(57)【要約】【課題】インタクトな赤血球を使用して検体中の抗赤血球抗体の存在を検査する際に使用される抗体結合着色粒子に関して、明瞭かつ安定した陽性像を形成することが可能な抗体結合着色粒子を作製すること。【解決手段】インタクトな赤血球を使用して検体中の抗赤血球抗体の存在を検査するための抗体結合着色粒子の作製方法であって、ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子を作製する工程；得られた粒子の懸濁液に染料を添加し、着色粒子を作製する工程；得られた着色粒子に、物理吸着法により、被検生物種に対する抗体を結合させる工程を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インタクトな赤血球を使用して検体中の抗赤血球抗体の存在を検査するための抗体結合着色粒子の作製方法であって、
ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子を作製する工程；
得られた粒子の懸濁液に染料を添加し、着色粒子を作製する工程；
得られた着色粒子に、物理吸着法により、被検生物種に対する抗体を結合させる工程
を含む方法。
【請求項２】
前記染料が反応染料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
得られた着色粒子を加熱処理する工程を更に含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記染料が、ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子１ｇあたり0.05〜0.5ｇの量で添加される、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載の方法により作製された抗体結合着色粒子。
【請求項６】
検体中の抗赤血球抗体の存在を検査する方法であって、
請求項１〜４の何れか１項に記載の方法で作製された抗体結合着色粒子と、インタクトな赤血球を固相化した基板と、検体との間で凝集反応を行う工程；および
凝集反応の有無を目視で判定する工程
を含む方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、
抗体結合着色粒子が、磁性粒子であり、
凝集反応が、磁性混合受身血球凝集法（magnetic-mixed passive hemagglutination法；M-MPHA法）により行われる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インタクトな赤血球を使用して検体中の抗赤血球抗体の存在を検査するための抗体結合着色粒子の作製方法、および当該方法により作製される抗体結合着色粒子に関する。本発明の抗体結合着色粒子は、被検生物種に対する抗体を結合しており、インタクトな赤血球と抗赤血球抗体の複合体を結合し、視覚化する機能を有する。
【背景技術】
【０００２】
免疫学的検査における凝集法は、抗原/抗体が固相された粒子と検体中の目的物質が反応することにより、粒子間で架橋反応が起こること（凝集）を観察する検査方法である。
【０００３】
このための粒子として、古くはヒツジやニワトリ等の動物赤血球を固定化したものを使用していた（OLYMPUS社  anti-PLTオリビオMPHAII、特殊免疫研究所  マイセルanti-HBc、富士レビオ社  セロディアHbs）。赤血球に含まれるヘモグロビンが固定されることにより、褐色を呈するので、特別に染色等の処理を行わなくても、目視が容易であった。しかし、動物由来の細胞であるので、Lot間の差、使用する動物の個体差、或いは、動物細胞を使用することに起因する非特異反応の発生が問題となる。
【０００４】
これらを解決するために人工粒子を使用した凝集試薬が市販され、たとえば、ポリスチレンやゼラチン粒子などの人工的に合成した高分子粒子が使用されている。ここで問題となるのは、凝集反応を視認性良く、観察するための粒子の染色である。ポリスチレン粒子を使用した着色粒子としては、Lab screen(one Lamda社)などが広く使用されている。ゼラチン粒子に関しては、Ortho社  HCV ab PA test II、富士レビオ社  セロディアHTLV1などが市販化されている。しかし、紫等極めて限られた色でしか実現していない。
【０００５】
一方、他の人工粒子として、生体由来のゼラチンと水溶性多糖類を用いた複合コアセルベートが使用されている。ゼラチンと水溶性多糖類であるアラビアゴムを使用する複合コアセルベートの歴史は古く、非特許文献１（HG Bundenberg de Jong. In Colloid Science 1949 Vol2, Amsterdam）によって紹介され、その後、数々の検討がなされている。特許文献１（特開昭59-35143）では有機溶媒非存在下でゼラチン、水溶性多糖及びメタリン酸イオンからコアセルベートを作成する方法を述べている。コアセルベート合成時に有機溶媒を使用する方法も、特許文献２（特開昭57-153658号）、特許文献３（特開昭58-113754号）に記載されている。また、特許文献４（特公平7-86508）は、ゼラチン、アラビアゴムとを親水性有機溶媒の存在下でコアセルベートを形成する方法を報告している。特許文献１および３は、ゼラチンと水溶性多糖類を含む粒子の染色に関して言及しており、「担体を着色する場合には、着色剤を粒子形成前に溶液に加えておくのがよいこと」を述べている。
【０００６】
また、上記コアセルベート粒子への抗体の結合に関して、特許文献５（特開2005-043269）および特許文献６（特開2004-157040）は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド法（EDAC/NHS法）で抗体を結合させると高い抗体結合量が得られることを記載している。
【非特許文献１】HG Bundenberg de Jong. In Colloid Science 1949 Vol 2, Amsterdam
【特許文献１】特開昭５９−３５１４３号公報
【特許文献２】特開昭５７−１５３６５８号公報
【特許文献３】特開昭５８−１１３７５４号公報
【特許文献４】特公平７−８６５０８号公報
【特許文献５】特開２００５−４３２６９号公報
【特許文献６】特開２００４−１５７０４０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、インタクトな赤血球を使用して検体中の抗赤血球抗体の存在を検査する際に使用される抗体結合着色粒子に関して、明瞭かつ安定した陽性像を形成することが可能な抗体結合着色粒子を作製することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、下記（Ａ）〜（Ｃ）の実験結果に基いて完成された。
【０００９】
（Ａ）特許文献１および３に記載される従来法に従って、ゼラチン/アラビアゴム粒子の形成前（すなわち粒子形成中）に染料を添加して着色粒子を作製したところ、染色後の洗浄操作により染料の色が落ちてしまい、結果的に粒子は染色されなかった。一方、粒子形成後に染料を添加して粒子を染色したところ、粒子形成後であるにもかかわらず、染料は粒子に安定して組み込まれ、色落ちすることがないことが見出された（下記例１参照）。
【００１０】
（Ｂ）着色粒子への抗体の導入に関しては、一般に、凝集反応の効率を高めるために多くの抗体を導入することが求められる。そこで、上述のとおり作成された着色粒子に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド法（EDAC/NHS法）により抗体を結合させたところ、染料濃度の増加による抗体結合量の低下が観察された。これに対し、物理吸着法により抗体を結合させた場合、染料濃度の増加による抗体結合量の低下は観察されなかった（下記例３〜４参照）。
【００１１】
（Ｃ）また、「EDAC/NHS法により抗体を結合させた抗体結合着色粒子」は、インタクトな赤血球と抗赤血球抗体の複合体を凝集させる凝集反応において、抗体結合量が多いにもかかわらず、凝集反応効率は低いことが観察された（下記例６参照）。一方、「物理吸着法により抗体を結合させた抗体結合着色粒子」は、血小板、血漿蛋白、顆粒球に対する抗体を検出する場合の凝集反応では、抗体非結合粒子の場合でも陽性像（偽陽性反応）を呈してしまうという不具合があった。これに対し「物理吸着法により抗体を結合させた抗体結合着色粒子」は、赤血球に対する抗体（抗赤血球抗体）を検出する場合の凝集反応では、偽陽性反応を呈することなく、陽性検体に対して高い凝集反応効率を示すことが見出された（下記例５〜９参照）。
【００１２】
すなわち、本発明は、一つの側面によれば、インタクトな赤血球を使用して検体中の抗赤血球抗体の存在を検査するための抗体結合着色粒子の作製方法であって、ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子を作製する工程、得られた粒子の懸濁液に染料を添加し、着色粒子を作製する工程、および得られた着色粒子に、物理吸着法により、被検生物種に対する抗体を結合させる工程を含む方法、並びにこの方法により作製された抗体結合着色粒子である。
【００１３】
別の側面によれば、本発明は、検体中の抗赤血球抗体の存在を検査する方法であって、前記抗体結合着色粒子と、インタクトな赤血球を固相化した基板と、検体との間で凝集反応を行う工程；および凝集反応の有無を目視で判定する工程を含む方法である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の抗体結合着色粒子は、検体中に抗赤血球抗体が存在する場合のみ、高い凝集反応効率で、明瞭かつ安定した陽性像を形成することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明について説明するが、以下の記載は、本発明を説明するためのものであって、本発明を限定するものではない。
【００１６】
１．抗体結合着色粒子
本発明の抗体結合着色粒子は、インタクトな赤血球を使用して検体中の抗赤血球抗体の存在を検査するための粒子である。具体的には、本発明の抗体結合着色粒子は、被検生物種に対する抗体を結合しており、インタクトな赤血球と抗赤血球抗体の複合体を結合し、視覚化する機能を有する。
【００１７】
本発明の抗体結合着色粒子は、ゼラチン/アラビアゴムコアセルベート着色粒子に、被検生物種に対する抗体を結合させることにより得ることができる。すなわち、本発明の抗体結合着色粒子は、
（１）ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子を作製する工程；
（２）得られた粒子の懸濁液に染料を添加し、着色粒子を作製する工程；
（３）得られた着色粒子に、物理吸着法により、被検生物種に対する抗体を結合させる工程
を含む方法により作製することができる。
【００１８】
以下、各工程の順に説明する。
【００１９】
（１）粒子を作製する工程
本発明において「ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子」は、ゼラチンとアラビアゴムを含むコアセルベート粒子であり、ここで「含む」とは、ゼラチンおよびアラビアゴムを主成分として粒子が構成されているが、その他必要に応じて任意成分を含んでいてもよいことを意味する。任意成分としては、例えば、粒子に所望の性質を付与するために添加される物質、および粒子を形成する際に添加され粒子に混入する化学物質等が挙げられる。ここで「粒子に所望の性質を付与するために添加される物質」には、粒子内に封入される後述の芯物質が含まれる。
【００２０】
本発明の粒子の原料となるゼラチンは、当該技術分野でゼラチンアラビアゴムコアセルベートを調製する際に使用可能なものであればよく、主として、ウシ、ブタの骨や皮に含まれるコラーゲン質を分解生成したものを使用することができる。ゼラチンおよびアラビアゴムは、商業的に入手可能なものを使用することができる。
【００２１】
作製されるコアセルベート粒子の径（直径）は、コアセルベート形成終了時のｐＨおよびゼラチン/アラビアゴム比（Ｇ/Ａ）により適宜調節することができるが、一般に免疫学的分析に使用する粒子を作製する場合には、コアセルベート径（直径）を例えば１〜１０μｍとすることができる。
【００２２】
「ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子を作製する工程」について、以下説明する。
【００２３】
まず、ゼラチンのゲル化温度以上（好ましくは35℃以上、例えば約40℃）において、0.01〜2重量％のゼラチン(Ｇ)と0.01〜2重量％のアラビアゴム(Ａ)を、その重量比(Ｇ/Ａ)を一般的には0.5〜1.5、好ましくは0.5〜1.2、より好ましくは0.5〜1.0になるように、29〜65重量％の水溶性有機溶媒中で混合する。ここで水溶性有機溶媒は、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン等が使用可能であるが、毒性等を考慮すればエタノールが望ましい。また、Ｇ/Ａが上記範囲を超えるとコアセルベート径の調製が困難になる傾向があり、上記範囲を下回るとリガンドの結合量が減少する傾向がある。コアセルベートの調製液中には、当該分野で公知のとおり、コアセルベート粒子の凝集を防止するために、界面活性剤を添加しておくことが好ましい。界面活性剤の種類および添加量については、その効果を奏する範囲内において当業者であれば適宜設定することができる。
【００２４】
次いで、酸（例えば酢酸、プロピオン酸、希塩酸、希硫酸）の添加により、ゼラチンアラビアゴムコアセルベートを析出させる。ここで酸の添加量は、作製したいコアセルベート径に応じて適宜設定する。その後ゲル化温度以下（好ましくは35℃以下、例えば約10℃）に冷却し、グルタルアルデヒド、ホルマリン等のアルデヒドで架橋する。
【００２５】
また、コアセルベート粒子の作製にあたっては、芯物質を加えて、芯物質をコアセルベートで包んだいわゆるマイクロカプセルとすることもできる。所望の芯物質を用いることにより、コアセルベートの比重調整、コアセルベートの磁性化等を行うことが可能である。その際には適当な界面活性剤（例えばTween20、Tween80、Triton X-100など）を添加して、分散性を上げておくことが望ましい。芯物質としては、SiO2（ガラス）、TiO2、CuO、CoO、Fe2O3などの金属酸化物の微粉末、カーボン、タルクなど種々のものを利用することができる。磁性体を含有させたコアセルベート粒子は、適宜の磁気発生手段（永久磁石、電磁石等）により、液体中での攪拌、洗浄、測定等の各種処理工程を短時間で行うことができる。なお、当業者であれば、コアセルベート粒子を所望の性質とするために適切な芯物質の種類および芯物質の使用量について適宜選択することができる。
【００２６】
（２）着色粒子を作製する工程
本発明において粒子の着色は、作製されたゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子を、たとえば５〜３０重量％の濃度で精製水に懸濁し、そこに染料を添加することにより行うことができる。すなわち、本発明において染料は、粒子作製中ではなく粒子作製後に添加される。
【００２７】
本発明で使用される「染料」は、ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子を染色可能なものであれば任意のものを使用することができ、好ましくは反応染料が使用され、より好ましくは反応性の高い反応染料が使用される。本発明において「反応染料」は、化学分野で一般に反応染料と規定される染料を指す。「反応染料」は、より具体的には、染色目的物質の−ＯＨ基と化学反応により結合する染料である。本発明では、「反応染料」として市販されている任意の染料を使用することができ、たとえば後述の実施例で使用される染料、Kayacion Red E8BN、Kayacion Turquoise ENA（日本化薬株式会社）などを使用することができる。
【００２８】
粒子の着色は、たとえば、20重量％のゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子懸濁液を１Ｌ調製し、そこに反応染料を0.05〜0.5重量％の量で添加することにより行うことができる。後述の例３に示されるとおり、染料の濃度が増すと、着色粒子の視認性は増大するが、リガンドの結合量が低下する傾向が見られるため、着色粒子の視認性とリガンド結合量の両方の観点から、染料濃度は、20重量％の粒子懸濁液１Ｌに対し、好ましくは0.5重量％以上であり、より好ましくは0.5〜5重量％、更に好ましくは1〜3重量％である。染料濃度を、粒子１グラムあたりの染料の添加量（ｇ）に換算すると、粒子１ｇあたり、好ましくは0.05ｇ以上であり、より好ましくは0.05〜0.5ｇ、更に好ましくは0.1〜0.3ｇである。
【００２９】
染料を添加された粒子懸濁液は、一般的には室温〜100℃で１〜10時間、たとえば40℃で6時間、撹拌しながら染色反応を行う。
【００３０】
染色反応後、好ましくは、粒子に加熱処理を行う。加熱処理は、粒子懸濁液をオートクレーブで100〜130℃で10〜30分、たとえば120℃で15分、処理してもよいし、粒子懸濁液を60〜180分、煮沸処理してもよい。後述の例２に示されるとおり、粒子に加熱処理を行うことにより、粒子染色後の洗浄による色落ちを低減することができ、安定した染色が可能である。
【００３１】
後述の例１で実証されるとおり、本発明に従って粒子作製後に染料を添加して着色粒子を作製することにより、色落ちすることなく安定して染料を含むゼラチン/アラビアゴム着色粒子を作製することが可能である。
【００３２】
（３）抗体を結合させる工程
本発明では、上述の方法に従って作製された着色粒子に、物理吸着法を用いて、被検生物種に対する抗体を結合させる。「被検生物種」は、検体が由来する生物種を意味する。被検生物がヒトである場合、結合させる抗体は、たとえばウサギ抗ヒト抗体である。「物理吸着法」は、担体や粒子に物理吸着により抗体を結合させる手法として公知であり、一般的には、上述の方法に従って作製された着色粒子と抗体を適切な緩衝液中で室温で一晩反応させることにより、担体や粒子に抗体を物理的に吸着させることができる。なお、物理吸着法は、後述の例４に示されるとおり、非着色粒子に抗体を結合させることができないため、「染色法」とも称される。「物理吸着法」は、生化学分析におけるタンパクの測定やタンパク電気泳動における染色で利用されている染料とタンパクの結合と同じ原理に基くものである。
【００３３】
作製された抗体結合着色粒子は、そのまま目的とする免疫学的反応用の溶液に置換して目的の反応に利用してもよいし、バイアル瓶等に分注して凍結乾燥し、長期保存をすることも可能である。
【００３４】
２．検体中の抗赤血球抗体の存在を検査する方法
検体中の抗赤血球抗体の存在を検査する方法は、
上述の方法に従って作製された抗体結合着色粒子と、インタクトな赤血球を固相化した基板と、検体との間で凝集反応を行う工程；および
凝集反応の有無を目視で判定する工程
を含む。
【００３５】
本発明の検査方法は、当該技術分野で「混合受身血球凝集法（mixed passive hemagglutination法；MPHA法）」と称される方法を利用したものである。本発明において好ましくは、抗体結合着色粒子として磁性体を含有する磁性粒子が使用され、この方法は、「磁性混合受身血球凝集法（magnetic-mixed passive hemagglutination法；M-MPHA法）と称される。
【００３６】
ここで「インタクトな赤血球」とは、文字通り、完全な形態の生きた赤血球を意味する。インタクトな赤血球は、当該技術分野で公知の手法に従って基板に固相化することができる。基板は、陽性反応により得られる着色粒子の凝集物と陰性反応により得られる着色粒子の非凝集物とが異なるパターンを形成することが可能な形状を有している必要がある。基板は、たとえばＵ底のウェルの形状を有し、ここで、着色粒子の凝集物は広がったパターンを形成し、着色粒子の非凝集物は、ウェル底部の中央に集中して沈降する。
【００３７】
たとえば、後述の例５および６に記載されるとおり、本発明の検査方法を実施することができる。すなわち、「インタクトな赤血球を固相化した基板」と、「検体溶液」と、「被検生物種に対する抗体を結合した本発明の抗体結合着色粒子」とを反応させ、凝集反応の有無を目視で判定することにより、検体溶液中に抗赤血球抗体が存在するか否か検査を行うことができる。かかる免疫学的反応において本発明の抗体結合着色粒子は、好ましくは0.1〜0.6重量％の粒子浮遊液の状態で使用され得る。
【００３８】
このように本発明の抗体結合着色粒子は、着色されているため、凝集反応を目視により観察することが可能である。
【００３９】
本発明の抗体結合着色粒子は、検体中の抗赤血球抗体の検出に用いた場合、後述の例５および６で実証されるとおり、検体中に抗赤血球抗体が存在する場合のみ、高い凝集反応効率で、明瞭かつ安定した陽性像を形成することが可能である。
【００４０】
なお、本発明の抗体結合着色粒子は、検体中の血漿蛋白抗体、顆粒球抗体、血小板抗体の検出に用いた場合、抗体非結合粒子を用いた場合であっても偽陽性反応を示すため、かかる抗体の検出に使用することはできない。これは、抗原と着色粒子の染料とが非特異的に反応したためと考えられる（後述の例７〜９参照）。
【００４１】
一方、「EDAC/NHS法により抗体を結合させた着色粒子」は、抗赤血球抗体の検出に用いた場合、多量に抗体を結合させた場合であっても、本発明の抗体結合着色粒子に比べて、その凝集反応効率は低く、陽性像は明瞭ではなかった（後述の例６参照）。これに対し、本発明の「物理吸着法により抗体を結合させた着色粒子」は、少ない抗体結合量でも、その凝集反応効率は高く、検体中に抗赤血球抗体が存在する場合のみ、明瞭かつ安定した陽性像を形成した（後述の例６参照）。この結果は、本発明の抗体結合着色粒子が、「インタクトな赤血球」に引き寄せられ反応効率が高まり、抗赤血球抗体と特異的に反応したためと推測される。
【実施例】
【００４２】
例１：着色粒子の作製
（１）コアセルベート作製工程
コアセルベートの主要構成材料のゼラチンS1757はニッピ工業、アラビアゴムは仙波糖化工業より入手した。エタノール、1N NaOH、1N酢酸、グルタルアルデヒド、Tween20は和光純薬製を使用した。コアセルベートは、撹拌機で600rpmで撹拌を行い、合成した。
【００４３】
4.2 gのアラビアゴムを40％EtOH水480 mlに溶かし、更に10％ Tween20  1.4 ml、フェリコロイドW10（タイホー工業）0.7 mlを添加し、1N NaOHでpHを10以上にした後、40℃に加温した4％ゼラチン水溶液（ニッピ工業）70mlを混合した。撹拌しながら、0.2N酢酸をゆっくり添加し、コアセルベートを作製した。予め求めたpHにおいて酢酸添加を中止して、7μm径の磁性体粒子を作製した。コアセルベートが形成されたら、氷水の入ったバットにて撹拌して10℃以下に冷却し、ゲル化した。その後、グルタルアルデヒドを14ml加え、そのまま30分間撹拌した後、室温で一晩静置して、コアセルベート（磁性体粒子）を架橋した。
【００４４】
（２）染色工程
コアセルベート作製中またはコアセルベート作製後の何れかの時期に染料を添加して粒子を染色した。以下、コアセルベート作製中の染色（比較例）を、「先染色」ともいい、コアセルベート作成後の染色（本発明の例）を「後染色」ともいう。
【００４５】
コアセルベート作製中の染色に関しては、上記工程のアラビアゴムとゼラチン混合物に酢酸を添加する前に、表１に記載の染料を、記載される添加量で添加し、酢酸を添加してコアセルベートを形成することにより行った。表１において添加量は、アラビアゴム0.6 g、ゼラチン0.4 gあたりの量を示す。ここで添加量0.2 g（コアセルベート調製液中、約0.3重量％）は、通常の染色剤の使用量である。
【００４６】
コアセルベート作製後の染色に関しては、作製されたコアセルベートを20重量％の濃度の懸濁液100 mlに調整し、その懸濁液に0.5重量％（コアセルベート粒子１ｇあたり0.025ｇ）の染料を添加し、40℃で6時間撹拌することにより染色を行った。使用した染料は表２に示す。
【００４７】
（３）洗浄工程
染色された粒子を精製水で3回水洗した。水洗後、粒子を10％浮遊濃度に調整し、120℃で15分、オートクレーブで加熱処理し、冷却後、洗浄して余分な染料を除去した。
【００４８】
得られた粒子の染色結果を以下の表１〜２および図１に示す。表１には、「先染色」の例（比較例）の結果を示し、表２には、「後染色」の例（本発明の例）の結果を示す。図１は、「後染色」の結果を示し、上段は、左端から順に、Kayacion Red E8BN (0.5重量％)；Orange E2G (0.5重量％)；Scarlet E2G (0.5重量％)；Green ES4BD (0.5重量％)；Black PGS (0.5重量％)；Blue AB (0.5重量％)；Navy PN2R (0.5重量％)；Navy ESNR (0.5重量％)の染料の場合を示し、下段は、左から6番目のウェルから順にBlue ESE (0.5重量％)；Navy PN2R (0.5重量％)；Turquoise ENA (0.5重量％)の染料の場合を示す。
【表１】
2009265038.tif 000002
【００４９】
【表２】
2009265038.tif 000003
【００５０】
表１に示されるとおり、「先染色」の例では、0.2 g（通常量）の染料の添加により、粒子そのものが合成されなかった。これは、染料の塩類が入ることにより、ゼラチンとアラビアゴムの電気的な結合が阻害されたためと推測される。染料の添加量を0.05 gに減らすことにより粒子の合成は可能になったが、染色された粒子を水洗する際に染色粒子から色が抜け、最終的に染色された粒子は得られなかった。
【００５１】
表２に示されるとおり、「後染色」により、色落ちしない染色粒子の作製が可能になった。ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子の染色には、反応染料が好ましく、特に、染色性分類のなかで反応性の高いものが好ましいことが分かった。一方、一般の蛋白染色剤や、ゼラチンを染色するのに好ましいとされている酸性染料は、ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子の染色に適さないことが分かった。
【００５２】
これら結果より、以下の実施例ではすべて「後染色」した着色粒子を利用した。また、以下の実施例において染料の添加量（％）は、重量％を表す。
【００５３】
例２：洗浄工程における加熱処理効果
本実施例では、例１の（３）洗浄工程について、「遠心洗浄」を行った場合と「加熱処理による洗浄」を行った場合を比較した。染料としては、Kayacion Red E8BNを、20重量％コアセルベート粒子の懸濁液１Lに対し1.5％の濃度で使用した。
【００５４】
「遠心洗浄」は、「後染色」された粒子を精製水で3回水洗し、その後、粒子を10％浮遊濃度に調整し、遠心分離（1700×ｇで5分）した。その後、洗浄して余分な染料を除去した。
【００５５】
「加熱処理による洗浄」は、「後染色」された粒子を精製水で3回水洗し、その後、粒子を10％浮遊濃度に調整し、120℃で15分、オートクレーブで加熱処理し、冷却した。その後、洗浄して余分な染料を除去した。
【００５６】
「遠心洗浄」の場合、粒子を10回洗浄しても、上清は透明にならず、粒子からの色落ちがみられた。一方、「加熱処理による洗浄」を行った場合、加熱処理後、3回洗浄すると上清は透明になり、色落ちがみられなくなった。
【００５７】
例３：EDAC/NHS法による着色粒子への抗体の感作（比較例）
本実施例では、例１に記載の方法に従って作製された着色粒子に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド法（EDAC/NHS法）で抗体を結合させ、抗体結合量を2次標識抗体で測定した。染料としては、Kayacion Red E8BN、Turquoise ENA、Scarlet E2Gを、それぞれ0％、0.025％、0.05％、0.1％、0.2％の濃度で使用した。ここで染料濃度は、20重量％コアセルベート粒子の懸濁液１Lに対する濃度を示す。
【００５８】
以下、実験の詳細を記す。
【００５９】
例１に記載の方法に従って作製された着色粒子（洗浄済み粒子）を、20％（V/V）に調整し、純水で遠心洗浄し、NHS（ナカライテスク(株)）およびEDAC（Sigma Chemical）をそれぞれ0.01 g/mlの濃度になるように加えて、室温で2時間撹拌し、反応させた。その後、純水で3回洗浄してNHS処理磁性体粒子とした。前処理した磁性体粒子に、ウサギ抗ヒトIgG抗体（Jackson）を0.01M AcOH-AcONa pH5.0で10μg/mLに希釈したものを粒子濃度10%になるように添加して、室温でOverNight撹拌して感作を行った。その後、感作粒子を0.2%BSA/PBS pH7.2で1回洗浄して、同バッファーに1時間浮遊させて時々撹拌してブロッキングを行った。後、0.2%BSA/PBS pH7.2で2回洗浄して、10%濃度になるように浮遊して感作磁性体粒子を得た。結合したIgGを測定するためにこの粒子の一定量を分取して、抗ヒトIgG-POD標識抗体（フナコシ）を2000倍で反応させた後、洗浄して、POD基質液で発色させた。
【００６０】
その結果を図２に示す。
【００６１】
染料の濃度が増すと、着色粒子の視認性は増大するが、抗体結合量は低下する傾向が見られた。着色粒子の視認性と抗体結合量の両方の観点から、染料濃度は、好ましくは0.05〜0.5重量％であり、より好ましくは0.1〜0.3重量％、更に好ましくは0.1〜0.2重量％であると考えられた。ここで染料濃度は、20重量％コアセルベート粒子の懸濁液１Lに対する濃度を示すため、粒子１グラムあたりの染料の添加量（ｇ）に換算すると、好ましくは0.0025〜0.025ｇであり、より好ましくは0.005〜0.015ｇ、更に好ましくは0.005〜0.01ｇである。
【００６２】
例４：物理吸着法による着色粒子への抗体の感作（本発明の例）
本実施例では、例１に記載の方法に従って作製された着色粒子に、物理吸着法で抗体を結合させ、抗体結合量を2次標識抗体で測定した。染料としては、Kayacion Red E8BNを0〜5％（w/v）の濃度で使用した。ここで染料濃度は、10重量％コアセルベート粒子の懸濁液１Lに対する濃度を示す。
【００６３】
以下、実験の詳細を記す。
【００６４】
例１に記載の方法に従って作製された着色粒子（洗浄済み粒子）を、20％(V/V)に調整し、純水で遠心洗浄し、この粒子に、ウサギ抗ヒトIgG抗体（Jackson）を0.01Ｍ PBS  ｐＨ7.2に５μｇ/ｍＬになるように溶解したものを加えて、室温で一晩反応させた。以後、例３のＮ−ヒドロキシスクシンイミド法によるウサギ抗ヒトIgG抗体の結合と同様に操作し、ウサギ抗ヒトIgG感作粒子を作製した。
【００６５】
結合したIgGを測定するためにこの粒子の一定量を分取して、AFP標識抗体（フナコシ）を反応させた後、AFP基質液で発色させた。
【００６６】
その結果を図３に示す。
【００６７】
染料濃度0の非着色粒子に、抗体は結合しなかった。染料濃度0.5％（w/v）以上で一定の抗体結合が認められた。例３で着色粒子にEDAC/NHS法で抗体を結合させた場合、染料の濃度が増すと抗体結合量は低下する傾向が見られたが、本実施例のように物理吸着法で抗体を結合させた場合、染料の濃度が増大しても抗体結合量は低下しなかった。物理吸着法で抗体を結合させる場合、染料濃度は、着色粒子の視認性と抗体結合量の両方の観点から、好ましくは0.5重量％以上であり、より好ましくは0.5〜5重量％、更に好ましくは1〜3重量％であると考えられた。ここで染料濃度は、10重量％コアセルベート粒子の懸濁液１Lに対する濃度を示すため、粒子１グラムあたりの染料の添加量（ｇ）に換算すると、好ましくは0.05ｇ以上、より好ましくは0.05〜0.5ｇ、更に好ましくは0.1〜0.3ｇである。
【００６８】
例５：抗赤血球抗体の検出
本実施例では、例４に従って物理吸着法で抗体（抗ヒトIgG）を結合させた抗体結合着色粒子と、赤血球試薬を固相したプレートを用いて、検体中の抗赤血球抗体を検出した。
【００６９】
染料としては、Kayacion Red E8BNを2％（w/v）の濃度で使用した。抗ヒトIgGは、4μg/mlになるように0.01Ｍ PBS pH7.2中に溶解したものを使用した。
【００７０】
以下、実験の詳細を記す。
【００７１】
セレクトジェン固相マイクロプレートは、以下のとおり作製した：WGA(小麦胚芽レクチン)を固相したNunc Maxisorpプレートに、セレクトジェン（I+IIプールを0.01M PBS pH7.2で0.8%に希釈したもの；Orthoクリニカルダイアグノスティック社）を25μL分注し、室温で10分間静置し、1.3%NaClで3回洗浄して、セレクトジェン固相プレートとした。
【００７２】
検体として抗D抗体（Orthoクリニカルダイアグノスティック社）の希釈系列を使用した。セレクトジェン固相マイクロプレートに、検体希釈液(LISS)を75μL/well分注して、検体を25μl/wellの量で穏やかに分注し、穏やかに1回吐出攪拌した。その後37℃インキュベーターで10分間反応させた後、NaCl洗浄液を用いてプレートウォッシャー(バイオテックAMW24)で5回洗浄した。洗浄後、例４で作製された抗体感作磁性粒子の浮遊液（0.5重量％）を25μL/well分注して、3分間磁石上でパターン形成した。
【００７３】
その結果を図４に示す。図４において、上段および下段は、それぞれ、左のウェルから順に、抗Ｄ抗体の希釈倍率×1、×2、×4、×8、×16、×32、×64、×128を示し、残りの4つのウェルは、抗Ｄ抗体陰性コントロール(-)（抗Ｄ抗体を含まない検体、すなわち陰性検体）を示す。
【００７４】
図４に示されるとおり、明瞭な陽性像と陰性像が得られた。これら結果は、本発明の抗体結合着色粒子を用いて凝集反応を行うことにより、抗赤血球抗体の存在を目視で検査可能であることを示す。
【００７５】
例６：抗赤血球抗体の検出（物理吸着法とEDAC/NHS法の比較）
本実施例では、例４に従って物理吸着法で抗体を結合させた抗体結合着色粒子（本発明の例）、または例３に従ってEDAC/NHS法で抗体を結合させた抗体結合着色粒子（比較例）の何れかと、血球試薬を固相したプレートを用いて、検体中の抗赤血球抗体を検出した。
【００７６】
「本発明の例」では、染料として、Kayacion Red E8BNを2％（w/v）の濃度で使用した。本発明の例では、抗ヒトIgGは、5μg/mlになるように0.01Ｍ PBS pH7.2中に溶解したものを使用し、これを例４に従って物理吸着法により着色粒子に結合させた。抗体結合量は、図３に示されるとおりＯＤ値として約0.2である。
【００７７】
「比較例」では、染料として、Kayacion Turquoise ENAを0.2％（w/v）の濃度で使用した。比較例では、抗ヒトIgGは、10μg/mlになるように0.01M AcOH-AcONa pH5.0中に溶解したものを使用し、これを例３に従ってEDAC/NHS法により着色粒子に結合させた。抗体結合量は、図２に示されるとおりＯＤ値として約2.0である。
【００７８】
抗赤血球抗体を検出する実験は、例５に従って、赤血球を固相したマイクロプレート上で抗Ｄ抗体の希釈系列を反応させ、更に抗体結合着色粒子を反応させることにより行った。
【００７９】
その結果を図５に示す。図５において、上段は、抗体結合着色粒子として、EDAC/NHS法により抗ヒトIgGを結合させた粒子を使用した例（比較例）を示し、下段は、物理吸着法により抗ヒトIgGを結合させた粒子を使用した例（本発明の例）を示す。図５において、上段および下段は、それぞれ、左のウェルから順に、抗Ｄ抗体の希釈倍率×1、×2、×4、×8、×16、×32、×64、×128を示す。
【００８０】
図５に示されるとおり、「本発明の例」では、陽性像の広がりが良好であった。一方、「比較例」は、本発明の例と比べると、陽性像の広がりが悪かった。
【００８１】
「本発明の例」で陽性像の広がりが良好であったのは、「本発明の例」の着色粒子の抗体結合量が、「比較例」に比べて多かったからではないことを以下説明する。
【００８２】
上述の図３と図２に示される抗体結合量の値は、異なる標識法により得られた値である（図３はAFP標識により得られた値であり、図２はPOD標識により得られた値である）ため、これらを単純に比較することで、「本発明の例」と「比較例」の粒子の抗体結合量を比較することはできない。そこで、EDAC/NHS法（比較例）による抗体結合量と物理吸着法（本発明の例）による抗体結合量を、同じ標識法により比較した。すなわち、例３と例４における抗体感作濃度を0〜12μg/mLに変えて、粒子に抗体を結合させ、それを一定量分取して、抗ウサギIgG-POD標識抗体（フナコシ）を用いて発色させ、結合したウサギ抗ヒトIgG抗体の結合量を比較した。その結果を図６に示す。図６より、EDAC/NHS法（比較例）の方が、物理吸着法（本発明の例）より着色粒子に抗体を多く結合させることができることがわかる。
【００８３】
以上より、本実施例において「本発明の例」は、「比較例」より着色粒子に結合している抗体量が少ないにもかかわらず、明瞭かつ安定した陽性像の形成が可能であると結論づけることができる。
【００８４】
例７：血漿蛋白抗体の検出例
本実施例では、例４に従って物理吸着法で抗体を結合させた抗体結合着色粒子と、IgAを固相したプレートを用いて、検体中の血漿蛋白抗体（抗IgA抗体）を検出した。
【００８５】
IgA固相マイクロプレートは、以下のとおり作製した：IgA（フナコシ）をNunc Maxisorp Uプレートに50μL/Well分注して、冷蔵オーバーナイトでインキュベート後、純水で3回洗浄し、その後、0.1%BSA,でブロッキングした。
【００８６】
IgA固相マイクロプレートに、0.01M PBSで10倍に希釈した抗IgA血漿タンパク抗体陽性検体（中央血液研究所分与）を50μL/well分注して37℃で30分間インキュベートした。その後、マイクロプレートウォッシャーAMW24(バイオテック)を用いて0.05% Tween20を含む生理食塩水で5回洗浄した。洗浄後、5%サッカロース溶液で復元した0.25%濃度の上記抗体感作粒子の浮遊液を25μL/well分注し、磁石上で3分間パターン形成した。
【００８７】
抗体未感作粒子として、ゼラチンアラビアゴムコアセルベートをRed E8BNで2%染色を行った粒子を使用した。
【００８８】
本発明の抗体結合着色粒子を用いて、上記検体（陽性検体）の検査を行った場合、陽性像が得られた。また、抗体未感作粒子を用いて、陽性検体の検査を行った場合にも陽性像が得られ、偽陽性反応を呈した。また、陰性検体（抗体を含まない検体、すなわち抗体陰性検体）でも陽性像を呈した。
【００８９】
例８：顆粒球抗体の検出例
本実施例では、例４に従って物理吸着法で抗体を結合させた抗体結合着色粒子と、顆粒球を固相したプレートを用いて、検体中の顆粒球抗体を検出した。
【００９０】
顆粒球固相マイクロプレートは、以下のとおり作製した：WGA(小麦胚芽レクチン)を固相したマイクロプレートに顆粒球（自家調製）を10000cell/μL濃度で固相し、洗浄して顆粒球固相プレートとした。
【００９１】
顆粒球固相マイクロプレートに、0.01M PBSで10倍に希釈した抗顆粒球抗体陽性検体（中央血液研究所分与）を50μL/well分注して37℃で30分間インキュベートした。その後、マイクロプレートウォッシャーAMW24(バイオテック)を用いて0.05% Tween20を含む生理食塩水で5回洗浄した。洗浄後、5%サッカロース溶液で復元した0.25%濃度の上記抗体感作粒子の浮遊液を25μL/well分注し、磁石上で3分間パターン形成した。
【００９２】
抗体未感作粒子として、ゼラチンアラビアゴムコアセルベートをRed E8BNで2%染色を行った粒子を使用した。
【００９３】
本発明の抗体結合着色粒子を用いて、上記検体（陽性検体）の検査を行った場合、陽性像が得られた。また、抗体未感作粒子を用いて、陽性検体の検査を行った場合にも陽性像が得られ、偽陽性反応を呈した。また、陰性検体（抗体を含まない検体、すなわち抗体陰性検体）でも陽性像を呈した。
【００９４】
例９：血小板抗体の検出例
本実施例では、例４に従って物理吸着法で抗体を結合させた抗体結合着色粒子と、血小板抽出抗原を固相したプレートを用いて、検体中の血小板抗体を検出した。
【００９５】
血小板抽出抗原固相プレート（オリンパスanti-PLTオリビオMPHAII）に、検体希釈液（0.01M PBS）で希釈した血小板抗体陽性検体（オリンパス株式会社）の希釈系列を25μL分注して、37℃で30分間反応させた。その後、洗浄液で洗浄して、0.25重量％の上記抗体感作粒子の浮遊液を25μL/well分注し、磁石上で3分間静置した。
【００９６】
抗体未感作粒子として、ゼラチンアラビアゴムコアセルベートをRed E8BNで2%染色を行った粒子を使用した。
【００９７】
本発明の抗体結合着色粒子を用いて、上記検体（陽性検体）の検査を行った場合、陽性像が得られた。また、抗体未感作粒子を用いて、陽性検体の検査を行った場合にも陽性像が得られ、偽陽性反応を呈した。また、陰性検体（抗血小板抗体陰性検体）でも陽性像を呈した。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】「後染色」された粒子の染色結果を示す写真。
【図２】染料の濃度とEDAC/NHS法による抗体結合量の関係を示すグラフ。
【図３】染料の濃度と物理吸着法による抗体結合量の関係を示すグラフ。
【図４】抗赤血球抗体の検出結果を示す写真（例５）。
【図５】抗赤血球抗体の検出結果を示す写真（例６）。
【図６】EDAC/NHS法による抗体結合量と物理吸着法による抗体結合量を対比するグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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