(57)【要約】【課題】細胞を溶解して細胞内のＡＴＰを生物発光法以外の方法で測定する際に、界面活性剤が及ぼす酵素の劣化を防止して、簡便でかつ高精度な細胞内ＡＴＰの測定方法を提供することを目的とする。【解決手段】界面活性剤を用いて細胞内のＡＴＰを抽出するＡＴＰ抽出工程と、前記ＡＴＰ抽出工程の後に疎水性化合物を添加してその疎水性化合物と前記疎水性化合物以外のものとを分離する界面活性剤除去工程と、前記界面活性剤除去工程の後にＡＴＰ量を測定するＡＴＰ測定工程と、からなる細胞内ＡＴＰの測定方法。【選択図】無し【特許請求の範囲】
【請求項１】
界面活性剤を用いて細胞内のＡＴＰを抽出するＡＴＰ抽出工程と、
前記ＡＴＰ抽出工程の後に疎水性化合物を添加する界面活性剤除去工程と、
前記界面活性剤除去工程の後にＡＴＰ量を測定するＡＴＰ測定工程と、
からなる細胞内ＡＴＰの測定方法。
【請求項２】
前記ＡＴＰ抽出工程は、界面活性剤に細胞を懸濁して細胞内ＡＴＰ抽出液を調製する請求項１に記載の細胞内ＡＴＰの測定方法。
【請求項３】
前記界面活性剤除去工程は、前記疎水性化合物に添加した後に前記疎水性化合物と前記疎水性化合物以外のものとを分離する請求項２に記載の細胞内ＡＴＰの測定方法。
【請求項４】
前記ＡＴＰ測定工程は、前記分離された疎水性化合物以外の物質のＡＴＰ量を測定する請求項３に記載の細胞内ＡＴＰの測定方法。
【請求項５】
前記界面活性剤は、陽イオン界面活性剤である請求項１から４に記載の細胞内ＡＴＰの測定方法。
【請求項６】
前記陽イオン界面活性剤は、塩化ベンザルコニウムである請求項５に記載の細胞内ＡＴＰの測定方法
【請求項７】
前記疎水性化合物は、疎水基を有する化合物である請求項１から６に記載の細胞内ＡＴＰの測定方法。
【請求項８】
前記疎水性化合物を担体に結合させた請求項１から７に記載の細胞内ＡＴＰの測定方法。
【請求項９】
前記担体は、オクタデシル基を導入したシリカゲル担体である請求項８に記載の細胞内ＡＴＰの測定方法。
【請求項１０】
前記測定工程は、酵素反応を用いた測定方法である請求項４に記載の細胞内ＡＴＰの測定方法。
【請求項１１】
請求項１から１０記載のいずれかの方法を用いた細胞内ＡＴＰの測定試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内ＡＴＰの測定方法に関する。より詳細には、酵素反応を用いた細胞内ＡＴＰの測定方法において、酵素反応を阻害する界面活性剤を簡便に除去することができ、より正確にかつ感度良く細胞内ＡＴＰを測定する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞から細胞内ＡＴＰを抽出するためには、細胞を溶解しなければならない。細胞を溶解するための細胞溶解剤は、主として界面活性剤から成る。この界面活性剤がリン脂質を中心に構成される細胞膜に吸着することで、細胞膜の流動性が高まり細胞の溶解を誘導するためと考えられている。このため、細胞内ＡＴＰの抽出には、広く界面活性剤が使われている。
【０００３】
この界面活性剤には、陽イオン界面活性剤が一般的に用いられる。プラス電荷を有する陽イオン界面活性剤は、マイナスの電荷を有する細胞表面への吸着速度が速いため、迅速に細胞を破壊することができるからである。このような陽イオン界面活性剤として、塩化ベンザルコニウムや塩化ベンゼトニウムがある。
【０００４】
しかしながら、界面活性剤には、酵素の疎水基部分に結合することにより、酵素の構造を変性して活性を低下させるので、酵素を用いた細胞内ＡＴＰを測定の際、測定値に大きな影響を与えてしまう。例えば、塩化ベンザルコニウムを用いて細胞内ＡＴＰを十分に抽出するためには、試料と塩化ベンザルコニウムを混合した混合溶液に対し、塩化ベンザルコニウム濃度が０．１％以上になるように添加することが望ましい。しかし、界面活性剤濃度が０．１％以上である場合、酵素反応を著しく阻害するため、測定感度及び測定精度が大きく低下する。一方、塩化ベンザルコニウム濃度が０．１％より低いと酵素反応阻害は抑制される反面、細胞内ＡＴＰの抽出効率が不十分となる。
【０００５】
そのため、近年では界面活性剤に対する酵素反応阻害を抑制するため、様々な試みがなされてきた。例えば、ホタル由来ルシフェラーゼを用いたＡＴＰ測定法（生物発光反応）においては、塩化ベンザルコニウムに耐性を有する変異ルシフェラーゼを遺伝子組換えにより調製し、ＡＴＰを定量できる方法が提案された（例えば、特許文献１参照。）。この変異ルシフェラーゼは、０．１％の塩化ベンザルコニウム存在下においても残存活性を示し、酵素反応を阻害しない濃度まで細胞内ＡＴＰ抽出液を希釈する必要がないため、操作が簡便で、感度良くＡＴＰを定量できる。
【特許文献１】特開平１１−２３９４９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、前記従来の構成では、塩化ベンザルコニウム耐性の変異ルシフェラーゼが、界面活性剤として塩化ベンザルコニウム及びルシフェラーゼによる生物発光反応を用いたＡＴＰ測定方法のみに限定されている。そのため、別の測定手法、例えば電気化学的測定手法を用いてＡＴＰの測定を行う場合には、酵素の種類に応じて界面活性剤耐性を図らなければならないという課題を有していた。
【０００７】
本発明は、前記従来課題を解決するもので、生物発光法以外の方法でＡＴＰを測定する際に、界面活性剤が及ぼす酵素の劣化を防止して、簡便でかつ高精度な細胞内ＡＴＰの測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の細胞内ＡＴＰの測定方法は、界面活性剤を用いて細胞内のＡＴＰを抽出するＡＴＰ抽出工程と、前記ＡＴＰ抽出工程の後に疎水性化合物を添加する界面活性剤除去工程と、前記界面活性剤除去工程の後にＡＴＰ量を測定するＡＴＰ測定工程と、からなることを特徴としたものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の細胞内ＡＴＰの測定方法によれば、疎水性化合物で界面活性剤を除去することで、酵素の劣化を防止することができるため、酵素や界面活性剤の種類を問わず、感度良く細胞内ＡＴＰを測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に、本発明の細胞内物質の抽出方法の実施の形態を詳細に示す。
（実施の形態１）
本発明の界面活性剤の除去について、その原理を以下に説明する。細胞を破壊した後のＡＴＰ抽出液には、細胞内にＡＴＰと界面活性剤とその他の物質とが含まれている。この中で、界面活性剤はその分子内に親水基と疎水基とを併せ持ち、ＡＴＰは水への親和性が高い物質である。発明者は、この点に着目し、ＡＴＰ抽出液に疎水性化合物を添加した。その結果、この疎水性化合物と界面活性剤とが疎水結合を行い、ＡＴＰ抽出液に含まれる界面活性剤を除去できることを見出した。この疎水性化合物は、ある種の担体に結合させたものでも良い。本発明では、疎水基であるオクタデシル基にシリカゲルビーズからなる担体に結合させたオクタデシルシリカゲル担体（ＯＤＳ）を用いた。ＯＤＳの調製は、（化１）に示すように、シリカゲル表面のシラノール基にシリル化剤を導入することで得ることができる。
【００１１】
【化１】
2009077644.tif 000002
【００１２】
塩化ベンザルコニウムにＯＤＳを添加する（ＯＤＳ処理）ことにより、塩化ベンザルコニウムの除去が出来ることを以下に示す。１０％塩化ベンザルコニウム溶液を精製水で希釈することにより０．１％の塩化ベンザルコニウム溶液を調製した。調製した０．１％塩化ベンザルコニウム溶液１５０μＬを、ＯＤＳをカラム剤としたスピンカラムに分注し、２０００ｒｐｍ、２分間遠心処理した。遠心処理した塩化ベンザルコニウム溶液を２６０ｎｍの吸光度を測定した結果を表１に示す。
【００１３】
【表１】
2009077644.tif 000003
【００１４】
表１で明らかなように、ＯＤＳ処理前の吸光度０．７６９に比べて、ＯＤＳ処理後の吸光度は、０．０２とブランクに近い値を示す。すなわち、ＯＤＳ処理により塩化ベンザルコニウムが除去できたことを示している。
【００１５】
次に、ＯＤＳ処理がＡＴＰ検出に与える影響を示す。ＡＴＰを精製水に溶解させ、それぞれ０．３ｎｍ、３ｎｍ、３０ｎｍのＡＴＰ溶解液を調製した。調製したＡＴＰ溶解液を、ＯＤＳスピンカラム（ＨＡＲＶＡＲＤ  Ｍａｃｒｏ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｏｍｓ）に分注し、２０００ｒｐｍ、２分間遠心処理した。遠心処理したＡＴＰ溶解液１００μＬを、ルシフェール２５０プラス発光試薬（キッコーマン）１００μＬと混合し、ルミテスターＣ−１０００（キッコーマン）で発光量を測定した。結果を表２に示す。
【００１６】
【表２】
2009077644.tif 000004
【００１７】
表２で明らかなように、ＯＤＳ処理前と処理後では、発光量の変化はほとんど見られない。すなわち、ＯＤＳ処理を施しても、ＡＴＰ測定値に影響しないことを示している。
【００１８】
以下、本発明の具体的な実施例を詳細に説明する。
【００１９】
＜大腸菌細胞からのＡＴＰ抽出＞
大腸菌をＬＢ寒天培地［バクトトリプトン１％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム１％（ｗ／ｖ）、寒天１．５％（ｗ／ｖ）］上で、３７℃で１８時間培養を行った。ＬＢ寒天培地上で生育した大腸菌１コロニーを接種して１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）［１０ｍＭリン酸二水素カリウム、１０ｍＭリン酸水素二カリウム、０．９％塩化ナトリウム（ｗ／ｖ）］５００μＬに懸濁させ大腸菌懸濁液を作製した。得られた大腸菌懸濁液を８０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離して大腸菌を沈殿させた。上清を捨て、１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）５００μＬで再度懸濁した。この操作を３度繰り返し、大腸菌細胞を洗浄し、大腸菌懸濁液を調製した。この大腸菌懸濁液をＬＢ寒天培地上で３７℃、１８時間培養し、コロニー数を計測した結果、調整した大腸菌細胞懸濁液には１０5ＣＦＵ／ｍＬ相当の生菌が存在した。
【００２０】
得られた大腸菌懸濁液５００μLに対し、０．２％の塩化ベンザルコニウム５００μＬを加えて攪拌することで、大腸菌細胞内ＡＴＰ抽出液を調製した。
【００２１】
＜界面活性剤の除去＞
大腸菌細胞内ＡＴＰ抽出液１５０μLを、ＯＤＳスピンカラム（ＨＡＲＶＡＲＤ  Ｍａｃｒｏ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｏｍｓ）に分注し、２０００ｒｐｍ、２分間遠心した。得られた大腸菌細胞内ＡＴＰ抽出液を以後の電気化学測定に用いた。
【００２２】
＜ＡＴＰの電気化学測定に用いた酵素反応＞
ＡＴＰの電気化学測定は、下記の（１）〜（３）の酵素反応を用い、生成した過酸化水素を電気化学的に測定した。
（１）ミオキナーゼ
ＡＴＰ＋アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）→２アデノシン二リン酸ＡＤＰ
（２）ピルビン酸キナーゼ
ＡＤＰ＋ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）→ピルビン酸＋ＡＴＰ
（３）ピルビン酸オキシダーゼ
ピルビン酸＋Ｏ2＋リン酸＋Ｈ2Ｏ→アセチルリン酸＋Ｈ2Ｏ2＋ＣＯ2
＜酵素電極の作製＞
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のピルビン酸オキシダーゼを電極表面上に固定化した酵素電極を作製した。１．１２ユニット相当の東洋紡製Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のピルビン酸オキシダーゼを直径３ｍｍのプラチナ（Ｐｔ）電極表面に滴下し、４℃で一晩風乾した。風乾後、電極表面を和光純薬製２５％グルタルアルデヒド溶液の蒸気に約３０分間曝すことで、ピルビン酸オキシダーゼをＰｔ電極表面に固定化した。固定化した酵素電極を１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）に１時間浸すことで、電極表面を平衡化させた。最後に１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に１時間浸すことで洗浄し、酵素電極を作製した。
【００２３】
＜ＡＴＰの電気化学測定＞
下記（イ）〜（リ）の試薬を含むＡＴＰ測定溶液２．８ｍＬを調製した。但し、（イ）〜（リ）に示す濃度は、３ｍＬに対する濃度である。
（イ）１０ｍＭ  塩化マグネシウム六水和物
（ロ）０．０１ｍＭ  フラビンアデニンジヌクレオチド二ナトリウム塩
（ハ）０．２ｍＭ  塩化チアミンピロリン酸
（ニ）０．３３ｍＭ  アデノシン一リン酸
（ホ）０．３３ｍＭ  ホスホエノールピルビン酸
（ヘ）ウサギ筋肉由来  ４．７１Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  ピルビン酸キナーゼ
（ト）５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
（チ）０．１％  塩化ベンザルコニウム（ＯＤＳ処理済み）
調整したＡＴＰ測定溶液に対し、２５℃でピルビン酸オキシダーゼを固定化した酵素電極、銀（Ａｇ）／塩化銀（ＡｇＣｌ）を参照電極、Ｐｔワイヤを対極とし、＋６００ｍＶの電位を印加した。電流値が安定した後、ＯＤＳ処理を施した大腸菌細胞内ＡＴＰ抽出液１００μＬ、ウサギ筋肉由来０．３１Ｕｎｉｔｓ／ｍＬミオキナーゼ１００μＬを順に加え、反応させた。
【００２４】
なお、従来例としてＯＤＳ処理を施していない大腸菌細胞内ＡＴＰ抽出液を測定した。図１に、これらの試料の酵素電極から対極に流れる応答電流の時間変化を示す。
【００２５】
図１より明らかに、従来例（ＯＤＳ処理を施していない大腸菌細胞内ＡＴＰ抽出液）では、全く応答電流が流れない。一方、本発明のＯＤＳ処理した試料では、充分に高い応答電流が見られた。これは、本発明のＯＤＳ処理により塩化ベンザルコニウムを除去したことで、酵素反応の阻害を大幅に抑制したことを示している。
【００２６】
なお、本発明の実施の形態１においては、疎水性化合物として、ＯＤＳを用いたが、界面活性剤の有する疎水基と、疎水性化合物の有する疎水基とで生じる疎水結合を利用したものであるため、用いる疎水性化合物は、界面活性剤と疎水結合するものであれば特に限定されない。また、以下に詳述するが、疎水性化合物は担体に結合された状態で使用するため、その担体は細胞内ＡＴＰ抽出液と担体が分離できるものであれば特に限定されない。このようなものとして、例えば、ビーズ、流路等の固相への固定が挙げられる。
【００２７】
また、本発明に用いる界面活性剤は、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤等、細胞表面に存在するリン脂質に吸着することにより流動性が変化し、細胞表面構造の維持を不安定化させるものであれば特に限定されないが、細胞表面への吸着速度が速い陽イオン界面活性剤が好ましい。さらに、細胞内ＡＴＰ測定方法は、酵素を用いるものであれば特に限定されず、このような例として生物発光法、電気化学測定法、酵素法がある。
【００２８】
以上のことから、本発明のＡＴＰ測定方法は、界面活性剤の影響を大幅に低減し、酵素や界面活性剤の種類を問わず、正確かつ感度良く細胞内ＡＴＰを測定することができる。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明にかかる細胞内ＡＴＰの測定方法は、酵素反応を阻害する界面活性剤を選択的に除去することが出来るため、酵素や界面活性剤の種類を問わず、ＡＴＰを測定することができるため、ＡＴＰ酵素センサに応用できることを特徴とし、食品衛生分野における簡便なＡＴＰ測定に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の実施例１におけるＡＴＰの電気化学測定結果を示す図
【図１】
2009077644.tif 000005