(57)【要約】【課題】  凝集を起こさず、感度の高い免疫検査方法を提供することである。【解決手段】  磁性金属を主成分とする金属粒子核に無機材料で被覆を形成した磁気ビーズを用い、塩化ナトリウムを含む検体の塩化ナトリウム濃度が０．４５重量％以上０．９０重量％以下となるように前記検体と希釈液と前記磁気ビーズを混合し、前記検体の免疫検査を行うことを特徴とする。前記免疫検査方法の混合工程において、りん酸二水素ナトリウムまたはりん酸二水素ナトリウムを含む溶液を添加することができる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性金属を主成分とする金属粒子核に無機材料で被覆を形成した磁気ビーズを用い、塩化ナトリウム濃度が０．４５重量％以上０．９０重量％以下となるように前記検体と希釈液と前記磁気ビーズを混合し、前記検体の免疫検査を行うことを特徴とする免疫検査方法。
【請求項２】
前記無機材料がチタン酸化物を主成分とすることを特徴とする請求項１に記載の免疫検査方法。
【請求項３】
前記無機材料が互いに異なる２種以上の無機材料であることを特徴とする請求項１に記載の免疫検査方法。
【請求項４】
前記無機材料の最外層がケイ素酸化物であることを特徴とする請求項３に記載の免疫検査方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の免疫検査方法の混合工程において、りん酸二水素ナトリウムまたはりん酸二水素ナトリウムを含む溶液を添加することを特徴とする免疫検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁気ビーズを用いる免疫検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体物質を定量的に測定する方法の一つとして、測定対象物質と抗体との結合能力を利用する免疫検査方法がある。医療診断分野では、例えば、感染症の検出や、がんなどの疾病の早期発見などを目的に免疫検査が用いられている。
【０００３】
また、磁気ビーズが生化学・医療の分野に利用されている。磁気ビーズはミクロンサイズの軟磁性材料を用い、表面にシリカ膜が被覆された構造（例えば特許文献１）や、ナノサイズ微小粒子が高分子で包含された表面に官能基などが修飾された構造を有す（例えば特許文献２）。この磁気ビーズは免疫検査用途では、他の手法に比べ遥かに自動化が容易であることから固相担体として用いられている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−８９５６３号公報
【特許文献２】特開平９−１８３８６２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、磁気ビーズは検体によっては凝集を起こすので、免疫検査の感度の低下が懸念される。本発明の目的は、凝集を起こさず、免疫検査の感度が高い免疫検査方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の免疫検査方法は、磁性金属を主成分とする金属粒子核に無機材料で被覆を形成した磁気ビーズを用い、塩化ナトリウム濃度が０．４５重量％以上０．９０重量％以下となるように前記検体と希釈液と前記磁気ビーズを混合し、前記検体の免疫検査を行うことを特徴とする。ここで、混合液の単位重量を１００重量％としたときの塩化ナトリウム濃度が０．４５重量％以上０．９０重量％以下である。
【０００７】
前記無機材料はチタン酸化物を主成分とすることがより好ましい。水溶液中においても化学的に安定になり好ましい。また、前記無機材料が互いに異なる２種以上の無機材料であることが好ましい。耐食性をより高くすることができる。更に、前記無機材料の最外層がケイ素酸化物であることが好ましい。ケイ素酸化物はリガンドの固定が容易であり、免疫検査用の固相担体に好適に用いることができる。
【０００８】
上述の免疫検査方法の混合工程において、りん酸二水素ナトリウムまたはりん酸二水素ナトリウムを含む溶液を添加することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、凝集を起こさず、免疫検査の感度が高い免疫検査方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（磁気ビーズ）
磁性金属はＦｅ、Ｃｏ、Ｎｉから選ばれる少なくとも１つの元素を主成分とする磁性金属であるのが好ましく、特にＦｅであるのがより好ましい。高い飽和磁化を発現することができ、磁界応答性がよく、外部磁界による捕集が容易であり好ましい。
【００１１】
金属粒子核は、無機材料（もしくは無機質材料）で一部分または全体を被覆する。その被覆はＡｌ、Ｃｒ、Ｎｂ、Ｖ、Ｔｉ、Ｚｒ、炭素、窒化ほう素から選ばれる少なくとも１種を主体として構成されることが好ましい。なお、炭素単体は無機材料に含まれるものとする。被覆層を設けることにより化学的な安定性を得ることができ、大気中で取り扱うことが可能となる。より好ましくは、無機材料がチタン酸化物を主体として構成されることである。より化学的安定性が向上し、金属粒子核中の金属の溶出を抑制でき、磁気ビーズが水溶液中でも安定である。また、互いに異なる２種以上の無機材料で被覆されていると、化学的安定性が向上し、高塩濃度の溶液中で安定になり好ましい。さらに、無機材料の被覆層の最外層はケイ素酸化物であることが好ましい。ケイ素酸化物は、リガンドを固定する様々な方法が知られており、容易にリガンドを固定できる。
【００１２】
（検体）
本発明の検体は、塩化ナトリウムを含む。塩化ナトリウム濃度は０．４５重量％以上且つ０．９０重量％以下であることが好ましい。哺乳類の体液の塩化ナトリウム濃度はおおよそ０．９０重量％であることから０．９０％以下で用いることが好ましい。また、０．４５重量％以上０．９０重量％以下であると、免疫検査感度への塩化ナトリウムの阻害が少ないため好ましい。
【００１３】
検体にりん酸二水素ナトリウムまたはその水和物（ＮａＨ２ＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、或いはＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２０）を添加することが好ましい。りん酸二水素ナトリウムの濃度を制限するものではないが、０．５重量％以上の濃度であることが好ましい。免疫検査の検出されるシグナル強度が強くなり、高感度に免疫検査を行うことができる。
【００１４】
（免疫検査方法）
本発明の免疫検査は、例えば、非競合法（サンドイッチ法）や、競合法などを用いて行うことが好ましい。
【実施例】
【００１５】
以下、本発明に係る実施例等を詳細に説明する。ただし、これら実施例によって必ずしも本発明が限定されるわけではない。
【００１６】
（磁気ビーズ作製）
平均粒径０．０３μｍのα−Ｆｅ２Ｏ３粉末と、平均粒径１μｍのＴｉＣ粉末と、平均粒径２．８μｍのＴｉＮ粉末を、７０：１８：１２の重量比でビーズミルにより１０時間混合し、得られた混合粉末をアルミナボート内で、窒素ガス中８００℃で２時間熱処理し、室温まで冷却した。得た試料粉末５ｇとイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）５０ｍｌとを１００ｍｌのビーカに投入し、１０分間超音波を照射した。次いで永久磁石をビーカの外面に１分間接触させ、磁性粒子だけをビーカ内壁に吸着させ、黒灰色の上澄み液を除去した。この磁気分離操作を５０回繰り返し、平均粒径０．８μｍの精製された被覆金属微粒子を得た。なお、粒径はレーザー回折粒度分布測定機（ＨＯＲＩＢＡ製：ＬＡ−９２０）で測定した。
【００１７】
上記の方法で得た被覆金属微粒子に対してシリカ膜を被覆し、シリカ被覆金属微粒子を得た。前記シリカ被覆金属微粒子と３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）水溶液とを混和し、１時間攪拌した。大気中において乾燥処理を施し、アミノ基が固定化された磁気ビーズ（アミノ基コート磁気ビーズ）を得た。アミノ基コート磁気ビーズに無水コハク酸を用いてカルボキシル基を固定化し、更にカルボジイミドを用いて活性化を行ないストレプトアビジンを固定化した。これら固定化処理を経たアミノ基コート磁気ビーズにビオチン標識抗ヒトアディポネクチン抗体（マウス）（Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ社製Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ／Ａｃｒｐ３０  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｂｉｏｔｉｎ  ｌａｂｅｌｅｄ）を３０分インキュベートし、抗体が固定化された磁気ビーズを作製した。
【００１８】
（予備実験１）
前記抗体が固定化された磁気ビーズを用い、サンドイッチ式ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法を行った。検体として純水により２５０nｇ/ｍｌに調整したヒトアディポネクチン（ＢｉｏＶｅｎｄｏｒ社製Ｈｕｍａｎ  Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ，Ｈｉｓ−Ｔａｇｇｅｄ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を用いた。最初に、抗体が固定化された磁気ビーズと検体を１０分間反応させた。その後、ヒトアディポネクチンＥＬＩＳＡキット（大塚製薬社製）付属の抗ヒトアディポネクチン抗体（ラビット）（第一抗体液）とインキュベートし洗浄後、西洋ワサビペルオキターゼ（ＨＲＰ）標識抗ラビットＩｇＧポリクローナル抗体（ゴート）（酵素標識抗体液）とインキュベートし洗浄を行った。更に、基質と反応させた後反応停止液で反応を停止させ、ＵＶスペクトル測定機を用い４５０ｎｍの吸収度（シグナル強度）を測定した。測定結果を図1に示す。
【００１９】
（予備実験２）
抗体が固定化された磁気ビーズとしてＤｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とビオチン標識抗ヒトアディポネクチン抗体（マウス）を３０分インキュベートして作製した磁気ビーズを用いた以外は予備実験１と同様の方法でＥＬＩＳＡを行った。測定結果を図１に示す。
【００２０】
（参考例１及び２、及び実施例１〜３）
検体として表１の塩化ナトリウム濃度の塩化ナトリウム水溶液により２５０nｇ/ｍｌに調整したヒトアディポネクチンを用いた以外は予備実験１と同様の方法でＥＬＩＳＡを行った。測定結果を図１に示す。また、検体は塩濃度を薄めると、検体に含まれる測定対象物質も希釈される。そこで、哺乳類の体液の塩化ナトリウム濃度とほぼ同じである塩化ナトリウム濃度 ０．９０重量％を基準とし、各々のシグナル強度に希釈率（各々の塩化ナトリウム濃度を０．９０で割った値）をかけた値を規格化シグナル強度とし図２に示す。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
（比較例１〜３）
検体として表２の塩化ナトリウム濃度の塩化ナトリウム水溶液により２５０nｇ/ｍｌに調整したヒトアディポネクチンを用いた以外は予備実験２と同様の方法でＥＬＩＳＡを行った。測定結果を図１に、規格化シグナル強度を図２に示す。
【００２３】
【表２】
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【００２４】
図１において明らかなように実施例１及び２は予備実験１と比べてシグナル強度が増幅されていることがわかる。また、実施例１〜３のシグナル強度は比較例１〜３と比べてシグナル強度が強いことがわかる。つまり、本発明の磁気ビーズが塩化ナトリウムを含む検体中で有用であることが示された。更に、実施例１〜３（つまり塩化ナトリウム濃度が０．４５〜０．９０重量％）では、参考例１及び２（塩化ナトリウム濃度が０．１１重量％及び０．２５重量％）及び、同じ塩化ナトリウム濃度の比較例１〜３と比べて規格化シグナル強度が顕著に強いことから、より高感度に免疫検査が行えることがわかる。
【００２５】
（実施例４）
検体として０．６重量％の塩化ナトリウムと０．５重量％のりん酸二水素ナトリウムを含む水溶液により２５０nｇ/ｍｌに調整したヒトアディポネクチンを用いた以外は予備実験１と同様の方法でＥＬＩＳＡを行った。得られたシグナル強度を、りん酸二水素ナトリウムを添加していない以外は同様の操作を行い得たシグナル強度で割った値（以下、増幅率）を表３に示す。
【００２６】
【表３】
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【００２７】
表３に示すように、りん酸二水素ナトリウムを塩化ナトリウム水溶液に添加することによりシグナル強度が１．３５〜１．３７倍に増幅していることがわかる。つまり、本発明の免疫検査方法が有用であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】予備実験１、予備実験２、実施例１〜３、参考例１及び２、比較例１〜３のシグナル強度を比較したグラフである。
【図２】実施例１〜３、参考例１及び２、比較例１〜３の規格化シグナル強度を比較したグラフである。
【図１】
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【図２】
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