(57)【要約】【課題】メタノールを基本原料として、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−ヒドロキシヘキサン酸）（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ））を生産することを目的とする。【解決手段】本発明によれば、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸）生産能を有するメタノール資化性菌メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物を広基質特異性ポリエステル重合酵素遺伝子を含有する組換えベクターを用いて形質転換し、メタノール源を含有する培地で形質転換体を増殖させることにより、形質転換体内でＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を製造する方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ（３−ヒドロキシブタン酸）生産能を有するメタノール資化性菌メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物を広基質特異性ポリエステル重合酵素遺伝子を含有する組換えベクターを用いて形質転換し、メタノール源を含有する培地で形質転換体を増殖させることにより、形質転換体内でポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）を製造する方法。
【請求項２】
微生物が、メチロバクテリウム・エクストルクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
メチロバクテリウム・エクストルクエンスが、ＡＭ１株（ＪＣＭ２８０５）、ＪＣＭ２８０２株、ＪＣＭ２８０３株、ＪＣＭ２８０４株、ＪＣＭ２８０４株、またはＪＣＭ２８０６株である、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
広基質特異性ポリエステル重合酵素遺伝子が、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物由来である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
アエロモナスが、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）である、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
アエロモナス・キャビエが、ＦＡ４４０株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７８６）である、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
広基質特異性ポリエステル重合酵素遺伝子が、
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質；又は
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつポリエステル重合活性を有するタンパク質
をコードする核酸からなる、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
広基質特異性ポリエステル重合酵素遺伝子が、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリエステル重合活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる、請求項６に記載の製造方法。
【請求項９】
製造されるポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）に含有する３−ヒドロキシヘキサン酸分率が０．０１〜２０モル％であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の製造方法において使用される、広基質特異性ポリエステル重合酵素遺伝子を含有する組換えベクターを用いて形質転換した形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メタノールを基本原料として、微生物により分解可能であり、生体適合性にも優れた共重合ポリエステルの１つであるポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）を微生物により製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物が産生するポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）は、バイオマスを原料として生産可能な環境低負荷型の生分解性プラスチックである。代表的なＰＨＡであるポリ（３−ヒドロキシブタン酸）（本明細書中「Ｐ（３ＨＢ）」と略記する。）を生合成し、エネルギーの貯蔵物質として菌体内に蓄積する微生物が存在する。この菌体から抽出したＰ（３ＨＢ）は、優れた生分解性と生体適合性を有するが、固くて脆いという物性のため実用化が困難である。
【０００３】
また、Ｐ（３ＨＢ）は、前述の微生物（菌体）を用いて糖や植物油等の炭素源から合成可能であるが、Ｐ（３ＨＢ）生産菌に与える炭素源を工夫することにより、第二のモノマーユニットを導入した共重合ポリエステルを合成することができる。一般に、共重合ポリエステルは、第二のモノマーユニットの構造や組成によって、生産される共重合ポリエステルの物性が変化することから、実用的な生分解性プラスチックとして利用できる共重合ポリエステルの微生物による合成が注目されている。
【０００４】
例えば、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）や遺伝子組換えラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）により脂肪酸や植物油を炭素源としてポリ(３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）［Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）］（図１を参照）が合成される。この共重合体はＰ（３ＨＢ）と比較して低融点及び高柔軟性の優れたプラスチック素材である（特許文献１、非特許文献１−４）。一方、メタノールを炭素源として増殖するメタノール資化性細菌の中には、Ｐ（３ＨＢ）を蓄積するものが知られている。しかしながら、メタノールを唯一の原料として共重合ポリエステルを生合成した例はない。
【０００５】
上述のように、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）は優れた物性を示すバイオポリエステルであり、いくつかの細菌や遺伝子組換え細菌により脂肪酸や植物油を炭素源として生合成される。糖質を原料としてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を生合成する野生の微生物は知られていないが、遺伝子組換え細菌による生合成が報告されている（非特許文献５）。一般に、Ｐ（３ＨＢ）生合成細菌ではアセチル−ＣｏＡの二量化により炭素数４の代謝中間体が合成され、モノマーである（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ（３ＨＢ−ＣｏＡ）が供給される。この３ＨＢ−ＣｏＡポリエステル重合酵素の作用により重合され、高分子量のポリエステルが重合される。上述の組換え株では炭素数４の代謝中間体の１つであるクロトニル−ＣｏＡから還元酵素（クロトニル−ＣｏＡ還元酵素、Ｃｃｒ）によりブチリル−ＣｏＡが生成する。これがチオラーゼの作用によりもう１分子のアセチル−ＣｏＡと縮合し、さらに還元されることにより炭素数６の（Ｒ）−３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ（３ＨＨｘ−ＣｏＡ）が供給され、広基質特異性を示すポリエステル重合酵素により３ＨＢ−ＣｏＡとともに共重合される。
【０００６】
メタノールは、天然ガス（メタン）をスチーム改質した合成ガスから得られる。天然ガスは化石資源の中でも多量に存在し、かつＣＯ2の発生量が比較的少ないことから次世代エネルギー源として注目され、従来の石油から天然ガスへの移行が進んでいる。さらに、メタノールは取り扱いや貯蔵が容易であるという利点がある。また、バイオマスからのメタノール生産も研究されている。これらメタンやメタノールの資化能を有するメチロトロフはＣ１資源のバイオテクノロジーによる利用を目指す上で重要な役割を果たすと考えられる。
【０００７】
メチロバクテリウム・エクストルクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）は、メタノールを炭素源・エネルギー源として好気的に生育できる。Ｍ．エクストルクエンスでは、メタノールはホルムアルデヒドを経てセリン経路に入り、マリル−ＣｏＡの開裂によりグリオキシル酸とアセチル−ＣｏＡが生成する。このアセチル−ＣｏＡを前駆体としてポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸）［Ｐ（３ＨＢ）］を生合成し蓄積することが知られている。また、グリオキシル酸を再生する経路には、上述のクロトニル−ＣｏＡ還元酵素が関与していることがわかっている（図２を参照）（非特許文献６及び７）。
【０００８】
一般に、微生物が生合成するポリエステルの組成は、その微生物が有するモノマー供給代謝経路と、ポリエステル重合酵素の基質特異性によって決定されると考えられる。Ｍ．エクストルクエンスは、Ｃ６モノマー供給の鍵酵素であるＣｃｒを有していることから３ＨＢ−ＣｏＡに加えて３ＨＨｘ−ＣｏＡを細胞内で生合成できる可能性はあるが、ポリエステル重合酵素の基質特異性のために、Ｐ（３ＨＢ）ホモポリマーのみを生合成していることが推測された。
【０００９】
【特許文献１】特許第３０６２４５９号
【非特許文献１】Ｓｈｉｍａｕｒａ，Ｅ．ら，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（１９９４）２７，８７８−８８０
【非特許文献２】Ｄｏｉ，Ｙ．ら，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（１９９５）２７，４８２２−４８２８
【非特許文献３】Ｆｕｋｕｉ，Ｔ．及びＤｏｉ，Ｙ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９７）１７９，４８２１−４８３０
【非特許文献４】Ｆｕｋｕｉ，Ｔ．及びＤｏｉ，Ｙ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９８）４９，３３３−３３６
【非特許文献５】Ｆｕｋｕｉ，Ｔ．ら，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２００２）３，６１８−６２４
【非特許文献６】Ｋｏｒｏｔｋｏｖａら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（２００２）１８４：１７５０−１７５８
【非特許文献７】Ｃｈｉｓｔｏｓｅｒｄｏｖａ，Ｌ．ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（２００３）１８５：２９８０−２９８７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、メタノール資化性菌メチロバクテリウム属に属する微生物の染色体上のポリエステル重合酵素遺伝子を広基質特異性ポリエステル重合酵素遺伝子に置換することにより、メタノールを基本原料としたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）共重合体の微生物合成法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題に基づいて鋭意研究を行った結果、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸）（Ｐ（３ＨＢ））生産能を有する微生物に広基質特異性ポリエステル重合酵素遺伝子を導入することにより、メタノールを基本原料として、微生物内でポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ））を生産できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸）生産能を有するメタノール資化性菌メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物を広基質特異性ポリエステル重合酵素遺伝子を含有する組換えベクターを用いて形質転換し、メタノール源を含有する培地で形質転換体を増殖させることにより、形質転換体内でポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）を製造する方法を提供する。
【００１３】
本発明の製造方法に使用することができる微生物は、限定されないが、メチロバクテリウム・エクストルクエンス（旧名であるメチロバクテリウム・メソフィリクム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃｕｍ）、メチロバクテリウム・ラジオトレランス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、メチロバクテリウム・ロデシアヌム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｏｄｅｓｉａｎｕｍ）、メチロバクテリウム・ロジヌム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｏｄｉｕｎｍ）、メチロバクテリウム・ザトマニイ（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｚａｔｍａｎｉｉ）を含む）である。好ましくは、メチロバクテリウム・エクストルクエンスである。さらに好ましい態様として、メチロバクテリウム・エクストルクエンスには、限定されないが、ＡＭ１株（ＪＣＭ２８０５）、ＪＣＭ２８０２株、ＪＣＭ２８０３株、ＪＣＭ２８０４株、ＪＣＭ２８０４株、ＪＣＭ２８０６株、及びこれらに由来する株が含まれる。
【００１４】
本発明によれば、本発明の製造方法に使用される広基質特異性ポリエステル重合酵素遺伝子は、アエロモナス属に属する微生物由来であることが好ましい。より好ましくは、アエロモナス・キャビエ由来である。さらに好ましくは、ＦＡ４４０株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７８６）である。
【００１５】
本発明によれば、広基質特異性ポリエステル重合酵素遺伝子は、
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質；又は（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつポリエステル重合活性を有するタンパク質をコードする核酸であることができる。また、本発明の製造方法に使用される広基質特異性ポリエステル重合酵素遺伝子は、（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリエステル重合活性を有するタンパク質をコードする核酸であることができる。
【００１６】
本発明によれば、製造されるポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）共重合体における３−ヒドロキシヘキサン酸分率が０．０１〜２０モル％であることを特徴とする前記共重合体を製造する方法が提供される。
【００１７】
さらに、本発明によれば、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）の製造方法において使用される、広基質特異性ポリエステル重合酵素遺伝子を含有する組換えベクターを用いて形質転換した形質転換体が提供される。
【発明の効果】
【００１８】
次世代エネルギーとして着目されているメタノールを基本原料として、広基質特異性ポリエステル重合酵素遺伝子を導入した微生物内からポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ））を生産することができるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の説明のために、好ましい実施形態に関して詳述する。
前述の通り、本発明は、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸）生産能を有するメタノール資化性菌メチロバクテリウム属に属する微生物を広基質特異性ポリエステル重合酵素遺伝子を含有する組換えベクターを用いて形質転換し、メタノール源を含有する培地で形質転換体を増殖させることにより、形質転換体内でポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）を製造する方法を提供する。
【００２０】
（１）広基質特異性ポリエステル重合酵素遺伝子のクローニング
本発明の製造方法に使用される「広基質特異性ポリエステル重合酵素」とは、微生物内で該酵素をコードする核酸から翻訳されたポリエステル重合酵素であって、微生物内で酵素の幅広い基質特異性により、酵素の触媒活性が１つの基質だけに限定されない酵素をいう。このような性質を有する酵素は、ポリエステル重合酵素を発現できる微生物であっても、酵素の基質特異性により生合成ができない微生物に広基質特異性ポリエステル重合酵素の遺伝子を導入することによって、微生物内でポリエステルを重合させることができる。前記ポリエステル重合酵素には、例えば、アエロモナス・キャビエＦＡ４４０株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７８６）（特許文献１）、アエロモナス・ヒドロフィラＷＱ株及び４ＡＫ５株（Ｌｕ，Ｘ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｗｏ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  ｓｐｐ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（２００５）２４３（１）：１４９−５５）などが知られている。好ましくは、ＦＡ４４０株である。
【００２１】
なお、本発明の製造方法に使用される広基質特異性ポリエステル重合酵素をコードする核酸をコードする核酸は、一本鎖又は二本鎖型ＤＮＡ、及びそのＲＮＡ相補体も含む。ＤＮＡには、例えば、天然由来のＤＮＡ、組換えＤＮＡ、化学合成したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組み合わせが含まれる。本発明で使用される核酸としてはＤＮＡが好ましい。なお、周知の通り、コドンには縮重があり、１つのアミノ酸をコードする塩基配列が複数存在するアミノ酸もあるが、広基質特異性ポリエステル重合酵素をコードする核酸の塩基配列であれば、いずれの塩基配列を有する核酸も本発明の範囲に含まれる。
【００２２】
本発明の製造方法においては、広基質特異性ポリエステル重合酵素遺伝子として、前記Ａ．キャビエＦＡ４４０株のポリエステル重合酵素遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｄ８８８２５）を利用することができる（特許文献１、非特許文献３）。このＦＡ４４０株は、すでに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７８６として寄託されおり、当業者であれば、所定の手法により、ＦＡ４４０株からの該遺伝子を単離し、使用することができる。
【００２３】
該酵素をコードする遺伝子は、Ｄ８８８２５に示されるヌクレオチド１−５０５１のうちヌクレオチド２６９４−４４７８である。本明細書では、該遺伝子の塩基配列（ＡＹ５３００１９のヌクレオチド２６９４−４４７８に相当）及びそれがコードする推定アミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び２として配列表に記載する。
【００２４】
本発明の一態様として、Ａ．キャビエ由来の広基質特異性ポリエステル重合酵素遺伝子は、
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質；又は
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつポリエステル重合活性を有するタンパク質
をコードする核酸からなる。
【００２５】
本発明の好ましい態様として、Ａ．キャビエ由来の広基質特異性ポリエステル重合酵素遺伝子は、
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るタンパク質；又は
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつポリエステル重合活性を有するタンパク質
をコードする核酸からなる。
【００２６】
本発明の別の態様として、Ａ．キャビエ由来の広基質特異性ポリエステル重合酵素遺伝子は、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリエステル重合活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。
【００２７】
本発明の別の好ましい態様として、Ａ．キャビエ由来の広基質特異性ポリエステル重合酵素遺伝子は、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列から成る核酸；又は
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列から成る核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリエステル重合活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。
【００２８】
前記広基質特異性ポリエステル重合酵素遺伝子（本明細書中「Ａｃ−ｐｈａＣ」と称することがある。）は、例えば、後述する実施例１に記載するように、配列番号１の塩基配列に基づいてプライマーとして合成ヌクレオチド（配列番号３及び４）を設計し、Ａ．キャビエＦＡ４４０株に導入されているプラスミドｐＪＲＤＥＥ３２（特許文献１、非特許文献３）を鋳型として増幅することができる。
【００２９】
なお、実施例１に示すように、Ａｃ−ｐｈａＣについては、配列番号３及び４のプライマーを使用した場合、ＰＣＲ産物として約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片が得られるので、例えば、これらをアガロースゲル電気泳動等の分子量によりＤＮＡ断片を篩い分ける方法で分離し、特定のバンドを切り出す方法等の常法に従って核酸を単離することができる。
【００３０】
ここで、核酸を増幅するための手法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４（１９８５））、ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ Ｄ．Ｙ．ら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４，５６０−５６９（１９８９））、及び転写に基づく増幅（Ｋｗｏｈ Ｄ．Ｙ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，１１７３−１１７７（１９８９））等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒ Ｇ．Ｔ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３９２−３９６（１９９２）； Ｗａｌｋｅｒ Ｇ．Ｔ．ら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，１６９１−１６９６（１９９２））、自己保持配列複製（３ＳＲ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ Ｊ．Ｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４−１８７８（１９９０））、及びＱβレプリカーゼシステム（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，１１９７−１２０２（１９８８））等の恒温反応を利用することができるが、これらに限定されない。本発明の製造法においては、ＰＣＲ法を使用することが好ましい。
【００３１】
本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度又は高程度なストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度のストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，７．４２−７．４５（２００１）に示されるが、ニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０〜５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ〜６×ＳＳＣ（又は約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、及び約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般的に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、及び約６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。当業者は、温度及び洗浄溶液塩濃度は、プローブの長さ等の要因に従って、必要に応じて調整可能であることを認識するであろう。
【００３２】
上記のような核酸増幅反応又はハイブリダイゼーション等を使用してクローニングされる相同な核酸は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列に対して少なくとも３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する。
【００３３】
なお、同一性パーセントは、視覚的検査及び数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、２つの核酸配列の同一性パーセントは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，３８７（１９８４）に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３）を用いて、配列情報を比較することによって、決定可能である。
【００３４】
タンパク質に関して、一般に、酵素のような生理活性を有するタンパク質において、そのアミノ酸配列のうち、１若しくは数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加された場合であっても、該生理活性が維持されることがあることは周知である。また、天然産のタンパク質の中には、それを生産する生物種の品種の違いや、生態型（ｅｃｏｔｙｐｅ）の違いによる遺伝子の変異、あるいはよく似たアイソザイムの存在等に起因して、１から数個のアミノ酸変異を有する変異タンパク質が存在することは知られている。
【００３５】
したがって、上記の通り、本発明の製造方法において使用されるＡ．キャビエ由来の広基質特異性ポリエステル重合酵素は、典型的には、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するが、該酵素がポリエステル重合活性を有する限り、該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加等の変異が生じてもよい。ここで、用語「数個」とは、本明細書中で使用するとき、好ましくは２〜１００個、より好ましくは２〜５０個、さらにより好ましくは２〜２０個、最も好ましくは２〜１０個である。一般的には、部位特異的な変異によってアミノ酸が置換された場合に、元々のタンパク質が有する活性を保持する程度に置換が可能なアミノ酸の個数は、好ましくは１〜１０個である。
【００３６】
本発明の最も好ましい態様として、Ａ．キャビエ由来の広基質特異性ポリエステル重合酵素は、配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るタンパク質をコードする核酸、又は配列番号１で表される塩基配列から成る核酸である。
【００３７】
（２）遺伝子置換ベクターの構築及び組換え微生物の作製
本発明によれば、広基質特異性ポリエステル重合酵素をコードする遺伝子を相同性組換え用ベクターに組み込んだ遺伝子置換ベクターが提供される。ここで、ベクターに遺伝子を組み込む方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．１（２００１）に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、トーヨーボー社製等）を用いることもできる。
【００３８】
ベクターは、簡単には当該技術分野において入手可能な組換え用ベクター（例えば、プラスミドＤＮＡ等）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。本発明のポリヒドロキシアルカン酸共重合体の製造方法に用いられるベクターとしては、微生物内で、微生物の染色体に既に組み込まれている微生物由来のポリエステル重合酵素遺伝子を外来の広基質特異性ポリエステル重合酵素遺伝子によって置換することを目的として、限定されないが、相同性組換え用ベクターｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ（Ｓｃｈａｆｅｒら，Ｇｅｎｅ  １４５，６９−７３（１９９４））、ｐＪＱ２００（Ｑｕａｎｄｔ，Ｊ．及びＨｙｎｅｓ，Ｍ．Ｐ．，“Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｓｕｉｃｉｄｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｗｈｉｃｈ  ａｌｌｏｗ  ｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ”，Ｇｅｎｅ（１９９３）１２７：１５−２１を使用することが好ましい。なお、本発明の製造方法では、１又は複数個の発現ベクターにポリヒドロキシアルカン酸共重合体に関与する複数の遺伝子を組み込み、微生物内に該ベクターを導入し、所望の共重合体を発現させることもできることは当業者に理解されるであろう。
【００３９】
また、当業者であれば、組換えベクターに適合するように制限末端を適宜選択することができ、さらに、所望のタンパク質を発現させるために、宿主細胞に適した組換えベクターを適宜選択することができる。このようなベクターは、本発明で使用する遺伝子が目的の宿主細胞の遺伝子と相同組換えが起るように機能する領域（必要に応じて、自立複製起点、接合伝達領域、選択マーカー（例えば、カナマイシン耐性遺伝子）等）が適切に配列されており又は導入することにより、該核酸が適切に組換えられるように構築されている又は構築することが好ましい。後述する実施例１に示すように、大腸菌内で機能する自立複製基点、接合伝達領域、選択マーカーであるカナマイシン耐性遺伝子及びレバンシュークラーゼ遺伝子ｓａｃＢを有するベクターｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ（上述）を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、複製起点等を含むＤＮＡ断片を単離して脱リン酸化処理を行い、この断片と、Ａｃ−ｐｈａＣが連結された組換えプラスミドｐＵＣｐｈａＣＡｃを制限酵素ＥｃｏＲＩで処理することで切り出し、単離した３．４ｋｂｐ断片を連結することで遺伝子置換ベクターｐＫ１８ｐｈａＣＡｃ（図３）を作製した。
【００４０】
一般的に、形質転換体は、組換えベクターを宿主細胞に組み込むことによって作製することができる。この場合、宿主細胞として原核細胞（例えば、大腸菌（Ｓ１７−１株等）、枯草菌）であっても真核細胞（哺乳類細胞、酵母、昆虫細胞等）であっても使用することができる。組換えベクターの宿主細胞への導入（形質転換）は公知の方法を用いて行うことができる。例えば、細菌（大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ等）の場合は、例えばＣｏｈｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２））、プロトプラスト法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９））やコンピテント法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６，２０９（１９７１））、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、ラルストニア属、アルカリゲネス属、シュードモナス属等に属する菌体への発現ベクターの導入では、接合伝達法を使用することができる（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１４７，１９８（１９８１））。
【００４１】
この接合伝達法は、簡単には、細胞同士の接触によって染色体ゲノム又はプラスミドを一方の細胞から他方の細胞に移行させる細胞の性質を利用したものであり、例えば、目的のＤＮＡを担持する自己伝達性プラスミドが導入された供与菌と該プラスミドを有しない受容菌との接合に始まり、両菌体における橋の形成、該プラスミドの複製と移行、並びにＤＮＡ合成の完了と共に菌体の分離といった一連の工程によって遺伝子導入を可能にする手段である。
【００４２】
本発明の製造方法に使用される宿主細胞は、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸）（Ｐ（３ＨＢ）生産能を有する機能を有する微生物であれば、特に限定されない。本発明によれば、このような機能を有する天然に存在する細胞（細菌）を使用してもよく、又は、遺伝子工学的手法により作製したこのような機能を発現する形質転換体（細胞株、菌株など）を使用してもよい。
【００４３】
本発明に使用されるＰ（３ＨＢ）生産能を有する微生物は、限定されないが、メタノール資化性菌メチロバクテリウム属に属する微生物を含む。好ましい態様として、本発明の製造方法に使用される微生物は、限定されないが、メチロバクテリウム・エクストルクエンス（旧名であるメチロバクテリウム・メソフィリクム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃｕｍ）、メチロバクテリウム・ラジオトレランス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、メチロバクテリウム・ロデシアヌム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｏｄｅｓｉａｎｕｍ）、メチロバクテリウム・ロジヌム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｏｄｉｕｎｍ）、メチロバクテリウム・ザトマニイ（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｚａｔｍａｎｉｉ）を含む）である。さらに、メチロバクテリウム・エクストルクエンスに属する菌株は、ＡＭ１株（ＪＣＭ２８０５）、ＪＣＭ２８０２株、ＪＣＭ２８０３株、ＪＣＭ２８０４株、ＪＣＭ２８０４株、ＪＣＭ２８０６株、これらに由来する菌株、より好ましくは、ＡＭ１株（ＪＣＭ２８０５）である。本発明の製造方法に使用されるこれらの菌株は、例えば、ＪＣＭ（Ｊａｐａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）又はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から容易に入手可能である。なお、後述する実施例２では、作製した遺伝子置換ベクター（ｐＫ１８ｐｈａＣＡｃ）をＡＭ１株に接合伝達法により導入し、ベクターが相同領域で単交差相同性組換えにより染色体に挿入された組換え株をカナマイシン耐性を指標に単離した。その後、この株から染色体内部での相同性組換えによりベクター部分が切り出された株をシュークロース耐性を指標に単離し、その中から染色体上でＭｅ−ｐｈｂＣがＡｃ−ｐｈａＣに置換された形質転換体を得た。
【００４４】
（３）共重合ポリエステルの合成
ポリエステル合成は、上述した形質転換体をメタノールを含む所定の培地で培養し、培養細胞（例えば、菌体）内又は培養物（例えば、培地）中に共重合ポリエステルを生成及び蓄積させ、培養細胞又は培養物から目的とする共重合ポリエステルを採取することにより行われる。なお、本発明の製造方法に使用される形質転換体の培養法は、通常、宿主細胞の培養に使用される方法に従って行われる。
【００４５】
メチロバクテリウム属に属する菌体を宿主とした場合の培地として、微生物が資化し得るメタノール源を添加し、窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源のいずれかを制限した培地が挙げられる。典型的には、培地温度を２５℃〜３７℃の範囲にし、好気的に１〜１０日培養することにより、共重合ポリエステルを菌体内に生成し蓄積させ、その後、回収・精製することによって所望の共重合ポリエステルを調製することができる。
【００４６】
本発明の製造方法で使用されるメチロバクテリウムは、メタノール資化性菌であり、メタノールを炭素源として成長し得る細菌として知られている。ここで、使用可能なメタノールとしては、一般的には、市販されているメタノールを使用することができ、その供給源は特に限定されない。また、本発明によれば、本発明の形質転換体は、親株のメチロバクテリウム属菌株と同様の培養条件で培養することができ、培地中のメタノール濃度は、０．１〜５％が好ましいが、当業者であれば適宜調整することができる。
【００４７】
また、必要であれば、培地中に窒素源や無機物を添加してもよい。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニア、ペプトン、酵母エキス等が列挙される。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、塩化ナトリウム等が列挙される。
【００４８】
培養は、通常、振とう培養が用いられ、好気的条件下で、２５℃〜３７℃で遺伝子発現誘導後少なくとも１日以上行うことが好ましい。抗生物質として、カナマイシン、アンピシリン等を培地に添加してもよい。また、必要であれば、遺伝子発現誘導剤として、アラビノース、インドールアクリル酸（ＩＡＡ）、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を使用することができる。当業者であれば、所望の遺伝子発現のために可能な培養条件、遺伝子発現の誘導条件等を適宜選択できる。
【００４９】
（４）共重合ポリエステルの精製と構造解析
本発明において、共重合ポリエステルは、下記の通り精製することができる：培地から遠心分離によって形質転換体を回収し、蒸留水で洗浄後、乾燥又は凍結乾燥させる。その後、クロロホルムに乾燥した形質転換体を懸濁させ、室温で所定時間撹拌し、共重合ポリエステルを抽出する。抽出の段階で、必要であれば加熱してもよい。濾過によって残渣を除去し、上清にメタノールを加えて共重合ポリエステルを沈殿させ、沈殿物を濾過又は遠心分離によって、上清を除去し、乾燥させて精製した共重合ポリエステルを得ることができる。
【００５０】
得られた共重合ポリエステルが所望のものであることを確認するための手段は、限定されないが、ＮＭＲ（核磁気共鳴）、ガスクロマトグラフィーを用いる方法を含む。本発明によれば、共重合ポリエステルのモノマーユニットの比、即ち、３−ヒドロキシブタン酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシヘキサン酸（３ＨＨｘ）の比を遺伝子発現条件、培養条件等を変えることにより適宜調節することができる。本発明の製造方法によって得られる共重合ポリエステルの３ＨＨｘ分率は、好ましくは０．０１〜２０モル％、より好ましくは０．０５〜２０モル％、さらにより好ましくは０．１〜５モル％、さらになおより好ましくは０．１〜５．０モル％、最も好ましくは０．１〜１．０モル％である。用語「モル％」は、本明細書中で使用するとき、多成分系における各成分のモル数の和で、ある成分のモル数を割ったものをいう。例えば、本発明の製造方法により得られる共重合体の一般式を３ＨＢ及び３ＨＨｘのモノマーユニットの数として、それぞれ「ａ」及び「ｂ」を用いて表記した場合（図１を参照）、３ＨＨｘ分率は、式：ａ×１００／（ａ＋ｂ）により求めることができる。なお、後述する実施例３で示すように、本発明の製造方法により、３ＨＨｘ分率が異なる共重合ポリエステルを得ることができた（表２）。また、ＮＭＲによって、共重合体であることを確認した（データ示さず）。
【００５１】
また、本発明の製造方法によって得られる共重合ポリエステルの平均分子量（例えば、重量平均分子量（Ｍw）及び数平均分子量（Ｍn））は、当業者に周知な方法、例えば、クロマトグラフィー（ＧＰＣ）法、粘度法、末端基定量法、浸透圧法、光散乱法、沈降速度法により測定することができる。本明細書中で使用するとき、用語「重量平均分子量（Ｍw）」は、多分散系高分子化合物の分子量を意味する。具体的には、分子量Ｍiの分子がｎi個（ｉ＝１、２、・・・）ある多分散系における重量平均分子量は、下式：
【００５２】
【化１】
2009207420.tif 000002
【００５３】
で表される。また、用語「数平均分子量（Ｍn）」は、２個以上の原子より分子が構成されているときの平均分子量でｉ番目の原子量をＭi、その数をＮi個とすると、下式：
【００５４】
【化２】
2009207420.tif 000003
【００５５】
で表される。
【００５６】
本発明の共重合ポリエステルの分子量分布は、Ｍw／Ｍn（分散比）によって表すことができる。一般的に、分散比が２以上の場合に、共重合ポリエステルの網目が良好であることが予測される。
【００５７】
また、本発明の製造方法によって製造された共重合ポリエステルは、乾燥菌体重量当り１重量％以上、好ましくは１０重量％以上、より好ましくは２０重量％以上、さらにより好ましくは３０重量％以上の割合で菌体に蓄積される。
【実施例】
【００５８】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１  遺伝子置換ベクターの作製
公知のアエロモナス・キャビエＦＡ４４０株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７８６）のポリエステル合成遺伝子群塩基配列（Ｄ８８８２５）からポリエステル合成酵素遺伝子（Ａｃ−ｐｈａＣ）の領域に相同な下記のプライマー：
配列１：ATGAGCCAACCATCTTATGGCCCGC（配列番号３）
（配列番号１のヌクレオチド１−２５に対応）
配列２：TCATGCGGCGTCCTCCTCTGTTGGG（配列番号４）
（配列番号１のヌクレオチド１７８５−１７６１に対応）
を設計した。次に、これらのプライマーを用いて、Ａ．キャビエ由来のＡｃ−ｐｈａＣを含むプラスミドｐＪＲＤＥＥ３２（特許文献１、非特許文献３を参照）を鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＡｃ−ｐｈａＣ領域１．８ｋｂｐを増幅した。ＰＣＲはＫＯＤ  Ｐｌｕｓ（トーヨーボー社製）を用い、９８℃で２０秒、６０℃で３０秒、６８℃で３．５分の反応を１サイクルとし、これを３０サイクル行った。増幅したＡｃ−ｐｈａＣをＴ４キナーゼを用いて５’−末端をリン酸化した。
【００５９】
また、公知のメチロバクテリウム・エクストルクエンスＡＭ１株（ＪＣＭ２８０５）の凍結乾燥菌体からＮＲ培地（１％魚肉エキス、１％ポリペプトン、２％酵母エキス）で終夜培養し、その後、その培養液１．５ｍｌから、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１巻，２．４．３．頁，１９９４年；Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ出版）により染色体ＤＮＡを得た。次に、インターネット上で公開されているＭ．エクストルクエンスのゲノム解析結果（http://www.integratedgenomics.com/genomereleases.html# list4）のＣｏｎｔｉｇ１５５７の配列（その一部の配列を配列番号５として配列表に示す）から、Ｍ．エクストルクエンス由来のポリエステル重合酵素遺伝子（Ｍｅ−ｐｈｂＣ）及びその上流下流それぞれ約８１０ｂｐからなる領域に相同な下記のプライマー：
配列３：GCGGAATTCGCCGGCGGTCTCGACGAGTTTC（配列番号６）
（下線部：配列番号５のヌクレオチド３４３４−３４１３に対応）
配列４：AGCGAATTCGGGCGGCCAGACCCAGCAGGTA（配列番号７）
（下線部：配列番号５のヌクレオチド１−２２に対応）
配列５：GCGACACGTCCTCCCAAAGGTCCG（配列番号８）
（下線部：配列番号５のヌクレオチド２６２６−２６４９に対応）
配列６：GGGCATGAAGGTGTGAGGGATCG（配列番号９）
（下線部：配列番号５のヌクレオチド８０７−７８５に対応）
を設計した。
【００６０】
次に、抽出した染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列３及び配列４のプライマー（共に５’−末端にＥｃｏＲＩ認識配列を配置）を用いたＰＣＲ法によって、Ｍｅ−ｐｈｂＣを含む領域３．４ｋｂｐを増幅した。ＰＣＲは、ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ（トーヨーボー社製）を用い、９８℃で２０秒、６８℃で３．５分の反応を１サイクルとし、これを３０サイクル行った。増幅したＤＮＡ断片をＴ４キナーゼを用いて５’−末端をリン酸化した。また、プラスミドベクターｐＵＣ１１８を制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、脱リン酸化した状態で市販されているもの（タカラバイオ社製）と、リン酸化した断片とをＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（トーヨーボー社製）を用いて連結した。次いで、得られた組換えプラスミドを鋳型とし、外向きに設計した配列５及び配列６のプライマーを用いたインバースＰＣＲ法によって、Ｍｅ−ｐｈｂＣ領域を含まないＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲは、ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ（トーヨーボー社製）を用い、９８℃で２０秒、６８℃で４．５分の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。増幅したＤＮＡ断片をＴ４キナーゼを用いて５’−末端をリン酸化し、これと先に５’−リン酸化したＡｃ−ｐｈａＣ断片を連結した。この際、本来位置していたＭｅ−ｐｈｂＣと同じ方向でＡｃ−ｐｈａＣが連結された組換えプラスミドを選抜し、ｐＵＣｐｈａＣＡｃとした。
【００６１】
さらに、大腸菌内で機能する自立複製基点、接合伝達領域、選択マーカーであるカナマイシン耐性遺伝子及びレバンシュークラーゼ遺伝子ｓａｃＢを有するベクターｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ（Ｓｃｈａｆｅｔｅｒら、１９９４、上述）を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、複製起点等を含むＤＮＡ断片を単離して脱リン酸化処理を行った。この断片とｐＵＣｐｈａＣＡｃを制限酵素ＥｃｏＲＩで処理することで切り出し、単離した３．４ｋｂｐ断片を連結することにより、遺伝子置換ベクターｐＫ１８ｐｈａＣＡｃ（図３）を作製した。
【００６２】
実施例２  組換え微生物の作製
得られた遺伝子置換ベクターｐＫ１８ｐｈａＣＡｃを用いて、メタノール資化性細菌Ｍ．エクストルクエンスＡＭ１株（ＪＣＭ２８０５）をエレクトロポレーション法によって形質転換した。まず、ＡＭ１株をＨｙｐｈｏ−コハク酸培地（Ｋ2ＨＰ4  ２．５３ｇ、ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ  ２．５９ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4  ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4  ０．０２ｇ、トレースエレメント（表１参照）１ｍｌ、コハク酸二ナトリウム塩５ｇ、蒸留水１０００ｍｌ）５０ｍｌで濁度（ＯＤ６００ｎｍ）が０．５〜０．７となるまで培養し、遠心分離による集菌、冷水による洗浄、冷１０％グリセロール溶液で洗浄後、冷１０％グリセロール溶液２ｍｌに懸濁し、−８０℃で冷凍保存した。
【００６３】
【表１】
2009207420.tif 000004
【００６４】
この菌体懸濁液２０μｌに１〜２μｌのプラスミド溶液を加え、幅０．１ｃｍの電極キュベットに入れ、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ（バイオラッド社）により電気パルス処理を加えた。処理条件は、電圧１８００Ｖ、電気容量２５μＦ、抵抗値２００Ωとした。電圧印可後、速やかに８００μｌのＮ培地（０．５％魚肉エキス、０．５％ポリペプトン）を加え、３０℃で終夜培養を行った。この培養液を５０μｇ／ｍｌカナマイシンを添加したＨｙｐｈｏ−コハク酸寒天培地に塗布し、３０℃で５日間培養した。ｐＫ１８ｐｈａＣＡｃは、Ｍ．エクストルクエンス細胞内では自立複製が不能なため、上記培地上で増殖したカナマイシン耐性株は、Ａｃ−ｐｈａＣ遺伝子の両側に配置したＭｅ−ｐｈｂＣ上流領域あるいは下流領域を相同領域とした単交差相同性組換えにより組換えプラスミドが染色体に挿入された株である。
【００６５】
得られたコロニーから１個を単離し、Ｈｙｐｈｏ−コハク酸培地で終夜培養し、その後、菌液を５％シュークロースを含むＨｙｐｈｏ−コハク酸培地に塗布し、３０℃で５日間培養した。染色体に挿入された組換えプラスミド部分に存在するｓａｃＢ遺伝子によりコードされるレバンシュークラーゼは、シュークロース存在化で異常多糖の合成による毒性を示すため、上記培地上で増殖したシュークロース耐性株は染色体中の相同領域での相同性組換えによりプラスミド部分が脱落した株である。その際、染色体にＭｅ−ｐｈｂＣ領域が保存された株と、Ａｃ−ｐｈａＣ領域が保存された株の２種類の菌株が生じるが、上記配列１及び配列２のオリゴヌクレオチドを用いたコロニーＰＣＲによって、Ａｃ−ｐｈａＣ領域が保存された株を選抜し、この形質転換体を「ＡＭ１ＣＡｃ株」と命名した（図４）。
【００６６】
実施例３  Ｍ．エクストルクエンスＡＭ１株及びＡＭ１ＣＡｃ株によるポリエステル合成
Ｍ．エクストルクエンスによるポリエステル合成は一段培養で行った。Ｈｙｐｈｏ−コハク酸培地で前培養したＭ．エクストルクエンスを１００ｍｌのＨｙｐｈｏ−メタノール培地（Ｋ2ＨＰ4  ２．５３ｇ、ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ  ２．５９ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4  ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4  ０．０２ｇ、トレースエレメント１ｍｌ、メタノール５ｍｌ、蒸留水１０００ｍｌ）に植菌し、坂口フラスコ中、３０℃で７２〜９６時間振とう培養した。生育曲線を図５に示す。培養終了後に遠心分離によって菌体を回収し、蒸留水で洗浄して凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。
【００６７】
乾燥菌体４０ｍｇに２ｍｌの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱することにより、菌体内ポリエステル分解物のメチルエステルを得た。これに１ｍｌの蒸留水を添加し、激しく撹拌した。静置して二相に分離させた後、下相の有機層を取り出した。有機相０．１ｍｌに０．１％オクタン酸メチル・クロロホルム溶液０．１ｍｌ、ジメチルホルムアミド０．３ｍｌとビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド０．１ｍｌを加え、７０で３０分間加熱し、水酸基をトリメチルシリル化した。その後、室温まで冷却し、ヘキサン１ｍｌと精製水１ｍｌを加え、激しく撹拌し、静置後、上部の有機相をキャピラリーガスクロマトグラフィーによって分析した。ガスクロマトグラフは、島津製作所製ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ  ＢＯＮＤ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。温度条件は、初発温度１００℃から８℃／分の速度で昇温した。得られた結果を表２に示す。
【００６８】
【表２】
2009207420.tif 000005
【００６９】
野生株であるＡＭ１株の培養では、Ｐ（３ＨＢ）ホモポリマーのみが乾燥菌体重量あたり４．７％の低い率で蓄積することを確認した。ＡＭ１ＣＡｃ株では、生育速度はＡＭ１株に比べて若干低下するものの、最終的には多量の菌体が得られ、また乾燥菌体重量あたり３６重量％のポリエステル蓄積が得られ、約７倍に向上した。さらに、ＡＭ１ＣＡｃ株により合成されたポリエステル中には０．３ｍｏｌ％の３ＨＨｘユニットが導入されたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）共重合体であった。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】ポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）の構造を示す。
【図２】メタノール資化性細菌メチロバクテリウム・エクストルクエンスにおけるメタノール代謝経路とポリエステル生合成のスキームを示す。
【図３】構築した遺伝子置換ベクターｐＫ１８ｐｈａＣＡｃを示す。
【図４】相同性組換えによる遺伝子置換株を単離する模式図を示す。
【図５】Ｍ．エクストルクエンスＡＭ１株及びＡＭ１ＣＡｃ株の生育曲線を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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