(57)【要約】【課題】１又は複数のプロテアーゼを多重に欠失又は不活性化した変異微生物、若しくは野生型の微生物における物質生産性を向上させる。【解決手段】枯草菌のhtrA遺伝子及び/又はhtrB遺伝子、若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させる。ここで、当該遺伝子に相当する遺伝子とは、枯草菌のhtrA遺伝子及びhtrA遺伝子と機能的に一致すると認められる、枯草菌以外の微生物由来の遺伝子を含む意味である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
枯草菌のhtrA遺伝子及びhtrB遺伝子、若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた微生物。
【請求項２】
上記htrA遺伝子、上記htrB遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子によりコードされるプロテアーゼとは異なるプロテアーゼをコードする１以上の遺伝子を更に欠失又は不活性化したことを特徴とする請求項１記載の微生物。
【請求項３】
上記htrA遺伝子、上記htrB遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子によりコードされるプロテアーゼとは異なるプロテアーゼをコードする遺伝子が、枯草菌のaprE遺伝子、nprB遺伝子、nprE遺伝子、bpr遺伝子、vpr遺伝子、mpr遺伝子、epr遺伝子、wprA遺伝子及びaprX遺伝子並びに当該各遺伝子に相当する遺伝子からなる群から選ばれるものであることを特徴とする請求項２記載の微生物。
【請求項４】
枯草菌のaprE遺伝子、nprB遺伝子、nprE遺伝子、bpr遺伝子、vpr遺伝子、mpr遺伝子、epr遺伝子、wprA遺伝子及びaprX遺伝子、又は当該各遺伝子に相当する遺伝子を更に欠失又は不活性化したことを特徴とする請求項１記載の微生物。
【請求項５】
バチルス属細菌であることを特徴とする請求項１乃至４いずれか一項記載の微生物。
【請求項６】
枯草菌であることを特徴とする請求項５記載の微生物。
【請求項７】
タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入したことを特徴とする請求項１記載の微生物。
【請求項８】
上記タンパク質又ポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域から選ばれる１以上の領域を結合したことを特徴とする請求項７記載の微生物。
【請求項９】
上記タンパク質又ポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域を結合したことを特徴とする請求項７記載の微生物。
【請求項１０】
上記タンパク質又ポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、枯草菌由来のセルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1kbに存在する転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域を結合したことを特徴とする請求項７記載の微生物。
【請求項１１】
上記タンパク質又ポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、バチルス属細菌のリパーゼ遺伝子由来又はプロテアーゼ遺伝子由来の分泌シグナル領域を結合したことを特徴とする請求項７記載の微生物。
【請求項１２】
上記タンパク質又ポリペプチドをコードする遺伝子は枯草菌のLipA遺伝子であることを特徴とする請求項７乃至１１いずれか一項記載の微生物。
【請求項１３】
請求項１乃至１２いずれか一項記載の微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
【請求項１４】
請求項１２記載の微生物を用いるリパーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアーゼをコードする特定の遺伝子を欠失又は不活性化した微生物、当該微生物を用いたタンパク質又はポリペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬や、洗剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。
【０００３】
こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっており、遺伝子組換えのための宿主微生物の開発が進められている。例えば、枯草菌（Bacillus subtilis） Marburg  No.168系統株の様に宿主微生物として安全かつ優良と認められた微生物菌株に更に改良を加えた菌株が開発されている。
【０００４】
しかしながら、微生物は元来、自然界における環境変化に対応するための多種多様な遺伝子群を有しており、限定された生産培地が使用されるタンパク質等の工業的生産においては、必ずしも効率的であるとは言えない状況であった。特に、微生物はタンパク質を分解して窒素及び炭素源として利用するために多種のタンパク質分解酵素を持っており、これらが目的のタンパク質等を分解し、外来タンパク質等の生産において大きな障害になっていた。
【０００５】
こうしたタンパク質分解酵素（プロテアーゼ、ペプチダーゼなど）の遺伝子を欠損させることによって、生産される目的タンパク質の分解を防ぐ試みは古くから行われており、特に枯草菌においては、主要な細胞外アルカリプロテアーゼであるAprE、或いは中性プロテアーゼであるNprEをコードする遺伝子、或いはそれら両遺伝子の欠損（非特許文献１、２及び３参照）を初めとして、計８種類（aprE遺伝子、nprB遺伝子、nprE遺伝子、bpr遺伝子、vpr遺伝子、mpr遺伝子、epr遺伝子、wprA遺伝子及びaprX遺伝子）の細胞外や細胞壁結合型のプロテアーゼ、ペプチダーゼの遺伝子について遺伝子欠損微生物、更にはこれら８種類のプロテアーゼ、ペプチダーゼの遺伝子が全て欠損した枯草菌株の報告例も知られていた(非特許文献４参照）。また、特許文献１には、これら８種類のプロテアーゼ遺伝子の他にaprX遺伝子を更に欠失又は不活性化した微生物が開示され、当該微生物により有用酵素やタンパク質の分泌生産性が向上するといった技術が開示されていた。
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−１７４７０７号公報
【非特許文献１】J. Bacteriol., 158, 411, (1984)
【非特許文献２】J. Bacteriol., 160, 15, (1984)
【非特許文献３】J. Bacteriol., 160, 442, (1984)
【非特許文献４】Appl. Environ. Microbiol., 68, 3261, (2002)
【非特許文献５】Microbiology, 145, 3121-3127, (1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、複数のプロテアーゼ遺伝子を多重に欠失又は不活性させた変異微生物であっても、未だ十分な分泌生産性を達成できたとは言えず、また、当該変異微生物を用いても生産対象のタンパク質又ポリペプチドの種類によっては分泌生産性が向上したとは言えない状況であった。
【０００８】
そこで、本発明者らは、上述したような実情に鑑み、１又は複数のプロテアーゼを多重に欠失又は不活性化した変異微生物若しくは野生型の微生物における物質生産性が向上した微生物及び当該微生物を用いた物質の生産方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、枯草菌においてhtrA遺伝子及びhtrB遺伝子を欠失又は不活性化したときに、タンパク質又はポリペプチドの生産性が向上することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明に係る微生物は、枯草菌のhtrA遺伝子及びhtrB遺伝子、若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた微生物である。ここで、当該遺伝子に相当する遺伝子とは、枯草菌のhtrA遺伝子及びhtrA遺伝子と機能的に一致すると認められる、枯草菌以外の微生物由来の遺伝子を含む意味である。すなわち、本発明に係る微生物は、好ましくはバチルス属に属する微生物、特に枯草菌由来であることが望ましいが、これらに限定されるものではない。
【００１１】
特に、本発明に係る微生物は、上記htrA遺伝子、上記htrB遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子によりコードされるプロテアーゼとは異なるプロテアーゼをコードする１以上の遺伝子（以下、他のプロテアーゼ遺伝子と称する）を更に欠失又は不活性化したものであることが好ましい。他のプロテアーゼ遺伝子としては、枯草菌のaprE遺伝子、nprB遺伝子、nprE遺伝子、bpr遺伝子、vpr遺伝子、mpr遺伝子、epr遺伝子、wprA遺伝子及びaprX遺伝子並びに当該各遺伝子に相当する遺伝子を挙げることができる。ここで、微生物が生育可能である限り、複数のプロテアーゼ遺伝子が欠失又は不活性化していてもよい。特に、これら９種類の他のプロテアーゼ遺伝子全てが欠失又は不活性化していることが好ましい。
【００１２】
さらに、本発明に係る微生物は、遺伝子産物を生産目的として、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入することができる。このとき、導入される遺伝子は、本発明に係る微生物中で発現可能となるように導入される。例えば、上記タンパク質又ポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域から選ばれる１以上の領域（好ましくは、３領域全て）を結合することができる。特に、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域としては、枯草菌由来のセルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1kbに存在する領域を挙げることができる。また分泌シグナル領域としては、バチルス属細菌のリパーゼ遺伝子由来又はプロテアーゼ遺伝子由来の分泌シグナル領域を挙げることができる。
【００１３】
本発明に係る微生物を用いて生産するタンパク質又ポリペプチドとしては、何ら限定されないが、例えば、リパーゼ及びプロテアーゼを挙げることができる。より具体的には、本発明に係る微生物を用いることによって、枯草菌のLipA遺伝子によりコードされるリパーゼを製造することが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る微生物によれば、目的タンパク質又はポリペプチドの分解を防ぐことができ、これらを効率よく大量に生産することができる。また、本発明に係るタンパク質又ポリペプチドの製造方法によれば、目的タンパク質又はポリペプチドの分解を防ぐことができ、これらを効率よく大量に生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、図面を参照して本発明を詳細に説明する。
本発明に係る微生物は、枯草菌のhtrA遺伝子及びhtrB遺伝子、若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた微生物である。ここで枯草菌のhtrA遺伝子とは、Noone D, Howell A, Devine KM (2000) Expression of ykdA, encoding a Bacillus subtilis homologue of HtrA, is heat shock inducible and negatively autoregulated. J Bacteriol 182:1592-9.に開示された、ヒートショック・セリンプロテアーゼをコードする遺伝子として知られている。枯草菌のhtrA遺伝子の塩基配列及びHtrAタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。一方、枯草菌のhtrB遺伝子とは、Darmon E, Noone D, Masson A, Bron S, Kuipers OP, Devine KM, van Dijl JM (2002) A novel class of heat and secretion stress-responsive genes is controlled by the autoregulated CssRS two-component system of Bacillus subtilis. J Bacteriol 184:5661-71.に開示された、htrA遺伝子に類似したセリンプロテアーゼをコードする遺伝子として知られている。枯草菌のhtrB遺伝子の塩基配列及びHtrBタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３及び４に示す。
【００１６】
これらhtrA遺伝子及びhtrB遺伝子にコードされるHtrAタンパク質及びHtrBタンパク質は、共通して膜貫通ドメインを有しており、枯草菌の細胞壁に存在するタイプのセリンプロテアーゼである。したがって、これらHtrAタンパク質及びHtrBタンパク質は、分泌型タンパク質に対する分解活性を示すものである。
【００１７】
本発明に係る微生物を枯草菌から作製する場合には、上述したように定義したhtrA遺伝子及びhtrB遺伝子を欠失又は不活性化すればよい。しかしながら、本発明に係る微生物は、枯草菌から作製されたものに限定されず、枯草菌以外の如何なる微生物から作製してもよい。枯草菌以外の微生物から作製する場合には、対象とする微生物におけるhtrA遺伝子及び/又はhtrB遺伝子に相当する遺伝子（以下htrA相同遺伝子及びhtrB相同遺伝子と称する）を特定し、特定されたhtrA相同遺伝子及びhtrB相同遺伝子を当該微生物において欠失又は不活性化することで、本発明に係る微生物を作製することができる。
【００１８】
ここで、htrA相同遺伝子とは、上述したように定義された枯草菌のhtrA遺伝子と機能的に一致する遺伝子であると定義することができる。より具体的にhtrA相同遺伝子としては、配列番号２に示すHtrAタンパク質のアミノ酸配列に対して、例えば７０％以上、８０％以上或いは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列のタンパク質をコードする遺伝子と定義することができる。また、htrA相同遺伝子としては、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、特に好ましくは９７％以上、より特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列のタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。ここで、アミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法 (Science,227, 1435, (1985))によって計算される値を意味する。より具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される値を意味する。
【００１９】
これらhtrA相同遺伝子及びhtrB相同遺伝子は、htrAファミリーに属する一群の遺伝子として知られている。htrAファミリーは膜局在性ドメインをアミノ末端に持ち、ドデカマー形成に必要なPDZドメインと呼ばれる部位を有し、かつ、活性中心にセリンを有するタンパク質の総称である。HtrAファミリーは、マイコプラズマ以外の生物に広く見出されており、大腸菌においてはhhoA(degQ)遺伝子及びhhoB(degS)遺伝子、緑膿菌においてはmucD遺伝子及びalgW遺伝子が知られている。
【００２０】
換言すると、本発明に係る微生物は、上述したようなhtrAファミリーに属するヒートショック・セリンプロテアーゼ遺伝子を有する微生物から作製することができる。但し、本発明に係る微生物は、htrAファミリーに属する遺伝子を有することが知られている微生物から作製されたものに限定されるものではない。つまり、本発明に係る微生物としては、上述したhtrA遺伝子及びhtrB遺伝子の塩基配列又はHtrAタンパク質及びHtrBタンパク質のアミノ酸配列に基づいて、遺伝子配列やタンパク質のアミノ酸配列を格納したデータベースから上述した同一性を基準としてhtrA相同遺伝子又はhtrB相同遺伝子を検索することで、htrA相同遺伝子又はhtrB相同遺伝子を有するものとして同定された微生物を用いてもよい。これら微生物としては、大腸菌やシュードモナス(Pseudomonas)属細菌以外にマイコバクテリウム(Mycobacterium)属細菌や、ヘルモフィルス(Haemophilus)属細菌、トレポネーマ(Treponema)属、が挙げられる。
【００２１】
なかでも本発明に係る微生物は、枯草菌などのバチルス(Bacillus)属細菌や、クロストリジウム(Clostridium)属細菌、或いは酵母等から作製されることが好ましい。特に、バチルス属細菌から本発明に係る微生物を作製することが好ましい。更に、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、またタンパク質又はポリペプチドを菌体外に分泌生産させる能力を有する点から、本発明に係る微生物は特に枯草菌から作製することが好ましい。さらに、枯草菌としては、タンパク質又はポリペプチドを菌体外に分泌生産させる能力の向上が図られた枯草菌変異株を使用することが好ましい。当該枯草菌変異株としては、本来有している複数のプロテアーゼ遺伝子のうち１又は複数のプロテアーゼ遺伝子が欠失又は不活性化されたものを使用することが好ましい。枯草菌変異株としては、具体的に、aprE、nprB、nprE、bpr、vpr、mpr、epr、wprA及びaprXの各遺伝子又は当該遺伝子に相当する９種類の遺伝子より選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化させたものが好ましい。特に、枯草菌変異株としては、主要な細胞外アルカリプロテアーゼであるAprE及び中性プロテアーゼであるNprEをそれぞれコードするaprE及びnprE遺伝子又は当該遺伝子に相当する３種類の遺伝子を欠失又は不活性化させたものが好ましく、更にはaprE、nprB、nprE、bpr、vpr、mpr、epr、wprA及びaprXの各遺伝子の全て、又は当該遺伝子に相当する９種類の遺伝子の全てを欠失又は不活性化させたものが特に好ましい。
【００２２】
ここで、htrA遺伝子、htrB遺伝子、htrA相同遺伝子又はhtrB相同遺伝子を欠失又は不活性化する方法としては、特に限定されず、従来公知の如何なる手法を用いても良い。すなわち、所定の遺伝子を欠失させる方法としては、相同組換えを用いて欠失対象の遺伝子を染色体ゲノムから削除する方法、ランダムに突然変異を誘発した後に所定の遺伝子を欠失した株を選抜する方法を挙げることができる。また、所定の遺伝子を不活性化する方法としては、相同組換えを用いて所定の遺伝子のコーディング領域、転写制御領域又は翻訳制御領域にDNA断片を挿入する方法、相同組み換えを用いて所定の遺伝子の転写制御領域又は翻訳制御領域をゲノム染色体から欠失させる方法、ランダムに突然変異を誘発した後に所定の遺伝子の転写制御領域又は翻訳制御領域が欠失した株を選抜する方法等を挙げることができる。
【００２３】
特に、本発明微生物を構築するための微生物として枯草菌を用いる場合、相同組換えにより所定の遺伝子を欠失又は不活性化させる方法については、Mol. Gen. Genet., 223, 268 (1990) 等を参照することができる。
【００２４】
以下、より具体的にSOE (splicing by overlap extension)-PCR法（Gene, 77, 61, (1989)）によって調製される欠失導入用DNA断片を用いた二重交差法による欠失方法について説明するが、本発明に於ける遺伝子欠失方法は下記に限定されるものではない。
【００２５】
本方法で用いる欠失導入用DNA断片は、欠失対象遺伝子の上流に隣接する約0.2〜3kb断片と、同じく下流に隣接する約0.2〜3kb断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片を挿入した断片である。まず、１回目のPCRによって、欠失対象遺伝子の上流断片及び下流断片、並びに薬剤耐性マーカー遺伝子断片の３断片を調製するが、この際、例えば、上流断片の下流末端に薬剤耐性マーカー遺伝子の上流側10〜30塩基対配列、逆に下流断片の上流末端には薬剤耐性マーカー遺伝子の下流側10〜30塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図１）。
【００２６】
次いで、１回目に調製した３種類のPCR断片を鋳型とし、上流断片の上流側プライマーと下流断片の下流側プライマーを用いて２回目のPCRを行うことによって、上流断片の下流末端及び下流断片の上流末端に付加した薬剤耐性マーカー遺伝子配列において、薬剤耐性マーカー遺伝子断片とのアニーリングが生じ、PCR増幅の結果、上流側断片と下流側断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子が挿入したDNA断片を得ることができる（図１）。
【００２７】
薬剤耐性マーカー遺伝子として、スペクチノマイシン耐性遺伝子を用いる場合、例えば表２に示したプライマーセットと適当な鋳型DNAを用い、Pyrobest DNAポリメラーゼ（宝酒造）などの一般のPCR用酵素キット等を用いて、成書（PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by B.A.White, Humana Press, pp251 (1993)、Gene, 77,61, (1989)等）に示される通常の条件によりSOE-PCRを行うことによって、各遺伝子の欠失導入用DNA断片が得られる。
【００２８】
かくして得られた欠失導入用DNA断片を、コンピテントセル形質転換法（J. Bacteriol.93, 1925 (1967)）等によって細胞内に導入すると、同一性のある欠失対象遺伝子の上流及び下流の相同領域おいて、細胞内での遺伝子組換えが生じ、標的遺伝子が薬剤耐性遺伝子と置換した細胞を薬剤耐性マーカーによる選択によって分離することができる（図１）。例えばスペクチノマイシン耐性遺伝子を用いて調製した欠失導入用DNA断片を導入した場合、スペクチノマイシンを含む寒天培地上に生育するコロニーを分離し、目的の遺伝子が欠失してスペクチノマイシン耐性遺伝子と置換していることを、ゲノムを鋳型としたPCR法などによって確認すれば良い。
【００２９】
また、所定の遺伝子の欠失方法としては、SOE-PCR法によって調製される欠失導入用DNA断片を挿入した欠失導入用プラスミドを用いた２段階の１重交差法を用いることもできる。
本方法については、特開２００６−１７４７０７号公報を参照にして実施することが可能である。
【００３０】
以上の様な方法により構築された本発明に係る微生物に、目的とするタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入することによって、当該タンパク質又はポリペプチドを高生産する組換え微生物を得ることができる。
【００３１】
本発明の微生物を用いて生産する目的タンパク質又はポリペプチドとしては、例えば洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断等の各種産業用酵素や生理活性因子等のタンパク質やポリペプチドが挙げられる。また、産業用酵素の機能別には、酸化還元酵素 (Oxidoreductase)、転移酵素 (Transferase)、加水分解酵素 (Hydrolase)、脱離酵素(Lyase)、異性化酵素(Isomerase)、合成酵素(Ligase/Synthetase)等が含まれるが、好適にはプロテアーゼ及びリパーゼを挙げることができる。
【００３２】
特に、本発明に係る微生物は、枯草菌の細胞壁に存在するタイプのセリンプロテアーゼであるhtrA遺伝子或いはhtrA相同遺伝子及びhtrB遺伝子或いはhtrB相同遺伝子を欠失又は不活性化しているため、分泌型のタンパク質又はポリペプチドを生産することが好ましい。より詳細に本発明に係る微生物は、分泌型のタンパク質又はポリペプチドのなかでも、細胞壁に存在するタイプのセリンプロテアーゼによって分解されやすい分泌型のタンパク質又はポリペプチドの生産に使用することが好ましい。
【００３３】
具体的には、本発明に係る微生物を用いて分泌型のリパーゼを生産することが好ましい。特にリパーゼとしては、Jaegerらの分類（Biochem. J.  1999 343:177-183）に従いTrue lipaseに分類されるリパーゼ、GDSLファミリーに分類されるリパーゼ、HSLファミリーに分類されるリパーゼの他、フアミリーIIIからVIIIに分類されるリパーゼを生産対象のリパーゼとすることが好ましい。中でもリパーゼとしては、例えば枯草菌のLipA遺伝子によってコードされるLipAタンパク質や膜に局在することが知られているSerratia marcescens由来LipA（Journal of bioscience and bioengineering 2001 (4) 409-415）が挙げられる。
【００３４】
さらに生産対象のタンパク質としては、分泌型のプロテアーゼを挙げることができる。特に、プロテアーゼとしては、true subtilisin(Siezen and Leunissen, Protein science, 6, 501-523, 1997)に分類されるプロテアーゼ、Oxidatively Stable alkaline Proteases(OSPs)(Saeki et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 279, 313-319, 2000)に属するプロテアーゼ、high-alkaline protease(Siezen and Leunissen, Protein science, 6, 501-523, 1997)に分類されるプロテアーゼを生産対象のプロテアーゼとすることが好ましい。中でもプロテアーゼとしては、例えばバチルス・エスピーKSM-K16株（GenBank accession no. Q99405(:微工研条寄第3376号由来)）が分泌するM-protease（KAP）があげられる。その他にも生産対象のプロテアーゼとしてはtrue subtilisin(Siezen and Leunissen, Protein science, 6, 501-523, 1997)に分類されるプロテアーゼaprE(GenBank accession no. AAA22742（バチルス・エスピー168株由来）及びプロテアーゼKS(特開2004-313043号公報（バチルス・エスピーKSM-KP43株由来）、Oxidatively Stable alkaline Proteases(OSPs)(Saeki et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 279, 313-319, 2000)に属するプロテアーゼKP-43(国際公開第99/18218号パンフレット：GenBank accession no. AB051423(バチルス・エスピーKSM-KP43株（FERM BP-6532）由来))、プロテアーゼNP-1(国際公開第88/01293号パンフレット：GenBank accession no. AB046406(バチルス・エスピーNCIB 12KS9株由来))及びプロテアーゼE-1(特許公開昭49-071191号公報：Genbank accession no. AB046402（バチルス・エスピーD-6株(FERM P-1592)由来）)があげられる。さらに、本発明に係る微生物により生産されるタンパク質としてはヒトなどの高等生物由来の生理活性タンパク質や酵素などが挙げられる。好適な例としては、インターフェロンα、インターフェロンβ、成長ホルモン、唾液腺アミラーゼ等が挙げられる。また、生理活性タンパク質などを構成する一部のドメイン等も発現可能であり、例えば、ヒトＣ型肝炎ウィルス抗体の抗原認識ドメインPreS2などが挙げられる。
【００３５】
また、目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域が適正な形で結合されていることが望ましい。特に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が結合されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス属細菌のリパーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始領域及び翻訳開始領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1 kb領域であるものが、目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子と適正な形で結合されていることが望ましい。例えば、特開2000-210081号公報や特開平4-190793号公報等に記載されているバチルス属細菌、すなわちKSM-S237株（FERM BP-7875）、KSM-64株（FERM BP-2886）由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域が目的タンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。より具体的には配列番号５で示される塩基配列の塩基番号1〜659の塩基配列、配列番号６で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜696の塩基配列、また当該塩基配列に対して７０％以上、８０％以上または、９０％以上の相同性を有することが好ましく、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、特に好ましくは９７％以上、より特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、あるいは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片が、目的タンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。なお、ここで、上記塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片とは、上記塩基配列の一部を欠失しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を保持しているＤＮＡ断片を意味する。
【００３６】
上記の目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子を含むDNA断片と適当なプラスミドベクターを結合させた組換えプラスミドを、一般的な形質転換法によって本発明に係る微生物に取り込ませることによって、目的タンパク質又はポリペプチドを生産する組換え微生物を得ることができる。また、当該DNA断片に本発明に係る微生物のゲノムとの適当な相同領域を結合したDNA断片を用い、ゲノムに直接組み込むことによっても当該組換え微生物を得ることができる。
【００３７】
組換え微生物を用いた目的タンパク質又はポリペプチドの生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、タンパク質又はポリペプチドを採取・精製することにより行えばよい。培地の成分・組成などは特に限定されないが、好ましくは、炭素源としてマルトース又はマルトオリゴ糖を含む培地を用いれば、より良い結果が得られる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３９】
以下の実施例におけるDNA断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）には、GeneAmp PCR System（アプライドバイオシステムズ）を使用し、Pyrobest DNA Polymerase（タカラバイオ）と付属の試薬類を用いてDNA増幅を行った。PCRの反応液組成は、適宜希釈した鋳型DNAを1μL、センス及びアンチセンスプライマーを各々20pmol及びPyrobest DNA Polymeraseを2.5U添加して、反応液総量を50μLとした。PCRの反応条件は、98℃で10秒間、55℃で30秒間及び72℃で1〜5分間（目的増幅産物に応じて調整。目安は1kbあたり1分間）の3段階の温度変化を30回繰り返した後、72℃で5分間反応させることにより行った。
【００４０】
また、以下の実施例において、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の開始コドンの5’側に続く領域を示し、一方、下流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の終始コドンの3’側に続く領域を示す。
【００４１】
さらに、以下の実施例における各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Nature, 390, 249-256,(1997)で報告され、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。
【００４２】
さらにまた、以下の実施例において、枯草菌の形質転換は以下の様に行った。すなわち、枯草菌株をSPI培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.02% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.25μM 塩化マンガン、50μg/ml トリプトファン）において37℃で、生育度(OD600)の値が1程度になるまで振盪培養した。振盪培養後、培養液の一部を9倍量のSPII培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.01% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.40μM 塩化マンガン、5μg/ml トリプトファン）に接種し、更に生育度(OD600)の値が0.4程度になるまで振盪培養することで、枯草菌株のコンピテントセルを調製した。
【００４３】
次いで調製したコンピテントセル懸濁液（SPII培地における培養液）100μLに各種DNA断片を含む溶液（SOE-PCRの反応液等）5μLを添加し、37℃で１時間振盪培養後、適切な薬剤を含むLB寒天培地（1%トリプトン、0.5%酵母エキス、1%NaCl、1.5%寒天）に全量を塗沫した。37℃における静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするPCRによって目的とするゲノム構造の改変が為されたことを確認した。
【００４４】
目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の宿主微生物への導入は、コンピテントセル形質転換法（J. Bacteriol. 93, 1925 (1967)）、エレクトロポレーション法（FEMS Microbiol. Lett. 55, 135 (1990)）、プロトプラスト形質転換法（Mol. Gen. Genet. 168, 111 (1979)）のいずれかによって行った。
【００４５】
組換え微生物によるタンパク質生産用の培養には、LB培地（1％トリプトン、0.5％酵母エキス、1％NaCl）、2xYT培地（1.6％トリプトン、1％酵母エキス、0.5％NaCl）、2xL−マルトース培地（2％トリプトン、1％酵母エキス、1％NaCl、7.5％マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物）、或いはCSL発酵培地（2%酵母エキス、0.5%コーンスティープリカー（CSL）、0.05%塩化マグネシウム七水和物、0.6%尿素、0.2%L-トリプトファン、10%グルコース、0.15%リン酸二水素ナトリウム、0.35%リン酸水素二ナトリウム、pH7.2）を用いた。
【００４６】
〔実施例１〕枯草菌ゲノム中htrA及びhtrB遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換
本実施例では、図１に示したSOE-PCRを用いて枯草菌ゲノム中htrA及びhtrB遺伝子の薬剤耐性遺伝子にて置換することで、htrA遺伝子欠失株、htrB遺伝子欠失株及びhtrA/htrB遺伝子欠損株を構築した。なお、htrA及びhtrB遺伝子は枯草菌のhtrAプロテアーゼファミリーに属する分泌ストレス応答系細胞膜プロテアーゼをコードする遺伝子である（Molecular Microbiology 2001 42(5) 1159-1172）。
【００４７】
htrA遺伝子欠失用DNAは枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表１に示したhtrA/Cm-F及びhtrA-RVのプライマーセットを用いて、ゲノム中のhtrA遺伝子の上流に隣接する1kb断片をPCRにより増幅した。また、上記ゲノムDNAを鋳型とし、htrA-FW及びhtrA/Cm-Rのプライマーセットを用いて、ゲノム中のhtrA遺伝子の下流に隣接する1kb断片をPCRにより増幅した。
【００４８】
htrB遺伝子欠失用DNAに関してもhtrAの場合と同様に、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表1に示したhtrB/SP-F及びhtrB-Rのプライマーセットを用いて、ゲノム中のhtrB遺伝子の上流に隣接する1kb断片をPCRにより増幅した。また、上記ゲノムDNAを鋳型とし、htrB-F及びhtrB/Sp-Rのプライマーセットを用いて、ゲノム中のhtrB遺伝子の下流に隣接する1kb断片をPCRにより増幅した。
【００４９】
さらに、プラスミドpC194（J. Bacteriol. 150 (2), 815 (1982)）のクロラムフェニコール（Cm）耐性遺伝子を有するプラスミドpCBB31を鋳型とし、表１に示したCmF及びCmRのプライマーセットを用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子領域をPCRにより調製した。
【００５０】
また、スペクチノマイシン（Sp）耐性遺伝子に関しても同様に、スペクチノマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドpDG1727（Gene, 167, 335, (1995)）を鋳型とし、表１に示したSpF及びSpRのプライマーセットを用いて、スペクチノマイシン耐性遺伝子領域をPCRにより調製した。
【００５１】
【表１】
2009038985.tif 000002
【００５２】
次に、図１に示したように、得られた遺伝子上流断片、遺伝子下流断片及び薬剤耐性遺伝子領域の3断片を混合して鋳型として、htrA-R2及びhtrA-F2のプライマーセットを用いたSOE-PCR法によって、3断片が連続して含まれるhtrA遺伝子欠失用DNA断片（D）を得た。htrB遺伝子欠失用DNA断片も同様の手法によりhtrB-R2及びhtrB-F2のプライマーセットを用いたSOE-PCR法によって取得した。
【００５３】
コンピテントセル形質転換法によって、得られたDNA断片を用いて、プロテアーゼ遺伝子９重欠失株（Kao9株）（特開2006-174707号公報）の形質転換を行った。なお、プロテアーゼ遺伝子９重欠失株（Kao9株）とは、枯草菌のaprE、nprB、nprE、bpr、vpr、mpr、epr、wprA及びaprXの各遺伝子を欠損した枯草菌変異株である。形質転換後、クロラムフェニコール（10μg/mL）もしくはスペクチノマイシン（0.5μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。
【００５４】
得られた形質転換体のゲノムDNAを抽出し、PCRによって標的遺伝子が薬剤耐性遺伝子に置換していることを確認した。以上のようにして、htrA遺伝子欠失株及びhtrB遺伝子欠失株（ΔhtrA株、ΔhtrB株）を構築した。さらに、同様の手法によりhtrB欠失用DNA断片を用いてΔhtrA株の形質転換を行い、htrA遺伝子及びhtrB遺伝子が共に欠失したhtrA/htrB遺伝子欠失株株（ΔhtrA/B株）を構築した。
【００５５】
〔実施例２〕
実施例１にて得られたΔhtrA株、ΔhtrB株及びΔhtrA/B株の異種タンパク質生産性評価は、配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるリパーゼの生産性を指標として行った。リパーゼ生産性評価の際に用いる発現用DNAは以下の手法にて構築した。枯草菌１６８株より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表2に示されるS237p+lipApre-FとlipA-R(XbaI)のプライマーセットを用いてPCRを行い、リパーゼLipA（Eur J Biochem 1993 216 155-160）をコードする配列番号２３で示される塩基配列のうちLipAのシグナル配列、プロ配列および成熟酵素領域を含む1.2kbのDNA断片を増幅した。またバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表2に示されるS237-F(BamHI)とS237p+lipApre-Rのプライマーセットを用いてPCRを行い、配列番号２５で示されるアルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報、本遺伝子によりコードされるアルカリセルラーゼのアミノ酸配列を配列番号２６に示す）のうち転写開始制御領域、翻訳開始制御プロモーター領域をコードする0.6kbのDNA断片を増幅した。次いで、得られたの2断片を混合して鋳型とし、表2に示されるS237-F(BamHI)とlipA-R(XbaI)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御プロモーター領域の下流に、LipAのシグナル配列、プロ配列、成熟酵素領域、転写終結領域が連結したDNA断片を得た。得られたDNA断片をシャトルベクターpHY300PLK（ヤクルト）のBamHI-XbaＩ制限酵素切断点に挿入し、LipA生産性評価用プラスミドpHLApmを構築した。
【００５６】
【表２】
2009038985.tif 000003
【００５７】
プロトプラスト形質転換法を用いてKao9株、ΔhtrA株、ΔhtrB株及びΔhtrA/B株にpHLApmを導入後、これによって得られた菌株を5mLのLB培地で一夜30℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.03 mLを30 mLの2xL−マルトース培地（2% トリプトン、1% 酵母エキス、1% NaCl、7.5% マルトース、7.5 ppm 硫酸マンガン4-5水和物、15 ppm テトラサイクリン）に接種し、30℃で3日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のリパーゼ活性をリキテックリパーゼカラー（ロシュ）により測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたLipAの量を求めた。リキテックリパーゼカラーは、1,2-O-ジラウリル-rac-グリセロ-3-グルタル酸-(6-メチルレゾルフィン)エステルを基質として含み、遊離したメチルレゾルフィンの増加による吸光度変化を測定することでリパーゼ活性を測定する試薬である（Neumann, U.ら EP 207252）。具体的には、試薬1（緩衝液）と試薬2（基質液）を5:3の割合で混合した反応溶液100μLに、13.3 mMリン酸緩衝液（pH7.4 和光純薬工業）で適宜希釈したサンプル溶液50μLを混合し、マイクロプレートリーダー（SPECTRAmax PLUS, Molecular Devices）によって30℃における570 nmの吸光度（A570nm）変化を10分間測定した。1分間にメチルレゾルフィンを1μM遊離する酵素量を1ユニット（U）と定義し、酵素キャリブレーターC.f.a.s.II（ロシュ）を標準液として、各サンプルの活性（U/L）を測定した。結果を図2に示す。
【００５８】
図2は、24時間（白）、48時間（灰）、72時間（黒）目にサンプリングを行った結果であり、横軸にはhtrA、htrBをKao9株から欠失（−）もしくは非欠失（＋）した株を示している。縦軸には培養液の遠心後上清におけるリパーゼ活性を示しており、活性値はKao9株［htrA、htrBとも非欠失（+）で表記］を宿主とした場合の48時間目における活性を100%とした相対活性で示している。この結果より、リパーゼはhtrA、htrB単独欠失では殆ど生産性向上効果がみられない一方で、両欠失株には明らかに生産性向上効果（113%）が見られることがわかる。
【００５９】
〔実施例３〕セルラーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ分泌生産評価
実施例１にて得られたΔhtrA/B株のリパーゼ以外の異種タンパク質生産性評価は、配列番号２６で示されるアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼ、配列番号３２で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌由アルカリプロテアーゼ及び配列番号３４で示されるアミノ酸配列からなるアルカリアミラーゼの生産性を指標として行った。
【００６０】
＜セルラーゼ分泌生産能評価＞
アルカリセルラーゼ生産性評価に関しては、バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）をコードするDNA断片（3.1kb）がシャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドpHY-S237を用いて行った。プロトプラスト形質転換法を用いてKao9株及びΔhtrA/B株にpHY-S237を導入後、これによって得られた菌株を5mLのLB培地で一夜30℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.03 mLを30 mLの2xL−マルトース培地（2% トリプトン、1% 酵母エキス、1% NaCl、7.5% マルトース、7.5 ppm 硫酸マンガン4-5水和物、15 ppm テトラサイクリン）に接種し、30℃で4日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。セルラーゼ活性測定については、1/7.5M リン酸緩衝液(pH7.4 和光純薬)で適宜希釈したサンプル溶液50μLに0.4mM p-nitrophenyl-β-D-cellotrioside(生化学工業)を50μL加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロフェノール量を420nmにおける吸光度(OD420nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとした。
【００６１】
＜プロテアーゼ分泌生産能評価＞
アルカリプロテアーゼ生産性評価は以下の手法にて行った。まず、発現用DNAの構築に際して、バチルス クラウジイ（Bacillus clausii）KSM-K16株（FERM BP-3376）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表３に示されるS237pKAPpp-FとKAPter-R(BglII)のプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリプロテアーゼ（特許第3026111）をコードする配列番号３１で示される塩基配列のうちアルカリプロテアーゼのシグナル配列、プロ配列および成熟酵素領域を含む1.2kbのDNA断片を増幅した。またバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表3に示されるS237ppp-F2(BamHI)とS237pKAPpp-Rのプライマーセットを用いてPCRを行い、配列番号２５で示されるアルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）のうち転写開始制御領域、翻訳開始制御プロモーター領域をコードする0.6kbのDNA断片を増幅した。次いで、得られたの2断片を混合して鋳型とし、表3に示されるS237ppp-F2(BamHI)とKAPter-R(BglII)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御プロモーター領域の下流に、アルカリプロテアーゼのシグナル配列、プロ配列および成熟酵素領域が連結した1.8kbのDNA断片を得た。得られた1.8kbのDNA断片をシャトルベクターpHY300PLK（ヤクルト）のBamHI-BglII制限酵素切断点に挿入し、アルカリプロテアーゼ生産性評価用プラスミドpHYKAP（S237p）を構築した。
【００６２】
【表３】
2009038985.tif 000004
【００６３】
さらに、構築したプラスミドpHYKAP(S237p)をプロトプラスト形質転換法によって各菌株に導入した。これによって得られた組換え菌株を10 mLのLB培地で一夜37℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.05 mLを50 mLの2×L-マルトース培地（2% トリプトン、1% 酵母エキス、1% NaCl、7.5% マルトース、7.5 ppm硫酸マンガン4-5水和物、15 ppmテトラサイクリン）に接種し、30℃にて３日間振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリプロテアーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリプロテアーゼの量を求めた。培養上清中のプロテアーゼの活性測定は以下のとおり行った。すなわち、2mM CaCl2溶液で適宜希釈した培養上清50μlに、7.5mMのSuccinyl-L-Alanyl-L-Alanyl-L-Alanine p-Nitroanilide (STANA ペプチド研究所)を基質として含む75mM ほう酸-KCl緩衝液（pH10.5）を100μL加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロアニリン量を420nmにおける吸光度変化(OD420nm)により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロアニリンを遊離させる酵素量を1Uとした。
【００６４】
＜アミラーゼ分泌生産能評価＞
アルカリアミラーゼ評価生産性評価は以下の手法にて行った。まず、発現用DNAの構築に際して、バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-K38株（FERM BP-6946）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表4に示されるK38matu-F2(ALAA)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いてPCRを行い、成熟型のアルカリアミラーゼ（特開2000-184882号公報、Eur.J.Biochem.,268,2974,2001）をコードする領域を含む1.5kbのDNA断片を増幅した。増幅したDNA断片のうち、成熟型アミラーゼをコードする領域及びその下流を配列番号３３に示す。またバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表4に示されるS237ppp-F2(BamHI)とS237ppp-R2(ALAA)のプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）の転写開始制御領域、翻訳開始制御プロモーター領域及び分泌シグナル配列をコードする領域を含む0.6kbのDNA断片を増幅した。次いで、得られた2断片を混合して鋳型とし、表4に示されるS237ppp-F2(BamHI)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御プロモーター領域及び分泌シグナル配列をコードする領域の下流に成熟型のアルカリアミラーゼをコードする遺伝子が連結した2.1kbのDNA断片を得た。得られた2.2kbのDNA断片をシャトルベクターpHY300PLK（ヤクルト）のBamHI-XbaI制限酵素切断点に挿入し、アルカリアミラーゼ生産性評価用プラスミドpHYK38(S237ps)を構築した。
【００６５】
【表４】
2009038985.tif 000005
【００６６】
さらに、構築したプラスミドpHYK38(S237ps)をプロトプラスト形質転換法によって各菌株に導入した。これによって得られた組換え菌株を10 mLのＬＢ培地で一夜37℃において振盪培養を行い、更にこの培養液0.05 mLを50 mLの2×L-マルトース培地（2% トリプトン、1% 酵母エキス、1% NaCl、7.5% マルトース、7.5 ppm硫酸マンガン4-5水和物、15 ppmテトラサイクリン）に接種し、30℃にて３日間振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアミラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアミラーゼの量を求めた。
【００６７】
培養上清中のアミラーゼの活性測定にはリキテックAmy EPS(ロシュ・ダイアグノスティックス社)を使用した。すなわち1% NaCl-1/7.5M リン酸緩衝液 (pH7.4 和光純薬工業)で適宜希釈したサンプル溶液50μLに、100μLのR1・R2混合液(R1(カップリング酵素)：R2(アミラーゼ基質)=5：1(Vol.))を加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロフェノール量を405nmにおける吸光度(OD405nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとした。
【００６８】
＜結果＞
本実施例で行ったセルラーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼの生産性評価結果を図3に示す。図3は、24時間（白）、48時間（灰）、72時間（黒）目にサンプリングを行った結果であり（a）がセルラーゼ、（b）がプロテアーゼ、(c)がアミラーゼの生産性評価結果である。縦軸に培養液の遠心後上清における各酵素活性を相対活性で示しており、セルラーゼ、プロテアーゼに関してはKao9株を宿主とした場合の48時間目における活性を100%とした相対活性で示している。また、アミラーゼに関してはKao9株を宿主とした場合の72時間目における活性を100%とした相対活性で示している。この結果より、プロテアーゼはΔhtrA/B欠失株で顕著な生産性向上効果があることがわかった（156%）。
【００６９】
＜比較実験＞
本実施例では、上述したΔhtrA/B株における異種タンパク質の生産性と、ΔhtrA単独欠失株及びΔhtrB単独欠失株による異種タンパク質の生産性とを比較した。すなわち、プラスミドpHYKAP(S237p)をプロトプラスト形質転換法によって、実施例１にて得られたΔhtrA株、ΔhtrB株、ΔhtrA/B株及びKao9株に導入した。これによって得られた組換え菌株を10 mLのLB培地で一夜37℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.05 mLを50 mLの2×L-マルトース培地（2% トリプトン、1% 酵母エキス、1% NaCl、7.5% マルトース、7.5 ppm硫酸マンガン4-5水和物、15 ppmテトラサイクリン）に接種し、30℃にて３日間振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリプロテアーゼ活性を上述した手法にて測定した。
【００７０】
＜結果＞
本比較実験で行ったプロテアーゼの72時間目における生産性評価結果を図4に示す。活性はKao9株を宿主とした場合の培養活性を100%とする相対活性で示している。図4よりΔhtrA単独欠失株、ΔhtrB単独欠失株によるプロテアーゼ生産性向上効果は確認できず、プロテアーゼ生産性向上には両遺伝子の多重欠失（ΔhtrA/B欠失株）が必要であることが判明した。
【００７１】
〔実施例４〕野生株及びプロテアーゼ3重欠失株（Kao3株）、プロテアーゼ5重欠失株（Kao5株）を親株とした場合のΔhtrA/Bによるリパーゼ及びアミラーゼ生産性向上効果
実施例1と同様の手法にて野生型枯草菌（Bacillus subtilis 168株）、プロテアーゼ3重欠失株（Kao3株）（特開2006-174707号公報）、プロテアーゼ5重欠失株(kao5株)（特開2006-174707号公報）からhtrA及びhtrBを二重欠失した株168ΔhtrA/B株、Kao3ΔhtrA/B株、Kao5ΔhtrA/B株を作製した。ここで、プロテアーゼ3重欠失株（Kao3株）は、aprE、nprE、及びaprXの3遺伝子が欠失した変異株であり、プロテアーゼ5重欠失株(kao5株)は、nprB、bpr、mpr、epr及びwprA を欠失した変異株である。プロトプラスト形質転換法によって、作製した変異株及び親株に実施例1で作成したプラスミドpHLApmもしくは実施例2において構築したプラスミドpHYKAP(S237p)を導入し、これによって得られた組換え菌株を10 mLのLB培地で一夜37℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.05 mLを50 mLの2×L-マルトース培地（2% トリプトン、1% 酵母エキス、1% NaCl、7.5% マルトース、7.5 ppm硫酸マンガン4-5水和物、15 ppmテトラサイクリン）に接種し、30℃にて３日間振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のリパーゼ活性またはアルカリプロテアーゼ活性を実施例2または実施例3と同様の手法にて測定した。
【００７２】
＜結果＞
本実施例で行ったリパーゼの72時間目における生産性評価結果を図5(a)に、プロテアーゼの生産性評価結果を図5(b)に示す。活性は各々の親株を宿主とした場合の培養活性を100%とする相対活性で示している。図5(a)よりリパーゼに関してはKao3株及びKao5株を親株としてhrtA及びhtrBを欠失した場合に生産性向上効果が確認された（127%及び123%）。また、図5(b)よりプロテアーゼに関してはKao5株を親株としてhrtA及びhtrBを欠失した場合に生産性向上効果が確認された（183%）。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】SOE-PCRによる遺伝子欠失導入用DNA断片の調製、及び当該DNA断片を用いて標的遺伝子を欠失（薬剤耐性遺伝子と置換）させる方法を示す模式図である。
【図２】ΔhtrA株、ΔhtrB株及びΔhtrA/B株におけるリパーゼ分泌生産能を示す特性図である。
【図３】ΔhtrA/B株におけるセルラーゼ、プロテアーゼ及びアミラーゼの分泌生産能を示す特性図である。
【図４】ΔhtrA株、ΔhtrB株及びΔhtrA/B株におけるプロテアーゼ分泌生産能を示す特性図である。
【図５】168ΔhtrA/B株、Kao3ΔhtrA/B、Kao5ΔhtrA/Bにおけるリパーゼ及びプロテアーゼの分泌生産能を示す特性図である。
【図１】
2009038985.tif 000006
【図２】
2009038985.tif 000007
【図３】
2009038985.tif 000008
【図４】
2009038985.tif 000009
【図５】
2009038985.tif 000010
【配列表】
2009038985000001.app