(57)【要約】【課題】ヒトを含めた被験体での再生医療に用い得る、安全な移植材料を提供する。【解決手段】本発明によれば、上皮系細胞シートの作製において用いる、同種皮膚由来フィーダー細胞が提供される。また、本発明によれば、同種皮膚由来フィーダー細胞を用いて作製された上皮系細胞シート、及び同種皮膚由来細胞をフィーダー細胞として用いる上皮系細胞シートの作製方法が提供される。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮系細胞シートの作製において用いるフィーダー細胞であって、前記上皮系細胞と同種の個体の皮膚に由来する、上記フィーダー細胞。
【請求項２】
前記上皮系細胞に対して自己由来である、請求項１に記載のフィーダー細胞。
【請求項３】
ヒト由来である、請求項１又は２に記載のフィーダー細胞。
【請求項４】
線維芽細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のフィーダー細胞。
【請求項５】
前記上皮系細胞が、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、及び／又は結膜上皮細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のフィーダー細胞。
【請求項６】
同種皮膚由来細胞をフィーダー細胞として用いて培養された、上皮系細胞シート。
【請求項７】
前記皮膚由来細胞が、前記上皮系細胞に対して自己由来である、請求項６に記載の細胞シート。
【請求項８】
前記皮膚由来細胞がヒト由来である、請求項６又は７に記載の細胞シート。
【請求項９】
前記上皮系細胞が、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、及び／又は結膜上皮細胞である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の細胞シート。
【請求項１０】
組織の一部若しくは全部の欠損を伴う疾患又は状態を治療若しくは処置するためのものである、請求項６〜９のいずれか１項に記載の細胞シート。
【請求項１１】
前記疾患又は状態が、角膜上皮幹細胞疲弊症又は屈折矯正手術後の角膜上皮欠損である、請求項１０に記載の細胞シート。
【請求項１２】
同種皮膚由来細胞をフィーダー細胞として用いて上皮系細胞を培養するステップを含む、上皮系細胞シートの作製方法。
【請求項１３】
前記皮膚由来細胞が、前記上皮系細胞に対して自己由来である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記皮膚由来細胞がヒト由来である、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記上皮系細胞が、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、及び／又は結膜上皮細胞である、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上皮系細胞シートの作製において用いるフィーダー細胞に関する。より詳細には、本発明は、上皮系細胞シートの作製において用いる、同種皮膚由来フィーダー細胞に関する。また、本発明は、同種皮膚由来フィーダー細胞を用いて作製された上皮系細胞シート、及び同種皮膚由来細胞をフィーダー細胞として用いる上皮系細胞シートの作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療は、近年とみに研究が進展し、その可能性が注目されている。従来の医療は、臓器障害を可能な限り早期に発見し、その原因の除去及び生体防御反応の制御等を助けることにより、障害を受けた臓器の自然回復を待つ手法を採っていた。しかしながら、一定の限度を超えると、臓器障害は不可逆的となり、自然治癒による臓器の機能回復は困難となる。そのような不可逆的障害を受けた細胞、組織又は臓器を体内で再生するか（ｉｎ ｖｉｖｏ法）あるいは目的とする細胞、組織又は臓器を体外で人為的に再生した後に患者に移植する（ｅｘ ｖｉｖｏ法）ことにより、治療を行う手法が再生医療である。
【０００３】
上記のｅｘ ｖｉｖｏ法では、移植のための細胞又は組織を調製するために、これらを体外で培養することが必要である。再生医療に用いられる細胞又は組織の培養には、多くの場合、フィーダー細胞又はフィーダー層と呼ばれる栄養支持細胞（層）との共培養が必要とされる。従来、このフィーダー細胞として、安定して目的細胞・組織の増殖を支持できるマウス由来線維芽細胞株などが用いられている。しかし、ヒトでの再生医療では、このような異種細胞の使用は、移植材料の外来性感染因子による汚染、及び異種細胞由来の成分による拒絶反応の惹起の可能性などから好ましくない。
【０００４】
そのため、ｅｘ ｖｉｖｏ法での移植材料の調製のために、フィーダー細胞としてヒト由来細胞を用いる試みがなされている。例えば、移植材料として広範な適用が期待されるヒト胚性幹細胞の培養のためのフィーダー細胞として、ヒト成体卵管線維芽細胞及びヒト胎児筋線維芽細胞（特許文献１）、ヒト肺線維芽細胞（特許文献２）、ヒト成体皮膚線維芽細胞（非特許文献１）、並びにヒト骨髄細胞（非特許文献２）を用いることが提案されている。
【０００５】
一方、医療技術の著しい発展により、治療困難となった臓器を他人の臓器と置き換える臓器移植が一般化してきた。対象となる臓器も皮膚、角膜、腎臓、肝臓、心臓等と実に多様となり、術後の経過も格段に改善され、医療の一技術として既に確立されつつある。一例として角膜移植を挙げると、約４０年前に日本にもアイバンクが設立され、移植活動が始められた。しかしながら、いまだドナー数が少なく、日本国内だけでも角膜移植の必要な患者が年間約２万人発生するのに対し、実際に移植治療を行うことができる患者は約１／１０の２千人程度でしかないと言われている。角膜移植というほぼ確立された技術があるにもかかわらず、現状では、ドナー不足という問題のため新たな医療技術の開発が求められている。ドナーの不足によりニーズを満足するだけの移植治療を行うことができない状況は、他の臓器の移植に関してはより深刻である。また、他人の組織又は臓器を移植する場合、周知のとおり、拒絶反応が大きな問題である。
【０００６】
このような背景の下で、以前より、人工代替物又は細胞を培養して組織化させたものを患者に移植する技術が注目されている。その代表的な例として、人工皮膚及び培養皮膚が挙げられる。しかしながら、合成高分子を用いた人工皮膚は、拒絶反応等が生じる可能性があり、移植用材料としては好ましくない。一方で、培養皮膚は、本人の正常な皮膚の一部を必要な大きさまで培養したものであるため、これを使用しても拒絶反応等の心配がなく、最も自然な移植用材料（マスキング剤）といえる。
【０００７】
移植用培養皮膚に関しては、ヒト新生児由来表皮角化細胞をケラチン組織の膜が容器表面上に形成される条件下で培養し、生成したケラチン組織膜を酵素を用いて剥離させることを特徴とする、移植可能な培養細胞膜を製造する方法が提案されている（特許文献３）。具体的には、マウス線維芽細胞株である３Ｔ３細胞をフィーダー層として用いて、播種した表皮細胞を増殖させ、かつ重層化させる。このような方法は、現在では表皮角化細胞を培養する方法の主流となっている。しかしながら、この方法には、上記のように、異種細胞をフィーダー細胞として用いていることに関する問題がある。
【０００８】
この点を解決すべく、これまでに種々の検討がなされてきた。例えば、３Ｔ３細胞の馴化培地を用いて培養基材上で表皮角化細胞を培養する方法が提案されている（特許文献４及び５）。しかしながら、この方法では、異種動物の細胞自体の混入を防ぐことはできるが、馴化培地中に外来性感染因子が混入する危険性は回避することができず、また移植材料中に異種細胞由来の成分が取り込まれることが予想されるため、基本的に同様な問題が残される。
【０００９】
その他に、ヒト由来の細胞をフィーダー層として、組織培養に利用しようとする試みもなされている。例えば、ヒトの皮下脂肪組織由来細胞をフィーダー細胞として用いて、上皮細胞を培養する方法が提案されている（特許文献６）。この方法では、移植材料を患者自身から採取した細胞から調製し、かつ移植材料の調製に用いるフィーダー細胞として同じ患者由来の細胞を用いることができるため、上記のような外来性感染因子による汚染及び異種細胞由来成分の混入の問題は最小限にすることができる。しかしながら、この方法は、ヒトの皮下組織の採取を必要とし、このステップでの侵襲が非常に大きいため、最良の方法であるとは言えない。
【００１０】
【特許文献１】特表２００５−５０３８２２号公報
【特許文献２】国際公開第２００５／０７８０７０号パンフレット
【特許文献３】特公平２−２３１９１号公報
【特許文献４】特開平９−３１３１７２号公報
【特許文献５】特開２００１−１４９０７０号公報
【特許文献６】国際公開第２００５／０３５７３９号パンフレット
【非特許文献１】Ｒｉｃｈａｒｄｓら，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２００３，２１，ｐ．５４６−５５６
【非特許文献２】Ｃｈｅｎｇら，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２００３，２１，ｐ．１３１−１４２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記のとおり、再生医療に用いる移植材料の調製のために、安全かつ入手容易なフィーダー細胞の供給が必要とされている。特に、ヒトでの再生医療での使用のための、ヒト由来移植材料用のヒト自己由来フィーダー細胞であって、現実的に利用可能であるために低侵襲で入手することができるものが求められている。しかしながら、現状では、ヒトでの適用に要求される安全性を満たし、フィーダー細胞として十分に機能し、かつ低侵襲であるという必要な条件をすべて満たすそのようなシステムは開発されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題に鑑み、移植材料として有用な上皮系細胞シートの培養において、ヒト自己由来皮膚細胞をフィーダー細胞として用いるシステムを開発した。本発明で用いる皮膚由来細胞は、極めて侵襲性の低い方法により採取可能である。また、本発明者らが開発したシステムを用いれば、自己由来の移植材料の調製に際して、自己由来の細胞をフィーダー細胞として使用することができるため、外来性感染因子による汚染の危険性、並びに異種細胞由来成分の混入及びそれによる拒絶反応の惹起の危険性を最小限にすることができる。したがって、本発明は、再生医療の実用化において非常に有利である。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下の特徴を有する。
（１）上皮系細胞シートの作製において用いるフィーダー細胞であって、前記上皮系細胞と同種の個体の皮膚に由来する、上記フィーダー細胞。
（２）前記上皮系細胞に対して自己由来である、上記（１）に記載のフィーダー細胞。
（３）ヒト由来である、上記（１）又は（２）に記載のフィーダー細胞。
（４）線維芽細胞である、上記（１）〜（３）のいずれか１つに記載のフィーダー細胞。
（５）前記上皮系細胞が、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、及び／又は結膜上皮細胞である、上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載のフィーダー細胞。
（６）同種皮膚由来細胞をフィーダー細胞として用いて培養された、上皮系細胞シート。
（７）前記皮膚由来細胞が、前記上皮系細胞に対して自己由来である、上記（６）に記載の細胞シート。
（８）前記皮膚由来細胞がヒト由来である、上記（６）又は（７）に記載の細胞シート。
（９）前記上皮系細胞が、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、及び／又は結膜上皮細胞である、上記（６）〜（８）のいずれか１つに記載の細胞シート。
（１０）組織の一部若しくは全部の欠損を伴う疾患又は状態を治療若しくは処置するためのものである、上記（６）〜（９）のいずれか１つに記載の細胞シート。
（１１）前記疾患又は状態が、角膜上皮幹細胞疲弊症又は屈折矯正手術後の角膜上皮欠損である、上記（１０）に記載の細胞シート。
（１２）同種皮膚由来細胞をフィーダー細胞として用いて上皮系細胞を培養するステップを含む、上皮系細胞シートの作製方法。
（１３）前記皮膚由来細胞が、前記上皮系細胞に対して自己由来である、上記（１２）に記載の方法。
（１４）前記皮膚由来細胞がヒト由来である、上記（１２）又は（１３）に記載の方法。
（１５）前記上皮系細胞が、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、及び／又は結膜上皮細胞である、上記（１２）〜（１４）のいずれか１つに記載の方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、公知の方法と比較して極めて低侵襲で同種由来フィーダー細胞を入手することが可能となるため、異種細胞をフィーダー細胞として用いることなく移植材料を調製することが非常に容易になる。すなわち、本発明により、安全な移植材料の入手可能性が画期的に高まり、これは再生医療の普及に対して大きな原動力となり得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は上皮系細胞シートの作製において用いる、同種皮膚由来フィーダー細胞に関する。また、本発明は、同種皮膚由来フィーダー細胞を用いて作製された上皮系細胞シート、及び同種皮膚由来細胞をフィーダー細胞として用いる上皮系細胞シートの作製方法に関する。
【００１６】
一態様において、本発明は、上皮系細胞シートの作製において用いる、同種皮膚由来フィーダー細胞を提供する。
【００１７】
本発明において、「フィーダー細胞」とは、動物組織／細胞から誘導された移植材料の培養において、該移植材料の形成を支援する支持細胞（群）を意味する。本明細書中では、「フィーダー細胞」及び「フィーダー層」との用語は、相互に交換可能に用いられる。通常用いられるフィーダー細胞は、形態及びタンパク質発現などの特徴から線維芽細胞と特徴付けられる細胞からなる。したがって、本発明におけるフィーダー細胞もまた、細胞分類上は線維芽細胞に属する細胞からなるものであり得る。線維芽細胞の特徴は、当業者に周知であるが、例えば、ディッシュ上での培養で紡錘形に近い形態を有すること、コラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質を発現することなどが挙げられる。
【００１８】
移植材料の調製においては、多くの場合、まずフィーダー細胞を構成する細胞を培養基材上に播種し、該細胞を基材に接着させた後、目的とする移植材料のための細胞をその上に播種し、適切な条件下で培養することにより細胞分化／組織形成させる。このとき、フィーダー細胞と移植材料との間には、メンブレン等のさらなる支持材を挿入してもよい。培養を培養ディッシュ上で行う場合には、さらなる支持材は培養インサートの形状となっているのが有利である。目的とする移植材料が上皮系細胞シートである場合、支持材としてカルチャーインサートタイプの温度応答性培養皿（セルシード社から入手可能；Ｈｉｒｏｓｅ，Ｍ．，ら，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０００，１，ｐ．３７７−３８１などを参照されたい）を用いることができる。
【００１９】
本明細書中では、「皮膚細胞」及び「皮膚由来細胞」との用語は、相互に交換可能に用いられ、いずれも、フィーダー細胞を構成する、皮膚組織由来の培養細胞を意味する。上記のとおり、移植材料の培養のためのフィーダー細胞は、通常は線維芽細胞の特徴を有する細胞からなるので、本発明における皮膚由来細胞もまた線維芽細胞の特徴を有する細胞からなるものであり得る。
【００２０】
皮膚から細胞を取得し、培養する方法は当業者に周知であるが、例えば、真皮を含む皮膚組織を直径３ｍｍ程度採取するステップ、採取した皮膚組織から表皮層を除去し、真皮層を得るステップ、真皮層を細切し、適切な培地中に播種し、インキュベートするステップを含む。皮膚組織の採取は、体表面の皮膚を極めて小さな範囲にわたって採取することにより行われ、したがって侵襲が少なく、創傷治癒は早い。しかしながら、ヒトから皮膚組織を採取する場合には、組織採取の部位及び大きさ、並びに術後の痛みについて被験者から予め同意を得る必要がある。皮膚由来フィーダー細胞を培養するために用いる培地は、皮膚由来の線維芽細胞が正常に増殖し得るものであれば特に制約されないが、それを用いて作製した上皮系細胞シートをヒトに使用する場合には、培地成分の由来が明確なもの、又は医薬品としての使用が認められている成分からなるものが望ましい。培地には、該皮膚由来細胞を採取した個体に由来する血清を加えることもできる。
【００２１】
本発明のフィーダー細胞は、上皮系細胞との共培養の前に、２回以上、好ましくは３〜５回継代することができる。好ましくは本発明のフィーダー細胞は、さらに、上皮系細胞との共培養の前に増殖を止めるための処理を施される。該処理とは、限定するものではないが、例えば放射線処理、マイトマイシンＣ処理等を含み、好ましくは放射線処理である。放射線処理は、例えば４０グレイの線量で行うことができる。
【００２２】
上皮系細胞シートの作製のための本発明のフィーダー細胞は、例えば、上記のようにして得た皮膚由来の培養細胞を、増殖を止めるために放射線照射し、適切な密度（例えば、５×１０４〜２×１０５細胞／６０ｍｍディッシュ）で細胞培養ディッシュに播種し、１２〜３６時間インキュベートすることにより調製することができる。
【００２３】
本発明において、「同種」とは、生物学的な分類上、同一の種に属することを意味する。また、同様に「異種」とは、生物学的な分類上、異なる種に属することを意味する。例えば、マウス由来細胞は、ヒトに対して「異種」である。同種由来のフィーダー細胞を用いて上皮系細胞シートなどの移植材料を調製することは、上記のとおり、異種細胞に由来する外来性感染因子、特に人畜共通感染症の原因病原体などによる移植材料の汚染防止につながり、また、移植材料に異種細胞由来成分が混入することによる拒絶反応の惹起を防ぐ。
【００２４】
本発明において「上皮系細胞シート」及び「上皮細胞シート」との用語は相互に交換可能に用いられ、上皮組織に由来する細胞若しくはその子孫、又は上皮細胞に分化させた細胞（以下、単に「上皮系細胞」と記す。）を、フィーダー層を含むか含まない平面状の培養基材上で培養することにより、シート状構造を形成させたものを意味する。個々の上皮組織及び上皮細胞の特徴は標準的な組織学の教科書などに記載されており、当業者は容易に知得することができる。典型的には、上皮組織は、基底層に近い部分では小型の未分化な細胞により構成され、表層に近い部分は分化した比較的大型で扁平な細胞から構成されている。最表部は角化している場合がある。上記のようにシート状構造を形成した上皮系細胞同士は、細胞間接着により十分に接着しており、移植に耐え得る強度を有する。
【００２５】
上皮系細胞シートの作製方法は、当業者には周知であり、国際公開第２００５／０３５７３９号パンフレット及びＮｉｓｈｉｄａ，Ｋ．，ら，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．，２００４，３５１（１２），ｐ．１１８７−１１９６などに詳細に記載されている。例えば口腔粘膜上皮から作製する場合には、限定するものではないが、以下のステップを含むことができる：対象動物の口腔をポビドン・ヨードで消毒し、キシロカイン等で局所麻酔した後、頬粘膜から３ｍｍ平方の粘膜組織を切除するステップ、得られた粘膜組織片にディスパーゼ処理を施し、上皮層を基底膜から剥離するステップ、トリプシン処理などにより、細胞を分散させ、単一細胞懸濁液を調製するステップ、フィーダー層上の細胞培養インサートに口腔粘膜由来細胞を播種するステップ、該細胞を１０〜２０日間、好ましくは１４〜１７日間培養するステップ、及び培養インサートから上皮系細胞シートを回収するステップを含む。上皮系細胞を培養するために用いる培地は、ＫＣＭ培地など、上皮細胞が正常に増殖し得るものであれば特に制約されないが、該細胞から形成される上皮系細胞シートをヒトに使用する場合には、培地成分の由来が明確なもの、又は医薬品としての使用が認められている成分からなるものが望ましい。口腔粘膜は再生能力が高いので、組織採取による傷は瘢痕を残すことなく迅速に治癒する。口腔粘膜組織の採取は、口腔機能に影響を与えないことはもちろん、痛みも軽度である。組織採取後は、鎮痛剤、抗生物質及び消炎剤などを用いた処置を行うことが好ましい。
【００２６】
上皮系細胞シートは、重層化していることが好ましい。ここで「重層化」とは、細胞が何層か重なって肥厚した平面を形成していることを意味する。上皮系細胞シートが重層化している場合、表層に近い細胞は比較的扁平な形状を有し、培養基材に近い側の細胞は丈の高い立方体ないし多面体になっていること、すなわち、生体内に存在する重層扁平上皮の形態に近い形態的特徴を示す。上皮系細胞シートの重層化は、該シートを包埋してブロックを作製し、それを薄切して切片を作製し、該切片をヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）することにより、構造を調べることによって確認することができる。
【００２７】
好ましい実施形態では、本発明の皮膚由来フィーダー細胞は、それを用いて培養される上皮系細胞に対して自己由来である。
【００２８】
本発明において「自己由来」とは、それぞれの細胞が同じ個体に由来することを意味する。例えば、上皮系細胞シート作製のために上皮系細胞を採取した患者自身から、皮膚細胞を採取し、それをフィーダー細胞として用いる場合、該フィーダー細胞は該上皮系細胞に対して「自己由来」である。自己由来の細胞同士は、同一の個体から採取するのであれば、同時期に採取されてもよいし、異なる時期に採取されてもよい。
【００２９】
好ましい実施形態では、本発明のフィーダー細胞はヒト由来である。上記のとおり、本発明のフィーダー細胞とそれを用いて培養される上皮系細胞とは同種由来であるため、該フィーダー細胞がヒト由来であれば、該上皮系細胞もヒト由来である。ヒト由来のフィーダー細胞を用いて調製された上皮系細胞シートは、外来性感染因子による汚染及び異種細胞由来成分による拒絶反応の心配なく、ヒトに対して好適に用いることができる。
【００３０】
特定の実施形態では、上皮系細胞は、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、及び結膜上皮細胞のいずれか、あるいはこれらのうち２つ以上を混合した細胞である。本発明では、上皮細胞は特に口腔粘膜上皮細胞である。これらには、上記の「上皮系細胞」の定義と同様に、角膜上皮、口腔粘膜上皮、又は結膜上皮に由来する上皮細胞、その子孫、又は未分化な細胞からそれらの細胞に分化させた細胞が含まれる。
【００３１】
口腔粘膜上皮細胞を用いて調製された上皮系細胞シートは、無縫合移植術を用いてそれを移植することにより、角膜表面を再構築することができ、重症の両眼性眼表面疾患の治療に有効であることが示されている（Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｋ．，ら、上掲）。
【００３２】
好ましい実施形態では、上皮系細胞シートは、組織の一部若しくは全部の欠損を伴う疾患又は状態を治療若しくは処置するためのものである。そのような疾患としては、眼科疾患、特に角膜疾患、皮膚疾患、消化管疾患、気道疾患、生殖器疾患などが挙げられる。特定の実施形態では、該疾患又は状態は、角膜移植を必要とする角膜疾患又は状態である。例えば、該角膜疾患又は状態は、角膜びらん及び／又は角膜潰瘍を伴うものである。あるいは、該角膜疾患又は状態は、角膜上皮に大きな損傷を伴うものである。そのような疾患又は状態としては、特に、角膜上皮幹細胞疲弊症又は屈折矯正手術後（例えば、ＰＲＫ手術後）の角膜上皮欠損が挙げられる。角膜上皮疲弊症には、熱傷による角膜傷害、薬剤への直接曝露による角膜傷害、スティーブンス・ジョンソン症候群によるものなどが含まれる。代表的にはエキシマレーザーを用いる屈折矯正手術（例えば、ＰＲＫ手術）では、角膜上皮が損傷し、その治癒の過程で角膜の濁り（“ｈａｚｅ”）が生じることがあるため、それを防ぐために角膜上皮損傷の迅速な治癒が求められる。
【００３３】
別の態様では、本発明は、同種由来皮膚細胞をフィーダー細胞として用いて作製された上皮系細胞シートを提供する。該上皮系細胞シートは、典型的には重層化している。好ましくは、該皮膚細胞は、それをフィーダー細胞として用いて培養される上皮系細胞に対して自己由来である。
【００３４】
好ましい実施形態では、上記皮膚細胞はヒト由来である。該皮膚細胞とそれを用いて培養される上皮系細胞とは同種由来であるため、該皮膚細胞がヒト由来であれば、該上皮系細胞もヒト由来である。ヒト由来のフィーダー細胞を用いて調製された上皮系細胞シートは、外来性感染因子による汚染及び異種細胞由来成分による拒絶反応の心配なく、ヒトに対して好適に用いることができる。
【００３５】
特定の実施形態では、上皮系細胞は、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、及び結膜上皮細胞のいずれか、あるいはこれらのうち２つ以上を混合した細胞である。本発明では、上皮細胞は特に角膜上皮細胞又は口腔粘膜上皮細胞である。
【００３６】
好ましい実施形態では、本発明の上皮系細胞シートは、組織の一部若しくは全部の欠損を伴う疾患又は状態を治療若しくは処置するためのものである。そのような疾患又は状態としては、眼科疾患、特に角膜疾患、皮膚疾患、消化管疾患、気道疾患、生殖器疾患などが挙げられる。特定の実施形態では、該疾患は、角膜移植を必要とする角膜疾患又は状態である。例えば、該角膜疾患又は状態は、角膜びらん及び／又は角膜潰瘍を伴うものである。あるいは、該角膜疾患又は状態は、角膜上皮に大きな損傷を伴うものである。そのような疾患又は状態としては、特に、角膜上皮幹細胞疲弊症又は屈折矯正手術後（例えば、ＰＲＫ手術後）の角膜上皮欠損が挙げられる。角膜上皮疲弊症には、熱傷による角膜傷害、薬剤への直接曝露による角膜傷害、スティーブンス・ジョンソン症候群によるものなどが含まれる。代表的にはエキシマレーザーを用いる屈折矯正手術（例えば、ＰＲＫ手術）では、角膜上皮が損傷し、その治癒の過程で角膜の濁り（“ｈａｚｅ”）が生じることがあるため、それを防ぐために角膜上皮損傷の迅速な治癒が求められる。
【００３７】
別の態様では、本発明は、同種皮膚由来細胞をフィーダー細胞として用いる上皮系細胞シートの作製方法を提供する。典型的には、該上皮系細胞シートは重層化している。好ましくは、該皮膚由来細胞は、それをフィーダー細胞として用いて培養される上皮系細胞に対して自己由来である。
【００３８】
好ましい実施形態では、上記皮膚細胞はヒト由来である。該皮膚細胞とそれを用いて培養される上皮系細胞とは同種由来であるため、該皮膚細胞がヒト由来であれば、該上皮系細胞もヒト由来である。ヒト由来のフィーダー細胞を用いて調製された上皮系細胞シートは、外来性感染因子による汚染及び異種細胞由来成分による拒絶反応の心配なく、ヒトに対して好適に用いることができる。
【００３９】
特定の実施形態では、上皮系細胞は、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、及び結膜上皮細胞のいずれか、あるいはこれらのうち２つ以上を混合した細胞である。本発明では、上皮細胞は特に角膜上皮細胞又は口腔粘膜上皮細胞である。
【００４０】
好ましい実施形態では、上皮系細胞シートは、組織の一部若しくは全部の欠損を伴う疾患又は状態を治療若しくは処置するためのものである。そのような疾患又は状態としては、眼科疾患、特に角膜疾患、皮膚疾患、消化管疾患、気道疾患、生殖器疾患などが挙げられる。特定の実施形態では、該疾患は、角膜移植を必要とする角膜疾患又は状態である。例えば、該角膜疾患又は状態は、角膜びらん及び／又は角膜潰瘍を伴うものである。あるいは、該角膜疾患又は状態は、角膜上皮に大きな損傷を伴うものである。そのような疾患又は状態としては、特に、角膜上皮幹細胞疲弊症又は屈折矯正手術後（例えば、ＰＲＫ手術後）の角膜上皮欠損が挙げられる。角膜上皮疲弊症には、熱傷による角膜傷害、薬剤への直接曝露による角膜傷害、スティーブンス・ジョンソン症候群によるものなどが含まれる。代表的にはエキシマレーザーを用いる屈折矯正手術（例えば、ＰＲＫ手術）では、角膜上皮が損傷し、その治癒の過程で角膜の濁り（“ｈａｚｅ”）が生じることがあるため、それを防ぐために角膜上皮損傷の迅速な治癒が求められる。
【００４１】
以下に、実施例により本発明を具体的に説明するが、これにより本発明の範囲が何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４２】
ヒト皮膚由来フィーダー細胞の調製
ヒト皮膚組織から細胞を調製した。ヒト被験者には、組織採取の部位及び大きさ、並びに術後の痛みについて十分に説明し、予め同意を得た。被験者皮膚から、直径３ｍｍのデルマパンチ（ニプロ社製）を用いて、皮膚組織を真皮を含めて採取した。
【００４３】
組織採取後の培養ステップは、すべてクリーンベンチ内で無菌操作により行った。採取した皮膚組織から表皮層を切除し、残った真皮層を細切した。真皮片を培地中に入れ、３５ｍｍディッシュに播種し、培養した。培地は、１０％の被験者由来自己血清を添加したＤＭＥＭ（インビトロジェン社製）に、さらにファンギゾン（ブリストル・マイヤーズ社製）及びゲンタシン（シェリング・プラウ社製）を添加したものを用いた。このようにして得た皮膚由来線維芽細胞の初代培養を、３〜４回継代し、増殖させて、フィーダー細胞とした。得られた細胞は、形態学的な特徴から線維芽細胞であると考えられた。下記の粘膜上皮との共培養の前に、増殖を抑えるために、得られたフィーダー細胞を放射線照射した（４０グレイ）。
【実施例２】
【００４４】
口腔粘膜上皮細胞の調製
ヒト口腔粘膜上皮細胞を調製した。実施例１で皮膚組織を採取したのと同一のヒト被験者から口腔粘膜組織を採取した。口腔粘膜組織採取は、被験者の口腔内をポビドン・ヨードで消毒し、シタネストで局所麻酔を施したあと、頬粘膜から３〜５ｍｍ平方の粘膜組織を切除することにより行った。粘膜組織採取後には、被験者に鎮痛剤、抗生物質及び消炎剤を投与した。
【００４５】
採取した口腔粘膜組織をディスパーゼ（インビトロジェン社製）で処理し（２．４Ｕ／ｍＬ、４℃、４時間）、上皮層を基底膜から剥離した。上皮層をトリプシン・ＥＤＴＡ溶液（インビトロジェン社製）を用いて処理して、細胞層を分散させ、単一細胞懸濁液を得た。
【実施例３】
【００４６】
コロニーアッセイ
実施例１で調製したヒト皮膚由来細胞が、上皮系細胞シート作製のためのフィーダー細胞として機能し得ることを確認するために、コロニーアッセイを行った。対照として、既に上皮細胞シート作製のフィーダー細胞として報告されている（Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｋ．，ら、上掲）ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を用いた。
【００４７】
コロニーアッセイの方法は以下のとおりとした。増殖を抑制するためにともに４０グレイの線量で放射線処理した、実施例１で調製した皮膚由来細胞（２．５×１０４細胞／ｍＬ、１０％自己血清ＤＭＥＭ）及びＮＩＨ／３Ｔ３細胞（１×１０５細胞／ｍＬ、１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ）を６０ｍｍディッシュに播種した（培地：４ｍＬ／ディッシュ）。約２４時間のインキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２）後、実施例２で調製した口腔粘膜上皮細胞３，０００個又は５，０００個を、フィーダー細胞層の上に直接播種し、培養した（培地：ＫＣＭ、３７℃、５％ＣＯ２）。約１０日間培養した後、ホルマリン固定し、ローダミンでコロニーを染色し、コロニー形成率を調べた。
【００４８】
ローダミン染色の結果を図１に示す。コロニー形成率は、直径２ｍｍ以上の細胞集団をコロニーとして目視によりコロニー数を計数し、形成されたコロニー数／播種した口腔粘膜細胞数（％）として算出した。皮膚由来細胞及びＮＩＨ／３Ｔ３細胞をフィーダー細胞として得られたコロニー形成率は、それぞれ１．０％及び２．３％であった。このことから、実施例１で調製した皮膚由来細胞が、既に報告されているフィーダー細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３細胞）と比較して遜色なく、口腔粘膜上皮に対するフィーダー細胞として機能し得ることが示された。
【実施例４】
【００４９】
口腔粘膜上皮シートの作製
口腔粘膜上皮シートの作製方法は以下のとおりとした。増殖を抑制するためにともに４０グレイの線量で放射線処理した、実施例１で調製した皮膚由来細胞（２．５×１０４細胞／ｍＬ、１０％自己血清ＤＭＥＭ）及びＮＩＨ／３Ｔ３細胞（１×１０５細胞／ｍＬ、１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ）を６ウェルプレートに播種した（培地：２ｍＬ／ウェル）。約２４時間のインキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２）後、フィーダー細胞の上に、６ウェルプレート用温度応答性細胞培養インサート（セルシード社製）をセットし、その上に実施例２で調製した口腔粘膜上皮細胞を播種した（２×１０５細胞／ウェル、培地：ＫＣＭ）。上記培養インサートには、温度応答性インテリジェントポリマーがコーティングされており、該ポリマーは３７℃では薄膜状となり、その上での細胞の接着及び増殖を支援するが、３０℃未満に温度を下げると親水化する。これにより、その上で形成された細胞シートを、タンパク質分解酵素による処理などを行うことなく、インタクトなまま回収することができる（特開２００４−２６１５３２号公報；特開平２００６−２６１５３３号公報；Ｈｉｒｏｓｅ，Ｍ．，ら、上掲）。
【００５０】
３７℃、５％ＣＯ２にて培養を開始し、７日後及び１０日後に、播種した口腔粘膜上皮細胞がシートを形成していることが確認された。その後、培養を継続し、１４日後には重層化した上皮細胞シートが得られた。上皮細胞シートの重層化は、位相差顕微鏡での観察によって、例えば、細胞の並び方、焦点の合い具合などから判断することができる。
【００５１】
重層化した上皮細胞シートの回収方法は以下のとおりとした。上皮細胞シートを、培養プレートごと２０℃で３０分間冷却した。培地を静かに吸引し、中心を直径１．５ｃｍの同心円状に切り抜いた直径２．１ｃｍのドーナツ型のフッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレンキャリアを、形成された上皮細胞シートにかぶせた。続いて、上皮細胞シートをキャリアとともに培養インサートから剥離させた。得られた上皮細胞シートは移植等の操作に耐え得る強度を有しているようであった。
【００５２】
形態学的観察
形成された上皮細胞シートについて、形態学的観察を行った。上皮細胞シートをパラフィン包埋し、厚さ方向に薄切し、１０μｍ厚の切片を得た。得られた切片について、常法に従いヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）を施した。結果を図２に示す。皮膚由来細胞をフィーダー細胞として用いた場合（図２、左パネル）とＮＩＨ／３Ｔ３細胞をフィーダー細胞として用いた場合（図２、右パネル）のいずれにおいても、上皮細胞は重層化した細胞シートを形成しており、ここで、基底部には未分化な小型の細胞が観察され、表層には分化した比較的大型で扁平な細胞が観察された。これにより、形成された上皮細胞シートは、いずれのフィーダー細胞を用いた場合でも、正常な上皮様の形態を有することが示された。
【００５３】
免疫組織化学
また、上皮細胞シートについて免疫組織化学的分析を行った。上皮細胞シートをＯＣＴコンパウンドに包埋し、３μｍ厚の凍結切片を得た。得られた切片について、それぞれケラチン３（Ｋ３）（モノクローナル、ＡＥ５、Ｐｒｏｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ）、ケラチン１０（Ｋ１０）（モノクローナル、Ｄａｋｏ）、ＺＯ−１（モノクローナル、ＺＹＭＥＤ）、ｐ６３（モノクローナル、４Ａ４、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びＭＵＣ−１６（モノクローナル、ａｂｃａｍ）に対する抗体を用いて免疫染色を行い、蛍光標識二次抗体により可視化し、蛍光顕微鏡観察により染色像を得た。細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて対比染色されている。結果を図３に示す。角膜上皮に特異的に発現するケラチン３（Ｋ３）は、いずれの上皮細胞シートにおいても強く発現していた（図３、最上段）。角化上皮で発現するケラチン１０（Ｋ１０）は、培養上皮細胞シートでは発現していなかった（図３、２段目）。上皮の幹細胞マーカーであるｐ６３は、いずれの上皮細胞シートにおいても基底部の細胞で発現していたことが見て取れる（図３、３段目）。上皮組織において細胞間に形成されるタイトジャンクションを構成する膜の裏打ちタンパク質であるＺＯ−１は、いずれの上皮細胞シートにおいても最表層の細胞間において検出された（図３、４段目）。上皮細胞に発現する膜貫通型ムチンであるＭＵＣ−１６は、最表層の細胞において検出された（図３、最下段）。以上より、皮膚細胞をフィーダー細胞として形成された上皮細胞シートは、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞をフィーダー細胞として用いた場合とまったく同様のタンパク質発現を示し、これにより、これら２種のフィーダー細胞を用いた上皮細胞シートが互いに機能的に同等であることが示唆された。
【００５４】
シート中に含まれる細胞数
形成された口腔粘膜上皮細胞シートに含まれる細胞数は、異なる２人の被験者から採取した口腔粘膜組織由来細胞について、皮膚由来細胞をフィーダーとして用いた場合、それぞれ８．０×１０５及び８．０×１０５細胞／シート、並びにＮＩＨ／３Ｔ３細胞をフィーダー細胞として用いた場合、１．１×１０６及び１．６×１０６細胞／シートであった。この結果からも、皮膚由来のフィーダー細胞が、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞に対して遜色なく、口腔粘膜上皮細胞シートの形成を支援することが示された。
【００５５】
まとめ
以上より、自己由来皮膚から得たフィーダー細胞は、口腔粘膜上皮細胞からの細胞シートの形成を良好に支援し得ることが示された。上記のとおり、口腔粘膜上皮細胞を用いて作製された細胞シートは、無縫合移植術を用いてそれを移植することにより、角膜表面を再構築することができ、重症の両眼性眼表面疾患の治療に有効であることが示されている（Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｋ．，ら、上掲）。また、屈折矯正手術後の角膜上皮欠損については、ウサギを用いた実験において、フィーダー細胞を用いない系で作製した角膜上皮細胞シートによる処置が有効であることが示されている（Ｈａｙａｓｈｉｄａ，Ｙ．，ら，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，２００６，４７，２，５５２−５５７）。したがって、本実施例において作製された上皮系細胞シートもまた、角膜上皮幹細胞疲弊症等の重症眼疾患の治療及び屈折矯正手術後の角膜上皮欠損の処置に有効であることが予想される。ここで、同種由来、さらには自己由来フィーダー細胞を用いて作製された本実施例の上皮系細胞シートは、異種細胞を用いて作製された既報の細胞シートよりも明らかに有用であることが当業者には容易に理解されるであろう。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明は、安全な移植材料を提供することにより、再生医療及びそのための治療用医薬品の製造などにおいて有用性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】皮膚由来細胞（左パネル）及びＮＩＨ／３Ｔ３細胞（右パネル）をフィーダー細胞として用いた場合の、口腔粘膜上皮細胞のコロニー形成を示す写真である。
【図２】皮膚由来細胞（左パネル）及びＮＩＨ／３Ｔ３細胞（右パネル）をフィーダー細胞として用いた場合の、口腔粘膜上皮細胞からの上皮系細胞シートのＨＥ染色像である。
【図３】皮膚由来細胞（左パネル）及びＮＩＨ／３Ｔ３細胞（右パネル）をフィーダー細胞として用いた場合の、口腔粘膜上皮細胞からの上皮系細胞シートについての種々のタンパク質の発現を表す免疫染色像である。
【図１】
2009225675.tif 000003
【図２】
2009225675.tif 000004
【図３】
2009225675.tif 000005