(57)【要約】【課題】単球を含む細胞懸濁液から、簡便且つ選択的に単球を分離するデバイス、及び該デバイスを使用し、簡便、選択的で且つ高効率な単球ならびに樹状細胞の調製方法を提供すること。【解決手段】細胞非付着用剤として細胞回収容器などにコート剤として用いられてきたポリマーをシャーレなどの細胞と一定時間相互作用を保つことができる基材に被覆した場合に、細胞付着抑制能とは正反対の機能である単球を選択的に接着させる能力を有することが明らかとなった。  即ち、単球を含む細胞懸濁液から、簡便且つ選択的に単球を分離するデバイス、及び該デバイスを使用し、簡便、選択的で且つ高効率な単球ならびに樹状細胞の調製方法を見出した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも単球を含有する細胞懸濁液から単球を選択的に捕捉する単球分離方法であって、デバイス表面を側鎖に官能基を有するポリマーにてコーティングした単球捕捉用デバイスを用い、次の（a）〜（ｃ）の順に処理することを特徴とする単球分離方法：
・  単球を含有する細胞懸濁液を単球捕捉用デバイスに添加する、
・  ３７℃でインキュベートを行い、単球を捕捉する、
・  不要な非付着細胞を除く。
【請求項２】
官能基が、感光性の反応基を含むものである請求項１記載の単球分離方法。
【請求項３】
感光性の反応基が、窒素原子を含む反応基である請求項２記載の単球分離方法。
【請求項４】
窒素原子を含む反応基が、アジド基である請求項３記載の単球分離方法。
【請求項５】
ポリマーが、水溶性である請求項１〜４のいずれかに記載の単球分離方法。
【請求項６】
水溶性ポリマーが、デンプン、ゼラチン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドの中から選ばれる１種以上を含む請求項５記載の単球分離方法。
【請求項７】
単球を含有する細胞懸濁液が体液成分である請求項１〜６のいずれかに記載の単球分離方法。
【請求項８】
体液成分が血漿であることを特徴とする請求項７記載の単球分離方法。
【請求項９】
請求項１〜８いずれかに記載の単球分離方法を用いて調製された単球濃縮画分。
【請求項１０】
請求項１〜８いずれかに記載の単球分離方法によって捕捉された単球を、回収せずに分化誘導し樹状細胞にすることを特徴とする樹状細胞調製方法。
【請求項１１】
少なくとも単球を含有する細胞懸濁液から単球を選択的に捕捉するデバイスであって、該デバイスの表面が側鎖に官能基を有するポリマーにてコーティングされていることを特徴とする単球捕捉用デバイス。
【請求項１２】
官能基が、感光性の反応基を含むものである請求項１１記載の単球捕捉用デバイス。
【請求項１３】
感光性の反応基が、窒素原子を含む反応基である請求項１２記載の単球捕捉用デバイス。
【請求項１４】
窒素原子を含む反応基が、アジド基である請求項１３記載の単球捕捉用デバイス。
【請求項１５】
ポリマーが、水溶性である請求項１１〜１４のいずれかに記載の単球捕捉用デバイス。
【請求項１６】
水溶性ポリマーが、デンプン、ゼラチン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドの中から選ばれる１種以上を含む請求項１５記載の単球捕捉用デバイス。
【請求項１７】
請求項１１〜１６のいずれかに記載の単球捕捉用デバイスを用いて調製された単球濃縮画分。
【請求項１８】
容器にポリマーを塗布し、ポリマー被膜層を形成させる処理１と、
紫外線を照射し、容器にポリマーを結合させる処理２と、
以上の順に処理を行うことを特徴とする請求項１１〜１６のいずれかに記載の単球捕捉用デバイスの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単球を含む細胞懸濁液から、単球を選択的に捕捉するデバイス、該デバイスによって調製された画分、単球及び樹状細胞の調製方法、該デバイスの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、血液や骨髄等に含まれる細胞を分離し、血管などの組織再生ならびにガン患者の免疫賦活を目的として移植する細胞治療が実用化されている。これに伴って、治療に有効な細胞を選択的に分離する材料、デバイスが種々開発されている。血液に代表される体液中に存在する細胞の中で、単球は、血管再生能を有すると共に（非特許文献１，２）細胞免疫療法のひとつである樹状細胞療法における樹状細胞の前駆細胞として注目されている（非特許文献３）。
【０００３】
血液等の体液から単球を分離する代表的な方法として、１）細胞の比重差を利用して分離する比重密度勾配遠心法やアフェレーシス等によって、末梢血から単球を含んだ血液成分を分離し、付着性の高い単球をポリスチレン製フラスコなどの理化学器具に付着させ、非付着性細胞の除去を行うことによって単球を分離する方法、２）単球に対する抗体を結合した磁気ビーズを利用して、単球を選択的に分離する方法（磁気ビーズ法）、３）傾斜を持つチャンバー内に細胞浮遊液を入れて遠心し、一方では緩衝液を遠心と逆方向に流すことで特定の細胞層を形成させる方法（エルトリエーション法）、等が挙げられる。ここで分離された単球は、IL−４、GM−CSFなどのサイトカインを加えて培養することによって樹状細胞に分化誘導が可能であり、癌治療用細胞として使用されている。
【０００４】
しかし、上記した単球の付着性を利用した単球分離工程においては、非付着性細胞の除去が十分でなく、不要細胞の混入が生じることや、分離効率が悪いこと等、問題を抱えている。磁気ビーズ法は、単球を比較的高純度に分離することができるが、処理に長時間を要し、また高価であることが問題視されている。この問題はエルトリエーション法においても同様である。
【０００５】
一方、細胞の接着を防ぐ目的でポリマー等をコートすることが知られている。（特許文献１）しかしこれらのポリマーを単球分離に使用することは全く報告されていない。
【非特許文献１】Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，ｖｏｌ．１００，Ｎｏ．５：２４２６−２４３１，２００３．
【非特許文献２】Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓｅｒｃｈ，４９（３）：６７１−６８０，２００１．
【非特許文献３】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ｖｏｌ．５９：５６−５８．１９９９．
【特許文献１】特開２００６−２０４２３２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、単球を含む細胞懸濁液から、簡便且つ選択的に単球を分離するデバイスの提供、また、該デバイスを使用し、簡便で且つ高効率な単球ならびに樹状細胞の調製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するために、鋭意検討を行った。その結果、従来、細胞非付着用剤として細胞回収容器などにコート剤として用いられてきたポリマーをシャーレなどの細胞と一定時間相互作用を保てる基材に被覆した場合、驚くべきことに、従来報告されている肝、腎細胞などの付着抑制能とは正反対の機能である単球を接着させる能力があることが明らかとなった。
【０００８】
即ち、単球を含む細胞懸濁液から、簡便且つ選択的に単球を分離するデバイス、及び該デバイスを使用し、簡便、選択的で且つ高効率な単球ならびに樹状細胞の調製方法を見出し、本発明を完成させるに至った。本発明は、かかる新規知見に基づいて完成されたものであり、以下の発明を包含する：
［１］
少なくとも単球を含有する細胞懸濁液から単球を選択的に捕捉する単球分離方法であって、デバイス表面を側鎖に官能基を有するポリマーにてコーティングした単球捕捉用デバイスを用い、次の（a）〜（ｃ）の順に処理することを特徴とする単球分離方法：
・  単球を含有する細胞懸濁液を単球捕捉用デバイスに添加する
・  ３７℃でインキュベートを行い、単球を捕捉する
・  不要な非付着細胞を除く
［２］
官能基が、感光性の反応基を含むものである［１］記載の単球分離方法。
［３］
感光性の反応基が、窒素原子を含む反応基である［２］記載の単球分離方法。
［４］
窒素原子を含む反応基が、アジド基である［３］記載の単球分離方法。
［５］
ポリマーが、水溶性である［１］〜［４］のいずれかに記載の単球分離方法。
［６］
水溶性ポリマーが、デンプン、ゼラチン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドの中から選ばれる１種以上を含む［５］記載の単球分離方法。
［７］
単球を含有する細胞懸濁液が体液成分である［１］〜［６］いずれかに記載の単球分離方法。
［８］
体液成分が血漿であることを特徴とする［７］記載の単球分離方法。
［９］
［１］〜［８］いずれかに記載の単球分離方法を用いて調製された単球濃縮画分。
［１０］
請求項１〜８いずれかに記載の単球分離方法によって捕捉された単球を、回収せずに分化誘導し樹状細胞にすることを特徴とする樹状細胞調製方法。
［１１］
少なくとも単球を含有する細胞懸濁液から単球を選択的に捕捉するデバイスであって、該デバイスの表面が側鎖に官能基を有するポリマーにてコーティングされていることを特徴とする単球捕捉用デバイス。
［１２］
官能基が、感光性の反応基を含むものである［１１］記載の単球捕捉用デバイス。
［１３］
感光性の反応基が、窒素原子を含む反応基である［１２］記載の単球捕捉用デバイス。
［１４］
窒素原子を含む反応基が、アジド基である［１３］記載の単球捕捉用デバイス。
［１５］
ポリマーが、水溶性である［１１］〜［１４］のいずれかに記載の単球捕捉用デバイス。
［１６］
水溶性ポリマーが、デンプン、ゼラチン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドの中から選ばれる１種以上を含む［１５］記載の単球捕捉用デバイス。
［１７］
［１１］〜［１６］のいずれかに記載の単球捕捉用デバイスを用いて調製された単球濃縮画分。
［１８］
容器にポリマーを塗布し、ポリマー被膜層を形成させる処理１と、
紫外線を照射し、容器にポリマーを結合させる処理２と、
以上の順に処理を行うことを特徴とする［１１］〜［１６］のいずれかに記載の単球捕捉用デバイスの製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、単球を含む細胞懸濁液から簡便かつ選択的に単球を分離するデバイスを作製し、該デバイスを使用し、簡便で選択的に高効率で単球ならびに樹状細胞を調製することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明について、以下具体的に説明する。
本発明における単球を含む細胞懸濁液とは、少なくとも単球が懸濁された液体を指し、末梢血液、骨髄液、臍帯血液、等の体液そのもの、または前記液群のアフェレーシス等によって処理された遠心分離処理産物、または所望によりフィコール、パーコール、バクティナーチューブ、リフォプレップ、ＨＥＳ（ヒドロキシエチルスターチ）などを使用し、比重密度遠心分離処理を施した単球を含む細胞画分を、血漿、血清等の体液成分、生理食塩水、リン酸バッファー等の緩衝液、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＡＩＭ−Ｖ等の細胞培養培地等で懸濁したものを指す。
【００１１】
本発明における単球捕捉用デバイスとは、官能基を有するポリマーから構成されていることを特徴とする。材料表面の少なくとも一部が糖構造を有する物質から構成されているとは、１）デバイス材料自体が該ポリマーで構成されている場合、または、２）デバイスの基材と該ポリマーが異なり、デバイスの表面の全てまたは一部が、該ポリマーで構成される場合、が挙げられる。
【００１２】
本発明における官能基を有するポリマーは、基材の表面に固定化または被覆できるものであれば特に限定されないが、基材からの溶出を抑止するという観点から、基材表面に化学的に固定可能なポリマーであることが好ましい。例示すると、ポリマーは感光性の反応基、放射線反応性の反応基、電子線反応性の反応基、感熱性の反応基、等を含むことが好ましく、中でも、簡易な製造設備で製造可能なことから感光性の反応基を含むことが最も好ましい。また、該ポリマーは、基材への影響が少ない溶媒に溶解可能であることが好ましく、感光性の反応基としては窒素原子を含むことが好ましく、窒素原子反応基はアジド基であることが好ましい。中でも水溶性ポリマーが最も好ましい。水溶性ポリマーとして例示すると、デンプン、ゼラチン等の天然ポリマー、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース等の半合成ポリマー、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド等の合成ポリマー等が挙げられる。
【００１３】
本発明において、ポリマーに単球との相互作用を高める成分を混合しても良く、混合成分としては、単球がレセプターを持つことで知られるマンノースが例として挙げられる。ポリマーとの反応性を考えるとマンノースには適当な官能基を持たせることが好ましく、例えばアミノ基、カルボキシル基等を持つことが好ましい。混合方法は、物理的に混合してから基材へ固定化を行っても良いし、ポリマーを基材に固定化した後、カルボジイミドに代表される縮合剤を用いて表面に固定化しても良い。
【００１４】
本発明のデバイスの基材としては、シャーレ、フラスコ、プレート、バッグ、カートリッジ、カセットなど平板構造を有する器具、あるいは連通孔を持つ構造体、例えば不織布、繊維、多孔体、球状担体などが挙げられ、特に形態は限定されないが、細胞が一定時間デバイス表面のポリマーと相互作用できるような構造が好ましい。
【００１５】
本発明のデバイスの基材が、シャーレ、フラスコ、プレート、バッグ、カートリッジ、カセットなどの場合には、その形態、大きさは特に限定されない。材質としても特に限定されないが、非反応性ポリマーまたは生物親和性金属あるいはその合金などが好ましい。または、これら非反応性ポリマーや生物親和性金属でコートあるいはメッキされた材料でも良い。具体的には、該ポリマーとして、アクリロニトリルブタジエンスチレンターポリマー等のアクリロニトリルポリマー、ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、コポリマーテトラフルオロエチレンまたはヘキサフルオロプロピレン等のハロゲン化ポリマー、ポリアミド、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリドアクリルコポリマー、ポリカーボネートアクリロニトリルブタジエンスチレン、スチレンブタジエンコポリマー、ポリスチレン等が挙げられる。金属材料としては、ステンレス鋼、チタン、白金、タンタル、金、またはそれらの合金、並びに金メッキ合金鉄、白金メッキ合金鉄、コバルトクロミウム合金、または窒化チタン被覆ステンレス鋼などが挙げられる。また、シリコンコートされたガラスであっても良い。とくに好ましくは耐滅菌性を有する素材であるが、具体的にはシリコンコートされたガラス、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリサルフォン、ポリメチルペンテンなどがあげられる。
【００１６】
また、本発明のデバイスの基材として、シャーレ、フラスコ、プレート、バッグ、カートリッジ、カセットなどを用いる場合、ガス透過性構造を有する材料が好ましい。ガス透過性構造を有する材料として、コンタミネーションの抑制が可能な程度の微細な孔構造やスリット構造を有するものや、材質的にガス透過性が高い素材が挙げられる。ガス透過性が高い素材としては、例えばポリメチルペンテン、環状ポリオレフィン、オレフィン系熱可塑性エラストマー、スチレン系熱可塑性エラストマー、ポリアミド系熱可塑性エラストマーなどが挙げられるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１７】
本発明のデバイスの基材として、不織布状、または多孔体状の場合には、その平均孔径は例えば、９μｍ〜８０μｍの範囲が好ましく、その素材としては、特に限定されないが、例えば、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリオレフィン、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ナイロン、ポリイミド、アラミド、ポリアミド、アクリル樹脂等に代表される合成高分子、キチン、キトサン、酢酸セルロース、セルロース、レーヨン、アガロース、アルギン酸等に代表される天然高分子、ハイドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ等に代表される無機材料、ステンレス、チタン等に代表される金属等が挙げられる。
【００１８】
多孔状の形態は、スポンジ状、フエルト状、綿状、繊維状、粒子状、パイプ状、円盤状、円筒状などのいずれの形態であっても良い。デバイスの基材が球形担体の場合、粒径は１０μｍ〜２０００μｍが好ましく、処理効率からより好ましくは７０μｍ〜１０００μｍである。その素材としては、例えば、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレン、エチレン−酢酸ビニル共重合体ケン化物、架橋ポリアクリル酸、架橋ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレンなどの合成高分子化合物や結晶性セルロース、架橋セルロース、セルロース誘導体、架橋アガロース、架橋デキストリン、キチン、キトサンなどの多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組合せによって得られる、有機−有機、有機−無機などの複合担体などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
本発明のデバイスは、液体入口および／または液体出口を有する容器に充填したものであっても良い。該容器の形態、材質、大きさにはとくに限定されず、コンテナ、バッグ、チューブ、カラム、カセット、フラスコなど任意の形態であってよい。本発明のデバイスの一例を挙げると、容量約０．１〜５００ｍｌ程度、直径約０．１〜１０ｃｍ程度の透明または半透明の筒状容器に、球状担体などの連通孔を有する構造体を充填し、カラム形状とすることなどがあげられ、該カラムは単球選択的なデバイスとして本発明に含まれる。該デバイスは、体液流入口および体液流出口のある容器に体液流入口と体液流出口を仕切るように装着・充填し、フィルターまたはクロスフロー型モジュールとすることが好ましく、該フィルターおよびクロスフロー型モジュールも単球選択的な分離デバイスとして本発明に含まれる。また容器に不織布、多孔体を装着・充填する場合は、単層もしくは複数枚積層することができ、また材料表面が糖構造を有する物質から構成されていない材料と組み合わせて装着・充填することもできる。
【００２０】
本発明のデバイスの容器素材としては、特に限定されるものではないが、非反応性ポリマーまたは生物親和性金属あるいはその合金などが使用される。または、これら非反応性ポリマーや生物親和性金属でコートあるいはメッキされた材料でも良い。具体的には、該ポリマーとして、アクリロニトリルブタジエンスチレンターポリマー等のアクリロニトリルポリマー、ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、コポリマーテトラフルオロエチレンまたはヘキサフルオロプロピレン等のハロゲン化ポリマー、ポリアミド、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリドアクリルコポリマー、ポリカーボネートアクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリスチレン等が挙げられる。金属材料としては、ステンレス鋼、チタン、白金、タンタル、金、およびそれらの合金、並びに金メッキ合金鉄、白金メッキ合金鉄、コバルトクロミウム合金、および窒化チタン被覆ステンレス鋼などが挙げられる。また、シリコンコートされたガラスであっても良い。とくに好ましくは耐滅菌性を有する素材であるが、具体的にはシリコンコートされたガラス、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリサルフォン、ポリメチルペンテンなどが挙げられる。
【００２１】
本発明において調製された単球は、血管再生や樹状細胞への分化誘導など、再生医療、細胞医療分野に使用される。
【００２２】
以下に該デバイスの処理工程の詳細について、代表的な形態を例に説明する。
【００２３】
＜デバイスまたはその基材が、シャーレ、フラスコ、プレート、バッグ、カートリッジ、カセットなどの場合＞
１）デバイスへの体液の接触工程； 
対象となる単球を含む細胞懸濁液を、シャーレ、フラスコ、プレート、バッグ、カートリッジ、カセットなどを基材とする本発明のデバイスに注入後、５分から１２０分間、静置、旋回、または振とうすることにより該デバイスと該懸濁液の接触を行う。単球の安定した捕捉および細胞に対するダメージを少なくするという観点より、接触時間は１５分から９０分の間がより好ましい。
【００２４】
２）非捕捉細胞の洗浄工程；
デバイスと該懸濁液を所定時間接触後、該懸濁液とともに非捕捉着細胞をデバイスより除去する。該懸濁液の除去方法は、ピペットやシリンジにて吸引する、あるいはデカンテーションなどにて除去する方法が挙げられる。該懸濁液を除去後、生理食塩液または培養液、緩衝溶液などを再度デバイスに注入し、細胞付着面を洗浄後、上清を前記方法にて除去することにより、非接着細胞の洗浄・除去を行う。非接着細胞の除去が不十分な場合は、該操作を数回繰り返すことにより、非接着細胞の洗浄を行うことができる。
【００２５】
＜不織布、繊維、多孔体、球状担体など連通孔を有する構造体を容器に充填したデバイスの場合＞
１）デバイスへの単球を含む細胞懸濁液の接触工程；
該懸濁液と該デバイスとの接触は、デバイスに該懸濁液を通液させることで行う。本発明における該懸濁液の通液方法は、本発明の該デバイスの液体入口から体液を導入し、一定方向に通液させることをいう。体液を導入する手段は、シリンジポンプ、ペリスタポンプ等の機械を用いる方法や、シリンジを用いた手動通液、高低差を利用した自然落下処理等が挙げられるが、この限りではない。通液の速度は、０．１ｍｌ／ｍｉｎ〜１００ｍｌ／ｍｉｎの間が好ましく、体液を該デバイスに１回通液させてもよいし、循環処理にて複数回接触させてもよい。
【００２６】
２）非捕捉細胞の洗浄工程；
非捕捉細胞を洗浄液で洗浄する方法は、デバイスに洗浄液を液体入口から（体液流入方向と同一方向）、あるいは液体出口から（体液流入方向と逆方向）通液させることをいう。細胞洗浄液の例としては、生理的食塩液、リンゲル液、リン酸緩衝液等の緩衝液、ＲＰＭＩ１６４０等の細胞培養用培地が挙げられるが、この限りではない。洗浄液を導入する手段は、シリンジポンプ、ペリスタポンプ等の機械を用いる方法や、シリンジを用いた手動通液、高低差を利用した自然落下処理等が挙げられるが、この限りではない。ポンプにより通液する場合の流速は、０．１ｍｌ／ｍｉｎ〜１００ｍｌ／ｍｉｎ程度が挙げられる。洗浄液量は、該デバイスの材料や容積により異なるが、容積の約１〜５倍程度の体積で洗浄することが好ましい。
【００２７】
このようにして得られた単球は、デバイスから回収しても良く、回収方法としては、デバイスを冷却する、物理的な衝撃を与える、回収液によって回収する、などが挙げられる。ここでいうデバイスの冷却とは、デバイスと単球との相互作用を弱めることを目的にデバイスを冷却することを指す。冷却温度は、０℃以下では単球が凍結してしまうため、＜０〜１０℃が好ましい。
【００２８】
前記物理的な衝撃とは、デバイスを叩いたり、揺することを指し、その衝撃で単球を剥離させる。前記した回収液による回収は、トリプシン、コラゲナーゼ、リパーゼに代表される酵素液の酵素反応、高粘度液のピペッティング、浸透圧の異なる液による剥離、糖等によるアフィニティ、等を利用することが出来る。以上、単球の回収方法を列挙したが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２９】
本発明における樹状細胞の調製方法としては、以下の方法が例示できるが、本発明はこの限りではない。
【００３０】
１）デバイスに単球を含む細胞懸濁液を接触させて単球を捕捉させる工程、
２）非捕捉細胞を洗浄液で洗浄する工程、
３）捕捉された単球を分化誘導する工程、
３）の分化誘導の工程に関して、詳細な説明を以下に例示する。
【００３１】
非捕捉細胞の洗浄工程を行った後、ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−４含有培養液を添加し、約１週間培養することによりデバイス中に捕捉されている単球を、未熟樹状細胞に分化させる。その後、ＩＬ−１β，ＰＧＥ２，ＩＬ−６，ＴＮＦ−αを含む培養液にて、約１週間培養することにより成熟樹状細胞に分化誘導することができる。また必要に応じ、癌抗原の添加に代表される抗原提示能を獲得させる工程を経て、癌抗原を提示させた樹状細胞を分化誘導することもできる。
【００３２】
以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【実施例】
【００３３】
（実施例１）
（１）単球分離デバイスの調製
水溶性ポリマーとして、側鎖にアジド基を有するポリビニルアルコール（東洋合成工業社製  Biosurfine-AWP）を、１０％エタノールを用いて１％（Ｗ／Ｖ）の濃度に調製した。該溶液を市販の１ｍｌポリスチレンシャーレ（直径３５ｍｍ）に１００μＬ添加し、シャーレ表面に広げた後、室温で約１２Ｈｒ静置した。次に、ＵＶランプでＵＶ光（波長：２８０〜３８０ｎｍ、照度：２０２．５ｍＪ／ｃｍ２）を照射し、ポリマーの硬化を行った。次に、純水５００ｍｌにてシャーレのポリマー固定化面を洗浄し、乾燥を行うことで単球分離デバイスを調製した。
【００３４】
（２）単球の分離
健常人末梢血液を採取し、Ｆｉｃｏｌｌ（ＧＥヘルスケア製  Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ）を用いて単核球を分取した。また、該血液を遠心分離し、血漿を採取した。該単核球を該血漿にて懸濁し、所定濃度の単核球懸濁液を調製した。
【００３５】
次に、調製した単核球懸濁液１ｍｌ（有核細胞数５．０×１０６cells）を（１）の単球分離デバイスに添加した後に、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内にて６０分間静置した。所定時間後、上清の回収を行い、またシャーレは生理食塩液１ｍｌにて洗浄を行った。単球の接着率、純度を下式（１）、（２）にて求めた。
【００３６】
単球接着率（％）＝１００−（非接着単球数／播種前単球数）×１００・・式（１）  単球純度  （％）＝（播種前単球数−非接着単球数）／（播種前単球数−非接着単球数+播種前リンパ級数−非接着リンパ球数）×１００・・式（２）
単球数は、以下方法によって算出した。シャーレから回収した細胞懸濁液中の白血球数を、血球カウンター（ＫＸ−２１ＮＶ，シスメックス製）を用いて測定した。また、該細胞懸濁液をＣＤ１４−ＰＥ蛍光抗体（日本ベクトンディッキンソン製）にて標識を行い、フローサイトメーター（ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ，日本ベクトンディッキンソン製）にて単球の比率を求め、該白血球数に該単球比率を掛けることにより求めた。また、リンパ球数は、該フローサイトメーターにて細胞の大きさ、密度からリンパ球の比率を求め、該白血球数に該リンパ球比率を掛け合わせることで求めた。
【００３７】
なお播種前の単球数についても播種前細胞懸濁液を対象に同様の操作を行い求めた。  結果、単球接着率９８％、単球純度５９％であった。
【００３８】
（比較例１）
細胞懸濁液に培地（ＧＩＢＣＯ製  ＡＩＭ−Ｖ培地）を試用した以外は、実施例１と同様の方法にて、単球の接着率、純度を求めた。その結果、単球接着率４％、単球純度５％であった。
【００３９】
（比較例２）
単球分離デバイスの代わりに、市販細胞接着性シャーレを使用した以外は、実施例１と同様の方法にて、単球の接着率、純度を求めた。その結果、単球接着率２％、単球純度１１％であった。
【００４０】
（比較例３）
細胞懸濁液に培地（ＧＩＢＣＯ製  ＡＩＭ−Ｖ培地）を使用した以外は、比較例２と同様の方法にて、単球の接着率、純度を求めた。その結果、単球接着率８９％、単球純度１５％であった。
【００４１】
（比較例４）
（３）ブタ骨髄液由来間葉系幹細胞の調製
ブタ骨髄液を採取し、市販組織培養用フラスコに播種した。その後培地交換を繰り返すことで赤血球等の非接着夾雑物を除去した。フラスコ上に接着する該細胞をトリプシン−EDTA処理にて回収し、洗浄を行うことで、ブタ骨髄液由来間葉系幹細胞の調製を行った。
（３）で調製したブタ骨髄液由来間葉系幹細胞を、同個体から採取した血漿に懸濁し、これを実施例１で調製した単球分離デバイスに１ｍｌ播種した（播種細胞数  ３．０×１０５cells）。播種２４時間後に上清の回収を行い、該細胞の接着率を下式（３）にて求めた。
【００４２】
細胞接着率（％）＝１００−（非接着細胞数／播種細胞数）×１００・・式（３）
結果、細胞の接着率は０％であった。
【００４３】
（比較例５）
培地（ＧＩＢＣＯ製  αＭＥＭ培地、１０％ＦＢＳ含有）を用いてブタ骨髄液由来間葉系幹細胞を懸濁した以外は、比較例４と同様に細胞の接着率を求めた。結果、細胞接着率は０％であった。