(57)【要約】【課題】生体材料を体内に埋入する際に、骨や皮膚といった周辺組織との固着・接着を促進するために繊維芽細胞成長因子(FGF-2)は効果的であるが、生体材料の埋入箇所に組織再生に適切な量の活性を有するFGF-2を長期間にわたって徐放する材料はこれまで生分解性の有機物に限られていたため、生体材料を被覆しても機械強度の違いから埋入時に剥離することが予想され、さらに生体材料と周辺組織との直接的な接触を妨げることから固着・接着の促進という目的には必ずしも最適ではない。【解決手段】3種類以上の医療用輸液を混合して作製したリン酸カルシウム過飽和溶液にFGF-2を溶解させた浸漬液を作製し、陽極酸化チタンあるいは水酸アパタイトで出来た生体材料表面上にFGF-2と低結晶質アパタイトの複合層を析出させる。層の厚さやFGF-2含有量は、溶液組成を変化させることで制御可能であり、生体材料表面に直接形成されるため埋入時の剥離の可能性は低い。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともカルシウム成分を含む医療用輸液と少なくともリン酸成分を含む医療用輸液とを含む少なくとも２種類の医療用輸液並びに繊維芽細胞成長因子（FGF-2)を混合し、１μg/ml以上20μg/ml未満のFGF-2を含有する過飽和リン酸カルシウム溶液を調製し、該FGF-2含有過飽和リン酸カルシウム溶液中に、陽極酸化チタン膜を有する生体適合性基材を24〜48時間漬浸しFGF-2を含有する低結晶アパタイト層で被覆することを含む、繊維芽細胞成長因子(FGF-2)を0.05〜0.65μg/cm2含有する低結晶質アパタイト層で被覆されたFGF-2徐放性生体材料を製造する方法。
【請求項２】
FGF-2を含有する過飽和リン酸カルシウム溶液中のカルシウム濃度が1.4〜3.4 mMであり、リン酸濃度が1.4〜3.1 mMである、請求項１記載のFGF-2徐放性生体材料を製造する方法。
【請求項３】
生体適合性基材が創外固定用基材である、請求項１又は２に記載のFGF-2徐放性生体材料を製造する方法。
【請求項４】
少なくともカルシウム成分を含む医療用輸液と少なくともリン酸成分を含む医療用輸液とを含む少なくとも２種類の医療用輸液並びに繊維芽細胞成長因子（FGF-2)を混合し、１μg/ml以上20μg/ml未満のFGF-2を含有する過飽和リン酸カルシウム溶液を調製し、該FGF-2含有過飽和リン酸カルシウム溶液中に、水酸アパタイトセラミックからなる生体適合性基材を24〜48時間漬浸しFGF-2を含有する低結晶アパタイト層で被覆することを含む、繊維芽細胞成長因子(FGF-2)を0.05〜3.00μg/cm2含有する低結晶質アパタイト層で被覆されたFGF-2徐放性生体材料を製造する方法。
【請求項５】
FGF-2を含有する過飽和リン酸カルシウム溶液中のカルシウム濃度が1.6〜3.2 mMであり、リン酸濃度が0.7〜2.2 mMである、請求項４記載のFGF-2徐放性生体材料を製造する方法。
【請求項６】
生体適合性基材が人工骨材料である、請求項４又は５に記載のFGF-2徐放性生体材料を製造する方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法により製造される、陽極酸化チタン膜を有する生体適合性基材が繊維芽細胞成長因子(FGF-2)を0.05〜0.65μg/cm2含有する低結晶質アパタイト層で被覆されたFGF-2徐放性生体材料。
【請求項８】
生体活性を有するFGF-2を0.25〜320 ng/cm2含有する、請求項７記載のFGF-2徐放性生体材料。
【請求項９】
生体適合性基材が創外固定用基材である、請求項７又は８に記載のFGF-2徐放性生体材料。
【請求項１０】
請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法により製造される、水酸アパタイトセラミックが繊維芽細胞成長因子(FGF-2)を0.05〜3.00μg/cm2含有する低結晶質アパタイト層で被覆されたFGF-2徐放性生体材料。
【請求項１１】
生体活性を有するFGF-2を0.25〜320 ng/cm2含有する、請求項９記載のFGF-2徐放性生体材料。
【請求項１２】
生体適合性基材がバーホールボタンである、請求項１０又は１１に記載のFGF-2徐放性生体材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、繊維芽細胞成長因子(FGF-2)−アパタイト複合化層で被覆され、FGF-2を徐放する生体材料に関する。この材料は生体内で複合化層中のアパタイトの吸収に伴いFGF-2を放出することにより周辺組織の再生を促すため、FGF-2担体である生体材料の埋入部周辺組織への早期の固着・接着が可能となる。
【背景技術】
【０００２】
現在、骨欠損部の充填に使用される人工骨材料としてはセラミックや金属などが挙げられる。セラミック人工骨材料としては骨伝導性の水酸アパタイトや吸収性のβ-リン酸三カルシウムなどが用いられることが多い。負荷がかかる大腿骨などの長骨への埋入は、生体内でも化学的に安定なチタンやその合金が用いられる場合が多く、人工骨材料として以外でも人工歯根や創外固定具などの強度を要求される医療材料には広く使用されている。上記のいずれの材料も、高い生体適合性を有するものの、材料自体には埋入部周辺組織の再生を促す作用はなく、挿入後の骨組織との固着・安定に至るまでに時間を要す。
【０００３】
特に経皮的に骨に埋入される人工歯根や創外固定具といったデバイスに関しては、骨界面との固着が短期間であるほど緩みに起因する埋入初期の感染リスクを低減することが期待できる。反対に、初期の感染が原因で骨髄炎を発症すると完全治癒に至らしめることが難しいため、骨の再生を促し速やかに骨と固着する材料が望まれる。
【０００４】
スクリューの骨組織との固着強度増大に関しては、これまでに考案されてきた、人工材料表面を水酸アパタイト(HA)やβ-リン酸三カルシウム(β-TCP)で被覆する方法が有効である。被覆の方法は、例えばプラズマ溶射コーティング法(特許文献１を参照)及びスパッタリングによるHAの製膜法(特許文献２および３を参照)、あるいはカルシウムとリンを含有する材料の塗布熱分解法(特許文献４を参照)などの材料の加熱を伴う方法と、カルシウムイオンとリン酸イオンを含有する過飽和溶液を用いるHAコーティング法(特許文献５〜８を参照)などの材料の加熱を必要としない方法に大別される。特にHAは骨伝導性であることから、プラズマ溶射HA膜を形成した創外固定スクリューや椎弓根スクリュー、あるいは水溶液中でHAコーティングされたチタンスクリューは、未処理のチタンスクリューに比べ骨との固着強度が有意に強くなる(非特許文献１〜３を参照)。しかしHA自体は骨伝導性ではあっても骨組織形成促進効果を持たないことから、スクリューにHAコーティングを施しても埋入初期、あるいは骨形成能が低下している高齢者における速やかな骨固着強度の増大はあまり期待できない。
【０００５】
迅速な組織再生には成長因子の投与が効果的である。このうちFGF-2は骨芽細胞のみならず繊維芽細胞、軟骨細胞など様々な細胞の増殖及びそれらが形成する組織の再生に関与し、更に血管新生も促進するため、例えば経皮的に骨に挿入される創外固定用スクリューの骨との固着のみならず、皮膚との接着促進が期待できるなど、用途は非常に幅広い。FGF-2を使用する場合、単独での患部への投与方法は散布や注入が考えられるが、FGF-2を大量に消費せざるを得ないこと、FGF-2の効果が拡散や失活により投与後の短期間に終了してしまうことなどの問題がある。これらの問題解決のため、FGF-2を酸性ムコ多糖、コラーゲン、ゼラチンなどの生分解性材料に含有させて失活を抑制しつつ徐放させる材料も考案されている(特許文献９および１０を参照)。これらはFGF-2の徐放性に優れるものの、基材となるチタンや水酸アパタイトとの機械強度差により挿入時に剥離する可能性、さらに吸収性の高さにより材料と周辺組織との界面に間隙を生じる可能性があり、材料と周辺組織の確実且つ早期の固定実現という目的にはそぐわない。生体材料表面に直接形成される薄層であって、生体活性を有するFGF-2を長期にわたり放出し続ける材料が望ましい。その点、HAコーティングは、基材の表面に化学結合によって直接形成することが可能なため、厚さを調節すれば生体内への挿入時に剥離する可能性は低い。
【０００６】
リン酸カルシウム過飽和溶液を用いるHAコーティング法は、適当な生体活性物質、例えばFGF-2、ラミニン、フィブロネクチンやコラーゲン、あるいは非生体活性物質のチトクロームCや牛アルブミンなどを液中に添加することによって、共沈過程で陽極酸化チタン、アパタイトセラミック、生分解性ポリマーなどの様々な基材上に形成されるHAコーティング中に複合化可能である(特許文献１１〜１４、および非特許文献４〜７を参照)。HAコーティング作製に用いるリン酸カルシウム過飽和溶液は、本発明者である伊藤等の研究により、既に医療用に認可されており、しかも滅菌済みである医療用輸液の混合によっても作製可能であるため(特許文献１１を参照)、医療用輸液を使用すれば目的外の毒性物質、例えばエンドトキシンなどを複合化する危険性がない。以上の操作でHAコーティングに取り込まれたチトクロームCは10日間に渡って徐放される(非特許文献７を参照)。つまり、FGF-2を複合化の過程で失活させることがなければ、基材となる物質に数日間作用する特定の生体活性を付与することが可能である。しかしFGF-2は多機能のタンパクで、例えば骨周辺部に投与する場合でも量に応じて骨形成を促進したり軟組織形成を促進したりと効果が異なる(非特許文献８を参照)。そのため、複合化するFGF-2量は埋入部位や目的とする機能に対応して厳密に制御される必要がある。
【０００７】
【特許文献１】特開平07-100158号公報
【特許文献２】特開平10-328292号公報
【特許文献３】特開2003-342113号公報
【特許文献４】特開2001-340445号公報
【特許文献５】特開平06-293505号公報
【特許文献６】特開2005−237632号公報
【特許文献７】特開2006-075500号公報
【特許文献８】特開2006-255319号公報
【特許文献９】特開2002-308798号公報
【特許文献１０】特開2007-068884号公報
【特許文献１１】特開2004−173795号公報
【特許文献１２】US6,136,369号公報
【特許文献１３】US6,143,948号公報
【特許文献１４】US6,344,061号公報
【非特許文献１】Clin Ortop, 388, 209-217 (2001)
【非特許文献２】Spine Journal, 5, 239-243, (2005)
【非特許文献３】J Mater Sci Mater Med, (2007)
【非特許文献４】Key Eng Mater, 330-332, 691-694 (2007)
【非特許文献５】J Biomed Mater Res, 72A, 168-174 (2005)
【非特許文献６】Biomed Mater, 2, 116-123 (2007)
【非特許文献７】Curr Appl Phys, 5, 526-530 (2005)
【非特許文献８】Clin Orthop Res, 333, 252-60 (1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記の問題点を考慮して、医療用輸液の混合により得られるリン酸カルシウム過飽和溶液を用いてFGF-2とリン酸カルシウムを含む複合化層で被覆し、その層からのFGF-2の徐放によって埋入周辺部の骨又は皮膚組織の再生を促す陽極酸化チタン又は水酸アパタイト（HA）セラミックを基材とする生体材料である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明では、3種類以上の医療用輸液のみを混合して得たリン酸カルシウム過飽和溶液に生体活性物質としてFGF-2のみを含む市販の医薬品を添加することによって滅菌済み且つ発熱性物質などが除去されている浸漬液を作成し、滅菌を行った陽極酸化チタンあるいはHAセラミックからなる基材を浸漬してこの表面上にFGF-2及びリン酸カルシウム複合化層を析出させる。さらに、基材上へのFGF-2の担持量はリン酸カルシウム過飽和溶液の組成、あるいはこれに添加するFGF-2の濃度を変化させることによって制御する。
【００１０】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  少なくともカルシウム成分を含む医療用輸液と少なくともリン酸成分を含む医療用輸液とを含む少なくとも２種類の医療用輸液並びに繊維芽細胞成長因子（FGF-2)を混合し、１μg/ml以上20μg/ml未満のFGF-2を含有する過飽和リン酸カルシウム溶液を調製し、該FGF-2含有過飽和リン酸カルシウム溶液中に、陽極酸化チタンからなる生体適合性基材を24〜48時間漬浸しFGF-2を含有する低結晶アパタイト層で被覆することを含む、繊維芽細胞成長因子(FGF-2)を0.05〜0.65μg/cm2含有する低結晶質アパタイト層で被覆されたFGF-2徐放性生体材料を製造する方法。
[２]  FGF-2を含有する過飽和リン酸カルシウム溶液中のカルシウム濃度が1.4〜3.4 mMであり、リン酸濃度が1.4〜3.1 mMである、[１]のFGF-2徐放性生体材料を製造する方法。
[３]  生体適合性基材が創外固定用基材である、[１]又は[２]のFGF-2徐放性生体材料を製造する方法。
【００１１】
[４]  少なくともカルシウム成分を含む医療用輸液と少なくともリン酸成分を含む医療用輸液とを含む少なくとも２種類の医療用輸液並びに繊維芽細胞成長因子（FGF-2)を混合し、１μg/ml以上20μg/ml未満のFGF-2を含有する過飽和リン酸カルシウム溶液を調製し、該FGF-2含有過飽和リン酸カルシウム溶液中に、水酸アパタイトセラミックからなる生体適合性基材を24〜48時間漬浸しFGF-2を含有する低結晶アパタイト層で被覆することを含む、繊維芽細胞成長因子(FGF-2)を0.05〜3.00μg/cm2含有する低結晶質アパタイト層で被覆されたFGF-2徐放性生体材料を製造する方法。
[５]  FGF-2を含有する過飽和リン酸カルシウム溶液中のカルシウム濃度が1.6〜3.2 mMであり、リン酸濃度が0.7〜2.2 mMである、[４]のFGF-2徐放性生体材料を製造する方法。
[６]  生体適合性基材が人工骨材料である、[４]又は[５]のFGF-2徐放性生体材料を製造する方法。
【００１２】
[７]  [１]〜[３]のいずれかの方法により製造される、陽極酸化チタンからなる繊維芽細胞成長因子(FGF-2)を0.05〜0.65μg/cm2含有する低結晶質アパタイト層で被覆されたFGF-2徐放性生体材料。
[８]  生体活性を有するFGF-2を0.25〜320 ng/cm2含有する、[７]のFGF-2徐放性生体材料。
[９]  生体適合性基材が創外固定用基材である、[７]又は[８]のFGF-2徐放性生体材料。
[１０]  [４]〜[６]のいずれかの方法により製造される、水酸アパタイトセラミックからなる繊維芽細胞成長因子(FGF-2)を0.05〜3.00μg/cm2含有する低結晶質アパタイト層で被覆されたFGF-2徐放性生体材料。
[１１]  生体活性を有するFGF-2を0.25〜320 ng/cm2含有する、[９]のFGF-2徐放性生体材料。
[１２]  生体適合性基材がバーホールボタンである、[１０]又は[１１]のFGF-2徐放性生体材料。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、滅菌済みの医療用輸液あるいは医薬品を浸漬液の材料として作成される極めて生体適合性の高いFGF-2及びリン酸カルシウム複合層により被覆されており、使用する医療用輸液の混合比や医薬品の溶解量を変化させることにより、ターゲットとなる組織ごとに必要量が異なる複合層中のFGF-2量に応じて変化可能で、複合層に取り込まれたFGF-2を少なくとも10日間に渡って徐放し、徐放されるFGF-2によって埋入部周辺組織の再生を実現する。また、基材として現状でも臨床応用されている医用材料を利用しても作製可能で、特別な材料、試薬や装置を準備する必要なく、50℃以下の低温で簡便に、しかも病院施設内で作製することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の生体材料は、基材に繊維芽細胞成長因子（FGF-2)を含有する低結晶アパタイト層で被覆された基材からなる。本発明の生体材料は、安全性が高く、生体親和性及び生体適合性が高い。本発明の生体材料からはFGF-2が徐放される。本発明のFGF-2が徐放される生体材料をFGF-2徐放性生体材料という。
【００１５】
本発明で使用する基材としては、表面に低結晶質アパタイトが成長する核となる物質が既に存在する、あるいは不均一核形成を起こしうる加工が施してある基材であって、生体適合性の基材であればどのようなものでも使用可能である。例えば、表面に陽極酸化処理を施したチタン、アルカリ処理とそれに続く加熱処理を施したチタン又はそれらのその合金等の金属材料、水酸アパタイト（HA)セラミック、含カルシウム及び含リン酸溶液に対して交互浸漬処理を施した各種ポリマーなどが挙げられる。陽極酸化処理を施したチタン製の基材は、陽極酸化チタン膜を有する。このため、創外固定に使用される市販の陽極酸化チタンスクリューや脳外科手術後の頭蓋骨の穴を埋める水酸アパタイト製バーホールボタンなどのインプラント材料や創外固定基材を使用して本発明の生体材料を作成することが可能である。これらの基材は滅菌されていないこともあるため、コンタミネーション及びFGF-2の分解を避けるため使用前にはEOGガス滅菌、又は乾熱滅菌等により滅菌処理を行うことが望ましい。
【００１６】
本発明で用いるリン酸カルシウム過飽和溶液は、公知の方法(特開2004−173795、特開2005−237632号公報等参照)に従い、少なくともカルシウム成分を含有する医療用輸液又は製剤、少なくともリン酸成分を含有する医療用輸液又は製剤及びpH補正用の適当な酸性輸液又はアルカリ性輸液を混合することで調製できる。医療用輸液とは、体液又はその成分の欠乏に際して、それを補充するための溶液をいい、水、電解質、ブドウ糖等を含み、細胞外液と類似した電解質組成を有する。例えば、０〜５％程度のブドウ糖、10〜150mEq/Lのナトリウム、０〜20mEq/L程度のカリウムを含む。また、カルシウム成分として例えば塩化カルシウム、乳酸カルシウム、酢酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等が挙げられ、リン酸成分としてはリン酸、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等が挙げられる。医療用輸液又は製剤としては、例えば、医療用電解質輸液剤、透析・腹膜灌流液、輸液の補正用製剤、カルシウム製剤、透析・腹膜灌流液の補充剤、補正用電解質輸液剤等が挙げられる。本発明で用いる輸液又は製剤は、カルシウム成分又はリン酸成分の少なくとも1つを含んでいればよく、両方を含んでいてもよい。最終的に複数の輸液又は製剤を混合したときにカルシウム成分とリン酸成分の両方が含まれていればよい。また、混合する輸液又は製剤の種類数に限定はなく少なくとも２種類、好ましくは３種類以上の輸液又は製剤を混合すればよい。少なくともカルシウム成分を含有する医療用輸液の例としては市販のリンゲル液(大塚製薬)やコンクライトCa(大塚製薬)、少なくともリン酸成分を含有する医療用輸液の例としては市販のクリニザルツB(アイロム製薬)、ソリタT2(大塚製薬)やコンクライトPK(大塚製薬)、pH補正用電解質輸液の例としては市販のメイロン(大塚製薬)や透析専用炭酸水素ナトリウム補充液のバイフィル(味の素ファルマ)などのアルカリ化剤が挙げられる。
【００１７】
混合後の溶液中のカルシウムイオン濃度は、１mM以上、好ましくは1.4〜3.4 mM、混合後の溶液中のリン酸成分の量は、リン酸イオン濃度で、0.7〜3.1mMが好ましい。また、Ca/Pモル比は、0.5以上、好ましくは1.0〜2.0である。混合溶液中のカルシウムイオン濃度およびリン酸イオン濃度は生体適合性材料により変えることができる。例えば、陽極酸化チタン膜を有する生体適合性基材を用いる場合、好ましくはカルシウムイオン濃度が1.4〜3.4 mMであり、リン酸イオン濃度が1.4〜3.1 mMである。また、水酸アパタイトセラミック基材を用いる場合、好ましくはカルシウムイオン濃度が1.6〜3.2 mMであり、リン酸イオン濃度が0.7〜2.2 mMである。
【００１８】
繊維芽細胞成長因子-2（FGF-2）は、天然のもの、リコンビナントのものいずれも用いることができる。FGF-2の配列情報は、GenBankアクセッション番号A26642、X04431等で入手することができる。また、市販のフィブラストスプレー(科研製薬)のキットの内、凍結乾燥品の有効成分として含まれており、これを使用することが出来る。この凍結乾燥品は直接上記の医療用輸液、例えばリンゲル液などに溶解することも可能であるし、場合によっては市販の生理食塩水(大塚製薬等)に溶解した溶液を上記医療用輸液の混合液に添加することも可能である。
【００１９】
FGF-2含有リン酸カルシウム過飽和溶液(浸漬液)の組成は、混合する医療用輸液の体積比、あるいは添加するフィブラストスプレーキットの凍結乾燥品の量によって自由に変化させることが可能で、基材表面の性質や必要となるFGF-2量によって適宜調節する。好ましくは、医療用輸液の混合液中に、FGF-2が１μg/ml以上20μg/ml未満、好ましくは2〜10μg/ml、さらに好ましくは3〜5μg/ml含まれるように調製する。
【００２０】
このようにして市販の医療用輸液や医薬品を滅菌的に混合して作成された、カルシウム成分、リン酸成分及びFGF-2を含む浸漬液に滅菌された基材を浸漬することにより、基材上にFGF-2及び低結晶質アパタイト複合層を形成することが出来る。この際、溶液中のリン酸イオンとカルシウムイオンを主成分として、FGF-2が共沈しリン酸カルシウム沈殿が生じる。FGF-2の失活を極力抑えるため、浸漬時間は長くとも2日間以内、浸漬温度は体温と同等の37℃以下に設定することが望ましい。浸漬時間は、好ましくは数時間〜２日間（48時間）、さらに好ましくは12〜48時間、特に好ましくは24〜48時間である。また、浸漬温度は好ましくは20〜37℃である。加えて浸漬液のpHは、FGF-2の変性を防止できれば特に制限はないが、浸漬液調製直後のpHは6.5〜8.5の中性〜弱塩基性領域が好ましい。FGF-2は、低結晶質アパタイト表面への単なる吸着だけではなく、低結晶質アパタイト内に捕捉され、低結晶質アパタイト内部にも存在する。すなわち、FGF-2が低結晶質アパタイト層中に化学的あるいは物理的に保持される。本明細書において、FGF-2が低結晶質アパタイトに「担持」されるという。
【００２１】
また、浸漬液からの炭酸の放出過程で層形成が行われ、炭酸ガスが生成されるため、浸漬容器からガスが放出されるようにしておくのが好ましい。例えば浸漬容器のふたをコンタミネーションが起こらない程度に緩めておいてもよいし、あるいは浸漬容器に小孔を設けてもよい。
【００２２】
浸漬後は浸漬液から基材を取り出してそのまま使用可能であるが、複合層に取り込まれず基材表面に吸着しているFGF-2が一緒に投与されることを避ける場合には、浸漬液を作成する際に使用した生理的食塩水やリンゲル液などの輸液で洗浄して使用することが出来る。
【００２３】
本発明で基材上に形成されるFGF-2を含む低結晶質アパタイト複合層の厚さは特に制限されないが、あまり厚さが増すと埋入時の剥離が起こりやすくなるため、300μm以下、好ましくは80〜200μmに制御されることが望ましい。基材表面に形成された被覆の厚さは、例えば、電子顕微鏡で計測することができる。
【００２４】
このように作製された生体材料が、低結晶質アパタイトを無機主成分とする層で覆われていることは、当業者に既知の方法で確認できる。例えば、混合層を乾燥、より好ましくは凍結乾燥して、さらに好ましくは混合層を材料表面から分離すれば、粉末X線回折で構成成分の相同定が可能である。但し、基材にHAセラミックを選択した場合は、材料表面からの分離が困難なため有効な確認手段ではない。また、走査型電子顕微鏡や光学顕微鏡等の当業者に既知の方法で、浸漬液への浸漬前後の基材表面の変化を観察することにより、被覆状態を確認することもできる。この場合、表面に成長している結晶形状の観察により、経験則ではあるが層の無機主成分の同定が可能である。すなわち、結晶形状がいわゆる骨類似アパタイト様であるか否かによって複合層構成物が低結晶質アパタイトであると判断できることから、HAセラミックを基材にした場合の有用な分析方法といえる。
【００２５】
本発明の生体材料上に形成される低結晶質アパタイトとは、浸漬液中のリン酸イオンとカルシウムイオンを主成分として化学反応の結果生成した塩のことであるが、浸漬液は医療用輸液を混合して作製するため、医療用輸液に含まれるナトリウム、カリウム、マグネシウムなどの陽イオン、炭酸、酢酸などの陰イオンあるいは水や糖類などの成分が少量含まれることがあり、その点についての規定は特にない。詳細な化学組成を必要とする場合、FGF-2及び低結晶質アパタイト複合層を材料から分離し、必要ならば酸で溶解して当業者に既知の種々の方法で化学分析することも可能である。
【００２６】
このように生体材料を覆っている低結晶質アパタイトを無機主成分とする層には0.05〜0.65μg/cm2のFGF-2が含有されることが望ましい。その分析は、定性的にはX線光電子分光分析、定量的には浸漬液あるいは抽出液のタンパク定量キットによる分析が適用できる。本材料の作製に用いられる医療用輸液、医薬品、基材の内、窒素を含有するものは医薬品中のFGF-2のみとすることが可能なので、作製された材料表面のX線光電子スペクトルを測定し、窒素の存在を確認することで、材料表面に形成された低結晶質アパタイト層にFGF-2が取り込まれていることが確認できる。また、基材の浸漬前後での溶液中のFGF-2濃度変化を調べることにより、基材上へのFGF-2の担持量を見積もることが出来る。あるいは、表面に形成された層を、1〜2時間程度の短時間、室温、pH5〜6に調製した滅菌済みのクエン酸バッファで溶解し、抽出したFGF-2を直接定量する方法も有効である。定量方法としては例えばBradford法や、Biuret法にBicinchonic Acidを組み合わせた比色分析が挙げられる。
【００２７】
本発明のFGF-2及び低結晶質アパタイト複合層で被覆された、FGF-2を担持した生体材料からFGF-2が徐放される。上記の使用する医療用輸液の混合比やFGF-2の溶解量を変化させることにより、ターゲットとなる組織ごとに必要量が異なる複合層中のFGF-2量を応じて変化可能で、複合層に取り込まれたFGF-2を少なくとも10日間に渡って徐放し、徐放されるFGF-2によって埋入部周辺組織の再生を実現する。
【００２８】
FGF-2及び低結晶質アパタイト複合層で被覆された生体材料中のFGF-2が徐放される期間は、作製された材料を、体液に類似の組成を有する無機溶液、例えば生理食塩水などを体温とほぼ同等の37℃に保った状態で浸漬し、一定期間ごとにこれを採取して溶液中のタンパク濃度変化曲線を作成することで調査可能である。
【００２９】
このようにFGF-2を徐放するFGF-2及び低結晶質アパタイト複合層には、細胞増殖効果を含む生体活性を保持するFGF-2は0.25〜320 ng/cm2の密度で存在することが望ましい。FGF-2及び低結晶質アパタイト複合層で被覆された材料中のFGF-2が活性を維持しているか否かについては、材料自体、あるいは複合層の溶解により得られるFGF-2の抽出液を、NIH3T3などの繊維芽細胞の無血清培養系に浸漬、あるいは添加して72時間培養した後の細胞数変化を調べることによりin vitroで検査可能である。活性を持つFGF-2の量は、FGF-2濃度既知に調製された無血清培養液中でNIH3T3を72時間培養した後の細胞数変化を基に検量線を作成すれば、試料浸漬後の細胞増殖数から算出可能である。材料自体を浸漬する場合は、細胞と材料が直接触れ合わないように適当なスペーサーを使用して培養することにより徐放性についても検討可能である。抽出液を使用する場合は、1〜2時間程度の短時間、室温、pH5〜6に調製した滅菌済みのクエン酸バッファ中といった極力穏やかな条件で複合層を溶解しFGF-2を抽出する。
【００３０】
本発明のFGF-2及び低結晶質アパタイト複合層で被覆された生体材料は、骨組織等の組織へ埋込むことにより、周辺組織にFGF-2が徐放され、周辺組織の再生を促す。例えば、創外固定用スクリュー等の創外固定用器具として骨折等により骨欠損部に埋込むことにより、周辺骨組織の再生を促し、スクリューの骨組織に対する固着強度を増すことができる。ここで、スクリューとは骨折部位の固定を行うための器具をいう。特に基材が陽極酸化チタン膜を有する生体適合性基材である場合、好適に創外固定用器具として用いることができる。また、バーホールボタン等の人工骨材料をFGF-2及び低結晶質アパタイト複合層で被覆した後に、骨欠損部に埋入することで周辺骨組織と人工骨材料との早期固着が促進される。ここで、バーホールボタンとは、頭蓋骨に空けた穴に挿入する人工骨をいう。特に基材が水酸アパタイトセラミックである場合、好適に人工骨材料として用いることができる。
【００３１】
FGF-2及び低結晶質アパタイト複合層で被覆された材料中のFGF-2が組織再生能を保持しているか否かは動物実験によって確認が可能である。骨組織再生に関しては、骨埋入型の場合、ラットの頭蓋骨に欠陥を作製し、そこに複合層で覆われた欠陥と同じサイズの生体材料を埋入し、4週間飼育後の生体材料周辺部の新生骨形成状態を組織学的に観察することで評価できる。経皮的挿入型の場合、白色家ウサギの脛骨近位骨幹端内側に埋入し、4週間飼育後の材料周辺部の新生骨形成状態を組織学的に観察すると同時に、抜去トルクを測定すれば、生体材料の骨固着強度を数値として評価することが可能である。皮膚組織の再生に関しては、経皮的に埋入された試料周辺部の4週間飼育後の皮膚を組織学的に観察することで評価できる。更に、炎症反応を観察することで、生体材料と皮膚界面における封鎖状態を判定することが出来る。
【００３２】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
【実施例１】
【００３３】
陽極酸化チタンスクリュー（AO Ti スクリュー、SYNTHES(株)製、φ4.0、300 mm長）を15 mLのコニカルチューブに入れ、FGF-2添加リン酸カルシウム過飽和溶液10 mlに浸漬した。この浸漬液は創傷治療薬であるフィブラスト（商標）を、試薬を溶解させることにより作製した医療用輸液であるリンゲル液、クリニザルツB、バイフィルの炭酸ナトリウム補充液(以下本文中バイフィル)、コンクライトCa、コンクライトPKと同じ化学成分を含む溶液を混合して作製した（表１）。浸漬液はCa/Pモル比が2.0、カルシウム濃度が1.83 mM、炭酸ナトリウム濃度が15.09 mMとなるよう設定し、FGF-2は0μg・mL-1 (以下、浸漬液名F0)、4μg・mL-1 (同F4)、10μg・mL-1 (同F10)及び20μg・mL-1 (同F20)の濃度となるように添加し調製した（表２）。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
【表２】
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【００３６】
AO Tiスクリューの浸漬時間は2日間（48h）とし、その際の処理温度は体温とほぼ等しい37℃に設定した。浸漬後、AO Tiスクリューを浸漬液から抜き取り、超純水で3回洗浄した後、室温にて乾燥させた。浸漬後のAO Tiスクリューの表面形態を走査電子顕微鏡(SEM)で観察し、X線光電子分光法(XPS)により表面の定性分析も行った。更に表面の析出物をAO Tiスクリューから掻き落とし、無反射シリコン板に塗布して粉末X線回折測定(XRD)を行った。また、浸漬後の浸漬液に残留したタンパク量を定量し、AO Tiスクリューに担持されたFGF-2量を見積もった。
【００３７】
表２に混合直後(Initial)及び浸漬後(Final)の浸漬液のpHを示す。混合直後のpHは7.4よりも高く、アパタイトなどのリン酸カルシウムが析出しやすいpHを示している。一方で浸漬後はF20を除くすべての条件でpHが低下している。これは、アパタイトの析出時に特徴的な傾向である。
【００３８】
図１〜４は、各組成の浸漬液で処理したAO Tiスクリュー表面を走査電子顕微鏡(SEM)で観察した結果である。F0、F4及びF10処理AO Tiスクリュー表面は0.3〜2.5μm程度の球状粒子で覆われている様子が確認できた。一方で、F20処理後は球状粒子の析出はほとんど見られなかった。析出した球状粒子をAO Tiスクリューから掻き落としてXRD測定を行ったところ、図５に示すようにいずれも低結晶質のアパタイトであると同定された。アパタイト層が析出していることが明らかとなったF0、F4及びF10処理スクリューについて、さらにXPSによる表面分析を行うと、ピーク面積で0.00 ± 0.00、2241 ± 657及び2092 ± 1103の窒素が存在することが確認された。窒素はFGF-2のみに含まれていることから、F4及びF10処理AO Tiスクリュー上にはFGF-2が存在していることが分かった。浸漬液中の残留FGF-2量の定量結果から、F4処理するとAO Tiスクリュー上に0.62±0.22μg/cm2、F10では0.67±0.19μg/cm2の FGF-2が担持されることが分かった。
【００３９】
本実施例では、AO Tiスクリュー上にFGF-2と低結晶質アパタイトからなる複合層の形成が可能で、浸漬液中のFGF-2濃度は、少なくとも10μg・mL-1の濃度まで上昇させることが可能であり、20μg・mL-1以上の濃度にすると低結晶質アパタイト形成阻害効果が顕著になることを示している。
【実施例２】
【００４０】
AO Tiスクリュー上に担持されたFGF-2の活性の有無を調べるため、FGF-2・低結晶質アパタイト複合層からFGF-2を抽出し、それを無血清の細胞培養系に添加して増殖効果を調べた。
【００４１】
AO Tiスクリュー上への複合層の形成はF0処理及びF4処理で行った（表２）。これを10 mM、pH5.43に調製したクエン酸バッファ3 mLに2時間浸漬し、複合層を溶解することによってFGF-2を抽出した。一方、繊維芽細胞様細胞NIH3T3を1×104個含む無血清培地1mLを24ウェルプレートの各ウェルに注ぎ、1時間予備培養を行った。無血清培地はDMEMにL-グルタミン(0.3 mg・mL-1)、牛血清アルブミン(1.0 mg・mL-1)、インスリン(5.0μg・mL-1)及びトランスフェリン(1.0μg・mL-1)を添加して作製した。予備培養後、先の抽出液50 μLを各ウェルに添加し、更に72時間の本培養を行った後、細胞数を位相差顕微鏡下でカウントした。コントロールは、抽出液の代わりにクエン酸バッファのみを50μL加える系とした。更に、抽出液ではなく、既知のFGF-2量を添加したウェルも用意し、72時間後の細胞数を求めることによって検量線を作製し、活性を持つFGF-2量の定量も行った。
【００４２】
図６〜図９はそれぞれクエン酸のみを添加した系、及びF0、F4あるいはF10処理で形成された層の抽出液を添加した各系の、それぞれの無血清培地中のNIH3T3細胞の72時間培養後の様子を示したものである。F0処理で形成した層の抽出液を添加してもクエン酸のみ添加の場合と細胞形態に明瞭な差異はなかったが、F4あるいはF10処理で形成した層の抽出液を添加すると形状が明瞭となり、細胞数も増加していることが分かる。図１０に示す細胞カウントの結果の通り、確かにF4及びF10処理物の抽出液添加によって有意に細胞数が増加していることが明らかとなった。すなわち、F4あるいはF10処理で形成された複合相中のFGF-2は完全には失活していないことが示された。検量線(図１１)から、F4処理で形成した層中には活性のあるFGF-2が少なくとも3.74 ng/cm2 (総FGF-2担持量の約0.6 %)存在し、F10処理の場合は少なくとも387 ng/cm2(総FGF-2担持量の約58 %)が存在することが明らかとなった。
【００４３】
実施例１では、FGF-2の担持処理方法について議論したが、担持処理中のFGF-2の失活については検討していなかった。実施例２によって、担持したFGF-2は少なくとも完全に失活していないことが示された。
【実施例３】
【００４４】
未処理及びF0処理、F4処理あるいはF10処理により複合層を形成した4種類のAO TiスクリューをEOG滅菌後に動物実験に供した。体重約3.0 kgの成熟日本白色家兎の脛骨近位骨幹端内側に経皮的にスクリューを挿入し、挿入時の最大トルクを測定した(n=5)。術後4週でスクリュー挿入部の肉眼観察を行い、炎症レベルをGrade 1〜Grade 3の三段階に分類した。更に屠殺した後のスクリューの抜去時の最大トルクを測定し(n=19)、抜去後に組織学的に観察・評価を行った。
【００４５】
術後4週でのスクリュー周辺部の炎症の様子を例示すると、図１２はGrade 1で、皮膚組織に異常がなく、スクリューは脛骨に固着していた例、図１３はGrade 2で、皮膚に発赤が認められるもののスクリューが脛骨と固着していた例であり、図１４はGrade 3で皮膚の発赤を認め、更に骨髄炎発症によりスクリューの脛骨との固着が起こらなかった例である。すなわちGradeの数値が大きいほど重度の感染を起こしているといえる。各検体についてn=16で炎症レベルを分類したところ図１５に示すようになった。重度の炎症であるGrade 3は、未処理(UN)及びF0処理スクリューを挿入した場合に確認されたが、F4及びF10処理スクリュー挿入では確認されなかった。一方で、炎症を認めないGrade 1の検体数が最も多いのはF4処理スクリュー挿入した場合であり、F10処理スクリューの場合は却って炎症を認めない検体数は減少した。以上の結果はAO Tiスクリューに上に形成された複合層から徐放されるFGF-2の働きによってスクリュー−皮膚界面の封鎖性が最も向上するのはF4処理を施した場合であることを示している。
【００４６】
スクリューの挿入トルクはいずれのスクリューでも0.12 Nmでほぼ一定であり、複合層が形成されたことによる摩擦などの物理的要因がトルク測定に影響を及ぼすことがないことが確かめられた(図１６)。術後4週になると、F0処理及びF4処理スクリューの抜去トルクは未処理スクリューの抜去トルクに比べて35〜58%も高い値を示し、骨固着強度が上昇することが分かった。しかし、活性を保持したFGF-2が最も多く担持されているF10処理スクリューを用いると、抜去トルクは未処理スクリューのそれとほぼ同等程度となった(図１６)。FGF-2は過剰投与により骨組織の形成を抑制するとともに軟組織の形成を促進するが、この結果は、複合層が存在することによって上昇するスクリューと骨の界面の固着強度がF4処理でFGF-2を担持しても低下せず、骨組織形成に悪影響を及ぼさないことを示している。
【００４７】
スクリュー挿入部周辺の軟組織を観察すると、Grade 0の場合炎症反応が見られたとしても非常に穏やかなものであることが図１７より分かる。更に血管新生を伴う皮膚の再生も認められた。一方で、図１８に示すようにGrade 1やGrade 2の場合は軟組織に壊死を伴う明瞭な炎症反応を認めた。スクリュー挿入部周辺の骨組織の脱灰標本の観察結果は図１９〜２２に示す。未処理のスクリュー周辺部では皮質骨との界面の空隙にのみ新生骨が形成されるのに対して、F0及びF4処理スクリュー周辺部では皮質骨との界面の空隙だけでなく、髄腔に突き出たスクリュー表面にも新生骨の形成が認められた。F10スクリュー表面には骨様の組織の形成は認められなかった。これらの事から、抜去トルクがF0及びF4処理スクリューで高い値を示すのは、スクリュー周辺部での新生骨形成量の増大によるものと推察される。
【００４８】
実施例３の結果により、複合層中のFGF-2は生体内でも生理活性を示し、特に皮膚組織の再生に有効であることが確かめられた。更に、複合層に含まれる活性FGF-2には骨組織・皮膚組織再生に有効となる最適量(少なくとも3.74 ng/cm2)が存在し、逆に多すぎると(例えば387 ng/cm2)効果が低減することが示された。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】浸漬後のAO Tiスクリュー表面のSEM像（F0）を示す図である。
【図２】浸漬後のAO Tiスクリュー表面のSEM像（F4）を示す図である。
【図３】浸漬後のAO Tiスクリュー表面のSEM像（F10）を示す図である。
【図４】浸漬後のAO Tiスクリュー表面のSEM像（F20）を示す図である。
【図５】F0、F4及びF10に浸漬したAO Tiスクリュー表面の析出物のXRDプロファイルを示す図である。
【図６】クエン酸を添加した無血清培地で72時間培養したNIH3T3細胞の位相差顕微鏡像を示す図である。
【図７】F0で形成した層の抽出物を添加した無血清培地で72時間培養したNIH3T3細胞の位相差顕微鏡像を示す図である。
【図８】F4で形成した層の抽出物を添加した無血清培地で72時間培養したNIH3T3細胞の位相差顕微鏡像を示す図である。
【図９】F10で形成した層の抽出物を添加した無血清培地で72時間培養したNIH3T3細胞の位相差顕微鏡像を示す図である。
【図１０】クエン酸及び層の抽出物を添加した無血清培地で72時間培養した後のNIH3T3の細胞密度を示す図である。
【図１１】NIH3T3の細胞密度と活性FGF-2の添加量との関係(活性FGF-2の検量線) を示す図である。
【図１２】Grade 1(感染なし)の例を示す図である。
【図１３】Grade 2(皮膚に発赤あり)の例を示す図である。
【図１４】Grade 3(骨髄炎発症)の例を示す図である。
【図１５】術後4週での各AO Tiスクリュー挿入部周辺組織の炎症レベル頻度を示す図である。
【図１６】各AO Tiスクリューの挿入トルク及び術後4週での抜き去りトルクを示す図である。
【図１７】AO Tiスクリュー抜去後の軟組織の標本写真(Grade 0)を示す図である。
【図１８】AO Tiスクリュー抜去後の軟組織の標本写真(Grade 1、2)を示す図である。
【図１９】AO Tiスクリュー抜去後の骨組織の標本写真(未処理)を示す図である。
【図２０】AO Tiスクリュー抜去後の骨組織の標本写真(F0処理)を示す図である。
【図２１】AO Tiスクリュー抜去後の骨組織の標本写真(F4処理)を示す図である。
【図２２】AO Tiスクリュー抜去後の骨組織の標本写真(F10処理)を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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