(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト腫瘍壊死因子受容体の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸配列から成る単離されたポリペプチド、前記ポリペプチドをコードする核酸分子、前記核酸分子を含んでなるベクター、前記ベクターを含んでなる組換え宿主細胞、前記宿主細胞を培養することを含んでなる前記ポリペプチドの生成方法、および好ましくは免疫グロブリン成分を含んでなる第２のポリペプチドに連結された前記ポリペプチドを含んでなる融合タンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ配列のアミノ酸残基７−71を含んで成る単離されたポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基１−71を含んで成る請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸配列を含んで成る請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸配列から成るアミノ酸配列を有する請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
（ａ）配列番号２のアミノ酸残基７−71のアミノ酸配列、（ｂ）配列番号２のアミノ酸残基１−71のアミノ酸配列、及び（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列、から成る群から選択されたアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子。
【請求項６】
配列番号２のアミノ酸残基７−71を含んで成るアミノ酸配列をコードする請求項５記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
配列番号１のヌクレオチド27−578、又は配列番号１のヌクレオチド45−299のヌクレオチド配列を含んで成る請求項５記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
請求項７記載の単離された核酸分子を含んで成るベクター。
【請求項９】
配列番号２のアミノ酸残基７−71を含んで成るポリペプチドをコードする核酸分子、転写プロモーター及び転写ターミネーターを含んで成り、ここで前記プロモーターが前記核酸分子と作用可能に結合されており、そして前記核酸分子が前記転写ターミネーターと作用可能に結合されていることを特徴とする発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９記載の発現ベクターを含んで成る、細菌、酵母細胞、鳥類細胞、菌類細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞及び植物細胞から成る群から選択された組換え宿主細胞。
【請求項１１】
配列番号２のアミノ酸残基７−71を含んで成るポリペプチドの生成方法であって、請求項９記載の発現ベクターを含んで成り、そして前記ポリペプチドを生成する組換え宿主細胞を培養することを含んで成る方法。
【請求項１２】
前記培養された組換え宿主細胞から前記ポリペプチドを単離することをさらに含んで成る請求項11記載の方法。
【請求項１３】
請求項４記載のポリペプチドと特異的に結合する、抗体又は抗体フラグメント。
【請求項１４】
（ａ）ポリクローナル抗体、（ｂ）ネズミモノクローナル抗体、（ｃ）（ｂ）由来のヒト化抗体、及び（ｄ）ヒトモノクローナル抗体から成る群から選択される請求項13記載の抗体。
【請求項１５】
請求項１記載のポリペプチドを含んで成る融合タンパク質。
【請求項１６】
配列番号２のアミノ酸残基１〜71を含んで成る請求項15記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
免疫グロブリン成分をさらに含んで成る請求項15又は16記載の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的に、ヒト細胞により発現される新規タンパク質に関する。特に、本発明は、“Ztnfr12”と称する受容体をコードする新規遺伝子、及びZtnfr12ポリペプチドをコードする核酸分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインは、多くの細胞型の増殖及び分化の調節を包含する種々の生物学的効果を仲介する可溶性の小さなタンパク質である（例えば、Araiなど., Annu. Rev. Biochem. 56: 783 (1990); Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3:311 (1991); Paul and Seder, Cell 76: 241 (1994) を参照のこと）。サイトカイングループを構成するタンパク質は、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子及び他の調節分子を包含する。例えば、ヒトインターロイキン−17は、インターロイキン−６、細胞内付着分子１、インターロイキン−８、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の発現、及びプロスタグランジンE2発現を刺激し、そしてCD34+造血前駆体の好中球への選択的成熟において役割を演じるサイトカインである。（Yaoなど., J. Immunol. 155: 5483 (1995); Fossiez など., J. Exp. Med. 183: 2593 (1996)）。
【０００３】
サイトカインを結合する受容体は典型的には、高い親和性でサイトカインを結合し、そしてこの結合現象を、一定の受容体サブユニットの細胞質部分を通して細胞にトランスダクションする１又は複数の膜内在性タンパク質から構成される。サイトカイン受容体は、それらの細胞外リガンド結合ドメインにおける類似性に基づいて、いくつかのクラスに分類されている。例えば、インターフェロンの結合及び/又はその効果のトランスダクションを担当する受容体鎖は、特徴的な200個の残基の細胞外ドメインに基づいて、タイプIIサイトカイン受容体ファミリーのメンバーである。
【０００４】
免疫応答の間に生じる細胞相互作用は、いくつかの細胞表面受容体ファミリー、例えば腫瘍壊死因子受容体（TNFR）ファミリーのメンバーにより調節される。TNFRファミリーは、多くの膜内在性糖タンパク質から成り、それらの多くは、それらのそれぞれのリガンドと共に、異なった造血細胞系間での相互作用を調節する（例えば、Cosman, Stem Cells 12: 440 (1994); Wajantなど., Cytokine Cytokine Growth Factor Rev. 10:15 (1999); Yehなど., Immunol. Rev. 169: 283 (1999); Idriss and Naismith, Microsc. Res. Tech. 50: 184 (2000)を参照のこと）。
【０００５】
１つのそのような受容体は、TACI、トランスメンブラン活性化因子及びCAML相互作用体である（von Bulow and Bram. Science 228: 138 (1997); PCT公開WO98/39361号）。TACIは、２種のシステインに富んでいる擬似反復体を含む細胞外ドメイン、トランスメンブランドメイン及びCAML（カルシウムモジュレーター及びシクロフィリンリガンド）と相互作用する細胞質ドメインを有する膜結合受容体、すなわちJurkat細胞において過剰発現される場合、NF−AT活性化の同時インジューサーである、細胞内小胞に位置する膜内在性タンパク質である。TACIは、B細胞、及びT細胞のサブセットにより会合される。
【０００６】
腫瘍壊死因子受容体の明らかにされたインビボ活性は、他のそのような受容体、及び腫瘍壊死因子受容体アゴニスト及びアンタゴニストの臨床学的可能性、及びそれについての必要性を示す。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、“Ztnfr12”と称する新規腫瘍壊死因子受容体を提供する。本発明はまた、Ztnfr12ポリペプチド及びZtnfr12融合タンパク質、並びにそのようなポリペプチド及びタンパク質をコードする核酸分子、及びそれらの核酸分子及びアミノ酸配列の使用方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、IgG1サブクラスの免疫グロブリンの図である。CL：L鎖不変領域；CH1, CH2, CH3: H鎖不変領域；VL：L鎖可変領域；VH：H鎖可変領域；CHO：炭水化物；N：アミノ末端；C：カルボキシル末端。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
発明の特定の記載：
１．概観
ZTNF4は、腫瘍壊死因子（TNF）リガンドファミリーのメンバーである（配列番号５）。この分子はまた、“BAFF”、“BlyＳ”、“TALL−１”及び“THANK”としても命名されている（Mooreなど., Science 285: 269 (1999); Mukhopadhyayなど., J. Biol. Chem. 274: 15978 (1999); Schnoiderなど．，J．Exp. Med. 189: 1747 (1999); Shuなど．，J. Leukoc. Biol. 65: 680 (1999)）。ZTNF4と結合する次の２種の受容体が同定されている：トランスメンブラン活性化因子及びCAML相互作用体（TACI）及びβ−細胞成長因子（BCMA）（Grossなど., Nature 404: 999 (2000)）。
【００１０】
ビオチニル化されたZTNF4が、このリガンドのための可能性ある新規受容体を同定するために使用された。それらの研究においては、一群の腫瘍細胞へのビオチニル化されたZTNF4の結合が、流動細胞計測法を用いて測定された。驚くべきことには、ZTNF4は、TACIに対するモノクローナル抗体又はBCMAに対するポリクローナル抗体のいずれかによる細胞の結合がほとんど存在しない場合でさえ、ヒトB−リンパ前駆体細胞系（REH細胞）に結合することが見出された。類似する結果が、ヒトリンパ腫に由来するBJAB細胞により見出された。それらの観察は、ZTNF4がTACI又はBCMA以外の受容体と結合したことを示した。
【００１１】
さらにこの可能性を調査するために、125I−ラベルされたZTNF4がB−リンパ前駆体細胞に結合し、そして細胞表面分子に交差された。抗−ZTNF4ポリクローナル抗体による処理は放射性沈殿物を生成したが、ところが抗−TACI又は抗−BCMAポリクローナル抗体による処理は放射性沈殿物を生成しなかった。従って、このデータは、新規受容体が細胞へのZTNF4の結合の原因である仮説を支持した。“Ztnfr12”として命名された前記受容体が、例１に記載記載のようにして単離された。結合研究は、その新規受容体がZTNF4を結合したが、しかし”ZTNF2“として命名されたリガンド（配列番号６）を結合しなかったことを示した。ZTNF2はまた“APRIL”及び“TNRF死亡リガンド−１”としても命名されている（Hahneなど., J. Exp. Med. 188: 1185 (1998); Kellyなど., Cancer Res. 60: 1021 (2999)）。
【００１２】
Ztnfr12の結合特性がまた、組換え宿主細胞を用いて調べられた。子供のハムスター腎臓細胞が、Ztnfr12コード配列を含んで成る発現ベクターによりトランスフェクトされ、そしてそのトランスフェクトされた細胞が125Ｉ−ラベルされたZTNF4による結合研究に使用された。結合研究及びスキャッチャード分析は、Ztnfr12に対するZTNF4のKdが1.0nMであり、これは、TACI発現ベクターによりトランスフェクトされた子供ハムスター腎臓細胞により発現されるTACI受容体に対するZTNF4のKd（1.25nM）に匹敵できることを示した。トランスフェクトされた細胞は、細胞当たり約150×106のZtnfr12細胞表面受容体を発現した。
【００１３】
ZTNF4は、実質的にすべての成熟CD19+末梢B細胞に対して結合し、骨髄における未成熟B細胞に対して弱く結合し、そしてほとんどの形質転換されたB細胞に対して結合するように思える。しかしながら、いくつかのBリンパ腫、REH及びBJABは例えば、ZTNF4を結合するが、しかし適切なレベルのTACI又はBCMAのいずれも発現しない。さらに、TACI及びBCMA表面発現及びZTNF4結合が、流動細胞計測法を用いて、扁桃、末梢血液及び骨髄から単離された細胞に対して決定された。その結果は、TACI及びBCMAがヒト扁桃及び末梢血液におけるほとんどの未成熟B細胞集団、すなわちIgM+IgD-上で最高レベルで発現されることを示す。
【００１４】
両受容体の発現レベルは、より成熟したIgM+IgD+B細胞の表面上で低下し、そしてIgM-IgD+B細胞、すなわちB細胞成熟の最も成熟した段階を表す集団上で非常に低いレベルで見出される。しかしながら、ZTNF4リガンドは、実質的にすべての成熟B細胞に、高レベルで結合する。一緒に考慮すると、それらのデータは、いくつかのB細胞腫瘍及び末梢ヒトB細胞上でのZTNF4のための追加の受容体の存在を包含する。それらのデータは、Ztnfr12がほとんどの成熟IgM-IgD+B細胞上で最高レベルで発現され、そしてこの集団への最高レベルのzTNF4結合の原因であり得ることを示す。
【００１５】
Ztnfr12をコードする例示のヌクレオチド配列は、配列番号１により提供される。そのコードされるポリペプチドは、次のアミノ酸配列を有する：MRRGPRSLRG RDAPAPTPCV PAECFDLLVR HCVACGLLRT PRPKPAGASS PAPRTALQPQ ESVGAGAGEA ALPLPGLLFG APALLGLALV LALVLVGLVS WRRRQRRLRG ASSAEAPDGD KDAPEPLDKV IILSPGISDA PAPAWPPPGE DPGTTPPGHS VPVPATELGS TELVTTKTAG PEQQ（配列番号２）。Ztnfr12ポリペプチドの特徴は、配列番号２のアミノ酸残基１−69又は配列番号２のアミノ酸残基１−79を含んで成る細胞外ドメイン、配列番号２のアミノ酸残基70−100又は配列番号２のアミノ酸残基80−100を含んで成るトランスメンブランドメイン、及び配列番号２のアミノ酸残基101−184での細胞内ドメインを包含する。
【００１６】
Ztnfr12遺伝子を含むヌクレオチド配列は、配列番号９により提供される。Ztnfr12遺伝子は３個のエキソンを含んで成る。配列番号２のアミノ酸に関しては、エキソン１はアミノ酸残基１〜アミノ酸46のためのコドンの第１ヌクレオチドをコードし、エキソン２はアミノ酸46の残り〜アミノ酸123のためのコドンの第１ヌクレオチドをコードし、そしてエキソン３はアミノ酸123の残り〜アミノ酸184をコードする。3’−未翻訳領域は配列番号９のヌクレオチド2405〜約5720を含む。表１はこのヌクレオチド配列のさらなる特徴を提供する。
【００１７】
【表１】
2009225798.tif 000002
【００１８】
Ztnfr12遺伝子は染色体22q13.2に存在し、そしてZtnfr12はほとんどのリンパ組織（例えばリンパ節組織）、B−細胞腫瘍及び胚中心B−細胞において発現される。ノザン及びドットブロット分析は、Ztnfr12遺伝子発現が脾臓、リンパ節、末梢血液リンパ球、腎臓、心臓、肝臓、骨格筋、膵臓、副腎、精巣、脳、子宮、胃、骨髄、気管、胸腺、胎盤、胎児肝臓及びRaji細胞において検出できることを示した。最も強いシグナルは、脾臓及びリンパ節組織と結合されるが、ところが弱いシグナルは脳、子宮及び胎盤組織により結合される。従って、Ztnfr12抗体及び核酸プローブは、それらの組織間で分化するために使用され得る。
【００１９】
下記のように、本発明は、（ａ）配列番号２のアミノ酸残基７−69、（ｂ）配列番号２のアミノ酸残基７−79、（ｃ）配列番号２のアミノ酸残基７−39、（ｄ）配列番号２のアミノ酸残基19−35、（ｅ）配列番号２のアミノ酸残基１−69、（ｆ）配列番号２のアミノ酸残基１−79、（ｇ）配列番号２のアミノ酸残基１−39、（ｈ）配列番号２のアミノ酸残基１−71、（ｉ）配列番号２のアミノ酸残基７−71、（ｊ）配列番号２のアミノ酸残基70−100、（ｋ）配列番号２のアミノ酸残基80−100、（ｌ）配列番号２のアミノ酸残基101−184、及び（ｍ）配列番号２のアミノ酸配列から成る群から選択された対照アミノ酸配列に対して少なくとも70％、少なくとも80％、又は少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含んで成る、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号10のアミノ酸配列のいずれかから成るポリペプチドと特異的に結合する抗体と特異的に結合する単離されたポリペプチドを提供する。
【００２０】
一定のZtnfr12ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列から成るポリペプチドと特異的に結合する抗体と特異的に結合する。一定のZtnfr12ポリペプチドは、ZTNFを特異的に結合し、そして他のポリペプチドは、ZTNF4を特異的に結合するが、しかしZTNF2を特異的に結合しない。例示的なZtnfr12ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基７−69、配列番号２のアミノ酸残基７−79、配列番号２のアミノ酸残基７−39、配列番号２のアミノ酸残基19−35、配列番号２のアミノ酸残基１−69、配列番号２のアミノ酸残基１−79、配列番号２のアミノ酸残基１−71、配列番号２のアミノ酸残基７−71、配列番号２のアミノ酸残基１−39、配列番号２のアミノ酸残基80−100、配列番号２のアミノ酸残基70−100、配列番号２のアミノ酸残基101−184、及び配列番号２のアミノ配列を含んで成るか又はそれらから成るポリペプチドを包含する。
【００２１】
本発明はまた、配列番号２のアミノ酸残基７−69、配列番号２のアミノ酸残基７−79、配列番号２のアミノ酸残基７−39、配列番号２のアミノ酸残基19−35、配列番号２のアミノ酸残基１−69、配列番号２のアミノ酸残基１−79、配列番号２のアミノ酸残基１−71、配列番号２のアミノ酸残基７−71、配列番号２のアミノ酸残基１−39の少なくとも15個、又は少なくとも30個の連続アミノ酸残基を含んで成る単離されたポリペプチドを提供する。
【００２２】
本発明はさらに、少なくとも１つのZtnfr12エキソンによりコードされるポリペプチドを提供する。例えば、そのようなポリペプチドは、配列番号２の次のアミノ酸から成ることができる：アミノ酸残基１−45、アミノ酸残基47−122、及びアミノ酸残基124−184。
【００２３】
本発明はまた、変異体Ztnfr12ポリペプチドを包含し、ここで前記変異体ポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも70％の同一性、少なくとも80％の同一性、少なくとも90％の同一性、少なくとも95％の同一性又は95％以上の同一性から成る群から選択された、配列番号２のアミノ酸残基７−69、配列番号２のアミノ酸残基７−79、配列番号２のアミノ酸残基７−39、配列番号２のアミノ酸残基19−35、配列番号２のアミノ酸残基１−69、配列番号２のアミノ酸残基１−79、配列番号２のアミノ酸残基１−39、配列番号２のアミノ酸残基１−71、配列番号２のアミノ酸残基７−71、又は配列番号２のアミノ酸残基１−184との同一性を共有し、そして前記変異体ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号２のアミノ酸配列との間のいずれかの差異は１又は複数の保存性アミノ酸置換によるものである。
【００２４】
本発明はさらに、そのようなポリペプチドと特異的に結合する抗体及び抗体フラグメントを提供する。典型的な抗体は、ポリクローナル抗体、ネズミモノクローナル抗体、ネズミモノクローナル抗体に由来するヒト化抗体及びヒトモノクローナル抗体を包含する。例示的な抗体フラグメントは、F(ab’)2, F(ab)2, Fab’, Fab ，Fv, scFv及び最少認識単位を包含する。本発明はさらに、キャリヤー、及び本明細書に記載されるペプチド、ポリペプチド、抗体又は抗−イディオタイプ抗体を含んで成る組成物を提供する。
【００２５】
本発明はまた、（ａ）配列番号３のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子、（ｂ）配列番号２のアミノ酸残基７−69、配列番号２のアミノ酸残基７−79、配列番号２のアミノ酸残基７−39、配列番号２のアミノ酸残基19−35、配列番号２のアミノ酸残基１−69、配列番号２のアミノ酸残基１−79、配列番号２のアミノ酸残基１−39、配列番号２のアミノ酸残基１−71、配列番号２のアミノ酸残基７−71、又は配列番号２のアミノ酸残基１−184を含んで成るアミノ酸配列をコードする核酸分子、及び（ｃ）配列番号１のヌクレオチド27−578のヌクレオチド配列、配列番号１のヌクレオチド27−233のヌクレオチド配列、配列番号１のヌクレオチド27−578の相補体、又は配列番号１のヌクレオチド27−233の相補体を含んで成る核酸分子に対して、緊縮洗浄条件下でハイブリダイズされたまま存続する核酸分子から成る群から選択された、Ztnfr12ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。例示的な核酸分子は、核酸分子（ｃ）によりコードされるアミノ酸配列と配列番号２のその対応するアミノ酸配列との間のいずれかの差異が保存性アミノ酸置換のためであるそれらの核酸を包含する。
【００２６】
本発明はさらに、配列番号１のヌクレオチド27−578（配列番号２のアミノ酸残基１−184をコードする）、配列番号１のヌクレオチド27−233（配列番号２のアミノ酸残基１−69をコードする）、配列番号１のヌクレオチド27−263（配列番号２のアミノ酸残基１−79をコードする）、配列番号１のヌクレオチド45−233（配列番号２のアミノ酸残基7−69をコードする）、配列番号１のヌクレオチド45−263（配列番号２のアミノ酸残基7−79をコードする）、配列番号１のヌクレオチド45−143（配列番号２のアミノ酸残基7−39をコードする）、配列番号１のヌクレオチド81−131（配列番号２のアミノ酸残基19−35をコードする）、配列番号１のヌクレオチド27−239（配列番号２のアミノ酸残基１−71をコードする）、配列番号１のヌクレオチド45−239（配列番号２のアミノ酸残基7−71をコードする）、配列番号１のヌクレオチド327−578（配列番号２のアミノ酸残基101−184をコードする）を含んで成る単離された核酸分子を企画する。
【００２７】
本発明はまた、Ztnfr12エキソン又はイントロンのヌクレオチド配列から成る核酸分子を提供する。それらのエキソン及びイントロのヌクレオチド配列が表１に同定される。
【００２８】
本発明はまた、そのような核酸分子を含んで成るベクター及び発現ベクターを包含する。そのような発現ベクターは、転写プロモーター及び転写ターミネーターを含んで成り、ここで前記プロモーターが前記核酸分子と作用可能に結合され、そして前記核酸分子が前記転写ターミネーターと作用可能に結合される。本発明はさらに、それらのベクター及び発現ベクターを含んで成る組換え宿主細胞及び組換えウィルスを包含する。例示的な宿主細胞は、細菌、鳥類、酵母、菌類、昆虫、哺乳類及び植物を包含する。そのような発現細胞を含んで成る組換え宿主細胞は、発現ベクターを含んで成り、そしてZtnfr12タンパク質を生成するそのような組換え宿主細胞を培養し、そして任意には、培養された組換え宿主細胞からZtnfr12タンパク質を単離することによって、Ztnfr12ポリペプチドを生成するために使用され得る。本発明はさらに、そのような方法の生成物を包含する。
【００２９】
本発明はまた、配列番号13のアミノ酸残基１−69を含んで成るポリペプチド、配列番号13のアミノ酸残基１−69の少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25又は少なくとも30個の連続したアミノ酸残基を含んで成るポリペプチド、配列番号13のアミノ酸残基21−38を含んで成るポリペプチド、配列番号13のアミノ酸残基１−69を含んで成る融合タンパク質、そのようなアミノ酸配列をコードする核酸分子、そのような核酸分子を含んで成る発現ベクター、及びそのような発現ベクターを含んで成る組換え宿主細胞を提供する。本発明はさらに、そのような組換え宿主細胞を用いてネズミZtnfr12ポリペプチドを生成するための方法を包含する。
【００３０】
TACI, BCMA, ヒトZtnfr12及びネズミZtnfr12のアミノ酸配列の一列整列は、細胞外ドメインの次のモチーフ：
C[NVPS][QPE][TAEN][EQ][CY][FW]D[PLS]L[VL][RGH][NHTA]C[VMI][SAP]Cを表し、ここで所定の位置についての許容できるアミノ酸が角型括弧内に示される（配列番号46）。本発明は、このモチーフから成るアミノ酸配列を有する、ZTNF4を結合するポリペプチドを包含する。本発明はまた、このモチーフから成るアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する抗体を包含する。
【００３１】
さらに、本発明は、医薬的に許容できるキャリヤー、及び発現ベクター又はそのような発現ベクターを含んで成る組換え２ウィルスの少なくとも１つを含んで成る医薬組成物を提供する。本発明はさらに、医薬的に許容できるキャリヤー及び本明細書に記載されるポリペプチドを含んで成る医薬組成物を包含する。
【００３２】
本発明はまた、生物学的サンプルにおけるZtnfr12 RNAの存在を検出するための方法を提供し、ここで前記方法は、（ａ）Ztnfr12核酸プローブと、（i）前記生物学的サンプルから単離された試験RNA分子、又は（ii）前記単離されたRNA分子から合成された核酸分子のいずれかとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触せしめ、ここで前記プローブが、配列番号１のヌクレオチド配列の一部、又はその相補体から成るヌクレオチド配列を含んで成り；そして（ｂ）前記核酸プローブ、及び前記試験RNA分子又は合成された核酸分子のいずれかのハイブリッドの形成を検出し、ここで前記ハイブリッドの存在が前記生物学的サンプルにおけるZtnfr12 RNAの存在を示す。例えば、適切なプローブは、次のヌクレオチドから成る：配列番号１のヌクレオチド27−578及び配列番号１のヌクレオチド27−233。他の適切なプローブは、それらのヌクレオチド配列の相補体、又は本明細書に記載されるようなヌクレオチド配列又はそれらの相補体の一部から成る。
【００３３】
本発明はさらに、生物学的サンプルにおけるZtnfr12の存在を検出するための方法を提供し、ここで前記方法は、（ａ）前記生物学的サンプルと、配列番号２のアミノ酸配列から成るポリペプチドと特異的に結合する抗体、又は抗体フラグメントとを接触せしめ、ここで前記接触が、前記生物学的サンプルへの前記抗体又は抗体フラグメントの結合を可能にする条件下で行われ、そして（ｂ）前記結合された抗体又は結合された抗体フラグメントのいずれかを検出する段階を含んで成る。そのような抗体又は抗体フラグメントはさらに、放射体同位体、蛍光ラベル、化学ルミネセントラベル、酵素ラベル、生物ルミネセントラベル及びコロイド状金から成る群から選択された検出できるラベルを含んで成る。
【００３４】
本発明はまた、それらの検出方法を行うためのキットを提供する。例えば、Ztnfr12遺伝子発現の検出のためのキットは、核酸分子を含んで成る容器を含んで成り、ここで前記核酸分子は、（ａ）配列番号１のヌクレオチド27−233のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子、（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド27−233の相補体を含んで成る核酸分子、及び（ｃ）少なくとも８個のヌクレオチドから成る（ａ）又は（ｂ）のフラグメントである核酸分子から成る群から選択される。そのようなキットはまた、核酸分子の存在を示すことができる１又は複数の試薬を含んで成る第２容器を含んで成る。他方では、Ztnfr12タンパク質の検出のためのキットは、配列番号２のアミノ酸配列から成るポリペプチドと特異的に結合する、抗体又は抗体フラグメントを含んで成る容器を含んで成る。
【００３５】
本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列から成るポリペプチドを特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントを特異的に結合する、抗−イディオタイプ抗体又は抗−イディオタイプ抗体フラグメントも企画する。典型的な抗−イディオタイプ抗体は、配列番号２のアミノ酸残基1−69、配列番号２のアミノ酸残基1−79、配列番号２のアミノ酸残基７−69、配列番号２のアミノ酸残基７−79、配列番号２のアミノ酸残基1−71、又は配列番号２のアミノ酸残基７−７１から成るポリペプチドを特異的に結合する抗体と結合する。
【００３６】
本発明はまた、Ztnfr12ポリペプチド及び免疫グロブリン成分を含んで成る融合タンパク質を提供する。そのような融合タンパク質においては、免疫グロブリン成分は、免疫グロブリンH鎖不変領域、例えばヒトFcフラグメントであり得る。本発明はさらに、そのような融合タンパク質をコードする単離された核酸分子を包含する。
【００３７】
本発明はさらに、Ztnf12（例えば、、ZTNF4）を結合するリガンドの活性を、哺乳類において阻害するための方法を包含し、ここで前記方法は、（ａ）可溶性Ztnfr受容体、（ｂ）Ztnfr12の細胞外ドメインと特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント、及び（ｃ）Ztnfr12の細胞外ドメインを含んで成る融合タンパク質の少なくとも１つを含んで成る組成物を、前記哺乳類に投与することを含んで成る。例示として、そのような組成物は、Bリンパ球、活性化されたBリンパ球、又は休止Bリンパ球に関連する障害及び疾病を処理するために使用され得る。
【００３８】
本明細書に記載される分子により処理され得るB細胞リンパ腫の例は、バーキットリンパ腫、非バーキットリンパ腫、非ホドキンリンパ腫、多発性骨髄腫、小胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、大細胞リンパ腫、周縁領域リンパ腫、被膜細胞リンパ腫、大細胞リンパ腫（例えば、免疫芽球性リンパ腫）、小リンパ性リンパ腫及び他のＢ細胞リンパ腫を包含する。そのような組成物はまた、T細胞リンパ腫、例えばリンパ芽球性リンパ腫、退性大細胞リンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、末梢T細胞リンパ腫、血管性免疫芽球リンパ腫、血管中枢リンパ腫、腸T細胞リンパ腫、成人T細胞リンパ腫、成人T細胞白血病及び同様のものを処理するために使用され得る。
【００３９】
例えば、本発明は、腫瘍細胞（例えば、B細胞リンパ腫細胞又はT細胞リンパ腫細胞）の増殖を阻害するための方法を包含し、ここで前記方法は、（ａ）可溶性Ztnfr受容体、（ｂ）Ztnfr12の細胞外ドメインと特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント、及び（ｃ）Ztnfr12の細胞外ドメインを含んで成る融合タンパク質の少なくとも１つを含んで成る組成物を、前記腫瘍細胞に投与することを含んで成る。そのような生成物は、インビトロで培養される細胞に投与され得る。他方では、前記組成物は、医薬組成物であり得、そして前記医薬組成物は、腫瘍を有する対象に投与される。
【００４０】
融合タンパク質の１つの例は、Ztnfr12の細胞外ドメイン、配列番号２のアミノ酸１−69を含んで成るポリペプチドのフラグメントを含んで成るZtnfr12ポリペプチド、及び免疫グロブリンの不変領域を含んで成る免疫グロブリン成分を含んで成るZtnfr12−免疫グロブリン融合タンパク質である。例示的な免疫グロブリン成分は、H鎖不変領域を含んで成る。Ztnfr12−免疫のグロブリン融合タンパク質は、下記で論じられるように、モノマー、ダイマー又は他の配列のものであり得る。
【００４１】
もう１つの例においては、抗−Ztnfr12抗体成分を含んで成る組成物は、細胞の増殖を阻害するために腫瘍細胞に投与される。前記組成物はインビトロで培養される細胞に投与され得、又は腫瘍を有する対象において投与される医薬組成物であり得る。そのような組成物は、裸のZtnfr12抗体である抗−Ztnfr12抗体成分を含んで成り、又はそのような組成物は裸のZtnfr12抗体フラグメントである抗−Ztnfr12抗体成分を含んで成る。さらに、組成物は、抗−Ztnfr12抗体成分及び治療剤を含んで成る免疫接合体を含むことができる。例示的な治療剤は、化学療法剤、細胞毒素、イムノモジュレーター、キレート化剤、硼素化合物、光活性剤、光活性色素及び放射性同位体を包含する。
【００４２】
そのような組成物は、抗−Ztnfr12抗体成分、及びイムノモジュレーター又は細胞毒素ポリペプチドのいずれかを含んで成る抗体融合タンパク質を含んで成ることができる。組成物のいずれかの形は、抗−Ztnfr12裸抗体成分、及び少なくとも１つの抗−BCMA裸抗体成分、並びに抗−TACI裸抗体成分を含んで成る多特異的抗体である。例示的な多特異的抗体組成物は、Ztnfr12、及びBCMA及びTACIの少なくとも１つを結合する二特異的抗体を含んで成る。多特異的抗体組成物はさらに、治療剤を含んで成る。さらに、多特的抗体組成物は、（ａ）イムノモジュレーター又は細胞毒性ポリペプチドのいずれかを含んで成る抗−Ztnfr12抗体融合タンパク質、及び（ｂ）抗−BCMA抗体成分又は抗−TACI抗体成分の少なくとも１つを含んで成ることができる。
【００４３】
Ztnfr12細胞外ドメイン又は抗―Ztnfr12抗体のいずれかを含んで成るポリペプチドは、自己免疫疾患を処理するために使用され得る。自己免疫疾患の例は、全身性エリテマートデス、重症筋無力症、多発性硬化症、インスリン依存性真性糖尿病及びリウマチ様関節炎を包含する。Ztnfr12細胞外ドメイン又は抗−Ztnfr12抗体を含んで成るポリペプチドはまた、ぜん息、気管支炎、気腫、及び最終段階腎不全又は腎疾患を処理するためにも使用され得る。例示的な腎疾患は、糸球体腎炎、脈管炎、慢性リンパ白血病、腎炎及び腎盂腎炎を包含する。Ztnfr12細胞外ドメイン又は抗−Ztnfr12抗体を含んで成るポリペプチドはさらに、腎新生物、多発性骨髄腫、リンパ腫、L鎖ニューロパシー又はアミロイド症を処理するために使用され得る。
【００４４】
本発明はまた、ZTNF4活性がエフェクターT細胞に関連される、ZTNF4活性を阻害するための方法も包含する。関連する方法においては、ZTNF4活性が免疫応答の調節に関連される。もう１つの方法においては、ZTNF4活性が、免疫抑制に関連される。さらにもう１つの方法においては、免疫抑制は、移植片拒絶、対宿主性移植片病又は炎症に関連される。さらにもう１つの方法においては、免疫抑制は自己免疫疾患に関連される。例示としての自己免疫患者はインスリン−依存性真性糖尿病又はクローン病であり得る。さらに他の方法においては、免疫抑制は炎症に関連している。そのような炎症は、例えば関節痛、腫張、貧血又は敗血性ショックに関連している。
【００４５】
本発明はまた、（ａ）対象の生物学的サンプルから単離されたゲノムDNAから、（ｉ）少なくとも１つのZtnfr12エキソン１〜３をコードするヌクレオチド配列を含んで成るか、又は（ii）前記（ｉ）の相補体であるヌクレオチド配列を含んで成るいずれかである核酸分子を増幅し、そして（ｂ）前記増幅された核酸分子における突然変異（この突然変異の存在が染色体22ｑ13.2異常を示す）を検出することによって、対象における染色体22ｑ13.2異常性を検出するための方法を包含する。それらの方法の変法においては、検出段階は、配列番号１又は９のヌクレオチド配列に対して、増幅された核酸分子のヌクレオチド配列を比較することによって行われる。
【００４６】
本発明はさらに、（ａ）対象の生物学的サンプルから単離されたゲノムDNAから、少なくとも１つのイントロン１及びイントロン２のヌクレオチド配列、又は少なくとも１つのイントロン１及びイントロン２の相補的ヌクレオチド配列のいずれかを含んで成るZtnfr12のセグメントを増幅し、そして（ｂ）前記増幅された核酸分子における突然変異（この突然変異の存在が染色体22q13.2異常を示す）を検出することを含んで成る、対象における染色体22q13.2異常性を検出するための方法を提供する。それらの方法の変法においては、検出段階は、前記増幅されたZtnfr12遺伝子セグメントを膜に結合し、そして前記膜と核酸プローブとを、高い緊縮条件下で接触せしめることによって行われ、ここでハイブリッドの不在がZtnfr12の発現に関連する異常性、又は染色体22q13.2における突然変異を示す。例示としての適切な核酸プローブは、イントロン１及び２のいずれか１つのヌクレオチド配列（又はそのヌクレオチド配列の補体）を含んで成ることができる。
【００４７】
Ztnfr12遺伝子又はその遺伝子生成物の突然変異又は変更の例は、点突然変異、欠失、挿入及び転移を包含する。Ztnfr12に遺伝子突然変異のもう１つの例は、異数性である。本発明はまた、本明細書に記載される検出方法を用いての、Ztnfr12遺伝子の第１エキソンの上流の領域（例えば、配列番号９のヌクレオチド１−1000内）における変更の同定を含んで成る、対象における染色体22q13.2異常性を検出するための方法を包含する。
本発明のそれらの及び他の観点は、次の特定の記載に基づいて明らかになるであろう。さらに、種々の文献が下記に同定される。
【００４８】
２．定義
次の記載においては、多くの用語が広範囲に使用される。次の定義は、本発明の理解を促進するために提供される。
【００４９】
本明細書において使用される場合、“核酸”又は“核酸分子”とは、ポリヌクレオチド、例えばデオキシリボ核酸（DNA）又はリボ核酸（RNA）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）により生成されるフラグメント、及び連結、切断、エンドヌクレアーゼ作用及びエキソヌクレアーゼ作用のいずれかにより生成されるフラグメントを言及する。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド（例えばDNA及びRNA）、又は天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば天然に存在するヌクレオチドのα−鏡像異性体形）、又は両者の組み合わせであるモノマーから構成され得る。
【００５０】
修飾されたヌクレオチドは、糖成分において、及び/又はピリミジン又はプリン塩基成分において変更を有することができる。糖修飾は、ハロゲン、アルキル基、アミン及びアジド基による１又は複数のヒドロキシル基の置換を包含し、又は糖はエーテル又はエステルとして機能され得る。さらに、全糖成分は、立体的に及び電子的に類似する構造体、例えばアザ−糖及びカルボン酸糖類似体により置換さえ得る。塩基成分における修飾の例は、アルキル化されたプリン及びピリミジン、アシル化されたプリン又はピリミジン、又は他の良く知られている複素環式置換基を包含する。
【００５１】
核酸モノマーは、ホスホジエステル結合又はそのような結合の類似体により結合さえ得る。ホスホジエステル結合の類似体は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニリデート、ホスホラミデート、及び同様のものを包含する。用語“核酸分子”とはまた、いわゆる、ポリアミド主鎖に結合される天然に存在するか又は修飾された核酸塩基を含んで成る“ペプチド核酸”も包含する。核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれかであり得る。
【００５２】
用語“核酸分子の相補体”とは、相補的ヌクレオチド配列、及び対照ヌクレオチド配列に比較して逆の配向を有する核酸分子である。例えば、配列5’ ATGCACGGG 3’ は、5’ CCCGTGCAT 3’に対して相補的である。
用語“contig ”とは、他の核酸分子に対する一連の連続した同一の又は相補的な配列を有する核酸分子を示す。連続した配列とは、核酸分子の全体において、又はその一部に沿って、一定の長さの核酸分子を“オーバーラップ”すると言われる。
【００５３】
用語“縮重ヌクレオチド配列”とは、１又は複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列（ポリペプチドをコードする対照ポリヌクレオチドに比較して）を示す。縮重コドンは、ヌクレオチドの異なったトリプレットを含むが、しかし同じアミノ酸残基をコードする（すなわち、GAU及びGACトリプレットはそれぞれAspをコードする）。
用語“構造遺伝子”とは、特定のポリペプチドの特徴のアミノ酸の配列に翻訳されるメッセンジャーRNA（mRNC）に転写される核酸分子を言及する。
【００５４】
“単離された核酸分子”とは、生物のゲノムDNAに組み込まれない核酸分子である。例えば、細胞のゲノムDNAから分離された成長因子をコードするDNA分子が、単離されたDNA分子である。単離された核酸分子のもう１つの例は、生物のゲノムに組み込まれない、化学的に合成された核酸分子である。特定の種から単離された核酸分子は、その種からの染色体の完全なDNA分子よりも小さい。
“核酸分子構造体”とは、天然においては存在しない配置で組み合わされ、そして並置された核酸のセグメントを含むようヒト介在を通して修飾された−本鎖又は二本鎖の核酸分子である。
【００５５】
“線状DNA”とは、遊離5’及び3’及び末端を有する非環状DNA分子を示す。線状DNAは、閉環DNA分子、例えばプラスミドから、酵素消化又は物理的な破壊により調製され得る。
“相補的DNA（cDNA）”とは、逆転写酵素によりmRNA鋳型から形成される一本鎖DNA分子である。典型的には、mRNAの一部に対して相補的なプライマーは、逆転写の開始のために使用される。当業者はまた、そのような一本鎖DNA分子及びその相補的DNA鎖から成る二本鎖DNA分子を言及するために用語“cDNA”を用いる。用語“cDNA”はまた、RNA鋳型から生成されたcDNA分子のクローンも言及する。
【００５６】
“プロモーター”とは、構造遺伝子の転写を方向づけるヌクレオチド配列である。典型的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位に最も近い、遺伝子の5’非コードに領域位置する。転写の開始において機能するプロモーター内の配列要素は、しばしば、コンセンサスヌクレオチド配列により特徴づけられる。
【００５７】
それらのプロモーター要素は、RNAポリメラーゼ結合部位、TATA配列、CAAT配列、分化−特異的要素（DSE：McGeheeなど., Mol. Endocrinol. 7: 511 (1993)）、サイクリックのAMP応答要素（CRE）、血清応答要素（SRE：Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1: 47 (1990)）、グルココルチコイド応答要素（GRE）及び他の転写因子のための結合部位、例えばCRE/ATF（O’Reillyなど., J. Biol. Chem. 267: 19938 (1992)）、AP2 (Yeなど., J. Biol. Chem. 269: 25728 (1994)), SP1, cAMP応答要素結合タンパク質（CREB；Loeken, Gene Expr. 3: 253 (1993)）、及びオクタマー因子（一般的には、Watsonなど., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (The Benjamin Kummings Publishing Company, Inc. 1987), and Lemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303: 1 (1994)）を包含する。プロモーターが誘発プロモーターである場合、転写の速度は誘発剤に応答して上昇する。対照的に、転写の速度は、プロモーターが構成プロモーターである場合、誘発剤により調節されない。抑制できるプロモーターはまた知られている。
【００５８】
“コアプロモーター”は、TATAボックス及び転写の開始を包含するプロモーター機能のための必須ヌクレオチド配列を含む。この定義によれば、コアプロモーターは、活性を増強し又は組織特異的活性を付与することができる特定の配列の不在下で検出できる活性を有しても又は有さなくても良い。
“調節要素”は、コアプロモーターの活性を調節するヌクレオチド配列である。例えば、調節要素は、特定の細胞、組織又はオルガネラにおいて独占的に又は選択的に転写を可能にする細胞因子と結合するヌクレオチド配列を含むことができる。それらのタイプの調節要素は通常、“細胞−特異的”、“組織−特異的”、又は“オルガネラ−特異的”態様で発現される遺伝子に結合されている。
“エンハンサー”は、転写の開始部位に対してエンハンサーの距離又は配向に関係なく、転写の効率を高めることができるタイプの調節要素である。
【００５９】
“異種DNA”とは、所定の宿主細胞内に天然において存在しない、DNA分子又はDNA分子の集団を言及する。特定宿主細胞に対して異種であるDNA分子は、宿主DNAが非宿主DNA（すなわち、外来性DNA）と組み合わされる限り、宿主細胞種（すなわち、内因性DNA）に由来するDNAを含むことができる。例えば、転写プロモーターを含んで成る宿主DNAセグメントに作用可能に連結されるポリペプチドをコードする非宿主DNAセグメントを含むDNA分子は、異種DNA分子であると思われる。逆に言えば、異種DNA分子は、外来プロモーターと作用可能に連結される内因性遺伝子を含むことができる。もう１つの例として、野生型細胞に由来する遺伝子を含んで成るDNA分子は、そのDNA分子が野生型遺伝子を欠いている突然変異細胞中に導入される場合、異種DNAであると思われる。
【００６０】
“ポリペプチド”とは、天然又は合成的に生成されても、ペプチド結合により連結されるアミノ酸残基のポリマーである。約10個よりも少ないアミノ酸残基のポリペプチドは通常、“ペプチド”として言及される。
“タンパク質”は、1又は複数のポリペプチド鎖を含んで成る高分子である。タンパク質はまた、非ペプチド成分、例えば炭水化物基を含むことができる。炭水化物及び他の非ペプチド置換基は、タンパク質が生成される細胞により付加され、そして細胞型により変化するであろう。タンパク質は、それらのアミノ酸主鎖により本明細書において定義され；置換基、例えば炭水化物基は一般的に、特定されないが、しかしそれにもかかわらず、存在することができる。
【００６１】
非宿主DNA分子によりコードされるペプチド又はポリペプチドは“異種”ペプチド又はポリペプチドである。
“組み込まれた遺伝子要素”とは、その要素がヒトによる操作を通して細胞中に導入された後、宿主細胞の染色体中に組み込まれているDNAのセグメントである。本発明においては、組み込まれた遺伝子要素は通常、エレクトロポレーション又は他の技法により細胞中に導入される線状化されたプラスミドに由来する。組み込まれた遺伝子要素は、元の宿主細胞からその子孫に通過される。
【００６２】
“クローニングベクター”は、宿主細胞において自律的に複製する能力を有する、核酸分子、例えばプラスミド、コスミド、又はバクテリオファージである。クローニングベクターは典型的には、ベクターの必須の生物学的機能を失わないで、決定できる態様で核酸分子の挿入を可能にする１又は少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、及びクローニングベクターにより形質転換された細胞の同定及び選択への使用のために適切であるマーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む。マーカー遺伝子は典型的には、テトラサイクリン耐性又はアンピシリン耐性を付与する遺伝子を含む。
【００６３】
“発現ベクター”は、宿主細胞において発現される遺伝子をコードする核酸分子である。典型的には、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子及び転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は通常、プロモーターの制御下に配置され、そしてそのような遺伝子はプロモーターに“作用可能に結合される”と言われる。同様に、調節要素及びコアプロモーターは、調節要素がコアプロモーターの活性を調節する場合、作用可能に連結される。
【００６４】
“組換え宿主”とは、異種核酸分子、例えばクローニングベクター又は発現ベクターを含む細胞である。本明細書においては、組換え宿主の例は、発現ベクターからZtnfr12を生成する細胞である。対照的に、Ztnfr12は、Ztnfr12の“天然源”であり、そして発現ベクターを欠いている細胞により生成さえ得る。
“インテグレイティブ組換え体”は、異種DNAが細胞ゲノムDNA中に組み込まれるようになる組換え宿主細胞である。
【００６５】
“融合タンパク質”は、少なくとも２つの遺伝子のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子により発現されるハイブリッドタンパク質である。例えば、例えば、Ztnfr12−免疫グロブリン融合タンパク質は、Ztnfr12受容体成分及び免疫グロブリン成分を含んで成る。本明細書において使用される場合、“Ztnfr12受容体成分”とは、ZTNF2又はZTNF4の少なくとも１つを結合するZtnfr12受容体の細胞外ドメインの一部である。用語“免疫グロブリン”とは、免疫グロブリンの不変領域を含んで成るポリペプチドを言及する。例えば、免疫グロブリン成分は、H鎖不変領域を含んで成る。用語“Ztnfr12−Fc”融合タンパク質とは、免疫グロブリン成分が免疫グロブリンH鎖不変領域CH2及びCH3を含んで成る、Ztnfr12−免疫グロブリン融合タンパク質を言及する。
【００６６】
用語“受容体”とは、“リガンド”と称する生物活性分子に結合する、細胞結合されたタンパク質を示す。この相互作用は、細胞に対するリガンドの効果を介在する。  Ztnfr12受容体においては、用語“特異的に結合する”、又は“特異的結合”とは、受容体と競争して結合するリガンドの能力を言及する。例えば、ZTNF4はZtnfr12受容体と特異的に結合し、そしてこれは、検出可能的にラベルされたZTNF4とラベルされていないZTNFとの間でのZtnfr12受容体についての競争を観察することによって示され得る。
【００６７】
受容体は、膜結合されたシトソール又は核；モノマー（例えば、胸腺刺激性ホルモン受容体、β−アドレナリン作用受容体）又はマルチマー（例えば、PDGF受容体、成長ホルモン受容体IL−３受容体、GM−CSF受容体、G−CSF受容体、エリトロポエチン受容体及びIL−６受容体）であり得る。膜結合された受容体は、細胞外リガンド−結合ドメイン、及び典型的には、シグナルトランスダクションに関与する細胞内エフェクタードメインを含んで成る多−ドメイン構造により特徴づけられる。一定の膜結合された受容体においては、細胞外リガンド−結合ドメイン及び細胞内エフェクタードメインは、完全な機能的受容体を含んで成る別々のポリペプチドに位置する。
【００６８】
一般的に、受容体へのリガンドの結合は、細胞の代謝における変更を導く、細胞におけるエフェクタードメインと他の分子との間の相互作用を引き起こす受容体のコンホメーション変化をもたらす。受容体−リガンド相互作用にしばしば連結される代謝現象は、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、サイクリックAMPを生成の上昇、細胞カルシウムの代謝、膜脂質の代謝、細胞付着、イノシトール脂質の加水分解及びリン脂質の加水分解を包含する。
【００６９】
用語“分泌シグナル配列”とは、それが合成される細胞の分泌路を通してより大きなポリペプチドを、より大きなポリペプチドの成分として方向づけるペプチド（“分泌ペプチド”）をコードするDNA配列を示す。前記のより大きなポリペプチドは、分泌路を通しての移動の間、分泌ペプチドを除去するために通常分解される。
【００７０】
“単離されたポリペプチド”は、汚染性細胞成分、例えば炭水化物、脂質又は天然においてポリペプチドに関連している他のタンパク質性不純物を実質的に含まないポリペプチドである。典型的には、単離されたポリペプチドの調製物は、高く精製された形で、すなわち少なくとも約80％の純度、少なくとも約90％の純度、少なくとも約95％の純度、95％以上の純度、又は99％以上の純度でポリペプチドを含む。特定のタンパク質調製物が単離されたポリペプチドを含むことを示すための1つの手段は、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びゲルのクーマシーブルー染色によるシングルバンドの出現によるものである。しかしながら、用語“単離された”とは、他の物理形、例えばダイマー又は他のグリコシル化された又は誘導体化された形での同じポリペプチドの存在を排除しない。
【００７１】
用語“アミノ−末端”及び“カルボキシル−末端”とは、ポリペプチド内の位置を示すために本明細書において使用される。その情況が可能である場合、それらの用語は、接近性又は相対的位置を示すためにポリペプチドの特定の配列又は一部に関して使用される。例えば、ポリペプチド内の対象配列のカルボキシル末端側に位置する一定の配列は、その対照配列のカルボキシル末端に隣接して位置するが、しかし完全なポリペプチドのカルボキシル末端では必ずしも必要ではない。
【００７２】
用語“発現”とは、遺伝子生成物の生合成を言及する。例えば、構造遺伝子においては、発現はmRNAへの構造遺伝子の転写及び１又は複数のポリペプチドへのmRNAの翻訳を包含する。
【００７３】
用語“スプライス変異体”とは、遺伝子から転写されるRNAの二者択一の形を示すために、本明細書において使用される。スプライス変異は、転写されたRNA分子内の、又は通常低いが、別々に転写されたRNA分子間の二者択一のスプライシング部位の使用を通して天然において生じ、そして同じ遺伝子から転写されるいくつかのmRNAをもたらすことができる。スプライス変異体は、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語スプライス変異体はまた、遺伝子から転写されるmRNAのスプライス変異体によりコードされるポリペプチドを示すために本明細書において使用される。
【００７４】
本明細書において使用される場合、用語“イムノモジュレータ−”とは、サイトカイン、幹細胞成長因子、リンフォトキシン、同時−刺激分子、造血因子及びそれらの分子の合成類似体を包含する。
【００７５】
用語“相補体／抗−相補体対”とは、適切な条件下で、非共有的に会合される安定した対を形成する非同一性成分を示す。例えば、ビオチン及びアビジン(又はストレプタビジン)は、相補体／抗−相補体対の基本型メンバーである。他の典型的な相補体／抗−相補体対は、受容体／リガンド対、抗体／抗原(又はハプテン又はエピトープ)対、センス／アンチセンス  ポリヌクレオチド対、及び同様のものを包含する。相補体／抗−相補体対の続く解離が所望される場合、その相補体／抗−相補体対は好ましくは、＜１０9Ｍ-1の結合親和性を有する。
【００７６】
“抗−イディオタイプ抗体”とは、免疫グロブリンの可変領域ドメインと結合する抗体である。本明細書においては、抗−イディオタイプの抗体は、抗−Ztnfr12抗体の可変領域と結合し、そして従って、抗−イディオタイプ抗体はZtnfr12のエピトープを模倣する。
“抗体フラグメント”は、抗体の一部、例えばF(ab’)2, F(ab)2, Fab’, Aab及び同様のものである。構造に関係なく、抗体フラグメントは、損なわれていない抗体により認識される同じ抗原と結合する。例えば、抗−Ztnfr12モノクローナル抗体フラグメントは、Ztnfr12のエピトープと結合する。
【００７７】
用語“抗体フラグメント”はまた、特定の抗原に結合する、合成の又は遺伝的に構築されたポリペプチド、例えばL鎖可変領域から成るポリペプチド、H及びL鎖の可変領域から成る“Fv”フラグメント、L及びH鎖可変領域がペプチドリンガーにより連結されている組換え一本鎖ポリペプチド分子（“svFvタンパク質”）、及び超可変領域を模倣するアミノ酸残基から成る最少認識単位を包含する。
“キメラ抗体”は、囓歯動物抗体に由来する種々のドメイン及び相補的決定領域を含む組換えタンパク質であるが、ところが抗体分子の残りはヒト抗体に由来する。
【００７８】
“ヒト化抗体”は、モノクローナル抗体のネズミ相補的決定領域がネズミ免疫グロブリンのH及びL可変鎖からヒト可変ドメインに移行されている組換えタンパク質である。
本明細書において使用される場合、“治療剤”は、治療のために有用である接合体を生成するために抗体成分に接合される分子又は原子である。治療剤の例は、薬剤、毒素、イムノモジュレーター、キレート化剤、硼素化合物、光活性剤又は染料、及び放射生同位体を包含する。
“検出できるラベル”は、診断のために有用な分子を生成するために抗体成分に接合され得る分子又は原子である。検出できるラベルの例は、キレート化剤、光活性剤、放射性同位体、蛍光剤、常磁性イオン又は他のマーカー成分を包含する。
【００７９】
“親和性標識”とは、第２ポリペプチドの精製又は検出を提供し、又は基質への第２ポリペプチドの結合のための部位を供給するために、第2ポリペプチドに結合され得るポリペプチドセグメントを示すために本明細書において使用される。主に、抗体又は、他の特異的結合剤が利用できるいずれかのペプチド又はタンパク質が親和性標識として使用され得る。親和性標識は、ポリ−ヒスチジン系、すなわちプロテインA (Nilsson など.,  EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson など.,  Methods  Enzymol. 198: 3, 1991), グルタチオンＳ  トランスフェラーゼ（Smits and Johnson, Gene 67; 31, 1988）, Glu-Glu親和性標識 （Grussenmeyerなど.,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952-4, 1985）, 物質Ｐ、すなわちFlagTM ペプチド（Hoppなど.,  Biotechnology 6: 1204-1210, 1988）、ストレプタビジン結合ペプチド、又は他の抗原性エピトープ又は結合ドメインを包含する。
【００８０】
一般的に、Ford など., Protein  Expression  and  Purification 2:95-107, 1991を参照のこと。親和性標識をコードする核酸分子は、商品供給者（例えばPharmacia Biotech, Piscataway, NJ; Eastman Kodak, New Heven, CT; New England Biolabs, Beverly, MA）から入手できる。
【００８１】
“裸の抗体”は、抗体フラグメントに対立するものとして、治療剤により接合されない完全な抗体である。裸の抗体は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体、並びに一定の組換え抗体、例えばキメラ性及びヒト化抗体を包含する。
“二特異的抗体”とは、単一抗体分子内に２種の異なった抗原のための結合部位を有する。
“多特異的抗体組成物”とは、２種の異なった抗体のための結合部位を有する抗体成分を含んで成る。例えば、多特異的抗体組成物は二特異的抗体成分を含んで成ることができ、又は多特異的抗体組成物は、異なった抗原と結合する少なくとも２種の抗体成分を含んで成ることができる。
【００８２】
本明細書において使用される場合、用語“抗体成分”は、完全な抗体及び抗体フラグメントの両者を包含する。
“免疫接合体”は、治療剤又は検出できるラベルと抗体成分との接合体である。
本発明において使用される場合、用語“抗体融合タンパク質”とは、抗体成分及びZtnfr12ポリペプチド成分を含んで成る組換え分子を言及する。抗体融合タンパク質の例は、Ztnfr12細胞ドメイン、及びFcドメイン又は抗原−結合領域のいずれかを含んで成るタンパク質を包含する。
【００８３】
“標的ポリペプチド”又は“標的ペプチド”は、少なくとも１つのエピトープを含み、そして標的細胞、例えば腫瘍細胞、又は感染剤抗原を担持する細胞上で発現されるアミノ酸配列である。T細胞は、標的ポリペプチド又は標的ペプチドに、主要組織適合性複合体分子により提供されるペプチドエピトープを認識し、そして典型的には、標的細胞を溶解し、又は標的細胞の例に他の免疫細胞を補充し、それにより標的細胞を殺害する。
【００８４】
“抗原性ペプチド”は、T細胞により認識されるMHC−ペプチド複合体を形成するために、主要組織適合複合体分子を結合し、それにより、T細胞への提供に基づいて細胞毒性リンパ球応答を誘発するペプチドである。従って、抗原性ペプチドは、適切な主要組織適合性複合体分子に結合し、そして細胞毒性T細胞応答、例えば抗原を結合するか又は発現する標的細胞に対する細胞溶解又は特異的サイトカイン開放を誘発することができる。抗原性ペプチドは、抗原提供細胞又は標的細胞上に、クラスI又はクラスII主要組織適合性複合体分子に関して結合され得る。
【００８５】
真核生物においては、RNAポリメラーゼIIは、mRNAを生成するために構造遺伝子の転写を触媒する。核酸分子はRNAポリメラーゼII鋳型を含むより企画され、ここでRNA転写体は特定のmRNAの配列に対して相補的である配列を有する。RNA転写体は、“アンチセンスRNA”と呼ばれ、そしてアンチセンスRNAをコードする核酸分子は“アンチセンス遺伝子”と呼ばれる。アンチセンスRNA分子は、mRNA分子に結合することができ、mRNA翻訳の阻害をもたらす。
【００８６】
“Ztnfr12に対して特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド”又は“Ztnfr12アンチセンスオリゴヌクレオチド”は、（ａ）Ztnfr12遺伝子の一部と共に安定した三量体を形成できるか、又は（ｂ）Ztnfr12遺伝子のmRNA転写体の一部と共に安定した二量体を形成できる配列を有するオリゴヌクレオチドである。
“リボザイム”は、触媒中心を含む核酸分子である。この用語は、RNA酵素、自己スプライシングRNA、自己分解性RNA及びそれらの触媒機能を行う核酸分子を包含する。
“外部案内配列”（external guide sequence）は、細胞内mRNAの特定種に内因性リボザイム、すなわちRNアーゼPを方向づけ、RNアーゼPによるmRNAの分解をもたらす核酸分子である。外部案内配列をコードする核酸分子は、“外部案内配列遺伝子”と呼ばれる。
【００８７】
用語“変異体Ztnfr12遺伝子”は、配列番号２の修飾であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子を言及する。そのような変異体は、天然に存在する多型現象のZtnfr12遺伝子、及び配列番号２のアミノ酸配列の保存性アミノ酸置換を含む合成遺伝子を包含する。Ztnfr12遺伝子の追加の変異体形は、本明細書に記載されるヌクレオチド配列の挿入又は欠失を含む核酸分子である。変異体Ztnfr12遺伝子は、その遺伝子が配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子、又はその補体と、緊縮条件下でハイブリダイズするかどうかを決定することによって同定され得る。
【００８８】
他方では、変異体Ztnfr12遺伝子は、配列−比較により同定さえ得る。２つのアミノ酸配列は、その２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が、最大の応答により整列される場合、同じである場合、“100％のアミノ酸配列同一性”を有する。配列比較は、標準のソフトウェアプログラム、例えばDNASTAR（Madison, Wisconsin）により製造されるLASERGENE生物情報コンピューターサイトに包含されるそれらのプログラムを用いて行われ得る。
【００８９】
最適な整列を決定することによって、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列を比較するための他の方法は、当業者に良く知られている（例えば、Peruski and Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997), Wu など. (eds.), “Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins.” In Methods in Gene Biotechnology, Pages 123-151 (CRC Press. Inc. 1997), 及びBishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2nd Edition (Academic Press, Inc. 1998) を参照のこと）。配列同一性を決定するための特定の方法は下記に記載される。
【００９０】
変異体Ztnfr12遺伝子又は変異体Ztnfr12ポリペプチド、変異体遺伝子又はそれによりコードされるポリペプチドは、抗−Ztnfr12抗体に対して特異的に結合する能力、ZTNF4を特異的に結合する能力、又はZTNF4を特異的に結合するが、しかしZTNF2を特異的に結合しない能力により機能的に特徴づけられる。
【００９１】
用語“対立遺伝子変異体”とは、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の複数の遺伝子の二者択一形のいずれかを示すために、本明細書において使用される。対立遺伝子変異は、突然変異を通して天然では生じ、そして集団内の表現型多型現象をもたらすことができる。遺伝子突然変異は、サイレントであり(コードされたポリペプチドにおける変化がない)、又は変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語、対立遺伝子変異体はまた、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるタンパク質を示すために本明細書において使用される。
【００９２】
用語“オルト体（orthology）”とは、異なった種からのポリペプチド又はタンパク質の機能的相対物である、１つの種から得られるポリペプチド又はタンパク質を示す。オルト体間の配列の差異は、特定化の結果である。
“パラ体（paralogs）”とは、生物によって製造される、異なっているが，しかし構造的に関連するタンパク質である。パラ体は、遺伝子重複を通して生じると思われる。例えば、α−グロビン、β−グロビン及びミオグロビンは、お互いパラ体である。
【００９３】
本発明は、Ztnfr12遺伝子の機能的フラグメントを包含する。本発明においては、Ztnfr12遺伝子の“機能的フラグメント”は、本明細書に記載されるドメインであるZtnfr12ポリペプチドの一部をコードする核酸分子を言及するか、又は抗−Ztnfr12抗体に対して特異的に結合する能力、ZTNF4を特異的に結合する能力、及びZTNF4を特異的に結合するが、しかしZTNF2を特異的に結合しない能力により機能的に特徴づけられる。
標準分析法の不正確さのために、ポリマーの分子量及び長さは、おおよその値であることが理解される。そのような値が“約”X又は“およそ”Xとして表される場合、Xの言及された値は、±10％で正確であると理解されるであろう。
【００９４】
３．Ztnfr12をコードする核酸分子の生成
ヒトZtnfr12遺伝子をコードする核酸分子は、配列番号１及び９に基づいてのポリヌクレオチドプローブを用いて、ヒトcDNA又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。それらの技法は、標準であり、そして十分に確立されている。
【００９５】
例示されるように、ヒトZtnfr12遺伝子をコードする核酸分子は、ヒトcDNAライブラリーから単離され得る。この場合、第１段階は、当業者に良く知られている方法を用いて、例えば胚中心B-細胞又はリンパ節組織からRNAを単離することによって、cDNAライブラリーを調製することである。一般的に、RNA単離技法は、細胞を分解するための方法、RNAのRNアーゼ指図された分解を阻害するための手段、及びDNA、タンパク質及び多糖類汚染物からRNAを分離する方法を提供すべきである。
【００９６】
例えば、全RNAは、液体窒素において組織を凍結し、その凍結された組織を乳針及び乳棒により粉砕し、細胞を溶解し、フェノール/クロロホルムの溶液により前記粉砕された組織を抽出し、タンパク質を除き、そして塩化リチウムによる選択的沈殿によりRNAを残る不純物から分離することによって単離され得る（例えば、Ausubel など., (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition pages4-1〜4-6  (John Wiley& Sons 1995 )[“Ausubel (1995)”]; Wuなど., Methods in Gene Biotechnology, pages33-41 (CRC Press, Inc. 1997 ) [“Wu(1997)”]を参照のこと）。
【００９７】
他方では、全RNAは、粉砕された組織をグアニジニウムイソチオシアネートにより抽出し、有機溶媒により抽出し、そしてRNAを汚染物から示差遠心分離により分離することによって単離され得る（例えば、Chirgwinなど., Biochemistry 18: 52 (1979); Ausubel (1995) P.4-1〜4-6; Wu (1997) P.33-41 を参照のこと）。
【００９８】
cDNAライブラリーを構成するために、ポリ(A)+RNAが全RNA調製物から単離されるべきである。ポリ(A)+RNAは、オリゴ（dT）−セルロースクロマトグラフィーの標準技法を用いて、全RNAから単離され得る（例えば、Aviv and Leder, Proc. Natl. Acad.Sci. USA69: 1408 (1972); Ausubel (1995) P. 4-11〜4-12を参照のこと）。
【００９９】
二本鎖cDNA分子は、当業者に良く知られている技法を用いて、ポリ(A)+RNAから合成される（例えば、Wu (1997) P.41-46を参照のこと）。さらに、市販のキットが、二本鎖cDNA分子を合成するために使用され得る。例えば、そのようなキットは、Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Promega Corporation (Madison, WI) 及びSTRATAGENE (La Jolla, CA) から入手できる。
【０１００】
種々のクローニングベクターが、cDNAライブラリーの構成のために適切である。例えば、cDNAライブラリーは、バクテリオファージに由来するベクター、例えばλgt10バクターにおいて調製され得る。例えば、Huynhなど., “Construction and Screening cDNA Libraries in λgt10 and λ11” in DNA Cloning: A Practica Approach Vol. I, Glovar (ed.), page 49 (IRL Press, 1985); Wu (1997) at pages 47-52 を参照のこと。
【０１０１】
他方では、二本鎖cDNA分子は、プラスミドベクター、例えばPBLUESCRIPTベクター（STRATAGENE；La Jolla, CA）, LAMDAGEM-4 (Promega Corp.) 又は他の市販のベクター中に挿入され得る。適切なクローニングベクターはまた、American Type Culture Collection (Manassas. VA) から入手できる。
クローン化されたcDNA分子を増幅するために、cDNAライブラリーが、標準技法を用いて、原核宿主中に挿入される。例えば、cDNAライブラリーは、例えばLife Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD) から得られるコンピテントE.コリDH5細胞中に導入され得る。
【０１０２】
ヒトゲノムライブラリーは、当業界において良く知られている手段により調製され得る（例えばAusubel (1995) p. 5-1〜5-6; Wu (1997) p. 307-327を参照のこと）。ゲノムDNAは、界面活性剤Sarkosylにより組織を溶解し、その溶解物をプロテイナーゼKにより消化し、不溶性残骸を溶解物から遠心分離により清浄し、イソプロパノールを用いて溶解物から核酸を沈殿し、そして塩化セシウム密度グラジエント上で再懸濁されたDNAを精製することによって単離され得る。
【０１０３】
ゲノムライブラリーの生成のために適切であるDNAフラグメントは、ゲノムDNAのランダム剪断により、又は制限エンドヌクレアーゼによるゲノムDNAの部分消化により得られる。ゲノムDNAフラグメントは、従来の技法、例えば適切な末端を供給するために制限酵素消化の使用、DNA分子の所望しない連結を回避するためにアルカリホスファターゼ処理の使用、及び適切がリガーゼによる連結に従って、ベクター、例えばバクテリオファージ又はコスミドベクター中に挿入され得る。そのような操作のための技法は当業界において良く知られている（例えば、Ausubel (1995) p. 5-1〜5−6; Wu (1997) p. 307-327 を参照のこと）。
【０１０４】
他方では、ゲノムライブラリーは、市販源、例えばResearch Genetic (Huntsville, AL) 及びATCC (Marassas, VA) から得られる。
cDNA又はゲノムクローンを含むライブラリーは、標準方法を用いて、配列番号１及び４に基づかれる１又は複数のポリヌクレオチドプローブによりスクリーンされ得る（例えば、Ausubel (1995) p. 6-1〜6-11を参照のこと）。
【０１０５】
ヒトZtnfr12遺伝子をコードする核酸分子はまた、本明細書に記載されるように、Ztnfr12遺伝子のヌクレオチド配列に基づくヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーによるポリメラーゼ鎖反応（PCR）を用いて得られる。PCRによるライブラリーのスクリーニングの一般的方法は、例えば、Yuなど., “Use of The Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries”. In Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Application, White (ed.), p.211-215 (Humana Press, Inc. 1993)により提供される。
【０１０６】
さらに、関連する遺伝子を単離するためへのPCRの使用の技法は、例えばPreston, “Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members,” in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols; Current Metods and Applications. White (ed.), pages 317-337 (Humana Press, Inc. 1993) により記載される。
【０１０７】
下記のようにして生成された抗−Ztnfr12抗体はまた、cDNAライブラリーからのZtnfr12遺伝子をコードするDNA配列を単離するためにも使用され得る。例えば、抗体はλgt11発現ライブラリーをスクリーンするために使用され、又は抗体はハイブリッド選択及び翻訳に続くイムノスクリーニングのために使用され得る（例えば、Ausubel（1995）p.6-12〜6-16; Margolis など., “Screening λ expression libraries with untibody and Protein Probes” in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover など (eds.) p. 1-14 (Oxford University Press 1995) を参照のこと）。
【０１０８】
他に、Ztnfr12遺伝子は、お互いプライムする長いオリゴヌクレオチド、及び本明細書に記載されるヌクレオチド配列を用いて、核酸分子を合成することによって得られる（例えば、Ausubel (1995) p.8-8〜8-9を参照のこと）。ポリメラーゼ鎖反応を用いての確立された技法は、少なくとも２kbの長さのDNA分子を合成する能力を提供する（Adang など., Plant Molec. Biol. 21: 1131 (1993). Bambot など., PCR Methods and Applications 2:266 (1993), Dilfon など., “Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Constrauction of Synthetic Genes,” in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications. White (ed.), Pages 263-268. (Humana Press. Inc. 1993), 及びHolowachukなど., PCR Methods Appl. 4: 299 (1995)）。
【０１０９】
本発明の核酸分子はまた、ホスホラミジット方法のようなプロトコールを用いて、“遺伝子機会”により合成され得る。化学的に合成される二本鎖DNAが遺伝子又は遺伝子フラグメントの合成のような用途のために必要とされる場合、個々の相補的鎖は別々に製造される。短い遺伝子（60〜80の塩基対）の生成は技術的に簡単であり、そして相補的鎖を合成し、そして次にそれらをアニーリングすることによって達成され得る。しかしながら、長い遺伝子（300以上の塩基対）の生成に関しては、化学的DNA合成の間、個々のサイクルのカップリング効率はめったに100％ではないので、特殊な手段が必要とされる。
【０１１０】
この問題を克服するために、合成遺伝子（二本鎖）が、20〜100個の長さのヌクレオチドである一本鎖フラグメントからモジュラー形でアセンブルされる。ポリヌクレオチド合成の再考のためには、例えば、Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press 1994), Itakura など., Annu. Rev. Biochem. 53: 323 (1984), などClimie など., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 87: 633 (1990) を参照のこと。
【０１１１】
Ztnfr12 cDNA又はZtnfr12ゲノムフラグメントの配列は、標準の方法を用いて決定され得る。本明細書に開示されるZtnfr12ポリヌクレオチド配列はまた、Ztnfr12遺伝子の5’側の非−コード領域をクローン化するためのプローブ又はプライマーとして使用され得る。Ztnfr12遺伝からのプロモーター要素は、例えばリンパ節組織、例えばトランスジェニック動物、又は遺伝子治療を受けている患者において異種遺伝子の発現を方向づけるために使用され得る。そのようなプロモーター要素は、配列番号９のヌクレオチド１−1000のうち50, 100, 200, 400又は600個のヌクレオチドから成るフラグメントにより提供され得る。他方では、Ztnfr12遺伝子プロモーターは、配列番号９のヌクレオチド１−1000により提供され得る。Ztnfr12プロモーター又は調節要素を含むゲノムフラグメントの同定は、十分に確立された技法、例えば欠失分析を用いて達成され得る（一般的には、Ausubel (1995) を参照のこと）。
【０１１２】
5’側フランギング配列のクローニングはまた、アメリカ特許第5,641,670号に開示される方法に従って、“遺伝子活性化”によるZtnfr12タンパク質の生成を促進する。手短くに言及すれば、細胞における内因性Ztnfr12遺伝子の発現は、少なくとも標的配列、調節配列、エキソン、及び対になっていないスプライスドナー部位を含んで成るDNA構造体を、Ztnfr12遺伝子座中に導入することによって変更される。標的配列は、内因性Ztnfr12遺伝子座を有する構造体の相同組換えを可能にするZtnfr12 5’側非コード配列であり、それにより、前記構造体内の配列は内因性Ztnfr12コード配列により作用可能に連結されるようになる。この場合、内因性Ztnfr12プロモーターが、他の調節は列により置換されるか又はそれにより補充され、増強された組織特異的、又は他方では、調節された発現が提供される。
【０１１３】
４．Ztnfr12変異体の生成
本発明は、本明細書に開示されるZtnfr12ポリペプチドをコードする種々の核酸分子、例えばDNA及びRNA分子を提供する。当業者は、遺伝子コードの縮重の観点から、相当の配列変動がそれらのポリヌクレオチド分子間で可能であることを容易に認識するであろう。配列番号３は、それぞれ配列番号２のZtnfr12ポリペプチドをコードするすべての核酸分子を包含する縮重ヌクレオチド配列である。当業者は、配列番号３の縮重配列がまた、Tに代わってUを置換することによって、それぞれ配列番号２をコードするすべてのRNA配列を提供することを認識するであろう。従って、本発明は、配列番号１のヌクレオチド27−578、及びそれらのRNA同等物を含んで成るZtnfr12ポリペプチド−コード核酸分子を企画する。
【０１１４】
表２は、縮重ヌクレオチド位置を示すために、配列番号３内に使用される1文字コードを示す。“解”は、コード文字により示されるヌクレオチドである。“相補体”とは、相補的ヌクレオチドのためのコードを示す。例えば、コードYはC又はTのいずれかを示し、そしてその補体RはA又はGを示し、AはTに対して相補的であり、そしてGはCに対して相補的である。
【０１１５】
【表２】
2009225798.tif 000003
【０１１６】
所定のアミノ酸についてのすべての可能なコドンを包含する、配列番号３に使用される縮重コドンが表３に示される。
【０１１７】
【表３】
2009225798.tif 000004
【０１１８】
当業者は、いくらかのあいまいさが、個々のアミノ酸をコードするすべての可能なコドンの代表である縮重コドンの決定において導入されることを理解するであろう。例えば、セリン（WSN）のための縮重コドンは、ある環境下で、アルギニン（AGR）をコードすることができ、そしてアルギニン（MGN）のための縮重コドンは、ある環境下で、セリン（AGY）をコードすることができる。類似する関係が、フェニルアラニン及びロイシンをコードするコドン間に存在する。従って、縮重配列により包含されるいくつかのポリヌクレオチドは、変異体アミノ酸配列をコードすることができるが、しかし当業者は、配列番号２のアミノ酸配列への参照によりそのような変異体配列を容易に同定することができる。変異体配列は、本明細書に記載のようにして官能性について容易に試験され得る。
【０１１９】
異なった種は“選択的コドン使用法”を示すことができる。一般的には、Grantham,など., Nuc. Acids Res. 8: 1893−912, 1980; Haas, など., Curr. Biol. 6: 315−24, 199６;  Wain−Hobson、など.,Gene  13：355−64，1981；Grosjean  and  Fiera，Gene  18：199−209、1982；Holm,Nuc．Acids  Res．14：3075−87、1986；Ikemura，Ｊ．Mol．Biol．158：573−97，1982、Sharyp and Matassi, Curr. Opin. Genet. Dev. 4: 851 (1994), Kane, Curr. Opin. Biotechnol. 6: 494(1995), 及びMakrides, Microbiol. Rev. 60: 512(1996) を参照のこと。
【０１２０】
本明細書において使用される場合、用語、“選択的コドン使用法”又は“選択的コドン”とは、一定の種の細胞に最も頻繁に使用され、従って個々のアミノ酸をコードする可能なコドンの１又は少数の代表を好むタンパク質翻訳コドンを言及する技術的用語である(表２を参照のこと)。例えば、アミノ酸トレオニン（Thr）は、ACA、ACC、ACG、又はACTによりコードされるが、しかし哺乳類細胞においては、ACCが最も通常に使用されるコドンであり；他の種においては、例えば昆虫細胞、酵母、ウィルス又は細菌においては、異なったThrコドンが好ましい。
【０１２１】
特定の種のための選択的コドンは、当業界において知られている種々の方法により、本発明のポリヌクレオチド中に導入され得る。例えば、組換えDNA中への選択的コドン配列の導入は、特定の細胞型又は種内でタンパク質の翻訳により効果的にすることによって、そのタンパク質の生成を増強する。従って、配列番号３に開示される縮重コドン配列は、当業界において通常使用され、そして本明細書において開示される種々の細胞型及び種においてポリペプチドの発現を最適化するための鋳型として作用する。選択コドンを含む配列は、種々の種における発現について試験され、そして本明細書に開示される官能性について試験され得る。
【０１２２】
本発明はさらに、他の種（オルト体）からの相対物を表すポリペプチド及び核酸分子を供給する。それらの種は、哺乳類、鳥類、両性類、ハ虫類、魚類、昆虫及び他の脊椎及び無脊椎動物種を包含するが、但しそれらだけには限定されない。例示のように、配列番号12, 13及び14は、それぞれネズミZtnfr12のヌクレオチド、アミノ酸及び宿主ヌクレオチド配列を提供する。ネズミZtnfr12ポリペプチドの特徴は、配列番号13のアミノ酸残基１−69での細胞外ドメイン、配列番号13のアミノ酸残基70−96でのトランスメンブランドメイン、配列番号13のアミノ酸残基97−175での細胞内ドメイン、及び配列番号13のアミノ酸残基21−138でのcysに富んでいる領域を包含する。
【０１２３】
特に興味あるものは、他の哺乳類種、例えばネズミ、ブタ、羊、ウシ、犬、ネコ、馬及び他の霊長類リガンドからのZtnfr12ポリペプチドである。ヒトZtnfr12ポリペプチドのオルト体は、従来のクローニング技法と組合して、本発明により供給される情報及び組成物を用いてクローン化され得る。例えば、Ztnfr12 ｃDNAは、Ztnfr12を発現する組織又は細胞型から得られるｍRNAを用いてクローン化され得る。mRNAの適切な源は、本明細書に開示される配列から企画されたプローブによりノザンブロットをプローブすることによって同定され得る。次に、ライブラリーが陽性の組織又は細胞系のｍRNAから調製される。
【０１２４】
Ztnfr12コードのｃDNAが種々の方法、例えば完全な又は部分的なｃDNAにより、又は前記開示される配列に基づく１又は複数の変性プローブにより、プローブすることによって単離され得る。ｃDNAはまた、本明細書に開示される代表的なZtnfr12配列から企画されたプライマーを用いて、ポリメラーゼ鎖反応を用いてもクローン化され得る。さらに、cDNAライブラリーが、宿主細胞を形質転換し、又はトランスフェクトするために使用され、そして興味あるcDNAの発現がZtnfr12ポリペプチドに対する抗体により検出され得る。
【０１２５】
当業者は、配列番号１に開示される配列がヒトZtnfr12の単一の対立遺伝子を表し、そして対立遺伝子変動及び交互のスプライシングが生じることが予測されることを認識するであろう。本明細書に開示されるヌクレオチド配列の対立遺伝子変異体は、標準の方法に従って、異なった個人からのcDNA又はゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。本明細書に開示されるヌクレオチド配列の対立遺伝子変異体、例えばサイレント突然変異を含むそれらの変異体及び突然変異がアミノ酸配列変更をもたらすそれらの変異体は、本明細書に開示されるアミノ酸配列の対立遺伝子変異体であるタンパク質のように、本発明の範囲内である。
【０１２６】
Ztnfr12ポリペプチドの性質を保持する、もう１つのスプライスされたmRNAから生成されるcDNAは、そのようなcDNA及びmRNAによりコードされるポリペプチドと同じように、本発明の範囲内に包含される。それらの配列の対立遺伝子変異体及びスプライス変異体は、当業界において知られている標準の方法に従って、異なった個人又は組織からのcDNA又はゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。
【０１２７】
本発明の好ましい態様においては、単離された核酸分子は、本明細書に開示されるヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子に対して、緊縮条件下でハイブリダイズするであろう。例えば、そのような核酸分子は、緊縮条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子、配列番号１のヌクレオチド27−578のヌクレオチド配列から成る核酸分子、又は配列番号１に対して相補的なヌクレオチド配列又は配列番号１のヌクレオチド27−578を含んで成る核酸分子にハイブリダイズすることができる。一般的に、緊縮条件は、定義されたイオン強度及びpHで、特定の配列のための熱溶融点（Tm）よりも約５℃低くあるよう選択される。Tmは、標的配列の50％が好ましく適合されたプローブに対してハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度及びpH下で）である。
【０１２８】
１対の核酸分子、例えばDNA-DNA, RNA-RNA及びDNA-RNAは、ヌクレオチド配列がいくらかの程度の相補性を有する場合、ハイブリダイズすることができる。ハイブリッド二重ヘリックスにおけるミスマッチ塩基対を許容できるが、しかしハイブリッドの安定性はミスマッチの程度により影響される。ミスマッチハイブリッドのTmは、１〜1.5％の塩基対ミスマッチごとに１℃低下する。ハイブリダイゼーション条件の緊縮性の変更は、ハイブリッドに存在するであろうミスマッチの程度に対する制御を可能にする。
【０１２９】
緊縮性の程度は、ハイブリダイゼーション温度が上昇し、そしてハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度が低下するにつれて、上昇する。緊縮ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリッドの熱溶融点（Tm）よりも約５〜25℃低い温度、及び１MまでのNa+を有するハイブリダイゼーション緩衝液を包含する。より低い温度でのより高い温度の緊縮性は、緩衝溶液における個々の１％ホルムアミドについて約１℃、ハイブリッドのTmを低めるホルムアミドの添加により達成され得る。一般的に、そのような緊縮条件は、20〜70℃の温度、及び６×SSC及び０〜50％のホルムアミドを含むハイブリッド緩衝液を包含する。
【０１３０】
高い程度の緊縮性は、40〜70℃の温度で及び４×SSC及び０〜50％のホルムアミドを有するハイブリダイゼーション緩衝液により達成され得る。高い緊縮条件は典型的には、42〜70℃の温度、及び１×SSC及び０〜50％のホルムアミドを有するハイブリダイゼーション緩衝液を包含する。異なった程度の緊縮液が、標的配列への最大の特異的結合を達成するために、ハイブリダイゼーション、及び洗浄の間、使用され得る。典型的には、ハイブリダイゼーションに続く洗浄は、ハイブリダイズされた複合体からハイブリダイズされていないポリヌクレオチドプローブを除去するために、上昇する程度の緊縮性で行われる。
【０１３１】
上記条件は、ガイドとして作用することを意味し、そしてそれは特定のポリペプチドハイブリッドとの使用のためのそれらの条件を適合するために、十分に当業者の能力の範囲内である。特定の標的配列についてのTmは、標的配列の50％が完全に適合されたプローブ配列にハイブリダイズするであろう温度（定義された条件下での）である。Tmに影響を及ぼすそれらの条件は、ポリヌクレオチドプローブのサイズ及び塩基対含有率、ハイブリダイゼーション溶液のイオン温度、及びハイブリダイゼーション溶液における不安定化剤の存在を包含する。
【０１３２】
Tmを計算するための多くの等式は当業界において知られており、そして種々の長さのDNA、RNA及びDNA−RNAハイブリッド及びポリヌクレオチドプローブ配列に対して特異的である（例えば、Sambrook など., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Press 1988)； Ausubel など., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987); Berger and Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987); 及びWetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227 (1990)を参照のこと）。
【０１３３】
配列分析ソフトウェア、例えばOLIGO6.0（LSR; Long Lake, MN）及びPrimer Premier 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA), 並びにインターネット上のサイトが所定の配列を分析し、そして使用者の定義された基準に基づいてTmを計算するための手段を入手できる。そのようなプログラムはまた、定義された条件下で所定の配置を分析し、そして適切なプローブ配列を同定することができる。典型的には、50以上の塩基対の長いポリヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションは、計算されたTmよりも約20〜25℃低い温度で行われる。50以下の塩基対の小さなプローブに関しては、ハイブリダイゼーションは典型的には、Tm又はそれよりも５〜10℃以下で行われる。これは、DNA−DNA及びDNA−RNAハイブリッドに関して、最大速度のハイブリダイゼーションを可能にする。
【０１３４】
ヌクレオチド配列の長さは、ハイブリッド形成の速度及び安定性に影響を及ぼす。小さなプローブ配列、すなわち50個以下の塩基対は、相補的配列との平衡化にすばやく達するが、しかし安定したハイブリッドは形成されない。インキュベーション時間（およそ分〜時）が、ハイブリッド形成を達成するために使用され得る。より長いプローブ配列はよりゆっくりと平衡化するが、しかし低い温度でさえ、より安定した複合体を形成する。インキュベーションは、一晩又はそれ以上の間、進行せしめられる。一般的に、インキュベーションは、計算されたコット時間の３倍に等しい期間、行われ得る。コット時間、すなわちポリヌクレオチド配列が再会合するのにかかる時間は、当業界において知られている方法により、特定の配列について計算され得る。
【０１３５】
ポリヌクレオチド配列の塩基対組成が、ハイブリッド複合体の熱安定性をもたらし、それにより、ハイブリダイゼーション温度の選択及びハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度に影響を及ぼす。A−T対は、塩化ナトリウムを含む水溶液においてG−C対よりも低い安定性である。従って、G−C含有率が高いほど、ハイブリッドはより安定する。配列内のG及びC残基の平等な分布がまた、ハイブリッド安定性に正に寄与する。
【０１３６】
さらに、塩基対組成は、所定の配列のTmを変えるために操作され得る。例えば５−メチルデオキシシヂンは、デオキシシスチジンより置換され得、そして５−ブロモデオキシウリジンは、デオキシシチジンにより置換され得、そして５−ブロモデオキシウリジンはTmを高めるためにチミジンにより置換され、そして７−デアズ−2’−デオキシグアノシンは、Tmに対する依存性を低めるためにグアノシンにより置換され得る。
【０１３７】
ハイブリダイゼーション緩衝液のイオン濃度はまた、ハイブッリドの安定性に影響お及ぼす。ハイブリダイゼーション緩衝液は一般的にブロッキング剤、例えばDenhardt溶液（Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.）、変性されたサケ精子DNA、粉乳（BLOTTO）、ヘパリン又はSDS、及びNa+源、例えばSSC（１×SSC：0.15：NのNaCl、15mMのクエン酸ナトリウム）又はSSPE（１×SSPE：1.8MのNaCl、10mMのNaH2PO4、1mMのEDTA、pH7.7）を含む。典型的には、ハイブリダイゼーション緩衝液は、10mM〜１MのNa+を含む。
【０１３８】
不安定剤又は変性剤、例えば、ホルムアミド、テトラアルキルアンモニウム塩、グアニジウムカチオン又はチオシアネートカチオンのハイブリダイゼーション溶液への添加が、ハイブリッドのTmを変更するであろう。典型的には、ホルムアミドが、より便利で且つ低い温度でのインキュベーションの実施を可能にするために、50％までの濃度で使用される。ホルムアミドはまた、RNAプローブを用いる場合、非特異的バッググラウンドを低めるためにも作用する。
【０１３９】
例示のように、変異体Ztnfr12ポリペプチドをコードする核酸分子が、配列番号１のヌクレオチド配列（又はその相補体）を有する核酸分子により、５０％ホルムアミド、５×SSC、50mMのリン酸ナトリウム（pH7.6）、５×Denhardt’s 溶液（100×Denhardt’s 溶液：２％（w/v）のFicoll 400, 2% (w/v)のポリビニルピロリドン及び２％（w/v）のウシ血清アルブミン）、１０％の硫酸デキストラン及び２０μg/mlの変性され、剪断されたサケ精子DNAを含んで成る溶液において、４２℃で一晩ハイブリダイズされ得る。
【０１４０】
当業者は、それらのハイブリダイゼーション条件の変動性を考慮することができる。例えば、ハイブリダイゼーション混合物は、ホルムアミドを含まない溶液において、高度で、例えば約６５℃でインキュベートされ得る。さらに、予備混合されたハイブリダイゼーション溶液が入手でき（例えば、CLONTECH Laboratories, Inc. からのEXPRESSHYB Hybridization Solution），そしてハイブリダイゼーションは製造業者の説明書に従って行われ得る。
【０１４１】
ハイブリダイゼーションに続いて、核酸分子は、緊縮条件下で、又は高い緊縮条件下で、ハイブリダイズされなかった核酸分子を除去するために洗浄され得る。典型的な緊縮洗浄条件は、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含む0.5×〜２×SSC溶液による５５〜６５％での洗浄を包含する。すなわち、変異体Ztnfr12ポリペプチドをコードする核酸分子は、緊縮洗浄条件下で、配列番号１のヌクレオチド27−578のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズし、ここで前記洗浄緊縮性は、55〜65℃での、0.1％SDSを含む0.5×〜２×SSC溶液、例えば５５℃での、0.1％SDSを含む0.5×SSC溶液、又は65℃での0.1％SDSを含む２×SSC溶液に等しい。当業者は、例えば洗浄溶液におけるSSCをSSPEにより置換することによって同等の条件を容易に製造することができる。
【０１４２】
典型的な高い緊縮洗浄条件は、50〜65℃での0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含む0.1×〜0.2×SSCの溶液による洗浄を包含する。例えば、変異体Ztnfr12ポリペプチドをコードする核酸分子は、高い緊縮洗浄条件下で、配列番号１のヌクレオチド27−578のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズし、ここで前記洗浄緊縮性は、５0〜６５℃での、0.1％SDSを含む0.１×〜0．２×SSC溶液、例えば５0℃での、0.1％SDSを含む0.1×SSC溶液、又は６５℃での0.1％SDSを含む0.２×SSC溶液に等しい。
【０１４３】
本発明はまた、配列番号２のポリペプチド又はそれらのオルト体に対して実質的に類似する配列同一性を有する単離されたZtnfr12ポリペプチドも提供する。用語“実質的に類似する配列同一性”とは、配列番号２で示される配列又はそれらのオルト体に対して少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも95％以上の配列同一性を有するポリペプチドを示すために本明細書において使用される。
【０１４４】
本発明はまた、２種の次の基準を用いて同定され得るZtnfr12変異体核酸分子を企画する：配列番号２のアミノ酸配列とコードされたポリペプチドとの間の類似性の決定、及びハイブリダイゼーションアッセイ。そのようなZtnfr12変異体は、（１）55〜65℃での0.1％SDSを含む0.5×〜２×SSC溶液に等しい緊縮洗浄条件下で、配列番号１のヌクレオチド27−578のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズし、そして（２）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも70％,少なくとも80％,少なくとも90％,少なくとも95％又は95％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。
【０１４５】
他方では、Ztnfr12変異体は、（１）50〜65℃での0.1％SDSを含む0.1×〜0.2×SSC溶液に等しい、高い緊縮洗浄条件下で、配列番号１のヌクレオチド27−578のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズし、そして（２）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも70％,少なくとも80％,少なくとも90％,少なくとも95％又は95％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子として特徴づけられ得る。
【０１４６】
％配列同一性は、従来の方法により決定される。例えば、Altschulなど., Bull. Math. Bio. 48 : 603−616, 1986及びhenikoff and Henikoff, Pruc.Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915−10919, 1992を参照のこと。手短に言及するば、２種のアミノ酸配列が、10のギャップ開始ペナルティー、１のギャップ拡張ペナルティー、及び表４（アミノ酸は標準の１文字コードにより示される）に示されるようなHenikoff and Henikoff （前記）の“BLOSUM62”評点マトリックスを用いて、その整合評点を最適化するために整合される。次に、％同一性が次のようにして計算される：（［同一の適合するものの合計数］／[より長い配列の長さ＋  ２種の配列を整合するためにそのより長い配列中に導入されるギャップの数]）（100）。
【０１４７】
【表４】
2009225798.tif 000005
【０１４８】
当業者は、２種のアミノ酸配列を整列するために多くの確立されたアルゴリズムが存在することを理解している。Pearson and Lipmanの“FASTA”類似性調査アルゴリズムは、本明細書に開示される１つのアミノ酸配列及び推定上のZtnfr12変異体のアミノ酸配列により共有される同一性のレベルを試験するための適切なタンパク質整列方法である。前記FASTAアルゴリズムは、Pearson and Lipman, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), 及びPearson, Meth. Enzymol. 183: 63 (1990) により記載される。手短には、FASTAがまず、問題の配列（例えば、配列番号２）及び保存性アミノ酸置換、挿入又は欠失を考慮しないで、最高密度の同一性（ktup変数が１である場合）又は対の同一性（ktup＝2である場合）のいずれかを有する試験配列により共有される領域を同定することによって配列を特徴づける。
【０１４９】
次に、最高密度の同一性を有する10の領域が、アミノ酸置換マトリックスを用いて、すべての対合されたアミノ酸の類似性を比較することによって再評価され、そして前記領域の末端が、最高の評点に寄与するそれらの残基のみを含むよう“整えられる”。“カットオフ”値（配列の長さ及びktup値に基づいて予定された式により計算される）よりも高い評点を有するいくつかの領域が存在する場合、その整えられた初期領域が、その領域がギャップとのおおよその一列配列を形成するために結合され得るかどうかを決定するために試験される。
【０１５０】
最終的に、２種のアミノ酸配列の最高評点領域が、アミノ酸挿入及び欠失を可能にする、Needleman-Wunsch アルゴリズム（Needleman and winsch, J. Mol. Biol. 48: 444, 1970; Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26: 787, 1974）の変法を用いて整列される。FASTA 分析のための好ましいパラメーターは次のものである：ktup＝１、ギャップ開始ペナルティー＝10、ギャップ拡張ペナルティー＝１及び置換マトリックス＝BLOSUM62。それらのパラメーターは、Appendix 2 of Pearson, 1990 (前記)に説明されるように、評点マトリックスを調節することによってFASTAプログラム中に導入され得る。
【０１５１】
FASTAはまた、上記に開示されるような割合を用いて、核酸分子の配列同一性を決定するためにも使用され得る。ヌクレオチド配列比較のためには、ktup値は、上記に設定される他のパラメーターを伴なって、１〜６、好ましくは３〜６、最も好ましくは３であり得る。
【０１５２】
本発明は、本明細書に開示されるアミノ酸配列に比較して、１又は複数の保存性アミノ酸変更を有するポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。例えば、配列番号２の１又は複数のアミノ酸置換を含む変異体が得られ、ここでアルキルアミノ酸がZtnfr12アミノ酸配列におけるアルキルアミノ酸に代わって置換され、芳香族アミノ酸がZtnfr12アミノ酸における芳香族アミノ酸に代わって置換され、硫黄含有アミノ酸がZtnfr12アミノ酸配列における硫黄含有アミノ酸に代わって置換され、ヒドロキシ含有アミノ酸Ztnfr12アミノ酸配列におけるヒドロキシ含有アミノ酸に代わって置換され、酸性アミノ酸がZtnfr12アミノ酸配列における酸性アミノ酸に代わって置換され、塩基性アミノ酸がZtnfr12アミノ酸配列における塩基性アミノ酸に代わって置換され、又は二塩基性モノカルボン酸アミノ酸Ztnfr12アミノ酸配列における二塩基性モノカルボン酸アミノ酸に代わって置換される。
【０１５３】
通常のアミノ酸の中で、“保存性アミノ酸置換”は、次のグループの個々内のアミノ酸間の置換により示される：（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン、（３）セリン及びトレオニン、（４）アスパラギン酸及びグルタミン酸、（５）グルタミン及びアスパラギン、及び（６）リシン、アルギニン及びヒスチジン。
【０１５４】
BLOSUM62表は、関連するタンパク質の500以上のグループの高く保存された領域を表す、タンパク質配列セグメントの約2,000の局部の複数整列に由来するアミノ酸置換マトリックスである［Henikoff and Henikoff, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 89: 10915 (1992) ］。従って、BLOSUM62置換頻度は、本発明のアミノ酸配列中に導入され得る保存性アミノ酸置換を定義するために使用され得る。単に化学的性質に基づいてのアミノ酸置換を企画することが可能であるが（上記で論じられたように）、用語“保存性アミノ酸置換”とは、−１よりも大きなBLOSUM62値により表される置換を言及する。例えば、アミノ酸置換は、その置換が０，１，２又は３のBLOSUM62値により特徴づけられる場合、保存性である。このシステムによれば、好ましい保存性アミノ酸置換は、少なくとも１（例えば、１，２又は３）のBLOSUM62値により特徴づけられ、ところがより好ましくは保存性置換は、少なくとも２（例えば、２又は３）のBLOSUM62値により特徴づけられる。
【０１５５】
一定の保存性アミノ酸置換が、ヒト及びネズミZtnfr12アミノ酸配列を一列整列することによって同定され得る。例えば、一列整列は、配列番号２のヒトZtnfr12アミノ酸配列における次のアミノ酸置換、すなわちAla15のVal15への、Arg39のHis39への、及びAla71のLeu71への置換を示す。そのような一列整列は、ヒトZtnfr12アミノ酸配列の他の保存性アミノ酸置換、又はネズミZtnfr12アミノ酸配列の保存性アミノ酸置換を同定する。
【０１５６】
Ztnfr12の特定の変異体が、その対応するアミノ酸配列（すなわち、配列番号２）に対して、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％又は95％以上の配列同一性を有することによって特徴づけられ、ここでアミノ酸配列の変動は、１又は複数のアミノ酸置換による。
【０１５７】
Ztnfr12遺伝子における保存性アミノ酸変化が、配列番号１のいずれか１つに列挙されるヌクレオチドに代わってヌクレオチドを置換することによって導入され得る。そのような“保存性アミノ酸”変異体は、例えばオリゴヌクレオチド指図された突然変異誘発、リンカー走査突然変異誘発、ポリメラーゼ鎖反応を用いての突然変異誘発及び同様の方法により得られる（Ausubel（1995）pages8-10〜8-22; 及びMcPhrson（ed.）, Directed Mutagenesis: A Practical Approach (IRL Press 1991) を参照のこと）。変異体Ztnfr12ポリペプチドが、抗−Ztnfr12抗体を特異的に結合する能力により同定され得る。
【０１５８】
本発明のタンパク質はまた、天然に存在しないアミノ酸残基を含んで成る。天然に存在しないアミノ酸は、トランス−３−メチルプロリン、２,４−メタプロリン、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシプロリン、N−メチルグリシン、アロ−トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチルプロリン、３,３−ジメチルプロリン、tert−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、及び４−フルオロフェニルアラニンを包含する。
【０１５９】
天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質中に導入するためのいくつかの方法が当業界において知られている。例えばナンセンス突然変異が化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAを用いて抑制されるインビトロシステムが使用され得る。アミノ酸を合成し、そしてｔRNAをアミノアシル化するための方法は、当業者において知られている。ナンセンス突然変異を含むプラスミドの転写及び翻訳は、E.コリS30抽出物及び市販の酵素及び他の試薬の含んで成る細胞フリーシステムにおいて実施される。タンパク質は、クロマトグラフィーにより精製される。例えば、Rovertsonなど., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman など., Meth. Enzymol. 202: 301,1991; Chung など., Science 259: 806−09, 1993; 及びChungなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10145−49, 1993を参照のこと。
【０１６０】
第２の方法においては、翻訳は、突然変異誘発されたmRNA及び化学的にアミノアミル化されたサプレッサ−ｔRNAのマイクロインジェクションによりアフリカツメガエル卵母細胞において行われる( Turcatti など., J. Biol. Chem. 271: 1991−98, 1996 )。 第３の方法においては、E.コリ細胞が、置換される予定である天然のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の不在下で及び所望する天然に存在しないアミノ酸（例えば、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン又は４−フルオロフェニルアラニン）の存在下で培養される。
【０１６１】
天然に存在しないアミノ酸は、その天然の相対物の代わりにタンパク質中に導入される。Koide など., Biochem. 33: 7470−46, 1994を参照のこと。天然に存在するアミノ酸残基は、インビトロ化学的に修飾により天然に存在しない種に転換され得る。化学的修飾は、置換の範囲をさらに拡張するために特定部位の突然変異誘発と組み合わされ得る（Wynn and Richards,Protein Sci. 2: 395−403, 1993)。
【０１６２】
限定された数の非保存性アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、及び不自然なアミノ酸が、Ztnfr12アミノ酸により置換され得る。
【０１６３】
本発明のポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当業界において知られている方法、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニン−走査突然変異誘発により同定され得る（Cunningham and Wells, Science 244: 1081−1085, 1989; Bassなど., Proc. Natl. Scad. Sci. USA 88: 4498−502, 1991）, Coombs and Corey, “Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering” ,in Proteins: Analysis and Design, Angeletti(ed.) Ppages 259-311(Academic Press, Inc. 1998))。後者の技法においては、単一のアラニン突然変異が分子中のあらゆる残基で導入され、そして得られる変異体分子が、前記分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定するために、下記に開示されるようして、生物学的活性について試験される。また、Hiltonなど., J. Biol. Chem. 271: 4699−5708, 1996を参照のこと。
【０１６４】
配列分析はZtnfr12受容体結合部位を同定するために使用され得るが、Ztnfr12受容体結合ドメインの位置はまた、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異と共に、核磁気共鳴、結晶学、電子回折又は光親和性ラベリングのような技法により決定されるように、構造体の物理的分析によっても決定され得る。例えば、de Ves など., Science 255: 306 (1992), Smith など., J. Mol. Biol. 224: 899 (1992), 及びWlodaver など., FEBS Lett. 309:59 (1992) を参照のこと。
【０１６５】
複数アミノ酸置換は、突然変異誘発及びスクリーニングの既知方法、例えばReidhaar−Olson and Sauer （science 241: 53−57, 1988）又はBowie and Sauer（ Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:2152−2156,1989 ）により開示される方法を用いて行われ、そして試験される。手短に言及すれば、それらの著者は、ポリペプチドにおける複数の位置を同時ランダム化し、機能的ポリペプチドをスクリーンし、そして次に個々の位置での可能な置換の範囲を決定するために、突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定するための方法を開示する。
【０１６６】
使用され得る他の方法は、ファージ表示（例えば、Lowman など., Biochem. 30 : 10832−10837,1991; Ladner など., アメリカ特許第5,223,409号; Huse, WIPO公開WO 92／06204号）、及び領域−指図された突然変異誘発（Derbyshire など., Gene 46 : 145, 1986; Ner など., DNA 7 : 127, 1988 ）を包含する。さらに、ビオチン又はFITCによりラベルされたZtnfr12は、新規Ztnfr12リガンドの発現クローニングのために使用され得る。
【０１６７】
開示されるZtnfr12ヌクレオチド及びポリペプチド配列の変異体は、Stemmer, Nature 370 : 389−91, 1994, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747−51, 1994及びWIPO公開WI97／20078により開示されるように、DNA  シャフリングを通して生成され得る。手短に言及すれば、変異体DNA分子が、ランダムに導入された点突然変異をもたらす、親DNAのランダム断片化、続く、PCRを用いてのアセンブリーによるインビトロ相同組換えにより生成される。この技法は、前記工程中に追加の変動性を導入するために、親DNAのファミリー、例えば異なった種からの対立遺伝子変異体又はDNAを用いて改良され得る。所望する活性の選択又はスクリーニング、突然変異誘発及びアッセイの続くさらなる相互作用が、有害な変化に対して同時に選択しながら、所望する突然変異について選択することによって、配列の急速な“進化”を提供する。
【０１６８】
本明細書に開示されるような突然変異誘発方法は、宿主細胞におけるクローン化された突然変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するために高処理量の自動化されたスクリーニング方法と組み合わされ得る。生物学的に活性のポリペプチド又は抗−Ztnfr12抗体と結合するポリペプチドをコードする突然変異誘発されたDNA分子が、宿主細胞から回収され、そしてすぐに、近代的装置を用いて配列され得る。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性の急速な決定を可能にし、そして未知の構造のポリペプチドに適用され得る。
【０１６９】
本発明はまた、Ztnfr12ポリペプチドの“機能的フラグメント”及びそのような機能的フラグメントをコードする分子を包含する。核酸分子の通常の欠失分析は、Ztnfr12ポリペプチドをコードする核酸分子の機能的フラグメントを得るために行われ得る。例示されるように、配列番号１のヌクレオチド27−578のヌクレオチド配列を有するDNA分子は、一連の欠失を得るためにBal3 Tヌクレアーゼにより消化され得る。
【０１７０】
次に、フラグメントが正しい読み取り枠を整合して発現ベクター中に挿入され、そして発現されたポリペプチドが単離され、そして細胞−細胞相互作用について、又はZtnfr12抗体を結合する能力について試験される。エキソヌクレアーゼ消化のための1つの方法は、欠失を導入するためにオリゴヌクレオチド−指図された突然変異誘発を使用し、又は所望するフラグメントの生成を特定するために停止コドンを使用することである。他方では、Ztnfr12遺伝子の特定のフラグメントは、ポリメラーゼ鎖反応を用いて合成され得る。機能的フラグメントの例は、Ztnfr12の細胞外ドメイン（すなわち、配列番号２のアミノ酸残基１−69、又は配列番号２のアミノ酸残基１−79）である。
【０１７１】
この一般的アプローチは、インターフェロンのいずれかの又は両末端での切断に基づいての研究が、Horisberger and Di Marco, pharmac. Ther. 66: 507 (1995) により要約されることにより例示される。さらに、タンパク質の機能的分析のための標準技法は、例えばTreulterなど., Molec. Gen. Genet. 240: 113 (1993), Content など., “Expression and preliminary deletion analysisi of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon”, in Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.), Pages 65-72 (Nijhoff 1987), Herschman, “The EGF Enzyme”, in Cortrol of Animal Cell Proliferation, Vol. 1, Boynton など., (eds.) pages 169-199 (Academic Press 1985), Counailleau など., J. Biol. Chem. 270: 29270 (1995); Fukunaga など., J. Biol. Chem. 270: 25291 (1995); Yamaguchi など., Biochem. Pharmacol. 50: 1295 (1995); 及びMeiselなど., Plant Molec. Biol. 30: 1 (1996)により記載される。
【０１７２】
本発明はまた、本明細書に開示されるアミノ配列に比較して、アミノ配列変化を有するZtnfr12遺伝子の機能的フラグメントも企画する。変異体Ztnfr12遺伝子は、上記のように、開示されるヌクレオチド及びアミノ酸配列との同一性のレベルを決定することにより、構造体に基づいて同定され得る。構造体に基づいて変異体遺伝子を同定するもう１つのアプローチは、可能性ある変異体Ztnfr12遺伝子をコードする核酸分子が、上記のように、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズすることができるかどうかを決定することである。
【０１７３】
本発明はまた、本明細書に記載されるZtnfr12ポリペプチドのエピトープ−担持の部分を含んで成るポリペプチドフラグメント又はペプチドも提供する。そのようなフラグメント又はペプチドは、完全なタンパク質が免疫原として使用される場合、抗体応答を誘発するタンパク質の一部である“免疫原性エピトープを含んで成る。免疫原性エピトープ−担持のペプチドは、標準方法を用いて同定され得る。（例えば、Geysenなど., Proc. Natl. Acad Sci. USA81: 3988, 1983を参照のこと）。
【０１７４】
対照的に、ポリペプチドフラグメント又はペプチドは、抗体が特異的に結合することができるタンパク質分子の領域である“抗原性エピトープ”を含んで成る。一定のエピトープは、線状又は連続した範囲のアミノ酸から成り、そしてそのようなエピトープの抗原性は、変性剤により破壊されない。タンパク質のエピトープを模倣する比較的短い合成ペプチドがタンパク質に対する抗体の生成を刺激するために使用され得ることは、当業界において知られている（例えば、Sutcliffeなど., Science 219: 660, 1983を参照のこと）。従って、本発明の抗原性エピトープ−担持のペプチド及びポリペプチドは、本明細書に記載されるポリペプチドと結合する抗体を生ぜしめるために有用である。
【０１７５】
抗原性エピトープ−担持のペプチド及びポリペプチドは好ましくは本明細書に開示されるアミノ酸配列の少なくとも４〜10個のアミノ酸、少なくとも10〜15個のアミノ酸、又は約15〜約30個のアミノ酸を含む。そのようなエピトープ−担持のペプチド及びポリペプチドは、本明細書に記載されるように、Ztnfr12ポリペプチドのフラグメント化又は化学的ペプチド合成により生成され得る。さらに、エピトープは、ランダムペプチドライブラリーのファージ表示により選択され得る（例えば、Lane and Stephen, Curr. Opin. Immunol. 5: 268, 1993, 及びCortese など., Curr. Opin. Biotechnol. 7: 616, 1996を参照のこと）。
【０１７６】
エピトープを含んで成る小さなペプチドからエピトープを同定し、そして抗体を生成するための標準の方法は、例えばMole, “Epitope Mapping,” in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), Pages 105-16 (The Humana Press, Inc., 1992), Price, “Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies,” in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman (eds.), page 60-84 (Cambridge University Press 1995), 及びColigan など. (eds.), Current Protocols in Immunology, pages 9.3.1-9.3.5 and pages 9.4.1-9.4.11 (John Wiley & Sons, 1997)により記載される。
【０１７７】
上記の使用の他に、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、遺伝子学及び分子生物学、タンパク質化学及び抗体生成及び分析に関連する過程のための実験室用実施キットにおける教育手段として有用である。そのユニークなポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のために、Ztnfr12の分子は試験目的のための標準として、又は“未知のもの”として使用され得る。
【０１７８】
例えば、Ztnfr12ポリヌクレオチドは、Ztnfr12が発現されるべき遺伝子である、融合構成体を包含する、細菌、ウィルス又は哺乳類発現のための発現構成体をいかにして調製するか、生徒に教授するための；ポリヌクレオチドの制限エンドヌクレアーゼ分解部位の決定のための；組織におけるZtnfr12ポリヌクレオチドのmRNA及びDNA局在化の決定のための（すなわち、ノザン及びサザンブロット、及びポリメラーゼ鎖反応による）；及び核酸ハイブリダイゼーションにより関連するポリヌクレオチド及びポリペプチドの同定のための助剤として使用され得る。例示として、学生は、配列番号１のヌクレオチド27−578のヌクレオチド配列から成る核酸分子のPstI消化が約174塩基対及び378塩基対の２種のフラグメントを提供し、そしてHinfI消化が約182塩基対、226塩基対、及び144塩基対のフラグメントを生成することを見出すであろう。
【０１７９】
Ztnfr12ポリペプチドは、抗体の調製の教授のための；ウェスターンブロットによるタンパク質の同定のための；タンパク質精製のための；発現される合計タンパク質に対する比率としての発現されるZtnfr12ポリペプチドの重量を決定するための；ペプチド分解部位の同定のための；アミノ及びカルボキシル末端標識のカップリングのための；アミノ酸配列分析のための；及び天然及び標識されたタンパク質の両者の生物学的活性（すなわち、プロテアーゼ阻害）のインビトロ及びインビボでのモニターのための助剤として使用され得る。例えば、学生は、エンドペプチダーゼLys Cによるグリコシル化されていないZtnfr12の消化が4370, 7691, 883, 4758及び729のおおよその分子量を有する５種のフラグメントを生成し、そしてBNPS又はNCS/ウレアによるグリコシル化されていないZtnfr12の消化が10279, 4740及び3877のおおよその分子量を有するフラグメントを生成することを見出すであろう。
【０１８０】
Ztnfr12ポリペプチドはまた、分析熟練、例えば、特に４種のαヘリックスのコンホメーションを決定するために質量分光学、円二色性を、原子的に詳細に立体構造を決定するためにX−線結晶学を、溶液でのタンパク質の構造を表すために核磁気共鳴分光学を教授するためにも使用され得る。例えば、Ztnfr12を含むキットは、分析する学生に与えられ得る。アミノ酸配列は教授によっては知られているので、すなわちタンパク質は、学生の熟練を決定するか、又は学生の熟練を開発するための試験として学生に与えられるので、教授は、学生がポリペプチドを正しく分析したか又はしなかったかを知るであろう。あらゆるポリペプチドはユニークであるので、Ztnfr12の教育学的利用性はそれ自体ユニークであろう。
【０１８１】
Ztnfr12に対して特異的に結合する抗体は、Ztnfr12を精製するために親和製クロマトグラフィーカラムをいかにして調製するかを、学生に教授するための教授助剤として、抗体をコードするポリヌクレオチドをクローニングし、そして配列決定するための教授助剤として、及び従って、ヒト化抗体をいかにして企画するか、学生を教授するための実習課目として使用され得る。Ztnfr12遺伝子、ポリペプチド又は抗体は、試薬会社によりパッケージングされ、そして学生が分子生物学の熟練を得るために教育機関に市販されている。個々の遺伝子及びタンパク質はユニークであるので、個々の遺伝子及びタンパク質は実験実習課目における学生のためのユニークな挑戦及び学習経験を創造する。Ztnfr12遺伝子ポリペプチド又は、抗体を含むそのような教育用キットは、本発明の範囲内にあると思われる。
【０１８２】
変異体及び融合タンパク質を包含するいずれかのZtnfr12ポリペプチドに関しては、当業者は、上記表１及び２に示される情報を用いて、その変異体をコードする十分な縮重ポリヌクレオチド配列を容易に生成することができる。さらに、当業者は、本明細書に記載されるヌクレオチド及びアミノ酸配列に基づいて、種々のZtnfr12変異体に標準のソフトウェアを使用することができる。従って、本発明は、次の配列、すなわち配列番号１、２及び３の少なくとも1つの配列を提供するデータ構造によりコードされるコンピューターに読み取り可能媒体を包含する。
【０１８３】
適切な形のコンピューター読み取り可能媒体は、磁気媒体及び光学的読み取り可能な媒体包含する。磁気媒体の例は、ハード又は固定されたドライブ、ランダムアクセス記憶（RAM）チップ、フロッピー（登録商標）ディスク、デジタルリニアーテープ（DLT）、ディスクカーシ及びZIPディスクを包含する。光学的読み取り可能な媒体は、コンパクトディスク（例えば、CD−読み取りのみ記憶（ROM）、CD−再書き込みできる（RW）及びCD−再記録できる）、及びデジタル可転性/ビデオディスク（DVD）（例えば、DVD−ROM, DVD−RAM及びDVD＋RW）により例示される。
【０１８４】
５．Ztnfr12ポリペプチドの生成
十分な長さのポリペプチド、機能的フラグメント及び融合タンパク質を包含する本発明のポリペプチドは、従来の技法に従って、組換え宿主細胞において生成され得る。Ztnfr12遺伝子を発現するためには、ポリペプチドをコードする核酸分子が、発現ペプチドにおいて転写発現を制御し、そして次に、宿主細胞中に導入される調節配列に作用可能に連結されるべきである。転写調節配列、例えばプロモーター及びエンハンサーの他に、発現ベクターは、翻訳調節配列、及び発現ベクターを担持する細胞の選択のために適切なマーカー遺伝子を包含することができる。
【０１８５】
真核細胞において外来性タンパク質の生成のために適切である発現ベクターは、典型的には、（１）細胞宿主における発現ベクターの増殖及び選択を提供するための細菌複製起点及び抗生物質耐性マーカーをコードする真核DNA要素；（２）転写の開始を制御する真核DNA要素、例えばプロモーター；及び（３）転写体のプロセッシングを制御するDNA要素、例えば転写終結/ポリアデニル化配列を含む。上記で論じられたように、発現ベクターはまた、異種ポリペプチドを、宿主細胞の分泌経路中に方向づける分泌配列コードするヌクレオチド配列を包含する。例えば、Ztnfr12発現ベクターは、Ztnfr12遺伝子、及びいずれかの分泌された遺伝子に由来する分泌配列を含むことができる。
【０１８６】
Ztnfr12の発現は、Ztnfr12遺伝子の非コード部分を包含するか又は包含しない核酸分子を用いて達成され得る。しかしながら、一定の組換え宿主細胞からのより高い生成効率が、少なくとも１つのZtnfr12イントロン配列が発現ベクターに包含される場合に得られる。
【０１８７】
本発明のZtnfr12タンパク質は、哺乳類細胞において発現され得る。適切な哺乳類宿主細胞の例は、アフリカミドリザル腎細胞（Vero; ATCC  CRL1587）、ヒト胚腎細胞（293−HEK; ATCC CRL1573）、子供のハムスター腎細胞（BHK−21, BHK−570；ATCC CRL8544, ATCC CRL10314）、イヌ腎細胞（MDCK；ATCC CCL34）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO−K1; ATCC CCL61; CHO DG44 [Chasinなど., Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555 (1986)]、ラット下垂体細胞（CH1；ATCC CCL82）、HeLa S3細胞（ATCC CCL2.2）、ラット肝癌細胞（H−４−II−E；ATCC CRL1548）、SV40−形質転換されたモンキー腎細胞（COS−１；ATCC CRL1650）及びネズミ胚細胞（NIH−3T3；ATCC CRL1658）を包含する。
【０１８８】
哺乳類宿主に関しては、転写及び翻訳シグナルは、ウィルス源、例えばアデノウィルス、ウシ乳頭腫ウィルス、サルウィルス又は同様のものに由来することができ、ここで調節するシグナルは、高レベルの発現を有する特定の遺伝子に関連している。適切な転写及び翻訳調節配列はまた、哺乳類遺伝子、例えばアクチン、コラーゲン、ミコシン及びメタロチオネイン遺伝子から得られる。
【０１８９】
転写調節配列は、RNA合成の開始を方向づけるために十分なプロモーター領域を含む。適切な真核プロモーターは、マウスメタロチオネインI遺伝子のプロモーター（Hamerなど., J. Molec. Appl. Genet. 1: 273 (1982)）、ヘルペスウィルスのTKプロモーター（Mcknight, Cell 31 : 355 (1982)）、SV40初期プロモーター（Benoistなど., Nature 290: 304 (1981)）、Rous肉腫ウィルスプロモーター（Gormanなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6777 (1982)）、サイトメガロウィルスプロモーター（Foeckingなど., Gene 45: 101 (1980)）及びマウス乳腫瘍ウィルスプロモーター（一般的には、Etcheverry, “Expression of Engineered Protein in Mammalian Cell Culture”, in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland など., (eds.), p. 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)を参照のこと）を包含する。
【０１９０】
他方では、原核プロモーター、例えばバクテリオファージT3 RNAポリメラーゼプロモーターは、その原核プロモーターが真核プロモーターにより調節される場合、哺乳類細胞におけるZtnfr12遺伝子発現を制御するために使用され得る（Zhouなど., Mol. Cell. Biol. 10: 4529 (1990), 及びKaukamanなど., Nucl. Acids Res. 19: 4485 (1991) を参照のこと）。
【０１９１】
発現ベクターは、種々の標準の技法、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、リポソーム−介在性トランスフェクション、マイクロプロジェクト−介在性供給、エレクトロポレーション及び同様のものを用いて、宿主細胞中に導入され得る。好ましくは、トランスフェクトされた細胞が選択され、そして増殖され、宿主細胞ゲノムに安定して組み込まれる発現ベクターを含んで成る組換え宿主細胞が供給される。真核細胞中にベクターを導入するための技法、及び優性選択マーカーを用いてのそのような安定した形質転換体を選択するための技法は、例えばAusubel (1995) 及びMurray (ed.), Gene Transfer and Expression Protocols (Humana Press 1991) により記載される。
【０１９２】
例えば、1つの適切な選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性を付与する遺伝子である。この場合、選択は、ネオマイシン型薬物、例えばG−418又は同様のもの存在下で実施される。“増幅”として言及される方法である選択システムは、興味ある遺伝子の発現レベルを高めるためにも使用される。増幅は、低レベルの選択剤の存在下でトランスフェクタントを培養し、そして次に、導入された遺伝子の生成物を高レベルで生成する細胞を選択するために選択剤の量を高めることによって実施される。
【０１９３】
好ましい増幅可能選択マーカーは、メトトレキセートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼである。他の耐薬物性遺伝子(例えば、ヒグロマイシン耐性、複数薬物耐性、ピューロマイシン  アセチルトランスフェラーゼ)もまた、使用され得る。変更された表現型を導入する他のマーカー、例えば緑色蛍光タンパク質、又は細胞表面タンパク質、例えばCD4,  CD8,クラスI  MHC、胎盤アルカリホスファターゼが、FACS分類又は磁気ビース分離技法のような手段により、トランスフェクトされていない細胞とトランスフェクトされた細胞とを分類するために使用され得る。
【０１９４】
Ztnfr12ポリペプチドはまた、ウィルス供給システムを用いて、培養された哺乳類細胞により生成され得る。この目的のための典型的なウィルスは、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス及びアデノ関連ウィルス（AAV）を包含する。アデノウィルス、すなわち二本鎖DNAウィルスは現在、異種核酸の供給のための最も研究されている遺伝子トランスファーベクターである（Becker など., Meth. Cell Bio. 43: 161−89, 1994; 及びJ. T. Douglas and D.T. Curiel, Science & Medicine 4: 44−53, 1997 を参照のこと）。アデノウィルスシステムの利点は、比較的大きなDNA挿入体の収容、高い力価に増殖する能力、広範囲の哺乳類細胞型を感染する能力、及び異なったプロモーターを含む多数の入手できるベクターとの使用を可能にする柔軟性を包含する。
【０１９５】
アデノウィルスゲノムの一部を欠失することによって、異種DNAの大きな挿入体（7kbまでの）が収容され得る。それらの挿入体は、直接的な連結により、又はトランスフェクトされたプラスミドによる相同組換えにより、ウィルスDNA中に導入され得る。EI遺伝子が宿主細胞により供給されない場合、複製の無能性をもたらす、ウィルスベクターからの必須EI遺伝子を欠失することは任意である。例えば、アデノウィルスベクター−感染されたヒト293細胞（ATCC No. CRL−1573, 45504, 45505）は、有意な量のタンパク質を生成するために比較的高い細胞密度で、付着細胞として、又は懸濁培養物において増殖され得る（Garnierなど., Cytotechnol. 15: 145 (1994) を参照のこと）。
【０１９６】
Ztnfr12はまた、他の高等真核細胞、例えば鳥類、菌類、昆虫、酵母、又は植物細胞においても発現され得る。バキュロウィルスシステムは、昆虫細胞中に、クローン化されたZtnfr12遺伝子を導入するための効果的な手段を提供する。適切な発現ベクターは、オートグラファ・カリホルニカ（Autographa californica） 核多角体病ウィルス（AcMNPV）に基づかれており、そして良く知られているプロモーター、例えばショウジョウバエ熱ショックタンパク質（hsp）70プロモーター、オートグラファ・カルホルニカ核多角体病ウィルス即時−初期遺伝子プロモーター（ie-I）及び遅延された初期39K プロモーター、バキュロウィルスp10プロモーター及びジョウジョウバエメタロチオネインプロモーターを含む。
【０１９７】
組換えバキュロウィルスを製造するための第２の方法は、Luckow ( Luckow, VA, など., J. Virol 67: 4566−79, 1993 ) により記載されるトランスポゾンに基づくシステムを利用する。トランスファーベクターを利用するこのシステムは、Bac−to−BacTMキット（Life  Technologies, Rockville,  MD）として市販されている。このシステムは、“bacmid”  と呼ばれる大きなプラスミドとして、E.コリに維持されるバキュロウィルスゲノム中に、Ztnfr12リガンドポリペプチドをコードするDNAを移動せしめるために、Tn7トランスポゾンを含むトランスファーベクター、pFastBacI TM (Life Technologies )を利用する。Hill−Perkins, M.S. and Possee, R.D., J. Gen. Virol. 71: 971−6, 1990; Bonning, B.C. など., J. Gen. Virol. 75: 1551−6, 1994; 及びChazenbalk, G. D., and  Rapoport, B., J. Biol Chem. 270: 1543−9,1995 を参照のこと。
【０１９８】
さらに、トランスファーベクターは発現されたZtnfr12ポリペプチドのC−又はN−末端でエピトープ標識、例えばGlu−Glu  エピトープ標識をコードするDNAとのイン−フレーム融合体を含むことができる（Grussenmeyer, T. など., Peoc. Natl. Acad. Sci. 82: 7952−6, 1985）。当業界において知られている技法を用いて、Ztnfr12遺伝子を含むトランスファーベクターにより、E.コリが形質転換され、そして組換えバキュロウィルスの表示である断続的lacZ遺伝子を含むbacmida についてスクリーンされる。組換えバキュロウィルスゲノムを含むbacmid DNA が、通常の技法を用いて単離される。
【０１９９】
例示的なPFASTBACベクターは、相当の程度まで修飾され得る。例えば、前記ポリヒドリンプロモーターは、除去され、そしてバキュロウィルス感染において早めに発現され、そして分泌されたタンパク質を発現するために好都合であることが知られているバキュロウィルス塩基性タンパク質プロモーター（また、Pcor, p6.9又はMPプロモーターとしても知られている）により置換され得る。Hill−Perkins, M.S. and Possee, R.D., J. Gen. Virol. 71: 971−6, 1990; Bonning, B.C. など., J. Gen. Virol. 75: 1551−6, 1994; 及びChazenbalk, G. D., and  Rapoport, B., J. Biol Chem. 270: 1543−9,1995 を参照のこと。
【０２００】
そのようなトランスファーベクター構造体においては、塩基性タンパク質プロモーターの短いか又は長いバージョンが使用され得る。さらに、昆虫タンパク質に由来する分泌シグナル配列により天然のZtnfr12分泌シグナル配列を置換しているトランスファーベクターが構成さえ得る。例えば、エクジステロイド・グルコシルトランスフェラーゼ（EGT）、ミツバチMelittin (Invitrogen, Carlsbad, CA) 又はバキュロウィルスgp67（PharMingem, San Diego, CA)からのシグナル配列は、生来のZtnfr12分泌シグナル配列を置換するために、構造体に使用され得る。
【０２０１】
組換えウィルス又はバクミド（bacmid）は、宿主細胞をトランスフェクトするために使用される。適切な昆虫宿主細胞は、IPLB−Sf−21に由来する細胞系、スポドプテラフルギペルダ（Spodoptera frugiperda）さなぎ卵巣細胞系、例えばSf9 (ATCC CRL 1711)、Sf21AE及びSf21（Invitrogen Corporation; San Diego, CA）、及びショウジョウバエSchneider−２細胞、並びにトリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）に由来するHIGH FIVEO 細胞系（Invitrogen）を包含する（アメリカ特許第5,300,435号）。
【０２０２】
市販の血清フリー培地が、細胞の増殖及び維持のために使用され得る。適切な培地は、Sf9細胞に関しては、Sf900IITM (Life Technologies) 又はESF921TM (Expression Systems)；及びトリコプルシア・ニ細胞に関しては、Ex−cellO405TM (JRH Biosiences, Lenexa, KS) 又はExpress FiveOTM (Life Technologies)を包含する。組換えウィルスが使用される場合、細胞は典型的には、組換えウィルスストックが0.1〜10、より典型的には、約３の感染の多重度（MOI）で添加される地点で、約２〜５×105個の細胞１〜２×106個の細胞の接種密度で触媒される。
【０２０３】
バキュロウィルスでの組換えタンパク質を生成するための確立された技法は、Baileyなど., “Manipulation of Baculovirus Vectors”, in Methods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (ed.), P. 147-168 (The Humana Press, (nc. 1991) により、Patel など., “The buculovirus expression system”, in DNA Cloing2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover など., (eds.) p.205-244 (Oxford University Press 1995) により、Ausubel (1995) p.16-37〜16-57により、Richardson (ed.), Baculovirus Expression Proteocols (The Humana Press, Inc. 1995) により、及びLucknow, “Insect Cell Expression Technology”, in Protein Engineering: Principles and Practice. Cleland など. (eds.), p.183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996) により提供される。
【０２０４】
菌類細胞、例えば酵母細胞はまた、本明細書に開示される遺伝子を発現するためにも使用され得る。これに関して、特に興味ある酵母種は、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）, ピチア・パストリス（Pichia pastoris）及びピチア・メタノリカ(pichia methanolica) を包含する。酵母における発現のための適切なプロモーターは、GAL1（ガラクトース）、PGK（ホスホグリセリンキナーゼ）、ADH（アルコールデヒドロゲナーゼ）、AOX1（アルコールオキシダーゼ）、HIS4（ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ）及び同様のものからのプロモーターを包含する。
【０２０５】
外因性DNAによりS.  セレビシアエ細胞を形質転換し、そしてそれから組換えポリペプチドを生成するための方法は、例えばKawasaki, アメリカ特許第4,599,311号；Kawasaki など., アメリカ特許第4,931,373号；Brake, アメリカ特許第4,870,008号；Welchなど., アメリカ特許第5,037,743号；及びMurray など., アメリカ特許第4,845,075号により開示される。形質転換された細胞は、選択マーカー、通常、耐薬物性、又は、特定の栄養物（例えばロイシン）の不在下で増殖する能力により決定される表現型により選択される。
【０２０６】
サッカロミセス・セレビシアエへの使用のための好ましいベクターシステムは、グルコース含有培地における増殖により形質転換された細胞の選択を可能にする、Kawasaki など. (アメリカ特許第4,931,373号)により開示されるPOT１ベクターシステムである。酵母への使用のための適切なプロモーター及びターミネーターは、解糖系酵素遺伝子（例えば、Kawasaki, アメリカ特許第4,599,311号；Kingsmanなど., アメリカ特許第4,615,974号；及びBitter, アメリカ特許第4,977,092 号を参照のこと）及びアルコール  デヒドロゲナーゼ遺伝子からのものを包含する。また、アメリカ特許第4,990,446 号；第5,063,154号；第5,139,936 号；及び第4,661,454号を参照のこと。
【０２０７】
他の酵母、例えばハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、シゾサッカロミセス・ポンベ（ Schizosaccharomyces pombe ）、クルイベリミセス・ラクチス（ Kluyveromyces lactis ）、クルイベリミセス・フラギリス（Kluyveromyces  fragilis ）、ウスチラゴ・マイジス（Ustilago maydis ）、ピチア・パストリス（ Pichia pastoris ）、ピチア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピチア・グイレルモンジ（ Pichia guillermondii ）、及びカンジタ・マルトサ（Candida maltosa ）のための形質転換システムは、当業界において知られている。
【０２０８】
例えば、Gleeson など., J. Gen. Microbiol. 132: 3459−3465, 1986 及びCregg, アメリカ特許第4,882,279 号を参照のこと。アスペルギラス細胞は、Mcknight など.,アメリカ特許第4,935,349号の方法に従って使用され得る。アクレモニウム・クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）を形質転換するための方法は、Sumino ., アメリカ特許第5,162,228号により開示される。ニューロスポラ（Neurospora）を形質転換するための方法は、Lambowitz, アメリカ特許第4,486,533号により開示される。
【０２０９】
例えば、組換えタンパク質の生成のための宿主としてのピチア・メタノリカの使用は、Raymond、アメリカ特許第5,716,808号、Raymond、アメリカ特許第5,736,383号、Raymondなど.,Yeast 14: 11-23 (1998)、及びWIPO公開WO97／17450, WO97／17451、WO98／02536及びWO98／02565に開示される。P.メタノリカの形質転換に使用するためのDNA分子は通常、形質転換の前、好ましくは線状化される、二本鎖の環状プラスミドとして調製されるであろう。P.メタノリカにおけるポリペプチド生成のためには、プラスミドにおけるプロモーター及びターミネーターは、P.メタノリカ遺伝子、例えばP.メタノリカ  アルコール利用遺伝子（AUG１又はAUG２）のものであることが好ましい。
【０２１０】
他の有用なプロモーターは、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（DHAS）、ギ酸デヒドロゲナーゼ（FMD）、及びカタラーゼ（CAT）遺伝子のものを包含する。宿主染色体中へのDNAの組み込みを促進するためには、宿主DNA配列を両端に有するプラスミドの完全な発現セグメントを有することが好ましい。ピチア  メタノリカへの使用のための好ましい選択マーカーは、アデニンの不在下でade2宿主細胞の増殖を可能にする、ホスホリボシル−５−アミノイミダゾールカルボキシラーゼ（AIRC; EC. 4.1.1.21）をコードするP.メタノリカADE2遺伝子である。メタノールの使用を最少にすることが所望される大規模産業方法のためには、両メタノール利用遺伝子（AUG１及びAUG２）が欠失されている宿主細胞を使用することが好ましい。
【０２１１】
分泌されたタンパク質の生成のためには、液胞プロテアーゼ遺伝子（PEP４及びPRB１）を欠いている宿主細胞が好ましい。エレクトロポレーションが、P.メタノリカ細胞中への、興味あるポリペプチドをコードするDNAを含むプラスミドの導入を促進するために使用される。2.5〜4.5kV/cm,好ましくは約3.75kV/cmの電場の強さ、及び1〜40m秒、最も好ましくは約20m秒の時定数（t）を有する、指数的に減衰する、パルスされた電場を用いて、エレクトロポレーションによりP.メタノリカ細胞を形質転換することが好ましい。
【０２１２】
発現ベクターはまた、植物プロトプラスト、損なわれていない植物組織又は単離された植物細胞中にも導入され得る。植物組織中に発現ベクターを導入するための方法は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、マイクロプロジェクティル−介在性供給、DNA注射、エレクトロポレーション及び同様のものによる植物組織の直接的な感染又はそれらと共にs植物細胞の同時培養を包含する。例えば、Horschなど., Science 227：1229 (1995)、Kleinなど., Biotechnology 10: 268 (1992) 及びMikiなど., “Procedures for Intoducing Foreign DNA into Plants”, in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick など. (eds.), P.67-88 (CRC Press, 1993) を参照のこと。
【０２１３】
他方では、Ztnfr12遺伝子は、原核宿主細胞において発現され得る。原核細胞においてZtnfr12ポリペプチドを発現するために使用され得る適切なプロモーターは、当業者に良く知られており、そしてT4, T3, Sp6及びT7ポリメラーゼを認識できるプロモーター、バクテリオファージλのPR及びPLプロモーター、E.コリのtrp, recA, 熱ショック、lacUV5, tac, lpp-lacSpr, phoA及びlacZプロモーター、B.スブチリスのプロモーター、バチルスのバクテリオファージのプロモーター、ストレプトミセスプロモーター、バクテリオファージλのintプロモーター、pBR322のblaプロモーター及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のCATプロモーターを包含する。原核プロモーターは、Glick, J. Ind. Microbiol. 1: 277 (1987), Watsonなど., molecular Biology of the Gene, 4th Ed. (Benjamin Cummins 1987), 及びAusubelなど. (1995) により再考されている。
【０２１４】
適切な原核宿主は、E.コリ及びバチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）を包含する。E.コリの適切な株は、BL21 (DE3), BL21 (DE3) pLysS, BL21 (DE3)pLysE, DH1, DH4, DH5, DH51, DH51F, DH51MCR, DH 10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451及びER1647を包含する（例えば、Brown (ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991) を参照のこと）。バチルス・スブチリスの適切な株は、BR151、YB886、MI119、MI120及びBI70を包含する（例えば、Hardy, “Bacillus Cloning Methods”, in DNA Cloning: A Practical Approach, Clover (ed.) (IRL Press 1985) を参照のこと。
【０２１５】
細菌、例えばE.コリにおいてZtnfr12ポリペプチドを発現する場合、そのポリペプチドは、典型的には不溶性顆粒として細胞質に保持され得、又は細菌の分泌配列により細胞周辺腔に向けられ得る。前者の場合、細胞は溶解され、そして顆粒が回収され、そして例えばグアニジンイソチオシアネート又はウレアを用いて変性される。次に、変性されたポリペプチドが再生され、そして例えばウレア、及び還元された及び酸化されたグルタチオンの組み合わせの溶液に対する透析、続く緩衝溶液に対する透析により、前記変成体を希釈することによってニ量体化され得る。後者の場合、ポリペプチドは、細胞周辺腔の内容物を開放するために細胞を破壊し（例えば、音波処理又は浸透ショックにより）、そしてタンパク質を回収することによって、細胞周辺腔から可溶性及び機能性形で回収され、それにより、変性及び再生のための必要性を回避することができる。
【０２１６】
原核宿主においてタンパク質を発現するための方法は、当業者に良く知られている（例えば、Williamsなど., “Expression of foreign protein in E.coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies” in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover など. (eds.), P.15 (Oxford University Press 1995), Ward など., “Genetic Manipulation and Expression of Antibodies” in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, p. 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995), 及びGeorgiou, “Expression of Proteins in Bacteria”, in Protein Engineering: Principles and Practice; Cleland など. (eds.), p101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996) を参照のこと）。
【０２１７】
細菌、酵母、昆虫及び植物細胞中に発現ベクターを導入するための標準方法は、Ausubel (1995) により提供される。
哺乳類細胞系により生成される外来性タンパク質を発現し、そして回収するための一般的方法は、例えばEtcheverry, “Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture “in Protein Englineering: Principles and Practice, Cleland など. (eds.), p163 (Wiley-Liss, Inc. 1996) により提供される。
【０２１８】
細菌系により生成されるタンパク質を回収するための標準技法は、例えばGrisshammer など., “Purification of Over-Produced proteins from E.coli cells “in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover など. (eds.), p.59-92 (Oxford University Press 1995) により提供される。バキュロウィルス系から組換えタンパク質を単離するための確立された方法は、Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995) により記載される。
【０２１９】
他方では、本発明のポリペプチドは、独占的固相合成、部分固相方法、フラグメント縮合又は従来の溶液合成により合成され得る。それらの合成方法は、当業者に良く知られている（例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963), Stewart et al., “Solid Phase Peptide Synthesis” (2nd Edition), (Pierce Chemical Co. 1984), Bayer and Rapp, Chem. Pept. 3.3 (1986). Atherton など., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press 1989). Fields and Colowick, “Solid-Phase Peptide Synthesis.” Methods in Enzymology Volume 289 (Academic Press 1997), 及び  Lloyd-Williams など., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (CRC Press, Inc. 1997)を参照のこと）。
【０２２０】
全体的な化学合成方法、例えば“生来の化学的連結”及び“発現されたタンパク質連結”における変動性もまた標準である（例えば、Dawsonなど., Science 266: 776 (1994), Hackengなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA94: 7845 (1997), Dawson, Methods Enzymol. 287: 34 (1997), Muir など., proc. Natl. Acad. Sci. USA95: 6705 (1998),及び Severinov and Muir, J. Biol. Chem. 273: 16205 (1998)を参照のこと）。
【０２２１】
本発明のペプチド及びポリペプチドは、配列番号２の少なくとも６個、少なくとも９個又は少なくとも15個の連続したアミノ酸残基を含んで成る。例示として、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基１−69、配列番号２のアミノ酸残基１−79、配列番号２のアミノ酸残基７−69、又は配列番号２のアミノ酸残基７−79のアミノ酸残基の少なくとも６、少なくとも９又は少なくとも15個の連続したアミノ酸残基を含んで成る。本発明の１つの態様においては、ポリペプチドは、それらのアミノ酸配列の20個，30個，40個，50個，100個又はそれ以上の連続した残基を含んで成る。
【０２２２】
例えば、ポリペプチドは、次のアミノ酸残基から成る群から選択されたアミノ酸配列の少なくとも30個の連続したアミノ酸残基を含んで成る：（ａ）配列番号２のアミノ酸残基１−184、（ｂ）配列番号２のアミノ酸残基１−69、（ｃ）配列番号２のアミノ酸残基１−79、（ｄ）配列番号２のアミノ酸残基７−69、及び（ｅ）配列番号２のアミノ酸残基７−79。そのようなペプチド及びポリペプチドをコードする核酸分子は、ポリメラーゼ鎖反応プライマー及びプローブとして有用であり、そしてそれらのペプチド及びポリペプチドはZtnfr12に対する抗体を生成するために有用である。
【０２２３】
６．Ztnfr12融合タンパク質及び接合体の生成
１つの一般的な種類のZtnfr12類似体は、本明細書に開示されるアミノ酸配列の突然変異であるアミノ酸配列を有する変異体である。もう１つの一般的種類のZtnfr12類似体は、下記のように、抗−イディオタイプ抗体及びそのフラグメントにより供給される。さらに、抗−イディオタイプの可変ドメインを含んで成る組換え抗体が、類似体として使用され得る（例えば、Monfardiniなど., proc. Assoc. Am. Physicians 108: 420 (1996) を参照のこと）。抗−イディオタイプZtnfr12抗体の可変ドメインはZtnfr12を模倣するので、それらのドメインは、Ztnfr12結合活性を提供することができる。、抗−イディオタイプ触媒性抗体を生成するための方法は、当業者に知られている（例えば、Joronなど., Ann. N. Y. Acad. Sci. 672:216(1992), Fribouletなど., Appl. Biochem. Biotechnol. 47:229(1994),及びAvalleなど., Ann. N. Y. Acad. Sci.864:118(1998)を参照のこと）。
【０２２４】
Ztnfr12類似体を同定するもう１つのアプローチは、結合ライブラリーの使用により提供される。ファージ表示及び他の結合ライブラリーを構成し、そしてスクリーニングする方法は、例えばKayなど., Phage Display of Peptide and Proteins (Academic Press 1996), Verdine, アメリカ特許第5,783,384号、Kay, など., アメリカ特許第5,747, 334号及びKauffmanなど., アメリカ特許第5,723,323号により提供される。
【０２２５】
Ztnfr12ポリペプチドは、インビボ及びインビトロの両者において使用される。例示として、Ztnfr12の可溶形が、培養された細胞により生成されるか、又は試験培地に添加されるZtnfr12の効果を阻害するために、細胞培養培地に添加され得る。
【０２２６】
Ztnfr12の融合タンパク質は、組換え宿主においてZtnfr12を発現するために、そして発現されたZtnfr12を単離するために使用され得る。下記に記載されるように、特定のZtnfr12融合タンパク質はまた、診断及び治療にも使用される。１つのタイプの融合タンパク質は、組換え宿主細胞からのZtnfr12ポリペプチドを案内するペプチドを含んで成る。Ztnfr12ポリペプチドを、真核細胞の分泌経路中に方向づけるためには、分泌シグナル配列（また、シグナルペプチド、リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）が、Ztnfr12発現ベクターに供給される。
【０２２７】
分泌シグナル配列はZtnfr12に由来するが、適切なシグナル配列はまた、もう１つの分泌されたタンパク質から誘導されるか、又は新たに合成され得る。分泌シグナル配列は、Ztnfr12−コード配列に作用可能に連結され、すなわち２つの配列は正しく読み取り枠を整合して連結され、そして宿主細胞の分泌経路中に新しく合成されたポリヌクレオチドを方向づけるように配置される。分泌シグナル配列は通常、興味あるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の5’ 側に位置するが、但し一定の分泌シグナル配列は、興味あるヌクレオチド配列の他の場所に位置することもできる（例えば、Welchなど.,アメリカ特許第5,037,743号；Hollandなど., アメリカ特許第5,143,830号を参照のこと）。
【０２２８】
Ztnfr12又は哺乳類細胞により生成されるもう１つのタンパク質（例えば、アメリカ特許第5,641,655号に記載されるような組織タイプのプラスミノーゲン活性化因子シグナル配列）は、組換え哺乳類宿主におけるZtnfr12の発現のために有用であるが、酵母シグナル配列は、酵母細胞における発現のために有用である。適切な酵母シグナル配列の例は、酵母対合現象α−因子（MFα１遺伝子によりコードされる）、インバーターゼ（SUC2遺伝子によりコードされる）又は酸性ホスファターゼ（PHO遺伝子によりコードされる）に由来するそれらのものである。例えば，Romanos など., “Expression of Cloned Genes in Yeast” in DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2nd Edition, Glover and Hames (eds.), p.123-167 (Oxford University Press 1995) を参照のこと。
【０２２９】
細菌細胞においては、毒性を低め、安定性を高め、そして発現されたタンパク質の回収性を高めるために、異種タンパク質を融合タンパク質として発現することが、しばしば所望される。例えばZtnfr12は、グルタチオンS−トランスフェラーゼポリペプチドを含んで成る融合タンパク質として発現され得る。グルタチオンS−トランスフェラーゼ融合タンパク質は、典型的には、可溶性であり、そして固定されたグルタチオンカラム上でE. コリ融解物から容易に精製できる。類似するアプローチにおいては、マルトース結合タンパク質ポリペプチドを含んで成るZtnfr12融合タンパク質は、アミロース樹脂カラムにより単離され得、そして切断されたタンパク質A遺伝子のC−末端を含んで成る融合タンパク質は、IgG−セファロースを用いて精製され得る。
【０２３０】
細菌細胞において異種ポリペプチドを、融合タンパク質として発現するために確立された技法は、Williamsなど., “Expression of Foreign Proteins in E. coli Using Plasmid Vectors and Purification of Specific Polyclonal Antibodies”, in DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2nd Edition, Glover and Hames (Eds.), p.15-58 (Oxford University Press 1995) により記載される。さらに、市販の発現システムが利用できる。例えば、PINPOINT Xaタンパク質精製システム（Promega Corporation, Madison, WI）は、アビジンを含んで成る樹脂により、発現の間、ビオチニル化されるポリペプチドを含んで成る融合タンパク質を単離するための方法を提供する。
【０２３１】
原核又は真核細胞により発現される異種ポリペプチドを単離するために有用であるペプチド標識は、ポリヒスチジン標識（ニッケル−キレート化樹脂に対する親和性を有する）、c-myc標識、カルモジュリン結合タンパク質（カルモジュリン親和性クロマトグラフィーにより単離される）、物質P, RYIRS 標識（抗−RYIRS抗体と結合する）、Gln−Gln標識及びFLAG標識（抗−FLG抗体と結合する）を包含する。例えば、Luoなど., Srch. Biochem. Biophys. 329: 215 (1996), Morganti など., Biotechnol. Appl. Biochem. 23: 67 (1996), 及びZhengなど., Gene 186: 55 (1997) を参照のこと。そのようなペプチド標識コードする核酸分子は、例えばSigma−Aldrich Corporation (St. Louis, MO) から入手できる。
【０２３２】
もう1つの形の融合タンパク質は、Ztnfr12ポリペプチド、及び２又は３個の複領域ドメイン及びヒンジ領域を含むが、しかし可変領域を欠いている免疫グロブリンH鎖不変領域、典型的なFcフラグメントを含んで成る。Ztnfr12成分及びFc成分を含んで成る融合タンパク質は、インビトロアッセイ手段として使用され得る。例えば生物学的サンプルにおけるZtnfr12リガンドの存在は、Ztnfr12−免疫グロブリン融合タンパク質を用いて検出され得、ここでZtnfr12成分は、前記リガンド、及び高分子、例えばタンパク質A又は抗−Fc抗体を結合するために使用され、すなわち固体支持体に融合タンパク質を結合するために使用される。さらに、そのようなシステムは、Ztnfr12リガンドのその受容体への結合を妨害するアゴニスト及びアンタゴニストを同定するために使用され得る。
【０２３３】
例示のように、Chang など., (アメリカ特許第5,723,125号) は、ヒトインターフェロン及びヒト免疫グロブリンFcフラグメントを含んで成る融合タンパク質を記載する。インターフェロンのC−末端は、ペプチドリンカー成分によりFcフラグメントのN−末端に連結される。ペプチドリンカーの例は、免疫学的に不活性であるT細胞不活性配列を主に含んで成るペプチドである。典型的なペプチドリンカーは、アミノ酸配列：GGSGG SGGG SGGGG S (配列番号４) を有する。融合タンパク質においては、好ましいFc成分は、溶液において安定性であり、そして活性を活性化する補体をほとんど有さないか又は完全に有さないヒトγ鎖である。
【０２３４】
従って、本発明はZtnfr12成分及びヒトFcフラグメントを含んで成るZtnfr12融合タンパク質を企画し、ここで前記Ztnfr12成分のC−末端は、ペプチドリンカー、例えば配列番号４のアミノ酸配列から成るペプチドを通してFcフラグメントのN−末端に結合される。Ztnfr12成分は、Ztnfr12分子又はそのフラグメントであり得る。例えば、融合タンパク質は、Fcフラグメント（例えば、ヒトFcフラグメント）、配列番号２のアミノ酸残基１−69、及び配列番号２のアミノ酸残基１−79を含んで成ることができる。
【０２３５】
もう１つの態様においては、Ztnfr12融合タンパク質は、IgG配列、IgG Ztnfr12のアミノ酸末端に共有結合されるZtnfr12成分、及びZtnfr12のアミノ酸末端に共有結合されるシグナルペプチドを含んで成り、ここで前記IgG配列は、次の順序での次の要素から成る：CH2ドメイン及びCH3ドメイン。従って、IgG配列はCH1ドメインを欠いている。Ztnfr12成分は、本明細書に記載されるように、Ztnfr12活性、例えばZtnfr12リガンドと結合する能力を示す。抗体及び非抗体部分の両者を含んで成る融合タンパク質を生成するこの一般的なアプローチは、LaRochelleなど., ヨーロッパ特許第742830号（WO95/21258号）により記載されている。
【０２３６】
例４は、IgG由来の免疫グロブリンが一定の突然変異を含む、Ztnfr12融合タンパク質の構成を記載する。５種の免疫グロブリンIgG, IgA, IgM, IgD及びIgEが高等脊椎動物において同定されている。IgG, IgD及びIgEタンパク質は、２種の同一のH鎖及び２種の同一のL鎖からなる、特徴的にジスルフィド結合されたヘテロテトラマーである。典型的には、IgMはテトラマーのペンタマーとして見出され、そしてIgAはテトラマーのダイマーとして存在する。
【０２３７】
IgGは、それが血漿に見出される第２の最も多くのタンパク質として通常、存在する場合、主用クラスを包含する。ヒトにおいては、IgGは、IgG1, IgG2, IgG3及びIgG4と称する４種のサングラスから成る。図１に示されるように、個々の免疫グロブリンH鎖は、所定のサブクラスのために不変である不変領域タンパク質ドメイン（CH1、ビンジ、CH2及びDH3）から成る不変領域を有する。IgGクラスのH鎖不変領域は、ギリシア記号γにより同定される。例えば、IgG1サブクラスの免疫グロブリンは、γ１H鎖不変領域を含む。
【０２３８】
Fcフラグメント又はFcドメインは、ジスルフィド結合されたH鎖ヒンジ領域、CH2及びCH3ドメインから成る。免疫グロブリン融合タンパク質においては、IgG1サングラスのFcドメインは、IgG1が血清タンパク質のいずれかの最長の血清半減期を有するので、しばしば免疫グロブリン成分として使用される。長い血清半減期は、動物研究及び可能性あるヒト治療使用のための特徴的な所望するタンパク質であり得る。さらに、IgG1サブクラスは、抗体介在性エフェクター機能を実施する最長の効力を有する。
【０２３９】
免疫グロブリン融合タンパク質において最も有用であり得る主要エフェクター機能は、抗体依存性細胞毒性を介在するIgG1抗体についての能力である。他方では、これは、主要機能がアンタゴニストとして存在する融合タンパク質の所望しない機能であり得る。IgG1サングラスにおける抗体不変領域介在性活性のために重要である特異的アミノ酸残基のいくつかが同定されている。従って、それらの特異的アミノ酸の包含又は排除は、特異的免疫グロブリン不変領域介在活性の包含又は排除を可能にする。
【０２４０】
例４は、Ztnfr12−Fc融合タンパク質を創造するために生成された、修飾されたヒトIgG1 Fcの２種のバージョンを記載する。Fc4及びFc5は、FcγRI結合及び補体C1q結合を低めることによって、Fcにより介在されるエフェクター機能を低めるための突然変異を含む。特に、３種のアミノ酸置換が、EcγR1結合を低めるために導入された。それらは、EUインデックス位置234及び237（野生型免疫グロブリンγI領域の配列である、配列番号17のアミノ酸残基38、 39及び41）での置換である。それらの位置での置換は、FcγRIへの結合を低めることが示されている（Duncanなど., Nature 332: 563 (1988)）。それらのアミノ酸置換はまた、FcγRIIa結合、及びFcγRIII結合も低めることができる（Sondermannなど., Nature 406: 267 (2000); winesなど., J. Immunol. 164: 5313 (2000)）。
【０２４１】
いくつかのグループが、補体C1q結合及び続く補体固定におけるEUインデックス位置330及び331（配列番号17のアミノ酸残基134及び135）の適切性を記載している（Cafield and Mirrison, J. Exp. Med. 173: 1483 (1991); Taoなど., J. Exp. Med. 178: 1661 (1993)）。それらの位置でのアミノ酸置換は、補体固定化を低めるためにFc4において導入された。Fc4のCH3ドメインは、その対応する野生型ポリペプチドにおいて見出されるそのドメインと同一であるが、但しクローン化されたDNAがdam＋E．コリの株において増殖される場合、可能性あるdamメチル化部位を排除するためにTGAからTAAに変更される停止コドンを除く。
【０２４２】
Fc5においては、EUインデックス位置218でのアルギニン残基は、BglIIクローニングスキームがこの特定のFcを含む融合タンパク質において使用されなかったので、リシンに突然変異された。Fc5配列の残りは、Fc4についての上記の記載に適合する。
【０２４３】
他の有用なFc変異体は、Fc6、Fc7及びFc8を包含する。Fc6はFc5と同一であるが、但し、カルボキシル末端リシンコドンが排除されていることを除く。成熟免疫グロブリンのC末端リシンはしばしば、B細胞からの分泌の前、成熟免疫グロブリンから後−翻訳的に除去されるか、又は血清循環の間、除去される。従って、C末端リシン残基は典型的には、循環抗体上では見出されない。上記Fc4及びFc5に関しては、Fc6配列における停止コドンは、TAAに変更されている。
【０２４４】
Fc7は野生型γ１ Fcと同一であるが、但しCH2ドメインに位置するEUインデックス位置297でのアミノ酸置換を除く。EUインデックス位置Asn−297（配列番号17のアミノ酸残基101）は、N−連結された炭水化物結合の部位である。N−結合された炭水化物は、その炭水化物構造における可能性あるバッチからバッチへの変動のために、組換え発現されたタンパク質への可能性ある変動性の源を導入している。この可能性ある変動性を排除する試みにおいては、Asn−297が、その残基位置でN−結合された炭水化物の結合を妨げるためにグルタミン残基に突然変異誘発された。残基297での炭水化物はまた、FcγRIIIに結合するFcにも包含される（Sondermannなど., Nature 406: 267 (2000)）。従って、炭水化物の除去は、融合タンパク質を含む組換えFc7のFcγRへの結合を一般的に低める。上記のように、Fc7配列のおける停止コドンは、TAAに突然変異誘発された。
【０２４５】
Fc8は、配列番号17に示される野生型免疫グロブリンγ１領域と同一であるが、但し、EUインデックス位置220でのシステイン残基（配列番号17のアミノ酸残基24）がセリン残基により置換されている。この突然変異は、免疫グロブリンL鎖不変領域と通常、ジスルフィド結合するシステイン残基を排除した。
【０２４６】
本発明は、配列番号２のアミノ酸残基７−69、配列番号２のアミノ酸残基７−79、配列番号２のアミノ酸残基７−39、配列番号２のアミノ酸残基19−35、配列番号２のアミノ酸残基１−69、配列番号２のアミノ酸残基１−79、配列番号２のアミノ酸残基１−71、配列番号２のアミノ酸残基７−71、又は配列番号２のアミノ酸残基１−39から成るZtnfr12受容体成分を含んで成るZtnfr12−免疫グルブリン融合タンパク質を企画する。より一般的には、本発明は、Ztnfr12−免疫グロブリン融合タンパク質を包含し、ここで前記Ztnfr12受容体成分は、配列番号２のアミノ酸残基１−69、配列番号２のアミノ酸残基１−71、配列番号２のアミノ酸残基７−71、又は配列番号２のアミノ酸残基１−79のフラグメントから成り、そして前記Ztnfr12受容体成分はZTNF4で結合する。
【０２４７】
本明細書に記載される融合タンパク質の免疫グロブリン成分は、免疫グロブリンの少なくとも１つの不変領域を含んで成る。好ましくは、免疫グロブリン成分は、ヒト免疫グロブリンのセグメントを表す。ヒト免疫グルブリン配列は、上記で論じられたアミノ酸突然変異の少なくとも１つを有する、野生型アミノ酸配列、又は修飾された野生型アミノ酸配列であり得る。
【０２４８】
ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列はまた、既知のアロタイプ決定基の特徴である１又は複数の突然変異を有することによって野生型とは異なることができる。表５は、ヒトIgGγI不変領域のアロタイプ決定基を示す（Putman, The Plasma Proteins, Vol. V. Pages49 to 140 (Academic Press, Inc. 1987)）。EUインデックス位置214, 356, 358及び431は、既知のIgGγ１アロタイプを定義する。位置214は、IgGγ１不変領域のCH1ドメインに存在し、そして従って、Fc配列以内に存在しない。配列番号17の野生型Fc配列は、Glm（１）及びGlm（２−）アロタイプを包含する。しかしながら、TACI−Fcタンパク質のFc成分は、それらのアロタイプのいずれかの組み合わせを表すために修飾され得る。
【０２４９】
【表５】
2009225798.tif 000006
【０２５０】
本明細書において開示されるZtnfr12−F2タンパク質の例は、ヒトIgI不変領域を開示する。しかしながら、適切な免疫グロブリン成分はまた、少なくとも１つの不変領域、例えば次の免疫グロブリンのいずれか、すなわちIgG2, IgG2, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE及びIgMからのH鎖不変領域を含んで成るプロペプチドを包含する。本発明はまた、Ztnfr12ダイマー及びマルチマーを生成するために、上記のようなZtnfr12受容体成分、及びアルブミン又はβ2−マイクログロブリンのいずれか、及び同様のものを含んで成る融合タンパク質にも関する。Ztnfr12融合タンパク質ダイマー及びマルチマーを生成するために適切な追加のタンパク質の成分は、当業者に知られている。
【０２５１】
一定の状態の処理においては、Ztnfr12−免疫グルブリン融合タンパク質と、TACI−免疫グロブリン融合タンパク質及びBCMA−免疫グロブリン融合タンパク質の少なくとも１つとを組合すことは好都合である。この組合せ療法は、種々のタイプの免疫グロブリン融合タンパク質を、例えばダイマーとして投与することによって、又はZtnfr12−免疫グロブリン、TACI−免疫グロブリン及びBCMA−免疫グロブリン融合タンパク質のへテロダイマーを投与することによって達成され得る。
【０２５２】
本発明の融合タンパク質は、一本鎖ポリペプチド、ダイマー、トリマー、又は複数のダイマー又はトリマーの形を有することができる。ダイマーは、ホモダイマー又はヘテロダイマーであり得、そしてトリマーはホモトリマー又はヘテロトリマーであり得る。ヘテロダイマーの例は、Ztnfr12−免疫グロブリンポリペプチド及びBCMA−免疫グロブリンポリペプチドのダイマー、Ztnfr12−免疫グロブリンポリペプチド及びTACI−免疫グロブリンポリペプチドのダイマー、及びBCMA−免疫グロブリンポリペプチド及びTACI−免疫グルブリンポリペプチドのダイマーを包含する。
【０２５３】
ヘテロポリマーの例は、Ztnfr12−免疫グロブリンポリペプチド及び２種のBCMA−免疫グロブリンポリペプチドのトリマー、Ztnfr12−免疫グロブリンポリペプチド及び２種のTACI−免疫グロブリンポリペプチドのトリマー、BCMA−免疫グロブリンポリペプチド及び２種のZtnfr12−免疫グロブリンポリペプチドのトリマー、２種のTACI−免疫グロブリンポリペプチド及びBCMA−免疫グロブリンポリペプチドのトリマー、１つのTACI−免疫グロブリンポリペプチド及び２種のZtnfr12−免疫グロブリンポリペプチドのトリマー、２種のBCMA−免疫グロブリンポリペプチド及びTACI−免疫グロブリンポリペプチドのトリマー、及びTACI−免疫グロブリンポリペプチド、BCMA−免疫グロブリンポリペプチド及びZtnfr12−免疫グロブリンポリペプチドのトリマーを包含する。
【０２５４】
そのような融合タンパク質においては、TACI受容体成分は、配列番号８の次のアミノ酸配列の少なくとも１つを含んで成ることができる：アミノ酸残基30−154、アミノ酸残基34−66、アミノ酸残基71−104、アミノ酸残基47−62及びアミノ酸残基86−100。BCMA受容体成分は、配列番号７の次のアミノ酸配列の少なくとも１つを含んで成ることができる：アミノ酸残基１−48、アミノ酸残基８−41及びアミノ酸残基21−37。Ztnfr12受容体成分は、配列番号２の次のアミノ酸配列の少なくとも１つを含んで成ることができる：アミノ酸残基７−69、アミノ酸残基19−35、アミノ酸残基１−69、アミノ酸残基７−79、アミノ酸残基１−71、アミノ酸残基７−71又はアミノ酸残基１−39。
【０２５５】
免疫グロブリン融合タンパク質は、標準の方法を用いて生成され得る。例示として、例４は、例示的なZtnfr12−Fc5融合タンパク質を構成するために使用され得るPCR方法の使用を記載する。
抗体融合タンパク質の他の例は、抗原−結合ドメイン、及びZtnfr12細胞外ドメインを含むZtnfr12フラグメントを含んで成るポリペプチドを包含する。そのような分子は、Ztnfr12結合活性の有益性のための特定の組織を標的化するために使用され得る。
【０２５６】
本発明はさらに、種々の他のポリペプチド融合体を提供する。例えば、生物学的機能を付与するドメインの一部又はすべては、腫瘍壊死因子受容体ファミリーの他のメンバーからの機能的に同等のドメインにより本発明のZtnfr12間で置換され得る。ポリペプチド融合体は、Ztnfr12融合類似体を生成するために、組換え宿主細胞において発現され得る。Ztnfr12ポリペプチドは、複数の成分又はドメイン、例えば精製の親和性標識及び標的化ドメインに融合され得る。ポリペプチド融合体はまた、特にドメイン間での１又は複数の切断部位を含むことができる。例えば、Tuanなど., Connective Tissue Research 34; 1(1996) を参照のこと。
【０２５７】
融合タンパク質は、その融合タンパク質の個々の成分を調製し、そしてそれらを化学的に接合することによって、当業者に知られている方法により調製され得る。他方では、正しく読み取り枠を整合して融合タンパク質の両成分をコードするポリヌクレオチドは、既知の技法を用いて生成され、そして本明細書に記載される方法により発現され得る。融合タンパク質の酵素的及び化学分解のための一般的な方法は、例えばAusubel（1995）、p. 16-19〜16−25により記載される。
【０２５８】
Ztnfr12はZtnfr12以外のリガンドを結合することができる。Ztnfr12ポリペプチドはそのような追加の、可能性あるZtnfr12リガンドを同定し、そして単離するために使用される得る。例えば、本発明のタンパク質及びペプチドが、カラム上に固定され、そしてカラム上で作動する生物学的サンプルからのリガンドを結合するために使用され得る（Hermansonなど. (eds.), Immobilized Affinity Ligand Techniques, P. 195-202 (Academic Press 1992)）。
【０２５９】
受容体リガンドとして、Ztnfr12ポリペプチドの活性が、受容体結合及び続く生理学的細胞応答に関連する、細胞外酸性化速度又はプロトン排泄を測定する、珪素に基づくバイオセンサーのマイクロフィジオメーターにより測定され得る。典型的な装置は、Molecular Devices, Sunnyvale, CAにより製造されるCytosensorTM マイクロフィジオメーターである。種々の細胞応答、例えば細胞増殖、イオン輸送、エネルギー生成、炎症応答、調節及び受容体活性化及び同様のものが、この方法により測定され得る。
【０２６０】
例えば、McConnell, H.M.など., Science 257：1906-1912, 1992; Pitchford, S. など., Meth. Enzymol. 228: 84-108, 1997: Arimilli, S. など., J. Immunol. Meth. 212: 49-59, 1998; Van Liefde, I. など., Eur. J. Pharmacol. 346: 87-95, 1998を参照のこと。さらに、マイクロフィジオメーターは、付着性又は非付着性真核又は原核細胞をアッセイするために使用され得る。時間にわたっての細胞培地における細胞外酸性化変化を測定することによって、マイクロフィジオメーターは、種々の刺激に対する細胞応答、例えばZtnfr12のアゴニスト、リガンド又はアンタゴニストを直接的に測定する。
【０２６１】
例えば、マイクロフィジオメーターは、Ztnfr12ポリペプチドを発現しない対照の真核宿主に比較して、Ztnfr12−発現真核細胞の応答を測定するために使用され得る。Ztnfr12−調節刺激に対して応答性の適切な細胞は、Ztnfr12発現バクターを含んで成る組換え宿主細胞、及び天然においてZtnfr12を発現する細胞を包含する。細胞外酸性化は、Ztnfr12−調節された細胞応答についての1つの測定を提供する。さらに、このアプローチは、Ztnfr12リガンド、そのアゴニスト及びアンタゴニストを同定するために使用され得る。例えば、分子は、Ztnfr12ポリペプチドを発現する細胞を供給し、前記細胞の第1部分を、試験化合物の不在下で培養し、前記細胞の第２部分を、試験化合物の存在下で培養し、そして前記第１部分と比較して、前記第2部分が細胞応答を示すかどうかを決定することによって、Ztnfr12リガンドのアゴニストとして同定され得る。
【０２６２】
他方では、固相システムが、Ztnfr12リガンド、ZTNF4のアゴニスト又はアンタゴニストを同定するために使用され得る。例えば、Ztnfr12ポリペプチド又はZtnfr12融合タンパク質が、市販のバイオセンサー装置の受容体チップの表面上に固定され得る（BLACORE, Biacore AB; uppsala, Sweden）。この装置の使用は、例えばkarlsson, Immunol. Methods 145:229 (1991)、及びCunningham and Wells, J. Mol. Biol. 234:554 (1993) により開示される。
【０２６３】
手短には、Ztnfr12ポリペプチド又は融合タンパク質は、流動細胞内の金フィルムに結合されるデキストラン繊維に、アミン又はスルフヒドリル化学を用いて、共有結合される。次ぎに、試験サンプルが、細胞を通して通される。リガンドがサンプルに存在する場合、それは固定されたポリペプチド又は融合タンパク質に結合し、培地の屈折率の変化を引き起こし、これが金フィルムの表面プラスモン共鳴の変化として検出される。このシステムは、結合親和性が計算され得るオン−及びオフ−速度の測定、及び結合の化学量論の評価を可能にする。このシステムはまた、抗体−抗原相互作用、及び他の補体/抗−補体対の相互作用を試験するためにも使用され得る。
【０２６４】
Ztnfr12結合ドメインはさらに、Ztnfr12リガンドアゴニストの推定上の接触部位アミノ酸の突然変異に関連して、核磁気共鳴、結晶学、電子回折又は光親和性ラベリングのような技法により決定されるように、耕造体の物理的分析により特徴づけられ得る。例えば、de Vosなど., Science 255:306 (1992), Smithなど., J. Mol. Biol. 224:899 (1992), 及びWlodaverなど., FEBS Lett. 309: 59 (1992) を参照のこと。
【０２６５】
本発明はまたZtnfr12ポリペプチドがポリマーにより連結される、化学的に修飾されたZtnfr12組成物を企画する。例示的なZtnfr12ポリペプチドは、機能的なトランスメンブランドメインを欠いている可溶性ポリペプチド、例えば配列番号２のアミノ酸残基１−69から成るポリペプチド、又は配列番号２のアミノ酸残基１−79から成るポリペプチドである。典型的には、前記ポリマーは、Ztnfr12結合体が水性環境、例えば生理学的環境において沈殿しないよう水溶性である。適切なポリマーの例は、単一の反応基、例えばアシル化のための活性エステル、又はアルキル化のためのアルデヒドを有する修飾されている１つのポリマーである。
【０２６６】
この場合、重合化の程度は調節され得る。反応性アルデヒドの例は、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、又はモノ−（C1−C10）アルコキシ、又はそれらのアリールオキシ誘導体である（例えば、Harrisなど., アメリカ特許第5,252,714号を参照のこと）。ポリマーは枝分かれ鎖であっても、又は枝分かれ鎖でなくても良い。さらに、ポリマーの混合物がZtnfr12接合体を生成するために使用され得る。
【０２６７】
治療のために使用され得るZtnfr12接合体は、医薬的に許容できる水溶性ポリマー成分を含むことができる。適切な水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（PEG）、モノメトキシ−PEG、モノ−（C1−C10）アルコキシ−PEG、アリールオキシ−PEG、ポリ−（N−ビニルピロリドン）PEG、トレシルモノメトキシPEG、PEGプロピオンアルデヒド、ビス−スクシンイミジルカーボネートPEG、プロピレングリコールホモポリマー、酸化ポリプロピレン/酸化エチレンコポリマー、ポリオキシエチル化されたポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、デキストラン、セルロース又は他の炭水化物基材のポリマーを包含する。適切なPEGは、約600〜約60,000、例えば5,000、12,000及び25,000の分子量を有することができる。Ztnfr12接合体はまた、そのような水溶性ポリマーの混合物も含むことができる。
【０２６８】
Ztnfr12接合体の１つの例は、Ztnfr12成分、及びZtnfr12成分のN−末端に結合される酸化ポリアルキル成分を含んで成る。PEGは、１つの適切な酸化ポリアルキルである。例示として、Ztnfr12は、PEG、すなわち“PEG化”として知られている方法により修飾され得る。Ztnfr12のPEG化は、当業界において知られているPEG化反応のいずれかにより行われ得る（例えば、ヨーロッパ特許第0154316号、Delgadoなど., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249 (1992), Duncan and Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27: 290 (1994) 及びFrancis など., Int, J. Hematol. 68: 1 (1998) を参照のこと）。
【０２６９】
例えば、PEG化は反応性ポリエチレングリコール分子によるアシル化反応又はアルキル化反応により行われ得る。他のアプローチにおいては、Ztnfr12接合体は、PEGの末端ヒドロキシ又はアミノ基が活性化されたリンカーにより置換されている活性化されたPEGを縮合することによって形成される（例えば、Karasiewiczなど., アメリカ特許第5,382,657号を参照のこと）。
【０２７０】
アシル化によるPEG化は典型的には、Ztnfr12ポリペプチドとPEGの活性エステル誘導体との反応を必要とする。活性化されたPEGエステルの例は、N−ヒドロキシスクシンイミドにエステル化されたPEGである。本明細書において使用される場合、用語“アシル化”とは、Ztnfr12と水溶性ポリマー間のタイプの結合を包含する：アミド、カルバメート、ウレタン及び同様のもの。アシル化によるPEG化されたZtnfr12の調製方法は、典型的には、（ａ）Ztnfr12ポリペプチドとPEG（例えば、PEGのアルデヒド誘導体の反応性エステル）とを、１又は複数のPEG基がZtnfr12に結合する条件下で反応せしめ、そして（ｂ）その反応生成物を得る段階を含んで成る。一般的に、アシル化反応のための最適な反応条件は、既知のパラメーター及び所望する結果に基づいて決定されるであろう。例えば、PEG：Ztnfr12の比が高いほど、ポリPEG化されたZtnfr12生成物の％が高くなる。
【０２７１】
アシル化によるPEG化の生成物は典型的には、リシンε−アミノ基がアシル結合を通してPEG化されるポリPEG化されたZtnfr12生成物である。典型的には、その得られるZtnfr12は、少なくとも95％、モノ−、ジ−又はトリ−ペルギレートされるが、但し高い程度のPEG化を有するいくつかの種は、その反応条件に依存して形成され得る。PEG化された種は、標準の精製方法、例えば透析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー及び同様のものを用いて、接合されていないZtnfr12ポリペプチドから分離され得る。
【０２７２】
アルキル化によるPEG化は一般的に、還元剤の存在下で、Ztnfr12と、PEGの末端アルデヒド誘導体との反応を包含する。PEG基は好ましくは、−CH2−NH基を通してポリペプチドに結合される。
【０２７３】
モノPEG化された生成物を生成するためへの還元性アルキル化を通しての誘導体化は、誘導体化のために利用できる異なったタイプの第１アミノ基の示差反応性を利用する。典型的には、前記反応は、リシン残基のε−アミノ基とタンパク質のN−末端残基のα−アミノ基との間のpKa差異の利用を可能にするpHで行われる。そのような選択的誘導体化により、反応性基、例えばアルデヒドを含む水溶性ポリマーのタンパク質への結合が調節される。ポリマーとの接合は、他の反応性基、例えばリシン側鎖アミノ基の有意な修飾を伴なわないで、タンパク質のN−末端で優先的に生じる。本発明は、Ztnfr12モノポリマー接合体の実質的な調製物を提供する。
【０２７４】
モノポリマーZtnfr12接合体分子の実質的に均質な集団を生成するための還元性アルキル化は、（ａ）Ztnfr12のアミノ末端でのα−アミノ基選択的修飾を可能にするために適切なpHでの還元性アルキル化条件下で反応性PEGとンZtnfr12ポリペプチドとを反応せしめ、そして（ｂ）反応生成物を得る段階を含んで成る。還元性アルキル化のために使用される還元剤は、水溶液において安定性であり、そして好ましくは、還元性アルキル化の初期工程において形成されるSchiff塩基のみを還元できるべきである。好ましくは還元剤は、硼水素化ナトリウム、シアノ硼水素化ナトリウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン及びビリジンボランを包含する。
【０２７５】
モノポリマーZtnfr12接合体の実質的に均質な集団に関しては、還元性アルキル化反応条件は、Ztnfr12のN−末端への水溶性ポリマーの成分の結合を可能にするそれらの条件である。そのような反応条件に、N−末端でのα−アミノ基とリシンアミノ基との間のpKa差異を提供する。pHはまた、使用されるポリマー：タンパク質の比にも影響を及ぼす。一般的に、pHが低い場合、タンパク質よりも過剰量のポリマーが、N−末端α−基が反応性であるほど、より多くのポリマーが最適な条件を達成するために、必要とされるので、所望される。pHが高い場合、ポリマー：Ztnfr12は、より多くの反応性基が利用できるので、高くある必要はない。典型的には、pHは、３〜９又は３〜６の範囲内であろう。
【０２７６】
考慮すべきもう1つの因子は、水溶性ポリマーの分子量である。一般的に、ポリマーの分子量が高いほど、より少数のポリマー分子がタンパク質に結合され得る。PEG化反応に関しては、典型的な分量は、約２kDa〜約100kDa、約5kDa〜約50kDa又は約12kDa〜約25kDaである。水溶性ポリマー：Ztnfr12のモル比は、一般的に、１：１〜100：１の範囲であろう。典型的には、水溶性ポリマー：Ztnfr12のモル比は、ポリPEG化に関して、１：１〜20：１であり、そしてモノPEG化に関しては、１：１〜５：１であろう。
【０２７７】
ポリペプチド及び水溶性ポリマー成分を含んで成る接合体を生成するための一般的な方法は当業界において知られている。例えば、Karasiewiczなど., アメリカ特許第5,382,657号、Greewaldなど., アメリカ特許第5,738,846号、Nieforthなど., Clin. Pharmacol. Ther. 59: 636 (1996), Monkarsh など., Anal. Biochem. 247: 434 (1997) を参照のこと。
【０２７８】
本発明は、本明細書に記載されるペプチド又はポリペプチドを含んで成る組成物を企画する。そのような組成物はさらに、キャリヤーを含むことができる。前記キャリヤーは、従来の有機又は無機キャリヤーであり得る。キャリヤーの例は、水、緩衝液、アルコール、ポリエチレングリコール、マクロゲル、ゴマ油、トウモロコシ油及び同様のものを包含する。
【０２７９】
さらに、組成物は、キャリヤー、Ztnfr12ポリペプチド、及びTACIポリペプチド又はBCMAポリペプチドの１つを含んで成ることができる。一定の組成物は、それらの受容体の可溶性形を含んで成る。そのような組成物の例は、キャリヤー、配列番号２のアミノ酸残基7−69（例えば、配列番号２のアミノ酸残基1−79, 1−69, 1−79, 1−71又は7−71から成るポリペプチドを含んで成るZtnfr12ポリペプチド、及び（１）配列番号７のアミノ酸残基1−51を含んで成るBCMAポリペプチド、（２）配列番号８のアミノ酸残基1−166を含んで成るTACIポリペプチド又は（３）配列番号７のアミノ酸残基1−51を含んで成るBCMAポリペプチド、及び配列番号８のアミノ酸残基1−166を含んで成るTACIポリペプチドを含んで成る組成物を包含する。
【０２８０】
７．Ztnfr12ポリペプチド及び融合タンパク質についてのアッセイ
Ztnfr12ポリペプチド及びZtnfr12−免疫グロブリン融合タンパク質の機能が、ZTNF4を融合する融合タンパク質の能力を評価するために種々のアプローチを用いて試験され得る。例えば、１つのアプローチは、125I−ラベルされたZTNF4の結合についてZtnfr12−被覆されたプレートと競争するZtnfr12ポリペプチド又はZtnfr12−免疫グロブリン融合タンパク質の能力を測定する。例示のように、50μgのZTNF4が、単一IODO−BEAD（Pierce；Rockford, IL）を用いて、4mCiの125Iによりラベルされ得る。その反応がウシ血清アルブミンの0.25％溶液により急冷され、そして遊離125IがPD−10カラム（Pierce）を用いてのゲル濾過により除去される。
【０２８１】
125I−ZTNF4調製物の比放射能が、脱塩段階の前及び後、トリクロロ酢酸沈殿により決定される。“Ztnfr12−N”として命名された、Ztnfr12受容体のN−末端フラグメントが、96−ウェルプレートに添加され（例えば、0.1μg/mlで100μl）、そして4℃で一晩インキュベートされる。プレートが洗浄され、SUPERBLOCK（Pierce）によりブロックされ、そして再び洗浄される。０〜約12ng/mlの範囲の種々の濃度でのZtnfr12ポリペプチド又はZtnfr12−Fc構成体が、固定された濃度の125I−ZTNF4と共に混合され、そしてZtnfr12−Nにより被覆されたプレート上で37℃で約２時間インキュベートされる。対照は、溶液でのZtnfr12を含むか、又はZtnf12ポリペプチド又はZtnfr12−Fc構成体を欠いている。インキュベーションの後、プレートは洗浄され、そして計数される。
【０２８２】
もう１つのアプローチにおいては、上昇する濃度の125IラベルされたZTNF4が、Ztnfr12ポリペプチド又はZtnfr12−Fc構成体と共にインキュベートされ、そして沈殿されたZTNF4−Ztnfr12ポリペプチド複合体又はZTNF4−Ztnfr12−Fc複合体に関連する放射能が測定される。例示のように、約0.05nMのZtnfr12ポリペプチド又はZtnfr12−Fc構成体が、約0.4pM〜約1.5nMの125I−ZTNF4と共に、管当たり0.25mlの合計体積で、30分間、室温でインキュベートされ得る。
【０２８３】
Pansorbin (Staph A) 懸濁液が個々の管に添加され、そして15分後、サンプルが遠心分離され、２度洗浄され、そしてペレットが計数される。非特異的結合が、125I−ZTNF4/Ztnfr12ポリペプチドミックス、又は125I−ZTNF4/Ztnfr12−Fcミックスへの130nMのラベルされていないZTNF4の添加により決定される。特異的結合が、個々の濃度の125I−ZTNF4で結合される合計cpmからラベルされていないZTNF4の存在下で結合されたcpmを控除することによって計算される。
【０２８４】
他方では、Ztnfr12ポリペプチド及びZtnfr12−免疫グロブリン融合タンパク質が、Grossなど., 国際公開番号WO 00/40716号により記載のようにして、可溶性ZTNF4によるヒトB細胞の刺激を阻害する能力により特徴づけられ得る。手短には、ヒトB細胞が、CD19磁気ビーズ及びVarioMacs磁気分離システム（Miltenyi Biotec; Auburn, CA）を用いて、製造業者の説明書に従って、末梢血液単核細胞から単離される。精製されたB細胞は、可溶性ZTNF4（25ng/ml）及び組換えヒトIL−４（10ng/ml, Pharmingen）と共に混合され、そして細胞がウェル当たり１×105個の細胞で丸底96ウェルプレート上にプレートされる。
【０２８５】
Ztnfr12ポリペプチド又はZtnfr12−免疫グロブリンタンパク質が約５μg/ml〜約６ng/mlに希釈され、そしてウェル当たり１μCiの3H−チミジンにより４日目、一晩パルスしながら、B細胞と共に５日間インキュベートされる。対照として、Ztnfr12ポリペプチド又はZtnfr12−免疫グロブリンタンパク質がまた、ATNF4を伴なわないで、B細胞及びIL−４と共にインキュベートされ得る。プレートが、Packardプレート収穫機を用いて収穫され、そしてPackardリーダーを用いて計算される。
【０２８６】
十分に確立された動物モデルが、一定の疾病状態におけるZtnfr12ポリペプチド又はZtnfr12−免疫グロブリンタンパク質のインビボ効能を試験するために入手できる。例えば、Ztnfr12ポリペプチド又はZtnfr12−免疫グロブリンタンパク質は、多くの自己免疫疾患の動物モデル、例えばSLE（全身性エリテマトーデス）のモデルとして作用するMRL−lpr/lpr又はNZB×NZW F1コンジェニックマウス株において試験され得る。そのような動物は、当業界において知られている（例えば、Cohen and Miller (Eds.), Autoimmune Disease Models: A Guidebook (Academic Press, Inc., 1994を参照のこと)。
【０２８７】
New Zealand Black (NZB) マウスとNew Zealand White (NZW) マウスとの間の交雑の子孫が、ヒトにおけるSLEに密接に類似するSLEの自発形を成長せしめる。NZBWとして知られているそれらの子孫マウスは、生後１ヶ月でT−細胞に対してIgM自己抗体を成長し始め、そして生後５〜７ヶ月までに、抗−DNA自己抗体は優性免疫グロブリンである。ポリクローナルB−細胞過活性は、自己抗体の過生成を導く。それらの自己抗体、特に一本鎖のDNAに対して向けられたそれらの抗体の沈着は、タンパク尿、窒素血症及び腎不全からの死亡として臨床学的に明白である糸球体腎炎の進行に関連している。
【０２８８】
腎不全は、自発性SLEにより影響されるマウスにおいて死の腫瘍原因であり、そしてNZBW株においては、この工程は慢性及び閉塞性である。前記疾病は雄よりも雌においてより急速且つ重症であり、そして平均生存日は雄の406日に比較して、雌はわずか245日である。雌マウスの多くは、生後７〜９ヶ月まで症候性（タンパク尿性）であるが、それらの何匹かは、それらが徴候を進行する場合、より若いか又は年をとっている。NZBWマウスに見られる致命的な腎炎は、ヒトSLEにおいて見られる糸球体腎炎に非常に類似し、この自発的ネズミモデルを、可能性あるSLE治療の試験のために非常に魅力的にする（Putterman and Naparstek, “Murine Models of Spontaneous Systemic Lupus Erythematosus”, in Autoimmune Disease Models: A Guidebook, Pages 217-234 (Academic Press, Inc., 1994); Mohan など., J. Immunol. 154: 1470 (1995); 及びDaikhなど., J. Immunol. 159: 3104 (1997)）。
【０２８９】
Grossなど., 国際公開番号WO 00/40716号により記載されるように、ZTNF4を結合するTACI−免疫グロブリンタンパク質が、平均して、B−細胞自己抗体生成がNZBWマウスにおいて高いレベルで存在すると思われる場合、５週間にわたってB細胞に対するその抑制効果をモニターするためにNZBWマウスに投与され得る。この方法は、Ztnfr12−免疫グロブリン融合タンパク質のZtnfr12ポリペプチドの効能を決定するために適用され得る。手短には、100匹の生後８週目の雌（NEB×NZW）F1マウスが、15匹のマウスの６種のグループに分けられ得る。
【０２９０】
処理の前、マウスはタンパク尿について１ヶ月に１度モニターされ、そして血液がCBC及び血清バンクのために採血される。タンパク尿は糸球体腎炎の典型的な徴候であるので、尿タンパクレベルが、研究の期間にわたって、規則的な間隔で計量棒によりモニターされる。処理は、マウスが生後、約５ヶ月である場合に開始される。マウスは、ビークルのみ（リン酸緩衝液）又はヒト免疫グロブリン（対照タンパク質）、又はZtnfr12−免疫グロブリンタンパク質（例えば、用量当たり20〜100μgの試験タンパク質）を、５週間、３度受ける。類似する研究がZtnfr12にポリペプチドにより行われ得る。
【０２９１】
血液は、処理の間、２度、採血され、そして処理の後、少なくとも２度、採血されるであろう。タンパク尿においての尿計量棒値及び体重が、処理の開始の後、２週ごとに測定される。血液、尿計量棒値及び体重が、安楽死の時点で取られる。脾臓及び胸腺が、蛍光活性化された細胞分類分析及び組織学のために分けられる。下顎下唾液腺、腸間膜リンパ節鎖、肝臓葉及び胆嚢、盲腸及び大腸、胃、小腸、膵臓、右腎臓、副腎、舌（及び気管及び食道）、心臓及び肺がまた、組織研究のために収集される。
【０２９２】
実験用アレルギー性脳脊髄炎についてのネズミモデルが、免疫介在性疾病の機構、及び可能性ある治療介入方法の両者を調べるための手段として使用されて来た。このモデルはヒト多発性硬化症に類似し、そして神経タンパク質、例えばミエリン基本タンパク質又はタンパク脂質タンパク質へのT−細胞活性化の結果として脱髄を生成する。抗原による接種は、CD4+、クラスII MHC−制限されたT−細胞（Th1）の誘発を導く。実験用アレルギー性脳脊髄炎についてのプロトコールの変化は、モデルの急性、慢性−再発性又は受動性−トランスファー変異体を生成することができる（Weinbergなど., J. Immunol. 162: 1818 (1999);Mijabaなど., Cell. Immunol. 186:94 (1999); 及びGlabinski, Meth. Enzym. 288: 182 (1997)）。
【０２９３】
Grossなど., 国際公開番号WO 00/40716号は、実験のアレルギー性脳脊髄炎に関連する徴候の改善におけるTACI−免疫グロブリンタンパク質の効能の評価への１つのアプローチを記載する。手短には、25匹の雌PLxSJL F1マウス（生後12週）は、完全フロイントアジュバントに配合された抗原（エミリンタンパク質、PLP, 残基139−151）を125μg/マウスで皮下注射される。マウスは、５匹のマウスの５種のグループに分けられる。百日咳毒素（400ng）の腹腔内注射が、０及び２日目に与えられる。グループは、１倍、10倍又は100倍用量のTACI−免疫グロブリンタンパク質を与えられ、１つのグループはビークルのみを受け、そして１つのグループは処理を受けないであろう。予防療法は、０日目に開始し、介入療法は７日目に、又は臨床学的徴候の開始で始まる。
【０２９４】
疾病の徴候、体重の低下及び麻痺が約10〜14日で明白であり、そして約１週間、続く。動物は、体重を計量し、そしてそれらの徴候の程度に対応する臨床学的評点を割り当てることによって毎日、評価される。実験のアレルギー性脳脊髄炎の臨床学的徴候は、接種の10〜14日以内に現れ、そして約１週間、続く。研究の最後で、すべての動物は、ガスの過剰投与により安楽死され、そして検死される。脳及び脊椎が組織研究のために収集され、又はmRNA分析のために凍結される。体重及び臨床学的評点のデータが個人及びグループによりプロットされる。このアプローチは、Ztnfr12ポリペプチド又はZtnfr12−免疫グロブリン融合タンパク質を試験するために使用され得る。
【０２９５】
コラーゲン−誘発された関節炎モデルにおいては、マウスは、ヒトリウマチ様関節炎に密接に類似する慢性炎症性関節炎を進行する。コラーゲン−誘発された関節炎はリウマチ様関節炎と、免疫学的及び病理学的特徴を共有するので、これは、可溶性あるヒト抗炎症性化合物をスクリーニングするための理想的モデルにする。コラーゲン−誘発された関節炎モデルを用いることのもう１つの利点は、病因の機構が知られていることである。
【０２９６】
II型コラーゲン上のT及びB細胞エピトープは同定されており、そして免疫−介在性関節炎に関連する、種々の免疫学的（遅延された型の過毎性及び抗−コラーゲン抗体）及び炎症性（サイトカイン、ケモカイン及びマトリックス−分解性酵素）パラメーターは決定されており、そしてモデルにおける試験化合物効能を評価するために使用され得る（Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407（1999）；Williamsなど., Immunol. 89: 9784 (1992); Myersなど., Life Sci. 61: 1861 (1997); 及びWangなど., Immunol. 92: 8955 (1995)）。
【０２９７】
Grossなど., 国際公開番号WO 00/40716号は、コラーゲン−誘発された関節炎に関連する徴候の改善におけるTACI−免疫グロブリンタンパク質の効能を評価するための方法を記載する。手短には、生後８週の雄のDBA/１Jマウス（Jackson Labs）が、５匹のマウス/グループのグループに分けられ、そして３週間融で、1mg/mlのコラーゲン（ニワトリ又はウシ起源）50〜100μlの２回の皮下注射を与えられる。１つの対照は、コラーゲン注射を受けない。第１回目の注射は、完全フロイントアジュバントにおいて配合され、そして第２回目の注射は、不完全フロイトアジュバントにおいて配合される。
【０２９８】
TACI−免疫グロブリンタンパク質が、２回目の注射の時点で又はその前、又は動物が少なくとも24時間、持続する、２又はそれ以上の臨床学的評点を進行した後、予防的に投与される。動物は、通常２〜３週以内に、第２回目のコラーゲン注射に続いて、関節炎の症状を示し始める。例えば、TACI−Fc、対照タンパク質、ヒトIgFc又はリン酸緩衝溶液（ビークル）が、第２回目の注射の７日前（−７日目）、予防的に投与され得る。タンパク質は、100μlの腹腔内注射として週３度、与えられ、そして４週間、続けられる。
【０２９９】
疾病の程度が、足の厚さを測定するためにカリパスを用い、そして個々の足に臨床学的評点を割り当てることにより個々の足において評価される。例えば、“０”の臨床学的評点は正常なマウスを示し、“１”の評点は、１又は複数の足指が赤くはれ上がることを示し、“３”の評点は、中位の足の炎症を示し、そして“４”の評点は重度の足の炎症を示す。動物は、疾病が設定期間、通常７日間、確立された後、安楽死される。足が組織研究又はmRNA分析のために集められ、そして血清が免疫グロブリン及びサイトカインアッセイのために収集される。コラーゲン−誘発された関節炎モデルは、Ztnfr12ポリペプチド又はZtnfr12免疫グロブリン融合タンパク質を試験するために使用され得る。
【０３００】
重症筋無力症は、ネズミモデルが利用できるもう１つの自己免疫疾患である。重症筋無力症は、ニコチン様アセチルコリン受容体に対して向けられた自己抗体の生成を包含する、神経筋肉伝達の障害である。この疾病は、運動に対する異常な虚弱及び疲労を包含する臨床学的特徴を獲得するか、又は受け継がれる。
【０３０１】
重症筋無力症のネズミモデルは確立されている（Christadossなど., “Establishment of a Mouse Model of Myaschenia gravis Which Mimics Human Myashenia gravid Phathogenesis for Immune Intervention”, in Immunology of Proteins and Peptide VIII, Atassi and Bixler (Eds.), Pages 195-199 (1995)）。実験の自己免疫重症筋無力症は、アセチルコリン受容体に対する抗体の存在により特徴づけられる抗体介在性疾病である。それらの抗体は、筋肉の虚弱さをもたらす、欠陥性神経筋肉電気的衝撃を導く受容体を破壊する。
【０３０２】
実験の自己免疫重症筋無力症モデルにおいては、マウスがニコチン様アセチルコリン受容体により免疫化される。重傷筋肉無力症の臨床学的徴候は、二次免疫化の後、数週で明らかになる。実験の自己免疫重症筋無力症は、ラジオイムノアッセイによるアセチルコリン受容体抗体の血清レベルの測定（Christadoss and Dauphinee, J. Immunol. 136: 2437 (1986); Liadstromなど., Methods Enzymol. 74: 432 (1981)）、筋肉アセチルコリン受容体の測定を包含するいくつかの方法、又は筋電図検査（Coligan など. (Ed.), protocols in Immunolog. Vol. 3, page15.8.1 (John Wiley & Sons, 1997)）により評価される。
【０３０３】
実験の自己免疫重症筋無力症に対するZtnfr12ポリペプチド又はZtnfr12−免疫グロブリン融合タンパク質の効果は、B６マウスにおける臨床学的重症筋無力症の進行の間、融合タンパク質を投与することによって決定され得る。例えば、100匹のB6マウスが、０及び30日目、完全フロイントアジュバント中、20μgのアセチルコリン受容体により免疫化される。約40〜60％マウスが、アセチルコリン受容体による追加免疫化の後、中位（等級２）〜重度（等級３）の臨床学的重症筋無力症を進行するであろう。
【０３０４】
等級２及び３の臨床学的疾病を有するマウスが、３種のグループ（等しい等級の虚弱性を有する）に分けられ、そして計量され（虚弱性を有するマウスはまた、それらが食物及び水の消費において困難性を有するので、体重が低下する）、そして血清（前処理抗−アセチルコリン受容体抗体及びイソタイプレベルについて）のために放血される。グループAは、リン酸緩衝溶液によりI.P.注射され、グループBは対照タンパク質（100μg）としてヒトIgG−Feにより腹腔内に注射され、そしてグループCは100μgのZtnfr12ポリペプチド又はZtnr12−免疫グロブリン融合タンパク質により４週間、週３度、注射される。
【０３０５】
マウスは、週２度、臨床学的筋肉虚弱性についてスクリーンされ、そして計量され、そして処理の開始の15及び30日後、血清のために放血される。完全な血液が、マーカーB220及びCD5を用いて、蛍光活性化された細胞分類分析によりT/B細胞比を決定するために、15日目に採血される。生存するマウスは、処理の開始の30〜45日後に殺害され、そしてそれらの死体は、筋肉アセチルコロン受容体の損失、すなわち重症筋無力症における腫瘍病理学を決定するために、筋肉アセチルコロン受容体の後での抽出のために凍結される（例えば、Coliganなど: (Eds.), Protocols in Immunology. Vol.3, page 15. 8. 1 (John Wiley & Sons, 1997) を参照のこと）。
【０３０６】
マウス筋肉アセチルコリン受容体に対する血清抗体が、確立されたラジオイムノアッセイにより決定され、そして抗−アセチルコリン受容体抗体イソタイプ（IgM, IgG1, IgG2b及びIgG2c）がELISAにより測定される。そのような方法は知られている。進行性臨床学的重症筋無力症、抗−アセチルコリン受容体抗体及びイソタイプレベル、及び筋肉アセチルコロン受容体損傷に対するZtnfr12ポリペプチド又はZtnfr12−免疫グロブリン融合タンパク質の効果が決定される。
【０３０７】
約100匹マウスが、０日及び30日目、完全フロイントアジュバント中、20μgのアセチルコリン受容体により免疫化され得る。臨床学的重症筋無力症を有するマウスは４種のグループに分けられる。グループは、100μgの対照Fcにより腹腔内注射され、グループBは20μgの対照Fcにより注射され、グループCは100μgのZtnfr12ポリペプチド又はZtnfr12又はZtnfr12−免疫グロブリン融合タンパク質により注射され、そしてグループDは20μgのZtnfr12ポリペプチド又はZtnfr12−免疫ブリン融合タンパク質により４週間、週３度、注射される。マウスが計量され、そして処理の開始の前、及び15及び30日で、血清のために放血される。血清は、上記のようにして、抗−アセチルコリン受容体及びイソタイプについて試験される。筋肉アセチルコリン受容体損失がまた、測定される。
【０３０８】
それらのインビトロ及びインビボアッセイがまた、Ztnfr12抗体成分、抗体融合タンパク質、免疫接合体及び同様のものを評価するために使用され得る。Ztnfr12ポリペプチド、Ztnfr12−免疫グロブリン融合タンパク質又はZtnfr12抗体成分の他の適切なアッセイは、当業者により決定され得る。
【０３０９】
８．Ztnfr12ポリペプチドの単離
本発明のポリペプチドは、汚染性高分子、特に他のタンパク質及び核酸に対して、少なくとも約80％の純度、少なくとも約90％の純度、少なくとも約95％の純度、又は95％以上の純度に精製することが好ましく、そして感染性及び発熱性剤を有さない。本発明のポリペプチドはまた、99.9％以上の純度である医薬的に純粋な状態に精製され得る。特定の製剤においては、精製されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に有さない。
【０３１０】
分別及び/又は従来の精製方法は、天然源（例えば、リンパ節組織）から精製されたZtnfr12、合成Ztnfr12ポリペプチド、及び組換え宿主細胞から精製された組換えZtnfr12ポリペプチド及び融合Ztnfr12ポリペプチドの調製物を得るために使用され得る。一般的に、硫酸アンモニウム沈殿及び酸又はカオトロピック剤抽出は、サンプルの分別のために使用される。典型的な精製段階は、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、FPLC及び逆相高性能液体クロマトグラフィーを包含する。適切なクロマトグラフィー用媒体は、誘導体化されたデキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特別なシリカ及び同様のものを包含する。PEI、DEAE、QAE及びQ誘導体が好ましい。
【０３１１】
典型的なクロマトグラフィー用媒体は、フェニル、ブチル又はオクチル基により誘導体化されたもの、例えばフェニル−Sepharose FF(pharmacia),Toyopearl ブチル650（Toso Haas, Montgomeryville, PA）、オクチル−Sepharrose (Pharmacia)及び同様のもの；又はポリアクリル樹脂、例えばAmberchrom CG71 (Toso Haas)及び同様のものを包含する。適切な固体支持体は、ガラスビーズ、シリカ基材の樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋されたアガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋されたポリアクリルアミド樹脂及びそれらが使用される条件下で不溶性である同様のものを包含する。それらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基及び／又は炭水化物成分によるタンパク質の結合を可能にする反応性基より変性され得る。
【０３１２】
カップリング化学物質の例は、臭化シアン活性化、N−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化及びカルボジイミド  カップリング化学物質のためのカルボキシル及びアミノ誘導体を包含する。それらの及び他の固体媒体は当業界において良く知られており、そして広く使用されており、そして商業的供給者から入手できる。ポリペプチド単離及び精製の特定方法の選択は、通常のことであり、そして選択された支持体の性質により一部決定される。例えば、Affinity Chromatograpy: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988、及びDoonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press 1996)を参照のこと。
【０３１３】
Ztnfr12単離及び精製における追加の変動は、当業者により調節され得る。例えば、下記のようにして得られる抗−Ztnfr12抗体は、免疫親和性精製により多量のタンパク質を単離するために使用され得る。
【０３１４】
本発明のポリペプチドは、アニオン及びカチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除、及び親和性クロマトグラフィーを包含する方法の組み合わせより単離され得る。例えば、固定された金属イオン吸着（IMAC）クロマトグラフィーが、ヒスチジンに富んでいるタンパク質、及びポリヒスチジン標識を含んでなるそれらのタンパク質を精製するために使用され得る。手短に言及すれば、ゲルがまず、二価金属イオンにより荷電され、キレートが形成される( Sulkowski, Trends in Biochem. 3: 1−7, 1985)。
【０３１５】
ヒスチジンに富んでいるタンパク質が、使用される金属イオンに依存して、異なった親和性を有するこのマトリックスに吸着され、そして競争溶出、ｐHの低下、又は強いキレート化剤の使用により溶出されるであろう。他の精製方法は、レクチン親和性クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化されたタンパク質の精製を包含する（M. Deutscher, (ed.), Methods Enzymol. 182, 529(1990)）。本発明のさらなる態様においては、興味あるポリペプチド、及び親和性標識（例えばマルトース−結合タンパク質、FLAG標識、Glu-Gku標識、免疫グロブリンドメイン）の融合体が、精製を促進するために構成され得る。
【０３１６】
Ztnfr12ポリペプチド又はそのフラグメントはまた、下記のようにして、化学合成を通して調製され得る。Ztnfr12ポリペプチドは、モノマー又はマルチマーであり得；グリコシル化されても、又はグリコシル化されなくても良く；PEG化されても、又はPEG化されなくても良く；そして初期メチオニンアミノ酸残基を含むことができるか、又は含まなくても良い。
【０３１７】
9．Ztnfr12タンパク質に対する抗体の生成
Ztnfr12に対する抗体は、例えば抗原として、Ztnfr12発現ベクターの生成物又は天然源から単離されたZtnfr12を用いて得られる。特に有用な抗−Ztnfr12抗体は、Ztnfr12を、“特異的に結合する”。抗体は、その抗体が次の２つの性質の少なくとも１つを示す場合、特異的に結合すると思われる：（１）抗体が限界レベルの結合活性を伴って、Ztnfr12に結合し、そして（２）抗体がZtnfr12に関連するポリペプチドと有意に交差反応しない場合。
【０３１８】
第１の特徴に関しては、抗体は、それらが、106M-1又はそれ以上、好ましくは107M-1又はそれ以上、より好ましくは108M-1又はそれ以上、及び最も好ましくは109M-1又はそれ以上の結合親和性（Ka）を伴なって、Ztnfr12ポリペプチド、ペプチド又はエピトープに結合する場合、特異的に結合する。抗体の結合親和性は、Scatchard 分析（Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660 (1949)）により、当業者により容易に決定され得る。第２の特徴に関しては、抗体は、それらが、標準のウェスターンブロット分析を用いて、Ztnfr12を検出するが、しかし現在知られているポリペプチドを検出しない場合、関連するポリペプチドと有意に交差反応しない。既知の関連するポリペプチドの例は、既知の腫瘍壊死因子受容体を包含する。例えば、一定の抗−Ztnfr12抗体は、Ztnfr12と結合するが、しかしTACI又はBCMAとは結合しない。
【０３１９】
抗−Ztnfr12抗体は、抗原性Ztnfr12エピトープ−担持ペプチドを用いて生成され得る。本発明の抗原性エピトープ−担持ペプチド及びポリペプチドは、配列番号２内に含まれる、少なくとも９個、又は15〜約30個のアミノ酸の配列、又は本明細書に開示されるもう１つのアミノ酸配列を含む。しかしながら、30〜50個のアミノ酸、又は本発明のポリペプチドの全アミノ酸配列までのいずれかの長さのアミノ酸を含む、本発明のアミノ酸配列の大きな部分を含んで成るペプチド又はポリペプチドはまた、Ztnfr12と結合する抗体を誘発するためにも有用である。所望には、エピトープ担持ペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒において実質的な溶解性を提供するよう選択される（すなわち、前記配列は、比較的親水性の残基を包含し、そして疎水性残基は好ましくは、回避される）。さらに、プロリン残基を含むアミノ酸配列がまた、抗体生成のために所望される。
【０３２０】
例示のように、Ztnfr12における可能性ある抗原性部位が、LASERGENE（DNASTAR；Madison, WI）のPROTEANプログラム（バージョン3.14）により実効されるように、Jameson-Wolf method, Jameson and Wolf, CABIOS 4: 181, (1988) を用いて、同定された。デフォールトパラメーター（default parameter）が、この分析に使用された。
【０３２１】
Jameson−Wolf方法は、タンパク質構造予測のために６種の主要サブルーチンを組合すことによって、可能性ある抗原決定基を予測する。手短には、Hopp−Woods方法、Hoppなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 3924 (1981) が最初に、最大の局部親水性の領域を表すアミノ酸配列を同定するために使用された（パラメーター：平均７個の残基）。第２段階においては、Emini方法、Eminなど., J. Virolgy 55: 836 (1985) が、表面確立を計算するために使用された（パラメーター：表面決定限界値（0.6）＝１）。第３に、Karplus−Schultz方法、Karplus and Schultz, Naturwissenschaften 72: 212 (1985) が、主鎖柔軟性を予測するために使用された（パラメーター：柔軟性限界値（0.2）＝１）。
【０３２２】
分析の第４及び第５段階においては、二次構造の予測が、Chou-Fasmanの方法、Chou, “Prediction of Protein Structural Classes from Amino Acid Composition”, in Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, Fasman (ed.), p.549-586 (1978) を用いて、データに適用された（Chou-Fasman パラメーター：コンホメーション表＝64タンパク質；β領域限界値＝105；Grrnier-Robsonパラメーター：α及びβ決定パラメーター＝０）。
【０３２３】
第６のサブルーチンにおいては、柔軟性パラメーター及び水治療/溶媒接近性因子が、“抗原指数”として呼ばれる表面輪郭値を決定するために組合された。最終的に、ピーク拡大機能が、抗原指数に適用され、内部領域に対する表面領域の移動度に由来する追加の自由エネルギーを計算するために、それぞれのピーク値の20, 40, 60又は80％を付加することによって主用表面ピークを拡大する。しかしながら、この計算は、ヘリカル領域がほとんど柔軟性になる傾向がないので、ヘリカル領域に存在するいずれかの主用ピークにも適用されなかった。
【０３２４】
この分析の結果は、配列番号２の次のアミノ酸配列が適切な抗原性分子を提供することを示した：アミノ酸１−17、アミノ酸、アミノ酸102−129、アミノ酸135−142、アミノ酸146−159及び、アミノ酸174−182。本発明は、Ztnfr12に対する抗体を生成するためにそれらのアミノ酸配列のいずれか１つの使用を企画する。本発明はまた、それらの抗原性分子の少なくとも１つを含んで成るポリペプチドを企画する。
【０３２５】
同様に、Jameson-Wolf分析の結果は、配列番号13の次のアミノ酸配列が適切な抗原性分析を提供することを示した：アミノ酸10−26、アミノ酸45−69、アミノ酸106−113及びアミノ酸139−151。本発明は、ネズミZtnfr12に対する抗体を生成するためへのそれらの抗原性アミノ酸配列のいずれか１つの配列の使用を企画する。本発明はまた、それらの抗原性分子の少なくとも１つを含んで成るポリペプチドにも関する。
【０３２６】
有用な抗体はまた、ヒト遺伝子の少なくとも１つのZtnfr12エキソンを含んで成る抗原性分子を用いて生成され得る。例えば、そのような抗原性分子は、配列番号２の次のアミノ酸配列から成るポリペプチドを含んで成ることができる：アミノ酸残基１−45、アミノ酸残基47−122、及びアミノ酸残基124−184。
【０３２７】
ZTNF4によるシグナルトランスダクションを阻止する抗体は、治療用途において有用であり得る。抗−Ztnfr12抗体の阻止は、例えば、腫瘍細胞系上のZtnfr12へのビオチン−ZTNF4結合のそれらの阻害により同定され得る。Ztnfr12細胞内ドメインと結合する抗体はまた、ZTNF4−誘発されたシグナルトランスダクションを阻止するためにも使用され得る。そのような抗体は、配列番号２のアミノ酸残基101−184内のZtnfr12の細胞内ドメインを結合することができる。さらに、可能性あるTRAF結合ドメインが、配列番号２のアミノ酸残基159−178で存在する。従って、一定のシグナル−阻止抗体は、この領域内のZtnfr12の細胞内ドメインを結合することができる。本発明は、配列番号２のアミノ酸残基159−178内のZtnfr12を結合する抗体を包含する。標準の方法は、細胞の細胞内企画への抗体の導入のために利用できる。例えば、そのような抗体は、リポソームに封入され得る。
【０３２８】
シグナル−誘発性抗−Ztnfr12抗体はまた有用である。Ztnfr12受容体に結合することによってシグナルを誘発する抗体はまた、転写レポーター要素及びZtnfr12を含む適切なレポーター細胞系を用いて同定され得る。例示のように、Ztnfr12を発現する、構築された哺乳類細胞系（例えば、Jurkat）、及び転写レポーター遺伝子は、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）の転写を刺激するそれらの能力について、抗−Ztnf12モノクローナル抗体を試験するために使用され得る。
【０３２９】
組換えZtnfr12タンパク質、又は天然源から単離されたZtnfr12に対するポリクローナル抗体は、当業者に良く知られている方法を用いて調製され得る。例えば、Green など., “Production of polyclonal Antisera,” in Immunochemical Protecols (Manson, ed.), pages 1-5 (Humana Press 1992), 及びWilliams など., “Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies,” in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover など., (eds.), page 15 (Oxford University press 1995を参照のこと。Ztnfr12ポリペプチドの免疫原性は、アジュバント、例えばみょうばん（水酸化アルミニウム）又はフロイント完全又は不完全アジュバントの使用を通して高められ得る。
【０３３０】
免疫化のために有用なポリペプチドはまた、融合ポリペプチド、例えばZtnfr12又はその一部と、免疫グロブリンポリペプチド又はマルトース結合タンパク質との融合体を包含する。ポリペプチド免疫原は、十分な長さの分子又はその一部であり得る。ポリペプチド部分が“ハプテン−様”である場合、そのような部分は好都合には、免疫化のために高分子キャリヤー（例えば、カサガイヘモシアニン（KLH）、ウシ血清アルブミン（BSA）又は破傷風トキソイド）に結合されるか又は連結され得る。
【０３３１】
ポリクローナル抗体は典型的には、動物、例えば馬、牛、犬、鶏、ラット、マウス、ウサギ、テンジュクネズミ、ヤギ又は羊において生ぜしめられるが、本発明の抗−Ztnfr12抗体はまた、ヒトに近い霊長類抗体から誘導され得る。ヒヒにおいて診断的に及び治療的に有用な抗体を生ぜしめるための一般的な技法は、例えばGoldenbergなど., 国際特許出願番号WO91/11465号及びLosmanなど., Int. J. Cancer 46: 310, 1990に見出され得る。
【０３３２】
他方では、モノクローナル抗−Ztnfr12抗体が生成され得る。特定抗原に対する囓歯動物モノクローナル抗体は、当業者に知られている方法により得られる（例えば、Kohler など., Nature 256: 495 (1975), Coliga など., (eds.), Current Protocols in Immunology, Vol. 1, page 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991), Picksley など., “Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli,” in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover など. (eds.), page 93 (Oxford University Press 1995を参照のこと)。
【０３３３】
手短には、モノクローナル抗体は、Ztnfr12遺伝子生成物を含んで成る組成物をマウスに注射し、血清サンプルを除去することにより抗体生成の存在を確かめ、B−リンパ球を得るために脾臓を除去し、ハイブリドーマを生成するために前記リンパ球を骨髄腫細胞により融合し、ハイブリドーマをクローニングし、抗原に対する抗体を生成する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を生成するクローンを培養し、そしてハイブリドーマ培養物から抗体を単離することに得られる。
【０３３４】
さらに、本発明の抗−Ztnfr12抗体は、ヒトモノクローナル抗体から誘導され得る。ヒトモノクローナル抗体は、抗原攻撃に応答して特定のヒト抗体を生成するよう構築されたトランスジェニックマウスから得られる。この技法においては、ヒトH鎖及びL鎖遺伝子座の要素が、内因性H鎖及びL鎖遺伝子座の標的化された破壊を含む胚幹細胞系に由来するマウス株中に導入される。トランスジェニックマウスは、ヒト抗原に対して特異的なヒト抗体を合成することができ、そして前記マウスはヒト抗体−分泌性ハイブリドーマを生成するために使用され得る。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、Greenなど., Nat. Genet. 7: 13, 1994, Lonberg など., Nature 368: 856, 1994, 及びTaylorなど., Inc. Immun. 6: 576, 1994により記載される。
【０３３５】
モノクローナル抗体は、種々の十分に確立された技法により、ハイブリドーマ培養物から単離され、そして精製され得る。そのような単離技法は、プロテイン−Aセファロースによる親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーを包含する（例えば、Coligan, page 2.7.1-2.7.12及びpage 2.9.1^2.9.3; Bainesなど.,” Purification of Imunoglobulin G (IgG)”, Methods in Molecular Biology, vol, 10, p. 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992) を参照のこと）。
【０３３６】
特定の用途に関しては、抗−Ztnfr12抗体のフラグメントを調製することが所望される。そのような抗体フラグメントは、例えば抗体のタンパク質加水分解により得られる。抗体フラグメントは、従来の方法による完全な抗体のペプシン又はパパイン消化により得られる。例示のように、抗体フラグメントは、F(ab’)2として示される５Sフラグメントを供給するためにペプシンによる抗体の酵素分解により生成され得る。このフラグメントはさらに、3.5S Fab’ 単価フラグメントを生成するためにチオール還元剤を用いて分解され得る。
【０３３７】
任意には、その分解反応は、ジスルフィド結合の分解に起因するスルフヒドリル基に関するブロッキング基を用いて行われ得る。他の手段としては、ペプシンを用いての酸素分解が２種の単位Fabフラグメント及びFcフラグメントを直接的に生成する。それらの方法は、例えば、Goldenberg, アメリカ特許第4,331,647号、Nisonoff など., Arcg Biochem. Biophys. 89: 230, 1960, Porter, Biochem. J. 73: 119, 1959, Edelman など., in Methods in Enzymology vol. 1, p. 422 (Academic Press 1967), 及びColigan, p. 2.8.1-2.8.10及び2.10-2.10.4により記載される。
【０３３８】
抗体を分解する他の方法、例えば単価L−H鎖フラグメントを形成するためへのH鎖の分解、フラグメントの追加の分解、又は他の酵素的、化学的又は遺伝的技法がまた、そのフラグメントが損なわれていない抗体により認識される抗原に結合する限り、使用され得る。
例えば、Fvフラグメントは、VH及びVL鎖の会合を含んで成る。この会合は、Inbar など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2659, 1972により記載のように、非共有的であり得る。他方では、可変鎖は、分子間ジスルフィド結合により連結され、又は化学物質、例えばグルテルアルデヒドにより交差結合され得る（例えば、Sandhu, Crit. Rew. Biotech. 12: 437, 1992を参照のこと）。
【０３３９】
Fvフラグメントは、ペプチドリンカーにより連結されるVH及びVL鎖を含んで成る。それらの一本鎖抗原結合タンパク質（scFv）は、オリゴヌクレオチドにより連結されるVH及びVLドメインをコードするDNA配列を含んで成る構造遺伝子を構成することによって調製される。構造遺伝子が、続いて、宿主細胞、例えばE.コリ中に導入される発現ベクター中に挿入される。組換え宿主細胞は、２種のVドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単鎖ポリペプチドを合成する。ScFvを生成するための方法は、例えばWhitlow など., Methods: A Companion to Metheds in Enzymology 2:97, 1991により記載される。Bird など., Science 242:423, 1988, Ladner など., アメリカ特許第4,946,778号、Packなど., Bio/Technology 11: 1271, 1993及びSandhu, 前記も参照のこと。
【０３４０】
例示のように、scFvは、インビトロで、Ztnfr12ポリペプチドにリンパ球を暴露し、そしてファージ又は類似するベクターにおける抗体表示ライブラリーを選択すること（例えば、固定された又はラベルされたZtnfr12タンパク質又はペプチドの作用を通して）によって得られる。可能性あるZtnfr12ポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ（ファージ表示）又は細菌、例えばＥ．コリ上に表示されるランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、多くの手段、例えばランダム突然変異誘発及びランダムポリヌクレオチド合成を通して得られる。それらのランダムペプチド表示ライブラリーは、タンパク質又はポリペプチドであり得る既知の標的物、例えばリガンド又は受容体、生物学的又は合成高分子、又は有機又は無機物質と相互作用するペプチドについてスクリーンするために使用され得る。
【０３４１】
そのようなランダムペプチド表示ライブラリーを創造し、そしてスクリーニングするための技法は、当業界において知られており（Ladner など., アメリカ特許第5,223,409 号; Ladner など., アメリカ特許第4,946,778 号；Ladner など., アメリカ特許第5,403,484 号及びLadner など., アメリカ特許第5,571,698 号、及びKayなど., Phage Display of Peputides and Proteins (Academic Press, Inc. 1996)）、そしてランダムペプチド表示ライブラリー及びそのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えばClontech (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) 及びPharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piccataway, MJ) から市販されている。ランダムペプチド表示ライブラリーは、Ztnfr12に結合するタンパク質を同定するために、本明細書に開示されるZtnfr12配列を用いてスクリーンされ得る。
【０３４２】
抗体フラグメントのもう１つの形は、単一の相補性決定領域（CDR）をコードするペプチドである。CDRペプチド（“最小認識単位”）は、興味ある抗体のDCRをコードする遺伝子を構成することによって得られる。そのような遺伝子は、例えば抗体−生成細胞のRNAから可変領域を合成するためにポリメラーゼ鎖反応を用いることによって調製される（例えば、Larrick など., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, (1991), Courtenay-Luck, “Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies,” in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter など., (eds.), page 166 (Cambridge University Press 1995), 及びWard など., “Genetic Manipulation and Expression of Antibodies,” in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch など., (eds.), page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)を参照のこと）。
【０３４３】
もう１つの有用な抗−受容体抗体はキメラ抗体である。キメラ抗体は、可変ドメイン、及び囓歯動物抗体に由来する相補性決定領域を含んで成り、そして抗体分子の残りはヒト抗体に由来する。例えば、Verma and Boleti, “Engineering Antibody Molecules”, in Diagnostic and Therapeutic Antibodies, George and Urch (Eds.), Pages 35-52 (Humana Press, Inc. 2000) を参照のこと。
【０３４４】
他方では、抗−Ztnfr12抗体は、“ヒト化”（humanized）モノクローナル抗体から誘導され得る。ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンH及びL可変鎖からのマウス相補性決定領域を、ヒト可変ドメイン中に移行することにより生成される。次に、ヒト抗体の典型的な残基がネズミ対応物の骨格領域において置換される。ヒト化モノクローナル抗体に由来する抗体成分の使用は、ネズミ不変領域の免疫原性に関連する可能性ある問題を回避する。ネズミ免疫グロブリン可変ドメインをクローン化するための一般的な技法は、例えば、Orlandiなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833, 1989により記載される。
【０３４５】
ヒト化モノクローナル抗体を生成するための技法は、例えば、Jones など., Nature 321:522, 1986, Carter など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285, 1992, Sandhu, Crit. Rey. Biotech. 12: 437, 1992, Singer など., J. Tmmun. 150: 2844, 1993, Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols (Humana Press, Inc. 1995), Kelley, “Engineering Therapeutic Antibodies,” in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland など. (eds.), pages 399-434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996), 及びQueen など., アメリカ特許第5,693,762号（1997）により記載される。
【０３４６】
本発明は、Ztnfr12細胞外領域を結合する抗体成分、及びTACI細胞外領域及びBCMA細胞外領域の少なくとも１つを結合する抗体成分を含んで成る組織物の使用を包含する。例えば、そのような“多特異的抗体組成物”は、異種抗体混合物（すなわち、異なった結合特異性をそれぞれ有する、少なくとも２つの抗体成分の集合体）、二特異的抗体（すなわち、２つの異なった結合部位を有する抗体成分）、単鎖二特異的ポリペプチド、及び同様のものを含んで成ることができる。
【０３４７】
二特異的抗体は、種々の従来の方法により製造され得る。例示としては、二特異的抗体は、異なった抗体の還元性切断に起因するFab’フラグメントの酸化切断により調製されて来た。例えば、Winterなど., Nature 349: 293 (1991) を参照のこと。これは、２種の異なった抗体のペプシン消化、Fab’フラグメントの混合を形成するための還元性切断、続いて、元のエピトープの個々に対して特異的なFab’部分を含む二特異的抗体を包含するF(ab’)2フラグメントの混合物を生成するためにジスルフィド結合の酸化再形成により生成される２種の異なったF(ab’)2フラグメントを混合することによって行われ得る。そのような二特異的抗体の調製のための一般的技法は、例えばNisonhoffなど., Arch Biochem. Biophys. 93: 470 (1961), Hammerling など., J. Exp. Med. 128: 1461 (1968) 及びアメリカ特許第4,331,647号に見出され得る。
【０３４８】
他方では、結合は、異種二官能価リンカー、例えばマレイミド−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いることによって達成され得る。抗体又はフラグメントと前記エステルとの反応は前記抗体又はフラグメント上のアミン基を誘導体化し、そして次に、その誘導体は遊離スルヒドリル基を有する抗体Fabフラグメント（又は、例えばTrautの試薬によりそれに付加されるスルフヒドリル基を有する大フラグメント又は損なわれていない抗体）と反応せしめられ得る。そのようなリンカーは、同じ抗体における基をたぶんほとんど架橋せず、そして結合の選択性を改良する。
【０３４９】
もう１つの例示として、二特異的F(ab’)2抗体は、二官能価架橋剤o−フェニレンジマレイミドを用いて、それらのヒンジ領域SH基を通して２種のFab’フラグメントを連結することによって生成され得る。例えば、Tso, “F(ab’)2 Fusion Proteins and Bispecific F(ab’)2” in Chamow and Ashkenazi (Eds.), Antibody Fusion Proteins, Pages 127-150 (Wiley-Liss, Inc. 1999), and french, “How to Make Bispecific Antibodies”, in George and Urch (Eds.), Diagnostic and Therapeutic Antibodies, pages 333-339 (Humana Press, Inc. 2000) を参照のこと。
【０３５０】
抗原結合部位から遠く離れた部位で抗体又はフラグメントを結合することは好都合である。これは、例えば、上記に示されるように、切断された鎖間スルフヒドリル基への連結により達成され得る。もう１つの方法は、酸化された炭水化物部分を有する抗体と、少なくとも１つの遊離アミン機能を有するもう１つの抗体とを反応せしめることを包含する。これは、例えば最終複合体を形成するために、硼水素化合物還元による第二アミンへの還元により安定化され得る初期シッフ塩基（イミン）結合をもたらす。そのような部位特異的結合は、小さな分子に関しては、アメリカ特許第4,671,958号に開示され、そして大きな付加物に関しては、アメリカ特許第4,699,784号に開示されている。
【０３５１】
他方では、二特異的抗体は、２種のハイブリドーマ細胞系（１つの細胞系は抗−Ztnfr12モノクローナル抗体を生成し、そしてもう1つの細胞系は抗−BCMAモノクローナル抗体又は抗―TACIモノクローナル抗体のいずれかを生成する）を融合することによって生成され得る。テトラドーマを生成するための技法は、例えばMilsteinなど., Nature 305: 538 (1983) 及びPohlなど., Inc. J. Cancer 54: 418 (1993) により記載される。
【０３５２】
二特異的抗体はまた、遺伝子工学により生成され得る。例えば、抗−Ztnfr12モノクローナル抗体の可変ドメインをコードするDNAを含むベクターが、抗−TACI抗体又は抗−BCMA抗体を分泌するハイブリドーマ中に導入され得る。その得られる形質転換体は、Ztnfr12、及びBCMA又はTACIのいずれかを結合する二特異的抗体を生成する。他方では、抗−Ztnfr12結合ドメイン、及び少なくとも１つの抗−BCMA結合ドメイン又は抗―TACI結合ドメインをコードするキメラ遺伝子が企画され得る。
【０３５３】
二特異的抗体を生成するための種々の遺伝的方法が当業者に入手できる。１つのアプローチにおいては、例えば二特異的F(ab’)2がロイシンジッパーを用いて生成され得る。例えばTso, “F(ab’)2 Fusion Proteins and Bispecific F(ab’)2” in Chamow and Ashkenazi (Eds.), Antibody Fusion Proteins, pages 127-150 (Wiley-Liss, Inc. 1999) を参照のこと。遺伝子工学により二特異的抗体を生成するための一般的技法は、例えばSongsivilaiなど., Biochem. Biophys. Res. Commun. 164: 271 (1989), Trauneckerなど., EMBO J. 10: 3655 (1991) 及びWeinerなど., J. Immunol. 147: 4035 (1991) により記載される。
【０３５４】
本発明の二特異的分子はまた、一本鎖二特異的分子、例えば一本鎖二特異的抗体、一本鎖抗体及び結合決定基を含んで成る一本鎖二特異的分子、又は２種の結合決定基を含んで成る一本鎖二特異的分子であり得る。
二特異的抗体は、標準技法、例えば二特異的ELISAを用いてスクリーンされ得る。
【０３５５】
本発明はさらに、標準技法を用いて、抗−Ztnfr12抗体又は抗体フラグメントにより動物を免疫化することによって調製され得るポリクローナル抗−イディオタイプ抗体を包含する。例えば：Immunochemical Protocols, Madison (ed.), Pages 1-12 (Humana Press 1992) 及びColigan, pages 2. 4. 1-2. 4. 7を参照のこと。
【０３５６】
他方では、モノクローナル抗−イディオタイプ抗体は、上記の技法により、抗−Ztnfr12抗体又は抗体フラグメントを免疫原として用いて調製され得る。もう1つの方法として、ヒト化抗−イディオタイプ抗体又は人間に近い霊長類抗−イディオタイプ抗体が、上記技法を用いて調製され得る。抗−イディオタイプ抗体を調製するための方法は、例えばIrie, アメリカ特許第5,208,146号, Greeneなど., アメリカ特許第5,637,677号、及びVarthakovi and Minocha, J. Gen. Virol 77: 1875, 1996により記載される。
【０３５７】
本発明の抗−Ztnfr12抗体成分及び抗−インディオタイプ抗体は、プレ−B又はB−細胞白血病、例えば血漿細胞白血病、慢性又は急性リンパ球白血病、骨髄腫、例えば多発生骨髄腫、血漿細胞骨髄腫、内皮骨髄腫及び巨細胞骨髄腫、及びリンパ腫、例えば非−ホドキンスリンパ腫（Ztnfr12リガンド、例えばZTNF4の上昇に関連する）を処理するためにZtnfr12リガンド（例えば、ZTNF4）の効果を中和するのに有用である。本明細書に記載される分子により処理され得るB細胞リンパ腫の追加の例は、バーキットリンパ腫、非バーキットリンパ腫、小胞性リンパ腫、急性リンパ芽白血病、大細胞型リンパ腫、境界領域リンパ腫、被膜細胞リンパ腫、大細胞型リンパ腫（例えば、免疫芽球性リンパ腫）、小リンパ球性リンパ腫及び他のB細胞リンパ腫を包含する。
【０３５８】
10．遺伝子発現及び遺伝子構造を検出するためへのZtnfr12ヌクレオチド配列の使用
核酸分子は、生物学的サンプルにおけるZtnfr12遺伝子の発現を検出するために使用され得る。適切なプローブ分子は、配列番号１のヌクレオチド配列、又はその一部を含んで成る二本鎖核酸分子、及び配列番号１のヌクレオチド配列の補体、又はその一部を有する1本鎖核酸分子を包含する。本明細書において使用される場合、用語“一部”とは、少なくとも８個のヌクレオチド〜少なくとも20個又はそれ以上のヌクレオチドを言及する。例示的なプローブは、他の腫瘍壊死因子受容体遺伝子における相当の領域に対して低い配列類似性を有する、Ztnfr12遺伝子の領域と結合する。
【０３５９】
基本的アッセイにおいては、一本鎖プローブ分子が、プローブと標的Ztnfr12 RNA種との間の塩基対合を促進する、温度及びイオン強度の条件下で、生物学的サンプルから単離されたRNAと共にインキュベートされる。末結合のプローブをハイブリダイズされた分子から分離した後、ハイブリッドの量が検出される。
【０３６０】
RNA検出の十分に確立されたハイブリダイゼーション方法は、ノザン分析及びドット/スロット  ブロットハイブリダイゼーションを包含する（例えば、Ausubel 前記、p４−１〜４−27、及びWuなど. (eds.)、”Analysis of Gene Expression at the RNA Level”, in Methods in Gene Biotechnology, p. 225-39, CRC Press, Inc., 1997を参照のこと）。核酸プローブは、放射性同位体、例えば32P又は35Sにより検出できるようラベルされ得る。他方では、Ztnfr12 RNAは、非放射性ハイブリダイゼーション方法により検出され得る（例えば、Isaac (ed.), Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes, Humana Press, Inc., 1993を参照のこと）。典型的には、非放射能性検出は、クロモゲン又は化学ルミネセンス基質の酵素転換により達成される。例示的な非放射性成分は、ビオチン、フルオレセイン及びジゴキシゲニンを包含する。
【０３６１】
Ztnfr12オリゴヌクレオチドプローブはまた、インビボ診断のためにも有用である。例示として、16F−ラベルされたオリゴヌクレオチドが対象に投与され、そして陽電子射出断層撮影法により可視可され得る（Tavitian など., Nat. Med. 4: 467, 1998）。
【０３６２】
多くの診断方法は、検出方法の感度を高めるために、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）を利用する。PCRを実施するための標準技法は良く知られている（一般的には、Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics, Humana Press, Inc., 1991; White (ed.), PCR Protocols: Current Methods and Applications, Humana Press, Inc., 1993; Cotter (ed.), Molecular Diagnosis of Cancer, Humana Press, Inc., 1996; Hanausek and Walaszed (eds.), Tumor Marker Protocols, Humana Press, Inc., 1998; Lo (ed.), Clinical Applications of PCR, Humana Press, Inc., 1998及びMeltzer (ed.), PCR in Bioanalysis, Humana Press, Inc., 1998を参照のこと）。
【０３６３】
PCRプライマーは、他のタンパク質、例えば、他の腫瘍壊死因子受容体タンパク質における相当の領域に対して低い配列類似性を有するZtnfr12遺伝子の一部を増幅するよう企画される。
【０３６４】
診断アッセイについてのPCRの１つの変法は、逆転写酵素−PCR（RT−PCR）である。RT−PCR技法においては、RNAが生物学的サンプルから単離され、cDNAに逆転写され、そしてそのcDNAがZtnfr12プライマーと共にインキュベートされる（例えば、Wuなど. (eds.), “Rapid Isolation of Specific cDNA or Genes by PCR”, in Methods in Gene Biotechnology, P. 15-28, CRC Press, Inc. 1997を参照のこと）。次に、PCRが行われ、そして生成物が標準技法を用いて分析される。
【０３６５】
例示のように、RNAは、例えば上記グアニジニウム−チオシアネート細胞溶解を用いて、生物学的サンプルから単離される。他方では、固相技法が、細胞溶解物からmRNAを単離するために使用され得る。逆転写反応は、ランダムオリゴヌクレオチド、dTの短いホモポリマー、又はZtnfr12アンチセンスオリゴマーを用いて、単離されたRNAにより感作され得る。オリゴ−dTプライマーは、対照の標的配列を提供することができる種々のmRNAヌクレオチド配列が増幅される利点を提供する。Ztnfr12配列は、典型的には20個の長さの塩基である２種のフランキングオリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリメラーゼ鎖反応により増幅される。
【０３６６】
PCR増幅方法は、種々のアプローチを用いて検出され得る。例えば、PCR生成物は、ゲル電気泳動により分別され、そして臭化エチジウム染色により可視化される。他方では、分別されたPCR生成物は、膜に移行され、検出できるようにラベルされたZtnfr12プローブによりハイブリダイズされ、そしてオートラジオグラフィーにより試験され得る。追加の他のアプローチは、化学ルミネセンス検出及びC−TRAK比色アッセイを提供するために、ジゴキシゲニンによりラベルされたデオキシリボ核酸三ミリ酸の使用を包含する。
【０３６７】
Ztnfr12発現の検出のためのもう1つのアプローチは、サイクリングプローブ技法（CDT）であり、ここで一本鎖DNA標的物が過剰のDNA−RNA−DNAキメラプローブと結合し、複合体を形成し、RNA部分がRNアーゼHにより分化され、そして分解されたプローブの存在が検出される（例えば、Beggsなど., J. Clin. Microbiol. 34: 2985, 1996, 及び  Bekkuouiなど., Biotechniques 20: 240, 1996を参照のこと）。Ztnfr12配列の検出のための他の方法は、核酸配列に基づく増幅（NASBA）、交差ハイブリダイゼーションによる鋳型の協同増幅（CATCH）及びリガーゼ鎖反応（LCR）のようなアプローチを利用することができる（例えば、Marshallなど., アメリカ特許第5,686,272号（1997）、Dyerなど., J. Virol. Methods 60: 161, 1996; Ehrichtなど., Eur. J. Biochem. 243: 358, 1997; 及びChadwickなど., J. Viro. Methods 70:59, 1998を参照のこと）。他の標準方法も当業者に知られている。
【０３６８】
Ztnfr12プローブ及びプライマーはまた、組織サンプルにおけるZtnfr12遺伝子発現を検出し、そして位置決定するためにも使用され得る。そのような現場ハイブリダイゼーションのための方法は、当業者に良く知られている（例えば、Choo (ed.), In situ Hybridization Protocols, Humana Press, Inc., 1994; We など. (eds.), “Analysis of Cellular DNA or Abundance of mRNA by Radioactive In Situ Hybridization (RISH), “ in Methods in Gene Biotechnology, pages 259-278, CRC Press, Inc., 1997; 及びWuなど. (eds.), “Localizaion of DNA or Abundance of mRNA by Fluorescence In Situ Hybridization (RISH),” in Methods in Gene Biotechnology, pages 279-289, CRC Press, Inc., 1997を参照のこと）。
【０３６９】
種々の追加の診断アプローチも当業者に良く知られている（例えば、Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics, Humana Press, Inc., 1991; Coleman and Tsongalis, Molecular Diagnostics, Humana Press, Inc., 1996; 及びElles, molecular Diagnosis of Genetics Diseases, Humana Press Inc., 1996を参照のこと）。適切な試験サンプルは、血液、尿、唾液、組織、生検及び検死を包含する。
【０３７０】
Ztnfr12遺伝子は、染色体22q13.2、すなわち、疾病及び障害、例えばFechtner症候群、Sorsby下部ジストロフィー、難聴、及び好中球免疫欠損症候群に関連する領域に存在する。さらに、サイトカイン受容体の突然変異は特定の疾病に関連している。例えば、サイトカイン受容体の多形現象は、肺胞タンパク質症、家族性周期性発熱及び赤白血病に関連している。従って、Ztnfr12ヌクレオチド配列は、種々の疾病についての連鎖に基づく試験において、及び対象の染色体がZtnfr12遺伝子に突然変異を含むかどうかを決定するために使用され得る。Ztnfr12遺伝子座での検出できる染色体逸脱は、異数性、遺伝子コピー数変化、挿入、欠失、制限部位変化及び転位を包含するが、但しそれらだけには限定されない。Ztnfr12遺伝子を不活性化する遺伝子変更が特に興味の対象である。
【０３７１】
Ztnfr12遺伝子座に関連する逸脱は、分子遺伝子技法、例えば制限フラグメント長さ他型現象分析、PCR技法を用いる短いタンデム反復体分析、増幅−不応性突然変異システム分析、一本鎖コンホメーション多型現象検出、RNアーゼ切断方法、変性グラジエントゲル電気泳動、蛍光−助力のミスマッチ分析、及び当業界において知られている他の遺伝子分析により、本発明の核酸分子を用いて検出され得る（例えば、Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press. Inc. 1991), Marian, Chest 108：255 (1995), Coleman and Tsongalis, Molecular Diagnositics (Human Press, Inc. 1996), Elles (ed.) Morecular Diagnosis of Genetic Diseases (Humana Press, Inc. 1996), Landegren (ed.), Laboratory Protocols for Mutation Detection (Oxford University Press 1996), Burren など. (eds.), Genome Analysis, Vol. 2: Detecting Genes (Cold Spring Habor Laboratory Press 1998), Dracopoli など. (eds.), Current Protocols in Human Genetics (John Wiley & Sons 1998), 及びRichards and Ward, “Molecular Diagnostic Testing,” in Principles of Molecular Medicine, Pages 83-88 (Humana Presa. Inc. 1998) を参照のこと）。
【０３７２】
例示として、Ztnfr12遺伝子における大きな欠失は、サザンハイブリダイゼーション分析又はPCR増幅を用いて検出され得る。特定のZtnfr12エキソンにおける欠失は、エキソンを両端に有するPCRプライマーを用いて検出され得る。表１は、配列番号１及び９のヌクレオチド配列に存在するZtnfr12エキソンの位置を提供する。この情報は、特定のエキソンを増幅するプライマーを企画するために使用され得る。
【０３７３】
突然変異はまた、正常なZtnfr12配列を含んで成るオリゴヌクレオチドプローブを、サザンブロット又は膜結合されたPCR生成物にハイブリダイズすることによって検出され得る。識別は、高い緊縮性の条件下でハイブリダイズするか、又は種々の緊縮条件下で洗浄することによって達成され得る。この分析は、特定のコード配列に標的化され得る。他方では、このアプローチは、疾病原因の突然変異がしばしば位置する、即時フランキングイントロン配列におけるスプライス−ドナー又はスプライス−受容体部位を試験するために使用される。適切なオリゴヌクレオチドは、表１、及び配列番号１及び９に提供される情報を用いて、選択のエキソン中に配列を延長することによって企画され得る。
【０３７４】
遺伝子のすべて又は一部の重複は、その重複された物質が遺伝子の読み取り枠中に挿入され、そして翻訳の未熟終結を引き起こす場合、障害を引き起こすことができる。重複及び挿入は、標準方法、及びサザンハイブリダイゼーション、蛍光現場ハイブリダイゼーション、パルスされたフィールドゲル分析、又はPCRにより対象のゲノムDNAを分析することによって直接的に試験され得る。さらに、重複の効果は、下記に記載されるタンパク質切断アッセイにより検出され得る。
【０３７５】
点突然変異は、Ztnfr12機能の変更、又はアミノ酸コドンの停止コドンへの変化をもたらす非保存性変化を導くことができる。点突然変異がイントロン内で生じる場合、その突然変異はスプライシングの適合性に影響を及ぼすことができる。点突然変異は、標準技法、例えばサザンハイブリダイゼーション分析、PCR分析、配列決定、連結鎖反応及び他のアプローチを用いて検出され得る。一本鎖配座多形現象分析においては、PCRにより増幅されたフラグメントが一本鎖に分離され、そして変性条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析される。
【０３７６】
ゲルを通しての移動速度が、塩基配列に依存する配座の関数である。突然変異は１つの又は両者の一本鎖の移動速度を変更することができる。化学的分析アプローチにおいては、ハイブリッド分析が試験DNAと対照DNA（例えば、配列番号２のアミノ酸配列をコードするDNA）との間で生成される。突然変異による塩基対ミスマッチの部位が誤って対合され、そして鎖はそれらの部位での化学的分析に対して敏感になるであろう。
【０３７７】
タンパク質切断試験はまた、翻訳−終結突然変異がコードされたタンパク質の一部のみを生成する、遺伝子の不活性化を検出するために有用である（例えば、Stoppa-Lynnet など., Blood 91: 3920 (1998) を参照のこと）。このアプローチによれば、RNAが生物学的サンプルから単離され、そしてcDNAを合成するために使用される。次に、PCRが、Ztnfr12標的物配列を増幅し、そしてRNAポリメラーゼプロモーター、翻訳開始配列及びインフレ−ムATGトリプレットを導入するために使用される。PCR生成物が、RNAポリメラーゼを用いて転写され、そして転写体がT7−結合された網様体溶解物システムによりインビトロで翻訳される。次に、翻訳生成物が、その翻訳生成物の長さを決定するために、SDS−PAGEにより分別される。タンパク質切断試験は、例えば、Dracopoliなど. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, p.9.11.1-9.11.18 (John Wiley & Sons 1998) により記載される。
【０３７８】
他のアプローチにおいては、突然変異は、配列ミスマッチの部位でRNA−DNAハイブリッドのRNA鎖を分解するであろう、リボヌクレアーゼAを用いて検出され得る。手短には、対象のZtnfr12遺伝子又はcDNAのPCR−増幅された配列が、一般的集団から選択された正常で健康な個人のDNAから調製された、インビトロで転写された、ラベルされたRNAプローブによりハイブリダイズされる。RNA−DNAハイブリッドが、リボヌクレアーゼAにより消化され、そして変性ゲル電気泳動を用いて分析される。２本の鎖間の配列ミスマッチは保護されたフラグメントの分析を引き起こし、そして小さな追加のフラグメントは、突然変異誘発されたZtnfr12遺伝子を有する対象に由来するサンプルにおいて検出されるであろう。突然変異の部位は、分解生成物のサイズから推定され得る。
【０３７９】
Ztnfr12ポリヌクレオチド配列を用いての染色体DNAの分析は、染色体22q、 特に染色体22q13.2に位置する異常性と疾病とを関連づけるために有用である。１つの態様においては、本発明の方法は、（ａ）個人からのサンプルからZtnfr12  RNAを獲得し、（ｂ）Ztnfr12 cDNAをポリメラーゼ鎖反応により生成し、そして（ｃ）配列番号１に示されるような核酸配列に、前記Ztnfr12 cDNAのヌクレオチド配列を比較することを含んで成る、前記サンプルにおける染色体22q13.2異常性を検出するための方法を提供する。さらなる態様においては、サンプルにおけるZtnfr12 cDNA又はZtnfr12遺伝子の配列と配列番号１又は９に示されるようなZtnfr12配列との間の差異が、染色体22q13.2異常性を示す。
【０３８０】
もう１つの態様においては、本発明は、（ａ）個人からのサンプル中の核酸分子と配列番号１のヌクレオチド配列、その補体又はフラグメントから成る核酸分子に緊縮条件下でハイブリダイズする核酸プローブとを接触せしめ、そして（ｂ）前記サンプルにおける核酸分子との前記プローブのハイブリダイゼーションの存在を検出し、ここで前記ハイブリダイゼーションの染色体22ｑ13.2異常性、例えばZTNF4に対する応答の低下を引き起こす異常性を表す段階を含んで成る、ZtNF4活性の変更に関連する染色22q13.2異常性を前記サンプルにおいて検出するための方法を提供する。
【０３８１】
本発明はまた、（ａ）個人からのサンプルからZtnfr12をコードする核酸分子を単離し、そして（ｂ）前記単離されたZtnfr12コードの配列のヌクレオチド配列と配列番号１のヌクレオチド配列とを比較することを含んで成る、ZTNF4活性における変更に関連するZtnfr12遺伝子異常性を、前記サンプルにおいて検出する方法を提供し、ここで前記単離されたZtnfr12コードの配列、又は前記単離されたZtnfr12コードの配列から生成されたZtnfr12ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、配列番号１のヌクレオチド配列との間の差異が、個人における疾病又は疾病に対する感受性に関連するZtnfr12遺伝子異常性、例えばZTNF4に対する応答性の低下を引き起こす異常性を表す。
【０３８２】
本発明はまた、（ａ）個人からのサンプルからZtnfr12 RNAを獲得し、（ｂ）前記Ztnfr12 RNAからポリメラーゼ鎖反応によりZtnfr12 cDNAを生成し、そして（ｃ）前記Ztnfr12 cDNAのヌクレオチドと配列番号１のヌクレオチド配列とを比較することを含んで成る、疾病又は疾病に対する感受性に関連するZtnfr12遺伝子の発現の異常性を、前記サンプルにおいて検出する方法を提供し、ここで前記Ztnfr12 cDNAの配列と、配列番号１のヌクレオチド配列との差異が、疾病又は疾病に対する感受性に関連するZTNFR12遺伝子の発現の異常性を表す。
【０３８３】
他の観点においては、本発明は、（ａ）サンプル核酸分子と、配列番号１のヌクレオチド配列、その補体又はフラグメントを有する核酸分子に緊縮条件下でハイブリダイズする核酸プローブとを接触せしめ、そして（ｂ）ハイブリダイゼーションの存在又は不在を検出することを含んで成る、Ztnfr12遺伝子異常性を、前記サンプルにおいて検出するための方法を提供し、ここで前記ハイブリダイゼーションの存在がZtnfr12異常性を示す。
【０３８４】
現場ハイブリダイゼーションは、Ztnfr12遺伝子異常性を同定するためのもう1つのアプローチを提供する。このアプローチによれば、Ztnfr12プローブが、当業界において知られているいずれかの方法に従って、検出できるマーカーによりラベルされる。例えば、プローブは、ランダムプライミング、末端ラベリング、PCR、又はニック翻訳により直接的にラベルされ得る。適切な直接的ラベルは、放射性ラベル、例えば32P, 3H及び35S, 及び非放射性ラベル、例えば蛍光マーカー（例えば、フルオレセイン、Texas Red, AMCAブルー（７−アミノ−４−メチル−クマリン−３−アセテート）、ルシファーイエロー、ローダミン、等）、シアニン染料（可視光により検出できる）、酵素及び同様のものを包含する。
【０３８５】
酸素によりラベルされたプローブは、その酵素のための基質を提供することによって比色反応を通して検出され得る。種々の基質の存在下で、異なった色彩が反応により生成され、そしてそれらの色彩は、所望により、複数のプローブを別々に検出するために可視化され得る。アルカリホスファターゼのための適切な基質は、５−ブロモ−５−クロロ−３−インドリルホスフェート及びニトロブルーテトラゾリウムを包含する。ホースラディシュペルオキシダーゼのための１つの適切な基質はジアミノベンゾエートである。
【０３８６】
現場ハイブリダイゼーションによる染色体異常性を検出するための例示的方法は、Wangなど., アメリカ特許第5,856,089号により記載される。このアプローチに従って、例えば対象から得られた固定された組織サンプルから細胞における染色体構成異常性を検出するためのZtnfr12プローブによる現場ハイブリダイゼーションを行うための方法は、
（１）患者からの固定された組織サンプルを獲得し、
（２）段階（１）において得られた固定された組織サンプルを、亜硫酸水素イオン組成物により前処理し、
（３）前記固定された組織サンプルをプロテイナーゼにより消化し、
【０３８７】
（４）段階（３）の消化された、固定された組織サンプルから得られる細胞に対して、Ztnfr12遺伝子に対して特異的にハイブリダイズするプローブにより現場ハイブリダイゼーションを行い、ここでハイブリダイズされたプローブのシグナルパターンが得られ、
（５）興味ある正常な決定的染色体領域を有する細胞に対する現場ハイブリダイゼーションを行う場合に得られるハイブリダイズされたプローブの予定されたシグナルパターンに、段階（４）でのハイブリダイズされたプロ−グのシグナルパターンを比較し、そして
（６）段階（４）で得られたシグナルパターンと前記予定されるシグナルパターンとの間の差異を検出することによって、前記患者の細胞における染色体構造異常性を検出する段階を含んで成る。Ztnfr12遺伝子異常性の例は、欠失、増幅、トランスロケーション、逆位及び同様のものを包含する。そのようなアッセイは、例えばZTNP4に対する変更された応答性に関連する疾病又は障害を有すると思われる対象からの組織を試験するために使用され得る。
【０３８８】
本発明はまた、Ztnfr12遺伝子発現のための診断アッセイを行うための又はZtnfr12遺伝子における突然変異を検出するためのキットも企画する。そのようなキットは、核酸プローブ、例えば配列番号１のヌクレオチド27−578のヌクレオチド配列、配列番号１のヌクレオチド27−233のヌクレオチド配列、又はその一部を含んで成る二本鎖分子、及び配列番号１のヌクレオチド27−578のヌクレオチド配列、配列番号１のヌクレオチド27−233のヌクレオチド配列、又はその一部を有する一本鎖核酸分子を含んで成る。プローブ分子は、DNA、RNA、オリゴヌクレオチド及び同様のものであり得る。キットは、PCRを行うための核酸プライマーを含んで成る。
【０３８９】
そのようなキットは、上記核酸診断アッセイを行うためのすべての必要な要素を含むことができる。キットは、Ztnfr12プローブ又はプライマーを含んで成る少なくとももう１つの容器を含むであろう。キットはまた、Ztnfr12配列の存在を示すことができる１又は複数の試薬を含んで成る第２容器を含むことができる。そのようなインジケーター試薬の例は、検出できるラベル、例えば放射性ラベル、蛍光色素、化学ルミネセント剤、及び同様のものを包含する。
【０３９０】
キットはまた、Ztnfr12プローブ及びプライマーがZtnfr12遺伝子発現を検出するために使用される、使用者に知られるための手段を含んで成る。例えば、文書の説明書は、封入されている核酸分子が、Ztnfr12をコードする核酸分子、又はZtnfr12コードのヌクレオチド配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を有する核酸分子のいずれかを検出するために使用され得ることを記載する。その文書の材料は、容器に直接的に適用され、又は文書の材料は、パッケージング挿入体の形で提供され得る。
【０３９１】
11．Ztnfr12を検出するためへの抗−Ztnfr12抗体の使用
本発明は、Ztnfr12の存在についてインビトロで生物学的サンプルをスクリーンするためへの抗−Ztnfr12抗体の使用を企画する。1つのタイプのインビトロアッセイにおいては、抗−Ztnfr12抗体が液相において使用される。例えば、生物学的サンプルにおけるZtnfr12の存在は、生物学的サンプルと、微量のラベルされたZtnfr12及び抗−Ztnfr12抗体とを、Ztnfr12とその抗体との間の結合を促進する条件下で混合することによって試験され得る。サンプルにおけるZtnfr12及び抗−Ztnfr12の複合体が、前記複合体を、抗体、例えばFc抗体又はスタフィロコーカスタンパク質Aと結合する同定されたタンパク質とを接触することによって、反応混合物から分離され得る。生物学的サンプルにおけるZtnfr12の濃度は、抗体に結合されるラベルされたZtnfr12の量に反比例し、そして遊離ラベルにされたZtnfr12の量に直接的に関連する。例示的な試験サンプルは、血液、尿、唾液、組織生検及び検死材料を包含する。
【０３９２】
他方では、抗−Ztnfr12抗体が固相キャリヤーに結合されるインビトロアッセイが行われ得る。例えば、抗体が、不溶性支持体、例えばポリマー−被覆されたビーズ、プレート又は管に抗体を結合するために、ポリマー、例えばアミノデキストランに結合され得る。他の適切なインビトロアッセイは、当業者に明らかであろう。
【０３９３】
もう１つのアプローチにおいては、抗−Ztnfr12抗体が、生検検体から調製された組織切片においてZtnfr12を検出するために使用され得る。そのような免疫化学的検出が、比較的多くのZtnfr12を決定するために、及び試験される組織におけるZtnfr12の分布を決定するために使用され得る。一般的な免疫化学的技法は、十分に確立されている（例えば、Ponder, “Cell Marking Techniques and Their Application.”in Mammalian Development: A Practical Approach, Monk (ed.), pages 115-38 (IRL Press 1987), Coligan at pages 5.8.1-5.8.8, Ausubel (1995) at pages 14.6.1 to 14.6.13 (Wiley interscience 1990), and Manson (ed.), Methods In Molecular Biology. Vol. 10: Immunochemical Proteocols (The Humana Press. Inc. 1992) を参照のこと）。
【０３９４】
免疫化学的検出は、生物学的サンプルと抗−Ztnfr12抗体とを接触し、そして次に、前記生物学的サンプルと、抗体に結合する検出できるラベルされた分子とを接触せしめることによって行われ得る。例えば、前記検出できるラベルされた分子は、抗−Ztnfr12抗体に結合する抗体成分を含んで成る。他方では、抗−Ztnfr12抗体は、アビジン/ストレプタビジン（又はビオチン）により接合され、そして検出できるラベルされた分子はビオチン（又はアビジン/ストレプタビジン）を含むことができる。この基本的技法の多くの変法は、当業者に良く知られている。
【０３９５】
他方では、抗−Ztnfr12抗体が、抗−Ztnfr12免疫接合体を形成するために、検出できるラベルにより接合され得る。適切な検出できるラベルは、例えば放射生同位体、蛍光ラベル、化学ルミネセンスラベル、酵素ラベル、生物ルミネセンスラベル又はコロイド状金を包含する。そのような検出できるラベルされた免疫接合体の製造及び検出方法は、当業者に良く知られており、そして下記により詳細に記載される。
【０３９６】
検出できるラベルは、オートラジオグラフィーにより検出される放射性同位体であり得る。本発明のために特に有用である同位体は、3H, 125I, 131I, 35S及び14Cである。
【０３９７】
抗−Ztnfr12免疫接合体はまた、蛍光化合物によりラベルされ得る。蛍光ラブルされた抗体の存在は、適切な波長の光に免疫接合体を暴露し、そして得られる蛍光を検出することによって決定される。蛍光ラベル化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o−フタルアルデヒド及びフルオレサミンを包含する。
【０３９８】
他方では、抗−Ztnfr12免疫接合体は、化合物ルミネセンス化合物に抗体化合物を接合することによって、検出的にラベルされ得る。化学ルミネセンス−標識された免疫接合体の存在は、化学反応の間に生じるルミネセンスの存在を検出することによって決定される。化学ルミネセンスラベリング化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びオキサレートエステルを包含する。
【０３９９】
同様に、化学ルミネセンス化合物は、本発明の抗−Ztnfr12免疫接合体をラベルするために使用され得る。生物発光は、触媒タンパク質が化学ルミネセンス反応の効率を高める生物学的システムに見出されるタイプの化学ルミネセンスである。生物ルミネセンスタンパク質の存在は、ルミネセンスの存在を検出することによって決定される。ラベリングのために有用である生物ルミネセンス化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンを包含する。
【０４００】
他方では、抗−Ztnfr12免疫接合体は、酵素に抗−Ztnfr12抗体化合物を接合することによって検出できるようラベルされ得る。抗−Ztnfr12−酵素接合体が適切な基質の存在下でインキュベートされる場合、酵素成分は、分光光度、蛍光又は可視手段により検出され得る化学成分を生成するために基質と反応する。多くの特異的免疫接合体を検出できるようにラベルするために使用され得る酵素の例は、β−ガラクトシダーゼ、グルコオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼを包含する。
【０４０１】
当業者は、本発明に従って使用され得る他の適切なラベルを知っているであろう。抗−Ztnfr12抗体へのマーカー成分の結合は、当業界において知られている標準技法を用いて達成され得る。これに関しての典型的な方法論は、Kennedyなど., Clin. Chim. Acta 70:1 (1976), Schursなど., Clim. Acta 81:1 (1977), Shihなど., Int’l. J. Cancer 46:1101 (1990), steinなど., Cancer  Res. 50:1330 (1990), 及びColigan、前記により記載される。
【０４０２】
さらに、免疫化学的検出の便利さ及び多様性は、アビジン、ストレプタビジン及びビオチンにより接合された抗−Ztnfr12抗体を用いることによって増強され得る（例えば、Wilchek. など., (eds.), “Avidin-Biotin Technology,” Methods In Enzymology, Vol. 184 (Academic Press 1990), and Bayerなど., “Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology,” in Methods In Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.) pages 149-162 (The Humana Press. Inc. 1992) を参照のこと）。
【０４０３】
イムノアッセイを行うための方法は十分に確立されている。例えば、Cook and Self, “Monoclonal Antibodies in Diagonostic Immunoassays,” in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman (eds.), Pages 180-208. (Cambridg University Press, 1995), Perry, “The Role of Monoclonal antibodies in the Advancement of Immunoassay Technoogy”, in Monoclonal Antibodies; Principles and applications, Birch and Lennox (eds.), pages 107-120 (Wiley-Liss, Inc. 1995), and Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996 を参照のこと。
【０４０４】
本発明はまた、Ztnfr12遺伝子発現についての免疫学的診断アッセイを行うためのキットも企画する。そのようなキットは、抗−Ztnfr12抗体又は抗体フラグメントを含んで成る少なくとも１つの容器を含んで成る。キットはまた、Ztnfr12抗体又は抗体フラグメントの存在を示すことができる１又は複数の試薬を含んで成る第２容器を含むことができる。そのようなインジケーター試薬の例は、検出できるラベル、例えば放射性ラベル、蛍光ラベル、化学ルミネセンスラベル、酵素ラベル、生物ルミネセンスラベル、コロイド状金及び同様のものを包含する。
【０４０５】
キットはまた、Ztnfr12抗体又は抗体フラグメントが、Ztnfr12タンパク質を検出するために使用される、使用者に伝達するための手段を含んで成る。例えば、文書の説明書は、封入される抗体又は抗体フラグメントが、Ztnfr12を検出するために使用され得ることを言及する。文書の材料は容器に直接的に適用され、又は文書の材料は、パッケージング挿入体の形で提供され得る。
【０４０６】
12．Ztnfr12活性を有するポリペプチドの治療的使用
Ztnfr12活性を有するアミノ酸配列は、Ztnfr12リガンド（例えば、ZTNF4）を結合し、そして従って、Ztnfr12リガンドの結合を内因性Ztnfr12受容体により妨げることにより、免疫系を調節するために使用され得る。従って、本発明は、Ztnfr12活性を有するタンパク質、ポリペプチド及びペプチド（例えば、Ztnfr12ポリペプチド（例えば、Ztnfr12ポリペプチド、Ztnfr12類似体（例えば、抗−Ztnfr12抗−イディオタイプ抗体）、及びZtnfr12融合タンパク質））の、適切な量のZtnfr12ポリペプチドを欠いているか、又は過剰のZTNF4を生成する対象への使用を包含する。
【０４０７】
対照的に、Ztnfr12アンタゴニスト（例えば、抗−Ztnfr12抗体）が、過剰のZTNF4又はZtnfr12を生成する対象を処理するために使用され得る。それらの分子は、処理の必要ないずれかの対象に投与され、そして本発明は、獣医学的及びヒト治療使用を企画する。例示的対象は、哺乳類対象、例えば農業用動物、家畜及びヒト患者を包含する。ヒト又はネズミZtnfr12ポリペプチドが、それらの用途のために使用され得る。
【０４０８】
Ztnfr12活性を有する分子は、自己免疫疾患、B細胞癌、免疫調節、IBD及びいずれかの抗体介在性病理学（例えば、ITCP、重症筋無力症及び同様のもの）、腎疾患、間接的T細胞免疫応答、移植片拒絶及び対宿主移植片病の処理のために使用され得る。本発明ポリペプチドは、免疫応答の間、B細胞応答を特異的に調節するために標的化され得る。さらに、本発明のポリペプチドは、B細胞の成長、他の細胞の成長、抗体生成及びサイトカイン生成を調節するために使用され得る。本発明のポリペプチドはまた、ZTNF4の増殖効果を中和することによって、T細胞及びB細胞伝達を調節することができる。
【０４０９】
本発明のZtnfr12ポリペプチドは、ZTNF4ポリペプチドの上昇が関与する、プレ−B又はB−細胞白血病、例えば血漿細胞白血病、慢性又は急性リンパ球性白血病、骨髄腫、例えば多発性骨髄腫、血漿細胞骨髄腫、内皮骨髄腫及び巨大細胞骨髄腫、及びリンパ腫、例えば非ホドキンスリンパ腫を処理するためにZTNF4の効果を中和するために有用である。本明細書に記載される分子により処理され得るB細胞リンパ腫の追加の例は、バーキットリンパ腫、非バーキットリンパ腫、小胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、大細胞リンパ腫、周辺領域リンパ腫、被膜細胞リンパ腫、大細胞型リンパ腫（例えば、免疫芽球性リンパ腫）、小リンパ性リンパ腫、及び他のB細胞リンパ腫を包含する。
【０４１０】
ZTNF4は、CD8+細胞、単球、樹状突起細胞、活性化された単球において発現され、このことは、一定の自己免疫疾患においては、細胞毒性T−細胞がZTNF4の過剰生成を通してB−細胞生成を刺激することを示す。B−リンパ球の作用を選択的に阻止する免疫抑制リンパ質が、疾病の処理に使用される。自己抗体生成は、いくつかの自己免疫疾患に共通し、そして疾病の組織破壊及び悪化に寄与する。自己抗体はまた、免疫複合体沈着合併症の発生を導き、そして全身性エリテマトーデス、例えば腎不全、神経痛症状及び死の多くの症状を導く。
【０４１１】
細胞応答に無関係な調節抗体生成はまた、多くの疾病状態において有益である。B細胞はまた、リウマチ様関節炎における関節炎原性（arthritogenic）免疫グロブリンの分泌において役割を演じることが示されている。ZTNF4−刺激された抗体生成の阻害は、自己免疫疾患、例えば重症筋無力症及びリウマチ様関節炎の処理において有益である。免疫抑制剤、例えばB−リンパ球の作用を選択的に阻止するか又は中和する可溶性Ztnf12は、そのような目的のために有用である。
【０４１２】
本発明は、自己免疫疾患に関連するか又は関連しない、最終段階腎臓疾患に関連するB−細胞の作用を選択的に阻止するか又は中和するためにZtnfr12ポリペプチド、融合体、アゴニスト又はアンタゴニストを使用する方法を提供する。そのような方法はまた、免疫学的腎疾患のためにも有用である。そのような方法は、疾病、例えば膜ネフロパシー、IgAネフロパシー又はBerger’s病に関連する糸球体腎炎、IgMネフロパシー、Goodpasture’s病、後−感染性糸球体腎炎、糸球体間質増殖性疾患、慢性リンパ性白血病、微少変化ネフローゼ症候群を処理するために有用である。
【０４１３】
そのような方法はまた、狼瘡、多発性動脈炎、Henoch-Schonlein, 硬皮症、HIV−関連疾患、アミロイド症、又は溶血性尿毒症候群のような疾病に関連する二次糸球体腎炎又は処理するための治療用途として作用する。本発明の方法はまた、慢性腎盂腎炎に関連する介在性腎炎又は腎盂腎炎、無痛性乱用、腎石炭、他の剤により引き起こされるネフロパシー、腎石症又は慢性又は急性介在性腎炎を処理するための治療用途の一部としても有用である。
【０４１４】
本発明の方法はまた、高血圧性又は大血管疾患、例えば腎動脈狭窄又は閉塞、及びコレステロール塞栓又は腎塞栓の処理へのZtnfr12ポリペプチド、融合体、抗体又はアンタゴニストの使用も包含する。
本発明はまた、腎又は泌尿器新生物、多発性骨髄腫、リンパ腫、L鎖ニューロパシー又はアミロイドーシスの処理のための方法を提供する。
本発明はまた、ぜん息及び他の慢性気道疾患、例えば気管支炎及び気腫の処理のために、Ztnfr12ポリペプチド、融合体、抗体、アゴニスト又はアンタゴニストを用いて、活性化されたB細胞を阻止し、又は阻害するための方法を提供する。
【０４１５】
免疫抑制への使用のために、特に対宿主性移植片病及び移植片拒絶に関してのそのような治療使用のために、Ztnfr12ポリペプチド、融合体、抗体、アゴニスト又はアンタゴニストを用いて、エフェクターT細胞応答を阻害するか又は応答を阻害するか又は中和するための方法もまた提供される。さらに、Ztnfr12ポリペプチド、融合体、抗体、アゴニスト又はアンタゴニストは、そのような自己免疫疾患、例えばインスリン依存性真性糖尿病（IDDM）及びクローン病の処理のための治療プロトコールにおいて有用である。本発明の方法は、慢性炎症性疾患を処理するために、特に関節痛、腫張、貧血及び他の関連する症状を低めるために、及び敗血性ショックを処理するために追加の治療価値を有する。
【０４１６】
Ztnfr12アゴニストとして同定される化合物はまた、体液性免疫応答を増強するためにも有用である。B細胞応答は、感染性疾病、例えば細菌、ウィルス、原生動物及び寄生性感染の攻撃において重要である。感染性微生物に対する抗体は、抗原に結合することによって病原体を固定し、続いて補体介在性溶菌又は細胞介在性攻撃を伴なう。Ztnfr12アゴニストは、体液性応答を増強するよう作用し、そして感染性疾病又は免疫無防備状態の危険性の個人のための有用な治療剤であり、又はワクチン接種へのサプリメントとして有用である。
【０４１７】
十分に確立された動物モデルは、ある疾病状態における本発明の可溶性Ztnfr12ポリペプチドのインビボ効能を試験するために利用できる。特に、可溶性Ztnfr12ポリペプチド及びポリペプチドフラグメントは、自己免疫疾患の多くの動物モデル、例えばSLE（全身性エリテマトーデス）のモデルとして作用する、MRL−lprllpr又はNZB×NZW F1近交系マウス株においてインビボで試験され得る。そのような動物モデルは、当業者において知られており、そして例示的モデル、例えばSLEの自発形を進行するNZBWマウス、実験用アレルギー性脳脊髄炎のためのネズミモデル、コラーゲン誘発性関節炎ネズミモデル、ネズミ実験用自己免疫重症筋無力症、及び同様のものが上記に記載されている。
【０４１８】
一般的に、投与されるZtnfr12（又はZtnfr12類似体又は融合タンパク質）の用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、一般的な医学的状態及びこれまでの医学的歴史のような要因に依存して変化するであろう。典型的には、約１pg/kg〜10mg/kg（剤の量/患者の体重）の範囲でのZtnfr12の用量（但し、それよりも低いか又は高い用量もまた、環境が指図する場合、投与され得る）を、受容体に供給することが所望される。
【０４１９】
Ztnfr12ポリペプイドの対象への投与は、局部カテーテルを通しての灌流によるか又は直接的な病変内注入による、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、鞘内投与であり得る。注射により治療用タンパク質を投与する場合、投与は連続的注入によるか、又は一回又は複数回のボーラスによることができる。
【０４２０】
投与の追加経路は、経口、粘膜、肺及び経皮を包含する。経口供給は、ポリエステル微小球、ゼイン微小球、プロテイノイド微小球、ポリシアノアクリレート微小球及び脂質基剤システムのために適切である（例えば、DiBase and Morrel, “Oral Delivery of Microencapsulated Protein”, in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), p.255-288 (Plenum Press 1977) を参照のこと）。鼻腔内供給の実行可能性は、インスリン投与のそのような態様により例示される（例えば、Hinchcliffe and Illum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35: 199 (1997) を参照のこと）。Ztnfr12を含んで成る乾燥又は液体粒子は、乾燥−粉末分散機、液体エーロゾル発生器又はネブライザーの助けにより調製され、そして吸入され得る（例えば、Pettit and Gombotz, TIBTECH 16: 343 (1998); Patton など., Adv. Drug Deliv. Rev. 35: 235 (1999) を参照のこと）。
【０４２１】
このアプローチは、エーロゾル化されたインスリンを肺に供給する電動吸入器であるAERX糖尿病治療システムにより例示される。研究によれば、48,000kDaほどの大きなタンパク質が、経皮投与の実行可能性を例示する、低周波超音波の助けにより治療濃度で皮膚を通して供給されることが示された（Mitragotriなど., Science 269: 850 (1995)）。エレクトロポレーションを用いての経皮供給は、Ztnfr12活性を有する分子を投与するもう１つの手段を提供する（Pottsなど., Pharm. Biotechnol. 10: 213 (1997)）。
【０４２２】
Ztnfr12結合活性を有するタンパク質、ポリペプチド又はヘプチドを含んで成る医薬組成物は、医薬的に有用な組成物を調製する既知の方法に従って配合され得、それによれば、治療用タンパク質が医薬的に許容できるキャリヤーと共に混合される。組成物は、その投与が受容体患者により許容され得る場合、“医薬的に許容できるキャリヤー”であると言われる。無菌リン酸緩衝溶液は、医薬的に許容できるキャリヤーの1つの例である。他の適切なキャリヤーは、当業者に良く知られている。例えば、Gennaro (ed.), Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995) を参照のこと。
【０４２３】
治療のためには、Ztnfr12活性を有する分子及び医薬的に許容できるキャリヤーが、治療的に有効な量で患者に投与される。Ztnfr12活性を有するタンパク質、ポリペプチド又はペプチド、及び医薬的に許容できキャリヤーの組み合わせは、  その投与される量が生理学的に有意である場合、“治療的に有効な量”で投与されると言われる。剤は、その存在が受容体患者の生理学において検出される変化をもたらす場合、生理学的に有意である。例えば、炎症を処理するために使用される剤は、その存在が炎症応答を緩和する場合、生理学的に有意である。もう１つの例として、腫瘍細胞の増殖を阻害するために使用される剤は、その剤の投与が腫瘍細胞の数の低下、低められた転位、固形腫瘍のサイズの低下、又は腫瘍の高められた壊死をもたらす場合、生理学的に有意である。
【０４２４】
Ztnfr12（又はZtnfr12類似体又は融合タンパク質）を含んで成る医薬組成物は、液体形、エーロゾル、又は固体形で維持され得る。液体形は、注射用溶液及び経口懸濁液により例示される。典型的な固体形は、カプセル、錠剤及び調節された開放形を包含する。後者の形は、ミニ浸透ポンプ及び移植体により例示される（Bremer など., Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997): Ranade. “Implants in Drug Delivery,” in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 95-123 (CRC Press 1995); Bremer など., “Protein Delivery with Infusion Pum-s,” in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), Pages 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey など., “Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant,” in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), Pages 93-117 (Plenum Press 1997)）。
【０４２５】
リポソームは、治療用ポリペプチドを、患者に、静脈内、腹膜内、鞘内、筋肉内、皮下、又は経口、吸入又は鼻腔内供給するための１つの手段を提供する。リポソームは、水性区画を取り組む１又は複数の脂質二層から成る微小ビークルである（一般的には、Bakker Woudenberg など., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1): S61 (1993), Kim Drugs 46:618 (1993), and Ranade, “Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers,” in Drug Delivery Systems, Ranade and組生Hollinger (eds.), pages 3-24 (CRC Press 1995)を参照のこと）。
【０４２６】
リポソームは、組成において細胞膜に類似し、そして結果として、リポソームは安全に投与され、そして生分解性である。調製方法に依存して、リポソームは、単層又は多層性であり得、そしてリポソームは0.02μm〜10μm以上の範囲の直径でサイズ的に変化することができる。種々の剤がリポソームに封入され得る：疎水性剤は二層に分割され、そして親水性剤は内部水性空間内に封入される（例えば、Macky など., Liposomes In Cell Biology and Pharmacology (John Libbey 1987), 及びOstroなど., American J. Hosp. Pharm. 46: 1576 (1989) を参照のこと）。さらに、リポソームサイズ、二層の数、脂質組成、及びリポソームの電荷及び表面性質を変えることにより、封入される剤の治療利用性を調節することが可能である。
【０４２７】
リポソームは、実質的にいずれかのタイプの細胞に吸着することができ、そして次に、封入された剤をゆっくりと開放する。他方では、吸収されたリポソームは、食細胞性である細胞によりエンドサイト−シス化され得る。エンドサイト−シスに続いて、リポソーム脂質のリソソーム内分解が伴ない、そして封入された剤が開放される（Scherphof など., Ann. N.Y. Acad. Sci. 446: 368 (1985)）。静脈内投与の後、小さなリポソーム（0.1〜1.0μm）は、典型的には、肝臓及び脾臓に主として位置する網内細胞系の細胞により摂取されるが、ところが3.0μmよりも大きなリポソームは肺に沈着される。網内細胞系の細胞による小さなリポソームのこの好ましい摂取は、マクロファージ及び肝臓の腫瘍に化学治療剤を供給するために使用されて来た。
【０４２８】
網内細胞系は、いくつかの方法、例えば多量のリポソーム粒子による飽和、又は薬理学的手段による選択的マクロファージ不活性化により回避され得る（Claassenなど., Biochim. Biophys. Acta 802: 428 (1984)）。さらに、リポソーム膜中への糖脂質−又はポリエチレングリコール−誘導されたリン脂質の組み込みは、網内細胞系による有意に低められた摂取をもたらすことが示されている（Allen など., Biochim. Biophys. Acta 1068:133 (1991); Allen など., Biochim. Biophys. Acta 1150: 9 (1993)）。
【０４２９】
リポソームはまた、リン脂質組成を変えることによって、又はリポソーム中に受容体又はリガンドを挿入することによって、特定の細胞又は器官を標的化するためにも調製され得る。例えば、高い含有率の非イオン性界面活性剤により調製されたリポソームが、肝臓を標的化するために使用されて来た（Hayakawaなど., 日本特許04-244,018号；Katoなど., Biol. Pharm. Bull. 16:960 (1993)）。それらの配合物は、メタノールにおいて、大豆ホスファチジルコリン、α−トコフェロール及びエトキシル化され、水素付加されたヒマシ油（HCO−60）を混合し、前記混合物を真空下で濃縮し、そして次に、前記混合物を水により再構成することによって調製された。大豆由来のステリルグルコシド混合物（SG）及びコレステロール（Ch）と共にジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）のリポソーム配列物はまた、肝臓を標的化することが示されている（Shimizuなど., Biol. Pharm. Bull. 20:881（1997））。
【０４３０】
他方では、種々の標的化リガンドが、リポソーム、例えば抗体、抗体フラグメント、炭水化物、ビタミン及び輸送タンパク質の表面に結合され得る。例えば、リポソームは、肝臓細胞の表面上で独占的に発現されるアシアログリコプロテイン（ガラクトース）受容体標的化するために、枝分かれ型のガラクトシル脂質誘導体により変性され得る（Kato and Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst. 14: 287 (1997); Murahashiなど., Biol. Pharm. Bull. 20:259 (1997)）。同様に、Wuなど., Hepatology 27: 772 (1988) は、アジアロフェチュインによるリポソームのラベリングが短くされたリポソーム結晶半減期を導き、そしてアジアロフェチュイン−ラベルされたリポソームの肝細胞による摂取を非常に高めたことを示している。
【０４３１】
他方では、枝分かれ型のガラクトシル脂質誘導体を含んで成るリポソームの肝臓蓄積が、アジアロフェチュインの前注入により阻害され得る（Murahashiなど., Biol. Pharm. Bull. 20: 259 (1997)）。ポリアコニチル化されたヒト血清アルブミンリポソームは、肝臓細胞へのリポソームの標的化のためのもう１つのアプローチを提供する（Kamps など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 11681 (1997)）。さらに、Gehoなど., (アメリカ特許第4,603,044号)は、肝臓の特殊化された代謝細胞に関連する肝胆管受容体に対する特異性を有する、肝細胞−指図されたリポソーム小胞供給システムを記載する。さらに、抗−Ztnfr12抗体成分は、Ztnfr12発現細胞、例えばB細胞起源の腫瘍細胞にリポソームを方向づけるために使用され得る。
【０４３２】
組織標的化へのより一般的なアプローチにおいては、標的細胞は、標的細胞により発現されるリガンドに対して特異的な、ビオチニル化された抗体によりプレラベルされる（Harasymなど., Adv. Drug Deliv. Rev. 32: 99 (1998)）。遊離抗体の血漿排除の後、ストレプタビジン−接合されたリポソームが投与される。もう1つのアプローチにおいては、標的化抗体は、リポソームに直接的に結合される（Harasymなど., Adv. Drug. Deliv. Rev. 32: 99 (1998)）。
【０４３３】
Ztnfr12活性を有するポリペプチドは、タンパク質のマイクロカプセル封入の標準技法を用いて、リポソーム内に封入され得る（例えばAndersonなど., Infect. Immun. 31: 1099 (1981), Andersonなど., Cancer Res. 50: 1853 (1990), and Cobenなど., Biochim. Biophys. Acta 1063:95 (1991), Alving など., “Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies,” in Liposome Technology, 2nd Edition, Vol. III, Gregoriadis (ed.), page 317 (CRC Press 1993), Wassef など., Meth. Enzymol. 149: 124 (1987)を参照のこと）。上記に示されるように、治療的に有用なリポソームは、種々の成分を含むことができる。例えば、リポソームは、ポリ（エチレングリコール）の脂質誘導体を含むことができる（Allenなど., Biochim. Biophys. Acta 1150: 9 (1993)）。
【０４３４】
分解性ポリマー微小球が、治療用タンパク質の高い全身レベルを維持するため企画された。微小球は、分解性ポリマー、例えばポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（PLG）、ポリ無水物、ポリ（オルトエステル）、モノ生分解性エチルビニルアセテートポリマー（タンパク質がポリマー封入される）から調製されるGombotz and Pettit, Bioconugate Chem. 6:332 (1995); Ranade, “Role of Polymers in Drug Delivery.” In Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 51-93 (CRC Press 1995); Roskos and Maskiewicz, “Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery,” in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 45-92 (Plenum Press 1997); Bartus など., Science 281:1161 (1998); Putney and Burke, Nature Biotechnology 16:153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548 (1998))。ポリエチレングリコール（PEG）被覆された超微小球はまた、治療用タンパク質の静脈内投与のためのキャリヤーを提供することができる（例えば、Grefなど., Pharm. Biotechnol. 10:167 (1997) を参照のこと）。
【０４３５】
本発明はまた、上記で論じられたように、ポリペプチドがポリマーにより結合されている、Ztnfr12活性を有する化学的に変性されたポリペプチド及びZtnfr12アンタゴニストを企画する。さらに、本発明は、上記で論じられるように、キャリヤー、Ztnfr12ポリペプチド、及びBCMAポリペプチド及びTACIポリペプチドの少なくとも1つを含んで成る組成物、例えば医薬組成物に関する。
【０４３６】
他の用量形は、例えば、Anset and Popovich. Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems. 5th Edition (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remington’s Pharmaceutical sciences. 19th Edition (Mack Publishing Company 1995) により、及びRanade and Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996) により示されるように、当業者により考案され得る。
【０４３７】
例示のように、医薬組成物は、Ztnfr12細胞外ドメイン又はZtnfr12アンタゴニスト（例えば、Ztnfr12ポリペプチドを結合する抗体又は抗体フラグメント）と共に１つのポリペプチドを含んで成る容器を含んで成るキットとして供給され得る。治療用ポリペプチドは、単一又は複数回の用量のための注射用溶液の形で、又は注射の前、再構成されるであろう無菌粉末として供給され得る。他方では、そのようなキットは、治療用ポリペプチドの投与のための乾燥粉末分散機、液体エーロゾル発生機又はネブライザーを包含することができる。そのようなキットはさらに、医薬組成物の指示及び使用法に対する文書での情報を包含する。さらに、そのような情報は、Ztnfr12組成物が、Ztnfr12に対する既知の過敏性を有する患者に禁忌を示される提示も包含することができる。
【０４３８】
13．Ztnfr12ヌクレオチド配列の治療的使用
本発明は、Ztnfr12を、そのような処理の必要な対象に供給するためへのZtnfr12ヌクレオチド配列の使用を包含する。Ztnfr12活性の増強は、免疫抑制疾患の処理の一部として有用であリ得る。さらに、Ztnfr12遺伝子発現を阻害する治療用発現ベクター、例えばアンチセンス分子、リボザイム又は外部案内配列分子が供給され得る。ZTNF4活性の阻害は、ZTNF4を結合せず、又はZTNF4との結合に続いてシグナルを生成しない（例えば、Ztnfr12細胞内ドメインにおける突然変異のために）Ztnfr12受容体の形をコードする発現ベクターを導入することによって達成され得る。家畜治療用途又はヒト治療用途に関しては、そのような核酸分子は、上記で論じられるように、障害又は疾病を有する対象に投与され得る。上記で論じられた１つの例として、Ztnfr12−免疫グロブリン融合タンパク質をコードする核酸分子は、全身性エリトマトーデスの長期治療のために使用され得る。
【０４３９】
Ztnfr12を発現する組換え宿主細胞の使用、Ztnfr12をコードする裸の核酸の供給、Ztnfr12をコードする核酸分子と共にカチオン性脂質キャリヤーの使用、及びZtnfr12を発現するウィルス、例えば組換えレトロウィルス、組換えアデノ−関連ウィルス、組換えアデノウィルス、及び組換えヘルペス単純ウィルス（HSV）の使用を包含する、Ztnfr12遺伝子を対象に導入するための多くのアプローチが存在する（例えば、Mulligan, Science 260: 926 (1993), Rosenberg など., Science 242: 1575 (1988), LaSalle など., Science 250: 988 (1993), Wolffなど., Science 247: 1465 (1990), Breakfield and Deluca, The New Biologist 3: 203 (1991) を参照のこと）。エクスビボアプローチにおいては、細胞が対象から単離され、Ztnfr12遺伝子を発現するベクターによりトランスフェクトされ、そして次に、対象中に移植される。
【０４４０】
Ztnfr12遺伝子の発現をもたらすために、Ztnfr12遺伝子をコードするヌクレオチド配列が、遺伝子転写を制御するために、コアプロモーター及び任意には、調節要素に作用可能に連結される発現ベクターが構成される。発現ベクターの一般的な必要性は、上記に記載されている。
【０４４１】
他方では、Ztnfr12遺伝子は、組換えウィルスベクター、例えばアデノウィルスベクター（例えば、Kass-Eister など., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 90: 11498 (1993), Kolis など., proc. Nat’l Acad. Sci. USA 91: 215 (1994), Liなど., Hum. Gene Ther. 4;403 (1993), Vincent など., Nat. Genet. 5:130 (1993), and Zabner など., Cell 75: 207 (1993)）、アデノウィルス−関連ウィルスベクター（Flotteなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10613 (1993)）、アルファウィルス、例えば“Semliki Forest ウィルス及びSindbisウィルス（Hertz and Huang, J. Vir. 66: 857 (1992), Raju and Huang, J.vir. 65:2501 (1991), 及びXiongなど., Science 243: 1188 (1989)）、ヘルペスウィルスベクター（Koeringなど., Hum. Gene. Therap. 5: 457 (1994)）、
【０４４２】
ポックスウィルスベクター（Ozakiなど., Biochem. Biophys. Res. Comm. 193: 653 (1993), Panicali and Paoietti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 4927 (1982)）、ポックスウィルス、例えばカナリヤポックスウィルス又はワクシニアウィルス（Fisher-Hochなど., Proc. Hatl. Acad. Sci. USA 86: 317 (1989) 及びFlexner など., Ann. N. Y. Acad. Sci. 569: 86 (1989)）、及びレトロウィルス（Baba など., J. Neurosurg 79: 729 (1993), Ram など., Cancer Res. 53:83 (1993), Takamiyaなど., J. Neurosci. Res. 33: 493 (1992), Vile and Hart, Cancer Res. 53: 962 (1993), Vile and Hart, Cancer Res. 53: 3860 (1993) 及びAndersonなど., アメリカ特許第5,399,346号）を用いて供給され得る。種々の態様においては、ウィルスベクター自体又はウィルスベクターを含むウィルス粒子のいずれかが、下記に記載される方法及び組成物に使用され得る。
【０４４３】
１つシステムの例示として、アデノウィルス、すなわち二本鎖DNAウィルスは、異種核酸分子の供給のための十分に特徴づけられた遺伝子トランスファーベクターである（Beckerなど., Meth. Cell Biol. 43:161 (1994); Douglas and Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997)）。アデノウィルスシステムは、次のいくつかの利点を提供する：（ｉ）比較的大きなDNA挿入体を収容する能力、（ii）高い力価に増殖する能力、（iii）広範囲の哺乳類細胞型を感染する能力、及び（iV）多くの異なったプロモーター、例えば遍在性で、組織特異的な、及び調節できるプロモーターと共に使用される能力。さらに、アデノウィルスは、そのウィルスが血流において安定しているので、静脈内注射により投与され得る。
【０４４４】
アデノウィルスゲノムの一部が欠失されているアデノウィルスベクターを用いて、挿入体は、直接的な連結により、又は同時トランスフェクトされたプラスミドによる相同組換えにより、ウィルスDNA中に組み込まれる。典型的なシステムにおいては、必須E1遺伝子がウィルスベクターから欠失され、そしてウィルスは、E1遺伝子が宿主細胞により供給されない場合、複製しないであろう。損なわれていない動物に静脈内供給される場合、アデノウィルスは主に、肝臓を標的化する。E1遺伝子欠失を有するアデノウィルス供給システムが宿主細胞において複製しない場合、宿主の組織は、コードされた異種タンパク質を発現し、そしてプロセッシングするであろう。宿主細胞はまた、その対応する遺伝子が分泌シグナル配列を含む場合、異種タンパク質を分泌するであろう。分泌されたタンパク質は、異種遺伝子を発現する組織（例えば、高く血管化された肝臓）から循環に侵入するであろう。
【０４４５】
さらに、ウィルス遺伝子の種々の欠失を含むアデノウィルスベクターは、そのベクターに対する免疫応答を低めるか又は排除するために使用され得る。そのようなアデノウィルスは、E1−欠失され、そしてさらに、E2A又はE4の欠失を含む（Luskyなど., J. Virol. 72: 2022 (1998); Raper など., Human Gene Therapy 9: 671 (1998)）。E2bの欠失はまた、免疫応答を低めることが報告されている（Amalfitanoなど., J. Virol. 72:926 (1998)）。完全なアデノウィルスゲノムを欠失することによって、異種DNAの非常に大きな挿入体が収容され得る。すべてのウィルス遺伝子が欠失されている、いわゆる“不活性（gutless）”アデノウィルスの生成は、異種DNAの大きな挿入体の挿入のために特に好都合である（Yeh and Perricaudet, FASEB J. 11: 615 (1997) を参照のこと）。
【０４４６】
治療用遺伝子を発現できる組換えウィルスの高い力価のストックが、標準方法を用いて、感染された哺乳類細胞から得られる。例えば、組換えHSVは、Vero細胞において、Brandtなど., J. Gen. Virol. 72: 2043 (1991), Herold など., J. Gen. Virol. 75:1211 (1994), Visalli and Brandt, Virology 185:419 (1991), Grauなど., Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 30: 2474 (1989), Brandiなど., J. Virol. Meth. 36:209 (1992), 及びBrawn and MacLean (eds.), HSV Virus Protocols (Human Press 1997) により記載のようにして、調製され得る。
【０４４７】
他方では、Ztnfr12遺伝子を含んで成る発現ベクターは、リポソームを用いてのインビボリポフェクションにより、対象の細胞に導入され得る。合成カチオン脂質が、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製するために使用され得る（Felgner など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-17, 1987; 及びMackey など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8027-31, 1988）。インビボで特定の器官中に外因遺伝子を導入するためへのリポフェクションの使用は、一定の実際的な利点を有する。特定細胞型へのトランスフェクションの方向づけが、細胞異質性を有する組織、例えば膵臓、肝臓、腎臓及び脳において特に好都合であることは明白である。脂質は、標的化のために他の分子に化学的に得られる。標的化されたペプチド（例えば、ホルモン又は神経伝達物質）、タンパク質、例えば抗体又は非ペプチド分子は、化学的にリポソームに結合され得る。
【０４４８】
エレクトロポレーションは、投与のもう１つの態様である。例えば、Aihara and Miyazaki, Nature Biotechnology 16: 867 (1998) は、筋肉中への遺伝子トランスファーのためへのインビボエレクトロポレーションの使用を示している。
遺伝子療法へのもう1つのアプローチにおいては、治療用遺伝子は、Ztnfr12の発現を阻害するZtnfr12アンチセンスRNAをコードすることができる。アンチセンス分子のための適切な配列は、本明細書に開示されるZtnfr12のヌクレオチド配列から誘導され得る。
【０４４９】
他方では、調節要素がリボザイムをコードするヌクレオチド配列に作用可能に連結される発現ベクターが構成され得る。リボザイムは、mRNA分子における一定の標的配列に向けられるエンドヌクレアーゼ活性を発現するよう企画され得る（例えば、Draper and Macejak, アメリカ特許第5,496,698号、McSwiggen, アメリカ特許第5,525,468号、Chowrira and McSwiggen, アメリカ特許第5,631,369号及びRobertson and Goldberg, アメリカ特許第5,225,337号を参照のこと）。本発明においては、リボザイムはZtnfr12 mRNAと結合するヌクレオチド配列を包含する。
【０４５０】
もう１つのアプローチにおいては、調節要素がZtnfr12遺伝子をコードするmRNA分子のRNアーゼP−介在性切断を促進できるRNA転写体の生成を方向づける発現ベクターが構成され得る。このアプローチによれば、外部案内配列が、細胞リボザイムにより続いて切断される、特定種の細胞内mRNAに内因性リボザイム、すなわちRNアーゼPを向けるために構成され得る（例えば、Altmanなど., アメリカ特許第5,168,053号、Yuanなど., Science 263: 1269 (1994), Paceなど., WO96/18733号、Georgeなど., WO96/21731号及びWemerなど., WO97/33991号を参照のこと）。例えば、前記外部案内配列は、Ztnfr12 mRNAに対して相補的な10〜15個のヌクレオチド配列、及び3’−NCCAヌクレオチド配列（ここで、Nは好ましくはプリンである）を含んで成る。外部案内配列転写体は、mRNAと相補的外部案内配列との間での塩基対の形成により、標的化されたmRNA種に結合し、従って、前記塩基対合された領域の5’側に位置するヌクレオチドでのRNアーゼPによるmRNAの切断を促進する。
【０４５１】
一般的に、Ztnfr12ヌクレオチド酸配列を有する治療用ベクター、例えば組換えウィルスを含んで成る組成物の用量は、対照の年齢、体重、身長、性別、一般的な医学的状態及びこれまでの医学的歴史のような要因に依存して変化するであろう。治療用ベクターの適切な投与経路は、静脈内注射、動脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、腫瘍内注射、及び腫瘍を含む腔中への注射を包含する。例示のように、Hortonなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 1553 (1999)は、インターフェロン−αをコードするプラスミドDNAの筋肉内注射がネズミモデルにおいて一次及び転移性腫瘍に対する可能性ある抗腫瘍効果を生成することを示す。
【０４５２】
本発明のウィルスベクター、非ウィルスベクター又はウィルス及び非ウィルスベクターの組み合わせを含んで成る組成物は、医薬的に有用な組成物を調製するための既知方法に従って配合され得、それによれば、ベクター又はウィルスは、医薬的に許容できるキャリヤーと共に混合される。上記で示されるように、組成物、例えばリン酸緩衝溶液は、その投与が受容体対象により許容され得る場合、“医薬的に許容できるキャリヤー”であると言われる。他の適切なキャリヤーは、当業者に良く知られている（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995), 及びGilman’s the Pharmacological Basis of Therapeutics, 7th Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985) を参照のこと）。
【０４５３】
治療のためには、治療用遺伝子ベクター、又はそのようなベクターを含んで成る組換えウィルス、及び医薬的に許容できるキャリヤーが、治療的有効量で対象に投与され得る。発現ベクター（又はウィルス）及び医薬的に許容できるキャリヤーの組み合わせは、投与される量が生理学的に有意である場合、“治療的有効量”で投与されると言われる。剤は、その存在が受容体対象の生理学において検出できる変化をもたらす場合、生理学的に有意である。例えば、炎症を処理するために使用される剤は、その存在が炎症応答を緩和する場合、生理学的に有意である。もう１つの例として、腫瘍細胞の増殖を阻害するために使用される剤は、その剤の投与が腫瘍細胞の数の低下、低められた転移、固形腫瘍のサイズの低下、又は腫瘍の低められた壊死をもたらす場合、生理学的に有意である。
【０４５４】
治療用遺伝子発現ベクター又は組換えウィルスにより処理される対象がヒトである場合、治療は好ましくは、体細胞遺伝子治療である。すなわち、治療用遺伝子発現ベクター又は組換えウィルスによるヒトの好ましい処理は、ヒト生殖細胞系の一部を形成し、そして次の世代に通され得る核酸分子を細胞中に導入すること（すなわち、ヒト生殖系遺伝子治療）を必要としない。
【０４５５】
14．治療的に有用な免疫接合体
本発明は、上記で論じられたように、裸抗−Ztnfr12抗体（又はその裸抗体フラグメント）の使用、及び種々の疾病、例えばB−細胞悪性疾患の処理をもたらすためへの免疫接合体の使用に関する。免疫接合体は、標準技法を用いて調製され得る。例えば、免疫接合体は、抗体成分に治療剤を間接的に接合することによって生成され得る（例えば、Shihなど., Int. J. Cancer41: 832-839 (1988); Shihなど., Int. J. Cancer 46: 1101-1106 (1990); 及びShihなど., アメリカ特許第5,057,313号を参照のこと。
【０４５６】
手短には、１つの標準アプローチは、酸化された炭水化物部分を有する抗体成分と、少なくとも１つの遊離アミン機能を有し、そして多くの薬剤、トキシン、キレート化剤、硼素付加物又は他の治療材を負荷されているキャリヤーポリマーとを反応せしめることを包含する。この反応は、最終接合体を形成するために第二アミンへの還元により安定化され得る初期シェフ塩基（イミン）連結をもたらす。
【０４５７】
前記キャリヤーポリマーは、他の実質的に同等のポリマーキャリヤーがまた使用され得るが、少なくとも50個のアミノ酸残基のアミノデキストラン又はポリペプチドであり得る。好ましくは、最終免疫接合体は、投与の容易性及び治療への使用のためへの効果的標的化のために、水溶液、及び哺乳類血清に可溶性である。従って、キャリヤーポリマー上の安定化官能基は、最終免疫接合体の血清溶解を増強するであろう。
【０４５８】
ポリペプチド治療剤を含んで成る免疫接合体を生成するための他のアプローチにおいては、治療剤は、グルタアルデヒド縮合により、又はポリペプチド上の活性化されたカルボキシ基とアミノデキストラン上のアミンとの反応によりアミノデキストランに結合される。キレート化剤は、放射性金属又は磁気共鳴エンハンサーを含んで成る免疫接合を調製するために抗体成分に結合され得る。例示的キレート化剤は、エチレンジアミン四酢酸及びジエチレントリアミン五酢酸の誘導体を包含する。硼素付加物、例えばカルボランは従来の方法により抗体成分に結合され得る。
【０４５９】
免疫接合体はまた、治療剤と抗体成分とを直接的に接合することによって調製され得る。その一般的方法は、間接的接合方法に類似し、但し治療剤は酸化された抗体成分に直接的に結合されている。
【０４６０】
さらなる例示として、治療剤は、ジスルフィド結合形成を通して、還元された抗体分分のヒンジ領域で結合され得る。例えば、テタヌストキシンペプチドは、抗体成分にペプチドを結合するために使用される単一のシステイン残基により構成され得る。他の手段として、そのようなペプチドは、ヘテロ二官能価架橋剤、例えばN−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオーネートを用いて、抗体成分に結合され得る。
【０４６１】
そのような接合についての一般的技法は、当業界において知られている。例えば、Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking (CRC Press 1991); Upeslacisなど., “ Modification of Antibodies by Chemical Methods” in Monoclonal Antibodies; Principles and Applications, Birchなど. (eds.), pages187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, “Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies” in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritterなど., (eds.), Pages 60-84 (Cambridge University Press 1995) を参照のこと。
【０４６２】
上記のように、抗体のFc領域における炭水化物成分は、治療剤を接合するために使用され得る。しかしながら、Fc領域は、抗体フラグメントが免疫接合体の抗体成分として使用され得る場合、不在である。それにもかかわらず、抗体又は抗体フラグメントのL鎖可変領域中に炭水化物成分を導入することが可能である。例えば、Leungなど., J. Immunol. 154: 5919 (1996); Hansen など., アメリカ特許第5,443,953号（1995）を参照のこと。次に、構築された炭水化物成分が、治療剤を結合するために使用される。
【０４６３】
さらに、当業者は、接合方法の多くの可能性ある変法を認識するであろう。例えば、炭水化物成分は、血液、リンパ又は他の細胞外流体における損なわれていない抗体又はその抗原−結合フラグメントの半減期を拡張するために、ポリエチレングリコールを結合するために使用され得る。さらに、炭水化物成分又は遊離スルフヒドリル基に治療剤を結合することによって、二価の免疫接合体を構成することが可能である。そのような遊離スルフヒドリル基は、抗体成分のヒンジ領域に位置することができる。
【０４６４】
１つのタイプの免疫接合体は抗体成分及びポリペプチド細胞毒素を含んで成る。適切なポリペプチド細胞毒素の例は、リボソーム不活性化タンパク質である。I型リボソーム不活性化タンパク質は一本鎖タンパク質であり、そしてII型リボソーム不活性化タンパク質は、ジスルフィド結合により連結される非同一のサブユニット（A及びB鎖）から成る（再考のためには、Soriaなど., Targeted Diagn. Ther. 7: 193 (1992) を参照のこと）。
【０４６５】
有用なI型リボソーム不活性化タンパク質は、次のものを包含する：サポナリア・オフィシナリス（Saponaria officinalis）(例えば、サポリン−１、サポリン−２、サポリン−３、サポリン−６)、モモルジカ・カランチア（Momordica charantia）(例えば、モモルジン)、ビロニア・ジオイカ（Byronia dioica）(例えば、ブリオジン、ブリオジン−２)、トリコサンテス・キリロウイ（Trichosanthes kirilowii）(例えば、トリコサンチン、トリコキリン)、ゲロニウム・ムルチフロラム（Gelonium multiflorum）(例えば、ゲロニン)、フィトロカ・アメリカナ（Phytolacca americana）(例えば、ヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質、アマゴボウ抗ウィルスタンパク質−II、抗ウィルスタンパク質)、及び同様のものからのポリペプチド。リボソーム不活性化タンパク質は、例えばアメリカ特許5,635,386号（Walshなど.,）により記載される。
【０４６６】
適切なII型リボソーム不活性タンパク質は、リシナス・コムニス（Ricinus communis）(例えば、リシン)、アブラス・プレカトリウム（Abrus precatorius）(例えば、アブリン)、アデニア・ディジタタ（Adenia digitata）（例えば、モデシン）、及び同様のものからのポリペプチドを包含する。II型リボソーム不活性化タンパク質は、ガラクトシドを結合するB鎖、及びアデンソインを浄化する毒性A鎖を包含するので、II型リボソーム不活性化タンパク質接合体はA鎖を包含するべきである。
【０４６７】
追加の有用なリボソーム不活性化タンパク質は、ボウガニン（bouganin）、クラビン、トウモロコシリボソーム不活性化タンパク質、バカリア・ピラミダタ（Vaccaria pyramidata）リボソーム不活性化タンパク質、ニグリンb, 塩基性ニグリン１、エブリン、ラセモシンｂ、ルフィン−ａ、ルフィン−ｂ、ルフィン−S及び当業者に知られている他のリボソーム不活性化タンパク質を包含する。
【０４６８】
例えば、Bolognesi and Stripeによる国際公開番号WO98/55623号、Colnaghiなどによる国際出願番号WO97/49726号、Heyなどによるアメリカ特許第5,635,384号、Bolognesi and Stripeによる国際公開番号WO95/07297号、Ariasなどによる国際公開番号WO94/20540号、Watanabeなど., J. Biochem. 106: 6977 (1989); Islam など., Agric. Biol. Chem. 55: 229 (1991), 及びGaoなど., FEBS Lett. 347: 257 (1994) を参照のこと。
【０４６９】
天然に存在するリボソーム不活性化タンパク質はまた、本明細書に記載される標的化組成物のためにも適切であり、そしてそのようなタンパク質は当業者に知られている。リボソーム不活性化タンパク質は、公的に入手できるアミノ酸及びヌクレオチド配列を用いて生成され得る。例示のように、サポリン−６をコードするヌクレオチド配列は、Lorenzettiなど., アメリカ特許第5,529,932号により開示され、そしてWalshなど., アメリカ特許第5,635,384号は、トウモロコシ及び大麦リボソーム不活性化タンパク質ヌクレオチド及びアミノ酸配列を記載する。さらに、リボソーム不活性化タンパク質はまた市販されている。
【０４７０】
追加のポリペプチド細胞毒素は、リボヌクレアーゼ、DNアーゼI、ブドウ球菌エンテロトキシン−A、ジフテリア毒素、シュードモナスエキソトキシン及びシュードモナスエンドトキシンを包含する。例えば、Pastanなど., Cell 47: 641 (1986), 及びGoldenberg, CA A Cancer Journal for Clinicians 44: 43 (1994) を参照のこと。他の適切なトキシンは、当業者に知られている。
【０４７１】
もう１つの一般的なタイプの有用な細胞毒素は、チロシンキナーゼインヒビターである。チロシンキナーゼによる増殖の活性化は腫瘍の進行及び経過において役割を演じることが示されているので、この活性化は、チロシンキナーゼインヒビターを供給するZtnfr12抗体成分により阻害され得る。適切なチロシンキナーゼインヒビターは、イソフラボン、例えばゲニステイン（5, 7, 4’−トリヒドロキシイソフラボン）、ダイゼン（7, 4’−ジヒドロキシイソフラボン）及びビオカニンA（４−メトキシゲニステイン）及び同様のものを包含する。成長因子にチロシンインヒビターを接合する方法は、例えばアメリカ特許第5,911,995号（Uckun）により記載される。
【０４７２】
もう１つのグループの有用なポリペプチド細胞毒素は、免疫モジュレーターを包含する。本明細書に使用される場合、“免疫モジュレーター”とは、サイトカイン、幹細胞成長因子、リンフォトキシン、同時刺激分子、造血因子及び同様のもの、並びにそれらの分子の合成類似体を包含する。免疫モジュレーターの例は、壊死因子、インターロイキン（例えば、インターロイキン−１（IL−１）、IL−２〜IL−21）、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球−コロニー刺激因子及び顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、−β、−γ、−ω及び−τ）、“S１因子”と称する幹細胞成長因子、エリトロポエチン及びトロンボポエチンを包含する。例示的な免疫モジュレーター成分は、IL−２、IL−６、IL−10、インターフェロン−γ、TNF−α及び同様のものを包含する。
【０４７３】
免疫モジュレーターを含む免疫接合体は、免疫モジュレーターを標的細胞に供給するための手段を提供し、そして腫瘍細胞に対して特に有用である。免疫モジュレーターの細胞毒性効果は、当業者に良く知られている。例えば、Klegermanなど、“Lymphokines and Monokines”, in Biotechnology and pharmacy, Pessutoなど. (eds.), pages 53-70 (Chapman & Hall 1993) を参照のこと。例示のように、インターフェロンは、種々の細胞の表面上でのクラスI組織適合性抗原の高められた発現を誘発することによって細胞増殖を阻害し、そして従って、細胞毒性Tリンパ球による細胞の破壊速度を増強する。さらに、腫瘍壊死因子、例えば腫瘍壊死因子−αは、DNA断片化を誘発することによって、細胞毒性効果を生成すると思われる。
【０４７４】
本発明はまた、細胞毒素をコードする核酸分子を含んで成る免疫接合体を包含する。このアプローチの例として、Hogansonなど., Human Gene Ther. 9: 2565 (1998) は、サポリン遺伝子を含んで成る発現ベクターにより縮合されたFGF−２−ポリリシン接合体を生成することによって、サポリン遺伝子のFGF−２介在性供給を記載する。
他の適切な毒素は、当業者に知られている。
【０４７５】
細胞毒性ポリペプチド及び抗体成分の接合体は、ポリペプチドを接合するための標準の技法を用いて調製され得る。例えば、Lam and Kelleher, アメリカ特許第5,055,291号は、ジフテリア毒素フラグメントA又はリシン毒素のいずれかにより接合される抗体の生成を記載する。一般的なアプローチはまた、Lappiなど., Biochem. Biophys. Res. Commun. 160: 917 (1989), Soria など., Targeted Diagn. Ther. 7: 193 (1992), Buechlerなど., Eur. J. Biochem. 234: 706 (1995), Behar-Cohenなど., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 36: 2434 (1995), Lappi and Baird, アメリカ特許第5,191,067号、Calabresiなど.,アメリカ特許第5,478,804号、及びLappi and Baird, アメリカ特許第5,576,288号により記載されるように、サポリンによる線維芽細胞成長因子の接合方法により例示される。
【０４７６】
また、Ghetie and Vitteta, “Chemical Construction of Immunotoxin”, in Drug Targetting: Strategies, Principles, and Applications, Francis and Delgado (Eds.), pages 1-26 (Humana Press, Inc. 2000), Hall (Ed.), Immunotoxin Methods and Protocols (Humana Press, Inc. 2000), 及びNewton and Rybak, “Construction of Ribonuclease-Antibody Conjugates for Selective Cytotoxicity”, in Drug Targeting: Strategies, principles and Applications, Francis and Delgade (Eds.), pages 27-35 (Humana Press, Inc. 2000) を参照のこと。
【０４７７】
一方では、抗体成分及び細胞毒素ポリペプチドを含んで成る融合タンパク質は、標準の方法を用いて生成され得る。細胞毒素ポリペプチド成分を含んで成る融合タンパク質を調製するための方法は、抗体−毒素融合タンパク質生成の業界において良く知られている。例えば、インターロイキン−２成分を含んで成る抗体融合タンパク質は、Boletiなど., Ann. Oncol. 6: 945 (1995), Nicoletなど., Cancer Gene Ther. 2: 161 (1995), Beckerなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7826 (1996), Hankなど., Clin. Cancer Res. 2: 1951 (1996), 及びHuなど., Cancer Res. 56: 4998 (1996) により記載されている。さらに、Yangなど., Hum. Antibodies Hybridomas 6: 129 (1995) は、F(ab’)2 フラグメント及び腫瘍壊死因子−α成分を含む融合タンパク質を記載する。
【０４７８】
抗体−シュ−ドモナスエキソトキシンA融合タンパク質は、Chaudharyなど., Nature 339：394（1989）、Brinkmannなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8616 (1991), Batraなど., proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5867 (1992), Friedmanなど., J. Immunol. 150: 3054 (1993), Wels など., Int. J. Can. 60: 137 (1995), Fominayaなど., J. Biol. Chem. 271: 10560 (1996), Kuan など., Biochemistry 35: 2872 (1996), 及びSchmidtなど., Int. J. Can. 65: 538 (1996) により記載されている。
【０４７９】
ジフテリア毒素成分を含む抗体−毒素融合タンパク質は、Kreitmanなど., keukemia 7: 553 (1993), Michollsなど., J. Biol. Chem. 268: 5302 (1993), Thompsonなど., J. Biol. Chem. 270: 28038 (1995), 及びValleraなど., Blood 88: 2342 (1996) により記載されている。Deonarainなど., Tumor Targetting 1: 177 (1995) はRNアーゼ成分を有する抗体−毒素融合タンパク質を記載しており、そしてLinardouなど., Cell Biophys. 24-25: 243 (1994) は、DNアーゼI成分を含んで成る抗体−毒素融合タンパク質を生成した。
【０４８０】
ゲロニンは、Betterなど., J. Biol. Chem. 270: 14951 (1995) の抗体−毒素融合タンパク質における毒素成分として使用された。さらなる例として、Dohlstenなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8945 (1994) は、ブドウ球菌エンテロトキシン−Aを含んで成る抗体−毒素融合タンパク質を報告している。また、Newton and Rybak, “Preparation of Recombinant Rnase Sigle-Chain Antibody Fusion Proteins”, in Drug Targeting: Strategies, Principles, and Applications, Francis and Delgado (Eds.), pages 77-95 (Humana press, Inc. 2000) を参照のこと。
【０４８１】
ポリペプチド細胞毒性に代わるものとして、免疫接合体は、細胞毒素成分として放射性同位体を含むことができる。例えば、免疫接合体は、抗−Ztnfr12成分及びα−放射性同位体、β−放射性同位体、γ−放射性同位体、Auger電子エミッター、α−粒子を放射する中性子捕獲剤、及び電子保護により崩壊する放射性同位体を含むことができる。適切な放射性同位体は次のものを包含する：198Au, 199Au, 32P, 33P, 125I, 131I, 123I, 90Y, 186Re, 188Re, 67Cu, 211At, 47Sc, 103Pb, 109Pd, 212Pb, 71Ge, 77As, 105Rh, 113Ag, 119Sb, 121Sn, 131Cs, 143Pr, 161Tb, 177Lu, 191Os, 193MPt, 197Hg及び同様のもの。
【０４８２】
放射性同位体は、抗体成分に、キレート化剤を通して直接的に、又は間接的に接合され得る。例えば、β−粒子及びγ−線を供給する放射性同位体であると思われる67Cuは、キレート化剤、すなわちp−ブロモアセトアミド−ベンジル−テトラエチルアミノ四酢酸を用いて、抗体成分に接合され得る。（Chase and Shapiro, “Medical Applications of Radioisotopes”, in gennaro (ed.), Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th Edition, p. 943-865 (Mack Publishing Company 1995)）。
【０４８３】
他のものとして、エネルギッシュなβ−粒子を放射する90Yはジエチレントリアミン五酢酸を用いて、抗体成分に結合され得る。さらに、131Iによる抗体成分の直接的な放射性ラベリングのための典型的な適切な方法は、Steinなど., Antibody Immunoconj. Radiopharm. 4: 703 (1991) により記載される。他方では、硼素添加物、例えばカルボランが、標準技法を用いて、抗体成分に結合され得る。
【０４８４】
免疫接合体の調製のためのもう１つの型の適切な細胞毒素は、化学療法薬物である。例示的な化学療法薬物は、窒素マスタード、アルキルスルホネート、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、抗生物質、エピポドフィロトキシン、白金配位錯体、及び同様のものを包含する。化学療法薬物の特定の例は、メトトレキサート、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シトシンアラビノシド、シス−プラチン、ビンデシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、メルファラン、クロラムブシル、マイタンシノイド、カリケアマイシン、タキサノール及び同様のものを包含する。適切な化学療法剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mark Publishing Co. 1995), 及びGoodman and gilman’s The Pharmacological basis of Therapeutics, 7th Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985) に記載される。他の適切な化学治療剤は、当業者に知られている。
【０４８５】
もう１つのアプローチにおいては、免疫接合体は、抗体成分に光活性剤又は色素を接合することにより調製される。蛍光及び他の色原体、又は例えば可視光に対して敏感なポルフィリンは、病変に対して適切な光を向けることによって、病変を検出し、そして処理するために使用されて来た。このタイプの“光放射線”、“光治療”又は“光力学”療法は、例えばMewなど., J. Immunol. 130; 1473 (1983), Joriなど. (eds.), Photodynamic Therapy of Tumors and Other Diseases (Libreria Progetto 1985), oseroffなど., proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8744 (1986), van den Bergh, Chem. Britain 22: 430 (1988), Hasanなど., prog. Clin. Biol. Res. 288: 471(1989), Tatsutaなど., Lasers Surg. Med. 9: 422 (1989), 及びPelegrinなど., Cancer 67: 2529 (1991) により記載される。
【０４８６】
治療のために使用される免疫接合体は、医薬的に許容できる水溶性ポリマー成分を含んで成ることができる。そのようなポリマーを結合するための方法は、当業者に知られており、そしてそれまで記載されて来た。
上記アプローチはまた、免疫接合体を含んで成る多特異的抗体組成物を調製するためにも使用され得る。ポリペプチド細胞毒素はまた、抗体成分への接合の前又は後、上記方法を用いて、適切なポリマーにより接合され得る。可溶性ポリマーはまた、抗体融合タンパク質により接合され得る。
【０４８７】
一般的に、抗−Ztnfr12免疫接合体は、Ztnfr12ポリペプチドの治療使用に関して前で論じられたようにして投与され得る。裸抗−Ztnfr12抗体又は抗体フラグメントは、免疫接合体又は抗体融合タンパク質投与により補充され得る。１つの変法においては、裸抗−Ztnfr12抗体（又は裸抗体フラグメント）は、低用量の放射性ラベルされた抗−Ztnfr12抗体又は抗体フラグメントと共に投与される。第２の変法として、裸抗−Ztnfr12抗体（又は抗体フラグメント）は、低用量の放射性ラベルされた抗−Ztnfr12抗体−サイトカイン免疫接合体と共に投与される。
【０４８８】
第３の変法として、裸抗−Ztnfr12抗体（又は抗体フラグメント）は、放射性ラベルされていない抗−Ztnfr12−サイトカイン免疫接合体と共に投与される。“低用量”の131I−ラベルされた免疫接合体に関しては、好ましい用量は、15〜40mCiであり、そして最も好ましい範囲は20〜30mCiである。対照的に、好ましい用量の90Y−ラベルされた免疫接合体は10〜30mCiであり、そして最も好ましい範囲は10〜20mCiである。同様に、二特異的抗体成分は、免疫接合体又は抗体融合タンパク質投与により補充される。
【０４８９】
熱中性子活性化治療のための硼素添加された−負荷キャリヤーを有する免疫接合体は通常、類似する手段でもたらされるであろう。しかしながら、中性子照射が行われる前、標的化されていない免疫接合体がクリアランスになるまで待つことが好都合である。クリアランスは、免疫接合体に結合する抗体を用いて促進され得る。この一般的原理の記載については、アメリカ特許第4,624,846号を参照のこと。
【０４９０】
本発明はまた、免疫モジュレーターが、正常細胞及び特に造血細胞の放射線−誘発された、又は薬剤−誘発された毒性を妨げるか、移動せしめるか又は逆転するために投与される処理方法にも関する。付加的免疫モジュレーター療法は、受容体哺乳類の高められた耐性のために、より高い用量の細胞毒性剤の投与を可能にする。さらに、付加的免疫モジュレーター療法は、用量制限の骨髄毒性を妨げるか、軽減するか又は逆転することができる。付加的療法のための適切な免疫モジュレーターの例は、顆粒球−コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子、トロンボポイエチン、IL−１、IL−３、IL−12及び同様のものを包含する。付加的免疫モジュレーター治療方法は、アメリカ特許第5,120,525号（Goldenberg）により開示される。
【０４９１】
抗−Ztnfr12抗体及び免疫接合体は、Ztnfr12ポリペプチド及びZtnfr12融合タンパク質の評価について上記に記載される、インビトロアプローチ及び動物モデルを用いて試験され得る。
【０４９２】
抗−Ztnfr12抗体療法の効能は、本明細書に記載される免疫接合体及び他の形の補充療法により裸抗体成分を補充することによって増強され得る。そのような多様レジメにおいては、補充治療組成物は、裸抗−Ztnfr12抗体の投与の前、それと同様に又はその後、投与され得る。本発明の多様性療法はさらに、抗−Ztnfr12免疫接合体の投与により補充される補抗−Ztnfr12抗体成分による免疫治療を包含する。もう１つの形の多様性治療においては、対象は、裸抗−Ztnfr12抗体及び標準の癌化学療法を受ける。
【０４９３】
医薬組成物は、抗−Ztnfr12抗体成分又は二特異的抗体成分を含んで成る容器を含んで成るキットとして供給され得る。治療分子は、単一又は複数回用量のための注射用溶液の形で、又は注射の前、再構成される無菌粉末として提供され得る。他方では、そのようなキットは、抗−Ztnfr12抗体成分の投与のための乾燥−粉末分散器、液体エアロゾル発生器又はネブライザーを包含することができる。そのようなキットはさらに、医薬組成物の表示及び使用法についての文章情報を含んで成る。さらに、そのような情報は、前記組成物が外因性抗体に対して既知の過敏性を有する患者において禁忌を示される言明を包含することができる。
【０４９４】
15．トランスジェニックマウスの生成
トランスジェニックマウスは、すべての組織において、又は組織−特異的又は組織に好ましい調節要素の制御下で、Ztnfr12遺伝子を過剰発現するよう構築され得る。Ztnfr12のそれらの過剰生成体は、過剰発現に起因する表現型を特徴づけるために使用され得、そしてトランスジェニック動物は過剰Ztnfr12により引き起こされるヒト疾病のためのモデルとして作用することができる。Ztnfr12を過剰発現するトランスジェニックマウスはまた、大きな動物の乳汁又は血液におけるZtnfr12、例えば可溶性Ztnfr12の生成のためのモデル生物反応体を提供する。
【０４９５】
トランスジェニックマウスを生成するための方法は、当業者に良く知られている（例えば、Jacob, “Expression and Knockout of interferons in Transgenic Mice,” in Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (ed.), Pages 111-124 (Academic Press, Ltd. 1994), Monastersky and Robl (eds.), Strategies in Transgenic Animal Science (ASM Press 1995), and Abbud and Nilson, “Recombinant Protein Expression in Transgeic Mice,” in Gen Expression Systems: using Nature for the Art of Expression, Fernandez and Hoeffler (eds.), pages 367-397 (Academic Press, Inc. 1999)を参照のこと）。
【０４９６】
例えば、Ztnfr12遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを生成するための方法は、成熟した受精能雄（種マウス）（B6C3f1, 生後２−８ヶ月（Tacomic Farms, Germantown, NY））、精管切除された雄（duds）(B6D2f1, ２−８ヶ月(Taconic Farms）)、 思春期直前受胎能雌（ドナー）（B6C3f1, 4-5週（Taconic Farms））、及び成熟した受胎能雌（受容体）（B6D2f1, ２−４ヶ月（taconic farms））により開始することができる。ドナーは、１週間、気候順応化され、そして次に、約８IU/マウスのPregnant Mare’s Serum ゴナドトロピン（Sigma Chemical Company, St. Louis, MO）I.P. により、及び46−47時間後、8IU/マウスのヒトChorionic Gonadotropin (hCG (Sigma)) L.P. により注射され、過剰排卵を誘発された。ドナーが、ホルモン注射に続いて、種マウスにより交配される。排卵は一般的に、hCG注射の13時間以内に生じる。交接は、交配の次の朝、膣栓の存在により確認される。
【０４９７】
受精された卵を手術用スコープ下で集める。卵管を集め、そして卵を、ヒアルロニダーゼ（Sigma）を含む尿検査用スライド中に開放する。卵を、１度、アヒルロニダーゼにより洗浄し、そして２度、Whitten’s W640 媒体（Menino and O’cloray, Biol. Reprod. 77: 159 (1986), 及びDienhart and Downs, Zygote 4: 129 (1996) により記載される）により洗浄し、これを５％CO2、5％O2及び90％N2と共に37℃でインキュベートする。次に、卵を、マイクロインジェクションまで、37℃/5％CO2のインキュベーターに貯蔵する。
【０４９８】
Ztnfr12コード配列を含むプラスミドDNA10〜12μgを、線状化し、ゲル精製し、そしてマイクロインジェクションのために５−10ng/μlの最終濃度で、10mMのトリス−HCl (pH7.4), 0.25mMのEDTA（pH8.0）の溶液に再懸濁する。例えば、Ztnfr12コード配列は、配列番号２のアミノ酸残基１−69、配列番号２のアミノ酸残基１−79又は配列番号13のアミノ酸残基１−69をコードすることができる。
【０４９９】
プラスミドDNAを、暖かな、CO2平衡化された鉱油により被覆された1度のW640媒体に含まれる、収穫された卵中にマイクロインジェクトする。DNAを注射用針中に吸い込み（0.75mmのID, 1mmのOD硼珪酸塩ガラス細管から引き抜かれる）、そして個々の卵中に注入する。注射用針により、個々の卵の、ハプロイド前核の１つ又は両者中に貫通する。
数ピコリットルのDNAを前核中に注入し、そして注射用針を、核と接触しないよう引き抜く。前記方法を、すべての卵が注入されるまで、反復する。都合良くマイクロインジェクトされた卵を、前もってガス抜きされたW640媒体を有する器官組織−培養皿中に移し、37℃/5％CO2のインキュベーターにおいて一晩、貯蔵する。
【０５００】
次の日、２細胞の胚を、偽妊娠受容体中に移す。受容体は、精管切除されたdudsとの交接の後、膣栓の存在により同定される。受容体に麻酔をし、そして背面左側上の毛を剃り、そして手術用顕微鏡に移す。切開を、皮膚において、及び胸郭、背部及び後脚により概略される腹部の中央、すなわち膝と脾臓との間の中途まで筋肉壁を通して行う。生殖器官を、小さな手術用ドレープ上に切除する。脂肪パッドを、手術用ドレープ上に広げ、そして子供用止血小鉗子（Roboz, Rockville, MD）を、脂肪パットに取り付け、そしてマウスの背部上をつるし、器官が腹部にスライドすることを防ぐ。
【０５０１】
鉱油、続いて交互にW640及び空気気泡を含む精巧なトランスファーピペットにより、前日の注入からの12〜17個の健康な２−細胞胚を、受容体中に移す。膨張した膨大部を位置決定し、そしてその膨大部と包との間の卵管を保持し、卵管の刻み目を前記包に隣接して、28gの針により行い、膨大部又は包を裂かないことを確かめる。
【０５０２】
ピペットを、卵管における刻み目に移し、そして胚を吹き込み、最初の空気気泡のピペットからの除去を可能にする。脂肪パッドを軽く、腹膜中に押し込み、そして生殖器官を滑り込ませる。腹膜壁を、１つの縫合により閉じ、そして皮膚を傷口用クリップにより閉じる。マウスは、少なくとも４時間、37℃の暖かなスライド上で回復した。
【０５０３】
受容体を、対でカゴに戻し、そして19−21日の妊娠を可能にする。誕生後、19−21日の産後を、離乳の前に可能にする。離乳子供の性別を鑑別し、そして別々の性別のカゴに入れ、そして0.5cmの生検（遺伝子型識別のために使用される）を、尾から、無菌のハサミにより取る。
【０５０４】
ゲノムDNAを、QIAGEN DNEASYキットを用いて、その製造業者の説明書に従って、切り取られた尾から調製する。ゲノムDNAを、同じプラスミドに導入されたZtnfr12遺伝子又は選択マーカー遺伝子を増幅するために企画されたプライマーを用いて、PCRにより分析する。動物がトランスジェニックであることが確かめられた後、それらは、トランスジェニック雌を野生型雄と共に、又はトランスジェニック雄を１又は複数の野生型雌と共に配置することによって、近交系に戻し交雑する。子供が生まれ、そして離乳され、性別を分け、そしてそれらの尾を、遺伝子型識別のために切り取る。
【０５０５】
生存動物におけるトランスジーンの発現について調べるために、部分肝切除を行う。手術準備を、zyphoid工程下で直接的に上部腹部に行う。無菌技法を用いて、小さな1.5−2cmの切開を、胸骨下で行い、そして肝臓の左側葉を取り出す。４−０絹糸を用いて、下部葉を体腔外に確保するために、その下部葉の回りを縛る。クランプを用いて、その結び目を保持し、そして吸収性Dexon (American Cyanamid; Wayne, N. J.) の第２ループを、最初の結び目に隣接して配置する。遠位切断をDexon結び目から行い、そして約100mgの切除された肝臓組織を、無菌ペトリ皿に配置する。
【０５０６】
切除された肝臓切片を、14mlのポリプロピレン丸底管に移し、そして液体窒素において凍結し、そして次に、ドライアイス上に貯蔵する。手術部位を、縫合及び傷口用クリップにより閉じ、そして動物のカゴを、37℃で加熱されるパッド上に、手術の後、24時間、配置する。動物を手術の後、毎日調べ、そして傷口用クリップを、手術の７−10日後に取り除く。Ztnfr12  mRNAの発現レベルを、RNA溶液ハイブリダイゼーションアッセイ又はポリメラーゼ鎖反応を用いて、個々のトランスジェニックマウスについて試験する。
【０５０７】
Ztnfr12を過剰発現するトランスジェニックマウスを生成する他に、その遺伝子を異常に低く発現するか、又はまったく発現しないトランスジェニックマウスを構築することは有用である。そのようなトランスジェニックマウスは、Ztnfr12の欠失に関連する疾病のための有用なモデルを提供する。上記で論じられたように、Ztnfr12遺伝子発現は、アンチセンス遺伝子、リボザイム遺伝子、又は外部案内配列遺伝子を用いて阻害され得る。Ztnfr12遺伝子を過少発現するトランスジェニックマウスを生成するためには、そのような阻害配列がZtnfr12 mRNAに標的化される。特定の遺伝子の異常に低い発現をトランスジェニックマウスを生成するための方法は、当業者に知られている（例えば、Wuなど., “Gene Under Expression in Cultured Cells and Animals by Antisense DNA and DNA Strategies” in Methods in Gene Biotechnology, p. 205-224 (CRC Press 1997) を参照のこと）。
【０５０８】
Ztnfr12遺伝子発現をほとんどか又はまったく有さないトランスジェニックマウスを生成するための他のアプローチは、非官能性Ztnfr12遺伝子により置換された、少なくとも１つの正常Ztnfr12対立遺伝子を有するマウスを生成することである。非官能性Ztnfr12遺伝子を企画する１つの方法は、もう１つの遺伝子、例えば選択マーカー遺伝子を、Ztnfr12をコードする核酸分子内に挿入することである。いわゆるそれらの“ノックアウトマウス”を生成するための標準の方法は、当業者に知られている（例えば、Jacob, “Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice,” in Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (ed.), Pages 111-124 (Academic Press, Ltd, 1994), 及びWuなど., “New Strategies for Gene Knockout,” in Methods in Gene Biotechnology, Pages 339-365 (CRC Press 1997)を参照のこと）。
【０５０９】
一般的に記載されて来た本発明は、次ぎの例により容易に理解されるであろう。但し、それらの例は、本発明を制限するものではない。
【実施例】
【０５１０】
例１．Ztnfr12をコードする核酸分子の単離
この研究は、“Reh”（ATCC No. CRL-8286）と称するヒトB−リンパ前駆体細胞系を使用した。cDNAライブラリーを、Reh細胞から調製し、そして16個の96−ウェルプレートを用いてアッセイした。個々のウェルは、約250個のE．コリコロニーを含み、そして個々のコロニーは、１つのcDNAクローンを含む。DNA miniprepsを、Qiaprep 96 Turboキット（Qiagen, Inc, ; Valencia, CA）を用いて、96−ウェル形で調製した。次に、DNAを、それぞれ3000個のクローンを表した128のプールに分けた。それらのプールを、12−ウェルプレートにおけるCOS−７細胞にトランスフェクトし、そして陽性プールを、細胞−表面ZTNF4結合により決定した。
【０５１１】
COS細胞トランスフェクションを次の通りにして行った。５μlのプールされたDNA（約0.5−1.0μg）及び５μlのリポフェクタミンを、92μlの血清フリーDMEM培地（500mgのDMEM中、55mgのピルビン酸ナトリウム、146mgのL−グルタミン、5mgのトランスフェリン、2.5mgのインスリン、1μgのセレニウム及び5mgのフェチュイン）において混合し、室温で30分間インキュベートし、そして次に、400μlの血清フリーDMEM培地を添加した。この混合物500μlを、12−ウェルのフィブリネクチン−前処理された組織培養プレート上にプレートされた1.5×105個の細胞/ウェルに添加し、そして細胞を37℃で５時間インキュベートした。次に、500μlの20％FBS DMEM培地（500mlのDMEM中、100mlのFBS、55mgのピルビン酸ナトリウム及び146mgのL−グルタミン）を、ウェル当たりに添加し、そして細胞を一晩インキュベートした。
【０５１２】
細胞表面結合アッセイを、次の通りにして、ビオチニル化されたFLAG−標識されたZTNF4を用いて行った。培地を、１％BSA/PBSにより細胞からすすぎ、そして細胞を、TNB（水中、0.1Mのトリス−HCl、0.15MのNaCl及び0.5％ブロッキング試薬−NEN Renaissance TSA-Direct Kit Cat # NEL701）により１時間ブロックした。次に、細胞を、TNB中、３μg/mlのビオチニル化されたFLAG−標識されたZTNF4と共に１時間インキュベートした。細胞を、１％BSA/PBSにより洗浄し、そして次に、TNB中、１：300に希釈されたストレプタビジン−HPP（NENキット）と共にさらに１時間インキュベートした。
【０５１３】
細胞を１％BSA/PBSにより洗浄し、そして次に、PBS中、1.8％ホルムアルデヒドにより15分間、固定した。次に、細胞を、TNT（水中、0.1Mのトリス−HCl、0.15MのNaCl、及び0.05％のTween−20）により洗浄した。結合を、希釈緩衝液により1：50に希釈されたフルオレセインチラミド試薬と共に４〜５分間、細胞をインキュベートすることによって検出した（NENキット）。細胞をTNTにより洗浄し、そしてTNTにより１：５に希釈されたVECTASHIELD Mounting Media (Vector Labs; Burlingame, CA) により保存した。細胞を、蛍光顕微鏡上でFITCフィルターを用いて可視化した。
【０５１４】
１つの陽性DNAプール、すなわち“10A11”と、上記方法を用いて同定した。プール10A11のDNAを、E．コリDH10B中にエレクトロポレートし、そしてコロニーをフィルターにより持ち上げ、そして洗浄した。E．コリから単離されたDNAを、COS中にトランスフェクトし、そして陽性プールDNA“4D”を、ZTNF4結合アッセイを用いて同定した。プール4Dのコロニーを、96−ウェル中にトランスファーし、そしてDNAを、Qiaprep96Turboキットを用いて単離した。陽性クローン4D2H−6を上記方法を用いて同定した。ZTNF4結合の特異性を試験するために、4D2H−6クローンDNAを、COS細胞中にトランスファーし、そしてZTNF4及びZTNF2の結合を試験した。ZTNF4は4D2H−6 DNAによりトランスフェクトされたCOS細胞に結合するが、ZTNF2は前記細胞と結合しなかった。対照的に、ZTNF4及びZTNF2の両者は、TACI DNAによりトランスフェクトされたCOS細胞に結合した。
【０５１５】
例２．ヒト及びネズミ組織におけるZtnfr12遺伝子発現
ノザンブロット分析を、Human Multiple Tissue Blots (MTN I, MTN II及びMTN III) (CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, Ca), Human Immuno System ブロット（CLONTECH）、Human正常mRNAブロット（Invitrogen, San Diego, Ca）及びHuman Fetal Multiple Tissue Blots (CLONTECH) を用いて行った。570塩基対ヒトプローブを、次の反応条件下で、オリゴヌクレオチド37550（5’GCGAATTCGTCGGCACCATGAGGCGAGGG3’）（配列番号10）及び37549（5’CGCTCGAGCTGCCGGCTCCCTGCTATTGTTG3’）（配列番号11）によるPCRにより生成した：94℃で２分；94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で30秒（35サイクル）；続いて、72℃で５分。
【０５１６】
PCRフラグメントを、QIAQUICKゲル抽出キット（QIAGEN, Inc. ; Santa Clarita, Ca）を用いて、ゲル精製した。プローブを、REDIPRIME II DNA Labeling システム（AMERSHAM, Inc.; UK）を用いて、製造業者の規格に従って、32Pにより放射性ラベルした。プローブを、NUCTRAPプッシュカラム（Stratagene; La Jolla, Ca）を用いて精製した。EXPRESSHYB（CLONTECH）溶液を、ブロットのためのハイブリダイズ溶液のために使用した。ハイブリダイゼーションは65℃で一晩で生じた。
【０５１７】
次に、ブロットを、室温で２×SCC及び0.05％SDSにより４度、続いて、50℃で0.1×SSC及び0.1％SDSにより２度、洗浄した。１つの転写体サイズを、約4.4kbで検出した。
【０５１８】
腫瘍ブロットをまた、ヒト子宮腫瘍ブロット（Invitrogen, San Diego, Ca）、ヒト腫瘍パネルブロット４及び５（Invitrogen Gorporation; San Diego, Ca）、ヒトリンパブロット（Invitrogen）、ヒト癌細胞系ブロット（CLONTECH）及びヒト白血病ブロットにより試験した。ドットブロットをまた、Human Multiple Tissue Expression Blot (CLONTECH) 及びHuman Cancer Gene Screening Blot (Biochain Institute, Inc.; Hayward, Ca) を用いて分析した。ドットブロット分析のための方法及び条件は、上記に開示される複数組織ブロットについてと同じであった。
【０５１９】
Ztnfr12遺伝子発現を、脾臓、リンパ節、末梢血液リンパ球、腎臓、心臓、肝臓、骨格筋、膵臓、副腎、精巣、脳、子宮、胃、骨髄、気管支、胸腺、胎盤、胎児肝臓及びRaji細胞において観察した。最強のシグナルは、脾臓組織、リンパ節組織及び末梢血液に関連された。
【０５２０】
例３．細胞系におけるZtnfr12遺伝子発現
TAQMAN RT-PCR (Applied Biosystems; Foster City, CA) を用いて、Ztnfr12遺伝子、及びTACI及びBCMA遺伝子の発現をさらに試験した。それらの研究においては、内因性ヒトβ−グルクロニダーゼ又はグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの発現を、対照として使用した。Ztnfr12、TACI及びBCMA RNAレベルを、それらの対照遺伝子のRNAレベルに対して比較した。
【０５２１】
表６に示されるように、その結果は、Ztnfr12が主にB系細胞上で独占的に発現されることを示した。特に、Ztnfr12遺伝子発現を、形質転換されたBリンパ腫細胞系、例えばBurkitt’s リンパ腫由来の細胞（例えば、RAMOS細胞、DAUDI細胞、RAJI細胞、BJAB細胞、及びHS Sultan細胞）、非Hodgkin’s リンパ腫由来の細胞（RL細胞）、B−細胞リンパ芽球性白血病細胞（IM9, SUP-B15及びREH細胞）、及びB−細胞リンパ腫細胞系、DOHH-2及びWSU-NHLにおいて観察した。対照的に、Ztnfr12遺伝子発現は、急性Tリンパ腫細胞（Jurkat）、単級白血病細胞（THP-1及びU937）、前骨髄球性白血病細胞（HL-60）及び慢性骨髄性白血病細胞（K562）においては検出できなかった。
【０５２２】
それらの結果は、Ztnfr12タンパク質が、Burkitt’sリンパ腫、非Hodgkin’sリンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、及び種々の他のB−細胞リンパ腫に対して、モノクローナル抗体治療においては、有用な標的物を提供することを示す。Ztnfr12発現は、類似する受容体の発現レベルに比較して、それらの細胞系の多くにおいて相当に高い。例えば、BCMAは、血漿細胞上で主に発現されると思われる。
【０５２３】
【表６】
2009225798.tif 000007
【０５２４】
例４．Ztnfr12−Fc融合タンパク質の構成及び発現
A．Igγ1フラグメントの作製
Ztnfr12−Fc融合タンパク質を調製するために、ヒトIgG1のFc領域（ヒンジ領域、及びCH2及びDH3ドメイン）を修飾し、Fcγ1受容体（FcγR1）及び補体（C1q）結合機能を除去した。ヒトIgG1Fcのこの修飾されたバーションを、“Fc4”と命名した。
【０５２５】
Fc領域を、ヒト胎児肝臓ライブラリー（Clontech）PCRから、次のオリゴプライマーを用いて単離した：5’ATCAGCGGAA TTCAGATCTT CAGACAAAAC TCACACATGC CCAC3’（配列番号15）及び5’GGCAGTCTCT AGATCATTTA CCCGGAGACA GGGAG3’（配列番号16）。野生型ヒトγ不変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号17及び18で表される。Fc領域内の突然変異を、PCRにより導入し、FcγR1結合を低めた。FcγRI結合部位（Leu−Leu−Gly−Gly；EUインデックス位置234〜237に対応する配列番号18のアミノ酸残基38−41）を、Ala−Glu−Glu−Alaに突然変異誘発し、FcγRI結語を減じた（例えば、Duncanなど., Nature 332: 563 (1988); Baumなど., EMBO J. 13: 3992 (1994) を参照のこと）。
【０５２６】
オリゴヌクレオチドプライマー：5’CCGTGCCCAG CACCTGAAGC CGAGGGGGCA CCGTCAGTCT TCCTCTTCCC C3’（配列番号19）及び5’GGATTCTAGA TTATTTACCC GGAGACAGGG A3’（配列番号20）を用いて、突然変異を導入した。570ngのIgFc鋳型、5μlの10×Pfu反応緩衝液（Stratagene）、8μlの1.25mMのdNTP, 31μlの蒸留水、2μlの20mMのオリゴヌクレオチドプライマーを添加し、50μlの最終体積にした。
【０５２７】
等体積の鉱油を添加し、そして反応を94℃に１分間、加熱した。Pfuポリメラーゼ（2.5単位、Stratagene）を添加し、続いて、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で１分（25サイクル）、続いて72℃での７分間の延長を行った。反応生成物を、電気泳動により分別し、そして約676塩基対の予測されるサイズに対応するバンドを検出した。このバンドを、QIAGEN QIAQUICK Gel Extraction Kit (Qiagen) を用いて、製造業者の説明書に従って、ゲルから切除し、そして回収した。このフラグメントを、FcγRI結合部位突然変異誘発されたIgFc配列として命名した。
【０５２８】
PCRをまた用いて、AlaのSer（EUインデックス位置330に対応する、配列番号18のアミノ酸残基134）への突然変異及びProのSer（EUインデックス位置331に対応する、配列番号18のアミノ酸残基135）への突然変異を導入し、補体C1q結合又は補体固定を減じた（Duncan and Winter, Nature 332: 788 (1988)）。２種の第１回目の反応を、鋳型としてFcγI結合部位−突然変異誘発されたIgFc配列を用いて行った。
【０５２９】
1μlのFcγRI結合部位−突然変異誘発されたIgFc鋳型、5μlの10×Pfu反応緩衝液（Stratagene）、8μlの1.25mMのdNTP、 31μlの蒸留水、2μlの20mMの5’GGTGGCGGCT CCCAGATGGG TCCTGTCCGA GCCCAGATCT TCAGACAAAA CTCAC3’（配列番号21）、すなわち配列番号17のヌクレオチド36で開始する5’プライマー、及び2μlの20mMの5’TGGGAGGGCT TTGTTGGA3’（配列番号22）、すなわち配列番号17のヌクレオチド405の補体で開始する3’プライマーを添加し、50μlの最終体積にした。
【０５３０】
第２反応は、AlaからSerへの突然変異誘発、XbaI制限部位及び停止コドンを導入するために、オリゴヌクレオチドプライマー5’TCCAACAAAG CCCTCCCATC CTCCATCGAG AAAACCATCT CC3’（配列番号23）、すなわち配列番号17のヌクレオチド388で開始する5’プライマー及び5’GGATGGATCC ATGAAGCACC TGTGGTTCTT CCTCCTGCTG GTGGCGGCTC CCAGATG3’（配列番号24）、すなわち3’プライマーの20mMの原液をそれぞれ２μlを含んだ。等体積の鉱油を添加し、そして反応を94℃に１分間、加熱した。
【０５３１】
Pfuポリメラーゼ（2.5単位、Stratagene）を添加し、続いて、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で１分（25サイクル）、続いて72℃での７分間の延長を行った。反応生成物を、電気泳動により分別し、そして約370及び約395塩基対の予測されるサイズに対応するバンドを検出した。このバンドを、QIAGEN QIAQUICK Gel Extraction Kit (Qiagen) を用いて、製造業者の説明書に従って、ゲルから切除し、そして抽出した。
【０５３２】
上記フラグメントを連結し、そして5’BamHI制限部位、及びヒト免疫グロブリンJBL 2’CLH鎖可変領域からのシグナル配列を付加するために、第２回目の反応を行った（Cogneなど., Eur. J. Immunol. 18: 1485 (1988)）。30μlの蒸留水、8μlの1.25mMのdNTP, 5μlの10×Pfuポリメラーゼ反応緩衝液（Stratagene）及び２種の第１回目のPCR反応物の個々の１μlを添加し、50μlの最終体積にした。等体積の鉱油を添加し、そして反応を94℃に１分間、加熱した。Pfuポリメラーゼ（2.5単位、Stratagene）を添加し、続いて、94℃で30秒、55℃で30秒、及び72℃で２分（５サイクル）、PCR反応を行った。
【０５３３】
温度を94℃に再び上げ、そして5’GGATGGATCC ATGAAGCACC TGTGGTTCTT CCTCCTGCTG GTGGCGGCTC CCAGATG3’（配列番号25）、すなわちBamHI制限部位を導入する、配列番号17のヌクレオチド１で開始する5’プライマー、及び5’GGATTCTAGA TTATTTACCC GGAGACAGGG A3’（配列番号26）の20mMの原液それぞれ２μlを添加し、続いて、94℃で30秒、55℃で30秒、及び72℃で２分及び72℃で最終７分の拡張（25サイクル）を行った。前記反応の一部を、ゲル電気泳動を用いて可視化した。
【０５３４】
予測されるサイズに対応する789塩基対バンドを検出した。突然変異誘発されたFc PCRフラグメントの残りを、制限酵素BamHI及びXbaIにより消化した。消化されたフラグメントをクローン化し、そして配列分析により確かめた。突然変異誘発されたFcを、“Fc4”と命名した。Fc4のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号27及び28として提供されている。
【０５３５】
“Fc5”と称するIg融合セグメントを、次のオリゴヌクレオチドプライマーによりFc4 Ig融合セグメントを増幅するためにPCRを用いることによって生成した：5’GAGCCCAAAT CTTCAGACAA AACTCACACA TGCCCA3’（配列番号29）及び5’TAATTGGCGC GCCTCTAGAT TATTTACCCG GAGACA3’（配列番号30）。PCR増幅の条件は次の通りであった。236ngのFc4鋳型、5μlの10×Pfu反応緩衝液、4μlの2.5mMのdNTP、１μlのそれぞれ20μMのプライマー及び１μlのPfuポリメラーゼ（2.5単位、Stratagene）を添加し、50μlの最終体積にした。
【０５３６】
増幅熱プロフィールは、94℃で15秒、42℃で20秒、72℃で45秒（５サイクル）、94℃で15秒、72℃で１分20秒（20サイクル）、続いて72℃での７分の拡張から成った。反応生成物を、分離用アガロースゲル上で電気泳動処理し、そして718bpの予測されるサイズに対応するバンドを検出した。QIAGEN QIAQUICK Gel Extraction Kit (Qiagen) を用いて、製造業者の説明書に従って、バンドをゲルから切除し、そして回収した。突然変異誘導されたFcフラグメントをクローン化し、そして配列分析により確かめた。Fc5のヌクレオチド及びアミノ酸配列を、それぞれ配列番号31及び32として提供する。
【０５３７】
B．Ztnfr12−Fc5発現ベクターの作製
Ztnfr12-tcs-Fc5のための発現カセットをコードするタンパク質を、PCR鋳型としてマウス免疫グルブリンH鎖可変領域（IgVH）シグナル配列cDNA、Ztnfr12 cDNA及びFc5 DNAフラグメントを用いて、オーバーラップPCR（Hortonなど., Gene 77: 61 (1989)）により生成した。用語“tcs“とは、Ztnfr12セグメントをFc5セグメントとのトロンビン分解部位の存在を示す。
第１回目のPCR増幅は、第２回目のオーバーラップPCRに使用される４種のPCR生成物（第１回目のPCR生成物１，２，３及び４として命名される）を生成する４種の別々の反応から成った。
【０５３８】
第１回目のPCR生成物１，２，３及び４を、異なったオリゴヌクレオチドプライマー及びDNA鋳型を用いて、別々に生成した。約2ngの鋳型DNA、2.5μlの10×Pfuポリメラーゼ反応緩衝液（Stratagene）、2μlの2.5mMのdNTP, 2.5μlのRediload（ReGen; Huntsville, AL）、20pモルの個々の5’オリゴヌクレオチド及び3’オリゴヌクレオチドプライマー（下記を参照のこと）、及び0.5μlのPfuポリメラーゼ（2.5単位、Stratagene）を添加し、それぞれ25μlの最終体積にした。第１回目のPCR生成物４を生成する反応はまた、2.5μlのGC−Melt試薬（Clontech）の添加を包含した。PCR増幅に使用される鋳型及びプライマーに対する情報は、表７及び８に提供される。
【０５３９】
【表７】
2009225798.tif 000008
【０５４０】
【表８】
2009225798.tif 000009
【０５４１】
増幅熱プロフィールは、94℃で３分、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で２分（30サイクル）、続いて72℃での４分の拡張から成った。反応生成物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分別し、そして予測されるサイズに対応するバンドを、QIAGEN QIAQUICK Gel Extraction Kit (Qiagen) を用いて、製造業者の説明書に従って、ゲルから切除し、そして回収した。
【０５４２】
第２回目のPCR増幅、又はオーバーラップPCR増幅反応を、DNA鋳型として前記第１回目のPCRからのゲル精製されたフラグメントを用いて行った。第２回目のPCR増幅の条件は次の通りであった。１μlの個々の第１回目のPCR生成物１，２，３及び４、5μlの10×Pfuポリメラーゼ反応緩衝液（Stratagene）、４μlの2.5mMのdNTP, 5μlのRdiload (ResGen), 5μlのGC−Melt試薬（Clontech）、約40pモルの個々のZC38,989, ZC38,874及び0.5μlのPfu ポリメラーゼ（2.5単位、Stratagene）を添加し、50μlの最終体積にした。増幅熱プロフィールは、94℃で３分、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で３分（35サイクル）、続いて72℃で６分の拡張から成った。“Ztnfr12-tcs-Fc5 PCR”と称する反応生成物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分別し、そして予測されるサイズに対応するバンドを、QIAGEN QIAQUICK Gel Extraction Kit (Qiagen) を用いて、製造業者の説明書に従って、ゲルから切除し、そして回収した。
【０５４３】
Ztnfr12-tcs-Fc5 PCR生物を、Invitrogen’s ZEROBLUNT TOPO PCR Cloning Kit を用いて、製造業者の推薦されるプロトコールに従ってクローン化し、そしてそのDNA配列を確かめた。Ztnfr12-tcs-Fc5のヌクレオチド及びアミノ酸配列を、それぞれ配列番号41及び42として提供する。配列番号42においては、ネズミVH26-10シグナル配列は、アミノ酸残基１−19により表され、Ztnfr12細胞外ドメインは、アミノ酸残基20−90（すなわち、配列番号２のアミノ酸残基１−71）により表され、トロンビン分解部分は、アミノ酸残基91−96により表され、そしてFc5免疫グロブリン成分はアミノ酸残基97−328により表される。
【０５４４】
配列を確認されたZtnfr12-tes-Fc5をコードするプラスミドを、FseI及びAccIにより消化し、そのコードセグメントを開放した。FseI−AscIフラグメントを、サイトメガロウィルスプロモーター（CMV）プロモーター、SV40ポリAセグメント及びネズミジヒドロ破壊レダクターゼ遺伝子を含む哺乳類発生ベクター中に連結した。
【０５４５】
例５．チャイニーハムスター卵巣細胞によるZtnfr12−Fcタンパク質の生成
Ztnfr12-Fc5発現構成体を用いて、動物タンパク質フリーの培地において増幅された、懸濁−適合されたチャイニーズハムスター卵巣（CHO）DG44細胞を、エレクトロポレーションを通してトランスフェクトした（Urlanｂなど., Sam. Cell. Malec. 12:555(1986)）。CHO DG44細胞は、両ジヒドロ葉酸レダクターゼ染色体位置での欠失のために、機能的ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を欠いている。高められた濃度のメトトレキセートの存在下での細胞の増殖は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子の増幅、及び発現構成体上での連結された組換えタンパク質コード遺伝子の増幅をもたらす。
【０５４６】
CHO DG44細胞を、PFCHO培地（JRH Biosciences, Lenexa, KS）、4mMのL−グルタミン（JRH Biosciences）、及び１×ヒポサンキシン−チミジンサプリメント（Life Technologies）において継代し、そして細胞を、回転振盪プラットフォーム上で120RPMで、Corning振盪フラスコにおいて37℃及び５％CO2下でインキュベートした。細胞を、線状化された発現プラスミドにより別々にトランスフェクトした。
【０５４７】
滅菌を確かめるために、単一のエタノール沈殿段階を、20μlの剪断されたサケ精子キャリヤーDNA（5’→3’Inc, Boulder, Co, 10ng/ml）、 22μlの3MのNaOAc（pH5.2）及び484μlの100％エタノール（Gold Shield Chemical Co., Hayward, CA）と共に、Eppendorf管において200μgのプラスミドDNAを組合すことによって、25分間、氷上で行った。インキュベーションの後、管を、４℃の部屋に配置された遠心分離機において14,000RPMで遠心分離し、上清液を除去し、そしてペレットを70％エタノール0.5mlにより２度、洗浄し、そして空気乾燥せしめた。
【０５４８】
DNAペレットを、25mlの円錐形遠心分離管において900RPMで５分間、合計106個の細胞（16.5ml）を遠心分離することによって乾燥しながら、CHO DG44細胞を調製した。CHO DG44細胞を、合計体積300μlのPFCHO増殖培地中に再懸濁し、そして0.4cmの電極ギャップを有するGene−Pulser Cuvette（Bio−Rad）に配置した。約50分の乾燥時間の後、DNAを、500μlのPFCHO増殖培地中に再懸濁し、そして合計体積が800μlを越えないよう、キュベットにおける細胞に添加し、そして室温で５分間、静置し、泡の形成を低めた。キュベットを、0.296kV（キロボルト）及び0.950HC（高キャパシタンス）で設定されたBioRad Gene Pulser IIユニットに配置し、そしてすぐにエレクトロポレートした。
【０５４９】
細胞を室温で５分間インキュベートし、その後、CoStar T-75フラスコにおける合計20mlの体積のPFCHO培地に配置した。フラスコを、37℃で５％CO2下に48時間、配置し、次に細胞を、トリパンブルー排除を用いて血球計数計により計算し、そしてヒポサンキシン−チミジンサプリメントを含まないが、20mMのメトトレキセートを含むPFCHO選択培地（Cal Biochem）中に配置した。メトトレキセート選択工程の回復に基づいて、選択されたZtnfr12−Fc5タンパク質を含むならし培地を、ウェスターンブロット分析により試験した。
【０５５０】
１つの研究においては、融合タンパク質を次の通りにして精製した。CHO細胞からのならし培地10Lを透明にし、そして0.22μmのフィルターを通して無菌濾過した。次に、濾過された培地サンプルを、Ztnfr12−Fc5標的分子の捕獲のために72mlのプロテインAカラム（Poros 50A）に適用した。元の適用からの流動材料を、プロテインAカラム上で２度、再処理し、最大の回収性を増強した。非還元性SDS−PAGEによる分析は、この段階で回収された結合材料がマルチマー及びダイマーの両者であることを示した。還元性SDS−PAGEによる分別の後、36kDの分子量を有するモノマー融合タンパク質のみが観察された。次に、Ztnfr12−Fc5種の回収された混合物を、Superdex−200サイズ除去クロマトグラフィーカラム（318ml）に適用し、前記材料をさらに精製し、そして緩衝液−交換した。この段階は、マルチマー材料からのダイマー材料の分解を提供した。
【０５５１】
例６．Ztnfr12−Fc融合タンパク質の特性決定
エドマン分解を行い、Ztnfr12−Fc融合タンパク質のN−末端を同定した。この結果は、N−末端が消化され、そして最初のアミノ酸がSer7であることを示す。
Ztnfr12−Fcを、標準技法を用いて、トロンビンにより消化した。手短に言及すれば、トロンビン消化を、トロンビンをタンパク質に１：25の重量比で添加し、そして室温で60分間インキュベートすることによって行った。反応を、分析のLC分離部分のために、逆相HPLCカラム上へのすぐの注入により停止した。逆相カラムからの溶出液を、LCQ質量分光計に向け、そしてMS及びMS/MSデータを集めた。個々の消化物を、還元を伴って及びそれを伴なわないで分析し、そして特異的に回収されたことが観察されたピークを、可能な場合、質量適合及び配列（MS/MS）確認分析により同定した。タンパク質のトロンビン消化は、構築された部位の他に、Ztnfr12ドメインにおける次の２種の切断部位の存在を同定した：Arg39−Thr40及びArg54−Thr55。
【０５５２】
Fcドメインのプロテアーゼ耐性のために、グルコシル化修飾は、タンパク質のその部分については観察されなかった。単一の予測されるN−結合された炭水化物は、Asn159でFcドメインに存在する。
【０５５３】
しかしながら、多くの異種O−グリカンがZtnfr12ドメインに結合されることが観察された。それらのO−グリカンの十分に形成された構造は、CHO細胞において組換え的に生成されるタンパク質上に見出される、前に特徴づけられたO−グリカンと一致し、そしてテトラ−サッカリドの形、すなわち（N−アセチルヘキソサミン）−（N−アセチルノイラミン酸（すなわち、シアル酸））−（ヘキソース）−（N−アセチルノイラミン酸）である。観察される最も優性形は、トリ−サッカリド、すなわち（N−アセチルヘキソサミン）−（ヘキソース）−（N−アセチルノイラミン酸）であった。
【０５５４】
個々の部位は、単一のN−アセチルヘキソサミン〜十分に形成されたテトラ−サッカリドの範囲の複数形の炭水化物により部分的に及び異種的に占有されることが観察された。炭水化物の異種性及びこの分析の不完全な性質のために、％部位占有率の明確な割り当ては不可能であった。いくらかのレベルで修飾されることが観察された残基は、Thr17, Thr40, Ser49, Ser50, Thr55及びSer62であった。それらの炭水化物修飾は、Fcドメインに単一のN−結合された炭水化物のみを有するこの融合タンパク質とTACI−Fcとを区別する。
【０５５５】
Ztnfr12−Fc5を、ヤギ抗−ヒトIgG Fcにより被覆されたプレートに固定し、そしてZTNF4−ビオチンと共にインキュベートした。この研究の結果は、Ztnfr12−Fc5がZTNF4を結合することを示した。追加の研究は、Ztnfr12−Fc5が、可溶性ZTNF4及び組換えヒトIL-4により同時活性化されたヒト末梢血液細胞の増殖を阻害し、そしてZtnfr12−Fc5が可溶性TACI受容体へのZTNF4−ビオチン結合を阻害したことを示した。
【０５５６】
例７．可溶性Ztnfr12のバキュロウィルスでの発現
発現ベクターpZBV37L: sTNFR12ceeを、単一ペプチドの分解の後、C−末端“EE”標識（EYMPMD；配列番号45）を有する可溶性Ztnfr12ポリペプチド（配列番号２のアミノ酸残基1−71）を発現するよう企画した。
【０５５７】
A．pZBV37L: sTNFR12ceeの構成
それぞれ5’及び3’末端上にBspeI及びXbaI制限部位を含む、257塩基対のsTNFR12ceeフラグメントを、次のプライマーを用いて、Ztnfr12 cDNAを含むプラスミドからのPCR増幅により生成した：5’ATGCATTCCG GAATGAGGCG AGGGCCCCGG AGCCTG3’（配列番号43）及び5’ATGCATTCTA GATCAGTCCA TCGGCATGTA TTCCGCCGCC TCGCCGGCCC CCGC3’（配列番号44）。PCR反応条件は、10％DMSOを含む100μlの体積の反応について、Expand High Fidelity PCR System (Boehringer Mannheim) を用いて、次の通りであった：94℃で２分（１サイクル）；94℃で15秒、50℃で30秒、及び72℃で45秒（35サイクル）；72℃で５分（１サイクル）；続いて、4℃でのソーキング。
【０５５８】
5μlの反応混合物を、ゲル電気泳動（１％MuSieveアガロース）により可視化した。反応混合物の残りを、Qiagen PCR精製キットを通して、製造業者の説明書に従って精製し、そして30μlの水に溶出した。cDNAを、37℃で１時間、適切な緩衝液条件下でBspeI及びXbaI（New England Biolabs, Beverly, MA）を用いて35μlの体積において消化した。消化されたPCR生成物バンドを、１％アガロースTAEゲルを通して試験し、切除し、QIQUICK Gel Extraction Kit (Qiagen)を用いて抽出し、そして30μlの水に溶出した。精製され、消化されたsTNFR12cee PCR生成物を、前に調製され、そして制限酵素消化された（BspeI及びXbaI）ベクターpZBV37LのMCS中に連結した。
【０５５９】
pZBV37Lベクターは、ポリへドロンプロモーターが除去され、そして複数クローニング部位の上流の後期活性化Basic Protein Promoter及びEGTリーダーシグナル配列により置換されている、PFASTBAC1（Life Technologies）の修飾体である。5μlの制限消化されたsTNFR12cee及び約50ngのその対応するpZBV37Lベクターを、適切な緩衝液条件下で20μlの体積において16℃で一晩、連結した。5μlの連結混合物を用いて、2mmのギャップエレクトロポレーションキュベット（BTX）において、400オーム、2V及び25μFでのエレクトロポレーションにより、50μlのELECTOMAX DH12S細胞（Life Technologies）を形質転換した。形質転換された細胞を、350μlのSOS培地（2％ Bacto Tryptone, 0.5％ Bacto Yeast Extract, 10mlの１MのNaCl、1.5mMのKCl、10mMのMgCl2、10mMのMgSO4及び20mMのグルコース）により希釈し、37℃で１時間インキュベートし、そして50μlの希釈溶液を、100μg/mlのアンピシリンを含むLBプレート上にプレートした。
【０５６０】
クローンをPCR及び制限消化により分析した。陽性クローンを選択し、プレートし、そして配列決定のために提供した。正しい配列が確かめられると、25ngの陽性クローンDNAを用いて、42℃での熱ブロックにおける45秒間の熱ショックにより、100μlのDH10BAC MAX EFFICIENCYコンピテント細胞（GIBCO-BRL）を形質転換した。形質転換されたDH10BAC細胞を、900μlのSOC培地（１％Bacto  Trypton, 0.5％Bacto Yeast Extract, 10mlの１MのNaCl、1.5mMのKCl, 10mMのMgCl2、10mMのMgSO4及び20mMのグルコース）により希釈し、37℃で１時間インキュベートし、そしてその100μlを、50μg/mlのカナマイシン、7μg/mlのゲンタマイシン、10μg/mlのテトラサイクリン、40μg/mlのIPTG及び200μl/mlのBLUO−GAL（5−ブロモ−３−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド）を含むLuria寒天プレート上にプレートした。プレートを37℃で48時間インキュベートした。
【０５６１】
色彩選択を用いて、転移されたウィルスDNA（“bacmid”として言及される）を有するそれらの細胞を同定した。白色のそれらのコロニーを採取した。陽性の白色コロニー（所望するbacmidをふくむ）を、増殖及び続くbacmid DNA精製のために選択した。スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（Sf9）細胞を、培養増殖及びbacmid単離の後、トランスフェクトした。
【０５６２】
B．Sf9細胞のトランスフェクション
Sf9細胞を、６−ウェルプレートに、１×106個の細胞/ウェルで接触し、そして27℃で１時間、付着せしめた。約5μgのbacmid DNAを、100μlのSf−900II SFM (Life Technologies) により希釈した。20μlのLIPOFECTAMINE試薬（Life Technologies）を、100μlのSf−900II SFMにより希釈した。bacmid DNA及び脂質溶液を軽く混合し、そして室温で45分間インキュベートした。800μlのSf−900II SFMを、前記脂質−DNA混合物に添加した。培地をウェルから吸引し、そして1mlのDNA−脂質混合物を細胞に添加した。細胞を27℃で一晩インキュベートした。DNA−脂肪混合物を吸引し、そして2mlのSf−900II培地を個々のプレートに添加した。プレートを、27℃、90％湿度で、約７日間インキュベートし、そしてウィルスを収穫した。
【０５６３】
C．増幅
Sf9細胞を、2mlのSF−900IIを含む６−ウェルプレートに、１×106個の細胞/ウェルで接種した。トランスフェクションプレートからの500μlのウィルスを、ウェルにプレートし、そしてプレートを、27℃、90％湿度で96時間インキュベートし、この後、ウィルスを、一次増幅のために収穫した。追加の増幅を、次の方法を用いて達成することができる。
【０５６４】
第２回目の増幅を、次の通りに進行することができる：Sf9細胞を、2mlのSF−900IIを有する６−ウェルプレートに、１×106個の細胞/ウェルで接種する。一次増幅プレートからのウィルス100μlをウェルにプレートし、そしてプレートを27℃、90％湿度で96時間インキュベートし、そして次に、ウィルスを二次増幅を完結するために収穫した。
追加の増幅を行うことができる。Sf9細胞を、250mlの振盪フラスコにおける50mlのSf−900II SFMにおいて、１×106個の細胞/mlのおおよその密度まで増殖する。次に、それらを上記プレートからの500μlのウィルス原液により感染せしめ、そして27℃で３時間インキュベートし、この後、ウィルスを収穫する。
【０５６５】
このウィルス原液を、増殖阻害曲線により滴定し、そして１のMOIを示す滴定培養物を合計48時間、進行せしめる。上清液を、zVegf4（E3595）のGFDに対して特異的な一次モノクローナル抗体、及びHRP接合されたヤギ抗体−Mu二次抗体を用いて、非還元ウェスターンにより分析する。結果は、約79kDaのダイマーバンド及び追加の高分子量種のバンドを示すべきである。上清液をまた、活性分析のために使用することができる。
【０５６６】
多量のウェルス原液を次の方法により生成する：Sf9細胞を、2800mlの振盪フラスコにおける1LのSf−900II SFMにおいて、１×106個の細胞/mlのおおよその密度まで増殖する。次に、それらを、最後の増殖からのウィルス原液10mlにより感染し、そして27℃で96時間インキュベートし、この後、ウィルスを収穫する。
大規模感染を完結し、下流の精製のための材料を供給することができる。
【図１】
2009225798.tif 000010
【配列表】
2009225798000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年5月29日(2009.5.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基１−69；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基１−45；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基１−17；及び
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基39−64；
から選択されるアミノ酸配列から成るポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項３】
（ａ）配列番号１のヌクレオチド27−233；及び
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド27−162；
から選択されるヌクレオチド配列から成る、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
（ａ）配列番号１のヌクレオチド27−233；
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド163−393；
（ｃ）配列番号１のヌクレオチド27−578；
（ｄ）配列番号１のヌクレオチド394−578；及び
（ｅ）配列番号１のヌクレオチド27−162；
から選択されるヌクレオチド配列から成る核酸分子。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれか１項に記載の核酸分子を含んで成るベクター。
【請求項６】
更に、転写プロモーター及び転写ターミネーターを含んで成り、ここで当該プロモーターが前記核酸分子と作用可能に連結されており、そして当該核酸分子が前記転写ターミネーターと作用可能に結合されて発現ベクターである、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターを含んで成る、細菌、酵母細胞、鳥類細胞、菌類細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞及び植物細胞から成る群から選択された組換え宿主細胞。
【請求項８】
請求項１に記載のポリペプチドの生成方法であって、請求項６に記載の発現ベクターを含んで成り、そして前記ポリペプチドを生成する組換え宿主細胞を培養することを含んで成る方法。
【請求項９】
前記培養された組換え宿主細胞から前記ポリペプチドを単離することをさらに含んで成る請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
第２のポリペプチドに連結された第１のポリペプチドを含んでなる融合タンパク質において、当該第１のポリペプチドが請求項１に記載のポリペプチドから成るztnfr12ポリペプチドであり、そして当該第２のポリペプチドが異種性ポリペプチドを含んでなる、前記融合タンパク質。
【請求項１１】
前記第２のポリペプチドが免疫グロブリン成分を含んで成る請求項10に記載の融合タンパク質。
【外国語明細書】
2009225798000001.pdf