(57)【要約】      （修正有）【課題】ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）の細胞合成に有用なタンパク質をコードするＤＮＡ配列及びポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を産生方法を提供する。【解決手段】脂肪酸のドゥノボ生合成経路のポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）合成が欠失しているが脂肪酸のβ酸化経路のＰＨＡ生合成は阻害されていないＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＫＴ２４４０突然変異体の表現型相補性を利用して、ｐｈａＧ遺伝子を担持しているゲノムフラグメントをクローニングした。８８５ｂｐのｐｈａＧ遺伝子は、２９５個のアミノ酸から成る分子量３３，８７６Ｄａのタンパク質をコードしている。脂肪酸のドゥノボ生合成経路のＰＨＡ合成条件下でｐｈａＧの転写誘発が観察されたが、β酸化による脂肪酸分解経路のＰＨＡ合成促進条件下で誘発は全く検出されなかった。ｐｈａＧ遺伝子は細菌及び植物にＰＨＡを産生させるために有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列１の９１１位から１７９５位に示すコーディング鎖またはその相補鎖のヌクレオチド配列、
（ｂ）５５〜６５℃で０．５×ＳＳＣから２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに等価の洗浄緊縮性条件下で前記（ａ）のヌクレオチド配列にハイブリダイズでき且つポリヒドロキシアルカノエート産生に好適な活性を有しているタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｃ）前記（ａ）のヌクレオチド配列に少なくとも約４０％の相同性を有しており且つポリヒドロキシアルカノエート産生に好適な活性を有しているタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｄ）前記（ａ）のヌクレオチド配列と同じ遺伝情報をコードしているが遺伝コードの縮重性に従って縮重しているヌクレオチド配列、
（ｅ）前記（ｂ）のヌクレオチド配列と同じ遺伝情報をコードしているが遺伝コードの縮重性に従って縮重しているヌクレオチド配列、
から成るグループから選択されたヌクレオチド配列を含む単離されたＤＮＡ分子。
【請求項２】
配列１の９１１位から１７９５位までのＤＮＡ配列を有することを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡセグメント。
【請求項３】
宿主細胞中でＲＮＡ配列を産生させるべく機能するプロモーター領域と前記プロモーターに作用可能に連結された請求項１に記載のＤＮＡ配列とを含んで成る組換えＤＮＡセグメント。
【請求項４】
配列１の９１１位から１７９５位までのＤＮＡ配列を有することを特徴とする請求項３に記載の組換えＤＮＡセグメント。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載のＤＮＡセグメントを含む組換えベクター。
【請求項６】
請求項１から４のいずれか一項に記載のＤＮＡセグメントを含んでおり、前記ＤＮＡセグメントがプロモーター領域にヘテロロガスであることを特徴とする組換え宿主細胞。
【請求項７】
微生物または植物の細胞であることを特徴とする請求項６に記載の組換え細胞。
【請求項８】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ｒＲＮＡ相同グループＩの細菌であることを特徴とする請求項６に記載の組換え細胞。
【請求項９】
少なくとも２０ヌクレオチドの長さを有しており少なくとも２０個の連続する請求項１に記載のヌクレオチドに対応する配列を有することを特徴とする単離されたＤＮＡセグメント。
【請求項１０】
ポリヒドロキシアルカノエートを産生させるために有用な細胞を形質転換させる方法であって、
機能性ＰＨＡシンターゼ遺伝子を有する宿主細胞を選択する段階と、
宿主細胞中でＲＮＡ配列を産生するために機能するプロモーター領域と前記プロモーターに作用可能に連結されており前記プロモーター領域にヘテロロガスな請求項１に記載のＤＮＡ配列とを含む組換えベクターを作製する段階と、
選択された宿主細胞を形質転換させる段階と、
形質転換細胞を再生する段階と、
から成る細胞の形質転換方法。
【請求項１１】
組換えベクターが配列１の９１１位から１７９５位までのＤＮＡ配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
宿主細胞が微生物または植物の細胞であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
宿主細胞がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ｒＲＮＡ相同グループＩの細菌から選択されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
３〜１４個の炭素原子を有する反復単位から成るポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の産生方法であって、
請求項１０から１３のいずれか一項に記載の方法で作製した形質転換細胞をファージ遺伝子の発現が得られるように培養する段階と、
細胞からＰＨＡを回収する段階とから成る方法。
【請求項１５】
形質転換した微生物細胞を単純糖質基質を含む培地で培養することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
培地がグルコネート、グルコース、スクロース、フルクトースまたはラクトースから成ることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
形質転換細胞をコーンシロップまたは糖蜜から成る培地で培養することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
配列２のアミノ酸配列を有する実質的に精製されたタンパク質。
【請求項１９】
ＰｈａＧを発現する遺伝的に形質転換された植物を産生する方法であって、
（ｉ）植物細胞にＲＮＡ配列を産生させる機能を有しているプロモーターと、
（ｉｉ）前記プロモーターに作用可能に連結された請求項１に記載のＰｈａＧ  ＤＮＡ配列と、
を含んで成る組換え二重鎖ＤＮＡ分子を宿主植物細胞のゲノムに挿入する段階と、
形質転換植物細胞を作製する段階と、
形質転換植物細胞を再生させる段階と、
から成る方法。
【請求項２０】
ＰｈａＧ  ＤＮＡ配列が配列１の９１１位から１７９５位までの配列であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
宿主植物細胞のゲノムが更に機能性ＰＨＡシンターゼ遺伝子を含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
更に、形質転換された植物または植物の部分を採取する段階を含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
採取した植物の部分が葉、根、種子または塊茎であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
宿主植物が、トウモロコシ、ジャガイモ、テンサイ、タバコ、小麦、または、大豆、キャノーラ、ナタネ、ヒマワリ、亜麻、落花生及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓから成るグループから選択された高脂肪種子植物であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１８から２３のいずれか一項に記載の方法によって産生される植物。
【請求項２６】
グルコネートからＰＨＡを合成する能力を有していないがオクタン酸からＰＨＡを合成する能力を有している突然変異微生物。
【請求項２７】
微生物がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａの突然変異体であることを特徴とする請求項２６に記載の突然変異体。
【請求項２８】
微生物が細菌または真菌の突然変異体であることを特徴とする請求項２６に記載の突然変異体。
【請求項２９】
微生物が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ、ＨａｎｓｅｎｕｌａまたはＰｉｃｈｉａの突然変異体であることを特徴とする請求項２６に記載の突然変異体。
【請求項３０】
グルコネートからＰＨＡを合成する表現型の能力が配列１のＤＮＡ配列との相補性によって回復することを特徴とする請求項２６に記載の突然変異体。
【請求項３１】
微生物が放線菌類Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓまたは酵母の突然変異体であることを特徴とする請求項２８に記載の突然変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）の細胞合成に有用なタンパク質をコードするＤＮＡ配列に関する。これらのＤＮＡ配列は、形質転換された微生物及び植物中で発現され、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を産生し得る。
【背景技術】
【０００２】
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）として知られたポリマーのクラスに属する細胞内ポリエステルの産生は、多数の原核生物で観察されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｗｅｓ（１９９０）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５４：４５０）。このポリエステルを構成するモノマーの長さは、Ｃ４（３−ヒドロキシブチレート）からＣ１２（３−ヒドロキシドデカノエート）の範囲である（Ｌａｇｅｖｅｅｎら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：２９２４）。このクラスのポリエステルは、従来の石油化学由来のプラスチックに代替し得る有望な材料として大いに注目されている。
【０００３】
ＰＨＡは概して、それらの主鎖を構成するモノマーに従って特性決定されている。Ｃ４−Ｃ５単位から構成されたポリマーは短鎖長（ｓｃｌ）のＰＨＡとして分類され、Ｃ６単位以上のモノマーを含むポリマーは中鎖長（ｍｃｌ）のＰＨＡとして分類されている。ポリマーの一次構造はポリエステルの物理的特性に影響を与える。
【０００４】
ＰＨＡの形成に導く代謝経路がすべての生物で解明されているのではない。Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓの生合成経路が最も研究の進んだＰＨＡ生合成経路である（Ｐｅｏｐｌｅｓら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９８及びＶａｌｅｎｔｉｎら（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２７：４３）。この生物は、Ｃ４のホモポリマー（ポリヒドロキシブチレート、ＰＨＢ）またはＣ４−Ｃ５のコポリマー（ＰＨＢ−ＰＨＶ、ポリヒドロキシブチレート−ポリヒドロキシバレレート）を形成し得る（Ｋｏｙａｍａ  ａｎｄ  Ｄｏｉ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７：２８１）。従って、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓはｓｃｌ  ＰＨＡ生物として分類されている。同様に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種は、Ｃ６からＣ１２の範囲の長さをもつモノマーから構成されたポリマーを産生し（Ｔｉｍｍ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ（１９９０）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６：３３６０及びＬａｇｅｖｅｅｎら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：２９２４）、ｍｃｌ  ＰＨＡ生物として分類されている。
【０００５】
ヒドロキシアシル−ＣｏＡ基質の重合は、ＰＨＡシンターゼによって行われる。このクラスの酵素の基質特異性は、ＰＨＡを産生する生物に応じて異なっている。ＰＨＡシンターゼの基質特異性のこのような多様性はヘテロロガス発現の研究で観察された間接証拠によって確認されている（Ｌｅｅら（１９９５）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４２：９０１及びＴｉｍｍら（１９９０）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３３：２９６）。従って、ポリマーの主鎖の構造は、該ポリマーを形成させるＰＨＡシンターゼによる影響が大きい。
【０００６】
ｒＲＮＡ相同グループＩに属する蛍光性ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｄｓは、炭素原子数６〜１４の範囲の炭素鎖長をもつ種々の飽和及び不飽和のヒドロキシ脂肪酸から成るポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）を大量に合成し蓄積し得る（Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ  ａｎｄ  Ｖａｌｅｎｔｉｎ（１９９２）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１０３：２１７）。これらの細菌から単離されたＰＨＡはまた、分枝状、ハロゲン化、芳香族またはニトリル側鎖のような官能基をもつ成分を含有している（Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ  ａｎｄ  Ｖａｌｅｎｔｉｎ（１９９５）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２８：２１９）。ＰＨＡの組成は、ＰＨＡポリメラーゼ系、炭素源及び代謝経路に依存する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｗｅｓ（１９９０）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５４：４５０；Ｅｇｇｉｎｋら（１９９２）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１０５：７５９；Ｈｕｉｓｍａｎら（１９８９）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５５：１９４９；Ｌｅｎｚら（１９９２）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：４３８５；Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ  ａｎｄ  Ｖａｌｅｎｔｉｎ（１９９５）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２８：２１９）。Ｐ．ｐｕｔｉｄａ中では、ＰＨＡシンターゼの基質となる３−ヒドロキシアシル補酵素Ａチオエステルを合成するための少なくとも３つの異なる代謝経路が存在する（Ｈｕｉｊｂｅｒｔｓら（１９９４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：１６６１）。即ち、（ｉ）脂肪酸を炭素源として使用するときの主要経路となるβ−酸化、（ｉｉ）グルコネート、アセテートまたはエタノールのようなアセチル−ＣｏＡに代謝される炭素源で増殖するときの主要経路となる脂肪酸のドゥノボ生合成、（ｉｉ）アシル−ＣｏＡがアセチル−ＣｏＡと縮合して２炭素の鎖延長β−ケト生成物を形成し、次いでこれが３−ヒドロキシアセチル−ＣｏＡに還元される鎖延長反応、の経路が存在する。この最後の経路は、ヘキサノエートで増殖するときのＰＨＡ合成に関与する。
【０００７】
Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのようなポリヒドロキシ酪酸を蓄積する細菌中では、ＰＨＡＭＣＬシンターゼの一次構造の相同性がＰＨＡＳＣＬシンターゼに拡大されるので（Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌら（１９９２）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１０３：２１７）、ＰＨＡＭＣＬシンターゼの基質は（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡであるらしいと考えられる。グルコネートのような非近縁基質に由来のＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４２のポリエステルの主成分は３−ヒドロキシデカノエートであるが、３−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシオクタノエート、３−ヒドロキシドデカノエート、３−ヒドロキシドデセノエート、３−ヒドロキシテトラデカノエート及び３−ヒドロキシテトラデセノエートが少量成分として生じる（Ｈｕｉｊｂｅｒｔｓら（１９９４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：１６６１）。従って、ＰＨＡポリメラーゼの基質として作用できるように、アシルキャリヤータンパク質のヒドロキシアシル残基が対応するＣｏＡ誘導体に変換されると考えられる。これは、（Ｒ）−３−ヒドロキシアシルトランスフェラーゼに介在される１段階反応（ＡＣＰからＣｏＡ）である。あるいは、３−ケトまたは直鎖のような異なる官能基レベルでアシル基の転移が生じ、得られたアシル−ＣｏＡが図１に示すように別の酵素の作用によって３−ヒドロキシレベルに変換されることも考えられる。また、直接転移に加えて、遊離脂肪酸がチオエステラーゼによって遊離され次いで活性化されてＣｏＡ誘導体となる二段階プロセスの可能性も考えられる。これは図１に示すようにアシル−ＡＣＰのいずれかのレベルで生じるであろう。
【０００８】
このような酵素はＰＨＡを産生する組換え生物の代謝操作に有用であり得ると考えられるので、この変換に関与する（１つまたは複数の）タンパク質の解明は実用面で重要である。例えば、油を産生する植物（例えば、キャノーラまたは大豆）の種子中で（Ｒ）−３−ヒドロキシアシルトランスフェラーゼが発現すると、アシル基が脂質合成（ＡＣＰ−結合状態）からポリマー産生（ＣｏＡ−結合状態）に直接転移され得る。あるいは、同じ反応がチオエステラーゼ及びリガーゼの順次使用によって達成される。
【０００９】
本文中に記載したｐｈａＧの単離は、脂質合成をポリマー産生に関連させる酵素の単離の一例である。使用された方法はこのような遺伝子を細菌中で単離するモデル方法を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｗｅｓ（１９９０）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５４：４５０
【非特許文献２】Ｌａｇｅｖｅｅｎら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：２９２４
【非特許文献３】Ｐｅｏｐｌｅｓら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９８
【非特許文献４】Ｖａｌｅｎｔｉｎら（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２７：４３
【非特許文献５】Ｋｏｙａｍａ  ａｎｄ  Ｄｏｉ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７：２８１
【非特許文献６】Ｔｉｍｍ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ（１９９０）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６：３３６０
【非特許文献７】Ｌｅｅら（１９９５）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４２：９０１
【非特許文献８】Ｔｉｍｍら（１９９０）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３３：２９６
【非特許文献９】Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ  ａｎｄ  Ｖａｌｅｎｔｉｎ（１９９２）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１０３：２１７
【非特許文献１０】Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ  ａｎｄ  Ｖａｌｅｎｔｉｎ（１９９５）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２８：２１９
【非特許文献１１】Ｅｇｇｉｎｋら（１９９２）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１０５：７５９
【非特許文献１２】Ｈｕｉｓｍａｎら（１９８９）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５５：１９４９
【非特許文献１３】Ｌｅｎｚら（１９９２）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：４３８５
【非特許文献１４】Ｈｕｉｊｂｅｒｔｓら（１９９４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：１６６１
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、脂肪酸生合成とＰＨＡ産生との関連に関与するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離ＤＮＡフラグメントを提供する。このフラグメントは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０を単純糖質基質（例えばグルコネート）で増殖させるときに、この生物中でＰＨＡを産生するために必須であることが判明したタンパク質をコードするＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０由来のｐｈａＧ遺伝子を含む。“ｐｈａＧ”と命名されたこの遺伝子及びこの遺伝子によってコードされたタンパク質ＰｈａＧ、並びに、これらと生物学的機能の等価物はそれぞれ、植物を含む原核性及び真核性の生物中でＰＨＡの新規なコポリマーを産生するために他のＰＨＡ生合成酵素と共に使用され得る。ＰＨＡシンターゼをコードする遺伝子を非限定例とする別のＰＨＡ生合成遺伝子と共にｐｈａＧ遺伝子またはその等価物を含んでおり且つこれらを発現し得る形質転換細菌及びトランスジェニック植物は、脂肪酸のドゥノボ合成経路で単純炭素源からヒドロキシアシル−ＣｏＡ基質を形成でき、従って、石油化学由来のプラスチックと同様の物理的特性を有する新規な生分解性ポリエステルを産生し得るであろう。
【００１２】
本発明はまた、脂質生合成の中間体をＰＨＡ生合成の中間体に変換するプロセスに関与するタンパク質をコードする遺伝子を当業者が単離、同定及び特性決定できるような方法を提供する。特に、ＰＨＡ生合成のためにアシル−ＡＣＰをアシル−ＣｏＡに直接変換させ得るＣｏＡ−ＡＣＰアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を同定する方法が記載されている。
【００１３】
本発明の更に広い応用範囲は以下の詳細な記載から明らかにされるであろう。しかしながら、以下の詳細な記載及び特定実施例は本発明の好ましい実施態様を単なる代表例として示したものであり、本発明の要旨及び範囲内の種々の変更及び修正は以下の詳細な記載から当業者に明らかであろう。
【００１４】
本発明の上記及びその他の目的、特徴及び利点は添付図面を参照した以下の詳細な記載からより十分に理解されよう。これらの図面及び記載はすべて本発明の代表例であり、本発明はこれらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、脂肪酸のドゥノボ生合成経路のＰＨＡ合成中にＰｈａＧによって触媒されて生じることが可能な反応の概略図である。チオエステラーゼ／リガーゼの組合せはアシルトランスフェラーゼに関して詳細に図示しているアシル−ＡＣＰ形態のいずれかに対して活性であり得ると考えられる。
【図２】図２は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０  ｐｈａＧ遺伝子の遺伝子座の分子編成を表しており、  （ａ）は、ｐｈａＧ遺伝子を含むＥ３フラグメントの部分制限地図であり、  （ｂ）は、制限サブフラグメントＥ３、ＳＦ２２及びＢＨ１３を示しており、  （ｃ）は、ｐｈａＧの構造遺伝子の位置を、矢印で示すプロモーターと共に表す。
【００１６】
配列１は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０  ＰｈａＧタンパク質の推定アミノ酸配列を示す。
【００１７】
配列２は、フラグメントＥ３のヌクレオチド配列を示し、ｐｈａＧをコードするＤＮＡフラグメントのコーディング鎖を９１１位から１７９５位で示す。
【００１８】
発明の詳細な説明
当業者が本発明を容易に実施できるように本発明を以下に詳細に記載する。しかしながら、当業者は本発明の要旨及び範囲から逸脱することなく本文に記載の実施態様を修正及び変更できるので、以下の詳細な記載が本発明を不当に限定すると理解してはならない。
【００１９】
本文中に引用した参考文献は本発明が属する技術分野の技術レベルの証拠となる。これらの各参考文献の記載内容全部はそれらに引用されている参考文献と共に参照によって本発明に含まれるものとする。
【００２０】
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０  ＰＨＡＧＮ突然変異体は脂肪酸のドゥノボ生合成経路で生じるＰＨＡ生合成の支流だけで欠失している。発明者らは、この突然変異体の表現型相補性検定によってｐｈａＧをＰ．ｐｕｔｉｄａのＰＨＡ生合成に好適な新規な遺伝子座として同定し特性決定した。ＰＨＡＧＮ突然変異体中のβ−酸化を経由するＰＨＡ合成経路は阻害されていなかった。ＰＨＡＧＮ突然変異体はＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１のＰＨＡ−シンターゼ遺伝子座及び隣接のゲノム領域で相補されなかった。対照的に、どの基質においてもＰＨＡ合成が完全に欠損していたＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０の突然変異体はＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＰＨＡシンターゼ遺伝子座によって相補された。従って、ＰＨＡＧＮ突然変異体は、ＰＨＡ−シンターゼ遺伝子座が欠失しているのでなく、ｐｈａＧがＰＨＡシンターゼ遺伝子座に密接に関連していない可能性が大きい。更にｐｈａＧは一般には、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０中のＰＨＡ合成に必須ではなく、ＰＨＡ合成が開始される前にこの生物中でアセチル−ＣｏＡに異化代謝されるグルコネートまたはその他の単純炭素源（例えば、グルコース、スクロース、フルクトースまたはラクトース）からＰＨＡを合成し蓄積するためだけに必要とされる。図１はＰｈａＧによって触媒されることが考えられる反応を示しており、これらの反応のいずれかが阻止されると突然変異体の表現型が与えられる。
【００２１】
標識試験、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光分析及びガスクロマトグラフィー−質量分光分析（ＧＣ−ＭＳ）の結果から、Ｅｇｇｉｎｋら（１９９２）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１０５：７５９並びにＨｕｉｊｂｅｒｔｓら（１９９２）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８：５３６及び（１９９４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：１６６１は、単純炭素源からのＰＨＡ生合成の前駆体が主として脂肪酸のドゥノボ生合成経路で生じる（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ中間体に由来すると結論した。ＰＨＢ及びＰＨＡの成分がＲ−配置で存在するので、ＰＨＡＳＣＬ及びＰＨＡＭＣＬのシンターゼは高度に相同であり、脂肪酸代謝の中間体は重合以前に（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換され易い。しかしながら、別のＰＨＡ合成経路も有り得ると考えられる。現在では、（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰチオエステルがＰＨＡ合成の直接基質であるという可能性も排除できない。想到される別の代替経路としては、チオエステラーゼの活性による遊離脂肪酸の放出がある。次いで、この脂肪酸がリガーゼによって活性化され、対応するヒドロキシアシル−ＣｏＡチオエステルになる。更に、ＡＣＰからＣｏＡへのアシル転移リンクが３−ヒドロキシチオエステルレベルでなく図１に示す別のアシル官能基レベルに存在する可能性も考えられる。
【００２２】
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０の突然変異誘発は、グルコネートからのＰＨＡの生合成が完全に欠損した突然変異体を生じなかった。発明者らは、グルコネートで増殖させたときに細胞乾燥重量（ＣＤＷ）のわずか３％のＰＨＡを蓄積した５つの突然変異体（以後の記載ではサブクラスＩの突然変異体と呼ぶ）及び５〜１６％のＣＤＷを蓄積した３つの突然変異体（サブクラスＩＩ）を同定した。検出可能な範囲では、全部の突然変異体がこの経路の典型的なモノマー組成のポリエステルを含んでいた。しかしながら、得られた突然変異体の分析、相補性検定、ｐｈａＧのゲノム編成は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０中で単純炭素源からＰＨＡを合成するために必須の別のタンパク質が存在するという徴候を全く示さなかった。従って、グルコネートからＰＨＡを合成するためには、オクタノエートからのＰＨＡ合成には不要である追加の特異的酵素段階が１つだけ必要であると考えられる。サブクラスＩの突然変異体によるＰＨＡの蓄積が少ないことは上記の経路が存在することを証明しており、この経路は極めて低い効率でＰｈａＧ依存性経路に並列に作用する。サブクラスＩＩの突然変異体によるＰＨＡの蓄積が比較的多いことは、部分的に活性のｐｈａＧ遺伝子産物を残すような漏れ易い（ｌｅａｋｙ）突然変異の結果であると考えられる。
【００２３】
ｐｈａＧがＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのｒｈｌＡ及びｑｉｎ領域のそれぞれに対して有している高い相同性は、これらのタンパク質の機能に類似の機能を示している。“キノリン感受性タンパク質”の正確な機能はまだ記載されたことがない。ナリジキシン酸のようなキノロンは、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのようなグラム陰性菌に対して強力な抗菌作用を示す合成抗生物質である。ｒｈｌＡ遺伝子の産物はＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＧ２０１のラムノリピド生合成に関与する。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａラムノリピド生体界面活性剤は後期対数増殖期及び定常増殖期中に合成される。ラムノリピド生合成は、グリコシルの逐次転移反応によって進行する。各転移反応は特異的ラムノシルトランスフェラーゼによって触媒され、ＴＤＰ−ラムノースはラムノシルドナーとして作用し、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカノエートまたはＬ−ラムノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカノエートはアクセプターとして作用する。このことはＢｕｒｇｅｒら（１９６３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３８：２５９５及び（１９６６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．８：４４１に記載されている。３−ヒドロキシデカノエートはβ−酸化経路または脂肪酸生合成経路で形成され得る（Ｂｏｕｌｔｏｎ  ａｎｄ  Ｒａｓｔｌｅｄｇｅ（１９８７）Ｂｉｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｐ．４７）。２個のヒドロキシデカン酸分子から成る二量体は縮合によって形成される。しかしながらこの段階の正確なメカニズムは未知である。ＲｈｌＡは、ラムノシル−トランスフェラーゼ（ＲｈｌＢ）と共に同時発現されるとき、単離されたｒｈｌＢ遺伝子の発現に比べて、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＧ２０１のラムノリピド陰性突然変異体中のラムノリピドのレベルを有意に増進させる。アミノ酸分析によって、ＲｈｌＡのＮ末端の推定シグナルペプチドが判明した。これらの結果から、Ｏｃｈｓｎｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９７８７は、ＲｈｌＲタンパク質がラムノシルトランスフェラーゼ前駆体基質の合成または輸送に関与していること、及び、ＲｈｌＡが細胞質膜中のＲｈｌＢタンパク質の安定に必要であることが示唆された。ＰｈａＧのＮ−末端領域はまた、極性Ｎ−ドメイン、疎水性Ｈ−ドメイン及びより低度に疎水性のＣ−ドメインのようなグラム陰性細菌中で見出されるシグナルペプチドに共通の特性を幾つか有しているが、典型的な第二ターン及びＣ−ドメインの推定リーダーペプチダーゼ開裂部位は欠失している。短いリーダー配列があるので、ＰｈａＧは最初は別の経路に関与していたが生物の進化中に機能変化を生じたということも考えられる。
【００２４】
脂肪酸生合成によって生じる３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ中間体は恐らくは、グルコネートからＰＨＡ及びラムノリピドを生合成する双方の経路に共通の中間体であろう。ＡＣＰ誘導体がそれ自体ではＰＨＡシンターゼの基質またはラムノリピド生合成中の２つの３−ヒドロキシデカノイル部分の縮合に関与する酵素の基質として作用しないとしても、ＡＣＰ誘導体は対応するＣｏＡ誘導体に直接トランスエステル化されるかまたはチオエステラーゼとリガーゼとの組合せ作用によってＣｏＡチオエステルに転移されるかもしれない。従って、図１を参照すると、ＰｈａＧは、（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰから（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ誘導体への変換を触媒する（Ｒ）−３−ヒドロキシアシルＣｏＡ−ＡＣＰアシルトランスフェラーゼであるかもしれない。（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ誘導体は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ中で非近縁の基質からＰＨＡ重合を行う最終前駆体として作用する。このことは、Ｅｇｇｉｎｋら（１９９２）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１０５：７５９及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｅｉｊ  ａｎｄ  Ｗｉｔｈｏｌｔ（１９９５）Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１，Ｓｕｐｐ．１：２２に記載されている。あるいは、ＰｈａＧは上記の３−ヒドロキシ官能性以外のアシル基特異性をもつＣｏａ−ＡＣＰアシルトランスフェラーゼであるかもしれない。または、ＰｈａＧは特異的チオエステラーゼまたはリガーゼに関連した活性を有しているかもしれない（図１参照）。更に、ＰｈａＧは触媒酵素でなく、アシル基転移反応またはチオエステラーゼもしくはリガーゼ活性を触媒する触媒タンパク質複合体を安定または調節するタンパク質であるかもしれない。
【００２５】
定義
本発明の詳細な記載が当業者に理解し易いように本文中に使用した用語を以下に定義する。
【００２６】
“ＡＣＰ”はアシルキャリヤータンパク質を意味する。
【００２７】
“ＣｏＡ”は補酵素Ａを意味する。
【００２８】
“ＣｏＡ−ＡＣＰアシルトランスフェラーゼ”または“アシルトランスフェラーゼ”は、ＡＣＰとＣｏＡとの間のアシル基転移を触媒する酵素を意味する。
【００２９】
“Ｃ−末端領域”は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質の鎖の中央から遊離カルボキシル基を有しているアミノ酸を担持する末端までの領域を意味する。
【００３０】
“プロモーター領域にヘテロロガスなＤＮＡセグメント”なる表現は、コーディングＤＮＡセグメントが本来は、該セグメントと結合状態にあるプロモーターと同じ遺伝子中には存在しないことを意味する。
【００３１】
“コーディングＤＮＡ”なる用語は、本文中に記載の酵素のいずれかをコードする染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡを意味する。
【００３２】
細菌に使用されたときの“ゲノム”なる用語は、細菌宿主細胞中の染色体及びプラスミドの双方を包含する。従って、細菌宿主細胞に導入される本発明のコーディングＤＮＡは染色体に組込まれてもよくまたはプラスミドに局在してもよい。植物細胞に使用されたときの“ゲノム”なる用語は、核の内部に見出される染色体ＤＮＡだけでなく、細胞レベル以下の細胞成分内部に見出されるオルガネラＤＮＡを包含する。従って、植物細胞に導入される本発明のＤＮＡは染色体に組込まれてもよくまたはオルガネラに局在してもよい。
【００３３】
“リガーゼ”なる用語は、遊離脂肪酸の活性化を触媒してＣｏＡチオエステルを産生させる触媒を意味する。
【００３４】
“微生物”または“微小動植物”なる用語は、藻類、細菌、真菌類及び原生動物を意味する。
【００３５】
“ミューテイン（ｍｕｔｅｉｎ）”なる用語は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の突然変異形態を意味する。
【００３６】
“Ｎ−末端領域”は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の鎖の遊離アミノ基を有するアミノ酸から鎖の中央までの領域を意味する。
【００３７】
“超発現”なる用語は、宿主細胞に導入されたＤＮＡによってコードされたポリペプチドまたはタンパク質の発現に関する用語であり、該ポリペプチドまたはタンパク質が通常は宿主細胞中に存在しない場合、または、該ポリペプチドまたはタンパク質がそれらをコードする外因性遺伝子から正常に発現されるレベルよりも高いレベルで宿主細胞中に存在する場合を表している。
【００３８】
“プラスチド（色素体）”なる用語は、アミロプラスト、葉緑体、クロモプラロスト、エライオプラスト、エオプラスト、エチオプラスト、白色体及びプロプラスチド（原色素体）を含む植物細胞オルガネラのクラスを意味する。これらのオルガネラは、自律複製性であり、“葉緑体ゲノム”という通称で呼ばれる環状ＤＮＡ分子を含む。このＤＮＡ分子は植物の種類次第で約１２０〜約２１７ｋｂの範囲のサイズを有しており、通常は逆方向末端反復配列を含んでいる。
【００３９】
“ＰＨＡ生合成遺伝子”及び“ＰＧＡ生合成酵素”なる表現は、ＰＨＡ産生経路の同化反応に導く遺伝子または酵素を意味する。
【００４０】
“ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）シンターゼ”なる表現は、ヒドロキシアシル−ＣｏＡをポリヒドロキシアルカノエートと遊離ＣｏＡとに変換する酵素を意味する。
【００４１】
“単純糖質基質”なる表現は、単糖またはオリゴ糖を意味するが多糖を意味しない。単純糖質基質は、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトースを包含する。コーンシロップ、デンプン及び糖蜜のような媒体中で常用されるより複雑な糖質基質は単純糖質基質まで分解され得る。
【００４２】
“チオエステラーゼ”なる用語は、アシル−ＡＣＰ基から遊離脂肪酸とＡＣＰとを生じる加水分解を触媒する酵素を意味する。
【００４３】
材料及び方法
細菌の増殖：
大腸菌は、ルリア−ベルタニ（ＬＢ）培地で３７℃で増殖させた。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓは、栄養ブイヨン（ＮＢ；０．８％，ｗｔ／ｖｏｌ）の複合培地または０．０５％（ｗ／ｖ）のアンモニアを加えた無機塩培地（ＭＭ）（Ｓｃｈｌｅｇｅｌら（１９６１）Ａｒｃｈ．Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ．３８：２０９）で３０℃で増殖させた。
【００４４】
ポリエステル分析：
細菌のポリエステル含量を測定するために、３〜５ｍｇの凍結乾燥細胞材料を１５％（ｖ／ｖ）の硫酸の存在下でメタノール分解処理した。得られた３−ヒドロキシアルカン酸成分のメチルエステルを、Ｂｒａｎｄｔら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：１９７７のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を最近詳細に記載された手順（Ｔｉｍｍ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ（１９９０）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６：３３６０）で行うことによって検定した。
【００４５】
ＲＮＡ及びＤＮＡの単離：
全ＤＮＡは、Ｏｅｌｍｕｌｌｅｒら（１９９０）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈ．１１：７３に記載の手順で単離した。プラスミドＤＮＡは粗溶菌液からアルカリ抽出手順（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ  ａｎｄ  Ｄｏｌｙ（１９７９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．７：１５１３）によって調製した。全ゲノムＤＮＡはＡｕｓｕｂｅｌら（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＵＳＡに従って単離した。
【００４６】
ＤＮＡの分析及び操作：
単離したプラスミドＤＮＡは、種々の制限エンドヌクレアーゼを用いて、Ｓａｍｂｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹまたは製造業者によって記載された条件下で消化した。ＤＮＡ制限フラグメントは、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎキット（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．ａｎｄ  Ｄ．Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：６１５）を用いてアガロースゲルから単離した。
【００４７】
ＤＮＡの導入：
形質転換のためには、２０ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＬＢ培地で大腸菌を好気的に増殖させた。コンピテント細胞を調製し、Ｓａｍｂｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹによって記載された塩化カルシウム手順を用いて形質転換させた。Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０突然変異体（レシピエント）とハイブリッドドナープラスミドを担持する大腸菌Ｓ１７−１（ドナー）との交配は、“ミニ相補性検定（ｍｉｎｉｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）”に基づいて行った。３００μｌの濃縮レシピエント細胞懸濁液（ＯＤ４３６ｍｍ＝１００）を１．５％のグルコネートまたは０．３％のオクタノエートと２５ｍｇ／リットルのテトラサイクリンを補充したＭＭ培地寒天プレートに流した。５分間のインキュベーション後、異なる５０個のドナー菌株の細胞をコロニーから楊枝でレシピエント層を含む寒天プレートの各々に移した。プレートを３０℃で３６時間インキュベートした。
【００４８】
オリゴヌクレオチドの合成：
Ｇｅｎｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ  Ｐｌｕｓ装置を用い製造業者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって提供されたプロトコルに従ってデオキシヌクレオシドホスホアミジット（Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２２：１８５９）から０．２μｌの部分量で合成オリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドを支持体マトリックスから遊離させ、２５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）アンモニア中、５５℃で１５時間のインキュベーションによって保護基を除去した。最後に、オリゴヌクレオチドをＮＡＰ−５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に通すことによって精製した。
【００４９】
ＤＮＡ配列解析：
Ｔ７−ポリメラーゼ配列決定キットを製造業者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）のプロトコルに従って用い、ｄＧＴＰの代わりに７−デアザグアノシン５′−三リン酸（Ｍｉｚｕｓａｗａ，Ｓ．ら（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：１３１９）及び〔α３５Ｓ〕−ｄＡＴＰを用い、Ｓａｎｇｅｒら（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３によるジデオキシ−チェーンターミネーション法を用いることによって、一本鎖または二重鎖のアルカリ変性プラスミドＤＮＡに対するＤＮＡ配列決定を行った。合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し、“プライマー−ホッピング戦略”（Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｅ．Ｃ．ら（１９８６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５４：３５３）を使用した。配列決定反応の生成物を、Ｓ２−配列決定装置（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ，Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で、１００ｍＭの塩酸塩、８３ｍＭのホウ酸、１ｍＭのＥＤＴＡ及び４２％（ｗｔ／ｖｏｌ）の尿素を含有するバッファ（ｐＨ８．３）中の８％（ｗｔ／ｖｏｌ）のアクリルアミドゲルで分離し、Ｘ線フィルムで可視化した。
【００５０】
配列データの分析：
配列解析ソフトウェアパッケージ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ）（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．２，１９９０年６月）を使用し、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７によって、核酸配列データ及び推定アミノ酸配列を分析した。
【００５１】
転写開始部位の決定：
ヌクレアーゼ保護アッセイによって転写開始部位の決定を行った。Ｓ１ヌクレアーゼ保護アッセイのハイブリダイゼーション条件は、Ｂｅｒｋ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ（１９７７）Ｃｅｌｌ  １２：７２１及びＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに詳細に記載された条件を用い、Ｓ１ヌクレアーゼ反応はＡｌｄｅａら（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６５：１０１に記載された方法で行った。シグナルのサイズを決めるＤＮＡプローブ及びデオキシヌクレオチドの配列決定反応は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−ＢＨ１３  ＤＮＡ（表１及び図１）を鋳型として行った。アニーリング反応では、それぞれ、８８７〜８７１位に相補的なオリゴヌクレオチド（５′−ＧＧＧＴＡＴＴＣＧＣＧＴＣＡＣＣＴ−３′）及び９８６〜９７０位に相補的なオリゴヌクレオチド５′−ＣＣＧＣＡＴＣＣＧＣＧＣＧＡＴＡＧ−３′を〔３５Ｓ〕標識のために使用した。全部のマッピング実験では、２５μｇのＲＮＡを標識ＤＮＡフラグメントと混合した。特異的標識率は１μｇのＤＮＡあたり１０７ｃｐｍを上回っていた。
【００５２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）：
Ｏｍｉｎｇｅｎｅサーモサイクラー（Ｈｙｂａｉｄ  Ｌｔｄ．，Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，Ｕ．Ｋ．）及びＶｅｎｔポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＧｍｂＨ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに従って１００μｌ容量でＰＣＲ増幅を行った。部位特異的突然変異誘発のために、以下のヘテロロガスプライマーを（５′から３′の方向で）使用した：人工のＢａｍＨＩ部位及びＮｄｅＩ部位を含むＴＴＴＧＣＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＧＡＴＣＡＴＡＴＧＡＧＧＣＣＡＧＡＡＡＴＣ、及び、ｐｈａＧの下流に天然型ＨｉｎｄＩＩＩ部位を担持しているＧＴＴＡＴＡＡＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＴＣＧＧＣＧ。
【００５３】
細胞抽出物の調製：
約１ｇ（湿潤重量）の大腸菌細胞を、１ｍｌのバッファＡ（１ｍｌあたり２００μｇのフェニルメチルスルホニルフルオリドを補充した５０ｍＭのトリス塩酸塩；ｐＨ７．４，０．８％’ｖｏｌ／ｖｏｌ）のトリトン−Ｘ１００、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭのＥＤＴＡ）に浮遊させ、Ｗ２５０音波処理装置（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｃｈａｌｌｋｒａｆｔ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で１４μｍの振幅で１分間音波処理することによって破壊した。４℃、５０，０００×ｇで３０分間遠心することによって可溶性細胞画分が上清として得られた。
【００５４】
電気泳動法：
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及びメルカプトエタノールで変性したタンパク質を、トリス−グリシンバッファ（２５ｍＭのトリス、１９０ｍＭのグリシン、０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ）のＳＤＳ（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０）中の１１．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）のポリアクリルアミドゲルで分離した。タンパク質をクーマシーブリリアントブルー（Ｗｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｏｓｂｏｒｎ，１９６９）で染色した。
【００５５】
化学物質：
制限エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ検出キット、ＲＮＡ分子量マーカー、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ及びＤＮＡ修飾酵素は、Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ（Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。ＲＮアーゼ非含有ＤＮＡアーゼ、アガロースＮＡ及びホスホアミジットは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から入手した。ホルムアルデヒドは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｇａｕｔｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。ホルムアミド、臭化エチジウム及びＥＤＴＡは、Ｓｅｒｖａ  Ｆｅｉｎｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。複合培地は、Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＵＳＡ）から入手した。その他の全部の化学物質は、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ  ＡＧ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した最高純度の製品であった。
【００５６】
（実施例１）
脂肪酸のドゥノボ生合成経路のＰＨＡ合成が欠損した突然変異体の単離
ＰＨＡ代謝が阻害されたＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０の突然変異体を得るために、Ｍｉｌｌｅｒら（１９７２）に従ってニトロソグアニジン突然変異誘発を行った。１ｍｌあたり２００μｇのＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンの存在下で細胞を１５分間インキュベートした。適宜希釈した細胞浮遊液を、０．０５％（ｗ／ｖ）のアンモニアと単独炭素源となる１．５％（ｗ／ｖ）のグルコン酸ナトリウムとを含む無機塩培地（ＭＭ）−寒天プレートで平板培養した。コロニーの混濁度の違いに基づいてＰＨＡ蓄積細胞とＰＨＡ非蓄積細胞とを識別した。ＰＨＡシンターゼ遺伝子座が欠失しておりどの基質からもＰＨＡを合成しなかった突然変異体と、脂肪酸のドゥノボ生合成経路のＰＨＡ合成だけが欠失していた突然変異体とを識別するために、透明コロニーの細胞もＭＭ−グルコネートプレートから０．３％のオクタン酸ナトリウムを含むＭＭ−寒天プレートに移した。グルコネート寒天プレートでは透明コロニーを形成したがオクタノエート寒天プレートでは不透明コロニーを形成した突然変異体を、ＰＨＡＧＮ表現型突然変異体と命名した。これらを液体培地で２日間増殖させ、細胞をガスクロマトグラフィーで処理して、ＰＨＡの含量及び組成を分析した。発明者らは、細胞乾燥重量（ＣＤＷ）の３％以下の僅かなＰＨＡを蓄積した５つの突然変異体（以後サブクラスＩの突然変異体と呼ぶ）とグルコネートで増殖させたときに５〜１６％のＣＤＷを蓄積した３つの突然変異体（サブクラスＩＩ）とを同定した。表１参照。双方のサブクラスの代表は、オクタノエートを唯一の炭素源として培養したときには正常量のＰＨＡ（ＣＤＷ８５％以下）を蓄積した。ポリマーの組成は検出可能な範囲では変化していなかった。これらの突然変異体はオクタノエートまたはグルコネートで細胞増殖が阻害されることはなく野生型と同じ速度で増殖した。これらの突然変異体に加えて、グルコネート及びオクタノエートからのＰＨＡの合成が欠損した２つの突然変異体が得られた（表１参照）。従って、これらの突然変異体は既に
単離されていた突然変異体Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＧｐＰ１０４（Ｈｕｉｓｍａｎら（１９９２）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８：５３６）と同じ表現型を示した。
【００５７】
本発明では化学的突然変異誘発を使用したが、その他の多くの化学的、生物学的及び物理学的な突然変異体作製方法（例えば、他の突然変異誘発物質、トランスポゾンまたはＵＶ光）は当業者に明らかであろう。
【００５８】
【表１】
2009225794.tif 000002
2009225794.tif 000003
【００５９】
（実施例２）
脂肪酸のドゥノボ生合成経路のＰＨＡ合成が阻害された突然変異体の相補性
ＥｃｏＲＩ消化したＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０のゲノムＤＮＡのライブラリーを、大腸菌Ｓ１７−１中のコスミドベクターｐＶＫ１００（Ｋｎａｕｆ  ａｎｄ  Ｎｅｓｔｅｒ（１９８２）Ｐｌａｓｍｉｄ  ８：４５）及びＧｉｇａｐａｃｋ  ＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｃａｌｉｆ．）によって構築した。約５，０００のトランスダクタント（形質導入体）に対し、ＰＨＡＧＮ１型突然変異体２：１をレシピエントとして用いてミニ相補性検定を行った。１．５％のグルコネートを補充したＭＭ−寒天プレートで３０℃で２日間インキュベーション後、トランスダクタントコロニーの混濁度によって表現型の相補性を観察した。ハイブリッドコスミドの１つ（ｐＶＫ１００：：Ｋ１８）が３つのＥｃｏＲＩフラグメント（３、６及び９ｋｂ）を担持し、ＰＨＡＧＮ１突然変異体はアセチル−ＣｏＡ経路で異化代謝された炭素源からのＰＨＡの蓄積を再開していた。これらのフラグメントを、ＥｃｏＲＩ消化した広宿主域ベクターｐＭＰ９２（Ｓｐａｉｎｋら（１９７８）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９：２７）にサブクローニングし、次いで突然変異体２：１に接合的に導入させると、３ｋｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントが相補性であることが判明した。このフラグメントをＥ３（図２）と命名した。このフラグメントはこの表現型を示す８個の単離フラグメントのすべてに相補性であった。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１の７．３ｋｂｐの完全ＰＨＡシンターゼ遺伝子座とこの遺伝子伝座の上流領域の約１３ｋｐｂとを含むハイブリッドコスミドｐＨＰ１０１６：：ＰＰ２０００、または、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１のｐｈａＣ２遺伝子と下流隣接領域の約１６ｋｂｐとから成るハイブリッドコスミドｐＨＰ１０１６：：ＰＰ１８０は相補性でなかった（Ｔｉｍｍ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｎｂｕｃｈｅｌ（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９：１５）。この試験に使用したＰＨＡ合成が完全に欠損していた２つの突然変異体はｐＨＰ１０１６：：ＰＰ２０００ハイブリッドコスミドに相補性であったが、ｐｈａＣ２遺伝子の上流の機能性プロモーターの欠失したｐＰＨ１０１６：：ＰＰ１８０構築物またはプラスミドｐＶＫ１００：：Ｋ１８に相補性でなかった。
【００６０】
Ｅ３フラグメントを含むプラスミドを担持している突然変異体ＮＫ２：１は、１９９５年４月１２日にＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  Ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭ），Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ．１ｂ，Ｄ−３３００  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙに寄託番号ＤＳＭＺ９９２２で寄託した。
【００６１】
（実施例３）
アシルトランスフェラーゼ、チオエステラーゼ及びアシル−ＣｏＡリガーゼの遺伝子の追加クローニング方法
実施例１及び２で前述したｐｈａＧ突然変異体の単離及び相補によるｐｈａＧのクローニングは、炭素化合物が脂質生合成からＰＨＡ生合成に転移する際にに関与する遺伝子を検出する方法を提供する。このプロセスに関与する遺伝子の追加クローニング方法が必要であることは当業者に明らかであろう。このような方法は、生化学的方法、遺伝的方法及び分子クローニング方法の組合せから成る。
【００６２】
ｉ．アシルトランスフェラーゼ、チオエステラーゼ及びアシル−ＣｏＡリガーゼの活性に関する酵素アッセイの開発によって、コーディング遺伝子の新しいクローニング方法が提供されるであろう。
【００６３】
Ｃｏａ−ＡＣＰアシルトランスフェラーゼ活性を検出するための多数の方法が存在する。１つの方法では、アシル−ＣｏＡを出発基質として用いてＡＣＰのアシル化を分析し、アシル−ＡＣＰ産物を尿素−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（尿素−ＰＡＧＥ）によって同定する。尿素−ＰＡＧＥは、ＡＣＰプール組成物の分解に有用であることが証明されている（Ｐｏｓｔ−Ｂｅｉｔｔｅｎｍｉｌｌｅｒら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１８５８；Ｋｅａｔｉｎｇら（１９９６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：２６６２）。ゲルに対する検出は、クーマシーブルーによって行うか、または、出発アシル−ＣｏＡのアシル基が放射性標識されているときはオートラジオグラフィーによって検出する。あるいは、アシル−放射性標識アシル−ＣｏＡまたはアシル−ＡＣＰを出発基質として使用するときは、９６ウェルフォーマットで高スループットスクリーニングを実施し得る。この場合、アシル−ＡＣＰをトリクロロ酢酸水溶液（Ｋｏｐｋａら（１９９５）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２４：５１）で選択的に沈殿させ、市販の９６ウェルのフィルタープレートを用いて分離し、洗浄し、種々のコンパートメントの放射能を定量する。アシル−ＣｏＡ及びＣｏＡは溶出液捕獲プレートに捕獲されるが、沈殿したＡＣＰ及びアシル−ＡＣＰはフィルターにトラップされる。市販の任意のプレートカウンターを用いてカウントする。これらの方法は種々の組成のアシル基に対して、即ち、直鎖、２，３−エノイル−、３−ヒドロキシ−または３−ケト−のような官能基に対して同等に有効でなければならない。
【００６４】
所望の場合に９６ウェルプレートで行うアシルトランスフェラーゼ分光分析アッセイは、アシル基の官能価次第で異なる酵素結合系によってアシル−ＡＣＰからアシル−ＣｏＡへの変換をモニターするように設計され得る。例えば、アシル基が３−ヒドロキシのとき、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼに結合させ、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの変換を３４０ｎｍでモニターすることによって３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡの形成を検出し得る。３−ケト官能基は同様の方法を逆方向にしてモニターできる。直鎖または２，３−エノイルアシル基の場合には、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼと検出すべきＮＡＤ＋またはＮＡＤＨとが最終的に得られるように同様にして設計するが結合反応スキームが延長している。
【００６５】
リガーゼの機能は、典型的にはヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を化学的活性化物質として用いて遊離脂肪酸をＣｏＡチオエステルのレベルまで活性化することである。このプロセスで、ＮＴＰはピロリン酸塩（ＰＰｉ）及びヌクレオチド一リン酸（ＮＭＰ）に変換される。記載のアシルトランスフェラーゼアッセイと同様にしてリガーゼ活性の検出アッセイを設計し得る。即ち、形成されたアシル−ＣｏＡ産物は（直鎖、２，３−エノイル−、３−ヒドロキシ−または３−ケト−官能基のいずれであるかに関わりなく）直接または延長結合系によって３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼに結合され得る。検出はやはり分光光度測定によって３４０ｎｍのＮＡＤＨの産生または消費をモニターすることによって行う。あるいは、リガーゼが実際にＮＴＰを活性化物質として使用する場合には、無機のピロホスファターゼを用いてＰＰｉを遊離燐酸塩に変換後に分析し得る。遊離燐酸塩は標準的な燐酸塩ベースのアッセイを用いて定量され得る。
【００６６】
アシル−ＡＣＰがチオエステラーゼによって加水分解されて遊離脂肪酸及び遊離ＡＣＰが形成されることは、放射性標識アシル−ＡＣＰを用いる９６ウェルフォーマット及び上述のフィルタープレート技術で検出できる。しかしながら、この特定の場合には、溶出液捕獲プレート中に出現する放射性標識された遊離脂肪酸がモニターされるかまたはフィルタープレート中に残存する沈殿形態の加水分解されない放射性標識アシル−ＡＣＰがモニターされる。９６ウェルフォーマットで使用し得る別のアッセイでは、エルマンの試薬５，５′−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）によって遊離ＡＣＰ中のホスホパンテテイン基からスルフヒドリル基を検出する。この試薬は遊離スルフヒドリルと反応して、吸光係数１３．６ｍＭ−１ｃｍ−１（Ｅｌｌｍａｎ，１９５９）の濃い黄色を生じる。
【００６７】
ｉｉ．酵素精製手段である酵素アッセイを使用し、タンパク質配列から得られた情報を用いて遺伝子を単離し得る。精製されたタンパク質をプロテアーゼで消化し、フラグメントを精製する。種々のフラグメントを標準技術及びタンパク質配列に基づいて作製された縮重オリゴヌクレオチドプローブを用いて配列決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。これらのプローブを対象生物から作製したゲノムライブラリーにハイブリダイズさせる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。プローブにハイブリダイズするクローンを配列決定し、正しい遺伝子のクローニングを確認するために、ＤＮＡから予測されたアミノ酸配列をタンパク質から決定されたアミノ酸配列に比較する。
【００６８】
ｉｉｉ．細菌溶解液中の酵素活性を検出することによって、無作為に作製した突然変異体から活性の欠如した突然変異体をスクリーニングし得る。前述の手段のいずれかによって突然変異体を作製し、各突然変異誘発反応で得られた数千のクローンを適当な酵素活性に基づいてスクリーニングする。あるいは、精製タンパク質に対して産生させた抗体を用い、酵素の欠如に基づいて突然変異体をスクリーニングする（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。これらのスクリーニングで同定された突然変異体はいずれもアシルトランスフェラーゼ遺伝子を同定するために前述のように相補性検定する。
【００６９】
ｉｖ．β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰをβ−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する任意の酵素または酵素の組合せは、ＰＨＡシンターゼを担持するだけのＰＨＡ陰性細菌を、所望の活性を有すると予測される生物から構築されたゲノムライブラリーで形質転換させることによってクローニングし得るであろう。β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡは、ＰＨＡ合成の基質としてＰＨＡポリメラーゼによって直接に使用され、従って、前述のような単純炭素源からのＰＨＡの産生をスクリーニングし得る。ＰＨＡを作製するいずれの菌株に対しても、ＰＨＡ合成がアシルトランスフェラーゼ、チオエステラーゼとリガーゼとの組合せ、またはβ−ケトチオラーゼとアシル−ＣｏＡレダクターゼとの組合せのクローニングに起因するか否かを判定する試験を行う。
【００７０】
ｖ．所望の活性をコードしている遺伝子は、大腸菌に担持されたプラスミドまたはλファージにクローニングした対象生物に由来のＤＮＡの発現ライブラリーを用いて同定できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。クローニングした遺伝子から発現されたタンパク質を、クローンの直接酵素アッセイによってまたは精製タンパク質に対して産生された抗体を用いるクローンのスクリーニングによって検定する。アシルトランスフェラーゼ、チオエステラーゼまたはリガーゼをコードしていることが同定されたクローンの制限地図を作成し、対応する遺伝子を同定するためにサブクローニングし、遺伝子を配列決定し、遺伝子によって予測されるアミノ酸配列を精製タンパク質の配列決定から得られたアミノ酸配列に比較する。
【００７１】
ｖｉ．ｐｈａＧの発現は、細胞がグルコネートで増殖するかまたは脂肪酸で増殖するかに依存しており（実施例６参照）、ＡＣＰからＣｏＡへのアシル基の転移に関与するタンパク質に関しても、該タンパク質の活性は単純炭素源からＰＨＡを合成するときにだけ必要とされるので、同様の調節が存在すると予想される。差別的に発現される遺伝子は、削減的（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ）なｃＤＮＡプローブを用いて（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）、または、削減（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）手順（Ｋｉｍら（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３１：９６０）後のｃＤＮＡの直接クローニングによってクローニングできる。ｃＤＮＡ合成は、ｍＲＮＡのポリ−Ａテールにアニーリングするオリゴ−ｄＴプライマーを用いてプライミングされ得る。ポリ−Ａテールは多数の原核生物中のｍＲＮＡ分子の少なくとも１つのサブセットに存在し、オリゴ−ｄＴプライマーを用いて細菌ｃＤＮＡライブラリーが作製されている（Ｋｕｓｈｎｅｒ（１９９６）ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ｐ．８４９；Ｋｉｍら（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３１：９６０；Ｇｏｐａｌａｋｒｉｓｈｎａ  ａｎｄ  Ｓａｋａｒ（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２７４７）。代替的なプライミング戦略では、ｃＤＮＡ合成をプライミングするためにランダムオリゴヌクレオチドを利用する（Ｋｉｍら（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３１：９６０）。ｃＤＮＡ削減手順の後、対象生物のゲノムライブラリーからクローンを同定するためのハイブリダイゼーションスクリーニングにプローブを使用する。あるいは、ｃＤＮＡを直接にクローニングする。このスクリーニングで同定されたクローンを配列決定し、予測されるアシルトランスフェラーゼを同定するために種々の公知のアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子及びｐｈａＧに比較する。これらのクローンはまた、ｃＮＤＡの作製のもとになるｍＲＮＡをコードする完全遺伝子を含有するゲノムクローンを同定するためのプローブとして使用され得る。更に、ランダムプライムされたｃＤＮＡ（全遺伝子をコードしてはいないと考えられる）を自殺ベクターにクローニングし（例えば、Ｌｅｎｚら（１９９４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：４３８５によって使用されたベクター）、突然変異体を産生させるためにソース生物のゲノムに組込み、単純炭素源からＰＨＡを産生する突然変異体の能力を分析する。ＰＨＡ合成が阻害された突然変異体は、実施例２で前述したように対象生物のゲノムクローンを用いて相補性検定し得る。
【００７２】
ｖｉｉ．差別的に発現されたタンパク質は、２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて直接検出され得る。この方法は、大腸菌中のレギュロン調節下のタンパク質を研究するためにＮｅｉｄｈａｒｄｔ及び彼の共同研究者によって利用されて成功した（例えば、ＶａｎＢｏｇｅｌｅｎら（１９９６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：４３４４）。炭素源に応じて差別的に調節されることが確認されたタンパク質を精製し配列決定して、これらをコードしている（１つまたは複数の）遺伝子を前述のようにクローニングし分析し得る。
【００７３】
（実施例４）
ｐｈａＧの遺伝子座及びヌクレオチド配列の決定
３ｋｂｐのＥ３フラグメント（図２）をｐＢｌｕｅｓｋｒｉｐｔ  ＳＫベクターにクローニングし、汎用の逆向きの合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることによって、ジデオキシ−チェーンターミネーション方法及びプライマーホッピング戦略によってヌクレオチド配列を決定した。配列表の配列１は、フラグメントＥ３のヌクレオチド配列を示す。このフラグメントは、３つのＯＲＦをもつ３，０６１のヌクレオチドから成る。このフラグメントに局在するＯＲＦ１及びＯＲＦ３は不完全であり、ＯＲＦ１は５′−領域が欠失し、ＯＲＦ３は３′−領域が欠失している。図２参照。ＯＲＦ１の推定アミノ酸は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの特性未決定の仮定タンパク質（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ，Ｒ．Ｄ．ら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：４９６）に有意な相同性を有することが判明した。対照的に、ＯＲＦ３の場合、ＥＭＢＬデータベースから入手できる配列をもつ他のいかなる遺伝子産物に対しても有意な相同性を検出することができなかった。
【００７４】
このフラグメントに局在する唯一の完全なＯＲＦは、８８５のヌクレオチドをもつ中央のＯＲＦ２であり、これをｐｈａＧと命名した。このＯＲＦは９１１位に起点をもち、１７９５位に終点をもつ。この上流に８個のヌクレオチド離れて仮のＳ／Ｄ配列が存在した。ｐｈａＧの翻訳終止コドンの約２３０ｂｐ下流に、因子依存性でない転写ターミネーターが局在すると考えられる。数個の他のＯＲＦが検出された。しかしながら、これらはいずれもコーディング領域に関するＢｉｂｂ．Ｍ．Ｊ．ら（１９８４）Ｇｅｎｅ  ３０：１５７の法則に適合しないかまたは上流に確実なリボソーム結合部位を有していなかった。
【００７５】
（実施例５）
ｐｈａＧ翻訳産物の特性決定
３つのＯＲＦ全部に使用されているコドンは、典型的なＰ．ｐｕｔｉｄａの採択コドンに十分に合致しており、５９．２モル％というｐｈａＧのＧ＋Ｃ含量は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａの全ゲノムＤＮＡで測定された６０．７〜６２．５モル％という値（Ｒｏｔｈｍｅｌら（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０４：４８５及びＳｔａｎｉｅｒら（１９６６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：１５９）に近似しており、また、ｐｃｈＣ（６２．１モル％）及びｐｃｈＦ（５９．６モル％）（Ｋｉｍら（１９９４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：６３４９）及び他のＰ．ｐｕｔｉｄａ遺伝子（Ｈｏｌｌｏｗａｙ  ａｎｄ  Ｍｏｒｇａｎ（１９８６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４０：７９；Ｍｉｓｒａら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：５９７９；Ｎａｋａｉら（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２９２３）のＧ＋Ｃ含量に極めて近い値である。
【００７６】
ｐｈａＧ遺伝子は、２９５個のアミノ酸から成る分子量３３，８７６Ｄａのタンパク質をコードしている。推定されたアミノ酸配列を配列表の配列１に示す。配列の位置合せによれば、ｐａｇＧから推定されたアミノ酸はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＧ２０１のｒｈｌＡ遺伝子産物に全体で４４％の一致を有することが判明した（Ｏｃｈｓｎｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９７８７）。ＲｈｌＡもまた、２９５個のアミノ酸から成り、分子量３２．５ｋＤａを有している。この遺伝子は、ｒｈｌａ、ｒｈｌＢ及びｒｈｌＲから成る遺伝子クラスターの５′−末端の遺伝子を表す。最初の２つの遺伝子は、ラムノリピド生合成に関与するタンパク質をコードする構造遺伝子を表し、ＲｈｌＲはσ５４依存性プロモーターに作用する転写アクチベーターを表す。ｒｈｌＢ遺伝子産物は、ラムノシルトランスフェラーゼ活性を示した。ＲｈｌＡの機能はまだ特性決定されていないが有効なラムノリピド生合成に必要である（Ｏｃｈｓｎｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９７８７）。ＲｈｌＡ及びＰｈａＧのＣ−末端領域は、所謂“キノロン感受性タンパク質”をコードするＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの遺伝子領域（ｑｉｎ）に高い相同性を示した（Ｔｏｎｅｌｌｉ，Ｄ．Ａ．ａｎｄ  Ｒ．Ｖ．Ｍｉｌｌｅｒ，未公表結果（ＧｅｎＥＭＢＬデータライブラリー、アクセス番号Ｌ０２１０５）。この領域は１５０３個のヌクレオチドから成る。ｑｉｎ遺伝子のアミノ末端は正確に決定されず、データベースに示されている相同はこの配列のヌクレオチド２０７〜５６６の範囲でしかない。しかしながら６個の読み取り枠全部におけるこの配列の翻訳及びその後のｔＢＬＡＳＴｎの探索の結果として、示唆されたｑｉｎ翻訳開始コドンの上流領域の異なる読み取り枠にＰｈａＧ及びＲｈｌＡのそれぞれのＮ−末端領域との相同性が同定された。終止コドンはｑｉｎ遺伝子では他の遺伝子よりも３８個のアミノ酸だけ遅れて出現する。ｑｉｎ領域のアミノ酸一致は、２４９個のオーバーラップ残基中でＰｈａＧまたはＲｈｌＡに対してそれぞれ５０．６％及び４０．１％に達した。
【００７７】
ＰｈａＧは、脂質のようなエステルに対するヒドロラーゼ（例えば、トリアシルグリセロールリパーゼ；Ｒａｗａｄｉら（１９９５）Ｇｅｎｅ  １５８：１０７）またはポリヒドロキシアルカノエート（例えばＰＨＡデポリメラーゼ；Ｔｉｍｍ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９：１５）から主として構成される酵素グループに対してより小さいが追加の相同領域を有している。この相同領域はＰｈａＧの残基２０９〜２５８の範囲であり、これらのタンパク質中で高度に保存されるヒスチジン残基（ＰｈａＧの残基２５１）を含んでいる。これらのデータは、ＰｈａＧの触媒機能が恐らくはエステル結合の破壊に関与することを示唆している。このような活性はアシルトランスフェラーゼ、チオキナーゼまたはアシル−ＣｏＡリガーゼ中で予測され得る。
【００７８】
（実施例６）
プロモーターの同定及び調節
ｐｈａＧの２４４ｂｐ上流で推定σ７０依存性プロモーター構造ＴＴＧＣＧＣ−Ｎ１７−ＴＴＧＡＡＴが同定された。Ｅ３のサブフラグメントでＰＨＡＧＮ１突然変異体２：１を相補性検定することによってプロモーターを確認した。上記のプロモーター配列が欠失した２．２ｋｂｐのＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩサブフラグメント（ＳＦ２２）（図１）は、突然変異体２：１に相補的ではなかったが、Ｅ３の１．３ｋｂｐのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサブフラグメント（ＢＨ１３）（図２）はこの突然変異体に単純炭素源からＰＨＡを合成する能力を回復させた。
【００７９】
更に、この推定プロモーター構造の重要性は、定常増殖期に採取されたＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０のグルコネート増殖細胞及びオクタノエート増殖細胞から単離した全ＲＮＡによるＳ１ヌクレアーゼ保護によって証明された。転写開始部位は、推定プロモーターコンセンサス配列から５ヌクレオチド下流の６８３位であることが同定された（図２）。
【００８０】
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０のオクタノエート増殖細胞の場合、極めて弱いＲＮＡシグナルだけが検出できたが、グルコネートを炭素源として増殖させたＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ  Ｈ１６細胞から単離したＲＮＡでは強力なシグナルが検出された。この結果は脂肪酸のドゥノボ生合成経路のＰＨＡ合成条件下のｐｈａＧの強力な転写誘発を示している。
【００８１】
（実施例７）
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧに生物学的に等価の機能をもつペプチド、ポリペプチド及びタンパク質
本発明は、配列１の９１１位〜１７９５位で示されるヌクレオチド配列によってコードされるＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧタンパク質だけでなく、生物学的に等価の機能をもつペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を包含する。“生物学的に等価の機能をもつペプチド、ポリペプチド及びタンパク質”なる表現は、単純糖質基質で増殖する経路でＰＨＡ合成が欠損したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａのＰｈａＧ欠失突然変異体を利用する相補性検定によって生物学的に検定したときに、Ｐ．ｐｕｔｉｄａのＰｈａＧと同じまたは類似のＰｈａＧ活性を示すペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を意味する。“同じまたは類似のＰｈａＧ活性”なる表現は、ＰｈａＧと同じまたは類似の機能を発揮する能力を意味する。これらのペプチド、ポリペプチド及びタンパク質は、本文中に配列２として開示されたＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧタンパク質の対応する領域または部分に配列類似性を示す領域または部分を含む。しかしながら、これらのペプチド、ポリペプチド及びタンパク質がＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧタンパク質と同じまたは類似のＰｈａＧ活性を示す限りこれらの領域または部分は不要である。
【００８２】
ＰｈａＧタンパク質は、ＰＨＡの酵素的合成に有用であるだけでなく、このＰｈａＧタンパク質または可能な別のＰｈａｇ様タンパク質を精製または検出するために使用できる抗体を産生させる抗原として有用である。
【００８３】
ＰｈａＧタンパク質に生物学的に等価の機能をもつペプチド、ポリペプチド及びタンパク質は後述するような多様な形態で産生され得る。
【００８４】
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧのアミノ酸配列中の保存性アミノ酸変化
ＰｈａＧタンパク質に生物学的に等価の機能をもつペプチド、ポリペプチド及びタンパク質は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧの基本配列中にアミノ酸変化を含むアミノ酸配列を有している。本発明に包含されるＰｈａＧタンパク質に生物学的に等価の機能をもつペプチド、ポリペプチド及びタンパク質は、天然産生タンパク質またはその対応する領域もしくは部分に対して、一般には少なくとも約４０％の配列類似性、好ましくは少なくとも約６０％の配列類似性、最も好ましくは少なくとも約８０％の配列類似性を有していなければならない。本文中の“配列類似性”なる用語は、配列解析ソフトウェアパッケージ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１の“ギャップ”プログラムまたは“ベストフィット（最良適合）”プログラムによって決定される。このソフトウェアは、相同の程度を種々の付加、欠失、置換及びその他の修飾に割り当てることによって類似配列の突合せ（マッチング）を行う。ベストフィットプログラムは２つの配列間の最良の類似セグメントを最適に位置合せする。Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４２８−４８９の局所相同アルゴリズムを用いて一致数を最大にするようにギャップを挿入することによって、最適な位置合せを見出す。ギャッププログラムは、一致数が最大でギャップ数が最小になるような２つの完全配列の位置合せを見出すためにＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈのアルゴリズム（（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を使用する。
【００８５】
ＰｈａＧのフラグメント及び変異体
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧと同じまたは類似のＰｈａＧ活性を有しているＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧのフラグメント及び変異体も本発明に包含される。
【００８６】
ＰｈａＧのフラグメント
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧのフラグメントは、天然に生じるＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧと同じまたは類似のＰｈａＧ酵素活性を該フラグメントが有している限り、タンパク質またはその組合せのＮ−末端、Ｃ−末端、内部領域から１つまたは複数のアミノ酸が欠失した酵素の末端欠失形態でもよい。これらのフラグメントは天然に生じるＰｈａＧのミューテインでもよく、または、コーディングヌクレオチド配列の制限エンドヌクレアーゼ処理もしくはエキソヌクレアーゼＩＩＩ処理（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９４４）Ｇｅｎｅ  ２８：３５１）によって産生されてもよい。
【００８７】
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧの変異体
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧの変異体は、天然に生じるアミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸が別のアミノ酸で置換された酵素または天然アミノ酸配列に１つまたは複数のアミノ酸が挿入された酵素の形態を包含する。本文中で考察される変異体は、天然に生じるＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧと同じまたは類似のＰｈａＧ活性を維持している。これらの変異体は天然に生じるＰｈａＧのミューテインでもよくまたは野生型のコーディングヌクレオチド配列のランダム突然変異誘発によって産生されてもよく（Ｇｒｅｅｎｅｒら（１９９４）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ７：３２−３４）もしくはそのドメインをＰｈａＧの他の対象ドメインで置換することによって産生されてもよい。このような変異体のＰｈａＧ活性は前述のように相補性検定できる。
【００８８】
上記の組合せ、即ち、アミノ酸の付加、欠失及び置換を含むが天然に生じるＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧと同じまたは類似のＰｈａＧ活性を維持しているｐｈａＧの形態も本発明に包含される。
【００８９】
本発明に包含されるＰｈａＧのフラグメント及び変異体は、天然のＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧまたは対応するその領域またはその部分に対して好ましくは少なくとも約４０％の配列類似性、より好ましくは少なくとも約６０％の配列類似性及び最も好ましくは少なくとも約８０％の配列類似性を有していなければならない。配列類似性は、上述の配列解析ソフトウェアパッケージのギャッププログラムまたはベストフィットプログラムを用いて決定できる。
【００９０】
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧをコードするゲノムＤＮＡに生物学的に等価の機能をもつヌクレオチド配列
本発明は、配列１に示すＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧゲノムＤＮＡ配列だけでなく、生物学的に等価の機能をもつヌクレオチド配列を包含する。“生物学的に等価のヌクレオチド配列”なる表現は、酵素アッセイによるかまたは相補性検定によって試験したときに、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧと同じまたは類似のＰｈａＧ酵素活性を示すペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ及びｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むＤＮＡ及びＲＮＡを意味する。このような生物学的に等価の機能をもつヌクレオチド配列は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧの対応する領域または部分に配列類似性を示す領域または部分をコードするペプチド、ポリペプチド及びタンパク質をコードし得る。
【００９１】
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧのアミノ酸配列の保存性アミノ酸変化をコードするヌクレオチド配列
実施例７に示したように、生物学的に等価の機能をもつ本発明のヌクレオチド配列は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧのアミノ酸配列の内部の保存性アミノ酸変化をコードするヌクレオチド配列を含み、内部に沈黙の変化を生じさせる。従って、このようなヌクレオチド配列は、遺伝コードに基づいてＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧタンパク質をコードする野生型ヌクレオチド配列に比べたときに対応する塩基置換を含む。
【００９２】
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧ中の非保存性アミノ酸置換、付加または欠失をコードするヌクレオチド配列
生物学的に等価の機能をもつ本発明のヌクレオチド配列は、天然に生じるＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧアミノ酸配列の内部の保存性アミノ酸変化をコードするヌクレオチド配列に加えて、非保存性のアミノ酸置換、付加または欠失をコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ及びｍＲＮＡのヌクレオチド配列を含む。これらのヌクレオチド配列は、配列１のゲノムＰｈａＧ  ＤＮＡに含まれている遺伝情報と同一の固有遺伝情報を含み、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧの酵素活性と同じまたは類似のＰｈａＧ酵素活性を示すペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードしている核酸を包含する。このようなヌクレオチド配列は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧのフラグメントまたは変異体をコードし得る。このようなフラグメント及び変異体のＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧ様酵素活性は、前述のような相補性検定または酵素アッセイによって確認され得る。生物学的に等価の機能をもつこれらのヌクレオチド配列は、天然に生じるＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧのゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ及びｍＲＮＡのそれぞれまたはその対応する領域もしくは部分に対して、少なくとも４０％の配列一致、好ましくは少なくとも６０％の配列一致、及び、最も好ましくは少なくとも８０％の配列一致を有し得る。
【００９３】
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧのｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはその他の核酸に生じた突然変異は好ましくは、コーディング配列の読み取り枠を保存している。更にこれらの突然変異は好ましくは、ｍＲＮＡの翻訳に不利な影響を与えるループまたはヘアピンのようなｍＲＮＡ二次構造を形成するようにハイブリダイズする相補的領域を形成しないのが好ましい。
【００９４】
突然変異部位は予め決定できるが、突然変異自体の性質を予め決定する必要はない。例えば、所与の部位で最適特性値の突然変異体を選択するために、標的コドンで部位特異的突然変異を誘発し（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：５７３３５）、得られたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のＰｈａＧ酵素活性を酵素アッセイまたは相補性検定によって測定できる。
【００９５】
配列１に示すヌクレオチド配列を有するＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧのゲノムＤＮＡに生物学的に等価の機能をもつ核酸としては以下の核酸がある：
（１）本明細書でＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０を代表例としたＰ．ｐｕｔｉｄａに由来のＤＮＡ。これらのＤＮＡの長さは、部分的ヌクレオチドの挿入または欠失のような天然または人工の突然変異によって改変されており、従って、配列１の９１１位〜１７９５位のコーディング配列の全長を１００％とするとき、生物学的に等価の機能をもつヌクレオチド配列の長さは概して全長の約６０〜１２０％、好ましくは約８０〜１１０％である；
（２）部分的な（通常は全長の８０％以下、好ましくは６０％以下、より好ましくは４０％以下の）天然または人工の突然変異を含むヌクレオチド配列。このような配列は種々のアミノ酸をコードしているが、得られるタンパク質は天然に生じるＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧの酵素活性と同じまたは類似のＰｈａＧ酵素活性を維持している。このようにして作製された突然変異ＤＮＡは好ましくは、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧのアミノ酸配列に、少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約８０％の配列類似性をもつタンパク質をコードしているのが好ましい。配列類似性は、前述の配列解析ソフトウェアパッケージのギャッププログラムまたはベストフィットプログラムによって評価され得る。
【００９６】
本文中で考察されている人工の核酸突然変異を生じさせるために使用できる方法は特に限定されないので、当業界で慣用の任意の手段によってこのような突然変異を生じさせ得る。例えば、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ｐｈａＧ遺伝子、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡを適当な制限酵素で処理し、適正な核酸読み取り枠が保存されるように所望のＤＮＡフラグメントを挿入または欠失させる。制限エンドヌクレアーゼによる処理後、消化ＤＮＡを処理してオーバーハングを埋戻し、ＤＮＡを再結合させる。ＤＮＡをエキソヌクレアーゼＩＩＩで処理することによってＣ−末端の欠失が得られる。あるいは、制限酵素を用いて核酸を適宜操作し、次いで結合させることによって、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧの種々のドメインを別のＰｈａＧタンパク質の領域で置換し得る。
【００９７】
また、天然型Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧのゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡ配列のフラグメントに結合可能な隣接制限部位をもつ突然変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって特定遺伝子座に突然変異を導入してもよい。結合後に得られる再構築された配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換または欠失を有する生物学的機能の等価物をコードしている。
【００９８】
あるいは、オリゴヌクレオチド特異的、部位特異的またはセグメント特異的な突然変異の誘発手順を使用して、必要な挿入、置換または欠失に従って改変された特定コドンを有する改変ＤＮＡ配列を産生してもよい。
【００９９】
上述の改変を作製する代表的な方法は、Ｗａｌｄｅｒら（１９８６）Ｇｅｎｅ  ４２：１３３；Ｂａｕｅｒら（１９８５）  Ｇｅｎｅ  ３７：７３；Ｃｒａｉｋ（１９８５年１月）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１２−１９；Ｓｍｉｔｈら（１９８１）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｆｒｉｔｓ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎら（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０：６４８７−６４９７、及び、Ｏｓｕｎａら（１９９４）Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０：１０７−１１６に開示されている。
【０１００】
上記方法のいずれかによって産生された本文中に開示されたゲノムＤＮＡ配列に生物学的機能の等価物は、得られたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の前述のような相補性検定または酵素アッセイによって選択され得る。
【０１０１】
あるいは、天然型Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧのヌクレオチド配列のフラグメントに結合容易な隣接制限部位をもつ突然変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって特定遺伝子座に突然変異を導入してもよい。結合後に得られる再構築されたヌクレオチド配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換または欠失を有しており生物学的に等価の機能をもつ形態のシンターゼをコードしている。このようにして産生された突然変異形態のＰ．ｐｕｔｉｄａ様ＰｈａＧ活性を相補性検定または酵素アッセイによってスクリーニングし得る。
【０１０２】
配列１のゲノムｐｈａＧ  ＤＮＡの生物学的機能の等価物の有用な形態は、対応する配列１のゲノムｐｈａＧ  ＤＮＡの９１１位〜１７９５位の領域または部分に対して、少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約６０％、及びより好ましくは少なくとも約８０％のレベルの配列一致を示すヌクレオチド配列から成るＤＮＡを含む。配列一致は前述のベストフィットプログラムまたはギャッププログラムを用いて決定できる。
【０１０３】
遺伝的縮重ヌクレオチド配列
遺伝子コードが縮重性を有するので、即ち、タンパク質中に天然に存在する大抵のアミノ酸は２つ以上のコドンに対応できるので、本発明のゲノムＤＮＡと本質的に同じ遺伝情報を含んでおり且つ配列２に示すＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧのアミノ酸と同じアミノ酸配列をコードする遺伝的縮重ＤＮＡ（及びＲＮＡ）配列は本発明に包含される。本文中に記載されている任意の他の核酸の遺伝的縮重形態も本発明に包含される。
【０１０４】
ハイブリダイゼーションによって検出された生物学的に等価の機能をもつ核酸配列
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧをコードするヌクレオチド配列の１つの具体例を配列１の７１１位〜１７９５位で示しているが、生物学的に等価の機能をもつ別の形態のＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧをコードする核酸が慣用のＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション技術を用いて容易に単離できることは理解されよう。従って、本発明は、配列１の９１１位〜１７９５位及びその相補的配列にハイブリダイズし、発現されるとＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧの酵素活性と同じまたは類似の酵素活性を示すペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する。このようなヌクレオチド配列は好ましくは、中程度から高程度の緊縮性条件下で配列１の９１１位〜１７９５位及びその相補的配列にハイブリダイズする（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．参照）。代表的な条件は、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、１００ｍｇ／ｍｌの魚精子ＤＮＡ、０．１％のＳＤＳ中、５５℃でハイブリダイゼーションの達成に十分な時間（例えば数時間〜一夜）維持する初期ハイブリダイゼーションと、毎回２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用い、室温で１５分間行う２回の洗浄と、毎回０．５−１×のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを用い、５５℃で１５分間行う２回の洗浄と、オートラジオグラフィーとを順次に含む。典型的には、ハイブリダイゼーション混合物を０．１×ＳＳＣ中で５５℃、好ましくは６０℃、より好ましくは６５℃で少なくとも１回洗浄するときに、核酸分子がハイブリダイズし得る。
【０１０５】
遺伝コードが縮重性をもつことに基づいて本発明はまた、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧのアミノ酸配列またはその遺伝的縮重形態をコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又は合成ＤＮＡ分子に、等価の塩及び温度条件でハイブリダイズでき、発現されるとＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧの酵素活性と同じまたは類似のＰｈａＧ酵素活性を有するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する。
【０１０６】
上述のヌクレオチド配列は、ｉｎ  ｖｉｖｏの相補性検定によってＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧの活性に対して約±３０％以下、好ましくは約±２０％以下、より好ましくは約±１０％以下の違いをもつＰｈａＧ活性を有するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードしている場合に、本発明のＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧ遺伝子に実質的に等価の生物学的機能を有していると考えられる。
【０１０７】
相補性検定によって検出される生物学的に等価の機能をもつ核酸配列
生物学的に等価の機能をもつ推定核酸配列をシス位置に含み、同時に、発現に必要なすべての調節要素を含む広宿主域プラスミドを担持している大腸菌ドナー菌株は、ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３（Ｄｉｔｔａら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：７３４７）を用いる三親交配によってＰｈａＧ陰性のレシピエント細菌株にプラスミドを接合させるために使用できる。得られたトランスコンジュガントを適当な抗生物質を補充したポリマー伝導性培地で選択できる。種々の炭素基質を含む培地でトランスコンジュガントを発酵させ、次いで、得られたＰＨＡを分析すると、核酸機能の等価性を判断する手段が提供される。
【０１０８】
ゲノムプローブ
別の目的によれば、本発明は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧと同じまたは類似の酵素活性を有するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードしているＤＮＡ配列をゲノムライブラリー及びその他の核酸ライブラリーからスクリーニングするために有用なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを提供する。このプローブは、配列１の９１１位〜１７９５位の配列に基づいて設計され得る。このようなプローブは約２０〜約６０ヌクレオチドの長さ、一般には約２０ヌクレオチド、より典型的には約３０ヌクレオチド、好ましくは約４０ヌクレオチド、より好ましくは約５０〜６０ヌクレオチドの長さを有している。好ましくはこれらのプローブは、前述のようなハイブリダイゼーション条件下でＰ．ｐｕｔｉｄａのゲノムｐｈａＧ  ＤＮＡ配列、及び、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧと同じまたは類似のＰｈａＧ活性を有するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードしている他のＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズする。このようなオリゴヌクレオチドプローブは、全自動合成によって合成でき、通常は３２Ｐのような放射性核種またはビオチンなどのリポーターによって５′端が標識され得る。プローブされるライブラリーを、使用するベクター次第でコロニーまたはファージとして平板培養し、組換えＤＮＡをナイロンまたはニトロセルロースの膜に転移させる。ＤＮＡを変性し、中和し、膜に定着させた後、膜を標識プローブと共にハイブリダイズさせる。次いで、膜を洗浄し、リポーター分子を検出する。次に、ハイブリダイズするＤＮＡを担持しているコロニーまたはファージを単離し増殖させる。有望なクローンまたはＰＣＲ増幅フラグメントが、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ様ＰｈａＧ活性またはＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧと同じまたは類似の活性を有する近縁のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質をコードしているＤＮＡを含むことを種々の方法によって確認し得る。例えば、有望なクローンを重複のない第二のプローブとハイブリダイズさせるかまたはＤＮＡ配列を解析する。このＤＮＡによってコードされているペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の活性を評価するために、大腸菌のような適当な宿主中でＤＮＡをクローニングして発現させ、次いでペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を単離し、その活性のアッセイを行う。このような手段によって、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ以外の微生物からＰｈａＧタンパク質並びにＰＨＡを産生するために有用なＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧに生物学的に等価の機能をもつペプチド、ポリペプチド及びタンパク質をコードする核酸を単離し得る。
【０１０９】
縮重オリゴヌクレオチドプライマー
他の微生物に由来の生物学的機能が等価のｐｈａＧ遺伝子または等価のＰｈａＧコーディングｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いる増幅によって単離できる。Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧのアミノ酸配列に基づく縮重オリゴヌクレオチドプライマーを作製し、逆転写酵素を用いるＰＣＲ技術（Ｅ．Ｓ．Ｋａｗａｓａｋｉ（１９９０），Ｉｎ  Ｉｎｎｉｓら，Ｅｄｓ．，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３，ｐ．２１）と共に使用して、他の生物のゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから生物学的に等価の機能を有するＤＮＡを増幅し得る。
【０１１０】
あるいは、例えばλ  Ｚａｐ．ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のようなλファージベクター中でｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして縮重オリゴヌクレオチドを使用できる。
【０１１１】
（実施例９）
大腸菌中のｐｈａＧのヘテロロガス超発現
大腸菌中のＰｈａＧのヘテロロガス発現を確保するために、Ｔ７−ポリメラーゼ発現ベクターｐＴ７−７（Ｔａｂｏｒ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１０７４）を使用した。ｐｈａＧ遺伝子をｐＴ７−７の転写／翻訳開始領域に結合させるために、ＰＣＲ増幅によってｐｈａＧの開始コドンにＮｄｅＩ部位を作製した。０．９７ｋｂｐのＰＣＲ産物をＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同様に消化したベクターに結合させた。ｐＴ７−Ｇ１と命名したこの構築物の配列を確認し、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）誘発ｌａｃＵＶ５プロモーターのコントロール下にＴ７ポリメラーゼ遺伝子を担持している大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｆｆａｔｔ（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３）を形質転換した。ｐＴ７−Ｇ１を担持している細胞及びｐＴ７−７（陰性対照）を担持している細胞を、１ｍｌあたり１００μｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地で培養した。ＩＰＴＧを最終濃度０．４ｍＭまで添加することによって光学密度１．０〜５００ｎｍでＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの発現を誘発した。４時間のインキュベーション後、細胞を採集し、音波処理によって溶菌した。ｐＴ７−Ｇ１を担持する細胞は誘発中に大量の顆粒画分を産生した。それぞれ５，０００×ｇ及び３，０００×ｇの分別遠心、及び水洗を順次行うことによって顆粒画分を粗抽出物から部分的に分離した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の電気泳動図は、プラスミドｐＴ７−Ｇ１を含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物から得られた粗抽出物、ペレット画分及び顆粒画分調製物中に推定分子量３４ｋＤａの１つの主要バンドが存在することを示した。このバンドは、ｐＴ７−Ｇ１を担持する大腸菌細胞の可溶性画分中、及び、インサート非含有のｐＴ７−７を担持する大腸菌ＢＬ２１の対照調製物中には存在しなかった。ＰｈａＧの強力な超発現は不溶性タンパク質の集塊中でだけ観察されるという結果が得られた。
【０１１２】
Ｔ７発現系によって超発現されたＰｈａＧは多数の用途に使用できる。例えば、産生されたタンパク質は、抗体産生、Ｘ線結晶学検査、ＰｈａＧ活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析に使用でき、また、適当な酵素活性と組合せてＰＨＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成に使用できる。別の発現系はまた、組換え系でＰｈａＧを超発現させるために使用し得る。例えば、大腸菌のｔａｃプロモーターは、大腸菌及び別の細菌中でＰｈａＧを発現させるために有用なプロモーターである。組換え宿主中でＰｈａＧを発現させるために有用な他のプロモーターは当業者に公知である。ｔａｃプロモーターから発現されたタンパク質は、適当な宿主生物中で適当なＰＨＡ生合成酵素と組合せると、例えばグルコースのような単純炭素源からＰＨＡをｉｎ  ｖｉｖｏ産生するために好適である。ＰｈａＧを認識する抗体は、ＰｈａＧタンパク質またはＰｈａＧ様タンパク質を含む生物をスクリーニングするために使用し得る。抗体はまた、粗抽出物からＰｈａＧタンパク質及びＰｈａＧ様タンパク質を免疫精製するために有効であろう。
【０１１３】
（実施例１０）
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧタンパク質を発現する細菌及び植物によるポリヒドロキシアルカノエートの産生
Ｐ．ｐｕｔｉｄａのＰｈａＧコーディングＤＮＡを異なる種々の真核細胞及び原核細胞、例えば細菌及び植物のような体内でＰＨＡを容易に産生する宿主細胞に導入して発現させ得る。本文中で言及するＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧ及びこれをコードするゲノムＤＮＡはそれぞれ上述のような生物学的な機能の等価物を包含することを理解されたい。このようなＰＨＡ産生方法の利点は、石油由来のモノマー依存度を低減できること、並びに、細菌及び植物の大規模育成が容易なことである。
【０１１４】
細菌及び植物による脂肪酸のドゥノボ生合成経路の最適ＰＨＡ合成には少なくとも２つの遺伝子、即ち、ＰＨＡシンターゼ（ｐｈａＣ）とｐｈａＧ（本文中に開示）とが関与する。ＰＨＡシンターゼと他のＰＨＡ遺伝子（ｐｈａＡ（β−ケトチオラーゼ）及びｐｈａＢ（Ｄ−レダクターゼ））を形質転換及び発現のためのベクター構築物に組込む方法、これらの構築物を細菌及び植物の宿主細胞に導入してこのような細胞中でＰＨＡを産生させる方法は当業界で公知である。最近になってＰｏｉｒｉｅｒら（（１９９５）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：１４２−１５０）はこの領域の進歩を概説した論文を発表した。一般的に、このようなベクター構築物は内包する構造ＤＮＡ配列の発現を刺激するように機能的に作用可能に連結されたＤＮＡフラグメントの集合から成る。これらのベクター構築物は通常は、選択された宿主細胞中で機能するプロモーターを、互いに作用可能に連結されたリボソーム結合部位、転写ターミネーター、３′非翻訳ポリアデニル化シグナルのような必要な他の任意の調節領域並びに選択可能マーカーと共に含む（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）。
【０１１５】
このようなベクターは、例えば、塩化カルシウム／熱ショック処理または電気穿孔によって細菌細胞に導入され得る。形質転換された宿主を次に、選択培地で選択し、適当な培地中でＰＨＡの産生に導く条件下で培養し、次いでＰＨＡを細胞から回収する。代表的な方法はＳｌａｔｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：４４３１−４４３６；Ｓｌａｔｅｒら（１９９２）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８：１０８９−１０９４；Ｚｈａｎｇら（１９９４）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：１１９８−１２０５；及びＫｉｄｗｅｌｌら（１９９５）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１：１３９１−１３９８によって記載されている。
【０１１６】
ＰｈａＧを用いるＰＨＡポリマー産生に有用な宿主は、放線菌類Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種及びＮｏｃａｒｄｉａ種）；他の細菌（例えば、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ（例えばＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ，Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｂ．ｌｉｃｈｎｉｆｏｒｍｉｓ，Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ種（例えばＫ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ及びＫ．ｏｘｙｔｏｃａ），Ｌａｃｔｏｂａｃｃｉｌｌｕｓ，Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ及びＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ），Ｎｏｃａｒｄｉａ種（例えばＮ．ｃｏｒａｌｌｉｎａ）、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ種（例えばＲ．ｒｕｂｒｕｍ）；真菌類（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ及びＰｅｎｉｃｉｌｌｕｍ）；並びに酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ，Ｃａｎｄｉｄａ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ及びＰｉｃｈｉａ）である。
【０１１７】
その他の有用な細菌株としては、脂質を大量に蓄積し得る菌株、及び単純炭素源を高い変換率でアセチル−ＣｏＡに変換し得る菌株がある。
【０１１８】
ＰＨＡ生合成に関与する細菌遺伝子を植物体内に導入し得る形質転換ベクターを設計し得る。一般には、このようなベクターは、プロモーター及び選択可能マーカーを含む５′及び３′の調節配列の転写コントロール下に１つまたは複数の対象コーディング配列を含む。典型的な調節配列としては、転写開始起点部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終結部位、及び／または、ポリアデニル化シグナルがある。植物プロモーターは誘導性または構成性、環境調節型または発生調節型、細胞特異的または組織特異的のいずれでもよい。頻用されるプロモーターとしては、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０），促進されたＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルス（Ｆｉｇｗｏｒｔ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓ，ＦＭＶ）のプロモーター（Ｒｉｃｈｉｎｓら（１９８７）ＮＡＲ  ２０：８４５１）、マンノパインシンターゼ（ｍａｓ）のプロモーター、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）のプロモーター及びオクトパインシンターゼ（ｏｃｓ）のプロモーターがある。有用な誘導性プロモーターとしては、熱ショックプロモーター（Ｏｕ−Ｌｅｅら（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：６８１５；ホウレンソウの亜硝酸レダクターゼ遺伝子に由来の硝酸塩誘導プロモーター（Ｂａｃｋら（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７：９）；ホルモン誘導プロモーター（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ−Ｓｈｏｎｏｚａｋｉら（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：９０５；Ｋａｒｅｓら（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：９０５）；及びＲｕＢＰカルボキシラーゼ及びＬＨＣＰ遺伝子ファミリーの小サブユニットに関連した光誘導プロモーター（Ｋｕｈｌｅｍｅｉｅｒら（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：４７１；Ｆｅｉｎｂａｕｍら，（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２６：４４９；Ｗｅｉｓｓｈａａｒら（１９９１）ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：１７７７；Ｌａｍ  ａｎｄ  Ｃｈｕａ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：４７１；Ｃａｓｔｒｅｓａｎａら（１９８８）ＥＭＢＯ  Ｊ．７：１９２９；Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｌｅｆｅｒｔら（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８：６５１）がある。発生的に調節された有用な組織特異的プロモーターの例としては、β−コングリシニン７Ｓプロモーター（Ｄｏｙｌｅら（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：９２２８；Ｓｌｉｇｈｔｏｎ  ａｎｄ  Ｂｅａｃｈｙ（１９８７）Ｐｌａｎｔａ  １７２：３５６）、種子特異的プロモーター（Ｋｎｕｔｚｏｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２６２４；Ｂｕｓｔｏｓら（１９９１）ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：１４６９；Ｌａｍ  ａｎｄ  Ｃｈｕａ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：４７１）；Ｓｔａｙｔｏｎら（１９９１）Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８：５０７）がある。種子プラスチド中の優先的発現に有用な植物機能性プロモーターとしては、植物の貯蔵タンパク質遺伝子及び脂肪種子中の脂肪酸生合成に関与する遺伝子に由来のプロモーターがある。このようなプロモーターの例は、ナピン（Ｋｒｉｄｌら（１９９１）Ｓｅｅｄ  Ｓｃｉ．Ｒ���ｓ．１：２０９）、ファセオリン、ゼイン、大豆トリプシン阻害物質、ＡＣＰ、ステアロイル−ＡＣＰのデサチュラーゼ及びオレオシンなどの遺伝子に由来の５′調節領域である。種子特異的遺伝子調節は欧州特許第０，２５５，３７８号で検討されている。また、転写活性を促進するため（Ｈｏｆｆｍａｎ，米国特許第５，１０６，７３９号）、または、所望の転写活性と組織特異性とを組合せるために、プロモーターハイブリッドも構築できる。代表的なベクターはしばしば、植物体内で下流のヘテロロガス構造ＤＮＡの転写を指令するプロモーター配列と、任意の非翻訳リーダー配列と、対象タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、植物細胞内で転写を終結させ該タンパク質をコードするｍＲＮＡの３′端にポリアデニレートヌクレオチドを付加すべく機能するポリアデニル化シグナルをコードする３′非翻訳領域とから成り、これらは５′から３′の方向で作用可能に連結されている。更に、考察すべき要因は、ＰｈａＧ  ＰＨＡの生合成に必要な他の酵素の発現のタイミング及び細胞内局在位置である。例えば、キャノーラのような脂肪種子植物で脂肪酸生合成経路が利用されている場合には、ＰｈａＧ発現は種子の白色体または葉の葉緑体をターゲットとして脂肪酸生合成と同時に生じるであろう。
【０１１９】
このようなベクターを植物の原形質体、細胞、カルス組織、葉のディスク、分裂組織、などに導入してトランスジェニック植物を作製するために異なる種々の方法を使用し得る。例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに介在される形質転換、粒子ガンによるデリバリー、マイクロインジェクション、電気穿孔、ポリエチレングリコールに介在される原形質体の形質転換、リポソームに介在される形質転換、などがある（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ（１９９１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｙｈｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：２０５−２２５参照）。一般に、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧのコーディングＤＮＡを含有及び発現する細胞を含むトランスジェニック植物は、前述の方法のいずれかを用いて上述のＤＮＡ構築物によって植物細胞を形質転換させ、形質転換した植物細胞を選択培地で選択し、分化した植物を産生するように形質転換された植物細胞を再生し、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＰｈａＧのコーディングヌクレオチド配列を発現する形質転換植物を選択することによって産生され得る。
【０１２０】
コーディングＤＮＡは、単一形質転換イベント（必要な全部のＤＮＡが同一ベクターに存在する）、同時形質転換イベント（必要な全部のＤＮＡが植物または植物細胞に同時に導入される別々のベクターに存在する）、独立形質転換イベント（必要な全部のＤＮＡが植物または植物細胞に独立に導入される別々のベクターに存在する）、または再形質転換イベント（単一形質転換、同時形質転換または独立形質転換イベントによって得られた形質転換細胞系を形質転換させる）によって導入できる。次いで、従来の繁殖方法を必要に応じて適宜使用し、単一植物に完全経路を組込む。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの細胞中でＰＨＡポリヒドロキシブチレートの産生に成功したことはＰｏｉｒｉｅｒら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：５２０−５２３によって報告されており、そのプラスチド内部で産生に成功したことはＮａｗｒａｔｈら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１２７６０−１２７６４によって報告されている。
【０１２１】
多様な種類の双子葉類を形質転換してトランスジェニック植物を作製する特定の方法は文献に十分に記載されている（Ｇａｓｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｌｅｙ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２９３；Ｆｉｓｋ  ａｎｄ  Ｄａｎｄｅｋａｒ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｔｉａ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ  ５５：５−３６；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ（１９９４）Ａｇｒｏ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｈｉ  Ｔｅｃｈ（１９９４年，３月／４月）ｐ．１７及び該文献に引用された参考文献）。
【０１２２】
単子葉類では以下の植物で形質転換及び植物再生の成功が得られたと報告されている：アスパラガス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ；Ｂｙｔｅｂｉｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：５３４５）；大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒａｅ；Ｗａｎ  ａｎｄ  Ｌｅｍａｕｘ（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：３７）；トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ；Ｒｈｏｄｅｓら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：２０４；Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：６０３；Ｆｒｏｍｍら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：８３３；Ｋｏｚｉｅｌら（１９９３）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１９４）；エンバク（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ；Ｓｏｍｅｒｓら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１５８９）；カモガヤ（Ｄａｃｔｙｌｉｓ  ｇｌｏｍｅｒａｔａ；Ｈｏｒｎら（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．７：４６９）；米（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ，インディカ種及びジャポニカ種を含む；Ｔｏｒｉｙａｍａら（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１０；Ｚｈａｎｇら（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．７：３７９；Ｌｕｏ  ａｎｄ  Ｗｕ（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．６：１６５；Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｗｕ（１９８８）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７６：８３５；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９５７）；ライ麦（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ；Ｄｅ  ｌａ  Ｐｅｎａら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：２７４）；モロコシ類（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ；Ｃａｓｓａｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１２１２）；サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ種；Ｂｏｗｅｒ  ａｎｄ  Ｂｉｒｃｈ（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２：４０９）；ウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ；Ｗａｎｇら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：６９１）；芝草（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｐｕｌｕｓｔｒｉｓ；Ｚｈｏｎｇら（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１３：１）；及び小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ；Ｖａｓｉｌら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：６６７；Ｔｒｏｙ  Ｗｅｅｋｓら（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：１０７７；Ｂｅｃｋｅｒら（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．５：２９９）。
【０１２３】
ＰＨＡポリマーの産生に特に有用な植物としては、ＰＨＡ生合成に使用できる炭素基質を産生するジャガイモ及びテンサイのような植物がある。トウモロコシ、コムギ及びイネのような穀物も好ましい。他の有用な植物としては、タバコ、及び、タイズ、キャノーラ、ナタネ、Ａｒａｂｉｏｄｏｐｓｉｓ種及び落花生のような高脂肪種子植物がある。砂漠及び鉱物質土壌で生育する植物もＰＨＡ産生に使用できる。このようにして産生され得るポリマーの非限定例としては、ＰＨＢ、及び、ＰＨＢ−ＰＨＣコポリマー、ＰＨＣ−ＰＨＯコポリマー、ＰＨＯ−ＰＨＤコポリマーのような短鎖長モノマーと中鎖長モノマーとを組合せたコポリマーがある。
【０１２４】
上記の記載から、本発明の多様な変更が可能であることは明らかであろう。このような変更は本発明の要旨及び範囲から逸脱しないと考えられるべきであり、当業者に自明のこの種の変更のすべてが請求の範囲に包含されると理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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