(57)【要約】【課題】  本発明は一つ又は複数のＲＮＡ分子の５’末端の塩基配列情報を得るためのそれら分子の修飾に関する。【解決手段】  ＲＮＡ分子の末端を修飾する手段と、そのような修飾されたＲＮＡ分子を、修飾されたＲＮＡ分子に由来する任意のｃＤＮＡ、すべてのＲＮＡ、又は一部のＲＮＡのクローニング、検出、塩基配列決定、増幅を目的としたｃＤＮＡの合成に用いる手段を開示する。さらに本発明は、一分子検出およびハイスループット塩基配列決定を目的とした核酸分子の増幅と同定に関係するものである。加えて、 「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列」によってその由来を印付けられた各々の分子を含むプールサンプルを調製する手段を提供する。本発明は、生物学的システムとそこで発現する遺伝子の解析研究を促進する。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
解析、ハイブリダイゼーション及び塩基配列決定のための鋳型ＲＮＡを調製する方法であって、
（Ａ）サンプル中の複数のＲＮＡ分子中における第一のグループのＲＮＡ分子の５’末端からリン酸基を除去するステップと、
（Ｂ）複数のＲＮＡ分子中における第二のグループのＲＮＡ分子について５’末端にあるＣａｐ構造をリン酸基に転換するステップと、
（Ｃ）修飾されたＲＮＡ分子を生成するため、複数のＲＮＡ分子中における第二のＲＮＡグループについて５’末端にリン酸基を持つＲＮＡ分子に共有結合により官能基を付加するステップと、
（Ｄ）第二のＲＮＡ分子のグループにおける修飾されたＲＮＡ分子を官能基を用いて固体支持体上に結合するステップと、
（Ｅ）固体支持体上に結合した修飾されたＲＮＡ分子より非修飾ＲＮＡ分子を除去するステップと
を含む方法。
【請求項２】
Ｃａｐ構造を持つＲＮＡ分子が完全長ＲＮＡ分子である請求項１の方法。
【請求項３】
ＲＮＡ分子の５’末端リン酸基をホスファターゼの酵素活性により除去する請求項１の方法。
【請求項４】
Ｃａｐ構造のリン酸基への転換が、ピロホスファターゼの酵素活性により行われる請求項１の方法。
【請求項５】
官能基をリガーゼにより脱リン酸化ＲＮＡに共有結合させる請求項１の方法。
【請求項６】
解析、ハイブリダイゼーション及び塩基配列決定のための鋳型ＲＮＡを調製する方法であって、
（Ａ）５’末端にリン酸基をもつＲＮＡ分子の５’末端に官能基を共有結合させ、サンプル中の複数のＲＮＡ分子の中で修飾されたＲＮＡ分子グループを調製するステップと、
（Ｂ）官能基により修飾されたＲＮＡを固体支持体に結合するステップと
（Ｃ）固体支持体に結合した修飾されたＲＮＡ分子から非修飾ＲＮＡ分子を除去するステップと
を含む方法。
【請求項７】
解析、ハイブリダイゼーション及び塩基配列決定のための鋳型ＤＮＡを調製する方法であって、
（Ａ）サンプル中の複数のＲＮＡ分子中におけるＲＮＡ分子の５’末端からリン酸基を除去するステップと、
（Ｂ）複数のＲＮＡ分子中における第二のグループのＲＮＡ分子の５’末端にあるＣａｐ構造をリン酸基に転換するステップと、
（Ｃ）５’末端にリン酸基を持つＲＮＡ分子の５’末端に共有結合により官能基を付加し、複数のＲＮＡ分子中において修飾されたＲＮＡ分子を調製するステップと、
（Ｄ）複数のＲＮＡ分子中においてＲＮＡ分子に少なくとも一つのプライマーをハイブリダイズするステップと、
（Ｅ）複数のＲＮＡ分子に含まれ、プライマーに結合したＲＮＡ分子に相補的な部分配列又は全体的な配列を持つ一本鎖ＤＮＡを調製するステップと、
（Ｆ）一本鎖ＤＮＡからＲＮＡ分子を除去するステップと、
（Ｇ）官能基又はそれに由来する情報を用いて、一本鎖ＤＮＡを固体支持体に結合させるステップと
を含む方法。
【請求項８】
一本鎖ＤＮＡが逆転写酵素により鋳型ＲＮＡから調製される請求項７の方法
【請求項９】
逆転写酵素が部分的又は全体的にＲＮａｓｅ  Ｈ活性を欠いている請求項８の方法
【請求項１０】
ＲＮＡの除去がアルカリ処理又はＲＮａｓｅにより行われる請求項７の方法
【請求項１１】
官能基が、部分的又は全体的にデオキシリボヌクレオチドを含み、前記官能基又はその一部がＲＮＡの除去後にＤＮＡ分子に結合されたままの状態で、ＤＮＡ分子中に二本鎖ＤＮＡ領域を形成し、前記官能基が結合分子を含み、前記結合分子がＤＮＡ分子の固体支持体への結合に用いられる請求項７の方法。
【請求項１２】
増幅、解析、ハイブリダイゼーション及び塩基配列決定のための鋳型ＤＮＡを調製する方法であって、
（Ａ）複数のＲＮＡ分子に含まれるＲＮＡ分子のグループから５’末端のリン酸基を除去するステップと、
（Ｂ）複数のＲＮＡ分子に含まれるＲＮＡ分子のグループの５’末端のＣａｐ構造をリン酸基に転換するステップと、
（Ｃ）５’末端にリン酸基を持つＲＮＡ分子に官能基を共有結合させて複数のＲＮＡ分子の中で修飾されたＲＮＡを調製するステップと、
（Ｄ）複数のＲＮＡ分子中において官能基を持つ少なくとも一つのプライマーをＲＮＡ分子にハイブリダイズさせるステップと、
（Ｅ）複数のＲＮＡ分子に含まれ、プライマーに結合したＲＮＡ分子に相補的な部分配列又は全体配列を持つ一本鎖ＤＮＡを調製するステップと、
（Ｆ）一本鎖ＤＮＡからＲＮＡ分子を除去するステップと、
（Ｇ）ＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ分子中に二本鎖ＤＮＡ領域を合成するステップと、
（Ｈ）ＤＮＡリガーゼを用いて部分的二本鎖ＤＮＡ分子の５’末端と３’末端を連結して、一本鎖環状ＤＮＡ分子を形成するステップと、
（Ｉ）ローリングサークル法を用いて一本鎖環状ＤＮＡ分子を増幅し、直線状一本鎖ＤＮＡを作成するステップと、
（Ｊ）直線状一本鎖ＤＮＡ分子を固体支持体に結合するステップと
を含む方法。
【請求項１３】
一回又はそれ以上の塩基配列決定反応により双方向性鋳型からセンス鎖とアンチセンス鎖の塩基配列情報を得る請求項１２の方法
【請求項１４】
直線状一本鎖ＤＮＡの塩基配列決定反応を双方向性鋳型から固定支持体上の定義された位置において一回又は複数回行い、前記定義された位置が他の解読配列を同じ直線状一本鎖ＤＮＡ分子と関連付けることに使用される請求項１２の方法。
【請求項１５】
解析、ハイブリダイゼーション及び塩基配列決定のための鋳型ＤＮＡを調製する方法であって、
（Ａ）複数のＲＮＡ分子中において官能基を持つ少なくとも一つのプライマーをＲＮＡ分子にハイブリダイズさせるステップと、
（Ｂ）複数のＲＮＡ分子に含まれ、プライマーに結合したＲＮＡ分子に相補的な部分配列又は全体配列を持つ一本鎖ＤＮＡを調製し、プライマーと官能基を一本鎖ＤＮＡ分子に組み込むステップと、
（Ｃ）一本鎖ＤＮＡからＲＮＡ分子を除去するステップと、
（Ｄ）官能基を用いてＤＮＡ分子を固体支持体に結合するステップと、
（Ｅ）官能基を持たないＤＮＡ分子を、官能基を持ち固体支持体に結合しているＤＮＡ分子から除去するステップと
を含む方法。
【請求項１６】
プライマーが鋳型ＲＮＡにハイブリダイズしない一部の領域を含む請求項１５の方法。
【請求項１７】
逆転写酵素を用いて鋳型ＲＮＡから一本鎖ＤＮＡを調製する請求項１５の方法。
【請求項１８】
ＤＮＡ分子に含まれる全体又は一部の塩基配列情報を得るために、固体支持体上で鋳型の一つ又はそれ以上の解読配列を得る方法。
【請求項１９】
鋳型が固体支持体に結合した修飾ＲＮＡまたはＤＮＡである請求項１８の方法。
【請求項２０】
鋳型の塩基配列決定反応を固定支持体上の定義された位置において一回又は複数回行い、前記定義された位置が他の解読配列を同じ鋳型と関連付けることに使用され、同じ鋳型より解読配列を得る請求項１８の方法。
【請求項２１】
官能基がＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列の領域を含み、異なるＲＮＡグループの混合物中において一つのＲＮＡグループをラベルする、又は異なるＤＮＡグループの混合物中においてＲＮＡに由来するＤＮＡ分子のグループをラベルする方法。
【請求項２２】
異なるＲＮＡ又はＤＮＡグループの混合物が、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列を導入後同一反応容器内で同時に処理される請求項２１の方法。
【請求項２３】
塩基配列決定反応が、異なるＲＮＡ又はＤＮＡグループの混合物中においてＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子のグループをＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列により同定するために用いられる請求項２１または２２の方法
【請求項２４】
修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡ分子が、ハイブリダイゼーション反応に用いられる請求項２１または２２の方法。
【請求項２５】
ハイブリダイゼーション反応が、異なるＲＮＡグループの混合物中においてＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列によりＲＮＡ分子グループの同定のために用いられる請求項２４の方法
【請求項２６】
ＲＮＡまたはＤＮＡ分子が混合され、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子のグループの中でＲＮＡまたはＤＮＡ分子の統計的解析を可能とするために、同一反応容器内で同時に処理される請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ゲノムは、生物の発生や恒常性の維持に必要不可欠な情報を含んでいる。生物学的現象を理解するためには、ある時点の細胞や組織で遺伝情報がどのように利用されているかを知ることが必要である。ヒト、動物または植物において、遺伝情報や関係した制御パスウェイが誤った形で使われることが疾病の原因となる例が数多く知られている。ＲＮＡの発現は、個々の細胞、組織又は生命体によって非常に多様である。そのため、限られた量の細胞からＲＮＡとＤＮＡ分子を取り出して調製できる新しい方法の開発が期待されており、このような方法が開発されれば、組織の中の個々の細胞のＲＮＡ発現、プロモーター利用及び発現しているゲノム情報を解析することができる。ライフサイエンスの新しい方向は、このような要求に取り組んでいる。個々のＤＮＡおよびＲＮＡ分子を捕捉、解析し、遺伝子ネットワーク研究のような生物学的システム全体を理解するための技術の開発が進められている。
【背景技術】
【０００２】
［遺伝子発現解析］
発現プロファイリングや転写物の注釈付けには、種々の方法が用いられている。簡単に言うと、最近の大規模発現研究にはマイクロアレイのようなｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる方法、あるいはＳＡＧＥ、ＣＡＧＥ、ＭＰＳＳなどの短いタグの高速塩基配列による方法が用いられている。このような研究では、個々の遺伝子の発現レベルを調べるために、さらにノーザンブロッティングやＲＴ−ＰＣＲなどの従来の方法が組み合わせて用いられる。
【０００３】
大規模な発現プロファイリングには、通常、ＤＮＡマイクロアレイ(Ｊｏｒｄａｎ  Ｂ．，  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ: Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ-Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 ２００１： Ｓｃｈｅｎａ Ａ，ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ １９９９、これらは、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする) と呼ばれる技術が用いられている。この実験では、個々の遺伝子や転写物に対応するプローブを支持体上に固定し、そこに種々のＤＮＡ分子をハイブリダイズさせて行なわれる。ポジティブ信号は、支持体上に固定されたプローブとサンプル中の分子が反応した場合に得られる。これらの実験は、多数の遺伝子又は転写物を同時並行的に解析できるが、その反面、解析の対象が、他の実験や手段によって同定された遺伝子や転写物に限られるという制限がある。このような実験や手段は、ｃＤＮＡライブラリーや部分的に塩基配列がわかっているタグ、およびコンピューターによる予測結果を含む。将来的には、タイリングアレイによって、ゲノムの塩基配列が判っている生物の偏りのない発現プロファイリングが可能となる（Ｋａｐｒａｎｏｖ Ｐ． ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６，９１６−９１９，２００２、本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）であろうが、しかし、実験から得られる転写物の性質についてはタイリングアレイでの解釈は困難である。
【０００４】
ＤＮＡマイクロアレイによる解析が持つ問題を解決するために、複数のＲＮＡサンプルより得られる部分シーケンスやタグをベースとした発現プロファイリングや遺伝子探索が行われている。いわゆるＳＡＧＥ(Ｓｅｒｉａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ)法は、ｍＲＮＡの塩基配列から効率的に情報を得る方法として知られている（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ Ｖ．Ｅ． ｅｔ ａｔ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０，４８４−４８７，１９９５、本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする)。タグの塩基配列決定をハイスループットに行うために、この方法では、複数のＲＮＡサンプルの３’末端の塩基配列情報を含む短いＤＮＡフラグメント（当初は約１０塩基対）をつなぎ合わせてコンカテマーを作る。このコンカテマーの一回の塩基配列解析により、ＤＮＡコンカテマーに含まれる異なるＲＮＡ分子から得られるたくさんのタグの塩基配列を決定することができる。最近、ＳＡＧＥ法の一つであるＬｏｎｇ ＳＡＧＥ法が発表され、長いタグをクローニングすることが可能となった（Ｓａｈａ Ｓ． ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，５０８−１２，２００２、米国特許出願２００３０００８２９０号、米国特許出願２００３００４９６５３号、これらは、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする)。この概念は「Ｓｕｐｅｒ  ＳＡＧＥ」と呼ばれる方法に発展し、２５塩基対程度のタグの塩基配列を得ることができる（Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７，１１−１８，２００５、本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）。ＳＡＧＥ法は現在、生物、組織、特定の細胞などの遺伝子発現を解析する重要な手法として広く用いられており、このタグの情報は例えばｈｔｔｐ：／／ｃｇａｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＡＧＥで公開されている。最近のＳＡＧＥ研究の発展に関する情報は、Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｍ．：ＳＡＧＥ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｏｒｗｉｃｈ（２００５）（本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）で参照できる。
【０００５】
米国特許第６，３５２，８２８号、米国特許第６，３０６，５９７号、米国特許第６，２８０，９３５号、米国特許第６，２６５，１６３号、米国特許第５，６９５，９３４号（これらは、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）では、短いタグ配列を大規模に塩基配列決定する別の方法が開示されている。Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｒｌ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＭＰＳＳ）と呼ばれるこの方法は、Ｂｒｅｎｎｅｒらによれば（Ｂｒｅｎｎｅｒ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １８，６３０−６３４，２０００、Ｂｒｅｎｎｅｒ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７，１６５５−１６７０，２０００、これらは、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）、単層のビーズ上で異なる酵素を使ってサイクル反応を行ない、転写物の３’末端の短い塩基配列を超並列に得る方法である。ＷＯ０３／０９１４１６（本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）では、この方法の改良が開示されており、転写物の５’末端の短い塩基配列を決定することが出来るようになった。しかし、その初期の様態では、ＭＰＳＳはシグニチャータグの解読塩基長の短さのため限定された方法である。
【０００６】
３’末端塩基配列情報から５’末端塩基配列情報へのシフトは、それが技術的にはより難度が高いものであるが、発現情報と転写の調製原理を結びつけるために不可欠なものである。遺伝子発現の制御をする一般的な調節因子は転写物の５’末端近くに存在し、その遺伝子のプロモーターと呼ばれている。選択的プロモーターの利用や、ＲＮＡプロセッシング、スプライシングによる一次転写物の再構成により、高等動物では大部分の転写物のプロモーター領域を３’末端の情報から特定することは出来ない。従って、転写物の５’末端から特異的に配列タグを得る新しいアプローチが開発されてきたのである。そのようなアプローチはＰＣＴ／ＪＰ０３／０７５１４、Ｓｈｉｒａｋｉ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００，１５７７６−１５７８１（２００３）、Ｋｏｚｄｉｕｓ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄ  ３，２１１−２２２（２００６）、米国特許出願番号２００５０２５０１００号（これらは、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に開示されている。この方法はＣＡＧＥ（Ｃａｐ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）法とよばれ、転写物の５’末端から特異的に得たタグ配列をＳＡＧＥ法と同様にコンカテマーにしてクローニングする方法である。この方法により得られるＣＡＧＥタグは、転写物の検出や発現プロファイリングだけでなく、転写開始点の情報を得るために利用され、転写調節のメカニズム解析や転写物の高度な注釈付けを行なうことができる。同様の５’末端の塩基配列情報をコンカテマーにしてクローニングするアプローチが、最近いくつもの研究室より発表されている。例えば、Ｈｗａｎｇ  Ｂ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１，１６５０−１６５５（２００４）；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２，１１４６−１１４９（２００４）；Ｚｈａｎｇ  Ｚ．ａｎｄ  Ｄｉｅｔｒｉｃｈ  Ｆ．Ｓ．，Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３，２８３８−２８５１（２００５）；Ｗｅｉ  Ｃ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１，１１７０１−１１７０６（２００４）（これらの文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）などが挙げられる。これらのアプローチは、すべて５’末端を捕獲する方法に特徴がある。例えば、Ｃａｐ−Ｔｒａｐｐｅｒ又はＯｌｉｇｏ−Ｃａｐｐｉｎｇなどの方法である。５’末端タグの意義に関する詳細は、Ｈａｒｂｅｒｓ  Ｍ．ａｎｄ  Ｃａｒｎｉｎｃｉ  Ｐ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２，４９５−５０２（２００５）（本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に記載されている。
【０００７】
前述のアプローチは、タグの塩基配列決定の処理量の点で今もなお制限がある。さらに、それらのアプローチは、多くの操作を必要とするためコンカテマーより得られる塩基配列情報に間違いが起きる可能性がある。特に、増幅のステップにおいて、個々のＤＮＡ断片の異なる増幅効率に起因するタグ頻度のバイアスや人為的な影響が発生する可能性がある。これらの制限を解決するために、不必要に複雑な操作やクローニングステップを省くためのＤＮＡおよびＲＮＡ分子の直接的捕獲と、よりハイスループットなデータ収集とを目的としたさらなる開発が必要とされている。
【０００８】
［塩基配列決定技術］
遺伝コードの読み取りと解読はライフサイエンスの最も大きな発展の一つである。塩基配列決定技術は遺伝情報を得るための重要なキーとなってきている。当業者が知り得る塩基配列情報を得る手段としては、Ｓａｎｇｅｒ法やＭａｘｉｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法のようなＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｕｅｌｌ  Ｄ．Ｗ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）（本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に記載された方法が挙げられるが、これに限定するものではない。近年、ハイスループット塩基配列決定の新しい技術が開発された。電気泳動、ハイブリダイゼーションによる塩基配列決定、合成による塩基配列決定、ＭＰＳＳ塩基配列決定、非酵素的一分子塩基配列決定などの利用が挙げられる。例えば、ハイブリダイゼーションによる塩基配列決定では、決められた塩基配列のオリゴヌクレオチドセットが載っている高密度マイクロアレイを用い、ハイブリダイゼーションのパターンによって未知配列の新たな塩基配列決定を行うことができる。例えば、Ｐｅｒｌｅｇｅｎは、このような方法をヒトゲノム中の点突然変異解析に用いた。また、合成による塩基配列決定方法は、鋳型ＤＮＡに沿ってＤＮＡ分子が伸長する間にポリメラーゼがヌクレオチドを結合させることによって行われる。表面上で決められた位置に個々のヌクレオチドが結合するのをモニターし、さらにそれぞれの位置で引き続き結合するヌクレオチドを順番に見ることで、それぞれの位置にある核酸分子の塩基配列を決定する。非常に大量の伸長反応がひとつの反応器のなかで起こるため、例えばビーズアレイのガラススライド表面上では、使用する機器によって１００、０００から１、０００、０００種のサンプルを、一反応で並行的に塩基配列決定にかけることができる。とりわけ興味深いのは、本発明のＤＮＡの一分子検出と塩基配列決定への応用であり、最近、Ｍｅｔｚｋｅｒ  Ｍ．Ｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１５，１７６７−１７７６（２００５）；  Ｋｌｉｎｇ  Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３，１３３３−１３３５（２００５）；  Ｓｈｅｎｄｕｒｅ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５，３３５−３４４（２００４）（これらの文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に記載されている。これらアプローチのうちいくつかは、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．４５４．ｃｏｍ／）、  Ｈｅｌｉｃｏｓ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｅｌｉｃｏｓｂｉｏ．ｃｏｍ／）、Ｓｏｌｅｘａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｏｌｅｘａ．ｃｏｍ／Ｃｏｍｐａｎｙ／ｏｖｅｒｖｉｅｗ．ｈｔｍ）、Ｖｉｓｉｇｅｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｉｓｉｇｅｎｂｉｏ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）、ＧｅｎｅｏＶｏｘｘ  ＧｍｂＨ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｖｏｘｘ．ｄｅ／）（これらは、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）のような企業により商業的に利用されている。このような新しい技術は、現在の塩基配列決定速度を飛躍的にあげるであろう。使用する方法によっては、２０から２５塩基対の非常に短いタグ配列を、１ランあたり１，０００，０００種以上読むことができるという超ハイスループットの機器（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｓ、Ｓｏｌｅｘａなど）もある。また、４５４Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社の機器ははるかに長い１００塩基対以上の解読長を１ランあたり２００，０００から３００，０００種解読することができる。
【０００９】
［完全長ｃＤＮＡ分子の単離］
生物サンプルのＲＮＡを解析では、完全長ＲＮＡ分子を単離し、そのＲＮＡからｃＤＮＡを調製することにより大きな利益を得ることができる。特に、前述のようにＲＮＡの５’末端の塩基配列情報は、データの幅広い解析を可能とする。さらに、完全長ｃＤＮＡ技術はＲＮＡのプロセッシングやスプライシングに関係したプロセスを解析するためには、必須である。最近の種々の実験より得られたデータは、高等動物の複雑性がゲノム情報の選択的な利用によるものであることを示している。転写情報における組み合わせの再構成とプロセッシングのメカニズムは、遺伝プールの拡大と多様化に重要である（Ｚａｖｏｌａｎ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １３，２００３，１２９０−１３００、本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）。
【００１０】
完全長ｃＤＮＡを調製する種々の方法は、Ｄａｓ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６，５７−８０（２００１）（本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に記載されている。これらの中から、Ｃａｐ−Ｔｒａｐｐｅｒ法とＯｌｉｇｏ−Ｃａｐｐｉｎｇ法は、当業者が知り得る他の方法の中でも最も頻繁に使用されている。これらのアプローチは、ゲノム、転写物の構造、タンパク質配列の解析の手段として利用されてきた。さらに、完全長ｃＤＮＡだけがそれにコードされたタンパク質へとつながる手段であり、実験において必要とされるとき、あるいは産業応用に際して、機能的ベクターを使ってタンパク質を発現させることができる。
【００１１】
Ｃａｐ−Ｔｒａｐｐｅｒ法（Ｃａｒｎｉｎｃｉ  Ｐ．ａｎｄ  Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ  Ｙ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ３０３，１９−４４，１９９９；米国特許第５，９６２，２７２号、米国特許第６，０２２，７１５号、これらの文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）では、Ｃａｐ構造のジオール基を化学的にビオチン化し、ｍＲＮＡとｃＤＮＡの複合体をストレプトアビジンでコートしたビーズで捕獲する。残っているｔＲＮＡ、およびＲＮＡタンパク質などの一本鎖ＲＮＡと部分的にＤＮＡ−ＲＮＡがハイブリダイズしている複合体は、ＲＮａｓｅＩ分解によって破壊されるが、ｍＲＮＡとｃＤＮＡの複合体は分解されない。その後、濃縮された完全長ｃＤＮＡはＲＮＡの加水分解によってビーズより遊離する。
【００１２】
代替法となるＯｌｉｇｏ−Ｃａｐｐｉｎｇ法では、まずｍＲＮＡの５’末端を修飾する（Ｍａｒｕｙａｍａ  Ｋ．ａｎｄ  Ｓｕｇａｎｏ  Ｓ．，Ｇｅｎｅ  １３８，１７１−１７４，１９９４；Ｓｕｚｕｋｉ  Ｙ．Ｓｕｇａｎｏ  Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２２１，７３−９１，２００３、これらの文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）。最初のステップで、ＣａｐされていないｍＲＮＡと切断されているｍＲＮＡより脱リン酸化酵素によってリン酸基を除去し、次にタバコ酸ピロホスファターゼ処理によってｍＲＮＡのＣａｐ構造を取り除く。この処理により、完全長ｍＲＮＡのみが、リン酸化された５’末端を持つことになる。そのため、ＲＮＡリガーゼによりリン酸化された完全長ｍＲＮＡの５’末端にのみ、オリゴヌクレオチドを結合させることができる。ｍＲＮＡの５’末端に結合したオリゴヌクレオチドは、例えば第二鎖ｃＤＮＡの合成など、その後ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡの操作に利用することができる。
【００１３】
完全長ｃＤＮＡを選択するその他の方法には、Ｃａｐ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎを利用する方法（Ｅｄｅｒｙ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １５，３３６３−３３７１，１９９５、本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）、Ｃａｐ構造に対する抗体を利用する方法（Ｔｈｅｉｓｓｅｎ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｂｏ  Ｊ  ５，３２０９−３２１７（１９８６）、本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）、Ｃａｐ構造にオリゴヌクレオチドを結合させる方法（米国特許第５，９６２，２７２号、米国特許第６，０２２，７１５号、これらの文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｃｌｏｎｔｅｃｈ／ｓｍａｒｔ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ、ここに記載された情報は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）のＳＭＡＲＴ（商標）法などがある。しかし、Ｃａｐ−Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ法（Ｚｈｕ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３０，８９２−８９７，２００１、本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）を使うＳＭＡＲＴ（商標）法は、ｍＲＮＡの５’末端にＧＧＧという３つのヌクレオチドを追加するので、タグ部分の情報の長さを短縮させることになり、特に、塩基配列決定の場合には、解読長が非常に短いものとなってしまうため、５’末端タグのクローニングには好ましくない。
【発明の開示】
【００１４】
本発明は、一つ又は複数のＲＮＡ分子の５’末端の塩基配列情報を得るためのＲＮＡ分子の修飾に関するものである。本発明は、ＲＮＡ分子の修飾に関するものであり、ＲＮＡ分子に加えられた情報は解析および操作に用いられる。
【００１５】
本発明は、ＲＮＡおよびＤＮＡ分子、又はそれらの断片を取り出し一分子検出と塩基配列決定を行う手段を提供する。本発明は、新しい一分子検出のアプローチに必要な個々の分子を捕獲する手段を提供する。本発明は、ＲＮＡ分子およびそれに由来するＤＮＡ分子を、それら分子の特定の領域の塩基配列情報を得るために修飾する。従って、本発明は新しいハイスループット塩基配列決定方法とその応用手段、例えば発現プロファイリング、転写物特性解析、ゲノム注釈付、さらに解析するためのクローニング、その他従来の方法などへの応用手段を提供する。特に、本発明は重要な研究に手段を提供する。重要な研究とは、例えば５’末端特異的塩基配列に基づいた発現プロファイリングであり、これは法医学、診断、創薬、ライフサイエンスを含むが、これに限定されない商業的応用、試薬、サービスには不可欠な要素である。
【００１６】
一つの実施態様では、本発明は、天然又は人工的な一つ又は複数のＲＮＡ分子をｃＤＮＡに転写的に転換することに関係する。よって、本発明は一本鎖ＤＮＡ分子の合成と調製に関係するものであり、検出と解析を目的とした核酸分子の断片の単離方法に関係するものである。さらに、本発明は単一又は複数の種類の核酸分子を含むＲＮＡサンプルのＤＮＡ分子への転換に関係するものである。
【００１７】
別の実施態様において、本発明は核酸分子を直線状一本鎖ＤＮＡの形に調製するために核酸分子を操作する方法に関係するものであり、また、ＲＮＡから複写された直線状一本鎖ＤＮＡの操作、調製に関係するものである。
【００１８】
別の実施態様において、本発明はＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子の末端に官能基を付加する手段を提供する。よって本発明は官能基を用いて、操作と解析のためにＲＮＡとＤＮＡ分子を捕獲する手段を提供する。この実施態様において、本発明は解析、検出、塩基配列決定を目的とした核酸一分子の単離に関係するものであり、一分子検出とハイスループット塩基配列決定の鋳型調製の手段を提供する。
【００１９】
別の実施態様において、本発明は一本鎖ＤＮＡ分子を直接的にその塩基配列情報を得るために用いる方法に関係するものであり、また一本鎖ＤＮＡ断片の特定した領域の塩基配列情報を得ることに関係するものである。ある実施態様において、本発明によって調製されたＤＮＡ断片から得られた５’末端特異的塩基配列情報は、ＲＮＡ分子の５’末端塩基配列と関係するものである。このように本発明は、ＲＮＡ分子の塩基配列情報の取得に関係するものである。
【００２０】
別の実施態様において、本発明は、ＲＮＡに由来するＤＮＡ分子の反対側の末端を修飾する手段を提供する。この場合、ＲＮＡの５’末端に対応する末端およびＲＮＡの３’末端に対応する末端への修飾は、官能基または後のＤＮＡ分子の操作、検出及び解析のための機能を持った基の導入である。一つの実施態様においては、ＲＮＡの３’末端に対応する末端に官能基が導入され、それを表面上に結合させることによりｃＤＮＡを捕獲する。一つの実施態様においては、本発明に沿って調製されたＤＮＡ断片より得られた３’末端特異的な塩基配列情報は、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子の末端塩基配列に関係する。別の実施態様においては、ｃＤＮＡ分子がＬＡＭＰ法またはローリングサークル法によって増幅され得るようにｃＤＮＡ分子の両末端が修飾される。
【００２１】
別の実施態様において、本発明は、ＲＮＡの５’末端にある「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列」と呼ばれる、規定された塩基配列の領域を導入する手段を提供する。そのようなＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列は、分子の由来を特定する。従って、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列の導入により、由来の異なるサンプルからなるサンプルプールを解析することが可能となる。そのような異なる由来は、用いられる異なる細胞系、組織、器官または異なる発生段階、実験上の多様な時点などに関係する。別の実施態様において、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列は、本発明に従って調製された分子から得られる塩基配列の一部分である。別の実施態様において、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列は、この配列を持つ分子を検出、解析または塩基配列決定を目的として表面上の特定の位置に捕獲するために用いられる。別の実施態様において、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列は、プールされたサンプルの複数の分子の中から一つの分子の塩基配列決定をプライミングするために用いられる。前述の実施態様と同様に、本発明は、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列をＲＮＡの５’末端だけでなくＲＮＡの３’末端に相当するｃＤＮＡの領域に導入する手段を提供する。Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列の利用は、ＲＮＡの５’末端に限定されることなく、実験的な必要性に応じてＲＮＡに由来するｃＤＮＡのいずれの末端でも用いることができる。
【００２２】
本発明は、統計的解析を含むコンピューターによる注釈付や参照情報に対するアライメントによる注釈付、およびゲノム配列に対するマッピングなどを目的とし、本発明に従って得られたＤＮＡ断片のある領域の塩基配列決定に関係するものである。従って、本発明は、遺伝子探索、遺伝子同定、遺伝子発現プロファイル、およびそれらの注釈付の手段に関係するものである。
【００２３】
別の実施態様において、本発明は、本発明に沿って得られたＤＮＡ断片の塩基配列決定に関係し、それらの配列がゲノムの領域に関するものである場合には、その配列のコンピューターを用いた注釈付を可能にする。またＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列の解読、塩基配列の統計的解析を可能とする。よって本発明は、転写開始位置に関連して遺伝的要素の特性解析に関係するものである。
【００２４】
さらに別の実施態様において、本発明は核酸の末端より得られるハイブリダイゼーションプローブの調製に関係するものであり、その領域はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いて解析される。好ましい実施態様においては、そのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの実験は、タイリングアレイを用いて行われる。
【００２５】
また実施態様において、本発明は、本発明に従って得られたＤＮＡ断片の塩基配列情報が増幅される方法を用いた、核酸分子の完全長クローニングに関係するものである。ゲノム断片と同様に転写された領域のクローニングや増幅も本発明に含まれる。そのような断片は、プロモーター領域を含んでも良い。
【００２６】
従って、本発明は、例えば生物学的サンプルの特性解析のような必要に応じて、核酸分子やその短い断片を解析する手段を提供する。さらに、本発明は、迅速で効率的なＲＮＡやＤＮＡ断片の解析および塩基配列解析を行い、それら断片の一分子検出のような分析的検定を行う手段を提供する。よって、本発明は、特にハイスループット塩基配列決定や固体支持体上でのＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子の並列的検出に適している。
【００２７】
特にある実施態様では、本発明は環状一本鎖ＤＮＡに転換可能なＤＮＡの修飾による双方向的な鋳型構築に関係するものである。ＲＣＡ反応により環状一本鎖ＤＮＡ分子の増幅を行った後、双方向性の直線状一本鎖ＤＮＡ分子を得て、固体支持体上の規定された位置に直接結合させることができる。本発明は、同じ鋳型から複数の解読塩基配列を得ることを可能とするもので、規定された位置により種々の解読配列を同じ鋳型に関連付けることができる。双方向的直線状一本鎖ＤＮＡ分子を鋳型として用いることにより、修飾されたＤＮＡ分子の両鎖又はＲＮＡ分子の両端の配列情報を同じ鋳型から得ることができる。
【００２８】
本発明は、ライフサイエンス研究や診断に利用する分析的検定をデザインし実行する手段を提供する。それゆえ、本発明は生物学的システムの解析又は診断の手段に関係するものである。
【００２９】
本発明はまた、実験的な条件を充足させるため必要とされる本発明の部分的、又は全部の実行のための試薬やキットの製造およびデザインの手段を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明は、直線状と環状の核酸分子の形状である二本鎖核酸と一本鎖核酸の処理を行う方法を含む。二本鎖ＤＮＡとは、デオキシヌクレオチドから構成される二つの分子から成り、二つの分子が、実質的に互いに相補的な配列を持ち二量体を形成するように対合する任意の核酸分子を含む。二つのポリマーは、デオキシヌクレオチドの対応する塩基対の間で特有の水素結合によって結合している。二つもしくはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドにより形成される一つのポリマー鎖で構成され、対合する相補的なＤＮＡ分子がない任意のＤＮＡ分子も、本発明の目的によれば一本鎖ＤＮＡ分子とみなされる。そのような分子が二次元構造を形成し、二本鎖ＤＮＡの部分を含んでいる場合も同様である。互換性をもって用いられる「核酸分子」や「ポリヌクレオチド」の語句は一本鎖であるか二本鎖であるか、コーディングがノンコーディングか、相補的かそうでないか、センスかアンチセンスかによらずＲＮＡやＤＮＡを含み、またハイブリッド配列も含む。特に、ゲノムＤＮＡや相補的ＤＮＡを含み、それらは転写されることもされないこともあり、スプライスされることもされないこともあり、不完全なスプライシング又はプロセッシングを受けることもあり、その由来にはよらず、生物学的材料からクローニングされることもあり、あるいは合成によっても得られる。本発明の目的において、ＲＮＡとは、一本鎖の核酸分子であり、たとえ二次構造をとって二本鎖ＲＮＡを形成している部分があったとしても同様である。特に、本発明の目的においてＲＮＡはリボヌクレオチドで構成される任意の形状の核酸分子を含み、特定の塩基配列や由来とは関係ない。従って、ＲＮＡはｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで人工システムによって転写されても良いし、翻訳されなくても、スプライスされてもされなくても、不完全にスプライス又はプロセッシングを受けても良く、天然由来か人工的にデザインされた鋳型から生成されたかどうかは関係ない。それらは合成によって得られたｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡi、又はそれらの任意の混合物も含む。ＲＮＡは生物学的サンプル、あるいはより具体的には、血液や血清のような生物学的由来の液体から生成されても良い。例えば、ウイルスＲＮＡ又は個々の人の血液にあり得る他の寄生生物を含んでも良い。あるいは、ＲＮＡは、解剖された組織よりフローソートされた細胞を含む精製細胞から得ても良く、それら細胞はセルソートのための蛍光を発する抗体でラベルされていても良い。あるいは、当業者が知り得る手段を用いて、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のようなマーカーのトランジェニック発現によりラベルされても良い。他の方法として、これらの細胞は形態に基づいて選ばれることもでき、あるいはレーザーによるマイクロダイゼクションによって選ばれることも出来る。さらに正確には、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、「核酸」、「塩基配列」の表現は核酸材料そのものを含み、また塩基配列情報やベクター、ファージミド、又はその他の特定の核酸分子に限定されるものではない。「核酸」という語句は、また、本明細書では天然に存在し得る核酸、人工的に合成された又は調製された核酸、当業者の知り得る方法によって���るいは天然に発生する事象によって、少なくとも一つ又はそれ以上の修飾が導入された修飾核酸を含む。同様に、本発明の「タグ」または「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列」とは本発明によって調製される核酸分子の任意の領域でも良く、ここでいう「タグ」または「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列」とは、任意の核酸フラグメントを含み、由来が天然の事象により発生したものでも良く、人工的に合成又は調製されたものでも良く、また天然の事象によりあるいは当業者が知りえる方法により少なくともひとつの修飾が導入された核酸でも良い。さらに、「タグ」または「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列」は、特定の塩基配列情報や構成に関係するものではない。本発明においては、「純度」、「濃縮された」、「精製」、「濃縮」、又は「選択」という語句は、置換可能であり、生成物の絶対的な純度や濃縮を必要とするものではなく、むしろ、相対的な意味で用いられる。本発明において、「特異的」、「好ましい」、「優先的」という語句は、置換可能であり、ＤＮＡ又はＲＮＡのハイブリダイゼーションにおいて、絶対的な特異性や酵素の基質に対する特異性、反応を意味するものではなく、むしろ、相対的な意味で用いられ、酵素がその基質と関係したあるいは無関係の他の物質に対して低い、あるいは比較してより低い親和性を持つという意味も含まれる。同様に、酵素、又は酵素活性という語句は、本発明においては要素の機能や活性を表し、要素の絶対的な純度を必要とするものではない。従って、酵素若しくは同等の、又は関連した若しくは関連しない機能を持つ要素を含む混合物も本発明の対象となる。同様に、本発明におけるＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子は、ハイブリダイゼーションプローブとして機能することもでき、本発明の目的のために相補的配列を含んでも良い。相補配列を含むＤＮＡ又はＲＮＡは、関連する核酸分子を検出するためのプローブとして実験に使用することもでき、さらにそのようなプローブとターゲット分子は、異なる位置に突然変異を人工的又は自然発生的に導入することにより区別する実験に使用することもできる。「生物学的サンプル」とは、微生物、動物、植物、宿主に依存して複製するウイルスやプリオンなどの感染性粒子など、生物体から得られるあらゆる材料を含む。このような「生物学的サンプル」は、研究、開発、診断、治療などを目的として、患者、動物、植物、感染粒子から得られたあらゆる材料を含む。従って、本発明は特定の核酸分子又はその由来に限定されることはなく、本発明は、あらゆる核酸の操作、利用、応用のために普遍的な手段を与える。本発明に適用される核酸分子は、当業者が知りえる任意の方法によって調製、入手することができ、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ Ｊ． ａｎｄ  Ｒｕｓｓｕｅｌｌ Ｄ．Ｗ．  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１、本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）らの方法により得ることができるが、これに限定されるものではない。
【００３１】
本発明は、核酸分子より検出と解析のためにフラグメントを単離する方法に関するものである。この核酸分子の解析は、核酸分子の全体的又は部分的な塩基配列情報を得ることを含むが、これに限定されるものではない。当業者が知り得る塩基配列情報を得る方法は種々あり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｕｅｌｌ  Ｄ．Ｗ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）に記載されており、また従来技術として記載した新しく発展してきたハイスループット技術が含まれるが、これに限定されるものではない。本発明は、ある特有の塩基配列決定方法や技術への利用に限定されず、実験の条件に最も適した形やあるいは分野の新しい発展に適応した形で解析や検出をおこなうためにＲＮＡやＤＮＡを操作する汎用的な技術を提供する。
【００３２】
塩基配列決定反応を含む解析、検出又は操作のために、核酸分子は固体支持体上に結合されても良い。固体支持体は、要素が直接又は間接的に結合できる任意の固体材料でも良い。そのような材料はアクリルアミド、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、金、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキサイド、ポリシリケート、テフロン、フッ化炭素、ナイロン、シリコンゴム、ポリアンハイドライド、ポリグリコール酸、ポリ酢酸、ポリオルトエステル、機能性シラン、ポリプロピルフマル酸、コラーゲン、グリコサミノグリカン、ポリアミノ酸、またはそれらの混合物が含まれるが、これに限定するものではない。固体支持体はさらに、薄いフィルム、膜、ビン、皿、繊維、編まれた繊維、チューブ状、粒子状、ビーズ状、微粒子状などに成形されたポリマー、またはそれらの組み合わせを含む。
【００３３】
本発明は、ひとつ又はそれ以上の核酸分子を含むサンプルの転換に関するものである。そのような核酸分子又は核酸分子の混合物は、ＤＮＡに転換される。本発明を実施するために、核酸分子は、自然にあるゲノムＤＮＡ、ＲＮＡサンプル、人工的に作られたＤＮＡライブラリーから得ることができ、またそれらの任意の混合物でも良い。本発明は、単独又は任意の複数の核酸分子への適用に限定されるものではなく、核酸分子が単独であっても、複数であっても良く、自然発生的におきるか、あるいは既存のライブラリーから得られるか、あるいは人工的に作製されるかによらない。さらに、本発明は、その由来や性質に関わらず、あらゆる核酸分子を処理することができる。従って、自然事象によって得られる核酸分子でも完全長分子であっても良く、それらの断片でも良い。さらに、それらの核酸分子の断片は、ランダムなプロセスによって、あるいはある特定の塩基配列に作用する酵素を用いて核酸分子のターゲットを絞った方法によって、あるいは転写領域の中のエクソン、イントロンなどの核酸分子の構造をもとに断片化する方法によって調製することができるが、これに限定されるものではない。従って、本発明は、特定の出発材料に限定されるものではない。
【００３４】
本発明は、プールされたＲＮＡ分子の中のＲＮＡ分子、又は一つのＲＮＡ分子の５’末端に官能基および塩基配列情報を導入するために、一つ又は複数のＲＮＡ分子を修飾することに関係するものである。そのような官能基は、１、３、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２５、２５〜３５、３５〜４５または４５以上のヌクレオチドを含んでも良い。よって、本発明は、ＲＮＡ分子の操作および解析や修飾されたＲＮＡの調製や解析に用いられるＲＮＡ分子に情報を付加するために行うＲＮＡの修飾に関係するものである。
【００３５】
当業者が知り得る酵素的又は化学的なＲＮＡの修飾方法は、種々ある。好ましくは、本発明を実施するためには、ＲＮＡの酵素反応による修飾が望ましく、そうすることにより異なる酵素反応を用いてＲＮＡのグループ中において標的とする特定のＲＮＡの修飾を行うことができる。さらに好ましくは、トータルＲＮＡの中のｍＲＮＡ分子が優先的に修飾を受け選択的な濃縮が可能となる。しかしながら、本発明は、ｍＲＮＡの解析に限定されることなく、解析と検出のためにＲＮＡを捕獲する汎用的な手段を提供する。ｍｉＲＮＡやほかの短いＲＮＡ分子のような全く新しいＲＮＡの種類を特定の修飾と解析の対象とすることができる最近の研究の結果がＡｌｖａｒｅｚ−Ｇａｒｃｉａ  Ｉ．ａｎｄ  Ｍｉｓｋａ  ＥＡ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３５，４６５３−４６６２（２００５）（本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に示されている。
【００３６】
本発明を実施するために、標的とするＲＮＡは３つの概念的に異なるステップの対象とされる。（１）非完全長ｍＲＮＡ分子のマスキング、（２）分子に含まれるＣａｐ構造の反応分子への転換、（３）標的とするＲＮＡの５’末端への標的ＲＮＡ分子の付加の３つのステップである。ｍＲＮＡの５’末端へＲＮＡオリゴヌクレオチドを付加する標準的な方法は、Ｏｌｉｇｏ−Ｃａｐｐｉｎｇ法（Ｍａｒｕｙａｍａ  Ｋ．  ａｎｄ  Ｓｕｇａｎｏ  Ｓ．，Ｇｅｎｅ  １３８，１７１−１７４，１９９４；Ｓｕｚｕｋｉ  Ｙ．  ａｎｄ  Ｓｕｇａｎｏ  Ｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２２１，７３−９１，２００３、これらの文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）と呼ばれるものおよびその改変法がある。生きた生物からのＲＮＡ調製は、完全長ｍＲＮＡの５’末端にあるＣａｐ構造により特徴付けられるＲＮＡ種を含む。このＣａｐ構造によって、Ｃａｐ構造を欠き、そのかわりに自由なリン酸基を５’末端に含んでいる切断されたＲＮＡ種から区別することができる。Ｏｌｉｇｏ−Ｃａｐｐｉｎｇ法は、完全長ｍＲＮＡの独特な性質を選択的な濃縮に用いるものである。Ｏｌｉｇｏ−Ｃａｐｐｉｎｇ法は、プールされたＲＮＡ中においてｍＲＮＡを特異的に修飾するいくつもの酵素的ステップを含む。最初の酵素反応により、Ｃａｐ構造を持たない切断されたｍＲＮＡや小さいＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡなどがホスファターゼにより５’末端を脱リン酸化される。次に第二の反応により、Ｃａｐ構造を持つｍＲＮＡからタバコ酸ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）によりＣａｐ構造を除去する。この処理により、完全長ｍＲＮＡのみが５’末端にリン酸基を持つことになる。よって、第三の酵素反応においてＲＮＡリガーゼは、完全長ｍＲＮＡのリン酸化された５’末端にのみ、オリゴヌクレオチドを付加することができる。
【００３７】
第一の反応ステップでは、ＲＮＡの５’末端からリン酸基を除去することが可能な任意のホスファターゼを使用することができる。さらに具体的には、ホスファターゼはバクテリアアルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）、エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）、Ａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼの中より選ばれる。同様に本発明を実施するために異なるホスファターゼが用いられても良く、また最も一般的には、タバコ酸ホスファターゼ（ＴＡＰ）がＣａｐ構造の除去に用いられる。ＲＮＡのライゲーションステップでは、リン酸化ＲＮＡにＤＮＡおよびＲＮＡオリゴヌクレオチドを連結できる任意のＲＮＡリガーゼを使用することができる。最も一般的には、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼまたはサーモファージ一本鎖ＤＮＡリガーゼがこの反応に用いられる。サーモファージ一本鎖ＤＮＡリガーゼは商業的に入手可能であり、一本鎖ＤＮＡとＲＮＡのどちらにも使用できる（この酵素のより詳細な情報は、製品情報に記載されている。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｋａｒｉａ．ｃｏｍ／ｕｐｌｏａｄ／ｆｉｌｅｓ／Ｔｈｅｒｍｏｐｈａｇｅ−ｓｓＤＮＡ−ｌｉｇａｓｅ−ｖｅｒｓｉｏｎ−４−２．ｐｄｆ（本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）。よって、この酵素はＲＮＡに直接ＤＮＡを連結させるために好ましい。このように本発明は、ＲＮＡに直接ＤＮＡを連結し、デオキシリボヌクレオチドまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドとリボヌクレオチドまたはＲＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む直線的ヘテロポリマーを調製することができる。
【００３８】
当業者が知り得る本発明を実施するために用いられるＯｌｉｇｏ−Ｃａｐｐｉｎｇ法の改変法は種々ある。最も好ましくは、本発明は、特許出願２００６−１０６７７０号（本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に開示されているような一つの反応容器中ですべての酵素反応が行える方法を利用する。簡単に言うと、第一の反応ステップでＡｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼのような熱処理によって不活性化される酵素を用いる。一連の反応の中の第一の酵素を不活性化した後、新しく成分を添加することにより、バッファー条件をＴＡＰ反応に適した状態に変更する。ＴＡＰは、再度熱処理によって不活性化される。従って、追加成分とオリゴヌクレオチドの添加で再度バッファー条件を変更するだけで、最終ステップとしてリン酸化ＲＮＡにオリゴヌクレオチドを連結することができる（図１参照）。
【００３９】
前述した中で修飾反応は、プールされたＲＮＡの中のｍＲＮＡ分子に対して、後の操作のために行われる。しかしながら、本発明は、ｍＲＮＡの修飾に限定されるものではない。異なる例では、Ｃａｐ構造を欠き、リン酸化されたすべてのＲＮＡ分子が、ＲＮＡの５’末端にオリゴヌクレオチドを連結することによって直接修飾される。この例では、本発明は切断された(truncated)ＲＮＡ分子と非ｍＲＮＡ分子の選択的な修飾を可能とする。本発明の他の例では、Ｃａｐ構造を欠くＲＮＡ分子は、第一の酵素反応において修飾される。ある例では、Ｃａｐ構造を欠いたＲＮＡ分子のみが本発明によって操作のために修飾される。他の例では、第一の反応の後に異なるＲＮＡ分子を段階的に修飾する他のステップを行う。従って、第二の酵素反応では、完全長ｍＲＮＡ分子のＣａｐ構造は、ＴＡＰ酵素反応によって除去され、完全長ｍＲＮＡ分子の５’末端にリン酸基を与える。最後の反応ステップでは、同じ又は異なる塩基配列のオリゴヌクレオチドが完全長ｍＲＮＡ分子に連結される。この実施態様では、本発明は種々のＲＮＡ分子のプールの中にある異なるＲＮＡ種に異なるオリゴヌクレオチドを付加する手段を提供する。
【００４０】
上記の、あるいは図１に示した一連の操作に続いて、第一の反応では、ＲＮＡリガーゼが一つ又は複数のＲＮＡ分子に異なる種類のオリゴヌクレオチドを連結するために用いられる。本発明によれば、オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡオリゴヌクレオチド）、又はリボヌクレオチド（ＲＮＡヌクレオチド）から構成されるホモポリマーでもよく、またデオキシヌクレオチドとリボヌクレオチドから構成されるヘテロポリマー（ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドオリゴヌクレオチド）でも良く、あるいは、官能基をもった任意の種類のホモポリマー又はヘテロポリマーとなることもできる（図２参照）。本発明は、特有の核酸分子の利用に限定されず、修飾されたＲＮＡが本発明の異なる実施態様で使用される方法に応じた、違うタイプのオリゴヌクレオチドを用いることができる。当業者が知り得る多くのＤＮＡとＲＮＡの修飾がある。例えば、異なる修飾のオリゴヌクレオチドを調製するためのオリゴヌクレオチドの情報は、ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈのウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｗｇ−ｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｈｔｍｌ／ｓ＿ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ＿ａｃｉｄｓ／ｓ＿ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．ｓｈｔｍｌ（ここに示された情報は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に記載されている。ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈは、異なる位置に官能基としてビオチンやジゴキシゲニンを持つオリゴヌクレオチドを提供している。さらに、修飾されたオリゴヌクレオチドは、５'Ａｍｉｎｏｌｉｎｋ  Ｃ３／Ｃ５／Ｃ６／Ｃ１２、３'Ａｍｉｎｏｌｉｎｋ  Ｃ３／Ｃ６／Ｃ７、３'Ａｍｉｎｏｌｉｎｋ  Ｃ３／Ｃ６／Ｃ７、Ａｍｉｎｏ（Ｃ２／Ｃ６）−ｄＴ、Ａｍｉｎｏ  Ｃ６−ｄＣ、Ｓｐａｃｅｒ  Ｃ３／Ｃ９  （ＴＥＧ）、Ｓｐａｃｅｒ  Ｃ１２／Ｃ１８  （ＨＥＧ）、ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｔｈｉｏｌ  ｍｏｄｉｆｉｅｒのようなクロスリンクのための反応基など、ひとつ又はそれ以上の官能基を得ることができる。ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ．ｃｆｍ？ｐａｇｅｉｄ＝９９００、ここに示された情報は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）、またはＯｐｅｒｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｐｅｒｏｎ．ｃｏｍ／、ここに示された情報は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）から入手することができる。このように、ＲＮＡの５’末端に付加されるオリゴヌクレオチドを異なる機能を持つようにデザインすることができる。一つの例では、オリゴヌクレオチドは、１０から２５ヌクレオチドを持つ。別の例では、オリゴヌクレオチドは、２５から５０ヌクレオチドを持つ。また別の例では、オリゴヌクレオチドは、５０から１００ヌクレオチドを持つ。また別の例では、オリゴヌクレオチドは、１００以上のヌクレオチドを持つ。オリゴヌクレオチドは、化学合成によって、あるいは酵素的反応によって得ることができる。当業者が知り得るＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼはいくつもあり、例えば鋳型ＤＮＡからＲＮＡ分子を調製できるＴ３  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼなどがある。ＲＮＡポリメラーゼを用いたＲＮＡ調製の一つの例は、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｅｒｍｅｎｔａｓ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｉｎｆｏ／ｍｏｄｉｆｙｉｎｇｅｎｚｙｍｅｓ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｐ＿ｓｙｎｔｈｓｔｒｓｐｅｃｒｎａ．ｈｔｍ、ここに示された情報は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に記載されている。さらに、オリゴヌクレオチドは、リボゾームＲＮＡのような天然のものでも良い。任意の生物から得られる全ＲＮＡの調製では、得られる大部分のＲＮＡはｒＲＮＡであり、例えば、仔ウシ肝臓より得られる１８Ｓ＋２８ＳリボゾームＲＮＡは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ，ｃａｔａｌｏｇ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｒ０８８９）より商業的に入手可能である。ＲＮＡオリゴヌクレオチド、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、あるいは修飾されたオリゴヌクレオチドは、前述のようにＲＮＡリガーゼによって直接ＲＮＡ分子へ連結することができる。このように、反応条件は特定のリガーゼ、特定のオリゴヌクレオチドの修飾、特定の塩基配列のオリゴヌクレオチド、又は特定のオリゴヌクレオチド自体の利用に制限されるものではない。
【００４１】
最も一般的には、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡの５’末端にプライミング位置を導入するための「プライマー」として機能するようにデザインされている。プライマーは５、６、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、または５０以上のヌクレオチドからなっても良い。相補的核酸鎖合成の後、新しく合成された第二鎖は、３’末端にＲＮＡの５’末端に連結されたオリゴヌクレオチドと相補的な配列を持つ。ＲＮＡの５’末端に付加されたオリゴヌクレオチドと全く同じ、又は部分的に同じ配列を持つオリゴヌクレオチドは、修飾されたｍＲＮＡと全体的、又は部分的に同じ配列を持つ核酸分子の合成をプライミングするのに用いられる。第二鎖のプライミングは、例えば、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡの調製、ＤＮＡ又はＲＮＡの増幅、塩基配列決定に用いられる。ＤＮＡポリメラーゼによる第二鎖ＤＮＡ合成の別の方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ａｎｄ  Ｒｕｓｓｕｅｌｌ  Ｄ．Ｗ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１、本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）などの標準的な教科書に記載されている。そのようなＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片、Ｔ４またはＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、または他の既知のＤＮＡポリメラーゼを含むが、これに限定されない。例えば、直線状一本鎖ＤＮＡの調製には、当業者が知り得る様々な技術が発展してきた。いくつかの方法では、ＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ又はＲＮＡの鋳型より一本鎖ＤＮＡを合成する。特に、一本鎖ＤＮＡの合成は、非対象ＰＣＲと呼ばれる方法によって達成することができ、この方法では二つのプライマーが異なる濃度で使われる。律速となるプライマーが消費されたあと、反応は、二本鎖ＤＮＡの指数関数的増幅から律速となるプライマーより多量に入れられた片鎖のプライマーによる直線的増幅に切り替わる。他の方法では、ラムダエクソヌクレアーゼがリン酸化された５’末端をもつ二本鎖ＤＮＡの片鎖を分解するために用いられる。そのような鋳型は、二つのプライマーのうち、片方だけがリン酸化された５’末端を持つようにＰＣＲで調製される。ラムダエクソヌクレアーゼは、また「Ｓｔｒａｎｄａｓｅ（商標）」という名称で呼ばれており、Ｎｏｖａｇｅｎ、  （Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）から商業的に入手可能であり、「Ｓｔｒａｎｄａｓｅ（商標） ｓｓＤＮＡ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」、カタログ番号６９２０２（これは、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に説明が記載されている。同様に、ラムダエクソヌクレアーゼはＥｐｉｃｅｎｔｒｅ、（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）（カタログ番号ＬＥ０３５ＨおよびＬＥ０３２Ｋ）より入手可能である。数多くの直線状一本鎖ＤＮＡの応用のため、一本鎖ＤＮＡは、二つのプライマーのうち片方が特にタグづけられたプライマーセットを用いるＰＣＲによって調製される。官能基を持った鎖と鋳型ＤＮＡからの二次的な望まれない鎖を分けるために、ビオチンラベルが最も頻繁に用いられているが、これに限定されるものではない。この方法は、目的とする鎖を固体支持体や基盤上に結合させて用いる場合には、特に有用である。固定された一本鎖ＤＮＡは、支持体上で直接精製され、一本鎖ＤＮＡの分離及び調製に応じた検出検定やＤＮＡ塩基配列決定のための鋳型調製に用いられる。そのような応用は、例えば、ＤＡＳＨ  ＳＮＰ検出システムと呼ばれるようなゲノムＤＮＡ中のＳＮＰの特性解析などを含むが、これに限定されるものではない。この方法は、米国特許出願２００１０４６６７０号（本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に記載されている。Ｓ．  Ｓｔａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｔａｈｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６，３０２５−３０３８（１９８８）（本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）には、ビオチン化されたＤＮＡの異なる応用が記載されている。例えば、固相での塩基配列決定などである。他の実施態様として、Ｇｕａｔｅｌｌｉ  Ｊ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７、１８７４−１８７８（１９９０、本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に記載されている方法によれば、逆転写酵素、ＲＮａｓｅ  Ｈ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの活性を組み合わせた反応サイクルにより、修飾されたＲＮＡ分子を増幅することができる。
【００４２】
他の実施態様において、ＲＮＡの５’末端に付加されたオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子の操作を可能にするための配列情報を持つようにデザインされている。当業者が知り得る特定の塩基配列や認識部位への結合に依存する酵素活性は数多くある。それらの酵素の多くは、異なる業者から商業的に入手可能である。例えば、ＦＥＲＭＥＮＴＡＳ  ＵＡＢ（Ｖｉｌｎｉｕｓ，Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＵＳＡ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）、Ｔａｋａｒａ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、  Ｒｏｃｈｅ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  （Ｃａｒｄｉｆｆ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）などが含まれるが、これに限定されるものではない。通常、制限酵素はＤＮＡ分子を認識部位や認識部位の近傍の規定された位置で分解するために用いられる。一つの例では、オリゴヌクレオチドによって導入されＲＮＡの５’末端に付加された認識部位は、クラスＩＩ制限酵素の認識部位である。これらの酵素は、認識配列の外側で切断するもので、例えば、クラスＩＩ制限酵素であるＭｍｅＩは認識部位から２０／１８塩基対離れた部位を切断する。それゆえ、ＭｍｅＩは、通常、例えば、前述のＬｏｎｇＳＡＧＥ、５’−ＳＡＧＥ、またはＣＡＧＥ法などの短い塩基配列決定用タグの分離に用いられる。他の応用では、当業者が知るようにＤＮＡの組み換えやクローニングのために制限酵素を利用することができる。より詳しくは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｕｅｌｌ  Ｄ．Ｗ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）（本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に記載されている。さらに、修飾された又はデザインされた制限酵素は、鎖特異的ニッキング酵素として機能することができる。そのような制限酵素は、二本鎖ＤＮＡを基質として認識配列の中で一方のＤＮＡ鎖のみを切断する。そのような酵素は、商業的に入手可能であるＮ  Ｂｐｕ  １０Ｉ（ＦＥＲＭＥＮＴＡＳ  ＵＡＢ，Ｖｉｌｎｉｕｓ，Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）、Ｎ．Ｂｂｖ  Ｃ  ＩＡ、Ｎ．Ｂｓｔ  ＮＢ  Ｉ、Ｎ．  Ａｌｗ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＵＳＡ）などを含むが、これに限定されるものではない。ニッキング酵素は二本鎖ＤＮＡにプライミング部位を作る点で特に興味深く、ＤＮＡの合成や塩基配列決定に用いるためプライマー伸長反応に用いることができる。二本鎖のＤＮＡ分子の中の片鎖にＤＮＡ合成のためのプライミングサイトを作るために、酵素活性によってニックを入れる一つの例が、Ｗａｌｋｅｒ  Ｔ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９，３９２−３９６（１９９２）（本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に記載されている。他の例では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼの認識部位を導入する。ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを含むが、これに限定されるものではない。これらはすべてＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり、それぞれ特異性のある二本鎖プロモーターがある。プロモーター又はそれらの認識部位より始まり、これらは一本鎖又は二本鎖ＤＮＡのいずれかの鋳型から相補的なＲＮＡの合成を５’から３’方向へ触媒する。Ｇｕａｔｅｌｌｉ  Ｊ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．はＰｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７，１８７４０１８７８（１９９０）（本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの使用例を記載している。異なる例では、オリゴヌクレオチドはＤＮＡ結合タンパク質の認識部位を含んでも良い。多くのＤＮＡ結合タンパク質は当業者の知るところであり、天然に存在するものでも、タンパク質デザインによって調製されたものでもあり得る。そのようなＤＮＡ結合タンパク質は、転写因子、ゲノムＤＮＡの認識部位に直接又は間接的に結合する調製機能タンパク質などを含むが、これに限定されるものではない。転写因子は生命に不可欠の分子であり、ゲノム情報を利用するのに必要である。あらゆる生命体は多くの転写因子を含んでいる、例えば、Ｋａｎａｍｏｒｉ  Ｍ．，７８７−９３（２００４）（本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に既知のマウス転写因子すべてのデータベースが公開されている。転写因子は、異なる認識部位への親和性という点でほかのものと区別できる。この特異性は、与えられた転写因子および転写因子のグループの認識部位を含むＤＮＡ分子を濃縮するために用いることができる。しかしながら、当業者は、特異的配列よりもむしろ構造を認識するタンパク質について知るように、転写因子の結合特異性は、塩基配列への結合に限定されない。例えば、転写因子ＤＡＸ−１は、Ｚａｚｏｐｏｕｌｏｓ  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９０，３１１−３１５（１９９７）（本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に記載されているように異なるＤＮＡ構造に結合する。他の例では、ＤＮＡ結合タンパク質は一本鎖ＤＮＡに特異的に結合する。一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉのＳＳＢ、ファージＴ４のＧｅｎｅ３２の産物、アデノウイルスのＤＢＰ、一本鎖ＤＮＡに対して作られた抗体、仔ウシ胸腺  ＵＰ１、またはそれらの混合物などが含まれるが、これに限定するものではない。加えて、二本鎖ＤＮＡのミスマッチに特異的に結合するタンパク質がある。このグループのタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉの主要なミスマッチ修復パスウェイに関係するＭｕｔＳタンパク質ファミリー（タンパク質のファミリーについてはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／〜ｊｅｉｓｅｎ／ＭｕｔＳ／ＭｕｔＳ．ｈｔｍｌを参照、本ウェブページの内容は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）が含まれるが、これに限定されるものではない。修飾されたＲＮＡやＤＮＡに相補配列又はその部分的配列が付着される場合と比べて、塩基配列中にミスマッチがある場合のプライマーの伸長反応にプライマーが使われる場合、ＭｕｔＳタンパク質やその他の遺伝子ファミリーは、ミスマッチをもつ二本鎖のＤＮＡ種を特に濃縮するように用いても良い。加えて、ＭｕｔＳや遺伝子ファミリーは、プライマー伸長反応を操作するあるいはブロックするために用いられても良い。ＭｕｔＳタンパク質のいくつかは、商業的に入手可能であり、例えばＮｉｐｐｏｎｇｅｎｅのＴａｑ  ＭｕｔＳ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ，コード番号３１６−０４０１１）がある。異なる例では、オリゴヌクレオチドは「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒｈ配列」や「Ｂａｒｃｏｄｅ」として用いられる塩基配列の領域を含んでも良い。そのような塩基配列は、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列としてサンプルの由来の印となったり、核酸やＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列に相補的な塩基配列を持つ核酸とのハイブリダイゼーションによって、修飾されたＲＮＡやＤＮＡを特異的に捕獲するためのタグとして機能させることもできる。そのような塩基配列は、前述した酵素反応の任意の反応の特異的、選択的なプライミング部位として用いることもできる。Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列は、ＤＮＡポリメラーゼによる第二鎖の合成や、例えばＰＣＲによる増幅、一本鎖ＤＮＡの調製などのための選択的なプライミング部位となることもできる。このように、異なるＲＮＡ種に認識部位やＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列として異なるオリゴヌクレオチドを導入する前述の方法の組み合わせによって、本発明は、全ＲＮＡや複数のＲＮＡ分子中で、個々のＲＮＡ分子を分けて操作する手段を提供する。
【００４３】
異なる実施態様において、本発明は、ＲＮＡ分子又は種々のＲＮＡ分子の末端に官能基を導入する手段を提供する。多くの異なる官能基が結合分子に結合する親和性を持っている。官能基は、反応基又は化学反応において共有結合を形成するのに適した架橋リンカー、アミノ基、ビオチン、ジゴキシゲニン、抗体、抗原、タンパク質、核酸、核酸結合分子、またはそれらの組み合わせを含むが、これに限定するものではない。官能基や官能基に結合された分子は、基盤上にある結合分子と結合することができる。本発明を実施するための基盤は、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン結合分子、所定の配列をもったオリゴヌクレオチド、抗体またはリガンド、又は化学的基盤など、共有結合を形成する化学反応に用いられる反応基を固定化したものから選ぶことができる。用いられる官能基がビオチンの場合、対応する基盤はアビジンまたはストレプトアビジンである。同様に、官能基がジゴキシゲニンの場合、基盤はジゴキシゲニン結合分子である（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ  Ｃａｔａｌｏｇ、本文書は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）。官能基がオリゴヌクレオチドの場合、基盤は官能基の配列に相補的配列を持ったオリゴヌクレオチドであり、官能基が抗原の場合は、基盤は抗体またはｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ又はｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇのような抗体結合タンパク質である。従って、本発明はＲＮＡ分子へ官能基を導入する手段を提供し、官能基はオリゴヌクレオチドに付加される。修飾されたオリゴヌクレオチドは、多くの業者より商業的に入手可能である。最もよく使用されるのはビオチンラベル化オリゴヌクレオチドである。異なる修飾オリゴヌクレオチドの一つの例として、ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｗｇ−ｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｈｔｍｌ／ｓ＿ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ＿ａｃｉｄｓ／ｓ＿ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．ｓｈｔｍｌ、ここから入手できる情報は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に記載がある。ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈはオリゴヌクレオチドの異なる位置に官能基としてビオチンやジゴキシゲニンを持つオリゴヌクレオチドを提供できる。さらに、一つ又はそれ以上の官能基を持つ修飾オリゴヌクレオチドを得ることができる。例えば、５’Ａｍｉｎｏｌｉｎｋ  Ｃ３／Ｃ５／Ｃ６／Ｃ１２、３’Ａｍｉｎｏｌｉｎｋ  Ｃ３／Ｃ６／Ｃ７、３’Ａｍｉｎｏｌｉｎｋ  Ｃ３／Ｃ６／Ｃ７、Ａｍｉｎｏ（Ｃ２／Ｃ６）−ｄＴ、Ａｍｉｎｏ  Ｃ６−ｄＣ、Ｓｐａｃｅｒ  Ｃ３／Ｃ９（ＴＥＧ）、Ｓｐａｃｅｒ  Ｃ１２／Ｃ１８（ＨＥＧ）、あるいはｒｅｄｕｃｅｄ  Ｔｈｉｏｌ  ｍｏｄｉｆｉｅｒなどのクロスリンクのための反応基がある。ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入でき、そのようなＲＮＡオリゴヌクレオチドの情報はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ．ｃｆｍ？ｐａｇｅｉｄ＝９９００（ここに示された情報は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）で得ることができる。また、Ｏｐｅｒｏｎはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｐｅｒｏｎ．ｃｏｍ／（ここに示される情報は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）で役立つ情報を提供している。
【００４４】
前述の実施態様において、図１〜２で示すように、ＲＮＡリガーゼはＲＮＡ分子のリン酸化された５’末端にオリゴヌクレオチドを連結するために用いられる。通常用いられるＴ４  リガーゼのようなＲＮＡリガーゼは、オリゴヌクレオチドの３’末端のリボヌクレオチドに依存し、ＲＮＡにデオキシリボヌクレオチドを直接的に連結しなくても良い。さらに、ＲＮＡ分子へのオリゴヌクレオチドの連結は配列特異的ではなく、任意の配列のオリゴヌクレオチドをＲＮＡ分子と組み合わせることができる。代替的な方法がＣｌｅｐｅｔ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３２、  ｅ６  （２００４）（本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に示されており、その中でＤＮＡリガーゼはＲＮＡに二本鎖ＤＮＡ又は部分的に二本鎖になったＤＮＡ分子を連結する（ＲＮＡ−ｔａｇｇｉｎｇと呼ばれる）。例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼは鋳型ＤＮＡへのＲＮＡ断片の連結を触媒することができる（Ｋｌｅｐｐｅ、  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，６７，８-７３（１９７０）、Ｆａｒｅｅｄ，Ｇ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２４６、９２５-９３２（１９７１）（両文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）。連結反応を仲介する鋳型ＤＮＡは、個々のＲＮＡ分子を修飾するための塩基配列特異的な連結反応に用いることができる。配列特異性は、部分的に二本鎖となったオリゴヌクレオチドによって達成できる。そのようなオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ分子の５’末端にハイブリダイズする突出領域を持つ（図３参照）。突出領域は、４から６、又は６から８ヌクレオチドの長さでも良い。また８〜１２、又は１２ヌクレオチド以上の長さでも良い。当業者が知り得る、例えばＳｈｉｂａｔａ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３０，１２５０−１２５４（２００１）（本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に述べられているような連結反応において部分的に二本鎖となったオリゴヌクレオチドを用いる種々の方法がある。反応によって、突出領域は、例えば前述のＳｈｉｂａｔａ．ｅｔ．ａｌ．で用いられているようなランダム配列や特有のＲＮＡ分子を標的とした規定の配列を持つことができる。他の例として、突出領域は、認識部位にランダム配列を含む制限酵素や認識部位の外側で切断する制限酵素を用いて酵素反応的に作っても良い。そのような酵素は、ＢｓｔＸＩ（ＣＣＡＮＮＮＮＮ↓ＮＴＧＧ）、ＤｒｄＩ（ＧＡＣＮＮＮＮ↓ＮＮＧＴＣ）、ＢｇｌＩ（ＧＣＣＮＮＮ↓ＮＧＧＣ）、ＢｏｘＩ（ＧＡＣＮＮ↓ＮＮＧＴＣ）、ＢｓｅＪＩ（ＧＡＴＮＮ↓ＮＮＡＴＣ）、ＢｓｅＬＩ（ＣＣＮＮＮＮＮ↓ＮＮＧＧ）、ＣａｉＩ（ＣＡＧＮＮＮ↓ＣＴＧ）、ＣｓｅＩ（ＧＡＣＧＣ（５／１０）↓）、Ｅａｍ１１０５Ｉ（ＧＡＣＮＮＮ↓ＮＮＧＴＣ）、Ｅｃｏ３１Ｉ（ＧＧＴＣＴＣ（１／５）↓）、Ｅｃｏ５７Ｉ（ＣＴＧＡＡＧ（１６／１４）↓）、Ｅｓｐ３Ｉ（ＣＧＴＣＴＣ（１／５）↓）、ＨｐｙＦ１０ＶＩ（ＧＣＮＮＮＮ↓ＮＮＧＣ）、ＬｇｕＩ（ＧＣＴＣＴＴＣ（１／４）↓）、ＯｌｉＩ（ＣＡＣＮＮ↓ＮＮＧＴＧ）、ＰｄｍＩ（ＧＡＡＮＮ↓ＮＮＴＴＣ）、ＰｓｙＩ（ＧＡＣＮ↓ＮＮＧＴＣ）、ＳｆｉＩ（ＧＧＣＣＮＮＮＮ↓ＮＧＧＣＣ）、ＳｍｕＩ（ＣＣＧＧＣ（４／６）↓）、Ｖａｎ９１Ｉ（ＣＣＡＮＮＮ↓ＮＴＧＧ）、ＸａｇＩ（ＣＣＴＮＮ↓ＮＮＮＡＧＧ）、又はそれらのアイソザイムを含むが、これに限定されるものではない。これらの酵素は特に有用であり、ランダム突出領域は複数の核酸分子より調製される。例えば、ｃＤＮＡライブラリーは、前述の酵素の一つの認識部位を持つリンカーが５’末端に持つｃＤＮＡインサートで構築することができる。そのようなライブラリーの分子の切断は、もとのｃＤＮＡライブラリーに存在する分子を代表するランダムな突出領域を持つ複数の分子を生成する。よって、本発明は、反応に使用されるオリゴヌクレオチドに相補的な配列とＲＮＡ分子の５’末端に相補的な配列を持つ鋳型ＤＮＡによって、個々のＲＮＡ分子の目的とされた修飾を行う手段を提供する。一つの例では、それらの配列は５〜１０ヌクレオチドの長さであり、別の例では、１０〜２５ヌクレオチドの長さであり、また別の例では、２５ヌクレオチドよりも長い。ＲＮＡ分子の５’末端に相補的な領域は、実験的手法で得ることができ、例えば、複数の核酸分子の操作によって、あるいはコンピューターデザインによる組み合わせを用いた化学合成によって得ることができる。ＲＮＡ分子の配列情報は、当業者が知り得る公共データベース、例えばＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）、ＥＭＢＬ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｄａｔａｂａｓｅｓ／）、ＤＤＢＪ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）などより入手できる。ある例では、一つの鋳型ＤＮＡは特有のＲＮＡ分子を標的として用いることができる。別の例では、ランダム配列を含む複数の鋳型ＤＮＡが用いられる。さらに別の例では、複数の鋳型ＤＮＡは、特有の配列を含む。よって、本発明は、全ＲＮＡ中で、特有のＲＮＡ分子やｍＲＮＡなどのＲＮＡを標的とした操作を行う柔軟な手段を提供する。
【００４５】
ＲＮＡ分子はＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｕｅｌｌ  Ｄ．Ｗ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（２００１）（本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に記載の逆転写によるＤＮＡ転写物の調製の鋳型として用いることができる。当業者が知り得る異なる反応条件や酵素修飾などを含む多くの改変された方法がある。例えば、逆転写酵素は、ＡＭＶ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｍ−ＭＬＶ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｍ−ＭＬＶ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＲＮａｓｅ  Ｈ  ｍｉｎｕｓ、あるいはそれらの改変物などを含むが、これに限定されるものではない。任意の修飾されたＲＮＡは、前述の又は図１〜３で示されたすべての又は部分的なステップによって得ることができ、それらを鋳型にして、逆転写酵素によってＲＮＡ鋳型からコピーＤＮＡを合成するｃＤＮＡ合成反応に用いることができる。この反応は、鋳型ＲＮＡにハイブリダイズし、ＤＮＡ合成を開始するプライマーを必要とする。一つの例では、３’末端にランダム配列とそれに続く所定の配列を持ったプライマーセットが用いられる。所定の配列はＤＮＡの後の操作に役立てられるが、逆転写反応のプライミングには必要とされない。従って、本発明は、ランダム配列のみを持つプライマーを用いることができる。そのようなランダム配列自体又は規定配列を持つオリゴヌクレオチドの一部としてのランダム配列は、４〜６ヌクレオチド、又は６〜１０ヌクレオチド、又は１０〜１５ヌクレオチドの長さを取ることができる。ランダムプライマーを用いることにより、鋳型ＲＮＡの５’末端の配列に相補的な配列を持つＤＮＡ断片を合成することができる。ランダムプライマーは、鋳型ＲＮＡの任意の領域にハイブリダイズできるので、反応は異なる長さのＤＮＡ分子の混合物を生成する。ランダムプライミングでは、完全長ｃＤＮＡの調製はできないが、長いＲＮＡの本来の５’末端まで到達できるという有利な面があり、それを用いなければ逆転写反応の限界のため困難である。別の例では、オリゴｄＴプライマーが通常多くのｍＲＮＡ種の３’末端にあるポリＡ配列にハイブリダイズすることができる。ランダムプライミングとは対照的に、オリゴｄＴプライミングは、ＲＮＡ分子全体を反映した完全長ｃＤＮＡの合成に通常用いられる。さらに、規定配列のプライマーは、逆転写酵素反応を開始するために用いられ、例えば、通常ＲＡＣＥ法（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）などの応用に用いられる。完全長ｃＤＮＡ合成を開始する他の方法は、ＷＯ２００６／００３７２１（本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に開示されている。従って、本発明は図４と５に示されたように修飾されたＲＮＡからＤＮＡ転写物を調製する異なる手段を提供する。
【００４６】
前述の鋳型ＲＮＡからのＤＮＡの合成は、二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡ分子を生成する。このような二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡ分子の中のＲＮＡ部分は、ＲＮＡ分解酵素やバッファーのｐＨ変更により除去される。例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素は、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖分子のＲＮＡを特異的に分解するので、本発明の実施には好ましい酵素である。ＲＮＡの除去は、逆転写反応で使われたプライマーに関係なく、ランダムプライミングであっても特異的プライミングであってもオリゴｄＴプライミングであっても関係なく、任意の種類のｃＤＮＡに適用される。鋳型ＤＮＡ／ＲＮＡからのＲＮＡの除去の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｕｅｌｌ  Ｄ．Ｗ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（２００１）（本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に記載されている。任意のこのようなＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖分子の処理は、リボヌクレオチドから構成される鋳型の大部分又は全体より作られた一本鎖ＤＮＡとしてのＤＮＡ分子を遊離する。ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドが二本鎖ＤＮＡ領域を含む場合は、例えば、前のステップでＲＮＡ分子に付加されたオリゴヌクレオチドの一部又は全部がＤＮＡを含む場合、ＲＮＡ部分の除去により、鋳型ＲＮＡの５’末端に相当する末端に二本鎖ＤＮＡ領域を含むＤＮＡ分子が調製される。よって、本発明は、全ＲＮＡ又はｍＲＮＡに由来する塩基配列を持つ、あるいはそれらのＲＮＡ分子の操作により導入された塩基配列を持つ一本鎖又は部分的一本鎖ＤＮＡ分子を調製する手段を提供する。
【００４７】
一本鎖ＤＮＡはＤＮＡ解析や操作に重要であり、またバイオテクノロジーや分子生物学において多くの応用や技術は、一本鎖ＤＮＡの鎖特異的な調製を必要とする。そのような応用は、塩基配列決定や標識プローブの合成を含む鎖特異的ＤＮＡ合成のための鋳型ＤＮＡの調製、チミン残基のウラシルへの置換、点突然変異の導入、種々のＤＮＡまたはＲＮＡ分子の混合物からの個々のクローンの分離、検出やディファレンシャルハイブリダイゼーションのためのドライバーやテスターの調製、一塩基多型（ＳＮＰｓ）の検出と解析、マイクロアレイの調製を含むが、これに限定されるものではない。これらの方法や応用は分子生物学の当業者がよく知るところであり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｕｅｌｌ  Ｄ．Ｗ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（２００１）（本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に記載されている。
【００４８】
本発明により得られた鋳型ＤＮＡは、初期の段階でＲＮＡに付加されたオリゴヌクレオチドの性質によって区別でき、例えば、図２〜３に示される。よって、本発明は、図７に示されるような一本鎖ＤＮＡ又は部分的一本鎖ＤＮＡの調製に用いることができる。例えば、ＲＮＡにＲＮＡオリゴヌクレオチドが付加され、その修飾されたＲＮＡが逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成に用いられた場合、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド分子からのＲＮＡ部分の除去は、鋳型ＲＮＡに相補的配列、初期段階でＲＮＡの３’末端に付加されたＲＮＡオリゴヌクレオチドに相補的な配列、５’末端に逆転写反応に用いたプライマーより直接生成した配列（図７Ａ参照）を持つ一本鎖ＤＮＡを生成する。よって、そのようなＤＮＡ分子は、ＲＮＡに付加されたオリゴヌクレオチドより直接的又は間接的に生成された既知配列の領域に並んで潜在的に未知の配列を中心領域に含む。並んでいる領域の配列は既知なので、そのような分子は塩基配列決定や操作の鋳型として直接用いることができる。例えば、ＤＮＡの３’末端に相補的配列を持っているプライマーは、塩基配列決定反応のプライマーに用いることができる。鋳型ＤＮＡの塩基配列決定を行う従来の方法は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｕｅｌｌ  Ｄ．Ｗ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（２００１）（本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に記載されているサンガー法がある。しかしながら、本発明はサンガー法による鋳型ＤＮＡの塩基配列決定に限定されるのものではなく、最近数々の塩基配列決定法が開発されており、詳細はＭｅｔｚｋｅｒ  Ｍ．Ｌ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １５，１７６７−１７７６（２００５），Ｋｌｉｎｇ  Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３，１３３３−１３３５（２００５）；Ｓｈｅｎｄｕｒｅ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５，３３５−３４４（２００４）（これらの文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に記載されている。これらの方法のいくつかは商業的な応用の対象となっており、例えば４５４Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．４５４．ｃｏｍ／、Ｈｅｌｉｃｏｓ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｅｌｉｃｏｓｂｉｏ．ｃｏｍ／）、Ｓｏｌｅｘａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｏｌｅｘａ．ｃｏｍ／Ｃｏｍｐａｎｙ／ｏｖｅｒｖｉｅｗ．ｈｔｍ）、Ｖｉｓｉｇｅｎ、（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｉｓｉｇｅｎｂｉｏ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）、ＧｅｎｅｏＶｏｘｘ  ＧｍｂＨ、（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｖｏｘｘ．ｄｅ／）（これらのウェブページの一部又はすべてに見出される情報は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）などが挙げられる。本発明は、鋳型ＤＮＡの向かい合った末端をデザインする手段を提供するので、鋳型ＤＮＡは必要に応じた性質を持つようにデザインされることができ、例えば、前述の任意の方法又は他の新しい方法により塩基配列決定を行う必要に応じてデザインされることができる。例えば、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓによる用法で塩基配列決定を行う場合には、鋳型の向かい合った末端に特有のプライマー部位が要求され、これによりエマルジョンＰＣＲによるＤＮＡ分子のクローンの増幅が可能となる。好ましい例として、鋳型ＤＮＡは、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３７，３７６−８０（２００５）（本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に記載されているように、一分子のエマルジョンＰＣＲに適応するように５’末端と３’末端に二つの異なる塩基配列を含む。異なる例においては、ＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリッドオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡに付加され、逆転写によるｃＤＮＡ合成に用いられる。ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド分子からのＲＮＡ部分の除去はＲＮＡの５’末端に対応する長いＤＮＡ鎖の３’末端に二本鎖ＤＮＡの領域を持つ部分的な一本鎖ＤＮＡ分子を生成する。さらにこのＤＮＡ分子は、鋳型ＲＮＡに相補的な配列を含み、また３’末端に初期段階でＲＮＡに付加されたＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドに相補的な配列を含み、５’末端に逆転写反応で使われたプライマーから直接生成される配列を含む（図７Ｂ参照）。この一群では、ＤＮＡ分子の二本鎖領域は、ＤＮＡポリメラーゼ反応のプライマーとして機能する短いＤＮＡストレッチを含む。従って、本発明は、他に塩基配列決定用のプライマーを添加することなく、配列決定用の鋳型を直接提供する手段を提供する。別の例では、ＤＮＡオリゴヌクレオチドがｍＲＮＡに付加され、その結果作られる修飾されたＲＮＡ分子は逆転写によるｃＤＮＡ合成に用いられ、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド分子からのＲＮＡ部分の除去は、ＲＮＡの５’末端に対応する長いＤＮＡ鎖の３’末端に二本鎖ＤＮＡの領域を持つ部分的な一本鎖ＤＮＡ分子を生成する。さらにこのＤＮＡ分子は、鋳型ＲＮＡに相補的な配列を含み、また３’末端に初期段階でＲＮＡに付加されたＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドに相補的な配列を含み、５’末端に逆転写反応で使われたプライマーから直接生成される配列を含む（図７Ｃ参照）。これらの方法により得られた鋳型は、図７Ｂに記載されている鋳型とよく似ていて、二本鎖領域は鋳型ＲＮＡの５’末端で正確に止まっている。よって、ＤＮＡオリゴヌクレオチドやＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドオリゴヌクレオチドにより、もとのＲＮＡ分子の５’末端に直接に接しているか、もとのＲＮＡの５’末端より１〜５ヌクレオチド、又は５〜１０ヌクレオチド、又は１０〜１５ヌクレオチド、又は１５ヌクレオチド以上離れている。図７Ｃに示されるＤＮＡ分子は、図７Ｂに記載されている鋳型と同様の方法で塩基配列決定反応に用いられる。図７Ａと７Ｂに示されているＤＮＡ分子を調製する前述した例の改変法では、ＲＮＡに付加されるＤＮＡオリゴヌクレオチド、又はＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドは官能基を含む。この例では、本発明は、ＲＮＡの５’末端に対応する長いＤＮＡ鎖の３’末端に二本鎖ＤＮＡの領域を持つ部分的な一本鎖ＤＮＡ分子を調製し、二本鎖領域の短いほうの断片は官能基を含む。分子中の長いほうの断片は、鋳型ＲＮＡに相補的な配列を含��、また３’末端に初期段階でＲＮＡに付加されたＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドに相補的な配列を含み、５’末端に逆転写反応で使われたプライマーから直接生成される配列含む（図７Ｄ参照）。このような鋳型ＤＮＡは、塩基配列決定反応で用いられ、また官能基は支持体や基盤へ鋳型を直接結合させることを可能とする。官能基や官能基に付加された分子は、基盤上の結合分子と結合することができる。そのような基盤は、官能基の性質に応じて選択することができる。例えば、官能基がアミノ基だった場合、反応基は、化学反応で基盤に共有結合するものになる。官能基がビオチンだった場合には、基盤はアビジン又はストレプトアビジンになる。官能基がジゴキシゲニンの場合、基盤はジゴキシゲニン結合分子である（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ  Ｃａｔａｌｏｇ、本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）。官能基がオリゴヌクレオチドの場合、基盤は官能基の配列に相補的配列を持ったオリゴヌクレオチドであり、官能基が抗原の場合は、基盤は抗体またはｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ又はｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇのような抗体結合タンパク質である。従って、本発明は、プライマー部位と基盤又は支持体に直接結合する性質を持ったＤＮＡ分子又は塩基配列決定用鋳型を調製する手段を提供する。本発明の好ましい例においては、そのような鋳型は新しい塩基配列決定方法に適応し、個々の分子が直接塩基配列決定用の支持体に結合できる。そのような塩基配列決定方法は、例えば４５４Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．４５４．ｃｏｍ／、Ｈｅｌｉｃｏｓ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｅｌｉｃｏｓｂｉｏ．ｃｏｍ／）、Ｓｏｌｅｘａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｏｌｅｘａ．ｃｏｍ／Ｃｏｍｐａｎｙ／ｏｖｅｒｖｉｅｗ．ｈｔｍ）、Ｖｉｓｉｇｅｎ、（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｉｓｉｇｅｎｂｉｏ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）、ＧｅｎｅｏＶｏｘｘ  ＧｍｂＨ、（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｖｏｘｘ．ｄｅ／）（これらの一部又は全てのウェブページの情報は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）などが含まれるが、これに限定するものではない。
【００４９】
前述の例では、本発明はｍＲＮＡの５’末端を修飾する手段を提供する。しかしながら、本発明は５’末端の修飾に限定されるものではない。上述の逆転写反応によるｃＤＮＡ合成のプライミングと図４〜５に示される例によれば、オリゴｄＴのような一般的なプライマーやランダムプライマー又は特定の配列をもったプライマーのセットは鋳型ＲＮＡからｃＤＮＡの第一鎖を合成するのに用いられる。ｃＤＮＡ合成をプライミングするプライマーは、一本鎖ＤＮＡ、又はＷＯ２００６／００３７２１（本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に開示されるように部分的に一本鎖と二本鎖部分を持つＤＮＡを含んでも良い。プライマーは、鋳型ＲＮＡの中の配列に相補的な配列を含んでも良く、ｃＤＮＡの後の操作に用いられるようにデザインされた配列又はＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列として機能する配列を含んでも良い。ＲＮＡにハイブリダイズするヌクレオチドはランダム配列でも良く、特定のＲＮＡ種にプライミングするために公共のデータベースより得られた配列でも良く、またｍＲＮＡのポリＡ配列にハイブリダイズするようなｄＴの長いストレッチ配列から構成されるものでも良い。ＲＮＡ分子の配列にある情報は、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）、ＥＭＢＬ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｄａｔａｂａｓｅｓ／）、ＤＤＢＪ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）などの当業者が知り得る公共のデータベースを調べることにより得られ、また多くの場合、得られた情報は３’末端の特定のプライマーをデザインするのに充分である。別の例では、そのような配列情報は、スプライス部位やオープンリーディングフレームと呼ばれるコーディング領域の末端の一つのようなＲＮＡの規定領域を標的とするプライマーのデザインに用いられる。逆転写反応のプライミングに用いられるプライマーは、ＲＮＡに相補的な配列のみを含んでもよい。この例として、そのような反応より得られたｃＤＮＡは、その５’末端にＲＮＡの中の配列に相補的な配列を持つ。別の例では、プライマーは、ＲＮＡ配列に相補的な配列とＲＮＡの配列には関係のない配列とを含む。よって、本発明は、ｃＤＮＡの５’末端につなげる新しい配列をｃＤＮＡに導入する手段を提供する。当業者が知り得る特定の配列や認識部位への結合に依存する酵素活性は多々あり、多くのそれら酵素は商業的に種々の業者より入手可能である。それらの業者は、ＦＥＲＭＥＮＴＡＳ  ＵＡＢ（Ｖｉｌｎｉｕｓ，Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＵＳＡ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）、Ｔａｋａｒａ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、Ｒｏｃｈｅ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｒｄｉｆｆ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を含むが、これに限定されるものではない。通常、制限酵素は二本鎖ＤＮＡのみを切断し、一本鎖ＤＮＡは切断しない。よって、制限酵素は、第二鎖の合成後にのみ適用することができ、例えば、クローニングなどの目的に用いられる。よって、本発明は、核酸分子の完全長クローニングに関係し、得られたＤＮＡ断片より配列情報を得ることができる。特定の例では、制限酵素は、例えばＳｈｉｂａｔａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．  ３１，１０４８−１０４９（２００１）（本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に記載されているような方法によって、ｃＤＮＡからポリＡ／Ｔストレッチを除去するのに用いることができる。ポリＡ／Ｔストレッチの除去の方法は、ＲＮＡの３’末端のタグ配列を得るのに特に重要であり、それらの方法は特許出願ＵＳ２００５／０５９０２２、ＵＳ２００５／０２５５５０１、ＷＯ２００４／０５０９１８、米国特許第６，１３６，５３７号（これらの文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に開示されているが、これに限定するものではない。
【００５０】
ほかの例では、逆転写反応に用いられるプライマーは官能基を含む。そのような官能基は、プライマーがランダムプライマーであるか、特定のプライマーであるか、又はオリゴｄＴプライマーであるかというプライマーの性質とは関係なく、ｃＤＮＡに組み入れられる。よって、本発明は官能基を持った修飾された５’末端を持つｃＤＮＡ断片を調製する手段を提供する。当業者が知り得るところの結合分子へ結合する親和力をもった多くの官能基がある。官能基は反応基、アミノ基、ビオチン、ジゴキシゲニン、抗体、抗原、タンパク質、核酸結合分子などを含むが、これに限定されるものではない。官能基と官能基に付加された任意の分子は、基盤上に存在する結合分子と結合することができる。本発明の目的のために、基盤は、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン結合分子、抗体とそのリガンドが固定された任意の形状、および化学的基盤の中より選ぶことができる。用いられる官能基がアミノ基のような反応基の場合、反応基は化学反応で基盤に共有結合するために用いられる。官能基がビオチンだった場合には、基盤はアビジン又はストレプトアビジンになる。同様に官能基がジゴキシゲニンの場合、基盤はジゴキシゲニン結合分子である（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ  Ｃａｔａｌｏｇ、本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）。官能基が抗原の場合は、基盤は抗体またはｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ又はｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇのような抗体結合タンパク質である。修飾されたオリゴヌクレオチドは、多くの業者より商業的に入手可能であリ、ビオチンラベル化オリゴヌクレオチドが頻繁に使われている。種々の修飾オリゴヌクレオチドの調製の例は、ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｗｇ−ｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｈｔｍｌ／ｓ＿ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ＿ａｃｉｄｓ／ｓ＿ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．ｓｈｔｍｌ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ．ｃｆｍ？ｐａｇｅｉｄ＝９９００、Ｏｐｅｒｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｐｅｒｏｎ．ｃｏｍ／）（これらのウェブページに示された情報は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）のウェブページに記載されている。別の例では、オリゴヌクレオチドはＤＮＡ結合タンパク質の認識部位を持っても良い。当業者が知り得るＤＮＡ結合タンパク質は多数あり、それらは天然に存在するものでも、タンパク質デザインを使って調製されるものでも良い。そのようなＤＮＡ結合タンパク質は、転写因子、ゲノムＤＮＡの認識部位直接又は間接的に結合する調製機能タンパク質などを含むが、これに限定されない。転写因子は生命に不可欠の分子であり、ゲノム情報を利用するのに必要である。あらゆる生命体は多くの転写因子を含んでいる、例えば、Ｋａｎａｍｏｒｉ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．はＢｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，３２２，７８７−９３（２００４）（本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に、既知のマウス転写因子すべてのデータベースが公開されている。転写因子は異なる認識部位への親和性という点でほかのものとは区別できる。この特異性は、与えられた転写因子および転写因子のグループの認識部位を含むＤＮＡ分子を濃縮するために用いることができる。しかしながら、当業者が特異的配列よりもむしろ構造を認識するタンパク質について知るように、転写因子の結合特異性は、塩基配列への結合に限定されず、例えば、転写因子ＤＡＸ−１はＺａｚｏｐｏｕｌｏｓ  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９０，３１１−３１５（１９９７）（本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に記載されているように異なるＤＮＡ構造に結合する。他の例では、ＤＮＡ結合タンパク質は、一本鎖ＤＮＡに特異的に結合する。一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉのＳＳＢ、ファージＴ４のＧｅｎｅ３２の産物、アデノウイルスのＤＢＰ、一本鎖ＤＮＡに対して作られた抗体、仔ウシ胸腺  ＵＰ１、またはそれらの混合物などが含まれるが、これに限定するものではない。別の例では、結合タンパク質はＭｕｔＳ又はＭｕｔＳ遺伝子のファミリーであっても良い。さらに別の例では、オリゴヌクレオチドはＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列として用いられる配列の領域を含んでも良い。このような配列やＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列は、サンプルの由来の印となったり、核酸やＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列に相補的な塩基配列を持つ核酸とのハイブリダイゼーションによって、修飾されたＲＮＡやＤＮＡを特異的に捕獲するためのタグとして機能することもできる。また、前述した酵素反応の任意の反応の特異的、選択的なプライミング部位として用いることもできる。Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列は、ＤＮＡポリメラーゼによる第二鎖の合成や、例えばＰＣＲによる増幅、一本鎖ＤＮＡの調製、又は塩基配列反応のプライミングのための選択的なプライミング部位となることもできる。よって、先述の方法を組み合わせることによって、本発明は複数のＲＮＡの中のＲＮＡ分子に由来するｃＤＮＡに異なるオリゴヌクレオチドを導入する手段を提供する。 
【００５１】
先述した任意のステップによって、本発明は、ＲＮＡの５’末端に相当する位置に官能基を導入する手段を提供する。加えて、本発明は、ＲＮＡの３’末端に相当する位置又はｃＤＮＡ第一鎖の５’末端に相当する位置に官能基を導入する手段を提供する。従って、本発明は、ＲＮＡより生成されるｃＤＮＡのいずれかの末端に官能基を導入する手段を提供する。ＲＮＡ又はｃＤＮＡに付加された官能基は、他の分子に対する結合親和力を持ち、また官能基は修飾されたＲＮＡ又はＤＮＡを捕獲し表面上に結合するために用いることができる。官能基と結合分子の組み合わせ例は、化学反応により基盤上に共有結合を形成するアミノ基などの反応基、ビオチンとアビジン又はストレプトアビジンの結合、ジゴキシゲニンとジゴキシゲニン結合分子の結合、オリゴヌクレオチドの相補配列への結合、抗原の抗体への結合、抗体のｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉやｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇなどの抗体結合タンパク質への結合を含むが、これに限定されるものではない。官能基の位置によって、修飾されたＲＮＡ又はＤＮＡが表面上へ結合される方法や方向は異なる。例えば、部分的に二本鎖となっているｃＤＮＡ分子はＲＮＡの５’末端に相当する位置の官能基によって表面に結合することができる。この例では、部分的に二本鎖となったｃＤＮＡ分子は、ＲＮＡの５’末端に相当する位置からｃＤＮＡ断片の塩基配列決定を開始することができる（図９Ａ参照）。別の例では、一本鎖ｃＤＮＡ分子は、ＲＮＡの３’末端に対応する一本鎖ＤＮＡ分子の５’末端の位置に付加された官能基の相互作用によって表面に結合する。ＲＮＡの３’末端に対応する位置でｃＤＮＡが表面に結合するとき、外側プライマーはｃＤＮＡ分子の塩基配列決定を開始する位置を決定するために用いられても良い（図９Ｂ参照）。別の例においては、修飾されたＲＮＡまたはｃＤＮＡの第一鎖に付加された塩基配列は表面上に存在するオリゴヌクレオチドと相補的な配列を含んでも良い。図９Ｃは、表面上に結合しプライマーの機能を持つオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションによって表面上に結合する一本鎖ＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子の原理を示している。表面上のプライマーは、その配列に相補的な配列を含むか否かにより、どのＲＮＡ又はｃＤＮＡ断片が表面上に結合できるかを決定する。さらに、表面上のプライマーはｃＤＮＡ分子の塩基配列決定を始める位置を決定する。固相上の塩基配列決定の例はＳｔａｈｌ，Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６，３０２５−３０３８（１９８８）、Ｌｉｎｄｒｏｏｓ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９，Ｎｏ．１３  ｅ６９（２００１）（これらの文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に公表されている。当業者が知り得る規定された配列のオリゴヌクレオチド合成を支持体上で直接行う方法は種々あり、また支持体上にそれらオリゴヌクレオチドを結合する方法も種々ある。そのような方法は、通常マイクロアレイの作成に用いられ、より詳細にはＪｏｒｄａｎ  Ｂ．，ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、  Ｂ��ｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１：  Ｓｃｈｅｎａ  Ａ，  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ（１９９９）（両文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に記載されている。従って、本発明は、修飾された核酸分子を調製し、それらをＲＮＡやＤＮＡの塩基配列決定のような解析のために捕獲する手段を提供する。
【００５２】
前述の実施態様において、本発明は一本鎖又は部分的一本鎖ＲＮＡおよびＤＮＡ分子を調製する手段を提供する。官能基を用いて、それらの分子を表面上に結合することができる。表面上の分子は種々のバッファーによって精製や後の操作のために洗浄され得る。よって、本発明は一本鎖ＤＮＡ、部分的一本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡを精製する手段を提供する。そのような一本鎖ＤＮＡ、部分的一本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡを精製する方法は新しい技術によって達成される一分子検出には必須であり、そのような技術にはＭｅｔｚｋｅｒ  Ｍ．Ｌ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １５，１７６７−１７７６  （２００５）、  Ｋｌｉｎｇ  Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３、  １３３３−１３３５  （２００５）、Ｓｈｅｎｄｕｒｅ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５、  ３３５−３４４  （２００４）（両文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）が含まれるが、これに限定するものではない。従って、本発明は、塩基配列情報を直接得るために、一本鎖ＤＮＡ、部分的一本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡ分子を利用することに関する。好ましい実施態様においては、本発明は一本鎖ＤＮＡ断片の規定した領域から塩基配列情報を得ることに関する。好ましい例においては、ＲＮＡの５’末端特異的塩基配列情報は、ＲＮＡ分子の５’末端配列に相補的な配列を含み、本発明によって調製されるＤＮＡ断片より得られる。よって、本発明は、ＲＮＡの塩基配列情報を得ることに関する。
【００５３】
先述の図１から７で示される任意のステップによって、本発明はＲＮＡの５’末端に対応する位置にオリゴヌクレオチドを導入する手段を提供する。加えて、先述の図８に示される任意のステップによって、本発明はＲＮＡの３’末端に相当する位置にオリゴヌクレオチドを導入する手段を提供する。このように、本発明はＲＮＡに由来するｃＤＮＡのいずれかの末端に特定の塩基配列を導入する手段と修飾された末端を含むｃＤＮＡ断片の調製手段を提供する。ある例では、本発明により導入される配列は、一本鎖ＤＮＡがその鎖中にある相補的配列の部分で二本鎖を形成し末端に閉じたループを作るようなヘアピン構造を形成することができる。よって、前述の処理によりＲＮＡから向かい合った末端にヘアピン構造を持つように修飾されたｃＤＮＡ分子を得ることができる（図１０参照）。第一鎖ｃＤＮＡ合成がランダムプライマーを用いたかオリゴｄＴプライマーを用いたかによって、このような分子はＲＮＡに由来する部分的配列を含むか、又はＲＮＡに由来する全体の配列を含む（完全長ｃＤＮＡ）。ある例として、先述に従って調製されＲＮＡの５’末端に相当する末端にヘアピン構造を持つ一本鎖ｃＤＮＡ分子は、直接塩基配列決定ができ、その場合ヘアピン構造は塩基配列決定反応のプライミング部位として機能する。別の例では、先述に従って調製され両端にヘアピン構造を持つ一本鎖ｃＤＮＡ分子は、二つのヘアピン構造を利用して増幅することができる。図１１Ａに示されるように、各々の末端にループ構造を持つ一本鎖ＤＮＡ断片は、Ｎｏｔｏｍｉ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ８，ｅ６３（２０００）（本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に開示されているＬｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  （ＬＡＭＰ法）の鋳型となる。よって、本発明によって調製されるＤＮＡ分子は繰り返し配列が得られる方法で増幅することができ、このようなポリマーにあるループ構造は、増幅反応の伸長をプライミングするために用いることができ、又は塩基配列決定反応を推進するために用いることができる。ある例においては、増幅された断片は、２５〜５０塩基対、又は５０〜１００塩基対、又は１００〜２００塩基対、又は２００〜３００塩基対の長さをとる。別の例では、増幅されたＤＮＡ断片は３００塩基対以上の長さになる。よって、本発明によって調製されるＤＮＡ分子は繰り返し配列の直線状ポリマーが得られる方法で増幅することができ、そのようなポリマーは塩基配列決定反応を推進するために用いることができる。
【００５４】
好ましい例において、ループ構造を両端に持つＤＮＡ分子は、エクソヌクレアーゼ活性と鎖置換活性を持たないＤＮＡポリメラーゼによって、ヘアピン構造の自由３’末端が伸長される第一の反応を含むステップによって、環状一本鎖ＤＮＡ分子に転換され得る。このようなＤＮＡポリメラーゼは、Ｍ−ＭｕＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｈ  Ｍｉｎｕｓ  Ｍ−ＭｕＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＭｏｎｓｔｅｒＳｃｒｉｐｔ、Ｅｘｐａｎｄ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、又はそれらの混合物を含む任意の逆転写酵素を含むが、これに限定されるものではない。その他のＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｔ４とＴ７のＤＮＡポリメラーゼＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、又は既知の任意のＤＮＡポリメラーゼを含むが、これに限定されるものではない。鎖置換活性の欠如により、ＤＮＡポリメラーゼは向かい合ったヘアピン構造の５’末端に達した時に反応が停止する。第二の反応ステップでは、一本鎖ＤＮＡの開いた末端が環状ＤＮＡ分子を作るように結合される。そのような結合反応は任意のＤＮＡリガーゼによって行われ、それらＤＮＡリガーゼは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼを含むが、これに限定されるものではない。環状一本鎖ＤＮＡ分子はローリングサークル増幅法（ＲＣＡ法と呼ばれる）を用いて増幅できる。ＲＣＡ反応は、ＤＮＡポリメラーゼにより環状鋳型上のオリゴヌクレオチドプライマーを等温反応で伸長させることにより遂行される。詳細は米国特許５、８５４、０３３号および米国特許６、１４３、４９５号（両文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に開示されている。反応生成物は直線状環状ＤＮＡで、鋳型のコピーが直列に並んでいる。反応の時間や条件によって、反応生成物は数十、数百又は数千の鋳型のコピーを一分子中に持つ。ＲＣＡ反応で特に用いられるＤＮＡポリメラーゼは、当業者に公知の等温ＤＮＡ増幅に必要とされる強い鎖置換活性を持つｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼがあるが、これに限定されるものではない。当業者に公知の数多くのＣＡ法の応用や改変法がある。ＲＣＡ法に関するより詳細な記載は総説Ｇｕｓｅｖ、Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １５９，６３−６９（２００１）、Ｚｈａｎｇ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．３６３，６１−７０（２００６）（これらの文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に記載されている。従って、本発明により調製されたＤＮＡ分子は、繰り返し配列の直線状ポリマーが得られる方法により増幅することができ、それらのポリマーは塩基配列決定反応を推進するのに用いられる配列を含む。
【００５５】
一つの例では、ＲＣＡ反応は、反応生成物が直接又は間接的に規定された位置又は検出、解析、又は塩基配列決定のポイントと呼ばれる位置に結合できるような方法で実行される。一つ例では、Ｎａｌｌｕｒ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ，２９，ｅ１１８（２００１）に開示されているガラススライド上の信号増幅に仲介されたＲＣＡの手段がある。この例では、ＲＣＡは、複数の核酸分子の中の個々の標的のクローン増幅を実行するためのステップを可能とし、そのステップでは各々の分子は表面上の規定された位置で増幅される。ここでは、ＲＣＡ反応は、例えば従来のＰＣＲ法に見られるような増幅バイアスの危険を伴うことなく、高い並列性を持った方法で実行される。ＲＣＡ反応で表面上に結合されたプライマーを使うことにより、反応生成物が並んだ基盤を得ることができ、各々の反応生成物は一分子の中に鋳型のコピーを複数含んでいる。よって、ＲＣＡ反応は検出や解析の感度を大きく増幅することができ、規定の位置で信頼のおける塩基配列決定反応を実施することを可能とする。
【００５６】
別の例では、ＲＣＡ反応は規定の位置での検出、解析および塩基配列決定のための鋳型を調製することができ、鋳型は一つ又はそれ以上の検出ステップ、解析、又は塩基配列決定反応の対象となる。従って、本発明は鋳型の塩基配列決定を行う第一のステップと、塩基配列決定反応中に鋳型より生成された増幅産物を除去する第二のステップと、異なるプライマーによって同じ位置で同じ鋳型の塩基配列決定を再度行う第三のステップからなる手段を提供する。そのような一連の反応は、一つの鋳型より二回、三回、四回、五回、さらには五回以上回数を重ねて塩基配列決定を行い、解読配列を得るために実施されても良い。ＤＮＡの表面への共有結合的な結合は、Ｂｅｉｅｒ  Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｈｅｉｓｅｌ  Ｊ．Ｄ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２７，１９７０−１９７７（１９９９）によれば、少なくとも３０サイクルのハイブリダイゼーションとハイブリダイズしたＤＮＡの除去を可能とすると記載されている。よって、本発明は一つの鋳型から一種以上の配列情報を得る手段を提供し、その異なる塩基配列決定反応は同じ位置で実行され、その位置により同じ鋳型より得られる違う解読塩基配列のつながりが規定される。
【００５７】
別の例では、ＲＣＡ反応は、もとのＲＮＡ分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖の多数のコピーを含む反応生成物を調製するために用いられる。そのような反応生成物は、図１１Ｂで示されるステップによって環状鋳型が調製される場合に得られる。環状鋳型は、ＲＮＡより得られる二本鎖ｃＤＮＡの中にあるセンスとアンチセンス鎖を含み、もとのＲＮＡの向かい合った末端に対応する位置にヘアピン構造によりつながっている。この鋳型は双方向性である。本発明の好ましい例では、ヘアピン構造はセンス、アンチセンス鎖がそれらの末端からの塩基配列決定を可能にするプライミング位置を含む。よって、ＲＮＡ分子の向かい合った末端より末端配列を得る手段を提供する。このとき、ＲＮＡ分子はｃＤＮＡに転換され、ｃＤＮＡは最初のＲＮＡ分子配列を持つセンス、アンチセンス鎖を持つ二本鎖から成り、二本鎖ｃＤＮＡにあるセンス、アンチセンス鎖は一本鎖ＤＮＡを含む環状分子を構成するヘアピン構造により連結され、環状一本鎖ＤＮＡ分子はセンス、アンチセンス鎖を含む塩基配列決定のための直線状鋳型ＤＮＡを生成するためにＲＣＡにより増幅され、ＤＮＡ又はもとのＲＮＡの向かい合う末端から得られる配列情報は、二つ又はそれ以上の連続した塩基配列決定反応が同じ位置で行われることにより得られる。この例では、本発明は、ＲＮＡの末端配列、転写物の境界、ゲノム中の転写の開始、終止点、又は任意のＤＮＡ分子の末端配列を決定するために用いることができる。別の例では、本発明は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡ内における規定された領域の末端配列を決定するために用いることができる。そのような規定された領域の境界は、それらの調製段階における特定のステップによって決定される。その断片は、生物学的由来のものでも良く、また完全なランダム切断によって生成されても良い。さらに、塩基配列決定用のプライマーは、従来のプライマーウォーキング法と同じように、鋳型の任意の領域にハイブリダイズするようにデザインされることができ、又は鋳型中の特定の部位、例えばスプライス部位などに対してデザインされても良い。例えば環状一本鎖ＤＮＡ分子を形成するために、直線状二本鎖ＤＮＡの末端にヘアピン構造を持ったオリゴヌクレオチドを連結することによって、任意の二本鎖ＤＮＡを双方向性鋳型へ転換することは、本発明の範囲内である。環状一本鎖ＤＮＡ分子は、ＲＣＡによって増幅され、もとのＤＮＡ分子のセンス、アンチセンス鎖を含む塩基配列決定用の直線状鋳型ＤＮＡが生成される。ＤＮＡの向かい合った末端からの配列情報は、同じ位置で行われる二つ又はそれ以上の連続した塩基配列決定反応によって得られる。この例では、本発明は、例えばエクソンの末端配列やクロマチンＩＰより得られたゲノム断片の末端配列、ハイパーセンシティブ部位の境界配列などを決定するために用いることができる。
【００５８】
別の実施態様では、本発明は、ＲＮＡの５’末端やＲＮＡの３’末端に相当する領域に導入されたＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列の利用に関する。先述のとおり、本発明によって調製されたｃＤＮＡの向かい合った末端にＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列、又は特定の配列を導入する手段を提供する。好ましい例では、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列は、ＲＮＡまたはｃＤＮＡの末端の近傍に位置し、ＲＮＡやｃＤＮＡそのものから配列情報をえるための同じ塩基配列決定反応より塩基配列を決定することを可能とする。Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列は、１塩基対、２塩基対、３塩基対、４塩基対、５塩基対、６塩基対、６〜１０塩基対、１０〜１５塩基対、１５〜２０塩基対、又は２０塩基対以上の長さでも良い。好ましいＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列は、６〜１２塩基対、又は２５〜７５塩基対の長さである。Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列は任意の性質、ランダム配列であっても良い。それらはコンピューターによってデザインされても良く、生物学的サンプルからとっても良く、また人工的に作られても良い。それらは、制限酵素又はその他の酵素やタンパク質の認識部位やプライミング部位を含んでも良い。Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列は、以下のすべて又は任意のいずれかの法則によってデザインされることができる。
−  塩基配列決定またはハイブリダイゼーションによる同定を行うのに充分な長さを持つ
−  同じ実験で用いる異なるＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列の塩基配列は、区別可能である。
−  同じ実験で用いる異なるＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列は、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列の塩基配列決定にエラーが起こった場合でも明確な同定を可能にするため、一つの位置以上において区別できる。
−  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列は、塩基配列決定反応を妨げるような配列や構造をとる塩基配列を避ける（例えばＧリッチ配列、パリンドローム配列）。
−  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列は、相補的配列を安定なハイブリッドを形成するように選択されても良い。
−  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列は、制限酵素や転写因子のようなタンパク質への結合や特定の操作を可能にする塩基配列を持っても良い。
−  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列は、本発明を実施する際にＲＮＡやＤＮＡの操作を妨げる塩基配列を避ける（例えば、操作の過程で使用される制限酵素の認識部位を持たない）。
【００５９】
本発明の好ましい例では、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列は、サンプルのプールの中で、サンプルの由来を印付けるために用いられ、サンプルプールのすべての構成物は同じ実験で同時に扱われる。サンプルプールのサンプルは、出来るだけ早く混合されるべきであり、好ましくは修飾されるＲＮＡサンプルの段階で混合されているべきである。異なるＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列を持つ異なるＲＮＡサンプルの混合によって得られるサンプルは「プールサンプル」となり、異なる形で修飾されたＲＮＡを含む（図１２Ｂ参照）。それゆえ、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列は、好ましくはＲＮＡの５’末端近くに位置し、それゆえｍＲＮＡやトータルＲＮＡの修飾のための最初のステップで導入される。
【００６０】
一つの実施態様では、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列は、異なる生物種や組織、生物学的実験の種々の処理あるいは時間的な段階、あるいは異なる細胞種を含む多数の生物学的サンプルから得られる特定のＲＮＡにある核酸分子を印付けるために用いられる。実験のデザインにおいてサンプルのプーリングは、種々の機能的な意味を持つ。例えば新しい塩基配列決定方法のハイスループット性を十分に活用するためにサンプルの複雑性を高めること、同時に扱うサンプルの数を減らすことにより多くのサンプルの処理を単純化すること、特定のデータ解析の形態を可能にすることなどを含むが、これに限定されるものではない。一つの好ましい実施態様において、異なるサンプルに異なるシステムエラーが起きるような個々の実験と比較し、共通の統計的解析のためにすべての操作のステップにおいて同じシステムエラーがあるようにするためサンプルはプールされる。例えば、一つの典型的な応用において、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列は、本発明によってＲＮＡが修飾される際にＲＮＡの５’末端近傍に付加され、その後修飾されたＲＮＡサンプルはｃＤＮＡの調製より先に混合される。プールサンプルは、区別できるＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列を持つ修飾されたＲＮＡサンプルの異なる種類の混合物であるように調製される。修飾されたＲＮＡサンプルのプールは、その後データを得るために本発明に沿って一つのサンプルとして処理される。例えば、修飾されたＲＮＡサンプルの解読配列はプールライブラリーより得られる。配列情報はこの分野で知られる任意の方法によって決定することができるが、好ましくは、各々の解読配列がＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列ともとのＲＮＡ又はｃＤＮＡサンプルに由来する配列情報の両方を含む。配列の決定後、個々の解読配列からＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列を認識し、同じＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列を持つ解読配列をその後の解析のためにグループ化するためにコンピューターにより処理されることができる。もとのＲＮＡに関係する塩基配列は、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列とは分けて実験的なデザインの必要に沿って解析される。これらの塩基配列は、「配列タグ」と呼ばれるものやＲＮＡやｃＤＮＡに由来する部分的な配列を含む短い解読配列に関連する。配列タグは、転写物やゲノム中の位置を同定するために用いることができ、あるいはプールサンプルの中の転写物の発現レベルを統計的に解析するために用いても良い。配列タグの利用についてより詳細な情報は、Ｈａｒｂｅｒｓ  Ｍ．ａｎｄ  Ｃａｒｎｉｎｃｉ  Ｐ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈ．２，４９５−５０２（２００５）（本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に記載されている。配列情報は、データベースに格納され、または解析、保管、又は参照データセットの構築の目的でコンピューターに格納される。そのようなデータベースは、例えば、塩基配列情報、異なる組織、細胞株より得られた配列タグの発現頻度、ゲノム中の転写物、遺伝子、機能要素に関する注釈付データをふくむことができる。
【００６１】
別の例においては、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列は塩基配列決定によって同定されず、基盤や支持体に結合したＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列に相補的な配列を持つ核酸分子と特定のハイブリッドを形成するために用いられる（図１２Ｃ参照）。この例では、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列は、表面上の規定された位置に同じ由来から生成されたサンプルをグループ化するために用いられる。その位置は、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列の性質やプールサンプルの中のＲＮＡ、ＤＮＡ、サンプルの由来を明らかにするために用いられる。従って、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列の読み取りは直接塩基配列決定を必要とせず、かわりに特定のハイブリダイゼーション反応に行うことができる。
【００６２】
別の例では、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列は、塩基配列決定やハイブリダイゼーションによって同定されず、支持体や基盤に結合したＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列に結合親和性をもったタンパク質に特異的に結合するために用いられる。この例では、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列は、同じ由来のサンプルを表面上の規定された位置にグループ化するために用いられる。その位置は、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列の性質やプールサンプルの中のＲＮＡ、ＤＮＡ、サンプルの由来を明らかにする。従って、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列の読み取りは直接塩基配列決定やハイブリダイゼーションを必要とせず、かわりにＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列に高い親和性を持つたんぱく質に結合することによって行われる。
【００６３】
本発明は、コンピューターによる注釈付を目的とし、本発明に従って得られるＤＮＡ断片の領域の塩基配列決定に関係する。注釈付は、統計的解析、参照情報に対するアライメント、およびゲノム配列へのマッピングなどを含む。よって、本発明は、遺伝子発見、遺伝子同定、遺伝子発現プロファイリング、注釈付の手段に関する。
【００６４】
他の実施態様では、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる領域解析のために、核酸分子の末端からハイブリダイゼーションプローブを調製することに関する。好ましい例では、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション実験は、タイリングアレイを用いて行う。この実施態様では、本発明は、ハイブリダイゼーションプローブのデザインに関する。プローブはマイクロアレイ上のものを含むがこれに限定されるものではない。
【００６５】
よって、本発明は、例えば生物学的サンプルの特性解析のような必要に応じて、核酸分子やそれらの短い断片を解析する手段を提供する。さらに、本発明は、ＲＮＡやＤＮＡ断片を解析的検定に利用するために効率的で迅速な操作を行う手段を提供する。この意味では、本発明は、新しいハイスループット塩基配列機器と技術を利用するための手段を提供する。
【００６６】
他の実施態様では、逆転写反応に特定プライマーを用いて、本発明に従って調製された修飾されたＲＮＡは、当業者が知るＲＡＣＥ法と類似のプロトコールによって実際の５’末端配列を決定するために用いられる。
【００６７】
本発明は、生物学的サンプルの状態、すなわち遺伝情報や発現プロファイル、調節パスウェイやネットワークの活性などを調べるための重要な情報を得るために必要な手段を提供する。よって、本発明は、ライフサイエンスや診断の研究に用いられる解析的検定のデザインや実行に関する。本発明は、生物学的システムの解析と診断の手段を提供する。
【００６８】
本発明、又はその一部は、試薬、核酸分子、およびＲＮＡの操作やＤＮＡの調製に必要な酵素、その他の要素を含むキットの製造に用いることができる。一つの実施態様では、キットはＲＮＡを修飾するために必要な試薬を提供する。別の実施態様では、キットは鋳型ＤＮＡを調製するために用いる試薬を提供する。好ましい実施態様では、キットは一分子検出のための鋳型を調製するための試薬を提供する。好ましい実施態様では、キットは研究目的の試薬を提供する。さらに好ましい実施態様では、キットは診断的な検定のための試薬を提供する。
【００６９】
本発明の主要なステップを詳細に説明する。ここで用いるすべての名前や省略形は、当業者に公知の意味で用いられる。
【実施例１】
【００７０】
［ＲＮＡの単離］
本発明を実施するために、ｍＲＮＡまたはトータルＲＮＡのサンプルは，当業者に公知の方法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ａｎｄ  Ｒｕｓｓｕｅｌｌ  Ｄ．Ｗ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）（本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に開示されている方法により調製された。さらにＣａｒｎｉｎｃｉ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３３，２００２，３０６−３０９、本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）によれば、細胞質ｍＲＮＡの分画を得る方法が開示されている。細胞質ｍＲＮＡの分画を用いるのが好ましいが、本発明はこれに限定されるものではなく、他の任意のｍＲＮＡやトータルＲＮＡの調製方法を用いても本発明を同様の方法で実施することができる。
【００７１】
本発明を実施するには、トータルＲＮＡを用いると完全長ｃＤＮＡライブラリーを調製する際に行うＣａｐ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎとの組み合わせで十分は結果を得られるので、本発明を実施するためには、全ＲＮＡ又は細胞質ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製が好ましいが、必須ではない。ｍＲＮＡの量はトータルＲＮＡの調製の約１〜３％であり、その後、商業的に販売されているオリゴｄＴ−セルロースマトリックスを使ったキットを用いて調製される。このような商業的キットは、本発明を実施するためにｍＲＮＡの分画を調製するのに用い、推奨される条件下で十分なｍＲＮＡを得られるＭＡＣＳ  ｍＲＮＡ分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙ）を含むがこれに限定されるものではない。本発明を実施するために、１サイクルのオリゴｄＴ−ｍＲＮＡ選択で十分であり、強いｍＲＮＡ精製は長いｍＲＮＡを失う可能性がある。
【００７２】
本発明の実施に用いられるすべてのＲＮＡサンプルは、ＲＮＡの純度を調べるために２３０、２６０、２８０ｎｍのＯＤ比率が計測された。２３０／２６０比が０．５より低い場合には、多糖類の除去が成功したと考えられ、２６０／２８０比が１．８より高いもしくは２．０付近のとき、効果的なタンパク質の除去が行われたと考えられた。ＲＮＡサンプルはさらに、トータルＲＮＡ調製時の２８Ｓと１８Ｓ  ｒＲＮＡの比率が適当であることを確認し、ＲＮＡ分画の品質を調べるために、アガロースゲルの電気泳動によって解析された（ｒＲＮＡのサイズは哺乳類以外の種から得られるトータルＲＮＡではことなることがある）。
【実施例２】
【００７３】
［５’末端誘導体化ＲＮＡ分子のライブラリーの調製］
本実施例は、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いてＲＮＡ分子の５’末端を誘導体化する典型的なプロトコールである。すべての反応は、核酸の損失を避けるために、５００μｌのシリコン化したマイクロチューブとシリコン化したチップを用いて行われた。
【００７４】
ＲＮＡサンプルは、最初に脱リン酸化された。ＲＮＡ（例えば１ｎｇから１μｇ）と２μｇのグリコーゲンを一緒にチューブに加え、全量５μｌに調製された。反応バッファーは、通常の濃度の１／１０または、５ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ−Ｐｒｏｐａｎｅ−ＨＣｌ、０．１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０１ｍＭのＺｎＣｌ２（ｐＨ  ６．０）、２５°Ｃを用いた。グリコーゲンは、操作中にＲＮＡがプラスチックに付着するのを避けるために加えられた。サンプルを６５℃で５分間変性し、後で除去するためにリン酸基を露出させた。その後３７℃で２分間置き、Ａｎｃｔａｒｔｉｃ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を２．５ユニット加えた。サンプルは３７℃で３時間から一晩処理された。一晩脱リン酸化を行うことにより、リン酸基の９８〜９９％が除去された。４５℃で活性が高くなるトレハロースを最終濃度０．６Ｍとなるように加え、４５℃で短いインキュベーションを行うこともできる。
【００７５】
その後、Ａｎｃｔａｒｔｉｃ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅは６５℃で不活性化されたが、この処理の前に二価イオンをキレートする必要があった。このため、０．５５μｌの溶液（０．５Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ  ６．０）、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１％のβ−メルカプトエタノール及び０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を加えた。ＥＤＴＡは、二価イオンをキレートし、次のＴＡＰ処理に適した条件となった。Ａｎｃｔａｒｔｉｃ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅも、またバッファー中のＥＤＴＡによって阻害された。不活性化は６５℃で５から１５分間行われた。
【００７６】
次に、０．２μｌ（２ユニット）のタバコ酸ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）を加えｄｅｃａｐｐｉｎｇを行った。ＴＡＰは、実験当たり２０ユニットまで増やすことが可能であった。反応は３７℃で２時間行い、続いて６５℃で１５分間熱不活性化を行った後、サンプルを氷上で冷却した。また、ＧＣリッチなＲＮＡの二次構造を解くために役立つベタインを１Ｍ加えても良い。この処理の後、ＴＡＰはＡＴＰをそれ以上分解しなかった。ＡＴＰはその後のステップにおいて必要である。その後、任意の配列の５μＭの「ｃａｐｐｉｎｇ  ＲＮＡ」オリゴヌクレオチドを加え、ライゲーションを行った。反応液６．７５μｌに対して２μｌのＲＮＡリガーゼ（５００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０、２５°Ｃ）、１００ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＤＴＴ）を加えた。ＤＴＴはＴＡＰを阻害した。１ｍＭのｈｅｘａｍｉｎｏ  ｃｏｂａｌｔｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＨＣＣ）を加えても良いが、これは任意であり、必須ではない。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００）を最終濃度が２５％となるように加え、ＡＴＰの１２５μＭ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）１０ユニットを加えた。このような条件では、最終的な混合液はライゲーションステップを阻害するものではなかった。
【００７７】
２時間から一晩（１６時間）２０℃でライゲーション反応を行った。この時点で、ＲＮＡのＣａｐ構造はオリゴヌクレオチドに置き換えられ、これは完全長ｃＤＮＡ調製のような他の例で示すように、他のテストに用いられる。
【実施例３】
【００７８】
［修飾ＲＮＡの調製に用いられる酵素の活性試験］
実施例２で用いたれた酵素とバッファーの活性試験を行った。
（Ａ）Ａｎｔａｒｃｔｉｃ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）の活性試験
５’リン酸化オリゴヌクレオチドを次のバッファー中、３７℃で２時間脱リン酸化を行った。続いてオリゴヌクレオチドをＴ４リガーゼとγ−３２Ｐ−ＡＴＰによってＲＩラベルし、ＰＡＧＥによって解析した。脱リン酸化されていなければ、５’リン酸基のためにＲＩラベルは不可能である。
【００７９】
（Ｂ）タバコ酸ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）活性試験
γ−３２Ｐ−ＡＴＰを２ユニットのＴＡＰと反応バッファー中でインキュベートした。放射性ＡＴＰとインキュベーションを行う前に、ＴＡＰを１５分間加熱した。
【００８０】
（Ｃ）Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）の活性試験
放射性ラベル化オリゴヌクレオチドを、ラベルしていないオリゴリボヌクレオチドの存在下でインキュベートした。ライゲーションの結果、ポリアクリルアミドゲルの移動度が変化した。
【実施例４】
【００８１】
［修飾ＲＮＡからの完全長ｃＤＮＡの調製］
上記で調製したサンプルをｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−１００フィルターを使い、製造者（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の説明書に従って脱塩した。ライゲートされたＲＮＡに水、逆転写酵素、プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた。プライマー（ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＣＣＵ  ＣＧＡ  ＧＣＣ  ＵＡＧ  ＧＵＣ  ＣＧＡ  Ｃ）８００ｎｇを使い、３．３Ｍのソルビトール−トレハロース混合液を、最終濃度が０．５Ｍのソルビトール及び４％トレハロースになるように加え、逆転写反応液を調製する。ＲＮＡとプライマーの混合液を６５℃で１０分間加熱した後、他の試薬を準備する間氷上で保持する。１１μｌの２倍濃度ＧＣバッファー（Ｃａｒｎｉｎｃｉ，Ｓｈｉｒａｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２００２；３２，９８４−９８５、本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）から構成されるプレミックスを加え、その後、１０ｍＭのｄＮＴＰを１μｌ及びＭＭＬＶ逆転写酵素（ＲＮａｓｅＨ  ｍｉｎｕｓ、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を１μｌ加えた。ＧＣバッファーシステムは、製造者の推奨するバッファーに置き換えた。この反応液にＲＮＡサンプルを加え、２５℃で２分間（サンプルのアニーリングのため）、４２℃で３０分、５２℃で１０分、５６℃で１０分インキュベートした後、反応を停止した。この方法では、もとのｍＲＮＡの５’末端までのびたｃＤＮＡを高い頻度で得ることができた。その後、精製、処理された。例えば、プロテアーゼＫにより処理を行った（２０μｇをＥＤＴＡ（最終濃度が１０ｍＭ）と一緒に加え、９５℃で１５分インキュベートした）。このサンプルを、サイズ分画しプライマーを除去するため、Ｃ１４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で処理した。
【実施例５】
【００８２】
［ｃＤＮＡの第二鎖合成とＰＣＲ増幅］
ｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。ｃＤＮＡに最終濃度が１倍となるようにＴＡＫＡＲＡ  ＥＸバッファーを加え、さらにｄＮＴＰ(最終濃度２００μＭ)、５’オリゴヌクレオチド（配列：  ａｃｃ  ｔｃｇ  ａｇｃ  ｃｔａ  ｇｇｔ  ｃｃｇ  ａｃ）、３’オリゴヌクレオチド（配列：ｃａ  ｇｃｇ  ｔｃｃ  ｔｃａ  ａｇｃ  ｇｇｃ  ｃｇｃ）をそれぞれ４００ｎＭ、ＭｇＣｌ２を２．５ｍＭ、ＫＣｌを最終濃度５０ｍＭとなるように加えた。成分を混合した後、９４℃で５分加熱し、９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、６８℃で１．５分のサイクルを３０サイクル繰り返した。
【００８３】
生成された５’末端ｃＤＮＡを平滑末端化し、標準的な方法によりプラスミドベクターへクローニングした（クローニングと塩基配列決定の一般的な情報についてはＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ参照）。
【実施例６】
【００８４】
［ＲＡＣＥ法の実験］
Ｃａｐｐｅｄ  ＲＮＡを実施例２と同じようにＲＮＡオリゴヌクレオチドの配列のみ下記の様に変更して調製した。実施例２のプロセスを用い、次にＰＣＲを行い、ＲＡＣＥによる５’末端増幅が可能となった。５００ｎｇの肝臓トータルＲＮＡをＯＮＥ−Ｔｕｂｅ  ｏｌｉｇｏ−ｃａｐｐｉｎｇ法で処理し、未反応のオリゴリボヌクレオチドを除去、その後ランダムプライマーを用いて逆転写反応を行った。５’末端の増幅には下記の遺伝子特異的プライマー（ＴＴＧＧＡＧＡＧＡＧＧＧＴＴＴＣＧＡＣＧＡＧＴＣＡ）と、ｏｌｉｇｏ−ｃａｐに相補的なプライマー（ＣＧＡＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＡ）を用いた。
【実施例７】
【００８５】
［４５４塩基配列決定の応用と他の基盤］
実施例２の方法でｃＤＮＡを調製したが、オリゴヌクレオチドのデザインと調製は、ＲＮＡの３’末端と５’末端に異なるアダプターを付けるため下記の通りとした。
アダプターＡ
ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＣＣＡＴＣＴＧＴＴＣＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＡＧ
アダプターＢ
／５ＢｉｏＴＥＧ／ＣＣＵＡＵＣＣＣＣＵＧＵＧＵＧＣＣＵＵＧＣＣＵＡＵＣＣＣＣＵＧＵＵＧＣＧＵＧＵＣＵＣＡＧ
【００８６】
アダプターＢは「ｏｌｉｇｏ−ｃａｐｐｉｎｇ」配列として用い、アダプターＡは第一鎖合成のためのオリゴランダムプライマーと一緒に用いた。第一鎖合成後、Ｃｌ−４Ｂスパンカラムを用いて未反応のプライマーと分離した。続いて、サンプルをエマルジョンＰＣＲにかけた。塩基配列決定反応は４５４−Ｌｉｆe  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔに沿って行った（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２００５；  ４３７（７０５７）：３７６−３８０、本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）。この結果、１ランで数十万の解読配列を得ることができた。
【実施例８】
【００８７】
［５’末端塩基配列タグの応用］
実施例２とそれに続く実施例のようにｃＤＮＡを合成し、当業者が知る標準的な方法でｃＤＮＡ第二鎖の合成を行った。例えば、Ｋｏｄｚｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６  Ｍａｒ；  ３（３）：２１１−２２（本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に記載されている。ＤＮＡをＭｍｅ  Ｉにより切断し、第二リンカーを付加、増幅、精製を行い、コンカテマーを作成した。この方法の詳細は種々に記載されているが、例えば、Ｋｏｄｚｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２００６  Ｍａｒ；  ３（３）：２１１−２２（本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）に記載されている。これらの塩基配列タグは、その後塩基配列決定、遺伝子の境界の同定（Ｃａｒｎｉｎｃｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２００５  Ｓｅｐ  ２；  ３０９（５７４０）：１５５９−６３、本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）、発現プロファイリング、遺伝子のプロモーター（Ｈａｒｂｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｎｉｎｃｉ，Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００５  Ｊｕｌ；  ２（７）：  ４９５−５０２、本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）などに用いることができる。
【実施例９】
【００８８】
［固体支持体に結合したＤＮＡの塩基配列決定］
実施例２とその後の例にそってｃＤＮＡを合成し、当業者の知る標準的なプロトコールを用いてｃＤＮＡの第一鎖を合成した。それらは例えば、Ｋｏｄｚｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２００６  Ｍａｒ、  ３（３）：２１１−２２に記載されている。続いて、核酸を米国特許出願番号２００６００１２７９３号、米国特許出願番号２００６００１２７８４号、米国特許出願番号２００６０００８８２４号に開示された方法により固相基盤に結合した。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、ＲＮＡの酵素的修飾の概念図である。この図にあるように、ＲＮＡ調製はｍＲＮＡの５’末端のＣａｐ構造の存在によって特徴づけられたＲＮＡの種類を含んでも良い。Ｃａｐ構造は、他のＣａｐ構造を欠き、自由リン酸基を５’末端に持つ切断されたＲＮＡ種から区別するために使われる。一連の酵素反応の中で、まずホスファターゼにより、切断されたＲＮＡの自由リン酸基が除去される。次にピロホスファターゼにより完全長ｍＲＮＡよりＣａｐ構造が取り除かれ、Ｃａｐ構造の代わりにリン酸基が露出する。５’末端にリン酸基をもったＲＮＡ分子のみが、ＲＮＡリガーゼによってオリゴヌクレオチドと共有結合して修飾を受けることができる。オリゴヌクレオチドは斜線で示されている。
【図２】図２は、オリゴヌクレオチドの付加によるＲＮＡの修飾を概念的に示したものである。図１で示されたその後のステップの前に、ＲＮＡリガーゼは一つ又は複数のＲＮＡ分子に異なる種類のオリゴヌクレオチドを結合させるのに用いられる。本発明によれば、オリゴヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドまたはＤＮＡオリゴヌクレオチド、又はリボヌクレオチドまたはＲＮＡヌクレオチドからなるホモポリマーであることが可能である（パネルＡ）。またデオキシヌクレオチドとリボヌクレオチドからなるヘテロポリマーとなることも可能である（パネルＢ）。あるいは、官能基（パネルＣ中で「Ｆ」で示されている）をもった任意の種類のホモポリマー又はヘテロポリマーとなることもできる。
【図３】図３は、ＲＮＡの５’末端へオリゴヌクレオチドを連結する代替法の概念図である。図１、２で示すように、ＲＮＡリガーゼはＲＮＡのリン酸化された５’末端にオリゴヌクレオチドを結合させることができる。しかし、そのような反応はオリゴヌクレオチドの３’末端のリボヌクレオチドに依存することもあるが塩基配列の特異性はなく、任意のオリゴヌクレオチドがＲＮＡ分子と結合することができる。反応に配列特異性を与えるには、部分的に二本鎖になっているオリゴヌクレオチドを用い、突出領域をＲＮＡ分子の５’末端の配列とハイブリダイズさせる。反応によっては、突出領域はランダム配列でも良いし、特定のＲＮＡ分子を標的とした決められた配列でも良い。さらに、部分的に二本鎖になったオリゴヌクレオチドはＤＮＡリガーゼを用いてＲＮＡにオリゴヌクレオチドを連結させるのに用いることもできる。その後、適当なプライマーの結合、逆転写酵素の処理、ＲＮＡの分解を行い、ｃＤＮＡを得る。下記でさらに詳細とバリエーションを述べる。
【図４】図４は、ランダムプライミングを用いたｃＤＮＡ第一鎖合成の概念図である。図１から３に示されるすべてのステップ、又は部分的なステップに沿って得られた単一又は複数の種類の修飾されたＲＮＡ分子は、逆転写酵素を用いて鋳型ＲＮＡのコピーｃＤＮＡを合成する反応に用いることができる。この反応は鋳型ＲＮＡにハイブリダイズしＤＮＡ合成を開始するプライマーが必要である。この図に示されている例では、３’末端にランダム配列（図中ＮＮＮＮで示す）とそれに続く確定した配列を持つプライマーセットが用いられている。任意のこのようなプライマーセットが、塩基配列および５’末端に付加したオリゴヌクレオチド（パネルＡからＣ）から得られる官能基を持った修飾ＲＮＡを鋳型として行われるＤＮＡ合成のプライミングに用いることができる。
【図５】図５は、オリゴｄＴプライマーを用いたｃＤＮＡ第一鎖合成の概念図である。図１から３に示されるすべてのステップ、又は部分的なステップに沿って得られた単一又は複数の種類の修飾されたＲＮＡ分子は、逆転写酵素を用いて鋳型ＲＮＡのコピーｃＤＮＡを合成する反応に用いることができる。この反応は鋳型ＲＮＡにハイブリダイズしＤＮＡ合成を開始するプライマーが必要である。この図に示されている例では、多種類のｍＲＮＡの３’末端に通常見られるポリＡ配列にハイブリダイズするオリゴｄＴプライマーが用いられている。オリゴｄＴプライマーは、塩基配列および５’末端に付加したオリゴヌクレオチド（パネルＡからＣ）から得られる官能基を持った修飾ＲＮＡを鋳型として行われるＤＮＡ合成のプライミングに用いることができる。
【図６】図６は、ＤＮＡ／ＲＮＡの複合体からＲＮＡ除去を示す概念図である。図４、５で示すＲＮＡを鋳型としたＤＮＡの合成はＤＮＡ／ＲＮＡ複合体を形成する。このような任意のＤＮＡ／ＲＮＡ複合体分子のＲＮＡ部分はＲＮＡ分解酵素又は反応バッファーのｐＨを変えることによって取り除くことができる。例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素は特にＤＮＡ／ＲＮＡ複合体のＲＮＡを分解するので本発明の実施には好ましい酵素である。このような任意のＤＮＡ／ＲＮＡ複合体に対する処理はＤＮＡ鎖を一本鎖ＤＮＡ（パネルＡ）として、又は部分的に二本鎖のＤＮＡ分子として遊離する。部分的に二本鎖のＤＮＡ分子には前のステップでＲＮＡ分子に付加されたオリゴヌクレオチド（パネルＢ〜Ｄ）の部分がある。図にはオリゴｄＴを用いて得られるｃＤＮＡが描かれているが、ここで述べるＲＮＡの除去は逆転写反応に用いられるプライミングの種類によらず任意のｃＤＮＡにも適用できる。
【図７】図７は、本発明によって得られるＤＮＡ分子の応用の概念図である。本発明によって得られる図１〜６のいずれかに描かれている鋳型ＤＮＡは、例えば図２と３にある初期の段階でＲＮＡに付加されたオリゴヌクレオチドの性質の点で特徴を持っている。基本的な構造と応用はパネルＡ〜Ｄに示されている。
【図８】図８は、ｃＤＮＡの３’末端への官能基の導入を示した概念図である。図４と５で示すステップによって通常のオリゴｄＴプライマーまたはランダムプライマーが鋳型ＲＮＡからの第一鎖ｃＤＮＡ合成をプライミングするために必要である。そのようなプライマーは鋳型ＲＮＡの配列と相補配列領域を含んでも良く、後のｃＤＮＡ操作に用いるようにデザインされた配列を含んでも良い。また、図中「Ｆ」で示されているようにプライマーに官能基が付加されていても良い。そのような官能基は、ランダムプライマー（パネルＡ）又はオリゴｄＴプライマー（パネルＢ）のどちらを用いるかに関わらずｃＤＮＡに導入することができる。従って、本発明は修飾された末端をもつｃＤＮＡ断片を調製する手段を提供する。
【図９】図９は、修飾されたＤＮＡ断片の捕獲を示した概念図である。図１〜７のいずれかに示されたステップに従って本発明はＲＮＡ分子の５’末端に相当する位置に官能基を導入する手段を提供する。加えて、図８に示されたいずれかのステップに従って本発明はＲＮＡ分子の３’末端に相当する位置に官能基を導入する手段を提供する。本発明はＲＮＡに由来するｃＤＮＡのいずれかの末端に官能基を導入する手段を提供する。図中「Ｆ」で示されｃＤＮＡに付加される官能基が図中の開いたクランプで示される他の分子に対して結合親和性を持っている場合、官能基は修飾されたｃＤＮＡを捕獲し表面上に結合させるために用いることができる。パネルＡは官能基と表面上の結合相手の反応によって部分的二本鎖を持つｃＤＮＡが表面上に結合される原理を示している。ｃＤＮＡ分子の部分的に二本鎖になっている領域は、ＲＮＡの５’末端に相当するｃＤＮＡ断片の末端からの塩基配列決定を可能にする。パネルＢは官能基と表面上の結合相手の反応によって一本鎖ｃＤＮＡが表面上に付けられる原理を示している。ｃＤＮＡはＲＮＡの３’末端に相当する位置で表面上に結合するのに対し、ｃＤＮＡ分子の塩基配列決定を始める位置は外部プライマーを用いて決めても良い。パネルＣは表面上に結合したオリゴヌクレオチドまたはプライマーとハイブリダイゼーションすることによって一本鎖ｃＤＮＡ分子が表面上に結合する原理を示している。表面上のプライマーによって、ｃＤＮＡ断片に含まれる表面上プライマーとの配列相補性に基づいてどのｃＤＮＡ断片が表面に結合しているかを決定することができる。さらに、表面上プライマーはｃＤＮＡ分子の塩基配列決定の開始位置を決定する。
【図１０】図１０は、ヘアピン構造の導入を示す概念図である。図１〜７に記載のいずれかのステップによって、本発明はＲＮＡの５’末端に相当する位置にオリゴヌクレオチドを導入する手段を提供する。加えて、図８に示されたいずれかのステップに従って本発明はＲＮＡ分子の３’末端に相当する位置にオリゴヌクレオチドを導入する手段を提供する。本発明は、ｃＤＮＡ断片に修飾された末端を与えるために、ＲＮＡに由来するｃＤＮＡのいずれかの末端に特定の配列を導入する手段を提供する。図で示されるプロセスでは、本発明により導入される配列は、一本鎖ＤＮＡがその鎖中にある相補的配列の部分で二本鎖を形成し末端に閉じたループを作ってヘアピン構造を形成することができる。ここで開示された手段を用いて、ＲＮＡに由来するＤＮＡ分子は、ｃＤＮＡ合成にランダムプライマー（パネルＡ）を用いたかオリゴｄＴプライマー（パネルＢ）を用いたかに関わらず、向かい合った末端にヘアピン構造を含むように修飾されることができる。
【図１１】図１１は、修飾されたＤＮＡ断片の増幅を示した概念図である。図１０で示されたステップによって調製されたＤＮＡ断片は、二つの向かい合った末端にあるヘアピン構造を使って増幅することができる。パネルＡに示すように、向かい合った末端にループ構造を持つ一本鎖ＤＮＡ断片はＬＡＭＰ法と呼ばれるＬｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｎｏｔｏｍｉ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ８，ｅ６３，２０００、本文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）の鋳型となることができる。本発明により調製されたＤＮＡ断片は繰り返し配列を含むポリマーが得られる方法で増幅することが可能であり、このようなポリマーが含むループ構造は増幅反応の伸長をプライミングするために用いることができ、また塩基配列決定反応を推進するために用いることができる。パネルＢに示されるように、各々の末端にループ構造を持つＤＮＡ断片は、エクソヌクレアーゼ活性と鎖置換活性を持たないＤＮＡポリメラーゼによって、ヘアピン構造の自由３’末端が伸長される第一の反応を含むステップによって、環状一本鎖ＤＮＡ分子に転換され得る。鎖置換活性の欠如により、ＤＮＡポリメラーゼは向かい合ったヘアピン構造の５’末端に達した時に反応が停止する。第二の反応ステップでは、一本鎖ＤＮＡの開いた末端が環状ＤＮＡ分子を作るように結合される。環状一本鎖ＤＮＡ分子はＲＣＡ法によって増幅することが可能である。ＲＣＡ法における種々の改変や応用は当業者が知り得るものである。他のＲＣＡ法の参照文献としてＧｕｓｅｖ、  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １５９，６３−６９  （２００１）、  Ｚｈａｎｇ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ，３６３，６１−７０  （２００６）（これらの文献は、参照することによって本明細書に組み込まれるものとする）が挙げられる。従って、本発明によって調製されたＤＮＡ断片は直線状の繰り返し配列を含むポリマーが得られる方法で増幅することができる。そのようなポリマーは、少なくとも最初のＲＮＡの配列のコピーを二つ含み、よって二つの配列はお互いに相補的となる。そのようなポリマーはまた、最初のＲＮＡに由来する二つの配列のいずれかより塩基配列決定反応を推進するために用いることができる配列を含んでいる。
【図１２】図１２は、プールされたサンプルとｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列との導入を示す概念図である。図１と２で示すいずれかのステップは完全長ｍＲＮＡの５’末端にオリゴヌクレオチドを導入するために用いることができる。そのようなオリゴヌクレオチドは、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列と呼ばれる配列情報を含む領域を含んでも良く、それは修飾されたＲＮＡおよびＲＮＡに由来する任意のＤＮＡの由来をプールされたサンプル中で同定するために用いられる。プールされたサンプルは、異なるＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列（パネルＢ）を含むＲＮＡサンプルを混合して得られる。さらに、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列は検出と解析のために一分子を捕獲するために用いても良く、またプールサンプルの中にある選ばれたサンプルの塩基配列決定反応をプライミングするために用いても良い。そのようなＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列は、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列を塩基配列反応で決定することにより、あるいはＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列と相補的な配列（パネルＣ）かまたはＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ配列を含む分子を表面上の規定された位置で選択的に捕獲することにより、ＲＮＡに由来する個々のＤＮＡまたはＲＮＡの由来を同定するために用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【外国語明細書】
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