(57)【要約】【課題】ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）の新規被覆方法を提供すること。【解決手段】ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）分子の表面に重合性官能基を導入する重合性官能基導入工程と、該重合性官能基と重合性モノマーが共重合をおこす共重合工程と、を１７℃以下で行うビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）の被覆方法を提供する。該被覆方法を用いれば、被覆したビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）の酵素活性の低下を抑制しつつ、熱や有機溶媒に対する安定性を向上させることができる。該方法を用いて被覆したビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）は、燃料電池の酵素電極に好適に用いることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）分子の表面に重合性官能基を導入する重合性官能基導入工程と、
該重合性官能基と重合性モノマーが共重合を起こす共重合工程と、
を１７℃以下で行うビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）の被覆方法。
【請求項２】
４℃以上１７℃以下で行うことを特徴とする請求項１記載の被覆方法。
【請求項３】
前記重合性官能基は、アクリロイル基であることを特徴とする請求項１記載の被覆方法。
【請求項４】
前記重合性モノマーは、アクリルアミドであることを特徴とする請求項１記載の被覆方法。
【請求項５】
請求項１記載の被覆方法を用いたビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）の安定化方法。
【請求項６】
耐熱性を向上させることを特徴とする請求項５の安定化方法。
【請求項７】
有機溶媒耐性を向上させることを特徴とする請求項５記載の安定化方法。
【請求項８】
前記有機溶媒は、メタノールであることを特徴とする請求項７記載の安定化方法。
【請求項９】
請求項１記載の被覆方法を用いて被覆されたビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）。
【請求項１０】
請求項９のビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）を少なくとも固定化した酵素電極。
【請求項１１】
請求項１０の酵素電極を少なくとも用いた燃料電池。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）の被覆方法に関する。より詳しくは、ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）を、酵素活性の低下を抑制しつつ被覆する方法、該被覆方法を利用したビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）安定化方法、前記被覆方法により被覆されたビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）、該ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）を固定化した酵素電極、及び該酵素電極を用いた燃料電池に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビリルビンオキシダーゼ（Bilirubin oxidase（ＢＯＤ））は、マルチ銅オキシダーゼ（複数の銅イオンを活性中心に持つ酵素の総称）に属する酵素の一種であり、ビリルビンからビルベルジンへの酸化反応を触媒する酵素である。この酵素は、従来から臨床検査の場面における肝機能等の検査試薬（血清中のビリルビンの測定試薬）として広く使用されている。例えば、特許文献１には、１００ｍＭ〜８００ｍＭのカリウムイオン共存下において、試料にビリルビンオキシダーゼを作用させ、該試料の光学的変化により試料中の直接型ビリルビンを測定する方法が開示されている。
【０００３】
ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）のような酵素は、通常、生体内において、生命の維持に係わる多くの反応を温和な条件下で円滑に進める生体内触媒であるが、近年、このような酵素を生体外で利用する技術が注目されている。例えば、有用物質の生産、エネルギー関連物質の生産、測定又は分析、環境保全、医療などの様々な技術分野におおける酵素の利用や、燃料電池の一種である酵素電池、酵素電極、酵素センサー（酵素反応を利用して化学物質を計測するセンサー）などの技術も開発されつつある。
【０００４】
ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）も、酵素電池のカソード（Cathode、正極）側において、酸素の電気化学的４電子還元反応を実現する触媒として注目されている。例えば、引用文献２には、正極にビリルビンオキシダーゼを固定した燃料電池が開示されている。
【０００５】
ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）のような酵素はタンパク質なので、熱やｐＨの程度、有機溶媒などの影響により変性し易い性質を有する。このため、酵素は、金属触媒などの他の化学的触媒に比べて生体外での安定性が低い。従って、酵素を生体外で利用する場合は、活性を維持しつつ、安定性を高めることが重要である。
【０００６】
ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）の安定化方法としては、例えば、特許文献３には、ＢＯＤ含有溶液中にペンタシアノ鉄錯塩および／またはヘキサシアノ鉄錯塩、および第３級アミン類を含有させるＢＯＤの安定化方法が、特許文献４には、リチウム化合物又はホモシスチンを安定化剤として用いるビリルビンオキシダーゼの安定化方法が、引用文献５には、遺伝子工学的手法により製造した耐熱性ビリルビンオキシダーゼが開示されている。
【０００７】
ここで、本発明に関連する被覆技術について説明する。
近年、医薬分野、化粧品分野、食品分野に至る幅広い分野において、タンパク質等の生理活性物質をポリマー等で被覆する技術が開発されている。ドラッグデリバリーシステム等が代表的な一例である。これらの技術は、活性部位の制御、生体内の運搬、安定性・保存性の向上、反応性の制御など様々な目的で用いられている。具体的には、生理活性物質等をポリマー等で被覆し、目的の活性部位などで生理活性物質等を遊離させて活性反応を起こさせるという技術である。
【０００８】
これらの技術に続く新たな技術として、非特許文献１には、酵素活性を維持したまま耐熱性と有機溶媒耐性を向上し得るホースラディッシュペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase（ＨＲＰ））を１分子単位でナノゲルに封入する技術が開示されている。 この技術は、酵素を１分子単位でナノゲル封入し、封入後も酵素活性を低下させないという特徴を有するが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）以外の生理活性物質への応用が可能であるかは不明であり、更なる研究の途が残されていた。
【特許文献１】特開２００４−１９４６７０号公報。
【特許文献２】特開２００７−８７６２７号公報。
【特許文献３】特開２０００−８３６６１号公報。
【特許文献４】特開２０００−２５３８７３号公報。
【特許文献５】特開２００４−８９０４２号公報。
【非特許文献１】J.AM.CHEM.SOC.2006,128,11008-11009
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）の酵素活性の低下を抑制しつつ、ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）を被覆する新規な方法を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者らは、前記非特許文献１の技術に基づき、ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）の被覆を試みたところ、被覆には成功したものの、酵素活性の著しい低下がみられた。そこで、本願発明者らは、ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）を被覆する方法について鋭意研究した結果、被覆時における技術常識の発想を転換することで、酵素活性の低下を抑制しつつ、ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）を被覆する新規な方法を見出した。
【００１１】
本発明では、まず、ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）分子の表面に重合性官能基を導入する重合性官能基導入工程と、該重合性官能基と重合性モノマーが共重合を起こす共重合工程と、を１７℃以下で行うビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）の被覆方法を提供する。
従来、各工程、特に共重合工程は、一定以上の高温でしか反応が進まないのが技術常識であったが、本発明では、その発想を大きく転換し、１７℃以下という比較的低温で各工程を行う方法に成功した。
本各工程は、１７℃以下で行うが、４℃以上１７℃以下で行うとより好適である。
前記重合性官能基は、ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）分子の表面に導入可能な重合性官能基であれば特に限定されないが、一例としては、アクリロイル基が挙げられる。
前記重合性モノマーは、前記重合性官能基と重合可能な重合性モノマーであれば特に限定されないが、一例としは、アクリルアミドが挙げられる。
本発明に係る被覆方法を用いれば、ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）を安定化することができる。
例えば、耐熱性を向上させることにより、ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）を安定化させることが可能である。
また、有機溶媒耐性を向上させることにより、ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）を安定化させることが可能である。前記有機溶媒は特に限定されないが、例えば、メタノール耐性を向上させることにより、ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）を安定化させることが可能である。
本発明では、また、本発明に係る被覆方法を用いて被覆されたビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）を提供する。
該ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）は、公知のあらゆる用途に用いることができるが、一例を挙げると、酵素電極に固定化して触媒として用いることができる。
本発明では、更に、前記酵素電極を少なくとも用いた燃料電池を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る被覆方法を用いれば、酵素活性の低下を抑制しつつ、ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）を１分子単位で被覆することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１４】
図１は、本発明に係るビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）の被覆方法の概要を示す図である。符号Ｉは、本発明に係る被覆方法の重合性官能基導入工程を、符号IIは、共重合工程をそれぞれ示す。また、符号１はビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）分子、符号２は重合性官能基、符号１２は重合性官能基が表面に導入されたビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）分子、符号１３は被覆されたビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）分子をそれぞれ示す。
【００１５】
＜重合性官能基導入工程Ｉ＞
本発明に係る被覆工程では、まず、ビリルビンオキシダーゼ（以下「ＢＯＤ」と称する。）分子の表面に重合性官能基２を導入する工程を行う。重合性官能基２の導入方法は、公知のあらゆる方法を用いることができる。例えば、ＢＯＤ表面に存在するアミノ基に、重合性官能基２を有する有機化合物等を共有結合させることで、ＢＯＤ分子表面に重合性官能基２を導入することができる。
【００１６】
重合性官能基導入工程Ｉは、１７℃以下で行う。ＢＯＤの酵素活性の低下を抑制するためである。従来、重合性官能基２の導入は、３０℃前後で行うことが常識であった。しかし、本発明では、従来技術の発想を大きく転換し、比較的低温の１７℃以下で重合性官能基２の導入を行うことにより、ＢＯＤの酵素活性の低下を抑制することに成功した。
【００１７】
重合性官能基導入工程Ｉは１７℃以下で行えば、ＢＯＤの酵素活性の低下を産業上利用可能な範囲に抑制することができるが、生産性を考えると、好ましくは４℃以上、より好ましくは４℃以上８℃以下で行うとよい。４℃未満になると、化学反応の進行が著しく遅くなるためである。
【００１８】
重合性官能基２は、ＢＯＤ分子の表面に導入可能な重合性官能基２であれば特に限定されない。例えば、ラジカル重合性、カチオン重合性、アニオン重合性、付加重合性、縮合重合性のいずれであってもよい。具体的な重合性官能基２としては、アクリロイル基、メタクリロイル基、ビニル基、アリル基、プロペニル基、アクリルアミド基、ビニルアミド基、ビニリデン基、ビニレン基等が挙げられる。一例として、ＢＯＤ分子にアクリロイル基を導入する場合の重合性官能基導入工程Ｉを下記の化学式１で示す。なお、ＢＯＤ分子表面のアミノ基とアクリルロイル基の共有結合の状態を分かりやすくするために、ＢＯＤ分子表面のアミノ基を具体的に記載する。
【化１】
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【００１９】
重合性官能基導入工程Ｉでは、必要に応じて、ＢＯＤの安定剤を加えることも可能である。安定剤は特に限定されないが、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraacetic acid））、ジメチルアミノアンチピリン、アスパラギン酸をＢＯＤの安定剤として用いることができる。ＢＯＤの活性中心イオンである銅イオンの安定化やプロテアーゼを阻害するためである。
【００２０】
＜共重合工程II＞
本発明に係る被覆工程では、重合性官能基導入工程Iを経た後、導入した重合性官能基２と重合性モノマーの共重合反応を起こさせる工程を行う。共重合工程IIにおける共重合反応は、公知のあらゆる方法を用いることができる。例えば、分子表面に重合性官能基２を導入したＢＯＤに重合開始剤や反応促進剤を加え、ＢＯＤ分子表面での重合性官能基２同士の共重合を開始させ、そこへ重合性モノマーと架橋剤を加えることにより行うことができる。
【００２１】
共重合工程IIは、１７℃以下で行う。ＢＯＤの酵素活性の低下を抑制するためである。従来、共重合反応は、２５℃前後で行うことが常識であった。しかし、本発明では、従来技術の発想を大きく転換し、比較的低温の１７℃以下で共重合反応を進行させることにより、ＢＯＤの酵素活性の低下を抑制することに成功した。
【００２２】
共重合工程IIは１７℃以下で行えば、ＢＯＤの酵素活性の低下を産業上利用可能な範囲に抑制することができるが、生産性を考えると、好ましくは４℃以上、より好ましくは４℃以上８℃以下で行うとよい。４℃未満になると、共重合反応の進行が著しく遅くなるためである。
【００２３】
共重合工程IIにおいて、ＢＯＤ分子表面に導入した重合性官能基２と共重合を進行させる重合性モノマーは、前記重合性官能基との共重合が可能であれば特に限定されない。例えば、アクリルアミド、アクリル酸、メタクリル酸、2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（MPC）、N-イソプロピルアクリルアミド、2-ヒドロキシエチルメタクリレート、N-ビニルピロリドン、2-アミノエチルメタクリレート等が挙げられる。
【００２４】
共重合工程IIでは、必要に応じて、重合開始剤、反応促進剤、架橋剤等を用いることができる。重合開始剤としては例えば、硫酸アンモニウム、過酸化ベンゾイル（benzoyl peroxide（BPO））、アゾビスイソブチロニトリル (azobisisobutyronitrile, azobisisobutylonitrile（AIBN）)、テトラメチルエチレンジアミン(tetramethylethylenediamine（TMED）)等が挙げられる。反応促進剤としては例えば、テトラメチルエチレンジアミン(tetramethylethylenediamine（TMED）)等が挙げられる。架橋剤としては例えば、N,N'-メチレンビスアクリルアミド（N,N’-methylene bisacrylamide（MBAAm））、エチレングリコールジメタクリレート（ethyleneglycoldimethacrylate（EDMA））等が挙げられる。
【００２５】
本発明に係るＢＯＤの被覆方法は、ＢＯＤの酵素活性の低下を抑制しつつ、ＢＯＤ分子を被覆し、安定化することができる。従来の被覆方法は、安定化のために酵素をポリマー等で被覆すると、酵素活性が低下してしまった。しかし、本発明に係る被覆方法では、ＢＯＤの酵素活性の低下を抑制しつつ、ＢＯＤ分子を被覆し、安定化させるため、高安定で高い酵素活性を有するＢＯＤを作製できるというメリットが生じる。
【００２６】
本発明に係る被覆方法は、ＢＯＤ分子を１分子単位で被覆するため、様々な面で安定化が図れるが、例えば、耐熱性を向上させることによるＢＯＤの安定化を図ることができる。本発明でいう耐熱性の向上は、熱処理温度を上昇させた場合にも、熱処理時間を長くした場合にも発揮される。
【００２７】
また、有機溶媒耐性を向上させることによるＢＯＤの安定化を図ることもできる。この場合の有機溶媒は特に限定されないが、例えば、メタノールなどのアルコール類、エーテル類、アセトン、ヘキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサンなどが挙げられる。
【００２８】
本発明に係る被覆方法で被覆したＢＯＤは、酵素活性を示しつつ、熱や有機溶媒等に対し安定性が高い。従って、公知のあらゆる用途に好適に用いることができる。特に、発熱を伴う用途や、ＢＯＤを有機溶媒に溶解させて用いる用途などには有効に用いることができる。
【００２９】
具体的な一例としては、酵素電池のカソード（Cathode、正極）側に固定することにより、酸素の電気化学的４電子還元反応を実現する触媒として用いることができる。本発明における酵素電極は、本発明に係る被覆方法で被覆したＢＯＤを少なくとも固定していれば、他の構造、機能は特に制限されない。
【００３０】
本発明に係るＢＯＤは被覆されているため、安定性が高く、電極に固定化した際の酵素活性の低下も抑制することができる。例えば、本発明に係るＢＯＤは熱に対する安定性が高いため、酵素電極の耐久性を向上させることができる。
【００３１】
また、従来、ＢＯＤは、酵素活性の低下が懸念されるために有機溶媒に溶解して電極上に固定化することが難しかった。しかし、本発明に係るＢＯＤは、有機溶媒に対する安定性も高いため、有機溶媒を用いた酵素固定化法を用いることもできるといったメリットがある。
【００３２】
本発明に係る酵素電極は、公知のあらゆる燃料電池に用いることができる。該燃料電池は、本発明に係る酵素電極を少なくとも使用できるものであれば、燃料の種類、構造、機能などは制限されない。
【００３３】
本発明に係る燃料電池の酵素電極に用いるＢＯＤは、熱や有機溶媒等に対する安定性が高いため、燃料電池自体の安定性や耐久性を向上させることが可能である。
【実施例１】
【００３４】
実施例１では、従来技術と同様の方法によりビリルビンオキシダーゼ（以下「ＢＯＤ」と称する。）を被覆した場合の酵素活性、及び耐熱性の変化を調べた。
【００３５】
＜重合性官能基の導入＞
本実施例では、重合性官能基の一例として、アクリロイル基の導入を行った。
まず、１０ｍｇのＢＯＤと、安定剤として１ｍｇの４−ジメチルアミノアンチピリンを１００ｍＭのホウ酸溶液（ｐＨ９．３）３．８ｍＬに溶解した。次に、０．２ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide)）に４．０ｍｇのＮ−アクリロキシスクシンイミドを溶解し、前記ホウ酸緩衝液にゆっくりと加え、３０℃で２時間反応させた。その後、セファデックスＧ２５カラムを用いて、アクリロイル基を導入したＢＯＤ（以下「アクリロイル化ＢＯＤ」と称する。）を精製した。
【００３６】
＜ＢＯＤのアクリルロイル化率の測定＞
０．１ｍｇ／ｍＬフルオレスアミン（１．５ｍＬのアセトンに溶解）に対し、前記で精製したアクリロイル化ＢＯＤ（０．１Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ８．０に溶解）を０．５ｍＬ加え、２５℃で７分間反応させた。その後、分光蛍光光度計を用い、励起波長３９０ｎｍ、発光波長４８３ｎｍにおける蛍光強度を測定した。未反応のアミン残基の量を測定するために、重合性官能基が導入されていないＢＯＤ（以下「フリーＢＯＤ」と称する。）をコントロールとして用いた。前記で導入したアクリルロイル化ＢＯＤのアクリルロイル化率は５５．９％であった。
【００３７】
＜共重合＞
バイアルの中で、全体が３．５ｍＬになるようにアクリロイル化ＢＯＤと４−ジメチルアミノアンチピリンを混ぜ、窒素を除去した。次に、硫酸アンモニウム（３ｍｇ）を除酸素した脱イオン水３０μＬに溶解した溶液と、N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン３μＬをバイアルの中に加え、アクリロイル化ＢＯＤの表面において重合を開始した。
【００３８】
その後、アクリルアミドとN,N'-メチレンビスアクリルアミドをモル比１０：１で混合したものを除酸素した脱イオン水０．５ｍＬに溶解し、前記アクリロイル化ＢＯＤ溶液に均一に加え６０分間反応させた。更に、窒素存在下で６０分間反応させた。最後にセファデックスＧ７５カラムを用いて、被覆されたＢＯＤ（以下「被覆ＢＯＤ１」と称する。）を精製した。なお、被覆ＢＯＤ１のアクリルアミドとN,N'-メチレンビスアクリルアミドの混合物と、ＢＯＤのモル比は４００：１であった。
【００３９】
精製した被覆ＢＯＤ１を用い、アクリルアミドとN,N'-メチレンビスアクリルアミドの混合物と、ＢＯＤをモル比４００：１で更に上記の方法を繰り返し行い、被覆されたＢＯＤ（以下「被覆ＢＯＤ２」と称する。）を得た。
【００４０】
コントロールとして、被覆を行わず、被覆ＢＯＤ２を作製する過程と同時間、４℃下で保存したＢＯＤ（以下「フリーＢＯＤ１」と称する。）を用いた。
【００４１】
＜酵素活性の測定＞
上記で得た被覆ＢＯＤ１、２、及びフリーＢＯＤ１のミカエリス定数（ＫＭ）、反応速度定数（ｋcat）を、以下の表１の条件下で測定した。基質にはＡＢＴＳ（2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt）を用いた。なお、各ＢＯＤのタンパク量は、BCA colorimetric protein assayを用いて標準タンパク質のＢＳＡの検量線から求めた。
【表１】
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【００４２】
結果を図２に示す。図２は、ミカエリスメンテン式でフィッティングを行った被覆ＢＯＤ１、２、及びフリーＢＯＤ１の基質濃度と酵素活性の関係を示す図面代用グラフである。また、図２から得られた被覆ＢＯＤ１、２、及びフリーＢＯＤ１のミカエリス定数（ＫＭ）、反応速度定数（ｋcat）を表２に示す。
【表２】
2009044997.tif 000005
【００４３】
被覆ＢＯＤ１、２とフリーＢＯＤ１のミカエリス定数（ＫＭ）、及び反応速度定数（ｋcat）を比較してみると、ミカエリス定数（ＫＭ）には大きな差は見られないが、反応速度定数（ｋcat）に関しては、被覆ＢＯＤ１がフリーＢＯＤ１の約２３分の１倍、被覆ＢＯＤ２がフリーＢＯＤ１の約１２２分の１倍になってしまうことが分かった。
【００４４】
＜耐熱性試験―熱処理時間依存性＞
４６．５ｍＭ、ｐＨ７．０のリン酸ナトリウム溶液に、それぞれ被覆ＢＯＤ１を２．４６μＭ、被覆ＢＯＤ２を１１．８μＭ、フリーＢＯＤ１を１．０７μＭ溶解し、６５℃のホットプレート上で熱処理を行った。熱処理後、表３に記載の条件の下、酵素活性を測定した。
【表３】
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【００４５】
ここで、タンパク質の熱変性反応は下記反応式２で示されるが、ｋ２＞＞ｋ-1と仮定した場合、タンパク質の熱変性反応は下記反応式３で表され、１次反応の速度解析式は下記数式１とすることができる。そこで、下記数式１の速度解析式を用い、フィッティングを行った。
【化２】
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【化３】
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【数１】
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【００４６】
結果を図３及び図４に示す。図３は、数式１の速度解析式でフィッティングを行った被覆ＢＯＤ１、２、及びフリーＢＯＤ１の熱処理時間と酵素活性の関係を示す図面代用グラフである。図４は、数式１の速度解析式でフィッティングを行った被覆ＢＯＤ１、２、及びフリーＢＯＤ１の熱処理時間と残存活性の関係を示す図面代用グラフである。
【００４７】
被覆ＢＯＤ１、２とフリーＢＯＤ１の熱処理時間６０分における残存活性を比較してみると、フリーＢＯＤ１は約０％の残存活性であるのに対し、被覆ＢＯＤ１、２は約１５％の残存活性を示していた。
【００４８】
実施例１では、ＢＯＤを従来技術と同様の方法を用いて被覆することにより、耐熱性は向上するが、酵素活性が著しく低下してしまうことが分かった。
【実施例２】
【００４９】
実施例２では、実施例１の被覆方法中、重合性官能基の導入工程と共重合工程を４℃で行った場合のＢＯＤの酵素活性、及び耐熱性の変化を調べた。
【００５０】
＜重合性官能基の導入＞
本実施例では、重合性官能基の一例としてアクリロイル基の導入を行った。
まず、４０ｍｇのＢＯＤと、安定剤として１ｍｇのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraacetic acid））を１００ｍＭのホウ酸溶液（ｐＨ９．３）３．８ｍＬに溶解した。次に、０．２ｍＬのＤＭＳＯに６．０ｍｇのＮ−アクリロキシスクシンイミドを溶解し、前記ホウ酸緩衝液にゆっくりと加え、４℃で１０時間反応させた。その後、４℃下において、セファデックスＧ２５カラムを用いて、アクリロイル基を導入したアクリロイル化ＢＯＤを精製した。
【００５１】
＜ＢＯＤのアクリルロイル化率の測定＞
実施例１と同様の方法でＢＯＤのアクリルロイル化率を測定したところ、前記で導入したアクリルロイル化ＢＯＤのアクリルロイル化率は６０．６％であった。
【００５２】
＜共重合＞
４℃下において、バイアルの中で全体が３．５ｍＬになるようにアクリロイル化ＢＯＤとＥＤＴＡを混ぜ、窒素を除去した。次に、硫酸アンモニウム（３ｍｇ）を除酸素した脱イオン水３０μＬに溶解した溶液と、N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン３μＬをバイアルの中に加え、アクリロイル化ＢＯＤの表面において重合を開始した。
【００５３】
その後、４℃下において、アクリルアミドとN,N'-メチレンビスアクリルアミドをモル比１０：１で混合したものを除酸素した脱イオン水０．５ｍＬに溶解し、前記アクリロイル化ＢＯＤ溶液に均一に加え６０分間反応させた。更に、４℃、窒素存在下で６０分間反応させた。最後にセファデックスＧ７５カラムを用いて、被覆されたＢＯＤ（以下「被覆ＢＯＤ３」と称する。）を精製した。なお、被覆ＢＯＤ３のアクリルアミドとN,N'-メチレンビスアクリルアミドの混合物と、ＢＯＤのモル比は４００：１であった。
【００５４】
精製した被覆ＢＯＤ３を用い、アクリルアミドとN,N'-メチレンビスアクリルアミドの混合物と、ＢＯＤをモル比４００：１で更に上記の方法を繰り返し行い、被覆されたＢＯＤ（以下「被覆ＢＯＤ４」と称する。）を得た。
【００５５】
コントロールとして、被覆を行わず、被覆ＢＯＤ４を作製する過程と同時間、２５℃下で保存したＢＯＤ（以下「フリーＢＯＤ２」と称する。）、及び、被覆ＢＯＤ４を作製する過程と同時間、４℃下で保存したＢＯＤ（以下「フリーＢＯＤ３」と称する。）を用いた。
【００５６】
＜酵素活性の測定＞
上記で得た被覆ＢＯＤ３、４、フリーＢＯＤ２、及び３のミカエリス定数（ＫＭ）、反応速度定数（ｋcat）を、以下の表４の条件下で測定した。基質にはＡＢＴＳ（2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt）を用いた。なお、各ＢＯＤのタンパク量は、BCA colorimetric protein assayを用いて標準タンパク質のＢＳＡの検量線から求めた。
【表４】
2009044997.tif 000010
【００５７】
結果を図５に示す。図５は、ミカエリスメンテン式でフィッティングを行った被覆ＢＯＤ３、４、フリーＢＯＤ２、及び３の基質濃度と酵素活性の関係を示す図面代用グラフである。また、図５から得られた被覆ＢＯＤ３、４、フリーＢＯＤ２、及び３のミカエリス定数（ＫＭ）、反応速度定数（ｋcat）を表５に示す。
【表５】
2009044997.tif 000011
【００５８】
被覆ＢＯＤ３、４とフリーＢＯＤ２、３のミカエリス定数（ＫＭ）、反応速度定数（ｋcat）を比較してみると、ミカエリス定数（ＫＭ）に関しては、被覆ＢＯＤ３、４がフリーＢＯＤ２、３の約２倍になり、反応速度定数（ｋcat）に関しては、被覆ＢＯＤ３、４がフリーＢＯＤ２の約３分の１倍、フリーＢＯＤ３の約４分の１倍になったことが確認できた。
【００５９】
＜耐熱性試験―熱処理時間依存性＞
４６．５ｍＭ、ｐＨ７．０のリン酸ナトリウム溶液に、それぞれ被覆ＢＯＤ３を１．１４μＭ、被覆ＢＯＤ４を１．９８μＭ、フリーＢＯＤ２を０．３６２μＭ、フリーＢＯＤ３を０．３７７μＭ溶解し、６５℃のホットプレート上で熱処理を行った。熱処理後、表６に記載の条件の下、酵素活性を測定した。
【表６】
2009044997.tif 000012
【００６０】
結果を図６、図７に示す。図６は、上記数式１の速度解析式でフィッティングを行った被覆ＢＯＤ３、４、フリーＢＯＤ２、及び３の熱処理時間と酵素活性の関係を示す図面代用グラフである。図７は、数式１の速度解析式でフィッティングを行った被覆ＢＯＤ３、４、フリーＢＯＤ２、及び３の熱処理時間と残存活性の関係を示す図面代用グラフである。
【００６１】
図７に示す通り、被覆ＢＯＤ３、４の熱処理時間増加に伴う残存活性の曲線は、フリーＢＯＤ２、３の熱処理時間増加に伴う残存活性の曲線に比べ、グラフ中時間軸増加方向にずれていることが分かる。即ち、被覆ＢＯＤ３、４は、熱処理時間に対する耐熱性が向上していることが確認できた。
【００６２】
＜耐熱性試験―熱処理温度依存性＞
４６．５ｍＭ、ｐＨ７．０のリン酸ナトリウム溶液に、被覆ＢＯＤ３、４、フリーＢＯＤ２、及び３を溶解し、それぞれ約１．９μＭになるように調整した。調整溶液を２５、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０℃の各温度のホットプレート上で、１０分間熱処理を行った。熱処理後、上記表６に記載の条件の下、酵素活性を測定した。
【００６３】
結果を図８、図９、図１０に示す。図８は、被覆ＢＯＤ３、４、フリーＢＯＤ２、及び３の熱処理温度と酵素活性の関係を示す図面代用グラフである。図９は、被覆ＢＯＤ３、４、フリーＢＯＤ２、及び３の熱処理温度と残存活性の関係を示す図面代用グラフである。図１０は、図９の５０℃〜７０℃の範囲を拡大した図面代用グラフである。
【００６４】
図９に示す通り、被覆ＢＯＤ３、４の熱処理温度増加に伴う残存活性の曲線は、フリーＢＯＤ２、３の熱処理温度増加に伴う残存活性の曲線に比べ、熱処理温度が増加するにつれてグラフ中温度軸増加方向にずれていることが分かる。即ち、被覆ＢＯＤ３、４は、熱処理温度に対する耐熱性が向上していることが確認できた。
【００６５】
また、残存活性が５０％になる熱処理温度をＴｍ（変性中点）と定義し、図１０より各ＢＯＤのＴｍ（変性中点）を求めた。結果を表７に示す。
【表７】
2009044997.tif 000013
【００６６】
表７に示す通り、Ｔｍ（変性中点）は、被覆ＢＯＤ３、４の方がフリーＢＯＤ２、３に比べ、高温になっていることが分かる。即ち、被覆ＢＯＤ３、４は、熱処理温度に対する耐熱性が向上していることが確認できた。
【００６７】
実施例１の方法（従来技術）でＢＯＤを被覆した場合も実施例２の方法でＢＯＤを被覆した場合も、耐熱性の向上は認められた。しかし、実施例１の方法（従来技術）でＢＯＤを被覆した場合は、酵素活性の著しい低下が認められたのに対し、実施例２の方法でＢＯＤを被覆した場合は、酵素活性の低下を抑制することが確認できた。
【００６８】
従って、ＢＯＤの被覆方法において、重合性官能基の導入工程と共重合工程を低温で行えば、ＢＯＤの酵素活性の低下を抑制しつつ、耐熱性を向上させることが可能であることが分かった。
【実施例３】
【００６９】
実施例３では、本発明に係るＢＯＤの被覆方法の温度の上限を計算した。
【００７０】
実施例１で示した通り、２５℃においてＢＯＤの被覆を行うと、ＢＯＤの酵素活性が約１００分の１と著しく減少した。一方、実施例２で示した通り、４℃においてＢＯＤの被覆を行うと、酵素活性の低下を約４分の１に抑制することができた。そこで、ＢＯＤ被覆の過程の温度Ｔ（℃）とＢＯＤの残存活性の割合に図１１のような関係があると仮定できた。
【００７１】
そして、産業上利用可能なＢＯＤ活性減少量を１０分の１倍とすると、ＢＯＤ被覆の過程の温度Ｔ（℃）の上限は約１７℃と設定できた。更に、より好適な温度としては、ＢＯＤ活性減少量を５分の１倍とすると、ＢＯＤ被覆の過程の温度Ｔ（℃）の上限は約８℃と設定できた。
【実施例４】
【００７２】
実施例４では、本発明に係る被覆方法を用いて被覆を行ったＢＯＤの有機溶媒耐性を調べた。
【００７３】
１５％のメタノールを含んだ４６．５ｍＭ、ｐＨ７．０のリン酸ナトリウム溶液に、実施例２で得た被覆ＢＯＤ３、４、及びフリーＢＯＤ２をそれぞれ１．６μＭ溶解し、６０℃で１０分間熱処理を行った。熱処理後、下記表８に記載の条件の下、酵素活性を測定した。
【表８】
2009044997.tif 000014
【００７４】
結果を図１２に示す。図１２に示す通り、フリーＢＯＤ２の有機溶媒処理後の残存活性は約１２％であるのに対し、被覆ＢＯＤ３は約１４％、被覆ＢＯＤ４は約２０％であった。この結果から、有機溶媒耐性は、フリーＢＯＤ２に対し、被覆ＢＯＤ３は約２％、被覆ＢＯＤ４は約８％上昇することが分かった。
【００７５】
実施例４では、本発明に係る被覆方法を用いてＢＯＤを被覆することにより、ＢＯＤの有機溶媒耐性を向上させることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明に係る被覆方法を用いれば、被覆したビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）の酵素活性の低下を抑制しつつ、熱や有機溶媒に対する安定性を向上させることができる。
【００７７】
本発明に係る被覆方法を用いて被覆したビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）を燃料電池の酵素電極に用いれば、安定性、耐久性の高い燃料電池を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】本発明に係るビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）の被覆方法の概要を示す図である。
【図２】ミカエリスメンテン式でフィッティングを行った被覆ＢＯＤ１、２、及びフリーＢＯＤ１の基質濃度と酵素活性の関係を示す図面代用グラフである。
【図３】数式１の速度解析式でフィッティングを行った被覆ＢＯＤ１、２、及びフリーＢＯＤ１の熱処理時間と酵素活性の関係を示す図面代用グラフである。
【図４】数式１の速度解析式でフィッティングを行った被覆ＢＯＤ１、２、及びフリーＢＯＤ１の熱処理時間と残存活性の関係を示す図面代用グラフである。
【図５】ミカエリスメンテン式でフィッティングを行った被覆ＢＯＤ３、４、フリーＢＯＤ２、及び３の基質濃度と酵素活性の関係を示す図面代用グラフである。
【図６】数式１の速度解析式でフィッティングを行った被覆ＢＯＤ３、４、フリーＢＯＤ２、及び３の熱処理時間と酵素活性の関係を示す図面代用グラフである。
【図７】数式１の速度解析式でフィッティングを行った被覆ＢＯＤ３、４、フリーＢＯＤ２、及び３の熱処理時間と残存活性の関係を示す図面代用グラフである。
【図８】被覆ＢＯＤ３、４、フリーＢＯＤ２、及び３の熱処理温度と酵素活性の関係を示す図面代用グラフである。
【図９】被覆ＢＯＤ３、４、フリーＢＯＤ２、及び３の熱処理温度と残存活性の関係を示す図面代用グラフである。
【図１０】図９の50℃〜70℃の範囲を拡大した図面代用グラフである。
【図１１】ＢＯＤ被覆の過程の温度Ｔ（℃）とＢＯＤの残存活性の割合を示す図面代用グラフである。
【図１２】有機溶媒処理後の各ＢＯＤの残存活性を示す図面代用グラフである。
【符号の説明】
【００７９】
１  ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）分子
２  重合性官能基
【図１】
2009044997.tif 000015
【図２】
2009044997.tif 000016
【図３】
2009044997.tif 000017
【図４】
2009044997.tif 000018
【図５】
2009044997.tif 000019
【図６】
2009044997.tif 000020
【図７】
2009044997.tif 000021
【図８】
2009044997.tif 000022
【図９】
2009044997.tif 000023
【図１０】
2009044997.tif 000024
【図１１】
2009044997.tif 000025
【図１２】
2009044997.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】平成20年9月9日(2008.9.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
ビリルビンオキシダーゼ（Bilirubin oxidase（ＢＯＤ））は、マルチ銅オキシダーゼ（複数の銅イオンを活性中心に持つ酵素の総称）に属する酵素の一種であり、ビリルビンからビリベルジンへの酸化反応を触媒する酵素である。この酵素は、従来から臨床検査の場面における肝機能等の検査試薬（血清中のビリルビンの測定試薬）として広く使用されている。例えば、特許文献１には、１００ｍＭ〜８００ｍＭのカリウムイオン共存下において、試料にビリルビンオキシダーゼを作用させ、該試料の光学的変化により試料中の直接型ビリルビンを測定する方法が開示されている。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
重合性官能基２は、ＢＯＤ分子の表面に導入可能な重合性官能基２であれば特に限定されない。例えば、ラジカル重合性、カチオン重合性、アニオン重合性、付加重合性、縮合重合性のいずれであってもよい。具体的な重合性官能基２としては、アクリロイル基、メタクリロイル基、ビニル基、アリル基、プロペニル基、アクリルアミド基、ビニルアミド基、ビニリデン基、ビニレン基等が挙げられる。一例として、ＢＯＤ分子にアクリロイル基を導入する場合の重合性官能基導入工程Ｉを下記の化学式１で示す。なお、ＢＯＤ分子表面のアミノ基とアクリロイル基の共有結合の状態を分かりやすくするために、ＢＯＤ分子表面のアミノ基を具体的に記載する。
【化１】
2009044997.tif 000027
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
＜ＢＯＤのアクリロイル化率の測定＞
０．１ｍｇ／ｍＬフルオレスカミン（１．５ｍＬのアセトンに溶解）に対し、前記で精製したアクリロイル化ＢＯＤ（０．１Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ８．０に溶解）を０．５ｍＬ加え、２５℃で７分間反応させた。その後、分光蛍光光度計を用い、励起波長３９０ｎｍ、発光波長４８３ｎｍにおける蛍光強度を測定した。未反応のアミン残基の量を測定するために、重合性官能基が導入されていないＢＯＤ（以下「フリーＢＯＤ」と称する。）をコントロールとして用いた。前記で導入したアクリロイル化ＢＯＤのアクリロイル化率は５５．９％であった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
＜共重合＞
バイアルの中で、全体が３．５ｍＬになるようにアクリロイル化ＢＯＤと４−ジメチルアミノアンチピリンを混ぜ、酸素を除去した。次に、硫酸アンモニウム（３ｍｇ）を除酸素した脱イオン水３０μＬに溶解した溶液と、N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン３μＬをバイアルの中に加え、アクリロイル化ＢＯＤの表面において重合を開始した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
＜ＢＯＤのアクリロイル化率の測定＞
実施例１と同様の方法でＢＯＤのアクリロイル化率を測定したところ、前記で導入したアクリロイル化ＢＯＤのアクリロイル化率は６０．６％であった。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
＜共重合＞
４℃下において、バイアルの中で全体が３．５ｍＬになるようにアクリロイル化ＢＯＤとＥＤＴＡを混ぜ、酸素を除去した。次に、硫酸アンモニウム（３ｍｇ）を除酸素した脱イオン水３０μＬに溶解した溶液と、N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン３μＬをバイアルの中に加え、アクリロイル化ＢＯＤの表面において重合を開始した。