(57)【要約】【課題】  鶏伝染性気管支炎ウイルスのウイルス様粒子を産生させる方法を提供する。【解決手段】  鶏伝染性気管支炎ウイルスのスパイク蛋白質をコードする遺伝子、エンベロープ蛋白質をコードする遺伝子、メンブレン蛋白質をコードする遺伝子、及びヌクレオカプシド蛋白質をコードする遺伝子を発現するプラスミドＤＮＡを真核細胞に導入して細胞を培養後、培養上清から回収することで伝染性気管支炎ウイルス様粒子が得られる。このウイルス様粒子は、ウイルスではないので、鶏に病気を引き起こす恐れが全く無い安全な組換えコンポーネントワクチンとして機能することが期待される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
鶏伝染性気管支炎ウイルスのスパイク蛋白質をコードする遺伝子、エンベロープ蛋白質をコードする遺伝子、メンブレン蛋白質をコードする遺伝子、及びヌクレオカプシド蛋白質をコードする遺伝子を発現するプラスミドＤＮＡを真核細胞に導入して細胞を培養後、培養上清から回収することを特徴とする伝染性気管支炎ウイルス様粒子の製造法。
【請求項２】
鶏伝染性気管支炎ウイルスのスパイク蛋白質をコードする遺伝子、エンベロープ蛋白質をコードする遺伝子、メンブレン蛋白質をコードする遺伝子、及びヌクレオカプシド蛋白質をコードする遺伝子を発現するプラスミドＤＮＡがＳとＥ蛋白質を発現するプラスミドＤＮＡと、ＮとＭ蛋白質を発現するプラスミドＤＮＡの２種類の混合物である請求項１記載の製造法。
【請求項３】
鶏伝染性気管支炎ウイルスのスパイク蛋白質をコードする遺伝子、エンベロープ蛋白質をコードする遺伝子、メンブレン蛋白質をコードする遺伝子、及びヌクレオカプシド蛋白質をコードする遺伝子を発現するプラスミドＤＮＡが各１つの蛋白質を発現する４種類のプラスミドＤＮＡからなる請求項１記載の製造法。
【請求項４】
プラスミドＤＮＡを導入する真核細胞が、鶏胚繊維芽細胞又は培養細胞ライン株である請求項１〜３のいずれかに記載の製造法。
【請求項５】
培養上清からの回収が、鶏胚繊維芽細胞又は培養細胞ライン株である請求項１〜３のいずれかに記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鶏伝染性気管支炎ウイルス様の粒子を遺伝子組換え技術を用いて産生する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
伝染性気管支炎（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ）は、１９３１年に米国ではじめて報告された、伝染性の激しい呼吸器病である。病原体である鶏伝染性気管支炎ウイルス（以下、「ＩＢＶ」ということがある）に感染した場合に起こる鶏の疾病で、潜伏期間３６時間で呼吸器症状や産卵低下などの産卵障害、さらに腎炎を引き起こす株もある。不顕性感染に終わることも珍しくないが、６週齢以下では致死率は高くなる。組織学的には、気管、腎臓、卵管  等の上皮細胞が変性破壊される。この病気は養鶏産業を営むほとんどの国々で発生、蔓延している。
【０００３】
ＩＢＶはコロナウイルス科に属する１本鎖のＲＮＡウイルスで、外膜を保有している。ウイルス粒子は４つの構造蛋白質を有し、その内３つが外膜を構成するスパイク（Ｓ）蛋白質（糖蛋白質）、メンブレン（Ｍ）蛋白質（糖蛋白質）、エンベロープ（Ｅ）蛋白質であり、もう一つがヌクレオカプシド（Ｎ）蛋白質である。
【０００４】
ＩＢＶは鶏が自然宿主であり、監視伝染病の対象である。多くの血清型が存在すると考えられている。代表的な血清型として、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（通称Ｍａｓｓ）タイプ、Ａｒｋａｎｓａｓ（通称Ａｒｋ）タイプ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ（通称Ｃｏｎｎ）タイプがあるが、血清型と病型の間には明らかな関係は認められていない。
【０００５】
本症には数多くの生ワクチンと不活化ワクチンがあるが、野外で流行しているウイルスとワクチンウイルスとの血清型の違いなどから予防効果は完全ではない。それらは、いずれも、鶏伝染性気管支炎ウイルスを発育鶏卵で増殖させて得たウイルスを原料としており、製造コストの面で発育鶏卵を用いない製造方法が望まれていた。
【０００６】
遺伝子組換え技術の進展により、ＩＢワクチンを遺伝子組換えで製造しようとする試みがなされてきた。古くは、スパイク蛋白質をワクシニアウイルスで発現させた報告（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８７）６８：２２９１−２２９８）がある。しかし、この報告では、接種したマウスのスパイク蛋白質に対する抗体価を上昇させたとあるが、その後、鶏でワクチン効果があったという報告はなされていない。
他にも鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）やヘルペスウイルスをベクターとしてスパイク蛋白質を発現させた文献や特許がある（Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ４６：８３１−８３８（２００２）、米国特許第５３１０６７１号公報、特開平０５−１０３６６７号公報）が、十分なワクチン効果があったという報告はない。また、ＩＢＶのＳとＭ蛋白質をコードする遺伝子を挿入した組換え七面鳥ヘルペスウイルス（以下、「ＨＶＴ」ということがある）の報告がある（米国特許５９６１９８２号公報）が、ワクチン効果のデータはない。
【０００７】
組換えコンポーネントワクチンを作製する試みとしては、大腸菌でＳ蛋白質全長を発現させた報告はなく、我々も部分蛋白しか発現させることができなかった。また、Ｓ蛋白を上で述べたようにウイルスベクターを使って発現させても、Ｓ蛋白質の発現量は少なく、圧倒的に多い宿主−ベクター由来の蛋白質群から精製することは困難であった。
【０００８】
遺伝子組換えワクチンの成功例の多くの報告は、ウイルス様粒子を作らせることで成し遂げられてきた。例えば、エイズウイルス（ＨＩＶ）のウイルス様粒子（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９０）６４：２６５３−２６５９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９６）７０：２６４３−２６４９）ロタウイルスのウイルス様粒子（Ｖａｃｃｉｎｅ  （１９９８）１６：５０７−５１６）、ヒトパピローマウイルス（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９９）６７：３６７４−３６７９）などの例が挙げられる。しかしながら、ＩＢＶに関しては、ウイルス様粒子の形成に成功したという報告はない。
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５３１０６７１号公報
【特許文献２】特開平０５−１０３６６７号公報
【特許文献３】米国特許第５９６１９８２号公報
【００１０】
【非特許文献１】Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６８：２２９１−２２９８（１９８７）
【非特許文献２】Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ４６：８３１−８３８（２００２）
【非特許文献３】Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６４：２６５３−２６５９（１９９０）
【非特許文献４】Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７０：２６４３−２６４９（１９９６）
【非特許文献５】Ｖａｃｃｉｎｅ  １６：５０７−５１６（１９９８）
【非特許文献６】Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ６７：３６７４−３６７９（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上述の従来技術の問題点に鑑みて、鶏伝染性気管支炎ウイルスのウイルス様粒子を産生させるための方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ＩＢＶのスパイク蛋白質をコードする遺伝子、エンベロープ蛋白質をコードする遺伝子、メンブレン蛋白質をコードする遺伝子、及びヌクレオカプシド蛋白質をコードする遺伝子を発現するプラスミドＤＮＡを真核細胞に導入することによって、その培養上清に、ＩＢＶ様の粒子を産生させ、それを回収することを特徴とする伝染性気管支炎ウイルス様粒子の製造法を見出し、本発明を完成したものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の製造法を用いれば、ＩＢＶウイルス様粒子が簡便に製造できる。このウイルス様粒子は、ウイルスではないので、鶏に病気を引き起こす恐れが全く無い安全な組換えコンポーネントワクチンとして機能することが期待される。しかもウイルス様粒子という形状から、従来ワクチン同様の高いワクチン効果を示すことが期待される。
【００１４】
かくして本発明によれば、（１）〜（５）が提供される。
（１）鶏伝染性気管支炎ウイルスのスパイク蛋白質をコードする遺伝子、エンベロープ蛋白質をコードする遺伝子、メンブレン蛋白質をコードする遺伝子、及びヌクレオカプシド蛋白質をコードする遺伝子を発現するプラスミドＤＮＡを真核細胞に導入して細胞を培養後、培養上清から回収することを特徴とする伝染性気管支炎ウイルス様粒子の製造法。
（２）鶏伝染性気管支炎ウイルスのスパイク蛋白質をコードする遺伝子、エンベロープ蛋白質をコードする遺伝子、メンブレン蛋白質をコードする遺伝子、及びヌクレオカプシド蛋白質をコードする遺伝子を発現するプラスミドＤＮＡがＳとＥ蛋白質を発現するプラスミドＤＮＡと、ＮとＭ蛋白質を発現するプラスミドＤＮＡの２種類の混合物である前記（１）記載の製造法。
（３）鶏伝染性気管支炎ウイルスのスパイク蛋白質をコードする遺伝子、エンベロープ蛋白質をコードする遺伝子、メンブレン蛋白質をコードする遺伝子、及びヌクレオカプシド蛋白質をコードする遺伝子を発現するプラスミドＤＮＡが各１つの蛋白質を発現する４種類のプラスミドＤＮＡからなる前記（１）記載の製造法。
（４）プラスミドＤＮＡを導入する真核細胞が、鶏胚繊維芽細胞又は培養細胞ライン株である前記（１）〜（３）のいずれかに記載の製造法。
（５）培養上清からの回収が、鶏胚繊維芽細胞又は培養細胞ライン株である前記（１）〜（３）のいずれかに記載の製造法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下に本発明を詳述する。
プラスミドＤＮＡ
本発明の鶏伝染性気管支炎ウイルスのＳ蛋白質をコードする遺伝子（以下、「Ｓ遺伝子」ということがある）、Ｅ蛋白質をコードする遺伝子（以下「Ｅ遺伝子」ということがある）、Ｍ蛋白質をコードする遺伝子（以下、「Ｍ遺伝子」ということがある）、及びＮ蛋白質をコードする遺伝子（以下、「Ｎ遺伝子」というこｔがある）が真核細胞中で働くプロモーターとともに挿入されたプラスミドＤＮＡの元となるプラスミドは、特に限定されるものではなく、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２７、ｐＢＲ３２８、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ７、ｐＵＣ８、およびｐＵＣ９などのプラスミド、ｐＨＣ７９などのコスミド等を例示することができる。
本発明で、鶏伝染性気管支炎ウイルスのＳ遺伝子、Ｅ遺伝子、Ｍ遺伝子、及びＮ遺伝子を真核細胞中で働くプロモーターとともに挿入するのに用いる方法は、特に限定されないが、元プラスミド中にある制限酵素サイトを利用することが簡便で望ましい。その制限酵素サイトの制限酵素は特に限定されない。
【００１６】
尚、本発明で鶏伝染性気管支炎ウイルスのＳ遺伝子、Ｅ遺伝子、Ｍ遺伝子、及びＮ遺伝子が真核細胞中で働くプロモーターとともに挿入されたプラスミドＤＮＡは、Ｓ遺伝子、Ｅ遺伝子、Ｍ遺伝子、及びＮ遺伝子の４遺伝子を全て一つのプラスミドに含んでいてもよいし、４つの内の１つずつを含む４つの独立したプラスミドＤＮＡの混合物であってもよい。あるいは、異なった二つの遺伝子をそれぞれ含むような２種類のプラスミドＤＮＡの混合物であってもよい。
【００１７】
鶏伝染性気管支炎ウイルス
本発明において、Ｓ遺伝子、Ｅ遺伝子、Ｍ遺伝子、及びＮ遺伝子の由来となる鶏伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）は、細胞・微生物・遺伝子バンクであるＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣなどから有償または無償で入手できるものの他、ＩＢＶ感染鶏から直接得られたものであってもよい。その血清型も特に限定されないが、広く分布していることから、ＭａｓｓタイプかＡｒｋタイプのウイルスが望ましく、特に望ましくはＭａｓｓタイプである。ウイルス株も特に限定されないが、具体的にはＭａｓｓ４１株、ＭａｓｓＨ１２０株、ＡｒｋＤＰＩ株などが挙げられる。
【００１８】
鶏伝染性気管支炎ウイルス由来の蛋白質をコードする遺伝子
鶏伝染性気管支炎ウイルス由来のＳ遺伝子、Ｅ遺伝子、Ｍ遺伝子、及びＮ遺伝子は、上記の鶏伝染性気管支炎ウイルスのゲノムであるＲＮＡから調製されたｃＤＮＡのＳ蛋白質、Ｍ蛋白質、及びＥ蛋白質にそれぞれ該当する遺伝子であれば、特に限定されない。
これらの遺伝子は、ウイルスゲノム由来のｃＤＮＡの配列をそのまま用いることもできるが、相同ベクターへサブクローニングしやすい様に、終止コドンや制限酵素サイトを付加するなど改変して用いても良い。具体的には、Ｓ蛋白質をコードする遺伝子、Ｍ蛋白質をコードする遺伝子、及びＥ蛋白質をコードする遺伝子として、それぞれ配列番号１、３及び５の配列が挙げられる。これらは、Ｍａｓｓ４１株由来の特に好ましい例であるが、これに限定されるものではなく、１又は複数個のアミノ酸が、置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。例えば、Ｍａｓｓ４１株のＳ蛋白質とＡｒｋＤＰＩ株のＳ蛋白質との相同性は８６．６％である。即ち、Ｍａｓｓ４１株の蛋白質との相同性が８５％以上であれば、本願発明に用いることができる。ここで、相同性は、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ）の相同性検索「Ｔｈｅ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ  （ＢＬＡＳＴ）」によって求められる値である。
【００１９】
プロモーター
本発明で用いるプロモーターについては、真核細胞内で機能する（即ち、ｍＲＮＡ合成のためのＲＮＡポリメラーゼを結合させ、転写を促す能力を有する）遺伝子であれば特に限定されない。具体的にはＣｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）プロモーターや、Ｒｏｕｓｅ  Ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）プロモーター、ＳＶ４０  ｅａｒｌｙプロモーターの如く異種ウイルスプロモーター；鶏細胞由来のβ−アクチンプロモーター（鶏β−アクチンプロモーター）；サイトメガロウイルスエンハンサー、ニワトリβ−アクチンプロモーター、ウサギβグロビンのスプライシングアクセプターおよびウサギβグロビン由来のポリＡ配列からなるプロモーターなどの人工ハイブリッドプロモーター（ＣＡＧプロモーター；特開平３−１６８０８７号公報）などが例示される。
【００２０】
鶏伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）様粒子の作製法
鶏伝染性気管支炎ウイルスのＳ遺伝子、Ｅ遺伝子、Ｍ遺伝子、及びＮ遺伝子が真核細胞中で働くプロモーターとともに、挿入されたプラスミドＤＮＡを真核細胞に導入して培養後、その培養上清から鶏伝染性気管支炎ウイルス様粒子を回収する方法で用いる真核細胞は、特に限定されないが、鶏胚繊維芽（ＣＥＦ）細胞のような初代培養細胞や、ヒト胎児腎臓細胞ＨＥＫ２９３、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの株化培養細胞などが例示される。
【００２１】
細胞へのプラスミドの導入方法は、電気穿孔（エレクトロポレーション）法やトランスフェクション試薬など、特に限定されるものではない。導入後の細胞の培養についても、使用する細胞毎に最適な培地や培養時間が異なるので、一概に決めることはできず、予め条件を調べておくのが望ましい。好適な例としては、１×１０８細胞の初代ＣＥＦ細胞に１μｇのプラスミドＤＮＡを電気穿孔法で導入し、培養２日後の培養上清を集め、低速遠心分離（５０００×ｇ、５分）で細胞残渣を沈殿させ、その上清を超遠心分離用のチューブに移して、１０００００×ｇ、１時間の条件で、ウイルス様粒子を回収することができる。
【００２２】
ＩＢＶワクチン
回収したウイルス様粒子を、等張の塩類溶液、緩衝液、組織培養液などの溶媒、例えばＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ）に浮遊し、ワクチン原液を調製する。必要であれば、ワクチン抗原を常用の固定化剤で固定することにより、その立体構造を固定化することもできる。固定化剤としては、例えば、ホルマリン、フェノール、グルタルジアルデヒド、β−プロピオラクトン等があげられる。固定化剤は、ワクチン原液を調製する前に抗原に添加するか、又はワクチン原液に添加することができる。
【００２３】
次に、ワクチン原液を希釈して、ワクチン溶液を調製する。ワクチン原液は、例えば、ＰＢＳを用いて、ワクチン中の抗原量が、抗体産生を誘導して免疫を奏するのに必要な量、例えばタンパク質含量で１〜２０μｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌとなるように希釈する。ワクチン溶液を調製する際に、ワクチンの耐熱性を増強する安定化剤や、免疫原性を高める補助剤としてのアジュバントを添加混合してもよい。安定化剤としては、糖類やアミノ酸類が挙げられ、アジュバントとしては、鉱物油、植物油、ミョウバン、アルミニウム化合物、ベントナイト、シリカ、ムラミルジペプチド誘導体、サイモシン、インターロイキン等が挙げられる。
ワクチン溶液を適当な容量の容器、例えば約０．５〜２０ｍｌ容のバイアルに分注し、密栓・密封した後に、ワクチンとして使用に供する。かかるワクチンは、液状のみならず、分注後に凍結乾燥を行うことにより、乾燥製剤として使用に供することもできる。
このようにして調製されたワクチンの接種方法に特別な制限はなく、初日齢の鶏の頸部皮下に、あるいは孵化前の卵に注射や接種用機器を使って投与することができる。
【実施例】
【００２４】
以下に実施例を挙げて、本発明を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
本発明のプラスミド構築は特に記載がない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ．Ｎ．Ｙ．１９８９）記載の標準的な分子生物学手法を用いて行った。尚、制限酵素断片はアガロースゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製、カタログ番号＃２８７０４）を使って精製した。
【００２５】
１．ＩＢＶ由来のｃＤＮＡの調製
ＩＢＶのＭａｓｓタイプの野外分離株Ｍａｓｓ＃１４（バイオミューン社製）からＲＮＡを以下の様にして回収した。まず、保存してあったウイルス（１チューブ）を超遠心分離チューブに移し、２８ｍｌのＰＢＳを添加して４３２０００×ｇ、１時間の超遠心分離にかけた。遠心分離後、上清を捨て沈殿物に０．６ｍｌのＲＬＴバッファー（ＱＩＡＧＥＮ社製、ＲＮｅａｓｙミニキット、カタログ＃：７４１０４）を加えて２０ゲージ針の注射器でその沈殿物をホモジナイズした。その後、０．６ｍｌの７０％エタノールを加えて混合した。それらを２本のＲＮｅａｓｙ  スピンカラム（上記ミニキットに同梱）にのせて、エッペンドルフ遠心機で１０，０００回転、１５秒間遠心分離した。カラムを通過した液を捨て、カラムに０．７ｍｌのＲＷ１バッファー（上記ミニキットに同梱）をのせて再び１５秒間遠心分離した。更に、０．５ｍｌのＲＰＥバッファー（上記ミニキットに同梱）で２回カラムを洗浄した。その後、エッペンドルフ遠心機で１４，０００回転、１分間遠心分離してカラムに残っている液を除き、カラムを新しいチューブの上に設置して、３０μｌの滅菌水を加えて１０，０００回転１分間遠心して、ＲＮＡを回収した。
【００２６】
回収したウイルスＲＮＡからのｃＤＮＡ合成は、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（インビトロジェン社製、ＲＴ−ＰＣＲキット、カタログ＃：１１９０４−０１８）を用いて以下のようにして行った。回収したＲＮＡ液の８μｌに、ランダムヘキサマーを１μｌ、１０ｍＭｄＮＴＰを１μｌ加えて６５℃で５分間置いた後、氷冷した。これに、１０×ＲＴバッファーを２μｌ、２５ｍＭ塩化マグネシウムを４μｌ、０．１ｍＭ  ＤＴＴを２μｌ、ＲＮａｓｅＯｕｔ液（２００ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ８．４）、５００ｍＭ塩化カリウム）を１μｌ加えて、２５℃に２分間置いた後、酵素Ｓｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＩＩ  ＲＴを１μｌ加えた。２５℃に１０分間置いた後、４２℃で５０分間静置し、７０℃で１５分間、その後４℃に移した。ここにＥ．ＣｏｌｉＲＮａｓｅＨ（２単位／μｌ）を１μｌ加えて、３７℃で２０分間静置した。以上の操作によってＩＢＶウイルスのｃＤＮＡを調製した。
【００２７】
２．ＩＢＶの各蛋白質をコードする遺伝子のクローニング
実施例１で調製したｃＤＮＡをテンプレートとして用い、Ｓ蛋白質をコードする遺伝子のＰＣＲクローニングを実施した。使用したＰＣＲプライマーはＸＢＡ−ＭＡＳＳ−Ｓ（配列番号９）と、ＭＡＳＳ−ＳＡＬ−Ｓ（配列番号１０）で、酵素は、Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製、製品名「ＴＡＫＡＲＡ  Ｅｘ  Ｔａｑ」）を用いた。ＰＣＲの結果、３．５ｋｂｐのＤＮＡが増幅され、ＴＡクローニングベクター（インビトロジェン社、製品名「ＴＯＰＯ  ＴＡ  ＰＣＲ２．１  ミニプレップ」）にメーカー推奨の方法に従ってプローニングした。
得られた形質転換株からミニプレップ法でプラスミドＤＮＡを調整し、制限酵素ＳａｌＩで切断して、アガロースゲル電気泳動で切断パターンを確認した。
その結果からＳ蛋白をコードする遺伝子がクローニングされているプラスミドｐＣＲ２．１−Ｓ（ｍａｓｓ）として２クローン（＃７と＃８）が得られた。
【００２８】
この２クローンを塩基配列解析した。使用したシーケンスプライマーは、市販のＴ７プロモータープライマー（東洋紡績社製、カタログ番号：ＰＲＭ−１０２）とＰ８プライマー（東洋紡績社製、カタログ番号：ＰＲＭ−００８）以外に、Ｍａｓｓ−Ｓ−Ｆ２（配列番号１１）、Ｍａｓｓ−Ｓ−Ｒ２（配列番号１２）、Ｍａｓｓ−Ｓ−Ｆ３（配列番号１３）、Ｍａｓｓ−Ｓ−Ｒ３（配列番号１４）、Ｍａｓｓ−Ｓ−Ｆ４（配列番号１５）、Ｍａｓｓ−Ｓ−Ｆ５（配列番号１６）、Ｍａｓｓ−Ｓ−Ｆ６（配列番号１７）、Ｍａｓｓ−Ｓ−Ｒ４（配列番号１８）、Ｍａｓｓ−Ｓ−Ｒ５（配列番号１９）、Ｍａｓｓ−Ｓ−Ｒ６（配列番号２０）のシーケンスプライマーを使用した。
【００２９】
塩基配列解析の結果、クローン＃８は３，４８９塩基であり、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録されているＭａｓｓ４１株（アクセッション＃：ＡＹ８５１２９５）のＳ遺伝子と比較すると、４塩基（Ｃ１８９６Ｔ、Ａ２２４１Ｇ、Ａ２６７９Ｇ、Ｔ３４４４Ｃ）の変異しかなく、これらは全てアミノ酸が変わらないサイレント変異であることがわかった。クローニングされたＳ蛋白をコードする遺伝子配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００３０】
Ｍ遺伝子とＥ遺伝子のＰＣＲクローニングに使用したプライマーは次の通り。
Ｍ遺伝子のクローニング用ＰＣＲプライマーは、ＸｂａＭＡＳＳ＿Ｍ（配列番号２１）とＭＡＳＳ＿ＭＳａｌ（配列番号２０）、ＰＣＲで増幅させたＤＮＡをＴＯＰＯクローニングベクターにライゲーションして、３つの候補クローン（＃７，１１，１２）をシーケンスしたところ、＃１１のクローンのみ、２箇所にサイレントな塩基の違いがあるだけで、＃１１のクローンはアミノ酸配列がＭａｓｓ４１株と同じであった。
＃１１クローンのＭ遺伝子のＯＲＦは６７８ｂｐ（配列番号３）でアミノ酸配列を配列番号４に示す。このプラスミドをｐＣＲ２．１−Ｍ（ｍａｓｓ）と命名した。
【００３１】
一方、Ｅ遺伝子のクローニングにＰＣＲプライマーＸｂａＭＡＳＳ＿Ｅ（配列番号２３）とＭＡＳＳ＿ＥＳａｌ（配列番号２４）を用いた。こちらもＰＣＲで増幅させたＤＮＡをＴＯＰＯクローニングベクターにライゲーションして、２つの候補クローン得た。ｐＣＲ２．１−Ｅ（ｍａｓｓ）クローン＃４と＃５である。この２クローンは向きが逆であったが同一配列であり、ＧｅｎｅＢａｎｋのＭａｓｓ４１株（ＡＹ８５１２９５）とは、１塩基（１アミノ酸）のみ異なっていた（Ｔ１５７Ｇ、Ｌ５３Ｖ）。Ｅ蛋白質をコードする遺伝子のＯＲＦは３３０ｂｐであり、塩基配列番号５に、アミノ酸配列を配列番号６に示す。
【００３２】
Ｎ遺伝子のクローニングに、ＰＣＲプライマーＢａｍＭａｓｓ−Ｎ−Ｆ（配列番号２５）とＭＡＳＳ−Ｎ−Ｒｓａｌ（配列番号２６）を用いた。こちらもＰＣＲで増幅させたＤＮＡをｐＰＣＲ  Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にライゲーションして、２つの候補クローン得た。ｐＰＣＲ−Ｎ＿Ｍａｓｓ  の＃３クローンと＃７クローンである。シーケンスの結果、＃３のクローンは、ＭａｓｓタイプのＮ遺伝子（１，２３０塩基）であり、データベースにあるＭａｓｓ  ４１  株（ＡＹ８５１２９５）のＮ遺伝子と比較すると、７４０番目と７４１番目の２塩基が異なるのみであった。このクローニングされたＮ蛋白質遺伝子の配列を、配列番号７に示す。
一方＃７のクローンは、＃３と比較して、１塩基（１８７番目のＡ）欠失しており、Ｎ蛋白質アミノ酸がフレームシフトを生じてしまうので、廃棄した。
【００３３】
３．ＩＢＶの各蛋白質をコードする遺伝子が真核細胞中で働くプロモーターとともに挿入されたプラスミドＤＮＡの構築
３−１．ｐ４６ＣｏａＭ（ｍａｓｓ）の作製
米国特許第６６３２６６４号の実施例１に記載されているように七面鳥ヘルペスウイルスＦＣ１２６株（以下、単に「ＨＶＴ」と略す）のＤＮＡを調製した。外来遺伝子を挿入するためのＳｆｉＩ制限酵素サイトを導入するため、２組のＰＣＲプライマーセットとＨＶＴのＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
一つのセットは、ＨＶＴ４５Ｓｐｈ（配列番号２７）と４５ＳｆｉＩＲ（配列番号２８）、もう一つのセットは、４６ＳｆｉＦ（配列番号２９）とＨＶＴ４６Ｘｈｏ（配列番号３０）のセットである。それぞれのＰＣＲ産物（０．４ｋｂｐと０．６ｋｂｐ）が増幅されたのを確認後、その産物を１：１の割合になるように混合し、ＨＶＴ４５ＳｐｈとＨＶＴ４６ＸｈｏのプライマーセットでＰＣＲを再度実施した。
その結果、０．９８ｋｂｐの断片が増幅された。この増幅断片をＳｐｈＩとＸｈｏＩで二重切断して、同じくＳｐｈＩとＸｈｏＩで二重切断したｐＮＺ４５／４６ＳｆｉＩ（米国特許６６３２６６４の実施例２）とライゲーションさせ、ｐ４６Ｓｆｉ（５４９１ｂｐ）を構築した。
【００３４】
合成オリゴヌクレオチドＳｆｉ−ｐｏｌＡ−Ｓａｌ−Ｐｓｔ−Ｓｆｉ−Ｕ（配列番号３１）とＳｆｉ−ｐｏｌＡ−Ｓａｌ−Ｐｓｔ−Ｓｆｉ−Ｌ（配列番号３２）をアニーリングさせて、制限酵素ＳｆｉＩで切断したｐ４６Ｓｆｉにライゲーションしてｐ４６Ｓｆｉ−ｐＡ（５５４３ｂｐ）を作製した。
米国特許第７１５３５１１号に記載されているプラスミドｐＮＺ４５／４６ＢａｃｐＡをＰｓｔＩとＳａｌＩで切断して得た鶏βアクチン（Ｂａｃ）プロモーター断片（１．５７ｋｂｐ）を１．２％アガロースゲルから回収した。プラスミドｐ４６Ｓｆｉ−ｐＡをＰｓｔＩとＳａｌＩで二重切断し、回収したＢａｃプロモーター断片とライゲーションして、ｐ４６Ｂａｃ（７１０１ｂｐ）を作製した。
【００３５】
米国特許第６８６６８５２号の実施例１に記載されたプラスミドｐＧＩＣＯＡをＰｓｔＩとＸｂａＩで二重切断してアガロースゲルから回収したＢａｃプロモーターのコア領域（約３００塩基）を、ｐ４６ＢａｃをＰｓｔＩとＸｂａＩで切断した断片とライゲーションしてｐ４６Ｃｏａ（５８２２ｂｐ）を作製した。
プラスミドｐＣＲ２．１−Ｍ（ｍａｓｓ）をＸｂａＩとＳａｌＩで切断して、アガロースゲルから回収したＭ蛋白質をコードする遺伝子（６７８ｂｐ）を、同じくＸｂａＩとＳａｌＩで二重切断したプラスミドｐ４６Ｃｏａとライゲーションしてｐ４６ＣｏａＭ（ｍａｓｓ）（６５１１ｂｐ）（図１）を作製した。
【００３６】
３−２．ｐ４６ｃｍｖＳ（ｍａｓｓ）の作製
サイトメガロウイルスのＩＥプロモーターは市販プラスミドｐＢＫ−ＣＭＶ（ストラタジーン社；カタログ＃：２１２２０９）から得た。このプロモーター内には、制限酵素ＢｇｌＩの認識サイトが３箇所ある。プラスミド構築にはこのサイトが邪魔になるので、このサイトをつぶす為に４つのプライマーセットを用いたＰＣＲを使ってインビトロ変異を行った。プライマーセットは、（ア）ＰｒＣＭＶ１（配列番号３３）とＰｒＣＭＶ３（配列番号３４）のセット、（イ）ＰｒＣＭＶ４（配列番号３５）とＰｒＣＭＶ５（配列番号３６）のセット、（ウ）ＰｒＣＭＶ６（配列番号３７）とＰｒＣＭＶ２（配列番号３８）のセット、（エ）ＰｒＣＭＶｏ１（配列番号３９）とＰｒＣＭＶＲ１（配列番号４０）のセットである。プラスミドｐＢＫ−ＣＭＶを鋳型にして、この４つのプライマーセットでそれぞれＰＣＲを行い、これらのＰＣＲ産物を混合して、ＰｒＣＭＶ１とＰｒＣＭＶＲ１で２回目のＰＣＲを行って３箇所の塩基配列を変更したＣＭＶプロモーターのＤＮＡ断片（６０４ｂｐ）を産生した。このＣＭＶプロモーターの配列は配列番号４１である。
【００３７】
このＣＭＶプロモーター断片をＰｓｔＩとＸｂａＩで切断し、同じくＰｓｔＩとＸｂａＩで切断したプラスミドｐＵＣ１８ｐｏｌＡＳｆｉ（米国特許第６８６６８５２号）に挿入してｐＧＩＣＭＶ（−）（３３２１ｂｐ）を作製した。ＳＶ４０ポリＡシグナル配列は、ｐＢＫ−ＣＭＶを鋳型としてＰｏｌｙＡ−ＳａｌＫｐｎ（配列番号４２）とＰｏｌｙＡ−ＳｆｉＦ２（配列番号４３）のプライマーセットでＰＣＲ増幅して得、ＳａｌＩとＳｆｉＩで二重切断して回収した断片を、同じくＳａｌＩとＳｆｉＩで二重切断したｐＧＩＣＭＶ（−）とライゲーションしてプラスミドｐＧＩＣＭＶｐＡ（３３５４ｂｐ）を作製した。
【００３８】
ＣＭＶプロモーターからｐｏｌｙＡまでの断片の末端を修飾するため、ｐＧＩＣＭＶｐＡを鋳型としてＰｒＣＭＶ１Ｂｇｌ（配列番号４４）とＰｏｌＡ−ＳｆｉＲ（配列番号４５）のプライマーセットでＰＣＲを行った。９５５ｂｐの増幅産物をＢｇｌＩで切断し、ＳｆｉＩで切断したｐ４６Ｓｆｉに挿入してｐ４６ＣＭＶを作製した。
プラスミドｐＣＲ２．１−Ｓ（ｍａｓｓ）をＸｂａＩとＳａｌＩで二重切断して得た、約３．５ｋｂｐのＳ蛋白質をコードする遺伝子を、同じくＸｂａＩとＳａｌＩで二重切断したｐ４６ＣＭＶとライゲーションして、ｐ４６ｃｍｖＳ（ｍａｓｓ）（図２）を構築した。
【００３９】
３−３．  ｐ４６ＣｏａＥ（ｍａｓｓ）の作製
プラスミドｐＣＲ２．１−ＩＢＶ＿ＥをＸｂａＩ／ＳａｌＩで切断して、アガロースゲルから回収したＥ遺伝子（３３０ｂｐ）を、同じくＸｂａＩ／ＳａｌＩで二重切断したプラスミドｐ４６Ｃｏａとライゲーションして、プラスミドｐ４６ＣｏａＥ（ｍａｓｓ）（図３）を作製した。
【００４０】
３−４．  ｐ４６ｃｍｖＮ（ｍａｓｓ）の作製
プラスミドｐＰＣＲ−Ｎ＿ｍａｓｓをＸｂａＩとＳａｌＩで二重切断して得た、１，２３０ｂｐのＮ遺伝子を、同じくＸｂａＩとＳａｌＩで二重切断したｐ４６ＣＭＶとライゲーションして、ｐ４６ｃｍｖＮ（ｍａｓｓ）（図４）を構築した。
【００４１】
３−５．ｐ４６ＣｏａＭｃｍｖＮの作製
ｐ４６ｃｍｖＮ（ｍａｓｓ）を制限酵素ＢｇｌＩで切断後、アガロースゲルから回収した約２．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＳｆｉＩで切断したｐ４６ＣｏａＭ（ｍａｓｓ）とライゲーションして、プラスミドｐ４６ＣｏａＭｃｍｖＮ（図５）を作製した。
【００４２】
３−６．ｐ４６ＣｏａＥｃｍｖＳの作製
ｐ４６ｃｍｖＳ（ｍａｓｓ）を制限酵素ＢｇｌＩで切断後、アガロースゲルから回収した約４．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＳｆｉＩで切断したｐ４６ＣｏａＥ（ｍａｓｓ）とライゲーションして、プラスミドｐ４６ＣｏａＥｃｍｖＳ（図６）を作製した。
【００４３】
４．プラスミドＤＮＡの真核細胞へのトランスフェクション
鶏胚繊維芽（ＣＥＦ）細胞をＬＭ（＋）培地（４％牛血清を含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５とＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ  Ｍｅｄｉｕｍ（ともにＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製、カタログ番号＃４１３００−０３９、＃２１５００−０６１）を同容量比で混合した培地）とともに培養シャーレにまき、シート状になった初代細胞をトリプシン消化して、シャーレから剥し、遠心分離して回収した細胞を新鮮な培養培地に懸濁後、１ウェル当たり２ｍｌづつ、６穴プレートに撒いてＣＯ２インキュベーター内で３７℃、一晩培養して、セカンダリー細胞を準備した。次の日にトランスフェクション試薬（リポフェクタミン２０００：インビトロジェン社製、カタログＮｏ．：１１６６８−０１９）を使って、試薬に添付されたプロトコルに従って、表１に示す各々のプラスミド０．４μｇを各１ウェルのＣＥＦ細胞に導入した。ＣＯ２インキュベーターにて３時間以上培養後、ＬＭ（＋）培地５００ｕｌ／ｗｅｌｌに置換して、一晩培養した。
次の日にＰＢＳにて２回細胞を洗浄後、−２０℃のエタノールを５００μｌ／ｗｅｌｌ加えて、室温で５分間放置した。この後ＰＢＳにて２回洗浄し、一次抗体と反応させた。一次抗体として用いたのは（１）ＩＢＶの血清型Ｍａｓｓ株に対するモノクローナル抗体１５８８（コーネル大学より分与された。参考論文はＡｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ（１９９２）３６：９０３−９１５）、（２）ＩＢＶ血清型Ｍａｓｓ株で過免疫した鶏血清（ＳＰＡＦＡＳ社製）、（３）プラスミドｐＧＥＸ−６Ｐ−３（アマシャムバイオサイエンス社製、カタログＮｏ．２７−４５９９−０１）を使って大腸菌で発現させたＭ蛋白質の９７番目から２２５番目までの領域の組換え蛋白を鶏に免疫して得た鶏血清（抗Ｍ蛋白質鶏血清）、（４）同じ大腸菌発現ベクターを使って、Ｎ蛋白質の３１４番目から４０９番目までの領域の組換え蛋白を鶏に免疫して得た鶏血清（抗Ｎ蛋白質鶏血清）を用いた。３７℃で１時間放置後、ＰＢＳで２回洗浄し、２次抗体として５０００倍稀釈したビオチン化抗マウスＩｇＧ（ベクターラボラトリー社製、カタログＮｏ．ＢＡ−９２００）又はビオチン化抗鶏ＩｇＧ抗体（同社、ＢＡ−９０１０）と反応させた。再び１時間放置後、ＰＢＳで２回洗浄し、ＡＢＣ−ＡＬＰ（ベクターステイン社製、ＡＫ−５０００）液で３０分間放置した。ＰＢＳ洗浄後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ロッシュダイアゴノスティックス社製、カタログＮｏ．１１６８１４５１００１）にて発色させた。検鏡しながら反応の進行を確認し、呈色反応は試薬を捨てて水に置換して停止させた。
【００４４】
表１に示すようにＭ蛋白質とＮ蛋白質とを発現するプラスミドｐ４６ＣｏａＭｃｍｖＮと、ＳとＥ蛋白を発現するプラスミドｐ４６ＣｏａＥｃｍｖＳの二つのプラスミドをＣＥＦ細胞にトランスフェクトした場合のみ、Ｓ蛋白質に対するモノクローナル抗体（１５８８）と反応した。１５８８は血清特異的なモノクローナル抗体であるとともに、ウエスタンブロットでは反応しないことから、Ｓ蛋白質の立体構造を認識していると考えられている（Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ（１９９２）３６：９０３−９１５）。このモノクローナル抗体に反応したということは、二つのプラスミドのコトランスフェクションによって発現するＳ蛋白質は立体構造上、ＩＢＶのＭａｓｓ株のＳ蛋白質と類似した構造をとっていることを示唆している。ｐ４６ＣｏａＥｃｍｖＳ（ｍａｓｓ）単独や、ｐ４６ｃｍｖＳ（ｍａｓｓ）では、そのようなＳ蛋白質の立体構造はとれないということがわかった。
【００４５】
【表１】
2009225735.tif 000002
【００４６】
５．ＩＢＶ用粒子の確認
ＣＥＦ細胞を直径１５ｃｍの培養シャーレにまき、シート状になった初代細胞をトリプシン消化して、シャーレから剥し、遠心分離して回収した細胞（１×１０７ｃｅｌｌｓ）をＭＥＦ−１バッファー（アマクサバイオシステムズ社製、カタログＮｏ．ＶＰＤ−１００４）０．１ｍｌに懸濁し、表２に示す各プラスミド０．５μｇを加えて、エレクトロポレーションキュベット（０．２ｃｍ  ｇａｐ）に移し、機械（アマクサバイオシステムズ社製、製品名「Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ」）に設定されたプログラムＡ−２３でエレクトロポレーションしてプラスミドを細胞に導入した。その後、細胞をＬＭ（＋）培地２０ｍｌで懸濁して１５ｃｍディッシュにまいて３７℃、ＣＯ２インキュベーターで２晩培養した。
２日後、培地を回収して、低速遠心で、細胞残渣を除き、その上清を超遠心分離機で１００，０００×ｇで１時間遠心分離する。沈殿物をＰＢＳで洗浄後、レムリバッファー（２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、６２．５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ６．８）、５％２−メルカプトエタノール、０．００２５％ブロムフェノールブルー）で０．１ｍｌに懸濁して、その液を１ｍｌシリンジ（ニプロ社製、２６ＧＸ１／２ＳＢスベルクリン）に何度も通したのち、煮沸してＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルとした。１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで各サンプルを泳動したあと、ウエスタンブロットして、蛋白をナイロンメンブレンに移した。
そのメンブレンを実施例４と同様に、表２に示す３種類の鶏血清をそれぞれ一次抗体として反応させ発色させた結果、ｐ４６ＣｏａＭｃｍｖＮとｐ４６ＣｏａＥｃｍｖＳの二つのプラスミドを導入した細胞培養上清からの沈殿物のみ、約１００ｋＤａのＳ蛋白質、２５ｋＤａのＭ蛋白質、及び５０ｋＤａのＮ蛋白質のバンドが認められ、それ以外はすべてネガティブであった（表２）。
【００４７】
【表２】
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【００４８】
６．ＩＢＶ用粒子の製造
ＣＥＦ細胞を直径１５ｃｍの培養シャーレにまき、シート状になった初代細胞をトリプシン消化して、シャーレから剥し、遠心分離して回収した細胞（１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ）をＭＥＦ−１バッファー（アマクサバイオシステムズ社製、カタログＮｏ．ＶＰＤ−１００４）０．１ｍｌに懸濁し、０．５μｇのプラスミドｐ４６ＣｏａＭｃｍｖＮと同じく０．５μｇのプラスミドｐ４６ＣｏａＥｃｍｖＳを加えて、エレクトロポレーションキュベット（０．２ｃｍ  ｇａｐ）に移し、機械（アマクサバイオシステムズ社、製品名「Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ」）に設定されたプログラムＡ−２３でエレクトロポレーションしてプラスミドを細胞に導入した。その後、細胞をＬＭ（＋）培地２０ｍｌで懸濁して１５ｃｍディッシュにまいて３７℃、ＣＯ２インキュベーターで２晩培養した。
２日後、培地を回収して、低速遠心（５００×ｇ、２０分間）で細胞残渣を除き、その上清を１００，０００×ｇ、１時間の条件で超遠心分離した。その沈殿物を２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）１ｍｌに懸濁し、その懸濁液を３０％（ｗ／ｗ）及び１０％蔗糖を含む２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）各２ｍｌの上に乗せ、超遠心分離機で１００，０００×ｇで１時間遠心分離した。二つのレイヤー層の間の画分をパスツールピペットで遠心チューブから注意深く回収した。これがＩＢＶウイルス様粒子である。
【００４９】
この画分から１０μｌのサンプルを抜き出し、レムリバッファー０．１ｍｌに加えてその液を１ｍｌシリンジ（ニプロ社製、２６ＧＸ１／２ＳＢスベルクリン）に何度も通したのち、煮沸してＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルとした。１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで各サンプルを泳動したあと、ウエスタンブロットして、蛋白をナイロンメンブレンに移した。
そのメンブレンを実施例５と同様に、表２に示す３種類の鶏血清をそれぞれ一次抗体として反応させ発色させた結果、１００ｋＤａのＳ蛋白質、約２５ｋＤａのＭ蛋白質、及び５０ｋＤａのＮ蛋白質蛋白質のバンドが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、プラスミドｐ４６ＣｏａＭ（ｍａｓｓ）の模式図である。
【図２】図２は、プラスミドｐ４６ｃｍｖＳ（ｍａｓｓ）の模式図である。
【図３】図３は、プラスミドｐ４６ＣｏａＥ（ｍａｓｓ）の模式図である。
【図４】図４は、プラスミドｐ４６ＣｏａＭｃｍｖＳ（ｍａｓｓ）の模式図である。
【図５】図５は、プラスミドｐ４６ＣｏａＭｃｍｖＮの模式図である。
【図６】図６は、プラスミドｐ４６ＣｏａＥｃｍｖＳの模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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