(57)【要約】【課題】ペプチド中のプロリン残基のＣ末端側のペプチド結合に対する加水分解活性を有する、エンドペプチダーゼを提供すること。【解決手段】本発明のメタロエンドペプチダーゼは、プロリン残基を含むペプチド中の該プロリン残基のＣ末端側のペプチド結合に対する加水分解活性を有し、好適には、以下の性質：（１）至適反応ｐＨ：ｐＨ６．５〜７．５；（２）至適反応温度：約４０℃；（３）熱安定性：５０％熱不活性化温度として、約５０℃；（４）カルシウムイオンおよびコバルトイオンにより活性化される；および（５）ＥＤＴＡ、１，１０−フェナンスロリン、ジチオトレイトールおよびグルタチオンによって阻害される；を有する。また、本発明のメタロエンドペプチダーゼは、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＴＨ−３（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３４３）により産生される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロリン残基を含むペプチド中の該プロリン残基のＣ末端側のペプチド結合に対する加水分解活性を有する、メタロエンドペプチダーゼ。
【請求項２】
以下の性質：
（１）至適反応ｐＨ：ｐＨ６．５〜７．５；
（２）至適反応温度：約４０℃；
（３）熱安定性：５０％熱不活性化温度として、約５０℃；
（４）カルシウムイオンおよびコバルトイオンにより活性化される；および
（５）ＥＤＴＡ、１，１０−フェナンスロリン、ジチオトレイトールおよびグルタチオンによって阻害される；
を有する、請求項１に記載のメタロエンドペプチダーゼ。
【請求項３】
ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＴＨ−３（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３４３）により産生される、請求項１または２に記載のメタロエンドペプチダーゼ。
【請求項４】
（Ａ）配列表の配列番号２の２２１位から５４７位までのアミノ酸配列、
（Ｂ）配列表の配列番号２の２２１位から５４７位までのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸配列、および
（Ｃ）配列表の配列番号２の２２１位から５４７位までのアミノ酸配列に対し、配列同一性が、少なくとも７５％であるアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１から３のいずれかの項に記載のメタロエンドペプチダーゼ。
【請求項５】
配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列の３位のアミノ酸残基と４位のアミノ酸残基との間のペプチド結合に対する加水分解活性を有する、請求項１から４のいずれかの項に記載のメタロエンドペプチダーゼであって、該配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、２位がＡｒｇ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、およびＴｙｒからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、３位がＴｙｒ、Ｐｒｏ、およびＬｅｕからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、そして４位がＬｅｕおよびＡｌａからなる群より選択されるアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるペプチドに対する基質優先性を有する、メタロエンドペプチダーゼ。
【請求項６】
メタロエンドペプチダーゼをコードする遺伝子であって、該メタロエンドペプチダーゼが、プロリン残基を含むペプチド中の該プロリン残基のＣ末端側のペプチド結合に対する加水分解活性を有し、そして該遺伝子が、
（ａ）配列表の配列番号２の２２１位から５４７位までのアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｂ）配列表の配列番号２の２２１位から５４７位までのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｃ）配列表の配列番号２の２２１位から５４７位までのアミノ酸配列に対し、配列同一性が、少なくとも７５％であるアミノ酸配列をコードする塩基配列、および
（ｄ）配列表の配列番号２の２２１位から５４７位までのアミノ酸配列をコードする塩基配列のアンチセンス鎖と、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする塩基配列、
からなる群より選択される塩基配列を有する、遺伝子。
【請求項７】
前記メタロエンドペプチダーゼが、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列の３位のアミノ酸残基と４位のアミノ酸残基との間のペプチド結合に対する加水分解活性を有し、そして該配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、２位がＡｒｇ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、およびＴｙｒからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、３位がＴｙｒ、Ｐｒｏ、およびＬｅｕからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、そして４位がＬｅｕおよびＡｌａからなる群より選択されるアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるペプチドに対する基質優先性を有する、請求項６に記載の遺伝子。
【請求項８】
請求項６または７に記載の遺伝子を含む、発現用担体。
【請求項９】
請求項６または７に記載の遺伝子が組み込まれている、形質転換細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の形質転換細胞により産生される、組換えメタロエンドペプチダーゼ。
【請求項１１】
ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＴＨ−３（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３４３）株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド中のプロリン残基のＣ末端側のペプチド結合に対する加水分解活性を有する新規メタロエンドペプチダーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質分解反応は、タンパク質を多く含む食品における調味料の開発に重要である。短いペプチドおよび遊離アミノ酸は、食品の特有の味を誘起してうまみを導き出す。一方、長いペプチドは一般的に苦いため、加水分解によって苦味を低減させる。
【０００３】
カゼイン、グルテン、コラーゲン、ゼラチンなどは、プロリンリッチなタンパク質として知られている。例えば、コラーゲンは、非常の多量のプロリン残基を含み（２０％以上）、代表的なプロリンリッチなタンパク質である。コラーゲン分子のポリペプチド鎖は、多くのトリペプチド繰り返し単位Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘａａから構成されており、Ｘａａはプロリンであることが多い。また、ペプチド中のプロリン残基は、翻訳後修飾によりヒドロキシプロリンになっていることも多い。プロリンは、ピロリジン環構造を有するためＮ−Ｃα結合間の回転が制限される独特のアミノ酸である。そのため、プロリン残基に隣接するペプチド結合は、分解しにくく、一般的に入手可能な酵素を用いて切断することは困難である。しかし、コラーゲンおよびそのペプチドは、生化学的および医学的機能のため、産業上興味深い生体材料である。したがって、細菌由来のプロリン特異的プロテアーゼおよびアミノペプチダーゼを、コラーゲンからのペプチドフラグメントおよびアミノ酸の生成に用いることが期待される。
【０００４】
現在までに、いくつかの細菌由来のコラーゲン分解性プロテアーゼが報告されている（非特許文献１）。それらのいくつかは、ビブリオまたはクロストリジウム種のような病原性細菌によって産生されるので、食品や医薬品産業への利用には適切ではない（非特許文献２〜５）。
【０００５】
プロリルオリゴペプチダーゼは、Ｎ末端にプロリン残基を含むペプチドからプロリンを切断するエキソペプチダーゼであることが知られている（非特許文献６）。さらに、Lactobacillus（非特許文献７）、Streptomyces（非特許文献８）、およびBifidobacterium（非特許文献９）由来のオリゴペプチダーゼのいくつかが、プロリンに特異的な活性を有することが報告されている。しかし、その活性は、オリゴペプチドに対するものに限られる。
【０００６】
近年、プロテアーゼの基質優先性について、ＦＲＥＴＳコンビナトリアルライブラリーを用いて検討されている（非特許文献１０〜１２および特許文献１）。しかし、プロリン残基を含むペプチド中の該プロリン残基のＣ末端側のペプチド結合に対する加水分解活性（以下、「ポストプロリン加水分解活性」という場合がある）を有するエンドペプチダーゼについての報告はない。
【特許文献１】特開２００６−１９７８０２号公報
【非特許文献１】K. Watanabe、Appl. Microbiol. Biotechnol. 2004年，63巻，520-526頁
【非特許文献２】H. Takeuchiら、Biochem. J.，1992年，281巻，703-708頁
【非特許文献３】S. Miyoshiら、Infect. Immun.，1998年，66巻，4851-4855頁
【非特許文献４】K. Yoshiharaら、J. Bacteriol.，1994年，176巻，6489-6496頁
【非特許文献５】O. Matsushitaら、J. Bacteriol.，1994年，176巻，149-156頁
【非特許文献６】D. ReaおよびV. Fulup，Cell Biochem. Biophys.，2006年，44巻，349-365頁
【非特許文献７】Y-S. Chenら、Appl. Environ. Microb.，2003年，69巻，1276-1282頁
【非特許文献８】C. Janerら、Appl. Environ. Microb.，2005年，71巻，8460-8465頁
【非特許文献９】Y. Umezawaら、J. Biochem.，2004年，136巻，293-300頁
【非特許文献１０】T. Hatanakaら、Arch. Biochem. Biophys.，2005年，434巻，289-298頁
【非特許文献１１】K. Odaら、FEBS Lett.，2005年，579巻，5013-5018頁
【非特許文献１２】S. Tankulら、Biochem. Biophys. Res. Commun.，2003年，309巻，547-551頁
【非特許文献１３】K. Titaniら、Nature，1972年，238巻，35-37頁
【非特許文献１４】S. Kojimaら、Biosci. Biotechnol. Biochem.，1998年，62巻，1392-1398頁
【非特許文献１５】U. Neumannら、Anal. Biochem.，2004年，328巻，166-173頁
【非特許文献１６】H. Tsuyukiら、J. Biochem.，1991年，110巻，339-344頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のように、コラーゲンおよびそのペプチドは、生化学的および医学的機能のため、産業上興味深い生体材料であり、そのペプチド中のポストプロリンの加水分解活性を有するエンドペプチダーゼが、このようなプロリンリッチなタンパク質の処理に必要とされている。したがって、本発明のポストプロリン加水分解活性を有するエンドペプチダーゼを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
近年、ストレプトマイセス・セプタタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｐｔａｔｕｓ）ＴＨ−２株が、無機リン酸および炭素源の存在下で大量のメタロエンドペプチダーゼ（ＳＳＭＰ）を分泌することが見い出されている（特許文献１および非特許文献１０）。そこで、入手可能なストレプトマイセス属放線菌においてフルオレセイン結合ゼラチン（ＦＩＴＣ−ゼラチン）に対するタンパク質分解活性についてスクリーニングして、ポストプロリン加水分解活性を有するプロテアーゼを探索し、新規なエンドペプチダーゼを得ることに成功した。
【０００９】
本発明は、プロリン残基を含むペプチド中の該プロリン残基のＣ末端側のペプチド結合に対する加水分解活性を有する、メタロエンドペプチダーゼを提供する。
【００１０】
１つの実施態様では、上記メタロエンドペプチダーゼは、以下の性質：
（１）至適反応ｐＨ：ｐＨ６．５〜７．５；
（２）至適反応温度：約４０℃；
（３）熱安定性：５０％熱不活性化温度として、約５０℃；
（４）カルシウムイオンおよびコバルトイオンにより活性化される；および
（５）ＥＤＴＡ、１，１０−フェナンスロリン、ジチオトレイトールおよびグルタチオンによって阻害される；
を有する。
【００１１】
ある実施態様では、上記メタロエンドペプチダーゼは、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＴＨ−３（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３４３）により産生される。
【００１２】
さらなる実施態様では、上記メタロエンドペプチダーゼは、（Ａ）配列表の配列番号２の２２１位から５４７位までのアミノ酸配列、
（Ｂ）配列表の配列番号２の２２１位から５４７位までのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸配列、および
（Ｃ）配列表の配列番号２の２２１位から５４７位までのアミノ酸配列に対し、配列同一性が、少なくとも７５％であるアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【００１３】
さらにある実施態様では、上記メタロエンドペプチダーゼは、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列の３位のアミノ酸残基と４位のアミノ酸残基との間のペプチド結合に対する加水分解活性を有し、そして該配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、２位がＡｒｇ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、およびＴｙｒからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、３位がＴｙｒ、Ｐｒｏ、およびＬｅｕからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、そして４位がＬｅｕおよびＡｌａからなる群より選択されるアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるペプチドに対する基質優先性を有する。
【００１４】
本発明はまた、メタロエンドペプチダーゼをコードする遺伝子を提供し、該メタロエンドペプチダーゼは、プロリン残基を含むペプチド中の該プロリン残基のＣ末端側のペプチド結合に対する加水分解活性を有し、そして該遺伝子は、
（ａ）配列表の配列番号２の２２１位から５４７位までのアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｂ）配列表の配列番号２の２２１位から５４７位までのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｃ）配列表の配列番号２の２２１位から５４７位までのアミノ酸配列に対し、配列同一性が、少なくとも７５％であるアミノ酸配列をコードする塩基配列、および
（ｄ）配列表の配列番号２の２２１位から５４７位までのアミノ酸配列をコードする塩基配列のアンチセンス鎖と、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする塩基配列、
からなる群より選択される塩基配列を有する。
【００１５】
１つの実施態様では、上記遺伝子がコードするメタロエンドペプチダーゼは、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列の３位のアミノ酸残基と４位のアミノ酸残基との間のペプチド結合に対する加水分解活性を有し、そして該配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、２位がＡｒｇ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、およびＴｙｒからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、３位がＴｙｒ、Ｐｒｏ、およびＬｅｕからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、そして４位がＬｅｕおよびＡｌａからなる群より選択されるアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるペプチドに対する基質優先性を有する。
【００１６】
本発明はさらに、上記の遺伝子を含む、発現用担体を提供する。
【００１７】
本発明はまた、上記の遺伝子が組み込まれている、形質転換細胞を提供する。
【００１８】
本発明はさらに、上記の形質転換細胞により産生される、組換えメタロエンドペプチダーゼを提供する。
【００１９】
本発明はまた、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＴＨ−３（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３４３）株を提供する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、ポストプロリン加水分解活性を有するメタロエンドペプチダーゼが提供される。本発明のメタロエンドペプチダーゼを用いれば、カゼイン、グルテン、コラーゲン、ゼラチンなどのプロリンリッチなタンパク質を、比較的短いペプチドに加水分解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本明細書において、アミノ酸の表記を、３文字または１文字で表記する場合がある。すなわち、アラニンは、ＡｌａまたはＡ；アルギニンは、ＡｒｇまたはＲ；アスパラギンは、ＡｓｎまたはＮ；アスパラギン酸は、ＡｓｐまたはＤ；システインは、ＣｙｓまたはＣ；グルタミン酸は、ＧｌｕまたはＥ；グルタミンは、ＧｌｎまたはＱ；グリシンは、ＧｌｙまたはＧ；ヒスチジンは、ＨｉｓまたはＨ；イソロイシンは、ＩｌｅまたはＩ；ロイシンは、ＬｅｕまたはＬ；リジンは、ＬｙｓまたはＫ；メチオニンは、ＭｅｔまたはＭ；フェニルアラニンは、ＰｈｅまたはＦ；プロリンは、ＰｒｏまたはＰ；セリンは、ＳｅｒまたはＳ；トレオニンは、ＴｈｒまたはＴ；トリプトファンは、ＴｒｐまたはＷ；チロシンは、ＴｙｒまたはＹ；そしてバリンは、ＶａｌまたはＶを示す。また、任意のアミノ酸は、ＸａａまたはＸ、あるいはＹａａまたはＺａａと表記する場合がある。
【００２２】
本明細書において、「置換、欠失、挿入または付加」を有するアミノ酸配列とは、天然由来の変異を有するアミノ酸配列であってもよく、人為的な変異を導入されたアミノ酸配列であってもよい。「アミノ酸配列の置換、欠失、挿入または付加」は、当該技術分野で通常用いられる部位特異的変異導入法などにより、アミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸に対して生じさせ得る。得られたアミノ酸配列を有するペプチドが、元のペプチドと同等またはそれ以上の活性を示せばよい。
【００２３】
本発明のメタロエンドペプチダーゼは、ポストプロリン加水分解活性を有する。すなわち、ペプチド中のプロリン残基のＣ末端側のペプチド結合を切断する活性を有する。
【００２４】
本発明において、メタロエンドペプチダーゼの酵素活性を測定する際に用いられる基質としては、ＦＩＴＣ−ゼラチン（Molecular Probes）が挙げられる。これは、ゼラチンを、プロテアーゼによる切断により蛍光が消光して、その蛍光を検出するように、フルオレセインで高濃度に標識されている。このような基質として他に、例えば、高蛍光の（７−メトキシクマリン−４−イル）アセチル−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄ−２，３−ジアミノプロピオン酸（２，４−ジニトロフェニル）−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号３：以下、ＭＯＣＡｃ−ＫＰＬＧＬ−Ｄｎｐと記載する）が挙げられる。
【００２５】
本発明において、メタロエンドペプチダーゼの酵素活性の測定は、例えば、以下のように行われ得る。まず、測定対象の酵素を含む反応液を基質溶液（例えば、約５０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ−ゼラチンおよび２５ｍＭのＣａＣｌ２を含む８０〜１００ｍＭのＴｒｉｓ−マレイン酸緩衝液（ｐＨ７．０））に加え、次いで反応液を３７℃にて約１〜５分間インキュベートする。次いで、反応を、３７℃にてλｅｘ３５５ｎｍおよびλｅｍ４６０ｎｍでの蛍光強度の上昇によってモニターすることができる。あるいは、ＭＯＣＡｃ−ＫＰＬＧＬ−Ｄｎｐを基質として用いる場合は、反応を、加熱処理（９０℃にて約５分間）で停止させた後、例えば、等量の水／アセトニトリル／ＴＦＡ＝７０／３０／０．１(v/v/v)を試料に加え、そして得られた試料をＨＰＬＣ分析することによって、切断されたＭＯＣＡｃ−ＫＰＬＧＬ−Ｄｎｐに由来するフラグメントを検出できる（例えば、励起波長３２８ｎｍおよび発光波長３９３ｎｍ）。
【００２６】
本発明のメタロエンドペプチダーゼは、至適反応ｐＨが、好ましくはｐＨ６．５〜７．５であり、そして至適反応温度が、１０℃以上、好ましくは２５℃以上、より好ましくは３７℃以上、さらに好ましくは約４０℃である。また、本発明のメタロエンドペプチダーゼは、５０％熱不活性化温度として、約５０℃の熱安定性を示す。
【００２７】
本発明のメタロエンドペプチダーゼは、カルシウムイオンおよびコバルトイオンの存在により、その酵素活性が増強される。しかし、酵素の安定性については、これらの金属イオンによる影響を受けない。一方、ＥＤＴＡ、１，１０−フェナンスロリン、ジチオトレイトールおよびグルタチオンの存在下では、酵素活性が阻害される。例えば、１０ｍＭの還元型および酸化型グルタチオンの存在下では、酵素活性は完全に阻害される。
【００２８】
本発明のメタロエンドペプチダーゼは、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、好ましくは、２位がＡｒｇ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、およびＴｙｒからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、３位がＴｙｒ、Ｐｒｏ、およびＬｅｕからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、そして４位がＬｅｕおよびＡｌａからなる群より選択されるアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるペプチドに対して、３位のアミノ酸残基と４位のアミノ酸残基との間のペプチド結合に対する加水分解活性についての基質優先性を有する。
【００２９】
本発明のメタロエンドペプチダーゼは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲルろ過分析、およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析に基づいて算出された分子量が約３５ｋＤａであり、単量体である。
【００３０】
本発明のメタロエンドペプチダーゼとしては、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＴＨ−３株［Streptomyces aureofaciens TH-3と命名・表示され、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３４３（寄託日：２００７年８月１７日）として、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１−１）に寄託されている］により産生されるメタロエンドペプチダーゼが挙げられる。
【００３１】
本発明のストレプトマイセス・オーレオファシエンス  ＴＨ−３（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３４３）株は、岡山県の吉備高原の土壌より分離された放線菌であり、ＩＳＰ培地Ｎｏ．２（「ダイゴ」日本製薬株式会社）にて３０℃で４８時間培養した場合、以下の（ｉ）〜（iii）の性質を有する。
【００３２】
（ｉ）形態的性質（ＩＳＰ培地Ｎｏ．２で生育）
コロニーサイズ：φ４．０〜５．０ｍｍ
コロニー表面の形状：しわ状
コロニーの色調：表面（気菌糸）および裏面（基生菌糸）ともに茶色
水溶性色素産生：−
なお、ＩＳＰ培地Ｎｏ．３、ＩＳＰ培地Ｎｏ．４、またはＩＳＰ培地Ｎｏ．５で生育させた場合には、コロニー表面および基底ともに灰色であった。
【００３３】
（ii）培養的性質
気菌糸の形状：分岐あり、幅０．７〜０．８μｍ
【００３４】
（iii）生理・生化学的性質（＋は陽性、−は陰性を示す）
ゼラチンの液化：              −
デンプンの加水分解：          ＋
硝酸還元反応：                −
脱脂粉乳のペプトン化・凝固：  −
生育温度の範囲（℃）：
２０                    ＋（反応弱）
２５                    ＋
３０                    ＋
３７                    ＋
４５                    −
耐塩性（％）：
３．０                  −
５．０                  −
７．０                  −
１０．０                −
炭素源の利用性：
ＩＳＰ培地Ｎｏ．９          −
グルコース                  ＋
Ｌ−ラムノース              ＋
Ｄ−マンニトール            ＋
Ｄ−フラクトース            −
Ｌ−アラビノース            ＋
ラフィノース                ＋
シュクロース                −
Ｄ−キシロース              ＋
イノシトール                ＋
メラニン様色素産生：
ＩＳＰ培地Ｎｏ．６          −
ＩＳＰ培地Ｎｏ．７          −
【００３５】
このストレプトマイセス・オーレオファシエンス  ＴＨ−３株を培養し、培養上清から単離・精製することによって、メタロエンドペプチダーゼを容易に得ることができる。ストレプトマイセス・オーレオファシエンス  ＴＨ−３株の培養条件は、特に限定されず、約３０℃、例えば、２５〜３４℃で、５日間前後、例えば、３〜５日間培養する条件が挙げられる。菌体を良好に生育させる観点から、エアレーションを十分にすることが望ましく、例えば、回転振盪させることが望ましい。
【００３６】
より具体的には、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス  ＴＨ−３株を、５００ｍＬ容のバッフル付きフラスコ中の２．０％(w/v)グルコース、０．８％(w/v)Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５％(w/v)ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５％(w/v)ポリペプトン、および０．５％(w/v)イーストエクストラクトを含む培養培地（５０ｍＬ）にて、１２５ｒｐｍで回転振盪しながら３０℃にて３日間増殖させる。
【００３７】
得られた培養物は、細胞と培地成分とを分離し得る手段、例えば、遠心分離、限外ろ過などに供し、培養上清を得る。得られた培養上清は、適切な緩衝液などに対して透析してもよい。さらに、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーなどの当該技術分野で通常用いられるタンパク質精製法により、本発明のメタロエンドペプチダーゼを精製することができる。
【００３８】
より具体的には、４℃にて、０．４５μｍ孔径での限外ろ過により培養ろ液（上清）を得る。このろ液を７０％(w/v)飽和硫酸アンモニウム分画に供し、沈殿物を回収して、０．２ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解する。この溶液を、ゲルろ過カラムにかけ、活性の高い画分をプールし、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析する。遠心分離後、得られた上清を、イオン交換カラムにかけて、活性の高い画分を溶出させることにより、目的のメタロエンドペプチダーゼを得ることができる。
【００３９】
このようにして得られるストレプトマイセス・オーレオファシエンス  ＴＨ−３株由来のメタロエンドペプチダーゼの一次構造は、バシラス・サーモプロテオリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来のサーモライシン（非特許文献１３）、ストレプトマイセス・セプタタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｐｔａｔｕｓ）由来のメタロエンドペプチダーゼ（非特許文献１０）、およびストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）由来のメタロエンドペプチダーゼ（非特許文献１４）と、それぞれ４０％、６６％、および６１％の配列同一性を示す。また推定アミノ酸配列は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属のメタロエンドペプチダーゼ中で保存されている亜鉛結合のためのＨＥＸＸＨコンセンサス配列およびＣＦＣモチーフを含む。
【００４０】
本発明のメタロエンドペプチダーゼとしては、より具体的には、
（Ａ）配列表の配列番号２の２２１位から５４７位までのアミノ酸配列、
（Ｂ）配列表の配列番号２の２２１位から５４７位までのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸配列、および
（Ｃ）配列表の配列番号２の２２１位から５４７位までのアミノ酸配列に対し、ＦＡＳＴＡアルゴリズムで、ＫＴＵＰ ２、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０．０、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １の条件で算出された配列同一性が、少なくとも７５％であるアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、メタロエンドペプチダーゼが挙げられる。
【００４１】
上記（Ａ）の配列表の配列番号２の２２１位から５４７位までのアミノ酸配列は、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス  ＴＨ−３株のメタロエンドペプチダーゼのアミノ酸配列である。このストレプトマイセス・オーレオファシエンス  ＴＨ−３株由来のメタロエンドペプチダーゼは、配列表の配列番号２の１位から９位までのアミノ酸配列からなるプレ配列、および１０位から２２０位までのアミノ酸配列からなるプロ配列を有すると推定される。
【００４２】
本発明においては、上記メタロエンドペプチダーゼ活性の測定法の条件下に、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列の３位のアミノ酸残基と４位のアミノ酸残基との間のペプチド結合に対する加水分解活性を有し、該配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、２位がＡｒｇ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、およびＴｙｒからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、３位がＴｙｒ、Ｐｒｏ、およびＬｅｕからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、そして４位がＬｅｕおよびＡｌａからなる群より選択されるアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるペプチドに対する優先性を有するものであれば、本発明のメタロエンドペプチダーゼには、配列表の配列番号２の２２１位から５４７位までのアミノ酸配列のバリアントの配列を有するポリペプチドも含まれる。配列表の配列番号２の２２１位から５４７位までのアミノ酸配列のアミノ酸配列のバリアントとしては、上記（Ｂ）または（Ｃ）のアミノ酸配列が挙げられる。また、後述の核酸によりコードされるポリペプチドであって、上記メタロエンドペプチダーゼ活性の測定法の条件下に同様の活性を示すものであれば、本発明のメタロエンドペプチダーゼに含まれる。
【００４３】
上記（Ｂ）および（Ｃ）のアミノ酸配列のバリアントの天然の供給源となる生物は、特に限定されるものではなく、ストレプトマイセス・オーレオファシエンスに分類される他の株などが挙げられる。
【００４４】
上記（Ｂ）のアミノ酸配列について、配列表の配列番号２の２２１位から５４７位までのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加（以下、「変異」ともいう）の数は、上記メタロエンドペプチダーゼ活性の測定法の条件下に同様の活性を示す範囲であればよく、少なくとも１個、好ましくは、１個〜複数個、より好ましくは、１個〜数個である。上記変異を有するアミノ酸配列は、天然に存在するアミノ酸配列、すなわち、自然発生による変異を有するアミノ酸配列であってもよく、人為的に、所望の部位またはアミノ酸残基に変異を導入したアミノ酸配列であってもよい。人為的に、所望の部位またはアミノ酸残基に変異を導入する場合、天然に存在する配列表の配列番号２の２２１位から５４７位までのアミノ酸配列のバリアントに準じて人為的に変異を導入してもよい。人為的な変異の導入は、例えば、慣用のＰＣＲを用いた部位特異的変異導入方法などにより行われ得る。
【００４５】
上記（Ｂ）のアミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、配列表の配列番号２の２２１位から５４７位までのアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基が、類似した物理学的性質を有する他のアミノ酸残基に置換（保存的置換）されたアミノ酸配列が挙げられる。保存的置換は、例えば、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴などに類似した機能を発揮するアミノ酸残基との置換、本来のポリペプチドの生理活性を維持する程度にのみ該ポリペプチドの立体構造や折り畳み構造を変化させ得ないアミノ酸残基との置換などが挙げられる。より具体的には、上記（Ｂ）のアミノ酸配列としては、配列表の配列番号２の２２１位から５４７位までのアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基が、他のアミノ酸と保存的置換されたアミノ酸配列を有し、該保存的置換が、以下のアミノ酸群（１）〜（６）：
（１）グリシンおよびアラニン、
（２）バリン、イソロイシンおよびロイシン、
（３）アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンおよびグルタミン、
（４）セリンおよびスレオニン、
（５）リジンおよびアルギニン、および
（６）フェニルアラニンおよびチロシン
からなる群より選択されるアミノ酸群に属するアミノ酸残基内で行われたものであるアミノ酸配列が挙げられる。
【００４６】
上記（Ｃ）において、配列同一性は、参照配列（例えば、配列表の配列番号２の２２１位から５４７位までのアミノ酸配列）に対して、クエリー配列（評価対象の配列）を、適切にアラインメントし、算出された値である。具体的には、本明細書においては、配列同一性は、商品名：ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ（ソフトウェア開発株式会社製）によるマルチプルアラインメントにおいて使用可能なアルゴリズムをデフォルト値、より具体的には、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎによるＦＡＳＴＡアルゴリズムで、ＫＴＵＰ １〜２（アミノ酸配列ベース）、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０．０、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １の条件で用いて、算出された値である。
【００４７】
本発明においては、配列同一性は、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらにより好ましくは９０％以上、特に好ましくは９８％以上である。
【００４８】
本発明のメタロエンドペプチダーゼはまた、以下に詳述する本発明の遺伝子を用いて、遺伝子工学的に製造することができる。例えば、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス  ＴＨ−３株とは異なる異種細胞において、本発明のメタロエンドペプチダーゼを発現させることができる。
【００４９】
本発明のメタロエンドペプチダーゼをコードする遺伝子は、
（ａ）配列表の配列番号２の２２１位から５４７位までのアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｂ）配列表の配列番号２の２２１位から５４７位までのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｃ）配列表の配列番号２の２２１位から５４７位までのアミノ酸配列に対し、ＦＡＳＴＡアルゴリズムで、ＫＴＵＰ ２、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０．０、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １の条件で算出された配列同一性が、少なくとも７５％であるアミノ酸配列をコードする塩基配列、および
（ｄ）配列表の配列番号２の２２１位から５４７位までのアミノ酸配列をコードする塩基配列のアンチセンス鎖と、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする塩基配列、
からなる群より選択される塩基配列を有する。
【００５０】
このうち（ａ）〜（ｃ）の塩基配列は、それぞれ、上記（Ａ）〜（Ｃ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列であり、そして（ｄ）の塩基配列は、上記（Ａ）〜（Ｃ）のアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列であり得る。この遺伝子によってコードされるメタロエンドペプチダーゼは、プロリン残基を含むペプチド中の該プロリン残基のＣ末端側のペプチド結合に対する加水分解活性を有する。
【００５１】
上記（ｄ）の「ストリンジェントな条件」とは、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ＳＤＳと５×デンハルトと１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡと５０％(v/v)ホルムアミドとを含む溶液中、室温にて１２時間インキュベートし、さらに０．５×ＳＳＣで５０℃以上の温度で洗浄する条件をいう。さらに、よりストリンジェントな条件、例えば、４５℃または６０℃にて１２時間インキュベートすること、０．２×ＳＳＣまたは０．１×ＳＳＣで洗浄すること、洗浄に際し６０℃または６５℃以上の温度条件で洗浄することなどの、より厳しい条件も含む。また、本発明においては、配列表の配列番号２の２２１位から５４７位までのアミノ酸配列をコードする塩基配列のアンチセンス鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列は、該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列に関して、配列表の配列番号２の２２１位から５４７位までのアミノ酸配列との配列同一性が、少なくとも７５％、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９８％以上であり、該塩基配列に関して、配列表の配列番号２の２２１位から５４７位までのアミノ酸配列をコードする塩基配列との配列同一性が、少なくとも７０％、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である塩基配列との特異的なハイブリダイゼーションが達成され得る条件であることが望ましい。
【００５２】
なお、本明細書においては、塩基配列の配列同一性は、ＦＡＳＴＡアルゴリズムで、ＫＴＵＰ ６、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ ２．０、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １４、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ ２の条件で算出された値である。
【００５３】
また、本発明の遺伝子に基づき、本発明のメタロエンドペプチダーゼと同等の生理活性を示すアイソザイムをスクリーニングするための、プローブおよびプライマー対も提供できる。
【００５４】
さらに、本発明の遺伝子を含むメタロエンドペプチダーゼの発現用担体を用いて、本発明の遺伝子によりコードされる組換えメタロエンドペプチダーゼを製造することもできる。本明細書において、「発現用担体」とは、慣用の生物ベクターなどを基本骨格として含有し、かつ適切な位置に本発明の遺伝子が作動可能に連結された核酸構築物；金粒子、リポソーム、デキストラン、リン酸カルシウムなどの担体に、細胞内での発現に適したエレメントなどを有する本発明の遺伝子を担持させた構築物などを意味する。
【００５５】
本発明のメタロエンドペプチダーゼの発現用担体を用いて、本発明のメタロエンドペプチダーゼをストレプトマイセス・オーレオファシエンス  ＴＨ−３株以外の細胞に導入することができ、それにより、異種細胞において本発明のメタロエンドペプチダーゼを発現させることができる。したがって、本発明のメタロエンドペプチダーゼの工業的な生産のための手段が提供される。
【００５６】
上記生物ベクターとしては、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＣＲ３、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ、ｐＥＴｋｍＳ２（Mishima, N.ら、Biotechnol. Prog.、第13巻、864-868頁、1997年）、ｐＯＭａｌ（New England Biolabs）などの大腸菌用プラスミドベクター；λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１１などの大腸菌用ファージベクター；ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＵｒａ３、ｐＩＣＺα（インビトロジェン株式会社）などの酵母用ベクター；ｐＩＪ４８６（Mol. Gen. Genet.、203巻、468-478頁、1986年）、ｐＫＣ１０６４（Gene、103巻、97-99頁、1991年）、ｐＵＷＬ−ＫＳ（Gene、165巻、149-150頁、1995年）、ｐＩＪ７０２（Katz, E.ら、J. Gen. Microbiol.、129巻、2703-2714頁、1983年）、およびｐＩＪ８６００（Sun, J.ら、Microbiology、145巻、2221-2227頁、1999年）などの放線菌用ベクター；ｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａなどの昆虫細胞用ベクター；ｐＫＣＲ、ｐＥＦＢＯＳ、ｃＤＭ８、ｐＣＥＶ４などの動物細胞用ベクターなどが挙げられる。このようなベクターには、適切なプロモーター（例えば、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターなど）、選択マーカー遺伝子、ターミネーターなどのエレメントを適宜有していてもよい。
【００５７】
また、上記ベクターは、本発明のメタロエンドペプチダーゼを、慣用のタグ（例えば、Ｈｉｓタグなど）や融合パートナー（例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼなど）と融合した状態で発現させ得るベクターであってもよい。
【００５８】
このようなベクターの調製に用いられる菌としては、例えば、当該技術分野で通常用いられる宿主菌が挙げられ、具体的には、例えば、放線菌、大腸菌などが挙げられる。より具体的には、放線菌としては、ストレプトマイセス・リビダンス１３２６、ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ−２３など、そして大腸菌としては、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＪＭ１０９などが挙げられる。これらの宿主菌のうち、精製の容易化、大量調製、安全性などの観点から、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＪＭ１０９が望ましい。
【００５９】
本発明のメタロエンドペプチダーゼの発現用担体は、適切な宿主細胞へ導入されて、宿主細胞を形質転換して、形質転換細胞を作製する。形質転換法として、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクル銃によるボンバードメント法など、当業者に周知の方法が採用される。
【００６０】
本発明においては、宿主細胞として、好適には微生物（宿主菌）が用いられる。宿主菌としては、放線菌、大腸菌、バシラス属菌、シュードモナス属菌、サーマス属菌、アグロバクテリウム属菌、酵母（例えば、メタノール資化性酵母Ｐｉｃｈｉａなど）などが挙げられる。中でも、本発明においては、放線菌が好適に用いられる。
【００６１】
本発明において、放線菌とは、放線菌目（ｏｒｄｅｒ  Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）に属する菌をいう。放線菌は、グラム陽性細菌に所属する一分類群であり、主に土壌などに生息する。原核生物であるが、多くの放線菌は分岐を伴う糸状の生育を示し、多様な形態を呈する。また、一般的に胞子を形成し、中には胞子嚢や運動性胞子を形成する種も存在する。また、放線菌からは種々の抗生物質および他の生物学的に重要な化合物が発見されている。放線菌目には、フランキア科（Ｆｒａｎｋｉａｃｅａｅ）、ミクロモノスポラ科（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）、プロピオニバクトリウム科（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、シウドノカルジア科（Ｐｓｕｏｄｏｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）、ストレプトマイセス科（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅａｅ）、ストレプトスポランギウム科（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｕａｃｅａｅ）、テルモモノスポラ科（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）、コリネバクテリウム科（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、マイコバクテリウム科（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕａｃｅａｅ）、およびノカジア科（Ｎｏｃａｕｄｉａｃｅａｅ）が含まれる。本発明において放線菌とは、好ましくは、ストレプトマイセス科、より好ましくはストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する菌である。ストレプトマイセス属に属する菌としては、例えば、ストレプトマイセス・セプタタス（Ｓ．ｓｅｐｔａｔｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・ラベンデュラエ（Ｓ．ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）、ストレプトマイセス・バージニア（Ｓ．ｖｉｒｇｉｎｉａ）、およびストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）が挙げられる。本発明においては、宿主菌として、特にストレプトマイセス・リビダンスが好適に用いられる。このようなストレプトマイセス属に属する放線菌やその他の放線菌は、種々のカタログに記載されており、当業者であれば容易に入手可能である。
【００６２】
宿主細胞への本発明の発現用担体の導入により得られた細胞が、目的の形質転換細胞であることは、細胞または該細胞の培養上清について、上記メタロエンドペプチダーゼ活性の測定法により、メタロエンドペプチダーゼ活性が検出されることを指標として、確認され得る。
【００６３】
本発明の形質転換細胞を培養して増殖させることにより、本発明のメタロエンドペプチダーゼを遺伝子工学的に容易に精製できる状態で発現させることができ、それにより、該メタロエンドペプチダーゼを工業的に製造することができる。
【００６４】
本発明の組換えメタロエンドペプチダーゼの製造においては、培地組成、培地のｐＨ、培養温度、培養時間の他、インデューサーの使用量、使用時間などについて、メタロエンドペプチダーゼの発現の最適な条件を決定することによって、効率よく組換えメタロエンドペプチダーゼを生産させることができる。
【００６５】
本発明の形質転換細胞の培養に通常用いられる培地としては、天然培地および合成培地のいずれを用いてもよい。液体培地または固体培地を使用することができる。例えば、宿主菌が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であればよい。炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、スクロース、ラフィノース、デンプンなどの炭水化物、酢酸、プロピオン酸などの有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物が挙げられる。その他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、各種アミノ酸などを含んでいてもよい。その他に、無機塩として、微量のカリウム、ナトリウム、鉄などのリン酸塩、塩酸塩、硝酸塩、酢酸塩などを含んでいてもよい。また、必要に応じて植物油、界面活性剤、シリコンなどの消泡剤を添加してもよい。
【００６６】
培養条件は、培地の種類、培養方法などにより適宜選択すればよく、宿主細胞が増殖し、目的のタンパク質を産生できる条件であれば特に制限はない。通常、液体培地中で振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下で、１０℃〜４０℃、好ましくは２８℃で１２〜１２０時間行われる。ｐＨは、４から１０、好ましくは６から８に調節される。ｐＨの調整は、無機酸または有機酸、アルカリ溶液などを用いて行う。
【００６７】
形質転換細胞が生産する組換えメタロエンドペプチダーゼは、それが細胞内に生産されるときは細胞内の他のタンパク質、他のポリペプチドなどが共存するが、これらは発現されるメタロエンドペプチダーゼの量に比べて微量にすぎないため、その精製は極めて容易であるという優れた利点がある。また、ベクターとして菌体外分泌型のベクターを用いた場合、メタロエンドペプチダーゼが菌体外に分泌される。
【００６８】
形質転換細胞の培養物からメタロエンドペプチダーゼ活性を有するポリペプチドを精製するには通常の方法が用いられる。形質転換細胞が大腸菌のように細胞内にメタロエンドペプチダーゼ活性を有するポリペプチドが蓄積する場合には、培養終了後、遠心分離によって形質転換細胞を集め、得られた細胞を超音波処理などによって破砕した後、遠心分離などによって無細胞抽出液を得る。これを出発材料とし、塩析法や、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーなどの一般的なタンパク質精製法により精製することができる。用いる形質転換細胞によっては、発現産物が細胞外に分泌される場合がある。このような場合、培養上清から同様に精製を行えばよい。
【実施例】
【００６９】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は、実施例により限定されるものではない。特に明記しない限り、各種操作は、モレキュラークローニング ア ラボラトリー マニュアル（Molecular Cloning A Laboratory Manual）第２版（ザンブルーク（Sambrook, J）ら、1989年）に従って行った。なお、実施例において、％は、特に明記しない限り、ｗ／ｖ％を表す。
【００７０】
以下の実施例における一般的な酵素活性の測定は、ＦＩＴＣ−ゼラチン加水分解アッセイにより行った。
【００７１】
ＦＩＴＣ−ゼラチン（Molecular Probes）は、フルオレセインで大量に標識されており、その分子内ではほぼ完全に消光しているが、酵素加水分解により分子内自己消光が緩和され、明るい蛍光反応産物を生成する。代表的には、以下のように測定した。このＦＩＴＣ−ゼラチンを蒸留水に溶解し、基質溶液とした（１ｍｇ／ｍＬ）。１０μＬの基質溶液を、蛍光分析用のマイクロタイタープレートのウェルあたり２５ｍＭのＣａＣｌ２を含む１００ｍＭのＴｒｉｓ−マレイン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１８０μＬに加えた。１０ｍＬの酵素溶液を各ウェルに加えて反応を開始した。反応を、ARVO 1420マルチラベルカウンター（Perkin Elmer）を用いて３７℃にてλｅｘ５３５ｎｍおよびλｅｍ４８５ｎｍでの蛍光強度の上昇によってモニターした。酵素活性を、フルオレセインイソチオシアネート（和光純薬工業株式会社）溶液を用いてプロットした標準曲線から推定した。
【００７２】
（実施例１：ストレプトマイセス・オーレオファシエンスＴＨ−３株の培養物からのメタロエンドペプチダーゼの精製および生化学的特徴）
岡山県の吉備高原の土壌より分離された放線菌ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＴＨ−３株を、５００ｍＬ容のバッフル付きフラスコ中の２．０％グルコース、０．８％Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５％ポリペプトン、および０．５％イーストエクストラクトを含む培養培地（５０ｍＬ）にて、１２５ｒｐｍで回転振盪しながら３０℃にて３日間増殖させた。
【００７３】
次いで、４℃にて、０．４５μｍ孔径での限外ろ過により、１５０ｍＬの培養ろ液を得た。このろ液を７０％飽和硫酸アンモニウムに加え、１５０００×ｇにて２時間遠心分離して沈殿物を回収した。得られた沈殿物を、０．２ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解して、試料を調製した。この試料を、同じ緩衝液で平衡化しておいたＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムにかけ、活性の高い画分をプールし、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析した。遠心分離後、上清を、透析緩衝液で予め平衡化しておいたＭｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ５／５にかけた。２０ベッド容量の緩衝液中の０〜０．２５ＭのＮａＣｌでの直線グラジエントにより酵素を溶出した。精製過程を表１に示す。精製工程において、酵素活性は、２５ｍＭのＣａＣｌ２を含む８０ｍＭのＴｒｉｓ−マレイン酸（ｐＨ７．０）中の５０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ−ゼラチンを用いて３７℃にて測定した。酵素活性の１ユニットは、上記条件下で１分当たり１ｎｍｏｌのＦＩＴＣを放出するに必要な酵素量として算出した。
【００７４】
【表１】
2009171871.tif 000002
【００７５】
１５０ｍＬの培養ろ液から、メタロエンドペプチダーゼを均一にまで精製し（図１）、８．０％の収率で１３．１倍に精製した。このストレプトマイセス・オーレオファシエンスＴＨ−３株由来のメタロエンドペプチダーゼをキビライシン（kibilysin）と命名した。したがって、以下、ストレプトマイセス・オーレオファシエンスＴＨ−３株由来のメタロエンドペプチダーゼをキビライシンと記載する場合がある。
【００７６】
得られた酵素の一部を、ZipTip μC18（Millipore）を用いて固相抽出によって精製し、そしてAutoflex II TOF/TOF（BRUKER DALTONICS）でのマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）飛行時間マススペクトル法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）分析を行った。その結果、分子量が約３５ｋＤの単量体であることがわかった。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲルろ過クロマトグラフィーによっても、分子量が約３５ｋＤａであることを確認した。
【００７７】
至適ｐＨおよび温度、熱およびｐＨ安定性、アクチベーターおよびインビビターなどの基本的酵素学的特性について検討した。結果を表２に示す。
【００７８】
【表２】
2009171871.tif 000003
【００７９】
酵素活性は、２５ｍＭＣａＣｌ２の存在によって１．３倍に増強されたが、その安定性は増強されなかった（データは示さず）。２５ｍＭのＣａＣｌ２の存在下で１０ｍＭのＣｏＣｌ２によっても１．７倍の増強効果があった（データは示さず）。一方、酵素活性は、ＥＤＴＡ、１，１０−フェナンスロリン、およびジチオトレイトールによって阻害された。さらに、１０ｍＭの還元型および酸化型グルタチオンの存在下でも、酵素活性は完全に阻害された。
【００８０】
（実施例２：基質特異性の検討）
蛍光エネルギー転移（ＦＲＥＴＳ）コンビナトリアルライブラリーにより、基質特異性の解析を行った。ＦＲＥＴＳ−２５Ｘａａライブラリー（株式会社ペプチド研究所：配列番号３）は、図２に示される構造を有する基質のライブラリーである。これは、アミノ末端のＤ−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄ−Ａ２ｐｒ）残基の側鎖に結合した高蛍光の２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイル（Ｎｍａ）基を含み、このＮｍａはＬｙｓのε−アミノ基に連結した２，４−ジニトロフェニル（Ｄｎｐ）基によって効率的に消光されているという性質を有する。ＦＲＥＴＳ−２５Ｘａａライブラリーを基質として、上記実施例１で得た精製キビライシンについて、１００ｍＭのＴｒｉｓ−マレイン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて３７℃にて酵素反応を行った。
【００８１】
一次スクリーニングに、５０ｎｇの精製キビライシンを用いた。ＦＲＥＴＳを用いる手順は、非特許文献１０に従って行った。反応を、ARVO 1420マルチラベルカウンター（Perkin Elmer）を用いて３７℃にてλｅｘ３５５ｎｍおよびλｅｍ４６０ｎｍでの蛍光強度の上昇によってモニターした。なお、配列番号３（ＦＲＥＴＳ−２５Ｘａａライブラリー）の４位のアミノ酸がＧｌｙであるＦＲＥＴＳ−２５Ｇｌｙの２種の分解産物を用いて検量線を作成し、該検量線に基づき、基質選択性を評価した。結果を図３に示す。この結果から、キビライシンが、図３のグラフのＸ軸に記載の左から順にＰ１位でＬｅｕ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、およびＴｈｒ残基を優先することがわかる。
【００８２】
次いで、二次スクリーニングについては、ライブラリー中から最良の基質としてＦＲＥＴＳ−２５Ｌｅｕ（配列番号４）を選択した。２００ｎｇの精製キビライシンを用いて３７℃にて７分間または１４分間酵素反応を行って、Ｐ２位およびＰ３位についての酵素の基質優先性を決定した。反応液へのＥＤＴＡの添加により反応を停止し、基質の切断割合を決定した。得られた試料は、約５〜１７％が切断されていた液体クロマトグラフィー（ＬＣ）−マススペクトロメトリー（ＭＳ）により、酵素によって切断されたＦＲＥＴＳ−２５Ｌｅｕに由来する配列を同定した。結果を図４に示す。
【００８３】
図４に示すように、精製キビライシンは、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、およびＬｅｕにＰ１優先性を有し、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、およびＴｙｒにＰ２優先性を有し、そしてＬｅｕおよびＡｌａにＰ１’優先性を有した。この結果は、精製キビライシンがポストプロリン加水分解活性を明らかに有することを示す。なお、精製キビライシンは、Ｇｌｙ−Ｚａａ−Ｙａａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｈｅ配列を有するＦＲＥＴＳ−２５Ｐｒｏ（配列番号５）に対する活性が低かったので（データは示さず）、そのポストプロリン加水分解活性は、Ｐ３、Ｐ２およびＰ１’位の残基によって影響を受けるようである。
【００８４】
（実施例３：速度論的検討）
上記実施例２のＦＲＥＴＳ−２５Ｘａａライブラリーを用いて得られた結果に基づいて、高蛍光の（７−メトキシクマリン−４−イル）アセチル（ＭＯＣＡｃ）基を含むＦＲＥＴＳであるＭｏＣＡｃ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ２（ＭＯＣＡｃ−ＫＰＬＧＬ−Ｄｎｐ（非特許文献１５）、株式会社ペプチド研究所：配列番号６）を基質として設計した。
【００８５】
精製キビライシンのポストプロリン加水分解活性を確認するために、ＨＰＬＣ分析を行った。ＨＰＬＣは、Waters 474スキャンニング蛍光検出器を備えたＨＰＬＣミレニアムシステム（Ｗａｔｅｒｓ）およびYMC Hydrosphere C18  150×4.6mmカラム（ＹＭＣ）を用いて行った。溶離液Ａは、０．１％(v/v)トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）であり、そして溶離液Ｂは、水／アセトニトリル／ＴＦＡ＝３０／７０／０．０８５(v/v/v)であった。０．８ｍＬ／分の流速で２０分の時点で２０〜１００％の溶離液Ｂのグラジエントを用いた。検出波長は、３２５ｎｍ（励起）および４００ｎｍ（発光）であった。２５μＭのＭＯＣＡｃ−ＫＰＬＧＬ−Ｄｎｐを、２５ｍＭのＣａＣｌ２を含む１００ｍＭのＴｒｉｓ−マレイン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した。精製酵素（１００ｎｇ）を１００μＬの基質溶液に加え、次いで反応液を３７℃にて５分間インキュベートした。酵素反応を加熱処理（９０℃にて５分間）で停止した後、等量の水／アセトニトリル／ＴＦＡ＝７０／３０／０．１(v/v/v)を試料に加え、そして１０μＬの反応液をＨＰＬＣ分析に供した。Ｗａｔｅｒｓ社に依頼して、ＬＣ−ＭＳにより、精製キビライシンによって切断されたＭＯＣＡｃ−ＫＰＬＧＬ−Ｄｎｐに由来するフラグメントの分子量を同定した。結果を図５に示す。
【００８６】
精製キビライシンでの処理により、保持時間６分に新しいピークを検出した。このピークの蛍光強度は、保持時間１７分に検出される未処理の基質（ＭＯＣＡｃ−ＫＰＬＧＬ−Ｄｎｐ）よりも１０倍増強した。ＬＣ−ＭＳおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いて、切断された基質が、ＭＯＣＡｃ−ＫＰおよびＬＧＬ−Ｄｎｐの両フラグメントを含むことを確認した。この結果によれば、精製キビライシンは、確実にポストプロリン加水分解活性を有することがわかる。
【００８７】
次いで、基質のストック溶液を、２５ｍＭのＣａＣｌ２を含む１００ｍＭのＴｒｉｓ−マレイン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈した。この希釈した基質（３〜５０μＭ、４９０μＬ）を３７℃にて５分間プレインキュベートした。１０μＬの精製メタロエンドペプチダーゼ（５０ｎｇ／μＬ）を基質溶液に加え、次いで３７℃にて１分間反応させた。アッセイを、サーマルセルホルダーを備えたＨｉｔａｃｈｉ蛍光分光光度計F-4500を用いて行った（励起波長３２８ｎｍおよび発光波長３９３ｎｍ）。反応速度を、ＭＯＣＡｃ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（株式会社ペプチド研究所）溶液を用いてプロットした標準曲線から推定した。
【００８８】
その結果、基質に対するＳ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ  ＴＨ−３由来の精製メタロエンドペプチダーゼ（キビライシン）のＫｍ、ｋｃａｔ、およびｋｃａｔ／Ｋｍは、それぞれ２８．１±２．５μＭ、１２．０±０．８（１／秒）および０．４３±０．０１（１／秒・１／μＭ）であった。
【００８９】
（実施例４：メタロエンドペプチダーゼ遺伝子の取得）
精製キビライシンを１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。次いで、得られたゲル中のタンパク質を、トランスブロットＳＤセル（ＢｉｏＲａｄ社製）を用い、製造者の説明書に準じて、シーケブロットＰＶＤＦ（ＢｉｏＲａｄ社製）にエレクトロブロッティングした。ブロットされたタンパク質を、プロテインシークエンサーに供して、Ｎ末端アミノ酸配列（ＡＡＧＴＧＮＶＦＶ：配列番号７）を同定した。また、精製キビライシンを、トリプシンで処理し、トリプシン処理ペプチド断片を得た。得られたトリプシン処理ペプチド断片を、ＬＣ−ＭＳにより解析し、内部アミノ酸配列（ＥＳＡＡＶＤＡＱＦＧ：配列番号８およびＡＡＴＬＳＡＡＳＤＬＹＧ：配列番号９）を同定した。
【００９０】
次に、ゲノムＤＮＡを、Hopwoodらの方法（D.A. Hopwoodら、A Laboratory Manual, The John Ines Foundation，Norwich，1985年，70-84頁）を用いてストレプトマイセス・オーレオファシエンスＴＨ−３株から調製した。キビライシン遺伝子フラグメントを、キビライシンのＮ末端配列（ＡＡＧＴＧＮＶＦＶ：配列番号７）および内部配列（ＡＡＴＬＳＡＡＳＤＬＹＧ：配列番号９）から設計したプライマー（フォワード：５’−ＡＣ（ＣＧ）ＧＧ（ＣＧ）ＡＡＣＧＧ（ＣＧ）ＧＴ（ＣＧ）ＴＴＣＧＴ−３’（配列番号１０）およびリバース：５’−ＣＣＧＴＡ（ＣＧ）Ａ（ＧＡ）ＧＴＣ（ＣＧ）（ＣＧ）（ＴＡ）（ＣＧ）ＧＣ（ＣＧ）ＧＣ−３’（配列番号１１））を用いて、ゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲは、９８℃にて１分のインキュベーションの後、９８℃にて３０秒、５０℃にて３０秒、７２℃にて１分を３０サイクル行い、次いで７２℃にて５分のインキュベーションを行った。ＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（Promega）中にクローニングし、そして配列決定した。ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識したプローブを、キビライシン遺伝子配列の一部およびＰＣＲ  ＤＩＧプローブ合成キット（Roche Molecular Biochemicals）を用いて合成した。このプローブを、ＢａｌＩで切断したゲノムＤＮＡの２．５ｋｂフラグメントにハイブリダイズさせた。次に、これらのフラグメントを、アガロースゲル電気泳動を用いて回収し、そして自己ライゲートさせた。ライゲーション産物を、キビライシン遺伝子の部分ＤＮＡフラグメントから設計したプライマーセットを用いて増幅した。ＰＣＲ産物をクローニングして配列決定した。結果を図６に示す。
【００９１】
図６に示すように、キビライシン遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１、ＤＤＢＪデータベースアクセッション番号：ＡＢ２８１１８５）を示す。Ｎ末端および内部アミノ酸配列の解析から、１８６１〜１８６３位にインフレームの停止コドンＴＡＧがある。推定アミノ酸配列からのキビライシンの一次構造は、Ｓ．ｓｅｐｔａｔｕｓ  ＴＨ−２（ＳＳＭＰ）（非特許文献１０）およびＳ．ｇｒｉｓｅｕｓ（ＳＧＭＰ）（非特許文献１６）由来のメタロエンドペプチダーゼの構造と類似する。キビライシン遺伝子とこれらの２つの放線菌メタロエンドペプチダーゼの遺伝子とを比較すると、キビライシンは、Ｎ−プレ配列（１１アミノ酸残基）およびＮ−プロ配列（２０９アミノ酸残基）を有するようである。推定リボソーム結合部位は、Ｎ−プレ配列の上流に見られた。推定リボソーム結合部位からＮ−プレ配列までの領域に、ＡＴＧ開始コドンはなかった。ヌクレオチド２２０〜２２２位に見られるＧＴＧコドンは、放線菌の開始コドンと同様に作用すると推定された。オープンリーディングフレームは、１６４４ヌクレオチド長であり、推定分子量５６９４５の５４７アミノ酸の酵素をコードすると推定された。成熟酵素の計算分子量は３４３８９であり、これはＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって決定した実測分子量（約３５ｋＤ）と一致する（データは示さず）。
【００９２】
また、成熟メタロエンドペプチダーゼの一次構造のアラインメントを図７に示す。図７においては、ＳＳＭＰ、ＳＧＭＰ、およびサーモライシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ由来：非特許文献９）と並べた。アステリスクは、４つの配列中の同一残基を示す。亜鉛結合部位についてのコンセンサス配列（ＨＥＸＸＨ）に下線を付し、そしてＣＦＣモチーフを四角で囲む。その推定アミノ酸配列は、亜鉛結合に関与するＨＥＸＸＨコンセンサス配列を含み、したがって、メタロエンドペプチダーゼをコードすることを確認した。
【００９３】
（参考例１：発現ベクターｐＴＯＮＡ５の作製）
大腸菌と放線菌との間の遺伝子間結合によって、ストレプトマイセスのメタロエンドペプチダーゼのプロモーターを含む発現ベクターｐＴＯＮＡ５ａを構築した。
【００９４】
まず、pBluescript II KS (-)（TOYOBO）を鋳型に大腸菌ＪＭ１０９のｏｒｉ（０．６ｋｂ）の部分をプライマー１および２（配列番号１２および１３）を用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲの条件は、９４℃で２分の後、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で１分を３０サイクル繰り返し、その後４℃に冷却した。ＰＣＲには、KOD plus DNAポリメラーゼ（TOYOBO）を用いた。次いで、ｐＴＹＭ１８（オナカ（Onaka,H.）ら、J. Antibiotics、56巻、950-956頁、2003年）を鋳型に、ａｐｈＩＩ（大腸菌−放線菌カナマイシン耐性遺伝子：１．３ｋｂ）を、プライマー３および４（配列番号１４および１５）を用いて上記と同様にＰＣＲで増幅した。
【００９５】
得られた２つの断片をそれぞれ制限酵素SspIおよびPstIで処理し、２つの断片を互いにライゲーションした後、大腸菌に導入した。大腸菌を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地（１％ＮａＣｌ、１％ポリペプトン、および０．５％酵母エキス）中３７℃にてカナマイシンを選択マーカーにして、ライゲーションした断片を含むプラスミドｐＢＳａｐｈＩＩを得た。ｐＩＪ７０２（モルナー（Molnar）ら、J. Ferment. Bioeng.、72巻、368-372頁、1991年）および得られたｐＢＳａｐｈＩＩをそれぞれ制限酵素PstIで処理し、２つの断片をライゲーションした後、大腸菌に導入した。カナマイシンを選択マーカーにして、プラスミドｐＩＪＥ７０２を得た。
【００９６】
次に、ｐＴＹＭ１８を鋳型にｏｒｉＴ（０．８ｋｂ）をプライマー５および６（配列番号１６および１７）を用いて上記と同様にＰＣＲで増幅した。得られた断片を制限酵素HincIIおよびSmaIで処理し、そしてｐＩＪＥ７０２を制限酵素SspIで処理した。得られた２つの断片をライゲーションした後、大腸菌に導入した。カナマイシンを選択マーカーにして、プラスミドｐＩＪＥＣ７０２を得た。次いで、ｐＩＪＥＣ７０２のNdeI部位を、QuikChange II Kit（Stratagene）ならびにプライマー７および８（配列番号１８および１９）を用いてサイレント変異によって欠失させ、ｐＩＪＥＣ’７０２を得た。
【００９７】
次に、S. septatus TH-2ゲノムＤＮＡを、S. septatus TH-2［Streptomyces septatus TH-2と命名・表示され、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３２９（寄託日：１９９９年３月２４日）として、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所、特許微生物寄託センター（現：独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター）（日本国茨城県つくば市東１丁目１−１）に寄託されている］から、サイトウ・ミウラ法（サイトウ（Saito,H.）ら、Biochem.Biophys.Acta.，72巻、619-629頁、1963年）により調製した。ＳＳＭＰプロモーター（０．４ｋｂ）を、S. septatus TH-2ゲノムＤＮＡを鋳型としてプライマー９および１０（配列番号２０および２１）を用いて上記と同様にＰＣＲで増幅した。また、S. aureofaciens TH-3ゲノムＤＮＡをS. aureofaciens TH-3（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３４３）から上記と同様の方法により調製した。ＴＨ−３  ｃｏｌｌターミネーター（０．５ｋｂ）を、S. aureofaciens TH-3ゲノムＤＮＡを鋳型としてプライマー１１および１２（それぞれ配列番号２２および２３）を用いて上記と同様にＰＣＲで増幅した。ＳＳＭＰプロモーター断片を、AseIおよびEcoRIで処理し、ターミネーター断片をEcoRIおよびBglIIで処理し、そしてｐＩＪＥＣ’７０２を制限酵素AseIおよびBglIIで処理した。得られた３つの断片をライゲーションした後、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。カナマイシンを選択マーカーにして、プラスミドｐＴＯＮＡ５を得た。プラスミドｐＴＯＮＡ５の構成（制限酵素地図）を図８に示す。このプラスミドｐＴＯＮＡ５には、ＳＳＭＰプロモーター配列（配列番号２４）およびＴＨ−３  ｃｏｌｌターミネーター（配列番号２５）が含まれている。
【００９８】
（実施例５：組換えメタロエンドペプチダーゼ発現ベクターの構築）
本実施例において、S. lividans 1326株を、キビライシン発現用の宿主株として用いた。キビライシン遺伝子を、ＮｄｅＩ部位（ＣＡＴＡＴＧ：ＡＴＧが開始コドン）を含むセンスプライマー（ＣＡＴＡＴＧＡＡＧＣＧＡＡＡＧＣＴＣＧＣＡＧＣＴ：配列番号２６）と停止コドンの下流にＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むアンチセンスプライマー（ＡＡＧＣＴＴＡＧＧＣＣＣＧＡＧＣＴＡＧＴＴＧＡＣＧＴＴＧＡＣ：配列番号２７）とのセットおよびＫＯＤ  ｖｅｒ．２  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績株式会社）を用いてＰＣＲにより増幅した。得られたフラグメントを、pCR-Blunt II-TOPOクローニングベクター（Invitrogen）を用いてクローニングして配列決定した。キビライシンをコードするＤＮＡフラグメントをＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、そしてｐＴＯＮＡ５ａのＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩギャップに連結した（ｐＴＯＮＡ５−キビライシン）。
【００９９】
（実施例６：組換えメタロエンドペプチダーゼの発現および精製）
上記実施例５で得られた発現ベクターを、大腸菌Ｓ１７−１に導入して形質転換した。形質転換体の単一コロニーを、カナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地中で３７℃にて７時間振盪培養した。細胞を回収し、ピペットを用いてＬＢ培地で３回洗浄して、カナマイシンを除去した。細胞を５００μＬのＬＢ培地に懸濁し、次いで放線菌S. lividans 1326株の胞子懸濁液と混合した。混合物をＩＳＰ  Ｎｏ．４寒天プレート（10cmΦ）上に塗布し、３０℃にて一晩培養した。カナマイシン２０μｇ／ｍLおよびナリジキシン酸ナトリウム５μｇ／ｍＬを含むソフトアガー栄養培地の３ｍＬアリコートを、プレート上に重層し、３０℃にて３〜５日間インキュベートした。単一コロニーを、水道水中に２．０％大豆ミール、２．０％マンニトール、カナマイシン（２０μｇ／ｍＬ）およびナリジキシン酸ナトリウム（５μｇ／ｍＬ）を含む培地を含む寒天プレート上に画線した。プレートを、３０℃にて５〜７日間インキュベートした。得られたS. lividans 1326形質転換体を、５００ｍＬ容バッフル付フラスコ中の０．８％Ｋ２ＨＰＯ４、２．０％グルコース、０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５％ポリペプトンおよび０．５％イーストエクストラクトを含む培養培地（ＰＧ培地）５０ｍＬに接種し、そして１８０ｒｐｍで回転振盪しながら３０℃にて６日間増殖させた。
【０１００】
限外ろ過装置（Millipore、０．４５μｍ孔径）を用いて培養ろ液を得た。ろ液を、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対して透析した。この溶液を、同じ緩衝液で平衡化したVivapure-Qスピンカラム（Millipore）にかけた。結合したタンパク質を、５０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液を用いて溶出させた。溶出液を１０ｍＭのＴｒｉｓ−マレイン酸（ｐＨ７．０）に対して透析し、精製組換えキビライシンを含む試料を得た。
【０１０１】
得られた精製組換えキビライシンについて、上記実施例３に記載と同様の操作をおこなって、ポストプロリン加水分解活性を確認した。その結果、精製組換えキビライシンでは、基質に対するＫｍ、ｋｃａｔ、およびｋｃａｔ／Ｋｍは、それぞれ３４．２±５．９μＭ、１３．３±１．６（１／秒）および０．３９±０．０３（１／秒・１／μＭ）であった。したがって、組換え酵素の活性は、野生型とほぼ同様であった。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明によれば、ポストプロリン加水分解活性を有するメタロエンドペプチダーゼが提供される。本発明のメタロエンドペプチダーゼを用いれば、カゼイン、グルテン、コラーゲン、ゼラチンなどのプロリンリッチなタンパク質を、比較的短いペプチドに加水分解することができる。したがって、食品、医薬品などの分野において、これらのプロリンリッチなタンパク質のさらなる利用が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】ストレプトマイセス・オーレオファシエンス  ＴＨ−３株由来の精製メタロエンドペプチダーゼＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動写真である。レーン１は分子量マーカーであり、そしてレーン２は、３μｇの精製酵素である。
【図２】ＦＲＥＴＳ−２５Ｘａａコンビナトリアルライブラリーの構造を示す。Ｘａａは、Ｃｙｓ以外の１９の天然アミノ酸のそれぞれが組み込まれた固定位置を示す。５アミノ酸残基（Ｐ、Ｙ、Ｋ、Ｉ、およびＤ）の混合物を、各固定されたＸａａに対するＺａａ位の５アミノ酸残基（Ｆ、Ａ、Ｖ、Ｅ、およびＲ）の混合物とともにＹａａ位に組み込んだ。
【図３】ＦＲＥＴＳ−２５Ｘａａコンビナトリアルライブラリーを用いたＰ１位の一次スクリーニングの結果を示すグラフである。
【図４】ＦＲＥＴＳ−２５Ｌｅｕを用いたＰ１、Ｐ２、およびＰ３位の二次スクリーニングの結果を示すグラフである。相対蛍光強度を、ＬＣ−ＭＳによるピーク面積から決定した。切断部位を、スラッシュで示す。
【図５】精製メタロエンドペプチダーゼによるＭＯＣＡｃ−ＫＰＬＧＬ−Ｄｎｐの加水分解産物のＨＰＬＣ／蛍光検出によるクロマトグラムである。約１７分のピークは、１２５ｎｍｏｌのＭＯＣＡｃ−ＫＰＬＧＬ−Ｄｎｐを示す。約６分のピークは、精製メタロエンドペプチダーゼとともに３７℃にて５分間インキュベートした後の、１２５ｎｍｏｌのＭＯＣＡｃ−ＫＰＬＧＬ−Ｄｎｐの断片を示す。
【図６】キビライシン遺伝子のヌクレオチド配列を示す図である。メタロエンドペプチダーゼ遺伝子の推定−３５および−１０配列に下線を付す。開始コドンの５ヌクレオチド上流のプリンリッチ配列であるＧＡＡＧＧＡは、リボソーム結合部位として作用し得る。亜鉛結合のためのコンセンサス配列（ＨＥＸＸＨ）を四角で囲む。シグナルペプチドの可能性のある切断部位（白三角）を示す。二次切断（黒三角で示す部位）は、メタロエンドペプチダーゼの成熟化の間、分泌後に生じる。
【図７】成熟メタロエンドペプチダーゼの一次構造のアラインメントを示す図である。
【図８】プラスミドｐＴＯＮＡ５の構成（制限酵素地図）を示す模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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