(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のα及びβサブユニットをコードする核酸分子、該核酸分子を含む哺乳動物及び両生動物細胞、並びにα及びβサブユニットの製造方法を提供する。【解決手段】ヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のα６サブユニットをコードする核酸分子及びβ３サブユニットをコードする分子。また、複数のサブユニットの組合わせ、例えばα１、α２、α３、α４、α５、α６及び／又はα７サブユニットのうちの一つ以上とβ３サブユニットの一つ以上との組合わせ、又はβ２、β３及び／又はβ４サブユニットとα６サブユニットとの組合せ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体の全長β３サブユニットをコードする分離核酸分子であって、
β３サブユニットをコードするヌクレオチド配列は、以下のａからｃのヌクレオチド配列から選択される前記核酸分子：
ａ．配列番号１５に示すヌクレオチド９８−１４７１を含むヌクレオチド配列；
ｂ．配列番号１６を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
ｃ．ａまたはｂに示された配列に縮重するヌクレオチド配列。
【請求項２】
配列番号１５に示すヌクレオチド９８−１４７１を含む請求項１の核酸分子。
【請求項３】
配列番号１５に示す最初の１０５個のヌクレオチドからなる翻訳配列に示されている任意の２８個の連続塩基又はその相補体を含む少なくとも２８塩基の長さを有する一本鎖核酸分子。
【請求項４】
標識されている請求項３に記載の核酸分子。
【請求項５】
３２Ｐで標識されている請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】
ヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットをコードするＤＮＡを分離するための方法であって、請求項４に記載の核酸分子を用いてライブラリーをスクリーニングし、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で請求項４に記載の核酸にハイブリダイズするクローンを分離する操作を含む前記方法。
【請求項７】
分離クローンが高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細胞が原核細胞又は真核細胞であり、核酸分子が細胞に対して外来性である請求項１に記載の核酸分子を含む細胞。
【請求項９】
哺乳動物細胞又は両生動物卵母細胞である請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
ＤＮＡである請求項１に記載の分子。
【請求項１１】
ＲＮＡである請求項１に記載の分子。
【請求項１２】
ヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体の活性を調節する化合物を同定するために化合物をスクリーニングする方法であって、該方法は、請求項８に記載の細胞内のニューロンニコチン性アセチルコリン受容体活性に対する試験化合物の作用を決定し、これを対照細胞に対する作用又は化合物の不在下における細胞のニューロンニコチン性アセチルコリン受容体活性と比較することからなる前記方法。
【請求項１３】
配列番号１６に示されたアミノ酸配列と９０％の同一性を有する、実質的に純粋なヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体β3サブユニット。
【請求項１４】
配列番号１６に示されたアミノ酸配列と９０％の同一性を有するヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体β３サブユニットを含む実質的に純粋な組換えヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体。
【請求項１５】
機能性ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体サブユニット及びこれらの組合わせを同定するための方法であって、（ａ）請求項１に記載の核酸分子を真核細胞に導入し、（ｂ）ステップ（ａ）の細胞内のニューロンニコチン性アセチルコリン受容体活性を検出する操作を含み、前記活性が、導入分子でコードされたサブユニットを含む受容体によって仲介される前記方法。
【請求項１６】
ｍＲＮＡである請求項１に記載の核酸。
【請求項１７】
請求項１６に記載のｍＲＮＡを含む分離細胞。
【請求項１８】
配列番号１５のヌクレオチド９８−２１１を含む分離核酸分子。
【請求項１９】
配列番号１５に示すヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の核酸分子。
【請求項２０】
ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体を発現する請求項８に記載の細胞。
【請求項２１】
配列番号１６のアミノ酸１−２８をコードするヌクレオチド配列を含む分離核酸分子。
【請求項２２】
配列番号１６のアミノ酸１−２０をコードするヌクレオチド配列を含む分離核酸分子。
【請求項２３】
ヒトｃＤＮＡライブラリーから得られる請求項１に記載の核酸分子。
【請求項２４】
配列番号１５に示すヌクレオチド９８−２１１と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願明細書は、米国内向けでは、１９９５年６月７日出願のＥｌｌｉｏｔｔらによる米国特許出願明細書第０８／４８４，７２２号“ＨＵＭＡＮ  ＮＥＵＲＯＮＡＬ  ＮＩＣＯＴＩＮＩＣ  ＡＣＥＴＹＬＣＨＯＬＩＮＥ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＥＭＰＬＯＹＩＮＧ  ＳＡＭＥ（ヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体組成物及び該組成物を使用する方法）”の一部継続出願である。米国特許出願明細書第０８／４８４，７２２号の論題は全体が本出願明細書に参考として包含される。
【０００２】
本出願明細書は、米国特許明細書第５，３６９，０２８号及び米国特許出願明細書第０８／０２８，０３１号、第０８／１４９，５０３号、第０８／４９６，８５５号、第０７／９３８，１５４号、第０８／４６７，５７４号、第０８／４６６，５８９号、第０８／４８７，５９６号にも関連している。これらの米国特許出願明細書及び米国特許明細書の論題は本出願明細書に参考として包含される。
【０００３】
発明の分野
本発明は、ヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体タンパク質サブユニットをコードする核酸分子、及びコードされたタンパク質に関する。特に、ヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体αサブユニットをコードするＤＮＡ及びＲＮＡ、αサブユニットタンパク質、βサブユニットをコードするＤＮＡ及びＲＮＡ、βサブユニットタンパク質、並びにこれらの組合わせを提供する。
【０００４】
発明の背景
リガンド依存性イオンチャンネルは中枢神経系の細胞間の情報伝達手段を提供する。これらのチャンネルは、ある細胞から放出された信号（例えば神経伝達物質と称する化学物質）を、標的細胞膜に沿って伝搬する電気信号に変換する。中枢及び末梢神経系には種々の神経伝達物質及び神経伝達物質受容体が存在する。神経筋及びニューロン由来のニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）を含む５種類のリガンド依存性受容体類が同定された（Ｓｔｒｏｕｄら，１９９０  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：１１００９−１１０２３）。しかしながら、種々の受容体が神経系の種々の部分で神経伝達物質又は他の調節リガンドに対する種々の応答を発生させるメカニズムは殆ど解明されていない。
【０００５】
ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）は、神経筋及びニューロン由来のマルチサブユニットタンパク質である。これらの受容体は、神経伝達物質アセチルコリン（ＡＣｈ）との相互作用時に、神経と筋肉との間、及びニューロン間のシナプス伝達を仲介するリガンド依存性イオンチャンネルを形成する。様々なニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）サブユニットが存在するため、様々なｎＡＣｈＲ組成物（即ちサブユニットの組合わせ）が存在する。異なるｎＡＣｈＲ組成物は種々のリガンドに対して異なる特異性を示すため、薬理学的に識別可能である。脊椎動物神経筋接合部、脊椎動物交感神経節及び脊椎動物中枢神経系で発現されるニコチン性アセチルコリン受容体は、種々のｎＡＣｈＲ組成物に結合する種々のリガンドの作用に基づいて識別された。例えば、神経筋接合部のニコチン性アセチルコリン受容体の活性化を阻止するメガネヘビα神経毒は、幾つかの異なるニューロン由来細胞系で発現される一部のニューロンニコチン性アセチルコリン受容体の活性化は阻止しない。
【０００６】
筋肉ｎＡＣｈＲは、化学量論（α）２β（γ又はε）δで５種類のサブユニットからなる糖タンパク質である。各サブユニットは約５０〜６０キロドルトン（ｋｄ）の質量を有し、異なる遺伝子によってコードされる。（α）２β（γ又はε）δ複合体は、二つのリガンド結合部位と一つのリガンド依存性トランスメンブランチャンネルとを含む機能性受容体を形成する。筋肉ニコチン性ｎＡＣｈＲは、コリン作動性アゴニストとの相互作用時にナトリウムイオンを伝導する。ナトリウムイオンの流入は、プラズマ膜の内外で維持されていた正常なイオン勾配を即座に破壊し、その結果、プラズマ膜が脱分極する。膜の内外の電位差を減少させると、神経筋接合部で化学信号が電気信号に変換され、筋肉の収縮を誘発する。
【０００７】
機能性筋肉ニコチン性アセチルコリン受容体は、αβδγサブユニット、αβγサブユニット，αβδサブユニット、αδγサブユニットで形成されたが、一つのサブユニットだけでは形成されていない（例えば、Ｋｕｒｏｓａｋｉら（１９８７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１４  ２５３−２４８；Ｃｏｍａｃｈｏら（１９９３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １３：６０５−６１３参照）。これに対し、機能性ニューロンｎＡＣｈＲは、αサブユニットのみ、又はα及びβサブユニットの組合わせによって形成できる。より大きいαサブユニットは一般的にＡＣｈ結合サブユニットと考えられており、より小さい分子量のβサブユニットは一般的に構造サブユニットと考えられているが、βサブユニットがＡＣｈに結合する能力を有していない、又はＡＣｈ結合部位の形成に関与しないという決定的な証拠はない。機能性イオンチャンネルの形成に関与するサブユニットはいずれも、結果として得られるチャンネルの構造に寄与するという範囲で、ＡＣｈ結合能力（又は不能）にかかわりなく「構造」サブユニットである。リガンド依存性イオンチャンネルでもあるニューロンｎＡＣｈＲは、自律神経系及び中枢神経系の神経節（ニューロンｎＡＣｈＲが信号伝達を仲介する場所）、並びにシナプス前及びシナプス外位置（ニューロンｎＡＣｈＲが神経伝達を調節し、別の機能も果たし得る場所）で発現される。Ｗｏｎｎａｃｏｔｔら（１９９０）Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａ．Ｎｏｒｄｂｅｒら編，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１５７−１６３。
【０００８】
ｎＡＣｈＲをコードするＤＮＡは幾つかの由来源から分離された。この種の研究から得られる情報に基づいて、しばらくの間、筋肉、自律神経節及び中枢神経系で発現されるｎＡＣｈＲがそれぞれ機能的に異なることは明らかだとされていた。この機能的多様性は、少なくとも部分的には、存在する種々のｎＡＣｈＲサブユニットの数が多いことに起因し得る。しかしながら、特にニューロン細胞で、（どの）ｎＡＣｈＲサブユニットがどのように組合わせられて独自のｎＡＣｈＲサブタイプを形成するのかは完全には解明されていない。実際、特定のサブタイプのみがアルツハイマー病のような疾患に関与し得ることは証明されている。また、類似の組織又は細胞種類に由来するｎＡＣｈＲが類似の交差種であるかどうかは不明である。
【０００９】
従って、各ヒトニューロンｎＡＣｈＲサブユニット、この種のサブユニットを含む組換え細胞、及びこれらから形成された受容体をコードするＤＮＡを分離し、特徴を解明する必要がある。ヒトニューロンｎＡＣｈＲの機能を調べ、疾患特異的な薬理学的活性物質を得るために、分離（好ましくは精製）ヒトニューロンｎＡＣｈＲ及び分離（好ましくは精製）ヒトニューロンｎＡＣｈＲサブユニットを得る必要もある。また、このような薬理学的活性物質を同定するためのアッセイを開発する必要もある。
【００１０】
前述のような核酸、細胞、受容体サブユニット及び受容体組成物を利用できれば、非ヒトｎＡＣｈＲデータ、又はヒトもしくは非ヒト筋肉もしくは神経節ｎＡＣｈＲデータから導き出した予測に基づくヒトニューロンｎＡＣｈＲの構造及び機能に関する推測の不確実さが除去される。
【００１１】
従って本発明は、ヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のサブユニットをコードするＤＮＡを分離し特徴を解明することを目的とする。本発明は、ヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットを組換えにより製造する方法を提供することも目的とする。本発明は更に、精製受容体サブユニットを提供すること、並びにヒトニューロンｎＡＣｈＲの活性を調節する化合物を同定するために化合物をスクリーニングする方法を提供することも目的とする。
【００１２】
これらの目的及び他の目的は、本明細書の本文及び「特許請求の範囲」を更に検討することにより当業者に理解されよう。
【００１３】
発明の概要
ヒトニューロンｎＡＣｈＲα及びβサブユニットをコードする分離核酸分子を提供する。特に、ヒトニューロンｎＡＣｈＲα６及びβ３サブユニットをコードする分離ＤＮＡ及びＲＮＡを提供する。前記ＤＮＡによってコードされるメッセンジャーＲＮＡ及びポリペプチドも提供する。
【００１４】
α６及びβ３サブユニットを含む組換えヒトニューロンニコチン性ｎＡＣｈＲサブユニット、並びにその製造方法も提供する。更に、少なくとも一つのヒトニューロンニコチン性ｎＡＣｈＲサブユニットを含む組換えヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体、及びその製造方法も提供する。また、宿主細胞でコードされた一つ以上のｎＡＣｈＲサブユニットと外来ＤＮＡもしくはＲＮＡ（即ち宿主細胞内に導入した本明細書に記載のＤＮＡもしくはＲＮＡ）でコードされた一つ以上のｎＡＣｈＲサブユニットとの混合物を含む組換えニューロンニコチン性ｎＡＣｈＲ、及びその製造方法も提供する。
【００１５】
前述のサブユニットをコードするＤＮＡを含むプラスミドも提供する。本発明は、前述のＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はプラスミドを含む組換え細胞も提供する。この種の細胞は、例えばＤＮＡの複製、ヒトｎＡＣｈＲサブユニット及び組換え受容体の製造、並びに一つ以上のヒトサブユニットを含む受容体を発現する細胞の製造に有用である。
【００１６】
本発明が提供するＤＮＡ、ＲＮＡ、ベクター、受容体サブユニット、受容体サブユニットの組合わせ及び細胞は、選択したニューロンニコチン性ｎＡＣｈＲ受容体サブタイプ、及びこれらのサブタイプの特定の組合わせ、並びに受容体サブユニットに対する抗体の製造を可能にする。これは、その存在が単一ｎＡＣｈＲサブタイプの分析を妨害し得る他の多くの受容体タンパク質が実質的に混入していない合成もしくは組換え受容体及び受容体サブユニットの製造手段を提供するものである。所望の受容体サブタイプを入手できれば、薬剤物質が特定の受容体サブタイプに与える作用を観察することが可能になり、従ってヒト及びヒトニューロンニコチン性ｎＡＣｈＲｓサブタイプに特異的な試験システムで薬剤物質の初期ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングを実施することが可能になる。
【００１７】
本発明は、ここに開示するＤＮＡ分子の一部と、該ＤＮＡでコードされたタンパク質に特異的に結合する抗体とを含む一本鎖プローブも提供する。また、配列番号１５のヌクレオチド９８−２１１を含む分離核酸分子も提供する。
【００１８】
前記ＤＮＡでコードされたタンパク質も提供する。これらのタンパク質は、前記ＤＮＡを適当な原核又は真核宿主細胞内で発現させ、その結果産生されたタンパク質を分離することにより製造し得る。
【００１９】
機能性ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体サブユニット及びこれらの組合わせを同定する方法も提供する。
【００２０】
ヒトニコチン性アセチルコリン受容体の活性を調節する化合物を同定するアッセイも提供する。特定の受容体組成物に対する薬剤の作用を調べるために薬剤物質をｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングすることができれば、受容体サブタイプ特異的又は疾患特異的薬剤の開発及びスクリーニングが可能になる。種々の潜在的アゴニスト又はアンタゴニストを用いて単一受容体サブユニット又は特定受容体サブタイプの組合わせを試験すれば、個々のサブユニットの機能及び活性に関して更に情報が得られ、受容体サブユニット又は受容体サブタイプの一つ以上と極めて特異的に相互作用することができる化合物の同定及び設計が可能になる。得られる薬剤は、種々のサブタイプを発現する細胞を用いてスクリーニングすることにより同定した薬剤と比べて、望ましくない副作用が少ない。
【００２１】
更に、薬剤の開発及び種々の疾患状態の治療に関連して、ヒトニューロンｎＡＣｈＲサブユニットをコードするＤＮＡ及びＲＮＡを利用できれば、特定の疾患状態の発生と相関し得るような遺伝子中の任意の変化（例えば突然変異）を同定する手段が得られる。また、このような突然変異を、後で作用を調べるために実験動物又はｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイシステム中に導入し得る合成ＤＮＡ配列中に特異的に導入することにより、前述のような疾患状態の動物モデルの製造が可能になる。
【００２２】
図面の簡単な説明
第１図は、α６コーディングフラグメントをＥｃｏＲＩ挿入物として含むサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターをベースとするベクターｐｃＤＮＡ３−ＫＥアルファ６．３の制限地図を示す説明図である。
【００２３】
第２図は、β３コーディングフラグメントをＥｃｏＲＩ挿入物として含むＣＭＶプローモーターをベースとするベクターｐｃＤＮＡ３−ＫＢベータ３．２の制限地図を示す説明図である。
【００２４】
好ましい実施態様の詳細な説明
定義
特に指示がない限り、本明細書で使用する総ての技術及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を表す。本明細書で言及する総ての特許及び出版物は、特に指示がない限り、全体が参考として本明細書に包含される。
【００２５】
本明細書で核酸分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド又はタンパク質を形容する語として使用する「分離」（又は実質的に精製した、もしくは純粋な）という用語は、このように形容されるＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド又はタンパク質が人の手を介してｉｎ  ｖｉｖｏ細胞環境から分離されたものであることを意味する。従って、例えば本明細書中の「分離（又は実質的に純粋な）ＤＮＡ」とは、当業者に使用されている標準的方法（例えばＭａｎｉａｔｉｓら（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ参照）で精製したＤＮＡフラグメントを意味する。
【００２６】
同様にして、本明細書でＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド又はタンパク質を形容する語として使用する「組換え」という用語は、このように形容されるＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド又はタンパク質が、例えばクローニング、組換え発現といったような方法で人為的に製造されたものであることを意味する。従って、例えば本明細書中の組換えタンパク質とは、人為的に加えられたＤＮＡを含みこれを発現する組換え宿主により産生されたタンパク質を意味する。
【００２７】
本明細書で使用するベクター（又はプラスミド）という用語は、外来ＤＮＡをその発現又は複製のために細胞内に導入するのに使用される別個のエレメントを意味する。このようなビヒクルの選択及び使用は、当業者が随意に実施できる範囲のものである。発現ベクターには、調節配列と作用的に結合するＤＮＡを発現することができるベクター、例えば前記のようなＤＮＡフラグメントの発現を生起させることができるプローモー領域が含まれる。従って、発現ベクターとは、組換えＤＮＡもしくはＲＮＡ構築物、例えばプラスミド、ファージ、組換えウイルス、又は、宿主細胞内に導入されるとベクター上の適当な部位内にクローニングされたＤＮＡを発現させる他のベクターを意味する。適当な発現ベクターは当業者に良く知られており、真核細胞及び／又は原核細胞内で複製できるもの、並びにエピソーム状態を維持するもの、又は宿主細胞ゲノム内に組込まれるものがある。真核宿主細胞、特に哺乳動物細胞内でｎＡＣｈＲサブニットを発現させるための、現時点で好ましいプラスミドの非限定的具体例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）及びマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター含有ベクター、例えば、ｐＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１，ｐｃＤＮＡ３、ｐＺｅｏＳＶ、ｐＣＥＰ４、ｐＭＡＭｎｅｏ及びｐＭＡＭｈｙｇが挙げられる。
【００２８】
本明細書で使用するプロモーター領域という用語は、ＤＮＡに作用的に結合してその転写を制御するＤＮＡセグメントを意味する。プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼの認識、結合及び転写開始に十分な特異的配列を含む。プロモーター領域のこの部分をプロモーターと称する。プロモーター領域は更に、ＲＮＡポリメラーゼの認識、結合及び転写開始活性を調節する配列も含む。これらの配列はシス作用性であり得、又はトランス作用因子に応答し得る。プロモーターは、調節の種類に応じて構成性であり得、又は調節される。本発明で使用し得るプロモーターの具体例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）ステロイド誘導プロモーター及びモロネーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモーター、並びに他の適当なプロモーターが挙げられる。
【００２９】
本明細書で使用する「作用的に結合」という用語は、ＤＮＡと調節及びエフェクターヌクレオチド配列、例えばプロモーター、エンハンサー、転写及び翻訳開始及び終結部位、並びに他のシグナル配列との機能的関係を指す。例えば、ＤＮＡとプロモーターとの作用的結合は、ＤＮＡとプロモーターとの物理的及び機能的関係であって、ＤＮＡの転写が、該ＤＮＡを特異的に認識し、これに結合し且つこれを転写するＲＮＡポリメラーゼによりプロモーターから開始されるような関係を意味する。発現及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を最適化するためには、クローンの５’非翻訳部分を除去又は変化させて、余計な潜在的な別の翻訳開始コドン、又は転写もしくは翻訳のレベルで発現を妨害もしくは低下させる別の配列を除去する必要があり得る。あるいは、コンセンサスリボソーム結合部位（例えばＫｏｚａｋ（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７−１９８７０参照）を開始コドンの５’に隣接させて挿入して、発現を促進することもできる。このような修飾が望ましい（又は必要である）かどうかは、経験的に決定し得る。
【００３０】
本明細書で使用する発現という用語は、ポリ核酸がｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に翻訳されるプロセスを意味する。ポリ核酸がゲノムＤＮＡに由来する場合には、適当な真核宿主細胞又は生物を選択すれば、発現はｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【００３１】
哺乳動物細胞のトランスフェクションに特に好ましいベクターはＳＶ４０プロモーターをベースとする発現ベクター、例えばｐＺｅｏＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＣＭＶプロモーターをベースとするベクター、例えばｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）及びＭＭＴＶプロモーターをベースとするベクター、例えばｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。
【００３２】
本明細書中のヒトαサブユニット遺伝子とは、ヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のαサブユニットをコードする遺伝子である。ヒトｎＡＣｈＲのαサブユニットは典型的には、デンキナマズ（Ｔｏｒｐｅｄｏ）αサブユニット（Ｎｏｄａら（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ２９９：７９３−７９７参照）のシステイン１９２及び１９３と相同である、サブユニットの推定細胞外ドメイン内の隣接システイン残基の保存を示す。
【００３３】
本明細書で使用するαサブユニットサブタイプという用語は、ここに開示するニューロンｎＡＣｈＲαサブユニットコーディングＤＮＡクローンのうちの少なくとも一つに高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするＤＮＡでコードされるヒトニューロンｎＡＣｈＲサブユニットを意味する。αサブユニットは通常、生理学的条件下で、生理学的濃度で、任意的なβサブユニットの存在下で（即ち、あるαサブユニットは単独で機能するが、別のαサブユニットはβサブユニットの存在を必要とする）ＡＣｈに結合し、通常は、本明細書に記載の方法又は当業者に公知の方法で評価して、機能性のｎＡＣｈＲを形成する。
【００３４】
前述のようなαサブユニットをコードするが、遺伝暗号の縮重に起因して、指定のハイブリダイゼーション条件下で開示のＤＮＡに必ずしもハイブリダイズしないＤＮＡ分子でコードされるαサブユニットも考えられる。このようなサブユニットも、通常は一つ以上のβサブユニットサブタイプと一緒に、本明細書に記載の方法又は当業者に公知の方法で評価して機能性の受容体を形成する。典型的には、αサブユニットが別のスプライシングから生じるＲＮＡ（即ちスプライス変種（ｓｐｌｉｃｅ  ｖａｒｉａｎｔ））でコードされる場合を除いて、αをコードするＤＮＡ及び該ＤＮＡでコードされたαサブユニットは、本明細書に記載のαサブユニットＤＮＡ（及び該ＤＮＡでコードされたタンパク質）の少なくとも一つに対して実質的な配列相同を有する。ここで理解されることとして、スプライス変種をコードするＤＮＡ又はＲＮＡは全体で本発明が提供するＤＮＡ又はＲＮＡに対して９０％以下の相同を有し得るが、本明細書に開示のＤＮＡフラグメントに対してほぼ１００％相同の領域を含んでおり、開始及び終止コドンを含み機能性αサブユニットをコードする読取り枠をコードする。
【００３５】
本明細書中のヒトβサブユニット遺伝子とは、ヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のβサブユニットをコードする遺伝子である。推定上のニューロンｎＡＣｈＲサブユニットに「β」という名称を付けた理由は、隣接システイン残基の欠失にある（これらの残基はαサブユニットに特徴的なものである）。βサブユニットはしばしば構成性ｎＡＣｈＲサブユニットと呼ばれる（但しβサブユニットがＡＣｈ結合特性を有する可能性もある）。適当なβサブユニットと適当なαサブユニットとを組合わせれば、機能性受容体が形成される。
【００３６】
本明細書中のβサブユニットサブタイプとは、本明細書に開示のニューロンｎＡＣｈＲコーディングＤＮＡの少なくとも一つに高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするＤＮＡでコードされるニューロンｎＡＣｈＲサブユニットを意味する。βサブユニットは適当なαサブユニットサブタイプと一緒に、本明細書に記載の方法又は当業者に公知の方法で評価して機能性のｎＡＣｈＲを形成し得る。
【００３７】
前述のようなβサブタイプをコードするが、遺伝暗号の縮重に起因して、指定のハイブリダイゼーション条件下で必ずしも開示のＤＮＡとハイブリダイズしないＤＮＡにコードされるβサブユニットも考えられる。この種のサブユニットも適当なαサブユニットサブタイプと一緒に、本明細書に記載の方法又は当業者に公知の方法で評価して機能性の受容体を形成し得る。典型的には、βサブユニットがスプライス変種として生じるＲＮＡでコードされる場合を除いて、βコーディングＤＮＡ及び該ＤＮＡにコードされたβサブユニットは、本明細書に記載のβコーディングＤＮＡ及びβサブユニットタンパク質に対して実質的な配列相同を共有する。ここで理解されることとして、スプライス変種をコードするＤＮＡ又はＲＮＡは全体で本発明が提供するＤＮＡ又はＲＮＡに対して９０％以下の相同を有し得るが、このようなＤＮＡは本明細書に開示のＤＮＡに対してほぼ１００％相同の領域を含む。
【００３８】
本明細書で使用するｎＡＣｈＲサブタイプという用語は、α及び／又はβサブユニットサブタイプの特定の組合わせを含むニコチン性アセチルコリン受容体、例えばヒトｎＡＣｈＲα６及びβ３サブユニットを含む受容体を意味する。
【００３９】
本明細書中のスプライス変異体とは、１種類以上のｍＲＮＡを形成させることになるゲノムＤＮＡの一次転写体の分別プロセシングによって生じる変異体ｎＡＣｈＲサブユニットコーディング核酸を意味する。分別的にプロセシングされたゲノムＤＮＡに由来するｃＤＮＡは、完全に同じアミノ酸を有する部分と、異なるアミノ酸配列を有する部分とを有するｎＡＣｈＲサブユニットをコードする。従って、同一のゲノム配列が多数の関連ｍＲＮＡ及びタンパク質の産生を生起し得る。その結果得られるｍＲＮＡ及びタンパク質を「スプライス変異体」と称する。
【００４０】
本明細書中の外来（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ又はｆｏｒｅｉｇｎ）ＤＮＡ及びＲＮＡとは、それを含んでいるゲノムの一部としては生来存在しない、又は生来の位置とは異なるゲノム内位置に存在するＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。典型的には、細胞に対して内生ではなく、人為的に細胞内に導入されたＤＮＡ又はＲＮＡである。外来ＤＮＡの非限定的具体例としては、ヒトｎＡＣｈＲサブユニットをコードするＤＮＡ、及び転写、翻訳又は他の調節可能な生化学的プロセスに作用することにより内生ＤＮＡの発現を仲介又は変化させるＲＮＡ又はタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。ヒトｎＡＣｈＲサブユニットをコードするＤＮＡのような外来ＤＮＡを発現する細胞は、同じ又は異なるニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットをコードするＤＮＡを含み得る。外来ＤＮＡは発現される必要はなく、宿主細胞ゲノム内に組込まれるように、又はエピソーム状に維持されるように導入し得る。
【００４１】
本明細書では、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーとは、ポリ核酸ハイブリッドを安定にしておく条件を意味する。当業者に公知のように、ハイブリッドの安定性はハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）に反映される。Ｔｍは下記の式：
【００４２】
【化１】
2009050270.tif 000002
によって概算できる。前記式中、ｌはヌクレオチドで表されるハイブリッドの長さである。Ｔｍは配列相同が１％減少する毎に約１〜１．５℃低下する。一般的には、ハイブリッドの安定性はナトリウムイオン濃度及び温度の関数である。典型的には、ハイブリダイゼーション反応を低ストリンジェンシー条件下で実施し、次いで異なる、但しより高いストリンジェンシーで洗浄を行う。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーという用語は、このような洗浄条件について使用される。
【００４３】
本明細書では、（１）高ストリンジェンシー条件とは、フラグメントのハイブリダイセーションに関しては、０．０１８Ｍ  ＮａＣｌ中６５℃で安定なハイブリッドを形成する核酸配列だけがハイブリダイズできる条件を意味する（即ち、あるハイブリッドが０．０１８Ｍ  ＮａＣｌ中６５℃で安定でなければ、そのハイブリッドは本明細書で考慮する高ストリンジェンシー条件下で安定ではない）。高ストリンジェンシー条件は例えば、５０％ホルムアミド、５×デンハーツ（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌ変性音波処理ニシン精子ＤＮＡ、４２℃でハイブリダイセーションを行い、次いで０．１×ＳＳＰＥ及び０．１％ＳＤＳ中６５℃で洗浄することにより与えることができる。（２）中間ストリンジェンシー条件とは、フラグメントのハイブリダイセーションに関して、５０％ホルムアミド、５×デンハーツ溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌ変性音波処理ニシン精子ＤＮＡ、４２℃でハイブリダイセーションを行い、次いで０．２×ＳＳＰＥ及び０．２％ＳＤＳ中６０℃で洗浄することに等しい条件を意味する。（３）低ストリンジェンシー条件とは、フラグメントのハイブリダイセーションに関して、１０％ホルムアミド、５×デンハーツ溶液、６×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌ変性音波処理ニシン精子ＤＮＡでハイブリダイセーションを行い、次いで１×ＳＳＰＥ及び０．２％ＳＤＳ中５０℃で洗浄することに等しい条件を意味する。（４）高ストリンジェンシー条件は、オリゴヌクレオチド（即ち長さ約３０ヌクレオチド以下の合成ＤＮＡ）に関しては、１０％ホルムアミド、５×デンハーツ溶液、６×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌ変性音波処理ニシン精子ＤＮＡ、４２℃でハイブリダイセーションを行い、次いで１×ＳＳＰＥ及び０．２％ＳＤＳ中５０℃で洗浄することに等しい条件を意味する。
【００４４】
尚、これらの条件は種々の緩衝液及び温度を使用して再現し得、必ずしも厳密ではない。
【００４５】
デンハーツ溶液及びＳＳＰＥは（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第二版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）、他の適当なハイブリダイセーション緩衝液と同様に当業者に良く知られている。例えば、ＳＳＰＥはｐＨ７．４のリン酸緩衝０．１８Ｍ  ＮａＣｌである。ＳＳＰＥは例えば、１７５．３ｇのＮａＣｌと２７．６ｇのＮａＨ２ＰＯ４と７．４ｇのＥＤＴＡとを８００ｍｌの水に溶解し、ｐＨを７．４に調整し、次いで水を１ｌになるまで加えることにより２０×原液として調製できる。デンハーツ溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ（１９６６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３：６４１）は例えば、５ｇのＦｉｃｏｌｌ（タイプ４００，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＩＮＣ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）と５ｇのポリビニルピロリドンと５ｇのウシ血清アルブミン（フラクションＶ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とを混合し、水を５００ｍｌになるまで加え、粒状物を除去すべく濾過することにより、５０×原液として調製できる。
【００４６】
本明細書で使用する「実質的な配列相同」という表現は、同一度が約９０％以上の二つのヌクレオチド配列、及び典型的には９５％以上のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列に関するものである。しかしながら、スプライス変異体として生じる前記レベルより低い相同を有する、又は保守的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）アミノ酸置換（もしくは縮重コドンの置換）によって修飾されたタンパク質（及びこのようなタンパク質をコードするＤＮＡもしくはｍＲＮＡ）も期待される。
【００４７】
「実質的に同じ」という表現は、本明細書では、ここに開示する実際の配列と比べて僅かな重要ではない配列変化を有するＤＮＡヌクレオチド配列、ＲＮＡリボヌクレオチド配列又はアミノ酸配列もしくはタンパク質について使用されている。実質的に同じ種は、開示の配列と機能的に同等であるとみなされる。従って、本明細書中の機能的に同等の核酸分子又はタンパク質とは、実質的に同じ結果を得るために実質的に同じ方法で機能するように十分に類似している核酸分子又はタンパク質である。
【００４８】
本明細書で使用する「僅かな重要ではない配列変化」とは、ここに開示するＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質と実質的に同じである配列が、ここに開示するヒト由来配列と機能的に同等であることを意味する。機能的に同等の配列は、実質的に同じ方法で機能して、ここに開示するヒト由来核酸及びアミノ酸組成物と実質的に同じ組成物を産生する。特に、機能的に同等のＤＮＡ分子は、ここに開示するものと同じ、又は保守的アミノ酸変化、例えばある非極性残基による別の非極性残基の置換、もしくはある帯電残基による類似の帯電残基の置換（例えば表１参照）を有するヒト由来タンパク質をコードする。これらの変化には、当業者によってタンパク質の三次構造を実質的に変化させないと認識されているものが含まれる。
【００４９】
適当なアミノ酸保存置換は当業者に公知であり、通常は結果として得られる分子の生物学的活性を変えずに実施し得る。当業者に認識されているように、一般的には、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸の置換は生物学的活性を実質的に変化させない（例えばＷａｔｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，第四版，１９８７，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２４４参照）。このような置換は、下記の表１に示すように実施するのが好ましい。
【００５０】
【表１】
2009050270.tif 000003
【００５１】
別の置換も許容し得、経験的に決定し得るか、又は既知の保存置換と一致し得る。ポリペプチドのこの種の修飾はいずれも当業者に公知の任意の方法で実施し得る。
【００５２】
本明細書中のヒトニューロンｎＡＣｈＲの活性とは、ｎＡＣｈＲに特有の任意の活性を意味する。このような活性は典型的には一つ以上のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法で測定することができ、しばしばヒトニューロンｎＡＣｈＲのｉｎ  ｖｉｖｏ活性に対応する。このような活性は当業者に公知の任意の方法、例えば刺激に応答して組換え体チャンネルに流れる電流の量を測定することにより測定し得る。
【００５３】
ヒトニューロンｎＡＣｈＲの存在及び／又は活性を決定する方法の非限定的具体例としては、ニコチン結合、８６Ｒｂイオン流、Ｃａ２＋流入、細胞の電気生理学的応答、ＲＮＡを導入した卵母細胞の電気生理学的応答を測定するアッセイが挙げられる。ここでは特に、ＤＮＡ又はｍＲＮＡを含む細胞を試験化合物と接触させた時のｎＡＣｈＲ仲介応答を測定又は検出する方法を提供する。
【００５４】
本明細書中の組換え又は外来ヒトニューロンｎＡＣｈＲとは、受容体タンパク質を発現することができる細胞内に導入され発現された外来ＤＮＡにコードされるサブユニットを一つ以上含む受容体を意味する。組換えヒトニューロンｎＡＣｈＲは、宿主細胞にとって内生のＤＮＡにより産生されるサブユニットも含み得る。ある実施態様では、組換え又は外来ヒトニューロンｎＡＣｈＲは、外来ＤＮＡにコードされるサブユニットのみを含み得る。
【００５５】
本明細書中の機能性ニューロンｎＡＣｈＲとは、ここに開示する、又は当業者に公知のｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏアッセイで評価して、ニューロンニコチン性ｎＡＣｈＲ活性を示す受容体を意味する。当業者に公知の、及び本発明で提供する任意の方法で評価し得る前述の活性を所有していれば、受容体は機能性とみなすことができる。ｎＡＣｈＲタンパク質及び／又は活性の検出方法の非限定的具体例としては、ニコチン結合、８６Ｒｂイオン流、Ｃａ２＋流入、及び一つ以上の受容体サブユニットサブタイプをコードする外来ＤＮＡ又はｍＲＮＡを含む細胞の電気生理学的応答を測定するアッセイが挙げられる。α及びβサブユニットの総ての組合わせが機能性受容体を形成し得るとは限らないため、このような受容体を産生する特定のサブユニット及び細胞の特徴を十分に解明するために、α及びβサブユニットの組合わせを多数試験し得る。従って、本明細書で組換え又は外来ヒトニューロンｎＡＣｈＲに関して使用する「機能性」という用語は、受容体チャンネルが刺激に応答して例えばＮａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋又はＢａ２＋のようなヒトニューロンｎＡＣｈＲ浸透性イオンを提供し且つその流入を調節することができ、及び／又は受容体に対する親和性を有するリガンドと結合できることを意味する。このようなヒトニューロンｎＡＣｈＲ活性は、電気生理学的方法、薬理的方法又は当業者の公知の別の方法により、宿主細胞によって生じ得る内因性ｎＡＣｈＲ活性から識別されることが好ましい。
【００５６】
本明細書中のある種類の「対照」細胞又は「対照」培養物は、対照培養物は試験化合物に暴露しないという点を除いて、試験化合物に暴露した細胞又は培養物と実質的に同様に処理した細胞又は培養物である。別の種類の「対照」細胞又は「対照」培養物は、対照培養に使用した細胞が機能性ニコチン性アセチルコリン受容体を発現しないという点を除いて、トランスフェクションした細胞と同一である細胞又は細胞培養物であり得る。この場合は、細胞又は各種類の細胞の培養物をアッセイすべき化合物の存在下で実質的に同じ反応条件に暴露した時の、試験化合物に対するニコチン性アセチルコリン受容体陰性細胞の応答（又は応答欠失）と、試験化合物に対する試験細胞の応答とを比較する。
【００５７】
本明細書中の「ニューロンｎＡＣｈＲの活性を調節する」化合物又はシグナルとは、前記化合物又はシグナルの存在下と不在下とではｎＡＣｈＲの活性が異なるようにｎＡＣｈＲの活性を変化させる化合物又はシグナルを意味する。このような化合物又はシグナルとしては、特にアゴニスト及びアンタゴニストが挙げられる。アゴニストという用語は、受容体の機能を活性化する物質又はシグナル、例えばＡＣｈを意味し、アンタゴニストという用語は、受容体の機能を妨害する物質を意味する。典型的には、アンタゴニストの作用は、アゴニストによる活性化の阻止として観察される。アンタゴニストには競合アンタゴニスト及び非競合アンタゴニストがある。競合アンタゴニスト（又は競合遮断剤）は、同じ又は近傍の部位に関してアゴニスト（例えばリガンド又は神経伝達物質）に特異的な部位又はその近傍と相互作用する。非競合アンタゴニスト又は遮断剤は、アゴニストと相互作用する部位以外の部位と相互作用することにより受容体の機能を不活化する。
【００５８】
Ａ．  分離ＤＮＡクローン
ヒトニューロンｎＡＣｈＲα及びβサブユニットをコードするＤＮＡ分子を提供する。特定的には、ヒトニューロンｎＡＣｈＲのα６及びβ３サブユニットをコードする分離ＤＮＡ分子を開示する。前述のＤＮＡでコードされる組換えメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）及び組換えポリペプチドも提供する。
【００５９】
本明細書で使用する「α６サブユニットをコードする（コーディング）核酸」という用語は、同じ名称のニューロンニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットをコードするＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。このような核酸分子は多くの方法で特徴を調べることができ、例えばＤＮＡのヌクレオチド（又はＲＮＡのリボヌクレオチド）は配列番号１０又は配列番号２０に示すアミノ酸配列をコードし得る。
【００６０】
現時点で好ましいα６コーディング核酸としては、高ストリンジェンシー条件下で、配列番号９に示すコーディング配列（好ましくは該コーディング配列の実質的に全部、即ちヌクレオチド１４３−１６２４）、又は配列番号１９に示すコーディング配列（好ましくは該コーディング配列の実質的に全部、即ちヌクレオチド１４３−１５７９）にハイブリダイズするＤＮＡ又はＲＮＡが挙げられる。
【００６１】
特に好ましいα６コーディング核酸分子は、配列番号１０又は配列番号２０に示すものと実質的に同じアミノ酸配列を有する（即ち保守的アミノ酸置換のみを有する）タンパク質をコードする分子である。最も好ましい分子は、配列番号９に示すものと実質的に同じヌクレオチド配列（即ち、特に該配列のヌクレオチド１４３−１６２４）又は配列番号１９に示すものと実質的に同じヌクレオチド配列（即ち、特に該配列のヌクレオチド１４３−１５７９）を有するヌクレオチド（又はＴがＵで置換されたリボヌクレオチド）配列である。
【００６２】
典型的には、α６サブユニットがスプライス変異体として生じる場合を除いて、α６コーディングＤＮＡはここに開示するα６コーディング核酸分子に対して実質的な配列相同（即ち約９０％以上）を有する。スプライス変異体をコードするＤＮＡ又はＲＮＡはここに開示するＤＮＡ又はＲＮＡに対して９０％以下の総合的配列相同を有し得るが、このようなスプライス変異体は、ここに開示する核酸分子の一つ以上に対してほぼ１００％相同の領域を含む。
【００６３】
本発明は、「β３サブユニットコーディング核酸」も提供する。これには、同じ名称のニューロンニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットをコードするＤＮＡ又はＲＮＡ分子が含まれる。このような核酸分子は多くの方法で特徴を調べることができ、例えばＤＮＡのヌクレオチド（又はＲＮＡのリボヌクレオチド）は配列番号１６に示すアミノ酸配列をコードし得る。
【００６４】
現時点で好ましいβ３コーディング核酸としては、高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１５に示すコーディング配列（好ましくは該コーディング配列の実質的に全部、即ちヌクレオチド９８−１４７１）にハイブリダイズするＤＮＡ又はＲＮＡが挙げられる。より好ましいのは、配列番号１６に示すアミノ酸配列（又は実質的に保守的アミノ酸置換のみを有する前記アミノ酸配列）を含むタンパク質をコードする核酸である。本発明が提供する特に好ましいβ３コーディング核酸分子は、配列番号１５に示すものと実質的に同じヌクレオチド配列（即ち、特に該配列のヌクレオチド９８−１４７１）を有する。
【００６５】
典型的には、β３サブユニットがスプライス変異体として生じる場合以外は、β３コーディング核酸は開示のβ３コーディング核酸分子に対して実質的な配列相同（約９０％以上）を有する。スプライス変異体をコードするＤＮＡ又はＲＮＡは開示のＤＮＡ又はＲＮＡに対して９０％以下の総合的配列相同を有し得るが、このような核酸は、前述の核酸分子の一つ以上に対してほぼ１００相同の領域を含む。
【００６６】
Ｂ．  プローブ
ヒトニューロンニコチン性ｎＡＣｈＲα及びβサブユニットをコードするＤＮＡは、ここに開示するＤＮＡ（配列番号９又は１５に由来するヌクレオチドを含む）を用いて、適当なハイブリダイゼーション条件下で適当なヒトｃＤＮＡ又はヒトゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより分離し得る。適当なライブラリーは、ニューロン組織試料、脳底神経節、視床及び視床下部組織から製造し得る。ライブラリーは、ＤＮＡのサブユニットコーディング配列全体を含むＤＮＡ部分を用いてスクリーニングするのが好ましく、又はライブラリーは適当なプローブを用いてスクリーニングし得る。典型的には、プローブを、同定可能なタグ、例えば放射性標識、酵素又は他の当業者に公知のタグで標識する。
【００６７】
α６及びβ３コーディング核酸を分離する方法で使用するためのプローブも提供する。例えばヒトα６サブユニットに関しては、プローブは、配列番号９又は配列番号１９に示す任意の２７個の塩基と同じ（又はその相補体）である少なくとも２７個の連続塩基を含むヌクレオチド配列を有する一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。
【００６８】
ヒトβ３サブユニットに関しては、プローブは、配列番号１５に示すシグナル配列／コーディング配列の最初の１０５個のヌクレオチドに由来する任意の２８個の塩基と同じ（又はその相補体）である少なくとも２８個の連続塩基を含むヌクレオチド配列を有する一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡである。
【００６９】
プローブを構築するための好ましい領域の非限定的具体例としては、５’及び／又は３’コーディング配列、トランスメンブランドメインをコードすると予測される配列を含む領域、細胞質ループをコードすると予測される配列を含む領域、シグナル配列、並びにアセチルコリン（ＡＣｈ）及びα−ブンガロトキシン（α−ｂｇｔｘ）結合部位が挙げられる。ＡＣｈ及びα−ｂｇｔｘ結合には、典型的には、デンキナマズｎＡＣｈＲαサブユニットの残基１９０−１９８に対応するアミノ酸（例えばＫａｒｌｉｎ（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．３：２９９−３０９参照）が関与する。別のプローブに関して、前述のような領域を含む大凡のアミノ酸残基を下記の表２に示す。
【００７０】
【表２】
2009050270.tif 000004
【００７１】
あるいは、ＤＮＡの一部分を、特定ライブラリー内の選択したフラグメントを増幅するためのプライマーとして使用することもできる。
【００７２】
Ｃ．  ヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のα６及びβ３サブユニットをコードするクローンの分離
前述のプローブを使用して適当なライブラリーをスクリーニングする。各サブユニットをコードするＤＮＡを得るのに適したライブラリーの非限定的具体例としては、ヒトα６コーディングＤＮＡを分離する場合の黒質、視床又は視床下部、並びにヒトβ３コーディングＤＮＡを分離する場合の黒質又は視床が挙げられる。
【００７３】
ライブラリーのスクリーニング後、ハイブリダイゼーションシグナルの検出によって陽性クローンを同定する。同定されたクローンは、制限酵素地図及び／又はＤＮＡ配列分析よって特徴を調べ、次いで開示の配列と比較して、完全なα又はβサブユニットをコードするＤＮＡを含んでいるかどうかを確認する。選択したクローンが不完全であれば、これらのクローンを使用して、重複クローンを得るために同じ又は異なるライブラリーを再スクリーニングし得る。所望であれば、ライブラリーは、完全なα又はβサブユニットをコードする重複クローンが得られるまで陽性クローンを用いて繰り返しスクリーニングし得る。ライブラリーがｃＤＮＡライブラリーの場合には、重複クローンは読取り枠を含む。ライブラリーがゲノムライブラリーの場合には、重複クローンはエキソン及びイントロンを含み得る。完全クローンは、本発明が提供するＤＮＡ及びコードされたタンパク質との比較によって同定し得る。
【００７４】
ヒトニューロンｎＡＣｈＲα及びβサブユニットの種々のサブタイプをコードする相補的ＤＮＡクローンが分離された。サブユニットの各サブタイプは、異なる遺伝子でコードされると思われる。ここに開示するＤＮＡクローンは、各サブタイプをコードするゲノムクローンの分離、並びに種々の神経組織から製造したライブラリーのスクリーニングによる任意のスプライス変異体の分離に使用し得る。ヒトニューロンｎＡＣｈＲサブユニットのスプライス変異体は、当業者に良く知られている核酸増幅方法を使用して検出することができる。この操作は、分岐（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ）配列を包囲するＤＮＡ配列をベースとするオリゴヌクレオチドをヒトＲＮＡ又はゲノムＤＮＡ増幅用プライマーとして使用して行う。増幅産物の大きさ及び配列決定により、スプライス変異体の存在を明らかにすることができる。また、ハイブリダイゼーションによってヒトゲノムＤＮＡ配列を分離すると、ヒトニューロンｎＡＣｈＲサブユニットをコードする転写体の種々のスプライス変異体に対応する、イントロンで分離された複数のエキソンを含むＤＮＡが得られる。
【００７５】
総てのサブユニットサブタイプが総ての神経組織又は総ての脳部分で発現されるとは限らないことが判明した。従って、特定のサブユニットサブタイプ又はこのようなサブタイプのスプライス変異体をコードするｃＤＮＡを分離するためには、種々のニューロン又は神経組織から製造したライブラリーをスクリーニングすることが好ましい。
【００７６】
Ｄ．  α６及びβ３コーディング核酸を含む細胞及びベクター
ヒトｎＡＣｈＲサブユニットをコードする前述の核酸分子は、更に操作を行うためにベクター内に導入できる。適当な発現ベクター内へのクローン化ＤＮＡの導入、一つ以上の別個の遺伝子をコードする単一の発現構築物もしくは複数の発現構築物の組合わせ又は直鎖状ＤＮＡの真核細胞内へのトランスフェクション、並びにトランスフェクションした細胞の選択は当業者に良く知られている（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第二版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ参照）。外来ＤＮＡは、当業者に公知の任意の方法、例えばＣａＰＯ４沈降により外来ＤＮＡをコードする発現構築物をトランスフェクションする方法で宿主細胞内に導入し得る（例えば、Ｗｉｇｌｅｒら（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７６：１３７３−１３７６参照）。次いで組換え細胞を、ＤＮＡでコードされたサブユニットを発現させる条件下で培養し得る。好ましい細胞の非限定的具体例としては、哺乳動物細胞（例えばＨＥＫ２９３、ＣＨＯ及びＬｔｋ細胞）、酵母細胞（例えばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのようなメチロトロフィック（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ）酵母細胞）及び細菌細胞（例えば大腸菌）が挙げられる。
【００７７】
α６及びβ３サブユニットをコードする核酸は、更に操作を行うために、個々に、又は別のニコチン性アセチルコリン受容体をコードする核酸と組合わせてベクター内に導入できる。ヒトニューロンｎＡＣｈＲサブユニットをコードする完全長ＤＮＡクローンが、ベクターｐｃＤＮＡ３に、即ちＣＭＶプロモーター／エンハンサーと、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーの下流のポリリンカーと、これに次ぐウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルとを含むｐＵＣ１９ベースの哺乳動物細胞発現ベクター内に、挿入された。ｎＡＣｈＲサブユニットをコードするＤＮＡをＣＭＶプロモーターとＢＧＨポリアデニル化シグナルとの間に配置すると、構築物をトランスフェクションした哺乳動物細胞内でＤＮＡの構成的発現が得られる。哺乳動物細胞内でのヒトｎＡＣｈＲサブユニットコーディングＤＮＡの誘導発現のためには、ＤＮＡをｐＭＡＭｎｅｏのようなプラスミド内に挿入し得る。このプラスミドは、作用的に結合した外来ＤＮＡのステロイド誘導発現のためのマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターを含む。宿主細胞が、細胞内へのグルココルチコイド（即ちＭＭＴＶプロモーターの誘発物質）の取込みに必要な内生グルココルチコイド受容体を発現しない場合には、更にグルココルチコイド受容体をコードするＤＮＡ（ＡＴＣＣ受託番号６７２００）を細胞にトランスフェクションする必要がある。
【００７８】
別の実施態様では、前述のポリ核酸（即ちＤＮＡ又はｍＲＮＡ）を含む細胞を提供する。ＤＮＡの複製及びｎＡＣｈＲサブユニットの製造には、細菌、酵母及び哺乳動物細胞のような宿主細胞を使用し得る。発現ベクターを構築し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写体を形成し、ＤＮＡを哺乳動物細胞内にトランスフェクションし、卵母細胞に注入し、ここに記載のような受容体発現及び機能を評価するための電気生理学的分析及び他の分析を実施する方法は、ＰＣＴ出願公開明細書ＰＣＴ／ＵＳ９１／０２３１１号、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０２４４７号、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０５６２５号及びＰＣＴ／ＵＳ９２／１１０９０号、米国特許明細書第５，３６９，０２８号並びに同時係属米国特許出願明細書第０７／５６３，７５１号及び第０７／８１２，２５４号にも記述されている。これらの出願明細書の論題はその全体が参考として本明細書に包含される。
【００７９】
本発明が提供するＤＮＡは、酵母細胞（例えばＰｉｃｈｉａ、特にＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（米国特許明細書第４，８８２，２７９号、第４，８３７，１４８号、第４，９２９，５５５号及び第４，８５５，２３１号参照）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ及び他の酵母細胞）を含む任意の真核細胞内で発現し得、現時点で好ましいのは、本発明が提供するヒトニューロンニコチン性ｎＡＣｈＲサブユニットをコードするＤＮＡを発現するための、市販の系及び他の当業者に公知の系を含む哺乳動物発現系である。ＤＮＡのＲＮＡ転写体の発現にはアフリカツメガエル卵母細胞が好ましい。
【００８０】
任意のヒトニューロンニコチン性ｎＡＣｈＲサブユニットをコードするクローン化完全長ＤＮＡは、真核細胞内での発現のためにプラスミドベクター内に導入し得る。このようなＤＮＡはゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡであってよい。各々が少なくとも一つのヒトニューロンｎＡＣｈＲサブユニットをコードする単一のプラスミド又は複数のプラスミドの組合わせを宿主細胞にトランスフェクションし得る。外来ＤＮＡは細胞内でエピソームエレメントとして維持され得、又は細胞の染色体ＤＮＡ中に組込まれ得る。
【００８１】
ＤＮＡ又はＲＮＡを導入し得る真核細胞としては、このようなＤＮＡもしくはＲＮＡをトランスフェクション又は注入し得る任意の細胞が挙げられる。好ましい細胞は、一時的又は安定的にトランスフェクションすることができ、ＤＮＡ及びＲＮＡを発現することもできる細胞である。現時点で最も好ましい細胞は、外来ＤＮＡでコードされたサブユニットを一つ以上含む組換え又は外来ヒトニューロンニコチン性ｎＡＣｈＲを形成することができる細胞である。このような細胞は経験的に同定し得、又はトランスフェクションもしくは注入が容易なことが知られているものの中から選択し得る。
【００８２】
ＤＮＡを導入するための細胞の非限定的具体例としては、哺乳動物由来の細胞（例えばＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、ＧＨ３細胞及び他の当業者に公知の細胞）、両生動物細胞（例えばＸｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ卵母細胞）及び酵母細胞（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が挙げられる。注入ＲＮＡ転写体を発現するための代表的な細胞はＸｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ卵母細胞である。ＤＮＡのトランスフェクションに好ましい細胞は当業者の公知であり、又は経験的に同定し得、具体例としてはＨＥＫ２９３（受託番号＃ＣＲＬ  １５７３でＡＴＣＣから入手可能）、Ｌｔｋ−細胞（受託番号＃ＣＣＬ１．３でＡＴＣＣから入手可能）、ＣＯＳ−７細胞（受託番号＃ＣＲＬ  １６５１でＡＴＣＣから入手可能）及びＧＨ３細胞（受託番号＃ＣＣＬ８２．１でＡＴＣＣから入手可能）が挙げられる。現時点で好ましい細胞としては、ＧＨ３細胞及びＨＥＫ２９３細胞、特に懸濁液増殖用に調整され、液体窒素中で冷凍し、その後解凍して再増殖することができるＨＥＫ２９３細胞が挙げられる。ＨＥＫ２９３細胞は、例えばＧｏｒｍａｎの米国特許明細書第５，０２４，９３９号に記載されている（Ｓｔｉｌｌｍａｎら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：２０５１−２０６０も参照）。
【００８３】
ＤＮＡは当業者に公知の方法で細胞内に安定に導入することができ、又は一時的に導入し得る。安定にトランスフェクションした哺乳動物細胞は、ｎＡＣｈＲサブユニットをコードするＤＮＡを含む一つ以上の発現構築物及び選択可能マーカー遺伝子（非限定的具体例としてネオマイシン耐性、ゼオシン耐性もしくはハイグロマイシン耐性用の遺伝子）を有する別個の発現ベクターを細胞にトランスフェクションするか、又はｎＡＣｈＲサブユニットをコードするＤＮＡと選択可能マーカーとを含む一つ以上の発現構築物を細胞にトランスフェクションし、トランスフェクションした細胞を、マーカー遺伝子発現細胞に関して選択的な条件下で増殖させることにより製造し得る。このような細胞を製造するためには、外来ＤＮＡでコードされたヒトサブユニットを含むヒトニューロンｎＡＣｈＲを形成するのに十分な濃度のサブユニットコーディング核酸を細胞にトランスフェクションしなければならない。サブユニットをコードするＤＮＡの正確な量及び比率は経験的に決定し得、サブユニット、細胞及びアッセイ条件の特定の組合わせに関して最適化し得る。特に好ましいのは、外来ＤＮＡ又はＲＮＡのみによってコードされたサブユニットを含むニューロンｎＡＣｈＲを発現する組換え細胞である。
【００８４】
Ｅ．  組換えｎＡＣｈＲ及びｎＡＣｈＲサブユニットタンパク質
本発明は、実質的に純粋なヒトｎＡＣｈＲサブユニットタンパク質、特にヒトα６及びβ３サブユニットタンパク質を提供する。前記ヒトｎＡＣｈＲサブユニットタンパク質の少なくとも一つを含む組換えｎＡＣｈＲも提供する。従って、本発明の別の実施態様は、組換えヒトｎＡＣｈＲサブユニット及び該サブユニットを含む受容体の製造方法を含む。
【００８５】
好ましい実施態様では、ヒトｎＡＣｈＲサブユニット、特にヒトｎＡＣｈＲα６及びβ３サブユニットをコードするＤＮＡをベクター内に連結し、得られた構築物を適当な宿主細胞内に導入して、特定のヒトニューロンｎＡＣｈＲ受容体サブタイプ又はサブタイプの特定の組合わせを発現する形質転換細胞系を形成する。得られた細胞系は次いで、受容体機能に対する薬剤の作用の再現可能な定量分析を行うために量的に製造し得る。別の実施態様では、各サブユニットをコードするＤＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によりｍＲＮＡを製造し得る。単一サブユニットクローン又は複数のクローンの組合わせに由来する前記ｍＲＮＡは、次いでアフリカツメガエル卵母細胞内に注入し得、そこでｍＲＮＡがヒト受容体サブユニットの合成を指示し、これらのサブユニットが機能性受容体を形成する。あるいは、機能性受容体を発現させるために、サブユニットをコードするＤＮＡを卵母細胞に直接注入することもできる。トランスフェクションを行った哺乳動物細胞、又は注入を行った卵母細胞は、次いで本明細書に記載の薬剤スクリーニング方法で使用し得る。
【００８６】
得られた組換え細胞は培養し得、又はこのような培養物又はその継代培養物から継代培養（ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ、又は哺乳動物の場合はｐａｓｓａｇｅ）し得る。トランスフェクション、注入及び組換え細胞培養方法は当業者に公知である。また、ヒトニューロンニコチン性ｎＡＣｈＲサブユニットは、当業者に公知のタンパク質精製方法を用いて精製し得る。例えば、サブユニットの一つ以上に特異的に結合する抗体又は他のリガンドを、サブユニット又はサブユニット含有ヒトニューロンｎＡＣｈＲのアフィニティ精製に使用し得る。
【００８７】
ある実施態様では、ヒトニューロンｎＡＣｈＲサブユニット及び機能性受容体を発現する細胞の製造方法も提供する。これらの方法の一つでは、ニューロンｎＡＣｈＲの少なくとも一つのαサブユニット及び少なくとも一つのβサブユニットをコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクションする。α及び／又はβサブユニットをコードするＤＮＡ又はＲＮＡを含むトランスフェクション細胞は、ノーザンブロット又はスロットブロット分析のような方法を用いて選択できる。トランスフェクション細胞は、ｎＡＣｈＲタンパク質を発現する細胞を同定するための分析にもかける。分析は例えば、細胞がアセチルコリン、ニコチン又はｎＡＣｈＲアゴニストに結合する能力を測定し、非トランスフェクション宿主細胞又は他の適当な対照細胞のニコチン結合能力と比較するか、又はｎＡＣｈＲアゴニストに応答して細胞膜に流れる電流を電気生理学的に観察することにより実施できる。
【００８８】
特に好ましいこととして、外来ＤＮＡを含み、このＤＮＡを発現し、組換え機能性ニューロンｎＡＣｈＲを形成する真核細胞が得られる。より好ましいこととして、組換えニューロンｎＡＣｈＲ活性を容易に検出することができる。なぜなら、これは非トランスフェクション宿主細胞に存在しないか、又は非トランスフェクション細胞内で示されない量を有する種類のものだからである。組換え受容体を含むような細胞は例えば、ヒトニューロンニコチン性ｎＡＣｈＲα６及びβ３をサブユニットをコードするＤＮＡで形質転換した細胞に、一つ以上のα及び／又はβｎＡＣｈＲサブユニットの存在下又は不在下で、対応するタンパク質を発現させることにより製造し得る。得られる合成又は組換え受容体はα６及びβ３ｎＡＣｈＲサブユニットを含む。このような受容体は、種々の用途、例えば非ヒト受容体又はヒト組織調製物を使用する先行技術のアッセイシステムでしばしば見られる妨害がないアッセイシステムの一部として有用である。また、単一受容体サブユニットを種々の潜在的アゴニスト又はアンタゴニストを用いて試験すれば、個々のサブユニットの機能及び活性に関して更に情報が得られる。このような情報は、受容体サブユニットの一つ以上と極めて特異的に相互作用することができる化合物の同定につながり得る。このような特異性は、医療用途で極めて有用であり得る。
【００８９】
一つ以上のヒトニューロンｎＡＣｈＲサブユニットをコードするＤＮＡは、個々のサブユニット及び機能性ｎＡＣｈＲを発現するために、適当な宿主細胞（例えば真核又は原核細胞）内に導入し得る。好ましくは、αサブユニット及びβサブユニットの組合わせを細胞内に導入し得る。このような組合わせは、α２、α３、α４、α５、α６及びα７とβ２、β３及び／又はβ４との任意の一つ以上の組合わせを含む。これらのサブユニットの各々に関する配列情報は添付の配列表に示す。α５の配列情報はＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１５７２−１５７６にも記載されており、α２、α３、α４、α７、β２及びβ４の配列情報は、本明細書に参考として包含されるＰＣＴ出願公開明細書第９４／２０６１７号にも記載されている。現時点で好ましいサブユニットの組合わせとしては、α６及び／又はβ３とα２、α３、α４、α５、β２又はβ４のうちのいずれか一つ以上との組合わせが挙げられる。一部のサブユニットは別のサブユニットの不在下でイオン輸送機能を有し得、他のサブユニットはイオン輸送機能を示すために二つ以上のサブユニットの組合わせを必要とすることが認識されている。例えば、α７サブユニットは任意のβサブユニットを付加しない状態で機能する。また、一部のサブユニットは単独又は組合わせ状態で機能性ｎＡＣｈＲを形成し得ないが、他のｎＡＣｈＲサブユニットの組合わせの特性を調節し得る。
【００９０】
ある実施態様では、細胞内で翻訳される少なくとも一つのＲＮＡ転写体を含む第一の組成物をヒトニューロンｎＡＣｈＲのサブユニット内に導入することによって、外来ヒトニューロンｎＡＣｈＲを含む真核細胞を製造する。好ましい実施態様では、翻訳されるサブユニットがヒトニューロンｎＡＣｈＲのαサブユニットを含む。より好ましくは、導入する組成物は、αサブユニットをコードするＲＮＡ転写体を含み、ヒトニューロンｎＡＣｈＲのβサブユニットをコードするＲＮＡ転写体も含む。ＲＮＡ転写体は、ヒトニューロンｎＡＣｈＲをコードするＤＮＡをトランスフェクションした細胞から得ることができ、又はサブユニットをコードするＤＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって得ることができる。クローン化ＤＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写させ、得られたｍＲＮＡを真核細胞内に注入する方法は当業者に良く知られている。ヒトニューロンｎＡＣｈＲＤＮＡクローンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写体の発現には両生動物卵母細胞が特に好ましい。イオンチャンネルを研究するためのアフリカツメガエル卵母細胞の使用については、例えばＤａｓｃａｌ（１９８９）ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：３１７−３８７を参照し得る。
【００９１】
一つ以上のαサブタイプ及び一つ以上のβサブタイプをコードするＤＮＡ又はＲＮＡを段階的に細胞内に導入することが可能である。得られた細胞は、機能性ｎＡＣｈＲ活性を検出するために、本明細書に記載の方法又は当業者に公知の方法で試験し得る。このような試験は、機能性ｎＡＣｈＲを形成するα及びβサブユニットサブタイプの組合わせ、並びに機能性ｎＡＣｈＲを形成する個々のサブユニットの同定を可能にする。
【００９２】
組換え真核細胞の表面に存在する組換え受容体は、ヒトニューロンｎＡＣｈＲサブユニットをコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡでコードされた一つ以上のサブユニットを含み得、又は宿主細胞にコードされたサブユニットと外来ＤＮＡもしくはｍＲＮＡにコードされたサブユニットとの混合物を含み得る。組換え受容体は均質であり得、又はサブタイプ混合物であり得る。種々の由来源、例えばマウス及びヒトに由来する受容体をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡの混合物も細胞内に導入し得る。このようにして、α６及びβ３サブユニットのみを含む、又はここに開示する任意の別のα及びβサブユニットとの組合わせを含む組換え受容体を発現する細胞を製造し得る。例えば、ここに記載のα６及びβ３サブユニットのいずれか又は両方を、α２、α３、α４、α５、α７、β２及び／又はβ４受容体サブユニットと一緒に発現できる。前述のように、一部のニューロンｎＡＣｈＲサブユニットは、別のサブユニットの不在下で機能性受容体を形成する能力を有し得、従って機能性受容体を形成するために同時発現が必ず必要であるとは限らない。また、一部のｎＡＣｈＲサブユニットは、機能性受容体の形成に参加するために、二つ以上のｎＡＣｈＲサブユニットとの同時発現を必要とし得る。
【００９３】
Ｆ．  アッセイ
本発明の実施態様の一つでは、組換えヒトニューロンｎＡＣｈＲ発現哺乳動物細胞又は卵母細胞を試験化合物と接触させ、次いで試験化合物の存在下及び不在下でのｎＡＣｈＲ仲介応答を比較するか、又は試験化合物の存在に対する試験細胞もしくは対照細胞のｎＡＣｈＲ仲介応答を比較することにより、試験化合物の調節作用を評価することができる。
【００９４】
当業者に理解されているように、ヒトニューロンｎＡＣｈＲ活性を調節する化合物（例えばアゴニスト及びアンタゴニスト）を同定するためのアッセイ方法は通常、対照との比較を必要とする。前述のように、ある種類の「対照」細胞又は「対照」培養物は、対照培養物は試験化合物に暴露しないという点を除いて、試験化合物に暴露した細胞又は培養物と実質的に同じ方法で処理した細胞又は培養物である。例えば、電圧固定電気生理学的操作を使用する方法では、細胞を浸漬する外部溶液を変えるだけで、同じ細胞を試験化合物の存在下及び不在下で試験することができる。別の種類の「対照」細胞又は「対照」培養物は、対照培養物に使用した細胞が機能性ヒトニューロンｎＡＣｈＲを発現しないという点を除いて、トランスフェクション細胞と同じである細胞又は細胞培養物であり得る。この場合は、細胞又は各種類の細胞の培養物を、アッセイすべき化合物の存在下で実質的に同じ反応条件に暴露した時の、試験化合物に対する受容体陰性（対照）細胞の応答（又は応答欠如）と、試験化合物に対する試験細胞の応答とを比較する。
【００９５】
機能性組換えヒトニューロンｎＡＣｈＲはヒトニューロンｎＡＣｈＲの少なくとも一つのαサブユニット、又は少なくとも一つのαサブユニット及びβサブユニットを含む。これらのサブユニットを発現する真核細胞は、ＲＮＡ転写体の注入及びＤＮＡのトランスフェクションによって製造された。これらの細胞は、外来ヒトニューロンｎＡＣｈＲサブユニットの一つ以上を含むヒトニューロンｎＡＣｈＲに起因し得るｎＡＣｈＲ活性を示した。
【００９６】
機能性外来ヒトニューロンｎＡＣｈＲの活性の測定については、内生ｎＡＣｈＲ活性、そして所望であれば、内生宿主細胞サブユニットと外来サブユニットとの混合物を含むｎＡＣｈＲの活性を、可能であれば、化学的、薬理学的及び電気生理学的方法で大幅に阻害すべきである。
【００９７】
Ｇ．  抗体
本発明は、前述のｎＡＣｈＲサブユニット又はその一部分に対して産生される抗体も提供する。この種の抗体は、受容体組織の検出、サブタイプ組成、機能ドメインの構造、受容体の精製の評価、並びに診断及び治療用途で使用し得る。好ましくは治療用途では、使用する抗体はモノクローナル抗体である。
【００９８】
前述の抗体は、本明細書に記載のｎＡＣｈＲサブユニットタンパク質又はその一部分を抗体産生用の抗原として使用して、当業者に良く知られている標準的方法で製造できる。抗ペプチド抗体及び抗融合タンパク質抗体の両方を使用し得る［例えば、Ｂａｈｏｕｔｈら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１２：３３８−３４３；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）参照］。免疫原として（合成ペプチド又は組換えにより産生した細菌融合タンパク質として）使用するためのｎＡＣｈＲサブユニットの部分の選択で考慮すべき要素としては、抗原性、アクセスの容易さ（即ち細胞外及び細胞質ドメイン）、特定サブタイプに対する特有性、及び他の当業者に公知の要素が挙げられる。
【００９９】
サブタイプ特異的抗体を入手できれば、免疫化学の手法を種々のサブタイプの分布及び発現密度（例えば正常及び疾患脳組織内）の観察に適用することが可能になる。ヒトｎＡＣｈＲサブユニットを免疫原として製造した抗体は、種々の特性の中でも特に、生物学的試料又はこの種の試料に由来する溶液中に存在し得るヒトｎＡＣｈＲ又はそのサブユニットに特異的且つ優先的に結合する能力、及び／又は前記ヒトｎＡＣｈＲもしくはそのサブユニットを免疫沈降させる能力を有する。このような抗体は、これらの抗体が特異的に結合するサブユニットを含むヒトｎＡＣｈＲを発現する細胞を選択的に分離するためにも使用し得る。これらの抗体は診断及び治療用途でも使用し得る。更に別の実施態様では、受容体を有効量の前記抗体と接触させることにより、ｎＡＣｈＲのイオンチャンネル活性を調節する方法も提供する。
【０１００】
本明細書に記載の抗体は、標準的方法、例えば腹腔内、筋内、静脈内もしくは皮下注射、移植又は経皮による投与方法を用いて対象に投与し得る。当業者は、使用する投与方法に基づいて、投薬形態、治療計画等を容易に決定し得る。
【０１０１】
以下の実施例は本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０１０２】
ヒトｎＡＣｈＲα６サブユニットをコードするＤＮＡの分離
ヒト黒質ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を、マウスｎＡＣｈＲα６サブユニットｃＤＮＡのフラグメントへのハイブリダイゼーションについてスクリーニングした。分離したプラークをニトロセルロースフィルターに移し、ハイブリダイゼーションを５×デンハーツ、５×ＳＳＰＥ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ及び０．２％ＳＤＳ中で４２℃で実施した。洗浄を０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中６０℃で実施した。
【０１０３】
五つのハイブリッド形成クローンをプラーク精製し、制限エンドヌクレアーゼ地図及びＤＮＡ配列決定分析により特徴を調べた。市販のλｇｔ１０前進及びリバースオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ｃＤＮＡ挿入物の５’及び３’末端のＤＮＡ配列を決定した。五つのｃＤＮＡ挿入物のＤＮＡ配列の分析の結果、三つのクローンが、翻訳開始コドンと完全長α読取り枠（配列番号９のヌクレオチド１４３−１６２４）と翻訳終止コドンと５’−非翻訳配列の更に１４２個のヌクレオチドと３’−非翻訳配列の１１６個のヌクレオチドとを含んでいた。完全長クローンのヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列は、マウスｎＡＣｈＲα６サブユニットＤＮＡから推定されるアミノ酸配列に対して〜８２％の同一性を有する。推定マウス及びヒトα６アミノ酸配列の幾つかの領域は著しく相違している：アミノ酸１−３０（ヒトシグナル配列はマウス配列に対して〜５６％の同一性しか有していない）、アミノ酸３１−５０（ヒト配列はマウス配列に対して〜７０％の同一性しか有していない）、アミノ酸３４４−３９１（ヒト配列はマウス配列に対して〜４０％の同一性しか有していない）、アミノ酸４０１−４２８（ヒト配列はマウス配列に対して〜６４％の同一性しか有していない）。
【０１０４】
また、単一クローンＫＥα６．５の挿入ＤＮＡは、α６コーディング配列の４５個のヌクレオチドを欠失しており、その結果、推定アミノ酸配列の１５個のアミノ酸残基（配列番号１０の残基７４−８８）が枠内欠失（ｉｎ−ｆｒａｍｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ）していると決定された。この配列を欠失している
α６サブユニット変異体のヌクレオチド配列は配列番号１９に示し、該ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列は配列番号２０に示す。興味深いことに、欠失部位のすぐ下流の推定アミノ酸配列は、推定マウスα６アミノ酸配列に対して〜５８％のアミノ酸同一性しか有していない（配列番号１０のアミノ酸８９−１００）。
【実施例２】
【０１０５】
ヒトｎＡＣｈＲβ３サブユニットをコードするＤＮＡの分離
ヒト黒質ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を、ヒトニコチン性ｎＡＣｈＲβ３サブユニットｃＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションについてスクリーニングした。分離したプラークをニトロセルロースフィルターに移し、オリゴヌクレオチドに対して高ストリンジェンシーの条件下で（洗浄条件１×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、５０℃）、配列番号１５のヌクレオチド２１２−２３０及び１４４２−１４６９を含むヒトβ３ｎＡＣｈＲサブユニットｃＤＮＡの配列に対して相補的な合成オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた。
【０１０６】
二つのハイブリッド形成クローンをプラーク精製し、制限エンドヌクレアーゼ地図で特徴を調べた。市販のＴ７及びＳＰ６オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ｃＤＮＡ挿入物の５’及び３’末端のＤＮＡ配列を決定した。クローンＫＢβ３．２の完全配列が決定された。クローンＫＢβ３．２は、完全長β３ｎＡＣｈＲサブユニットをコードする１，３７７ヌクレオチド読取り枠（配列番号１５のヌクレオチド９８−１４７１）と、５’非翻訳配列の９７個のヌクレオチド及び３’非翻訳配列の４５４個のヌクレオチドとを含む１９２７ｂｐのｃＤＮＡ挿入物を含んでいる。完全長クローンのヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列は、マウスニコチン性ｎＡＣｈＲβ３サブユニットＤＮＡから推定されるアミノ酸配列に対して〜８１％の同一性を有する。推定マウス及びヒトβ３アミノ酸配列の幾つかの領域は著しく相違している：アミノ酸１−２８（ヒトシグナル配列はマウス配列に対して〜２５％の同一性しか有していない）、アミノ酸３４７−３９３（ヒト配列はマウス配列に対して〜５５％の同一性しか有していない）、アミノ酸４４０−４６４（ヒト配列はマウス配列に対して〜６８％の同一性しか有していない）。
【実施例３】
【０１０７】
組換えヒトニューロンｎＡＣｈＲサブユニットを発現するための構築物の製造
ヒトニューロンｎＡＣｈＲサブユニットをコードする分離ｃＤＮＡを、哺乳動物宿主細胞内でのサブユニットの発現に使用され、アフリカツメガエル卵母細胞内で発現すべきＤＮＡからのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写体の形成に使用されるベクターに導入した。構築物の製造には下記のベクターを使用した。
【０１０８】
Ａ．  ヒトｎＡＣｈＲα６サブユニットを発現するための構築物
完全長ｎＡＣｈＲα６サブユニットをコードする１，７４３ｂｐ  ＥｃｏＲＩフラグメントを標準的方法でＫＥα６．３から分離し、ベクターｐｃＤＮＡ３のＥｃｏＲＩポリリンカー部位に連結して、ｐｃＤＮＡ３−ＫＥα６．３を形成した（第１図参照）。プラスミドｐｃＤＮＡ３（第１図参照）は、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーと、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーの下流に位置するＴ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーターと、Ｔ７プロモーターの下流のウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルと、Ｔ７プロモーター及びＢＧＨポリアデニル化シグナル間のポリリンカーとを含むｐＵＣ１９ベースのベクターである。従ってこのベクターは、ポリリンカー位にベクター内に導入された外来ＤＮＡを哺乳動物細胞内で発現させるのに必要な調節エレメントを総て含む。更に、Ｔ７プロモーターがポリリンカーのすぐ上流に位置するため、このプラスミドはポリリンカーレベル位にベクター内にサブクローニングされた外来ＤＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写体の合成に使用できる。このプラスミドは更に、トランスフェクション時に選択可能マーカーとして使用されるネオマイシン耐性をコードする遺伝子を含む。
【０１０９】
第１図はｐｃＤＮＡ３−ＫＥα６．３の部分的制限地図も示している。
【０１１０】
完全長ヒトｎＡＣｈＲα６サブユニットの発現は、翻訳開始コドンの前にコンセンサスリボソーム結合部位［ＲＢＳ；例えばＫｏｚａｋ（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７−１９８７０参照］を導入することによって最適化した。既存の５’非翻訳領域を、ＤＮＡ鋳型としてプラスミドｐｃＤＮＡ３−ＫＥα６．３と、適当なヌクレオチドＲＢＳ置換体及び非翻訳５’ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ部位を含む相補上流オリゴヌクレオチドと、翻訳開始コドン下流のα６コーディング〜４５０ヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドとを使用して、ＰＣＲ突然変異誘発により修飾した。その結果得られた増幅産物は、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ部位と、これに続くコンセンサスＲＢＳ及びヒトｎＡＣｈＲα６コーディング配列ヌクレオチド１−４５９（配列番号９のヌクレオチド１４３−６０２）とを含んでいた。増幅ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化し、３０８ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを分離し、ｐｃＤＮＡ３−ＫＥα６．３の５．３ｋｂ  ＢａｍＨＩ−ＰｖｕＩフラグメント及びｐｃＤＮＡ３由来の１．４ｋｂ  ＰｖｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントに連結して、〜７．０ｋｂプラスミドｐｃＤＮＡ３−ＫＥα６ＲＢＳを形成した。
【０１１１】
Ｂ．  ヒトニューロンｎＡＣｈＲβ３サブユニットを発現させるための構築物
完全長ニコチン性ＡＣｈＲβ３サブユニットをコードする〜２．０ｋｂ  ＥｃｏＲＩフラグメントを標準的方法でＫＥβ３．２から分離し、ベクターｐｃＤＮＡ３のＥｃｏＲＩポリリンカー部位に連結して、ｐｃＤＮＡ３−ＫＥβ３．２を形成した（第２図参照）。第２図はｐｃＤＮＡ３．ＫＥβ３．２の部分的制限地図も示している。
【０１１２】
完全長ヒトニコチン性ｎＡＣｈＲβ３サブユニットの発現は、翻訳開始コドンの前にコンセンサスリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を導入することによって最適化する。α６ｎＡＣｈＲサブユニットについて上述したものと類似の方法を用いてＰＣＲ突然変異誘発により既存の５’非翻訳領域を修飾し、ｐｃＤＮＡ３−ＫＥβ３ＲＢＳを形成した。
【実施例４】
【０１１３】
アフリカツメガエル内での組換えヒトニューロンｎＡＣｈＲの発現
アフリカツメガエル卵母細胞に、α６及びβ３サブユニットをコードするＤＮＡを含む構築物から製造したｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写体を注入する。二電極電圧固定法を使用して卵母細胞トランスメンブラン電流の電気生理学的測定を行う（例えばＳｔｕｈｍｅｒ（１９９２）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０７：３１０−３３９参照）。
【０１１４】
１．  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写体の調製
ｍＭｅｓｓａｇｅ及びｍＭａｃｈｉｎｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写キットを製造業者のキャップ化転写体プロトコル通りに使用して（ＡＭＢＩＯＮ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸのカタログ１３４４）、直線化プラスミドからｐｃＤＮＡ３−ＫＥαＲＢＳ及びｐｃＤＮＡ３−ＫＥβ３ＲＢＳの組換えキャップ化転写体を合成する。合成した転写体の質量をＵＶ吸光率によって測定し、転写体の完全性をアガロースゲル電気泳動で調べる。
【０１１５】
２．  電気生理学
アフリカツメガエル卵母細胞に、卵母細胞当たり１２．５、５０又は１２５ｎｇの１種類以上のヒトニコチン性ｎＡＣｈＲα及びβサブユニット転写体を注入する。卵母細胞の調製及び注入操作は、Ｄａｓｃａｌ（１９８７），Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：３１７：３８７に記載のように実施する。ｍＲＮＡの注入から２〜６日後、二電極電圧固定法を用いて卵母細胞を調べる。１μＭのアトロピンを含み、１００μＭのｄ−チュボキュラリンを含む又は含まないリンガー液（１１５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３）に細胞を浸漬する。細胞を−６０〜−８０ｍＶで電圧固定する。Ａｘｏｔａｐｅソフトウエアで２〜５Ｈｚでデータを得る。アゴニストアセチルコリン（ＡＣｈ）、ニコチン及びシチシンを０．１μＭ〜１００μＭの濃度で加える。
【実施例５】
【０１１６】
哺乳動物細胞内でのヒトｎＡＣｈＲサブユニットの組換え発現
ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞に、ヒトニューロンニコチン性ｎＡＣｈＲα６及びβ３サブユニットをコードするＤＮＡを一時的及び安定的にトランスフェクションする。種々のアッセイ、例えば電気生理学的方法、Ｃａ２＋＋感受性蛍光指示薬をベースとするアッセイを用いて、一時的トランスフェクション細胞をニコチン性ｎＡＣｈＲの発現について分析する。
【０１１７】
１．  ＨＥＫ細胞の一時的トランスフェクション
ＨＥＫ細胞に、一つ以上のαサブユニット及び／又は一つ以上のβサブユニットをコードするＤＮＡを一時的に同時トランスフェクションする。約２×１０６のＨＥＫ細胞に１８μｇの指定プラスミドを、標準的ＣａＰＯ４トランスフェクション方法で（Ｗｉｇｌｅｒら（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７６：１３７３−１３７６）、又はリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）を製造業者（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＢＲＬ），Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ）の指示通りに使用して、一時的にトランスフェクションする。更に、トランスフェクション効率を観察するために、ＣＭＶプロモーターに融合した大腸菌βガラクトシダーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＣＭＶβｇａｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）２μｇをリポーター遺伝子として同時トランスフェクションする。βガラクトシダーゼ活性の測定により、トランスフェクション細胞をβガラクトシダーゼ発現について分析する［Ｍｉｌｌｅｒ（１９７２）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｐｐ．３５２−３５５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ］。トランスフェクション細胞は、βガラクトシダーゼ及びＸ−ｇａｌ基質が関与する反応の生成物を直接染色することにより、βガラクトシダーゼ発現についても分析し得る［Ｊｏｎｅｓ（１９８６）ＥＭＢＯ ５：１３３−３１４２］。
【０１１８】
２．  ＨＥＫ細胞の安定なトランスフェクション
リン酸カルシウムトランスフェクション法［Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒ−Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １４，Ｕｎｉｔ  ９．１．１−９．１．９（１９９０）］を使用してＨＥＫ細胞のトランスフェクションを行う。所望のα及びβサブユニットをコードするＤＮＡとｐＳＶ２ｎｅｏ（選択可能マーカー）とを含むＤＮＡ／リン酸カルシウム沈降物１ｍｌをＨＥＫ細胞にトランスフェクションする。１μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地で１４日間増殖させた後、形成されたコロニーをクローニングシリンダーを用いて個々に分離する。分離物を限界希釈にかけ、後述のように最大レベルのｎＡＣｈＲを発現するものを同定するためにスクリーニングする。
【実施例６】
【０１１９】
ヒトニューロンｎＡＣｈＲを発現する細胞系の特徴分析
ヒトニューロンｎＡＣｈＲサブユニットをコードするＤＮＡをトランスフェクションすることにより形成した実施例５に記載のような組換え細胞系は、下記の方法の一つ以上を用いて更に特徴を分析し得る。
【０１２０】
Ａ．  α及び／又はβサブユニットコーディングメッセージの発現に関するノーザン又はスロットブロット分析
〜１×１０７個の細胞から全ＲＮＡを分離し、各細胞種類のＲＮＡを１０〜１５μｇ使用してノーザンブロット又はスロットブロットハイブリダイゼーション分析を行う。ヒトニューロンｎＡＣｈＲコーディングプラスミド由来の挿入物は、ニックトランスレーションにかけてプローブとして使用し得る。また、各ブロット上のＲＮＡの存在又は不在を確認し、細胞系間のα又はβ特異的ｍＲＮＡレベルの差の定量に使用する大体の標準を与えるために、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）遺伝子配列（Ｔｓｏら（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：２４８５）をニックトランスレーションにかけ、二重フィルター上で対照プローブとして使用し得る。典型的なノーザンブロット及びスロットブロットハイブリダイゼーション並びに洗浄条件は下記の通りである：５×ＳＳＰＥ、５×デンハーツ溶液、０．２％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌ変性音波処理ニシン精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミド中４２℃でハイブリダイズし、次いで０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中６５℃で洗浄する。
【０１２１】
Ｂ．  結合アッセイ
ヒトニューロンｎＡＣｈＲのα又はα及びβサブユニットをコードするＤＮＡのトランスフェクションによって製造した細胞系は、例えばニコチン又は他のアゴニストに結合する能力について、対照細胞系、例えばニューロン由来細胞系ＰＣ１２（Ｂｏｕｌｔｅｒら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３１９：３６８−３７４；ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１７２１）及びＩＭＲ３２（Ｃｌｅｍｅｎｔｉら（１９８６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．４７：２９１−２９７；ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１２７）、並びに筋肉由来細胞系ＢＣ３Ｈ１（Ｐａｔｒｉｃｋら（１９７７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：２１４３−２１５３）と比較して分析し得る。陰性対照細胞（即ち、トランスフェクション細胞の形成に使用した宿主細胞）もアッセイに含まれる。アッセイは次のように実施する：アッセイにかける直前に、トランスフェクション細胞をスクラッピングによってプレートから除去する。使用する陽性対照細胞は、ＰＣ１２、ＢＣ３Ｈ１及びＩＭＲ３２である（これらの細胞には数日間新しい培地を与えなかった）。３７℃のアッセイ緩衝液（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ及び０．１％アプロチニン、ｐＨ７．４）中で濯ぐことにより対照細胞系を除去する。細胞を洗浄し、１×１０６／２５０μｌの濃度に再懸濁する。各プラスチックアッセイ管に、２５０μｌの細胞溶液と、１５ｎＭ  ３Ｈ−ニコチンと、１ｍＭ非標識ニコチン有または無と、最終容量を５００μｌにする量のアッセイ緩衝液とを加える。トランスフェクション細胞系のアッセイを室温で３０分間インキュベートする。陽性対照細胞のアッセイは１℃で２分間インキュベートする。適当な時間にわたってインキュベートした後、アッセイ容量の４５０μｌアリコートを、０．０５％ポリエチレンイミン中４℃で２４時間インキュベートすることにより予備処理したＷｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｃグラスファイバーフィルターで濾過する。次いで、フィルターを各回４ｍｌの氷冷アッセイ緩衝液を使用して２回洗浄する。洗浄後、フィルターを乾燥し、５ｍｌのシンチレーション液を入れたバイアルに加え、放射能を測定する。
【０１２２】
Ｃ．  ８６Ｒｂイオン流アッセイ
ニコチン又はｎＡＣｈＲアゴニスト及びアンタゴニストがトランスフェクション細胞及び対照細胞内への８６Ｒｂの流入を仲介する能力は、細胞表面上の機能性ｎＡＣｈＲの存在を指示するものであることが分かっている。８６Ｒｂイオン流アッセイは下記のように実施する：
１．  実験の前夜、ウェル数６のポリリシンコーティングしたプレートにウェル当たり２×１０６個の細胞（即ちウェル当たり２ｍｌ）を播く。
２．  培養培地をデカントし、プレートを２ｍｌのアッセイ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２６０ｍＭスクロース、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．８ｍＭ  ＭｇＳＯ４、５．５ｍＭグルコース）で室温で洗浄する。
３．  アッセイ緩衝液をデカントし、３μＣｉ／ｍｌの８６Ｒｂを５ｍＭウワバイン及び最大応答を与える濃度のアゴニスト又はアンタゴニストと共に含むアッセイ緩衝液を１ｍｌ加える。
４．  プレートを氷上１℃で４分間インキュベートする。
５．  緩衝液を廃棄物容器にデカントし、各ウェルを３ｍｌのアッセイ緩衝液で洗浄し、次いで各回２ｍｌで２回洗浄する。
６．  細胞をウェル当たり２×０．５ｍｌの０．２％ＳＤＳで溶解し、５ｍｌのシンチレーション液を入れたシンチレーションバイアルに移す。
７．  各バイアル５に含まれている放射能を測定し、データを計算する。このアッセイでは陽性対照細胞から下記のデータが得られた：
【０１２３】
【表３】
2009050270.tif 000005
【０１２４】
Ｄ．  ヒトニューロンｎＡＣｈＲサブユニットをコードするＤＮＡをトランスフェクションした哺乳動物細胞の電気生理学的分析
組換え受容体の活性の評価、又は試験化合物がリガンド依存性組換えｎＡＣｈＲを介してカチオン流の規模及び持続時間を助長、拮抗又は調節する能力の評価には、電気生理学的測定を使用し得る。発現したニューロンｎＡＣｈＲの機能は、二電極電圧固定法及びパッチ固定法を含む種々の電気生理学的方法で評価できる。ｎＡＣｈＲに固有のカチオン伝導チャンネルは、アセチルコリン（ＡＣｈ）又は他のニコチン性コリン作動性アゴニストに応答して開き、その結果、生理学的条件下で主にナトリウム及びカリウムイオンにより担われているトランスメンブラン電流が流れる。この電流は電圧固定法で直接観察することができる。好ましい実施態様では、トランスフェクションを行った哺乳動物細胞又は注入を行った卵母細胞を、ｎＡＣｈＲアゴニスト依存電流の存在に関して電気生理学的に分析する。
【０１２５】
Ｅ．  蛍光指示薬をベースとするアッセイ
アゴニストによりリガンド依存性ｎＡＣｈＲが活性化されると、Ｃａ＋＋を含むカチオンが受容体チャンネルを介して流入する。チャンネルを介するＣａ＋＋の細胞内流入は、細胞内ストアに含まれていたカルシウムの放出を誘発し得る。一価のカチオンがチャンネルを介して細胞内に流入すると、膜の脱分極及びその結果として生じる電圧依存カルシウムチャンネルの活性化を通して、細胞質Ｃａ＋＋レベルが増加し得る。従って、細胞内カルシウム濃度の一時的増加を検出する方法は、機能性ニコチン性ｎＡＣｈＲ発現の分析に適用できる。細胞内カルシウム濃度を測定する方法の一つは、カルシウム感受性蛍光指示薬の使用をベースとする。
【０１２６】
カルシウム感受性指示薬、例えばフルオ（ｆｌｕｏ）−３（カタログ番号ＦＯ１２４１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）は、膜透過性であるアセトキシメチルエステルとして入手できる。アセトキシメチルエステル形態の指示薬が細胞内に入ると、エステル基が細胞質ゾルエステラーゼによって除去され、その結果細胞質ゾル内に遊離指示薬が捕捉される。遊離指示薬とカルシウムとが相互作用すると、指示薬の蛍光が増加する。従って、指示薬を含んでいる細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度の増加は、蛍光の増加として直接示すことができる。ニコチン性ｎＡＣｈＲをアッセイするための自動化蛍光検出システムは文献に記述されている（米国特許出願明細書第０８／２２９，１５０号、第０８／２４４，９８５号、第０８／４３４，５１１号及び第０８／４３４，９６８号並びに対応する国際特許出願公開明細書ＵＳ９２／１１０９０号参照。国際特許出願公開明細書第９６／０５４８８号も参照）。
【０１２７】
自動化蛍光指示薬ベースアッセイを用いて、適当なα及び／又はβサブユニット並びにα６及びβ３サブユニットをコードするＤＮＡを一時的又は安定的に同時トランスフェクションしたＨＥＫ細胞を、機能性組換えｎＡＣｈＲの発現について分析する。アッセイの手順は次の通りである。非トランスフェクションＨＥＫ細胞と適当なα及び／又はβサブユニットをコードするＤＮＡを同時トランスフェクションしたＨＥＫ細胞とを、ウェル数９６のミクロタイター皿のウェル内に播き、ＨＢＳ（１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．６２ｍＭｍ  ＭｇＳＯ４、６ｍＭグルコース、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）中２０μＭフルオ−３、０．２％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７を含む培地中で２０℃で２時間インキュベートすることによりフルオ−３を充填する。次いで、細胞をアッセイ緩衝液（即ちＨＢＳ）で洗浄する。アンタゴニストｄ−ツボクラリンを一部のウェルに最終濃度１０μＭで加える。次いで、ミクロタイター皿を蛍光プレート読取り器内に配置し、各ウェルの基本蛍光を測定し、記録した後、アゴニスト、例えば２００μＭニコチンをウェルに加える。ニコチンの添加後、約６０秒間にわたり、ウェルの蛍光を繰り返し観察する。
【０１２８】
非トランスフェクションＨＥＫ細胞の蛍光は、ニコチン添加後にも変化しない。これに対し、同時トランスフェクションを行った細胞の蛍光は、ｄ−ツボクラリンの不在下では、ウェルへのニコチンの添加後に急増する。このニコチン刺激による蛍光の増加は、アンタゴニストｄ−ツボクラリンに暴露した同時トランスフェクション細胞では観察されない。このような結果は、同時トランスフェクション細胞が、ニコチンによって活性化され且つｄ−ツボクラリンによって阻害される機能性組換えｎＡＣｈＲを発現することを示すものである。
【０１２９】
好ましい実施例を挙げて本発明を詳細に説明してきたが、種々の変形が本発明の思想及び範囲を逸脱せずに可能である。
【０１３０】
変形例は当業者に明らかであるため、本発明は後述の「請求の範囲」によってのみ限定される。
【０１３１】
【表４】
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【０１３２】
配列の要約
配列番号１はヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のα２サブユニットをコードするヌクレオチド配列及びその推定アミノ酸配列である。
【０１３３】
配列番号２は配列番号１に示すヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のα２ｐサブユニットのアミノ酸配列である。
【０１３４】
配列番号３はヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のα３サブユニットをコードするヌクレオチド配列及びその推定アミノ酸配列である。
【０１３５】
配列番号４は配列番号３に示すヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のα３サブユニットのアミノ酸配列である。
【０１３６】
配列番号５はヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のα４サブユニットをコードするヌクレオチド配列及びその推定アミノ酸配列である。
【０１３７】
配列番号６は配列番号５に示すヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のα４サブユニットのアミノ酸配列である。  配列番号７はヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のα５サブユニットをコードするヌクレオチド配列及びその推定アミノ酸配列である。
【０１３８】
配列番号８は配列番号７に示すヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のα５サブユニットのアミノ酸配列である。
【０１３９】
配列番号９はヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のα６サブユニットをコードするヌクレオチド配列及びその推定アミノ酸配列である。
【０１４０】
配列番号１０は配列番号９に示すヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のα６サブユニットのアミノ酸配列である。
【０１４１】
配列番号１１はヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のα７サブユニットをコードするヌクレオチド配列及びその推定アミノ酸配列である。
【０１４２】
配列番号１２は配列番号１１に示すヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のα７サブユニットのアミノ酸配列である。
【０１４３】
配列番号１３はヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のβ２サブユニットをコードするヌクレオチド配列及びその推定アミノ酸配列である。
【０１４４】
配列番号１４は配列番号１３に示すヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のβ２サブユニットのアミノ酸配列である。
【０１４５】
配列番号１５はヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のβ３サブユニットをコードするヌクレオチド配列及びその推定アミノ酸配列である。
【０１４６】
配列番号１６は配列番号１５に示すヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のβ３サブユニットのアミノ酸配列である。
【０１４７】
配列番号１７はヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のβ４サブユニットをコードするヌクレオチド配列及びその推定アミノ酸配列である。
【０１４８】
配列番号１８は配列番号１７に示すヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のβ４サブユニットのアミノ酸配列である。
【０１４９】
配列番号１９はヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体の変異体α６サブユニットをコードするヌクレオチド配列及びその推定アミノ酸配列である。
【０１５０】
配列番号２０は配列番号１９に示すヒトニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のα６サブユニットのアミノ酸配列である。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１】第１図は、α６コーディングフラグメントをＥｃｏＲＩ挿入物として含むサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターをベースとするベクターｐｃＤＮＡ３−ＫＥアルファ６．３の制限地図を示す説明図である。
【図２】第２図は、β３コーディングフラグメントをＥｃｏＲＩ挿入物として含むＣＭＶプローモーターをベースとするベクターｐｃＤＮＡ３−ＫＢベータ３．２の制限地図を示す説明図である。
【図１】
2009050270.tif 000060
【図２】
2009050270.tif 000061
【手続補正書】
【提出日】平成20年12月12日(2008.12.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009050270000001.app