(57)【要約】【課題】  グルコース資化能に関与する遺伝子以外の遺伝情報が、野生株であるＨ１６株と同じであることが明らかな株、すなわち特異的操作によってグルコース資化能が付与されたＣ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株由来グルコース資化性菌株を作製すること、及び該菌株によりグルコースを炭素源としてＰＨＡの効率的生産方法を提供すること。【解決手段】  ザイモモナス  モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）のグルコーストランスポーター蛋白をコードする遺伝子をＣ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株に導入することで、グルコースの取り込みが可能になり、その結果としてグルコース資化能を付与することができた。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来遺伝子導入よりグルコース非資化性Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌にグルコース資化性を付与する方法。
【請求項２】
外来遺伝子がグルコーストランスポーター蛋白をコードする遺伝子である請求項１記載の方法。
【請求項３】
グルコーストランスポーター蛋白をコードする遺伝子がＺｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ由来遺伝子である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
グルコーストランスポーター蛋白をコードする遺伝子が、配列番号５に示される塩基配列と配列同一性８５％以上を示す塩基配列からなる遺伝子である請求項２に記載の方法。
【請求項５】
Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌がＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒである請求項１から４に記載の方法。
【請求項６】
Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒがＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１から６記載の方法によってグルコース資化性が付与されたＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌の形質転換体。
【請求項８】
炭素源としてグルコースを用いて請求項７記載の形質転換体を培養することを特徴とするポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
【請求項９】
ポリヒドロキシアルカン酸がポリ３−ヒドロキシ酪酸である請求項８記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生分解性プラスチックであるポリヒドロキシアルカン酸生産細菌カプリアビダス  ネケーター（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）にグルコース資化性を付与する方法に関する。また、グルコース資化性を付与した細菌を用いて、グルコースを炭素源として生分解性プラスチックを製造する方法に関する。より詳細には、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ由来のグルコーストランスポーター蛋白をコードした遺伝子をＣ．ｎｅｃａｔｏｒに導入することによって、該細菌にグルコース資化性を付与することに関する。また、グルコースを炭素源として、該細菌を培養することを特徴とするポリヒドロキシアルカン酸製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物の中には、糖や植物油脂といったバイオマスから、エネルギー貯蔵物質としてポリヒドロキシアルカン酸（以下、ＰＨＡと略す）を合成し、細胞内に蓄積するものが存在する。ＰＨＡは環境中の微生物によって分解される生分解性プラスチックの１種であり、現在広く使われている石油を原料としたプラスチックとは異なる環境負荷の少ないプラスチックである。
【０００３】
このＰＨＡを構成するモノマー単位は一般名３−ヒドロキシアルカン酸であって、具体的には３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、あるいはよりアルキル鎖の長い３−ヒドロキシアルカン酸である。これら３−ヒドロキシアルカン酸が単重合もしくは共重合することにより、ポリマー分子が形成されている。３−ヒドロキシ酪酸（以下３ＨＢと略す）のホモポリマーであるポリ−３−ヒドロキシ酪酸（以下、Ｐ（３ＨＢ）と略す）は、１９２５年にバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）で最初に発見され、実用化が期待され種々の研究が行われてきた。
【０００４】
水素細菌であるカプリアビダス  ネケーター  Ｈ１６株（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ、旧名はＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ等）は代表的なＰＨＡ生産菌で、フルクトースや植物油脂を炭素源としてＰ（３ＨＢ）を菌体内に大量に合成するため、以前は商業的生産にも用いられてきた。しかし、これらの原料は食料供給と競合してしまうという欠点がある。そこで、木質や稲藁などの、食用に供さないソフトバイオマスに含まれるセルロースに由来するグルコース等の糖類を、炭素源として使用することができれば、食料供給と競合しないＰＨＡの生産が可能となる。
【０００５】
しかし、現在のところ、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒの多くはフルクトース資化性であるが、グルコース資化能を有していない。フルクトースとグルコースの一般的代謝経路から考えると、両者は比較的早い段階で同一の経路によって代謝されることから、グルコース資化性がない原因はその取り込み能がないからだと考えられる（非特許文献１）。
【０００６】
現在でも、少数のグルコース資化性Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ、例えばＮＣＩＢ１１５９９株やＢ８５６２株、ＫＣＴＣ  １０３５１ＢＰ株等が開発されている（特許文献１、特許文献２、非特許文献２）。しかし、それらは非特異的な化学的変異剤等、突然変異誘発処理によって育種された菌株であり、目的とするグルコース資化能向上に関与する遺伝子以外の遺伝情報にも、何らかの変異が導入されている蓋然性が高い。例えばこれまでの遺伝子組換菌を利用したＰＨＡ生産では、代表的なＰ（３ＨＢ）非生産株であるＣ．ｎｅｃａｔｏｒ  ＰＨＢ−４株（ＤＳＭ  Ｎｏ．５４１，以下ＰＨＢ−４株）がその宿主として多く用いられてきた。ＰＨＢ−４株はＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）から入手し得る。ＰＨＢ−４株は１９７０年にＣ．ｎｅｃａｔｏｒ（当時名ハイドロゲノモナス）の野生株であるＣ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株（ＤＳＭ  Ｎｏ．４２８、以下Ｈ１６株）から変異剤処理によって作製された菌株である（非特許文献３）。Ｈ１６株は前出のＤＳＭＺから入手し得る。非特異的な変異剤によって処理された株であるため、目的としたＰ（３ＨＢ）非生産という点だけでなくその他の遺伝子にも変異が導入されている可能性を否定できない。事実、Ｓｃｈｌｅｇｅｌ等によるとＰＨＢ−４株は親株Ｈ１６株と比べて増殖能力やある種の生物活性が劣っていることが示されている（非特許文献３）。従って、非特異的な変異処理によって分離されたグルコース資化性のＣ．ｎｅｃａｔｏｒがＰＨＡ生産株として最高の生産能力を発揮できているかどうか不明であった。
【０００７】
また、本来グルコース資化性である菌株、例えば大腸菌やシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌を用いてＰＨＡを生産する方法も検討されている。しかし、大腸菌は本来Ｐ（３ＨＢ）等のＰＨＡを産生する菌株ではないため、複数のＰＨＡ合成関連酵素遺伝子の導入を含む複雑な遺伝子操作が必要となる（非特許文献４）。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌ではＰＨＡの生産性がＣ．ｎｅｃａｔｏｒよりも低かったりすることが指摘されている（非特許文献５）。
【０００８】
そこで、グルコース資化性向上に関与する遺伝子以外の遺伝情報が、野生株であるＨ１６株と同じであることが明らかな株、すなわち、特異的操作によってグルコース資化能が付与されたＣ．ｎｅｃａｔｏｒ菌株の開発が望まれていた。
【特許文献１】特許１８８８５６８号
【特許文献２】韓国公開公報２００４００４６６７８号
【非特許文献１】Ｋｕｅｈｎ等、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、ｖｏｌ．１４、ｐ１２５９、（１９６８）
【非特許文献２】Ｖｏｌｖａ等、Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｉａ、ｖｏｌ．７４、ｐ７８８，（２００５）
【非特許文献３】Ｓｃｈｌｅｇｅｌ等、Ａｒｃｈ．Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ．、ｖｏｌ．７１、ｐ２８３、（１９７０）
【非特許文献４】Ｌｉｍ等、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．、ｖｏｌ．９３、ｐ５４３、（２００２）
【非特許文献５】Ｓｕｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、ｖｏｌ．１３２、ｐ２８０、（２００７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上のように、グルコース資化性ＰＨＡ生産菌株による、ＰＨＡの効率的商業生産に関して課題が存在していた。本発明の目的は、グルコース資化能に関与する遺伝子以外の遺伝情報が、野生株であるＨ１６株と同じであることが明らかな株、すなわち特異的操作によってグルコース資化能が付与されたＣ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株由来グルコース資化性菌株を作製すること、及び該菌株によりグルコースを炭素源としてＰＨＡの効率的生産方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ゲノム解析（Ｐｏｈｌｍａｎｎ等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，ｖｏｌ．２４、ｐ１２５７、（２００６））よりＣ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株にはグルコースから中央代謝に至る経路の存在が推測された。
【００１１】
一方、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株がグルコース資化能を有しない理由は、グルコースの取り込み能がないからだと考えられる。グルコースの取り込みが可能になれば、グルコースからフルクトース−６−リン酸を経てフルクトースと同じ代謝経路をたどっていくため、グルコースを原料としてＰＨＡ合成が効率よく生産できるようになると考えられた。
【００１２】
そこで、本発明者らは鋭意研究した結果、グルコース資化能を有するエタノール発酵細菌として知られているザイモモナス  モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）のグルコーストランスポーター蛋白をコードする遺伝子をＣ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株に導入することで、グルコースの取り込みが可能になり、その結果としてグルコース資化能を付与することができることを見出し、本研究を完成するに至った。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、木質や稲藁など含まれるセルロースからも調製しうる、安価なグルコースを炭素源としてポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）を高生産できる組換え微生物株が提供され、簡便かつ大量に、しかも安価に製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明におけるＰＨＡとは、以下の一般式：
【００１５】
【化１】
2009225662.tif 000002
（式中、Ｒ１及びＲ２は炭素数１以上１３以下であるアルキル基を表し、互いに同一であっても異なっていてもよい。ｍおよびｎは該ＰＨＡのモノマー単位数を表す。）で表される３−ヒドロキシアルカン酸をモノマー単位とする高重合体である。Ｒ１及びＲ２が共にメチル基のホモポリマーであるＰ（３ＨＢ）であっても良い。または、モノマー単位が３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシヘプタン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシウンデカン酸、３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシトリデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシペンタデカン酸、３−ヒドロキシヘキサデカン酸からなる群より選択されるモノマー単位の２種以上から構成される共重合ＰＨＡであっても良い。
【００１６】
本発明で用いる微生物は、グルコース取り込み能が無いか低い微生物であって、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を生物種として原初的にその染色体ＤＮＡ等に有し、菌体中のグルコースをＰＨＡに変換し得る微生物であれば特に制限なく使用することができる。改変された微生物、基質モノマーの生成や取り込み能が改変された微生物、または生産を増大するように改変された微生物も含まれる。例としては、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属等の細菌類が含まれる。安全性及び生産性の観点から好ましくはＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒであり、より好ましくはＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株である。
【００１７】
以下にＣ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株にグルコース資化能付与する方法を、より具体的に例示する。
【００１８】
遺伝子供与体としてはエタノール発酵菌として知られているＺｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ（ＤＳＭ  Ｎｏ．４２４）を用いることができる。本菌は前出のＤＳＭＺから入手し得る。本菌から得られる、配列番号５に示されるＺ．ｍｏｂｉｌｉｓ由来ｇｌｆ遺伝子は、促進拡散と呼ばれる受動輸送によりグルコースを取り込むトランスポーターをコードしていることが知られている。また３つのグルコース代謝関連遺伝子ｚｗｆ遺伝子（グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、ｅｄｄ遺伝子（６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ）、ｇｌｋ遺伝子（グルコキナーゼ）とオペロン（ｇｌｆ−ｚｗｆ−ｅｄｄ−ｇｌｋ）を形成していることも報告されている（Ｂａｒｎｅｌｌ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．１７２、ｐ７２２７，（１９９０））。これらの遺伝子はＺ．ｍｏｂｉｌｉｓにおけるグルコースの取り込みと、グルコース代謝経路としてＥｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ経路の最初の３段階に関与していると考えられる。配列番号５に示される塩基配列からなる遺伝子は本発明に使用し得る。さらに、配列番号５に示される塩基配列と８５％以上の配列同一性を示す塩基配列からなる遺伝子であれば、グルコーストランスポーター蛋白をコードする限りにおいては本発明に利用し得る。このとき、配列同一性は９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが、更に好ましく、９８％以上であることが、更により好ましく、９９％以上であることが最も好ましい。用いる遺伝子は野生型であっても、変異処理を行ったものでも、グルコーストランスポーター蛋白をコードする限りにおいては本発明に利用し得る。
【００１９】
遺伝子のクローニングはサザンハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法など公知の方法で行うことができるが、この菌株のグルコーストランスポーターｇｌｆ遺伝子単独及びｇｌｆ遺伝子を含むオペロン全体をＰＣＲによりクローニングした。上記の遺伝子はプロモーターおよび／またはリボソーム結合部位を有しているが、大腸菌などの既知のプロモーターを利用することも可能である。
【００２０】
クローニングした断片はＣ．ｎｅｃａｔｏｒ細胞内で発現するよう発現ベクターや染色体に挿入しうる。発現ベクターとしては、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ内で自律して複製されるベクターであればどのようなベクターでも使用できるが、例えば、ｐＪＲＤ２１５由来やｐＢＢＲ１由来のベクターが使用できる。それぞれの断片をｌａｃプロモーターを持つ広宿主域ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ３（Ｋｏｖａｃｈ等、Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１６６、ｐ１７５，（１９９５）、ＤＤＢＪアクセッション番号；Ｕ２５０５９）に挿入した。構築したプラスミドのＣ．ｎｅｃａｔｏｒへの導入は既知の方法が利用できる。例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポーレーション法、接合伝達法などである。今回はエレクトロポーレーション法によりＣ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株に導入した。選択マーカーとしては例えばカナマイシン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、アンピシリン等の抗生物質の耐性遺伝子や各種の栄養要求性を相補する遺伝子等が使用できる。ｐＪＲＤ２１５由来やｐＢＢＲ１誘導体を用いた発現ベクターをＣ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株に導入した場合にはカナマイシンやテトラサイクリンの耐性遺伝子が好適である。
【００２１】
作製した形質転換体は０．５％または２％グルコースを単一炭素源とした培地中で、３０℃で振とう培養して、グルコース資化性が付与されていることを確認した。ポリエステル生産確認の簡易法としては、Ｎｉｌｅｒｅｄを用いた染色法を利用できる。すなわち、組換え菌が生育する寒天培地にＮｉｌｅｒｅｄを加え、組換え菌を１〜７日間培養し、組換え菌が赤変するか否かを観察することにより、ポリエステル生産の有無を確認できる。
【００２２】
本発明において、本発明の微生物をグルコース存在下で増殖させることにより、微生物菌体内にＰＨＡを蓄積させることができる。炭素源としては、糖、油脂または脂肪酸等を用いることができる。炭素源以外の栄養源として、窒素源、無機塩類、そのほかの有機栄養源を任意に用いることができる。
【００２３】
糖としては、グルコースの他、例えばシュークロース、フラクトース等の炭水化物が挙げられる。油脂としては、炭素数が１０以上である飽和・不飽和脂肪酸を多く含む油脂、例えばヤシ油、パーム油、パーム核油等が挙げられる。脂肪酸としては、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸等の飽和・不飽和脂肪酸、あるいはこれら脂肪酸のエステルや塩等の脂肪酸誘導体が挙げられる。
【００２４】
窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。
【００２５】
無機塩類としては、例えばリン酸水素２カリウム、リン酸２水素カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
【００２６】
そのほかの有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
【００２７】
培養温度は、その菌が生育可能な温度であればよいが、２０℃から４０℃が好ましい。培養時間は、特に制限はないが、１〜１０日間程度で良い。
【００２８】
得られた該培養菌体に蓄積されたポリエステルは公知の方法により回収することができる。例えば次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてＰＨＡを抽出する。このＰＨＡを含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてＰＨＡを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてＰＨＡを回収することができる。
【００２９】
また菌体内ポリエステルの蓄積は乾燥菌体のメタノリシス処理により生じた３−ヒドロキシアルカン酸メチルエステルをガスクロマトグラフィーにより分析することによってもＰＨＡを蓄積していることを確認できる。
【実施例】
【００３０】
以下に実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら制限されるものではない。なお全体的な遺伝子操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８９））の記載に準じて行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その説明に従い使用することができる。なお、酵素としては、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。
【００３１】
（実施例１）Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓのｇｌｆオペロンの増幅
Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ（ＤＳＭ  Ｎｏ．４２４）から定法に従い染色体ＤＮＡを抽出した。染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１と配列番号２で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ条件は（１）９８℃で２分、（２）９８℃で２０秒、（３）５６℃で３０秒、（４）６８℃で６．５分、（２）から（４）を３０サイクル、（５）７２℃で５分であり、ポリメラーゼとしてはＫＯＤ  Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いて約６．４ｋｂｐ断片を増幅させた。
【００３２】
（実施例２）Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓのｇｌｆ遺伝子の増幅
Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ（ＤＳＭ  Ｎｏ．４２４）の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３と配列番号４で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ条件は（１）９８℃で２分、（２）９８℃で２０秒、（３）５８℃で３０秒、（４）６８℃で２分、（２）から（４）を２５サイクル、（５）７２℃で５分であり、ポリメラーゼとしてはＫＯＤ  Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いて約１．６ｋｂｐ断片を増幅させた。
【００３３】
（実施例３）増幅断片のサブクローニング
増幅させた各断片の大量調製及び塩基配列確認のため、ｐＵＣ１１８にサブクローニングした。その方法は以下の通りである。まず、増幅した各断片をＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ製）を用いて精製し、次にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（タカラバイオ製）を用いてリン酸化した。その断片を、制限酵素ＨｉｎｃＩＩ切断及び脱リン酸化したクローニングベクターｐＵＣ１１８と連結し、定法に従い大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。Ｘ−Ｇａｌ及びＩＰＴＧ含有培地で白色を呈するコロニーから定法に従いプラスミドを抽出して制限酵素ＸｂａＩ或いはＸｂａＩとＳａｌＩ切断により挿入方向を確認した。所望の挿入方向であったプラスミドの挿入部分について塩基配列確認を行い、それぞれｇｌｆ遺伝子或いはｇｌｆオペロンであることを確認した。
【００３４】
（実施例４）発現ベクターの構築
ｇｌｆ遺伝子断片或いはｇｌｆオペロン遺伝子を連結したｐＵＣ１１８ベクターをそれぞれ制限酵素ＸｂａＩ及びＡｌｗ４４Ｉで切断し、それぞれｇｌｆ遺伝子或いはｇｌｆオペロン遺伝子をＸｂａＩ断片として抽出・精製した。一方、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−３もＸｂａＩで切断後、脱リン酸化し、それぞれの断片と連結し、定法に従い大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。出現したコロニーから定法に従いプラスミドを抽出して制限酵素ＸｂａＩとＮｃｏＩ切断により挿入方向を確認し、所望の挿入方向であった発現ベクターをそれぞれｐＢＢＲ３−ｇｌｆ或いはｐＢＢＲ３−ｇｌｆ＿ｚｅｇと命名した。
【００３５】
（実施例５）形質転換体の作製
実施例４で得られた発現ベクターを導入したＣ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の形質転換体を電気パルス法により作製した。遺伝子導入装置はＢｉｏｒａｄ社製のジーンパルサー  Ｘｃｅｌｌを用い、キュベットは同じくＢｉｏｒａｄ社製のｇａｐ０．１ｃｍのものを用いた。キュベットに、コンピテント細胞２０μｌと発現ベクターｐＢＢＲ３−ｇｌｆ或いはｐＢＢＲ３−ｇｌｆ＿ｚｅｇを１〜２μｌ注入してパルス装置にセットし、静電容量２５μＦ、電圧１．８ｋＶ、抵抗値２００Ωの条件で電気パルスをかけた。パルス後、キュベット内の菌液を０．８ｍｌのＳＯＣ培地で３０℃、一晩振とう培養し、選択プレート（ＮＲ培地（１％魚肉エキス、１％ポリペプトン、２％酵母エキス）、テトラサイクリン２５ｍｇ／Ｌ、１．５％寒天）で、３０℃にて培養して形質転換体を取得し、Ｈ１６［ｐＢＢＲ３−ｇｌｆ］或いはＨ１６［ｐＢＢＲ３−ｇｌｆ＿ｚｅｇ］と命名した。
【００３６】
同様に、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ３をＣ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株に導入して、形質転換体を作製し、Ｈ１６［ｐＢＢＲ１ＭＣＳ３］と命名した。
【００３７】
（実施例６）グルコース資化性の確認
実施例５で得た形質転換体Ｈ１６［ｐＢＢＲ３−ｇｌｆ］及びＨ１６［ｐＢＢＲ３−ｇｌｆ＿ｚｅｇ］のグルコース資化性を以下のようにして確認した。前培養として１２．５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含む３ｍｌのＮＲ培地（１％魚肉エキス、１％ポリペプトン、２％酵母エキス）に、上記形質転換株と、対照としてＨ１６［ｐＢＢＲ１ＭＣＳ３］を、それぞれ２株ずつ植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した。遠心分離により集菌し、ＭＢ培地（９ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１．５ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ  ＮＨ４Ｃｌ、０．２ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｍｌ／Ｌ  微量金属溶液（０．１Ｎ  ＨＣｌ中、０．２１８ｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、９．７ｇ／Ｌ  ＦｅＣｌ３、７．８ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２、０．１１８ｇ／Ｌ  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１０５ｇ／Ｌ  ＣｒＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、０．１５６ｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ））に懸濁した。次にＯＤ６６０が０．００５になるようにそれぞれの懸濁液を１００ｍｌのＭＢ培地（１２．５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含む）に植菌し、３０℃で培養した。この時、炭素源はそれぞれグルコース濃度０．５％或いは２％とした。
【００３８】
グルコース濃度２％時の培養結果を図１に示す。Ｈ１６［ｐＢＢＲ３−ｇｌｆ］とＨ１６［ｐＢＢＲ３−ｇｌｆ＿ｚｅｇ］ではその生育やＰＨＡの蓄積に差は見られなかった。グルコース濃度が２％では０．５％の際に比べて最終的な菌体量は約２倍となり、３．２〜４．３ｇ／Ｌの乾燥菌体重量が得られた。この様にＺ．ｍｏｂｉｌｉｓのｇｌｆ遺伝子或いはｇｌｆ−ｚｅｇ遺伝子を導入したＣ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株では非導入のＨ１６株に比べて有意な増殖性が認められ、同遺伝子或いはオペロンによりグルコース資化能が付与されたことが明らかになった。
【００３９】
（実施例７）Ｐ（３ＨＢ）生産量の測定
実施例６で培養した菌体中のＰ（３ＨＢ）含量を以下のようにして測定した。乾燥菌体４０ｍｇに２ｍｌの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱することにより、菌体内ポリエステル分解物のメチルエステルを得た。これに１ｍｌの蒸留水を添加して激しく撹拌した。静置して二層に分離させた後、下層の有機層を取り出した。有機相０．１ｍｌに０．１％オクタン酸メチル−クロロホルム溶液を０．１ｍｌ、ジメチルホルムアミド０．３ｍｌとＢｉｓ（ｔｒｉｍｅｔｈｙｓｉｌｙｌ）ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｅ０．１ｍｌを加え、７０℃で３０分間加熱して水酸基をトリメチルシリル化した。室温まで冷却し、ヘキサン１ｍｌと精製水１ｍｌを加えて激しく撹拌し、静置後、上層の有機層をキャピラリーガスクロマトグラフィーによって分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所製ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡＢＯＮＤ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。温度条件は、初発温度１００℃から８℃／分の速度で昇温した。結果を図２に示した。菌体内Ｐ（３ＨＢ）ホモポリマーの蓄積率は、乾燥菌体重量あたり７０〜８０ｗｔ％に達した。これはフルクトースを炭素源とした際と同等の菌体収率およびＰ（３ＨＢ）蓄積率であった。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】２％グルコース培地におけるＣ．ｎｅｃａｔｏｒ形質転換株の増殖性を示す。図中の横軸は培養時間、縦軸はＯＤ６６０を示す。ｐＢＢＲ３−ｇｌｆはＨ１６［ｐＢＢＲ３−ｇｌｆ］、ｐＢＢＲ３−ｇｌｆ＿ｚｅｇはＨ１６［ｐＢＢＲ３−ｇｌｆ＿ｚｅｇ］、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ３はＨ１６［ｐＢＢＲ１ＭＣＳ３］を指す。
【図２】２及び０．５％グルコース培地におけるＣ．ｎｅｃａｔｏｒ形質転換株の乾燥菌体重量とＰ（３ＨＢ）蓄積率を示す。図中のＰＨＡ蓄積率は本願ではＰ（３ＨＢ）蓄積率で評価した。ＰＨＡ蓄積率は、乾燥菌体重量に占めるＰＨＡ蓄積量から計算し得る。2% glucoseおよび0.5% glucoseは培養時の炭素源を示す。ｇｌｆはＨ１６［ｐＢＢＲ３−ｇｌｆ］を、ｇｌｆ＿ｚｅｇはＨ１６［ｐＢＢＲ３−ｇｌｆ＿ｚｅｇ］を指す。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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