(57)【要約】【課題】動物組織、特に凍結された動物組織に由来するドナー細胞からであっても正常なｎｔＥＳ細胞やクローン動物を作成することができる方法、ならびにかかる方法により得られるｎｔＥＳ細胞やクローン動物を提供すること。【解決手段】本発明は、動物組織から核移植ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）またはクローン動物を作成する方法であって、工程：（ａ）該組織中のドナー細胞を破砕して核を取り出すこと；次いで（ｂ）高分子ポリオールの存在下で、レシピエントである除核した卵に前記核を移植することを含むことを特徴とする方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物組織から核移植ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）またはＥＳ状細胞を作成する方法であって、下記の工程：
（ａ）該組織中のドナー細胞を破砕して核を取り出すこと；次いで
（ｂ）高分子ポリオールの存在下で、レシピエントである除核した卵に前記核を移植すること
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
工程（ａ）の細胞の破砕がホモジナイズ法により行われることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）が高分子ポリオールを含む培地において行われることを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
高分子ポリオールがポリビニルアルコール（ＰＶＡ）である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
動物組織が凍結されている、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
動物組織からクローン動物を作成する方法であって、下記の工程：
（ａ）該組織中のドナー細胞を破砕して核を取り出すこと；
（ｂ）高分子ポリオールの存在下で、レシピエントである除核した卵に前記核を移植すること；次いで
（ｃ）工程（ｂ）で作成されたクローン胚を発生させて仮親に戻すこと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
工程（ａ）の細胞の破砕がホモジナイズ法により行われることを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
工程（ａ）が高分子ポリオールを含む培地において行われることを特徴とする、請求項６または７記載の方法。
【請求項９】
高分子ポリオールがポリビニルアルコール（ＰＶＡ）である、請求項６〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
動物組織が凍結されている、請求項６〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法により作成されたｎｔＥＳ細胞またはＥＳ状細胞を動物組織中のドナー細胞として用いる、クローン動物の作成方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法により作成されたクローン動物、ｎｔＥＳ細胞またはＥＳ状細胞。
【請求項１３】
裸の核をレシピエント細胞に移植する方法であって、高分子ポリオールの存在下で移植を行うことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物組織、特に凍結された動物組織からクローン動物およびｎｔＥＳ細胞を作成する方法、ならびこれらの方法により得られたクローン動物およびＥＳ細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来技術では、クローン動物または核移植ＥＳ細胞（以下、ｎｔＥＳ細胞とする）を作成するためには、生きたドナー細胞が必要とされ、この細胞に最適化された核移植技術が開発されてきた。すなわち、生きたドナー細胞の核を除核した卵に細胞融合法あるいは核注入法により移植する方法により、クローン動物またはｎｔＥＳ細胞が作成されてきた（非特許文献１および２）。本発明において、ｎｔＥＳ細胞とは、体細胞などから核を除核した卵に移植することにより作成されたＥＳ細胞のことをいう。しかし、ドナー細胞として凍結保護剤などを使用せずに凍結された細胞を用いた場合、すべて凍結障害により崩壊してしまうこと等から、凍結された死んだ個体からクローン動物を作ることは不可能と考えられてきた。
【非特許文献１】Wakayama, T. et al., Nature 394, 369-374 (1998)
【非特許文献２】Wakayama, T. et al., Science 292,740-743(2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、本発明の解決課題は、動物組織、特に凍結された動物組織に由来するドナー細胞からであっても正常なｎｔＥＳ細胞やクローン動物を作成することができる方法、ならびにかかる方法により得られるｎｔＥＳ細胞やクローン動物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして、驚くべきことに、これまで動物組織、例えば凍結された組織から核移植を行うことは不可能と考えられてきたが、ホモジナイズ法を用いることにより上記組織中のドナー細胞を破砕して核を裸の状態にし、高分子ポリオール、特にＰＶＡ（ポリビニルアルコール）を含む培地中で核移植を行ったところ、クローン動物の作成およびｎｔＥＳ細胞の樹立に成功した。さらに、本発明者らは、この方法により樹立されたｎｔＥＳ細胞を用いて再度核移植を行うと、クローン動物の作成効率が向上することも示した。
【０００５】
すなわち、本発明は：
（１）動物組織から核移植ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）またはＥＳ状細胞を作成する方法であって、下記の工程：
（ａ）該組織中のドナー細胞を破砕して核を取り出すこと；次いで
（ｂ）高分子ポリオールの存在下で、レシピエントである除核した卵に前記核を移植すること
を含むことを特徴とする方法、
（２）工程（ａ）の細胞の破砕がホモジナイズ法により行われることを特徴とする、（１）記載の方法、
（３）工程（ａ）が高分子ポリオールを含む培地において行われることを特徴とする、（１）または（２）記載の方法、
（４）高分子ポリオールがポリビニルアルコール（ＰＶＡ）である、（１）〜（３）のいずれか１つに記載の方法、
（５）動物組織が凍結されている、（１）〜（４）のいずれか１つに記載の方法、
（６）動物組織が脳または血液である、（１）〜（５）のいずれか１項記載の方法。
（７）動物組織からクローン動物を作成する方法であって、下記の工程：
（ａ）該組織中のドナー細胞を破砕して核を取り出すこと；
（ｂ）高分子ポリオールの存在下で、レシピエントである除核した卵に前記核を移植すること；次いで
（ｃ）工程（ｂ）で作成されたクローン胚を発生させて仮親に戻すこと
を含むことを特徴とする方法、
（８）工程（ａ）の細胞の破砕がホモジナイズ法により行われることを特徴とする、（７）記載の方法、
（９）工程（ａ）が高分子ポリオールを含む培地において行われることを特徴とする、（７）または（８）記載の方法、
（１０）高分子ポリオールがポリビニルアルコール（ＰＶＡ）である、（７）〜（９）のいずれか１つに記載の方法、
（１１）動物組織が凍結されている、（７）〜（１０）のいずれか１つに記載の方法、
（１２）動物組織が脳または血液である、（７）〜（１１）のいずれか１つに記載の方法、
（１３）（１）〜（６）のいずれか１つに記載の方法により作成されたｎｔＥＳ細胞またはＥＳ状細胞を動物組織中のドナー細胞として用いる、クローン動物の作成方法、
（１４）（１）〜（１３）のいずれか１つに記載の方法により作成されたクローン動物、ｎｔＥＳ細胞またはＥＳ状細胞、
（１５）裸の核をレシピエント細胞に移植する方法であって、高分子ポリオールの存在下で移植を行うことを特徴とする方法
を提供する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、ドナー細胞源としての動物組織が凍結保護を行わずに凍結された状態であっても、核移植を成功させ、クローン動物またはｎｔＥＳ細胞を作成できる。さらに、この方法により作成されたｎｔＥＳ細胞あるいはＥＳ状細胞から再度核移植を行うと、クローン動物を効率的に作成することができる。一方で、ｎｔＥＳ細胞は無限に増え、多能性を持ち、凍結保存可能なことから、凍結死体からｎｔＥＳ細胞を作ることによって遺伝子改変動物だけでなく絶滅してしまった動物の遺伝子資源をすぐに利用可能な状態で長期間保存することも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、動物組織、特に凍結組織からクローン動物およびｎｔＥＳ細胞を作成する方法を提供する。本発明において、ドナー細胞源として適する動物は、ヒト以外のいかなる動物（非ヒト動物）であってもよく、例えば、ほ乳類であってもよく、マウス、ラット、ハムスター、モルモットのごとき齧歯類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の有蹄類、イヌ、ネコ、ウサギなどの他のほ乳類、ならびに霊長類が挙げられる。現在、クローン動物に関して研究が進んでいる実験動物としてマウスが挙げられ、本発明の方法を適用するのに最も好ましい動物の一例である。さらには、ノックアウトマウスやトランスジェニックマウスなどの遺伝子改変動物、ならびに絶滅危惧種や絶滅した動物種、例えば、マンモスなどであってもよい。本発明におけるドナー細胞とは、核移植の際に核を提供する側の細胞のことをいう。
【０００８】
本発明のドナー細胞として用いられうる上記動物の組織は、細胞に核を有する組織であればいかなる組織であってもよく、例えば、脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、膵臓、脾臓、腎臓、腸、骨髄および血液などを含む。本発明を適用する組織として好ましいのは脳または血液である。また、本発明に用いることができるドナー細胞としては、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞、ＥＳ状細胞ならびにＥＳ細胞に類似した性質を有する細胞、例えば、ＥＧ（胚性生殖幹）細胞、組織幹細胞およびｉＰＳ（人工多能性幹）細胞などであってもよい。かかる細胞はいかなる取得手段・経路であってもよい。それゆえ、本発明は、本発明により樹立されたｎｔＥＳ細胞あるいはＥＳ状細胞を、再度本発明を用いてクローン動物またはｎｔＥＳ細胞を作成することを含む。本発明において、ＥＳ状細胞とは、ＥＳ細胞に形態や状態が類似する細胞のことをいう。
【０００９】
本発明の最大の利点は、上記の動物または組織が凍結された状態であっても本発明の方法を用いることができる点である。ここで、本発明における凍結とは、動物組織が凍っている状態であればあらゆる温度であってよく、例えば、０℃以下の状態であってもよく、好ましくは−２０〜−３０℃以下であり、最も好ましくは−２０℃の状態である。本発明における凍結の期間は、核が変性または崩壊しなければ、どんな期間であってもよい。これまでに、凍結保護剤などによる凍結処理を施していない凍結された動物組織から核移植を行い、クローン動物の作成に成功した例はなかった。それゆえ、本発明は、絶滅危惧種および絶滅してしまった動物の凍結サンプルが存在すれば、かかる動物のクローンまたはｎｔＥＳ細胞もしくはＥＳ状細胞を作成することが可能である。特に、ｎｔＥＳ細胞は無限に増え、多能性能を有し、凍結保存が可能なことから、凍結死体からｎｔＥＳ細胞を作ることにより絶滅してしまった動物の遺伝子資源をすぐに利用可能な状態で長期間保存することができる。
【００１０】
本発明は、上記動物および組織から核を取り出す工程を提供する。本発明において、核を取り出す工程は、当該技術分野において公知の方法を用いてもよい。例えば、体細胞核移植法（ＳＣＮＴ法）のように単一の細胞の懸濁液を作成し、この細胞からインジェクションピペットで核を吸い取る方法であってもよい（Wakayama, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 96, 14984-14989 (1999); Wakayama, T. et al. Nature 394, 369-374 (1998)）。しかし、上記のような従来の方法においては、一度凍結され、次いで溶解された動物組織の細胞から核を取り出すことは、細胞が萎縮することや核がピペットにくっつき損傷することなどから、非常に困難であった。そこで、本発明では、一般的な細胞の粉砕手段、例えばホモジナイズ法などを用いて核を裸の状態にしてから核を移植することを含む。本発明に用いられうるホモジナイズ法は、一般的な方法であってもよく、例えば、ロータースターラー、ビーズミル、乳鉢/乳棒、および市販の組織溶解バッファーなどを用いるホモジナイズ法であってもよい。
【００１１】
次いで、本発明は、レシピエントである除核した卵に核を移植する工程を提供する。本発明において、核を移植する工程は、一般的な方法により行うことができる。例えば、取り出した核をインジェクションピペットで吸い取り、除核した卵に移植してもよい。通常、核移植用培地には細胞の培養液ＣＺＢにＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）を添加したものが使用され、核の培養用培地にはＮＩＭ（核単離培地）が用いられる。これらの培地は当該技術分野において公知である（Kuretake, S.,et.al., Biol Reprod 55,789-795(1996)）。しかし、これらの培地を裸の核に適用すると、核が変性したり、あるいはインジェクションピペットに核がくっつき損傷させてしまう。そこで、本発明は、高分子ポリオールの存在下で核移植を行うことにした。この点が本発明の最大の技術的特徴である。すなわち、高分子ポリオールの存在下で核移植工程を行うことにより、従来の培地では不可能であった裸の状態の核を操作することが可能となった。本発明の方法に使用される高分子ポリオールはいずれの種類のものであってもよく、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレングリコールなどが例示されるが、これらに限らない。本発明の方法において用いられる特に好ましい高分子ポリオールはポリビニルアルコール（ＰＶＡ）である。
【００１２】
通常は、本発明の核移植工程を、高分子ポリオールを含有する培地中で行うことができる。本発明で用いられる高分子ポリオールの種類および濃度は、ドナー核の状態やそれが由来する動物の種類、レシピエント卵の状態やそれに由来する動物の種類、および培地の組成などの要因により変更することができる。かかる変更は当業者の通常の技量の範囲内である。例えば、高分子ポリオールとしてＰＶＡをＮＩＭ（核単離培地）培地に添加して用い、マウスの凍結組織をドナー細胞源として用いる場合には、核移植培地中のＰＶＡ濃度は０．０１〜１％であってもよく、好ましくは０．０１〜０．０５％である。高分子ポリオールを含ませる培地は、好ましくはＮＩＭであるが、これ以外の核移植に用いられる一般的な培地であってもよい。さらに本発明では、高分子ポリオールを含む培地は、核を取り出す工程、例えばホモジナイズ法における培地にも用いることができる。また、本発明は、上記の使用態様以外のあらゆる使用態様において高分子ポリオールを用いることを想定している。例えば、核移植の際にインジェクションピペットの先に高分子ポリオールを含ませておくことなどである。さらに、本発明では、裸の核を吸い取る際に、市販されている一般的なインジェクションピペットを用いてもよい。その際、核の直径よりも大きな内径を有するインジェクションピペットを用いることにより裸の核の損傷を抑制することができるが、レシピエントの卵を破壊する可能性が高くなる。しかし、高分子ポリオールを含む培地を用いることで、卵が壊れにくくなるという利点がある。本発明において、核移植は、通常、顕微鏡下でマニピュレーターを用いて行う。
【００１３】
本発明におけるレシピエントとは、核移植の際に核を受容する側の細胞のことをいう。本発明にレシピエントとして用いることができる卵は、ドナー細胞を供給する動物種と同一のものであることが好ましいが、異なる系統であってもよい。さらに、ドナー細胞を供給する動物種と異なる動物種のものであってもよい。例えば、マウス−ラット間やウサギ−ヒト間であってもよい。本発明に用いられる卵は、一般的には除核した未受精卵母細胞が用いられるが、多分化能を有する細胞、例えば、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞、ＥＧ細胞、ｉＰＳ細胞および組織幹細胞などを除核したものであってもよい。本発明において、卵を除核する方法は、公知の種々の方法で行われてもよく、例えば、核をピペットに吸引する方法、透明帯にスリットを入れ、卵子を押すことでスリットから核を吐き出させる方法、遠心処理やデメコルチン（Ｄｅｍｅｃｏｒｔｉｎｅ）などの薬品処理によって核を卵から分離する方法などであってよい。
【００１４】
本発明では、上記工程により作成されたクローン胚を用いてクローン動物またはｎｔＥＳ細胞あるいは増殖するＥＳ状細胞を作成することを含む。本明細書において、クローン胚とは、ドナー細胞の核がレシピエントの除核された卵に移植された胚のことをいい、再構築胚ともいう。本発明では、上記工程によるクローン胚作成後におけるクローン動物またはｎｔＥＳ細胞の作成に、当該技術分野で公知の方法を用いてもよい（Wakayama, T. et al., Nature 394,369-374、Li, J. et al., Curr Biol 15,R756-757(2005)、Nagy, A. et al., Development 110,815-821(1990)、特願２００８−００００８９およびWakayama, T. et al., Science 292,740-743(2001)）。例えば、本発明におけるクローン動物は、上記工程により作成されたクローン胚を２細胞期まで培養して、偽妊娠させた仮親に戻す方法により得られてもよい（Wakayama, T. et al., Nature 394,369-374）。本明細書では、この方法により得られたクローン動物のマウスをクローンマウスといい、下記の四倍体胚相補発生法（ｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）により作成された疑似クローンマウスと区別する。
【００１５】
本発明の１の具体例では、本発明におけるクローン動物は、上記工程によるクローン胚作成後、２細胞期まで培養して発生させ、電気融合などにより作出された４倍体胚と一緒に培養してキメラを作成して偽妊娠させた仮親に戻す方法（四倍体胚相補発生法（ｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）（Li, J. et al., Curr Biol 15,R756-757(2005)、Nagy, A. et al., Development 110,815-821(1990)および特願２００８−０００８９）により得られてもよい。本明細書では、この方法により得られたキメラマウスをクローナルマウスまたはキメラクローナルマウスといい、ほぼクローンに近いマウスであることが示されている。
【００１６】
さらに、本発明の別の具体例では、上記工程により作成されたクローン胚からｎｔＥＳ細胞あるいはＥＳ状細胞を作成する方法を含む。このｎｔＥＳ細胞の樹立法もまた公知の方法を用いることができる（Wakayama, T. et al., Science 292,740-743(2001)）。例えば、上記工程により作成されたクローン胚を培養することにより胚盤胞まで発生させ、この胚盤胞中の内部細胞塊を分離してフィーダー細胞上で培養することにより、ｎｔＥＳ細胞を樹立させてもよい。また、胚盤胞を直接フィーダー細胞上で培養することによりｎｔＥＳ細胞を樹立させてもよい。ｎｔＥＳ細胞の樹立に使用する培地組成や培養条件は、当業者が適宜選択できるものである。さらに本発明では、上記工程により作成されたものがｎｔＥＳ細胞ではなくＥＳ状細胞であったとしても適用することができる。
【００１７】
本発明では、別の態様として、本発明により作成されたｎｔＥＳ細胞あるいはＥＳ状細胞をドナー細胞として用いて、クローン動物または再度ｎｔＥＳ細胞を作成してもよい。クローン動物またはｎｔＥＳ細胞の作成方法は、当該技術分野で周知の方法（Wakayama, T. et al., Nature 394,369-374、特願２００８−００００８９およびWakayama, T. et al., Science 292,740-743(2001)）により行ってもよい。例えば、凍結された動物組織から上記工程を用いてｎｔＥＳ細胞またはＥＳ状細胞を作成し、次いで、一般的な核移植法（Wakayama, T. et al., Nature 394,369-374）、四倍体胚相補発生法（特願２００８−００００８９）およびｎｔＥＳ細胞の作成方法（Wakayama, T. et al., Science 292,740-743(2001)）を適用することを含む。この場合、直接クローン動物を作成するより、一度ｎｔＥＳ細胞またはＥＳ状細胞を作成し、このｎｔＥＳ細胞またはＥＳ状細胞からもう一度核移植または四倍体胚相補発生法によりクローン動物を作成した方が効率良くクローン動物を作成でき、利益が大きい。また、特に、凍結された組織が少量のみである場合、ｎｔＥＳ細胞を作成することにより安定して大量にｎｔＥＳ細胞を供給することが可能になるために極めて有効である。
【００１８】
さらに、本発明は、本発明により作成されたｎｔＥＳ細胞またはＥＳ状細胞を用いて、再度本発明による工程を含むクローン動物またはｎｔＥＳ細胞の作成を行うことを含むものとする。
【００１９】
本発明は、上記方法により作成されたクローン動物またはｎｔＥＳ細胞も提供する。これらのクローン動物またはｎｔＥＳ細胞は、遺伝子改変動物としてだけでなく、例えば、絶滅してしまった動物の遺伝子資源を利用可能な状態で保存しておくのに非常に有用である。
【００２０】
さらに本発明は、裸の核をレシピエント細胞に移植する方法であって、高分子ポリオールの存在下で移植を行うことを特徴とする方法を提供する。該方法において用いられる高分子ポリオールはいずれの種類のものであってもよく、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレングリコールなどが例示されるが、これらに限らない。本発明の方法において用いられる特に好ましい高分子ポリオールはポリビニルアルコール（ＰＶＡ）である。上記の核移植方法は当業者に公知の核移植手段および方法を用いて行うことができる。通常は、上記の核移植方法を、高分子ポリオールを含有する培地中で行うことができる。本発明で用いられる高分子ポリオールの種類および濃度は、ドナー核の状態やそれが由来する動物の種類、レシピエントである卵の状態やそれが由来する動物の種類、および培地の組成などの要因により変更することができる。かかる変更は当業者の通常の技量の範囲内である。また、上記方法において、高分子ポリオールを培地に含ませる態様以外の態様において高分子ポリオールを用いてもよい。例えば、核移植の際にインジェクションピペットの先に高分子ポリオールを含ませておいてもよい。
【００２１】
次に、下記の実施例に用いた主な材料および方法を示すが、本発明を限定するものではない。
【００２２】
ドナー細胞の調製
凍結に対して耐性のある細胞を選択するために、１１種のマウス組織をいずれの凍結保護を施すことなく−３０℃でＣｒｙｏｔｕｂｅ（ＮＵＮＣ社）中で一週間保存した。長期保存の実験には、マウスの体全体を−３０℃で３か月まで（ＢＤＦ１系統）または−２０℃で１６年間（Ｃ３Ｈ／Ｈｅ）保存し、凍結された脳組織を核移植直前にドライアイス上で頭部から採取した。この組織に４００μＬのＮＩＭを添加して解凍し（Kuretake, S.,et.al., Biol Reprod 55,789-795(1996)）、穏やかにホモジナイズして裸になった核を収集した。血球細胞は、簡単に洗浄した尻尾から圧搾して血液１−２μＬを採取し、ＮＩＭで希釈した。これらの核を使用するまで４℃に保ち、このストックからドナーの核を毎回マイクロマニピュレーションチャンバーに添加した。
【００２３】
核移植およびクローンマウスの産生
核移植を文献に記載の方法により行った（Wakayama, T. et al., Nature 394,369-374(1998)およびKishigami, S. et al., Nat Prot 1,125-138(2006)）。しかし、本発明者らは、裸の核に対する損傷を避けるために、直径の大きなインジェクションピペットを用いて除核した卵への核移植を行い、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）含有培地の代わりに核インジェクション用に改良したＮＩＭ（ｍＮＩＭ）を使用した。ｍＮＩＭについては下記にて詳細を記載する。次いでクローン胚を２細胞期まで発生させ、これらを偽妊娠０．５日目のＩＣＲ雌マウスに移植し、新生仔を偽妊娠１９．５日目に帝王切開により収集した。
【００２４】
改良した核移植法（ＰＶＡ存在下での核移植法）
凍結状態から融解させた組織からインタクトな単一の細胞を酵素処理により採取することは困難であるので、核単離培地（ＮＩＭ；図１ａ、ｂ）中で組織をホモジナイズすることにより裸の核を採取した（Kuretake, S.,et.al., Biol Reprod 55,789-795(1996)）。１．５ｍｌのマイクロチューブ内に凍結組織を入れ、４℃のＰＶＡ入り培地を０．５ｍｌ加え、砕いた氷の中でホモジナイザーペッスルを用いて４−５回組織をホモジナイズした。血球細胞だけは例外として、簡単に洗浄した尻尾から圧搾することにより１−２μＬの血液を採取し、ＮＩＭで希釈した。予備実験では、マイクロマニピュレーションチャンバー内のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）含有培地に入れると、全ての核が急速に萎んでしまった。これまでの方法では核移植後に再構築胚は発生しなかった。それゆえ、ドナーの核をマニピュレーションチャンバー内のＮＩＭに直接置いた。核の損傷を最小限にするために、直径の大きなインジェクションピペット（図１ｃおよびｄ）を用いて除核卵に核移植を行ったが、しばしば卵の溶解が起きた。そこで、ＮＩＭにポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を０．０１％で添加した培地（ｍＮＩＭ）を用いたところ、核移植後の生存率が改善した。
【００２５】
ｎｔＥＳ細胞の樹立
核移植した胚を柔実胚期または胚盤胞期まで発生させ、これらを文献に記載の方法によりｎｔＥＳ細胞株を樹立するために用いた（Wakayama, T. et al., Science 292,740-743(2001)）。簡単に説明すると、胚をアシッドタイロード溶液で処理して透明帯を除去し、１０日間以上マウス胚線維芽細胞（ＩＣＲ系統由来）と一緒に９６マルチウェルディッシュ中に置いた。増殖した細胞塊をトリプシン消化により解離させ、安定な細胞株が形成するまで線維芽細胞上に再び置いた。樹立されたｎｔＥＳ細胞全てを、アルカリホスファターゼ染色、Ｏｃｔ３／４およびＮａｎｏｇに対する免疫染色、ならびに１０種の無作為に選択されたｎｔＥＳ細胞株を製造業者のプロトコールによるＳＫＹ−ＦＩＳＨ染色を用いて核型分析することにより多能性能を確認した。
【００２６】
二倍体および四倍体キメラの産生（四倍体胚相補発生法）
二倍体胚と四倍体胚をＩＣＲの雄と交配させたＩＣＲ系統の雌から得た。四倍体胚を２細胞期胚の電気融合により作成した。二倍体キメラを作成するために、ｎｔＥＳ細胞を胚盤胞の胞胚腔に注入した。四倍体キメラ、すなわちクローナル胚を構築するため、８細胞期の四倍体胚３個とｎｔＥＳ細胞の小集団とを凝集させた（特願２００８−００００８９）。翌日、キメラ胚盤胞を偽妊娠させた雌に移植した。
【００２７】
クローンマウスの遺伝子型および遺伝子再構成の検討
マイクロサテライトマーカーであるＤ１Ｍｉｔ２６、Ｄ３Ｍｉｔ１８およびＤ３Ｍｉｔ２１のＤＮＡ配列を国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）から得たプライマーの組合せの配列（それぞれ５’−ＧＡＧＧＡＡＴＣＴＴＧＡＡＴＧＧＧＣＡＡ−３’、５’−ＣＣＡＧＧＴＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＴＣＣＡ−３’および５’−ＡＡＧＣＴＣＴＡＣＡＧＣＧＧＡＡＧＣＡＣ−３’）を用いてＰＣＲにより増幅させた。ＤＮＡをｎｔＥＳ細胞およびクローンマウスとクローナルマウスの尻尾の先端から抽出した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を３０サイクル行い、反応物を視覚化する前に３％アガロースゲル上で分離させた。
Ｔ、Ｂ細胞由来のｎｔＥＳ細胞株および凍結されたＣ３Ｈマウスから樹立された細胞株（１−１０）から抽出したＤＮＡサンプルを、Ｔ細胞受容体と免疫グロブリンｋ軽鎖の再構成について分析した。ＰＣＲに用いるプライマーの組合せはＤｂ鎖の上流の遺伝子断片を増幅させ、Ｔ細胞由来のＥＳ細胞株の４０％がこの断片の欠失を示した。免疫グロブリンの再構成では、プライマーの組合せはＪｋ複合体の上流を増幅させ（Novobrantseva. et al., J. Exp. Med 1999, vol196 75-87を参照）、Ｂ細胞由来のＥＳ細胞の４５％がこの断片に欠失を示した。
【００２８】
以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例１】
【００２９】
本発明者らの方法を凍結組織由来のクローンマウスの作成に応用するため、まず、−３０℃で一週間凍結させたマウスの異なる組織に由来する体外培養におけるクローン胚の発生効率を検討した。単一の細胞の懸濁液を作成する代わりに核単離培地（ＮＩＭ）（Kuretake, S. et al., Biol Reprod 55,789-795）中で組織をホモジナイズすることにより裸の核を収集した（図１ｄおよびｅ）。すなわち、１．５ｍｌのマイクロチューブ内に凍結組織を入れ、４℃のＰＶＡ入り培地を０．５ｍｌ加え、砕いた氷の中でホモジナイザーペッスルを用いて４−５回組織をホモジナイズした。血液については尻尾の静脈から収集し、ＮＩＭで希釈した。核の損傷を最小限にし、インジェクション後の卵の生存率を向上させるため、除核卵への核移植をｍＮＩＭ中で直径の大きなインジェクションピペットを用いて行った（図１ｆおよびｇ）。凍結マウスのほとんどの組織からの核を用いた場合、柔実胚期／胚盤胞期まで発生する胚の割合は非常に低く（表１および図１ｈ）、生きている卵丘細胞または線維芽細胞の核を用いた場合ほど効率的ではない（Wakayama, T. et al., Nature 394,369-374およびWakayama, T. et al., Nat Genet 22,127-128）。しかしながら、脳組織の核に由来するクローン胚は、以前の報告（Wakayama, T. et al., Nature 394,369-374）と同等またはそれ以上に効率的に柔実胚期／胚盤胞期まで発生した（表１および図１ｉ）。さらに、尻尾の血液細胞からの核もまた、低い効率ではあるが、柔実胚期／胚盤胞期までの発生を示す（表１）。それゆえ、凍結組織からのクローンマウスの作成のための核の供給源としてこれら２つの組織（脳と血液）に着目した。
【表１】
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【００３０】
核移植によるクローンマウスを作成するため、凍結された２種の異なるマウス系統（１週間または１ヶ月間−３０℃で凍結させたＢＤＦ１および１６年間−２０℃で凍結させたＣ３Ｈ／Ｈｅ；図１ａ−ｃ）に由来する脳組織を採取し、核を除核した卵に移植した。実験操作は上記と同様に行った。生じた２細胞期胚をレシピエントの雌に移植した。ＢＤＦ１核に由来する再構築胚については、１週間および１ヶ月間凍結の雄のサンプル各々において３匹および５匹の生存クローンマウスを得た（表２）。これらのクローンマウスは異常を全く示さず、成体まで成長した。一方で、１６年間凍結させたＣ３Ｈ系統のマウスからの脳ではクローンマウスは作成されなかった。しかしながら、実施例２に示すように、１６年間凍結させたＣ３Ｈ系統のマウスであっても、一度ｎｔＥＳ細胞を樹立させ、このｎｔＥＳ細胞を用いて再度核移植および四倍体胚相補発生法を行うことによりクローンマウスを作成することができた（表４）。
【表２】
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【実施例２】
【００３１】
一方で、本発明者らは、核のドナー供給源として凍結脳組織を用いた核移植胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞の樹立を試みた。表３に示すように、本発明者らは、１６年間凍結させたＣ３Ｈ／Ｈｅマウスを含む脳サンプル全てから４６種のｎｔＥＳ細胞株および尻尾の血液サンプルから４２種のｎｔＥＳ細胞を樹立させた。樹立の割合は凍結期間とともに減少したが、樹立された全ｎｔＥＳ細胞株は、ＥＳ細胞特異的な多能性マーカー、Ｏｃｔ３／４（図２ａおよびｂ）、Ｎａｎｏｇおよびアルカリホスファターゼ（図２ｃ）の染色に対して陽性であった。１０種の無作為に選択されたｎｔＥＳ細胞株は正常な核型を示す（図２ｄ）。これらを二倍体の白色種系統マウス（ＩＣＲ系統由来）の胚盤胞に注入すると、これらｎｔＥＳ細胞からｎｔＥＳ細胞寄与率の高いキメラマウスが作成された（図１）。さらに、凍結されたＣ３Ｈ／Ｈｅ由来ｎｔＥＳ細胞株の生殖系列への移行（ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）を確認し、ｎｔＥＳ細胞の多能性が示された。
【表３】
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【００３２】
これらｎｔＥＳ細胞を用いて、核移植２回目および四倍体胚相補発生法によるクローンマウスおよびキメラクローナルマウスの産生を試みた。この四倍体胚相補発生法では、ｎｔＥＳ細胞を四倍体胚と一緒に凝集させ、発生したキメラ新生仔はほぼ完全にｎｔＥＳ細胞由来となる（Li, J. et al., Curr Biol 15,R756-757(2005)およびNagy, A. et al., Development 110,815-821(1990)）。表４に示すように、ドナーの雌雄または保存期間にかかわらず、ｎｔＥＳ細胞核の除核卵への２回目の移植により全実験群からクローンマウスを得た。重要なことに、１６年間凍結されたＣ３Ｈ／ＨｅマウスからｎｔＥＳ細胞を介在して４匹のクローンマウスおよび９匹のクローナルマウスを作成した。これらクローンマウスおよびクローナルマウスはドナーＣ３Ｈ／Ｈｅ系統のアグーチの毛色を表し（図２ｅ、ｅ’およびｆ）、一方で卵のドナーおよび代理の雌はアグーチ遺伝子を有していない。遺伝子型のマイクロサテライト分析は、全ｎｔＥＳ細胞株、ならびにクローンマウスとクローナルマウスが実際にドナーマウス由来であることを示した（図３ａ）。加えて、ｎｔＥＳ細胞株のいずれにおいても遺伝子再構成が見られず（図３ｂ）、ドナーの核がＴ−またはＢ−リンパ球ではなく、ｎｔＥＳ細胞と同様にドナーマウスの完全なゲノムがうまく戻ったことを示した。以上より、凍結脳組織から直接またはｎｔＥＳ細胞核を介在した核移植によりクローンマウスを得ることができた。
【表４】
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【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明は、凍結された組織からクローンを作成できることから、クローン技術の研究分野に利用可能である。また、ＥＳ細胞を用いる各種の研究分野および再生医療の分野においても利用できる。さらに、本発明は、動物学、博物学などの分野においても利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ドナー細胞と死んで凍結されたマウスを示す。ａは、１６年間−２０℃で凍結されたＣ３Ｈ／Ｈｅ系統の雄マウスである。ｂ、ｃは、ドライアイス上で採取した凍結脳組織である。ｄは、穏やかなホモジナイズにより脳断片から採取したドナー核を示す。ｅは、ヘキスト３３３４２で染色した核である。ｆ、ｇは、裸にした核を改良したＮＩＭ中で直径の大きなピペットを用いて集め、インジェクション培地を添加することなく脱核した卵に注入している図を示す。ｈは、胸腺の細胞核に由来するクローン胚である。ｉは、脳の核に由来するクローン胚である。再構築胚の約半数が柔実胚期／胚盤胞期まで発生した。
【図２】Ｃ３Ｈ系統凍結マウスに由来するｎｔＥＳ細胞およびクローンマウスを示す。ａ−ｃは、ｎｔＥＳ細胞が多能性であることを表す。ａは、ｎｔＥＳ細胞の位相差顕微鏡写真である。ｂは、同じ細胞について、ＵＶ波で多能性マーカーＯｃｔ３／４が陽性である免疫染色した図を示す。ｃは、同じ細胞について、アルカリホスファターゼ染色した図である。ｄは、Ｃ３Ｈ由来のｎｔＥＳ細胞を染色する蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎによるスペクトル核型分析で正常な核型を示す図である。ｅとｅ’は、ｎｔＥＳ細胞のキメラ形成を介して作成されたＣ３Ｈ系統の凍結脳に由来するクローンマウスである。１匹のクローンは呼吸不全で生後すぐに死亡し、１匹は母親に食われたが、残り２匹のクローンは成体まで成育した。ｆは、最初のＣ３Ｈ／Ｈｅ系統クローンマウスは、１ヶ月間凍結させたＢＤＦ１の脳組織に由来するｎｔＥＳ細胞の２回の核移植により作成された雌のクローンマウスと交配させると正常な受精率を示す。ｇは、凍結期間によるｎｔＥＳ樹立の割合をグラフにしたものである。凍結期間に依存してｎｔＥＳ細胞の樹立の割合が減少するが、１６年間凍結させたサンプルはｎｔＥＳ株を確立する能力を保持する。
【図３】遺伝子再構成の遺伝子型および実験を示す。ａは、クローンマウスおよびクローナルマウスならびにｎｔＥＳ細胞株の遺伝子型を表す図である。ＢＤＦ１系統の卵ドナー以外の全サンプルがドナーＣ３Ｈ凍結マウス同じパターンであった。ｂは、マイクロサテライト分析の結果である。１０種のｎｔＥＳ細胞株のいずれにおいても遺伝子再構成が見られず、ドナーの核がＴ−またはＢ−リンパ球ではなく、ｎｔＥＳ細胞のドナーマウスの完全なゲノムがうまく戻ったことを示す。
【配列表フリーテキスト】
【００３５】
SEQ ID NO:1: primer for D1Mit26
SEQ ID NO:2: primer for D3Mit18
SEQ ID NO:3: primer for D3Mit21
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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