(57)【要約】      （修正有）【課題】ＰＣＲ法を用い複数のＤＮＡ断片を融合させたＤＮＡ断片の製造に利用可能なプライマー、及びこれをもちいた融合ＤＮＡ断片の効果的な製造方法の提供。【解決手段】オーバーラップエクステンションＰＣＲ法で利用可能なプライマーにおいて、オーバーラップさせるプライマーの５’末端が、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）の含量が５０％以上で、９−４５ｂｐの長さを有し、標的ＤＮＡ断片同士を相補的に結合可能な、特定の配列であることを特徴とする１組のプライマー、及びこれを用いた融合ＤＮＡ断片の製造方法。【選択図】図１
2009268360.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）２つの領域からなり、２種類の標的ＤＮＡ断片を結合させるために用いられることを特徴とする、１組のプライマー。
（ａ）標的ＤＮＡ断片の末端の部分配列と相同性を有する、３’末端側の領域
（ｂ）グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）とを５０％以上含有し、全長が９−４５ｂｐで、標的ＤＮＡ断片同士を相補的に結合可能な、５’末端側の領域（以下「融合配列」という）
【請求項２】
融合配列のＧＣ含量が８０％以上である、請求項１に記載のプライマー
【請求項３】
融合配列が連続した（ＧＣ）ｍ（ｍは５以上２０以下の整数）を持たない、請求項２に記載のプライマー。
【請求項４】
以下の（１）、（２）のプライマーを用い、ＰＣＲ法によりｎ個の標的ＤＮＡ断片（ｎは２以上１０以下の整数）を含む融合ＤＮＡ断片を製造する方法。
（１）融合ＤＮＡ断片の全長を増幅するためのプライマー
（２）請求項１から請求項３のうちいずれか１項に記載のプライマー
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数のＤＮＡ断片を融合させたＤＮＡ断片（融合ＤＮＡ断片）を効果的に製造可能なプライマーに及びこれを用いた融合ＤＮＡ断片の製造方法に関し、より詳しくは、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）により複数の標的ＤＮＡ断片から１つの融合ＤＮＡ断片を製造可能なプライマー及びこれを用いた融合ＤＮＡ断片の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子遺伝学分野において、組換えＤＮＡ断片の製造は、目的とするタンパク質の大量生産、タンパク質検出のためのツール製造、機能性タンパク質の改変など、種々の目的に広く利用される技術である。この中でも特に、検出ツールの製造や機能性タンパク質の改変などの際には、複数のドメインをコードしたＤＮＡ断片を融合させる技術が必要となる。これらの例として、ターゲット遺伝子をコードしたＤＮＡ断片とＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードしたＤＮＡ断片を融合させて蛍光融合タンパク質をコードしたＤＮＡ断片を製造する技術などが用いられている。通常の組換えＤＮＡ断片の製造には、コアとなるＤＮＡ断片をＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）などにより製造し、大腸菌プラスミドを制限酵素により切断し、リガーゼを用いてこの中にコアＤＮＡ断片を融合させてベクターとし、更に大腸菌を当該プラスミドで形質転換するという方法が一般的であり、操作が煩雑で時間がかかるという大きな問題点があった。
【０００３】
融合ＤＮＡ断片の製造にＰＣＲを介する方法として、オーバーラップエクステンション法（Ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）が知られている。この技術の原理はＰＣＲ反応における標的ＤＮＡの増幅に際し、標的ＤＮＡ特異的なプライマーの５’末端側に別の配列を付加しておくことによって、新たな配列をＰＣＲ産物に付加し、この新たな配列が複数の標的ＤＮＡ間で相補的になるよう設計しておくことによって、アニーリング時に複数の標的ＤＮＡの末端同士を融合させ、その後のＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応で１本のＰＣＲ産物を合成するというものである。この原理を様々に応用し、遺伝子内に変異を挿入する手法などがこれまでに開発されてきている（非特許文献１−４、特許文献１，２）。しかしながら、オーバーラップエクステンション法は融合ＤＮＡ断片の製造に一般的には用いられておらず、主には制限酵素とＤＮＡリガーゼによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えなどが開発され利用されている。ＤＮＡ断片の自由自在な融合は遺伝子操作の基本技術であって、その操作性の高さと確実性とが求められており、オーバーラップエクステンション法は理論的には大変有用な手法であるが、これまでは、ＰＣＲの条件を厳しく最適化しなければならないなどの問題が多く、原理的には自由にＤＮＡの配列をデザイン可能、という利点を活かし切れていないのが現状であった。簡便かつ確実にオーバーラップエクステンションを行うことができ、ＰＣＲ条件の最適化も必要ではなく、複数のＤＮＡ断片も一度に融合可能な手法の開発が望まれていた。
【特許文献１】ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ２００４／００５３２６７
【特許文献２】ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ２００６／０２５７８７６
【非特許文献１】Ｋｕｗａｚａｗａ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔ．２４：１３０７−１３１２．
【非特許文献２】Ｃｈａｒｌｉｅｒ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０８：６７−７４．
【非特許文献３】Ｙａｎｇ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｃｅｌｌ  ３（５）：１３５９−１３６２．
【非特許文献４】Ｈｅｃｋｍａｎ  Ｋ．＆Ｐｅａｓｅ  Ｌ．２００７．Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２（４）：９２４−９３２．
【非特許文献５】Ｂｒａｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｙｅａｓｔ  １４：１１５−１３２．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記の現状に鑑み、本発明は、ＰＣＲ法を用い複数のＤＮＡ断片を融合させたＤＮＡ断片の製造に利用可能なプライマー、及びこれをもちいた融合ＤＮＡ断片の効果的な製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するため、本発明者らは、オーバーラップエクステンションを効率的に行える手法を検討してきた。その過程において、オーバーラップさせる１組のプライマーの５’末端側に、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）の含量が５０％以上で、９−４５ｂｐの長さを有し、２つの標的ＤＮＡ断片を結合可能な特定の相補的配列を用いることで、従来よりもはるかに高い効率でオーバーラップエクステンションを行えるという事実を見いだし、本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち本発明の第１の態様は、以下の（ａ）、（ｂ）２つの領域からなり、２種類の標的ＤＮＡ断片を結合させるために用いられることを特徴とする、１組のプライマーを提供する。
（ａ）標的ＤＮＡ断片の末端の部分配列と相同性を有する、３’末端側の領域
（ｂ）グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）とを５０％以上含有し、全長が９−４５ｂｐで、標的ＤＮＡ断片同士を相補的に結合可能な、５’末端側の領域（以下「融合配列」という）
【０００７】
本発明の第２の態様は、融合配列のＧＣ含量が８０％以上である、第１の態様に記載のプライマーを提供する。
本発明の第３の態様は、融合配列が連続した（ＧＣ）ｍ（ｍは５以上２０以下の整数）を持たない、第２の態様に記載のプライマーを提供する。
本発明の第４の態様は、以下の（１）、（２）のプライマーを用い、ＰＣＲ法によりｎ個の標的ＤＮＡ断片（ｎは２以上１０以下の整数）を含む融合ＤＮＡ断片を製造する方法を提供する。
（１）融合ＤＮＡ断片の全長を増幅するためのプライマー
（２）第１から第３の態様のうちいずれか１つに記載のプライマー
【発明の効果】
【０００８】
本発明の提供するプライマーを用いることにより、複数個の、好ましくは２−４個のＤＮＡ断片から１つのＤＮＡ断片を製造することが可能となる。この方法は、任意の機能的なドメインを融合させた新しいタンパク質をコードする遺伝子等を効率よく、簡便に製造することを可能とするＤＮＡ断片の製造方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下に本発明を実施するための最良の形態を示す。本発明は２種類の標的ＤＮＡ断片を結合させるために用いられることを特徴とする、１組のプライマーであって、具体的には次の２つの領域からなる１組のプライマーである。
（ａ）標的ＤＮＡ断片の末端の部分配列と相同性を有する、３’末端側の領域
（ｂ）グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）とを５０％以上含有し、全長が９−４５ｂｐで、標的ＤＮＡ断片同士を相補的に結合可能な、５’末端側の領域（以下「融合配列」という）
図１に、本発明の基本的な概念を示している。図１Ａで示すとおり、本発明の提供するプライマーは上記（ａ）、（ｂ）の２つの領域からなる１組のプライマーであって、これを用いた標的ＤＮＡ断片の結合様式を図１Ｂに示している。標的ＤＮＡ断片１と２は、本発明のプライマーの融合配列を介して相補的に結合する。
また、本発明の提供するプライマーを用いた融合ＤＮＡ断片の製造方法の模式図を図２に示している。本態様はｎ個の標的ＤＮＡ断片（ｎは２以上１０以下の正の整数）から、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により１つのＤＮＡ断片（融合ＤＮＡ断片）を製造可能なプライマーであって、プライマー（１）：融合ＤＮＡ断片の５’末端及び３’末端の部分配列と相補的な配列を有する１組のプライマー、及び、プライマー（２）：融合配列では内部に位置する標的ＤＮＡ断片の５’末端または３’末端の部分配列と相補的な塩基配列を有し、更にその５’末端側に、ＧＣの含量が５０％以上で、９−４５ｂｐの長さを有し、標的ＤＮＡ断片同士を結合可能な塩基配列（融合配列）を有する、第１から第３の態様に記載のプライマー、好ましくはｎ−１組の前記プライマー、とを用いることを特徴とする、融合ＤＮＡ断片の製造方法である。ここで、前記プライマー（２）の各々の組の融合配列は互いに相補的である。本発明はいわゆるオーバーラップエクステンションと呼ばれる、ＰＣＲを用いた核酸増幅方法に大幅な改良を加え、標的配列が２個や３個の場合だけでなく、４以上の場合にも適用可能としたものである。
【００１０】
図２において、上段にｎ＝２の場合を示している。プライマー（１）は融合ＤＮＡ断片の５’と３’の各末端と相補的な配列であり、一方プライマー（２）は融合ＤＮＡ断片の内部に位置する配列である。プライマー（２）の３’末端側はそれぞれの標的ＤＮＡ断片の末端と相補的な配列を有しており、一方５’末端側が融合配列で、プライマー（２）−５’、（２）−３’の融合配列は互いに相補的である。この組合せでＰＣＲ、すなわちまずプライマー（２）を用いたＰＣＲ（１ｓｔ  ＰＣＲ）を行い、標的ＤＮＡ断片に融合配列が付加された産物を得、このＰＣＲで得られた産物を鋳型にプライマー（１）を用いたＰＣＲ（２ｎｄ  ＰＣＲ）を行うことにより、標的ＤＮＡ断片１と標的ＤＮＡ断片２の間に融合配列を挟んだ融合ＤＮＡ断片を製造できる。
図２下段にはｎ≧３の場合を示している。代表例としてｎ＝３を示すが、原理は３以外でも共通である。プライマー（１）は融合ＤＮＡ断片の５’と３’の各末端と相補的な配列であり、一方２組のプライマー（２ａ）、（２ｂ）は融合ＤＮＡ断片の内部に位置する配列である。プライマーのデザインはｎ＝２の場合と同様であるが、重要なのは各組のプライマーの融合配列が相手とのみ相補的な結合可能な様にするという点である。この組合せでＰＣＲを行うことにより、５’末端側から標的ＤＮＡ断片１，２，３の順に並んだ、原理的には１種類のＰＣＲ産物が増幅される。
【００１１】
本発明の提供するプライマーにおいて最も重要なのは、融合配列のデザインである。融合配列は、下記実施例に示すとおり、単にお互いが相補的であれば良いというわけではない。グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）の含量が５０％以上で、９−４５ｂｐ、好ましくは１２−２４ｂｐの長さを有する塩基配列を有する条件が必要である。
ＤＮＡの相補的な結合においては、Ａ−ＴよりもＧ−Ｃの結合の方が「結合の手」が多いことからより特異性が高いと考えられ、従来オーバーラップエクステンションに用いられてきたプライマーがＧＣ含量に着目していなかったのと異なり、本発明の提供するプライマーの融合配列のＧＣ含量が５０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは１００％という条件は一つの目安となりうる。下記実施例１に示すとおり、融合配列のＧＣ含量が２０−２５％では良好な結果が得られず、５０％以上が好ましい。
加えて、融合配列が（ＧＣ）ｍ（ｍは５−２０の正の整数）を含まない塩基配列という点も重要である。実施例４で示す通り、（ＣＧ）１５の様な融合配列では、ＧＣ含量が１００％であるにもかかわらずＰＣＲ産物が得られていない。ＲＮＡなどの研究から、ある程度の長さを持った１本鎖の核酸はその末端同士が相補的な塩基配列を有する場合、相補的な部分が結合してループ上の構造をとることが知られており、プライマーでこれがアニーリング時に起こるとＰＣＲの増幅効率を著しく下げることが考えられる。従って、融合配列の条件として、（ＧＣ）ｍ、（ｍは５−２０の正の整数）を持たないこと、または５’末端、３’末端の各々３０％程度が相補的でないという条件が重要になる。
【００１２】
上記の条件を満たす融合配列の好ましい例としては、ＧまたはＣのどちらか１つが複数個、好ましくは９−３０個連なった配列があげられる。更にその片側または両側の末端に、ＡまたはＴが単数または複数個、好ましくは１−５個付加された配列も、上記条件を満たす限りは有効である。ＡまたはＴが末端ではなく内部にある配列も、上記条件を満たす限りは有効である。
融合配列の好ましい例としては、下記実施例４で示す通り、ＧまたはＣの塩基とＡまたはＴの塩基が交互にくり返す配列、例えば（ＧＡ）ｍ、（ＧＴ）ｍ、（ＣＡ）ｍ、（ＣＴ）ｍ、（ＡＧ）ｍ、（ＴＧ）ｍ、（ＡＣ）ｍ、（ＴＣ）ｍ（ｍは５−２０の正の整数）で表される配列があげられる。ｍは好ましくは６−１５の範囲内の正の整数である。
融合配列としては、更に複雑な構造を有する配列も、上記の条件を満たしていれば本発明の好適な例として適用可能である。例えば３Ｇ３Ｃ３Ｇ３Ｃ３Ｇ、３Ｃ３Ｇ３Ｃ３Ｇ３Ｃ、５Ｃ５Ｇ５Ｃ、５Ｇ５Ｃ５Ｇなどである。
【００１３】
融合配列は融合ＤＮＡ断片の内部に入るため、融合ＤＮＡ断片からタンパク質を合成する際には融合配列の塩基数にも注意が必要である。融合ＤＮＡ断片の製造が遺伝子破壊を目的とする様なケース（実施例５）では、その塩基数に特に注意する必要はないが、複数のドメインを結合させた改良遺伝子などを製造する場合には、融合配列を３の倍数となるよう設計して翻訳時のフレームシフトが起こらない様にするなどの工夫が必要である。
また融合配列は、長ければ長いほどその特異性が高まると考えられるが、プライマーが２次構造を取る可能性やＰＣＲそのものの効率の観点から、好ましくは９ｂｐ以上４５ｂｐ以下、更に好ましくは１５−２４ｂｐの長さが良い。以下に本発明の実施例を示すが、本発明は実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例１】
【００１４】
（酵母、その培養、及びＤＮＡ抽出）酵母株として、ＢＹ系列の酵母（非特許文献５）を用いた。酵母の培養法はＹＰＤ寒天培地（１％  酵母抽出物、２％  ポリペプトン、２％  グルコース、２％  寒天）を用いて培養し、酵母からのＤＮＡ抽出は、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ（生化学工業社製）の粉末３ｍｇを０．９ｍｌのＳＥＴ  ｂｕｆｆｅｒ（１．２Ｍ  Ｓｏｒｂｉｔｏｌ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）に溶かし、０．１ｍｌのβ−メルカプトエタノールを加えてＤＮＡ抽出溶液とし、培養した酵母細胞をＤＮＡ抽出溶液、次いで１０％ＳＤＳ溶液に溶かし、フェノール−クロロホルム抽出／エタノール沈澱を行ってＤＮＡを抽出・精製した。抽出したＤＮＡはＴＥ  ｂｕｆｆｅｒに溶かし、ＲＮａｓｅ処理により予めＲＮＡを除去した。
【００１５】
（標的ＤＮＡ断片の製造）予め大量に調製したプラスミドｐＳＴ１０６をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、０．７％アガロースゲルで電気泳動して１．８ｋｂｐのバンドを切り出し、フィルターで遠心精製して、ＵＲＡ３ＴＤＨ３ｐ断片を得た。
１．２ｋｂｐと１．０ｋｂｐのＰｐＨＩＳ３断片はＲＡＫ３６００から、２．１ｋｂｐのＴＤＨ３ｐＴＡＡ断片はｐ３１６ＴＤＨＴＡＡプラスミドから、１．２ｋｂｐのＵＲＡ３断片はＵＲＡ３ＴＤＨ３ｐ断片から、２．４ｋｂｐのＴＤＨ３ｐＴＡＡＰＧＫ断片はｐ３１６ＴＤＨＴＡＡＰＧＫプラスミドから、０．３ｋｂｐのＵＲＡ３−５’断片と１．３ｋｂｐのＵＲＡ３−３’断片はＢＹ４７０４から、０．８ｋｂｐのＡＤＥ２−５’断片と２．０ｋｂｐのＡＤＥ２−３’断片はＢＹ４７４１から、１．２ｋｂｐのＵＲＡ３断片はＢＹ４７０４から、それぞれＰＣＲ法にて増幅した。全てのＰＣＲ反応（１０μｌ）はＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）を用いて用法に従い行った。ＰＣＲの各反応条件は、下記表１の通りである。なお、以降のＰＣＲ反応においてアニーリング温度は適宜変更し、変更の際にはその旨明記している。
【００１６】
【表１】
2009268360.tif 000003
【００１７】
（オーバーラップエクステンション１）上記にて製造した複数の標的ＤＮＡ断片を鋳型に、これを融合させるオーバーラップエクステンションＰＣＲを行った。ＰＣＲは１０μｌの系で行い、反応条件は上記表１と基本的に同じで、アニーリング温度を５０−６８℃の間で適宜変更して最適条件を探索した。
まず、オーバーラップエクステンションＰＣＲに対する融合配列のＧＣ含量の影響を検証した。上記標的ＤＮＡ配列のうちＴＤＨ３ｐＴＡＡとＰｐＨＩＳ３とを融合させるため、プライマー（１）としてＴＤＨ３−５７２プライマー（配列番号１）及びＵＲＡ３−２００ｃプライマー（配列番号２）を、プライマー（２）として、融合配列のＧＣ含量が５／２０（２５％）で長さ２０塩基のプライマー、すなわちＰＧＫ１ｔｅｒ１−２０ｃ−ＴＡＡｃプライマー（配列番号３）及びＰＧＫｔｅｒ１−２０−ＰｐＨＩＳ３（配列番号４）の組合せ、またはプライマー（２）として、融合配列のＧＣ含量が７／３０（約２３％）で長さ３０塩基のプライマー、すなわちＰＧＫｔｅｒ１−３０ｃ−ＴＡＡｃプライマー（配列番号５）及びＰＧＫｔｅｒ１−３０−ＰｐＨＩＳ３プライマー（配列番号６）の組合せ、またはプライマー（２）として、融合配列のＧＣ含量が８／４０（２０％）で長さ４０塩基のプライマー、すなわちＰＧＫｔｅｒ１−４０ｃ−ＴＡＡｃプライマー（配列番号７）及びＰＧＫｔｅｒ１−４０−ＰｐＨＩＳ３プライマー（配列番号８）の組合せ、の３種類のプライマーセットを用いたＰＣＲを行った。アニーリングの温度条件は５０℃、５５℃、６０℃、６８℃の４条件であった。ＰＣＲの概要を図３に示した。
【００１８】
上記の融合配列に加えて、ＧＣ含量を高める検討も行った。上記と同じ標的配列、同じ条件を用いたＰＣＲにおいて、プライマー（２）として１５Ｇ−ＴＡＡｃ（配列番号９）、及び１５Ｃ−ＰＧＫｔｅｒ１（配列番号１０）のプライマーを用いたＰＣＲを行った。融合配列のＧＣ含量は１００％、アニーリング温度は６８℃であった。ＰＣＲ反応の概要を図４に示した。
【００１９】
ＰＣＲの結果を、図５に示す。図はＰＣＲ産物の電気泳動写真を示しており、レーンＭは分子量マーカー（ｋｂラダー）を、矢印は泳動の方向を、レーン２０，３０，４０はそれぞれ融合配列の長さを示し、更にその上にはアニーリングの温度条件を示している。この結果から、ＧＣ含量が２０−２５％と低い割合の融合配列を用いた場合には、６０℃以下のアニーリング温度条件下では２０，３０，４０のいずれでも融合ＤＮＡ断片（３．３ｋｂｐ）が増幅されないという事が示された。６０℃では融合配列長が３０，４０のときバンドが現れたが明瞭ではなく、６８℃においても良い増幅効率とはいえない結果であった。
【００２０】
一方、図５中右端のレーンは、融合配列が１５個のＣからなるプライマーを用いたＰＣＲの結果を示す。左側の各レーンとは異なり、３−４ｋｂｐに明瞭なシングルバンドが確認され、このサイズは２つの標的ＤＮＡ断片を融合させた際の理論上の大きさと一致した。ＧＣ含量が低い融合配列よりも短い融合配列であったのにもかかわらず、オーバーラップエクステンション産物が増幅され、ＧＣ含量が大きい（ＧＣリッチな）融合配列を用いることがオーバーラップエクステンションの成功には重要であることが示された。
【実施例２】
【００２１】
融合配列が１５Ｇである融合プライマーで良好な結果が得られたため、Ｇ（またはＣ）のみからなる融合配列の長さについて検討した。標的配列としてＴＤＨ３ｐＴＡＡＰＧＫとＵＲＡ３配列を鋳型とし、プライマー（１）としてＴＤＨ３−５７２プライマー（配列番号１１）及びＫａｎＭＸ７５−ＴＤＨｕ１プライマー（配列番号１２）を、プライマー（２）として連続するＧ／Ｃの数が９個の９Ｇ−ＰＧＫｔｅｒＣプライマー（配列番号１３）及び９Ｃ−ＡＳＣプライマー（配列番号１４）の組合せ、またはＧ／Ｃの数が１２個の１２Ｇ−ＰＧＫｔｅｒＣプライマー（配列番号１５）及び１２Ｃ−ＡＳＣプライマー（配列番号１６）の組合せ、またはＧ／Ｃの数が１５個の１５Ｇ−ＰＧＫｔｅｒＣプライマー（配列番号１７）及び１５Ｃ−ＡＳＣプライマー（配列番号１８）の組合せ、の３種類のＰＣＲを行った。アニーリング温度は５０℃、５５℃、６５℃の３種類を検討した。ＰＣＲ反応の概要を図６に示す。
【００２２】
上記ＰＣＲの結果を図７に示す。図７中、下線「実施例２」に上記ＰＣＲの結果を示す。実施例２，３，４で図は共通である。本図はＰＣＲ産物を電気泳動したものであり、レーンＭは分子量マーカーを、横の数字は分子量（ｋｂｐ）を、それぞれ表している。Ａ，Ｂ，Ｃはそれぞれアニーリング温度が５０℃、５５℃、６５℃での結果を示す。ＰＣＲで増幅された産物は３ｋｂｐ−４ｋｂｐの位置にシングルバンドとして表れ、これは標的配列から予測される大きさ（３．５ｋｂｐ）と一致した。レーン９Ｃは融合配列中のＧ／Ｃ数が９個のＰＣＲ産物であり、５０℃、５５℃では増幅が見られず、６５℃で産物が見られた。
レーン１２Ｃは融合配列中のＧ／Ｃ数が１２個のＰＣＲ産物であり、５０℃では産物の量が少ないものの、５５℃と６５℃では増幅が見られ、特に６５℃では多くのＰＣＲ産物が得られていることが示された。
レーン１５Ｃは融合配列中のＧ／Ｃ数が１５個のＰＣＲ産物であり、５０℃から６５℃まで、明瞭なＰＣＲ産物が確認された。ＰＣＲ産物量（蛍光の強度が表す）は全ての温度条件下で１５Ｃが最も多かった。これらの結果から、プライマー（２）における融合配列がＧｍまたはＣｍ（ｍは９−４５正の整数）で表されるとき、その数がＰＣＲの効率には重要であり、ｍが９以上３０以下、好ましくは１２以上２１以下、更に好ましくは１５以上１８以下であるプライマーが適していることが示された。
【実施例３】
【００２３】
（オーバーラップエクステンション３）Ｃ９、Ｃ１２、Ｃ１５で表される融合配列が良好な結果を示したため、次に、融合配列Ｃ１５にＴを加えた場合についてのＰＣＲ増幅の効率を検討した。標的配列として実施例２と同様、ＴＤＨ３ｐＴＡＡＰＧＫとＵＲＡ３配列を鋳型とし、プライマー（１）としてＴＤＨ３−５７２プライマー（配列番号１１）及びＫａｎＭＸ７５−ＴＤＨｕ１プライマー（配列番号１２）を、プライマー（２）として１５個のＣの間にＴを付加し（５Ｃ−Ｔ−４Ｃ−Ｔ−３Ｃ−Ｔ−２Ｃ−Ｔ−ＣＴ）となるようデザインした１５ＣＣＴ−ＡＳＣプライマー（配列番号１９）及び１５ＡＧＧ−ＰＧＫｔｅｒＣプライマー（配列番号２０）の組合せ、または１５個の連続したＣの両端にＴを付加したＴ−１５Ｃ−Ｔ−ＡＳＣプライマー（配列番号２１）及びＡ−１５Ｇ−Ａ−ＰＧＫｔｅｒＣプライマー（配列番号２２）の組合せ、または１５個の連続したＣの両端に３つのＴを付加した３Ｔ−１５Ｃ−３Ｔ−ＡＳＣプライマー（配列番号２３）及び３Ａ−１５Ｇ−３Ａ−ＰＧＫｔｅｒＣプライマー（配列番号２４）の組合せ、または３つのＴが１５個のＣの間に付加された（５Ｃ３Ｔ）３−ＡＳＣプライマー（配列番号２５）及び（３Ａ５Ｇ）３−ＰＧＫｔｅｒＣプライマー（配列番号２６）の組合せ、の４種類のＰＣＲを行った。アニーリング温度は５０℃、５５℃、６５℃の３種類を検討した。
【００２４】
図７中、下線「実施例３」に上記ＰＣＲの結果を示す。図中レーン１５Ｃ−Ｔは（５Ｃ−Ｔ−４Ｃ−Ｔ−３Ｃ−Ｔ−２Ｃ−Ｔ−ＣＴ）の融合配列でのＰＣＲ産物であり、５０℃では少し増幅が弱いものの５５℃、６５℃とアニーリング温度が上昇するにつれて産物量が多くなり、６５℃では１５Ｃと同程度の産物量であることが示された。
レーンＴ−１５Ｃ−Ｔは１５個の連続したＣの両末端にＴを付加した融合配列でのＰＣＲ産物であり、１５Ｃ−Ｔと同様、アニーリング温度が高くなるにつれて産物量が多くなる傾向が見られ、６５℃では１５Ｃと同程度の産物が得られていた。
レーン３Ｔ−１５Ｃ−３Ｔは１５個の連続したＣの両末端に３個のＴを付加した融合配列でのＰＣＲ産物であり、このとき融合配列のＧＣ含量は約７０％であったが、５０℃と５５℃で上の２つのプライマーよりも増幅の効率がすぐれており、６５℃でも１５Ｃと同程度の産物が得られていた。
レーン（５Ｃ３Ｔ）３は５個のＣの後に３個のＴが付加されたものが３回くり返した融合配列でのＰＣＲ産物であり、このとき融合配列のＧＣ含量は約６０％であったが、５０℃ではやや増幅の効率が悪いものの、５５℃と６５℃では１５Ｃと同程度の産物が得られており、この融合配列が有効であることが示された。
【００２５】
上記の結果から、融合配列として５Ｃ−Ｔ−４Ｃ−Ｔ−３Ｃ−Ｔ−２Ｃ−Ｔ−ＣＴ、Ｔ−１５Ｃ−Ｔ、３Ｔ−１５Ｃ−３Ｔ、（５Ｃ３Ｔ）３の各配列が適していることが示された。
【実施例４】
【００２６】
（オーバーラップエクステンション４）融合配列のＧＣ含量が６０％程度であってもオーバーラップエクステンションが良好な結果を示したため、次に、融合配列において異なる塩基種がくり返した場合について検討した。標的配列として実施例２と同様、ＴＤＨ３ｐＴＡＡＰＧＫとＵＲＡ３配列を鋳型とし、プライマー（１）としてＴＤＨ３−５７２プライマー（配列番号１１）及びＫａｎＭＸ７５−ＴＤＨｕ１プライマー（配列番号１２）を、プライマー（２）として、ＣＧが１５回くり返した（ＣＧ）１５−ＡＳＣプライマー（配列番号２７）及び（ＧＣ）１５−ＰＧＫｔｅｒＣプライマー（配列番号２８）の組合わせ、またはプライマー（２）として、ＣＴが１５回くり返した（ＣＴ）１５−ＡＳＣプライマー（配列番号２９）及び（ＡＧ）１５−ＰＧＫｔｅｒＣプライマー（配列番号３０）の組合せ、またはプライマー（２）としてＣＴが１０回くり返した（ＣＴ）１０−ＡＳＣプライマー（配列番号３１）及び（ＡＧ）１０−ＰＧＫｔｅｒＣプライマー（配列番号３２）の組合せ、またはプライマー（２）としてＣＡが１０回くり返した（ＣＡ）１０−ＡＳＣプライマー（配列番号３３）及び（ＴＧ）１０−ＰＧＫｔｅｒＣプライマー（配列番号３４）の組合せ、のそれぞれについて検討した。プライマー（２）として、Ａが１５回くり返した１５Ａ−ＡＳＣプライマー（配列番号３５）及び１５Ｔ−ＰＧＫｔｅｒＣプライマー（配列番号３６）についても同様に検討した。アニーリング温度は５０℃、５５℃、６５℃の３種類を検討した。
【００２７】
図７中、下線「実施例４」に、上記ＰＣＲの結果を示す。図中レーン（ＣＧ）１５はＣＧが１５回くり返した融合配列での結果を示す。この融合配列はＧＣ含量が１００％であるにもかかわらず、全ての温度条件でＰＣＲ産物が観察されなかった。これは、ＰＣＲのアニーリング時に融合配列の末端同士が相補的に結合してループ状の構造を形成し、ＰＣＲ反応の効率が極端に低下したのが原因と考えられた。この結果から、融合配列が（ＧＣ）ｍまたは（ＣＧ）ｍ（ｍは５−２０の正の整数）では表されないことがオーバーラップエクステンションには重要であることが示された。
レーン（ＣＴ）１５は、ＣＴが１５回くり返した融合配列での結果を示す。（ＣＧ）１５とは異なり、この融合配列でのＰＣＲの結果は良好であり、特に５５℃、６５℃では高い増幅効率を示した。（ＣＴ）１５では融合配列の末端同士は相補的でないことから、上記の予測を支持する結果といえる。
レーン（ＣＴ）１０は、ＣＴが１０回くり返した融合配列での結果を示す。（ＣＴ）１５に比べて、５０℃では増幅の効率が少し低いものの、５５℃、６５℃では良好な結果を示し、この融合配列が適していることが示された。
レーン（ＣＡ）１０は、ＣＡが１０回くり返した融合配列での結果を示す。全ての温度条件下で良好な増幅が見られ、この融合配列が適していることが示された。
レーン１５Ａは、Ａが１５個連続した融合配列での結果を示す。１５Ｃの結果と異なり、この融合配列ではどの温度条件でもＰＣＲ産物が観察されなかった。このことから、融合配列におけるＧＣ含量の重要性が改めて示された。
【００２８】
以上の結果から、融合配列におけるくり返しのパターンとしては（ＣＴ）ｍ、（ＣＡ）ｍ（ｍは５−２０、好ましくは１０−１５の正の整数）が適していることが示された。
【実施例５】
【００２９】
（３つの標的ＤＮＡ断片を用いたオーバーラップエクステンション−遺伝子破壊）２つの標的ＤＮＡ断片を用いたオーバーラップエクステンションが良好な結果を示したため、標的ＤＮＡ断片が３つのオーバーラップエクステンションを検討した。３つの標的ＤＮＡ断片を融合させる手法は、標的遺伝子の５’末端側領域と３’末端側領域の間に特定の配列を挿入して遺伝子の機能を破壊する「遺伝子破壊」に用いることができるため、酵母の系を用いて融合ＤＮＡ断片の製造とその検証を行った。
【００３０】
遺伝子破壊の標的遺伝子としてはＡＤＥ２（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌａｍｉｎｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）遺伝子を用い、ＡＤＥ２遺伝子の開始コドンから３７９塩基下流の部分にＰｐＨＩＳ３断片を挿入するオーバーラップエクステンションを試みた。
酵母ＲＡＫ３６００株のゲノムＤＮＡから、ＰｐＨＩＳ３遺伝子断片を増幅し、ＡＤＥ２遺伝子破壊のため、ＡＤＥ２−５断片とＡＤＥ２−３断片をそれぞれ酵母ＢＹ４７４１株よりＰＣＲで増幅した。これら３つの標的配列を鋳型に、プライマー（１）としてＡＤＥ２−７９７プライマー（配列番号３７）及びＡＤＥ２＋２３９２ｃプライマー（配列番号３８）を、プライマー（２）として１５Ｃ−ＰｐＨＩＳ３−１プライマー（配列番号３９）及び１５Ｇ−ＡＤＥ２−１ｃプライマー（配列番号４０）の組合せ、及び５Ｃ５Ｇ５Ｃ−ＡＤＥ２＋３７９プライマー（配列番号４１）及び５Ｇ５Ｃ５Ｇ−ＰｐＨＩＳ３ｃプライマー（配列番号４２）の組合せをそれぞれ用い、オーバーラップエクステンションを行った。ＰＣＲの概要を図８に示す。ＰＣＲ産物を０．７％アガロースゲル電気泳動にて確認し、その結果を図９に示す。図はＰＣＲ産物の電気泳動像であり、レーンＭは分子量マーカー（ｋｂｐラダー）を、レーン２はそれぞれオーバーラップエクステンションＰＣＲの産物を表している。図が示すとおり、レーン２には４ｋｂｐ付近にシングルバンドが観察され、これはオーバーラップエクステンションの予測値（３．８ｋｂｐ）とよく一致した。
得られたＰＣＲ産物５０ｎｇを用い、酵母ＢＹ４７４１株に酢酸リチウム法によって形質転換を行った。１２０μｌの６０％ＰＥＧ３３５０、１０μｌのキャリアＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）、５μｌの４Ｍ  酢酸リチウム、６５μｌのＢＹ４７４１株培養液、５０ｎｇのＰＣＲ産物を混合し、４２℃のヒートショックを加えることで酵母細胞内にＰＣＲ産物を導入した。形質転換後の細胞をヒスチジン欠失培地にまき、出現したコロニーを観察した。ＡＤＥ遺伝子破壊株はこの培地上で赤色を示すため、出現した赤色コロニーをＡＤＥ２破壊株としてカウントした。遺伝子破壊株の全体に対する割合は２８．９％（赤コロニー４８８／赤コロニー＋白コロニー１６８８）であった。
【実施例６】
【００３１】
（４つの標的配列を用いたオーバーラップエクステンション）３つの標的配列を用いたオーバーラップエクステンションが良好な結果を示したため、４つの標的配列の融合を検討した。標的配列としてＡＤＥ２−５（０．８ｋｂｐ）、ＰｐＨＩＳ３（１．０ｋｂｐ）、ＡＤＥ２−３（２．０ｋｂｐ）、ＵＲＡ３（１．２ｋｂｐ）を用い、プライマー（１）としてＡＤＥ２−７９７プライマー（配列番号４３）及びＵＲＡ３−２００ｃプライマー（配列番号４４）を、プライマー（２）として５Ｇ５Ｃ５Ｇ−ＰｐＨＩＳ３プライマー（配列番号４５）及び５Ｃ５Ｇ５Ｃ−ＡＤＥ２−１ｃプライマー（配列番号４６）の組合せ、及び３Ｃ３Ｇ３Ｃ３Ｇ３Ｃ−ＡＤＥ２＋３７９プライマー（配列番号４７）及び３Ｇ３Ｃ３Ｇ３Ｃ３Ｇ−ＰｐＨＩＳ３ｃプライマー（配列番号４８）の組合せ、及び１５Ｃ−ＵＲＡ３−２２３プライマー（配列番号４９）及び１５Ｇ−ＡＤＥ２−１ｃプライマー（配列番号５０）の組合せ、の各プライマーを用い、アニーリング温度６８℃でＰＣＲを行った。図１０に、実施例６のＰＣＲの概要を示す。
【００３２】
ＰＣＲの結果を、図１１に示す。図はＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した結果を示し、レーンＭは分子量マーカー（ｋｂｐラダー）を、レーン１はＰＣＲ産物を表している。図が示すとおり、５．０ｋｂｐ付近にバンドが観察され、これは４つの標的ＤＮＡ断片から推定される分子量と一致した。本発明のオーバーラップエクステンションが、標的配列が４つの場合にも有効に利用できることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明の技術の概要を示す。
【図２】本発明の提供するプライマーを用いた融合ＤＮＡ断片の製造方法の模式図を示す。
【図３】実施例１（前半）のオーバーラップエクステンションの概要を示す。
【図４】実施例１（後半）のオーバーラップエクステンションの概要を示す。
【図５】実施例１のＰＣＲ産物の電気泳動像を示す。
【図６】実施例２−実施例４のオーバーラップエクステンションの概要を示す。
【図７】実施例２−実施例４のＰＣＲ産物の電気泳動像を示す。
【図８】実施例５のオーバーラップエクステンションの概要を示す。
【図９】実施例５のＰＣＲ産物の電気泳動像を示す。
【図１０】実施例６のオーバーラップエクステンションの概要を示す。
【図１１】実施例６のＰＣＲ産物の電気泳動像を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図５】
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【図７】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年4月17日(2009.4.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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