(57)【要約】      （修正有）【課題】トマトのリコペンβ−サイクラーゼ遺伝子が野生型であるか、あるいはｏｇｃ変異型であるかを判別する方法の提供。【解決手段】特定な配列の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、および、上記オリゴヌクレオチドと異なる特定な配列の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドから選択される少なくとも１つの、リコペンβ−サイクラーゼ遺伝子が野生型であるか、またはｏｇｃ変異型であるかを判別するためのプライマーセットを用いて遺伝子増幅を行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号２１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号１９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号２０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドから選択される少なくとも１つの、リコペンβ−サイクラーゼ遺伝子が野生型であるか、またはｏｇｃ変異型であるかを判別するためのプライマー。
【請求項２】
配列番号１８または２１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、および配列番号１９または２０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、リコペンβ−サイクラーゼ遺伝子が野生型であるか、またはｏｇｃ変異型であるかを判別するためのプライマーセット。
【請求項３】
配列番号１８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、および配列番号２０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、請求項２に記載のプライマーセット。
【請求項４】
配列番号２１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、および配列番号１９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、請求項２に記載のプライマーセット。
【請求項５】
請求項１に記載のプライマーまたは、請求項２〜４のいずれか一項に記載のプライマーセットを含む、リコペンβ−サイクラーゼ遺伝子が野生型であるか、またはｏｇｃ変異型であるかを判別するためのキット。
【請求項６】
請求項１に記載のプライマー、請求項２〜４のいずれか一項に記載のプライマーセット、または請求項５に記載のキットを用いて遺伝子増幅を行うことを特徴とする、リコペンβ−サイクラーゼ遺伝子がｏｇｃ変異型であるトマト個体を判別する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はｏｇｃ変異体トマトとｏｇｃ変異を有しないトマトを判別するためのプライマーセットおよびそれを使用したｏｇｃ変異体トマトの判別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リコペンβ−サイクラーゼは対称性リコペンに２つの環を加えて二環式β−カロテンを形成する酵素である。トマトの中にはこの酵素をコードする遺伝子に変異を有する個体が知られており（old gold crimson（ｏｇｃ）変異体）、この変異体はリコペンβ−サイクラーゼの発現が低下しており、その結果、リコペンの量が野生株と比較して増加している（非特許文献１）。リコペンは機能性成分であることから、トマトケチャップや野菜ジュースなどの材料となる加工用トマト品種にはこの変異が導入されているものがよく使用されている。
【０００３】
ｏｇｃ変異の導入は野生株とｏｇｃ変異体を交配することによってなされるが、従来は、交配によって得られる個体群からｏｇｃ変異を持つ個体を選別するためには、個体群をある程度育ててから、形質を見て判断されていた。しかしながら、ｏｇｃ変異は劣性でホモ体にのみ形質が現れるため、Ｆ２世代では１／４のみが目的のトマトであり、ある程度育ててから選別することは効率が悪く、より、簡便で正確に判別できる方法が望まれていた。
【０００４】
遺伝子解析によって一塩基多型などの遺伝子変異を解析する試みが数多くなされている。
しかしながら、ｏｇｃ変異は通常アデニン塩基が９つ連続するところ、８つしかないという欠失変異であり、一塩基の違いを長さで判定することは難しく、また、野生型と変異体の一方のみを特異的に増幅できるプライマーの設計も困難であった。
【非特許文献１】Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. vol. 97, No. 20, p11102-11107
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は遺伝子解析によってｏｇｃ変異体トマトとｏｇｃ変異を有しないトマトを正確に判別するため方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、変異を含む領域にミスマッチを１個有する配列、すなわち、配列番号１８または２１の塩基配列を有するプライマーと配列番号１９または２０の塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、効率よくｏｇｃ変異型遺伝子と野生型遺伝子のそれぞれを選択的に増幅でき、これによりｏｇｃ変異体トマトとｏｇｃ変異を有しないトマトを効率よく判別できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）配列番号１８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号２１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号１９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号２０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドから選択される少なくとも１つの、リコペンβ−サイクラーゼ遺伝子が野生型であるか、またはｏｇｃ変異型であるかを判別するためのプライマー
（２）配列番号１８または２１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、および配列番号１９または２０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、リコペンβ−サイクラーゼ遺伝子が野生型であるか、またはｏｇｃ変異型であるかを判別するためのプライマーセット。
（３）配列番号１８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、および配列番号２０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、（２）のプライマーセット。
（４）配列番号２１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、および配列番号１９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、（２）のプライマーセット。
（５）（１）に記載のプライマーまたは、（２）〜（４）のいずれか一つに記載のプライマーセットを含む、リコペンβ−サイクラーゼ遺伝子が野生型であるか、またはｏｇｃ変異型であるかを判別するためのキット。
（６）（１）に記載のプライマー、（２）〜（４）のいずれか一つに記載のプライマーセット、または（５）に記載のキットを用いて遺伝子増幅を行うことを特徴とする、リコペンβ−サイクラーゼ遺伝子がｏｇｃ変異型であるトマト個体を判別する方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のプライマーセットを用いることによりｏｇｃ変異体トマトとｏｇｃ変異を有しないトマトを効率よく簡便に判別できる。また、苗の段階でｏｇｃ変異を持つ個体を選ぶことができるため、選んだものだけを実際に畑で育てることができる。
ｏｇｃ変異は劣性であるため、野生型と交配した場合、そのＦ２世代では、ｏｇｃ変異のホモが１／４、ヘテロが１／２、野生型のホモが１／４の確率で出現するが、実際に必要なのはｏｇｃ変異のホモだけであるため、これを本発明によって遺伝子診断で選別することにより選抜効率を４倍上げることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のプライマーセットは配列番号１８または２１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、および配列番号１９または２０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む。
野生型リコペンβ−サイクラーゼ遺伝子には、配列番号１：
5'-
atggaagctc ttctcaagcc ttttccatct cttttacttt cctctcctac accccatagg     60
tctattttcc aacaaaatcc ctcttttcta agtcccacca ccaaaaaaaa atcaagaaaa    120
tgtcttctta gaaacaaaag tagtaaactt ttttgtagct ttcttgattt agcacccaca    180
tcaaagccag agtctttaga tgttaacatc tcatgggttg atcctaattc gaatcgggct    240
caattcgacg tgatcattat cggagctggc cctgctgggc tcaggctagc tgaacaagtt    300
tctaaatatg gtattaaggt atgttgtgtt gacccttcac cactctccat gtggccaaat    360
aattatggtg tttgggttga tgagtttgag aatttaggac tggaaaattg tttagatcat    420
aaatggccta tgacttgtgt gcatataaat gataacaaaa ctaagtattt gggaagacca    480
tatggtagag ttagtagaaa gaagctgaag ttgaaattgt tgaatagttg tgttgagaac    540
agagtgaagt tttataaagc taaggtttgg aaagtggaac atgaagaatt tgagtcttca    600
attgtttgtg atgatggtaa gaagataaga ggtagtttgg ttgtggatgc aagtggtttt    660
gctagtgatt ttatagagta tgacaggcca agaaaccatg gttatcaaat tgctcatggg    720
gttttagtag aagttgataa tcatccattt gatttggata aaatggtgct tatggattgg    780
agggattctc atttgggtaa tgagccatat ttaagggtga ataatgctaa agaaccaaca    840
ttcttgtatg caatgccatt tgatagagat ttggttttct tggaagagac ttctttggtg    900
agtcgtcctg ttttatcgta tatggaagta aaaagaagga tggtggcaag attaaggcat    960
ttggggatca aagtgaaaag tgttattgag gaagagaaat gtgtgatccc tatgggagga   1020
ccacttccgc ggattcctca aaatgttatg gctattggtg ggaattcagg gatagttcat   1080
ccatcaacag ggtacatggt ggctaggagc atggctttag caccagtact agctgaagcc   1140
atcgtcgagg ggcttggctc aacaagaatg ataagagggt ctcaacttta ccatagagtt   1200
tggaatggtt tgtggccttt ggatagaaga tgtgttagag aatgttattc atttgggatg   1260
gagacattgt tgaagcttga tttgaaaggg actaggagat tgtttgacgc tttctttgat   1320
cttgatccta aatactggca agggttcctt tcttcaagat tgtctgtcaa agaacttggt   1380
ttactcagct tgtgtctttt cggacatggc tcaaacatga ctaggttgga tattgttaca   1440
aaatgtcctc ttcctttggt tagactgatt ggcaatctag caatagagag cctttgaatg   1500
tgaaaagttt gaatcatttt cttcatttta atttctttga ttattttcat attttctcaa   1560
ttgcaaaagt gagataagag ctacatactg tcaacaaata aactactatt ggaaagttaa   1620
aatatgtgtt tgttgtatgt tattctaatg gaatggattt tgtaaa                  1666
-3'
に示すように、下線で示した塩基番号１０３〜１１１までアデニン塩基（Ａ）が９個連続するが、
ｏｇｃ変異型遺伝子（配列番号２）：
5'-
atggaagctc ttctcaagcc ttttccatct cttttacttt cctctcctac accccatagg     60
tctattttcc aacaaaatcc ctcttttcta agtcccacca ccaaaaaaaa tcaagaaaat    120
gtcttcttag aaacaaaagt agtaaacttt tttgtagctt tcttgattta gcacccacat    180
caaagccaga gtctttagat gttaacatct catgggttga tcctaattcg aatcgggctc    240
aattcgacgt gatcattatc ggagctggcc ctgctgggct caggctagct gaacaagttt    300
ctaaatatgg tattaaggta tgttgtgttg acccttcacc actctccatg tggccaaata    360
attatggtgt ttgggttgat gagtttgaga atttaggact ggaaaattgt ttagatcata    420
aatggcctat gacttgtgtg catataaatg ataacaaaac taagtatttg ggaagaccat    480
atggtagagt tagtagaaag aagctgaagt tgaaattgtt gaatagttgt gttgagaaca    540
gagtgaagtt ttataaagct aaggtttgga aagtggaaca tgaagaattt gagtcttcaa    600
ttgtttgtga tgatggtaag aagataagag gtagtttggt tgtggatgca agtggttttg    660
ctagtgattt tatagagtat gacaggccaa gaaaccatgg ttatcaaatt gctcatgggg    720
ttttagtaga agttgataat catccatttg atttggataa aatggtgctt atggattgga    780
gggattctca tttgggtaat gagccatatt taagggtgaa taatgctaaa gaaccaacat    840
tcttgtatgc aatgccattt gatagagatt tggttttctt ggaagagact tctttggtga    900
gtcgtcctgt tttatcgtat atggaagtaa aaagaaggat ggtggcaaga ttaaggcatt    960
tggggatcaa agtgaaaagt gttattgagg aagagaaatg tgtgatccct atgggaggac   1020
cacttccgcg gattcctcaa aatgttatgg ctattggtgg gaattcaggg atagttcatc   1080
catcaacagg gtacatggtg gctaggagca tggctttagc accagtacta gctgaagcca   1140
tcgtcgaggg gcttggctca acaagaatga taagagggtc tcaactttac catagagttt   1200
ggaatggttt gtggcctttg gatagaagat gtgttagaga atgttattca tttgggatgg   1260
agacattgtt gaagcttgat ttgaaaggga ctaggagatt gtttgacgct ttctttgatc   1320
ttgatcctaa atactggcaa gggttccttt cttcaagatt gtctgtcaaa gaacttggtt   1380
tactcagctt gtgtcttttc ggacatggct caaacatgac taggttggat attgttacaa   1440
aatgtcctct tcctttggtt agactgattg gcaatctagc aatagagagc ctttgaatgt   1500
gaaaagtttg aatcattttc ttcattttaa tttctttgat tattttcata ttttctcaat   1560
tgcaaaagtg agataagagc tacatactgt caacaaataa actactattg gaaagttaaa   1620
atatgtgttt gttgtatgtt attctaatgg aatggatttt gtaaa                   1665
-3'
ではこのアデニン塩基の繰り返しが８個（下線で示した塩基番号１０３〜１１２）しかない。
【００１０】
したがって、本発明において用いるリコペンβ−サイクラーゼ遺伝子の野生型、ｏｇｃ変異型とは、上記の配列番号１と２の塩基配列で示すように、リコペンβ−サイクラーゼ遺伝子の塩基番号１０３（本明細書で記載する塩基番号は、翻訳開始コドンであるatgのaを塩基番号１と数えたものである。）からアデニン塩基（Ａ）が９個連続しているリコペンβ−サイクラーゼ遺伝子を野生型、塩基番号１０３からアデニン塩基（Ａ）が８個連続しているリコペンβ−サイクラーゼ遺伝子をｏｇｃ変異型と定義する。本発明のプライマーおよびプライマーセットはこの違いを判別するためのものである。
【００１１】
本発明において用いる配列番号１８〜２１の塩基配列とは、以下の塩基配列を意味する。
5'-AAGACATTTTCTTGATTTTTTvTG-3'（配列番号１８）
5'-AAGACATTTTCTTGATTTTTTTvTG-3'（配列番号１９）
5'-CTAAGTCCCACCACCAAAAAAAbAT-3'（配列番号２０）
5'-CTAAGTCCCACCACCAAAAAAbAT-3'（配列番号２１）
ｖはＡ（アデニン）、Ｇ（グアニン）またはＣ（シトシン）を表し、ｂはＴ（チミン）、ＧまたはＣを表す。
【００１２】
配列番号１８および配列番号２１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドはｏｇｃ変異型遺伝子増幅用のプライマーとして用いることができる。
配列番号１８の塩基配列は配列番号２の塩基番号１０２〜１２５の領域に相補的であるが、３’末端から３つ目の塩基が配列番号２の塩基番号１０４のＡとミスマッチとなるよう、Ａ、Ｇ、Ｃのいずれかとなっている。
配列番号２１の塩基配列は配列番号２の塩基番号８８〜１１１の領域に相当するが、３’末端から３つ目の塩基が配列番号２の塩基番号１０９のＡとミスマッチとなるよう、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかとなっている。
【００１３】
配列番号１９および配列番号２０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドは野生型リコペンβ−サイクラーゼ遺伝子増幅用のプライマーとして用いることができる。
配列番号１９の塩基配列は配列番号１の塩基番号１０２〜１２６の領域に相補的であるが、３’末端から３つ目の塩基が配列番号１の塩基番号１０４のＡとミスマッチとなるよう、Ａ、Ｇ、Ｃのいずれかとなっている。
配列番号２０の塩基配列は配列番号１の塩基番号８８〜１１２の領域に相当するが、３’末端から３つ目の塩基が配列番号１の塩基番号１１０のＡとミスマッチとなるよう、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかとなっている。
【００１４】
なお、配列番号１８〜２１の配列を含むオリゴヌクレオチドのプライマーとしての特異性は５’側に塩基が付加されても変わらないため、配列番号１８〜２１の配列の５’側に任意の１〜４０塩基、好ましくは１〜２０塩基が付加されてもよい。
【００１５】
配列番号１８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとして具体的には実施例で示す配列番号５、７、９または１１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
配列番号２１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとして具体的には実施例で示す配列番号１３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
配列番号１９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとして具体的には実施例で示す配列番号１４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
配列番号２０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとして具体的には実施例で示す配列番号６、８、１０または１２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００１６】
上記のような配列番号１８または２１の塩基配列を含むｏｇｃ変異型特異的オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲなどの遺伝子増幅を行い、特異的に遺伝子が増幅されたならば、解析対象のリコペンβ−サイクラーゼ遺伝子はｏｇｃ変異型であると判別することができる。また、配列番号１９または２０の塩基配列を含む野生型特異的オリゴヌクレオチドを、プライマーとして用いてＰＣＲなどの遺伝子増幅を行い、特異的に遺伝子が増幅されたならば、解析対象のリコペンβ−サイクラーゼ遺伝子は野生型であると判別することができる。また、上記のｏｇｃ変異型特異的オリゴヌクレオチドおよび野生型特異的オリゴヌクレオチドの両方で、特異的に遺伝子が増幅されたならば、解析対象のリコペンβ−サイクラーゼ遺伝子はｏｇｃ変異型と野生型のヘテロ接合体であると判別することができる。よって、上記ｏｇｃ変異型特異的オリゴヌクレオチドと野生型特異的オリゴヌクレオチドは、それぞれ単独で用いても良いが、組合せて用いることが好ましい。
【００１７】
プライマーとして用いる上記ｏｇｃ変異型特異的オリゴヌクレオチドと野生型特異的オリゴヌクレオチドの組合せについては特に制限されないが、両方のオリゴヌクレオチドを同時に増幅反応系に加えるときは、野生型遺伝子増幅産物とｏｇｃ変異型遺伝子増幅産物を長さで判別できるようにするために、配列番号１８の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号２０の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの組み合わせ、または配列番号２１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号１９の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの組合せで使用することが好ましい。
【００１８】
上記ｏｇｃ変異型特異的オリゴヌクレオチド及び／または野生型特異的オリゴヌクレオチドを特異的プライマーとして用いて遺伝子増幅を行う場合、これらの特異的プライマーとともに使用するプライマー（対プライマー；特異的プライマーがフォワードプライマーの場合のリバースプライマー、特異的プライマーがリバースプライマーの場合のフォワードプライマー）が必要である。対プライマーは共通領域に設定してもよい。
【００１９】
対プライマーは、特異的プライマーとともに使用したときに電気泳動などで判別可能な増幅産物が得られるのであれば、配列番号１においてＡが９つ連続する領域（塩基番号１０３〜１１１）の５’側または３’側の任意の位置に設定することができる。また、公知のリコペンβ−サイクラーゼ遺伝子の配列に基づいて５’−非翻訳領域や３’−非翻訳領域に設定してもよい。
【００２０】
対プライマーは野生型遺伝子増幅用とｏｇｃ変異型遺伝子増幅用に共通する一種類のプライマーを使用してもよいが、野生型遺伝子増幅産物とｏｇｃ変異型遺伝子増幅産物を長さで判別するためには、５’側と３’側にそれぞれ一種類ずつ、野生型遺伝子増幅産物とｏｇｃ変異型遺伝子増幅産物の長さが異なるような位置に設計することが好ましい。
【００２１】
対プライマーの例としては、例えば、実施例で示す配列番号３または４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。配列番号３はリコペンβ−サイクラーゼ遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（配列番号１の塩基配列における位置３〜２３）に設定されたプライマーであり、配列番号１８との間で１２９ｂｐの増幅産物を、または配列番号１９のプライマーとの間で１３０ｂｐの増幅産物を生じる。配列番号４はリコペンβ−サイクラーゼ遺伝子のＯＲＦ（配列番号１の５６４〜５８４の相補鎖）に設定されたプライマーであり、配列番号２０との間で４９７ｂｐの増幅産物を、または配列番号２１のプライマーとの間で４９６ｂｐの増幅産物を生じる。
【００２２】
遺伝子増幅方法は公知の方法が使用できるが、解析対象トマトの苗などから単離されたゲノムＤＮＡを鋳型に使用してＰＣＲを行うことが好ましい。野生型遺伝子増幅反応とｏｇｃ変異型遺伝子増幅反応は別々の反応系で行ってもよいが、同一反応系で行うことが好ましい。
【００２３】
ＰＣＲの条件は適宜設定することができるが、特異的に増幅するためにプライマーのアニーリング温度は５６〜６２℃に設定することが好ましい。プライマーの長さが長くなる場合、さらにアニ−リング温度を上げることが好ましい。
得られた増幅産物を電気泳動などで解析することによって、解析対象のリコペンβ−サイクラーゼ遺伝子が野生型であるか、またはｏｇｃ変異型であるか、あるいは両者のヘテロであるかを判別することができる。
【００２４】
本発明のキットは、上記プライマーセットを含む、リコペンβ−サイクラーゼ遺伝子が野生型であるか、またはｏｇｃ変異型であるかを判別するためのキットである。本発明のキットは、上記対プライマーをさらに含むことが好ましい。本発明のキットはさらに、ＤＮＡポリメラーゼやＰＣＲ用バッファーなどのＰＣＲ用試薬を含むものであってもよい。
本発明のプライマーセットまたはキットを使用して遺伝子増幅を行うことにより、ｏｇｃ変異型であるトマト個体を効率よく判別することができる。
【実施例】
【００２５】
１．ＤＮＡの抽出１
日本デルモンテ社の保有するold gold crimson変異（ｏｇｃ）をホモでもった育種母本「ＮＤＭ  ｏｇｃ」の葉からＤＮＡ抽出を行った。約３００mgの葉とジルコニアボールを１．５ml容量のプラスチックチューブに入れ、−８０℃の冷凍庫中で凍結し、多検体細胞破砕装置「ＳｈａｋｅＭａｓｔｅｒ」（バイオメディカルサイエンス社製）で粉砕した。ＤＮＡ抽出試薬ＤＮＡＺＯＬ  ＥＳ（Molecular Research Center社製）を使用し、プロトコールに従って粉砕した葉からＤＮＡを抽出した。ＤＮＡは、５０μlのＴＥバッファー（１０μg／mlのＲＮａｓｅ  Ａを含む）に溶解し、ＰＣＲ反応時の鋳型ＤＮＡとした。
【００２６】
２．ＤＮＡの抽出２
ｏｇｃ変異を保有しないトマト品種「Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ」とｏｇｃ変異をヘテロで保有する系統「ＮＤＭ  ｏｇｃ／＋」の葉からＤＮＡ抽出を行った。約３００mgの葉とジルコニアボールを１．５ml容量のプラスチックチューブに入れ、−８０℃の冷凍庫中で凍結し、多検体細胞破砕装置「ＳｈａｋｅＭａｓｔｅｒ」（バイオメディカルサイエンス社製）で粉砕した。粉末に６００μlの２％ＣＴＡＢ液（２％ｗ／ｗ臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、０．１Ｍトリスバッファー、２０mM  ＥＤＴＡ、１．４Ｍ  塩化ナトリウム）と６μlの２−メルカプトエタノールを加えて混合し、５６℃で１０分間インキュベートした。その後、６００μlのクロロホルム−イソアミルアルコールを加えて混合し、さらに、２２℃で、２００００ｇ、１０分間の遠心分離を行った。上層を新しいチューブに移し、６００μlのイソプロパノールを加え、混合した。室温で５分間放置した後、２２℃で、２００００ｇ、１０分間の遠心分離を行い、ＤＮＡの沈殿を得た。沈殿は、７０％エタノールで洗浄した後、５０μlのＴＥバッファー（１０μg／mlのＲＮａｓｅ  Ａを含む）に溶解し、ＰＣＲ反応時の鋳型ＤＮＡとした。
【００２７】
３．（実施例１）ｏｇｃ変異を判別するプライマーの設計と変異型遺伝子と野生型遺伝子の検出
ｏｇｃ変異はリコペン−β−サイクラーゼに生じた突然変異で、翻訳開始点から１０３塩基目からはじまるＡの繰り返しが８回である。野生型の９回よりも１塩基少ないために、遺伝子の機能が失われている。このＡの繰り返し数の違いを検出するためのプライマーを設計した。まず、ｏｇｃ変異を含む領域を増幅する共通プライマーとして、
Ctrl-b_3F：5'-GGAAGCTCTTCTCAAGCCTTT-3'（配列番号３）と
Ctrl-b_584R：5'-TCATGTTCCACTTTCCAAACC-3'（配列番号４）
を設計した。
【００２８】
次に、ｏｇｃ変異を検出する変異型特異的プライマーとして、
ogcR_3C：5'-TCTAAGAAGACATTTTCTTGATTTTTTCTG-3'（配列番号５）
を設計した。変異型特異的プライマーｏｇｃＲ＿３Ｃは、非特異的増幅を抑えるために３’末端から３番目の塩基にミスマッチになるＣを配置したものである。変異型特異的プライマーｏｇｃＲ＿３Ｃは、共通プライマーＣｔｒｌ−ｂ＿３Ｆとの組合せで１２９ｂｐのＤＮＡ断片を増幅できる。
【００２９】
野生型の配列を検出する野生型特異的プライマーとして、
ogwtF_3G：5'-CTAAGTCCCACCACCAAAAAAAGAT-3'（配列番号６）
を設計した。プライマーｏｇｗｔＦ＿３Ｇは、非特異的増幅を抑えるために３’末端から３番目の塩基にミスマッチになるＧを配置したものである。野生型特異的プライマーｏｇｗｔＦ＿３Ｇは、共通プライマーＣｔｒｌ−ｂ＿５８４Ｒとの組合せで４９７ｂｐのＤＮＡ断片を増幅できる。
【００３０】
４種のプライマーｏｇｃＲ＿３Ｃ、Ｃｔｒｌ−ｂ＿３Ｆ、ｏｇｗｔＦ＿３Ｇ、Ｃｔｒｌ−ｂ＿５８４Ｒを混合してＰＣＲを行うことで、鋳型ＤＮＡがｏｇｃ変異を持つか、野生型であるかを判別できる。
【００３１】
ＰＣＲの鋳型ＤＮＡには、ｏｇｃ変異をホモで保有する系統「ＮＤＭ  ｏｇｃ」、ｏｇｃ変異を保有しない系統「Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ」および「ＮＤＭ  ｏｇｃ」と「Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ」のＤＮＡを１：１で混合したものを使用した。ＰＣＲの反応溶液は、鋳型ＤＮＡ１．５μl、３μＭプライマー各１μl、１０×ＰＣＲバッファー１μl、２．５mM  ｄＮＴＰｓ  ０．８μl、ＤＮＡポリメラーゼとして５Ｕ／μl  ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ  ＨＳ（タカラバイオ社製）０．０５μl、および滅菌蒸留水２．６５μlを混合したものとした。反応温度条件は、９５℃２分間の熱変性後、９５℃３０秒間・５８℃３０秒間・７２℃４５秒間を４０サイクル繰り返し、７２℃５分間の伸長反応を行うものとした。
【００３２】
結果を図１に示す。「Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ」（図１のＭで示されるレーン）では、野生型特異的プライマーｏｇｗｔＦ＿３Ｇと共通プライマーＣｔｒｌ−ｂ＿５８４Ｒとの組合せで増幅される４９７ｂｐのＤＮＡ断片（図１において矢印で示す野生型）の増幅が認められた。一方、変異型特異的プライマーｏｇｃＲ＿３Ｃと共通プライマーＣｔｒｌ−ｂ＿３Ｆとの組合せで増幅される１２９ｂｐのＤＮＡ断片の増幅は認められなかった。「ＮＤＭ  ｏｇｃ」（図１のｏで示されるレーン）では、変異型特異的プライマーｏｇｃＲ＿３Ｃと共通プライマーＣｔｒｌ−ｂ＿３Ｆとの組合せで増幅される１２９ｂｐのＤＮＡ断片（図１において矢印で示すｏｇｃ突然変異）の増幅が認められた。一方、野生型特異的プライマーｏｇｗｔＦ＿３Ｇと共通プライマーＣｔｒｌ−ｂ＿５８４Ｒとの組合せで増幅される４９７ｂｐのＤＮＡ断片（図１において矢印で示す野生型）の増幅は認められなかった。「ＮＤＭ  ｏｇｃ」と「Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ」のＤＮＡを１：１で混合したもの（図１のＭ／ｏで示されるレーン）では、４９７ｂｐのＤＮＡ断片と１２９ｂｐのＤＮＡ断片の両方の増幅が認められた。
【００３３】
この結果から、４９７ｂｐのＤＮＡ断片と１２９ｂｐのＤＮＡ断片の増幅の有無を確認することにより、「ＮＤＭ  ｏｇｃ」、「Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ」、「ＮＤＭ  ｏｇｃ：Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ＝１：１」を判別できることが分かった。なお、図１において矢印で示す共通とは、共通プライマーＣｔｒｌ−ｂ＿３ＦとＣｔｒｌ−ｂ＿５８４Ｒとの組合せで増幅される５８１ｂｐ（ｏｇｃ型）および／または５８２ｂｐ（野生型）のＤＮＡ断片を意味する。
【００３４】
また、遺伝子型が不明なトマト（サンプルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）からゲノムＤＮＡを単離し、上記プライマーセットを使用してＰＣＲを行った（図２）。
【００３５】
遺伝子型が不明なトマトＡ（図２においてサンプルＡで示されるレーン）では、４９７ｂｐのＤＮＡ断片と１２９ｂｐのＤＮＡ断片の両方の増幅が確認された。遺伝子型が不明なトマトＢ（図２においてサンプルＢで示されるレーン）では、４９７ｂｐのＤＮＡ断片の増幅は確認されたが、１２９ｂｐのＤＮＡ断片の増幅は確認されなかった。遺伝子型が不明なトマトＣ（図２においてサンプルＣで示されるレーン）では、４９７ｂｐのＤＮＡ断片の増幅は確認されたが、１２９ｂｐのＤＮＡ断片の増幅は確認されなかった。遺伝子型が不明なトマトＤ（図２においてサンプルＤで示されるレーン）では、４９７ｂｐのＤＮＡ断片と１２９ｂｐのＤＮＡ断片の両方の増幅が確認された。
【００３６】
この結果より、サンプルＡとＤがｏｇｃ／野生型のヘテロであり、サンプルＢとＣが野生型のホモであることを判別できた。
【００３７】
４．（実施例２）ｏｇｃ変異を判別するプライマーの設計と変異型遺伝子の検出（ミスマッチ配列の検討）
実施例１に記載した方法により、検出プライマーにミスマッチとなる塩基を加えることで変異の検出に成功した。このときのミスマッチはＴに対してＧ、Ａに対してＣを配置したものであった。そこで、次にミスマッチの塩基を変更したプライマーを設計し、その効果を検討した。
【００３８】
まず、ミスマッチをＴに対してＣ、Ａに対してＧとして配置したプライマーを設計した。
ｏｇｃ変異を検出する変異型特異的プライマーとして、
ogcR_3G：5'-TCTAAGAAGACATTTTCTTGATTTTTTGTG-3'（配列番号７）
を、
野生型の配列を検出する野生型特異的プライマーとして、
ogwtF_3C：5'-CTAAGTCCCACCACCAAAAAAACAT-3'（配列番号８）
を設計した。
【００３９】
次に、ミスマッチをＴに対してＡ、Ａに対してＴとして配置したプライマーを設計した。
ｏｇｃ変異を検出する変異型特異的プライマーとして、
ogcR_3A：5'-TCTAAGAAGACATTTTCTTGATTTTTTATG-3'（配列番号９）
を、
野生型の配列を検出する野生型特異的プライマーとして、
ogwtF_3T：5'-CTAAGTCCCACCACCAAAAAAATAT-3'（配列番号１０）
を設計した。
【００４０】
実施例１の変異型特異的プライマーｏｇｃＲ＿３Ｃと同様に、変異型特異的プライマーｏｇｃＲ＿３  ＧまたはｏｇｃＲ＿３Ａは、共通プライマーＣｔｒｌ−ｂ＿３Ｆとの組合せで１２９ｂｐのＤＮＡ断片を増幅できる。
実施例１の野生型特異的プライマーｏｇｗｔＦ＿３Ｇと同様に、野生型特異的プライマーｏｇｗｔＦ＿３ＣまたはｏｇｗｔＦ＿３Ｔは、共通プライマーＣｔｒｌ−ｂ＿５８４Ｒとの組合せで４９７ｂｐのＤＮＡ断片を増幅できる。
【００４１】
ＰＣＲの鋳型ＤＮＡには、ｏｇｃ変異をホモで保有する系統「ＮＤＭ  ｏｇｃ」、ｏｇｃ変異を保有しない系統「Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ」およびｏｇｃ変異をヘテロで保有する系統「ＮＤＭ  ｏｇｃ／＋」を使用した。ＰＣＲの反応溶液は、５ｎｇ／μlの鋳型ＤＮＡ１．５μl、３μＭプライマー各１．５μl、１０×ＰＣＲ  バッファー１．５μl、２．５  mM  ｄＮＴＰｓ  １．２μl、ＤＮＡポリメラーゼとして５Ｕ／μl  ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ  ＨＳ（タカラバイオ社製）０．０７５μl、および滅菌蒸留水４．７２５μlを混合したものとした。反応温度条件は、実施例１と同じとした。
【００４２】
プライマーＣｔｒｌ−ｂ＿３Ｆ、Ｃｔｒｌ−ｂ＿５８４Ｒ、ｏｇｃＲ＿３Ｇ、ｏｇｗｔＦ＿３Ｃを用いてＰＣＲを行った結果を図３に示す。「Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ」（図３のＭで示されるレーン）では、野生型特異的プライマーｏｇｗｔＦ＿３Ｃと共通プライマーＣｔｒｌ−ｂ＿５８４Ｒとの組合せで増幅される４９７ｂｐのＤＮＡ断片（図３において矢印で示す野生型）の増幅が認められた。一方、変異型特異的プライマーｏｇｃＲ＿３Ｇと共通プライマーＣｔｒｌ−ｂ＿３Ｆとの組合せで増幅される１２９ｂｐのＤＮＡ断片の増幅は認められなかった。「ＮＤＭ  ｏｇｃ」（図３のｏで示されるレーン）では、変異型特異的プライマーｏｇｃＲ＿３Ｇと共通プライマーＣｔｒｌ−ｂ＿３Ｆとの組合せで増幅される１２９ｂｐのＤＮＡ断片（図３において矢印で示すｏｇｃ突然変異）の増幅が認められた。一方、野生型特異的プライマーｏｇｗｔＦ＿３Ｃと共通プライマーＣｔｒｌ−ｂ＿５８４Ｒとの組合せで増幅される４９７ｂｐのＤＮＡ断片（図３において矢印で示す野生型）の増幅は認められなかった。ｏｇｃ変異をヘテロで保有する系統「ＮＤＭ  ｏｇｃ／＋」（図１のＨで示されるレーン）では、４９７ｂｐのＤＮＡ断片と１２９ｂｐのＤＮＡ断片の両方の増幅が認められた。この結果から、「ＮＤＭ  ｏｇｃ」、「Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ」および「ＮＤＭ  ｏｇｃ／＋」を判別できることが分かった。
【００４３】
プライマーＣｔｒｌ−ｂ＿３Ｆ、Ｃｔｒｌ−ｂ＿５８４Ｒ、ｏｇｃＲ＿３Ａ、ｏｇｗｔＦ＿３Ｔの組み合わせでＰＣＲを行った結果を図４に示す。図３と同様な結果が得られたので、「ＮＤＭ  ｏｇｃ」、「Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ」および「ＮＤＭ  ｏｇｃ／＋」を判別できることが分かった。
【００４４】
以上のことから、ミスマッチの塩基を変更してもｏｇｃ変異型と野生型の判別が可能であることが明らかとなった。
【００４５】
５．（実施例３）ｏｇｃ変異を判別するプライマーの設計と変異型遺伝子の検出（プライマー長の検討）
次にプライマー長を検討した。上述の実験で使用したプライマーのプライマー長を伸ばしたプライマーを設計した。
ｏｇｃ変異を検出する変異型特異的プライマーとして、
ogcR_3G_40bp:5'-TACTTTTGTTTCTAAGAAGACATTTTCTTGATTTTTTGTG-3'（配列番号１１）を、
野生型の配列を検出する野生型特異的プライマーとして
ogwtF_3G_30bp:5'-CTTTTCTAAGTCCCACCACCAAAAAAAGAT-3'（配列番号１２）
を設計した。
共通プライマーとして、
Ctrl-b_3F_23bp：5'-GGAAGCTCTTCTCAAGCCTTTTC-3'（配列番号２２）
Ctrl-b_584R_30bp：5'-TCAAATTCTTCATGTTCCACTTTCCAAACC-3'（配列番号２３）
を設計した。
【００４６】
プライマーＣｔｒｌ−ｂ＿３Ｆ＿２３ｂｐ、Ｃｔｒｌ−ｂ＿５８４Ｒ＿３０ｂｐ、ｏｇｃＲ＿３Ｇ＿４０ｂｐ、ｏｇｗｔＦ＿３Ｇ＿３０ｂｐを用いてＰＣＲを行った。反応溶液と反応条件は、実施例１の方法に順ずる。
アニーリング温度を６２℃としてＰＣＲを行った結果、実施例１、２と同様な結果が得られたので、ｏｇｃ変異型と野生型を明確に判別することができた（図５）。アニーリング温度を高めることで、４０塩基程度の長さを持つプライマーでもｏｇｃ変異型と野生型を判別できると考えられた。
【００４７】
６．（実施例４）ｏｇｃ変異を判別するプライマーの設計と変異型遺伝子の検出（ｏｇｃ変異検出プライマーの位置を変異の５’側にした場合）
実施例１〜３では、ｏｇｃ変異を検出するプライマーは変異の３’側の配列で作製し、野生型の配列を検出するプライマーは、変異の５’側の配列で作製した。そこで、これを逆にし、変異の５’側の配列でｏｇｃ変異を検出するプライマーを、変異の３’側の配列で野生型の配列を検出するプライマーを作製し、その検出能力を検討した。
【００４８】
ｏｇｃ変異を検出する変異型特異的プライマーとして、
ogcF_3G：5'-CTAAGTCCCACCACCAAAAAAGAT-3'（配列番号１３）
を、
野生型の配列を検出する野生型特異的プライマーとして
ogwtR_3G：5'-CTAAGAAGACATTTTCTTGATTTTTTTGTG-3'（配列番号１４）
を設計した。
【００４９】
実施例１〜３とは反対に、変異型特異的プライマーｏｇｃＦ＿３Ｇは、共通プライマーＣｔｒｌ−ｂ＿５８４Ｒとの組合せで４９６ｂｐのＤＮＡ断片を増幅できる。
実施例１〜３とは反対に、野生型特異的プライマーｏｇｗｔＲ＿３Ｇは、共通プライマーＣｔｒｌ−ｂ＿３Ｆとの組合せで１３０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅できる。
【００５０】
プライマーＣｔｒｌ−ｂ＿３Ｆ、Ｃｔｒｌ−ｂ＿５８４Ｒ、ｏｇｃＦ＿３Ｇ、ｏｇｗｔＲ＿３Ｇを用いてＰＣＲを行った。反応溶液と反応条件は、実施例１の方法に順ずる。
【００５１】
実施例１〜３で示す図１〜５の結果とは反対に、「Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ」（図６のＭで示されるレーン）では、野生型特異的プライマーｏｇｗｔＲ＿３Ｇと共通プライマーＣｔｒｌ−ｂ＿３Ｆとの組合せで増幅される１３０ｂｐのＤＮＡ断片（図６において矢印で示す野生型）の増幅が認められた。一方、変異型特異的プライマーｏｇｃＦ＿３Ｇと共通プライマーＣｔｒｌ−ｂ＿５８４Ｒとの組合せで増幅される４９６ｂｐのＤＮＡ断片の増幅は認められなかった。「ＮＤＭ  ｏｇｃ」（図６のｏで示されるレーン）では、変異型特異的プライマーｏｇｃＦ＿３Ｇと共通プライマーＣｔｒｌ−ｂ＿５８４Ｒとの組合せで増幅される４９６ｂｐのＤＮＡ断片（図６において矢印で示すｏｇｃ突然変異）の増幅が認められた。一方、野生型特異的プライマーｏｇｗｔＲ＿３Ｇと共通プライマーＣｔｒｌ−ｂ＿３Ｆとの組合せで増幅される１３０ｂｐのＤＮＡ断片（図６において矢印で示す野生型）の増幅は認められなかった。「ＮＤＭ  ｏｇｃ／＋」（図６のＨで示されるレーン）では、４９６ｂｐのＤＮＡ断片と１３０ｂｐのＤＮＡ断片の両方の増幅が認められた。
【００５２】
この結果から、これらのプライマーを用いることによってもｏｇｃ変異型と野生型を明確に判別することができた（図６）。
以上のことから、プライマーを設計する位置を、変異の５’側と３’側で交換しても、変異型遺伝子を判別できることが明らかとなった。
【００５３】
７．（比較例１）ｏｇｃ変異を判別するプライマーの設計と変異型遺伝子の検出
ｏｇｃ変異を検出する変異型特異的プライマーとして、
ogcF:5'-AAGTCCCACCACCAAAAAAAATC-3'（配列番号１５）
を設計した。ｏｇｃＦは、ｏｇｃ変異体の配列に完全に一致する配列を有し、配列内にＡの８回繰り返しを含む。変異型特異的プライマーｏｇｃＦは、共通プライマーＣｔｒｌ−ｂ＿５８４Ｒとの組合せで４９４ｂｐのＤＮＡ断片を増幅できる。
【００５４】
野生型の配列を検出する野生型特異的プライマーとして、
ogwtR:5'-TAAGAAGACATTTTCTTGATTTTTTTTTGG-3'（配列番号１６）
を設計した。ｏｇｗｔＲは、野生型の配列に完全に相補的な配列を有し、配列内にＡの９回繰り返しを含む。野生型特異的プライマーｏｇｗｔＲは、共通プライマーＣｔｒｌ−ｂ＿３Ｆとの組合せで１２８ｂｐのＤＮＡ断片を増幅できる。
【００５５】
ＰＣＲの鋳型ＤＮＡには、ｏｇｃ変異をホモで保有する系統「ＮＤＭ  ｏｇｃ」を使用した。プライマーには、Ｃｔｒｌ−ｂ＿３Ｆ、Ｃｔｒｌ−ｂ＿５８４Ｒ、ｏｇｃＦ、ｏｇｗｔＲを使用した。ＰＣＲの反応溶液は、１０ｎｇ／μlの鋳型ＤＮＡ１μl、３μＭプライマー各１μl、１０×ＰＣＲ  バッファー１μl、２．５mM  ｄＮＴＰｓ  ０．８μl、ＤＮＡポリメラーゼとして５Ｕ／μl  ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ  ＨＳ（タカラバイオ社製）０．１μl、および滅菌蒸留水３．１μlを混合したものとした。反応温度条件は、９５℃２分間の熱変性後、９５℃３０秒間・５６℃３０秒間・７２℃４５秒間を３５サイクル繰り返し、７２℃７分間の伸長反応を行うものとした。
【００５６】
その結果（図７）、ｏｇｃ変異（４９４ｂｐ）を弱く検出できた（図７において矢印で示すＡ）ものの、プライマーＣｔｒｌ−ｂ＿３ＦとｏｇｗｔＲの非特異的ＰＣＲ産物（１２８ｂｐ）が強く検出された（図７において矢印で示すＢ）。また、プライマーｏｇｃＦとｏｇｗｔＲのプライマーダイマーが非常に強く増幅された（図７において矢印で示すＣ）。
このため、ｏｇｃＦとｏｇｗｔＲでは、ｏｇｃ変異のＰＣＲによる検出はできないと考えられた。
【００５７】
８．（比較例２）ｏｇｃ変異を判別するプライマーの設計と変異型遺伝子の検出（ミスマッチ数を２つに増加）
ミスマッチを増やした場合にｏｇｃ変異を検出できるかどうかを検討した。
ｏｇｃ変異を検出するプライマーとして
ogcR_3G8C:5'-TCTAAGAAGACATTTTCTTGATCTTTTGTG-3'（配列番号１７）
を設計した。ｏｇｃＲ＿３Ｇ８Ｃは、３’末端から３塩基目にミスマッチになるＧを配置し、加えて、３’末端から８塩基目にミスマッチになるＣを配置したものである。変異型特異的プライマーｏｇｃＲ＿３Ｇ８Ｃは、共通プライマーＣｔｒｌ−ｂ＿３Ｆとの組合せで１２９ｂｐのＤＮＡ断片を増幅できる。
野生型特異的プライマーは、ミスマッチ数を１つのｏｇｗｔＦ＿３Ｇを用いた。
【００５８】
プライマーＣｔｒｌ−ｂ＿３Ｆ、Ｃｔｒｌ−ｂ＿５８４Ｒ、ｏｇｃＲ＿３Ｇ８Ｃ、ｏｇｗｔＦ＿３Ｇを用いてＰＣＲを行った。
反応溶液と反応条件は、実施例２の方法に順ずる。
【００５９】
「Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ」（図８のＭで示されるレーン）と「ＮＤＭ  ｏｇｃ／＋」（図８のＨで示されるレーン）では、野生型特異的プライマーｏｇｗｔＦ＿３Ｇと共通プライマーＣｔｒｌ−ｂ＿５８４Ｒとの組合せで増幅される４９７ｂｐのＤＮＡ断片（図８において矢印で示す野生型）の増幅が認められた。しかしながら、変異型特異的プライマーｏｇｃＲ＿３Ｇ８Ｃと共通プライマーＣｔｒｌ−ｂ＿３Ｆとの組合せで増幅される１２９ｂｐのＤＮＡ断片は、認められなかった（図８のｏおよびＨで示されるレーン）。この結果から、アニーリング温度５８℃ではｏｇｃ変異を検出できない（図８）ことが明らかとなった。なお、データには示していないが、アニーリング温度を下げると非特異的増幅が認められた。
【００６０】
したがって、ミスマッチを２つにした場合、プライマーの結合力が低下し、ｏｇｃ変異を検出することができないと考えられた。
【００６１】
〔その他〕
国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１７年度独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構「生物系産業創出のための異分野融合研究支援事業」、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの）」
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】プライマーにｏｇｃＲ＿３ＣとｏｇｗｔＦ＿３Ｇを用いたＰＣＲの結果を示す電気泳動写真。Ｍは「Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ」、Ｍ／ｏは「ＮＤＭ  ｏｇｃ：Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ＝１：１」、ｏは「ＮＤＭ  ｏｇｃ」を示す。
【図２】プライマーにｏｇｃＲ＿３ＣとｏｇｗｔＦ＿３Ｇを用いたＰＣＲの結果を示す電気泳動写真。Ａ〜Ｄは遺伝子型が不明な解析対象であり、鋳型のわかっている右側３レーンのポジティブコントロールとの比較により、ＡとＤがｏｇｃ／野生型のヘテロ、ＢとＣが野生型／野生型のホモと判定できた。電気泳動  １.５％アガロース、ＴＢＥバッファー、１００Ｖ、３０分間。
【図３】プライマーにｏｇｃＲ＿３Ｇ、ｏｇｗｔＦ＿３Ｃを用いたＰＣＲの結果を示す電気泳動写真。Ｍは「Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ」、Ｈは「ＮＤＭ  ｏｇｃ／＋」、ｏは「ＮＤＭ  ｏｇｃ」を示す（以下、同じ）。
【図４】プライマーにｏｇｃＲ＿３Ａ、ｏｇｗｔＦ＿３Ｔを用いたＰＣＲの結果を示す電気泳動写真。
【図５】プライマーにｏｇｃＲ＿３Ｇ＿４０ｂｐ、ｏｇｗｔＦ＿３Ｇ＿３０ｂｐを用いたＰＣＲの結果を示す電気泳動写真。
【図６】プライマーにｏｇｃＦ＿３Ｇ、ｏｇｗｔＲ＿３Ｇを用いたＰＣＲの結果を示す電気泳動写真。
【図７】プライマーにｏｇｃＦとｏｇｗｔＲを用いたＰＣＲの結果を示す電気泳動写真。
【図８】プライマーにｏｇｃＲ＿３Ｇ８Ｃ、ｏｇｗｔＦ＿３Ｇを用いたＰＣＲの結果を示す電気泳動写真。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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