(57)【要約】【課題】簡便、迅速に未同定一塩基置換型ポリヌクレオチドを同定する方法の提供。【解決手段】フォワードプライマー（ＦＰ）の３’末端の塩基に対応する鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基及び／又はリバースプライマー（ＲＰ）の３’末端の塩基に対応する（ＴＰ）の塩基が一塩基置換されたポリヌクレオチドであるか否かを同定するための未同定一塩基置換型ポリヌクレオチドの同定方法であって３’末端がＴＰと相補し、３’末端の１又は２つ隣の塩基がＴＰの塩基と相補しないＦＰと３’末端がＴＰと相補し、３’末端の１又は２つ隣の塩基がＴＰの塩基と相補しないＲＰとからなるプライマー対を用いてＰＣＲを行う工程ポリヌクレオチドの増幅の有無を判定する工程増幅ポリヌクレオチドに対応するプライマー対からプライマー対に対応するＴＰを特定することにより未同定一塩基置換型ポリヌクレオチドの塩基配列を同定する工程を有する方法。【選択図】 なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フォワードプライマー（ＦＰ）の３’末端の塩基（ＳＢ１）に対応する鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ１）及び／又はリバースプライマー（ＲＰ）の３’末端の塩基（ＳＢ２）に対応する鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ３）が一塩基置換されたポリヌクレオチドであるか否かを同定するための未同定一塩基置換型ポリヌクレオチドの同定方法であって、
３’末端の塩基（ＳＢ１）が、鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ１）と相補する塩基であり、この塩基（ＳＢ１）の１つ又は２つ隣の塩基が鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ２）と相補しない塩基であるフォワードプライマー（ＦＰ）と、
３’末端の塩基（ＳＢ２）が、鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ３）と相補する塩基であり、この塩基（ＳＢ２）の１つ又は２つ隣の塩基が鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ４）と相補しない塩基であるリバースプライマー（ＲＰ）とからなるプライマー対を用いてＰＣＲを行うＰＣＲ工程（１）；
ＰＣＲによるポリヌクレオチドの増幅の有無を判定する判定工程（２）；及び
増幅したポリヌクレオチドに対応するプライマー対から、このプライマー対に対応する鋳型ポリヌクレオチドを特定することにより、未同定の一塩基置換型ポリヌクレオチドの塩基配列を同定する同定工程（３）を有することを特徴とする同定方法。
【請求項２】
フォワードプライマー（ＦＰ）の３’末端の塩基（ＳＢ１）に対応する鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ１）及びリバースプライマー（ＲＰ）の３’末端の塩基（ＳＢ２）に対応する鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ３）が一塩基置換されたポリヌクレオチドであるか否かを同定するための未同定一塩基置換型ポリヌクレオチドの同定方法である請求項１に記載の同定方法。
【請求項３】
ＰＣＲ工程（１）をマイクロ流体デバイス又は複数個のチューブを持つプレートを用いて行う請求項１又は２に記載の同定方法。
【請求項４】
ＰＣＲ用フォワードプライマー（ＦＰ）及びＰＣＲ用リバースプライマー（ＲＰ）がそれぞれ相違する請求項１〜３のいずれかに記載の同定方法。
【請求項５】
鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）が病原微生物ＤＮＡ又はヒトゲノムＤＮＡである請求項１〜４のいずれかに記載の同定方法。
【請求項６】
鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）に共通する共通プライマー（ＣＰ）を用いて、未同定の一塩基置換型ポリヌクレオチドをプレ増幅するＰＣＲ工程（４）を有する請求項１〜５のいずれかに記載の同定方法。
【請求項７】
共通プライマー（ＣＰ）が、１６ＳリボソームＲＮＡに対応する共通プライマーである請求項６に記載の同定方法。
【請求項８】
フォワードプライマー（ＦＰ）の３’末端の塩基（ＳＢ１）に対応する鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ１）及び／又はリバースプライマー（ＲＰ）の３’末端の塩基（ＳＢ２）に対応する鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ３）が一塩基置換されたポリヌクレオチドであるか否かを同定するためのフォワードプライマー（ＦＰ）及びリバースプライマー（ＲＰ）からなり、
３’末端の塩基（ＳＢ１）が、鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ１）と相補する塩基であり、この塩基（ＳＢ１）の１つ又は２つ隣の塩基が鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ２）と相補しない塩基であるフォワードプライマー（ＦＰ）と、
３’末端の塩基（ＳＢ２）が、鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ３）と相補する塩基であり、この塩基（ＳＢ２）の１つ又は２つ隣の塩基が鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ４）と相補しない塩基であるリバースプライマー（ＲＰ）とからなることを特徴とするＰＣＲ用プライマー対。
【請求項９】
フォワードプライマー（ＦＰ）の３’末端の塩基（ＳＢ１）に対応する鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ１）及びリバースプライマー（ＲＰ）の３’末端の塩基（ＳＢ２）に対応する鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ３）が一塩基置換されたポリヌクレオチドであるか否かを同定するためのフォワードプライマー（ＦＰ）及びリバースプライマー（ＲＰ）からなる請求項８に記載のＰＣＲ用プライマー対。
【請求項１０】
フォワードプライマー（ＦＰ）及びリバースプライマー（ＲＰ）がそれぞれ相違する請求項８又は９に記載のプライマー対。
【請求項１１】
鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）が病原微生物ＤＮＡ又はヒトゲノムＤＮＡである請求項８〜１０のいずれかに記載のプライマー対。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、未同定の一塩基置換型ポリヌクレオチドを同定するための同定方法及びプライマー対に関する。
【背景技術】
【０００２】
１塩基の違いを区別するために、３’末端の塩基から５塩基以内に、鋳型ポリヌクレオチドとミスマッチする塩基を入れたプライマーを用いて、核酸増幅反応をマイクロ流体デバイス上で行い、増幅の有無をもってポリヌクレオチドの一塩基多型あるいは変異の有無の判定方法が知られている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−１６８３５０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来の判定方法を用いた場合、鋳型ポリヌクレオチドによってそれぞれ厳密なＰＣＲの条件設定が必要であり、汎用的な技術に至っていない。
本発明の目的は、簡便かつ迅速に、未同定の一塩基置換型ポリヌクレオチドを同定する方法及びこの方法に最適なＰＣＲ用プライマー対を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の同定方法の特徴は、フォワードプライマー（ＦＰ）の３’末端の塩基（ＳＢ１）に対応する鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ１）及び／又はリバースプライマー（ＲＰ）の３’末端の塩基（ＳＢ２）に対応する鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ３）が一塩基置換されたポリヌクレオチドであるか否かを同定するための未同定一塩基置換型ポリヌクレオチドの同定方法であって、
３’末端の塩基（ＳＢ１）が、鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ１）と相補する塩基であり、この塩基（ＳＢ１）の１つ又は２つ隣の塩基が鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ２）と相補しない塩基であるフォワードプライマー（ＦＰ）と、
３’末端の塩基（ＳＢ２）が、鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ３）と相補する塩基であり、この塩基（ＳＢ２）の１つ又は２つ隣の塩基が鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ４）と相補しない塩基であるリバースプライマー（ＲＰ）とからなるプライマー対を用いてＰＣＲを行うＰＣＲ工程（１）；
ＰＣＲによるポリヌクレオチドの増幅の有無を判定する判定工程（２）；及び
増幅したポリヌクレオチドに対応するプライマー対から、このプライマー対に対応する鋳型ポリヌクレオチドを特定することにより、未同定の一塩基置換型ポリヌクレオチドの塩基配列を同定する同定工程（３）を有する点を要旨とする。
【０００６】
本発明のＰＣＲ用プライマー対の特徴は、フォワードプライマー（ＦＰ）の３’末端の塩基（ＳＢ１）に対応する鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ１）及び／又はリバースプライマー（ＲＰ）の３’末端の塩基（ＳＢ２）に対応する鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ３）が一塩基置換されたポリヌクレオチドであるか否かを同定するためのフォワードプライマー（ＦＰ）及びリバースプライマー（ＲＰ）からなり、
３’末端の塩基（ＳＢ１）が、鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ１）と相補する塩基であり、この塩基（ＳＢ１）の１つ又は２つ隣の塩基が鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ２）と相補しない塩基であるフォワードプライマー（ＦＰ）と、
３’末端の塩基（ＳＢ２）が、鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ３）と相補する塩基であり、この塩基（ＳＢ２）の１つ又は２つ隣の塩基が鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ４）と相補しない塩基であるリバースプライマー（ＲＰ）とからなる点を要旨とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の同定方法によると、簡便かつ迅速に、未同定の一塩基置換型ポリヌクレオチドを同定するができる。また、本発明のＰＣＲ用プライマー対を用いると、簡便かつ迅速に、未同定の一塩基置換型ポリヌクレオチドを同定するができる。また、本発明の同定方法を２対の染色体のそれぞれに適用すると、一塩基置換のタイプがホモ型か、ヘテロ型かを判定できる。
【０００８】
したがって、本発明の同定方法及び本発明のＰＣＲ用プライマーを用いると、鋳型ポリヌクレオチドによってそれぞれ厳密なＰＣＲの条件設定が不必要であり、汎用的な技術として、広く適用できる。
また、鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）が病原微生物ＤＮＡである場合、迅速な医療処置が可能になり、人命救助に極めて大きく貢献できる。
また、鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）がヒトゲノムＤＮＡである場合、ＤＮＡと、疾患、薬物代謝又は薬物反応性等との相関が解明できるため、遺伝子診断等、医療分野に大きく貢献できる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の同定方法は、フォワードプライマー（ＦＰ）の３’末端の塩基（ＳＢ１）に対応する鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ１）及び／又はリバースプライマー（ＲＰ）の３’末端の塩基（ＳＢ２）に対応する鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ３）が一塩基置換されたポリヌクレオチドであるか否かを同定するための未同定一塩基置換型ポリヌクレオチドの同定方法であり、ポリヌクレオチドの一塩基多型又は変異を同定する方法である。
【００１０】
本発明において、ＰＣＲとは、polymerase chain reaction（核酸増幅反応）を意味する。また、塩基とは、アデニン、チミン、シトシン、グアニン又はウラシルを意味する。
【００１１】
鋳型ポリヌクレオチドとは、複数のヌクレオチド（核酸）が重合したものであり、ヌクレオチドの数は特に限定されないが、少なくとも２０個が好ましく、さらに好ましくは少なくとも３０個、特に好ましくは少なくとも４０個、最も好ましくは少なくとも５０個である。
【００１２】
鋳型ポリヌクレオチドは、全血、血清、糞便由来物又は尿等の生体に由来するものでもよいし、動物、植物又はウイルス等の細胞組織又は細胞培養物に由来するものでもよく、飲料物又は缶詰等の加工食品に由来するものであってもよい。
鋳型ポリヌクレオチドのうち、ＤＮＡが好ましく、さらに好ましくはヒトゲノムＤＮＡ及び病原微生物ＤＮＡ（たとえば、ウイルス、結核菌、コレラ菌、ボツヌルス菌、腸チフス菌及びＢＳＥ菌）である。
【００１３】
鋳型ポリヌクレオチドは、塩基配列が既知のものであり、同定対象である一塩基置換型ポリヌクレオチドの塩基配列の全部又は一部に対応する。そして、鋳型ポリヌクレオチドに対応する複数種類のフォワードプライマー（ＦＰ）及びリバースプライマー（ＲＰ）を公知の方法により、予め合成しておき、これらをＰＣＲ工程（１）に使用する。
【００１４】
フォワードプライマー（ＦＰ）は、３’末端の塩基（ＳＢ１）が鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ１）と相補する塩基であり、この塩基（ＳＢ１）の１つ又は２つ隣の塩基が鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ２）と相補しない塩基である。
【００１５】
リバースプライマー（ＲＰ）は、３’末端の塩基（ＳＢ２）が、鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ３）と相補する塩基であり、この塩基（ＳＢ２）の１つ又は２つ隣の塩基が鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）の塩基（ＴＰ４）と相補しない塩基である。
【００１６】
フォワードプライマー（ＦＰ）及びリバースプライマー（ＲＰ）の塩基数については特に限定がないが、ＰＣＲの反応効率等の観点から、１０〜５０塩基が好ましく、さらに好ましくは１５〜４０塩基、特に好ましくは２０〜３５塩基である。
【００１７】
フォワードプライマー（ＦＰ）及びリバースプライマー（ＲＰ）は、同じ塩基配列であっても、異なる塩基配列であってもよい。フォワードプライマー（ＦＰ）及びリバースプライマー（ＲＰ）がそれぞれ相違することが好ましい。
【００１８】
フォワードプライマー（ＦＰ）及びリバースプライマー（ＲＰ）は、鋳型ポリヌクレオチドにアニーリングし、未同定の一塩基置換型ポリヌクレオチドがフォワードプライマー（ＦＰ）の３’末端の塩基（ＳＢ１）と相補し、かつ／又は、リバースプライマー（ＲＰ）の３’末端の塩基（ＳＢ２）と相補する場合、ＰＣＲ伸長反応が進行する。
【００１９】
一方、フォワードプライマー（ＦＰ）及びリバースプライマー（ＲＰ）は、鋳型ポリヌクレオチドにアニーリングし、未同定の一塩基置換型ポリヌクレオチドがフォワードプライマー（ＦＰ）の３’末端の塩基（ＳＢ１）と相補せず、かつ、リバースプライマー（ＲＰ）の３’末端の塩基（ＳＢ２）と相補しない場合、ＰＣＲ伸長反応が進行しない。
【００２０】
すなわち、未同定の一塩基置換型ポリヌクレオチドが、フォワードプライマー（ＦＰ）の３’末端の塩基（ＳＢ１）及び／又はリバースプライマー（ＲＰ）の３’末端の塩基（ＳＢ２）と相補する場合、ＰＣＲ伸長反応が進行し、未同定の一塩基置換型ポリヌクレオチドが、３’末端の塩基（ＳＢ１）及び３’末端の塩基（ＳＢ２）と相補しない場合、ＰＣＲ伸長反応が進行しない。
【００２１】
本発明の好ましい態様において、フォワードプライマー（ＦＰ）及びリバースプライマー（ＲＰ）は、鋳型ポリヌクレオチドにアニーリングし、未同定の一塩基置換型ポリヌクレオチドがフォワードプライマー（ＦＰ）の３’末端の塩基（ＳＢ１）と相補し、かつ、リバースプライマー（ＲＰ）の３’末端の塩基（ＳＢ２）と相補する場合、ＰＣＲ伸長反応が進行する。
【００２２】
一方、フォワードプライマー（ＦＰ）及びリバースプライマー（ＲＰ）は、鋳型ポリヌクレオチドにアニーリングし、未同定の一塩基置換型ポリヌクレオチドがフォワードプライマー（ＦＰ）の３’末端の塩基（ＳＢ１）と相補せず、及び／又は、リバースプライマー（ＲＰ）の３’末端の塩基（ＳＢ２）と相補しない場合、ＰＣＲ伸長反応が進行しない。
【００２３】
すなわち、未同定の一塩基置換型ポリヌクレオチドが、フォワードプライマー（ＦＰ）の３’末端の塩基（ＳＢ１）及びリバースプライマー（ＲＰ）の３’末端の塩基（ＳＢ２）と相補する場合、ＰＣＲ伸長反応が進行し、未同定の一塩基置換型ポリヌクレオチドが、３’末端の塩基（ＳＢ１）及び／又は３’末端の塩基（ＳＢ２）と相補しない場合、ＰＣＲ伸長反応が進行しない。
【００２４】
従来のポリヌクレオチドの一塩基多型あるいは変異の有無の判定方法では、フォワードプライマーのみに工夫がなされており、リバースプライマーは共通プライマーを用いている。しかし、塩基配列が完全に相補的でないにもかかわらず、しばしばＰＣＲ伸長反応が進行してまうことがある。
これに対して、本発明の同定方法を適用すると、未同定の一塩基置換型ポリヌクレオチドと、フォワードプライマー（ＦＰ）及び／又はリバースプライマー（ＲＰ）の３'末端の塩基とが相補した場合に限り、ＰＣＲ伸長反応が進行する。この場合、フォワードプライマー（ＦＰ）の１つ及び／又はリバースプライマー（ＲＰ）の１つの塩基が相補していないにもかかわらず、ＰＣＲ伸長反応が進行する。したがって、本発明の同定方法を適用すると、未同定の一塩基置換型ポリヌクレオチドの同定が著しく正確に行うことができる。
【００２５】
本発明の好ましい態様において、本発明の同定方法を適用すると、未同定の一塩基置換型ポリヌクレオチドと、フォワードプライマー（ＦＰ）及びリバースプライマー（ＲＰ）の３'末端の両方の塩基とが相補した場合に限り、ＰＣＲ伸長反応が進行する。この場合、フォワードプライマー（ＦＰ）の１つ及びリバースプライマー（ＲＰ）の１つの塩基が相補していないにもかかわらず、ＰＣＲ伸長反応が進行する。したがって、本発明の同定方法を適用すると、未同定の一塩基置換型ポリヌクレオチドの同定が著しく正確に行うことができる。
【００２６】
フォワードプライマー（ＦＰ）及びリバースプライマー（ＲＰ）は、通常、等量で用いられるが、これらのうち一方の使用量を多く用いる非対称ＰＣＲも適用できる。
【００２７】
ＰＣＲ工程（１）で使用される試薬及び装置は特に制限されず、通常の試薬及び装置等が適用できる。
【００２８】
ポリメラーゼは、逆転写酵素や核酸増幅能をもつ酵素であれば任意のもの等が使用できるが、熱安定性のポリメラーゼが好ましい。
【００２９】
ＰＣＲ工程（１）では、迅速性及び簡便性（自動化）等の観点から、マイクロ流体デバイス（特許文献１等）又は複数個のチューブを持つプレート（特開２００３−１０２４７７号公報等）を用いて行うことが好ましい。
【００３０】
ＰＣＲ工程（１）の前に、鋳型ポリヌクレオチドに共通する共通プライマー（ＣＰ）を用いて、未同定の一塩基置換型ポリヌクレオチドをプレ増幅するＰＣＲ工程（４）を有することが好ましい。ＰＣＲ工程（４）を行うことにより、未同定の一置換型ポリヌクレオチドが微量であっても、ＰＣＲ工程（４）により、同定に十分な測定試料を確保することができる。また、同定する必要のないポリヌクレオチドが含まれている場合、同定対象のポリヌクレオチドだけ増幅反応により増やすことができ、同定する必要のないポリヌクレオチドを排除することができる。
【００３１】
共通プライマー（ＣＰ）としては、鋳型ポリヌクレオチドに共通する共通プライマーであれば制限なく使用できる。たとえば、鋳型ポリヌクレオチドが病原微生物ＤＮＡの場合、１６ＳリボソームＲＮＡに対応する共通プライマーが好ましい。
【００３２】
ＰＣＲによる増幅の有無を判定する判定工程（２）は、公知の方法（特許文献１及び特開２００３−１０２４７７号公報）等によって増幅の有無が判定できる。たとえば、ゲル電気泳動方法及び蛍光標識方法等によって、ＰＣＲによる増幅の有無を判定することができる。これらのうち、迅速性及び簡便性（自動化）等の観点から、蛍光標識による方法が好ましい。
【００３３】
同定工程（３）では、判定工程（２）でＰＣＲによる増幅が確認されたポリヌクレオチドに対応するプライマー対から、このプライマー対に対応する鋳型ポリヌクレオチドを特定した後、この鋳型ポリヌクレオチドの塩基配列から、未同定の一塩基置換型ポリヌクレオチドの塩基配列を同定する（未同定の一塩基置換型ポリヌクレオチドの塩基配列が、鋳型ポリヌクレオチドの塩基配列を含む。）。
【００３４】
ＰＣＲ工程（１）、判定工程（２）及び同定工程（３）のいずれか、または全てをメカトロニクス技術等により自動化することができ、正確性、迅速性及び簡便性（自動化）等の観点から、ＰＣＲ工程（１）、判定工程（２）及び同定工程（３）の全てを自動化することが好ましい。
【００３５】
本発明のＰＣＲ用プライマー対は、フォワードプライマー（ＦＰ）及びリバースプライマー（ＲＰ）からなり、上記の同定方法に好適であるが、上記以外の同定方法にも適用できる。また、本発明のＰＣＲ用プライマー対は、フォワードプライマー（ＦＰ）及びリバースプライマー（ＲＰ）が混合されていてもよく、フォワードプライマー（ＦＰ）及びリバースプライマー（ＲＰ）が別々になっていてもよい。また、溶液状であってもよく、乾燥状態でもよい。すなわち、ＰＣＲ反応において、共に用いられるものであれば、形態等に制限はない。
【００３６】
本発明のプライマー対は、フォワードプライマー（ＦＰ）及びリバースプライマー（ＲＰ）がそれぞれ相違することがこのましい。また、本発明のプライマー対は、対応する鋳型ポリヌクレオチド（ＴＰ）が病原微生物ＤＮＡ又はヒトゲノムＤＮＡであることが好ましい。
【実施例】
【００３７】
＜実施例１＞
細菌性食中毒菌のみを国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information；ＮＣＢＩ）から、表１に示した菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ塩基配列２７種を取得し、この菌配列２７種について、ClustalＷ（国立遺伝学研究所のホームページ）を用いたアライメントにより、相同な配列と非相同な配列を特定した。
【００３８】
【表１】
2009225787.tif 000002
【００３９】
相同な配列を用いて、病原菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域が増幅される次の共通プライマー（ｃｐ１）（配列番号１及び２）を設計した。
【００４０】
ＣＦ：  5'-gaacgctggc ggcaggccta a-3'
ＣＲ：  5'-ggtgtgacgg gcggtgagta caa-3'
【００４１】
病原菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域中の非相同な配列を用いて、Escherichia coli（以下、E. coliと略する。） JM109ゲノムＤＮＡに対して特異的に増幅できるプライマーを、非相同部をプライマーの３’末端の塩基にして、この３’末端の塩基（ＳＢ１）の１つ又は２つ隣の塩基をミスマッチさせて、次のフォワードプライマー及びリバースプライマーを設計した（大文字で記載した箇所がミスマッチさせた箇所である。）。なお、非相同部には非相同配列が一塩基のみであった。
【００４２】
＜フォワードプライマー（配列番号３〜８）＞
Ａ１：5'-gtcga acggt aacag gaaCa-3'
Ａ２：5'-gtcga acggt aacag gaaTa-3'
Ａ３：5'-gtcga acggt aacag gaGga-3'
Ａ４：5'-gtcga acggt aacag gaCga-3'
Ｂ１：5'-tgctc ttcgc tgacg agtAc-3'
Ｂ２：5'-tgctc ttcgc tgacg agtCc-3'
【００４３】
＜リバースプライマー（配列番号９〜１３）＞
Ｃ１：5'-gcaaa ggtat taact ttCct-3'
Ｄ１：5'-tctgc gggta acgtc aatAa-3'
Ｄ２：5'-tctgc gggta acgtc aatTa-3'
Ｄ３：5'-tctgc gggta acgtc aaCga-3'
Ｅ１：5'-gtccc cctct ttggt cttgc-3'
【００４４】
E. coli及びSalmonella typhimurium（以下、Salmonellaと略記する。）をそれぞれ核酸抽出して、濃度を１ｎｇ／μｌに調整し、鋳型ポリヌクレオチドとして、共通プライマー（ｃｐ１）（１０ｐｍｏｌ／μｌ）を用いて、ＰＣＲを行った。次いで、ポリヌクレオチドの増幅の有無を、電気泳動法（臭化エチル、ＵＶ照射）により判定し、増幅産物を得た。
【００４５】
増幅産物（１ｎｇ／μｌ）を鋳型ポリヌクレオチドとして、表２に示したプライマー対（フォワードプライマー及びリバースプライマーの溶液、それぞれ１０ｐｍｏｌ／μｌ）を用いて、ＰＣＲを行った。次いで、ポリヌクレオチドの増幅の有無を、電気泳動法（臭化エチル、ＵＶ照射）により判定し、E. coliから抽出した測定試料について、増幅したが、Salmonellaから抽出した測定試料について、増幅が見られなかったことを確認した。
測定試料、フォワードプライマー及びリバースプライマーは、それぞれ、TE Buffer（１０ｍＭTris−ＨＣｌBuffer／１ｍＭＥＤＴＡ（ＰＨ７．５））の溶液として用いた。
【００４６】
なお、ＰＣＲの条件は以下の通りである。
１０×ＮＨ４Reaction Buffer５μｌ（Bioline社）
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ４μｌ（Bioline社）
５０ｍＭＭｇＣｌ２５μｌ
測定試料１μｌ
フォワードプライマー１μｌ
リバースプライマー１μｌ
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼＢｉｏ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）０．５μｌ（Bioline社）
滅菌蒸留水３５．５μｌ
反応時間３０秒
反応温度９５℃
変性時間１０秒
変性温度９５℃
アニーリング時間２０秒
アニーリング温度５５℃
伸長時間１分（３０サイクル後に２分間伸長反応をした）
伸長温度７２℃
サイクル数３０回
【００４７】
【表２】
2009225787.tif 000003
【００４８】
＜実施例２＞
病原菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域中の非相同な配列を用いて、SalmonellaゲノムＤＮＡに対して特異的に増幅できるプライマーを、非相同部をプライマーの３’末端の塩基にして、この３’末端の塩基（ＳＢ１）の１つ又は２つ隣の塩基をミスマッチさせて、実施例１と同様にして、フォワードプライマー及びリバースプライマーを設計した。なお、非相同部には非相同配列が一塩基のみであった。
【００４９】
＜フォワードプライマー（配列番号１４）＞
Ｆ１：5'-gctga cgagt gccgg acAgt-3'
【００５０】
＜リバースプライマー（配列番号１５）＞
Ｇ１：5'-tgagc ccggg gattt caAac-3'
【００５１】
実施例１と同様にして、E. coli及びSalmonellaをそれぞれ核酸抽出して、濃度を１ｎｇ／μｌに調整し、鋳型ポリヌクレオチドとして、共通プライマー（ｃｐ１）（１０ｐｍｏｌ／μｌ）を用いて、ＰＣＲを行った。次いで、ポリヌクレオチドの増幅の有無を、電気泳動法（臭化エチル、ＵＶ照射）により判定し、増幅産物を得た。
【００５２】
実施例１と同様にして、増幅産物（１ｎｇ／μｌ）を鋳型ポリヌクレオチドとして、プライマー対（１９）（フォワードプライマー（Ｆ１）及びリバースプライマー（Ｇ１）の溶液（それぞれ１０ｐｍｏｌ／μｌ）を用いて、ＰＣＲを行った。次いで、ポリヌクレオチドの増幅の有無を、電気泳動法（臭化エチル、ＵＶ照射）により判定し、Salmonellaから抽出した測定試料について、増幅したが、E. coliから抽出した測定試料について、増幅が見られなかったことを確認した。
【００５３】
＜実施例３＞
E. coli、Salmonella、Vibrio cholerae及びClostridium botulinumをそれぞれ核酸抽出して、濃度を１ｎｇ／μｌに調整し、鋳型ポリヌクレオチドとして、共通プライマー（ｃｐ１）（１０ｐｍｏｌ／μｌ）を用いて、ＰＣＲを行った。次いで、ポリヌクレオチドの増幅の有無を、電気泳動法（臭化エチル、ＵＶ照射）により判定し、増幅産物を得た。それぞれの増幅産物を混合して、１ｎｇ／μｌに調整し、測定試料とした。測定試料について、共通プライマー（ＣＦ／ＣＲ）を用いて、実施例１と同様にして混合増幅産物を得た。
【００５４】
引き続き、混合増幅産物について、表２に示したプライマー対（１）及び実施例２で得たプライマー対（１９）（Ｆ１／Ｇ１）を用いて、実施例１と同様にしてＰＣＲを行った。
次いで、ポリヌクレオチドの増幅の有無を判定したところ、プライマー対（１）を用いた場合増幅し、プライマー対（１９）を用いた場合増幅は見られなかった。
したがって、プライマー対（１）から、測定試料はE. coliに由来するポリヌクレオチドであると同定した。
【００５５】
＜実施例４＞
実施例３で調製した混合増幅産物について、表２に示したプライマー対（２）及び実施例２で得たプライマー対（１９）（Ｆ１／Ｇ１）を用いて、実施例１と同様にしてＰＣＲを行った。
次いで、ポリヌクレオチドの増幅の有無を判定したところ、プライマー対（１９）を用いた場合増幅し、プライマー対（１）を用いた場合増幅は見られなかった。
したがって、プライマー対（１９）から、測定試料はSalmonellaに由来するポリヌクレオチドであると同定した。
【００５６】
＜実施例５＞
骨粗鬆症関連多型遺伝子（ＥＲ遺伝子多型３種類、ＶＤＲ  遺伝子多型３種類）計６種類をニプロ株式会社総合研究所から取得した。なお、これらＤＮＡ断片はＰＣＲ反応により増幅された２本鎖ＤＮＡ（１ｓｔＰＣＲ産物）であり、その遺伝子配列上に遺伝子多型１箇所を含んでいる。また、ＥＲ遺伝子多型についてはＧ／Ｇタイプ、Ｇ／Ａタイプ、Ａ／Ａタイプの３種類であり、ＶＤＲ遺伝子多型についてはＴ／Ｔタイプ、Ｔ／Ｃタイプ、Ｃ／Ｃタイプの３種類である。
【００５７】
骨粗鬆症関連多型遺伝子配列６種について、３’末端から二番目又は三番目の塩基配列がミスマッチするような二種類のプライマー（フォワードプライマー及びリバースプライマー）を設計した。なお、リバースプライマーの３’末端プライマーの配列が遺伝子多型のゲノム上の位置に相当するように設計した。また、フォワードプライマーについては３’末端の配列が１ｓｔＰＣＲ産物の配列と相同な配列となるように設計した。この二種類のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行ない、増幅できるかどうかによって各型の骨粗鬆症の遺伝子配列を決定した。
【００５８】
フォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列を以下に示す。
大文字で記載した箇所が恣意的にミスマッチさせた箇所である。フォワードプライマーの３’末端は１ｓｔＰＣＲ産物と相同な配列であり、リバースプライマーの３’末端の配列は遺伝子多型のゲノム上の位置に相同又は非相同な配列である。
【００５９】
＜フォワードプライマー（配列番号１６〜１８）＞
ＥＲ遺伝子：
ＥＦ４：5’- ctgtg ttgtc catca gtAca-3’
ＶＤＲ遺伝子：
ＶＦ５：5’- ctata taggc agaac caCct-3’
ＶＦ６：5’- ctata taggc agaac caGct-3’
【００６０】
＜リバースプライマー（配列番号１９〜２２＞
ＥＲ遺伝子
ＥＲａ４：5’-ccaat gctca tccca acAct-3’
ＥＲｇ３：5’-ccaat gctca tccca actTc-3’
ＶＤＲ遺伝子：
ＶＲｔ２：5’-gggcc acaga caggc ctgAa-3’
ＶＲｃ３：5’-gggcc acaga caggc ctgTg-3’
【００６１】
ＰＣＲの条件は以下の通りである。
１０×ＮＨ４Reaction Buffer０．４μｌ（Biolines社）
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰＳ  Ｍｉｘ１．６μｌ（Biolines社）
５０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２０．８μｌ
測定試料（１ｓｔ  ＰＣＲ産物）０．４μｌ
フォワードプライマー０．４μｌ（４ｐｍｏｌ）
リバースプライマー０．４μｌ（４ｐｍｏｌ）
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ  Ｂｉｏ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）０．２μｌ
滅菌蒸留水１４．２μｌ
トータル  ２０μｌ
ＰＣＲ反応条件：
９４℃    ５ｍｉｎ
９４℃  ３０ｓｅｃ
６５℃  ３０ｓｅｃ
７２℃  ３０ｓｅｃ
７２℃    ７ｍｉｎ
サイクル数３０回または４０回（ＶＤＲ遺伝子多型判定時のみ）
プライマーの組み合わせは以下の表に示した
【００６２】
【表３】
2009225787.tif 000004
【００６３】
表３において、プライマー対１の組み合わせによって特異的な増幅がみられ、かつプライマー対２の組み合わせでは増幅が見られない場合、ＥＲ遺伝子多型はＡ／Ａタイプである。また、プライマー対１及び２の組み合わせで共に特異的な増幅が見られた場合、ＥＲ遺伝子多型はＧ／Ａタイプである。また、プライマー対２の組み合わせのみで特異的な増幅が見られた場合、ＥＲ遺伝子多型はＧ／Ｇタイプである。
同様に、プライマー対３の組み合わせによって特異的増幅が見られ、プライマー対４の組み合わせで増幅が見られない場合、ＶＤＲ遺伝子多型はＴ／Ｔタイプであり、プライマー対３及び４の組み合わせで共に特異的増幅が見られた場合、ＶＤＲ遺伝子多型はＴ／Ｃタイプであり、プライマー対４の組み合わせのみで特異的増幅が見られた場合、ＶＤＲ遺伝子多型はＣ／Ｃタイプである。
【００６４】
各型の骨粗鬆症の遺伝子１ｓｔ  ＰＣＲ産物を鋳型ＤＮＡとして、濃度１０倍希釈して、上記に示したプライマー対を用いて、ＰＣＲを行った。次いで、目標の配列増幅の有無を、電気泳動法によって判定したところ、ＥＲ遺伝子型、ＶＤＲ遺伝子型共に各遺伝子型に特異的な増幅を示し、遺伝子型の判定ができた。また、これらの結果は、予めＡＢＩ社のＤＮＡシーケンサーで決定した塩基配列と矛盾しなかった。
【００６５】
＜比較例１＞
実施例３で調製した混合増幅産物について、プライマー対（２０）（フォワードプライマー（Ａ１）及びリバースプライマー（ＣＲ）、及びプライマー対（２１）（フォワードプライマー（Ｆ１）及びリバースプライマー（ＣＲ）を用いて、実施例１と同様にしてＰＣＲを行った。
次いで、ポリヌクレオチドの増幅の有無を判定したところ、プライマー対（２０）を用いた場合も、プライマー対（２１）を用いた場合も増幅が確認された。
【００６６】
＜比較例２＞
実施例３で調製した混合増幅産物について、プライマー対（２２）（フォワードプライマー（Ａ２）及びリバースプライマー（ＣＲ）、及びプライマー対（２１）（フォワードプライマー（Ｆ１）及びリバースプライマー（ＣＲ）を用いて、実施例１と同様にしてＰＣＲを行った。
次いで、ポリヌクレオチドの増幅の有無を判定したところ、プライマー対（２２）を用いた場合も、プライマー対（２１）を用いた場合も増幅が確認された。
【配列表】
2009225787000001.app