(57)【要約】      （修正有）【課題】油脂産業において大量に副生成するグリセロールを有効利用し、これを主原料として機能性糖質であるＤ−アラビトールを安価で効率良く発酵生産する方法、及びそれを効率的に実施するために用いる微生物の提供。【解決手段】グリセロールを炭素源とした液体培地において、キャンディダ・クエルシトルーサ（Candida quercitrusa）、デバリオミセス・ハンゼニイ（Debaryomyces hansenii）、ピヒア・スチピチス（Pichia stipitis）、メチニコビア・ゾベリ（Metschnikowia zobelli）又はメチニコビア・ルナタ（Metschnikowia lunata）から選択される少なくとも１種の微生物を培養する、Ｄ−アラビトールの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリセロールを炭素源とした液体培地において、キャンディダ・クエルシトルーサ（Candida quercitrusa）、デバリオミセス・ハンゼニイ（Debaryomyces hansenii）、ピヒア・スチピチス（Pichia stipitis）、メチニコビア・ゾベリ（Metschnikowia zobelli）又はメチニコビア・ルナタ（Metschnikowia lunata）から選択される少なくとも１種の微生物を培養する、Ｄ−アラビトールの製造方法。
【請求項２】
キャンディダ・クエルシトルーサ（Candida quercitrusa）が、キャンディダ・クエルシトルーサ（Candida quercitrusa）17-2A（FERM P-21420）である、請求項１に記載のＤ−アラビトールの製造方法。
【請求項３】
微生物が、キャンディダ・クエルシトルーサ（Candida quercitrusa）17-2A（FERM P-21420）である、請求項１に記載のＤ−アラビトールの製造方法。
【請求項４】
グリセロールが、植物油の分解又はエステル交換の副生成物である、請求項１から３のいずれか１項に記載のＤ−アラビトールの製造方法。
【請求項５】
37℃で生育が可能である、微生物キャンディダ・クエルシトルーサ（Candida quercitrusa）。
【請求項６】
ビタミン欠乏培地で生育が可能である、微生物キャンディダ・クエルシトルーサ（Candida quercitrusa）。
【請求項７】
L-アラビニトール資化性を有する、微生物キャンディダ・クエルシトルーサ（Candida quercitrusa）。
【請求項８】
37℃で生育が可能であり、ビタミン欠乏培地で生育が可能であり、かつL-アラビニトール資化性を有する、微生物キャンディダ・クエルシトルーサ（Candida quercitrusa）。
【請求項９】
微生物キャンディダ・クエルシトルーサ（Candida quercitrusa）17-2A（FERM P-21420）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリセロール、特に油脂産業等の副産物として大量に生成される安価なグリセロールを主原料として微生物培養の培地に用いることで、機能性糖質であるＤ−アラビトールを効率的に発酵生産するＤ−アラビトールの製造方法、及びその方法を効率良く実施するために用いる微生物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｄ−アラビトールは、従来Ｄ−アラビノースの化学的還元方法によって製造されてきた糖アルコールである。出発原料であるＤ−アラビノース自体が高価な糖であり、その結果Ｄ−アラビトールも非常に高価なものとなっていた。しかしながら、Ｄ−アラビトールは、主として化学試薬として用いられる需要の少ない化合物であることから、従来コスト高に関してはあまり重要視されてはいなかった。
【０００３】
しかし、昨今、糖アルコールの機能に対する関心が高まってきており、今後の需要拡大が予想されている。例えばその引き金となったキシリトールは、ショ糖よりもカロリーが低く、かつショ糖に匹敵する甘味を呈するため低カロリー甘味料として将来有望であるだけでなく、抗う蝕性を有することから虫歯予防甘味料としても利用されている。さらに、キシリトールは血糖値を上昇させないため、糖尿病治療の際の輸液としても利用されている。
【０００４】
同様に、Ｄ−アラビトールもそれ自体、保湿効果のある機能性素材として、また抗う蝕性を有する甘味料としての有用性が見出されている。さらに、Ｄ−アラビトールは、既に大きな需要のある上記キシリトール製造の出発原料としても利用できることが報告されており（特許文献１、２、非特許文献１）、極めて有用な糖質として今後の需要拡大が見込まれている。
【０００５】
しかし上述の通り、Ｄ−アラビトールは非常に高価であるため、昨今の需要の高まりに応じて、高価なＤ−アラビノースを出発原料としない方法、例えば、安価な原料を用いた発酵法の検討が進められている。グルコース、フルクトース等の極めて安価な糖質を原料とするＤ−アラビトールの生産に関する微生物として、例えばデバリオミセス・ハンゼニイ（Debaryomyces hansenii）（非特許文献２）、メチニコビア（Metschnikowia）属（特許文献３）、キャンディダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）（特許文献４）等に属する酵母菌が報告されている。これらの発酵法は経済性が高く、グルコースやフルクトースから特異的に、Ｄ−アラビトールのみを生産できることから、反応後、Ｄ−アラビトールを非常に容易に分離できる。
【０００６】
一方、昨今地球温暖化防止対策、持続可能な社会の育成という観点から、バイオマスエネルギーの利用促進が進められ、バイオエタノールの生産原料として膨大な量の糖質が利用されるようになり、糖質原料の価格高騰が進んでいる。今やグルコースは決して安価な原料とは言えない状況にある。対照的に、同じ再生可能な天然資源として植物油を原料とする素材開発、バイオディーゼルの生産等の分野においては、副産物として大量にグリセロールが生産されている。これら余剰のグリセロールは、今後も増加の一途をたどると予想され、その処理、又は有効利用方法の開発が望まれている。
【０００７】
最近では上述の時代背景も相まって、グリセロールを発酵原料として機能性物質を生産する研究も活発に進められている。ここで注目すべき報告例として、グリセロールを原料として上記Ｄ−アラビトールを発酵生産する製造方法に関する古い報告例（特許文献５、非特許文献３）が挙げられる。ここでは、キャンディダ・ポリモルファ（Candida polymorpha）、サッカロミセス・ルキシー（Saccharomyces rouxii）、トルロプシス・ハマタ（Torulopsis famata）に属する微生物を用い、グリセロールを主たる炭素原料とした培地中でＤ−アラビトールの発酵生産を行っているが、その生産量は十分とは言えなかった。また上記３例以外の微生物によるグリセロールを原料としたＤ−アラビトールの発酵生産例は無い。
【０００８】
【特許文献１】ヨーロッパ特開４０３３９２号公報
【特許文献２】ヨーロッパ特開４２１８８２号公報
【特許文献３】特開２００１−８６８２号公報
【特許文献４】特開２００２−１９１３８８号公報
【特許文献５】特公昭４７−２０３９４号公報
【非特許文献１】エイチ．オオニシ（Ｈ．Ｏｎｉｓｈｉ），ティ，スズキ（Ｔ．Ｓｕｚｕｋｉ），「アプライド マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）」，１８巻，ｐ１０３１−１０３５（１９６９）．
【非特許文献２】エム．エフ．ノブル（Ｍ．Ｆ．Ｎｏｂｒｅ），エム．エス．ダコスタ（Ｍ．Ｓ．Ｄａｃｏｓｔａ），「カナデアン ジャーナル オブ マイクロバイオロジー（Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）」，３１巻，ｐ４６７−４７１（１９８５）．
【非特許文献３】エイチ．オオニシ（Ｈ．Ｏｎｉｓｈｉ），ティ，スズキ（Ｔ．Ｓｕｚｕｋｉ），「ジャーナル オブ ファーメンテーション テクノロジー（Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．）」，４８巻，ｐ５６３−５６６（１９７０）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記事情を鑑みて、本発明では、より安価な原料であるグリセロール、特に油脂産業において大量に副生成するグリセロールを主原料として用いることで、機能性糖質であるＤ−アラビトールを安価で効率良く発酵生産する方法、及びそれを効率的に実施するために用いる微生物の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、環境中からスクリーニングしてきた微生物及びその類縁菌等を用い、主原料としてグリセロールを添加した液体培地で培養することで、Ｄ−アラビトールを従来の発酵生産方法よりも高い収量で安価に生産できることを見出し、本発明をなすに至ったものである。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の〔１〕〜〔９〕に示される。
〔１〕グリセロールを炭素源とした液体培地において、キャンディダ・クエルシトルーサ（Candida quercitrusa）、デバリオミセス・ハンゼニイ（Debaryomyces hansenii）、ピヒア・スチピチス（Pichia stipitis）、メチニコビア・ゾベリ（Metschnikowia zobelli）又はメチニコビア・ルナタ（Metschnikowia lunata）から選択される少なくとも１種の微生物を培養する、Ｄ−アラビトールの製造方法。
〔２〕キャンディダ・クエルシトルーサ（Candida quercitrusa）が、キャンディダ・クエルシトルーサ（Candida quercitrusa）17-2A（FERM P-21420）である、〔１〕に記載のＤ−アラビトールの製造方法。
〔３〕微生物が、キャンディダ・クエルシトルーサ（Candida quercitrusa）17-2A（FERM P-21420）である、〔１〕に記載のＤ−アラビトールの製造方法。
〔４〕グリセロールが、植物油の分解又はエステル交換の副生成物である、〔１〕から〔３〕のいずれか１つに記載のＤ−アラビトールの製造方法。
〔５〕37℃で生育が可能である、微生物キャンディダ・クエルシトルーサ（Candida quercitrusa）。
〔６〕ビタミン欠乏培地で生育が可能である、微生物キャンディダ・クエルシトルーサ（Candida quercitrusa）。
〔７〕L-アラビニトール資化性を有する、微生物キャンディダ・クエルシトルーサ（Candida quercitrusa）。
〔８〕37℃で生育が可能であり、ビタミン欠乏培地で生育が可能であり、かつL-アラビニトール資化性を有する、微生物キャンディダ・クエルシトルーサ（Candida quercitrusa）。
〔９〕微生物キャンディダ・クエルシトルーサ（Candida quercitrusa）17-2A（FERM P-21420）。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、安価な原料であるグリセロール、特に油脂産業等の副産物、あるいは産業廃棄物として大量に生成される安価なグリセロールを主原料として、付加価値の高いＤ−アラビトールを生産することができる。これまで、グルコース、フルクトース、スクロース等の糖質を原料とする製造技術の報告はあったが、さらに安価な原料であるグリセロールを用いることで、より低価格でＤ−アラビトールを市場に提供することができる。
グリセロールを原料としてＤ−アラビトールを生産する能力を有する微生物は、これまでに、キャンディダ・ポリモルファ（Candida polymorpha）、サッカロミセス・ルキシー（Saccharomyces rouxii）、トルロプシス・ハマタ（Torulopsis famata）に属する微生物の３例が報告されているが、本発明で用いる微生物はこれらを上回る収量でＤ−アラビトールを生産することが可能であり、また低純度のグリセロールからも生産可能である。
特に、昨今の時代背景から、上記糖質の価格高騰が予想されるのに対して、余剰グリセロールの生成量は増加の一途をたどると予想されることから、本発明を利用することによるＤ−アラビトールの価格低下に対する効果は極めて大きい。
また同時に、本発明は、これまで利用方法の限られていた、産業界における余剰グリセロールの処理及び有効利用に向けた一つの方法を提供するものであり、天然資源の効率的循環に大きく貢献するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明につきさらに詳しく説明する。
〈Ｄ−アラビトールの製造に使用できる微生物〉
本発明を実施するために使用する微生物としては、キャンディダ・クエルシトルーサ（Candida quercitrusa）、デバリオミセス・ハンゼニイ（Debaryomyces hansenii）、ピヒア・スチピチス（Pichia stipitis）、メチニコビア・ゾベリ（Metschnikowia zobelli）、またはメチニコビア・ルナタ（Metschnikowia lunata）から選択される少なくとも１種の微生物が挙げられる。また、これらの微生物を常法に基づき得られた変異株も包含する。
【００１４】
さらに、本発明者らは、上記キャンディダ・クエルシトルーサ（Candida quercitrusa）の中でも、沖縄県那覇市で採取した植物（花）サンプルから新規に発見されたキャンディダ・クエルシトルーサ（Candida quercitrusa）17-2A（FERM P-21420）が、グリセロールからＤ−アラビトールを選択的に生産する能力を有することを見出し、本発明でより有効に利用できることを突き止めた。従って、本発明の方法においては、このキャンディダ・クエルシトルーサ（Candida quercitrusa）17-2A（FERM P-21420）を、上記他の微生物と組み合わせて、又は単独で用いることもできる。以下、この新規株の菌学的性質について説明する。
【００１５】
〈17-2A株の菌学的性質〉
17-2A株は、YM寒天培地上にて25℃、4日間培養することで、直径が2〜3ｍｍ程度のコロニーを形成する（形：円形、隆起状態：クッション形、周縁：ほぼ全縁、表面の形状：平滑または僅かに皺状、色調：白色からクリーム色、光沢および性状：白亜状、バター様）。さらに、光学顕微鏡による微視的形態性状観察によれば、上記培養4日後の本菌株の栄養細胞は楕円形であり、多極出芽により増殖することが確認される。また、偽菌糸の形成も認められる。なお、培養1ヶ月経過した培地上で有性生殖器官の形成は認められない。
【００１６】
17-2A株は、リボソームRNA遺伝子の26SrDNA-D1/D2領域の塩基配列（rDNA配列）を決定し、アポロンDB-FU（Ver.1.0）並びに国際塩基配列データベースを用いてBLAST相同性検索（S.F., Altschulら、Nucleic Acids Research, 25, 3389-3402 (1997)）を行ったところ、キャンディダ・クエルシトルーサ（Candida quercitrusa）のrDNA配列と99.8 ％一致した。本菌株の分子系統樹を図１に示す。さらに、本菌株の生理性状試験の結果（表１）を合わせて、本菌株をキャンディダ・クエルシトルーサ（Candida quercitrusa）17-2A株と命名した。本菌株は、平成19（2007）年10月30日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（IPOD）（茨城県つくば市東１−１−３）に受託番号FERM P-21420として寄託されている。従来のキャンディダ・クエルシトルーサは、Ｌ−アラビニトールの資化能を示さず、ビタミン欠乏培地での生育及び37℃での生育を示さない（Kurtzman, C. P. and Fell, J. W. 1998. The Yeasts, a taxonomic study, 4th edition, Elsevier, Amsterdam, Netherlands）。これに対して本菌株は、Ｌ−アラビニトール資化能を有し、ビタミン欠乏培地での生育及び37℃での生育を示す。従って、本菌株は、Ｌ−アラビニトール資化能を有することにより利用可能な栄養源の種類が増え、ビタミン欠乏培地での生育を示すことにより貧栄養培地中での培養が可能となる。さらに、37℃での生育を示すことにより、一般的に発熱を伴う、微生物を用いた発酵生産において、従来のキャンディダ・クエルシトルーサを用いた場合のように冷却の工程を必要とせず、コストを軽減できる。以上のように、本菌株は、発酵生産を行う上で優れた利点を有する。
【００１７】
【表１】
2009148211.tif 000002
表中の「＋」は反応が陽性、「−」は反応が陰性、「Ｗ (weak)」は弱い陽性反応、「S (slow)」は試験開始後２週間から３週間にかけて徐々に陽性反応が認められたこと、「Ｌ (latent)」は試験開始後２週間以降に急速に陽性反応が認められたことを示す。
【００１８】
〈Ｄ−アラビトールの製造方法〉
本発明のＤ−アラビトールの製造方法は、上記の微生物を、グリセロールを炭素源とした培地で培養することにより行う。該方法の詳細を以下に記載する。
〈培地、培養条件〉
本発明では、上記の微生物の少なくとも１種又は２種以上を、液体培地中で好気的に培養することが望ましい。
前記液体培地は、溶媒、例えば水に、炭素源、窒素源、無機塩類、ビタミン等の栄養素を添加したものを用いることができる。
本発明のＤ−アラビトールの製造方法においては、主な炭素源として、グリセロールを使用する。前記グリセロールは、市販の高純度のグリセロール試薬を用いることができるが、本発明においては特に、油脂産業などにおいて植物油の分解又はエステル交換の副生成物として生成する廃グリセロールをそのまま用いることが可能である。さらに、活性炭処理などによって廃グリセロールに含有する微生物生産阻害物（微量金属など）を除去して培養液に使用すればなお良い。具体的には、上記廃グリセロールに活性炭素（和光純薬工業製、顆粒状）（例えば廃グリセロール１Ｌに対して２００〜５００ｇ）を加え、室温にて６０分以上撹拌後、ろ過によって活性炭素を除去したろ液分を活性炭処理済み廃グリセロールとして用いることが望ましい。液体培地に添加されるグリセロール純分の濃度条件は５０〜５００ ｇ／Ｌ、好ましくは１００〜４００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは１５０〜３５０ｇ／Ｌ、最も好ましくは２００〜３００ｇ／Ｌの範囲で使用されることが好ましい。グリセロールを、例えば初期に１００〜４００ｇ／Ｌ添加し、その後培養２〜４日間隔で１００〜２００ｇ／Ｌずつ段階的に追加することもできる。また、グリセロールに加えて、本発明の実施に用いる微生物が資化可能な一般的に用いられる糖類、例えばグルコース、ガラクトース、スクロース等、または糖蜜などを１０〜５０ｇ／Ｌ程度添加することで炭素源として併用しても良い。
【００１９】
窒素源としては、微生物により利用可能な窒素化合物、例えば有機物（酵母エキス、ペプトン、麦芽エキス、カザミノ酸、コーンスチープリカー、アミノ酸、尿素など）、無機物（硝酸ナトリウム等の硝酸塩、アンモニウム塩など）のいずれかを単独、または混合して使用でき、発酵生産性を高める観点から酵母エキスを好適に用いることができる。
無機塩類は、ミネラル分として、リン酸塩類、カルシウム塩類（例えば塩化カルシウム）、マグネシウム塩類、マンガン塩類、鉄分、亜鉛分などのいずれかを単独、または混合して使用してもよい。さらに、各種のビタミン、消泡剤なども必要に応じて適宜選択添加することができ、その使用は常法の通りにすればよい。
本発明の方法においては、上記窒素源の濃度を、０．１〜２０ｇ／Ｌ、好ましくは１〜１０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは５〜９ｇ／Ｌ、最も好ましくは６〜８ｇ／Ｌの範囲とすることが、発酵生産性を高める観点から好ましい。また、上記カルシウム塩類の濃度を、０．１〜２０ｇ／Ｌ、好ましくは０．２〜１０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．５〜２ｇ／Ｌの範囲とすることが、発酵生産性を高める観点から好ましい。
以下、上記のようなＤ−アラビトールを生産するために使用する培地を、「Ｄ−アラビトール製造培地」と言う。
【００２０】
〈Ｄ−アラビトール製造方法の例〉
例えばD-グルコース１０ ｇ／Ｌ、酵母エキス３ ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ ｇ／Ｌ、ペプトン５ ｇ／Ｌを含む寒天培地で生育させた前記微生物の菌体を、Ｄ−アラビトール製造培地に直接接種するか、又は別に前培養によって得られる種培養液を、Ｄ−アラビトール製造培地に接種することにより行う。この種培養液の調製は、例えば殺菌したグリセロール１０ ｇ／Ｌ、酵母エキス３ ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ ｇ／Ｌ、ペプトン５ ｇ／Ｌを含む液体培地に、上記寒天培地上の菌体を１白金耳接種して２５〜３０℃で２０〜３０時間好気的に培養することにより行われる。Ｄ−アラビトールを製造するための培養（本培養）の培養温度は、２０〜４０℃で行われるが、好ましくは２５〜３４℃の範囲である。Ｄ−アラビトール製造培地のｐＨは通常３〜１０、好ましくは５〜８で調整される。培養期間は使用するグリセロールの濃度により異なるため、３〜１４日の範囲でグリセロール消費量に対する菌体増殖量とＤ−アラビトール生産量が定常状態に落ち着く最も効果的な時期に終了させることが望ましい。
【００２１】
〈Ｄ−アラビトールの定量、回収、精製〉
培養液中のＤ−アラビトールの生成量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）やガスクロマトグラフィーなどの周知の方法を用いて測定することができる。得られた培養液中からのＤ−アラビトールの単離、精製に関しては、ろ過、遠心分離、イオン交換または吸着クロマトグラフィー、溶媒抽出、結晶化などの通常用いられる操作を必要に応じて適宜組み合わせて行われる。例えば、遠心分離などにより培養液から菌体を除去し、次いでこの液を活性炭で処理して着色物質などを除き、さらにイオン交換樹脂により脱塩した後、濃縮したシロップから例えばエタノール、アセトンなどの有機溶媒の存在、非存在下で晶析することにより、純粋なＤ−アラビトールの結晶を得ることができる。
以下に、実施例および比較例を示して本発明を説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。また、濃度（ｇ／Ｌ）で示す場合には、全て培養液１Ｌに対する物質の純分の濃度を意味する。また、以下に特に記載しない限り、全ての培養を好気的条件下で行った。
【実施例】
【００２２】
（実施例１）
（廃グリセロールを用いたＤ−アラビトール生産）
【００２３】
グリセロールからＤ−アラビトールを生産する微生物として、キャンディダ・クエルシトルーサＮＢＲＣ１０２２株を使用した。
【００２４】
上記の菌株を、D-グルコース１０ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌを含む寒天培地で培養し、菌体１白金耳を種培養培地（グリセロール１０ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、１２１℃で２０分間滅菌）５ｍＬを含む試験管に接種し、２８℃、１５０ｒｐｍで２４時間振とう培養し、これを種培養液とした。
【００２５】
この種培養液１ Ｌを、Ｄ−アラビトール製造培地（活性炭処理済み廃グリセロール２５０ ｇ／Ｌ、酵母エキス６ ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１ｇ／Ｌ、ｐＨ６．５、１２１℃で２０分間滅菌）３０ｍＬを含む３００ｍＬ容三角フラスコに接種し、２８℃、２５０ｒｐｍで７日間振とう培養した。なお、ここで用いた活性炭処理済み廃グリセロールとは、植物油脂のエステル交換反応で副生成する廃グリセロール液（ライオン株式会社製廃グリセロール  グリセロール分８５質量％）を２倍に希釈し、これに活性炭（和光純薬工業製、顆粒状）を４０質量％（対グリセロール）加えて室温、１時間撹拌し、ろ過によって活性炭を除去したろ液のことである。以下、特に記載がない場合、「活性炭処理済みグリセロール」と記載する場合には、前記処理を行ったグリセロールを意味するものとする。なお、活性炭処理の前後において、グリセロールの濃度に変化は無かった。
【００２６】
培養液中に生成したアラビトール濃度の測定は、一部採取した培養液から遠心分離により菌体を除去した後、その上清を適宜希釈し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供することにより測定した。ＨＰＬＣ分析はＳｈｏｄｅｘ  Ｓｕｇａｒ  ＳＣ１０１１をカラムに用い、カラム温度８０℃、移動相に純水を用い、流速１．０ ｍＬ／分の条件で測定した。検出器は、示差屈折率（RI）検出器を使用した。例として、キャンディダ・クエルシトルーサＮＢＲＣ１０２２株の培養液上清のＨＰＬＣチャートを図１に示す。これを見ると、培地成分、炭素源であるグリセロール以外には、Ｄ−アラビトールのピークのみが検出されており、選択的にＤ−アラビトールのみを生産していることが示された。なお、Ｄ−アラビトールの生成量は、Ｄ−アラビトール標準品（和光純薬工業製、商品名D-(+)-アラビトール）を使用して作成した検量線を基にして算出した。
（実施例２〜実施例７）
グリセロールからＤ−アラビトールを生産する微生物として、メチニコビア・ゾベリＮＢＲＣ１６８０株（実施例２）、メチニコビア・ルナタＮＢＲＣ１６０５株（実施例３）、デバリオミセス・ハンゼニイ  バー  ファブリ（Debaryomyces hansenii var. fabryi）ＮＢＲＣ００１５株（実施例４）、デバリオミセス・ハンゼニイ  バー  ハンゼニイ（Debaryomyces hansenii var. hansenii）ＮＢＲＣ００８３株(実施例５)、ピヒア・スチピチスＮＢＲＣ１６８７株（実施例６）又はキャンディダ・クエルシトルーサ17-2A（FERM P-21420）株（実施例７）を使用し、実施例１と同様にして行った。
【００２７】
（実施例８、９）
（純グリセロールを用いたＤ−アラビトール生産）
市販の純粋なグリセロール試薬（和光純薬工業製）を用い、キャンディダ・クエルシトルーサＮＢＲＣ１０２２株（実施例８）及びキャンディダ・クエルシトルーサ17-2A(FERM P-21420)株（実施例９）のＤ−アラビトール生産性を調べた。培養、分析に関しては実施例１と同様に行った。
【００２８】
（比較例１、２）
（既存Ｄ−アラビトール生産菌による廃グリセロールからのＤ−アラビトール生産）
比較例として、グルコースを炭素源としてＤ−アラビトールを生産することが従来の報告（特許文献３）により知られているメチニコビア・パルチェリマ（Metschnikowia pulcherrima）ＮＢＲＣ１６７８株（比較例１）、メチニコビア・ロイカウフィ（Metschnikowia reukaufii）ＮＢＲＣ１６７９株（比較例２）を用いて、廃グリセロールからのＤ−アラビトール生産性を調べた。培養、分析に関しては実施例１と同様に行った。
（比較例３〜比較例６）
（他のキャンディダ属酵母による廃グリセロールからのＤ−アラビトール生産）
比較例として、図１においてキャンディダ・クエルシトルーサと分子系統学上で近縁と考えられたキャンディダ・フラジ（Candida fragi）ＮＢＲＣ１０７５９（比較例３）、キャンディダ・ナタレンシス（Candida natalensis）ＮＢＲＣ１９８１（比較例４）、さらにキャンディダ・ファンデルワルチ（Candida vanderwaltii）ＮＢＲＣ１０３１９（比較例５）、キャンディダ・アジマ（Candida azyma）ＮＢＲＣ１０４０６（比較例６）を用いて、廃グリセロールからのＤ−アラビトール生産性を調べた。培養、分析に関しては実施例１と同様に行った。
【００２９】
実施例１〜９および比較例１〜６において得られたＤ−アラビトールの生産量の分析結果を表２にまとめた。実施例において、用いたすべての菌株で廃グリセロールからＤ−アラビトールの生成が６．６〜４１．７ｇ／Ｌの範囲で確認された。キャンディダ・クエルシトルーサＮＢＲＣ１０２２株ならびにキャンディダ・クエルシトルーサ17-2A(FERM P-21420)株においては、簡便な活性炭処理により廃グリセロールから純グリセロールを使用した場合とほぼ同等のＤ−アラビトールを生成することが示された。
また比較例においては、グルコースからＤ−アラビトールを生産できることが既知である２菌株、キャンディダ・クエルシトルーサと分子系統学上で近縁と考えられた２菌株、及びキャンディダ属に属するそれ以外の２菌株、全ての検討で、廃グリセロールからＤ−アラビトールを生成することができなかった。
【００３０】
【表２】
2009148211.tif 000003
【００３１】
（実施例１０）
（Ｄ−アラビトール生産におけるグリセロール濃度の影響）
キャンディダ・クエルシトルーサＮＢＲＣ１０２２株を用い、１５０〜３５０ｇ／Ｌのグリセロール濃度のＤ−アラビトール製造培地を用いた場合の、Ｄ−アラビトール生産性を調べた。市販の純粋なグリセロール試薬（和光純薬工業製）を炭素源として用い、その他は実施例１と同様に行った。
実施例１０において得られたＤ−アラビトールの生産量の分析結果を表３にまとめた。用いた全てのグリセロール濃度において、Ｄ−アラビトールの生成が７．９〜４５．０ ｇ／Ｌの範囲で確認され、特にグリセロール濃度２５０ｇ／Ｌで培養を行った時にＤ−アラビトールの生産量が最大となった。
【表３】
2009148211.tif 000004
【００３２】
（実施例１１）
（Ｄ−アラビトール生産における窒素源の影響）
キャンディダ・クエルシトルーサＮＢＲＣ１０２２株を用い、Ｄ−アラビトール製造培地において各種窒素源を用いた場合の、Ｄ−アラビトール生産性を調べた。供試窒素源の濃度を５ｇ／Ｌとし、さらに微量元素等の栄養源を補うために酵母エキスを１ｇ／Ｌとなるように添加した。その他は実施例１と同様に行った。
実施例１１において得られたＤ−アラビトールの生産量の分析結果を表４にまとめた。用いた全ての窒素源濃度において、Ｄ−アラビトールの生成が３．７〜４５．０ ｇ／Ｌの範囲で確認され、特に酵母エキスを用いた時にＤ−アラビトールの生産量は最大となった。
【００３３】
【表４】
2009148211.tif 000005
【００３４】
（実施例１２）
（Ｄ−アラビトール生産におけるｐＨの影響）
キャンディダ・クエルシトルーサFERM P-21420株を用い、Ｄ−アラビトール製造培地における各ｐＨ条件下でのＤ−アラビトール生産性を調べた。Ｄ−アラビトール製造培地のｐＨを３〜９に調整し、それ以外は実施例１と同様に行った。
実施例１２において得られたＤ−アラビトールの生産量の分析結果を表５にまとめた。培養試験を行った全てのpHにおいて、Ｄ−アラビトールの生成が１２．６〜３５．６ ｇ／Ｌの範囲で確認され、特にｐＨ５〜９の範囲の時、効果的にＤ−アラビトールを生産した。
【表５】
2009148211.tif 000006
【００３５】
（実施例１３）
（Ｄ−アラビトール生産における酵母エキス濃度の影響）
キャンディダ・クエルシトルーサＮＢＲＣ１０２２株を用い、Ｄ−アラビトール製造培地における２〜８ｇ／Ｌの酵母エキス濃度でのＤ−アラビトール生産性を調べた。Ｄ−アラビトール製造培地中の酵母エキスの濃度以外は実施例１と同様に行った。
実施例１３において得られたＤ−アラビトールの生産量の分析結果を表６にまとめた。用いた全ての酵母エキス濃度において、Ｄ−アラビトールの生成が１３．５〜４５．０ｇ／Ｌの範囲で確認され、特に酵母エキス濃度を６〜８ｇ／Ｌの範囲で用いた時にＤ−アラビトールの生産量は大きくなった。
【表６】
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【００３６】
（実施例１４）
（Ｄ−アラビトール生産におけるカルシウムの影響）
キャンディダ・クエルシトルーサＮＢＲＣ１０２２株を用い、Ｄ−アラビトール製造培地におけるカルシウム存在下でのＤ−アラビトール生産性を調べた。Ｄ−アラビトール製造培地に塩化カルシウム二水和物を０〜２ｇ／Ｌとなるように添加し、それ以外は実施例１と同様に行った。
実施例１３において得られたＤ−アラビトールの生産量の分析結果を表６にまとめた。用いた全ての塩化カルシウム濃度において、Ｄ−アラビトールの生成が４５．０〜５８．２ ｇ／Ｌの範囲で確認され、特に０．５ｇ／Ｌ以上の塩化カルシウム二水和物を添加した時、効果的にＤ−アラビトールを生産した。
【表７】
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【００３７】
（実施例１５）
（キャンディダ・クエルシトルーサＮＢＲＣ１０２２株、ならびにキャンディダ・クエルシトルーサ17-2A(FERM P-21420)株における発酵槽を使用した廃グリセロールからのＤ−アラビトール生産）
キャンディダ・クエルシトルーサＮＢＲＣ１０２２株ならびにキャンディダ・クエルシトルーサ17-2A(FERM P-21420)株を、実施例１の種培養と同様の条件で培養し、これを種培養液１とした。この種培養液１ ｍＬを、種培養培地２（D-グルコース１０ ｇ／Ｌ、酵母エキス３ ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ ｇ／Ｌ、ペプトン５ ｇ／Ｌ、１２１℃で２０分間滅菌）３０ ｍＬを含む３００ ｍＬ容三角フラスコ２本にそれぞれ接種し、２８℃、２５０ ｒｐｍで１日間振とう培養した。
【００３８】
この種培養２液の全量を、Ｄ−アラビトール製造培地（活性炭処理済み廃グリセロール２５０ ｇ／Ｌ、酵母エキス６ ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１ ｇ／Ｌ、ｐＨ６．５、１２１℃で２０分間滅菌）８００ ｍＬを含む２０００ ｍＬ容発酵槽に接種し、２８℃、８００ ｒｐｍ、通気量１ ｖｖｍで７日間培養した。培養液の分析に関しては実施例１と同様に行った。それぞれの菌株について、菌体増殖量及びＤ−アラビトール生産量を培養時間に沿って追跡したグラフを図３及び４に示す。
【００３９】
培養７日目でのＤ−アラビトール生成量は、ＮＢＲＣ１０２２株で５０．１ ｇ／Ｌ、17-2A(FERM P-21420)株で４５．０ ｇ／Ｌを示した。
（実施例１６）
（キャンディダ・クエルシトルーサＮＢＲＣ１０２２株における発酵槽を使用したカルシウム添加条件での廃グリセロールからのＤ−アラビトール生産）
キャンディダ・クエルシトルーサＮＢＲＣ１０２２株を、実施例１４の種培養１、２と同様の条件で培養した。
この種培養２液の全量を、Ｄ−アラビトール製造培地（活性炭処理済み廃グリセロール２５０ ｇ／Ｌ、酵母エキス６ ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１ ｇ／Ｌ、塩化カルシウム二水和物２ｇ／Ｌ、ｐＨ６．５、１２１℃で２０分間滅菌）８００ ｍＬを含む２０００ ｍＬ容発酵槽に接種し、２８℃、８００ ｒｐｍ、通気量１ ｖｖｍで７日間培養した。培養液の分析に関しては実施例１と同様に行った。それぞれの菌株について、菌体増殖量及びＤ−アラビトール生産量を培養時間に沿って追跡したグラフを図５に示す。
培養７日目でのＤ−アラビトール生成量は、６５．３ ｇ／Ｌを示した。これは、従来の報告（非特許文献２）で示された、キャンディダ・ポリモルファＡＴＣＣ２０２１３株を用いた純グリセロールからのＤ−アラビトール生成量（３０．４ ｇ／Ｌ）の２倍以上であり、極めて効率良くＤ−アラビトールが生産されることが確認された。以上より、本発明によれば安価な廃グリセロールを原料に用いて、高い収量でＤ−アラビトールを生産できる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】キャンディダ・クエルシトルーサ17-2A株から得られた塩基配列をもとに作成した分子系統樹を示す。
【図２】実施例１において、キャンディダ・クエルシトルーサＮＢＲＣ１０２２株の培養液上清の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析結果を示す。
【図３】実施例２において、発酵槽を用いて行ったキャンディダ・クエルシトルーサＮＢＲＣ１０２２株の培養試験による、菌体増殖量及びＤ−アラビトール生産量を培養時間に沿って追跡したグラフである。
【図４】実施例２において、発酵槽を用いて行ったキャンディダ・クエルシトルーサ17-2A（FERM P-21420）株の培養試験による、菌体増殖量及びＤ−アラビトール生産量を培養時間に沿って追跡したグラフである。
【図５】実施例１５において、発酵槽を用いて行ったキャンディダ・クエルシトルーサＮＢＲＣ１０２２株のカルシウム添加条件下での培養試験による、菌体増殖量及びＤ−アラビトール生産量を培養時間に沿って追跡したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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