(57)【要約】【課題】生体物質検出用基板の回転による遠心作用で生体物質や緩衝剤を測定流路内に完全に充填できる生体物質検出用基板およびそれを用いた生体物質検出方法を提供する【解決手段】蛍光物質が標識された生体物質を測定するための検出用流路を少なくとも一つ以上有する生体物質検出用基板であって、前記検出用流路は有限の長さを持って前記生体物質検出用基板の中心に対して円周上に弧を描くように配置されており、前記円周上に前記検出用流路に隣接して前記検出用流路の深さをモニターするためのモニター流路を備えた生体物質検出用基板により上記課題を解決することができる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光物質が標識された生体物質を測定するための検出用流路を少なくとも一つ以上有する生体物質検出用基板であって、
前記検出用流路は有限の長さを持って前記生体物質検出用基板の中心に対して円周上に弧を描くように配置されており、
前記円周上に前記検出用流路に隣接して前記検出用流路の深さをモニターするためのモニター流路を備えた生体物質検出用基板。
【請求項２】
前記モニター流路は有限の長さを持ち、その長手方向を前記円周に対して略直角の方向に配置している請求項１に記載の生体物質検出用基板。
【請求項３】
前記モニター流路は、その底面と周囲に前記蛍光物質と同様の光学特性を持つ塗料が塗布された請求項１あるいは２に記載の生体物質検出用基板。
【請求項４】
請求項１に記載の生体物質検出用基板の前記モニター流路に励起光を照射して前記モニター流路の底面から発する第一の蛍光と前記モニター流路の周辺から発する第二の蛍光とを検出するモニター流路蛍光検出ステップと、
前記第一の蛍光と前記第二の蛍光との差分値を演算する蛍光差演算ステップと、
前記差分値より前記検出用流路の深さを演算する流路深さ演算ステップと、
前記モニター流路の深さに応じて前記生体物質検出用基板の回転速度と回転時間を演算する回転制御演算ステップと、
からなる生体物質検出方法。
【請求項５】
前記流路深さ演算ステップは、前記モニター流路の深さを前記検出用流路の深さとする請求項４に記載の生体物質検出方法。
【請求項６】
前記回転制御演算ステップは、前記生体物質検出用基板を回転させることにより前記生体物質を前記前記検出用流路に充分に充填できるための回転速度と回転時間との関係を示したテーブルを前記検出用流路の深さに応じて持ち、前記流路深さ演算ステップにより得られた流路深さを参照し前記生体物質検出用基板の回転速度と回転時間を演算する請求項４に記載の生体物質検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡやタンパクその他の生体物質を検出する生体物質検出用基板およびそれを用いた生体物質検出装置に関し、より詳細には、生体物質の充填を確実に行うための生体物質検出用基板およびそれを用いた生体物質検出装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、核酸、タンパク質、酵素等の生体分子を検出する手法として、蛍光反応を利用する蛍光検出法が採用されてきた。既存の光源や受光素子等の光学部品を組み合わせて、ラジオアイソトープを使わず、安全、安価に生体分子の測定が可能であることから、蛍光検出法は酵素免疫測定、電気泳動、共焦点走査型蛍光顕微鏡法などさまざまな生体分子の検出に応用されている。
【０００３】
蛍光検出法は、励起光を照射することで生体分子から発せられる蛍光信号を検出する方法である。例えばＦＩＴＣは波長４９５ｎｍの励起光を照射すると波長５２０ｎｍの蛍光を発する物質であり、測定すべき生体分子に結合させる（蛍光標識させる）ことにより蛍光検出を行うことが出来る。蛍光を発する物質を検出するためには、励起波長を有する光と蛍光波長を検出する受光部とを組み合わせて測定する。これらを行うために、落射式と呼ばれている蛍光測定方法が知られている。これは励起光を試料上方から照射し、励起光によって起こる蛍光反応の変化を、励起光照射側に配置した受光素子で検出するものである。蛍光を発する物質と、それに対応した励起光と受光素子を利用することで、様々な蛍光物質や蛍光標識した生体分子を検出できる。
【０００４】
蛍光検出を行う場合、試料を支持するための基板やセル、流路などの基板が用いられるが、近年、樹脂製のプレートに微細な流路を形成したものを用いて検出を行う装置が出てきた。この装置では、流路内に蛍光物質が修飾された試料と緩衝液を充填した後、緩衝液に所定の電位勾配をかけて試料を電気泳動させ、泳動中の試料に励起光を照射して蛍光の強度分布を検出することにより、試料の泳動状態を観察する方式が見られる（例えば、特許文献１参照。）。
【０００５】
電気泳動を行って測定するためには、測定すべき生体物質は密閉した測定流路内に十分に充填される必要がある。その為に、従来の生体物質検出装置は、測定流路の両端に固定された電極を配置し、電圧を印加することで流れる電流をモニターして生体物質の充填状態を検出し通知する手段が必要になる（例えば、特許文献２参照。）。
【特許文献１】特表２００５−０６４３３９号公報
【特許文献２】特開２００３−１５９０５４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、前記従来の構成では、生体物質検出用基板を回転させた際に生じる遠心力を利用して生体物質や緩衝剤を測定流路内に充填するが、測定流路の溝深さがばらつくと生体物質や緩衝剤を測定流路内に完全に充填できず、その結果、生体物質の測定が出来ないという課題を有していた。
【０００７】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、生体物質検出用基板の回転による遠心作用で生体物質や緩衝剤を測定流路内に完全に充填できる生体物質検出用基板およびそれを用いた生体物質検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記従来の課題を解決するために、本発明の生体物質検出用基板およびそれを用いた生体物質検出方法は、蛍光物質が標識された生体物質を測定するための検出用流路を少なくとも一つ以上有する生体物質検出用基板であって、前記検出用流路は有限の長さを持って前記生体物質検出用基板の中心に対して円周上に弧を描くように配置されており、前記円周上に前記検出用流路に隣接して前記検出用流路の深さをモニターするためのモニター流路を備えたことを特徴とする。
【０００９】
さらに本発明の生体物質検出用基板およびそれを用いた生体物質検出方法は、請求項１に記載の生体物質検出用基板の前記モニター流路に励起光を照射して前記モニター流路の底面から発する第一の蛍光と前記モニター流路の周辺から発する第二の蛍光とを検出するモニター流路蛍光検出ステップと、前記第一の蛍光と前記第二の蛍光との差分値を演算する蛍光差演算ステップと、前記差分値より前記検出用流路の深さを演算する流路深さ演算ステップと、前記モニター流路の深さに応じて前記生体物質検出用基板の回転速度と回転時間を演算する回転制御演算ステップと、からなることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の生体物質検出用基板およびそれを用いた生体物質検出方法によれば、モニター流路の検出の為に光学システムの追加することなしに、生体物質検出用基板の流路深さを検出することができ、生体物質検出用基板の流路の深さのばらつきに対して、流路の深さにあわせた回転数及び回転時間を適宜に制御することで、生体物質や緩衝剤を測定流路内に完全に充填できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に、本発明の蛍光検出装置の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【００１２】
（実施の形態１）
図１を用いて、生体物質検出用基板１の説明をする。図１（ａ）は生体物質検出用基板１を示す図であり、図１（ｂ）は生体物質検出用基板１内の泳動ユニットを拡大した図である。
【００１３】
図１（ａ）に示すように、生体物質検出用基板１は、自家蛍光の無い黒色物質が練りこまれたポリプロピレン系の樹脂から成り、射出成型で作製される。生体物質検出用基板１の厚みは２ｍｍであり、片側には、幅５０ｕｍ〜３００ｕｍで深さ１５０μｍ以下の流路やリザーバーとなる溝が掘られた流路形成面が設けられており、これらの溝を密閉するために流路形成面の上面に厚さ５０μｍのポリプロピレン製フィルムを接着する。また、生体物質検出用基板１の重心２には、生体物質検出用基板１を図示しない検査装置に固定するための孔が設けられている。本実施の形態の生体物質検出用基板１では、一つの生体物質を検出するための泳動ユニットが、１ａから１ｈに示すように８個設けられている。
【００１４】
次に図１（ｂ）を用いて、生体物質検出用基板１の一つの泳動ユニット１ａについて詳細に説明する。泳動ユニット１ａには、緩衝剤と生体物質の界面での拡散を防止するために１００ｃｐ以上、好ましくは２５０ｃｐ程度の緩衝剤を注入するための緩衝剤注入部３と、生体物質を注入する生体物質注入部４が形成されている。生体物質注入部４は、流路５によりサンプル保持部６と接続されており、サンプル保持部６は、流路７によりバッファ部８と接続されている。正電極１０は、流路９より緩衝剤注入部３と接続されており、さらに、流路１２よりサンプル保持部６と接続している。負電極１１は、流路９より緩衝剤注入部３と接続されており、さらに、検出流路１３よりサンプル保持部と接続されている。
【００１５】
生体物質は、判別したいＳＮＰｓ部位を含む約６０塩基長の１本鎖ＤＮＡであり、蛍光物質（Ｃｙ５）で標識されたＤＮＡである。サンプル注入部へ注入された生体物質は、流路５を通りサンプル保持部６まで移動し、一定量の生体物質がサンプル保持部６に保持される。一定量を超える生体物質は、流路７を通りバッファ部８まで移動する。
【００１６】
緩衝剤としてＤＮＡコンジュゲートを用いる。ＤＮＡコンジュゲートとは、６〜１２塩基長1本鎖ＤＮＡの５'末端に高分子のリニアポリマーが共有結合したものである。さらにＤＮＡは、正常型に対しては相補であるが変異型に対しては相補ではない配列であり、正常型ＤＮＡに対しての結合力が強く、変異型ＤＮＡに対しての結合力が弱い特性がある。また、電気泳動した場合、５'末端に結合した、リニアポリマーがおもりとなり泳動速度がかなり遅いという特性もある。緩衝剤注入部３へ注入された緩衝剤は、生体物質検出用基板１を回転させることで生じる遠心力を利用して、流路９より正電極１０および負電極１１へ移動し、さらに、流路１２および検出流路１３を満たす。正電極１０および負電極１１との間に電圧を印加する。
【００１７】
電圧の印加は、正電極１０および負電極１１より緩衝剤に接触するように針状の電極を挿入した状態で行う。電圧印加により、流路１２および検出流路１３に電場が発生し、サンプル保持部６に保持された生体物質は検出流路１３中を電気泳動する。図３に検出流路中を流れるＤＮＡサンプルの状態を検出するための光学系を示す。光源４ａには、波長６３５ｎｍのレーザーダイオードを用いる。この光源の条件は、ＤＮＡを標識する蛍光物質Ｃｙ５の吸収波長域であり、蛍光物質Ｃｙ５を励起できる励起パワーであることである。ダイクロイックミラー４ｂは、波長６３５ｎｍ付近の光を反射し、波長６７０ｎｍ付近の光を透過する特性を持ち、励起光はダイクロイックミラー４ｂで反射される。さらに、励起光は、対物レンズ４ｃにより集光され、生体物質検出用基板４ｅ上の流路４ｄへ照射される。流路４ｄ中のＤＮＡサンプルに標識された蛍光物質は、励起光を照射され、蛍光を発する。蛍光は、対物レンズ４ｃ、ダイクロイックミラー４ｂ、集光レンズ４ｆを通り、フォトダイオード４ｇで受光される。生体物質検出用基板４ｅを駆動させるための駆動部４ｈにより、生体物質検出用基板４ｅを回転させ、図１（ｂ）の流路１３中のＤＮＡサンプルの電気泳動の分布をスキャンする。以上の操作により、検出流路１３中を電気泳動するＤＮＡサンプルの状態を検出することが出来る。
【００１８】
次に、図１（ｂ）を参照して、本発明の特徴である流路深さを検出するためのモニター流路の構成を説明する。モニター流路１４は、検出流路１３と隣接して形成されており、検出流路１３と同一の円周にある。このモニター流路１４は、長手方向が検出流路１３とほぼ直角に配置されている。この直角に配置する理由は、励起光のスポット形状が検出流路と同心円方向には小さく、直角方向には大きいためである。モニター流路１４の深さは、検出流路１３の深さと同一になるように設計されている。
【００１９】
図２は、図１の生体物質検出用基板１の点Ａおよび点Ｂにおける断面図である。生体物質検出用基板１において表面の定義は、検出流路１３を形成し、ポリプロピレン製フィルム２ｂを貼付した面とする。生体物質検出用基板１の表面に、波長６３５ｎｍの励起光により、波長６７０ｎｍ付近の蛍光を発する特性を持ち、光量はＤＮＡサンプルと同程度である塗料をモニター流路１４の底面及びその周辺部１ミリ以内の範囲に、厚さ１０ｕｍ以下で均一に塗布する。その理由は、光量が大きすぎるとオーバーレンジになり、モニター流路底面部とモニター流路周辺部での光量の差の検出を行うことが出来ない為である。
【００２０】
図４は、モニター流路１４の深さと検出流路１３の深さとの関係を示す図であり、モニター流路の深さと検出流路の深さとは、正比例しており、且つ１：１の関係にあることを示している。
【００２１】
図３で説明した光学系を利用することで、流路深さの検出ができる。以下、その詳細を説明する。光源４ａのレーザーダイオードの光をダイクロイックミラー４ｂで反射した後、モニター流路１４に励起光を照射する。励起光により照射されたモニター流路底面部１４ａから発せられる蛍光は、対物レンズ４ｃ、ダイクロイックミラー４ｂ、集光レンズ４ｆを通り、フォトダイオード４ｇで受光される。受光された信号は信号解析部４ｉで解析され、そのデータは一時的に保管される。次にモニター流路１４の周辺部に励起光を照射する。励起光により照射されたモニター流路周辺部１４ｂから発せられる蛍光は、対物レンズ４ｃ、ダイクロイックミラー４ｂ、集光レンズ４ｆを通り、フォトダイオード４ｇで受光される。受光された信号は信号解析部４ｉで解析され、モニター流路底面部とモニター流路周辺部との検出出力との差異が求められる。この検出出力を、あらかじめ作成しておいた検出出力と流路深さの検量線から得られた値を用いることで、モニター流路の深さを検出することが出来る。図５に励起パワー０．５ｍＷの励起光をこの塗装面に照射した際の検出出力と流路深さの関係図を示す。すなわち、検出出力差を利用すれば、流路の深さを測定することが出来る。
【００２２】
生体物質検出用基板回転手段の回転速度及び回転時間を制御方法について説明する。先に説明した通り、生体物質検出用基板１を回転させることにより発生する遠心力を利用して緩衝液を検出流路１３に充填させる。このとき、生体物質検出用基板１を回転させる回転手段の回転速度が回転時間を一定にしたままでは、検出流路１３の流路深さがばらつくと検出流路１３に緩衝剤が充分に充填できなくなる。そのため、生体物質検出用基板１を回転させる回転手段の回転速度が回転時間は、検出流路１３の深さに応じて適切に制御しなければならない。図６に２００ｃｐの粘度を有する緩衝剤を検出流路１３に適切に充填するための、検出流路１３の流路深さ６０、７０、８０μｍとした際の、生体物質検出用基板１の回転速度と回転時間との関係を示す。流路の深さが分かれば、図６の結果を利用して検出流路１３に適切に充填できる回転数と回転時間とを求めることができる。
【００２３】
次に、本発明による具体的な実施例を示す。まず、２００ｃｐの粘度を有する緩衝剤を緩衝剤注入部３に注入した後、生体物質検出用基板１を回転させる。この時に得られたモニター流路１４の蛍光パワーは８０ｐＷであったので、図５より流路深さは７０μｍとなる。モニター流路１４の深さと検出流路１３との深さは１：１の関係があるので、このときの検出流路１３の溝深さは７０μｍとなる。本実施例では緩衝剤の充填完了時間の１００秒とした。この時の適正回転数は、図６より３０００ｒｐｍとなる。回転速度と回転時間との間にはトレードオフの関係があるので、充填時間を短くするためには回転数を上げる必要がある。本実施例では、消費電力と動作音の低減のためにできる限り低い回転数を選ぶように緩衝剤の充填完了時間を設定した。
【００２４】
以上のように、本実施の形態においては、生体物質検出用基板１おいて検出流路１３と同心円上で、かつ、検出流路１３の延長線上にモニター流路１４を設け、生体物質検出用基板１の流路形成面から塗料でモニター流路１４及びその周辺部を均一に塗装し、モニター流路底面１４ａ及び周辺部１４ｂの検出出力の差を算出することにより、流路の深さを同定できる。また以上の動作を試料充填動作の前に実施することにより、流路深さに最適な回転速度及び回転時間を試料充填動作開始までに設定することが可能となり、ＤＮＡサンプル及び緩衝液の充填動作を迅速かつ確実に実施することができる。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明に係る生体物質検出装置および生体物質検出用基板は、モニター流路を検出するための光学システムの追加をすることなく、生体物質検出用基板の検出流路深さを検出することができ、且つモニター流路が生体サンプルでは無いので、保存状況による光学検出の変動が無く安定しているので、生体物質検出用基板の流路の深さにあわせた回転数及び回転時間を適宜に制御でき、生体物質検出用基板の緩衝材及び生体物質の充填動作の最適方法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】（ａ）本発明の実施の形態１における生体物質検出用基板の構成を示す図（ｂ）本発明の実施の形態１における泳動ユニットの模式図
【図２】（ａ）本発明の実施の形態１における生体物質検出用基板の断面図（ｂ）本発明の実施の形態１における生体物質検出用基板の断面の拡大図
【図３】検出流路とモニター流路の深さとの関係を示す図
【図４】流路深さと検出出力差との関係を示す図
【図５】流路深さ毎の最適に充填できる回転数と回転時間との関係を示す図
【図６】光学検出部の構成を示す図
【符号の説明】
【００２７】
１  生体物質検出用基板
１ａ〜１ｈ  泳動ユニット
３  緩衝剤注入部
４  生体物質注入部
６  サンプル保持部
５、７、９  流路
８  バッファ部
１０  正電極
１１  負電極
１３  検出流路
１４  ダミー流路
１４ａ  ダミー流路底面塗料塗布面
１４ｂ  ダミー流路周辺部塗料塗布面
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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