(57)【要約】【課題】微生物由来のエンドトキシンを含まないヒトチオレドキシンを産生することができる、低コストで簡便なヒトチオレドキシンの産生方法を提供すること。【解決手段】キク科植物葉緑体の形質転換用ベクター、キク科植物の葉緑体を形質転換することによりヒトチオレドキシンを発現させた葉緑体形質転換キク科植物、及びその製造方法、並びに前記形質転換キク科植物から抽出されたヒトチオレドキシンを含むヒトチオレドキシン含有組成物とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともヒトチオレドキシンの遺伝子及びキク科植物葉緑体ゲノム由来の遺伝子が組み込まれていることを特徴とするキク科植物（Asteraceae）の葉緑体形質転換用ベクター。
【請求項２】
前記キク科植物がレタス（Lactuca sativa L.）であることを特徴とする請求項１に記載の葉緑体形質転換用ベクター。
【請求項３】
前記葉緑体形質転換用ベクターが、２つのキク科植物葉緑体ゲノム由来の遺伝子を有し、これら２つの遺伝子の間に、少なくとも１種の制限酵素切断部位を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の葉緑体形質転換用ベクター。
【請求項４】
前記葉緑体形質転換用ベクターが、２つのキク科植物葉緑体ゲノム由来の遺伝子を有し、これらの遺伝子が、キク科植物の葉緑体ゲノム由来のリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ大サブユニット遺伝子とアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニット遺伝子であって、これら遺伝子の間で、葉緑体で機能するプロモーター及びターミネーターを有し、さらに前記プロモーターとターミネーターとの間にヒトチオレドキシンをコードする塩基配列を有することを特徴とする請求項1乃至３いずれか記載の葉緑体形質転換用ベクター。
【請求項５】
前記プロモーターがタバコ由来のｐｓｂＡプロモーターであって、前記ターミネーターがリボソームタンパク質Ｓ１６ターミネーターであることを特徴とする請求項４に記載の葉緑体形質転換用ベクター。
【請求項６】
前記キク科植物の葉緑体ゲノム由来のリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ大サブユニット遺伝子と前記タバコ由来のｐｓｂＡプロモーターの間に、タバコ葉緑体ゲノム由来のｒＲＮＡオペロンのプロモーターとｐｓｂＡ遺伝子のターミネーターを有し、さらに前記プロモーター及びターミネーターとの間に任意の外来遺伝子が挿入されていることを特徴とする請求項５に記載の葉緑体形質転換用ベクター。
【請求項７】
キク科植物（Asteraceae）の葉緑体に形質転換用ベクターを導入して形質転換することにより、該葉緑体においてヒトチオレドキシンが産生されていることを特徴とする形質転換キク科植物。
【請求項８】
前記キク科植物がレタス（Lactuca sativa L.）であることを特徴とする請求項７に記載の形質転換キク科植物。
【請求項９】
前記形質転換キク科植物の葉緑体における前記ヒトチオレドキシンの重量が、前記形質転換キク科植物の葉緑体中の可溶性タンパク質の１重量％以上であることを特徴とする請求項７又は８に記載の形質転換キク科植物。
【請求項１０】
請求項７乃至９いずれかに記載の形質転換キク科植物から抽出されたヒトチオレドキシンを含有するヒトチオレドキシン含有組成物。
【請求項１１】
前記ヒトチオレドキシン含有組成物が微生物由来のエンドトキシンを含まないことを特徴とする請求項１０に記載のヒトチオレドキシン含有組成物。
【請求項１２】
下記の段階を備えることを特徴とするヒトチオレドキシン産生形質転換キク科植物の製造方法であって、
（１）ヒトチオレドキシンの遺伝子を含有するキク科植物の葉緑体形質転換用ベクターを製造する段階
（２）前記ベクターを、キク科植物の葉緑体に導入する段階
前記工程（１）において製造されるベクターが、少なくともヒトチオレドキシンの遺伝子及び２つのキク科植物葉緑体ゲノム由来の遺伝子を有し、前記キク科植物葉緑体ゲノム由来の遺伝子が、キク科植物の葉緑体ゲノム由来のリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ大サブユニット遺伝子とアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニット遺伝子であって、これら遺伝子の間に、葉緑体で機能するプロモーター及びターミネーターを有し、さらに前記プロモーターとターミネーターとの間にヒトチオレドキシンをコードする塩基配列を有することを特徴とする製造方法。
【請求項１３】
前記プロモーターが、タバコ由来のｐｓｂＡプロモーターであって、前記ターミネーターが、リボソームタンパク質Ｓ１６ターミネーターであることを特徴とする請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記キク科植物の葉緑体ゲノム由来のリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ大サブユニット遺伝子と前記タバコ由来のｐｓｂＡプロモーターの間に、タバコ葉緑体ゲノム由来のｒＲＮＡオペロンのプロモーターとｐｓｂＡ遺伝子のターミネーターを有し、さらに前記プロモーター及びターミネーターとの間に任意の外来遺伝子が挿入されていることを特徴とする請求項１３に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キク科植物葉緑体の形質転換用ベクター、キク科植物の葉緑体を形質転換することによりヒトチオレドキシンを発現させた葉緑体形質転換キク科植物、及びその製造方法、並びに前記形質転換キク科植物から抽出されたヒトチオレドキシンを含むヒトチオレドキシン含有組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在の医薬品用タンパク質は、主に大腸菌を始めとする微生物により生産されている。しかし、微生物により生産されるタンパク質には、微生物由来エンドトキシンが含まれており、医薬品としての安全性に課題を有している。近年、この課題を克服するための試みとして、植物を用いた外来タンパク質の生産が検討されている。植物を用いた外来タンパク質の生産は、微生物による生産に比べて、得られるタンパク質がエンドトキシンフリーであるため安全性に優れ、また低い生産コストにより省エネルギーで環境調和型である等の多くの優位性を有している。植物体中の葉緑体は、特に高濃度に外来タンパク質を貯蔵できる器官であることから、外来タンパク質を生産させる最適な場所と考えられ、タバコ、ジャガイモ、ダイズ、レタス等でその形質転換方法が確立されている（特許文献１参照。）。これらのうちタバコは、ニコチンを蓄積するために食用及び医療用には不適であり、ジャガイモおよびダイズも葉は食用ではない。これらは、高レベルの管理が可能となる水耕栽培技術が完全には確立されておらず、医薬品レベルでの品質管理に難がある。一方、レタスは、葉に毒性代謝物等が存在しない葉菜植物であり、また植物工場での栽培方法も確立されていることから、医薬用を含む外来タンパク質を生産させる植物として最適である。
【０００３】
近年、医薬品としての応用が期待されているタンパク質の一つとして、ヒトチオレドキシン（ｈＴｒｘ）が挙げられる。ｈＴｒｘは、酸化／還元を制御する生体内タンパク質であり、糖尿病をはじめとする生活習慣病、虚血性灌流障害、肺障害など、酸化ストレスが関与する障害や疾患に対する防御効果を有するため、医薬品としての応用が期待されている。しかし現在、ｈＴｒｘは、大腸菌を使って生産されている（特許文献２参照）。そこで、ｈＴｒｘのより安全で低コストでの生産方法の確立が課題となっている。
【０００４】
より安全で低コストでｈＴｒｘ生産を実現するためには、葉緑体中にｈＴｒｘを産生するように形質転換したレタスを開発し、その葉からｈＴｒｘを抽出する技術を確立する必要がある。しかし、植物の形質転換を目的とした葉緑体への遺伝子導入は、これまでのところタバコを用いたケースが多く、他の植物での実施例は少ない。タバコ以外の植物を用いた先行技術では、大腸菌から取り出したタンパク質産生ＤＮＡを、キク科植物（レタスを含む）の葉緑体ゲノム中に導入し、その発現を確認している（特許文献３）。しかし、同種植物のＤＮＡを導入する形質転換においても、遺伝子置換効率は十分に高くないのが現状である。そのため高効率で遺伝子を置き換えられる技術（例えば高効率遺伝子転換が可能な形質転換用ベクター）の確立が期待されている。
【特許文献１】特開２００６−７５０２８号公報
【特許文献２】ＷＯ２００５／０７７３９９号公報
【特許文献３】特開２００６−７５０７８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、微生物由来のエンドトキシンを含まないヒトチオレドキシンを産生することができる、低コストで簡便なヒトチオレドキシンの産生方法を提供することである。即ち、本発明は、キク科植物の葉緑体にヒトチオレドキシンを発現させることができる形質転換用ベクター、ヒトチオレドキシンが産生されている形質転換キク科植物、及びこの形質転換キク科植物を製造する方法、並びに前記形質転換キク科植物から抽出したヒトチオレドキシンを含むヒトチオレドキシン含有組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
請求項１に係る発明は、少なくともヒトチオレドキシンの遺伝子及びキク科植物葉緑体ゲノム由来の遺伝子が組み込まれていることを特徴とするキク科植物（Asteraceae）の葉緑体形質転換用ベクターに関する。
請求項２に係る発明は、前記キク科植物がレタス（Lactuca sativa L.）であることを特徴とする請求項１に記載の葉緑体形質転換用ベクターに関する。
請求項３に係る発明は、前記葉緑体形質転換用ベクターが、２つのキク科植物葉緑体ゲノム由来の遺伝子を有し、これら２つの遺伝子の間に、少なくとも１種の制限酵素切断部位を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の葉緑体形質転換用ベクターに関する。
請求項４に係る発明は、前記葉緑体形質転換用ベクターが、２つのキク科植物葉緑体ゲノム由来の遺伝子を有し、これらの遺伝子が、キク科植物の葉緑体ゲノム由来のリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ大サブユニット遺伝子とアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニット遺伝子であって、これら遺伝子の間で、葉緑体で機能するプロモーター及びターミネーターを有し、さらに前記プロモーターとターミネーターとの間にヒトチオレドキシンをコードする塩基配列を有することを特徴とする請求項1乃至３いずれか記載の葉緑体形質転換用ベクターに関する。
請求項５に係る発明は、前記プロモーターがタバコ由来のｐｓｂＡプロモーターであって、前記ターミネーターがリボソームタンパク質Ｓ１６ターミネーターであることを特徴とする請求項４に記載の葉緑体形質転換用ベクターに関する。
請求項６に係る発明は、前記キク科植物の葉緑体ゲノム由来のリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ大サブユニット遺伝子と前記タバコ由来のｐｓｂＡプロモーターの間に、タバコ葉緑体ゲノム由来のｒＲＮＡオペロンのプロモーターとｐｓｂＡ遺伝子のターミネーターを有し、さらに前記プロモーター及びターミネーターとの間に任意の外来遺伝子が挿入されていることを特徴とする請求項５に記載の葉緑体形質転換用ベクターに関する。
請求項７に係る発明は、キク科植物（Asteraceae）の葉緑体に形質転換用ベクターを導入して形質転換することにより、該葉緑体においてヒトチオレドキシンが産生されていることを特徴とする形質転換キク科植物に関する。
請求項８に係る発明は、前記キク科植物がレタス（Lactuca sativa L.）であることを特徴とする請求項７に記載の形質転換キク科植物に関する。
請求項９に係る発明は、前記形質転換キク科植物の葉緑体における前記ヒトチオレドキシンの重量が、前記形質転換キク科植物の葉緑体中の可溶性タンパク質の１重量％以上であることを特徴とする請求項７又は８に記載の形質転換キク科植物に関する。
請求項１０に係る発明は、請求項７乃至９いずれかに記載の形質転換キク科植物から抽出されたヒトチオレドキシンを含有するヒトチオレドキシン含有組成物に関する。
請求項１１に係る発明は、前記ヒトチオレドキシン含有組成物が微生物由来のエンドトキシンを含まないことを特徴とする請求項１０に記載のヒトチオレドキシン含有組成物に関する。
請求項１２に係る発明は、下記の段階を備えることを特徴とするヒトチオレドキシン産生形質転換キク科植物の製造方法であって、
（１）ヒトチオレドキシンの遺伝子を含有するキク科植物の葉緑体形質転換用ベクターを製造する段階
（２）前記ベクターを、キク科植物の葉緑体に導入する段階
前記工程（１）において製造されるベクターが、少なくともヒトチオレドキシンの遺伝子及び２つのキク科植物葉緑体ゲノム由来の遺伝子を有し、前記キク科植物葉緑体ゲノム由来の遺伝子が、キク科植物の葉緑体ゲノム由来のリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ大サブユニット遺伝子とアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニット遺伝子であって、これら遺伝子の間に、葉緑体で機能するプロモーター及びターミネーターを有し、さらに前記プロモーターとターミネーターとの間にヒトチオレドキシンをコードする塩基配列を有することを特徴とする製造方法に関する。
請求項１３に係る発明は、前記プロモーターが、タバコ由来のｐｓｂＡプロモーターであって、前記ターミネーターが、リボソームタンパク質Ｓ１６ターミネーターであることを特徴とする請求項１２に記載の製造方法に関する。
請求項１４に係る発明は、前記キク科植物の葉緑体ゲノム由来のリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ大サブユニット遺伝子と前記タバコ由来のｐｓｂＡプロモーターの間に、タバコ葉緑体ゲノム由来のｒＲＮＡオペロンのプロモーターとｐｓｂＡ遺伝子のターミネーターを有し、さらに前記プロモーター及びターミネーターとの間に任意の外来遺伝子が挿入されていることを特徴とする請求項１３に記載の製造方法に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の形質転換用ベクターにより、キク科植物の葉緑体へ、ヒトチオレドキシンをコードする遺伝子を導入することができる。
本発明の形質転換キク科植物は、本発明の形質転換用ベクターにより、キク科植物（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）の葉緑体が形質転換されている。この形質転換キク科植物は、その葉緑体においてヒトチオレドキシンを産生している。詳細には、このヒトチオレドキシンの産生量は、葉緑体中の可溶タンパク質重量の１重量％以上である。
本発明のヒトチオレドキシン含有組成物は、ヒトチオレドキシンを含有し、このヒトチオレドキシンは、本発明の形質転換キク科植物で産生されたものである。従って、従来の大腸菌等の微生物で産生されるヒトチオレドキシンと比較して、本発明のヒトチオレドキシン含有組成物に含まれるヒトチオレドキシンは、微生物由来のエンドトキシンを含まないという利点を有する。従って、本発明のヒトチオレドキシン含有組成物は、厳しい品質管理が要求される医薬等の分野で使用可能である。
本発明の形質転換キク科植物の製造方法は、本発明の形質転換キク科植物を製造することができる。この製造方法によると、キク科植物の葉緑体へ、ヒトチオレドキシンをコードする遺伝子を導入することができ、従って、その葉緑体においてヒトチオレドキシンを産生することができる。
【０００８】
本発明のヒトチオレドキシン産生形質転換キク科植物は、特にこれがレタスの葉緑体を形質転換して得られた植物である場合、植物工場を利用して工業的に大量生産ができる。従って、安全かつ安価にヒトチオレドキシンを生産できる。更に、天候や病虫害に左右されないので、安定したヒトチオレドキシンの生産システムを構築できる。
本発明の形質転換キク科植物は、ヒトチオレドキシンをコードする遺伝子が、核ゲノムではなく、葉緑体ゲノムに直接導入されることにより製造される。従って、例えば、核に遺伝子が導入された植物のように、花粉が風や昆虫により広範囲に撒き散らされ、動植物界への悪影響を与えるなどの環境汚染を防止することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明のキク科植物（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）の葉緑体形質転換用ベクター、形質転換キク科植物、及びこの形質転換キク科植物を製造する方法並びに前記形質転換キク科植物から抽出したヒトチオレドキシンを含むヒトチオレドキシン含有組成物について説明する。
【００１０】
まず、キク科植物（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）の葉緑体を形質転換するために導入されるベクター（以下、形質転換用ベクターと略記する。）について説明する。
本発明のキク科植物の葉緑体形質転換用ベクターには、キク科植物葉緑体ゲノム由来の遺伝子及びヒトチオレドキシンの遺伝子が組み込まれている。
本発明に用いられるキク科植物葉緑体ゲノム由来の遺伝子としては、例えばリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ大サブユニット遺伝子（以下、ｒｂｃＬ遺伝子と略記する。）、及びアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニット遺伝子（以下、ａｃｃＤ遺伝子と略記する。）などが挙げられる。
【００１１】
ｒｂｃＬ遺伝子は、葉緑体ゲノムにコードされているＲｕｂｉｓＣＯのラージサブユニット遺伝子である。ＲｕｂｉｓＣＯは、光合成ＣＯ２固定反応回路（カルビンサイクル）において，初発段階であるＣＯ２固定反応（カルボキシラーゼ反応）を触媒し、前記回路における代謝回転の律速となる鍵酵素である。また、該酵素は酸素（Ｏ２）を固定する反応（オキシゲナーゼ反応）も触媒する。ｒｂｃＬ遺伝子としては、とりわけレタス葉緑体ゲノム由来のｒｂｃＬ遺伝子が好ましい。
【００１２】
レタス葉緑体ゲノム由来のｒｂｃＬ遺伝子は、配列表の配列番号１（１４３４ｂｐ）で示される。前記配列番号１の塩基配列中の１個または複数個の塩基、例えば、１〜１５０個の塩基が欠失されるか、または別の塩基に置換されるか、または１〜１５０個の別の塩基を付加されるかして改変されたＤＮＡがｒｂｃＬ遺伝子と相同的組換えし得る配列であれば好ましく用いることができる。
【００１３】
ａｃｃＤ遺伝子は、葉緑体ゲノムにコードされているアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの遺伝子である。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、植物において脂肪酸合成に関与している酵素である。ａｃｃＤ遺伝子としては、レタス葉緑体ゲノム由来のａｃｃＤ遺伝子が好ましい。
レタス葉緑体ゲノム由来のａｃｃＤ遺伝子は、配列表の配列番号２（１５９３ｂｐ）で示される。前記配列番号２の塩基配列中の１個または複数個の塩基、例えば、１〜１００個の塩基が欠失されるか、または別の塩基に置換されるか、または１〜１００個の別の塩基を付加されるかして改変されたＤＮＡがａｃｃＤ遺伝子と相同的組換えし得る配列であれば好ましく用いることができる。
【００１４】
本発明において、例えばレタス葉緑体ゲノム由来のｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子とを用いることにより、ベクターに導入されるヒトチオレドキシンをコードする遺伝子が、相同組換えによりレタス葉緑体ゲノムに組み込まれやすくなり、
また、本発明において、葉緑体ゲノム由来のｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子はそれらの全長を使う必要はない。例えばｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子との間の非コード領域の、被導入遺伝子の導入位置からｒｂｃＬ遺伝子側またはａｃｃＤ遺伝子側にそれぞれ約１０００〜１５００程度の塩基対の長さを有し、ｒｂｃＬ遺伝子またはａｃｃＤ遺伝子とそれぞれ相同的組換えし得る配列であればよい。
【００１５】
上記ｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子の間には、少なくとも１種、好ましくは２種以上の制限酵素切断部位（以下、制限酵素サイトとも言う。）を有することが好ましい。制限酵素サイトは、制限酵素で認識され切断される部位を含む配列であればいずれの配列も好ましく用いることができる。制限酵素サイトとしては、特に限定されず、例えばＮｄｅＩサイト、ＥｃｏＲＩサイト、ＮｏｔＩサイト、ＳａｌＩサイト、またはＥｃｏ４７ＩＩＩサイト、ＰｓｔＩサイト、などが好ましく挙げられる。これら制限酵素サイトは、各々制限酵素ＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ、ＳａｌＩ、ＰｓｔＩまたはＥｃｏ４７ＩＩＩで切断され得る。
【００１６】
上記ｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子の間には、葉緑体で機能するプロモーター及びターミネーターを有し、さらに前記プロモーターとターミネーターとの間にヒトチオレドキシンをコードする塩基配列を有する。
前記プロモーターは、タバコ葉緑体由来のｐｓｂＡプロモーター（配列番号３：以下、ＰｐｓｂＡと略記する。）であって、前記ターミネーターは、タバコ葉緑体由来のリボソームタンパク質Ｓ１６ターミネーター（配列番号４：以下、Ｔｒｐｓ１６と略記する。）である。
前記ｐｓｂＡ遺伝子とは、光合成の光化学系ＩＩの反応中心であるＤ１タンパク質をコードする遺伝子である。
前記ｒｐｓ１６遺伝子とは、葉緑体リボソームタンパク質Ｓ１６をコードする遺伝子である。
【００１７】
本発明に係るヒトチオレドキシン（ｈＴｒｘ）は、ヒト由来のチオレドキシンであって、配列番号５に示される１０５個のアミノ酸からなるポリペプチドを指す。尚、配列番号６は、配列番号５のアミノ酸配列をコードする核酸配列を表す。
ｈＴｒｘは、酸化／還元を制御する生体内タンパク質であり、糖尿病をはじめとする生活習慣病、虚血性灌流障害、肺障害など、酸化ストレスが関与する障害や疾患に対する防御効果を有する
【００１８】
本発明の形質転換用ベクターは、さらに、上記ｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子の間であって、前記ＰｐｓｂＡの上流側に、さらに、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  Ｌ．）の葉緑体ゲノム由来プロモーター及びターミネーターを含み、これらの間に任意の外来遺伝子が挿入されてもよい。
前記プロモーターとしては、タバコ葉緑体ゲノム由来のｒＲＮＡオペロンのプロモーター（以下、Ｐｒｒｎと略記する。）、ターミネーターとしては、タバコ葉緑体ゲノム由来のｐｓｂＡ遺伝子のターミネーター（以下、ＴｐｓｂＡと略記する。）が好適に使用される。
上記したタバコ葉緑体ゲノム由来のＰｒｒｎは、配列表の配列番号７（１４２ｂｐ）で示され、タバコ葉緑体ゲノム由来のＴｐｓｂＡは、配列表の配列番号８（３９０ｂｐ）で示される。前記配列番号７または８の塩基配列のうち、１個または複数個の塩基、例えば、１〜１０個の塩基が欠失されるか、または別の塩基に置換されるか、または１〜１０個の別の塩基を付加されるかして改変されたＤＮＡであって、それぞれ前記任意の外来遺伝子の転写開始および転写終結を認識できる配列であればいずれも好ましく用いることができる。
【００１９】
また、上記プロモーターおよびターミネーターは、任意の外来遺伝子の転写開始および転写終結を認識できるものであれば、上記プロモーターおよびターミネーターに限定されず、他のプロモーター及びターミネーターであってもよい。このようなプロモーターとしては、例えばｐｓｂＡプロモーター、ｒｂｃＬプロモーター、ｐｓｂＤプロモーターまたはａｔｐＢプロモーター等が挙げられる。これらプロモーターも、キク科植物の葉緑体ゲノム由来のプロモーターが好ましく、レタス葉緑体ゲノム由来のプロモーターがより好ましい。また該ターミネーターとしては、例えばｒｐｓ１６ターミネーターが挙げられる。
【００２０】
前記任意の外来遺伝子とは、例えば、ｍｅｒＡ遺伝子、病虫害耐性遺伝子や除草剤耐性遺伝子、抗酸化作用を有するカロテノイドやビタミンＥなどの生合成に関る遺伝子、光合成に関与する例えばフルクトース１，６−ビスホスファターゼ／セドヘプツロース１，７−ビスホスファターゼ遺伝子でありこれらに限定されない。但し、共にヒトチオレドキシンが産生される本発明の形質転換キク科植物では、フルクトース１，６−ビスホスファターゼ／セドヘプツロース１，７−ビスホスファターゼ遺伝子が好適に使用される。ラン藻由来のフルクトース１，６−ビスホスファターゼ／セドヘプツロース１，７−ビスホスファターゼ遺伝子が最も良い。
【００２１】
本発明の形質転換用ベクターに、例えば、葉緑体に、ｍｅｒＡ遺伝子などのメタロチオネイン遺伝子を導入した場合、このベクターにより形質転換されたキク科植物は、ヒトチオレドキシンを発現するとともに、土壌などの環境中の有害重金属や水銀などを無害化または無毒化し得るので、ファイトレメディエーション（Ｐｈｙｔｏ Ｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ；植物を利用した環境浄化技術）に利用できる。
【００２２】
本発明の形質転換用ベクターに、例えば、葉緑体に病虫害耐性遺伝子や抗生物質耐性遺伝子（ａａｄＡ）を導入した場合、ヒトチオレドキシンの発現に加えて、害虫抵抗性や感染性細菌耐性のキク科植物を製造することができる。
【００２３】
本発明の形質転換用ベクターに、例えば、抗酸化作用を有するカロテノイドやビタミンＥなどの生合成に関る遺伝子を導入した場合は、ヒトチオレドキシンの発現に加えて、キク科植物の例えばヒマワリや紅花などにおいて、該ヒマワリや紅花などが生成する油脂類中のカロテノイドやビタミンＥなどの有用成分の含有量を上げることが可能となる。
【００２４】
本発明の形質転換用ベクターに、光合成に関与する例えばラン藻由来のフルクトース１，６−ビスホスファターゼ／セドヘプツロース１，７−ビスホスファターゼ遺伝子を導入した場合、該遺伝子が導入されたキク科植物は、ヒトチオレドキシンを発現するだけでなく、野生株に比べて、背丈が大きく、また葉の面積も大きく、早く生育し、かつ糖やデンプンの合成能力が増大し得る。このような生育促進は、レタス１固体当たりのヒトチオレドキシンの生産量を増加させることを可能とする。
【００２５】
上記遺伝子を備える形質転換用ベクターを宿主細胞に導入し、本発明の形質転換キク科植物を製造する。以下、形質転換用ベクター並びに形質転換キク科植物の製造方法について詳説する。
本発明の形質転換用ベクターｐＬＤ６Ｎ（配列番号９；４５９２ｂｐ）及びｐＲＬ２００（配列番号１０；５３５８ｂｐ）は、特開２００２−２７２４７６号公報に記載のｐＬＤ６プラスミド（配列番号１１；４５９１ｂｐ）およびｐＬＤ２００プラスミド（配列番号１２；５５８１ｂｐ）を利用することにより構築できる。
尚、ｐＬＤ６プラスミドは、ブタペスト条約に基づいて、平成１３年３月１９日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８２６０として寄託されている。ｐＬＤ２００プラスミドは、ブタペスト条約に基づいて、平成１３年３月１９日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８２６１として寄託されている。
【００２６】
以下、本発明の形質転換用ベクターｐＬＤ６Ｎ及びｐＲＬ２００:ｈＴｒｘの作製方法を詳説する。
ヒトチオレドキシン遺伝子 （ｈＴｒｘ１）は、ヒトチオレドキシンのcDNAが挿入されたpcDNA3 (Invitrogen)をテンプレートとして、forwardプライマー： 5’-GCCCATATGGTGAAGCAGATCGAG-3’とreverseプライマー： 5’-ATGAATTCAGAAAACATGATTAGACTAATTC-3’を用いてＰＣＲにより増幅を行う。Forwardプライマーは5’端にNdeIサイトを含み、reverseプライマーは5’端にEcoRIサイトを含む。
増幅断片はｐＬＤ６のマルチクローニングサイトを5’- CCAAGATCTAAAAGGAGAAATTAAGCATGCTCTAGATCGATGAATTCGCCC -3’から5’-CCAAGATCTAAAAGGAGAAATTACATATGAATCGATTCTAGAGAATTCGCCC-3’に変換したpLD6NのNdeIとEcoRIサイトに挿入し、pLD6N:hTrxが作製される。pLD6N:hTrxを、例えばNotIとSalIで制限酵素処理を行い、得られたaadAとhTrx1を含むDNA断片を、pRL200プラスミドのNotIとSalIサイトに挿入し、pRL200:hTrxを作製する。このようにして作製されたpRL200:hTrxは、aadAの上流にプロモーター（例えば、タバコ由来のリボソームRNAプロモーターであるPrrn）、下流にターミネーター（例えば、タバコ由来のpsbAターミネーターであるTpsbA）、hTrx1の上流にプロモーター（例えば、タバコ由来のpsbAプロモーターであるPpsbA）、下流にターミネーター（例えば、リボソームタンパク質Ｓ16ターミネーターであるTrps16）が存在する。これらの配列が、相同性組換えのためのrbcLとaccD配列間に挟まれている。
【００２７】
本発明の形質転換用ベクターは、好ましくは、遺伝子組換え体を識別するための遺伝子を有する。遺伝子組換え体を識別するための遺伝子としては、特に限定されず、自体公知のものを用いてよい。例えば、各種薬剤耐性遺伝子があげられる。より具体的には、カナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴ）、スペクチノマイシン耐性遺伝子（ａａｄＡ）、ベタインアルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＢＡＤＨ）等が挙げられる。また、該遺伝子の上流、下流には、それぞれ該遺伝子を発現制御するためのプロモーターおよびターミネーター配列を配することが好ましい。例えば、ａａｄＡ遺伝子を葉緑体で発現させるためには、上記した植物由来のプロモーター及びターミネーターを好ましく使用できるが、ｒｒｎプロモーターおよびｐｓｂＡターミネーターが特に好適である。
【００２８】
このようにして作製された形質転換用ベクターを宿主細胞に導入し、本発明の形質転換キク科植物が製造される。このとき、宿主細胞としては、キク科植物細胞が好ましく、キク科植物葉細胞がより好ましく、キク科植物の葉緑体がさらに好ましく、レタス葉緑体が特に好ましい。本発明のベクターを宿主細胞、特に葉緑体へ導入して形質転換する方法としては、公知の方法、例えばパーティクルガン法（Ｓｖａｂ，Ｚ．，Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，Ｐ．，ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ，Ｐ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０年，第８７巻，ｐ．８５２６−８５３０）やＰＥＧ法（Ｇｏｌｄｓ，Ｔ．，Ｍａｌｉｇａ，Ｐ．，ａｎｄ Ｋｏｏｐ，Ｈ．−Ｕ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９３年，第１１巻，ｐ．９５−９７）等を好ましく用いることができる。例えば、パーティクルガン法は、ベクターを金またはタングステンの極めて細かい粒子にまぶし、該ベクターの付着した粒子を火薬または高圧ガスで宿主細胞に打ち込むことにより、ベクターを宿主細胞に導入することができる。
【００２９】
本発明の葉緑体形質転換用ベクターが導入された形質転換キク科植物の葉細胞、例えばレタス葉細胞は、植物培養用培地で培養し植物体とすることができる。植物培養用培地は、ガンボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）Ｂ５、ムラシゲ・スクーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ；ＭＳ）、ニッチ・ニッチ（Ｎｉｔｃｈ＆Ｎｉｔｃｈ）などのような無機塩、ビタミン類を含有する基礎培地に、植物ホルモンを加えたものが好ましい。基礎培地としては特にＭＳ培地が好ましい。植物ホルモンとしては、オーキシンおよびサイトカイニンを組み合わせるのがよい。オーキシンとしては、ナフタレン酢酸（以下、ＮＡＡと略記する。）、２−ナフトキシ酢酸、インドール酢酸、４−クロロインドール酢酸、インドール酪酸または２，４−ジクロロフェノキシ酢酸などが挙げられ、ＮＡＡが特に好ましい。サイトカイニンとしては、カイネチン，ゼアチンまたはベンジルアデニン（以下、ＢＡと略記する。）、イソペンテニルアデニンなどが挙げられ、ＢＡが特に好ましい。基礎培地に添加するオーキシンおよびサイトカイニンの濃度は、使用するオーキシンおよびサイトカイニンにより異なるが、オーキシンは約０．０１〜１．０ｍｇ／Ｌ、好ましくは約０．０５〜０．２ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは約０．１ｍｇ／Ｌ、サイトカイニンは約０．０１〜１．０ｍｇ／Ｌ、好ましくは約０．０５〜０．２ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは約０．１ｍｇ／Ｌとなるよう添加される。オーキシンに対するサイトカイニンの割合（重量比）は、約１：０．８〜１．２が好ましい。培地にはさらに、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を約１００〜１０００ｐｐｍ、好ましくは約３００〜７００ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは約４００〜６００ｐｐｍを添加するのがよい。培地にオーキシンやサイトカイニンを加えることにより、形質転換されたキク科植物、とりわけレタスの再分化を促進するようになり、またＰＶＰの添加によって培養時の褐変による枯死が防止できる。
【００３０】
また、上記培地には、炭素源としての糖類や、ビタミン類、培地を固めるための支持体などを添加するのがよい。糖類としては、例えばショ糖などが挙げられる。糖類の添加量は、約１〜１０重量％、好ましくは約２〜５重量％程度である。ビタミン類としては、例えば塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、ニコチン酸またはイノシトールなどが挙げられる。支持体としては、例えば寒天、ゲランガムまたはペーパーブリッジなどが挙げられる。支持体の濃度は、培地のｐＨなどにより異なるが、例えばゲランガムの場合、約０．２〜０．３重量％程度が好ましい。
また、上記培地には、アミノ酸（例．グリシンなど）、アデニンおよび／またはココナツウォーターなどを添加してもよい。
培地は、通常水酸化カリウムなどでｐＨ約４〜８、好ましくはｐＨ約５〜７に調整される。
【００３１】
本発明の形質転換キク科植物は、キク科植物（Asteraceae）の葉緑体に形質転換用ベクターを導入して形質転換することにより、該葉緑体においてヒトチオレドキシンが産生されている。
前記キク科植物はいずれの種類であってもよく、例えばレタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｓ）、アーティチョーク（Ｃｙｎａｒａ ｓｃｏｌｙｍｕｓ）、ゴボウ（Ａｒｃｔｉｕｍ ｌａｐｐａ）、キク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）、コスモス（Ｃｏｓｍｏｓ ｂｉｐｉｎｎａｔｕｓ）、キバナノコギリソウ（Ａｃｈｉｌｌａ ｆｉｌｐｅｎｄｕｌｉｎａ）、キンセンカ（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ ａｒｖｅｎｓｉｓ）、デージー（Ｒｕｄｂｅｃｋｉａ ｈｉｒｔａ）、ヒャクニチソウ（Ｚｉｎｎｉａ ｅｌｅｇａｎｓ Ｊａｃｑ．）などが挙げられる。これらのうち、レタスが好適に使用される。さらに詳細には、コスレタス（Ｌ．ｓ．ｖａｒ．ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ）やシスコレタスが好適で、コスレタスが最適に使用される。
形質転換されたキク科植物、中でもレタスは自体公知の条件の下、路地または水耕栽培で生育させることができる。また、レタスは、葉に毒性代謝物等が存在しない葉菜植物であり、また植物工場での栽培方法も確立されていることから、好適に本発明の形質転換キク科植物とされる。さらに、レタスは、ベクターに導入された遺伝子がコードするタンパク質を高度に発現させることができる。また、本発明の形質転換体は導入した遺伝子の花粉を介した環境への飛散を防ぐことができるなどの利点がある。
【００３２】
なお、上記の遺伝子工学または生物工学の操作については、市販の実験書、例えば、１９８２年発行のモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８９年発行のモレキュラー・クローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄ．）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）などに記載された方法に従って容易に行うことができる。
【００３３】
本発明の形質転換キク科植物には、ヒトチオレドキシンが産生されている。本発明の形質転換されたキク科植物における、ヒトチオレドキシンの産生量は、好ましくは葉緑体の可溶タンパク重量のうち１重量％以上である。
【００３４】
本発明の形質転換キク科植物は、これをそのまま食してもよいし、形質転換キク科植物からヒトチオレドキシンを抽出して、これを食してもよい。形質転換キク科植物からヒトチオレドキシンを抽出する方法は従来の方法を採用することができるが、好ましくは、形質転換キク科植物（好ましくはレタス葉）をミキサーもしくはすり鉢で破砕した後、水または特に必要な場合は生理食塩水か最適な緩衝液中に浸漬して、破砕残留物を遠心または濾過により除去する方法を採用する。また、形質転換キク科植物から精製したチオレドキシンを注射により血管内投与してもよい。
【００３５】
本発明のヒトチオレドキシン含有組成物は、前記形質転換キク科植物から抽出されたヒトチオレドキシンを含む組成物である。前記形質転換キク科植物から抽出されたヒトチオレドキシンは、従来ヒトチオレドキシンを生産するために使用されてきた大腸菌等の微生物により生産されたヒトチオレドキシンと異なり、大腸菌由来のエンドトキシンを含まないという利点を有する。
本発明のヒトチオレドキシン含有組成物は、医薬品、食品等として好適に使用される。
【００３６】
以下に具体的実施例を挙げ、さらに詳細に説明するが、本発明はこれらに特に限定されることはない。
【実施例】
【００３７】
〔実施例１：ｈＴｒｘ遺伝子を導入したベクターｐＬＤ６Ｎ（ｐＬＤ６Ｎ：ｈＴｒｘ）の作成〕
ｈＴｒｘ遺伝子は、ｈＴｒｘのｃＤＮＡが挿入されたｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をテンプレートとして設定した、５’端にＮｄｅＩサイトをもつｆｏｒｗａｒｄプライマー（５’−ＧＣＣＣＡＴＡＴＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＴＣＧＡＧ−３’）、および５’端にＥｃｏＲＩサイトをもつｒｅｖｅｒｓｅプライマー（５’−ＡＴＧＡＡＴＴＣＡＧＡＡＡＡＣＡＴＧＡＴＴＡＧＡＣＴＡＡＴＴＣ−３’）を用いてＰＣＲ増幅した。増幅したｈＴｒｘ遺伝子を含む断片は、２箇所のマルチクローニング領域を有する特開２００２−２７２４７６に記載のベクターｐＬＤ６（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８２６０）の下流側のマルチクローニングサイトを５’−ＣＣＡＡＧＡＴＣＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＧＣＡＴＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＧＡＴＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣ−３’から５’−ＣＣＡＡＧＡＴＣＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＴＣＧＡＴＴＣＴＡＧＡＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣ−３’に変換したｐＬＤ６Ｎ（図１）のＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩサイトに、制限酵素ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩを用いて導入した。この操作により、ｈＴｒｘ遺伝子を導入したｐＬＤ６Ｎ：ｈＴｒｘが作成された。
【００３８】
〔実施例２：ｈＴｒｘ遺伝子を導入した発現ベクター（ｐＲＬ２００：ｈＴｒｘ）の作製〕
実施例１の操作で作成したｐＬＤ６Ｎ：ｈＴｒｘは、制限酵素ＮｏｔＩおよびＳａｌＩで処理され、ａａｄＡ（当初ｐＬＤ６に導入されていた遺伝子組換え体識別遺伝子）とｈＴｒｘを含むＤＮＡに断片化した。このＤＮＡ断片は、マルチクローニング領域の上流および下流にレタス葉緑体ゲノム由来のｒｂｃＬおよびａｃｃＤを有する特開２００６−７５０７８に記載のベクターｐＲＬ２００のＮｏｔＩおよびＳａｌＩサイトに、制限酵素ＮｏｔＩおよびＳａｌＩを用いて導入された。これらの操作により、レタス葉緑体用ｈＴｒｘ産生ベクター（ｐＲＬ２００：ｈＴｒｘ）が作成された。作成した発現ベクター（ｐＲＬ２００：ｈＴｒｘ）には、ａａｄＡの上流にタバコ由来のリボソームＲＮＡプロモーターであるＰｒｒｎ、下流にタバコ由来のｐｓｂＡターミネーターであるＴｐｓｂＡ、ｈＴｒｘの上流にタバコ由来のｐｓｂＡプロモーターであるＰｐｓｂＡ、下流にリボソームタンパク質Ｓ１６ターミネーターであるＴｒｐｓ１６が存在する（図２）。さらにこれらの配列は、相同性組換えのためのｒｂｃＬとａｃｃＤ配列の間に挟まれている。
【００３９】
〔実施例３：レタス葉緑体の形質転換と再分化〕
ＭＳ培地に播種後、約３〜５週間、無菌栽培したレタスの生葉が形質転換に用いられた。ＭＳ培地は、ＭＳ塩、イノシトール（１００ｍｇ／Ｌ）、塩酸チアミン（０．１ｍｇ／Ｌ）、塩酸ピリドキシン（０．５ｍｇ／Ｌ）、ニコチン酸（０．５ｍｇ／Ｌ）、グリシン（２ｍｇ／Ｌ）、ショ糖（３０ｇ／Ｌ）、ゲランガム（２ｇ／Ｌ）を含み、ＫＯＨでｐＨ５．８に調整した。直径２．５ ｃｍの円状のレタスのリーフディスクは、再分化培地に置床したプレートで一日間前培養された。再分化培地は、ＭＳ培地にＢＡ（０．１ｍｇ／Ｌ）とＮＡＡ（０．１ｍｇ／Ｌ）を添加したものである。直径０．６ミクロンの金粒子６ｍｇ、レタス葉緑体形質転換用ベクター２０μｇ、２．５Ｍ塩化カルシウム、および０．１Ｍスペルミジンの混合は、４℃で２０分間、懸濁された。これらは、さらにエタノールで４回洗浄され、最終的に６０μＬ（１０回の打ち込み実験での使用量に相当）のエタノールに懸濁された。その後、前培養したレタスのリーフディスクにパーティクルガン（型式ＰＤＳ−１０００／ＨｅＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて１１００ｐｓｉで打ち込まれた。ラプチャーディスクとステージ間の距離は、６ｃｍに設定し、打ち込み回数は、１０回／実験とした。打ち込み後、暗所に３日間静置した。その後、打ち込まれたリーフディスクは４ｍｍ四方の切片にメスで刻み、スペクチノマイシン（３０ｍｇ／Ｌ）を含む再分化培地に置床された。約３〜４週間後、白色化した葉切片から生じた緑色のカルス（図３Ａ）は、再分化し（図３Ｂ）、植物個体に再生した（図３Ｃ）。
【００４０】
〔実施例４：形質転換したレタス葉緑体中の導入遺伝子（ａａｄＡ）の確認〕
実施例３で再分化したレタス植物体の葉組織のゲノムＤＮＡ中のａａｄＡは、植物ＤＮＡ抽出キットＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）を用いて用意した。ゲノムＤＮＡ中のａａｄＡ配列は、ｆｏｒｗａｒｄプライマー：５’−ＡＴＧＧＣＴＣＧＴＧＡＡＧＣＧＧＴＴＡＴ−３’およびｒｅｖｅｒｓｅプライマー：５’−ＴＴＡＴＴＴＧＣＣＡＡＣＴＡＣＣＴＴＡＧ−３’を用いてＰＣＲ反応を行い、アガロースゲル電気泳動により確認した。対照として、発現ベクター（ｐＲＬ２００：ｈＴｒｘ）および野生株のレタスの葉組織から取り出したゲノムＤＮＡ中のａａｄＡ配列が、同じプライマーを用いたＰＣＲ反応で調べられた。形質転換したレタスのゲノムＤＮＡ（図４Ｂ、Ｃ）および発現ベクター（ｐＲＬ２００：ｈＴｒｘ）（図４Ｄ）には、ａａｄＡ遺伝子の存在を示す０．８ｋｂｐのバンドがみられた。一方、野生型レタスのゲノムＤＮＡには、そのバンドは検出されなかった（図４Ａ）。この結果は、ａａｄＡ遺伝子が形質転換レタスの葉緑体ゲノムの目的領域に導入されたことを意味する。
【００４１】
〔実施例５：形質転換したレタス葉緑体中の導入遺伝子（ｈＴｒｘ）の確認〕
導入遺伝子（ｈＴｒｘ）は、ｆｏｒｗａｒｄプライマー：５’−ＧＣＣＣＡＴＡＴＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＴＣＧＡＧ−３’およびｒｅｖｅｒｓｅプライマー：５’−ＡＴＧＡＡＴＴＣＡＧＡＡＡＡＣＡＴＧＡＴＴＡＧＡＣＴＡＡＴＴＣ−３’を用いてａａｄＡと同じ手法で確認された。対照として、発現ベクター（ｐＲＬ２００：ｈＴｒｘ）および野生株のレタスの葉組織から取り出したゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ反応により調べられた。形質転換したレタスのゲノムＤＮＡ（図５Ｂ、Ｃ）と発現ベクター（ｐＲＬ２００：ｈＴｒｘ）（図５Ｄ）には、ｈＴｒｘ１遺伝子の存在を表す０．３ｋｂｐのバンドがみられた。一方、野生型ゲノムＤＮＡでは、そのバンドは検出されなかった（図５Ａ）。この結果は、ｈＴｒｘ遺伝子が、形質転換レタスの葉緑体ゲノムの目的領域に導入されたことを意味する。
【００４２】
〔実施例６：形質転換したレタス葉緑体における遺伝子置換効率〕
形質転換したレタス葉緑体における遺伝子置換効率を調べるために、形質転換したレタス葉緑体中の遺伝子導入葉緑体ゲノムおよび野生型葉緑体ゲノムの存在比率が、各サンプルから取り出されたＤＮＡを鋳型としたｆｏｒｗａｒｄプライマー：５’−ＣＧＴＡＧＣＴＡＡＴＣＧＡＧＴＡＧＣＴＣ−３’とｒｅｖｅｒｓｅプライマー：５’−ＧＡＧＴＴＧＴＧＡＴＡＣＣＴＧＴＣＴＣＧ−３’を使用したＰＣＲ反応とアガロースゲル電気泳動により調べられた。対照として、発現ベクター（ｐＲＬ２００：ｈＴｒｘ）と野生株のレタスの葉組織から取り出したゲノムＤＮＡを用いた。発現ベクター（ｐＲＬ２００：ｈＴｒｘ）のレーン（図６Ｄ）には、２．４ｋｂｐの導入遺伝子を表すバンドが確認された。このバンドは、形質転換したレタスのゲノムＤＮＡにも見られ（図６Ｂ、Ｃ）、またそのバンドサイズは発現ベクター（ｐＲＬ２００：ｈＴｒｘ）のものと同じであった。一方、野生型葉緑体のゲノムＤＮＡでは０．４ｋｂｐのバンドが検出された（図６Ａ）。このバンドは、レーンＢとＣでは検出されなかったことから、形質転換したレタスの葉緑体ゲノムは、野生のレタスのものから殆ど置き換わっていると考えられる。
【００４３】
〔実施例７：形質転換したレタス葉におけるｈＴｒｘの発現量〕
形質転換したレタス葉におけるｈＴｒｘの発現量を測定した。形質転換したレタスの葉から可溶性タンパク質画分を取り出すために、形質転換レタス葉は、タンパク質抽出バッファー（６１．５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、３８．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  βメルカプトエタノール、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）中で破砕され、その上清を得るために遠心で回収された。タンパク質の定量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法に従った。回収された上清は、等量の２×ＳＤＳサンプルバッファー（４％ＳＤＳ、０．２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、５％スクロース、１０％βメルカプトエタノール、０．００４％ブロモフェノールブルー）を添加し、１００℃、５分間加熱した。この調整サンプルは、タンパク質を分離するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥに各レーン１６μｇ量で供された。泳動後、タンパク質はクマシーブリリアントブルーで染色された。その結果、ｈＴｒｘと思われるバンドが、検出された（図７）。
【００４４】
〔実施例８：形質転換したレタス葉におけるｈＴｒｘの発現量の定量〕
検出されたバンドがｈＴｒｘであることを確認するために、ウェスタンブロッティングを実施した。先述の要領で用意した形質転換したレタス葉の破砕後上清の０．５μｇ（図８Ａ）、１．０μｇ（図８Ｂ）、２．０μｇ（図８Ｃ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動後のゲルをニトロセルロース膜に転写し、ブロッキングを行い、得られた膜をｈＴｒｘモノクローナル抗体（５０００倍希釈）に反応させた。反応後、膜を洗浄し、１０００倍に希釈した二次抗体（ＨＲＰ標識された抗マウス抗体）と反応させた。さらに膜を洗浄した後、コニカイムノステインキット（生化学工業）でシグナルを検出した。その結果、形質転換レタスにおいて、ｈＴｒｘのシグナルを検出することができた（図８Ａ，Ｂ，Ｃ）。また、レタス葉におけるｈＴｒｘ量を定量するために、精製大腸菌リコンビナントｈＴｒｘをコントロールとして５０ｎｇ（図８Ｄ）、１００ｎｇ（図８Ｅ）、１５０ｎｇ（図８Ｆ）、２００ｎｇ（図８Ｇ）を用い、同様のウェスタンブロッティングを行った。なお、大腸菌リコンビナントｈＴｒｘはＮ末端にＨｉｓタグが付加しているため、本来のｈＴｒｘよりも分子量が大きい。大腸菌リコンビナントｈＴｒｘのシグナル強度から作製した検量線を用いて、レタス葉のｈＴｒｘ量を見積もった。その結果、形質転換レタスの葉においてｈＴｒｘは可溶性タンパク質の１％を占めることが判明した。
【００４５】
〔実施例９：形質転換したレタスの葉に含まれるｈＴｒｘの還元活性〕
形質転換したレタスの葉で産生されたｈＴｒｘの活性は、インシュリン還元活性で測定した。測定用タンパク質は、実施例７に記載の方法に従い調整したタンパク質抽出バッファーを用いた。インシュリンの還元に伴う６５０ｎｍの吸光度の上昇は、活性測定バッファー（１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．５）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＤＴＴ、１４０μＭ  インシュリン）に抽出タンパク質をそれぞれ１００μｇ（図９Ａ）、５０μｇ（図９Ｂ）添加して反応させた後、分光光度計を用いて経時モニターした。対照として、野生株レタス葉からの抽出タンパク質１００μｇ（図９Ｃ）がモニターされた。活性測定は３０℃で４０分間継続した。インシュリン還元活性は、形質転換レタス葉からのタンパク質でのみ確認された（図９Ａ，Ｂ）。このことは、形質転換したレタスの葉に発現したｈＴｒｘが、機能を有していることを意味する。
【００４６】
〔実施例１０：形質転換したレタスの葉からｈＴｒｘを精製する方法、および精製したｈＴｒｘの活性〕
形質転換したレタスの葉からｈＴｒｘを精製するため、形質転換したレタスの葉４０ｇが、抽出バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＤＴＴ）２００ｍｌと一緒にすり潰された（粗酵素溶液）。粗酵素溶液は、ミラクロスでろ過後、１２，０００ｇ、１０分間の遠心でその上清を回収した。上清に、２Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．５）を最終濃度５０ｍＭで添加した。添加後、氷中で２０分間、撹拌した。この溶液は、１２，０００ｇ、２０分間の遠心にかけられ、その上清が回収された。この上清は、クロマトバッファーＡ（５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、２Ｍ硫酸アンモニウム）で平衡化したブチルセファロースにアプライされ、クロマトバッファーＡで洗浄後、６０％クロマトバッファーＡでさらに洗浄された。洗浄後、６０％クロマトバッファーＡからクロマトバッファーＢ（５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５））へのリニアーグラジェントによりｈＴｒｘを含む溶出画分を得た。ｈＴｒｘ溶出画分は、限外濾過膜（分子量５０００）で濃縮した。濃縮したサンプルは、クロマトバッファーＢで平衡化したゲル濾過カラム（Ｈｉｌｏａｄ２６／６０ｐｇ、ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス）にアプライされ、ゲル濾過クロマトグラフィーに供された。回収されたｈＴｒｘ溶出画分は、クロマトバッファーＢで平衡化した陽イオン交換カラム（ＳＰセファロース、ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス）に供され、クロマトバッファーＡから５０％クロマトバッファーＢ（５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、１ＭＮａＣｌ）へのリニアーグラジェントにより溶出し、精製ｈＴｒｘを回収した。精製ｈＴｒｘは、１５％アクリルアミド濃度のゲルを使ったＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クマシーブリリアントブルーで染色することにより、精製度を確認した。その結果、単一バンドとしてｈＴｒｘが精製されていることが確認された（図１０）。実施例９と同様の方法で精製したｈＴｒｘのインシュリン還元活性を測定した結果、活性を有していることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ベクターｐＬＤ６Ｎの模式図を表す。Ｐｒｒｎはタバコ葉緑体由来のｒｒｎプロモーターを表す。ａａｄＡはスペクチノマイシン耐性遺伝子を表す。ＴｐｓｂＡはタバコ葉緑体由来のｐｓｂＡターミネーターを表す。ＰｐｓｂＡはタバコ葉緑体由来のｐｓｂＡプロモーターを表す。Ｔｒｐｓ１６はタバコ葉緑体由来のｒｐｓ１６ターミネーターを表す。塩基配列を記載した部位はマルチクローニング領域である。ＮｏｔI、ＮｄｅI、ＥｃｏＲIおよびＳａｌIは制限酵素切断部位を表す。太線部位はＮｄｅIとＥｃｏＲIの認識配列を示す。
【図２】ベクターｐＲＬ２００：ｈＴｒｘの模式図を表す。ｒｂｃＬはタバコ葉緑体由来のｒｂｃＬ遺伝子を表す。ａｃｃＤはタバコ葉緑体由来のａｃｃＤ遺伝子を表す。ｈＴｒｘはヒトチオレドキシン遺伝子を表す。
【図３】ヒトチオレドキシン遺伝子が導入され、実施例で得られた形質転換レタスの外観を示す。Ａはカルス、ＢおよびＣは再分化した植物体を示す。
【図４】実施例で得られた葉緑体形質転換体レタスにおけるａａｄＡ遺伝子を確認するために、レタスＤＮＡ溶液を用いて行ったアガロースゲル電気泳動図である。（Ａ）ヒトチオレドキシン遺伝子が導入されていない野生型のレタス。（ＢおよびＣ）形質転換レタスのゲノムＤＮＡ。（Ｄ）ベクターｐＲＬ２００：ｈＴｒｘ。
【図５】実施例で得られた葉緑体形質転換体レタスにおけるｈＴｒｘ遺伝子を確認するために、レタスＤＮＡ溶液を用いて行ったアガロースゲル電気泳動図である。（Ａ）ヒトチオレドキシン遺伝子が導入されていない野生型のレタス。（ＢおよびＣ）形質転換レタスのゲノムＤＮＡ。（Ｄ）ベクターｐＲＬ２００：ｈＴｒｘ。
【図６】実施例で得られた形質転換レタスにおける遺伝子導入された葉緑体ゲノムと遺伝子導入されずに野生型のままで残っている葉緑体ゲノムの存在を確認することにより形質転換用ベクターの遺伝子導入効率を調べた結果（電気泳動図）である。各ゲノムは、各サンプルから取り出されたＤＮＡを鋳型としたプライマーを使用したＰＣＲ反応とアガロースゲル電気泳動により調べられた。（Ａ）ヒトチオレドキシン遺伝子が導入されていない野生型のレタスのゲノムＤＮＡ。（ＢおよびＣ）形質転換レタスのゲノムＤＮＡ。（Ｄ）ベクターｐＲＬ２００：ｈＴｒｘ。ｐＲＬ２００：ｈＴｒｘには、２．４ｋｂｐの導入遺伝子を表すバンドが確認された。
【図７】形質転換レタスにおけるｈＴｒｘの発現を、実施例で得られた形質転換レタスの葉から抽出したタンパク質抽出バッファーを用いて実施したＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。ｈＴｒｘと思われるバンドが、矢印部に現れた。
【図８】図７で出現したバンドがｈＴｒｘであることの確認および発現ｈＴｒｘの定量のために実施したウェスタンブロッティングの結果である。（Ａ）形質転換レタス葉の破砕後上清０．５μｇをアプライ。（Ｂ）同１．０μｇをアプライ。（Ｃ）同２．０μｇをアプライ。（Ｄ）精製大腸菌リコンビナントｈＴｒｘを５０ｎｇアプライ。（Ｅ）同１００ｎｇをアプライ。（Ｆ）同１５０ｎｇをアプライ。（Ｇ）同２００ｎｇをアプライ。
【図９】実施例で得られた形質転換レタスの葉で産生されたｈＴｒｘのインシュリン還元活性の測定結果である。活性測定バッファーに抽出タンパク質を１００μｇ（Ａ）および５０μｇ（Ｂ）添加して反応させた後、分光光度計を用いて６５０ｎｍの吸光度を経時モニターした。対照として、野生株レタス葉からの抽出タンパク質１００μｇ（Ｃ）をモニターした。
【図１０】実施例で得られた形質転換レタスの葉から抽出したｈＴｒｘを各種クロマトグラフィーにより精製し、その精製度を確認した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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