(57)【要約】【課題】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素のＩｂドメインにおいて非ネイティブエピトープを含むＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ様キメラ免疫原、これらの免疫原を使用して免疫応答を誘発する方法を提供すること。【解決手段】無毒性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ様（「ＰＥ様」）キメラ免疫原であって、（１）細胞表面レセプターに結合する１０と１５００との間のアミノ酸の細胞認識ドメイン；（２）細胞サイトゾルへのトランスロケーションをもたらすのに十分なＰＥドメインＩＩの配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むトランスロケーションドメイン；（３）非ネイティブエピトープをコードする５と１５００との間のアミノ酸のアミノ酸配列を含む非ネイティブエピトープドメイン；および（４）小胞体（「ＥＲ」）保持配列を含むＥＲ保持ドメインをコードするアミノ酸配列、を含む免疫原。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
無毒性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ様（「ＰＥ様」）キメラ免疫原。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、１９９７年７月１１日に出願した同時係属出願第６０／０５２，３７５号（この内容を、この全体において、本明細書中で参考として援用する）の出願日の利益を請求する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、キメラタンパク質および免疫学の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
感染性疾患に対する免疫は、近年の医学の偉大な業績の１つである。ワクチンは、ワクチンがそれ自体有意に病原性でない場合のみ、有用であり得る。多くのワクチンが、病原体を不活化することによって産生される。例えば、肝炎ワクチンは、ウイルスを加熱し、そしてホルムアルデヒドでそれを処置することによって作製され得る。他のワクチン（例えば、特定のポリオワクチン）は、生病原体を弱毒化することによって産生される。しかし、その病理学が完全に解明されていない特定の感染性因子（例えば、ＨＩＶ）のための弱毒化ワクチンの産生についての関心が存在する。
【０００４】
分子生物学は、サブユニットワクチン（免疫原が親タンパク質または複合体のフラグメントまたはサブユニットであるワクチン）の産生を可能にしてきた。ＨＩＶ−１のエンベロープタンパク質（例えば、ｇｐ１２０）は、サブユニットワクチンとして評価されている。いくつかの研究は、ｇｐ１２０のＶ３ループ領域に対する抗体が、ウイルス中和化を介して保護を提供することを示唆してきた（Ｅｍｉｎｉ，Ｅ．Ａ．ら、１９９２，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５５，  ７２８−３０；Ｊａｖａｈｅｒｉａｎ，Ｋら、１９８９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６，  ６７６８−７２；Ｓｔｅｉｍｅｒ，Ｋ．Ｓ．ら、１９９１，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４，  １０５−８；Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ら、１９９１，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４，  ２８５−８）。
【０００５】
しかし、サブユニットワクチンは、適切な免疫反応を生成するのに十分な複合体でなくてもよい。また、病原体が高度に変異しやすい（ｍｕｔａｂｌｅ）場合（例えば、ＨＩＶである場合）、株特異的免疫性を誘発するサブユニットワクチンは、全体的な保護を産生することに効果的でなくてもよい。さらに、不活化ウイルスの注射またはエンベロープタンパク質自体さえ、中和抗体およびいわゆる「増強」抗体の混合物を産生する可能性を有する（Ｔｏｔｈ，Ｆ．Ｄ．ら、１９９４，  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９６，  ３８９−９４；Ｅａｔｏｎ，Ａ．Ｍ．ら、１９９４，  Ａｉｄｓ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １０，  １３−８；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｗ．Ｍ．ら、１９９５，  Ａｉｄｓ  ９．２７−３４：Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ，Ｄ．Ｃ．ら、１９９６，  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １７３，  ６０−７）。
【０００６】
サブユニットワクチンの免疫原性は、時々、結合体ワクチンを生成するキャリアタンパク質にサブユニットをカップリングすることによって増加される。１つのこのようなキャリアタンパク質は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ（「ＰＥ」）である。研究者は、リポポリサッカライド（「ＬＰＳ」）由来の非免疫原性Ｏ−ポリサッカライドをＰＥに共有結合させた。得られる結合体ワクチンは、ＬＰＳおよびＰＥの両方に対して免疫応答を誘発した（Ｓ．Ｊ．Ｃｒｙｚ，Ｊｒ．ら（１９８７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，  ８０：５１−５６およびＳ．Ｊ．Ｃｒｙｚ，Ｊｒ．ら（１９９０）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  １６３：１０４０−１０４５）。別の研究において、研究者は、スペーサーを介してＰＥにカップリングさせることにより、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ抗原に対して免疫応答を誘発し得た（Ｊ．Ｕ．Ｑｕｅら（１９８８）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  ５６：２６４５−４９）。第３の研究において、研究者は、ＰＥを解毒し、そしてそれにＨＩＶ−１の主要中和ドメイン（ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）（「ＰＮＤ」）ペプチドを化学的に架橋させた。結合体ワクチンは、ＰＮＤペプチドを認識する抗体の産生を誘発し、そして相同株ＨＩＶ−１ＭＮを中和した（Ｓ．Ｊ．Ｃｒｙｚ，Ｊｒ．ら（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ，  １３：６６−７１）。
【０００７】
ＨＩＶ−１の成分を含むキメラタンパク質は構築されており、そしてそれらの免疫原的特性は評価されている。これらは、以下を含む：ＨＩＶ−１由来のｇｐ４１膜貫通糖タンパク質のエピトープを含むポリオウイルス抗原（Ｅｖａｎｓ，Ｄ．Ｊ．ら、１９８９，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３９，  ３８５−８）、Ｖ３ループの多数コピーを含むムチンタンパク質（Ｆｏｎｔｅｎｏｔ，Ｊ．Ｄ．ら、１９９５，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ９２，  ３１５−９）、Ｖ３ループ配列を有する一般的に改変されたコレラＢ鎖（Ｂａｃｋｓｔｒｏｍ，  Ｍ．ら、１９９４，  Ｇｅｎｅ  １４９，２１１−７）、および化学的に解毒されたＰＥ−Ｖ３ループペプチド結合体（Ｃｒｙｚ，Ｓ．，Ｊｒ．ら、１９９５，  Ｖａｃｃｉｎｅ  １３，  ６７−７１）。
【０００８】
エンベロープタンパク質ｇｐ１２０の第３可変（ｔｈｉｒｄ  ｖａｒｉｂｌｅ）（Ｖ３）ループは、ＨＩＶ−１の主要中和ドメインを含む（Ｅｍｉｎｉ，Ｅ．Ａ．ら、１９９２，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５５，  ７２８−３０；Ｊａｖａｈｅｒｉａｎ，Ｋら、１９８９，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６，  ６７６８−７２；Ｒｕｓｃｈｅ，Ｊ．Ｒ．ら、（出版された正誤表はＰｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２２，  ８６９７  １９８８、およびＰｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ５，  １６６７  １９８９に掲載される）；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５，  ３１９８−２０２  １９８８）。Ｖ３ループは、種々のＨＩＶ−１株の間で相当変化するが（Ｂｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｗ．ら、１９９０，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４５，  ６２２−５）、この領域に対して特異的な抗体は、ウイルスの感染性を中和し、そしてインビトロでウイルス細胞融合を防止することが示されている（Ｋｏｖａｃｓ，Ｊ．Ａ．ら、１９９３，  Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９２，  ９１９−２８）。さらに、ｇｐ１２０の組換え形態での全身性免疫は、ＨＩＶ−１全身性チャレンジによる感染からチンパンジーを有意に保護するようである。Ｗｈｉｔｅ−Ｓｃｈａｒｆ，Ｍ．Ｅ．ら、１９９３，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９２，  １９７−２０６。
【０００９】
ＨＩＶは、しばしば、粘膜表面で身体への進入を獲得する。しかし、現在利用可能なＨＩＶ免疫原は、分泌性免疫応答（これは、粘膜を介するウイルス接近を阻害する）を誘発することが知られていない。
【００１０】
体液性応答および細胞性応答（粘膜性免疫を含む）の両方を誘発し得、かつ感染性因子の多くの株（例えば、ＨＩＶ−１）由来の配列を取り込むのに十分可動性であり得る安定なワクチンの開発が所望されている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ様（「ＰＥ様」）キメラ免疫原（ここで、非ネイティブエピトープは、Ｉｂドメインに挿入される）は、非ネイティブエピトープに対する、体液性免疫応答、細胞媒介性免疫応答、およびう分泌性免疫応答を誘発するのに有用である。詳細には、非ネイティブエピトープは、ＨＩＶのｇｐ１２０のＶ３ループであり得る。このようなキメラは、ＨＩＶ感染に対するワクチンにおいて有用である。
【００１２】
ＰＥキメラ免疫原は、いくつかの利点を提供する。第１に、全体として組換え手段によって作製され得る。このことは、化学的架橋によってエピトープをＰＥに接続し、かつ体外毒素を化学的に不活化する必要性を排除する。組換え技術はまた、Ｉｂドメイン位置で非ネイティブエピトープの選択についての挿入部位を有するキメラ「カセット」を作製することを可能にする。このことは、エピトープの存在する改変体、または迅速に進化するエピトープの新規な改変体を迅速に挿入することを可能にする。このことは、異なる免疫原のカクテルを含むワクチンの産生を可能にする。
【００１３】
第２に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素は、そのドメインの機能を変化させるように操作され得、それにより種々の活性を提供する。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａのネイティブ細胞結合ドメイン（ドメインＩａ）を、特定の細胞レセプターについてのリガンドと置換することにより、特定の細胞型に結合するキメラを標的し得る。
【００１４】
第３に、Ｉｂドメインはシステイン−システインループを含むので、天然においてかなり束縛されるエピトープは、ほぼネイティブなコンフォメーションで提示され得る。このことは、ネイティブ抗原に対する免疫応答を惹起することを補佐する。例えば、ターン−ターン−へリックスモチーフは、環状であることが明らかであるが（ジスルフィド結合によって束縛される）、線状エピトープではない（Ｏｇａｔａ，Ｍ．ら、１９９０，  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６５，  ２０６７８−８５）。また、環状ペプチドは、線状のものよりも、抗Ｖ３ループモノクローナル抗体によってより容易に認識される（Ｃａｔａｓｔｉ，Ｐ．ら、１９９５，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０，  ２２２４−３２）。
【００１５】
第４に、本発明のキメラは、体液性免疫応答、細胞媒介性免疫応答、または分泌性免疫応答を誘発するために使用され得る。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素は、抗原提示細胞において前もってプロセシングすることではなく、ＭＨＣクラスＩＩ分子に対して直接的に結合する「スーパー抗原」として作用することが報告されている。Ｐ．Ｋ．Ｌｅｇａａｒｄら（１９９１）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３５：３７２−３８２。このことは、非ネイティブエピトープを含むタンパク質を保有する細胞に対するＭＨＣクラスＩＩ媒介性免疫応答を促進する。また、細胞表面レセプターへの結合に基づいて、キメラＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素はサイトゾルにトランスロケーションする。このことは、それらの表面において非ネイティブエピトープを保有する細胞に対するＭＨＣクラスＩ依存性免疫応答を可能にする。この局面は、特に有利である。なぜなら、正常な免疫系は、細胞によって生成されるタンパク質に対してのみＭＨＣクラスＩ依存性免疫応答を増加するからである。また、キメラを粘膜表面に指向させることによって、ＩｇＡに関与する分泌性免疫応答を誘発し得る。
【００１６】
１つの局面において、本発明は、以下を含む無毒性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ様（「ＰＥ様」）キメラ免疫原を提供する：（１）細胞表面レセプターに結合する１０と１５００との間のアミノ酸の細胞認識ドメイン；（２）細胞サイトゾルへのトランスロケーションをもたらすのに十分なＰＥドメインＩＩの配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むトランスロケーションドメイン；（３）非ネイティブエピトープを含む５と１５００との間のアミノ酸のアミノ酸配列を含む非ネイティブエピトープドメイン；および、必要に応じて（４）小胞体（「ＥＲ」）保持ドメイン保持配列を含むＥＲ保持ドメインをコードするアミノ酸配列。１つの実施態様において、キメラ免疫原は、無毒性ＰＥのアミノ酸配列を含み、ここでドメインＩｂはさらに、ドメインＩｂの２つのシステイン残基の間に非ネイティブエピトープを含む。
【００１７】
特定の実施態様において、細胞認識ドメインは、α２−マクログロブリンレセプター（「α２−ＭＲ」）、上皮増殖因子（「ＥＧＦ」）レセプター、ＩＬ−２レセプター、ＩＬ−６レセプター、ヒトトランスフェリンレセプター、またはｇｐ１２０に結合する。別の実施態様において、細胞認識ドメインは、増殖因子のアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、トランスロケーションドメインは、ＰＥのドメインＩＩのアミノ酸２８０〜３８４を含む。別の実施態様において、非ネイティブエピトープドメインは、非ネイティブエピトープドメインを含むシステイン−システインループを含む。別の実施態様において、非ネイティブエピトープドメインは、ＨＩＶ−１のＶ３ループから選択されるアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、ＥＲ保持ドメインは、ＡＤＰリボシル化活性を排除する変異体（例えば、ΔＥ５５３）を含むＰＥのドメインＩＩＩである。ＥＲ保持ドメインは、ＥＲ保持配列ＲＥＤＬＫ（配列番号１１）、ＲＥＤＬ（配列番号１２）、またはＫＤＥＬ（配列番号１３）を含み得る。別の実施態様において、非ネイティブエピトープは、病原体由来のエピトープ（例えば、ウイルス、細菌、または寄生性原虫由来のエピトープ）またはガン抗原由来のエピトープである。
【００１８】
別の実施態様において、細胞認識ドメインはＰＥのドメインＩａであり、トランスロケーションドメインはＰＥのドメインＩＩであり、非ネイティブエピトープドメインは、ＰＥのドメインＩｂの２つのシステイン残基間に挿入された非ネイティブエピトープをコードするアミノ酸配列を含み、そしてＥＲ保持ドメインは、ＰＥのドメインＩＩＩであり、かつＡＤＰリボシル化活性を排除する変異体を含む。
【００１９】
別の局面において、本発明は、本発明のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ様キメラ免疫原をコードする核酸配列を含む組換えポリヌクレオチドを提供する。１つの実施態様において、組換えポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列に作動可能に連結される発現制御配列をさらに含む発現ベクターである。
【００２０】
別の局面において、本発明は、以下をコードするヌクレオチド配列を含むＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ様キメラ免疫原クローニングプラットフォームを提供する：（１）細胞表面レセプターに結合する１０と１５００との間のアミノ酸の細胞認識ドメイン；（２）細胞サイトゾルへのトランスロケーションをもたらすのに十分なＰＥドメインＩＩの配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むトランスロケーションドメイン；（３）小胞体（「ＥＲ」）保持ドメイン保持配列を含むＥＲ保持ドメインをコードするアミノ酸配列、および必要に応じて（４）トランスロケーションドメインをコードする配列とＥＲ保持ドメインをコードする配列との間のスプライシング部位。１つの実施態様において、組換えポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列に作動可能に連結される発現制御配列をさらに含む発現ベクターである。
【００２１】
別の局面において、本発明は、システイン−システインループ内に天然に存在する非ネイティブエピトープに対する抗体を産生するための方法を提供する。この方法は、動物に、本発明の無毒性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ様キメラ免疫原を接種する工程を包含し、ここで非ネイティブエピトープドメインは、非ネイティブエピトープを含むシステイン−システインループを含む。
【００２２】
別の局面において、本発明は、少なくとも１つの無毒性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ様キメラ免疫原を含むワクチンを提供し、これは細胞認識ドメイン、トランスロケーションドメイン、非ネイティブエピトープをコードする非ネイティブエピトープドメイン、および小胞体（「ＥＲ」）保持ドメイン保持配列を含むＥＲ保持ドメインを含む。１つの実施態様において、ワクチンは、複数のＰＥ様キメラ免疫原を含み、各免疫原は、異なる非ネイティブエピトープを有する。別の実施態様において、異なる非ネイティブエピトープは、同じ病原体の異なる株のエピトープである。
【００２３】
別の局面において、本発明は、被験体において、非ネイティブエピトープに対する免疫応答を誘発する方法を提供する。この方法は、本発明の少なくとも１つのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ様キメラ免疫原を含むワクチンを被験体に投与する工程を包含する。１つの実施態様において、非ネイティブエピトープは、被験体のＭＨＣクラスＩＩ分子についての結合モチーフを含み、そして誘発される免疫応答は、ＭＨＣクラスＩＩ依存性細胞媒介性免疫応答である。別の実施態様において、非ネイティブエピトープは、被験体のＭＨＣクラスＩ分子についての結合モチーフを含み、そして誘発される免疫応答は、ＭＨＣクラスＩ依存性細胞媒介性免疫応答である。
【００２４】
別の局面において、本発明は、本発明の無毒性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ様キメラ免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの組換えポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドワクチンを提供する。
【００２５】
別の局面において、本発明は、被験体において、非ネイティブエピトープに対する免疫応答を誘発する方法を提供する。この方法は、本発明の無毒性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ様キメラ免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの組換えポリヌクレオチドを含むワクチンを被験体に投与する工程を包含する。１つの実施態様において、組換えポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列に作動可能に連結される発現制御配列を含む発現ベクターである。
【００２６】
別の局面において、本発明は、被験体において、非ネイティブエピトープに対する免疫応答を誘発する方法を提供する。この方法は、本発明の無毒性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ様キメラ免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトする工程、および被験体に細胞を投与する工程を包含する。
【００２７】
別の局面において、本発明は、ＩｇＡ媒介性分泌性免疫応答を誘発する方法を提供する。この方法は、本発明の無毒性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素キメラ免疫原を粘膜に投与する工程を包含し、ここで細胞認識ドメインは、粘膜上のレセプターに結合する。細胞認識ドメインは、α２−ＭＲ（例えば、ＰＥのネイティブ細胞認識ドメイン）またはＥＧＦレセプターに結合し得る。粘膜表面は、口、鼻、肺、腸、膣、結腸、または直腸であり得る。
【００２８】
別の局面において、本発明は、粘膜表面を介して身体に進入する病原体のエピトープ（例えば、ＨＩＶ−１のエピトープ）を特異的に認識する分泌性ＩｇＡ抗体を含む組成物を提供する。
【００２９】
さらに、本発明は、以下の手段もまた、提供する：
（項目１）  無毒性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ様（「ＰＥ様」）キメラ免疫原であって、以下：
（１）細胞表面レセプターに結合する１０と１５００との間のアミノ酸の細胞認識ドメイン；
（２）細胞サイトゾルへのトランスロケーションをもたらすのに十分なＰＥドメインＩＩの配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むトランスロケーションドメイン；
（３）非ネイティブエピトープをコードする５と１５００との間のアミノ酸のアミノ酸配列を含む非ネイティブエピトープドメイン；および
（４）小胞体（「ＥＲ」）保持配列を含むＥＲ保持ドメインをコードするアミノ酸配列、
を含む免疫原。
【００３０】
（項目２）  ＰＥΔＥ５３３のドメインＩｂの配列がドメインＩｂの２つのシステイン残基の間の前記非ネイティブエピトープを含むことを除く、ＰＥΔＥ５３３のアミノ酸配列を有する、項目１に記載の免疫原。
【００３１】
（項目３）  前記細胞認識ドメインが、ＰＥのドメインＩａである、項目１に記載の免疫原。
【００３２】
（項目４）  前記細胞認識ドメインが、α２−マクログロブリンレセプター（「α２−ＭＲ」）、上皮増殖因子（「ＥＧＦ」）レセプター；ＩＬ−２レセプター；ＩＬ−６レセプター；ＨＩＶ感染細胞；ケモカインレセプター；白血球細胞表面レセプター；ＩｇＡレセプターのリガンド；またはレセプターを指向する抗体もしくは抗体フラグメントに結合する、項目１に記載の免疫原。
【００３３】
（項目５）  前記細胞認識ドメインが、増殖因子または抗体のアミノ酸配列を含む、項目１に記載の免疫原。
【００３４】
（項目６）  前記細胞認識ドメインが、前記ＥＲ保持ドメインに含まれる、項目１に記載の免疫原。
【００３５】
（項目７）  前記トランスロケーションドメインが、ＰＥのドメインＩＩのアミノ酸２８０〜３６４を含む、項目１に記載の免疫原。
【００３６】
（項目８）  前記トランスロケーションドメインが、ＰＥのドメインＩＩである、項目１に記載の免疫原。
【００３７】
（項目９）  前記非ネイティブエピトープドメインが、前記非ネイティブエピトープを含むシステイン−システインループを含む、項目１に記載の免疫原。
【００３８】
（項目１０）  前記非ネイティブエピトープドメインが、ＰＥのドメインＩｂの２つのシステイン残基の間に挿入された非ネイティブエピトープをコードするアミノ酸配列を含む、項目１に記載の免疫原。
【００３９】
（項目１１）  前記非ネイティブエピトープドメインが、ＣＴＲＰＮＹＮＫＲＫ  ＲＩＨＩＧＰＧＲＡＦ  ＹＴＴＫＮＩＩＧＴＩ  ＲＱＡＨＣ（配列番号３）またはＣＴＲＰＳＮＮＴＲＴ  ＳＩＴＩＧＰＧＱＶＦ  ＹＲＴＧＤＩＩＧＤＩ  ＲＫＡＹＣ（配列番号４）から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の免疫原。
【００４０】
（項目１２）  前記ＥＲ保持ドメインが、変異ΔＥ５５３を含むＰＥのドメインＩＩＩである、項目１に記載の免疫原。
【００４１】
（項目１３）  前記ＥＲ保持配列が、ＲＥＤＬＫ（配列番号１１）、ＲＥＤＬ（配列番号１２）、またはＫＤＥＬ（配列番号１３）を含む、項目１に記載の免疫原。
【００４２】
（項目１４）  項目１に記載の免疫原であって、該免疫原は、ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ１４またはｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６である、免疫原。
【００４３】
（項目１５）  前記非ネイティブエピトープが、ウイルス性病原体、細菌性病原体、または寄生性原虫病原体由来のエピトープである、項目１に記載の免疫原。
【００４４】
（項目１６）  前記非ネイティブエピトープが、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０のＶ３ループのエピトープである、項目９に記載の免疫原。
【００４５】
（項目１７）  前記非ネイティブエピトープが、レトロウイルスの主要な中和ループのエピトープである、項目９に記載の免疫原。
【００４６】
（項目１８）  前記非ネイティブエピトープが、Ｖ３ループの尖を含む少なくとも８アミノ酸のＨＩＶ−２の主要中和ループ、またはＨＩＶ−１のｇｐ１２０のＶ３ループのエピトープである、項目９に記載の免疫原。
【００４７】
（項目１９）  無毒性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ様（「ＰＥ様」）キメラ免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチドであって、該ＰＥ様キメラ免疫原は以下：
（１）細胞表面レセプターに結合する１０と１５００との間のアミノ酸の細胞認識ドメイン；
（２）細胞サイトゾルへのトランスロケーションをもたらすのに十分なＰＥドメインＩＩの配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むトランスロケーションドメイン；
（３）非ネイティブエピトープをコードする５と１５００との間のアミノ酸のアミノ酸配列を含む非ネイティブエピトープドメイン；および
（４）小胞体（「ＥＲ」）保持配列を含むＥＲ保持ドメインをコードするアミノ酸配列、
を含む、組換えポリヌクレオチド。
【００４８】
（項目２０）  前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結される発現制御配列をさらに含む発現ベクターである、項目１９に記載の組換えポリヌクレオチド。
【００４９】
（項目２１）  前記ヌクレオチド配列が、ＰＥのアミノ酸配列をコードし、ここでＰＥのドメインＩｂが、ドメインＩｂの２つのシステイン残基の間の非ネイティブエピトープをさらに含む、項目１９に記載の組換えポリヌクレオチド。
【００５０】
（項目２２）  組換え無毒性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ様（「ＰＥ様」）キメラ免疫原クローニングプラットフォームであって、以下：
（１）細胞表面レセプターに結合する１０と１５００との間のアミノ酸の細胞認識ドメイン；
（２）細胞サイトゾルへのトランスロケーションをもたらすのに十分なＰＥドメインＩＩの配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むトランスロケーションドメイン；
（３）小胞体（「ＥＲ」）保持配列を含むＥＲ保持ドメインをコードするアミノ酸配列；ならびに
（４）トランスロケーションドメインをコードする配列と、該保持ドメインをコードする配列との間のスプライス部位、
をコードするヌクレオチド配列を含む、組換え無毒性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ様（「ＰＥ様」）キメラ免疫原クローニングプラットフォーム。
【００５１】
（項目２３）  前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結される発現制御配列をさらに含む発現ベクターである、項目２２に記載の組換えクローニングプラットフォーム。
【００５２】
（項目２４）  非ネイティブエピトープに対する抗体を産生するための方法であって、該非ネイティブエピトープはシステイン−システインループ内に天然に存在し、該方法は、無毒性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ様（「ＰＥ様」）キメラ免疫原を動物に接種する工程を包含し、該ＰＥ様キメラ免疫原は以下：
（１）細胞表面レセプターに結合する１０と１５００との間のアミノ酸の細胞認識ドメイン；
（２）細胞サイトゾルへのトランスロケーションをもたらすのに十分なＰＥドメインＩＩの配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むトランスロケーションドメイン；
（３）システイン−システインスープ内に非ネイティブエピトープをコードする５と１５００との間のアミノ酸のアミノ酸配列を含む該システイン−システインスープを含む非ネイティブエピトープドメイン；および
（４）小胞体（「ＥＲ」）保持配列を含むＥＲ保持ドメインをコードするアミノ酸配列、
を含む、方法。
【００５３】
（項目２５）  前記システイン−システインループが、約３０アミノ酸以下を含む、項目２４に記載の方法。
【００５４】
（項目２６）  前記非ネイティブエピトープが、ＨＩＶ−１のＶ３ドメインのエピトープである、項目２４に記載の方法。
【００５５】
（項目２７）  少なくとも１つの無毒性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ様（「ＰＥ様」）キメラ免疫原を含むワクチンであって、該ＰＥ様キメラ免疫原は以下：
（１）細胞表面レセプターに結合する１０と１５００との間のアミノ酸の細胞認識ドメイン；
（２）細胞サイトゾルへのトランスロケーションをもたらすのに十分なＰＥドメインＩＩの配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むトランスロケーションドメイン；
（３）非ネイティブエピトープをコードする５と１５００との間のアミノ酸のアミノ酸配列を含む非ネイティブエピトープドメイン；および
（４）小胞体（「ＥＲ」）保持配列を含むＥＲ保持ドメインをコードするアミノ酸配列、
を含む、ワクチン。
【００５６】
（項目２８）  複数のＰＥ様キメラ免疫原を含み、各免疫原が異なる非ネイティブエピトープを有する、項目２７に記載のワクチン。
【００５７】
（項目２９）  薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、項目２７に記載のワクチン。
【００５８】
（項目３０）  免疫用量の形態である、項目２７に記載のワクチンであって、前記免疫原が、ヒト被験体において前記非ネイティブエピトープに対する免疫応答を誘発するに有効な量で存在する、ワクチン。
【００５９】
（項目３１）  前記異なる非ネイティブエピトープが、同じ病原体の異なる株のエピトープである、項目２８に記載のワクチン。
【００６０】
（項目３２）  前記非ネイティブエピトープが、ＨＩＶ−１のＶ３ループのエピトープであり、そして前記同じ病原体の異なる株が、ＨＩＶ−１  ＭＮおよびＨＩＶ−１  Ｔｈａｉ−Ｅである、項目３１に記載のワクチン。
【００６１】
（項目３３）  被験体において、非ネイティブエピトープに対する免疫応答を誘発する方法であって、該方法は、少なくとも１つの無毒性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ様（「ＰＥ様」）キメラ免疫原を含むワクチンを該被験体に投与する工程を包含し、該ＰＥ様キメラ免疫原は以下：
（１）細胞表面レセプターに結合する１０と１５００との間のアミノ酸の細胞認識ドメイン；
（２）細胞サイトゾルへのトランスロケーションをもたらすのに十分なＰＥドメインＩＩの配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むトランスロケーションドメイン；
（３）非ネイティブエピトープをコードする５と１５００との間のアミノ酸のアミノ酸配列を含む非ネイティブエピトープドメイン；および
（４）小胞体（「ＥＲ」）保持配列を含むＥＲ保持ドメインをコードするアミノ酸配列、
を含む、方法。
【００６２】
（項目３４）  前記非ネイティブエピトープが、前記被験体のＭＨＣクラスＩＩ分子の結合モチーフを含み、そして前記誘発される免疫応答は、ＭＨＣクラスＩＩ依存性細胞媒介性免疫応答である、項目３３に記載の方法。
【００６３】
（項目３５）  前記非ネイティブエピトープが、前記被験体のＭＨＣクラスＩ分子の結合モチーフを含み、そして前記誘発される免疫応答は、ＭＨＣクラスＩ依存性細胞媒介性免疫応答である、項目３３に記載の方法。
【００６４】
（項目３６）  前記非ネイティブエピトープが、ＨＩＶ−１のＶ３ドメインのエピトープである、項目３３に記載の方法。
【００６５】
（項目３７）  前記ワクチンが、前記非ネイティブエピトープを保有する因子によって媒介される疾患に対して予防的処置として投与される、項目３３に記載の方法。
【００６６】
（項目３８）  前記ワクチンが、前記非ネイティブエピトープを保有する因子によって媒介される疾患に対して治療的処置として投与される、項目３３に記載の方法。
【００６７】
（項目３９）  無毒性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ様（「ＰＥ様」）キメラ免疫原をコードするヌクレオチド配列含む少なくとも１つの組換えポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドワクチンであって、該ＰＥ様キメラ免疫原は以下：
（１）細胞表面レセプターに結合する１０と１５００との間のアミノ酸の細胞認識ドメイン；
（２）細胞サイトゾルへのトランスロケーションをもたらすのに十分なＰＥドメインＩＩの配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むトランスロケーションドメイン；
（３）非ネイティブエピトープをコードする５と１５００との間のアミノ酸のアミノ酸配列を含む非ネイティブエピトープドメイン；および
（４）小胞体（「ＥＲ」）保持配列を含むＥＲ保持ドメインをコードするアミノ酸配列、
を含む、ポリヌクレオチドワクチン。
【００６８】
（項目４０）  被験体において、非ネイティブエピトープに対する免疫応答を誘発する方法であって、該方法は、無毒性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ様（「ＰＥ様」）キメラ免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの組換えポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドワクチンを該被験体に投与する工程を包含し、該ＰＥ様キメラ免疫原は以下：
（１）細胞表面レセプターに結合する１０と１５００との間のアミノ酸の細胞認識ドメイン；
（２）細胞サイトゾルへのトランスロケーションをもたらすのに十分なＰＥドメインＩＩの配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むトランスロケーションドメイン；
（３）非ネイティブエピトープをコードする５と１５００との間のアミノ酸のアミノ酸配列を含む非ネイティブエピトープドメイン；および
（４）小胞体（「ＥＲ」）保持配列を含むＥＲ保持ドメインをコードするアミノ酸配列、
を含む、方法。
【００６９】
（項目４１）  前記組換えポリヌクレオチドが、前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結される発現制御配列を含む発現ベクターである、項目４０に記載の方法。
【００７０】
（項目４２）  前記ヌクレオチド配列が、前記免疫原のアミノ末端に接続される哺乳動物分泌配列をさらにコードする、項目４０に記載の方法。
【００７１】
（項目４３）  被験体において、非ネイティブエピトープに対する免疫応答を誘発する方法であって、該方法は、無毒性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ様（「ＰＥ様」）キメラ免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトする工程および該被検体に該細胞を投与する工程を包含し、該ＰＥ様キメラ免疫原は以下：
（１）細胞表面レセプターに結合する１０と１５００との間のアミノ酸の細胞認識ドメイン；
（２）細胞サイトゾルへのトランスロケーションをもたらすのに十分なＰＥドメインＩＩの配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むトランスロケーションドメイン；
（３）非ネイティブエピトープをコードする５と１５００との間のアミノ酸のアミノ酸配列を含む非ネイティブエピトープドメイン；および
（４）小胞体（「ＥＲ」）保持配列を含むＥＲ保持ドメインをコードするアミノ酸配列、
を含む、方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７２】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明に属する当業者により共通に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明に使用される多くの用語の一般的な定義を有する技術のものを提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（第２版、１９９４）；ＴＨＥ  ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｗａｌｋｅｒ編、１９８８）；ＴＨＥ  ＧＬＯＳＳＡＲＹ  ＯＦ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ，第５版、Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒら（編），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；およびＨａｌｅおよびＭａｒｈａｍ、ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９１）。本明細書中に使用されるように、以下の用語は別に特定されない限りそれらに基づいた意味を有する。
【００７３】
「ポリヌクレオチド」はヌクレオチド単位を構成するポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは天然に存在する核酸、例えばデオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）およびリボ酢酸（「ＲＮＡ」）、ならびに核酸アナログを含む。核酸アナログは天然に存在しない塩基、天然に存在するホスホジエステル結合以外の、他のヌクレオチドとの連結で結合するヌクレオチドを含むか、またはホスホジエステル以外の連結によって結合された塩基を含むものである。従って、ヌクレオチドアナログは、例えばそして限定することなく、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル、ホスホラミデート、ボラノホスフェート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）などを含む。このようなポリヌクレオチドは、例えば、自動化ＤＮＡ合成器を使用して、合成され得る。用語「核酸」は、代表的には、長いポリヌクレオチドを表す。用語「オリゴヌクレオチド」は、代表的には、短いポリヌクレオチド（一般的には、約５０ヌクレオチド以下）を表す。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）で表される場合、これもまたＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）（ここで「Ｕ」は、「Ｔ」を置き換える）を含むことが、理解される。
【００７４】
「ｃＤＮＡ」は、一本鎖または二本鎖形態のいずれかにおいて、ｍＲＮＡと相補的または同一のＤＮＡを表す。
【００７５】
慣用的な記号が、ポリヌクレオチドを記載するために本明細書中で使用される：一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は５’末端である；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は５'方向を表す。新生ＲＮＡ転写物に対するヌクレオチドの５’から３’付加の方向は、転写方向として表される。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖は「コード鎖」として表される；ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡと同じ配列を有し、かつＲＮＡ転写物の５’末端に対し５’に位置されるＤＮＡ鎖における配列は、「上流配列」として表される；ＲＮＡと同じ配列を有しかつコードＲＮＡ転写物の３’末端に対し３’に位置されるＤＮＡ鎖における配列は、「下流配列」として表される。
【００７６】
「相補的」は２つのポリヌクレオチドの相互作用する表面の局所的適合性または共に一致することを表す。従って、２つの分子は相補的として記載され得、そしてさらに、接触表面の特徴は互いに相補的である。第１のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が第２ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド結合パートナーのヌクレオチド配列と同一である場合、第２ポリヌクレオチドと相補的である。従って、配列５’−ＴＡＴＡＣ−３’のポリヌクレオチドはその配列が５’−ＧＡＴＡＴＡ−３’であるポリヌクレオチドと相補的である。
【００７７】
ヌクレオチド配列は、対象ヌクレオチド配列に対する配列相補性が参照ヌクレオチド配列と実質的に同じである場合、参照ヌクレオチド配列と「実質的に相補的」である。
【００７８】
「コードする」はポリヌクレオチド（例えば、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ）におけるヌクレオチドの特異的な配列の固有な特性を表し、定義されたヌクレオチドの配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）または定義されたアミノ酸の配列のいずれかを有する生物学的プロセス、およびそれらから得られる生物学的特性における他のポリマーおよび高分子の合成のためのテンプレートとして役立つ。従って、遺伝子は、その遺伝子により産生されるｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生物学的系におけるタンパク質を産生する場合、タンパク質をコードする。転写のためのテンプレートとして使用される、遺伝子またはｃＤＮＡの、コード鎖、ｍＲＮＡ配列と同一であり、そして通常配列表に提供されるヌクレオチド配列、および非コード鎖の両方は、遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードするとして表され得る。他に限定がなければ、「アミノ酸配列コードヌクレオチド配列」は全てのヌクレオチド配列を含み、これらは互いの縮重版であり、そして同じアミノ酸配列をコードする。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含み得る
「組換えポリヌクレオチド」は共に天然には結合されていない配列を有するポリヌクレオチドを表す。増幅されたまたは集合された組換えポリヌクレオチドは適切なベクターに含まれ得、そしてこのベクターを使用して適切な宿主細胞を形質転換し得る。組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」として表される。次いで、遺伝子は組換え宿主細胞において発現され、例えば「組換えポリペプチド」を産生する。組換えポリヌクレオチドは同様に非コード機能（例えば、プロモーター、複製起点、リボソーム結合部位など）に役立ち得る。
【００７９】
「発現制御配列」は、それに作動可能に連結したヌクレオチド配列の発現（転写および／または翻訳）を調節するポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド配列を表す。「作動可能に連結した」は、２つの部分間の機能的相互関係を表し、ここで、１つの部分の活性（例えば、転写を調節する能力）が他の部分の作用（例えば、配列の転写）を生じる。発現制御配列は、例えばそして限定することなく、プロモーター（例えば、誘導性または構成性）、エンハンサー、転写ターミネーター、開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンについてのスプライシングシグナル、および終止コドンの配列を含み得る。
【００８０】
「発現ベクター」は、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結した発現制御配列を含む、組換えポリヌクレオチドを含むベクターを表す。発現ベクターは、発現についての十分なシス−作用性エレメントを含む；発現についての他のエレメントは、宿主細胞またはインビトロ発現系によって供給され得る。発現ベクターは、コスミド、プラスミド（例えば、裸であるかまたはリポソームに含まれる）および組換えポリヌクレオチドを取り込むウイルスのような当該分野に公知の全てのものを含む。
【００８１】
「増幅」は、ポリヌクレオチド配列がコピーされ、従って、ポリヌクレオチド分子が、例えば逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応、およびリガーゼ連鎖反応により多数のポリヌクレオチド分子に伸長される、任意の手段を表す。
【００８２】
「プライマー」は、設計されたポリヌクレオチドテンプレートに特異的にハイブリダイズし、そして相補的なポリヌクレオチドの合成のための開始点を提供し得るポリヌクレオチドを表す。このような合成はポリヌクレオチドプライマーが合成が誘導される条件下（すなわち、ヌクレオチド、相補的ポリヌクレオチドテンプレート、およびＤＮＡポリメラーゼのような重合のための因子の存在下）に置かれる場合に、生じる。プライマーは代表的には一本鎖であるが、二本鎖でもあってもよい。プライマーは、代表的にはデオキシリボ核酸であるが、広範な種々の合成プライマーおよび天然に存在するプライマーも、多くの適用に有用である。プライマー合成の開始のための部分として役に立つようにハイブリダイズするために設計されるテンプレートと相補的であるが、テンプレートの正確な配列を反映する必要はない。このような場合、テンプレートに対するプライマーの特異的なハイブリダイゼーションはハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。プライマーは、例えば、色素産生性、放射活性、または蛍光部分で標識され得、そして検出可能部分として使用され得る。
【００８３】
「プローブ」は、ポリヌクレオチドに関して使用される場合、別のポリヌクレオチドの設計された配列に特異的にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドを表す。プローブは標的相補的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするが、テンプレートの正確な相補的配列を反映する必要はない。このような場合、標的に対するプローブの特異的ハイブリダイゼーションはハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。プローブは、例えば、色素産生性、放射活性、または蛍光部分で標識され得、そして検出可能部分として使用され得る。
【００８４】
第１配列は、配列が第１の配列であるポリヌクレオチドが、配列が第２の配列であるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする場合、第２の配列に関して「アンチセンス配列」である。
【００８５】
「特異的にハイブリダイズする」または「特異的ハイブリダイゼーション」または「選択的にハイブリダイズする」は、配列がＤＮＡまたはＲＮＡの複合混合物（例えば、全細胞性）に存在する場合、ストリンジェントな条件下での特定のヌクレオチド配列に優先的に核酸分子を、結合、複製、またはハイブリダイズすることを表す。
【００８６】
用語「ストリンジェントな条件」は、プローブがその標的部分配列に優先的にハイブリダイズし、そして他の配列のより少ないまたは全くない程度にハイブリダイズする条件を表す。核酸ハイブリダイゼーション実験（例えば、サザンおよびノーザンハイブリダイゼーション）の文脈における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存性であり、そして異なる環境パラメーター下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  パートＩ  第２章「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに見出される。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、定義されるイオン強度およびｐＨにおける特定の配列についての熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。Ｔｍは標的配列の５０％が（定義されたイオン強度およびｐＨの下で）完全に適合したプローブとハイブリダイズする温度である。非常にストリンジェントな条件は特定のプローブについてのＴｍに等しくなるように選択される。
【００８７】
相補的な核酸のハイブリダイゼーション（これらは、サザンまたはノーザンブロットおいてフィルター上に１００より多い相補的残基を有する）のためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、一晩行われるハイブリダイゼーションで、４２℃において１ｍｇのへパリンを含む５０％ホルマリンである。高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、約１５分間７２℃における０．１５Ｍ  ＮａＣｌである。ストリンジェントな洗浄条件の例は、１５分間６５℃における０．２×ＳＳＣ洗浄である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＳＳＣ緩衝液の記載について参照のこと）。しばしば、高度なストリンジェンシー洗浄は、低ストリンジェンシー洗浄を先に行い、バックグラウンドプローブシグナルを除去する。例えば、１００ヌクレオチドより多い複製についての、中ストリンジェンシー洗浄の例は、１５分間４５℃における１×ＳＳＣである。例えば、１００ヌクレオチドより多い複製についての、低ストリンジェンシー洗浄の例は、１５分間４０℃における４〜６×ＳＳＣである。一般的に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおける無関係のプローブについて観測されるより２倍（またはそれ以上）のシグナル対ノイズ比は、特異的なハイブリダイゼーションの検出を増加する。
【００８８】
「ポリペプチド」はアミノ酸残基から構成されるポリマーを表し、これらは天然に存在する構造改変体、およびそれらのペプチド結合を介して結合した天然に存在しない合成アナログに関連し、天然に存在する構造改変体、およびそれらの天然に存在しない合成アナログに関連する。合成ポリペプチドは、例えば、自動化ポリペプチド合成器を用いて合成され得る。用語「タンパク質」は代表的には、大きなポリペプチドを表す。用語「ペプチド」は代表的には、短いポリペプチドを表す。
【００８９】
慣用的な記号は、ポリペプチド配列を言葉で示すために本明細書中で使用される：ポリペプチド配列の左側末端はアミノ末端である；ポリペプチド配列の右側末端はカルボキシル末端である。
【００９０】
「保存的置換」は機能的に類似のアミノ酸とアミノ酸のポリペプチドにおける置換を表す。以下の６つのグループの各々は互いについての保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００９１】
「対立遺伝子改変体」は、同じ遺伝子座を占有する遺伝子の任意の２つ以上の多形形態を表す。対立遺伝子改変体は変異を通して自然に生じ、そして集団内の表現型多形性を生じ得る。遺伝子変異はサイレント（コードされたポリペプチドにおいて変化しない）であり得、または変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。「対立遺伝子改変体」はまた、遺伝子の対立遺伝子改変体のｍＲＮＡ転写物由来のｃＤＮＡ、ならびにそれらにコードされるタンパク質を表す。
【００９２】
用語「同一」または「同一性」の割合は、２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈において、２つ以上の配列または部分配列を表し、これらは、最大一致について比較されそして整列された場合、続く配列比較アルゴリズムの１つを用いてまたは視診によって測定された場合、同じであるかあるいは同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定の割合を有する。
【００９３】
句「実質的に同一」は、２つの核酸またはポリペプチドの文脈において、最大一致について比較されそして整列された場合、続く配列比較アルゴリズムの１つを用いてまたは視診によって測定された場合、少なくとも６０％、８０％、９０％、９５％または９８％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有する２つ以上の配列または部分配列を表す。好ましくは、実施的な同一性は、少なくとも約５０残基長の配列の領域にわたって、より好ましくは、少なくとも約１００残基の領域にわたって存在し、最も好ましくは、配列は実質的に少なくとも約１５０残基にわたって同一である。最も好ましい実施態様において、配列は、コード領域の全長にわたって実質的に同一である。
【００９４】
配列比較について、代表的には１つの配列は、参照配列として作用し、試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列はコンピューターに入力され、必要であれば、部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列についての配列同一性の割合を計算する。
【００９５】
比較についての配列の最適整列は、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４（１９８８）の類似の方法についての検索によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化の実行によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または視診によって（一般的にはＡｕｓｕｂｅｌら（前出）を参照のこと）、実行され得る。
【００９６】
有用なアルゴリズムの１つの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、進行性の、ペアをなす整列を用いる関連する配列のグループから複数の配列整列を作成して、関係および配列同一性の割合を示す。それはまた使用されるクラスター形成関係を示す樹系図またはデンドグラム（ｄｅｎｄｏｇｒａｍ）をプロットして、整列を作成する。ＰＩＬＥＵＰはＦｅｎｇおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０（１９８７）の進行性整列法の単純化を使用する。使用される方法は、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３（１９８９）により記載される方法に同様である。プログラムは、３００配列まで整列し得る（各々の最大長の５，０００ヌクレオチドまたはアミノ酸）。複数の整列手段は、２つの最も類似する配列のペアをなす整列で始まり、２つの整列した配列のクラスターを生成する。次いで、このクラスターは、整列した配列の次の最も関連する配列またはクラスターに整列される。配列の２つのクラスターは、２つの個々の配列のペアをなす整列の単純な延長により整列される。最後の配列は、一連の進行性のペアをなす整列により達成される。プログラムは特定の配列、および配列比較の領域についてのそのアミノ酸配列またはヌクレオチド座標を指定することにより、そしてプログラムパラメーターを指定することにより実行される。例えば、参照配列は他の試験配列と比較されて以下のパラメーターを使用して配列同一性関連の割合を決定し得る：デフォルトギャップ重量（３．００）、デフォルトギャップ長重量（０．１０）、および加重末端ギャップ。
【００９７】
配列同一性の割合および配列類似性の割合を決定するために適切なアルゴリズムの別の例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これはＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎについてのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒを通して公然に入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。このアルゴリズムは、まず照会配列における長さＷの短縮ワードを同定することによって、高スコアリング配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを包含し、これは、データベース配列における同じ長さのワードで整列される場合、いくつかの正の閥値スコアＴと一致するかまたは満たすかのいずれかである。Ｔは隣接ワードスコア閥値として表される（Ａｌｔｓｃｈｌら、前出）。これらの初期隣接ワードヒットは、開始検索についての発端（ｓｅｅｄ）として作用し、それらを含むより長いＨＳＰを見つける。次いで、ワードヒットは、累積整列スコアが増加され得る限りの間、各配列に沿った両方の方向に拡張される。累積スコアはヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（一致残基のペアについての報酬スコア；常に＞０）およびＮ（不一致残基についてのペナルティースコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列について、スコアリングマトリクスを使用して累積スコアを計算する。各方向におけるワードヒットの拡張は、以下の場合停止される：累積整列スコアが達成されたその最大値からの量Ｘによって降下する場合；累積スコアが、１つ以上の負のスコアリング残基整列の増幅のために、ゼロまたはそれ未満になる場合；あるいはいずれかの配列の末端が達成される場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは整列の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較をデフォルトとして、使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９８９）を参照のこと）をデフォルトとして、使用する。
【００９８】
計算する配列同一性の割合に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた２つの配列間の類似性の統計学的な分析を実施する（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７（１９９３））。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測定は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸の参照核酸に対する比較における最小合計確率が約０．１より小さい、より好ましくは約０．０１より小さい、そして最も好ましくは約０．００１より小さい場合、参照配列と同様であると考慮される。
【００９９】
以下に記載されるように、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるさらなる指標は、第１核酸によりコードされるポリペプチドが第２の核酸によりコードされるペプチドとの免疫学的交叉反応であることである。従って、ポリペプチドは代表的には、第２ポリペプチド（例えば、ここで２つのペプチドは保存的置換基によってのみ異なる）と実質的に同一である。本明細書中に記載されるように、２つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
【０１００】
「リガンド」は標的分子と特異的に結合する化合物である。
【０１０１】
「レセプター」はリガンドと特異的に結合する化合物である。
【０１０２】
「抗体」は免疫グロブリン遺伝子もしくは免疫グロブリン遺伝子類、またはそれらのフラグメントによって実施的にコードされるポリペプチドリガンドを表し、これらはエピトープ（例えば、抗原）を特異的に結合し、そして認識する。認識された免疫グロブリン遺伝子はκおよびλ軽鎖定常領域遺伝子、α、γ、δ、εおよびμ重鎖定常領域遺伝子および無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。抗体は、例えばインタクトな免疫グロブリンとしてまたは種々のペプチドでの消化により産生された多数の良く特徴付けされたフラグメントとして存在する。これは、例えば、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ）’２フラグメントを含む。本明細書中に使用されるように、用語「抗体」はまた、全抗体の改変または組換えＤＮＡ方法論を使用する新規に合成されるもののいずれかによって産生される抗体フラグメントを含む。それはまた、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体を含む。抗体の「Ｆｃ」部分は、免疫グロブリン重鎖の部分を表し、これは１つ以上の重鎖定常領域ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含むが、重鎖可変領域を含まない。
【０１０３】
リガンドまたはレセプター（例えば、抗体）は、リガンドまたはレセプターが異種の化合物のサンプルにおける分析物の存在の決定因子である結合反応において機能する場合、化合物分析物と「特異的に結合する」または「特異的に免疫活性である」。従って、設計されたアッセイ（例えば、イムノアッセイ）条件下、リガンドまたはレセプターは、特定の分析物と優先的に結合し、そしてサンプルに存在する他の化合物に十分な量で結合しない。例えば、ポリヌクレオチドはハイブリダイゼーション条件下で、相補的配列を含む分析物ポリヌクレオチドに対して特異的に結合する；抗体はイムノアッセイ下で、抗体が惹起されるエピトープを保有する抗原分析物に対して特異的に結合する；そして吸着剤は適切な溶出条件下で分析物と特異的に結合する。
【０１０４】
「イムノアッセイ」はサンプルにおける分析物を検出する方法を表し、サンプルと分析物と特異的に結合する抗体との接触する工程、および抗体と分析物との間の結合を検出する工程を含む。種々のイムノアッセイフォーマットを使用して、特定のタンパク質との抗体特異的免疫反応を選択し得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイを慣用的に使用して、タンパク質とのモノクローナル抗体特異的免疫活性を選択する。ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。イムノアッセイフォーマットおよび条件の記載について、これを使用して特異的免疫反応性を決定し得る。
【０１０５】
「ワクチン」は、非常に低レベルの罹患率または死亡率のみを生じる間、生物における治療的程度の免疫性を与えるのに有効な薬剤または薬剤を含む組成物を表す。もちろん、ワクチンを製造する方法は、免疫系研究ならびに動物またはヒトの疾患の予防および処置に有用である。
【０１０６】
「免疫原性量」は被験体における免疫応答を誘発するのに有効な量である。
【０１０７】
対象の種を意味する「実質的に純粋」または「単離された」は、優勢な種の存在（すなわち、モル濃度を基に、組成物における任意の他の個々の高分子種より大量）であり、そして実質的に精製された画分は組成物であり、ここで対象種は全ての高分子種の存在の少なくとも約５０％（モル濃度を基に）含む。一般的に、実質的に純粋な組成物は、組成物における約８０％から９０％以上の高分子種の存在が目的の精製種であることを意味する。対象種は、組成物が本質的に単一の高分子種からなる場合、本質的に均一（汚染種は従来の検出方法により組成物中に検出され得ない）に精製される。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）、安定化剤（例えば、ＢＳＡ）、および元素イオン種は本定義の目的のための高分子種とみなされない。
【０１０８】
対象に適用されるような「天然に存在する」は、実験室の人間により故意に改変されていない対象が天然に見出され得る事実を表す。例えば、天然の供給源から単離され得、生物（ウイルスを含む）に存在する、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【０１０９】
「検出する」は、サンプル中の分析物の存在、非存在、または量を検出することを表し、そしてサンプル中の分析物の量またはサンプル中の細胞当たりの量を定量することを含み得る。
【０１１０】
「検出可能部分」または「標識」は分光学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、または化学手段により検出可能な組成物を表す。例えば、有用な標識は、３２Ｐ、３５Ｓ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用される場合）、ビオチン−ストレプトアビジン、ジオキシゲニン、ハプテン、および抗血清またはモノクローナル抗体が入手可能なタンパク質、または標的に相補的な配列を有する核酸分子を含む。検出可能部分は、しばしば、測定可能シグナル、例えば、放射活性、色素原性、または蛍光シグナルを生成し、これらを使用して、サンプル中の結合検出可能部分の量を定量し得る。検出可能部分は共有、またはイオン、ファンデルワールスもしくは水素結合を介してのいずれかでプライマーまたはプローブに取り込まれるかまたは結合し得る（例えば、放射活性ヌクレオチド、またはストレプトアビジンにより認識されるビオチン化ヌクレオチドの取り込み）。検出可能部分は直接または間接的に検出可能であり得る。間接検出は、第２の直接または間接検出可能部分の検出可能部分に対する結合を包含し得る。例えば、検出可能部分は結合パートナーのリガンド（例えば、ビオチン（これはストレプトアビジンについての結合パートナーである）、またはヌクレオチド配列（これは相補的配列についての結合パートナーであり、特異的にハイブリダイズし得る））であり得る。結合パートナーはそれ自身直接検出可能であり得、例えば、抗体はそれ自身蛍光分子で標識され得る。結合パートナーはまた、間接的に検出可能であり得、例えば、相補的ヌクレオチド配列を有する核酸は、分岐したＤＮＡ分子の部分であり得、これは次いで他の標識された核酸分子とハイブリダイゼーションを介して検出可能である。（例えば、ＰＤ．ＦａｈｒｌａｎｄｅｒおよびＡ．Ｋｌａｕｓｎｅｒ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：１１６５を参照のこと。）シグナルの定量は例えばシンチレーション計数、デンシトメトリー、またはフローサイトメトリーによって達成される。
【０１１１】
「リンカー」は２つの他の分子、共有、またはイオン、ファンデルワールスもしくは水素結合を介してのいずれかで結合する分子を表し、例えば、５‘末端で１つの相補的配列および３’末端で別の相補的配列にハイブリダイズし、従って２つの非相補的配列を結合する核酸分子である。
【０１１２】
「薬学的組成物」は哺乳動物において薬学的使用のために適切な組成物を表す。薬学的組成物は、薬理学的有効量の活性試薬および薬学的に受容可能なキャリアを含む。「薬理学的有効量」は意図される薬理学的結果を生成するのに有効な試薬の量を表す。「薬学的受容可能なキャリア」は、任意の標準薬学的なキャリア、緩衝液、および賦形剤（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、５％デキストロース水溶液、および乳濁液（例えば、油／水または水／油乳濁液）、および種々の型の湿潤剤および／またはアジュバント）を表す。適切な薬学的キャリアおよび処方物はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、１９９５）に記載される。好ましい薬学的キャリアは活性試薬の投与の意図された様式に依存する。代表的な投与の様式は、腸内（例えば、経口）または非経口（例えば、皮下、筋肉内、静脈内または腹腔内注射；または局所、経皮、または経粘膜投与）を含む。「薬学的に受容可能な塩」は、例えば、金属塩（ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど）およびアンモニアまたは有機アミンの塩を含む、薬学的使用のための化合物中に処方され得る塩である。
【０１１３】
「小有機分子」は、一般的に薬学的に使用されるこれらの有機分子に適合性のサイズの有機分子を表す。この用語は有機生体高分子（例えば、タンパク質、核酸など）を含む。好ましい小有機分子は、約５０００Ｄａまで、約２０００Ｄａまで、または約１０００Ｄａまでのサイズの範囲である。
【０１１４】
診断または処置の「被験体」は、ヒトまたは非ヒト動物（哺乳動物または霊長類を含む）である。
【０１１５】
「処置」は予防処置または治療的処置を表す。
【０１１６】
「予防」処置は、初期兆候のみを示す疾患の兆候を示さないかまたは被験体に対する発達した病理学のリスクを減少するための投与処置である。
【０１１７】
「治療的」処置は、これらの兆候を減少するかまたはなくすための病理学の兆候を示す被験体に対する投与処置である。
【０１１８】
「診断的」は、病理学の状態の存在または性質の同定を意味する。診断的方法は、それらの特異性および選択性において異なる。特定の診断方法は状態の最終的な診断を提供し得ないが、方法が診断の助けになるポジティブ指標を提供する場合、十分である。
【０１１９】
「予後の」は病理学の状態の起こりそうな発達（例えば、重症度）の予想を意味する。
【０１２０】
「複数」は少なくとも２つを意味する。
【０１２１】
「Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ」または「ＰＥ」は、３つの突起した球状ドメイン（Ｉａ、ＩＩ、およびＩＩＩ）およびドメインＩＩおよびＩＩＩを連結する１つの小さいサブドメイン（Ｉｂ）から構成される６７ｋＤタンパク質としてＰｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａにより分泌される。（Ａ．Ｓ．Ａｌｌｕｒｅｄら（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３：１３２０−１３２４。）ＰＥのドメインＩａは細胞結合を媒介する。事実上、ドメインＩａは低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質（「ＬＲＰ」）（α２−マクログロブリンレセプター（「α２−ＭＲ」）としても公知である）と結合する。（Ｍ．Ｚ．Ｋｏｕｎｎａｓら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２４２０−２３。）それはアミノ酸１−２５２におよぶ。ドメインＩＩはサイトゾルへのトランスロケーションを媒介する。それはアミノ酸２５３−３６４におよぶ。ドメインＩｂは機能が公知ではない。それはアミノ酸３６５−３９９におよぶ。ドメインＩＩＩは細胞毒性を担い、そして小胞体保持配列を含む。それは伸長因子２のＡＤＰリボシル化を媒介し、これはタンパク質合成を不活性化する。それはアミノ酸４００−６１３におよぶ。ＰＥは、それがＥＦ２  ＡＤＰ  リボシル化活性を欠く場合、「無毒性」である。ドメインＩＩＩ由来のアミノ酸Ｅ５５３の欠失（「ΔＥ５５３」）は分子を解毒する。変異ΔＥ５５３を有するＰＥは本明細書中で「ＰＥΔＥ５５３」として称される。ＰＥの遺伝子的に改変された形態は、例えば、Ｐａｓｔａｎら、米国特許第５，６０２，０９５号；Ｐａｓｔａｎら、米国特許第５，５１２，６５８号およびＰａｓｔａｎら、米国特許第５，４５８，８７８号に記載される。ＰＥの対立遺伝子形態は、本定義に含まれる。例えば、Ｍ．Ｌ．Ｖａｓｉｌら、（１９８６）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５２：５３８−４８参照のこと。「システイン−システインループ」はポリペプチドにおけるペプチド部分を表し、これは２つのジスルフィド−結合したシステイン残基により隣接する（ｂｏｒｄｅｒｅｄ）アミノ酸配列により定義される。
【０１２２】
「非ネイティブエピトープ」は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素ＡのＩｂドメイン中に天然に生じないアミノ酸配列によってコードされるエピトープを表す。
【０１２３】
（ＩＩ．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ様キメラ免疫原）
（Ａ．基本構造）
本発明のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ様（「ＰＥ様」）キメラ免疫原は、本明細書中で提供されるようなものを除いては、ＰＥの４つの構造ドメイン（すなわち、Ｉａ、ＩＩ、Ｉｂ、およびＩＩＩ）と同一の配列で組織化された構造ドメインを有し、そしてＰＥの機能的ドメインによってまた保有される特定の機能（例えば、細胞認識、サイトゾルトランスロケーション、および小胞体保持）を有する、ポリペプチドである。さらに、本発明のＰＥ様キメラ免疫原は、これまで機能が同定されていなかったＰＥのドメインを機能化するドメインを保有する。すなわち、ＰＥ様キメラ免疫原は、ＰＥのＩｂドメインを、非ネイティブエピトープに対する免疫応答を誘発する免疫原として働く、機能的な非ネイティブエピトープドメインに置き換える。
【０１２４】
従って、ＰＥ様キメラ免疫原は、アミノ酸配列から構成される次の構造ドメイン（そのキメラタンパク質に特定の機能を与える）を含む：（１）細胞表面レセプターのリガンドとして機能し、そして細胞へのタンパク質の結合を媒介する「細胞認識ドメイン」；（２）エンドソームからサイトゾルへのトランスロケーションを媒介する「トランスロケーションドメイン」；（３）免疫原性非ネイティブエピトープを含む「非ネイティブエピトープドメイン」；および、必要に応じて、（４）エンドソームから、小胞体（ここから分子はサイトゾルに入る）に分子をトランスロケーションするように機能する、「小胞体（「ＥＲ」）保持ドメイン」。ＥＲ保持ドメインが除去された場合、キメラ免疫原はなお免疫原性機能を保持し得る。
【０１２５】
１つの実施態様において、ＰＥ様キメラ免疫原は、非ネイティブエピトープのアミノ酸配列を含むように操作されているＩｂドメインを除いて、ＰＥのネイティブ配列を含む。例えば、Ｉｂドメインのシステイン−システインループに、非ネイティブエピトープをコードするアミノ酸配列を挿入し得る。しかし、ＰＥ構造とその機能との関係は、広範に研究された。ＰＥのアミノ酸配列は、新しい機能を提供するために繰り返し操作され、そして多くの、ＰＥ機能に決定的なアミノ酸またはペプチドセグメントおよび決定的でないアミノ酸またはペプチドセグメントが同定された。本発明のＰＥ様キメラ免疫原は、ＰＥに対するこれらの構造的な改変を組み込み得る。
【０１２６】
（Ｂ．細胞認識ドメイン）
本発明のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素キメラは、「細胞認識ドメイン」をコードするアミノ酸配列を含む。細胞認識ドメインは、細胞表面レセプターのリガンドとして機能する。それはタンパク質の細胞への結合を媒介する。その目的は、キメラを、プロセッシングのためにサイトゾルにタンパク質を輸送する細胞に標的化することである。細胞認識ドメインは、ＰＥのドメインＩａの位置に配置され得る。しかし、このドメインは、正常の組織的な配列の外に移動され得る。より詳細には、細胞認識ドメインはＥＲ保持ドメインの上流に挿入され得る。あるいは、細胞認識ドメインは化学的に毒素に結合され得る。また、キメラはＩａドメインの位置に第１の細胞認識ドメインを含み得、そしてＥＲ保持ドメインの上流に第２の細胞認識ドメインを含み得る。このような構築物は１つより多い細胞型に結合し得る。例えば、Ｒ．Ｊ．Ｋｒｅｉｔｍａｎら、（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：６３−６８を参照のこと。
【０１２７】
細胞認識ドメインは、キメラを細胞に付着させるためのハンドル（取っ手）として機能するので、特定のレセプターに結合することが知られる任意のポリペプチドの構造を有し得る。従って、そのドメインは一般的に既知のポリペプチドリガンドのサイズを有し、例えば約１０アミノ酸と約１５００アミノ酸との間、または約１００アミノ酸と約３００アミノ酸との間である。
【０１２８】
キメラ免疫原における使用のための機能的な細胞認識ドメインを同定するために、いくつかの方法が有用である。１つの方法は、細胞認識ドメインを含むキメラとレセプターまたはレセプターを有する細胞との間の結合の検出を含む。他の方法は、キメラがサイトゾルに入ることを検出することを含み、このことは第１の段階である細胞結合が成功したことを示す。これらの方法は、以下の試験に関するセクションの中で詳細に記載される。
【０１２９】
細胞認識ドメインは、細胞表面レセプターに結合する任意のポリペプチドの構造を有し得る。１つの実施態様において、アミノ酸配列はＰＥのドメインＩａのアミノ酸配列であり、それによってキメラタンパク質をα２−ＭＲドメインに標的化する。他の実施態様において、ドメインＩａは以下で置き換えられ得る：ＴＧＦαのような増殖因子、これは上皮増殖因子（「ＥＧＦ」）に結合する；ＩＬ−２、これはＩＬ−２レセプターに結合する；ＩＬ−６、これはＩＬ−６レセプターに結合する（例えば、活性化されたＢ細胞、および肝細胞）；ＣＤ４、これはＨＩＶ感染細胞に結合する；ケモカイン（例えば、Ｒａｎｔｅｓ、ＭＩＰ−１αまたはＭＩＰ−１β）、これは、ケモカインレセプターに結合する（例えば、ＣＣＲ５またはｆｕｓｉｎ（ＣＸＣＲ４））；白血球細胞表面レセプターのリガンド、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ；ＩｇＡレセプターのリガンド；または任意のレセプターを指向する抗体または抗体フラグメント（例えば、ヒトトランスフェリンレセプターに対する単鎖抗体）。Ｉ．Ｐａｓｔａｎら、（１９９２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３３１−５４。
【０１３０】
１つの実施態様において、細胞認識ドメインがＰＥのドメインＩａの代わりに配置される。それはリンカーを通じて分子の他の部分に付着し得る。しかし、操作研究は、ポリペプチドのカルボキシ末端に位置するＥＲ保持配列の上流に細胞認識ドメインを導入することにより、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素が特定の細胞型に標的化され得ることを示す。例えば、ＴＧＦαは、アミノ酸６０４の直前、すなわちカルボキシ末端から約１０アミノ酸のドメインＩＩＩに挿入された。このキメラタンパク質はＥＧＦレセプターを有する細胞に結合する。Ｐａｓｔａｎら、米国特許第５，６０２，０９５号。
【０１３１】
タンパク質である細胞特異的リガンドは、しばしば部分的または全体的に本発明のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素キメラとの融合タンパク質として形成され得る。「融合タンパク質」とは、一方のポリペプチドのアミノ末端および他方のポリペプチドのカルボキシ末端によって形成されたペプチド結合による、２つ以上のポリペプチドの結合によって形成されたポリペプチドをいう。融合タンパク質は、成分ポリペプチドの化学的カップリングによって形成され得るが、代表的には単一の連続する融合タンパク質をコードする核酸配列から単一のポリペプチドとして発現される。このような融合タンパク質には、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）が含まれる。特に好ましい標的化されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素キメラは、本明細書中で例示されるような融合タンパク質として部分的に形成され得る、ジスルフィド安定化タンパク質である。他のタンパク質細胞特異的リガンドは、当業者に周知のクローニング方法論を用いて融合タンパク質として形成され得る。
【０１３２】
細胞特異的リガンドの付着もまた、リンカーの使用を通して達成され得る。リンカーは、両方の分子への共有結合または高アフィニティーの非共有性の結合を形成し得る。適切なリンカーは当業者に周知であり、直鎖状または分岐鎖の炭素リンカー、複素環式炭素リンカー、またはペプチドリンカーを含むがこれらに限定されない。リンカーは、アミノ酸の側鎖（例えば、システインへのジスルフィド結合）を通して成分アミノ酸に連結され得る。
【０１３３】
１つの実施態様において、ドメインＩａは、標的細胞に特異的な免疫グロブリンからの免疫グロブリン重鎖のポリペプチド配列で置き換えられる。免疫グロブリンの軽鎖は、軽鎖−重鎖ダイマーを形成するように、ＰＥ様キメラ免疫原とともに同時発現され得る。結合体タンパク質においては、抗体は、キメラ免疫原の他のドメインを含むポリペプチドに化学的に連結される。
【０１３４】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素キメラを抗体または他の細胞特異的リガンドに付着する手順は、毒素の化学構造に従って変化する。抗体は、種々の官能基を含む：例えば、スルフヒドリル基（−Ｓ）、カルボン酸（ＣＯＯＨ）、または遊離のアミン基（−ＮＨ２）、これらは毒素上の適切な官能基との反応に利用可能である。さらに、またはあるいは、抗体またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素キメラは、さらなる反応性の官能基に暴露されるか、または付着されるために誘導体化され得る。誘導体化は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓから入手可能なもののような任意の多数のリンカー分子の付着を含み得る。
【０１３５】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素キメラ上の基と反応性である１つの官能基、および細胞特異性リガンドと反応性の別の基を有する二官能性リンカーは、所望の結合体を形成するために使用され得る。あるいは、誘導体化は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素キメラまたは細胞特異的リガンドの化学処理を含み得る（例えば、遊離のアルデヒド基を生じるように過ヨウ素酸塩を用いる、糖タンパク質抗体の糖部分のグリコール切断）。抗体上の遊離のアルデヒド基は、抗体上の遊離のアミンまたはヒドラジン基と反応して、そこにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素キメラが結合し得る（Ｊ．Ｄ．Ｒｏｄｗｅｌｌら、米国特許第４，６７１，９５８号を参照のこと）。抗体または他のタンパク質上に遊離のスルフヒドリル基を生成する方法はまた、公知である（Ｒ．Ａ．Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉら、米国特許第４，６５９，８３９号を参照のこと）。
【０１３６】
（Ｃ．トランスロケーションドメイン）
ＰＥ様キメラ免疫原はまた、「ＰＥトランスロケーションドメイン」をコードするアミノ酸配列を含む。ＰＥトランスロケーションドメインは、細胞によってサイトゾルにエンドサイトーシスされたキメラタンパク質のトランスロケーションをもたらすに十分なアミノ酸配列を含む。アミノ酸配列は、ＰＥのドメインＩＩから選択された配列に同一であるか、または実質的に同一である。
【０１３７】
トランスロケーションをもたらすに十分なアミノ酸配列は、ネイティブなＰＥのトランスロケーションドメインから誘導され得る。このドメインは、アミノ酸２５３〜３６４にわたる。トランスロケーションドメインはドメインＩＩの完全配列を含み得る。しかし、完全配列はトランスロケーションに必要ではない。例えば、アミノ酸配列は、最小限、例えば、ＰＥのドメインＩＩのアミノ酸２８０〜３４４を含み得る。この領域の外側の配列、すなわちアミノ酸２５３〜２７９および／または３４５〜３６４は、ドメインから除去され得る。このドメインはまた、トランスロケーション活性が保持される限り、置換により操作され得る。
【０１３８】
トランスロケーションドメインは以下のように機能する。細胞表面のレセプターに結合後、キメラタンパク質はクラスリンコートされたくぼみを通してエンドサイトーシスによって細胞に入る。残基２６５および２８７はジスルフィドループを形成するシステインである。いったん酸性環境を有するエンドソーム中に取り込まれると、ペプチドはプロテアーゼフリン（ｆｕｒｉｎ）によってＡｒｇ２７９とＧｌｙ２８０との間で切断される。次いで、ジスルフィド結合が還元される。Ａｒｇ２７９における変異は、タンパク質分解的な切断および続いて起こるサイトゾルへのトランスロケーションを阻害する。Ｍ．Ｏｇａｔａら、（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２０６７８−８５。しかし、Ａｒｇ２７９の下流の配列を含むＰＥのフラグメント（「ＰＥ３７」と呼ばれる）は、サイトゾルにトランスロケーションする実質的な能力を保持する。Ｃ．Ｂ．Ｓｉｅｇａｌｌら、（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４２５６−６１。ドメインＩＩにおけるアミノ酸３４５を超える配列もまた、トランスロケーションを阻害することなく欠失され得る。さらに、３３９位および３４３位のアミノ酸は、トランスロケーションに必須のようである。Ｃ．Ｂ．Ｓｉｅｇａｌｌら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：７１５４−５９。
【０１３９】
トランスロケーションドメインの機能性を決定する方法は、以下の試験に関するセクションの中で記載される。
【０１４０】
（Ｄ．非ネイティブエピトープドメイン）
ＰＥ様キメラ免疫原はまた、「非ネイティブエピトープドメイン」をコードするアミノ酸配列を含む。非ネイティブエピトープドメインは、非ネイティブエピトープのアミノ酸配列を含む。このドメインは、免疫系に対する提示のための免疫原非ネイティブエピトープを含むように機能する。非ネイティブエピトープドメインは、トランスロケーションドメイン（例えば、ドメインＩＩ）とＥＲ保持ドメイン（例えば、ドメインＩＩＩ）との間のＰＥのＩｂドメイン位置に操作される。トランスロケーションドメインの免疫原性を決定するための方法は、以下の試験に関するセクションの中で記載される。
【０１４１】
非ネイティブエピトープは、免疫原性である任意のアミノ酸配列であり得る。非ネイティブエピトープドメインは、約５アミノ酸と約１５００アミノ酸との間を有し得る。これは約１５アミノ酸と_約３５０アミノ酸との間、または約１５アミノ酸と約５０アミノ酸との間を有するドメインを含む。
【０１４２】
ネイティブなＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａにおいて、ドメインＩｂはアミノ酸３６５〜３９９にわたる。ネイティブなＩｂドメインは、３７２位と３７９位の２つのシステインの間のジスルフィド結合によって構造的に特徴付けられる。ドメインＩｂは、細胞結合、トランスロケーション、ＥＲ保持、またはＡＤＰリボシル化活性に必須ではない。それゆえ、それは完全に再操作され得る。
【０１４３】
非ネイティブエピトープドメインは、直鎖状であり得るか、または非ネイティブエピトープを含むシステイン−システインループを含み得る。１つの実施態様において、非ネイティブエピトープドメインは、非ネイティブエピトープを含むシステイン−システインループを含む。この配置は、いくつかの利点を提供する。第１に、非ネイティブエピトープが天然にシステイン−システインジスルフィド結合したループ内部に存在するか、またはシステイン−システインジスルフィド結合したループを含む場合に、非ネイティブエピトープドメインはネイティブに近いコンフォメーションにあるエピトープを示す。第２に、ネイティブＩｂドメイン中の荷電アミノ酸残基は、分子からそして溶媒（ここでアミノ酸残基は免疫系の成分と相互作用するために利用可能である）へと突出した親水性構造を生じると考えられている。それゆえ、非ネイティブエピトープもまた親水性である場合、非ネイティブエピトープをシステイン−システインループ内に配置することは、より効果的な提示を生じる。第３に、Ｉｂドメインは変異に対して高度に非感受性である。それゆえ、ネイティブＩｂドメインのシステイン−システインループはシステイン残基間に６アミノ酸のみを有するが、細胞結合、トランスロケーション、ＥＲ保持、またはＡＤＰリボシル化活性を破壊することなく、ループ中により長い配列を挿入し得る。
【０１４４】
本発明は、非ネイティブエピトープドメインをＩｂドメイン配置に操作するいくつかの方法を意図する。１つの方法は、非ネイティブエピトープのアミノ酸配列を、ネイティブアミノ酸配列の欠失を伴うか、または伴わないで、直接的にＩｂドメインのアミノ酸配列に挿入する工程を含む。別の方法は、Ｉｂドメインのすべてまたは一部を除去する工程、および、タンパク質が発現される場合にシステインがジスルフィド結合に従事するように、２つのシステイン残基間の非ネイティブエピトープを含むアミノ酸配列でそれを置き換える工程を含む。例えば、ポリペプチドのシステイン−システインループ構造内に非ネイティブエピトープが通常存在する場合、ループおよび非ネイティブエピトープを含むポリペプチドの部分は、システイン−システインループドメインの代わりに挿入され得る。
【０１４５】
非ネイティブエピトープの選択は、当業者の裁量にある。選択する際に、当業者は以下を考慮し得る。非ネイティブエピトープドメインは直鎖状であり得るが、システイン−システインループ内に天然に存在する非ネイティブエピトープは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素ＡのＩｂループの天然構造をうまく利用する。不活性な感染またはガン特異的抗原の原因である因子からのエピトープは魅力的である。なぜなら、これらの抗原は、免疫系からの攻撃に抵抗する傾向があるからである。また、組換え技術は、エピトープをコードするポリヌクレオチドを、キメラタンパク質をコードするベクターに迅速に挿入することを可能にする。それゆえ、非ネイティブエピトープの変化に応じて配列を迅速に変化させ得る。従って、急速に進化する感染因子からのエピトープは、魅力的な挿入物を作る。
【０１４６】
従って、例えば、エピトープは任意の病原体、例えば、ウイルス、細菌、および原虫寄生生物から選択され得る。エピトープのウイルスの供給源は、例えば、ＨＩＶ、帯状疱疹、インフルエンザ、ポリオ、および肝炎を含む。細菌の供給源は、例えば、結核、クラミジア、またはサルモネラを含む。寄生性原虫の供給源には、例えば、ＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａまたはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍを含む。特に、因子は体内への侵入を上皮粘膜を通過して得るものであり得る。有用なガン特異的な抗原は、細胞表面で発現されるものを含み、そしてそれゆえ、細胞傷害性のＴ−リンパ球応答（例えば、前立腺ガン特異的マーカー（例えば、ＰＳＡ）、乳ガン特異的マーカー（例えば、ＢＲＣＡ−１またはＨＥＲ２）、膵臓ガン特異的マーカー（例えば、ＣＡ９−１９）、メラノーママーカー（例えば、チロシナーゼ）またはＥＧＦのガン特異的な変異形態）の標的であり得る。
【０１４７】
１つの実施態様において、非ネイティブエピトープは、レトロウイルス（例えば、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２）の主要な中和ループから誘導される。特に、エピトープはＨＩＶ−１からのｇｐ１２０タンパク質のＶ３ループから誘導され得る。中和ループは、中和抗体、すなわち、ウイルスの感染性を中和する抗体によって同定され得る。配列は、任意の株、特に循環する株由来であり得る。このような株は、例えば、ＭＮ（例えば、サブタイプＢ）またはＴｈａｉ−Ｅ（例えば、サブタイプＥ）を含む。 ＨＩＶ−１の種々の株のＶ３ループは、約３５アミノ酸を有する。ＨＩＶの株は、Ｔ細胞向性またはマクロファージ向性であり得る。１つの実施態様において、Ｖ３ループからの配列は、Ｖ３ループの頂尖を含む少なくとも８アミノ酸（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ結合ポケットに適合するに十分な長さのペプチド）を含む。ＨＩＶのＭＮ株のＶ３ループは配列：ＣＴＲＰＮＹＮＫＲＫ  ＲＩＨＩＧＰＧＲＡＦ  ＹＴＴＫＮＩＩＧＴＩ  ＲＱＡＨＣ（配列番号３）を有する。ＨＩＶのＴｈａｉ−Ｅ株のＶ３ループは、配列：ＣＴＲＰＳＮＮＴＲＴ  ＳＩＴＩＧＰＧＱＶＦ  ＹＲＴＧＤＩＩＧＤＩ  ＲＫＡＹＣ（配列番号４）を有する。Ｖ３ループの頂尖に下線を付す。配列は約１４から約２６アミノ酸長である。ワクチンは異なるウイルスエピトープを有する複数の免疫原を含み得る。
【０１４８】
別の実施態様において、非ネイティブエピトープは、疾患の間に細胞によって発現されるエピトープであり得る。例えば、非ネイティブエピトープは、ガン細胞マーカーであり得る。例えば、特定の乳ガンは、スプライシング改変体から生じる変異体ＥＧＦ（「上皮増殖因子」）レセプターを発現する。この変異体形態は独特なエピトープを示す。
【０１４９】
（Ｅ．ＥＲ保持ドメイン）
ＰＥ様キメラ免疫原はまた、「小胞体保持ドメイン」をコードするアミノ酸配列を含み得る。小胞体（「ＥＲ」）保持ドメインは、エンドソームから、小胞体（ここからサイトゾルへ輸送される）へのキメラタンパク質のトランスロケーションにおいて機能する。ＥＲ保持ドメインは、ＰＥのドメインＩＩＩの位置に配置される。ＥＲ保持ドメインは、そのカルボキシ末端にＥＲ保持配列を有するアミノ酸配列を含む。ネイティブＰＥにおけるＥＲ保持配列は、ＲＥＤＬＫ（配列番号１１）である。リジンは活性を減少させることなく除去され得る（すなわち、ＲＥＤＬ（配列番号１２））。ＲＥＤＬＫ（配列番号１からの）は、ＫＤＥＬ（配列番号１２）またはこれらの配列のポリマーのような他のＥＲ保持配列で置き換えられ得る。Ｍ．Ｏｇａｔａら、（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２０６７５−８５。Ｐａｓｔａｎら、米国特許第５，４５８，８７８号。Ｉ．Ｐａｓｔａｎら、（１９９２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３３１−５４。
【０１５０】
ＥＲ保持配列の上流の配列は、（好ましくは無毒化された）ネイティブＰＥドメインＩＩＩであり得るか、完全に除去され得るか、または別のアミノ酸配列によって置き換えられ得る。別のアミノ酸配列によって置き換えられた場合、配列は、それ自体、高度に免疫原性であり得るか、またはわずかに免疫原性であり得る。高度に免疫原性のＥＲ保持ドメインは、体液性免疫応答を誘発することにおける使用に好ましい。ＥＲ保持ドメインがわずかに免疫原性であるのみであるキメラは、ＭＨＣクラスＩ依存性細胞媒介性免疫応答が所望である場合に、より有用である。
【０１５１】
このドメインの活性は、以下に記載するアッセイを用いて、タンパク質の標的細胞サイトゾルへのトランスロケーションを試験することによって評価され得る。
【０１５２】
ネイティブなＰＥにおいて、ＥＲ保持配列はドメインＩＩＩのカルボキシ末端に配置される。ドメインＩＩＩはＰＥにおいて２つの機能を有する。ドメインＩＩＩはＡＤＰリボシル化活性を示し、そしてエンドサイトーシスされた毒素を小胞体へ方向付ける。キメラタンパク質からＥＲ保持配列を除去することは、スーパー抗原としてのＰｓｅｕｄｏｎｏｍａｓ体外毒素の活性を変化させないが、ＭＨＣクラスＩ依存性細胞媒介性応答を誘発するための有用性を示す。
【０１５３】
ＰＥのリボシル化活性は、ＰＥのアミノ酸約４００と６００との間に位置する。本発明のキメラタンパク質を用いて被験体にワクチン接種する方法において、タンパク質が無毒性であることが好ましい。そうすることの１つの方法は、ＡＤＰリボシル化活性を除去することによる。この方法において、キメラタンパク質は、毒素としてよりも、細胞によってプロセシングされ、そしてＭＨＣクラスＩ分子を有する細胞表面上で提示される非ネイティブエピトープ配列のためのベクターとして機能し得る。ＡＤＰリボシル化活性は、例えば、アミノ酸Ｅ５５３を欠失させること（「ΔＥ５５３」）によって除去され得る。Ｍ．Ｌｕｋａｃら、（１９８８）Ｉｎｆｅｃｔ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎ．５６：３０９５−３０９８。あるいは、ドメインＩＩＩのアミノ酸配列またはその部分が、タンパク質から欠失され得る。当然ながら、ＥＲ保持配列はカルボキシ末端に含まれるべきである。
【０１５４】
１つの実施態様において、ＥＲ保持ドメインの配列は、ドメインＩＩＩのネイティブなアミノ酸配列、またはそのフラグメントに実質的に同一である。１つの実施態様において、ＥＲ保持ドメインは、ＰＥのドメインＩＩＩである。
【０１５５】
別の実施態様において、細胞認識ドメインは、ＥＲ保持ドメインのアミノ酸配列に（例えば、ドメインＩＩＩに）挿入される。例えば、細胞認識ドメインは、ＥＲ保持配列のすぐ上流に挿入され得、その結果ＥＲ保持配列は、直接的に連結されるかまたは細胞認識ドメインのカルボキシ末端の１０アミノ酸以内にある。
【０１５６】
（Ｆ．ＰＥ様キメラ免疫原を作製する方法）
ＰＥ様キメラ免疫原は、以下に記載するように好ましくは組換え的に産生され得る。本発明はまた、当該分野に利用可能な方法を用いて、化学合成によるＰＥキメラタンパク質の産生を意図する。
【０１５７】
（Ｇ．ＰＥ様免疫原性キメラの試験）
キメラ免疫原のドメインとして種々の構造を選択すると、これらのドメインの機能、および全体としてのキメラの機能が、機能性を検出するために試験され得る。ＰＥ様免疫原性キメラは、慣用的なアッセイを用いて、細胞認識、サイトゾルトランスロケーションおよび免疫原性について試験され得る。完全なキメラタンパク質が試験され得るか、または、種々のドメインの機能が野生型毒素のネイティブドメインの代わりにそれらで置換することによって試験され得る。
【０１５８】
（１．レセプター結合／細胞認識）
細胞結合ドメインの機能は、単離されたか、または細胞表面にあるかのいずれかの標的レセプターに結合するキメラの機能として試験され得る。
【０１５９】
１つの方法において、標的へのキメラの結合は、アフィニティークロマトグラフィーによって行われる。例えば、キメラはアフィニティーカラム中のマトリックスに付着され得、そしてマトリックスへのレセプターの結合が検出される。
【０１６０】
細胞上のレセプターへのキメラの結合は、例えば、キメラを標識し、そして細胞へのその結合を、例えば、蛍光細胞ソーティング、オートラジオグラフィーなどによって検出することによって試験され得る。
【０１６１】
細胞認識ドメインが由来するリガンドに結合する抗体が同定された場合、抗体はまた、イムノアッセイによって、または同種のレセプターについての競合アッセイによって、キメラ免疫原中の細胞認識ドメインの存在を検出するに有用である。
【０１６２】
（２．サイトゾルへのトランスロケーション）
トランスロケーションドメインおよびＥＲ保持ドメインの機能は、サイトゾルへの接近を得るキメラの能力の機能として試験され得る。接近は第１に細胞への結合を必要とするので、これらのアッセイはまた、細胞認識ドメインが機能しているかどうかを決定することに有用である。
【０１６３】
（ａ．サイトゾルにおける存在）
１つの方法において、サイトゾルへの接近は、サイトゾル中のキメラの物理的な存在を検出することによって決定される。例えば、キメラは標識され得、そしてキメラは細胞に暴露される。次いで、サイトゾル画分は単離され、そして画分中の標識の量が決定される。画分中の標識を検出することは、キメラがサイトゾルへの接近を得たことを示す。
【０１６４】
（ｂ．ＡＤＰリボシル化活性）
別の方法において、トランスロケーションドメインおよびＥＲ保持ドメインのサイトゾルへのトランスロケーションをもたらす能力は、ＡＤＰリボシル化活性を有するドメインＩＩＩを含む構築物を用いて試験され得る。手短にいえば、細胞を組織培養プレートに播種し、そしてネイティブドメインの代わりに、改変されたトランスロケーションドメインもしくはＥＲ保持配列を含むキメラタンパク質または操作されたＰＥ体外毒素に暴露する。ＡＤＰリボシル化活性は、例えば、３Ｈ−ロイシンの取り込みをモニターすることによって、タンパク質合成の阻害の関数として決定される。
【０１６５】
（３．免疫原性）
非ネイティブエピトープの機能は、体液性または細胞媒介性免疫原性を決定することによって決定され得る。免疫原性は、いくつかの方法によって試験され得る。体液性免疫応答は、動物に接種すること、および外来性の免疫原に対する抗体の産生を検出することによって試験され得る。細胞媒介細胞傷害性免疫応答は、免疫原で動物を免疫すること、細胞傷害性Ｔ細胞を単離すること、およびそれらのＭＨＣクラスＩ分子が非ネイティブエピトープからのアミノ酸配列を有する細胞を殺傷する能力を検出することによって試験され得る。細胞傷害性Ｔ細胞応答を生成することは、キメラの細胞への結合、およびサイトゾルへのトランスロケーションの両方を必要とするので、この試験はまた、細胞認識ドメイン、トランスロケーションドメイン、およびＥＲ保持ドメインの活性を試験する。
【０１６６】
（ＩＩＩ．ＰＥ様キメラ免疫原をコードする組換えポリヌクレオチド）
（Ａ．組換えポリヌクレオチド）
（１．供給源）
本発明は、本発明のＰＥ様キメラ免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドは、ＰＥ様キメラ免疫原を作製するために有用である。別の局面において、本発明は、細胞認識ドメイン、トランスロケーションドメイン、ＥＲ保持ドメイン、およびトランスロケーションドメインとＥＲ保持ドメインとの間の、非ネイティブエピトープドメインをコードするポリヌクレオチド配列のためのクローニング部位をコードする組換えポリヌクレオチド配列を含む、ＰＥ様タンパク質クローニングプラットフォームを提供する。
【０１６７】
本発明の組換えポリヌクレオチドは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａをコードするポリヌクレオチド、またはその部分に基づく。ＰＥをコードするヌクレオチド配列は上記に示される。従事者はこの配列を使用して、全長配列を単離するためのＰＣＲプライマーを調製し得る。ＰＥの配列は改変され、ＰＥ様キメラ免疫原またはプラットフォームをコードするポリヌクレオチドを操作し得る。
【０１６８】
本発明のキメラタンパク質に使用されるＰＥをコードするポリヌクレオチドまたは任意の他のポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）、自己支持配列複製系（３ＳＲ）、およびＱβレプリカーゼ増幅系（ＱＢ）のようなインビトロ方法によってクローニングされ得るか、または増幅され得る。例えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＰＥまたは細胞認識分子のＤＮＡ配列に基づくプライマーを使用してｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応によって単離され得る。
【０１６９】
広範な種々のクローニングおよびインビトロ増幅方法論は、当業者に周知である。ＰＣＲ法は、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号；Ｍｕｌｌｉｓら（１９８７）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３；およびＥｒｌｉｃｈ、編、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９）に記載される。ポリヌクレオチドはまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、所望のポリヌクレオチドの配列から選択されるプローブを用いてゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得る。
【０１７０】
（２．変異誘発させたバージョン）
タンパク質の変異体バージョンは、タンパク質をコードする他のポリヌクレオチドの部位特異的変異誘発によって、または０．１ｍＭ  ＭｎＣｌ２および不均衡なヌクレオチド濃度を用いて、もともとのポリヌクレオチドのＰＣＲの誤りの頻度を増加させることによって引き起こされたランダム変異誘発によって作製され得る。
【０１７１】
アミノ酸１〜２５２をコードするヌクレオチドを除去することは、「ＰＥ４０」と呼ばれる構築物を産生する。アミノ酸１〜２７９をコードするヌクレオチドを除去することは、「ＰＥ３７」と呼ばれる構築物を産生する（Ｐａｓｔａｎら、米国特許第５，６０２，０９５号を参照のこと）。従業者は、細胞認識ドメインをコードする配列をこれらのプラットフォームの５’末端に連結して、特定の細胞表面レセプターに指向されるＰＥ様キメラタンパク質を操作し得る。これらの構築物は、必要に応じてアミノ末端メチオニンをコードし得る。細胞認識ドメインは、ＥＲ保持ドメインをコードするヌクレオチド配列中でこのような構築物に挿入され得る。
【０１７２】
（３．キメラタンパク質クローニングプラットフォーム）
非ネイティブエピトープドメインのクローニング部位は、ドメインＩｂのシステイン残基をコードするヌクレオチドの間に導入され得る。例えば、実施例で述べるように、システインコード残基の間のＩｂドメインの部分をコードするヌクレオチド配列は除去され得、そしてあるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列およびＰｓｔＩクローニング部位を含むヌクレオチド配列で置き換えられ得る。非ネイティブエピトープをコードし、そしてＰｓｔＩ配列で隣接されるポリヌクレオチドは、ベクターに挿入され得る。
【０１７３】
構築物はまた、タンパク質のアミノ末端に分泌配列をコードするように操作され得る。このような構築物は、哺乳動物細胞中で免疫原を産生するために有用である。インビトロにおいて、このような構築物は免疫原の単離を単純化する。インビボにおいて、このような構築物はポリヌクレオチドワクチンとして有用である；この構築物を組み込まれる細胞は、タンパク質を発現し、そしてそれを分泌し、そこで免疫系と相互作用し得る。
【０１７４】
（Ｂ．発現ベクター）
本発明はまた、ＰＥ様キメラ免疫原を発現するための発現ベクターを提供する。発現ベクターは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチド分子である。発現ベクターは、転写およびｍＲＮＡの翻訳のために、適切なプロモーター、複製配列、マーカーなどの包含によって、原核生物または真核生物における機能に適合され得る。発現ベクターの構築およびトランスフェクトされた細胞における遺伝子の発現は、当該分野でも周知の分子クローニング技術の使用を含む。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（１９８９）およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編、（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との間のジョイントベンチャー）。このような目的のための有用なプロモーターは、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ  ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（例えば、ヒト最初期ＣＭＶプロモーター）、および構成的ＣＭＶプロモーターを含む。遺伝子治療に有用なプラスミドは、選択マーカー、同定領域、および他の遺伝子のような他の機能的なエレメントを含み得る。
【０１７５】
本発明において有用な発現ベクターは、それらの意図する使用に依存する。そのような発現ベクタ-は、当然ながら、宿主細胞と適合可能な発現および複製シグナルを含まなければならない。ＰＥ様キメラ免疫原を発現するに有用な発現ベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスのようなウイルスベクター、プラスミドベクター、コスミドなどが含まれる。ウイルスベクターおよびプラスミドベクターが、哺乳動物細胞のトランスフェクトのために好まれる。発現ベクターｐｃＤＮＡ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）は、発現制御配列がＣＭＶプロモーターを含み、良好なトランスフェクションおよび発現割合を提供する。アデノ随伴ウイルスベクターは、本発明の遺伝子治療法において有用である。
【０１７６】
細胞にポリヌクレオチドを送達するために種々の手段が利用可能であり、それらには、例えば、細胞による溶液からの直接的な分子の取り込み、リポフェクション（例えば、リポソームまたは免疫リポソーム）を介する取り込みの促進、粒子媒介トランスフェクション、および阻害ポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を有する発現カセットからの細胞内発現が含まれる。Ｉｎｏｕｙｅら、米国特許第５，２７２，０６５号；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，編）（１９９０）またはＭ．Ｋｒｉｅｇｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，（１９９０）もまた参照のこと。組換えＤＮＡ発現プラスミドもまた、遺伝子治療による以外の手段による送達のために本発明のポリヌクレオチドを調製するために使用され得るが、インビトロでの化学合成による短いオリゴヌクレオチドを作製することはより経済的であり得る。
【０１７７】
構築物はまた、タンパク質の単離を単純化するためのタグを含み得る。例えば、例えば６ヒスチジン残基のポリヒスチジンタグが、タンパク質のアミノ末端に組み込まれ得る。ポリヒスチジンタグは、ニッケルキレートクロマトグラフィーによって単一工程でタンパク質の便利な単離を可能にする。
【０１７８】
（Ｃ．組換え細胞）
本発明はまた、本発明のＰＥキメラ免疫原をコードするヌクレオチド配列の発現のための発現ベクターを含む組換え細胞を提供する。宿主細胞は、タンパク質を精製するために高レベルの発現について選択され得る。細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉのような原核細胞または真核細胞であり得る。有用な真核細胞は、酵母および哺乳動物細胞を含む。細胞は、例えば、培養した組換え細胞またはインビボの細胞であり得る。
【０１７９】
Ｅ．ｃｏｌｉは、ＰＥ様キメラ免疫原を産生するために首尾よく使用されてきた。タンパク質は折り畳まれ得、そしてこの細胞中でジスルフィド結合が形成し得る。
【０１８０】
（ＩＶ．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ様キメラ免疫原ワクチン）
ＰＥ様キメラ免疫原は、非ネイティブエピトープを有する因子に対して防御的な免疫応答を誘発するためのワクチンにおいて有用である。ワクチンは、１つまたは複数（すなわち、多価ワクチン）の異なるＰＥ様キメラ免疫原を含み得る。例えば、ワクチンは、その非ネイティブエピトープがいくつかの病原体の循環する株に由来する、ＰＥ様キメラ免疫原を含み得る。病原体が進化するにつれて、例えば、ブレークスルーウイルスからの変化したエピトープを含む、新規なＰＥ様キメラ免疫原が構築され得る。１つの実施態様において、ワクチンは、Ｔ細胞向性ウイルスからの、およびマクロファージ向性ウイルスからのエピトープを含む。例えば、ＨＩＶ感染に対するワクチンは、その非ネイティブエピトープがＨＩＶのＭＮ株およびＴｈａｉ−Ｅ株のＶ３ループに由来する免疫原を含み得る。また、エピトープは、膜融合に関与するＨＩＶからの任意のペプチド（例えば、ｇｐ１２０またはｇｐ４１）に由来し得る。あるいは、それらはサブユニットワクチンであるので、ワクチンは、その非ネイティブエピトープが同一の病原体の種々のエピトープから選択される、ＰＥ様キメラ免疫原を含み得る。
【０１８１】
ワクチンは凍結乾燥した状態で、または使用のために滅菌溶液中にあらかじめ再構成されて供給され得る。免疫用量は、組換えタンパク質の約１μｇと約１０００μｇとの間、より通常には、約１０μｇと約５０μｇとの間である。免疫用量の決定については、例えば、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｈ．Ｒ．ＲｏｓｅおよびＨ．Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８０）を参照のこと。単位用量は、約０．０５ｍｌ〜約１ｍｌ、より通常には約０．５ｍｌである。用量は、好ましくは皮下または筋肉内で送達される。注射は、約４〜約８週間間隔でさらに数回継続し得る。追加免疫用量は、約１〜約１０年間継続し得る。ワクチンは、１と５０用量との間（例えば、０．５ｍｌ〜２５ｍｌ）、より通常には１と１０用量との間（例えば、０．５ｍｌ〜５ｍｌ）を含む用量形態で調製され得る。ワクチンはまた、抗原と組み合わせて用いられた場合に免疫応答を強化する、アジュバントを含み得る。有用なアジュバントは、ミョウバン、水酸化アルミニウム、またはリン酸アルミニウムを含む。
【０１８２】
（Ｖ．免疫応答を誘発する方法）
ＰＥ様キメラ免疫原は、非ネイティブエピトープを有する抗原に対する免疫応答を誘発するにおいて有用である。体液性の免疫応答を誘発することは、非ネイティブエピトープを特異的に認識する抗体の産生において、そして非ネイティブエピトープを有する細胞、ウイルス、または他の因子に対する免疫化において有用である。ＰＥ様キメラ免疫原はまた、ＭＨＣクラスＩ依存性またはＭＨＣクラスＩＩ依存性細胞媒介免疫応答を誘発するにおいて有用である。これらはまた、分泌性の免疫応答を誘発するにおいても有用である。
【０１８３】
（Ａ．予防的および治療的処置）
ＰＥ様キメラ免疫原は、病原性生物または被験体からの病理学的な細胞（例えば、ガン細胞）からの非ネイティブエピトープを含み得る。従って、本発明は、非ネイティブエピトープを有する病原体または異常な細胞のいずれかである因子の病理学的活性を含む、疾患に対する予防的および治療的処置を提供する。本方法は非ネイティブエピトープを有するＰＥ様キメラ免疫原で被験体を免疫する工程を含む。生じる免疫応答は、病原体それ自体、または非ネイティブエピトープを発現する細胞に対する攻撃の準備をする。例えば、病原体が細菌または寄生性原虫感染から生じる場合、免疫系は、病原体それ自体に対する応答を準備する。病原体がウイルスである場合、感染した細胞はそれらの表面に非ネイティブエピトープを発現し、そして細胞傷害性応答の標的となる。ガン細胞のような異常な細胞は、しばしば通常でないエピトープを発現し、そしてまた細胞傷害性免疫応答を受け得る。
【０１８４】
（Ｂ．体液性免疫応答）
ＰＥ様キメラ免疫原は、被験体による非ネイティブエピトープに対する抗体の産生を誘発するに有用である。ＰＥ様キメラ免疫原は、システイン−システインループ内に天然に生じる非ネイティブエピトープに対する抗体を作製するために魅力的な免疫原である。それらはシステイン−システインループ内に非ネイティブエピトープを含むので、それらはネイティブに近いコンフォメーションで免疫系にエピトープを提示する。生じる抗体は一般的に、非ネイティブエピトープの直鎖状バージョンに対して惹起された抗体よりもより良好にネイティブな抗原を認識する。
【０１８５】
ポリクローナル抗体を産生する方法は、当業者に公知である。手短にいえば、免疫原、好ましくは精製されたポリペプチド、適切なキャリアにカップリングされたポリペプチド（例えば、ＧＳＴ、キーホールリンペットヘモシアニンなど）、または組換えワクシニアウイルス（米国特許第４，７２２，８４８号を参照のこと）のような免疫化ベクターに組み込まれたポリペプチドを、アジュバントとともに混合する。動物をこの混合物で免疫する。免疫原性調製物に対する動物の免疫応答を、試験出血を取り、そして目的のポリペプチドに対する反応性の力価を決定することによってモニターする。免疫原に対する適切な高力価の抗体が得られる場合には、血液が動物から収集され、そして抗血清が調製される。ポリペプチドに反応性の抗体について富化するためのさらなる抗血清の分画が、所望の場合行われる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，ＮＹ；ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照のこと。
【０１８６】
種々の実施態様において、最終的に産生される抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、または抗体フラグメントであり得る。
【０１８７】
モノクローナル抗体は、所望の抗体を分泌する細胞から調製される。これらの抗体は、エピトープを含むポリペプチドへの結合についてスクリーニングされるか、またはアゴニストもしくはアンタゴニスト活性、例えば、非ネイティブエピトープを含む因子を通して媒介される活性についてスクリーニングされる。いくつかの例において、種々の哺乳動物宿主（例えば、マウス、げっ歯動物、霊長類、ヒトなど）からのモノクローナル抗体を調製することが所望される。このようなモノクローナル抗体を調製するための技術の記載は、例えば、Ｓｔｉｔｅｓら（編）Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ，ＣＡおよびそこで引用される参考文献；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，前出；Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；ならびにＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７に見出される。
【０１８８】
別の実施態様において、抗体はヒト化免疫グロブリンである。ヒト化抗体は、組換えＤＮＡ技術によってヒト定常領域に非ヒト抗体のＣＤＲ領域を連結することによって作製される。Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号を参照のこと。
【０１８９】
本発明の別の実施態様において、非ネイティブエピトープに対する抗体のフラグメントが提供される。代表的には、これらのフラグメントは、完全な免疫グロブリンのエピトープに類似する非ネイティブエピトープへの特異的な結合を示す。抗体フラグメントは、別個の重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖを含む。フラグメントは、組換えＤＮＡ技術によって産生されるか、またはインタクトな免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的な分離によって産生される。
【０１９０】
他の適切な技術は、ファージまたは類似のベクター中の組換え抗体のライブラリーの選択を含む。Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；およびＷａｒｄら（１９８９）_Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６を参照のこと。
【０１９１】
ヒトモノクローナル抗体またはその結合フラグメントをコードするＤＮＡ配列を単離するためのアプローチは、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）によって概説された一般的なプロトコールに従ってヒトＢ細胞からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、次いで所望の特異性の抗体（または結合フラグメント）をコードする配列をクローニングし、そして増幅することによる。Ｈｕｓｅによって記載されたプロトコールは、ファージディスプレイ技術と組み合わせてより効果的になる。例えば、Ｄｏｗｅｒら、ＷＯ９１／１７２７１およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと。ファージディスプレイ技術はまた、本発明のポリペプチドまたはそれらのリガンドについてアフィニティーを有することがすでに示されている抗体のＣＤＲ領域を変異誘発するためにも使用され得る。改善された結合アフィニティーを有する抗体が選択される。
【０１９２】
本発明の抗体は、非ネイティブエピトープを有する因子を単離する際のアフィニティークロマトグラフィーのために有用である。カラムを、例えば、固体支持体（例えば、アガロース、Ｓｅｐｈａｄｅｘなどのような粒子）に連結した抗体を用いて調製する。ここで細胞溶解物をカラムに通し、洗浄し、そして漸増濃度の穏やかな変性剤で処理し、それによって精製された因子が放出される。
【０１９３】
非ネイティブエピトープとして、ｇｐ１２０  Ｖ３ループを有するＰＥ様キメラ免疫原を用いてｇｐ１２０に対して抗体を産生させた。モノクローナル抗体は、可溶性ＭＮおよびＴｈ−Ｅキメラタンパク質を選択的に捕獲し、Ｖ３ループが抗体プローブに暴露され、そして接近可能であったことを確認した。また、免疫されたウサギからの血清は、インビトロアッセイにおいてＨＩＶ−１の感染性を中和した。
【０１９４】
（Ｃ．ＭＨＣクラスＩＩ依存性細胞媒介性免疫応答）
別の局面において、本発明は、非ネイティブエピトープを発現する細胞に対するＭＨＣクラスＩＩ依存性免疫応答を誘発するための方法を提供する。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、当該分野で周知の特定のアミノ酸モチーフを有するペプチドに結合する。ＭＨＣクラスＩＩ依存性応答は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）による抗原の取り込み、そのプロセシング、およびＭＨＣクラスＩＩ／抗原性ペプチド複合体の一部としての細胞表面での提示を含む。あるいは、細胞表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子は、適切なモチーフを有するペプチドに結合し得る。
【０１９５】
抗原提示細胞は、ＣＤ４ポジティブヘルパーＴ細胞と相互作用し、それによってヘルパーＴ細胞を活性化する。活性化されたヘルパーＴ細胞はＢリンパ球を刺激して抗原に対する抗体を産生する。抗体は表面に抗原を有する細胞に印を付ける。印を付けられた細胞は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害をこうむり、そこではＦｃレセプターを有するＮＫ細胞またはマクロファージが印を付けられた細胞を攻撃する。
【０１９６】
ＭＨＣクラスＩＩ依存性免疫応答を誘発するための方法は、被験体のＭＨＣクラスＩＩ分子によって認識されるアミノ酸モチーフを含むキメラＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素の免疫原的な量を含むワクチンを被験体に投与する工程を含む。あるいは、抗原提示細胞は、そのようなペプチドとともに結合を可能にするために培養され得、そしてこの細胞は被験体に投与され得る。好ましくは、細胞は被験体と同系である。
【０１９７】
（Ｄ．ＭＨＣクラスＩ依存性細胞媒介性免疫応答）
別の局面において、本発明は、被験体において非ネイティブエピトープを発現する細胞に対するＭＨＣクラスＩ依存性細胞媒介性免疫応答を誘発するための方法を提供する。ＭＨＣクラスＩ分子は、当該分野で周知の特定のアミノ酸モチーフを有するペプチドに結合する。細胞中で発現するタンパク質はペプチドに消化され、そしてＭＨＣクラスＩ分子と結合して細胞表面上に提示される。そこで、それらはＣＤ８ポジティブリンパ球によって認識され、ＭＨＣクラスＩ分子と結合したエピトープを発現する細胞に対して細胞傷害性Ｔリンパ球応答を生じる。ＨＩＶに感染したＣＤ４ポジティブＴリンパ球はｇｐ１２０、従ってＶ３ドメインを発現するので、このような細胞を攻撃する細胞傷害性Ｔリンパ球の生成は、ＨＩＶ感染の予防的または治療的処置において有用である。
【０１９８】
ＨＬＡ−Ａ１結合モチーフは、Ｔ、ＳまたはＭという第１の保存性残基、ＤまたはＥという第２の保存性残基、およびＹという第３の保存性残基を含む。他の第２の保存性残基は、Ａ、ＳまたはＴである。第１および第２の保存性残基は隣接し、そして好ましくは第３の保存性残基とは６〜７残基離れている。第２のモチーフは、ＥまたはＤという第１の保存性残基、およびＹという第２の保存性残基からなり、ここで第１の保存性残基と第２の保存性残基とは５〜６残基離れている。ＨＬＡ−Ａ３．２結合モチーフは、２位にＬ、Ｍ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ａ、ＴおよびＦという第１の保存性残基、ならびにＣ末端にＫ、Ｒ、またはＹという第２の保存性残基を含む。他の第１の保存性残基は、Ｃ、Ｇ、またはＤ、あるいはＥである。他の第２の保存性残基は、ＨまたはＦである。第１の保存性残基と第２の保存性残基とは好ましくは６〜７残基離れている。ＨＬＡ−Ａ１１結合モチーフは、２位にＴまたはＶという第１の保存性残基、およびＫというＣ末端保存性残基を含む。第１の保存性残基と第２の保存性残基とは好ましくは６または７残基離れている。ＨＬＡ−Ａ２４．１結合モチーフは、２位にＹ、ＦまたはＷという第１の保存性残基、およびＦ、Ｉ、Ｗ、ＭまたはＬというＣ末端保存性残基を含む。第１の保存性残基と第２の保存性残基とは好ましくは６〜７残基離れている。
【０１９９】
別の方法は、このような発現ベクターを用いて、エキソビボで細胞をトランスフェクトする工程、および被験体に細胞を投与する工程を含む。細胞は好ましくは被験体と同系である。
【０２００】
被験体内でウイルスに対する免疫応答を誘発する方法は、未だに感染していない被験体にワクチンを投与する場合に、ウイルスの感染を予防するための予防的方法において有用である。
【０２０１】
（Ｅ．ＩｇＡ媒介性分泌性免疫応答）
粘膜は、多くの感染性病原体にとって主要な通路である。このような病原体には、例えば、ＨＩＶ、ヘルペス、ワクシニア、サイトメガロウイルス、エルジニア、およびビブリオが含まれる。粘膜には、口、鼻、咽喉、肺、膣、直腸、および結腸が含まれる。侵入に対する防御として、身体は、病原体に対して、上皮粘膜の表面に分泌性のＩｇＡを分泌する。さらに、１つの粘膜表面に提示された抗原は、これらの粘膜間の抗体分泌細胞のトラフィッキングにより、他の粘膜表面における応答の引き金を引き得る。分泌性ＩｇＡの構造は、持続性残存および粘膜の管腔の表面における効果的な機能に決定的であることが示唆されてきた。本明細書中で使用される場合、「分泌性ＩｇＡ」または「ｓＩｇＡ」は、Ｊ鎖により連結され、そしてさらに分泌性成分と結合している２つのＩｇＡ免疫グロブリンを含むポリマー性分子をいう。抗原の粘膜投与はＩｇＧ応答を生じ得るが、免疫原の非経口投与は強力なｓＩｇＡ応答をほとんど生じない。ＨＩＶに対する防御のための分泌性の免疫応答を生成することは、認識されている必要性である（Ｂｕｋａｗａ，Ｈ．ら、１９９５，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １，６８１−５；Ｍｅｓｔｅｃｋｙ，Ｊ．，ら，１９９４，Ａｉｄｓ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １０，Ｓ１１−２０）。
【０２０２】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素は、粘膜上のレセプターに結合する。それゆえ、ＰＥ様キメラ免疫原は、粘膜表面に非ネイティブエピトープを運ぶための魅力的なベクターである。そこでは、免疫原が、免疫原に対するＩｇＡ媒介性免疫応答を誘発する。従って、本発明は粘膜を介して侵入する病原体からの非ネイティブエピトープを含むＰＥ様キメラ免疫原を提供する。細胞認識ドメインは、任意の粘膜表面レセプターに標的化され得る。これらのＰＥ様キメラ免疫原は、粘膜表面を介して身体へ侵入する免疫原に対する、ＩｇＡ媒介性の分泌性免疫応答を誘発するために有用である。この目的のために使用されるＰＥ様キメラ免疫原は、それらの細胞認識ドメインとして、粘膜上のレセプターに結合するリガンドを有するべきである。例えば、上皮増殖因子は、粘膜表面上の上皮増殖因子レセプターに結合する。
【０２０３】
免疫原は、液体または固体の形態の薬学的組成物（例えば、スプレー、軟膏、坐剤または免疫原を含浸させた浸食性のポリマー）を含む任意の代表的な手段によって粘膜表面に適用され得る。投与は、免疫原を複数の異なる粘膜表面に一連の免疫、例えば追加抗原免疫として適用することを含み得る。追加抗原接種はまた、非経口的に（例えば、皮下に）投与され得る。免疫原は約１μｇ〜１０００μｇの用量で、例えば、約１０μｇ〜１００μｇで投与され得る。
【０２０４】
ＨＩＶのｇｐ１２０の主要な中和ドメインからのエピトープを含むワクチンを用いる皮下接種は、分泌性ＩｇＡを生成することが知られていない。従って、本発明のキメラ免疫原の粘膜提示は、これらの従来未知であった抗体を産生するために有用である。本発明はまた、粘膜を介して体に侵入する他の病原体のエピトープを特異的に認識する分泌性ＩｇＡを提供する。
【０２０５】
ＩｇＡ応答は，免疫原に暴露された粘膜表面において最も強力である。それゆえ、１つの実施態様において、免疫原は特定の病原体への暴露の部位であるらしい粘膜表面に適用される。従って、性感染病に対するキメラ免疫原は、膣、肛門、または口の粘膜表面に投与され得る。
【０２０６】
本発明のキメラ免疫原の粘膜投与は、ＩｇＡおよびＩｇＧの両方についての強力な記憶応答を生じる。それゆえ、それを用いるワクチン投与において、粘膜的または非経口的のいずれかでの追加抗原用量を提供することは有用である。記憶応答は、最初の用量後１年を越えて追加抗原用量を投与することによって誘発され得る。例えば、追加抗原用量は、最初の用量から約１２、約１６、約２０、または約２４か月後に投与され得る。
【０２０７】
（ＶＩ．遺伝子治療のポリヌクレオチドワクチンおよび方法）
タンパク質免疫原をコードするポリヌクレオチドを含有するワクチン（しばしば、「ＤＮＡワクチン」と呼ばれる）は、ポリペプチドワクチンに対して特定の利点を提供する。ＤＮＡワクチンは、所望されないタンパク質免疫原による汚染の危険を冒さない。被検体への投与の際、ポリヌクレオチドは、細胞によって取り込まれる。ＲＮＡは、ＤＮＡに逆転写される。ＤＮＡは、形質転換された細胞のゲノム内に特定のパーセントで組み込まれる。発現制御配列と作動可能に連結されるようにＤＮＡが組み込まれる場合、またはこのような配列が、組換えポリヌクレオチドと共に提供される場合、この細胞はコードされたポリペプチドを発現する。細胞からの分泌に際し、ポリペプチドは免疫原として作用する。裸のＤＮＡは、優先的に、肝臓および筋肉細胞によって取り込まれる。従って、ポリペプチドは、例えば、微粒子銃注入によって、筋肉組織内に注入され得るか、または提供される。一般に、裸のポリヌクレオチドの用量は、代表的な７０ｋｇの患者において、約１μｇ〜１００μｇである。
【０２０８】
本発明のポリヌクレオチドワクチンは、ポリペプチドワクチンにおいて使用されるＰＥ様キメラ免疫原をコードするポリヌクレオチドを含み得る。これは、エピトープの数個の改変体を含む多重免疫原を含む。
【０２０９】
以下の実施例は、例示によって提供されるが、これらに限定されない。
【０２１０】
（実施例）
（Ｉ．ＰＥ様キメラ免疫原の構築）
キメラタンパク質を生成するために、ｎｔＰＥのサブドメインＩｂを、ＨＩＶ−１のＭＮ（サブタイプＢ）またはＴｈａｉ−Ｅサブタイプ株のいずれかに由来するＶ３ループ配列と置き替えた。このＭＮ配列は、Ｔ細胞向性株由来である一方で、Ｔｈａｉ−Ｅ配列は、マクロファージ向性株由来である。
【０２１１】
野生型（ＷＴ）ＰＥは、６１３アミノ酸から構成され、そして６７，１２２  Ｄａの分子量を有する。グルタミン酸５５３（ΔＥ５５３）の欠損は、ＰＥの無毒性バージョンを生じ（Ｌｕｋａｃ，  Ｍ．，ら、１９８８、Ｉｎｆｅｃｔ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎ  ５６：３０９５−３０９８）、ｎｔＰＥと命名される。
【０２１２】
プラスミドを、Ｖ３ループ配列をコードするオリゴヌクレオチド二本鎖を、新規なＰｓｔＩ部位を用いて設計された新しいＰＥをベースとするベクターに挿入することによって構築した。ｇｐ１２０中に見出されるトポロジーと同様のトポロジーのＶ３ループを生成する試みにおいて、１４または２６アミノ酸の挿入物を、システイン残基によって隣接させた（図１Ｃ−太字）。新規なベクターの構築は、Ｖ３ループの挿入点付近のｎｔＰＥのアミノ酸配列内において、幾つかの変化を生じた（図１Ｃ−斜体）。無毒性キメラ、ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ１４、ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６およびｎｔＰＥ−Ｖ３Ｔｈ−Ｅ２６は、それぞれ、ＭＮ株由来の１４もしくは２６アミノ酸またはＴｈａｉ−Ｅ株由来の２６アミノ酸Ｖ３ループを含んでいた（ｎｔ  ＝  「無毒性」）。不適切な１６アミノ酸配列の挿入は、ｎｔＰＥ−ｆｐ１２６と命名されるコントロールキメラの構築を生じる。Ｉｂループ（６アミノ酸）の除去およびＶ３ループ挿入物に隣接する側方アミノ酸の修飾は、野生型ＰＥに比べて分子量のわずかな増加を生じた（図１Ｃ）。
【０２１３】
より詳細には、ＰＥをコードするプラスミドｐＭＯＡ１Ａ２ＶＫ３５２（Ｏｇａｔａ，  Ｍ．，  ら、１９９２、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２６７，  ２５３９６−４０１）を、Ｓｆｉ１およびＡｐａＩ（それぞれ残基１１４３および１２７５）を用いて消化し、次いで、新規なＰｓｔ１部位を含む二本鎖を用いて再結合させた。この二本鎖のコードストランドは、以下の配列を有した：５’−ｔｇｇｃｃｃｔｇａｃ  ｃｃｔｇｇｃｃｇｃｃ  ｇｃｃｇａｇａｇｃｇ  ａｇｃｇｃｔｔｃｇｔ  ｃｃｇｇｃａｇｇｇｃ  ａｃｃｇｇｃａａｃｇ  ａｃｇａｇｇｃｃｇｇ  ｃｇｃｇｇｃａａａｃ  ｃｔｇｃａｇｇｇｃｃ−３’（配列番号：５）。得られたプラスミドは、ＰＥのわずかにより小さいバージョンをコードし、そしてドメインＩｂのほとんどを欠いた。次いで、ＰｓｔＩ部位を、システイン残基によって隣接されるＶ３ループ配列をコードする二本鎖を導入するために使用した。無毒性タンパク質を生成するために、ベクターを、ｐＶＣ４５ΔＥ５５３由来の酵素学的に不活性なドメインＩＩＩ中に、サブクローン化することによって、修飾した。ｐＪＨ４（Ｈｗａｎｇ，  Ｊ．，ら、１９８７、Ｃｅｌｌ、４８、１２９−１３６）由来の追加のサブクローン化が、シグナル配列を欠いたベクターを生成するために必要とされた。二本鎖の挿入およびサブクローン化修飾は、初めに制限分析によって確証され、一方で、最終構築物が、ジデオキシ二本鎖配列決定によって確認された。
【０２１４】
（ＩＩ．キメラの特徴付け）
（Ａ．発現）
全てのｎｔＰＥ−Ｖ３ループキメラタンパク質を、Ｔ７プロモーター／Ｔ７ポリメラーゼシステム（Ｓｔｕｄｉｅｒ，  Ｆ．Ｗ．，ら、１９９０、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８５、６０−８９）を使用して、Ｅ  ｃｏｌｉ  ＳＡ２８２１／ＢＬ２１（λＤＥ３）において発現した。ＳＡ２８２１／ＢＬ２１（λＤＥ３）細胞を、適切なプラスミドを用いて形質転換し、アンピシリンを含む培地中で１．０（６００  ｎｍ）の吸光度にまで成長させた。高いレベルのタンパク質発現を誘導するために、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（１  ｍＭ）を培地に添加し、そして追加の９０分間インキュベートした。Ｅ．  ｃｏｌｉ  細胞ペレットを、５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ／２０  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ｐＨ  ８．０（ＴＥ緩衝液）中に再懸濁し、そしてＴｉｓｓｕｅ  Ｍｉｓｅｒ  を使用して分散した。細胞溶解を、リゾチーム（２００  μｇ／ｍｌ最終濃度；Ｓｉｇｍａ）を用いて達成し、そして膜結合タンパク質を、２．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．５  Ｍ  ＮａＣｌの添加によって溶解した。
【０２１５】
ＰＥ−Ｖ３ループキメラは封入体内に存在し、これは、遠心分離によって回収された。０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＴＥを用いて洗浄、次いでＴＥ単独で洗浄した後、封入体を、６Ｍグアニジンおよび６５  ｍＭ  ジチオエリスリトールの添加によって溶解した。０．５  Ｍ  Ｌ−アルギニン（Ｓｉｇｍａ）、２  ｍＭ  ＥＤＴＡ  および０．９  ｍＭ  グルタチオンを含む０．１  Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ８．０）において、８℃で、最小２４時間の間、１００μｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度にて、再折りたたみを進めた。プロテアーゼインヒビターＡＥＢＳＦ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を、０．５  ｍＭ  の最終濃度まで添加した。タンパク質を、２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２  ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１００  ｍＭ  尿素、ｐＨ  ７．４に対して透析した。透析後、タンパク質を、Ｑセファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）に付与した。０．１  Ｍ  ＮａＣｌを含む２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ８．０）を用いて洗浄した後、キメラタンパク質を、同じ緩衝液中の０．３  Ｍ  ＮａＣｌを用いて溶出し、そして、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３０限外濾過装置（Ａｍｉｃｏｎ，  Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）を使用して濃縮した。最終生成物を単離するために、ＨＰＬＣゲル濾過カラム（Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ  からのＧ３０００ＳＷ；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，  ＰＡ）を、使用した。４Ｌバクテリア培養あたりの適切に折りたたまれたタンパク質の代表的な収率は、５０−１００  ｍｇ  であり、純度は、９５％より高かった。
【０２１６】
（Ｂ．生化学的特徴付け）
キメラタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、８−１６％勾配ポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ；  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を使用して分離し、そしてＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅを用いた染色によって視覚化した。ウェスタンブロット分析において、タンパク質は、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ  メンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）上に移し、そして抗ＰＥマウスモノクローナル抗体（Ｍ４０−１（Ｏｇａｔａ，  Ｍ．，ら、１９９１、Ｉｎｆｅｃｔ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎ  ５９、４０７−４１４））または抗−ｇｐ１２０マウスモノクローナル抗体（ＭＮ配列の場合１Ｆ１２、もしくはＴｈａｉ−Ｅ配列の場合１Ｂ２；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．；Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ）のいずれかに曝露した。一次抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した二次抗マウス抗体によって検出した。反応生成物を、ジアミノベンザジンおよび過酸化水素の添加によって視覚化した。免疫捕捉実験を、１Ｆ１２抗−ｇｐ１２０モノクローナル抗体を使用して、２３℃で、３０分間行った。抗体−キメラタンパク質複合体を、タンパク質Ｇセファロースビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）を用いて回収し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して（上記のように）、分離した。ＨＩＶ−１−ＭＮ（１２０／ＭＮ；  Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．）およびＴｈａｉ  サブタイプＥ単離体（ｇｐ１２０／Ｔｈ−Ｅ−Ｃｈｉａｎｇ  Ｍａｉ；  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃｏｌｕｍｂｉａ  ＭＤ）  由来のｇｐ１２０の組換え形態を、標準として使用した。
【０２１７】
精製されたｎｔＰＥ−Ｖ３ループキメラのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図２Ａ）は、計算された分子量と一致した（図１Ｃ）。ｇｐ１２０／ＭＮ（１Ｆ１２）またはｇｐ１２０／Ｔｈ−Ｅ（１Ｂ２）に対して惹起したモノクローナル抗体を使用するウエスタンブロットは、ＭＮおよびＴｈａｉ−Ｅ  Ｖ３ループキメラとの株特異的反応性を示した（図２Ｂ）。
【０２１８】
精製されたｎｔＰＥ−Ｖ３ループの遊離スルフヒドリル分析は、任意の不対システインを実証するのに失敗し、このことは、精製されたｎｔＰＥ−Ｖ３ループキメラが再度折りたたまれ、そして酸化されて、Ｖ３ループのベースにてジスルフィド結合を形成したことを示唆する（図１Ａ）。このジスルフィド結合の形成は、キメラの表面にて、Ｖ３ループの曝露を生じることが期待された。
【０２１９】
スルフヒドリル含有量を決定するために、１  ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）中のキメラタンパク質（１５  ｎｍｏｌｓ）を、１５分間、２３℃にて、１  ｍＭチオニトロベンゾエート（ＤＴＮＢ）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ  Ｃｏ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）と反応させた。チオニトロベンゾエートの放出を、４１２  ｎｍ  にてモニターした。ＤＴＮＢ反応性を、システインの使用によって確証した。
【０２２０】
これを、直接に、免疫捕捉研究によって試験した（図２Ｃ）。１Ｆ１２および１Ｂ２モノクローナル抗体は、可溶性ＭＮおよびＴｈ−Ｅキメラタンパク質を選択的に捕捉し、このことは、Ｖ３ループが曝露され、そして抗体プローブに接近可能であったことを確証する。ウェスタンブロットにて、１Ｆ１２抗体がｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ１４と強く反応したという事実にもかかわらず（図２Ｂ）、それは、ほんの少量の可溶性タンパク質のみ（図２Ｃ、レーン３）を捕捉し、このことは、たった１４個のアミノ酸が挿入された場合、反応性エピトープが、完全に曝露されなかったことを示す。
【０２２１】
（Ｃ．円二色性）
アミノ酸の挿入物がキメラの二次構造に及ぼす影響について評価するため、精製したｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ１４およびｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６タンパク質について、近および遠ＵＶ  ＣＤ  スペクトル分析を行い、これらを野生型ＰＥ（ｗｔＰＥ）スペクトルに対して比較した（図３Ａおよび３Ｂ）。円二色性（ＣＤ）スペクトルを、Ａｖｉｖ  ６０ＤＳ  分光偏光計上で回収した。１  ｃｍ  光路長セル内のサンプルについて、近ＵＶ  ＣＤ  スペクトル（４００  ｎｍ〜２５０  ｎｍ）を、０．５  ｎｍ  バンド幅および５秒間一定（１５０  読み込み／秒平均）で、０．２  ｎｍ  おきに得た。遠ＵＶ  スペクトル（２５０  ｎｍ〜１９０  ｎｍ）を、０．０５  ｃｍ  光路長セル内で、０．５  ｎｍ  バンド幅および３秒間一定で、０．２  ｎｍ  おきに回収した。各スペクトルを、デジタル形式で、Ｓａｖｉｔｓｋｙ−Ｇｏｌａｙ  アルゴリズム（Ｇｏｒｒｙ，  Ｐ．Ａ．１９９０，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ  ６２，  ５７０−５７３）を使用して平滑化し、濃度について補正し、そして、以下の関係式を使用して、平均残基質量楕円率（θＭＲＷ）の単位で規格化した：
【０２２２】
【数１】
2009079068.tif 000002
【０２２３】
ここで、θｏｂｓ  は、観測された楕円率であり、ＭＷｍｏｎｏｍｅｒは、モノマーの分子量であり、ｎｍｏｎｏｍｅｒは、モノマー中のアミノ酸の数であり、ｄは、セルの光路長（ｃｍ）であり、そして、ｃは、セル内のサンプルの濃度（ｍｇ／ｍｌ）である。
【０２２４】
二次構造計算（図３Ｃ）は、これらのタンパク質とｗｔＰＥとの間に有意な差がなかったことを示した。ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ１４は、ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６およびｗｔＰＥに比べ、より負の楕円率を示し、このことは、このキメラのループ挿入物のベースにおけるジスルフィド結合においてより多くの歪みが生じ得ることを示す。ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ１４およびｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６の両方は、２９０  ｎｍ  にて明確なレッドシフトを示し、恐らく、キメラ内の追加のチロシン残基に起因する。あるいは、このレッドシフトは、トリプトファン残基の環境のわずかな乱れから生じ得る。結局、これらの結果は、Ｖ３ループ挿入物が、野生型毒素に対して二次構造の大きな変化を生じず、そして、三次構造内の変化が１４および２６アミノ酸挿入物の存在と一致したことを示す。
【０２２５】
（ＩＩＩ．サイトゾルへのトランスロケーション）
ＬＲＰレセプターに結合した後、ｎｔＰＥ−Ｖ３ループキメラは、エンドサイトーシスによりインターナリゼーションし、フューリンによって切断され、そしてドメインＩＩを含むＣ末端部位、Ｖ３ループおよびＩＩＩは、ｗｔＰＥと同様の様式でサイトゾルにトランスロケーションされる（Ｏｇａｔａ，  Ｍ．，ら、１９９０、Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６５、２０６７８−８５）。これは、ＰＥ−Ｖ３ＭＮ１４および２６の酵素学的に活性なバージョン（グルタミン酸５５３を含み、そして延長因子２をＡＤＰリボシル化する能力を有する）を生成することによって、直接に試験され、そして、細胞毒性アッセイにて、それらの活性をｗｔＰＥと比較した。
【０２２６】
ヒトＡ４３１（類表皮癌腫）細胞を、２４−ウェル組織培地プレート内に、５％ウシ胎児血清で補充されたＲＰＭＩ  １６４０  培地中の１×１０５細胞／ウェルで播種した。２４時間後、細胞を、１８時間、３７℃にて、キメラタンパク質のｗｔＰＥまたは毒性形態（５５３位にグルタミン酸残基を有し、そして延長因子２をＡＤＰリボシル化し得る）のいずれかの４倍希釈物を用いて処理した。タンパク質合成の阻害を、３Ｈ−ロイシンの取り込みをモニターすることによって評価した。
【０２２７】
タンパク質合成を阻害するその能力についてアッセイする場合、ＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６は、ヒトＡ４３１細胞内のｗｔＰＥと同様の毒性を示した（図４）。ＰＥ−Ｖ３ＭＮ１４はまた、完全に毒性であった。これらの結果は、Ｖ３ループ挿入物のサイズと位置がサイトゾルへの毒素送達を妨害しないことを確証した。さらに、これらのデータは、単離、再折りたたみおよびこれらのキメラを調製するために使用された精製プロトコールが、正確に折りたたまれ、かつ機能的なタンパク質の産生をもたらしたことを示す。
【０２２８】
（ＩＶ．免疫原性）
免疫原としてのそれらの有用性を調べるために、ウサギに２００μｇのＭＮまたはＴｈａｉ−Ｅキメラのいずれかを皮下に注入した。ウサギは、２００μｇ（合計）のｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６を用いて皮下に４ヶ所にて免疫化した。最初の注入は、完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバントを用いて投与した。全ての後の注入（２、４、および１２週間にて）を、不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバントを用いて与えた。第三の注入後に毎週、静脈の放血を得て、そしてｇｐ１２０に対して免疫ブロットすることによってスクリーニングした。
【０２２９】
ウェスタンブロットにて、ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮタンパク質を用いて免疫化したウサギ由来の血清サンプルは、免疫化された組換えｇｐ１２０／ＭＮについて強い反応性を示した（図５Ａ）。反応力価は時間と共に増加した：６週間目には１：２００の希釈で反応性が注目され、１２週間目には１：５，０００の希釈で注目され、そしてそれより遅い時間では、１：２５，０００で反応性が検出された。これらの抗Ｖ３ループ／ＭＮ血清はｇｐ１２０／Ｔｈａｉ−Ｅとは反応性ではなかった（図５Ａ）。無毒性ＰＥ（例えば、挿入物を有しないｎｔＰＥ）と共に注入されたウサギ由来血清は、ｇｐ１２０に対し反応性を示さなかった。ｎｔＰＥ−Ｖ３Ｔｈ−Ｅと共に注入されたウサギは、ｇｐ１２０／Ｔｈａｉ−Ｅに対し反応性血清を生成したが、ｇｐ１２０／ＭＮに対しては生成しなかった（図５Ａ）。
【０２３０】
ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６を用いて免疫化したウサギ由来の血清を、さらに特徴づけた。これらの血清が可溶性の組換えｇｐ１２０／ＭＮと予備混合された場合、固定化ｇｐ１２０／ＭＮに対する反応性が吸収された（図５Ｂ）。このブロッキング活性（用量に依存し、そして５０μｇ／ｍｌにおいて最大であった）は、ウサギが、ｇｐ１２０の表面上に曝露されるＶ３ループ配列に主に応答したことを示した。
【０２３１】
免疫化されたウサギ由来の血清はまた、インビトロアッセイにおけるＨＩＶ−１感染性を中和することが見出された（図６）。このアッセイは、ＨＩＶ−１−媒介細胞死の指標としてＭＴ４細胞を利用した（Ｍｉｙｏｓｈｉ，  Ｉ．，ら、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ  ２９４、７７０−１）。抗血清の二重の連続希釈物を、ＦＤＡ／Ｈ９細胞内で増殖させたＨＩＶ−１／ＭＮとともにインキュベートし（Ｐｏｐｏｖｉｃ，  Ｍ．，ら、１９８４、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４，４９７−５００）、そしてこの混合物を細胞に７日間添加した。ウィルス媒介細胞死を、ＭＴＴ色素アッセイ（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，  Ｇ．  Ａ．，  ら、１９８８、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０、１９５−２０２）および５７０  ｎｍ  における分光光度法分析を使用して、評価した。血清の５０％阻害濃度を計算し、そして中和力価として報告した。
【０２３２】
予備免疫血清は、ＨＩＶ−１  ＭＮによる殺傷からのヒトＴ細胞株、ＭＴ４の保護を全く示さなかった。免疫化後５週間目における血清はまた全く保護を示さなかったが、８週間目および２７週間目の血清は、約１：４００の希釈において生じる５０％中和をともなってウィルス抗原投与に対して保護的であった。使用された免疫スケジュールに基づき、５週間目の血清は、免疫化され、そして一度追加免疫された動物内の応答を反映したが、一方で、８週間目の血清は２回追加免疫された動物由来であり、そして２７週間目の血清は、３回追加免疫された動物由来であった。８週目および２７週目の出血において、１：１００未満の血清の希釈において得られたＭＴ４細胞生存値は、規格化のために使用された抗原投与されていない細胞コントロールより大きかった。これは、ウサギ血清内に存在する成長因子による刺激に起因するものらしかった。このデータは、ｎｔＰＥ−Ｖ３ループキメラの皮下注入後の免疫応答が、中和抗体の生成を生じ得ることを示唆する。
【０２３３】
（Ｖ．感染力の中和）
キメラ免疫原によって誘発された抗体は、ｐ２４産生の抑制がＨＩＶ中和の指標として使用されたウィルス増殖アッセイにおいて、ＨＩＶ−１の感染力を中和する能力を有することが示された。サブタイプＢ、ＲＶＬ０５およびサブタイプＥ、Ｔｈ９２００９に対応する臨床分離株を、ウサギ血清の希釈物とともにインキュベートし、そして合計で５日間ＰＢＭＣ内で培養した。
【０２３４】
１つのアッセイは、ＨＩＶ−１−媒介細胞死の指標としてＭＴ４細胞を利用した。Ｉ．Ｍｉｙｏｓｈｉら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９４：７７０−７７１。抗血清の二重の連続希釈物をＨＩＶ−１／ＭＮを用いてインキュベートし、ＦＤＡ／Ｈ９細胞内で増殖させ、そしてこの混合物をＭＴ４細胞に７日間添加した。Ｍ．Ｐｏｐｏｖｉｃら（１９８４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４  ：  ４９７−５００。ウィルス媒介細胞死を、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド色素アッセイおよび５７０  ｎｍ  における分光学法分析を使用して評価した。Ｇ．Ａ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら（１９８８）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０  ：  １９５−２０２。血清５０％阻害濃度を計算し、中和力価として報告した。
【０２３５】
第二のアッセイは、ウィルス増殖の指標としてｐ２４産生を使用した。Ｔ．Ｗｒｉｎら（１９９５）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６９  ：  ３９−４８。初期ウィルスを最初に滴定し、顕著ではあるが準最大量のｐ２４を再現可能に得られた量を決定した。ウィルス調製物を、免疫または予備放血のいずれかのウサギ血清の種々の希釈物と、３７℃で１時間インキュベートし、次いで、この混合物を４通りで２．５×１０５ＰＢＭＣに添加した。培養を３日間継続し、この時間に細胞を洗浄し、そしてＶ３  Ｌｏｏｐ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｈｉｍｅｒａｓ  ９９５２をインターロイキン２を含む培地中に再懸濁した。ｐ２４の蓄積を、ＥＬＩＳＡによって検出した。
【０２３６】
ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６を用いて免疫化したウサギの１つから採取した血清は、ＭＴ４アッセイで１：４００の希釈にてウィルスを中和したため、この血清を、臨床単離体に対する活性を評価するために使用した。２４週間目にて採取した血清サンプルは、ＢおよびＥサブタイプ単離体の両方に対する中和活性を示した（図１４を参照）。同じウサギ由来の予備放血の血清を用いた場合、中和活性は観察されなかった。
【０２３７】
（ＶＩ．ＩｇＡ−媒介免疫応答の誘発）
ＨＩＶ−１のｇｐ１２０のＶ３ループの２６個のアミノ酸を含むＰＥ様キメラ免疫原による粘膜播種は、ＨＩＶ−１に対する体液性および細胞媒介免疫応答の両方を誘発した。このキメラの毒性バージョンは、集密の単層として増殖したヒト腸細胞株、Ｃａｃｏ−２を殺傷し得た。非致死的形態のキメラを、皮下、または膣、直腸、胃もしくは鼻の粘膜表面のいずれかにて、マウスに投与した。皮下投与により、これらの種々の粘膜表面において、次の追加免疫を行った。血清および唾液サンプル内のＭＮｇｐ１２０−特異的抗体の測定は、全ての群の粘膜および皮下投与において、ＩｇＡおよびＩｇＧ応答の両方を証明した。これらの結果は、本発明のＰＥ様キメラ免疫原が上皮細胞に浸入し得、天然毒素と同様に輸送され得、インタクトな上皮障壁を横切って輸送し得、そしてＩｇＡおよびＩｇＧ抗体の両方の生成を誘導することを示す。
【０２３８】
（Ａ．ＰＥ様キメラ免疫原）
これらの実験において使用されたＰＥ様キメラは、実施例Ｉに記載される。ネイティブ（毒性）ＰＥをコードする構造遺伝子を改変してＩｂ領域を欠失し、そして２６アミノ酸のＶ３ループ配列の挿入のための唯一のＰｓｔＩ部位を提供した。無毒性バージョンのＰＥ−Ｖ３ループキメラが調製され、これは、５５３位におけるグルタミン酸残基を欠き（ΔＥ５５３）、従ってＡＤＰリボシル化活性は有していない。全てのＰＥ−Ｖ３ループキメラタンパク質を、Ｅ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（λＤＥ３）中で、Ｔ７プロモーター／Ｔ７ポリメラーゼシステムを使用して発現した。ＩＰＴＧ（１．０  ｍＭ、９０分間）を添加し、タンパク質発現を向上させた。ＰＥ−Ｖ３ループタンパク質を封入体から単離し、そしてアニオン交換クロマトグラフィーの連続的なラウンドおよび最後のゲル濾過によって精製した。
【０２３９】
（Ｂ．細胞ベースの研究）
ＭＮ  ｇｐ１２０（ｔＰＥ−ＭＮ２６）のＶ３ループの２６アミノ酸を含む毒性バージョンのＰｓｕｄｏｍｏｎａｓ  体外毒素（ＰＥ）キメラを、分極したＣａｃｏ−２細胞の集密の単層の尖端表面に付与した。Ｃａｃｏ−２細胞を培養し、そして以前に記載されたように（Ｗ．  Ｒｕｂａｓ  ら（１９９６）「Ｃａｃｏ−２  単層を横切るフラックス測定はヒト大腸組織における輸送を予見し得る」Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８５：１６５−１６９）、予め湿らせた（ＰＢＳ、１５分、外側次いで内側）コラーゲン被覆ポリカーボネートフィルター支持体（ＳｎａｐｗｅｌｌｓＴＭ）上に維持した。培養培地を１日おきに変え、そして集密の単層を、播種の２５日後および３０−３５の継代で使用した。毒性バージョンのＰＥおよびＰＥ−Ｖ３ループキメラを培養培地内の尖端表面に添加した。３７℃で２４時間の連続的なインキュベーション後、Ｃａｃｏ−２単層をＰＢＳで３回洗浄し、血清エステラーゼ活性を除去し、そしてカルセインＡＭおよびエチジウムホモダイマーとともにインキュベートし、生／死細胞比（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｅｕｋｏｌｉｇｈｔ  ｋｉｔ  ；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｅｕｇｅｎｅ，  ＯＲ）を決定した。
【０２４０】
キメラは、これらの腸上皮細胞を、標準ＰＥのそれと同様な効力で殺傷した（図８）。細胞の生存率を、生細胞と死細胞の比として測定した。
【０２４１】
無毒性（Δ５５３）キメラ（ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６）を、全ての後の免疫化研究に使用し、ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６のＣａｃｏ−２単層上においてＰＥの毒性作用をブロックする能力について検討した（図８）。従って、図８の結果は、ＰＥの内因性Ｉｂループの代わりにＭＮｇｐ１２０（ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６）のＶ３ループの２６個のアミノ酸の取り込みが、ＰＥキメラの分極した、集密上皮細胞によって取り込まれ、かつプロセッシングされる能力を変化させないことを示す。上皮細胞によって取り込まれ、かつプロセッシングされるＰＥ−Ｖ３ループキメラのこの能力は、ＨＩＶ−１のような病原体（ヒト腸上皮細胞の機能に影響を及ぼし、かつ改変し得る）に対して、重要である。Ｄ．Ｍ．Ａｓｍｕｔｈ  ら（１９９４）「ヒト腸上皮細胞に対するＨＩＶ感染の生理学的影響：ＨＩＶ腸症に対するインビトロモデル」ＡＩＤＳ  ８  ：  ２０５−２１１。
【０２４２】
（Ｃ．免疫化プロトコール）
雌ｂａｌｂ−ｃマウスは、Ｓｉｍｏｎｓｅｎ  から６−８週令の年令で得、そして研究前２週間の間検疫した。動物を２週間のインターバルで三回播種した６グループの一つに配置した。この動物を適宜に食物および水で維持した。動物グループは、以下のように免疫化された：（１）経口、経口、経口；（２）膣、膣、膣；（３）直腸、直腸、直腸；（４）膣、経口、経口；（５）直腸、経口、経口；および（５）皮下、皮下、皮下。各々の経口播種は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、１  ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ  および０．２  Ｍ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ  ＝  ８．１）を含む２００μｌのＰＢＳ中の４０μｇのＰＥ−Ｖ３ループキメラを使用した。全ての膣、直腸および皮下播種は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む２０μｌのＰＢＳ中の２０μｇ  ＰＥ−Ｖ３ループキメラを含んだ。
【０２４３】
（Ｄ．抗体力価）
０．１  ｍｇ  のピロカルピンの腹腔内注入の後、マウス唾液（代表的には５０μｌ）を、ポリプロピレンＰａｓｔｅｕｒ  ピペットを用いて回収し、そしてポリプロピレンチューブに配置した。血清サンプル（１００μｌ）を、血清分離チューブを使用して、眼窩周囲放血から得た。回収された血清および唾液サンプルを、分析するまで−７０℃で貯蔵した。ｇｐ１２０−特異的ＥＬＩＳＡを、ｇｐ１２０でコートしたＣｏｓｔａｒ  ９０１８  Ｅ．Ｉ．Ａ．／Ｒ．Ｉ．Ａ．プレートを使用して行った。ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０  および０．０１％チメロゾールを含むＰＢＳ）で洗浄した後、プレートをアッセイ緩衝液（０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳＴ）でブロックした。次の洗浄は、血清または唾液サンプルの導入（１００μｌ／ウェル）前に行った。結合した免疫グロブリンを、ビオチン化した全ヤギ抗体（これはマウスＩｇＡまたはマウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）のいずれかを選択的に認識する）を使用してタグ化した。１Ｆ１２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．）で表示されたマウスモノクローナル抗体を、ＩｇＧアッセイにおける陽性コントロールとして使用した。ｇｐ１２０−特異的マウスＩｇＡは、陽性標準として利用可能でなかった。ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標）ペルオキシダーゼ複合体（Ｓｉｇｍａ）、２，２’−アジノ−ビス（２エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸（Ｓｉｇｍａ）ならびに尿素および過酸化水素を含むリン酸−クエン酸緩衝液を、４０５  ｎｍ  にて結合した抗体を定量化するために使用した。
【０２４４】
無毒性ＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６を、経口栄養、膣粘膜への適用、直腸粘膜への適用との組み合わせで、あるいは皮下注射により、ｂａｌｂ−ｃマウスに送達した。血清および唾液サンプルを、各投与群からの最初の接種の１ヶ月、２ヶ月、および３ヶ月後に回収し、そしてＥＬＩＳＡにより分析して、ＭＮ  ｇｐ１２０に特異的なＩｇＧおよびＩｇＡ抗体力価を決定した。免疫前の唾液および血清サンプルは、これらのｇｐ１２０特異的ＥＬＩＳＡにおいて有意なバックグラウンド反応を示さなかった。ｇｐ１２０特異的ＩｇＧの測定可能な量が、全ての投与群の血清において観察された（図９）。観察されたＩｇＧ応答は、皮下群（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｇｒｏｕｐ）において最初は最も大きかったが、全ての群は最終的に強い血清ＩｇＧ応答を示した。ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６に経口的に曝露された群はまた、膣粘膜または直腸粘膜においてのみ曝露された群よりも速いＩｇＧ応答を得るようであった。マウスモノクローナルＩｇＧ１（これは、ＭＮ  ｇｐ１２０のＶ３ループを選択的に認識する）と比較すると、ｇｐ１２０特異的ＩｇＧの各群における最も高い測定レベルは、５〜２５μｇ／ｍｌ血清であった。
【０２４５】
ＩｇＡ抗体は、粘膜性転移増殖の後に進行して全身性疾患を引き起こす、厳格な（ｓｔｒｉｃｔ）粘膜性病原体および侵襲性因子の両方に対する耐性に寄与するようである。Ｒ．Ｉ．Ｗａｌｋｅｒら（１９９４）「より効果的な免疫を達成するために粘膜ワクチン接種を使用するための新規ストラテジー」Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：３８７−４００。ＥＬＩＳＡを使用して、回収された唾液サンプル中のｇｐ１２０特異的ＩｇＡレベルを、粘膜抗体応答の指標として決定した。入手可能なＭＮ  ｇｐ１２０特異的モノクローナルＩｇＡは存在しないので、ＥＬＩＳＡにより得られた値は、群の間でのみ比較され、絶対的レベルとしては特徴付けられなかった。全ての６つの投与群由来の唾液サンプルは、ｇｐ１２０特異的ＩｇＡを含有した（図１０）。最も強いＩｇＡ応答は、最初にＰＥ−Ｖ３ループキメラの経膣投与を受容し、そして引き続いて経口投与を受容した動物において観察された。皮下注射のみを受容した動物が、キメラの粘膜曝露のみを受容した群において観察されるＩｇＡレベルのいくつかに相当するＩｇＡレベルを示したことは、興味深いことであった。このことは、ＩｇＡ  ＥＬＩＳＡにおいて用いられた抗体の問題に関し得る。それにも関わらず、これらの結果は、粘膜的および全身的の免疫性の両方が、百日咳毒素を用いる経口的免疫で以前に観察されたことと同様に、粘膜免疫によって誘発され得ることを示している。Ｍ．Ｊ．Ｗａｌｋｅｒら（１９９２）「Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ａｒｏ  Ａ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ，および侵襲性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ発現組換え百日咳毒素Ｓ１サブユニットを用いたマウスの経口免疫後の特異的な肺粘膜および全身性の免疫応答」Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：４２６０。
【０２４６】
ＨＩＶ−１サブユニットワクチンは、皮下投与の後にのみＩｇＧ応答を生じる（Ｍ．Ｂ．Ｖａｓｕｄｅｖａｃｈａｒｉら（１９９２）「組換えＨＩＶ−１  ｇｐ１６０をワクチン接種された個体の唾液中におけるエンベロープ特異的抗体」Ｊ．Ａｃｑｕｉｒ．Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃ．Ｓｙｎｄｒ．５：８１７−８２１）、あるいは筋肉内注射の後にＩｇＧおよびＩｇＡの両方を生じる（Ｇ．Ｊ．Ｇｏｒｓｅら（１９９６）「ヒト免疫欠損ウイルスタイプ１組換えｇｐ１２０ワクチンにより誘発された、唾液結合抗体」Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：７６９−７７３）ことが報告されてきた。これらの著者は、粘膜抗体の産生を最大化することはＨＩＶ−１ワクチンのために重要であると示唆しているが、しかし、検出されたＩｇＡ抗体が分泌物であったかどうかは不明である。おそらく、ｓＩｇＡは、唾液サンプル中のＩｇＡの最初の形態であり、そしてダイマーＩｇＡは、本研究と同様の血清サンプル中のＩｇＡの最初の形態である。ここで使用されたＩｇＡ結合試薬は、血清ＩｇＡに対して産生され、従ってＩｇＡ測定において偏りを提供し得る。従って、血清中で測定されたＩｇＡレベルは、ダイマーＩｇＡに対する親和性よりも低いｓＩｇＡに対する親和性に起因する唾液レベルよりも大きく見えるにすぎない。従って、本研究で得られるＩｇＡ値は、相対的スケールでのみ示される。
【０２４７】
Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞により放出される多くの因子が、ＩｇＡ応答を調節することが示されている（Ｊ．Ｒ．ＭｃＧｈｅｅら（１９９３）「ワクチン開発に重点を置いた、粘膜免疫における新規展望」Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ．３０：３−１５）。例えば、ＩＬ−５の存在下で、ＩＬ−２はＴＧＦ−βと相乗してＩｇＡ合成を増強し、免疫応答の薬理学的操作の展望がもたらされる。しかしながら、抗原提示の形態は、免疫原の運命（ｆａｔｅ）により顕著に指示される。粘膜表面における上皮細胞（これは、ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６に結合しそしてｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６を内在化させるためのＬＲＰレセプターを有する）は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質を発現することが示されており、そしてクラスＩＩは、リソソーム性起源からの抗原提示のために細胞の表面に効果的に到達し得る（Ｖ．Ｇ．  Ｂｒａｃｈｅｔら（１９９７）「Ｉｉ鎖は、リソソームへおよびリソソームからの主要組織適合性遺伝子複合体クラスＩＩ分子の輸送を制御する」Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３７：５１−６５）。従って、ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６は、  ＭＨＣクラスＩＩ構造によって、上皮細胞の細胞表面に送達され得る。あるいは、免疫原が粘膜バリアを横断し、そして内在する（ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ）固有層中のプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｃｅｌｌ）にインタクトな形態で到達する場合、これはＴｈ２応答を誘発し、そしてＭＨＣクラスＩの制限された抗原提示を生じるはずである。
【０２４８】
（ＶＩＩ．キメラ免疫原の粘膜投与により誘発される記憶応答）
ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６の粘膜投与は、Ｔｈ１およびＴｈ２経路の両方の血清ＩｇＧアイソタイプの組み合わせにより特徴付けられる、有意な記憶応答を生じた。Ｔｈ２応答は、ウイルスの中和化に有利であることが提唱されており、そしてＴｈ１事象に関連する細胞傷害性免疫応答は、細胞内ウイルスに対する効果的な免疫応答に必要とされ得るので（Ｊ．Ｒ．ＭｃＧｈｅｅら（１９９４）Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．６：３６９−３７９）、これらの結果は、ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６を用いる粘膜免疫化が、ＨＩＶ−１感染に対する保護のために必要とされるタイプの応答を提供することを示唆した（Ｇ．Ｌ．Ａｄａら（１９９７）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １３：２０５−２１０。
【０２４９】
（Ａ．材料および方法）
（１．試薬）
これらの研究に用いられたｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６の構造および調製は、本明細書中に記載される。ＭＮ  ｇｐ１２０、およびＭＮ  ｇｐ１２０のＶ３ループを認識する１Ｆ１２モノクローナル抗体を、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ）にて調製した。マウスＩｇＧまたはマウスＩｇＡのいずれかに対して惹起されたビオチン標識化ヤギ抗体を、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）から購入した。マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、およびＩｇＥを認識するビオチン化ラット抗体を、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から得た。
【０２５０】
（２．免疫プロトコルおよびサンプル回収）
雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを６〜８週齢で得、そして研究の前の２週間にわたって隔離し、そして研究の間、適宜に食料および水を維持した。動物を、群（ｎ＝６）にランダムに割り当て、これらは、経口、経膣、経直腸、または皮下投与の組み合わせを受容した。経口接種を、２００μｌのＰＢＳ（０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３（最終ｐＨ＝８．１）、および４０μｇのｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６を含有する）の経口栄養により実施した。経膣、経直腸、および皮下接種物は、２０μｌのＰＢＳ（０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含有する）中に、２０μｇのｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６を含有した。マウス唾液（代表的には、５０〜１００μｌ）を、動物１匹当たり０．１ｍｇのピロカルピンの腹腔内注射により誘発された過流涎の後、約１０分にわたって、ポリプロピレンパスツールピペットを用いて回収した。血清サンプル（１００μｌ）を、血清分離管を用いて、眼窩骨膜血から得た。回収した血清および唾液サンプルを、分析まで−７０℃で保存した。
【０２５１】
別の研究において、マウスに２０μｇのｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６または２０μｇのｎｔＰＥを皮下注射し、そして２週間および７週間追加免疫した。ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６を受容した動物（ｎ＝３）とｎｔＰＥを受容した動物（ｎ＝２）の１組に、４０μｌのフロイント完全アジュバントを最初に、そして４０μｌのフロイント不完全アジュバントを、２週間および７週間で同時に投与した。４０μｌの通常の生理食塩水中で処方した２０μｇのｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６を投与した動物（ｎ＝３）の１組を、コントロールとして供した。血清サンプル（１００μｌ）を、毎週ベースで得、そして上記のように保存した。
【０２５２】
（３．抗体応答の測定）
抗ｇｐ１２０特異的抗体を、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。簡潔には、Ｃｏｓｔａｒ９０１８Ｅ．Ｉ．Ａ．／Ｒ．Ｉ．Ａ．９６ウェルプレートを、１μｇ／ウェルのＭＮ  ｇｐ１２０でコーティングし、ＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）を含有する）で３回洗浄し、次いでＰＢＳ（１％ＢＳＡを含有する）で、一晩４℃にてブロックした。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、プレートを血清または唾液サンプルの希釈物（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％ＢＳＡを含有する）で希釈した）でインキュベートした。プレートを、穏やかに撹拌しながら室温で２時間インキュベートし、次いで、  ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、そしてビオチン複合体化ヤギ抗マウスＩｇＡまたはＩｇＧとともにインキュベートするか、あるいはＩｇＧサブクラスまたはＩｇＥ応答を決定するために、ビオチン複合体化ラット抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、またはＩｇＥで、１時間、同様のインキュベーション条件を用いてインキュベートした。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体化ストレプトアビジンを添加した。結合抗体を、ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標）ペルオキシダーゼ複合体（Ｓｉｇｍａ）、２，２’−アジノ−ビス（２エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸（Ｓｉｇｍａ）により視覚化し、そしてリン酸−クエン酸緩衝液（尿素および過酸化水素を含有する）を用いて、４０５ｎｍにて結合抗体を定量した。
【０２５３】
（Ｂ．結果）
（１．ＩｇＡ抗体はｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６に対して応答する）
動物に、種々の経路にて、ｎｔ−Ｖ３ＭＮ２６を接種し（ｎ＝６／群）、次いで第１４日目および第２１日目に、次いで第１６ヶ月目に、２回追加免疫した。  動物は、経口的に（ＰＯ）、経膣的に（Ｖ）、経直腸的に（Ｒ）、経膣的および経口的に（Ｖ／ＰＯ）、経直腸的および経口的に（Ｒ／ＰＯ）、または皮下的に（ＳＣ）のいずれかで、ｎｔ−Ｖ３ＭＮ２６を受容した。唾液サンプルを、第３０日目、第６０日目、および第９０日目に回収し、次いで第１６．５ヶ月目に再び、抗原特異的ＩｇＡについて分析した（図１１）。アッセイを標準化するための抗Ｖ３ループＩｇＡ抗体なしで、１つの強くポジティブなサンプルに対して応答を正規化した。抗原特異的ＩｇＡユニットの任意のスケールについて値を報告した。全ての投与群は、第３０日目および第６０日目にて、同等の唾液ＩｇＡ応答を示した。第９０日目までに、最初に経膣投与を受容し続いて経口追加免疫を受容した群において、最も強い唾液ＩｇＡ応答が観察された。第１６．５ヶ月目にて、全ての経口群、全ての経膣群、および全ての経直腸群は、最も高いレベルの抗原特異的唾液ＩｇＡを示した。組み合わせの粘膜接種群（経膣／経口および経直腸／経口）の応答は、皮下的に投与された群において観察された応答と同等であった。
【０２５４】
これらの唾液ＩｇＡ応答が、唾液成分に対する抗原特異的結合を反映し、かつ非特異的結合は反映しないということを確認するために、免疫前唾液サンプルを評価し、そしてＶ３ループペプチドとｎｔＰＥとの混合物をマウスに投与する研究を実行した。この研究は、未希釈の免疫前唾液サンプルが、ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて測定可能なバックグラウンドを示さないことを示した。ｎｔＰＥと未結合体化Ｖ３ループ（ジスルフィド結合で束縛されている）を同時に投与した動物もまた、測定可能なＭＮ  ｇｐ１２０特異的ＩｇＡレベルを有さなかった。これらの結果は、ＥＬＩＳＡにおいて非特異的交差反応性が少しであったか、または全くなかったことを示している。
【０２５５】
検出可能な抗体特異的血清ＩｇＡ応答は、１ヶ月、２ヶ月、または３ヶ月のサンプリング時間において、いずれの投与群においても観察されなかった。しかしながら、１６．５ヶ月目において、全ての群から回収された血清は、抗原特異的ＩｇＡを示した（表１）。この時点における血清ＩｇＡを検出する能力は、特異的刺激に起因するものではなく、高められた全免疫応答に起因し得る可能性がある。興味深いことに、相対的な血清ＩｇＡレベルは、唾液ＩｇＡレベルと相関しなかった。例えば、経直腸／経口の組合せ接種は、より弱い記憶唾液ＩｇＡ応答の１つを生じたが、最も強い記憶血清ＩｇＡ応答を生じた（表１、図１１）。全ての経口群、全ての経膣群、または全ての経直腸群（これらは第１６．５ヶ月にて最も大きい唾液ＩｇＡ応答を提供した）は、この時点で、最も弱い血清ＩｇＡ応答をいくつか有した。ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６の粘膜投与（ここで、唾液および血清の対向するレベルが標準値である）とは異なり、ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６の皮下接種は、マウスの唾液および血清の両方において、中程度のＩｇＡ応答を生じた（表１、図１１）。ＩｇＡ産生の刺激が何であっても、抗原特異的血清ＩｇＡレベルは一過性であった。第２２ヶ月のサンプリングにて、経直腸／経口群のちょうど２つの動物は、ＭＮ  ｇｐ１２０を認識する測定可能な血清ＩｇＡに対して、ポジティブのみを示した。他の群は、皮下注射群でさえも、この時点で、いかなる検出可能な血清ＩｇＡレベルも示さなかった。
【０２５６】
表１．ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６での免疫化は、マウスにおいて抗原特異的血清ＩｇＡおよび唾液ＩｇＧの産生を刺激する
【０２５７】
【表１】
2009079068.tif 000003
【０２５８】
ａ免疫は、第０日目、第１４日目、第２１日目、および第１６ヶ月目において、経口的に（ＰＯ）、経膣的に（Ｖ）、経直腸的に（Ｒ）、または皮下的に（ＳＣ）のいずれかで、動物に実行された。
【０２５９】
ｂＭＮ  ｇｐ１２０特異的ＩｇＡレベルは、第１６．５ヶ月目にてＥＬＩＳＡにより測定され、そして単一のサンプル標準に対して正規化され、そして任意の単位で報告された。
【０２６０】
ｃＭＮ  ｇｐ１２０特異的ＩｇＧレベルは、第１６．５ヶ月目にてＥＬＩＳＡにより測定され、そしてマウスモノクローナル抗体（１Ｆ１２）（これは、タンパク質のＶ３ループを認識する）に対して校正された。
【０２６１】
（２．ＩｇＧ抗体は、ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６に応答する）
ＥＬＩＳＡにより測定された血清および唾液の抗原特異的ＩｇＧ応答を、マウスモノクローナル抗体（１Ｆ１２）（これは、ＭＮ  ｇｐ１２０のＶ３ループを認識する）を用いて標準化した。アッセイは、１Ｆ１２について０．０５〜２．５μｇの範囲にわたって直線状であり、そして免疫前血清および唾液は、ＥＬＩＳＡフォーマットにおいてネガティブであった。最初の接種とそれに続く２回の追加免疫により生じたＩｇＧ応答は、皮下注射群において最終的に最も大きかったが、全ての粘膜接種群は、第３０日目、第６０日目、および第９０日目において、強い血清ＩｇＧ応答を示した（図１２）。第１６ヶ月目におけるｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６追加免疫の２週間後、皮下注射群は、最も高い血清ＩｇＧ記憶応答を有した。全ての粘膜群はまた、この時点で、強い記憶応答を示した（図１２）。しかしながら、第２２週目までに、抗原特異的血清ＩｇＧ力価は、全ての群において減少した。
【０２６２】
（３．血清および唾液のＩｇＧおよびＩｇＡレベルの比較）
先行する研究は、血清ＩｇＧが粘膜表面上で漏出し得、おそらく免疫保護のいくつかの形態を提供することを示唆してきた。Ｍ．Ｂ．Ｖａｓｕｄｅｖａｃｈａｒｉら（１９９２）Ｊ．Ａｃｑｕｉｒ．Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃ．Ｓｙｎｄｒ．５：８１７−８２１。他の研究は、このような漏出事象を示すことができていない。Ｅ．−Ｌ．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら（１９９８）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６：５１４−５２０。これらの研究において、抗原特異的ＩｇＧは、唾液サンプルにおいて、第１ヶ月目、第２ヶ月目、および第３ヶ月目にて観察されなかったが、第１６ヶ月目の追加免疫後、検出可能なレベルまで上昇した（表１）。全ての粘膜投与された動物の群は、この時点で同等の唾液ＩｇＧ応答を有しており、これは皮下的にｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６を受容した動物について観察された唾液ＩｇＧ応答よりも大きかった（表１）。血清および唾液の抗原特異的ＩｇＧの相対的なレベル間に相関性がないこと（図１２、表１）は、血清および唾液のＩｇＧプールの分離が、この記憶応答から生じることを示唆している。従って、本研究における唾液中に存在するＩｇＧは、循環する血清抗体からの「溢流出（ｓｐｉｌｌ−ｏｖｅｒ）」ではなく、局所的な抗体産生から、有意な程度で生じ得るように見える。
【０２６３】
（４．血清ＩｇＧアイソタイプは、ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６に応答する）
マウスにおいて、Ｔｈ１応答の導入は、代表的にＢ細胞によるＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３の産生をもたらすが、一方、Ｔｈ２応答は、ＩｇＧ１およびおそらくはＩｇＥ産生を生じる。Ａ．Ｋ．Ａｂｂａｓら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８３：７８７−７９３。Ｔｈ１またはＴｈ２応答のいずれかの発達は、特定のサイトカイン（例えば、インターフェロン−γおよびＩＬ−４）により駆動される。ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６の皮下注射による全身的導入、あるいは経口的、経膣的、または経直腸組織的な適用によるｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６の導入のいずれかは、抗原特異的血清ＩｇＧ応答に発達をもたらす。これらの血清サンプルのＩｇＧアイソタイプ集団が研究され、そしてＭＮ  ｇｐ１２０特異的応答は、ＩｇＧ１により支配されていた（約５５％）ことが見出された。より少なくかつ同等の量の抗原特異的ＩｇＧ２ａ(約２０％）およびＩｇＧ２ｂ(約２０％）が、少量（約５％）のＩｇＧ３と共に見出された。抗原特異的ＩｇＥは検出されなかった。これらの結果は、ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６の皮下投与が、Ｔｈ２表現型支配を有するＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＴｈ１およびＴｈ２応答の両方を誘発することを示唆する。
【０２６４】
（ＶＩＩＩ．アジュバントとしてのｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６の評価）
アジュバントは、接種の部位において抗原の提示を促進しおよび／または免疫応答を活性化するために作用し得る。Ｆ．Ｒ．Ｖｏｇｅｌら（１９９５）、ワクチンアジュバントおよび賦形剤の要約、１４１〜２２８頁。Ｍ．Ｆ．Ｐｏｗｅｌｌ、およびＭ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ（編）、ＶＡＣＣＩＮＥ  ＤＥＳＩＧＮ中：ＴＨＥ  ＳＵＢＵＮＩＴ  ＡＮＤ  ＡＤＪＵＶＡＮＴ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ、第６巻、Ｐｌｅｍｕｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。入手可能な最も強力なアジュバントのうちの１つとして認識されたフロイントアジュバントは、鉱油、界面活性剤、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの混合物である。ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６による血清ＩｇＧ導入の効率を評価するための研究は、最初にｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６とフロイント完全アジュバントとをマウスに皮下注射し、１４日および４９日後にｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６とフロイント不完全アジュバントとで追加免疫し、次いでＩｇＧ血清応答を、フロイントアジュバントなしでｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６を受容した動物のＩｇＧ血清応答と比較することにより、実施した（図１３）。フロイントアジュバントの代わりに通常の生理食塩水を用いる、ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６の同様の皮下投与レジメンを受容している動物は、このキメラをフロイントアジュバントと共に受容する動物において観察された免疫応答のほぼ３分の１の抗原特異的免疫応答を示した。この時間枠にわたるｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６の応答のレベルは、第１ヶ月目、第２ヶ月目、および第３ヶ月目において、図１２中で図示された皮下注射群において観察されたレベルと同様であり、このことは、このキメラ送達のこの形態についての完全に一致する結果を示唆している。フロイントアジュバントのレジメンが無毒性ＰＥ（これは、ＭＮ  ｇｐ１２０のＶ３ループを欠く）と共に注射されるコントロールは、測定される免疫応答の特異性を示した（図１３）。
【０２６５】
本発明は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ様キメラ免疫原、および免疫応答を惹起する方法を提供する。特定の実施例が提供されてきたが、上記記載は例示であって、限定するものではない。本発明の多くの改変は、本明細書を検討すると、当業者に明らかになる。従って、本発明の範囲は、上記記載を参照して決定されるべきではなく、添付の特許請求の範囲をその同等物の全範囲と共に参照して決定されるべきである。
【０２６６】
本出願中で引用された全ての刊行物および特許文献は、全ての目的のために、同じ程度まで、個別の刊行物または特許文献のそれぞれが個々に示されているかのごとく、その全体が参考文献として援用される。出願人は、この文献中におけるそれらの種々の参考文献の引用によって、いかなる特定の参考文献も、それらの発明に対して「先行技術」であるとは認めない。
【図面の簡単な説明】
【０２６７】
【図１】（ＡおよびＢ）ドメインＩＩとＩＩＩとの間のＩｂおよびＶ３ループの相対的位置を示すＰＥおよびＰＥ-Ｖ３ループキメラの模式図。ＰＥ毒性を除去するための単一アミノ酸欠失（ΔＥ５３３）の適切な位置もまた、示される。（Ｃ）単一のレターコードで表したアミノ酸配列（これは、ジスルフィド結合形成後にループコンフォメーションを生じるように設計された２つのシステイン残基を含む、ＨＩＶ−１のＭＮまたはＴｈａｉ−Ｅ（ＴＥ）株のいずれか由来である、ｇｐ１２０のＶ３ループ配列（太字）と野生型ＰＥのＩｂループを置き換えた）。Ｖ３ループ配列の導入のために使用された、固有のＰｓｔＩ制限部位の挿入は、Ｉｂループ（イタリック）に隣接する野生型ＰＥアミノ酸配列のいくつかの改変を生じた。無関連なコントロールペプチド挿入物をコントロールとして調製し、そしてｎｔＰＥ−ｆｐ１６と命名する。計算された分子量は、全長の発現タンパク質について示される。野生型ＰＥ−−配列番号６；ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ１４−−配列番号７；ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６−−配列番号８；ｎｔＰＥ−Ｖ３Ｔｈ−Ｅ２６−−配列番号９；ｎｔＰＥ−ｆｐ１６−−配列番号１０。
【図２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離後のｎｔＰＥ−Ｖ３ループキメラの特徴付け。（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離に続く、精製されたｎｔＰＥ−Ｖ３ループキメラのクーマシーブルー染色。約１μｇのタンパク質を各レーンにロードした。（Ｂ）ｎｔＰＥ−Ｖ３ループキメラのウエスタンブロット分析。イモビロンＰ膜への移入後、タンパク質をインタクトなｇｐ１２０／ＭＮ（１Ｆ１２）またはｇｐ１２０／Ｔｈａｉ−Ｅ（１Ｂ２）に対して産生されたモノクローナル抗体でプローブした。１６アミノ酸の無関連配列を、ｎｔＰＥ（ｎｔＰＥ−ｆｐ１６）のＩｂループ領域へ挿入し、そしてネガティブコントロールとして本明細書で使用した。（Ｃ）プロテインＧセファロ−ス上に固定した１Ｆ１２または１Ｂ２のいずれかを用いる、免疫捕獲研究を使用して、種々のキメラタンパク質の表面上へのＶ３ループ配列の曝露を特徴付けた。タンパク質をクーマシーブルーでゲルを染色することによって可視化した。Ｇｐ１２０およびｎｔＰＥ−ｆｐ１６を、それぞれポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして使用した。ＰＥ−Ｖ３ループタンパク質の捕獲を、１つの三角矢印によって示し、そしてｇｐ１２０の捕獲を２つの三角矢印によって示す。左パネルは、抗体重鎖の（ｈｃ）の存在を示す。なぜなら軽鎖（ｌｃ）のみが、ゲルから流出したからである。右パネルは両鎖を示す。
【図３】Ｖ３ループアミノ酸配列挿入物は、野生型ＰＥの二次構造を有意に変化させない。近ＵＶ（Ａ）および遠ＵＶ（Ｂ）ＣＤスペクトル（バックグラウンドスペクトルの減算に続く３回のスキャンの平均）を、計数的に円滑化し、濃度について補正し、そして平均残基重量楕円率の単位へ基準化した。（Ｃ）二次構造計算をＳＥＬＣＯＮフィッティングプログラムを使用して実施した。＊計算したαヘリックス含量は、２２２ｎｍで観測された楕円率の変化から決定した値と一致する。
【図４】毒性ＰＥ−Ｖ３ループキメラは、細胞生存率に影響する。３Ｈ−ロイシン取り込みによって評価したタンパク質合成の程度を、種々の濃度の野生型ＰＥまたはＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６の毒性形態（５５３位でのグルタミン酸残基およびＡＤＰリボシル化可能な伸長因子２と共に）のいずれかへの１８時間の曝露後のヒトＡ４３１細胞において決定した。
【図５】ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６またはｎｔＰＥ−Ｖ３Ｔｈ−Ｅ２６のいずれかでの免疫後のウサギ血清の特徴付け。（Ａ）組換えｇｐ１２０／ＭＮおよびｇｐ１２０／Ｔｈ−Ｅについて１：１０００に希釈したウサギ抗血清のウエスタンブロット反応性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、そしてタンパク質のイモビロンＰ膜への移入によって評価した。反応性一次抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼへ結合体化させた二次抗ウサギ抗体によって検出した。（Ｂ）ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６を注射した動物から得たウサギ血清を、５０μｇ／ｍｌまでの濃度で、競合する可溶性ｇｐ１２０／ＭＮと共に予めインキュベートした。残存反応性を、（Ａ）について記載されるように、固定化したｇｐ１２０／ＭＮのウエスタンブロット分析によって検出した。
【図６】ウサギへ投与したｎｔＰＥ−Ｖ３ループキメラは、インビトロでＨＩＶ−１感染性を中和し得る抗体応答を産生する。ウサギを、２００μｇのｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６で皮下的に免疫し、そして、２、４、１２週後に同様に追加免疫した。最初の投与後２７週までに回収した血清を、ＭＴＴ色素転換アッセイによって評価したように、ヒトＴ細胞株、ＭＴ４をＨＩＶ−１ＭＮによる殺傷から保護する能力について評価した。数値は、ウイルスによってチャレンジされないコントロールＭＴ４インキュベーションに対して正常化された３連読み込みを表す。
【図７】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ構造の図である。配列番号２に基づくアミノ酸位が示される。ドメインＩａは、アミノ酸１〜２５２から伸長する。ドメインＩＩは、アミノ酸２５３〜３６４から伸長する。これは、アミノ酸２６５〜２８７のシステインによって形成されるシステイン-システインループを含む。フーリン（ｆｕｒｉｎ）は、アミノ酸２７９と２８０との間のシステイン−システインループ内を切断する。アミノ酸２８０で始まるＰＥのフラグメントは、サイトゾルへトランスロケーションする。アミノ酸３４５〜３６４が排除される構築物もまた、トランスロケーションする。ドメインＩｂは、アミノ酸３６５から３９９にかかる。これは、アミノ酸３７２および３７９のシステインによって形成されたシステイン−システインループを含む。このドメインは、全体的に排除され得る。ドメインＩＩＩは、アミノ酸４００〜６１３へかかる。アミノ酸５５３の欠失は、ＡＤＰリボシル化活性を排除する。小胞体配列ＲＥＤＬＫ（配列番号１１）は、アミノ酸６０９〜６１３から、この分子のカルボキシル末端に位置する。
【図８】ＰＥ−Ｖ３ループキメラが、ネイティブＰＥと同様に輸送されることを証明する。Ｃａｃｏ−２細胞のコンフルエントな単層が、組換えの酵素的に活性であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素（ｒＥＡ−ＰＥ）に対して突端的に曝露された。種々のネイティブＰＥ（ｒＥＡ−ＰＥ）濃度での２４時間の曝露によって生じた細胞殺傷を、ＨＩＶ−１  ＭＮｇｐ１２０のＶ３ループの１４または２６アミノ酸のいずれかを含む、ＰＥキメラの酵素的活性バージョンによる同様の処理によって生じた細胞殺傷と比較した。
【図９】ＰＥ−Ｖ３ループキメラが、血清ＩｇＧ応答を誘導することを証明する。ＨＩＶ−１  ＭＮｇｐ１２０（ＰＥＭＮ２６）のＶ３ループの２６のアミノ酸を含む無毒性（酵素的に不活性である）Ｖ３ループキメラを、６つの異なる接種プロトコルによってウサギへ投与した。記載された時間で取り出された血清サンプルを、モノクローナル抗体（１Ｆ１２）（これは、アッセイ較正のために、このタンパク質のＶ３ループを認識する）を使用して、ＭＮｇｐ１２０特異的ＩｇＧについてＥＬＩＳＡによってアッセイした。
【図１０】ＰＥ−Ｖ３ループキメラが、唾液ＩｇＡ応答を誘導することを示す。 ＨＩＶ−１  ＭＮｇｐ１２０（ＰＥＭＮ２６）のＶ３ループの２６個のアミノ酸を含む無毒性（酵素的に不活性である）Ｖ３ループキメラを、６つの異なる接種プロトコルによってウサギへ投与した。記載された時間でのピロカプリン投与後に得られた唾液サンプルを、ＭＮｇｐ１２０特異的ＩｇＡについてＥＬＩＳＡによってアッセイした。ｇｐ１２０特異的ＩｇＡ抗体を、アッセイ較正のために利用し得なかった。値を、標準化ポジティブサンプルに対して正規化した値として報告する。
【図１１】ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６での粘膜接種または全身性接種後の唾液腺ＩｇＡの相対レベルを示す。ＭＮ−ｇｐ１２０特異的ＩｇＡ抗体を、強いポジティブサンプルに対して正規化した唾液サンプルにおいてＥＬＩＳＡによって測定し、任意のスケールの１つの抗原特異的ＩｇＡユニットで報告した。
【図１２】ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６での粘膜接種または全身性接種後のＩｇＧの血清レベルを示す。ＭＮ−ｇｐ１２０特異的ＩｇＧ抗体を、ＥＬＩＳＡによって血清サンプルにおいて測定し、そしてマウスモノクローナル抗体（これは、ＭＮｇｐ１２０のＶ３ループを特異的に認識する）に対して正規化した。
【図１３】ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６の皮下注射後のＩｇＧの血清レベルを示す。ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６の注射から生じた免疫応答（斜線四角）を、フロイント完全アジュバントおよび不完全アジュバント（黒四角）のレジメンで同時注射した場合に誘導された免疫応答と比較した。ＭＮｇｐ１２０のＶ３ループからの２６個のアミノ酸を含まない無毒性ＰＥを、コントロ−ルと同様のアジュバントレジメンで注射した。ＭＮ−ｇｐ１２０特異的ＩｇＧ抗体を、ＥＬＩＳＡによって血清サンプル中で測定し、そしてマウスモノクローナル抗体（これは、ＭＮｇｐ１２０のＶ３ループを特異的に認識する）に対して基準化した。
【図１４】本発明のキメラ免疫原で誘発した抗体での臨床的ＨＩＶ単離物の中和を示す。ｎｔＰＥ−Ｖ３ＭＮ２６を注射したウサギからの予防接種後の血清を、Ｂ（図１４Ａ）またはＥ（図１４Ｂ）サブタイプウイルスのいずれかと混合した。３７℃での１時間のインキュベーション後、ウイルス感染性を、別に３日間、ＰＢＭＣへの処理されたウイルスの添加によって決定した。ウイルス増殖の阻害を、ｐ２４レベルを測定することによって評価した。白四角：ｐ２４抗原（未感染）；黒丸：血清から分取後のｐ２４抗原１；白丸：ｐ２４抗原１免疫血清（２４週）。
【０２６８】
（配列表）
【表Ａ−１】
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【表Ａ−２】
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【表Ａ−３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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