(57)【要約】      （修正有）【課題】下痢または感染性下痢を予防、または治療することにおいて、芳香族化合物の医薬または獣医的の使用および組成物を提供する。【解決手段】該組成物は、式（Ｉ）に対応し、最も好ましくはクロトリマゾールまたはその代謝物（特に、２−クロロフェニル−ビス−フェニル−メタノール）またはミコナゾールまたはエコナゾールである。2009007368.tif 000017【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下痢治療のための薬剤の製造における芳香族化合物の使用であって、該芳香族化合物が一般式：
【化１】
2009007368.tif 000007
式中、ｎ＝０−３、ｐ＝０または１、Ｘは（ＣＨ２）ｍ（ｍ＝0，１，２または３）、ＣＨ＝ＣＨ、ＣＸ≡Ｃ、ＳＣＨ２、ＯＣＨ２およびＮＯＣＨ２からなる群から選ばれ、Ｒ’はＨ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＨＯ、ＯＮＨ２、ＣＯＨ、ＣＯＲ”、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ”、ＯＲ”、ＳＲ”、ＮＲ”Ｒ”、ＣＯＮＲ”Ｒ”、ヘテロアリールおよびＣＯＮＲ”（ＯＣＨ３）からなる群から選ばれ、Ａｒ１はフェニル、置換フェニルおよびヘテロアリールからなる群から選ばれ、Ａｒ２はフェニルおよび置換フェニルからなる群から選ばれ、Ａｒ３はフェニル、置換フェニル、ビフェニル、ビベンジルおよびナフチルからなる群から選ばれ、フェニル置換基はＣｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、Ｒ、ＯＲ”、ＳＲ”、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＦ３、ＮＲ”Ｒ”およびＣＯ２Ｒからなる群から選ばれ、ＲはＣＺ（ｚ＝１−５）の直鎖アルキル、ＣＺ（ｚ＝１−５）の置換直鎖アルキル、ＣＺ（ｚ＝１−５）の分枝アルキルおよび ＣＺ（ｚ＝１−５）の置換分枝アルキルからなる群から選ばれ、アルキル置換基はＣｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＮＨ２、ＮＨＣＨ３およびＮ（ＣＨ３）２からなる群から選ばれ、Ｒ”は水素原子およびＲからなる群から選ばれる、を有する、前記使用。
【請求項２】
芳香族化合物がクロトリマゾールである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
芳香族化合物が、
【化２】
2009007368.tif 000008
からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
芳香族化合物が経口的に投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
対象がヒトである、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
対象に抗下痢剤を投与することをさらに含む、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
抗下痢剤が経口再水和液である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
芳香族化合物が２−クロロフェニル−ビス−フェニル−メタノールであり、次式：
【化３】
2009007368.tif 000009
を有する、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
対象の感染性下痢を抑制するために有効な量の芳香族化合物および抗感染性下痢剤を含む獣医製剤であって、該芳香族化合物が一般式：
【化４】
2009007368.tif 000010
式中、n＝０−３、p＝０または１、Ｘは（ＣＨ２）ｍ（ｍ＝0，１，２または３）、ＣＨ＝ＣＨ、Ｃ≡Ｃ、ＳＣＨ２、ＯＣＨ２およびＮＯＣＨ２からなる群から選ばれ、Ｒ’はＨ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＨＯ、ＯＮＨ２、ＣＯＨ、ＣＯＲ”、ＣＯ２Ｈ、 ＣＯ２Ｒ”、ＯＲ”、 ＳＲ”、ＮＲ”Ｒ”、ＣＯＮＲ”Ｒ”、ヘテロアリールおよびＣＯＮＲ”（ＯＣＨ３）からなる群から選ばれ、Ａｒ１はフェニル、置換フェニルおよびヘテロアリールからなる群から選ばれ、Ａｒ２はフェニルおよび置換フェニルからなる群から選ばれ、Ａｒ３はフェニル、置換フェニル、ビフェニル、ビベンジルおよびナフチルからなる群から選ばれ、フェニル置換基はＣｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、Ｒ、ＯＲ”、ＳＲ”、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＦ３、ＮＲ”Ｒ”およびＣＯ２Ｒからなる群から選ばれ、ＲはＣＺ（ｚ＝１−５）の直鎖アルキル、ＣＺ（ｚ＝１−５）の置換直鎖アルキル、ＣＺ（ｚ＝１−５）の分枝アルキルおよび ＣＺ（ｚ＝１−５）の置換分枝アルキルからなる群から選ばれ、アルキル置換基はＣｌ、Ｂｒ、Ｆ、 Ｉ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＳＨ、 ＳＣＨ３、ＮＨ２、ＮＨＣＨ３およびＮ（ＣＨ３）２からなる群から選ばれ、Ｒ”は水素原子およびＲからなる群から選ばれる、を有する、前記獣医製剤。
【請求項１０】
芳香族化合物がクロトリマゾールである、請求項９に記載の獣医製剤。
【請求項１１】
抗感染性下痢剤が初乳抽出物である、請求項９に記載の獣医製剤。
【請求項１２】
抗感染性下痢剤が初乳の免疫製剤である、請求項９に記載の獣医製剤。
【請求項１３】
抗感染性下痢剤が微生物特異的免疫製剤である、請求項９に記載の獣医製剤。
【請求項１４】
抗感染性下痢剤が経口再水和液である、請求項９に記載の獣医製剤。
【請求項１５】
抗感染性下痢剤が置換電解質組成物である、請求項９に記載の獣医製剤。
【請求項１６】
抗感染性下痢剤が抗生物質組成物である、請求項９に記載の獣医製剤。
【請求項１７】
獣医製剤が乾燥製剤である、請求項９に記載の獣医製剤。
【請求項１８】
芳香族化合物が２−クロロフェニル−ビス−フェニル−メタノールであり、次式：
【化５】
2009007368.tif 000011
を有する、請求項９に記載の獣医製剤。
【請求項１９】
下痢を抑制するために有効な量の芳香族化合物および抗下痢剤を含む医薬製剤であって、該芳香族化合物が一般式：
【化６】
2009007368.tif 000012
式中、ｎ＝０−３、ｐ＝０または１、Ｘは（ＣＨ２）ｍ（ｍ＝0，１，２または３）、ＣＨ＝ＣＨ、Ｃ≡Ｃ、ＳＣＨ２、ＯＣＨ２およびＮＯＣＨ２からなる群から選ばれ、Ｒ’はＨ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＨＯ、ＯＮＨ２、ＣＯＨ、ＣＯＲ”、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ”、ＯＲ”、ＳＲ”、ＮＲ”Ｒ”、ＣＯＮＲ”Ｒ”、ヘテロアリールおよびＣＯＮＲ”（ＯＣＨ３）からなる群から選ばれ、Ａｒ１はフェニル、置換フェニルおよびヘテロアリールからなる群から選ばれ、 Ａｒ２はフェニルおよび置換フェニルからなる群から選ばれ、Ａｒ３はフェニル、置換フェニル、ビフェニル、ビベンジルおよびナフチルからなる群から選ばれ、フェニル置換基はＣｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、Ｒ、ＯＲ”、ＳＲ”、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＦ３、ＮＲ”Ｒ”およびＣＯ２Ｒからなる群から選ばれ、ＲはＣＺ（ｚ＝１−５）の直鎖アルキル、ＣＺ（ｚ＝１−５）の置換直鎖アルキル、ＣＺ（ｚ＝１−５）の分枝アルキルおよび ＣＺ（ｚ＝１−５）の置換分枝アルキルからなる群から選ばれ、アルキル置換基はＣｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＮＨ２、ＮＨＣＨ３およびＮ（ＣＨ３）２からなる群から選ばれ、Ｒ”は水素原子およびＲからなる群から選ばれる、を有する、前記医薬製剤。
【請求項２０】
芳香族化合物が２−クロロフェニル−ビス−フェニル  メタノールであり、次式：
【化７】
2009007368.tif 000013
を有する、請求項１９に記載の医薬製剤。
【請求項２１】
芳香族化合物がクロトリマゾールである、請求項１９に記載の医薬製剤。
【請求項２２】
抗下痢剤が経口再水和液である、請求項１９に記載の獣医製剤。
【請求項２３】
抗下痢剤が抗生物質である、、請求項１９に記載の医薬製剤。
【請求項２４】
抗下痢剤が電解質組成物である、請求項１９に記載の医薬製剤。
【請求項２５】
抗下痢剤が牛初乳からの免疫製剤である、請求項１９に記載の医薬製剤。
【請求項２６】
抗下痢剤が経口糖−電解質溶液である、請求項１９に記載の医薬製剤。
【請求項２７】
下痢の治療のための薬剤の製造における芳香族化合物の使用であって、該芳香族化合物がミコナゾールおよびエコナゾールからなる群から選択される、前記使用。
【請求項２８】
感染性下痢を治療するための方法であって、そのような治療の必要な対象に、感染性下痢を抑制するために有効な量の芳香族化合物を投与する段階を含み、該芳香族化合物がミコナゾールおよびエコナゾールからなる群から選択される、前記方法。
【請求項２９】
感染性下痢の治療方法であって、そのような治療の必要な対象に、感染性下痢を抑制するために有効な量の芳香族化合物を投与する段階を含み、該芳香族化合物が一般式：
【化８】
2009007368.tif 000014
式中、ｎ＝０−３、ｐ＝０または１、Ｘは（ＣＨ２）ｍ（ｍ＝0，１，２または３）、ＣＨ＝ＣＨ、Ｃ≡Ｃ、ＳＣＨ２、ＯＣＨ２およびＮＯＣＨ２からなる群から選ばれ、Ｒ’はＨ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＨＯ、ＯＮＨ２、ＣＯＨ、ＣＯＲ”、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ”、ＯＲ”、ＳＲ”、ＮＲ”Ｒ”、ＣＯＮＲ”Ｒ”、ヘテロアリールおよびＣＯＮＲ”（ＯＣＨ３）からなる群から選ばれ、Ａｒ１はフェニル、置換フェニルおよびヘテロアリールからなる群から選ばれ、 Ａｒ２はフェニルおよび置換フェニルからなる群から選ばれ、 Ａｒ３はフェニル、置換フェニル、ビフェニル、ビベンジルおよびナフチルからなる群から選ばれ、フェニル置換基はＣｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、Ｒ、ＯＲ”、ＳＲ”、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＦ３、ＮＲ”Ｒ”およびＣＯ２Ｒからなる群から選ばれ、ＲはＣＺ（ｚ＝１−５）の直鎖アルキル、ＣＺ（ｚ＝１−５）の置換直鎖アルキル、ＣＺ（ｚ＝１−５）の分枝アルキルおよび ＣＺ（ｚ＝１−５）の置換分枝アルキルからなる群から選ばれ、アルキル置換基はＣｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＮＨ２、ＮＨＣＨ３およびＮ（ＣＨ３）２からなる群から選ばれ、Ｒ”は水素原子およびＲからなる群から選ばれる段階を有する、前記方法。
【請求項３０】
芳香族化合物がクロトリマゾールである、請求項２９に記載の感染性下痢の治療方法。
【請求項３１】
芳香族化合物が、
【化９】
2009007368.tif 000015
からなる群から選択される、請求項２９に記載の感染性下痢の治療方法。  
【請求項３２】
芳香族化合物が経口的に投与される、請求項２９に記載の感染性下痢の治療方法。
【請求項３３】
対象が馬、牛、ブタおよび山羊からなる群から選ばれる、請求項２９に記載の感染性下痢の治療方法。
【請求項３４】
対象に抗感染性下痢剤を投与することをさらに含む、請求項２９に記載の感染性下痢の治療方法。
【請求項３５】
芳香族化合物が２−クロロフェニル−ビス−フェニル−メタノールであり、次式：
【化１０】
2009007368.tif 000016
を有する、請求項２９に記載の感染性下痢の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は下痢および感染性下痢を治療するための方法および製造物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
急性および慢性の下痢は世界の多くの地域において主要な医学的課題を示している。下痢は栄養失調の重要な因子であり、５才にならない子供の主要な死（５，０００，０００死亡／年）の原因でもある。分泌性下痢は、後天性免疫不全症候群（エイズ）および慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の患者において危険な状態でもある。先進国から途上国への毎年１６００万人の旅行者は旅行先の国や地域によって異なる重症度と数の下痢を発症している。下痢疾患の主な医学的結果は脱水、アシドーシス、死および成長不全を含む。
【０００３】
牛、ブタ、馬、羊、山羊、猫、犬等の家畜やペットの下痢は、感染性下痢としても知られ、これら動物の死の主たる原因である。下痢は、離乳とか肉体的な動き等のなんらかの大きな変化から生じる。下痢の一つの形は、細菌またはウイルス感染による下痢を特徴とし、一般的に動物の生命の初めの数時間内におこる。
【０００４】
下痢疾患の主な結果は非常に似ているが、数多くの原因の下痢がある。分泌性および滲出性下痢は、主として細菌またはウイルス感染によっておこる。最も普通の下痢をおこす細菌は、Ｋ９９線毛抗原を有する腸毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）である。下痢の普通のウイルス性の原因は、ロタウイルスおよびコロナウイルスである。他の感染性のものは、クリプトスポリジウム、ランブル鞭毛虫、サルモネラ等である。
【０００５】
下痢治療は、患者や感染源による。先進国への旅行者に見られる下痢（旅行者の下痢）は、しばしば糞に汚染された食物および／または水の摂取によって入る細菌性病原体によっておこる。これらの場合の約５０−７５％はＥＴＥＣによる。旅行者の下痢は苦痛ではあるが、一般に生命に危険はなく、しばしば症状は３−５日続く。症状には、緊急な下痢、腹部痙攣、悪心および熱である。旅行者の下痢の最も効果的な治療手段は、経口再水和剤とともに抗生物質の投与である。抗生物質の予防的な投与は、旅行者の経験する下痢の数多くの症状を劇的に軽減する。しかし、抗生物質の常用投与は、それが耐性菌株を生じさせることになるので推奨されない。他の治療方法としては、次サリチル酸ビスマスの投与であり、しばしばペプトービスマル、ジフェノキシレートおよびロペラミドのかたちをとる。
【０００６】
エイズ患者の下痢は消耗をおこす非常にきびしい状態であり、これら患者の衰弱の重要な因子である。エイズ患者は、しばしば彼等の免疫システムが戦えない腸感染による下痢をおこすが、またエイズ患者はエイズ腸症による下痢をおこす。エイズ腸症は二次感染を含まぬ下痢を特徴とする疾患である。それは小腸粘膜細胞および結腸粘膜細胞のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染によっておこる。エイズ患者の腸感染による下痢をおこす最も普通の感染物はクリプトスポリジウム（cryptosporidium）である。エイズ患者の下痢を治療する方法は、抗生物質の投与および免疫グロブリンまたは牛初乳の免疫グロブリンに富む分画の投与を含む。出産後哺乳動物によってつくられる初めのミルクである初乳は抗体に富んでいる。
【０００７】
急性下痢または感染姓下痢は、子牛や子ブタのような多くの家畜の死の主たる原因である。感染姓下痢はしばしばＫ９９線毛抗原を有するＥＴＥＣによっておこる。 ＥＴＥＣによる感染は液および電解質の過分泌をおこす。過分泌は次いで新生の子牛や子ブタの死を生じさせる脱水およびｐＨインバランスを生じる。
【０００８】
また新生の家畜は感染姓下痢を生じるウイルス感染物にかかり易い。ロタウイルスおよびコロナウイルスによる感染は新生の子牛や子ブタでは普通である。ロタウイルス感染はしばしば出生１２時間以内におこる。ロタウイルス感染の症状は水様便の排泄、脱水および衰弱を含む。新生動物のもっと重症をおこすコロナウイルスは、ロタウイルス感染よりも高い死亡率を有する。しかし、しばしば若い動物は、一度に一つ以上のウイルスまたはウイルスと細菌性微生物の組み合わせによって感染する。これは疾患の重症度を劇的に増す。
【０００９】
ウイルスまたは細菌感染から新生家畜の一番の保護は初乳を使うことである。母親の動物がこれらの感染物にさらされてきたならば、抗体を有しており、これがしばしば新生児を病気から守るのに十分である。しかし、時々これが十分でなく、動物はさらなる予防を必要とする。治療の通常の方法は、濃厚な初乳液または初乳液から単離された免疫グロブリン分画の投与である。この経口治療は再水和塩と組み合わせてもよい。これらの方法は感染姓下痢を有する新生動物の罹患率および死亡率を改善したが、未だより効果的な治療に対する要求がある。
【００１０】
クロトリマゾールのようなある種のイミダゾール類は、抗真菌剤として局所的ならびに全身的に用いられてきた。より最近の研究によりそのようなイミダゾール類の他の用途を確認した。USP ５,273,992は、これらイミダゾール類が赤血球におけるＣａ＋＋活性化K＋チャンネルを調節し、従ってカリウム輸送を阻害する鎌状赤血球性貧血を治療することに有効であることを示した。またこれらイミダゾール類は、内皮および／または血管の平滑筋細胞増殖を阻害することに有効であることが発見された。この発見の結果は、USP 5,358，959および動脈硬化および血管再生を各々治療するためにクロトリマゾールを使用することを開示しているUSSN 08／018，840に記載されている。また非イミダゾール代謝物および前記化合物のアナローグが前記状態を治療するのに有効であると記載されている（USSN 08／307，874および08／307，887参照）。
【発明の開示】
【００１１】
発明の要約
本発明は下痢および感染性下痢を治療するための方法および製造物を提供する。芳香族化合物は下痢の患者を治療することに有効であることが発見された。これらの化合物は腸細胞における分泌促進物質刺戟線上皮起電性のクロライド分泌の強力は阻害剤である。
【００１２】
本発明の一側面として、広範な病因の下痢を治療する方法が提供される。この方法はそのような治療を必要としている対象に下痢を防ぐために効果的な量の本発明の芳香属族合物を投与することからなる。好ましくは、化合物を経口再水和液と同時に経口的に投与する。本発明に有用な芳香族化合物は次式を有する：
【化１】
2009007368.tif 000002
式中、n＝０−３、p＝０または１、Ｘは（ＣＨ２）ｍ（ｍ＝0，1，２または３）、ＣＨ＝ＣＨ、Ｃ≡Ｃ、ＳＣＨ２、ＯＣＨ２およびＮＯＣＨ２からなる群から選ばれ、Ｒ'はＨ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＨＯ、ＯＮＨ２、ＣＯＨ、ＣＯＲ”、ＣＯ２Ｈ、 ＣＯ２Ｒ”、ＯＲ”、ＳＲ”、ＮＲ”Ｒ”、ＣＯＮＲ”Ｒ”、ヘテロアリールおよびＣＯＮＲ”（ＯＣＨ３）からなる群から選ばれ、Ａｒ１はフェニル、置換フェニルおよびヘテロアリールからなる群から選ばれ、 Ａｒ２はフェニルおよび置換フェニルからなる群から選ばれ、Ａｒ３はフェニル、置換フェニル、ビフェニル、ビベンジルおよびナフチルからなる群から選ばれ、フェニル置換基はＣｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、Ｒ、ＯＲ”、ＳＲ”、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＦ３、ＮＲ”Ｒ”およびＣＯ２Ｒからなる群から選ばれ、ＲはＣＺ（ｚ＝１−５）の直鎖アルキル、ＣＺ（ｚ＝１−５）の置換直鎖アルキル、ＣＺ（ｚ＝１−５）の分枝アルキルおよび ＣＺ（ｚ＝１−５）の置換分枝アルキルからなる群から選ばれ、アルキル置換基はＣｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＮＨ２、ＮＨＣＨ３およびＮ（ＣＨ３）２からなる群から選ばれ、Ｒ”は水素原子およびＲからなる群から選ばれる。
【００１３】
ヘテロアリール群はフラニル、イミダゾール、ピリジニル、チオフェニル、インドリル、イミダゾリルおよびキノリルを含むが限定はされない。
本発明の好ましい態様において、芳香族化合物はクロトリマゾールまたはクロトリマゾールの代謝物である。
本発明に有用な他の芳香族化合物はミコナゾールまたはエコナゾールである。
本発明の一つの態様において、前記芳香族化合物を他の抗下痢剤と組み合わせて投与してよい。また他の態様において、芳香族化合物を他の抗感染性下痢剤と組み合わして投与してよい。
【００１４】
本発明の一つの態様によれば、そのような治療の必要な対象は下痢または感染性下痢の症状をもつ対象である。本発明の他の態様において、そのような治療の必要な対象は下痢または感染性下痢を進行させる危険のある対象である。
本発明の他の観点によれば、医薬製剤が提供される。これら医薬製剤は抗下痢剤と共に本発明の芳香族化合物を含む。一つの態様において、本発明の有用な芳香族化合物は上記一般式をもつ。他の態様において、本発明の有用な芳香族化合物はミコナゾールまたはエコナゾールからなる群からから選ばれる。さらに他の態様において、本発明の有用な芳香族化合物は上記の一般式を有しているが、式中Ｒ'およびＡｒ１がイミダゾールを含まない。好ましくは、本発明の医薬組成物を経口的に投与してよい。
【００１５】
本発明の他の観点によれば、獣医製剤が提供される。これら獣医製剤は、抗感染性下痢剤と共に本発明の有用な芳香族化合物を含む。一つの態様において、本発明の芳香族化合物は上記一般式をもつ。他の態様において、本発明の有用な芳香族化合物はミコナゾールまたはエコナゾールからなる群からから選ばれる。さらに他の態様において、本発明の有用な芳香族化合物は上記の一般式を有しているが、式中Ｒ'およびＡｒ１がイミダゾールを含まない。
【００１６】
また本発明は、下痢の治療のための薬剤製造における本発明の芳香族化合物を提供する。一つの態様において、本発明の芳香族化合物は上記の一般式をもつが、クロトリマゾールを含まない。他の態様において、下痢の治療のための薬剤製造に有用な芳香族化合物は上記の一般式を有しているが、式中Ｒ'およびＡｒ１がイミダゾールを含まない。
【００１７】
また本発明は感染性下痢の治療のための薬剤製造における本発明の芳香族化合物を提供する。一つの態様において、本発明の芳香族化合物は上記の一般式をもつが、クロトリマゾールを含まない。
他の態様において、感染性下痢の治療のための薬剤製造に有用な芳香族化合物は上記の一般式を有しているが、式中Ｒ'およびＡｒ１がイミダゾールを含まない。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、下痢の症状の軽減または進行する下痢の危険がある対象における下痢を防ぐための方法および製造物からなる。本発明化合物は芳香族化合物である。本発明による有用な芳香族化合物は医薬製剤および獣医製剤において提供される。本発明の芳香族化合物は、下痢および感染性下痢を防ぐ方法のみならず下痢および感染性下痢を治療する方法においても有用である。
【００１９】
本発明に有用であると知られる芳香族化合物は次式を有する：
【化２】
2009007368.tif 000003
式中、n＝０−３、p＝０または１、Ｘは（ＣＨ２）ｍ（ｍ＝0，１，２または３）、ＣＨ＝ＣＨ、Ｃ≡Ｃ、ＳＣＨ２、ＯＣＨ２およびＮＯＣＨ２からなる群から選ばれ、Ｒ'はＨ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＨＯ、ＯＮＨ２、ＣＯＨ、ＣＯＲ”、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ”、ＯＲ”、ＳＲ”、ＮＲ”Ｒ”、ＣＯＮＲ”Ｒ”、ヘテロアリールおよびＣＯＮＲ”（ＯＣＨ３）からなる群から選ばれ、Ａｒ１はフェニル、置換フェニルおよびヘテロアリールからなる群から選ばれ、Ａｒ２はフェニルおよび置換フェニルからなる群から選ばれ、Ａｒ３はフェニル、置換フェニル、ビフェニル、ビベンジルおよびナフチルからなる群から選ばれ、フェニル置換基はＣｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、Ｒ、ＯＲ”、ＳＲ”、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＦ３、ＮＲ”Ｒ”およびＣＯ２Ｒからなる群から選ばれ、ＲはＣＺ（ｚ＝１−５）の直鎖アルキル、ＣＺ（ｚ＝１−５）の置換直鎖アルキル、ＣＺ（ｚ＝１−５）の分枝アルキルおよび ＣＺ（ｚ＝１−５）の置換分枝アルキルからなる群から選ばれ、アルキル置換基はＣｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＮＨ２、ＮＨＣＨ３およびＮ（ＣＨ３）２からなる群から選ばれ、 Ｒ”は水素原子およびＲからなる群から選ばれる。
【００２０】
ヘテロアリール群はフラニル、イミダゾール、ピリジニル、チオフェニル、インドリル、イミダゾリルおよびキノリルを含むが限定はされない。
一つの態様において、本発明の芳香族化合物はクロトリマゾールであり、以下の化学構造を有する。
【化３】
2009007368.tif 000004
【００２１】
本発明により有用とされる他の芳香族化合物はクロトリマゾール代謝物であり、以下の構造を有する。
【化４】
2009007368.tif 000005
【００２２】
本発明により有用とされる他の芳香族化合物は以下の化学構造を有するミコナゾールおよびエコナゾールを含む。
【化５】
2009007368.tif 000006
本発明の芳香族化合物は上市化合物であるか、上市化合物から誘導されるか、または当業者に知られた通常の化学合成法を用いて新たに合成される。
【００２３】
ここで用いられる下痢は、下痢または感染性下痢の症状を特徴とする医学的症候をいう。下痢は、基礎にあるメカニズムに基づいて三つのカテゴリーに分類される。即ち滲出性、減少した吸収性および分泌性である。滲出性下痢は、損なわれた結腸吸収に導く炎症プロセスおよび潰瘍性大腸炎、細菌性赤痢およびアメーバ症のような障害によって起される細胞およびコロイドの流出のためである。減少した吸収性の障害は浸透圧性障害、解剖学的障害および動きの障害を含む。浸透圧下痢はラクトース不耐性のような消化異常の結果として起る。解剖学的障害は結腸亜全切除術および胃大腸壁瘻のような操作によっておこる減少した吸収表面の結果である。動きの障害は、甲状腺機能亢進症および炎症性腸症候群のような疾患から生じる減少する接触時間の結果である。分泌性下痢は、腸壁の細胞から液および電解質の過分泌を特徴とする。古典的なかたちでは、過分泌は透過性、吸収能および腸内の外から生じさせられる浸透圧勾配と無関係な変化による。しかし、全ての下痢は分泌性要素を表わす。
【００２４】
本発明の方法および製造物は、特に分泌性下痢治療に有用である。しかし、本発明の方法および製造物を、減少した吸収性または炎症によって起される下痢を治療するために当該技術で公知の他の方法と組み合わせて使用してもよい。本発明の化合物は、Ｃｌ−分泌を調節することに関与し、液分泌全体を減少するために単独でも機能するが、主として吸収性の異常または炎症による場合でも、または他の治療方法と組み合わせて機能する。
【００２５】
本発明の方法および製造物は、対象が下痢および感染性下痢の障害の危険な状態にさらされることを防ぐことに有用である。下痢および感染性下痢を発症する危険性のある対象とは、これら症状をおこす細菌およびウイルス微生物にさらされる蓋然性の高い対象である。例えば、開発途上国への旅行者の約１／３が下痢になり、ロタウイルスの感染が開発途上国の幼児の死の主たる原因であり、ＨＩＶをもつ患者は、下痢の発症が５０％以上の確率であり、そして多くの新生子牛および子ブタが感染性下痢をおこす。炎症性腸疾患の患者は再発性下痢をおこす。
【００２６】
本発明の方法および製造物は、既に下痢および感染性下痢の症状を示している対象を治療することにおいても有用である。一度対象が症状を起す微生物にさらされると、対象は症状を減じるために本発明の方法および製造物によって治療される。下痢の症状は、腸の不正常、ナトリウムやカリウムに富む便性液、液様便、脱水、発熱、体重減少、頭痛、食欲不振、嘔吐、倦怠症および筋肉痛を含む。感染性下痢の症状は、体重減少または成長不振、脱水、悪臭便、液様便、部分的に消化されたミルクの一部または半固体物質を含む便および黄白色または灰色の便を含む。
【００２７】
本発明の一つの製造物は、本発明の芳香族化合物の獣医製剤であり、それ単独でまたは抗感染性下痢剤と組み合わせて使用される。抗感染性下痢剤は感染性下痢の症状を防いだり阻害することに有用であることが知られている組成物である。公知の組成物は、例えばUSP  4、377，569およびカナダ特許No．1、175，352に記載されたり、広く上市（例えば、溶解性初乳粉、VedCo社、St．Joseph  MO；初乳塊ＩＩ、ＲＸベテナリープロダクト、Kansas City MO等）されている様な初乳抽出物、下痢をおこすある種の微生物に対して免疫されたミルクをつくる哺乳動物から分けられた初乳の免疫製剤であって、USP  4、834、974、オーストラリア特許No．39340/89、オーストラリア特許No．52547/90およびドイツ特許No．1、560，344に記載されているようなもの、Sherman et al、Infection and Immunity、４２巻（２）ページ653‐658（1983）に記載されているような、微生物特異的ハイブリドーマ由来モノクロナル抗体を含む微生物特異的免疫製剤、およびUSP  3、984，539に記載の分画のような牛血漿または澄明な牛血清から製造される牛免疫グロブリン分画、経口再水和液および／または経口や静脈投与ために製造された乾燥組成物または液剤の形で広く上市されている置換電解質組成物、（例えば、電解質Ｈ、Agri‐Pet社、Aubrey  TX；電解質粉８Ｘ、Phoenix  Pharmaceutical社、St．Joseph  MO；電解質溶液Ｒｘ、Lextron社、Greeley社、ProLabs社、St。Joseph MOおよびVetTek社、Blue Springs  ＭO；牛再水和剤、Durvet社、 Blue Spring MO等）および上市されている抗生物質組成物（例えば、商標BIOSOL液、The  UpJohn Company Animal Health Division、Kalamazoo MI；商標AMOXIBOL、SmithKline‐Beecham Animal Health、Exton PA；商標5‐WAY CALF SCOUR BOLUS、Agri Laboratories社、St.Joseph MO；1‐ A‐DAY  CALF SCOUR BOLUS、A. H. A．；商標GARACIN PIG PUMP、Schering‐plough  Animal Health Corporation、Kenilworth  NJ等）を含む。  
【００２８】
一つの態様において、獣医製剤に有用な芳香族化合物はミコナゾール、エコナゾールおよび上記一般式の芳香族化合物を含む。
他の態様において、獣医製剤に有用な芳香族化合物は上記一般式の芳香族化合物を含むが、式中Ｒ'およびＡｒ１はイミダゾールを含まない。
一つの態様において、獣医製剤は本発明の芳香族化合物および抗感染性下痢剤の乾燥製剤である。乾燥製剤を直接投与するか、水和するかおよび／または投与前に溶液剤で希釈する。他の態様において、獣医製剤は本発明の化合物および抗感染性下痢剤の溶液剤である。
【００２９】
本発明の他の製造物は、本発明の芳香族化合物および抗下痢剤の医薬製剤である。抗下痢剤は、例えば、牛初乳からの免疫グロブリン製剤；ロモティル（lomotil）；静脈内または経口再水和液；乾燥再水和組成塩；電解質置換組成物（乾燥または液の形）；経口または静脈内糖−電解質溶液または乾燥組成物；テトラサイクリン、トリメトプリムまたはスルホメトキサゾール等の抗生物質； ノルフロキサシンまたはシプロフロカサシン等のキノロン薬、次サリチル酸ビスマス、ジフェノキシレートおよびロペラミドを含む。
【００３０】
一つの態様において、医薬製剤において有用な芳香族化合物は、ミコナゾール、エコナゾールおよび上記一般式の芳香族化合物を含む。
他の態様において、医薬製剤に有用な芳香族化合物は上記一般式の芳香族化合物を含むが、式中Ｒ'およびＡｒ１はイミダゾールを含まない。
一つの態様において、医薬製剤は本発明の芳香族化合物および抗下痢剤の乾燥製剤である。乾燥製剤を直接投与するか、水和するかおよび／または投与前に溶液剤で希釈する。他の態様において、医薬製剤は本発明の化合物および抗下痢剤の溶液剤である。
ここで用いられる対象は、ヒト、霊長類、馬、牛、羊、ブタ、山羊、猫、犬である。
【００３１】
本発明による有用な芳香族化合物の投与時間は、投与の目的によって変わる。本発明の化合物を、感染物にさらされる高い危険のある地域へ旅行する対象またはさもなければ下痢を起すものにさらされる対象に下痢の発症を防ぐために投与するとき、化合物を対象が危険または高い危険地域にさらされる頃に投与すべきである。化合物を感染性下痢の発症を防ぐために対象に投与するとき、獣医製剤を生後１２時間以内、好ましくは生後の初めの４時間以内に投与すべきである。本発明の化合物を、下痢または感染性下痢の症状を有する対象を治療するために使用するとき、化合物を対象が症状を経験している時ならいつでも、好ましくは症状が発生するとすぐに投与する。
【００３２】
投与する場合、本発明の処方を薬学的に許容される量および薬学的に許容される組成で適用する。そのような製剤は、通常塩、緩衝剤、保存剤、適合担体および任意の他の治療成分を含む。医薬品において使用される場合、塩は薬学的に許容されるべきであるが、薬学的に許容されない塩を、その薬学的に許容される塩を製造するために都合よく使用してよく、本発明の範囲から除外しない。そのような薬理学的および薬学的に許容される塩は、限定されるものではないが、以下の酸、即ち塩酸、臭酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、蟻酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸およびベンゼンスルホン酸を含む。また、薬学的に許容される塩をカルボン酸基のナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩のようなアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩として製造できる。
【００３３】
適当な緩衝剤は、即ち酢酸および塩（１−２％Ｗ／Ｖ）、クエン酸および塩（１−３％Ｗ／Ｖ）、ホウ酸および塩（０．５−２．５％Ｗ／Ｖ）およびリン酸および塩（０．８−２％Ｗ／Ｖ）を含む。
適当な保存剤は、塩化ベンズアルコニウム（０．００３−０．０３％Ｗ／Ｖ）、クロロブタノール（０．３−０．９％Ｗ／Ｖ）、パラベン（０.０１−０.２５％Ｗ／Ｖ）およびチメロサール（０．００４−０．０２％Ｗ／Ｖ）を含む。
【００３４】
本発明の活性化合物は、抗下痢剤と組み合わせて任意に薬学的に許容される担体中に含有される。治療的に有効量の上記一般式の芳香族化合物を有する医薬組成物であることができる。また、本発明の活性化合物は、抗感染性下痢剤と組み合わせて任意に薬学的に許容される担体中に含有される治療的に有効量の上記一般式の芳香族化合物を有する獣医組成物であることができる。ここで使用される“薬学的に許容される担体”という用語は、ヒトまたは動物への投与に適当な一つ以上の適合する固体または液体充填剤、希釈剤またはカプセル化物質を意味する。“担体”という用語は有機または無機成分、天然または合成のものであり、活性成分がその適用を促進するために組み合わされるものを指す。医薬組成物の構成成分は、本発明の化合物と所望の薬学的効果を本質的に損なう相互作用を起こさないように、抗下痢剤または抗感染性下痢剤およびその両方と混合することもできる。
【００３５】
通常の投与媒体（例えば、丸剤、錠剤、ボーラス、希釈用散剤または液剤、ピグポンプ、埋め込み剤、注射液剤等）は、本発明に有用な化合物と抗下痢剤または抗感染性下痢剤とを含有する。従って、本発明は、本発明の活性化合物をその一つ以上の薬学的に許容される担体および他の治療成分と一緒に含む医学または獣医学的使用のための医薬または獣医組成物を提供する。
【００３６】
本発明の処方は有効量で投与される。有効量は、腸上皮細胞のＣｌ−分泌を阻害するために十分な量であり、それによって分泌応答を効果的に下げ、またそれによって下痢または感染性下痢、および／またはそれらの症状の減少となる。勿論有効量は、治療される特殊な状態、即ち状態の重症度、および年齢、肉体的状態、身長および体重を含む個々の患者のパラメター、合併治療、治療頻度および投与モードによる。これらの因子は当業者にはよく知られており、通常の実験の範囲内で行なわれる。一般的に、最大用量を使用するのが好ましく、即ち特に、急性の下痢または感染性下痢が主たる臨床的兆候であるならば正常な医学的判断による最も高い安全用量である。
【００３７】
用量は、所望の薬物血漿濃度を達成するように適宜調節される。一般的に、活性化合物の一日経口用量は、一日約０．０１ミリグラム／ｋｇから１０００ミリグラム／ｋｇである。一日一乃至数回投与で、５０−５００ミリグラム／ｋｇの経口用量は所望の効果を生じることが期待される。対象の対応がそのような用量で不十分である場合、より高い用量（または異なるより局所の送達ルート）を、患者が耐えられる範囲で適用される。一日当たりの投与回数は化合物の適当なレベルを達成するように考慮される。
【００３８】
種々の投与ルートがある。選択される特定のモードは、勿論選択される薬物、治療される下痢または感染性下痢の重症度および治療効果に対して要求される用量による。一般的に言って、本発明の方法は医学的に許容されるいかなる投与モード即ち臨床的に許容されない副作用をおこすことなく活性化合物の効果的レベルを生じるモードを使用して行われる。そのような投与モードは、経口、直腸、局所、経鼻、経皮または非経口ルートを含む。“非経口”という用語は皮下、静脈内、筋肉内または輸液を含む。静脈内および筋肉内ルートは、長期治療および予防にあまり適当ではない。しかし、それらは緊急状態において好ましい。経口投与は、投与スケジュールのみならず患者の都合から、予防的治療に好ましい。
【００３９】
組成物は、好都合には単位用量形態で与えられ、薬学の技術でよく知られているどのような方法によっても製造される。全ての方法は、活性化合物を一つ以上の付加担体と一緒にするステップを含む。一般的に、組成物を、均一かつしっかりと活性化合物を液体担体、細かく砕かれた固体担体またはその両方と一緒にさせ、次いで必要に応じて製造物の形をつけることによって製造する。
【００４０】
経口投与に適する組成物は、カプセル剤、カシェー剤、錠剤またはドロップ剤等の明確な単位としてあたえられ、各々は予め決められた量の活性化合物を含む。他の組成物は、シロップ剤、エリキシール剤または乳剤等の水溶性液剤または非水溶性液剤の懸濁剤を含む。経口的に投与される活性成分は、経口投与に適する形、例えば丸剤、錠剤、ボーラス、飲む溶液剤、食物で希釈または混合される液体または粉の組成物、ピグポンプ等である。
【００４１】
非経口投与に適する組成物は、好都合には投与を受けるものの血液と好ましくは等張である活性化合物の滅菌水剤からなる。この水剤は、適当な分散剤または湿潤剤それと懸濁剤を用いる公知の方法によって処方される。また滅菌注射剤は、例えば１，３−ブタンジオールの溶液のような無毒な非経口的に許容される希釈液または溶媒の非滅菌注射溶液または懸濁液である。許容媒体および溶媒の中で、使用されるものは水、リンゲル液および等張食塩溶液である。加えて、滅菌安定油を好都合に溶媒または懸濁媒体として使用する。この目的のためには、合成モノまたはジグリセリドを含むいかなる無刺戟油も用いられる。加えて、オレイン酸等の脂肪酸は注射剤の製造において使用されることがある。経口、皮下、静脈内、筋肉内等に適する担体処方は、Remington's  Pharmaceutical  Sciences、Mack Publishing 社、Easton PAの中に見い出だされる。
【００４２】
他の送達システムは、時間放出、遅延放出または持続放出の送達システムを含む。そのようなシステムは、本発明の活性化合物の繰り返しの投与をさけることができ、対象および医師により便利である。多くのタイプの放出の送達システムは、利用できかつ当業者に公知である。それらはポリ酢酸およびポリグリコール酸、ポリ無水物およびポリカプロラクトン等のシステムに基づくポリマー、コレステロール、コレステリルエステルおよび脂肪酸等のステロールを含む脂肪またはモノ、ジおよびトリグリセリド等の中性脂肪、ヒドロゲル放出システム、シラスティク(silastic）システム、ペプチドに基づくシステム、ワックス被覆、通常の結合剤および賦形剤を使用する圧縮錠剤、部分的融合埋め込み剤等を含む。特定の例は、但し限定されるものではないが、即ち（ａ）USP4 ,452,775(Kent)、USP 4,667,014(Nestor et al)およびUSP 4，748，034およびUSP 5,239,660（Leonard）に見い出される多糖類をマトリックス内に形にして含むエロジオンシステムおよび（b）USP  3，832，253（Higuchi et al）および3，854，480（Zaffaroni）に見い出される活性成分がポリマーを通してコントロールされた速度で透過する拡散システムを含む。加えて、ポンプに基づくハードウエアー送達システムを使用でき、そのいくつかは埋め込みに合わされる。
【００４３】
長期間持続放出埋め込み剤の使用は、本発明の組成物の持続的投与を必要とする免疫不全患者の下痢の治療に特に適する。ここで用いられる“長期間”放出は、埋め込み剤が活性成分の治療レベルを少なくとも３０日間、好ましくは６０日間送達するように構築されかつ手配される。長期間持続放出埋め込み剤は当業者によく知られており、上記放出システムのいくつかを含む。
【実施例】
【００４４】
実施例  １：クロトリマゾールは腸上皮細胞の水および電解質分泌を阻害する。
分泌性下痢の生化学的基盤は、腸腺窩細胞における腸Ｃｌ−分泌を含む。正常な状態では、 Ｃｌ−をＮａ／Ｋ  ＡＴＰアーゼポンプおよびＮａ／Ｋ／２Ｃｌ共輸送のような一次および二次活性輸送機構によって電気化学ポテンシャルをこえるレベルで腸腺窩細胞内で維持する。 Ｃｌ−は先端（apical）Ｃｌ−チャンネルを通じて腸腺窩細胞から内腔へ輸送される。Ｋ＋、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰおよびＣａ＋＋の細胞内レベルは、全て分泌応答を調節することに含められる。
Ｔ８４細胞は、クロトリマゾールが腸腺窩細胞のＣｌ−分泌を調節するかどうかを決定するために使用された。 Ｔ８４細胞は、円柱上皮の集密的細胞単層を形成し、これが高い経上皮抵抗、分極した先端膜およびバソラテラル（basilateral）膜、および生きた腸で見い出されるのと類似したｃＡＭＰおよびＣａ＋＋調節のＣｌ−分泌経路をを示す。
【００４５】
方法
Ｔ８４細胞の増殖：  ＡＴＣＣから得られたＴ８４細胞を、等部のダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｄ−グルコース１g／ｌおよびHams  Ｆ−１２栄養混合物中で、５％新生牛血清、HEPES  １５ｍＭ、ＮａＨＣＯ３  １４ｍＭ、ペニシリン４０ｍｇ／ｌ，アンピシリン８ｍｇ／ｌおよびストレプトマイシン０．９０ｍｇ／ｌを付加して培養および継代した。細胞を前記のとおり希釈されたラットコラーゲンで被覆した０．３３ｃｍ２または５ｃｍ２トランスウエルインサート(Costar Cambridge, MA)に集密的細胞密度で植えた（Lencer et al J. Clin. Invest.92: 2941‐2951（1993）； Lencer et al、J．Cell  Biol．117：1197−1209（1992））。経上皮抵抗は７日後安定したレベルに達する（＞１０００オーム． ｃｍ２）。高い経上皮抵抗の発生は、形態分析で評価されるよく出来上がった緊密な結合をもつ集密的細胞単層およびＣｌ−を分泌する単層の能力と関連した（Madara et al、Gastro．92：1133−1145（1987）。
【００４６】
電気生理学（電気発生性Ｃｌ−分泌の測定）：  集密的細胞単層を、ＣａＣｌ２  ０．１８５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４  ０．０９８ｇ／ｌ、ＫＣｌ  ０．４ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．０６ｇ／ｌ、ＮａＣｌ８ｇ／ｌ 、 Ｎａ２ＨＰＯ４  ０．０４８ｇ／ｌ、グルコース１ｇ／ｌおよびｐＨ７．４ HEPES  １０ｎＭ を含むHanks緩衝塩溶液（HBSS）へ移した。漿膜および粘膜レザバーをリンゲル緩衝液でつくられた５％寒天橋を介してカロメルおよびＡｇ−ＡｇＣｌ電極に結合した。経上皮抵抗を２５μＡまたは５０μＡ 電流パルスを与える二重電圧クランプを用いて測定した。短絡電流（Ｉｓｃ）を以前記載されているようにオームの法則を用いて計算した（Lencer et al、J．Clin．Invest．92：2941−2951（1993）； Lencer et al、J．Cell Biol．117：1197−1209（1992））。
【００４７】
結果
クロトリマゾールは、Ｃａ＋＋またはｃＡＭＰ依存アゴニストによって誘起されるＴ８４細胞におけるＣｌ−分泌を阻害する。：  以前の研究は、 Ｔ８４細胞におけるＣｌ−分泌が生物物理学的および薬理学的に互いに異なるＫ＋外向き流束によってコントロールされることを示してきた。
一つの経路はｃＡＭＰ依存アゴニストに対する分泌応答にあずかりＢａ＋＋塩に対する感受性を示す（McRoberts et al、J．Biol．Chem．260：14163‐14172（1985）；Reentra，Am．J．Physiol．264：C161−168（1993））。他はＣａ＋＋依存アゴニストにたいする応答を仲介し、 Ｂａ＋＋非感受性である。Ｋ＋チャンネルのいくつかの経路に特異的なアゴニストは、特定の化合物がＣａ＋＋またはｃＡＭＰ特異的経路を通して作用するかどうかを決定するために有用である。例えば、バソアクティブ・インテスティナル・ペプチド（ＶＩＰ）およびコレラ毒素は、 Ｋ＋チャネルのｃＡＭＰ仲介アゴニストが、カルバコールはＣａ＋＋調節Ｋ＋チャネルのＣａ＋＋依存アゴニストである。 Ｔ８４細胞のＣｌ−分泌の特定の阻害剤が機能する経路を、Ｃｌ−分泌を刺戟するためにＶＩＰまたはカルバコールで処理されるＴ８４細胞の経上皮抵抗を修飾する阻害剤の力を測定することによって同定する。
【００４８】
Ｔ８４細胞を上記のように育て、Ｃｌ−分泌はカルバコール（１００μＭ）またはＶＩＰ（５ｎＭ）のいずれかを培地に加えることによって刺戟される。次いで細胞をＢａＣｌ２（３ｍＭ）、チャリブソトキシン（１００nＭ）またはクロトリマゾール（３３μＭ）で処理した。短絡電流（Ｉｓｃ）を、阻害剤の存在しない対照の％として各阻害剤処理に対して決定した（図１）。ＢａＣｌはｃＡＭＰ仲介アゴニストＶＩＰへの分泌応答を強く阻害したが、Ｃａ＋＋依存アゴニストのカルバコールによって誘起される分泌応答にはあまり影響しなかった。対照的に、サソリ毒チャリブソトキシンはカルバコールによって誘起される分泌応答を強く阻害したが、 ＶＩＰによって誘起されるＣｌ−分泌についてはごく小さな影響であった。しかし、クロトリマゾールは両方のアゴニストに対するＣｌ−分泌応答を阻害した。クロトリマゾールによるＣｌ−分泌の阻害は、牛血清アルブミン０．０１ｍｇ／ｍｌの存在下６０分後完全に可逆的（９６±２％、ｎ＝４）であった。
【００４９】
ｃＡＭＰおよびＣａ＋＋仲介アゴニストの協同作用に関するクロトリマゾールの影響を調べるために、先ずＶＩＰで刺戟された単層を分泌の定常状態に達しさせ、次いでカルバコール（１００μＭ）に加えてさらした。クロトリマゾールは、ｃＡＭＰよりもカルバコールに対する分泌応答を阻害することに、各々ＩＣ５０値が３μＭと８μＭで少しだけ有効であった。ｃＡＭＰおよびＣａ＋＋依存分泌経路へのクロトリマゾールの効果を同じ単層について調べたとき、ＶＩＰとカルバコールの協同応答の阻害は、Ｃａ＋＋アゴニストのみでおこされる分泌の阻害と同等であることが見い出された。低い用量（＝１０−７以下）では、クロトリマゾールはいずれのアゴニストに対するＣｌ−分泌応答をわずかに（５−１０％）強めた。クロトリマゾールは、コレラ毒素（２０ｎＭ、 ｃＡＭＰ依存アゴニスト）および大腸菌熱安定毒素（１００ｎｍ、ｃＧＭＰ依存アゴニスト）（ＩＣ５０値が各々１０μＭと１５μＭ）に対する分泌応答を効果的に阻害した。
【００５０】
また、Ｋ＋コンダクタンスへのクロトリマゾールの効果を８６Ｒｂを用いる同位体フラックスによって調べた。Ｔ８４細胞をｃＡＭＰアゴニストＶＩＰまたはＣａ＋＋仲介アゴニスト（タプシガルジン, Thapsigargin）の存在において育てた。クロトリマゾールを加え、８６Ｒｂ外向き流束を測定した。クロトリマゾールは有意にベースラインを阻害し Ｃａ＋＋は、クロトリマゾールで処理されなかった細胞に比べてｃＡＭＰおよびＣａ＋＋仲介アゴニスト両方の存在において８６Ｒｂ外向き流束を刺戟した。
【００５１】
本発明の他の芳香族化合物は、Ｃｌ−分泌を阻害することが見い出された。クロトリマゾールはｃＡＭＰおよびＣａ＋＋誘起Ｃｌ−分泌の試験された最も強力な阻害剤であったけれども、ケトコナゾール、エコナゾール、ミコナゾールおよび２−クロロフェニル−ビス−フェニルメタノールもＣｌ−分泌を阻害する点で効果的であった。
総合すると、これらの研究はクロトリマゾールがＴ８４細胞におけるｃＡＭＰおよびＣａ＋＋仲介Ｋ＋チャネルによって誘起されるＣｌ−分泌を阻害することを示す。
【００５２】
実施例  ２：クロトリマゾールはｃＡＭＰおよびＣａ＋＋依存シグナル伝達経路の遠位ステップに働く。
クロトリマゾールの作用点を決定するために、クロトリマゾールの予め処理効果を、ｃＡＭＰシグナルカスケードの逐次ステップでＣｌ−分泌を開始するアゴニストで刺戟された単層について調べた。 Ｔ８４単層をクロトリマゾール（３３μＭ）の存在または非存在下ＨＢＳＳ中プレインキュベートし、ついでＶＩＰ５nＭ（ヘテロ三量体ＧＴＰアーゼの連鎖した細胞表面レセプターを通してアデニレートサイクラーゼを活性化する）、フォルスコリン１０μＭ（アデニレートサイクラーゼを直接活性化する）または８Ｂｒ−ｃＡＭＰ３ｍＭ（プロテインカイネースＡの直接の活性化剤）のいずれかで刺戟した。クロトリマゾールはこれらのアゴニストの各々への分泌応答を阻害した。これらのデータは、クロトリマゾールがプロテインカイネースＡの活性化の遠位ステップに働くと言う証拠を提供する。
【００５３】
Ｔ８４および他の非興奮性細胞のＣａ＋＋依存細胞内シグナリングは、イノシトールトリフォスフェート（ＩＰ３）依存細胞内Ｃａ＋＋貯蔵の漸増（HalmとFrizell、分泌性下痢のテキストブック、Raven Press，47‐58（1990）；Mandel et al、J．Biol．Chem．267：704−712（1986）；Halm et al、Am. J. Physiol．（Cell Physiol．23）254：C505‐C511（1988））および続く細胞膜Ｃａ＋＋インフラックス経路の活性化（Barrett，Am．J．Physiol．（Cell Physiol．34）：C859‐C868（1993）を含む。ダウンストリームできごとは、［Ｃａ＋＋］ｉ、ＩＰ３、ジアシルグリセロールまたは未だ同定されていない分散性因子によって仲介される（PutneyとBird、Cell75：199−201（1993）。クロトリマゾール作用だけのところを調べるために、クロトリマゾール（３３μＭ）の存在または非存在において予め処理されたＴ８４単層のこのシグナリングカスケードを、Ｃａ＋＋依存アゴニストのカルバコール（１００μＭ、Ｃａ＋＋およびＩＰ３シグナルを誘起する）、タプシガルジン（５μＭ、ＥＲＣａ＋＋ ＡＴＰアーゼの阻害を介して細胞質Ｃａ＋＋を上げる）（Vandorpe et al、Biophys．J．66：46‐58（1994））またはＣａ＋＋イオノホアのイオノマイシン（１０μＭ）で刺戟した。クロトリマゾールは、強くこれら試薬の各々に対するＣｌ分泌応答を阻害した。これらのデータはクロトリマゾールが細胞内Ｃａ＋＋貯蔵の放出に対して遠位な分泌応答に働くことを示唆する。
【００５４】
実施例  ３：クロトリマゾールは先端膜のアニオンコンダクタンスまたはバソラテラルＮａＫ２Ｃｌ共輸送に影響をあたえない。
方法
１２５Ｉ外向き流束の実験
５ｃｍ２のトランスウエル装置の集密的細胞単層を１０ー１４日集落形成後使用した。１２５Ｉを以前記載されているように（Venglarik et al、Am．J．Physiol．（Cell Physiol．28）：C358‐C364（1990））先端Ｃｌ−チャネルおよびバソラテラルＫ＋チャネル活性の指標として測定した。単層を、ＨＢＳＳ中３７゜Ｃで１２５Ｉ４μCｉ／ｍｌと９０分プレインキュベートした、この９０分プレインキュベートの間の終りの３０分間クロトリマゾール３３μＭを存在させたりさせなかったりした。クロトリマゾール前処理は、細胞の１２５Ｉ負荷を変えなかった。新鮮なＨＢＳＳで二度洗浄した後、サンプル０．５ｍｌを先端レザバーから２分ごとに得、新鮮なＨＢＳＳで置換した。四つのベースラインサンプルを得てから、細胞をバソアクティブインテスティナルペプチド（ＶＩＰ、５ｎＭ）またはタプシガルジン（５μＭ）でＣｌ−分泌を活性化するために処理（ｔ＝８分で）し、加えて１５の定時サンプルを得た。最後に、細胞単層をリンスし、ポリスチレン環から支持台で切断され、残留細胞に関連する放射活性を決定した。単層を実験中部屋を３７゜Ｃで維持した。１２５Ｉは、ガンマー計数管で数え、以前記載したように全取り込み％に標準化した（Venglarik et al、Am．J．Physiol．（Cell  Physiol．28）：C358‐C364（1990））。
【００５５】
８６Ｒｂ取り込み実験
５ｃｍ２のトランスウエル装置の集密的細胞単層を、ＨＢＳＳ中３７゜Ｃで３０分インキュベートした。コントロールとクロトリマゾール（ＣＬＴ）処理（３３μＭ、３０分間）した単層の群をブメタニド（１０μＭ、１２分間）で処理した。次いで、全ての単層をＶＩＰ（５ｎＭ）で処理し、８６Ｒｂ１μＣｉ／ｍｌを含有するＨＢＳＳへ３７゜Ｃで３分移行した。８６Ｒｂ取り込みをＭｇＣｌ２１００ｍＭおよびｐＨ７．４のＴＲＩＳ−Ｃｌ  １００ｍＭを含有する氷冷溶液中で洗浄することによって終了させた。単層を装置から切断し、シンチレーションバイアルにいれ、通常の方法を用いて数えた。
【００５６】
結果
実験は起電性Ｃｌ−分泌の阻害が先端膜のＣｌ−チャンネルの阻止または基底外側に位置するＮａＫ２Ｃｌ共輸送の阻止によっておこるのかどうかを決定するために行われた。クロトリマゾールが先端膜Ｃｌ−チャンネルを通したイオンコンダクタンスに影響するのかどうか決定するために、我々は、クロトリマゾールの存在または非存在下予め処理されたＴ８４単層からの１２５Ｉ外向き流束の時間経過を調べた（Vengalrik et al、Am．J．Physiol．（Cell  Physiol．28）：C358‐C364（1990））。クロトリマゾールはＶＩＰで処理された単層からの１２５Ｉ外向き流束の時間経過にほんのわずかの影響または無影響であった。クロトリマゾール処理または無処理の単層からの１２５Ｉ外向き流束の速度常数は区別ができなかった（０．０６３７％対０．０６４５％取り込み／分、二回でｎ＝２）。クロトリマゾールはタプシガルジンによって刺戟された１２５Ｉ外向き流束へ同様影響が無かった。我々は、次いでブメタミド感受性８６Ｒｂ取り込みによって評価されたようにバソラテラルＮａＫ２Ｃｌ共輸送へのクロトリマゾールの影響を試験した（Matthews et al、J．Biol．Chem．269：15703‐15709（1994））。クロトリマゾール処理は８６Ｒｂ取り込みの全量を５３．６±５．８％（平均±ＳＥＭ、ｎ＝６）減少したが、ブネタニド感受性である分画成分への影響はなかった（８８±３．２対７５．２±１２．７全取り込み％、平均±ＳＥＭ）。総合すると、これらのデータは、クロトリマゾールが先端膜Ｃｌ−チャネルまたはバソラテラル膜ＮａＫ２Ｃｌ共輸送の阻害を介してＴ８４細胞におけるＣｌ−分泌に影響しないことを強く示す。
【００５７】
実施例  ４：クロトリマゾールはＴ８４細胞におけるバソラテラルＫ＋チャンネルを通すＫ＋外向き流束を阻害することによってクロライド分泌を阻害する。
方法
１．  クロトリマゾールはＢａ＋＋感受性およびチャリブドトキシン感受性両チャンネルを通すＫ＋輸送の阻止によってクロライド分泌を阻害する。
８６Ｒｂ外向き流束実験
５ｃｍ２のトランスウエル装置の集密的細胞単層を１０ー１４日集落形成後使用した。８６Ｒｂ外向き流束を以前記載されているように（Venglarik et al、Am．J．Physiol．（Cell  Physiol．28）：C358‐C364（1990））先端Ｃｌ−チャンネルおよびバソラテラルＫ＋チャンネル活性の指標として測定した。単層を、ＨＢＳＳ中３７゜Ｃで８６Ｒｂ４μCｉ／ｍｌと９０分プレインキュベートした、この９０分プレインキュベートの間の終りの３０分間クロトリマゾール３３μＭを存在させたりさせなかったりした。クロトリマゾール前処理は、細胞の８６Ｒｂ負荷を変えなかった。サンプル１ｍｌを得、バソラテラルレザバーから置換した。四つのベースラインサンプルを得てから、細胞をバソアクティブインテスティナルペプチド（ＶＩＰ、５ｎＭ）またはタプシガルジン（５μＭ）でＣｌ−分泌を活性化するために処理（ｔ＝８分で）し、加えて１５の定時サンプルを得た。最後に、細胞単層をリンスし、ポリスチレン環から支持台で切断され、残留細胞に関連する放射活性を決定した。単層を実験中室温を３７゜Ｃで維持した。８６Ｒｂは、ガンマー計数管で数え、以前記載したように全取り込み％に標準化した（Vengalrik et al、Am．J．Physiol．（Cell Physiol．28）：C358‐C364（1990））。
【００５８】
結果
Ｋ＋チャネル活性を８６Ｒｂ外向き流束の測定によって推定した。クロトリマゾールはｃＡＭＰアゴニストＶＩＰ（５ｎＭ）で処理した後８６Ｒｂ外向き流束の速度を有意に阻害することが見い出された。 ＶＩＰ刺戟８６Ｒｂ外向き流束の速度常数をクロトリマゾールで処理した単層において８７％減少した（０．００６２％対０．０４６５％取り込み／分、三回でｎ＝２）。クロトリマゾールは、タプシガルジンによって刺戟された単層からの８６Ｒｂ外向き流束を同程度阻害し（パネルＢ，速度常数０．０１１対０．０４８取り込み％／分、ｎ＝２），クロトリマゾールがＢａ＋＋感受性およびチャリブドトキシン感受性両チャンネルを通すＫ＋輸送の阻止によってクロライド分泌を阻害することができることを示唆している。
【００５９】
２．  クロトリマゾールは異なるｃＡＭＰおよびＣａ＋＋感受性バソラテラルＫ＋チャンネルを通すクロライド分泌を阻害する。
選択的膜透過性およびバソラテラル膜のカリウムコンダクタンスの測定。バソラテラルカリウムコンダクタンスをDawson et al によって開発された技術を使用して測定した。カリウム勾配（粘膜から漿膜へ）をＫ＋を唯一の透過イオンとして含む非対称粘膜および漿膜緩衝液を用い単層をよこぎって先ずつくった。粘膜レザバーへアムホテリシンＢ（２０μＭ）の添加が先端膜に伝導孔を形成し、従ってこの膜をよこぎる経上皮カリウム運動に対する全ての抵抗を除く。従って、本実験条件下、単層は短絡され（即ち、ゼロポテンシャルで電圧固定される）、経上皮カリウム勾配は一定し、アムホテリシン依存Ｉｓｃがバソラテラル膜をよこぎる経上皮カリウムフラックスの速度のめどになる。短絡電流（Ｉｓｃ）の変化は、次いでバソラテラルＫ＋コンダクタンス（ｇＫ）の変化をあらわす。ＩｓｃとＫ＋コンダクタンスをカロメル電極、３ＭＫＣｌ寒天橋および電圧固定（Iowa大学、Iowa市）を用いて測定した。電圧−電流チャネル関係をつくるため、非対称的高Ｋ＋グルコネート溶液における−８０から＋８０まで１０ｍＶ増加ごとに試験ポテンシャルが１秒で誘起された。
【００６０】
バソラテラル膜のＫ＋透過性の計算：  膜透過性を式にしたがって計算した。
ｐＫ＝（ｃｍ／ｓ）＝１Ｋ（ｍＭ／ｃｍ２・ｓ）／・［ Ｋ＋］（ｍＭ／ｃｍ３）
式中、・［ Ｋ＋］は、非対称的先端およびバソラテラル浴槽溶液間のＫ＋濃度（１３５ｍＭ）の差に等しい。最大Ｉｓｃを、以前に記載された用にファラデイ定数Ｆ（９６，５００クーロン／ｍｏｌ）で割ることによってＫ＋フラックスへ変換した（Huflejt et al、J．Clin．Invest．93：1900−1910（1994））。
【００６１】
結果
バソラテラル Ｋ＋輸送をアムホテリシンＢの前処理によって先端で透過されるＴ８４単層で調べた。先端およびバソラテラル緩衝液は唯一つの透過イオンとしてＫ＋を含有した。全ての実験を１３５ｍＭの基底外側に向けられたＫ＋勾配で行った。この方法は、Ｔ８４細胞およびＨＴ２９−Ｃｌ．１６Ｅ細胞におけるＣｌ−およびＫ＋両輸送を調べるため前から利用されてきた。簡単には、集密Ｔ８４細胞単層の内腔またはバソラテラル膜のイオンコンダクタンスをイオノフォアのアムホテリシンＢを用いて評価できる。これは、イオノフォアのアムホテリシンＢによってできた孔を含む細胞膜をよこぎるイオン輸送に対する全ての電気的抵抗を人工的に取り除く。結果として、無処置対側細胞膜は経上皮イオン輸送の律速になる。イオンコンダクタンスのアゴニスト依存変化を、できあがあったイオン勾配の存在における経上皮短絡電流（Ｉｓｃ）としてか、またはできあがあった経上皮ポテンシャルの存在における経上皮コンダクタンス（G）として直接評価できる。
【００６２】
Ｋ＋輸送を、ベースラインにおいておよびｃＡＭＰとＣａ＋＋アゴニストの決められた添加後に測定した。アムホテリシンＢを用いた初期透過はコンダクタンスの４９±１９％増加をともなった。アムホテリシンＢで形成される孔は、一価カチオンに選択性を示す。Ｃａ＋＋は、アムホテリシンＢを用いた先端透過によっておこるＩｓｃおよびＧｋのすこしの定常状態増加で証明されるように比較的不透過のままであった。この低いベースラインＩｓｃおよびＧｋを与えると、 ｃＡＭＰとＣａ＋＋感受性Ｋ＋透過率（ＰＫ）は、アゴニスト刺戟後容易にあきらかであった。 ｃＡＭＰアゴニストのフォルスコリン（１０μＭ）を用いた処理は、ＩｓｃおよびＧの対称的増加によって証明されるように明らかに低コンダクタンス経路を通るＫ＋輸送の活発な増加を生じた。カルバコールもＫ＋電流を増加した。しかし、カルバコール誘起Ｉｓｃｋの大きさは、カルバコールだけまたはフォルスコリンの後に加えても同様であった（各々１１１．７±７．４対１８０．７±１５．７μＡ／ｃｍ２）。従って、先端で透過された細胞システムで期待されるように、 ｃＡＭＰとＣａ＋＋の仲介Ｋ＋経路の間に協同作用の明らかな証拠はない。無処置Ｔ８４単層における我々の以前の発見と同様に、Ｉｓｃのフォルスコリン誘起変化を、カルバコールの効果が短命である間維持した。ＩｓｃｋおよびＧｋの両方は、カルバコール添加後５分以内にベースラインへ戻った。
【００６３】
形式的な電流／電圧（Ｉ／Ｖ）関係を、ｃＡＭＰとＣａ＋＋依存両電流が生理的膜ポテンシャルで誘起されることを確かめるためにアゴニスト刺戟の前後で定義した。タプシガルジンをこれらの実験でＣａ＋＋アゴニストとしてカルバコールの代りに使用した。なぜなら、タプシガルジンによって誘起されるＫ＋過渡が無処置単層におけるように、非常に長く持続する定常状態を達成する。基底外側に向かうＫ＋勾配の条件下、フォルスコリンおよびタプシガルジン共、正の経上皮電圧で肉眼的に外向きに調整された（粘膜から漿膜へ）電流を活性化する。フォルスコリンおよびタプシガルジンの刺戟後得られる実験的Ｉ／Ｖ関係は、計算されたネルンストポテンシャル（ＲＴ／ｚＱｏｌｏｇ［Ｎａ］ｏｕｔ／［Ｎａ］ｉｎとして計算された−８５ｍＶ）に近似する逆ポテンシャル（−４０ｍＶ）を示した。これらの結果は、一つ以上の非特異的経上皮イオンシャントと関係する別個のｃＡＭＰおよびＣａ＋＋感受性バソラテラル膜Ｋ＋コンダクタンスの活性化と合い、多分細胞内密着帯またはバソラテラル膜の“リーク”を通しておこる。
【００６４】
ＩｓｃおよびＧの観察される変化はＫ＋選択的経路を通したＫ＋輸送を表わすことを確かめるため、Ｔ８４単層コンダクタンスへのフォルスコリンおよびカルバコールの影響をＮａ＋を唯一つの透過カチオンとして含む緩衝液を用いて調べた。これらの実験を、類似する１３５ｍＭの基底外側に向かうカチオン（Ｎａ＋）勾配を用いて行った。ＩｓｃおよびＧの増加はＫ＋の非存在の場合検出されなかった。従って、アゴニスト刺戟によって誘導されるカチオンコンダクタンスの増加はＫ＋輸送に特異的である。
【００６５】
二つの薬理学的に異なるＫ＋外向き流束経路が以前無処理Ｔ８４細胞で見つけられていた。一つの経路がｃＡＭＰ依存アゴニストに対する分泌応答に関与し、Ｂａ＋＋塩に感受性を示した。他のＫ＋外向き流束経路はＣａ＋＋依存アゴニストに対する応答を仲介し、Ｂａ＋＋不感受性である。これらの発見は透過性を上げた細胞モデルで確かめられた。ｃＡＭＰ感受性Ｉｋ（フォルスコリン１０μＭの処理で誘起）を、バソラテラルレザバーへＢａＣｌ２（３ｍＭ）の添加によって７０％以上阻害した。しかし、Ｂａ＋＋は同じ単層に次のカルバコール（１００μＭ）の添加によって誘導されるＫ＋輸送に検出できる影響をあたえなかった。対照的に、透過性を上げた単層をカルバコールで先ず処理したとき、誘導Ｃａ＋＋ Ｉｋをサソリ毒チャリブドトキシン（１００ｎＭ）の前処理で５０％阻害した。しかし、チャリブドトキシンは次のフォルスコリンの添加によって誘導されるＫ＋輸送に検出できる影響をあたえなかった。従って、透過性を上げた細胞において、 Ｋ＋チャンネルブロッカーのＢａＣｌ２およびチャリブドトキシンの阻害に対するＫ＋輸送の異なる感受性は、無処理細胞におけるＫ＋輸送へのこれらのチャンネル選択的阻害剤の影響とまさに同様であった（Ｃｌ−電流として間接的に測定）。
総合すると、透過性を上げたＴ８４細胞モデルを明らかにし、定められた条件下ＩｓｃおよびＧは共に別個のｃＡＭＰおよびＣａ＋＋感受性バソラテラルＫ＋チャネルを通したＫ＋輸送を表わすという強い証拠を提供する。
【００６６】
３．  クロトリマゾールおよび構造的に関連する安定代謝物の２−クロロフェニル−ビス−フェニル  メタノールはｃＡＭＰおよびＣａ＋＋感受性両Ｋ＋チャンネルを通すＫ＋輸送を阻害する。
我々はつぎにクロトリマゾールがヒト腸Ｔ８４細胞において、赤血球におけるようにバソラテラル膜Ｋ＋チャンネルを直接阻害するという仮設を試験した。クロトリマゾールは、ｃＡＭＰアゴニストのフォルスコリン（１０μＭ）およびＣａ＋＋アゴニストのカルバコール（１００μＭ）で処理後のＫ＋輸送の時間経過状態を有意に阻害した。ｃＡＭＰまたはＣａ＋＋刺戟後の定常状態でとられた形式的ＩＶ関係は、クロトリマゾールがｃＡＭＰおよびＣａ＋＋感受性両Ｋ＋チャネルに影響したことを確認する。ほぼ同じ結果が２−クロロフェニル−ビス−フェニル  メタノールについて得られた。クロトリマゾールおよびその代謝物の２−クロロフェニル−ビス−フェニル  メタノールは、直接ｃＡＭＰおよびＣａ＋＋感受性両Ｋ＋チャンネルを通すＫ＋輸送を阻害し、イミダゾール環のない環構造がこの生物活性に十分であることを示している。
【００６７】
４．  クロトリマゾールはＴ８４細胞の先端表面よりもバソラテラル表面を目標にする。
方法
先端細胞膜のＣｌ−コンダクタンスの測定：
先端Ｃｌ−コンダクタンスを調べるために、Ｃｌ−を同一の先端およびバソラテラル緩衝溶液を使用する唯一つの透過イオンとして用いる。単層は、漿膜層レザバーへアムホテリシンＢ（１００μＭ）の添加によって基底外側に透過性を上げられた。チャンネル電流の電圧−電流カーブの生成を、対称的高コリンクロリド緩衝液中１０ｍＶごとに−８０から＋８０ｍＶの１秒試験ポテンシャルによって誘起した。
【００６８】
結果
クロトリマゾールの最初のターゲットがバソラテラルまたは先端の細胞表面に位置しているのかを決定するために実験を行った。最も早い阻害を単層の両側にクロトリマゾールとインキュベートして得た。しかし、バソラテラル適用だけが両側上でのインキュベーションとほぼ同じように効果的であった。加えて、決まった時点でのクロトリマゾールの見かけの阻害強度は、先端よりもバソラテラルに適用されたときより大きいことが分かった。細胞のバソラテラル表面でのクロトリマゾールの優先的な作用は、その主たるターゲットがバソラテラルＫ＋チャンネルであるという仮設と一致する。
【００６９】
これらの発見を確かめるため、我々はアムホテリシンＢによって形成される孔で基底外側に透過性を上げられたＴ８４細胞単層のＣｌ−輸送を調べた。これらの実験を、唯一つのアニオンとしてのＣｌ−および対称的先端およびバソラテラルＣｌ−濃度（１４２ｍＭ）で行った。クロトリマゾールで処理されない単層において、バソラテラルレザバーへのフォルスコリン（１０μＭ）の添加は、多分嚢胞性繊維症トランスメンブラン調節（ＣＦＴＲ）Ｃｌ−チャンネルの活性化を介して有意にベースラインよりもＣｌ−コンダクタンスを増加した。しかし、クロトリマゾールのバソラテラルＫ＋コンダクタンスへの明らかな阻害的影響と対照的に、クロトリマゾールはフォルスコリンまたはタプシガルジン刺戟Ｃｌ−コンダクタンスへの検出できる影響はなかった。Ｃｌ−輸送のＩ／Ｖ関係はクロトリマゾールで処理されたかまたはされなかった単層でほぼ同じであった。これらのデータは、クロトリマゾールが特異的にバソラテラルＫ＋チャネルに影響して無処理Ｔ８４細胞単層のＣｌ−分泌を阻害するというさらなる証拠を提供する。先端膜Ｃｌ−チャンネルは阻害されない。
【００７０】
実施例  ５：クロトリマゾールはインヴィボのＣｌ−分泌を阻害する。
１．家兎結腸粘膜を用いるユシングチェンバー実験
方法
ニュージーランド家兎雄四匹（２．５ｋｇ）をペントバルビタール（０．５ｍｌ／ｋｇ）の静脈注射によって麻酔した。遠位結腸を長さ１５ｃｍ取り出し、縦走方向に開いた。外筋層を鈍解離で取り出し、結腸粘膜標本をユシングチェンバー（DCTSYS；Precision  Instrument Design社、ＣＡ；表面積１０．３ｃｍ２）につるし、クロトリマゾール（３０μＭ）の存在または存在なしに、ｍＭでＮａＣｌ；１２２．０、ＣａＣｌ2：２．０；ＭｇＳＯ４；１．３、ＫＣｌ；５．０、グルコース；２０、ＮａＨＣＯ３；２５．０（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２のガスを通じたときのｐＨ；温度は３７°Cに保つ）を含む緩衝液でインキュベートした。粘膜の各サイドの液量は７ｍｌであった。
【００７１】
電位差およびＩｓｃを連続的にモニターし、１０分毎に記録した。内腔および漿膜層緩衝液をＡｇ−ＡｇＣｌ電極（電圧／電流クランプ、モデルＶＣＣ６００、Physiologic Instruments社、San Diego、CA、USA）およびリンゲル／寒天橋を介して電圧クランプデバイス（モデルＤＶＣ−１０００；電圧／電流クランプ、World Precision Instruments社）に接した。抵抗（Ｒ）をオームの法則を用いて計算し、ＩｓｃはΩ×ｃｍ２で与えられる。安定したベースライン抵抗およびＩｓｃ値が得られた後、粘膜標本を漿膜層クロトリマゾール（３０μＭ）の存在または存在なしに３０分インキュベートし、次いでフォルスコリン（１０μＭ）またはカルバコール（１０μＭ）を漿膜層レザバーへ添加して刺戟した。
【００７２】
結果
生きた腸組織のＫ＋チャネルおよび従ってＣｌ−分泌を阻止するクロトリマゾールの能力を試験するために、我々はクロトリマゾール（３０μＭ）の存在または存在なしに修飾リンゲル溶液を含むユシングチェンバー中家兎結腸粘膜の単離標本をつるした。Ｉｓｃが安定した後、フォルスコリン（１０μＭ）および次いでカルバコール（１００μＭ）と順次の添加を漿膜層レザバーへ適用し、ＩｓｃおよびＧを連続的にモニターした。クロトリマゾールはフォルスコリン誘導Ｉｓｃの時間経過状態を強く阻害した。カルバコールはこのシステムではＩｓｃへの影響はなかった。
【００７３】
２．分泌性下痢のマウスモデル
方法
処理およびコントロール、未処理マウスに、クロトリマゾール（１５０ｍｇ／ｋｇ／日を二つの等用量に分け、２０ｍｇ／ｍｌの濃度でピーナツ油に溶かし）またはコントロール担体を７日間の負荷期間強制摂取させた。次いで、マウスにＰＢＳ中精製コレラトキシン２５μｇ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）、コントロール担体のみ（コレラトキシンなしのＰＢＳ ）またはクロトリマゾール３０μＭを含むＰＢＳ中のコレラトキシンのいずれかで強制的にチャレンジした。動物を５時間後混んでいないＣＯ２フードで殺した。死体の重さをはかり、腹部を開け、リガチャーを近位十二指腸および遠位直腸で結んだ。腸ブロックを支持構造から切りはなし、一つのユニットとして取り出し、重さをはかった。小腸および大腸セグメントを各動物の体重（腸の重さ／死体重）に標準化した。
【００７４】
結果
クロトリマゾールがインヴィボで腸分泌を阻害するかどうかを試験するために、我々は分泌性下痢のマウスモデルを利用した。Ｂａｌｂ／Ｃマウスにクロトリマゾール１５０ｍｇ／ｋｇ／日、二つの等用量に分け、またはをコントロール担体を７日間、１２時間毎にの負荷期間強制摂取させ、次いで精製コレラトキシン（２５μｇ）を経口的にチャレンジした。コレラトキシン処理後５時間で、マウスを殺し、腸液分泌を重量評価した。クロトリマゾール前処理はコレラトキシンによって誘発される腸液分泌を８６％減少した。クロトリマゾールは、コレラトキシンの無い場合には腸分泌に影響しなかった。従って、クロトリマゾールは、インヴィボの分泌性下痢を多分腺窩上皮細胞のバソラテラルＫ＋チャンネルを阻害することによって効果的に治療した。
【００７５】
各々の前記特許、特許出願および引用文献は全て引用することにより本明細書に含まれる。本発明に記載の好ましい態様を記載したが、ここに示された教示に鑑み他の修飾、変形または交換は、当業者に自明のことと考えられる。従って、そのようなすべての修飾、変形または交換は次に掲げる請求の範囲によって定義される本発明の範囲に属するものと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１は、Ｔ８４細胞におけるｃＡＭＰおよびＣａ＋＋依存Ｃｌ−分泌の阻害におけるクロトリマゾールの効果を描く棒グラフである。
【図２】図２は、ベースラインおよびＴ８４単層からＣａ＋＋刺戟８６Ｒｂエフラックス（efflux)の阻害に関するクロトリマゾールの効果を示すグラフである。
【図１】
2009007368.tif 000018
【図２】
2009007368.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】平成20年8月15日(2008.8.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下痢治療のための薬剤の製造における芳香族化合物の使用であって、該芳香族化合物が一般式：
【化１】
2009007368.tif 000020
式中、ｎ＝０−３、ｐ＝０または１、Ｘは（ＣＨ２）ｍ（ｍ＝0，１，２または３）、ＣＨ＝ＣＨ、Ｃ≡Ｃ、ＳＣＨ２、ＯＣＨ２およびＮＯＣＨ２からなる群から選ばれ、Ｒ’はＨ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＨＯ、ＯＮＨ２、ＣＯＨ、ＣＯＲ”、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ”、ＯＲ”、ＳＲ”、ＮＲ”Ｒ”、ＣＯＮＲ”Ｒ”、フラニル、ピリジニル、チオフェニル、インドリル、キノリルおよびＣＯＮＲ”（ＯＣＨ３）からなる群から選ばれ、Ａｒ１はフェニル、置換フェニルおよびヘテロアリールからなる群から選ばれ、Ａｒ２はフェニルおよび置換フェニルからなる群から選ばれ、Ａｒ３はフェニル、置換フェニル、ビフェニル、ビベンジルおよびナフチルからなる群から選ばれ、フェニル置換基はＣｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、Ｒ、ＯＲ”、ＳＲ”、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＦ３、ＮＲ”Ｒ”およびＣＯ２Ｒからなる群から選ばれ、ＲはＣＺ（ｚ＝１−５）の直鎖アルキル、ＣＺ（ｚ＝１−５）の置換直鎖アルキル、ＣＺ（ｚ＝１−５）の分枝アルキルおよび ＣＺ（ｚ＝１−５）の置換分枝アルキルからなる群から選ばれ、アルキル置換基はＣｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＮＨ２、ＮＨＣＨ３およびＮ（ＣＨ３）２からなる群から選ばれ、Ｒ”は水素原子およびＲからなる群から選ばれる、を有する、前記使用。
【請求項２】
芳香族化合物が、
【化２】
2009007368.tif 000021
からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
芳香族化合物が経口的に投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
対象がヒトである、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
対象に抗下痢剤を投与することをさらに含む、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
抗下痢剤が経口再水和液である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
芳香族化合物が２−クロロフェニル−ビス−フェニル−メタノールであり、次式：
【化３】
2009007368.tif 000022
を有する、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
対象の感染性下痢を抑制するために有効な量の芳香族化合物および抗感染性下痢剤を含む獣医製剤であって、該芳香族化合物が一般式：
【化４】
2009007368.tif 000023
式中、n＝０−３、p＝０または１、Ｘは（ＣＨ２）ｍ（ｍ＝0，１，２または３）、ＣＨ＝ＣＨ、Ｃ≡Ｃ、ＳＣＨ２、ＯＣＨ２およびＮＯＣＨ２からなる群から選ばれ、Ｒ’はＨ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＨＯ、ＯＮＨ２、ＣＯＨ、ＣＯＲ”、ＣＯ２Ｈ、 ＣＯ２Ｒ”、ＯＲ”、 ＳＲ”、ＮＲ”Ｒ”、ＣＯＮＲ”Ｒ”、フラニル、ピリジニル、チオフェニル、インドリル、キノリルおよびＣＯＮＲ”（ＯＣＨ３）からなる群から選ばれ、Ａｒ１はフェニル、置換フェニルおよびヘテロアリールからなる群から選ばれ、Ａｒ２はフェニルおよび置換フェニルからなる群から選ばれ、Ａｒ３はフェニル、置換フェニル、ビフェニル、ビベンジルおよびナフチルからなる群から選ばれ、フェニル置換基はＣｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、Ｒ、ＯＲ”、ＳＲ”、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＦ３、ＮＲ”Ｒ”およびＣＯ２Ｒからなる群から選ばれ、ＲはＣＺ（ｚ＝１−５）の直鎖アルキル、ＣＺ（ｚ＝１−５）の置換直鎖アルキル、ＣＺ（ｚ＝１−５）の分枝アルキルおよび ＣＺ（ｚ＝１−５）の置換分枝アルキルからなる群から選ばれ、アルキル置換基はＣｌ、Ｂｒ、Ｆ、 Ｉ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＮＨ２、ＮＨＣＨ３およびＮ（ＣＨ３）２からなる群から選ばれ、Ｒ”は水素原子およびＲからなる群から選ばれる、を有する、前記獣医製剤。
【請求項９】
抗感染性下痢剤が、初乳抽出物、初乳の免疫製剤、微生物特異的免疫製剤、経口再水和液、置換電解質組成物、または抗生物質組成物である、請求項８に記載の獣医製剤。
【請求項１０】
獣医製剤が乾燥製剤である、請求項８に記載の獣医製剤。
【請求項１１】
芳香族化合物が２−クロロフェニル−ビス−フェニル−メタノールであり、次式：
【化５】
2009007368.tif 000024
を有する、請求項８に記載の獣医製剤。
【請求項１２】
下痢を抑制するために有効な量の芳香族化合物および抗下痢剤を含む医薬製剤であって、該芳香族化合物が一般式：
【化６】
2009007368.tif 000025
式中、ｎ＝０−３、ｐ＝０または１、Ｘは（ＣＨ２）ｍ（ｍ＝0，１，２または３）、ＣＨ＝ＣＨ、Ｃ≡Ｃ、ＳＣＨ２、ＯＣＨ２およびＮＯＣＨ２からなる群から選ばれ、Ｒ’はＨ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＨＯ、ＯＮＨ２、ＣＯＨ、ＣＯＲ”、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ”、ＯＲ”、ＳＲ”、ＮＲ”Ｒ”、ＣＯＮＲ”Ｒ”、フラニル、ピリジニル、チオフェニル、インドリル、キノリルおよびＣＯＮＲ”（ＯＣＨ３）からなる群から選ばれ、Ａｒ１はフェニル、置換フェニルおよびヘテロアリールからなる群から選ばれ、 Ａｒ２はフェニルおよび置換フェニルからなる群から選ばれ、Ａｒ３はフェニル、置換フェニル、ビフェニル、ビベンジルおよびナフチルからなる群から選ばれ、フェニル置換基はＣｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、Ｒ、ＯＲ”、ＳＲ”、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＦ３、ＮＲ”Ｒ”およびＣＯ２Ｒからなる群から選ばれ、ＲはＣＺ（ｚ＝１−５）の直鎖アルキル、ＣＺ（ｚ＝１−５）の置換直鎖アルキル、ＣＺ（ｚ＝１−５）の分枝アルキルおよび ＣＺ（ｚ＝１−５）の置換分枝アルキルからなる群から選ばれ、アルキル置換基はＣｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＮＨ２、ＮＨＣＨ３およびＮ（ＣＨ３）２からなる群から選ばれ、Ｒ”は水素原子およびＲからなる群から選ばれる、を有する、前記医薬製剤。
【請求項１３】
芳香族化合物が２−クロロフェニル−ビス−フェニル  メタノールであり、次式：
【化７】
2009007368.tif 000026
を有する、請求項１２に記載の医薬製剤。
【請求項１４】
抗下痢剤が、経口再水和液、抗生物質、電解質組成物、牛初乳からの免疫製剤、または経口糖−電解質溶液である、請求項１２に記載の医薬製剤。
【請求項１５】
下痢の治療のための薬剤の製造における芳香族化合物の使用であって、該芳香族化合物がミコナゾールおよびエコナゾールからなる群から選択される、前記使用。
【請求項１６】
感染性下痢の治療方法であって、そのような治療の必要な、馬、牛、ブタおよび山羊からなる群から選ばれる対象に、感染性下痢を抑制するために有効な量の芳香族化合物を投与する段階を含み、該芳香族化合物が一般式：
【化８】
2009007368.tif 000027
式中、ｎ＝０−３、ｐ＝０または１、Ｘは（ＣＨ２）ｍ（ｍ＝0，１，２または３）、ＣＨ＝ＣＨ、Ｃ≡Ｃ、ＳＣＨ２、ＯＣＨ２およびＮＯＣＨ２からなる群から選ばれ、Ｒ’はＨ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＨＯ、ＯＮＨ２、ＣＯＨ、ＣＯＲ”、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ”、ＯＲ”、ＳＲ”、ＮＲ”Ｒ”、ＣＯＮＲ”Ｒ”、フラニル、ピリジニル、チオフェニル、インドリル、キノリルおよびＣＯＮＲ”（ＯＣＨ３）からなる群から選ばれ、Ａｒ１はフェニル、置換フェニルおよびヘテロアリールからなる群から選ばれ、Ａｒ２はフェニルおよび置換フェニルからなる群から選ばれ、 Ａｒ３はフェニル、置換フェニル、ビフェニル、ビベンジルおよびナフチルからなる群から選ばれ、フェニル置換基はＣｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、Ｒ、ＯＲ”、ＳＲ”、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＦ３、ＮＲ”Ｒ”およびＣＯ２Ｒからなる群から選ばれ、ＲはＣＺ（ｚ＝１−５）の直鎖アルキル、ＣＺ（ｚ＝１−５）の置換直鎖アルキル、ＣＺ（ｚ＝１−５）の分枝アルキルおよび ＣＺ（ｚ＝１−５）の置換分枝アルキルからなる群から選ばれ、アルキル置換基はＣｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＮＨ２、ＮＨＣＨ３およびＮ（ＣＨ３）２からなる群から選ばれ、Ｒ”は水素原子およびＲからなる群から選ばれる段階を有する、前記方法。