(57)【要約】【課題】高い精度で早期に診断でき、例えば末梢血などの、サイトカインの含有量が微量な検体でも診断可能な、膠原病診断方法を提供すること。【解決手段】（ａ）採取された末梢血に含まれるＴｈ１７と、Ｔｈ１及びＴｈ２の少なくとも１つとを刺激する工程と、（ｂ）刺激された前記Ｔｈ１７と、Ｔｈ１及びＴｈ２の少なくとも１つとにより産生されるサイトカインの発現量として、前記サイトカインのｍＲＮＡレベルの発現量を測定する工程と、（ｃ）測定された前記Ｔｈ１７により産生されるサイトカインの発現量と、測定された前記Ｔｈ１及びＴｈ２の少なくとも１つにより産生されるサイトカインの発現量との比率を算出し、前記比率を指標として膠原病であるか否かを診断する工程と、を含むことを特徴とする膠原病診断方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）採取された末梢血に含まれるＴｈ１７と、Ｔｈ１及びＴｈ２の少なくとも１つとを刺激する工程と、
（ｂ）刺激された前記Ｔｈ１７と、Ｔｈ１及びＴｈ２の少なくとも１つとにより産生されるサイトカインの発現量として、前記サイトカインのｍＲＮＡレベルの発現量を測定する工程と、
（ｃ）前記Ｔｈ１７により産生されるサイトカインの発現量と、前記Ｔｈ１及びＴｈ２の少なくとも１つにより産生されるサイトカインの発現量との比率を算出し、前記比率を指標として膠原病であるか否かを診断する工程と、
を含むことを特徴とする膠原病診断方法。
【請求項２】
ｍＲＮＡレベルの発現量の測定が、定量ＲＴ−ＰＣＲにより行われる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｔｈ１により産生されるサイトカインとして、ＩＦＮ−γの発現量を測定する請求項１から２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
（ａ）採取された末梢血に含まれるＴｈ１７とＴｈ２とを刺激する工程と、
（ｂ）刺激された前記Ｔｈ１７とＴｈ２とにより産生されるサイトカインの発現量として、前記サイトカインのタンパクレベルの発現量を測定する工程と、
（ｃ）前記Ｔｈ１７により産生されるサイトカインの発現量と、前記Ｔｈ２により産生されるサイトカインの発現量との比率を算出し、前記比率を指標として膠原病であるか否かを診断する工程と、
を含むことを特徴とする膠原病診断方法。
【請求項５】
Ｔｈ１７により産生されるサイトカインとして、ＩＬ−１７の発現量を測定する請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
Ｔｈ２により産生されるサイトカインとして、ＩＬ−４の発現量を測定する請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
（ａ）工程において、末梢血から分取された単核球画分を刺激する請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
比重遠心法により単核球画分が分取される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
刺激が、酢酸ミリスチン酸ホルボール及びイオノマイシンを添加することにより行われる請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
膠原病が、関節リウマチ及び全身性エリテマトーデスのうちいずれかである請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、混合性結合組織病、ベーチェット病、全身性硬化症（強皮症）、皮膚筋炎、結節性動脈周囲炎などの膠原病及び膠原病類縁疾患を診断する膠原病診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
膠原病及び膠原病類縁疾患（以下、「膠原病」には膠原病類縁疾患も含むものとする。）は、全身の血管結合組織に炎症性病変が現れる自己免疫疾患であり、例えば、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、ベーチェット病、全身性硬化症（強皮症）、皮膚筋炎、結節性動脈周囲炎などが挙げられる。
【０００３】
前記関節リウマチは、末梢関節に対称的に炎症を起こし、骨や軟骨などの関節構造に進行性の破壊を生じる疾患であり、通常は全身症状を伴う。
関節リウマチの治療法としては、従来では鎮痛薬など効果の穏やかな薬が優先して用いられていたが、近年になって一般的な治療方針が大きく転換し、関節の破壊を遅らせるために、早い段階から抗リウマチ薬などの効果の強い薬が積極的に用いられるようになった。また、最近では、前記抗リウマチ薬よりも効果の高い薬として、モノクローナル抗体や、サイトカイン受容体と抗体とのキメラタンパクなどからなる生物製剤が用いられている。
【０００４】
また、前記全身性エリテマトーデスは、慢性、多臓器性、自己免疫性病因の可能性の高い炎症性疾患であり、主に若い女性に発病する。
全身性エリテマトーデスは、かつては原因不明の難病であって、生存率の低い疾患であったが、副腎皮質ステロイドが治療に利用されるようになって症状の進行を抑制できるようになり、生存率も飛躍的に高まった。
【０００５】
このように、膠原病の治療においては、できるだけ早期に診断を確定し、早期に治療を開始することが重要である。さらに、前記抗リウマチ薬や副腎皮質ステロイドのような膠原病の治療薬は、比較的副作用が強いことが知られている。したがって、早期に診断できる上に、高い精度で診断可能な膠原病診断方法が、望まれているのが現状である。
【０００６】
一方、獲得免疫の中心的役割を担うヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）は、産生するサイトカインの違いなどから、細胞性免疫を促進するＴｈ１（タイプ１ヘルパーＴ細胞）と液性免疫を促進するＴｈ２（タイプ２ヘルパーＴ細胞）とに分類される。従来から、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスの異常は様々な免疫関連疾患の発症に関与すると考えられている。例えば、Ｔｈ１細胞へのバランス偏向は、臓器特異的自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病など）に関与すると考えられており、また、Ｔｈ２細胞へのバランス偏向は、全身性自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス）に関与すると考えられている。しかしながら、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスという概念では、免疫関連疾患の発症を説明できないことも多く、臨床の現場では利用されていない。
【０００７】
近年、複数の論文により、新たなＴｈサブセットであるＴｈ１７が報告された（例えば、非特許文献１〜３参照）。この細胞はもっぱらＩＬ−１７を産生することにより、自己免疫性炎症の増悪に関与している。
ここで、前記膠原病を診断する方法として、採血した血液又は関節液中のインターロイキン−１７（ＩＬ−１７）の含量を測定してその数値により慢性関節リウマチ疾病を診断する方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。
しかしながら、通常、ＩＬ−１７などのサイトカインは、関節液中には豊富に存在するが、血液中には微量しか含まれていないことが知られている。前記特許文献１に開示される方法では、関節液中のＩＬ−１７を測定することはできても、血液中のＩＬ−１７を定量することは困難であるという問題があった。
さらに、前記特許文献１に開示される方法により診断可能な膠原病は、関節リウマチ（ＲＡ）のみであって、例えば全身性エリテマトーデスやベーチェット病などの他の膠原病については、診断方法が提供されていないという問題があった。
【０００８】
【特許文献１】特開２０００−１８６０４６号公報
【非特許文献１】Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００５  Ｎｏｖ；６（１１）：１１２３−３２
【非特許文献２】Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００５  Ｎｏｖ；６（１１）：１１３３−４１
【非特許文献３】Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００６  Ｎｏｖ  ２７；２０３（１２）：２６７３−８２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、高い精度で早期に診断でき、例えば末梢血などの、サイトカインの含有量が微量な検体でも診断可能な、膠原病診断方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、膠原病患者及び健常者から採取された末梢血由来の単核球（Ｔｈ１、２、１７を含む）を刺激し、刺激されたＴｈ１、２、１７がそれぞれ産生するＩＦＮ−γ、ＩＬ−４及びＩＬ−１７の発現量を測定し、ＩＬ−１７／ＩＦＮ−γや、ＩＬ−１７／ＩＬ−４といった比率を算出して、膠原病患者と健常者との比率を比較したところ、膠原病患者の比率では特有の傾向が示された、という知見である。
【００１１】
前記したように、採取した血液又は関節液中のＩＬ−１７の含量を測定してその数値により関節リウマチ（ＲＡ）を診断する方法が開示されている。
しかしながら、末梢血中のサイトカインを直接測定するのではなく、末梢血中の単核球（Ｔｈ１、２、１７を含む）を刺激した後に、前記Ｔｈ１、２、１７がそれぞれ産生するサイトカインの発現量を測定することで、初めて末梢血を検体とした膠原病の診断が可能となること、及び、Ｔｈ１７やその産物であるＩＬ−１７のみを指標とするのではなく、Ｔｈ１７を含むＴｈサブセット間の比率（例えば、ＩＬ−１７／ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７／ＩＬ−４など）を指標とすることで、初めて高い精度で膠原病の診断が可能となることは従来全く知られておらず、本発明者らの新たな知見である。
【００１２】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  （ａ）採取された末梢血に含まれるＴｈ１７と、Ｔｈ１及びＴｈ２の少なくとも１つとを刺激する工程と、
（ｂ）刺激された前記Ｔｈ１７と、Ｔｈ１及びＴｈ２の少なくとも１つとにより産生されるサイトカインの発現量として、前記サイトカインのｍＲＮＡレベルの発現量を測定する工程と、
（ｃ）前記Ｔｈ１７により産生されるサイトカインの発現量と、前記Ｔｈ１及びＴｈ２の少なくとも１つにより産生されるサイトカインの発現量との比率を算出し、前記比率を指標として膠原病であるか否かを診断する工程と、
を含むことを特徴とする膠原病診断方法である。
＜２＞  ｍＲＮＡレベルの発現量の測定が、定量ＲＴ−ＰＣＲにより行われる＜１＞に記載の方法である。
＜３＞  Ｔｈ１により産生されるサイトカインとして、ＩＦＮ−γの発現量を測定する＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の方法である。
＜４＞（ａ）採取された末梢血に含まれるＴｈ１７とＴｈ２とを刺激する工程と、
（ｂ）刺激された前記Ｔｈ１７とＴｈ２とにより産生されるサイトカインの発現量として、前記サイトカインのタンパクレベルの発現量を測定する工程と、
（ｃ）前記Ｔｈ１７により産生されるサイトカインの発現量と、前記Ｔｈ２により産生されるサイトカインの発現量との比率を算出し、前記比率を指標として膠原病であるか否かを診断する工程と、
を含むことを特徴とする膠原病診断方法である。
＜５＞  Ｔｈ１７により産生されるサイトカインとして、ＩＬ−１７の発現量を測定する＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の方法である。
＜６＞  Ｔｈ２により産生されるサイトカインとして、ＩＬ−４の発現量を測定する＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の方法である。
＜７＞  （ａ）工程において、末梢血から分取された単核球画分を刺激する＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の方法である。
＜８＞  比重遠心法により単核球画分が分取される請求項７に記載の方法。
＜９＞  刺激が、酢酸ミリスチン酸ホルボール及びイオノマイシンを添加することにより行われる＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の方法である。
＜１０＞  膠原病が、関節リウマチ及び全身性エリテマトーデスのうちいずれかである＜１＞から＜９＞のいずれかに記載の方法である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によると、従来における諸問題を解決することができ、高い精度で早期に診断でき、例えば末梢血などの、サイトカインの含有量が微量な検体でも診断可能な、膠原病診断方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（膠原病診断方法）
本発明の膠原病診断方法は、下記工程（ａ）乃至（ｃ）を含んでなり、必要に応じてその他の工程を含む。
なお、下記工程（ａ）乃至（ｃ）は、少なくとも被検者から採取された末梢血を検体として行われ、更に必要に応じて健常者群や患者群から採取された末梢血を検体として行われる。
【００１５】
＜工程（ａ）＞
前記診断方法においては、まず、採取された末梢血に含まれるＴｈ１７（タイプ１７ヘルパーＴ細胞）と、Ｔｈ１（タイプ１ヘルパーＴ細胞）及びＴｈ２（タイプ２ヘルパーＴ細胞）の少なくとも１つとを刺激する（工程（ａ））。
【００１６】
前記Ｔｈ１７とは、近年、複数の論文により、新たに報告されたＴｈ（ヘルパーＴ細胞）サブセットである。Ｔｈ１７は、もっぱらサイトカインであるＩＬ−１７を産生することにより、膠原病のような自己免疫性疾患において、重要な役割を果たすことが知られている。
【００１７】
前記Ｔｈ１とは、Ｔｈサブセットの１つであり、細胞性免疫を促進することが知られている。また、前記Ｔｈ１は、ＩＦＮ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）−γ、ＴＮＦ（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ）−αなどのサイトカインを産生することが知られている。
前記Ｔｈ２とは、Ｔｈサブセットの１つであり、液性免疫を促進することが知られている。また、前記Ｔｈ２は、ＩＬ−４、５、１０、１３などのサイトカインを産生することが知られている。
以下、前記「Ｔｈ１７と、Ｔｈ１及びＴｈ２の少なくとも１つと」を含む群を、適宜、「Ｔｈ群」と称する。
【００１８】
前記末梢血の採取方法としては、特に制限はなく、常法により採取することができ、例えば、静脈採血や動脈採血が挙げられる。また、前記末梢血が採取される部位としても、特に制限はなく、体のどの部位から採取された末梢血であっても好適に利用できる。
【００１９】
−刺激−
前記工程（ａ）における「刺激」とは、前記Ｔｈ群に刺激物質を接触させることにより、前記Ｔｈ群が産生するサイトカインの発現量を増加させることを意味する。
【００２０】
前記Ｔｈ群に刺激物質を接触させる方法としては、特に制限はないが、通常、Ｔｈ群を含む溶液に対して、刺激物質を含有する溶液を添加することで、前記Ｔｈ群及び／又は前記刺激物質が溶液中を拡散してお互いを接触させることができる。
【００２１】
前記刺激物質としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＰＭＡ（Ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ、酢酸ミリスチン酸ホルボール）及びイオノマイシン（Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）の併用、コンカナバリン  Ａ（ＣｏｎＡ）、フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）などの抗原非特異的な刺激物質；抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の併用などの抗原特異的な刺激物質が挙げられる。中でも、刺激が強力で、多量のサイトカインを産生させることができる点で、ＰＭＡ及びイオノマイシンの併用が好ましい。前記刺激物質は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。また、Ｔｈ１、２、１７のそれぞれに対し、異なる刺激物質を添加してもよい。
【００２２】
前記刺激物質の添加量としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はないが、例えばＰＭＡ及びイオノマイシンを併用する場合には、ＰＭＡ及びイオノマイシンの終濃度として、それぞれ、１２〜５０ｎｇ／ｍｌ及び０．２５〜１μｇ／ｍｌが好ましく、２５〜４０ｎｇ／ｍｌ及び０．５〜１μｇ／ｍｌがより好ましく、４０ｎｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌが特に好ましい。
前記ＰＭＡ及びイオノマイシンの添加量が、それぞれ１２ｎｇ／ｍｌ未満及び０．２５μｇ／ｍｌ未満、あるいは、それぞれ５０ｎｇ／ｍｌを超過及び１μｇ／ｍｌを超過する場合には、サイトカイン産生が低下する可能性がある。
【００２３】
刺激される際のＴｈ群の状態としては、後記する比率の算出に用いるＴｈサブセット間での細胞数比が、末梢血中の細胞数比と変わらない限り、特に制限はなく、例えば、末梢血そのものに含有された状態であってもよく、末梢血から分取された画分に含有された状態であってもよい。ただし、末梢血から赤血球が除去されていない場合には、赤血球由来のタンパクやｍＲＮＡが混入し、正確な測定が阻害されるおそれが生じるため、前記末梢血から分取された画分に含有された状態が好ましい。さらに、これらに対して、例えば、培地や緩衝液などの、その他の成分が添加されていてもよい。
【００２４】
前記末梢血から分取された画分としては、特に制限はなく、例えば、単核球画分、Ｔ細胞画分、Ｔｈ群のみを単離された画分などが挙げられる。中でも、簡便に分取できる点で、単核球画分が好ましい。
前記単核球画分の分取方法としては、特に制限はなく、例えば、比重遠心法（フィコール・コンレイ比重遠心法など）；低浸透圧の溶液中で赤血球を選択的に溶血させる方法；などが挙げられる。中でも、簡便に分取できる点で、比重遠心法が好ましい。
前記Ｔ細胞画分は、ＣＤ４陽性細胞及びＣＤ８陽性細胞を含む。前記Ｔ細胞画分の分取方法としては、特に制限はなく、例えば、イムノビーズ（ＭＡＣＳ、Ｄｙｎａビーズなど）を利用して分取する方法が挙げられる。
前記Ｔｈ群のみを単離された画分の分取方法としては、特に制限はなく、例えば、セルソーターを用いて単離する方法、イムノビーズを利用して単離する方法が挙げられる。
【００２５】
また、必要に応じて、Ｔｈ群及び刺激物質を充分に反応させるためのインキュベーション工程や攪拌工程など、その他の工程を含んでいてもよい。前記インキュベーション工程の諸条件、例えば、温度条件、時間条件、雰囲気条件などについては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はないが、前記温度条件としては３７℃が好ましく、前記時間条件としては、５時間が好ましく、前記雰囲気条件としては、５％炭酸ガスが好ましい。
【００２６】
＜工程（ｂ）＞
前記診断方法においては、次いで、刺激されたＴｈ１７と、Ｔｈ１及びＴｈ２の少なくとも１つと（Ｔｈ群）により産生されるサイトカインの発現量を測定する（工程（ｂ））。
【００２７】
Ｔｈ１７により産生されるサイトカインのうち、発現量が測定されるサイトカインとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＩＬ−１７が挙げられる。
Ｔｈ１により産生されるサイトカインのうち、発現量が測定されるサイトカインとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αなどが挙げられる。中でも、Ｔｈ１から産生されるサイトカインの中で最も代表的であり、知見が豊富に蓄積されている点で、ＩＦＮ−γが好ましい。
Ｔｈ２により産生されるサイトカインのうち、発現量が測定されるサイトカインとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＩＬ−４、５、１０、１３などが挙げられる。中でも、Ｔｈ１から産生されるサイトカインの中で最も代表的であり、知見が豊富に蓄積されている点で、ＩＬ−４が好ましい。
また、１種類のＴｈサブセットにつき１種類のサイトカインの発現量を測定してもよく、２種類以上のサイトカインの発現量を測定してもよい。
【００２８】
前記工程（ｂ）におけるサイトカインの発現量としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、例えば、前記サイトカインの遺伝子から転写されるｍＲＮＡの発現量（以下、「ｍＲＮＡレベルの発現量」と称する）、又は、前記ｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質の発現量（以下、「タンパクレベルの発現量」と称する）が挙げられる。中でも、膠原病の診断に利用できるサイトカインの種類が多い点で、ｍＲＮＡレベルの発現量が好ましい。
前記ｍＲＮＡレベルの発現量の測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、定量ＲＴ−ＰＣＲ法、マイクロアレイ法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法、ノーザンブロット法などが挙げられる。中でも、定量精度が高い点で、定量ＲＴ−ＰＣＲ法が好ましい。
【００２９】
前記定量ＲＴ−ＰＣＲとは、ＲＴ−ＰＣＲにおけるＰＣＲ反応を、定量リアルタイムＰＣＲにより行うものである。前記定量ＲＴ−ＰＣＲの試薬、プライマーの塩基配列、反応条件としては、特に制限はなく、例えば、各種メーカより提供される定量ＲＴ―ＰＣＲ用のキットやサーマルサイクラーで推奨されるものを好適に利用することができる。
【００３０】
前記定量リアルタイムＰＣＲ法としては、例えば、ＴａｑＭａｎプローブ法、サイクリングプローブ法、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ法、ＦＲＥＴ法などが挙げられる。中でも、プローブ類を含み試薬類が手に入りやすく、多くの技術的積み重ねがあり問題点をクリアしやすく、対応可能なサーマルサイクラーが多くのメーカより発売されているなどの点で、ＴａｑＭａｎプローブ法が好ましい。
【００３１】
前記ＴａｑＭａｎプローブ法では、増幅産物を検出するためのプローブとして、一端を蛍光物質で、他端を消光物質で修飾されたプローブを用いる。
そして、前記ＴａｑＭａｎプローブ法は、増幅産物にハイブリダイズした前記プローブが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって分解されたときに、蛍光物質が消光物質から遊離することで発する蛍光をリアルタイムで検出する方法である。
【００３２】
前記サイクリングプローブ法は、増幅産物を検出するためのプローブとして、ＲＮＡ塩基を含む核酸鎖において、一端を蛍光物質で、他端をクエンチャー物質で修飾されたプローブを用いる。
そして、前記サイクリングプローブ法は、増幅産物にハイブリダイズした前記プローブが反応液中に共存されたＲＮａｓｅＨによって分解されたときに、蛍光物質が消光物質から遊離することで発する蛍光をリアルタイムで検出する方法である。
【００３３】
前記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ法は、増幅産物を検出するためのプローブとして、ヘアピン型二次構造をとりうるプローブにおいて、一端を蛍光物質で、他端をクエンチャー物質で修飾されたプローブを用いる。
そして、前記サイクリングプローブ法は、前記プローブが増幅産物にハイブリダイズすることでヘアピン型二次構造が解除されたときに、蛍光物質と消光物質との距離が離れることで発する蛍光をリアルタイムで検出する方法である。
【００３４】
前記ＦＲＥＴ法は、増幅産物を検出するためのプローブとして、一端を第一の蛍光物質で修飾され、他端を第二の蛍光物質で修飾されたプローブを用いる。なお、前記第二の蛍光物質は、前記第一の蛍光物質の蛍光波長により励起される性質を有する。
そして、前記ＦＲＥＴ法は、第一の蛍光物質を励起させる励起光を照射して、第二の蛍光物質が発する蛍光をリアルタイムで検出する方法であって、増幅産物にハイブリダイズした前記プローブが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって分解されたときに、第一の蛍光物質が第二の蛍光物質から遊離することで、第二の蛍光物質が発する蛍光強度が低下することを指標とする。
【００３５】
前記インターカレーター法では、ＰＣＲの反応液中に、二本鎖ＤＮＡに挿入されることで蛍光を発する蛍光物質（インターカレーター）が添加される。前記インターカレーターとしては、例えば、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉなどが挙げられる。
そして、前記インターカレーター法は、ポリメラーゼ反応によって合成された二本鎖ＤＮＡ中にインターカレーターが挿入されることで発する蛍光をリアルタイムで検出する方法である。
【００３６】
前記タンパクレベルの発現量の測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ、酵素免疫吸着測定）法、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）法、ウェスタンブロット法、ドットブロット法などが挙げられる。中でも、検出感度が高い点で、ＥＬＩＳＡ法が好ましい。
【００３７】
前記ＥＬＩＳＡ法とは、抗体を酵素などで標識し、抗体と結合する物質を検出する方法である。前記ＥＬＩＳＡ法としては、特に制限はなく、例えば、直接吸着法、サンドイッチ法、競合法などが挙げられる。前記ＥＬＩＳＡ法の試薬、抗体の結合部位、反応条件としては、特に制限はなく、例えば、各種メーカより提供されるＥＬＩＳＡ用のキットで推奨されるものを好適に利用することができる。
【００３８】
＜工程（ｃ）＞
前記診断方法においては、次いで、測定された前記Ｔｈ１７により産生されるサイトカインの発現量と、測定された前記Ｔｈ１及びＴｈ２の少なくとも１つにより産生されるサイトカインの発現量との比率を算出し、前記比率を指標として膠原病であるか否かを診断する（工程（ｃ））。
前記「比率」とは、例えば、「Ｔｈ１７により産生されるサイトカインの発現量／Ｔｈ１により産生されるサイトカインの発現量」、「Ｔｈ１７により産生されるサイトカインの発現量／Ｔｈ２により産生されるサイトカインの発現量」などの式により算出することができる。また、例えば、前記「Ｔｈ１７により産生されるサイトカインの発現量／Ｔｈ１により産生されるサイトカインの発現量」と「Ｔｈ１７により産生されるサイトカインの発現量／Ｔｈ２により産生されるサイトカインの発現量」との平均なども、前記「比率」に含まれる。
さらに、前記工程（ｂ）において、１つのＴｈサブセットにつき、複数のサイトカインの発現量を測定した場合には、前記複数のサイトカインの発現量に基づいて各Ｔｈ１、２、１７により産生されるサイトカインの発現量を算出し、これらの値に基づいて前記比率を算出してもよい。
なお、Ｔｈ１７により産生されるＩＬ−１７の発現量のみを指標としても膠原病を診断することはできず、前記「比率」によって初めて膠原病を診断できることは、従来全く知られておらず、後記する実施例で示されるように、本発明者らの新たな知見である。
【００３９】
前記膠原病であるか否かを診断する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、健常者群と比較して、被検者の比率が有意に異なる場合には、膠原病であると診断することができる。また、例えば、患者群と比較して、被検者の比率が同等であると判断される場合にも、膠原病であると診断することができる。ここで、前記健常者群及び患者群は、被検者の比較対象となるものであるから、末梢血の採取、Ｔｈ群の刺激、比率の算出式などにおいて、同じ条件で行うことが好ましいことは言うまでもない。
なお、本発明者らにより、後記する実施例において、前記比率としての「Ｔｈ１７により産生されるサイトカインの発現量／Ｔｈ１により産生されるサイトカインの発現量」や、「Ｔｈ１７により産生されるサイトカインの発現量／Ｔｈ２により産生されるサイトカインの発現量」は、健常者よりも膠原病患者の方が高いことが示されている。
【００４０】
＜対象疾患＞
本発明の診断方法は、高い精度で早期に診断でき、例えば末梢血などの、サイトカインの含有量が微量な検体でも診断可能であるので、膠原病及び膠原病類縁疾患の診断に好適に利用することができる。
前記膠原病及び膠原病類縁疾患としては、特に制限はなく、例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、混合性結合組織病、ベーチェット病、全身性硬化症（強皮症）、皮膚筋炎、結節性動脈周囲炎などが挙げられる。中でも、関節リウマチ及び全身性エリテマトーデスが好ましく、全身性エリテマトーデスがより好ましい。
【００４１】
診断対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サルなどが挙げられる。
診断時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、膠原病と診断されていない被検者に対して診断してもよく、既に臨床所見などで膠原病と診断された患者に対して確認のために診断してもよく、治療後の患者に対してその予後を調べるために診断してもよい。
【実施例】
【００４２】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００４３】
（実施例１）
実施例１は、刺激されたＴｈ群が産生するサイトカインの発現量として、ｍＲＮＡレベルの発現量を評価した実施例である。
なお、実施例１において、Ｔｈ１が産生するサイトカインとしてＩＦＮ−γを、Ｔｈ２が産生するサイトカインとしてＩＬ−４を、Ｔｈ１７が産生するサイトカインとしてＩＬ−１７を、それぞれ評価した。
【００４４】
＜方法＞
−末梢血の採取、単核球の分取−
測定対象は、関節リウマチ（ＲＡ）患者７人、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者４人、及び、健常者３人である。
まず、前記患者及び健常者から、静脈血（末梢血）を５ｍｌヘパリン添加採血管に採取した。前記末梢血からの単核球の分取は、フィコール・コンレイ比重遠心法に従って行った。フィコール・コンレイ比重遠心法の具体的な手順は、以下の通りである。
【００４５】
５０ｍｌの遠心管にフィコール・コンレイ溶液（比重１．０７７）を２０ｍｌ入れた。そして、前記末梢血をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２倍に希釈した後に、前記フィコール・コンレイ溶液の上に、界面を崩さないように静かに重層した。４００×ｇにて室温で３０分間遠心後、中間層（単核球）を分取し、ＰＢＳにて３回洗浄した。前記単核球は、Ｔｈ１、２、１７を含む。
【００４６】
−単核球の培養−
洗浄された前記単核球を、０．５ｍｌの１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）添加ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社製）内で培養した。抗原非特異的に単核球を刺激するために、ＰＭＡ及びイオノマイシン（いずれも、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、終濃度がそれぞれ４０ｎｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌとなるように添加し、５時間培養した。
【００４７】
−サイトカインｍＲＮＡの定量−
単核球培養後の培養液を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移し、１，５００回転／分（ｒｐｍ）で１分間の遠心により上清とペレットとに分け、前記ペレットに含まれる単核球からＲＮＡを精製した。前記ＲＮＡの精製は、ＲＮＡｅａｓｙ（キアゲン社製）を用いて、キットに添付されているプロトコールに従って行った。
そして、精製したＲＮＡを定量し、３００ｎｇを逆転写反応に用いた。前記逆転写反応は、緩衝液、ＭｇＣｌ２，ｄＮＴＰ，Ｏｌｏｇｏ  ｄＴ，ＲＮａｓｅ阻害薬及び逆転写酵素の存在下（合計４０μｌ）で、４８℃で１０分間反応させ、続いて９５℃で５分間反応させることで行った。前記逆転写反応後のサンプルから１／１０（ｖ／ｖ）を分取し、定量リアルタイムＰＣＲに供した。
【００４８】
定量リアルタイムＰＣＲにおける反応液は、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライドバイオシステム社製）と、各サイトカインに対応したプライマー及びＴａｑＭａｎプローブのセット（ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−γ  ＨＳ９９９９９０４１，ｈｕｍａｎ  ＩＬ−４ＨＳ００１７４１２２，ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１７  ＨＳ００１７４３８３、いずれも（アプライドバイオシステム社製））とを用いて、添付されるプロトコールに従って調製した。また、定量リアルタイムＰＣＲの反応乃至検出には、アプライドバイオシステム  ７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いた。反応条件としては、５０℃で２分間、９５℃で１０分間処理した後、９５℃で１５秒、６２度で１分間のサイクルを４０サイクル行った。
これにより、刺激されたＴｈ１、２、１７がそれぞれ産生するＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１７のｍＲＮＡレベルの発現量が測定された。
なお、定量のための標準サンプルとしては、ヒトＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１７の各サイトカインのｃＤＮＡをＴＡクローニングベクターに組み込んだプラスミドを、段階希釈して用いた。また、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素）についても同様に発現量を測定し、前記ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１７の発現量を、ＧＡＰＤＨの発現量で補正した。ＧＡＰＤＨは、刺激の有無によらず恒常的に発現するため、一般に陽性対照として用いられる。
【００４９】
＜結果＞
図１は、ＩＬ−１７とＩＦＮ−γとのｍＲＮＡレベルの発現量の関係を示す散布図である。図１に示すように、健常者群は、ＩＬ−１７が少なくＩＦＮ−γが多い領域（右下）に分布し、一方で、膠原病患者（特にＳＬＥ患者）は、ＩＬ−１７が少なくＩＦＮ−γが多い領域（左上）に分布していた。即ち、刺激されたＴｈ１７及びＴｈ１により産生されるＩＬ−１７及びＩＦＮ−γの比率により、膠原病が診断できることが示された。
一方、ＩＬ−１７の発現量（縦軸）のみを指標としても、膠原病を区別することができないことが示唆された。
【００５０】
図２は、ＩＬ−１７とＩＬ−４とのｍＲＮＡレベルの発現量の関係を示す散布図である。図２に示すように、健常者群は、ＩＬ−１７が少なくＩＬ−４が多い領域（右下）に分布し、一方で、膠原病患者（特にＳＬＥ患者）は、ＩＬ−１７が少なくＩＬ−４が多い領域（左上）に分布していた。即ち、刺激されたＴｈ１７及びＴｈ２により産生されるＩＬ−１７及びＩＬ−４の比率により、膠原病が診断できることが示された。
一方、ＩＬ−１７の発現量（縦軸）のみを指標としても、膠原病を区別することができないことが示唆された。
【００５１】
図３は、ＩＦＮ−γとＩＬ−４とのｍＲＮＡレベルの発現量の関係を示す散布図である。図３においては、図１及び図２と異なり、健常者と膠原病患者との分布に差が見られなかった。即ち、Ｔｈ１とＴｈ２との比率だけでは、膠原病が診断できないことが示され、従来のＴｈ１／Ｔｈ２バランスで免疫関連疾患を説明できるという仮説が、有効ではないことが示された。
【００５２】
ここで、ＩＬ−１７とＩＦＮ−γとのｍＲＮＡレベルの発現量の関係（図１参照）と、ＩＬ−１７とＩＬ−４とのｍＲＮＡレベルの発現量の関係（図２参照）とを比較し、いずれの指標が、膠原病患者の診断により有効であるかを検討した。
【００５３】
図４は、ＩＬ−１７とＩＦＮ−γとのｍＲＮＡレベルの発現量の比率（ＩＬ−１７／ＩＦＮ−γ）を示す図である。図４に示すように、ＩＬ−１７／ＩＦＮ−γでは、値を０．００１５（区画線１）で区切ることにより、感度９０％（ＲＡでは８３％，ＳＬＥでは１００％）、特異度１００％を得た。
【００５４】
図５は、ＩＬ−１７とＩＬ−４とのｍＲＮＡレベルの発現量の比率（ＩＬ−１７／ＩＬ−４）を示す図である。図５に示すように、ＩＬ−１７／ＩＬ−４でも、値を０．１５（区画線２）で区切ることにより、全く同じ感度・特異度を得た。さらに、図５においては、区切る値を０．１５−０．１８の間で動かしても、同じ感度・特異度を得ることができた。
【００５５】
即ち、図５に示すＩＬ−１７／ＩＬ−４は、図４に示すＩＬ−１７／ＩＦＮ−γと感度・特異度が同じで、そのうえで、安全域が広い。したがって、ＩＬ−１７／ＩＬ−４（図５参照）を指標とする方が、膠原病の診断に対して、より有効であると考えられる。
【００５６】
（実施例２）
実施例２は、刺激されたＴｈ群が産生するサイトカインの発現量として、タンパクレベルの発現量を評価した実施例である。
なお、実施例２において、実施例１と同様に、Ｔｈ１が産生するサイトカインとしてＩＦＮ−γを、Ｔｈ２が産生するサイトカインとしてＩＬ−４を、Ｔｈ１７が産生するサイトカインとしてＩＬ−１７を、それぞれ評価した。
【００５７】
＜方法＞
測定対象は、関節リウマチ（ＲＡ）患者１５人、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者４人、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）患者１人、ベーチェット病患者５人、及び、健常者６人である。
そして、実施例１と同様に、末梢血の採取、単核球の分取、単核球の培養を行った。
【００５８】
−サイトカインタンパクの定量−
単核球培養後の培養液を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移し、５，０００回転／分（ｒｐｍ）で１分間の遠心を行い上清とペレットに分けた。
前記培養上清中のサイトカイン（ＩＦＮ−γ，ＩＬ−４，ＩＬ−１７）の量を、ＥＬＩＳＡ法により測定した。前記サイトカイン量の測定としては、Ｐｅｐｒｏｔｅｃ社製のＥＬＩＳＡキットを用い、キットに添付されているプロトコールに従って行った。
【００５９】
＜結果＞
図６は、ＩＬ−１７とＩＦＮ−γとのタンパクレベルの発現量の関係を示す散布図である。図６においては、健常者と膠原病患者との分布に差が見られなかった。即ち、ＩＬ−１７とＩＦＮ−γとの比率を指標として膠原病を診断する場合には、タンパクレベルの発現量（図６参照）を評価するよりも、ｍＲＮＡレベルの発現量（図１参照）を評価する方が、好適であることが示された。
【００６０】
図７は、ＩＬ−１７とＩＬ−４とのタンパクレベルの発現量の関係を示す散布図である。図７に示すように、健常者群は、ＩＬ−１７が少なくＩＬ−４が多い領域（右下）に分布し、一方で、膠原病患者（特にＳＬＥ患者）は、ＩＬ−１７が少なくＩＬ−４が多い領域（左上）に分布していた。ここで、ｘ軸、ｙ軸をそれぞれＩＬ−１７，ＩＬ−４の値とし、ｙ＞１．７ｘという簡単な式を考えると、ＳＬＥ患者は全員がその領域に入り、健常者は１人も入らない。即ち感度、特異度共１００％となる。ＲＡにおいては前記領域に１２人が含まれ、３人がｙ＜１．７ｘとなるため感度は８０％，特異度１００％となる。ベーチェット病でも領域に４人入り、１人が入らないため感度８０％，特異度１００％となる。即ち、図２と同様に、刺激されたＴｈ１７及びＴｈ２により産生されるＩＬ−１７及びＩＬ−４の比率により、膠原病が診断できることが示された。
一方、ＩＬ−１７の発現量（縦軸）のみを指標としても、膠原病を区別することができないことが示唆された。
【００６１】
図８は、ＩＦＮ−γとＩＬ−４とのタンパクレベルの発現量の関係を示す散布図である。図８に示すように、健常者と膠原病患者との分布に差が見られなかった。即ち、図３と同様に、Ｔｈ１とＴｈ２との比率だけでは、膠原病が診断できないことが示され、従来のＴｈ１／Ｔｈ２バランスで免疫関連疾患を説明できるという仮説が、有効ではないことが示された。
【００６２】
本実施例（実施例１、実施例２）の結果によれば、タンパクレベルの発現量、ｍＲＮＡレベルの発現量いずれにおいても、ＩＬ−１７とＩＬ−４との比率（Ｔｈ１７により産生されるサイトカインとＴｈ２により産生されるサイトカインとの比率に対応）が、健常者と膠原病患者（特にＳＬＥ患者）とを区別する際に有用であることが示された。また、ｍＲＮＡレベルの発現量においては、ＩＬ−１７とＩＦＮ−γとの比率（Ｔｈ１７により産生されるサイトカインとＴｈ１により産生されるサイトカインとの比率に対応）が、健常者と膠原病患者（特にＳＬＥ患者）とを区別する際に有用であることが示された。
一方で、図１、図２及び図７に示すように、ＩＬ−１７の発現量（縦軸）のみを指標としても、膠原病を区別することはできない。
これまで末梢血由来のサイトカインを定量する方法が一般化されていなかったためこれらの比率を測定することは困難であったが、単核球画分に含まれるＴｈ群を刺激することによって測定が可能となった。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明の膠原病診断方法は、高い精度で早期に診断でき、例えば末梢血などの、サイトカインの含有量が微量な検体でも診断可能なので、例えば、膠原病の診断キットとして好適に利用することができる。また、前記膠原病診断方法は、膠原病の発症や治療に関する研究や、膠原病の治療薬のスクリーニングに好適に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、実施例１における、ＩＬ−１７とＩＦＮ−γとのｍＲＮＡレベルの発現量の関係を示す散布図である。
【図２】図２は、実施例１における、ＩＬ−１７とＩＬ−４とのｍＲＮＡレベルの発現量の関係を示す散布図である。
【図３】図３は、実施例１における、ＩＦＮ−γとＩＬ−４とのｍＲＮＡレベルの発現量の関係を示す散布図である。
【図４】図４は、実施例１における、ＩＬ−１７とＩＦＮ−γとのｍＲＮＡレベルの発現量の比率（ＩＬ−１７／ＩＦＮ−γ）を示す図である。
【図５】図５は、実施例１における、ＩＬ−１７とＩＬ−４とのｍＲＮＡレベルの発現量の比率（ＩＬ−１７／ＩＬ−４）を示す図である。
【図６】図６は、実施例２における、ＩＬ−１７とＩＦＮ−γとのタンパクレベルの発現量の関係を示す散布図である。
【図７】図７は、実施例２における、ＩＬ−１７とＩＬ−４とのタンパクレベルの発現量の関係を示す散布図である。
【図８】図８は、実施例２における、ＩＦＮ−γＩＬ−４とのタンパクレベルの発現量の関係を示す散布図である。
【符号の説明】
【００６５】
１      区画線
２      区画線
【図１】
2009050232.tif 000002
【図２】
2009050232.tif 000003
【図３】
2009050232.tif 000004
【図４】
2009050232.tif 000005
【図５】
2009050232.tif 000006
【図６】
2009050232.tif 000007
【図７】
2009050232.tif 000008
【図８】
2009050232.tif 000009