(57)【要約】      （修正有）【課題】市場価値のある植物の生育を阻害せずに雑草の生育を阻害する除草剤を製造する方法の提供。【解決手段】特定な配列のアミノ酸配列からなるＣＤＰＫ２酵素タンパク質等か、該酵素タンパク質を含む融合タンパク質かと、タンパク質リン酸化活性増強剤候補化合物とを用意するステップと、前記タンパク質又は融合タンパク質と、前記タンパク質リン酸化活性増強剤候補化合物とを含む反応液中で、タンパク質リン酸化活性を測定するステップとを含むタンパク質リン酸化活性増強作用の評価方法を用いる、複数の前記タンパク質リン酸化活性増強剤候補化合物のうちタンパク質リン酸化活性増強作用が強力な候補化合物をタンパク質リン酸化活性増強剤として選択するステップを含む、除草剤の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）（１）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＤＰＫ２酵素タンパク質と、
（２）前記アミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム依存性タンパク質リン酸化活性を有するタンパク質と、
（３）前記アミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アルタナル酸により増強される前記タンパク質リン酸化活性を有するタンパク質とからなるグループから選択されることを特徴とするタンパク質と、
（４）前記（１）ないし（３）のタンパク質からなる第１ポリペプチドと、特異的結合タグとからなる第２ポリペプチドとが連結した融合タンパク質とのうちのいずれか１つのタンパク質と、タンパク質リン酸化活性増強剤候補化合物とを用意するステップと、
（Ｂ）前記タンパク質又は融合タンパク質と、前記タンパク質リン酸化活性増強剤候補化合物とを含む反応液中で、タンパク質リン酸化活性を測定するステップとを含むことを特徴とするタンパク質リン酸化活性増強作用の評価方法。
【請求項２】
前記特異的結合タグは、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、インテインタグ、ＭＢＰ又はＧＳＴからなるグループから選択されることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質リン酸化活性増強作用の評価方法。
【請求項３】
前記反応液はＣａ２＋及びＭｇ２＋イオンを含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の評価方法。
【請求項４】
前記タンパク質リン酸化活性増強剤候補化合物はアルタナル酸の誘導体であることを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の評価方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれかに記載の評価方法を用いて、複数の前記タンパク質リン酸化活性増強剤候補化合物のうちタンパク質リン酸化活性増強作用が強力な候補化合物をタンパク質リン酸化活性増強剤として選択するステップを含むことを特徴とするタンパク質リン酸化活性増強剤の製造方法。
【請求項６】
請求項１ないし４のいずれかに記載の評価方法によって、複数の前記タンパク質リン酸化活性増強剤候補化合物のうち特定の植物種由来のＣＤＰＫ２酵素に対するタンパク質リン酸化活性増強作用が他の植物種由来ＣＤＰＫ２酵素に対するタンパク質リン酸化活性増強作用に比べて弱い候補化合物を該特定の植物の生育を阻害しない除草剤として選択するステップを含むことを特徴とする除草剤の製造方法。
【請求項７】
前記特定の植物種はジャガイモであることを特徴とする請求項６に記載の除草剤の製造方法。
【請求項８】
前記他の植物種はシロイヌナズナ又はタバコであることを特徴とする請求項６又は７に記載の除草剤の製造方法。
【請求項９】
（Ａ）（１）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＤＰＫ２酵素タンパク質と、
（２）前記アミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム依存性タンパク質リン酸化活性を有するタンパク質と、
（３）前記アミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アルタナル酸により増強される前記タンパク質リン酸化活性を有するタンパク質とからなるグループから選択されることを特徴とするタンパク質と、
（４）前記（１）ないし（３）のタンパク質からなる第１ポリペプチドと、特異的結合タグとからなる第２ポリペプチドとが連結した融合タンパク質とのうちのいずれか１つのタンパク質とを含むことを特徴とするタンパク質リン酸化活性増強剤候補化合物のタンパク質リン酸化活性増強作用の評価キット。
【請求項１０】
前記特異的結合タグは、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、インテインタグ、ＭＢＰ又はＧＳＴからなるグループから選択されることを特徴とする請求項９に記載の評価キット。
【請求項１１】
前記タンパク質リン酸化活性増強剤候補化合物はアルタナル酸の誘導体であることを特徴とする請求項９又は１０に記載の評価キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なタンパク質リン酸化活性増強作用の評価方法と、該タンパク質リン酸化活性増強作用を指標とする除草剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルタナル酸（Ａｌｔｅｒｎａｒｉｃ  ａｃｉｄ）は、ジャガイモ又はトマトの胴枯れ病の原因となる真菌であるＡｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉにより産生される毒素であり、図１に示す構造を有する。アルタナル酸は、宿主特異性の決定と、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉにより引き起こされる疾病の発病とに関わることが報告されている（非特許文献１及び２）。またジャガイモの塊茎の切片に塗布されたアルタナル酸がＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓの非親和性レースによる感染後の宿主植物の過敏感反応（Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の発生を遅延させることから、アルタナル酸は過敏感反応のサプレッサーであることが報告されている（非特許文献３）。アルタナル酸は除草剤としての用途があることが知られている（特許文献１）。
【特許文献１】米国特許第５，２５６，６２８号明細書
【非特許文献１】Ｆｕｒｕｉｃｈｉ，Ｎ．ａｎｄ  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｓ．（１９８４）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｎａｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｆｌｕｉｄｓ  ｏｆ  Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ．  Ａｎｎ．ｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．５０：１２８（Ａｂｓｔｒ．ｉｎ  Ｊａｐａｎｅｓｅ）．
【非特許文献２】Ｌａｎｇｓｄｏｒｆ，Ｇ．，Ｆｕｒｕｉｃｈｉ，Ｎ．，Ｄｏｋｅ，Ｎ．ａｎｄ  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｓ．（１９９０）Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ：Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｎａｒｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ａ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｐｏｒｅ−ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｆｌｕｉｄ  ｏｆ  Ａ．ｓｏｌａｎｉ．  Ｊ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １２８：２７１−２８２．
【非特許文献３】Ｆｕｒｕｉｃｈｉ，Ｎ．，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｓ．  ａｎｄ  Ｌａｎｇｓｄｏｒｆ，Ｇ．（１９９２）Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｎａｒｉｃ  ａｃｉｄ，ａ  ｔｏｘｉｎ  ｏｆ  Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ，ｏｎ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｐｏｔａｔｏ  ｔｏ  Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ．  Ａｎｎ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．５８：１−７
【０００３】
過敏感反応サプレッサーで処理後のジャガイモのさまざまなタンパク質がカルシウム依存性のリン酸化により修飾されることが報告されている（非特許文献４）。また、カルシウム依存性タンパク質リン酸化酵素（以下、「ＣＤＰＫ」という。）は、遺伝子発現、代謝、膜輸送及び細胞構造の制御に関与する複数のアイソフォームを有する多機能酵素である（非特許文献５）。
【非特許文献４】Ｆｕｒｕｉｃｈｉ，Ｎ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａ．Ｊ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．ａｎｄ  Ｔａｋｅｍｏｔｏ，Ｊ．Ｙ．（１９９４）Ｅｌｉｃｉｔｏｒ  ａｎｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｐｏｔａｔｏ  ａｎｄ  ｂｅａｎ  ｔｉｓｓｕｅｓ．  Ｉｎ  Ｈｏｓｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔｏｘｉｎ：Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｋｏｈｍｏｔｏ，Ｋ．ａｎｄ  Ｙｏｄｅｒ，Ｏ．Ｃ．，ｅｄｓ．）．ｐｐ．２７３−２７４，Ｔｏｔｔｏｒｉ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｔｏｒｉ．
【非特許文献５】Ｈａｒｍｏｎ，Ａ．Ｃ．，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈａｒｐｅｒ，Ｊ．Ｆ．（２０００）ＣＤＰＫｓ−ａ  ｋｉｎａｓｅ  ｆｏｒ  ｅｖｅｒｙ  Ｃａ２＋  Ｓｉｇｎａｌ？  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．５：１５４−１５９．
【０００４】
最近、病原菌由来の過敏感反応サプレッサーによる過敏感反応の抑制と、前記病原菌による病気の宿主組織全体での発症とにジャガイモ由来のＣＤＰＫが関与することが発表された（特許文献２）。それによると、過敏感反応が抑制される過程は、（１）過敏感反応サプレッサーが宿主細胞壁及び形質膜を貫通する段階と、（２）前記過敏感反応サプレッサーとＣＤＰＫ１の受容体部位とが結合する段階と、（３）リン酸化反応を介してＣＤＰＫ２がシグナル伝達を行う段階と、（４）過敏感反応が抑制されることにより宿主組織全体が疫病に罹患する段階とを含む。
【特許文献２】公開特許公報（特開２００７−６８４３９）明細書
【０００５】
本発明はアルタナル酸がＣＤＰＫ２のタンパク質リン酸化活性を増強する作用を有することの発見に基づいて、新規な除草剤を開発することを意図する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来の除草剤は市場価値のある植物の生育を阻害せずに雑草の生育を阻害することができない。特定の除草剤に対する耐性遺伝子を導入したトランスジェニック植物は該特定の除草剤によって生育が阻害されないが、市場価値のある全ての植物に前記耐性遺伝子を導入することは事実上不可能に近い。そこで、除草剤の作用機序の知見に基づいて、より強力な除草剤及び市場価値のある植物の生育を阻害せずに雑草の生育を阻害する除草剤を製造する方法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明はタンパク質リン酸化活性増強作用の評価方法を提供する。本発明のタンパク質リン酸化活性増強作用の評価方法は、
（Ａ）（１）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＤＰＫ２酵素タンパク質と、（２）前記アミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム依存性タンパク質リン酸化活性を有するタンパク質と、（３）前記アミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アルタナル酸により増強される前記タンパク質リン酸化活性を有するタンパク質とからなるグループから選択されることを特徴とするタンパク質と、（４）前記（１）ないし（３）のタンパク質からなる第１ポリペプチドと、特異的結合タグとからなる第２ポリペプチドとが連結した融合タンパク質とのうちのいずれか１つのタンパク質と、タンパク質リン酸化活性増強剤候補化合物とを用意するステップと、
（Ｂ）前記タンパク質又は融合タンパク質と、前記タンパク質リン酸化活性増強剤候補化合物とを含む反応液中で、タンパク質リン酸化活性を測定するステップとを含む。本発明の評価方法は、前記候補化合物の存在下と非存在下とにおける前記タンパク質又は融合タンパク質のタンパク質リン酸化活性を比較すること、及び、前記候補化合物存在下でのタンパク質リン酸化活性が非存在下でのタンパク質リン酸化活性よりどの程度高いかを評価することを含む場合がある。本発明のタンパク質リン酸化活性増強作用の評価方法に用いる反応液にはＣａ２＋及びＭｇ２＋イオンを含む場合がある。
【０００８】
第２ポリペプチドの特異的結合タグは、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、インテインタグ、ＭＢＰ又はＧＳＴからなるグループから選択される場合がある。
【０００９】
本発明の評価方法でタンパク質リン酸化活性増強作用が評価されるタンパク質リン酸化活性増強剤候補化合物はアルタナル酸の誘導体の場合がある。
【００１０】
本発明は、本発明の評価方法を用いて複数の前記タンパク質リン酸化活性増強剤候補化合物のうちタンパク質リン酸化活性増強作用が強力な候補化合物を除草剤として選択するステップを含むことを特徴とする除草剤の製造方法を提供する。
【００１１】
本発明は、本発明の評価方法によって複数の前記タンパク質リン酸化活性増強剤候補化合物のうち特定の植物種由来のＣＤＰＫ２酵素に対するタンパク質リン酸化活性増強作用が他の植物種由来ＣＤＰＫ２酵素に対するタンパク質リン酸化活性増強作用に比べて弱い候補化合物を除草剤として選択するステップを含むことを特徴とする除草剤の製造方法を提供する。
【００１２】
本発明の除草剤の製造方法において、前記特定の植物種はジャガイモの場合があり、前記他の植物種はシロイヌナズナ又はタバコの場合がある。
【００１３】
本発明はタンパク質リン酸化活性増強剤候補化合物のタンパク質リン酸化活性増強作用の評価キットを提供する。本発明の評価キットは、（Ａ）（１）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＤＰＫ２酵素タンパク質と、（２）前記アミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム依存性タンパク質リン酸化活性を有するタンパク質と、（３）前記アミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アルタナル酸により増強される前記タンパク質リン酸化活性を有するタンパク質とからなるグループから選択されることを特徴とするタンパク質と、（４）前記（１）ないし（３）のタンパク質からなる第１ポリペプチドと、特異的結合タグとからなる第２ポリペプチドとが連結した融合タンパク質とのうちのいずれか１つのタンパク質とを含むことを特徴とする。
【００１４】
本発明のタンパク質リン酸化活性増強作用の評価キットにおいて、前記特異的結合タグは、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、インテインタグ、ＭＢＰ又はＧＳＴからなるグループから選択される場合がある。前記タンパク質リン酸化活性増強剤候補化合物はアルタナル酸の誘導体である場合がある。
【００１５】
本明細書で用いられるところの「タンパク質」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合で連結した化合物である。タンパク質は、メチル基、チオール基、リン酸、糖鎖、及び／又は、その他の共有結合による修飾を含む場合がある。本明細書で用いられるところの「ポリペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合で連結した化合物である。
【００１６】
本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質をエンコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡを、無生物発現系か、宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系かで発現させることにより産生される。本発明の融合タンパク質は、第１ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡと、第２ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡとが連結されたＤＮＡを、無生物発現系か、宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系かで発現させることにより産生される。前記宿主生物は、大腸菌、枯草菌等のような原核生物と、酵母、菌類、植物、動物等のような真核生物とを含む。本発明の宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系は、細胞や組織のような生物の一部か、生物の個体全体かの場合がある。
【００１７】
配列番号１のアミノ酸配列からなるカルシウム依存性タンパク質リン酸化酵素ＣＤＰＫ２は、Ｒｉｓｈｉｒｉ品種のジャガイモから単離された。配列番号１のアミノ酸配列は、ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬのデータベースにアクセッション番号ＡＢ０５５１８０９として登録された。
【００１８】
本明細書で用いられるところの「第１ポリペプチド」とは、所望の機能、すなわち、タンパク質リン酸化活性を有するポリペプチドである。本明細書で用いられるところの「第２ポリペプチド」とは、発現タンパク質の分離、精製又は検出をより容易に行うために、第１ポリペプチドとペプチド結合で連結されるポリペプチドである。第２ポリペプチドは、第１ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に連結される場合がある。
【００１９】
本発明の第１ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなるＲｉＣＤＰＫ２酵素タンパク質か、前記アミノ酸配列において１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム依存性タンパク質リン酸化活性を有するタンパク質かの場合がある。本発明の第１ポリペプチドのタンパク質リン酸化活性はアルタナル酸により増強される場合がある。
【００２０】
本発明の酵素のタンパク質リン酸化活性は、該酵素タンパク質自体が基質になる場合の他、他のタンパク質又はポリペプチドを基質とする場合がある。本発明のカルシウム依存性タンパク質リン酸化活性とは、本発明の酵素のタンパク質リン酸化活性がＣａ２＋イオン存在下では非存在下でよりも高い、すなわち、増強されることをいう。本発明のタンパク質リン酸化活性増強剤は、該増強剤の存在下で非存在下でよりもタンパク質リン酸化活性を増強する。本発明のタンパク質リン酸化活性増強剤候補化合物は、本発明のタンパク質リン酸化活性増強剤となる可能性がある化合物であって、本発明の評価方法によってタンパク質リン酸化活性増強作用が強力なものが本発明のタンパク質リン酸化活性増強剤として選択される。本発明のタンパク質リン酸化活性増強剤の製造方法は、本発明の評価方法を用いて本発明のタンパク質リン酸化活性増強剤候補化合物のタンパク質リン酸化活性増強作用を評価して、該作用が強力なものを本発明のタンパク質リン酸化活性増強剤として選択するステップを含む。
【００２１】
第２ポリペプチドは特異的結合タグからなる。本発明で用いられるところの「特異的結合タグ」とは、所望の機能を有するポリペプチドを遺伝子組み換えによって調製する際に、前記所望の機能を有するポリペプチドとペプチド結合で連結した融合タンパク質として発現させることにより、形質転換体からの発現タンパク質の分離、精製又は検出をより容易に行うことを可能にするために、他のタンパク質、多糖類、糖脂質、核酸及びこれらの誘導体、樹脂、シリコン等と特異的に結合するポリペプチドである。特異的結合タグは、水溶液中に溶解した物質又は固体支持体と結合する場合がある。本発明の特異的結合タグは、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、インテインタグ、ＭＢＰ、ＧＳＴその他これらに類するポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。前記特異的結合タグは、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、インテインタグ、ＭＢＰ又はＧＳＴからなるグループから選択される場合がある。
【００２２】
本発明で用いられるところの「Ｈｉｓタグ」とは、ヒスチジン残基が連続するアミノ酸配列からなるタグである。前記ヒスチジン残基の数は少なくとも５個、好ましくは６ないし１０個、最も好ましくは６個である。Ｈｉｓタグを連結した融合タンパク質は、Ｈｉｓタグと金属イオンとキレート化合物とが錯体を形成することを利用して分離、精製される。本発明で用いられるところの「キレート化合物」とは、金属イオンと特異的に配位結合をする原子団をいう。前記キレート化合物は、ニトリロ三酢酸又はイミノ二酢酸の場合があるがこれらに限定されない。前記キレート化合物は、直接的に、又はスペーサーを介して間接的に、カラム担体等の固体支持体に固定化される。前記金属イオンは、Ｎｉ２＋イオン又はＣｏ２＋イオンのような遷移金属イオンの場合があるがこれらに限定されない。Ｈｉｓタグを利用するタンパク質精製用の前記金属イオンを捕捉したキレート化合物を固定化した固体支持体は、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースとして、インビトロジェン、キアゲン社等から入手することができる。Ｈｉｓタグを利用するタンパク質精製システムで商業的に入手可能なものには、Ｎｉ−ＮＴＡ精製システム（インビトロジェン株式会社、カタログ番号：Ｋ９５００１）、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｆａｓｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｋｉｔ（株式会社キアゲン、カタログ番号：３０６００）等が含まれるがこれらに限定されない。
【００２３】
Ｈｉｓタグを連結した融合タンパク質の精製の手順は、（１）前記金属イオンを捕捉したキレート化合物を固定化した固体支持体を用意するステップと、（２）前記固体支持体と前記融合タンパク質とを接触させることにより、前記金属イオンと融合タンパク質のＨｉｓタグ部分のイミダゾール基を構成する窒素との間で配位結合を形成させ、前記融合タンパク質を前記固体支持体に捕捉するステップと、（３）前記固体支持体を洗浄して不要成分を除去するステップと、（４）遊離イミダゾール化合物を含む溶出液を添加することにより前記融合タンパク質を前記固体支持体から解離させて回収するステップとを含むのが一般的である。
【００２４】
本発明で用いられるところの「ｍｙｃタグ」とは、ヒトｃ−ｍｙｃタンパク質の４１０番−４１９番の１０個のアミノ酸の配列に対応する、配列番号３のアミノ酸配列からなるタグである。ｍｙｃタグを連結した融合タンパク質は、ｍｙｃタグと該タグに特異的に結合する抗体との抗原抗体複合体形成を利用して分離、精製される。本発明で用いられるところの「ｍｙｃタグペプチド」とは、ヒトｃ−ｍｙｃタンパク質の４１０番−４１９番の１０個のアミノ酸の配列に対応する、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。本発明で用いられるところの「抗体」は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む。抗ｍｙｃタグモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ細胞９Ｅ１０株により産生される。ｍｙｃタグを利用するタンパク質精製システムで商業的に入手可能なものには、ＡＮＴＩ−ｃ−Ｍｙｃ  ＡＧＡＲＯＳＥ  ＣＯＮＪＵＧＡＴＥ（シグマアルドリッチ ジャパン株式会社、カタログ番号：Ａ７４７０）、ｃ−Ｍｙｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ（シグマアルドリッチ ジャパン株式会社、カタログ番号：Ｍ２４３５）、ｃ−Ｍｙｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｇａｒｏｓｅ  Ｂｅａｄｓ（クロンテック、タカラバイオ株式会社、カタログ番号：３８４３−１）等が含まれるが、これらに限定されない。
【００２５】
ｍｙｃタグを連結した融合タンパク質の精製の手順は、（１）抗ｍｙｃタグ抗体が固定化された固体支持体を用意するステップと、（２）前記固体支持体と前記融合タンパク質とを接触させることにより、前記融合タンパク質のｍｙｃタグ部分と前記抗体との間で複合体を形成させて、前記融合タンパク質を前記固体支持体に捕捉するステップと、（３）前記固体支持体を洗浄し不要成分を除去するステップと、（４）ｍｙｃタグペプチドを含む溶出液を添加することにより前記融合タンパク質を前記固体支持体から解離させて回収するステップとを含むのが一般的である。
【００２６】
本発明で用いられるところの「ＨＡタグ」とは、ヒトインフルエンザウィルスのヘマグルチニン（ＨＡ）の９８番−１０６番の９個のアミノ酸に対応する、配列番号４のアミノ酸配列からなるタグである。ＨＡタグを連結した融合タンパク質は、ＨＡタグと該タグに特異的に結合する抗体との抗原抗体複合体形成を利用して分離、精製される。ＨＡタグに対応するモノクローナル抗体は例えば、ハイブリドーマ細胞ＨＡ−７株により産生される。ＨＡタグを利用するタンパク質精製システムで商業的に入手可能なものには、例えばＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉ−ＨＡ  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｌｏｎｅ  ＨＡ−７（シグマアルドリッチ ジャパン株式会社、カタログ番号：Ａ２０９５）、ＩＮＦＬＵＥＮＺＡ  ＨＥＭＡＧＧＬＵＴＩＮＩＮ（ＨＡ）ＰＥＰＴＩＤＥ（シグマアルドリッチ ジャパン株式会社、カタログ番号：Ｉ２１４９）等が含まれるがこれらに限定されない。
【００２７】
ＨＡタグを連結した融合タンパク質は、ｍｙｃタグの場合と同様の手順で精製される。
【００２８】
本発明で用いられるところの「インテインタグ」とは、インテインにキチン結合ドメイン（ＣＢＤ）等のリガンド特異的結合ドメインを連結したタグである。インテインタグを連結した融合タンパク質は、キチン結合ドメインとキチンとの結合形成を利用して分離、精製される。インテインの自己切断能力を利用して、ワンステップで前記タグの除去後のタンパク質として精製することができる。インテインタグを利用するタンパク質発現・精製システムで商業的に入手可能なものには、ＩＭＰＡＣＴ（商標）  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社、カタログ番号：Ｅ６９００Ｓ）が含まれるがこれに限定されない。
【００２９】
インテインタグを連結した融合タンパク質の精製の手順は、（１）インテインタグを連結した融合タンパク質の溶液を用意するステップと、（２）前記溶液とキチンが固定化された固体支持体とを接触させることによりインテインタグのキチン結合ドメインとキチンとの間で複合体を形成させ、前記融合タンパク質を前記固体支持体に捕捉させるステップと、（３）前記固体支持体を洗浄し不要成分を除去するステップと、（４）ＤＴＴ又はβ−メルカプトエタノールのような還元剤の添加によりインテインの自己切断能力を活性化させて融合タンパク質からインテインタグを切断するステップと、（５）インテインタグが切断されたタンパク質を回収するステップとを含むのが一般的である。
【００３０】
本発明で用いられるところの「ＭＢＰ」とは、マルトース結合タンパク質である。ＭＢＰを連結した融合タンパク質は、アミロース等とＭＢＰとの結合形成を利用して分離、精製される。ＭＢＰを利用するタンパク質発現・精製システムで商業的に入手可能なものには、例えばｐＭＡＬ（商標）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社、カタログ番号：＃Ｅ８０００Ｓ）が含まれるがこれに限定されない。
【００３１】
本発明で用いられるところの「ＧＳＴ」とは、グルタチオンＳ転移酵素である。ＧＳＴを連結した融合タンパク質は、ＧＳＴと該酵素の基質であるグルタチオンとの親和性を利用して分離、精製される。ＧＳＴを利用するタンパク質精製システムで商業的に入手可能なものには、例えばＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社、カタログ番号：１７−５１３２−０１）、ＧＳＴｒａｐ  ＦＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社、カタログ番号：１７−５１３０−０２）等が含まれるがこれらに限定されない。
【００３２】
好ましくは第２ポリペプチドには、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、インテインタグ、ＭＢＰ又はＧＳＴが選択される。さらに好ましくはＨｉｓタグが選択される。
【００３３】
本発明の融合タンパク質は、第２ポリペプチドに加えて第３ポリペプチドが第１ポリペプチドに連結される場合がある。本明細書で用いられるところの「第３ポリペプチド」とは、第１ポリペプチドが第２ポリペプチドに連結されている場合にさらに連結されるポリペプチドであって、第１ポリペプチドを遺伝子組み換えによって調製する際に前記第３ポリペプチドと前記第１ポリペプチドとを連結した融合タンパク質として発現させることにより、形質転換体からの発現タンパク質の分離、精製又は検出をより容易に行うことを可能にする場合があるポリペプチドである。第３ポリペプチドは、形質転換体での発現タンパク質の分泌、安定化を可能にする場合がある。第３ポリペプチドは、第１ポリペプチドに対して第２ポリペプチドと同じ側か反対側かに連結される場合がある。第３ポリペプチドには、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、インテインタグ、ＭＢＰ、ＧＳＴの他、シグナルペプチド、プロテインＡ、Ｔｒｘタグ、ＣＢＰタグ、ＣＢＤタグ、ＣＢＲタグ、ｌｕｃ、ＨＳＰ、ＬａｃＺ、ＩｇＧ、アビジン、プロテインＧ等が含まれるがこれらに限定されない。
【００３４】
本発明のタンパク質リン酸化活性増強作用の評価方法のステップ（Ａ）で用意されるタンパク質リン酸化活性増強剤候補化合物は、ステップ（Ｂ）のリン酸化活性の測定に供試できるものであればよく、特に限定されない。前記タンパク質リン酸化活性増強剤候補化合物は、アルタナル酸の誘導体の場合がある。
【００３５】
本発明のタンパク質リン酸化活性増強作用の評価方法のステップ（Ｂ）では、該ステップのリン酸化活性測定において前記リン酸化活性増強剤誘導体候補化合物によるリン酸化活性を増強させ、該候補化合物間のリン酸化活性の差異をより明確に把握するために、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋イオンを添加する場合がある。前記Ｃａ２＋及びＭｇ２＋イオンの濃度は、リン酸化活性測定に問題が生じない濃度であれば特に限定されない。Ｃａ２＋イオンの濃度は１００μＭの場合がある。Ｍｇ２＋イオンの濃度は９００μＭの場合がある。
【００３６】
本発明のタンパク質リン酸化活性増強作用の評価方法のステップ（Ｂ）のタンパク質リン酸化活性は、ＣＤＰＫ２酵素によるタンパク質リン酸基転移反応を適切に測定できるいずれかの方法で測定される。例えば、ＣＤＰＫ２酵素とＡＴＰとを混合してリン酸化反応を行わせた後、リン酸基の脱離により生成したＡＤＰをホスホクレアチンとクレアチンキナーゼとを使用して定量することによりタンパク質リン酸化活性を測定することができる。また、ＣＤＰＫ２酵素とγ位のリン原子が放射性同位体であるＡＴＰ（例えば［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ）とを混合して反応させた後、タンパク質に結合した放射能を定量することによりタンパク質リン酸化活性を定量することができる。リン酸化活性測定システムで商業的に入手可能なものには、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｓｓａｙ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社、カタログ番号：ＲＰＮ７７）、ＳｉｇｎａＴＥＣＴ（商標）ＣａＭ  ＫＩＩ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社、カタログ番号：Ｖ８１６１）等が含まれるが、これらに限定されない。
【００３７】
本発明のタンパク質リン酸化活性増強剤の製造方法では、前記リン酸化活性増強剤の評価方法のステップ（Ｂ）に供試された複数のリン酸化活性増強剤候補化合物の中から、測定されたリン酸化活性が高い候補化合物をタンパク質リン酸化活性増強剤として選択する場合がある。
【００３８】
本発明のタンパク質リン酸化活性増強剤候補化合物はアルタナル酸の誘導体の場合がある。アルタナル酸は除草剤であるから、本発明のタンパク質リン酸化活性増強剤の製造方法により除草剤が製造される場合がある。したがって、本発明は除草剤の製造方法を提供する。アルタナル酸の誘導体は、アルタナル酸の各原子にさまざまな修飾を加えることによって合成される。
【００３９】
本発明の除草剤の製造方法における前記リン酸化活性増強剤候補化合物を選択するステップでは、前記リン酸化活性増強剤の評価方法のステップ（２）に供試された複数の前記タンパク質リン酸化活性増強剤候補化合物のうち特定の植物種由来のＣＤＰＫ２酵素に対するタンパク質リン酸化活性増強作用が他の植物種由来ＣＤＰＫ２酵素に対するタンパク質リン酸化活性増強作用に比べて弱い候補化合物を選択するステップを含む場合がある。このようにして選択されたリン酸化活性増強剤は前記特定の植物種の生育を阻害しない除草剤の場合がある。前記特定の植物種がジャガイモの場合には、前記他の植物種はジャガイモ畑に繁茂しうるジャガイモ以外のいずれかの植物であり、本発明の除草剤の製造方法はジャガイモの生育を阻害せずに雑草に有効な除草剤を製造することができる。
【００４０】
本発明において雑草とは、作物、花卉園芸等として市場価値がある植物以外の植物をいい、ジャガイモについて雑草とはジャガイモ以外の植物をいう。本発明の雑草には、ウキクサ（ｄｕｃｋｗｅｅｄｓ）、アカザ（ｒｅｄｒｏｏｔ  ｐｉｇｗｅｅｄ）、イヌホオズキ(ｂｌａｃｋ  ｎｉｇｈｔｓｈａｄｅ)、白花ようしゅちょうせんあさがお（ｊｉｍｓｏｎｗｅｅｄ）、タデ科雑草（ｎｏｒｔｈｅｎ  ｊｏｉｎｔｖｅｔｃｈ）、マメ科雑草、ウマゴヤシ、クローバー等が含まれるが、これらに限定されない。前記雑草のモデル植物としてシロイヌナズナ又はタバコを用いる場合がある。シロイヌナズナ及びタバコ由来のＣＤＰＫ２タンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３及び４に示す。本発明の除草剤の製造方法では、シロイヌナズナ又はタバコ由来のＣＤＰＫ２タンパク質を用いる本発明の評価方法によってタンパク質リン酸化活性増強作用が強力な候補化合物を選択し、該候補化合物のうち、ジャガイモ由来のＲｉＣＤＰＫ２タンパク質を用いる本発明の評価方法によってタンパク質リン酸化活性増強作用が弱い候補化合物をさらに選択することにより、ジャガイモの生育を阻害しないでジャガイモ以外の植物の生育を阻害する除草剤を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
以下に示す実施例によって本発明をより詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の詳細な説明のために一例として示すものであり、これらの実施例によって本発明の範囲が制限されると理解するべきではない。
【実施例１】
【００４２】
１．トマト葉に及ぼすアルタナル酸処理の影響の検討
１．１  方法
（生物学的材料の調製）
トマト植物として、品種「Ｆｕｋｕｊｕ  ＩＩ」を供試した。ジャガイモ植物として、品種「Ｒｉｓｈｉｒｉ」の塊茎を４°Ｃで保存し供試した。Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉを、ジャガイモ−ブドウ糖培地にて保存し供試した。
【００４３】
（アルタナル酸の精製）
Ｌａｎｇｓｄｏｒｆ，Ｇ．，Ｆｕｒｕｉｃｈｉ，Ｎ．ａｎｄ  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｓ．（１９８９）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｔｅｒｎａｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ．Ｉｎ  Ｈｏｓｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔｏｘｉｎｓ：  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ（Ｋｏｈｍｏｔｏ，Ｋ．ａｎｄ  Ｄｕｒｂｉｎ，Ｒ．Ｄ．ｅｄｓ．）．ｐｐ．４５−５８，Ｔｏｔｔｏｒｉ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｔｏｒｉ．及びＦｕｒｕｉｃｈｉ，Ｎ．，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｓ．ａｎｄ  Ｌａｎｇｓｄｏｒｆ，Ｇ．（１９９２）Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｎａｒｉｃ  ａｃｉｄ，ａ  ｔｏｘｉｎ  ｏｆ  Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ，ｏｎ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｐｏｔａｔｏ  ｔｏ  Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ．Ａｎｎ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．５８：１−７に記載の方法に従って、アルタナル酸（Ａｌｔｅｒｎａｒｉｃ  ａｃｉｄ）をＡ．ｓｏｌａｎｉの培養液から精製した。具体的には、Ａ．ｓｏｌａｎｉを、ジャガイモブドウ糖培地で２５°Ｃ、２５日間増殖させ、Ａ．ｓｏｌａｎｉ培養液を得た。該培養液は和光ゲルＣ２００シリカゲルを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィー法で分画し、クロロホルム：エタノール（体積比１９：１）の混合液で溶出した。アルタナル酸は０．５％アセトンを含む水溶液に溶解して保存した。
【００４４】
（トマト葉のアルタナル酸処理）
完全に成長したＦｕｋｕｊｕＩＩ品種のトマトの複葉を０．１％次亜塩素酸ナトリウムで消毒し、蒸留水で複数回リンスした後、植物１本あたり２枚の葉の表面を１５ｍｍ２未満の面積だけ均一に針で穿孔した。その後、前記葉をアルタナル酸を０、０．１、０．２５、２．５及び２５μＭそれぞれ添加した０．５％アセトンを含む水溶液３０μＬで処理し、昼１４時間、２３°Ｃ、無菌条件下でインキュベーションした。葉のネクローシスの有無はアルタナル酸処理の２４時間後に評価した。
【００４５】
１．２  結果
図２Ａはそれぞれの濃度のアルタナル酸で処理された葉表面の写真である。図２Ａ−ａ、図２Ａ−ｂ、図２Ａ−ｃ、図２Ａ−ｄはそれぞれ、２５μＭ、２．５μＭ、０．２５μＭ、０．１μＭのアルタナル酸溶液で処理したトマトの葉である。図２Ａ−ｅは対照実験のアルタナル酸を含まない０．５％アセトンを含む水溶液で処理したトマトの葉である。アルタナル酸での処理による特徴的な症状として、トマトの葉の葉脈につづく葉脈間のネクローシスと、広範な白化とが観察された。トマト葉でのネクローシスの重篤度は、処理液中のアルタナル酸の濃度に依存し（図２Ａ）、０．２５μＭより高い濃度のアルタナル酸溶液で処理した場合には処理後２４時間以内に静脈のネクローシスが肉眼で観察され（図２Ａ−ａ、図２Ａ−ｂ、図２Ａ−ｃ）、２５μＭのアルタナル酸溶液で処理したときに最も重度なネクローシスが観察された（図２Ａ−ａ）。しかし、０．１μＭのアルタナル酸溶液処理でも葉の処理部位の黄変がみられた（図２Ａ−ｄ）。これは、Ａ．ｓｏｌａｎｉをジャガイモの葉に感染させたときの徴候に類似していた。なお、本条件下での処理の２４時間後に顕微鏡で観察したところ、アルタナル酸で処理されたトマト細胞の過敏感細胞死の発生は、観察されなかった。これにより、アルタナル酸は宿主植物の過敏感反応を抑制することが確認された。本実施例により、Ａ．ｓｏｌａｎｉは宿主植物組織の過敏感反応を抑制することによりネクローシスを進行させ感染を成立させることと、Ａ．ｓｏｌａｎｉが生成するアルタナル酸が感染成立に関与する成分であることとが確認された。
【実施例２】
【００４６】
２．トマト葉に及ぼすＡ．ｓｏｌａｎｉの接種の影響の検討
２．１  方法
アルタナル酸処理の実験と同じように消毒、リンス及び穿孔されたトマトの葉をＡ．ｓｏｌａｎｉ生菌で処理して感染させた。
【００４７】
２．２  結果
図２Ｂ−２、２Ｂ−３、２Ｂ−４及び２Ｂ−５は、それぞれＡ．ｓｏｌａｎｉ感染後２、３，４及び５日後のトマト葉表面の写真である。図２Ｂから、Ａ．ｓｏｌａｎｉは接種２日後にトマト葉で症状を引き起こし（図２Ｂ−２）、感染後５日間にネクローシスが広がった（図２Ｂ−５）。これによりＡ．ｓｏｌａｎｉ生菌がネクローシスを誘発し感染を成立させることが確認された。
【実施例３】
【００４８】
３．ＲｉＣＤＰＫ２ｃＤＮＡの単離及びＲｉＣＤＰＫ２融合タンパク質の発現
３．１  方法
（ｃＤＮＡライブラリーの調製）
全ＲＮＡをＲｉｓｈｉｒｉ品種のジャガイモの葉及び根茎から単離し、オリゴｄＴセルロースを用いるクロマトグラフィによってポリＡ＋−ＲＮＡを精製した。該ポリＡ＋−ＲＮＡからオリゴｄＴプライマー及びｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｐｌｕｓ（アマシャムバイオサイエンス株式会社）を使って２本鎖ｃＤＮＡを合成した。前記２本鎖ｃＤＮＡとラムダｇｔ１１ファージをベクターとからｃＤＮＡライブラリを構築した。得られたｃＤＮＡライブラリからＤＮＡを抽出して、これを鋳型として、配列番号３及び４に列挙されたヌクレオチド配列を有するプライマーを用いてＲｉｓｈｉｒｉ品種のジャガイモＣＤＰＫ２（以下、「ＲｉＣＤＰＫ２」という。）をエンコードするｃＤＮＡを増幅した。
【００４９】
（ＲｉＣＤＰＫ２融合タンパク質発現ベクターの構築）
配列番号１のアミノ酸配列を有するＲｉＣＤＰＫ２タンパク質のＣ末端に６個のヒスチジン残基からなるＨｉｓタグが連結した融合タンパク質（以下、「Ｈｉｓ−ＲｉＣＤＰＫ２」という。）が発現できるようにＲｉＣＤＰＫ２のｃＤＮＡをｐＣＲＴ７ＣＴ  ＴＯＰＯベクターにクローン化した。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｖｏｌ．１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．）に記載の方法に従って、Ｈｉｓ−ＲｉＣＤＰＫ２を発現するｐＣＴＴ７ＣＴ  ＴＯＰＯコンストラクトで大腸菌（ＢＬ２１、ｐＬｙｓＳ）細胞を形質転換し、Ｈｉｓ−ＲｉＣＤＰＫ２を発現させた。
【００５０】
（Ｈｉｓ−ＲｉＣＤＰＫ２の調製）
発現したＨｉｓ−ＲｉＣＤＰＫ２の精製は、Ｘｐｒｅｓｓ（商標）Ｓｙｓｔｅｍタンパク質精製プロトコール（インビトロジェン株式会社）に従って行なった。アンピシリン７０μｇ／ｍｌと形質転換された大腸菌細胞とを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地に０．６ｍＭのＩＰＴＧを添加することによりタンパク質発現を誘導した。前記大腸菌細胞を２４時間、２５°Ｃで振とう培養し、ＲＰＲ−２０ローター（株式会社日立ハイテクノロジーズ）で４°Ｃ、１０分間、４０００ｒｐｍ遠心分離して回収した。回収した大腸菌をグアニジウムを含む溶菌バッファーで可溶化し、ＲＰＲ−２０ローターで４°Ｃ、１５分間、６５００ｒｐｍの遠心分離により上清を回収した。該上清を前記タンパク質精製プロトコールに従ってヒスチジン結合樹脂カラムに通し、Ｈｉｓ−ＲｉＣＤＰＫ２を溶出した。溶出されたＨｉｓ−ＲｉＣＤＰＫ２を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む水溶液に対して透析した。透析後のＨｉｓ−ＲｉＣＤＰＫ２溶液中のタンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．（１９７６）Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｇｒａｍ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４．）に従って、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準としてＢｉｏ−Ｒａｄ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔを使用することにより決定した。
【００５１】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンイムノブロット分析）
Ｈｉｓ−ＲｉＣＤＰＫ２の純度の確認のために、Ｌｅａｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．２２７，ｐｐ．６８０−６８１（１９７０）に記載の方法に従って、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動をｍｉｎｉＰＡＧＥ  Ｓｙｓｔｅｍ（アトー株式会社）を用いて分離し、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）Ｇ−２５０により染色し検出した。ウエスタンイムノブロット分析のため、電気泳動で分離されたタンパク質を、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Ｉｍｍｏｂｌｉｎ（商標）Ｐ、孔径０．４５μｍ、日本ミリポア株式会社）に写しとった。前記膜を、ブロッキング用緩衝液（３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、ＴＢＳ（２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ）でブロッキングし、希釈用緩衝液（１％のＢＳＡ及び０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加したＴＢＳ）で１／５０００に希釈した抗Ｈｉｓ（Ｃ末端）−マウスモノクローナルＩｇＧ２ｂ抗体とともに終夜インキュベーションを行なった。前記膜をＴＢＳＴ（０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加したＴＢＳ）で２回洗浄した後、２５０倍に希釈したアルカリホスフェターゼ結合ラビット抗マウス抗体（ＤＡＫＯ  Ｄ０３１４、ダコ  ジャパン株式会社）とともに室温にて１時間インキュベーションを行なった。前記膜をＴＢＳＴで洗浄した後、アルカリホスファターゼ緩衝液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．５）で洗浄し、ＡＰ結合基質キット（バイオラッドラボラトリーズ株式会社）を用いて、抗原−抗体複合体を検出した。
【００５２】
３．２  結果
ＲｉＣＤＰＫ２のヌクレオチド配列を配列番号２に示す。ＲｉＣＤＰＫ２がエンコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に示す。Ｈｉｓ−ＲｉＣＤＰＫ２は配列番号１のＲｉＣＤＰＫ２タンパク質のＮ末端に６個のヒスチジン残基からなるＨｉｓタグが連結した融合タンパク質である。ＩＰＴＧ誘導によりＨｉｓ−ＲｉＣＤＰＫ２を過剰発現させた大腸菌の培養２００ｍＬから、約１００μｇのＨｉｓ−ＲｉＣＤＰＫ２が精製された。Ｈｉｓ−ＲｉＣＤＰＫ２融合タンパク質は主に不溶性タンパク質画分で回収された。精製後の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動バンドから判断して約９０％であった。
【実施例４】
【００５３】
４．Ｃａ２＋イオン存在下及び非存在下でのＨｉｓ−ＲｉＣＤＰＫ２の酵素活性に対するアルタナル酸の影響の検討
４．１  方法
Ｈｉｓ−ＲｉＣＤＰＫ２の酵素活性は、Ｆｕｒｕｉｃｈｉ，Ｎ．、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａ．Ｊ．、Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．及びＴａｋｅｍｏｔｏ，Ｊ．Ｙ．（１９９４、Ｅｌｉｃｉｔｏｒ  ａｎｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｐｏｔａｔｏ  ａｎｄ  ｂｅａｎ  ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｉｎ  Ｈｏｓｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔｏｘｉｎ：Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｋｏｈｍｏｔｏ，Ｋ．ａｎｄ  Ｙｏｄｅｒ，Ｏ．Ｃ．，ｅｄｓ．）．ｐｐ．２７３−２７４、Ｔｏｔｔｏｒｉ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｔｏｒｉ）に記載の方法に従って実施された。図３に酵素活性のアッセイ系の概略を示す。簡潔には、９６ウェルマイクロタイタープレートを使用して、１処理当たり１個のウェルに１５５μＬの反応混合液（８．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．１）、５ｍＭ  ホスホクレアチン、０．４単位  クレアチンホスホキナーゼ（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）、１．５μｇ  Ｈｉｓ−ＲｉＣＤＰＫ２）を添加した。アルタナル酸及びＣａ２＋イオンの効果を調べる実験にはそれぞれ２５μＭのアルタナル酸及び０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２を前記反応混合液に添加した。酵素反応は０．９ｍＭ  ＡＴＰを添加することによって開始され、３０°Ｃ、１０分間継続された。酵素反応は、０．２％  １−ナフトール（和光純薬工業株式会社）及び０．０６％  ２，３−ブタンジオン（和光純薬工業株式会社）を含むストックアルカリ溶液（１．５Ｍ  ＮａＯＨ、０．７Ｍ  ＮａＨＣＯ３）を各ウェルに添加して発色させた。酵素活性の定量は、マイクロプレートリーダー（バイオラッド３５００、バイオラッドラボラトリーズ株式会社）を用いて５９５ｎｍの吸光度を１０分ごとには５０分後まで測定することによって実施された。吸光度の測定と次の測定との間、酵素反応に用いるマイクロタイタープレートは３０°Ｃに保温された。
【００５４】
４．２  結果
図４は、アルタナル酸及びＣａ２＋イオンの存在下におけるＨｉｓ−ＲｉＣＤＰＫ２のキナーゼ活性を、キナーゼ反応で生じるＡＤＰ量に対応する吸光度の相対値で表した棒グラフである。アルタナル酸存在下で５０分間反応させた場合の吸光度を１００％として、アルタナル酸及びＣａ２＋イオンとも非存在下（黒ベタ塗り）か、あるいは、アルタナル酸単独存在下（横線ハッチング）か、Ｃａ２＋イオン単独存在下（網掛けハッチング）か、アルタナル酸及びＣａ２＋イオンの両方の存在下（白）かのそれぞれの２回の異なる実験の結果の０分から５０分までの１０分おきの平均と標準偏差の上限とを示す。図４のグラフから、Ｈｉｓ−ＲｉＣＤＰＫ２のキナーゼ活性がＣａ２＋イオン存在下で増強されることから、カルシウム依存性タンパク質リン酸化活性があること、及び、アルタナル酸がＨｉｓ−ＲｉＣＤＰＫ２のキナーゼ活性を増強することが示された。
【実施例５】
【００５５】
５．Ｃａ２＋及びＭｇ２＋イオン存在下及び非存在下でのＨｉｓ−ＲｉＣＤＰＫ２の酵素活性に対するアルタナル酸の影響の検討
５．１  方法
アルタナル酸がＭｇ２＋イオン存在下でもＨｉｓ−ＲｉＣＤＰＫ２のタンパク質リン酸化活性に影響を与えるかどうかを調べるために、２５μＭのアルタナル酸、１００μＭのＣａＣｌ２及び９００μＭのＭｇＣｌ２を前記反応混合液に添加することを除いて、実施例４に記載のアッセイ系と同じ条件で実験を行なった。
【００５６】
５．２  結果
図５は、アルタナル酸、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋イオンの存在下におけるＨｉｓ−ＲｉＣＤＰＫ２のキナーゼ活性を、キナーゼ反応で生じるＡＤＰ量に対応する吸光度の相対値で表した棒グラフである。アルタナル酸、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋イオン存在下で５０分間反応させた場合の吸光度を１００％として、アルタナル酸及びＣａ２＋イオンとも非存在下（黒ベタ塗り）か、あるいは、アルタナル酸単独存在下（横線ハッチング）か、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋イオン存在下（網掛けハッチング）か、アルタナル酸とＣａ２＋及びＭｇ２＋イオンとの存在下（白）かのそれぞれの２回の異なる実験の結果の０分から５０分までの１０分おきの平均と標準偏差の上限とを示す。図５のグラフから、Ｈｉｓ−ＲｉＣＤＰＫ２のキナーゼ活性がＣａ２＋及びＭｇ２＋イオン存在下で増強されること、及び、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋イオンの有無にかかわらずアルタナル酸がＨｉｓ−ＲｉＣＤＰＫ２のキナーゼ活性を増強することが示された。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】アルタナル酸の化学構造式。
【図２Ａ】異なる濃度のアルタナル酸で処理された葉表面の写真。
【図２Ｂ】Ａ．ｓｏｌａｎｉ感染後２ないし５日後のトマト葉表面の写真。
【図３】酵素活性のアッセイ系の模式図。
【図４】アルタナル酸及びＣａ２＋イオンの存在下におけるＨｉｓ−ＲｉＣＤＰＫ２のキナーゼ活性を、キナーゼ反応で生じるＡＤＰ量に対応する吸光度の相対値で表した棒グラフ。
【図５】アルタナル酸、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋イオンの存在下におけるＨｉｓ−ＲｉＣＤＰＫ２のキナーゼ活性を、キナーゼ反応で生じるＡＤＰ量に対応する吸光度の相対値で表した棒グラフ。
【図１】
2009050223.tif 000002
【図３】
2009050223.tif 000003
【図４】
2009050223.tif 000004
【図５】
2009050223.tif 000005
【図２Ａ】
2009050223.tif 000006
【図２Ｂ】
2009050223.tif 000007
【配列表】
2009050223000001.app