することができる。例えば、組織化学的染色、酵素結合抗体免疫アッセイ（ELISA）、サザンハイブリダイゼイション、ノーザンハイブリダイゼイション、ウェスタンハイブリダイゼイション、ＰＣＲ、等を用いて、染色組織または再生植物体の形質転換された核酸またはタンパク質を検出することができる。
【００９０】
ここで、ウキクサがバリスティック衝撃法およびアグロバクテリウムを利用して形質転換できることが明らかにされた以上、本明細書中で述べた一般の方法の変更を用いて、効率を増大し、または形質転換に対して何らかの抵抗を示す株を形質転換することができる。形質転換の効率に影響を及ぼす要因として、ウキクサの種、感染組織、組織培養の培地組成物、選択可能なマーカー遺伝子、上述したステップのうちいずれかの長さ、ベクターの種類、光／暗条件が挙げられる。特にアグロバクテリウム媒介形質転換では、Ａ．ツメファシエンスまたはＡ．リゾゲネスの濃度および株も考慮に入れる必要がある。したがって、これらや他の要因は特定のウキクサ種または株の最適な形質転換プロトコールを決定するために変化させることができる。すべての種と株が形質転換条件に対して同じ反応を示すわけではなく、本明細書中に開示したプロトコールのわずかに異なる変更を必要とすることもある。しかし、それぞれの変数を変更することにより、すべのウキクサ系に対する最適なプロトコールを得ることができる。
【００９１】
以下の実施例は実例として提供され、限定されるものではない。実施例に用いられている通り、“時（hr）”は時間を意味し、“秒（sec）”は秒数を意味し、“ｇ”はグラムを意味し、“ｍｇ”はミリグラムを意味し、“ｌ”はリットルを意味し、“ｍｍｏｌ”はミリモルを意味し、“ｍＭ”はミリモルを意味し、“μＭ”はマイクロモルを意味し、“ｍ”はメートルを意味し、“ｍｍ”はミリメートルを意味し、“ＢＡ”はベンジルアデニンを意味し、“２，４−Ｄ”は２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を意味し、“ＮＡＡ”はナフタレン酢酸を意味するとともに、“ＩＡＡ”はインドール酢酸を意味する。
【００９２】
実施例
組織培養：
本節ではウキクサカルスを作製する方法に属する実験を示す。多くの実施例ではウキクサ株としてイボウキクサ（Lemna gibba）を使用し、この株は培養パラメータ、すなわち（１）基礎培地調製、（２）植物増殖調節剤の種類と濃度、および（３）導入スケジュールを最適化するために使用した。カルス生成の知見の増大に伴い、これは他のウキクサ種にも適用された。ウキクサ種は３種類のカルス、すなわち（ａ）緻密な半組織的カルス（Ｉ型と呼ぶ）；（ｂ）破砕性の白色の未分化カルス（ＩＩ型と呼ぶ）；および（ｃ）緑色の分化カルス（ＩＩＩ型と呼ぶ）を生成する。組織培養では、カルスは２つの経路、すなわち胚とシュート（ウキクサでは葉がシュート）生成を介してのみ植物を再生することができる。以下に示したデータは、形質転換ウキクサ植物体が葉のカルス再生の周知の経路すべてから再生し得ることを明らかに示している。
【００９３】
実施例１
オーキシン、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、およびサイトカイン、ベンジルアデニン（ＢＡ）の１８種類の組合わせを、ウキクサ種、イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３のカルス誘導に対する影響について試験した。
【００９４】
ウキクサ葉は、３％スクロースを含有する液体ホアグランド（Hoagland）培地（ホアグランドとスニーダー（Snyder）、Proc. Amer. Soc. Hort. Sci. 30, 288（1933)）において、実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で２週間発育させた。カルス誘導については、３％スクロース、０．１５％ゲルライト（Gelrite）および０．４％ジフコ（Difco）バクト（Bacto）寒天を含有するムラシゲとスコーグ（Murashige and Skoog）基礎培地（ムラシゲとスコーグ、Physiol. Plant. 15, 473（1962)）の１８種類の１００ｍｌ部を、濃度１０、２０および５０μＭの２，４−Ｄおよび濃度０、０．０１、０．１、１．０、２．０、および１０．０μＭのＢＡで調製し、２０分間１２１℃で加圧滅菌し、冷却するとともに、各１００ｍｌを４個の１００ｍｍｘ１５ｍｍのペトリ皿に混釈した。
【００９５】
３種類の２，４−Ｄ濃度ｘ６種類のＢＡ濃度、４種類の複製、１複製当たり１ペトリ皿および１ペトリ皿当たり葉５枚の全要因実験計画（全体で１８処置）を用いた。カルス誘導については、５枚のウキクサ葉を培地の各プレート上の背軸側に配置した。７２個のプレートを約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で２７日間培養した。２７日後、ウキクサ組織を同じ種類の新鮮培地に移し、同じ温度と光培養条件下にさらに３５日間培養を継続した。
【００９６】
カルス誘導の頻度で測定された結果（カルスを生成する＃葉／全＃葉）は培養６２日後に３種類のカルス増殖を示した。（１）緻密な白色−黄色のカルスが確認され、「Ｉ型」と呼んだ。約５％の低頻度の葉はこの型のカルスを増殖した。（２）破砕性の白色のカルスが確認され「ＩＩ型」と呼んだ。（３）範囲が細胞組織の程度の緑色のカルスが確認され、「ＩＩＩ型」と呼んだ。この型のカルスは培養期間中に増殖した全葉の５０％より多く生成された。３種類のカルスはすべて異なる頻度で１８種類の２，４−ＤとＢＡの組合わせですべて増殖を明らかに示した。カルス増殖は、２０〜５０μＭの広範囲の２，４−Ｄ濃度、および０．０１〜０．１μＭのＢＡ濃度で最も活発であった。
【００９７】
実施例２
オーキシン、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、およびサイトカイン、ベンジルアデニン（ＢＡ）の４０種類を、イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３のウキクサ葉からのカルス誘導のためにオーキシンとサイトカインをより最適化するために試験した。
【００９８】
ウキクサ葉は、３％スクロースを含有する液体ホアグランド（Hoagland）培地（ホアグランドとスニーダー（Snyder）、Proc. Amer. Soc. Hort. Sci. 30, 288（1933)）において、実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で２週間発育させた。カルス誘導については、３％スクロース、０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジフコバクト寒天を含有するムラシゲとスコーグ（Murashige and Skoog）基礎培地（ムラシゲとスコーグ、Physiol. Plant. 15, 473（1962)）の４０種類の１００ｍｌ部を、濃度２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００μＭの２，４−Ｄおよび濃度０．０１、０．０５、０．１、０．５および１．０μＭのＢＡで調製した。全培地をｐＨ５．８に調節し、２０分間１２１℃で加圧滅菌し、冷却するとともに、各１００ｍｌを４個の１００ｍｍｘ１５ｍｍのペトリ皿に混釈した。
【００９９】
８種類の２，４−Ｄ濃度ｘ５種類のＢＡ濃度、４種類の複製、１複製当たり１ペトリ皿および１ペトリ皿当たり葉５枚の全要因実験計画（全体で４０処置）を用いた。カルス誘導については、５枚のウキクサ葉を培地の各プレート上の背軸側に配置した。各プレートを約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で２７日間培養した。２７日後、ウキクサ組織を同じ種類の新鮮培地に移し、同じ温度と光培養条件下にさらに３５日間培養を継続した。
【０１００】
６３日の培養後に得られた結果は３種類のカルス、すなわち（１）Ｉ型カルス、（２）ＩＩ型カルス、および（３）ＩＩＩ型カルスが増殖していたことを示した。数値頻度データ（カルスを生成する＃葉／全＃葉）の回帰分析（二次反応表面）は各種型のカルス誘導の葉反応の差を示した。ＩＩ型カルスおよびＩＩＩ型カルスの頻度は２，４−ＤおよびＤＡの濃度により有意に影響を受けたが、Ｉ型カルスの頻度は２，４−Ｄ頻度のみにより有意に影響を受けた。広範囲の植物増殖調節剤で生じる最適なカルス誘導を証明する２，４−ＤまたはＢＡの特異的濃度は認められなかった。葉の約５０％がＩＩ型カルスを生成し、約２５％がＩＩ型カルスを生成するとともに、ＩＩＩ型カルスを生成せいたのは５％未満であった。
【０１０１】
実施例３
オーキシン、ジカンバ（dicamba）、およびサイトカイン、ベンジルアデニン（ＢＡ）の４０種類を、ウキクサ種、イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３のカルス誘導について２，４−Ｄに対するジカンバの相対効果を比較するために試験した。
【０１０２】
ウキクサ葉は、３％スクロースを含有する液体ホアグランド（Hoagland）培地（ホアグランドとスニーダー（Snyder）、Proc. Amer. Soc. Hort. Sci. 30, 288（1933)）において、実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で２週間発育させた。カルス誘導については、３％スクロース、０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジフコバクト寒天を含有するムラシゲとスコーグ（Murashige and Skoog）基礎培地（ムラシゲとスコーグ、Physiol. Plant. 15, 473（1962)）の４０種類の１００ｍｌ部を、濃度２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００μＭジカンバおよび濃度０．０１、０．０５、０．１、０．５および１．０μＭのＢＡで調製した。全培地をｐＨ５．８に調節し、２０分間１２１℃で加圧滅菌し、冷却するとともに、各１００ｍｌを４個の１００ｍｍｘ１５ｍｍのペトリ皿に混釈した。
【０１０３】
８種類のジカンバ濃度ｘ５種類のＢＡ濃度、４種類の複製、１複製当たり１ペトリ皿および１ペトリ皿当たり葉５枚の全要因実験計画（全体で４０処置）を用いた。カルス誘導については、５枚のウキクサ葉を培地の各プレート上の背軸側に配置した。各プレートを約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で２７日間培養した。２８日後、ウキクサ組織を同じ種類の新鮮培地に移し、同じ温度と光培養条件下にさらに３５日間培養を継続した。
【０１０４】
７３日の培養後に得られた結果は３種類のカルス増殖、すなわち（１）Ｉ型カルス、（２）ＩＩ型カルス、および（３）ＩＩＩ型カルスの増殖が確認された。全体として、カルス増殖は弱く、１０および２０μＭのジカンバ濃度で生じ、３０μＭ以上ではカルス増殖が生じることはなかった。ＩＩ型カルスおよびＩＩＩ型カルスはジカンバに反応して増殖し、Ｉ型カルス増殖は稀であった。
【０１０５】
実施例４
ＢＡと組合わせた２，４−Ｄの２つの濃度を用いて、カルス増殖を維持することができ、イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３で確認された３型からのカルス系が確立できるかどうかを測定した。
【０１０６】
ウキクサ葉は、１％スクロースを含有する液体シェンクとヒルデブラント培地（シェンクとヒルデブラント、Can. J. Bot. 50, 199 (1972)）において、実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で２週間発育させた。カルス誘導については、３％スクロース、０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジフコバクト寒天を含有するムラシゲとスコーグ基礎培地を１０および４０μＭ濃度の２，４−Ｄで調製した。全培地をｐＨ５．８に調節し、２０分間１２１℃で加圧滅菌し、冷却するとともに、それぞれ２００ｍｌを８個の１００ｍｍｘ１５ｍｍのペトリ皿に混釈した。
【０１０７】
４つの複製、複製当たり１ペトリ皿および１ペトリ皿当たり葉５枚による２つの処置のランダムブロック実験計画を行った。カルス誘導については、５枚のウキクサ葉を培地の各プレート上の背軸側に配置した。各プレートを約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で２７日間培養した。４週間後、ウキクサ組織を同じ種類の新鮮培地に移し、同じ温度と光培養条件下にさらに４週間培養を継続した。
【０１０８】
８週間の培養後に３種類のカルス増殖、すなわち（１）Ｉ型カルス、（２）ＩＩ型カルス、および（３）ＩＩＩ型カルスの増殖が確認された。３種類のカルス型をそれまで配置されていたのと同一の組成の新鮮培地に移し、同一の培養条件での培養を４週間の継代培養で継続した。さらに２か月の培養後、１０μＭ ２，４−Ｄと０．０１μＭ ＢＡでのＩ型カルスとＩＩＩ型カルスの健常が確立され、カルス培養株を増殖していた。ＩＩ型カルスが増殖することはなかった。カルス増殖は４週間の継代培養スケジュールで維持されたが、継代培養期間の第３週目および第４週目でカルス低下が認められた。
【０１０９】
実施例５
カルス増殖を維持する継代培養スケジュールをイボウキクサ（Lemna gibba）
Ｇ３で試験した。ウキクサ葉は、１％スクロースを含有する液体シェンクとヒルデブラント培地（シェンクとヒルデブラント、Can. J. Bot. 50, 199 (1972)）
において、実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で２週間発育させた。カルス誘導については、３％スクロース、０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジフコバクト寒天を含有するムラシゲとスコーグ基礎培地を３０μＭ ２，４−Ｄおよび０．０２μＭ ＢＡで調製し、ｐＨ５．８に調節するとともに、２０分間１２１℃で加圧滅菌し、冷却するとともに、２０個の１００ｍｍｘ１５ｍｍのペトリ皿に混釈した。
【０１１０】
２つの複製、複製当たり５ペトリ皿および１ペトリ皿当たり葉５枚による２つの処置のランダムブロック実験計画を行った。カルス誘導については、５枚のウキクサ葉を培地の各プレート上の背軸側に配置した。各プレートを約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で２週間培養した。２週間後、プレートの半分（１０プレート）上のウキクサ組織を同じ種類の新鮮培地に移し、移動していない組織と同じ温度と光培養条件下に培養を継続した。４週間後、組織のカルス増殖を評価した。３種類のカルス、すなわち（１）Ｉ型カルス、（２）ＩＩ型カルス、および（３）ＩＩＩ型カルスが増殖した。移動することなく４週間培養されたウキクサ組織と比較して、２週間の時点で移動した組織間のカルスの種類および増殖に差は確認されなかった。
【０１１１】
Ｉ型カルスおよびＩＩ型カルスをオリジナルの葉から離して継代培養し、３％スクロース、０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジフコバクト寒天、１０μＭ ２，４−Ｄおよび０．０１μＭ ＢＡを含有するムラシゲとスコーグ培地で培養を継続した。増殖カルスを２週間間隔で同じ組成の新鮮培地に継続して継代培養した。移動間の長い間隔により、２週間と３週間との間でカルス健常性における突然の低下が生じた。カルス増殖は、２週間の継代培養スケジュールを維持すると成長力を失うことなく継続した。
【０１１２】
実施例６
２つの異なる基礎培地、ムラシゲとスコーグおよびニッチュとニッチュ（Science 163, 85 (1969)）を試験し、イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３のカルス誘導の相対的有効性を比較した。
【０１１３】
ウキクサ葉は、１％スクロースを含有する液体シェンクとヒルデブラント培地において、実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で２週間発育させた。カルス誘導については、３％スクロース、０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジフコバクト寒天、３０μＭ ２，４−Ｄおよび０．０１μＭ ＢＡを含有するムラシゲとスコーグ培地およびニッチュとニッチュ培地のそれぞれ５００ｍｌを調製し、ｐＨ５．８に調節するとともに、２０分間１２１℃で加圧滅菌し、冷却するとともに、２０個の１００ｍｍｘ１５ｍｍのペトリ皿に混釈した。
【０１１４】
２つの複製、複製当たり１ペトリ皿および１ペトリ皿当たり葉５枚による２つの処置のランダムブロック実験計画を行った。カルス誘導については、５枚のウキクサ葉を培地の各プレート上の背軸側に配置した。各プレートを約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で２週間培養した。２週間後、ウキクサ組織を同じ種類の新鮮培地に移し、同じ温度と光培養条件下に培養を継続した。
【０１１５】
４週間の培養後にすべてのプレート上の組織のカルス増殖を評価した。ニッチュとニッチュ培地で培養した葉はカルスの有意量を増殖しなかった。この培地上のウキクサ組織は色が薄く、黄色になり始めていた。ムラシゲとスコーグ培地で培養したウキクサ葉は通常の３種類のカルス、すなわちＩ型カルス、ＩＩ型カルス、およびＩＩＩ型カルスを増殖した。
【０１１６】
Ｉ型カルスおよびＩＩ型カルスをオリジナルの葉から離して継代培養し、３％スクロース、０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジフコバクト寒天、１０μＭ ２，４−Ｄおよび０．０１μＭ ＢＡを含有するムラシゲとスコーグ培地で培養を継続した。増殖カルスを２週間間隔で同じ組成の新鮮培地に継続して継代培養した。移動間の長い間隔により、２週間と３週間との間でカルス健常性における突然の低下が生じた。カルス増殖は、２週間の継代培養スケジュールを維持すると成長力を失うことなく継続した。
【０１１７】
実施例７
３つの異なる基礎培地、ムラシゲとスコーグ、シェンクとヒルデブラント、およびガムボルグＢ５（ガムボルグら、In Vitro 12, 473 (1976)）を試験し、イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３のカルス誘導の相対的有効性を比較した。
【０１１８】
ウキクサ葉は、１％スクロースを含有する液体シェンクとヒルデブラント培地において、実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で２週間発育させた。カルス誘導については、３つの培地のそれぞれ５００ｍｌを３％スクロース、０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジフコバクト寒天、３０μＭ ２，４−Ｄおよび０．０１μＭ ＢＡで調製し、ｐＨ５．８に調節するとともに、３０分間１２１℃で加圧滅菌し、冷却するとともに、２０個の１００ｍｍｘ１５ｍｍのペトリ皿に混釈した。
【０１１９】
２つの複製、複製当たり１ペトリ皿および１ペトリ皿当たり葉５枚による３つの処置のランダムブロック実験計画を行った。カルス誘導については、５枚のウキクサ葉を培地の各プレート上の背軸側に配置した。各プレートを約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で２週間培養した。２週間後、ウキクサ組織を同じ種類の新鮮培地に移し、同じ温度と光培養条件下に培養を継続した。
【０１２０】
４週間の培養後にすべてのプレート上の組織のカルス増殖を評価した。ガムボルグＢ５で培養した葉は色が薄く、黄色の老化葉が存在した。明らかなカルス増殖は生じなかった。シェンクとヒルデブラント培地で培養した葉は濃い緑色で変状の葉を増殖し、明らかなカルス増殖は生じなかった。ムラシゲとスコーグ培地で培養したウキクサ葉は通常の３種類のカルス、すなわちＩ型カルス、ＩＩ型カルス、およびＩＩＩ型カルスを増殖した。
【０１２１】
Ｉ型カルスおよびＩＩＩ型カルスをオリジナルの葉から離して継代培養し、３％スクロース、０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジフコバクト寒天、１０μＭ ２，４−Ｄおよび０．０１μＭ ＢＡを含有するムラシゲとスコーグ培地で培養を継続した。増殖カルスを２週間間隔で同じ組成の新鮮培地に継続して継代培養した。移動間の長い間隔により、２週間と３週間との間でカルス健常性における突然の低下が生じた。カルス増殖は、２週間の継代培養スケジュールを維持すると成長力を失うことなく継続した。
【０１２２】
実施例８
４つの基礎培地、すなわちムラシゲとスコーグ（ＭＳ）、シェンクとヒルデブラント（ＳＨ）、ニッチュとニッチュ（ＮＮ）、およびガムボルグＢ５（Ｂ５）を用いて液体培地におけるイボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３のＩＩＩ型カルス増殖を支持するそれぞれの有効性を比較した。
【０１２３】
ウキクサ葉は、１％スクロースを含有する液体シェンクとヒルデブラント培地において、実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で２週間発育させた。カルス誘導については、３つの培地のそれぞれ５００ｍｌを３％スクロース、０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジフコバクト寒天、３０μＭ ２，４−Ｄおよび０．０１μＭ ＢＡで調製し、ｐＨ５．８に調節するとともに、３０分間１２１℃で加圧滅菌し、冷却するとともに、２０個の１００ｍｍｘ１５ｍｍのペトリ皿に混釈した。
【０１２４】
カルス誘導については、５枚のウキクサ葉を培地の各プレート上の背軸側に配置した。２０枚のプレートを約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で２週間培養した。２週間後、ウキクサ組織を同じ種類の新鮮培地に移し、同じ温度と光培養条件下に培養を継続した。
【０１２５】
４週間後、ＩＩ型カルス組織を用いて、カルス浮遊培養液の液体培地を接種した。浮遊カルス確立のために、４つの基礎培地、ＭＳ、ＳＨ、ＮＮ、およびＢ５のそれぞれ１００ｍｌを３％スクロース、１０μＭ ２，４−Ｄおよび０．０１μＭ ＢＡで調製した。それぞれの培地をｐＨ５．８に調節し、４つの２５ｍｌ部分標本を１２５ｍｌフラスコに配置するとともに、全１６フラスコの培地を１８分間１２１℃で加圧滅菌した。冷却後、各フラスコを１〜２の小部分のＩＩ型の破砕性の白色カルスを接種した。それぞれのフラスコをアルミフォイルで包むとともに、暗所で１００ｒｐｍで一定に振盪して２週間、２３℃下に培養した。
【０１２６】
２週間後にフラスコのカルス増殖を評価した。ムラシゲとスコーグ培地およびニッチュとニッチュ培地ではわずかな量の増殖が認められた。培地を変更せずにフラスコをさらに２週間培養し、さらにカルスの増殖は認められなかった。
【０１２７】
実施例９
ウキクサ科の遺伝的多様性を広範囲に代表する１５種にわたる３２のウキクサ株を用いて、イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３で開発されたカルス誘導のための方法および培地が全科にわたって補外する程度を測定した。
【０１２８】
ウキクサ葉は、１％スクロースを含有する液体シェンクとヒルデブラント培地において、実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で２週間発育させた。カルス誘導については、６つの基礎培地すなわち、ムラシゲとスコーグ、シェンクとヒルデブラント（シェンクとヒルデブラント、Can. J. Bot. 50, 199 (1972)）、ニッチュとニッチュ、Ｎ６（チュら、Scientia Sinica 18, 659 (1975)）、ガムボルグＢ５、およびホアグランドの培地を用いた。イボウキクサ（L. gibba）Ｇ３におけるカルス増殖を誘発することが知られている２つの植物増殖調節剤の組合わせ、すなわち３０μＭ ２，４−Ｄと０．０２μＭ ＢＡ、および５μＭ ２，４−Ｄと２μＭ ＢＡを用いた。各株のために、それぞれの２００ｍｌの基礎培地を３％スクロース、０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジフコバクト寒天で調製した。２００ｍｌを２個の１００ｍｌ部分に分け、使用すべきそれぞれを２つの植物増殖調節剤濃度に調製した。全培地のｐＨは５．８に調整し、３０分間１２１℃で加圧滅菌し、冷却するとともに、４個の１００ｍｍｘ１５ｍｍのペトリ皿に混釈した。
【０１２９】
６培地ｘ２植物増殖調節剤の組合せ、１２処置のランダムブロック実験計画を用いて各ウキクサ株を試験した。この計画は、複製当たり１個のペトリ皿とペトリ皿当たり６枚の葉で４回反復した。カルス誘導については、アオウキクサ（Lemna）、ウキクサ（Spirodela）およびウォルヒエラ（Wolfiella）種の大きな葉の６枚のウキクサ葉を培地の各プレート上の背軸側に配置した。ミジンコウキクサ内の株については、小さな葉の群ではなく、個々の葉のコーティングを技術的に阻止した小さな葉を実験単位として用いた。各プレートを約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で４〜５週間培養した。この時点で葉の一般的な健康状態（色：緑色〜黄色、および増殖の活力により判定）および３型すなわちＩ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型のカルス開始の頻度を評価した。
【０１３０】
結果は、カルス誘導培地に対する異なるウキクサ種の反応性にばらつきを示した。一般に、アオウキクサ（Lemna）属およびミジンコウキクサ（Wolffia）属の種および株が最も反応であった。イボウキクサ（Lemna gibba）の５株はすべて、５μＭ ２，４−Ｄおよび２μＭ ＢＡを含有するＭＳ、Ｂ５、およびＮ６培地上で異なる程度のカルス誘導を示した。レムナ・ミノール（Lemna minor）の両方の株は同じパターンに従い、イボウキクサ（Lemna gibba）株に対してより大きな程度のカルス誘導を示した。レムナ・ミニスキュラ（Lemna minisculla）の両方の株は高頻度のカルス誘導を示し、白色カルスの増殖がレムナ・ミノール（Lemna minor）またはイボウキクサ（Lemna gibba）とはわずかに異なっていた。レムナ・エクイノクチアリス（Lemna aequinoctialis）は、オーキシンの最高濃度で葉のカーリングと膨張を示したが、真カルス培養株の増殖は確認されず、使用したオーキシン濃度が十分に高くないことを示した。レムナ・ヴァルジヴィアーナ（Lemna valdiviana）はカルス誘導を示すことはなかった。ミジンコウキクサ種では、ウォルヒア・アルヒザ（Wollfia arrhiza[ミジンコウキクサ]）が５μＭ ２，４−Ｄおよび２μＭ ＢＡを含有するＢ５培地で少量のカルス増殖を示した。ウォルヒア・ブラジリエンシス（Wolffia brasiliensis）およびウォルヒア・コロンビナーナ（Wolffia columbinana）が５μＭ ２，４−Ｄおよび２μＭ ＢＡを補充したホアグランド培地でカルス誘導を示した。残りのミジンコウキクサ種、ウォルヒア・オーストラリアーナ（Wollfia australiana）はカルス誘導を示しことはなかったが、葉は膨張とわずかに異常な増殖を示した。ウォルヒエラ種とウキクサ（Spirodela）種はカルス誘導を示すことはなかった。ウキクサ種の葉は高濃度の２，４−Ｄで生存することはなく、低濃度で十分に増殖した。この反応パターンはウキクサ種がアオウキクサ種やミジンコウキクサ種よりもオーキシンに対して感受性であるとともに、低いオーキシン濃度はその後の実験で用いてカルス形成を誘導するべきであるという解釈と一致している。
【０１３１】
表I
2009148286.tif 000002
実施例１０
４種類のオーキシン、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２，４−Ｄ、インドール酪酸（ＩＢＡ）およびジカンバについて、３種類の基礎培地すなわちＳＨ、ＭＳおよびＮ６でのイボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３の葉からのカルス誘導能を試験した。
【０１３２】
ウキクサ葉は、１％スクロースを含有する液体シェンクとヒルデブラント培地において、実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で２週間発育させた。カルス誘導については、３種類の培地すなわちムラシゲとスコーグ、シェンクとヒルデブラント、およびＮ６を試験した。サイトキニンとして１μＭの濃度でベンジルアデニンを用いた。オーキシン濃度はオーキシンの種類でばらつきがあった。比較的強いオーキシン、２，４−Ｄおよびジカンバの濃度は、０、１、５、１０および２０μＭであった。弱いオーキシン、ＮＡＡおよびＩＢＡの濃度は０、５、１０、２０および５０μＭであった。各用量反応実験では、２リットルの基礎培地をＢＡで調製し、ｐＨを５．８に調整した。容量は２０、１００ｍｌ部分の部分標本に分けた。これらの部分のそれぞれに適量のオーキシンを添加し、培地を０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジフコバクト寒天に調整した。培地を３０分間１２１℃で加圧滅菌し、冷却するとともに、４個の１００ｍｍｘ１５ｍｍのペトリ皿に混釈した。
【０１３３】
３培地ｘ４オーキシンｘ５濃度の組合せ、６０処置のランダムブロック実験計画を用いて各ウキクサ株を試験した。この計画は、複製当たり１個のペトリ皿とペトリ皿当たり５枚の葉で２回反復した。カルス誘導については、葉を培地の各プレート上の背軸側に配置した。各プレートを約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で５週間培養した。５週間後、それぞれオリジナルの葉から発するウキクサ組織の新鮮重量を測定し、これらの組織集団の誘導されたカルス数および生成されたカルス型について目視的に検査した。
【０１３４】
結果には多くのトレンドが確認された。まず、低濃度のオーキシンと弱いオーキシンが葉の増殖を促進する。この増殖はオーキシンなしの増殖度よりも大きい。葉が増殖中、カルス誘導頻度は低い。高濃度のオーキシンまたは強いオーキンでは、葉のカーリングと増殖の大きな低下が確認された。カルス形成は葉のカーリングと関係があった。オーキシンの種類（最大のカーリングから最小のカーリングまで）は次の順であった：２，４−Ｄ、ジカンバ、ＮＡＡおよびＩＢＡ。Ｎ６とＭＳはカルス形成を支持し、ＳＨは支持しなかった。Ｎ６はＭＳよりも大きな増殖を支持した。Ｎ６ではＭＳ培地よりもカルス形成を誘導するために高濃度のオーキシンを必要とした。緻密なＩ型カルス誘導について、２，４−Ｄ、ジカンバ、およびＮＡＡはすべて同程度のカルス形成をＭＳ培地で示し、Ｎ６培地では２，４−Ｄおよびジカンバのみがカルスを生成した。最大のカルス誘導は１０μＭ ＮＡＡを含有するＭＳ培地で確認された。
【０１３５】
実施例１１
４種類のサイトキニン、すなわちベンジルアデニン（ＢＡ）、キネチン、チジアズロン（ＴＤＺ）、および２−ｉＰについて、３種類の基礎培地すなわちＳＨ、ＭＳおよびＮ６でのイボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３の葉からのカルス誘導能を試験した。
【０１３６】
ウキクサ葉は、１％スクロースを含有する液体シェンクとヒルデブラント培地において、実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で２週間発育させた。カルス誘導については、３種類の培地すなわちムラシゲとスコーグ、シェンクとヒルデブラント、およびＮ６を試験した。オーキシンとしてとして２０μＭの濃度で２，４−Ｄを用いた。サイトキニン濃度は０、０．０５、０．１、０．５、１および５μＭであった。各用量反応実験では、２４００ｍｌの基礎培地を２，４−Ｄで調製し、ｐＨを５．８に調整した。容量は２０、１００ｍｌ部分の部分標本に分けた。これらの部分のそれぞれに適量のサイトキニンを添加し、培地を０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジフコバクト寒天に調整した。培地を３０分間１２１℃で加圧滅菌し、冷却するとともに、４個の１００ｍｍｘ１５ｍｍのペトリ皿に混釈した。
【０１３７】
３培地ｘ４サイトキニン種類ｘ６サイトキニン濃度の組合せ、７２処置のランダムブロック実験計画を用いて各ウキクサ株を試験した。この計画は、複製当たり１個のペトリ皿とペトリ皿当たり５枚の葉で２回反復した。カルス誘導については、葉を培地の各プレート上の背軸側に配置した。各プレートを約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で５週間培養した。５週間後、それぞれオリジナルの葉から発するウキクサ組織の新鮮重量を測定し、これらの組織集団の誘導されたカルス数および生成されたカルス型について目視的に検査した。
【０１３８】
結果には多くのトレンドが確認された。葉の増殖は２０μＭの２，４−Ｄ濃度が高すぎたため全処置にわたって生じることがなかった。葉のカーリングは全処置にわたって明らかであった。ＭＳとＮ６はカルス誘導を示し、ＭＳが明らかに勝っていた。ＳＨ培地ではカルス誘導が生じることはなかった。ＴＤＺは広範囲の濃度にわたってＭＳ培地で最大頻度のカルス誘導を示した。Ｉ型カルスとＩＩ型カルスの誘導間には釣合が存在する。Ｉ型カルス誘導が高いと、ＩＩ型カルス誘導は低い。
【０１３９】
実施例１２
コウキクサ（Lemna minor）株８７４４および８２６７が、イボウキクサ（Lemna gibba）株よりも大きなカルス誘導と急速なカルス増殖を示したため（実施例９および表１を参照）、Ｌ．ｍｉｏｒについてさらに培養条件の最適化を行った。カルス誘導について試験した変数には、ａ）基礎培地組成物のスクリーニング、ｂ）オーキシンの種類と濃度のスクリーニング、およびｃ）サイトキニンの種類と濃度のスクリーニングが含まれた。
【０１４０】
基礎培地スクリーニングでは、３種類の培地、すなわちシェンクとヒルデブラント、ムラシゲとスコーグ、およびフリック（Frick）により開発されたＦ培地（フリック、（1991）J. Plant Physiol. 137:397-401）を試験した。３つの実験で用いた保存葉は使用前に２週間、２４μＭ ２，４−Ｄおよび２μＭ ２ｉＰを補充したＦ培地で増殖させた。カルス誘導培地は実施例８の通り調製した。葉を分離し、根を切断するとともに、半分を誘導培地に配置する前に（フリックの方法に従い）強制的に濾過器に通し、残りの半分の葉をすべてコーティングした。葉は６週間、実施例８に示した条件下に培養し、６週間の時点で、カルス誘導の有無、カルスが増殖した程度、およびカルスの基礎形態について評価した。
【０１４１】
ムラシゲとスコーグ培地は両方のコウキクサ株で最良のカルス誘導を示した。シェンクとヒルデブラント培地ではカルスは生成されず、Ｆ培地でのカルス誘導は最小であった。コーティング前に強制的にふるいに通した葉にはカルス誘導に対する効果は認められなかった。
【０１４２】
オーキシンの種類と濃度の実験では、４種類のオーキンシ、すなわち２，４−Ｄ、ＮＡＡ、ＩＢＡおよびジカンバについて、それぞれ４種類の濃度すなわち２、５、１０および２０μＭで、コウキクサ株８７４４および８６２７からのカルス誘導能について試験した。使用した基礎培地はＭＳであり、培地および実験プロトコールは基本的に実施例１０に従った。実験で使用した葉は３種類の培養条件、すなわち１）植物増殖調節剤を含まないＳＨ培地、２）２４μＭ ２，４−Ｄおよび２μＭ ２−ｉＰを含むＦ培地、および３）２４μＭ ２，４−Ｄおよび２μＭ ２−ｉＰを含むＳＨ培地で、カルス誘導時のコーティング前に２週間増殖させた。葉を分離し、根を切断するとともに誘導培地でコーティングした。これらの葉を実施例８に示した条件下に６週間培養し、６週間の時点で、カルス誘導の有無、カルスが増殖した程度、およびカルスの基礎形態について評価した。
【０１４３】
カルス誘導は誘導オーキシンがＮＡＡまたはＩＢＡである処置のいずれでも確認されなかった。８７４４株について、５または１０μＭ濃度の２，４−Ｄ処置では豊富なカルス誘導が確認され、５μＭ ２，４−Ｄで最良の誘導を示した。
【０１４４】
カルス誘導はジカンバの最大濃度、２０μＭでも確認された。コウキクサ株８６２７については、２，４−Ｄおよびジカンバでもカルス誘導は確認されたが、低濃度では確認されなかった。２，４−Ｄでは、１および５μＭで最も豊富なカルス誘導が確認され、５μＭで最良の誘導を示した。カルス誘導のためのジカンバの有効な濃度は５および１０μＭであった。カルス誘導処置にかかわらず、カルス形成は植物増殖調節剤を含まないシェンクとヒルデブラント培地で予め増殖された葉からのみ生じた。
【０１４５】
サイトキニンの種類と濃度の実験では、４種類のサイトキニン、すなわちＢＡ、キネチン、２−ｉＰ、およびチジアルロンについて、それぞれ５種類の濃度すなわち０．０５、０．１、０．５、１および５μＭで、コウキクサ株８７４４および８６２７からのカルス誘導能について試験した。使用した基礎培地はＭＳであり、培地および実験プロトコールは基本的に実施例１１に従った。実験で使用した葉は３種類の培養条件、すなわち１）植物増殖調節剤を含まないＳＨ培地、２）２４μＭ ２，４−Ｄおよび２μＭ ２−ｉＰを含むＦ培地、および３）２４μＭ ２，４−Ｄおよび２μＭ ２−ｉＰを含むＳＨ培地で、カルス誘導時のコーティング前に２週間増殖させた。葉を分離し、根を切断するとともに誘導培地でコーティングした。これらの葉を実施例８に示した条件下に６週間培養し、６週間の時点で、カルス誘導の有無、カルスが増殖した程度、およびカルスの基礎形態について評価した。
【０１４６】
８７４４株については、２−ｉＰまたはチジアズロンのいずれかで、それぞれ０．５または１μＭのいずれかで豊富なカルス誘導が確認された。カルス誘導培地でのコーティング前のＦ培地で増殖させた葉でのみカルス誘導が確認された。コウキクサ株８６２７についても、カルス誘導が２−ｉＰまたはチジアズロンのいずれかで確認されたが、０．１または０．５μＭの低濃度であった。この株では、０．５および１μＭでＢＡを用いてもカルス誘導が確認された。
【０１４７】
実施例１３
コウキクサ株８６２７および８６４４を用いてカルス増殖および長期確立に対する影響について基礎培地組成物を試験した。
【０１４８】
３種類の培地組成物、すなわちＭＳ、Ｆ培地および半強ＳＨを、健常なカルス増殖の維持能について試験した。全培地は３％スクロースを含有し、０．４％ジフコバクト寒天および０．１５％ゲルライトでゲル化した。ＭＳ培地は１μＭ ２，４−Ｄ、２μＭ ＢＡを補充し、半強ＳＨ培地は１μＭ ＢＡを補充するとともに、Ｆ培地は９μＭ ２，４−Ｄおよび１μＭ ２−ｉＰを補充した。実施例１２の通り以前のカルス誘導培地で増殖された株８７４４および株８６２７からのカルス培養株を実験のために使用した。カルスは２週間の継代培養期間で増殖させ、増殖、色および一般健康状態を評価した。
【０１４９】
コウキクサ株８７４４については、１μＭ ＢＡを補充した半強ＳＨがカルスの増殖および健康の維持で最良を示し、得られたカルスは組織化および変状の葉再生の区域を示した。この培地では緑色から薄い黄色の色の区域が存在した。ＭＳまたはＦ培地でカルスを培養すると、きわめて迅速に増殖し、新鮮重量は６日ごとに２倍になった。以上２種類の培地で増殖したカルスは、はるかに少ない組織化と葉の再生を示した。株８６２７については、基礎培地の効果はほとんどなく、カルス増殖は全３培地で同等に良好であった。株８７４４と同じく、１μＭ ＢＡで補充した半強ＳＨで増殖させると、カルスはより多くの組織化を示した。
【０１５０】
実施例１４
コウキクサ（lemna minor）はイボウキクサ（Lemna gibba）よりも大きなカルス誘導を示したため、葉の増殖速度およびタンパク質含量を除くすべてについて、さらに３種類のコウキクサ株の追加のスクリーニングを行い、コウキクサ８７４４および８６２７からのカルス誘導のプロトコールがこれら新しい株に補外できるかどうかを測定した。それぞれの株はコウキクサ（L. minor）７５０１、８６２６、および８７４５とした。
【０１５１】
以前の実施例で開発されたカルス誘導系は以下の通りであった。３％スクロース、５μＭ ２，４−Ｄおよび２μＭ ＢＡを補充するとともに、０．４％ジフコバクト寒天および０．１５％ゲルライトでゲル化したムラシゲとスコーグ培地をカルス誘導のために用いた。葉は植物増殖調節剤を避けた液体ＳＨ培地で増殖し、カルス誘導培地でコーティングする前に１％スクロースを補充した。葉をカルス誘導培地にコーティングし、５週間後にカルス誘導の相対頻度およびカルス増殖の相対速度を評価した。
【０１５２】
株８６２６および８７４５については、５週間の誘導期間中にカルス誘導は生じなかったが、その後の培養により低頻度のカルス増殖が得られた。株８６２６および８７４５からのカルスの形態および色は、８７４４および８６２７から増殖したものと変わりはなく、カルス維持培地に移すと十分に増殖した。株７５０１は低頻度のカルス誘導を示し、カルスの形態は株８６２６および８７４５から生成されたものとほぼ同じであった。
【０１５３】
実施例１５
レムナ・ミニスキュラ（Lemna minuscula）は最初のスクリーニング時に有意なカルス誘導を示したため（実施例９参照）、レムナ・ミニスキュラ株６６００および６７４７でカルス誘導を反復した。カルス誘導培地は実施例１４に記載通りに調製するとともに葉を培養した。
【０１５４】
レムナ・ミニスキュラの両方の株、６６００および６７４７はきわめて高い頻度のカルス誘導を示し、事実上すべての葉からカルス増殖が認められた。カルス開始は、コーティング後２〜３週間に最初に確認されたカルスによりこれらの株で迅速に生じた。カルスの色は薄く、コウキクサ株８７４４または８６２７から生じたものよりも緩徐に増殖した（実施例１４参照）。
【０１５５】
実施例１６
以前の実施例に記載した調査に基づき、ウキクサ科におけるカルスの誘導および増殖の好ましい方法は以下の通りです。
【０１５６】
ウキクサ植物体からのカルスの誘導、増殖および葉の再生は、適切な培地およびカルスの形成、増殖および完全に分化された植物体への再組織化を促進する特異的な発生段階での植物増殖調節剤の種類および濃度の操作により達成される。典型的に、アオウキクサ属内の種については、カルス誘導の好ましい培地はＮ６とＭＳであり、最も好ましいのはＭＳである。葉はオーキシンとサイトキニンの存在下に培養され、好ましいオーキシンはＮＡＡと２，４−Ｄであるとともに好ましいサイトキニンはＢＡとＴＤＺである。これらの植物増殖調節剤の濃度葉広範囲にわたってばらつきがある。オーキシンについては、好ましい濃度は５〜２０μＭであり、最も好ましいのは５〜１０μＭであるとともに、サイトキニンについては、好ましい濃度は０．５〜５μＭであり、最も好ましいのは０．５〜１μＭである。葉は両方の植物増殖調節剤を含有する培地上で３〜５週間の誘導期間に培養され、この期間中にカルスが増殖する。
【０１５７】
カルス増殖については、好ましい培地はカルス誘導と同じであるが、オーキシン濃度は低下する。オーキシンの好ましい濃度は１〜５μＭであり、サイトキニンの好ましい濃度は０．５〜１μＭである。継代培養期間もカルス誘導で４〜５週間から長期カルス増殖で２週間まで削減される。カルス増殖は寒天、ゲルライト、または両方の組合せで、好ましい組合せは０．４％ジフコバクト寒天と０．１５％ゲルライトゲル化した固形培地または液体培地のいずれかで維持することができる。カルス培養はこの方法を用いた不定期間の健常な状態で維持することができる。
【０１５８】
実施例１７
ミジンコウキクサ（Wolffia）内の株はアオウキクサ（Lemna）内の株と同じようにカルス植物調節剤の濃度に対して反応する。したがって、選択したミジンコウキクサ株のカルス増殖能をさらに調査した。
【０１５９】
４種類のウォルヒア・アルヒザ株（Wolffia arrhiza）株、すなわち７２４６、８８５３、９０００、および９００６ならびに４種類のウォルヒア・ブラジリエンシス（Wolffia brasiliensis）、すなわち７３９３、７８５１、７５９１、および８３１９について、植物増殖調節剤に対するカルス増殖能を試験した。基礎培地は３％スクロース、５μＭ ２，４−Ｄ、それぞれ５μＭ ＢＡおよびキネチン、ならびに６５μＭ フェニルホウ酸を補充したＭＳを使用した。培養株をコーティングし、カルス誘導培地で５週間培養した後、カルス増殖について評価した。
【０１６０】
カルス増殖は試験したいずれの株からも５週間培養期間中に確認されなかった。しかし、ウォルヒア・アルヒザ８８５３、９０００、９００６およびウォルヒア・ブラジリエンシス７５８１を含めて前カルス誘導形態がいくつかの株で容易に確認された。これらの株では、葉の肥厚が明らかであり、カルス形成が明らかになる前の葉に反応が頻繁に確認され、使用したオーキシン濃度がカルス増殖を支持するには不十分であることを示している。
【０１６１】
形質転換：
この選択は実際の遺伝子導入に用いられる方法に属する実験をカバーする。３種類の選択、すなわち（１）遺伝子銃を用いた葉の形質転換、（２）ウキクサ葉を用いたアグロバクテリウム媒介形質転換、および（３）ウキクサカルスを用いたアグロバクテリウム媒介形質転換がある。葉の実験の形質転換を用いて実際の遺伝子導入に影響を及ぼすパラメータ、すなわち（ａ）細菌増殖、（ｂ）アセトシリンゴンの含有、（ｃ）細菌濃度、（ｄ）細菌の再懸濁溶液および浸透圧ショックの影響、（ｅ）葉とカルスのための共生培地、（ｆ）接種期間、（ｇ）葉とカルスのための共生培養時間、および（ｈ）共生培養時の光条件を最適化した。葉で開発されたプロトコールを適用し、最適化組織培養手順を用いて得られたカルス培養株を形質転換した。選択に採用されて再生により形質転換葉を得るのがこの形質転換カルスである。
【０１６２】
遺伝子銃媒介形質転換：
実施例１８
イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３の葉を微小担体衝撃法（microcarrier bombardment）の対象とし、外来遺伝子構成体の発現能を試験した。
【０１６３】
葉の増殖については、３％スクロースおよび８％寒天を補充した６０ｍｌの高塩培地（デ・フォッサード（De Fossard）、TISSUE CULTURE FOR PLANT PROPAGATORS 132-52 (1976)）を調製し、ｐＨを５．８に調整し、１２１℃で２０分間、加圧滅菌するとともに、これを用いて６個の６０ｍｍｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。１枚の葉を各ペトリ皿に接種した。この葉を約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で２週間培養した。
【０１６４】
衝撃法については、１．６μｍの金微小担体を調製し、プラスミドｐＲＴ９９からの遺伝子を、メーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の遺伝子銃プロトコールに従って、微小担体上に沈降した。プラスミド、ｐＲＴ９９（トップファーら（Topfer et al.）、Nucleic Acid Res. 16, 8725 (1988)）は、いずれもＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下にネオマイシンホスホトラスフェラーゼ遺伝子およびβグルクロニダーゼ遺伝子をコードする（ＧＵＳ； ジェファーソンら、EMBO J. 6, 3901 (1987)）。
【０１６５】
ウキクサ葉の背軸面を上向きにし、４種類のヘリウム圧力レベル、すなわち８００、６００、および４００ibs/sq.インチでＤＮＡコーティングした微小担体を衝撃した。ストンプ（Stomp）（『β−グルコロニダーゼの組織化学的局在』
、GUS PROTOCOLS所収 103-114 (S.R. Gallagher ed. 1991)）の方法に従い、基質として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−ｇｌｕｃ）を用いたＧＵＳのための組織化学的染色法を衝撃後２４時間に行った。ＧＵＳ陽性染色中心の頻度は衝撃に用いた圧力に直接比例し、ＧＵＳ発現細胞の最大数は８００ｐｓｉで認められ、頻度の範囲は４〜２０染色細胞／葉であった。全処置における衝撃法により半数を超す葉の破壊が生じた。
【０１６６】
実施例１９
イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３の葉を微小担体衝撃法の対象とし、外来遺伝子発現の頻度に対する微小担体サイズの影響を試験した。
【０１６７】
葉の増殖については、３％スクロースおよび８％寒天を補充した２００ｍｌの高塩培地を調製し、ｐＨを５．８に調整し、１２１℃で２０分間、加圧滅菌するとともに、これを用いて２０個の６０ｍｍｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。１枚の葉を各ペトリ皿に接種した。この葉を約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で２週間培養した。２種類の微小担体サイズ１．０および１．６μｍについて、デュポン社が製造したＰＤＳ−１０００／Ｈｅ遺伝子銃を用いて３種類のヘリウム圧力レベル、すなわち４００、８００、および１２００ｐｓｉで試験した。金の微小担体を調製し、プラスミドｐＲＴ９９からの遺伝子を、メーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の遺伝子銃プロトコールに従って、微小担体上に沈降した。
【０１６８】
衝撃したウキクサ葉をストンプ（『β−グルコロニダーゼの組織化学的局在』、GUS PROTOCOLS所収 103-114 (S.R. Gallagher ed. 1991)）の組織化学的染色法を用いて衝撃後２４時間のＧＵＳ発現について評価した。ＧＵＳ発現の最大頻度は１．６μｍの微小担体およびヘリウム圧力８００ｐｓｉで衝撃した葉に認められた。ＧＵＳ陽性事象の数は葉１枚当たり１〜２１の範囲であった。
【０１６９】
実施例２０
トランスジェニックウキクサ植物体は衝撃法（ballistic bombardment）により形質転換されたウキクサカルスから再生される。Ｉ型カルス培養株を以下の実施例４２に記載通りに増殖させる。典型的に、直径約２〜４ｍｍのウキクサカルス２０〜３０個をＭＳ培地（実施例４２に記載したＭＳ培地）上の衝撃区域にわたって均等に広げる。実施例１８および実施例１９に記載した通りに金粒子（直径１．６μＭ）および衝撃法（ヘリウム圧力８００ｐｓｉ）を用いる。衝撃法のためのＤＮＡは目的の遺伝子（例えば、ＧＵＳ、別のマーカー遺伝子、哺乳動物タンパク質をコードする遺伝子、または選択可能なマーカー遺伝子、例えば、ｎｐＩＩ（カナマイシン耐性）、ｈｐｔＩＩ（ヒグロマイシ耐性）、ｓｈ ｂｌｅ（ゾエシン耐性）、およびｂａｒ（ホスフィノトリシン耐性）のほか、遺伝子発現に必要な他の配列（例えば、プロモーター配列、末端配列）を含む発現プラスミドからなる。８００ｌｂｓ／ｓｑ．インチでの衝撃後、カルスを暗所で２日間（または必要に応じてさらに長く）培養した後、約３〜５μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度下に４〜６週間培養した。カルスを２週間ごとに新鮮培地に移し、衝撃後２〜４週間に選択可能剤を培地に添加した。耐性カルスの選択は、完全に耐性カルスが生じるまで８〜１６週間継続する。トランスジェニック葉および植物体の再生を実施例４２に記載した通りに行う。
【０１７０】
ウキクサ葉を用いたアグロバクテリウムによる形質転換： 
実施例２１
イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３のウキクサ葉を用いて、共生培養用の２種類の培地、シェンクとヒルデブラントおよびムラシゲとスコーグを用いたアグロバクテリウム・ツメファシエンスに対するウキクサの感受性を試験した。
【０１７１】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＴ６５６および非ビルレントＡ．ツメファシエンス株Ａ１３６を用いてウキクサ葉を培養した。株ＡＴ６５６はｐＴｉＢｏ５４２プラスミド上にｐＴｉＢｏ５４２ ｖｉｒ領域を含むＥＨＡ１０５株（フッドら（Hood et al.）、Transgenic Res. 2, 208 (1993)）から構成されている。Ｔ−ＤＮＡはバイナリープラスミド、ｐＣＮＬ５６（リら（Li et al.）、Pl. Mol. Biol. 20, 1037 (1992)）上に保持される。このバイナリープラスミドはｐＢＩＮ１９由来であり、ノパリンシンテアーゼプロモーターの制御下にネオマイシンホスホトラスフェラーゼ遺伝子とネオパリンシンテアーゼターミネーター、およびｍａｓ２’−ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下にβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子（ジャンセンとガードナー（Janssen and Gardner）、Plant Mol. Biol. 14, 61 (1989)）およびオクトピンシンテアーゼターミネーター保持するように改変されている。ＧＵＳコード領域は遺伝子のコード配列内にイントロンを含み、ＧＵＳの細菌発現を予防する（ヴァンキャニートら（Vancanneyt et al.）、Mol. Gen. Genet. 220, 245 (1990)）。Ａ１３６株は広範囲な宿主株、Ｃ５８由来である。Ｃ５８を３０℃以上の温度で増殖させると、アビルレントＡ１３６となるＴｉ−プラスミドを喪失する。これら２つの株、ＡＴ６５６とＡ１３６を、２８℃で１．６％寒天で固形化するとともに１００μＭアセトシリンゴンを補充したＡＢ最小培地（クリントンら（Clinton et al.）、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 71, 3672 (1974)）で一夜増殖させた。
【０１７２】
ウキクサ葉は、３％スクロースを含有する液体ホアグランド培地において、実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で２週間発育させた。共生培養のために、１％スクロースおよび０．６％寒天を含有するシェンクとヒルデブラント５００ｍｌを調製し、ｐＨを５．６に調節し、３０分間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。１％スクロースおよび０．６％寒天を含有するムラシゲとスコーグ培地５００ｍｌも調製し、ｐＨを５．８に調製し、３０分間１２１℃下に加圧滅菌するとともに冷却した。両方の培地にアセトシリンゴンの濾過滅菌溶液を最終培地濃度２０ｍｇ／Ｌまで添加した。２０個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に各冷却培地から注入した。各細菌株について、１個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿からの細菌を以下の溶液すなわち、ガムボルグＢ５塩、ムラシゲとスコーグビタミン、グリシン（８ｍｇ／Ｌ）、アスパラギン酸（２６６ｍｇ／Ｌ）、アルギニン（１７４ｍｇ／Ｌ）、グルタミン（８７６ｍｇ／Ｌ）、カサミノ酸（５００ｍｇ／Ｌ）、スクロース（６．８５％）、グルコース（３．６％）、およびアセトシリンゴン（２０ｍｇ／Ｌ）１００ｍｌ中に使用の少なくとも１時間前に再浮遊した（ヒエイら（Hiei et al.）、The Plant J. 6, 271 (1994)。この溶液を調製し、ｐＨを５．８に調整するとともに、細菌の添加前に濾過滅菌した。
【０１７３】
細菌株２ｘ共生培養培地２、複製５、複製当たりペトリ皿２およびペトリ皿当たり葉２０枚の全要因実験計画（全体で４処置）を用いた。接種のために、ウキクサ葉を細菌溶液に数分間浮遊した。共生培養のために、上述した通り葉をシェンクとヒルデブラント培地またはムラシゲとスコーグ培地のいずれかに移した。葉を約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で数日間培養した。次に葉をアセトシリンゴンが非存在であることを除き同じ組成の新鮮培地に移し、チメチン５００ｍｇ／Ｌおよび硫酸カナマイシンを培地に添加した。
【０１７４】
ストンプ（『β−グルコロニダーゼの組織化学的局在』、GUS PROTOCOLS所収 103-114 (S.R. Gallagher ed. 1991)）の方法に従い、ＧＵＳ活性の組織化学的染色を用いて、葉への遺伝子移入を確認した。Ａ１３６を接種した葉の染色を対照として行い、細菌接種された葉の内在ＧＵＳ活性を試験した。接種後１０日に行った染色は、共生培養に用いた基礎培地がＭＳまたはＳＨのいずれかに関係なく、Ａ１３６接種対照ではＧＵＳ染色を示さず、ＡＴ６５６を接種した葉の染色で高頻度を示した。元の接種葉の７０％を超える形質転換率が確認され、葉内部におけるＧＵＳ陽性細胞の存在を示した。
【０１７５】
実施例２２
イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３のウキクサ葉を用いて、共生培養後のＧＵＳ発現頻度に対する創傷の影響を測定した。
【０１７６】
ウキクサ葉は、１％スクロースを含有する液体シェンクとヒルデブラント培地において、実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で２週間増殖させた。共生培養のために、３％スクロースおよび０．６％寒天、２０μＭ ２，４−Ｄ、２μＭ ＢＡ、および２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンを含有するムラシゲとスコーグ培地１リットルを調製し、ｐＨを５．６に調節し、３０分間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。アセトシリンゴンの濾過滅菌溶液を最終培地濃度２０ｍｇ／Ｌまで添加した。４０個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に各冷却培地から注入した。
【０１７７】
接種のために、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＡＴ６５６株を用いるとともに、５０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンおよび２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンを含有するＡＢ最小培地（クリントンら（Clinton et al.）、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 71, 3672 (1974)）で２８℃下に一夜増殖させた。接種のために、実施例２１に記載した通り１００ｍｍｘ１５ｍｍペトリ皿１個からの細菌を再浮遊した。
【０１７８】
創傷処置２ｘ細菌接種２、複製５、複製当たりペトリ皿２およびペトリ皿当たり葉２０枚の全要因実験計画（全体で４処置）を用いた。創傷処置のために、ウキクサ葉の塊をＳＨ培地から湿った滅菌濾紙に移した。塊を個々の葉に分離し、葉の背軸面を上向きにするとともに、２つの方法、すなわち１）葉中心上を横に切断し、左から右ヘ隣接分裂領域を切断するか、または２）中心の両側を切断し、各分裂領域を縦に切断する方法の１つで葉を創傷した。細菌処置のために、両クラスの創傷葉を、１）再浮遊ＡＴ６５６または２）細菌を含まない再浮遊液に浮遊させた。接種のために、葉を１０〜３０分間浮遊させたままにした。
【０１７９】
共生培養のために、ウキクサ葉を細菌溶液に数分間浮遊した。共生培養のために、上述した通り葉を３％スクロースおよび０．６％寒天、２０μＭ ２，４−Ｄ、２μＭ ＢＡ、および２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンを含有するムラシゲとスコーグ培地に移した。葉を約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で４日間培養した。葉のサブサンプルをストンプ（Stomp）（『β−グルコロニダーゼの組織化学的局在』、GUS PROTOCOLS所収 103-114 (S.R. Gallagher ed. 1991)）の方法に従ってＧＵＳについて染色した。接種後４日の共生培養葉の染色は、創傷の方向がＧＵＳ染色による葉の頻度に影響を及ぼすことはなく、平均約７０％であることを示した。細菌を含まない細菌再浮遊溶液を接種した対照の創傷葉はＧＵＳ染色を示さなかった。分裂領域内の染色葉の数は平均約４０％であった。
【０１８０】
実施例２３
イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３のウキクサ葉を用いて、共生培養後のＧＵＳ発現頻度に対する細菌再浮遊培地における損傷葉の接種時間の影響を測定した。
【０１８１】
ウキクサ葉は、１％スクロースを含有する液体ホアグランド培地において、実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃下に、１２５ｍｌフラスコ中培地２５ｍｌ当たり約１２０葉の密度で増殖させた。共生培養のために、１％スクロースおよび０．６％寒天を含有するシェンクとヒルデブラント培地１５００ｍｌを調製し、ｐＨを５．６に調節し、３０分間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。アセトシリンゴンの濾過滅菌溶液を最終培地濃度２０ｍｇ／Ｌまで添加した。６０個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に各冷却培地から注入した。
【０１８２】
接種時間処置４、複製３、複製当たりペトリ皿５、およびペトリ当たり葉２５枚によるランダムブロック実験計画を用いた。接種のために、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＡＴ６５６株を用いるとともに、５０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンおよび２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンを含有するＡＢ最小培地で２８℃下に一夜増殖させた。接種のために、実施例２１に記載した通り１００ｍｍｘ１５ｍｍペトリ皿１個からの細菌を再浮遊した。
【０１８３】
接種のために、個々の葉を塊から分離し、それぞれの背軸面を上向きにするとともに分裂領域に滅菌メスで創傷し、細菌浮遊液に移すとともに、１５、３０、４５、または６０分間培養した。共生培養のために、上述した通り、ウキクサ葉をシェンクとヒルデブラント共生培地に移した。合計６０個のペトリ皿を約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で４日間培養した。各接種時間（１５、３０、４５、または６０分）からの共生培養葉のサブサンプルを共生培養の２、３および６日後に採取した。サブサンプル葉をストンプ（『β−グルコロニダーゼの組織化学的局在』、GUS PROTOCOLS所収 103-114 (S.R. Gallagher ed. 1991)）の手順に従ってＧＵＳ発現のために染色した。結果を表ＩＩに示す。
【０１８４】
表ＩＩ
2009148286.tif 000003
創傷幹端上のＧＵＳ染色は２日で明らかであったが、分裂領域内のＧＵＳ染色は共生培養２日では明らかではなかった。分裂染色は共生培養３日で最大であり、共生培養６日で減少した。細菌浮遊溶液でのウキクサ葉の接種時間は共生培養後の全体的ＧＵＳ発現の頻度に対する有意な影響を示すことはなかった。
【０１８５】
実施例２４
イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３のウキクサ葉を用いて、共生培養後のＧＵＳ発現頻度に対するアグロバクテリウム株および外来遺伝子構成物の影響を測定した。
【０１８６】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス株、すなわちＡＴ６５６およびＣ５８ｓＺ７０７ｐＢＩ１２１を用いた。Ｃ５８ｓＺ７０７ｐＢＩ１２１は、安全化された広域宿主範囲Ｃ５８株であり、ｐＢＩ１２１が導入されている。バイナリープラスミド、ｐＢＩ１２１はｐＢＩＮ１９由来であり、そのＴ−ＤＮＡはノパリンシンテターゼプロモーターおよびノパリンシンテターゼターミネーターの制御下にネオマイシンホスホトラスフェラーゼ遺伝子をコードするとともに、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよびオクトピンシンテターゼターミネーターの制御下にβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子をコードするβグルクロニダーゼ遺伝子をコードする。ＡＴ６５６を５０ｍｇ／Ｌで硫酸カナマイシン含有ＡＢ最小培地で画線するとともに、Ｃ５８ｓＺ７０７ｐＢＩ１２１を５００ｍｇ／Ｌでストレプトマイシン、５０ｍｇ／Ｌでスペクチノマイシンおよび５０ｍｇ／Ｌで硫酸カナマイシン含有ＡＢ最小培地で画線した。両方の細菌株を２８℃下に一夜増殖させた。
【０１８７】
ウキクサ葉は、１％スクロースを含有する液体ホアグランド培地において、実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で４週間増殖させた。共生培養のために、１％スクロースおよび０．６％寒天を含有するシェンクとヒルデブラント培地５００ｍｌを調製し、ｐＨを５．６に調節し、３０分間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。アセトシリンゴンの濾過滅菌溶液を最終培地濃度２０ｍｇ／Ｌまで添加した。２０個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に各冷却培地から注入した。
【０１８８】
２細菌株処置、２複製、複製当たり５ペトリ皿、および当たり２５枚の葉によるランダムブロック実験計画を用いた。接種のために、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＡＴ６５６株を用いるとともに、５０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンおよび２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンを含有するＡＢ最小培地で２８℃下に一夜増殖させた。接種のために、実施例２１に記載した通り各株のＡＢプレート１枚からの細菌を再浮遊した。
【０１８９】
接種のために、個々の葉を塊から分離し、それぞれの背軸面を上向きにするとともに分裂領域に滅菌メスで創傷し、細菌浮遊液に移すとともに、１５〜３０分間培養した。共生培養のために、上述した通り、ウキクサ葉をシェンクとヒルデブラント共生培地に移した。合計４０個のペトリ皿を約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で６日間培養した。葉のサブサンプルを共生培養６日で採取し、ＧＵＳ発現のために染色した。ＡＴ６５６では、採取したウキクサ葉塊１３中１２がＧＵＳ染色を示したが、分裂領域では確認されなかった。Ｃ５８ｓＺ７０７ｐＢＩ１２１では、すべてのウキクサ葉塊が広範囲わたる染色を示した。
【０１９０】
硫酸カナマイシンを含有する新鮮培地に移入後１週間の残りのすべての葉について培養を継続した。増殖葉はカナマイシンに対する３つの反応カテゴリーを示した。すなわち（１）細菌株ＡＴ６５６により最初に共生培養されたものから発した葉の約２０％がカナマイシン存在下に活発な増殖を示すとともに、細菌株Ｃ５８ｓＺ７０７ｐＢＩ１２１により最初に共生培養されたものから発した葉の約３０％がカナマイシン存在下に活発な増殖を示した、（２）葉の別の群が明らかに増殖せず、クロロフィルが漂白するとともに死滅しかけていた、（３）葉の中間群がカナマイシン存在下に相当の増殖するも葉が半分漂白し、カナマイシンに対する感受性を示した。ＧＵＳ染色の結果は、活性酵素が依然、最初に共生培養した葉に高頻度に存在することを示した。
【０１９１】
実施例２５
イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３のウキクサ葉を用いて、共生培養後のＧＵＳ発現頻度に対するアグロバクテリウム株、外来遺伝子構成物、および葉前処置の影響を測定した。
【０１９２】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス株、すなわちＡＴ６５６およびＥＨＡ１０１ｐＪＲ１を用いた。ＥＨＡ１０１ｐＪＲ１は、野生型株、Ｂｏ５４２の高ビルレンス領域を保持する安全化されたｐＴｉＢｏ５４２および強化されたアルコールデヒドロゲナーゼ１、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびＡＴ６５６と同じく構成されたβ−グルクロニダーゼ遺伝子を保持する小バイナリープラスミドを含有するバイナリーアグロバクテリウム・ツメファシエンス株である。これら２つの株を５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むジャガイモデキストロース寒天上で画線するとともに２８℃下に一夜増殖させた。
【０１９３】
ウキクサ葉は、増殖速度を増大するために十分な濃度の１０μＭインドール酢酸（ＩＡＡ）の使用不使用とともに１％スクロースを含有する液体シェンクとヒルデブラントで増殖させた。葉は実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃下、１２５ｍｌ中培地の２５ｍｌ部分標本内で増殖させた。共生培養のために、１％スクロースおよび０．６％寒天を含有するシェンクとヒルデブラント培地５００ｍｌを調製し、ｐＨを５．６に調節し、３０分間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。アセトシリンゴンの濾過滅菌溶液のほか、アセトシリンゴンおよびインドール酢酸を適切な最終培地濃度まで冷却培地に添加した。２０個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に冷却培地から注入した。
【０１９４】
細菌株処置２ｘ葉増殖培地２、複製５、複製当たりペトリ皿１、ペトリ皿当たり葉２０枚によるランダムブロック実験計画を用いた。接種のために、各株の細菌を実施例２１に記載通りに別個に再浮遊した。接種のために、個々の葉を塊から分離し、それぞれの背軸面を上向きにするとともに分裂領域に滅菌メスで創傷し、ＡＴ６５６またはＥＨＡ１０１ｐＪＲ１の細菌浮遊液に移すとともに、１０〜１５分間培養した。共生培養のために、上述した通り１０μＭインドール酢酸の使用不使用による１％スクロース、０．８％寒天および１００μＭアセトシリンゴンを含む固形シェンクとヒルデブラント培地に葉の背軸面を下向きにして移した。
【０１９５】
葉を約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で４日間共生培養した。４処置のそれぞれからのプレート２枚をＧＵＳについて染色した。表ＩＩＩにＧＵＳ染色の結果を示す。
【０１９６】
表ＩＩＩ
2009148286.tif 000004
ＩＡＡの存在または非存在に関係なく、ＥＨＡ１０１ｐＪＲ１と共生培養した葉はＧＵＳ発現を示す葉の頻度がはるかに低かった。培地におけるＩＡＡの影響がＩＡＡ含有培地で検出され、ＧＵＳ発現を示す共生培養葉が４８％であったのに対して、ＩＡＡを含まない培地で共生培養された葉では２０％であった。
【０１９７】
実施例２６
イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３のウキクサ葉を５つの異なる時間、すなわち１２．５、１８．５、４０．５、８２、および１１２時間、細菌株ＡＴ６５６と共生培養し、共生培養後のＧＵＳ発現頻度に対する共生時間の影響を試験した。
【０１９８】
ウキクサ葉は、１％スクロースおよび１０μＭインドール酢酸を含有する液体シェンクとヒルデブラントで実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃下に２週間増殖させた。共生培養のために、１％スクロース、０．８％寒天、１０μＭインドール酢酸、および２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンを含むシェンクとヒルデブラント７５０ｍｌを調製し、ｐＨを５．６に調節し、培地を３０分間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。アセトシリンゴンおよびインドール酢酸の濾過滅菌溶液を最終培地濃度まで添加した。３０個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に冷却培地から注入した。細菌株ＡＴ６５５をジャガイモデキストロース寒天上で画線するとともに２８℃下に一夜増殖させた。
【０１９９】
培養時間５、複製６、複製当たりペトリ皿１、ペトリ皿当たり葉６０枚によるランダムブロック実験計画を用いた。接種のために、細菌を実施例２１に記載通りに再浮遊した。接種のために、個々の葉を塊から分離し、それぞれの背軸面を上向きにするとともに分裂領域に滅菌メスで創傷した。次に葉を細菌再浮遊溶液に移すとともに約１０〜１５分間培養した。共生培養のために、上述した通り固形シェンクとヒルデブラント培地に葉の背軸面を下向きにして移した。葉を約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で４日間共生培養した。
【０２００】
適切な時間で、葉１０枚をペトリ皿から取出し（６サンプル）、ＧＵＳについて染色した。表ＩＶにＧＵＳ染色の結果を示す：
表ＩＶ
2009148286.tif 000005
共生培養時間葉ＧＵＳ発現を有する葉の頻度に対して有意な影響を示した。４０時間前にはＧＵＳ発現は検出不可能であった。３．５日（８２時間）でＧＵＳ発現は容易に検出可能であった。長い共生培養はウキクサ葉におけるＧＵＳ発現の頻度、強度、または組織関連パターンを有意に増大することはなかった。３．５〜４日が遺伝子導入の最大頻度を示す最短共生培養期間であると結論された。
【０２０１】
実施例２７
３種類の細菌培地、すなわちＡＢ最小、ジャガイモデキストロース、およびマニトールグルタミンルリアブロス上で増殖させたＡＴ６５６株の細菌を用いて、共生培養前にインドール酢酸の使用不使用により増殖されていたイボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３を明と暗の状態下に共生培養し、共生培養後のＧＵＳ発現に対するこれらの処置の影響を試験した。
【０２０２】
イボウキクサＧ３葉は、１２５ｍｌフラスコ中２５ｍｌ部分標本に１％スクロースを含有し、１０μＭインドール酢酸の使用不使用による液体シェンクとヒルデブラントで実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で２週間増殖させた。共生培養のために、１％スクロース、０．８％寒天、１０μＭインドール酢酸の使用不使用、および２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンを含むシェンクとヒルデブラント９００ｍｌを調製し、ｐＨを５．６に調節し、培地を３０分間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。アセトシリンゴンおよびインドール酢酸の濾過滅菌溶液を最終培地濃度まで添加した。３６個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に冷却培地から注入した。３種類の細菌培地、すなわち１）１．６％寒天を含有するＡＢ最小（ＡＢ）、１．６％寒天を含有するジフコジャガイモ培地（ＰＤＡ）、および１．６％寒天を含むマニトールグルタミン（ロベルツとケール（Roberts and Kerr）、Physiol. Plant Path. 4, 81 (1974）ルリアブロス培地（ＭＧＬ；ミラー（Miller）、EXPERIMENTS IN MOLECULAR GENETICS 433 (1972)）を調製し、２０分間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。硫酸カナマイシンおよびアセトシリンゴンの濾過滅菌溶液をそれぞれ最終培地濃度５０ｍｇ／Ｌおよび２０ｍｇ／Ｌまで冷却培地に添加した。これらの３つの培地でＡＴ６５６を画線するとともに２８℃下に一夜増殖させた。
【０２０３】
細菌培地３ｘ植物培地２ｘ光条件処置２（全体で１２処置）、複製３、複製当たりペトリ皿１、およびペトリ皿当たり葉２０〜２５枚による全要因実験計画を用いた。接種のために、各培地からの細菌を実施例２１に記載通りに再浮遊した。
【０２０４】
接種のために、個々の葉を塊から分離し、それぞれの背軸面を上向きにするとともに分裂領域に滅菌メスで創傷した。次に葉を細菌再浮遊溶液に移すとともに約１０〜１５分間培養した。培養後、上述した通りに固形シェンクとヒルデブラント共生培地に葉を移した。葉を約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で４日間共生培養し、光処置または暗処置のために完全な暗所に配置した。共生培養後、全葉をストンプ（『β−グルコロニダーゼの組織化学的局在』、GUS PROTOCOLS所収 103-114 (S.R. Gallagher ed. 1991)）の手順に従ってＧＵＳ発現のために染色した。表ＶはＧＵＳ染色の結果を示す：
表Ｖ
2009148286.tif 000006
細菌培地は共生培養４日後のＧＵＳ発現の頻度に対して有意な影響を示す。ＡＢ培地はＧＵＳ発現の最低頻度を示し、ＰＤＡは最高頻度を示した。接種前のインドール酢酸での葉の増殖は、共生培養後のＧＵＳ発現頻度を増大した。共生培養時の光の存在はインドール酢酸を使用せずに増殖させた葉を用いた処置における共生培養後のＧＵＳ発現頻度に有意な影響を及ぼすことはなかったが、暗所での共生培養は、インドール酢酸の存在下に増殖させた葉を用いた処置における共生培養後のＧＵＳ発現頻度を増大した。インドール酢酸を使用したシェンクとヒルデブラント培地で増殖させたウキクサ葉のＰＤＡおよびＭＧＬからの平均頻度葉、約１７％の分裂組織におけるＧＵＳ発現の頻度を示す。
【０２０５】
実施例２８
６回の共生培養および共生培養時の光の存在と非存在を、共生培養後のＧＵＳ発現に対する影響について検査した。
【０２０６】
イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３のウキクサ葉を１％スクロースおよび１０μＭインドール酢酸を含有するシェンクとヒルデブラントで実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で１７日間間増殖させた。共生培養のために、１％スクロース、１％寒天、１０μＭインドール酢酸、および２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンを含むシェンクとヒルデブラント１５０ｍｌを調製し、ｐＨを５．６に調整し、培地を３０分間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。アセトシリンゴンおよびインドール酢酸の濾過滅菌溶液を最終培地濃度まで添加した。この培地を用いて６個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。アグロバクテリウム・ツメファシエンスＡＴ６５６株を５０ｍｇ／Ｌおよび２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンでカナマイシンを含有するＡＢ最小培地で画線し、２３℃下に一夜増殖させた。
【０２０７】
培養時間６、複製６、複製当たりペトリ皿１、ペトリ皿当たり葉３０枚によるランダムブロック実験計画を用いた。接種のために、１ペトリ皿からの細菌を実施例２１に記載通りに再浮遊した。
【０２０８】
接種のために、個々の葉を塊から分離し、それぞれの背軸面を上向きにするとともに分裂領域に滅菌メスで創傷した。次に葉を細菌再浮遊溶液に移すとともに１０分間培養した。共生培養のために、上述した通りシェンクとヒルデブラント培地に移した。プレート３枚をアルミフォイルで包み、完全に暗くするとともに約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下２３℃下に６回、すなわち１３、２３、３６、４９、７３．５、および９３時間培養した。適切な時間の共生培養後、葉５枚をプレート６枚のそれぞれから取出す（暗サンプル３枚および明サンプル３枚）とともにストンプ（『β−グルコロニダーゼの組織化学的局在』、GUS PROTOCOLS所収 103-114 (S.R. Gallagher ed. 1991)）の手順に従ってＧＵＳ発現のために染色した。
【０２０９】
結果は、ＧＵＳ発現が共生培養後２３時間で明らかとなり、幹の破損端でのみ発現が検出されることを示した。３６時間では、創傷を囲む細胞および幹の破損で端染色が検出された。染色は全体的に強かったが、染色強度は暗くして培養した葉でより大きかった。４９時間では、明処置に対して暗処置で染色強度および染色パターンの差が明らかであった。染色は暗くして培養した葉でより大きかったが、ＧＵＳ発現を示す葉の頻度および分裂領域を発現するＧＵＳの頻度は明と暗の処置間に有意差はなかった。７５．５時間では、創傷組織の染色が暗処置でより優勢であったことを除き、暗と明の処置間に有意差はなかった。９３時間では（約４日）、ＧＵＳ発現が最大数の分裂領域が検出され、暗処置は明らかに明処置よりも勝っていた。強い染色は依然として創傷細胞に認められた。
【０２１０】
実施例２９
イボウキクサＧ３の葉を用いて、共生培養後のＧＵＳ発現に対する細菌浮遊溶液、これらの溶液の浸透圧ポテンシャル、および葉創傷の影響を測定した。
【０２１１】
葉は、１％スクロースを含有する液体シェンクとヒルデブラントで実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で増殖させた。共生培養のために、１％スクロース、０．８％未洗浄水、および２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンを含むシェンクとヒルデブラント１８００ｍｌを調製し、ｐＨを５．６に調節し、培地を３０分間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。濾過滅菌溶液として熱不安定アセトシリンゴンを加熱滅菌した冷却培地に添加した。冷却培地を用いて７２個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。アグロバクテリウムＡＴ６５６株を５０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンを含有するＡＢ最小培地上で画線し、２８℃下に一夜増殖させた。
【０２１２】
細菌浮遊溶液１２ｘ創傷処置２（全体で２４処置）、複製３、複製当たりペトリ皿１、およびペトリ皿当たり葉２０枚による全要因実験計画を用いた。２種類の細菌浮遊溶液、すなわち１）ガムボルグＢ５塩、ムラシゲとスコーグビタミン、グリシン（８ｍｇ／Ｌ）、アスパラギン酸（２６６ｍｇ／Ｌ）、アルギニン（１７４ｍｇ／Ｌ）、グルタミン（８７６ｍｇ／Ｌ）、カサミノ酸（５００ｍｇ／Ｌ）、スクロース（６．８５％）、グルコース（３．６％）、およびアセトシリンゴン（２０ｍｇ／Ｌ）、および２）１％スクロースを含有するシェンクとヒルデブラント培地の組合を、それぞれ５種類のマニトール濃度、すなわち０、０．２、０．４、０．６および０．８Ｍで遺伝子導入におけるそれぞれの効果について試験した。また、２つの別の溶液、すなわち３）ガムボルグＢ５塩、ムラシゲとスコーグビタミン、グリシン（８ｍｇ／Ｌ）、アスパラギン酸（２６６ｍｇ／Ｌ）、アルギニン（１７４ｍｇ／Ｌ）、グルタミン（８７６ｍｇ／Ｌ）、カサミノ酸（５００ｍｇ／Ｌ）、スクロース（６．８５％）、グルコース（３．６％）、およびアセトシリンゴン（２０ｍｇ／Ｌ）、および４）スクロース（６．８５％）、グルコース（３．６％）、およびアセトシリンゴン（２０ｍｇ／Ｌ）を試験した。全細菌再浮遊溶液は使用前に濾過滅菌した。接種のために、ＡＢプレート１枚からの細菌を少なくとも使用１時間前に１２の再浮遊溶液のそれぞれ１００ｍｌ中に再浮遊した。
【０２１３】
接種前に葉を創傷することの重要性についても試験した。創傷葉または未創傷葉のいずれかについて、個々の葉をまず塊から分離した。創傷については、背軸面を上向きにするとともに分裂領域に滅菌メスで傷をつけた。未創傷葉は個々の葉に分離した後さらに処置した。
【０２１４】
接種のために、創傷６０および未創傷６０の葉１２０枚をそれぞれ１２の細菌再浮遊培地に１０分間浮遊させ、創傷葉は未創傷葉から分離して接種した。共生培養のために、上述した通りに固形シェンクとヒルデブラント培地に葉を移した。全処置を暗所で４日間共生培養した。共生培養の４日後、各処置のプレート２枚を無作為に取出すとともにＧＵＳ発現のために染色した。
【０２１５】
結果は、培地に関係なく、０．６マニトールが共生培養後のＧＵＳ発現の最高頻度を示すことを示した。単純なシェンクとヒルデブラント培地調製液はガムボルグＢ５塩を用いた複雑な培地と同じく良好な作用を示した。創傷は、統計的に有意ではないものの、ＧＵＳ発現を示す頻度の測定可能な増大を示し、分裂領域における染色頻度を増大することはなかった。
【０２１６】
実施例３０
イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３のウキクサ葉を用いて、共生培養後のＧＵＳ発現頻度に対する接種時の細菌濃度の影響を試験した。
【０２１７】
ウキクサ葉は、１％スクロースおよび１０μＭインドール酢酸を含有する液体シェンクとヒルデブラント培地において、約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃下に、１２５ｍｌフラスコ中２５ｍｌの部分標本内で使用前２週間増殖させた。共生培養のために、１％スクロース、１％寒天、２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴン、および１０μＭインドール酢酸を含むシェンクとヒルデブラント培地７５０ｌを調製し、ｐＨを５．６に調節し、３０分間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。アセトシリンゴンおよびインドール酢酸の濾過滅菌溶液を添加し、最終培地濃度を得た。冷却培地を用いて３０個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。アグロバクテリウム株ＡＴ６５６を１．６％ジフコバクト寒天、２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴン、および５０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンを含む半強ジフコジャガイモデキシトロース寒天−マニトールグルタミンルリアブロス培地で画線し、２８℃で一夜増殖させた。
【０２１８】
細菌濃度処置１０、複製３、複製当たりペトリ皿１、およびペトリ皿当たり個別の葉またはペトリ皿当たり植物２０塊によるランダムブロック実験計画を用いた。接種のために、１ペトリ皿からの細菌を実施例２１に記載した通り再浮遊した。この細菌溶液は「非希釈」サンプルを構成するとともに以下の希釈、すなわち、１／３、１０−１、１／３３、１０−２、１／３３３、１０−３、１／３３３３、１０−４、１０−５の一連の希釈シリーズの開始となった。１／３希釈は１．００６のＯＤ５４０ｎｍであり、これは約１．６ｘ１０９細菌／ｍｌに対応した。
【０２１９】
接種のために、個々の葉を塊から分離し、それぞれの背軸面を上向きにするとともに分裂領域に滅菌メスで創傷した。次に葉を１０種類の細菌再浮遊溶液濃度のそれぞれに移すとともに約１０〜１５分間培養した。共生培養のために、上述した通り、ウキクサ葉の背軸面を下向きにしてシェンクとヒルデブラント共生培地に移した。葉を暗くして２３℃下、４日間共生培養した。共生培養後、ストンプ（『β−グルコロニダーゼの組織化学的局在』、GUS PROTOCOLS所収 103-114 (S.R. Gallagher ed. 1991)）の手順に従いＧＵＳ発現のために染色した。
【０２２０】
結果は、ＧＵＳ発現の頻度が細菌濃度全体で１０倍変動することを示した。ＧＵＳ発現の最大頻度は試験した最高細菌濃度で確認された。１０−３を超える希釈ではＧＵＳ発現は検出されなかった。
【０２２１】
実施例３１
イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３のウキクサ葉を用いて、最適化形質転換プロトコールを用いたＧＵＳ発現に対する４種類の共生培養培地の影響を試験した。
【０２２２】
ウキクサ葉は、１％スクロースおよび１０μＭインドール酢酸を含有する液体シェンクとヒルデブラント培地において、約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃下に増殖させた。共生培養のために４種類の培地、すなわち１）２０μＭ ２，４−Ｄおよび０．１μＭ ＢＡを含むムラシゲとスコーグ培地（ＭＳ）（ＭＳ１）、２）２０μＭ ２，４−Ｄおよび１μＭ ＢＡを含むＭＳ培地（ＭＳ２）、３）２０μＭ ２，４−Ｄおよび２μＭ ＢＡを含むＭＳ培地（ＭＳ３）、および４）シェンクとヒルデブラント培地（ＳＨ）を用いた。各培地について、３％スクロース、０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジフコバクト寒天を含有する１００ｍｌを調製し、ｐＨを５．６に調節し、２０分間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。濾過滅菌アセトシリンゴン溶液を各冷却培地に添加し、最終培地濃度を２０ｍｇ／Ｌとした。各培地を用いて４個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。細菌株ＡＴ６５６を２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンおよび５０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンを含むジャガイモデキシトロース寒天上で画線し、２８℃で一夜増殖させた。
【０２２３】
培地処置４、複製４、複製当たりペトリ皿１、およびペトリ皿当たり葉２０枚によるランダムブロック実験計画を用いた。接種のために、１ペトリ皿からの細菌を使用前の１時間、ｐＨ５．６で０．６Ｍマニトールおよび２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンを含む濾過滅菌ＳＨ培地１００ｍｌ中に再浮遊した。接種のために、個々の葉を塊から分離し、再浮遊細菌に８〜１０分間浮遊した。共生培養のために、上述した通りに共生培地（ＭＳ１、ＭＳ２、ＭＳ３、ＳＨ）に移した。葉を暗くして２３℃下、４日間共生培養した。共生培養の４日後、全葉をＧＵＳ発現のために染色した。
【０２２４】
ＧＵＳ発現を示す葉の頻度は全処置にわたって８０〜９０％の範囲であった。共生培地はこの頻度に有意な影響を示さなかった。ＧＵＳ染色の強度は軽度ないし強度の範囲であった。染色は根先端、幹、幹の破損端および創傷、分裂領域、および葉縁に関連していた。
【０２２５】
実施例３２
アグロバクテリウムを用いた葉の形質転換は、接種前の葉の細胞分裂速度、アグロバクテリウムを増殖させる培地、アセトシリンゴンなど二次代謝産物を含む共生培養パラメータの最適化、アグロバクテリウムの濃度、接種液の浸透圧、共生培養の期間、および共生培養期間の光度の操作により達成される。
【０２２６】
これまでの実施例に述べた試験に基づき、葉の形質転換および選択の好ましい方法は以下の通りである。典型的に、葉は葉の増殖速度を増大するオーキシンを含有する培地で増殖させ、ＮＡＡ、ＩＢＡおよびＩＡＡが好ましいオーキシンであるとともに好ましい濃度は０．２〜１μＭの範囲である。アグロバクテリウムは高栄養補充物を含まず、アセトシリンゴンなどの二次代謝産物を含む培地で増殖され、好ましい培地としてはジャガイモデキシトロース寒天やマニトールグルタミンルリアブロスである。形質転換の頻度は接種液の組成により決定され、好ましい液体は０．６Ｍマニトールおよび１００μＭアセトシリンゴンを補充したＭＳまたはＳＨ基礎塩である。この接種液中に再浮遊されるアグロバクテリウムの濃度は形質転換の頻度に影響を及ぼし、好ましい濃度はおよそ１ｘ１０９細菌／ｍｌである。接種時間にはばらつきがあり、好ましい時間の範囲は２〜２０分のである。共生培養時間も形質転換の頻度に影響を及ぼし、３〜４日が好ましい時間である。共生培養は光または暗条件下に行うことができ、暗いこと（例えば、半暗光）が好ましい。
【０２２７】
形質転換葉の増殖も好ましい条件に依存する。ＭＳおよびＳＨが好ましい培地である。感染アグロバクテリウムからの葉の脱汚染化は、典型的に１００〜５００ｍｇ／Ｌの高濃度の適切な抗生物質を用いて行われ、好ましい方法は２〜４日ごとに抗生物質を含む新鮮培地に移動することである。好ましい範囲が１〜５μｍｏｌ／ｍ２・秒の低光度下の培養は、最初の休止／回復期間が３〜６週間が好ましい。
【０２２８】
選択剤の存在下の増殖による選択は異なる時点で開始することができ、好ましい時点は接種後１〜３週間である。低い光レベルおよび低い選択剤濃度での最初の選択も好ましく、１〜５μｍｏｌ／ｍ２・秒の光レベルおよび低濃度の範囲が特的薬剤の毒性試験から測定された選択剤に適している。硫酸カナマイシンの典型的な範囲は２〜１０ｍｇ／Ｌである。
【０２２９】
実施例３３
ウキクサ１０種内の株、すなわち、レムナ・トリスルカ（Lemna trisulca）７３１５、レムナ・ミノール（Lemna minor）７１０１、レムナ・ジャポニカ（Lemna japonica）７４２７、レムナ・ツリオニフェラ（Lemna turionifera）６６０１、イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３、レムナ・ヴァルジヴィアナ（Lemna valdiviana）７００２、レムナ・エクイノクティアリス（Lemna aequinocitalis）
７００１、レムナ・ミニスキュラ（Lemna miniscula）６７１１、レムナ・オブスキュラ（Lemna obscula）７３２５、およびスピロデラ・プンクタータ（Spirodela punctata）７３２７の葉について、イボウキクサＧ３で開発された形質転換プロトコールを用いた共生培養後のＧＵＳ発現を示す能力を試験した。
【０２３０】
イボウキクサＧ３を除く全ウキクサ株を、１２５ｍｌフラスコ中２５ｍｌの部分標本内で１％スクロースを含む液体シェンクとヒルデブラント培地で増殖させた。イボウキクサＧ３は１％スクロースおよび１０μＭインドール酢酸を含むシェンクとヒルデブラント培地で増殖させた。全ウキクサ培養株を約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下２３℃下で培養した。共生培養のために、１％スクロース、０．９％寒天、および２０ｍｇ／Ｌアセロシリゴンを含有するシェンクとヒルデブラント培地４００ｌを調製し、ｐＨを５．６に調節し、３０分間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。アセトシリンゴンおの濾過滅菌溶液を冷却培地に添加し、最終培地濃度を得た。冷却培地を用いて１０個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＴ６５６を２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンおよび５０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンを含有する半強マニトールグルタミンルリアブロス培地と混合した半強いジャガイモデキシトロース寒天で２８℃下一夜、画線した。
【０２３１】
ウキクサ株処置１０、複製１、複製当たりペトリ皿１、ペトリ皿当たり葉２０〜２５枚によるランダムブロック実験計画を用いた。接種のために、１ペトリ皿からの細菌を実施例２１に記載通りに再浮遊した。
【０２３２】
接種のために、個々の葉を塊から分離し、それぞれの背軸面を上向きにするとともに分裂領域に滅菌メスで創傷した。葉を細菌再浮遊溶液に移すとともに約１０分間培養した。共生培養のために、上述した通りシェンクとヒルデブラント培地に移すとともに２３℃下、暗くして４日間培養した。
【０２３３】
共生培養後、ＧＵＳ発現のために葉を染色した。試験した１０株中８株がイボウキクサ（L. gibba）Ｇ３と同一のパターンであるとともに１４％ないし８０％の範囲の頻度でＧＵＳ発現を示した。
【０２３４】
実施例３４
ウキクサ科（Lemnaceae）の４属からのウキクサ２０株をイボウキクサ（L. gibba）Ｇ３で開発された形質転換プロトコールを用いた共生培養後のＧＵＳ発現を示す能力を試験した。２０株は、ウォルヒエラ・リングタータ（Wolffiella lingulata）株８７４２および９１３７、Ｗｌ．ネオトロピカ（Wl. neotropica）株７２７９および８８４８、Ｗｌ．オブロガータ（Wl. oblogata）株８０３１および８７５１、ウォルヒア・アルヒザ（Wolffia arrhiza）株７２４６および９００６、Ｗａ．オーストラリアーナ（Wa. australiana）７３１７、Ｗ．ブラジリエンシス（Wa. brasiliensis）株７３９７、７５８１、および８９１９、Ｗａ．コロンビアーナ（Wa. columbiana）株７１２１および７９１８、スピロデラ・インターメジア（Spirodela intermedia）７１７８、Ｓ．ポリヒザ（S. polyrrhiza）株７９６０および８６５２、Ｓ．プンクタータ（S. punctata）株７４８８および７７７６、およびイボウキクサ（L. gibba）Ｇ３であった。
【０２３５】
全株を、１％スクロース、ｐＨ５．６を含む液体シェンクとヒルデブラント培地で実験前の２週間増殖させた。共生培養のために、１％スクロース、０．８％寒天、および２０ｍｇ／Ｌアセロシリゴンを含有するシェンクとヒルデブラント培地１，５００ｌを調製し、ｐＨを５．６に調節し、３０分間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。アセトシリンゴンの濾過滅菌溶液を冷却培地に添加し、最終培地濃度を得た。冷却培地を用いて６０個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。細菌株ＡＴ６５６を２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンおよび５０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンを含むジャガイモデキシトロース寒天で画線し、２８℃下一夜、増殖させた。接種のため、１ペトリ皿からの細菌を使用前の少なくとも１時間、ｐＨ５．６で０．６Ｍマニトールおよび２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンを含むシェンクとヒルデブラント培地に再浮遊した。
【０２３６】
ウキクサ株処置２０、複製３、複製当たりペトリ皿１、ペトリ皿当たり葉２０枚によるランダムブロック実験計画を用いた。スピロデラ株とウォルヒエラ株およびイボウキクサ（L. gibba）Ｇ３の個々の葉を塊から分離した。ウォルヒア株については、サイズが小さく個々の葉の分離が困難であるため塊として接種した。接種のために各ウキクサ株の葉を細菌浮遊溶液に２〜５分間浮遊した。共生培養のために、上述した通り固形シェンクとヒルデブラント培地に移した。スピロデラ株とウォルヒエラ株およびイボウキクサＧ３については、個々の葉をそれぞれ３個の複製皿に移し、ウォルヒア株については、２０の小さな葉塊をそれぞれ３個の複製プレートに移した。全株を暗くして２３℃下に４日間共生培養した。
【０２３７】
共生培養後、各株のプレート２枚をＧＵＳ発現のために染色した。染色結果は試験した１種以外のすべてと種内の大半のウキクサ株が共生培養後４日で相当のＧＵＳ発現を示すことを示した。試験した４つのウォルヒア種のうち、すべてが異なる頻度のＧＵＳ発現を示した。Ｗ．ブラジリエンシス株の３つは範囲５０〜７５％の最高頻度のＧＵＳ発現を示した。ウォルヒア属内の６株の全体にわたって、ＧＵＳ発現頻度は５〜１２％と低かった。３つのスピロデラ種のうち２つは１０および３５％のＧＵＳ発現を示し、３番目はＧＵＳ発現を示さなかった。陽性対照として用いたイボウキクサＧ３は約５０％のＧＵＳ発現頻度を示した。
【０２３８】
カルス培養株を用いたアグロバクテリウムによる形質転換：
実施例３５
イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３葉から生成されるＩ型カルスを用いて、イボウキクサ（L. gibba）Ｇ３葉で開発された最適化形質転換プロトコールを用いたＧＵＳ発現能を試験するとともに真空浸潤の影響を試験した。
【０２３９】
Ｉ型カルスは、３％スクロース、０．１５％ゲルライト、０．４％ジフコバクト寒天、５μＭ ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、および２μＭＢＡ（ＢＡ）を含有するムラシゲとスコーグ培地で葉を増殖することで生成された。カルス誘導およびその後の培養は、２３℃および約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗とした。カルス誘導の４週間後、Ｉ型カルス塊を個別に濃度を１μＭに低下した２，４−Ｄを含む同じ培地で培養した。実験用に十分なカルスが増殖するまで２週間ごとにカルスを新鮮培地に継代培養した。
【０２４０】
共生培養のために、３％スクロース、０．１５％ゲルライト、０．４％ジフコバクト寒天、１μＭ ２，４−Ｄ、および２μＭ ＢＡを含むムラシゲとスコーグ培地（ＭＳ）４００ｍｌを調製し、ｐＨを５．６に調整し、１２１℃下に２０分間加圧滅菌するとともに冷却した。アセトシリンゴンの濾過滅菌溶液を冷却培地に添加し、最終培地濃度を２０ｍｇ／Ｌとした。冷却培地を用いて１６個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。細菌株ＡＴ６５６を２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンおよび５０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンを含むジャガイモデキシトロース寒天で画線し、２８℃下一夜、増殖させた。
【０２４１】
真空浸潤処置２、複製４、複製当たりペトリ皿１、ペトリ皿当たりカルス１０個によるランダムブロック実験計画を用いた。接種のために、ｐＨ５．６で０．６Ｍマニトールおよび２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンを含有する濾過滅菌したシェンクとヒルデブラント培地に使用前の少なくとも１時間、細菌を再浮遊した。細菌による接種は真空浸潤の使用不使用で行った。真空浸潤を使用しない場合は、少数のＩ型カルスを細菌溶液に１０分間配置し、ブロッティングするとともに、上述した通りＭＳ共生培地に移した。真空浸潤を使用する場合は、カルスを細菌溶液に配置し、１０インチマーキュリーの真空を１０分間かけ、カルスをブロッティングするとともにＭＳ共生培地に移した。全皿を２３℃で暗くして共生培養した。
【０２４２】
共生培養の４、６および９日後に、それぞれ約４０、２０および２０個のカルスをＧＵＳ発現のために染色した。結果は、ＧＵＳ発現を示すカルスの頻度が真空浸潤に対して変化せず、共生培養の期間によっても頻度が変化しないことを示した。全時点にわたって真空浸潤を使用しない場合、ＧＵＳ染色の範囲は２５〜７８％であり、真空浸潤をした場合の頻度は２５〜７４％の範囲であった。ＧＵＳ染色の強度は、濃いブルーから明るいブルーとばらつきがあり、処置との相関を示さなかった。
【０２４３】
実施例３６
４種類の共生培地について、アグロバクテリウム株ＡＴ６５６によるＩ型カルスの共生培養後のＧＵＳ発現頻度に対する影響を試験した。
【０２４４】
Ｉ型カルスは、３％スクロース、０．１５％ゲルライト、０．４％ジフコバクト寒天、５μＭ ２，４−Ｄ、および２μＭ ＢＡを含有するムラシゲとスコーグ培地で葉を増殖することで生成された。カルス誘導およびその後の培養は、２３℃および約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗とした。カルス誘導の４週間後、Ｉ型カルス塊を個別に濃度を１μＭに低下した２，４−Ｄを含む同じ培地で培養した。実験用に十分なカルスが増殖するまで２週間ごとにカルスを新鮮培地に継代培養した。
【０２４５】
共生培養のために、４種類の培地、すなわち、２０μＭ ２，４−Ｄおよび０．１μＭ ＢＡを含むムラシゲとスコーグ培地（ＭＳ）（ＭＳ１）、２０μＭ ２，４−Ｄおよび１μＭ ＢＡを含むＭＳ培地（ＭＳ２）、２０μＭ ２，４−Ｄおよび２μＭ ＢＡを含むＭＳ培地（ＭＳ３）、および植物増殖調節剤を含まないシェンクとヒルデブラント培地（ＳＨ）を試験した。３％スクロース、０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジフコバクト寒天を含有する各培地５０ミリリットルを調製し、ｐＨを５．６に調節し、２０分間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。濾過滅菌アセトシリンゴン溶液を各冷却培地に添加し、最終培地濃度を２０ｍｇ／Ｌとした。各培地を用いて２４個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。細菌株ＡＴ６５６を２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンおよび５０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンを含むジャガイモデキシトロース寒天上で画線し、２８℃で一夜増殖させた。
【０２４６】
共生培地処置２、複製２、複製当たりペトリ皿１、ペトリ皿当たりカルス２０個によるランダムブロック実験計画を用いた。接種のために、ｐＨ５．６で０．６Ｍマニトールおよび２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンを含有する濾過滅菌したＳＨ培地に使用前の少なくとも１時間、細菌を再浮遊した。接種のために、Ｉ型カルス細菌溶液に８分間配置し、ブロッティングするとともに、４種類の共生培地に移した。全プレートを２３℃で暗くして４日間共生培養した。共生培養後、全カルスをＧＵＳ発現のために、ストンプ（『β−グルコロニダーゼの組織化学的局在』、GUS PROTOCOLS所収 103-114 (S.R. Gallagher ed. 1991)）の手順に従い染色した。
【０２４７】
共生培地はＧＵＳ発現を死すカルスの頻度に対して有意な影響を示すことはなかった。全処置にわたって、ＧＵＳ発現頻度の範囲は７０〜８５％であった。ＧＵＳ発現の強度は濃いブルーから明るいブルーとばらつきがあった。
【０２４８】
実施例３７
２日と４日の２種類の共生培養期間について、アグロバクテリウム株ＡＴ６５６によるＩ型カルス共生培養後のＧＵＳ発現頻度に対する影響を試験した。
【０２４９】
Ｉ型カルスは、３％スクロース、０．１５％ゲルライト、０．４％ジフコバクト寒天、５μＭ ２，４−Ｄ、および２μＭ ＢＡを含有するムラシゲとスコーグ培地で葉を増殖することで生成された。カルス誘導およびその後の培養は、２３℃および約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗とした。カルス誘導の４週間後、Ｉ型カルス塊を個別に濃度を１μＭに低下した２，４−Ｄを含む同じ培地で培養した。実験用に十分なカルスが増殖するまで２週間ごとにカルスを新鮮培地に継代培養した。
【０２５０】
共生培養のために、３％スクロース、０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジフコバクト寒天、１μＭ ２，４−Ｄ、および２μＭ ＢＡを含有する固形ムラシゲとスコーグ培地（ＭＳ）４００ｍｌを調製し、ｐＨを５．６に調節し、２０分間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。濾過滅菌アセトシリンゴン溶液を各冷却培地に添加し、最終培地濃度を２０ｍｇ／Ｌとした。各培地を用いて１６個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。アグロバクテリウム株ＡＴ６５６を２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンおよび５０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンを含むジャガイモデキシトロース寒天上で画線し、２８℃で一夜増殖させた。
【０２５１】
共生培養期間２、複製２、複製当たりペトリ皿４、ペトリ皿当たりカルス１０個によるランダムブロック実験計画を用いた。接種のために、ｐＨ５．６で０．６Ｍマニトールおよび２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンを含有する濾過滅菌したシェンクとヒルデブラント培地に使用前の少なくとも１時間、細菌を再浮遊した。接種のために、Ｉ型カルス細菌溶液に配置した。全プレートを２３℃で暗くして４日間共生培養した。２日または４日のいずれかの共生培養後、全カルスをＧＵＳ発現のために染色した。
【０２５２】
結果は、ＧＵＳ発現頻度が共生培養期間に対して変化しないことを示した。全処置にわたって、ＧＵＳ発現頻度の範囲は５０〜７０％であった。ＧＵＳ発現の強度は濃いブルーから明るいブルーとばらつきがあった。しかし、細菌の強い過剰増殖が共生培養の４日後に認められ、この細菌のコーティングがＧＵＳ染色を抑制することがわかった。
【０２５３】
実施例３８
異なる遺伝子構成物を用いて、別のアグロバクテリウム株、Ｃ５８ｓＺ７０７ｐＢＩ１２１によるＩ型カルス共生培養プロトコールの効果を試験した。
【０２５４】
Ｉ型カルスは、３％スクロース、０．１５％ゲルライト、０．４％ジフコバクト寒天、５μＭ ２，４−Ｄ、および２μＭ ＢＡを含有するムラシゲとスコーグ培地で葉を増殖することで生成された。カルス誘導およびその後の培養は、２３℃および約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗とした。カルス誘導の４週間後、Ｉ型カルス塊を個別に濃度を１μＭに低下した２，４−Ｄを含む同じ培地で培養した。実験用に十分なカルスが増殖するまで２週間ごとにカルスを新鮮培地に継代培養した。
【０２５５】
共生培養のために、３％スクロース、０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジフコバクト寒天、１μＭ ２，４−Ｄ、および２μＭ ＢＡを含有する固形ムラシゲとスコーグ培地（ＭＳ）４００ｍｌを調製し、ｐＨを５．６に調節し、２０分間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。濾過滅菌アセトシリンゴン溶液を各冷却培地に添加し、最終培地濃度を２０ｍｇ／Ｌとした。各培地を用いて１６個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。アグロバクテリウム株Ｃ５８ｓＺ７０７ｐＢＩ１２１を２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンおよび５００ｍｇ／Ｌ硫酸ストレプトマイシン、５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン、および５０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンを含むジャガイモデキシトロース寒天上で画線し、２８℃で一夜増殖させた。
【０２５６】
細菌株処置１、複製４、複製当たりペトリ皿４、ペトリ皿当たりカルス１０個によるランダムブロック実験計画を用いた。接種のために、１ペトリ皿からの細菌をｐＨ５．６で０．６Ｍマニトールおよび２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンを含有する濾過滅菌したシェンクとヒルデブラント培地に使用前の少なくとも１時間、細菌を再浮遊した。接種のために、Ｉ型カルス細菌溶液に８〜１０分間配置した。共生培養のために、カルスをブロッティングし、上述した通りＭＳ共生培地に移した。全カルスを暗くして２３℃で２日間共生培養した。共生培養後、カルス２個を複製当たりプレート１枚から選択し（全体で８個）、ＧＵＳ発現のために染色した。
【０２５７】
全個のカルスは濃いブルーから明るいブルーのＧＵＳ発現を示した。残りのカルスをＭＳ培地から最初の２週間はセホタキシム５００ｍｇ／Ｌ、その後はセホタキシムとカルベニシリンがそれぞれ５００ｍｇ／Ｌ含まれる同一のＭＳ培地に移し、細菌汚染された組織を除去した。全カルスを２週間間隔でセホタキシムとカルベニシリンを含む新鮮ＭＳ培地に移した。それぞれの移動時に、カルスのサブサンプルをＧＵＳ発現のために染色した。ＧＵＳ発現頻度はわずかに低下したが、相当のＧＵＳ発現を示す７０〜９５％と高いままであった。抗生物質培地に対するカルスの目視的検査では、培養の４週間後に細菌汚染は示されなかった。
【０２５８】
実施例３９
ＩＩ型カルスおよびＩＩＩ型カルスについて、アグロバクテリウム株ＡＴ６５６の存在下における共生培養後にＧＵＳ発現を示す能力を試験した。
【０２５９】
両型のカルスは、３％スクロース、０．１５％ゲルライト、０．４％ジフコバクト寒天、３０μＭ ２，４−Ｄ、および０．０２μＭ ＢＡを含有するムラシゲとスコーグ培地において、２３℃で約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗下にイボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３葉を培養することにより誘導された。４週間後、ＩＩ型カルスおよびＩＩＩ型カルスを元の葉から分離し、同じ温度と光条件下にカルスの維持のために３％スクロース、０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジフコバクト寒天、１０μＭ ２，４−Ｄ、および０．０１μＭ ＢＡを含有する固形ムラシゲとスコーグ培地に移した。実験用に十分なカルスが増殖するまで２週間ごとにカルスを新鮮培地に継代培養した。
【０２６０】
アグロバクテリウム株ＡＴ６５６を、２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンおよび５０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンを含むジャガイモデキシトロース寒天上で画線し、２８℃で一夜増殖させた。共生培養のために、３％スクロース、０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジフコバクト寒天、１０μＭ ２，４−Ｄ、および０．０１μＭ ＢＡを含むムラシゲとスコーグ培地（ＭＳ）２００ｍｌを調製し、ｐＨを５．６に調整し、２０分間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。濾過滅菌アセトシリンゴン溶液を各冷却培地に添加し、最終培地濃度を２０ｍｇ／Ｌとした。冷却培地を用いて８個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。
【０２６１】
カルス型処置２種類によるランダムブロック実験計画を用いた。ペトリ皿４枚に移した４０塊の緑色のカルス、およびペトリ皿４枚に移した９塊の白色のカルスを接種した。接種のために、ｐＨ５．６で０．６Ｍマニトールおよび２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンを含有する濾過滅菌したシェンクとヒルデブラント培地に使用前の少なくとも１時間、細菌を再浮遊した。接種のために、緑色のカルスおよび白色のカルスを細菌溶液に２〜５分間浸した。共生培養のために、カルスをブロッティングし、上述した通りＭＳ共生培地に塊として移した。全カルスを暗くして２３℃で２日間共生培養した。
【０２６２】
共生培養後、プレート当たり白色の全カルスおよび緑色のカルス３個を無作為に取出し、ＧＵＳ発現のために染色した。白色のカルス９塊のうち、７塊が異なる強度のＧＵＳ発現を示した。緑色のカルス１２塊のうち、６塊が異なる強度のＧＵＳ発現を示した。
【０２６３】
実施例４０
イボウキクサ（Lemna gibba）の２種類の迅速増殖株（株６８６１および７７８４）および（lemna minor）の１株から確立されたＩ型カルスをＡＴ６５６と共生培養し、イボウキクサＧ３を用いて確立されたプロトコールによる形質転換頻度を測定した。
【０２６４】
アグロバクテリウム株ＡＴ６５６を、２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンおよび５０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンを含むジャガイモデキシトロース寒天上で画線し、２８℃で一夜増殖させた。共生培養のために、３％スクロース、０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジフコバクト寒天、１０μＭ ２，４−Ｄ、および０．０１μＭ ＢＡを含むムラシゲとスコーグ培地（ＭＳ）２００ｍｌを調製し、ｐＨを５．６に調整し、２０分間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。濾過滅菌アセトシリンゴン溶液を各冷却培地に添加し、最終培地濃度を２０ｍｇ／Ｌとした。冷却培地を用いて８個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。
【０２６５】
接種のために、ｐＨ５．６で０．６Ｍマニトールおよび２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンを含有する濾過滅菌したシェンクとヒルデブラント培地に使用前の少なくとも１時間、細菌を再浮遊した。接種のために、３種類のウキクサ株およびイボウキクサ（陽性対照）からの約１０〜１５個のＩ型カルスを細菌溶液に２〜５分間浸した。共生培養のために、各カルスをブロッティングし、上述した通り共生培地のプレート２枚（各ウキクサ株用）に塊として移した。全カルスを暗くして２３℃で２日間共生培養した。
【０２６６】
共生培養後、２種類のイボウキクサ株の全カルスおよび（Lemna minor）株からの３個のカルスを無作為に取出すとともにＧＵＳ発現のために染色した。全部のカルスが共生培養後２週間にＧＵＳ染色細胞の多重小スポットを示し、成功した形質転換と一致した。
【０２６７】
葉を用いた選択：
実施例４１
イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３を用いて、ＧＵＳを発現するとともにカナマイシン選択培地で増殖する葉の救済にたいする３種類の共生培地の影響を試験した。
【０２６８】
葉は使用前に３日間、１％スクロース、および１０μＭインドール酢酸を含有する液体シェンクとヒルデブラント培地で増殖させた。細菌株、ＡＴ６５６を２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンおよび５０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンを含むジャガイモデキシトロース寒天上で、２８℃下に一夜増殖させた。共生培養のために、３種類の固形培地、すなわち１）３％スクロース、１％寒天、２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴン、および１０μＭインドール酢酸を含有するシェンクとヒルデブラント（ＳＨ）、２）３％スクロース、１％寒天、２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴン、および５０μＭ ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）を含有するムラシゲとスコーグ培地（ＭＳ）、および３）３％スクロース、１％寒天、５μＭ ２，４−Ｄ、１０μＭ ナフタレン酢酸、１０μＭ ジベレリン酸Ｇ３、および２μＭベンジルアデニンを含有するムラシゲとスコーグを用いた。培地を調製し、ｐＨを５．６（ＳＨ）または５．８（２種類のＭＳ）に調整し、加圧滅菌し、冷却し、濾過滅菌溶液として熱不安定成分アセトシリンゴン、インドール酢酸およびジベレリン酸を添加するとともに、培地を１００ｍｍｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。各培地のために、２０ペトリ皿（５００ｍｌ）を調製した。
【０２６９】
３種類の共生培地処置、複製４、複製当たりペトリ皿５、ペトリ皿当たり葉２０枚によるランダムブロック実験計画を用いた。接種のために、１ペトリ皿からの細菌を実施例２１に記載通りに再浮遊した。
【０２７０】
接種のために、個々の葉を塊から分離し、それぞれの背軸面を上向きにするとともに分裂領域に滅菌メスで創傷した。葉を細菌再浮遊溶液に移すとともに１０分間培養した。共生培養のために、上述した通り３種類の共生培地に葉を移すとともに２３℃下、暗くして５．５日間培養した。
【０２７１】
共生培養後、培地当たりペトリ皿２枚からの葉をＧＵＳ発現のために染色した。結果は、シェンクとヒルデブラント培地で共生培養された葉に広範囲に認められるが、ムラシゲとスコーグ培地での葉にはほとんど染色が認められないことを示した。各培地の他のプレート１８枚（１８プレートｘ３培地＝５４プレート）からの残りの葉を、アセトシリンゴンを含まず、チメジン５００ｍｇ／Ｌを含む同じ組成の固形と液体の培地に移した。プレート３枚からの葉を２５ｍｌの液体培地を含むフラスコ３つに移すとともに、２３℃で約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗下に増殖させた。固形培地のプレート１５枚の葉を２群、すなわち１）元のプレート１０枚からの葉を新しいプレート１２枚に移し、暗くして培養した（１２プレート）、２）元のプレート５枚からの葉を新しいプレート６枚に移し、５μｍｏｌ／ｍ２・秒未満の光半暗光下に培養した群に分けた。
【０２７２】
増殖の１１日後、葉のサブサンプルを採取し、ＧＵＳ発現のために染色した。結果は、光処置または培地処置に関係なく、ＧＵＳ発現が依然として存在することを示した。半暗光下に培養された葉はすべて培地に関係なく、最高強度のＧＵＳ発現を示した。暗くして培養した葉は中間レベルのＧＵＳ発現を示し、明るくして培養した葉はきわめて低いレベルを示した。シェンクとヒルデブラント培地で培養した葉は最高頻度のＧＵＳ陽性組織を示したが、新しく伸びる葉と関連していた。
【０２７３】
カルス誘導のために調製されたムラシゲとスコーグ培地では、染色パターンは単細胞およびきわめて小さい領域に限定されていた。２，４−Ｄ、ＮＡＡ、ＧＡ３およびＢＡを含むＭＳ培地での葉は、２，４−Ｄのみを含むＭＳ培地で培養された葉よりも強い染色を示した。カルス形成のために調整した植物増殖調節剤を含む両方のＭＳ基礎培地でのカルス形成は、暗い場合には生じなかったが、半暗光下に２，４−Ｄ、ＮＡＡ、ＧＡ３およびＢＡを含むＭＳ培地では開始していた。これらの結果に基づき、シェンクとヒルデブラント培地での葉は実験から除外した。暗くした場合のＭＳ培地での残りの葉をすべて半暗光条件に移して培養を継続した。全組織を同じ培地形成を維持したが、チメチンを含む新鮮培地に移すとともに半暗光条件下に約５週間培養を継続した。
【０２７４】
共生培養後７週間に残りの組織をすべて新鮮培地に移し、１０ｍｇ／Ｌ（組織の約２５％）または２ｍｇ／Ｌ（残りの組織の約７５％）のいずれかでカナマイシンを含めた。１週間後、両方のカナマイシン処置からの組織のサブサンプルをＧＵＳ発現のために染色した。３種類の染色、すなわち１）元の共生培養葉と関連した染色、２）Ｉ型カルスと関連した染色、および３）ＩＩ型カルスと関連した染色が存在した。カルス染色の頻度は高くなく、推定で約５〜８葉であり、共生培養された葉１００枚当たりのカナマイシン耐性培養株の上昇を示した。組織の培養および継代培養を半暗光下にさらに５週間継続した。
【０２７５】
１２週間の時点で、残った組織はすべて２，４−Ｄ、ＮＡＡ、ＧＡ３およびＢＡを含むＭＳ培地での培養株由来であった。この組織を１μＭ ２，４−Ｄ、２μＭ ＢＡ、０．１５ｇ／Ｌゲルライト、０．４ｇ／Ｌジフコバクト寒天、５００ｍｇ／Ｌチメチンおよび１０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンを含むムラシゲとスコーグ培地に移した。熱不安定成分を濾過滅菌し、加圧滅菌した冷却培地に添加した。それぞれ最初に共生培養した葉から増殖していた健常組織を別個のペトリ皿に移した。全組織を２３℃で培養するとともに、半暗光から全光度約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒および１６時間明／８時間暗光期間に変更した。この時点で組織の小サブサンプルをＧＵＳ発現のために染色し、結果はＩＩＩ型カルスと関連した低頻度のＧＵＳ染色を示した。２週間後の目視観察のより、全光への変更がカナマイシン感受性組織からのカナマイシン耐性カルスの分離を強化することが明らかとなった。全生存組織を新鮮培地に移すことにより、カナマイシン上でのカルスの増殖をさらに４週間継続し（全体で１６週まで）。
【０２７６】
共生培養後１６週間と２０週間との間で、カナマイシン耐性カルス系が確立した。これらの緻密なＩ型カルスおよびＩＩＩ型カルスは、明るくして１０ｍｇ／Ｌカナマイシン上での増殖により特徴づけられた。８つのカナマイシン耐性培養株が３６０の元の共生培養葉から増殖した。これら８つの系が発達したため、カルスのサブサンプルを０．５％スクロースを含有する半強シェンクとヒルデブラント培地に移し、葉を再生した。これら８つのうち、３つがカナマイシン非存在下に葉を再生し、葉の再生はカナマイシン存在下には生じないとみられる。これらの葉のうち染色した場合にＧＵＳ発現を示すものはなかった。
【０２７７】
カルス培養株の選択および形質転換葉の再生：
実施例４２
Ｉ型カルスについて、アグロバクテリウム株Ｃ５８ｓＺ７０７ｐＢＩ１２１存在下の共生培養後に示すＧＵＳ発現能および硫酸カナマイシン耐性能を試験した。
【０２７８】
Ｉ型カルスは、３％スクロース、０．１５％ゲルライト、０．４％ジフコバクト寒天、５μＭ ２，４−Ｄ、および２μＭ ＢＡを含有する固形ムラシゲとスコーグ培地において、イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３葉を増殖させることにより得られた。カルス誘導およびその後の培養は、２３℃下および約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗下とした。カルス誘導の４週間後、Ｉ型カルスを個別に２，４−Ｄ濃度を１μＭに低下させた同じ培地で培養した。このカルスを実験用に十分なカルスが増殖するまで２週間ごとに新鮮培地に継代培養した。
【０２７９】
共生培養のために、３％スクロース、０．１５％ゲルライト、０．４％ジフコバクト寒天、１μＭ ２，４−Ｄ、および２μＭ ＢＡを含む固形ムラシゲとスコーグ培地（ＭＳ）４００ｍｌを調製し、ｐＨを５．６に調整し、１２１℃下に２０分間加圧滅菌するとともに冷却した。アセトシリンゴンの濾過滅菌溶液を冷却培地に添加し、最終培地濃度を２０ｍｇ／Ｌとした。冷却培地を用いて２０個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。アグロバクテリウム株Ｃ５８ｓＺ７０７ｐＢＩ１２１を２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンおよび５００ｍｇ／Ｌストレプトマイシン、５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン、および５０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンを含むジャガイモデキシトロース寒天で画線し、２８℃下に一夜、増殖させた。
【０２８０】
細菌株処置１、複製１、複製当たりペトリ皿２０、ペトリ皿当たりカルス約１０個によるランダムブロック実験計画を用いた。接種のために、ｐＨ５．６で０．６Ｍマニトールおよび２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンを含有する濾過滅菌したシェンクとヒルデブラント培地に使用前の少なくとも１時間、細菌を再浮遊した。接種のために、Ｉ型カルス部分を細菌溶液に配置した。共生培養のために、このカルス部分を、上述したＭＳ共生培地に移した。全カルス部分を暗くして２３℃で２日間共生培養した。共生培養後、カルス部分のサブサンプルをＧＵＳ発現のために組織化学的に染色した。結果は、異なる強度の高頻度のＧＵＳ発現を示した。
【０２８１】
約２００の残りのカルス部分を脱汚染化培地に移した。脱汚染化のために、３％スクロース、０．１５％ゲルライト、０．４％ジフコバクト寒天、１μＭ ２，４−Ｄ、および２μＭ ＢＡを含む固形ＭＳ培地５００ｍｌを調製し、ｐＨを５．６に調整し、１２１℃下に２０分間加圧滅菌するとともに冷却した。セホタキシムを含有する濾過滅菌溶液を冷却培地に添加し、最終培地濃度を５００ｍｇ／Ｌとした。冷却培地を用いてプレート２０枚に注入した。それぞれ１０個のカルスを脱汚染化培地のペトリ皿２０枚に移した。全ペトリ皿を暗くして２３℃で培養した。週１回カルス部分を同一の新鮮培地に継代培養し、カルスを同じ条件下に培養した。５週の時点で、カルス組織の小サブサンプルをＧＵＳ発現のために染色した。発現は高頻度と異なる強度で存在した。
【０２８２】
５週の時点で、残りのカルス部分を選択培地に移した。選択のために、３％スクロース、０．１５％ゲルライト、０．４％ジフコバクト寒天、１μＭ ２，４−Ｄ、および２μＭ ＢＡを含む固形ＭＳ５００ｍｌを調製し、ｐＨを５．６に調整し、１２１℃下に２０分間加圧滅菌するとともに冷却した。セホタキシム、カルベニシリン、および硫酸カナマイシンを含有する濾過滅菌溶液を冷却培地に添加し、最終培地濃度をそれぞれ５００、５００および２ｍｇ／Ｌとした。冷却培地を用いてプレート２０枚に注入した。約９〜１０のカルス部分を選択培地のペトリ皿２０枚に移した。全カルスを約３〜５μｍｏｌ／ｍ２・秒の半暗光度の１６時間明／８時間暗下に２３℃で培養した。培養の１週間後、カナマイシン濃度を１０ｍｇ／Ｌに増大したのを除き同じ培地に移した。カルス培養を同じ培養条件下にさらに１週間継続し、組成が同一の新鮮培地に１回継代培養した。この２週間のカナマイシン選択期間の最後に、約２５％の元のカルス部分は健常なカルス増殖を示し、残りのカルスは衰えた。
【０２８３】
７週の時点で、６４個の最も健常なカルス部分を、３％スクロース、０．１５％ゲルライト、０．４％ジフコバクト寒天、１μＭ ２，４−Ｄ、２μＭ ＢＡ、５００ｍｇ／Ｌ、それぞれカルベニシリン、およびセホタキシム、４種類の濃度、すなわち１０、２０、４０、および８０ｍｇ／Ｌの硫酸カナマイシン含む固形ＭＳ培地に移した。１６０ｍｌの培地を調製し、ｐＨを５．６に調整し、加熱滅菌するとともに冷却した。熱不安定抗生物質の濾過滅菌溶液を添加して適切な濃度にした。次に冷却培地を用いて１６個の６０ｍｍｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。約４個のカルス部分を各プレートに移し、プレート４枚をそれぞれカナマイシン濃度で調製した（カナマイシン濃度当たりカルス部分１６個）。カルスの培養を半暗光下に２３℃で継続した。週１回の間隔で、それぞれのカナマイシン濃度から１枚のプレート４枚を４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の高光度に移した。９週の時点で、光条件に関係なく、全カルスを以前の継代培養と同一の組成の新鮮培地に移した。１２週まで、全カルスを４０μｍｏｌ／ｍ２・秒のよりも高い光度下においた。カルス培養をさらに４週間（１６週まで）継続し、２週間間隔で新鮮培地に継代培養した。
【０２８４】
１６週時点で、残りの健常カルスの小サブサンプルをＧＵＳ発現のために染色した。健常カルス部分のすべてがＧＵＳ発現を示し、カルス部分全体が非発現カルスからのＧＵＳ発現カルスの分離を示唆する均一の染色を示した。大部分のカルスはこの時点までに死滅していたが、１０％を超えるカルスは異なる程度の健常なカルス増殖を示した。３種類のカルス系、Ａ、ＢおよびＣが同一であり、培地に移して葉再生を促進させた。さらに選択培地でカルス部分を増殖させる継代培養時に、別の６つのカルス系、Ｄ−１が確認され、再生培地に移した。９系中８系が１０ｍｇ／Ｌカナマイシン含有培地で認められた。例外は、４０ｍｇ／Ｌカナマイシンで十分に増殖を示すＤ系であった。その後の継代培養時に、６つのカルス系、すなわちＡ、Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、およびＩが継続して増殖した。
【０２８５】
確認された９系中２系は、染色時にＧＵＳ発現陽性であり、カナマイシンの存在または非存在下に容易に増殖する葉を再生し続けた。再生のために、０．４％ジフコバクト寒天および０．１５％ゲルライトを含む１００ｍｌの蒸留水から水性寒天を調製し、ｐＨを５．６に調整するとともに、培地を１２１℃で１８分間加圧滅菌した。この培地を用いて１０個の６０ｍｍｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、およびＩ系からの小部分のカルスをそれぞれ培地の２個のペトリ皿に移した。このカルスを約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下２３℃下に培養した。水性寒天でのカルス培養を６週間継続し、２週間間隔で新鮮水性寒天に継代培養した。６週までに、全系からのカルスは黄色または茶色に変色していた。このカルスを６週の最後に、０．５％スクロースおよび０．８％ジフコバクト寒天（固形培地のみ）を含有する固形または液体のいずれかの半強シェンクとヒルデブラント培地に移した。４〜６週間後、カルスは厚い葉状構造物に分化した緑色の結節体を組織化していた。葉はカルス塊から検出できたため、それらの１％スクロースを含有する全強シェンクとヒルデブラント培地に移し、約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下２３℃下に培養した。これらの葉の増殖は液体ＳＨ培地では不明確であった。これらの葉はカナマイシンの存在または非存在でＳＨ培地で同等に十分増殖した。葉の漂白はカナマイシンの存在下には確認されなかった。葉のサブサンプルを周期的に採取し、ＧＵＳ発現のために染色した。すべての葉がＧＵＳ発現を示した。
【０２８６】
形質転換を確認するために、Ａ系およびＤ系から分離されたＤＮＡについてサザンハイブリダイゼイション分析を行った。ウキクサＤＮＡ調製液をドイルとドイルのＣＴＡＢ法（Doyle and Doyle）（Amer. J. of Botany 75, 1238 (1988)）を用いて形質転換されていないイボウキクサ（L. gibba）Ｇ３および形質転換されたＡ系とＤ系から調製した。分離ＤＮＡは制限酵素ＥｃｏＲ１およびＨｉｎｄ ＩＩＩ、および両方の酵素で消化され、フラグメントは０．７％アガロースゲルで電気泳動により分離された。このゲルをサムブロック（Sambrook）の方法に従ってナイロン膜にブロッティングした。サムブロックら、分子クローニング（MOLECULAR CLONING）：実験マニュアル（A LABORATORY MANYUAL）（１９８９）。プローブのために、ｐＢＩ１２１からのプラスミドＤＮＡをサムブロックのアルカリＳＤＳ法（同上）を用いて分離した。１２．８ｋｂプラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ１およびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、β−グルクロニダーゼ遺伝子からなる３．２ｋｂフラグメントおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む約９ｋｂフラグメントを生成した。両方のフラグメントは、アガロースゲルから分離され、Ｐｒｉｍｅ−ａ−Ｇｅｎｅキット（プロメガ（Promega））を用いたランダムプライミング法により同位体標識された。これらのプローブを用いて、形質転換されていないウキクサＤＮＡおよび形質転換されたＡ系または形質転換されたＤ系のいずれかのＤＮＡを保持するブロットでハイブリダイゼイションを行った。ハイブリダイゼイション反応はハイブリダイゼイションオーブンで一夜６５℃下に行った。膜を０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの厳重な条件下に洗浄した。次にブロットをＢＩＯＭＡＸ ＭＳフィルム（コダック）と接触させ、オートラジオグラフィに−７０℃で２日間曝露した。
【０２８７】
ハイブリダイゼイション実験結果は、ＧＵＳおよびＮＰＴＩＩハイブリッドＤＮＡがウキクサ系ＡおよびＤには存在するが、形質転換されていないウキクサからのＤＮＡには存在しないことを示した（図１に示したＤ系の結果）。形質転換ウキクサＤＮＡの二重消化は予想分子量でのハイブリダイゼイションを示した。単一消化はハイブリダイゼイションが予想されない分子量のＤＮＡフラグメントと関連していることを示し、ハイブリッドＤＮＡが細菌起源ではなく、植物ＤＮＡに消化されることを示した。標識ビルレンス領域プローブによる同じブロットのプロービングはハイブリダイゼイションの非存在を示し、陽性ＧＵＳおよびＮＰＴＩＩシグナルが植物由来であり、細菌起源ではないことを示した。
【０２８８】
実施例４３
Ｉ型カルスについて、アグロバクテリウム株Ｃ５８ｓＺ７０７ｐＢＩ１２１存在下の共生培養後に示すＧＵＳ発現能および硫酸カナマイシン耐性能を試験した
Ｉ型カルスは、３％スクロース、０．１５％ゲルライト、０．４％ジフコバクト寒天、５μＭ ２，４−Ｄ、および２μＭ ＢＡを含有する固形ムラシゲとスコーグ培地において、イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３葉を増殖させることにより得られた。カルス誘導およびその後の培養は、２３℃下および約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗下とした。カルス誘導の４週間後、Ｉ型カルスを個別に２，４−Ｄ濃度を１μＭに低下させた同じ培地で培養した。このカルスを実験用に十分なカルスが増殖するまで２週間ごとに新鮮培地に継代培養した。
【０２８９】
共生培養のために、３％スクロース、０．１５％ゲルライト、０．４％ジフコバクト寒天、１μＭ ２，４−Ｄ、および２μＭ ＢＡを含む固形ムラシゲとスコーグ培地（ＭＳ）７５０ｍｌを調製し、ｐＨを５．６に調整し、１２１℃下に２０分間加圧滅菌するとともに冷却した。アセトシリンゴンの濾過滅菌溶液を冷却培地に添加し、最終培地濃度を２０ｍｇ／Ｌとした。冷却培地を用いて３０個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。アグロバクテリウム株Ｃ５８ｓＺ７０７ｐＢＩ１２１を２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンおよび５００ｍｇ／Ｌストレプトマイシン、５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン、および５０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンを含むジャガイモデキシトロース寒天で画線し、２８℃下に一夜、増殖させた。
【０２９０】
細菌株処置１、複製１、複製当たりペトリ皿３０、ペトリ皿当たりカルス約５個によるランダムブロック実験計画を用いた。接種のために、ｐＨ５．８で０．６Ｍマニトールおよび２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンを含有する濾過滅菌したシェンクとヒルデブラント培地に使用前の少なくとも１時間、細菌を再浮遊した。接種のために、Ｉ型カルス部分を細菌溶液に配置した。共生培養のために、このカルス部分をブロッティングし、上述した通りＭＳ共生培地に移した。全カルス部分を暗くして２３℃で２日間共生培養した。共生培養後、カルス部分のサブサンプルをＧＵＳ発現のために組織化学的に染色した。結果は、異なる強度の高頻度のＧＵＳ発現を示した。
【０２９１】
約１５０の残りのカルス部分を脱汚染化培地に移した。脱汚染化のために、３％スクロース、０．１５％ゲルライト、０．４％ジフコバクト寒天、１μＭ ２，４−Ｄ、および２μＭ ＢＡを含む固形ＭＳ培地７５０ｍｌを調製し、ｐＨを５．８に調整し、１２１℃下に２０分間加圧滅菌するとともに冷却した。セホタキシムおよびカルベニシリンを含有する濾過滅菌溶液を冷却培地に添加し、それぞれ最終培地濃度を５００ｍｇ／Ｌとした。冷却培地を用いてプレート３０枚に注入した。約５個のカルスをそれぞれ脱汚染化培地のペトリ皿３０枚に移した。次にこのカルスを暗くして２３℃下に培養した。週１回カルス部分を同一の新鮮培地に継代培養し、カルスを同じ条件下に培養した。
【０２９２】
カナマイシン耐性カルス系の選択は５週で開始した。選択のために、３％スクロース、０．１５％ゲルライト、０．４％ジフコバクト寒天、１μＭ ２，４−Ｄ、および２μＭ ＢＡを含む固形ＭＳ７５０ｍｌを調製し、ｐＨを５．８に調整し、１２１℃下に２０分間加圧滅菌するとともに冷却した。セホタキシム、カルベニシリン、およびカナマイシンを含有する濾過滅菌溶液を冷却培地に添加し、最終培地濃度をそれぞれ５００ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、および２ｍｇ／Ｌとした。冷却培地を用いてプレート３０枚に注入した。約５個のカルスをそれぞれ選択培地のペトリ皿３０枚に移した。次にカルスを暗くして２３℃で培養した。
【０２９３】
６週目および７週目に、カナマイシン濃度を１０ｍｇ／Ｌに増大した同一の新鮮培地にカルスを移した。培養を２３℃で暗くして継続した。８週目の初めにカナマイシン濃度を増大した。組成が以前の継代培養のものと同一のムラシゲとスコーグ培地を半分はカナマイシン１０ｍｇ／Ｌを含有する培地ともう半分はカナマイシン４０ｍｇ／Ｌを含有する培地で調製した。約半分の残りのカルスを各カナマイシン濃度に移した。培養の光条件も変更した。全カルスを約３〜５μｍｏｌ／ｍ２・秒の半暗光度の１６時間明／８時間暗下に２３℃で培養した。カルスをこれらの培地および培養条件下に２週間維持した。半暗光レベルで２週間後、カルスを１０または４０ｍｇ／Ｌでカナマイシンを含有する同一の組成の新鮮培地に移し、光度を４０μｍｏｌ／ｍ２・秒に増大した。カルスを同一の培地および培養条件の２週継代培養方式で維持した。
【０２９４】
１２週まで、約１０％のカルスは健常のまま増殖し続けた。残った１５の増殖性カルス系のうち、半分は１０ｍｇ／Ｌ、残りは４０ｍｇ／Ｌのカナマイシンで増殖し続けた。６系からのカルスの小サブサンプルの組織化学的染色は、カルス部分の領域でＧＵＳ発現を示した。
【０２９５】
実施例４２の方法に従って葉を再生した。硫酸カナマイシンの存在下または非存在下で増殖させると葉の増殖は正常であり、葉の漂白は確認されなかった。葉は強度のＧＵＳ組織化学的染色も示した。サザンハイブリダイゼイション分析では、ＧＵＳ遺伝子およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の予想フラグメントのＤＮＡ配列の存在、およびｖｉｒ領域からのＤＮＡ配列の非存在が示された。実施例４２における通り適切な制限酵素分析を行い、結果は植物ゲノムへの外来遺伝子の組込みの所見と一致した。
【０２９６】
実施例４４
これまでの実施例に基づくと、アグロバクテリウムでウキクサカルスを形質転換した後、形質転換植物体の選択と再生には以下の方法が好ましい。全体として、コウキクサ（Lemna minor）が特に活発なカルス系であり、この種から形質転換植物体が容易に再生される。
【０２９７】
典型的に、カルス形質転換、選択、および葉再生は十分に確立された系に依存するとともに、方法の各ステップのために最適化された多くのパラメータに依存する。活発に増殖するカルス培養株は実施例１６に記載した通りに維持される。アグロバクテリウムは（適切な抗生物質および１００μＭアセトシリンゴンを含むジャガイモデキストロース寒天で）増殖され、好ましい再浮遊培地がＳＨよりもＭＳであることを除き、実施例３２の通りに再浮遊される。カルス部分は再浮遊細菌溶液中に最小３〜５分間浸けることで接種し、ブロッティングして過剰な液体を除去するとともに、最適化されたオーキシンおよびサイトキニンを補充したＭＳからなる共生培地上にコーティングし、カルス増殖および１００μＭアセトシリンゴンを促進する。接種されたカルスは暗くして２日間培養する。
【０２９８】
共生培養後、抗生物質を含有する新鮮培地にカルスを移し、アグロバクテリウムの感染から培養株を脱汚染化する。好ましい培地は、０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジフコバクト寒天および抗生物質でゲル化した、３％スクロース、０．１５％ゲルライト、０．４％ジフコバクト寒天、１μＭ ２，４−Ｄ、および２μＭ ＢＡを含むＭＳである。３〜５μｍｏｌ／ｍ２・秒の半暗光下にカルスを培養する。カルスを２〜５日、好ましくは３日ごとに同じ組成の新鮮培地に移す。総回復期間は２〜３週間、３〜６継代培養である。
【０２９９】
カルス選択は回復期間後に行う。１μＭ ２，４−Ｄ、２μＭ ＢＡ、３％スクロース、０．４％ジフコバクト寒天、０．１５％ゲルライト、および１０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンを補充したＭＳ培地にカルスを移す。３〜５μｍｏｌ／ｍ２・秒の半暗光下にカルスを培養し、２週間ごとに同じ組成の新鮮培地に移す。このようにしてカルスを４〜６週間維持する。次に同じ培地で４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の全光下にカルスを培養する。選択は、カルスが選択剤上で活発な増殖を示す場合に完全とみなす。
【０３００】
選択剤の存在下にカルス維持培地で活発な増殖を示すカルスを再生培地に移し、植物体を組織化するとともに、これを生成する。一般に、ウキクサは栄養分のない培地で再生する。コウキクサ（L. minor）では、これは１％スクロースを含む半強ＳＨ培地であり、イボウキクサ（L. gibba）では水性寒天である。典型的に、選択剤は再生培地には存在しない。カルスは全光下に再生培地上で葉が現れるまで２〜４週間培養される。完全に組織化された葉を１〜３％スクロースを含み、植物増殖調節剤を含まないＳＨ培地に移すとともに全光下にさらにクローン増殖のために培養する。
【０３０１】
実施例４５
光度および硫酸カナマイシン濃度の影響について、コウキクサ（Lemna minor）カルス培養株の形質転換頻度に対する影響を試験した。
【０３０２】
コウキクサ葉は、１％スクロースを含有する液体シェンクとヒルデブラント培地において、実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で２週間増殖させた。カルス誘導は、コウキクサ株８７４４からの葉を用いた実施例１４の通りに行った。３％スクロース、１μＭ ２，４−Ｄ、２μＭ ＢＡ、０．４％バクト寒天および０．１５％ゲルライトを含有するＭＳ培地で共生培養前１３週間カルスを維持した。この１３週間２週間ごとに新鮮培地にカルスを継代培養した。
【０３０３】
実施例２１に記載した通り、ＡＴ６５６株からのバイナリープラスミドを含有するＴ−ＤＮＡを保持するアグロバクテリウム株Ｃ５８ｓＺ７０７を、５０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシン、５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン、および５００ｍｇ／Ｌストレプトマイシンを含有するＰＤアグロバクテリウムで２８℃下に２日間増殖させた。共生培養のために、３％スクロース、１μＭ ２，４−Ｄ、２μＭ ＢＡ、０．４％バクト寒天、および０．１５ゲルライトを含む固形ＭＳ培地を調製し、ｐＨを５．６に調整し、培地を１２１℃で２０分間加圧滅菌するとともに、冷却した。アセトシリンゴンの濾過滅菌溶液を最終培地濃度１００ｍｇ／Ｌまで冷却培地に添加した。冷却培地を用いて８個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。
【０３０４】
接種のために、０．６Ｍマニトールおよび１００μＭアセトシリンゴン、ｐＨ５．６を含有する濾過滅菌ＭＳ培地に接種前の少なくとも１時間アグロバクテリウムを再浮遊した。接種のために、カルス２０個のバッチで２〜５分間、細菌溶液に約１６０個のＩ型カルスを浸けた。共生培養のために、カルス部分をブロッティングし、共生培養培地に塊として移し、１００ｍｍｘ１５ｍｍペトリ皿当たりカルス塊２０とした。全接種カルスを暗くして２３℃で２日間培養した。
【０３０５】
選択のために、１μＭ ２，４−Ｄ、１μＭ ＢＡ、３％スクロース、５００ｍｇ／Ｌカルベニシリン、５００ｍｇ／Ｌセホタキシム、１０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシン、０．４％バクト寒天および０．１５ゲルライトを含有するＭＳ培地２００ｍｌを調製し、ｐＨを５．６に調整し、培地を１２１℃で２０分間加圧滅菌するとともに、８個の１００ｍｍｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。注入直前に濾過滅菌溶液としての冷却加圧滅菌培地に抗生物質を添加した。共生培養カルス塊を新鮮選択培地に移し、ペトリ皿当たり２０カルス塊とした。８０個のカルス塊（４プレート）を５μｍｏｌ／ｍ２・秒未満の半暗光下に培養するとともに、他の８０個のカルス塊（４プレート）を４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の高光度に移した。３週間、抗生物質含有新鮮培地にカルスを週１回継代培養した。４週目に各光処置からの半分（４０カルス塊）のカルスを、カナマイシン濃度を１０ｍｇ／Ｌから４０ｍｇ／Ｌに増大した新鮮培地に移した。残りの４０個のカルス塊を１０ｍｇ／Ｌの元のカナマイシン濃度を維持する新鮮培地に移した。同一の半暗光または全光条件下およびカナマイシンの低濃度または高濃度下の培養をさらに２週間、週１回の継代培養を含めて培養を継続した。接種後６週目に、全サンプルを新鮮培地に移すとともに全光度下に培養した。この時点以降、継代培養を２週間間隔とした。
【０３０６】
カナマイシンでの培養１２週間後に、活発に増殖するカルスを新鮮再生培地に移した。葉再生培地の構成は１％スクロース、０．４％バクト寒天、および０．１５ゲルライトを含有する半強シェンクとヒルデブラント培地とした。カルス塊を２週間ごとに同じ組成の新鮮培地に移した。葉は再生培地への移動後３〜６週間にカルス塊から再生した。
【０３０７】
２つの形質転換されたクローン葉系がこの実験から再生した。両方の系はＧＵＳ組織化学的染色示し、基質としてメチルウンベリフェロン−グルクロン酸（ＭＵＧ）を用いた可溶性アッセイで測定された通り異なるレベルのＧＵＳ酵素活性（抽出可能なタンパク質の０．３１％と０．１４％）を示すとともに、酵素結合抗体免疫アッセイ（ELISA）を用いて測定される通り、検出可能なレベルのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ酵素を示した。サザンハイブリダイゼイション分析では高分子量のＤＮＡにおける外来ＤＮＡ配列の存在が確認され、これは適切な制限酵素で消化されると予想フラグメントサイズを示した。元のアグロバクテリウムのビルレンス領域を表すＤＮＡ配列を有するストリップトブロット（stripped blot）の再プロービングでは検出可能なハイブリダイゼイションは示されなかった。
【０３０８】
実施例４６
形質転換された葉の救済頻度のコウキクサ（Lemna minor）遺伝子型の影響を株８６２７からのコウキクサカルス培養株を用いて試験した。
【０３０９】
接種前のカルス維持、細菌株、接種のための細菌増殖、細菌再浮遊、カルス接種法、および暗くした２日間の共生培養は実施例４５の通り行った。
【０３１０】
共生培養後のカナマイシン選択のために、１μＭ ２，４−Ｄ、１μＭ ＢＡ、３％スクロース、５００ｍｇ／Ｌカルベニシリン、５００ｍｇ／Ｌセホタキシム、１０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシン、０．４％バクト寒天および０．１５ゲルライトを含有するＭＳ培地に１８０個のカルス塊を移した。全カルスを５μｍｏｌ／ｍ２・秒未満の半暗光下に培養した。接種後の第２週目に、カルスの半分をカナマイシン濃度を１０ｍｇ／Ｌから４０ｍｇ／Ｌに増大した新鮮選択培地に移し、残りは１０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有する新鮮培地に移した。週１回の継代培養を接種後５週まで継続し、この時点で継代培養を２週間ごとに行った。
【０３１１】
形質転換葉を再生するために、１２週間後にカナマイシンで活発に増殖するとともに組織化学的染色を用いてＧＵＳ発現を示すカルス系を１％スクロース、０．４％バクト寒天、および０．１５ゲルライトを含有する半強シェンクとヒルデブラント培地に移した。葉は再生培地で３〜４週間後に再生した。再生葉は１％スクロースを含むＳＨ培地で維持した。
【０３１２】
３つの形質転換されたクローン葉系がこの実験で再生した。全３系はＧＵＳ組織化学的染色示し、ＭＵＧアッセイで測定された通り異なるレベルのＧＵＳ酵素活性（抽出可能なタンパク質の０．２％〜０．３％）を示すとともに、酵素結合抗体免疫アッセイ（ELISA）を用いて測定された通りネオマイシンホスホトランスフェラーゼタンパク質の検出可能なレベルを示した。サザンハイブリダイゼイション分析を用いて、ウキクサＤＮＡへの外来ＤＮＡ配列の形質転換および組込みを確認した。
【０３１３】
実施例４７
コウキクサ（L. minor）カルス培養株からの葉再生に対する培地組成物の影響も試験した。７種類の培地調製液、すなわち（１）水性寒天、（２）１００μＭ硫酸アデニンを含む水性寒天、（３）１０μＭ ＢＡを含む水性寒天、（４）１０μＭ ＢＡおよび１μＭ ＩＢＡを含む水性寒天、（５）半強ＳＨ、（６）１０μＭ ＢＡを含む半強ＳＨ、および（７）１０μＭ ＢＡおよび１μＭ ＩＢＡを含む半強ＳＨを試験した。実施例１２の通りこれまでのカルス誘導培地で増殖した株８７４４および株８６２７からのカルス培養株をこの実験に用いた。カルスを７種類の培地で８週間培養し、葉の発生を継続的に観察した。
【０３１４】
葉再生は半強ＳＨ処置でのみ達成された。半強ＳＨに１０μＭ ＢＡのみを補充すると、カルス増殖は植物増殖調節剤を含まない半強ＳＨ上にコーティングした場合よりも迅速であったが、再生は半強ＳＨよりも長くかかった。培地へのＩＢＡの追加は、カルスの葉を再生する時機または能力に対する影響を示さなかった。
【０３１５】
実施例４８
哺乳動物の遺伝子発現のためのウキクサ系の有効性をヒトβ−ヘモグロビン遺伝子構成物およびＰ４５０オキシダーゼ構成物を用いて試験した。
【０３１６】
２つのアグロバクテリウム株を用いて、コウキクサ（Lemna minor）株８６２７のＩ型カルスを接種した。β−ヘモグロビン形質転換のために、３つのプラスミド、すなわち、ｐＧＶ３８５０、ｐＴＶＫ２９１、ｐＳＬＤ３４を保持する株Ｃ５８ Ｃ１を用いた。ｐＴＶＫ２９１はｐＴｉＢｏ５４２からの超ビルレンスＧ遺伝子を含む。ｐＳＬＤ３４は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下にネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、およびスーパーマック（super-mac）プロモーターにより駆動されるヒトβ−ヘモグロビンからなるｐＢＩＮ１９由来のアグロバクテリウムバイナリープラスミドである。
【０３１７】
Ｐ４５０オキシダーゼ形質転換のために、３つのプラスミド、すなわち、ｐＧＶ３８５０、ｐＴＶＫ２９１、ｐＳＬＤ３４を保持する株Ｃ５８ Ｃ１を用いた。Ｔ−ＤＮＡは、構造がｐＳＬＤ３４とほぼ同じであるバイナリープラスミド、ｐＳＬＤ３５に保持されるが、例外として、ｐＳ：Ｄ３５はβ−ヘモグロビン遺伝子を含まず、その代わりに３つのタンパク質、すなわちヒトＰ４５０オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、およびシトクロムＢ５をコードするＤＮＡ配列を含む。それぞれの遺伝子はスーパーマックプロモーターにより駆動される。ｐＳＬＤ３５プラスミドはヒグロマイシンおよびカナマイシン選択可能なマーカー遺伝子を含む。
【０３１８】
細菌株２種類ｘ早期選択時の光度２種類ｘ選択実験計画時（全体で８処置）のカナマイシン濃度２種類、複製３、複製当たりペトリ皿２、ペトリ皿当たり１０個のカルスの基礎実験計画によるいくつかの実験を行った。コウキクサ（Lemna minor）株８６２７と８７４４およびイボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３から得られたカナマイシン培養株をこれらの実験に使用した。接種前のカルス維持、細菌株、接種のための細菌増殖、細菌再浮遊、カルス接種法、および暗くした２日間の共生培養は実施例４５の通り行い、例外として、細菌は接種前に５０ｍｇ／Ｌカナマイシン、５０ｍｇ／Ｌゲンタマイシン、１００ｍｇ／Ｌカルベニシリン、および１００μＭアセトシリンゴンを含有するＰＤＡで増殖させた。
【０３１９】
共生培養後のカナマイシン選択のために、１μＭ ２，４−Ｄ、１μＭ ＢＡ、５００ｍｇ／Ｌカルベニシリン、および２種類の濃度、すなわち１０ｍｇ／Ｌおよび４０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有するＭＳ培地にカルス塊を移した。さらにカルス培養株を培養時にカルス部分をそれぞれカナマイシン濃度の半分ずつに分け、一方を半暗光に、もう一方を全光下に培養した。共生培養後の最初の４週間は週１回の間隔で同じ組成の新鮮培地にカルスを継代培養した。５週目から全培養株を全光度下にさらに６週間培養し、２週間ごとに新鮮培地に継代培養した。
【０３２０】
葉再生は、実施例４２および実施例４７に記載した通りに、イボウキクサ（L. gibba）Ｇ３またはコウキクサ（L. minor）からの葉再生のための適切な培地を用いて行った。葉は再生培地で３〜４週間後に再生した。再生葉は１％スクロースを含むＳＨ培地で維持した。
【０３２１】
実験全体で２０を超す形質転換クローン葉系が救済された。選択濃度として４０ｍｇ／Ｌに対して１０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを用いた方が多くの系が確認された。全系はカナマイシンで活発なカルス増殖を示し、酵素結合抗体免疫アッセイ（ELISA）を用いて測定される通り、検出可能でばらつきのあるレベルのネオマイシンホスホトランスフェラーゼタンパク質を示した。Ｐ４５０オキシダーゼおよびβ−ヘモグロビンＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質の存在は、それぞれ、サザン、ノーザンおよびウエスタンハイブリダイゼイションなど技術上周知の方法すべてによる安定に形質転換されたウキクサ植物体において検出される。
【０３２２】
本明細書中で言及された刊行物および特許出願のすべては、本発明が属する当業者のレベルを示している。すべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が参考として援用されることを特別にかつ個別に示された同じ程度に本明細書中で参考として援用される。
【０３２３】
上述の発明は理解を明確にする目的で図解および実施例により相当に詳細に述べられているが、添付した請求事項の範囲内で一部の変更や修正を実施することもできる。
【０３２４】
以下、本発明に関連する諸態様について記載する。
（態様１）
第１の態様として、目的のヌクレオチド配列によりウキクサを形質転換するための方法を提供し、前記ヌクレオチド配列（核酸）は選択剤に対する耐性を付与する遺伝子を含む少なくとも１つの発現カセットを含み、（ａ）ウキクサ標的組織を備え、ウキクサ組織の細胞は細胞壁を含有するステップと、（ｂ）細胞壁を穿刺し、組織の細胞内のヌクレオチド配列を析出するために十分な速度でウキクサ標的組織でのヌクレオチド配列を射出するステップとを含む方法であって、ヌクレオチド配列は微小発射体により運搬されるとともに、ヌクレオチド配列は組織での微小発射体を射出することにより組織で射出される方法を提供する。この方法は、形質転換した組織を選択剤で培養するステップをさらに含むものとしてもよく、形質転換したウキクサ植物体を再生するステップをさらに含むものとしてもよい。前記組織としては、カルス組織、分裂組織、葉組織とすることができる。また、ウキクサ組織としては、たとえばウキクサ（Spirodela）属、ミジンコウキクサ（Wolffia）属、ウォルヒエラ（Wolfiella）属、およびアオウキクサ（Lemna）属からなる群から選択可能である。あるいは、ウキクサ組織はレムナ・ミノール（Lemna minor）種、レムナ・ミニスキュラ（Lemna miniscula）種、およびイボウキクサ（Lemna gibba）種からなる群から選択することもできる。前記微小発射体は、例えば金属粒子を含むものが好ましく、約２分の１マイクロメーターないし約３マイクロメーターの直径を有するものが好ましい。また、複数の微小発射体を備え、各微小発射体はその上に固定されたヌクレオチド配列を有するとともに、各微小発射体は植物標的組織で射出されるものであってもよい。前記ヌクレオチド配列はインスリン、成長ホルモン、αインターフェロン、βグルコセレブロシダーゼ、網膜芽細胞腫タンパク質、ｐ５３タンパク質、アンジオスタチン、レプチン、および血清アルブミンからなる群から選択されるタンパク質又はペプチドをコード化するものとすることができる。あるいは、前記ヌクレオチド配列は多量体タンパク質の少なくとも１つのタンパク質又はペプチドサブユニットをコード化するものであってもよい。
（態様２）
第２の態様として、目的のヌクレオチド配列によりウキクサを形質転換するための方法を提供し、（ａ）ヌクレオチド配列を含むベクターであって、ヌクレオチド配列は選択剤に対する耐性を付与する遺伝子を含む少なくとも１つの発現カセットを含むベクターを含むアグロバクテリウムをウキクサ植物体組織に接種するステップと、（ｂ）アグロバクテリウムと組織を共生培養して形質転換組織を生成するステップとを含む方法を提供する。この方法は、アグロバクテリウムの増殖を抑制するために十分な抗生物質を含む培地で形質転換組織を培養するステップをさらに含むものとしてもよく、選択剤を含む培地で形質転換組織を培養するステップをさらに含むものとしてもよく、当該形質転換組織から形質転換ウキクサ植物体を再生するステップをさらに含むものであってもよい。前記組織としては、カルス組織、分裂組織、葉組織とすることができる。また、ウキクサ組織としては、たとえばウキクサ（Spirodela）属、ミジンコウキクサ（Wolffia）属、ウォルヒエラ（Wolfiella）属、およびアオウキクサ（Lemna）属からなる群から選択可能である。あるいは、ウキクサ組織はアオウキクサ（Lemna）属から選択されるものであってもよい。あるいは、ウキクサ組織はレムナ・ミノール（Lemna minor）種、レムナ・ミニスキュラ（Lemna miniscula）種、およびイボウキクサ（Lemna gibba）種からなる群から選択することもできる。なお、アグロバクテリウムとしては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、アグロバクテリウム・リゾゲネスを、ベクターとしては、スーパーバイナリーベクター、Ｃ５８由来ベクターが採用可能である。また、選択剤に対して耐性を付与する遺伝子はｎｅｏ，ｂａｒ，ｐａｔ，ＡＬＳ，ＨＰＨ，ＨＹＧ，ＥＰＳＰおよびＨｍ１からなる群から選択されるのが好ましい。また、前記ヌクレオチド配列は、２つの目的の遺伝子を含むものとしてもよい。ヌクレオチド配列は、例えば、インスリン、成長ホルモン、αインターフェロン、βグルコセレブロシダーゼ、網膜芽細胞腫タンパク質、ｐ５３タンパク質、アンジオスタチン、レプチン、および血清アルブミンからなる群から選択されるタンパク質又はペプチドをコード化するものであり、あるいは、ヘモグロビン、コラーゲン、Ｐ４５０オキシ
ダーゼ、およびモノクローン抗体からなる群から選択される多量体タンパク質の少なくとも１つのタンパク質又はペプチドサブユニットをコード化するものとしてもよい。
（態様３）
第３の態様として、本発明は電気穿孔法によりウキクサを形質転換する方法を提供する。
（態様４）
第４の態様として、本発明は上述した方法により生成される形質転換ウキクサ植物体および形質転換ウキクサ組織培養株を提供する。
（態様５）
第５の態様として、形質転換ウキクサ植物体を用いて組換えタンパク質またはペプチドを生成する形質転換ウキクサ植物体および方法を提供する。具体的には、組換えタンパク質又はペプチドを生成する方法において、（ａ）少なくとも１つの異種タンパク質又はペプチドを発現する形質転換ウキクサ植物体を培養するステップと、（ｂ）ウキクサ植物体から少なくとも１つのタンパク質又はペプチドを採集するステップとを含む方法を提供する。形質転換ウキクサ植物体は廃水で増殖されるものとしてもよく、多量体タンパク質（例えば、コラーゲン、ヘモグロビン、Ｐ４５０オキダーゼ、およびモノクローン抗体からなる群から選択される多量体タンパク質）のサブユニットすべてを発現するとともにアセンブルするものであってもよい。あるいは、前記形質転換ウキクサ植物体はバイオレアクタ管で増殖されるものとしてもよい。この方法により、１つの組換えタンパク質又はペプチドが生成され、好ましくは、少なくとも１つの異種タンパク質又はペプチドが治療的タンパク質又はペプチドである。また、少なくとも１つの異種タンパク質又はペプチドは、インスリン、成長ホルモン、αインターフェロン、βグルコセレブロシダーゼ、網膜芽細胞腫タンパク質、ｐ５３タンパク質、アンジオスタチン、レプチン、および血清アルブミンからなる群から選択されるのが好ましい。また、少なくとも１つの異種タンパク質又はペプチドは酵素であってもよい。前記ウキクサ植物体は、例えば、ウキクサ（Spirodela）属、ミジンコウキクサ（Wolffia）属、ウォルヒエラ（Wolfiella）属、およびアオウキクサ（Lemna）属からなる群から選択されるものである。あるいは、前記ウキクサ植物体はレムナ・ミノール（Lemna minor）種、レムナ・ミニスキュラ（Lemna miniscula）種、およびイボウキクサ（Lemna gibba）種からなる群から選択されるものであってもよい。好ましくは、少なくとも１つの異種タンパク質又はペプチドが、形質転換ウキクサ植物体から選択される。
（態様６）
第６の態様として、そのゲノムに組込まれた目的の異種核酸を含む形質転換ウキクサ植物体を提供する。前記目的の核酸はそのゲノムに組込まれたＴ−ＤＮＡ境界配列によりフランキングされているものとしてもよい。また、前記ウキクサ植物体は前記目的の異種核酸の５つより少ないコピーを含むものとしてもよい。前記ウキクサ植物体は、例えば、ウキクサ（Spirodela）属、ミジンコウキクサ（Wolffia）属、ウォルヒエラ（Wolfiella）属、およびアオウキクサ（Lemna）属からなる群から選択されるものである。あるいは、前記ウキクサ植物体はアオウキクサ（Lemna）属から選択されるものであってもよい。あるいは、前記ウキクサ植物体はレムナ・ミノール（Lemna minor）種、レムナ・ミニスキュラ（Lemna miniscula）種、およびイボウキクサ（Lemna gibba）種からなる群から選択されるものであってもよい。そのゲノムに組込まれたＴ−ＤＮＡ境界配列によりフランキングされている前記目的の異種核酸を含む形質転換ウキクサ植物体において、前記核酸は選択剤に対する耐性を付与する遺伝子を含む少なくとも１つの発現カセットを含むものとしてもよく、選択剤に対する耐性を付与する前記遺伝子が、ｎｅｏ，ｂａｒ，ｐａｔ，ＡＬＳ，ＨＰＨ，ＨＹＧ，ＥＰＳＯおよびＨｍｌであってもよい。また、前記核酸は２つの目的の遺伝子を含むものであってもよく、インスリン、成長ホルモン、αインターフェロン、βグルコセレブロシダーゼ、網膜芽細胞腫タンパク質、ｐ５３タンパク質、アンジオスタチン、レプチン、および血清アルブミンからなる群から選択されるタンパク質又はペプチドをコード化するものであってもよく、ヘモグロビン、コラーゲン、Ｐ４５０オキシダーゼ、およびモノクローン抗体からなる群から選択される多量体タンパク質の少なくとも１つのタンパク質又はペプチドサブユニットをコード化するものであってもよい。
【図１】
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