(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞外（血中）では核酸分子を安定に保持し、細胞内ではエンドソームから速やかに脱出し、核酸分子を放出可能なｐＨ応答性核酸キャリア、及び標的細胞特異的な核酸キャリアを提供し、それを用いた標的細胞内への効率的核酸デリバリーシステムを提供する。【解決手段】新規なポリビニルイミダゾールの部分的なアルキル置換体又はアミノアルキル置換体を製造し、当該部分アルキル置換又は部分アミノアルキル置換ポリビニルイミダゾールと核酸と静電的に結合させたｐＨ応答性核酸複合体を提供した。当該ｐＨ応答性核酸複合体は、優れたｐＨ応答性核酸キャリアとして用いることができ、さらに、糖鎖修飾ポリ−Ｌ−リジンを静電的に結合させた三元複合体は、標的細胞特異的な核酸キャリアとして働くので、副作用の少ない遺伝子治療用、又は診断用核酸キャリアとして特に優れている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）
【化１】
2009007547.tif 000016
〔式中、ＡはＨ又はＮＨ２を表す。ｒはモル分率を表し、０＜ｒ＜１であり、ｍは１〜１８の自然数を表す。〕で示される、数平均分子量１．０×１０３〜１．０×１０６の部分アルキル化もしくは部分アミノアルキル化ポリビニルイミダゾール又はその塩。
【請求項２】
式（１）において、ｍが２であり、前記部分アミノアルキル化ポリビニルイミダゾールが部分アミノエチル化ポリビニルイミダゾールであることを特徴とする、請求項１に記載の部分アミノアルキル化ポリビニルイミダゾール又はその塩。
【請求項３】
式（１）において、ｍが４であり、前記部分アルキル化ポリビニルイミダゾールが部分ブチル化ポリビニルイミダゾールであることを特徴とする、請求項１に記載の部分アルキル化ポリビニルイミダゾール又はその塩。
【請求項４】
1−ビニルイミダゾールを重合させて得られた
式（２）
【化２】
2009007547.tif 000017
〔式中、ｎは繰り返し数であって、式（２）のポリビニルイミダゾールの数平均分子量が１．０×１０３〜１．０×１０６となるに必要な重合度を表す。〕で示される、数平均分子量１．０×１０３〜１．０×１０６のポリビニルイミダゾールと、
式（３）
【化３】
2009007547.tif 000018
〔式中、ｍは式（１）と同一の意味を表す。〕で示される、ハロゲン化アルキルアミン、又は
式（４）
【化４】
2009007547.tif 000019
〔式中、ｍは式（１）と同一の意味を表す。〕で示される、ハロゲン化アルキルとを、非プロトン性有機溶媒中で反応させることを特徴とする、
式（１）
【化５】
2009007547.tif 000020
〔式中、Ａ、ｒ、ｍは式（１）と同一の意味を表す。〕で示される、数平均分子量１．０×１０３〜１．０×１０６の部分アルキル化もしくは部分アミノアルキル化ポリビニルイミダゾール又はその塩の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の部分アルキル化もしくは部分アミノアルキル化ポリビニルイミダゾールのカチオン性の塩と核酸とが静電的に結合していることを特徴とするｐＨ応答性核酸複合体。
【請求項６】
前記核酸が、発現ベクターを含む、もしくは含まないＤＮＡ分子であり、標的細胞内で発現させることを特徴とする請求項５に記載のｐＨ応答性核酸複合体。
【請求項７】
前記核酸が、発現ベクターを含む、もしくは含まないＲＮＡ分子であり、標的細胞内でｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、またはリボザイムとして機能させることを特徴とする請求項５に記載のｐＨ応答性核酸複合体。
【請求項８】
前記核酸が、標識された核酸であるか又はレポーター遺伝子を含む核酸であることを特徴とする請求項５〜７のいずれか１項に記載のｐＨ応答性核酸複合体。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか１項に記載のｐＨ応答性核酸複合体を含み、標的細胞内に目的の核酸を輸送し、標的細胞内で当該核酸を発現させるか又は機能させるためのｐＨ応答性核酸キャリア。
【請求項１０】
請求項５〜８のいずれか１項に記載のｐＨ応答性核酸複合体に対して、さらに下記式（５）で示される数平均分子量が１．０×１０３〜１．０×１０６の糖鎖修飾ポリリジンが静電的に結合していることを特徴とする、糖鎖修飾ポリリジン／部分アミノアルキル化ポリビニルイミダゾール塩／核酸からなるｐＨ応答性三元複合体。
式（５）
【化６】
2009007547.tif 000021
〔式中、ｐはモル分率を表し、０＜ｐ＜１である。〕
【請求項１１】
前記糖鎖修飾ポリリジンが
式（６）
【化７】
2009007547.tif 000022
〔式中、ｐは式（５）と同一の意味を表す。〕で示されるラクトース修飾ポリリジン、
又は、β−ガラクトース末端を有する糖鎖修飾ポリリジンであることを特徴とする、請求項１０に記載のｐＨ応答性三元複合体。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載のｐＨ応答性三元複合体を含むことを特徴とする、標的細胞内に目的の核酸を特異的に輸送し、標的細胞内で当該核酸を発現させるか又は機能させるための標的細胞特異的ｐＨ応答性核酸キャリア。
【請求項１３】
ｐＨ応答性三元複合体中の糖鎖修飾ポリリジンがラクトース又はβ−ガラクトース末端を有する糖鎖で修飾されたポリリジンであって、かつ標的細胞が肝細胞であることを特徴とする、請求項１２に記載の標的細胞特異的ｐＨ応答性核酸キャリア。
【請求項１４】
請求項９に記載のｐＨ応答性核酸キャリア又は請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の標的細胞特異的ｐＨ応答性核酸キャリアを有効成分として含むことを特徴とする、遺伝子治療用医薬組成物。
【請求項１５】
請求項９に記載のｐＨ応答性核酸キャリア又は請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の標的細胞特異的ｐＨ応答性核酸キャリアを有効成分として含むことを特徴とする、標的細胞の同定、検出又は診断用試薬。
【請求項１６】
請求項９に記載のｐＨ応答性核酸キャリアを用いることを特徴とする、標的細胞内に目的の核酸を輸送し、標的細胞内で当該核酸を発現させるか又は機能させる核酸デリバリー方法。
【請求項１７】
請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の標的細胞特異的ｐＨ応答性特異的核酸キャリアを用いることを特徴とする、標的細胞内に特異的に目的の核酸を輸送し、標的細胞内で当該核酸を発現させるか又は機能させる核酸デリバリー方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内に核酸を導入し機能させるための核酸用キャリア及び核酸デリバリー方法に関する。また、当該核酸キャリアを用いた肝臓の遺伝子治療用薬剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
(遺伝子治療における核酸デリバリーについて)
遺伝子治療において一つの重要なポイントは、遺伝子をはじめとする核酸物質を効率よく細胞内に取り込ませ、その発現を高めるための材料、技術、方法論の開発である。
遺伝子の細胞内への導入方法としては、キャリアと呼ばれる遺伝子の運搬体を用いるのが一般的であり、古くはウイルスを用いたアプローチがなされてきた。ウイルスの遺伝子導入の効率は非常に高いが、天然のウイルスを用いるこの方法は、ウイルスのタンパクによる免疫原性、さらには組み替えによって起こる病原性の再発などの安全性の他、体内動態がコントロールできないといった問題がある。
これに対して、プラスミドＤＮＡ水溶液を直接投与する方法は、安全性の点で優れているものの遺伝子導入効率が低い。プラスミドＤＮＡは、細胞に導入される前に生体内に存在する核酸分解酵素などによって分解・失活するばかりか、プラスミドＤＮＡなどの核酸分子は、いわばリン酸基の連なったポリアニオンであり、分子内で電気的反発により広がった構造をとっているため、そのままではマイナスの電荷を有している細胞表面に付着できず、細胞内に導入されにくいと考えられている。
そこで、これらの問題を解決して、遺伝子治療を有効な治療手段として確立するためには、安全性の高い非ウイルス性の核酸キャリアを用いた、ＤＤＳ(ドラッグデリバリーシステム)の概念を遺伝子治療に適応する研究が必要である。
【０００３】
人工キャリア−核酸複合体（核酸キャリア）のうちでも、特に遺伝子治療用の遺伝子キャリアに対しては、導入された遺伝子を核内で発現させるための機能として以下のようなことが求められる。
（１）ＤＮＡを効率的にコンパクトに凝縮し、生体内外のＤＮＡ分解酵素から保護すること。
（２）効率よく、あるいは特異的に細胞に結合し取り込まれること。
（３）エンドソームから脱出し、細胞質中に移行すること。
（４）核内への集積を促進すること。
（５）遺伝子を遊離し、遺伝子を転写可能な状態にすること。
とりわけ、エンドサイトーシス経路により細胞内に取り込まれた外来遺伝子にとって、リソソームで分解されるか、あるいは細胞外に排出されるかの経路があるため、遺伝子の機能発現には、この（３）のエンドソームから細胞質への移行は重要なステップであり、近年ではｓｉＲＮＡ、リボザイム等、核への移行を必要としないＲＮＡレベルでの核酸分子の機能発現の重要度が高まったことから、エンドソームから細胞質へのエスケープ工程は遺伝子キャリア設計において最も重要な要因として位置づけることができる。
【０００４】
（カチオン性ポリマーについて）
標的細胞に遺伝子を効率よく導入するための人工キャリアとして、様々なカチオン性脂質やカチオン性ポリマーが開発されており、これらのカチオン性物質は、正に帯電しているため、負に帯電した遺伝子と静電相互作用によって容易に複合体(ポリイオンコンプレックス）を形成する。これらの複合体はリポプレックス(カチオン性リポソーム−ＤＮＡ複合体)及びポリプレックス(カチオン性ポリマー−ＤＮＡ複合体）ともよばれる。
現在までに、様々なポリカチオンが遺伝子キャリアとして合成されているが、最初に用いられたポリカチオンは、１９８７年のWuらによるポリ−Ｌ−リジン(ＰＬＬ)である（非特許文献１）。その後、ポリエチレンイミン(ＰＥＬ)（非特許文献２）、ポリアミドアミンデンドリマー（非特許文献３）、ポリ−２−ジメチルアミノエチルメタクリレート（非特許文献４）やキトサン（非特許文献５）等の多くの合成及び天然のポリカチオンが研究されてきた。
また、ポリカチオンとポリアニオンであるＤＮＡとのポリイオンコンプレックスの静電的相互作用の安定性を高めつつ、血清タンパク質との相互作用を抑制する為に、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)などの非イオン性親水性高分子も利用されている。これまで、ＰＥＧとＰＬＬとのブロック及びグラフト共重合体、ＰＥＧとＰＥＩのグラフト共重合体（非特許文献６）、デキストランとＰＬＬのグラフト共重合体（非特許文献７）など、様々な非イオン性の親水性高分子とポリカチオンとのコンジュゲートも合成されている。
【０００５】
（ポリカチオンにおけるエンドソームエスケープ）
これらポリカチオンにおいては、エンドソームから細胞質へのエスケープに関しては、活発な研究開発が行われている。
例えば、エンドソームからエスケープするポリカチオンの代表例として、１９９５年に提唱されたプロトンスポンジ仮説を有するポリエチレンイミンが挙げられる（非特許文献２）。生理ｐＨから、エンドソームを経由してリソソームの様な酸性条件下に外部環境が変化すると、ポリエチレンイミンのプロトン化した窒素原子は１５％から４５％にまで増加する。あたかもスポンジの様にプロトンを吸収し、付随してカウンターイオンである塩化物イオンの流入を引き起こす。その結果、エンドソーム及びリソソーム内の浸透圧が上昇し、エンドソームはバーストし、内包物が細胞質に放出されると考えられている。
１９９７年には、ポリ−Ｌ−リジンと相対的弱塩基であるポリ(２−ジエチルアミノエチルメタクリレート)との異種塩基性セグメントを有するグラフト共重合体がエンドソームからのエスケープの為の新しい遺伝子キャリアの設計概念として発表された（非特許文献８）。
２０００年、Wymanらはアニオン性両親媒性ペプチド(ＧＡＬＡ)のグルタミン酸残基をリジン残基に置換した両親媒性ペプチドＫＡＬＡ(WEAK−LAKA−LAKA−LAKH−LAKA−LAKA−LKAC−EA)がポリカチオンを用いた遺伝子デリバリーシステムヘ用いられた（非特許文献９）。ＫＡＬＡは外部ｐＨが７．５〜５．０に低下すると、両親媒性のα−helixからランダムコイルヘとコンフオーメーションが変化する。ポリカチオンとＤＮＡの複合体を、静電的相互作用によりＫＡＬＡペプチドで覆い、エンドソームからのエスケープを図っている。
また、ヒスチジンはその側鎖イミダゾール基のｐＫａが約６であり、エンドソーム内ｐＨに相当する。従って、細胞外では多くのイミダゾール基はプロトン化されていないが、エンドソーム内では内部の酸性化に伴いプロトン化され、プラス電荷をもつことになる。その結果、ヒスチジンを含むペプチドあるいはポリマーのリン酸膜との相互作用が増大し、最終的にエンドソーム膜破壊を引き起こす。このヒスチジン残基の性質を利用したヒスチジン化オリゴリジンが設計され、アンチセンスＤＮＡの細胞質への送達が試みられた。ポリ−Ｌ−リジンの遊離アミノ基の３８％をヒスチジン残基で最適修飾したポリカチオンも設計され、ヒスチジンで修飾していないポリ−Ｌ−リジンに比べて、高い遺伝子導入活性が得られた（非特許文献１０）。
一方、ポリ−Ｌ−リジンを主鎖にポリ−Ｌ−ヒスチジンを側鎖にしたグラフト共重合体が合成され、ポリ−Ｌ−リジン単独に比べて高い遺伝子発現活性が認められた（非特許文献１１）。さらに、ポリ(１−ビニルイミダゾール)を主鎖にラクトース化ポリ−Ｌ−リジンを側鎖に用いたグラフト共重合体が合成され、ｐＨ７．５からｐＨ６．０に外部ｐＨを低下させることにより、ポリカチオンとＤＮＡとのポリイオンコンプレックスの集合構造を変化させた（非特許文献１２）。
しかしながら、いずれの遺伝子キャリアにおいても、細胞内へ核酸物質を輸送しエンドソームからのエスケープまでの工程での効率はかなりの改善がなされたものの、キャリアから核酸物質の解離工程も不十分である。最終的にこれらポリカチオンを主要骨格とした非ウイルス性遺伝子キャリアの遺伝子発現効率はウイルス性の遺伝子キャリアに比べて極めて遺伝子発現効率が低いのが現状である。
【０００６】
（遺伝子治療におけるターゲティング）
薬物の体内での行先（体内動態）を積極的にコントロールし、薬物本来の効能をより発揮させようとする試みは、ターゲティング療法と呼ばれ、ＤＤＳの中核を成す研究課題となっているが、遺伝子治療においても、標的細胞に対する特異的な遺伝子発現が行えれば、期待した遺伝子効果が得られるのに加えて、標的細胞以外の細胞へ遺伝子が導入されることによる副作用の問題も解決できるため、ターゲティングは重要である。
そのためには、標的細胞特異的なリガンド分子を結合させた核酸キャリアを創設する必要があるが、上記発現効率の低い遺伝子キャリアに対して、さらに細胞ターゲティング能を付加することには困難を極める。
前述したように、遺伝子はキャリアによって凝縮される必要があると同時に、最終ステップにおいては、遺伝子を遊離して速やかに遺伝子の転写を開始させる必要がある。
ＰＬＬやＰＥＩ、ポリアミンドアミンデンドリマーとＤＮＡとのポリプレックスはヌクレアーゼ耐性に優れることが報告されている（非特許文献１３）。一方、ヌクレアーゼ耐性が、酵素による認識(切断)からの回避であることからも予測できるように、高いヌクレアーゼ耐性は、同時に転写因子による認識をも抑制する。事実、ポリプレックスのヌクレアーゼ耐性と転写因子との間の負の相関も指摘されている。つまり、カチオン性キャリアとＤＮＡの強い静電的相互作用は、転写因子によるＤＮＡの認識に対して直接的な影響を与えるため、高効率の非ウイルスキャリアを設計するにあたって、キャリア分子の化学的・物理化学的性質とポリプレックスの被転写翻訳効率との相関を解明し、さらに、その構造を最適化する戦略がとられるようになってきた。
YAMAOKA等は、ポリプレックスを核ヘマイクロインジェクションし、遺伝子発現との相関を評価することで、異なるキャリア分子からなるポリプレックスでのＤＮＡ分子の転写がキャリア分子に大きく影響されることを定量的に示すことに成功した。細胞による取り込みや細胞内移行性などは、生成したコンプレックスのサイズや物性に影響されるのに対して、転写のステップは、キャリアポリマーとＤＮＡ分子の直接的な高分子物性間相互作用が関与しているために、キャリア分子の特性が極めて大きな影響を及ぼす。
YAMAOKA等は、光散乱法、ゼータ電位測定、蛍光プローブ法など様々な手法により複合体の物性を詳細に解析した結果、３級および４級カチオン基は、複合体の凝縮を抑制し、さらにＤＮＡの解離を容易にすること、また、水酸基などの非電荷親水性基は、複合体形成のドライビングフォースである静電的相互作用に関与しないため、複合体の親水性を保ち、膨潤した状態の複合体を形成することを明らかにした。これらはいずれも高い転写活性を示し、ポリプレックスの解離のしやすさの傾向が、直接的に転写活性に影響を与えることが示された（非特許文献１４）。
このように、キャリア分子には、分子の凝縮によるヌクレアーゼ耐性の獲得と、コンプレックス中のＤＮＡ転写を許容するようなコンプレックスの凝集状態という、相反する性質を満たす必要がある。その上、さらに細胞ターゲティング能も持たせようとするのは困難であり、未だウイルス性キャリアに匹敵するような非ウイルス性核酸キャリアが提供できているとは言い難い。
【非特許文献１】J. Biol. Chem. 262, 4429 (1987)
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7297 (1995)
【非特許文献３】Bioconjugate Chem. 4, 372 (1993)
【非特許文献４】Pharm. Res. 13, 1038 (1996)
【非特許文献５】J. Control. Release 51, 213 (1998)
【非特許文献６】Bioconjugate Chem. 9, 805 (1998)
【非特許文献７】Bioconjugate Chem. 9, 292 (1998)
【非特許文献８】Bioconjugate Chem. 8, 833 (1997)
【非特許文献９】J. Control. Release 76, 183 (2001)
【非特許文献１０】Bioconjugate Chem. 10, 406 (1999)
【非特許文献１１】Bioconjugate Chem. 11, 637 (2000)
【非特許文献１２】Colloids Surf. B: Biointerf. 22, 183 (2001)
【非特許文献１３】J Pharm Sci. 87, 160 (1998)
【非特許文献１４】Nucleic Acids Symp Ser. 49, 365 (2005)
【非特許文献１５】Bioconjugate Chem.9,476 (1998)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
細胞外(血中)で核酸分子を安定に保持することができ、かつエンドソームから脱出して、速やかに細胞質中で核酸分子を放出できるｐＨ応答性核酸キャリアを提供し、さらに標的細胞への特異的な細胞取り込みも可能な標的細胞特異的なｐＨ応答性核酸キャリアを提供すること、及びそれらを用いた核酸デリバリーシステムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明では、細胞内に取り込まれた後、エンドソームから脱出させることができ、細胞質に移行した後では速やかに核酸分子を放出できる核酸キャリアとして、ポリビニルイミダゾールに着目し、その各種置換体について鋭意研究の結果、新規なポリビニルイミダゾールの部分的なアミノアルキル置換体であるＰＶＩｍ−ＮＨ２が、優れたｐＨ応答性核酸キャリアとして働くことを見いだした。
さらに、細胞ターゲティングを実現するために、細胞の糖鎖認識に着目して、肝細胞をモデルとし、肝細胞表面に存在するアシアロ糖タンパク質レセプターを特異的に認識するラクトースをリガンドとしたラクトース修飾ポリ−Ｌ−リジン(ＰＬＬ−Ｌａｃ)を合成した。
そして、ＰＬＬ−Ｌａｃと上記ＰＶＩｍ−ＮＨ２とをＤＮＡと共に複合化（三元複合化）させたところ、２種のキャリアの相加効果を超えて、レセプターを介した特異的な細胞内取り込みと、エンドソームからの脱出促進のみならず、細胞外でのＤＮＡの安定保持と、細胞質内におけるキャリアからの速やかなＤＮＡ遊離が実現でき、高い遺伝子発現が確認された。
これらの知見をもとに、優れたｐＨ応答性核酸複合体及び標的細胞特異的ｐＨ応答性三元複合体、並びにこれらを核酸キャリアとして用いた核酸デリバリーシステムに関する本発明を完成させた。
本発明者らは、その後、さらに単独で細胞内に取り込まれ、目的核酸分子を効率的に発現させることができるポリイミダゾール置換体の研究開発に取り組み、イミダゾール基の部分的なアルキル置換体（ＰＶＩｍ−Ｒ）が、糖鎖修飾ポリリジンとの三元複合体を形成しなくても細胞内に核酸分子を導入できるばかりか、優れたｐＨ応答性核酸複合体形成能は失わずに、目的核酸分子の高い発現効率を達成できたという驚くべき結果を得て、さらに本発明を発展させた。
即ち、本発明は以下の通りである。
［１］式（１）
【０００９】
【化８】
2009007547.tif 000002
〔式中、ＡはＨ又はＮＨ２を表す。ｒはモル分率を表し、０＜ｒ＜１であり、ｍは１〜１８の自然数を表す。〕で示される、数平均分子量１．０×１０３〜１．０×１０６の部分アルキル化もしくは部分アミノアルキル化ポリビニルイミダゾール又はその塩。
［２］  式（１）において、ｍが２であり、前記部分アミノアルキル化ポリビニルイミダゾールが部分アミノエチル化ポリビニルイミダゾールであることを特徴とする、前記［１］に記載の部分アミノアルキル化ポリビニルイミダゾール又はその塩。
［３］  式（１）において、ｍが４であり、前記部分アルキル化ポリビニルイミダゾールが部分ブチル化ポリビニルイミダゾールであることを特徴とする、前記［１］に記載の部分アルキル化ポリビニルイミダゾール又はその塩。
［４］
1−ビニルイミダゾールを重合させて得られた
式（２）
【化９】
2009007547.tif 000003
〔式中、ｎは繰り返し数であって、式（２）のポリビニルイミダゾールの数平均分子量が１．０×１０３〜１．０×１０６となるに必要な重合度を表す。〕で示される、数平均分子量１．０×１０３〜１．０×１０６のポリビニルイミダゾールと、
式（３）
【化１０】
2009007547.tif 000004
〔式中、ｍは式（１）と同一の意味を表す。〕で示される、ハロゲン化アルキルアミン、又は
式（４）
【化１１】
2009007547.tif 000005
〔式中、ｍは式（１）と同一の意味を表す。〕で示される、ハロゲン化アルキルとを、非プロトン性有機溶媒中で反応させることを特徴とする、
式（１）
【化１２】
2009007547.tif 000006
〔式中、Ａ、ｒ、ｍは式（１）と同一の意味を表す。〕で示される、数平均分子量１．０×１０３〜１．０×１０６の部分アルキル化もしくは部分アミノアルキル化ポリビニルイミダゾール又はその塩の製造方法。
［５］  前記［１］〜［３］のいずれかに記載の部分アルキル化もしくは部分アミノアルキル化ポリビニルイミダゾールのカチオン性の塩と核酸とが静電的に結合していることを特徴とするｐＨ応答性核酸複合体。
［６］  前記核酸が、発現ベクターを含む、もしくは含まないＤＮＡ分子であり、標的細胞内で発現させることを特徴とする前記［５］に記載のｐＨ応答性核酸複合体。
［７］  前記核酸が、発現ベクターを含む、もしくは含まないＲＮＡ分子であり、標的細胞内でｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、またはリボザイムとして機能させることを特徴とする前記［５］に記載のｐＨ応答性核酸複合体。
［８］  前記核酸が、標識された核酸であるか又はレポーター遺伝子を含む核酸であることを特徴とする前記［５］〜［７］のいずれかに記載のｐＨ応答性核酸複合体。
［９］  前記［５］〜［８］のいずれかに記載のｐＨ応答性核酸複合体を含み、標的細胞内に目的の核酸を輸送し、標的細胞内で当該核酸を発現させるか又は機能させるためのｐＨ応答性核酸キャリア。
［１０］  前記［５］〜［８］のいずれかに記載のｐＨ応答性核酸複合体に対して、さらに下記式（５）で示される数平均分子量が１．０×１０３〜１．０×１０６の糖鎖修飾ポリリジンが静電的に結合していることを特徴とする、糖鎖修飾ポリリジン／部分アミノアルキル化ポリビニルイミダゾール塩／核酸からなるｐＨ応答性三元複合体。
式（５）
【００１０】
【化１３】
2009007547.tif 000007
〔式中、ｐはモル分率を表し、０＜ｐ＜１である。〕
［１１］  前記糖鎖修飾ポリリジンが
式（６）
【００１１】
【化１４】
2009007547.tif 000008
〔式中、ｐは式（５）と同一の意味を表す。〕で示されるラクトース修飾ポリリジン、
又は、β−ガラクトース末端を有する糖鎖修飾ポリリジンであることを特徴とする、前記［１０］に記載のｐＨ応答性三元複合体。
［１２］  前記［１０］又は［１１］に記載のｐＨ応答性三元複合体を含むことを特徴とする、標的細胞内に目的の核酸を特異的に輸送し、標的細胞内で当該核酸を発現させるか又は機能させるための標的細胞特異的ｐＨ応答性核酸キャリア。
［１３］  ｐＨ応答性三元複合体中の糖鎖修飾ポリリジンがラクトース又はβ−ガラクトース末端を有する糖鎖で修飾されたポリリジンであって、かつ標的細胞が肝細胞であることを特徴とする、前記［１２］に記載の標的細胞特異的ｐＨ応答性核酸キャリア。
［１４］  前記［９］に記載のｐＨ応答性核酸キャリア又は前記［１０］〜［１３］のいずれかに記載の標的細胞特異的ｐＨ応答性核酸キャリアを有効成分として含むことを特徴とする、遺伝子治療用医薬組成物。
［１５］  前記［９］に記載のｐＨ応答性核酸キャリア又は前記［１０］〜［１３］のいずれかに記載の標的細胞特異的ｐＨ応答性核酸キャリアを有効成分として含むことを特徴とする、標的細胞の同定、検出又は診断用試薬。
［１６］  前記［９］に記載のｐＨ応答性核酸キャリアを用いることを特徴とする、標的細胞内に目的の核酸を輸送し、標的細胞内で当該核酸を発現させるか又は機能させる核酸デリバリー方法。
［１７］  前記［１０］〜［１３］のいずれかに記載の標的細胞特異的ｐＨ応答性核酸キャリアを用いることを特徴とする、標的細胞内に特異的に目的の核酸を輸送し、標的細胞内で当該核酸を発現させるか又は機能させる核酸デリバリー方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のｐＨ応答性核酸複合体は、核酸キャリアとして用いることで、血液中（細胞外）では核酸分子を安定に保持できる、かつ細胞に取り込まれてからは、速やかにエンドソームから脱出し、核酸分子も放出して核酸を発現させるか又は機能させることができる。
特に、標的細胞に特異的な糖鎖で修飾したポリリジンをさらに静電的に結合させたｐＨ応答性三元複合体は、目的の核酸を標的細胞内に特異的に輸送し、標的細胞内で効率よく核酸本来の機能を発揮させることができる。
本発明のこれらのｐＨ応答性複合体を核酸キャリアとして用いることで、副作用の少ない効率的な肝臓の遺伝子治療が可能となり、同時に、導入した核酸又はその発現産物の肝臓内での動向のモニターがリアルタイムで行うことも可能となった。
糖鎖として各種細胞に特異的なレセプターのリガンドとなる糖鎖を選択すれば、種々の臓器特異的な遺伝子治療が可能になり、特に癌細胞特異的な糖鎖を用いれば、効果的な抗癌剤、癌診断剤を提供することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
〔１〕新規化合物である「部分アミノアルキル化ポリビニルイミダゾール」及び「部分アルキル化ポリビニルイミダゾール」について
１．新規ｐＨ応答性遺伝子キャリアである「部分アミノアルキル化ポリビニルイミダゾール」の設計
目的とした遺伝子デリバリーシステムを達成するためのｐＨ応答性遺伝子として、新規ポリカチオンである「部分アミノアルキル化ポリビニルイミダゾール」を想定し、その典型的な部分アミノエチル化ポリビニルイミダゾール（ＰＶＩｍ−ＮＨ２）を設計した。（ＰＶＩｍ−ＮＨ２）はノニオンの親水性高分子であるポリ（１−ビニルイミダゾール）（ＰＶＩｍ）にアミノエチル基を複数導入したポリカチオンであり、以下の３つの特徴を期待した。
（ａ）アミノエチル基によるＤＮＡ保持
動物の血清中には、多くのＤＮＡ分解酵素が含まれており、血清中でのプラスミドＤＮＡの活性の半減期は５分以下である。また、ＤＮＡが細胞に取り込まれると、エンドソームはライソソームと融合し、ＤＮＡは多量の分解酵素にさらされる。さらに、運よく細胞質に逃げ出せたとしても、そこには細胞質ＤＮＡ分解酵素がやはり存在する。このように、生体は外来のＤＮＡ分子を攻撃、不活性化するシステムを何重にも備えており、投与された遺伝子医薬はこれを全てクリアしなければならない。
タンパク製剤のように、活性発現部位が限定された高分子医薬の場合には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような生体不活性剤な合成高分子と共有結合することによって、酵素や抗体の接近を防ぐことも有効である。しかし、遺伝子治療に用いられるプラスミド分子では、その大部分が活性に直接関与しており、さらに高次構造も発現に大きく影響するために、このような保護高分子との直接的な結合は難しい。そこで、ＤＮＡ分子をこれらの酵素分解から守る、より簡便で効果的な方法は、ＤＮＡを小さく折りたたむことである。投与されたときから、標的細胞の核内で翻訳される直前まで、プラスミドの二重鎮をコンパクトに折りたたんで、酵素がアタックできないようにしておくことが、効率よい遺伝子発現のために効果的である。また、サイズの凝縮という点から考慮しても、ＤＮＡはコンパクトに凝縮される必要がある。
そのため、ＰＶＩｍ−ＮＨ２には、アミノエチル基を複数導入することでカチオン化した。生理ｐＨで正電荷を有するアミノエチル基が、ＤＮＡのリン酸基と相互作用することにより、ＤＮＡを静電的にキャリア内に保持し、ＤＮＡ分解酵素からの保持、複合体サイズの凝縮といった効果を発揮することを期待した。
（ｂ）親水主鎖による親水性
ＤＮＡ複合体は、サイズが大きくなることによって、体内動態の変化や細胞内取り込みの低下が問題となる。プラスミドＤＮＡのような高分子を細胞が取り込むメカニズムは、エイドサイトーシスによる輸送が一般的であるが、通常の細胞が行う飲作用(ピノサイトーシス)と呼ばれるエンドサイトーシスで形成されるエンドソームは、直径１５０ｎｍ以下の小さなものである。従って、ＤＮＡ分子がランダムコイル状のままの大きさでは、細胞への効率的な取り込みは望めない。事実、nakedプラスミドＤＮＡ分子の筋肉組織内への直接投与においては、細胞表面のマイナスチャージとの反発も合いまって、細胞に取り込まれるのは１％以下である、と報告されている。また、循環系への投与を考えた場合、最も透過しやすい肝臓の不連続型血管壁であっても、そのｇａｐサイズは３０〜５００ｎｍであり、核酸製剤はこれ以下のサイズでないと、実質細胞へのスムーズな核移行はできない。
従って、ＤＮＡ複合体には水溶液中で、凝集体を形成せずに、小さな粒子サイズを保持する必要がある。
また、キャリアが親水鎖を有することで、血清タンパク質との非特異的相互作用や細網内皮系への捕獲を回避し、血中滞留性を向上させる効果を期待できる。そこで、生理ｐＨでノニオンの水溶性高分子であるポリビニルを選択し、キャリアの水溶性、ＤＮＡ複合体の分散安定性を得ることを期待した。
（ｃ）イミダゾール基によるｐＨ応答的なエンドソーム膜破壊
イミダゾール基はｐＫａが約６であるため、細胞外では多くのイミダゾール基はプロトン化されていないが、エンドソーム内では内部の酸性化に伴いプロトン化される。このため、エンドソーム内でプロトンスポンジ効果を発揮することによるエンドソーム膜破壊が期待できる。また、プロトン化によりイミダゾール基がプラス電荷をもち、複合体外側にカチオン化部位が表出するといった構造変化を起こすことにより、負に帯電したエンドソーム膜との相互作用を増大し、最終的にエンドソーム膜を破壊することが期待される。プロトンスポンジ効果と構造変化による細胞膜破壊活性の相乗効果により、ＰＶＩｍ−ＮＨ２はエンドソームから細胞質への移行を促進すると考えられる。
【００１４】
（ｄ）「部分アルキル化ポリビニルイミダゾール」について
本発明者らの先に開発したポリイミダゾール部分置換体である「ＰＶＩｍ−ＮＨ２」は、核酸キャリアとして核酸複合体を形成し、糖鎖修飾ポリリジンとの三元複合体となって細胞特異的に細胞内に取り込まれ、取り込まれた細胞内ではエンドソーム脱出、核酸分子の解離後、目的核酸分子の発現が効果的に行える優れた核酸キャリアではあるが、三元複合体を形成せずに核酸複合体単独では細胞内に取り込まれる効率がきわめて低かったので、何らかの細胞内への導入手段と組み合わせて用いる必要がある。
本発明者らは、さらに細胞内での優れた特性は失わずに、糖鎖修飾ポリリジンとの三元複合体を形成させなくても、単独で細胞内に取り込まれ、目的核酸分子を効率的に発現させることができるポリイミダゾール置換体が開発できないかとのコンセプトのもとに鋭意研究を続け、イミダゾール基への導入側鎖を種々検討した結果、アミノ基のようなカチオン性を付与する官能基を全く持たない疎水性のシンプルなアルキル基置換体が、そのような優れた特性を有しているという驚くべき結果を得た。
結果から見て、ポリイミダゾールのイミダゾール基の３位のＮにブチル基、オクチル基という炭素数の異なるアルキル基で部分的に置換された部分アルキル置換ポリイミダゾール「ＰＶＩｍ−Ｒ」においては、親水性のイミダゾール基の作用で標的細胞内外での水溶性を保ち、エンドソーム内では充分なプロトンスポンジ効果を有する点では変わりないが、一部分導入されたアルキル基の疎水性がイミダゾール基の親水性とあわさり両親媒性効果を発揮して、細胞膜と絶妙な相互作用を果たしたことで、エンドソーム膜融合が可能となったものと考えられる。また、意外なことに、イミダゾール環にあえてカチオン性官能基を導入しなくてもイミダゾール環の３位のＮが４級化した程度でも充分に生理的ｐＨ条件下では核酸分子との安定な複合体が形成できることを示す結果となった。
当該部分アルキル化ポリイミダゾールは、特にブチル基などのように炭素数が少ない場合には生体毒性も極めて低いため遺伝子治療用の核酸キャリアとしても極めて有用であり、特定の細胞に対してのみ特異的に発現させたい場合は、糖鎖修飾ポリリジンなどとの三元複合体化により、ターゲティングも可能である。
【００１５】
２．本発明における「部分アミノアルキル化ポリビニルイミダゾール」、「部分アルキル化ポリビニルイミダゾール」及びその塩
本発明は、優れたｐＨ応答性核酸キャリアとして開発された、新規な「部分アミノアルキル化ポリビニルイミダゾール」、「部分アルキル化ポリビニルイミダゾール」及びその塩に関するものである。
本発明の「部分アルキル化もしくは部分アミノアルキル化ポリビニルイミダゾール」（以下、前者を単に「アルキル化ポリビニルイミダゾール」、後者を「アミノ化ポリビニルイミダゾール」ともいう。）は具体的には、下記式（１）の化合物であり、核酸キャリアとしてはそのカチオン塩が用いられる。
式（１）
【００１６】
【化１５】
2009007547.tif 000009
ここで、ＡはＨ又はＮＨ２を表す。なお、ＡがＨの場合が「アルキル化ポリイミダゾール」であり、ＡがＮＨ２の場合が「アミノ化ポリイミダゾール」に対応する。ｒはモル分率を表し、０＜ｒ＜１であるが、ｐＨ応答性核酸キャリアとして好ましい範囲は、ｒが０．０１〜０．５であり、アミノ化ポリイミダゾールの場合、より好ましくは０．０２〜０．１である。一方、アルキル化ポリイミダゾールの場合は、導入するアルキル基の炭素数が多い場合（ｍ＝６〜１８）は疎水性が高まるためモル分率は低い方がより好ましくｒ＝０．０２〜０．２５がさらに好ましいが、アルキル基の炭素数が少ない場合（ｍ＝１〜５）は、むしろｒ＝０．１〜０．３がより好ましい。この様なモル分率の範囲であれば、イミダゾール基に基づく細胞内に取り込まれた後のエンドソーム内での細胞外生理ｐＨとの差ｐＨ５〜７でのプロトンスポンジ効果が期待できる。その分子量は、数平均分子量１．０×１０３〜１．０×１０６の範囲であるが、好ましくは、２．０×１０３〜２．０×１０４、より好ましくは８．０×１０３〜１．１×１０４の範囲である。分子量が大きい方が核酸キャリアとしての特性は高まるが、大きすぎると腎排出されにくく生体への蓄積毒性の危険性が高まる。また、ｍは１〜１８の自然数を表し、アミノ化ポリイミダゾールの場合にはｍは１〜５が好ましく、ｍ＝２の「部分アミノエチル化ポリビニルイミダゾール（ＰＶＩｍ−ＮＨ２）」が最も好ましい。アルキル化ポリイミダゾールの場合は、ｍ＝２〜１８が好ましく、ｍ＝２〜１０がより好ましく、ｍ＝３〜８がさらに好ましく、ｍ＝４の部分ブチル化ポリイミダゾールが最も好ましい。
また、本発明はアミノ化ポリビニルイミダゾール又はアルキル化ポリイミダゾールの製造法にも係るものであり、具体的には、式（２）の数平均分子量１．０×１０３〜１．０×１０６、好ましくは２．０×１０３〜２．０×１０４より好ましくは９．０×１０３〜１．１×１０４の範囲のポリビニルイミダゾールを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）等の非プロトン性有機溶媒中で、ハロゲン化アルキルアミン、又はハロゲン化アルキルと共に数時間インキュベートすることで得られる。
ここで、ポリビニルイミダゾールの数平均分子量は、生成物の「部分アミノアルキル化ポリビニルイミダゾール」と同様、数平均分子量１．０×１０３〜１．０×１０６の範囲であるが、好ましくは、２．０×１０３〜２．０×１０４、より好ましくは８．０×１０３〜１．１×１０４の範囲である。対応する繰り返し単位ｎは、約１０〜１．０×１０４であり、好ましくは２０〜２００、より好ましくは９０〜１１０である。
ハロゲン化アルキルアミンとしては、ブロモアルキルアミン、ヨウ素化アルキルアミンが通常用いられる。本実施態様では２−ブロモエチレンアミンを用いた。
ハロゲン化アルキルとしては、ブロモアルキル、ヨウ素化アルキルが通常用いられる。本実施態様では１−ブロモブタン及び１−ブロモオクタンを用いた。
【００１７】
３．新規なｐＨ応答性核酸キャリア
本発明で得られた「部分アミノアルキル化ポリビニルイミダゾール」及び「部分アルキル化ポリビニルイミダゾール」はいずれも核酸と静電的に結合して核酸複合体を形成する。
対象の核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれであってもよく、単離されたものでも合成されたものでも、一部に修飾を受けたものでもよい。長さは、数ヌクレオチド長から100,000ヌクレオチド長まで可能であり、好ましくは10〜10,000ヌクレオチド長、より好ましくは5,000〜7,000ヌクレオチド長である。典型的には、遺伝子治療などに用いる各種治療用遺伝子、または細胞内での薬剤の動向などをモニターするための蛍光タンパク質など標識となるタンパク質をコードするレポーター遺伝子が用いられる。治療用遺伝子としては、各種の酵素、ホルモン、サイトカイン、抗体、リガンド、エピトープをコードするＤＮＡなどが用いられ、レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、またはグリーンフルオレッセンスプロテイン遺伝子が好適に用いられる。これらはＤＮＡ分子にプロモーター等の調節遺伝子をつなげただけでもよいが、発現プラスミド、ウイルスベクターなど通常の発現ベクターに挿入した状態で用いてもよい。
また、ｓｉＲＮＡやマイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムなどのＲＮＡも用いられ、これらＲＮＡ分子はそのまま直接用いてもよく、また細胞内で所望のアンチセンスＲＮＡやｓｉＲＮＡなどを生成できるように構成された発現ベクターで用いることもできる。
核酸複合体の調製は、ｐＨ７.２〜７.４の緩衝液中、室温下で、本発明で得られた「部分アミノアルキル化ポリビニルイミダゾール」又は「部分アルキル化ポリビニルイミダゾール」を核酸と混合するだけでよく、簡単に静電的に結合する。その際のｐＨ調製は、ＰＢＳ（−），ＰＢ又は純粋に緩衝液を加えて行う。緩衝液としては、生理ｐＨ条件のｐＨ７.２〜７.４を保つことができるものであれば何でもよいが、リン酸緩衝液が好ましい。
特に、「部分アルキル化ポリビニルイミダゾール」を用いたｐＨ応答性核酸キャリアは、糖鎖修飾ポリリジンと共に三元複合体を形成させなくても、細胞膜と融合して細胞内に取り込まれて目的核酸分子を効率的に発現させることができる（実施例８−４、図１７）。とりわけ、部分アルキル基の炭素数（ｍ）が少ない場合（例えば、部分ブチル化ポリビニルイミダゾール）は生体毒性も極めて低いため、遺伝子治療用の核酸キャリアとしての有用性が高い。
【００１８】
〔２〕糖鎖修飾ポリリジンについて
１．細胞ターゲティング遺伝子用キャリアとしての糖鎖修飾ポリリジンの設計
次に、細胞ターゲティング用キャリアの検討を行った。細胞ターゲティングを実現するため、細胞の糖鎖認識に着目した。
生体内の各臓器中の細胞表面には、細胞特異的な膜結合型レセプターが存在している場合が多く、それぞれそのレセプターに特異的に認識されるリガンドは、細胞特異的なリガンドとして働く。例えば、肝実質細胞表面に多数存在するアシアロ糖タンパク質レセプターは、ラクトース又はβガラクトース末端糖鎖を有する糖類などにより特異的に認識される。肝臓癌細胞にもアシアロ糖タンパク質レセプターは発現しているので、これらの糖鎖修飾は有効であり、さらに癌細胞に特異的な糖鎖認識の利用も期待できる。また、肝類洞内皮細胞への認識能を有するヒアルロン酸等の糖類は周知の糖鎖リガンドとして、医薬組成物のデリバリー（ＤＤＳ）などで広く用いられている（非特許文献１５）。
本発明の実施の態様では、肝細胞をモデルとし、肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質レセプターを特異的に認識するラクトースを、リガンドとしてポリ−Ｌ−リジン(ＰＬＬ)に修飾した、ラクトース修飾ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ−Ｌａｃ)を、細胞ターゲティング用キャリアとして用いた。ＰＬＬ−Ｌａｃのラクトース修飾率は９５−１００ｍｏｌ％の高い修飾率のものを設計した。これは、リガンド数を増やすことにより細胞認識能を高めること加えて、ラクトースの立体障害によりＤＮＡとの結合力を弱め、エンドソーム内での解離を促進する効果を期待した。
【００１９】
２．糖鎖修飾ポリリジン
本発明の糖鎖修飾ポリリジンは、以下の構造式を有する。
式（４）
【００２０】
【化１６】
2009007547.tif 000010
〔式中、ｐはモル分率を表し、０＜ｐ＜１である。〕
数平均分子量が１．０×１０３〜１．０×１０６であれば適宜用いられるが、好ましくは１．０×１０４〜３．０×１０５であり、より好ましくは１．１×１０５〜１．３×１０５である。対応する繰り返し単位は、約２〜２１００であって、好ましくは２１〜６４０、より好ましくは２３０〜２８０に相当する。
糖鎖の導入率ｐは、モル分率で０＜ｐ＜１で、好ましくは約０．０１〜１.０、より好ましくは０.５〜１.０、最も好ましくは０．９〜１．０である。
導入する糖鎖としては、核酸を輸送しようとするターゲットとなる細胞表面に特異的に存在するレセプターのリガンドとなる糖鎖が選択される。本発明の実施態様では、実質肝細胞に特異的に存在するアシアロ糖蛋白質レセプターの特異的リガンドである糖鎖のうちラクトースをモデルとして検討したが、他の糖鎖、特に糖単位が１〜１０までの、単糖、二糖又はオリゴ糖が好ましい。アシアロ糖蛋白質レセプターの特異的リガンド糖鎖としては、他にβ―ガラクトース末端を有する糖鎖などがあり、同様に好ましい。その他、肝臓癌細胞にもアシアロ糖蛋白質レセプターは発現しており、癌細胞への特異的糖鎖認識の利用も期待できる。また、肝類洞内皮細胞への認識能を有するヒアルロン酸、炎症性内皮細胞上へ誘導されるセレクチンを認識するシアリルルイスｘ等の糖鎖の利用も考えられる。
【００２１】
〔３〕ｐＨ応答性三元複合体（以下、主に「ＰＬＬ−Ｌａｃ/ＰＶＩｍ−ＮＨ２/核酸」について述べるが、「ＰＬＬ−Ｌａｃ/ＰＶＩｍ−Ｒ/核酸」についても同様に適用できる。）
１．ＰＬＬ−Ｌａｃ/ＰＶＩｍ−ＮＨ２/核酸からなるｐＨ応答性三元複合体（以下、単に「三元複合体」ともいう。）を形成させ、その特性を調べることで新規核酸デリバリーシステムと成り得る可能性を検討し、次いで実際に当該三元複合体を用いてin vitroでの実験を行い、細胞ターゲティング能を有する新規ｐＨ応答性核酸デリバリーシステムとしての可能性を示す。
【００２２】
２．ＰＬＬ−Ｌａｃ/ＰＶＩｍ−ＮＨ２/核酸からなる三元複合体の調製
ここで、対象の核酸としては、上記したとおり、ＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、実施態様としては、発現程度を簡単に観察できる化学発光系のレポーター遺伝子であるルシフェラーゼをコードしたプラスミドＤＮＡを用いたので、ＰＬＬ−Ｌａｃ/ＰＶＩｍ−ＮＨ２/ＤＮＡの三元複合体調製について述べる。
ＰＬＬ−Ｌａｃ/ＰＶＩｍ−ＮＨ２/ＤＮＡ三元複合体は、ＰＢＳ (−)、ＰＢ、または純水に、ＰＬＬ−ＬａｃとＰＶＩｍ−ＮＨ２を加え、最後にＤＮＡを加えてピペッティングすることにより、静電的に自己組織化させ形成できる。
このような手法に限らず透析法等が適用できる。
【００２３】
３．核酸キャリアとしてのｐＨ応答性三元複合体
ＰＬＬ−Ｌａｃ/ＰＶＩｍ−ＮＨ２/ＤＮＡ三元複合体がエンドサイトーシス効果を得られるかどうかの粒子サイズの検討、ｐＨ変化に対応して、血清中での安定性と同時にエンドソーム内でのプロトンスポンジ効果が引き起こし、かつｐＨ応答的膜破壊を起こせるか否かの検討、さらに細胞質内の環境で遺伝子を遊離できるか否かの検討を行い、いずれも良好な結果を得た。
さらに、モデル細胞として、培養肝細胞を用いた実験により、肝細胞特異的に遺伝子を細胞内に輸送し、かつ遺伝子を効率的に発現させることができることを確認した。
本発明が対象とする生体内細胞や各種癌細胞は、表面に当該細胞特異的なレセプターを有しており、当該レセプターが特異的な糖鎖リガンドを有する場合が好ましいが、どのような細胞に対しても細胞内に遺伝子導入しようという場合は、普遍的な糖鎖リガンドを選択することで、一般的な細胞への導入が可能となる。例えば、デキストランなどを用いることにより、非特異的なエンドサイトーシスによる取り込みを誘起させることが考えられる。
【００２４】
４．遺伝子治療用医薬組成物
本発明のｐＨ応答性核酸複合体及び同三元複合体を通常の医薬用担体と共に遺伝子治療用医薬組成物として用いることができる。
遺伝子治療用の核酸については、上記〔１〕３．で述べたように、ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれであってもよく、フラグメントであっても適宜発現ベクターに含まれていても良い。
医薬用担体としては、典型的には、本発明の複合体は薬学的に許容される担体又は希釈剤と共に投与目的で製剤化される。薬学的に許容される担体又は希釈剤は、例えば、等張性溶液である。例えば、固形経口形態は、活性化合物と共に、例えば、ラクトース、デキストロース、サッカロース、セルロース、コーンスターチ又はポテトスターチのような希釈剤；シリカタルク、ステアリン酸、セテアリン酸マグネシウム又はカルシウム、及び／又はポリエチレングリコールのような滑剤；例えば、スターチ、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシルメチルセルロース又はポリビニルピロリドンのような結合剤；スターチ、アアルギン酸、アルギン酸塩、又はスターチグリコン酸マトリウムのような崩壊剤；発泡性混合物；色素；甘味料；レシチン、ポリソルベート、ラウリル硫酸塩のような湿潤剤；及び一般的に、製薬において使用される非毒性及び薬学的に非活性な物質を含むことが出来る。また、経口投与用の液体分散物としては、例えばサッカロース、又はサッカロースとグリセリン及び／又はマンニトール／ソルビトールを含むシロップなどを用いることができる。
（遺伝子治療用医薬組成物として、患者に投与する場合の投与量、投与方法）
本発明の医薬組成物の投与方法は特に限定されず、経口投与又は非経口投与のいずれも選択可能であり、薬学的に許容される周知の担体又は希釈剤と共に製剤化される。経口投与の剤形としては、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、カプセル剤、内服液剤等を挙げることができ、非経口投与の剤形としては、例えば、注射剤、点滴剤、点眼剤、軟膏剤、坐剤等を挙げることができる。これらのうち注射剤又は点滴剤が好ましく、投与方法としては、静脈注射、動脈注射、皮下注射、皮内注射などのほか、標的とする細胞や臓器に対しての局所注射を挙げることができる。
本発明の医薬組成物 の投与量及び投与期間などは特に限定されず、有効成分として作用する核酸の種類や三元複合体中の核酸保持量、対象となる臓器の種類や患者の体重、年齢など、種々の条件に応じて適切な投与量及び投与期間を適宜選択可能である。典型的には、本発明の三元複合体で輸送される核酸の量は、具体的な製剤の活性、治療対象者の年齢、体重及び病状、変性の型及び重度、並びに、頻度及び投与経路に応じ、１μｇ〜１ｇ、好ましくは１００μｇ〜１０ｍｇの範囲である。
【００２５】
５．標的細胞の同定・検出・診断用試薬、又はモニター用組成物
同定・検出・診断用、又はモニター用に用いられる核酸としては、上記遺伝子治療用核酸（上記〔１〕３．）と同様の各種ＤＮＡ又はＲＮＡが用いられる。その際に、モニターしようとする目的の核酸に対して直接標識してもよいし、種々のレポーター遺伝子をつなげて、標的細胞内で発現させて発光などを観察してもよい。また、短いフラグメントである核酸プローブ、プライマーなどに標識を付けて用いることもできる。
【００２６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００２７】
（実施例１）アミノ化ポリビニルイミダゾールの合成
１−１．  1−ビニルイミダゾールとＶ−６５の精製
１−ビニルイミダゾールを減圧蒸留で精製した。精製前後で、1−ビニルイミダゾールは黄色液体から白色液体に変化した。精製した１−ビニルイミダゾールは、Ｎ２置換し、遮光４℃の条件下で保存した。
ラジカル重合開始剤であるＶ−６５(２、２'−Azobis(２、４−dimethylvaleronitrile))をエタノールで再結晶し精製した。室温で、Ｖ−６５  ９．３１ｇを１２０ｍＬのエタノールに溶解した。−２０℃でー晩静置し、再結晶した。再結晶化したＶ−６５は吸引ろ過により回収し、冷やしたエタノールで洗浄した。３０℃で３ｈ真空乾燥後、粉末を回収し、遮光４℃条件下で回収した。
１−２．  ＰＶＩｍの合成
ＰＶＩｍは１−ビニルイミダゾールのラジカル重合により得た。Ｖ−６５  １５．８ｍｇをＤＭＦ３００ｕＬに溶解し、１−ビニルイミダゾール３００ｍｇを溶解したＤＭＦ溶液２４００ｕＬへ加えた。４０ｍｉｎ窒素バブリングした後、４５℃に設定したウォーターバスで攪拌せずに２ｈインキュベートした。その後、アセトン８０ｍＬ（４０ｍＬｘ２ｉｎ遠心管）に滴下し、２６００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した。上澄み液を捨て、そこへ新しいアセトン８０ｍＬを加え２６００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離を２回繰り返した後、上澄み液を捨て、３０℃で一晩真空乾燥後、得られた粉末を回収した。
真空乾燥後、白色固体のＰＶＩｍ  ３３．６ｍｇが回収された。収率は１１％であった。
１−３．  ＰＶＩｍ−ＮＨ２の合成
ＰＶＩｍ−ＮＨ２は、ＰＶＩｍのアミノエチル化により得た。ＰＶＩｍ２５ｍｇと２−ブロモエチルアミン３．７５ｇをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１２．５ｍＬに溶解し、４０℃で５ｄａｙｓインキュベートした。インキュベート後、ＭＷＣＯ１０００の透析膜を用い３ｄａｙｓ透析し、凍結乾燥により回収した。
ＤＭＳＯに溶解直後は透明であったが、数時間インキュベートすると、濃黄色液体に変化し、その後見た目の変化はなかった。凍結乾燥後、薄黄色固体のＰＶＩｍ−ＮＨ２が１２ｍｇ得られた。収率は４８％であった。
【００２８】
【化１７】
2009007547.tif 000011
【００２９】
（実施例２）２−３ポリビニルイミダゾール、アミノ化ポリビニルイミダゾールのキャラクタリゼーション
２−１．１Ｈ−ＮＭＲ
＜実験＞
ＰＶＩｍ、ＰＶＩｍ−ＮＨ２はプロトン−核磁気共鳴分光法(Proton−Nuclear Magneti・Resonance、１Ｈ−ＮＭＲ)により同定した。ＰＶＩｍ、ＰＶＩｍ−ＮＨ２ ３ｍｇを７００ｕＬの重水に溶解し測定に用いた。
＜結果および考察＞
結果を図１に示す。１−ビニルイミダゾールで見られた特徴的な共役ピーク（ＰＰＭ５．２−５．３and４．８）が、ＰＶＩｍでは高磁場側ヘシフトした。さらに、ポリマーとなることで、様々な電子状態のイミダゾール基が存在するため、イミダゾール基のピークはブロード化した。ＰＶＩｍ−ＮＨ２のスペクトルは、ＰＶＩｍとピークのシフトは見られなかった。これは、アミノエチル基の修飾率が小さいため、アミノエチル基のメチレンのピークを明確に観測できなかったと考えられる。また、ＰＶＩｍのイミダゾール基のピークは非常にブロードであったため、アミノエチル基導入によるイミダゾールピークのシフトから、アミノエチル基修飾率を見積もることもできなかった。しかし、２−ブロモエチルアミンのピークが観測されなかったことから、ＰＶＩｍ−ＮＨ２の精製は確認された。
【００３０】
２−２．  ＧＦＣ測定
ＰＶＩｍ、ＰＶＩｍ−ＮＨ２の分子量、重合度はゲルろ過クロマトグラフィー(ＧＦＣ、Gel Filtration Chromatography)より算出した。ＧＦＣは、試料の分子サイズに基づく篩い分けを原理とするクロマトグラフィーで、移動相が水溶液なものである。
＜実験＞
０．５ＭＣＨ３ＣＯＯＨ、０．２ＭＮａＮＯ３混合水溶液を調製し、ろ過フィルターに通して、ＧＦＣキャリアとした。ＰＶＩｍまたはＰＶＩｍ−ＮＨ２をキャリアに１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した後、０．２ｕｍ孔のセルロースアセテートに通してろ過し、流量１ｍｌ／ｍｉｎ、１ａｔｍでＧＦＣ測定を行った。数平均分子量・重量平均分子量は、あらかじめ作製しておいたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の検量線に基づき、ＰＥＧ換算で算出した。
＜結果および考察＞
ＧＦＣにより算出した結果、ＰＶＩｍは、数平均分子量７．２×１０３、重量平均分子量２．６×１０４、分子量分布３．６であった。アミノエチル基を導入したＰＶＩｍ−ＮＨ２は、数平均分子量８．１×１０３、重量平均分子量２．５×１０４、分子量分布３．０と算出した。
ＰＶＩｍ−ＮＨ２は、合成高分子であるため生体への蓄積毒性を考慮する必要がある。一般的に、合成高分子の分子量と毒性は比例し、低分子量のものほど毒性は低い。特に、分子量１００００以下のポリビニル主鎖の高分子は、体内において腎排出されやすいことが知られている。従って、合成したＰＶＩｍ−ＮＨ２の分子量は、遺伝子キャリアとして用いるにあたって適切な大きさであるといえる。
【００３１】
２−３．  アミノ基定量
ＰＶＩｍ−ＮＨ２のアミノエチル基導入率は、フルオレサミンによるアミノ基定量法により算出した。フルオレサミンは、その自身は蛍光物質ではないが、ｐＨ７−９の水溶液中で第一級のアミンと特異的に反応し、４７５ｎｍに強い蛍光を発する。この測定法の長所としては、反応速度が速いこと、試料が少量でよいこと、また試料にフルオレサミンを添加するだけでよいので、操作が簡単であることが挙げられる。しかし、濃度が濃い場合、蛍光のクエンチングが起こり、正確な値がでないことがあるため、低濃度での測定に適している。
＜実験＞
４ｍｇ／ｍＬのＰＶＩｍ−ＮＨ２水溶液を調製し、１０ｕＬをｐＨ８の５０ｍＭリン酸緩衝液１４９０ｕＬに加え、サンプル溶液とした。また、３ｍｇのフルオレサミンをＭ−ジオキサン１０ｍＬに溶解し、フルオレサミン溶液とした。サンプル溶液１５００ｕＬとフルオレサミン溶液５００ｕＬを混ぜ、１０ｓｅｃ激しく撹絆した。室温で１０ｍｉｎ静置後、以下の測定条件により蛍光分光光度計で測定した。検量線はグリシン（ＮＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ）を用いて作製し（図２）、アミノエチル基導入率はグリシン換算で算出した。
＜結果および考察＞
ＰＶＩｍ−ＮＨ２を含むサンプル溶液の蛍光強度はおよそ４００であった。検量線を用い逆算し、およそイミダゾール基４０個に対しアミノ基１個の割合であることを算出した。つまり、アミノエチル基の導入率はおよそ２．５ｍｏｌ％と見積もられた。以後の実験でのＰＶＩｍ−ＮＨ２としては、全てこの修飾率のＰＶＩｍ−ＮＨ２を用いた。
【００３２】
２−４．  酸塩基滴定
酸塩基滴定により、ＰＶＩｍ、ＰＶＩｍ−ＮＨ２のｐＨ変化に伴ったプロトン化度を評価した。
＜実験＞
５ｍｇのＰＶＩｍまたはＰＶＩｍ−ＮＨ２を１．５ｍＬの純水に溶解し、１Ｎ  ＮａＯＨを加えｐＨ１０付近まで変化させた。１Ｎ  ＨＣｌを１ｕＬずつ加えていき、ｐＨ変化を計測した。
＜結果および考察＞
結果を図３に示す。ＰＶＩｍ、ＰＶＩｍ−ＮＨ２はｐＨ３−６の広範囲にわたってプロトンを緩衝し、ポリ（Ｌ−ヒスチジン）（ＰＬＨ）のようなシャープな緩衝は見られなかった。しかし、生理ｐＨとエンドソームｐＨの差に相当するｐＨ５−７において、ＰＶＩｍ、ＰＶＩｍ−ＮＨ２はおよそ５０％のイミダゾール基をプロトン化していた。一般的なプロトンスポンジ型高分子であるＰＥＩでは、この範囲でプロトン化するアミンは、およそ１７％といわれていることから、ＰＶＩｍ−ＮＨ２は、エンドソーム内でプロトンスポンジ効果を発揮することが示唆された。
【００３３】
２−５．  水溶液の濁度測定
水溶液の濁度測定により、ＰＶＩｍ、ＰＶＩｍ−ＮＨ２の親水性を評価した。
＜実験＞
５ｍｇのＰＶＩｍまたはＰＶＩｍ−ＮＨ２を１．５ｍＬの純水に溶解し、１Ｎ  ＮａＣｌを加えｐＨ１０付近まで変化させた。１Ｎ  ＨＣｌを少量ずつ加えていき、ｐＨ変化を計測した。同時に５００ｎｍの吸光度を分光光度計により測定した。
＜結果および考察＞
結果を図４に示す。代表的なｐＨ応答性高分子であるＰＬＨでは、中性から塩基性条件下にかけて高い濁度を示したｐＨ６付近でイミダゾール基の脱プロトン化が起こることから、可溶性を失い、凝集体を形成するためである。これは、ペプチド主鎖構造が剛直であり、かつ、分子内・分子間で水素結合を形成しやすいためであると考えている。一方、ＰＶＩｍ、ＰＶＩｍ−ＮＨ２では、生理ｐＨを含む全てのｐＨにおいて低い濃度であり、可溶性が示された。これは、ノニオンの水溶性高分子であるポリビニル主鎖の効果によるものである。従って、ＰＶＩｍ−ＮＨ２は生理ｐＨで可溶性を有し、ＤＮＡ複合体の分散性を高める遺伝子キャリアとして有用であることが示された。
【００３４】
２−６．  ＰＶＩｍ−ＮＨ２の血清中安定性評価
＜実験＞
１ｍｇ／ｍＬＰＶＩｍ−ＮＨ２ＰＢＳ（−）溶液を５００ｍＬとり．  ＦＢＳ  ５００ｕＬと加えた（Ｆｉｎａｌ  ５０％  ＦＢＳ）。０，１，２，３，４，５，１０，１５，２０ｍｉｎ後，７００ｎｍの吸光度を測定した。コントロールＰＥＩを用いた。ＰＶＩｍ−ＮＨ２とＰＥＩ重量濃度を等しくした。
＜結果および考察＞
結果を図５に示す。ＰＥＩでは、ポリマーを血清中に加えた途端に濁度は一気に上昇し、２０ｍｉｎ後まで高い濁度を維持した。これは、ＰＥＩはカチオンリッチなポリマーであるため、血清タンパク質との非特異的な相互作用が過剰に起こったためである。
対して、ＰＶＩｍ−ＮＨ２では濁度の上昇は見られず、高い血清中安定性であった。ＰＶＩｍ−ＮＨ２は、カチオン性基を有するものの、カチオン密度が低く、さらにノニオンの水溶性主鎖がＰＥＧのような水溶性シールドとして働くためと考えられる。さらに、ＤＮＡ複合体を形成する際は、アミノエチル基のカチオン電荷は除去されるため、ＰＶＩｍ−ＮＨ２は、ＤＮＡ複合体の血中滞習性を向上させる遺伝子キャリアとなりうる可能性を示した。
【００３５】
（実施例３）アルキル化ポリビニルイミダゾール（ＰＶＩｍ−Ｒ）の合成
上記実施例１−２．で得られたＰＶＩｍを用い、１−ブロモブタン及び１−ブロモオクタンで部分アルキル化した。ＰＶＩｍ２５ｍｇと１−ブロモブタン５μＬ及び１−ブロモオクタンをそれぞれ２０μＬずつをジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、２４時間４０℃でインキュベートした。インキュベート後、ジエチルエーテルにより再沈を行い、さらに水で透析し、精製を行った。
ＤＭＦに溶解直後は透明であったが、数時間インキュベートすると、いずれも見た目の変化はほとんどなかった。精製後、白色固体のブチル化ポリビニルイミダゾール（ＰＶＩｍ−Ｂｕ）が２ｍｇ（収率は８％）、オクチル化ポリビニルイミダゾール（ＰＶＩｍ−Ｏｃ）が２０ｍｇ（収率は８０％）得られた。
【００３６】
（実施例４）アルキル化ポリビニルイミダゾールのキャラクタリゼーション
４−１．  ＰＶＩｍ−Ｂｕ及びＰＶＩｍ−Ｏｃのアルキル基導入率と分子量
上記実施例２−１．で用いたと同様のプロトン核磁気共鳴分光法を用いてＰＶＩｍ−Ｂｕ、ＰＶＩｍ−Ｏｃそれぞれの導入が確認され、イミダゾール基とアルキル基の積分比から前者の導入率が１８％であり、後者の導入率が２３％であることが確認された。（図６、図７）
上記実施例２−２．で用いたと同様のＧＦＣ測定により、合成されたＰＶＩｍ−Ｂｕの数平均分子量を測定したところ、Ｍｎ＝約８．８×１０３であった。
【００３７】
４−２．  酸塩基滴定
上記実施例２−４．と同様の酸塩基滴定により、ＰＶＩｍ−Ｂｕ及びＰＶＩｍ−ＯｃのｐＨ変化に伴ったプロトン化度を評価した。詳細には、ＰＶＩｍ−Ｂｕ水溶液（５ｍｇ／１．５ｍｌ）及び、ＰＶＩｍ−Ｏｃ水溶液（５ｍｇ／１．５ｍｌ）に１Ｎ  ＨＣｌを加え、ｐＨを４まで降下させた。その後、０．２Ｎ  ＮａＯＨ水溶液を、サンプルを攪拌しながら１μlずつ加え、ｐＨ１０まで上昇させた。
結果を図８に示す。ＰＶＩｍ−Ｂｕ及びＰＶＩｍ−Ｏｃは、エンドソームｐＨに相当するｐＨ６．５付近において、プロトン緩衝能が確認された（図８）。このことから、ＰＶＩｍ−Ｂｕ及びＰＶＩｍ−Ｏｃは、エンドソーム内でプロトンスポンジ効果を発揮することが期待される。
【００３８】
４−３．  水溶液の濁度測定
酸塩基滴定後のＰＶＩｍ−Ｂｕ及びＰＶＩｍ−Ｏｃのサンプルをそのまま用い、上記実施例２−５．と同様に、１Ｎ  ＮａＯＨを加えｐＨ１０付近まで変化させて各ｐＨの５００ｎｍの吸光度を指標とし、水溶液の濁度測定を行った。
結果を図９に示す。ＰＶＩｍ−Ｂｕ及びＰＶＩｍ−Ｏｃでは、イミダゾール基の脱プロトン化にもかかわらず、生理ｐＨを含む全てのｐＨにおいて水可溶性が示された。ＰＶＩｍ−Ｂｕ及びＰＶＩｍ−Ｏｃのいずれも、生理ｐＨで可溶性を有していることから、ＤＮＡ複合体の分散性を高める遺伝子キャリアとして有用であることが示された。
【００３９】
４−４．  ＰＶＩｍ−Ｂｕ及びＰＶＩｍ−Ｏｃの細胞毒性試験
ＰＶＩｍ−Ｂｕ及びＰＶＩｍ−Ｏｃの細胞毒性評価を、ＨｅｐＧ２細胞を用いたアラマーブルー法で行った。（なお、アラマーブルー法についての詳細は、下記実施例１４において述べる。）
＜実験＞
ＨｅｐＧ２細胞を、９６穴プレートに１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、１０％ＦＢＳ含有培地中で２４時間インキュベート後、ＰＶＩｍ−Ｂｕ及びＰＶＩｍ−Ｏｃを０〜４００μｇ／ｍＬ加え、７２時間インキュベートを行った後の細胞生存率を測定した。同時に、ＰＶＩｍ−ＮＨ２及びコントロールとして公知ポリカチオン型キャリアのＰＥＩの細胞生存率を測定した。
＜結果および考察＞
結果を図１０に示す。コントロールとしてのＰＥＩは、５０μｇ／ｍＬ濃度で全滅してしまうのに対して、ＰＶＩｍ−Ｏｃは細胞毒性は認められたものの生存率６０％で、ＰＥＩよりも細胞毒性は低く、ＰＶＩｍ−Ｂｕ及びＰＶＩｍ−ＮＨ２では、ほぼ生存率に変化はなかった。さらに１００μｇ／ｍＬ以上に高濃度にするとＰＶＩｍ−Ｏｃの場合は生存率が急激に低下したが、ＰＶＩｍ−Ｂｕ及びＰＶＩｍ−ＮＨ２では、有意な細胞毒性が認められなかった。特に、ＰＶＩｍ−Ｂｕについては、細胞毒性がない点でもＰＶＩｍ−ＮＨ２と匹敵しており、下記に述べるような優れた核酸分子とのｐＨ応答性二元複合体形成能力と相まって、通常の核酸キャリアとしてはもちろんのこと、遺伝子治療用の優れたツールとしての期待も大きい。
なお、今回実施例で用いたＰＶＩｍ−Ｏｃであっても、従来型ポリカチオン型キャリアよりは細胞毒性が低いため、充分に核酸キャリアとして有用であるが、ＰＶＩｍ−Ｂｕ等と比較した場合には細胞毒性が存在する。これは、ブチル基に比較して、オクチル基の方が疎水性が高いにもかかわらず、ポリビニルイミダゾールへの導入率が２３％と高かったため、部分オクチル化ポリビニルイミダゾール全体の両親媒性が疎水性側に傾いたことが原因であると考えられる。すなわち、細胞毒性を低くする観点からは、アルキル基の炭素数が大きい場合には、導入率を最大でも２０％、好ましくは１５％以下にすることが好ましい。
【００４０】
（実施例５）アミノ化ポリビニルイミダゾールのｐＨ応答的膜破壊
エンドソーム膜モデルとしてヒツジ赤血球を用い、ｐＨに依存したＰＶＩｍ−ＮＨ２の細胞膜破壊活性を評価した。
具体的には、赤血球を加えるリン酸緩衝液を、生理塩濃度に調製することにより、プロトンスポンジ効果によらない、キャリアの構造変化による細胞膜破壊を評価した。
＜実験＞
エッペンドルフチューブにｐＨ７．４、６．０または５．０の等張リン酸緩衝液（１３０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭ（ＰＯ４）３−を１４０ｕＬ入れ、１０ｍｇ／ｍＬのＰＶＩｍ−ＮＨ２水溶液を１０ｕＬ加えた。室温でヒツジ血液２０ｕＬを加えた後、３７℃で９０ｍｉｎインキュベートした。インキュベート後、１３０００ｒｐｍ、４℃、１ｍｉｎの条件で遠心分離した。上澄み液１００ｕＬを純水１００ｕＬで希釈し、分光光度計により、ヘモグロビンの流出量に依存する５７７ｎｍの吸光度を測定した。ネガティブコントロールとして、キャリアなし（等張リン酸緩衝液１５０ｕＬ＋ヒツジ血液２０ｕＬ、ポジティブコントロールとして純水（純水１５０ｕＬ＋ヒツジ血液２０ｕＬ）を用いた。
＜結果および考察＞
結果を図１１に示す。ＰＶＩｍ−ＮＨ２は、生理ｐＨ７．４と比較して、エンドソーム内に相当するｐＨ６または５で有意にヘモグロビンを流出した。これは、エンドソームｐＨでＰＶＩｍ−ＮＨ２のイミダゾール基がプロトン化することにより表出し、負に帯電した赤血球膜との相互作用を増強したためである。これらの結果より、ＰＶＩｍ−ＮＨ２は、エンドソーム内において、細胞膜破壊活性を増強し、エンドソームから細胞質への移行を促進することが示唆された。
【００４１】
（実施例６）アミノ化ポリビニルイミダゾール/ＤＮＡ複合体の調製
６−１．  アガロースゲル電気泳動 
ＰＶＩｍ−ＮＨ２のＤＮＡ複合体形成をアガロースゲル電気泳動により確認した。アガロースゲル電気泳動は、ＤＮＡ複合体形成の一般的な評価法である。ＤＮＡはリン酸基による負電荷を持っているため、泳動槽に電気を流すとゲル内を通り正電荷の方向へ泳動する。しかし、ポリイオンコンプレックスを形成し電荷が打ち消された状態になると、ＤＮＡはその場で停滞(リターデーション)するため、泳動後のＤＮＡの位置を確認することによりＤＮＡ複合体の形成が確認できる。通常は、ＤＮＡを可視化するためエチジウムブロマイドが使用される。
＜実験＞
調製したｐＨ７．４または６．０の５０ｍＭリン酸緩衝液をエッペンドルフチューブに入れ、ＤＮＡ溶液６ｕｇ、ＰＶＩｍ−ＮＨ２水溶液を加えピペッティングし、３０ｍｉｎ室温静置した。ＤＮＡ溶液はあらかじめＰＢＳで溶解したものを用いた。ＰＶＩｍ−ＮＨ２は、ＤＮＡのリン酸基に対して、イミダゾール基が０、５、１０、２０、３０、４０倍になるように加えて、複合体溶液は全量１００ｕＬになるように調製した。静置後、チューブ内をピペッティングしてブロモフェノルブルーをｌ０ｕＬ加え、再度ピペッティングしサンプルとした。１％アガロースゲル（溶媒ｐＨ７．４or６．０  ５０ｍＭ  ＰＢ）１０ｍＬを加熱溶解させ、エチジウムブロマイド１ｕＬを加え、均一にゲル型に流し込み、１５分室温静置し凝固させた。サンプルはゲルに挿入する前に再度ピペッティングして、１０ｕＬずつ挿入した。ゲルをｐＨ７．４または６．０の５０ｍＭリン酸緩衝液中で、５０Ｖ、１５ｍｉｎの条件下で電気泳動した後、ゲルをＵＶ照射し、核酸バンドの蛍光発光を評価した。
＜結果および考察＞
結果を図１２に示す。生理ｐＨ７．４において、アミノエチル化していないＰＶＩｍを加えたとき、ＤＮＡ由来の蛍光は正極方向への泳動が観測された。対して、ＰＶＩｍ−ＮＨ２を加えると、ＤＮＡのリターデーションが確認された。これは、ＤＮＡとのポリイオンコンプレックスの形成を示しており、導入したアミノエチル基によるＤＮＡ複合体形成能が示された。また、ＰＶＩｍ−ＮＨ２、イミダゾール／リン酸基＝４０においても、完全にＤＮＡを複合化しておらず、freeなＤＮＡが観測された。このことから、ＰＶＩｍ−ＮＨ２はＤＮＡを保持するが、その相互作用は弱いものであることが示唆された。
ｐＨ６においては、ＰＶＩｍ、ＰＶＩｍ−ＮＨ２共に２０倍イミダゾール以上で、ＤＮＡの蛍光は消光した。これは、ＤＮＡが過度に凝縮され、エチジウムブロマイドがインターカレーションされなかったためである。すなわち、ｐＨ＝６においては、ＰＶＩｍ、ＰＶＩｍ−ＮＨ２は、イミダゾール基がプロトン化し、ＤＮＡとの相互作用に関与するため、カチオンリッチな状態となり、ＤＮＡを強くコンパクションすることが示された。これにより、ＰＶＩｍ−ＮＨ２はｐＨ応答的にＤＮＡを複合化することが示された。
【００４２】
６−２．  粒子サイズ・ゼータ電位測定
ＰＶＩｍ−ＮＨ２/ＤＮＡ複合体の粒子サイズは動的光散法により測定した。動的光散乱法とは、粒子のブラウン運動によって生じる散乱光の揺らぎから粒径を求める方法であり、サブミクロン以下の粒子測定にすぐれている。溶液中の微粒子は、並進・回転などのブラウン運動により、その位置・方位・形態を時々刻々変えている。これらの粒子にレーザー光を照射し、出てくる散乱光を検出すると、その粒子のブラウン運動に依存した散乱光の揺らぎが観測される。通常、粒子サイズの小ささに依存してブラウン運動は激しくなるため、散乱光の時間的な揺らぎを観測することで、粒子のブラウン運動の速度(拡散係数)が得られ、分子の大きさを知ることができる。
ＰＶＩｍ−ＮＨ２/ＤＮＡ複合体のゼータ電位は、電気泳動光散乱測定法により算出した。帯電したコロイド粒子が分散している系に、外部から電場をかけると、粒子は電極に向かって泳動する。その速度は粒子の荷電に比例するため、その粒子の泳勤速度を測定することによりゼータ電位が求められる。電気泳動光散乱測定法は、「光や音波が動いている物体に当たり反射したり散乱すると、光や音波の周波数が物体の速度に比例して変化する」という“ドップラー効果”を利用して粒子の泳動速度を求めている。電気泳動している粒子にレーザー光を照射すると粒子からの散乱光は、ドップラー効果により周波数がシフトする。シフト量は粒子の泳動速度に比例することから、このシフト量を測定することにより粒子の泳動速度を求めることができる。
＜実験＞
ＰＢＳ（−）、または６．０、５．０の等張リン酸緩衝液（１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、  １０ｍＭ（ＰＯ４）３−）中でＰＶＩｍ−ＮＨ２／ＤＮＡ複合体を形成させサンプルとした。サンプル溶液はＦｉｎａｌ  ＤＮＡ濃度５ｕｇ／ｍＬ、全量４ｍＬとし、＋／−＝４の複合化比となるようにＰＶＩｍ−ＮＨ２を加えた。粒子サイズ・ゼータ電位測定は、大塚電子（株）に依頼した。
＜結果および考察＞
ＰＶＩｍ−ＮＨ２／ＤＮＡ複合体の粒子サイズとゼータ電位を表１に示す。生理ｐＨにおいて、ＰＶＩｍ−ＮＨ２／ＤＮＡの粒径は６００ｎｍ以上の大きなものであった。これは、ＰＶＩｍ−ＮＨ２は電荷密度が小さく、またノニオンの水溶性主鎖を有するためＤＮＡのコンパクションが十分ではないためであると考えられる。ノニオンの水溶性主鎖は、ＤＮＡ複合体形成のドライビングフォースである静電的相互作用には関与しないため、複合体の親水性を保ち、膨潤した状態の複合体(uncompacted complex)を形成するとみられる。また、生理ｐＨで、ＰＶＩｍ−ＮＨ２のゼータ電位は負電荷であったことから、パッシブターゲティングの有効性を示したものの、アクティブターゲティングを可能とするターゲティングリガンド部位を導入する必要が示唆された。複合化電荷比と形成されたコンプレックスのゼータ電位が異なるのは、ＰＶＩｍ−ＮＨ２は可溶性で、水溶液中で安定であり、かつ、カチオン電荷密度が小さいため、ＤＮＡと会合体を形成しにくいためと考えられる。しかし、これについては明らかでなく、ＰＶＩｍ−ＮＨ２のカチオン基導入率も含め、再度検討する必要があるかもしれない。
ｐＨ６．０、５．０では、複合体サイズは３００ｎｍ付近となった。これは、イミダゾール基がプロトン化し、ＤＮＡ複合体形成に関与するカチオン基が増加したため、ＤＮＡを強くコンパクションしたと考えられる。また、ｐＨの低下に伴って、複合体のゼータ電位は正になり、エンドソーム内ｐＨでは、細胞膜との相互作用を増大させることが示された。
【００４３】
【表１】
2009007547.tif 000012
【００４４】
（実施例７）アミノ化ポリビニルイミダゾール/ＤＮＡ複合体の遺伝子導入評価
＜実験＞
・細胞培養
１０％ウシ胎仔血清(Fetal Bovine Serum、 ＦＢＳ)、１％抗生物質(ストレプトマイシン、アンホリテシンＢ含有)を含むＤＭＥＭ培地にて、ヒト肝癌由来細胞ＨｅｐＧ２を継代、培養した（培養条件：３７℃・ＣＯ２濃度５％）。
・細胞播種
コンフルエントのＨｅｐＧ２をトリプシン処理し、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。９６穴プレートに細胞懸濁液を１００ｕＬ／ｗｅｌｌ（１０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）播種し、２４ｈ培養した。
・コンプレックス調製
滅菌チュープ内で複合体を形成させ３０ｍｉｎ室温静置した。プラスミドＤＮＡ(ｐＤＮＡ)は蛍ルシフェラーゼをコードしたｐＧＬ３(Promega)をＴＥ液１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  １ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解したものを用いた。複合体はｐＧＬ３濃度が２００ｎｇ／１５ｕＬとなるようにした。キャリア、溶媒はAcrodisc Syringe Filter でろ過滅菌したものを用いた。
・トランスフェクション
９６穴プレートに培養したＨｅｐＧ２に、調整したコンプレックス溶液を１５ｕＬ／ｗｅｉｌ（ｐＤＮＡ；２００ｎｇ／ｗｅｌｌ）加え、２４ｈインキュベートした。９６穴プレートの培地を除去し、新たなＤＭＥＭ培地（ＦＢＳ１０％、抗生物質１％含有）を加え、さらに７２ｈインキュベートした。培地を除去し、ＰＢＳ（−）で３度洗浄した。Cell Culture Lysis Reagentを４０ｕＬ／ｗｅｌｌ加え、室温で２０ｍｉｎ静置し細胞を溶解させた。
高血清存在下、無血清条件下での実験は、コンプレックス溶液を加える前に、それぞれ高濃度ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地、無血清ＤＭＥＭ培地に交換した。２４ｈインキュベート後、通常の培養ＤＭＥＭ培地ＦＢＳ１０％、抗生物質１％）に交換した。
・ルシフェリン発光測定
Lusiferase Assay System (Promega)を用いた。 Luciferase Assay Substrate とLuc if erase Assay Bufferを混合しWorking Reagentとした。エッペンドルフチューブにWorking Reagent １００ｕＬと、細胞溶解液４０ｕＬを入れ、ピペッティングし、ルミノメーターを用い、ルシフェリンの発光強度を測定した。
・タンパク定量
エッペンドルフチューブに入れた純水４６０ｕＬに、細胞溶解液４０ｕＬを加え全量５００ｕＬとした。Micro BCAProtein Assay Reagent Kit (PIERCE)より調製したＢＣＡ溶液５００ｕＬをエッペンドフルチューブに加えピペッティングした。６０ｍｉｎのウォーターバスで６０ｍｉｎインキュベートした。室温で６０ｍｉｎ放冷し、５６２ｎｎｎの吸光度を測定した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）換算で作製した検量線により、総タンパク濃度を算出した。
＜結果および考察＞
遺伝子導入実験の結果を図１３に示す。ＰＶＩｍ−ＮＨ２/ＤＮＡ複合体の遺伝子発現活性は、naked ＤＮＡ と同程度であり、ポジティブコントロールのＰＥＩに対して有意に低かった。この原因として細胞内取り込みが挙げられる。ＰＶＩｍ−ＮＨ２/ＤＮＡ複合体は、ゼータ電位測定により、負電荷表面を有していることが明らかになった。細胞膜表面も同様に負に帯電しているため、静電的な反発により、細胞膜に接着することが困難であったと考えられる。また、複合体は運よく細胞膜に接着したとしても、粒子サイズが６００ｎｍ以上であるため、細胞内に効率的に取り込まれにくいと思われる。この問題点を克服するため、（１）レセプターを介した細胞への効果的な取り込みを促進するため、複合体にリガンド部位を設ける。（２）ＤＮＡをさらにコンパクトに凝縮し、サイズを縮小する。ことが求められる。そのため、本研究では、新規三元複合体を設計した。リガンドを持つターゲティング用キャリアを加えることにより、標的細胞内への集積を促進し、さらに２種のキャリアによりＤＮＡをコンパクションすることにより、ＤＮＡ複合体サイズをナノスケールで制御することを目指した。
【００４５】
（実施例８）アルキル化ポリビニルイミダゾール/核酸分子複合体の遺伝子導入評価
８−１．  ブチル化ポリビニルイミダゾール（ＰＶＩｍ−Ｂｕ）とＤＮＡとの複合体形成能評価
＜実験＞
上記実施例６と同様に、１μｇのＤＮＡのリン酸基１ｍｏｌに対し、ＰＶＩｍ−Ｂｕをイミダゾール基０，２．５，５，１０，３０，６０ｍｏｌの割合（＋／−＝０，０．５，１，２，６，１２）でｐＨ７．４及びｐＨ６のリン酸緩衝液（Ｐ．Ｂ）中で混合し、３０分静置した後、１５分間５０Ｖエチジウムブロマイド含有アガロースゲル電気泳動を行った。
＜結果および考察＞
結果を図１４に示す。ＰＶＩｍ−Ｂｕは生理ｐＨ７．４でそのカチオンとＤＮＡのアニオンの電荷比が１以上ではフリーなＤＮＡが認められず、ＤＮＡと複合体を形成したことを示している。一方、ｐＨ６．０においては、第２番目のレーンにおいてもフリーなＤＮＡは全く認められなかった。すなわち、ＰＶＩｍ−Ｂｕのエンドソーム内でのｐＨ条件において、ＰＶＩｍ−Ｂｕのイミダゾール基のプロトン化が適切に行われることが示され、ＰＶＩｍ−ＢｕとＤＮＡ複合体がｐＨ応答性であることが示された。
【００４６】
８−２．  ＰＶＩｍ−Ｂｕ／ＤＮＡ複合体の安定性評価
＜実験＞
電荷比＝１：１２のＰＶＩｍ−Ｂｕ／ＤＮＡ二元複合体（ＤＮＡ＝７００ｎｇ）をｐＨ７．４Ｐ．Ｂ中で形成した。硫酸基濃度１０，５０，１００，２００ｍＭのデキストラン硫酸 (ＤＳ)水溶液を調製し、それぞれサンプルに加えた（Ｆｉｎａｌ  １，５，１０，２０ｍＭ硫酸基)。１０分インキュベート後、１５分間５０Ｖエチジウムブロマイド含有アガロースゲル電気泳動を行った。
＜結果および考察＞
結果を図１５に示す。ＰＶＩｍ−ＢｕとＤＮＡとの複合体は、高濃度(５ｍＭ)のデキストラン硫酸存在下においても、フリーなＤＮＡが認められなかったのに対して、ＰＶＩｍ−ＮＨ２とＤＮＡとの複合体ではフリーなＤＮＡが認められた。すなわち、ＰＶＩｍ−ＢｕはＰＶＩｍ−ＮＨ２よりもＤＮＡを安定に保持することが示された。
【００４７】
８−３．  ＰＶＩｍ−Ｂｕ／ＤＮＡ複合体の赤血球溶血活性評価
＜実験＞
ｐＨ７．４，ｐＨ６．０の等張リン酸緩衝液（１０ｍＭ  Ｐ．Ｂ，１３０ｍＭ  ＮａＣｌ）に、電荷比＝１：１２ＰＶＩｍ−Ｂｕ／ＤＮＡの二元複合体（ＰＶＩｍ−Ｂｕ＝６０μｇ）を全量が１５０μＬになるように加え、さらにエンドソームモデルとしてヒツジ赤血球を２０μＬ加えた。３７℃で１２０分インキュベート後、遠心分離により赤血球を取り除き、上澄み液に放出されたヘモグロビン量を５７７ｎｍ吸光度測定により評価した。
＜結果および考察＞
結果を図１６に示す。ＰＶＩｍ−ＢｕとＤＮＡとの複合体は、エンドソーム内ｐＨにおいて、有意な赤血球溶血活性を示した。このことは、エンドソームからの複合体の脱出が期待できることを示すものである。
【００４８】
８−４．  ＰＶＩｍ−Ｂｕ／ＤＮＡ複合体による遺伝子発現能の評価
＜実験＞
ＨｅｐＧ細胞を９６−穴プレートに１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、１０％ＦＢＳ含有培地中で２４時間インキュベート後、ＰＶＩｍ−Ｂｕ／ＤＮＡ二元複合体、ＰＶＩｍ−ＮＨ２／ＤＮＡ二元複合体、及びＰＥＩ／ＤＮＡ二元複合体をそれぞれ加えた。ＤＮＡとしては、上記実施例７と同様に、蛍ルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＧＬ３(Promega)をＴＥ液１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  １ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解したものを用いた。複合体はｐＧＬ３濃度が２００ｎｇ／１５ｕＬとなるようにした。ｐＧＬ３を用い、７２時間後の遺伝子発現をルシフェラーゼ活性により評価した。
＜結果および考察＞
結果を図１７に示す。ＨｅｐＧ細胞への遺伝子導入実験結果によれば、ＰＶＩｍ−Ｂｕ／ＤＮＡ複合体においては、ＰＶＩｍ−ＮＨ２／ＤＮＡ複合体に比べて、きわめて高い遺伝子発現を示した。得られた発現活性は、公知の核酸キャリアであるのＰＥＩ／ＤＮＡ複合体と比較しても有意に高いものであった。
【００４９】
（実施例９）ラクトース修飾ポリリジンの合成
ＰＬＬ−Ｌａｃは還元アミノ化法により合成した。０．１  Ｍ  Ｎａ２Ｂ４Ｏ７と０．１  ＭＨ３ＢＯ３を調製し、ｐＨ８．５になるように混合し、０．１  Ｍ sodium borate buffeK（Ｂ．Ｂ）を調製した。ＰＬＬ・ＨＢｒ  ５０ｍｇ（ＮＨ２  ０．２ｍｍｏｌ）を５．０ｍＬ  Ｂ.Ｂに、lactose・Ｈ２Ｏ ２８８ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）を２．５ｍＬ  Ｂ．Ｂに、それぞれ溶解した。２溶液を混合し、３７℃で７２ｈインキュベートした（フルオレサミン用サンプルとしてインキュベート前に１．３ｕＬ取り冷蔵庫にて保存した）。インキュベート後、ＮａＢＨ３ＣＮ  １８９ｍｇを２．５ｍＬ  Ｂ．Ｂに溶解し、反応溶液に加え、さらに３７℃で７２ｈインキュベートした（フルオレサミン用サンプルとしてインキュベート後に２．６ｕＬ取り冷蔵庫にて保存した）。ＭＷＣＯ＝１０００の透析膜で透析し、凍結乾燥により回収した。
３１．２ｍｇの弱黄色固体を得た。収率はおよそ２８．９％であった（ラクトース修飾率１００％として算出）。
【００５０】
（実施例１０）ラクトース修飾ポリリジンのキャラクタリゼーション
１０−１．  １Ｈ−ＮＭＲ
＜実験＞
１Ｈ−ＮＭＲにより、ＰＬＬ-Ｌａｃの同定と、ラクトース修飾率を見積もった。ＰＬＬ−Ｌａｃ ３ｍｇを７００ｕＬの重水に溶解し測定に用いた。
＜結果および考察＞
結果を図１８に示す。ＰＬＬ−Ｌａｃでは、ＰＬＬ由来のプロトンピークが確認でき、さらに３−４．５ｐｐｍ付近にラクトースに帰属するピークが見られたことから、ＰＬＬ−Ｌａｃの合成に成功したといえる。積分比から求められるラクトース修飾率は、およそ９０％であり、目的とした高いラクトース修飾率のＰＬＬ−Ｌａｃが合成されたといえる。ラクトース修飾率は、フルオレサミン法によるアミノ基定量でさらに詳細に検討した（７−３．参照）。
【００５１】
１０−２．  ＧＦＣ測定
＜実験＞
０．５Ｍ  ＣＨ３ＣＯＯＨ、０．２ＭＮａＮＯ３混合水溶液を調製し、ろ過フィルターに通して、ＧＦＣキャリアとした。
ＰＬＬ−Ｌａｃをキャリアに１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した後、０．２ｕｍ孔のセルロースアセテートに通してろ過し、流量１ｍｌ／ｍｉｎでＧＦＣ測定を行った。数平均分子量・重量平均分子量は、あらかじめ作製しておいたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の検量線に基づき、ＰＥＧ換算で算出した。
＜結果および考察＞
ＧＦＣにより算出した結果、ＰＬＬ−Ｌａｃは、数平均分子量３．０×１０４、重量平均分子量８．１×１０４と算出した。分子量分布はおよそ２．７であった。
【００５２】
１０−３．  アミノ基定量
＜実験＞
バイアル瓶にそれぞれ反応前サンプル１．３ｕＬ、反応後サンプル２．６ｕＬ取り、ｐＨ８の５０ｍＭリン酸緩衝液１．５ｍＬに加え、サンプル溶液とした。また、３ｍｇのフルオレサミンを１，４−ジオキサン１０ｍＬに溶解し、フルオレサミン溶液とした。サンプル溶液とフルオレサミン溶液５００ｕＬを混ぜ、１０ｓｅｃ激しく撹件した。室温で１０ｍｉｎ静置後、蛍光分光光度計で測定した。
条件を、以下に示す。
[測定条件]
EXλ:390nm
Emλ:475nm
Cycle Number and Time : 3,0min05sec
Response :１sec
PMT Gain:medium                                           
Ex SBW : 10nm
Em SBW : 10nm
＜結果および考察＞
結果を表２に示す。フルオレサミン法から算出されたＰＬＬ−Ｌａｃのラクトース修飾率はおよそ９９％であった。１Ｈ−ＮＭＲの結果と一致し、目的とした修飾率の高いＰＬＬ−Ｌａｃの合成に成功したといえる。
【００５３】
【表２】
2009007547.tif 000013
【００５４】
（実施例１１）ラクトース修飾ポリリジン/アミノ化ポリビニルイミダゾール/ＤＮＡ三元複合体の調製
ＰＬＬ−Ｌａｃ/ＰＶＩｍ−ＮＨ２/ＤＮＡ三元複合体は、ＰＢＳ(−)、ＰＢ、または純水に、ＰＬＬ−ＬａｃとＰＶＩｍ−ＮＨ２を加え、最後にＤＮＡを加えてピペッティングすることにより、静電的に自己組織化させ形成した。
ＰＬＬ−Ｌａｃ/ＰＶＩｍ−ＮＨ２/ＤＮＡ三元複合体の形成は、ＦＩＴＣ蛍光ラベル化ＰＬＬ−Ｌａｃ(ＰＬＬ−Ｌａｃ−ＦＩＴＣ)を用いたアガロースゲル電気泳動により評価した。ＤＮＡの複合化を確認するため、エチジウムブロマイド含有アガロースゲルでの電気泳動を行った。さらに、ＰＬＬ−Ｌａｃの複合化を確認するため、ＰＬＬ−Ｌａｃ−ＦＩＴＣを用い、エチジウムブロマイドを含まないアガロースゲルで電気泳動を行った。ＰＶＩｍ−ＮＨ２の複合化は、ｐＨを変化させたときのＤＮＡの複合化挙動の変化より評価した。
＜実験＞
[ＰＬＬおよびＰＬＬ−ＬａｃへのＦＩＴＣラベル]
ＰＬＬおよびＰＬＬ−Ｌａｃ１０ｍｇを１ｍＬ  １０ｍＭ  Ｋ２ＣＯ３に溶解した。Fluorescein isothiocyanate isomer I、Minimum ９０％（ＦＩＴＣ）  １ｍｇを０．１ｍＬ  １０ｍＭ  Ｋ２ＣＯ３に溶解し、ＰＬＬおよびＰＬＬ−Ｌａｃ溶液に加えた。室温で２ｈインキュベート後、ＭＷＣＯ＝１０００の透析膜で４８ｈ透析し、凍結乾燥により回収した。
[アガロースゲル電気泳動]
ｐＨ７．４または６．０の５０ｍＭリン酸緩衝液をエッペンドルフチューブに入れ、ＰＬＬ−Ｌａｃ（or  ＰＬＬ−Ｌａｃ−ＦＩＴＣ）水溶液、ＰＶＩｍ−ＨＮ２水溶液、ＤＮＡ溶液６ｕｇを順に加えピペッティングし、３０ｍｉｎ室温静置した。ＤＮＡ溶液はあらかじめＰＢＳで溶解したものを用いた。ＰＬＬ−Ｌａｃ（or  ＰＬＬ−Ｌａｃ−ＦＩＴＣ）は、ＤＮＡのリン酸基に対して電荷比で１；１になるように加えた。ＰＶＩｍ−ＨＮ２は、ＤＮＡのリン酸基に対して電荷比が０、１、２、４、８倍になるように加えた。複合体溶液は全量１００ｕＬになるように調製した。
静置後、チューブ内をピペッティングしてブロモフェノルブルーを１０ｕＬ加え、再度ピペッティングしサンプルとした。１％アガロースゲル（溶媒ｐＨ７．４or６．０  ５０ｍＭ  ＰＢ）１０ｍＬを加熱溶解させ、エチジウムブロマイドｌｕＬを加え（ＰＬＬ−Ｌａｃ−ＦＩＴＣを用いた際は加えない）、均一にゲル型に流し込み、１５分室温静置し凝固させた。サンプルはゲルに挿入する前に再度ピペッティングして、１０ｕＬずつ挿入した。ゲルをｐＨ７．４または６．０の５０ｍＭリン酸緩衝液中で、５０Ｖ、１５ｍｉｎの条件下で電気泳動した後、ゲルをＵＶ照射し、核酸バンドの蛍光発光（エチジウムブロマイド含有アガロース）と、ＰＬＬ−Ｌａｃ−ＦＩＴＣ（エチジウムブロマイド非含有アガロース）を評価した。
さらにコントロール実験として、ＰＬＬ−Ｌａｃ−ＦＩＴＣに変えて、ＦＩＴＣラペル化ＰＬＬ（ＰＬＬ−ＦＩＴＣ）を用い、同様の実験を行った。ラクトース修飾していないＰＬＬを用いることで、ラクトース修飾が複合体形成に及ぼす効果を評価した。
＜結果および考察＞
電気泳動後のＤＮＡの蛍光写真を図１９（Ａ）に示す。ｐＨ７．４において、ＤＮＡのみでは正極方向に泳動が見られたのに対し、ＰＬＬ−Ｌａｃ、ＰＶＩｍ−ＮＨ２を加えたlane2−6ではＤＮＡはリターデーションしていた。これにより、キャリアによるＤＮＡの複合化が示された。さらにｐＨ６においては、複合化比の大きいサンプルでは、ＤＮＡは強くコンパクションされ、蛍光は消光した(lane4'−6')。これは、ｐＨ応答的なＤＮＡの複合化を表しており、ｐＨ応答性高分子であるＰＶＩｍ−ＮＨ２の複合化が確認された。
さらに、電気泳動後のＰＬＬ−Ｌａｃ−ＦＩＴＣの蛍光を図１９（Ｂ）に示す。ＤＮＡのみ(lane7,7’)では蛍光は観測されなかった。ｐＨ７．４において、複合体中のＰＬＬ−Ｌａｃ−ＦＩＴＣは、注入部位にリターデーションしていた。これにより、ＰＬＬ−Ｌａｃ−ＦＩＴＣの複合化が確認された。これらの結果より、３成分全ての複合化が確認され、ＰＬＬ−Ｌａｃ/ＰＶＩｍ−ＮＨ２/ＤＮＡ三元複合体の形成が認められた。
ここで、興味深いことに、複合化比の大きい複合体では、ｐＨ６において、ＰＬＬ−Ｌａｃ−ＦＩＴＣは負極方向へ泳動していた(lane10'−12')。これは、ＰＬＬ−Ｌａｃ−ＦＩＴＣ複合化しておらず、フリーな状態であることを示している。すなわち、三元複合体は、ｐＨ６において、複合体からＰＬＬ−Ｌａｃ−ＦＩＴＣを解離することが示された。これは、酸性化に伴ってＰＶＩｍ−ＮＨ２のイミダゾール基がプロトン化することにより、ＤＮＡのリン酸基の電荷を奪い、ＤＮＡとの総合力が小さいＰＬＬ−Ｌａｃ−ＦＩＴＣが複合体から解離されたと考えられる（図２０）。
以上より、ＰＬＬ−Ｌａｃ/ＰＶＩｍ−ＮＨ２/ＤＮＡ三元複合体は、エンドソーム内で不要になったターゲティングリガンドであるＰＬＬ−Ｌａｃを解離し、ＰＶＩｍ−ＮＨ２/ＤＮＡ二元複合体となることが示唆された。これにより、エンドソーム内でターゲティングリガンドを解離する新しい遺伝子キャリアの設計論を示した。
さらに、ＰＬＬ−ＦＩＴＣを用いたコントロール実験の結果を図２１に示す。ｐＨ６において、ＰＬＬ−ＦＩＴＣは、ＰＬＬ−Ｌａｃ−ＦＩＴＣと同様に、複合体から解離する傾向が見られた。このことから、ラクトース修飾に関わらず、キャリアからのリガンド解離が起こりえることが示された。しかし、ＰＬＬ−Ｌａｃ−ＦＩＴＣと比較すると、ＰＬＬ−ＦＩＴＣの解離率は小さいと見られ（定量はしておらず、定性的に判断した。）、ラクトース修飾がキャリアの解離を促進する傾向も見られた。これらの結果から、本研究では、解離を促すためラクトース修飾率９５−１００％のＰＬＬ−Ｌａｃを用いたが、ＰＬＬ−Ｌａｃはラクトース修飾率に関わらず、エンドソーム内において複合体から解離することが示唆された。ＰＬＬ−Ｌａｃにおけるラクトース修飾率を変化させることで、最適なラクトース修飾率に適宜設定することで、さらなる機能向上が得られる。
【００５５】
（実施例１２）ラクトース修飾ポリリジン/アミノ化ポリビニルイミダゾール/ＤＮＡ三元複合体のキャラクタリゼーション
１２−１．  三元複合体の粒子サイズ・ゼータ電位測定
＜実験＞
複合体の粒子サイズは動的光散乱法により測定した。また、ゼータ電位は、電気泳動光散乱測定法により算出した。三元複合体は、動的光散乱測定により評価した。ｐＨ７．４、６．０または５．０の等張リン酸緩衝液（１３０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  （ＰＯ４）３−）中でＰＬＬ−Ｌａｃ／ＰＶＩｍ−ＮＨ２／ＤＮＡ三元複合体を形成させ、サンプルとした。複合体の複合化比は、ＰＬＬ−Ｌａｃ／ＰＶＩｍ−ＮＨ２／ＤＮＡ＝１／４／１  (at charge ratio)とした。サンプル溶液はＤＮＡ濃度５ｕｇ／ｍＬ、全量４ｍＬとし、粒子サイズ、ゼータ電位の測定は、大塚電子（株）に依頼した。
＜結果および考察＞
結果を表３に示す。三元複合体は、ｐＨ７．４で、３００−４００ｎｍのサイズで単分散していた。一般的に５００ｎｍ以上の粒子は、細網内皮系にトラップされやすいことが知られている。また、一般的な細胞の飲作用により発生するエンドサイトーシスは４００ｎｍ以下であるとされる。このことから、三元複合体は、細網内皮系によるトラップの回避と、効果的に細胞内取り込みされやすいことが示唆された。ＰＶＩｍ−ＮＨ２／ＤＮＡ二元複合体は、ＤＮＡコンパクションが弱く、６００ｎｍ以上の複合体を形成していたことから、ＰＬＬ−Ｌａｃを加え三元複合化することにより、複合体サイズを減少することに成功した。
【００５６】
【表３】
2009007547.tif 000014
また、ｐＨ７．４において三元複合体は電位的に中性であった。このことから、負電荷を有する血清タンパク質との非特異的な相互作用と、非特異的な細胞取り込みを抑制することが示唆された。粒子サイズと合わせて考察すると、三元複合体は血中滞留性が高いと期待することができる。
さらに、ｐＨをエンドソーム内ｐＨに低下させると、複合体はややサイズダウンした。これは、ＰＶＩｍ−ＮＨ２がプロトン化することによりＤＮＡのコンパクションが強まったためと考えられる。さらに、ｐＨ６−５では、複合体は強く正に帯電したことから、負に帯電したエンドソーム膜との相互作用により膜破壊を促すことがゼータ電位測定からも示された。
【００５７】
１２−２．  三元複合体の酸塩基滴定
＜実験＞
３０．６ｕｇのＰＬＬ−Ｌａｃと２０７ｕｇのＰＶＩｍ−ＮＨ２を純水に溶解し、そこへ９０ｕｇのＤＮＡ  ＰＢＳ（−）溶液を加え、ピペッティングすることにより、ＰＬＬ−Ｌａｃ／ＰＶＩｍ−ＮＨ２／ＤＮＡ三元複合体(１／４／１ at charge ratio)を形成させた。溶液は全量１．５ｍＬとなるように調製した。複合体溶液に、１Ｎ  ＮａＣｌを加えｐＨ１０付近まで変化させた。１Ｎ  ＨＣｌを少量ずつ加えていき、ｐＨ変化を計測した。同時に５００ｎｍの吸光度を分光光度計により測定した。
＜結果および考察＞
結果を図２２に示す。三元複合体は、ＰＶＩｍ−ＮＨ２単独での滴定曲線と同様の傾向を示した。このことより、三元複合化によるＰＶＩｍ−ＮＨ２のｐＨ応答的物性の変化は見られず、三元複合体はエンドソーム内でプロトンスポンジ効果を引き起こすことが示唆された。
【００５８】
１２−３．  三元複合体の濁度測定
＜実験＞
３０．６ｕｇのＰＬＬ−Ｌａｃと２０７ｕｇのＰＶＩｍ−ＮＨ２を純水に溶解し、そこへ９０ｕｇのＤＮＡ  ＰＢＳ（−）溶液を加え、ピペッティングすることにより、ＰＬＬ−Ｌａｃ／ＰＶＩｍ−ＮＨ２／ＤＮＡ三元複合体（１／４／１ at charge ratio)を形成させた。溶液は全量１．５ｍＬとなるように調製した。複合体溶液に、1Ｎ ＮａＣｌを加えｐＨ１０付近まで変化させた。１Ｎ  ＨＣｌを少量ずつ加えていき、ｐＨ変化を計測した。同時に５００ｎｍの吸光度を分光光度計により測定した。
＜結果および考察＞
結果を図２３に示す。ＰＶＩｍ−ＮＨ２では、全てのｐＨで濁度はなかった。しかし、三元複合体では、生理ｐＨ付近でわずかに濁度が上昇する傾向を示した。この結果は、上記１２−１．に記した、表３の実験結果と一致している。三元複合体は生理ｐＨでは、やや会合度の大きい複合体となっており、ｐＨ５よりもｌ００ｎｍ程度大きな複合体を形成しているため、濁度が上昇したと思われる。原因は明らかではないが、生理ｐＨで、三元複合体は電位的に中性であるため、やや凝集体を形成しやすいのではないかと考えている。従って、複合化比を変化させることよって、深度上昇が起こらない複合体を形成できると思われる。
なお、本実験では濁度を観測しやすくするため、高濃度条件下で複合体を形成させており、細胞実験に用いた濃度の複合体溶液では、深度の上昇はおこらないことを確認している。
【００５９】
１２−４．  三元複合体の血清中安定性評価
＜実験＞
ＰＢＳ（−）にＰＬＬ−Ｌａｃ３０．６ｕｇ．  ＰＶＩｍ−ＮＨ２  ２０７ｕｇ．ＤＮＡ  ９０ｕｇ  を順に加え，ピペッティングしＰＬＬ−Ｌａｃ／ＰＶＩｍ−ＮＨ２／ＤＮＡ三元複合体（１／４／１ at charge ratio）を形成させた。三元複合体のＰＢＳ（−）溶液は全量が５００ｕＬになるようにした。複合体溶液にＦＢＳ  ５００ｕＬと加えた（Ｆｉｎａｌ  ５０％ＦＢＳ）。０，１，２，３，４，５，１０，１５，２０ｍｉｎ後ｓ ７００ｎｍの吸光度を測定した。コントロールとしてＰＥＩ／ＤＮＡ複合体（Ｎ／Ｐ＝１５，＋／−＝５）を用いた。
＜結果および考察＞
結果を図２４に示す。ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体では、血清中に加えた途端に濁度は一気に上昇し、２０ｍｉｎ後まで高い濁度を維持した。これは、カチオンリッチな複合体が形成されているため、血清タンパク質との非特異的な相互作用が過剰に起こったためである。
対して、三元複合体では血清を加えた後、濁度はやや上昇したが、ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体と比較すると、濁度は低く、２０ｍｉｎ後まで一定の濁度を維持し、血清中安定性が示された。やや濁度の上昇が見られたのは、ゼータ電位測定より、わずかだがカチオンのゼータ電位であったことと、フリーなポリマーを除去していないためであると考えられる。これは、複合化比の再検討と、カラムなどにより複合化していないフリーなポリマーを除去することにより改善することが可能である。
【００６０】
１２−５．  三元複合体のｐＨ応答的膜破活性
＜実験＞
エッペンドルフチューブにｐＨ７．４、６．０または５．０の等張リン酸緩衝液（１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ（ＰＯ４）３−を入れ、ＰＬＬ−Ｌａｃ水溶液１０．２ｕｇ、ＰＶＩｍ−ＮＨ２水溶液１７３ｕｇ、ＤＮＡ  ＰＢＳ（−）溶液７．５ｕｇを順に、全量が１５０ｕＬになるように加え（ＰＬＬ−Ｌａｃ／ＰＶＩｍ−ＮＨ２／ＤＮＡ＝１／４／ｌ at charge ratio）、ピペッティングした。室温でヒツジ血液２０ｕＬを加えた後、３７℃で９０ｍｉｎインキュベートした。インキュベート後、１３０００ｒｐｍ、４℃、１ｍｉｎの条件で遠心分離した。上澄み液１００ｕＬを純水９００ｕＬで希釈し、分光光度計により、ヘモグロビンの流出量に依存する５７７ｎｍの吸光度を測定した。ネガティブコントロールとして、バッファーのみ（等張リン酸緩衝液１５０ｕＬ＋ヒツジ血液２０ｕＬ）、ポジティブコントロールとして純水（純水１５０ｕＬ−ｔ−ヒツジ血液２０ｕＬ）を用いた。
＜結果および考察＞
結果を図２５に示す。三元複合体は、ＰＶＩｍ−ＮＨ２単独（実施例５参照）と同様に、生理ｐＨ７．４と比較して、エンドソーム内に相当するｐＨ６または５で有意にヘモグロビンを流出した。これらの結果より、ＰＶＩｍ−ＮＨ２は、複合体形成後でも、ｐＨ応答的な謨破壊活性を有することが示された。従って、三元複合体は、ＰＶＩｍ−ＮＨ２の膜破壊活性により、エンドソームからの脱出することが示唆された。
【００６１】
（実施例１３）細胞質でのキャリアからの遺伝子遊離評価
（実施例１１）において、ＰＬＬ−Ｌａｃ／ＰＶＩｍ−ＮＨ２／ＤＮＡ三元複合体は、エンドソーム内の酸性化に伴って、ターゲティングリガンドポリカチオンであるＰＬＬ−Ｌａｃを解離し、ＰＶＩｍ−ＮＨ２／ＤＮＡ二元複合体となり、細胞質へ移行しうることが示唆された。
ここでは、細胞質内のポリアニオンモデルとして、デキストラン硫酸を用い、ＰＶＩｍ−ＮＨ２／ＤＮＡ二元複合体、ＰＬＬ−Ｌａｃ／ＰＶＩｍ−ＮＨ２／ＤＮＡ三元複合体の安定性を評価した。安定な三元複合体が、細胞質内で二元複合体となることで、ポリアニオン置換によるキャリアからのＤＮＡ遊離を促す効果を期待した。
＜実験＞
ｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸緩衝液をエッペンドルフチューブに入れ、ＰＬＬ−Ｌａｃ水溶液、ＰＶＩｍ−ＮＨ２水溶液を加えた。最後にＤＮＡ（ＰＢＳ溶液）を６ｕｇ加え、ピペッティングし、３０ｍｉｎ室温静置した。サンプルは全量が１００ｕＬになるように調製した。ＰＬＬ−Ｌａｃ／ＰＶＩｍ−ＮＨ２／ＤＮＡ＝ｌ／４／ｌ（電荷比）で調製した。同様にＰＶＩｍ−ＮＨ２／ＤＮＡ二元複合体を４／１電荷比となるように調整した。
硫酸基濃度１０、２０、３０、４０ｍＭのデキストラン硫酸水溶液を調製し、それぞれ別のサンプルに１１ｕＬずつ加えた。（Ｆｉｎａｌ  １、２、３、４ｍＭ硫酸基。）
１０ｍｉｎ室温で静置後、チューブ内をピペッティングしてブロモフェノルブルーをｌ０ｕＬ加え、再度ピペッティングしサンプルとした。１％アガロースゲル（溶媒ｐＨ７．４  ５０ｍＭ  ＰＢ）１０ｍＬを加熱溶解させ、エチジウムブロマイドｌｕＬを加え、均一にゲル型に流し込み、１５分室温静置し凝固させた。サンプルはゲルに挿入する前に再度ピペッティングして、１０ｕＬずつ挿入した。ゲルをｐＨ７．４  ５０ｍＭ  リン酸緩衝液中で、５０Ｖ、１５ｍｉｎの条件下で電気泳動した後、ゲルをＵＶ照射し、核酸バンドの蛍光発光を評価した。
＜結果および考察＞
結果を、図２６に示す。ＤＮＡのみで電気泳動をかけると、ＤＮＡは正極方向へ泳動した(land1,1')。ＤＮＡにキャリアを加えると、二元複合体、三元複合体共にＤＮＡは複合化されリターデーションされた(lane2,2')。ここへ、デキストラン硫酸を加えると、ＰＶＩｍ−ＮＨ２/ＤＮＡ二元複合体では、デキストラン硫酸の硫酸基濃度に依存してＤＮＡはリターデーションされなくなり、正極方向へ泳動した(lane3'−6')。これは、キャリアからＤＮＡが遊離され、フリーな状態となっていることを示しており、ＰＶＩｍ−ＮＨ２/ＤＮＡ二元複合体は、デキストラン硫酸存在下で不安定であり、ＤＮＡはキャリアから遊離されることが示された。
これに対し、三元複合体では、デキストラン硫酸存在下においてもＤＮＡはリターデーションした(lane3'−6')。４ｍＭ硫酸基のデキストラン硫酸存在下で、わずかに泳動したＤＮＡが見られた(lane6')が、大部分のＤＮＡは注入部位にリターデーションしていた。このことから、三元複合体はＤＮＡを複合体内に安定に保持し、ポリアニオン存在下でもＤＮＡを遊難しないことが示された。以上の結果より、ＰＬＬ−Ｌａｃ／ＰＶＩｍ−ＮＨ２／ＤＮＡ三元複合体は、細胞外では遺伝子を安定に保持し、エンドソーム内においてＰＬＬ−Ｌａｃを解離して、不安定なＰＶＩｍ−ＮＨ２／ＤＮＡ二元複合体と構造変化することで、細胞質でのＤＮＡ遊離を促進する遺伝子デリバリーシステムに成りうることが示された。
【００６２】
（実施例１４）ラクトース修飾ポリリジン、アミノ化ポリビニルイミダゾールの細胞毒性
ＰＬＬ−ＬａｃとＰＶＩｍ−ＮＨ２の細胞毒性は、アラマーブルー法を用いて行った。アラマーブルーは、ヒトおよび動物細胞、バクテリア、菌類等の増殖を定量的に測定するために開発された色素で、アラマーブルー法は、アラマーブルーが生細胞により還元させ、極大吸収波長が変化する性質を利用し、細胞生存率を見積もる手法である。しかし、そのメカニズムの詳細は明らかにされていない部分が多く、細胞内のミトコンドリアの呼吸代謝系の還元酵素デヒドロゲナーゼによって還元されるのではないかと考えられている。６００ｎｍ付近に極大吸収波長を持つ酸化型（レザズリン）から５７０ｎｍ付近に極大吸収波長を有する還元型（レゾルフリン）に変換される試薬で、その吸光度の変化量から細胞生存率を算出することが可能である。小スケールでも実験可能であり、また、還元型精製物が水溶性であるといったメリットがある。しかし、アラマーブルーが還元されるまでに必要な時間が細胞によって異なるといったデメリットもある。
【００６３】
【化１８】
2009007547.tif 000015
＜実験＞
・細胞培養
１０％ウシ胎仔血清(Fetal Bovine Serum、 ＦＢＳ)、１％抗生物質(ストレプトマイシン、アンホリテシンＢ含有)を含むＤＭＥＭ培地にて、ヒト肝癌由来細胞ＨｅｐＧ２を継代、培養した（培養条件：３７℃・ＣＯ２濃度５％）。
・細胞播種
コンフルエントのＨｅｐＧ２をトリプシン処理し、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。９６穴プレートに細胞懸濁液を１００ｕＬ／ｗｅｌｌ（１０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）播種し、２４ｈ培養した。
・細胞毒性評価
９６穴プレートに培養したＨｅｐＧ２に，各キャリア水溶液（ＰＬＬ−Ｌａｃ、ＰＶＩｍ−ＮＨ２、ＰＥＩ、リポフェクチン）を、それぞれ１，５，１０，２０，４０ｕｇ／ｗｅｌｌ（Ｆｉｎａｌキャリア濃度，１０，５０，１００，２００，４００ｕｇ／ｍＬ）加え、２４ｈインキュベートした。
２４ｈ後、アラマーブルーをｌ０ｕｇ／ｗｅｌｌ加え、３７℃・ＣＯ２濃度５％条件下で４ｈインキュベートした。インキュベーターからプレートを取り出し、マイクロプレートリーダーにより、吸光度（酸化型：５９５ｎｍ、還元型：５７０ｎｍ）を測定し、細胞生存率を見積もった。
＜結果および考察＞
結果を図２７に示す。コントロールとして用いたカチオン性リポソームのリポフェクチンは、キャリア１０ｕｇ／ｍＬ存在下から細胞生存率は５０％程度まで低下し、１００ｕｇ／ｍＬでは８％、２００ｕｇ／ｍＬでは０％に低下した。カチオン性リポソームは、遺伝子発現効率は高いものの、負に帯電した細胞膜と謨融合し、高い毒性を示すことが問題となっている。本実験からも同様にリポソームの高い毒性が示された。
ポリカチオン型キャリアのコントロールであるＰＥＩでは、リポソームよりは低毒性であったものの、キャリア１００ｕｇ／ｍＬ存在下から細胞生存率は８０％に低下し、２００ｕｇ／ｍＬでは８％、４００ｕｇ／ｍＬでは０％となった。ＰＥＩは、カチオン性密度が高いポリカチオンであるため、細胞膜に損傷を与えやすいとされる。
２つのコントロールに対して、ＰＬＬ−Ｌａｃ、ＰＶＩｍ−ＮＨ２は、４００ｕｇ／ｍＬの高濃度条件下においても細胞生存率は低下しなかった。このことから、本研究で用いたＰＬＬ−Ｌａｃ、ＰＶＩｍ−ＮＨ２は、低毒性の遺伝子キャリアとして期待される。
また、上述のように、核酸分子との二元複合体の状態で高い遺伝子発現効率を達成できたＰＶＩｍ−Ｂｕの場合もＰＶＩｍ−ＮＨ２と同様に細胞毒性が無視できる程度に低く、低毒性の遺伝子キャリアとして期待される。
【００６４】
（実施例１５）ラクトース修飾ポリリジン/アミノ化ポリビニルイミダゾール/ＤＮＡ三元複合体の遺伝子導入活性
＜実験＞
上記（実施例７）に記した通りに実験を行った。ただし、コンプレックス調製は以下のように行った。
・コンプレックス調製
滅菌チューブ内にＰＢＳ（−）を加え、ＰＬＬ−Ｌａｃ水溶液、ＰＶＩｍ−ＮＨ２水溶液、プラスミドＤＮＡ溶液（蛍ルシフェラーゼをコードしたｐＧＬ３(Promega)をＴＥ液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解したもの）を順に、に加え、ピペッティングしＰＬＬ−Ｌａｃ／ＰＶＩｍ−ＮＨ２／ＤＮＡ三元複合体を形成した。複合体はｐＧＬ３濃度が２００ｎｇ／１５ｕＬとなるようにした。キャリア、溶媒はAcrodisc Syringe Filterでろ過滅菌したものを用いた。
コントロールとしてＰＥＩ／ｐＤＮＡ複合体Ｎ／Ｐ＝１５、＋／−≒５）を用いた。
＜結果および考察＞
ＰＬＬ−Ｌａｃ／ＰＶＩｍ−ＮＨ２／ＤＮＡ三元複合体の遺伝子発現を図２８に示す。
最初に、三元複合体の三元複合体の複合化電荷比を変化させ、最も高い発現を示す複合化比を検討した（図２８（Ａ）（Ｂ））。まず、ＰＶＩｍ−ＮＨ２の複合化比を検討した。  図２８（Ａ）より、三元複合体は、ＤＮＡのリン酸基に対して、電荷比で、ＰＶＩｍ−ＮＨ２を４−８の間で複合化したときに最も高い発現を示した。
そこで、ＰＶＩｍ−ＮＨ２の複合化電荷比を４−８に固定して、ＰＬＬ−Ｌａｃの複合化比を１−８に変化し、遺伝子発現活性を比較した。図２８（Ｂ）より、三元複合体へのＰＬＬ−Ｌａｃ複合化比は１のとき、最も高い発現を示し、複合化電荷比を大きくすると半減が低下する傾向が見られた。通常、複合体のカチオン電荷比が大きいほど、負に帯電した細胞膜と相互作用しやすいため、遺伝子発現も大きくなりやすい。三元複合体では、その傾向は見られず、三元複合体は電荷比で、ＰＬＬ−Ｌａｃ：  ＰＶＩｍ−ＮＨ２：ＤＮＡ＝１：４：１とき、最も高い遺伝子発現を示した。この結果を基に、以降の実験はこの電荷比の複合体を用いた。
三元複合体（ＰＬＬ−Ｌａｃ：ＰＶＩｍ−ＮＨ２：ＤＮＡ＝１：４：１）の遺伝子発現活性を図２８（Ｃ）に示す。三元複合体は、それぞれのキャリアとＤＮＡの二元複合体に対して、有意に高い発現を示し、ポジティブコントロールのＰＥＩと同程度の遺伝子発現を示した。このことから、三元複合体は２種のキャリアの相乗効果により、それぞれのキャリアを単独で用いるよりも、高い遺伝子発現を示すことが明らかとなった。
【００６５】
（実施例１６）ラクトース修飾ポリリジン／アミノ化ポリイミダゾール／ＤＮＡ三元複合体の細胞ターゲティング能の検討  （レセプター阻害実験）
三元複合体のレセプター介在型エンドサイトーシスを評価するため、アシアロ糖タンパク質レセプターの阻害剤としてラクトースを倍地中に存在させ、遺伝子導入実験を行った。阻害剤添加系では、阻害剤がレセプターを占有してしまうため、三元複合体中のＰＬＬ−Ｌａｃとレセプター間の相互作用が減少すると考えられる。コントロールとして、アシアロ糖タンパク質レセプターを認識しない糖鎖であるマルトースを用いた。
＜実験＞
上記（実施例７）に記した通りに実験を行った。ただし、以下の操作を加えた。
・コンプレックス調製
滅菌チューブ内にＰＢＳ（−）を加え、ＰＬＬ−Ｌａｃ水溶液、ＰＶＩｍ−ＮＨ２水溶液、プラスミドＤＮＡ溶液（蛍ルシフェラーゼをコードしたｐＧＬ３(Promega)をＴＥ液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  １ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解したもの）を順に、に加え（ＰＬＬ−Ｌａｃ／ＰＶＩｍ−ＮＨ２／ＤＮＡ＝１／４／１ at charge ratio)、ピペッティングしＰＬＬ−Ｌａｃ/ＰＶＩｍ−ＮＨ２/ＤＮＡ三元複合体を形成した。複合体はｐＧＬ３濃度が２００ｎｇ／１５ｕＬとなるようにした。キャリア、溶媒はAcrodisc Syringe Filter でろ過滅菌したものを用いた。
・阻害剤添加
ラクトース４４ｍＭ  ＰＢＳ溶液、マルトース４４ｍＭ  ＰＢＳ溶液を調製し、Acrodisc Syringe Filterでろ過滅菌した。９６穴に播種した細胞に、ラクトース・マルトース溶液をｌ０ｕＬ／ｗｅｌｌ（Ｆｉｎａｌ  ４ｍＭ／ｗｅｌｌ）加え、ｌ０ｍｉｎ静置後に、複合体溶液を加えた。
＜結果および考察＞
結果を図２９に示す。三元複合体の遺伝子発現は、ラクトース、マルトース存在下で、ほとんど変化しなかった。この原因として、ＰＬＬ−Ｌａｃ／ＰＶＩｍ−ＮＨ２／ＤＮＡ三元複合体中のＰＬＬ−Ｌａｃは多数のラクトースを有する高分子のため、レセプターとマルテバレントに認識し合い、低分子のラクトースよりもレセプターとの親和性が強かったため、ラクトースによるレセプター阻害が起こりにくかったと考えられる。また、本実験では、細胞内への複合体取り込み期間として、３７℃で２４ｈインキュベートしたが、３７℃では活発なエンドサイトーシスが起こっており、またインキュベート時間が長いため、レセプターの阻害が起きにくかったと思われる。
【００６６】
（実施例１７）細胞種における遺伝子発現の比較
三元複合体のレセプター介在型エンドサイトーシスによる細胞ターゲティング能を評価するため、異なる三種の細胞における遺伝子発現活性を評価した。細胞種は、アシアロ糖タンパク質レセプターを有するＨｅｐＧ２と、アシアロ糖タンパク質レセプターを持たない、ラット皮膚由来細胞(ＦＲ)、マウス頭蓋冠由来骨芽細胞様細胞（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１)を用いた。
＜実験＞
・細胞培養
ＨｅｐＧ２、ＦＲ、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１は、１０％ウシ胎仔血清（Fetal Bovine Serum、ＦＢＳ）、１％抗生物質（ストレプトマイシン、アンホリテシンＢ含有）を含むＤＭＥＭ培地にて、継代、培養した（培養条件：３７℃・ＣＯ２濃度５％）。
・コンプレックス調製は５−４−１項に記した通り行った。コントロールのＰＶＩｍ−ＮＨ２/ＤＮＡ、ＰＬＬ−Ｌａｃ/ＤＮＡ、ＰＥＩ/ＤＮＡ各複合体は、カチオンが５倍過剰の電荷比で複合化した。
・遺伝子導入実験は、上記（実施例７）に記した通り行った。
＜結果および考察＞
結果を図３０に示す。アシアロ糖タンパク質レセプターを有するＨｅｐＧ２において、三元複合体は、２種のキャリアの相乗効果により、それぞれのキャリアとＤＮＡの二元複合体に対して、有意に高い発現を示した。三元複合体とＰＥＩ/ＤＮＡ複合体の遺伝子発現は同程度であった。
さらに、アシアロ糖タンパク質レセプターを持たないＦＲ細胞、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞における結果と比較すると、ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体では三種全ての細胞で高い発現を示したのに対し、三元複合体はアシアロ糖タンパク質レセプターを有するＨｅｐＧ２でのみ高い発現を示した。これらの結果から、三元複合体のＰＬＬ−Ｌａｃによる細胞ターゲティング能が示された。
【００６７】
（実施例１８）ラクトース修飾ポリリジン／アミノ化ポリビニルイミダゾール／ＤＮＡ三元複合体のｐＨ応答的エンドソームリリースの検討
さらに、三元複合体のｐＨ応答的なエンドソーム脱出を明らかにするため、エンドソーム内の酸性化阻害剤であるクロロキンを用い細胞実験を行った。
＜実験＞
上記（実施例７）に記した通りに実験を行った。ただし、以下の操作を加えた。
・クロロキン添加
クロロキン１ｍＭ  ＰＢＳ溶液を調製し、Acrodisc Syringe Filter でろ過滅菌した。９６穴に播種した細胞にクロロキン溶液を１０ｕＬ／ｗｅｌｌ  （Ｆｉｎａｌ  １００ｕＭ／ｗｅｌｌ）加え、１０ｍｉｎ静置後に、複合体溶液を加えた。コントロールとして、ｐＨ応答性を持たない遺伝子キャリアであるＰＬＬを用いた。
＜結果および考察＞
結果を図３１に示す。コントロールとして用いたプロトン緩衝能を持たないＰＬＬでは、クロロキン存在下で発現はおよそ１７倍上昇した。これは、エンドソーム内の酸性化が阻害され、分解酵素の働きが低下したことに加え、クロロキンには、細胞膜やエンドソーム膜の透過性を向上させる作用があるためであると考えられる。
一対、三元複合体では、クロロキンの存在下で発現はおよそ１／１７に低下した。これは、エンドソーム内における、ＰＶＩｍ−ＮＨ２のプロトン化が抑制されたためであると考えられる。すなわち、三元複合体はＰＶＩｍ−ＮＨ２のｐＨ応答性によりエンドソームから脱出していることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明の核酸キャリアを用いることで、副作用の少ない効率的な、肝臓治療薬、抗癌剤などの遺伝子治療用の医薬組成物が提供でき、また、肝臓など各種臓器、癌細胞などをリアルタイムでモニターできる診断にも役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１は、ＰＶＩｍ−ＮＨ２の合成を示す１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図である。  ：（Ａ）１−ビニルイミダゾール、（Ｂ）ポリ（１−ビニルイミダゾール）、（Ｃ）アミノエチル化ポリ（１−ビニルイミダゾール）
【図２】図２は、フルオレサミン法によるアミノ基定量の検量線である。
【図３】図３は、ＰＶＩｍ−ＮＨ２のプロトン緩衝効果を示すための酸塩基滴定である。  ：（●）ポリヒスチジン、（■）ポリ（１−ビニルイミダゾール）、（▲）アミノエチル化ポリ（１−ビニルイミダゾール）
【図４】図４は、ＰＶＩｍ−ＮＨ２の親水性度を示すための水溶液の濁度測定図である。  ：（●）ポリヒスチジン、（■）ポリ（１−ビニルイミダゾール）、（▲）アミノエチル化ポリ（１−ビニルイミダゾール）
【図５】図５は、ＰＶＩｍ−ＮＨ２の血清安定性を示すものである。  ：（●）アミノエチル化ポリ（１−ビニルイミダゾール）、（◇）ポリエチレンイミン
【図６】図６は、ＰＶＩｍ−Ｂｕの合成を示す１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図である。
【図７】図７は、ＰＶＩｍ−Ｏｃの合成を示す１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図である。
【図８】図８は、ＰＶＩｍ−Ｂｕ及びＰＶＩｍ−Ｏｃのプロトン緩衝効果を示すための酸塩基滴定である。  ：（○）ＰＶＩｍ−Ｂｕ、（■）ＰＶＩｍ−Ｏｃ
【図９】図９は、ＰＶＩｍ−Ｂｕ及びＰＶＩｍ−Ｏｃの親水性度を示すための水溶液の濁度測定図である。  ：（○）ＰＶＩｍ−Ｂｕ、（■）ＰＶＩｍ−Ｏｃ
【図１０】図１０は、ＰＶＩｍ−Ｂｕ、ＰＶＩｍ−Ｏｃ及びＰＶＩｍ−ＮＨ２の細胞毒性評価である。  ：（▲）ＰＶＩｍ−Ｂｕ、（●）ＰＶＩｍ−Ｏｃ、（■）ＰＶＩｍ−ＮＨ２、（◆）ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）
【図１１】図１１は、ＰＶＩｍ−ＮＨ２の赤血球溶血活性におけるｐＨ依存性（Ｐ＜０．００２）を示すものである。
【図１２】図１２は、ＰＶＩｍ−ＮＨ２のアガロースゲル電気泳動によるＤＮＡ複合体形成能を示すものである。  ：（左）ポリ（１−ビニルイミダゾール）、（右）アミノエチル化ポリ（１−ビニルイミダゾール）
【図１３】（Ａ）は、ＰＶＩｍ−ＮＨ２／ＤＮＡの二元複合体の遺伝子発現活性を示すものであり、（Ｂ）は、さらに複合体電荷比変化及び血清添加の効果を示すものである。
【図１４】図１４は、ＰＶＩｍ−ＢｕとＤＮＡとの複合体形成能を示すものである。
【図１５】図１５は、ＰＶＩｍ−Ｂｕ／ＤＮＡ複合体の安定性評価を示すものである。：ＤＳはデキストラン硫酸
【図１６】図１６は、ＰＶＩｍ−Ｂｕ／ＤＮＡ複合体の赤血球溶血活性評価を示すものである。
【図１７】図１７は、ＰＶＩｍ−Ｂｕ／ＤＮＡ複合体の遺伝子導入活性評価を示すものである。
【図１８】図１８は、ラクトース修飾ポリ−Ｌ−リジンの合成を示す１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。  ：（Ａ）ポリ−Ｌ−リジン、（Ｂ）ラクトース、（Ｃ）ラクトース修飾ポリ−Ｌ−リジン
【図１９】図１９は、アガロースゲル電気泳動によるＤＮＡ三元複合体形成能を示すものである。  ：（Ａ）アミノエチル化ポリ（１−ビニルイミダゾール）とラクトース修飾ポリ−Ｌ−リジンとの混合系（エチジウムブロマイド含有）、（Ｂ）アミノエチル化ポリ（１−ビニルイミダゾール）とＦＩＴＣラベル化ラクトース修飾ポリ−Ｌ−リジンとの混合系（エチジウムブロマイド非含有）
【図２０】図２０は、ＤＮＡ三元複合体からのｐＨ応答的糖鎖リガンド解離の概念図である。
【図２１】図２１は、ＤＮＡ三元複合体及びＰＶＩｍ−ＮＨ２のエンドソーム内での解離を示す酸塩基滴定である。  ：（●）三元複合体、（▲）アミノエチル化ポリ（１−ビニルイミダゾール）
【図２２】図２２は、三元複合体のプロトン緩衝効果を示すための酸塩基滴定である。  ：(●)三元複合体、（▲）アミノエチル化ポリ（１−ビニルイミダゾール）
【図２３】図２３は、三元複合体の親水性度を示すための水溶液の濁度測定である。  ：(●)三元複合体、（▲）アミノエチル化ポリ（１−ビニルイミダゾール）
【図２４】図２４は、三元複合体の血清安定性を示す図である。  ：（●）三元複合体、（◆）コントロールとしてのポリエチレンイミン／ＤＮＡ二元複合体
【図２５】図２５は、三元複合体の赤血球溶血活性におけるｐＨ依存性（Ｐ＜０．０１）を示す。
【図２６】図２６は、二元及び三元複合体のＤＮＡ保持安定性を示す。
【図２７】図２７は、二元及び三元複合体を、アラマーブルーアッセイを用い、細胞毒性を評価した図である。
【図２８】図２８は、二元及び三元複合体の遺伝子発現効率を示す。
【図２９】図２９は、三元複合体の糖鎖競争阻害による細胞認識阻害実験を示す。
【図３０】図３０は、各種細胞に対する三元複合体の細胞特異的なトランスフェクション活性（Ｐ＜０．０１）を示す。
【図３１】図３１は、クロロキン存在下における三元複合体のトランスフェクション活性を示す。
【図１】
2009007547.tif 000023
【図２】
2009007547.tif 000024
【図３】
2009007547.tif 000025
【図４】
2009007547.tif 000026
【図５】
2009007547.tif 000027
【図６】
2009007547.tif 000028
【図７】
2009007547.tif 000029
【図８】
2009007547.tif 000030
【図９】
2009007547.tif 000031
【図１０】
2009007547.tif 000032
【図１１】
2009007547.tif 000033
【図１２】
2009007547.tif 000034
【図１３】
2009007547.tif 000035
【図１４】
2009007547.tif 000036
【図１５】
2009007547.tif 000037
【図１６】
2009007547.tif 000038
【図１７】
2009007547.tif 000039
【図１８】
2009007547.tif 000040
【図１９】
2009007547.tif 000041
【図２０】
2009007547.tif 000042
【図２１】
2009007547.tif 000043
【図２２】
2009007547.tif 000044
【図２３】
2009007547.tif 000045
【図２４】
2009007547.tif 000046
【図２５】
2009007547.tif 000047
【図２６】
2009007547.tif 000048
【図２７】
2009007547.tif 000049
【図２８】
2009007547.tif 000050
【図２９】
2009007547.tif 000051
【図３０】
2009007547.tif 000052
【図３１】
2009007547.tif 000053