(57)【要約】【課題】従来のヒスチジンやシステインとは異なるタグを簡便にタンパク質に付加することを可能にするベクター、及び該ベクターが導入された形質転換体を提供する。【解決手段】(A)連続する3〜5個のメチオニン残基からなるメチオニンタグをコードする塩基配列、(B)プロモーター配列（ここで、前記プロモーター配列は、前記メチオニンタグをコードする塩基配列の上流に接続されている）、及び(C)所望のタンパク質をコードする塩基配列（ここで、前記所望のタンパク質をコードする塩基配列は、前記プロモーター配列の下流に接続されており、かつ前記メチオニンタグをコードする塩基配列の上流または下流に接続されている。）を含む、メチオニンタグ付きタンパク質発現ベクター。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(A)〜(C)を含む、メチオニンタグ付きタンパク質発現ベクター。
(A)連続する3〜5個のメチオニン残基からなるメチオニンタグをコードする塩基配列、
(B)プロモーター配列（ここで、前記プロモーター配列は、前記メチオニンタグをコードする塩基配列の上流に接続されている）、及び
(C)所望のタンパク質をコードする塩基配列（ここで、前記所望のタンパク質をコードする塩基配列は、前記プロモーター配列の下流に接続されており、かつ前記メチオニンタグをコードする塩基配列の上流または下流に接続されている。）
【請求項２】
以下の(D)〜(F)を含む、メチオニンタグベクター。
(D)連続する3〜5個のメチオニン残基からなるメチオニンタグをコードする塩基配列、
(E)プロモーター配列（ここで、前記プロモーター配列は、前記メチオニンタグをコードする塩基配列の上流に接続されている）、及び、
(F)所望のタンパク質をコードする塩基配列を導入するためのクローニングサイト（ここで、前記クローニングサイトは、前記プロモーター配列の下流に接続されており、かつ前記メチオニンタグをコードする塩基配列の上流及び／または下流に接続されている）。
【請求項３】
請求項2に記載のベクターに接続されたクローニングサイトに、所望のタンパク質をコードする塩基配列が導入された、メチオニンタグ付きタンパク質発現ベクター。
【請求項４】
請求項1または3に記載のベクターを宿主細胞に導入して形質転換させることにより得られる形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メチオニンタグ付きタンパク質発現ベクター、メチオニンタグベクター及び該メチオニンタグベクターにタンパク質をコードする塩基配列が導入されたベクター、ならびに前記ベクターが導入された形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、特定のタンパク質を大腸菌、酵母、動物細胞等の宿主細胞などで発現させ、これを検出または精製するために、特定のタンパク質の末端にいわゆるタグとなる配列を付加する方法が知られている。これらのタグ（タグペプチド）としては、ヒスチジンがつながったヒスチジンタグ、システインがつながったシステインタグが例示される。
【０００３】
これらのタグペプチドが付加されたタンパク質を検出する方法としては、例えば、これらのタグとなる配列を認識する抗体を用いる方法が知られている。また、例えば、ヒスチジンタグが付加されたタンパク質を、亜鉛またはコバルトを用いて単離する方法が報告されている（特許文献1）。また、例えば、ヒスチジンタグが付加されたタンパク質を、ニッケルアフィニティーカラムを利用することにより取得する方法が報告されている（特許文献2）。
【特許文献１】特表2007-505134号公報
【特許文献２】特開平10-212298号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、従来のヒスチジンやシステインとは異なるタグを簡便にタンパク質に付加することを可能にするベクターを提供することを課題とする。具体的には、本発明は、メチオニンタグを簡便にタンパク質に付加することを可能にするベクターを提供することを課題とする。また、本発明は、前記ベクターが導入された形質転換体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題について検討を行い、タンパク質にメチオニンタグを付加するためのベクターの構築に成功した。また、本発明者らは、メチオニン残基をコードする塩基配列と所望のタンパク質をコードする塩基配列とを持つベクターの構築に成功した。さらに、本発明者らは、このベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を作製し、当該形質転換体においてメチオニンタグが付加された所望のタンパク質を発現できることを見出した。本発明は当該知見に基づきさらに検討を重ねた結果完成されたものであり、下記に掲げるものである。
項1．以下の(A)〜(C)を含む、メチオニンタグ付きタンパク質発現ベクター。
(A)連続する3〜5個のメチオニン残基からなるメチオニンタグをコードする塩基配列、
(B)プロモーター配列（ここで、前記プロモーター配列は、前記メチオニンタグをコードする塩基配列の上流に接続されている）、及び
(C)所望のタンパク質をコードする塩基配列（ここで、前記所望のタンパク質をコードする塩基配列は、前記プロモーター配列の下流に接続されており、かつ前記メチオニンタグをコードする塩基配列の上流または下流に接続されている。）
項2．以下の(D)〜(F)を含む、メチオニンタグベクター
(D)連続する3〜5個のメチオニン残基からなるメチオニンタグをコードする塩基配列、
(E)プロモーター配列（ここで、前記プロモーター配列は、前記メチオニンタグをコードする塩基配列の上流に接続されている）、及び、
(F)所望のタンパク質をコードする塩基配列を導入するためのクローニングサイト（ここで、前記クローニングサイトは、前記プロモーター配列の下流に接続されており、かつ前記メチオニンタグをコードする塩基配列の上流及び／または下流に接続されている）。
項3．項2に記載のベクターに接続されたクローニングサイトに、所望のタンパク質をコードする塩基配列が導入された、メチオニンタグ付きタンパク質発現ベクター。
項4．項1または3に記載のベクターを宿主細胞に導入して形質転換させることにより得られる形質転換体。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のメチオニンタグ付きタンパク質発現ベクターによれば、これを宿主細胞に導入することにより得られた形質転換体において、連続した3〜5個のメチオニン残基からなるメチオニンタグが付加された所望のタンパク質を容易に発現させることができる。
【０００７】
また、本発明のメチオニンタグベクターによれば、これに所望のタンパク質をコードする塩基配列を挿入することにより、連続した3〜5個のメチオニン残基からなるメチオニンタグが付加された所望のタンパク質発現ベクターを容易に作製することができる。また、このようにして作製されたベクターを宿主細胞に導入することにより、得られた形質転換体において、連続した3〜5個のメチオニン残基からなるメチオニンタグが付加された所望のタンパク質を容易に発現させることができる。
【０００８】
また、これらのベクターを用いることにより、連続した3〜5個のメチオニン残基からなるメチオニンタグが付加された所望のタンパク質を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明について説明する。
(1)メチオニンタグ付きタンパク質発現ベクター
本発明のメチオニンタグ付きタンパク質発現ベクター（以下、発現ベクターと称することもある）は、(A)メチオニンタグをコードする塩基配列、(B)プロモーター配列、及び(C)所望のタンパク質をコードする塩基配列を少なくとも有する。
【００１０】
前記メチオニンタグをコードする塩基配列は、連続する3〜5個のメチオニン残基をコードする塩基配列からなる。前記発現ベクターを構築するために用いられるベクター（以下、基本ベクターと称することもある）にあらかじめメチオニン残基をコードする塩基配列が含まれている場合には、これを前記メチオニンタグの一部または全部として利用することができる。前記基本ベクターにあらかじめ含まれるメチオニン残基をコードする塩基配列としては、開始メチオニンに相当する塩基配列も包含する。すなわち、前記発現ベクターに含まれるメチオニンタグをコードする塩基配列は、(i)基本ベクターに、連続する3〜5個のメチオニン残基をコードする塩基配列を導入することにより得られるものでもあってもよく、また(ii)基本ベクター中にあらかじめ含まれている連続する3〜5個のメチオニン残基（開始メチオニンであってもよい）をコードする塩基配列であってもよく、また(iii)基本ベクターに導入された塩基配列と、基本ベクター中にあらかじめ含まれている塩基配列とをあわせることにより得られる連続する3〜5個のメチオニン残基をコードする塩基配列でもよい。前記メチオニンタグをコードする塩基配列は、好ましくは連続する3〜4個のメチオニン残基をコードする塩基配列からなる。
【００１１】
このため、前記発現ベクターを利用することにより発現されるメチオニンタグは、前記基本ベクターに導入される塩基配列のみから発現されるか、前記基本ベクター中にあらかじめ含まれている塩基配列のみから発現されるか、または前記基本ベクターに導入される塩基配列と基本ベクター中にあらかじめ含まれている塩基配列とをあわせた塩基配列から発現される。
【００１２】
本発明におけるメチオニンタグは連続する3〜5個のメチオニン残基からなり、好ましくは連続する3〜4個のメチオニン残基からなる。
【００１３】
前記発現ベクターにおけるプロモーター配列の接続位置は、前記発現ベクターを導入することにより得られる形質転換体において、連続した3〜5個のメチオニン残基からなるメチオニンタグが付加された所望のタンパク質が発現される限り限定されない。例えば、前記プロモーター配列は、前記メチオニンタグをコードする塩基配列の上流に接続される。前記発現ベクターにおいて、前記メチオニンタグをコードする塩基配列は該プロモーター配列の制御下にある。
【００１４】
ここで使用されるプロモーターは、当該分野で従来公知のプロモーターであれば限定されない。例えば、プロモーターとしてT7lac、T7、araBADプロモーターなどが挙げられ、これらは、例えば大腸菌においてタンパク質を発現させる場合に使用される。また、SV40、CMV、RSV、TK、EF-1αプロモーターなどが挙げられ、これらは、例えば動物細胞においてタンパク質を発現させる場合に使用される。プロモーターとして、他に酵母用プロモーター、昆虫細胞用プロモーター、ウイルスプロモーターを使用することも可能である。
【００１５】
また、前記発現ベクターにおける所望のタンパク質をコードする塩基配列の接続位置も、前記発現ベクターを導入することにより得られる形質転換体において、連続した3〜5個のメチオニン残基からなるメチオニンタグが付加された所望のタンパク質が発現される限り限定されない。
【００１６】
例えば、前記所望のタンパク質をコードする塩基配列は、前記プロモーター配列より下流に接続され、かつ前記メチオニンタグをコードする塩基配列の上流または下流に接続される。前記所望のタンパク質をコードする塩基配列が、前記メチオニンタグをコードする塩基配列の上流に接続されるか、または下流に接続されるかについては、使用する所望のタンパク質の性質や宿主細胞の性質等に応じて適宜変更され、当該変更は当該分野において一般的に検討される範囲内で行われる。
【００１７】
例えば、前記所望のタンパク質をコードする塩基配列が前記メチオニンタグをコードする塩基配列の下流に接続され、かつその所望のタンパク質をコードする塩基配列のＮ末端部にメチオニン等のシグナル配列がある場合、これは当該Ｎ末端部でメチオニンプロテアーゼ等の酵素の作用により切断を受ける可能性がある。このような場合には、好ましくは、所望のタンパク質をコードする塩基配列は、前記プロモーター配列より下流に接続されており、かつ前記メチオニンタグをコードする塩基配列の上流に接続されている。
【００１８】
いずれの場合であっても、前記発現ベクターにおいて、所望のタンパク質をコードする塩基配列は前記プロモーター配列の制御下にある。
【００１９】
所望のタンパク質の種類は限定されず、任意のタンパク質を使用することができる。
【００２０】
このほか、前記発現ベクターには、タンパク質の発現に一般に必要な複製起点やリボソーム結合部位などの緒因子が接続されており、またGreen Fluorescent Protein(GFP)遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子、薬剤耐性遺伝子等の塩基配列、また、β−ガラクトシダーゼをコードする塩基配列（LacZ遺伝子）等が接続されていてもよい。これらの塩基配列は、メチオニンタグ及び所望のタンパク質の好適な発現を妨げない限り、前記発現ベクターの任意の位置に接続される。
【００２１】
前記発現ベクターの製造方法としては、当該分野で従来公知の方法を用いることができ、所望の発現ベクターが得られる限り限定されない。
【００２２】
例えば、基本ベクターへの前記所望のタンパク質をコードする塩基配列の導入は、基本ベクター上に前記メチオニンタグをコードする塩基配列とともにクローニングサイトを配置し、該クローニングサイト部分に制限酵素等を用いて所望のタンパク質をコードする塩基配列を導入することにより行ってもよい。
【００２３】
また、例えば、基本ベクターへの前記メチオニンタグをコードする塩基配列の導入は、基本ベクター上に、所望のタンパク質をコードする塩基配列とともにクローニングサイトを配置し、該クローニングサイト部分に、制限酵素等を用いてメチオニンタグをコードする塩基配列を導入することにより行ってもよい。
【００２４】
また、例えば、基本ベクターへの、前記メチオニンタグをコードする塩基配列及び所望のタンパク質をコードする塩基配列の導入は、前記メチオニンタグをコードする塩基配列と所望のタンパク質をコードする塩基配列とをあらかじめ接続し、これを基本ベクターに導入することにより行ってもよい。
【００２５】
前記発現ベクターを構築するために用いられるベクター（基本ベクター）は、所望のタンパク質発現ベクターが得られる限り種々のものが利用でき限定されない。該ベクターとしては、例えば、pUC18/19、pBR322、pBluescriptなどのプロモーターを含まないベクターやpET vector、pCruz expression vector、pcDNA vectorなどのあらかじめプロモーターを含むベクターが挙げられる。これらのベクターは、当該分野において一般的に検討される範囲内で使用目的に応じて適宜選択すればよい。
(2)メチオニンタグベクター
本発明のメチオニンタグベクター（以下、タグベクターと称することもある）は、(D)メチオニンタグをコードする塩基配列、(E)プロモーター配列、及び(F)クローニングサイトを少なくとも有する。
【００２６】
前記メチオニンタグをコードする塩基配列は、連続する3〜5個のメチオニン残基をコードする塩基配列からなり、前記(A)メチオニンタグをコードする塩基配列と同様のものが使用される。
【００２７】
すなわち、本発明のタグベクターを構築するために用いられるベクター（以下、基本ベクターと称することもある）にあらかじめメチオニン残基（開始メチオニンであってもよい）をコードする配列が含まれている場合には、これをメチオニンタグの一部または全部として利用することができる。このため、該タグベクターに含まれる前記メチオニンタグをコードする塩基配列も、(i)基本ベクターに、連続する3〜5個のメチオニン残基をコードする塩基配列を導入することにより得られるものでもあってもよく、また(ii)基本ベクター中にあらかじめ含まれている連続する3〜5個のメチオニン残基をコードする塩基配列であってもよく、また(iii)基本ベクターに導入された塩基配列と基本ベクター中にあらかじめ含まれている塩基配列とをあわせることにより得られる連続する3〜5個のメチオニン残基をコードする塩基配列でもよい。
【００２８】
前記メチオニンタグをコードする塩基配列は、好ましくは連続する3〜4個のメチオニン残基をコードする塩基配列からなる。
【００２９】
このため、前記タグベクターを利用して発現されるメチオニンタグは、前記基本ベクターに導入される塩基配列のみから発現されるか、前記基本ベクター中にあらかじめ含まれている塩基配列のみから発現されるか、または前記基本ベクターに導入される塩基配列と基本ベクター中にあらかじめ含まれている塩基配列とをあわせた塩基配列から発現される。
【００３０】
本発明におけるメチオニンタグも連続する3〜5個のメチオニン残基からなり、好ましくは連続する3〜4個のメチオニン残基からなる。
【００３１】
前記タグベクターにおける前記プロモーター配列の接続位置は、所望の効果を有するベクターが得られる限り限定されない。例えば、前記プロモーター配列は、前記メチオニンタグをコードする塩基配列の上流に接続される。前記タグベクターにおいて、前記メチオニンタグをコードする塩基配列は前記プロモーター配列の制御下にある。ここで使用されるプロモーターは、当該分野で公知のプロモーターであれば限定されず、前述のものが例示される。
【００３２】
また、前記タグベクターにおけるクローニングサイトの接続位置も、所望の効果を有するベクターが得られる限り限定されない。例えば、前記クローニングサイトは、前記プロモーター配列の下流に接続され、かつ前記メチオニンタグをコードする塩基配列の上流及び／または下流に接続される。
【００３３】
前記クローニングサイトが、前記メチオニンタグをコードする塩基配列の上流に接続されるか、または下流に接続されるかについては、その後、該クローニングサイトに導入され得るタンパク質の性質や、更には宿主細胞の性質等に応じて適宜変更され、当該変更は当該分野において一般的に検討される範囲内で行われる。
【００３４】
例えば、該クローニングサイトが、前記メチオニンタグをコードする塩基配列の下流に接続され、かつ、該クローニングサイトにその後に導入され得るタンパク質をコードする塩基配列のＮ末端部にメチオニン等のシグナル配列がある場合、これは当該Ｎ末端部でメチオニンプロテアーゼ等の酵素の作用により切断を受ける可能性がある。このような場合には、好ましくは、前記クローニングサイトは、前記メチオニンタグをコードする塩基配列の上流に接続される。
【００３５】
なお、前記クローニングサイトが、前記メチオニンタグをコードする塩基配列の上流及び下流に接続される場合には、その後に導入され得るタンパク質をコードする塩基配列は、上流部または下流部のいずれかのクローニングサイトに導入されればよい。この場合、タンパク質をコードする塩基配列をどちらのクローニングサイトに導入するかについては、前述のように該クローニングサイトに導入され得るタンパク質の性質や、更には宿主細胞の性質等に応じて適宜決定される。
【００３６】
前記クローニングサイトは、所望のタンパク質をコードする塩基配列を前記タグベクターに導入するために接続されており、これは限定されないが、例えばマルチクローニングサイトが挙げられる。このため、前記クローニングサイトは、前記タグベクターにおいて導入された所望のタンパク質をコードする塩基配列が前記プロモーター配列の制御下にあるように接続される。
【００３７】
前記所望のタンパク質の種類は限定されず、任意のタンパク質を使用することができる。
【００３８】
このほか、前記タグベクターには、タンパク質の発現に一般に必要な緒因子が接続されており、またＧＦＰ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、薬剤耐性遺伝子等の遺伝子をコードする塩基配列などが接続されていてもよく、その塩基配列及び導入場所は前述のものが例示される。
【００３９】
前記タグベクターにおける、メチオニンタグをコードする塩基配列、プロモーター配列、及びクローニングサイトの配置は、図1に例示される。図1に示されるタグベクターでは、メチオニンタグをコードする塩基配列(tag)の上流及び下流にマルチクローニングサイト(MCS)が接続されており、上流側のマルチクローニングサイトのさらに上流にプロモーター配列(promoter)が接続されている。また、図１に示されるタグ付きベクターでは、複製起点(Ori)及び薬剤耐性遺伝子も示されている。
【００４０】
前記のタグベクターの製造方法は、当該分野で従来公知の方法を用いることができ、所望のタグベクターが得られる限り限定されない。また、前記のタグベクターを構築するために用いられるベクター（基本ベクター）としては、前述のものが例示される。
(3)タンパク質をコードする塩基配列のタグベクターへの導入
前記タグベクターには、所望のタンパク質をコードする塩基配列を導入することができる。好ましくは、所望のタンパク質をコードする塩基配列は、前記メチオニンタグをコードする塩基配列の上流または下流に導入される。さらに好ましくは、所望のタンパク質をコードする塩基配列は、前記タグベクターに接続されたクローニングサイトに導入される。ここで、所望のタンパク質は限定されない。
【００４１】
前記所望のタンパク質をコードする塩基配列のタグベクターへの導入は、当該分野で公知の方法に従い行われる。例えば、前記所望のタンパク質をコードする塩基配列がクローニングサイトに導入される場合、該クローニングサイトに含まれる制限酵素認識部位を利用することにより、目的とする位置に該塩基配列を導入させることができる。
【００４２】
このように所望のタンパク質をコードする塩基配列を前記タグベクターに導入することにより、該塩基配列のＮ末端側またはＣ末端側に連続した3〜5個のメチオニン残基からなる塩基配列を付加することができる。
(4)形質転換体
本発明の形質転換体は、前記発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、または前記タグベクターに所望のタンパク質をコードする塩基配列を導入した後、これを宿主細胞に導入することによりにより得ることができる。
【００４３】
ここで、上記宿主細胞は限定されず、大腸菌をはじめとする細菌類、酵母、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞など種々の細胞が挙げられる。好ましくは、細菌類、動物細胞である。
【００４４】
また、前記発現ベクターまたは所望のタンパク質をコードする塩基配列が導入されたタグベクターの宿主細胞への導入は、当該分野で従来公知の方法に従い行うことができる。
【００４５】
例えば、これらのベクターの大腸菌への導入には、塩化カルシウム法や塩化ルビジウム法で作製したコンピテントセルにヒートショック法で導入する方法や、電気的に細胞膜に穴を開けて導入するエレクトロポレーション法などを用いることができる。また、例えば酵母細胞にはＬｉ法など、植物細胞にはアグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法など、哺乳細胞には塩化カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＤＥデキストラン法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ウイルス法などを用いることができる。
【００４６】
このようにして得られた形質転換体を用いることにより、当該形質転換体において、Ｎ末端またはＣ末端に連続した3〜5個のメチオニン残基からなるメチオニンタグが付加されたタンパク質を発現させることができる。
【００４７】
このような形質転換体における前記タンパク質の発現は、当該分野で従来公知の方法に従い行うことができる。例えば、以下の実施例に記載するように、好適な培地で形質転換体を培養する工程を経ることにより、前記メチオニンタグが付加されたタンパク質を発現させることができる。
【００４８】
また、このように発現されたタンパク質は、当該分野で従来公知の方法に従い、回収・精製することができる。例えば、これらのタンパク質は、以下の実施例に記載する方法に従い、回収・精製することができる。また、これらのタンパク質は、連続する3〜5個のメチオニン残基からなるメチオニンタグと金を利用して回収・精製することができる。金を利用して回収する方法としては、以下の実施例に記載する方法が挙げられる。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例を挙げて、本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
本発明のメチオニン付き発現ベクターの構築は、大腸菌でタンパク質発現が可能であるベクターpET-15b（MERCK/Novagen）を用いて行なった。所望のタンパク質として、マーカータンパク質としてよく用いられるEnhanced Green Fluorescent Protein (EGFP)を用いた。前述のタンパク質EGFPを含むpCruz GFP Expression vector C (Santa Cruz Biotechnology, Inc.)を使用し、EGFPをコードする塩基配列の3’末端側に存在するmultiple cloning site (MCS)のScaI、BglII部位間に以下のメチオニン3個をコードする塩基配列を含むメチオニンタグ導入用配列のオリゴヌクレオチド（5’-CATGATGATGTA-3’と5’-GATCTACATCATCATG-3’）をアニールさせたものを導入した。なお、前者のプライマーをprimer 1-1とし、配列番号１で表す。また、後者のプライマーをprimer 1-2とし、配列番号２で表す。
【００５０】
具体的には、pCruz GFP Expression vector C  ５μｇを制限酵素ScaI（東洋紡績株式会社） 25 Uを用い添付のバッファー条件を用いて100μｌ中37℃で16時間処理した後、その処理液の一部を使い完全切断を電気泳動で確認した。さらに、得られた処理液に制限酵素BglII（東洋紡績株式会社製）25 Uを加え37℃で３時間処理した後、その処理液の一部を使い完全切断を電気泳動で確認した。確認後、得られた処理液をTE（10 mM Tris-HCl(pH7.5),1 mM EDTAを含有する精製水）で200μlにメスアップし、容量比が、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール=25：24：1の混合液を200μl加えて、ボルテックスミキサーで混合し酵素を失活させた。その後、遠心機M150-IV（株式会社佐久間製作所製）を用い15000rpm、5分間、室温で遠心分離を行ない、上清を分取した。その上清に、10μg/μl グリコーゲン水溶液を1μl、3M 酢酸ナトリウム水溶液(pH 5.2)を20μl、エタノール（特級：ナカライテスク株式会社製）を500μl加えてよく混和後、15000rpm、5分間、4℃で遠心分離を行ない、上清を除いた。これに、さらに70容量％エタノール水溶液を500μl加えて懸濁後、15000rpm、5分間、4℃で遠心分離を行ない、上清を除き真空乾燥させた。これをTE 30μlに溶解後、その一部を使い、電気泳動を行ない、切断されたpCruz GFP Expression vector Cが回収できているかを確認し、分子量マーカーを用いて濃度を推定した。
【００５１】
一方、メチオニンタグ導入用配列を含むオリゴヌクレオチドをそれぞれ100pmol/μlになるようにTEで溶解し、これを各5μlと5M NaCl水溶液25 μlをTEで500μlにメスアップし95℃、5分間、熱処理した後、1時間半ほどかけて徐冷した（アニール後の溶液濃度は10pmol/μl）。これを150fmolまたは300fmol用いて、先に制限酵素処理を行なったpCruz GFP Expression vector C 50fmolにライゲーションキット（タカラバイオ株式会社製）を用いて16℃、30分間、導入した。導入後、得られた溶液をTEで200μlにメスアップし、容量比が、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール=25：24：1の混合液を200μl加えてボルテックスミキサーで混合し酵素を失活させた。さらに、15000rpm、5分間、室温で遠心分離を行ない、上清を分取させた。その上清に、10μg/μl グリコーゲン水溶液を1μl、3M 酢酸ナトリウム水溶液を20μl、エタノールを500μl加えてよく混和後、15000 rpm、5分間、4℃で遠心分離を行ない、上清を取り除いた。さらに70容量％エタノール水溶液を500μl加え懸濁後、15000rpm、5分間、4℃で遠心分離を行ない、上清を取り除き、真空乾燥させた。これをTE 5μlで溶解後、制限酵素ScaI 5 Uを用いて添付のバッファー条件で50μl中37℃、30分間、処理した。さらにTEで200μlにメスアップし、容量比が、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール=25：24：1の混合液を200μl加えてボルテックスミキサーで混合し酵素を失活させた。15000rpm、5分間、室温で遠心分離を行ない、上清を分取した。その上清に、3M 酢酸ナトリウム水溶液を20μl、エタノール（ナカライテスク株式会社）を500μl加えてよく混和後、15000rpm、5min、4℃で遠心分離を行ない、上清を取り除いた。さらに70容量％エタノール水溶液を500μl加え懸濁後、15000rpm、5分間、4℃で遠心分離を行ない、上清を除き真空乾燥後、TE 5μlで溶解した。この溶液全量にコンピテントセルDH5α 50μlを加え、氷上で30分間静置後、42℃で60秒、氷上で3分間静置後、SOC medium 450μlを加え、37℃で１時間インキュベートし、LB (Amp+) plateに塗布した。37℃、16時間後、得られたコロニーからプラスミドを調製し、導入したメチオニンタグが含まれているものを、プラスミドの塩基配列を確認して同定した。
【００５２】
得られたプラスミドを鋳型にプライマー（5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’、5’-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3’）を用いてPCRを行なった。なお、前者のプライマーをprimer 2-1とし、配列番号３で表す。また、後者のプライマーをprimer 2-2とし、配列番号４で表す。増幅したメチオニンタグを含むEGFP部分を制限酵素NcoIとBglIIで処理し、得られた断片（EGFPのC末端側にメチオニンタグをコードする塩基配列を導入した配列）をpET−15bのNcoI、BamHI部位に挿入し、大腸菌用のメチオニンタグ付きEGFP発現ベクターを作成した。
【００５３】
具体的には、得られたプラスミドを100倍に希釈したもの0.5μlを鋳型に、上記に記載のプライマーを各2.5 fmolを用いてEX Taq (タカラバイオ株式会社)の添付プロトコール通りにPCR反応を行なった。なお、PCRのサイクルは95℃，30秒、(95℃，10秒、55℃，20秒、72℃，60秒)×30サイクル、72℃，4分、15℃に保持で行なった。反応後、得られたPCR産物をWizard（登録商標）SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)を用いて添付プロトコールに従って精製した。得られた溶液全量を制限酵素NcoI (NEB)、BclII (NEB)各20 Uを用いて100μl中で添付バッファー条件を用いて37℃、2時間処理した。全量を7％ SEAKEM（登録商標）GTG（登録商標）Agarose(CAMBREX)ゲルを用いてTABバッファー中で100V定圧条件で30分間、電気泳動を行なった。確認された所定の位置の泳動バンドを切り出し、Wizard（登録商標）SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)を用いて添付プロトコールに従ってゲルからの精製を行なった。得られた断片溶液を一部電気泳動し、サイズマーカーから濃度を推定した。
【００５４】
これを導入するプラスミドpET-15bは5μgを制限酵素NcoI(タカラバイオ株式会社)、BamHI (タカラバイオ株式会社) 各25 Uを用いて100μl中で添付バッファー条件を用いて37℃、16時間処理した。一部を使い7重量％アガロース（タカラバイオ株式会社）ゲル電気泳動で確認後、TE（10 mM Tris-HCl(pH7.5),1mM EDTAを含有する精製水）で200μlにメスアップし、容量比が、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール=25：24：1の混合液を200μl加えて、ボルテックスミキサーで混合し酵素を失活させた。15000rpm、5分間、室温で遠心分離を行ない、上清を分取した。その上清に、10μg/μl グリコーゲン水溶液を1μl、3 M 酢酸ナトリウム水溶液を20μl、エタノールを500μl加えてよく混和後、15000rpm、5分間、4℃で遠心分離を行ない、上清を除いた。さらに70容量％エタノール水溶液を500μl加え、懸濁後、15000rpm、5分間、4℃で遠心分離を行ない、上清を除き真空乾燥させた。これをTE 20μlに溶解後、Alkaline phosphatase (BAPC75、タカラバイオ株式会社)を用いて添付プロトコールにしたがって65℃、30分間、処理後、さらに酵素を1μl追加し65℃、30分間、処理した。反応後、TEで200μlにメスアップ後、容量比が、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール=25：24：1の混合液を200μl加えて、ボルテックスミキサーで混合し酵素を失活させた。得られた溶液について15000rpm、5分間、室温で遠心分離を行ない、さらに下層のフェノールを分取したのち、再度、容量比が、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール=25：24：1の混合液を200μl加えて、ボルテックスミキサーで混合し酵素を完全に失活させた。この上清を分取し、3M 酢酸ナトリウム水溶液を20μl、エタノールを500μl加えてよく混和後、15000rpm、5分間、4℃で遠心分離を行ない、上清を取り除いた。さらに70容量％エタノール水溶液を500μl加え懸濁後、15000rpm、5分間、4℃で遠心分離を行ない、上清を除き真空乾燥後、TE 30μlで溶解した。一部をとって電気泳動を行ない回収できているかを確認し、分子量マーカーを用いて濃度を推定した。
【００５５】
このプラスミド50 fmolと先に回収した断片溶液50 fmolをライゲーションキット（タカラバイオ株式会社）の添付プロトコール通りに16℃で、30分間反応させ、一部をコンピテントセルDH5αにトランスフォーメーションした。得られたコロニーからプラスミドを調製し、pET-15bにおいてEGFPのＣ末端側にメチオニンタグがついたプラスミドを得た。EGFPをコードする塩基配列のＣ末端側にメチオニンタグをコードする塩基配列が存在するかどうかを確かめるために、導入した配列の全塩基配列を確認した。
【００５６】
同様にして先に示したメチオニンタグ導入用プライマーにメチオニンを5個コードする配列を含む以下の配列（5’- CATGATGATGATGATGTA -3’と5’- GATCTACATCATCATCATCATG -3’）を使用することによってメチオニンが5個ついたメチオニンタグ付きEGFP発現ベクターを得た。なお、前者のプライマーをprimer 3-1とし、配列番号５で表す。また、後者のプライマーをprimer 3-2とし、配列番号６で表す。
実施例２
メチオニンタグ付きタンパク質は公知の方法で発現させ、回収することが可能である。実施例2では、前記実施例1で作製したメチオニンタグ付きEGFP発現ベクターを大腸菌に形質転換して得られた組み換え大腸菌を用いて実験を行った。なお、以下の操作は、メチオニンが3個ついたメチオニンタグ付きEGFP発現ベクター及びメチオニンが5個ついたメチオニンタグ付きEGFP発現ベクターについて各々行った。
【００５７】
具体的には、前記形質転換は次のように行った。実施例1で作製したメチオニンタグ付きEGFP発現ベクタープラスミド約10ｎｇをコンピテントセルBL21(DE3)100μlに加え、氷上で30分静置後、42℃で、60秒間、熱処理し、すばやく氷上に戻し3分間静置した。その後、SOC mediumを1 ml加え、37℃でインキュベートし、LB（カルベニシリン添加）plateに塗布し、37℃で16時間インキュベートして得たコロニーを形質転換体とした。
【００５８】
得られた形質転換体を、50μg/mlカルベニシリンを含むLB液体培地を用いて30℃で培養し、対数増殖期（OD600=0.6付近）にIPTGを終濃度1mMになるように加えて発現誘導をかけ、3時間後に大腸菌を回収した。これより以下の操作をすべて4℃で行なった。
【００５９】
回収した大腸菌をトリスバッファー（20mM Tris-HCl(pH 8.0)、50mM NaCl、1mM DTT）で2回洗浄後、protease inhibitor(ナカライテスク株式会社)含有トリスバッファーで懸濁し、氷上で超音波破砕した。得られた懸濁液を遠心分離し、その上清を0.45μmのフィルターで濾過した後、Econo gradient pump system（Bio-Rad）とEcono packイオン交換カートリッジ High Q (Bio-Rad)を用いて精製した。この際に、トリスバッファーを用いてEGFPをカラムへ結合させ、NaCl濃度を80mMに上げることによりEGFP以外のタンパク質を除去した。その後、塩濃度を80mMから110mMまで濃度勾配をかけ110mM付近でEGFPを含む画分を回収、濃縮することにより、EGFPの精製（メチオニンタグなし）を行ない、同様にメチオニンタグ付きEGFPタンパク質の精製も行なった。
実施例3
メチオニンタグ付きタンパク質を、金のついた磁性金属酸化物粒子（（大阪大学工学部  山本孝夫教授の研究室から提供。以下、金磁性粒子と称する）を用いた方法で特異的にかつ効率よく分離、精製することを試みた。
【００６０】
ここで、磁性金属酸化物粒子としては、γ−Fe3O4を使用し、前記金磁性粒子はＷＯ２００４／０８３１２４号パンフレットに記載の方法に従い製造した。また、本実験は、前記実施例２において得られた、メチオニンタグとしてメチオニンが３個付加されたEGFP、メチオニンが５個付加されたEGFP、及びメチオニンタグが付加されていないEGFPについて各々行った。
【００６１】
実施例２で作成した各々のメチオニンタグEGFPタンパク質またはタグなしEGFPタンパク質を限外ろ過システムで濃縮しながら、バッファー（10mM リン酸バッファー）に置き換えた。また、金磁性粒子を同バッファーであらかじめ洗浄した。各々のEGFPタンパク質溶液は、蛍光強度(単位なし)を測定した後、200（蛍光強度）/μlになるようにバッファーを用いて希釈した。これらのEGFPタンパク質溶液100μlを金磁性粒子400μl(Fe 5 mg/ml)に加え、ロータリーシェイカーで混合し(４℃，60分間)、金磁性粒子とEGFPタンパク質とを結合させた。その後、EGFPタンパク質を結合させた金磁性粒子を、磁石上で30分間静置し（磁気分離）、上清を分取した。この上清を蛍光測定し、得られた値から結合前の溶液の蛍光量を差し引いて、金磁性粒子に結合したEGFPタンパク質量を求めた。
【００６２】
さらに、前記磁気分離により回収された金磁性粒子とEGFPタンパク質との結合物を含む残渣をバッファーで懸濁し、磁気分離後、上清を除くという操作を２回行なうことで、金磁性粒子への非特異的な吸着物等を除去し、その後、12mM メルカプトエタノールを含むバッファー 500μlで懸濁後、ロータリーシェイカーで４℃，30分間混合しながら、EGFPタンパク質を溶出させた。そして、磁気分離後の蛍光量を測定し、これを上記結合物からのEGFPタンパク質溶出量とした。結果を図２に示した。
【００６３】
蛍光量は96穴プレートに測定サンプル100μlとり、蛍光プレートリーダーCyto FluorII（PerSeptive Biosystems）を用いて測定（使用フィルターはEx ; 485/20、Em : 530/25）し、バックグラウンドを差し引いた後、実際の液量に換算して結合量および溶出量を求めた。
【００６４】
その結果、タグ領域がないものと比べ、タグ領域にメチオニンが３個あるものと５個あるものでは結合量が増加した。また、溶出量もタグがないものと比べメチオニンタグを持つ方の溶出量が増加した。結合量、溶出量ともにタグ領域にメチオニンがない場合とある場合を比較していずれも有意な差が見られた（**: P<0.01, * ; p<0.05）。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】タグベクターにおける、メチオニンタグをコードする塩基配列、プロモーター配列、及びクローニングサイトの配置の例を示す。メチオニンタグの部位をtagと表記する。タグ部位の上流にプロモーター配列が存在し、このプロモーター配列とタグ部位の間、及びタグ部位のすぐ下流に所望のタンパク質をコードする塩基配列を導入するためのMCSが存在する。またこのベクターは、形質転換体の作製に必要な薬剤耐性遺伝子と、大腸菌内でのベクターの複製に必要な複製起点（ori）を含む。
【図２】実施例3の結果を示す。粒子の作成日が異なる3種を用いて、精製した各タグタンパク質の結合量および溶出量をそれぞれ求めて平均および標準偏差をとりグラフに示した。
【配列表フリーテキスト】
【００６６】
配列番号１はprimer 1-1の塩基配列を示す。
【００６７】
配列番号２はprimer 1-2の塩基配列を示す。
【００６８】
配列番号３はprimer 2-1の塩基配列を示す。
【００６９】
配列番号４はprimer 2-2の塩基配列を示す。
【００７０】
配列番号５はprimer 3-1の塩基配列を示す。
【００７１】
配列番号６はprimer 3-2の塩基配列を示す。
【図１】
2009189306.tif 000002
【図２】
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【配列表】
2009189306000001.app