(57)【要約】【課題】簡易で安価なハプロタイプ遺伝子を検出する方法を提供する。【解決手段】２つの対立遺伝子を含む標的ＤＮＡと一方に相補的な標識化オリゴヌクレオチドを合成しそれらを混合することで一方の対立遺伝子をマスクする。この混合物を各対立遺伝子近傍と相補的配列のプローブを搭載したマイクロアレイとハイブリダイズし、マスクしたオリゴヌクレオチドの標識がどのプローブで検出されるかによってそのハプロタイプを決定することを特徴とする新規ハプロタイピングの手法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の対立遺伝子の配列を同時に決定し、ハプロタイプ遺伝子を検出する方法であって、
各対立遺伝子の一方をマスクする標識化オリゴヌクレオチドを標的ゲノムＤＮＡにアニールさせて一方の対立遺伝子の検出をブロックするマスク手段と、
他方のブロックされない対立遺伝子を捕捉する捕捉手段と、
マスクした前記オリゴヌクレオチドの標識を検出する検出手段と、
を有する各対立遺伝子を決定するハプロタイプ遺伝子検出方法。
【請求項２】
前記マスク手段におけるオリゴヌクレオチドは、複数の個体のＤＮＡ配列についてアライメントした結果１％以上の頻度で見られる変異である多型のヌクレオチドとその近傍配列とからなることを特徴とする請求項１記載のハプロタイプ遺伝子検出方法。
【請求項３】
前記捕捉手段における対立遺伝子の配列を有する捕捉プローブは、固相担体上に固定されていることを特徴とする請求項１記載のハプロタイプ遺伝子検出方法。
【請求項４】
前記捕捉手段における捕捉プローブを固相担体上に固定し、前記マスク手段により処理された標的ゲノムＤＮＡとハイブリダイズすることを特徴とする請求項１記載のハプロタイプ遺伝子検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、同一染色体上の２つ以上の変異部分を含む配列を同時に決定するハプロタイプ決定法に関する技術である。
【背景技術】
【０００２】
ハプロタイプは単一の染色体に位置する２つまたはそれより多い多型マーカーのシス配置である。ハプロタイプ情報は特定の疾患や異常と関連していたり、特定の薬剤感受性と関連していたりと非常に有用な情報であると考えられている。従来、ハプロタイプの解析は家系の多世代にわたる多型マーカーの遺伝情報の追跡調査や、計算機における推定アルゴリズムを必要とした。一方、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の技術の進歩により分子レベルでＤＮＡを直接分析できるようになり、その分析結果をハプロタイプの決定に利用する方法が提案されている。しかし、ＰＣＲを利用してハプロタイプを決定するためには、対立遺伝子に特異的なプライマーの組合せを複数用意し、多数回のＰＣＲを実施する必要があった。また、２つの対立遺伝子に限定すれば、２つのプライマーペアを多型部位に配し、その増幅の有無によってハプロタイプを決定しようとする試みもある。これは、単一試験管アッセイ形式のハプロタイプ決定方法（特許文献１参照）で提案されている。具体的に示すと、第一の多型マーカーを含む順方向プライマーは、５'末端にアレルによって異なるシグナルを与える標識が修飾されている。また第二の多型マーカーを含む逆方向プライマーにおいては、５'末端にターゲット配列には含まれないフラップ配列をつけて、アレルによって異なる長さになるように設計されている。これらのプライマーを用いて両方向でアレル特異的にＰＣＲを行う。ＰＣＲ増幅産物中の蛍光標識と増幅産物長を検出することによって、どのプライマー対により増幅されたかが分かり、ハプロタイプを決定することが可能となる。また、本発明に非常に近いケースとしてサンドイッチハイブリを利用したハプロタイプ検出法（特許文献２参照）がある。この方法は、一方の多型を担体上のプローブで固定し、他方の多型は標識化されたオリゴヌクレオチドがハイブリダイズするため、担体上の位置と標識のタイプによりハプロタイプを決定しようというものである。
【特許文献１】特開２００２−２７２４８２号公報
【特許文献２】米国特許第２００３／００９６２３１号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
従来法では、アレル特異的ＰＣＲを実現させる条件が極めて重要であり、多型の有無により伸長に差が認められなければならないため、いかに非特異的な増幅を回避するかが鍵になっていた。すなわちプライマー設計とＰＣＲプロトコルの最適条件を、ターゲットに応じてその都度探索しなくてはならなかった。また、サンドイッチハイブリ様式では、多型部位におけるヌクレオチドを異なる別箇の標識を割り当てることで識別をすることができるため、最低でも２種類の標識を用意しなくてはならず高価なハプロタイピングシステムになっていた。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、上記課題を解決するために次の（１）〜（４）のように構成した１標識だけのマスクオリゴヌクレオチドセットとプローブセットをデザインし、複対立遺伝子のハプロタイプを決定する処理手順を提供するものである。
【０００５】
（１）複数の対立遺伝子の配列を同時に決定する方法に関し、各対立遺伝子の一方をマスクする標識化オリゴヌクレオチドを標的ゲノムＤＮＡにアニールさせて一方の対立遺伝子の検出をブロックするマスク手段と、他方のブロックされない対立遺伝子を捕捉する捕捉手段と、マスクした前記オリゴヌクレオチドに付加した標識を検出する検出手段とから、各対立遺伝子を決定するハプロタイプ遺伝子検出方法。
【０００６】
（２）複数の個体のＤＮＡ配列についてアライメントした結果１％以上の頻度で見られる変異である多型のヌクレオチドとその近傍配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする（１）のハプロタイプ遺伝子検出方法。
【０００７】
（３）前記捕捉手段における該対立遺伝子の配列をもつ捕捉プローブは、固相担体上に固定されていることを特徴とする（１）のハプロタイプ遺伝子検出方法。
【０００８】
（４）前記捕捉手段における捕捉プローブを固相担体上に固定し前記マスク手段により処理された標的ゲノムＤＮＡとハイブリダイズすることを特徴とする（１）のハプロタイプ遺伝子検出方法。
【発明の効果】
【０００９】
以上、説明したように、本発明によれば、アレル特異的プライマーを使用することなく、また、一つの標識を使うだけで、２つの対立遺伝子のハプロタイプを決定することができるハプロタイピング手法を開発した。その結果、非特異的増幅を回避するためのプライミング条件を検討することなく、簡易で安価なハプロタイピングキットを構成できるという効果が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
各対立遺伝子の一方のアレルをマスクする標識化オリゴヌクレオチドと標的ゲノムＤＮＡを混合し、その対立遺伝子の検出をブロックする手段（マスク手段）と、他方の対立遺伝子を捕捉する捕捉手段と、を有し、上記マスクした標識化オリゴヌクレオチドの検出と、捕捉された対立遺伝子とをそれぞれ識別して検出することにより、そのプローブ配列と標識からハプロタイプ遺伝子を決定することができる。
【００１１】
本発明における、マスク手段において用いられる上記標識化オリゴヌクレオチドは、定法に従い合成され、通常１５−３０ｍｅｒである。また、上記標識化オリゴヌクレオチドは、複数の個体のＤＮＡ配列についてアライメントした結果１％以上の頻度で見られる変異である多型のヌクレオチドとその近傍配列とからなるオリゴヌクレオチドを用いる。なお、ここでいう変異とは、例えば１塩基変異、インサーション、デリーションを挙げることができる。
【００１２】
本発明における捕捉手段としては、特に対立遺伝子の配列をもつ捕捉プローブが固相固体上に固体されている形態をとることが望ましい。したがって、例えばマイクロアレイを挙げることができ、その他にもビーズアレイや、マイクロウェルプレートを応用したものなどを挙げることができる。
【００１３】
本発明のハプロタイプ遺伝子検出方法では、上記マスク手段と上記捕捉手段とを用い、更にマスク手段における標識化オリゴヌクレオチドを標識体に即した手段を用いて検出することにより対立遺伝子の配列が決定し、したがってハプロタイプの遺伝子の検出が可能となる。
【実施例】
【００１４】
本発明の第１の実施例を、図１を用いて以下に説明する。
【００１５】
図１は、実線で図示する２つのハプロタイプＨ１、Ｈ２について、２つの対立遺伝子Ａ／ａ、Ｂ／ｂと、各対立遺伝子について一方のアレルだけをマスクする破線で図示する標識（黒丸で図示）付マスクオリゴヌクレオチドを示す。１Ａは、Ｈ１のＡとハイブリダイズする標識付マスクオリゴヌクレオチドとＨ１のＢとハイブリダイズする標識付マスクオリゴヌクレオチドで構成されている。この場合、Ｈ１は両対立遺伝子ともマスクされているために、Ｈ２は標識がないために、プローブとハイブリダイズしても検出しない。１Ｂは、Ｈ１のＡとハイブリダイズする標識付マスクオリゴヌクレオチドとＨ２のｂとハイブリダイズする標識付マスクオリゴヌクレオチドで構成されている。この場合、Ｈ１はＢを含むプローブとハイブリダイズし、Ｈ２はａを含むプローブとハイブリダイズし検出する。
【００１６】
すなわち、１対のマスクオリゴヌクレオチドの選別によっては、すべてのハプロタイプのパターンを識別することができないことを意味する。そこで、１対のマスクオリゴヌクレオチドを２通り選び、その各々で２回ハイブリダイゼーションを実行することでこれを補う。
【００１７】
２つの対立遺伝子のハプロタイプの組み合わせは、ＡＢ、Ａｂ、ａＢ、ａｂの４通りあるが、２つの染色体をもつためにそのディプロタイプの組み合わせは、ＡＢ／ＡＢ、ＡＢ／Ａｂ、ＡＢ／ａＢ、ＡＢ／ａｂ、Ａｂ／Ａｂ、Ａｂ／ａＢ、Ａｂ／ａｂ、ａＢ／ａＢ、ａＢ／ａｂ、ａｂ／ａｂの１０通りになる。
【００１８】
図２は、一方の染色体を行、他方の染色体を列として組んだマトリックスであり、対角線から上方が前記の１０通りの組み合わせに対応する。対立遺伝子Ａのマスクオリゴヌクレオチドのみを使用した場合に検出するプローブを記し、検出する：〇、検出しない：×で表記している。
【００１９】
図３は、対立遺伝子ＡとＢをマスクするマスクオリゴヌクレオチドを使用した場合のプローブによる検出結果を示し、図４は、対立遺伝子Ａとｂをマスクするマスクオリゴヌクレオチドを使用した場合のプローブによる検出結果を示す。ディプロタイプの組合せ（図１の１Ａ）によってはいずれも検出できないことがあるが、両者の情報を総合すると、図５に示すようにすべてのディプロタイプの組合せを検出できる。
【００２０】
以下、本実施態様における手順を説明する
Ｉ．ゲノムＤＮＡからＣＹＰ２Ｄ６遺伝子領域の抽出
使用したテンプレートＤＮＡは次のようにして得られた。検体は、財団法人ヒューマンサイエンス振興財団のヒューマン研究資源バンク（ＨＳＲＲＢ）が保有している、ファルマＳＮＰコンソーシアム（ＰＳＣ）細胞株（日本人由来Ｂ細胞株）から抽出されたものである。ＴＥバッファーにゲノムＤＮＡが５０ｎｇ／ｕＬの濃度になるように調製した。さらに、抽出されたゲノムＤＮＡから代謝酵素遺伝子であるＣＹＰ２Ｄ６の領域５ｋｂｐに限定して増幅し、これは、擬似遺伝子であるＣＹＰ２Ｄ７、ＣＹＰ２Ｄ８等の重複配列部分を除外し、ＣＹＰ２Ｄ６部位だけに純化する目的で処理されている。
【００２１】
詳細には、使用したプライマーは、一般的に広く用いられている表１のものを使用した。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
また、ＰＣＲ溶液の調製法は表２の通りに、ＰＣＲサイクルは表３のとおりに実施し、その結果、増幅されたＣＹＰ２Ｄ６遺伝子領域の産物（５１０３ｂｐ）を得た。
【００２４】
反応プロセスには、変性、アニールおよび伸長の３ステップサイクルを３５回繰り返し、冷却後、精製プロセスにより増幅産物の純化を行った。具体的な条件は以下に示すが、９４℃／１分の保持の後、９４℃(変性)／１分、６６．５℃（アニーリング）／３０秒および６８℃（伸長）／５分を１サイクルとして３５サイクル、最後に６８℃／７分保持した。その後１５℃に維持した。
【００２５】
続いて、ＰＣＲ増幅産物は精製用カラム（Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いて精製し、ＰＣＲ増幅産物溶液の液量は、５０μＬとなるように調製した。
【００２６】
【表２】
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【００２７】
【表３】
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【００２８】
ＩＩ．２回目のＰＣＲ増幅
Ｉ．で取得したＣＹＰ２Ｄ６遺伝子領域のうち、２箇所の多型Ｃ１００Ｔ、Ｇ３１０Ｔを含む塩基長４７４ｂｐの領域を増幅する。Ｃ１００Ｔの野生型配列とＧ３１０Ｔの野生型配列、および増幅プライマー配列と増幅産物の配列とを表４に示す。太文字は多型位置を、下線部はＣ１００Ｔ、Ｇ３１０Ｔ配列の位置を記す。
【００２９】
【表４】
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【００３０】
ＰＣＲ溶液の調製法は表５のとおりに、ＰＣＲサイクルは表６のとおりに実施した。反応プロセスには、変性、アニールおよび伸長の３ステップサイクルを３５回繰り返し、冷却後、精製プロセスにより増幅産物の純化を行った。すなわち、９５℃／５分の保持の後、９５℃(変性)／３０秒、６０℃（アニーリング）／３０秒および７２℃（伸長）／３０秒を１サイクルとして３５サイクル、最後１０℃に維持した。
【００３１】
ＰＣＲ増幅産物は精製用カラム（Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いて精製し、ＰＣＲ増幅産物溶液の液量は、５０μＬとなるように調製した。
【００３２】
【表５】
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【００３３】
【表６】
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【００３４】
ＩＩＩ．マイクロアレイの作製
（１）プローブの設計
上記、ＰＣＲ産物に対して２つの対立遺伝子に対応した４種類のプローブを設計した。その４種の配列を表７に示す。Ｃ１００Ｔの野生型および変異型に対応するプローブは、それぞれ１００−Ｗおよび１００−Ｍであり、同様に、Ｇ３１０Ｔの野生型および変異型に対応するプローブは、それぞれ３１０−Ｗおよび３１０−Ｍである。また、太文字は多型のヌクレオチドに対応する。
【００３５】
【表７】
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【００３６】
（２）プローブの合成及びマイクロアレイの作製
プローブの合成およびマイクロアレイの作製は、特開平１１−１８７９００号公報にて開示されているＤＮＡマイクロアレイの作製法に従って行った。すなわち、基板プロセスに関しては、石英ガラスにシランカップリング剤処理及びＥＭＣＳを結合し、それにより表面にマレイミド基を導入した。またプローブ合成は、５'末端にチオール基が導入されたプローブを合成し、ＨＰＬＣ精製した。インクジェットプリンター（商品名：ＢＪＦ−８５０、キヤノン社製）の改造機を使用し、ガラス基板上に各プローブをスポットしてＤＮＡマイクロアレイを得た。なお、ガラス基板のサイズ（Ｗ×Ｌ×Ｔ）は２５ｍｍ×７５ｍｍ×１ｍｍとした。
【００３７】
以上のように作製されたＤＮＡマイクロアレイは、本発明の検出方法における捕捉手段として用いることができる。固相担体上に固定する一例としてここではガラス基板上に各プローブ(捕捉プローブ)をスポットすることを挙げている。そして、このＤＮＡマイクロアレイと次に述べるマスクオリゴヌクレオチドを用いたマスク手段とは、共に本願発明の構成要素をなす。
【００３８】
ＩＶ．マスクオリゴヌクレオチドの合成
２つの対立遺伝子Ｃ１００Ｔの野生型とＧ３１０Ｔの変異型に対応するオリゴヌクレオチドを合成する。配列は、表８に示すように表７のプローブ配列と同様であり、太文字は多型のヌクレオチドに対応する。５’末端はＣｙ３標識とし、プローブ−標的ＰＣＲ産物−Ｃｙ３標識マスクオリゴヌクレオチドのように２重ハイブリダイズする場合にのみ蛍光を検出できるようになる。
【００３９】
【表８】
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【００４０】
Ｖ.ハイブリダイゼーション
ＩＩＩ.で作製したＤＮＡマイクロアレイと、サンプル核酸検体としてＩＩ.で作製したＰＣＲ増幅産物とを用いて、マイクロアレイ上でのハイブリダイゼーションを行った。
【００４１】
（１）ＤＮＡマイクロアレイのブロッキング
ＢＳＡ（牛血清アルブミンＦｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ：Ｓｉｇｍａ社製）を１重量％となるように、１００ｍＭ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ  リン酸バッファーに溶解した。この溶液にＩＩ．で作製したＤＮＡマイクロアレイを室温で２時間浸し、ガラス基板面のブロッキングを行った。ブロッキング終了後、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む３０ｍＭの２×ＳＳＣ溶液（ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ（ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｄｉｈｙｄｒａｔｅ，Ｃ6Ｈ5Ｎａ3・２Ｈ2Ｏ）（ｐＨ７．０）で洗浄を行った。その後、純水でリンスし、次いでスピン・ドライ装置でＤＮＡマイクロアレイの水切りを行った。
【００４２】
（２）ハイブリダイゼーション溶液の調製
各ＰＣＲ産物を０．２ｐｍｏｌなるように調製し、ＩＶ.で合成した各オリゴヌクレオチドを等モル量加えてハイブリダイゼーション溶液を調製した。ハイブリダイゼーション溶液の組成は以下のとおりである
６×ＳＳＰＥ／ １０％ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ／ ＰＣＲ増幅産物溶液
（６×ＳＳＰＥ：ＮａＣｌ ９００ｍＭ、ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ ６０ｍＭ、ＥＤＴＡ ６ｍＭ、ｐＨ７．４）。
【００４３】
（３）ハイブリダイゼーション
水切りしたＤＮＡチップを、ハイブリダイゼーション装置（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｔａｔｉｏｎ）にセットした。そして、上記組成のハイブリダイゼーション溶液を用いて、下記手順および条件でハイブリダイゼーション反応を行った。すなわち、
ハイブリダイゼーション溶液を、６５℃に加温し３分間保持したあと、さらに９２℃で２分間、続いて５０℃で４時間保持した。その後、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを用いて、４０℃で洗浄をした。さらに２×ＳＳＣを用いて２５℃で洗浄を行い、必要に応じて通常のマニュアルに従い純水でリンスして、最後にスピン・ドライ装置で水切りを行い乾燥させた。
【００４４】
（４）蛍光測定
ハイブリダイゼーション反応終了後、スピン・ドライ乾燥したＤＮＡチップについて、ＤＮＡマイクロアレイ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、Ｇｅｎｅｐｉｘ ４０００Ｂ）を用いて、ハイブリッド体に由来する蛍光測定を行った。輝度解析は、Ａｒｒａｙ−ＰＲＯ Ａｎａｌｙｓｅｒ４．５(Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．)を用いて行った。図６に、蛍光を検知している画像を図示する。Ｇ３１０Ｔの野生型プローブ(３１０−Ｗ)にハイブリした標的産物のＣ１００Ｔの野生型部位にハイブリダイズしていると考えられる１００−Ｗ−Ｃｙ３の蛍光を検知していることがわかる。この結果、Ｃ１００Ｔが野生型でＧ３１０Ｔが野生型のハプロタイプを検出した。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の第１の実施例における２つの対立遺伝子と各アレルの一方をマスクする標識付オリゴヌクレオチドの構成図である。
【図２】本発明の第１の実施例における２つの対立遺伝子のアレルＡをマスクした場合のプローブ検出の可否を示すハプロタイプのマトリックス図である。
【図３】本発明の第１の実施例における２つの対立遺伝子のアレルＡ、Ｂをマスクした場合のプローブ検出の可否を示すハプロタイプのマトリックス図である。
【図４】本発明の第１の実施例における２つの対立遺伝子のアレルＡ、ｂをマスクした場合のプローブ検出の可否を示すハプロタイプのマトリックス図である。
【図５】本発明の第１の実施例における２つの対立遺伝子のアレルＡ、Ｂをマスクした場合とＡ、ｂをマスクした場合のプローブ検出の可否を示すディプロタイプ構成表である。
【図６】本発明の第１の実施例における、ハプロタイプの結果を示すマイクロアレイの画像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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