(57)【要約】【課題】金属タンパク質以外のタンパク質であっても、その変性を電気化学的手法を用いて検出することができる分析装置を提供することを課題とする。【解決手段】ダイヤモンド電極と、対電極と、前記ダイヤモンド電極及び前記対電極に電圧が印加されることにより発生した電流値を測定する電流測定装置と、異なる試料溶液を前記セルに流したときに発生した前記電流値を比較する比較部と、印加電圧値と、その印加電圧値において観察されるピークの由来となるアミノ酸残基又はアミノ酸残基間の結合とを、対にして格納する格納部と、を備えるようにした。【選択図】図１
2009216602.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の変性を電気化学的に検出する分析装置であって、
ダイヤモンド電極と、
対電極と、
前記ダイヤモンド電極及び前記対電極に電圧が印加されることにより発生した電流値を測定する電流測定装置と、
異なる試料溶液を前記セルに流したときに発生した前記電流値を比較する比較部と、
印加電圧値と、その印加電圧値において観察されるピークの由来となるアミノ酸残基又はアミノ酸残基間の結合とを、対にして格納する格納部と、を備えているタンパク質変性検出装置。
【請求項２】
前記ダイヤモンド電極と前記対電極とを内蔵し、それら電極と接触するように試料溶液を収容可能であるセルを備えている請求項１記載のタンパク質変性検出装置。
【請求項３】
ダイヤモンド電極及び対電極を備え、タンパク質の変性を電気化学的に検出する分析装置を制御するシステムであって、
前記ダイヤモンド電極及び前記対電極に、異なる試料溶液を接触させて、所定の電圧を印加したときに発生した電流値を比較する比較部と、
印加電圧値と、その印加電圧値において観察されるピークの由来となるアミノ酸残基又はアミノ酸残基間の結合とを、対にして格納する格納部と、を備えている制御システム。
【請求項４】
ダイヤモンド電極及び対電極を備え、タンパク質の変性を電気化学的に検出する分析装置を制御するシステムを作動させるコンピュータに、
前記ダイヤモンド電極及び前記対電極に、異なる試料溶液を接触させて、所定の電圧を印加したときに発生した電流値を比較する比較部と、
印加電圧値と、その印加電圧値において観察されるピークの由来となるアミノ酸残基又はアミノ酸残基間の結合とを、対にして格納する格納部と、しての機能を実現させるためのプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、タンパク質の変性を電気化学的に検出する分析装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質はネイティブな状態では折りたたまれたコンパクトな立体構造をとるが、強酸、強アルカリ、有機溶媒、重金属塩、変性剤、界面活性剤等の化学的要因や、熱、凍結、高圧、超音波、紫外線、Ｘ線、攪拌、吸着、希釈等の物理的要因に晒されると高次構造が壊れて変性し、ペプチド鎖がランダムコイル構造へと変化する。
【０００３】
このようなタンパク質の変性は蛍光分光法、紫外可視分光法、ＮＭＲ、ＣＤ等により検出することができるが、電気化学的手法を用いてその変性が検出できたタンパク質としてはシトクロムＣ等の金属タンパク質が報告されているのみである（非特許文献１）。
【非特許文献１】FEDURCO Milan, et al. “Electrochemistry of UnfoldedCytochrome c in Neutral and Acidic Urea Solutions”, J Am Chem Soc, Vol.127, No.20,Page.7638-7646 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで本発明は、金属タンパク質以外のタンパク質であっても、その変性を電気化学的手法を用いて検出することができる分析装置を提供すべく図ったものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
すなわち本発明に係るタンパク質変性検出装置は、タンパク質の変性を電気化学的に検出する分析装置であって、ダイヤモンド電極と、対電極と、前記ダイヤモンド電極及び前記対電極に電圧が印加されることにより発生した電流値を測定する電流測定装置と、異なる試料溶液を前記セルに流したときに発生した前記電流値を比較する比較部と、印加電圧値と、その印加電圧値において観察されるピークの由来となるアミノ酸残基又はアミノ酸残基間の結合とを、対にして格納する格納部と、を備えていることを特徴とする。
【０００６】
上述のとおり、従来タンパク質の変性を検出するには、ＮＭＲ、ＣＤ（Circular Dichroism）、蛍光分光法、紫外可視分光法等が用いられているが、ＮＭＲは部分的な構造変化の検出に主に使用されており、タンパク質全体の変性度合いの検出にはあまり使用されない。これは、ＮＭＲでは、構造変化に関する細かいデータが得られるものの、データの分析や解釈が難しいためである。また、ＣＤはαへリックスやβシート等のタンパク質の二次構造を解析することができるが、特定のアミノ酸残基に由来する変性を検出することはできない。一方、蛍光分光法では、主にトリプトファンに由来する変化を目的とする分析を高感度で行なうことができるが、定性的な情報しか得られないので、タンパク質の変性の程度を知るためには、他の分析方法と組み合わせることが必要となる。また、紫外可視分光法は、トリプトファンとチロシンに由来する変化を検出することができるが、感度が低く、試料溶液のタンパク質濃度が２〜３００μｇ／ｍｌ以上であることが必要である。
【０００７】
これに対して、本発明であれば、トリプトファン、チロシン、システイン、メチオニン等のアミノ酸残基や、ジスルフィド結合等のアミノ酸残基間の結合に由来する変化を高感度で検出することができるので、タンパク質の変性状態や変性度合いを、より多くのアミノ酸残基に由来する情報に基づき多角的に高感度で検出することができる。また、分光法と異なり、着色や濁りのある試料溶液であっても測定することができる。
【０００８】
そして、本発明に係るタンパク質変性検出装置によれば、印加電圧値とアミノ酸残基等との対応関係が予め格納されているので、印加する電圧値を変えて複数点で測定を行なうことにより、変性に関与しているアミノ酸残基等を、迅速かつ容易に把握することができる。
【０００９】
本発明で用いるダイヤモンド電極としては、１３族又は１５族の元素の混入により導電性とされたダイヤモンド薄膜を有するものが挙げられ、なかでも、ホウ素、窒素、及び、リンからなる群から選択される少なくとも一種の元素を混入したものが好ましく、特に、ホウ素を混入したボロンドープダイヤモンド電極が好適である。
【００１０】
また、前記ダイヤモンド電極としては、８族、９族又は１０族の元素の混入により導電性とされたダイヤモンド薄膜を有するものを使用することもでき、このような導電性ダイヤモンド電極としては、白金、パラジウム、ニッケル、ルテニウム、及び、イリジウムからなる群から選択される少なくとも一種の元素が混入されたものが挙げられる。
【００１１】
本発明に係るタンパク質変性検出装置は、前記ダイヤモンド電極と前記対電極とを内蔵し、それら電極と接触するように試料溶液を収容可能であるセルを備えていて、当該ダイヤモンド電極及び対電極を用いる二電極法を用いるものでもよいが、高感度及び高精度の測定を行う場合は、更に参照電極を用いる三電極法を用いるものが好ましい。試料溶液に、更に参照電極を接触させることにより、ダイヤモンド電極と対電極との間に印加する電圧の絶対値を制御することができる。
【００１２】
また、ダイヤモンド電極及び対電極を備え、タンパク質の変性を電気化学的に検出する分析装置を制御するシステムであって、前記ダイヤモンド電極及び前記対電極に、異なる試料溶液を接触させて、所定の電圧を印加したときに発生した電流値を比較する比較部と、印加電圧値と、その印加電圧値において観察されるピークの由来となるアミノ酸残基又はアミノ酸残基間の結合とを、対にして格納する格納部と、を備えている制御システムもまた、本発明の１つである。
【００１３】
更に、ダイヤモンド電極及び対電極を備え、タンパク質の変性を電気化学的に検出する分析装置を制御するシステムを作動させるコンピュータに、前記ダイヤモンド電極及び前記対電極に、異なる試料溶液を接触させて、所定の電圧を印加したときに発生した電流値を比較する比較部と、印加電圧値と、その印加電圧値において観察されるピークの由来となるアミノ酸残基又はアミノ酸残基間の結合とを、対にして格納する格納部と、しての機能を実現させるためのプログラムもまた、本発明の１つである。
【発明の効果】
【００１４】
このように本発明によれば、電子移動による酸化・還元を利用して、変性によるタンパク質の高次構造の変化を直接的に検出することができ、変性に関与しているアミノ酸残基等を、迅速かつ容易に把握することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下に本発明の一実施形態について図面を参照して説明する。
【００１６】
本実施形態に係るタンパク質変性検出装置１は、図１に模式的に示すように、電気化学測定用のフローセルを用いた液体注入型の電気化学的測定装置（フローインジェクション分析装置）である。
【００１７】
フローインジェクション分析は、定量ポンプ等を用いて制御された連続流れをつくりだし、この流れの中で種々の反応、分離や試料注入等を行い、末端に設置したフローセルを備えた検出器により溶液中の成分を分析する方法である。
【００１８】
本実施形態に係るタンパク質変性検出装置１は、流路の上流側から、対電極４、ボロンドープダイヤモンド電極５及び参照電極６が内蔵されたフローセル３、ポンプ２、を備えており、対電極４、ボロンドープダイヤモンド電極５及び参照電極６は、ポテンショガルバノスタット７に接続され、更にポテンショガルバノスタット７には情報処理装置８が接続されている。
【００１９】
前記ポンプ２としては一定速度で試料溶液Ｓをフローセル３に送ることができるものであれば特に限定されず、例えば液体クロマトグラフィー用ポンプ等を用いることができる。
【００２０】
前記フローセル３は、図２に示すように、ボロンドープダイヤモンド電極５、対電極４、及び、参照電極６が、試料溶液Ｓが流れる内部流路３１内に露出され、試料溶液Ｓと接触できるよう構成されている。ボロンドープダイヤモンド電極５はそのダイヤモンド薄膜が、内部流路３１内に露出され、試料溶液Ｓと接触している。試料溶液Ｓは、内部流路３１の流入口３２から入り、図中の矢印のように流れ、流出口３３に至る。そして、ボロンドープダイヤモンド電極５と対電極４との間に電圧が印加されることにより、試料溶液Ｓ中で電気化学的反応が起こる。
【００２１】
ボロンドープダイヤモンド電極５は、絶縁体であるダイヤモンドにホウ素が添加されることにより導電性を示すようになったものである。高濃度でホウ素をドープしたボロンドープダイヤモンド電極５は、電位窓が広く（酸化電位及び還元電位が広い）、他の電極材料と比較してバックグラウンド電流が低く、酸化還元種に対して感度が高く、金や白金等に比べて電極表面に物理的吸着が生じにくいため酸素・水素発生以外のピークが出にくい、といった優れた性質を有している。また、ボロンドープダイヤモンド電極５は、化学的耐久性、機械的耐久性、電気伝導度、耐腐食性等にも優れている。更に、ボロンドープダイヤモンド電極５はその硬度から化学的・物理的な洗浄を行ないやすく、電極表面を清浄な状態に維持しやすいという利点も有する。
【００２２】
ダイヤモンドへのホウ素の添加量は、ダイヤモンドに導電性を付与できる範囲で適宜決定されてよいが、例えば抵抗率１×１０−２〜１０−６Ωｃｍ程度の導電性を与える量であることが好ましく、当該添加量は一般的には製造工程において制御される。
【００２３】
ボロンドープダイヤモンドそれ自体を基材の支持によらず電極とすることも可能であるが、基材上にボロンドープダイヤモンドの薄膜を形成し、この薄膜に導線を接続させ、電極とすることが好ましい。基材としては、Ｓｉ（例えば、単結晶シリコン）、Ｍｏ、Ｗ、Ｎｂ、Ｔｉ、Ｆｅ、Ａｕ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ａｌ２Ｏ３、ＳｉＣ、Ｓｉ３Ｎ４、ＺｒＯ２、ＭｇＯ、黒鉛、単結晶ダイヤモンド、ｃＢＮ、石英ガラス等が挙げられ、特に単結晶シリコン、Ｍｏ、Ｗ、Ｎｂ、Ｔｉ、ＳｉＣ、単結晶ダイヤモンドが好適に用いられる。
【００２４】
ボロンドープダイヤモンド薄膜の厚さは、特に限定されないが、１〜１００μｍ程度の厚さが好ましく、より好ましくは５〜５０μｍ程度である。
【００２５】
本発明においては、ボロンドープダイヤモンド電極５は、マイクロ電極の形態のものであってもよい。ここで、マイクロ電極形態のボロンドープダイヤモンド電極５とは、Ｐｔ等の細線の末端を鋭利に切断し、電解研磨により末端を更に鋭利にした後、その末端表面にボロンドープダイヤモンドの薄膜を形成した構成のものをいう。
【００２６】
ボロンドープダイヤモンド電極５の製造方法として、マイクロ波プラズマアシストＣＶＤ法を用いた一例を以下に具体的に説明する。まず、水素ガスが充満したチャンバー内に水素プラズマを生成し、そこにボロン種を溶解したアセトンとメタノールの混合ガスを導入し、炭素源を導入し、例えばシリコン基板等の導電性（又は半導電性）基板上に気相成長させる。基板としてはシリコン基板｛Ｓｉ（１００）｝を用い、基板表面をテクスチャー処理（例えば、０．５μｍのダイヤモンド粉による研磨）した後、基板を成膜装置のホルダーにセットする。成膜用ソースとしては、アセトンとメタノールの混合物（液体で、混合比は体積比９：１）を用い、この混合物に酸化ホウ素（Ｂ２Ｏ３）をホウ素／炭素（Ｂ／Ｃ）比で１０４ｐｐｍとなるように溶解する。そして、この成膜用ソースにキャリアーガスとして純Ｈ２ガスを通した後、チャンバー内に導入し、予め別ラインで水素（例えば、５３２ｍｌ／ｍｉｎ）を流して所定圧力（例えば、１１５Ｔｏｒｒ＝１１５×１３３．３２２Ｐａ）となるように調整する。そして、２．４５ＧＨｚのマイクロ波電力を注入し、放電させた後、電力が５ｋＷとなるように調整する。そして、安定したところで、成膜用ソースにキャリアーガスとして純Ｈ２ガス（例えば、１５ｍｌ／ｍｉｎ）を流して成膜を行う。
【００２７】
上記のマイクロ波プラズマアシストＣＶＤ法を用いた製造方法により、成膜速度１〜４μｍ／時で、約３０μｍの厚さとなるまでダイヤモンド薄膜の成膜を行ったところ、基板の加熱は行わなかったものの、定常状態において約８５０〜９５０℃の温度となっていることが観察された。また、得られたダイヤモンド薄膜のラマンスペクトルをとると、１３３３ｃｍ−１に単一ピークのみが観察された。また、電気伝導度は抵抗率約１０−３Ωｃｍ程度であり、０．５Ｍ硫酸中においてサイクリックボルタモグラムを測定した結果、−１．２５〜＋２．３Ｖ（対ＳＨＥ（標準水素電極））と、広い電位窓を有することが確認できた。
【００２８】
前記対電極４としては、例えば白金、炭素、ステンレス、金、ダイヤモンド、ＳｎＯ２等を用いることができる。
【００２９】
前記参照電極６としては公知のものを利用することができ、標準水素電極、銀塩化銀電極、水銀塩化水銀電極、水素パラジウム電極等を用いることができる。
【００３０】
ポテンショガルバノスタット７は、ボロンドープダイヤモンド電極５の電位を参照電極６に対して一定にした状態で、ボロンドープダイヤモンド電極５と対電極４との間に発生した電流を検出し、その検出信号を情報処理装置８に伝達する。
【００３１】
情報処理装置８は、ＣＰＵや、メモリ、入出力チャンネル、キーボード等の入力手段、ディスプレイ等の出力手段、Ａ／Ｄ変換器、Ｄ／Ａ変換器等を備えた汎用乃至専用のものであり、前記ＣＰＵ及びその周辺機器が、前記メモリの所定領域に格納されたプログラムに従って協働動作することにより、標準電流値格納部８１、テーブル格納部（本発明に係る格納部）８２、比較部８３等として機能する。なお、この情報処理装置８は、物理的に一体である必要はなく、有線又は無線により複数の機器に分割されていてもよい。
【００３２】
標準電流値格納部８１は、ネイティブなタンパク質を含む標準溶液をタンパク質変性検出装置１に流して、所定の電圧を印加したときに発生した標準電流の検出信号を、ポテンショガルバノスタット７から受信して、その標準電流値を格納するものである。
【００３３】
テーブル格納部８２は、印加電圧値とその印加電圧値において観察されるピークの由来となるアミノ酸残基又はアミノ酸残基間の結合とが対になっているテーブルを格納するものである。印加電圧値とアミノ酸残基等との対応は、例えば、０．６５〜０．７５Ｖにはシステイン、トリプトファン、チロシンに由来するピークが現れ、１．１Ｖには酸化型グルタチオン等のジスルフィド結合に由来するピークが現れ（図３参照）、１．２〜１．３Ｖにはメチオニンに由来するピークが現れる（図４参照）。
【００３４】
なお、図３は、作用電極としてボロンドープダイヤモンド電極を用い、走査速度１００ｍＶ／ｓで行なったサイクリックボルタンメトリー（以下ＣＶと記す）による測定の結果を示し、実線が１ｍＭの酸化型グルタチオンを含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）のボルタモグラムであり、点線が０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）のボルタモグラムである。一方、図４は、同様の条件におけるＣＶ測定の結果を示し、実線が１ｍＭのメチオニンを含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）のボルタモグラムであり、点線が０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）のボルタモグラムである。
【００３５】
比較部８３は、被験タンパク質を含む試料溶液Ｓをタンパク質変性検出装置１に流して、所定の電圧を印加したときに発生した電流の検出信号を、ポテンショガルバノスタット７から受信して、当該電流値と、標準電流値格納部８１から取得した標準電流値とを比較して、電流値の変化を検出するものである。なお、電流値を比較するためには、試料溶液Ｓの被験タンパク質濃度は標準溶液のネイティブなタンパク質濃度と同じであることが必要である。次いで、比較部８３は、テーブル格納部８２から、印加電圧値とアミノ酸残基等とが対になったテーブルを取得して、電流測定時に印加した電圧値に対応するアミノ酸残基等を選び出す。
【００３６】
このように構成されたタンパク質変性検出装置１を用いて被験タンパク質の変性を検出するには、まず、被験タンパク質を含有しないリン酸緩衝液等のキャリア溶液のみをフローセル３に流し、いわゆるバックグラウンド電流をできるだけ小さくし、かつ安定させる。次に、ネイティブなタンパク質を含む標準溶液を前記キャリア溶液に混合させてフローセル３に流す。
【００３７】
そして、対電極４、ボロンドープダイヤモンド電極５及び参照電極６が標準溶液に接触した状態で、ボロンドープダイヤモンド電極５と対電極４との間に電圧を印加することにより、ネイティブなタンパク質がボロンドープダイヤモンド電極５上で酸化又は還元され、酸化還元反応に伴う電流が発生する。
【００３８】
当該電気化学的反応によって発生した標準電流値（電気信号）はポテンショガルバノスタット７に伝達し各電極における信号の制御・検出が行われる。ポテンショガルバノスタット７で検出された信号は標準電流値格納部８１に送信され、その標準電流値の情報が格納される。
【００３９】
引き続いて、被験タンパク質を含む試料溶液Ｓを前記標準溶液と同様に前記キャリア溶液に混合させてフローセル３に流し、同様にして所定電圧印加下での電流値を測定する。そして、ポテンショガルバノスタット７で検出された電流値の検出信号は比較部８３に送信される。なお、被験タンパク質を含む試料溶液Ｓと前記標準溶液とのタンパク質の濃度は同じであることが必要である。
【００４０】
比較部８３は、ポテンショガルバノスタット７から送信された被験タンパク質に基づく電流値の検出信号を受信し、標準電流値格納部８１からはネイティブなタンパク質に基づく標準電流値を取得して、被験タンパク質に基づく電流値と標準電流値とを比較して、変性の度合いを算出する。次いで、比較部８３は、テーブル格納部８３から取得したテーブルを参照して、測定時に印加した電圧値に対応するアミノ酸残基等を選び出す。
【００４１】
そして、変性に関与するアミノ酸残基等の種類と変性の度合いについての情報が比較部８３からディスプレイ等の出力手段へ伝達され、当該情報がオペレータにより取得される。この一連の操作を、印加する電圧値を変えて複数点で行うことにより、変性に関与するより多くのアミノ酸残基等を検出することができる。なお、測定が終了した試料溶液Ｓはタンパク質変性検出装置１外に排出される。
【００４２】
このように構成されたタンパク質変性検出装置１によれば、トリプトファン、チロシン、システイン、ジスルフィド結合、メチオニン等に由来する変化を高感度で検出することができるので、タンパク質の変性状態や変性度合いを、より多くのアミノ酸残基に由来する情報に基づき多角的に高感度で検出することができる。また、分光法と異なり、着色や濁りのある試料溶液であっても測定することができる。
【００４３】
タンパク質変性検出装置１を用いて変性度合いを定量的に観察するには、例えば、尿素等のタンパク質変性剤を一定量添加した試料と変性剤無添加の試料とについて、タンパク質変性検出装置１を用いてＣＶ測定を行い、酸化ピークの高さの違いから変性度合いを算出することができる。また、タンパク質変性検出装置１を用いてＣＶ測定を行い、酸化ピークの変化から変性に関与するアミノ酸残基等を検出することにより、タンパク質の活性や立体構造に関する手がかりを得ることが可能となる。
【００４４】
また、タンパク質変性検出装置１では、フローインジェクション法（ＦＩＡ法）が採用されているので、タンパク質と電極表面との接触時間が短く、変性により内部の疎水性アミノ酸残基がタンパク質表面に現れて、固体表面に吸着しやすくなったタンパク質であっても、タンパク質の電極表面への物理的な吸着が生じにくい。更に、タンパク質の電気化学的酸化・還元を高電位で行なうと、タンパク質のペプチド鎖が解裂することがあるが、タンパク質と電極表面との接触時間が短い場合は、高電位で電気化学的酸化・還元を行なっても、タンパク質のペプチド鎖の解裂が起こりにくいので、タンパク質の一次構造（アミノ酸配列）に影響を与えずに測定を行なうことができる。このため、電子移動による酸化・還元を利用して、変性によるタンパク質の高次構造の変化及びその程度を直接的に検出することができる。
【００４５】
そして、タンパク質変性検出装置１によれば、印加電圧値とアミノ酸残基等との対応関係が予め格納されているので、印加する電圧値を変えて複数点で測定を行なうことにより、変性に関与しているアミノ酸残基を、迅速かつ容易に把握することができる。
【００４６】
なお、本発明は前記実施形態に限られるものではない。
【００４７】
ボロンドープダイヤモンド電極５に代えて、窒素、リン等の１５族の元素の混入により導電性とされたダイヤモンド薄膜を有するダイヤモンド電極や、白金、パラジウム、ニッケル、ルテニウム、イリジウム等の８族、９族又は１０族の元素の混入により導電性とされたダイヤモンド薄膜を有するダイヤモンド電極を使用することもできる。
【００４８】
前記実施形態に係るタンパク質変性検出装置１は、対電極４、ボロンドープダイヤモンド電極５及び参照電極６が備わった三電極法による測定を行うものであるが、本発明に係るタンパク質変性検出装置は、ボロンドープダイヤモンド電極５及び対電極４のみを備えた二電極法によるものであってもよい。三電極法の方が、ボロンドープダイヤモンド電極５と対電極４との間に印加する電圧の絶対値を制御することができるので、精度及び感度の高い測定を行うことが可能であるが、二電極法によれば、用いる電極がボロンドープダイヤモンド電極５及び対電極４の２種類の電極ですむので、フローセル３の構造を単純化、小型化することができ、測定セルをチップ化し使い捨てとすることも可能で、より簡便な測定を行いうる。
【００４９】
また、前記実施形態ではセルがフロー型であったが、セルがバッチ型であってもよい。
【００５０】
その他、前述した実施形態や変形実施形態の一部又は全部を適宜組み合わせてもよく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々の変形が可能であるのは言うまでもない。
【実施例】
【００５１】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００５２】
＜ボロンドープダイヤモンド電極を用いた牛血清アルブミンのＣＶ測定＞
５０μｇ／ｍｌ牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）について、作用電極としてボロンドープダイヤモンド電極を用い、走査速度１００ｍＶ／ｓで、ＣＶ測定を行なった。結果を図５のグラフに示した。
【００５３】
なお、図５のグラフでは、実線が５０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）のボルタモグラムであり、点線が０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）のボルタモグラムである。
【００５４】
図５に示すように、ＢＳＡを含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）のボルタモグラムには、システイン、トリプトファン、チロシンに由来する０．６５〜０．７５Ｖ付近のピークと、ジスルフィド結合に由来する１．１Ｖ付近のピークと、メチオニンに由来する１．２〜１．３Ｖ付近のピークの、３つの酸化ピークが確認された。
【００５５】
＜ＣＶ測定によるタンパク質変性の検出＞
５０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）に対し、タンパク質変性剤である尿素を濃度が８Ｍとなるように添加した試料と無添加な試料とを調整し、作用電極としてボロンドープダイヤモンド電極を用いて、走査速度１００ｍＶ／ｓで、ＣＶ測定を行なった。結果を図６のグラフに示した。
【００５６】
図６のグラフより、尿素濃度の上昇によりＢＳＡは変性状態へと変化し、これに伴いＣＶ測定の電流値は上昇したことが確認された。
【００５７】
＜ＦＩＡ法によるタンパク質変性の検出＞
５０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）について、尿素濃度を変化させて、作用電極としてボロンドープダイヤモンド電極を使用したＦＩＡ法（酸化電位：１３００ｍＶ）と、蛍光分析法（測定波長：２８０ｎｍ、励起波長：２９０−５００ｎｍ）とにより、尿素濃度依存性の測定を行なった。結果を図７のグラフに示した。
【００５８】
なお、図７のグラフにおいて、○は、蛍光分析法による測定結果（蛍光強度）を示し、□はＦＩＡ法による測定結果（酸化電流の逆数）を示す。
【００５９】
図７のグラフに示すように、蛍光分析法とＦＩＡ法とでは、得られた尿素濃度依存性が一致した。このため、作用電極としてボロンドープダイヤモンド電極を用いたＦＩＡ法はタンパク質の高次構造変化を検出するために適用可能であることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明の一実施形態に係るタンパク質変性検出装置の概要図。
【図２】図１に示すタンパク質変性検出装置のフローセルの構成を示す概要図。
【図３】酸化型グルタチオンを測定対象とするＣＶ測定の結果を示すボルタモグラム。
【図４】メチオニンを測定対象とするＣＶ測定の結果を示すボルタモグラム。
【図５】ウシ血清アルブミンを測定対象とするＣＶ測定の結果を示すボルタモグラム。
【図６】ウシ血清アルブミンに対して尿素を添加した影響を示すＣＶ測定のボルタモグラム。
【図７】ウシ血清アルブミンに添加する尿素の濃度を変化させたときの、ボロンドープダイヤモンド電極を作用電極として使用したＦＩＡ法と蛍光分析法とにより測定した尿素濃度依存性を示すグラフ。
【符号の説明】
【００６１】
１・・・タンパク質変性検出装置
３・・・フローセル
４・・・対電極
５・・・ボロンドープダイヤモンド電極
７・・・ポテンショガルバノスタット
８２・・・テーブル格納部
８３・・・比較部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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