(57)【要約】      （修正有）【課題】コンドロイチン分解活性を有する高等生物由来のタンパク質を有効成分とするムコ多糖分解促進剤を提供する。【解決手段】特定な配列のアミノ酸配列からなるタンパク質、または特定な配列のアミノ酸配列において１個もしくは数十個のアミノ酸が置換され、欠失され、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−グルクロン酸に結合したＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解する活性を有するタンパク質を有効成分とする、ムコ多糖分解促進剤。当該ムコ多糖分解促進剤は、細菌毒素等を含まない真核生物由来の酵素を有効成分とするムコ多糖分解促進剤として、脊椎障害等の治療に利用可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号１に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数十個のアミノ酸が置換され、欠失され、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−グルクロン酸に結合したＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解する活性を有するタンパク質を有効成分とする、ムコ多糖分解促進剤。
【請求項２】
配列番号１において１〜２６番目のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１において１〜２６番目のアミノ酸残基が欠失し、さらに１個もしくは数個のアミノ酸が置換され、欠失され、又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を有効成分とする、請求項１に記載のムコ多糖分解促進剤。
【請求項３】
ムコ多糖がコンドロイチン、コンドロイチン硫酸又はコンドロイチン硫酸とデルマタン硫酸の混成多糖である、請求項１又は２に記載のムコ多糖分解促進剤。
【請求項４】
タンパク質が融合タンパク質の形態である、請求項１〜３の何れかに記載のムコ多糖分解促進剤。
【請求項５】
請求項１〜４の何れかに記載のムコ多糖分解促進剤及び薬学的不活性成分を含む医薬組成物。
【請求項６】
脊髄損傷治療用の、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
脊椎損傷が椎間板ヘルニアによる損傷である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
椎間板ヘルニアが、硬膜外遊走型椎間板ヘルニアまたは経靭帯性脱出型椎間板ヘルニアである、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
ムコ多糖からグルクロン酸を非還元末端として有するオリゴ糖を製造する方法であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数十個のアミノ酸が置換され、欠失され、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−グルクロン酸に結合したＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解する活性を有するタンパク質、配列番号１において１〜２６番目のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、及び配列番号１において１〜２６番目のアミノ酸残基が欠失し、さらに１個もしくは数個のアミノ酸が置換され、欠失され、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−グルクロン酸に結合したＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解する活性を有するタンパク質よりなる群から選ばれるタンパク質とムコ多糖とを反応させる工程、及びグルクロン酸を非還元末端として有するオリゴ糖を回収する工程を含む、前記方法。
【請求項１０】
ムコ多糖がコンドロイチン、コンドロイチン硫酸又はコンドロイチン硫酸とデルマタン硫酸の混成多糖である、請求項９に記載のオリゴ糖を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）由来のムコ多糖加水分解活性を有するタンパク質を有効成分とするムコ多糖分解促進剤、およびその医薬用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
コンドロイチナーゼやヒアルロニダーゼは、コンドロイチンやヒアルロナンなどのアミノ糖を有する長鎖多糖類であるムコ多糖（グリコサミノグリカン）を分解する酵素タンパク質として知られている。中でもコンドロイチナーゼは、ヒアルロナン、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン、デルマタン硫酸等のムコ多糖類を、不飽和糖を含む二糖に分解する反応を触媒する。
【０００３】
これまでに、多種の生物由来のコンドロイチナーゼが報告されている。代表的な例は、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のコンドロイチナーゼＡＢＣ（特許文献１）、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＡＣ（非特許文献１）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ由来のコンドロイチナーゼＡＣＩＩ（非特許文献２）、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．Ｈｐ１０２由来のコンドロイチナーゼ ＡＣＩＩＩ、コンドロイチナーゼＣ（非特許文献３）、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＢ（非特許文献４）などである。
【０００４】
コンドロイチナーゼＡＢＣ（ＥＣ ４．２．２．４）は、哺乳動物軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ａ、鮫軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ｃおよび哺乳動物皮膚由来のコンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸）を分解する一方、ヒアルロナンの分解能は低いという特異性を有するタンパク質であり、動物組織からのムコ多糖類の除去剤、また組織中のムコ多糖を同定するための試薬として市販されている。
【０００５】
最近、コンドロイチナーゼ、特にコンドロイチナーゼＡＢＣあるいはコンドロイチナーゼＡＣを、椎間板腔に直接投与する椎間板ヘルニア治療剤として利用する試みが行なわれている（特許文献２）。従来、植物パパイヤ由来の蛋白分解酵素キモパパインや、バクテリア由来の膠質分解酵素コラゲナ−ゼ等をヘルニア症患者の椎間板腔に注入する、椎間板溶解療法（ＩＤ療法）が利用されてきた。しかし、蛋白分解酵素を用いるＩＤ療法には、脊椎・椎間板のヘルニア部分のみならず周辺の構造組織の蛋白部分が分解されるために神経麻痺やアレルギー発現等の副作用を生じやすい、という欠点が指摘されている。
【０００６】
したがって、タンパク質分解酵素ではなく、ムコ多糖分解酵素活性を有するコンドロイチナーゼを用いた脊椎損傷治療に、多くの期待が寄せられている。しかし、既知のコンドロイチナーゼの多くはタンパク質分解酵素も同時に生産する微生物から得られるものが殆どである。コンドロイチナーゼＡＢＣは、その典型例である。その微生物培養物には、プロテアーゼ活性、エンドトキシン活性、さらには核酸などが混在しているため、微生物由来のコンドロイチナーゼの椎間板ヘルニアの治療薬として人体に投与するための高純度の試薬への利用は、不都合な面を有している。
【０００７】
また、長鎖多糖類であるムコ多糖については保湿性、潤滑性その他の有用性が指摘されており、ムコ多糖を含む健康食品や医薬が種々開発されているが、これらの多糖類に代わり、これを低分子化したオリゴ糖についても様々な生理活性機能を有することが期待されている。
【特許文献１】特開平６−１５３９４７号公報
【特許文献２】米国特許第４６９６８１６号
【非特許文献１】Ｙａｍａｇａｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９６８年、第２４３巻、第１５２３頁
【非特許文献２】Ｈｉｙａｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９７５年、第２５０巻、第１８２４頁
【非特許文献３】宮園博文ら、「生化学」、１９８９年、第６１巻、第１０２３頁
【非特許文献４】Ｍｉｃｈｅｌａｃｃｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、１９７４年、第５６巻、第９７３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明においては、微生物により産生されるコンドロイチナーゼに代わり、タンパク質分解酵素等の混入のおそれの少ない高等動物由来のムコ多糖分解活性を有するタンパク質を、医薬等として提供する、また該タンパク質を用いた機能性オリゴ糖の製造方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、線虫におけるコンドロイチンの生理機能に関する研究過程において、線虫にコンドロイチナーゼ活性を有する酵素タンパク質が存在することを見いだし、下記の各発明を完成した。
【００１０】
（１）  配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号１に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数十個のアミノ酸が置換され、欠失され、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつかつＤ−グルクロン酸に結合したＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解する活性を有するタンパク質を有効成分とする、ムコ多糖分解促進剤。
【００１１】
（２）配列番号１において１〜２６番目のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１において１〜２６番目のアミノ酸残基が欠失し、さらに１個もしくは数個のアミノ酸が置換され、欠失され、又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を有効成分とする、（１）に記載のムコ多糖分解促進剤。
【００１２】
（３）ムコ多糖がコンドロイチン、コンドロイチン硫酸又はコンドロイチン硫酸とデルマタン硫酸の混成多糖である、（１）又は（２）に記載のムコ多糖分解促進剤。
【００１３】
（４）タンパク質が融合タンパク質の形態である、（１）〜（３）の何れかに記載のムコ多糖分解促進剤
【００１４】
（５）（１）〜（３）の何れかに記載のムコ多糖分解促進剤及び薬学的不活性成分を含む医薬組成物。
【００１５】
（６）脊髄損傷治療用の、（５）に記載の医薬組成物。
【００１６】
（７）脊椎損傷が椎間板ヘルニアによる損傷である、（６）に記載の医薬組成物。
【００１７】
（８）椎間板ヘルニアが、硬膜外遊走型椎間板ヘルニアまたは経靭帯性脱出型椎間板ヘルニアである、（７）に記載の医薬組成物。
【００１８】
（９）ムコ多糖からグルクロン酸を非還元末端として有するオリゴ糖を製造する方法であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数十個のアミノ酸が置換され、欠失され、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−グルクロン酸に結合したＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解する活性を有するタンパク質、配列番号１において１〜２６番目のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、及び配列番号１において１〜２６番目のアミノ酸残基が欠失し、さらに１個もしくは数個のアミノ酸が置換され、欠失され、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−グルクロン酸に結合したＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解する活性を有するタンパク質よりなる群から選ばれるタンパク質とムコ多糖とを反応させる工程、及びグルクロン酸を非還元末端として有するオリゴ糖を回収する工程を含む、前記方法。
【００１９】
（１０）ムコ多糖がコンドロイチン、コンドロイチン硫酸又はコンドロイチン硫酸とデルマタン硫酸の混成多糖である、（９）に記載のオリゴ糖を製造する方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のムコ多糖分解促進剤は、細菌毒素等を含まない高等動物由来の酵素タンパク質を有効成分とするムコ多糖分解促進剤として、脊椎障害等の治療に利用可能である。また、ムコ多糖分解促進剤であるタンパク質を用いて製造されるオリゴ糖は、非還元末端にグルクロン酸を有する様々な構造からなるオリゴ糖であり、哺乳動物、特にヒトに対して抗原性の低い安全な機能性オリゴ糖を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明のムコ多糖分解促進剤は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる、線虫由来のタンパク質を有効成分とする。
【００２２】
配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列クローンＴ２２Ｃ８．２は、ＧｅｎＢａｎｋＴＭ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ＿０６３４２９として、２００５年に登録されている。このクローンＴ２２Ｃ８．２は、５’末端側に１５１ｂｐの非翻訳領域を、４つのＮ−グリコシル化部位をもつ４５８アミノ酸残基に相当する１３７７ｂｐのＯＲＦを、そして３’末端側に８４ｂｐの非翻訳領域を有している。また、膜タンパク質における二次構造を予測するＳＯＳＵＩ Ｓｙｓｔｅｍ（ｈｔｔｐ：／／ｂｐ．ｎｕａｐ．ｎａｇｏｙａ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉ／）を用いた、前記ＯＲＦにコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質の二次構造の解析から、同タンパク質は、Ｎ末端２６アミノ酸残基からなる疎水性領域を有する、ＩＩ型の膜貫通型タンパク質であると推測される。
【００２３】
さらに、タンパク質のアミノ酸配列情報に関するデータベースに対して、前記ＯＲＦにコードされているアミノ酸配列に相同なタンパク質の検索を行うことにより、ヒト由来のヒアルロニダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋＴＭ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ＿００７３１２）が２８％の相同性を有するタンパク質として特定される。しかしながら、その相同性は３０％以下と低いこと、そして本発明者らの研究により線虫にはヒアルロン酸が殆ど存在しないことが明らかにされた（Ｙａｍａｄａら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、１９９９年、第４５９巻、第３２７−３３１頁）ことなどから、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の機能ないし生理活性は、不明なままであった。
【００２４】
本発明者らは、その後の研究により、線虫の細胞分裂にコンドロイチンの生成と分解が関係していることを突き止め（Ｉｚｕｍｉｋａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００４年、第２７９巻、第５３７５５−５３７６１）、さらに前記配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質が、Ｄ−グルクロン酸に結合したＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解する活性を有し、ムコ多糖、特にコンドロイチン、コンドロイチン硫酸、またコンドロイチン硫酸とデルマタン硫酸との混成鎖からなるムコ多糖に対して分解活性を示すタンパク質であることを、組み換え細胞を用いて発現させた当該タンパク質を利用した実験を通じて確認した。本発明はかかる知見に基づいて完成された発明である。以下、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をＣｅ−Ｃｈｎａｓｅと表すこととする。
【００２５】
既知のコンドロイチナーゼのアミノ酸配列と配列番号１のアミノ酸配列との間の同一性は、配列番号１のアミノ酸配列を１００とすると、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のコンドロイチナーゼＡＢＣが１．３％、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＡＣが１．１％、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ由来のコンドロイチナーゼＡＣＩＩが３．２％、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のコンドロイチナーゼＢが５．７％である。この様に、本発明のＣｅ−Ｃｈｎａｓｅは、コンドロイチンに対して高い分解活性を示す酵素タンパク質ではあるが、既知のコンドロイチナーゼに対しては殆ど同一性を示さない、特徴的なアミノ酸配列を有している。
【００２６】
Ｃｅ−Ｃｈｎａｓｅのムコ多糖分解活性は、ムコ多糖、例えばコンドロイチンを基質として適当な緩衝液中でＣｅ−Ｃｈｎａｓｅを反応させることにより生じる分解生成物を、ゲル濾過その他の方法で検出することによって確認することができる。特に、基質であるムコ多糖をＦＩＴＣ（フルオレセイン５（６）イソチオシアネート）その他の適当なラベリング試薬を用いて予めラベルしておき、蛍光その他のシグナルを利用して分解生成物を検出或いは定量することで、ムコ多糖の分解活性を簡便に測定し、さらには定量することができる。
【００２７】
ＣＯＳ７細胞を用いて組み換えタンパク質として発現させたＣｅ−Ｃｈｎａｓｅと、ＦＩＴＣでラベル化したコンドロイチンとを反応させ、またＣｅ−Ｃｈｎａｓｅと各種のムコ多糖とを反応させることによって確認されたＣｅ−Ｃｈｎａｓｅの酵素学的性質は、次の通りである。
【００２８】
１）Ｃｅ−ＣｈｎａｓｅはＤ−グルクロン酸に結合したＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解する活性を有する。その結果、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸とデルマタン硫酸との混成鎖を有するムコ多糖を分解する。特にコンドロイチンに対して高い分解活性を示し、コンドロイチン硫酸に対しては低い分解活性を示す。分解活性の高低は、コンドロイチン＞＞コンドロイチン硫酸Ａ＞コンドロイチン硫酸Ｃである。コンドロイチンを基質としたときのＣｅ−Ｃｈｎａｓｅの分解活性を１００としたときの、コンドロイチン硫酸Ａ又はコンドロイチン硫酸Ｃを基質としたときの分解活性は、それぞれ１２、７である。また、コンドロイチン硫酸とデルマタン硫酸との混成鎖を有するムコ多糖に対しては、コンドロイチン硫酸とデルマタン硫酸との混成比によって分解活性は変動する。
【００２９】
２）Ｃｅ−Ｃｈｎａｓｅによるコンドロイチンの分解反応による生成物は、ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（ＧｌｃＵＡはＤ−グルクロン酸を、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを、β１−３はβ１−３結合を、β１−４はβ１−４結合を、それぞれ示す）であり、還元末端はＧａｌＮＡｃ（Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン）である。この結果は、Ｃｅ−Ｃｈｎａｓｅが加水分解酵素であるエンド−β−ガラクトサミニダーゼの一種であることを示すものである。なお、既知の細菌由来のコンドロイチナーゼは、いずれも加水分解酵素ではなく脱離酵素（エリミナーゼ）である。先に述べた、既知のコンドロイチナーゼと本発明のＣｅ−Ｃｈｎａｓｅとの間に殆ど同一性がないのは、この反応機構の相違と関係しているものと推察される。
【００３０】
３）Ｃｅ−Ｃｈｎａｓｅのコンドロイチン分解活性の至適ｐＨはｐＨ５．０〜６．０の範囲である。
【００３１】
この様に、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びデルマタン硫酸を強く分解し、ヒアルロナンを弱く分解する脱離酵素の一種である従来のコンドイチナーゼＡＢＣ、ＢＣ、ＡＣＩＩ等と比較して、加水分解酵素の一種であるＣｅ−Ｃｈｎａｓｅは、Ｄ−グルクロン酸に結合したＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解し、特にコンドロイチンに対して高い分解活性を有する酵素タンパク質である。
【００３２】
本発明は、上記に説明したＣｅ−Ｃｈｎａｓｅ、すなわち配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を有効成分とするムコ多糖分解促進剤に加えて、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が置換され、欠失され、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−グルクロン酸に結合したＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解する活性を有するタンパク質を有効成分とするムコ多糖分解促進剤を提供する。
【００３３】
本発明におけるアミノ酸配列の置換、欠失、及び／又は付加に関する「１若しくは数十個」とは、１〜数十アミノ酸以内、好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜５０個、更に好ましくは１〜３０個、特に好ましくは１〜１５個のアミノ酸残基の変化を意味する。アミノ酸配列の同一性（％）で表せば、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列として表すことができる。
【００３４】
タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸残基の電荷、大きさ、疎水性等の物理化学的性質について、保存性の高い変異が許容され得ることが、経験的に認められている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）等が挙げられる。また、上述の保存性を超えた場合でも、なおそのタンパク質の本質的な機能を失わない変異が存在し得ることも当業者において経験されるところである。
【００３５】
従って、配列番号１に記載されたアミノ酸配列において、1若しくは数十個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加したアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、Ｄ−グルクロン酸に結合したＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解する活性を分解する活性を有する場合もあり、この様なタンパク質をムコ多糖分解促進剤として利用することは本発明の一態様である。例えば、後に詳細に説明するように、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端２６アミノ酸残基からなる疎水性領域を欠失させたアミノ酸配列からなるＣｅ−Ｃｈｎａｓｅは、コンドロイチンを分解する活性を保持している。かかるＮ末端２６アミノ酸残基が欠失されたタンパク質も本発明であるＣｅ−Ｃｈｎａｓｅの一態様である。
【００３６】
すなわち本発明は、配列番号１において１〜２６番目のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１において１〜２６番目のアミノ酸残基が欠失し、さらに１個もしくは数個のアミノ酸が置換され、欠失され、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−グルクロン酸に結合したＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解する活性を有するタンパク質、さらにはそれらタンパク質を有効成分とするムコ多糖分解促進剤も提供するものである。
【００３７】
また上記のＣｅ−Ｃｈｎａｓｅは、そのＮ末端及び／又はＣ末端に、その他のタンパク質又はポリペプチドを付加させた、いわゆる融合タンパク質として製造し、ムコ多糖分解促進剤として利用することができる。この様な融合タンパク質及びそのムコ多糖分解促進剤としての利用も、本発明の一態様である。かかる融合タンパク質は、Ｃｅ−Ｃｈｎａｓｅにその他のタンパク質又はポリペプチドが示す機能が付加される点で、Ｃｅ−Ｃｈｎａｓｅを単独で製造し、あるいは使用する場合に比べて、高められた有用性を有する。
【００３８】
タンパク質の例としては、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、プロテインＡ、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼその他の、融合蛋白質の製造に汎用されるタンパク質を挙げることができる。また、ＦＬＡＧタグ、ヒスチジンタグ又はキチン結合配列のように、組み換えタンパク質の製造、特に組み換えタンパク質の精製を容易にするポリペプチドを利用すれば、Ｃｅ−Ｃｈｎａｓｅの製造をより有利に行うことができる。
【００３９】
さらに、Ｃｅ−Ｃｈｎａｓｅには、必要に応じて、蛍光物質や放射性物質等の適当な標識化合物を付加したり、種々の化学修飾物質やポリエチレングリコール等の高分子を結合させたりすることが可能であり、あるいはＣｅ−Ｃｈｎａｓｅを不溶性担体へ結合させたりすることも可能である。こうしたタンパク質を対象とした化学的修飾法は当業者に広く知られており、本発明で使用されるタンパク質の機能を損なわない限り、どの様に修飾し、利用してもよい。かかる修飾を有する前記Ｃｅ−Ｃｈｎａｓｅを有効成分とするムコ多糖分解促進剤も、本発明の一態様である。
【００４０】
本発明にかかるＣｅ−Ｃｈｎａｓｅは、線虫から直接精製して使用してもよいが、Ｃｅ−Ｃｈｎａｓｅをコードする核酸、配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡを用い、組み換えタンパク質として製造することが好ましい。
【００４１】
配列番号２に示される塩基配列からなる核酸は、線虫のゲノムＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、配列番号２に示される塩基配列情報を基に適当なＰＣＲプライマーを設計、合成し、ｃＤＮＡライブラリーに対して公知の方法（例えばＭｉｃｈａｅｌ  Ａ．Ｉ．等，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９０年参照）に従ってＰＣＲ反応を行うことで、クローニングする事ができる。また配列番号２に示される塩基配列からなる核酸は、本明細書に開示された塩基配列情報を基に、ホスホアミダイト法などの化学合成的手法により、あるいは市販のＤＮＡシンセサイザー等を用いて製造することもできる。
【００４２】
本発明にかかるＣｅ−ＣｈｎａｓｅをコードするＤＮＡは、適当な発現ベクターに組み換えることができ、かかる組み換えベクターは前記した本発明で使用されるタンパク質の組換え的生産に利用される。当該組換えベクターは、環状、直鎖状等いかなる形態のものであってもよい。かかる組換えベクターは、本発明で使用されるタンパク質をコードする核酸に加え、必要ならば他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基配列とは、エンハンサー配列、プロモーター配列、リボゾーム結合配列、コピー数の増幅を目的として使用される塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、他のポリペプチドをコードする塩基配列、ポリＡ付加配列、スプライシング配列、複製開始点、選択マーカーとなる遺伝子の塩基配列等のことである。
【００４３】
遺伝子組み換えに際しては、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンをＣｅ−Ｃｈｎａｓｅをコードする核酸に付加したり、あるいは塩基配列内に適当な制限酵素切断配列を新たに発生させたりあるいは消失させたりすることも可能である。これらは当業者が通常行う作業の範囲内であり、当業者はＣｅ−ＣｈｎａｓｅをコードするＤＮＡを基に任意かつ容易に加工することができる。
【００４４】
また本発明で使用されるタンパク質をコードする核酸を保持するベクターは、使用する宿主に応じた適当なベクターを選択して使用すればよく、プラスミドの他にバクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス等の種々のウイルスを用いることも可能である。
【００４５】
利用可能な市販の発現ベクターとしては、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐｃＤＮＡＩ（フナコシ社製）、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＥＧＦＰ-Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＢＴ−９(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製)、等を例示することができる。
【００４６】
本発明で使用されるタンパク質の発現は、該タンパク質をコードする遺伝子固有のプロモーター配列の制御下に発現させることができる。あるいは、本発明で使用されるタンパク質をコードする塩基配列の上流に別の適当な発現プロモーターを連結して使用することもできる。
【００４７】
発現プロモーターは、宿主及び発現の目的に応じて適宜選択すればよく、例えば宿主が大腸菌である場合にはＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λＰＬプロモーターなどが、宿主が酵母である場合にはＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合にはＳＶ４０由来プロモーター、レトロウィルスプロモーター、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。
【００４８】
本発明で使用されるタンパク質をコードする核酸、好ましくはＤＮＡを上記に例示されたプロモーターに連結する、あるいは発現ベクターに組み込む等の操作は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），１９８９年、参照）を初めとする、種々の遺伝子組み換え操作を詳細に解説した実験操作マニュアル書の指示に基づいて行うことができる。
【００４９】
宿主細胞の例としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、バチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、エルウニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属細菌、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属微生物、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属微生物、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母等の微生物、カイコなどの昆虫細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＭＥＦ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＷＩ３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ１２７細胞、ＨＫＧ細胞、ヒト腎細胞株等の動物細胞を挙げることができる。中でも、真核生物の細胞、特にＣＯＳ−７細胞等の哺乳類細胞の利用が好ましい。
【００５０】
宿主細胞に発現ベクターを導入する方法としては、前記のＳａｍｂｒｏｏｋらを初めとする実験操作マニュアル書に記載されている方法、例えば、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈澱法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法等により行うことができる。Ｓｆ９やＳｆ２１等の昆虫細胞の利用については、バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２年）やＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９８８年、第６巻、第４７頁等に記載されている。
【００５１】
本発明で使用されるタンパク質は、前記の発現ベクターを上記の宿主細胞内で発現させ、宿主細胞或いは培地から目的とするタンパク質を回収し、精製することによって得ることができる。タンパク質を精製する方法としては、蛋白質の精製に通常使用されている方法の中から適切な方法を適宜選択して行うことができる。すなわち、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィー等の各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー等、通常使用され得る方法の中から適切な方法を適宜選択し、必要によりＨＰＬＣシステム等を使用して適当な順序で精製を行えば良い。
【００５２】
本発明で使用されるタンパク質を他の機能性タンパク質やポリペプチドとの融合タンパク質として発現させた場合には、その機能性タンパク質やポリペプチドに特徴的な精製法を採用することが好ましい。融合タンパク質は、適当なプロテアーゼ（トロンビン、トリプシン等）を用いて切断し、本発明のタンパク質を回収することができる。
【００５３】
この様に本発明で使用されるタンパク質は、それ単独の形態でも別種の蛋白質との融合蛋白質の形態でも調製することができるが、これらのみに制限されるものではなく、本発明で使用されるタンパク質を更に種々の形態へと変換させることも可能である。例えば、蛋白質に対する種々の化学修飾、ポリエチレングリコール等の高分子との結合、不溶性担体への結合、リポソームへの封入など、当業者に知られている多種の手法による加工が考えられる。
【００５４】
また本発明で使用されるタンパク質は、例えばＦｍｏｃ法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)やｔＢｏｃ法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の、有機化学的合成方法、あるいは市販されている適当なペプチド合成機を用いて製造することもできる。
【００５５】
本発明は、上記したＣｅ−Ｃｈｎａｓｅを有効成分とするムコ多糖分解促進剤、及び該ムコ多糖分解促進剤と薬学的不活性成分とを含む医薬組成物を提供する。当該医薬組成物は、脊髄損傷治療用、特に椎間板ヘルニア、より好ましくは硬膜外遊走型椎間板ヘルニアまたは経靭帯性脱出型椎間板ヘルニアによる脊椎損傷を治療するための医薬組成物である。
【００５６】
医薬組成物中のＣｅ−Ｃｈｎａｓｅの含有量は、脊椎に損傷を与えているムコ多糖を含む物質、具体的には髄核を分解乃至溶解するための有効量であればよい。ここで「有効量」とは、突出、遊走等により脊髄硬膜外腔に存在する髄核を溶解し、髄核による影響を排除することのできる量を意味する。
【００５７】
薬学的不活性成分は、それ自体は治療目的に対する有効成分ではない、すなわち薬理活性を持たない成分であるが、担体、賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤その他のような、薬剤あるいは医薬組成物の調製に通常用いられる成分を意味する。
【００５８】
例えば、担体あるいは賦形剤としては、デキストラン類、スクロース、ラクトース、マルトース、キシロース、トレハロース、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、イノシトール、血清アルブミン、ゼラチン、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール）などを挙げることができる。
【００５９】
本発明組成物中のＣｅ−Ｃｈｎａｓｅと薬学的不活性成分の配合比率は特に限定されるものではなく、投与量や組成物の形態等に応じて、当業者が適宜決定することができる。また本発明のムコ多糖分解促進剤又はこれを含む医薬組成物は、液剤、固体剤、ペーストその他の形態の何れであってもよく、それらは製剤学的に公知の方法を採用することで、適宜調製することができる。好ましい形態は、Ｃｅ−Ｃｈｎａｓｅを含む注射用製剤の形態であり、特に凍結乾燥状態の製剤である。かかる製剤は、タンパク質を含む注射用製剤、特に凍結乾燥製剤を調製する一般的な方法によって製造することができる。
【００６０】
なお、本発明のムコ多糖分解促進剤、及び該ムコ多糖分解促進剤と薬学的不活性成分とを含む医薬組成物には、Ｃｅ−ＣｈｎａｓｅのＤ−グルクロン酸に結合したＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解する活性を抑制或いは不活性化するものでなければ、鎮痛剤、消炎剤その他の薬理活性成分を含んでいてもよい。
【００６１】
本発明の医薬組成物は、脊椎損傷、例えば椎間板ヘルニアによる脊椎損傷、特に硬膜外遊走型椎間板ヘルニアや経靭帯性脱出型椎間板ヘルニア等の、突出や遊離等によって髄核が脊髄硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアの治療に用いることができる。ヘルニアによる脊椎損傷に対するコンドロイチナーゼＡＢＣによる治療効果はすでに確認されており（池上ら、「臨床整形外科」、２００７年、第４２巻、第２号、第１２４−１２８頁）、コンドロイチンを分解する活性を有するＣｅ−Ｃｈｎａｓｅも、コンドロイチナーゼＡＢＣと同様、脊椎損傷、特に椎間板ヘルニアによる脊椎損傷に対する治療効果を有するものである。
【００６２】
また、これまでに医薬として利用が検討されているコンドロイチナーゼＡＢＣを初めとする細菌由来の既知のコンドロイチナーゼは、脱離反応によって、非還元末端に不飽和結合を持つウロン酸を有するオリゴ糖を生成させる。不飽和ウロン酸は哺乳動物には存在しない糖であり、哺乳動物に対して抗原性を示す。そのため、既知の細菌由来のコンドロイチナーゼの利用は、ヒトに対して抗原性を示す物質が投与されたヒトの体内で生成してしまうという問題を有している。一方の本発明にかかるＣｅ−Ｃｈｎａｓｅは、加水分解反応によって、非還元末端に不飽和結合を持たないグルクロン酸を有するオリゴ糖が生成させる。グルクロン酸は哺乳動物に対する抗原性は非常に低く、従って、Ｃｅ−Ｃｈｎａｓｅを含むムコ多糖分解促進剤または該ムコ多糖分解促進剤と薬学的不活性成分とを含む医薬組成物をヒトに投与しても、細菌由来の既知のコンドロイチナーゼの投与で指摘される問題は発生しない。
【００６３】
本発明は、上記の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数十個のアミノ酸が置換され、欠失され、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−グルクロン酸に結合したＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解する活性を有するタンパク質、配列番号１において１〜２６番目のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、及び配列番号１において１〜２６番目のアミノ酸残基が欠失し、さらに１個もしくは数個のアミノ酸が置換され、欠失され、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−グルクロン酸に結合したＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解する活性を有するタンパク質よりなる群から選ばれるタンパク質とムコ多糖とを反応させる工程、及びグルクロン酸を非還元末端として有するオリゴ糖を回収する工程を含む、ムコ多糖からグルクロン酸を非還元末端として有するオリゴ糖を製造する方法も提供する。
【００６４】
タンパク質とムコ多糖とを反応させる工程は、先に説明したＣｅ−Ｃｈｎａｓｅのムコ多糖分解活性が発揮されるｐＨ、温度等の条件において、適当量の基質と酵素タンパク質とを混合してインキュベートする工程である。Ｃｅ−Ｃｈｎａｓｅは組み換え生産されたタンパク質であることが好ましく、特に適当なレジンに固相化したＣｅ−Ｃｈｎａｓｅであることが特に好ましい。かかる固相化されたＣｅ−Ｃｈｎａｓｅを利用すれば、固相化した酵素タンパク質とムコ多糖を連続的に反応させることで、機能性ムコ多糖類を連続的に、また大量に製造することができる。
【００６５】
グルクロン酸を非還元末端として有するオリゴ糖を回収する工程は、タンパク質とムコ多糖とを反応させた後の反応液から、生成物であるグルクロン酸を非還元末端として有するオリゴ糖を、反応液の形態で回収する、部分的に精製された形態で回収する、又は実質的に完全に精製された形態で回収する工程である。上記したような固相化した酵素タンパク質とムコ多糖との連続反応では、固相担体から分離される反応液の形態ですでに生成物であるオリゴ糖は十分に精製された状態になっている。またオリゴ糖は、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーその他のオリゴ糖の精製に通常用いられる、当業者に広く知られた種々の分画方法によって、高度に精製し、あるいはオリゴ糖の構成糖の種類、あるいは糖鎖数毎にさらに細かく分画して利用してもよい。
【００６６】
グルクロン酸を非還元末端として有するオリゴ糖は、ヒトに対する抗原性が非常に低く、かつムコ多糖類として抗炎症作用、癌転移の阻害その他の有用な機能を発揮することが期待されており、本発明は、かかる機能性オリゴ糖を製造する方法として有益である。
【００６７】
なお、本発明におけるＣｅ−Ｃｈｎａｓｅはコンドロイチンやコンドロイチン硫酸に対して、特にコンドロイチンに対して高い分解活性を示すことから、本発明のムコ多糖分解促進剤及びこれを含む医薬の好ましい態様は、コンドロイチン分解促進剤、コンドロイチン硫酸分解促進剤又はそれらを含む医薬であり、特に好ましい態様はコンドロイチン分解促進剤又はそれを含む医薬である。また同様に、ムコ多糖からオリゴ糖を製造する方法の好ましい態様は、コンドロイチン又はコンドロイチン硫酸からオリゴ糖を製造する方法であり、特に好ましい態様はコンドロイチンからオリゴ糖を製造する方法である。
【００６８】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明する。
【実施例】
【００６９】
＜実施例１＞  組み換えＣｅ−Ｃｈｎａｓｅの製造
【００７０】
（１）クローニング
クローンＴ２２Ｃ８．２（ＷｏｒｍＢａｓｅ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｔ２２Ｃ８．２）の塩基配列情報を基に下記の２組のプライマーＤＮＡを用意し、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＮ２のｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてネスティッドＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）を行った。
【００７１】
プライマーＦ１（配列番号３）
５’−ＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＧＴＧＡＡＧＴＴＴＧＧＴＡＧＧＡ−３’ 
プライマーＲ１（配列番号４）
５’−ＣＴＣＧＡＧＴＣＴＣＡＡＡＧＴＣＡＡＡＡＴＧＧＣＡＡＡ−３’
プライマーＦ２（配列番号５）
５’−ＣＴＣＧＡＧＧＧＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＴＴＧＡＴＣＣＡＡ−３’
プライマーＲ２（配列番号６）
５’−ＣＴＣＧＡＧＡＧＡＡＧＡＴＴＧＣＡＣＴＧＣＣＡＡＣＡ−３’
【００７２】
ＰＣＲは、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）を用い、５％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシドの存在下で、［９５℃を３０秒間、５４℃で４５秒間、６８℃で２分間］からなるサイクルを３０回行った。増幅されたＤＮＡ断片（約１．４ｋｂｐ）を回収し、末端にアデノシンモノリン酸を付加し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に挿入した。挿入部分の塩基配列を決定し、配列番号２に示すＤＮＡ（配列番号１のアミノ酸配列をコードするＯＲＦを含む全１３７７ｂｐのＤＮＡ）を保持した組み換えベクターが得られたことを確認した。
【００７３】
（２）発現ベクターの構築
（１）で得た組み換えベクターを鋳型として、下記の一組のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件は（１）と同じである。
【００７４】
プライマーＦ３（配列番号７）
５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＴＣＧＧＧＡＧＣＣＴＣＣ−３’
プライマーＲ３（配列番号８）
５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＴＴＧＴＴＣＡＣＴＡＴＴＡＴ−３’
【００７５】
増幅されたＤＮＡ断片（約１３００ｂｐ）をＢａｍＨＩで消化し、発現ベクターｐ３ＸＦＬＡＧ−ＣＭＶ−８（Ｓｉｇｍａ社）のＢａｍＨＩサイトにサブクローニングした。この操作により、配列番号１のＮ末端から２６アミノ酸残基が欠失した可溶化型Ｃｅ−ＣｈｎａｓｅのＮ末端側にプレプロトリプシンのリーダー配列及び３ＸＦＬＡＧタグが付加された融合タンパク質をコードするＤＮＡを保持した発現ベクターを得た。この融合タンパク質の全アミノ酸配列は、配列番号９に示されるとおりである。
【００７６】
（３）組み換え細胞を用いた発現
ＦｕＧＥＮＥＴＭ６（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いて、（２）で得た発現ベクター（６．６μｇ）をＣＯＳ７細胞に導入し、３７℃で３日間培養後、１ｍＬの培地を回収して、５μＬのＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ２ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｇｅｌと４℃で一晩インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２５ｍＭのトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ−Ｔ）でレジンを洗浄後、ＤＴＴを含む３０μＬのＳＤＳサンプルバッファーで１００℃、５分処理した。遠心分離後の上澄みを回収してＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、泳動後のタンパク質をＰＶＤＭに転写した。転写後のＰＶＤＭ膜にＴＢＳ−Ｔで１０００倍稀釈したＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ社）で一晩インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔで１００００倍に稀釈したＥＣＬＴＭホースラディッシュパーオキシダーゼでラベルした抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）とＰＶＤＭ膜とをインキュベーションし、膜に結合した抗体をＥＣＬ Ａｄｖａｎｃｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて検出した。その結果、Ｎ末端２６アミノ酸残基が欠失され、代わりにＦＬＡＧタグが付加されたＣｅ−Ｃｈｎａｓｅが培養液に分泌されていることが確認された。
【００７７】
＜実施例２＞  コンドロイチン分解促進活性の測定
【００７８】
（１）分解活性の確認
実施例１で調製されたＣｅ−Ｃｈｎａｓｅが結合したＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ２ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｇｅｌを、ＴＢＳＴ、さらに１５０ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄後、ＦＩＴＣでラベルしたコンドロイチン６μｇを含む同緩衝液に再懸濁し、２８℃で１２時間反応させた。Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いた濾過でレジンを除いた後、濾液をＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にアプライしてゲル濾過を行った。検出は励起波長４９０ｎｍ、発光波長５２０ｎｍの蛍光を検出することで行った。活性は、ＲＴ１９分〜５１分までの総ピーク面積をＦＩＴＣでラベルしたコンドロイチンの総蛍光強度とし、総蛍光強度に対する低分子量フラグメント（ＲＴ３４分〜５１分）の存在比率をそのピーク面積から求めることで表した。
【００７９】
酵素反応前のＦＩＴＣでラベルしたコンドロイチンのゲル濾過の溶出パターンを図１のパネルＡに、酵素反応後の濾液のゲル濾過の溶出パターンを図１のパネルＢに、それぞれ示す。酵素反応によりコンドロイチンのピークが消失し、オリゴサッカライドのピークが観察された。
【００８０】
（２）反応産物の質量分析
実施例１で調製されたＣｅ−Ｃｈｎａｓｅが結合したＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ２ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｇｅｌ１５μＬとラベルしていないコンドロイチン６μｇを２８℃で１２時間反応させ、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いた濾過でレジンを除いた後、Ｋｉｎｏｓｈｉｔａらの方法（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第２６９巻、第３６７−３７８頁）に従い、２−アミノベンゼンアミド（２ＡＢ）を濾液に加えてサンプルをラベルし、過剰の２ＡＢをクロロホルム抽出で除去した。ラベルしたサンプルを０．２ＭのＮＨ４ＨＣＯ３で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｌｕｍｎにアプライしてゲル濾過を行った。ゲル濾過の溶出パターン（図２）から２つのピーク（Ｏ−１とＯ−２）をそれぞれ分取し、ＤＥ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ ＳＴＲ−Ｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて分析した。そのチャートを図３Ａ（ピークＯ−１）と図３Ｂ（ピークＯ−２）に示す。
【００８１】
ピークＯ−１のＭＳスペクトルからは、［Ｍ＋Ｈ］＋、［Ｍ＋Ｎａ］＋、及び「Ｍ−Ｈ］−の分子イオンシグナルがそれぞれｍ／ｚ９８７、ｍ／ｚ９１９及びｍ／ｚ８９５の位置に観察された。このことから、ピークＯ−１の成分はＨｅｘＵＡ２ＨｅｘＮＡｃ２−２ＡＢ（ＨｅｘＵＡ及びＨｅｘＮＡｃはそれぞれヘキサウロン酸及びＮ−アセチルヘキソサミンをそれぞれ示す）で表される４糖類であることが示唆された。一方のピークＯ−２のＭＳスペクトルからは、［Ｍ＋Ｈ］＋、［Ｍ＋Ｎａ］＋、［Ｍ＋Ｋ］＋及び「Ｍ−Ｈ］−の分子イオンシグナルがそれぞれｍ／ｚ１２７７、ｍ／ｚ１２９９、ｍ／ｚ１３１５及びｍ／ｚ１２７４の位置に観察された。このことから、ピークＯ−２の成分はＨｅｘＵＡ３ＨｅｘＮＡｃ３−２ＡＢで示される６糖類であることが示唆された。このことから、Ｃｅ−Ｃｈｎａｓｅは加水分解酵素であることが確認された。
【００８２】
（３）反応産物の還元末端の特定
（２）で調製した２ＡＢでラベルしたサンプル３μｇに、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｏｒ  ａｕｒｅｓｃｅｎｓ由来のコンドロイチナーゼＡＣ−ＩＩ（ＣＳａｓｅＡＣ−ＩＩ）５ｍＩＵ／μＬ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０を加え、３７℃で１時間反応させた。反応前と反応後のサンプルそれぞれを、アミン結合シリカＰＡ０３カラム（ＹＭＣ  Ｃｏ．）にアプライして、ＮａＨ２ＰＯ４の１６−８００ｍＬのリニアグラジエント／６０分、１ｍＬ／分の条件でアニオン交換イオンクロマトグラフィー（アニオン交換ＨＰＬＣ）を行った。その結果を図４に示す。パネルＡはマーカー、パネルＢは反応前のサンプル、パネルＣは反応後のサンプルの溶出パターンをそれぞれ示す。
【００８３】
パネルＢは、反応前のサンプルに、テトラサッカライド（ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ−ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ）、ヘキササッカライド（ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ−ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ−ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ）さらにオクタサッカライド （ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ−ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ−ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ−ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ）が含まれていることを示している。一方のパネルＣは、不飽和のジサッカライドであるΔＨｅｘＵＡ−ＧａｌＮＡｃ−２ＡＢのピークのみを与えた。このことから、反応前のサンプルに含まれているＣｅ−Ｃｈｎａｓｅの反応生成物の還元末端はＧａｌＮＡｃであり、同酵素はヘキソサミニダーゼの一種であることが確認された。
【００８４】
＜実施例３＞  酵素特性の解析
【００８５】
（１）ｐＨ安定性
（４）の反応で用いた緩衝液を５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ４．０〜８．０として、２８℃で９時間反応させて、ｐＨプロファイルを確認した。その結果、Ｃｅ−ＣｈｎａｓｅはｐＨ５．０〜６．０の範囲に至適ｐＨを有することが確認された（図５）。
【００８６】
（２）基質特異性の確認
（３）でタンパク質を結合させたＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ２ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｇｅｌ１５μＬを、コンドロイチン、クジラ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ａ（ＣＳ−Ａ）、サメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ｃ（ＣＳ−Ｃ）、各６μｇと２８℃で１２時間反応させた。各分解生成物をＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｌｕｍｎ（GEヘルスケア社）にアプライしてゲル濾過を行った。その結果を図６Ａ〜６Ｂに示す。コンドロイチンを基質としたときのＣｅ−Ｃｈｎａｓｅの分解活性を１００としたときの、ＣＳ−Ａ及びＣＳ−Ｃに対する分解活性は、１２及び７であった。
【００８７】
また、図６ＡのピークＡ−１と図６ＢのピークＣ−１をそれぞれ回収し、実施例２の（２）（３）に記載した方法に従い、２ＡＢによるラベル化、ＣＳａｓｅＡＣ−ＩＩによる消化、アニオン交換ＨＰＬＣを行った。アニオン交換ＨＰＬＣのチャートを図７に示す。パネルＡがピークＡ−１、パネルＢがピークＣ−１に関する。ピークＡ−１とＣ−１はそれぞれピークＡ−Ａ、ピークＣ−Ｃとして溶出され、その構造はＡ−ＡがＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ（４−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）−ＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ（４−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）、Ｃ−ＣがＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ（６−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）−ＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ（６−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）として特定された。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】酵素反応前のＦＩＴＣでラベルしたコンドロイチンのゲル濾過の溶出パターン（パネルＡ）と、酵素反応による分解生成物のゲル濾過の溶出パターン（パネルＢ）を示す。Ｖ０はボイド、Ｖｔは全容量を、また図中の▼はラベルしていない８糖、６糖、４糖からなるグリコサミノグリカンの溶出位置をそれぞれ示す。
【図２】２ＡＢでラベルされた分解生成物のゲル濾過の溶出パターンを示す。Ｖ０はボイド、Ｖｔは全容量をそれぞれ示す。
【図３】２ＡＢでラベルされた分解生成物（ピークＯ−１及びＯ−２）のＤＥ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳチャートを示す。パネルＡがピークＯ−１、パネルＢがピークＯ−２をそれぞれ示す。
【図４】２ＡＢでラベルされた分解生成物をアニオン交換クロマトグラフィー分析したときの溶出パターンを示す。パネルＡはオリゴサッカライドマーカーの溶出パターン、パネルＢはＣＳａｓｅＡＣ−ＩＩ反応前の分解生成物の溶出パターン、パネルＣはＣＳａｓｅＡＣ−ＩＩ反応後の分解生成物の溶出パターンを、それぞれ示す。またパネルＡの各ピークは次の通りである。  ピーク１：ΔＨｅｘＵＡ−ＧｌｃＮＡ、ピーク２：ΔＨｅｘＵＡ−ＧａｌＮＡｃ、ピーク３：ΔＨｅｘＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（６−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）、ピーク４：ΔＨｅｘＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（４−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）、ピーク５：ΔＨｅｘＵＡ（２−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）−ＧａｌＮＡｃ（６−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）、ピーク６：ΔＨｅｘＵＡ（２−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）−ＧａｌＮＡｃ（４−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）、ピーク７：ΔＨｅｘＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ｄｉｓｕｌｆａｔｅ）、ピーク８：ΔＨｅｘＵＡ（２−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）−ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ｄｉｓｕｌｆａｔｅ）
【図５】Ｃｅ−Ｃｈｎａｓｅのコンドロイチン分解活性のｐＨプロファイルを示す。
【図６Ａ】クジラ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ａ（ＣＳ−Ａ）にＣｅ−Ｃｈｎａｓｅを作用させたときの反応物のゲル濾過による溶出パターンを示す。
【図６Ｂ】サメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ｃ（ＣＳ−Ｃ）にＣｅ−Ｃｈｎａｓｅを作用させたときの反応物のゲル濾過による溶出パターンを示す。
【図７】２ＡＢ化した図６ＡのピークＡ−１、図６ＢのピークＣ−１をＣＳａｓｅＡＣ−ＩＩで消化した消化物の、アニオン交換ＨＰＬＣチャートを示す。パネルＡがピークＡ−１、パネルＢがピークＣ−１にそれぞれ関する。また、図中の１〜８の↓は、下記の化合物のピーク位置を示す。  １：ΔＨｅｘＡ−ＧｌｃＮＡｃ、２：ΔＨｅｘＡ−ＧａｌＮＡｃ、３：ΔＨｅｘＡ−ＧａｌＮＡｃ（６−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）、４：ΔＨｅｘＡ−ＧａｌＮＡｃ（４−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）、５：ΔＨｅｘＡ（２−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）−ＧａｌＮＡｃ（６−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）、６： ΔＨｅｘＡ（２−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）−ＧａｌＮＡｃ（４−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）、７：ΔＨｅｘＡ−ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ｄｉｓｕｌｆａｔｅ）、８： ΔＨｅｘＡ（２−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）−ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ｄｉｓｕｌｆａｔｅ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【配列表】
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