(57)【要約】【課題】アラントインを、親水性相互作用クロマトグラフィー（HILIC）を用いて分析する方法を提供する。【解決手段】ホウ酸を含有する移動相を用いることを特徴とする親水性相互作用クロマトグラフィーによるアラントインの分析方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホウ酸を含有する移動相を用いることを特徴とする親水性相互作用クロマトグラフィーによるアラントインの分析方法。
【請求項２】
２００nm〜２２０nmの波長の吸光度を指標としてアラントインを検出する請求項１記載のアラントインの分析方法。
【請求項３】
移動相中のホウ酸含有量が５０mM〜２００mMである請求項１又は２記載のアラントインの分析方法。
【請求項４】
移動相中に、アセトニトリル、水及びホウ酸を含有し、アセトニトリルと水の配合比が７：３〜４：１であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載のアラントインの分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高極性化合物であるアラントインの親水性相互作用クロマトグラフィーによる分析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、アラントインは逆相の高速液体クロマトグラフィー（以下、高速液体クロマトグラフィーを「HPLC」と記す。）を用いて分析されていた。しかし、アラントインは非常に極性の高い化合物であるため、化学結合型充填剤であるオクタデシルシリル（ODS）カラムには保持されない。そのため、この系でアミノ酸のような親水性成分と分離することが困難であった。
【０００３】
アラントインは、例えば市販の点眼剤に配合されているが、市販の点眼剤にはアミノ酸をはじめとして化学的性質が異なる多くの成分が配合されている。そのため、汎用の化学結合型充填剤と逆相HPLCを組み合わせた系を用いてアラントインと点眼剤中のその他の各成分を分離する高精度の分析は困難であった。
【０００４】
また、高極性化合物であるアラントインの分析法としては、アラントインの移動相中への溶解性から、移動相が有機溶媒のみからなる順相HPLC条件は好ましくない。
【０００５】
一方、逆相HPLC条件及び順相HPLC条件とは異なる分離モードである親水性相互作用クロマトグラフィー（Hydrophilic Interaction Chromatography、以下適宜、「HILIC」と記す。）は医薬品、化粧品などの有効成分として汎用されているアスパラギン酸などのアミノ酸類、ペプチド類といった高極性化合物の分析に用いられている。
【０００６】
HILICについての文献では、「HILICとは親水性固定相と大部分が有機溶媒である疎水的な移動相との組合せによるクロマトグラフィーである」と定義している。一般的に順相液体クロマトグラフィーでは非極性の溶媒のみを移動相に用いるが、HILICでは移動相に３０％程度までの水を添加する。非特許文献１中では、固定相にはシリカゲルに2-hydroxyethyl asparamideを共有結合させた充填剤を用い、移動相にアセトニトリル比率70%以上の水溶液を用い、アミノ酸、糖、ペプチド、オリゴDNAを分離した例が開示されている（非特許文献１参照）。
【０００７】
ここに、アラントインは親水性相互作用クロマトグラフィーを用いることで分析はされていた（非特許文献２参照）。
【０００８】
そして、上述の他にもHILICでアラントインの分析を試みた事例はあるが（非特許文献３参照）、医薬品、化粧品分野で求められる精度の高い分析はできていなかった。
【０００９】
なお、逆相HPLCでは、塩基性ホウ酸塩によって移動相の液性を塩基性にして目的の化合物を分離することが知られている（特許文献１参照）が、HILICにおいては分離成分の保持は液性に依存しないため通常は移動相に塩基性ホウ酸塩を添加はしないし、ましてホウ酸を添加することは思いもよらなかった。
【００１０】
また、HILICにおいて紫外吸光度検出器（以下適宜、「UV検出器」と記す。）を用いた分析事例は知られている（非特許文献１及び４参照）。
【００１１】
【特許文献１】特開平11-189551号公報
【非特許文献１】Andrew J.Alpert J.Chromatogr. 499 (1990) 177-196.
【非特許文献２】Yusuke Iwasaki et.al. BUNSEKI KAGAKU 54 (2005) 135-142.
【非特許文献３】Ph.Dallet、L. Labat、E.Kummer、J.P. Dubost J.Chromatogr.B 742 (2000) 447-452.
【非特許文献４】Jifeng Zhang, Daniel I.C. Wang J.Chromatogr.B 712 (1998) 73-82.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
アラントインは医薬品、化粧品などの製剤中で用いられることが多いが、製剤中にはアラントイン以外の主成分及び種々の添加剤が含有されており、本発明者らはHILICを用いてアラントインを分析する場合は、報告例のある分析条件では、ピーク分離も不完全で精度の良い分析ができないという問題点を見出した。
【００１３】
よって本発明は、HILICを用いてアラントインを精度良く分析することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、意外にもHILICにおいて移動相にホウ酸を添加することで、高極性化合物であるアラントインを精度良く分析できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
即ち、本発明は次のとおりである。
（１）ホウ酸を含有する移動相を用いることを特徴とする親水性相互作用クロマトグラフィーによるアラントインの分析方法。
（２）２００nm〜２２０nmの波長の吸光度を指標としてアラントインを検出する（１）記載のアラントインの分析方法。
（３）移動相中のホウ酸含有量が５０mM〜２００mMである（１）又は（２）記載のアラントインの分析方法。
（４）移動相が、アセトニトリル、水及びホウ酸を含有し、アセトニトリルと水の配合比が７：３〜４：１であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれか記載のアラントインの分析方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、医薬品、化粧品などに配合されているアラントインとHILICにおいて非極性溶媒に３０％程度までの水を添加しただけの移動相組成では分離が達成されなかった他の成分との分離が達成され、精度良くかつ効率的に分析することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
HILICにおけるHPLC分析時の流速、温度、ピーク位置特定などの分析条件の設定は、一般的なHPLCにおける分析条件設定手法に準じて分析条件の設定をすることができる。なお、分析方法とは、定性的分析、定量的分析を含む意味に用いる。
【００１８】
HILICに特徴的な分析条件について以下に述べる。
【００１９】
HILICに用いるカラムとはシリカゲル、グリセロール基、ポリオール基、アミノ基、アミド基、アスパラギン誘導体などの極性基を有する固定相を充填したカラムであれば良く、HILIC用の市販カラムを用いることができる。
【００２０】
本発明のHILICにおける移動相とは極性溶媒と有機溶媒を混合した移動相でホウ酸を含有しているものである。ホウ酸を添加することでピークの分離が改善され、アラントインの良好な分析が達成されるからである。
【００２１】
本発明の移動相は、水系の極性溶媒を含む移動相でホウ酸を含有しているものが好ましく、ホウ酸を含有するアセトニトリル−水の系が特に好ましい。
【００２２】
本発明に用いる移動相において、アセトニトリルと水の配合比は７：３〜４：１であることが好ましい。配合比がこの範囲で保持時間の再現性が良好だからである。
【００２３】
移動相中のホウ酸濃度は５０mM〜２００mMが好ましい。この濃度範囲で保持時間の再現性が良好だからである。
【００２４】
分析対象であるアラントインとは、Ｃ４Ｈ６Ｎ４Ｏ３、分子量１５８．１２、プリン体の代謝産物である。刺激性がなく粘膜保護作用などを有し点眼剤、化粧品などの有効成分として用いられる。アラントインはとくに分子内の電気的な偏りの大きい化合物であり高極性化合物に属する。
【００２５】
アラントインのピークの検出には、分析機器としては医薬品、化粧品などのHPLCによる分析で汎用されている紫外吸光度検出器（UV検出器）を用いることができる。アラントインの分析では、UV検出器の検出波長は２００nm〜２２０nmである。
【００２６】
本発明によって、医薬品、化粧品などに含まれるアラントインでも精度良く、効率的に分析できる。分析に供されるサンプルが、医薬品、化粧品などに含まれる有効成分、例えばビタミン類、生薬、ミネラル、アミノ酸及びその塩類などの成分を含んでいる場合にこそ、本発明を用いる意義は大きい。同様に、分析サンプルは当該組成物の調製に通常用いられる甘味剤、矯味剤、ｐＨ調整剤、保存剤、抗酸化剤などを含んでいても良い。
【実施例】
【００２７】
以下に、実施例及び比較例を挙げ、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例等に何ら限定されるものではない。
【００２８】
［装置］ 
フォトダイオードアレイ検出器（ＰＤＡ検出器、Waters2996、Waters製）（検出波長：210nｍ）を接続した一体型HPLC装置（Waters 2695、Waters製）を用いた。
カラムは、Atlantis HILIC シリカ (150 mm × 2.1 mm I.D.、3 μm、Waters製)を用いて分析した。
カラムに流量０．２ｍＬ／ｍｉｎで移動相を２時間程度通液することによってカラムを平衡化した後に分析を行った。
カラム温度は３０℃、試料注入量は２μＬとした。
すべてのデータは、Empower Software (Version 5.00.00.00、Waters製)にて解析を行った。
【００２９】
［試薬及び試液］
標準物質アラントイン（99.3%）は川研ファインケミカル（Tokyo、Japan）より購入した。
移動相用のホウ酸は、特級の市販品を使用した。
移動相用の液体クロマトグラフ用アセトニトリルは、液体クロマトグラフ用の市販品を使用した。
【００３０】
分析に供した市販製剤Ａの主薬成分は、メチル硫酸ネオスチグミン、0.002％：アミノエチルスルホン酸（タウリン）、0.5％：Ｌ−アスパラギン酸マグネシウム・カリウム、0.5％：塩酸ピリドキシン（ＶＢ６）、0.1％：グリチルリチン酸二カリウム、0.05％：マレイン酸クロルフェニラミン、0.02％：コンドロイチン硫酸ナトリウム、0.1％：アラントイン、0.1％である。
【００３１】
同様に、市販製剤Ｂの主薬成分は、メチル硫酸ネオスチグミン、0.002％：アラントイン、0.1％：アミノエチルスルホン酸（タウリン）、0.5％：Ｌ−アスパラギン酸カリウム、0.5％：塩酸ピリドキシン（ＶＢ６）、0.1％：酢酸ｄ−α−トコフェロール（天然型ビタミンＥ）、0.05％である。
【００３２】
［標準溶液］
アラントインを105℃で4時間乾燥し、その約20mgを精密に量り、液体クロマトグラフ用アセトニトリル／水混液(7:3)に溶かし、正確に20mLとする。この液2mLを正確に加え、液体クロマトグラフ用アセトニトリル／水混液(7:3)を加えて正確に20mLとし、標準溶液とした。
【００３３】
［試料溶液］
市販の製剤中のアラントイン2mg対応量を正確に量り、液体クロマトグラフ用アセトニトリル／水混液(7:3)を加え正確に20mLとし、試料溶液とする。
【００３４】
［比較例１］
移動相に加える添加剤としてホウ酸のかわりに塩化アンモニウムを用いた場合の検討を行った。
移動相中の塩化アンモニウム濃度は、100、200、300mMとした。それぞれの場合に対してｐＨは5.0であった。
上述の計３条件に対して、移動相中のアセトニトリル濃度を70、75、80％としてアラントインの保持時間への影響などを確認した。
【００３５】
製剤Ａでは他の成分がほぼ同じ保持時間に溶出し、ピークがほぼ完全に重なることが確認できた。今回調製した移動相のいずれにおいてもこの妨害を回避出来なかったことから、塩化アンモニウムを移動相に添加した場合は、HILICによる当該製剤中のアラントイン分析は困難であることが確認された。
【００３６】
代表的なクロマトグラムとして、移動相に液体クロマトグラフ用アセトニトリル／200mM塩化アンモニウム溶液混液 (4:1)を用いた際のクロマトグラムを図１に示す。
【００３７】
［実施例１］
移動相としてアセトニトリルと水の混合液を用い、ホウ酸を添加した場合の分離条件の検討を行った。
移動相中のホウ酸濃度は、0、50、100、200、300mMとしたが、この濃度範囲でのｐＨは5.0であった。上述の計５条件に対して、移動相中のアセトニトリル濃度を60、65、70、75、80％としてアラントインの保持時間への影響などを確認した。
【００３８】
結果を表１及び図２に示す。
【００３９】
【表１】
2009250730.tif 000002
【００４０】
ホウ酸を使用した場合には、塩濃度の変化に関してもアラントインの保持に与える影響が少ないことが確認できた。配合他成分については塩濃度の影響を受けたため、溶出位置がそれぞれ移動し、表１に示すようにホウ酸濃度50mM−アセトニトリル75％、80％、ホウ酸濃度100mM−アセトニトリル75％、80％、ホウ酸濃度200mM−アセトニトリル70％で特異性が確保された。
【００４１】
中でも塩濃度が50mM、有機溶媒含量が80%のとき、最も良好な分離を示した。このときのアラントイン標準、サンプル製剤Ａ、サンプル製剤Ｂ、サンプル製剤Ｂ（アラントイン抜き）のクロマトグラムを図３に示す。とくに、サンプル製剤Ｂではアラントイン溶出位置に妨害となるピークが検出されないことが確認できた。
【００４２】
［分析法バリデーション］
本発明のHILICにおいて、移動相にホウ酸を添加することで、極性の非常に高い化合物であるアラントインを精度良く分析する方法について、分析方法が確立されていることを検証するため分析法バリデーション（分析法の検証）を実施した。
【００４３】
分析法バリデーションは、「第１５改正 日本薬局方 参考情報 分析法バリデーション」、「平成７年７月２０日 薬審７５５」、「平成９年１０月２８日 医薬審３３８」に基づいて試験内容を設定しており、以下に示した項目を検証することで分析方法として確立したものであることが検証できる。
【００４４】
まず、アラントイン標準溶液の直線性を濃度５０〜１５０％の範囲で確認したところ、相関係数0.999以上の良好な直線が得られた（表２）。
【００４５】
更に、製剤Ａのアラントイン抜き試料に、定量濃度の８０、１００、１２０％になるように各々アラントイン標準溶液を添加し（ｎ＝３）、回収率及び精度を確認した。その結果、回収率は98.7〜99.3％と良好な値が得られた。また、精度に関しても、ＲＳＤ0.2〜0.7％であり良好な結果であるといえる（表２）。
【００４６】
【表２】
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【００４７】
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明により、医薬品、ドリンク剤、飲料、点眼剤、軟膏剤、化粧品（化粧水、ローション、メイク落し）などの数々の有効成分及び添加剤を含んでいる製剤に配合されるアラントインを分析する場合の分離精度がとくに向上し、アラントインを精度良く分析できるようになったため、医薬品、化粧品などに含まれるアラントインの規格試験、品質試験などの効率化が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】塩化アンモニウムを含有した移動相によるHILICの分析クロマトグラムであり、縦軸にピーク強度、横軸に保持時間を示す。  左のクロマトグラムはアラントイン標準であり、アラントインは３．２分に溶出する  右のクロマトグラムはサンプル製剤Ａであり、アラントインのピークは分離できていない
【図２】ホウ酸を含有した移動相条件の検討、縦軸にアラントインの保持時間、横軸に移動相組成を示す。
【図３】ホウ酸を含有した移動相によるHILICの分析クロマトグラムであり、縦軸にピーク強度、横軸に保持時間を示す。  左端のクロマトグラムはアラントイン標準であり、アラントインのピークのみ確認できる  中央左のクロマトグラムはサンプル製剤Ａであり、アラントインのピーク（３分に溶出）が分離されている  中央右のクロマトグラムはサンプル製剤Ｂであり、アラントインのピーク（３分に溶出）が分離されている  右端のクロマトグラムはサンプル製剤Ｂのアラントイン抜きであり、アラントインのピークは溶出位置に確認できない
【図１】
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【図２】
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【図３】
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