(57)【要約】      （修正有）【課題】コンパクトな装置で、生体組織の洗浄、分解および濃縮を行うことができて、操作性を向上し、装置間の移し替えをなくして無菌的に濃縮された組織由来細胞を得る。【解決手段】脂肪組織Ａを含む混合液Ｗを収容する収容部２と、該収容部２に設けられる２つの開口部３ａ，３ｂとを備える容器３と、該容器３の一方の開口部３ａを閉塞する位置に配置され脂肪組織Ａの通過を禁止する第１のフィルタ４と、容器３の他方の開口部３ｂを閉塞する位置に配置され脂肪組織Ａの通過を禁止し、脂肪由来細胞の通過を許容する第２のフィルタ５と、該第２のフィルタ５側の開口部３ｂに一端が接続された回収チューブ６と、該回収チューブ６の他端にを閉塞する位置に配置され、脂肪由来細胞の通過を禁止し、赤血球の通過を許容する第３のフィルタ７と、容器３内における混合液Ｗの流動方向を切り替える流動方向切替機構とを備える細胞分離装置１を提供する。【選択図】図２
2009038998.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪組織を含む混合液を収容する収容部と、該収容部に設けられる２つの開口部とを備える容器と、
該容器の一方の開口部を閉塞する位置に配置され脂肪組織の通過を禁止する第１のフィルタと、
前記容器の他方の開口部を閉塞する位置に配置され脂肪組織の通過を禁止し、脂肪由来細胞の通過を許容する第２のフィルタと、
該第２のフィルタ側の開口部に一端が接続された回収チューブと、
該回収チューブの他端を閉塞する位置に配置され、脂肪由来細胞の通過を禁止し、赤血球の通過を許容する第３のフィルタと、
前記容器内における前記混合液の流動方向を切り替える流動方向切替機構とを備える細胞分離装置。
【請求項２】
前記第１のフィルタが備えられた開口部に、前記収容部内に洗浄液を供給する洗浄液供給部と、洗浄後の廃液を排出する廃液排出部とが接続されている請求項１に記載の細胞分離装置。
【請求項３】
前記洗浄液供給部が、洗浄液とともにガスを供給する請求項２に記載の細胞分離装置。
【請求項４】
前記容器の収容部に消化酵素液を供給する酵素供給口が設けられている請求項１に記載の細胞分離装置。
【請求項５】
前記流動方向切替機構は、容器が、脂肪組織の洗浄時および消化時に第１のフィルタが設けられた開口部を下側に向けて配置され、消化終了後に第２のフィルタが設けられた開口部を下側に向けて配置されるよう容器を回転させる請求項１から請求項４のいずれかに記載の細胞分離装置。
【請求項６】
前記第２のフィルタ側の開口部近傍において、前記回収チューブを開閉するバルブを備え、
前記第３のフィルタを挟んで前記回収チューブとは反対側から洗浄媒体を供給する洗浄媒体供給部が備えられている請求項１に記載の細胞分離装置。
【請求項７】
前記洗浄媒体が、洗浄液および／またはガスである請求項６に記載の細胞分離装置。
【請求項８】
前記第１のフィルタ側の開口部に、他の回収チューブの一端が接続され、
該他の回収チューブの他端を閉塞する位置に、脂肪由来細胞の通過を禁止し、赤血球の通過を許容する第４のフィルタが備えられている請求項１から請求項６のいずれかに記載の細胞分離装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞分離装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体組織を分解して組織由来幹細胞を分離するためには、生体組織を洗浄し、消化酵素液内において攪拌することにより分解し、得られた細胞懸濁液を遠心分離機にかけて濃縮する方法が知られている（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００３】
【非特許文献１】K.Yoshimura et al., "Characterization of  Freshly Isolated   and Cultured Cells Derived Fromthe Fatty and Fluid Portions of Liposuction Aspirates", J. Cellular  Physiology 208, pp64-76，2006
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１の方法は、生体組織の洗浄、分解および濃縮の工程をそれぞれ別個の装置において行う必要があり、装置全体が大型化するとともに、工程間で生体組織や細胞懸濁液を移し替えなければならないという不都合がある。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、コンパクトな装置で、生体組織の洗浄、分解および濃縮を行うことができて、操作性を向上し、装置間の移し替えをなくして無菌的に濃縮された組織由来細胞を得ることができる細胞分離装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、脂肪組織を含む混合液を収容する収容部と、該収容部に設けられる２つの開口部とを備える容器と、該容器の一方の開口部を閉塞する位置に配置され脂肪組織の通過を禁止する第１のフィルタと、前記容器の他方の開口部を閉塞する位置に配置され脂肪組織の通過を禁止し、脂肪由来細胞の通過を許容する第２のフィルタと、該第２のフィルタ側の開口部に一端が接続された回収チューブと、該回収チューブの他端を閉塞する位置に配置され、脂肪由来細胞の通過を禁止し、赤血球の通過を許容する第３のフィルタと、前記容器内における前記混合液の流動方向を切り替える流動方向切替機構とを備える細胞分離装置を提供する。
【０００６】
本発明によれば、容器の収容部に脂肪組織を含む混合液を収容し、流動方向切替機構の作動により、混合液の流動方向を第１のフィルタに向かう方向に設定することにより、混合液内の脂肪組織を第１のフィルタにより捕捉させ、それよりも小さい物質を第１のフィルタに通過させて除去することができる。例えば、洗浄液を用いて脂肪組織を洗浄し、第１のフィルタによって濾過することにより、脂肪組織に付着していた組織残渣や血液成分等の塵埃を除去することができる。その後、消化酵素液と脂肪組織を混合することにより、収容部内において脂肪組織を分解させ、脂肪由来細胞を含む細胞懸濁液を生成する。
【０００７】
そして、流動方向切替機構を作動させて、細胞懸濁液の流動方向を第２のフィルタに向かう方向に切り替えることにより、分解された脂肪由来細胞およびそれより小さい赤血球等を第２のフィルタに通過させ、それよりも大きな脂肪組織を第２のフィルタに捕捉させて収容部内に維持する。第２のフィルタを通過した脂肪由来細胞は、第２のフィルタ側の開口部に接続された回収チューブ内に回収され、回収チューブの他端を閉塞する位置に配置された第３のフィルタによって捕捉される。一方、脂肪由来細胞よりも粒径の小さい赤血球等は第３のフィルタを透過して脂肪由来細胞から分離される。
【０００８】
すなわち、本発明によれば、脂肪組織や細胞懸濁液の別個の容器への移し替え作業を行うことなく、脂肪組織の洗浄、消化および濃縮を簡易に実施することができる。したがって、操作性を向上し、移し替えに伴う細菌等の混入を防止して無菌的に脂肪由来細胞を分離回収することができる。また、分離に際して遠心分離機を使用することなく、コンパクトな構成で、より簡易に脂肪由来細胞を濃縮分離することができる。
【０００９】
上記発明においては、前記第１のフィルタが備えられた開口部に、前記収容部内に洗浄液を供給する洗浄液供給部と、洗浄後の廃液を排出する廃液排出部とが接続されていることとしてもよい。
このようにすることで、洗浄液供給部から洗浄液を供給すると、第１のフィルタが備えられた開口部を介して収容部内に洗浄液が供給され、収容部内に収容されている脂肪組織を洗浄することができる。そして、洗浄後の廃液が廃液排出部から排出されることにより、洗浄された脂肪組織を第１のフィルタに捕捉させ、脂肪組織に付着していた組織残渣や血液成分等の塵埃等を第１のフィルタに通過させて除去することができる。
【００１０】
また、上記発明においては、前記洗浄液供給部が、洗浄液とともにガスを供給することとしてもよい。
このようにすることで、ガスの作用により収容部内の脂肪組織と洗浄液とをよく攪拌することができ、脂肪組織に付着している塵埃等を効率的に除去することが可能となる。
【００１１】
また、上記発明においては、前記容器の収容部に消化酵素液を供給する酵素供給口が設けられていることとしてもよい。
このようにすることで、容器の収容部に設けられた酵素供給口から収容部内に消化酵素液を供給することにより、収容部内の脂肪組織に消化酵素液を作用させて脂肪組織を分解し、脂肪由来細胞を単離させることができる。
【００１２】
また、上記発明においては、前記流動方向切替機構は、容器が、脂肪組織の洗浄時および消化時に第１のフィルタが設けられた開口部を下側に向けて配置され、消化終了後に第２のフィルタが設けられた開口部を下側に向けて配置されるよう容器を回転させることとしてもよい。
【００１３】
このようにすることで、流動方向切替機構の作動により、第１のフィルタを下方に向けて容器を配置して洗浄を行うことで、第１のフィルタによって脂肪組織を捕捉し、洗浄液および塵埃を第１のフィルタから下方に通過させて排出することができる。また、第１のフィルタを下方に向けて容器を配置して分解を行うことで、収容部内に貯留された消化酵素液内において脂肪組織を効率的に分解し、脂肪由来細胞が浮遊した細胞懸濁液を得ることができる。
【００１４】
そして、流動方向切替機構の作動により、容器を回転させて第２のフィルタが設けられた開口部を下側に向けることにより、第２のフィルタを介して細胞懸濁液を流動させ、第２のフィルタに脂肪組織を捕獲させ、十分に粒径の小さい脂肪由来細胞を通過させることができる。これにより、第３のフィルタが設けられた回収チューブ内に脂肪由来細胞およびそれより小さい粒径の物質を導き、脂肪組織から分離することができる。そして、脂肪由来細胞を第３のフィルタに捕獲させ、それよりも粒径の小さい赤血球等は、第３のフィルタを通過させて外部に排出することができる。
【００１５】
また、上記発明においては、前記第２のフィルタ側の開口部近傍において、前記回収チューブを開閉するバルブを備え、前記第３のフィルタを挟んで前記回収チューブとは反対側から洗浄媒体を供給する洗浄媒体供給部が備えられていることとしてもよい。
このようにすることで、脂肪由来細胞が回収チューブ内に回収された後は、バルブを閉じることにより、回収チューブを収容部から切り離すことができる。この状態で、洗浄媒体供給部の作動により第３のフィルタ側から洗浄媒体を供給することにより、第３のフィルタに捕捉されていた脂肪由来細胞を第３のフィルタから剥離させて回収チューブ内に回収することができる。
この場合に、前記洗浄媒体が、洗浄液および／またはガスであることとしてもよい。
【００１６】
また、上記発明においては、前記第１のフィルタ側の開口部に、他の回収チューブの一端が接続され、該他の回収チューブの他端を閉塞する位置に、脂肪由来細胞の通過を禁止し、赤血球の通過を許容する第４のフィルタが備えられていることとしてもよい。
このようにすることで、例えば、洗浄液を用いた洗浄中に、第１のフィルタを通過して、脂肪由来細胞が排出されてしまうのを防止することができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、コンパクトな装置で、生体組織の洗浄、分解および濃縮を行うことができて、操作性を向上し、装置間の移し替えをなくして無菌的に濃縮された組織由来細胞を得ることができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の一実施形態に係る細胞分離装置１について、図１〜図７を参照して説明する。
本実施形態に係る細胞分離装置１は、図１に示されるように、脂肪組織を収容する略円筒状の収容部２を備え、両端に開口する開口部３ａ，３ｂを備えた容器３と、該容器３の一端の第１の開口部３ａを閉塞する位置に配置された第１のフィルタ４と、容器３の他端の第２の開口部３ｂを閉塞する位置に配置された第２のフィルタ５と、前記第２の開口部３ｂに一端を接続した回収チューブ６と、該回収チューブ６の他端を閉塞する位置に配置された第３のフィルタ７と、前記回収チューブ６の第２のフィルタ５側の開口部を開閉するピンチバルブ８とを備えている。
【００１９】
収容部２には、生体組織を投入し、あるいは、後述する消化酵素液を注入するための導入口９が開閉可能に設けられている。
また、前記容器３の第１の開口部３ａには、洗浄液および窒素ガスを供給する洗浄液供給部１０と、洗浄後の廃液を排出するための廃液排出部１１とが設けられている。
また、前記回収チューブ６の第３のフィルタ７よりも外側には、窒素ガスを供給するためのガス供給口１２と、廃液を排出するための廃液排出部１３とが設けられている。
【００２０】
前記回収チューブ６は、例えば、ポリエチレンのように熱により簡易に切断可能な材質により構成されている。これにより、公知の方法によって、回収チューブ６を熱により切断しながら断面を閉塞する無菌的切断処理を行うことができるようになっている。
【００２１】
前記容器３は、半径方向に延びる水平な軸線Ｃ回りに回転可能に設けられている。
前記第１のフィルタ４は、５〜２５μｍの透孔を有し、１０〜１５μｍの透孔を有していることが好ましい。
前記第２のフィルタ５は、３０〜１５０μｍの透孔を有し、４０〜７０μｍの透孔を有していることが好ましい。
前記第３のフィルタ７は、３〜１０μｍの透孔を有し、５〜８μｍの透孔を有していることが好ましい。
【００２２】
このように構成された本実施形態に係る細胞分離装置１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る細胞分離装置１を用いて脂肪組織Ａから脂肪由来細胞Ｂを分離回収するには、まず、図２に示されるように、第１のフィルタ４が下側に配置されるように容器３を配置し、容器３の収容部２内に脂肪組織Ａを収容し、洗浄液供給部１０から洗浄液Ｗおよび窒素ガスを供給する。容器３内に洗浄液Ｗが貯留され、該洗浄液Ｗ内に脂肪組織Ａが浸漬された状態で窒素ガスが供給されることにより、脂肪組織Ａが洗浄液Ｗ内で攪拌され、効率的に洗浄されることになる。
【００２３】
そして、洗浄液Ｗおよび窒素ガスの供給を停止し、図３に示されるように、廃液排出部１１から洗浄後の廃液を排出することにより、第１のフィルタ４によって脂肪組織Ａが収容部２内から排出されないように捕捉される一方、それよりも小さい組織残渣や血液成分等の塵埃が第１のフィルタ４を通過して廃液排出部１１から外部に排出される。この工程を複数回繰り返すことによって、より確実に脂肪組織Ａを洗浄することができる。また、洗浄液Ｗおよび窒素ガスを第１のフィルタ４の下方から収容部２内に供給することにより、第１のフィルタ４に捕捉された組織残渣や血液成分等の塵埃が逆洗され、第１のフィルタ４が目詰まりすることを防止できる。
【００２４】
そして、洗浄液Ｗの廃液が廃液排出部１１から排出された後に、廃液排出部１１をバルブ（図示略）等により閉塞し、図４に示されるように、容器３に設けられた導入口９から消化酵素液Ｄを収容部２内に供給する。これにより、収容部２内に消化酵素液Ｄが貯留され、該消化酵素液Ｄ内に脂肪組織Ａが浸漬されることになり、経時的に脂肪組織Ａが分解されて、脂肪由来細胞Ｂが単離される。このとき、洗浄液供給部１０から窒素ガスを供給することにより、脂肪組織Ａと消化酵素液Ｄとを十分に混合させることができる。そして、所定時間が経過することにより、単離した多数の脂肪由来細胞Ｂが消化酵素液Ｄ内に浮遊する細胞懸濁液が形成される。
【００２５】
この状態で、図５に示されるように、容器３を水平な軸線Ｃ回りに回転させることにより、第１のフィルタ４が上方に配置され第２のフィルタ５が下側に配置されるように容器３を配置する。これにより、細胞懸濁液は、第２のフィルタ５を介して下方に流動するようになる。そして、細胞懸濁液に含まれている脂肪組織Ａは第２のフィルタ５に捕捉されて収容部２内に留まり、それよりも小さい脂肪由来細胞Ｂや赤血球が第２のフィルタ５を透過して回収チューブ６内に流動する。
【００２６】
回収チューブ６の他端には、第３のフィルタ７が設けられているので、図６に示されるように、回収チューブ６内に流動した細胞懸濁液の内、比較的大きな脂肪由来細胞Ｂが第３のフィルタ７に捕捉される一方、比較的小さい赤血球は第３のフィルタ７を透過して廃液排出部１３から外部に排出されるようになる。これにより、所望の脂肪由来細胞Ｂが濃縮された状態で第３のフィルタ７上に残るので、回収チューブ６に設けられたピンチバルブ８を閉じた上で、図７に示されるように、容器３を水平な軸線Ｃ回りに再度回転させて反転させ、第３のフィルタ７が上方に配置されるようにする。
【００２７】
この状態で、ガス供給口１２からリンゲル液を供給して第３のフィルタ７に捕捉されていた脂肪由来細胞Ｂを剥離させるとともに、窒素ガスを供給することにより第３のフィルタ７を逆洗し、ピンチバルブ８によって閉塞された回収チューブ６内に回収する。そして、回収チューブ６の第３のフィルタ７側の端部およびピンチバルブ８と容器３との間の端部（図中破線部Ｅ）を、熱により切断しながら閉塞する処理（無菌的切断処理）により切断することにより、回収チューブ６内に密封することができる。
【００２８】
このように、本実施形態に係る細胞分離装置１によれば、透孔の口径の異なる３つのフィルタ４，５，７を利用するとともに、容器３反転させるだけで液体の流動方向を切り替えて、脂肪組織Ａの洗浄、分解および脂肪由来細胞Ｂの濃縮を簡単に行うことができる。すなわち、従来、別個の容器に収容して行われていた洗浄工程、分解工程および濃縮工程を単一の装置により簡易に行うことができる。したがって、入れ替え作業を省略して操作性を向上することができる。
【００２９】
また、入れ替えを伴わないので脂肪組織Ａが収容部２内に収容されてから脂肪由来細胞Ｂが濃縮されるまでの間に、収容部２内の物質が外気に触れることがなく、細菌等の混入をより確実に防止して無菌的に処理することができるという利点がある。
【００３０】
なお、本実施形態においては、脂肪組織Ａの洗浄時に生成された廃液を第１のフィルタ４を介して廃液排出部１１から排出することとしたが、図８に示されるように、第１の開口部３ａに他の回収チューブ６′の一端を接続し、第３のフィルタ７と同等の透孔を有する第４のフィルタ１４によって他端開口部を閉塞しておくことにしてもよい。このようにすることで、第１のフィルタ４を透過した廃液が、第４のフィルタ１４を通過させられる際に、廃液内に存在している脂肪由来細胞Ｂが第４のフィルタ１４に捕捉される。これにより、洗浄中に脂肪組織から単離した脂肪由来細胞Ｂや血液由来細胞が、廃液とともに排出されてしまうことを防止して、脂肪由来細胞Ｂや血液由来細胞の回収効率を高めることができる。
【００３１】
また、本実施形態においては、フィルタ４，７の逆洗用に窒素ガスを用いたが、これに限定されるものではなく、他の不活性ガスあるいは、脂肪由来細胞Ｂに無害な任意のガスを使用することにしてもよい。
また、円筒状の容器３の両端に開口部３ａ，３ｂを設けたが、これに代えて、水平な軸線Ｃ回りの任意の位置に開口部を設けることにしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の一実施形態に係る細胞分離装置を示す全体構成図である。
【図２】図１の細胞分離装置による洗浄工程を説明する図である。
【図３】図１の細胞分離装置による洗浄工程終了後の状態を説明する図である。
【図４】図１の細胞分離装置による消化工程を説明する図である。
【図５】図４の消化工程終了後の濃縮工程を説明する図である。
【図６】図４の濃縮工程において、第３のフィルタに脂肪由来細胞が濃縮された状態を示す図である。
【図７】図４の濃縮工程において第３のフィルタ上に濃縮された脂肪由来細胞の回収方法を説明する図である。
【図８】図１の細胞分離装置の変形例を示す全体構成図である。
【符号の説明】
【００３３】
Ａ  脂肪組織
Ｂ  脂肪由来細胞
Ｃ  軸線
１  細胞分離装置
２  収容部
３  容器
３ａ  第１の開口部
３ｂ  第２の開口部
４  第１のフィルタ
５  第２のフィルタ
６  回収チューブ
６′  他の回収チューブ
７  第３のフィルタ
８  ピンチバルブ（バルブ）
９  酵素供給口
１０  洗浄液供給部
１１  廃液排出部
１２  洗浄媒体供給部
１４  第４のフィルタ
【図１】
2009038998.tif 000003
【図２】
2009038998.tif 000004
【図３】
2009038998.tif 000005
【図４】
2009038998.tif 000006
【図５】
2009038998.tif 000007
【図６】
2009038998.tif 000008
【図７】
2009038998.tif 000009
【図８】
2009038998.tif 000010