(57)【要約】【課題】本発明の目的は、夾雑物が共存した被検体からでも簡易且つ精度良くフコキサンチンを定量することが出来る方法の提供である。【解決手段】下記式（Ｉ）：    Ｙ  ＝  （１０／ＭＷ）×（Ｘ１／ε）          （Ｉ）（式中、Ｙは濃度（Ｍ）、ＭＷは分子量、Ｘ１は吸収極大波長における吸光度からその吸収がない波長における吸光度を差し引いた値、且つεは分子吸光係数である）；を利用することによる溶液中のフコキサンチン濃度を定量する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）：
Ｙ  ＝  （１０／ＭＷ）×（Ｘ１／ε）          （Ｉ）
（式中、Ｙは濃度（Ｍ）、ＭＷは分子量、Ｘ１は吸収極大波長における吸光度からその吸収がない波長における吸光度を差し引いた値、且つεは分子吸光係数である）；
を利用することによる溶液中のフコキサンチン濃度を定量する方法。
【請求項２】
吸収がない波長が５４０ｎｍ以上６００ｎｍ以下である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
吸収がない波長が５６０ｎｍである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
分子吸光係数εの値の範囲が１１００以上１３２０以下である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
分子吸光係数εの値が１２７６である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
下記式（ＩＩ）：
Ｙ  ＝  （１０／ＭＷ）×（Ｘ２／ε）          （ＩＩ）
（式中、Ｙは濃度（Ｍ）、ＭＷは分子量、Ｘ２は吸収極大波長における吸光度、且つεは分子吸光係数である）；
を利用することによる溶液中のフコキサンチン濃度を定量する方法であって、ここで分子吸光係数εの値の範囲が１１４０より大きく且つ１３２０以下である、方法。
【請求項７】
分子吸光係数εの値が１２７６である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
溶液が、
（ａ）褐藻を無水アルコールに浸すこと；
を含む抽出法によって褐藻からフコキサンチンを抽出した抽出液である、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
抽出法が更に、
（ｂ）工程（ａ）による抽出液をシリカゲルカラムに付して夾雑物を除くこと；
を含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
下記式（ＩＩＩ）：
ＹＭ  ＝  （１０／ＭＷＭ）×（ＸＭ／εＭ）          （ＩＩＩ）
（式中、ＹＭは濃度（Ｍ）、ＭＷＭは分子量、ＸＭは吸収極大波長における吸光度からその吸収がない波長における吸光度を差し引いた値、且つεＭは分子吸光係数である）；
を利用することによる溶液中のフコキサンチン代謝物濃度を定量する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フコキサンチン抽出液の吸光度を測定することによる、フコキサンチン濃度の簡易定量法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満防止、美肌効果、がん予防などの機能性が強く注目されているフコキサンチンは、コンブ、ワカメ、アラメ、ホンダワラ、ヒジキなどの褐藻に特異的に含まれている。フコキサンチンは、これらの褐藻からの抽出液として利用されることが多いので、調製した抽出液に含まれるフコキサンチンの定量は必須である。また、フコキサンチンは光や熱に不安定で壊れ易いため、賞味期限の設定などのためにもフコキサンチンの定量が必須である。
【０００３】
フコキサンチンの従来の定量法は、褐藻からフコキサンチンを精製するか、又はきわめて高価な標品フコキサンチンを購入するかして得たフコキサンチン抽出液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供して検量線を作成し、被検体も同じＨＰＬＣに供して、検量線から被検体中のフコキサンチン濃度を算出するという方法である。この方法の欠点は、褐藻からフコキサンチン抽出液を調製する場合には、（１）生の褐藻が手に入りにくいこと、及び（２）仮に生の褐藻を入手できても、精製のために、抽出、シリカゲル又は活性炭などでの処理、ＨＰＬＣでの精製、及び再結晶化などの時間と経費がかかる操作を必要とすることである。また、標品フコキサンチンを用いる場合には、（３）その市販価格は１０μｇが１〜４万円と非常に高価であり、さらに搬送中に一部が分解しているために、純度は８０％以下で、標品として用いるためには再度の精製を必要とするということである。
【０００４】
このように、従来法ではフコキサンチンの定量はきわめて困難であった。それゆえ、簡易且つ精度良くフコキサンチンを定量する方法が強く求められている。また、フコキサンチン定量の被検体は通常クロロフィルや他のキサントフィル類などの夾雑物を多様に含んでおり、夾雑物の吸光度がフコキサンチンの定量を阻害するのは当然である。そこで、特に、夾雑物が共存した被検体からでも精度良くフコキサンチンを定量する方法の開発は非常に重要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、夾雑物が共存した被検体からでも簡易且つ精度良くフコキサンチンを定量することが出来る方法の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために、分光光度計による測定で得られる吸光度を利用して被検体を定量する方法に着目し鋭意検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は以下の通りである：
［１］下記式（Ｉ）：
Ｙ  ＝  （１０／ＭＷ）×（Ｘ１／ε）          （Ｉ）
（式中、Ｙは濃度（Ｍ）、ＭＷは分子量、Ｘ１は吸収極大波長における吸光度からその吸収がない波長における吸光度を差し引いた値、且つεは分子吸光係数である）；
を利用することによる溶液中のフコキサンチン濃度を定量する方法。
［２］吸収がない波長が５４０ｎｍ以上６００ｎｍ以下である、上記［１］記載の方法。
［３］吸収がない波長が５６０ｎｍである、上記［１］又は［２］記載の方法。
［４］分子吸光係数εの値の範囲が１１００以上１３２０以下である、上記［１］〜［３］のいずれか記載の方法。
［５］分子吸光係数εの値が１２７６である、上記［１］〜［４］のいずれか記載の方法。
［６］下記式（ＩＩ）：
Ｙ  ＝  （１０／ＭＷ）×（Ｘ２／ε）          （ＩＩ）
（式中、Ｙは濃度（Ｍ）、ＭＷは分子量、Ｘ２は吸収極大波長における吸光度、且つεは分子吸光係数である）；
を利用することによる溶液中のフコキサンチン濃度を定量する方法であって、ここで分子吸光係数εの値の範囲が１１４０より大きく且つ１３２０以下である、方法。
［７］分子吸光係数εの値が１２７６である、上記［６］記載の方法。
［８］溶液が、
（ａ）褐藻を無水アルコールに浸すこと；
を含む抽出法によって褐藻からフコキサンチンを抽出した抽出液である、上記［１］〜［７］のいずれか記載の方法。
［９］抽出法が更に、
（ｂ）工程（ａ）による抽出液をシリカゲルカラムに付して夾雑物を除くこと；
を含む、上記［８］記載の方法。
［１０］下記式（ＩＩＩ）：
ＹＭ  ＝  （１０／ＭＷＭ）×（ＸＭ／εＭ）          （ＩＩＩ）
（式中、ＹＭは濃度（Ｍ）、ＭＷＭは分子量、ＸＭは吸収極大波長における吸光度からその吸収がない波長における吸光度を差し引いた値、且つεＭは分子吸光係数である）；
を利用することによる溶液中のフコキサンチン代謝物濃度を定量する方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の定量法は、吸光度を測定するだけで、夾雑物が共存した被検体からでも、フコキサンチン濃度を定量することが出来るため、従来の定量法と比較して格段に簡便である。また、本発明のフコキサンチンの分子吸光係数を用いることにより、本発明の定量法は、高い精度でフコキサンチン濃度を決定することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
定量法（Ｉ）
本発明は、分光光度計により測定される吸光度を利用する、溶液中のフコキサンチン濃度を定量する方法（以下、定量法（Ｉ）ともいう）を提供する。定量法（Ｉ）は、下記式（Ｉ）：
Ｙ  ＝  （１０／ＭＷ）×（Ｘ１／ε）          （Ｉ）
（式中、Ｙは濃度（Ｍ）、ＭＷは分子量、Ｘ１は吸収極大波長における吸光度からその吸収がない波長における吸光度を差し引いた値、且つεは分子吸光係数である）；
を利用することを特徴とする。
【０００９】
式（Ｉ）における分子量ＭＷ、即ちフコキサンチンの分子量は、フコキサンチンがＣ４２Ｈ５８Ｏ６の化学式を持つため、ＭＷ＝６５８．９２であるとすれば良い。
【００１０】
用語「分子吸光係数」とは、本明細書で使用される場合、１ｃｍのセルに１ｇ／１００ｍｌの濃度の溶液を入れて測定したときの吸光度を意味する。分子吸光係数は、物質固有の定数である。
式（Ｉ）における分子吸光係数ε、即ちフコキサンチンの分子吸光係数は、当該分野で周知の方法を用いて当業者は決定することができる。その方法を簡単に述べれば以下のようになる。即ち、高純度フコキサンチンを調製し、分光光度計を用いてその吸光度を測定して検量線を作成する。検量線の傾きの逆数が式（Ｉ）における比例係数、即ち（１０／ＭＷ）×（１／ε）であるため、この関係を利用してεの値を決定すれば良い。
或いは、分子吸光係数εは、例えばＭｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘに記載されたフコキサンチンの分子吸光係数１１４０を利用しても良い。
後述する試験例１で述べるように、本発明者らが高純度フコキサンチンを用いて決定した分子吸光係数によれば、分子吸光係数εは１１００〜１３２０の範囲内であることが好ましく、１２７６が特に好ましい。
【００１１】
従って、上記定量法（Ｉ）を、下記式（Ｉ’）：
Ｙ  ＝  α×Ｘ１          （Ｉ’）
（式中、Ｙは濃度（μＭ）、αは比例係数、且つＸ１は吸収極大波長における吸光度からその吸収がない波長における吸光度を差し引いた値である）；
という形で記述したとき、比例係数αは好ましくは１１．５〜１３．８の範囲内であり、特に好ましくは１１．９である。それゆえ、定量法（Ｉ）の特に好ましい実施態様として、下記式（Ｉ”）：
Ｙ  ＝  １１．９Ｘ１          （Ｉ”）
（式中、Ｙは濃度（μＭ）、Ｘ１は吸収極大波長における吸光度からその吸収がない波長における吸光度を差し引いた値である）；
が挙げられる。
【００１２】
フコキサンチンの吸収極大波長は、４４８．５ｎｍである。応用上は、４５０ｎｍの波長における吸光度を吸収極大波長における吸光度として良い。
【００１３】
分光光度計を用いた吸光度の測定は、当該分野では周知の技術であり、例えば、島津製作所社製ＵＶ−１８００、日立ハイテクノロジーズ社製Ｕ−３２１０などの紫外可視分光光度計を使用し、その添付説明書に従って当業者は容易に行うことが可能である。
【００１４】
上述の通り、前記式（Ｉ）、（Ｉ’）、及び（Ｉ”）におけるＸ１は、吸収極大波長における吸光度からその吸収がない波長における吸光度を差し引いた値である。Ｘ１についてこのような差し引きをした値を用いる理由は、溶液中の夾雑物からの吸光度への寄与を除外するためである。このような差し引きによって得られるＸ１の値は、理想的には、フコキサンチンの吸収極大波長における、フコキサンチンのみの寄与による吸光度となっているはずである。前記フコキサンチンの吸収がない波長として５４０ｎｍ未満の波長を用いた場合、フコキサンチン自体による吸光度が差し引かれてしまうなどの理由により正確な濃度からの誤差が大きくなり、また、６００ｎｍを超える波長を用いた場合、安価な分光光度計ではそのような近赤外に近い波長の吸光度の測定は不正確である。従って、フコキサンチンの吸収がない波長としては、５４０ｎｍ以上６００ｎｍ以下を用いることが好ましく、５６０ｎｍを用いることが特に好ましい。
【００１５】
上記定量法（Ｉ）を用いたフコキサンチン濃度の定量は、例えば、以下のようにして行う。吸収極大波長での吸光度が０．７１２６、その吸収がない任意の波長（例えば、５６０ｎｍ）での吸光度が０．０６０５０であるとき、分子量ＭＷ＝６５８．９２、及び分子吸光係数ε＝１２７６として、式（Ｉ）にこれらの値を代入して計算すると、Ｙ＝（１０／６５８．９２）×（０．７１２６−０．０６０５０）／１２７６＝７．７６μＭとなる。
【００１６】
上述の定量法（Ｉ）は、フコキサンチン代謝物の濃度決定に対しても、適切な分子量、吸光度、及び分子吸光係数を用いて、同様にして適用され得る。即ち、本発明はまた、下記式（ＩＩＩ）：
ＹＭ  ＝  （１０／ＭＷＭ）×（ＸＭ／εＭ）          （ＩＩＩ）
（式中、ＹＭは濃度（Ｍ）、ＭＷＭは分子量、ＸＭは吸収極大波長における吸光度からその吸収がない波長における吸光度を差し引いた値、且つεＭは分子吸光係数である）；
を利用することによる溶液中のフコキサンチン代謝物濃度を定量する方法も提供する。
【００１７】
上記フコキサンチン代謝物の例としては、フコキサンチノール（分子量：616、吸収極大波長：448.8 nm、分子吸光係数：1700）、アマロシアキサンチンＡ（分子量：614、吸収極大波長：467.5 nm）などが挙げられる。
（以上、定量法（Ｉ））
【００１８】
定量法（ＩＩ）
本発明はまた、下記式（ＩＩ）：
Ｙ  ＝  （１０／ＭＷ）×（Ｘ２／ε）          （ＩＩ）
（式中、Ｙは濃度（Ｍ）、ＭＷは分子量、Ｘ２は吸収極大波長における吸光度、且つεは分子吸光係数である）；
を利用することによる溶液中のフコキサンチン濃度を定量する方法であって、ここで分子吸光係数εの値の範囲が１１４０より大きく且つ１３２０以下である方法を提供する。分子吸光係数は、好ましくは１２７６である。分子量ＭＷ、フコキサンチンの吸収極大波長、及び吸光度の測定については、定量法（Ｉ）の説明において記載した内容が定量法（ＩＩ）にも適用される。
【００１９】
従って、上記定量法を、下記式（ＩＩ’）：
Ｙ  ＝  α×Ｘ２          （ＩＩ’）
（式中、Ｙは濃度（μＭ）、αは比例係数、且つＸ２は吸収極大波長における吸光度）；
という形で記述したとき、分子吸光係数αは好ましくは１１．５〜１３．８の範囲内であり、特に好ましくは１１．９である。それゆえ、定量法（ＩＩ）の特に好ましい実施態様として、下記式（ＩＩ”）：
Ｙ  ＝  １１．９Ｘ２          （ＩＩ”）
（式中、Ｙは濃度（μＭ）、且つＸ２は吸収極大波長における吸光度である）；
が挙げられる。
【００２０】
上記定量法（ＩＩ）を用いたフコキサンチン濃度の定量は、例えば、以下のようにして行う。吸収極大波長での吸光度が０．６５２１であるとき、分子量ＭＷ＝６５８．９２、及び分子吸光係数ε＝１２７６として、式（ＩＩ）にこれらの値を代入して計算すると、Ｙ＝（１０／６５８．９２）×（０．６５２１／１２７６）＝７．７６μＭとなる。
【００２１】
上述の定量法（ＩＩ）は、フコキサンチン代謝物の濃度決定に対しても、適切な分子量、吸光度、及び分子吸光係数を用いて、同様にして適用され得る。フコキサンチン代謝物の例は、定量法（Ｉ）の説明で挙げたものが同様に挙げられる。
（以上、定量法（ＩＩ））
【００２２】
上記定量法（Ｉ）又は（ＩＩ）を利用して溶液中のフコキサンチン濃度が定量され得るが、フコキサンチン濃度が定量される「溶液」には、分光光度計を使用した吸光度の測定に通常用いられるような、フコキサンチンを含有するあらゆる溶液が含まれる。
【００２３】
上記定量法（Ｉ）又は（ＩＩ）を利用してフコキサンチン濃度が定量される溶液は、例えば、（ａ）褐藻（例、コンブ、ワカメ、アラメ、ホンダワラ、ヒジキなど）を無水アルコールに浸すこと、を含む抽出法によって褐藻からフコキサンチンを抽出した抽出液であっても良い。該抽出液は更に、（ｂ）工程（ａ）による抽出液をシリカゲルカラムに付して夾雑物を除くこと、を含む抽出法によって褐藻からフコキサンチンを抽出した抽出液であっても良い。或いは、該抽出液は更に、前記工程（ｂ）により得た画分をＨＰＬＣに供してフコキサンチンを分収したものであっても良く、又はさらに高純度を求める場合は、分収液を再度クロマトグラフィーに通してさらに結晶化したものであっても良い。各工程における各手順（抽出、分離、精製）は、通常当該分野で実施される手法に準じて実施される。また、フコキサンチンを含有する溶液となる限り、上記以外の方法を用いることができることは当業者には明らかである。実際的には、下記実施例２に記載するように、（ａ）の抽出法、又は（ａ）及び（ｂ）の抽出法によって抽出した抽出液に対して定量法（Ｉ）を適用することにより、高い精度でフコキサンチン濃度を決定することが出来る。また、夾雑物が少ない溶液を用いる場合には、定量法（ＩＩ）によって充分な精度で濃度を定量することができる。
【００２４】
フコキサンチン代謝物濃度が定量される溶液についても、上記フコキサンチン濃度が定量される溶液で説明した事項が適用され得る。
【００２５】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制限されるものではない。
【実施例】
【００２６】
試験例１  分子吸光係数の決定
高純度標品フコキサンチン溶液を用いて、フコキサンチンの分子吸光係数を決定した。高純度標品フコキサンチン溶液は次のようにして調製した。即ち、裁断した生コンブを無水アルコールに浸して抽出し、その抽出液をシリカゲルカラムに通してクロロフィルなどの夾雑物を除いた。更に、得た画分をＨＰＬＣに供してフコキサンチンを分収し、分収液を再度クロマトグラフィーに通してさらに結晶化して鮮橙色の板状結晶を得た。吸光度の測定は、分光光度計Ｕ３２１０（日立ハイテクノロジーズ社製）を使用して行った。このようにして測定した吸光度を基に、検量線を作成した。図１がそのようにして作成した検量線である。
図１の直線の傾きの逆数が式（Ｉ’）におけるαの値である。従って、αは１／０．０７２５から１／０．０８６９まで、即ち１１．５から１３．８までの値であることが分かった。更に、分子量ＭＷ＝６５８．９として分子吸光係数εを求めると、１１００から１３２０までの値であることが分かった。再結晶を繰り返して得られた高純度標品の場合のαの値が１１．９であったため、分子吸光係数εの最適値は１２７６と決定された。
【００２７】
実施例１  定量法（Ｉ）によるフコキサンチンの定量
高純度標品フコキサンチン溶液に対して、上記定量法（Ｉ）を利用して定量を行った。高純度標品フコキサンチン溶液の調製、及び吸光度の測定は試験例１と同様にして行った。
定量法（Ｉ）を適用するにあたって、フコキサンチンの吸収極大波長４５０ｎｍにおける吸光度の測定値から、４７０ｎｍから１０ｎｍずつ増やした各波長における吸光度の測定値を差し引いた値を式（Ｉ）におけるＸ１として用いた。また、フコキサンチンの分子吸光度係数ε＝１２７６とし、フコキサンチンの分子量はＭＷ＝６５８．９２とした。上記波長ごとの吸光度の測定値を用いて算出したフコキサンチン量を表１に示す。
【００２８】
【表１】
2009180565.tif 000002
【００２９】
差し引く吸光度の波長が５６０ｎｍの場合は、定量値が１３．５μｍｏｌで、実際に用いたフコキサンチン量の１３．８μｍｏｌよりも約２．２％低かった。差し引く波長が６００ｎｍならば１００％精度で定量できた。しかし、２．２％は分光光度計の通常の誤差の範囲内であり、安価な分光光度計では６００ｎｍという近赤外に近い波長の吸光度は不正確である。
以上の結果から、差し引く吸光度の波長は５４０ｎｍ以上、６００ｎｍ以下であることが好ましく、特に好ましくは５６０ｎｍである。
【００３０】
実施例２  抽出液からの各精製段階におけるフコキサンチンの定量
生のコンブから通常の手法でフコキサンチンを抽出し、その過程でフコキサンチン含量を、本発明の簡易測定法（定量法（Ｉ））で定量し、従来法の定量値と比較した。通常の抽出法とは、（ａ）裁断した生コンブを無水アルコールに浸して抽出、（ｂ）抽出液をシリカゲルカラムに通してクロロフィルなどの夾雑物を除く、及び（ｃ）得た画分をＨＰＬＣに供してフコキサンチンを分収、さらに高純度を求める場合は、分収液を再度クロマトグラフィーに通してさらに結晶化する。そこで、それぞれの画分の純度をＨＰＬＣで測定した結果を図２に示した。
最上段は（ａ）の抽出液である。クロロフィルを多く含み、類似キサントフィルのゼアキサンチンも含んでいる。フコキサンチン量は、このＨＰＬＣで定量すると、１８９μｍｏｌ／Ｌであった。この抽出液を２５倍に希釈して卓上型の分光光度計で４５０ｎｍの波長における吸光度と５６０ｎｍの波長における吸光度を測定し、その差を計算式（Ｉ）のＸ１に当てはめて濃度を算出した（分子量ＭＷ＝６５８．９、分子吸光係数ε＝１２７６とした）。一例をあげると、４５０ｎｍでの吸光度が０．７１２６で５６０ｎｍでの吸光度が０．０６０５０であったので、その差０．６５２１を計算式に当てはめ２５倍すると１９４μｍｏｌ／Ｌであった。同様にして、同じ生コンブを別途抽出に供し、測定した。これを計４回行った平均値は：
従来法での測定値：  １８９±４．０  μｍｏｌ／Ｌ  （ｎ＝４）
定量法（Ｉ）での測定値：  １９４±１１    μｍｏｌ／Ｌ  （ｎ＝４）
であった。
（ｂ）のシリカゲルカラム後の画分も、（ａ）ほどではないが、クロロフィルやゼアキサンチンを混在させている。この画分に定量法（Ｉ）を適用した。
従来法での測定値：  １３７±２  μｍｏｌ／Ｌ  （ｎ＝４）
定量法（Ｉ）での測定値：  １３９±５  μｍｏｌ／Ｌ  （ｎ＝４）
であった。
つまり、様々な混在物が量的に多い抽出原液を定量法（Ｉ）で測定すると＋２．６％多く定量される程度でフコキサンチンの含有量を判定できた。そして、ある程度精製した抽出画分に適用すると、＋１．５％と、ほぼ正確に含有量を測定できた。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】フコキサンチンの分光光度計での検量線を示す。左は、表示した全濃度での吸光度のプロット、右は、５０μＭでの吸光度を除いたプロットである。
【図２】コンブからのフコキサンチン抽出液の各精製段階でのＨＰＬＣの結果を示す。（ａ）は生コンブからのアルコール抽出液、（ｂ）は（ａ）をシリカゲルカラムに通した溶液、及び（ｃ）は（ｂ）を同様のＨＰＬＣに供してフコキサンチン画分を分収したものである。
【図２】
2009180565.tif 000003
【図１】
2009180565.tif 000004