(57)【要約】【課題】ＸＶＩＩ型コラーゲン欠損においてみられる白毛化と脱毛が、どのようなメカニズムでおこるかを解明し、脱毛治療、白髪治療、皮膚や毛髪の再生老化制御、あるいは皮膚恒常性維持等へ役立つ技術の提供を目的とする。【解決手段】ＸＶＩＩ型コラーゲンを含むことにより、色素幹細胞又は毛包幹細胞の異所性分化、細胞死又は消失が抑制される。【選択図】図１
2009035514.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＸＶＩＩ型コラーゲン、又は
（ii）配列番号：１のアミノ酸配列に対して８０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ色素幹細胞の異所性分化を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体、
を含む、色素幹細胞の異所性分化抑制剤。
【請求項２】
前記色素幹細胞の異所性分化が、バルジ領域での成熟色素細胞への分化である、請求項１に記載の異所性分化抑制剤。
【請求項３】
（i）配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＸＶＩＩ型コラーゲン、又は
（ii）配列番号：１のアミノ酸配列に対して８０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ色素幹細胞の消失を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体、
を含む、色素幹細胞の消失抑制剤。
【請求項４】
前記色素幹細胞の消失が、バルジ領域での成熟色素細胞への分化に引き続いて起こる消失である、請求項３に記載の消失抑制剤。
【請求項５】
（i）配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＸＶＩＩ型コラーゲン、又は
（ii）配列番号：１のアミノ酸配列に対して８０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ毛包幹細胞の異常分化を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体、
を含む、毛包幹細胞の異常分化抑制剤。
【請求項６】
前記毛包幹細胞は、未分化角化細胞としてバルジ領域を構成しており、
前記毛包幹細胞の異常分化は、バルジ領域を構成する未分化角化細胞から表皮や脂腺等への異常な成熟分化である、請求項５に記載の異常分化抑制剤。
【請求項７】
（i）配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＸＶＩＩ型コラーゲン、又は
（ii）配列番号：１のアミノ酸配列に対して８０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ毛包幹細胞の消失を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体、
を含む、毛包幹細胞の消失抑制剤。
【請求項８】
前記毛包幹細胞は、未分化角化細胞としてバルジ領域を構成しており、
前記毛包幹細胞の消失は、バルジ領域を構成する未分化角化細胞から表皮や脂腺等への成熟分化による消失である、請求項７に記載の消失抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＸＶＩＩ型コラーゲンに関する異常分化抑制剤、又は消失抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、外界から個体を護るほかに、毛髪や皮膚の色調やパターンにより個体の識別や防御においても重要な役割を果たしている。外側から表皮、真皮、皮下脂肪組織の３層から成り、毛包が表皮から連続して皮下脂肪組織に向かって伸長する。毛包の恒常部は毛周期を通じて維持されるのに対し、一過性部は毛周期に同調してその成長と退縮を周期的に繰り返している。また、色素細胞は、皮膚において分化するとメラニン色素を産生し、周囲の角化細胞へと受け渡すことで、皮膚や毛に色素を供給しており、紫外線から皮膚を護ると同時に個体間の識別や防御等の役割を担っている。
【０００３】
一方、白髪は、我々の誰もが経験する最も目立つ老化現象である。白毛を生やす毛包では色素を産生する色素細胞の数が減少していることは現象として知られていたが、そのメカニズムについてはほとんど知られていなかった。１９９０年、Cotsarelis等は、毛包の幹細胞がバルジ領域に局在して多く認められることから、毛包の幹細胞がバルジ領域に存在することを提唱した（非特許文献１）。本発明者は、これまでに色素幹細胞を見いだし（非特許文献２）、白髪のメカニズムとして色素幹細胞の維持が必須であることを明らかとしてきた（非特許文献３）。また、ＸＶＩＩ型コラーゲン遺伝子欠損（ＣＯＬ１７ＫＯ）マウスにおいて脱色素毛および脱毛が見られることを見いだしたことから（非特許文献４）、ＣＯＬ１７ＫＯマウスを経時的に観察したところ、加齢に伴う白毛化と脱毛を認めた。
【非特許文献１】Cotsarelis G.等、Cell 61: 1329-1337.1990
【非特許文献２】Nishimura EK et al. Nature. 416(6883):854-60, 2002
【非特許文献３】Nishimura EK et al. Science. 307(5710):720-724. 2005
【非特許文献４】Nishie W. et al. Nature Medicine 2007
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、加齢に伴う白毛化と脱毛がどのようなメカニズムで起こっているかは明らかとなっていない。これらのメカニズムの解明は、脱毛治療や皮膚や毛髪再生老化制御、白髪治療、あるいは皮膚恒常性維持を目的とした医薬品およびバイオ関連製品開発の分野で望まれている。
【０００５】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、上記メカニズムを解明し、脱毛治療、白髪治療、皮膚や毛髪の再生老化制御、あるいは皮膚恒常性維持等へ役立つ技術の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に至る過程では、本発明者は、まず、ＸＶＩＩ型コラーゲンの皮膚での発現を詳細に解析し、特異的に発現する領域を見いだした。さらに、ＣＯＬ１７ＫＯマウスを、色素幹細胞に着目して観察したところ、白毛化と脱毛に先立ち、色素幹細胞がバルジ領域において成熟色素細胞へと異所性分化し、それに引き続いて、色素幹細胞の消失を認めた。さらに、毛包幹細胞について調べたところ、毛包幹細胞は未分化角化細胞としてバルジ領域を構成していることに加えて、そのバルジ領域を構成する未分化角化細胞が異常な成熟分化をすることにより毛包幹細胞が消失することも観察された。以上から、ＸＶＩＩ型コラーゲンが色素幹細胞及び毛包幹細胞の維持に必須であり、その維持不全により白毛化および脱毛を発症することが判明した。以上の結果より、ＸＶＩＩ型コラーゲンの欠損は白毛化を来たし、その白毛化は色素幹細胞の消失に起因することが明らかとなり、ＸＶＩＩ型コラーゲンにより色素幹細胞及び毛包幹細胞の異常分化が抑制され、その消失が抑制されることによって色素幹細胞及び毛包幹細胞が維持されることが証明され、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明によれば、ＸＶＩＩ型コラーゲンを含む、色素幹細胞の異所性分化抑制剤が提供される。本発明は、後述の実施例に示すように、ＸＶＩＩ型コラーゲンにより、色素幹細胞の異所性分化を抑制する。
【０００８】
さらに、本発明によれば、ＸＶＩＩ型コラーゲンを含む、色素幹細胞の消失抑制剤が提供される。本発明は、後述の実施例に示すように、ＸＶＩＩ型コラーゲンにより、色素幹細胞の消失を抑制する。
【０００９】
また、本発明によれば、ＸＶＩＩ型コラーゲンを含む、毛包幹細胞の異常分化抑制剤が提供される。本発明は、後述の実施例に示すように、ＸＶＩＩ型コラーゲンにより、毛包幹細胞の異常分化を抑制する。
【００１０】
また、本発明によれば、ＸＶＩＩ型コラーゲンを含む、毛包幹細胞の消失抑制剤が提供される。本発明は、後述の実施例に示すように、ＸＶＩＩ型コラーゲンにより、毛包幹細胞の消失を抑制する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、後述の実施例に示すように、ヒトＸＶＩＩ型コラーゲンにより、色素幹細胞の異所性分化又は消失、若しくは毛包幹細胞の異常分化又は消失を抑制する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（発明の経緯）
本発明者は、ＸＶＩＩ型コラーゲンの皮膚での発現を詳細に解析したところ、毛包間表皮に加えて毛包バルジ領域（毛包幹細胞に相当する細胞群）にその発現を特異的に認めた。さらに、加齢に伴い白毛化及び脱毛が起こるＣＯＬ１７ＫＯマウスを、色素幹細胞に着目して調べた。すると、白毛化と脱毛に先立ち、色素幹細胞がバルジ領域において成熟色素細胞へと異所性分化し、それに引き続いて消失することから、さらに、色素幹細胞の維持に重要となる周囲の毛包幹細胞について調べたところ、毛包幹細胞が未分化角化細胞としてバルジ領域を構成していることに加えて、そのバルジ領域を構成する未分化角化細胞が、表皮や脂腺等などの通常は抑制されている分化方向に対して異常な成熟分化を示すことにより、毛包幹細胞が消失することを認めた。つまり、毛包幹細胞において本来発現するヒトＸＶＩＩ型コラーゲンが欠損すると、毛包幹細胞によって維持されている色素幹細胞の消失がおこり、これに続いて毛包幹細胞も消失し始める。さらに、これにより、幹細胞が分化細胞を供給できなくなるため、白髪と脱毛が同時進行することが明らかになった。以上から、毛包幹細胞において発現するＸＶＩＩ型コラーゲンが、色素幹細胞及び毛包幹細胞の異常分化抑制及び維持に必須であり、その維持不全により白毛化および脱毛を発症することが判明した。また、ＣＯＬ１７ＫＯマウスにおいて毛包幹細胞を含む領域で特異的に発現するプロモーターを用いてヒトＸＶＩＩ型コラーゲンを発現させたところ、色素幹細胞および毛包幹細胞の異常分化が抑制され、形態・分布にも異常が見られず、白毛化及び脱毛は認められなかったことを確認している（データ未掲載）。以上の知見は、脱毛治療や皮膚や毛髪再生老化制御、白髪治療を目的として、あるいは皮膚恒常性維持および再生老化研究分野において、皮膚のＸＶＩＩ型コラーゲンを標的とした医薬品およびバイオ関連製品開発に応用できることを強く示唆する。
【００１３】
以上の結果より、ヒトＸＶＩＩ型コラーゲンの欠損は白毛化を来たし、その白毛化は色素幹細胞の異所性分化による消失に起因することが示された。つまり、ＸＶＩＩ型コラーゲンにより毛包幹細胞及び色素幹細胞の異常分化及び消失が抑制されることによって色素幹細胞及び毛包幹細胞を維持することが可能であることが明らかとなり、本発明を完成した。
【００１４】
（概要）
本実施形態は、ＸＶＩＩ型コラーゲンを含む、色素幹細胞の異所性分化抑制剤である。後述の実施例に示すように、ＸＶＩＩ型コラーゲンは、色素幹細胞の異所性分化を抑制するという機能を有するため、それを含む異所性分化抑制剤自体も色素幹細胞の異所性分化を抑制する。
【００１５】
さらに、本実施形態は、ＸＶＩＩ型コラーゲンを含む、色素幹細胞のバルジ領域での成熟色素細胞への分化抑制剤である。後述の実施例に示すように、ＸＶＩＩ型コラーゲンは、色素幹細胞のバルジ領域での成熟色素細胞への分化や引き続いておこる細胞消失を抑制して幹細胞維持を促進するという機能を有するため、それを含む異所性分化抑制剤自体も色素幹細胞の異所性分化を抑制する。その結果、バルジ領域における色素幹細胞の成熟色素細胞への異所性分化が抑制され、色素幹細胞の消失が抑制される。
【００１６】
本実施形態は、ＸＶＩＩ型コラーゲンを含む、色素幹細胞の消失抑制剤である。後述の実施例に示すように、ＸＶＩＩ型コラーゲンは、色素幹細胞の消失を抑制するという機能を有するため、それを含む細胞死抑制剤自体も色素幹細胞の消失を抑制する。
【００１７】
さらに、本実施形態は、ＸＶＩＩ型コラーゲンを含む、色素幹細胞のバルジ領域での成熟色素細胞への分化に引き続いて起こる消失の抑制剤である。後述の実施例に示すように、ＸＶＩＩ型コラーゲンは、色素幹細胞のバルジ領域での成熟色素細胞への分化に引き続いておこる消失を抑制して幹細胞維持を促進するという機能を有するため、それを含む細胞死抑制剤自体も色素幹細胞の消失を抑制する。その結果、バルジ領域における色素幹細胞の成熟色素細胞への分化に引き続いて起こる消失が抑制され、色素幹細胞の維持が促進される。
【００１８】
また、本実施形態は、ＸＶＩＩ型コラーゲンを含む、毛包幹細胞の異常分化抑制剤である。後述の実施例に示すように、ＸＶＩＩ型コラーゲンは、毛包幹細胞の異常分化抑制及び／又は維持促進するという機能を有するため、それを含む異常分化抑制剤自体も毛包幹細胞の異常分化を抑制する。
【００１９】
また、本実施形態は、ＸＶＩＩ型コラーゲンを含む、毛包幹細胞の成熟した表皮毛包脂腺系細胞への分化抑制剤である。後述の実施例に示すように、毛包幹細胞はバルジ領域を構成しており、ＸＶＩＩ型コラーゲンは、その毛包幹細胞が未分化角化細胞から異常な方向へ成熟分化することを抑制するという機能を有する。そのため、そのような機能を有するＸＶＩＩ型コラーゲンを含む異常分化抑制剤自体も、同様に毛包幹細胞の異常分化を抑制する。その結果、バルジ領域における毛包幹細胞の成熟した細胞への異常分化が抑制され、毛包幹細胞の消失が抑制される。
【００２０】
また、本実施形態は、ＸＶＩＩ型コラーゲンを含む、毛包幹細胞の消失抑制剤である。後述の実施例に示すように、ＸＶＩＩ型コラーゲンは、毛包幹細胞の消失抑制及び／又は維持促進するという機能を有するため、それを含む消失抑制剤自体も毛包幹細胞の消失を抑制する。
【００２１】
また、本実施形態は、ＸＶＩＩ型コラーゲンを含む、毛包幹細胞のバルジ領域を構成する未分化角化細胞からの異常な成熟分化による毛包幹細胞消失の抑制剤である。後述の実施例に示すように、ＸＶＩＩ型コラーゲンは、毛包幹細胞のバルジ領域を構成する未分化角化細胞から表皮や脂腺等への成熟分化による消失を抑制するという機能を有するため、それを含む消失抑制剤自体も毛包幹細胞の消失を抑制する。その結果、バルジ領域における毛包幹細胞のバルジ領域を構成する未分化角化細胞からの成熟分化による消失が抑制され、毛包幹細胞の維持が促進される。
【００２２】
（ＸＶＩＩ型コラーゲン）
ここで使用される「ＸＶＩＩ型コラーゲン」という用語は、天然配列ＸＶＩＩ型コラーゲンを含む。ここに記載されるＸＶＩＩ型コラーゲンは、組換え又は合成方法により調製しても種々の供給源から単離してもよい。
【００２３】
「天然配列ＸＶＩＩ型コラーゲン」は、天然由来のＸＶＩＩ型コラーゲンのアミノ酸配列を有するポリペプチドである。このような天然配列ＸＶＩＩ型コラーゲンは、組換え又は合成手段により生産することもでき、種々の供給源から単離することもできる。
【００２４】
（ＸＶＩＩ型コラーゲン変異体ポリペプチド）
「ＸＶＩＩ型コラーゲン変異体」とは、ここに開示される全長天然配列ＸＶＩＩ型コラーゲンと８０％以上のアミノ酸配列同一性を有するＸＶＩＩ型コラーゲンを意味する。このようなＸＶＩＩ型コラーゲン変異体には、全長天然アミノ酸配列のＮ-又はＣ-末端において一又は複数（例えば、２、３・・・）のアミノ酸残基が付加、置換若しくは欠失されたＸＶＩＩ型コラーゲンが含まれる。通常、ＸＶＩＩ型コラーゲン変異体は、ここに開示される全長天然アミノ酸配列、ここに開示された全長天然配列ＸＶＩＩ型コラーゲン配列と８０％以上のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％以上のアミノ酸配列同一性、より好ましくは９５％以上のアミノ酸配列同一性を有している。なお、以下に示す配列番号：１には、全長天然配列ＸＶＩＩ型コラーゲンのアミノ酸配列が示されている。
【００２５】
ここに定義される「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性が得られるように間隙を導入してもよく、保存的置換を配列同一性の一部と考えないとした、ＸＶＩＩ型コラーゲン配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントの選択は、当業者によく知られた方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含むアラインメントを測定するために、適切なパラメータを決定することができる。
【００２６】
（ＸＶＩＩ型コラーゲン変異体ポリヌクレオチド）
「変異体ポリヌクレオチド」とは、ポリペプチドが本来持っている活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子であり、ここに開示する全長天然配列ＸＶＩＩ型コラーゲンポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列に対して８０％以上の配列同一性を有する。通常は、ＸＶＩＩ型コラーゲン変異体ポリペプチドヌクレオチドは、ここに開示する全長天然配列ＸＶＩＩ型コラーゲンポリペプチド配列をコードする核酸配列に対して８０％以上の核酸配列同一性、好ましくは９０％の核酸配列同一性、より好ましくは９５％の核酸配列同一性を有している。変異体は、天然ヌクレオチド配列を含まない。なお、以下に示す配列番号：２には、ヒトＸＶＩＩ型コラーゲンをコードする完全長配列が含まれている。
【００２７】
ここで同定されるＸＶＩＩ型コラーゲンコード化核酸配列に対する「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性が得られるように間隙を導入してもよく、ＸＶＩＩ型コラーゲンポリペプチドコード化核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントの選択は、当業者にはよく知られた方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含むアラインメントを測定するために、適切なパラメータを決定することができる。
【００２８】
他の実施態様では、ＸＶＩＩ型コラーゲン変異体ポリヌクレオチドは、ＸＶＩＩ型コラーゲン変異体ポリペプチドをコードし、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、配列番号：１に示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする核酸分子である。ＸＶＩＩ型コラーゲン変異体ポリペプチドは、ＸＶＩＩ型コラーゲン変異体ポリヌクレオチドにコードされるものであってもよい。
【００２９】
（幹細胞）
幹細胞とは、高い自己維持能（自己複製能）を示し、分化した子孫細胞を供給できる未分化な細胞のことをいう。例えば、色素細胞を子孫細胞として供給する色素幹細胞や、未分化角化細胞としてバルジ領域を構成し、表皮、汗腺及び皮脂腺等の皮膚付属器官へと分化する能力を有する毛包幹細胞等が挙げられる。
【００３０】
（ニッチ）
ニッチとは、幹細胞にとっての生態的適所をいう。通常、組織幹細胞の局在部位をニッチと呼んでいる。ニッチ環境において、幹細胞は未分化な状態に維持される。例えば、色素幹細胞や毛包幹細胞のニッチはバルジ領域に存在する。通常、バルジ領域において色素幹細胞から増殖した子孫細胞の一部は、バルジ領域から毛母へ移動し、そこで色素細胞に分化・成熟してメラニン色素を毛に供給する。
【００３１】
（色素幹細胞の異常分化）
色素幹細胞の異常分化とは、本来野生型マウスでは未分化な状態で維持されるバルジ領域（ニッチ）において、異所性に（場違いに）色素幹細胞がメラニン顆粒を持ち樹状の形態を獲得するなど成熟分化してしまうことをいう。通常、この異所性分化した細胞は維持されないで消失する。例えば、バルジ領域において色素幹細胞が未分化性を喪失し、成熟した色素細胞に分化すること等をいう。
【００３２】
（毛包幹細胞の異常分化）
毛包幹細胞の異常分化とは、毛包幹細胞が自己維持することなく異常な分化方向へと分化していくことをいう。例えば、バルジ領域において毛包幹細胞が幹細胞性を維持できなくなり、毛包、表皮、脂腺などへと分化してしまうなど正常の制御を逸した分化をいう。
【００３３】
（作用効果）
以下に本実施形態の作用効果について説明する。
本実施形態では、加齢に伴う白毛化と脱毛のメカニズムを解明し、脱毛治療や白髪治療等へ役立つ技術の提供を目的として実験を行った。後述の実施例に示すように、色素幹細胞及び毛包幹細胞について詳細に調べたところ、加齢に伴う白毛化と脱毛に先立ち、色素幹細胞及び毛包幹細胞の消失が認められることが明らかとなり、さらに、毛包幹細胞において本来発現するヒトＸＶＩＩ型コラーゲンが欠損すると、毛包幹細胞によって維持されている色素幹細胞の消失がおこり、これに続いて毛包幹細胞も消失し始めることが明らかとなった。これにより、幹細胞が分化細胞を供給できなくなるため、白髪と脱毛が同時進行することが明らかとなった。
【００３４】
すなわち、本実施形態の（i）配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＸＶＩＩ型コラーゲン、又は（ii）配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、かつ色素幹細胞の異所性分化を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体を含む、色素幹細胞の異所性分化抑制剤は、ＸＶＩＩ型コラーゲンが色素幹細胞の異所性分化を抑制するという作用を有するため、後述の実施例に示すように、それを含む異所性分化抑制剤自体も色素幹細胞の異所性分化を抑制し、その結果、色素幹細胞の消失を抑制するという効果を奏する。
【００３５】
さらに、本実施形態は、ＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体を含む、色素幹細胞のバルジ領域での成熟色素細胞への分化抑制剤であってもよい。この場合には、後述の実施例に示すように、ＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体が色素幹細胞のバルジ領域での成熟色素細胞への分化を抑制するという機能を有するため、それを含む異所性分化抑制剤自体も色素幹細胞の異所性分化を抑制するという効果を奏し、その結果、色素幹細胞の消失を抑制するという効果を奏する。
【００３６】
また、本実施形態の（i）配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＸＶＩＩ型コラーゲン、又は（ii）配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、かつ色素幹細胞の消失を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体を含む、色素幹細胞の細胞死抑制剤は、ＸＶＩＩ型コラーゲンが色素幹細胞の消失を抑制するという作用を有するため、後述の実施例に示すように、それを含む消失抑制剤自体も色素幹細胞の消失を抑制し、その結果、色素幹細胞の維持を促進するという効果を奏する。
【００３７】
さらに、本実施形態は、ＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体を含む、色素幹細胞のバルジ領域での成熟色素細胞への分化に引き続いて起こる消失の抑制剤であってもよい。この場合には、後述の実施例に示すように、ＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体が色素幹細胞のバルジ領域での成熟色素細胞への分化に引き続いて起こる消失を抑制するという機能を有するため、それを含む細胞死抑制剤自体も色素幹細胞の細胞死を抑制するという効果を奏し、その結果、色素幹細胞の消失を抑制するという効果を奏する。
【００３８】
また、本実施形態の（i）配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＸＶＩＩ型コラーゲン、又は（ii）配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、かつ毛包幹細胞の異常分化を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体を含む、毛包幹細胞の異常分化抑制剤は、ＸＶＩＩ型コラーゲンが毛包幹細胞の異常分化を抑制し、毛包幹細胞の維持を促進するという作用を有するため、後述の実施例に示すように、それを含む異常分化抑制剤自体も毛包幹細胞の異常分化を抑制し、その結果、毛包幹細胞の消失を抑制するという効果を奏する。
【００３９】
また、本実施形態は、ＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体を含む、毛包幹細胞のバルジ領域での成熟した細胞への分化抑制剤であってもよい。この場合には、後述の実施例に示すように、毛包幹細胞はバルジ領域を構成しており、ＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体は、毛包幹細胞が未分化角化細胞から異常な方向へ成熟分化することを抑制するという機能を有する。そのため、そのような機能を有するＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体を含む異常分化抑制剤自体も、同様に毛包幹細胞の異常分化を抑制し、その結果、毛包幹細胞の消失を抑制するという効果を奏する。
【００４０】
また、本実施形態の（i）配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＸＶＩＩ型コラーゲン、又は（ii）配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、かつ毛包幹細胞の異常分化を抑制する活性を有するＸＶＩＩ型コラーゲン変異体を含む、毛包幹細胞の消失抑制剤は、ＸＶＩＩ型コラーゲンが毛包幹細胞の消失を抑制し、毛包幹細胞の維持を促進するという作用を有するため、後述の実施例に示すように、それを含む消失抑制剤自体も毛包幹細胞の消失を抑制し、その結果、毛包幹細胞の維持を促進するという効果を奏する。
【００４１】
また、本実施形態は、ＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体を含む、毛包幹細胞のバルジ領域を構成する未分化角化細胞から表皮や脂腺等への異常な成熟分化による消失抑制剤であってもよい。この場合には、後述の実施例に示すように、毛包幹細胞はバルジ領域を構成しており、ＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体は毛包幹細胞が未分化角化細胞から異常な方向へ成熟分化することによる消失を抑制するという機能を有する。そのため、そのような機能を有するＸＶＩＩ型コラーゲン又はＸＶＩＩ型コラーゲン変異体を含む消失抑制剤自体も、同様に毛包幹細胞の消失を抑制し、その結果、毛包幹細胞の維持を促進するという効果を奏する。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４３】
実施例１  ＣＯＬ１７ＫＯマウスの解析
１．試験方法
（１）実験動物
本研究で用いたＤｃｔ−ｌａｃＺトランスジェニックマウスは、英国MRC、Ian Jackson博士のご提供、ＣＡＧ−ＣＡＴ−ＥＧＦＰマウスは大阪大学、宮崎純一教授のご提供、Ｄｃｔｔｍｌ（Ｃｒｅ）ＢｅｅマウスはFreedrich Beerman博士のご提供、ＣＯＬ１７ＫＯマウスは北海道大学医学研究科皮膚科学分野清水宏教授のご提供による。
【００４４】
（２）免疫組織化学
マウスの背部皮膚を４％パラホルムアルデヒド固定、またはそのままで、ＯＣＴｃｏｍｐｏｕｎｄ (Sakura Finetechnical)で凍結包埋した後、８μｍの切片にし、３％スキムミルクを用いて常温で３０分間ブロッキングした。その後、一次抗体を適当に希釈し４℃で一晩反応させ、ＰＢＳで洗浄した後に二次抗体を反応させた。
【００４５】
免疫染色に使用した一次抗体は、抗ヒトＸＶＩＩ型コラーゲン抗体（N18、Santa Cruz）、抗マウスＸＶＩＩ型コラーゲン抗体（滋賀医科大学田中俊広教授より提供して頂いた）、抗βガラクトシダーゼ抗体 (Cappel)、抗ケラチン１５抗体(Covance)、抗ＣＤ３４抗体(eBioscience)、抗α６インテグリン抗体(BD Pharmingen)、抗Ｓ１００ａ６抗体(LAB VISION)である。二次抗体はＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ４８８、５６８、５９４(Molecular Probes)を用いた。
【００４６】
（３）Ｈ．Ｅ．染色
マウスの背部皮膚をブアン固定後にパラフィン包埋した後、４μｍの切片を作製し、ヘマトキシリン及びエオジンを用いて定法により染色した。
【００４７】
（４）色素細胞の分離
生後６日の色素幹細胞を含む色素細胞がＧＦＰ陽性となっているＣＡＧ−ＣＡＴ−ＥＧＦＰ；  Ｄｃｔｔｍｌ（Ｃｒｅ）Ｂｅｅマウスの背部皮膚を採取し、１０００Ｕ／ｍｌのディスパーゼ（SANKO JUNYAKU）／ＰＢＳの中にて４℃で一晩反応させた後、実体顕微鏡下で真皮を取り除いた。その後、０．２５％トリプシンを加え、３７℃で１０分反応させ、ウシ胎仔血清で中和した後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）法を用いてＧＦＰ陽性の色素細胞を分離した。
【００４８】
（５）フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析
色素細胞の分離には、上記の方法でGFP陽性細胞分画を採取した。また角化細胞については同様に酵素処理にて用意した皮膚懸濁液を上記のＣＤ３４、α６インテグリンの抗体と反応させた。ＦＡＣＳ分析にはＢａｙ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＪＳＡＮまたはＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳ caliberを使用した。
【００４９】
（６）ＲＴ−ＰＣＲによるマウスＸＶＩＩ型コラーゲンｍＲＮＡ発現の解析
マウス背部皮膚およびＧＦＰ陽性の色素細胞からＴＲＩｚｏｌ（GIBCO）を用いてＲＮＡを抽出した。３μｇのＲＮＡをＴＨＥＲＭＯＳＣＲＩＰＴ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（GIBCO）を用いて逆転写を行いｃＤＮＡを合成した。以下のプライマーを用いてマウスＸＶＩＩ型コラーゲンｍＲＮＡ発現の解析を行った。また、内部標準としてＧＡＰＤＨｍＲＮＡの発現を測定した。
・マウスＸＶＩＩ型コラーゲン
ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ａｃｔｃｇｃｃｔｃｔｔｃｔｔｃａａｃｃａ（配列番号：３）
ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ｇａｇｃａｇｇａｃｇｃｃａｔｇｔｔａｔｔ（配列番号：４）
・ＧＡＰＤＨ
ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ａｃｃａｃａｇｔｃｃａｔｇｃｃａｔｃａｃ（配列番号：５）
ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ｔｃｃａｃｃａｃｃｃｔｇｔｔｇｃｔｇｔａ（配列番号：６）
【００５０】
（結果及び考察）
ＣＯＬ１７ＫＯマウスは多くが生後２週間以内に死亡するが、生存する個体は、生後４週頃までは外見上は正常で、黒色の体毛に覆われていた（図１ａ）。しかしその後、徐々に白毛化がみられ、生後３ヵ月頃には、白毛化・脱毛がかなり目立つようになるとともに、体毛が通常よりも長くなってくる現象がみられた。生後６ヵ月頃には全身がほぼ完全に白毛化し、最終的に１０ヵ月頃には全身で脱毛が起こった。
【００５１】
我々は以前に色素幹細胞の維持不全が白毛化の原因となりうることを明らかにした。そこで、ＣＯＬ１７ＫＯマウスの白毛化の原因が、色素幹細胞の維持不全にあるのかどうかを調べるため、色素幹細胞をマーキングできるＤｃｔ−ＬａｃＺトランスジーンをＣＯＬ１７ＫＯマウスに導入し、ＣＯＬ１７ＫＯマウスの色素幹細胞の分布及び形態を観察した。その結果、ＸＶＩＩ型コラーゲンは、バルジ領域及び表皮の基底細胞で強く発現していること及び色素幹細胞が毛包幹細胞に囲まれた状態で存在していることが明らかとなった（図１ｃ）。また、ＣＯＬ１７ＫＯマウスにおける色素幹細胞の分布・形態は、出生直後において異常は認めなかったが、生後３ヵ月頃より、色素幹細胞の数が徐々に少なくなってくると同時に、メラニン顆粒をもち胞体がやや大きく複数の突起をもつ分化した形態の成熟した色素細胞がみられるようになった（図１ｄ、ｅ）。全身が白毛化を来す５ヵ月頃では、色素幹細胞は完全に消失した。以上の結果から、ＣＯＬ１７ＫＯマウスにおける白毛化の原因は色素幹細胞の維持不全によるものと結論づけられた。
【００５２】
一般的にＸＶＩＩ型コラーゲンは、ヘミデスモソームを形成する上皮系の細胞で発現する事が知られている。色素幹細胞を含む皮膚の色素細胞においてＸＶＩＩ型コラーゲン発現の有無を調べるため、色素細胞でＧＦＰを発現するマウス（ＣＡＧ−ＣＡＴ−ＥＧＦＰ；  Ｄｃｔｔｍｌ（Ｃｒｅ）Ｂｅｅマウス）で、ＧＦＰ陽性の色素細胞のＲＮＡを回収し、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、マウスＸＶＩＩ型コラーゲンｍＲＮＡの発現を解析したところ、色素幹細胞を含む色素細胞においてＸＶＩＩ型コラーゲンｍＲＮＡの発現がないことを確認した（図１ｆ）。以上の結果より、色素幹細胞ではＸＶＩＩ型コラーゲンの発現はなく、ＣＯＬ１７ＫＯマウスでみられる色素幹細胞の消失の原因として、色素幹細胞の周囲の細胞におけるＸＶＩＩ型コラーゲン発現の異常が原因である可能性が示唆された。
【００５３】
毛包幹細胞の異常の有無を調べるため、最初にＣＯＬ１７ＫＯマウス及びコントロールの背部皮膚を各週齢で調べた。 Ｈ．Ｅ．染色組織像の所見上、生後３ヵ月頃より、表皮の肥厚と脂腺の増大がみられた（図２ａ）。さらに６ヵ月頃では、毛包の嚢胞化や、萎縮した毛包が多くみられた（図２ｂ）。最終的に１０ヵ月頃では、毛包など皮膚付属器はほぼ消失した（図２ｃ）。これらの所見より、毛包の維持にはＸＶＩＩ型コラーゲンが必要であることが示唆された。また、これらのＨ．Ｅ．染色組織像の所見は表皮における幹細胞が枯渇するマウスとして報告されたｃ−Ｍｙｃが基底細胞で活性化されたマウスや、Ｒａｃ１が皮膚でノックアウトされたマウスのＨ．Ｅ．染色組織像の所見と非常に似ていることがわかった。そこで、ＣＯＬ１７ＫＯマウスでも、同様に毛包幹細胞が枯渇している可能性を考え、毛包幹細胞マーカーである抗ケラチン１５抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗α６インテグリン抗体、抗Ｓ１００ａ６抗体での染色、及びＦＡＣＳ分析を行い、毛包幹細胞の枯渇が確認できた（図２ｄ−ｆ）。
【００５４】
以上の結果より、ＸＶＩＩ型コラーゲンの欠損は白毛化を来たし、その白毛化は色素幹細胞の消失に起因することが示された。つまり、毛包幹細胞におけるＸＶＩＩ型コラーゲンは毛包幹細胞の維持においてのみならず、色素幹細胞の維持において必須であることが明らかになった。また、ＣＯＬ１７ＫＯマウスにおいて毛包幹細胞を含む領域で特異的に発現するプロモーターを用いてヒトＸＶＩＩ型コラーゲンを発現させたところ、色素幹細胞および毛包幹細胞の異常分化が抑制され、形態・分布にも異常が見られず、白毛化及び脱毛は認められなかったことを確認している（データ未掲載）。
【００５５】
ここで、色素幹細胞や毛包幹細胞の異常分化の抑制は、白髪治療や脱毛治療のみならず、皮膚や毛髪の再生老化制御、あるいは皮膚恒常性維持等の広い分野への応用が期待できる。例えば、毛包幹細胞は、表皮、毛包、汗腺及び皮脂腺等の皮膚付属器官へと分化する能力を有しているので、毛包幹細胞の異常を抑制することは、皮膚の再生やアンチエイジング、皮膚損傷の治癒等に有用であることが考えられる。また、その他にも毛髪成長の制御等へ応用可能であると考えられる。
【００５６】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ＣＯＬ１７ＫＯマウスでみられる白毛および脱毛、コントロールマウスにおけるＸＶＩＩ型コラーゲン発現を示す図である。(a)ＣＯＬ１７ＫＯマウスの写真。上から生後２週・６週・２ヵ月・３ヵ月・６ヵ月・１０ヵ月のマウスを示す。進行性の白毛化及び脱毛がみられた。(b)１０ヵ月のコントロールの写真。 (c) 左：ＸＶＩＩ型コラーゲンはバルジ領域及び表皮の基底細胞で強く発現している。右：色素幹細胞は毛包幹細胞に囲まれている。(d)出生後６日、３ヵ月、５ヵ月のコントロールのＬａｃＺ染色像。(e)ノックアウトマウス(ＫＯマウス)のＬａｃＺ染色像。ＫＯマウスではコントロールマウスに比べてＬａｃＺ陽性色素幹細胞は徐々に減少し、分化した像が目立つようになる。５ヵ月以降では陽性細胞はほぼ全て消失する。(f) ＲＴ−ＰＣＲ。ＧＦＰ陽性色素細胞ではＸＶＩＩ型コラーゲンの発現は認めない。
【図２】色素幹細胞のニッチである毛包幹細胞の消失を示す図である。（ａ）生後３ヵ月頃より、表皮の肥厚、脂腺の増大がみられた。（ｂ）生後６ヵ月頃より、毛包が嚢胞化する像もみられた。（ｃ）生後１０ヵ月では、毛包など皮膚付属器は消失する。（ｄ）α6インテグリンとＣＤ３４二重陽性の毛包幹細胞は、ＣＯＬ１７ＫＯマウスでは著しく減少した。 （ｅ）コントロール組織の毛包幹細胞マーカーでの染色。（ｆ）ＣＯＬ１７ＫＯマウス組織の毛包幹細胞マーカーでの染色。ＣＯＬ１７ＫＯマウスではケラチン１５・ＣＤ３４・α６インテグリン・Ｓ１００ａ６陽性細胞を認めなかった。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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