(57)【要約】【課題】  本発明は、合胞体形成阻害活性を有する抗ＨＩＶ薬であって単純なアクチノヒビン２量体よりも水に昜溶性であって優れた安定性を有する抗ＨＩＶ効果を高めた抗ＨＩＶ薬の提供を目的とする。【解決手段】３つのセグメントからなるアクチノヒビンにおいて各セグメントの糖鎖結合ポケットのアミノ酸配列を共通になるように改変した改変アクチノヒビン２分子をリンカーを介してまたは介さずに結合させた改変アクチノヒビン２量体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
３つのセグメントからなるアクチノヒビンにおいて各セグメントの糖鎖結合ポケットのアミノ酸配列を共通になるように改変した改変アクチノヒビン。
【請求項２】
請求項１に記載の改変アクチノヒビン２分子をリンカーを介してまたは介さずに結合させた改変アクチノヒビン２量体。
【請求項３】
(a)配列番号１で表されるポリペプチド、および／または
(b)(a)のアミノ酸配列中の１個または複数個のアミノ酸が置換もしくは欠失され、または付加されてなる合胞体形成阻害活性を有するホモログ
を５０個以下のリンカーで連結したものである請求項２記載の改変アクチノヒビン２量体。
【請求項４】
前記改変アクチノヒビン２量体と少なくとも１種の他のポリペプチドとの融合タンパク質。
【請求項５】
前記少なくとも１種の他のポリペプチドがHisタグ・Metを含む請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記リンカーがＧＧＧＳで表されるペプチド鎖のモノマー(monomer)、ダイマー(dimer)またはトリマー(trimer)である請求項２〜５のいずれかに記載の改変アクチノヒビン２量体またはこれを含む融合タンパク質。
【請求項７】
融合タンパク質が、Hisタグ−Met、配列番号１のポリペプチド、請求項６に挙げるリンカー、配列番号１のポリペプチドをこの順で結合したものである請求項５または６に記載の改変アクチノヒビン２量体を含む融合タンパク質。
【請求項８】
請求項２〜７のいずれかに記載の改変アクチノヒビン２量体または融合タンパク質を含むことを特徴とする抗ＨＩＶ(ヒト免疫不全ウイルス)薬。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載の改変アクチノヒビン、改変アクチノヒビン２量体または融合タンパク質をコードする塩基配列またはその相補鎖。
【請求項１０】
請求項９に記載の塩基配列を宿主細胞に導入した形質転換体。
【請求項１１】
宿主細胞が大腸菌または酵母である請求項１０に記載の形質転換体。
【請求項１２】
宿主細胞がEscherichia coli BL21(DE3)plysSである請求項１１に記載の形質転換体。
【請求項１３】
宿主細胞がPichia pastoris X-33、GS115またはKM71Hである請求項１１に記載の形質転換体。
【請求項１４】
請求項１０〜１３のいずれかに記載の形質転換体を培養して形質転換体内または培養物中に前記１〜７のいずれかに記載の改変アクチノヒビン、改変アクチノヒビン２量体またはこれを含む融合タンパク質を産生させ、これを単離することを含む請求項８に記載の抗ＨＩＶ薬の製造方法。
【請求項１５】
請求項５に記載の融合タンパク質を産生させ、さらにこれを７０％ギ酸中での臭化シアン処理する化学的な切断法によりHisタグ-Met-X結合を除去することを含む請求項１４に記載の抗ＨＩＶ薬の製造方法。
【請求項１６】
請求項７に記載の融合タンパク質を産生させ、さらにこれを７０％ギ酸中での臭化シアン処理する化学的な切断法によりHisタグ-Met-X結合を除去することを含む請求項１５に記載の抗ＨＩＶ薬の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変アクチノヒビン、その２量体、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ: human immunodeficiency virus)感染症に有効な抗ウイルス薬、特に、抗ＨＩＶ薬剤耐性ウイルスに有効な改変アクチノヒビン２量体およびその誘導体、この改変アクチノヒビン２量体およびその誘導体をコードするＤＮＡ、このＤＮＡを用いて形質転換した形質転換体および前記抗ＨＩＶ薬の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
AIDSはＨＩＶにより引き起こされるウイルス感染症であり、人類が直面した最も悲惨な疾患である。国連合同エイズ計画(UNAIDS)の報告によれば、2007年末には地球上で3320万人がＨＩＶに感染していると推定されている。そして毎年新たに250万人がＨＩＶ感染し、AIDS患者のうち年間210万人が死亡している。
【０００３】
AIDSは1981年米国で同性愛者が最初に患者として報告されて以来、80年代は「死の病」として恐れられた。しかし、1987年にグラクソ・スミスクライン社のジドブジン(AZT;  ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤)が上市されて以来、適切な治療を受ければ延命できるようになり、現在までに２０数種の治療薬が上市されている。
【０００４】
ＨＩＶおよびAIDSに対する治療薬としては、現在、逆転写酵素阻害剤とプロテアーゼ阻害剤の抗ＨＩＶ薬が使用されている。逆転写酵素阻害剤としてヌクレオシド系と非ヌクレオシド系があるが、前者は長期投与によって重篤な副作用を生じる。一方後者の副作用は少ないが、作用の特異性が高いために耐性変異ウイルス株が早期に出現する。プロテアーゼ阻害剤は単独でも良好な抗ウイルス活性を示すが、その効果は一時的で且つ体内での安定性や消化器障害などの点で問題がある。全般的に、抗ＨＩＶ薬を単独で長期間使用するとその薬剤に対する耐性変異ウイルス株が高頻度で出現する。
【０００５】
最近、ＨＩＶ患者のAIDS発症を遅らせる治療法として複数の薬剤を組み合わせた多剤併用療法が推奨され効果を挙げている。しかし、多剤耐性変異ウイルス株の出現や長期投与による副作用の問題は依然残されている。また、多剤併用療法によってウイルスの増殖は抑制されるが、ウイルス感染細胞を完全に消滅することは不可能である。
【０００６】
これらの現状からＨＩＶ感染患者の完治や健常者へのＨＩＶ感染予防策は未解決のまま残されている。そして既存の抗ＨＩＶ薬が効かない多剤耐性ＨＩＶの出現は、先進国、発展途上国ともに深刻な脅威になっている。AIDS撲滅のためには既存の治療薬とは全く異なる作用機序の新規抗ＨＩＶ薬と効果的なワクチンの開発が急務である。しかし、多くのワクチンで臨床試験が行われてきたが、成功した例は皆無であり現在再度ＨＩＶに関する基礎研究が重視され、有効なワクチン開発までには長期の時間が必要とされている。
【０００７】
したがって、ＨＩＶ感染防止とＡＩＤＳ発症予防のためには、逆転写酵素阻害剤やプロテアーゼ阻害剤に加えて既存の治療薬以外の部位をターゲットにした全く作用機序の異なる抗ＨＩＶ薬の開発が望まれている。
【０００８】
ＨＩＶの感染は、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質であるglycoprotein１２０（ｇｐ１２０）と宿主細胞表面の受容体であるＣＤ４との結合を介して、宿主細胞に接着して細胞内へ侵入することにより成立すると考えられていた。そこで、ｇｐ１２０とＣＤ４の結合を阻害する物質はＨＩＶと標的細胞の接着を阻害し、ＨＩＶの感染を防御できると期待されるためｇｐ１２０とＣＤ４との結合を阻害する試みがなされた。一例として、可溶性のＣＤ４を遺伝子工学的に作成して、ヒトの体内に投与するような試みなども行われた。しかしながら、このような方法では試験管内では阻害活性が認められるものの、生体内では半減期が短いなどの理由で抗ＨＩＶ活性は認められなかった。また、ヒトのＣＤ４をマウスの細胞に発現させても感染が起こらないことが明らかになり第２の接着分子の存在が示唆されていた。
【０００９】
近年、この第２の受容体が、一群のケモカイン受容体であるという報告が相次いだ。ＨＩＶは、マクロファージ指向性を示す株（Ｍ−トロピックＨＩＶ）とＴ細胞株指向性を示す株（Ｔ−トロピックＨＩＶ）の二種類に大別されるが、これらのウイルス株間に見られる細胞指向性の差が、第２受容体の分子種の違いによることが示された。すなわち、標的細胞が第２受容体としてＣＣケモカイン受容体５（ＣＣＲ５：Ｍ−トロピックＨＩＶ受容体）またはＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４：Ｔ−トロピックＨＩＶ受容体）のいずれかを発現しているかの違いにより決定されることが明らかになった。
【００１０】
このような新たな知見から現在、ＨＩＶの標的細胞への接着・侵入様式は次のように考えられている。まず、ｇｐ１２０とＣＤ４が結合し、続いて宿主細胞のケモカイン受容体ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４と結合する。これにより前駆体ｇｐ１６０からプロテアーゼで切断されたglycoprotein４１（ｇｐ４１）が裸出し、ＨＩＶ膜と宿主細胞膜が融合することによりＨＩＶの宿主細胞への接着・侵入感染が成立する。また、該当するケモカインはＨＩＶのケモカイン受容体への結合を競合的にブロックし、ＨＩＶの感染を抑制する。この一連の発見はＨＩＶ感染機序の解明を加速しただけでなく、抗ＨＩＶ薬開発戦略にも新たな視点を提供した。
【００１１】
こういった背景から、本発明者らは、この感染様式を試験管内実験系で再現する試験評価システム（合胞体形成阻害活性試験系）の構築に着手した。ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質複合体ｇｐ１２０／ｇｐ４１はウイルスと細胞膜との融合（接触・侵入）を仲介している。この融合は、ｅｎｖ発現細胞とＣＤ４＋細胞の間にも起こる。
【００１２】
これら細胞と細胞との融合はＨＩＶ−１の細胞感染に非常に類似している。Ｔ−細胞およびＭ−トロピックＨＩＶ−１はＣＤ４に加えて第２受容体として各々、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４とＣＣＲ５を要求するので、発明者らは、Ｔ−およびＭ−トロピックＨＩＶ−１のエンベロープ糖タンパク質遺伝子をもった二つのエンベロープ発現（env‐expressing）細胞系の構築と、さらに、形成された合胞体を比色法で測定するために、ｅｎｖ発現細胞には転写活性化タンパク質（Ｔａｔ）遺伝子を導入し、受容体発現細胞にはＬａｃ−Ｚ遺伝子にリンクしたＬＴＲ（末端反復配列）とベータガラクシダーゼ遺伝子を導入した。このようにしてＴ−トロピック合胞体形成用にＨｅＬａ／Ｔ−ｅｎｖ／ＴａｔおよびＨｅＬａ／ＣＤ４／Ｌａｃ−Ｚ（ＨｅＬａ細胞は元々ＣＸＣＲ４を持っている）を、Ｍ−トロピック用にＨｅＬａ／Ｍ−ｅｎｖ／ＴａｔおよびＨＯＳ／ＣＤ４／ＣＣＲ５／Ｌａｃ−Ｚ系を確立した。
【００１３】
本法は感染性のあるウイルス粒子などを使用しないことから、生物危害（バイオハザード）の恐れもなく、簡単で検出感度の優れた方法を世界で初めて確立した（H.Chiba, S.Asamura, M.Okamoto, J.Inokoshi, H.Tanaka, K.Fujita and
S.Omura, A simple screening system for anti‐HIV drugs : syncytium formation
assay using T-cell line tropic and macrophage tropic HIV env express cell
lines-Establishment and validation-J.Antibiot.,54, 818-826(2001)）。
【００１４】
最初に、当該試験システムの有用性評価（バリデーション）を行い、抗ＨＩＶ薬のスクリーニングに有効であることを立証した。次いで、上述の作用機序を有する抗ＨＩＶ薬を得る目的でエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ１２０、ｇｐ４１）を発現したＨｅＬａ細胞とＣＤ４およびＣＸＣＲ４を発現したＨｅＬａ細胞との融合による合胞体形成を阻害する物質を微生物の生産する代謝産物の中から探索した。８，０００株以上の放線菌、真菌、バクテリアをスクリーニングした結果、アクチノヒビン（Actinohivin）と名付けた抗ＨＩＶ活性を有する有望な合胞体形成阻害活性物質を新たに土壌から分離した放線菌Ｋ９７−０００３株（１９９８年１２月９日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国、３０５−８５６６、茨城県つくば市東１丁目１番地中央台６）に寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６７０として寄託）の培養液から発見した（特許文献１：国際公開第００／５２０４３号パンフレット）。
【００１５】
アクチノヒビンは低分子量のタンパク質であり、一次構造の決定により１１４アミノ酸残基からなり、分子量は１２，５２４であることが判明した。アクチノヒビンと既存タンパク質または既知の塩基配列の翻訳産生物との間で、配列の類似性をデータベースで検索した結果、同一のタンパク質および同一の塩基配列物質は存在せず、新規の化合物であることが明らかになった。
【００１６】
アクチノヒビンの遺伝子は、当該Ｋ９７−０００３株からクローニングした。このアクチノヒビンの遺伝子を大腸菌で発現し、組換体（リコンビナント）アクチノヒビンの生産系を確立した。組換体アクチノヒビンは天然型アクチノヒビンと同等の合胞体形成阻害活性を示した。
【００１７】
さらに、試験管内実験系で抗ＨＩＶ活性を検討した結果、アクチノヒビンはＨＩＶ−１ならびにＨＩＶ−２の各種ウイルスに対しても既知の抗ＨＩＶ薬に比較して極めて低い濃度で抗ウイルス効果を発揮した。
【００１８】
アクチノヒビンのＨＩＶに対する作用機序の解析から、アクチノヒビンはＨＩＶエンベロープ糖タンパク質gp120の高マンノース型糖鎖と結合することでＨＩＶの接着・侵入を阻害する。さらに、アクチノヒビンの抗ＨＩＶ活性はgp120上の糖鎖数、特にアクチノヒビンが標的とする高マンノース型糖鎖数に依存することが明らかになった。この裏付けとしてアクチノヒビンは、糖鎖数の少ないＨＩＶ株（アクチノヒビン非感受性株）に対して殆ど抗ＨＩＶ活性を示さない。
【００１９】
そこで、これらの糖鎖数の少ないＨＩＶ株に対しても活性を示すアクチノヒビン変異体を創製する目的で糖鎖結合部位を増やしたアクチノヒビン２量体の作製を大腸菌による組換体アクチノヒビンの生産系を応用して行った。アクチノヒビンを２量体とする上で２分子を直結すると活性が低下または失われることから適切なリンカーを選択し、さらに生成物の精製収率向上を目的に融合タンパク質(Hisタグ−TEVプロテアーゼ認識部位)を結合させたHis-TEVプロテアーゼ認識部位−アクチノヒビン２量体(His-TEV-AH２量体 RTB/L)を作製した（特許文献２：国際公開第２００６／０５９６３８号パンフレット、特許文献３：特願2006−323043）。
【００２０】
【特許文献１】国際公開第２０００／５２０４３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００６／０５９６３８号パンフレット
【特許文献３】特願2006−323043
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明は、合胞体形成阻害活性を有する抗ＨＩＶ薬であって特許文献２，３のアクチノヒビン２量体よりも水に昜溶性であって優れた安定性を有する抗ＨＩＶ効果を高めた抗ＨＩＶ薬の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
アクチノヒビンは１１４アミノ酸残基で構成され、分子内に３８アミノ酸残基からなる互いに相同性の高い領域を３個持つ (１〜３８：セグメント１（segment 1）、３９〜７６：セグメント２(segment 2)、７７〜１１４：セグメント３(segment 3))。そして、各セグメントの中央およびＣ末付近に
LD モチーフとQXW モチーフと呼ばれる保存された配列が存在する (表１)。
【００２３】
このように、分子内に３つ (あるいは３の倍数個) のセグメントを持つことと、特定のアミノ酸配列 (LD及びQXWモチーフ) を持つという２つの特徴から、アクチノヒビン（以下、AHで略すこともある。）はcarbohydrate binding module
family 13 (CBM13) に属すると考えている。ちなみに、CBM は現在40 種くらいのファミリーが存在し、特定のアミノ酸配列で分類されている。
【００２４】
CBM13 の特徴として、三個のセグメントが三つ葉のクローバー型に配置され、各セグメントのLD(Leu-Asp) モチーフのD とQXW(Gln-X-Trp)モチーフのQ の側鎖が水素結合で結合し、LD とQXWの間の配列がループ状となる。このループ状部分を糖鎖結合ポケットと呼んでいる。
【００２５】
【表１】
2009207382.tif 000002
【００２６】
AHの抗ＨＩＶ活性が関与する必須アミノ酸配列領域の解明を目的に、糖鎖と結合するアミノ酸残基が存在すると予想される、LD-QXW 間の配列 (AHのセグメント1 では、Leu13 からTrp35 まで)に着目した。推定立体構造上、ループ内部に側鎖が配置されているアミノ酸残基に注目し、これをAla に置換したAH変異体を特許文献１に示した大腸菌による組換え体AHの産生系を用いて作成し、合胞体形成阻害活性を測定した。その結果、Asp15、Tyr23、Leu25、Asn28、Tyr32 及びGln33 で活性低下が確認された (表２)。
【００２７】
この結果から、上記のアミノ酸残基はAHの活性に必須であることが明らかになった。また、これらの残基と同じ位置、同じ種類である、セグメント2と3 のアミノ酸残基も活性に関与していると考えられる (表３)。この証明として実際に、Tyr61、Tyr99、Gln71 および
Gln109 ではAla 置換による活性低下が確認された。ただし、Gln(33 、71 、109 )およびTyr(23、61、99)をAla に置換したとき、活性低下は観測されたが、活性低下の程度がセグメント毎にバラバラであった (表３)。
【００２８】
【表２】
2009207382.tif 000003
【００２９】
【表３】
2009207382.tif 000004
【００３０】
このことから、セグメント毎に糖鎖に対する親和性が異なっていると推測した。これまでの検討結果から構成する各セグメントはいずれも糖鎖に対する親和性を示すが、単独では十分な合胞体形成阻害活性を示さないことが明らかになっていたので、各セグメントを三つにした各々のセグメント・トリマーを調製し、糖類への親和性がどう変化するかを合胞体形成阻害活性で評価した。
【００３１】
最初に、AHの１〜３８番目までの配列を３個繰り返したAH(1-38)×３であるセグメント１の単純なトリマーを調製し、阻害活性を測定した。結果は、IC50＝＞10μMであり、本来のAHよりも阻害活性が低下した。
この試行結果から糖鎖結合ポケット領域以外のアミノ酸配列が、三つのポケットを適切に繋ぐために重要な役割を担っていると考えるに至った。
【００３２】
【表４】
2009207382.tif 000005
【００３３】
そこで、表４に示したように、XLDからQXW(セグメント１の１３〜３５番目まで、セグメント２の５１〜７３番目、セグメント３の８９〜１１１番目)までの糖鎖結合ポケットの配列を統一した各々の改変アクチノヒビンを調製し、活性評価を行った。その結果、セグメント１の糖鎖結合ポケット配列を共通して有する改変アクチノヒビン(表中および以下、seg1×3で示す)で活性が２倍向上した(表４)。セグメント３の糖鎖結合ポケット配列を共通して有する改変アクチノヒビン(表中および以下、seg3×3で示す)でも活性が若干向上した。この結果から、強い親和性を示すためには三つ以上のセグメントがタンデム(一列)に配列する構造が重要であることが明らかになった。
【００３４】
本発明者らは、特許文献３で融合タンパク質(Hisタグ−TEVプロテアーゼ認識部位)を結合したHis-TEV-AH２量体 RTB-LがフリーAHの約20倍活性が向上したことを開示した。一方、AHおよびHisタグ付AH(His-AH)は水に対する難溶性の問題が大きな課題として残っていた。
【００３５】
AHおよびHis−AHの溶解性の問題が解決しなければ、溶液調製に有機溶媒を用いなければならず、試料の保存および安定性や試験結果の再現性での懸念材料になる。
AHは、上述のようにセグメント１(Seg1)、２(Seg2)，３(Seg3)の三つのセグメントから構成されており、Seg2には２つのCysが存在して分子間S-S結合を形成すると推定される。その結果、このCys残基は精製する過程で分子間S-S結合を形成してAHを不溶化する傾向がある。予備検討でHis−TEV-AHとHis-Seg1×３(セグメント１の糖鎖結合ポケット配列を共通して有する改変アクチノヒビン)の溶解性を比較するとHis-Seg1×３の方が溶解性が高いことが明らかになった。また、上述したようにHis-Seg1×３の方がHis-AHよりも阻害活性が２倍高いことが明らかになりこれを大量産生する系に活用するのが有利と考えた。
【００３６】
更に、TEVプロテアーゼによるHis-タグの除去は高額なプロテアーゼを使用する上に、反応後に残存するプロテアーゼを完全に除去する必要があり、大量生産には実用的ではないと考えられたので酵素による切断に変わる方法として化学的切断を検討した。化学的切断法として70％ギ酸中での臭化シアンによるMet-X結合が効率が高く有効と考えた。AHにはMetが存在しないので、His-タグの後にMetを導入することにより、AH部分は無傷で切断することが可能と考えた。これによりTEVプロテアーゼ認識配列は不要となる。
【００３７】
特許文献１および特許文献２に開示したように、AHの多量体、特に２量体は高い阻害活性を有し、しかもリンカーにペプチド配列が存在する。このリンカーに用いたアミノ酸配列には、毒性の面で潜在的な不安材料があることから安全性が確認されているアミノ酸配列のリンカーの検討も行った。
【００３８】
また、AHを抗ＨＩＶ薬の素材として大腸菌を宿主に使用する場合、この生産系での混入不純物、特に大腸菌由来のリポポリサッカライド(LPS)を除去する必要がある。新精製法の追加を含めて検討を進めたが決定的なリポポリサッカライドの除去法が見出せず、発現系の宿主を大腸菌からピチア(Pichia)に変更することにした。
【００３９】
以上の点を考慮して宿主Pichiaでの新しいAH誘導体を構築し、作製した。その結果、アクチノヒビンの１のセグメントの糖鎖結合ポケットで他のセグメントの対応部分を置き換えたもの（改変アクチノヒビン）をリンカーで結合したアクチノヒビン新２量体および/または少なくとも１種の他のポリペプチドを含む融合タンパク質が結合した新物質は親水性が良く、安定性にも優れ、より高い抗ＨＩＶ効果を有することを見出し本発明を完成するに至った。
【００４０】
すなわち、本発明は、以下の新規なアクチノヒビン誘導体（改変アクチノヒビンおよび２量体）、抗ＨＩＶ薬、塩基配列、形質転換体および抗ＨＩＶ薬の製造方法を提供する。
【００４１】
１．３つのセグメントからなるアクチノヒビンにおいて各セグメントの糖鎖結合ポケットのアミノ酸配列を共通になるように改変した改変アクチノヒビン。
２．請求項１に記載の改変アクチノヒビン２分子をリンカーを介してまたは介さずに結合させた改変アクチノヒビン２量体。
３．
(a)配列番号１で表されるポリペプチド、および／または
(b)(a)のアミノ酸配列中の１個または複数個のアミノ酸が置換もしくは欠失され、または付加されてなる合胞体形成阻害活性を有するホモログ
を５０個以下のリンカーで連結したものである請求項２記載の改変アクチノヒビン２量体。
４．前記改変アクチノヒビン２量体と少なくとも１種の他のポリペプチドとの融合タンパク質。
５．前記少なくとも１種の他のポリペプチドがHisタグ・Metを含む請求項４に記載の融合タンパク質。
６．前記リンカーがＧＧＧＳで表されるペプチド鎖のモノマー(monomer)、ダイマー(dimer)またはトリマー(trimer)である請求項２〜５のいずれかに記載の改変アクチノヒビン２量体またはこれを含む融合タンパク質。
７．融合タンパク質が、Hisタグ−Met、配列番号１のポリペプチド、請求項６に挙げるリンカー、配列番号１のポリペプチドをこの順で結合したものである請求項５または６に記載の改変アクチノヒビン２量体を含む融合タンパク質。
８．請求項２〜７のいずれかに記載の改変アクチノヒビン２量体または融合タンパク質を含むことを特徴とする抗ＨＩＶ(ヒト免疫不全ウイルス)薬。
９．請求項１〜７のいずれかに記載の改変アクチノヒビン、改変アクチノヒビン２量体または融合タンパク質をコードする塩基配列またはその相補鎖。
１０．請求項９に記載の塩基配列を宿主細胞に導入した形質転換体。
１１．宿主細胞が大腸菌または酵母である請求項１０に記載の形質転換体。
１２．宿主細胞がEscherichia coli BL21(DE3)plysSである請求項１１に記載の形質転換体。
１３．宿主細胞がPichia pastoris X-33、GS115またはKM71Hである請求項１１に記載の形質転換体。
１４．請求項１０〜１３のいずれかに記載の形質転換体を培養して形質転換体内または培養物中に前記１〜７のいずれかに記載の改変アクチノヒビン、改変アクチノヒビン２量体またはこれを含む融合タンパク質を産生させ、これを単離することを含む請求項８に記載の抗ＨＩＶ薬の製造方法。
１５．請求項５に記載の融合タンパク質を産生させ、さらにこれを７０％ギ酸中での臭化シアン処理する化学的な切断法によりHisタグ-Met-X結合を除去することを含む請求項１４に記載の抗ＨＩＶ薬の製造方法。
１６．請求項７に記載の融合タンパク質を産生させ、さらにこれを７０％ギ酸中での臭化シアン処理する化学的な切断法によりHisタグ-Met-X結合を除去することを含む請求項１５に記載の抗ＨＩＶ薬の製造方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
［化合物］
本発明の第１の実施形態では、アクチノヒビンにおいて各セグメントの糖鎖結合ポケットのアミノ酸配列を共通になるように改変した改変アクチノヒビンおよびこれを２分子、リンカー（リンカー配列については次節参照）を介してまたは介さずに結合した改変アクチノヒビン２量体が提供される。各セグメントの糖鎖結合ポケットのアミノ酸配列は共通であれば、それ自体に制限はないが、特にセグメント１の糖鎖結合ポケットのアミノ酸配列を共通して有する分子が好ましい。
【００４３】
さらに本発明によれば、改変アクチノヒビン２量体に、少なくとも１種の他のポリペプチドまたはタンパク質を連結した融合タンパク質が提供される。ここで、上記の少なくとも１種の他のポリペプチドまたはタンパク質は、Metを含むことが好ましく、特定の機能を有する、例えば、精製に有用なペプチド、例えば、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を含むことが好ましい。
【００４４】
これらは、Ｎ末端側またはＣ末端側のいずれに付加してもよい。ポリヒスチジンタグが付加されたタンパク質は、Ｎｉ＋＋あるいはＣｏ＋＋等のポリヒスチジンと錯体を形成する金属イオンを坦持した精製手段、例えばＮｉ＋＋セファローズカラム等を使用してアクチノヒビン２量体の精製が極めて容易に行うことができ、且つ高収率で生成物を回収することができる。ここでポリヒスタグは例えばＨｉｓ６・ｔａｇである。
【００４５】
従って、本発明の融合タンパク質結合改変アクチノヒビン２量体は、好ましくは、Ｈｉｓタグ、Met、配列番号１のポリペプチド、後述するリンカーおよび配列番号１のポリペプチドをこの順で連結した分子である。
【００４６】
［抗ＨＩＶ薬］
本発明の第２の実施形態では、上記の改変アクチノヒビン２量体または融合タンパク質を含有する抗ＨＩＶ薬が提供される。
特に、アクチノヒビンの糖鎖結合ポケットのアミノ酸配列をセグメント１の当該配列で共通化した改変アクチノヒビンをリンカーで結合した新規な改変アクチノヒビン２量体（以下、アクチノヒビン新２量体ともいう。）および/または少なくとも１種の他のペプチドを含む融合タンパク質を含む抗ＨＩＶ薬が提供される。この改変アクチノヒビンは、
（ａ）配列番号１で表されるポリペプチド、および
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列中の１個または複数のアミノ酸が置換もしくは欠失されまたは付加されてなる合胞体形成阻害活性を有するホモログを含む。
【００４７】
上記（ｂ）に挙げるアミノ酸配列の一部が置換、欠失し、若しくは付加されるポリペプチドとは、配列番号１記載のアミノ酸配列と、少なくとも２０％、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上のアミノ酸相同性を有するポリペプチドを意味する。合胞体形成阻害活性が示される限りにおいて、アミノ酸の置換、欠失、または付加は、任意の場所で生じ得る。なお、ここで、Ｘ％以上の相同性を有する配列という場合、比較される２つの配列の長さが異なる場合、短い方の配列は長い方の配列のＸ％以上の配列長さを有する。例えば、配列番号１で表されるポリペプチドと９０％以上の相同性を有するポリペプチドは、配列番号１で表されるポリペプチドの配列長さの９０％以上の配列長さを有するものを指す。
【００４８】
また、本発明において抗ＨＩＶ薬として好ましい有効成分は、上記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列が直接に、または任意のリンカー配列を介して連結したものである。
リンカー配列は、２量体の抗ＨＩＶ作用を害せず、毒性がないものであれば、特に限定されないが、通常５０個以下、好ましくは２０個以下、より好ましくは１５個以下のアミノ酸残基からなる配列である。例えば、ＧＧＧＳで表されるペプチド鎖のモノマー(monomer；GSlinkx1)、ダイマー(dimer)またはトリマー(trimer)によって示されるポリペプチド（以下、総称してGSlinkともいう。）が含まれる。なお、ここでＧＧＧＳダイマー（GSlinkx2）はＧＧＧＳＸＧＧＧＳ、ＧＧＧＳトリマー（GSlinkx3）はＧＧＧＳＸＧＧＧＳＸＧＧＧＳ構造を有するものを含む。好ましくはＸはＧである。したがって、本発明において抗ＨＩＶ薬として好ましい有効成分には、配列番号１のポリペプチド−GSlink−配列番号１をこの順での連結したポリペプチドが含まれる。
【００４９】
［塩基配列］
本発明の第３の実施形態では、上記ポリペプチドをコードする塩基配列またはその相補鎖が提供される。
例えば、本発明により提供される塩基配列には、配列番号２〜５のポリペプチドに対応する配列番号７〜１０の塩基配列（終止コドンを含む）が含まれるが、より一般的には、（ａ’）配列番号１で表されるポリペプチドをコードする塩基配列、および（ｂ’）（ａ’）のアミノ酸配列中の１個または複数のアミノ酸が置換もしくは欠失し、または付加されてなる合胞体形成阻害活性を有するホモログをコードする塩基配列から選択されるアクチノヒビンコード領域（複数個）をリンカー配列をコードする塩基配列で連結した塩基配列に融合タンパク質のHis・tag-Metをコードする塩基配列を結合した塩基配列が提供される。
【００５０】
ここで、ホモログ、リンカー配列および合胞体形成阻害活性の意義は上記の通りである。ホモログは、配列番号１記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列と、少なくとも２０％、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上の相同性を有する。なお、ここで、Ｘ％以上の相同性を有する配列という場合、比較される２つの配列の長さが異なる場合、短い方の配列は長い方の配列のＸ％以上の配列長さを有する必要がある。例えば、ある塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列は、当該塩基配列の配列長さの９０％以上の配列長さを有するものを指す。
【００５１】
さらに、本発明による塩基配列は、ポリペプチドの産生に有用な配列も含んでもよい。例えば、生物体内で改変アクチノヒビンまたはその２量体を発現させる際に最初に前駆体ポリペプチドとして形成し、翻訳後修飾して改変アクチノヒビンまたはその２量体を成熟タンパク質として得ることが必要または有利な場合は、そのような塩基配列を含んでもよい。このような塩基配列としては、微生物の菌体外への分泌に用いられるシグナルペプチド配列領域が挙げられる。
【００５２】
なお、本願において、ポリペプチドをコードする塩基配列とは、縮重コドンのいずれによりコードされるものでもよいが、次項で述べる形質転換体中に適した塩基配列であることが好ましい。また、塩基配列は以上のいずれかの相補鎖であってもよい。
【００５３】
［形質転換体］
本発明の第４の実施形態では、上記塩基配列を宿主細胞に導入した形質転換体が提供される。形質転換体は、アクチノヒビン多量体を安定して発現できるものであればよく、大腸菌、放線菌その他の細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などが挙げられ、また、細胞融合、遺伝子操作などの手段により予め細胞工学的に変異させた細胞も、本発明の形質転換体の宿主に含まれる。特に好ましくは、宿主細胞は酵母(Pichia)または大腸菌および放線菌であり、このような形質転換体の例としては、Pichia
pastoris X-33,GS115,KM71H およびEscherichia coli BL21(DE3) plysS株が挙げられる。
【００５４】
形質転換体は当該技術分野で知られている任意の方法で作成できる。（例えば、
C. Guthric
& G.R. Fink Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. In 
Methods in Enzymology,
Vol.194 Academic Press(1991)
F.M.Ausubel
et al., Current Protocols in Molecular Biology Greence Publishing 
and
Wiley-interscience(1994)
J. Sambrook
et al., Molecular Cloning 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory
Press (2001)
参照）
【００５５】
［抗ＨＩＶ薬の製造方法］
本発明の第５の実施形態では、前記形質転換体を培養して形質転換体内または培養物中に前記ポリペプチドを産生させ、これを単離することを含む改変アクチノヒビン２量体抗ＨＩＶ薬の製造法が提供される。
【００５６】
本発明の形質転換体の培養に際しては、その形質転換体の培養に用いられる通常の培養方法が適用される。用いる培地は形質転換体の資化し得る炭素源、窒素源、無機物、
ビタミン、成長因子などを程よく含有する培地であれば天然培地、合成培地のいずれでも用いることができる。
【００５７】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、マンノース、マルトース、蔗糖、糖蜜などの炭水化物、クエン酸、りんご酸、酢酸などの有機酸、メタノール、エタノールなどのアルコール、大豆油、綿実油、パーム油などの油脂、メタン、エタン、ブタン、ｎ−パラフィンなどの炭化水素あるいはグリセロールなどが用いられる。
【００５８】
窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、アスパラギン酸、グルタミン、アラニンなどのアミノ酸、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチープ・リカー、大豆粉、ソルブル・ベジタブル・プロテイン、綿実粕、カゼイン、カザミノ酸、ファーマメデイアなどが用いられる。無機物としてはリン酸一カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、硫酸コバルト、硫酸亜鉛、モリブデン酸アンモニウム、硫酸アルミニウム、炭酸バリウム、炭酸カルシウム、食塩などが用いられる。その他必要に応じて培地に微量の金属塩、ビタミン類など菌体の増殖あるいはアクチノヒビン新２量体の生産を促進する物質を加えることができる。また形質転換体が特定の物質を要求する場合には、必要に応じて加える必要がある。これらのものはアクチノヒビン新２量体の産生に役立つものであればよく、例えば、形質転換体、特に、酵母、大腸菌および放線菌の培養原料として公知のものはすべて用いることができる。
【００５９】
形質転換体、特に微生物の大量培養には液体培地を用いた振とう培養法、通気撹拌培養法などが好ましい。培養温度は形質転換体が発育し、アクチノヒビン新２量体を生産できる範囲で適用できる。培養は形質転換体の性質に応じて、適宜選択しておこなうことができる。培養物中のアクチノヒビン新２量体が培養液中に存在する場合には、菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用できることもできるが、一般には常法にしたがって、ろ過、遠心分離などにより培養液中のアクチノヒビン新２量体と形質転換体とを分離した後のアクチノヒビン新２量体溶液が使用される。アクチノヒビン新２量体が形質転換体内に存在する場合は、得られた培養物をろ過または遠心分離などの手法により、菌体を採取し、次いでこの菌体を物理的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤および／または界面活性剤を添加して形質転換体細胞を可溶化して、水溶液として分離採取する。
【００６０】
このようにして得られたアクチノヒビン新２量体含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、さらには硫安などの塩析処理、あるいは親水性有機溶剤、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿させればよい。次いで、この沈殿物を水に溶解し、半透膜にて透析するか、あるいは分子ふるい膜でより低分子量の不純物を除去することができる。また吸着剤、あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーにより精製してもよい。特にＨｉｓ・ｔａｇを含む融合タンパク質結合アクチノヒビン新２量体を産生させる生産系では、Ｈｉｓ・ｔａｇを特異的に吸着するＮｉ＋＋キレートセファローズカラムで精製することができる。これらの手段により得られた融合タンパク質結合アクチノヒビン新２量体は含有溶液を減圧濃縮、凍結乾燥等の処理をすることにより精製された高純度の融合タンパク質結合アクチノヒビン多量体を得ることができる。
【実施例】
【００６１】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明を制限するものではない。なお、以下の例において、「アクチノヒビン・セグメント１×３」などの用語は、アクチノヒビン・セグメント１の３量体ではなく、アクチノヒビンにおいて、各セグメントの糖鎖結合ポケットの配列がセグメント１に統一されている（１分子中に３個存在する）ことを意味する。
【００６２】
実施例１：
（１）アクチノヒビン・セグメント１×３(AH seg.1×３)をコードする遺伝子の構築
図１に示した手順に従って、配列番号１で表されるアクチノヒビン・セグメント１×３をコードする遺伝子（配列番号７）を構築した。
AH遺伝子を含むプラスミドpBSK+:2A3K
を10 ng を鋳型として、AA-1 Bam (GGA TCC
GGC TCG GTC ACC ATC) 及び Seg1x3-1 (CGG TAC CGT CGC CGG
GGC CGG TCC) 各 5 pmolをプライマーとし、10×Takara Ex Taq buffer 5 μl、25 mM dNTP、DMSO 2.5 μl、Takara Ex Taq (タカラバイオ株式会社) 0.5 Uおよび滅菌水を加え全量 50 μl とし、PCRを行った。なお、反応条件は、94℃で 30秒、60℃で 30秒、72℃で 60秒を 1 サイクルとし、30 サイクル反応させた。増幅断片をアガロースゲルで精製し、pCR2.1 に連結し、pCR2.1:Seg1-1 を得た。このプラスミド 10 ng を鋳型として、Seg1x3-2 (GAC GGT ACC GTC CGC AAC GCC CAG ACC) と Seg1x3-3 (GTT CGA ATA GAA CAG CCA CCG CTG) およびSeg1x3-4 (ATT CGA ACG GCT ACA TCC AGAAC GTC GAG ACC GGC CGC) と TGA Hind 各 5 pmol をプライマーとし、上記の条件でPCR を行った。得られた ＤＮＡ 断片をアガロースゲルで精製し、pCR2.1 に連結して、pCR2.1:Seg1-2 及び pCR2.1:Seg1-3 を得た。pCR2.1:Seg1-1、pCR2.1:Seg1-2 および pCR2.1:Seg1-3 を BamH Iと Kpn I、Kpn I と Nsp V 及び Nsp V と
Hind III の制限酵素の組み合わせで消化し、アガロースゲルで精製した。これら 3 種の断片を、あらかじめBamH I と Hind
III で消化して、アガロースゲルで精製した pUC19 と連結し、pUC19:AH seg1x3 を構築した。このプラスミド 10 ng を鋳型として、AA-1 LIC (GGT ATT GAG GGT CGC GCC TCG GTG ACC ATC) 及び TGA-114 LIC (AGA GGA GAG TTA GAG CCT CAG CCG GTG TAC)を用いてPCR を行い、AH Seg1X3 遺伝子を増幅し、AH seg1x3遺伝子を構築した。
【００６３】
次に、増幅断片をアガロースゲルで精製し、回収した ＤＮＡ 溶液 1 μlに、10×T4 ＤＮＡ polymerase buffer (330 mM Tris-acetate (pH 7.9)、660 mM 酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、5 mM DTT、0.1% BSA) 2 μl、25 mM dGTP 2.5 μlおよびT4 ＤＮＡ polymerase (4 U/μl) (タカラバイオ株式会社) 1 μl を混合して全量を滅菌水で 20 μl として、22℃で 30 分間保温した後、75℃で 20 分間保温した。この ＤＮＡ 溶液 1 μlと大腸菌発現ベクター pET30 Xa/LIC 25 ng を混合して 22℃で 5 分間保温した後、EDTAを
6.25 mM になるように加え、反応を終了させ、His-AH seg1x3発現ベクター、pET 30: AH seg1x3を作成した。
【００６４】
(２)  His-Met−AH seg.1×３
GS link ２量体発現プラスミドの構築
図２、３、４、５に示した手順に従って、配列番号３、４、５で表されるHis-Met−AH seg.1×３ GS link ２量体をコードする遺伝子（それぞれ配列番号８、１０、９）を構築した。
(i)AH Seg.1 x3 GSlink x1 ２量体をコードする遺伝子の作成方法
pET151:Seg1×3プラスミドを鋳型とし、AH Seg1x3-NdeI-M-F プライマー（5’-
ATcatatgGCCTCGGTGACCATCC -3’）とAH Seg1x3-GGGS-BamHI-Rプライマー（5’-
atggatccacctccGCCGGTGTACCAC -3’）を用いてPCRを行い、5’端にNdeI酵素サイト及びメチオニン残基をコードする塩基配列（ATG）を、3’端にGly-Gly-Gly-Serをコードし、かつBamHI酵素サイトがある塩基配列（ggaggtggatccat）を有するAH Seg.1 x3遺伝子断片を得、それをクローニングベクターpBluescriptII
SK(+)のEcoRVサイトに挿入し、遺伝子の5’上流にpBluescriptII SK(+) マルチクローニングサイト由来のHindIII酵素サイトを有するプラスミドを得た。そのプラスミドをHindIII及びBamHIで消化し、AH Seg.1 x3遺伝子断片Aを調製した(図２．Ａ)。
【００６５】
また、同じ鋳型(pET151:Seg1 trimer )を用いて、AH 3xSeg1-BamHI-Fプライマー（5’-
ATggatccGCCTCGGTGACCATCCGCAA -3’）と AH-3xSeg1-Stop-XhoI-Rプライマー（5’-
ATctcgaGCTCGCCCTTTTATTA -3’）を用いてPCRを行い、5’端にBamHI酵素サイトを、3’端に停止コドンおよびXhoI酵素サイトを有するAH Seg.1x3遺伝子断片B(図２．Ｂ)を得、それをBamHI及びXhoIで消化し、予めBamHI及びXhoIで消化後に精製したpcＤＮＡ3.1(+)プラスミドベクターに挿入した。このプラスミドをHindIIIとBamHIで消化し、遺伝子断片Aを挿入することにより、pcＤＮＡ3.1：AH Seg.1x3 GSlink
x1 dimerプラスミドを得た。
【００６６】
(ii)AH Seg.1 x3 GSlink x3 ２量体をコードする遺伝子の作成方法
図３に示した手順に従って、配列番号５で表されるAH Seg.1 x3 GSlink x3２量体をコードする遺伝子（配列番号９）を構築した。
等量のgatc-GSlink-BamHIx2-F（5’- gatcaGGCGGAGGTGGATCCggcggtggcg -3’）及びgatc-GSlink-BamHIx2-R（5’- gatccgccaccgccGGATCCACCTCCGCCt -3’）を混ぜ、 96oCで5分間インキュベートした後、緩やかに室温にもどすことによって２つのオリゴをアニーリングさせた。そのアニーリングサンプルをT4 polynucleotide kinase処理することにより、5’端をリン酸化し、これをGSリンンカー遺伝子断片とした。
pcＤＮＡ3.1：AH Seg.1 x3 GSlink x1 dimerプラスミドをBamHIで消化した後、Alkaline Phosphataseによる脱リン酸化処理を行い、self-ligationを防いだプラスミドを調製。これにGSリンカー遺伝子断片をつなぎ、大腸菌株（DH10B）に形質導入し、pcＤＮＡ3.1：AH Seg.1 x3 GSlink x3 dimerプラスミドを得た。
【００６７】
(iii)AH Seg.1 x3 GSlink x2 ２量体をコードする遺伝子の作成方法
図４に示した手順に従って、配列番号４で表されるAH Seg.1 x3 GSlink
x2２量体をコードする遺伝子（配列番号１０）を構築した。
pcＤＮＡ3.1：AH Seg.1 x3 GSlink x3 dimerプラスミドの作製時、GSリンカー(GGGSGGGGSGGGGS)の最後のGGGGSをコードする遺伝子の5’端及び3’端にのみBamHI酵素サイトを残すようデザインしているため、これをBamHIで消化し、最後のGGGGS遺伝子を除去後、self-ligationさせて大腸菌株（DH10B）に形質導入することにより、 pcＤＮＡ3.1：AH Seg.1x3
GSlink x2 dimerプラスミドを得た。
【００６８】
(３)
His-Met−AH seg.1×３ GS link ２量体の大腸菌での発現
AH Seg.1 x3 GSlink x1 ２量体、AH Seg.1 x3 GSlink x2 ２量体、AH Seg.1 x3 GSlink
x3２量体遺伝子断片は全てpcＤＮＡ3.1プラスミドベクターに入っているものをNdeI及びXhoIで消化することにより調製した。これらの遺伝子を、予めNdeI及びXhoIで消化し、調製しておいたpET-15bプラスミドベクターにライゲーション後、大腸菌株（DH10B）に形質導入することによりpET15b: His-Met-AH Seg.1 x3 GSlink x1 ２量体、
pET15b: His-Met-AH Seg.1 x3 GSlink x2 ２量体、 pET15b:
His-Met-AH Seg.1x3 GSlink x3 ２量体を構築した (図５)
【００６９】
(４)
His-Met−AH seg.1×３ GS link ２量体のピチア(Pichia)での発現
(i)Pichia酵母発現プラスミドの構築方法
pcＤＮＡ3.1：AH Seg.1 x3 GSlink ２量体プラスミドを鋳型とし、pET15-EcoRI-M-His-Fプライマー(5’- ATGAATTCAACAAAatgggcagcagccatcatc -3’)とT7
terminatorプライマー（5’- GCTAGTTATTGCTCAGCGG -3’）を用いてPCRを行い、5’端にEcoRI酵素サイトを付加したAH Seg.1 x3 GSlink２量体遺伝子を増幅した。その遺伝子断片をEcoRI及びXhoIで消化し、予めEcoRI及びXhoIで消化し、調製しておいたピチア用プラスミドベクターpPICZ-Bにライゲーション後、大腸菌株（DH10B）に形質導入することにより、pPICZ：AH Seg.1 x3 GSlink ２量体を構築した。
【００７０】
(ii)形質転換Pichia酵母株の作成
pPICZ:AHseg.1×３GSlink ２量体発現ベクターをQIAGEN Midi-prepキットを用いて精製後、BstXIで消化することにより直線化したものをPichia酵母形質転換用ＤＮＡサンプルとした。
GS115（His4 / His-, Mut+）Pichia株及びKM71H(arg4 aox:ARG4 / MutS, ARG+)Pichia株を用もちいてコンピーテント細胞を作製し、形質転換用ＤＮＡサンプルを15μgずつ形質転換し、YPD+100μg/ml ゼオシン(Zeocin)アガー培地にまき、形質転換体を得た。その形質転換コロニー50個をYPD+2000μg/ml Zeocinアガー培地に移植し、この培地で生育できるゼオシン耐性株を単離した。
【００７１】
実施例２：
以下の手順によりピチアで発現させたHis-Met-AH seg.1×３ GS link ２量体を調製・精製し、その抗ＨＩＶ効果について試験した。
[宿主ピチアでの培養]
形質転換Pichia酵母株を、50mlのBMGY培地で一晩30℃で振盪培養する。培養液を5,000xgで10分間遠心分離し、菌体を集めた。培養上清を捨て、菌体ペレットをO.D.600が約1.0になるよう調整し、BMMY/1.5%MeOH含有培地に懸濁し、30度で振盪培養することによりタンパク質発現を誘導した。24時間おきに最終濃度1.5%MeOHを添加し、誘導をかけ続け、72時間後に5,000xgで10分間遠心分離し、菌体を集めた。
【００７２】
[ピチア酵母抽出液の調製]
得られた酵母菌体をソニケーションバッファー（6Mグアニジン塩酸、5mMイミダゾール、0.5M塩化ナトリウム、20mM Tris-HCl（pH7.9））に懸濁し、酵母菌体体積の1/2量のガラスビーズを加えた。それを超音波処理することで酵母菌体を破壊した後、12,000xgで30分間、4度で遠心分離を行い、上清を集めた。ペレットを再度ソニケーションバッファーに懸濁、超音波処理し、12,000xgで30分間、4度で遠心分離を行い、上清を集めた。得られたすべての上清を、再度12,000xgで30分間、4度で遠心分離を行い、その上清をニッケルキレートカラムクロマトグラフィーによる精製用の試料とした。
【００７３】
[精製]
精製用試料を1mlのNi Sepharose High Performance（GE Healthcare製）をオープンカラムに充填し、10mlのソニケーションバッファーで樹脂を平衡化して、試料溶液を通した。10mlのソニケーションバッファーで樹脂を洗浄後、さらに洗浄バッファー（6Mグアニジン塩酸、20mMイミダゾール、0.5M塩化ナトリウム、20mM Tris-HCl（pH7.9））で樹脂を洗浄後、溶出バッファー（6Mグアニジン塩酸、200mMイミダゾール、0.5M塩化ナトリウム、20mM Tris-HCl（pH7.9））でタンパク質を溶出させた。溶出タンパク質サンプルを透析膜に入れ、1Mギ酸に対して透析を行うことでバッファーの置換を行った後、真空凍結乾燥機で濃縮乾固した。
【００７４】
［合胞体形成阻害活性の測定法］
ＨｅＬａ／Ｔ−ｅｎｖ／Ｔａｔ細胞（ＨＩＶモデル細胞）およびＨｅＬａ／ＣＤ４／ＬＴＲ細胞（免疫系モデル細胞）の培養は、７５ｃｍ２培養フラスコを用いて、ＤＭＥ培地（Delbecco’s modified Eagle medium,KM（100μg/ml）、0.1%炭酸水素ナトリウム、10%
fetal bovine serum）で５％ＣＯ２気流下３７℃にて行った。
９６穴マイクロプレートの各穴にＤＭＥ培地で懸濁したＨｅＬａ／ＣＤ４／ＬＴＲ細胞を８×１０３個／５０μｌずつまいた。ここに、無血清ＤＭＥ培地（KM 100μg/ml）で希釈した試料溶液を１０μｌ添加し、さらにＤＭＥ培地で懸濁したＨｅＬａ／Ｔ−ｅｎｖ／Ｔａｔ細胞を８×１０３個／５０μｌずつまき、全量を１１０μｌとして５％ＣＯ２気流下３７℃で２４時間培養した。培養液を除き細胞溶解液（0.05%Triton X−100）２０μｌを加え、室温で１５分間静置した。発色基質液（60mM リン酸水素二ナトリウム,40mM リン酸二水素ナトリウム,10mM 塩化カリウム,1mM 硫酸マグネシウム,50mM β−メルカプトエタノール,0.8mg/ml ONPG（o‐ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド））を各穴に１００μｌ加え、３７℃で８０分間反応させた後、反応停止液２Ｍ炭酸ナトリウムを５０μｌずつ各穴に添加し、マイクロプレイトリーダーを用いて４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。得られた吸光度から合胞体形成率を求めた（次式）。
【００７５】
（数１）
合胞体形成率＝（阻害剤添加時の吸光度／阻害剤無添加時の吸光度）
【００７６】
このようにして得たHis-Met-AH seg.1×３ GS link ２量体の合法体形成に対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を表５に示す。
【００７７】
【表５】
2009207382.tif 000006
【００７８】
その結果、His-Met-AH seg.1×３ GS link ２量体の抗ＨＩＶ効果は、アクチノヒビン(AH)と比べ６〜７倍に向上した。
【００７９】
実施例３：
臭化シアンによるHisタグの除去
濃縮乾固したタンパク質試料に、タンパク質試料と等重量の臭化シアンを含む化学切断溶液（最終濃度1%で臭化シアンを1%ギ酸に溶解した溶液）を加えて溶解し、暗所、室温で約15時間静置することによりタグを切断した。化学切断溶液の10倍量のmilliQ水を加えて希釈後、真空凍結乾燥機で濃縮乾固した。濃縮乾固サンプルを10mg/ml（切断前タンパク質10mgに対して1ml）の割合で結合緩衝液（6Mグアニジン塩酸、5mMイミダゾール、0.5M塩化ナトリウム、20mM Tris-HCl（pH7.9））に懸濁した。10mlの結合緩衝液で平衡化した1mlのNi
Sepharose High performance （GE Healthcare製）を充填したオープンカラムに通し、Hisタグ及び無切断タンパク質を樹脂に吸着させ、Hisタグが除去された通過タンパク質分画を回収した。このタンパク質サンプルを透析膜に入れ、1Mギ酸に対して透析を行うことでバッファーの置換を行った後、真空凍結乾燥機で濃縮乾固した。
このようにしてHisタグを除去して得たAH seg.1×３ GS link ２量体のSDS-PAGE写真を図６に示す。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明の改変アクチノヒビンは新規な化合物であり、糖鎖に対する結合性がアクチノヒビンよりも改善されている。さらに、改変アクチノヒビン２量体は、抗ＨＩＶ薬の有効成分としてきわめて有効である。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】His-AH seg1×３遺伝子の構築方法を示す模式図。
【図２】AH Seg.1 x3 GSlink x1 ２量体をコードする遺伝子の作成方法を示す模式図。
【図３】AH Seg.1 x3 GSlink x3 ２量体をコードする遺伝子の作成方法を示す模式図。
【図４】AH Seg.1 x3 GSlink x2 ２量体をコードする遺伝子の作成方法を示す模式図。
【図５】His-Met−AHseg.1×３ GS link ２量体の大腸菌での発現方法を示す模式図。
【図６】臭化シアンによるHisタグの除去前後タンパク質のSDS-PAGE像。
【図１】
2009207382.tif 000007
【図２】
2009207382.tif 000008
【図３】
2009207382.tif 000009
【図４】
2009207382.tif 000010
【図５】
2009207382.tif 000011
【図６】
2009207382.tif 000012
【配列表】
2009207382000001.app