(57)【要約】【課題】  短時間で砒素を検出することができるバイオセンサーを提供する。【解決手段】  リコペンの基質であるフィトエンを生産させるためのフィトエン生産ベクターと、フィトエンを基質として砒素の存在下で特異的にリコペンを生産させるためのリコペン生産センサーベクターとが導入された組換え大腸菌からなる砒素検出バイオセンサーであって、フィトエン生産ベクターがゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素の遺伝子及びフィトエン合成酵素の遺伝子を含み、リコペン生産センサーベクターがフィトエンデサチュラーゼの遺伝子及びこの遺伝子の上流に操作可能に連結された砒素誘導性プロモーターを含むことを特徴とする砒素検出バイオセンサー。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リコペンの基質であるフィトエンを生産させるためのフィトエン生産ベクターと、フィトエンを基質として砒素の存在下で特異的にリコペンを生産させるためのリコペン生産センサーベクターとが導入された組換え大腸菌からなる砒素検出バイオセンサーであって、フィトエン生産ベクターがゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素（ｃｒｔＥ）の遺伝子及びフィトエン合成酵素（ｃｒｔＢ）の遺伝子を含み、リコペン生産センサーベクターがフィトエンデサチュラーゼ（ｃｒｔＩ）の遺伝子及びこの遺伝子の上流に操作可能に連結された砒素誘導性プロモーターを含むことを特徴とする砒素検出バイオセンサー。
【請求項２】
ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素の遺伝子、フィトエン合成酵素の遺伝子及びフィトエンデサチュラーゼの遺伝子がパントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）又はパントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）由来の遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の砒素検出バイオセンサー。
【請求項３】
砒素誘導性プロモーターが、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号１の塩基配列と少なくとも６０％相同な塩基配列からなりかつ砒素誘導性プロモーター活性を有するＤＮＡであることを特徴とする請求項１又は２に記載の砒素検出バイオセンサー。
【請求項４】
砒素誘導性プロモーターとフィトエンデサチュラーゼの遺伝子の間にＡｒｓＲタンパク質結合部位が配置されていることを特徴とする請求項３に記載の砒素検出バイオセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環境中の砒素を短時間で検出することができるバイオセンサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
砒素は０．０００１％と非常に低い濃度ではあるが地表に広く分布しており、銅や鉛、金のような金属の鉱物に結合して存在している。多くの砒素は河川や雨の作用により、水圏に溶出し、地下水や海洋水に蓄積する。このように砒素は地質学的に特定水圏に蓄積する特徴をもっている。砒素の蓄積はその周辺で生活する人々の健康に重大な影響を及ぼし、動脈硬化、心筋梗塞、四肢末梢循環障害などの健康障害をもたらしている。そのほとんどは、砒素に汚染された地下水の利用が原因である。従って、飲料水に使用する水源が砒素に汚染されていないかどうかを検査することは、砒素による健康障害を未然に防止するために極めて重要である。
【０００３】
一方、一般的に砒素の検出は、高感度な測定が可能な誘導結合プラズマ発光分光分析（ＩＣＰ−ＡＥＳ）により行われている。しかし、この分析法に用いられる装置は極めて高価であり（数千万円）、莫大なコストを要するため、簡易に砒素を検出できる方法の開発が強く求められている。
【０００４】
簡易な砒素検出方法の一つとして、砒素誘導性プロモーターとｌａｃＺなどのレポーター遺伝子とを組合せて生きた細菌に導入したバイオセンサーが従来作成されている。しかし、かかるバイオセンサーにはレポーター遺伝子の発現を調べるのに特殊な装置を必要とするという問題があった。この問題を解決する方法として、肉眼で色調の変化を観察できる色素生産をレポーターとして使用することが考えられ、スフェロイデノン色素をレポーターとし、この色素生産の有無による光合成細菌の色調変化を利用した砒素検出バイオセンサーが本発明者らにより開発されている（特許文献１参照）。このバイオセンサーは特別な装置を必要とせず肉眼で砒素汚染を判定できる優れたセンサーであるが、色調変化を確認するにはサンプル添加後比較的長時間（２４時間〜４８時間）培養する必要がある。従って、短時間で色調変化を確認できる砒素検出バイオセンサーに対する要望が存在していた。
【０００５】
【特許文献１】国際公開ＷＯ  ２００６／０２２２３５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上述の従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、短時間で砒素を検出することができるバイオセンサーを提供することである。
【０００７】
本発明者らはかかる目的を達成するために、レポーターとして使用する色素の種類及び宿主として使用する微生物の種類について鋭意検討した結果、レポーター色素としてリコペンを使用し、宿主として大腸菌を使用することにより、従来のバイオセンサーより短時間で砒素を検出できることを意外にも見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明によれば、リコペンの基質であるフィトエンを生産させるためのフィトエン生産ベクターと、フィトエンを基質として砒素の存在下で特異的にリコペンを生産させるためのリコペン生産センサーベクターとが導入された組換え大腸菌からなる砒素検出バイオセンサーであって、フィトエン生産ベクターがゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素（ｃｒｔＥ）の遺伝子及びフィトエン合成酵素（ｃｒｔＢ）の遺伝子を含み、リコペン生産センサーベクターがフィトエンデサチュラーゼ（ｃｒｔＩ）の遺伝子及びこの遺伝子の上流に操作可能に連結された砒素誘導性プロモーターを含むことを特徴とする砒素検出バイオセンサーが提供される。
【０００９】
本発明のバイオセンサーの好ましい実施態様によれば、ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素の遺伝子、フィトエン合成酵素の遺伝子及びフィトエンデサチュラーゼの遺伝子はパントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）又はパントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）由来の遺伝子であり、砒素誘導性プロモーターは、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号１の塩基配列と少なくとも６０％相同な塩基配列からなりかつ砒素誘導性プロモーター活性を有するＤＮＡであり、砒素誘導性プロモーターとフィトエンデサチュラーゼの遺伝子の間にＡｒｓＲタンパク質結合部位が配置されている。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のバイオセンサーは、レポーター色素としてリコペンを使用し、宿主として大腸菌を使用しているので、サンプル添加から数時間で色調変化を確認することができ、レポーター色素としてスフェロイデノンを使用し、宿主として光合成細菌を使用する従来のバイオセンサーと比べて砒素検出に必要な時間を大幅に短縮することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明のバイオセンサーについて更に具体的に説明する。本発明のバイオセンサーは、大腸菌のリコペン色素の生産の有無による培養液の色調変化を利用してサンプル中の砒素の存在を検出するものである。
【００１２】
リコペンは、カロテノイドの一種である橙色の色素である。リコペンは生体内では、図１に示すように、ジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）からファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）、及びフィトエンを経るいわゆるイソプレノイド経路によって生合成される［１］。最終生産物であるリコペンは橙色を呈するが、出発物質又は中間生産物であるＤＭＡＰＰ，ＦＰＰ，ＧＧＰＰ及びフィトエンはいずれも無色の物質である。リコペンの生合成には三種類の酵素が関与している。即ち、ＦＰＰからＧＧＰＰへの反応はゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素（ｃｒｔＥ）によって行われ、ＧＧＰＰからフィトエンへの反応はフィトエン合成酵素（ｃｒｔＢ）によって行われ、フィトエンからリコペンへの反応はフィトエンデサチュラーゼ（ｃｒｔＩ）によって行われる。
【００１３】
リコペンはどの生物でも生合成されるわけではなく、大腸菌はＦＰＰを合成するが、リコペンまでは合成しない。これは、ＦＰＰ以降の反応に必要な酵素ｃｒｔＥ，ｃｔｒＢ及びｃｒｔＩが大腸菌には存在しないためである。しかし、他の生物（例えば、腸内細菌科に属する微生物であるパントエア・アナナティス及びパントエア・アグロメランス）由来のこれらの酵素の遺伝子を大腸菌に導入して発現させれば、ＦＰＰ以降の反応が進行して大腸菌でもリコペンが生産されることが知られている［２，３］。
【００１４】
本発明ではこの知見を利用し、三種類の酵素の遺伝子を遺伝子組換えによって大腸菌に導入してリコペンを生産する組換え大腸菌を作成する。この際、三種類の酵素の遺伝子（ｃｒｔＥ，ｃｔｒＢ，ｃｒｔＩ）のうち、ｃｒｔＥ及びｃｔｒＢは、砒素の存在の有無にかかわらず恒常的に発現するようにしておき、ＦＰＰからＧＧＰＰを経てフィトエンが大腸菌中で恒常的に生産されるようにしておく。一方、残りのｃｒｔＩは砒素の存在下でのみ特異的に発現されるようにしておく。従って、この組換え大腸菌では砒素が存在しないとｃｒｔＥ及びｃｒｔＢしか発現されず、無色のフィトエンの段階で生合成が停止するが、砒素が存在するとｃｒｔＩも発現されて無色のフィトエンから橙色のリコペンが生産され、培養液の色調が変化する。これにより、本発明のバイオセンサーでは砒素の存在を視覚的に検出することができる。
【００１５】
具体的には、本発明のバイオセンサーは、リコペンの基質であるフィトエンを生産させるためのフィトエン生産ベクターと、フィトエンを基質として砒素の存在下で特異的にリコペンを生産させるためのリコペン生産センサーベクターという二種類のベクターが導入された組換え大腸菌からなる。フィトエン生産ベクターはゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素（ｃｒｔＥ）の遺伝子及びフィトエン合成酵素（ｃｒｔＢ）の遺伝子を含み、これらの酵素遺伝子が大腸菌中で発現されることによって、ＦＰＰからＧＧＰＰを経てフィトエンが大腸菌中で生産される。リコペン生産センサーベクターはフィトエンデサチュラーゼ（ｃｒｔＩ）の遺伝子を含み、この酵素遺伝子が大腸菌中で発現されることによって、フィトエンからリコペンが大腸菌中で生産される。リコペン生産センサーベクターにおいて、ｃｒｔＩ酵素遺伝子の上流には砒素誘導性プロモーターが操作可能に連結されており、砒素の存在下でのみｃｒｔＩ酵素遺伝子が発現されるようになっている。なお、フィトエン生産ベクターにおいて、ｃｒｔＥ及びｃｒｔＢ酵素遺伝子の上流には、これらの酵素遺伝子が恒常的に発現されることを確実にするため、所望により適切な構成的プロモーターが操作可能に連結されてもよい。また、本発明のバイオセンサーにおいて、酵素遺伝子を組込むベクター及びこれらのベクターを導入される大腸菌は、特別なものである必要はなく、市販のものから適宜選択すればよい。
【００１６】
本発明のバイオセンサーで使用するｃｒｔＥ，ｃｔｒＢ及びｃｒｔＩ酵素遺伝子は、大腸菌中で適切に発現されて機能する限りいかなる生物種由来のものであることもできるが、大腸菌での発現が確認されているパントエア・アナナティス又はパントエア・アグロメランス由来のものであることが好ましい。
【００１７】
本発明のバイオセンサーで使用する砒素誘導性プロモーターは、下流に連結された遺伝子を砒素の存在下で特異的に発現させることができるプロモーターであればいかなるものであることができ、例えば大腸菌の砒素耐性遺伝子オペロンの上流のプロモーター領域及び砒素耐性遺伝子オペロンの最上流の遺伝子領域からなるものであることができる。大腸菌の砒素耐性遺伝子オペロンは、ａｒｓＲ，ａｒｓＢ及びａｒｓＣの三つの遺伝子から構成されており、最も上流側のａｒｓＲ遺伝子の上流にプロモーター領域であるＰａｒｓが連結されている。このオペロンは、砒素が存在する時にのみ強く発現する制御を受けていることを特徴とし、これは、ａｒｓＲ遺伝子がコードする発現制御タンパクＡｒｓＲとａｒｓＲＢＣのプロモーター領域であるＰａｒｓとの相互作用によって担われている。ＡｒｓＲタンパク質は、砒素結合能を示す配列と、ａｒｓＲＢＣのプロモーター領域であるＰａｒｓに結合能を示す配列とを有しており、砒素が存在していない時にはＰａｒｓに結合し、ａｒｓＲＢＣの転写を抑制している。一方、砒素が存在する時には、ＡｒｓＲタンパク質は、砒素と結合することによりコンフォメーション変化を起こし、Ｐａｒｓから解離するため、Ｐａｒｓからの転写が行われる。このように大腸菌の砒素耐性遺伝子オペロンでは、ＡｒｓＲタンパク質とａｒｓＲＢＣのプロモーター領域であるＰａｒｓとの相互作用により砒素への応答及び転写制御が行われている。従って、この大腸菌のＰａｒｓ及びａｒｓＲの領域は、効果的な砒素誘導性プロモーターとして本発明のバイオセンサーで利用することができる。
【００１８】
具体的には、上述の砒素誘導性プロモーターは、例えば配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡであることができる。また、配列番号１の塩基配列と少なくとも６０％相同な塩基配列からなりかつ砒素誘導性プロモーター活性を有するＤＮＡ、即ち配列番号１の塩基配列と均等の範囲にあるＤＮＡも本発明のバイオセンサー中の砒素誘導性プロモーターとして用いることができる。
【００１９】
配列番号１の塩基配列に対して均等の範囲にあるＤＮＡの配列番号１の塩基配列に対する相同性の好ましい範囲は少なくとも７０％であり、更に好ましい範囲は少なくとも８０％であり、更に好ましい範囲は少なくとも９０％であり、更に好ましい範囲は少なくとも９５％であり、最も好ましい範囲は少なくとも９８％である。なお、かかる相同なＤＮＡは、例えば当業者に周知の部位特異的突然変異法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．２０，ｐ．６４８７−６５００，１９８２）等により容易に調製することができる。また、得られたＤＮＡが砒素誘導性プロモーター活性を有するかどうかは、例えば得られたＤＮＡを適当なレポーター遺伝子の上流に導入した形質転換体大腸菌を作成し、砒素の存在下で培養してレポーター遺伝子の発現の有無を検出することにより確認することができる。
【００２０】
本発明のバイオセンサーでは、リコペン生産センサーベクター中の上述の大腸菌の砒素誘導性プロモーターとその下流に連結されたｃｒｔＩ遺伝子の間にＡｒｓＲタンパク質結合部位（ＡＢＳ）が配置されていることが、バックグラウンドを抑制してプロモーターの砒素特異性を高める上で好ましい。
【００２１】
なお、本発明において、用語「操作可能に連結された」は、プロモーターが遺伝子の上流に、遺伝子の発現制御を可能とする態様で配置されることを意味する。
【００２２】
また、本発明において、用語「砒素誘導性プロモーター」又は「砒素に対して特異的に応答を示す誘導性プロモーター」は砒素の存在下でのみその下流に連結された遺伝子の転写を可能とするＤＮＡを意味し、これは、通常のプロモーター領域に加えて、必要により大腸菌のａｒｓＲ遺伝子のようなプロモーター領域と相互作用する追加の制御タンパク質の遺伝子配列も含む概念である。
【００２３】
本発明のバイオセンサーは、ｃｒｔＥ及びｃｒｔＢ遺伝子を必要により適切な構成的プロモーターと共に適当なベクターに組込んでフィトエン生産ベクターを作成し、ｃｒｔＩ遺伝子を砒素誘導性プロモーターと共に適当なベクターに組込んでリコペン生産センサーベクターを作成し、これらのベクターを大腸菌に導入することによって容易に製造することができる。これらの工程はいずれも当業者に周知の常法に従って行うことができるので、その詳細な説明は省略する。
【００２４】
本発明のバイオセンサーを使用したサンプル中の砒素の検出は、本発明のバイオセンサーを含む培養液にサンプルを添加して培養し、培養液の色調の変化を調査することによって行うことができる。サンプル添加後の培養時間は３時間〜６時間程度で十分である。サンプル中に砒素が存在していると、大腸菌中にリコペンが生産されて蓄積するので、最初褐色であった培養液はピンク色〜赤色へと色調を変化させる。この色調の変化は、特別な測定装置を使用しなくても肉眼で容易に判断することができる。従って、本発明のバイオセンサーは、環境中の砒素の検出など多数のサンプルを効率良く低コストで検出することが求められる用途に極めて有用である。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、実施例の記載は純粋に発明の理解のためのみに挙げるものであり、本発明はこれによって何ら限定されるものではない。
【００２６】
実施例Ａ．リコペン生産株の構築
１．本実施例の目的
本実施例では腸内細菌科に属す微生物であるパントエア・アナナティス（Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ）由来のｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩを利用して、リコペン生産株の構築を行う。
【００２７】
本実施例において用いたプライマーを表１に、プラスミドを表２に示す。
2009171928.tif 000002
2009171928.tif 000003
【００２８】
２．ｐＡＣＹＣ１８４改変ベクターの構築
基質生産プラスミドとして、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓのｃｒｔ遺伝子発現においてよく報告されているｐＡＣＹＣ１８４を用いた。ｐＡＣＹＣ１８４は、ｐ１５Ａ由来のｏｒｉを持ち、ｐＵＣシリーズやｐＢＲ３２２など、Ｃｏｌ  Ｅ１系のｏｒｉを持つプラスミドと共存することが可能である［５］。しかし、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓのｃｒｔＥとｃｒｔＢ、そしてｐＡＣＹＣ１８４の塩基配列を比較したところ、使用可能な制限酵素サイトは限られていた。そこで、今後の組み換えの利便性を考慮し、ｐＡＣＹＣ１８４のｔｅｔ遺伝子領域にアミノ酸配列を変えることなく、制限酵素サイトを増やす試みを行った。
【００２９】
ｐＡＣＹＣ１８４の配列情報をもとにｔｅｔ遺伝子のアミノ酸配列を保持したまま、一塩基置換を行うだけで、新たに導入することのできる制限酵素サイトを検索した。その結果、図２に示すように合計４ヶ所の新たな制限酵素サイトを見出すことができた。そこで、候補箇所に制限酵素サイトを導入するため、見出した配列をもとに一塩基置換用変異プライマーを設計した（表１の１番目〜８番目のプライマー）。なお、見出した配列中のＳｐｅＩとＫｐｎＩサイトは近接しているため、この置換は２箇所の変異塩基を有するプライマーを設計し、一度で行った。
【００３０】
ｐＡＣＹＣ１８４を鋳型にプライマーｐＡＣＹＣＴｅｔ−Ｓ１とｐＡＣＹＣ−Ｓａｃ−Ａ１、ｐＡＣＹＣ−Ｓａｃ−Ｓ１とｐＡＣＹＣ−Ａｐａ−Ａ１、ｐＡＣＹＣ−Ａｐａ−Ｓ１とｐＡＣＹＣ−ＳｐｅＫｐｎ−Ａ１、ｐＡＣＹＣ−ＳｐｅＫｐｎ−Ｓ１とｐＡＣＹＣＴｅｔ−Ａ１の組み合わせでそれぞれＰＣＲを行い、これら四つの断片を切り出して精製した。精製したＤＮＡ断片を１：１：１：１の割合で混合し、プライマーを加えずに３サイクルＰＣＲを行った後、この領域の両端にあたるプライマーｐＡＣＹＣＴｅｔ−Ｓ１とｐＡＣＹＣＴｅｔ−Ａ１を加えてさらに３０サイクルＰＣＲした。このＰＣＲ産物をＰＣＩ抽出、およびエタノール沈殿によって精製した後、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｒｕＩ処理を行った。次に同様にＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｒｕＩ処理したｐＡＣＹＣ１８４とライゲーションし、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換した。
【００３１】
得られたコロニーをピックアップし、アルカリＳＤＳ  ｐｒｅｐと制限酵素処理による確認を行った。その結果、図３に示すようにすべての制限酵素により切断できることが確認できた。
【００３２】
３．フィトエン生産ベクター（プラスミド）の構築
腸内細菌の一種であるＰ．ａｎａｎａｔｉｓをＡＴＣＣより購入した（ＡＴＣＣカタログ番号：ＡＴＣＣ１９３２１）。これを栄養培地で前培養し、栄養寒天でプレーティングしたのち、単一コロニーをピックアップし、さらに１〜２日培養した。培養した菌を集菌し、常法によりｔｏｔａｌ  ＤＮＡ抽出を行った。
【００３３】
ＧＥＮ  ＢＡＮＫにより報告されているｃｒｔＥ及びｃｒｔＢの配列を基にプライマーを設計し（表１の９番目〜１２番目のプライマー）、ＫＯＤ  ｐｌｕｓを用いて、ｔｏｔａｌ  ＤＮＡを鋳型にｃｒｔＥ、ｃｒｔＢそれぞれについてＰＣＲを行った。次に、参考文献［６］を参考に制限酵素サイトと、ＳＤ配列の付いたプライマーを設計した（表１の１３番目〜１６番目のプライマー）。そしてこれらのプライマーとＬＡ  Ｔａｑを用いて、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。そしてこの断片をゲルから切り出し精製し、ｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙ  ベクターにライゲーションしてｐＧＥＭ−Ｔ−ｃｒｔＥ及びｐＧＥＭ−Ｔ−ｃｒｔＢを構築した。
【００３４】
配列解析により、ライゲーションした配列を確認した結果、図４及び５に示すように、これらは目的の配列と１００％一致した。
【００３５】
次に、ｐＵＣ１８とｐＧＥＭ−Ｔ−ｃｒｔＢをＳａｃＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理し、ライゲーションして、ｐＵＣ１８−ｃｒｔＢを構築した。このｐＵＣ１８−ｃｒｔＢをＰｖｕＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理することにより、ｃｒｔＢをｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）の付いた状態で切り出し、ｐＡＣＹＣ１８４＋４のＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトに導入し、ｐＡＣＹＣ−ｃｒｔＢを構築した。ＰｖｕＩＩとＥｃｏＲＶはどちらも平滑末端を形成する。そして最後にｐＧＥＭ−Ｔ−ｃｒｔＥからＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ断片を切り出し、これをｐＡＣＹＣ−ｃｒｔＢのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩサイトに導入し、ｐＡＣＹＣ−ｃｒｔＥＢを構築した。プラスミド構築の確認は、制限酵素処理とＰＣＲの電気泳動によるバンドのサイズと配列解析により行った。
【００３６】
４．ｃｒｔＩ発現プラスミド（リコペン生産ベクター）の構築
腸内細菌Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓからｃｒｔＥ及びｃｒｔＢと同様の方法で表１の１７番目〜２０番目のプライマーを用いてｃｒｔＩをクローニングし、ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクターにライゲーションしてｐＧＥＭ−Ｔ−ｃｒｔＩを構築した。このプラスミドの配列解析を行ったところ、図６に示すように、プラスミドの配列は目的の配列と１００％一致した。
【００３７】
ｃｒｔＩ遺伝子を発現させるプラスミドとしては、ｐＡＣＹＣベクターと共存することが可能であり、かつハイコピーベクターであるｐＵＣ１８を利用した。図７に示すように、構築したｐＧＥＭ−Ｔ−ｃｒｔＩからＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトを切り出してｐＵＣ１８のマルチクローニングサイトにライゲーションしてｐＵＣ１８−ｃｒｔＩを構築した。
【００３８】
完成したリコペン生産プラスミドを前述のフィトエン生産プラスミドとともに大腸菌に導入した結果、ピンク色を呈するコロニーが得られた。ピンク色を呈したコロニーから色素を抽出して、ＨＰＬＣにより分析した結果、図８に示すように保持時間がリコペン標準液と一致し、このコロニーはリコペンを生産することが確認できた。また、フィトエン生産プラスミドのみを導入した株について同様のアッセイを行った結果、このようなピークは見られなかった。
【００３９】
５．まとめ
本実施例の結果は以下の通りである。
・  ｐＡＣＹＣ１８４を一塩基置換で変異させることによって、本来のｐＡＣＹＣ１８４よりも制限酵素サイトが４ヶ所多く存在するｐＡＣＹＣ１８４＋４を構築した。
・  Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ由来のｃｒｔＥ，ｃｒｔＢ，ｃｒｔＩのクローニングに成功した。
・  リコペンの基質であるフィトエンを生産させるためのフィトエン生産プラスミドｐＡＣＹＣ−ｃｒｔＥＢを構築した。
・  ｃｒｔＩを発現するプラスミド（リコペン生産プラスミド）ｐＵＣ１８−ｃｒｔＩを構築した。
・  構築したフィトエン生産プラスミドとリコペン生産プラスミドを大腸菌に導入した結果、ピンク色を呈するコロニーを得た。さらにこの色素を抽出してＨＰＬＣによって分離した結果、リコペン標準液の保持時間に一致し、このコロニーはリコペンを生産することが確認できた。また、この色素およびピークは、フィトエン生産プラスミドのみを導入した株においては見られないものであった。
【００４０】
実施例Ｂ．砒素検出バイオセンサー株の構築
１．本実施例の目的
実施例Ａにおいて、バイオセンサーの基質となるフィトエンを生産するフィトエン生産プラスミド、およびｃｒｔＩをＥ．ｃｏｌｉにおいて発現するプラスミド（リコペン生産プラスミド）を構築し、これらのプラスミドを大腸菌に導入してリコペン生産株を構築した。本実施例では、実施例Ａで構築したリコペン生産プラスミドを改変してそのｃｒｔＩの上流に砒素誘導性プロモーター（Ｐａｒｓ）とそのリプレッサー（ａｒｓＲ）を挿入することにより、砒素の存在下でのみリコペンを生産させるリコペン生産センサープラスミドを構築し、このプラスミドをフィトエン生産プラスミドと共に大腸菌に導入することにより、砒素検出バイオセンサー株を構築する。
【００４１】
本実施例において用いたプライマーを表３に、プラスミドを表４に示す。
2009171928.tif 000004
2009171928.tif 000005
【００４２】
２．リコペン生産センサープラスミドの構築
ｌａｃＺをレポーターとした砒素検出バイオセンサーにおいて、ａｒｓＲとｌａｃＺとの間にＡｒｓＲ結合部位（ＡＢＳ）を配置することで、バックグラウンドが抑えられたという報告がある［８］。そこでａｒｓＲとｃｒｔＩの間に同様にＡＢＳを配置することで、バックグラウンドが抑えられると考えられる。また、同じ文献においてｌｕｘＡＢをレポーターとするバイオセンサーではＡＢＳを配置するとセンサー株の応答が弱まったという報告もされている。そこで、本実施例では、リコペン生産センサープラスミドとして、ａｒｓＲとｃｒｔＩの間にＡＢＳを配置したプラスミドとＡＢＳを配置していないプラスミドの両方のプラスミドを作製し、比較検討することにした。
【００４３】
本実施例におけるプラスミドの構築手順の概略を図９に示す。具体的には、大腸菌の砒素耐性遺伝子オペロンの上流の砒素誘導性プロモーター領域の配列を基に、Ｓａｃ  ＩサイトとＳｍａ  Ｉサイトを付けたプライマーを設計した。ＡＢＳを配置していないプラスミド構築用のプライマーは、表３のプライマーＴｅｒｍ−Ｓａｃ−Ｓ１及びプライマーＥ．ｃｏｌｉａｒｓＲ−ＳｍａＡ１であり、ＡＢＳを配置したプラスミド構築用のプライマーは、表３のプライマーＴｅｒｍ−Ｓａｃ−Ｓ１及びプライマーＥ．ｃｏｌｉａｒｓＲ−ＳｍａＡ２であった。なお、プライマーＥ．ｃｏｌｉａｒｓＲ−ＳｍａＡ２は、プライマーＥ．ｃｏｌｉａｒｓＲ−ＳｍａＡ１にＡＢＳを付加したものに相当する。設計したそれぞれのプライマーを用いてｐＳＥＮＳＥ−Ａｓを鋳型にＰＣＲし、ターミネーターからａｒｓＲに至るまでの領域を増幅した。具体的には、プライマーＴｅｒｍ−Ｓａｃ−Ｓ１及びプライマーＥ．ｃｏｌｉａｒｓＲ−ＳｍａＡ１によって増幅されるのは、配列番号１の配列であり、プライマーＴｅｒｍ−Ｓａｃ−Ｓ１及びプライマーＥ．ｃｏｌｉａｒｓＲ−ＳｍａＡ２によって増幅されるのは、配列番号１の配列の３′末端に配列ＴＣＡＴＡＴＡＴＧＴＴＴＴＴＧが付加されたものである。なお、本実施例では、本発明者らが以前に構築した光合成細菌を宿主とするバイオセンサー用のセンサープラスミドｐＳＥＮＳＥ−ＡｓをＰＣＲの鋳型としたが、もちろん大腸菌のゲノムＤＮＡをＰＣＲの鋳型としても同様に砒素誘導性プロモーター領域の増幅を行うことができる。
【００４４】
増幅後、目的のバンドを切り出して精製し、ｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙベクターにそれぞれライゲーションしてｐＧＥＭ−Ｔ−ａｒｓを作製した。これらのプラスミドの配列解析を行ったところ、プラスミドの配列は目的の配列と１００％一致した。
【００４５】
次にｐＧＥＭ−Ｔ−ａｒｓと実施例Ａで構築したｐＵＣ１８−ｃｒｔＩをＳａｃＩとＳｍａＩで処理してライゲーションすることにより、二種類のリコペン生産センサープラスミド（ａｒｓＲとｃｒｔＩの間にＡＢＳを配置していないプラスミドｐＵＳ−ａｒｓ−ｃｒｔＩ（Ｉ）、及びａｒｓＲとｃｒｔＩの間にＡＢＳを配置したプラスミドｐＵＳ−ａｒｓ−ｃｒｔＩ（ＩＩ））を構築した。
【００４６】
３．バイオセンサー株の構築と機能評価
構築した二種類のリコペン生産センサープラスミドをそれぞれフィトエン生産プラスミドｐＡＣＹＣ−ｃｒｔＥＢと共に大腸菌に導入することにより、二種類の砒素検出バイオセンサー株を構築した。
【００４７】
続いて、構築したそれぞれのバイオセンサー株に対して砒素を添加し、その応答性を評価した。ここでは３価の砒素として亜砒酸（以下Ａｓ２Ｏ３と表記する）を用いた。まず、ＡＢＳの影響を評価するために、定常期に達したそれぞれのバイオセンサー株にＡｓ２Ｏ３を終濃度６０ｐｐｂとなるように添加し、その応答を比較した。定量の方法は参考文献［９］を参考にした。
【００４８】
その結果を図１０に示す。図１０から明らかな通り、ａｒｓＲとｃｒｔＩの間にＡＢＳを配置したバイオセンサー株（センサープラスミドとしてプラスミドｐＵＳ−ａｒｓＲ−ｃｒｔＩ（ＩＩ）を用いたバイオセンサー株）の方が、ａｒｓＲとｃｒｔＩの間にＡＢＳを配置していないバイオセンサー株（センサープラスミドとしてプラスミドｐＵＳ−ａｒｓＲ−ｃｒｔＩ（Ｉ）を用いたバイオセンサー株）よりバックグラウンドが有意に抑制され、また視覚的判断にも適していた。そこで以下の実施例では、ＡＢＳを配置したバイオセンサー株を用いて更なる調査を行った。
【００４９】
次に、このバイオセンサー株の砒素に対する応答時間を調査した。定常期に達したバイオセンサー株にＡｓ２Ｏ３を終濃度６０ｐｐｂとなるように添加し、０時間後、３時間後、及び６時間後に培養液を回収し、その菌体の色を観察し、リコペン含量を求めた。この結果から３時間で既に応答が完了していることが予想されたため、Ａｓ２Ｏ３添加の１時間後及び２時間後におけるリコペン含量も計算した。これらの結果をまとめて図１１に示す。図１１から明らかな通り、視覚的判断においてはＡｓ２Ｏ３添加の１時間後からその色調変化が確認できた。この結果から、本実施例で構築したバイオセンサー株は極めて短時間で砒素を検出することができることが明らかである。
【００５０】
さらに、このバイオセンサー株の砒素検出感度を調査した。バイオセンサー株に添加するＡｓ２Ｏ３の終濃度を６０ｐｐｂから６．０ｐｐｂ（１０倍希釈）まで低下させたが、図１２に示す通り、６．０ｐｐｂでもわずかながらも視覚的な色調変化を確認できた。ＷＨＯで定められている砒素の環境基準は１０ｐｐｂであるので、この結果は、本実施例で構築したバイオセンサー株が極めて高い砒素検出感度を有することを示す。
【００５１】
４．まとめ
本実施例の結果は以下の通りである。
・  リコペン生産センサープラスミドｐＵＣ−ａｒｓ−ｃｒｔＩを構築した。
・  フィトエン生産プラスミドｐＡＣＹＣ−ｃｒｔＥＢとリコペン生産センサープラスミドｐＵＣ−ａｒｓ−ｃｒｔＩで大腸菌を共形質転換することにより、砒素検出バイオセンサー株を構築した。
・  ＡｒｓＲ結合部位（ＡＢＳ）をリコペン生産センサープラスミドのａｒｓＲとｃｒｔＩの間に配置することにより、バイオセンサー株のバックグラウンドが抑制され、砒素による色調変化のより観察しやすい状態となった。
・  このバイオセンサー株の砒素に対する反応時間を調査したところ、Ａｓ２Ｏ３添加１時間後から視覚的変化が観察でき、約３時間後にほぼ最大に達した。
・  このバイオセンサー株の砒素検出感度を調査したところ、ＷＨＯで定められている環境基準の１０ｐｐｂよりも低濃度の６．０ｐｐｂにおいてもわずかながらも視覚的判断の可能な応答が観察できた。
・  これらの結果から、本実施例で構築したバイオセンサー株は、極めて短時間でかつ高感度で砒素を検出することができることが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明の砒素検出バイオセンサーによれば、サンプル添加からわずか数時間で砒素を検出することができる。また、本発明の砒素検出バイオセンサーによれば、ＷＨＯで定められている環境基準以下の低濃度の砒素を検出することができる。さらに、本発明の砒素検出バイオセンサーでは、砒素の存在は培養液の色調変化により肉眼で観察できるため、特別な測定機器を使用する必要がない。従って、本発明の砒素検出バイオセンサーは、飲料中における砒素混入のスクリーニング調査などの、多数のサンプルを短時間で高感度かつ簡便に調査することが求められる分野で利用するのに極めて有用である。
【００５３】
2009171928.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】細菌におけるリコペンの生合成経路を示す。
【図２】ｔｅｔ遺伝子中の新しい制限酵素認識部位を作成する位置を示す。
【図３】アルカリＳＤＳｐｒｅｐ及び制限酵素切断の結果を示す。
【図４−１】実施例Ａで増幅したパントエア・アナナティスのｃｒｔＥのＤＮＡ配列（上段）とＧＥＮ  ＢＡＮＫにより報告されているパントエア・アナナティスのｃｒｔＥのＤＮＡ配列（下段）との比較を示す。
【図４−２】実施例Ａで増幅したパントエア・アナナティスのｃｒｔＥのＤＮＡ配列（上段）とＧＥＮ  ＢＡＮＫにより報告されているパントエア・アナナティスのｃｒｔＥのＤＮＡ配列（下段）との比較を示す。
【図４−３】実施例Ａで増幅したパントエア・アナナティスのｃｒｔＥのＤＮＡ配列（上段）とＧＥＮ  ＢＡＮＫにより報告されているパントエア・アナナティスのｃｒｔＥのＤＮＡ配列（下段）との比較を示す。
【図５−１】実施例Ａで増幅したパントエア・アナナティスのｃｒｔＢのＤＮＡ配列（上段）とＧＥＮ  ＢＡＮＫにより報告されているパントエア・アナナティスのｃｒｔＢのＤＮＡ配列（下段）との比較を示す。
【図５−２】実施例Ａで増幅したパントエア・アナナティスのｃｒｔＢのＤＮＡ配列（上段）とＧＥＮ  ＢＡＮＫにより報告されているパントエア・アナナティスのｃｒｔＢのＤＮＡ配列（下段）との比較を示す。
【図５−３】実施例Ａで増幅したパントエア・アナナティスのｃｒｔＢのＤＮＡ配列（上段）とＧＥＮ  ＢＡＮＫにより報告されているパントエア・アナナティスのｃｒｔＢのＤＮＡ配列（下段）との比較を示す。
【図６−１】実施例Ａで増幅したパントエア・アナナティスのｃｒｔＩのＤＮＡ配列（上段）とＧＥＮ  ＢＡＮＫにより報告されているパントエア・アナナティスのｃｒｔＩのＤＮＡ配列（下段）との比較を示す。
【図６−２】実施例Ａで増幅したパントエア・アナナティスのｃｒｔＩのＤＮＡ配列（上段）とＧＥＮ  ＢＡＮＫにより報告されているパントエア・アナナティスのｃｒｔＩのＤＮＡ配列（下段）との比較を示す。
【図６−３】実施例Ａで増幅したパントエア・アナナティスのｃｒｔＩのＤＮＡ配列（上段）とＧＥＮ  ＢＡＮＫにより報告されているパントエア・アナナティスのｃｒｔＩのＤＮＡ配列（下段）との比較を示す。
【図６−４】実施例Ａで増幅したパントエア・アナナティスのｃｒｔＩのＤＮＡ配列（上段）とＧＥＮ  ＢＡＮＫにより報告されているパントエア・アナナティスのｃｒｔＩのＤＮＡ配列（下段）との比較を示す。
【図７】ｃｒｔＩ発現プラスミド（リコペン生産ベクター）の構築手順を示す。
【図８】各サンプルのＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図９】リコペン生産センサープラスミドの構築手順を示す。
【図１０】二種類のバイオセンサー株の砒素に対する応答性を示す。
【図１１】バイオセンサー株の砒素に対する応答時間を示す。
【図１２】バイオセンサー株の砒素検出感度を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００５５】
配列番号１は、砒素誘導性プロモーターのＤＮＡ配列である。
配列番号２は、砒素誘導性プロモーターのアミノ酸配列である。
配列番号３は、表１に記載したプライマーｐＡＣＹＣＴｅｔ−Ｓ１の配列である。
配列番号４は、表１に記載したプライマーｐＡＣＹＣＴｅｔ−Ａ１の配列である。
配列番号５は、表１に記載したプライマーｐＡＣＹＣ−ＳｐｅＫｐｎ−Ｓ１の配列である。
配列番号６は、表１に記載したプライマーｐＡＣＹＣ−ＳｐｅＫｐｎ−Ａ１の配列である。
配列番号７は、表１に記載したプライマーｐＡＣＹＣ−Ｓａｃ−Ｓ１の配列である。
配列番号８は、表１に記載したプライマーｐＡＣＹＣ−Ｓａｃ−Ａ１の配列である。
配列番号９は、表１に記載したプライマーｐＡＣＹＣ−Ａｐａ−Ｓ１の配列である。
配列番号１０は、表１に記載したプライマーｐＡＣＹＣ−Ａｐａ−Ａ１の配列である。
配列番号１１は、表１に記載したプライマーＰ．ａｎ−ｃｒｔＥ−Ｓ１の配列である。
配列番号１２は、表１に記載したプライマーＰ．ａｎ−ｃｒｔＥ−Ａ１の配列である。
配列番号１３は、表１に記載したプライマーＰ．ａｎ−ｃｒｔＢ−Ｓ１の配列である。
配列番号１４は、表１に記載したプライマーＰ．ａｎ−ｃｒｔＢ−Ａ１の配列である。
配列番号１５は、表１に記載したプライマーＰ．ａｎｃｒｔＥＫｐｎＳ２の配列である。
配列番号１６は、表１に記載したプライマーＰ．ａｎｃｒｔＥＢａｍＡ１の配列である。
配列番号１７は、表１に記載したプライマーＰ．ａｎｃｒｔＢＳａｃＳ１の配列である。
配列番号１８は、表１に記載したプライマーＰ．ａｎｃｒｔＢＨｉｎＡ１の配列である。
配列番号１９は、表１に記載したプライマーＰ．ａｎ−ｃｒｔＩ−Ｓ１の配列である。
配列番号２０は、表１に記載したプライマーＰ．ａｎ−ｃｒｔＩ−Ａ１の配列である。
配列番号２１は、表１に記載したプライマーＰ．ａｎｃｒｔＩＸｂａＳ１の配列である。
配列番号２２は、表１に記載したプライマーＰ．ａｎｃｒｔＩＨｉｎＡ１の配列である。
配列番号２３は、実施例Ａで増幅したパントエア・アナナティスのｃｒｔＥのＤＮＡ配列である。
配列番号２４は、ＧＥＮ  ＢＡＮＫにより報告されているパントエア・アナナティスのｃｒｔＥのＤＮＡ配列である。
配列番号２５は、実施例Ａで増幅したパントエア・アナナティスのｃｒｔＢのＤＮＡ配列である。
配列番号２６は、ＧＥＮ  ＢＡＮＫにより報告されているパントエア・アナナティスのｃｒｔＢのＤＮＡ配列である。
配列番号２７は、実施例Ａで増幅したパントエア・アナナティスのｃｒｔＩのＤＮＡ配列である。
配列番号２８は、ＧＥＮ  ＢＡＮＫにより報告されているパントエア・アナナティスのｃｒｔＩのＤＮＡ配列である。
配列番号２９は、表３に記載したプライマーＴｅｒｍ−Ｓａｃ−Ｓ１の配列である。
配列番号３０は、表３に記載したプライマーＥ．ｃｏｌｉａｒｓＲ−ＳｍａＡ１の配列である。
配列番号３１は、表３に記載したプライマーＥ．ｃｏｌｉａｒｓＲ−ＳｍａＡ２の配列である。
配列番号３２は、明細書［００４３］で言及した配列番号１への付加配列である。
【図１】
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【図２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図３】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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