(57)【要約】【課題】光老化を予防又は改善する物質の評価又は選択方法、および当該方法に使用されるモデル動物及びその作製方法を提供すること。【解決手段】げっ歯動物に被験物質を投与し、且つ当該動物の頸部に０．７〜１ＭＥＤのＢ波長紫外線を６〜２０週間照射し、次いで当該部位に形成されるしわを測定することを特徴とする、光老化の予防又は改善剤の評価又は選択方法。げっ歯動物の頸部に０．７〜１ＭＥＤのＢ波長紫外線を６〜２０週間照射した光老化モデル動物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（１）〜（３）：
（１）げっ歯動物に被験物質を投与する工程；
（２）当該動物の頸部に０．７〜１ＭＥＤのＢ波長紫外線を６〜２０週間照射する工程；
（３）当該部位に形成されるしわを測定する工程、
を含むことを特徴とする、表情筋の収縮又は弛緩により形成されるしわの予防又は改善剤の評価又は選択方法。
【請求項２】
前記被験物質が表情筋緩和剤である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記げっ歯動物がマウスである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
げっ歯動物の頸部に０．７〜１ＭＥＤのＢ波長紫外線を６〜２０週間照射することを特徴とする、表情筋の収縮又は弛緩により形成されるしわのモデル動物の作製方法。
【請求項５】
前記げっ歯動物がマウスである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
請求項４又は５記載の方法により作製された、表情筋の収縮又は弛緩により形成されるしわのモデル動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表情筋の収縮又は弛緩により生じるしわを予防又は改善する物質の評価又は選択方法、並びに当該方法に使用されるモデル動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の美容に対する関心の高まりにより、及び社会的な傾向として、男女を問わず、若々しい外見を保ちたいという欲求が高まっている。そこで現在では、若さの象徴である、しわのない、つやのある皮膚を保つための様々な方法について、盛んに言及されている。
【０００３】
人間の皮膚は年齢と共に老化し、しわを生じる。特に顔面や首筋、肩など太陽光のあたる部分の皮膚では、慢性的な紫外線の影響によりしわやたるみの形成が、他の光のあたらない部分と比較し顕著となる。こうした紫外線からの影響（光老化）に加えて、筋肉の収縮・弛緩もまた、顔面等のしわの形成に一定の影響を与えていることが従来知られている。ヒトの顔面の皮下には表情の形成に関わる一連の筋肉が存在し、これらはまとめて表情筋と呼ばれ、全て横紋筋である。
【０００４】
近年では、この表情筋に着目した新しい治療法が行われるようになった。例えば、筋弛緩剤として使用されているボツリヌス毒素（ＢＴＸ）は、表情筋の動きを緩和してしわを低減させる治療にも使用されている。横紋筋弛緩作用を有するアルベリンも、しわを低減する効果があることが知られている（特許文献１）。
【０００５】
ヒト顔面等の皮膚のしわの予防又は改善に有用な物質、化粧料、医薬品等を評価するためには、ヒトの顔面等の皮膚をより忠実に反映した皮膚モデルの構築が不可欠である。しわのモデル皮膚やモデル動物の作製法としては、培養３次元皮膚モデルに単回の紫外線を照射する方法（非特許文献１）や、ヘアレスマウス背部皮膚やラットの足底の皮膚に紫外線を毎日、数週間連続照射する方法（非特許文献２、非特許文献３）や、マウス背部にヒト皮膚を移植した後に、紫外線照射を行う方法（非特許文献４、特許文献２）が従来知られている。
【０００６】
上記従来モデルは、しかし、培養皮膚の場合、筋肉組織が存在しないという点で、そしてマウス背部皮膚の場合、皮下に平滑筋しか存在しないという点で、皮下に横紋筋である表情筋が存在する実際のヒト顔面等の皮膚とは異なっている。表情筋のような横紋筋と、平滑筋とでは、その収縮及び弛緩の動態が異なるため、上記従来モデルでは、横紋筋である表情筋の収縮により影響を受けるヒト顔面等の皮膚のしわを正確に再現できていない可能性があった。
【特許文献１】特許第３５４９８２３号公報
【特許文献２】特開２００７−１６７０６０号公報
【非特許文献１】Nelson D, Gay RJ, Photochem Photobiol. 1993, 57(5):830-7
【非特許文献２】Bissett DL, Hannon DP, Orr TV, Photochem Photobiol. 1987, 46(3):367-78
【非特許文献３】Imayama S, Nakamura K, Takeuchi M, Hori Y, Takema Y, Sakaino Y, Imokawa G, J Dermatol Sci. 1994, 7(1):32-8
【非特許文献４】Del Bino S, Vioux C, Rossio-Pasquier P, Jomard A, Demarchez M, Asselineau D, Bernerd F, Br J Dermatol. 2004, 150(4):658-67
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、表情筋の収縮又は弛緩により形成されるしわの予防又は改善剤の評価又は選択方法、並びに当該方法に使用されるモデル動物及びその作製方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、表情筋の収縮又は弛緩により影響を受けるヒト顔面等の皮膚のしわを予防又は改善する物質をより正確に評価又は選択する方法について検討したところ、げっ歯動物の頸部に一定量の紫外線照射を行うことにより、表情筋の収縮により影響を受ける皮膚のしわに酷似したしわモデルを作製でき、当該モデルを用いることにより、表情筋の収縮又は弛緩により生じるしわの予防又は改善剤をより正確に評価又は選択できることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下を提供する。
（I）   以下の工程（１）〜（３）：
（１）げっ歯動物に被験物質を投与する工程；
（２）当該動物の頸部に０．７〜１ＭＥＤのＢ波長紫外線を６〜２０週間照射する工程；
（３）当該部位に形成されるしわを測定する工程、
を含むことを特徴とする、表情筋の収縮又は弛緩により形成されるしわの予防又は改善剤の評価又は選択方法。
（II）  前記被験物質が表情筋緩和剤である、（I）記載の方法。
（III） 前記げっ歯動物がマウスである、（I）又は（II）記載の方法。
（IV）  げっ歯動物の頸部に０．７〜１ＭＥＤのＢ波長紫外線を６〜２０週間照射することを特徴とする、表情筋の収縮又は弛緩により形成されるしわのモデル動物の作製方法。
（V）   前記げっ歯動物がマウスである、（IV）記載の方法。
（VI）  （IV）又は（V）記載の方法により作製された、表情筋の収縮又は弛緩により形成されるしわのモデル動物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、表情筋緩和剤等の各種物質の、表情筋の収縮又は弛緩により形成されるしわに対する予防又は改善効果を、より正確に且つ高感度で評価することができ、また当該予防又は改善効果を有する物質をより正確に選択することが可能となる。さらに、本発明のモデル動物を用いれば、表情筋の収縮又は弛緩によりしわが形成されるメカニズムを調べることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明において用いられる動物は、頸部皮下に横紋筋が存在するげっ歯動物であればよく、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等が挙げられる。このうち、好ましい動物としてはマウス及びラットが挙げられ、マウスがより好ましい。さらに、剃毛の必要がないという点で、ヘアレスマウスがより好ましい。
【００１２】
投与される被験物質の種類は、直接的又は間接的にしわに影響を与え得ることが予想される物質である限り、特に限定されない。例えば、表情筋緩和剤、皮膚弾力性向上剤、抗酸化剤、保湿剤、皮膚新生促進剤等及びそれらの候補物質が挙げられる。
【００１３】
被験物質の投与は、被験物質の種類、剤型、予想される作用機序等に応じた、任意の方法で行われる。例えば、投与は、局所投与でも全身投与でもよく、好ましくは、局所投与である。投与経路としては、経口投与、塗布、滴下、噴霧、貼付等の経皮投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、尾静脈投与などの静脈内投与、腹腔内投与等が挙げられる。好ましくは塗布、噴霧及び注射であり、より好ましくは、塗布である。被験物質の投与量には特に制限はなく、被験物質の種類、剤型、投与経路、予想される作用機序、動物の飼育期間、照射条件等によって適宜決定され得る。
【００１４】
紫外線照射は、従来公知の方法に従って行うことができる。照射は、上記げっ歯動物の頸部を含む領域に対して行われ、被験物質の投与前でも、投与後でも、又は投与と並行して行われてもよい。ここで、「頸部」とは、げっ歯動物の背側（dorsal）部分のうち、耳の尾側端から前肢付け根の尾側端辺りまでの間の領域に位置し、Huber（Huber E., Evolution of facial musculature and cutaneous field or trigeminus. Part II. Quart. Rev. Biol. 1930, 5: 389-437）に示されるように皮下に横紋筋が存在する部分である。
【００１５】
照射波長、照射量及び照射時間は、公知の方法に従って、適宜設定することができる。例えば、照射は、Tsukaharaら（Br. J. Dermatol. 2004, 151: 984-994）記載の方法に従って行うことができる。照射量は、ＭＥＤ（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｒｙｔｈｅｍａ  ｄｏｓｅ；最小紅斑量）を基準として決定することができ、例えば、０．７〜１ＭＥＤに相当する量とすることができる。この最小紅斑量を決定する方法は、Tsukaharaら（J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 2008, 108: 82-90）に記載の方法に従って行うことができる。すなわち、ＵＶＢ照射装置には東芝SE20ランプを５本平行に設置されたものを使用し、照射高さは30cmとする。ランプを点灯させて１時間半後にＵＶラジオメーター（Topcon, mode 305）を用いて照射装置の照射強度を計測する。１０匹程度のネンブタール麻酔を行ったヘアレスマウス背部皮膚を平らにし、４穴アルミシール（１つの穴の大きさ10×6mm）を貼付し、１０〜９０ｍＪ/ｃｍ2のＵＶＢを照射し、24時間後にＵＶＢ照射部位の皮疹について５段階評価（−、±(最小紅斑),＋, ＋＋, +++）を行うことで決定する。決定した最小紅斑量に対して０．７〜１のＵＶＢ量（０．７〜１ＭＥＤ）を、例えば１日１回、週４〜７日、好ましくは週５〜６日、６週間以上ゲージに入れて麻酔を行わない状態のヘアレスマウスに照射することで頸部や背部等の皮膚にしわが形成される。最小紅斑量はマウスの週齢や月齢によっても異なるが、６週齢程度のヘアレスマウスでは約４５〜６５ｍＪ／ｃｍ2、４ヶ月齢程度のヘアレスマウスでは約３５〜５０ｍＪ／ｃｍ2である。本発明の方法における代表的な照射方法としては、上記０．７〜１ＭＥＤの照射量の、波長領域２９０ｎｍ〜３２０ｎｍのＢ波長紫外線（ＵＶＢ）について、１日１回、週５日で６〜２０週間連続して、動物の頸部皮膚を含む領域を曝露することが挙げられる。
【００１６】
斯くして形成された動物の頸部において、正中に対しておおむね直角（lateral）方向にしわが形成される（図１参照）。そしてこのしわは、後述の実施例に示されるように、公知の表情筋改善剤によって明らかに改善された。一方、頸部以外の他の皮膚領域に生じたしわについてはこのような明らかな改善効果は観察されなかった。すなわち、本発明の動物の頸部に形成されたしわは、表情筋の収縮又は弛緩によって形成される皮膚しわに酷似しており、したがって、当該動物は、表情筋の収縮又は弛緩によって形成されるしわのモデル動物となり得る。
【００１７】
本発明のモデル動物において形成されたしわの状態は、皮膚外観の観察、皮膚切片標本の観察、レプリカ法等の任意の方法により測定され得る。例えば、しわの状態は、モデル動物の頸部皮膚のレプリカを作製し、得られたレプリカの粗さを観察することによって、測定することができる。このようにして得られたしわの状態を、被験物質を投与していない群や対照物質投与群（コントロール）と比較することによって、被験物質のしわに対する予防又は改善効果を評価し、当該予防又は改善に有用な物質を選択することができる。
【実施例】
【００１８】
以下の実施例において、本発明をより詳細に説明する。
【００１９】
（１）マウス
ＨＲ／ＨＲとＨａＭ／ＩＣＲとの交配により作製した４〜６ヶ月齢のＩＣＲ／ＨＲ系雌性マウスを用いた。餌及び水は自由摂取させ、温度２３℃、湿度５５％及び紫外線の影響のない環境下にてヘアレスマウスの飼育を行った。
【００２０】
（２）モデルマウス作製
（i）紫外線照射
飼育したヘアレスマウスは８匹ずつ７群に分け、それぞれＵＶＢ照射を行った。ＵＶＢ照射はTsukaharaら（Br. J. Dermatol., 2004, 151: 984-994）等記載の通常使用される公知の方法に準拠した。具体的には、飼育したヘアレスマウスをケージに入れ、東芝ＳＥ２０ランプを５本平行に設置したＵＶＢ照射装置を用い、麻酔を行わない状態で照射を行った。照射量は通常の４ヶ月齢のヘアレスマウスに対する０．７〜１ＭＥＤとして、３５〜５０ｍＪ／ｃｍ2にて１日１回、週５回１０週間、照射を行った。
（ii）被験物質投与
公知のしわ抑制剤として、０．５％ＡＬＢ（アルベリンクエン酸塩；特許第３５４９８２３号及び特開平２００４−２７７４０７）／９０％ＥｔＯＨ溶液を調製し、コントロールとして９０％ＥｔＯＨ（コントロール）を調製した。各試料を、週５回、１０週間、１００μＬ／日で１日１回、紫外線照射直後に各ヘアレスマウス群の頸部を含む皮膚全体に塗布を行った。各試料を塗布した各ヘアレスマウス群を、それぞれコントロール群、ＡＬＢ群とした。
【００２１】
（３）しわの定量
しわを評価するために皮膚レプリカを採取し、画像解析を行った。レプリカの採取と画像解析は、Tsukaharaら（Br. J. Dermatol., 2004, 151; 984-994）等記載の公知の方法にて、ラバー系シリコン印象剤（ＧＣ社）を用い解析対象とする皮膚からレプリカを採取した。採取したレプリカは直径１ｃｍにくりぬき同印象剤にて裏打ちして補正後、画像解析に供した。画像解析にはＰＩＡＳ  ＬＡ−５５５（ＰＩＡＳ社）を用い、斜め３０度方向から光をあて、６ｍｍ×７ｍｍの範囲についてできる影（画像解析面積比％）を定量した。
【００２２】
（４）被験物質の評価
（i）頸部
紫外線照射開始１０週後における、ヘアレスマウスから作製された頸部レプリカの拡大写真を図２（Ａ）に、当該レプリカから得られた画像解析面積比％を図３（Ａ）に示す。コントロール群とＡＬＢ群とを比較すると、ＡＬＢ群に有意なしわ形成抑制効果が認められた（p<0.05、t検定）。
（ii）背部
紫外線照射開始１０週後における、ヘアレスマウスから作製された背部レプリカの拡大写真を図２（Ｂ）に、当該レプリカから得られた画像解析面積比％を図３（Ｂ）に示す。コントロール群とＡＬＢ群の間でしわ形成抑制効果に有意差は認められなかった。
（iii）頭部
紫外線照射開始１０週後における、ヘアレスマウスから作製された頭部レプリカの拡大写真を図２（Ｃ）に、当該レプリカから得られた画像解析面積比％を図３（Ｃ）に示す。コントロール群とＡＬＢ群の間でしわ形成抑制効果に有意差は認められなかった。
【００２３】
（５）塗布領域間の結果比較
紫外線照射により形成されたしわの状態、及び公知の表情筋弛緩剤アルベリンのしわ形成抑制効果を、頸部、背部及び頭部の間で比較した。頸部では顕著なしわ形成が観察され（図２（Ａ））、アルベリンの有意な効果も確認できた（図３（Ａ））。一方、従来モデルで使用されている領域である背部においては、頸部と比較して顕著なしわ形成が観察されず（図２（Ｂ））、アルベリンの有意な効果も確認できなかった（図３（Ｂ））。頸部と同様に皮下に横紋筋を有する頭部においては、いずれの群にも明瞭なしわは形成されず（図２（Ｃ））、アルベリンの有意な効果も確認できなかった（図３（Ｃ））。
【００２４】
（５）まとめ
本発明のモデル動物により、表情筋の収縮又は弛緩に影響を受けるしわを、従来モデルと比較してより正確に再現する事ができた。当該モデル動物を用いた本発明の方法により、表情筋の収縮又は弛緩により形成されるしわを予防又は改善する物質を、従来法と比較してより正確且つ高感度に評価又は選択することができた。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】マウス背側部写真。おおよその頸部領域（Ａ）、及び頸部に形成されたしわの一部（Ｂ；点線）を示す。
【図２】紫外線照射開始１０週後における、ヘアレスマウス皮膚レプリカの拡大写真。（Ａ）頸部、（Ｂ）背部、（Ｃ）頭部。
【図３】皮膚レプリカ画像解析（照射１０週間後）。コントロール群及びＡＬＢ群における画像解析面積比（％）。（Ａ）頸部、（Ｂ）背部、（Ｃ）頭部。エラーバー＝ＳＤ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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