(57)【要約】      （修正有）【課題】新規な癌ワクチンの提供。【解決手段】癌抑制遺伝子WT1の産物又はその部分ペプチドを活性成物とする癌抗原と、カチオン性リポソームとを含んで成る癌ワクチン。カチオン性リポソームとしては、N-〔1-(2,3-ジオレイルオキシ）プロピル〕-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライド、N-〔1-(2,3-ジオレイルオキシ）プロピル〕-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチルサルフェート、もしくはジオクタデシルアミド−グリシルスペルミンまたはそれらと中性脂質との混合物を含むリポソーム及びリポフェクチンが選ばれる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌抑制遺伝子ＷＴ１の産物又はその部分ペプチド又は修飾体を活性成分とする癌抗原とカチオン性リポソームとを含んで成る癌ワクチン。
【請求項２】
前記癌抗原が、配列番号：１のアミノ酸配列において、Phe，Tyr，Leu，Met，Asn及びIleから選択される少なくとも１個のアンカーアミノ酸を含む、連続する７〜30個のアミノ酸からなるペプチド、又は配列番号：２のアミノ酸配列において、Met，Leu及びValから選択される少なくとも１個のアンカーアミノ酸を含む、連続する７〜30個のアミノ酸から成るペプチドである請求項１に記載の癌ワクチン。
【請求項３】
前記抗原が、癌抑制遺伝子ＷＴ１の高発現をもたらす癌の抗原である、請求項１又は２に記載の癌ワクチン。
【請求項４】
癌が、白血病、骨髄異形成症候群、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌又は卵巣癌である、請求項１又は２に記載の癌ワクチン。
【請求項５】
前記癌抗原ペプチドが、
Ｋb 45 Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu（配列番号：３）
Ｋb 330  Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu（配列番号：４）
Ｄb 126  Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu（配列番号：５）
Ｄb 221  Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met（配列番号：６）
Ｄb 235  Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu（配列番号：７）
WH  187 Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val（配列番号：８）
のいずれかである、請求項１〜４のいずれかに記載の癌ワクチン。
【請求項６】
前記癌抗原ペプチドが、
Ｄb 126  Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu（配列番号：５）、又は
WH  187 Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val（配列番号：８）
である、請求項５に記載の癌ワクチン。
【請求項７】
前記癌抗原ペプチドが、次のアミノ酸配列：Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu（配列番号：９）を含み、９〜30個のアミノ酸から成るペプチドである、請求項１に記載の癌ワクチン。
【請求項８】
前記癌抗原ペプチドが、次のアミノ酸配列：Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu（配列番号：９）を有するペプチドである、請求項７に記載の癌ワクチン。
【請求項９】
前記カチオン性リポソームが、N-〔1-(2,3-ジオレイルオキシ）プロピル〕-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライド、N-〔1-(2,3-ジオレイルオキシ）プロピル〕-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチルサルフェート、もしくはジオクタデシルアミド−グリシルスペルミンまたはそれらと中性脂質との混合物を含むリポソームである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の癌ワクチン。
【請求項１０】
前記カチオン性リポソームがリポフェクチンである請求項９に記載の癌ワクチン。
【請求項１１】
癌ワクチンの製造のための、癌抑制遺伝子WT1の産物又はその部分ペプチド又は修飾体を活性成分とする癌抗原とカチオン性リポソームとの使用。
【請求項１２】
前記癌抗原が、配列番号：１のアミノ酸配列において、Phe，Tyr，Leu，Met，Asn及びIleから選択される少なくとも１個のアンカーアミノ酸を含む、連続する７〜30個のアミノ酸からなるペプチド、又は配列番号：２のアミノ酸配列において、Met，Leu及びValから選択される少なくとも１個のアンカーアミノ酸を含む、連続する７〜30個のアミノ酸から成るペプチドである請求項11に記載の使用。
【請求項１３】
前記抗原が、癌抑制遺伝子ＷＴ１の高発現をもたらす癌の抗原である、請求項11又は12に記載の使用。
【請求項１４】
癌が、白血病、骨髄異形成症候群、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌又は卵巣癌である、請求項11又は12に記載の使用。
【請求項１５】
前記癌抗原ペプチドが、
Ｋb 45 Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu（配列番号：３）
Ｋb 330  Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu（配列番号：４）
Ｄb 126  Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu（配列番号：５）
Ｄb 221  Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met（配列番号：６）
Ｄb 235  Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu（配列番号：７）
WH  187 Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val（配列番号：８）
のいずれかである、請求項11〜14のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
前記癌抗原ペプチドが、
Ｄb 126  Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu（配列番号：５）、又は
WH  187 Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val（配列番号：８）
である、請求項15に記載の使用。
【請求項１７】
前記癌抗原ペプチドが、次のアミノ酸配列：Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu（配列番号：９）を含み、９〜30個のアミノ酸から成るペプチドである、請求項11に記載の使用。
【請求項１８】
前記癌抗原ペプチドが、次のアミノ酸配列：Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu（配列番号：９）を有するペプチドである、請求項17に記載の使用。
【請求項１９】
前記カチオン性リポソームが、N-〔1-(2,3-ジオレイルオキシ）プロピル〕-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライド、N-〔1-(2,3-ジオレイルオキシ）プロピル〕-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチルサルフェート、もしくはジオクタデシルアミド−グリシルスペルミンまたはそれらと中性脂質との混合物を含むリポソームである、請求項11〜18のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
前記カチオン性リポソームがリポフェクチンである請求項19に記載の使用。
【請求項２１】
癌患者の治療方法において、癌抑制遺伝子WT1の産物又はその部分ペプチド又は修飾体を活性成分とする癌抗原とカチオン性リポソームとを投与することを含んで成る方法。
【請求項２２】
前記癌抗原が、配列番号：１のアミノ酸配列において、Phe，Tyr，Leu，Met，Asn及びIleから選択される少なくとも１個のアンカーアミノ酸を含む、連続する７〜30個のアミノ酸からなるペプチド、又は配列番号：２のアミノ酸配列において、Met，Leu及びValから選択される少なくとも１個のアンカーアミノ酸を含む、連続する７〜30個のアミノ酸から成るペプチドである請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗原が、癌抑制遺伝子WT1の高発現をもたらす癌の抗原である、請求項21又は22に記載の方法。
【請求項２４】
癌が、白血病、骨髄異形成症候群、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌又は卵巣癌である、請求項21又は22に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌抗原ペプチドが、
Ｋb 45 Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu（配列番号：３）
Ｋb 330  Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu（配列番号：４）
Ｄb 126  Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu（配列番号：５）
Ｄb 221  Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met（配列番号：６）
Ｄb 235  Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu（配列番号：７）
WH  187 Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val（配列番号：８）
のいずれかである、請求項21〜24のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記癌抗原ペプチドが、
Ｄb 126  Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu（配列番号：５）、又は
WH  187 Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val（配列番号：８）
である、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
前記癌抗原ペプチドが、次のアミノ酸配列：Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu（配列番号：９）を含み、９〜30個のアミノ酸から成るペプチドである、請求項21に記載の方法。
【請求項２８】
前記癌抗原ペプチドが、次のアミノ酸配列：Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu（配列番号：９）を有するペプチドである、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
前記カチオン性リポソームが、N-〔1-(2,3-ジオレイルオキシ）プロピル〕-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライド、N-〔1-(2,3-ジオレイルオキシ）プロピル〕-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチルサルフェート、もしくはジオクタデシルアミド−グリシルスペルミンまたはそれらと中性脂質との混合物を含むリポソームである、請求項21〜28のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記カチオン性リポソームがリポフェクチンである請求項29に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Wilms腫瘍の癌抑制遺伝子WT1の産物に基づく癌抗原とリポフェクチンとを含んで成る癌ワクチンに関する。この癌ワクチンは、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの血液の癌、又は固形癌、例えば胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等、並びにさらにはＷＴ１を発現するすべての癌に対する抗癌ワクチンとして有用である。
【背景技術】
【０００２】
異物を排除するための免疫機構には、一般に、抗原を認識して抗原提示細胞として機能するマクロファージ、該マクロファージの抗原提示を認識して種々のリンホカインを産生して他のＴ−細胞等を活性化するヘルパーＴ−細胞、該リンホカインの作用により抗体産生細胞に分化するＢ−リンパ球等が関与する液性免疫と、抗原の提示を受けて分化したキラーＴ−細胞が標的細胞を攻撃し破壊する細胞性免疫とがある。
【０００３】
現在のところ、癌の免疫は主として、キラーＴ−細胞が関与する細胞性免疫によるものと考えられている。キラーＴ−細胞による癌免疫においては、主要組織適合抗原（Major Histocompatibility Complex ; MHC）クラスＩと癌抗原との複合体の形で提示された癌抗原を認識した前駆体Ｔ−細胞が分化増殖して生成したキラーＴ−細胞が癌細胞を攻撃し、破壊する。この際、癌細胞はMHCクラスＩ抗原と癌抗原との複合体をその細胞表面に提示しており、これがキラーＴ−細胞の標的とされる（Cur. Opin, Immunol., 5, 709, 1993; Cur. Opin, Immunol., 5, 719, 1993; Cell, 82, 13, 1995; Immunol. Rev, 146, 167, 1995）。
【０００４】
標的細胞である癌細胞上にMHCクラスＩ抗原により提示される前記の癌抗原は、癌細胞内で合成された抗原蛋白質が細胞内プロテアーゼによりプロセシングされて生成した約８〜12個のアミノ酸から成るペプチドであると考えられている（Cur. Opin, Immunol., 5, 709, 1993; Cur. Opin. Immunol., 5, 719, 1993; Cell, 82, 13, 1995; Immunol. Rev., 146, 167, 1995)。
【０００５】
Wilms腫瘍の癌抑制遺伝子WT1（WT1遺伝子）は、Wilms腫瘍、無紅彩、泌尿生殖器異常、精神発達遅滞などを合併するWAGR症候群の解析からWilms腫瘍の原因遺伝子の１つとして染色体11p13から単離された（Gessler, M. ら、Nature, Vol. 343, p.774-778, 1990）ものであり、ゲノムDNAは約50kbで10のエキソンから成り、そのcDNAは約３kbである。cDNAから推定されるアミノ酸配列は、配列番号：１に示す通りである（Mol. Cell. Biol., 11, 1707, 1991）。
【０００６】
WT1遺伝子はヒト白血病で高発現しており、白血病細胞をWT1アンチセンスオリゴマーで処理するとその細胞増殖が抑制される（特開平9-104627号公報）ことなどから、ＷＴ１遺伝子は白血病細胞の増殖に促進的に働いていることが示唆されている。さらに、ＷＴ１遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌においても高発現しており（特願平9-191635）、WT1遺伝子は白血病及び固形癌における新しい腫瘍マーカーであることが判明した。
このため、WT1遺伝子の発現生成物の部分から成る約８〜12個のアミノ酸を有するペプチドを投与すれば上記広範囲の癌に対する癌ワクチンとして機能することが期待される。しかしながら、そのようなペプチドをそのまま投与しても癌ワクチンとして機能することは困難である。この原因としては、投与されたペプチドが抗原提示細胞上の主要組織抗原クラスＩに効果的に送達されないためと予想される。
【０００７】
カチオン性リポソームであるリポフェクチン（Lipofectin）は人工脂質であるN-〔1-(2,3-ジオレイルオキシ）プロピル〕-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライド（DOTMA）とリン脂質であるジオレイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）との1:1混合物であり、非ウイルス性の遺伝子導入用キャリヤーとして注目されたが、その後ペプチド抗原を抗原提示細胞表面の主要組織抗原クラスＩに送達するために機能することが注目されている（臨床免疫Vol.34, No.6, p842-847, 2000）。しかしながら、カチオン性リポソームがペプチド抗原のキャリヤーとしてどの程度普遍性があるか不明であり、癌抑制遺伝子ＷＴ１の発現生成物の断片からなる癌抗原ペプチドのキャリヤーとして機能し得るか否かは不明である。
【発明の開示】
【０００８】
従って本発明は、WT1遺伝子発現生成物に由来する癌抗原ペプチドと、そのためのキャリヤーとして有効な物質とを含んで成る新規な癌ワクチンを提供しようとするものである。
【０００９】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく種々検討した結果、WT1遺伝子の発現生成物のアミノ酸配列中で、マウス及びヒトのMHCクラスＩ及びMHCクラスIIとの結合において、アンカーアミノ酸として機能すると予想される少なくとも１個のアミノ酸を含有する連続する７〜30個のアミノ酸から成るポリペプチドが癌抗原として機能し、このペプチド抗原のキャリヤーとして、リポフェクチン等のカチオン性リポソームが有能であることを確認して本発明を完成した。
【００１０】
従って本発明は、マウスWT1発現産物又はその部分を含んで成る癌抗原と、カチオン性リポソームとを含んで成る癌ワクチンを提供する。好ましい態様において、本発明は、WT1のcDNAに対応する配列番号：１に示すアミノ酸配列において、MHC抗原との結合のためのアンカーアミノ酸として機能すると推定されるPhe，Tyr，Leu，Met，Asn及びIleから成る群から選択される少なくとも１個のアミノ酸を含む６〜30個のアミノ酸から成るペプチドを活性成分とする癌抗原と、カチオン性リポソームとを含んで成る癌ワクチンを提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、ヒトWT1のcDNAに対応する配列番号：２に示すアミノ酸配列において、MHC抗原との結合のためのアンカーアミノ酸として機能すると推定されるMet，Leu及びValから成る群から選択される少なくとも１個のアミノ酸を含む７〜30個のアミノ酸から成るペプチドを活性成分とする癌抗原と、カチオン性リポソームとを含んで成る癌ワクチンを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明においては、癌抗原ペプチドを設計する際の基礎として、マウスMHCクラスＩのＫb 及びＤb 、並びにヒトHLAのA0201を選択し、これらと高い親和性を有すると予想されるペプチドを選択した。
【００１３】
Immunogenetics Vol.41, p.178-228 (1995) の記載から、Ｋb への結合のアンカーアミノ酸として５番目のPhe及びTry並びに８番目のLeu及びMet等が予想され、またＤb への結合のアンカーアミノ酸として５番目のAsn並びに９番目のMet及びIle等が予想される。
【００１４】
また、癌細胞の表面においてMHCクラスＩにより提示される癌抗原ペプチドのサイズはおよそ８〜12個であることが知られている。従って、本発明の癌抗原ペプチドは、配列番号：１に示すWT1遺伝子産物のアミノ酸配列において、Phe，Tyr，Leu，Met，Asn及びIleの少なくとも１個を含む、連続する７〜30個のアミノ酸から成るペプチドである。アミノ酸の数は好ましくは８〜12個であり、例えば８又は９個である。
【００１５】
本発明においては、その具体例として、MHCクラスＩのＫb に結合するペプチドとして、アミノ酸８個からなる下記ペプチド：
Ｋb  45  Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu（配列番号：３）
Ｋb 330  Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu（配列番号：４）
【００１６】
MHCクラスＩのＤb に結合するペプチドとして、アミノ酸９個から成る下記のペプチド：
Ｄb 126  Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu（配列番号：５）
Ｄb 221  Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met（配列番号：６）
Ｄb 235  Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu（配列番号：７）
が挙げられる。上記配列において下線を付したアミノ酸がアンカーとして機能すると予想されるアミノ酸である。
【００１７】
これらはいずれもＫb 又はＤb と強〜中程度の結合親和性（kd値）を有しているが、最も高い結合親和性を示すＤb 126 ペプチドを以後の実験において用いた。
また、ヒトについては、Immunogenetics Vol. 41, p. 178-228 (1995) の記載から、ヒトのHLA-A0201への結合アンカーアミノ酸として、Ｎ−末端から２番目のLeu及びMet、並びにＮ−末端から９番目のVal及びLeuが予想される。そこで、ヒトWT1蛋白質のアミノ酸配列（Mol. Coll. Biol. Vol. 11, p. 1707-1712, 1991) （配列番号：２）中で、上の条件に合致する、９個のアミノ酸から成る下記の２種類のペプチドが挙げられる。
【００１８】
Ｄb 126; Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu（配列番号：５）
（マウスにおけるＤb 126 の配列と同じ）
WH 187; Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val （配列番号：８）
（下線はアンカーアミノ酸を示す）。
【００１９】
本発明の癌抗原ペプチドはまた、WT1遺伝子の発現生成物の部分であるペプチドにアミノ酸置換などの修飾を導入したペプチドであってもよい。このような修飾されたペプチドの例として、次のアミノ酸配列：Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu（配列番号：９）を含み、９〜30個のアミノ酸から成るペプチドを活性成分とする癌抗原ペプチドが挙げられる。具体例として、上記のペプチドＤb 235(配列番号：７）の２位のMetがTyrに変化したアミノ酸配列：Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu（配列番号：９）を有するペプチドが挙げられる。
【００２０】
カチオン性リポソームとしては、N-〔1-(2,3-ジオレイルオキシ）プロピル〕-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライド（DOTMA）、N-〔1-(2,3-ジオレイルオキシ）プロピル〕-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチルサルフェート（DOTAP）、もしくはジオクタデシルアミド−グリシルスペルミン（DOGS）またはそれらと中性脂質との混合物を含むリポソームが挙げられる。
【００２１】
中性脂質としては、たとえば、レシチン、リゾレシチン、スフィンゴミエリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）などが挙げられる。混合物の例としては、人工脂質であるN-〔1-(2,3-ジオレイルオキシ）プロピル〕-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライド（DOTMA）とリン脂質であるジオレイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）との1:1混合物であるリポフェクチン（Lipofectin）が挙げられる。
【００２２】
本発明の癌ワクチンは、WT1遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの血液の癌、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌の予防又は治療のために使用することができる。このワクチンは、経口投与、又は非経口投与、例えば腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与、鼻腔内投与等により投与することができる。
本発明の癌ワクチンの投与量は一般に、１日当り0.1μg〜1mg/kgである。
【実施例】
【００２３】
次に、実施例により、本発明の癌ワクチンの有用性を明らかにする。
実施例１．  リポポリサッカライド−ブラスト（LPS-blast）の調製
C57BL/6マウスから脾細胞を回収し、この細胞を、リポポリサッカライド（LPS）（10μg/mL）を含有する完全（complete）RPMI培地中で3日間インキュベートした。この細胞を洗浄した後、癌抗原ペプチドDb126（1μM）及びオボアルブミン（OVA）（100μg/mL）を含有する完全RPMI培地中で2時間インキュベートした。細胞を洗浄した後、2mLのHBSS（Hanks' balanced salt solution）中に懸濁し、これをポリサッカライド−ブラスト（LPS-blast）とした。
【００２４】
細胞障害性T細胞（CTL）誘導能の評価
C57BL/6マウスの背部皮下に癌抗原ペプチドDb126とリポフェクチン（LPF）との混合物（db126とLPFを1：2の重量比で混合したもの）（マウス当たり10nmolのDb126）又は、ポジティブコントロールとして、リポポリサッカライド−ブラスト（LPS-blast）（マウス当たり1mL）を腹腔に一週間隔で３回免疫した。最終免疫10日後に脾細胞を回収してエフェクター（effector）細胞とした。癌抗原ペプチドDb126で刺激（1μM、2時間、37℃、5％CO2条件下）した脾細胞をHBSSで洗浄し、スティムレーター（stimulator）細胞を得た。
【００２５】
前記のエフェクター細胞（5×106細胞/ウエル）と前記スティムレーター細胞（2.5×106細胞/ウエル）とを混合し、リンパ球・リンパ球混合培養を行うことにより、細胞障害性T細胞のイン−ビトロ2次抗原刺激を行った。5日後、細胞障害性T細胞を回収した。何れもNa251CrO4でラベル化（0.56MBq/106cells、37℃、5％CO2条件下で1時間処理）した、（１）Ｃ1498細胞、（２）TW１遺伝子が導入されておりそれを発現するC1498細胞（C1498muWT1）、（３）RMA-S細胞、及び（４）癌抗原ペプチドDb126で刺激（１μM、5％CO21時間処理）したRMA-S細胞（Db126-pulsed RMA-S）を、標的細胞として96ウエルマイクロプレートにプレートし（104細胞/ウエル）、これに、前記のごとく調製した細胞障害性T細胞に播種した。エフェクター細胞を加え、4時間培養し、上清に遊離した51Crの放射活性を測定した。細胞障害活性は以下に示す式に従って算出した。
【００２６】
【数１】
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【００２７】
結果
まず、誘導された細胞障害性T細胞が癌抗原ペプチドDb126に特異的か否かを検討するために、標的細胞として前記（３）RMA-S細胞と（４）Db126-pulsed RMA-S細胞を用いたところ、癌抗原ペプチドDb126特異的な細胞障害性T細胞の誘導が確認された(図１．A)。更に、誘導された細胞障害性T細胞がWT1発現細胞を特異的に障害するかを検討するために、標的細胞として、前記（１）C1498細胞と（２）WT1遺伝子導入細胞C1498muWT1とを用いたところ、WT1特異的なCTLの誘導が確認された（図１．B）。
【００２８】
実施例２．癌ワクチンキャリアーとしてリポフェクチン（LPF）を用いた際の癌抗原特異的抗腫瘍効果
実施例１において、癌抗原ペプチドDb126のアジュバントとしてリポフェクチン（LPF）を用いることにより細胞障害性T細胞を効果的に誘導することが示されたので、癌ワクチン用アジュバントとしてのリポフェクチン（LPF）の有用性を更に確認する目的で、アジュバント（キャリヤー）としてリポフェクチンを用いて免疫した際の癌抗原特異的抗腫瘍効果について検討した。
【００２９】
腫瘍モデルとしてWT1遺伝子導入C1498細胞（C1498muWT1細胞）を用い、免疫動物としてC57BL/6マウスを用い、そしてモデル癌抗原としてペプチドDb126を用いた。すなわち、マウスの背部皮下に、実施例１の場合と同じペプチドDb126とリポフェクチン（LPF）との混合物（マウス当たり10nmol）を投与し、あるいはC57BL/6マウスの腹腔にリポポリサッカライド−ブラスト（LPS-blast）（1mL）を一週間隔で3回免疫し、最終免疫一週間後にC1498muWT1細胞、又はC1498細胞を2×106細胞/100mLの量で腹腔に移植した。腫瘍ワクチン効果は、経日的に腫瘍径を測定し、以下の式を用いて腫瘍の大きさを算出することにより評価した。
［腫瘍の大きさ］＝［（長径）×（短径）2］1/3
各群において腫瘍の大きさが20mmとなったところで実験を終了した。
【００３０】
結果
癌ワクチン用アジュバント（キャリヤー）としてのリポフェクチン（LPF）の評価は、モデル腫瘍抗原としてWT1を用い、モデル腫瘍としてWT1遺伝子導入細胞（C1498muWT1細胞）を用い、ペプチドDb126/リポフェクチン（LPF）混合物を免疫した際のC1498muWT1細胞に対する抵抗性を指標に行った。その結果、ペプチドDb126/リポフェクチン（LPF）混合物を免疫すると、8例中3例の完全拒絶が見られた（図２．A）。
【００３１】
更に、この抗腫瘍効果がWT1特異的であることを確認するために、WT1を発現していないC1498細胞を用いて、同様の検討を行ったところ、（ａ）ペプチドDb126/リポフェクチン（LPF）混合物、（ｂ）遊離のペプチドDb126、及び（ｃ）リポポリサッカライド−ブラスト（LPS-blast）のいずれを免疫した場合においても、免疫していない群との差は見られなかった（図２．B）。従って、上記の抗腫瘍効果がWT1特異的であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１のAは、実施例１における、（３）RNAS細胞、及び（４）癌抗原ペプチドDb126で刺激」したRNAS細胞を用いて、癌抗原ペプチドDb126とリポフェクチン（LPF）との混合物（黒丸）、Db126でパルスしたリポポリサッカライド−ブラスト（白四角）、リポフェクチン単独（白三角）及び癌抗原ペプチドDb126単独（白丸）の、細胞障害性T細胞誘導能を比較したグラフであり、Bは（１）C1498細胞、及び（２）WT1遺伝子導入C1498細胞を用いて、上記Aと同様の試験を行なった結果を示すグラフである。Aは、癌抗原ペプチドDb126とリポフェクチンとの組合せが細胞障害性T細胞誘導能を有する事を示し、Bはその活性がWT1特異的である事を示す。
【００３３】
【図２】図２のAは、実施例２における、WT1遺伝子導入C1498細胞を用いての、ペプチドDb126の抗癌効果に対するアジュバント（キャリヤー）としてのリポフェクチンの効果を示すグラフであり、BはC1498細胞を用いての同様の試験の結果を示すグラフである。被験物質を示す記号は図１と同じである。Aはリポフェクチンが癌抗原ペプチドDb126のアジュバント（キャリヤー）として有効であることを示し、AとBとの比較から抗癌効果がWT1特異的である事が示される。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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