(57)【要約】【課題】  Ｔｏｌｌ様受容体３遺伝子を構成的に過剰発現する遺伝子導入マウスから樹立した細胞株を提供し、効率的なＴＬＲ３経路の解析を可能とする。また、この細胞株を利用した、Ｔｏｌｌ様受容体３の新規アゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法を提供する。【解決手段】  体細胞及び生殖細胞にＴｏｌｌ様受容体３をコードするＤＮＡを有し、且つＴｏｌｌ様受容体３遺伝子を過剰発現していることを特徴とする遺伝子導入マウスから樹立した細胞株、並びに、この細胞株及び対照細胞株に、試験物質を投与する投与ステップと、当該細胞株と対照細胞株で、Ｔｏｌｌ様受容体３の下流の遺伝子又はその遺伝子により発現されたタンパクの発現量を測定する測定ステップと、当該遺伝子の発現量が有意に異なる場合に、試験物質がＴｏｌｌ様受容体３のアゴニスト又はアンタゴニストであると判定し、当該試験物質を選択する選択ステップと、を含む、Ｔｏｌｌ様受容体３のアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
体細胞及び生殖細胞にＴｏｌｌ様受容体３をコードするＤＮＡを有し、且つＴｏｌｌ様受容体３遺伝子を過剰発現していることを特徴とする遺伝子導入マウスから樹立した、細胞株。
【請求項２】
前記ＤＮＡが、
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、
又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つヒトＴｏｌｌ様受容体３の機能を持つポリペプチドをコードするＤＮＡ、
である、請求項１に記載の細胞株。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の細胞株、及び対照細胞株に、試験物質を投与する投与ステップと、
当該細胞株と対照細胞株で、Ｔｏｌｌ様受容体３の下流の遺伝子又は該遺伝子により発現されたタンパクの発現量を測定する測定ステップと、
当該遺伝子の発現量が有意に異なる場合に、試験物質がＴｏｌｌ様受容体３のアゴニスト又はアンタゴニストであると判定し、当該試験物質を選択する選択ステップと、
を含む、Ｔｏｌｌ様受容体３のアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法。
【請求項４】
前記投与ステップの前若しくは後又は前記投与ステップにおいて、Ｔｏｌｌ様受容体３リガンドを投与する、請求項３に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
体細胞及び生殖細胞にＴｏｌｌ様受容体３をコードするＤＮＡを有し、且つＴｏｌｌ様受容体３遺伝子を過剰発現していることを特徴とする遺伝子導入マウス、及び対照マウスに、試験物質を投与するステップと、
前記遺伝子導入マウス及び対照マウスに、疾患を発症させるステップと、
前記遺伝子導入マウス及び対照マウスについて、発症させた前記疾患の程度を測定するステップと、
遺伝子導入マウスと対照マウスで疾患の程度が有意に異なる場合に、試験物質がＴｏｌｌ様受容体３のアゴニスト又はアンタゴニストであると判定し、当該試験物質を選択するステップと、
を含む、Ｔｏｌｌ様受容体３のアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡが、
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、
又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つヒトＴｏｌｌ様受容体３の機能を持つポリペプチドをコードするＤＮＡ、
である、請求項５に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体３遺伝子導入マウスから樹立した細胞株並びにＴｏｌｌ様受容体３のアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、補体、インターフェロン、Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ  細胞などが関与する自然免疫系が、適応免疫系の誘導の根幹を担うことが分子レベルで明らかにされてきており、免疫学において最も注目される分野のひとつとなっている。
【０００３】
現在までに、１０種に及ぶＴｏｌｌ様受容体が見出され、これらの分子が病原体由来分子を認識し、樹状細胞などの抗原提示細胞を活性化することによって適応免疫の誘導に重要な役割を果たしていることが判明している（特許文献１、特許文献２）。各Ｔｏｌｌ様受容体は、異なる病原体の構成成分を認識し、それぞれ微妙に異なった免疫応答を誘導する。なお、以下、Ｔｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を「ＴＬＲ」という。
【特許文献１】特開２００４−１８０５４０号公報
【特許文献２】特表２００５−５０５２８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＴＬＲのひとつであるＴＬＲ３はその機能について未知の点が多い。ＴＬＲ３のリガンドとして、二本鎖ＲＮＡ（Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））が知られているが、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）はＴＬＲ３のみに特異的なリガンドではないため、ＴＬＲ３本来の役割を解析することには適さない。また、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は毒性を持つため、医薬品として使用することも不可能である。そこで、ＴＬＲ３経路の解析及びそれを標的とした医薬品の開発には新規のＴＬＲ３特異的リガンドのスクリーニングが必須である。しかしながら、特異的なリガンドが同定されていない現状において、ＴＬＲ３遺伝子の構成的な発現量が低いことが、その研究及び新規リガンドのスクリーニングを更に困難にしている。
そこで、本発明の目的は、ＴＬＲ３遺伝子を構成的に過剰発現する遺伝子導入マウス（ＴＬＲ３  Ｔｇマウス）から樹立した細胞株を提供し、効率的なＴＬＲ３経路の解析を可能とすることである。本発明の別の目的は、この細胞株を利用した、ＴＬＲ３の新規アゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、体細胞及び生殖細胞にＴＬＲ３をコードするＤＮＡを有し、且つＴＬＲ３遺伝子を過剰発現していることを特徴とする遺伝子導入マウスから樹立した細胞株に関する。上記のＤＮＡは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つヒトＴＬＲ３の機能を持つポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい。
【０００６】
このような細胞株は、ＴＬＲ３遺伝子を構成的に高発現している。したがって、この細胞株を利用することにより、効率的なＴＬＲ３経路の研究や、いまだに発見されていない、ＴＬＲ３特異的な新規リガンドのスクリーニングが可能になる。また、導入されたＴＬＲ３遺伝子がヒトの遺伝子である場合には、得られた研究の成果をヒトに応用することができると推測される。
【０００７】
また、本発明は、上記の細胞株及び対照細胞株に、試験物質を投与する投与ステップと、細胞株と対照細胞株で、ＴＬＲ３の下流の遺伝子又は該遺伝子により発現されたタンパクの発現量を測定する（ＴＬＲ３の下流の遺伝子の発現量をｍＲＮＡレベルまたは蛋白レベルで測定する）測定ステップと、その遺伝子の発現量が有意に異なる場合に、試験物質がＴＬＲ３のアゴニスト又はアンタゴニストであると判定し、試験物質を選択する選択ステップと、を含む、ＴＬＲ３のアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法に関する。
【０００８】
細胞株によるスクリーニング系はハイスループット化が容易であるため、このようなスクリーニング方法によって、効率良くＴＬＲ３のアゴニスト又はアンタゴニストをスクリーニングすることができ、医薬品の開発効率を高めることができる。
【０００９】
また、このスクリーニング方法は、投与ステップの前若しくは後、又は投与ステップにおいて、ＴＬＲ３リガンドを投与してもよい。
【００１０】
試験物質がＴＬＲ３のアンタゴニストであった場合、ＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来の細胞に試験物質を投与した後にＴＬＲ３リガンドを投与すると、試験物質を投与せずにＴＬＲ３リガンドを投与したＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来の細胞と比較して、ＴＬＲ３の下流の遺伝子又はその遺伝子により発現されたタンパクの発現が有意に抑制される場合がある。このことを指標として、アンタゴニストをスクリーニングすることが可能である。
【００１１】
また、試験物質がＴＬＲ３のアンタゴニストであった場合、ＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来の細胞に試験物質とＴＬＲ３リガンドを同時に投与すると、両者が競合し、この場合においても、試験物質を投与せずにＴＬＲ３リガンドを投与したＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来の細胞と比較して、ＴＬＲ３の下流の遺伝子又はその遺伝子により発現されたタンパクの発現が有意に抑制される場合がある。このことを指標として、アンタゴニストをスクリーニングすることが可能である。
【００１２】
また、試験物質がＴＬＲ３のアンタゴニストであった場合、ＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来の細胞にＴＬＲ３リガンドを投与した後に試験物質を投与すると、両者が競合し、この場合においても、試験物質を投与せずにＴＬＲ３リガンドを投与したＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来の細胞と比較して、ＴＬＲ３の下流の遺伝子又はその遺伝子により発現されたタンパクの発現が有意に抑制される場合がある。このことを指標として、アンタゴニストをスクリーニングすることが可能である。
【００１３】
本発明はまた、体細胞及び生殖細胞にＴＬＲ３をコードするＤＮＡを有し、且つＴＬＲ３遺伝子を過剰発現していることを特徴とする遺伝子導入マウス、及び対照マウスに、試験物質を投与するステップと、遺伝子導入マウス及び対照マウスに、疾患を発症させるステップと、遺伝子導入マウス及び対照マウスについて、発症させた前記疾患の程度を測定するステップと、遺伝子導入マウスと対照マウスで疾患の程度が有意に異なる場合に、試験物質がＴｏｌｌ様受容体３のアゴニスト又はアンタゴニストであると判定し、当該試験物質を選択するステップと、を含む、ＴＬＲ３のアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法に関する。また、上記のＤＮＡは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つヒトＴｏｌｌ様受容体３の機能を持つポリペプチドをコードするＤＮＡ、であってもよい。
【００１４】
マウスを用いたスクリーニング系によれば、細胞株を用いたスクリーニング系よりも、よりヒトに投与した場合に近い状態で試験物質の効果を判定できると考えられる。このため、このようなスクリーニング方法によって、より実現可能性の高い医薬品の開発を行うことが可能である。
【００１５】
本発明はまた、体細胞及び生殖細胞にＴＬＲ３遺伝子を有し、且つＴＬＲ３遺伝子を過剰発現していることを特徴とする、ＴＬＲ３  Ｔｇマウスに関する。
【００１６】
このようなマウスは、ＴＬＲ３遺伝子を構成的に高発現している。したがって、このマウスを利用することにより、ＴＬＲ３以外のシグナル経路も同時に刺激してしまう既知のＴＬＲ３リガンド（Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））を用いて解析を行ったとしても効率的なＴＬＲ３の研究や新規リガンドのスクリーニングが可能になる。
【００１７】
上記のＴＬＲ３遺伝子は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つＴＬＲ３の機能を持つポリペプチドをコードするＤＮＡであることが好ましい。
【００１８】
このようなＴＬＲ３遺伝子を導入したＴＬＲ３  Ｔｇマウスを利用して研究を行えば、ヒトのＴＬＲ３についての知見を得ることができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によって、従来発現量が少なく、特異的なリガンドが同定されていないために研究が困難であった、ＴＬＲ３遺伝子を構成的に過剰発現する細胞株が提供される。この細胞株を実験材料に用いることにより、効率的なＴＬＲ３の研究や新規リガンドのスクリーニングが可能となる。また本発明によって、この細胞株を利用した、ＴＬＲ３の新規アゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法が提供され、新規医薬品の開発が促進されるなどの効果が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（ＴＬＲ３  Ｔｇマウスの作製）
ＴＬＲ３  Ｔｇマウスは、例えば以下のような方法で作製することができる。
【００２１】
まず、例えば、トリβ−アクチン遺伝子プロモーター、ヒトｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどの、哺乳動物の細胞内でタンパク発現を誘導することが可能なプロモーターの下流にＴＬＲ３遺伝子断片を連結し、更にその下流に、例えばウサギβ−グロビンポリＡ付加シグナル配列、又はポリＡ配列を連結した発現べクターを作製する。
【００２２】
ＴＬＲ３遺伝子断片は、例えば抹消血中の血球系細胞からＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅して得ることができる。ＴＬＲ３遺伝子はヒト由来のＴＬＲ３（ｈｕＴＬＲ３）であることが好ましい。ｈｕＴＬＲ３遺伝子を導入したｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスを利用して研究を行えば、ｈｕＴＬＲ３についての知見を得ることができ、研究の成果をヒトに応用することができると推測される。
【００２３】
一般的に、遺伝子には、多型が存在する場合がある。また、遺伝子のクローニング過程で変異が導入される場合がある。ＴＬＲ３遺伝子断片にこのような多型や変異が存在しても、それがコードするポリペプチドにＴＬＲ３タンパク（ポリペプチド）としての機能が保持されていれば、本発明のＴＬＲ３  Ｔｇマウスに使用することができる。ここで、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列に１〜２０個、より好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列である。また、上記の付加には、配列番号１に記載のアミノ酸配列の両末端へのアミノ酸の付加が含まれる。ＴＬＲ３の機能に影響のない領域においては、更に多くのアミノ酸の欠失、置換又は付加があってもよい。このようなアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ＴＬＲ３の機能を保持しているポリペプチドをコードするＤＮＡであれば、本発明のＴＬＲ３  Ｔｇマウス作製用の発現ベクターに使用することが可能である。ここで、ＴＬＲ３の機能とは、野生型ＴＬＲ３と同一のリガンドに応答して野生型と同一の遺伝子を誘導する能力を指す。
【００２４】
また、研究目的によっては、野生型ＴＬＲ３とは異なった機能を持つ「改変型ＴＬＲ３」をコードするＤＮＡを、ＴＬＲ３  Ｔｇマウス作製用の発現ベクターに使用してもよい。
【００２５】
さらに、発現べクターには、後の解析に便利なように、例えばＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグなどの標識ペプチドをコードする遺伝子断片をＴＬＲ３遺伝子の５’側あるいは３’側に、融合タンパクをコードする形で導入してもよい。また、発現ベクターには、ネオマイシン、ピューロマイシン、ゼオシンなどの薬剤耐性マーカー遺伝子を導入してもよい。
【００２６】
続いて、作製された発現ベクターをマイクロインジェクション法によってマウス受精卵に導入する。あるいは、エレクトロポレーション法などによってマウスＥＳ細胞に導入してもよい。発現ベクターは、導入前に適切な制限酵素処理によって切断し、目的遺伝子の発現に必要な部分以外を除去することが好ましい。
【００２７】
これらの受精卵やＥＳ細胞を用いて生殖系列のキメラマウスを作製し、野生型マウスと交配させて得られるヘテロ接合体マウス（Ｆ１：雑種第一代）同士を交配させることによって、メンデルの法則に従い産生するホモ接合体のＴＬＲ３  Ｔｇマウスを作製することができる。このようにして得られたＴＬＲ３  Ｔｇマウスは、体内の様々な臓器において、ＴＬＲ３を構成的に過剰発現する。過剰発現とは、例えばＴＬＲ３  Ｔｇマウスの組織や細胞におけるＴＬＲ３  ｍＲＮＡやＴＬＲ３タンパクの発現量が、野生型マウスの組織や細胞における発現量と比較して、２倍以上増加している状態と定義される。
【００２８】
さらに、研究上注目すべき遺伝子を欠損又は導入させた遺伝子改変マウスなどの、遺伝的背景の異なるマウスと、ＴＬＲ３  Ｔｇマウスを交配させることによって、注目すべき遺伝的背景を持ち、且つＴＬＲ３を構成的に過剰発現する遺伝子改変マウスを作製することもできる。
【００２９】
本発明はヒト治療薬となり得るＴＬＲ３アゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニングへの使用を考慮し、ヒトＴＬＲ３遺伝子を導入したところに特徴がある。また、現在ＴＬＲ３のリガンドとしてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）が使用されているが、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）はＴＬＲ３に特異的なリガンドではなく他の経路（ＲＩＧ／ＭＤＡ５経路）も同時に活性化する。しかもこれらＲＩＧ／ＭＤＡ５経路とＴＬＲ３経路はその下流で共通する転写因子を活性化することが知られており、誘導する遺伝子にも重なりがあるため、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）をリガンドとしてＴＬＲ３欠損マウスを解析する従来の方法では、ＴＬＲ３の本来の役割を解析することは困難である。例えばＴＬＲ３の役割がＲＩＧ／ＭＤＡ５経路によって補われる場合や両経路が互いに影響を及ぼし合う場合などは、単純にＴＬＲ３欠損マウスを解析しても明確な異常が観察できない。しかしながら本発明のようにＴＬＲ３を過剰に発現し、ＴＬＲ３依存的なシグナル経路を過剰に増幅する方法では、特異的なリガンドが存在しない現状でもＴＬＲ３の本来の役割を明確に解析できる。
【００３０】
（細胞株の樹立）
野生型マウスやＴＬＲ３  Ｔｇマウスから細胞を採取する。細胞は、目的に応じてマウスの臓器のいずれから採取してもよく、肝臓、肺、膵臓、腸、脾臓、心臓、腎臓、脳、皮膚、腹腔内、骨髄、血液、その他、体の如何なる部分から単離した細胞でも構わない。また、ＭＥＦ（ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、マウス胎児繊維芽細胞）も好適に使用可能である。採取した細胞は、そのまま使用することも可能であるが、ＥＢＶ（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）などのがんウイルスを感染させたり、ＳＶ４０  Ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原遺伝子などのがん遺伝子を導入することにより不死化、株化することが好ましい。または長期培養により不死化してもよい。株化することにより、細胞を安定的に、また大量に使用することが可能となる。
【００３１】
（ＴＬＲ３のアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング）
薬物受容体と相互作用して全活性の細胞内シグナル伝達を引き起こす物質をアゴニストという。また、アゴニストと拮抗的に作用してその作用を減弱させる物質をアンタゴニストという。アンタゴニストのうち、受容体に作用して、弱いながら部分活性を発現させる物質をパーシャルアゴニストという。近年、内因性リガンドや薬物の影響を受けずに構成的な部分活性を発現している受容体が見出されている。このような構成的受容体活性を減弱させる物質はインバースアゴニストと呼ばれている。本発明において、「アゴニスト又はアンタゴニスト」の用語は、これらのアゴニスト、アンタゴニスト、パーシャルアゴニスト及びインバースアゴニストを含む。
【００３２】
本発明は、ＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来の細胞株及び対照細胞株に、試験物質を投与するステップと、任意選択でＴＬＲ３リガンドを投与するステップと、当該細胞株と対照細胞株で、ＴＬＲ３の下流の遺伝子又はその遺伝子により発現されたタンパクの発現量を測定するステップと、当該遺伝子の発現量が有意に異なる場合に、試験物質がＴＬＲ３のアゴニスト又はアンタゴニストであると判定し、当該試験物質を選択するステップと、を含む、ＴＬＲ３のアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法に関する。
【００３３】
本発明において、「対照細胞株」の用語は、陽性対照を指す場合と陰性対照を指す場合がある。すなわち、試験物質若しくはＴＬＲ３リガンドを投与した、あるいは投与していない、野生型マウス由来の細胞株を指す場合がある。また、試験物質若しくはＴＬＲ３リガンドを投与した、あるいは投与していない、ＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来の細胞株を指す場合がある。
【００３４】
本発明において、「細胞」の用語は不死化された「細胞株」を指す場合と、プライマリの細胞を指す場合がある。プライマリの細胞とは、生体から採取した初代細胞のことをいう。
【００３５】
野生型マウス由来の細胞、及びＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来の細胞を９６ウェルプレートなどに接種し、例えばＭＥＦの場合、１時間から２４時間、好ましくは約５時間培養する。続いて、候補となる試験物質を培地に添加し、例えばｍＲＮＡの誘導を測定する場合、目的に応じて１時間から２４時間、好ましくは約４時間刺激する。また、例えばＥＬＩＳＡで評価する場合、目的に応じて１時間から２４時間、好ましくは約２４時間刺激する。この時に試験物質と共にＴＬＲ３のリガンドを添加してもよい。試験物質とＴＬＲ３のリガンドは目的に応じて同時に添加してもよいし、時間差を設けて別々に添加してもよいが、まず試験物質を添加し、１時間から２４時間、好ましくは約１時間培養した後にＴＬＲ３のリガンドを添加することがより好ましい。後者の場合、ＴＬＲ３のリガンドを添加後１時間から２４時間、好ましくは約１時間刺激するとよい。
【００３６】
ここで、試験物質とは、ＴＬＲ３のアゴニスト又はアンタゴニストの候補となる物質であり、低分子化合物、抗体、抗体断片、抗体誘導体、レクチン及びアプタマーが例示できる。低分子化合物の供給源としては例えば市販の化合物ライブラリを利用することができる。また、ＴＬＲ３を抗原とする抗体、抗体断片、抗体誘導体及びアプタマー並びにレクチンなども試験物質として好適である。
【００３７】
試験物質の濃度は培地中の終濃度で１ｎＭから１ｍＭが好ましく、１０ｎＭから１００μＭがより好ましく、１００ｎＭから１０μＭが更に好ましい。
【００３８】
ＴＬＲ３リガンドとしては、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）が好適である。Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）はＴＬＲ３のみに特異的なリガンドではないものの、現在知られた物質の中では最も効率よくＴＬＲ３を刺激することができる。ＴＬＲ３特異的なリガンドが発見された場合には、その物質も好適に使用することができる。ＴＬＲ３リガンドとしてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を使用する場合の添加量は、培地中の終濃度で０μｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌが好ましく、１μｇ／ｍｌから５００μｇ／ｍｌがより好ましく、１０μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌが更に好ましい。
【００３９】
続いてＴＬＲ３の下流の遺伝子又はその遺伝子により発現されたタンパクの発現量を測定する。発現量を測定する対象は、炎症性サイトカインやケモカインであることが好ましく、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、Ｐｔｇｓ２、Ｈｂｂ−ｂｈ１、ＩＬ−１α、Ｓａａ１、ＩＬ−１９、ＩＬ−１２ａ、Ｈａｓ１、ＣＸＣＬ２、Ｓａａ３、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ２、ＣＸＣＬ１、ＩＬ−１２Ｒβ１、ＩＬ−１７、ＩＬ−１０、ＣＣＬ７、Ｎｆｋｂｉｚ、Ｔｎｆからなる群から選ばれる少なくとも１つであることがより好ましく、ＩＬ−６又はＩＬ−１２ｐ４０であることが更に好ましい。後述するように、発明者らは、本発明において、これらの遺伝子がＴＬＲ３の下流で発現誘導されることを明らかにした。
【００４０】
ＴＬＲ３の下流の遺伝子又はその遺伝子により発現されたタンパクの発現量は、ＲＴ−ＰＣＲなどによって遺伝子レベルで測定してもよく、細胞内や培養上清中における発現をタンパクレベルで測定してもよい。タンパクレベルでの測定には、ＥＬＩＳＡ法や、ＦＡＣＳなどが使用可能である。
【００４１】
野生型マウス由来の細胞、及びＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来の細胞で、ＴＬＲ３の下流の遺伝子又はその遺伝子により発現されたタンパクの発現量が有意に異なる場合に、試験物質がＴＬＲ３のアゴニスト又はアンタゴニストであると判定し、試験物質を選択する。ここで「有意に異なる」とは、統計学的に有意な差が存在することを意味しており、Ｔ検定において有意水準ｐ＜０．０５の場合に有為差が存在すると判断する。また、「ＴＬＲ３の下流の遺伝子又はその遺伝子により発現されたタンパクの発現量が有意に異なる」とは、野生型マウス由来の細胞及びＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来の細胞で、注目するＴＬＲ３の下流の複数の遺伝子又はそれらの遺伝子により発現されたタンパクの発現上昇及び発現減少のパターンが異なる場合を含む。すなわち、ＴＬＲ３に作用して、弱いながら部分活性を発現させる場合を含む。このステップで多数の候補をスクリーニングすることが好ましい。
【００４２】
試験物質がＴＬＲ３のアンタゴニストであった場合、ＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来の細胞に試験物質を投与した後にＴＬＲ３リガンドを投与すると、試験物質を投与せずにＴＬＲ３リガンドを投与したＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来の細胞と比較して、ＴＬＲ３の下流の遺伝子又はその遺伝子により発現されたタンパクの発現が有意に抑制される場合がある。このことを指標として、アンタゴニストをスクリーニングすることが可能である。
【００４３】
また、試験物質がＴＬＲ３のアンタゴニストであった場合、ＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来の細胞に試験物質とＴＬＲ３リガンドを同時に投与すると、両者が競合し、この場合においても、試験物質を投与せずにＴＬＲ３リガンドを投与したＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来の細胞と比較して、ＴＬＲ３の下流の遺伝子又はその遺伝子により発現されたタンパクの発現が有意に抑制される場合がある。このことを指標として、アンタゴニストをスクリーニングすることが可能である。
【００４４】
次に、得られたいくつかのアゴニスト又はアンタゴニストの候補の試験物質を、マクロファージなどのプライマリの細胞に投与して、ＴＬＲ３の下流の遺伝子又はその遺伝子により発現されたタンパクの発現を検討し、更に候補を絞る。プライマリの細胞でスクリーニング時に得られた結果を再確認できるものを候補としてもよい。このような手順を踏むことによって、試験物質をより正確に評価することができる。
【００４５】
アゴニスト又はアンタゴニストの候補の試験物質による刺激を、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激と比較し、誘導される遺伝子の発現量、誘導される遺伝子の種類、誘導の経時的変化、反応する細胞の種類、ＴＬＲ３の経路に対する特異性などを検討し、更に候補を限定する。
【００４６】
ＴＬＲ３のアゴニストをスクリーニングする場合には、ＴＬＲ３のシグナル経路を特異的に活性化するものを選定する。ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスで応答が強いだけでなくＴＬＲ３  ＫＯマウスで全く応答が見られなくなることが好ましい。
【００４７】
続いて、得られたアゴニスト又はアンタゴニストの候補の試験物質について個体レベルで検討を行う。ＴＬＲ３のアゴニストを検討する場合には、試験物質の投与による影響を、既存のＴＬＲ３のリガンドであるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の投与による影響と比較し、どのような遺伝子が誘導されるか、どのような免疫応答が起こるか、抗ウイルス作用があるか、自己免疫疾患又は癌に対する治療効果があるか、副作用があるか、刺激の程度、刺激の持続がどうであるかについて検討する。また、ＴＬＲ３のアンタゴニストを検討する場合には、試験物質をＴＬＲ３のリガンドと同時に作用させて、上記と同様の検討を行う。
【００４８】
（ＴＬＲ３のアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング）
本発明はまた、上記のＴＬＲ３  Ｔｇマウス及び対照マウスに、候補となる試験物質を投与するステップと、疾患を発症させるステップと、疾患の程度を測定するステップと、遺伝子導入マウスと対照マウスで疾患の程度が有意に異なる場合に、試験物質がＴＬＲ３のアゴニスト又はアンタゴニストであると判定し、選択するステップを含む。
【００４９】
試験物質のマウスへの投与方法としては、食餌として与える方法、注射により腹腔内や血液中に導入する方法、経鼻投与などが挙げられる。あるいは、ＴＬＲ３  Ｔｇマウスから採取した腹腔内マクロファージや、骨髄から採取した血球細胞などを含む培地中に試験物質を添加してもよい。
【００５０】
疾患を発症させる方法は、例えばコクサッキーウイルスＢ群（ＣＶＢ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＳＶ）などのウイルスをマウスに腹腔内投与、静脈注射、経鼻投与、経口投与する方法などが挙げられる。または、特徴的な遺伝的背景を持つ疾患モデルマウスと本発明のＴＬＲ３  Ｔｇマウスを交配して得られたマウスを、疾患が発症する週齢まで飼育したり、疾患を発症させ得る薬剤を投与するなど、その疾患が発症する様々な処置を加える方法が挙げられる。疾患としては、感染症、自己免疫疾患、癌などが挙げられる。ＴＬＲ３はこれらの疾患と関連する可能性が高いため、これらの疾患を発症させてスクリーニングを行うことで、ＴＬＲ３のアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング効率を高めることができ、医薬品の効率的な開発が可能になることが期待できる。
【００５１】
疾患の程度を測定する方法は、発症させた疾患の種類による。例えばＣＶＢやＥＭＣＶを感染させた場合は、血中のウイルスタイターを測定したり、心臓切片や肝臓切片をＨＥ（ヘマトキシリン・エオシン）染色して傷害の程度を評価したり、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）−１２ｐ４０、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、などの血中濃度やｍＲＮＡ発現レベルを測定したり、マウスの死亡率を観察するなどの方法が挙げられる。
【００５２】
上記の方法によって評価した疾患の程度が、ＴＬＲ３  Ｔｇマウスと対照マウスで有意に異なる場合に、試験物質がＴＬＲ３のアゴニスト又はアンタゴニストであると判定し、選択することにより、ＴＬＲ３のアゴニスト又はアンタゴニストをスクリーニングすることができる。
【実施例】
【００５３】
以下、本発明の実施例を示して、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される物ではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲での種々の変更が可能である。
【００５４】
（ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスの作製）
発明者らは、トリβ−アクチン遺伝子プロモーターの下流にｈｕＴＬＲ３  ｃＤＮＡを接続した発現ベクターを作製した（図１、２、配列番号３、４）。この発現ベクターを、マウス受精卵に導入し、２つのｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス系統を得た。サザンブロット解析の結果、導入遺伝子のコピー数は系統２で約５６、系統６で約２３であることがわかった（図３）。
【００５５】
（ｈｕＴＬＲ３遺伝子の発現解析）
系統２のｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス及び野生型マウスにおけるｈｕＴＬＲ３  ｍＲＮＡの臓器別の発現をノーザンブロット解析により検討した。その結果、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスにおいては心臓で最も強い発現が見られた。また、腎臓、肝臓、脾臓、胸腺などのその他の臓器においても野生型マウスと比較して顕著に高いｈｕＴＬＲ３  ｍＲＮＡの発現が観察された（図４）。
【００５６】
（ｈｕＴＬＲ３タンパクの発現解析）
ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスと野生型マウスから腹腔内マクロファージを採取し、腹腔内マクロファージにおけるタンパクレベルでのｈｕＴＬＲ３の発現をウェスタンブロッティングにより解析した。図１、図２に示すように、本発明においてマウスに導入したｈｕＴＬＲ３遺伝子には、その３’末端側にＦＬＡＧタグをコードする遺伝子断片が連結されていた。したがって、抗ＦＬＡＧタグ抗体を用いてｈｕＴＬＲ３遺伝子の発現を検出することができる。抗ＦＬＡＧタグ抗体（ＳＩＧＭＡ社  Ａ８５２９）及び陽性対照として、抗β−アクチン抗体（ＳＩＧＭＡ社  Ａ５４４１）を用いて、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスと野生型マウスから採取した腹腔内マクロファージ由来のタンパクをサンプルとした、ウェスタンブロッティング解析を行った。その結果、ｈｕＴＬＲ３  ＴｇマウスにおいてはタンパクレベルでもｈｕＴＬＲ３が発現していることが確認できた（図５）。
【００５７】
（ＩＬ−１２ｐ４０の産生のＥＬＩＳＡによる解析）
得られた２系統のｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス及び野生型マウスから腹腔内マクロファージを採取した。これらのマクロファージにＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激（１００μｇ／ｍｌ）を行い、ＩＬ−１２ｐ４０の産生をＥＬＩＳＡにより測定した。その結果、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来腹腔内マクロファージでは、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激に対するＩＬ−１２ｐ４０の産生が増強された（図６）。
【００５８】
続いて、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスと野生型マウス由来の腹腔内マクロファージに、各種ＰＡＭＰｓ（Ｐａｔｈｏｇｅｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎ、宿主免疫活性化作用をもつ微生物成分）刺激を加え、培養上清中のＩＬ−１２ｐ４０の濃度をＥＬＩＳＡにて測定したところ、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来マクロファージにおいて、ＴＬＲ４のリガンドであるＬＰＳ（ＳＩＧＭＡ社  Ｌ２８８０）及びＴＬＲ９のリガンドであるＣｐＧ−Ｂ（北海道システムサイエンス社に合成依頼したＳ化オリゴヌクレオチド、塩基配列は配列番号２１に記載）刺激に対しては野生型マウスと同程度のＩＬ−１２ｐ４０が産生されたが、ＴＬＲ３のリガンドであるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）に対しては、顕著な産生増強が観察された（図７）。
【００５９】
（ＣＶＢウイルス感染による心臓の傷害）
ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス、ＴＬＲ３ノックアウトマウス（ＴＬＲ３  ＫＯマウス）（大阪大学医学部、審良静男先生より分与）及び野生型マウスに、腹腔内注射によりＣＶＢ  ５×１０４ｐｆｕ／匹を感染させた。感染から７日後に心臓を摘出し、４％パラフォルムアルデヒド固定し、パラフィン包埋して心臓標本を作製した。続いてクリオスタットを用いて心臓標本の切片を作製し、ＨＥ染色し、傷害の度合いを観察した。
【００６０】
その結果、ＴＬＲ３  ＫＯマウスの心臓では野生型マウスと比較して顕著な炎症性細胞の浸潤がみられた。これに対し、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスの心臓ではそのような細胞浸潤は認められなかった。この結果から、ＴＬＲ３はＣＶＢの感染に対する抵抗性に関与していることが確認された（図８）。
【００６１】
（血中ＣＶＢウイルスタイターの測定）
ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス及び野生型マウスに、腹腔内注射によりＣＶＢを感染させた。感染から２日後に採血し、血中のＣＶＢウイルスタイターを測定した。ウイルスタイターの測定はＶｅｒｏ細胞を用いたプラークアッセイにより測定した。その結果、野生型マウスでは１×１０６ｐｆｕ／ｍｌ以上のウイルスが血中から検出されたのに対し、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスでは検出限界以下であった（図９）。
【００６２】
（ＣＶＢの感染におけるＩＬ−１２ｐ４０遺伝子の発現解析）
ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス、ＴＬＲ３  ＫＯマウス及び野生型マウス由来のマクロファージにＣＶＢを感染させ、ＩＬ−１２ｐ４０  ｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した。ＱＩＡＧＥＮ社ＲＮｅａｓｙ（７４１０６）を用いて抽出したＲＮＡからＱＩＡＧＥＮ社Ｑｕａｎｔｉｔｅｃ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ（２０５３１３）を用いてｃＤＮＡを合成し、Ｒｏｃｈｅ社ｓｙｂｅｒｇｒｅｅｎ１（０４８８７３５２００１）および同社ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  ４８０装置を用いて定量的ＰＣＲを行った。図１０に結果を示す。対照遺伝子をグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）とし、ＩＬ−１２ｐ４０  ｍＲＮＡの発現量を、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量との相対値として表示した。ＩＬ−１２ｐ４０  ｃＤＮＡの増幅には、配列番号５及び６に記載する塩基配列のプライマーを使用した。また、ＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡの増幅には、配列番号９及び１０に記載する塩基配列のプライマーを使用した。その結果、ＴＬＲ３  ＫＯマウス由来マクロファージではＩＬ−１２ｐ４０  ｍＲＮＡの発現が野生型と比べて減少していた（図１０）。一方、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来マクロファージにおいて、ＩＬ−１２ｐ４０  ｍＲＮＡの発現の増強が見られた（図１０）。以上のことから、ＴＬＲ３は、ＩＬ−１２ｐ４０  ｍＲＮＡの発現に関与していることが確認された。
【００６３】
（不活化ＣＶＢの感染におけるＩＬ−１２ｐ４０遺伝子の発現解析）
ＴＬＲ３のウイルス認識メカニズムを解明するため、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス及び野生型マウス由来のマクロファージに、ＣＶＢ又はＵＶ照射により不活化したＣＶＢを感染させ、６時間後にＩＬ−１２ｐ４０  ｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した。図１１に結果を示す。ＩＬ−１２ｐ４０  ｍＲＮＡの発現量を、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量との相対値として表示した。その結果、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来マクロファージにおいて、不活化したＣＶＢを感染させた場合においてもＩＬ−１２ｐ４０  ｍＲＮＡの発現に増強が見られた（図１１）。このことから、ＴＬＲ３はウイルス複製時の二本鎖ＲＮＡ以外の物質も認識する可能性が示された。
【００６４】
（ＥＭＣＶウイルス感染実験）
ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス、ＴＬＲ３  ＫＯマウス及び野生型マウスに腹腔内注射によりＥＭＣＶウイルス  １×１０４ｐｆｕ／匹を感染させ、マウスの生死を観察した。その結果、ＴＬＲ３  ＫＯマウスでは野生型マウスよりも早期に死亡が観察された。また、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスは野生型マウスよりも長期間生存した（図１２）。
【００６５】
（ＥＭＣＶ感染におけるＩＬ−１２ｐ４０遺伝子の発現解析）
ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス及び野生型マウス由来のマクロファージにＥＭＣＶを感染させ、ＩＬ−１２ｐ４０  ｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した。図１３に結果を示す。ＩＬ−１２ｐ４０  ｍＲＮＡの発現量を、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量との相対値として表示した。その結果、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来のマクロファージにおいて、ＩＬ−１２ｐ４０  ｍＲＮＡの発現の増強が観察された（図１３）。以上の結果から、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスのウイルスに対する抵抗性、及びＩＬ−１２ｐ４０  ｍＲＮＡの発現については、ＣＶＢだけでなく脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）に対しても観察されることがわかった。
【００６６】
（ＴＬＲ３の下流のシグナル伝達機構のマイクロアレイ解析）
ＴＬＲ３の下流のシグナル伝達機構を解明するため、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス、及び野生型マウス由来マクロファージをＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）で刺激し、６時間後にＲＮＡを抽出した。このＲＮＡを用いて、マイクロアレイ解析を行った。表１に、各遺伝子の、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスにおける発現量を、野生型マウスにおける発現量に対する変化倍率（ｆｏｌｄ  ｉｎｃｅｒａｓｅ）で示す。その結果、野生型マウス及びｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスにおいて、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ（ＩＦＮ）−β１、ＩＦＮ−αＢ、ＩＦＮ−α１、ＩＲＦ−１、Ｏａｓ１ｃ、ＩＦＮ−α４、ＩＲＦ−５、ＩＦＮ−α９、ＩＦＮ−α５などの、Ｉ型インターフェロン及びその誘導遺伝子の発現に顕著な変化は認められなかった。
【００６７】
一方、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスにおいて、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、Ｐｔｇｓ２、Ｈｂｂ−ｂｈ１、ＩＬ−１α、Ｓａａ１、ＩＬ−１９、ＩＬ−１２ａ、Ｈａｓ１、ＣＸＣＬ２、Ｓａａ３、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ２、ＣＸＣＬ１、ＩＬ−１２Ｒβ１、ＩＬ−１７、ＩＬ−１０、ＣＣＬ７、Ｎｆｋｂｉｚ、Ｔｎｆなどの、炎症性サイトカイン及びケモカインの発現の増強が観察された（表１）。
【００６８】
【表１】
2009207467.tif 000002
【００６９】
（ＴＬＲ３の下流のシグナル伝達機構の定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析）
ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス、ＴＬＲ３  ＫＯマウス及び野生型マウス由来のマクロファージをＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）で刺激後、定量的ＲＴ−ＰＣＲによりｍＲＮＡ誘導を確認した。図１４に結果を示す。ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＦＮ−β１  ｍＲＮＡの発現量を、それぞれＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量との相対値として表示した。ＩＬ−６  ｃＤＮＡの増幅には、配列番号１１及び１２に記載する塩基配列のプライマーを使用した。また、ＩＦＮ−β１  ｃＤＮＡの増幅には、配列番号７及び８に記載する塩基配列のプライマーを使用した。その結果、マイクロアレイ解析の結果が裏付けられ、ＩＦＮ−β１  ｍＲＮＡの誘導はｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス、ＴＬＲ３  ＫＯマウス共に、野生型マウスと顕著な変化が認められなかったのに対し、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０  ｍＲＮＡの発現はＴＬＲ３  ＫＯマウスで減少し、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスで増強した（図１４）。従来、ＴＬＲ３下流のシグナル経路は、リガンドの刺激によってＩ型ＩＦＮを産生することに重要であると言われていたが、以上の結果から、ＴＬＲ３下流のシグナル経路はＩ型ＩＦＮの産生には関与せず、むしろ炎症生サイトカイン及びケモカインの誘導に重要である可能性が示された。
【００７０】
（ＡＲ１  ＫＯ／ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスを用いたＣＶＢ感染実験）
シグナル伝達機構の解明を更に進めるため、Ｉ型ＩＦＮレセプター欠損マウス（ＡＲ１  ＫＯマウス）を用いて実験を行った。ＡＲ１  ＫＯマウスはＢ＆Ｋ社より購入した。ＡＲ１  ＫＯ／ｈｕＴＬＲ３  ＴｇマウスはＡＲ１  ＫＯマウスとｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスを交配して得られたＡＲ１  ＋／−  ／ＴＬＲ３Ｔｇ  マウスを、更にＡＲ１ＫＯマウスと掛け合わせて作成した。ＡＲ１  ＫＯマウス及びＡＲ１  ＫＯ／ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスに、腹腔内注射によりＣＶＢ  １０００ｐｆｕ／匹を感染し生死を観察したところ、ＡＲ１  ＫＯマウスは２〜４日で死亡したのに対し、ＡＲ１  ＫＯ／ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスは死亡しなかった（図１５）。
【００７１】
（ＣＶＢ感染による肝臓の傷害）
ＡＲ１  ＫＯマウス、ＡＲ１  ＋／−マウス及びＡＲ１  ＫＯ／ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスに腹腔内注射によりＣＶＢ  １０００ｐｆｕ／匹を感染させた。２日後に肝臓を摘出し、パラフォルムアルデヒド固定し、パラフィン包埋して肝臓標本を作製した。続いてクリオスタットを用いて肝臓標本の切片を作製し、ＨＥ染色して傷害の度合いを観察したところ、ＡＲ１  ＫＯマウス由来の肝臓細胞には顕著な傷害が見られたのに対し、ＴＬＲ３  Ｔｇマウスの肝臓にはそのような障害は認められなかった（図１６）。
【００７２】
（血中ＣＶＢウイルスタイターの測定）
さらに、ＡＲ１  ＫＯマウス及びＡＲ１  ＫＯ／ＴＬＲ３  Ｔｇマウスに、腹腔内注射によりＣＶＢ  １０００ｐｆｕ／匹を感染させた。感染から２日後に採血し、血中のＣＶＢウイルスタイターを測定したところ、ＡＲ１  ＫＯマウスでは１×１０８ｐｆｕ／ｍｌ以上のウイルスが血中から検出されたのに対し、ＡＲ１  ＫＯ／ＴＬＲ３  Ｔｇマウスではその１／１００以下のウイルスしか検出されなかった（図１７）。
【００７３】
（ＣＶＢ感染後の血液中ＧＰＴ濃度及びＧＯＴ濃度の解析）
ウイルス感染後の肝臓傷害の程度をグルタミン酸ピルビン酸転移酵素（Ｇｌｕｔａｍｉｃ  Ｐｙｒｕｖｉｃ  Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ；ＧＰＴ）及びグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（Ｇｌｕｔａｍｉｃ  Ｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ；ＧＯＴ）の血中濃度の測定により検討した。これらの酵素の血中濃度は肝細胞の傷害の程度に応じて上昇することが知られている。
【００７４】
野生型マウス、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス、ＡＲ１  ＫＯマウス及びＡＲ１  ＫＯ／ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスに、腹腔内注射によりＣＶＢ  １０００ｐｆｕ／匹を感染させた。感染から２日後に血中のＧＰＴ濃度及びＧＯＴ濃度を測定した。測定はＳＲＬ社に外注した。その結果、ＡＲ１  ＫＯ／ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス  はＡＲ１  ＫＯマウスと比較して１／４程度のＧＰＴ濃度及びＧＯＴ濃度を示した（図１８）。
【００７５】
（ＣＶＢ感染後のマイクロアレイ解析）
ＡＲ１  ＫＯマウス及びＡＲ１  ＫＯ／ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスに、腹腔内注射によりＣＶＢ  １０００ｐｆｕ／匹を感染させた。感染から２日後の肝臓からＲＮＡを抽出し、マイクロアレイ解析を行った。表２に、ＡＲ１  ＫＯ／ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスにおける発現量が、ＡＲ１  ＫＯマウスにおける発現量の２倍以上の変化倍率（ｆｏｌｄ  ｉｎｃｅｒａｓｅ）を示した遺伝子を示す。その結果、ＡＲ１  ＫＯ／ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスにおいて炎症性サイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−１βなど）、ケモカイン（ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ２）、ＩＦＮ−γ及びその誘導遺伝子（ＩＲＦ１、Ｇｂｐ１、Ｇｂｐ３、Ｇｂｐ６、ＩＲＦ８）の高発現が見られた（表２）。
【００７６】
【表２】
2009207467.tif 000003
【００７７】
（ＣＶＢ感染後の定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析）
ＡＲ１  ＫＯ及びＡＲ１  ＫＯ／ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスに、腹腔内注射によりＣＶＢ  １０００ｐｆｕ／匹を感染させ、２日後の肝臓からＲＮＡを抽出し、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、各遺伝子の発現を確認した。図１９に感染なしの個体（−）、及び感染ありの２個体（＃１、＃２）の結果を示す。各遺伝子の発現量を、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量との相対値として表示した。ＣＣＬ２  ｃＤＮＡの増幅には、配列番号１３及び１４に記載する塩基配列のプライマーを使用した。ＣＸＣＬ１０  ｃＤＮＡの増幅には、配列番号１５及び１６に記載する塩基配列のプライマーを使用した。ＩＦＮ−γ  ｃＤＮＡの増幅には、配列番号１７及び１８に記載する塩基配列のプライマーを使用した。ＩＲＦ１  ｃＤＮＡの増幅には、配列番号１９及び２０に記載する塩基配列のプライマーを使用した。その結果、マイクロアレイ解析と同様の結果が得られた（図１９）。
【００７８】
以上のことから、ＴＬＲ３下流のシグナル経路は、Ｉ型ＩＦＮの誘導には関与せず、炎症性サイトカイン及びケモカインの誘導に重要であり、Ｉ型ＩＦＮによらない機構でウイルスに対する抵抗性を示すことが明らかとなった。
このような知見はこれまでに報告がなく、本発明のｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスを実験材料に用いることによって初めて明らかにすることができた。ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスの作製の成功によって、ｈｕＴＬＲ３の免疫学的意義について新しい知見を得ることが可能となった。また、新しい免疫病や感染症などの治療薬の開発が可能となった。
【００７９】
（ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来細胞株の樹立）
野生型マウス同士、及びｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス同士を交配し、１４日齢の胎児を取り出してＭＥＦを採取した。これらの細胞を１０ｃｍディッシュ１枚あたり１×１０６個接種し、ＳＶ４０  Ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原遺伝子（ＡＴＣＣから入手）を、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（ロシュ社）を用いて導入した。４８時間後に細胞を１０ｃｍディッシュ１枚あたり１×１０６個の細胞密度で接種し直し、培地にＧ４１８（ＧＩＢＣＯ社より入手）を０．４μｇ／ｍｌの終濃度で添加して薬剤選択を行った。約１ヵ月後に薬剤耐性株のコロニーを回収し、野生型マウス及びｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来のＭＥＦ細胞株を各２０クローンずつ得た。これらのクローンを約１ヶ月継代培養し、増殖が衰えなかった野生型マウス及びｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来のＭＥＦ細胞株各２クローンずつを選択し、実験に用いた。
【００８０】
（ＭＥＦ細胞株におけるＩＬ−６の産生のＲＴ−ＰＣＲによる解析）
６ウェルプレートに、樹立した野生型マウス及びｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来のＭＥＦ細胞株各２クローンを１．５×１０５個／ウェルで接種した。培地には１０％ＦＣＳ（Ｆａｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ、ウシ胎児血清）を含むＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）を使用した。５時間後に、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を終濃度１００μｇ／ｍｌで培地に添加して刺激を開始した。更に６時間後に細胞を回収し、ＲＮＡを抽出した。定量的ＲＴ−ＰＣＲによりＩＬ−６  ｍＲＮＡの発現を確認した。図２０に野生型マウス由来のＭＥＦ細胞株２クローン（＃１、＃２）及びｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来のＭＥＦ細胞株２クローン（＃１、＃２）の解析結果のグラフを示す。ＩＬ−６  ｍＲＮＡの発現量を、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量との相対値として表示した。（−）はＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激を行わなかった細胞の結果を示し、（＋）はＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激を行った細胞の結果を示す。その結果、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来のＭＥＦ細胞株において、野生型マウス由来のＭＥＦ細胞株と比較して、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激によるＩＬ−６  ｍＲＮＡの発現が顕著に誘導されていることが明らかとなった。
【００８１】
（ＭＥＦ細胞株におけるＩＬ−６の産生のＥＬＩＳＡによる解析）
９６ウェルプレートに、樹立した野生型マウス及びｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来のＭＥＦ細胞株各２クローンを５×１０４個／ウェルで接種した。培地には１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地を使用した。５時間後に、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を終濃度１００μｇ／ｍｌで培地に添加して刺激を開始した。更に２４時間後に培養上清中のＩＬ−６をＥＬＩＳＡにより測定した。図２１に野生型マウス由来のＭＥＦ細胞株２クローン（＃１、＃２）及びｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来のＭＥＦ細胞株２クローン（＃１、＃２）の培養上清中のＩＬ−６の濃度のグラフを示す。（−）はＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激を行わなかった細胞の結果を示し、「ＰＩＣ」はＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激を行った細胞の結果を示す。その結果、野生型マウス由来のＭＥＦ細胞株ではほとんどＩＬ−６が産生されなかったが、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来のＭＥＦ細胞株において、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激によるＩＬ−６の産生が顕著に誘導されていることが明らかとなった。
【００８２】
（ＭＥＦ細胞株におけるＩＬ−６の産生のＥＬＩＳＡによる解析）
９６ウェルプレートに、樹立した野生型マウス及びｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来のＭＥＦ細胞株各２クローンを５×１０４個／ウェルで接種した。培地には１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地を使用した。５時間後に、終濃度１００μｇ／ｍｌのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、終濃度１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ及び終濃度３μＭのＣｐＧ−Ｂをそれぞれ培地に添加して刺激を開始した。更に２４時間後に培養上清中のＩＬ−６をＥＬＩＳＡにより測定した。図２２に野生型マウス由来のＭＥＦ細胞株及びｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来のＭＥＦ細胞株の培養上清中のＩＬ−６の濃度のグラフを示す。（−）は刺激を行わなかった細胞の結果を示す。「ＰＩＣ」はＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激、「ＬＰＳ」はＬＰＳ刺激、「ＣｐＧ−Ｂ」はＣｐＧ−Ｂ刺激を行った細胞の結果を示す。その結果、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来のＭＥＦ細胞株において、野生型マウス由来のＭＥＦ細胞株と比較して、ＴＬＲ３のリガンドであるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激によるＩＬ−６の産生が顕著に誘導されていることが明らかとなった。また、ＴＬＲ４のリガンドであるＬＰＳによる刺激及びＴＬＲ９のリガンドであるＣｐＧ−Ｂによる刺激では、野生型マウス由来のＭＥＦ細胞株とｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来のＭＥＦ細胞株において、刺激によるＩＬ−６の産生量には顕著な差は認められなかった。
【００８３】
これらの細胞株を用いてＩＬ−１２ｐ４０やＩＬ−６などの発現誘導を指標にすることにより、ＴＬＲ３のアゴニストやアンタゴニストを効率的にスクリーニングすることが可能となった。ＴＬＲ３をターゲットとした医薬品は、効果が期待されながら実質的に開発が進んでいるものがほとんど存在していなかったが、このスクリーニング系はＴＬＲ３をターゲットとした、自己免疫疾患、感染症、癌の治療薬などの開発につながる有効なツールとなることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図１は、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス作製のための発現ベクターの説明図である。
【図２】図２は、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス作製のための発現ベクターの説明図である。
【図３】図３は、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスに導入されたｈｕＴＬＲ３遺伝子のコピー数を解析したサザンブロット解析の結果を表す写真である。
【図４】図４は、野生型マウス及びｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスの各臓器におけるｈｕＴＬＲ３遺伝子の発現を解析したノーザンブロット解析の結果を表す写真である。
【図５】図５は、野生型マウス及びｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスの腹腔内マクロファージにおけるｈｕＴＬＲ３タンパクの発現を解析したウェスタンブロッティング解析の結果を表す写真である。
【図６】図６は、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）で刺激後の腹腔内マクロファージによるＩＬ−１２ｐ４０タンパクの産生を解析したＥＬＩＳＡ解析の結果を表すグラフである。
【図７】図７は、各種ＰＡＭＰｓで刺激後の腹腔内マクロファージによるＩＬ−１２ｐ４０タンパクの産生を解析したＥＬＩＳＡ解析の結果を表すグラフである。
【図８】図８は、ＣＶＢ感染７日後の野生型マウス、ＴＬＲ３  ＫＯマウス及びｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスの心臓の傷害を解析した結果を表す組織染色の写真である。
【図９】図９は、感染２日後のマウスの血中ＣＶＢウイルスタイターを解析した結果を表すグラフである。
【図１０】図１０は、マウス由来マクロファージにＣＶＢを感染させ、ＩＬ−１２ｐ４０のｍＲＮＡの発現誘導を解析した結果を表すグラフである。
【図１１】図１１は、マウス由来マクロファージに不活化ＣＶＢを感染させ、ＩＬ−１２ｐ４０遺伝子の発現誘導を解析した結果を表すグラフである。
【図１２】図１２は、ＥＭＣＶウイルス感染後のマウスの生存率を表すグラフである。
【図１３】図１３は、マウス由来マクロファージにＥＭＣＶを感染させ、ＩＬ−１２ｐ４０のｍＲＮＡの発現誘導を解析した結果を表すグラフである。
【図１４】図１４は、マウス由来マクロファージをＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）で刺激し、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＦＮ−β１のｍＲＮＡの発現誘導を解析した結果を表すグラフである。
【図１５】図１５は、ＣＶＢ感染後のマウスの生存率を表すグラフである。
【図１６】図１６は、ＣＶＢ感染２日後のＡＲ１  ＫＯマウス、ＡＲ１  ＋／−マウス及びＡＲ１  ＫＯ／ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスの肝臓の傷害を解析した結果を表す組織染色の写真である。
【図１７】図１７は、感染２日後のマウスの血中ＣＶＢウイルスタイターを解析した結果を表すグラフである。
【図１８】図１８は、ＣＶＢ感染２日後のマウスの血中ＧＰＴ濃度及び血中ＧＯＴ濃度を解析した結果を表すグラフである。
【図１９】図１９は、ＣＶＢ感染２日後のマウスの肝臓における各遺伝子の発現を解析した結果を表すグラフである。
【図２０】図２０は、野生型マウス由来のＭＥＦ細胞株及びＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来のＭＥＦ細胞株におけるＩＬ−６の産生をＲＴ−ＰＣＲで解析した結果を表すグラフである。
【図２１】図２１は、野生型マウス由来のＭＥＦ細胞株及びＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来のＭＥＦ細胞株におけるＩＬ−６の産生をＥＬＩＳＡで解析した結果を表すグラフである。
【図２２】図２２は、野生型マウス由来のＭＥＦ細胞株及びＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来のＭＥＦ細胞株におけるＩＬ−６の産生をＥＬＩＳＡで解析した結果を表すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図１１】
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【図１６】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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