(57)【要約】【課題】  Ｔｏｌｌ様受容体３遺伝子を構成的に過剰発現する遺伝子導入マウスを提供する。【解決手段】  体細胞及び生殖細胞にＴｏｌｌ様受容体３をコードするＤＮＡを有し、且つＴｏｌｌ様受容体３遺伝子を過剰発現していることを特徴とする、遺伝子導入マウス。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
体細胞及び生殖細胞にＴｏｌｌ様受容体３をコードするＤＮＡを有し、且つＴｏｌｌ様受容体３遺伝子を過剰発現していることを特徴とする、遺伝子導入マウス。
【請求項２】
前記ＤＮＡが、
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、
又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つヒトＴｏｌｌ様受容体３の機能を持つポリペプチドをコードするＤＮＡ、
である、請求項１に記載の遺伝子導入マウス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体３遺伝子導入マウスに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、補体、インターフェロン、Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ  細胞などが関与する自然免疫系が、適応免疫系の誘導の根幹を担うことが分子レベルで明らかにされてきており、免疫学において最も注目される分野のひとつとなっている。
【０００３】
現在までに、１０種に及ぶＴｏｌｌ様受容体が見出され、これらの分子が病原体由来分子を認識し、樹状細胞などの抗原提示細胞を活性化することによって適応免疫の誘導に重要な役割を果たしていることが判明している（特許文献１、特許文献２）。各Ｔｏｌｌ様受容体は、異なる病原体の構成成分を認識し、それぞれ微妙に異なった免疫応答を誘導する。なお、以下、Ｔｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を「ＴＬＲ」という。
【特許文献１】特開２００４−１８０５４０号公報
【特許文献２】特表２００５−５０５２８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＴＬＲのひとつであるＴＬＲ３はその機能について未知の点が多い。しかしながら、ＴＬＲ３遺伝子の構成的な発現量は低く、特異的なリガンドも同定されていないため、その研究は困難である。
そこで、本発明の目的は、ＴＬＲ３遺伝子を構成的に過剰発現する遺伝子導入マウス（ＴＬＲ３  Ｔｇマウス）を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、体細胞及び生殖細胞にＴＬＲ３遺伝子を有し、且つＴＬＲ３遺伝子を過剰発現していることを特徴とする、遺伝子導入マウス（ＴＬＲ３  Ｔｇマウス）を提供する。
【０００６】
このようなマウスは、ＴＬＲ３遺伝子を構成的に高発現している。したがって、このマウスを利用することにより、ＴＬＲ３以外のシグナル経路も同時に刺激してしまう既知のＴＬＲ３リガンド（Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））を用いて解析を行ったとしても効率的なＴＬＲ３の研究が可能になる。
【０００７】
ＴＬＲ３遺伝子は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つＴＬＲ３の機能を持つポリペプチドをコードするＤＮＡであることが好ましい。
【０００８】
このようなＴＬＲ３遺伝子を導入したＴＬＲ３  Ｔｇマウスは、新規医薬品の開発に利用することができる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によって、従来発現量が少なく、特異的なリガンドが同定されていないために研究が困難であった、ＴＬＲ３遺伝子を構成的に過剰発現するＴＬＲ３  Ｔｇマウスが提供される。ＴＬＲ３  Ｔｇマウスを実験材料に用いることにより、効率的なＴＬＲ３の研究が可能となり、新規医薬品の開発が促進されるなどの効果が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のＴＬＲ３  Ｔｇマウスは、例えば以下のような方法で作製することができる。
【００１１】
まず、例えば、トリβ−アクチン遺伝子プロモーター、ヒトｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどの、哺乳動物の細胞内でタンパク発現を誘導することが可能なプロモーターの下流にＴＬＲ３遺伝子断片を連結し、更にその下流に、例えばウサギβ−グロビンポリＡ付加シグナル配列、又はポリＡ配列を連結した発現べクターを作製する。
【００１２】
ＴＬＲ３遺伝子断片は、例えば抹消血中の血球系細胞からＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅して得ることができる。ＴＬＲ３遺伝子はヒト由来のＴＬＲ３（ｈｕＴＬＲ３）であることが好ましい。ｈｕＴＬＲ３遺伝子を導入したｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスを利用して研究を行えば、ｈｕＴＬＲ３についての知見を得ることができ、研究の成果をヒトに応用することができると推測される。
【００１３】
一般的に、遺伝子には、多型が存在する場合がある。また、遺伝子のクローニング過程で変異が導入される場合がある。ＴＬＲ３遺伝子断片にこのような多型や変異が存在しても、それがコードするポリペプチドにＴＬＲ３タンパク（ポリペプチド）としての機能が保持されていれば、本発明のＴＬＲ３  Ｔｇマウスに使用することができる。ここで、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列に１〜２０個、より好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列である。また、上記の付加には、配列番号１に記載のアミノ酸配列の両末端へのアミノ酸の付加が含まれる。ＴＬＲ３の機能に影響のない領域においては、更に多くのアミノ酸の欠失、置換又は付加があっても良い。このようなアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ＴＬＲ３の機能を保持しているポリペプチドをコードするＤＮＡであれば、本発明のＴＬＲ３  Ｔｇマウス作製用の発現ベクターに使用することが可能である。ここで、ＴＬＲ３の機能とは、野生型ＴＬＲ３と同一のリガンドに応答して野生型と同一の遺伝子を誘導する能力を指す。
【００１４】
また、研究目的によっては、野生型ＴＬＲ３とは異なった機能を持つ「改変型ＴＬＲ３」をコードするＤＮＡを、ＴＬＲ３  Ｔｇマウス作製用の発現ベクターに使用しても良い。
【００１５】
更に、発現べクターには、後の解析に便利なように、例えばＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグなどの標識ペプチドをコードする遺伝子断片をＴＬＲ３遺伝子の５’側あるいは３’側に、融合タンパクをコードする形で導入しても良い。また、発現ベクターには、ネオマイシン、ピューロマイシン、ゼオシンなどの薬剤耐性マーカー遺伝子を導入しても良い。
【００１６】
続いて、作製された発現ベクターをマイクロインジェクション法によってマウス受精卵に導入する。あるいは、エレクトロポレーション法などによってマウスＥＳ細胞に導入してもよい。発現ベクターは、導入前に適切な制限酵素処理によって切断し、目的遺伝子の発現に必要な部分以外を除去することが好ましい。
【００１７】
これらの受精卵やＥＳ細胞を用いて生殖系列のキメラマウスを作製し、野生型マウスと交配させて得られるヘテロ接合体マウス（Ｆ１：雑種第一代）同士を交配させることによって、メンデルの法則に従い産生するホモ接合体のＴＬＲ３  Ｔｇマウスを作製することができる。このようにして得られたＴＬＲ３  Ｔｇマウスは、体内の様々な臓器において、ＴＬＲ３を構成的に過剰発現する。過剰発現とは、例えばＴＬＲ３  Ｔｇマウスの組織や細胞におけるＴＬＲ３  ｍＲＮＡやＴＬＲ３タンパクの発現量が、野生型マウスの組織や細胞における発現量と比較して、２倍以上増加している状態と定義される。
【００１８】
更に、研究上注目すべき遺伝子を欠損又は導入させた遺伝子改変マウスなどの、遺伝的背景の異なるマウスと、ＴＬＲ３  Ｔｇマウスを交配させることによって、注目すべき遺伝的背景を持ち、且つＴＬＲ３を構成的に過剰発現する遺伝子改変マウスを作製することもできる。
【００１９】
現在ＴＬＲ３のリガンドとしてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）が使用されているが、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）はＴＬＲ３に特異的なリガンドではなく他の経路（ＲＩＧ／ＭＤＡ５経路）も同時に活性化する。しかもこれらＲＩＧ／ＭＤＡ５経路とＴＬＲ３経路はその下流で共通する転写因子を活性化することが知られており、誘導する遺伝子にも重なりがある。このため、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）をリガンドとしてＴＬＲ３欠損マウスを解析する従来の方法では、ＴＬＲ３の本来の役割を解析することは困難であり、例えばＴＬＲ３の役割がＲＩＧ／ＭＤＡ５経路によって補われる場合や両経路が互いに影響を及ぼし合う場合などは、単純にＴＬＲ３欠損マウスを解析しても明確な異常が観察できない。しかしながら本発明のようにＴＬＲ３を過剰に発現し、ＴＬＲ３依存的なシグナル経路を過剰に増幅する方法では、特異的なリガンドが存在しない現状でもＴＬＲ３の本来の役割を明確に解析できる。
【実施例】
【００２０】
以下、本発明の実施例を示して、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される物ではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲での種々の変更が可能である。
【００２１】
（ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスの作製）
発明者らは、トリβ−アクチン遺伝子プロモーターの下流にｈｕＴＬＲ３  ｃＤＮＡを接続した発現ベクターを作製した（図１、２、配列番号３、４）。この発現ベクターを、マウス受精卵に導入し、２つのｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス系統を得た。サザンブロット解析の結果、導入遺伝子のコピー数は系統２で約５６、系統６で約２３であることがわかった（図３）。
【００２２】
（ｈｕＴＬＲ３遺伝子の発現解析）
系統２のｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス及び野生型マウスにおけるｈｕＴＬＲ３  ｍＲＮＡの臓器別の発現をノーザンブロット解析により検討した。その結果、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスにおいては心臓で最も強い発現が見られた。また、腎臓、肝臓、脾臓、胸腺などのその他の臓器においても野生型マウスと比較して顕著に高いｈｕＴＬＲ３  ｍＲＮＡの発現が観察された（図４）。
【００２３】
（ｈｕＴＬＲ３タンパクの発現解析）
ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスと野生型マウスから腹腔内マクロファージを採取し、腹腔内マクロファージにおけるタンパクレベルでのｈｕＴＬＲ３の発現をウェスタンブロッティングにより解析した。図１、図２に示すように、本発明においてマウスに導入したｈｕＴＬＲ３遺伝子には、その３’末端側にＦＬＡＧタグをコードする遺伝子断片が連結されていた。したがって、抗ＦＬＡＧタグ抗体を用いてｈｕＴＬＲ３遺伝子の発現を検出することができる。抗ＦＬＡＧタグ抗体（ＳＩＧＭＡ社  Ａ８５２９）及び陽性対照として、抗β−アクチン抗体（ＳＩＧＭＡ社  Ａ５４４１）を用いて、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスと野生型マウスから採取した腹腔内マクロファージ由来のタンパクをサンプルとした、ウェスタンブロッティング解析を行った。その結果、ｈｕＴＬＲ３  ＴｇマウスにおいてはタンパクレベルでもｈｕＴＬＲ３が発現していることが確認できた（図５）。
【００２４】
（ＣＶＢウイルス感染による心臓の傷害）
ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス、ＴＬＲ３ノックアウトマウス（ＴＬＲ３  ＫＯマウス）（大阪大学医学部、審良静男先生より分与）及び野生型マウスに、腹腔内注射によりＣＶＢ  ５×１０４ｐｆｕ／匹を感染させた。感染から７日後に心臓を摘出し、４％パラフォルムアルデヒド固定し、パラフィン包埋して心臓標本を作製した。続いてクリオスタットを用いて心臓標本の切片を作製し、ＨＥ染色し、傷害の度合いを観察した。
【００２５】
その結果、ＴＬＲ３  ＫＯマウスの心臓では野生型マウスと比較して顕著な細胞の浸潤がみられた。これに対し、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスの心臓ではそのような細胞浸潤は認められなかった。この結果から、ＴＬＲ３はＣＶＢの感染に対する抵抗性に関与していることが確認された（図６）。
【００２６】
（血中ＣＶＢウイルスタイターの測定）
ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス及び野生型マウスに、腹腔内注射によりＣＶＢを感染させた。感染から２日後に採血し、血中のＣＶＢウイルスタイターを測定した。ウイルスタイターの測定はＶｅｒｏ細胞を用いたプラークアッセイにより測定した。その結果、野生型マウスでは１×１０６ｐｆｕ／ｍｌ以上のウイルスが血中から検出されたのに対し、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスでは検出限界以下であった（図７）。
【００２７】
（ＣＶＢの感染におけるＩＬ−１２ｐ４０遺伝子の発現解析）
ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス、ＴＬＲ３  ＫＯマウス及び野生型マウス由来のマクロファージにＣＶＢを感染させ、ＩＬ−１２ｐ４０  ｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した。ＱＩＡＧＥＮ社ＲＮｅａｓｙ（７４１０６）を用いて抽出したＲＮＡからＱＩＡＧＥＮ社Ｑｕａｎｔｉｔｅｃ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ（２０５３１３）を用いてｃＤＮＡを合成し、Ｒｏｃｈｅ社ｓｙｂｅｒｇｒｅｅｎ１（０４８８７３５２００１）および同社ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  ４８０装置を用いて定量的ＰＣＲを行った。図８に結果を示す。対照遺伝子をグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）とし、ＩＬ−１２ｐ４０  ｍＲＮＡの発現量を、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量との相対値として表示した。ＩＬ−１２ｐ４０  ｃＤＮＡの増幅には、配列番号５及び６に記載する塩基配列のプライマーを使用した。また、ＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡの増幅には、配列番号９及び１０に記載する塩基配列のプライマーを使用した。その結果、ＴＬＲ３  ＫＯマウス由来マクロファージではＩＬ−１２ｐ４０  ｍＲＮＡの発現が野生型と比べて減少していた（図８）。一方、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来マクロファージにおいて、ＩＬ−１２ｐ４０  ｍＲＮＡの発現の増強が見られた（図８）。以上のことから、ＴＬＲ３は、ＩＬ−１２ｐ４０  ｍＲＮＡの発現に関与していることが確認された。
【００２８】
（不活化ＣＶＢの感染におけるＩＬ−１２ｐ４０遺伝子の発現解析）
ＴＬＲ３のウイルス認識メカニズムを解明するため、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス及び野生型マウス由来のマクロファージに、ＣＶＢ又はＵＶ照射により不活化したＣＶＢを感染させ、６時間後にＩＬ−１２ｐ４０  ｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した。図９に結果を示す。ＩＬ−１２ｐ４０  ｍＲＮＡの発現量を、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量との相対値として表示した。その結果、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来マクロファージにおいて、不活化したＣＶＢを感染させた場合においてもＩＬ−１２ｐ４０  ｍＲＮＡの発現に増強が見られた（図９）。このことから、ＴＬＲ３はウイルス複製時の二本鎖ＲＮＡ以外の物質も認識する可能性が示された。
【００２９】
（ＥＭＣＶウイルス感染実験）
ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス、ＴＬＲ３  ＫＯマウス及び野生型マウスに腹腔内注射によりＥＭＣＶウイルス  １×１０４ｐｆｕ／匹を感染させ、マウスの生死を観察した。その結果、ＴＬＲ３  ＫＯマウスでは野生型マウスよりも早期に死亡が観察された。また、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスは野生型マウスよりも長期間生存した（図１０）。
【００３０】
（ＥＭＣＶ感染におけるＩＬ−１２ｐ４０遺伝子の発現解析）
ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス及び野生型マウス由来のマクロファージにＥＭＣＶを感染させ、ＩＬ−１２ｐ４０  ｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した。図１１に結果を示す。ＩＬ−１２ｐ４０  ｍＲＮＡの発現量を、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量との相対値として表示した。その結果、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス由来のマクロファージにおいて、ＩＬ−１２ｐ４０  ｍＲＮＡの発現の増強が観察された（図１１）。以上の結果から、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスのウイルスに対する抵抗性、及びＩＬ−１２ｐ４０  ｍＲＮＡの発現については、ＣＶＢだけでなく脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）に対しても観察されることがわかった。
【００３１】
（ＴＬＲ３の下流のシグナル伝達機構のマイクロアレイ解析）
ＴＬＲ３の下流のシグナル伝達機構を解明するため、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス、及び野生型マウス由来マクロファージをＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）で刺激し、６時間後にＲＮＡを抽出した。このＲＮＡを用いて、マイクロアレイ解析を行った。表１に、各遺伝子の、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスにおける発現量を、野生型マウスにおける発現量に対する変化倍率（ｆｏｌｄ  ｉｎｃｅｒａｓｅ）で示す。その結果、野生型マウス及びｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスにおいて、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ（ＩＦＮ）−β１、ＩＦＮ−αＢ、ＩＦＮ−α１、ＩＲＦ−１、Ｏａｓ１ｃ、ＩＦＮ−α４、ＩＲＦ−５、ＩＦＮ−α９、ＩＦＮ−α５などの、Ｉ型インターフェロン及びその誘導遺伝子の発現に顕著な変化は認められなかった。
【００３２】
一方、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスにおいて、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、Ｐｔｇｓ２、Ｈｂｂ−ｂｈ１、ＩＬ−１α、Ｓａａ１、ＩＬ−１９、ＩＬ−１２ａ、Ｈａｓ１、ＣＸＣＬ２、Ｓａａ３、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ２、ＣＸＣＬ１、ＩＬ−１２Ｒβ１、ＩＬ−１７、ＩＬ−１０、ＣＣＬ７、Ｎｆｋｂｉｚ、Ｔｎｆなどの、炎症性サイトカイン及びケモカインの発現の増強が観察された（表１）。
【００３３】
【表１】
2009207465.tif 000002
【００３４】
（ＴＬＲ３の下流のシグナル伝達機構の定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析）
ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス、ＴＬＲ３  ＫＯマウス及び野生型マウス由来のマクロファージをＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）で刺激後、定量的ＲＴ−ＰＣＲによりｍＲＮＡ誘導を確認した。図１２に結果を示す。ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＦＮ−β１  ｍＲＮＡの発現量を、それぞれＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量との相対値として表示した。ＩＬ−６  ｃＤＮＡの増幅には、配列番号１１及び１２に記載する塩基配列のプライマーを使用した。また、ＩＦＮ−β１  ｃＤＮＡの増幅には、配列番号７及び８に記載する塩基配列のプライマーを使用した。その結果、マイクロアレイ解析の結果が裏付けられ、ＩＦＮ−β１  ｍＲＮＡの誘導はｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス、ＴＬＲ３  ＫＯマウス共に、野生型マウスと顕著な変化が認められなかったのに対し、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０  ｍＲＮＡの発現はＴＬＲ３  ＫＯマウスで減少し、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスで増強した（図１２）。従来、ＴＬＲ３下流のシグナル経路は、リガンドの刺激によってＩ型ＩＦＮを産生することに重要であると言われていたが、以上の結果から、ＴＬＲ３下流のシグナル経路はＩ型ＩＦＮの産生には関与せず、むしろ炎症生サイトカイン及びケモカインの誘導に重要である可能性が示された。
【００３５】
（ＡＲ１  ＫＯ／ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスを用いたＣＶＢ感染実験）
シグナル伝達機構の解明を更に進めるため、Ｉ型ＩＦＮレセプター欠損マウス（ＡＲ１  ＫＯマウス）を用いて実験を行った。ＡＲ１  ＫＯマウスはＢ＆Ｋ社より購入した。ＡＲ１  ＫＯ／ｈｕＴＬＲ３  ＴｇマウスはＡＲ１  ＫＯマウスとｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスを交配して得られたＡＲ１  ＋／−  ／ＴＬＲ３Ｔｇ  マウスを、更にＡＲ１ＫＯマウスと掛け合わせて作成した。ＡＲ１  ＫＯマウス及びＡＲ１  ＫＯ／ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスに、腹腔内注射によりＣＶＢ  １０００ｐｆｕ／匹を感染し生死を観察したところ、ＡＲ１  ＫＯマウスは２〜４日で死亡したのに対し、ＡＲ１  ＫＯ／ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスは死亡しなかった（図１３）。
【００３６】
（ＣＶＢ感染による肝臓の傷害）
ＡＲ１  ＫＯマウス、ＡＲ１  ＋／−マウス及びＡＲ１  ＫＯ／ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスに腹腔内注射によりＣＶＢ  １０００ｐｆｕ／匹を感染させた。２日後に肝臓を摘出し、パラフォルムアルデヒド固定し、パラフィン包埋して肝臓標本を作製した。続いてクリオスタットを用いて肝臓標本の切片を作製し、ＨＥ染色して傷害の度合いを観察したところ、ＡＲ１  ＫＯマウス由来の肝臓細胞には顕著な傷害が見られたのに対し、ＴＬＲ３  Ｔｇマウスの肝臓にはそのような障害は認められなかった（図１４）。
【００３７】
（血中ＣＶＢウイルスタイターの測定）
更に、ＡＲ１  ＫＯマウス及びＡＲ１  ＫＯ／ＴＬＲ３  Ｔｇマウスに、腹腔内注射によりＣＶＢ  １０００ｐｆｕ／匹を感染させた。感染から２日後に採血し、血中のＣＶＢウイルスタイターを測定したところ、ＡＲ１  ＫＯマウスでは１×１０８ｐｆｕ／ｍｌ以上のウイルスが血中から検出されたのに対し、ＡＲ１  ＫＯ／ＴＬＲ３  Ｔｇマウスではその１／１００以下のウイルスしか検出されなかった（図１５）。
【００３８】
（ＣＶＢ感染後の血液中ＧＰＴ濃度及びＧＯＴ濃度の解析）
ウイルス感染後の肝臓傷害の程度をグルタミン酸ピルビン酸転移酵素（Ｇｌｕｔａｍｉｃ  Ｐｙｒｕｖｉｃ  Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ；ＧＰＴ）及びグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（Ｇｌｕｔａｍｉｃ  Ｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ；ＧＯＴ）の血中濃度の測定により検討した。これらの酵素の血中濃度は肝細胞の傷害の程度に応じて上昇することが知られている。
【００３９】
野生型マウス、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス、ＡＲ１  ＫＯマウス及びＡＲ１  ＫＯ／ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスに、腹腔内注射によりＣＶＢ  １０００ｐｆｕ／匹を感染させた。感染から２日後に血中のＧＰＴ濃度及びＧＯＴ濃度を測定した。測定はＳＲＬ社に外注した。その結果、ＡＲ１  ＫＯ／ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス  はＡＲ１  ＫＯマウスと比較して１／４程度のＧＰＴ濃度及びＧＯＴ濃度を示した（図１６）。
【００４０】
（ＣＶＢ感染後のマイクロアレイ解析）
ＡＲ１  ＫＯマウス及びＡＲ１  ＫＯ／ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスに、腹腔内注射によりＣＶＢ  １０００ｐｆｕ／匹を感染させた。感染から２日後の肝臓からＲＮＡを抽出し、マイクロアレイ解析を行った。表２に、ＡＲ１  ＫＯ／ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスにおける発現量が、ＡＲ１  ＫＯマウスにおける発現量の２倍以上の変化倍率（ｆｏｌｄ  ｉｎｃｅｒａｓｅ）を示した遺伝子を示す。その結果、ＡＲ１  ＫＯ／ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスにおいて炎症性サイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−１βなど）、ケモカイン（ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ２）、ＩＦＮ−γ及びその誘導遺伝子（ＩＲＦ１、Ｇｂｐ１、Ｇｂｐ３、Ｇｂｐ６、ＩＲＦ８）の高発現が見られた（表２）。
【００４１】
【表２】
2009207465.tif 000003
【００４２】
（ＣＶＢ感染後の定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析）
ＡＲ１  ＫＯ及びＡＲ１  ＫＯ／ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスに、腹腔内注射によりＣＶＢ  １０００ｐｆｕ／匹を感染させ、２日後の肝臓からＲＮＡを抽出し、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、各遺伝子の発現を確認した。図１７に感染なしの個体（−）、及び感染ありの２個体（＃１、＃２）の結果を示す。各遺伝子の発現量を、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量との相対値として表示した。ＣＣＬ２  ｃＤＮＡの増幅には、配列番号１３及び１４に記載する塩基配列のプライマーを使用した。ＣＸＣＬ１０  ｃＤＮＡの増幅には、配列番号１５及び１６に記載する塩基配列のプライマーを使用した。ＩＦＮ−γ  ｃＤＮＡの増幅には、配列番号１７及び１８に記載する塩基配列のプライマーを使用した。ＩＲＦ１  ｃＤＮＡの増幅には、配列番号１９及び２０に記載する塩基配列のプライマーを使用した。その結果、マイクロアレイ解析と同様の結果が得られた（図１７）。
【００４３】
以上のことから、ＴＬＲ３下流のシグナル経路は、Ｉ型ＩＦＮの誘導には関与せず、炎症性サイトカイン及びケモカインの誘導に重要であり、Ｉ型ＩＦＮによらない機構でウイルスに対する抵抗性を示すことが明らかとなった。
このような知見はこれまでに報告がなく、本発明のｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスを実験材料に用いることによって初めて明らかにすることができた。ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスの作製の成功によって、ｈｕＴＬＲ３の免疫学的意義について新しい知見を得ることが可能となった。また、新しい免疫病や感染症などの治療薬の開発が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス作製のための発現ベクターの説明図である。
【図２】図２は、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウス作製のための発現ベクターの説明図である。
【図３】図３は、ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスに導入されたｈｕＴＬＲ３遺伝子のコピー数を解析したサザンブロット解析の結果を表す写真である。
【図４】図４は、野生型マウス及びｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスの各臓器におけるｈｕＴＬＲ３遺伝子の発現を解析したノーザンブロット解析の結果を表す写真である。
【図５】図５は、野生型マウス及びｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスの腹腔内マクロファージにおけるｈｕＴＬＲ３タンパクの発現を解析したウェスタンブロッティング解析の結果を表す写真である。
【図６】図６は、ＣＶＢ感染７日後の野生型マウス、ＴＬＲ３  ＫＯマウス及びｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスの心臓の傷害を解析した結果を表す組織染色の写真である。
【図７】図７は、感染２日後のマウスの血中ＣＶＢウイルスタイターを解析した結果を表すグラフである。
【図８】図８は、マウス由来マクロファージにＣＶＢを感染させ、ＩＬ−１２ｐ４０のｍＲＮＡの発現誘導を解析した結果を表すグラフである。
【図９】図９は、マウス由来マクロファージに不活化ＣＶＢを感染させ、ＩＬ−１２ｐ４０遺伝子の発現誘導を解析した結果を表すグラフである。
【図１０】図１０は、ＥＭＣＶウイルス感染後のマウスの生存率を表すグラフである。
【図１１】図１１は、マウス由来のマクロファージにＥＭＣＶを感染させ、ＩＬ−１２ｐ４０のｍＲＮＡの発現誘導を解析した結果を表すグラフである。
【図１２】図１２は、マウス由来のマクロファージをＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）で刺激し、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＦＮ−β１のｍＲＮＡの発現誘導を解析した結果を表すグラフである。
【図１３】図１３は、ＣＶＢ感染後のマウスの生存率を表すグラフである。
【図１４】図１４は、ＣＶＢ感染２日後のＡＲ１  ＫＯマウス、ＡＲ１  ＋／−マウス及びＡＲ１  ＫＯ／ｈｕＴＬＲ３  Ｔｇマウスの肝臓の傷害を解析した結果を表す組織染色の写真である。
【図１５】図１５は、感染２日後のマウスの血中ＣＶＢウイルスタイターを解析した結果を表すグラフである。
【図１６】図１６は、ＣＶＢ感染２日後のマウスの血中ＧＰＴ濃度及び血中ＧＯＴ濃度を解析した結果を表すグラフである。
【図１７】図１７は、ＣＶＢ感染２日後のマウスの肝臓における各遺伝子の発現を解析した結果を表すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１４】
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【図１７】
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【配列表】
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