(57)【要約】      （修正有）【課題】正常人と慢性肝炎、肝硬変、肝がん患者において存在の有無、存在量が異なるタンパク質およびその部分ペプチドを用いて慢性肝炎、肝硬変、肝がんを検出する方法、ならびに該タンパク質および部分ペプチドからなる慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別診断のためのバイオマーカーの提供。【解決手段】特定ののタンパク質からなる群および、これらのタンパク質の部分ペプチドであるアミノ酸配列からなる部分ペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質またはタンパク質から生じるアミノ酸残基５個以上のペプチド断片からなる慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別診断のためのバイオマーカー、ならび分別診断方法および、特定分別診断方法で用いるペプチド特異抗体を作成するための抗原ペプチド。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるHypothetical protein、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるNeuropeptide Y receptor type 1、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるPromyelocytic leukemia zinc finger、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるMicrotubule-associated protein 1A、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるComplement C3 precursor、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるHistone deacetylase 8、配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-1-antitrypsin
precursor、配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるChromosome 10 open
reading frame 76、配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるRearranged
immunoglobulin heavy chain variable region、配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるF-box/LRR-repeat protein 8、配列番号２１で表されるアミノ酸配列からなるImmunoglobulin lambda light chain variable region、配列番号２３で表されるアミノ酸配列からなるIg gamma-1 chain C region、配列番号２５で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-2-macroglobulin precursor、配列番号２７で表されるアミノ酸配列からなるRho/rac guanine nucleotide exchange factor 2、配列番号３１で表されるアミノ酸配列からなるPutative GTP-binding protein Parf、配列番号３３で表されるアミノ酸配列からなるIg lambda chain C regions、配列番号３５で表されるアミノ酸配列からなるZinc finger protein ZIC 1、配列番号３７で表されるアミノ酸配列からなるNeuroserpin precursor、配列番号３９で表されるアミノ酸配列からなるUbiquitin-conjugating
enzyme E2 U、配列番号４１で表されるアミノ酸配列からなるHemoglobin subunit
alpha、配列番号４３で表されるアミノ酸配列からなるSerum albumin precursor、配列番号４５で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-2-HS-glycoprotein precursor、配列番号４７で表されるアミノ酸配列からなるlymphocyte-specific protein 1、配列番号４９で表されるアミノ酸配列からなるApolipoprotein M、配列番号５１で表されるアミノ酸配列からなるBrefeldin
A-inhibited guanine nucleotide-exchange protein 3、配列番号５３で表されるアミノ酸配列からなるPlasma retinol-binding protein precursor、配列番号５５で表されるアミノ酸配列からなるInter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain precursor、配列番号５７で表されるアミノ酸配列からなるGMP reductase 1、配列番号５９で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-2-antiplasmin
precursor、配列番号６１で表されるアミノ酸配列からなるIg gamma-2 chain C
region、配列番号６４で表されるアミノ酸配列からなるSerotransferrin precursor、配列番号６７で表されるアミノ酸配列からなるHemopexin precursor、配列番号６９で表されるアミノ酸配列からなるGelsolin
precursor、配列番号７１で表されるアミノ酸配列からなるHistidine-rich
glycoprotein precursor、配列番号７３で表されるアミノ酸配列からなるComplement
factor I precursor、配列番号７５で表されるアミノ酸配列からなるApolipoprotein
A-I precursorからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質ないしペプチドまたは該タンパク質ないし該ペプチドから生じるアミノ酸残基５個以上のペプチド断片からなる慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別診断のためのバイオマーカー。
【請求項２】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるHypothetical proteinの部分ペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるNeuropeptide Y receptor type 1の部分ペプチド、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるPromyelocytic leukemia zinc fingerの部分ペプチド、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるMicrotubule-associated protein 1Aの部分ペプチド、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるComplement C3 precursorの部分ペプチド、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるHistone deacetylase 8の部分ペプチド、配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-1-antitrypsin precursorの部分ペプチド、配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるChromosome 10 open reading frame 76の部分ペプチド、配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなるRearranged immunoglobulin heavy chain variable regionの部分ペプチド、配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなるF-box/LRR-repeat protein 8の部分ペプチド、配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるImmunoglobulin lambda light chain variable regionの部分ペプチド、配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなるIg gamma-1 chain C regionの部分ペプチド、配列番号２６で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-2-macroglobulin precursorの部分ペプチド、配列番号２８で表されるアミノ酸配列からなるRho/rac guanine nucleotide exchange factor 2の部分ペプチド、配列番号２９で表されるアミノ酸配列からなるComplement C3 precursorの部分ペプチド、配列番号３０で表されるアミノ酸配列からなるIg gamma-1 chain C regionの部分ペプチド、配列番号３２で表されるアミノ酸配列からなるPutative GTP-binding protein Parfの部分ペプチド、配列番号３４で表されるアミノ酸配列からなるIg lambda chain C regionsの部分ペプチド、配列番号３６で表されるアミノ酸配列からなるZinc finger protein ZIC 1の部分ペプチド、配列番号３８で表されるアミノ酸配列からなるNeuroserpinの部分ペプチド、配列番号４０で表されるアミノ酸配列からなるUbiquitin-conjugating
enzyme E2 Uの部分ペプチド、配列番号４２で表されるアミノ酸配列からなるHemoglobin
subunit alphaの部分ペプチド、配列番号４４で表されるアミノ酸配列からなるSerum albumin
precursorの部分ペプチド、配列番号４６で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-2-HS-glycoprotein
precursorの部分ペプチド、配列番号４８で表されるアミノ酸配列からなるlymphocyte-specific
protein 1の部分ペプチド、配列番号５０で表されるアミノ酸配列からなるApolipoprotein Mの部分ペプチド、配列番号５２で表されるアミノ酸配列からなるBrefeldin A-inhibited guanine nucleotide-exchange protein 3の部分ペプチド、配列番号５４で表されるアミノ酸配列からなるPlasma retinol-binding protein precursorの部分ペプチド、配列番号５６で表されるアミノ酸配列からなるInter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain precursorの部分ペプチド、配列番号５８で表されるアミノ酸配列からなるGMP reductase 1の部分ペプチド、配列番号６０で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-2-antiplasmin
precursorの部分ペプチド、配列番号６２で表されるアミノ酸配列からなるIg gamma-2 chain
C regionの部分ペプチド、配列番号６３で表されるアミノ酸配列からなるIg gamma-1 chain C
regionの部分ペプチド、配列番号６５で表されるアミノ酸配列からなるSerotransferrin
precursorの部分ペプチド、配列番号６６で表されるアミノ酸配列からなるSerotransferrin
precursorの部分ペプチド、配列番号６８で表されるアミノ酸配列からなるHemopexin
precursorの部分ペプチド、配列番号７０で表されるアミノ酸配列からなるGelsolin
precursorの部分ペプチド、配列番号７２で表されるアミノ酸配列からなるHistidine-rich
glycoprotein precursorの部分ペプチド、配列番号７４で表されるアミノ酸配列からなるComplement
factor I precursorの部分ペプチド、配列番号７６で表されるアミノ酸配列からなるApolipoprotein
A-I precursorの部分ペプチド、配列番号７７で表されるアミノ酸配列からなるComplement C3
precursorの部分ペプチド、配列番号７８で表されるアミノ酸配列からなるSerotransferrin
precursorの部分ペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのペプチドからなる慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別診断のためのバイオマーカー。
【請求項３】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、２９および３０からなる群から選択される配列番号で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、肝がん患者生体試料中において、肝炎患者生体試料中と比較し出現または増加する肝がんバイオマーカー。
【請求項４】
配列番号４、２８、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２および６３からなる群から選択される配列番号で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、肝がん患者生体試料中において、肝硬変患者生体試料中と比較し出現または増加する肝がんバイオマーカー。
【請求項５】
配列番号４、６５および６６からなる群から選択される配列番号で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、肝がん患者生体試料中において、肝炎患者および肝硬変患者生体試料中と比較し出現または増加する肝がんバイオマーカー。
【請求項６】
配列番号６８、７０、７２、７４、７６、７７および７８からなる群から選択される配列番号で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、肝がん患者生体試料中において、肝炎患者および肝硬変患者生体試料中と比較し消失または減少する肝がんバイオマーカー。
【請求項７】
生体試料中の請求項１〜６のいずれか１項に記載の少なくとも１つのバイオマーカーを測定することを含む、慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別検出方法。
【請求項８】
生体試料中の請求項３記載の少なくとも１つの肝がんバイオマーカーを測定し、該バイオマーカーが肝炎患者と比較して多く存在する場合に、肝がんに罹患していると判断する肝がんの検出方法。
【請求項９】
生体試料中の請求項４記載の少なくとも１つの肝がんバイオマーカーを測定し、該バイオマーカーが肝硬変患者と比較して多く存在する場合に、肝がんに罹患していると判断する肝がんの検出方法。
【請求項１０】
生体試料中の請求項５記載の少なくとも１つの肝がんバイオマーカーを測定し、該バイオマーカーが肝炎患者または肝硬変患者と比較して多く存在する場合に、肝がんに罹患していると判断する肝がんの検出方法。
【請求項１１】
生体試料中の請求項６記載の少なくとも１つの肝がんバイオマーカーを測定し、該バイオマーカーが肝炎患者または肝硬変患者と比較して少なく存在する場合に、肝がんに罹患していると判断する肝がんの検出方法。
【請求項１２】
検出が酵素もしくは蛍光標識抗体法または質量分析法により行われる請求項７に記載の慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別検出方法。
【請求項１３】
検出が酵素もしくは蛍光標識抗体法または質量分析法により行われる請求項８〜１１に記載の肝がんの検出方法。
【請求項１４】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、２９、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６３、６５、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７７および７８からなる群から選択される配列番号で表されるアミノ酸配列からなるペプチド群の少なくとも１つを測定するための慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別検出キット。
【請求項１５】
配列番号１〜７８からなる群から選択される配列番号で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質ないしペプチドまたは該タンパク質ないし該ペプチドから生じるアミノ酸残基５個以上のペプチド断片の少なくとも１つに対する抗体もしくはアプタマーを含む慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別検出キット。
【請求項１６】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、２９、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６３、６５、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７７および７８からなる群から選択される配列番号で表されるアミノ酸配列からなるペプチド群の少なくとも１つに対する抗体もしくはアプタマーを含む慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別検出キット。
【請求項１７】
抗体またはアプタマーがビーズまたは基板上に固相化されている請求項１５または１６に記載の検出キット。
【請求項１８】
配列番号１〜７８からなる群から選択される配列番号で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質ないしペプチドまたは該タンパク質ないし該ペプチドから生じるアミノ酸残基５個以上のペプチド断片の少なくとも１つに対する抗体もしくはアプタマーが固相化されたビーズまたは基板を用いて、対応するタンパク質またはペプチドを沈降せしめ、該タンパク質または該ペプチドの質量数を測定することによって、慢性肝炎、肝硬変、肝がんを分別診断する方法。
【請求項１９】
配列番号１〜７８からなる群から選択される配列番号で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質ないしペプチドまたは該タンパク質ないし該ペプチドから生じるアミノ酸残基５個以上のペプチド断片の少なくとも１つに対する抗体もしくはアプタマーが固相化されたビーズまたは基板を用いて、対応するタンパク質またはペプチドを沈降せしめ、該タンパク質または該ペプチドの質量数を測定することによって、慢性肝炎、肝硬変、肝がんを分別診断するキット。
【請求項２０】
配列番号１〜７８からなる群から選択される配列番号で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質ないしペプチドまたは該タンパク質ないし該ペプチドから生じるアミノ酸残基５個以上のペプチド断片の少なくとも１つをバイオマーカーとして用いる慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別検出方法であって、生体試料中の該タンパク質および／または該ペプチドおよび／または該ペプチド断片の種類、存在量および／または存在比を測定し、タンパク質／ペプチド／ペプチド断片の組み合わせに基づくプロファイルを得ることを含む、慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別診断方法。
【請求項２１】
配列番号７９で表されるアミノ酸配列からなるHypothetical proteinの部分ペプチド、配列番号８０で表されるアミノ酸配列からなるNeuropeptide Y receptor type 1の部分ペプチド、配列番号８１で表されるアミノ酸配列からなるNeuropeptide Y receptor type 1の部分ペプチド、配列番号８２で表されるアミノ酸配列からなるNeuropeptide Y receptor type 1の部分ペプチド、配列番号８３で表されるアミノ酸配列からなるMicrotubule-associated protein 1Aの部分ペプチド、配列番号８４で表されるアミノ酸配列からなるChromosome 10 open reading frame 76の部分ペプチド、配列番号８５で表されるアミノ酸配列からなるF-box/LRR-repeat protein 8の部分ペプチド、配列番号８６で表されるアミノ酸配列からなるRho/rac guanine nucleotide exchange factor 2の部分ペプチド、配列番号８７で表されるアミノ酸配列からなるPutative GTP-binding protein Parfの部分ペプチド、配列番号８８で表されるアミノ酸配列からなるZinc finger protein ZIC 1の部分ペプチド、配列番号８９で表されるアミノ酸配列からなるInter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain precursorの部分ペプチド、配列番号９０で表されるアミノ酸配列からなるInter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain precursorの部分ペプチド、配列番号９１で表されるアミノ酸配列からなるGMP reductase 1の部分ペプチドからなる群から選択される少なくとも一つの部分ペプチドないし該部分ペプチドから生じるアミノ酸残基５個以上のペプチド断片であって、配列番号１、２、３、４、７、８、１５、１６、１９、２０、２７、２８、３１、３２、３５、３６、５５、５６、５７、５８からなる群から選択される少なくとも一つのタンパク質ないしペプチドまたは該タンパク質ないし該ペプチドから生じるアミノ酸残基５個以上のペプチド断片を特異的に認識する抗体もしくはアプタマーを作成するための抗原ペプチド。
【請求項２２】
アミノ酸配列上同一のタンパク質ないしタンパク質断片でありながら翻訳後修飾によってpI値の異なるアイソフォームが存在する場合に、生体試料について二次元電気泳動を行い、そのアミノ酸配列の一部に対する抗体を用いて、これらのアイソフォームを分別検出することを特徴とする肝炎、肝硬変、肝がんの分別診断方法。
【請求項２３】
請求項２２において、翻訳後修飾が糖鎖付加である慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別診断方法。
【請求項２４】
請求項２２において、タンパク質ないしタンパク質断片が配列番号５５ないし５６で表されるアミノ酸配列の全部または一部分からなる慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別診断方法。
【請求項２５】
請求項２４において、電気泳動後pI値が最小の領域にあって肝がん患者のみに検出される一個から四個のうちの少なくとも一個のスポットを検出することからなる肝がんの診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別診断に用い得る新規なペプチドバイオマーカーおよび該ペプチドバイオマーカーを用いた慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体の正常と正常以外の状態を呈する試料を用いてその差違を判別する手段としては、一般的には体外診断薬において用いられてきた技術が主たる従来技術である。体外診断薬のうち最も多いのが、血液中の成分をバイオマーカーとして分析することで診断検査を行うものである。本分野における従来技術では、血液中の単独の特定のタンパク質または分子量１万以下のいわゆるペプチドの存在量、あるいは酵素タンパク質の場合は活性の測定を行って、正常（正常人）試料と疾患試料との明らかな差をもって診断の一助としてきた。すなわちあらかじめ一定数の正常人と疾患患者由来の試料における単独もしくは複数の特定のタンパク質またはペプチドの量もしくは活性量を計測し、異常値と正常値の範囲を決め、評価する試料を同様の方法で測定し、異常値と正常値のどちらの範囲に属するかによって検査評価を行うものである。
【０００３】
具体的な計測方法としては、試料をそのまま、またはあらかじめ希釈しておき、単独または複数の特定のタンパク質またはペプチドの量を、基質と反応させると発色する酵素によって標識された特異的１次抗体または２次抗体を用いて、試料の発色量で計測する酵素結合免疫吸着測定法（ELISA; enzyme linked immmunosorbent assay）や化学発光測定法（CLIA; chemiluminescent immunoassay）と１次抗体または２次抗体に結合させたラジオアイソトープを用いて計測する放射性免疫測定法（RIA; radioimmunoassay）、タンパク質が酵素の場合は直接基質を与えて産生物を発色などで計測する酵素活性測定法などがある。また酵素の基質分解産物を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で分析する方法もある。
【０００４】
肝がん検出（診断）のためのマーカーとして、従来よりAFP（αフェトプロテイン）、PIVKA II（非特許文献１参照）、KM-2（非特許文献２参照）、CA125（非特許文献３参照）等が用いられていた。しかしながら、これらのマーカーは肝がんに特異性や陽性率が十分でなく、信頼できるマーカーとはいえなかった。とくに、慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別診断に用いることができるマーカーは存在しなかった。
【０００５】
また、これらの肝がんに対するマーカーも含めて従来のバイオマーカーの計測ターゲットは分解などを受けていないタンパク質（以下インタクトなタンパク質）であった。
【０００６】
分解産物を計測する検査方法として、唯一アルツハイマー病におけるアミロイドベータタンパク質の難溶性分解産物であるAβ42がある。これはアルツハイマー病の発症要因のひとつと考えられている難溶性Aβ42を脳脊髄液や血液中で計測する検査方法（特許文献１参照）である。ここでタンパク質の分解とは細胞内で起こるプロセシングやタンパク質の寿命による分解を主とするペプチド断片生成を伴うタンパク質の構造変化とし、タンパク質の消化分解とはこれに加えて細胞外でおこるペプチド断片を生ずるタンパク質分解を含めたものと定義する。
【０００７】
臨床における体外診断薬として質量分析を用いた計測はまだ行われていないが、研究レベルでは国内外でタンパク質のディファレンシャル解析技術としてタンパク質の質量分析が広く用いられている。もともと従来のタンパク質発現解析技術として二次元電気泳動法が広く用いられてきた。しかしタンパク質や１万以下の分子量のペプチドは検出感度が十分でないため、最近では生体試料をカラムクロマトグラフィーによって分画し、その画分に含まれるタンパク質とペプチドを質量分析によって分析する手法がある。またカラムクロマトグラフィーではなく、前処理としてプロテインチップを用いて質量分析する方法や、前処理として磁気ビーズを用いて質量分析する方法がある。またインタクトなタンパク質の解析を目的としてトリプシンなどで限定加水分解した後、上記の方法で質量分析まで行う方法も報告されている（特許文献２参照）。しかしいずれもインタクトなタンパク質の性質を利用して、そのまま分画し、または特異的に吸着するタンパク質分子を選別して質量分析で解析するものである。
【０００８】
【特許文献１】特開平07-51096号公報
【特許文献２】特開2004-333274号公報
【非特許文献１】Fujiyama S.ら、Cancer 61、 pp1621-1628 (1988)
【非特許文献２】Kumagai Y.等、Cancer Res. 52、 pp4987-4994 (1992)
【非特許文献３】Elias J.等、 Int.J. Cancer 46、 pp805-807 (1990)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、正常人と肝疾患患者および慢性肝炎、肝硬変、肝がん患者間において存在の有無、存在量が異なるタンパク質およびその部分ペプチドないしペプチド断片を用いて肝がんを検出する方法を提供し、さらに該部分ペプチドないしペプチド断片からなる慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別診断のためのバイオマーカーの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、慢性肝炎、肝硬変、肝がんを分別診断する方法について鋭意検討を行い、正常人においてインタクトなタンパク質として存在するタンパク質がこのような肝疾患患者において、転写または翻訳合成の低下を引き起こすように制御され、または消化分解され種々の消化分解産物ペプチドとして部分ペプチドないしペプチド断片を生成し、またはタンパク質の翻訳合成においてスプライシング異常等により、部分ペプチドないしペプチド断片として翻訳合成されることを見出した。さらに、本発明者は、慢性肝炎、肝硬変、肝がんなどの肝疾患の進行とともに消化分解または翻訳合成されるタンパク質の種類や生成する部分ペプチドの種類や量が変動することを見出した。特に本発明者は、特定のタンパク質の部分ペプチドないしペプチド断片が正常人では検出されず特定の肝疾患患者において特異的に検出され、また正常人のみで検出され肝疾患患者では検出されないことを見出した。本発明者らは、生体から得た生体試料中のこれらのタンパク質および部分ペプチドないしペプチド断片の種類および量を測定することにより、肝がんを含む肝疾患を正確に検出（診断）することができ、かつ肝疾患間を分別し、肝がんの進行度等を評価することができることを見出した。
【００１１】
具体的には、本発明者は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるHypothetical
protein、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるNeuropeptide Y receptor
type 1、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるPromyelocytic leukemia zinc
finger、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるMicrotubule-associated
protein 1A、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるComplement C3 precursor、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるHistone deacetylase 8、配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-1-antitrypsin
precursor、配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるChromosome 10 open
reading frame 76、配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるRearranged
immunoglobulin heavy chain variable region、配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるF-box/LRR-repeat protein 8、配列番号２１で表されるアミノ酸配列からなるImmunoglobulin lambda light chain variable region、配列番号２３で表されるアミノ酸配列からなるIg gamma-1 chain C region、配列番号２５で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-2-macroglobulin precursor、配列番号２７で表されるアミノ酸配列からなるRho/rac guanine nucleotide exchange factor 2、配列番号３１で表されるアミノ酸配列からなるPutative GTP-binding protein Parf、配列番号３３で表されるアミノ酸配列からなるIg lambda chain C regions、配列番号３５で表されるアミノ酸配列からなるZinc finger protein ZIC 1、配列番号３７で表されるアミノ酸配列からなるNeuroserpin precursor、配列番号３９で表されるアミノ酸配列からなるUbiquitin-conjugating
enzyme E2 U、配列番号４１で表されるアミノ酸配列からなるHemoglobin subunit
alpha、配列番号４３で表されるアミノ酸配列からなるSerum albumin precursor、配列番号４５で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-2-HS-glycoprotein precursor、配列番号４７で表されるアミノ酸配列からなるlymphocyte-specific protein 1、配列番号４９で表されるアミノ酸配列からなるApolipoprotein M、配列番号５１で表されるアミノ酸配列からなるBrefeldin
A-inhibited guanine nucleotide-exchange protein 3、配列番号５３で表されるアミノ酸配列からなるPlasma retinol-binding protein precursorの部分ペプチド、配列番号５５で表されるアミノ酸配列からなるInter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain precursor、配列番号５７で表されるアミノ酸配列からなるGMP reductase 1、配列番号５９で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-2-antiplasmin
precursor、配列番号６１で表されるアミノ酸配列からなるIg gamma-2 chain C region、配列番号６４で表されるアミノ酸配列からなるSerotransferrin precursor、配列番号６７で表されるアミノ酸配列からなるHemopexin precursor、配列番号６９で表されるアミノ酸配列からなるGelsolin
precursor、配列番号７１で表されるアミノ酸配列からなるHistidine-rich
glycoprotein precursor、配列番号７３で表されるアミノ酸配列からなるComplement
factor I precursor、配列番号７５で表されるアミノ酸配列からなるApolipoprotein
A-I precursorからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質ないしペプチドまたは該タンパク質ないし該ペプチドから生じるアミノ酸残基５個以上のペプチド断片からなる慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別診断のためのバイオマーカーとして用い得ることを見出した。
【００１２】
さらに、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるHypothetical proteinの部分ペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるNeuropeptide Y receptor type 1の部分ペプチド、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるPromyelocytic leukemia zinc fingerの部分ペプチド、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるMicrotubule-associated protein 1Aの部分ペプチド、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるComplement C3 precursorの部分ペプチド、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるHistone deacetylase 8の部分ペプチド、配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-1-antitrypsin precursorの部分ペプチド、配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるChromosome 10 open reading frame 76の部分ペプチド、配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなるRearranged immunoglobulin heavy chain variable regionの部分ペプチド、配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなるF-box/LRR-repeat protein 8の部分ペプチド、配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるImmunoglobulin lambda light chain variable regionの部分ペプチド、配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなるIg gamma-1 chain C regionの部分ペプチド、配列番号２６で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-2-macroglobulin precursorの部分ペプチド、配列番号２８で表されるアミノ酸配列からなるRho/rac guanine nucleotide exchange factor 2の部分ペプチド、配列番号２９で表されるアミノ酸配列からなるComplement C3 precursorの部分ペプチド、配列番号３０で表されるアミノ酸配列からなるIg gamma-1 chain C regionの部分ペプチド、配列番号３２で表されるアミノ酸配列からなるPutative GTP-binding protein Parfの部分ペプチド、配列番号３４で表されるアミノ酸配列からなるIg lambda chain C regionsの部分ペプチド、配列番号３６で表されるアミノ酸配列からなるZinc finger protein ZIC 1の部分ペプチド、配列番号３８で表されるアミノ酸配列からなるNeuroserpinの部分ペプチド、配列番号４０で表されるアミノ酸配列からなるUbiquitin-conjugating
enzyme E2 Uの部分ペプチド、配列番号４２で表されるアミノ酸配列からなるHemoglobin
subunit alphaの部分ペプチド、配列番号４４で表されるアミノ酸配列からなるSerum albumin
precursorの部分ペプチド、配列番号４６で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-2-HS-glycoprotein
precursorの部分ペプチド、配列番号４８で表されるアミノ酸配列からなるlymphocyte-specific
protein 1の部分ペプチド、配列番号５０で表されるアミノ酸配列からなるApolipoprotein Mの部分ペプチド、配列番号５２で表されるアミノ酸配列からなるBrefeldin A-inhibited guanine nucleotide-exchange protein 3の部分ペプチド、配列番号５４で表されるアミノ酸配列からなるPlasma retinol-binding protein precursorの部分ペプチド、配列番号５６で表されるアミノ酸配列からなるInter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain precursorの部分ペプチド、配列番号５８で表されるアミノ酸配列からなるGMP reductase 1の部分ペプチド、配列番号６０で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-2-antiplasmin
precursorの部分ペプチド、配列番号６２で表されるアミノ酸配列からなるIg gamma-2 chain
C regionの部分ペプチド、配列番号６３で表されるアミノ酸配列からなるIg gamma-1 chain C
regionの部分ペプチド、配列番号６５で表されるアミノ酸配列からなるSerotransferrin
precursorの部分ペプチド、配列番号６６で表されるアミノ酸配列からなるSerotransferrin
precursorの部分ペプチド、配列番号６８で表されるアミノ酸配列からなるHemopexin
precursorの部分ペプチド、配列番号７０で表されるアミノ酸配列からなるGelsolin
precursorの部分ペプチド、配列番号７２で表されるアミノ酸配列からなるHistidine-rich
glycoprotein precursorの部分ペプチド、配列番号７４で表されるアミノ酸配列からなるComplement
factor I precursorの部分ペプチド、配列番号７６で表されるアミノ酸配列からなるApolipoprotein
A-I precursorの部分ペプチド、配列番号７７で表されるアミノ酸配列からなるComplement C3
precursorの部分ペプチド、配列番号７８で表されるアミノ酸配列からなるSerotransferrin
precursorの部分ペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのペプチドからなる慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別診断のためのバイオマーカーとして用い得ることを見出した。
【００１３】
本発明者らは、さらに、これらのタンパク質や消化分解産物ペプチド等の部分ペプチドないしペプチド断片を酵素免疫吸着測定法や質量分析法を用いることにより、一度に多数のタンパク質および消化分解産物ペプチド等の部分ペプチドないしペプチド断片を測定することに成功し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち、本発明の態様は以下のとおりである。
[１]    配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるHypothetical
protein、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるNeuropeptide Y receptor
type 1、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるPromyelocytic leukemia zinc
finger、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるMicrotubule-associated
protein 1A、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるComplement C3 precursor、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるHistone deacetylase 8、配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-1-antitrypsin
precursor、配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるChromosome 10 open
reading frame 76、配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるRearranged
immunoglobulin heavy chain variable region、配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるF-box/LRR-repeat protein 8、配列番号２１で表されるアミノ酸配列からなるImmunoglobulin lambda light chain variable region、配列番号２３で表されるアミノ酸配列からなるIg gamma-1 chain C region、配列番号２５で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-2-macroglobulin precursor、配列番号２７で表されるアミノ酸配列からなるRho/rac guanine nucleotide exchange factor 2、配列番号３１で表されるアミノ酸配列からなるPutative GTP-binding protein Parf、配列番号３３で表されるアミノ酸配列からなるIg lambda chain C regions、配列番号３５で表されるアミノ酸配列からなるZinc finger protein ZIC 1、配列番号３７で表されるアミノ酸配列からなるNeuroserpin precursor、配列番号３９で表されるアミノ酸配列からなるUbiquitin-conjugating
enzyme E2 U、配列番号４１で表されるアミノ酸配列からなるHemoglobin subunit
alpha、配列番号４３で表されるアミノ酸配列からなるSerum albumin precursor、配列番号４５で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-2-HS-glycoprotein precursor、配列番号４７で表されるアミノ酸配列からなるlymphocyte-specific protein 1、配列番号４９で表されるアミノ酸配列からなるApolipoprotein M、配列番号５１で表されるアミノ酸配列からなるBrefeldin
A-inhibited guanine nucleotide-exchange protein 3、配列番号５３で表されるアミノ酸配列からなるPlasma retinol-binding protein precursor、配列番号５５で表されるアミノ酸配列からなるInter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain precursor、配列番号５７で表されるアミノ酸配列からなるGMP reductase 1、配列番号５９で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-2-antiplasmin
precursor、配列番号６１で表されるアミノ酸配列からなるIg gamma-2 chain C
region、配列番号６４で表されるアミノ酸配列からなるSerotransferrin precursor、配列番号６７で表されるアミノ酸配列からなるHemopexin precursor、配列番号６９で表されるアミノ酸配列からなるGelsolin
precursor、配列番号７１で表されるアミノ酸配列からなるHistidine-rich
glycoprotein precursor、配列番号７３で表されるアミノ酸配列からなるComplement
factor I precursor、配列番号７５で表されるアミノ酸配列からなるApolipoprotein
A-I precursorからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質ないしペプチドまたは該タンパク質ないし該ペプチドから生じるアミノ酸残基５個以上のペプチド断片からなる慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別診断のためのバイオマーカー。
[２]    配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるHypothetical
proteinの部分ペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるNeuropeptide Y
receptor type 1の部分ペプチド、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるPromyelocytic
leukemia zinc fingerの部分ペプチド、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるMicrotubule-associated
protein 1Aの部分ペプチド、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるComplement C3 precursorの部分ペプチド、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるHistone deacetylase 8の部分ペプチド、配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-1-antitrypsin precursorの部分ペプチド、配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるChromosome 10 open reading frame 76の部分ペプチド、配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなるRearranged immunoglobulin heavy chain variable regionの部分ペプチド、配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなるF-box/LRR-repeat protein 8の部分ペプチド、配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるImmunoglobulin lambda light chain variable regionの部分ペプチド、配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなるIg gamma-1 chain C regionの部分ペプチド、配列番号２６で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-2-macroglobulin precursorの部分ペプチド、配列番号２８で表されるアミノ酸配列からなるRho/rac guanine nucleotide exchange factor 2の部分ペプチド、配列番号２９で表されるアミノ酸配列からなるComplement C3 precursorの部分ペプチド、配列番号３０で表されるアミノ酸配列からなるIg gamma-1 chain C regionの部分ペプチド、配列番号３２で表されるアミノ酸配列からなるPutative GTP-binding protein Parfの部分ペプチド、配列番号３４で表されるアミノ酸配列からなるIg lambda chain C regionsの部分ペプチド、配列番号３６で表されるアミノ酸配列からなるZinc finger protein ZIC 1の部分ペプチド、配列番号３８で表されるアミノ酸配列からなるNeuroserpinの部分ペプチド、配列番号４０で表されるアミノ酸配列からなるUbiquitin-conjugating
enzyme E2 Uの部分ペプチド、配列番号４２で表されるアミノ酸配列からなるHemoglobin
subunit alphaの部分ペプチド、配列番号４４で表されるアミノ酸配列からなるSerum albumin
precursorの部分ペプチド、配列番号４６で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-2-HS-glycoprotein
precursorの部分ペプチド、配列番号４８で表されるアミノ酸配列からなるlymphocyte-specific
protein 1の部分ペプチド、配列番号５０で表されるアミノ酸配列からなるApolipoprotein Mの部分ペプチド、配列番号５２で表されるアミノ酸配列からなるBrefeldin A-inhibited guanine nucleotide-exchange protein 3の部分ペプチド、配列番号５４で表されるアミノ酸配列からなるPlasma retinol-binding protein precursor、配列番号５６で表されるアミノ酸配列からなるInter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain precursorの部分ペプチド、配列番号５８で表されるアミノ酸配列からなるGMP reductase 1の部分ペプチド、配列番号６０で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-2-antiplasmin
precursorの部分ペプチド、配列番号６２で表されるアミノ酸配列からなるIg gamma-2 chain
C regionの部分ペプチド、配列番号６３で表されるアミノ酸配列からなるIg gamma-1 chain C
regionの部分ペプチド、配列番号６５で表されるアミノ酸配列からなるSerotransferrin
precursorの部分ペプチド、配列番号６６で表されるアミノ酸配列からなるSerotransferrin
precursorの部分ペプチド、配列番号６８で表されるアミノ酸配列からなるHemopexin
precursorの部分ペプチド、配列番号７０で表されるアミノ酸配列からなるGelsolin
precursorの部分ペプチド、配列番号７２で表されるアミノ酸配列からなるHistidine-rich
glycoprotein precursorの部分ペプチド、配列番号７４で表されるアミノ酸配列からなるComplement
factor I precursorの部分ペプチド、配列番号７６で表されるアミノ酸配列からなるApolipoprotein
A-I precursorの部分ペプチド、配列番号７７で表されるアミノ酸配列からなるComplement C3
precursorの部分ペプチド、配列番号７８で表されるアミノ酸配列からなるSerotransferrin
precursorの部分ペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのペプチドからなる慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別診断のためのバイオマーカー。
【００１５】
[３]    配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、２９および３０からなる群から選択される配列番号で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、肝がん患者生体試料中において、肝炎患者生体試料中と比較し出現または増加する肝がんバイオマーカー。
[４]    配列番号４、２８、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２および６３からなる群から選択される配列番号で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、肝がん患者生体試料中において、肝硬変患者生体試料中と比較し出現または増加する肝がんバイオマーカー。
【００１６】
[５]    配列番号４、６５および６６からなる群から選択される配列番号で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、肝がん患者生体試料中において、肝炎患者および肝硬変患者生体試料中と比較し出現または増加する肝がんバイオマーカー。
[６]    配列番号６８、７０、７２、７４、７６、７７および７８からなる群から選択される配列番号で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、肝がん患者生体試料中において、肝炎患者および肝硬変患者生体試料中と比較し消失または減少する肝がんバイオマーカー。
【００１７】
[７]    生体試料中の[１]〜[６]のいずれか１項に記載の少なくとも１つの肝がんバイオマーカーを測定することを含む、慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別検出方法。
[８]    生体試料中の[３]記載の少なくとも１つの肝がんバイオマーカーを測定し、該バイオマーカーが肝炎患者と比較して多く存在する場合に、肝がんに罹患していると判断する肝がんの検出方法。
【００１８】
[９]    生体試料中の[４]記載の少なくとも１つの肝がんバイオマーカーを測定し、該バイオマーカーが肝硬変患者と比較して多く存在する場合に、肝がんに罹患していると判断する肝がんの検出方法。
[１０]    生体試料中の[５]記載の少なくとも１つの肝がんバイオマーカーを測定し、該バイオマーカーが肝炎患者または肝硬変患者と比較して多く存在する場合に、肝がんに罹患していると判断する肝がんの検出方法。
【００１９】
[１１]    生体試料中の[６]記載の少なくとも１つの肝がんバイオマーカーを測定し、該バイオマーカーが肝炎患者または肝硬変患者と比較して少なく存在する場合に、肝がんに罹患していると判断する肝がんの検出方法。
[１２]    検出が酵素もしくは蛍光標識抗体法または質量分析法により行われる[７]に記載の慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別検出方法。
【００２０】
[１３]    検出が酵素もしくは蛍光標識抗体法または質量分析法により行われる[８]〜[１１]に記載の肝がんの検出方法。
[１４]    配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、２９、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６３、６５、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７７および７８からなる群から選択される配列番号で表されるアミノ酸配列からなるペプチド群の少なくとも１つを測定するための慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別検出キット。
【００２１】
[１５]    配列番号１〜７８からなる群から選択される配列番号で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質ないしペプチドまたは該タンパク質ないし該ペプチドから生じるアミノ酸残基５個以上のペプチド断片の少なくとも１つに対する抗体もしくはアプタマーを含む慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別検出キット。
[１６]    配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、２９、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６３、６５、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７７および７８からなる群から選択される配列番号で表されるアミノ酸配列からなるペプチド群の少なくとも１つに対する抗体もしくはアプタマーを含む慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別検出キット。
【００２２】
[１７]    抗体またはアプタマーがビーズまたは基板上に固相化されている[１５]または[１６]に記載の検出キット。
[１８]    配列番号１〜７８からなる群から選択される配列番号で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質ないしペプチドまたは該タンパク質ないし該ペプチドから生じるアミノ酸残基５個以上のペプチド断片の少なくとも１つに対する抗体もしくはアプタマーが固相化されたビーズまたは基板を用いて、対応するタンパク質またはペプチドを沈降せしめ、該タンパク質または該ペプチドの質量数を測定することによって、慢性肝炎、肝硬変、肝がんを分別診断する方法。
【００２３】
[１９]    配列番号１〜７８からなる群から選択される配列番号で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質ないしペプチドまたは該タンパク質ないし該ペプチドから生じるアミノ酸残基５個以上のペプチド断片の少なくとも１つに対する抗体もしくはアプタマーが固相化されたビーズまたは基板を用いて、対応するタンパク質またはペプチドを沈降せしめ、該タンパク質または該ペプチドの質量数を測定することによって、慢性肝炎、肝硬変、肝がんを分別診断するキット。
[２０]    配列番号１〜７８からなる群から選択される配列番号で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質ないしペプチドまたは該タンパク質ないし該ペプチドから生じるアミノ酸残基５個以上のペプチド断片の少なくとも１つをバイオマーカーとして用いる慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別検出方法であって、生体試料中の該タンパク質および／または該ペプチドおよび／または該ペプチド断片の種類、存在量および／または存在比を測定し、タンパク質／ペプチド／ペプチド断片の組み合わせに基づくプロファイルを得ることを含む、慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別診断方法。
【００２４】
[２１]    配列番号７９で表されるアミノ酸配列からなるHypothetical proteinの部分ペプチド、配列番号８０で表されるアミノ酸配列からなるNeuropeptide Y receptor type 1の部分ペプチド、配列番号８１で表されるアミノ酸配列からなるNeuropeptide Y receptor type 1の部分ペプチド、配列番号８２で表されるアミノ酸配列からなるNeuropeptide Y receptor type 1の部分ペプチド、配列番号８３で表されるアミノ酸配列からなるMicrotubule-associated protein 1Aの部分ペプチド、配列番号８４で表されるアミノ酸配列からなるChromosome 10 open reading frame 76の部分ペプチド、配列番号８５で表されるアミノ酸配列からなるF-box/LRR-repeat protein 8の部分ペプチド、配列番号８６で表されるアミノ酸配列からなるRho/rac guanine nucleotide exchange factor 2の部分ペプチド、配列番号８７で表されるアミノ酸配列からなるPutative GTP-binding protein Parfの部分ペプチド、配列番号８８で表されるアミノ酸配列からなるZinc finger protein ZIC 1の部分ペプチド、配列番号８９で表されるアミノ酸配列からなるInter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain precursorの部分ペプチド、配列番号９０で表されるアミノ酸配列からなるInter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain precursorの部分ペプチド、配列番号９１で表されるアミノ酸配列からなるGMP reductase 1の部分ペプチドからなる、配列番号１、２、３、４、７、８、９、１０、１５、１６、１９、２０、２７、２８、３１、３２、３５、３６、５５、５６、５７、５８のタンパク質またはペプチドバイオマーカーを特異的に認識する抗体もしくはアプタマーを作成するためのペプチド。
[２２]    アミノ酸配列上同一のタンパク質ないしタンパク質断片でありながら翻訳後修飾によってpI値の異なる分子種が存在する場合に、生体試料について.二次元電気泳動を行い、そのアミノ酸配列の一部に対する抗体を用いて、これらの分子種を分別検出することを特徴とする慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別診断方法。
【００２５】
[２３]    [２２]において、翻訳後修飾が糖鎖付加である慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別診断方法。
[２４]    [２３]において、タンパク質ないしタンパク質断片が配列番号５６で表されるアミノ酸配列の全部または一部分からなる慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別診断方法。
[２５]    [２４]において、電気泳動後pI値が最小の一個ないし二個のスポットを検出することからなる肝がんの診断方法。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、被験者由来の生体試料中の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるHypothetical
protein、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるNeuropeptide Y receptor
type 1、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるPromyelocytic leukemia zinc
finger、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるMicrotubule-associated
protein 1A、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるComplement C3 precursor、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるHistone deacetylase 8、配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-1-antitrypsin
precursor、配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるChromosome 10 open
reading frame 76、配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるRearranged
immunoglobulin heavy chain variable region、配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるF-box/LRR-repeat protein 8、配列番号２１で表されるアミノ酸配列からなるImmunoglobulin lambda light chain variable region、配列番号２３で表されるアミノ酸配列からなるIg gamma-1 chain C region、配列番号２５で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-2-macroglobulin precursor、配列番号２７で表されるアミノ酸配列からなるRho/rac guanine nucleotide exchange factor 2、配列番号３１で表されるアミノ酸配列からなるPutative GTP-binding protein Parf、配列番号３３で表されるアミノ酸配列からなるIg lambda chain C regions、配列番号３５で表されるアミノ酸配列からなるZinc finger protein ZIC 1、配列番号３７で表されるアミノ酸配列からなるNeuroserpin precursor、配列番号３９で表されるアミノ酸配列からなるUbiquitin-conjugating
enzyme E2 U、配列番号４１で表されるアミノ酸配列からなるHemoglobin subunit
alpha、配列番号４３で表されるアミノ酸配列からなるSerum albumin precursor、配列番号４５で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-2-HS-glycoprotein precursor、配列番号４７で表されるアミノ酸配列からなるlymphocyte-specific protein 1、配列番号４９で表されるアミノ酸配列からなるApolipoprotein M、配列番号５１で表されるアミノ酸配列からなるBrefeldin
A-inhibited guanine nucleotide-exchange protein 3、配列番号５３で表されるアミノ酸配列からなるPlasma retinol-binding protein precursorの部分ペプチド、配列番号５５で表されるアミノ酸配列からなるInter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain precursor、配列番号５７で表されるアミノ酸配列からなるGMP reductase 1、配列番号５９で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-2-antiplasmin
precursor、配列番号６１で表されるアミノ酸配列からなるIg gamma-2 chain C
region、配列番号６４で表されるアミノ酸配列からなるSerotransferrin precursor、配列番号６７で表されるアミノ酸配列からなるHemopexin precursor、配列番号６９で表されるアミノ酸配列からなるGelsolin
precursor、配列番号７１で表されるアミノ酸配列からなるHistidine-rich
glycoprotein precursor、配列番号７３で表されるアミノ酸配列からなるComplement
factor I precursor、配列番号７５で表されるアミノ酸配列からなるApolipoprotein
A-I precursorからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質ないしペプチドまたは該タンパク質ないし該ペプチドから生じるアミノ酸残基５個以上のペプチド断片および／または配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるHypothetical proteinの部分ペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるNeuropeptide Y receptor type 1の部分ペプチド、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるPromyelocytic leukemia zinc fingerの部分ペプチド、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるMicrotubule-associated protein 1Aの部分ペプチド、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるComplement C3 precursorの部分ペプチド、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるHistone deacetylase 8の部分ペプチド、配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-1-antitrypsin precursorの部分ペプチド、配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるChromosome 10 open reading frame 76の部分ペプチド、配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなるRearranged immunoglobulin heavy chain variable regionの部分ペプチド、配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなるF-box/LRR-repeat protein 8の部分ペプチド、配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるImmunoglobulin lambda light chain variable regionの部分ペプチド、配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなるIg gamma-1 chain C regionの部分ペプチド、配列番号２６で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-2-macroglobulin precursorの部分ペプチド、配列番号２８で表されるアミノ酸配列からなるRho/rac guanine nucleotide exchange factor 2の部分ペプチド、配列番号２９で表されるアミノ酸配列からなるComplement C3 precursorの部分ペプチド、配列番号３０で表されるアミノ酸配列からなるIg gamma-1 chain C regionの部分ペプチド、配列番号３２で表されるアミノ酸配列からなるPutative GTP-binding protein Parfの部分ペプチド、配列番号３４で表されるアミノ酸配列からなるIg lambda chain C regionsの部分ペプチド、配列番号３６で表されるアミノ酸配列からなるZinc finger protein ZIC 1の部分ペプチド、配列番号３８で表されるアミノ酸配列からなるNeuroserpinの部分ペプチド、配列番号４０で表されるアミノ酸配列からなるUbiquitin-conjugating
enzyme E2 Uの部分ペプチド、配列番号４２で表されるアミノ酸配列からなるHemoglobin
subunit alphaの部分ペプチド、配列番号４４で表されるアミノ酸配列からなるSerum albumin
precursorの部分ペプチド、配列番号４６で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-2-HS-glycoprotein
precursorの部分ペプチド、配列番号４８で表されるアミノ酸配列からなるlymphocyte-specific
protein 1の部分ペプチド、配列番号５０で表されるアミノ酸配列からなるApolipoprotein Mの部分ペプチド、配列番号５２で表されるアミノ酸配列からなるBrefeldin A-inhibited guanine nucleotide-exchange protein 3の部分ペプチド、配列番号５４で表されるアミノ酸配列からなるPlasma retinol-binding protein precursor、配列番号５６で表されるアミノ酸配列からなるInter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain precursorの部分ペプチド、配列番号５８で表されるアミノ酸配列からなるGMP reductase 1の部分ペプチド、配列番号６０で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-2-antiplasmin
precursorの部分ペプチド、配列番号６２で表されるアミノ酸配列からなるIg gamma-2 chain
C regionの部分ペプチド、配列番号６３で表されるアミノ酸配列からなるIg gamma-1 chain C
regionの部分ペプチド、配列番号６５で表されるアミノ酸配列からなるSerotransferrin
precursorの部分ペプチド、配列番号６６で表されるアミノ酸配列からなるSerotransferrin
precursorの部分ペプチド、配列番号６８で表されるアミノ酸配列からなるHemopexin
precursorの部分ペプチド、配列番号７０で表されるアミノ酸配列からなるGelsolin
precursorの部分ペプチド、配列番号７２で表されるアミノ酸配列からなるHistidine-rich
glycoprotein precursorの部分ペプチド、配列番号７４で表されるアミノ酸配列からなるComplement
factor I precursorの部分ペプチド、配列番号７６で表されるアミノ酸配列からなるApolipoprotein
A-I precursorの部分ペプチド、配列番号７７で表されるアミノ酸配列からなるComplement C3
precursorの部分ペプチド、配列番号７８で表されるアミノ酸配列からなるSerotransferrin
precursorの部分ペプチドからなる群から選択される該タンパク質の少なくとも１つの消化分解産物ペプチド等の部分ペプチドないしペプチド断片の種類および量を計測することにより、被験者が慢性肝炎、肝硬変、肝がんに罹患しているかを分別して診断することができる。また、肝疾患、とくに肝がんの進行度がどの程度かも診断することができる。
【００２７】
本発明は、また精度および特異性の両方が極めて高い診断システムを提供する。本発明によって精度の高い診断がはじめて可能になる。また、本発明によって、慢性肝炎、肝硬変、肝がん間の分別診断ができるので肝がんの早期診断が可能になる。さらに、本発明のバイオマーカーは、薬剤効果判定においても有用性が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明は、被験者の生体内において正常状態ではインタクトなタンパク質として存在するが、生体が肝がんに罹患している状態では該インタクトなタンパク質の部分ペプチドないしペプチド断片が生じるとき、インタクトなタンパク質および／またはその部分ペプチドないしペプチド断片の種類および量を検出すると同時に、インタクトなタンパク質とその部分ペプチドないしペプチド断片の種類と量の変動を測定することにより被験者が肝がんを含む肝疾患に罹患しているか、とくに肝がんに罹患している場合の肝がんの進行度を診断する方法である。ここで、ペプチドは一般的には分子量１万以下のアミノ酸が連結したものをいい、あるいはアミノ酸残基の数としては数個から50個以下程度のものをいう。本発明においては、インタクトなタンパク質の部分ペプチドを肝がん検出のためのバイオマーカーとして用い得るが、部分ペプチドという場合、インタクトなタンパク質の有するアミノ酸配列の一部の部分的アミノ酸配列を有するペプチドであって分子量１万以下のものをいう。部分ペプチドのうち、アミノ酸残基数が5以上20以下のものをとくにペプチド断片という。本発明において、インタクトなタンパク質の部分ペプチドとは、インタクトなタンパク質の有するアミノ酸配列の一部の部分的アミノ酸配列を有するペプチドをいい、転写・翻訳による発現合成過程で部分ペプチドとして生成する場合と、インタクトなタンパク質として合成された後に、生体内で消化分解を受けて消化分解産物ペプチドとして生成する場合がある。この原因としては、生体が肝がん等の正常以外の状態にあるときに、タンパク質の合成および制御機構が脱制御されることが挙げられる。また、慢性肝炎、肝硬変、肝がんと病態が進行するに従って、このタンパク質の合成および制御機構の脱制御はことなる場合が挙げられる。すなわち、本発明は、生体内のタンパク質の発現合成および／または消化分解を指標として被験者が正常状態であるか肝がんに罹患しているかを判別し、また肝がんに罹患している場合の肝がんの進行度をも評価判別する方法でもある。さらには慢性肝炎、肝硬変の被験者の場合は、それぞれの疾患への罹患の有無とともに肝がんへの進行を評価判別する方法でもある。本発明において、肝がんの検出とは、被験者が肝がんに罹患しているかどうか評価判別、すなわち診断を行うことをいう。また、被験者が肝がんに罹患するリスクの決定等も含む。
【００２９】
本発明の方法において、慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別診断のためのバイオマーカーとして用い得るインタクトなタンパク質として、具体的には、Hypothetical protein（配列番号１）、Neuropeptide Y
receptor type 1（配列番号３）、Promyelocytic leukemia zinc
finger（配列番号５）、Microtubule-associated protein 1A（配列番号７）、Complement C3 precursor（配列番号９）、Histone
deacetylase 8（配列番号１１）、Alpha-1-antitrypsin precursor（配列番号１３）、Chromosome 10 open reading frame 76（配列番号１５）、Rearranged
immunoglobulin heavy chain variable region（配列番号１７）、F-box/LRR-repeat
protein 8（配列番号１９）、Immunoglobulin lambda light chain
variable region（配列番号２１）、Ig gamma-1 chain C region（配列番号２３）、Alpha-2-macroglobulin precursor（配列番号２５）、Rho/rac
guanine nucleotide exchange factor 2（配列番号２７）、Putative
GTP-binding protein Parf（配列番号３１）、Ig lambda chain C
regions（配列番号３３）、Zinc finger protein ZIC 1（配列番号３５）、Neuroserpin precursor（配列番号３７）、Ubiquitin-conjugating
enzyme E2 U（配列番号３９）、Hemoglobin subunit alpha（配列番号４１）、Serum albumin precursor（配列番号４３）、Alpha-2-HS-glycoprotein
precursor（配列番号４５）、lymphocyte-specific protein 1（配列番号４７）、Apolipoprotein M（配列番号４９）、Brefeldin
A-inhibited guanine nucleotide-exchange protein 3（配列番号５１）、Plasma retinol-binding protein precursor（配列番号５３）、Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain precursor（配列番号５５）、GMP reductase 1（配列番号５７）、Alpha-2-antiplasmin
precursor（配列番号５９）、Ig gamma-2 chain C region（配列番号６１）、Serotransferrin precursor（配列番号６４）、Hemopexin
precursor（配列番号６７）、Gelsolin precursor（配列番号６９）、Histidine-rich glycoprotein precursor（配列番号７１）、Complement factor I precursor（配列番号７３）およびApolipoprotein
A-I precursor（配列番号７５）が挙げられ、アミノ酸残基５個以上のペプチド断片も同じ目的に用い得る。
【００３０】
また、とくに慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別診断のためのバイオマーカーとして用い得るこれらの部分ペプチドとして、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、２９、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６３、６５、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７７および７８で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、２９、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６３、６５、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７７および７８で表されるペプチドは、それぞれHypothetical protein（配列番号１）、Neuropeptide Y
receptor type 1（配列番号３）、Promyelocytic leukemia zinc
finger（配列番号５）、Microtubule-associated protein 1A（配列番号７）、Complement C3 precursor（配列番号９）、Histone
deacetylase 8（配列番号１１）、Alpha-1-antitrypsin precursor（配列番号１３）、Chromosome 10 open reading frame 76（配列番号１５）、Rearranged
immunoglobulin heavy chain variable region（配列番号１７）、F-box/LRR-repeat
protein 8（配列番号１９）、Immunoglobulin lambda light chain
variable region（配列番号２１）、Ig gamma-1 chain C region（配列番号２３）、Alpha-2-macroglobulin precursor（配列番号２５）、Rho/rac
guanine nucleotide exchange factor 2（配列番号２７）、Putative
GTP-binding protein Parf（配列番号３１）、Ig lambda chain C regions（配列番号３３）、Zinc finger protein ZIC 1（配列番号３５）、Neuroserpin
precursor（配列番号３７）、Ubiquitin-conjugating enzyme E2 U（配列番号３９）、Hemoglobin subunit alpha（配列番号４１）、Serum
albumin precursor（配列番号４３）、Alpha-2-HS-glycoprotein
precursor（配列番号４５）、lymphocyte-specific protein 1（配列番号４７）、Apolipoprotein M（配列番号４９）、Brefeldin
A-inhibited guanine nucleotide-exchange protein 3（配列番号５１）、Plasma retinol-binding protein precursor（配列番号５３）、Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain precursor（配列番号５５）、GMP reductase 1（配列番号５７）、Alpha-2-antiplasmin
precursor（配列番号５９）、Ig gamma-2 chain C region（配列番号６１）、Serotransferrin precursor（配列番号６４）、Hemopexin
precursor（配列番号６７）、Gelsolin precursor（配列番号６９）、Histidine-rich glycoprotein precursor（配列番号７１）、Complement factor I precursor（配列番号７３）およびApolipoprotein
A-I precursor（配列番号７５）の部分ペプチドである。本発明においては、上記のインタクトなタンパク質および部分ペプチドをマーカーとして用いるが、配列番号１〜７８に表されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加したアミノ酸配列からなるタンパク質およびペプチドないしペプチド断片も含み、これらのタンパク質またはペプチドないしペプチド断片も本発明の方法においてバイオマーカーとして用いることができる。ここで、「１個または数個」とは「1個または３個」、「１個または２個」または「１個」をいう。
【００３１】
以下の記載において、特定のペプチドの検出可能なレベルでの存在の有無を記述する場合において、検出可能なレベルとは異なる肝疾患患者間での分別を可能にする閾値を意味する。上記ペプチド中、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、２９および３０で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、肝炎患者には検出可能なレベルで存在しないが、肝がん患者では検出可能なレベルで存在するペプチドである。また、配列番号４、２８、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２および６３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、肝硬変患者には検出可能なレベルで存在しないが、肝がん患者では検出可能なレベルで存在するペプチドである。前者のペプチドについては、存在を指標に肝炎患者の肝がんへの進行を検出することができ、後者のペプチドについては、存在を指標に肝硬変患者の肝がんへの進行を検出することができる。
【００３２】
また、上記ペプチド中、配列番号４、６５および６６で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、肝炎患者および肝硬変患者には検出可能なレベルで存在しないが、肝がん患者では検出可能なレベルで存在するペプチドである。一方、配列番号６８、７０、７２、７４、７６、７７および７８で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、肝炎患者および肝硬変患者には検出可能なレベルで存在するが、肝がん患者では検出可能なレベルで存在しないペプチドである。前者のペプチドについては、存在を指標に肝がんを検出することができ、後者のペプチドについては、非存在を指標に肝がんを検出することができる。
【００３３】
なお、インタクトなタンパク質またはその部分ペプチドないしペプチド断片に糖鎖が付加されることがある。本発明は、これらの糖鎖の付加を指標に肝がんを検出する方法も包含し、これらの糖鎖が付加したタンパク質および部分ペプチドないしペプチド断片も肝がん検出のためのバイオマーカーとして用い得る。このような部分ペプチドとして、例えば配列番号５５で表されるペプチドが挙げられる。
【００３４】
ある被験者から血清等の生体試料を採取し、試料中のタンパク質および部分ペプチドの種類とそれぞれの種類の量を測定した場合、タンパク質および部分ペプチドの種類およびそれぞれの量についての情報を含む該試料の特徴あるタンパク質／部分ペプチドプロファイルが得られる。ここで、タンパク質／部分ペプチドプロファイルとは、インタクトなタンパク質およびその部分ペプチドの種類および存在量で示されるタンパク質およびその部分ペプチドの存在パターンをいう。部分ペプチドがインタクトなタンパク質の分解産物である場合、タンパク質／消化分解産物ペプチドプロファイルという。このタンパク質／部分ペプチドプロファイルを上記のインタクトなタンパク質およびその部分ペプチドについて分析することにより、被験者が正常か、または肝がんに罹患しているか、さらに肝がんの進行度を知ることができる。
【００３５】
本発明において、バイオマーカーとして上記タンパク質および部分ペプチドないしペプチド断片のうち少なくとも一つのタンパク質および／または部分ペプチドないしペプチド断片を用いることができるが、好ましくは２種類以上、さらに好ましくは３種類以上、４種類以上、５種類以上、６種類以上、７種類以上、８種類以上、９種類以上または１０種類以上のタンパク質または部分ペプチドないしペプチド断片を用いるとより高精度に慢性肝炎、肝硬変、肝がんを分別診断することができる。この場合、異なるタンパク質の組合わせでもよいし、あるタンパク質とそのタンパク質以外のタンパク質の部分ペプチドないしペプチド断片あるいは部分ペプチドないしペプチド断片の組合わせであってもよい。また、複数のインタクトなタンパク質のみをバイオマーカーとしてもよい。このように、複数のタンパク質または部分ペプチドないしペプチド断片をバイオマーカーとして用いることにより、慢性肝炎、肝硬変、肝がんをより正確に分別診断することができ、また肝がんの進行状態を的確に判断することができる。
【００３６】
なお、本発明において、バイオマーカーを定量してもよいし、定性により存在、非存在を決定してもよい。同じ種類のタンパク質または部分ペプチドないしペプチド断片をバイオマーカーとして用いる場合、各バイオマーカーを定量し、正確な濃度を得た上で、タンパク質／部分ペプチドないしペプチド断片プロファイルを得た方が正確な判断をし得るが、バイオマーカーの種類が増える場合、それぞれのバイオマーカーの存在または非存在を定性的に測定し、存在または非存在に関するタンパク質／部分ペプチドないしペプチド断片プロファイルを得れば正確な判断が可能になる。
【００３７】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるHypothetical protein、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるNeuropeptide Y receptor type 1、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるPromyelocytic leukemia zinc finger、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるMicrotubule-associated protein 1A、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるComplement C3 precursor、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるHistone deacetylase 8、配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-1-antitrypsin
precursor、配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるChromosome 10 open
reading frame 76、配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるRearranged
immunoglobulin heavy chain variable region、配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるF-box/LRR-repeat protein 8、配列番号２１で表されるアミノ酸配列からなるImmunoglobulin lambda light chain variable region、配列番号２３で表されるアミノ酸配列からなるIg gamma-1 chain C region、配列番号２５で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-2-macroglobulin precursor、配列番号２７で表されるアミノ酸配列からなるRho/rac guanine nucleotide exchange factor 2、配列番号３１で表されるアミノ酸配列からなるPutative GTP-binding protein Parf、配列番号３３で表されるアミノ酸配列からなるIg lambda chain C regions、配列番号３５で表されるアミノ酸配列からなるZinc finger protein ZIC 1、配列番号３７で表されるアミノ酸配列からなるNeuroserpin precursor、配列番号３９で表されるアミノ酸配列からなるUbiquitin-conjugating
enzyme E2 U、配列番号４１で表されるアミノ酸配列からなるHemoglobin subunit
alpha、配列番号４３で表されるアミノ酸配列からなるSerum albumin precursor、配列番号４５で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-2-HS-glycoprotein precursor、配列番号４７で表されるアミノ酸配列からなるlymphocyte-specific protein 1、配列番号４９で表されるアミノ酸配列からなるApolipoprotein M、配列番号５１で表されるアミノ酸配列からなるBrefeldin
A-inhibited guanine nucleotide-exchange protein 3、配列番号５３で表されるアミノ酸配列からなるPlasma retinol-binding protein precursor、配列番号５５で表されるアミノ酸配列からなるInter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain precursor、配列番号５７で表されるアミノ酸配列からなるGMP reductase 1、配列番号５９で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-2-antiplasmin
precursor、配列番号６１で表されるアミノ酸配列からなるIg gamma-2 chain C
region、配列番号６４で表されるアミノ酸配列からなるSerotransferrin precursor、配列番号６７で表されるアミノ酸配列からなるHemopexin precursor、配列番号６９で表されるアミノ酸配列からなるGelsolin
precursor、配列番号７１で表されるアミノ酸配列からなるHistidine-rich
glycoprotein precursor、配列番号７３で表されるアミノ酸配列からなるComplement
factor I precursor、配列番号７５で表されるアミノ酸配列からなるApolipoprotein
A-I precursorからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質ないしペプチドまたは該タンパク質ないし該ペプチドから生じるアミノ酸残基５個以上のペプチド断片、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるHypothetical proteinの部分ペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるNeuropeptide Y receptor type 1の部分ペプチド、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるPromyelocytic leukemia zinc fingerの部分ペプチド、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるMicrotubule-associated protein 1Aの部分ペプチド、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるComplement C3 precursorの部分ペプチド、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるHistone deacetylase 8の部分ペプチド、配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-1-antitrypsin precursorの部分ペプチド、配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるChromosome 10 open reading frame 76の部分ペプチド、配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなるRearranged immunoglobulin heavy chain variable regionの部分ペプチド、配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなるF-box/LRR-repeat protein 8の部分ペプチド、配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるImmunoglobulin lambda light chain variable regionの部分ペプチド、配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなるIg gamma-1 chain C regionの部分ペプチド、配列番号２６で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-2-macroglobulin precursorの部分ペプチド、配列番号２８で表されるアミノ酸配列からなるRho/rac guanine nucleotide exchange factor 2の部分ペプチド、配列番号２９で表されるアミノ酸配列からなるComplement C3 precursorの部分ペプチド、配列番号３０で表されるアミノ酸配列からなるIg gamma-1 chain C regionの部分ペプチド、配列番号３２で表されるアミノ酸配列からなるPutative GTP-binding protein Parfの部分ペプチド、配列番号３４で表されるアミノ酸配列からなるIg lambda chain C regionsの部分ペプチド、配列番号３６で表されるアミノ酸配列からなるZinc finger protein ZIC 1の部分ペプチド、配列番号３８で表されるアミノ酸配列からなるNeuroserpinの部分ペプチド、配列番号４０で表されるアミノ酸配列からなるUbiquitin-conjugating
enzyme E2 Uの部分ペプチド、配列番号４２で表されるアミノ酸配列からなるHemoglobin
subunit alphaの部分ペプチド、配列番号４４で表されるアミノ酸配列からなるSerum albumin
precursorの部分ペプチド、配列番号４６で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-2-HS-glycoprotein
precursorの部分ペプチド、配列番号４８で表されるアミノ酸配列からなるlymphocyte-specific
protein 1の部分ペプチド、配列番号５０で表されるアミノ酸配列からなるApolipoprotein Mの部分ペプチド、配列番号５２で表されるアミノ酸配列からなるBrefeldin A-inhibited guanine nucleotide-exchange protein 3の部分ペプチド、配列番号５４で表されるアミノ酸配列からなるPlasma retinol-binding protein precursorの部分ペプチド、配列番号５６で表されるアミノ酸配列からなるInter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain precursorの部分ペプチド、配列番号５８で表されるアミノ酸配列からなるGMP reductase 1の部分ペプチド、配列番号６０で表されるアミノ酸配列からなるAlpha-2-antiplasmin
precursorの部分ペプチド、配列番号６２で表されるアミノ酸配列からなるIg gamma-2 chain
C regionの部分ペプチド、配列番号６３で表されるアミノ酸配列からなるIg gamma-1 chain C
regionの部分ペプチド、配列番号６５で表されるアミノ酸配列からなるSerotransferrin
precursorの部分ペプチド、配列番号６６で表されるアミノ酸配列からなるSerotransferrin
precursorの部分ペプチド、配列番号６８で表されるアミノ酸配列からなるHemopexin
precursorの部分ペプチド、配列番号７０で表されるアミノ酸配列からなるGelsolin
precursorの部分ペプチド、配列番号７２で表されるアミノ酸配列からなるHistidine-rich
glycoprotein precursorの部分ペプチド、配列番号７４で表されるアミノ酸配列からなるComplement
factor I precursorの部分ペプチド、配列番号７６で表されるアミノ酸配列からなるApolipoprotein
A-I precursorの部分ペプチド、配列番号７７で表されるアミノ酸配列からなるComplement C3
precursorの部分ペプチド、配列番号７８で表されるアミノ酸配列からなるSerotransferrin
precursorの部分ペプチドの少なくとも１つをマーカーとして用いる慢性肝炎、肝硬変、肝がんの分別診断方法であって、生体試料中の該タンパク質および／または部分ペプチドないしペプチド断片の種類、存在量および／または存在比を測定し、タンパク質／部分ペプチドないしペプチド断片プロファイルを得て、該プロファイルを解析することにより慢性肝炎、肝硬変、肝がんを分別診断することができる。
【００３８】
例えば、Hypothetical protein（配列番号１）、Neuropeptide Y receptor type 1（配列番号３）、Promyelocytic
leukemia zinc finger（配列番号５）、Microtubule-associated
protein 1A（配列番号７）、Complement C3 precursor（配列番号９）、Histone deacetylase 8（配列番号１１）、Alpha-1-antitrypsin
precursor（配列番号１３）、Chromosome 10 open reading frame 76（配列番号１５）、Rearranged immunoglobulin heavy chain variable region（配列番号１７）、F-box/LRR-repeat protein 8（配列番号１９）、Immunoglobulin
lambda light chain variable region（配列番号２１）、Ig gamma-1
chain C region（配列番号２３）、Alpha-2-macroglobulin precursor（配列番号２５）、Rho/rac guanine nucleotide exchange factor 2（配列番号２７）、Putative GTP-binding protein Parf（配列番号３１）、Ig
lambda chain C regions（配列番号３３）、Zinc finger protein ZIC
1（配列番号３５）、Neuroserpin precursor（配列番号３７）、Ubiquitin-conjugating enzyme E2 U（配列番号３９）、Hemoglobin
subunit alpha（配列番号４１）、Serum albumin precursor（配列番号４３）、Alpha-2-HS-glycoprotein precursor（配列番号４５）、lymphocyte-specific
protein 1（配列番号４７）、Apolipoprotein M（配列番号４９）、Brefeldin A-inhibited guanine nucleotide-exchange protein 3（配列番号５１）、Plasma retinol-binding protein precursor（配列番号５３）、Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain precursor（配列番号５５）、GMP reductase 1（配列番号５７）、Alpha-2-antiplasmin
precursor（配列番号５９）、Ig gamma-2 chain C region（配列番号６１）、Serotransferrin precursor（配列番号６４）、Hemopexin
precursor（配列番号６７）、Gelsolin precursor（配列番号６９）、Histidine-rich glycoprotein precursor（配列番号７１）、Complement factor I precursor（配列番号７３）およびApolipoprotein
A-I precursor（配列番号７５）は肝がん患者において、消化分解を受け得るので、これらのタンパク質の少なくとも１つのタンパク質の量の減少または消失は、肝がんへの罹患を示し得る。また、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、２９および３０で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、肝炎患者には検出可能なレベルで存在しないが、肝がん患者では検出可能なレベルで存在するペプチドである。また、配列番号４、２８、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２および６３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、肝硬変患者には検出可能なレベルで存在しないが、肝がん患者では検出可能なレベルで存在するペプチドである。従って、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、２９および３０で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの量の出現または増加は、肝炎患者の肝がんへの進行を示し得る。また、配列番号４、２８、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２および６３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの量の出現または増加は、肝硬変患者の肝がんへの進行を示し得る。すなわち、上記プロファイルを解析し、Hypothetical protein（配列番号１）、Neuropeptide Y
receptor type 1（配列番号３）、Promyelocytic leukemia zinc
finger（配列番号５）、Microtubule-associated protein 1A（配列番号７）、Complement C3 precursor（配列番号９）、Histone
deacetylase 8（配列番号１１）、Alpha-1-antitrypsin precursor（配列番号１３）、Chromosome 10 open reading frame 76（配列番号１５）、Rearranged
immunoglobulin heavy chain variable region（配列番号１７）、F-box/LRR-repeat
protein 8（配列番号１９）、Immunoglobulin lambda light chain
variable region（配列番号２１）、Ig gamma-1 chain C region（配列番号２３）、Alpha-2-macroglobulin precursor（配列番号２５）、Rho/rac
guanine nucleotide exchange factor 2（配列番号２７）、Putative
GTP-binding protein Parf（配列番号３１）、Ig lambda chain C
regions（配列番号３３）、Zinc finger protein ZIC 1（配列番号３５）、Neuroserpin precursor（配列番号３７）、Ubiquitin-conjugating
enzyme E2 U（配列番号３９）、Hemoglobin subunit alpha（配列番号４１）、Serum albumin precursor（配列番号４３）、Alpha-2-HS-glycoprotein
precursor（配列番号４５）、lymphocyte-specific protein 1（配列番号４７）、Apolipoprotein M（配列番号４９）、Brefeldin
A-inhibited guanine nucleotide-exchange protein 3（配列番号５１）、Plasma retinol-binding protein precursor（配列番号５３）、Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain precursor（配列番号５５）、GMP reductase 1（配列番号５７）、Alpha-2-antiplasmin
precursor（配列番号５９）、Ig gamma-2 chain C region（配列番号６１）、Serotransferrin precursor（配列番号６４）、Hemopexin
precursor（配列番号６７）、Gelsolin precursor（配列番号６９）、Histidine-rich glycoprotein precursor（配列番号７１）、Complement factor I precursor（配列番号７３）およびApolipoprotein
A-I precursor（配列番号７５）のうちの少なくとも１種類の量が肝炎患者に比較して減少するかまたは消失し、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、２９および３０で表されるアミノ酸配列からなるペプチドのうちの少なくとも１種類の量が肝炎患者に比較して出現または増加し、配列番号４、２８、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２および６３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの量が肝硬変患者に比較して増加または出現している場合、肝がんに進行していると判断することができる。
【００３９】
さらに、配列番号４、６５および６６で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、肝炎患者および肝硬変患者には検出可能なレベルで存在しないが、肝がん患者では検出可能なレベルで存在するペプチドである。また、配列番号６８、７０、７２、７４、７６、７７で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、肝炎患者および肝硬変患者には検出可能なレベルで存在するが、肝がん患者では検出可能なレベルで存在しないペプチドである。従って、配列番号４、６５および６６で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの量の出現または増加は、肝炎患者または肝硬変患者の肝がんへの進行を示し得る。また、配列番号６８、７０、７２、７４、７６、７７で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの量の消失または減少は、肝炎患者または肝硬変患者の肝がんへの進行を示し得る。すなわち、上記プロファイルを解析し、Hypothetical protein（配列番号１）、Neuropeptide Y
receptor type 1（配列番号３）、Promyelocytic leukemia zinc
finger（配列番号５）、Microtubule-associated protein 1A（配列番号７）、Complement C3 precursor（配列番号９）、Histone
deacetylase 8（配列番号１１）、Alpha-1-antitrypsin precursor（配列番号１３）、Chromosome 10 open reading frame 76（配列番号１５）、Rearranged
immunoglobulin heavy chain variable region（配列番号１７）、F-box/LRR-repeat
protein 8（配列番号１９）、Immunoglobulin lambda light chain
variable region（配列番号２１）、Ig gamma-1 chain C region（配列番号２３）、Alpha-2-macroglobulin precursor（配列番号２５）、Rho/rac
guanine nucleotide exchange factor 2（配列番号２７）、Putative
GTP-binding protein Parf（配列番号３１）、Ig lambda chain C
regions（配列番号３３）、Zinc finger protein ZIC 1（配列番号３５）、Neuroserpin precursor（配列番号３７）、Ubiquitin-conjugating
enzyme E2 U（配列番号３９）、Hemoglobin subunit alpha（配列番号４１）、Serum albumin precursor（配列番号４３）、Alpha-2-HS-glycoprotein
precursor（配列番号４５）、lymphocyte-specific protein 1（配列番号４７）、Apolipoprotein M（配列番号４９）、Brefeldin
A-inhibited guanine nucleotide-exchange protein 3（配列番号５１）、Plasma retinol-binding protein precursor（配列番号５３）、Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain precursor（配列番号５５）、GMP reductase 1（配列番号５７）、Alpha-2-antiplasmin
precursor（配列番号５９）、Ig gamma-2 chain C region（配列番号６１）、Serotransferrin precursor（配列番号６４）、Hemopexin
precursor（配列番号６７）、Gelsolin precursor（配列番号６９）、Histidine-rich glycoprotein precursor（配列番号７１）、Complement factor I precursor（配列番号７３）およびApolipoprotein
A-I precursor（配列番号７５）のうちの少なくとも１種類の量が肝炎患者もしくは肝硬変患者に比較して減少するかまたは消失し、配列番号４、６５および６６で表されるアミノ酸配列からなるペプチドのうちの少なくとも１種類の量が肝炎患者もしくは肝硬変患者に比較して出現または増加し、配列番号６８、７０、７２、７４、７６、７７および７８で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの量が肝炎患者もしくは肝硬変患者に比較して減少または消失している場合、肝がんに進行していると判断することができる。
【００４０】
本発明でバイオマーカーとして用いるタンパク質は、例えば正常である被験者の血清等の生体試料および肝がん患者である被験者の血清等の生体試料を等電点電気泳動およびSDS-PAGEを組み合せた二次元電気泳動に同時にかけ、電気泳動により移動したタンパク質を適当な方法で染色しスポットとして顕在化させた場合に、正常人において存在し、肝がん患者において消失または薄くなるスポットのタンパク質が挙げられる。従って、正常人から得た生体試料と肝がん患者から得た生体試料について二次元電気泳動を行ったときは、後者で消失または薄くなったスポットのタンパク質を選択することができる。二次元電気泳動は公知の方法で行うことができ、また市販の電気泳動装置を用いて行うことができる。さらに、肝疾患の進行に伴ってタンパク質の糖鎖付加のような翻訳後修飾状況が変化することがあり、その場合、例えば酸性糖が付加すればそのタンパク質の等電点が変化するので、これを二次元電気泳動によって検出することができる。また、二次元電気泳動の代わりに、例えば２種類のクロマトグラフィーを用いた、二次元ＨＰＬＣを用いてもよい。この場合の２種類のクロマトグラフィーは、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等の公知のクロマトグラフィーから選択すればよい。この際、二次元ＨＰＬＣを自動的に行い各画分について自動的に質量分析を行う自動装置を用いることにより、一度の大量の試料を迅速に調べることができる。
【００４１】
本発明の方法によれば、被験者の肝がんを含む肝疾患に罹患するリスクの大きさも評価することができ、予防医学にも有用である。さらに、肝疾患に罹患した患者に投薬治療を行った場合、肝疾患は治癒する方向に進み、それに応じてタンパク質／部分ペプチドないしペプチド断片プロファイルも変動する。これを測定することにより、投薬効果の評価判定を行うこともできる。従って、本発明の部分ペプチドないしペプチド断片は、薬剤効果判定エンドポイントのためのバイオマーカーとなり得る。また、肝疾患の予後を予測することも可能である。さらに、本発明の方法により、創薬ターゲット生体分子をスクリーニングすることができる。生体内のインタクトなタンパク質の多くは生理活性タンパク質として作用している。生体が正常状態にあるときは、該タンパク質の生理活性は、発現合成量の制御、酵素によるプロセシング、酵素による活性化等により制御されている。生理活性を有するインタクトなタンパク質は、その活性を制御する制御部位と活性を発揮する活性部位を有する場合があり、インタクトなタンパク質全体として、生体の状態により活性が制御されている。しかしながら、生体が正常以外の状態にある場合、インタクトなタンパク質の発現が影響を受け、または消化分解されて部分ペプチドが生じた場合、部分ペプチド自体が活性部位を有しているが、制御部位を有していない場合、生体の状態による活性の制御を受けなくなる場合がある。この場合、部分ペプチドは、生体の状態に拘わらず作用し、結果として生体を正常以外の状態、例えば疾患状態に誘導してしまう。また、部分ペプチド自体が制御部位を有している場合もあり、この場合は、本来インタクトなタンパク質が受けるべき制御を部分ペプチドが受け、ドミナントネガティブ効果により、インタクトなタンパク質が活性の制御から逸脱してしまう。この場合も、部分ペプチドの影響で生体を正常以外の状態、例えば疾患状態に誘導してしまう。このように、部分ペプチドが疾患等の正常以外の状態の原因物質となっている場合、この部分ペプチドの活性を抑えることにより、正常以外の状態を正常状態に回復させることができる。本発明の方法においては、正常以外の状態におけるタンパク質／部分ペプチドプロファイルを得ることができ、部分ペプチドの活性を分析することにより、疾患等の原因となる部分ペプチドを決定することができる。すなわち、本発明の方法により、創薬ターゲット生体分子をスクリーニングすることができる。
【００４２】
本発明の方法において、生体試料中のタンパク質／部分ペプチドないしペプチド断片プロファイルを調べるが、用いる生体試料は限定されない。例えば、生体から採取し得る液体試料、例えば全血、血清、血しょう、尿、唾液等の体液が挙げられる。なお、生体試料の保存状態によっては、生体試料中のタンパク質および部分ペプチドがさらに分解を受けることもあるので、生体試料は凍結融解を繰り返さずに用いるのが好ましい。また、生体試料中にプロテアーゼインヒビター等を添加してもよい。
【００４３】
生体試料中のタンパク質の種類および量は種々の方法で測定することができる。以下に例示するが、それらには限定されない。
１．酵素免疫吸着測定法（ELISA）
特定のインタクトなタンパク質とその部分ペプチドないしペプチド断片に対する抗体をあらかじめ特殊な化学修飾をしたマイクロタイタープレート等の担体に結合させる。結合は、物理的吸着、官能基を利用した共有結合等、公知の方法で行うことができる。使用する抗体は（１）特定のタンパク質の完全長のみを認識する抗体、（２）部分ペプチドのみを認識する抗体、（３）特定のタンパク質とその部分ペプチドないしペプチド断片の両方を認識する抗体のすべて、または上記（１）と（２）、（１）と（３）、もしくは（２）と（３）の組み合わせでもよい。試料を原液または緩衝液で段階希釈後、抗体を結合させたマイクロタイタープレートにこれを適当量加え、インキュベーションする。その後洗浄し、捕捉されなかったタンパク質および部分ペプチドないしペプチド断片を除く。次に蛍光もしくは化学発光物質または酵素を結合させた２次抗体を加えインキュベーションする。検出はそれぞれの基質を加えた後、蛍光もしくは化学発光物質または酵素反応による可視光を計測することによって評価判定を行う。
【００４４】
また、部分ペプチドないしペプチド断片がより多くなる場合は、用いる抗体の種類を多くし、あるいは組合せを多くすればよい。
【００４５】
この例は、抗体を用いた方法であるが、抗体の代わりにインタクトなタンパク質またはその部分ペプチドないしペプチド断片に結合し得る物質を用いてもよい。例えば、アプタマー等を用いることができる。
【００４６】
本発明は、酵素免疫吸着測定法により、肝がんを検出するための装置をも包含する。該装置は、少なくとも抗体もしくはアプタマー固定部（捕捉部）ならびに測定部を含む。抗体またはアプタマー固定部は、抗体またはアプタマーを固相化したスライドガラス、96ウェルタイタープレート等の固相担体からなる。また、測定部は、分光光度計、蛍光分光光度計等の光検出手段からなる。さらに、本発明の装置は、得られたデータを解析する解析部を含んでいてもよく、解析部はデータ処理装置および解析用ソフトウェアを含む。
【００４７】
２．マイクロアレイ（マイクロチップ）を用いた方法
マイクロアレイとは、担体（基板）上に測定しようとする物質に結合し得る物質を整列（アレイ）固定化させたデバイスを総称していう。本発明の場合、上記１のように、インタクトなタンパク質および部分ペプチドないしペプチド断片に対する抗体またはアプタマーを整列固定化させて用いればよい。マイクロアレイの担体としては、スライドガラス、ニトロセルロース膜等種々のものを用いることができる。固定化は、上記１の場合と同様に行うこともできるが、市販のマイクロアレイヤーやスポッターを用いることにより容易に行うことができる。マイクロアレイ法においては、固相化量は少なくてすみ、測定しようとするタンパク質濃度もフェムトモルオーダーで足りる。また、一枚の担体の上に数百から数万の物質を整列固定化することが可能であるので、測定しようとするタンパク質および部分ペプチドないしペプチド断片の種類および量が多い場合に適している。測定は、上記１と同様に、固相化した抗体等に、生体試料を添加し、マイクロアレイ上に測定しようとするタンパク質または部分ペプチドないしペプチド断片を結合させ、次に蛍光もしくは化学発光物質または酵素を結合させた２次抗体を加えインキュベーションする。検出はそれぞれの基質を加えた後、蛍光もしくは化学発光物質または酵素反応による可視光を計測すればよい。
【００４８】
本発明は、マイクロアレイを用いた方法により、肝がんを検出するための装置をも包含する。該装置の構成は、上記１に記載の装置の構成と同様である。
【００４９】
３．質量分析法
質量分析計を用いた質量分析法によりタンパク質および分解産物ペプチド等の部分ペプチドないしペプチド断片を解析することもできる。質量分析計は、試料導入部、イオン化室、分析部、検出部、記録部等を含む。イオン化法としては電子衝撃イオン化（EI）法、化学イオン化（CI）法、フィールドデソープション（FD）法、二次イオン化（SIMS）法、高速原子衝突（FAB）法、matrix-assisted laser desorption
ionization（MALDI）法、エレクトロスプレーイオン化（ESI）法等を用いればよい。また、分析部は、二重収束質量分析計、四重極型質量分析計、飛行時間型質量分析計、フーリエ変換質量分析計、イオンサイクロトロン質量分析計等が用いられる。
【００５０】
例えば、特定のタンパク質とその部分ペプチドないしペプチド断片に対する抗体をあらかじめ特殊な化学修飾をしたマイクロビーズもしくは基板（プロテインチップ）に結合させる。マイクロビーズは磁気ビーズであってもよい。基板の素材は問わない。使用する抗体は（１）特定のタンパク質の完全長のみを認識する抗体、（２）部分ペプチドないしペプチド断片のみを認識する抗体、（３）特定のタンパク質とその部分ペプチドないしペプチド断片の両方を認識する抗体のすべて、または上記（１）と（２）、（１）と（３）、もしくは（２）と（３）の組み合わせでもよい。試料を原液または緩衝液で段階希釈後、抗体を結合させたマイクロビーズまたは基板にこれを適当量加え、インキュベーションする。その後洗浄し、捕捉されなかったタンパク質および部分ペプチドないしペプチド断片を除く。その後、マイクロビーズまたは基板上に捕捉されたタンパク質および部分ペプチドないしペプチド断片をMALDI TOF-MS、SELDI TOF-MSなどを用いた質量分析によって分析し、各タンパク質および部分ペプチドないしペプチド断片のピークの質量数とピーク強度を計測する。SELDIとはチップ表面の化学官能基や固定化された分子を利用して、試料中から特定の性質を有する分子をチップ上に捕捉し、その後にレーザーを照射することにより捕捉された分子の脱離・イオン化を行う方法をいう。SELDI TOFMSは、例えば特表2005-509173に記載の方法に従って行うことができる。質量分析の前にトリプシンなどの特定のタンパク質分解酵素によってすべてペプチドに分解してもよい。これらの計測から得られたタンパク質および部分ペプチドの質量分析ピーク（質量スペクトル）とピークパターン（質量スペクトルパターン）をソフトウェアによって解析し、試料の評価判定を行う。質量分析による質量スペクトルおよび質量スペクトルパターンからインタクトなタンパク質およびその部分ペプチドないしペプチド断片の生体試料中での存在パターンがわかり、タンパク質／部分ペプチドないしペプチド断片プロファイルを得ることができる。
【００５１】
本発明は、質量分析を用いた方法により、肝がんを検出するための装置をも包含する。該装置は、少なくとも抗体もしくはアプタマー固定部（捕捉部）ならびに質量分析計（測定部）を含む。さらに、本発明の装置は、得られたデータを解析する解析部を含んでいてもよく、解析部はデータ処理装置および解析用ソフトウェアを含む。
【００５２】
さらに、上記の方法の他、二次元電気泳動を用いた方法、表面プラズモン共鳴を用いた方法等によっても、タンパク質および部分ペプチドないしペプチド断片を解析することが可能である。
【００５３】
従来の技術では、生体の正常と正常以外の状態におけるインタクトなタンパク質だけを計測しており、その合成過程において生成する部分タンパク質およびその分解過程で生ずる消化分解産物のペプチドを計測することはできなかった。またインタクトなタンパク質とその合成過程において生成する部分ペプチドおよびその分解過程で生ずる消化分解産物のペプチドの両方を計測できる装置も存在しなかった。
【００５４】
本発明の方法により従来達成できなかった病態特異的バイオマーカーを診断に利用できるようになる。本発明で提供する手段と方法は、生体の正常と正常以外の状態におけるインタクトなタンパク質および／またはその合成過程または分解過程で生ずるペプチドの計測を可能にする。
【００５５】
計測対象物のインタクトなタンパク質とその合成過程または分解過程で生ずる消化分解産物のペプチドに対して作製したそれぞれの抗体を使用することで、計測対象物を選択的に捕捉することができ、従来技術のELISA、RIA、CLIAなどを使用してそれぞれの捕捉量を計測することで、体の正常と正常以外の状態におけるインタクトなタンパク質とその合成過程または分解過程で生ずる消化分解産物のペプチド量もしくは存在比が計測できるようになった。
【００５６】
また質量分析法を用いるシステムでは、計測対象物のインタクトなタンパク質その合成過程または分解過程で生ずる消化分解産物のペプチドに対して作製したそれぞれの抗体をマイクロビーズやプロテインチップに結合させることで、感度に優れスループットの高い計測が可能になった。MALDI TOF-MSなどを用いた質量分析の感度は通常attoモルからzeptoモルレベルであり、ELISA、RIA、CLIAなどよりも優れている。
【００５７】
本発明は、正常状態にある被験者（正常人）および肝がんに罹患している被験者から採取した検体試料を二次元電気泳動に供し、両方の検体試料の電気泳動パターンを比較し、正常人で検出されるが肝疾患患者で消失または減少するタンパク質または部分ペプチドないしペプチド断片、あるいは正常人では検出されないが肝疾患患者で検出されるタンパク質または部分ペプチドないしペプチド断片を同定し、慢性肝炎、肝硬変、肝がんを分別診断するためのバイオマーカーをスクリーニングする方法も包含する。ここで、二次元電気泳動は、等電点電気泳動およびSDS-PAGEを組み合せた二次元電気泳動が好ましい。また、被験者から採取した生体試料を二次元電気泳動に供し、前記バイオマーカーの有無を指標に肝がんを検出する方法をも包含する。等電点電気泳動は、タンパク質、タンパク質断片あるいはペプチドにおいて、等電点に変異を生ずるアイソフォームを含む場合に適する。この場合は、SDS-PAGEを組み合せない一次元電気泳動でも、これを組み合わせた二次元電気泳動でも、どちらでもよい。等電点に変異のあるアイソフォームは、とくにタンパク質の翻訳後修飾で生ずる。その代表例はリン酸化と糖鎖付加である。翻訳後修飾の結果として生ずるこのような等電点変異を伴うアイソフォームが血清、血漿、組織などの検体試料において被験者の疾患の有無、相違およびその重篤度に応じて増減する可能性がある。本発明は、翻訳後修飾によって生ずる特定のタンパク質あるいはペプチドのアイソフォームの増減によって肝炎、肝硬変、肝がんを分別診断する方法も包含する。
【実施例】
【００５８】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００５９】
実施例１    二次元液体クロマトグラフィー（2D-LC）MALDI TOF-MSによる肝がん診断マーカーペプチドの探索
（１）方法
正常人、肝炎患者、肝硬変患者および肝がん患者の血清25μlの各々に475μlの0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）を加え、100℃で15分間煮沸した。その後、分子量1万以下のペプチドを回収するためにミリポア社YM-10を用いて限外ろ過をおこなった。回収サンプルを二次元HPLC（SCX陽イオン交換ならびにC18逆相カラム）を用いて1サンプルあたり1,146に分画した。分画されたすべてのサンプルはオンラインで接続されたスポッティングロボット(AccuSpotと命名)を用いてMALDI
TOF型質量分析機（AXIMA CFR plus）サンプル台上にスポットし、マトリックス溶液（α-シアノ-ヒドロキシケイ皮酸, CHCA）を混合して共結晶化後にレーザーを照射しリフレクトロンモードで質量を自動測定した。正常人と各肝疾患の間の発現差異ペプチドの検出および異なる肝疾患間の発現差異ペプチドの検出は、我々が開発した多群間統計解析ソフトウェア、DeViewを用いておこなった。発現量に差異の認められたペプチドは、そのままQIT型質量分析機AXIMA QITでMS/MSならびにMSのn乗解析にてアミノ酸配列を決定し、由来タンパク質を同定した。また、同一サンプルを新しく2D-LCで分離し、TOF/TOF型質量分析機UltraFlexIIでMS/MS分析を行ってアミノ酸配列を決定し、AXIMA QITで同定できなかった由来タンパク質を同定した。
【００６０】
（２）結果
上記2D-LC MALDI TOFMS法を用いて、肝がん患者、肝硬変患者および肝炎患者血清由来ペプチドを効果的に分離した結果を図１に示す。図１は肝がん患者血清を一つの例として、１次元目のSCX陽イオン交換カラムで6つの画分に分画した後、それぞれをC18逆相カラムで191の画分に分画した画分をMALDI TOF-MSで測定したスペクトルについて、横軸は質量を、縦軸は逆相カラムクロマトグラフィの分画としてDeViewで視覚化した図である。SCX 1は素通り画分、SCX 2は塩濃度10%で溶出した画分、SCX
3は塩濃度20%で溶出した画分、SCX 4 は塩濃度30%で溶出した画分、SCX 5 は塩濃度50%で溶出した画分、SCX 6 は塩濃度100%で溶出した画分である。図１より、SCX 1、SCX 3、SCX 4の画分でペプチドが多く存在しており、2D-LCで分画し、MALDI TOF-MSで検出したペプチドの総数はおよそ4,000であった。
【００６１】
上記2D-LC MALDI TOFMS法を用いて、肝がん患者、肝硬変患者および肝炎患者血清由来ペプチドを網羅的に差異解析し、肝がん患者群に対する肝硬変患者群、肝がん患者群に対する肝炎患者群と分けて差異解析した結果を図２に示す。図２は肝がん患者(HCC)、肝硬変患者(LC)および肝炎患者(CH)血清由来ペプチドを網羅的に差異解析した結果の一部である。図２のA)、C)は差異解析の結果検出されたMarker A(Neuropeptide Y
receptor type 1, MW: 898.89)が肝がん患者、肝硬変患者、および肝炎患者血清中に存在する量の割合を示す。図２のA)では肝がん患者群と肝硬変患者群を比較しており、その結果、図２のA)に示してあるcutoff値を境に肝がん患者におけるMarker Aが増加していることが判った。図２のC)では肝がん患者群と肝炎患者群を比較しており、その結果図２のC)に示してあるcutoff値を境に肝がん患者におけるMarker Aが増加していることがわかった。
【００６２】
図２のB)、D)はMarker Aについて、バイオマーカーとして有効であるかを受信者操作特性曲線(receiver
operating characteristic curve, ROC)分析を行った結果である。図２のB)、D)中の数値はROC曲線の下部の面積値(AUC of ROC)を表す。面積値が1に近いほどバイオマーカーとしての有効性が高かくなる。図２のB)では肝がん者と肝硬変患者で比較しており、AUC of ROCは0.77であり、感受性と特異性はそれぞれ80%、62%であった。図２の D)では肝がん者と肝炎患者で比較しており、AUC of ROCは0.77であり、感受性と特異性はそれぞれ86%、61%であった。感受性と特異性の値は図２のB)ないしD)においてy軸上の100%の点からROC曲線に直線を引いたとき、その距離が最小となるROC曲線上の点の座標により定められる。この点を与えるcutoff値が健常と疾患の分別および異なる疾患間の分別に有用な閾値となる。
【００６３】
図３は肝がん患者に対して正常人、肝炎患者及び肝硬変患者と比較して、差が見られたバイオマーカー候補の表である。Group Aは肝炎患者と肝がん患者を比較して肝がん患者で増加しているバイオマーカー群であり、Group Bは肝硬変患者と肝がん患者を比較して肝がん患者で増加しているバイオマーカー群である。Protein IDはインタクトタンパク質の配列番号であり、Peptide IDはバイオマーカーペプチドの配列番号に相当する。ROC値が0.6以上のものについてハイライトで印を付けた。Regulationはバイオマーカーペプチドが肝がん患者で増加している場合は[Ｕ]で、肝がん患者で減少している場合は[Ｄ]で表している。
【００６４】
図４は肝炎患者と肝硬変患者を併せた群と肝がん患者群を比較した時に差が見られたバイオマーカー候補の表である。Up-regulationは肝がんで増加しているバイオマーカー群、Down-regulationは肝がんで減少しているバイオマーカー群である。それぞれ、ROC値が0.76、0.78以上を示すバイオマーカー群を表に表した。Protein IDはインタクトタンパク質の配列番号であり、Peptide IDはバイオマーカーペプチドの配列番号に相当する。
【００６５】
図５は肝がん患者群、肝硬変患者群、肝炎患者群および正常人群がそれぞれ43例、43例、43例および11例について2D-LC MALDITOFMS法を行った際のMarker Aの検出の分布図を示す。分布図中の横線はそれぞれ肝がん患者群、肝硬変患者群、肝炎患者群および正常人群のMarker Aの検出値の平均である。これらの分布を元に、各疾患患者同士のt検定を行った。図５よりMarker Aは正常人と肝がん患者、肝炎患者を効果的に区別でき、P値はそれぞれ正常人対肝がん患者でP=0.00001であり、正常人対肝炎患者でP=0.0005であった。また、肝がん患者と肝炎患者、肝がん患者と肝硬変患者を効果的に区別でき、P値はそれぞれ肝がん患者対肝炎患者でP=0.00006であり、肝がん患者と肝硬変患者でP=0.00017であった。
【００６６】
このことから、Marker Aは肝がん検出に有効であり、さらに肝炎患者と肝硬変患者が肝がんへ病態が進行するか判断可能なバイオマーカーであることがわかった。
【００６７】
Marker Aを含め、疾患特異的に検出された、あるいは検出されなかったペプチド断片が同定された。図６にMarker Aについて、TOF/TOF型質量分析機でMS/MS解析した結果を示す。図６より、y-ionおよびb-ionを示すシグナルが十分に現れており、アミノ酸配列が容易に決定できた。
【００６８】
Marker Aを含め同定した結果を下に示す。Marker
Aと同様にTOF/TOF型質量分析機でMS/MS解析した結果、y-ionおよびb-ionを示すシグナルが十分に現れており、アミノ酸配列が容易に決定できた。下のアミノ酸配列は２つの配列のセットを示しているが、1番目の配列の配列全体はインタクトなペプチドもしくはタンパク質の構成アミノ酸の配列を示す。１番目の配列の下線部およびそれぞれの２番目の配列からなるペプチドが検出されたペプチド断片である。１はＮ末端であることを表す。遺伝子変異によるアミノ酸残基の変異があるタンパク質について、該当する箇所のアミノ酸残基は(X)で表した。
【００６９】
〔１〕  Hypothetical protein
配列番号２のHypothetical protein由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MNETNKTLVG PSELXRAXAV TPGQALGSGM ACAGRICAGG
CGPLXPHCTC
051 CQMPPLPPIP CQL  （配列番号１）
【００７０】
Hypothetical protein由来ペプチド
RADAVTPGQALGS  （配列番号２）
【００７１】
〔２〕  Neuropeptide Y receptor type 1
配列番号４のNeuropeptide Y receptor type 1由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MNSTLFSQVE NHSVHSNFSE KNAQLLAFEN DDCHLPLAMI
FTLALAYGAV
051 IILGVSGNLA LIIIILKQKE MRNVTNILIV NLSFSDLLVA
IMCLPFTFVY
101 TLMDHWVFGE AMCKLNPFVQ CVSITVSIFS LVLIAVERHQ
LIINPRGWRP
151 NNRHAYVGIA VIWVLAVASS LPFLIYQVMT DEPFQNVTLD
AYKDKYVCFD
201 QFPSDSHRLS YTTLLLVLQY FGPLCFIFIC YFKIYIRLKR
RNNMMDKMRD
251 NKYRSSETKR INIMLLSIVV AFAVCWLPLT IFNTVFDWNH
QIIATCNHNL
301 LFLLCHLTAM ISTCVNPIFY GFLNKNFQRD LQFFFNFCDF
RSRDDDYETI
351 AMSTMHTDVS KTSLKQASPV AFKKINNNDD NEKI  （配列番号３）
【００７２】
Neuropeptide Y receptor type 1由来ペプチド
VSGNLALII  （配列番号４）
【００７３】
〔３〕  Promyelocytic leukemia zinc finger
配列番号６のPromyelocytic leukemia zinc finger由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MDLTKMGMIQ LQNPSHPTGL LCKANQMRLA GTLCDVVIMV
DSQEFHAHRT
051 VLACTSKMFE ILFHRNSQHY TLDFLSPKTF QQILEYAYTA
TLQAKAEDLD
101 DLLYAAEILE IEYLEEQCLK MLETIQASDD NDTEATMADG
GAEEEEDRKA
151 RYLKNIFISK HSSEESGYAS VAGQSLPGPM VDQSPSVSTS
FGLSAMSPTK
201 AAVDSLMTIG QSLLQGTLQP PAGPEEPTLA GGGRHPGVAE
VKTEMMQVDE
251 VPSQDSPGAA ESSISGGMGD KVEERGKEGP GTPTRSSVIT
SARELHYGRE
301 ESAEQVPPPA EAGQAPTGRP EHPAPPPEKH LGIYSVLPNH
KADAVLSMPS
351 SVTSGLHVQP ALAVSMDFST YGGLLPQGFI QRELFSKLGE
LAVGMKSESR
401 TIGEQCSVCG VELPDNEAVE QH  （配列番号５）
【００７４】
Promyelocytic
leukemia zinc finger由来ペプチド
DDNDTEATM  （配列番号６）
【００７５】
〔４〕  Microtubule-associated
protein 1A
配列番号８のMicrotubule-associated
protein 1A由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
0001 MDGVAEFSEY
VSETVDVPSP XDLLEPPTSG GFLKLSKPCC YIFPGGRGDS
0051 ALFAVNGFNI
LVDGGSDRKS CLWKLVRXLD RIDSVLLTHI GADNLPGING
0101 LLQRKVAELE
EEQSQGSSSY SDWVKNLISP ELGVVFFNVP EKLRLPDASR
0151 KAKRSIEEAC
LTLQHLNRLG IQAEPLYRVV SNTIEPLTLF HKMGVXRLDM
0201 YVLNPVKDSK
EMQFLMXKWA GNSKAKTGIV LPNGKEAEIS VPYLTSITAL
0251 VVWLPANPTE
KIVRVLFPGN APQNKILEGL EKLRHLDFLR YPVATQKDLA
0301 SGAVPTNLKP
SKIKQRADSK ESLKATTKTX VSKLSTREEV VEEGAKEARS
0351 ELSKELSKTE
KKAQESSEKP PEKPXKPERV KTESSEALXA EKRKLIKDKV
0401 GKKHLKEKIS
KLEEKKDKEX KEIPXERKEL KKDEGRKEEK KDXKKEEKRK
0451 DTKPELKKIS
KPDLKPFTPE VRKTLYKAKV PGRVXIDRSR AIRGEKELSS
0501 EPQTPPAQKG
TVPLPTISGH RELVLSSPED LTQDFEEMKR EERALLAEQR
0551 DTGLGDKPFP
LDTAEEGPPS TAIQGTPPSV PGLGQEEHVM KEKELVPEVP
0601 EEQGSKDRGL
DSGAETEEEK DTWEEKKQRE AERLPDRTEA REESXPXVKE
0651 DVIEKAELEE
MEEVHPSDEE EEDATXXEGF YPXHMQEPLX VTPRSREAFG
0701 GRELGLQGKA
PEKETSLFLS SLTTPAGATE HVSYIQDETI PGYSETEQTI
0751 SDEEIHDEPE
ERPAPPRFHT STYDLPGPEG AGPFEASQPA DSAVPATSGK
0801 VYGTPETELT
YPTNIVAAPL AEEEHVSSAT SITECDKLSS FATSVAEDQS
0851 VASLTAPQTE
ETGKSSLLLD TVTSIPSSRT EATQGLDYVP SAGTISPTSS
0901 LXEXKGFXSP
PCEDFSVTGE SEKRGEIIGK GLSGERAVEE EEEETANVEM
0951 SEKLXSQXGT
PVFSAPGXAL HPGEPALGEA EERCLSPDDS TVKMASPPPS
1001 GPPSATHTPF
HQSPVEEKSE PQDFKEADSW GDTKRTPGVG KEDAAEETVK
1051 PGPEEGTLEK
EEKVPPPRSP QAQEAPVNID EGLTGCTIQL LPAQDKAIVF
1101 EIMEAGEPTG
PILGAEALPG GLRTLPQEPG KPQKDEVLRY PDRSLSPEDX
1151 ESLSVLSVPS
PDTXXQEPTP KSPCGLXEQX LHKDRWXEVS PEDTQSLSLS
1201 EESPSKETSL
DVSSKQLSPE SLGTLQFGEL NLGKEEMGHL MQAEDTSHHT
1251 APMSVPEPHA
ATASPPTDGT TRYSAQTDIT DDSLDRKSPA SSFSHSTPSG
1301 NGKYLPGAIT
SPDEHILTXD SSFSKSPESL XGPALXDIAI KWEDKVPGLK
1351 DRTSEQKKEP
EPKDEVLQQK DKTLEHKEVV EPKDTAIYQK DEALHVKNEA
1401 VKQQXKALEQ
KGRDLEQXDT ALEQKDKALE PKDKDLEXKD KALEQKDKIP
1451 XEKDKALEQK
DTALEQKDKA LEPKDKDLEQ KDRVLEQKEK IPEEKDKALD
1501 QKVRSVEHKA
PEDTVAEMKD RDLEQTDKAP EQKHQAQEQK DKVSEKKDQA
1551 LEXKYWALGQ
KDEALEXNIQ ALEENHQTQE QESLVQEDKT RKPKMLEEKS
1601 PEKVKAMEEK
LEALLEKTXA LGLEESLVQE GRAREQEEKY WRGQDVVQEC
1651 QETSPXREEP
AGEQKELXPA WEDTSPEQDN RYWRGREDVS LEQDTYWREL
1701 SCERKVWFPH
ELDVQGARPH YTXERESTFL DEGPDDEQEV PLREHATRSP
1751 WASDFKDFQE
SSPQKGLEVE RWLAESPVGL PPEEEDKLTR SPFEIISPPA
1801 SPPEMVGQRV
PSAPGQESPI PDPKLMPHMK NEPTTPSWLA XIPPWVPKXR
1851 PLPXAPLSPA
PGPPTPAPES HTPAPFSWGT PEYDSVVAAV QEGAAELEGG
1901 PYSPLGKDYR
KVXGEREEEG RAEAPDKSSH XSKVPEARKS HATTEPEQTE
1951 PEQREPTPYP DERSFQYADI
YEQMMLTGLG PACPTREPPL GAAGDWPPCL
2001 STKEAAAGRN
TSAEKELSSP ISPKSLQSDT PTFSYAALAG PTVPPRXEPG
2051 PSMEPSLTPP
AVPPRAPILS KGPSPPLNGN ILSCSPDRRS PSPKESGRSH
2101 WDDSTSDSEL
EKGAREQAEK EAQSPSPPHP IPMGSPTLWP ETEAHVSPPL
2151 XSHLGXARPS
LDFPASAFGF SSLEXAPPQX PSPAEPRSAP CGSLAFSGDR
2201 ALALAPGPPT
RTRYDEYLEV TKAPSLDSSL PQLPSPSSPG XPLLSNLPRP
2251 ASPALSEGSS
SEATTPVISS VAERFSPSLE AAEQESGELD PGMEPAAHXL
2301 WDLTPLSPAP
PASLDLALAP APSLPGDMGD GILPCHLECS EAATEKPSPF
2351 QVPSEDCAAN
GPTETSPNPP XPAPAKAENE EAAAXPAWER GAWPEGAERS
2401 SRPDTXLSPE
QPVCPXGGSG GPPSSASPEV EAGPQGCXTE PRPHRGELSP
2451 SFLNPPLPPS
IDDRDLSTEE VRLVGRGGRR RVGGPGTTGX PXPVTDETPP
2501 TSASDSGSSQ
SDSDVPPETE ECPSITAEAA LDSDEDGDFL PVDKXGGVSG
2551 THHPRPGHDP
PPLPQPDXRP SPPRPDVCMA DPEGLSSESG RXERLRXKEK
2601 VQGRVGRRAP
GKDKPVSPXR RLXLRGKRSP TPGKGSXDRV SRXPXRSRSX
2651 TSQVTPAEEK
DGHSPMSKGL VNGLKAGPXA LSSKGSSGAP VYVDLAYIPN
2701 HWSGKTADLD
FFRRVRASYY VVSGNDPANG EPSRAVLDAL LEGKAQWGEN
2751 LQVKVTLIPT
HDTEVTREWY QQTHEQQQQL NVLVLASSST VVMQDESFPA
2801 CKIEF  （配列番号７）
【００７６】
Microtubule-associated
protein 1A由来ペプチド
FYPGHMQEP  （配列番号８）
【００７７】
〔５〕  Complement C3
precursor
配列番号１０のComplement
C3 precursor由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
0001 MGPTSGPSLL
LLLLTHLPLA LGSPMYSIIT PNILRLESEE TMVLEAHDAQ
0051 GDVPVTVTVH
DFPGKKLVLS SEKTVLTPAT NHMGNVTFTI PANREFKSEK
0101 GRNKFVTVQA
TFGTQVVEKV VLVSLQSGYL FIQTDKTIYT PGSTVLYRIF
0151 TVNHKLLPVG
RTVMVNIENP EGIPVKQDSL SSQNQLGVLP LSWDIPELVN
0201 MGQWKIRAYY
ENSPQQVFST EFEVKEYVLP SFEVIVEPTE KFYYIYNEKG
0251 LEVTITARFL
YGKKVEGTAF VIFGIQDGEQ RISLPESLKR IPIEDGSGEV
0301 VLSRKVLLDG
VQNPRAEDLV GKSLYVSATV ILHSGSDMVQ AERSGIPIVT
0351 SPYQIHFTKT
PKYFKPGMPF DLMVFVTNPD GSPAYRVPVA VQGEDTVQSL
0401 TQGDGVAKLS
INTHPSQKPL SITVRTKKQE LSEAEQATRT MQALPYSTVG
0451 NSNNYLHLSV
LRTELRPGET LNVNFLLRMD RAHEAKIRYY TYLIMNKGRL
0501 LKAGRQVREP
GQDLVVLPLS ITTDFIPSFR LVAYYTLIGA SGQREVVADS
0551 VWVDVKDSCV
GSLVVKSGQS EDRQPVPGQQ MTLKIEGDHG ARVVLVAVDK
0601 GVFVLNKKNK
LTQSKIWDVV EKADIGCTPG SGKDYAGVFS DAGLTFTSSS
0651 GQQTAQRAEL
QCPQPAARRR RSVQLTEKRM DKVGKYPKEL RKCCEDGMRE
0701 NPMRFSCQRR
TRFISLGEAC KKVFLDCCNY ITELRRQHAR ASHLGLARSN
0751 LDEDIIAEEN
IVSRSEFPES WLWNVEDLKE PPKNGISTKL MNIFLKDSIT
0801 TWEILAVSMS
DKKGICVADP FEVTVMQDFF IDLRLPYSVV RNEQVEIRAV
0851 LYNYRQNQEL
KVRVELLHNP AFCSLATTKR RHQQTVTIPP KSSLSVPYVI
0901 VPLKTGLQEV
EVKAAVYHHF ISDGVRKSLK VVPEGIRMNK TVAVRTLDPE
0951 RLGREGVQKE
DIPPADLSDQ VPDTESETRI LLQGTPVAQM TEDAVDAERL
1001 KHLIVTPSGC
GEQNMIGMTP TVIAVHYLDE TEQWEKFGLE KRQGALELIK
1051 KGYTQQLAFR
QPSSAFAAFV KRAPSTWLTA YVVKVFSLAV NLIAIDSQVL
1101 CGAVKWLILE
KQKPDGVFQE DAPVIHQEMI GGLRNNNEKD MALTAFVLIS
1151 LQEAKDICEE
QVNSLPGSIT KAGDFLEANY MNLQRSYTVA IAGYALAQMG
1201 RLKGPLLNKF
LTTAKDKNRW EDPGKQLYNV EATSYALLAL LQLKDFDFVP
1251 PVVRWLNEQR
YYGGGYGSTQ ATFMVFQALA QYQKDAPDHQ ELNLDVSLQL
1301 PSRSSKITHR
IHWESASLLR SEETKENEGF TVTAEGKGQG TLSVVTMYHA
1351 KAKDQLTCNK
FDLKVTIKPA PETEKRPQDA KNTMILEICT RYRGDQDATM
1401 SILDISMMTG
FAPDTDDLKQ LANGVDRYIS KYELDKAFSD RNTLIIYLDK
1451 VSHSEDDCLA
FKVHQYFNVE LIQPGAVKVY AYYNLEESCT RFYHPEKEDG
1501 KLNKLCRDEL
CRCAEENCFI QKSDDKVTLE ERLDKACEPG VDYVYKTRLV
1551 KVQLSNDFDE YIMAIEQTIK
SGSDEVQVGQ QRTFISPIKC REALKLEEKK
1601 HYLMWGLSSD
FWGEKPNLSY IIGKDTWVEH WPEEDECQDE ENQKQCQDLG
1651 AFTESMVVFG CPN  （配列番号９）
【００７８】
Complement C3
precursorペプチド
APDHQELNLDVSLQLPSR  （配列番号１０）
【００７９】
〔６〕  Histone
deacetylase 8
配列番号１２のHistone
deacetylase 8由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MEEPEEPADS
GQSLVPVYIY SPEYVSMCDS PAKIPKRASM VHSLIEAYAL
051 HKQMRIVKPK
VASMEEMATF HTDAYLQHLQ KVSQEGDDDH PDSIEYGLGY
101 DCPATEGIFD
YAAAIGGATI TAAQCLIDGM CKVAINWSGG WHHAKKDEAS
151 GFCYLNDAVL
GILRLRRKFE RILYVDLDLH HGDGVEDAFS FTSKVMTVSL
201 HKFSPGFFPG
TGDVSDVGLG KGRYYSVNVP IQDGIQDEKY YQICESVLKE
251 VYQAFNPKAV
VLQLGADTIA GDPMCSFNMT PVGIGKCLKY ILQWQLATLI
301 LGGGGYNLAN
TARCWTYLTG VILGKTLSSE IPDHEFFTAY GPDYVLEITP
351 SCRPDRNEPH
RIQQILNYIK GNLKHVV  （配列番号１１）
【００８０】
Histone deacetylase
8由来ペプチド
DYAAAIGGAT  （配列番号１２）
【００８１】
〔７〕  Alpha-1-antitrypsin
precursor
配列番号１４のAlpha-1-antitrypsin
precursor由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MPSSVSWGIL
LLAGLCCLVP VSLAEDPQGD AAQKTDTSHH DQDHPTFNKI
051 TPNLAEFAFS
LYRQLAHQSN STNIFFSPVS IATAFAMLSL GTKADTHDEI
101 LEGLNFNLTE
IPEAQIHEGF QELLRTLNQP DSQLQLTTGN GLFLSEGLKL
151 VDKFLEDVKK
LYHSEAFTVN FGDTEEAKKQ INDYVEKGTQ GKIVDLVKEL
201 DRDTVFALVN
YIFFKGKWER PFEVKDTEEE DFHVDQVTTV KVPMMKRLGM
251 FNIQHCKKLS
SWVLLMKYLG NATAIFFLPD EGKLQHLENE LTHDIITKFL
301 ENEDRRSASL
HLPKLSITGT YDLKSVLGQL GITKVFSNGA DLSGVTEEAP
351 LKLSKAVHKA
VLTIDEKGTE AAGAMFLEAI PMSIPPEVKF NKPFVFLMIE
401 QNTKSPLFMG
KVVNPTQK  （配列番号１３）
【００８２】
Alpha-1-antitrypsin
precursor由来ペプチド
TEEEDFHVD  （配列番号１４）
【００８３】
〔８〕  Chromosome 10
open reading frame 76
配列番号１６のChromosome
10 open reading frame 76由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MTLCALIRGV
HQKNKSTSGF DIINMLMGFD KAELCMKNLM ESLDSLLCAE
051 GSESLKSLCL
KLLLCLVTVT DNISQNTILE YVMINSIFEA ILQILSHPPS
101 RREHGYDAVV
LLALLVNYRK YESVNPYIVK LSIVDDEATL NGMGLVIAQA
151 LSEYNRQYKD
KEEEHQSGFF SALTNMVGSM FIADAHEKIS VQTNEAILLA
201 LYEAVHLNRN
FITVLAQVGH IKNPSVFFSL NFIPINSIEK PIWLYLFKPC
251 FALSHPEMGL
VTTPVSPAPT TPPMRHRKKA ADKNLPCRPL VCAVLDLMVE
301 FIVTHMMKEF
PMDLYIRCIQ VVHKLLCYQK KCRVRLHYTW RELWSALINL
351 LKFLMSNETV
LLAKHNIFTL ALMIVNLFNM FITYGDTFLP TPSSYDELYY
401 EIIRMHQSFD
NLYSMVLRLS TNAGQWKEAA SKVTHALVNI RAIINHFNPK
451 IESYAAVNHI
SQLSEEQVLE VVRANYDTLT LKLQDGLDQY ERYSEQHKEA
501 AFFKELVRSI
STNVRRNLAF HTLSQEVLLK EFSTIS  （配列番号１５）
【００８４】
Chromosome 10 open
reading frame 76由来ペプチド
VLEVVRANYDT  （配列番号１６）
【００８５】
〔９〕  Rearranged
immunoglobulin heavy chain variable region
配列番号１８のRearranged
immunoglobulin heavy chain variable region由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 YTFTSYDINW
VRQATGQGLE WMGWMNPNSG NTGYAQKFQG RVTMTRDTSI
051 STAYMELSSL GSEDTAVYYC
ARG  （配列番号１７）
【００８６】
Rearranged
immunoglobulin heavy chain variable region由来ペプチド
SISTAYMELSSLG  （配列番号１８）
【００８７】
〔１０〕  F-box/LRR-repeat protein 8
配列番号２０のF-box/LRR-repeat
protein 8由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MAEPGEGLPE
EVLALIFRHL SLRDRAAAAR VCRAWAAAAT CSAVWHDTKI
051 SCECELEGML
PPYLSACLDH IHNLRLEFEP SRKPSRRAAI ELLMVLAGRA
101 PGLRGLRLEC
RGEKPLFDAG RDVLEAVHAV CGAASQLRHL DLRRLSFTLD
151 DALVLQAARS
CPELHSLFLD NSTLVGSVGP GSVLELLEAC PRLRALGLHL
201 ASLSHAILEA LAAPDRAPFA
LLALRCACPE DARASPLPNE AWVALRRRHP
251 GLAVELELEP
ALPAESVTRV LQPAVPVAAL RLNLSGDTVG PVRFAAHHYA
301 ATLCALEVRA
AASAELNAAL EELAARCAAL REVHCFCVVS HSVLDAFRAH
351 CPRLRTYTLK
LTREPHPWRP TLVA  （配列番号１９）
【００８８】
F-box/LRR-repeat
protein 8由来ペプチド
LRALGLHLASLSHAILEALA  （配列番号２０）
【００８９】
〔１１〕  Immunoglobulin
lambda light chain variable region
配列番号２２のImmunoglobulin
lambda light chain variable region由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 SYVVTQPPSV
SVAPGQTATI TCGGDDFEFL GVHWYQQRPG QAPLLVIHSD
051 SDRPSGIPER
FSGSNSGNTA TLTITRVEAG DEADYYCQVW DITSDPVIFG
101 GGTKLTVL  （配列番号２１）
【００９０】
Immunoglobulin
lambda light chain variable region由来ペプチド
QPPSVSVAPGQTATITCGGD  （配列番号２２）
【００９１】
〔１２〕  Ig gamma-1
chain C region
配列番号２４のIg gamma-1
chain C region由来ペプチドが肝がん患者で特異的に出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 ASTKGPSVFP
LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
051 HTFPAVLQSS
GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES
101 KYGPPCPSCP
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED
151 PEVQFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK
201 CKVSNKGLPS
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK
251 GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG
301 NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSLGK  （配列番号２３）
【００９２】
Ig gamma-1 chain C
region由来ペプチド
IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD  （配列番号２４）
【００９３】
〔１３〕  Alpha-2-macroglobulin
precursor
配列番号２６のAlpha-2-macroglobulin
precursor由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
0001 MGKNKLLHPS
LVLLLLVLLP TDASVSGKPQ YMVLVPSLLH TETTEKGCVL
0051 LSYLNETVTV
SASLESVRGN RSLFTDLEAE NDVLHCVAFA VPKSSSNEEV
0101 MFLTVQVKGP
TQEFKKRTTV MVKNEDSLVF VQTDKSIYKP GQTVKFRVVS
0151 MDENFHPLNE
LIPLVYIQDP KGNRIAQWQS FQLEGGLKQF SFPLSSEPFQ
0201 GSYKVVVQKK
SGGRTEHPFT VEEFVLPKFE VQVTVPKIIT ILEEEMNVSV
0251 CGLYTYGKPV
PGHVTVSICR KYSDASDCHG EDSQAFCEKF SGQLNSHGCF
0301 YQQVKTKVFQ
LKRKEYEMKL HTEAQIQEEG TVVELTGRQS SEITRTITKL
0351 SFVKVDSHFR
QGIPFFGQVR LVDGKGVPIP NKVIFIRGNE ANYYSNATTD
0401 EHGLVQFSIN
TTNVMGTSLT VRVNYKDRSP CYGYQWVSEE HEEAHHTAYL
0451 VFSPSKSFVH
LEPMSHELPC GHTQTVQAHY ILNGGTLLGL KKLSFYYLIM
0501 AKGGIVRTGT
HGLLVKQEDM KGHFSISIPV KSDIAPVARL LIYAVLPTGD
0551 VIGDSAKYDV
ENCLANKVDL SFSPSQSLPA SHAHLRVTAA PQSVCALRAV
0601 DQSVLLMKPD
AELSASSVYN LLPEKDLTGF PGPLNDQDDE DCINRHNVYI
0651 NGITYTPVSS
TNEKDMYSFL EDMGLKAFTN SKIRKPKMCP QLQQYEMHGP
0701 EGLRVGFYES
DVMGRGHARL VHVEEPHTET VRKYFPETWI WDLVVVNSAG
0751 VAEVGVTVPD
TITEWKAGAF CLSEDAGLGI SSTASLRAFQ PFFVELTMPY
0801 SVIRGEAFTL
KATVLNYLPK CIRVSVQLEA SPAFLAVPVE KEQAPHCICA
0851 NGRQTVSWAV
TPKSLGNVNF TVSAEALESQ ELCGTEVPSV PEHGRKDTVI
0901 KPLLVEPEGL
EKETTFNSLL CPSGGEVSEE LSLKLPPNVV EESARASVSV
0951 LGDILGSAMQ
NTQNLLQMPY GCGEQNMVLF APNIYVLDYL NETQQLTPEV
1001 KSKAIGYLNT
GYQRQLNYKH YDGSYSTFGE RYGRNQGNTW LTAFVLKTFA
1051 QARAYIFIDE
AHITQALIWL SQRQKDNGCF RSSGSLLNNA IKGGVEDEVT
1101 LSAYITIALL
EIPLTVTHPV VRNALFCLES AWKTAQEGDH GSHVYTKALL
1151 AYAFALAGNQ
DKRKEVLKSL NEEAVKKDNS VHWERPQKPK APVGHFYEPQ
1201 APSAEVEMTS
YVLLAYLTAQ PAPTSEDLTS ATNIVKWITK QQNAQGGFSS
1251 TQDTVVALHA
LSKYGAATFT RTGKAAQVTI QSSGTFSSKF QVDNNNRLLL
1301 QQVSLPELPG
EYSMKVTGEG CVYLQTSLKY NILPEKEEFP FALGVQTLPQ
1351 TCDEPKAHTS
FQISLSVSYT GSRSASNMAI VDVKMVSGFI PLKPTVKMLE
1401 RSNHVSRTEV SSNHVLIYLD
KVSNQTLSLF FTVLQDVPVR DLKPAIVKVY
1451 DYYETDEFAI
AEYNAPCSKD LGNA  （配列番号２５）
【００９４】
Alpha-2-macroglobulin
precursor由来ペプチド
VPVRDLKPAIVKVYD  （配列番号２６）
【００９５】
〔１４〕  Rho/rac guanine
nucleotide exchange factor 2
配列番号２８のRho/rac
guanine nucleotide exchange factor 2由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MCCCCGCCPL
LAHLEQGSLR ERTREKEKMK EAKDARYTNG HLFTTISVSG
051 MTMCYACNKS
ITAKEALICP TCNVTIHNRC KDTLANCTKV KQKQQKAALL
101 KNNTALQSVS
LRSKTTIRER PSSAIYPSDS FRQSLLGSRR GRSSLSLAKS
151 VSTTNIAGHF
NDESPLGLRR ILSQSTDSLN MRNRTLSVES LIDEAEVIYS
201 ELMSDFEMDE
KDFAADSWSL AVDSSFLQQH KKEVMKQQDV IYELIQTELH
251 HVRTLKIMTR
LFRTGMLEEL HLEPGVVQGL FPCVDELSDI HTRFLSQLLE
301 RRRQALCPGS
TRNFVIHRLG DLLISQFSGP SAEQMCKTYS EFCSRHSKAL
351 KLYKELYARD
KRFQQFIRKV TRPAVLKRHG VQECILLVTQ RITKYPLLIS
401 RILQHSHGIE
EERQDLTTAL GLVKELLSNV DEGIYQLEKG ARLQEIYNRM
451 DPRAQTPVPG
KGPFGREELL RRKLIHDGCL LWKTATGRFK DVLVLLMTDV
501 LVFLQEKDQK
YIFPTLDKPS VVSLQNLIVR DIANQEKGMF LISAAPPEMY
551 EVHTASRDDR
STWIRVIQQS VRTCPSREDF PLIETEDEAY LRRIKMELQQ
601 KDRALVELLR
EKVGLFAEMT HFQAEEDGGS GMALPTLPRG LFRSESLESP
651 RGERLLQDAI
REVEGLKDLL VGPGVELLLT PREPALPLEP DSGGNTSPGV
701 TANGEARTFN
GSIELCRADS DSSQRDRNGN QLRSPQEEAL QRLVNLYGLL
751 HGLQAAVAQQ
DTLMEARFPE GPERREKLCR ANSRDGEAGR AGAAPVAPEK
801 QATELALLQR
QHALLQEELR RCRRLGEERA TEAGSLEARL RESEQARALL
851 EREAEEARRQ
LAALGQTEPL PAEAPWARRP VDPRRRSLPA GDALYLSFNP
901 PQPSRGTDRL
DLPVTTRSVH RNFEDRERQE LGSPEERLQD SSDPDTGSEE
951 EGSSRLSPPH
SPRDFTRMQD IPEETESRDG EAVASES  (配列番号２７）
【００９６】
Rho/rac guanine
nucleotide exchange factor 2由来ペプチド
ALGLVKELLSNVD  （配列番号２８）
【００９７】
〔１５〕  Complement C3
precursor
配列番号２９のComplement
C3 precursor由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
0001 MGPTSGPSLL
LLLLTHLPLA LGSPMYSIIT PNILRLESEE TMVLEAHDAQ
0051 GDVPVTVTVH
DFPGKKLVLS SEKTVLTPAT NHMGNVTFTI PANREFKSEK
0101 GRNKFVTVQA
TFGTQVVEKV VLVSLQSGYL FIQTDKTIYT PGSTVLYRIF
0151 TVNHKLLPVG
RTVMVNIENP EGIPVKQDSL SSQNQLGVLP LSWDIPELVN
0201 MGQWKIRAYY
ENSPQQVFST EFEVKEYVLP SFEVIVEPTE KFYYIYNEKG
0251 LEVTITARFL
YGKKVEGTAF VIFGIQDGEQ RISLPESLKR IPIEDGSGEV
0301 VLSRKVLLDG VQNPRAEDLV
GKSLYVSATV ILHSGSDMVQ AERSGIPIVT
0351 SPYQIHFTKT
PKYFKPGMPF DLMVFVTNPD GSPAYRVPVA VQGEDTVQSL
0401 TQGDGVAKLS
INTHPSQKPL SITVRTKKQE LSEAEQATRT MQALPYSTVG
0451 NSNNYLHLSV
LRTELRPGET LNVNFLLRMD RAHEAKIRYY TYLIMNKGRL
0501 LKAGRQVREP
GQDLVVLPLS ITTDFIPSFR LVAYYTLIGA SGQREVVADS
0551 VWVDVKDSCV
GSLVVKSGQS EDRQPVPGQQ MTLKIEGDHG ARVVLVAVDK
0601 GVFVLNKKNK
LTQSKIWDVV EKADIGCTPG SGKDYAGVFS DAGLTFTSSS
0651 GQQTAQRAEL
QCPQPAARRR RSVQLTEKRM DKVGKYPKEL RKCCEDGMRE
0701 NPMRFSCQRR
TRFISLGEAC KKVFLDCCNY ITELRRQHAR ASHLGLARSN
0751 LDEDIIAEEN
IVSRSEFPES WLWNVEDLKE PPKNGISTKL MNIFLKDSIT
0801 TWEILAVSMS
DKKGICVADP FEVTVMQDFF IDLRLPYSVV RNEQVEIRAV
0851 LYNYRQNQEL
KVRVELLHNP AFCSLATTKR RHQQTVTIPP KSSLSVPYVI
0901 VPLKTGLQEV
EVKAAVYHHF ISDGVRKSLK VVPEGIRMNK TVAVRTLDPE
0951 RLGREGVQKE
DIPPADLSDQ VPDTESETRI LLQGTPVAQM TEDAVDAERL
1001 KHLIVTPSGC
GEQNMIGMTP TVIAVHYLDE TEQWEKFGLE KRQGALELIK
1051 KGYTQQLAFR
QPSSAFAAFV KRAPSTWLTA YVVKVFSLAV NLIAIDSQVL
1101 CGAVKWLILE
KQKPDGVFQE DAPVIHQEMI GGLRNNNEKD MALTAFVLIS
1151 LQEAKDICEE
QVNSLPGSIT KAGDFLEANY MNLQRSYTVA IAGYALAQMG
1201 RLKGPLLNKF
LTTAKDKNRW EDPGKQLYNV EATSYALLAL LQLKDFDFVP
1251 PVVRWLNEQR
YYGGGYGSTQ ATFMVFQALA QYQKDAPDHQ ELNLDVSLQL
1301 PSRSSKITHR
IHWESASLLR SEETKENEGF TVTAEGKGQG TLSVVTMYHA
1351 KAKDQLTCNK
FDLKVTIKPA PETEKRPQDA KNTMILEICT RYRGDQDATM
1401 SILDISMMTG
FAPDTDDLKQ LANGVDRYIS KYELDKAFSD RNTLIIYLDK
1451 VSHSEDDCLA
FKVHQYFNVE LIQPGAVKVY AYYNLEESCT RFYHPEKEDG
1501 KLNKLCRDEL
CRCAEENCFI QKSDDKVTLE ERLDKACEPG VDYVYKTRLV
1551 KVQLSNDFDE
YIMAIEQTIK SGSDEVQVGQ QRTFISPIKC REALKLEEKK
1601 HYLMWGLSSD
FWGEKPNLSY IIGKDTWVEH WPEEDECQDE ENQKQCQDLG
1651 AFTESMVVFG CPN  （配列番号９）
【００９８】
Complement C3
precursor由来ペプチド
PERLGREGVQKEDIPPAD  （配列番号２９）
【００９９】
〔１６〕  Ig gamma-1
chain C region
配列番号３０のIg gamma-1
chain C region由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 ASTKGPSVFP
LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
051 HTFPAVLQSS
GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP
101 KSCDKTHTCP
PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS
151 HEDPEVKFNW
YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK
201 EYKCKVSNKA
LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC
251 LVKGFYPSDI
AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
301 QQGNVFSCSV
MHEALHNHYT QKSLSLSPGK  （配列番号２３）
【０１００】
Ig gamma-1 chain C
region由来ペプチド
IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD  （配列番号３０）
【０１０１】
〔１７〕  Putative
GTP-binding protein Parf
配列番号３２のPutative
GTP-binding protein Parf由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 LGSVPGGRRR GCQAPGTGMA
FGLQMFIQRK FPYPLQWSLL VAVVAGSVVS
051 YGVTRVESEK
CNNLWLFLET GQLPKDRSTE QCRALQIQGV KENMDQNKAT
101 LALLRSNIRR
GAQDWALAKK VVREKLRKYV FDRVNMHNLL IHLVRRRGQK
151 LESMQLELDS
LRSQPDASKE ELRLLQIIRQ LENNIEKTMI KIITSQNIHL
201 LYLDLLDYLK
TVSPAAREGR GSGAGIWEGR ERP  （配列番号３１）
【０１０２】
Putative GTP-binding
protein Parf由来ペプチド
QAPGTGMAFGLQ  （配列番号３２）
【０１０３】
〔１８〕  Ig lambda chain
C regions
配列番号３４のIg lambda
chain C regions由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 QPKAAPSVTL
FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA
051 GVETTTPSKQ
SNNKYAASSY LSLTPEQWKS HRSYSCQVTH EGSTVEKTVA
101 PTECS  （配列番号３３）
【０１０４】
Ig lambda chain C
regions由来ペプチド
FYPGAVTVAWKAD  （配列番号３４）
【０１０５】
〔１９〕  Zinc finger
protein ZIC 1
配列番号３６のZinc finger
protein ZIC 1由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MLLDAGPQYP
AIGVTTFGAS RHHSAGDVAE RDVGLGINPF ADGMGAFKLN
051 PSSHELASAG
QTAFTSQAPG YAAAAALGHH HHPGHVGSYS SAAFNSTRDF
101 LFRNRGFGDA AAAASAQHSL
FAASAGGFGG PHGHTDAAGH LLFPGLHEQA
151 AGHASPNVVN
GQMRLGFSGD MYPRPEQYGQ VTSPRSEHYA APQLHGYGPM
201 NVNMAAHHGA
GAFFRYMRQP IKQELICKWI EPEQLANPKK SCNKTFSTMH
251 ELVTHVTVEH
VGGPEQSNHI CFWEECPREG KPFKAKYKLV NHIRVHTGEK
301 PFPCPFPGCG
KVFARSENLK IHKRTHTGEK PFKCEFEGCD RRFANSSDRK
351 KHMHVHTSDK
PYLCKMCDKS YTHPSSVRKH MKVHESSSQG SQPSPAASSG
401 YESSTPPTIV SPSTDNPTTS
SLSPSSSAVH HTAGHSALSS NFNEWYV  （配列番号３５）
【０１０６】
Zinc finger protein
ZIC 1由来ペプチド
NPTTSSLSPSSSAVH  （配列番号３６）
【０１０７】
〔２０〕  Neuroserpin
precursor
配列番号３８のNeuroserpin
precursor由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MAFLGLFSLL
VLQSMATGAT FPEEAIADLS VNMYNRLRAT GEDENILFSP
051 LSIALAMGMM
ELGAQGSTQK EIRHSMGYDS LKNGEEFSFL KEFSNMVTAK
101 ESQYVMKIAN
SLFVQNGFHV NEEFLQMMKK YFNAAVNHVD FSQNVAVANY
151 INKWVENNTN NLVKDLVSPR
DFDAATYLAL INAVYFKGNW KSQFRPENTR
201 TFSFTKDDES
EVQIPMMYQQ GEFYYGEFSD GSNEAGGIYQ VLEIPYEGDE
251 ISMMLVLSRQ
EVPLATLEPL VKAQLVEEWA NSVKKQKVEV YLPRFTVEQE
301 IDLKDVLKAL
GITEIFIKDA NLTGLSDNKE IFLSKAIHKS FLEVNEEGSE
351 AAAVSGMIAI
SRMAVLYPQV IVDHPFFFLI RNRRTGTILF MGRVMHPETM
401 NTSGHDFEEL  （配列番号３７）
【０１０８】
Neuroserpin
precursor由来ペプチド
MGMMELGAQGST  （配列番号３８）
【０１０９】
なお、上記部分ペプチドはメチオニン残基が酸化した状態であった。酸化したメチオニン残基はＮ末端から１、３、４番目であった。
【０１１０】
〔２１〕  Ubiquitin-conjugating
enzyme E2 U
配列番号４０のUbiquitin-conjugating
enzyme E2 U由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MHGRAYLLLH
RDFCDLKENN YKGITAKPVS EDMMEWEVEI EGLQNSVWQG
051 LVFQLTIHFT
SEYNYAPPVV KFITIPFHPN VDPHTGQPCI DFLDNPEKWN
101 TNYTLSSILL
ALQVMLSNPV LENPVNLEAA RILVKDESLY RTILRLFNRP
151 LQMKDDSQEL
PKDPRKCIRP IKTTSFSDYY QTWSRIATSK ATEYYRTPLL
201 KVPNFIGQYY
KWKKMDLQHQ KEWNLKYSVI KCWLARKRMP HEVTHSMEEI
251 KLCPTLIPTT
DEIFLESPTA INSITDIYET EEEGWKSDTS LYENDTDEPR
301 EEEVEDLISW
TNTLNTNTSE D  （配列番号３９）
【０１１１】
Ubiquitin-conjugating
enzyme E2 U由来ペプチド
YKGITAKP  （配列番号４０）
【０１１２】
〔２２〕  Hemoglobin
subunit alpha
配列番号４２のHemoglobin
subunit alpha由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MVLSPADKTN
VKAAWGKVGA HAGEYGAEAL ERMFLSFPTT KTYFPHFDLS
051 HGSAQVKGHG
KKVADALTNA VAHVDDMPNA LSALSDLHAH KLRVDPVNFK
101 LLSHCLLVTL
AAHLPAEFTP AVHASLDKFL ASVSTVLTSK YR  （配列番号４１）
【０１１３】
Hemoglobin subunit
alpha由来ペプチド
DMPNALSALSDLHAHKLRVD  （配列番号４２）
【０１１４】
〔２３〕  Serum albumin
precursor
配列番号４４のSerum
albumin precursor由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MKWVTFISLL
FLFSSAYSRG VFRRDAHKSE VAHRFKDLGE ENFKALVLIA
051 FAQYLQQCPF
EDHVKLVNEV TEFAKTCVAD ESAENCDKSL HTLFGDKLCT
101 VATLRETYGE
MADCCAKQEP ERNECFLQHK DDNPNLPRLV RPEVDVMCTA
151 FHDNEETFLK
KYLYEIARRH PYFYAPELLF FAKRYKAAFT ECCQAADKAA
201 CLLPKLDELR
DEGKASSAKQ RLKCASLQKF GERAFKAWAV ARLSQRFPKA
251 EFAEVSKLVT DLTKVHTECC
HGDLLECADD RADLAKYICE NQDSISSKLK
301 ECCEKPLLEK
SHCIAEVEND EMPADLPSLA ADFVESKDVC KNYAEAKDVF
351 LGMFLYEYAR
RHPDYSVVLL LRLAKTYETT LEKCCAAADP HECYAKVFDE
401 FKPLVEEPQN
LIKQNCELFE QLGEYKFQNA LLVRYTKKVP QVSTPTLVEV
451 SRNLGKVGSK
CCKHPEAKRM PCAEDYLSVV LNQLCVLHEK TPVSDRVTKC
501 CTESLVNRRP
CFSALEVDET YVPKEFNAET FTFHADICTL SEKERQIKKQ
551 TALVELVKHK
PKATKEQLKA VMDDFAAFVE KCCKADDKET CFAEEGKKLV
601 AASQAALGL  （配列番号４３）
【０１１５】
Serum albumin
precursor由来ペプチド
NPNLPRLVRPEVD  （配列番号４４）
【０１１６】
〔２４〕  Alpha-2-HS-glycoprotein
precursor
配列番号４６のAlpha-2-HS-glycoprotein
precursor由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MKSLVLLLCL
AQLWGCHSAP HGPGLIYRQP NCDDPETEEA ALVAIDYINQ
051 NLPWGYKHTL
NQIDEVKVWP QQPSGELFEI EIDTLETTCH VLDPTPVARC
101 SVRQLKEHAV
EGDCDFQLLK LDGKFSVVYA KCDSSPDSAE DVRKVCQDCP
151 LLAPLNDTRV
VHAAKAALAA FNAQNNGSNF QLEEISRAQL VPLPPSTYVE
201 FTVSGTDCVA
KEATEAAKCN LLAEKQYGFC KATLSEKLGG AEVAVTCTVF
251 QTQPVTSQPQ
PEGANEAVPT PVVDPDAPPS PPLGAPGLPP AGSPPDSHVL
301 LAAPPGHQLH
RAHYDLRHTF MGVVSLGSPS GEVSHPRKTR TVVQPSVGAA
351 AGPVVPPCPG  （配列番号４５）
【０１１７】
Alpha-2-HS-glycoprotein
precursor由来ペプチド
APPSPPLGAPGLPPAGSPPD  （配列番号４６）
【０１１８】
〔２５〕  lymphocyte-specific
protein 1
配列番号４８のlymphocyte-specific
protein 1由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MAEASSDPGA
EEREELLGPT AQWSVEDEEE AVHEQCQHER DRQLQAQDEE
051 GGGHVPERPK
QEMLLSLKPS EAPELDEDEG FGDWSQRPEQ RQQHEGAQGA
101 LDSGEPPQCR
SPEGEQEDRP GLHAYEKEDS DEVHLEELSL SKEGPGPEDT
151 VQDNLGAAGA
EEEQEEHQKC QQPRTPSPLV LEGTIEQSSP PLSPTTKLID
201 RTESLNRSIE
KSNSVKKSQP DLPISKIDQW LEQYTQAIET AGRTPKLARQ
251 ASIELPSMAV
ASTKSRWETG EVQAQSAAKT PSCKDIVAGD MSKKSLWEQK
301 GGSKTSSTIK
STPSGKRYKF VATGHGKYEK VLVEGGPAP  （配列番号４７）
【０１１９】
lymphocyte-specific
protein 1由来ペプチド
DSDEVHLEELSLSK  （配列番号４８）
【０１２０】
〔２６〕  Apolipoprotein
M
配列番号５０のApolipoprotein
M由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MFHQIWAALL
YFYGIILNSI YQCPEHSQLT TLGVDGKEFP EVHLGQWYFI
051 AGAAPTKEEL
ATFDPVDNIV FNMAAGSAPM QLHLRATIRM KDGLCVPRKW
101 IYHLTEGSTD
LRTEGRPDMK TELFSSSCPG GIMLNETGQG YQRFLLYNRS
151 PHPPEKCVEE
FKSLTSCLDS KAFLLTPRNQ EACELSNN  （配列番号４９）
【０１２１】
Apolipoprotein M由来ペプチド
GAAPTKEELATFDP  （配列番号５０）
【０１２２】
〔２７〕  Brefeldin
A-inhibited guanine nucleotide-exchange protein 3
配列番号５２のBrefeldin
A-inhibited guanine nucleotide-exchange protein 3由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
0001 MEEILRKLQK EASGSKYKAI
KESCTWALET LGGLDTIVKI PPHVLREKCL
0051 LPLQLALESK
NVKLAQHALA GMQKLLSEER FVSMETDSDE KQLLNQILNA
0101 VKVTPSLNED
LQVEVMKVLL CITYTPTFDL NGSAVLKIAE VCIETYISSC
0151 HQRSINTAVR
ATLSQMLSDL TLQLRQRQEN TIIENPDVPQ DFGNQGSTVE
0201 SLCDDVVSVL
TVLCEKLQAA INDSQQLQLL YLECILSVLS SSSSSMHLHR
0251 RFTDLIWKNL
CPALIVILGN PIHDKTITSA HTSSTSTSLE SDSASPGVSD
0301 HGRGSGCSCT
APALSGPVAR TIYYIAAELV RLVGSVDSMK PVLQSLYHRV
0351 LLYPPPQHRV
EAIKIMKEIL GSPQRLCDLA GPSSTESESR KRSISKRKSH
0401 LDLLKLIMDG
MTEACIKGGI EACYAAVSCV CTLLGALDEL SQGKGLSEGQ
0451 VQLLLLRLEE
LKDGAEWSRD SMEINEADFR WQRRVLSSEH TPWESGNERS
0501 LDISISVTTD
TGQTTLEGEL GQTTPEDHSG NHKNSLKSPA IPEGKETLSK
0551 VLETEAVDQP
DVVQRSHTVP YPDITNFLSV DCRTRSYGSR YSESNFSVDD
0601 QDLSRTEFDS
CDQYSMAAEK DSGRSDVSDI GSDNCSLADE EQTPRDCLGH
0651 RSLRTAALSL
KLLKNQEADQ HSARLFIQSL EGLLPRLLSL SNVEEVDTAL
0701 QNFASTFCSG
MMHSPGFDGN SSLSFQMLMN ADSLYTAAHC ALLLNLKLSH
0751 GDYYRKRPTL
APGVMKDFMK QVQTSGVLMV FSQAWIEELY HQVLDRNMLG
0801 EAGYWGSPED
NSLPLITMLT DIDGLESSAI GGQLMASAAT ESPFAQSRRI
0851 DDSTVAGVAF ARYILVGCWK
NLIDTLSTPL TGRMAGSSKG LAFILGAEGI
0901 KEQNQKERDA
ICMSLDGLRK AARLSCALGV AANCASALAQ MAAASCVQEE
0951 KEEREAQEPS
DAITQVKLKV EQKLEQIGKV QGVWLHTAHV LCMEAILSVG
1001 LEMGSHNPDC
WPHVFRVCEY VGTLEHNHFS DGASQPPLTI SQPQKATGSA
1051 GLLGDPECEG
SPPEHSPEQG RSLSTAPVVQ PLSIQDLVRE GSRGRASDFR
1101 GGSLMSGSSA
AKVVLTLSTQ ADRLFEDATD KLNLMALGGF LYQLKKASQS
1151 QLFHSVTDTV
DYSLAMPGEV KSTQDRKSAL HLFRLGNAML RIVRSKARPL
1201 LHVMRCWSLV
APHLVEAACH KERHVSQKAV SFIHDILTEV LTDWNEPPHF
1251 HFNEALFRPF
ERIMQLELCD EDVQDQVVTS IGELVEVCST QIQSGWRPLF
1301 SALETVHGGN
KSEMKEYLVG DYSMGKGQAP VFDVFEAFLN TDNIQVFANA
1351 ATSYIMCLMK
FVKGLGEVDC KEIGDCAPAP GAPSTDLCLP ALDYLRRCSQ
1401 LLAKIYKMPL
KPIFLSGRLA GLPRRLQEQS ASSEDGIESV LSDFDDDTGL
1451 IEVWIILLEQ
LTAAVSNCPR QHQPPTLDLL FELLRDVTKT PGPGFGIYAV
1501 VHLLLPVMSV
WLRRSHKDHS YWDMASANFK HAIGLSCELV VEHIQSFLHS
1551 DIRYESMINT
MLKDLFELLV ACVAKPTETI SRVGCSCIRY VLVTAGPVFT
1601 EEMWRLACCA
LQDAFSATLK PVKDLLGCFH SGTESFSGEG CQVRVAAPSS
1651 SPSAEAEYWR
IRAMAQQVFM LDTQCSPKTP NNFDHAQSCQ LIIELPPDEK
1701 PNGHTKKSVS
FREIVVSLLS HQVLLQNLYD ILLEEFVKGP SPGEEKTIQV
1751 PEAKLAGFLR
YISMQNLAVI FDLLLDSYRT AREFDTSPGL KCLLKKVSGI
1801 GGAANLYRQS
AMSFNIYFHA LVCAVLTNQE TITAEQVKKV LFEDDERSTD
1851 SSQQCSSEDE
DIFEETAQVS PPRGKEKRQW RARMPLLSVQ PVSNADWVWL
1901 VKRLHKLCME
LCNNYIQMHL DLENCMEEPP IFKGDPFFIL PSFQSESSTP
1951 STGGFSGKET
PSEDDRSQSR EHMGESLSLK AGGGDLLLPP SPKVEKKDPS
2001 RKKEWWENAG
NKIYTMAADK TISKLMTEYK KRKQQHNLSA FPKEVKVEKK
2051 GEPLGPRGQD
SPLLQRPQHL MDQGQMRHSF SAGPELLRQD KRPRSGSTGS
2101 SLSVSVRDAE
AQIQAWTNMV LTVLNQIQIL PDQTFTALQP AVFPCISQLT
2151 CHVTDIRVRQ
AVREWLGRVG RVYDIIV  （配列番号５１）
【０１２３】
Brefeldin
A-inhibited guanine nucleotide-exchange protein 3由来ペプチド
DSDEKQLLNQILNA  （配列番号５２）
【０１２４】
〔２８〕  Plasma
retinol-binding protein precursor
配列番号５４のPlasma
retinol-binding protein precursor由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MKWVWALLLL
AALGSGRAER DCRVSSFRVK ENFDKARFSG TWYAMAKKDP
051 EGLFLQDNIV
AEFSVDETGQ MSATAKGRVR LLNNWDVCAD MVGTFTDTED
101 PAKFKMKYWG
VASFLQKGND DHWIVDTDYD TYAVQYSCRL LNLDGTCADS
151 YSFVFSRDPN
GLPPEAQKIV RQRQEELCLA RQYRLIVHNG YCDGRSERNL
201 L  （配列番号５３）
【０１２５】
Plasma
retinol-binding protein precursor由来ペプチド
KARFSGTWYAMAKKD  （配列番号５４）
【０１２６】
なお、上記部分ペプチドはメチオニン残基が酸化した状態であった。酸化したメチオニン残基はＮ末端から１１番目であった。
【０１２７】
〔２９〕  Inter-alpha-trypsin
inhibitor heavy chain precursor
配列番号５６のInter-alpha-trypsin
inhibitor heavy chain precursor由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MKPPRPVRTC
SKVLVLLSLL AIHQTTTAEK NGIDIYSLTV DSRVSSRFAH
051 TVVTSRVVNR
ANTVQEATFQ MELPKKAFIT NFSMNIDGMT YPGIIKEKAE
101 AQAQYSAAVA
KGKSAGLVKA TGRNMEQFQV SVSVAPNAKI TFELVYEELL
151 KRRLGVYELL
LKVRPQQLVK HLQMDIHIFE PQGISFLETE STFMTNQLVD
201 ALTTWQNKTK
AHIRFKPTLS QQQKSPEQQE TVLDGNLIIR YDVDRAISGG
251 SIQIENGYFV
HYFAPEGLTT MPKNVVFVID KSGSMSGRKI QQTREALIKI
301 LDDLSPRDQF
NLIVFSTEAT QWRPSLVPAS AENVNKARSF AAGIQALGGT
351 NINDAMLMAV QLLDSSNQEE
RLPEGSVSLI ILLTDGDPTV GETNPRSIQN
401 NVREAVSGRY
SLFCLGFGFD VSYAFLEKLA LDNGGLARRI HEDSDSALQL
451 QDFYQEVANP
LLTAVTFEYP SNAVEEVTQN NFRLLFKGSE MVVAGKLQDR
501 GPDVLTATVS
GKLPTQNITF QTESSVAEQE AEFQSPKYIF HNFMERLWAY
551 LTIQQLLEQT
VSASDADQQA LRNQALNLSL AYSFVTPLTS MVVTKPDDQE
601 QSQVAEKPME
GESRNRNVHS GSTFFKYYLQ GAKIPKPEAS FSPRRGWNRQ
651 AGAAGSRMNF
RPGVLSSRLL GLPGPPDVPD HAAYHPFRRL AILPASAPPA
701 TSNPDPAVSR
VMNIKIEETT MTTQTPAPIQ APSAILPLPG QSVERLCVDP
751 RHRQGPVNLL
SDPEQGVEVT GQYEREKAGF SWIEVTFKNP LVWVHASPEH
801 VVVTRNRRSS
AYKWKETLFS VMPGLKMTMD KTGLLLLSDP DKVTIGLLFW
851 DGRGEGLRLL
LRDTDRFSSH VGGTLGQFYQ EVLWGSPAAS DDGRRTLRVQ
901 GNDHSATRER
RLDYQEGPPG VEISCWSVEL  （配列番号５５）
【０１２８】
Inter-alpha-trypsin
inhibitor heavy chain precursor
RLAILPASAPPATSNPD  （配列番号５６）
【０１２９】
なお、上記部分ペプチドは下に示すように糖鎖が付加された状態で存在した。
RLAILPASAPPATSNPD +
-GlcNAc-Hex-GlcNAc-Hex
【０１３０】
〔３０〕  GMP reductase 1
配列番号５８のGMP
reductase 1由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MPRIDADLKL
DFKDVLLRPK RSSLKSRAEV DLERTFTFRN SKQTYSGIPI
051 IVANMDTVGT FEMAAVMSQH
SMFTAIHKHY SLDDWKLFAT NHPECLQNVA
101 VSSGSGQNDL
EKMTSILEAV PQVKFICLDV ANGYSEHFVE FVKLVRAKFP
151 EHTIMAGNVV
TGEMVEELIL SGADIIKVGV GPGSVCTTRT KTGVGYPQLS
201 AVIECADSAH
GLKGHIISDG GCTCPGDVAK AFGAGADFVM LGGMFSGHTE
251 CAGEVFERNG
RKLKLFYGMS SDTAMNKHAG GVAEYRASEG KTVEVPYKGD
301 VENTILDILG
GLRSTCTYVG AAKLKELSRR ATFIRVTQQH NTVFS  （配列番号５７）
【０１３１】
GMP reductase 1由来ペプチド
VRAKFPEHTIMA  （配列番号５８）
【０１３２】
なお、上記部分ペプチドはメチオニン残基が酸化した状態であった。酸化したメチオニン残基はＮ末端から１１番目であった。
【０１３３】
〔３１〕  Alpha-2-antiplasmin
precursor
配列番号６０のAlpha-2-antiplasmin
precursor由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MALLWGLLVL
SWSCLQGPCS VFSPVSAMEP LGRQLTSGPN QEQVSPLTLL
051 KLGNQEPGGQ
TALKSPPGVC SRDPTPEQTH RLARAMMAFT ADLFSLVAQT
101 STCPNLILSP
LSVALALSHL ALGAQNHTLQ RLQQVLHAGS GPCLPHLLSR
151 LCQDLGPGAF
RLAARMYLQK GFPIKEDFLE QSEQLFGAKP VSLTGKQEDD
201 LANINQWVKE
ATEGKIQEFL SGLPEDTVLL LLNAIHFQGF WRNKFDPSLT
251 QRDSFHLDEQ
FTVPVEMMQA RTYPLRWFLL EQPEIQVAHF PFKNNMSFVV
301 LVPTHFEWNV
SQVLANLSWD TLHPPLVWER PTKVRLPKLY LKHQMDLVAT
351 LSQLGLQELF
QAPDLRGISE QSLVVSGVQH QSTLELSEVG VEAAAATSIA
401 MSRMSLSSFS
VNRPFLFFIF EDTTGLPLFV GSVRNPNPSA PRELKEQQDS
451 PGNKDFLQSL
KGFPRGDKLF GPDLKLVPPM EEDYPQFGSP K  （配列番号５９）
【０１３４】
Alpha-2-antiplasmin
precursor由来ペプチド
YPQFGSPK  （配列番号６０）
【０１３５】
〔３２〕  Ig gamma-2
chain C region
配列番号６２のIg gamma-2
chain C region由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 ASTKGPSVFP
LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
051 HTFPAVLQSS
GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTVER
101 KCCVECPPCP
APPVAGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP
151 EVQFNWYVDG
VEVHNAKTKP REEQFNSTFR VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC
201 KVSNKGLPAP
IEKTISKTKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLTCLVKG
251 FYPSDIAVEW
ESNGQPENNY KTTPPMLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN
301 VFSCSVMHEA
LHNHYTQKSL SLSPGK  （配列番号６１）
【０１３６】
Ig gamma-2 chain C
region由来ペプチド
VSHEDPEVQFNWYVD  （配列番号６２）
【０１３７】
〔３３〕  Ig gamma-1
chain C region
配列番号６３のIg gamma-1
chain C region由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 ASTKGPSVFP
LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
051 HTFPAVLQSS
GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP
101 KSCDKTHTCP
PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS
151 HEDPEVKFNW
YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK
201 EYKCKVSNKA
LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC
251 LVKGFYPSDI
AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
301 QQGNVFSCSV
MHEALHNHYT QKSLSLSPGK  （配列番号２３）
【０１３８】
Ig gamma-1 chain C
region由来ペプチド
VSHEDPEVKFNWYVD  （配列番号６３）
【０１３９】
〔３４〕  Serotransferrin
precursor
配列番号６５のSerotransferrin
precursor由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MRLAVGALLV
CAVLGLCLAV PDKTVRWCAV SEHEATKCQS FRDHMKSVIP
051 SDGPSVACVK
KASYLDCIRA IAANEADAVT LDAGLVYDAY LAPNNLKPVV
101 AEFYGSKEDP
QTFYYAVAVV KKDSGFQMNQ LRGKKSCHTG LGRSAGWNIP
151 IGLLYCDLPE
PRKPLEKAVA NFFSGSCAPC ADGTDFPQLC QLCPGCGCST
201 LNQYFGYSGA
FKCLKDGAGD VAFVKHSTIF ENLANKADRD QYELLCLDNT
251 RKPVDEYKDC
HLAQVPSHTV VARSMGGKED LIWELLNQAQ EHFGKDKSKE
301 FQLFSSPHGK
DLLFKDSAHG FLKVPPRMDA KMYLGYEYVT AIRNLREGTC
351 PEAPTDECKP
VKWCALSHHE RLKCDEWSVN SVGKIECVSA ETTEDCIAKI
401 MNGEADAMSL
DGGFVYIAGK CGLVPVLAEN YNKSDNCEDT PEAGYFAVAV
451 VKKSASDLTW
DNLKGKKSCH TAVGRTAGWN IPMGLLYNKI NHCRFDEFFS
501 EGCAPGSKKD
SSLCKLCMGS GLNLCEPNNK EGYYGYTGAF RCLVEKGDVA
551 FVKHQTVPQN
TGGKNPDPWA KNLNEKDYEL LCLDGTRKPV EEYANCHLAR
601 APNHAVVTRK
DKEACVHKIL RQQQHLFGSN VTDCSGNFCL FRSETKDLLF
651 RDDTVCLAKL
HDRNTYEKYL GEEYVKAVGN LRKCSTSSLL EACTFRRP  （配列番号６４）
【０１４０】
Serotransferrin
precursor由来ペプチド
PQTFYYAVAVVKKD  （配列番号６５）
【０１４１】
〔３５〕  Serotransferrin
precursor
配列番号６６のSerotransferrin
precursor由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MRLAVGALLV
CAVLGLCLAV PDKTVRWCAV SEHEATKCQS FRDHMKSVIP
051 SDGPSVACVK KASYLDCIRA
IAANEADAVT LDAGLVYDAY LAPNNLKPVV
101 AEFYGSKEDP
QTFYYAVAVV KKDSGFQMNQ LRGKKSCHTG LGRSAGWNIP
151 IGLLYCDLPE
PRKPLEKAVA NFFSGSCAPC ADGTDFPQLC QLCPGCGCST
201 LNQYFGYSGA
FKCLKDGAGD VAFVKHSTIF ENLANKADRD QYELLCLDNT
251 RKPVDEYKDC
HLAQVPSHTV VARSMGGKED LIWELLNQAQ EHFGKDKSKE
301 FQLFSSPHGK
DLLFKDSAHG FLKVPPRMDA KMYLGYEYVT AIRNLREGTC
351 PEAPTDECKP
VKWCALSHHE RLKCDEWSVN SVGKIECVSA ETTEDCIAKI
401 MNGEADAMSL
DGGFVYIAGK CGLVPVLAEN YNKSDNCEDT PEAGYFAVAV
451 VKKSASDLTW
DNLKGKKSCH TAVGRTAGWN IPMGLLYNKI NHCRFDEFFS
501 EGCAPGSKKD
SSLCKLCMGS GLNLCEPNNK EGYYGYTGAF RCLVEKGDVA
551 FVKHQTVPQN
TGGKNPDPWA KNLNEKDYEL LCLDGTRKPV EEYANCHLAR
601 APNHAVVTRK
DKEACVHKIL RQQQHLFGSN VTDCSGNFCL FRSETKDLLF
651 RDDTVCLAKL
HDRNTYEKYL GEEYVKAVGN LRKCSTSSLL EACTFRRP  （配列番号６４）
【０１４２】
Serotransferrin
precursor由来ペプチド
AYLAPNNLKPVVAEFYGSKED  （配列番号６６）
【０１４３】
〔３６〕  Hemopexin
precursor
配列番号６８のHemopexin
precursor由来ペプチドが肝がん患者で検出できなかった。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MARVLGAPVA
LGLWSLCWSL AIATPLPPTS AHGNVAEGET KPDPDVTERC
051 SDGWSFDATT
LDDNGTMLFF KGEFVWKSHK WDRELISERW KNFPSPVDAA
101 FRQGHNSVFL
IKGDKVWVYP PEKKEKGYPK LLQDEFPGIP SPLDAAVECH
151 RGECQAEGVL
FFQGDREWFW DLATGTMKER SWPAVGNCSS ALRWLGRYYC
201 FQGNQFLRFD
PVRGEVPPRY PRDVRDYFMP CPGRGHGHRN GTGHGNSTHH
251 GPEYMRCSPH
LVLSALTSDN HGATYAFSGT HYWRLDTSRD GWHSWPIAHQ
301 WPQGPSAVDA
AFSWEEKLYL VQGTQVYVFL TKGGYTLVSG YPKRLEKEVG
351 TPHGIILDSV
DAAFICPGSS RLHIMAGRRL WWLDLKSGAQ ATWTELPWPH
401 EKVDGALCME
KSLGPNSCSA NGPGLYLIHG PNLYCYSDVE KLNAAKALPQ
451 PQNVTSLLGC TH  （配列番号６７）
【０１４４】
Hemopexin precursor由来ペプチド
AAFRQGHNSVFLIKGD  （配列番号６８）
【０１４５】
〔３７〕  Gelsolin
precursor
配列番号７０のGelsolin
precursor由来ペプチドが肝がん患者で検出できなかった。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MAPHRPAPAL
LCALSLALCA LSLPVRAATA SRGASQAGAP QGRVPEARPN
051 SMVVEHPEFL
KAGKEPGLQI WRVEKFDLVP VPTNLYGDFF TGDAYVILKT
101 VQLRNGNLQY
DLHYWLGNEC SQDESGAAAI FTVQLDDYLN GRAVQHREVQ
151 GFESATFLGY
FKSGLKYKKG GVASGFKHVV PNEVVVQRLF QVKGRRVVRA
201 TEVPVSWESF
NNGDCFILDL GNNIHQWCGS NSNRYERLKA TQVSKGIRDN
251 ERSGRARVHV
SEEGTEPEAM LQVLGPKPAL PAGTEDTAKE DAANRKLAKL
301 YKVSNGAGTM
SVSLVADENP FAQGALKSED CFILDHGKDG KIFVWKGKQA
351 NTEERKAALK
TASDFITKMD YPKQTQVSVL PEGGETPLFK QFFKNWRDPD
401 QTDGLGLSYL
SSHIANVERV PFDAATLHTS TAMAAQHGMD DDGTGQKQIW
451 RIEGSNKVPV DPATYGQFYG
GDSYIILYNY RHGGRQGQII YNWQGAQSTQ
501 DEVAASAILT
AQLDEELGGT PVQSRVVQGK EPAHLMSLFG GKPMIIYKGG
551 TSREGGQTAP
ASTRLFQVRA NSAGATRAVE VLPKAGALNS NDAFVLKTPS
601 AAYLWVGTGA
SEAEKTGAQE LLRVLRAQPV QVAEGSEPDG FWEALGGKAA
651 YRTSPRLKDK
KMDAHPPRLF ACSNKIGRFV IEEVPGELMQ EDLATDDVML
701 LDTWDQVFVW
VGKDSQEEEK TEALTSAKRY IETDPANRDR RTPITVVKQG
751 FEPPSFVGWF
LGWDDDYWSV DPLDRAMAEL AA  （配列番号６９）
【０１４６】
Gelsolin precursor由来ペプチド
GTGQKQIWRIEGSNKVPVD  （配列番号７０）
【０１４７】
〔３８〕  Histidine-rich
glycoprotein precursor
配列番号７２のHistidine-rich
glycoprotein precursor由来ペプチドが肝がん患者で検出できなかった。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MKALIAALLL
ITLQYSCAVS PTDCSAVEPE AEKALDLINK RRRDGYLFQL
051 LRIADAHLDR
VENTTVYYLV LDVQESDCSV LSRKYWNDCE PPDSRRPSEI
101 VIGQCKVIAT
RHSHESQDLR VIDFNCTTSS VSSALANTKD SPVLIDFFED
151 TERYRKQANK
ALEKYKEEND DFASFRVDRI ERVARVRGGE GTGYFVDFSV
201 RNCPRHHFPR
HPNVFGFCRA DLFYDVEALD LESPKNLVIN CEVFDPQEHE
251 NINGVPPHLG
HPFHWGGHER SSTTKPPFKP HGSRDHHHPH KPHEHGPPPP
301 PDERDHSHGP
PLPQGPPPLL PMSCSSCQHA TFGTNGAQRH SHNNNSSDLH
351 PHKHHSHEQH
PHGHHPHAHH PHEHDTHRQH PHGHHPHGHH PHGHHPHGHH
401 PHGHHPHCHD
FQDYGPCDPP PHNQGHCCHG HGPPPGHLRR RGPGKGPRPF
451 HCRQIGSVYR
LPPLRKGEVL PLPEANFPSF PLPHHKHPLK PDNQPFPQSV
501 SESCPGKFKS
GFPQVSMFFT HTFPK  （配列番号７１）
【０１４８】
Histidine-rich
glycoprotein precursor由来ペプチド
GYLFQLLRIAD  （配列番号７２）
【０１４９】
〔３９〕  Complement
factor I precursor
配列番号７４のComplement
factor I precursor由来ペプチドが肝がん患者で検出できなかった。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MKLLHVFLLF
LCFHLRFCKV TYTSQEDLVE KKCLAKKYTH LSCDKVFCQP
051 WQRCIEGTCV
CKLPYQCPKN GTAVCATNRR SFPTYCQQKS LECLHPGTKF
101 LNNGTCTAEG
KFSVSLKHGN TDSEGIVEVK LVDQDKTMFI CKSSWSMREA
151 NVACLDLGFQ
QGADTQRRFK LSDLSINSTE CLHVHCRGLE TSLAECTFTK
201 RRTMGYQDFA
DVVCYTQKAD SPMDDFFQCV NGKYISQMKA CDGINDCGDQ
251 SDELCCKACQ
GKGFHCKSGV CIPSQYQCNG EVDCITGEDE VGCAGFASVA
301 QEETEILTAD
MDAERRRIKS LLPKLSCGVK NRMHIRRKRI VGGKRAQLGD
351 LPWQVAIKDA
SGITCGGIYI GGCWILTAAH CLRASKTHRY QIWTTVVDWI
401 HPDLKRIVIE
YVDRIIFHEN YNAGTYQNDI ALIEMKKDGN KKDCELPRSI
451 PACVPWSPYL
FQPNDTCIVS GWGREKDNER VFSLQWGEVK LISNCSKFYG
501 NRFYEKEMEC
AGTYDGSIDA CKGDSGGPLV CMDANNVTYV WGVVSWGENC
551 GKPEFPGVYT
KVANYFDWIS YHVGRPFISQ YNV  （配列番号７３）
【０１５０】
Complement factor I
precursor由来ペプチド
IVGGKRAQLGDLPWQVAIKD  （配列番号７４）
【０１５１】
〔４０〕  Apolipoprotein
A-I precursor
配列番号７６のApolipoprotein
A-I precursor由来ペプチドが肝がん患者で検出できなかった。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MKAAVLTLAV
LFLTGSQARH FWQQDEPPQS PWDRVKDLAT VYVDVLKDSG
051 RDYVSQFEGS
ALGKQLNLKL LDNWDSVTST FSKLREQLGP VTQEFWDNLE
101 KETEGLRQEM
SKDLEEVKAK VQPYLDDFQK KWQEEMELYR QKVEPLRAEL
151 QEGARQKLHE
LQEKLSPLGE EMRDRARAHV DALRTHLAPY SDELRQRLAA
201 RLEALKENGG
ARLAEYHAKA TEHLSTLSEK AKPALEDLRQ GLLPVLESFK
251 VSFLSALEEY
TKKLNTQ  （配列番号７５）
【０１５２】
Apolipoprotein A-I
precursor由来ペプチド
DEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLKDSGR  （配列番号７６）
【０１５３】
〔４１〕  Complement C3
precursor
配列番号７７のComplement
C3 precursor由来ペプチドが肝がん患者で検出できなかった。
インタクトタンパク質／ペプチド
0001 MGPTSGPSLL
LLLLTHLPLA LGSPMYSIIT PNILRLESEE TMVLEAHDAQ
0051 GDVPVTVTVH
DFPGKKLVLS SEKTVLTPAT NHMGNVTFTI PANREFKSEK
0101 GRNKFVTVQA
TFGTQVVEKV VLVSLQSGYL FIQTDKTIYT PGSTVLYRIF
0151 TVNHKLLPVG
RTVMVNIENP EGIPVKQDSL SSQNQLGVLP LSWDIPELVN
0201 MGQWKIRAYY
ENSPQQVFST EFEVKEYVLP SFEVIVEPTE KFYYIYNEKG
0251 LEVTITARFL
YGKKVEGTAF VIFGIQDGEQ RISLPESLKR IPIEDGSGEV
0301 VLSRKVLLDG
VQNPRAEDLV GKSLYVSATV ILHSGSDMVQ AERSGIPIVT
0351 SPYQIHFTKT
PKYFKPGMPF DLMVFVTNPD GSPAYRVPVA VQGEDTVQSL
0401 TQGDGVAKLS
INTHPSQKPL SITVRTKKQE LSEAEQATRT MQALPYSTVG
0451 NSNNYLHLSV
LRTELRPGET LNVNFLLRMD RAHEAKIRYY TYLIMNKGRL
0501 LKAGRQVREP
GQDLVVLPLS ITTDFIPSFR LVAYYTLIGA SGQREVVADS
0551 VWVDVKDSCV
GSLVVKSGQS EDRQPVPGQQ MTLKIEGDHG ARVVLVAVDK
0601 GVFVLNKKNK
LTQSKIWDVV EKADIGCTPG SGKDYAGVFS DAGLTFTSSS
0651 GQQTAQRAEL
QCPQPAARRR RSVQLTEKRM DKVGKYPKEL RKCCEDGMRE
0701 NPMRFSCQRR
TRFISLGEAC KKVFLDCCNY ITELRRQHAR ASHLGLARSN
0751 LDEDIIAEEN
IVSRSEFPES WLWNVEDLKE PPKNGISTKL MNIFLKDSIT
0801 TWEILAVSMS
DKKGICVADP FEVTVMQDFF IDLRLPYSVV RNEQVEIRAV
0851 LYNYRQNQEL
KVRVELLHNP AFCSLATTKR RHQQTVTIPP KSSLSVPYVI
0901 VPLKTGLQEV
EVKAAVYHHF ISDGVRKSLK VVPEGIRMNK TVAVRTLDPE
0951 RLGREGVQKE
DIPPADLSDQ VPDTESETRI LLQGTPVAQM TEDAVDAERL
1001 KHLIVTPSGC
GEQNMIGMTP TVIAVHYLDE TEQWEKFGLE KRQGALELIK
1051 KGYTQQLAFR
QPSSAFAAFV KRAPSTWLTA YVVKVFSLAV NLIAIDSQVL
1101 CGAVKWLILE
KQKPDGVFQE DAPVIHQEMI GGLRNNNEKD MALTAFVLIS
1151 LQEAKDICEE
QVNSLPGSIT KAGDFLEANY MNLQRSYTVA IAGYALAQMG
1201 RLKGPLLNKF
LTTAKDKNRW EDPGKQLYNV EATSYALLAL LQLKDFDFVP
1251 PVVRWLNEQR
YYGGGYGSTQ ATFMVFQALA QYQKDAPDHQ ELNLDVSLQL
1301 PSRSSKITHR
IHWESASLLR SEETKENEGF TVTAEGKGQG TLSVVTMYHA
1351 KAKDQLTCNK
FDLKVTIKPA PETEKRPQDA KNTMILEICT RYRGDQDATM
1401 SILDISMMTG
FAPDTDDLKQ LANGVDRYIS KYELDKAFSD RNTLIIYLDK
1451 VSHSEDDCLA
FKVHQYFNVE LIQPGAVKVY AYYNLEESCT RFYHPEKEDG
1501 KLNKLCRDEL
CRCAEENCFI QKSDDKVTLE ERLDKACEPG VDYVYKTRLV
1551 KVQLSNDFDE
YIMAIEQTIK SGSDEVQVGQ QRTFISPIKC REALKLEEKK
1601 HYLMWGLSSD
FWGEKPNLSY IIGKDTWVEH WPEEDECQDE ENQKQCQDLG
1651 AFTESMVVFG CPN  （配列番号９）
【０１５４】
Complement C3
precursor由来ペプチド
APDHQELNLDVSLQLPS  （配列番号７７）
【０１５５】
〔４２〕  Serotransferrin
precursor
配列番号７８のSerotransferrin
precursor由来ペプチドが肝がん患者で特異的に検出された。
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MRLAVGALLV
CAVLGLCLAV PDKTVRWCAV SEHEATKCQS FRDHMKSVIP
051 SDGPSVACVK
KASYLDCIRA IAANEADAVT LDAGLVYDAY LAPNNLKPVV
101 AEFYGSKEDP
QTFYYAVAVV KKDSGFQMNQ LRGKKSCHTG LGRSAGWNIP
151 IGLLYCDLPE
PRKPLEKAVA NFFSGSCAPC ADGTDFPQLC QLCPGCGCST
201 LNQYFGYSGA
FKCLKDGAGD VAFVKHSTIF ENLANKADRD QYELLCLDNT
251 RKPVDEYKDC
HLAQVPSHTV VARSMGGKED LIWELLNQAQ EHFGKDKSKE
301 FQLFSSPHGK
DLLFKDSAHG FLKVPPRMDA KMYLGYEYVT AIRNLREGTC
351 PEAPTDECKP
VKWCALSHHE RLKCDEWSVN SVGKIECVSA ETTEDCIAKI
401 MNGEADAMSL DGGFVYIAGK
CGLVPVLAEN YNKSDNCEDT PEAGYFAVAV
451 VKKSASDLTW
DNLKGKKSCH TAVGRTAGWN IPMGLLYNKI NHCRFDEFFS
501 EGCAPGSKKD
SSLCKLCMGS GLNLCEPNNK EGYYGYTGAF RCLVEKGDVA
551 FVKHQTVPQN
TGGKNPDPWA KNLNEKDYEL LCLDGTRKPV EEYANCHLAR
601 APNHAVVTRK
DKEACVHKIL RQQQHLFGSN VTDCSGNFCL FRSETKDLLF
651 RDDTVCLAKL
HDRNTYEKYL GEEYVKAVGN LRKCSTSSLL EACTFRRP  （配列番号６４）
【０１５６】
Serotransferrin
precursor由来ペプチド
SAHGFLKVPPRMD  （配列番号７８）
【０１５７】
本実験において、本発明者が独自に開発した二次元液体クロマトグラフィー（2D-LC）MALDI TOFMS法を用いて、肝炎患者、肝硬変患者および肝がん患者血清由来のペプチドを網羅的に解析することによって、肝がんを含む肝疾患特異的に出現あるいは消失するペプチドを同定することができた。これらはすべて、タンパク質がそれぞれに特異的なタンパク質分解酵素によって切断されたと思われる断片ペプチドであった。すなわち本実験によって、患者血清中に存在する、疾患特異的に活性化されたタンパク質分解酵素によって生じた断片ペプチドが肝がん特異的なバイオマーカーとなりうることが示された。また、本発明者が新たに開発した解析システムがこうしたペプチドを検出できることも明らかになった。
【０１５８】
実施例２    バイオマーカーペプチド合成とバイオマーカーペプチド特異ポリクローナル抗体作成
（１）方法
配列番号２のHypothetical protein由来ペプチド、配列番号４のNeuropeptide Y receptor type 1由来ペプチド、配列番号３Neuropeptide
Y receptor type 1インタクトタンパク質、配列番号３Neuropeptide Y
receptor type 1インタクトタンパク質のN末端側、配列番号８のMicrotubule-associated protein 1A由来ペプチド、配列番号１６のChromosome 10 open reading frame 76由来ペプチド、配列番号２０のF-box/LRR-repeat protein 8由来ペプチド、配列番号２８のRho/rac
guanine nucleotide exchange factor 2由来ペプチド、配列番号３２のPutative
GTP-binding protein Parf由来ペプチド、配列番号３６のZinc finger
protein ZIC 1由来ペプチド、配列番号５６のInter-alpha-trypsin
inhibitor heavy chain precursor由来ペプチドおよび配列番号５５のInter-alpha-trypsin
inhibitor heavy chain precursorインタクトタンパク質、配列番号５８のGMP
reductase 1由来ペプチドを認識する特異抗体を作製するためにそれぞれの抗原ペプチドを合成した。それぞれの合成ペプチドにはキャリアタンパク質と結合させるために、Ｃ末端もしくはＮ末端にシステイン残基を付加した。合成ペプチドの配列に疎水性アミノ酸が多い場合はシステイン残基とともにリジン残基を付加した。キャリアタンパク質と結合させたペプチドとアジュバントを混合し、ウサギに免疫した。1〜2週間おきに合計8回免疫し、4週間おきに2回試験採血を行い抗体力価をエンザイムイムノアッセイ法(EIA法)で測定した。免疫開始から3ヶ月後、全採血を行って抗血清を回収して、抗原ペプチドをリガンドとしたペプチドカラムを用いて特異抗体の精製を行った。
【０１５９】
（２）結果
バイオマーカーを認識するための特異抗体を作製するための抗原ペプチドの配列を下に示す。下のアミノ酸配列は２つの配列のセットを示しているが、1番目の配列の配列全体はインタクトなペプチドもしくはタンパク質の構成アミノ酸の配列を示す。１番目の配列の下線部が抗原として用いるペプチドを示す。２番目の配列からなるペプチドは１番目の配列の下線部のアミノ酸配列にＮ末端もしくはＣ末端にシステインを付加した合成ペプチドである。１はＮ末端であることを表す。
【０１６０】
〔４３〕  Hypothetical
protein
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MNETNKTLVG PSELXRAXAV
TPGQALGSGM ACAGRICAGG CGPLXPHCTC
051 CQMPPLPPIP CQL  （配列番号１）
【０１６１】
配列番号２のHypothetical protein由来ペプチドを認識する特異抗体を作製するための合成抗原ペプチド。Ｃ末端にシステインを付加している。
RADAVTPGC  （配列番号７９）
【０１６２】
〔４４〕  Neuropeptide Y
receptor type 1
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MNSTLFSQVE
NHSVHSNFSE KNAQLLAFEN DDCHLPLAMI FTLALAYGAV
051 IILGVSGNLA
LIIIILKQKE MRNVTNILIV NLSFSDLLVA IMCLPFTFVY
101 TLMDHWVFGE
AMCKLNPFVQ CVSITVSIFS LVLIAVERHQ LIINPRGWRP
151 NNRHAYVGIA
VIWVLAVASS LPFLIYQVMT DEPFQNVTLD AYKDKYVCFD
201 QFPSDSHRLS
YTTLLLVLQY FGPLCFIFIC YFKIYIRLKR RNNMMDKMRD
251 NKYRSSETKR
INIMLLSIVV AFAVCWLPLT IFNTVFDWNH QIIATCNHNL
301 LFLLCHLTAM
ISTCVNPIFY GFLNKNFQRD LQFFFNFCDF RSRDDDYETI
351 AMSTMHTDVS
KTSLKQASPV AFKKINNNDD NEKI  （配列番号３）
【０１６３】
配列番号４のNeuropeptide
Y receptor type 1由来ペプチドを認識する特異抗体を作製するための合成抗原ペプチド。Ｃ末端にシステインを付加している。
VSGNLALIIC  （配列番号８０）
【０１６４】
〔４５〕  Neuropeptide Y
receptor type 1
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MNSTLFSQVE
NHSVHSNFSE KNAQLLAFEN DDCHLPLAMI FTLALAYGAV
051 IILGVSGNLA
LIIIILKQKE MRNVTNILIV NLSFSDLLVA IMCLPFTFVY
101 TLMDHWVFGE
AMCKLNPFVQ CVSITVSIFS LVLIAVERHQ LIINPRGWRP
151 NNRHAYVGIA
VIWVLAVASS LPFLIYQVMT DEPFQNVTLD AYKDKYVCFD
201 QFPSDSHRLS
YTTLLLVLQY FGPLCFIFIC YFKIYIRLKR RNNMMDKMRD
251 NKYRSSETKR
INIMLLSIVV AFAVCWLPLT IFNTVFDWNH QIIATCNHNL
301 LFLLCHLTAM
ISTCVNPIFY GFLNKNFQRD LQFFFNFCDF RSRDDDYETI
351 AMSTMHTDVS KTSLKQASPV
AFKKINNNDD NEKI  （配列番号３）
【０１６５】
配列番号３のNeuropeptide
Y receptor type 1インタクトタンパク質を認識する特異抗体を作製するための合成抗原ペプチド。Ｎ末端にシステインを含むインタクトな配列で合成。
CFDQFPSDSH  （配列番号８１）
【０１６６】
〔４６〕  Neuropeptide Y
receptor type 1
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MNSTLFSQVE NHSVHSNFSE
KNAQLLAFEN DDCHLPLAMI FTLALAYGAV
051 IILGVSGNLA
LIIIILKQKE MRNVTNILIV NLSFSDLLVA IMCLPFTFVY
101 TLMDHWVFGE
AMCKLNPFVQ CVSITVSIFS LVLIAVERHQ LIINPRGWRP
151 NNRHAYVGIA
VIWVLAVASS LPFLIYQVMT DEPFQNVTLD AYKDKYVCFD
201 QFPSDSHRLS
YTTLLLVLQY FGPLCFIFIC YFKIYIRLKR RNNMMDKMRD
251 NKYRSSETKR
INIMLLSIVV AFAVCWLPLT IFNTVFDWNH QIIATCNHNL
301 LFLLCHLTAM
ISTCVNPIFY GFLNKNFQRD LQFFFNFCDF RSRDDDYETI
351 AMSTMHTDVS
KTSLKQASPV AFKKINNNDD NEKI  （配列番号３）
【０１６７】
配列番号３のNeuropeptide
Y receptor type 1インタクトタンパク質のN末端側を認識する特異抗体を作製するための合成抗原ペプチド。Ｎ末端にシステインを付加している。
CNHSVHSNFSEKNAQLL  （配列番号８２）
【０１６８】
〔４７〕  Microtubule-associated
protein 1A
インタクトタンパク質／ペプチド
0001 MDGVAEFSEY
VSETVDVPSP XDLLEPPTSG GFLKLSKPCC YIFPGGRGDS
0051 ALFAVNGFNI
LVDGGSDRKS CLWKLVRXLD RIDSVLLTHI GADNLPGING
0101 LLQRKVAELE
EEQSQGSSSY SDWVKNLISP ELGVVFFNVP EKLRLPDASR
0151 KAKRSIEEAC
LTLQHLNRLG IQAEPLYRVV SNTIEPLTLF HKMGVXRLDM
0201 YVLNPVKDSK
EMQFLMXKWA GNSKAKTGIV LPNGKEAEIS VPYLTSITAL
0251 VVWLPANPTE
KIVRVLFPGN APQNKILEGL EKLRHLDFLR YPVATQKDLA
0301 SGAVPTNLKP
SKIKQRADSK ESLKATTKTX VSKLSTREEV VEEGAKEARS
0351 ELSKELSKTE
KKAQESSEKP PEKPXKPERV KTESSEALXA EKRKLIKDKV
0401 GKKHLKEKIS
KLEEKKDKEX KEIPXERKEL KKDEGRKEEK KDXKKEEKRK
0451 DTKPELKKIS
KPDLKPFTPE VRKTLYKAKV PGRVXIDRSR AIRGEKELSS
0501 EPQTPPAQKG
TVPLPTISGH RELVLSSPED LTQDFEEMKR EERALLAEQR
0551 DTGLGDKPFP
LDTAEEGPPS TAIQGTPPSV PGLGQEEHVM KEKELVPEVP
0601 EEQGSKDRGL
DSGAETEEEK DTWEEKKQRE AERLPDRTEA REESXPXVKE
0651 DVIEKAELEE
MEEVHPSDEE EEDATXXEGF YPXHMQEPLX VTPRSREAFG
0701 GRELGLQGKA
PEKETSLFLS SLTTPAGATE HVSYIQDETI PGYSETEQTI
0751 SDEEIHDEPE
ERPAPPRFHT STYDLPGPEG AGPFEASQPA DSAVPATSGK
0801 VYGTPETELT
YPTNIVAAPL AEEEHVSSAT SITECDKLSS FATSVAEDQS
0851 VASLTAPQTE
ETGKSSLLLD TVTSIPSSRT EATQGLDYVP SAGTISPTSS
0901 LXEXKGFXSP
PCEDFSVTGE SEKRGEIIGK GLSGERAVEE EEEETANVEM
0951 SEKLXSQXGT
PVFSAPGXAL HPGEPALGEA EERCLSPDDS TVKMASPPPS
1001 GPPSATHTPF
HQSPVEEKSE PQDFKEADSW GDTKRTPGVG KEDAAEETVK
1051 PGPEEGTLEK
EEKVPPPRSP QAQEAPVNID EGLTGCTIQL LPAQDKAIVF
1101 EIMEAGEPTG
PILGAEALPG GLRTLPQEPG KPQKDEVLRY PDRSLSPEDX
1151 ESLSVLSVPS
PDTXXQEPTP KSPCGLXEQX LHKDRWXEVS PEDTQSLSLS
1201 EESPSKETSL
DVSSKQLSPE SLGTLQFGEL NLGKEEMGHL MQAEDTSHHT
1251 APMSVPEPHA
ATASPPTDGT TRYSAQTDIT DDSLDRKSPA SSFSHSTPSG
1301 NGKYLPGAIT
SPDEHILTXD SSFSKSPESL XGPALXDIAI KWEDKVPGLK
1351 DRTSEQKKEP
EPKDEVLQQK DKTLEHKEVV EPKDTAIYQK DEALHVKNEA
1401 VKQQXKALEQ
KGRDLEQXDT ALEQKDKALE PKDKDLEXKD KALEQKDKIP
1451 XEKDKALEQK
DTALEQKDKA LEPKDKDLEQ KDRVLEQKEK IPEEKDKALD
1501 QKVRSVEHKA
PEDTVAEMKD RDLEQTDKAP EQKHQAQEQK DKVSEKKDQA
1551 LEXKYWALGQ
KDEALEXNIQ ALEENHQTQE QESLVQEDKT RKPKMLEEKS
1601 PEKVKAMEEK LEALLEKTXA
LGLEESLVQE GRAREQEEKY WRGQDVVQEC
1651 QETSPXREEP
AGEQKELXPA WEDTSPEQDN RYWRGREDVS LEQDTYWREL
1701 SCERKVWFPH
ELDVQGARPH YTXERESTFL DEGPDDEQEV PLREHATRSP
1751 WASDFKDFQE
SSPQKGLEVE RWLAESPVGL PPEEEDKLTR SPFEIISPPA
1801 SPPEMVGQRV
PSAPGQESPI PDPKLMPHMK NEPTTPSWLA XIPPWVPKXR
1851 PLPXAPLSPA
PGPPTPAPES HTPAPFSWGT PEYDSVVAAV QEGAAELEGG
1901 PYSPLGKDYR
KVXGEREEEG RAEAPDKSSH XSKVPEARKS HATTEPEQTE
1951 PEQREPTPYP
DERSFQYADI YEQMMLTGLG PACPTREPPL GAAGDWPPCL
2001 STKEAAAGRN
TSAEKELSSP ISPKSLQSDT PTFSYAALAG PTVPPRXEPG
2051 PSMEPSLTPP
AVPPRAPILS KGPSPPLNGN ILSCSPDRRS PSPKESGRSH
2101 WDDSTSDSEL
EKGAREQAEK EAQSPSPPHP IPMGSPTLWP ETEAHVSPPL
2151 XSHLGXARPS
LDFPASAFGF SSLEXAPPQX PSPAEPRSAP CGSLAFSGDR
2201 ALALAPGPPT
RTRYDEYLEV TKAPSLDSSL PQLPSPSSPG XPLLSNLPRP
2251 ASPALSEGSS
SEATTPVISS VAERFSPSLE AAEQESGELD PGMEPAAHXL
2301 WDLTPLSPAP
PASLDLALAP APSLPGDMGD GILPCHLECS EAATEKPSPF
2351 QVPSEDCAAN
GPTETSPNPP XPAPAKAENE EAAAXPAWER GAWPEGAERS
2401 SRPDTXLSPE
QPVCPXGGSG GPPSSASPEV EAGPQGCXTE PRPHRGELSP
2451 SFLNPPLPPS
IDDRDLSTEE VRLVGRGGRR RVGGPGTTGX PXPVTDETPP
2501 TSASDSGSSQ
SDSDVPPETE ECPSITAEAA LDSDEDGDFL PVDKXGGVSG
2551 THHPRPGHDP
PPLPQPDXRP SPPRPDVCMA DPEGLSSESG RXERLRXKEK
2601 VQGRVGRRAP
GKDKPVSPXR RLXLRGKRSP TPGKGSXDRV SRXPXRSRSX
2651 TSQVTPAEEK
DGHSPMSKGL VNGLKAGPXA LSSKGSSGAP VYVDLAYIPN
2701 HWSGKTADLD
FFRRVRASYY VVSGNDPANG EPSRAVLDAL LEGKAQWGEN
2751 LQVKVTLIPT
HDTEVTREWY QQTHEQQQQL NVLVLASSST VVMQDESFPA
2801 CKIEF  （配列番号７）
【０１６９】
配列番号７のMicrotubule-associated
protein 1Aインタクトタンパク質を認識する特異抗体を作製するための合成抗原ペプチド。Ｎ末端にシステインを付加している。
CGHMQEPL  （配列番号８３）
【０１７０】
〔４８〕  Chromosome 10
open reading frame 76
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MTLCALIRGV
HQKNKSTSGF DIINMLMGFD KAELCMKNLM ESLDSLLCAE
051 GSESLKSLCL
KLLLCLVTVT DNISQNTILE YVMINSIFEA ILQILSHPPS
101 RREHGYDAVV
LLALLVNYRK YESVNPYIVK LSIVDDEATL NGMGLVIAQA
151 LSEYNRQYKD
KEEEHQSGFF SALTNMVGSM FIADAHEKIS VQTNEAILLA
201 LYEAVHLNRN
FITVLAQVGH IKNPSVFFSL NFIPINSIEK PIWLYLFKPC
251 FALSHPEMGL
VTTPVSPAPT TPPMRHRKKA ADKNLPCRPL VCAVLDLMVE
301 FIVTHMMKEF
PMDLYIRCIQ VVHKLLCYQK KCRVRLHYTW RELWSALINL
351 LKFLMSNETV
LLAKHNIFTL ALMIVNLFNM FITYGDTFLP TPSSYDELYY
401 EIIRMHQSFD
NLYSMVLRLS TNAGQWKEAA SKVTHALVNI RAIINHFNPK
451 IESYAAVNHI
SQLSEEQVLE VVRANYDTLT LKLQDGLDQY ERYSEQHKEA
501 AFFKELVRSI
STNVRRNLAF HTLSQEVLLK EFSTIS  （配列番号１５）
【０１７１】
配列番号１５のChromosome
10 open reading frame 76インタクトタンパク質を認識する特異抗体を作製するための合成抗原ペプチド。Ｎ末端にシステインを付加している。
CVVRANYDT  （配列番号８４）
【０１７２】
〔４９〕  F-box/LRR-repeat
protein 8
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MAEPGEGLPE
EVLALIFRHL SLRDRAAAAR VCRAWAAAAT CSAVWHDTKI
051 SCECELEGML
PPYLSACLDH IHNLRLEFEP SRKPSRRAAI ELLMVLAGRA
101 PGLRGLRLEC
RGEKPLFDAG RDVLEAVHAV CGAASQLRHL DLRRLSFTLD
151 DALVLQAARS
CPELHSLFLD NSTLVGSVGP GSVLELLEAC PRLRALGLHL
201 ASLSHAILEA LAAPDRAPFA
LLALRCACPE DARASPLPNE AWVALRRRHP
251 GLAVELELEP
ALPAESVTRV LQPAVPVAAL RLNLSGDTVG PVRFAAHHYA
301 ATLCALEVRA
AASAELNAAL EELAARCAAL REVHCFCVVS HSVLDAFRAH
351 CPRLRTYTLK
LTREPHPWRP TLVA  （配列番号１９）
【０１７３】
配列番号１９のF-box/LRR-repeat
protein 8インタクトタンパク質を認識する特異抗体を作製するための合成抗原ペプチド。Ｎ末端にリジンとシステインを付加している。
KCAILEALA  （配列番号８５）
【０１７４】
〔５０〕  Rho/rac guanine
nucleotide exchange factor 2
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MCCCCGCCPL
LAHLEQGSLR ERTREKEKMK EAKDARYTNG HLFTTISVSG
051 MTMCYACNKS
ITAKEALICP TCNVTIHNRC KDTLANCTKV KQKQQKAALL
101 KNNTALQSVS
LRSKTTIRER PSSAIYPSDS FRQSLLGSRR GRSSLSLAKS
151 VSTTNIAGHF
NDESPLGLRR ILSQSTDSLN MRNRTLSVES LIDEAEVIYS
201 ELMSDFEMDE
KDFAADSWSL AVDSSFLQQH KKEVMKQQDV IYELIQTELH
251 HVRTLKIMTR
LFRTGMLEEL HLEPGVVQGL FPCVDELSDI HTRFLSQLLE
301 RRRQALCPGS
TRNFVIHRLG DLLISQFSGP SAEQMCKTYS EFCSRHSKAL
351 KLYKELYARD
KRFQQFIRKV TRPAVLKRHG VQECILLVTQ RITKYPLLIS
401 RILQHSHGIE
EERQDLTTAL GLVKELLSNV DEGIYQLEKG ARLQEIYNRM
451 DPRAQTPVPG
KGPFGREELL RRKLIHDGCL LWKTATGRFK DVLVLLMTDV
501 LVFLQEKDQK
YIFPTLDKPS VVSLQNLIVR DIANQEKGMF LISAAPPEMY
551 EVHTASRDDR
STWIRVIQQS VRTCPSREDF PLIETEDEAY LRRIKMELQQ
601 KDRALVELLR
EKVGLFAEMT HFQAEEDGGS GMALPTLPRG LFRSESLESP
651 RGERLLQDAI
REVEGLKDLL VGPGVELLLT PREPALPLEP DSGGNTSPGV
701 TANGEARTFN
GSIELCRADS DSSQRDRNGN QLRSPQEEAL QRLVNLYGLL
751 HGLQAAVAQQ
DTLMEARFPE GPERREKLCR ANSRDGEAGR AGAAPVAPEK
801 QATELALLQR
QHALLQEELR RCRRLGEERA TEAGSLEARL RESEQARALL
851 EREAEEARRQ
LAALGQTEPL PAEAPWARRP VDPRRRSLPA GDALYLSFNP
901 PQPSRGTDRL
DLPVTTRSVH RNFEDRERQE LGSPEERLQD SSDPDTGSEE
951 EGSSRLSPPH
SPRDFTRMQD IPEETESRDG EAVASES  （配列番号２７）
【０１７５】
配列番号２７のRho/rac
guanine nucleotide exchange factor 2インタクトタンパク質を認識する特異抗体を作製するための合成抗原ペプチド。Ｎ末端にシステインを付加している。
CELLSNVD  （配列番号８６）
【０１７６】
〔５１〕  Putative
GTP-binding protein Parf
インタクトタンパク質／ペプチド
001 LGSVPGGRRR GCQAPGTGMA
FGLQMFIQRK FPYPLQWSLL VAVVAGSVVS
051 YGVTRVESEK
CNNLWLFLET GQLPKDRSTE QCRALQIQGV KENMDQNKAT
101 LALLRSNIRR
GAQDWALAKK VVREKLRKYV FDRVNMHNLL IHLVRRRGQK
151 LESMQLELDS
LRSQPDASKE ELRLLQIIRQ LENNIEKTMI KIITSQNIHL
0201 LYLDLLDYLK
TVSPAAREGR GSGAGIWEGR ERP  （配列番号３１）
【０１７７】
配列番号３１のPutative
GTP-binding protein Parfインタクトタンパク質を認識する特異抗体を作製するための合成抗原ペプチド。Ｃ末端にシステインを付加している。
QAPGTGMAC  （配列番号８７）
【０１７８】
〔５２〕  Zinc finger protein ZIC 1
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MLLDAGPQYP
AIGVTTFGAS RHHSAGDVAE RDVGLGINPF ADGMGAFKLN
051 PSSHELASAG
QTAFTSQAPG YAAAAALGHH HHPGHVGSYS SAAFNSTRDF
101 LFRNRGFGDA
AAAASAQHSL FAASAGGFGG PHGHTDAAGH LLFPGLHEQA
151 AGHASPNVVN
GQMRLGFSGD MYPRPEQYGQ VTSPRSEHYA APQLHGYGPM
201 NVNMAAHHGA
GAFFRYMRQP IKQELICKWI EPEQLANPKK SCNKTFSTMH
251 ELVTHVTVEH
VGGPEQSNHI CFWEECPREG KPFKAKYKLV NHIRVHTGEK
301 PFPCPFPGCG
KVFARSENLK IHKRTHTGEK PFKCEFEGCD RRFANSSDRK
351 KHMHVHTSDK
PYLCKMCDKS YTHPSSVRKH MKVHESSSQG SQPSPAASSG
401 YESSTPPTIV SPSTDNPTTS
SLSPSSSAVH HTAGHSALSS NFNEWYV  （配列番号３５）
【０１７９】
配列番号３５のZinc finger
protein ZIC 1インタクトタンパク質を認識する特異抗体を作製するための合成抗原ペプチド。Ｃ末端にシステインとリジンを付加している。
NPTTSSLSCK  （配列番号８８）
【０１８０】
〔５３〕  Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain
precursor
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MKPPRPVRTC SKVLVLLSLL AIHQTTTAEK NGIDIYSLTV
DSRVSSRFAH
051 TVVTSRVVNR ANTVQEATFQ MELPKKAFIT NFSMNIDGMT
YPGIIKEKAE
101 AQAQYSAAVA KGKSAGLVKA TGRNMEQFQV SVSVAPNAKI
TFELVYEELL
151 KRRLGVYELL LKVRPQQLVK HLQMDIHIFE PQGISFLETE
STFMTNQLVD
201 ALTTWQNKTK AHIRFKPTLS QQQKSPEQQE TVLDGNLIIR
YDVDRAISGG
251 SIQIENGYFV HYFAPEGLTT MPKNVVFVID KSGSMSGRKI
QQTREALIKI
301 LDDLSPRDQF NLIVFSTEAT QWRPSLVPAS AENVNKARSF
AAGIQALGGT
351 NINDAMLMAV QLLDSSNQEE RLPEGSVSLI ILLTDGDPTV
GETNPRSIQN
401 NVREAVSGRY SLFCLGFGFD VSYAFLEKLA LDNGGLARRI
HEDSDSALQL
451 QDFYQEVANP LLTAVTFEYP SNAVEEVTQN NFRLLFKGSE
MVVAGKLQDR
501 GPDVLTATVS GKLPTQNITF QTESSVAEQE AEFQSPKYIF
HNFMERLWAY
551 LTIQQLLEQT VSASDADQQA LRNQALNLSL AYSFVTPLTS
MVVTKPDDQE
601 QSQVAEKPME GESRNRNVHS GSTFFKYYLQ GAKIPKPEAS
FSPRRGWNRQ
651 AGAAGSRMNF RPGVLSSRLL GLPGPPDVPD HAAYHPFRRL
AILPASAPPA
701 TSNPDPAVSR VMNIKIEETT MTTQTPAPIQ APSAILPLPG
QSVERLCVDP
751 RHRQGPVNLL SDPEQGVEVT GQYEREKAGF SWIEVTFKNP
LVWVHASPEH
801 VVVTRNRRSS AYKWKETLFS VMPGLKMTMD KTGLLLLSDP
DKVTIGLLFW
851 DGRGEGLRLL LRDTDRFSSH VGGTLGQFYQ EVLWGSPAAS
DDGRRTLRVQ
901 GNDHSATRER
RLDYQEGPPG VEISCWSVEL  （配列番号５５）
【０１８１】
配列番号５６のInter-alpha-trypsin
inhibitor heavy chain precursor由来ペプチドを認識する特異抗体を作製するための合成抗原ペプチド。Ｃ末端にシステインを付加している。
RLAILPASC  （配列番号８９）
【０１８２】
〔５４〕  Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain
precursor
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MKPPRPVRTC SKVLVLLSLL AIHQTTTAEK NGIDIYSLTV
DSRVSSRFAH
051 TVVTSRVVNR ANTVQEATFQ MELPKKAFIT NFSMNIDGMT
YPGIIKEKAE
101 AQAQYSAAVA KGKSAGLVKA TGRNMEQFQV SVSVAPNAKI TFELVYEELL
151 KRRLGVYELL LKVRPQQLVK HLQMDIHIFE PQGISFLETE
STFMTNQLVD
201 ALTTWQNKTK AHIRFKPTLS QQQKSPEQQE TVLDGNLIIR
YDVDRAISGG
251 SIQIENGYFV HYFAPEGLTT MPKNVVFVID KSGSMSGRKI
QQTREALIKI
301 LDDLSPRDQF NLIVFSTEAT QWRPSLVPAS AENVNKARSF
AAGIQALGGT
351 NINDAMLMAV QLLDSSNQEE RLPEGSVSLI ILLTDGDPTV
GETNPRSIQN
401 NVREAVSGRY SLFCLGFGFD VSYAFLEKLA LDNGGLARRI
HEDSDSALQL
451 QDFYQEVANP LLTAVTFEYP SNAVEEVTQN NFRLLFKGSE
MVVAGKLQDR
501 GPDVLTATVS GKLPTQNITF QTESSVAEQE AEFQSPKYIF
HNFMERLWAY
551 LTIQQLLEQT VSASDADQQA LRNQALNLSL AYSFVTPLTS
MVVTKPDDQE
601 QSQVAEKPME GESRNRNVHS GSTFFKYYLQ GAKIPKPEAS
FSPRRGWNRQ
651 AGAAGSRMNF RPGVLSSRLL GLPGPPDVPD HAAYHPFRRL
AILPASAPPA
701 TSNPDPAVSR VMNIKIEETT MTTQTPAPIQ APSAILPLPG
QSVERLCVDP
751 RHRQGPVNLL SDPEQGVEVT GQYEREKAGF SWIEVTFKNP
LVWVHASPEH
801 VVVTRNRRSS AYKWKETLFS VMPGLKMTMD KTGLLLLSDP
DKVTIGLLFW
851 DGRGEGLRLL LRDTDRFSSH VGGTLGQFYQ EVLWGSPAAS
DDGRRTLRVQ
901 GNDHSATRER
RLDYQEGPPG VEISCWSVEL  （配列番号５５）
【０１８３】
配列番号５５のInter-alpha-trypsin inhibitor heavy
chain precursorインタクトタンパク質を認識する特異抗体を作製するための合成抗原ペプチド。Ｎ末端にシステインを付加している。
CEQGVEVTGQYEREKAGF  （配列番号９０）
【０１８４】
〔５５〕  GMP reductase 1
インタクトタンパク質／ペプチド
001 MPRIDADLKL DFKDVLLRPK RSSLKSRAEV DLERTFTFRN
SKQTYSGIPI
051 IVANMDTVGT FEMAAVMSQH SMFTAIHKHY SLDDWKLFAT
NHPECLQNVA
101 VSSGSGQNDL EKMTSILEAV PQVKFICLDV ANGYSEHFVE FVKLVRAKFP
151 EHTIMAGNVV TGEMVEELIL SGADIIKVGV GPGSVCTTRT
KTGVGYPQLS
201 AVIECADSAH GLKGHIISDG GCTCPGDVAK AFGAGADFVM
LGGMFSGHTE
251 CAGEVFERNG RKLKLFYGMS SDTAMNKHAG GVAEYRASEG
KTVEVPYKGD
301 VENTILDILG GLRSTCTYVG AAKLKELSRR ATFIRVTQQH NTVFS  （配列番号５７）
【０１８５】
配列番号５７のGMP reductase 1インタクトタンパク質を認識する特異抗体を作製するための合成抗原ペプチド。Ｃ末端にシステインを付加している。
VRAKFPEC  （配列番号９１）
【０１８６】
それぞれのバイオマーカーペプチドに特異な抗体を含む抗血清は抗原ペプチドをリガンドとしたペプチドカラムを用いて精製し、-80℃にて保存した。
【０１８７】
実施例３    抗体ビーズ作成
（１）方法
（１−１）  抗体の調製とProtein
Gへの結合
配列番号５６で示されるInter-alpha-trypsin
inhibitor heavy chain precursor由来ペプチドを特異的に認識する抗体(BMPEP1117R)2 mgを0.15
M 塩化ナトリウムを含む20 mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH
7.5)(PBS)で4 mlの抗体溶液にした。1 mlのProtein G Sepharose ビーズ(GEヘルスケア社)をPBSで洗浄し、抗体溶液と混合して室温で2時間穏やかに振盪した。その後、200 mM トリエタノールアミン-HCl (pH 8.5)でビーズを洗浄してProtein Gと結合しなかった抗体を除去した。
（１−２）  抗体とProteinGのクロスリンク
その後、溶液を除いたビーズに20 mM ジメチルピメリミドを含む200 mMトリエタノールアミン(DMP)を6 ml加えて室温で4時間穏やかに振盪し、抗体とProtein Gをクロスリンクして共有結合化した。
（１−３）  ブロッキング
その後、PBSでビーズを洗浄してDMPを除去し、さらに200 mM エタノールアミン(pH 8.0)を6 ml加えて室温で2時間穏やかに浸透し、アミン基のブロッキングを行った。
（１−４）  洗浄
エタノールアミンを除去した後、100
mM グリシン-塩酸緩衝液(pH 2.8)を6 ml加えて、10分間室温で穏やかに振盪した。その後、PBSでビーズを洗浄した。
（１−５）  抗体ビーズのクロスリンクの確認
10% ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)で確認した。クロスリンク前のProtein G Sepharoseとクロスリンク後のProtein G
Sepharoseにそれぞれ15 μl の超純水と5 μlのSDS サンプルバッファー(四倍濃度) を加えて95℃で8分煮沸した。上清をアクリルアミドゲルに供与し、20 mAの電流で泳動した。染色は銀染色法を行った。
（１−６）  保存
0.02% アジ化ナトリウムを含むPBS中で4℃保存。
【０１８８】
（２）  結果
図７は抗体ビーズのクロスリンクの確認のためにSDS-PAGEを行った結果である。抗体とProrein Gの結合は、抗体の重鎖Fc領域がProtein Gと会合してなされる。クロスリンクにより共有結合化されるとProtein Gと抗体の重鎖は熱ではほとんど切断されない。よって、クロスリンク後の抗体ビーズは煮沸しても抗体重鎖は遊離しない。図７中の矢印で示してある55 ｋDa付近のバンドは抗体の重鎖であり、クロスリンク前と後ではクロスリンク後の方が重鎖バンドが薄くなっている。このことはクロスリンクによりProtein Gと抗体重鎖の共有結合化が十分に行われていることを示している。
【０１８９】
実施例４    ImmunoMS法による臨床サンプルバリデーション実験
（１）  方法
正常人、肝炎患者、肝硬変および肝がん患者の血清25 μlの各々に100 fmol /μl のBMPEP1117合成ペプチドを1 μl添加し、4℃で10分間温置した。その後、475 μlの0.1%
トリフルオロ酢酸(TFA)を加え、105℃で5分間煮沸した。その後、14,000×gで15分間遠心後、上清に0.3 M塩化ナトリウム、0.2% n-オクチルグルコシドを含む100 mM トリス-HCl
(pH 7.5)を500 μl加えて、ペプチド溶液とした。ペプチド溶液に実施例３で作成したBMPEP1117R抗体ビーズを10 μl加えて2時間穏やかに振盪した。その後10,000×gで1分間遠心を行い、上清を除去した。0.15 M塩化ナトリウム、0.1% n-オクチルグルコシドを含む50 mM トリス-HCl
(pH 7.5)(TBS)を1 ml加えて、10分間穏やかに振盪した。ビーズを含む溶液を0.45 μm 遠心ろ過ユニット(ウルトラフリーＭＣ、ミリポア社)に移した後、1,000×gで1分遠心した。さらにTBSを400 μl加えて1,000×gで1分間遠心した。これを4回繰り返した。さらに、50 mM 炭酸アンモニウムを400 μl加えて1,000×gで1分間遠心した。これを3回繰り返した。2-プロパノール：水：ギ酸＝４：４：１の溶液を50 μl加えて10分間放置し、1,000×gで1分間遠心した。これを2回繰り返してろ液を回収した。ろ液は遠心真空乾燥を行い、乾固した。その後、5% アセトニトリルを含む0.095% TFAを20 μl加えて、超音波で再溶解した。C18ピペットチップ(Eppendorf社、PerfectPure C-18 Tip)でペプチドを濃縮してMALDIターゲットプレートにスポットし、MALDI TOF型質量分析機(AXIMA CFR plus)で質量測定した。スパイクしたBMPEP1117合成ペプチドの強度に対して、バイオマーカーである糖鎖修飾型BMPEP1117ペプチドの強度を補正し、半定量化した。
【０１９０】
（２）  結果
上記方法を用いて、糖鎖修飾型BMPEP1117ペプチドが肝炎、肝硬変および肝がん患者血清から検出された結果を図８に示す。図８は肝がん患者血清を一つの例として、上記方法で質量分析を行い、得られた質量スペクトル図である。図８の白矢印で示されるシグナルはスパイクしたBMPEP1117合成ペプチドであり、黒矢印で示されるシグナルは糖鎖修飾型BMPEP1117ペプチドである。BMPEP1117合成ペプチドは血清中に100 fmolスパイクしているので、質量分析で得られた強度はBMPEP1117合成ペプチドの量と相関があると見なし、糖鎖修飾型BMPEP1117ペプチドの強度をBMPEP1117合成ペプチドの強度で補正することにより、半定量化を行った。図９は正常人、肝炎患者、肝硬変患者および肝がん患者それぞれ10例ずつ上記方法で糖鎖修飾型BMPEP1117を検出した結果の分布図である。分布図中の横線はそれぞれ、正常人群、肝炎患者群、肝硬変患者群および肝がん患者群の糖鎖修飾型BMPEP1117の検出値の平均である。これらの分布を元に、各疾患患者同士のt検定を行った。図９より糖鎖修飾型BMPEP1117は正常人と肝炎患者、肝硬変患者、肝がん患者を効果的に区別でき、P値はそれぞれ正常人対肝炎患者でP=0.000003であり、正常人対肝硬変患者でP=0.00017、正常人対肝がん患者でP=0.0000004であった。また、肝炎患者および肝硬変患者と肝がん患者を区別でき、P値はP=0.0368であった。
【０１９１】
本実験において、本発明者が独自に開発したimmunoMS法を用いて、血清からバイオマーカーを検出し、正常と肝炎・肝硬変もしくは肝炎・肝硬変と肝がんを区別することができた。本実験では一種類のバイオマーカーペプチドを認識する特異抗体で判別したが、実施例１で見つかった他のバイオマーカーペプチドを認識する特異抗体を組み合わせることによって、さらに病態の診断の精度が高まることも示された。
【０１９２】
実施例５    2D-Western法による臨床サンプルバリデーション実験
（１）  方法
正常人、肝炎患者、肝硬変患者、肝がん患者の血清30 μlの各々に170 μl Buffer A (Agilent Tec.)を混合し、Agilent Multiple Affinity Removal System column (Agilent Tec.)に供与してアルブミンやグロブリンなどの血清中の大部分を占めるタンパク質を除去した。回収したサンプルをYM-10遠心ろ過ユニット(Miilipore社)で10 μlまで濃縮し、20 mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)溶液を加えてさらに遠心して溶媒置換を行った。濃縮したサンプルを回収して、7cm IPG ストリップ (pH 4〜7、GEヘルスケア社)に供与して等電点電気泳動を行った。等電点電気泳動後、IPGストリップを還元アルキル化した。10%アクリルアミド濃度のSDSポリアクリルアミドゲルにIPGストリップを供与し、10 mAで10分間、さらに20 mAで10分間泳動を行った。合計20分間の泳動が終わった後、IPGストリップを除去して別のIPGストリップを供与して、同様に泳動を行った。これを1枚のSDSポリアクリルアミドゲル当たり合計6回繰り返した。電気泳動後、アクリルアミドゲル中のタンパク質をPVDF膜に転写し、BMPEP1117R特異抗体を1次抗体としてウエスタンブロットを行った。2次抗体はペルオキシダーゼ標識したウサギ抗体を用いて、化学発光法で検出した。
正常人、肝炎患者、肝硬変患者、肝がん患者をそれぞれ20例ずつ2D-Western法を行った。
【０１９３】
（２）  結果
上記方法を用いて、BMPEP1117の35 ｋDa断片インタクトタンパク質Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain が正常人、肝炎、肝硬変および肝がん患者血清から検出された結果を図１０に示す。図１０のA)は正常人(Normal)３例および肝炎患者(CH)３例について上記方法でウェスタンブロットを行った図である。図１０のB)は肝硬変患者(LC)３例および肝がん患者(HCC)３例について同様にウェスタンブロットを行った図である。A)、B)に示すように、いずれの患者についてもpIがわずかに異なるアイソフォームがいくつか見られた。文献によれば、これらのアイソフォームは翻訳後修飾の典型的な一つである糖鎖付加によって生じたものであり、酸性の糖の付加数が異なることに基づく。図１０のC)は肝がん患者のウェスタンブロットの結果を示している。C)より肝がん患者ではアイソフォームが10あることがわかった。正常人、肝炎、肝硬変および肝がん患者ではアイソフォームは8から12あることが判った。図１０のA)でNormalでは各アイソフォームのスポットが薄いことから、NormalではInter-alpha-trypsin inhibitor heavy
chainが血中にほとんど存在しないことが示された。
図１１はウェスタンブロットで検出された各アイソフォームの検出強度に対しての比をプロットした図である。アイソフォームスポット１から８まで正常人から肝炎患者、肝硬変患者、肝がん患者と比較すると各スポットの強度は緩やかに上昇している。スポット９および１０については肝硬変患者まではほとんど強度はみられないが肝がん患者で強く検出されている。肝がん患者について丁寧に観察すると、より酸性側にやや濃度は低いもののさらに最低二つのアイソフォームスポットが見られる。このことよりアイソフォームスポット９および１０（さらに酸性側のアイソフォームスポットを含めてもよい）は肝がん患者のみで発現するスポットであることが示された。これらのうちの一つでも、認められるならば、肝がんと診断することが可能である。
【０１９４】
本実験において、2D-Westarn法を用いて、血清からInter-alpha-trypsin inhibitor heavy chainのアイソフォームを検出し、正常、肝炎、肝硬変と肝がんを区別するアイソフォームスポット９および１０が明らかとなった。本実験では肝硬変患者が肝がんへと病態が進行するかどうかをアイソフォームスポット９および１０で判断できることから、アイソフォームスポット９および１０（さらに酸性側のアイソフォームスポットを含めてもよい）が肝がんを識別するバイオマーカーとして、病態診断を高い精度で行えることが示された。本実験ではBMPEP1117Rバイオマーカーペプチド特異抗体でそのインタクトタンパク質であるInter-alpha-trypsin
inhibitor heavy chainのアイソフォームの病態の変化による違いを区別できたが、実施例１で見つかった他のバイオマーカーペプチドを認識する特異抗体でそれぞれのインタクトタンパク質およびそのアイソフォームを検出することで、病態の変化による違いが同様に検出される可能性を示唆しており、これらをを組み合わせることによって、さらに病態の診断の精度が高まることも示された。
【図面の簡単な説明】
【０１９５】
【図１】2D-LC MALDI TOFMS法で肝がん患者血清を分離した図。
【図２】肝がん患者(HCC)、肝炎患者(CH)および肝硬変患者(LC)由来ペプチドの差異解析の結果。A)Marker Aの肝がん患者と肝硬変患者での存在の割合を示した図。B)MarkerAの肝がん患者と肝硬変患者のROC曲線。C)Marker Aの肝がん患者と肝炎患者での存在の割合を示した図。D)Marker Aの肝がん患者と肝炎患者のROC曲線。
【図３】正常人、肝炎患者、肝硬変患者と肝がん患者を比較して差が現れたバイオマーカーペプチド群の表。Group Aは肝炎患者と比較して差が見られた肝がんバイオマーカー群。Group Bは肝硬変患者と比較して差が見られた肝がんバイオマーカー群。Protein IDはインタクトタンパク質の配列番号であり、Peptide IDはバイオマーカーペプチドの配列番号に相当する。
【図４】肝炎患者及び肝硬変患者を併せた群と肝がん患者群で比較した場合に差が見られたバイオマーカー群の表。Up-regulationは肝がん患者で増加するマーカー。Down-ragulationは肝がん患者で減少するマーカー。Protein IDはインタクトタンパク質の配列番号であり、Peptide IDはバイオマーカーペプチドの配列番号に相当する。
【図５】正常人、肝炎患者、肝硬変患者および肝がん患者でのMarker Aの検出の分布図とt検定の結果。
【図６】Marker AのTOF/TOF型質量分析機によるMS/MSスペクトル図。
【図７】抗体ビーズのクロスリンクの確認のためのSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動図。
【図８】BMPEP1117合成ペプチドおよび糖鎖修飾型BMPEP1117の質量分析の結果。
【図９】正常人、肝炎患者、肝硬変患者および肝がん患者について、BMPEP1117のimmunoMS法を行った結果の分布図。
【図１０】正常人、肝炎患者、肝硬変患者および肝がん患者のBMPEP1117インタクトタンパク質Inter-alpha-trypsininhibitor heavy chain の2D-Westarnの結果。A) 正常人、肝炎患者それぞれ３例の2D-Westarnの結果。B) 肝硬変患者および肝がん患者それぞれ３例の2D-Westarnの結果。C)肝がん患者で検出したInter-alpha-trypsin inhibitorheavy chainのアイソフォーム。
【図１１】2D-Westarnで検出されたInter-alpha-trypsin inhibitor heavy chainのアイソフォームスポットの検出強度に対する比をプロットした図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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