(57)【要約】【課題】  特定分子を選択的に認識する分子認識蛍光標識シリカナノ粒子の調製法、および、その分子認識能評価方法。【解決手段】  蛍光物質を内包させたシリカナノ粒子表面を、特定分子を認識する高分子（分子認識高分子、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ  Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、ＭＩＰｓ）でコーティングすることにより、分子認識能をもった蛍光標識シリカナノ粒子を調製した。その特定分子認識能の評価を、分子認識蛍光標識シリカナノ粒子を固体表面上に固定した特定分子と擬似免疫反応させることによって行った。この方法がＭＩＰｓの分子認識能の評価法として有効であることを示した。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光物質を内包させて作成したシリカナノ粒子（蛍光標識シリカナノ粒子、φ＝約１００ｎｍ）を、特定分子を認識する分子認識高分子（ＭＩＰｓ）でコーティングすることを特長とする、分子認識蛍光標識シリカナノ粒子の調製法。
【請求項２】
上記分子認識蛍光標識シリカナノ粒子を、固体表面上に固定化した特定分子と擬似免疫反応させることによる、分子認識能の評価方法。
【請求項３】
上記請求項１および２による、ＭＩＰｓの分子認識能評価法。
【発明の詳細な説明】
【詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、微量抗菌性物質、環境汚染物質あるいは生体関連物質等の特定分子を、高選択、高感度に検知・分析するための分子認識蛍光標識シリカナノ粒子の調製、評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  特定微量物質を高選択、高感度に検知・分析するため、生物学的抗原抗体反応が汎用されている。しかし、上記抗体を用いる方法では、抗体が不安定である、あるいは、抗体を用いる反応操作が煩雑である等のため、使用に熟練を要することが多い。また、抗体が高価で、測定あたりのコストが高すぎる等の欠点もある。これらの欠点を補うため、特定分子を鋳型とする分子認識高分子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ  Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、ＭＩＰｓ）の使用が公知である（例えば特許文献１参照）。
【特許文献１】  特開２００５−５３３１４６
【０００３】  さらに、抗原抗体反応においては、測定感度増加のため、抗体を蛍光分子あるいは酵素で標識化することが行われている。標識分子としてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ▲Ｒ▼  タンパク質標識キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）、ＨｉＬｙｔｅＦｌｕｏｒ天然抗体標識化シリーズ（コスモ・バイオ株式会社製）、あるいは、ＱｕａｎｔａＢｌｕＴＭ  Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（タカラバイオ株式会社製）ペルオキシダーゼ蛍光標識キット等が市販されている。しかし、上記標識分子はいずれも不安定であり、価格も高価である等の欠点を持つ。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】  本発明は、このような諸事情に対処する為に提案されたもので、従来の抗原抗体反応で使用されている、不安定で高価な蛍光標識化抗体に代わる、安定、且つ、安価な分子認識蛍光標識シリカナノ粒子を調製すること、および、その分子認識能の評価法を確立することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００５】  上記課題を解決するため、請求項１の発明では、蛍光標識シリカナノ粒子の表面を、特定分子を認識するＭＩＰｓでコーティングすることにより、特定分子を認識する蛍光標識シリカナノ粒子を調製した。【０００６】  請求項２記載の分子認識能評価は、上記分子認識蛍光標識シリカナノ粒子を、他の固体表面（例えばシリカゲル、φ＝約１００μｍ）上に固定した特定分子と擬似免疫反応させることによって行った。
【発明の効果】
【０００７】  上述のように、請求項１の発明により、蛍光標識シリカナノ粒子表面上に、安定、且つ、安価な特定分子を認識する吸着サイトを形成し、従って、試料中の特定分子を擬似免疫反応によって捕捉可能な人工抗体の調製が可能である。【０００８】  請求項２記載の評価法により、多種多様な特定分子を対象とするＭＩＰｓの分子認識能を容易に評価することが可能となる。【０００９】  また、希薄溶液に含まれる微量特定分子を固体に抽出・濃縮した後、特許文献２の方法により特定分子の定量測定を可能とする。
【特許文献２】  特願２００７−４１４１４
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】  以下、図を用いて本発明の、特に、ペニシリンＧ（ＰＧ）を認識する分子認識蛍光標識シリカナノ粒子の調製とその認識能の評価に係わる実施の形態について説明する。【００１１】  図１は本発明に係わる分子認識蛍光標識シリカナノ粒子の推定される模式図である。それは、ＰＧを認識するＭＩＰｓのコーティング膜（ＰＧ−ＭＩＰｓ）２と蛍光性ルテニウム錯体を内包させた約１００ｎｍの粒系をもつシリカナノ粒子１（ＲｕＢｐｙ−ＳｉＯ２）からなる。以下にＰＧ認識蛍光標識ルテニウム・シリカナノ粒子３（ＰＧ−ＭＩＰｓ／ＲｕＢｐｙ−ＳｉＯ２）の調製工程について説明する。【００１２】  ゾルゲル法により蛍光性ルテニウム錯体（Ｔｒｉｓ（２，２′−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ）ｄｉｃｈｌｏｒｏｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ）ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ，Ｒｕｂｐｙ  ｄｙｅ）をシリカナノ粒子に内包した蛍光性ＲｕＢｐｙ−ＳｉＯ２（φ＝約１００ｎｍ）を調製する。【００１３】  この蛍光性ＲｕＢｐｙ−ＳｉＯ２をＰＧ−ＭＩＰｓのアセトニトリル飽和溶液中に添加し、室温で１時間反応させた後、吸引ろ過によりアセトニトリル溶媒から分離、および、空気中で乾燥する。
【実施例】
【００１４】  以下に本発明の実施の形態について、実施例によってさらに詳しく説明する。
【実施例１】蛍光性標識シリカナノ粒子ＲｕＢｐｙ−ＳｉＯ２の調製【００１５】  蛍光性ＲｕＢｐｙ−ＳｉＯ２の調製は、Ｔａｎらの方法（参照文献１  Ｗ．Ｔａｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｐｔ．，６巻（２００１年），１６０頁）に従った。【００１６】  即ち、ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ（７．５ｍｌ）、ｎ−ｈｅｘａｎｏｌ（１．８ｍｌ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（１．７７ｍｌ）、１．２ｍＭ  Ｒｕｂｐｙ  ｄｙｅ（Ｔｒｉｓ（２，２’−ｂｉｐｙｒｉｄｙｌ）ｄｉｃｈｌｏｒｏｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ）−６Ｈ２Ｏ）／ｗａｔｅｒ（０．４８ｍｌ）、ＴＥＯＳ（Ｔｅｔｒａｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）（０．１ｍｌ）を混合し、室温で２０分間振とうした。【００１７】  その後、ＮＨ４ＯＨ（６０μｌ）を加え、室温で２４時間振とうを続けた。【００１８】  ２４時間の反応の後、（ＣＨ３）２ＣＯ  １１ｍｌを加えｖｏｒｔｅｘする。【００１９】  これを遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）し、沈殿したものを９５％エタノールで３回洗浄した後、室温、空気中で乾燥させ、蛍光性ＲｕＢｐｙ−ＳｉＯ２を得た。【００２０】  こうして調製された蛍光性ＲｕＢｐｙ−ＳｉＯ２は、その直径がおよそ１００ｎｍの球体であり、層状のシリカ内に蛍光物質であるＲｕｂｐｙ  ｄｙｅが内包された構造になっていると考えられている（図１、３）。【００２１】  ここでは、蛍光標識化のための蛍光物質としてＲｕｂｐｙ  ｄｙｅを用いたが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例２】  ＰＧ分子認識蛍光標識シリカナノ粒子ＰＧ−ＭＩＰｓ／ＲｕＢｐｙ−ＳｉＯ２の調製【００２２】  実施例１のように調製したＲｕＢｐｙ−ＳｉＯ２表面上に、ＰＧを鋳型として調製し、ＰＧに分子認識能を持つＭＩＰｓ（ＰＧ−ＭＩＰｓ）をコーティングし、ＰＧに分子認識能を持つ蛍光標識化ＭＩＰｓを調製する。【００２３】  ここでは、抗菌性物質であるペニシリンＧを鋳型として作製したＭＩＰｓを用いた例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。【００２４】  ＰＧを鋳型とするＭＩＰｓ（ＰＧ−ＭＩＰｓ）はＵｒｒａｃａらの方法に従って調製した（参照文献２  ＪＬ．Ｕｒｒａｃａ他，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７９巻（２００７年），６９５頁）。ＰＧ−ＭＩＰｓ１０ｍｇを、アセトニトリル１０ｍｌ中に加えて６０℃で温めながらその飽和溶液を調製する。【００２５】  得られた飽和溶液１ｍｌ中に、実施例１で調製したＲｕＢｐｙ−ＳｉＯ２１０ｍｇを加え、室温で一時間、放置する。【００２６】  その後、吸引ろ過によりアセトニトリル溶媒を除去し、空気中で乾燥した試料をＰＧ−ＭＩＰｓ／ＲｕＢｐｙ−ＳｉＯ２６とした（図１）。
【実施例３】  ＰＧ−ＭＩＰｓ／ＲｕＢｐｙ−ＳｉＯ２の分子認識能評価【００２７】  実施例２において調製したＰＧ−ＭＩＰｓ／ＲｕＢｐｙ−ＳｉＯ２の分子認識能評価を、粒径、約１００μｍのシリカゲル表面上に固定したＰＧ７（図１）と擬似免疫反応させることによって行った。【００２８】  即ち、実施例２で調製したＰＧ−ＭＩＰｓ／ＲｕＢｐｙ−ＳｉＯ２（図２  １１）を加えた緩衝溶液中に、表面にＰＧを固定化したシリカゲル（図２  １３）を加えて、室温で１０分反応させる。【００２９】  ＰＧ−ＭＩＰｓ／ＲｕＢｐｙ−ＳｉＯ２表面上のＰＧ吸着サイト５（図１）にＰＧ固定化シリカゲル表面のＰＧ７が結合（擬似免疫反応）する。【００３０】  反応後、未反応のＰＧ−ＭＩＰｓ／ＲｕＢｐｙ−ＳｉＯ２を洗浄し、ＰＧ固定化シリカゲルに結合したものだけを残す（図２  １６）。【００３１】  洗浄後、シリカゲルをガラスプレート上に取り出し、蛍光顕微鏡により観察した写真を図３  ３１に示す。【００３２】  比較のため、ＰＧ−ＭＩＰｓ／ＲｕＢｐｙ−ＳｉＯ２を加えることなく、同様な操作後（図２  １８、１９）に観察した結果を図３  ３２に示した。【００３３】  また、ＰＧ未固定のシリカゲルを用いた同様な操作後（図２  ２１、２２）に観察した結果を図３  ３３に示した。【００３４】  本発明のＰＧ−ＭＩＰｓ／ＲｕＢｐｙ−ＳｉＯ２をＰＧ固定化シリカゲルに結合させた結果（図３  ３１）では、シリカゲル上にＲｕＢｐｙ−ＳｉＯ２による強い蛍光が観察された。一方、ＰＧ−ＭＩＰｓ／ＲｕＢｐｙ−ＳｉＯ２を加えていないＰＧ固定化シリカゲル上には、その様な強い蛍光は観察されず（図３  ３２）、図３  ３１で観察された蛍光がＰＧ−ＭＩＰｓ／ＲｕＢｐｙ−ＳｉＯ２によるものであることが確認された。【００３５】  また、ＰＧ−ＭＩＰｓ／ＲｕＢｐｙ−ＳｉＯ２をＰＧ未固定のシリカゲルと反応させた結果（図３  ３３）では、微弱な蛍光しか観察されなかった。従って、図３  ３１で観察された強い蛍光は、ＰＧ−ＭＩＰｓ／ＲｕＢｐｙ−ＳｉＯ２上のＰＧ吸着サイトにシリカゲル表面上に固定化されたＰＧが擬似免疫反応によって結合したことを裏付ける結果とすることが出来る。【００３６】  このよう方法によってＰＧ−ＭＩＰｓ／ＲｕＢｐｙ−ＳｉＯ２が持つＰＧ吸着サイトによるＰＧ分子認識能が評価された。
【利用方法】
【００３７】  蛍光物質を内包するシリカナノ粒子表面上にコートされたＭＩＰｓは、ＭＩＰｓを調製する際に用いた特定鋳型分子を認識する吸着サイトを持ち、従って特定分子を擬似免疫反応により高選択的に捕捉することができる人工抗体として利用が可能である。
【００３８】  また、希薄溶液に含まれる微量特定分子を固体に抽出・濃縮した後、その特定分子を、分子認識蛍光標識シリカナノ粒子を人工抗体とする擬似免疫反応により、定量的に測定することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明における蛍光標識化分子認識人工抗体調製のための、蛍光物質を内包させたシリカナノ粒子、および、蛍光性シリカナノ粒子の分子認識人工抗体（ＭＩＰｓ）によるコーティングを示した図である。また、蛍光標識化分子認識人工抗体による特定分子の測定法についても示してある。図は全て断面図として示してある。
【図２】本発明において調製した蛍光標識化分子認識人工抗体の評価方法を示した図である。
【図３】本発明において調製した蛍光標識化分子認識人工抗体の評価結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【符号の説明】
【００３９】１  蛍光物質
２  シリカゲル層
３  蛍光性シリカゲル
４  分子認識人工抗体層
５  化合物分子認識サイト
６  蛍光標識化ＭＩＰｓ
７  化合物分子
８  ペニシリンＧ固定化シリカゲル
３１  蛍光標識化ＭＩＰｓとペニシリンＧ固定化シリカゲルとの結合物の顕微鏡写真
３２  ペニシリンＧ固定化シリカゲルの顕微鏡写真
３３  蛍光標識化ＭＩＰｓとペニシリンＧ未固定シリカゲルとの結合物の顕微鏡写真
【図１】
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【図２】
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【図３】
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