(57)【要約】【課題】新たな指標を用いた簡便且つ迅速な血球分析法（赤血球を利用した検査法）を提供すること。【解決手段】正電荷担体への赤血球の付着度を指標として酸化ストレスを評価する。また、評価結果をもとに、酸化ストレスに起因する障害又は疾病のリスクを判定する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
正電荷担体への赤血球の付着度を検出することを特徴とする、酸化ストレス評価法。
【請求項２】
以下の工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の酸化ストレス評価法：
（１）検体中の赤血球と正電荷担体を接触させる工程；
（２）正電荷担体に付着していない赤血球を除去する工程；
（３）正電荷担体に付着した赤血球数を検出する工程。
【請求項３】
工程（３）における検出が、顕微鏡観察、蛍光・発光測定法、透過光測定法、又は電気化学的測定法により行われることを特徴とする、請求項２に記載の酸化ストレス評価法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の酸化ストレス評価法による評価結果をもとに疾病リスクを判定することを特徴とする、酸化ストレスに起因する障害又は疾病のリスク検査法。
【請求項５】
酸化ストレスに起因する障害又は疾病が、血管障害又は動脈硬化症であることを特徴とする、請求項４に記載の疾病リスク検査法。
【請求項６】
正電荷担体への赤血球の付着度が小さいと酸化ストレスが強く疾病リスクが高い、という基準に従ってリスクを判定することを特徴とする、請求項４又は５に記載の疾病リスク検査法。
【請求項７】
以下の工程を含むことを特徴とする、酸化ストレスに起因する障害又は疾病に対する薬剤のスクリーニング法：
（１）生体外において、酸化剤と試験物質を赤血球に作用させる工程；
（２）工程（１）後の赤血球と正電荷担体を接触させる工程；
（３）正電荷担体に付着していない赤血球を除去する工程；
（４）正電荷担体に付着した赤血球数を検出する工程；
（５）工程（４）の検出結果を対照の検出結果と比較・評価する工程。
【請求項８】
以下の工程を含むことを特徴とする、酸化ストレスに起因する障害又は疾病に対する薬剤のスクリーニング法：
（１）酸化ストレスに起因する障害又は疾病の動物モデルに試験物質を投与する工程；
（２）工程（１）後の動物モデルから赤血球を採取・調製する工程；
（３）採取・調製した赤血球と正電荷担体を接触させる工程；
（４）正電荷担体に付着していない赤血球を除去する工程；
（５）正電荷担体に付着した赤血球数を検出する工程；
（６）工程（５）の検出結果を対照の検出結果と比較・評価する工程。
【請求項９】
酸化ストレスに起因する障害又は疾病に対する薬剤が、血管障害又は動脈硬化症の治療用薬剤であることを特徴とする、請求項７又は８に記載のスクリーニング法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は赤血球を利用した検査法に関する。詳しくは、酸化ストレスを評価する方法及びその用途（血管障害又は血管障害に起因する疾病のリスク検査法など）に関する。
【背景技術】
【０００２】
健康管理や疾病リスク（易罹患性、発症確率など）の発見を目的として人体からサンプルを採取して実施される検査は日常的且つ継続的に行われることが望ましいため、侵襲の負担が少ない方法（採血、採尿等）が採用される。なかでも血液検査は信頼性の高い多くの情報を与える方法であり、広く利用されている。しかしながら現状の血液検査は血清分析が中心であり、血球については特別な場合を除き数の算定程度しか行われていない。尚、赤血球を利用した検査法に関する先行技術（特許文献１）及び赤血球の分離に関する先行技術を以下に示す。
【特許文献１】特開平６−２８１６２２号公報
【特許文献２】特開２０００−１７１４６１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
血清分析は確かに、健康状態や特定の疾病への罹患の有無などに関して重要な情報を与える。しかしながら、血清分析が有効でない場合や血清分析のみでは適切な判断ができない場合がある。例えば、血清分析によって得られるコレステロール値、トリグリセライド値、血糖値などの管理目標のみでは、心筋梗塞などの動脈硬化疾患のリスクを完全にコントロールすることはできていない。その理由は、これらの危険因子の値が同等であっても個人個人の日内変動や組織・器官の応答が異なっているためであると考えられる。
血球分析が日常的に実施されない理由として、（１）血清に対して血球は採取後の保存が困難であること、（２）簡便な手法で測定できる方法がないこと、（３）測定すべき有効な指標が明らかとなっていないこと、が挙げられる。
そこで本発明は、新たな指標を用いた簡便且つ迅速な血球分析法（赤血球を利用した検査法）を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
ヒト赤血球は血液容量の半分近くを占め少量の血液から多くの細胞を得ることが可能である約１２０日間の長寿命を有する無核の細胞である。血液型として知られているように赤血球には例えば表面糖鎖の違いに代表される個人個人の違いが反映されており、低栄養、酸化等ストレスの有無なども反映することが知られている。赤血球は体内の血管系をくまなく循環し、無核であるため血管、血液を介して生体に発生したストレスを蓄積しており、細胞で構成される人体が実際どのようなダメージを受けているかを反映していると予想される。この点に着目するとともに、赤血球の細胞表面糖鎖のシアル酸脱離などに起因して細胞膜表面の荷電が変化することが知られていることを考慮した上で新規な検査法を創出すべく鋭意検討した。具体的には、正に帯電した担体（正電荷担体）を利用すれば赤血球の酸化ストレスを簡便且つ迅速に検出できるとの期待の下、種々の実験を施行した。その結果、酸化ストレスの量に応じて赤血球の正電荷担体への付着性が変化すること、及び短時間で付着の差を検出可能であることが判明した。即ち、赤血球の酸化ストレスの程度を、赤血球の正電荷担体への付着度によって迅速に評価できることが明らかとなった。また、動物モデルを使用したアッセイによって、赤血球の正電荷担体への付着度と、血管障害又は動脈硬化症のリスク因子との間に相関を認めた。このことは、赤血球の正電荷担体への付着度を調べれば血管障害又は動脈硬化症等、酸化ストレス等に基づいた疾病のリスクを判定できること（換言すれば、赤血球の正電荷担体への付着度が新規なリスクマーカーとなること）を意味する。
一方、正電荷担体への赤血球の付着度を指標とするアッセイ系は操作が簡便であり、しかも迅速な検出・検査が可能であるという特徴をもち、酸化ストレスに対する薬剤のスクリーニングにも好適であると考えられた。
本発明は主として以上の成果に基づくものであり、以下の通りである。
［１］正電荷担体への赤血球の付着度を検出することを特徴とする、酸化ストレス評価法。
［２］以下の工程を含むことを特徴とする、［１］に記載の酸化ストレス評価法：
（１）検体中の赤血球と正電荷担体を接触させる工程；
（２）正電荷担体に付着していない赤血球を除去する工程；
（３）正電荷担体に付着した赤血球数を検出する工程。
［３］工程（３）における検出が、顕微鏡観察、蛍光・発光測定法、透過光測定法、又は電気化学的測定法により行われることを特徴とする、［２］に記載の酸化ストレス評価法。
［４］［１］〜［３］のいずれか一項に記載の酸化ストレス評価法による評価結果をもとに疾病リスクを判定することを特徴とする、酸化ストレスに起因する障害又は疾病のリスク検査法。
［５］酸化ストレスに起因する障害又は疾病が、血管障害又は動脈硬化症であることを特徴とする、［４］に記載の疾病リスク検査法。
［６］正電荷担体への赤血球の付着度が小さいと酸化ストレスが強く疾病リスクが高い、という基準に従ってリスクを判定することを特徴とする、［４］又は［５］に記載の疾病リスク検査法。
［７］以下の工程を含むことを特徴とする、酸化ストレスに起因する障害又は疾病に対する薬剤のスクリーニング法：
（１）生体外において、酸化剤と試験物質を赤血球に作用させる工程；
（２）工程（１）後の赤血球と正電荷担体を接触させる工程；
（３）正電荷担体に付着していない赤血球を除去する工程；
（４）正電荷担体に付着した赤血球数を検出する工程；
（５）工程（４）の検出結果を対照の検出結果と比較・評価する工程。
［８］以下の工程を含むことを特徴とする、酸化ストレスに起因する障害又は疾病に対する薬剤のスクリーニング法：
（１）酸化ストレスに起因する障害又は疾病に起因する疾病の動物モデルに試験物質を投与する工程；
（２）工程（１）後の動物モデルから赤血球を採取・調製する工程；
（３）採取・調製した赤血球と正電荷担体を接触させる工程；
（４）正電荷担体に付着していない赤血球を除去する工程；
（５）正電荷担体に付着した赤血球数を検出する工程；
（６）工程（５）の検出結果を対照の検出結果と比較・評価する工程。
［９］酸化ストレスに起因する障害又は疾病に対する薬剤が、血管障害又は動脈硬化症の治療用薬剤であることを特徴とする、［７］又は［８］に記載のスクリーニング法。
［１０］工程（４）における検出が、顕微鏡観察、蛍光・発光測定法、透過光測定法、又は電気化学的測定法により行われることを特徴とする、［７］に記載のスクリーニング法。
［１２］工程（５）における検出が、顕微鏡観察、蛍光・発光測定法、透過光測定法、又は電気化学的測定法により行われることを特徴とする、［８］に記載のスクリーニング法。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
（酸化ストレス評価法）
本発明の第１の局面は、酸化ストレスを評価する方法（以下、「酸化ストレス評価法」ともいう）に関する。生体の酸化レベルは通常はほぼ一定に保たれているが、活性酸素種産生系と還元系のバランスが崩れると「酸化ストレス」が生ずる。酸化の影響が蓄積した結果を表すものとして「酸化ストレス」を捉えることができる。本発明の評価法では被検者から採取した赤血球を利用して「酸化ストレス」の程度（有無を含む）を評価する。より具体的には、正に帯電した担体（正電荷担体）への赤血球の付着度を指標として酸化ストレスを評価する。従って、本発明の評価法では、正電荷担体への赤血球の付着度が検出されることになる。酸化ストレスが大きくなれば正電荷担体への赤血球の付着度は低下し、酸化ストレスが小さくなれば正電荷担体への赤血球の付着度は増加する。正電荷担体の材質は特に限定されない。正電荷担体の材質の例としてガラス、ポリスチレン、シリコン、金属を挙げることができる。正電荷担体の形状も特に限定されない。正電荷担体の形状の例として板状、球ないし粒子（ビーズ）状を挙げることができる。尚、正電荷担体の具体例は、ガラス担体の表面に正電荷コート（例えばアミノ基の導入）を施したものである。
【０００６】
本発明の酸化ストレス評価法では、典型的には、以下の工程、即ち（１）検体中の赤血球と正電荷担体を接触させる工程；（２）正電荷担体に付着していない赤血球を除去する工程；及び（３）正電荷担体に付着した赤血球数を検出する工程が実施される。以下、工程毎に説明する。
【０００７】
（１）接触工程
この工程ではまず、赤血球を含む検体を用意する。そして、正電荷担体に検体を滴下したり、正電荷担体に形成した流路に検体を通過させたり、正電荷担体を検体中に挿入したり、正電荷担体を充填したカラムなどに検体を通過させたりすること等により、検体中の赤血球と正電荷担体を接触させる。赤血球を含む限り検体の種類は特に限定されない。例えば静脈血、毛細血管血由来の全血、赤血球画分、全血又は赤血球画分等から分離精製した赤血球（赤血球浮遊液）を検体として用いることができる。検体の調製は常法に従えばよい。赤血球として赤血球膜ゴーストを含む検体を用いることにしてもよい。
【０００８】
赤血球と正電荷担体との接触時間は、使用する正電荷担体によって変動するが、例えば１分〜６０分、好ましくは５分〜３０分とする。迅速に評価結果を得るという観点からは、接触時間は短い方がよい。本発明者らの検討の結果、接触時間が１０分程度であっても付着度の差を検出できることが示された。
【０００９】
（２）洗浄工程
この工程では、正電荷担体に付着していない赤血球が除去される。例えば、生理食塩水、PBS等の緩衝液を洗浄液としてこの工程を実施することができる。繰り返し洗浄し、非付着成分を可能な限り除去することが好ましい。洗浄操作の回数は例えば２〜５回である。
【００１０】
（３）検出工程
この工程では、正電荷担体に付着した赤血球数が検出される。即ち、洗浄後の正電荷担体に残存（付着）した赤血球の数が計測される。例えば、顕微鏡観察、蛍光・発光測定法、透過光測定法、又は電気化学的測定法を利用して赤血球数を検出することができる。顕微鏡観察では例えば位相差顕微鏡を用いて赤血球数を検出する。蛍光・発光測定法では、蛋白量や酵素活性等を蛍光試薬による染色強度あるいは化学発光を利用して測定し、細胞数を推定する。透過光測定法では、細胞数で変化する透過光強度を測定する。電気化学的測定法では、例えばフェリシアン化カリウムなどの酸化還元物質の共存下サイクリックボルタンメトリーやアンペロメトリーによる測定を行い酸化ピークの電流値を測定し、赤血球数を推定する。
尚、正電荷担体を充填したカラムを使用する場合には、カラムに供する前の検体中に存在していた赤血球数と、カラムから出てきた（正電荷担体に付着することなく排出された）赤血球数との差分として、正電荷担体に付着した赤血球数を検出することができる。
【００１１】
（リスク検査法）
本発明の第２の局面は、酸化ストレスに起因する障害又は疾病のリスク検査法に関する。本明細書において「疾病リスク」とは、障害又は疾病に罹患する可能性と、障害又は疾病を進展（悪化）させる可能性を包括的に表現する用語である。従って、本発明の疾病リスク検査法を実施することで得られる情報（疾病リスクの程度）は、障害又は疾病の罹患可能性を評価するための指標になるとともに、障害又は疾病に罹患している者（患者）を被検者とした場合においては障害又は疾病が進展（悪化）傾向にあるか又は改善傾向にあるか（或いは小康状態にあるか）を評価するための有効な指標となる。このように本発明の疾病リスク検査法は、罹患又は発症の阻止、発症又は進展（悪化）の遅延、患者の生活の質（ＱＯＬ：Quality of Life）の向上に資する有益な情報を提供する。
尚、被験者は特に限定されない。即ち、酸化ストレスに起因する障害又は疾病のリスク判定が必要な者に対して広く本発明を適用することができる。
【００１２】
本発明の疾病リスク検査法では、酸化ストレスに起因する障害又は疾病に関する「疾病リスク」が検査される。酸化ストレスは様々な障害、疾病の発症又は進展要因となることが知られている。本発明の疾病リスク検査法は、酸化ストレスに起因する障害又は疾病に対して広く適用可能である。「酸化ストレスに起因する」とは、酸化ストレスが直接的又は間接的な発症要因又は進展要因であることをいう。「酸化ストレスに起因する障害又は疾病」として、血管障害、動脈硬化症、糖尿病、がん、アルツハイマー病を例示できる。好ましくは、血管障害又は動脈硬化症のリスクが検査対象となる。血管障害又は動脈硬化症のリスクの検査に本発明が有効なことは、後述の実施例（動物モデルを使用したアッセイ）によって裏付けられる。
【００１３】
本発明の疾病リスク検査法では、上記酸化ストレス評価法による評価結果をもとにリスクが判定される。例えば「正電荷担体への赤血球の付着度が小さいと酸化ストレスが強く疾病リスクが高い」という判定基準に従って疾病リスクを判定することができる。
【００１４】
（薬剤のスクリーニング法）
本発明の第３の局面は薬剤のスクリーニング法に関する。本発明のスクリーニング法では、酸化ストレスに起因する障害又は疾病に対する薬剤がスクリーニングされる。「酸化ストレスに起因する障害又は疾病に対する薬剤」とは、酸化ストレスに起因する障害又は疾病に対して有効に作用する（薬効を発揮する）薬剤、即ち、酸化ストレスが直接的又は間接的な発症要因又は進展要因となる障害又は疾患の治療又は予防に有効な薬剤をいう。「酸化ストレスに起因する障害又は疾病に対する薬剤」の具体例は血管障害及び動脈硬化症である。本発明の一態様では血管障害又は動脈硬化症の治療用薬剤がスクリーニングされる。尚、本明細書では、障害・疾病の治癒や症状の改善など、治療目的で使用される薬剤と、障害・疾病の発症の阻止、遅延、再発防止など、予防目的で使用される薬剤を包括的に「治療用薬剤」と表現する。
【００１５】
本発明のスクリーニング法の一態様は、生体から採取された赤血球を用いるin vitroスクリーニング法である。尚、ここでの用語「生体」は、ヒトの生体のみを意味するものではない。即ち、好ましくはヒト生体から採取された赤血球が用いられるが、ヒト以外の動物（ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ニワトリ等である）から採取された赤血球を用いることもできる。
【００１６】
この態様では次の工程、即ち（１）生体外において、酸化剤と試験物質を赤血球に作用させる工程；（２）工程（１）後の赤血球と正電荷担体を接触させる工程；（３）正電荷担体に付着していない赤血球を除去する工程；（４）正電荷担体に付着した赤血球数を検出する工程；及び（５）工程（４）の検出結果を対照の検出結果と比較・評価する工程、が実施される。
【００１７】
工程（１）では、生体から採取・調製した赤血球に対して、酸化剤（酸化負荷を与える物質）と試験物質を一定の条件下で作用させる。具体的には例えば、赤血球画分に対して酸化剤と試験物質を所定濃度で添加し、両者を赤血球に作用させる。このように酸化剤と試験物質を赤血球に同時に作用させるのではなく、酸化剤を作用させた後に試験物質を作用させることにしてもよい。或いは、試験物質を先に作用させた後、酸化剤を作用させることにしてもよい。酸化剤は、生理条件下の生体内濃度として現実的である濃度範囲で使用する。試験物質についても同様である。
【００１８】
酸化剤としては、tert-ブチルヒドロペルオキシド(tBHP)、2,2'-アゾビス(2-アミジノプロパン)-ジヒドロクロリド(AAPH)、過酸化水素等を用いることができる。
【００１９】
試験物質としては様々な分子サイズの有機化合物又は無機化合物を用いることができる。有機化合物の例として、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質、複合脂質（ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド、ポリフェノール、カテキン、ビタミン（B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12、C、A、D、E等）を例示できる。試験物質は天然物由来であっても、或いは合成によるものであってもよい。後者の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なスクリーニング系を構築することができる。尚、細胞抽出液、培養上清などを試験物質として用いてもよい。また、既存の薬剤を試験物質としてもよい。
【００２０】
工程（２）〜（４）は、上記酸化ストレス評価法における工程（１）〜（３）と同様であるため、その説明を省略する。続く工程（５）では、工程（４）の検出結果を対照の検出結果と比較・評価する。ここでの「対照」としては、陰性対照（試験物質を使用しない試験区）及び陽性対照（既に有効であることが確認されている化合物を試験物質として使用する試験区）のいずれか又は両者が用いられる。陰性対照を用いた場合、試験群の検出結果と対照群の検出結果を比較し、試験群と対照群の間に有意差が認められれば、試験化合物を有効な化合物として選択する。一方、陽性対照を用いた場合、対照群の検出結果を基準として試験群の有効性の有無及び程度が判断されることになる。
【００２１】
本発明のスクリーニング法の他の態様は、動物モデルを用いるin vivoスクリーニング法である。この態様では、以下の工程、即ち（１）酸化ストレスに起因する障害又は疾病の動物モデルに試験物質を投与する工程；（２）工程（１）後の動物モデルから赤血球を採取・調製する工程；（３）採取・調製した赤血球と正電荷担体を接触させる工程；（４）正電荷担体に付着していない赤血球を除去する工程；（５）正電荷担体に付着した赤血球数を検出する工程；及び（６）工程（５）の検出結果を対照の検出結果と比較・評価する工程、が実施される。
【００２２】
工程（１）では、動物モデルに対して試験物質が投与される。酸化ストレスに起因する障害又は疾病を発症する動物モデルが用いられる。使用可能な動物モデルの具体例は糖尿病動物モデル、高血圧動物モデル、発癌動物モデル、アポE欠損高脂血症動物モデルである。糖尿病動物モデルとして、db/dbマウス、ob/obマウス、KKマウス、NODマウス、AKITAマウス、GKラット等や、アロキサンやストレプトゾトシン（STZ）などの薬物で誘発する誘発モデルを例示することができる。
【００２３】
試験物質の投与方法として経口投与、経鼻投与、経気管投与、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内又は腹腔内注射、標的組織又は気管への注入を例示することができる。試験物質を複数回投与することにしてもよい。投与量は任意に設定可能である。例えば、非ヒト動物に致死的な影響を与えない範囲で可能な限り最大の投与量とすることができる。投与回数も任意に設定可能である。例えば、投与回数を１〜２０回／日の範囲内とする。また、連日投与に限らず、例えば隔日投与や週１度の投与など任意の投与間隔で投与することができる。
【００２４】
工程（２）では、工程（１）後の動物モデルから赤血球を採取・調製する。例えば、全血、赤血球画分、全血又は赤血球画分等から分離精製した赤血球（赤血球浮遊液）等を常法に従い調製する。赤血球として、赤血球膜ゴーストを用いることにしてもよい。尚、赤血球の採取・調製を経時的又は経日的に行い、各赤血球を用いて以降の工程を実施することにしてもよい。このようにすれば経時変化又は経日変化を調べることができ、試験物質の有効性を評価する上で一層有益な情報が得られる。
【００２５】
工程（３）〜（６）は、上記態様の工程（２）〜（５）と同様であるため、その説明を省略する。
【００２６】
本発明のスクリーニング法によって選択された物質が十分な薬効を有する場合には、当該物質をそのまま医薬の有効成分として使用することができる。一方で十分な薬効を有しない場合には化学的修飾などの改変を施してその薬効を高めた上で、医薬の有効成分として使用することができる。勿論、十分な薬効を有する場合であっても、更なる薬効の増大を目的として同様の改変を施してもよい。
【実施例】
【００２７】
＜付着担体の検討＞
１．方法
（１）健常成人より血液を採取した後、遠心分離によって血小板及び白血球を除去し（遠心分離、上清及びバッフィーコートの廃棄、及びPBSによる洗浄からなるサイクルを３回）、赤血球画分を得た。
（２）酸化剤であるtert-ブチルヒドロペルオキシド(tBHP)を最終濃度0.1mM、0.5mMとなるように赤血球浮遊液に加えた後、37℃で1時間ゆるやかに攪拌し酸化ストレスを与えた。
（３）PBSで赤血球を洗浄した後、1×106 cells/mlに調製しDNAマイクロアレイ用コートスライドグラスtype1高密度化アミノ基導入タイプ（松浪硝子工業株式会社）及びラーゲンタイプIコートDISH35（AGCテクノグラス株式会社）に5μlずつスポットした。
（４）37℃で一定時間インキュベート後、PBSで3回洗浄し、付着していない赤血球を除去した。その後、メタノール固定し、標本を作製した。
（５）位相差顕微鏡にて付着細胞をカウントし、面積当たりの付着細胞数として算出した。
【００２８】
２．結果・考察
正電荷を有するスライドガラス（高密度化アミノ基導入タイプ）では、酸化ストレスの度合いが強くなるにつれて赤血球の付着数が減少する傾向が観察された（付着数の減少は酸化ストレスによる表面負電荷の減少による）。付着数も非常に多く、しかも短時間の接触によっても多くの細胞が付着することから、検出に有利である。（図１）これに対して、細胞との親和性が高いコラーゲンコートポリスチレンディッシュでは酸化ストレスの度合いが強くなるにつれて付着量が増える傾向が観察されたものの（図２）、付着数が少なく、弱い酸化処理の条件下では検出が困難である。
【００２９】
＜赤血球膜ゴーストの正電荷担体付着性評価＞
１．方法
（１）健常成人より血液を採取し、遠心分離によって血小板及び白血球を除去し（遠心分離、上清及びバッフィーコートの廃棄、及びPBSによる洗浄からなるサイクルを３回）、赤血球画分を得た。
（２）酸化剤であるtert-ブチルヒドロペルオキシド(tBHP)を最終濃度0.1mM、0.5mMとなるように赤血球浮遊液に加え37℃で1時間ゆるやかに攪拌し酸化ストレスを与えた
（３）PBSで赤血球を洗浄した後、常法に従って赤血球ゴーストを作製した、細胞膜のみの赤血球膜ゴーストを1×106 cells/mlに調製した後、DNAマイクロアレイ用コートスライドグラスtype1高密度化アミノ基導入タイプ（松浪硝子工業株式会社）に5μlずつスポットした。
（４）37℃で一定時間インキュベート後、スライドガラスをPBSで3回洗浄し、付着していない赤血球を除去した。その後、メタノール固定し、標本を作製した。
（５）位相差顕微鏡にて付着細胞をカウントし、面積当たりの付着細胞数として算出した。
【００３０】
２．結果
赤血球膜ゴースト（細胞膜画分のみ）を用いた場合であっても、酸化ストレスの度合いが強くなるにつれて付着数が減少する傾向が観察された（図３）。この結果は、酸化ストレスに応じた付着数の変化に赤血球膜の状態が関与していることを裏付ける。また、赤血球膜ゴーストを用いた場合においても、10分程度の接触時間で付着の差を十分に検出することが可能であった。
【００３１】
＜赤血球付着度と血清分析値との相関＞
１．方法
（１）非肥満II型糖尿病のモデルマウスであるAKITAマウス（通常食で飼育、17週齢）及び対照系統のC57BL/6マウス（通常食で飼育、17週齢）を用い、＜付着担体の検討＞と同様の方法で付着性試験を実施した。併せて、血清の生化学分析を実施した。尚、心臓採血した血液を検体とした。
尚、試験動物については日本エスエルシー株式会社から購入した。血清脂質についてはコレステロールE-テストワコー（和光純薬工業株式会社）、トリグリセライドE-テストワコー（和光純薬工業株式会社）、HDLコレステロールE-テストワコー（和光純薬工業株式会社）を用いて測定し、血清過酸化脂質はデタミナーLPO（協和メデックス株式会社）を用いて測定した。血糖値測定にはグルコースCIIテストワコー（和光純薬工業株式会社）を使用した。
【００３２】
LDL-コレステロール及び動脈硬化指数はそれぞれ以下の式で算出した。
LDLコレステロール＝総コレステロール−HDLコレステロール−（トリグリセライド／５）
動脈硬化指数＝（総コレステロール−HDLコレステロール）／HDLコレステロール
【００３３】
２．結果
生化学分析の結果を図４に示す。表中の数値にはいずれも有意な差が見られ、AKITAマウスのモデルは顕著な高血糖であるのみでなく、糖尿病に起因する酸化ストレス及び低インスリンによる代謝障害にさらされているために血清中総コレステロール、トリグリセリド、LDLコレステロール及び過酸化脂質の増加、並びに動脈硬化指数の高値を示し、血管障害のリスクが上昇しているモデルと捉えることができる。
糖尿病合併症の中で大血管病変は致命的であることから最も注意すべき疾患であるが、その予防は血糖値の管理のみでは不十分であり、血糖値に加え、血圧やコレステロール値も併せて管理するのが主流である。しかしながら、これらの数値はいずれもサンプリング時間などにより変動するものであることから、「管理目標」とはなり得ても、「リスク管理」の指標としては適当といえない。
一方、非侵襲的な動脈硬化の診断には、頚動脈内膜・中膜肥厚度(IMT)をBモード超音波断層法により計測する方法や血管を描出するMRAなどが用いられているが、これらはいずれも病変を検出するものであり、しかも日常的に実施できる方法ではないので、リスク管理目的には適合しない。
動脈硬化病変は酸化ストレスによりLDLが変性した酸化LDLをマクロファージが貪食し泡沫細胞となりプラークの原因となることがカスケードの初期に起こる。リスク管理のためには、血管内に発生する酸化ストレスによるダメージの蓄積、特に脂質の過酸化を検出する必要があるといえる。血管内を120日間パトロールし、血清に遊離してくる脂質と脂質交換を行う赤血球膜の状態は血管内の状態を反映すると予想された。実際、血管障害のリスクの高いAKITA群では赤血球付着数が対照群と比較して低下することが示された。この結果は、正電荷コート担体への赤血球の付着数を調べることが動脈硬化のリスクの評価に有効であることを示唆する。
【００３４】
各検査値と赤血球付着数との関係を調べた（図５〜９）。血糖値と赤血球付着数の関係を表したグラフ（図５）では、血糖値の高い群（AKITA）と通常群(B6)に完全に分離している。また、通常群内では、血糖値と赤血球付着数の間に１次関数的な相関は見られない。つまり、通常群内では付着数は血糖値によって規定されない。
【００３５】
一方、過酸化脂質と赤血球付着数との間には、血糖値の高い群（AKITA）と通常群(B6)の全体に亘って連続的に１次関数的な相関が観察された（図６）。この結果は、赤血球付着数が血管障害又は動脈硬化のリスクマーカーとして有用であることを示す。尚、過酸化脂質と血糖値との間にはこのような相関は認められない（図７）。
ところで、血糖値管理の際、ランセット血１滴を電気化学的にセンサーで血糖値を測定することが日常的に行われている。このような血糖値センサーに、血管障害又は動脈硬化のリスク管理に重要な血中過酸化脂質量を反映することが判明した赤血球付着度を評価する測定系を組み込めば、血管障害又は動脈硬化のリスク管理を簡便且つ日常的に行うことができる。
【００３６】
トリグリセリドと赤血球付着数の間にも血糖値の高い群と通常群の全体に亘って連続的に１次関数的な相関が認められた（図８）。この結果は、中性脂肪の管理を目的にした場合に血糖値に代わるマーカーとして赤血球付着数が有用であることを示す。尚、トリグリセリドと血糖値との間にはこのような相関は認められない（図９）。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明によれば、赤血球膜に蓄積した酸化ストレスを迅速に検出・評価することが可能である。また、酸化ストレスに起因する障害又は疾病のリスクを低侵襲的に且つ迅速に検査することが可能となる。本発明のリスク検査法は、酸化ストレスが関与する様々な疾患の悪性度ないし進行度の評価や治療有効性の評価に有用なツールといえる。
一方、本発明のスクリーニング法によれば、酸化ストレスに起因する障害又は疾病に有効な薬剤を簡便且つ迅速にスクリーニングできる。また、本発明のスクリーニング法は個人個人に適した薬剤を選択するツールとしても有用である。
【００３８】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】DNAマイクロアレイ用コートスライドグラスtype1高密度化アミノ基導入タイプに対する赤血球の付着度を示すグラフ。横軸は接触時間、縦軸は付着細胞数。
【図２】コラーゲンタイプIコートDISH35に対する赤血球の付着度を示すグラフ。横軸は接触時間、縦軸は付着細胞数。
【図３】正電荷担体への赤血球膜ゴーストの付着度を示すグラフ。
【図４】AKITAマウスとC57BL/6マウスの生化学分析の結果。
【図５】血糖値と赤血球付着数の関係を示すグラフ。
【図６】過酸化脂質（ＬＰＯ）と赤血球付着数との関係を示すグラフ。
【図７】過酸化脂質（ＬＰＯ）と血糖値との関係を示すグラフ。
【図８】トリグリセリド（ＴＧ）と赤血球付着数の関係を示すグラフ。
【図９】トリグリセリド（ＴＧ）と血糖値との関係を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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