(57)【要約】【課題】糸状菌の胞子着生効率の制御方法。【解決手段】ヒスチジンキナーゼ8-2遺伝子を用いて有性生殖または無性生殖を制御することによる、糸状菌の胞子着生効率の制御方法の提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の塩基配列、または該塩基配列において１から数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、酸素制限下にて有性生殖を促進する活性および好気環境下にて無性生殖を抑制する活性を有するタンパク質をコードする単離されたヒスチジンキナーゼ8-2（hk8-2）遺伝子。
【請求項２】
配列番号２の塩基配列または配列番号３の塩基配列からなり、好気環境下にて無性生殖を促進する活性を有するタンパク質をコードする変異hk8-2遺伝子。
【請求項３】
配列番号４、または該アミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、酸素制限下にて有性生殖を促進する活性および好気環境下にて無性生殖を抑制する活性を有するヒスチジンキナーゼ8-2（HK8-2）タンパク質。
【請求項４】
配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列からなり、好気環境下にて無性生殖を促進する活性を有する変異HK8-2タンパク質。
【請求項５】
請求項１または２記載の遺伝子の発現を制御するためのベクター。
【請求項６】
請求項１または２記載の遺伝子の発現を、該遺伝子の欠失、変異、高発現または条件特異的発現によって制御するための請求項５記載のベクター。
【請求項７】
請求項１または２記載の遺伝子の発現が制御されている、糸状菌。
【請求項８】
請求項１または２記載の遺伝子の発現が、該遺伝子の欠失、変異、高発現または条件特異的発現によって制御されている、請求項７記載の糸状菌。
【請求項９】
糸状菌が、Aspergillus属糸状菌、Rhizomucor属糸状菌、Penicillium属糸状菌、Trichoderma属糸状菌およびRhizopus属糸状菌からなる群より選択される、請求項７または８記載の糸状菌。
【請求項１０】
糸状菌が、Aspergillus nidulansである、請求項９記載の糸状菌。
【請求項１１】
糸状菌における請求項１または２記載の遺伝子の発現を制御することによる、糸状菌の有性生殖の制御方法。
【請求項１２】
糸状菌における請求項１または２記載の遺伝子の発現を制御することによる、糸状菌の無性生殖の制御方法。
【請求項１３】
請求項１または２記載の遺伝子の発現を、該遺伝子の欠失、変異、高発現または条件特異的発現によって制御する、請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
糸状菌が、Aspergillus属糸状菌、Rhizomucor属糸状菌、Penicillium属糸状菌、Trichoderma属糸状菌およびRhizopus属糸状菌からなる群より選択される、請求項１１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
糸状菌が、Aspergillus nidulansである、請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、糸状菌の有性胞子／無性胞子の着生効率に影響を与えるキナーゼ遺伝子、およびそれを用いた糸状菌の有性生殖および／または無性生殖を制御する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
醤油、味噌、清酒等の醸造用麹または試薬、医薬用酵素等を製造するための麹を製造する際に用いられる種麹は、通常、小麦、フスマ、米等の固体培養基に糸状菌を接種し、適当な条件で培養して無性胞子の着生が十分となった時点で出麹し、必要により乾燥して調製する。固体培養では大量の接種菌胞子を必要とするのであるが、この固体培養法で調製された種麹は、概して無性胞子着生量が少なく、従って、培養基中に効率的に無性胞子を形成させる手段の開発が望まれていた。
【０００３】
従来、固体培養に代えて液体培養を用いる方法が検討されている（特許文献１）。しかし、一般に糸状菌を液体培養する場合、固体培養法と比較して、菌糸体は容易に形成させることができるが、無性胞子については形成させることが難しいといった問題点が存在する。また、糸状菌を用いた産業用酵素生産において、液体培養法を用いて糸状菌を培養した場合、その酵素生産量は固体培養法を用いた場合と比べて圧倒的に低いといった問題点を有する。
【０００４】
また、固体培養基に麹菌を接種し、青色光または赤色光を照射しつつ培養することを特徴とする種麹の製造法が知られている（特許文献２）。これは、固体培養基に麹菌を接種し、波長４００〜５００ｎｍの青色光または波長５８０〜６８０ｎｍの赤色光を照射しつつ培養する種麹の製造法である。しかし、固定波長の照射装置を用いるためにコストが高い事、また、固体培地の内部に十分に光照射をすることが困難である事などのデメリットが存在するために、多量の無性胞子を得ることは難しい。
【０００５】
一方、糸状菌はタンパク質の分泌能力が高く、近年これらの糸状菌を宿主として、有用な物質を生産し得る菌株の作製が行われている。
【０００６】
一般的に、これらの形質転換体は定められた管理区域内で厳密に管理されているが、糸状菌の無性胞子は空気中に飛散しやすく、またさらなる無性胞子を形成することで繁殖範囲を広げていくことが可能である。従って、これら形質転換体を閉鎖環境中に留めて置くためには多大な労力を必要としている。
【０００７】
また、ホモタリックな糸状菌においては、培養中に有性生殖が誘発されると、その遺伝子発現プロファイルが大きく変化してしまう可能性がある。これは、形質転換体を利用した安定した物質生産の障害となり得る。
【０００８】
【特許文献１】特開平１０−２６２６５０号公報
【特許文献２】特開２００２−２６２８６０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで当該分野において、種麹等を製造するために、および糸状菌を管理するために、有性胞子／無性胞子の着生効率を制御する方法が望まれていた。
【００１０】
本願発明は、そのような有性胞子／無性胞子の着生効率の制御方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本願発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、糸状菌の有性生殖条件下（酸素制限下）において、優位に発現増加しているヒスチジンキナーゼ遺伝子を見出した。そしてこの遺伝子の発現を制御することによって、糸状菌の有性生殖および／または無性生殖を制御することが可能であることを見出し、本願発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本願発明は以下のとおりである。
［１］  配列番号１の塩基配列、または該塩基配列において１から数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、酸素制限下にて有性生殖を促進する活性および好気環境下にて無性生殖を抑制する活性を有するタンパク質をコードする単離されたヒスチジンキナーゼ8-2（hk8-2）遺伝子。
［２］  配列番号２の塩基配列または配列番号３の塩基配列からなり、好気環境下にて無性生殖を促進する活性を有するタンパク質をコードする変異hk8-2遺伝子。
［３］  配列番号４、または該アミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、酸素制限下にて有性生殖を促進する活性および好気環境下にて無性生殖を抑制する活性を有するヒスチジンキナーゼ8-2（HK8-2）タンパク質。
［４］  配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列からなり、好気環境下にて無性生殖を促進する活性を有する変異HK8-2タンパク質。
［５］  ［１］または［２］の遺伝子の発現を制御するためのベクター。
［６］  ［１］または［２］の遺伝子の発現を、該遺伝子の欠失、変異、高発現または条件特異的発現によって制御する、［５］のベクター。
［７］  ［１］または［２］の遺伝子の発現が制御されている、糸状菌。
［８］  ［１］または［２］の遺伝子の発現が、該遺伝子の欠失、変異、高発現または条件特異的発現によって制御されている、［７］の糸状菌。
［９］  糸状菌が、Aspergillus属糸状菌、Rhizomucor属糸状菌、Penicillium属糸状菌、Trichoderma属糸状菌およびRhizopus属糸状菌からなる群より選択される、［７］または［８］の糸状菌。
［１０］  糸状菌が、Aspergillus nidulansである、［９］の糸状菌。
［１１］  糸状菌における［１］または［２］の遺伝子の発現を制御することによる、糸状菌の有性生殖の制御方法。
［１２］  糸状菌における［１］または［２］の遺伝子の発現を制御することによる、糸状菌の無性生殖の制御方法。
［１３］  ［１］または［２］の遺伝子の発現を、該遺伝子の欠失、変異、高発現または条件特異的発現によって制御する、［１１］または［１２］の方法。
［１４］  糸状菌が、Aspergillus属糸状菌、Rhizomucor属糸状菌、Penicillium属糸状菌、Trichoderma属糸状菌およびRhizopus属糸状菌からなる群より選択される、［１１］〜［１３］のいずれかの方法。
［１５］  糸状菌が、Aspergillus nidulansである、［１４］の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本願発明により、糸状菌の有性生殖および／または無性生殖を制御することができる。従って、有性胞子／無性胞子の着生効率を制御することができ、種麹の製造効率を増大させること、不必要な有性胞子／無性胞子の飛散を抑制すること、有用な形質転換体の遺伝子プロファイルを維持することなどに利用することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本願発明を詳細に説明する。
本願発明は、単離されたヒスチジンキナーゼ8-2（hk8-2）遺伝子を提供する。
本願発明のhk8-2遺伝子は、配列番号１（Broad Institute Aspergillus Comparative DatabaseにおけるAN4113.3）で表される塩基配列、または該塩基配列において１から数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなる。「１から数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から20個、好ましくは１から10個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個、あるいは１個または２個である。
【００１５】
本願発明のhk8-2遺伝子には、当該遺伝子に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる遺伝子も含まれる。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、ナトリウム濃度が、10mM〜300mM、好ましくは20〜100mMであり、温度が25℃〜70℃、好ましくは42℃〜55℃での条件をいう。
【００１６】
また本願発明のhk8-2遺伝子には、配列番号１の塩基配列とBLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子も含まれる。
【００１７】
本願発明のhk8-2遺伝子は、酸素制限下にて有性生殖を促進する活性および好気環境下にて無性生殖を抑制する活性を有するタンパク質をコードする。酸素制限下の条件は、通常、糸状菌が生育する容器を密封することによって達成でき、糸状菌が生育する環境の大気中に酸素が２１％未満、好ましくは１０％未満、さらに好ましくは８％未満の条件をいう。一方、好気環境下の条件とは、通常の大気条件下をいい、糸状菌が生育する環境の大気中に酸素が２１％以上存在する条件をいう。
【００１８】
本願発明のhk8-2遺伝子は、下記の実施例に記載されるように、酸素制限下における糸状菌において、他のヒスチジンキナーゼ遺伝子と比較して高発現されているという特徴を有する。従って、酸素制限下において相対的に高発現され、かつ上記特徴に該当する遺伝子を、スクリーニングすることにより、hk8-2遺伝子の機能ホモログを同定することが可能である。スクリーニングには、ノーザン解析法、RT-PCR法、Real Time RT-PCR法などの、当業者には公知である一般的な遺伝子発現解析法を用いることができる。本願発明のhk8-2遺伝子には、このような方法で同定された遺伝子も含む。
【００１９】
本願発明は、配列番号１で表される塩基配列中に変異を導入し、好気環境下にて無性生殖を促進する活性を有するタンパク質をコードする、変異hk8-2遺伝子を提供する。当該遺伝子は、HK8-2タンパク質のGAFドメイン（アミノ酸38番目から190番目）、HKドメイン（アミノ酸549番目から835番目）およびRRドメイン（アミノ酸1075番目から1203番目）からなる群から選択されるドメインをコードする塩基配列中に変異を有し得る。好ましくはHKドメイン中の推定自己リン酸化部位またはRRドメイン中のリン酸基受容部位をコードする塩基配列中に変異を有する。さらに好ましくは、配列番号１で表されるhk8-2遺伝子内の1677番目のシトシンをグアニンに、または3379番目のグアニンをアデニンにそれぞれ置換し得る。本願発明の変異hk8-2遺伝子としては、配列番号２または３の塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。
【００２０】
変異の導入は、当該分野において周知である方法、例えば、ランダム変異および部位特異的変異を用いて行うことが可能である。
【００２１】
本願発明は、ヒスチジンキナーゼ8-2（HK8-2）タンパク質を提供する。
本願発明のHK8-2タンパク質は、配列番号４で表されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる。「１から数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から20個、好ましくは１から10個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個、あるいは１個または２個である。
【００２２】
本願発明のHK8-2タンパク質は、酸素制限下にて有性生殖を促進する活性および好気環境下にて無性生殖を抑制する活性を有する。酸素制限下の条件は、通常、糸状菌が生育する容器を密封することによって達成でき、糸状菌が生育する環境の大気中に酸素が２１％未満、好ましくは１０％未満、さらに好ましくは８％未満の条件をいう。一方、好気環境下の条件とは、通常の大気条件下をいい、糸状菌が生育する環境の大気中に酸素が２１％以上存在する条件をいう。
【００２３】
本願発明は、配列番号４で表されるアミノ酸配列中に変異を導入し、好気環境下にて無性生殖を促進する活性を有する変異HK8-2タンパク質を提供する。当該タンパク質は、HK8-2タンパク質のGAFドメイン（アミノ酸38番目から190番目）、HKドメイン（アミノ酸549番目から835番目）およびRRドメイン（アミノ酸１０７５番目から１２０３番目）からなる群から選択されるドメインに変異を有し得る。好ましくはHKドメイン中の推定自己リン酸化部位またはRRドメイン中のリン酸基受容部位にそれぞれ変異を有する。さらに好ましくは、配列番号４で表されるHK8-2タンパク質をコードするアミノ酸配列において、559番目のHis残基をGln残基に、または1127番目のAsp残基をAsn残基にそれぞれ置換し得る。本願発明の変異HK8-2タンパク質としては、配列番号５または６のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
【００２４】
本発明は、糸状菌においてhk8-2遺伝子の発現を制御するためのベクターを提供する。当該ベクターは、導入された糸状菌においてhk8-2遺伝子の発現を欠失、変異、高発現または条件特異的発現によって制御することが可能である。
【００２５】
当該ベクターは、当業者に周知である遺伝子工学的手法を用いて作製することができる。すなわち、遺伝子の導入および発現のために当業者に公知である一般的な糸状菌発現ベクターに、目的遺伝子を組み込んで作製することができる。用いるベクターとしては、多コピー型、単コピー型、染色体組み込み型のいずれも用いることが可能であるが、染色体組み込み型を用いるのが好ましい。
【００２６】
ベクターには、目的遺伝子の他に、宿主糸状菌における複製を可能とする複製起点、および形質転換体を同定する選択マーカー、さらに、好ましくは、糸状菌由来の適切な転写または翻訳制御配列が、所望により目的遺伝子配列に連結されて含まれ得る。制御配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、mRNAリボソーム結合部位、ならびに転写および翻訳開始および終結を調節する適切な配列が含まれる。用いることができる転写プロモーターは、宿主糸状菌内にて遺伝子発現を駆動できる限り、特に限定されず、例えばADH3プロモーター、tpiAプロモーター、alcAプロモーター、tef1プロモーター、taaG2プロモーター、amyBプロモーター、gpdAプロモーター等を用いることができるが、高発現可能なプロモーターおよび／または条件特異的に誘導可能なプロモーターが好ましく、特にalcAプロモーターを用いるのが好ましい。選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばハイグロマイシン、オーレオバシジン、またはピリチアミン等の抗真菌剤耐性遺伝子やウリジンやアルギニンなどの生合成遺伝子などが例示される。
【００２７】
hk8-2遺伝子の発現を欠失させる場合には、例えば、hk8-2遺伝子の上流配列と下流配列との間に、機能欠損型hk8-2遺伝子または別の遺伝子（例えば、選択マーカーなど）を連結した発現カセットを組み込んだベクターを用いて組換えを生じさせれば良い。あるいは、HK8-2タンパク質をコードするmRNAに特異的なsiRNAの鋳型DNAを適当なプロモーターに機能し得るかたちで連結して含むベクターを用いて、RNA干渉を利用して発現を欠失させることができる。
【００２８】
hk8-2遺伝子の発現を高発現または条件特異的発現させる場合には、高発現可能なプロモーターまたは条件特異的な発現が可能なプロモーターに、hk8-2遺伝子を機能し得るかたちで連結して含むベクターを用いることができる。
【００２９】
条件特異的な発現が可能なプロモーターとは、外的要因、例えば、強光、ＵＶ、傷害、高温、低温、塩、病害等のストレス、または特定のタンパク質もしくは化学物質の投与によって、その下流に連結された遺伝子の発現を誘導し得るプロモーターを意味する。このプロモーターを使用することによって、所定のストレス環境下、または所定のタンパク質もしくは化学物質の投与下においてのみ、目的遺伝子の発現を誘導することが可能である。
【００３０】
「機能し得るかたちで連結して含む」とは、当該発現ベクターが導入された糸状菌内において、プロモーターの制御の下、当該遺伝子が発現されるように、プロモーターを連結してベクターに組み込むことを意味する。
【００３１】
本願発明は、上記hk8-2遺伝子の発現が制御されている糸状菌を提供する。当該糸状菌においてhk8-2遺伝子の発現は、欠失、変異、高発現または条件特異的発現によって制御されている。
【００３２】
当該糸状菌は、上記ベクターを宿主糸状菌に導入して形質転換することによって作製することができる。
【００３３】
ベクターを宿主糸状菌に導入する方法としては、リン酸カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、PEGなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
【００３４】
宿主糸状菌として用いることができるものとしては、特に限定するものではないがAspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus glaucusなどを例とするAspergillus属糸状菌、Rhizomucor pusillus, Rhizomucor mieheiなどを例とするRhizomucor属糸状菌、Penicillium notatum, Penicillium chrysogenumなどを例とするPenicillium属糸状菌、Trichoderma reesei, Trichoderma viridaeなどを例とするTrichoderma属糸状菌、Rhizopus oryzaeを例とするRhizopus属糸状菌などが挙げられる。特にAspergillus nidulansが好ましい。
【００３５】
本願発明は、糸状菌における上記hk8-2遺伝子の発現を制御することによって、糸状菌の有性生殖または無性生殖を制御する方法を提供する。
【００３６】
上記糸状菌は有性生殖により生殖器官であるクライストセシアを形成し、その内部に子嚢胞子（有性胞子）を形成する。子嚢胞子は、子嚢内に通常８個形成されるが、１６個、３２個、またはそれ以上に多数になる場合、また８個より少数になる場合もある。一方、上記糸状菌は無性生殖により分生子（無性胞子）を形成する。分生子は、無性的な脱落性の不動胞子であり、菌糸上または分生子果内の分生子柄上に形成される。従って、本方法によって有性生殖または無性生殖を制御することにより、子嚢胞子（有性胞子）／分生子（無性胞子）の着生効率に影響を与えることができる。
【００３７】
本方法において、hk8-2遺伝子の発現の発現制御は、上記ベクターを糸状菌に導入することによる遺伝子工学的手法により行うことが可能である。
【００３８】
本方法を用いて、無性生殖を制御することによって、分生子の着生量を増加したり、または抑制したりすることができる。例えば、本願発明のhk8-2遺伝子を、好気環境下にて糸状菌に高発現させることによって分生子の着生を抑制することが可能であり、また本願発明の変異hk8-2遺伝子を好気環境下にて高発現させることによって分生子の着生量を増加させることが可能である。また、ベクター中に上記条件特異的な発現が可能なプロモーターを用いれば、条件特異的に分生子の着生量を制御することできる。
【００３９】
一方、本方法を用いて、有性生殖を制御することによって、子嚢胞子の形成を増加させたり、または抑制したりすることができる。例えば、酸素制限下にてhk8-2遺伝子の発現を欠失させることによって、有性生殖を抑制し、子嚢胞子の形成を抑えることが可能である。
【００４０】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでない。
【実施例】
【００４１】
実施例１．嫌気または微好気環境に応答するヒスチジンキナーゼの同定
嫌気あるいは微好気環境に応答するヒスチジンキナーゼを、当該環境下におけるヒスチジンキナーゼ遺伝子群の発現状況を解析することにより同定した。
【００４２】
Aspergillus nidulans ABPU1株（東京大学大学院農学生命科学研究科の堀内裕之先生より分与）の無性胞子10８個を２％グルコースを含む液体培地（NaNO3 0.1g、KCl 0.05g、KH2PO4 0.15g、グルコース 2.0g、トレースエレメント溶液0.15ml、MgSO4・7H2O 0.05g、アルギニン 0.05g、ウリジン 0.1g、ビオチン 1.0 mg、ピリドキシン HCl 0.25 mg/100ml pH6.5 (ただしトレースエレメント溶液はつぎのとおり；Na2B4O7・10H2O 40 mg、CuSO4・5H2O 0.4 g、FeSO4・7H2O 1.6 g、MnSO4・4H2O 0.8 g、Na2MoO4・2H2O 0.8 g、ZnSO4・7H2O 8.0 g /1L)）100ml に接種し、37℃で18時間培養後、菌糸をミラクロス（CALBIOCHEM）で回収した（Vegetative）。さらに、回収した菌糸を寒天培地（上記液体培地に1.4％アガーを含む）に接種し、無性生殖を誘導した（Asexual）。一方、回収した菌糸を接種した別の寒天培地は、ビニールテープなどでこの寒天培地を含むシャーレを密閉して酸素を制限し、有性生殖を誘導した（Sexual）。37℃で48時間培養後、製造者の指示書に従ってTRIzol Reagent (Invitrogen)を用いて、Vegetative、AsexualおよびSexualのそれぞれの菌糸サンプルからRNAを抽出した。次に抽出したRNAより、製造者の指示書に従ってExScript RT reagent Kit (Takara)を用いてcDNAを調製した。このcDNAを鋳型として用いて、各ヒスチジンキナーゼ遺伝子の発現量を、Real Time RT-PCR法を用いて比較した。Real Time RT-PCR法に用いたプライマーは、各遺伝子の配列情報（以下のプライマー名において、各遺伝子の登録番号を記載）を基に作製した。具体的には以下の通りである：
HK1（AN1800.3）プライマー
cgtatcatgtactgacccctgc（配列番号９）
cggtgtcataagcctcttggc（配列番号１０）
HK2（AN7945.3）プライマー
acgcgggagattcgagccatg（配列番号１１）
cggcttgttgatcctgtcggac（配列番号１２）
HK3（AN.5296.3）プライマー
tggacgtatccatgcccgtc（配列番号１３）
tccgcatcacccttcatcgc（配列番号１４）
HK4（AN3102.3）プライマー
agaatgtctccggctgctcg（配列番号１５）
atggccagctccatcagagc（配列番号１６）
HK5（AN3101.3）プライマー
gcgccggcttcaatgactatg（配列番号１７）
ccttaagccgatcgcggag（配列番号１８）
HK6（AN4479.3）
ccgcatttcgagcagtggtg（配列番号１９）
gctcgacgaggtgatcgatc（配列番号２０）
HK7（AN9008.3）プライマー
gagagtcagagtgaagtcgcg（配列番号２１）
ccacccatcgaagcctatatcc（配列番号２２）
HK8-1（AN2581.3）プライマー
cggtcaacctgcaactcctc（配列番号２３）
gcatgcgccttgtacacttcc（配列番号２４）
HK8-2（配列番号１：AN4113.3）プライマー
ggtcatgaacggattcgaggc（配列番号２５）
gccacgatcgtagtgggatg（配列番号２６）
HK8-3（AN6820.3）プライマー
cgtgatggacggactcactg（配列番号２７）
gtagcacgcttgcgatcctg（配列番号２８）
HK8-4（AN4818.3）プライマー
ccgctaagctggaacgtacc（配列番号２９）
cgttctacagcgtcgactgc（配列番号３０）
HK8-5（AN3214.3）プライマー
cacggcatcaaggacgatcc（配列番号３１）
gcttgctgctgcatatcgctc（配列番号３２）
HK8-6（AN2363.3）プライマー
gatggcattgttgcgacgaagg（配列番号３３）
cacgagatactcgtcaacccc（配列番号３４）
HK8-7（AN9048.3）プライマー
ccgtcaaagtcttcgccgtg（配列番号３５）
gttgaccgagtgacagcgg（配列番号３６）
HK9（AN4447.3）プライマー
cgtcagcgcagacgttacag（配列番号３７）
tcgctccaggtccatcagtc（配列番号３８）
Real Time PCRはRoche社のLight Cyclerを用いて以下の条件で行った。
2009207373.tif 000002
【００４３】
図１にVegetative、AsexualおよびSexual由来の菌糸におけるヒスチジンキナーゼ遺伝子の発現プロファイルを示す。この図に示されるように、VegetativeおよびAsexual由来のサンプルと比較して、Sexual由来のサンプルにおいてhk8-2遺伝子の発現が顕著に増加していることがわかった。したがって、hk8-2遺伝子を嫌気あるいは微好気環境に応答する遺伝子として同定した。
【００４４】
実施例２．hk8-2遺伝子の単離
Aspergillus nidulans ABPU1株の染色体DNA、プライマー1(tttaagagcaacattcccaca)（配列番号７）プライマー２（attaataagtgctcttctat）（配列番号８）、Phusion DNA Polymerase (Biolabs)、dNTPsを混合し（組成はPhusion DNA Polymerase (Biolabs)の推奨する濃度に従った）、PCR反応（98℃ 1分、60℃ 分、72℃ 2分  30サイクル）をおこなった。得られたDNA断片を、pGEM-T ベクター（Promega）のEcoR Vサイトに連結してプラスミドを得た。得られたプラスミドをテンプレートにhk8-2の塩基配列を決定し、Aspergillus nidulansのゲノムデータベースの配列と比較して、PCRによる変異が導入されていないことを確認した。
【００４５】
実施例３．hk8-2遺伝子の発現を制御した菌株の作製
3-1．hk8-2破壊株（△hk8-2株）の作製
hk8-2遺伝子の上流領域1290bpおよび下流領域1410bp、ならびにウリジン生合成遺伝子pyrGをPCRにより取得した。
PCRに用いたプライマーは以下の通り：
hk8-2遺伝子の上流領域1290bp
hk8-2us:tttaagagcaacattcccaca（配列番号３９）
hk8-2uas:gttcgttcggaaatgcttctc（配列番号４０）
hk8-2遺伝子の下流領域1410bp
hk8-2ds:tgttttctccatgtcctcatata（配列番号４１）
hk8-2das:attaataagtgctgcttctat（配列番号４２）
ウリジン生合成遺伝子pyrG (GenBank M19132)
gaattcgatacctgtcga（配列番号４３）
tcagtgcttgtctaccag（配列番号４４）
PCRは以下の条件で行った：
Aspergillus nidulans ABPU1株の染色体DNA、プライマー（上記）、Phusion DNA Polymerase (Biolabs)、dNTPsを混合し（組成はPhusion DNA Polymerase (Biolabs)の推奨する濃度に従った）、PCR反応（98℃ 1分、60℃ 1分、72℃ 2分  30サイクル）をおこなった。
【００４６】
得られたhk8-2遺伝子の上流領域のDNA断片をNotIおよびXbaIを用いて、ならびにhk8-2遺伝子の下流領域のDNA断片をPstIおよびClaIを用いて消化した。また、得られたウリジン生合成遺伝子pyrGをXbaIおよびPstIで消化した。これらのDNA断片をNotIおよびClaIで消化したpBS-KS+ ベクター(Stratagene)につないだ。このプラスミドよりhk8-2遺伝子の上流領域および下流領域、ならびにウリジン生合成遺伝子pyrGを含むNotI-ClaI DNA断片を抽出し、それを用いてプロトプラスト法によりウリジン要求性のAspergillus nidulans ABPU1株に導入した（図2）。ウリジンを含まない培地でも生育出来る形質転換株を取得し、サザンハイブリダイゼーションによりhk8-2遺伝子の発現が欠失していることを確認し、△hk8-2株を得た。
【００４７】
3-2．hk8-2遺伝子の高発現株（alcA(p)::hk8-2株）の作製
Aspergillus nidulans ABPU1株の染色体DNAを鋳型としてPCRによりhk8-2遺伝子およびalcAプロモーターを取得した。
PCRに用いたプライマーは以下のとおり：
8-2Xba1-his
5’-GCGCGCTCTAGACACCACCACCACCACCACATGGATCCAGACAGTTATCCCTTC（配列番号４５）
8-2ter
5’-GCGCGCAAGCTTACTAGTCCAGGGCGTTTGGGATATG-3’ （配列番号４６）
alcp1
5’-GCGCGCGAATTCGCGGCCGCGTCCCTTCGTATTTCTCCGCC-3’ （配列番号４７）
alcp2
5’-GCGCGCTCTAGACATTTTGAGGCGAGGTGATAGGATTG-3’ （配列番号４８）
PCRは以下の条件で行った：
Aspergillus nidulans ABPU1株の染色体DNA、プライマー（上記）、Phusion DNA Polymerase (Biolabs)、dNTPs（組成はPhusion DNA Polymerase (Biolabs)の推奨する濃度に従った）を混合し、PCR反応（98℃ 1分、60℃ 1分、72℃ 2分  30サイクル）をおこなった。
【００４８】
得られたalcAプロモーターを含むDNA断片をEcoRIおよびXbaIを用いて消化し、また得られたhk8-2遺伝子を含むDNA断片をXbaIおよびHindIIIで消化した。そしてこれらの断片をXbaI部位で連結した。
【００４９】
ピリドキシン生合成遺伝子pyroAをプライマーctgcagaagtgcgcgaaagc（配列番号４９）、ggatccaggagtatacggg（配列番号５０）を用いて増幅し、得られたピリドキシン生合成遺伝子pyroA のDNA断片をBamHIおよびPstIで消化した後、pBluescriptIIKS+(Stratagene)の同様のサイトに導入した。
【００５０】
上記alcAプロモーターとhk8-2遺伝子とを連結したDNA断片（EcoRI-HindIII）を、上記ピリドキシン生合成遺伝子pyroAを含むプラスミドの同様のサイトに導入した。
【００５１】
この組換えプラスミドを用いて、上記3-1．にて作製した△hk8-2株のpyroA座位に、alcAプロモーターに連結されているhk8-2遺伝子を相同組換えで導入し（図3）、alcA(p)::hk8-2株を作製した。
【００５２】
3-3．変異型hk8-2遺伝子発現株（H559Q株およびD1127N株）の作製
上記3-2．にて作製した組換えプラスミドを利用して、STRATAGENE社のQuikChange Site-Directed Mutsgenesis Kitを用いて、HK8-2タンパク質の559番目のHis残基がGln残基に、または1127番目のAsp残基がAsn残基に置換されるように、配列番号１で表されるhk8-2遺伝子配列内の1677番目のシトシンをグアニンに、または3379番目のグアニンをアデニンにそれぞれ置換した組換えプラスミドを作製した。当該置換は、以下のプライマーを用いたPCR法によって行った：
H559Q 作製用
hk8-2 Hismutant 1
GCAATATCTCTCAGGAACTGAGAAGCCCCC（配列番号５１）
hk8-2 Hismutant 2
GGGGGCTTCTCAGTTCCTGAGAGATATTGC（配列番号５２）
D1127N 作製用
hk8-2 Aspmutant 1
GCGCTGGTCATCATTAACATCTCCATGCC（配列番号５３）
hk8-2 Aspmutant 2
GGCATGGAGATGTTAATGATGACCAGCG（配列番号５４）
【００５３】
これらの変異型HK8-2遺伝子を持つ組換えプラスミドを、上記3-1．にて作製した△hk8-2株のpyroA座位に相同組換えで導入し、559番目のHis残基または1127番目のAsp残基に変異を有するHK8-2タンパク質を発現するH559Q株またはD1127N株を作製した。
【００５４】
実施例４．hk8-2遺伝子の破壊、変異、高発現、条件特異的発現による分生子（無性胞子）形成の制御
alcAプロモーターに依存した遺伝子発現は、培地中にトレオニンを添加することよって高度に誘導することが可能であり、一方、グルコースを添加した培地においてはその発現を抑制することができる。図4に示すように、2％グルコース含有寒天培地（hk8-2発現非誘導条件： NaNO3 0.1g、KCl 0.05g KH2PO4 0.15g、グルコース 2.0g、トレースエレメント溶液0.15ml、MgSO4・7H2O 0.05g、アルギニン 0.05g、ウリジン 0.1g、ビオチン 1.0 mg,ピリドキシン HCl 0.25 mg、Agar 1.4g /100ml pH6.5 (ただしトレースエレメント溶液はつぎのとおり；Na2B4O7・10H2O 40 mg、CuSO4・5H2O 0.4 g、FeSO4・7H2O 1.6 g、MnSO4・4H2O 0.8 g、Na2MoO4・2H2O 0.8 g、ZnSO4・7H2O 8.0 g /1L)または0.1M トレオニン含有寒天培地（hk8-2発現誘導条件：上記非誘導条件のグルコース 2.0gのかわりにトレオニン 1.191g, フルクトース 0.1g)の中央にAspergillus nidulans ABP1株（Aspergillus nidulans ABPU1株のウリジン要求性をpyrG遺伝子の導入によりなくした株）ならびに上記実施例３にて作製した△hk8-2株、alcA(p)::hk8-2株、H559Q株およびD1127N株をそれぞれ接種し、37℃にて4日間培養した。その後、形成された分生子を回収しカウントした。グラフは生育した菌の直径を測定し、単位面積あたりの分生子（無性胞子）数で示してある。
【００５５】
この結果より、好気環境下にてhk8-2遺伝子をトレオニンにより高発現させることにより、分生子形成量が顕著に低下することが見出された。また、有性生殖に必要とされる転写因子nsdDの発現量が上昇した（データ示さず）。一方、変異型hk8-2遺伝子を好気環境下にてトレオニンにより高発現させることにより、分生子形成量を顕著に増加できることが見出された（図4）。
【００５６】
このようにhk8-2遺伝子または変異型hk8-2遺伝子を条件特異的に高発現させることにより、分生子形成を人為的に制御できることがわかった。
【００５７】
実施例５．hk8-2遺伝子の破壊による有性生殖の抑制
Aspergillus nidulans野生株、△hk8-2株の胞子縣濁液を寒天培地（NaNO3 0.1g、KCl 0.05g KH2PO4 0.15g、グルコース 2.0g、トレースエレメント溶液 0.15ml、MgSO4・7H2O 0.05g、アルギニン 0.05g、ウリジン 0.1g、ビオチン 1.0 mg、ピリドキシン HCl 0.25 mg、Agar 1.4g /100ml pH6.5 (ただしトレースエレメント溶液はつぎのとおり；Na2B4O7・10H2O 40 mg、CuSO4・5H2O 0.4 g、FeSO4・7H2O 1.6 g、MnSO4・4H2O 0.8 g、Na2MoO4・2H2O 0.8 g、ZnSO4・7H2O 8.0 g /1L)）に塗布し37℃で２日間培養後、酸素制限のためにプレートのまわりをビニールテープで密閉して有性生殖を誘導し、37℃で５日間培養した。その後、ビニールテープをはずし、有性生殖の進行を観察した。その結果、△hk8-2株においては、黒い球状の構造を持つ子嚢胞子を含有するクライストセシアと呼ばれる生殖器官がほとんど観察されないことが見出された（図5）。嫌気あるいは微好気環境に応答するhk8-2遺伝子を破壊することにより、有性生殖を抑制することができ、すなわち、当該環境への適応を抑制できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明により無性生殖を制御することにより分生子の着生量を増加させたり、抑制させたりすることができる。分生子の着生量を増加させることにより、培養基や培養環境整備に要するコストを低減化することが可能であり、逆に着生量を抑制することによって、不必要な分生子の飛散を抑えることが可能である。また、本発明により有性生殖を制御することにより子嚢胞子の形成を制御することができる。組換え糸状菌が環境に放出されると、有性生殖により自然環境中の同種糸状菌に組換え遺伝子が伝播することになるが、hk8-2遺伝子破壊株を用いることによりこの伝播を防ぐことが可能となる。また、有性生殖を抑えることにより形質転換体による安定した物質生産を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、Real Time PCRを用いたヒスチジンキナーゼ遺伝子群の発現解析の結果を示す。Aspergillus nidulans ABPU1株を２％グルコースを含む液体培地で18時間培養後、ミラクロスで菌体を回収した（図のvegetative）。同様に液体培養した菌を寒天培地に移すことで無性生殖を誘導した（Asexsual）。また別のプレートの周りをテープで密閉することで酸素を制限し、有性生殖を誘導した（Sexual）。４８時間後、無性生殖、有性生殖誘導プレートそれぞれから菌体を回収した。回収した菌体からRNAを抽出し、Real Time PCRのサンプルとした。
【図２】図２は、hk8-2遺伝子破壊株（△hk8-2株）の作製方法を示す。hk8-2遺伝子を破壊するために、hk8-2遺伝子の上流領域と下流領域の間にウリジン要求遺伝子pyrGを連結したDNAフラグメントを作製し、これをウリジン要求性のAspergillus nidulansに導入した。ウリジン要求性の有無とサザンハイブリダイゼーションで、宿主hk8-2遺伝子の上流と下流領域で正しく組換えの起きた株を選択し、△hk8-2株とした。
【図３】図３は、hk8-2過剰発現株（alcA(p)::hk8-2株）の作製方法を示す。HK8-2の機能を解明するために、hk8-2遺伝子をalcAプロモーターの制御下に連結した株を作製した。具体的には、alkAプロモーターとhk8-2遺伝子を連結したプラスミドをピリドキシン要求遺伝子の部分で組換えて△hk8-2株に導入した。hk8-2の発現レベルを制御（グルコースによって抑制、トレオニンによって誘導）することによって生じるAspergillus nidulansの生育への影響を観察することにした。同様にhk8-2の推定自己リン酸化部位およびリン酸基受容部位に変異を導入した遺伝子もalkAプロモーターの制御下におき△hk8-2株に導入した(それぞれH559Q株、D1127N株）。
【図４】図４は、Aspergillus nidulansABP1株、△hk8-2株、H559Q株、およびD1127N株によって形成される分生子数の観察結果を示す。グルコース（上図）またはトレオニン（下図）を含む寒天培地の中央にそれぞれの株を植菌し、４日後に分生子を回収しカウントした。グラフは生育した菌の直径を測定し、単位面積あたりの分生子数で示した。
【図５】図５は、△hk8-2株によって形成されるクライストセシアの観察結果を示す。野生株、△hk8-2の胞子縣濁液を寒天培地に塗布し２日間培養後、有性生殖を誘導するためにプレートのまわりをビニールテープで密閉しさらに５日間培養した。その後、ビニールテープをはずし、子嚢胞子を含有するクライストセシアの形成を観察した。
【配列表フリーテキスト】
【００６０】
配列番号９〜５４は、合成オリゴヌクレオチド配列を示す。
【図１】
2009207373.tif 000003
【図２】
2009207373.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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