(57)【要約】【課題】液体試料の観察又は検査を良好に行うことのできる検査方法及び検査装置に関し、該試料の光学像と、一次線（電子線、荷電粒子線）を用いた像の同時取得を可能にする検査装置及び検査方法を提供する。【解決手段】試料検査装置は、第１の面３２ａに液体試料２０が保持される膜３２と、膜３２の第２の面に接する雰囲気を減圧する真空室１１と、真空室１１に接続され、膜３２を介して試料２０に一次線７を照射する一次線照射手段１と、一次線７の照射により試料２０に含まれる検査対象物から発生する二次的信号を検出する信号検出手段４と、該検査対象物の光学像を取得する光学像取得手段を備え、該一次線照射手段と該光学増取得手段とが該膜３２を間に介して対向配置されており、該膜３２が遮光性を有している。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜を介して検査対象物に一次線を照射する一次線照射手段と、該一次線の照射に応じて該検査対象物から発生する二次的信号を検出する信号検出手段と、該検査対象物に光を照射して、該検査対象物の光学像を取得する光学像取得手段とを備える検査装置であって、該膜が該光に対して遮光性を有し、該一次線照射手段と該光学像取得手段とが該膜を間に介して対向配置されていることを特徴とする検査装置。
【請求項２】
第一の面に検査対象物が保持される膜と、該膜の第二の面に接する雰囲気を減圧する真空室と、該真空室に接続され、該膜を介して該検査対象物に一次線を照射する一次線照射手段と、該一次線の照射に応じて該検査対象物から発生する二次的信号を検出する信号検出手段と、該検査対象物に光を照射して、該検査対象物の光学像を取得する光学像取得手段とを備える検査装置であって、該膜が該光に対して遮光性を有し、該一次線照射手段と該光学像取得手段とが該膜を間に介して対向配置されていることを特徴とする検査装置。
【請求項３】
前記膜において、前記検査対象物が保持される第一の面は、該検査対象物への外部からのアクセスが可能なように開放されていることを特徴とする請求項１又は２記載の検査装置。
【請求項４】
前記膜の第一の面が該膜の上面となっており、前記膜の第二の面が該膜の下面となっていることを特徴とする請求項１乃至３何れか記載の検査装置。
【請求項５】
前記膜は、ポリマー、ポリエチレン、ポリイミド、ポリプロピレン、カーボン、酸化シリコン、窒化シリコン、若しくは窒化ボロンのうちの少なくとも一つからなる層と、金属層とを含み、これらの層の層厚の合計が、２０〜１０００ｎｍの範囲にあることを特徴とする請求項１乃至４何れか記載の検査装置。
【請求項６】
前記金属層の層厚が１０〜１００ｎｍの範囲にあることを特徴とする請求項５記載の検査装置。
【請求項７】
前記金属層は、Ｂｅ、Ｍｇ、若しくはＡｌからなることを特徴とする請求項５又は６記載の検査装置。
【請求項８】
前記金属層は、前記膜の第一の面側に配置されていないことを特徴とする請求項５乃至７何れか記載の検査装置。
【請求項９】
前記一次線は電子線又は荷電粒子線であり、前記二次的信号は、反射電子、二次電子、吸収電流、カソードルミネッセンス光、若しくはＸ線のうちの少なくとも一つであることを特徴とする請求項１乃至８何れか記載の検査装置。
【請求項１０】
請求項１乃至９何れか記載の検査装置により、検査対象物の検査を行うことを特徴とする検査方法。
【請求項１１】
膜の第一の面に保持された検査対象物に、該膜の第二の面側から該膜を介して一次線を照射する一次線照射工程と、該一次線の照射に応じて該検査対象物から発生する二次的信号を検出する信号検出工程と、該膜の第一の面側から該検査対象物に光を照射して、該検査対象物の光学像を取得する光学像取得工程とを備える検査方法であって、該膜が該光に対して遮光性を有することを特徴とする検査方法。
【請求項１２】
膜の第一の面に検査対象物を保持する工程と、該膜の第二の面に接する雰囲気を減圧する工程と、該膜の第二の面に接する雰囲気側から該膜を介して該検査対象物に一次線を照射する一次線照射工程と、該一次線の照射に応じて該検査対象物から発生する二次的信号を検出する信号検出工程と、該膜の第一の面側から該検査対象物に光を照射して、該検査対象物の光学像を取得する光学像取得工程とを備える検査方法であって、該膜が該光に対して遮光性を有することを特徴とする検査方法。
【請求項１３】
前記膜において、前記検査対象物が保持される第一の面は、該検査対象物への外部からのアクセスが可能なように開放されていることを特徴とする請求項１２又は１３記載の検査方法。
【請求項１４】
前記膜の第一の面が該膜の上面となっており、前記膜の第二の面が該膜の下面となっていることを特徴とする請求項１１乃至１３何れか記載の検査方法。
【請求項１５】
前記膜は、ポリマー、ポリエチレン、ポリイミド、ポリプロピレン、カーボン、酸化シリコン、窒化シリコン、若しくは窒化ボロンのうちの少なくとも一つからなる層と、金属層とを含み、これらの層の層厚の合計が、２０〜１０００ｎｍの範囲にあることを特徴とする請求項１１乃至１４何れか記載の検査方法。
【請求項１６】
前記金属層の膜厚が１０〜１００ｎｍの範囲にあることを特徴とする請求項１５に記載の検査方法。
【請求項１７】
前記金属層は、Ｂｅ、Ｍｇ、若しくはＡｌからなることを特徴とする請求項１５又は１６何れか記載の検査方法。
【請求項１８】
前記金属層は、前記膜の第一の面側に配置されていないことを特徴とする請求項１５乃至１７何れか記載の検査方法。
【請求項１９】
前記一次線は電子線又は荷電粒子線であり、前記二次的信号は、反射電子、二次電子、吸収電流、カソードルミネッセンス光、若しくはＸ線のうちの少なくとも一つであることを特徴とする請求項１１乃至１８何れか記載の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、膜に保持された検査対象物に荷電粒子線等の一次線を照射して、当該検査対象物の検査を行うことのできる検査装置及び検査方法に関する。特に、検査対象物が生体細胞であり、その細胞に刺激を与えた際の反応の観察・検査に関する。
【背景技術】
【０００２】
生命科学や、製薬分野では、細胞に刺激（電気、化学物質、薬等）を与え、その反応を観察することが重要となっている。従来、このような観察には光学顕微鏡が用いられていたが、観察すべき重要な箇所は光学顕微鏡では観察不可能な０．１μｍ以下の微小領域であることも多い。例えば、細胞間の情報伝達物質のやり取りが正常に行えなくなることに起因する病気に高血圧症、尿崩症、不整脈、筋肉疾患、糖尿病、うつ病等がある。この細胞間の物質のやり取りは細胞膜にある１０ｎｍ程度の大きさの膜蛋白分子（リセプターやイオンチャンネル等）により行われる。このような膜蛋白分子は、光学顕微鏡では観察困難である為、分解能の高い走査型電子顕微鏡（以下、「ＳＥＭ」という）を用いた観察が望まれていた。
【０００３】
しかし、ＳＥＭの構成を備える検査装置において、検査対象となる検査対象物を含む試料は、通常、真空引きにより減圧された試料室内に配置される。そして、このように減圧雰囲気とされた試料室内に配置された試料に電子線（荷電粒子線）が照射され、当該照射により試料から発生する二次電子や反射電子（後方散乱電子）等の二次的信号が検出される。このようなＳＥＭによる試料検査では、試料が減圧雰囲気に晒されることとなる。よって、試料から水分が蒸発して細胞が死んでしまい、刺激に対する反応を観察することは不可能であった。
【０００４】
従って、試料に水分が含まれた状態で検査を行う際には、試料から水分が蒸発しないように、試料を減圧雰囲気に晒されることがないようにする必要がある。このように試料が減圧雰囲気に晒されることなくＳＥＭを用いて検査を行う例の一つとして、膜により開口（アパーチャ）が密封された試料容器の内部に試料を配置し、減圧雰囲気とされたＳＥＭの試料室内に、この試料容器を設置する手法が考えられている。
【０００５】
ここで、試料が配置される試料容器の内部は減圧されない。そして、試料容器に形成された当該開口を覆う膜は、ＳＥＭの試料室内の減圧雰囲気と試料容器内部の減圧されていない雰囲気（例えば、大気圧雰囲気）との間の圧力差に耐えられるとともに、電子線が透過するものとなっている（特許文献１参照）。
【０００６】
試料検査を行う際には、減圧雰囲気とされたＳＥＭの試料室内に配置された試料容器の当該膜を介して、試料容器の外部から試料容器内の試料に電子線が照射される。電子線が照射された試料からは反射電子が発生し、この反射電子は試料容器の当該膜を通過して、ＳＥＭの試料室内に設けられた反射電子検出器によって検出される。これにより、ＳＥＭによる像（ＳＥＭ像）が取得されることとなる。しかしながら、この場合では、試料は閉じた空間内に封入させるので、試料容器の外部から、例えばマニピュレータを用いて細胞に刺激を与えることは不可能であった。
【０００７】
なお、このように真空と大気圧との圧力差に耐えられる膜を介して試料に電子線を照射し、試料から発生する反射電子を検出してＳＥＭ像を取得する例は、非特許文献１（当該文献のChapter1 Introduction）にも記載されている。
【０００８】
また、このような膜を対向して設置して一対の膜を構成し、該一対の膜の間に試料を配置して透過型電子顕微鏡による像を取得する例は、特許文献２及び特許文献３に記載されている。特に、特許文献２には、このような一対の膜を利用して、その間に配置された試料のＳＥＭ像を取得する場合についても述べられている。
【０００９】
さらに、特許文献４には、膜に保持された試料の試料交換を迅速に行うこと及び真空室内の汚染を防止すること等を目的として、真空室内において、膜と一次線照射手段との間の空間を仕切るための開閉バルブを備える試料検査装置が示されている。
【００１０】
【特許文献１】特表２００４−５１５０４９号公報
【特許文献２】特開昭４７−２４９６１号公報
【特許文献３】特開平６−３１８４４５号公報
【特許文献４】特開２００７−２９２７０２号公報
【非特許文献１】「Atmospheric scanning electron microscopy」 Green, Evan Drake Harriman, Ph.D., Stanford University, 1993
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述した「細胞に刺激を与えた後の細胞の反応」で生ずる構造変化は微小領域で生じる為、光学顕微鏡では観察不可能でＳＥＭによる観察が必須となる。液体を保持したまま細胞をＳＥＭで観察する為には、細胞を含む試料を試料容器に封入し、試料容器に形成された膜を介して電子線を試料に照射することで像を得ていた。
【００１２】
しかし、試料容器は閉じた空間である為、密封された試料容器内の細胞に、マニピュレータを用いて刺激を与えること（マニピュレーション）は不可能であった。
【００１３】
また、密封される前の細胞に刺激を何らかの方法で与えたとしても、試料容器を密封してそれをＳＥＭの試料室に入れ、その試料室を真空引きし、電子線を照射する、という数分以上の時間を要する手順を行う必要がある。このため、刺激を与えた直後の細胞をＳＥＭにより観察することはできなかった。
【００１４】
さらに、ＳＥＭ像では通常撮像時間が１０秒〜１００秒必要であり、数秒で変位する細胞の部位を特定することが困難であった。その為、刺激に対する細胞の反応が速い場合、ＳＥＭでの撮像が間に合わないという問題があった。
【００１５】
本発明は、このような点に鑑みてなされたものであり、膜に保持された検査対象物に刺激を与え、その様子を光学顕微鏡で観察しつつ、これと同時に、該膜を介して一次線として電子線等の荷電粒子線を検査対象物に照射し、これによって検査対象物の高分解能像を取得することのできる検査装置及び検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明に基づく検査装置は、膜を介して検査対象物に一次線を照射する一次線照射手段と、該一次線の照射に応じて該検査対象物から発生する二次的信号を検出する信号検出手段と、該検査対象物に光を照射して、該検査対象物の光学像を取得する光学像取得手段とを備える検査装置であって、該膜が該光に対して遮光性を有し、該一次線照射手段と該光学像取得手段とが該膜を間に介して対向配置されていることを特徴とする。
【００１７】
本発明に基づく他の検査装置は、第一の面に検査対象物が保持される膜と、該膜の第二の面に接する雰囲気を減圧する真空室と、該真空室に接続され、該膜を介して該検査対象物に一次線を照射する一次線照射手段と、該一次線の照射に応じて該検査対象物から発生する二次的信号を検出する信号検出手段と、該検査対象物に光を照射して、該検査対象物の光学像を取得する光学像取得手段とを備える検査装置であって、該膜が該光に対して遮光性を有し、該一次線照射手段と該光学像取得手段とが該膜を間に介して対向配置されていることを特徴とする。
【００１８】
前記膜の第一の面は、前記検査対象物への外部からアクセスが可能なように開放されていると、マニピュレータ等により該検査対象物へ刺激を与えることができ、その際の該検査対象物の反応を観察・検査することができるので便利である。
【００１９】
また、前記膜の第一の面が該膜の上面となっており、前記膜の第二の面が該膜の下面となっていると、検査対象物を含む試料を該膜の第一の面に安定良く載置できるので便利である。
【００２０】
本発明に基づく検査方法は、膜の第一の面に保持された検査対象物に、該膜の第二の面側から該膜を介して一次線を照射する一次線照射工程と、該一次線の照射に応じて該検査対象物から発生する二次的信号を検出する信号検出工程と、該膜の第一の面側から該検査対象物に光を照射して、該検査対象物の光学像を取得する光学像取得工程とを備える検査方法であって、該膜が該光に対して遮光性を有することを特徴とする。
【００２１】
本発明に基づく他の検査方法は、膜の第一の面に検査対象物を保持する工程と、該膜の第二の面に接する雰囲気を減圧する工程と、該膜の第二の面に接する雰囲気側から該膜を介して該検査対象物に一次線を照射する一次線照射工程と、該一次線の照射に応じて該検査対象物から発生する二次的信号を検出する信号検出工程と、該膜の第一の面側から該検査対象物に光を照射して、該検査対象物の光学像を取得する光学像取得工程とを備える検査方法であって、該膜が該光に対して遮光性を有することを特徴とする。
【００２２】
上記各検査方法においても、前記膜の第一の面が、前記検査対象物への外部からアクセスが可能なように開放されていると、マニピュレータ等により該検査対象物へ刺激を与えることができ、その際の該検査対象物の反応を観察・検査することができるので便利である。
【００２３】
また、前記膜の第一の面が該膜の上面となっており、前記膜の第二の面が該膜の下面となっていると、検査対象物を含む試料を該膜の第一の面に安定良く載置できるので便利である。
【発明の効果】
【００２４】
本発明においては、一次線照射手段により膜を介して検査対象物に一次線を照射し、それによる該検査対象物からの二次的信号を信号検出手段により検出するとともに、一次線照射手段が位置する側の反対側から該検査対象物に光を照射して、その光学像を取得するときに、該膜が該光に対して遮光性を有している。
【００２５】
これにより、該光学像を取得すると同時に、一次線照射による検査対象物からの二次的信号を信号検出手段により検出する際に、この信号検出手段に向かう光は、該膜により遮られることとなる。
【００２６】
よって、上記二次的信号の検出時においてノイズとなる光が信号検出手段に入り込むことがなく、上記光学像の取得及び該二次的信号の検出を支障なく同時に行うことができる。
【００２７】
この結果、検査対象物（試料に含まれている）の光学像での観察を行っている最中に、当該二次的信号に基づく検査対象物の高分解像を取得することができる。これにより、光学像を確認しながらマニピュレータ等による細胞（検査対象物）への刺激を行い、その最中及び直後の細胞の状態をＳＥＭ観察することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、図面を参照して、本発明における検査装置及び検査方法について説明する。
【００２９】
図１は、本発明における試料検査装置の一実施例を示す概略構成図である。構成の主部分は、光学顕微鏡２７、マニピュレータ２６、及び電子線装置部２９（試料保持体４０より下の部分）である。この図において、一次線照射手段である鏡筒１には、電子銃（電子源）２が配置されている。電子銃２から加速された状態で放出された一次線としての電子線（荷電粒子線）７は、集束レンズ（対物レンズ）３により集束される。
【００３０】
これにより集束された電子線７は、試料保持体４０に形成された試料保持膜３２（後述）を介して、試料保持体４０に保持された液状試料２０に照射される。本実施例では、この液状試料２０には、検査対象物である細胞と、該細胞を包含する培地とが含まれている。
【００３１】
鏡筒１の先端側は真空室１１に接続されている。また、電子銃２が設けられた鏡筒１の基端側は真空室１１の下方に位置している。この構成により、電子銃２から放出された電子線７は、鏡筒１内を上方向に進み、真空室１１内の空間及び試料保持膜３２を通過し、液状試料２０に到達する。
【００３２】
当該照射時において、電子線７は図示しない偏向手段により偏向され、これにより電子線７は液状試料２０を走査する。このときには、液状試料２０に含まれる細胞も電子線７により走査される。
【００３３】
このように、この鏡筒１は、一次線照射手段を構成し、本実施例では倒立型鏡筒となっている。真空室１１内であって鏡筒１の先端側には、反射電子検出器４が設けられている。反射電子検出器４は、電子線７が液状試料２０内の細胞に照射された際に発生する反射電子を検出するものである。反射電子検出器４は、例えばPN接合を利用した半導体型検出器やYAG結晶を用いたシンチレータ型検出器が用いられる。
【００３４】
いずれにせよ、これら検出器は光に対しても信号を増幅するので、光学顕微鏡２７の液状試料２０への照射光が反射検出器４に当たる場合、反射電子信号のバックグラウンドになる。その為、照射光は反射電子検出器４にあたらないようにする必要がある。そこで、本発明では試料保護膜３２に遮光性を持たせる。
【００３５】
反射電子検出器４により検出された検出信号は、真空室１１の外部に配置された画像形成装置２２に送られる。画像形成装置２２は、当該検出信号に基づいて、画像データを形成する。この画像データは、ＳＥＭ画像に対応する画像データとなる。当該画像データは、表示装置２３に送られる。表示装置２３は、送られた画像データに基づく画像を表示する。表示された画像は、ＳＥＭ画像となる。
【００３６】
また、画像形成装置２２により形成された画像データは、必要に応じてコンピュータ２５に送られる。コンピュータ２５は、画像処理を当該画像データに対して施すとともに、当該画像処理の結果に基づく判定を実行する。
【００３７】
鏡筒１内は排気手段８により真空引きされて、所定の圧力まで減圧される。また、真空室１１内は、排気手段９により真空引きされ、これにより所定の圧力まで減圧される。ここで、真空室１１は、除振装置１３を介して、架台１０に載置されている。
【００３８】
真空室１１の上部には、試料保持体載置部１２が設けられている。試料保持体載置部１２には、電子線７を試料保持膜３２に照射させるための孔が形成されている。この試料保持体載置部１２には、Ｏリング（図示せず）を介して、試料保持体４０が載置されている。これにより、試料保持体４０は真空室１１に着脱自在に支持される。
【００３９】
また、真空室１１には、真空室１１内の圧力を検知する真空計１５が設置されている。鏡筒１先端と試料保持膜３２の間には、シャッター１４（図１は開放の状態）が設置されている。このシャッター１４は、試料保持膜３２が破壊され、真空計１５が所定の圧力上昇を検知した際に自動的に図２のように移動（閉鎖）する。例えば、試料保持膜３２が破壊され液状試料２０が真空室１１内に流入することで真空室が１００Ｐａより高い気圧になった場合、シャッター１４を図２のように移動させる。
【００４０】
これにより、真空室１１内へ流入した液体試料２０をシャッター１４で受け止めることができ、鏡筒１や反射電子検出器４の汚染を防止する。シャッターには液状試料を受け取る受け皿が備え付けてあると多量の液体試料の流入に対応できる。
【００４１】
シャッター１４は、真空室１１を上下２つの空間を完全ではなく、部分的に仕切る。その為、構造が簡単でシャッターの動作も高速にできる。本実施例では真空計１５が圧力上昇を検知して０．１秒でシャッターを動作（図１の状態から図２の状態にする）可能であった。また、シャッターの厚みも薄く出来るので、鏡筒１の先端と試料保持膜３２の距離（ＳＥＭでのワーキングディスタンス）を縮め、高分解能を達成することも可能である。
【００４２】
ここで、鏡筒１及び真空室１１を備える電子線装置部２９（シャッター１４と真空計１５も含む）は電子線制御部２４により制御される。また、試料保持体載置部１２には、細胞に刺激（電圧、化学物質、薬等）を与え、必要に応じて細胞を移動させるマニピュレータ２６と、細胞の観察やマニピュレータ２６の位置を確認する光学顕微鏡２７が載置されている。これらは制御部２８で制御されている。
【００４３】
なお、光学顕微鏡２７と電子線７の光軸は一致しており、もしくは、光学顕微鏡２７とＳＥＭ画像の視野中心は一致しており、光学顕微鏡の観察領域がＳＥＭ画像にほぼ一致させることができる。さらに、ＳＥＭ画像の視野と光学顕微鏡２７の視野調整は、マニピュレータ２６や、試料保持体４０が搭載されている試料保持体載置部１２を移動させる（移動機構は図示していない）ことによって行う。
【００４４】
本発明における検査装置は、電子線装置部２９、マニピュレータ２６、光学顕微鏡２７、電子線制御部２４、制御部２８、画像形成装置２２、及び表示装置２３を備えており、各部とコンピュータ２５が接続され、各部の情報がやり取りされることも可能である。
【００４５】
試料保持体４０は、図３のような構成となっている。この試料保持体４０は、プラスチック又はガラスからなる皿状の本体部３７と、電子線７が透過する試料保持膜３２が設けられた膜保持体（枠状部材）１８とから構成される。本体部３７は、光学顕微鏡７からの照射光を反射電子検出器４に照射させないような遮光性の特徴を持たせると良い。本体部３７の内側に位置する凹部の底面は、試料保持面３７ａを構成する。この試料保持面３７ａは、開放されている。
【００４６】
本体部３７の試料保持面３７ａの一部（図３の例では中央部）には、貫通孔３７ｂが形成されている。この孔３７ｂの試料保持面３７ａ側には、段差部３７ｃが設けられている。この段差部３７ｃに、膜保持体１８が配置されている。膜保持体１８は試料保持膜３２を備えており、この試料保持膜３２の第１の面３２ａは試料保持面３７ａを構成し、本体部３７の試料保持面３７ａとほぼ面一となっている。これにより、試料保持体４０の試料保持面３７ａの少なくとも一部は試料保持膜３２により構成されている。
【００４７】
また、孔３７ｂの試料保持面３７ａ側の反対側には、テーパ部３７ｄが設けられている。このテーパ部３７ｄは、試料保持面３７ａの反対側の面に向けて広がるように開いているテーパ構造となっており、その開き角度は９０度〜１２０度に設定されている。
【００４８】
さらに、試料保持体４０の下面で真空雰囲気に晒され、電子線７が照射される可能性のある領域には、電子線７の照射に伴う帯電を防止するため導電膜３０１が形成されている。導電膜３０１は膜保持体１８に接しており、電子線７の照射により蓄積された電荷を膜保持体１８（シリコン製）を介して液状試料２０へ逃がすことができる。この導電膜３０１があることにより試料保持体４０の下面での帯電を低減させ、電子線７の軌道変位や、（電子線７が液状試料２０に照射された際に発生する）反射電子の軌道変位により生ずるＳＥＭ画像の歪や輝度斑を防止することができる。また、電荷の蓄積を確実に防止するためには、液状試料２０へのアース線の接続や、導電膜３０１を試料保持体載置部１２と電気的に繋げておくことが有効である。導電膜３０１は、例えばアルミニウムや金を蒸着することによって形成させても、銀ペーストで塗りつけてもよい。この導電膜３０１は光学顕微鏡の照射光を反射電子検出器に照射させないようにする効果も有する。
【００４９】
膜保持体１８の構成を図４に示す。シリコン基板３４に試料保持膜３２が形成されており、この試料保持膜３２の第１の面３２ａ（図４では下面、図３では上面）は露出されている。この試料保持膜３２の第１の面（試料保持面）３２ａには、培地等の液体及び検査対象物となる細胞を含む液状試料２０が配置される。第一の面３２ａは大気圧下にあるので、液状試料２０からの水分の蒸発を極力抑えることができる。
【００５０】
また、シリコン基板３４の中央には開口３４ａ（図４では上面、図１および図３では下面）が形成されており、この開口３４ａは、試料保持膜３２により覆われている。ここで、試料保持膜３２における第２の面３２ｂの中央部は、該開口３４ａを介して真空室１１の内部雰囲気に露出されている。また、試料保持膜３２は、その第一の面３２ａが大気圧雰囲気に晒され、第二の面３２ｂが真空雰囲気に晒されるので、この圧力差に絶える為格子３５により支持されて補強されている。
【００５１】
次に、膜保持体１８の作成方法を、図５を用いて説明する。まず、シリコン基板５０１にスパッタリング法（もしくは真空蒸着法）を用いてＡｌ膜５０９を形成、さらにＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｖａｐｏｒ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）を用いて窒化シリコン膜５０２、５０３を形成する（図５（ａ））。代表的な厚みはＡｌ膜５０９が３０ｎｍ、窒化シリコン膜５０２が３０ｎｍである。この窒化シリコン膜５０２、５０３上にレジスト５０４，５０５を塗布する（図５（ｂ））。レジスト５０５を、フォトリソグラフィー装置を用いてパターンニングし、レジスト５０５aを残す（図５（ｃ））。レジストパターンをマスクとしてドライエッチングで窒化シリコン膜５０３を加工し、窒化シリコン膜５０３aを残す（図５（ｄ））。
【００５２】
このパターンをマスクとしてシリコン基板５０１をＫＯＨでウエットエッチングし、開口５１０を作る（図５（ｅ））。アッシングによりレジスト５０４，５０５aを除去する（図５（ｆ））。格子３５の無い場合の膜保持体１８はこれで完成である。窒化シリコン膜５０２上にレジスト５０６を塗布する（図５（ｇ））。窒化シリコン膜５０２とは反対側に金属５０７（例えばＡｌ，Ｎｉ）を１μｍ成膜する（図５（ｈ））。金属５０７上にレジスト５０８を塗布し、マスクとフォトリソグラフィー装置を用いてパターンを形成する（図５（ｉ））。レジスト５０８をマスクとして金属層５０７をエッチングする（図５（ｊ））。最後にレジスト５０８をアッシング、もしくは有機洗浄を行い除去する（図５（ｋ））。これにより、開口３４ａ、および格子３５が形成される。
【００５３】
このようにして作成された膜保持体１８は、図４の状態から上下反転され、試料保持膜３２（Ａｌ膜５０９と窒化シリコン膜５０２で構成）は、第１の面３２ａ（窒化シリコン膜５０２）を上面とする。なお、第２の面３２ｂ（Ａｌ膜５０９）を上面にすることも可能である。但し、液状試料２０が生細胞を含む場合、細胞と接する膜が金属の場合、金属イオンが細胞に悪影響を与えることもある。その場合は、細胞と接する面を金属にしないことが重要である。この試料保持膜３２は金属であるＡｌ膜を含んでいるので光を遮蔽することができる。これにより、光学顕微鏡の照射光が反射電子検出器４に照射されることは無くなり、細胞等を含む試料の反射電子像で照射光による背景信号を除くことができる。
【００５４】
この膜保持体１８を、試料保持体４０を構成する本体部３７に形成された孔３７ｂの上記段差部３７ｃに固着し、これにより試料保持体４０を作成する（図３）。この固着には、エポキシ系、シリコーン系の接着剤等による接着、又は熱、超音波若しくはレーザによる融着によって行うことができる。これにより、膜保持体１８は、本体部３７の試料保持面３７ａにおける孔３７ｂに対応する位置に固着される。
【００５５】
また、本実施例では、本体部３７と膜保持体１８を組み合わせて試料保持体４０を製作したが、本体部３７に試料保持膜３２を直接固着したり、本体部３７と試料保持膜３２を一体的に形成したりするようにしてもよい。さらに、試料保持膜３２の第１の面３２ａを含む試料保持面３７ａに、付着用分子としての細胞接着分子（後述）を塗布することができる。
【００５６】
ここで、窒化シリコン膜５０２およびＡｌ膜５０９の合計の厚みは、２０〜１０００ｎｍの範囲に設定される。Ａｌ膜５０９の厚みは、光を遮蔽する為に１０〜１００ｎｍに設定される。なお、膜保持体１８の試料保持膜３２として用いられる膜としては、窒化シリコン膜の他に、酸化シリコン、窒化ボロン、ポリマー、ポリエチレン、ポリイミド、ポリプロピレン、若しくはカーボンからなる膜を用いても良い。これらの膜を用いた場合でも、その膜厚は１０〜１０００ｎｍに設定される。また、Ａｌ膜の代わりにＢｅやＭｇを用いても良い。電子線の散乱を防止する為に低原子番号で構成されることが望ましい。
【００５７】
上述した素材からなる試料保持膜３２は、電子線７が透過するが気体や液体は透過しないものとなる。さらに、膜の両面で少なくとも一気圧の圧力差に耐えられる必要がある。なお、このような試料保持膜３２は、その厚さが薄ければ電子線７の散乱が少なくなるので分解能が向上するが破損しやすくなり、また、その厚さが厚くなれば電子線７の散乱が増加して分解能が低下するが破損しにくくなる。好適な膜厚としては２０〜２００ｎｍとなる。
【００５８】
次に、本発明における検査方法について説明する。まず、図３のように試料保持体４０を用いて、検査対象物となる細胞３８を培地３９中で培養させる。細胞３８をこのように培養させるには、予め細胞を培養してあるシャーレから試料保持体４０へ植え接ぎを行う必要がある。それには、以下に示す通常の方法を用いる。
【００５９】
まず、予め細胞の培養してあるシャーレ内から培地（例えばSigma社  D5796）を捨て、Tripsin＋EDTA（ethylenediaminetetraacetic acid）混合液を当該シャーレの中に入れることで、このシャーレに吸着した細胞を剥がす。次に、剥がれた細胞を遠沈管に回収して培地を加え、Tripsinの活性を止めた後に遠沈させる。その後、遠沈管内から上澄み液を捨て、培地で攪拌する。その攪拌された液（細胞３８を含む）の例えば１／１０を試料保持体４０に入れ、培地（試液）３９を継ぎ足す。
【００６０】
この状態で、培養室に静置後、数時間で試料保持体４０の試料保持面３７ａ（試料保持膜３２の表面３２ａを含む）に細胞３８が吸着し、増殖し始める。上記方法は細胞により異なり、一例として示した。これにより、試料保持体４０内において、観察・検査対象である細胞３８が培養され、培養された細胞３８と培地３９を含有する液状試料２０が構成されることとなる。
【００６１】
なお、細胞によっては試料保持体４０の試料保持面３７ａ、特に電子線による観察領域である試料保持膜３２の第一の面（試料保持面）３２ａに細胞接着分子（付着用分子）を塗布しておくと培養が容易になる。細胞接着分子とは、培養のために配置された細胞及び培養により増殖した細胞を試料保持面に吸着させる作用を有し、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン、インテグリン、クローディン、デスモグレイン、ニューロリギン、ニューレキシン、セレクチン、ラミニン、及びポリLリジンである。
【００６２】
上述のように試料保持体４０内で細胞が培養された後、試料保持体載置部１２に当該試料保持体４０を載置する。このとき、シャッター１４は閉じられており、図２の状態になっている。続いて、排気手段８，９を用いて真空室１１および鏡筒１内を所定の真空にする。例えば、真空室１１内の圧力は、１Ｐａ程度、鏡筒１１内（特に電子銃２周囲）の圧力は、例えば、１０−４Ｐａ〜１０−５Ｐａ程度に設定される。
【００６３】
次に、光学顕微鏡２７で細胞３８とマニピュレータ２６の位置を確認する。マニピュレータ先端はガラス微小管（中に微小電極を設置）が設置してあり、微小電極による細胞への電圧の印加や、ガラス微小管による液体の流出及流入が可能になっている。
【００６４】
この状態で、光学顕微鏡２７で観察しながら細胞３８とガラス微小管が近接するようにマニピュレータ２６を移動させる。その後、ガラス微小管に負の圧力を掛けて細胞膜と密着させる。これにより、電位応答が測定可能となる。
【００６５】
以上のようなマニピュレータ２６の移動の際、誤って試料保持膜３２を破損させ、真空室１１内に液体試料２０が流入することがあっても、シャッター１４が閉まっているので、液状試料２０はシャッター１４で受け止めることができ、鏡筒１が汚染されることは無い。シャッター１４が無い場合、液体試料２０は鏡筒１内に入り込み、装置の洗浄が必要で、時には装置が使用不可能な状態になる。
【００６６】
再び、観察の手順に戻る。液状試料２０が載置された試料保持膜３２が破壊されないことを確認した後、シャッター１４を開ける。
【００６７】
これに引き続き、細胞３８に、マニピュレータ２６の先端に設置してある微小電極を用いて電気刺激を加える。その反応を光学顕微鏡２７で観察し、細胞内で変化の生ずる部位を特定する。
【００６８】
その部位に対して、図１のように鏡筒１から電子線７を液状試料２０（細胞３８を含む）に向けて照射して撮像を行う。電子線７は試料保持体４０の試料保持膜３２を透過して細胞３８に照射され、当該照射に基づいて細胞３８から発生する反射電子（後方散乱電子）は反射電子検出器４で検出される。
【００６９】
このとき、試料保持体４０を構成する本体部３７の孔３７ｂには、上述したテーパ部３７ｄが設けられているので、反射電子が孔３７ｂの内側面に衝突して遮られることを極力防止することができ、反射電子検出器４による反射電子の検出を効率的に行うことができる。
【００７０】
反射電子検出器４からの検出信号は、画像形成装置２２に送られる。画像形成装置２２は、当該検出信号に基づいて、画像データを形成する。この画像データに基づいて、表示装置２３が画像（ＳＥＭ画像）を表示し、光学顕微鏡２７では得ることのできない高分解能像を得ることができる。
【００７１】
試料保持膜３２にＡｌ膜５０９を含んでいるので、光学顕微鏡から試料を照らす光が、真空室にある反射電子検出器に届くことは無い。その為、光学顕微鏡とＳＥＭで同時に撮像可能である。これにより、細胞に刺激を与えた直後の様子を光学顕微鏡で観察しつつ、高分解能像が必要な場合には、すぐにＳＥＭで撮像ができる。そのため、刺激に対する細胞の反応速度が速い場合にも対応することができる。
【００７２】
撮像後はシャッター１４を閉じることにより、万が一にでも試料保持膜３２が破壊される場合での鏡筒１への汚染を防止する。なお、上記のように細胞３８に刺激を与えた後の変化をＳＥＭで観察する前に、光学顕微鏡２７で観察する場合もある。その際も、シャッター１４を閉じておくと、試料保持膜３２が破れた際の汚染のリスクを低減できる。いずれにせよ、電子線７を液状試料２０に照射させない時はシャッター１４を閉じ、検査中におけるシャッター１４の開放時間を短縮することで、装置内部の汚染確立を低減させることができる。
【００７３】
刺激に対する細胞３８の反応速度が遅い場合、一旦シャッター１４を閉じ、反応した頃合を見計らって再度シャッター１４を開放し、電子線７による撮像を行っても良い。反応の確認は光学顕微鏡２７で行うことができる。
【００７４】
本実施例の装置では、シャッター１４と反射電子検出器４は別々の構成になっているが、図６のようにこれらが一体化されていても良い。すなわち、シャッター１４の先端に反射電子検出器１４が構成されている。シャッター１４が開放の場合、反射電子検出器１４が鏡筒１の直上に位置し、反射電子の検出効率が最大となる。
【００７５】
また、マニピュレータ２６には、化学物質や薬物を液状試料２０中に散布可能な機構を有すことができ、ＳＥＭで細胞を観察しながら化学物質や薬物に対する細胞３８の挙動も観察・検査することができる。また、マニピュレータ２６には、液体の流出機能を有することもでき、これにより散布した物質の回収を行うことや、培地のｐＨや浸透圧を一定にすることが可能になる。
【００７６】
上記において、像を形成する電子には反射電子を用いた。反射電子は原子番号に比例した信号強度を持つ。その為、生物試料のようにほぼ全体が低原子番号の物質で構成されている場合、像のコントラストが非常に弱く、分解能を向上させることが困難である。そこで、細胞３８の挙動で注目すべき部位に、金などの重金属を吸着させておくと良い。具体的には、該部位（抗原）に吸着する性質を持つ金粒子を標識した抗体を細胞に散布することで、抗原抗体反応を利用して、その部位（抗原）に該抗体を介して金を吸着させる。また、予め、電子線が照射されると発光する蛍光色素や量子ドット（例えばＳｉのナノ粒子、ＣｄＳｅをＺｎＳでコーティングした１０〜２０ｎｍの粒子）を細胞３８の特定部位に吸着させ発光を光学顕微鏡で観察しても良い。
【００７７】
上記実施例において、通常用いられる金粒子は１０〜３０ｎｍの粒径である。しかし、抗体と金粒子との吸着力が弱く、１０〜３０ｎｍの金粒子を付けられないこともある。その場合には、まず粒径数ｎｍと非常に小さな金（ナノゴールド）を抗体に付ける。このままでは金が小さすぎ、ＳＥＭでの観察は困難であるが、銀増感を利用して該金の周りに銀を吸着させることで、ＳＥＭで検出し易くする方法を用いても良い。
【００７８】
なお、上記においては、予めシャーレにおいて培養されていた細胞を取り出して、試料保持体４０に植え接ぎをして培養を行っていたが、生体から細胞を取り出して、この取り出された細胞を直接試料保持体４０の試料保持面３７ａに配置し、試料保持体４０内で当該細胞の培養をするようにしてもよい。
【００７９】
以上のように、本発明を用いて試料保持膜３２を介して液中試料のＳＥＭ観察が可能になった。特に開放された試料室を用いているため、外部から試料（検査対象物を含む）へのアクセスが可能で細胞に容易に刺激を与えることができる。さらに、試料保持膜３２の一部にＡｌ膜５０９を有することで遮光性を持たせ、光学顕微鏡７からの照射光が反射電子検出器４へ到達することを防止することができる。これにより、光学顕微鏡７と電子装置部（ＳＥＭ）２９による液状試料２０の同時撮像が可能になった。細胞の刺激に対する応答速度が速い場合でも、光学顕微鏡で細胞の変化を観察可能で、高分解能像が必要なときには即座にＳＥＭでの撮像ができる。
【００８０】
ＳＥＭで観察中（シャッター１４は図１のように開放）に試料保持膜３２が破れた場合には、液体試料２０が真空室１１に流入し圧力は上昇する。その圧力上昇を真空計１５で、例えば１００Ｐａより高い圧力を検知した場合、その情報が電子線制御部２４に送られ、シャッター１４にシャッター１４を閉鎖する命令が送られる。その結果、図２のようにシャッター１４は閉鎖され、液体試料２０はシャッター１４で受け止められることとなる。液体試料２０の量が多い場合、シャッター１４には受け皿を用意することも可能である。圧力上昇を検知して、シャッター１４を閉鎖するまでに要した時間は０．１秒であり、鏡体１の汚染を洗浄不要な程度にまで低減させることができる。
【００８１】
なお、上記実施例においては、一次線として電子線を用いたが、試料保持膜３２が他の荷電粒子（ヘリウムイオンビーム等）の照射に対する耐衝撃性及び強度が十分に高ければ、当該他の荷電粒子線を用いた場合でも適用可能である。
【００８２】
また、上記実施例では二次的信号として反射電子を用いたが、それ以外でも二次電子、Ｘ線、若しくはカソードルミネッセンス光、及び細胞３８への吸収電流を検出することにより、検査対象物である細胞３８の情報を得ることが可能である。なお、吸収電流の測定はマニピュレータ２６を用いると便利である。
【００８３】
本実施例での試料保持膜３２は、少なくとも一気圧の圧力差に耐えることができ、気体や液体の流入出がないことが必要である。具体的な物質としては、ポリマー、ポリエチレン、ポリイミド、ポリプロピレン、カーボン、酸化シリコン、窒化シリコン、若しくは窒化ボロンのうちの少なくとも一つと、金属層を含み、それら膜厚の合計が２０〜１０００ｎｍの範囲にあると良い。
【００８４】
このように、本発明における検査装置は、膜３２を介して検査対象物３８に一次線を照射する一次線照射手段１と、該一次線の照射に応じて検査対象物３８から発生する二次的信号を検出する信号検出手段４と、検査対象物３８に光を照射して、検査対象物３８の光学像を取得する光学像取得手段２７とを備える検査装置であって、膜３２が該光に対して遮光性を有し、一次線照射手段１と光学像取得手段２７とが膜３２を間に介して対向配置されている。
【００８５】
また、本発明における検査装置は、第一の面３２ａに検査対象物３８が保持される膜３２と、膜３２の第二の面３２ｂに接する雰囲気を減圧する真空室１１と、真空室１１に接続され、膜３２を介して検査対象物３８に一次線を照射する一次線照射手段１と、該一次線の照射に応じて検査対象物３８から発生する二次的信号を検出する信号検出手段４と、検査対象物３８に光を照射して、検査対象物３８の光学像を取得する光学像取得手段２７とを備える検査装置であって、膜３２が該光に対して遮光性を有し、一次線照射手段１と光学像取得手段２７とが膜３２を間に介して対向配置されている。
【００８６】
本発明における検査方法は、上記検査装置により、検査対象物の検査を行うことにより実行される。
【００８７】
すなわち、本発明における検査方法は、膜３２の第一の面３２ａに保持された検査対象物３８に、膜３２の第二の面３２ｂ側から膜３２を介して一次線を照射する一次線照射工程と、該一次線の照射に応じて検査対象物３８から発生する二次的信号を検出する信号検出工程と、膜３２の第一の面３２ａ側から検査対象物３８に光を照射して、検査対象物３８の光学像を取得する光学像取得工程とを備える検査方法であって、膜３２が該光に対して遮光性を有することを特徴としている。
【００８８】
また、本発明における検査方法は、膜３２の第一の面３２ａに検査対象物３８を保持する工程と、膜３２ａの第二の面３２ｂに接する雰囲気を減圧する工程と、膜３２の第二の面３２ｂに接する雰囲気側から膜を介して検査対象物３８に一次線を照射する一次線照射工程と、該一次線の照射に応じて検査対象物３８から発生する二次的信号を検出する信号検出工程と、膜３２の第一の面３２ａ側から検査対象物３８に光を照射して、検査対象物３８の光学像を取得する光学像取得工程とを備える検査方法であって、膜３２が該光に対して遮光性を有することを特徴としている。
【００８９】
上記検査装置及び検査方法において、膜３２における検査対象物３８が保持される第一の面３２ａは、検査対象物３８へのマニピュレータ等による外部からのアクセスが可能なように開放されている。このとき、膜３２の第一の面３２ａが膜３２の上面となっており、膜３２の第二の面３２ｂが膜３２の下面となっている。
【００９０】
ここで、３２膜は、ポリマー、ポリエチレン、ポリイミド、ポリプロピレン、カーボン、酸化シリコン、窒化シリコン、若しくは窒化ボロンのうちの少なくとも一つからなる層と、金属層とを含み、これらの層の層厚の合計が、２０〜１０００ｎｍの範囲にあるようにすることができる。
【００９１】
特に、金属層の膜厚を１０〜１００ｎｍの範囲にあるものとし、該金属層は、Ｂｅ、Ｍｇ、若しくはＡｌからなるようにすることができる。また、該金属層は、膜３２の第一の面３２ａ側に配置されないようにすることができる。
【００９２】
さらに、一次線は電子線又は荷電粒子線とし、二次的信号は、反射電子、二次電子、吸収電流、カソードルミネッセンス光、若しくはＸ線のうちの少なくとも一つとすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】本発明における試料検査装置の一実施例を示す概略構成図である。
【図２】本発明における試料検査装置の一実施例を示す概略構成図である。
【図３】本発明における試料保持体の構成を示す断面図である。
【図４】本発明における試料保持体を構成する枠状部材の概略図である。
【図５】本発明における試料保持体を構成する枠状部材の作成方法を示す図である。
【図６】本発明における試料検査装置の一実施例とは別の装置構成を示す概略構成図である。
【符号の説明】
【００９４】
１…鏡筒（一次線照射手段）、２…電子銃、３…集束レンズ、４…反射電子検出器（信号検出手段）、７…電子線（一次線）、８…排気手段、９…排気手段、１０…架台、１１…真空室、１２…試料保持体載置部（載置手段）、１３…除震装置、１４…シャッター、１５…真空計、１８…膜保持体（枠状部材）、１９…空間、２０…液状試料、２２…画像形成装置、２３…表示装置、２４…電子線制御部、２５…コンピュータ、２６…マニピュレータ、２７…光学顕微鏡（光学像取得手段）、２８…制御部、２９…電子線装置部、３２…試料保持膜（膜）、３２ａ…第１の面（試料保持面）、３２ｂ…第２の面、３４…シリコン基板、３４ａ…開口、３５…格子、３７…本体部、３７ａ…試料保持面、３７ｂ…孔、３７ｃ…段差部、３７ｄ…テーパ部、３８…細胞（検査対象物）、３９…培地、４０…試料保持体、４１…閉塞物質、４１ａ…閉塞物質、３０１…導電膜、５０１…シリコン基板、５０２…窒化シリコン膜、５０３…窒化シリコン膜、５０３ａ…窒化シリコン膜、５０４…レジスト、５０５…レジスト、５０５ａ…レジスト、５０６…レジスト、５０７…金属、５０８…レジスト、５０９…Ａｌ膜、５１０…開口
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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