(57)【要約】【課題】抗微生物活性を有する医薬組成物、およびその調製方法を提供する。【解決手段】本発明の医薬組成物は、活性成分としてのヒアルロン酸亜鉛会合体（錯体）またはヒアルロン酸コバルト会合体（錯体）を、医薬産業上一般に用いられる担体および／または他の添加剤と混合して含んでいる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗微生物活性を有する医薬組成物であって、活性成分としてのヒアルロン酸亜鉛会合体（錯体）またはヒアルロン酸コバルト会合体（錯体）を、医薬産業上一般に用いられる担体および／または他の添加剤と混合して含んでいる、前記組成物。
【請求項２】
活性成分として、ヒアルロン酸亜鉛会合体（錯体）を含んでいる、請求項１の医薬組成物。
【請求項３】
抗微生物活性を有する医薬組成物を調製する方法であって、活性成分としてのヒアルロン酸亜鉛会合体（錯体）またはヒアルロン酸コバルト会合体（錯体）を、医薬産業上一般に用いられる担体および／または他の添加剤と混合すること、およびこの混合物を、医薬組成物に加工することを含んでいる、前記方法。
【請求項４】
活性成分として、ヒアルロン酸亜鉛会合体（錯体）を使用することを含んでいる、請求項３の方法。
【請求項５】
抗微生物活性を有する医薬組成物を調製するために、ヒアルロン酸亜鉛会合体（錯体）またはヒアルロン酸コバルト会合体（錯体）を使用すること。
【請求項６】
抗微生物活性を有する医薬組成物を調製するために、ヒアルロン酸亜鉛会合体（錯体）を使用すること。
【請求項７】
細菌および真菌感染、並びにヘリコバクター・ピロリ誘発性の胃および十二指腸潰瘍を治療するために、ヒアルロン酸亜鉛会合体またはヒアルロン酸コバルト会合体を使用すること。
【請求項８】
細菌および真菌感染、並びにヘリコバクター・ピロリ誘発性の胃および十二指腸潰瘍を治療するために、ヒアルロン酸亜鉛会合体を使用すること。
【請求項９】
細菌および真菌感染、並びにヘリコバクター・ピロリ誘発性の胃および十二指腸潰瘍を治療する方法であって、治療される患者に、治療上有効である量のヒアルロン酸亜鉛会合体（錯体）またはヒアルロン酸コバルト会合体（錯体）を、単独で、または医薬組成物の形で投与することを含んでいる、前記方法。
【請求項１０】
細菌および真菌感染、並びにヘリコバクター・ピロリ誘発性の胃および十二指腸潰瘍を治療するための請求項９の方法であって、治療される患者に、１または複数回、有効な投与量のヒアルロン酸亜鉛会合体を、単独で、または医薬組成物の形で投与することを含んでいる、前記方法。
【請求項１１】
ヘリコバクター・ピロリ誘発性の胃および十二指腸潰瘍の治癒後に、再感染を予防するために、ヒアルロン酸亜鉛会合体（錯体）またはヒアルロン酸コバルト会合体（錯体）を使用することであって、１または複数回、有効な投与量のヒアルロン酸亜鉛会合体（錯体）またはヒアルロン酸コバルト会合体（錯体）を、単独で、または医薬組成物の形で投与することを含んでいる、前記の使用。
【請求項１２】
ヘリコバクター・ピロリ誘発性の胃および十二指腸潰瘍の治癒後に、再感染を予防するために、ヒアルロン酸亜鉛会合体（錯体）を使用することであって、１または複数回、有効な投与量のヒアルロン酸亜鉛会合体（錯体）を、単独で、または医薬組成物の形で投与することを含んでいる、前記の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸会合体（錯体）を含む抗微生物（anti-microbial）活性を有する医薬組成物、およびその調製方法に関する。
【０００２】
さらに本発明は、抗微生物活性を有する医薬組成物の調製において前記のヒアルロン酸会合体（錯体）を使用すること、および微生物誘発性の臨床像を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒアルロン酸会合体（錯体）、すなわちヒアルロン酸亜鉛およびヒアルロン酸コバルトは、抗微生物活性を有すること、特に、好気性および嫌気性微生物に対して、好ましい抗細菌（antibacterial）効果および殺真菌（fungicidal）効果を有することが明らかにされている。
【０００４】
ハンガリー国特許No.203,372には、脱プロトン化したヒアルロン酸と、周期表の第４周期の３ｄ金属イオンとの会合体、例えばヒアルロン酸亜鉛およびヒアルロン酸コバルトは、特に下腿の潰瘍またはじゅくそうなどに対する治療効果があることが記載されている。
【０００５】
ヒアルロン酸として知られている高分子は、通常ナトリウム塩の形で存在し、この化合物は、５０年に亘って知られている。これは、Meyer et al.によって、初めて報告された（非特許文献１、非特許文献２）。Meyerは、酸性条件で、このヒアルロン酸を単離した。しかし、生理学的なｐＨでは、そのカルボキシル基が解離していて、周囲の陽イオンがナトリウムの場合、この多糖は、ヒアルロン酸ナトリウムと呼ばれる。Weissman et al. によって、この構造が決定された（非特許文献３）。周囲の陽イオンの決定は、必ずしも単純ではないので、Balazの提案通りに、この多糖（ヒアルロン酸およびヒアルロン酸ナトリウム両方）の一般名はヒアルロナンとする（非特許文献４）。
【０００６】
ヒアルロン酸は、β１−４グルコサミン部分が交互に含まれる、高粘度の天然のグルコサミノグリカンである。この分子量は、５００００と数百万との間である。ヒアルロン酸は、全ての哺乳類の結合組織に見つかっていて、皮膚、眼の硝子体、滑液、さい帯、および軟骨組織では、より高濃度存在する。ヒアルロン酸の回収は、既に行われており、例えば特許文献１〜３には、超純粋なヒアルロン酸の分離および使用が記載されている。
【０００７】
ヒアルロン酸と傷の治癒との関係に関する参考文献が多数ある。Toole and Grossによれば、ヒアルロン酸は、細胞外マトリックスの主要成分であり、種々の型の細胞の移動の原因である（非特許文献５）。前記著者らは、実験調査から、傷の治癒の最中には、ヒアルロン酸の局所濃度が増加することによって、組織再生に必要な細胞反応が刺激されることを述べている。さらに別の実験から、ヒアルロン酸は、組織再生に参加する全細胞の移動と増殖にとって最適な状況を提供することによって、傷が治癒する生理学的な細胞反応を制御することが確認された。
【０００８】
昨年まで、治療（主に眼科学、皮膚科学、外科手術、関節の治療）および化粧品において、ヒアルロン酸は、ナトリウム塩として利用されていた。ヒアルロン酸と、アルカリ、アルカリ土類、マグネシウム、アルミニウム、アンモニウムおよび置換アンモニウムのイオ ンとの塩は、薬物の吸収を促進するための担体として機能することができる（特許文献４）。しかし、ヒアルロン酸と重金属との塩、特に銀との塩は、殺真菌剤として用いられ、一方、金との塩は、関節炎を治療するために用いられる（特許文献５）。しかし、銀および金の化合物による重度の逆効果、すなわち免疫系、造血器官および中枢神経系に対する影響が知られている（非特許文献６、７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第４，１４１，９７３号
【特許文献２】米国特許第４，３０３，６７６号
【特許文献３】欧州特許第０，１４４，０１９号
【特許文献４】ベルギー特許第９０４，５４７号
【特許文献５】国際公開第８７／０５５１７号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】J. Biol. Chem. 107, 629 (1934)
【非特許文献２】J. Biol. Chem. 114, 689 (1939)
【非特許文献３】J. Am. Chem. Soc. 76, 1753(1954)
【非特許文献４】The Biology of Hyaluronan 1989, John Wiley and Sons, Ciba Foundation Symposium, p.143
【非特許文献５】B. P. Toolees Gross: "The extracellular matrix of the generating newtlimb: synthesis and removal of hyaluronate prior to differentiation", Dev. Biol. 25, 55-57(1971)
【非特許文献６】M.Shinogi，S.Maeizumi: "Effect of preinduction of metallothionein on tissue distribution of silver and hepatic lipid peroxidation", Biol. Pharm. Bull (Japan) 16, 372-374 (1993)
【非特許文献７】C. Masson et al: Rev. Med. Interne (France) 13. 225-232 (1992)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、驚くことに次のことを見出した。ヒアルロン酸会合体、すなわちヒアルロン酸亜鉛およびヒアルロン酸コバルトは、上皮が欠落した身体表面での上皮形成の促進、下腿の潰瘍およびじゅくそうの潰瘍の治癒において有用であるが、これらは、有意な抗微生物効果、特に抗細菌および殺真菌効果を有し、さらに抗細菌活性の範囲内で、ヘリコバクター・ピロリ菌に対しても活性があることが判明した。この菌は、最近、胃および十二指腸の潰瘍の発症の原因であると考えられている。
【００１２】
ヒアルロン酸会合体の抗微生物効果は、驚くべきことである。なぜなら、これまで知られてきた、ヒアルロン酸会合体による、傷の治癒に関わる上皮形成促進効果は、傷の治癒において、ヒアルロン酸の身体への好ましい前記作用に基づいていると推測できるが、そこからヒアルロン酸会合体の抗微生物効果を推測することはできない。
【００１３】
本研究によれば、ヒアルロン酸の亜鉛およびコバルト会合体は、好気性細菌および嫌気性細菌、例えば黄色ブドウ球菌(Staphyloccus aureus)、ストレプトコッカス菌種(Streptococcus sp.)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ菌種(Salmonella sp.)、大腸菌(Escherichia coli)およびヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylory)のいずれに対しても、非常に活性があることが判明した。
【００１４】
黄色ブドウ球菌および緑膿菌は、眼感染症に関係する細菌の２つのタイプであるので、ヒアルロン酸塩錯体が、これらの両微生物に対して有効であるという事実は、非常に重要であり、そして眼科分野におけるヒアルロン酸会合体の利用には、特に展望があると思われる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
眼科分野では、眼内でのヒアルロン酸ナトリウムの使用が知られている。1980年以来、これは、白内障手術、人工レンズ移植、角膜移植の場合に広く用いられてきた。手術中に前眼房に投与する場合、これは、その崩壊(collpase)を抑制し、敏感な組織および細胞を保護する。手術後には、いくつかの疾患で発生する眼圧の増加を避けるために、眼からヒアルロン酸ナトリウムを洗い流す。
【００１６】
ヒアルロン酸ナトリウムは、「ドライアイ(dry eye)」症候群の治療にも利用されている（F. M. Polack et al: "The treatment of dry eyes with Na-hyaluronate", Cornea, 133-136 (1982)）。
【００１７】
本発明の会合体を利用する他の重要な分野には、眼感染症の局所的な抗細菌的治療がある。
【００１８】
ヒアルロン酸亜鉛およびヒアルロン酸コバルト会合体は、その抗細菌効果のおかげで、眼科分野の治療において特に有用と思われる。この分野では、主にヒアルロン酸亜鉛が、非常に有望であるようだ。眼科分野では、ヒアルロン酸亜鉛を、その潤滑効果に加えて、局所的な抗細菌剤として有効に用いることができる。
【００１９】
しかし、眼手術の場合にも、これを、１９８０年以来広く眼内に利用されているヒアルロン酸ナトリウムに匹敵するものとして、中程度の炎症反応を抑えるために（K. L. Goa et al: "Hyaluronic Acid，a Review of its Pharmacology and Use", Drugs 47, 536-566 (1994)）、および術中感染の危険性を減らすために、その抗細菌効果のおかげで、利用することができる。眼における必須微量要素としての亜鉛の役割が、長い間認識されてきた（D. A. Newsome, R. J. Rothman: "Zinc uptake in vitro by human retinal pigment epithelium", Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 28, 795-799 (1987)）。ヒアルロン酸亜鉛を使用する利点は、特に、眼手術中におそらく起こる亜鉛の減少を避けることができることである。すなわち、ポリアニオンとしてのヒアルロン酸は、術後の洗浄によってカチオンを運び去り得る。ヒアルロン酸に配位結合している亜鉛も眼中で減少する可能性を排除できない。この現象は、ヒアルロン酸亜鉛を使用することによって避けることができる。
【００２０】
眼における細菌の混入は、健康上の深刻な問題である。最も頻発する汚染菌は、スタフィロコッカス菌類である。それより頻度の低い汚染菌は、緑膿菌であり、これも眼にとって危険性が高い。これらの細菌が眼に感染すると、２４−４８時間内で、完全に失明する可能性がある。眼感染症は、しばしば、汚染した眼科分野の溶液（点眼剤、またはコンタクトレンズの保存液など）によって起こる。この様な眼科分野の溶液の汚染は、診察室、診療所、および、非常に頻発に家庭内の使用に際して、発生する。最も頻発に混入する微生物は、スタフィロコッカス菌類に属するが、頻度は低いが、危険度がより高い緑膿菌もまた、眼科分野の溶液中で急速に増殖し得る(Remington's Opthalmic Preservatives，Chapter 86, 1588)。従って、眼科分野におけるヒアルロン酸亜鉛およびヒアルロン酸コバルト会合体の使用は、前記の両微生物種に対する強力な活性の点から、非常に重要であるだろう。
【実施例】
【００２１】
微生物実験から、前記化合物の抗微生物効果を確認した。ハンガリー特許第２０３，３７２号に従って調製した、ヒアルロン酸亜鉛溶液およびヒアルロン酸コバルト溶液を用いて実験した。ヒアルロン酸ナトリウムを参考溶液として用いた。
【００２２】
以下の実施例１では、０．５％ヒアルロン酸亜鉛溶液の調製を記す。特に明記しない場合、以後、パーセンテージは、常時、重量／容積の値である。
【００２３】
０．１％または０．２％濃度溶液は、各々、実施例に記載した品質の蒸留水によって、０．５％ヒアルロン酸亜鉛溶液を希釈して得た。
【００２４】
実施例１「０．５％ヒアルロン酸亜鉛溶液１００ｍｌの調製」
本溶液の調製に用いたヒアルロン酸ナトリウムの特性は以下の通りである。
【００２５】
分子量：                                １００００００ダルトン
タンパク質含有量：                      ０．０４５％
紫外線吸光度：Ａ（１％，２５７ｎｍ）：  ０．０８５
Ａ（１％，２８０ｎｍ）：  ０．０５０
粘度：                                  η（Ｃ→０，２５℃）＝１７．２５ｄｌ／ｇ
ヒアルロン酸含有量：                    ９９．３％
以後の操作は、無菌状態で行う。
【００２６】
１００ｍｌフラスコ内に、ヒアルロン酸ナトリウム０．５０ｇを加えた後、２回蒸留水（注入用水、パイロジェン非含有、無菌）で調製した塩化亜鉛溶液（０．１０ｍｏｌ／リットル）１２．５０ｍｌを追加した。それから２回蒸留水で容量を５０ｍｌに調整した。これを一晩膨潤させ、撹拌して溶解し、そして２回蒸留水で最終容量に調整した。この溶液をポアサイズ０．４５μｍの膜フィルターで濾過して、０．５％ヒアルロン酸亜鉛溶液とした。
【００２７】
実施例２「０．５％ヒアルロン酸ナトリウム溶液の調製」
実施例１で用いたヒアルロン酸ナトリウム０．５０ｇを、前記の２回蒸留水（注入用水、パイロジェン非含有、無菌）１００ｍｌ中に溶解して、０．５％ヒアルロン酸ナトリウム溶液とした。０．１％または０．２％溶液は、各々、前記品質の蒸留水によって０．５％溶液を希釈して得た。
【００２８】
実験１
０．２％のヒアルロン酸亜鉛溶液およびヒアルロン酸ナトリウム溶液（実施例１および２の０．５％溶液を希釈して得た）に、同一数量の種々のテスト微生物を人工的に感染させ、そして微生物数の時間変化を測定した。微生物数は、ある時点において、プレーティング法によって決定した。計数は、糸状菌（moulds）の場合は、視覚的に行い、細菌および真菌の場合、コロニー自動計測器を用いて行った。
【００２９】
使用培地：  ダイズ−カゼイン・アガー (Caso-agar/Merck)
National Starin Collection of National Institute of Public Health(HNCMB)に登録された微生物を、テスト生物として用いた。
【００３０】
使用微生物：  黄色ブドウ球菌
ストレプトコッカス菌種
大腸菌
サルモネラ菌種
カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)
アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)
【００３１】
テスト生物の初期数：Σ１０6／ｍｌ
平行実験数：        ３
使用溶液：  １：    ０．２％ヒアルロン酸亜鉛水溶液
２：    ０．２％ヒアルロン酸ナトリウム水溶液
これらの結果を表１および２に示す。
【００３２】
【表１】
2009114206.tif 000002
【００３３】
【表２】
2009114206.tif 000003
【００３４】
表１および２に要約した前記の結果から、２４時間後に、抗微生物効果の本質的な差が現れたことがわかる。０．２％ヒアルロン酸亜鉛溶液は、テストした多くの生物で、数桁の減少を誘導したが、ヒアルロン酸ナトリウム溶液中では、テスト生物数は有意に変化しなかった。
【００３５】
実験２
ヒアルロン酸亜鉛の抗微生物効果を実証するために、さらに、０．２％以外の濃度の溶液を用いて、テスト時間を様々に延長して実験を行った。３つの顕著なテスト生物に対する、０．１％のヒアルロン酸亜鉛およびヒアルロン酸ナトリウム溶液の各効果を表３に示す。
【００３６】
【表３】
2009114206.tif 000004
【００３７】
ヒアルロン酸亜鉛を用いた実験から、テストした黄色ブドウ球菌およびサルモネラ菌の数は、４８時間以内に、実際上０まで減少することがわかったが、ヒアルロン酸ナトリウムを用いた実験の結果では、それらの数は、実際上同じ桁数で維持された。緑膿菌の場合、効果の発現が遅いことが認められ、有意な減少は２日目からのみ出現した。
【００３８】
実験３
眼科分野における緑膿菌の重要性を考えて、緑膿菌に対する、種々の濃度のヒアルロン酸亜鉛溶液の効果を、同濃度のヒアルロン酸ナトリウムと比較して実験した。この結果を表４および５に要約する。
【００３９】
【表４】
2009114206.tif 000005
【００４０】
【表５】
2009114206.tif 000006
【００４１】
表に示した結果から、有利な現象が明らかにされた。すなわち、ヒアルロン酸亜鉛溶液は、明らかにヒアルロン酸ナトリウム溶液より効果的であり、しかも０．１％のヒアルロン酸亜鉛は、０．２％または０．５％のヒアルロン酸亜鉛溶液の場合と同じ活性を既に示す。この結果に基づいて、有効な外用組成剤を開発することができる。
【００４２】
ヒアルロン酸コバルト（II）の抗細菌効果も調べた。ヒアルロン酸コバルト溶液の調製を実施例３に記す。
【００４３】
実施例３「０．１％ヒアルロン酸コバルト溶液の調製」
１００ｍｌフラスコ内に、実施例１のヒアルロン酸ナトリウム０．１０ｇを加えた後、２回蒸留水（注入用水、パイロジェン非含有、無菌）で調製した塩化コバルト溶液（０．１０ｍｏｌ／リットル）２．５０ｍｌを追加した。それから２回蒸留水で容量を５０ｍｌに調整した。これを一晩膨潤させ、撹拌して溶解し、そして２回蒸留水で最終容量に調整した。この溶液を、ポアサイズ０．４５μｍの膜フィルターで濾過して、０．１％濃度のヒアルロン酸コバルト溶液とした。
【００４４】
実験４
微生物実験を、前記載と同様に行った。ただし、サルモネラ菌種の代わりに大腸菌を用いた。この結果を表６に要約する。
【００４５】
【表６】
2009114206.tif 000007
【００４６】
表６の前記の結果から、テストした両生物に対して、ヒアルロン酸コバルト溶液は、ヒアルロン酸亜鉛溶液と同様な活性を示すことが明らかである。一方、比較したヒアルロン酸ナトリウム溶液は、測定方法の偏差を考慮すると、ここでも活性を示さなかった。
【００４７】
実験５
ヒアルロン酸亜鉛会合体の抗細菌効果を、最小阻害濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）および最小殺微生物濃度（micro bicidal concentration）（ＣＩＤ）によって、ヒアルロン酸ナトリウムの対応する値と比較して、評価することができる。
【００４８】
０．２％濃度溶液を用いて、ＭＩＣ値およびＣＩＤ値を決定した。この測定は、既知の方法で行った。テストする物質を連続的に希釈した溶液を調製し、これらの溶液に、選択したテスト生物の対応希釈液を人工的に感染させた。適当な温度で適当な時間培養した後、一連の濃度の対象について、視覚的に計数し、微生物の増殖を阻害する最小濃度（ＭＩＣ値）、または微生物の死滅を誘導する最小濃度（ＣＩＤ値）を決定した。この結果を表７に要約する。
【００４９】
【表７】
2009114206.tif 000008
【００５０】
０．２％ヒアルロン酸ナトリウム溶液は、濃度が２０００μｇ／ｍｌの時でさえ、いかなるテスト生物に対しても阻害効果を発揮しなかった。従って、ＭＩＣ値を決定できなかった。
【００５１】
前記の表７から、ヒアルロン酸亜鉛のＭＩＣ値は、本化合物の考慮すべき（かなり良い）微生物効果を示し、そしてヒアルロン酸ナトリウムの値より数桁良い。
【００５２】
実験６
眼科分野において、ヒアルロン酸会合体を将来有効に利用するためには、組成物の微生物安定性が良いこと、すなわち種々の微生物感染に対する適当な抵抗性が必要である。眼科分野において通常用いられるヒアルロン酸ナトリウムに比べて、ヒアルロン酸亜鉛およびヒアルロン酸コバルト溶液の微生物安定性を決定するために、広範な研究を行った。任意の保存剤を用いて、ヒアルロン酸亜鉛を含む溶液を保存する必要があるか否かに関しても研究した。
【００５３】
これらの研究は、USP XXII Edition (p.1478)“Antimicrobial preservativ eseffectiveness”の記載に従って行った。この実験の原理は次の通りである。テストする物質に、種々のテスト生物を人工的に感染させ、そしてコロニー形成単位数の経時変化を観察した。ＨＮＣＭＢに登録された微生物を、テスト生物として用いた。保存剤の存在下または非存在下に、種々の濃度のヒアルロン酸亜鉛およびヒアルロン酸ナトリウム溶液を用いて、実験を行った。
【００５４】
プレーティング（plate-moulding）法によって、サンプルのコロニー形成単位数（微生物数）を決定した。この計数は、細菌および真菌の場合、コロニー自動計数器を用い、または糸状菌の場合、視覚的に行った。
【００５５】
これらの結果を以下の表に示す。各結果は、３つの平行サンプルの平均値を、コロニー数／ｍｌで表す。
【００５６】
【表８】
2009114206.tif 000009
【００５７】
【表９】
2009114206.tif 000010
【００５８】
【表１０】
2009114206.tif 000011
【００５９】
【表１１】
2009114206.tif 000012
【００６０】
【表１２】
2009114206.tif 000013
【００６１】
ＵＳＰ XXIIに記載された必要条件および一般的な必要条件に従えば、人工的な感染によって導入された細菌数が１４日間で９９％減少する場合、１４日間でもテスト生物が増殖しないで、さらに任意のテスト生物の一時的な増殖が実験２８日間に認められない場合に、物質は適切に保存されていると言える。
【００６２】
実験の結果から次のことが言える。
【００６３】
１．用いた５つの微生物の内、４生物（黄色ブドウ球菌、緑膿菌、大腸菌、カンジダ・アルビカンス）は、必要とされる死滅の条件を満たすだけでなく、２８日目に採取したサンプル内に、生きている微生物を検出することはなかった。このことから、０．１％ヒアルロン酸亜鉛溶液の微生物安定性は、USP XXIIの必要条件を満たす。アスペルギルス・ニガーの経過は規則正しく、２桁の減少を示した。
【００６４】
２．０．２％ヒアルロン酸亜鉛溶液の微生物安定性は、０．１％ヒアルロン酸亜鉛溶液の安定性と同程度であるので、これは、ＵＳＰ XXIIの必要条件を満たす。
【００６５】
３．０．５％ヒアルロン酸亜鉛溶液の微生物安定性は、予想通りに、ＵＳＰ XXIIの必要条件を満たす。実際、実験結果は、ヒアルロン酸亜鉛濃度が増加すると、安定性が増すことを示している。
【００６６】
４．０．５％ヒアルロン酸亜鉛および０．１％ソルビン酸カリウムを含んだ溶液の安定性は十分であるが、保存剤ソルビン酸カリウムによって、大きく（有意に）改善されない。
【００６７】
５．０．１％ソルビン酸カリウムを含んだ０．５％ヒアルロン酸ナトリウム溶液は、テストした各微生物の場合、ＵＳＰ XXIIの必要条件を満たす。
【００６８】
これらの結果から、非常に重要な結論が導かれる。すなわち、ヒアルロン酸亜鉛溶液に、保存剤は全く必要でなく、逆に、ヒアルロン酸ナトリウムは、保存剤が含有されてさえも、ヒアルロン酸亜鉛溶液の場合より低い安定性を示す。ヒアルロン酸ナトリウム溶液には、無条件に保存剤が必要である。なぜなら、そうでなければ、この溶液は容易に感染するからである。
【００６９】
保存済は、しばしばアレルギーを誘発する効果があるので、これを除去することから、ヒアルロン酸亜鉛の利用は、特に眼科分野において非常に望ましい。このことを認識することは、非常に重要である。
【００７０】
実験７  ヒアルロン酸コバルトの微生物安定性の特性を表１３に示す。
【００７１】
【表１３】
2009114206.tif 000014
【００７２】
この表から、緑膿菌に対して、０．１％ヒアルロン酸コバルト溶液の微生物安定性は、０．１％ヒアルロン酸亜鉛溶液の場合と同程度に良いことがわかる。
【００７３】
この効果は、接種後ほぼ直ぐに起こることがわかる。72時間の実験終了後に、無菌性の実験を行ったところ、テストした細菌に対するヒアルロン酸コバルトの効果は、その特徴において静菌効果ではなく、殺菌効果であることが結論された。
【００７４】
眼科分野および皮膚科分野における外用の組成剤の調製を、以下の実施例に記す。
【００７５】
実施例４「ヒアルロン酸亜鉛を含んだ点眼剤」
「０．１％ヒアルロン酸亜鉛を含んだ点眼剤１００ｍｌの調製」
【００７６】
点眼剤の調製には実施例１のヒアルロン酸ナトリウムを用いた。
１００ｍｌフラスコ内に、純粋粉末のヒアルロン酸ナトリウム０．１０ｇを加えた後、塩化亜鉛溶液（０．１０ｍｏｌ／リットル）１．８７ｍｌ、およびソルビトール溶液（１．００ｍｏｌ／リットル）２７．５０ｍｌを追加した（２回蒸留水を用いて、これらの溶液を調製した）。それから２回蒸留水で容量を５０ｍｌに調整した。これを一晩膨潤させ、撹拌して溶解し、そして２回蒸留水で最終容量に調整した。最後に、この溶液を膜フィルター（ポアサイズ０．４５μｍ）で濾過した。
【００７７】
実施例５「ヒアルロン酸亜鉛を含んだ皮膚科分野の組成剤」
「０．２％ヒアルロン酸亜鉛を含んだゲル形剤１００ｇの調製」
ゲル形剤の調製に用いたヒアルロン酸ナトリウムの特性
分子量：                                  ８０００００ダルトン
タンパク質含有量：                        ０．０９４％
紫外線吸光度：  Ａ（１％，２５７ｎｍ）：  ０．３２０
Ａ（１％，２８０ｎｍ）：  ０．２４０
粘度：                                    η（Ｃ→０，２５℃）＝１４．５ｄｌ／ｇ
ヒアルロン酸含有量：                      ９５．２％
【００７８】
０．２ｇのヒアルロン酸ナトリウムを約３０ｍｌの蒸留水に溶かした後に、０．１Ｍ塩化亜鉛溶液５．０ｍｌを加えた。
Carbopol934ゲル化剤１．０ｇを、蒸留水４０ｍｌに混合し、１〜１．５時間撹拌し続けた。
１０〜１２時間膨潤させた後に、２０％水酸化ナトリウム溶液１ｍｌを加えた。
前もって調製したヒアルロン酸亜鉛溶液を、ポアサイズ０．４５μｍのフィルターで濾過した。これを、撹拌しながらゲルに加え、蒸留水で１００ｇに調整した。
【００７９】
表８〜１２で示した安定性の実験から、ヒアルロン酸亜鉛は、真菌および糸状菌種に対して、良い結果が得られていることから、これは、抗細菌効果だけではなく、有意に抗真菌効果も有することがわかる。
【００８０】
実験８
ヘリコバクター・ピロリ菌に対する、本化合物の効果も、同様に非常に重要である。この効果から、本化合物は、胃および十二指腸潰瘍の発症を治療または予防する際に、および主にその治癒後の再感染の予防に、有用である。
【００８１】
ヘリコバクター・ピロリ菌に対する効果の研究を行った。１．０％ヒアルロン酸亜鉛溶液を用いて、種々の潰瘍の患者から生検した胃のサンプルから培養されたヘリコバクター・ピロリ菌に対する実験を行った。参考物質として、１％Ｄｅ−Ｎｏｌ溶液（コロイド状次クエン酸ビスマス）を用いた。実験には、１０％ウシ血液を補充したアガー培養液（栄養培地）を用いた。対照プレートとして、テストする化合物を含まないプレートを用いた。接種したプレートを、３−５日間、３７℃で、５％酸素および７−８％二酸化炭素を含んだ気相環境下に培養した。物質のＭＩＣ値とは、対照プレート上で良く増殖する細菌の増殖を完全に阻害する最小濃度を意味する。
【００８２】
テストした菌株に対して各々測定した、ヒアルロン酸亜鉛およびDe-NolのＭＩＣ値を表14に示す。
【００８３】
【表１４】
2009114206.tif 000015
【００８４】
この表の結果から、ヘリコバクター・ピロリに対する、ヒアルロン酸亜鉛のインビトロ活性は、本治療に用いられるDe-Nolの活性に匹敵することが明らかである。この事実は、考慮するに値する。なぜならDe-Nolは、ビスマス含有組成剤であり、無視できない副作用を有するが（毒性問題、さらにその摂取は、患者にとって不愉快である）、ヒアルロン酸亜鉛を用いる場合、この様な副作用は、おそらく予想されることはないからである。