(57)【要約】【課題】セルロース分解性に優れた糖化用植物およびセルロース分解性に優れた植物由来原料の調製方法並びにエタノールの効率的な製造方法を提供する。【解決手段】植物にキシログルカナーゼ遺伝子を導入することによりキシログルカナーゼを過剰発現させ、植物体中のキシログルカンを生育中に分解する。これにより、セルロース分解性に優れ、エタノールの材料として好適な植物が得られる。【選択図】図３
2009225744.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞壁を構成するセルロース繊維の非結晶部位に編み込まれているヘミセルロースを分解する分解酵素遺伝子を導入した糖化用植物。
【請求項２】
前記分解酵素遺伝子が、キシログルカナーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の糖化用植物。
【請求項３】
前記分解酵素遺伝子が、キシラナーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項１又は２に記載の糖化用植物。
【請求項４】
a) 請求項１〜３のいずれかに記載の糖化用植物をセルロース分解酵素で処理し、糖化成分を得る工程と、
b) 前記糖化成分をエタノール発酵させてエタノールを得る工程と、
を有するエタノール製造方法。
【請求項５】
細胞壁を構成するキシログルカンおよびキシランの少なくとも一方を超音波処理によって破砕する植物由来原料の調製方法。
【請求項６】
超音波処理は、細胞壁を構成するセルロース繊維の非結晶部位に編み込まれているキシログルカン及び／又はキシランを破砕する条件で行われることを特徴とする請求項５に記載の植物由来原料の調製方法。
【請求項７】
植物由来原料は木質系原料であることを特徴とする請求項５又は６に記載の植物由来原料の調製方法。
【請求項８】
a) 植物由来原料を超音波処理して細胞壁を構成するキシログルカンおよびキシランの少なくとも一方を破砕する工程と、
b) 前記超音波処理された植物由来原料をセルロース分解酵素で処理し、糖化成分を得る工程と、
c) 前記糖化成分をエタノール発酵させてエタノールを得る工程と、
を有するエタノール製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エタノールの製造に適した糖化用植物及び植物由来原料に関する。
【背景技術】
【０００２】
資源枯渇等の問題を抱える石油などの化石資源に代わる燃料としてエタノールが注目されており、近年、植物系バイオマスを用いてエタノールを製造する方法の開発が進められている。
バイオマスエタノールの原料としては、生産効率の面から糖質やデンプン質を多く含むサトウキビやトウモロコシ、ジャガイモ等が主に利用されている。ところが、糖質やデンプン質は食用としても利用されることからエタノールと食料との競合が生じ、原料価格の高騰を招く。
これに対して、木質系バイオマスのセルロースからエタノールを製造する技術が開発されている(特許文献１，２参照)。しかし、植物細胞・組織の骨格を構築するセルロースは、グルコースが1,4-β-グルコシル結合で高度に重合したものが束になってミクロフィブリル(繊維）を形成しており、結合状態が強固である。このため、セルロースは分解効率が低く、効率的なエタノールへの変換技術が求められている。
【特許文献１】特開2008-5832号公報
【特許文献２】特開2008-43328号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明が解決しようとする課題は、セルロース分解性に優れた糖化用植物およびセルロース分解性に優れた植物由来原料の調製方法並びにバイオマスエタノールの効率的な製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
植物細胞壁中ではセルロースがヘミセルロース糖鎖によって架橋・拘束されており、このような架橋構造が植物細胞壁を堅固にしていると考えられている。そこで、本発明者は、ヘミセルロース糖鎖によるセルロースの架橋や拘束を解けば、植物の成長が促進されるとの考えのもと、ヘミセルロースの一つであるキシログルカンの分解酵素・キシログルカナーゼ遺伝子を導入したトランスジェニック植物を創成した。その後、このトランスジェニック植物が、野生型の植物に比べて成長が速く茎等の強度が高いこと、さらにセルロース含量が多い、といった利点を有することが実験により確認され、特許出願が行われた。この特許出願は既に公開されている(特開2004-187618号公報）。
【０００５】
さらに、本発明者は植物細胞の骨格構造等について鋭意研究を進め、植物細胞壁のセルロース繊維のヘミセルロース糖鎖による架橋や拘束を解くことにより、セルロースの分解効率が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明の一形態は、細胞壁を構成するセルロース繊維の非結晶部位に編み込まれているヘミセルロースを分解する分解酵素遺伝子を導入した糖化用植物に関する。
好ましくは、前記分解酵素遺伝子はキシログルカナーゼ遺伝子あるいはキシラナーゼ遺伝子である。
【０００６】
また、本発明の別の形態は、細胞壁を構成するキシログルカンおよびキシランの少なくとも一方を超音波処理によって破砕する植物由来原料の調製方法に関する。
超音波処理は、細胞壁を構成するセルロース繊維の非結晶部位に編み込まれているキシログルカン及び／又はキシランを破砕する条件で行われることが好ましい。
【０００７】
本発明のさらに別の形態は、ヘミセルロースの分解酵素遺伝子を導入した糖化用植物あるいは、超音波処理して細胞壁を構成するキシログルカンおよびキシランの少なくとも一方を破砕した植物由来原料を、セルロース分解酵素で処理し、糖化成分(グルコース)を得る工程と、前記糖化成分をエタノール発酵させてエタノールを得る工程とを有するエタノール製造方法に関する。
【発明の効果】
【０００８】
図１は、セルロースの構造の概略図である。セルロースは、グルコースが1,4-β-グルコシル結合で高度に重合したもの（グルカン）が束になってミクロフィブリル（繊維）を形成したものである。各グルカンのグルコース残基中の３番目の水酸基は５番目の酸素原子と、６番目の水酸基は２番目の水酸基と、それぞれ水素結合を形成する。すなわち、隣り合うグルコース同士は一つの共有結合と２つの分子内水素結合で結びつきながら、グルコース残基が互いに１８０度回転した位置で安定化している。このグルカンは、直鎖で平面状のコンフォメーションをとるため、グルカン同士は分子間水素結合により束になって結晶化する。ただし、セルロース繊維は全ての部位で結晶化されているのではなく、ほぼ一定の間隔で非結晶性部位が存在する。
【０００９】
図２は、セルロース繊維（写真）とその非結晶性部位の概略図である。結晶化部位の表層は様々なヘミセルロース糖鎖によって覆われ架橋されているが、非結晶性部位では様々なヘミセルロース糖鎖（ヘミセルロースには例えばキシラン、ガラクタン、グルコマンナン、キシログルカンが含まれる。ペクチンはヘミセルロースに含まれない。）がセルロース繊維に編み込まれている。このようなヘミセルロース糖鎖の編み込みがセルロース繊維を強固に架橋する。
【００１０】
本発明の糖化用植物は、非結晶性部位のセルロース繊維に編み込まれているヘミセルロース糖鎖が生育中に分解され、細胞壁のセルロース繊維の架橋・拘束が緩められる。このため、セルロース分解性に優れ、バイオマスエタノールの材料として好適となる。
【００１１】
同様に、本発明の植物由来原料の調製方法によれば、超音波処理により植物由来原料の細胞壁を構成するキシログルカンおよびキシランの少なくとも一方が破砕され、細胞壁のセルロース繊維の架橋・拘束が緩められる。このため、セルロース分解性に優れ、バイオマスエタノールの材料として好適な植物由来原料を調製することができる。
【００１２】
なお、本発明において「植物」とは、通常の植物体のみならず、葉、花弁、茎、木部、根、表皮、繊維細胞、枝、果実、種子等の植物体の部分、苗、カルス等も含むものとする。
また、本発明において「植物由来原料」とは、生の「植物」及び枯れている「植物」の両方を含む概念である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の第１の実施形態は、ヘミセルロース分解酵素遺伝子を導入することにより植物体内にヘミセルロース分解酵素を発現させた糖化用植物である。この糖化用植物では、細胞壁を構成するセルロース繊維の非結晶部位に編み込まれているヘミセルロースが生育中に分解される。この結果、植物細胞壁のセルロース繊維の架橋・拘束が緩められ、セルロースが分解され易くなる。
【００１４】
本発明の第２の実施形態は、植物由来原料を超音波処理することにより、細胞壁を構成するキシログルカンおよび／又はキシランを破砕する方法である。破砕されたキシログルカン及び／又はキシランは細胞壁から取り除くことができる。このため、植物由来原料の細胞壁を構成するセルロース繊維の架橋・拘束が緩められ、セルロースが分解され易くなる。
【００１５】
植物体内に発現させるヘミセルロース分解酵素としては、キシログルカナーゼ活性及び／またはキシラナーゼ活性を有する酵素（タンパク質）が好ましい。
キシログルカナーゼとは、キシログルカン特異的エンド−β−１，４−グルカナーゼ(xyloglucan-specific endo-β-1,4-glucanase:XEG)とも呼ばれ、キシログルカンの１，４−グルカン骨格を加水分解する酵素をいう。
キシログルカナーゼの種類、由来等は限定されないが、好ましくは糸状菌であるAspergillus aculeatus(麹菌）由来のものがよい。Aspergillus aculeatusとしては公知の菌を使用することができ、公知の方法で培養すればよい。
【００１６】
キシラナーゼとは、エンド−β−１，４−キシラナーゼ(endo-β-1,4-xylanase)とも呼ばれ、キシランのキシログルカンの１，４−キシラン骨格を加水分解する酵素をいう。
キシラナーゼの種類、由来等は限定されないが、好ましくはオオムギ(Hordeum vulgare)由来のものがよい。
【００１７】
本発明では、キシログルカナーゼをコードする遺伝子（DNA）、及び／またはキシラナーゼをコードする遺伝子（DNA）を植物に導入することにより、キシログルカナーゼ、及び／またはキシラナーゼを発現させ、植物体内中のキシログルカン、及び／またはキシランを分解して植物細胞壁のセルロースを分解し易くする。
【００１８】
キシログルカナーゼをコードするDNAとは、キシログルカナーゼ活性を有する酵素をコードする限り限定されない。また、キシラナーゼをコードするDNAとは、キシラナーゼ活性を有する酵素をコードする限り限定されない。
本発明で用いるDNAは、例えばアグロバクテリウム法のような公知の遺伝子工学的手法により植物に導入される。本発明で用いるDNAを公知のベクターに組み込み、得られたプラスミドを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることができる。宿主細胞としては、通常の遺伝子工学的手法に用いられている宿主細胞を使用でき、例えば大腸菌が好適に用いられる。
【００１９】
また、本発明で用いるDNAはエレクトロポレーション法等の公知の方法により細菌に導入することができる。細菌としては、好ましくはアグロバクテリウム細菌が用いられるが、特に限定されない。アグロバクテリウム細菌の菌株の種類は限定されないが、例えば、LBA404, GV3101, C58C1がある。
アグロバクテリウム法のような公知の方法により、本発明で用いるDNAが導入されたアグロバクテリウム細菌を植物細胞切片に接触させ、植物細胞に本発明で用いるDNAを導入することができる。
【００２０】
得られた植物細胞切片は、形質転換した植物細胞のスクリーニングのための例えばカナマイシンのような抗生物質、及びカルベシリン、セフォタキシム、クラホランのようなアグロバクテリウム細菌を殺すための抗生物質といった少なくとも２種以上の抗生物質存在下、ベンジルアデニン(1ppm)及びナフタレン酢酸(0.1ppm)を含むムラシゲ＆スクーグのような寒天培地で培養することができる。
【００２１】
植物細胞切片を培養することにより、カルス状の組織とともに芽（シュート）が出現する。これを４μMインドール酪酸を含むムラシゲ＆スクーグのような公知の発根培地に移植し、培養することにより植物体にした後、バーミキュライト又は土に移植して育てることにより、本発明の植物を得ることができる。
【００２２】
本発明において、植物の細胞にDNAが組み込まれたことは、酵素の定量、キシログルカナーゼ活性やキシラナーゼ活性の測定、ウェスタンブロッティング等の公知の方法によって確認できる。
本発明で用いるDNAを組み込むことができる植物としては何ら規定されず、木本植物であっても草本植物であってもよいが、収穫時期が限定されない点で木本植物が好ましい。
本発明の植物としては、ポプラ、アカシア、ファルカータ、オイルパーム等が例示できるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
以下、本発明をさらに詳しく説明するために実施例を挙げるが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
１．糖鎖分解酵素を発現するための様々なプラスミドの構築
(1) 麹菌（Aspergillus aculeatus）のキシログルカナーゼcDNA (AaXEG2) （配列番号１）は、DNA配列に相補的なXbaI部位を含むフォアワードプライマー（配列番号２）と内部SacI部位を含むリバースプライマー（配列番号３）を用いてpMX1を鋳型としてPCRによって増幅させた。増幅したDNAは、BamHIとSacIで切り出した後、pBEベクターの35Sプロモーター及びE12-Ωエンハンサー配列とNOS転写ターミネータの間に挿入してプラスミド構築物を得た。
【００２５】
(2) オオムギ（Hordeum vulgare）のキシラナーゼcDNA (HvXyl1, accession number U59312) は、DNA配列に相補的なBamHI部位を含むフォアワードプライマー（配列番号４）と内部SacI部位を含むリバースプライマー（配列番号５）を用いてpMX1を鋳型としてPCRによって増幅させた。増幅したDNAは、BamHIとSacIで切り出した後、pBEベクターの35Sプロモーター及びE12-Ωエンハンサー配列とNOS転写ターミネータの間に挿入してプラスミド構築物を得た。
【００２６】
２．ポプラへの遺伝子の導入
プラスミド構築物をアグロバクテリウム菌（Agrobacterium tumefaciens LBA4404）にエレクトロポレーション（400V、330μFの条件で）により導入した。そして、室温下、無菌でフラスコ培養したポプラ（Populus alba）の葉を細かく刻んだものに、上記アグロバクテリウム菌を接種した。
【００２７】
３．サンプルの調製
(1)上記のようにして得られた幼植物体を寒天培地の上で、グロースチャンバー中、18時間明期及び6時間暗期の周期で30日間、27℃で生育させた。その後、土壌に移植して30日間生育させたものを実験材料に用いた。具体的には、30cm以上の高さのポプラの茎から樹皮をはぎ、よく水洗いして木部を調製した。この木部はミルにより粉砕した。
(2)粉砕した木部100mgを測り取り、コーニングチューブ（5ml容）に入れた。各サンプルにつきそれぞれ3点取った。さらに、前記コーニングチューブに酢酸バッファー2 mlを加え、フタを若干緩めてオートクレーブした（121℃、20分間）。その後、100mg/mlのメイセラーゼ溶液（20FPU/ml）（セルラーゼ酵素標品、明治製菓株式会社）を200μl加えた。これを45℃、100rpmで２日間振とうした。
【００２８】
４．還元糖量の測定
２日間振とうしたサンプルから100μlを分取し、ソモギー・ネルソン法によって還元糖量を測定した。ソモギー・ネルソン法の手順は次の通りである。
(a）各サンプル100μlをガラス試験管に取り、各試験管に水400μlを入れて500μlにする。
(b）各試験管にソモギー銅液500μlを加え、ボルテックスミキサーで撹拌する。
(c）20分間、沸騰した湯（100℃）の中に置く。
(d）試験管を水（氷水）につけて冷却する。
(e）ネルソン液 500μlを加える。
(f）試験管をよく振って泡が出なくなるまでボルテックスミキサーで撹拌する。
(g）ＯＤ５００で比色定量する。
【００２９】
５．エタノール生産量の測定
(1) 2日間振とうしたサンプル（コーニングチューブ）に酵母用培地を 0.22 ml を加え、さらに、酵母を 0.22 ml を加えた。これを横倒しにして35℃、100rpm で２日間振とう培養した。
(2) 酵母用培地の組成及び酵母は次の通りである。
(a)酵母用培地
(NH4)2HPO4(リン酸水素二アンモニウム)を2.0g、MgSO4・7H2Oを0.1g、Yeast Extractを4g、メスフラスコに入れて混合し、純水で200mlにメスアップする
(b) 酵母
グルコース(10g), Yeast Extract (1g), KH2PO4 (0.1g), MgSO4・7H2O (0.1g)及び(NH4)2SO4 (0.1g)を加えて１リットルにする。200mlの三角フラスコに上記の培地50mlを入れ、酵母（コロニー）を植えて30℃、100 rpmの条件で24時間培養する。
【００３０】
(3) ２日間振とう培養したサンプル液を100μlを採取し、15000rpmで5 min遠心分離して上清（20μl）を採取した。この上清に0.5％イソプロピルアルコール水溶液20μlを加えて40μl とし、そのままガスクロマトグラフィでエタノール量を測定した。
エタノール量を測定するガスクロマトグラフィの条件は、下記の通りである。
・ガスクロオーブン温度50℃
・カラム：Supelco Supelcowax1 (0.53x15m)
・検出器：FID (250℃)。
【００３１】
６．糖化量及びエタノール生産量の測定結果
糖化量及びエタノール生産量の測定結果を表１(図３)に示す。表１には、ポプラ野生株（Populus alba）１〜７の糖化量及びエタノール生産量（比較例１〜７）と、ヘミセルロース糖鎖の分解酵素（キシログルカナーゼとキシラナーゼ）を過剰発現するポプラ(実施例８〜２１）の木部における糖化量及びエタノール生産量を示した。ここで、ポプラ野生株とはヘミセルロースの分解酵素遺伝子を導入していない植物(ポプラ)をいう。
表１から、ポプラ野生株１〜７の糖化量（比較例1〜7）に比べて、キシログルカナーゼを過剰発現するポプラ１〜７の糖化量（実施例8〜14）及びキシラナーゼを過剰発現するポプラ１〜７の糖化量（実施例15〜21）はいずれも増大した。
【００３２】
一方、キシログルカナーゼを過剰発現するポプラ１〜７のエタノール生産量（実施例8〜14）は、ポプラ（Populus alba）野生株１〜７のエタノール生産量（比較例1〜7）よりも増大したが、キシラナーゼを過剰発現するポプラ１〜７の糖化量（実施例15〜21）は、ポプラ野生株１〜７のエタノール生産量（比較例1〜7）とほぼ同じであった。このことは、キシラナーゼを過剰発現するポプラで糖化された糖は、エタノール醗酵に用いられるグルコースを中心とした６単糖ではなく、アラビノースなどを中心とした５単糖であることが推察された。
【実施例２】
【００３３】
１．超音波処理による植物由来原料の調製
キシログルカナーゼとキシラナーゼ）を過剰発現するポプラ（Populus alba）及びポプラの野生株、並びにファルカータ（Paraserianthes falcataria）、アカシア（Acacia mangium）及びパーム（Elaeis guineensis)の野生株の木部を超音波ホモジナイザー（Branson Sonifier250）を用いて、6.8 micro tiplimit, 50%のレベルで超音波処理した。超音波処理時間は、２分間、５分間、８分間とした。超音波処理は、サンプルを氷で冷やしながら行った。
２．サンプルの調製
(1) 超音波処理した木部100mgをコーニングチューブ（5ml容）に入れた。各サンプルについてそれぞれ3点取った。さらに、前記コーニングチューブに酢酸バッファー2mlを加え、フタを若干緩めてオートクレーブした（121℃、20分間）。その後、100mg/mlのメイセラーゼ溶液（20FPU/ml）（セルラーゼ酵素標品、明治製菓株式会社）を200μl加えた。これを45℃、100rpmで2日間振とうした。
【００３４】
３．還元糖量の測定
(1) 2日間振とうしたサンプルから100μlを分取し、ソモギー・ネルソン法によって還元糖量を測定した。ソモギー・ネルソン法は前述した通りである。
(2) 2日間振とうしたサンプル（コーニングチューブ）に、酵母用培地を 0.22 ml を加えた。このコーニングチューブに、更に酵母を 0.22 ml を加えた。横倒しにして35℃・2日間・100 rpm で振とう培養した。酵母用培地及び酵母は前述した通りである。
４．エタノール生産量の測定
(1) 2日間振とうしたサンプル（コーニングチューブ）に酵母用培地を 0.22 ml を加え、さらに、酵母を 0.22 ml を加えた。これを横倒しにして35℃、100rpm で２日間振とう培養した。酵母用培地の組成及び酵母は前述した通りである。
(2) 振とう培養したサンプル液を100μlを採取し、15000rpmで5分間遠心分離して上清（20μl）を採取した。この上清に0.5％イソプロピルアルコール水溶液を20μl加えて40μl とし、そのままガスクロマトグラフィでエタノール量を測定した。ガスクロマトグラフィの条件は前述した通りである。
【００３５】
５．糖化量及びエタノール生産量の測定結果
糖化量及びエタノール生産量の測定結果を表２(図４)に示す。表２に示すように、ポプラ野生株１（比較例 22〜25）では、超音波処理を行っていないもの(比較例22）に比べて超音波処理（2、5、8分間）を行ったもの(比較例23〜25）の方が糖化量及びエタノール生産量が増大した。また、超音波処理時間が長いほど、糖化量及びエタノール生産量は増大する傾向にあった。
【００３６】
これに対して、キシログルカナーゼを過剰発現するポプラ（キシログルカナーゼ１）では、超音波処理を行っても、また、超音波処理時間を長くしても糖化量及びエタノール生産量は増大しなかった（実施例 26〜29）。同様に、キシラナーゼを過剰発現するポプラ（キシラナーゼ3）においても、超音波処理（2、5、8分間）を行ったことによる、糖化量及びエタノール生産量の増大はみられなかった（実施例 30〜33）。
【００３７】
また、熱帯樹種であるパーム、ファルカータ及びアカシアのうちファルカータ及びアカシアについては超音波処理を行っていないもの(比較例38，42）に比べて超音波処理（2、5、8分間）を行ったもの(実施例39〜41，43）の方が糖化量及びエタノール生産量が増大した。また、超音波処理時間が長いほど、糖化量及びエタノール生産量は増大する傾向にあった。
【００３８】
一方、パームについては、超音波処理時間によって糖化量及びエタノール生産量の増大はみられなかった（比較例34、実施例35〜37）。
以上より、ポプラ及び一部の熱帯樹種において超音波処理により糖化量及びエタノール生産量が増大することが分かった。
【実施例３】
【００３９】
１．木部の超音波処理により遊離した糖鎖の構成糖比（％）の測定
ポプラ野生株（Populus alba）、キシログルカナーゼを過剰発現するポプラ、キシラナーゼを過剰発現するポプラ、熱帯樹種であるパーム（Elaeis guineensis）、ファルカータ（Paraserianthes falcataria）及びアカシア（Acacia mangium）の野生株の木部をそれぞれ超音波処理(2、5、8分間）し、これによって遊離した糖鎖を2Mのトリフルオロ酢酸によって120℃、1時間処理して単糖にまで加水分解した。超音波処理は上述した通りである。その後、ガスクロマトグラフィで構成糖を測定した。ガスクロマトグラフィの条件は、下記の通りである。
・ガスクロオーブン温度200℃
・カラム：DB-225 (0.25 x 30 m)
・検出器：FID (250℃)。
【００４０】
２．超音波処理による可溶化糖量の測定
ポプラ野生株（Populus alba）、キシログルカナーゼを過剰発現するポプラ、キシラナーゼを過剰発現するポプラ、熱帯樹種であるパーム（Elaeis guineensis)、ファルカータ（Paraserianthes falcataria）及びアカシア（Acacia mangium）の野生株の木部をそれぞれ超音波処理（2分間）し、可溶化された糖量をフェノール硫酸法によって測定した。フェノール硫酸法は下記のとおりである。
(a) 各サンプル10〜500μlをガラス試験管に取る。
(b) 各ガラス試験管に水0〜490μlを入れて、トータルで500μl とする。
(c) 2.5%のフェノール液500μl を加えて、トータルで1ml とし、ボルテックス撹拌する。
(d) 濃硫酸（conc. Ｈ２ＳＯ４）を2.5 ml加えてボルテックス撹拌する。その後、試験管が冷えるまで放置する（冷やしてはいけない）。
(e) ＯＤ４９０で比色定量する。
【００４１】
３．構成糖比及び糖量の測定結果
構成糖比及び糖量の測定結果を表３(図５)に示す。表３中、Rhaはラムノース、Fucはフコース、Araはアラビノース、Xylはキシロース、Manはマンノース、Galはガラクトース、Glcはグルコースを示す。
【００４２】
表３から、木部を超音波処理（2分間）することにより可溶化された糖鎖の構成糖の大半は、キシロース（Xyl）とグルコース（Glc）であることが明らかとなった（実施例44〜49）。このことは、木部の超音波処理によって可溶化される糖鎖はキシログルカンとキシランであることを示している。
表２に示したように、木部を超音波処理すると、すなわち、物理的に木部からキシログルカンとキシランを除くと糖化量が増大しており、この結果は、キシログルカナーゼやキシラナーゼを過剰発現したポプラの糖化量が増大した結果（実施例8〜21）と一致する。
【００４３】
また、キシログルカナーゼを過剰発現した木部やキシラナーゼを過剰発現させた木部を更に超音波処理（2分間）しても、糖化量やエタノール生産量が増大しない結果（実施例26〜33）とも一致した。
【００４４】
以上から、木部に超音波処理を行うこと、及びキシログルカナーゼやキシラナーゼの遺伝子を導入すること、のいずれの処理を行った場合でも、細胞壁のセルロース繊維に含まれるキシログルカンやキシランが分解或いは可溶化され、これによって糖化量やエタノール生産量を増大させることができることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】セルロース繊維を概略的に示す図。
【図２】セルロース繊維の顕微鏡写真及びセルロース繊維の非結晶化部位を模式的に示す図。
【図３】糖鎖分解酵素を過剰発現する組み換えポプラの糖化量をエタノール生産量を示す表。
【図４】超音波処理したポプラ及び熱帯樹木の糖化量をエタノール生産量を示す表。
【図５】超音波処理によって木部から可溶化された糖鎖の構成糖比を示す表。
【図１】
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【図３】
2009225744.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図２】
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【配列表】
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