(57)【要約】【課題】  微生物の莢膜抗原等の糖鎖抗原に基づく抗原型を簡易に判別する技術を提供する。【解決手段】  微生物の莢膜抗原等の糖鎖抗原に基づく抗原型の判別にあたり、前記抗原型に関連付けられる複数の糖転移酵素遺伝子をそれぞれ標的とするプローブを含むプローブセットを準備し、これらのプローブと被験体から取得した試料核酸とを接触させ、前記プローブに対する核酸ハイブリダイゼーションを検出するようにする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物の糖鎖抗原に基づく抗原型の判別方法であって、
前記抗原型に関連付けられる複数の糖転移酵素遺伝子をそれぞれ標的とするプローブを含むプローブセットを準備する工程と、
前記プローブと被験体から取得した試料核酸とを接触させる工程と、
前記プローブに対する核酸ハイブリダイゼーションを検出する工程と、
を備える、判別方法。
【請求項２】
前記複数の糖転移酵素遺伝子は、糖鎖抗原合成遺伝子クラスターに含まれる、請求項１に記載の判別方法。
【請求項３】
前記プローブセットは、さらに、前記糖鎖抗原合成遺伝子クラスターに含まれる糖転移酵素遺伝子以外の遺伝子を標的とするプローブを含む、請求項１又は２に記載の判別方法。
【請求項４】
前記微生物は、肺炎球菌、レジオネラ菌、サルモネラ菌、大腸菌、赤痢菌、及びビブリオから選択される１種又は２種以上である、請求項１〜３のいずれかに記載の判別方法。
【請求項５】
前記微生物は肺炎球菌を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の判別方法。
【請求項６】
前記微生物はレジオネラ菌を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の判別方法。
【請求項７】
前記プローブセットは、前記微生物の糖鎖抗原合成遺伝子において前記抗原型に特異的な領域を標的とする抗原特異的プローブを含む、
請求項１〜５のいずれかに記載の判別方法。
【請求項８】
前記微生物は肺炎球菌を含み、前記プローブは、以下の配列（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択される、請求項１〜７に記載の判別方法。
（ａ）配列番号１〜２２２のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列
（ｂ）配列番号１〜２２２の配列又はこれらの相補配列のいずれか１つに対して塩基の欠失、置換もしくは付加がなされた変異配列からなり、前記プローブの機能を有する配列
【請求項９】
前記微生物はレジオネラ菌を含み、前記プローブは、以下の配列（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選択される、請求項１〜８に記載の判別方法。
（ｃ）配列番号２２３〜６７１のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列
（ｄ）配列番号２２３〜６７１の配列又はこれらの相補配列のいずれか１つに対して塩基の欠失、置換もしくは付加がなされた変異配列からなり、前記プローブの機能を有する配列
【請求項１０】
前記プローブセット準備工程は、固相担体上に複数の前記抗原型に対応する複数の前記プローブセットを保持するアレイを準備する工程である、請求項１〜９のいずれかに記載の判別方法。
【請求項１１】
固相担体と、
前記固相担体の表面に保持され、微生物の糖鎖抗原に基づく抗原型に関連付けられる複数の糖転移酵素遺伝子をそれぞれ標的とするプローブを含むプローブセットと、
を備える、アレイ。
【請求項１２】
前記複数の糖転移酵素遺伝子は、糖鎖抗原合成遺伝子クラスターに含まれる、請求項１１に記載のアレイ。
【請求項１３】
前記微生物は、肺炎球菌、レジオネラ菌、サルモネラ菌、大腸菌、赤痢菌、及びビブリオから選択される１種又は２種以上である、請求項１１又は１２に記載のアレイ。
【請求項１４】
前記微生物は肺炎球菌を含む、請求項１１〜１３のいずれかに記載のアレイ。
【請求項１５】
前記微生物はレジオネラ菌を含む、請求項１１〜１４のいずれかに記載のアレイ。
【請求項１６】
複数の前記抗原型に対応する複数の前記プローブセットを保持する、請求項１１〜１５のいずれかにアレイ。
【請求項１７】
前記プローブセットは、前記微生物の糖鎖抗原合成遺伝子において前記抗原型に特異的な領域を標的とする抗原型特異的プローブを含む、
請求項１１〜１６のいずれかに記載のアレイ。
【請求項１８】
前記プローブセットは、さらに、糖鎖抗原合成遺伝子クラスターに含まれる前記糖転移酵素遺伝子以外の他の遺伝子を標的とするプローブを含む、請求項１１〜１７のいずれかに記載のアレイ。
【請求項１９】
前記微生物は肺炎球菌を含み、前記プローブは、以下の配列（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択される、請求項１１〜１８のいずれかに記載のアレイ。
（ａ）配列番号１〜２２２のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列
（ｂ）配列番号１〜２２２の配列またはこれらの相補配列のいずれか１つに対して塩基の欠失、置換もしくは付加がなされた変異配列からなり、前記プローブの機能を有する配列
【請求項２０】
前記微生物はレジオネラ菌を含み、前記プローブは、以下の配列（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選択される、請求項１１〜１９いずれかに記載のアレイ。
（ｃ）配列番号２２３〜６７１のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列
（ｄ）配列番号２２３〜６７１の配列またはこれらの相補配列のいずれか１つに対して塩基の欠失、置換もしくは付加がなされた変異配列からなり、前記プローブの機能を有する配列
【請求項２１】
固相担体と、
前記固相担体の表面に保持され、微生物の糖鎖抗原合成遺伝子において糖鎖抗原に基づく抗原型に特異的な領域を標的とする抗原型特異的プローブと、
を備える、アレイ。
【請求項２２】
さらに、糖鎖抗原合成遺伝子クラスター内の前記糖転移酵素遺伝子以外の他の遺伝子を標的とするプローブを備える、請求項２１に記載のアレイ。
【請求項２３】
前記微生物は肺炎球菌を含み、
前記抗原特異的プローブは、２種類以上の抗原型を判別可能に、以下の配列（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択される、請求項２１又は２２に記載のアレイ。
（ａ）配列番号１〜２２２のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列
（ｂ）配列番号１〜２２２の配列またはこれらの相補配列のいずれか１つに対して塩基の欠失、置換もしくは付加がなされた変異配列からなり、前記プローブの機能を有する配列
【請求項２４】
微生物の糖鎖抗原に基づく抗原型を判別するために用いるプローブの作製方法であって、
前記微生物の糖鎖抗原の合成に関連付けられる複数の糖転移酵素遺伝子について取得した塩基配列情報に基づいて前記複数の糖転移酵素遺伝子のそれぞれを標的とする複数のプローブの塩基配列を決定する工程、
を備える、作製方法。
【請求項２５】
さらに、前記塩基配列に基づいて前記複数のプローブを作製する工程、
を備える、請求項２４に記載の作製方法。
【請求項２６】
さらに、作製した前記複数のプローブを固相担体の表面に固定化する工程、
を備える、請求項２５に記載の作製方法。
【請求項２７】
微生物の糖鎖抗原に基づく抗原型を判別するためのプローブセットであって、
前記微生物の糖鎖合成遺伝子クラスターに含まれ、前記抗原型に関連付けられる複数の糖転移酵素遺伝子をそれぞれ標的とするプローブを含む、
プローブセット。
【請求項２８】
前記微生物は前記肺炎球菌を含み、前記プローブは、以下の配列（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択される抗原型特異的プローブを含む、請求項２７に記載のプローブセット。
（ａ）配列番号１〜２２２のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列
（ｂ）配列番号１〜２２２の配列またはこれらの相補配列のいずれか１つに対して塩基の欠失、置換もしくは付加がなされた変異配列からなり、前記プローブの機能を有する配列
【請求項２９】
前記微生物はレジオネラ菌を含み、前記プローブは、以下の配列（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選択される、請求項２７又は２８に記載のプローブセット。
（ｃ）配列番号２２３〜６７１のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列
（ｄ）配列番号２２３〜６７１の配列またはこれらの相補配列のいずれか１つに対して塩基の欠失、置換もしくは付加がなされた変異配列からなり、前記プローブの機能を有する配列
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病原性微生物などの微生物の莢膜抗原などの糖鎖抗原に基づく血清型などの抗原型を判別するための技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
各種感染症等の原因菌としてグラム陰性菌及び陽性菌に属する多数の種が特定されている。例えば、肺炎球菌は、肺炎の原因の６０％以上を占めており、小児及び高齢者に肺炎を生じさせ、しばしば死亡の原因となる。肺炎は、現代においてもなお世界レベルで主要な死亡原因であり、肺炎球菌は、呼吸器感染症起炎菌として最も重要な菌の一つである。また、レジオネラ菌は、市中における肺炎の原因となっている。特に公衆浴場や空調設備の冷却塔に存在し、その周囲の高齢者に肺炎を生じさせ、しばしば死亡の原因となる。レジオネラ菌は、呼吸器感染症起炎菌重要な菌である。そのため、多くの都道府県の条例で公衆浴場を備える施設ではレジオネラ属菌の検出が水質基準の検査項目として挙げられている。
【０００３】
肺炎球菌、ブドウ球菌など、病原性微生物の多くはその細胞壁の外側に莢膜（外周との境界が不明瞭な粘液層も含む。）を有している。莢膜の多くは多糖であり、莢膜多糖は耐熱性の糖鎖抗原（莢膜抗原）として知られている。また、レジオネラ菌を含むグラム陰性細菌の殆どが細胞外膜に糖鎖（Lipopolysaccaride, LPS、Lipooligosaccaride, LOS）を保有している。また、ＬＰＳはヒトを含む動物に対して強力な抗原活性を有するため、内毒素と呼ばれている。特に血流中に混入した微生物が破壊されることによりＬＰＳ等が放出された場合、過剰な免疫反応が誘起され、発熱やショック症状を引き起こす。
【０００４】
このように細胞の外側に露出される糖鎖は、細菌の血清学的な型分類（血清型）に用いられている。血清型は、細菌の細胞にある抗原の構造の違いに基づいて、菌種をさらに細分する場合に、その抗血清に対応した細菌の型を意味しており、一般に、細菌がもっているすべての抗原(菌体抗原、莢膜抗原、鞭毛抗原など)の組合せで表される。したがって、莢膜を有していない微生物であっても多糖体を含有し特異性の高い細胞表層を有している微生物であっても、糖鎖抗原（血清型）によって分類することが可能である。
【０００５】
血清型は、抗血清やワクチン製造のほか検査・診断に必要な情報である。例えば、肺炎球菌には、その莢膜の多様性に基づき９０種類の抗原性の異なる血清型（莢膜抗原型）が知られている。肺炎球菌の莢膜抗原を認識する抗体は感染防御に有効であるため、このような抗体をヒト体内で生産させるワクチンが開発されてきている。現在、頻度の高い２３種類の莢膜抗原型に対応する２３種の莢膜多糖体の混合物である２３価ワクチン、主要な７種類の莢膜抗原型に対応する７種類の莢膜多糖体にタンパク質を結合させた７価ワクチンが提供されている。
【０００６】
これらのワクチンの有効性は、そのとき流行している肺炎球菌の莢膜抗原型をカバーする莢膜多糖体を含有することに依存している。しかしながら、流行する肺炎球菌は、国や地域、疾患の種類及び年齢等のほか、時期によっても相違する。したがって、ワクチン等の製造にあたっては、感染する可能性の高い病原性微生物の莢膜抗原型を継続的にサーベイしなければならない。
【０００７】
従来、このような病原性微生物の莢膜抗原の同定や莢膜抗原を含む血清型の判別のための方法としては、抗体による方法があり、例えば、ラテックス凝集反応や莢膜膨化反応が挙げられる。また、糖鎖抗原型別に特異的とされる遺伝子の特定領域をプライマー部位としてマルチプレックスＰＣＲにより糖鎖抗原型を判別する手法も開示されている（非特許文献１）。さらに、同様のターゲットに対して、ＰＣＲにより増幅するとともにＤＮＡマイクロアレイを用いてハイブリダイゼーションを行う手法も開示されている（非特許文献２）。
【０００８】
また、レジオネラ属は４６菌種、７０の血清型が知られているが、Legionella pneumophilaに分類される血清型６種が特にヒトに対して高い病原性を持っている。レジオネラ菌の検出に関しては、人工培地を用いた培養による検出、また血清型１型のみについては感染者の尿中に排出される糖鎖抗原（尿中抗原）を抗体により検出する方法がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Dias et al.,  CAら、J. Med. Microbaiol. 2007 Sep;56: 1185-1188
【非特許文献２】Quan et.,  al. J/ Microbiol.. Methods, 68(2007) 128-136
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、抗体を用いる方法は、以下の理由により、実質的に普及していない。すなわち、肺炎球菌の莢膜抗原型を決定するには、血清を９０種類準備する必要があって非常に入手コストと労力がかかるという問題がある。また、９０種の血清型があるといっても、共通する抗原を有している場合があり、交差反応性のために判定が困難になっている。
【００１１】
また、莢膜抗原型別に16ＳｒDNAなど莢膜抗原に直接関係のない特定の遺伝子の特定領域を検出対象とするとき、プライマー部位に遺伝子変異が生じた場合には、判別不可能になる可能性がある。また、血清型別に特異的な遺伝子の特定領域は各莢膜抗原型について必ずしも常に存在するわけではないし、現状においては限られた莢膜抗原型を判別できるに過ぎない。
【００１２】
また、レジオネラ菌については、尿中抗原を用いる方法は血清型１型のみに特化しており、それ以外の型による感染で合った場合は、培養による検出が行われるが、レジオネラ菌は人工培地中での増殖が遅いため、培養法による検出は一般的に困難である。
【００１３】
以上のことから、現在までのところ、病原性微生物を含む微生物の莢膜抗原型を簡易に判別するための現実的な方法が確立されているわけでなかった。
【００１４】
そこで、本発明は、微生物の莢膜抗原に基づく抗原型を簡易に判別する技術を提供することを一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、莢膜やＬＰＳなどの糖鎖抗原に基づく抗原型において見出される多糖の多様性及び糖鎖抗原合成に関与する糖転移酵素の多様性に着目した。そして、この多様性を利用して、糖鎖抗原型を判別できるという知見を得た。本発明者らは、こうした知見に基づき本発明を完成した。本発明によれば、以下の手段が提供される。
【００１６】
本発明によれば、微生物の糖鎖抗原に基づく抗原型の判別方法であって、前記抗原型に関連付けられる複数の糖転移酵素遺伝子をそれぞれ標的とするプローブを含むプローブセットを準備する工程と、前記プローブと被験体から取得した試料核酸とを接触させる工程と、
前記プローブに対する核酸ハイブリダイゼーションを検出する工程と、を備える、判別方法が提供される。
【００１７】
本発明の判別方法において、前記複数の糖転移酵素遺伝子は、糖鎖抗原合成遺伝子クラスターに含まれていることが好ましい。また、前記プローブセットは、さらに、前記糖鎖抗原合成遺伝子クラスターに含まれる糖転移酵素遺伝子以外の遺伝子を標的とするプローブを含んでいることもできる。さらに、前記微生物は、肺炎球菌、レジオネラ菌、サルモネラ菌、大腸菌、赤痢菌、及びビブリオから選択される１種又は２種以上であることが好ましい。さらに、前記微生物は肺炎球菌を含んでいることが好ましく、前記糖転移酵素遺伝子は、莢膜多糖合成遺伝子クラスターに含まれる遺伝子であることが好ましい。前記微生物はレジオネラ菌を含んでいることも好ましい。本発明の判別方法において、前記プローブセットは、前記微生物の糖鎖抗原合成遺伝子において前記抗原型に特異的な領域を標的とする抗原特異的プローブを含むことが好ましい。
【００１８】
また、前記微生物は肺炎球菌を含み、前記プローブは、以下の配列（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択されることが好ましい。
（ａ）配列番号１〜２２２のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列
（ｂ）配列番号１〜２２２の配列又はこれらの相補配列のいずれか１つに対して塩基の欠失、置換もしくは付加がなされた変異配列からなり、前記プローブの機能を有する配列
また、前記微生物はレジオネラ菌を含み、前記プローブは、以下の配列（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選択されることが好ましい。
（ｃ）配列番号２２３〜６７１のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列
（ｄ）配列番号２２３〜６７１の配列又はこれらの相補配列のいずれか１つに対して塩基の欠失、置換もしくは付加がなされた変異配列からなり、前記プローブの機能を有する配列
本発明の判別方法においては、前記プローブセット準備工程は、固相担体上に複数の前記抗原型に対応する複数の前記プローブセットを保持するアレイを準備する工程とすることができる。
【００１９】
本発明によれば、固相担体と、前記固相担体の表面に保持され、微生物の糖鎖抗原に基づく抗原型に関連付けられる複数の糖転移酵素遺伝子をそれぞれ標的とするプローブを含むプローブセットと、を備える、アレイが提供される。本発明のアレイにおいては、前記複数の糖転移酵素遺伝子は、糖鎖抗原合成遺伝子クラスターに含まれることが好ましく、前記微生物は、肺炎球菌、レジオネラ菌、サルモネラ菌、大腸菌、赤痢菌、及びビブリオから選択される１種又は２種以上であることが好ましく、前記微生物は肺炎球菌を含むことが好ましく、また、レジオネラ菌を含むことも好ましい。さらに、複数の前記抗原型に対応する複数の前記プローブセットを保持することも好ましい。前記プローブセットは、前記微生物の糖鎖抗原合成遺伝子において前記抗原型に特異的な領域を標的とする抗原型特異的プローブを含むこともできる。さらにまた、前記プローブセットは、さらに、糖鎖抗原合成遺伝子クラスターに含まれる前記糖転移酵素遺伝子以外の他の遺伝子を標的とするプローブを含んでいてもよい。
さらに、前記微生物は肺炎球菌を含み、前記プローブは、上記配列（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択されてもよい。また、前記微生物はレジオネラ菌を含み、前記プローブは、上記配列（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選択されてもよい。
【００２０】
本発明によれば、固相担体と、前記固相担体の表面に保持され、微生物の糖鎖抗原合成遺伝子において糖鎖抗原に基づく抗原型に特異的な領域を標的とする抗原型特異的プローブと、を備える、アレイが提供される。さらに、糖鎖抗原合成遺伝子クラスター内の前記等転移酵素遺伝子以外の他の遺伝子を標的とするプローブを備えていてもよい。本発明のアレイにおいては、上記配列（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択される前記抗原型特異的プローブを２種類以上の抗原型を判別可能に備えることもできる。また、本発明のアレイにおいては、上記配列（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選択される前記プローブを２種類以上の抗原型を判別可能に備えることもできる。
【００２１】
本発明によれば、微生物の糖鎖抗原に基づく抗原型を判別するために用いるプローブの作製方法であって、前記微生物の糖鎖抗原の合成に関連付けられる複数の糖転移酵素遺伝子について取得した塩基配列情報に基づいて前記複数の糖転移酵素遺伝子のそれぞれを標的とする複数のプローブの塩基配列を決定する工程、を備える、作製方法も提供される。本発明の作製方法においては、さらに、作製した前記複数のプローブを固相担体の表面に固定化する工程を備えていてもよい。
【００２２】
本発明によれば、微生物の糖鎖抗原に基づく抗原型を判別するためのプローブセットであって、前記微生物の糖鎖合成遺伝子クラスターに含まれ、前記抗原型に関連付けられる複数の糖転移酵素遺伝子をそれぞれ標的とするプローブを含む、プローブセットが提供される。前記微生物は、肺炎球菌を含み、前記プローブは、上記配列（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択される、前記抗原型に特異的な領域を標的とする抗原型特異的プローブを含むことができる。また、前記微生物はレジオネラ菌を含み、前記プローブは、上記配列（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選択されるプローブを含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の概念を示す図である。
【図２】本発明の肺炎球菌判別用のプローブを示す図である。
【図３】本発明の肺炎球菌判別用のプローブを示す図である。
【図４】本発明の肺炎球菌判別用のプローブを示す図である。
【図５】本発明の肺炎球菌判別用のプローブを示す図である。
【図６】本発明の肺炎球菌判別用のプローブを示す図である。
【図７】本発明の肺炎球菌判別用のプローブを示す図である。
【図８】本発明の肺炎球菌判別用のプローブを示す図である。
【図９】本発明の肺炎球菌判別用のプローブを示す図である。
【図１０】実施例において血清型１につき検出された蛍光強度を示すグラフ図である。
【図１１】実施例において血清型１２Ｆにつき検出された蛍光強度を示すグラフ図である。
【図１２】血清型１４につき検出された蛍光強度を示すグラフ図である。
【図１３】血清型６Ｂにつき検出された蛍光強度を示すグラフ図である。
【図１４】血清型１８Ｂにつき検出された蛍光強度を示すグラフ図である。
【図１５】血清型１８Ｃにつき検出された蛍光強度を示すグラフ図である。
【図１６】血清型１１Ｃにつき検出された蛍光強度を示すグラフ図である。
【図１７】血清型１１Ｆにつき検出された蛍光強度を示すグラフ図である。
【図１８】本発明のレジオネラ菌判別用のプローブを示す図である。
【図１９】本発明のレジオネラ菌判別用のプローブを示す図である。
【図２０】本発明のレジオネラ菌判別用のプローブを示す図である。
【図２１】本発明のレジオネラ菌判別用のプローブを示す図である。
【図２２】本発明のレジオネラ菌判別用のプローブを示す図である。
【図２３】本発明のレジオネラ菌判別用のプローブを示す図である。
【図２４】本発明のレジオネラ菌判別用のプローブを示す図である。
【図２５】本発明のレジオネラ菌判別用のプローブを示す図である。
【図２６】本発明のレジオネラ菌判別用のプローブを示す図である。
【図２７】本発明のレジオネラ菌判別用のプローブを示す図である。
【図２８】本発明のレジオネラ菌判別用のプローブを示す図である。
【図２９】本発明のレジオネラ菌判別用のプローブを示す図である。
【図３０】本発明のレジオネラ菌判別用のプローブを示す図である。
【図３１】本発明のレジオネラ菌判別用のプローブを示す図である。
【図３２】本発明のレジオネラ菌判別用のプローブを示す図である。
【図３３】実施例においてレジオネラ菌血清型１型（ＳＴ１）につき検出された蛍光強度を示すグラフ図である。上段は、全プローブについての結果であり、下段は、血清型の判別に有効であるとして選択したプローブについての結果である。
【図３４】血清型２型（ＳＴ２）につき検出された蛍光強度を示すグラフ図である。上段は、全プローブについての結果であり、下段は、血清型の判別に有効であるとして選択したプローブについての結果である。
【図３５】血清型３型（ＳＴ３）につき検出された蛍光強度を示すグラフ図である。上段は、全プローブについての結果であり、下段は、血清型の判別に有効であるとして選択したプローブについての結果である。
【図３６】血清型４型（ＳＴ４）につき検出された蛍光強度を示すグラフ図である。上段は、全プローブについての結果であり、下段は、血清型の判別に有効であるとして選択したプローブについての結果である。
【図３７】血清型５型（ＳＴ５）につき検出された蛍光強度を示すグラフ図である。上段は、全プローブについての結果であり、下段は、血清型の判別に有効であるとして選択したプローブについての結果である。
【図３８】血清型６型（ＳＴ６）につき検出された蛍光強度を示すグラフ図である。上段は、全プローブについての結果であり、下段は、血清型の判別に有効であるとして選択したプローブについての結果である。
【図３９】大腸菌につき検出された蛍光強度を示すグラフ図である。
【図４０】肺炎桿菌につき検出された蛍光強度を示すグラフ図である。
【図４１】緑膿菌につき検出された蛍光強度を示すグラフ図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、微生物の莢膜抗原やＬＰＳなどの糖鎖抗原に基づく抗原型（以下、単に莢膜抗原型という。）の判別のためのアレイ及び当該アレイを用いた糖鎖抗原型の判別方法に関している。本発明のこれらの実施形態に共通する概念について図１を参照して説明する。
【００２５】
図１に示すように、微生物の細胞表層において提示される糖鎖抗原、すなわち、細胞表層の莢膜多糖やＬＰＳなどの多糖の糖鎖構造の相違は、結果として微生物において発現している莢膜多糖合成遺伝子などの糖鎖抗原合成遺伝子の相違に関連付けることができる。糖鎖抗原は、ある順序で糖が順次結合した糖鎖構造に由来するが、各糖鎖抗原型においてこうした糖鎖構造が極めて多様であることも知られている。このような糖鎖構造の多様性は、糖鎖抗原の合成に関連する各種の遺伝子の構造（遺伝子自体の有無のほか、各遺伝子における各種変異の有無を含む。）や組み合わせに関連付けることができる。なかでも、糖鎖抗原の構成糖を順次結合する各種の糖転移酵素遺伝子の構造や組み合わせに関連付けることができる。
【００２６】
例えば、このような糖鎖抗原合成遺伝子群が、肺炎球菌において、莢膜多糖体合成（Capsule Polysaccharide Synthesis）遺伝子クラスター（CPSクラスター）として存在していることが知られている（http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_pneumonie/CPS/）。また、このような糖鎖抗原合成遺伝子群が、レジオネラ菌において、多糖体合成遺伝子クラスターとして存在していることが知られている（Luneberg Eら、Mol. Microbiol. 2001 Mar ;28(5): 1259-1271）
【００２７】
本発明では、微生物の糖鎖抗原型に関連付けられる複数の糖転移酵素遺伝子を、糖鎖抗原型を判別するのに用いる。すなわち、このような複数の糖転移酵素のセットを、糖鎖抗原型を判別するための要素として用いる。すなわち、複数の糖転移酵素をそれぞれ標的とするプローブのセットを用い、これらのプローブとのハイブリダイゼーションを検出することにより、微生物糖鎖抗原型を、従来に比べてより客観的に、より直接的に、さらにより簡易に判別することができる。また、所定の複数の糖転移酵素遺伝子の有無に基づいて判断するため、特定遺伝子の特定領域の有無に基づいて判断する場合より、高い判別精度を得ることが期待できる。さらに、微生物の糖鎖抗原が、薬剤耐性獲得により変化している場合でも、それを容易に検出できることが期待できる。このため、当該薬剤耐性獲得後の新規な糖鎖抗原型にも容易に対応することができる。
【００２８】
また、本発明では、微生物の莢膜多糖合成遺伝子などの糖鎖抗原合成遺伝子の前記抗原型に特異的な領域を標的とする抗原特異的プローブを、糖鎖抗原型を判別するのに用いることもできる。こうしたプローブによれば、糖鎖抗原型特異的であるために、例えば、それ自体（単独）でも糖鎖抗原型判別に用いることができるほか、糖鎖抗原型に関連付けられる複数の糖転移酵素遺伝子を標的とするプローブセットとともに用いることで判別精度を一層高めることができる。
【００２９】
さらに、本発明では、微生物の糖鎖抗原合成遺伝子クラスターに属する糖転移酵素遺伝子以外の遺伝子を標的とするプローブを、糖鎖抗原型を判別するのに用いることができる。かかる遺伝子及びその組み合わせが、糖鎖抗原型を区別可能な特徴を有する場合があるからである。
【００３０】
また、本発明によれば、こうした各種のプローブを適宜組み合わせて固相担体上に保持させたアレイとするため、複数個の莢膜抗原型の判別を一挙に実施することができる。さらに、プローブのハイブリダイゼーションを利用して判別のため、当該部位に遺伝子上の変異が生じていても一定の寛容性の範囲内で判別が可能である。
【００３１】
さらに、本発明によれば、このような簡易かつ網羅的に糖鎖抗原型判別が可能であるため、例えば、肺炎の起炎菌である肺炎球菌の莢膜抗原型判別を日常的に行うことも可能になる。この結果、感染可能性の高い肺炎球菌に対する抗体産生を誘導できる有効性の高い肺炎予防ワクチンを製造することができる。すなわち、本発明のアレイ及び莢膜抗原型判別方法は、肺炎などの感染症予防ワクチンの製造に利用できる。
【００３２】
さらに、本発明によれば、このような簡易かつ網羅的に糖鎖抗原型を判別が可能であるため、例えば、肺炎の起炎菌であるレジオネラ菌の莢膜抗原型判別を日常的に行うことも可能になる。この結果、現在より簡便にレジオネラ菌の検出が可能となる。さらに、現在は検出が困難な血清型１型以外のレジオネラ菌の検出が可能となる。すなわち、感染症予防や感染経路特定の観点からも非常に有意義な検出法となる。
【００３３】
以下、本発明の各種の実施形態について詳細に説明する。
【００３４】
（アレイ）
本発明のアレイは、固相担体と、前記固相担体の表面に保持され、微生物の莢膜抗原に基づく抗原型に関連付けられる複数の糖転移酵素遺伝子をそれぞれ標的とするプローブを含むプローブセットと、を備えることができる。
【００３５】
本発明のアレイは、微生物の糖鎖抗原型を判別するのに用いるものである。本発明のアレイは、ヒトのほか家畜やペットなどの動物を対象とすることができる。また、被験体としては、これらの動物に由来する生体試料が挙げられる。例えば、血液、髄液、喀痰、胃液、膣分泌物、口腔内粘液等の体液、尿及び糞便のような排出物等、微生物が存在する可能性のあるものが挙げられる。また、感染や汚染の対象となる、食品、飲料のほか、各種器具、室内物品など、微生物が付着したりする可能性のある全ての媒体が水及び温泉水のような環境中の水等、など、細菌による汚染が引き起こされる可能性のある媒体が挙げられる。
【００３６】
なお、本明細書において「糖鎖抗原」とは、糖鎖抗原を有する微生物の細胞表面に存在する糖鎖（多糖）に基づく抗原である。なお、糖鎖抗原には莢膜、および内毒素(リポ多糖（LPS）、リポオリゴ糖（lipo-oligo saccharide, LOS)）も含まれる。莢膜には、粘液状のエンベロープも包含するものとする。莢膜を有する微生物としては肺炎球菌（グラム陽性）（肺炎、中耳炎等）、ブドウ球菌（グラム陽性）（肺炎、敗血症、髄膜炎、食中毒、皮膚疾患）、溶血レンサ球菌（グラム陽性）（咽頭炎、敗血症、劇症型感染症、皮膚疾患）、口腔レンサ球菌（グラム陽性）（う蝕、心内膜炎）、淋菌（グラム陰性）（淋病、咽頭炎）、髄膜炎菌（グラム陰性）（髄膜炎）、肺炎桿菌(典型的にはフリードレンデル桿菌、グラム陽性)（肺炎）、バチルス属菌（典型的には炭疽菌およびセレウス菌、グラム陽性）（肺炎、敗血症、食中毒）、ウェルシュ菌（グラム陽性）（ガス壊疽）、結核菌（グラム陽性）（結核）、カンピロバクター属菌（グラム陰性）（腸炎）、ヘリコバクター属菌（典型的にはピロリ菌、グラム陰性）（胃潰瘍）、インフルエンザ菌（グラム陰性）（肺炎、髄膜炎）、百日咳菌（グラム陰性）（百日咳、咽頭炎）、シュードモナス属菌（典型的には緑膿菌、グラム陰性）（敗血症）、大腸菌（典型的には腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、グラム陰性）（腸管感染症、異所性感染、敗血症、肺炎、敗血症）、サルモネラ菌（グラム陰性）（敗血症、腸管感染症）、ビブリオ属菌（グラム陰性）（食中毒、敗血症）などが挙げられる。これらは、それぞれ明示した感染症の起炎菌である病原性微生物でもある。なお、莢膜はグラム陽性菌にもグラム陰性菌にも観察される。莢膜抗原を特定するのが有効な感染症の予防及び診断に有効な病原性微生物としては、肺炎球菌、インフルエンザ菌、ビブリオ属菌が挙げられる。例えば、肺炎球菌においては、莢膜抗原により９０種の抗原型（血清型）に分類されている。また、ＬＰＳやＬＯＳは基本的に全てのグラム陰性菌が有する。ＬＰＳやＬＯＳを特定することが有効な病原微生物としてはレジオネラ菌、大腸菌、サルモネラ菌、が挙げられる。レジオネラ菌には70種の抗原型（血清型）が知られている。
【００３７】
本発明のアレイは、このような病原性微生物の糖鎖抗原型を判別用として好ましいほか、これらの病原性微生物を起炎菌とする感染症の診断用として好ましい。
【００３８】
（固相担体）
プローブを保持させるための固相担体としては、特に限定されない。意図するハイブリダイゼーションを生じさせうるものであればよい。固相担体の材料や形態も特に限定されない。こうした固相担体としては、例えば、ガラス基板、プラスチック基板、シリコン基板等の平板状体、ビーズ等の球状体、表面に不規則あるいは規則的な凹凸を有する三次元構造体、棒状、中空管状等の線状体が挙げられる。固相担体の表面はプローブの固定化に適した処理が施されていてもよい。例えば、プローブの吸着や共有結合のための官能基が導入されていてもよい。固相担体の表面処理については後述する。
【００３９】
（プローブセット）
本発明において用いるプローブセットは、微生物の糖鎖抗原に基づく抗原型（糖鎖抗原型）に関連付けられる複数の糖転移酵素遺伝子をそれぞれ標的としている複数のプローブを含んでいる。プローブは、ポリヌクレオチドであるが、通常、ＤＮＡである。ＤＮＡは、天然のヌクレオチドほか、固相担体への結合のための官能基、標識、あるいは検出のための官能基、安定性を高めるための官能基を備えるなどの各種の誘導体を含んでいてもよい。また、プローブとして機能しないリンカーとしてのヌクレオチド鎖を備える場合もある。このようなリンカー配列は、プローブの配列とは区別される。
【００４０】
（糖転移酵素遺伝子を標的とするプローブ）
糖鎖抗原型に関連付けられる複数の糖転移酵素遺伝子とは、糖鎖抗原型を判別可能に関連付けられている複数の糖転移酵素遺伝子であることが好ましい。すなわち、これらの複数の糖転移酵素遺伝子の組み合わせ自体が、判別しようとする他の糖鎖抗原型と相違していることが好ましい。このような組み合わせによれば、このプローブセットのみで糖鎖抗原型を判別することができる。糖鎖抗原の多様性、すなわち、糖転移酵素遺伝子の多様性を考慮すると、糖鎖抗原型に関連付けできる複数の糖転移酵素遺伝子の組み合わせ自体で多くの糖鎖抗原型を判別できる。
【００４１】
糖転移酵素とは、グリコシド結合を形成して糖を結合させる酵素である。糖転移酵素としては、莢膜抗原型に利用できるものであれば特に限定されない。糖転移酵素としては、グルコース転移酵素、Nアセチルフコサミン転移酵素、ラムノース転移酵素、シアル酸転移酵素、フコース転移酵素、ガラクトース転移酵素、N-アセチルグルコサミン転移酵素、N-アセチルガラクトサミン転移酵素、グルクロン酸転移酵素、ガラクロン酸転移酵素、が挙げられる。なお、糖転移酵素（タンパク質）として未だ分離されておらず、機能が未知であっても、塩基配列上あるいはアミノ酸配列上の相同性等に基づいて糖転移酵素としての活性が期待でき、他の莢膜抗原型との判別に用いることができるときには、本発明において糖転移酵素として取り扱うものとする。
【００４２】
糖転移酵素については、同じグリコシド結合を形成するものにも複数存在することが知られており、ファミリーを形成している場合もある。このような糖転移酵素の多様性が糖鎖抗原の多様性、特異性及び変化に関連していると考えられる。
【００４３】
複数の糖転移酵素遺伝子は、cpsクラスターを含む糖鎖合成遺伝子クラスターに含まれることが好ましい。この糖鎖合成遺伝子クラスターに含まれていることで、糖鎖抗原型を特徴付ける糖鎖抗原の合成に関連する糖転移酵素遺伝子であると特定できるからである。糖鎖合成遺伝子クラスターは、糖鎖抗原の合成に関連する糖転移酵素遺伝子を含み、さらに他の遺伝子を含む場合もあるが、既知の糖転移酵素の塩基配列や特異的なアミノ酸のドメインやモチーフの配列に基づき、各種の相同性検索プログラム（blastプログラム、NCBI、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）を利用することにより、糖転移酵素遺伝子を推定することができる。なお、既に、糖鎖合成遺伝子クラスターにおいてタンパク質として分離同定されている糖転移酵素の遺伝子はそれ自体推定することなく本発明の糖転移酵素遺伝子として取り扱うことができる。肺炎球菌のCPSクラスターに関しては、既に述べたように英国サンガー研究所のサイト（http：//www.sanger.ac.uk/Projects/S_pneumonie/CPS/）に開示されているほか、レジオネラ、大腸菌、サルモネラ菌等については、それぞれ米国コロンビア大学のサイト(http://genome3.cpmc.columbia.edu/~legion/g_info.html)、米国ウィスコンシン大学のサイト（http://www.genome.wisc.edu/index.html）、米国ベンター研究所(http://msc.tigr.org/salmonella/index.shtml)で既に塩基配列が公開されているゲノム配列の中に確認することができる。
【００４４】
プローブは、一つの糖転移酵素遺伝子につき、少なくとも１種あればよいが、好ましくは、２種類、より好ましくは３種類以上を準備する。一つの糖転移酵素遺伝子につき、複数のプローブを割り当てることで、当該糖転移酵素遺伝子をより精度よく検出でき、結果として糖鎖抗原型の判別精度を向上させることができる。
【００４５】
CPSクラスター等から見出した複数の糖転移酵素遺伝子が、糖鎖抗原型に関連付けられる複数の糖転移酵素遺伝子として用いることができるかどうかは、判別しようとする他の糖鎖抗原型において見出した複数の糖転移酵素遺伝子と比較することにより判定することができる。複数の糖転移酵素遺伝子のセットが、糖鎖抗原型を判別可能に関連付けられた複数の糖転移酵素遺伝子であるとき、これらの糖転移酵素遺伝子の各コード領域に特異的なプローブを設計れば、これらの複数のプローブからなるプローブセットは、それ自体糖鎖抗原型の判別のために用いることができる。例えば、肺炎球菌のCPSクラスターにおいて見出される糖転移酵素遺伝子は、多様性に富んでいるため、複数の糖転移酵素遺伝子の組み合わせにのみ基づいて、莢膜抗原型を判別することができる。
【００４６】
（他のプローブ）
プローブセットには、さらに他のプローブを含めることができる。例えば、糖鎖合成遺伝子クラスターに含まれている糖転移酵素遺伝子以外の他の遺伝子が糖鎖抗原型を判別するのに有用であるときには、その遺伝子を標的とするプローブを含めることで、糖鎖抗原型判別精度を高めることができる。また、このようなプローブを含めることで、糖転移酵素遺伝子プローブセットでは、糖鎖抗原型判別が困難である場合であっても、判別可能なセットを提供できるようになる。CPSクラスターに含まれることのある、このような糖転移酵素遺伝子以外のタンパク質としては、肺炎球菌のCPSクラスターの糖合成酵素（wzy３、manB）やレジオネラ菌の糖鎖合成遺伝子クラスターにおける糖修飾酵素（gip、neuC）が挙げられる。なお、当該他の遺伝子には、糖転移酵素遺伝子以外の遺伝子として同定されて遺伝子のほか、プローブを選択する時点において糖転移酵素遺伝子として同定されていない機能未知の遺伝子を含んでいる。
【００４７】
かかる他の遺伝子を標的とするプローブは、特に、糖鎖抗原合成遺伝子クラスターの糖転移酵素遺伝子が同定されていない場合に有効である。例えば、レジオネラ菌においては、血清型１型に分類される菌の糖鎖合成遺伝子クラスターにあるいくつかの糖転移酵素遺伝子が知られているに過ぎず、他の血清型の糖鎖合成遺伝子クラスターにおいては、現在までのところ糖転移酵素遺伝子が同定されていない。
【００４８】
こうした現状において、本発明者らが、レジオネラ菌の血清型１型の糖鎖合成遺伝子クラスターに含まれる遺伝子（既同定の糖転移酵素遺伝子と他の未同定の遺伝子を含む）に対して網羅的に複数のプローブを形成し、これらのプローブと血清型１型及び他の血清型（血清型２型〜６型）に由来する糖鎖合成遺伝子クラスターから調製した試料核酸とを、ハイブリダイゼーションさせた。これらのプローブには、他の血清型の試料核酸と反応するものがあるとともに、全く反応しないものもあった。また、血清型１型の糖鎖合成遺伝子クラスターに対する複数のプローブに対するハイブリダイゼーション反応性（ハイブリダイゼーションする／しない、その程度）は、各血清型（２型〜６型）で異なっており、ハイブリダイゼーションに基づくシグナル強度の分布パターン又はシグナル強度をグラフ化してスペクトルとすることで容易に各血清型を特徴付けが可能であることがわかった。また、各血清型を判別するのに有効なプローブを見出すことができることがわかった。
【００４９】
以上のことから、糖鎖抗原に特異的でないプローブを用いた場合でも、複数のプローブとのハイブリダイゼーション反応性の相違によって、糖鎖抗原型の判別が可能であることがわかった。また、このような特定の糖鎖抗原型の糖鎖合成遺伝子クラスターに対して作製した網羅的なプローブ群を利用することで、糖転移酵素遺伝子が同定されていなくても、糖鎖抗原型を判別するのに有効なプローブ又はそのセットを見出すことができることがわかった。
【００５０】
（プローブの設計）
複数の糖転移酵素遺伝子のコード領域とそれぞれ特異的にハイブリダイズするプローブの塩基配列は、糖転移酵素遺伝子の塩基配列に基づき、OLIGO（タカラバイオ株式会社製、ＯＬＩＧＯは商標である。）等のプログラムにより決定することができる。
【００５１】
糖転移酵素遺伝子を標的とするプローブは、そのコード領域内において判別しようとする一定範囲の糖鎖抗原型間（例えば、血清型間、サブクラス間、血清型とサブクラス間など）で保存されているコード領域を標的とするように設計してもよい。これらのプローブは、当該一定範囲の糖転移酵素遺伝子と特異的に反応するが、他の糖転移酵素遺伝子とは反応しない。こうした一定範囲の特異性を利用することで、特定の抗原型と他の抗原型を区別できる。また、保存領域を標的とするプローブであれば、プローブの作製コストを低減することができる。このため、このようなプローブを含むプローブセットを備える本発明のアレイは、プローブコストが低減できるため、検査コストの低減に寄与することができる。
【００５２】
糖転移酵素遺伝子を標的とするプローブは、それ自体が糖鎖抗原型特異的なプローブを含んでいてもよい。すなわち、ある糖転移酵素遺伝子のコード領域に、他の糖鎖抗原型から当該糖鎖抗原型を判別可能な程度に特異的な塩基配列を有する場合、当該塩基配列に特異的なプローブは、それ自体、当該糖鎖抗原型を判別できるプローブである。プローブセットが、このような糖鎖抗原型特異的プローブを含むときには、プローブセットによる糖鎖抗原型判別精度を一層高めることができる。また、プローブセットだけでは、すなわち、複数の糖転移酵素遺伝子の組み合わせだけでは、他の糖鎖抗原型と区別できない場合に極めて有用である。
【００５３】
このような糖鎖抗原型特異的プローブは、プローブセットにおいて１種のみ含まれていてもよいが、２種類以上含まれていることが好ましい。また、糖鎖抗原型特異的プローブは、１種類の糖転移酵素遺伝子のコード領域を標的としていてもよいし、２種類以上の糖転移酵素遺伝子のコード領域をそれぞれ標的とする２種類以上であってもよい。
【００５４】
また、糖鎖抗原型特異的プローブは、各糖転移酵素遺伝子につき、少なくとも１種あればよいが、好ましくは、２種類、より好ましくは３種類以上を準備する。一つの糖転移酵素遺伝子につき、複数のプローブを割り当てられることで、糖鎖抗原型特異性の高まるとともに、当該糖転移酵素遺伝子をより精度よく検出でき、結果として糖鎖抗原型の判別精度を向上させることができる。
【００５５】
糖鎖抗原型特異的プローブは、糖鎖抗原型を特異的に判別することができるように設計されている。すなわち、核酸ハイブリダイゼーションにより他の糖鎖抗原型と区別できる程度の特異性の塩基配列を有していることをいう。判別精度を考慮すると、プローブは、単一の糖鎖抗原型を判別できるものであることが好ましいが、２種類以上の糖鎖抗原型を特異的に判別できるものであってもよい。こうしたプローブであっても、型判別に有用であるからである。
【００５６】
糖鎖抗原型特異的プローブは、糖鎖抗原合成遺伝子上の糖鎖抗原型特異的なＤＮＡ領域を標的としているが、他の糖鎖抗原型との間で３０％以下の同一性、より好ましくは、１０％以下の同一性の領域を標的とすることができる。あるいは、４２個以上、より好ましくは５４個以上の塩基の不一致箇所がある領域を標的とすることができる。
【００５７】
糖鎖抗原型特異的プローブは、糖鎖抗原型内に含まれる菌株につき決定することで、糖鎖抗原型に属する多くの菌株に対しても有効である。すなわち、糖鎖抗原型は、菌種より下の分類であり、糖鎖抗原による分類であるから、ある菌株で糖鎖抗原型特異的なプローブであれば、同糖鎖抗原型の他の菌株においても糖鎖抗原型特異的であるといえる。
【００５８】
糖鎖抗原型特異的プローブは、糖転移酵素遺伝子以外の糖鎖抗原合成遺伝子のコード領域に特異的なプローブであってもよい。既述したように、糖鎖合成遺伝子クラスターには、微生物によっては、糖転移酵素遺伝子以外のタンパク質の遺伝子も含まれており、このような遺伝子のコード領域に糖鎖抗原型特異的な領域があればそれを利用することができる。
【００５９】
さらに、既に説明したように、プローブは特定の糖鎖抗原型の糖鎖抗原合成遺伝子クラスターに対して網羅的に作製したプローブとのハイブリダイゼーション反応性に基づいて当該特定の糖鎖抗原型や他の糖鎖抗原型の判別に有効なプローブを選択することもできる。このようにして選択されるプローブは、糖転移酵素遺伝子を標的とするプローブ、それ以外の遺伝子を標的とするプローブ、及び／又は機能未知の遺伝子を標的とするプローブが含まれている。
【００６０】
以上説明したプローブセットを構成することができるプローブは、糖鎖抗原型判別の特異性及びハイブリダイゼーションの観点からプローブの長さは、２０塩基以上４００塩基以下であることが好ましい。より好ましくは４５塩基以上７５塩基以下程度である。
【００６１】
図２〜図９に、肺炎球菌の９０種類の血清型について開示されているCPSクラスターの塩基配列に基づいて選択した２３種の血清型（２３価ワクチンに対応する莢膜抗原型（糖鎖抗原型）である。）の判別に好適な莢膜抗原型（糖鎖抗原型９特異的プローブの塩基配列（配列番号１〜２２２）を示す。本発明のプローブセットには、これらに示す塩基配列からなるプローブのほか、この相補配列からなるプローブを用いることができる。また、配列番号１〜２２２のいずれかに示す塩基配列又はこの相補配列に、プローブとしての機能を保持できる範囲内で、１から複数個の塩基の欠失、置換もしくは付加がなされた変異配列からなるプローブも本発明のプローブに含まれる。
【００６２】
また、図１８〜図３２に、レジオネラ菌の血清型１型について開示されているLPS合成遺伝子クラスター（糖鎖抗原合成遺伝子クラスター）の塩基配列に基づいて選択した血清型の判別に好適な糖鎖抗原遺伝子クラスターを標的とするプローブの塩基配列（配列番号２２３〜６７１）を示す。本発明のプローブセットには、これらに示す塩基配列からなるプローブのほか、この相補配列からなるプローブから選択されるプローブを用いることができる。また、配列番号２２３〜６７１のいずれかに示す塩基配列又はこの相補配列に、プローブとしての機能を保持できる範囲内で、１から複数個の塩基の欠失、置換もしくは付加がなされた変異配列からなるプローブも本発明のプローブに含まれる。
【００６３】
なお、プローブの機能が損なわれない範囲とは、プローブの莢膜抗原型などの糖鎖抗原型の判別の特異性が確保される範囲である。例えば、実施例などに記載するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で標的核酸にハイブリダイズできる範囲である。
【００６４】
本発明によれば、図２〜図９に開示する各種の莢膜抗原型特異的プローブ及びこれらの２種以上を含むプローブセットが提供される。例えば、7価ワクチンに含まれる７種の血清型判別のためのプローブセットも提供される。これらの莢膜抗原型特異的プローブは、上記した糖転移酵素遺伝子を標的とするプローブセットの一部としても用いることができるが、それ自体で莢膜抗原型判別が可能であることから、単独又はセットとして莢膜抗原型判別用に利用できる。なお、本発明によれば、１種又は２種以上の莢膜抗原型を含む糖鎖抗原型を判別可能にこれらの上記した抗原特異的プローブの１種又は２種以上を固相担体の表面上に備えるアレイも提供される。さらに多数の、例えば、上記したような７価ワクチンの７種の血清型を判別可能な莢膜抗原型特異的プローブを備えることもできるし、２３価ワクチンの２３種の血清型を判別可能な莢膜抗原型特異的プローブを備えることもできる。このような莢膜抗原型特異的プローブのみを備えていても、莢膜抗原型を極めて効率的に判別できる。特に、一つの血清型に特異的な複数個の莢膜抗原型特異的プローブを含んで多数の血清型に特異的な莢膜抗原型特異的プローブをアレイ上に保持させることで、各種のプローブにおけるハイブリダイゼーションによって得られるシグナルの分布に基づいて血清型を判別することもできる。
【００６５】
図２〜図９に開示するプローブによる糖鎖抗原型の判別の一例を表１に示す。表１に示すように、肺炎球菌の血清型11のサブクラスである血清型11F、11A、11B、11C、11Dは共通抗原性を持ち、cpsクラスター中の塩基配列にも共通性が見られる。例えばwchKの前半部分は11A、11B、11C、11Dの間で高度に保存されており、この部分を標的とするプローブ(11A-9-1)を設計することにより特異的に検出することができる。一方、同じwchK遺伝子の内部であっても後半部分には血清型間で変異が見られ、血清型11Aあるいは11Dのみを検出するためにこの部分を標的とするプローブ(11A-9-2)を設計することが可能である。また、糖転移酵素のバリエーションとして、wcyKおよびwcrLは11F、11A、11Dにのみ保存されているので、それぞれの遺伝子を標的とするプローブ(wcyKについて11A-10-1、11A-10-2、11A-10-3、およびwcrLについて11A-12-1、11A-12-2、11A-12-3、)によりその他の血清型（11B、11Cを含む）と判別が可能である。つまり、wchKの前半部(11A-9-1)のみ反応すれば11Bあるいは11Cであり、wchKの前半部(11A-9-1、11A-9-2)と反応せずにその後半部(11A-9-3)とwcyK、wcrLが反応すれば11F、またwchK、wcyK、wcrLの全てと反応すれば11Aあるいは11Dとして判定することが可能である。
【表１】
2009225793.tif 000003
【００６６】
本発明によれば、図１８〜図３２に開示するプローブ及びこれらの２種以上を含むプローブセットが提供される。このプローブセットは、レジオネラ菌の血清型１型のLPS合成遺伝子クラスターの糖転移酵素遺伝子を標的とするプローブ（lpg775、lpg778、lpg779が付されたプローブ）を含むほか、当該クラスターの糖転移酵素遺伝子以外の遺伝子や機能未知の遺伝子を標的とするプローブ（lpg775、lpg778、lpg779以外が付されたプローブ）を含んでいる。図１８〜図３２に示すプローブ又はこれらから選択されるプローブからなるセットによれば、複数のプローブを組み合わせたときのハイブリダイゼーション反応性の相違に基づいてレジオネラ菌の糖鎖抗原型（血清型１型〜６型）の判別が可能である。
【００６７】
より具体的には、このプローブセットから選択されるプローブによれば、レジオネラ菌の血清型１型を、血清型２型〜６型から区別することができる。また、このプローブセットから選択されるプローブによれば、レジオネラ菌を血清型２型〜６型をそれぞれ区別することができる。
【００６８】
また、本発明によれば、レジオネラ菌の血清型１型〜６型から選択される１種又は２種以上の血清型を判別可能に上記プローブセットを固相担体の表面上に備えるアレイも提供される。好ましくは、３種類以上の血清型が判別可能であり、より好ましくは５種類以上であり、さらに好ましくは６種類である。また、本発明のアレイが判別対象とするレジオネラ菌の糖鎖抗原型は、血清型１型を除く血清型２型〜６型から選択される１種又は２種以上であることが好ましく、１型をさらに含んでいてもよい。
【００６９】
以下に示すプローブは、いずれも、図１８〜図３２に記載の血清型１型のLPS合成遺伝子クラスター（糖鎖抗原合成遺伝子クラスター）を標的とするプローブ群から選択されるものであるが、血清型１型〜６型のそれぞれの判別に好ましいプローブである。判別しようとする血清型に対応するプローブに組み合わせて、各プローブに対するハイブリダイゼーション反応性の相違をみることで、その血清型を判別することができる。なお、血清型１型の判別に有用なプローブには、レジオネラ菌の血清型１型のLPS合成遺伝子クラスターの糖転移酵素遺伝子を標的とするプローブ（lpg775、lpg778、lpg779が付されたプローブ）が挙げられ、他の血清型の判別に有用なプローブには、同定された糖転移酵素遺伝子以外の遺伝子に対応するプローブが多く挙げられる。
【表２】
2009225793.tif 000004
【００７０】
本発明のアレイにおいては、以上説明したプローブが固相担体に保持されている。プローブを固相担体の表面に保持させる手法は特に限定されない。プローブの固定化には種々の方法が利用できる。例えば、固相担体のマレイミド基とチオール（−ＳＨ）基（プローブ側）との組合せを用いる方法、固相担体上のエポキシ基とアミノ基（プローブ側）の組み合わせを用いる方法等が挙げられる。また、固相担体表面への各種官能基に導入には、こうした官能基を含有する樹脂のコーティングのほか、各種シランカップリング剤による表面処理等を用いることができる。によって、予めプローブに導入した官能基と反応可能な官能基が導入されていてもよい。なお、プローブへのチオール基の導入は、例えば、5'-Thiol-Modifier C6（Glen Research社製）を用いることにより行うことができる。なお、プローブを固相担体表面に供給する方法も特に限定されない。スタンピング方式であってもよいし、インクジェット方式であってもよい。また、プローブは固相担体上において合成されるものであってもよい。
【００７１】
本発明のアレイの固相担体上には、少なくとも５個以上の糖鎖抗原型を判別するためのプローブを備えていることが好ましく、より好ましくは２０以上の糖鎖抗原型を判別するためのプローブを備えている。また、本発明のアレイが判別対象とする肺炎球菌における糖鎖抗原型は、２３価ワクチンが対象とする２３種の糖鎖抗原型（血清型）の一部又は全部であることが好ましい。また、７価ワクチンが対象とする７種の糖鎖抗原型（血清型）の一部又は全部であることが好ましい。
【００７２】
（微生物の抗原型の判別方法）
本発明の微生物の糖鎖抗原型の判別方法は、本発明のプローブセットを準備する工程と、アレイ上のプローブと試料核酸とを接触させる工程と、プローブに対する核酸ハイブリダイゼーションを検出する工程と、を備えることができる。アレイの準備工程は、上記した本発明のアレイを作製するか、本発明のアレイが供給可能な状態にあれば、予め作製されたものを入手することによって実施できる。
【００７３】
（接触工程）
接触工程は、プローブと、被験体から取得した試料核酸とを接触させる工程である。接触工程では、プローブと試料核酸とが接触されることで、試料核酸中にプローブとハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド断片があればハイブリダイゼーションが生じることになる。プローブと試料核酸とを接触させる条件は、プローブの長さ等を考慮して、適当な温度、塩濃度及びｐＨを設定すればよい。
【００７４】
各種の被験体をそのまま試料核酸として使用できる場合のほか、被験体から試料核酸を取得することができる。試料核酸を取得する方法は特に限定されないで、公知の方法を採用できる。試料核酸の調製にあたっては、単にＤＮＡを抽出するものであってもよいが、好ましくは、ＰＣＲ等の核酸増幅方法により被験体中のＤＮＡを増幅させる。例えば、判別対象微生物のＤＮＡの全体を均一に増幅するプライマーを用いたＰＣＲ産物を試料核酸としてもよいし、糖鎖抗原合成遺伝子相当部分のみを適切なプライマーを利用して増幅してもよい。例えば、cpsクラスターを増幅することが好ましい。このようなプライマーは、cpsクラスターやその近傍の塩基配列を取得することにより適切な塩基配列を決定することができる。なお、試料核酸は、蛍光色素等により標識されていることが好ましい。
【００７５】
（検出工程）
検出工程は、試料核酸のプローブに対する核酸ハイブリダイゼーションを検出する工程である。プローブと試料核酸中のＤＮＡ断片等のハイブリダイゼーションは、各種標識を用いるほか、公知の各種の方法により可能である。標識は、既に記載したように、プローブや試料核酸に付与されていてもよいし、ハイブリダイゼーション後のＤＮＡ断片に付与するものでもあってもよい。検出にあたっては、使用した標識等、ハイブリダイズ産物の検出方法に応じた手法を採用することができる。試料核酸調製時に、Cy3やCy5などの蛍光色素を付加したPCR産物を試料核酸とする場合には、ハイブリダイズ産物をこれらの色素の励起波長に相当する波長でスキャナーを用いることができる。
【００７６】
検出工程では、ハイブリダイズ産物のハイブリダイゼーションに基づき標識等によって発現されるシグナルを検出し、シグナルの有無やその強度に基づくことにより、ハイブリダイゼーションを検出し、それに基づき莢膜抗原型を判別することができる。
【００７７】
例えば、ある糖鎖抗原型に関連付けられるプローブセットの全てのプローブにつきハイブリダイゼーションシグナルを検出できたとき、被験体には当該プローブセットに関連付けられた糖鎖抗原型の微生物が存在しているとの肯定的判定ができる。これらのプローブセットを構成うるプローブの一部にハイブリダイゼーションシグナルを検出できないときには、否定的判定となる。また、あるプローブがある一つの糖鎖抗原型を特異的に判別可能であるとき、このプローブにつきハイブリダイゼーションを検出できれば、被験体には前記一つの糖鎖抗原型の微生物が存在しているとの肯定的判定ができる。また、これらのプローブにつきハイブリダイゼーションを検出できなければ、被験体には、前記一つの糖鎖抗原型の微生物が含まれていないという否定的判定ができる。
【００７８】
（キット）
本発明のキットは、以上説明した本発明のプローブ（配列番号１〜２２２の塩基配及びその相補配列並びにこれらと機能的な同等な塩基配列からなる）、これらのプローブのいずれかを含むプローブセット又はこれらのプローブが固相担体表面に保持されたアレイと、被験体の試料核酸とプローブとの反応を検出するための試薬とを含むことができる。このキットは、典型的には、肺炎球菌の莢膜抗原型判別用とすることができる。また、このキットには、試料核酸の調製のためのＰＣＲプライマーを含めることができる。肺炎球菌を判別対象とするとき、プライマーは、肺炎球菌の全ＤＮＡ領域を増幅するものであってもよいし、cpsクラスターを選択的に増幅できるものであってもよい。また、本発明のキットは、本発明のプローブ（配列番号２２３〜６７１の塩基配及びその相補配列並びにこれらと機能的な同等な塩基配列からなる）、これらのプローブから選択されるプローブを含むプローブセット又はこれらのプローブが固相担体表面に保持されたアレイと、被験体の試料核酸とプローブとの反応を検出するための試薬とを含むことができる。このキットは、典型的には、レジオネラ菌の糖鎖抗原型判別用とすることができる。また、このキットには、肺炎球菌用のキットと同様、レジオネラ菌の全ＤＮＡ領域若しくはその一部、あるいは糖鎖抗原合成遺伝子クラスターの全体若しくはその一部を選択的に増幅可能なＰＣＲプライマーを含めることができる。
【００７９】
本発明の莢膜抗原に基づく抗原型を判別するために用いるプローブの作製方法は、糖鎖抗原を備える微生物の糖鎖抗原の合成に関連付けられる複数の糖転移酵素遺伝子について取得した塩基配列情報に基づいて前記複数の糖転移酵素遺伝子のそれぞれを標的とする複数のプローブの塩基配列を決定する工程、を備えることができる。本発明の作製方法で作製しようとするプローブは、既に説明した、微生物の糖鎖抗原型に関連付けられる複数の糖転移酵素遺伝子を標的とする複数のプローブである。この作製方法によれば、糖鎖抗原型を簡易に判別するためのプローブを容易に得ることができる。糖転移酵素遺伝子の組み合わせ、すなわち、プローブセットの組み合わせに特異性があるため、プローブの塩基配列に特異性を求められず、糖転移酵素遺伝子の保存領域を標的とすることもできる。したがって、プローブを低コストで提供できる。また、こうしたプローブを固相担体上に固定化して、アレイとしてもよい。
【００８０】
本作製方法においてプローブ及びその作製には、上記した本発明のアレイに用いる複数のプロープについての各種実施態様をそのまま適用できる。また、アレイの作製には、上記した本発明のアレイにおける固相担体や固定化方法等についての各種態様をそのまま適用できる。
【実施例】
【００８１】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明する。しかしながら、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００８２】
本実施例では、以下の表３に示す５５種の血清型の肺炎球菌菌株からゲノムＤＮＡを抽出し、標識して核酸試料を調製し、別途作製したアレイに供してハイブリダイゼーションを行わせ、それを検出した。
【表３】
2009225793.tif 000005
【００８３】
（ゲノムDNAの抽出）
肺炎球菌菌株をbrain-heart infusion broth (0.3 % yeast extract添加) 5 mLで37 ℃、5 % CO2で24時間培養した。この培養液2 mLを12,000 ×g、25 ℃、2 min 遠心し、上精を捨て菌体を回収した。50 mM EDTA 450 μLとLysozyme (100 mg/mL) 12 μlを加え、37 ℃、1 時間インキュベートした。その後、Wizard genomic DNA purification kit (Promega)を用いて、添付されたプロトコルに従ってDNA精製を行った。
【００８４】
（サンプル標識）
精製したゲノムDNAを21 μl (500 ng)に調整し、これに2.5×Random Primere Mix (Invitrogen) 20μμlを加えた。95 ℃、5 min インキュベートした後、氷上で急冷した。10×dCTP mix を5μl、Cy3-dCTP またはCy5-dCTP (Invitrogen)を3μl加え、Exo-Klenow Fragment (Invitrogen) を1μl加え、37 ℃、2 時間インキュベートした。標識したサンプルはDNA purification kit (QIAGEN)を用いて精製、40μμlに濃縮した。その後Cy3あるいはCy5で標識したサンプル25μlに3 M 酢酸ナトリウム 5μl、グリコーゲン 1μlを加え混濁し、さらにエタノール125μlを加えて-80 ℃、30 min暗所で静置した後、12,000 ×g、4 ℃、30min遠心して上精を捨て、ペレットを回収した。暗所で5min 風乾した後、Hybridization buffer (25 % ホルムアミド、0.1 % SDS、6×SSPE buffer) 140 μlを加えペレットを懸濁した。暗所に30 min静置した後75 ℃ 8 minインキュベートし、その後42 ℃で30 minインキュベートした。
【００８５】
（アレイの作製）
配列番号１〜２２２の各塩基配列からなるプローブのほか、ポジティブコントロールプローブ（各種ハウスキーピング遺伝子を標的とするプローブ計２６種）及びネガティブコントロールプローブ（他の微生物の遺伝子を標的とするプローブ計２６種）の合計２７４種を用いてアレイを作製した。本実施例では、インクジェット方式（圧電駆動方式）のマイクロアレイ製造装置を用いた。具体的な、作製条件は以下の通りであった。
（１）プローブ合成：鎖長６０mer又は５９mer，修飾なし，カートリッジ精製
（２）スポット数：２７４
（３）パターン：１３行×１１列を２ブロック（１１列目のみ７行），ピッチ３００μm
（４）固相担体：７６．２ｍｍ×２５.４ｍｍ×１ｍｍ（活性エステル基板）
（５）固相担体へのプローブの供給：
インクジェット方式のマイクロアレイ製造装置に所定のプローブ溶液をセットし、固相担体上に（２）〜（４）の条件でスポットした。
（６）固定化
以下の操作でプローブを固相担体上に固定化した。
a）８０℃で１時間加熱処理をする
b）（２×SSC,０.２%SDS）溶液に１５分間浸漬する（室温）
c）（２×SSC,０.２%SDS）溶液に５分間浸漬する（９５℃）
d）滅菌水中で１０回程度振とうするe）遠心乾燥する
【００８６】
（ハイブリダイゼーション）
作製した標識した試料核酸を作製したDNAアレイに注入し、42℃、72時間インキュベートしハイブリダイゼーションを行った。また、血清型6Bの試料核酸と血清型14の試料核酸とを単一でハイブリダイゼーションするときのそれぞれ半量づつを用いた試料核酸を別に調製して、ハイブリダイゼーション行った。なお、ハイブリダイゼーション溶液の組成は(25 % ホルムアミド、0.1 % SDS、6×SSPE buffer) の組成であった。
【００８７】
（蛍光測定）
ハイブリダイゼーション後、アレイをBuffer A(1×SSC/0.1 %SDS)、Buffer B(0.05×SSC)、Buffer C(95 % エタノール)で洗浄した。アレイの測定はDNA Microarray Scanner G2565BA (Agilent)で行った。結果の一例(血清型１及び１２Ｆ)を図１０及び図１１に示す。各図においては、バックグラウンドデータも併せて示している。
【００８８】
図１０及び図１１に示すように、それぞれの血清型の肺炎球菌株に由来した試料核酸を用いたとき、試料核酸は、対応する血清型特異的プローブとハイブリダイゼーションし、使用した蛍光色素に由来する蛍光として検出することができた。また、他の血清型全てについても、同様に血清型特異的プローブとの特徴的なハイブリダイゼーションを検出できた。以上の結果からこれらのプローブが血清型（莢膜抗原型）の判別に極めて有効であることがわかった。また、図１０及び図１１から明らかなように、各血清型から取得した試料核酸が血清型特異的プローブについての特徴的な蛍光強度分布（スペクトル）を呈することにより、各血清型を明瞭かつ簡易に判別できることがわかった。
【００８９】
さらに、図１２及び図１３に示すように、血清型6Bの試料核酸と血清型14の試料核酸の混合試料核酸を用いたとき、それぞれの試料核酸は、それぞれの血清型特異的プローブとハイブリダイゼーションした。以上のことから、これらのプローブは、cpsクラスターの比較的近接した領域を標的とするが、交差してハイブリダイゼーションすることなく高い特異性でハイブリダイゼーションできることが確認された。
【００９０】
従来法である非特許文献１および２の方法では血清型18A、18B、18C、および18Fの判別が不可能である。本アレイの実施例には血清型18Bあるいは18Cであることが判別できるプローブが搭載されている。具体的には、以下の14プローブは血清型18Bおよび18Cに特異的に反応するよう設計されている；17F+18C+23F-8-1、17F+18C+23F-8-2、17F+18C+23F-8-3、18C-9-1、18C-9-2、18C-10-1、18C-10-2、18C-10-3、18C-11-1、18C-11-2、18C-11-3、18C-12-1、18C-13-2、18C-13-3。莢膜膨化試験によりすでに血清型18B、および18Cであることが判明している株を本方法に供したところ、図１４及び図１５に示すように、各株はそれぞれの血清型特異的プローブとハイブリダイゼーションし、血清型18Bあるいは18Cであることが判定可能であった。
【００９１】
従来法である非特許文献１および２の方法では血清型10C、10F、11A、11D、11Fの判別が不可能である。本アレイの実施例に搭載されたプローブはこれらを区別することができるよう設計されている。具体的には血清型11Cであれば11A-9-1のみ、血清型11Fであれば11A-9-3、11A-10-1、11A-10-2、11A-10-3、11A-12-1、11A-12-2、11A-12-3の7プローブがそれぞれ特異的に反応するよう設計されている。同様に11Aあるいは11D、10C、10Fも反応したプローブにより判別する事が可能である。莢膜膨化試験によりすでに11C、あるいは11Fであることが判明している株を本方法に供したところ、図１６及び図１７に示すように、各株はそれぞれの血清型特異的プローブとハイブリダイゼーションし、それぞれ11Cあるいは11Fとして判定可能であった。
【実施例２】
【００９２】
本実施例では、以下の表４に示す６種の血清型のレジオネラ菌の菌株からゲノムＤＮＡを抽出し、標識して核酸試料を調製し、別途作製したアレイに供してハイブリダイゼーションを行わせ、それを検出した。また、否定的判断材料として大腸菌(Escherichia coli)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumophila)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)のゲノムDNAも同様の処理を行った。
【表４】
2009225793.tif 000006
【００９３】
（ゲノムDNAの抽出）
レジオネラ菌菌株を人工培地(酵母エキス1%、ACES 1%、αケトグルタル酸 1.5%、L-システイン塩酸塩 0.04%、ピロリン酸第二鉄 0.025%)5 mLで37 ℃、72時間培養した。この培養液2 mｌを12,000 ×g、25 ℃、2分 遠心し、上精を捨て菌体を回収した。50 mM EDTA 450 μｌとLysozyme (100 mg/mL) 12 μｌを加え、37 ℃、1 時間インキュベートした。その後、Wizard genomic DNA purification kit (Promega)を用いて、添付されたプロトコルに従ってDNA精製を行った。
【００９４】
（サンプル標識）
精製したゲノムDNAを21 μｌ (500 ng)に調整し、これに2.5×Random Primere Mix (Invitrogen) 20μｌを加えた。95 ℃、5 分 インキュベートした後、氷上で急冷した。10×dCTP mix を5μｌ、Cy3-dCTP またはCy5-dCTP (Invitrogen)を3μｌ加え、Exo-Klenow Fragment (Invitrogen) を1μｌ加え、37 ℃、2 時間インキュベートした。標識したサンプルはDNA purification kit (QIAGEN)を用いて精製、40μｌに濃縮した。その後Cy3あるいはCy5で標識したサンプル25μｌに3 M 酢酸ナトリウム 5μｌ、グリコーゲン 1μｌを加え混濁し、さらにエタノール125μｌを加えて-80 ℃、30分暗所で静置した後、12,000 ×g、4 ℃、30分遠心して上精を捨て、ペレットを回収した。暗所で5分風乾した後、Hybridization buffer (25 % ホルムアミド、0.1 % SDS、6×SSPE buffer) 140 μｌを加えペレットを懸濁した。暗所に30 分静置した後75 ℃ 8分インキュベートし、その後42 ℃で30 分インキュベートした。
【００９５】
（アレイの作製）
図１８〜図３２（配列番号２２３〜６７１）の各塩基配列からなるプローブのほか、ポジティブコントロールプローブ（各種ハウスキーピング遺伝子を標的とするプローブ計２７種）及びネガティブコントロールプローブ（他の微生物の遺伝子を標的とするプローブ計２１種）の合計４９７種を用いてアレイを作製した。本実施例では、インクジェット方式（圧電駆動方式）のマイクロアレイ製造装置を用いた。具体的な、作製条件は以下の通りであった。配列番号２２３〜６７１で表される各塩基配列からなるプローブは、上記血清型１型のレジオネラ菌の糖転移酵素遺伝子を含む糖鎖抗原合成遺伝子クラスターに含まれる遺伝子を標的として作製した。
（１）プローブ合成：鎖長６０mer又は５９mer，修飾なし，カートリッジ精製
（２）スポット数：４９７
（３）パターン：１３行×１１列を４ブロック，ピッチ３００μm
（４）固相担体：７６．２ｍｍ×２５.４ｍｍ×１ｍｍ（活性エステル基板）
（５）固相担体へのプローブの供給：
インクジェット方式のマイクロアレイ製造装置に所定のプローブ溶液をセットし、固相担体上に（２）〜（４）の条件でスポットした。
（６）固定化
以下の操作でプローブを固相担体上に固定化した。
a）８０℃で１時間加熱処理をする
b）（２×SSC,０.２%SDS）溶液に１５分間浸漬する（室温）
c）（２×SSC,０.２%SDS）溶液に５分間浸漬する（９５℃）
d）滅菌水中で１０回程度振とうするe）遠心乾燥する
【００９６】
（ハイブリダイゼーション）
作製した標識した試料核酸を作製したDNAアレイに注入し、42℃、72時間インキュベートしハイブリダイゼーションを行った。また、血清型6Bの試料核酸と血清型14の試料核酸とを単一でハイブリダイゼーションするときのそれぞれ半量づつを用いた試料核酸を別に調製して、ハイブリダイゼーション行った。なお、ハイブリダイゼーション溶液の組成は(25 % ホルムアミド、0.1 % SDS、6×SSPE buffer) の組成であった。
【００９７】
（蛍光測定）
ハイブリダイゼーション後、アレイをBuffer A(1×SSC/0.1 %SDS)、Buffer B(0.05×SSC)、Buffer C(95 % エタノール)で洗浄した。アレイの測定はDNA Microarray Scanner G2565BA (Agilent)で行った。 血清型１型〜６型についての蛍光シグナル強度の分布を図３３〜図３８に示す。各図の上段においては、配列番号２２３〜６７１に記載のプローブを、遺伝子番号のより小さいプローブが左側になるように（配列番号がより大きい方が左側になるように）配列してグラフ化されている。また、バックグラウンドデータも併せて示している。これら各図の下段には、血清型１型〜６型を判別するように有効なプローブを選択して配列したグラフが示されている。また、図３９〜図４１に、否定的判断材料となる菌についての結果を示す。
【００９８】
図３３〜図３８の各図に示すように、各血清型のレジオネラ菌株に由来した試料核酸は、アレイ上のプローブ群と血清型に特異的なハイブリダイゼーション反応が生じて、それぞれの血清型に特有の蛍光強度分布（スペクトル）が得られた（各図の上段のグラフ参照）。また、これらの各図の下段に示す、各血清型の判別に有効であると選択したプローブについてグラフ化すると、さらに各血清型に特有の蛍光強度のスペクトルが得られた。血清型１型菌株に由来する試料核酸は、多くのプローブとハイブリダイゼーション反応が生じ、多くのプローブについて蛍光シグナルが得られた。また、血清型１型の糖鎖抗原合成遺伝子クラスター内の糖転移酵素遺伝子（lpg0775、lpg0778、lpg0779）をそれぞれ標的とするlpg0775_01、lpg0775_02、lpg0775_03、lpg0775_04、lpg0775_05、lpg0775_06、lpg0775_07、lpg0775_08、lpg0775_09、lpg0775_10、lpg0778_01、lpg0778_02、lpg0778_03、lpg0778_04、lpg0778_05、lpg0778_06、lpg0778_07、lpg0778_08、lpg0778_09、lpg0778_10、lpg0778_11、lpg0779_01、lpg0779_02、lpg0779_03、lpg0779_04、lpg0779_05、lpg0779_06、lpg0779_07、lpg0779_08、lpg0779_09、lpg0779_10、lpg0779_11、lpg0779_12及びlpg0779_13のプローブ（図３３〜図３８の下段においてＧＴａｓｅｇｅｎｅｓのフレーム内に左側から順に記載されている。）は、血清型１型由来の試料核酸と特異的にハイブリダイゼーションし、他の血清型２型〜６型と区別可能であった。すなわち、これらのプローブから選択される１種又は２種以上、好ましくは、２以上の糖転移酵素遺伝子を標的とする２種以上のプローブを用いることで血清型２型〜６型と明確に区別できることがわかった。
【００９９】
また、血清型２型菌株に由来する試料核酸は、図３４の上段に示すように、他の血清型とは異なる蛍光強度のスペクトルを示した。また、図３４の下段に示すように、lpg0753_13、lpg0752_10、lpg0758_01、lpg0755_01、lpg0746_06、lpg0759_18、lpg0750_03、lpg0757_10、lpg0750_06（図３３〜図３８の下段においてＳＴ２のフレーム内に左側から順に記載されている）及びlpg0779_09（ＧＴｇｅｎｅのフレーム内にある。）について、血清型１型及び３型〜６型と区別可能な特異的なシグナルを示した。すなわち、これらのプローブから選択される１種又は２種以上は、血清型２型を判別するのに有効なプローブであることがわかった。
血清型３型菌株に由来する試料核酸は、図３５の上段に示すように、他の血清型とは異なる蛍光強度のスペクトルを示した。また、図３５の下段に示すように、lpg0746_14、lpg0750_07、lpg0758_08、lpg0746_08、lpg0753_03、lpg0748_17、lpg0751_04、lpg0759_05、lpg0756_07及びlpg0761_01（図３３〜図３８の下段においてＳＴ３のフレーム内に左側から順に記載されている）について、血清型１型、２型及び４型〜６型と区別可能な特異的なシグナルを示した。すなわち、これらのプローブから選択される１種又は２種以上は、血清型３型を判別するのに有効なプローブであることがわかった。
血清型４型菌株に由来する試料核酸は、図３６の上段に示すように、他の血清型とは異なる蛍光強度のスペクトルを示した。また、図３６の下段に示すように、lpg0758_11、lpg0759_16、lpg0753_11、lpg0760_02、lpg0758_06、lpg0752_01、lpg0760_03、lpg0759_09、lpg0760_07、lpg0759_03（図３３〜図３８の下段においてＳＴ４のフレーム内に左側から順に記載されている）について、血清型１型〜３型及び５型、６型と区別可能な特異的なシグナルを示した。すなわち、これらのプローブから選択される１種又は２種以上は、血清型４型を判別するのに有効なプローブであることがわかった。
血清型５型菌株に由来する試料核酸は、図３７の上段に示すように、他の血清型とは異なる蛍光強度のスペクトルを示した。また、図３７の下段に示すように、lpg0780_09、lpg0755_09、lpg0759_17、lpg0760_11、lpg0757_07、lpg0747_01、lpg0752_06、lpg0746_17、lpg0780_08、lpg0759_02（図３３〜図３８の下段においてＳＴ５のフレーム内に左側から順に記載されている）について、血清型１型〜４型及び６型と区別可能な特異的なシグナルを示した。すなわち、これらのプローブから選択される１種又は２種以上は、血清型５型を判別するのに有効なプローブであることがわかった。
血清型６型菌株に由来する試料核酸は、図３８の上段に示すように、他の血清型とは異なる蛍光強度のスペクトルを示した。また、図３８の下段に示すように、lpg0749_03、lpg0757_08、lpg0746_16、lpg0751_01、lpg0750_02、lpg0748_12、lpg0746_10、lpg0748_13、lpg0782_10、lpg0760_07（図３３〜図３８の下段においてＳＴ６のフレーム内に左側から順に記載されている）について、血清型１型〜４型及び６型と区別可能な特異的なシグナルを示した。すなわち、これらのプローブから選択される１種又は２種以上は、血清型６型を判別するのに有効なプローブであることがわかった。
【０１００】
以上のことから、アレイに固定したプローブセットは、血清型１型〜６型をそれぞれ特異的に検出できるプローブセットであることがわかった。また、これらのプローブセットによって各血清型を明瞭かつ簡易に判別できることがわかった。さらに、これらのプローブセットから選択される、各血清型とそれぞれ特徴的なハイブリダイゼーション反応を呈するプローブのセット（上記参照）によっても、各血清型を明瞭かつ簡易に判別できることがわかった。以上のように、特定の血清型の糖鎖抗原合成遺伝子クラスターを網羅するプローブを用いて、他の血清型の糖鎖抗原合成遺伝子クラスターの試料核酸とのハイブリダイゼーション反応性を評価することで、他の血清型の判別に有効なプローブを選択できることがわかった。かかるプローブは、未だ同定されていない糖転移酵素遺伝子や糖転移酵素遺伝子以外の遺伝子を標的としているものと考えられる。
【０１０１】
さらに、図３９〜図４１に示すように、大腸菌(Escherichia coli)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumophila)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)のゲノムDNAを用いた場合、本アレイのネガティブコントロールとして搭載しているプローブとハイブリダイゼーションし、レジオネラ菌に特異的なプローブとはハイブリダイゼーションしなかった。以上のことから、異なる菌種のゲノムDNAが含まれていても、レジオネラ菌と明瞭に区別できることがわかった。
【配列表フリーテキスト】
【０１０２】
配列番号１〜６７１：プローブ
【図１】
2009225793.tif 000007
【図２】
2009225793.tif 000008
【図３】
2009225793.tif 000009
【図４】
2009225793.tif 000010
【図５】
2009225793.tif 000011
【図６】
2009225793.tif 000012
【図７】
2009225793.tif 000013
【図８】
2009225793.tif 000014
【図９】
2009225793.tif 000015
【図１０】
2009225793.tif 000016
【図１１】
2009225793.tif 000017
【図１２】
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【図１３】
2009225793.tif 000019
【図１４】
2009225793.tif 000020
【図１５】
2009225793.tif 000021
【図１６】
2009225793.tif 000022
【図１７】
2009225793.tif 000023
【図１８】
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【図１９】
2009225793.tif 000025
【図２０】
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【図２１】
2009225793.tif 000027
【図２２】
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【図２３】
2009225793.tif 000029
【図２４】
2009225793.tif 000030
【図２５】
2009225793.tif 000031
【図２６】
2009225793.tif 000032
【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【配列表】
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