(57)【要約】【課題】ウイルス増殖に必要な細胞性遺伝子を同定する方法および腫瘍サプレッサーとして機能する細胞性遺伝子を提供することを、本発明の課題とする。【解決手段】上記課題は、本発明の配列表に記載される配列を有する遺伝子を提供することによって解決された。本発明はまた、ウイルス感染または癌に関連した核酸、およびこのウイルス感染または癌を減少させるかまたは防止する方法を提供する。本発明はまた、実質的にウイルスを含有しない細胞培養物を産生する方法、およびさらなるこのような遺伝子についてスクリーニングするための方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下に記載のヌクレオチド配列を含む単離された、核酸：
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１１２、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６および配列番号１２７。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、国立保健研究所の助成金第ＣＡ６８２８３号および復員軍人省（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ａｆｆａｉｒｓ）の助成金の元に、一部政府の援助を用いてなされた。合衆国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ウイルス増殖または腫瘍の進行に使用される細胞性遺伝子を同定する方法を提供する。従って、本発明は、ウイルス感染を低減するかまたは予防し、そして腫瘍の進行を抑制することに関連した核酸およびそのための方法に関する。本発明はまた、さらなるこのような遺伝子についてスクリーニングするための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
種々のプロジェクトが、種々の動物（特にヒト）のゲノムを単離しそして配列決定することに向けられてきた。しかし、ほとんどの方法論は、その機能が関連も示唆さえもしないヌクレオチド配列を提供し、従ってこのようなデータの即時有用性を限定する。
【０００４】
本発明は、対照的に、特定のプロセス（すなわち、ウイルス感染または腫瘍の進行）に関与する核酸についてのみのスクリーニングの方法を提供する。ウイルス感染について、単離された核酸は、これらのプロセスの処置において有用である。なぜなら、この方法によって、細胞に必要ではない核酸のみが単離されるからである。このような方法は、非常に有用である。なぜなら、その方法は、機能を、各単離された遺伝子に起因させ、従って単離された核酸は、種々の特異的な方法および手順に即時に利用され得るからである。
【０００５】
例えば、本発明は、ウイルス感染に使用されるが細胞には必要ではない遺伝子産物をコードする核酸を単離する方法を提供する。ウイルス感染は、ヒトの罹患率および死亡率の有意な原因である。このような感染の分子機構を理解することは、これらの処置および制御における新たなアプローチを導く。
【０００６】
ウイルスは、種々のタイプの感染を確立し得る。これらの感染は、一般的に、溶解性または持続性として分類され得るが、いくつかの溶解性感染が、持続性であると考えられている。一般的には、持続性感染は、２つのカテゴリーに分類される：（１）慢性（生産的な）感染（すなわち、感染性ウイルスが存在し、そしてそれが伝統的な生物学的方法によって回収され得る感染）および（２）潜在性感染（すなわち、ウイルスゲノムは細胞中に存在するが、感染性ウイルスは再活性化の断続的な発症の間を除いては一般的に産生されない感染）。持続性は一般的に、生産的感染と潜在性の感染の両方の状態を含む。
【０００７】
溶解性感染はまた、全細胞の小さな部分のみが感染される条件下で持続し得る（鬱積（ｓｍｏｌｄｅｒ）（循環）感染）。わずかな感染細胞がウイルスを放出し、そして殺傷されるが、子孫ウイルスは、再度、全細胞の少数のみを感染する。このような鬱積感染の例としては、マウスにおける乳酸脱水素酵素ウイルス（非特許文献１）およびヒトにおけるアデノウイルス感染（Ｐｏｒｔｅｒ，Ｄ．Ｄ．  ７８４−７９０頁、Ｂａｒｏｎ，Ｓ編、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  第２版（Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ，  Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，  ＣＡ  １９８５））の持続性が挙げられる。
【０００８】
さらに、ウイルスは、いくつかの細胞型については溶解性であり得るが他の細胞型については溶解性であり得ない。例えば、証拠は、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）が、単球／マクロファージよりもＴ細胞に対してより溶解性であり、それゆえ、細胞死を生じ得るＴ細胞の生産的な感染を生じ得るが、一方、ＨＩＶ感染単核食細胞は、相当な期間細胞溶解せずにウイルスを産生し得ることを示唆する。（Ｋｌａｔｚｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２５：５９−６２（１９８４）；Ｋｏｙａｎａｇｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１６７３−１６７５（１９８８）；Ｓａｔｔｅｎｔａｕら、Ｃｅｌｌ  ５２：６３１−６３３（１９８８））。
【０００９】
伝統的なウイルス感染の処置は、ＨＩＶプロテアーゼまたは逆転写酵素のような特定のウイルス由来タンパク質、またはインターフェロンのような組換え（クローン化）免疫モジュレーター（宿主由来）を目的とする医薬品を含む。しかし、現在の方法は、抗ウイルス製剤を無効にさせる高い割合のウイルス変異を含むいくつかの制限および欠点を有する。免疫モジュレーターについて、制限された有効性、副作用を限定すること、特異性の欠失は、これらの薬剤の一般的な適用性を全て制限する。また、現在の抗ウイルスおよび免疫モジュレーターでの成功の割合は、期待はずれである。
【００１０】
本発明の１つの局面は、１つまたは両方の対立遺伝子において破壊される場合、細胞生存に必須ではないが、ウイルス複製に必要とされる遺伝子を単離することに焦点を合わせる。このことは、用量効果とともに生じ得、これにおいて１つの対立遺伝子ノックアウトは、ウイルス耐性の表現型を細胞に付与し得る。治療介入のための標的として、これらの細胞性遺伝子産物（タンパク質、タンパク質の一部（糖化、脂質修飾（ミリオレート（ｍｙｒｉｏｌａｔｅ）など）を含むがこれに制限されない改変酵素）、脂質、転写エレメント、およびＲＮＡ調節分子を含む）の阻害は、強い毒性の副作用をほとんど有さないようであり、そしてウイルス変異は、首尾よい複製に対する「ブロック」をほとんど克服しないようである。
【００１１】
本発明は、増殖するためにウイルスに必要とされる細胞性遺伝子に対処する（ａｄｄｒｅｓｓ）ことにより、ウイルス感染に対して試みられた治療的介入の以前の方法よりも有意な改善を提供する。従って、本発明はまた、ウイルス感染に必要な細胞性遺伝子を阻害することによりウイルスを処置する方法を提供することによって、ウイルス感染に介入するための画期的な治療的アプローチを提供する。これらの遺伝子は、それが本来検出された手段によって、ウイルス複製を阻害するのに必要な発現のレベルで細胞の生存に必要でないため、これらの処置方法は、以前の方法で見出されたような、被験体に深刻な有害な効果を与えずに、被験体に使用され得る。本発明はまた、ウイルス性感染細胞は、生存するために血清中の因子に依存するという驚くべき発見を提供する。従って、本発明はまた、この血清生存因子を阻害することによってウイルス感染を処置するための方法を提供する。最後に、これらの発見はまた、非感染細胞が選択的に生存するように培養物中のこの血清生存因子を除去し、阻害し、または破壊することによって、ウイルス性感染細胞を細胞培養物から除去するための新規な方法を提供する。
【００１２】
腫瘍抑制遺伝子（単数または複数）の選択は、ガンの治療的介入のための新たな標的の発見における重要な領域になっている。「形質転換された」表現型を抑制し得る特定の遺伝子によって、細胞が細胞周期への無差別な参入から制限されるという発見以来、このような遺伝子の発見に相当な時間が費やされている。これらの遺伝子のいくつかは、横紋筋肉腫に関連した遺伝子（Ｒｂ）およびｐ５３（アポトーシス関連）コード遺伝子に関連する遺伝子を含む。本発明は、遺伝子トラップを使用して、形質転換されていない細胞から形質転換された表現型を有する細胞株を選択し、そしてこれらの細胞から悪性の、または形質転換された表現型を抑制し得る遺伝子を単離する方法を提供する。従って、単離プロセスの特性によって、単離された遺伝子に機能が関連される。腫瘍抑制遺伝子を迅速に選択する能力は、ガンを処置するか予防し、さらに診断試験するプロセスにおけるユニークな標的を提供し得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｍａｈｙ，Ｂ．Ｗ．Ｊ．，  Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．  ４１：５０−５５（１９８５）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１）  以下に記載のヌクレオチド配列を含む単離された、核酸：
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１１２、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６および配列番号１２７。
（項目２）  項目１に記載のヌクレオチド配列の少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含む、核酸。
（項目３）  項目１に記載のヌクレオチド配列の少なくとも３０の連続するヌクレオチドを含む、核酸。
（項目４）  項目１に記載のヌクレオチド配列の少なくとも４０の連続するヌクレオチドを含む、核酸。
（項目５）  以下に記載のヌクレオチド配列を含む遺伝子によりコードされたタンパク質をコードする単離された、核酸：
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１１２、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６および配列番号１２７、またはこれらのホモログ。
（項目６）  項目１または５に記載の核酸を含む、宿主細胞。
（項目７）  項目１または５に記載の核酸とストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズする核酸を含む、核酸。
（項目８）  エキソン内の領域を有する核酸であって、該領域が、項目１または５に記載の核酸と少なくとも５０％の相同性を有する、核酸。
（項目９）  エキソン内の領域を有する核酸であって、該領域が、項目１または５に記載の核酸と少なくとも６０％の相同性を有する、核酸。
（項目１０）  エキソン内の領域を有する核酸であって、該領域が、項目１または５に記載の核酸と少なくとも７０％の相同性を有する、核酸。
（項目１１）  エキソン内の領域を有する核酸であって、該領域が、項目１または５に記載の核酸と少なくとも８０％の相同性を有する、核酸。
（項目１２）  エキソン内の領域を有する核酸であって、該領域が、項目１または５に記載の核酸と少なくとも９０％の相同性を有する、核酸。
（項目１３）  エキソン内の領域を有する核酸であって、該領域が、項目１または５に記載の核酸と少なくとも９５％の相同性を有する、核酸。
（項目１４）  項目１または５に記載の核酸によりコードされたアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
（項目１５）  以下に記載のヌクレオチド配列を含む遺伝子の調節領域を含む、核酸：
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１１２、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６および配列番号１２７、またはこれらのホモログ。
（項目１６）  項目１５に記載の調節領域を含む構築物であって、該調節領域がレポーター遺伝子に機能的に連結されている、構築物。
（項目１７）  被験体におけるウイルス感染を減少または阻害する方法であって、該被験体に、以下に記載の核酸：
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６または配列番号１２７、あるいはそれらのホモログを含む遺伝子によりコードされた遺伝子産物の発現または機能化を阻害する、ある量の組成物を投与する工程を包含し、それにより該ウイルス感染を処置する、方法。
（項目１８）  項目１７に記載の方法であって、ここで前記遺伝子が以下からなる群由来の遺伝子産物をコードする核酸から選択されるか、または前記遺伝子産物が以下からなる群から選択される、方法：
トリステトラプロリン（ヒトＺＦＰ−３６）、６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ、真核生物ＤｎａＪ様タンパク質、ＩＤ３（ＤＮＡ結合３のインヒビター）、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ｍＧＡＴ−１）、卵割刺激因子（ＣＳＴＦ２）、ＴＡＫ１結合タンパク質、ヒト亜鉛転写因子ＺＰＦ２０７、Ｄｌｘ２、Ｓｍａｄ７（Ｍａｄ関連タンパク質）、およびＰ糖タンパク質（ｍｄｒ１ｂ）。
（項目１９）  前記被験体がヒトである、項目１７に記載の方法。
（項目２０）  被験体におけるウイルス感染を減少または阻害する方法であって、選択された細胞において、以下に記載の核酸：
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６または配列番号１２７、あるいはこれらのホモログを含む内因性遺伝子を、該遺伝子の機能的遺伝子産物を産生し得ない変異遺伝子または該遺伝子の機能的遺伝子産物を減少した量で産生する変異遺伝子にエキソビボで変異させる工程、および該被験体中に該細胞を配置する工程を包含し、それにより該被験体における細胞のウイルス感染を減少させる、方法。
（項目２１）  前記細胞が造血細胞である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）  前記被験体がヒトである、項目２０に記載の方法。
（項目２３）  前記細胞が前記被験体由来である、項目２０に記載の方法。
（項目２４）  ウイルス感染を処置または予防する効力について化合物をスクリーニングする方法であって、以下：
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６または配列番号１２７に記載の核酸あるいはそのホモログを含む細胞性遺伝子、および該細胞中の該ウイルスの複製に必要であるが該細胞の生存に必要ではない遺伝子産物を機能的にコードする細胞性遺伝子を含有する細胞に該化合物を投与する工程、ならびに産生される該遺伝子産物のレベルおよび／または活性を検出する工程を包含する方法であって、ここで、該遺伝子産物および／または遺伝子産物の活性の減少または除去が該ウイルス感染を処置または予防するために有効な化合物を示す、方法。
（項目２５）  ウイルス感染を減少または阻害することについて化合物をスクリーニングする方法であって、該化合物を、項目１６に記載の構築物を含む細胞に投与する工程、および産生された前記レポーター遺伝子の産物のレベルを検出する工程を包含し、該レポーター遺伝子産物の減少または除去が、該ウイルス感染を減少または阻害するための化合物を示す、方法。
（項目２６）  ウイルス感染を処置または予防する効力について化合物をスクリーニングする方法であって、以下：
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６または配列番号１２７に記載の核酸、あるいはそのホモログを含有する細胞性遺伝子の遺伝子産物と、該化合物とを接触させる工程、および該遺伝子産物の機能を検出する工程を包含し、該機能の減少または除去がウイルス機能の減少または阻害のための化合物を示す、方法。
（項目２７）  被験体において細胞における悪性表現型を抑制する方法であって、該被験体に、配列番号９、配列番号１０、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３６または配列番号９４に記載の核酸、あるいはそれらのホモログを含む遺伝子によりコードされた遺伝子産物の発現または機能化を阻害する、ある量の組成物を投与する工程を包含し、それにより悪性表現型を抑制する、方法。
（項目２８）  ウイルス感染を処置することにおける効力について化合物をスクリーニングする方法であって、該化合物を遺伝子産物を機能的にコードする細胞性遺伝子を含有する細胞に投与する工程であって、ここで該遺伝子産物の過剰発現が該ウイルスの複製を阻害するが該細胞の生存を妨げない、工程、および、該生成された遺伝子産物のレベルを検出する工程を包含し、該遺伝子産物の増加が該ウイルス感染の処置に効果的な化合物を示す、方法。
（項目２９）  細胞において悪性表現型を抑制し得る化合物についてスクリーニングする方法であって、該化合物を、配列番号９、配列番号１０、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３６または配列番号９４に記載の核酸、あるいはそれらのホモログを含む遺伝子によりコードされた遺伝子産物を機能的にコードする核酸を含有する細胞に投与する工程、および該生成された遺伝子産物のレベルを検出する工程を包含し、該遺伝子産物の増加が該悪性表現型を抑制するために有効な化合物を示す、方法。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、特定の機能に関連した遺伝子由来の核酸を同定および単離するための選択プロセスとともに「遺伝子トラップ」法を利用する。詳細には、ウイルス感染に必要であるが、細胞の生存には必須でない細胞性遺伝子を単離する手段を提供し、そして腫瘍の進行を抑制する細胞性遺伝子を単離する手段を提供する。
【００１６】
本発明はまた、ウイルス性感染細胞は、生存のために血清に存在する少なくとも１つの因子に依存性になるが、非感染細胞はこの依存性を示さないという核心の発見を提供する。この核心の発見は、本発明においていく通りにて利用されている。最初に、「血清生存因子」の阻害は、非感染細胞の集団からの持続性のウイルス性感染細胞を全滅させるのに利用され得る。この因子の阻害はまた、本明細書中にさらに記載されるように、被験体におけるウイルス感染を処置するために使用され得る。さらに、組織培養物中における血清生存因子の阻害または回収は、ウイルス複製に必要とされるが、未感染細胞の生存に必須でない細胞性遺伝子の検出を可能にする。本発明はさらに、いくつかのこのような細胞性遺伝子、ならびにこのような遺伝子の機能を阻害することによってウイルス感染を処置する方法を提供する。
【００１７】
さらに、本発明は、過剰発現がウイルス増殖および／または複製の阻害に関連する細胞性遺伝子を提供する。
【００１８】
本方法は、細胞におけるウイルス増殖に必要であるが、細胞の生存に必須ではないいくつかの細胞性遺伝子を提供する。これらの遺伝子は、ウイルスによる溶解性および持続性感染に重要である。これらの遺伝子は、レトロウイルス遺伝子トラップベクターでの細胞の感染により遺伝子トラップライブラリーを作製し、遺伝子トラップ事象が生じる（すなわち、ベクターが挿入され、その結果無プロモーターマーカー遺伝子が挿入され、その結果細胞性プロモーターがマーカー遺伝子の転写を促進する（すなわち、機能する遺伝子に挿入される））細胞を選択し、細胞を血清飢餓させ、連続的血清飢餓の間選択された細胞を選択ウイルスで感染させ、そして限定希釈によってクローン化される可視コロニーの発色を可能にするために血清を添加することにより、単離された。次いで、レトロウイルス遺伝子トラップベクターに挿入された遺伝子は、レトロウイルス遺伝子トラップベクターに特異的なプローブを用いて、コロニーから単離された。従って、この方法によって単離された核酸は、単離された遺伝子の一部である。さらに、この方法を使用して、過剰発現がウイルス感染または腫瘍増殖を防ぐいくつかの細胞性遺伝子が単離された。そしてこれらは、これらの遺伝子の過剰発現によって、ウイルス感染または腫瘍増殖／抑制を処置する方法を提供する。
【００１９】
従って、本発明は、細胞におけるウイルス増殖に必要であり、そして細胞の生存に必須ではない細胞性遺伝子を同定する方法を提供し、この方法は、（ａ）細胞培養物（例えば、血清含有培地において増殖する）に、機能的プロモーターを欠失する選択的マーカー遺伝子をコードするベクターを遺伝子移入する工程、（ｂ）マーカー遺伝子を発現する細胞を選択する工程、（ｃ）培養培地から血清を除去する工程、（ｄ）細胞培養物をウイルスで感染させる工程、および（ｅ）生存する細胞から、マーカー遺伝子が挿入された細胞性遺伝子を単離し、それによって細胞におけるウイルス増殖に必要であり、そして細胞の生存に必須ではない遺伝子を同定する工程を含む。本発明はまた、細胞におけるウイルス増殖に使用され、そして細胞生存に必須ではない細胞性遺伝子を同定する方法を提供し、この方法は、（ａ）血清含有培地において増殖する細胞培養物に、機能的プロモーターを欠失する選択的マーカー遺伝子をコードするベクターを遺伝子移入させる工程、（ｂ）マーカー遺伝子を発現する細胞を選択する工程、（ｃ）培養培地から血清を除去する工程、（ｄ）細胞培養物をウイルスで感染させる工程、および（ｅ）生存する細胞から、マーカー遺伝子が挿入された細胞性遺伝子を単離し、それによって細胞におけるウイルス増殖に必要であり、そして細胞の生存に必須ではない遺伝子、またはその過剰発現がウイルス複製を防ぐが、細胞の生存に決定的ではない遺伝子を同定する工程を含む。任意の選択される細胞型（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞）において、血清飢餓が選択に必要であるかどうかを、容易に決定し得る。そうでなければ、血清飢餓はこの工程から除外され得る。
【００２０】
あるいは、培養培地から血清を除去するかわりに、ウイルスの増殖に必要な血清因子は、例えば、この因子に特異的に結合する抗体の投与によって阻害され得る。さらに、培養物中に持続的に感染した細胞が存在しないと考えられる場合、血清飢餓工程は除外され得、そして細胞は細胞型のための通常の培地において増殖され得る。血清飢餓が使用される場合、培養物がウイルスに感染した後に、一定期間続けられ得る。次いで、血清は培養物に添加され得る。いくつかの他の方法が因子を不活化するために使用される場合、培養物に新たな血清を添加する前に、中止されるか、不活化されるか、または除去（例えば、この抗因子抗体を（例えば、この抗体に対して指向される結合抗体を用いて）除去する）され得る。生存する細胞は、ウイルスの増殖に必要な遺伝子において不活性化挿入物を有する変異体である。次いで、挿入物を有する遺伝子は、マーカー遺伝子配列を有する配列を単離することによって単離され得る。この変異のプロセスは、野生型機能を妨げる。変異体遺伝子は、低レベルで正常の産物を産生し得るか、正常産物であるが通常はこれらの細胞では見出されないものを産生し得るか、正常産物を過剰生産を引き起こし得るか、いくつかの機能を有するが他のものは有さない改変産物を産生し得るか、または遺伝子機能を完全に破壊し得る。さらに、変異は、機能を有するが、決してタンパク質に翻訳されないＲＮＡを破壊し得る。例えば、αトロポミオシン遺伝子は、細胞調節に非常に重要であるが決してタンパク質に翻訳されない３’ＲＮＡを有する。（Ｃｅｌｌ  ７５  １１０７−１１１７頁、１９９３年１２月１７日）。
【００２１】
本明細書中に使用されるように、「細胞の生存に必須ではない」細胞性遺伝子は、１つまたは両方の対立遺伝子の破壊が、少なくとも一定期間生存可能な細胞を生じる遺伝子を意味し、これが、予防または治療的使用または研究における使用のために、ウイルス複製を阻害することを可能にする。「ウイルス増殖に必要な」遺伝子は、タンパク質またはＲＮＡのいずれかの遺伝子産物であり、分泌されるかまたはされず、ウイルスが増殖するためのいくつかの方法において、直接的または間接的のいずれかで必要または有益である遺伝子を意味し、それゆえ、その遺伝子産物（すなわち、機能的に利用可能な遺伝子産物）の非存在下では、ウイルスは蔓延しない。例えば、このような遺伝子は、細胞周期調節タンパク質、液胞の水素ポンプに作用するタンパク質、またはタンパク質フォールディングおよびタンパク質修飾（これは、以下を含むが限定されない：リン酸化、メチル化、糖化、ミリスチル化もしくは他の脂質部分、または酵素的プロセシングを介するタンパク質プロセシング）に関与するタンパク質をコードし得る。このような遺伝子のいくつかの例は、液胞のＨ+ＡＴＰａｓｅ、αトロポミオシン、ｇａｓ５遺伝子、ｒａｓ複合体、Ｎ−アセチル−グルコサミニル−１−トランスフェラーゼＩ  ｍＲＮＡ、アネキシンＩＩ、ｃ−ゴルジＣＭ１３０、およびカルサイクリンを含む。
【００２２】
細胞を感染し得る任意のウイルスが、この方法に使用され得る。ウイルスは、研究が所望される特定の感染に基づいて選択され得る。しかし、多くのウイルスは、生存について同じ細胞性遺伝子に依存することが、本発明によって意図される；従って、あるウイルスを用いて単離された細胞性遺伝子はまた、他のウイルスについての治療のための標的としても使用され得る。任意の細胞性遺伝子は、本明細書中に記載の方法を用いて（すなわち、一般的には、細胞において遺伝子またはその遺伝子産物を阻害し、そして所望のウイルスがその細胞において増殖し得るかどうかを決定することによって）、任意の所望のウイルスに対する関連性について試験され得る。ウイルスのいくつかの例としては、ＨＩＶ（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２を含む）；パルボウイルス；パピローマウイルス；ハンタウイルス；インフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザＡ、Ｂ、およびＣウイルス）；Ａ〜Ｇ型肝炎ウイルス；カリチウイルス；アストロウイルス；ロタウイルス；コロナウイルス（例えば、ヒト呼吸器コロナウイルス）；ピコルナウイルス（例えば、ヒトライノウイルスおよびエンテロウイルス）；エボラウイルス；ヒトヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ−１−９）；ヒトアデノウイルス；動物については、上記の任意のヒトウイルスの動物対応物、動物レトロウイルス（例えば、シミアン免疫欠損ウイルス、トリ免疫不全症ウイルス、ウシ免疫不全症ウイルス、ネコ免疫不全症ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス、アレナウイルス、アルボウイルス、ダニ媒介ウイルス、またはビスナウイルス）が挙げられる。
【００２３】
本発明の細胞性遺伝子を含む核酸は、上記の方法および実施例に記載のように単離された。本発明は、以下に記載のヌクレオチド配列を含む核酸を含む：、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１１２、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６および配列番号１２７（この一覧は、ときどき、本明細書中で簡潔に「配列表１」といわれる）。従って、これらの核酸は、配列表における各配列番号に記載のヌクレオチドに加えて、分子のいずれかの末端にさらなるヌクレオチドを含み得る。このようなさらなるヌクレオチドは、当該分野で公知のように、任意の標準的な方法（例えば、組換え法および合成法）によって付加され得る。本発明によって意図される配列表の任意の項目に記載のヌクレオチド配列を含むこのような核酸の例としては、例えば、ベクター中に配置される核酸；ベクターに特に、機能的な様式で（すなわち、ｍＲＮＡまたはタンパク質が産生され得るように）連結された１つ以上の調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化部位）を有する核酸；この遺伝子のさらなる核酸を含む核酸（例えば、この遺伝子のより大きいかまたは全長ゲノムフラグメント、部分的または全長ｃＤＮＡ、部分的または全長ＲＮＡ）が挙げられるが、これに限定されない。このようなより大きな核酸を作製および／または単離することは、以下にさらに記載され、そして当該分野で周知かつ標準的である。
【００２４】
配列番号１〜配列番号１３６（配列番号１および配列番号１３６を含む）において示される核酸配列に対応する二本鎖核酸もまた、本発明において提供される。本明細書において使用される「核酸」は、このような二本鎖核酸の両方またはいずれかの鎖（「ポジティブ」鎖および「ネガティブ」鎖としばしば言われるような鎖）を言い得る。このような二本鎖核酸のどちらかの鎖が本発明のポリペプチドをコードし得、そしてこのようなポリペプチドのコード配列は、いずれかの鎖の方向に沿って翻訳され得る。いずれかの鎖によりコードされるポリペプチドの例は本明細書中に開示される。
【００２５】
本発明はまた、配列表１において列挙される任意の配列において示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子によりコードされるタンパク質をコードする核酸、およびこのような各々の遺伝子の対立遺伝子改変体およびホモログを提供する。遺伝子は以下に記載されるような標準的な方法を使用して容易に入手され、そして当該分野で公知でありそして標準である。本発明はまた、これらの遺伝子の独特の任意のフラグメントまたは配列表１において列挙される任意の配列に示される核酸の独特の任意のフラグメントを意図する。本発明の遺伝子のフラグメントの例は、配列表１において列挙される任意の配列において示される配列を有する核酸を含み得る。独特であるためには、このフラグメントは、他の公知の配列（任意の核酸フラグメントをＧｅｎＢａｎｋのようなコンピューターデータベースにおける核酸のヌクレオチド配列と比較することにより最も容易に決定される）と識別するために十分なサイズでなければない。このような比較探索は当該分野で標準的なものである。代表的には、プライマーまたはプローブとして有用である独特のフラグメントは、少なくとも約２０〜約２５ヌクレオチド長であり、配列の特異的なヌクレオチド含有量に依存する。さらに、フラグメントは、例えば、少なくとも約３０、４０、５０、７５、１００、２００または５００ヌクレオチド長であり得る。この核酸は一本鎖または二本鎖であり得、これは意図される目的に依存する。
【００２６】
本発明は、配列表１に示されるヌクレオチド配列の任意の１つを含む遺伝子の調節領域を含む核酸およびこのような各々の遺伝子のホモログをさらに提供する。レポーター遺伝子に機能的に連結されるこのような調節領域を含む構築物もさらに提供される。このようなレポーター遺伝子構築物は、配列表１に示される配列を有する核酸を含む遺伝子またはそのホモログの発現に影響する化合物および組成物についてのスクリーニングに使用され得る。
【００２７】
配列表に示される核酸は、遺伝子フラグメントである；各フラグメントを含む全コード配列および全遺伝子の両方が本明細書中において意図され、そして配列表において示されるヌクレオチド配列を考えると標準的な方法により容易に入手される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９；  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  第１巻および第２巻、Ｇｌｏｖｅｒ，
Ｄ．Ｍ．編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  １９８５を参照のこと）。全ゲノム遺伝子を得るためには、簡潔には、配列が配列番号１〜１２７のいずれかで示される核酸、または好ましくは配列表１において示される配列のいずれか、あるいはそれらの小フラグメントを、高いストリンジェンシーの条件下で、ゲノムライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして利用し、そして単離されたクローンが配列決定される。一旦新しいクローンの配列が決定されると、プローブは、新しいクローンの前のフラグメントに存在しない部分から考案され得、そしてライブラリーとハイブリダイズして、遺伝子のフラグメントを含有しているより多くのクローンを単離し得る。このように、体系づけられた様式でこのプロセスを繰り返すことによって、染色体に沿って「歩き」得、そして最終的に全遺伝子のヌクレオチド配列を得ることができる。同様に、オープンリーディングフレームを含む本発明のフラグメントの部分またはゲノムライブラリーから得られるさらなるフラグメントを使用して、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、本遺伝子のコード配列全体を有するｃＤＮＡを得ることができる。反復されたスクリーニングは、必要に応じていくつかのクローンから完全な配列を得るために上記のように利用され得る。次いで、単離物を、ジデオキシヌクレオチド配列決定方法のような標準的な手段によって配列決定して、ヌクレオチド配列を決定し得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９を参照のこと）。
【００２８】
本遺伝子は、ラットから単離された。しかし、任意の所望の種（好ましくは哺乳動物、例えばヒト）におけるホモログは、本明細書中の配列表において示した核酸またはそのフラグメントの配列を含むプローブを用いてヒトライブラリー（ゲノムまたはｃＤＮＡ）をスクリーニングし、そして好ましくは比較的高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件下でプローブと特異的にハイブリダイズする遺伝子を単離することにより容易に得ることができる。例えば、高塩条件（例えば、６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥ中）および／または高温ハイブリダイゼーションが使用され得る。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは代表的には、所定の鎖の長さについてのＴｍ（半分の分子がその対から解離する融点）から約５℃〜約２０℃下である。当該分野で公知なように、ハイブリダイズする領域のヌクレオチド組成が、ハイブリッドの融点を決定する際の因子である。例えば、２０マープローブについて推薦されるハイブリダイゼーション温度は、代表的には約５５〜５８℃である。さらに、ラットの配列は、ラットのタンパク質の部分についてのアミノ酸配列を決定して、そして特定の動物におけるホモログのアミノ酸配列をコードするコドン使用頻度を最適化したプローブを選択することにより、任意の特定の動物におけるホモログのためのプローブを考案するために利用され得る。任意の単離遺伝子は、遺伝子を配列決定し、遺伝子が、本遺伝子を含むものとして本明細書中に収載されたヌクレオチド配列を含むことを決定され得る。任意のホモログは、ホモログとしてその機能性により確認することにより標的遺伝子であると確認され得る。
【００２９】
さらに、本発明によって、配列表Ｉに列挙される配列またはそのホモログのいずれかにより示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子によりコードされるタンパク質をコードする核酸のエキソンにおける領域に対し９８％、９５％、９０％、８５％、８０％、７０％、６０％または５０％以上の相同性を相同領域において有する、任意の所望の種、好ましくは哺乳動物、およびより好ましくはヒト由来の核酸が、さらに企図される。本発明はまた、配列表の配列表１に列挙される配列のいずれかで示されるヌクレオチド配列またはそのホモログを含む核酸のエキソンにおける領域に対し、相同領域において、９８％、９５％、９０％、８５％、８０％、７０％、６０％または５０％以上の相同性を有する、任意の所望の種、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト由来の核酸もまた、企図する。これらの遺伝子は、合成され得るか、またはホモログを単離するために使用した同じ方法により得られ得る。この方法は、所望であれば、所望の相同性が低減するのに従って、そしてさらに可変性が検索される任意の領域のＧＣまたはＡＴ豊富さ（ｒｉｃｈｎｅｓｓ）に依存して、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーが低減される。任意の本遺伝子またはそのホモログの対立遺伝子変異体は容易に単離され得、そして上記のプロトコル従ってさらなるライブラリーをスクリーニングすることにより配列決定され得る。合成遺伝子を作製する方法は、米国特許第５，５０３，９９５号、およびそこで引用される参考文献に記載される。
【００３０】
本発明の任意の選択されたタンパク質をコードする核酸は、そのタンパク質を機能的にコードする任意の核酸でもあり得る。例えば、機能的にコードする（すなわち、核酸の発現を可能にする）ためには、核酸は、例えば、外因性または内因性の発現制御配列（例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサー、および必要な情報処理部位（例えば、リボソーム結合部、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終結配列））を含み得る。好ましい発現制御配列は、メタロチオネイン遺伝子、アクチン遺伝子、免疫グロブリン遺伝子、ＣＭＶ、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウィルスなどから誘導されるプロモーターであり得る。発現制御配列は、核酸が配置される細胞における機能性について選択され得る。選択されたタンパク質をコードする核酸は、選択されたタンパク質のアミノ酸配列に基づいて、容易に決定され得、そして、明らかに、多くの核酸は、任意の選択されたタンパク質をコードする。
【００３１】
本発明は、配列表１に記載の核酸、または配列表１収載された任意の配列に示されたヌクレオチド配列を含む遺伝子によりコードされるタンパク質をコードする核酸とストリンジェントな条件下で、選択的にハイブリダイズする核酸をさらに提供する。このハイブリダイゼーションは、特異的であり得る。ハイブリダイズする核酸と核酸がハイブリダイズする配列との間の相補性の程度は、無関係なタンパク質をコードする核酸とのハイブリダイゼーションを排除するのに少なくとも十分であるべきである。従って、本タンパク質コード配列の核酸と選択的にハイブリダイズする核酸は、ストリンジェント条件下では、異なる無関係のタンパク質についての核酸とは選択的にハイブリダイズしないし、また逆もそうである。代表的には、選択的なハイブリダイゼーションを達成するためのハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、Ｔｍ（半分の分子がその対から解離する融解温度）より約１２〜２５℃低い温度での高イオン強度溶液（６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥ）でのハイブリダイゼーションに続く洗浄温度がハイブリッド分子のＴｍから約５℃〜２０℃低くなるように選択された温度および塩濃度の組合せでの洗浄を含む。温度および塩条件は、フィルターに固定化した参照ＤＮＡの試料を標識した目的の核酸にハイブリダイズさせ、次いで異なるストリンジェンシーの条件下で洗浄する予備実験において、経験的に容易に決定される。ハイブリダイゼーション温度は、代表的には、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションについて、より高い。洗浄温度は、当該分野で公知なように、選択的なストリンジェンシーを達成するために上記のように使用され得る。（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９；Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７：１５４：３６７，１９８７）。任意の所定の核酸に選択的にハイブリダイズする核酸フラグメントは、例えば、さらなるハイブリダイゼーションまたは増幅方法（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ））についてのプライマーおよび／またはプローブとして使用され得る。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションのための好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥ中において約６８℃（水溶液中）、続いて６８℃における洗浄であり得る。
【００３２】
本発明は、以下の配列番号において示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドをさらに提供する：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１１２、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６および配列番号１２７（すなわち、配列表１）。さらに、ストリンジェントな条件下で配列表１における核酸と選択的にハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。さらに、ポリペプチドは、エキソン内部の領域（この領域は配列表１における核酸と少なくとも５０、６０、７０、８０、９０または９５％の相同性を有する）を有する核酸によりコードされるアミノ酸配列を含む。これらのポリペプチドは、任意のいくつかの手段により容易に入手され得る。例えば、遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列は翻訳され得、次いで対応するポリペプチドが標準的な方法により機械的に合成され得る。さらに、遺伝子のコード領域は、発現され得るか、または合成され得、得られたポリペプチドについての特異的な抗体は、標準方法により、惹起され得る（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８８を参照のこと）、そして、タンパク質は、他の細胞性タンパク質から抗体との選択的なハイブリダイゼーションにより単離され得る。このタンパク質は、所望の程度にまでタンパク質精製の標準的な方法により精製され得る（例えば、  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９を参照のこと）。本発明の任意のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのアミノ酸配列は、核酸配列から推論され得、または、単離されたかまたは組換え的に産生されたタンパク質の配列決定によって、決定し得る。
【００３３】
用語「ペプチド」「ポリペプチド」および「タンパク質」は、相互交換可能に本明細書中で使用され得、そしてアミノ酸のポリマーをいい、そして全長タンパク質およびそのフラグメントを含む。本明細書および特許請求の範囲において用いられているように「ａ」は、使用される状況によって、一つ以上を意味し得る。アミノ酸残基は、ペプチド結合においてポリペプチドの化学的消化（加水分解）により形成されるアミノ酸である。本明細書中に記載されるアミノ酸残基は、好ましくはＬ異性体の形態である。しかし、所望の機能的な特性がポリペプチドにより保持される限り、Ｄ異性体形態の残基は、任意のＬアミノ酸残基と置換され得る。本明細書中では、標準的なポリペプチド命名法（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２４３：３５５２−５９（１９６９）に記載され、そして米国特許施行規則１，８２２（ｂ）章で採用されている）を使用する。
【００３４】
当業者により理解されるように、本発明はまた、アミノ酸配列または他の特性において軽微な変化を有するそれらのポリペプチドを含む。アミノ酸置換は、中性である公知のパラメーターにより選択され得る（例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＷＥ  Ｊｒ，およびＭｉｔｃｈｅｌｌ  ＷＭ，  ＡＩＤＳ  ４：Ｓ１５ｌ−Ｓ１６２（１９９０）を参照のこと）。このような変異は、対立遺伝子の変異（例えば、遺伝的多型のため）として天然に生じ得るか、またはヒトによる介入（例えば、クローン化されたＤＮＡ配列の変異誘発（例えば、誘導された点変異、欠損、挿入および置換変異）によって）により生成され得る。アミノ酸配列における小さな変化が、通常好ましい（例えば、保存的アミノ酸置換、小さな内部欠失、または挿入、および分子の末端における付加または欠失）。置換は、例えば、Ｄａｙｈｏｆｆらのモデルに基づいて設計され得る（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １９７８，  Ｎａｔ’ｌ  Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．  Ｆｏｕｎｄ．，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．）。これらの改変は、アミノ酸配列における変化を生じるか、サイレント突然変異を提供するか、制限部位を改変するか、または他の特異的な変異を提供し得る。同様に、このようなアミノ酸変化は、ポリペプチドおよびタンパク質をコードする異なる核酸を生じる。従って、代替の核酸もまた、このような改変によって意図される。
【００３５】
本発明はまた、本発明の核酸を含有している細胞を提供する。タンパク質をコードする核酸を含有している細胞は、代表的にはＤＮＡを複製し得、さらに、代表的にはコードするタンパク質を発現し得る。細胞は、原核生物細胞（特に核酸を多量に産生する目的のために）、または真核生物細胞（特に哺乳動物細胞）であり得る。生じる産生タンパク質が哺乳類のタンパク質プロセシング修飾を有するように、コードされたタンパク質を発現する目的のためには、細胞は、好ましくは哺乳動物細胞である。
【００３６】
本発明の核酸は、任意の選択された手段によって、特に、化合物および標的細胞の送達の目的に依存して、細胞に送達され得る。多くの送達手段は、当該分野において、周知である。例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、カチオンまたはアニオンリポソームおよび核への送達のための核局在化シグナルペプチドと組み合わせたリポソームが利用され得る。そして、このことは公知である。
【００３７】
本発明はまた、ウイルス性増殖に必要な変異された細胞性の遺伝子（本方法により産生される）ならびにこれらの変異体を含有している細胞もまた有用であり得ることを企図する。それらを含有するこれらの変異遺伝子および細胞は、単離され得、そして／または本明細書中で記載される方法に従って標準的な方法を使用して産生され得る。
【００３８】
本明細書中で示された配列が微小な配列誤差を含み得ることは理解されるべきである。このような誤差は、例えば、コード配列が、再単離され得、そして再配列決定され得るように、記載された配列由来の種々のプローブを用いる上記のハイブリダイゼーション手順を使用することによって修正され得る。
【００３９】
実施例において記載されるように、本発明は、持続性ウイルス感染細胞の生存のために必要である、血清中に存在する「血清生存因子」の知見を提供する。この因子の単離および特徴付けは、この因子がタンパク質であり、約５０ｋＤと１００ｋＤとの間の分子量を有し、低いｐＨ（例えば、ｐＨ２）およびクロロホルム抽出における不活化に耐性であり、約５分間の煮沸および低イオン強度溶液（例えば、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ）によって不活化されることを示した。従って、本発明は、約５０ｋＤと１００ｋＤとの間の分子量を有する精製された哺乳動物血清タンパク質を提供する。このタンパク質は、低いｐＨにおける不活化に耐性であり、そしてクロロホルム抽出による不活化に耐性であり、煮沸された場合不活化し、低イオン強度溶液において不活化し、そしてレオウイルスに持続感染した細胞を含む細胞培養物から除去された場合、レオウイルスに持続感染した細胞の生存を選択的に実質的に阻害する。上記の物理学的特徴に一致する因子は、この因子を無血清培地（以前は持続性ウイルス感染細胞の生存を維持し得なかった）に添加し、そして添加された推定上の因子を有するこの培地が今や持続性ウイルス感染細胞（特に、レオウイルスに持続感染した細胞）を維持し得るかどうかを決定することにより、容易に実証され得る。本明細書中に使用される場合、「精製」タンパク質は、そのタンパク質が少なくとも、およその分子量が決定され得るのに十分な純度であることを意味する。
【００４０】
タンパク質のアミノ酸配列は、標準的な方法により推定され得る。例えば、タンパク質に対する抗体が惹起され、そして発現ライブラリーをスクリーニングするために使用されて、タンパク質をコードする核酸配列が得られ得る。次いで、この核酸配列は、対応するアミノ酸配列へ単純に翻訳される。あるいは、タンパク質の一部が標準的なアミノ酸配列決定方法（アミノ末端配列決定）により直接的に配列決定され得る。次いで、このアミノ酸配列は、アミノ酸配列の一部に対する全ての可能なコード配列を含む一連の核酸プローブを生成するために使用され得る。一連のプローブはｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングをするために使用され、コード配列の残り、および従って最終的には対応するアミノ酸配列が得られる。
【００４１】
本発明はまた、さらなる血清生存因子の検出および単離方法を提供する。例えば、任意の公知の血清成分がウイルス増殖に必要かどうかを決定するために、その公知の成分は培養培地において阻害されるか、または培養培地から除去され得、そして持続性感染細胞が生存しないかどうかを決定することにより、ウイルス増殖が阻害されるかどうかが観察され得る。因子を戻し（または阻害を除去し）、そして因子がウイルスを増殖させるかどうかを決定し得る。
【００４２】
さらに、他の、未知の血清成分もまたウイルス増殖に必須であることが見出され得る。血清は種々の標準的手法により分画され、そして画分は無血清培地に添加されて、以前は血清の欠失により阻害された増殖を可能にする因子が反応中に存在するかどうかが決定され得る。次いで、この活性を有する画分は、因子が他の成分を比較的に有さなくなるまで、さらに分画され得る。次いで、この因子は標準的な方法（例えば、サイズ分画、種々の手段による変性および／または不活化など）により特徴付けられ得る。好ましくは、一旦この因子が所望のレベルの純度まで精製されれば、それは無血清培地中の細胞に添加され、無血清培地単独の場合には増殖しなかったウイルスに増殖させる機能を付与することが確認される。この方法は、任意の所望のウイルスについての特定の因子の要求性を確認するために繰り返され得る。なぜなら、任意の１つのウイルスに必要であると見出された各血清因子が、他の多数のウイルスに必要とされ得るからである。一般に、ウイルスが密接に関連するほど、そしてウイルスの感染様式が類似するほど、１つのウイルスに必要とされる因子が他のウイルスに必要とされるようである。
【００４３】
本発明はまた、本発明者らの知見を利用してウイルス感染を処置する方法を提供する。本明細書中に記載された任意の方法の被験体は、ウイルスに依存して、任意の動物、好ましくはヒトのような哺乳動物、家畜動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、またはウシ）、または研究動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、またはモルモット）であり得る。
【００４４】
本発明は、被験体におけるウイルス感染を減少または阻害し、そしてそれにより処置する方法を提供する。この方法は、被験体に本明細書中に記載された血清タンパク質（すなわち、低いｐＨにおける不活性化に耐性であり、そしてクロロホルム抽出による不活化に耐性であり、煮沸された場合に不活化され、低イオン強度溶液において不活化され、そしてウイルスに持続感染した細胞を含む細胞培養物から除去された場合にウイルスに持続感染した細胞の少なくともいくつかの生存を妨げる、約５０ｋＤと１００ｋＤとの間の分子量を有する血清タンパク質）の機能を阻害する組成物の阻害量を投与する工程を含み、それによりウイルス感染を処置する。組成物は、例えば、血清タンパク質に特異的に結合する抗体、または血清タンパク質を機能的にコードする遺伝子によりコードされたＲＮＡに結合するアンチセンスＲＮＡを含み得る。
【００４５】
処置されるべき選択された被験体に感染し得る任意のウイルスが、本方法により処置され得る。上記のように、任意の１つのウイルスに感染した細胞の増殖に必要であることが本方法により見出された任意の血清タンパク質または生存因子は、他の多くのウイルスに感染した細胞の増殖に必要であることが見出され得る。任意の所定の細胞とウイルスの組み合わせについて、血清タンパク質または因子は、本発明に記載の方法によって、増殖に必要であることが確認され得る。レオウイルス、哺乳動物病原体、およびラット細胞系を用いる実施例によって同定された細胞性遺伝子は、公知の全てならびに未だに発見されていないヒト病原体を含む他のウイルス感染への一般的な適用性を有する。この病原体は以下を含むが、それらに限定されない：ヒト免疫不全症ウイルス（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）；パルボウイルス；乳頭種ウイルス；ハンタウイルス；インフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザＡ、Ｂ、およびＣウイルス）；肝炎ウイルスＡ〜Ｇ；カリチウイルス；アストロウイルス；ロタウイルス；ヒト呼吸器コロナウイルスのようなコロナウイルス；ピコルナウイルス（例えば、ヒトライノウイルスおよびエンテロウイルス）；エボラウイルス；ヒトヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ−１〜９）；ヒトアデノウイルス；ハンタウイルス；動物については、上で列記したヒトウイルスのいずれかの動物対応物、動物レトロウイルス（例えば、サル免疫不全症ウイルス、トリ免疫不全症ウイルス、ウシ免疫不全症ウイルス、ネコ免疫不全症ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、ヤギ関節脳炎ウイルスアレナウイルス、アルボウイルス、ダニ媒介ウイルスまたはビスナウイルス）。
【００４６】
組成物のタンパク質阻害量は、例えば、種々の用量を細胞または被験体に投与し、次いで被験体の血液の量または体重に従って、タンパク質を阻害するための有効量を調整することにより、容易に決定され得る。タンパク質に結合する組成物は、タンパク質ゲル上で推定上の結合タンパク質を泳動すること、およびゲルでのタンパク質の移動の変化を観察することにより、容易に決定され得る。タンパク質の阻害は、任意の所望の手段（例えば、持続感染した細胞を維持するために使用される完全培地にインヒビターを添加し、そして細胞の生存度を観察すること）により決定され得る。組成物は、例えば、血清タンパク質に特異的に結合する抗体を含み得る。抗体による特異的結合とは、因子を血清から選択的に除去するため、または因子の生物学的活性を阻害するためにこの抗体が使用され得、そして放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、バイオアッセイ、または酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）技術によって容易に決定され得ることを意味する。組成物は、例えば、血清タンパク質をコードする遺伝子によってコードされるＲＮＡに特異的に結合するアンチセンスＲＮＡを含み得る。アンチセンスＲＮＡは、標準的な方法により合成および使用され得る（例えば、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ＤＮＡ，  Ｄ．  Ａ．  Ｍｅｌｔｏｎ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，
ＮＹ  （１９８８））。
【００４７】
本方法は、ウイルス感染の処置または阻止において効果的な化合物のスクリーニング方法を提供する。この方法は細胞においてウイルスの増殖に必要であるが細胞の生存には必要ではない遺伝子産物を機能的にコードする細胞遺伝子を含む細胞に化合物を投与する工程、および生成された遺伝子産物のレベルおよび／または活性（すなわち、機能）を検出する工程を包含し、遺伝子産物および／または遺伝子産物活性の減少または除去はウイルス感染の処置または予防のための化合物を示す方法である。細胞遺伝子は、例えば、以下に示される核酸であり得る：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６または配列番号１２７（本明細書において、簡潔さのために配列表２と時には称する）、それらの任意のホモログ、このような遺伝子を入手するための本明細書において提供される方法を使用して得られる任意の他の遺伝子。細胞の遺伝子はスクリーニングされる細胞において天然に存在し得るか、または細胞へ適切な発現な発現ベクター（当該分野において周知である）で導入され得ることが理解される。遺伝子産物のレベルは、任意の標準的な手段（例えば、タンパク質に対して特異的な抗体での検出による）によって測定され得る。遺伝子産物のレベルは、化合物に接触していないコントロール細胞における遺伝子産物のレベルと比較され得る。遺伝子産物のレベルは、化合物の添加の前の同じ細胞における遺伝子産物のレベルと比較され得る。活性または機能は任意の標準的な方法（例えば、生成物への基質の変換を測定する酵素学的アッセイ、または例えば、核酸へのタンパク質の結合を測定する結合アッセイ）によって測定され得る。活性／機能が測定され得る、本明細書において開示される遺伝子産物の例としては、トリステトラプロリン（ヒトのＺＦＰ−３６）、６−ピルボイル−テトラヒドロプテリンシンターゼ、真核生物のＤｎａＪ様タンパク質、ＩＤ３（ＤＮＡ結合３のインヒビター）、Ｎ−アセチルグルコース−アミニルトランスフェラーゼＩ（ｍＧＡＴ−１）、卵割刺激因子（ＣＳＴＦ２）、ＴＡＫ１結合タンパク質、ヒト亜鉛転写因子ＺＰＦ２０７、Ｄｌｘ２、Ｓｍａｄ７（Ｍａｄ関連タンパク質）およびＰ−糖タンパク質（ｍｄｒ１ｂ）を含む。活性は、化合物と接触していないコントロール細胞、または化合物の添加前の同じ細胞における活性と比較され得る。関連して、この遺伝子の調節領域はレポーター遺伝子と機能的に連結され得、そして化合物はレポーター遺伝子の阻害についてスクリーニングされ得る。このようなレポーター構築物は本明細書中に記載され得る。
【００４８】
本発明はまた、ウイルス感染の処置または予防に効果的な化合物のスクリーニング方法を提供する。この方法は、この化合物と配列表２の核酸を含む細胞遺伝子の遺伝子産物または任意のそのホモログとを接触させる工程、およびその遺伝子産物の機能を検出する工程を含み、機能の減少または削除がウイルス感染の処置または予防に有効な化合物を示す方法である。本発明の方法において利用され得る、本明細書中に開示される遺伝子産物の例は、トリステトラプロリン（ヒトのＺＦＰ−３６）、６−ピルボイル−テトラヒドロプテリンシンターゼ、真核生物のＤｎａＪ様タンパク質、ＩＤ３（ＤＮＡ結合３のインヒビター）、Ｎ−アセチルグルコース−アミニルトランスフェラーゼＩ（ｍＧＡＴ−１）、卵割刺激因子（ＣＳＴＦ２）、ＴＡＫ１結合タンパク質、ヒト亜鉛転写因子ＺＰＦ２０７、Ｄｌｘ２、Ｓｍａｄ７（Ｍａｄ関連タンパク質）およびＰ−糖タンパク質（ｍｄｒ１ｂ）を含む。
【００４９】
本発明は、血清の非存在下で第１の期間生存し得る動物細胞培養物から、ウイルスに持続感染した細胞を選択的に除去する方法を提供する。この方法は、血清の非存在下では持続感染細胞が生存し得ない第２の期間に、細胞培養物を血清の非存在下で増殖させる工程、それにより細胞培養物からウイルスに持続感染した細胞を選択的に除去する工程、を含む。第２の期間は、第１の期間よりも短くあるべきである。従って、標準的な培養培地組成物から一定の期間、単に血清を除去し（例えば、培養容器から血清含有培地を除去し、細胞を洗浄し、そして無血清培地を容器に戻すことによる）、次いで、血清飢餓の時間の後に、培養培地に血清を戻し得る。あるいは、血清飢餓の工程の代わりに培養物由来の血清生存因子を阻害し得る。さらに、その代わりに、ウイルス−因子相互作用を妨害し得る。このようなウイルス除去方法は、培養細胞についてそれらがウイルスを有さないままであることを確認するために、定期的に行われ得る。血清除去の期間は、非常に多様であり得、代表的な範囲は約１日〜約３０日である；好ましい期間は約３日〜約１０日であり得、そしてより好ましい期間は、約５日〜約７日であり得る。この期間は、血清の非存在下で生存する特定の細胞の能力ならびに標的ウイルスの生活環（例えば、レオウイルスについては約２４時間の生活環を有し、細胞の３日間の飢餓が劇的な結果を提供する）に基づいて選択され得る。
【００５０】
さらに、期間はまた、細胞を飢餓の間に継代することにより、短縮され得る；一般に、継代の数の増加は、培養物からのウイルスの完全な除去を得るために必要な血清飢餓（または血清因子阻害）の時間を減少し得る。継代の間に、細胞は、代表的には血清に短時間曝露される（代表的には約３〜約２４時間）。この曝露は、細胞を取り除くために使用されたトリプシンの作用の停止、および細胞を別の増殖サイクルへと刺激することの両方を行い、従ってこの選択プロセスを補助する。従って、飢餓／血清サイクルは、選択効果を最適にするために繰り返され得る。他の標準的な培養パラメータ（例えば、培養物のコンフルエンス、ｐＨ、温度など）は、血清飢餓（または血清生存因子阻害）に必要な期間を変更するために多様であり得る。この期間は、任意の所定のウイルス感染について、単純に血清を種々の期間除去し、次いで各試験期間で培養物を感染細胞の存在について試験し（例えば、血清の非存在下で生存する能力により、そして標準的なウイルス力価測定および免疫組織学的技術により、細胞におけるウイルスを定量することにより確認される）、次いで血清欠乏のどの期間でウイルス感染細胞が除去されたかを検出することにより、容易に決定され得る。依然として持続性感染細胞の除去を提供するより短い血清欠乏期間が使用されることが好ましい。さらに、飢餓、次いで血清の再度の添加、および培養物中に残っているウイルスの量の決定のサイクルは、実際に感染細胞が培養において存在しなくなるまで繰り返され得る。
【００５１】
従って、本方法は、さらに細胞の継代（すなわち、細胞培養物を第１の容器から第２の容器へ移すこと）を含み得る。このような移動は、ウイルス感染細胞の生存の選択的な欠失を促進し得る。移動は数回繰り返され得る。移動は、組織培養の標準的な方法により達成される（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，  第２版、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，
Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８７を参照のこと）。
【００５２】
本方法はさらに、細胞培養物からウイルスで持続感染した細胞を選択的に除去する方法を提供する。この方法は、低いｐＨにおける不活化に耐性であり、そしてクロロホルム抽出による不活化に耐性であり、煮沸された場合に不活化され、低イオン強度溶液において不活化され、そしてレオウイルスに持続感染した細胞を含む細胞培養物から除去された場合にはレオウイルスに持続感染した細胞の生存を実質的に妨げる、約５０ｋＤと１００ｋＤの間との分子量を有する血清タンパク質の機能的形態の非存在下で細胞培養物を増殖させる工程を含む。機能的形態の非存在は、いくつかの標準的な手段のいずれか（例えば、タンパク質を、そのタンパク質に対して選択的な抗体に結合させること（血清が細胞に添加される前または後のいずれかに、血清中でその抗体に結合させること；添加前である場合、血清タンパク質は、例えば、抗体をカラムに結合させ、そして血清にカラムを通過させることにより血清から除去され得、次いで生存タンパク質を有さない血清を細胞に投与する）、そのタンパク質を不活化する化合物を投与すること、またはウイルスとタンパク質との間の相互作用を妨害する化合物を投与すること）により達成され得る。
【００５３】
従って、本発明は、血清含有培地において増殖した細胞培養物から、ウイルスに持続感染した細胞を選択的に除去する方法を提供する。この方法は、低いｐＨにおける不活化に耐性であり、そしてクロロホルム抽出による不活化に耐性であり、煮沸された場合に不活化され、低イオン強度溶液において不活化され、そしてレオウイルスに持続感染した細胞を含む細胞培養物から取り出された場合にレオウイルスに持続感染した細胞の生存を実質的に阻害する、約５０ｋＤと１００ｋＤとの間の分子量を有するタンパク質を、血清中で阻害する工程を含む。あるいは、ウイルスと血清タンパク質との間の相互作用は破壊され、ウイルスに持続感染した細胞が選択的に除去され得る。
【００５４】
いくつかの形態の持続感染が可能な任意のウイルスが、本発明の除去方法を利用して、細胞培養物から除去され得る。この方法は、血清タンパク質の除去、阻害またはそうでなければ妨害（例えば、本明細書中に例示されたように）を含み、そしてまたウイルス増殖には必要であるが細胞には必須でない、本発明の方法によって見出された任意の細胞性遺伝子からの遺伝子産物の除去、阻害またはそうでなければ妨害を含む。例えば、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスが標的とされ得る。選択されたウイルスに感染した細胞が血清の除去により培養物から選択的に除去され得るかどうかは、ウイルスに許容的な細胞の血清を飢餓（または血清生存因子を阻害する）させ、選択されたウイルスを細胞に添加し、培養物に血清を添加し、そして感染細胞が死滅するかどうかを観察することにより（すなわち、ウイルスに対して特異的な抗体で生存細胞におけるウイルスのレベルを力価測定することにより）、容易に決定され得る。
【００５５】
血清の非存在下である期間維持され得る任意の動物細胞の培養物（すなわち、代表的には血清中での培養において増殖および維持される任意の細胞）は、本発明の方法を利用してウイルス感染から精製され得る。例えば、初代培養物ならびに樹立された培養物および細胞株が使用され得る。さらに、培養され得、そして血清の非存在下である期間維持され得る、任意の動物由来およびその動物中の任意の組織または細胞型由来の細胞の培養物が使用され得る。例えば、代表的には、感染性ウイルスに感染した、そして特に持続感染した組織由来の細胞の培養物が使用され得る。
【００５６】
本願の請求の範囲で使用される場合、「血清の非存在下」とは、持続的にウイルス感染した細胞が生存しないレベルを意味する。代表的には、閾値レベルは培地中で約１％の血清である。従って、約１％以下の血清が使用され得、例えば、約１％、０．７５％、０．５０％、０．２５％、０．１％の血清、または無血清が使用され得る。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、ウイルスに持続的に感染した細胞を「選択的に除却する」とは、ウイルスに持続的に感染した実質的に全ての細胞が死滅し、その結果、除却手順が実施された直後の培養物中にウイルス感染細胞の存在が検出され得ないことを意味する。さらに、「選択的に除却する」は、ウイルスに感染していない細胞が、この方法によって一般的には死滅しないことを包含する。いくつかの生存細胞は、低レベルではあるがウイルスをなお産生し得、そしていくつかはウイルスにより死滅へと導かれる経路が不完全であり得る。代表的には、ウイルスに持続的に感染した細胞が実質的に全て死滅するには、培養物の約９０％を上回る細胞、そしてより好ましくは約９５％、９８％、９９％、または９９．９９％を上回るウイルス含有細胞が死滅する。
【００５８】
本方法はまた、任意の遺伝子の調節領域を含む核酸を提供する。そのような調節領域は、上記のように単離および配列決定されたゲノム配列から単離され得、そしてその種の調節領域に特徴的な任意の観察される特徴によって、およびその遺伝子のコード領域の開始コドンとそれらとの関係によって同定され得る。本発明はまた、レポーター遺伝子に機能的に連結した調節領域を含む構築物を提供する。そのような構築物は日常的なサブクローン化方法によって作製され得、そして多くのベクターが入手可能であり、ベクター中で調節領域がマーカー遺伝子の上流にサブクローン化され得る。マーカー遺伝子は、マーカー遺伝子産物の検出
従って、本方法はまた、ウイルス感染を処置するための化合物をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、配列表２に示すヌクレオチド配列のいずれか、またはそれらの任意のホモログ（発現におけるその阻害または低減がウイルス複製の阻害を引き起こす）を含む遺伝子の１つの調節領域を含む上記の構築物のいずれかを含有する細胞にその化合物を投与する工程（ここで、その領域は、レポーター遺伝子に機能的に連結している）、および産生されるレポーター遺伝子産物のレベルを検出する工程を包含し、そのレポーター遺伝子産物の減少または排除が、そのウイルス感染を処置するための化合物を示す。この方法によって検出される化合物は、調節領域が単離されるその遺伝子の転写を阻害し、そして従って、被験体を処置するにおいて、その遺伝子によって産生される遺伝子産物の産生を阻害し、従ってそのウイルス感染を処置する。
【００５９】
いくつかの遺伝子は、レトロウイルス挿入の本発明の方法によって破壊された場合、その遺伝子産物の過剰発現を生じ、そしてこの過剰発現は、ウイルス複製を阻害した。従って、本発明は、ウイルス感染の処置における有効性について化合物をスクリーニングする方法を提供し、その方法は、その化合物を細胞内遺伝子（その過剰発現がそのウイルスの複製を阻害するが、その細胞の生存を阻害しない遺伝子産物を機能的にコードする）を含有する細胞に投与する工程、および産生された遺伝子産物のレベルを検出する工程を包含し、その遺伝子産物の増加が、そのウイスル感染を処置するために有効な化合物を示す。代表的には、増加は、その化合物が存在しない場合、産生された遺伝子産物に対して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上の増加である。
【００６０】
本発明はさらに、被験体においてウイルス感染を減少または阻害する方法を提供し、この方法は、配列表２のいずれかに示される核酸を含む遺伝子またはそのホモログによってコードされる遺伝子産物の発現または機能化を阻害する量の組成物をその被験体に投与する工程を包含し、それによってウイルス感染を処置する。ウイルス感染の低減または阻害は、当然ながら、その被験体の最初の感染と、すでに感染している被験体内での非感染細胞（例えば、被験体の細胞においてウイルス複製を阻害している）の感染との両方を含み得る。その組成物は、例えば、その遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する抗体を含み得る。その組成物はまた、その遺伝子によってコードされるタンパク質のレセプターに結合する抗体を含み得る。そのような抗体は、上記の標準的な方法によって選択されたタンパク質に対して惹起され得、そしてポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかであり得るが、モノクローナルが好ましい。あるいは、その組成物は、上記のように、その遺伝子によってコードされるＲＮＡに結合するアンチセンスＲＮＡを含み得る。治療的に有用であるアンチセンスＲＮＡの例には、上記の核酸のフラグメントが含まれる。さらに、その組成物は、その遺伝子によってコードされるＲＮＡを結合するアンチセンスＲＮＡを機能的にコードする核酸を含み得る。他の有用な組成物は、当業者には容易に明らかである。
【００６１】
本発明はまた、被験体においてウイルス感染を処置する方法を提供し、この方法は、その被験体に、遺伝子（その過剰発現が、ウイルス複製を低減または阻害する）の発現を増大させる処置有効量の組成物を投与する工程を包含する。代表的には、増加は、その組成物が存在しない場合に産生される遺伝子産物に対して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上の増加である。
【００６２】
本発明はさらに、被験体においてウイルス感染を減少または阻害する方法を提供し、この方法は、例えば、被験体、または同種の供給源から選択された細胞中で、配列表２に示される核酸を含む内因性遺伝子（その発現の阻害または減少が、ウイルス複製の阻害を生じる）またはそのホモログを、その遺伝子の機能的遺伝子産物を産生し得ない遺伝子形態、またはその遺伝子の機能的遺伝子産物の減少した量を産生する遺伝子形態へとエキソビボで変異させる工程、およびその細胞をその被験体中に戻す（または、その被験体自身の細胞の場合には、置換する）工程を包含し、それによってその被験体における細胞のウイルス感染を減少させる。特定のウイルス（その感染が減少、防止、または阻害される）の代表的な標的細胞に従って、細胞は選択され得る。いくつかのウイルスに好ましい細胞は、造血細胞である。選択した細胞が造血細胞である場合、感染が減少または阻害され得るウイルスには、例えば、ＨＩＶ（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２を含む）が挙げられ得る。しかし、多くの他のウイルス−細胞の組み合わせが当業者には明らかである。
【００６３】
本発明はまた、被験体においてウイルス感染を減少または阻害する方法を包含し、この方法は、例えば、被験体から、または同種の供給源からの選択された細胞において、配列表２に示される核酸（その過剰発現が、ウイルス複製の阻害を引き起こす）またはそのホモログを含む内因性の遺伝子を、その遺伝子をその内因性遺伝子よりも高レベルで発現する遺伝子形態へとエキソビボで変異させる工程、およびその細胞をその被験体中に配置するかまたはその被験体の細胞を置換する工程を包含する。代表的には、より高いレベルとは、変異していない内因性の遺伝子よりも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上であり得る。その細胞は、その感染が減少されるか、防止されるか、または阻害されるべき特定のウイルスの代表的な標的細胞に従って選択され得る。いくつかのウイルスについての好ましい細胞は、造血細胞である。その選択された細胞が、造血細胞である場合、感染から低減または阻害され得るウイルスには、例えば、ＨＩＶ（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２を含む）が挙げられ得る。しかし、多くの他のウイルス−細胞の組み合わせが、当業者に明らかである。
【００６４】
本発明はさらに、被験体においてウイルス感染耐性を増加させる方法を提供し、この方法は、例えば、被験体からの、または同種の供給源からの選択した細胞において、配列表２に示される核酸を含む内因性遺伝子（その発現の阻害または低減が、ウイルス感染耐性を増大させる）を、エキソビボで変異させる工程であって、その内因性遺伝子が、その遺伝子の機能的遺伝子産物を産生し得ない変異された遺伝子形態、またはその遺伝子の低減された量の機能的遺伝子産物を産生する遺伝子形態へと変異される工程、およびその細胞をその被験体に配置する工程を包含し、それにより、その被験体における細胞のウイルス感染抵抗性を増大させる。そのウイルスは、特にその細胞が造血細胞である場合には、ＨＩＶであり得る。しかし、多くの他のウイルス−細胞の組み合わせが、当業者に明らかである。
【００６５】
さらに、本発明は、腫瘍の進行において利用される細胞性遺伝子の単離のための方法を提供する。本発明は、細胞における悪性表現型を抑制し得る細胞性遺伝子を同定する方法を提供し、この方法は、（ａ）機能的プロモーターを欠く選択マーカー遺伝子をコードするベクターを、軟寒天またはＭａｔｒｉｇｅｌ中で良好に増殖し得ない細胞培養物中に移入する工程、（ｂ）マーカー遺伝子を発現する細胞を選択する工程、および（ｃ）マーカー遺伝子が挿入された細胞性遺伝子を、軟寒天またはＭａｔｒｉｇｅｌ中で増殖し得る選択した細胞から単離する工程を包含し、それによって細胞における悪性表現型を抑制し得る遺伝子を同定する。この方法は、任意の選択した非形質転換細胞株を使用して実施され得、それらの多くは当該分野において公知である。
【００６６】
本発明はさらに、細胞における悪性表現型を抑制し得る細胞性遺伝子を同定する方法を提供し、この方法は、（ａ）機能的プロモーターを欠く選択マーカー遺伝子をコードするベクターを、非形質転換細胞の細胞培養物中に移入する工程、（ｂ）マーカー遺伝子を発現する細胞を選択する工程、および（ｃ）マーカー遺伝子が挿入された細胞性遺伝子を、選択および形質転換した細胞から単離する工程を包含し、それによって細胞における悪性表現型を抑制し得る遺伝子を同定する。非形質転換表現型は、当該分野における任意のいくつかの標準的方法によって決定され得、例えば、軟寒天中で増殖し得ないこと、またはＭａｔｒｉｇｅｌ中で増殖し得ないことで例示される。
【００６７】
本発明はさらに、細胞における悪性表現型を抑制するための化合物をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、細胞における悪性表現型の確立に関与する遺伝子産物を機能的にコードする細胞性遺伝子を含有する細胞に化合物を投与する工程、および産生される遺伝子産物のレベルを検出する工程を包含し、遺伝子産物の減少、阻害または排除は、悪性表現型の抑制のために有効な化合物を示す。産生される遺伝子産物のレベルまたは量の検出は、タンパク質のレベルまたは量をアッセイするための、そして特定の遺伝子産物に基づいて選択される、当該分野において標準的な任意のいくつかの方法（例えば、タンパク質ゲル、抗体に基づくアッセイ、標識ＲＮＡの検出）によって、直接的または間接的に測定され得る。
【００６８】
本発明はまた、細胞において悪性の表現型を抑制するための化合物をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、遺伝子産物（その過剰発現が、細胞における悪性表現型の抑制に関与する）を機能的にコードする細胞性遺伝子を含む細胞にその化合物を投与する工程、および産生されたその遺伝子産物のレベルを検出する工程を包含し、その遺伝子産物の増加が、悪性の表現型を抑制するために有効である化合物を示す。
【００６９】
本発明はさらに、被験体の細胞における悪性表現型を抑制する方法を提供し、この方法は、その被験体に、配列番号９、配列番号１０、配列番号２６，配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９，配列番号３６、または配列番号９４に示される核酸遺伝子、あるいはこれらのホモログを含む遺伝子、または本発明によってその過剰発現がその細胞の悪性の表現型を抑制に関与することが見出される任意の遺伝子（例えば、本明細書で「ｘ」で命名されるクローン）によってコードされる遺伝子産物の発現または機能化を阻害する量の組成物を投与する工程を包含し、それにより、悪性表現型を抑制する。その組成物は、別例として、その遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する抗体を含み得る。その組成物は、別の例として、その遺伝子によってコードされるタンパク質についてのレセプターに結合する抗体を含み得る。その組成物は、その遺伝子によってコードされるＲＮＡに結合するアンチセンスＲＮＡを含み得る。さらに、その組成物は、その遺伝子によってコードされるＲＮＡに結合するアンチセンスＲＮＡを機能的にコードする核酸を含み得る。
【００７０】
本発明はさらに、被験体の細胞において悪性表現型を抑制する方法を提供し、この方法は、その被験体に、その過剰発現がその細胞における悪性表現型の抑制に関与する遺伝子産物の発現を増大させるための量の組成物を投与する工程を包含する。その遺伝子産物は、本発明のベクターによる上流遺伝子の破壊が、下流遺伝子の過剰発現を生じる遺伝子の産物であり、そしてその下流遺伝子の過剰発現が形質転換された表現型を実証した遺伝子の産物であり得る。その組成物は、例えば、ＣＯＸ２酵素のインヒビター（例えば、小分子インヒビター）であり得る。
【００７１】
本発明の診断剤または治療剤は、治療剤または診断剤をその選択部位に投与するための多くの任意の標準的手段、またはその型の機能性物質（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｎｔｉｔｙ）を投与するための標準法によって、被検体または動物モデルに投与され得る。例えば、薬剤は、経口的、非経口的（例えば、静脈内）、筋肉内注射により、腹腔内注射により、局所的、経皮的などで投与され得る。薬剤は、例えば、カチオン性リポソームとの複合体として、またはアニオン性リポソーム中にカプセル化されて投与され得る。組成物は、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせた種々の量の選択した薬剤を含み得、そしてさらに、所望であれば、他の医薬品、薬剤、キャリア、アジュバント、希釈剤などを含み得る。非経口投与は、使用される場合には、一般的に注射によって特徴付けられる。注射可能物質は、液体の溶液もしくは懸濁液として、注射前に液体に溶解もしくは懸濁するに適した固体形態として、またはエマルジョンとしてのいずれかの従来の形態で調製され得る。投与の様式に依存して、薬剤は、被検体中での分解を避けるために、例えば、カプセル化などによって最適化され得る。
【００７２】
投薬は、投与の様式、処置される疾患または状態、および個々の被検体の状態に依存するが、抗ウイルス剤または抗ガン剤の投与について代表的であり、かつ投与において使用される投薬である。投薬はまた、投与される組成物（例えば、タンパク質または核酸）に依存する。そのような投薬は当該分野で公知である。さらに、投薬は、処置される特定の疾患または状態について代表的な投薬に従って調整され得る。さらに、標的細胞型の培養細胞中のウイルス力価が、インビボでの標的細胞についての投薬を最適化するために使用され得、そして標的細胞型と同じ型の培養細胞中で達成される変化する投薬からの形質転換がモニターされ得る。しばしば、単一投薬が充分であり得る；しかし、所望であれば投薬は反復され得る。投薬は、有害な副作用を引き起こす程に大きくあるべきではない。一般的に、投薬は、被検体についての年齢、状態、性別、および疾患の程度によって変化し、そして当業者によって決定され得る。投薬はまた、任意の合併症の場合には個々の医師によって調整され得る。
【００７３】
被検体の中の細胞への投与については、組成物は、一旦被検体の中に入れば、当然ながら被検体の体温に順応する。エキソビボ投与については、組成物は、細胞の生存性を維持する任意の標準的な方法によって（例えば、組成物を（標的細胞に適切な）細胞培地に添加し、そしてこの培地を細胞に直接的に添加することによって）投与され得る。当該分野で公知であるように、この方法で使用される任意の培地は、細胞を非生存性にしないために水性かつ非毒性であり得る。さらに、培地は、所望であれば、細胞の生存性を維持するための標準的な栄養素を含有し得る。インビボ投与については、複合体は、例えば、患者由来の血液サンプルもしくは組織サンプルに、または薬学的に受容可能なキャリア（例えば、生理食塩水および緩衝化生理食塩水）に添加され得、そして当該分野で公知の任意のいくつかの手段によって投与され得る。投与の例には、非経口投与（例えば、標的細胞を有する組織もしくは器官に送血する血管を介する局部灌流を含む静脈内注射、またはエアロゾル吸入、皮下注射または筋肉内注射）、局所的投与（例えば、皮膚の創傷または損傷への）、例えば、移植のために調製された骨髄細胞への直接トランスフェクションおよびそれに続く被検体への移植、ならびに器官（続いて被検体に移植される）への直接トランスフェクションが挙げられる。さらなる投与方法には、経口投与（特に、組成物がカプセル化される場合）、または直腸投与（特に、組成物が坐剤形態である場合）が挙げられる。薬学的に受容可能なキャリアには、生物学的もしくは他の点で望ましくないところがない任意の物質が挙げられ、すなわち、この物質は、任意の望ましくない生物学的効果を引き起こすか、または薬学的組成物（その中にこの物質が含有される）の任意の他の成分と有害な様式で相互作用することなく、選択した複合体と共に個体に投与され得る。
【００７４】
特に、特定の細胞型が、例えば、器官または腫瘍の局部灌流によってインビボで標的化される場合、標的組織由来の細胞が生検され得、そしてその組織への複合体の移入のための最適の投薬が、本明細書中に記載されかつ当該分野で公知なようにインビトロで決定され得、インビボ投薬（濃度および時間の長さを含む）を最適化し得る。あるいは、同じ細胞型の培養細胞はまた、インビボでの標的細胞についての投薬を最適化するために使用され得る。
【００７５】
エキソビボ使用またはインビボ使用のいずれかについては、複合体は、任意の有効濃度で投与され得る。有効濃度は、ウイルス感染の減少、阻害、もしくは予防を生じるか、または細胞の形質転換された表現型の減少もしくは阻害を生じる量である。
【００７６】
核酸は、任意のいくつかの手段で投与され得、これは、利用されるベクター、（もしあれば）標的化される器官または組織、および被検体の特徴に従って選択され得る。核酸は、生理食塩水のような薬学的に受容可能なキャリア中で所望される場合、静脈内、動脈内、経口、非経口、皮下のように、全身的に投与され得る。核酸はまた、器官への直接注射によって、または標的組織に送血する血管への注射によって投与され得る。肺または気管の細胞の感染については、それは気管内投与され得る。核酸はさらに、局所的、経皮的などで投与され得る。
【００７７】
核酸またはタンパク質は、組成物中で投与され得る。例えば、組成物は、他の医薬品、薬剤、キャリア、アジュバント、希釈剤などを含み得る。さらに、組成物は、ベクターに加えて、リポソームのような脂質（例えば、カチオン性リポソーム（例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ−コレステロール）またはアニオン性リポソーム）を含み得る。リポソームはさらに、所望される場合、特定の細胞の標的化を促進するためのタンパク質を含み得る。ベクターおよびカチオン性リポソームを含む組成物の投与は、標的器官に輸血される血液に投与され得るか、または気道の細胞を標的化するために気道内に吸入され得る。リポソームに関しては、例えば、Ｂｒｉｇｈａｍら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｒｅｓｐ．  Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １：９５−１００（１９８９）；Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号を参照のこと。
【００７８】
核酸を含むウイルスベクターについては、組成物は、リン酸緩衝化生理食塩水または生理食塩水のような薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。ウイルスベクターは、当該分野で公知であるように、標的細胞に従って選択され得る。例えば、アデノウイルスベクター、特に複製欠陥アデノウイルスベクターが、その広い宿主域の理由で、任意の多数の細胞を標的化するために利用され得る。多くの他のウイルスベクターが利用可能であり、そしてそれらの標的細胞が公知である。
【００７９】
本出願を通して、種々の刊行物が引用される。これらの刊行物の開示は、その全体が、本発明の属する当該分野の技術水準をより十分に記載するために本明細書中で本出願への参考として援用される。
【実施例】
【００８０】
（細胞培養物からのウイルス感染細胞の選択的排除）
ラット腸管細胞株−１細胞（ＲＩＥ−１細胞）を、１０％ウシ胎児血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース）中で標準的に増殖させた。実験を開始するために、レオウイルスで持続的に感染させた細胞をコンフルエンス付近まで増殖させ、次いで培地を除去し、ＰＢＳ中で細胞を洗浄し、そして血清を添加していないフラスコ培地へ戻すことにより、血清を増殖培地から除去した。代表的には、血清含量を１％以下まで減少させた。細胞を、数日間または約１ヶ月程の期間、血清飢餓状態にして、それらを静止状態または増殖停止にする。次いで、１０％血清を含む培地を静止状態の細胞に添加して、細胞の増殖を刺激する。生存している細胞が、細胞が任意の感染性ウイルスを含むか否か確証するために使用される免疫組織化学的技術（ホモジナイズされた細胞の１ｍｌあたり１感染性ウイルスの感度）により、持続的に感染した細胞ではないことが見出される。
【００８１】
（細胞ゲノムＤＮＡの単離）
遺伝子トラップライブラリー：ＲＩＥ−１細胞を、１０細胞あたり１未満のレトロウイルスの比で、レトロウイルスベクター（Ｕ３遺伝子−トラップ）を用いて感染させることによりライブラリーを生成する。Ｕ３遺伝子トラップレトロウイルスが活性に転写される遺伝子内に組み込まれた場合、Ｕ３遺伝子トラップレトロウイルスがコードするネオマイシン耐性遺伝子もまた転写され、これは細胞に抗生物質ネオマイシンに対する耐性を与える。遺伝子トラップ事象を伴う細胞は、ネオマイシンへの曝露に対して生存し得るが、遺伝子トラップ事象を伴わない細胞は死滅する。次いで、ネオマイシン選択から生存する種々の細胞を、遺伝子トラップ事象のライブラリーとして増殖する。このようなライブラリーを、後の同定のために遺伝子にタグを付加する、転写的に活性な細胞プロモーター由来のレポーター遺伝子を発現する特性を有する任意のレトロウイルスベクターを用いて生成し得る。
【００８２】
レオウイルス選択：レオウイルス感染は、代表的には、ＲＩＥ−１細胞に対して致死性であるが、持続的に感染した細胞の発生を生じ得る。これらの細胞は、増殖を続ける一方、感染性レオウイルス粒子を産生する。レオウイルス耐性を細胞に与える遺伝子トラップ事象の同定のために、持続的に感染した細胞を排除しなければならないか、またはそれらを偽ポジティブとして記録する。本発明者らは、レオウイルスに持続的に感染したＲＩＥ−１細胞が血清の飢餓、継代、低密度でのプレーティングに対して非常に耐性に乏しいことを見出した。従って、本発明者らは、レオウイルス感受性細胞およびレオウイルスに持続的に感染した細胞の両方を選択するＲＩＥ−１遺伝子トラップライブラリーをスクリーニングするためのプロトコルを開発した。
１．ＲＩＥ−１ライブラリー細胞をコンフルエンス付近まで増殖させ、次いで、血清を培地から除去する。細胞を、数日間血清について飢餓状態にして、それらを静止状態または増殖停止にする。
２．ライブラリー細胞を１細胞あたり１０より大きいレオウイルスの力価でレオウイルスに感染させ、そして血清飢餓をさらに数日間続ける。
３．感染した細胞を継代し（それらが３〜６時間血清に曝されるプロセス）、次いでさらに数日間血清について飢餓状態にする。
４．次いで、生存している細胞を、血清の存在下で、それらを限界希釈によりクローン化する時点において目に見えるコロニーが発達するまで増殖させる。
培地：ダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース）（ＤＭＥ／ＨＩＧＨ）Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  カタログ番号ＳＨ３０００３．０２．ネオマイシン：Ｕ３遺伝子トラップレトロウイルスを有しない細胞を選択するために使用される抗生物質、（例えば、ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ  Ｓｉｇｍａ．から  カタログ番号Ｇ９５１６より）。
ラット腸管細胞株−１細胞（ＲＩＥ−１細胞）：これらの細胞は、Ｒａｙ  Ｄｕｂｏｉｓ博士（ＶＡＭＣ）の研究室由来である。それらを、代表的には、１０％ウシ胎児血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地中で培養する。
レオウイルス：セロタイプ１またはセロタイプ３のいずれかの研究室の株を使用する。これらは、本来Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ（故人）の研究室から入手した。これらのウイルスは詳細に記載されている。
レトロウイルス：本明細書中で使用されるＵ３遺伝子トラップレトロウイルスは、Ｅａｒｌ  Ｒｕｌｅｙ博士（ＶＡＭＣ）により開発され、そしてこのライブラリーを彼により示唆された一般的なプロトコルを使用して生成した。
血清：ウシ胎児血清  Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  カタログ番号Ａ−１１１５−Ｌ。
【００８３】
（単離された核酸のためのタグの同定）
ベクター（例えば、Ｕ３遺伝子トラップベクター）でタグ化されたゲノム配列は、そこから配列が単離された変異体細胞のゲノムライブラリーに対応する番号、およびライブラリーの独特のメンバーを示す文字が与えられる。同じ番号および文字を有する１つより多い配列は、その遺伝子を「タグ化」したベクター挿入物を囲むゲノムから得た複数の独自の配列を示す。このようなゲノム配列は、ベクターに基づくプライマー（これから配列決定が３’から５’または５’から３’へと起こる）を使用して得られる。前者の場合、そのベクターに挿入されるその遺伝子の方向を回復するために、そのベクタープライマーに由来する配列が逆転されそして相補されなければならない。そのような逆相補体配列は、「ｒＥ」と命名される。５’から３’に生じるプライマーからのゲノム配列決定の場合（すなわち、プライマーがベクターの３’末端である場合）、変化は必要とされない。なぜなら、その誘導された配列は、破壊された遺伝子においてみられるとおりの配列であるからである。このような配列は、「Ｂ４」と命名される。以下に示した相同性は、各ゲノム配列がネガティブ鎖上にあることが明確に示されていない限り正方向であることを示した。例として、配列番号２７は、ポジティブ鎖上の新規なポリペプチドをコードする核酸配列を含むが、ネガティブ鎖はフェリチンをコードする。
【００８４】
【表１】
2009100780.tif 000002
2009100780.tif 000003
2009100780.tif 000004
2009100780.tif 000005
2009100780.tif 000006
2009100780.tif 000007
2009100780.tif 000008
2009100780.tif 000009
2009100780.tif 000010
（ウイルス感染のために必要な遺伝子）
本明細書中で開示される単離された配列のいくつかは、以下のタンパク質をコードする配列を含む：トリステトラプロリン（ｔｒｉｓｔｅｔｒａｐｒｏｌｉｎ）（ヒトＺＦＰ−３６）、６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ、真核生物のＤｎａＪ−様タンパク質、ＩＤ３（ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ３のインヒビター）、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ｍＧＡＴ−１）、切断刺激因子（ＣＳＴＦ２）、ＴＡＫ１結合タンパク質、ヒトジンク転写因子ＺＰＦ２０７、Ｄｌｘ２、Ｓｍａｄ７（Ｍａｄ関連タンパク質）、およびＰ−糖タンパク質（ｍｄｒ１ｂ）。
【００８５】
（悪性表現型を抑制する細胞性遺伝子の単離）
本発明者らは、形質転換していない細胞（ＲＩＥ−１親）の集団から形質転換した表現型を有する（潜在的に腫瘍細胞である）細胞株を選択する遺伝子捕捉法を利用した。その親細胞株であるＲＩＥ−１細胞は、軟寒天において増殖する能力を有していないか、またはマウスにおいて腫瘍を生成する能力を有していない。遺伝子捕捉の後に、細胞を軟寒天において増殖するその能力についてスクリーニングした。これらの細胞をクローン化し、そしてゲノム配列をレトロウイルスベクターの５’または３’で得た（すなわち、配列番号９、配列番号１０、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３６、または配列番号９４；クローン名中「ｘ」で指定された配列）。その細胞株の全ては、それらが腫瘍細胞株であるかのように振る舞う。なぜなら、それらもまたマウスにおいて腫瘍を誘導するからである。
【００８６】
その細胞株のうち、２つは、プロスタグランジンシンセターゼ遺伝子ＩＩまたはＣＯＸ２の増幅された発現に関連する。レトロウイルス標的化による上流遺伝子の遺伝子機能の破壊が、下流遺伝子産物ＣＯＸ２の増大した発現を導いたことが示されている。ＣＯＸ２酵素の小分子インヒビターが添加されると、形質転換された表現型の復帰が生じた。ＣＯＸ２遺伝子は、ヒトにおける前ガン状態のアデノーマにおいて上昇し、そしてヒト大腸癌において過剰発現されることが見出されている。ＣＯＸ２発現のインヒビターはまた、腫瘍の増殖を阻止する。細胞株の１つであるｘ１８（配列番号９４）は、ＥＳＴ（ｄｂｅｓｔ）データベースに現在表される破壊された遺伝子を有するが、この遺伝子は公知でない（ＧｅｎＢａｎｋに存在しない）。
【００８７】
提供されたヌクレオチド配列が単離される各々の遺伝子（および「ｘ」で指定されるクローンのすべて）は、腫瘍サプレッサー遺伝子を表す。破壊された遺伝子が形質転換された表現型を抑制し得る機構は、現在は未知である。しかし、各々の遺伝子は、公知の遺伝子に対応するゲノム配列が存在しないので、潜在的に独特である腫瘍サプレッサー遺伝子を表す。腫瘍サプレッサー遺伝子を迅速に選択する能力は、ガンを処置するかまたは予防するプロセス（診断的試験について可能性がある）における独特の標的を提供し得る。
【００８８】
（ゲノム遺伝子全体の単離）
本発明の単離された核酸（その配列は、配列番号１〜配列番号１２７のいずれかに記載される）、またはより小さいそれらのフラグメントを、検出可能な標識により標識化し、そしてプローブとして使用して高ストリンジェンシーな（即ち、ハイブリダイゼーションを生成するための高塩濃度および高温ならびに洗浄温度５〜２０℃）条件下でラットゲノムライブラリー（λファージまたは酵母人口染色体ベクターライブラリー）をスクリーニングする。クローンを単離し、そして標準的なＳａｎｇｅｒジデオキシヌクレオチド配列決定法により配列決定した。一旦、新規なクローンの配列全体が決定されると、これをプローブ配列と整列させ、そしてプローブ配列に対するその配向性を決定した。第二および第三のプローブを、組み合わせたゲノム配列のいずれかの末端由来の配列を使用して、それぞれ設計した。これらのプローブを使用して、ライブラリーをスクリーニングし、新規なクローンを単離し、このクローンを配列決定した。これらの配列を、以前に得られた配列およびいずれかの末端の配列に対応して設計された新規なプローブと整列させ、そしてプロセス全体を、遺伝子全体が単離され、そしてマップされるまで繰り返した。配列の一端が全く新規なクローンを単離し得ない場合、新規なライブラリーがスクリーニングされ得る。完全な配列は、５’末端に調節領域および３’末端にポリアデニル化シグナルを含む。
（ｃＤＮＡの単離）
オープンリーディングフレームを含む、単離された核酸（その配列は、配列番号１〜配列番号１２７のいずれかに記載される）、またはより小さなそれらのフラグメント、あるいはゲノムライブラリーから得られたさらなるフラグメントを、検出可能な標識により標識化し、そしてプローブとして使用して本発明のフラグメントの一部をスクリーニングし、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。ラットｃＤＮＡライブラリーはラットｃＤＮＡを得て；ヒトｃＤＮＡライブラリーはヒトｃＤＮＡを得る。上記のように、繰り返されるスクリーニングを使用して、必要であればいくつかのクローン由来の遺伝子の完全なコード配列を獲得し得る。次いで、単離物を配列決定して、標準的な手段（例えば、ジデオキシヌクレオチド配列決定法）によりヌクレオチド配列を決定し得る。
【００８９】
（血清生存因子の単離および特徴付け）
血清飢餓に対する耐性の欠如は、血清中に存在する血清因子（生存因子）についての持続的に感染した細胞の後天的な依存に起因する。持続的に感染した細胞のための血清生存因子は、５０〜１００ｋＤの間の分子量を有し、そして低いｐＨ（ｐＨ２）およびクロロホルム抽出における不活性化に抵抗する。これは、５分間煮沸し［一旦、全血清から分画される（５０〜１００ｋＤ画分）］、そして低イオン強度の溶液［１０〜５０ｍＭ］中に入れることにより不活性化される。
【００９０】
因子を、３０〜１００ｋｄの排除サイズを有するｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ分子カットオフフィルター（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅおよびＡｍｎｉｃｏｎ）を使用するサイズ分画、および５０ｋｄの分子排除を有する透析チューブ（ｄｉａｌｙｓｉｓ
ｔｕｂｉｎｇ）により、血清から単離した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動および銀染色を使用して、全ての得られた物質が５０と１００ｋｄの間であることを決定した。このことは、最初の単離の正当性を確証する。さらなる精製を、イオン交換クロマトグラフィー、ヘパリン硫酸吸着カラム、続いてＨＰＬＣを使用して実施した。血清画分（３０〜１００ｋｄ画分）のｐＨを異なるｐＨ条件にＨＣｌを使用して調製し、生物学的活性の評価の前にｐＨをｐＨ７．４に再調整した後に活性を決定した。活性を含む画分を低イオン強度溶液に種々の長さの時間で透析し、そして画分を培地に対して透析することにより生物学的活性を決定する前にイオン強度を生理学的条件に再調整することにより、低イオン強度の感度を決定した。生物学的活性をクロロホルム抽出後の水溶液中で維持し、このことは、因子が脂質でないことを示す。生物学的活性は、３０〜１００ｋｄ画分を１００℃の水浴に５分間置いた後に失われた。
【００９１】
（単離された核酸分子）
単離されたタグ化ゲノムＤＮＡを、Ｓａｎｇｅｒジデオキシヌクレオチド配列決定法を使用する標準的な方法により配列決定した。その配列を、相同性サーチにおいてコンピュータデータバンクで実行した。これらの遺伝子は、特に、１つまたは両方の対立遺伝子の破壊が生存細胞を生じるので、治療標的であり得る。
【００９２】
（配列表）
【化１】
2009100780.tif 000011
【化２】
2009100780.tif 000012
【化３】
2009100780.tif 000013
【化４】
2009100780.tif 000014
【化５】
2009100780.tif 000015
【化６】
2009100780.tif 000016
【化７】
2009100780.tif 000017
【化８】
2009100780.tif 000018
【化９】
2009100780.tif 000019
【化１０】
2009100780.tif 000020
【化１１】
2009100780.tif 000021
【化１２】
2009100780.tif 000022
【化１３】
2009100780.tif 000023
【化１４】
2009100780.tif 000024
【化１５】
2009100780.tif 000025
【化１６】
2009100780.tif 000026
【化１７】
2009100780.tif 000027
【化１８】
2009100780.tif 000028
【化１９】
2009100780.tif 000029
【化２０】
2009100780.tif 000030
【化２１】
2009100780.tif 000031
【化２２】
2009100780.tif 000032
【化２３】
2009100780.tif 000033
【化２４】
2009100780.tif 000034
【化２５】
2009100780.tif 000035
【化２６】
2009100780.tif 000036
【化２７】
2009100780.tif 000037
【化２８】
2009100780.tif 000038
【化２９】
2009100780.tif 000039
【化３０】
2009100780.tif 000040
【化３１】
2009100780.tif 000041
【化３２】
2009100780.tif 000042
【化３３】
2009100780.tif 000043
【化３４】
2009100780.tif 000044
【化３５】
2009100780.tif 000045
【化３６】
2009100780.tif 000046
【化３７】
2009100780.tif 000047
【化３８】
2009100780.tif 000048
【化３９】
2009100780.tif 000049
【化４０】
2009100780.tif 000050
【化４１】
2009100780.tif 000051
【化４２】
2009100780.tif 000052
【化４３】
2009100780.tif 000053
【化４４】
2009100780.tif 000054