(57)【要約】【課題】本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ａ株およびＢ株）由来のタンパク質を提供することを課題とする。【解決手段】上記課題は、本明細書に記載されたアミノ酸配列、対応するヌクレオチド配列、発現データ、および血清学的なデータが提供されることによって解決された。本発明のタンパク質は、ワクチン、免疫原性組成物、および／または診断薬のために有用な抗原である。したがって、本発明は、ワクチン、免疫原性組成物、および／または診断薬なども提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ細菌由来の抗原に関
する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、ヒトにおいて病原性であ
る非運動性のグラム陰性双球菌である。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、咽頭
にコロニー形成をし、髄膜炎（および、時折、髄膜炎のない敗血症）を引き起こ
す。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに密接に関
係しているが、髄膜炎菌が淋病菌と明らかに異なる１つの特徴は、全ての病原性
髄膜炎菌に存在する多糖類性莢膜の存在である。
【０００３】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、風土病および伝染病を引き起こす。米国に
おいて、発病率は１年間に１００，０００人中０．６〜１人の割合であり、そし
て大発生によりずっと大きくなり得る（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（１９９６）Ｓａ
ｆｅｔｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  Ｓｅｒｏｇｒｏ
ｕｐｓ  Ａ／Ｃ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｏｌｉｇｏ
ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅ
ｉｎ  Ｙｏｕｎｇ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ．ＪＡＭＡ  ２７５（１９）：１４９９
−１５０３；Ｓｃｈｕｃｈａｔら（１９９７）Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｍｅｎｉｎ
ｇｉｔｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｉｎ  １９９５，Ｎ
Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７７（１４）：９７０−９７６）。発展途上国では
、風土病の割合は、よりずっと大きくそして伝染病発生率は１年間あたり１００
，０００人あたり５００件に達し得る。死亡率は極めて高く、米国では１０〜２
０％、そして発展途上国においてはよりずっと高い。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  
ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する共役ワクチンの導入の結果、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉ
ｔｉｄｉｓは、米国において全ての年齢における細菌性髄膜炎の主な原因である
（Ｓｃｈｕｃｈａｔ（１９９７）前出）。
【０００４】
この生物の莢膜多糖類に基づいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの１２血清
群が同定されている。Ａ群はサハラアフリカ周縁での伝染病において最も頻繁に
関与している病原体である。血清型Ｂ群および血清型Ｃ群は、米国および大部分
の先進国における症例の大部分の原因である。血清型Ｗ１３５およびＹは、米国
および先進国における症例の残りの原因である。現在使用される髄膜炎ワクチン
は、血清型Ａ、Ｃ、Ｙ、およびＷ１３５で構成される４価の多糖類ワクチンであ
る。これは、青年および成人には効果があるが、弱い免疫応答および短い保護持
続期間を誘導し、そして乳児には使用され得ない（例えば、Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ
ａｎｄ  Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｗｅｅｋｌｙ  ｒｅｐｏｒｔ，Ｖｏｌ．４６，
Ｎｏ．ＰＲ−５（１９９７））。これは、多糖類が、繰り返し免疫処置により増
強され得ない弱い免疫応答を誘導するＴ細胞独立性抗原であるからである。Ｈ．
ｉｎｆｌｕｅｎｚａに対するワクチン接種の成功に続き、血清型Ａおよび血清型
Ｃに対する共役ワクチンが開発されており、そして臨床試験の最終段階である（
Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ  ＷＤ「Ｎｅｗ  ａｎｄ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｖａｃｃｉｎ
ｅｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ」Ｎｅｗ
Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，前出，４６９−４８８頁；Ｌｉｅ
ｂｅｒｍａｎら（１９９６）前出；Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏら（１９９２）Ｄｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｅｓｔｉｎ
ｇ  ｏｆ  ａ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｅｎ
ｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ  ＡおよびＣ．Ｖａｃｃｉｎｅ  １０：６９１−６９８）
。
【０００５】
しかし、髄膜炎菌Ｂは問題を残している。この血清型は現在、米国、欧州、お
よび南アメリカにおける全髄膜炎のおおよそ５０％の原因である。この多糖類ア
プローチは使用され得ない。なぜなら、ｍｅｎＢ莢膜多糖類は、哺乳動物組織に
もまた存在するα（２−８）−結合型Ｎ−アセチルノイラミン酸のポリマーであ
るからである。これは抗原に対する寛容性を生ずる；実際、免疫応答が惹起され
た場合、それは抗−自己であり、それ故、所望されない。自己免疫の誘導を回避
しそして保護的免疫応答を誘導するために、この莢膜性多糖類は、例えば、Ｎ−
アセチル基をＮ−プロピオニル基と置換するように化学的に改変されるが、特異
的抗原性は不変のままである（ＲｏｍｅｒｏおよびＯｕｔｓｃｈｏｏｒｎ（１９
９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  ｇ
ｒｏｕｐ  Ｂ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ：ｃａｐｓｕｌａｒ  ｏ
ｒ  ｎｏｎ−ｃａｐｓｕｌａｒ？  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ７
（４）：５５９−５７５）。
【０００６】
ｍｅｎＢワクチンに対する代替のアプローチは、外膜タンパク質（ＯＭＰ）の
複合体混合物（ＯＭＰのみを含むかまたはポーリンに富むＯＭＰのいずれかを含
む）を使用するか、または細菌活性をブロックする抗体を誘導すると考えられる
クラス４ＯＭＰを欠失した。このアプローチは、十分に特徴付けられていないワ
クチンを産生する。それらワクチンは、相同な菌株に対して保護し得えるが、外
膜タンパク質の多くの抗原性改変体が多く存在する場合、全体として効果がない
。抗原変異性を克服するために、９つまでの異なるポーリンを含む多価ワクチン
が構築されている（例えば、Ｐｏｏｌｍａｎ  ＪＴ（１９９２）Ｄｅｖｅｌｏｐ
ｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ．Ｉｎｆｅ
ｃｔ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｄｉｓ．４：１３−２８）。外膜ワクチンで使用されるさ
らなるタンパク質は、ｏｐａおよびｏｐｃタンパク質であるが、これらのアプロ
ーチは抗原変異性を克服し得ない（例えば、Ａｌａ’ＡｌｄｅｅｎおよびＢｏｒ
ｒｉｅｌｌｏ（１９９６）Ｔｈｅ  ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  ｔｒａｎｆｅ
ｒｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １  ａｎｄ  ２  ａｒｅ  ｂｏ
ｔｈ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｘｐｏｓｅｄ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｂａｃｔ
ｅｒｉｃｉｄａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｋｉｌｌｉ
ｎｇ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｔｒａｉ
ｎｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ  １４（１）：４９−５３）。
【０００７】
特定の量の配列データは、髄膜炎菌および淋病菌の遺伝子ならびにタンパク質
（例えば、ＥＰ−Ａ−０４６７７１４，ＷＯ９６／２９４１２）について利用可
能であるが、これは決して完全ではない。さらなる配列の供給は、免疫系に対す
る標的と推測され、そして抗原的に変異し得ることのない分泌タンパク質または
表面露出タンパク質を同定するための機会を提供し得た。例えば、同定されたタ
ンパク質のいくつかは、髄膜炎菌Ｂに対して効果のあるワクチンの成分であり、
いくつかは全ての髄膜炎菌血清型に対するワクチンの成分であり、そして他は全
ての病原性Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｅに対するワクチンの成分であり得た。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（本発明）
本発明は、本実施例で開示されたＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓアミノ酸配列
を含むタンパク質を提供する。したがって、本発明は、以下をも提供する。
（１）  配列番号２、４、および６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
（２）  項目１に記載のタンパク質をコードする、核酸分子。
（３）  配列番号１、３、および５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、項目２に記載の核酸分子。
（４）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、および９０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
（５）請求項４に記載のタンパク質に対して５０％以上の配列同一性を有するタンパク質。
（６）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、および９０からなる群より選択されるアミノ酸配列のフラグメントを含む、タンパク質。
（７）項目４−６のいずれか１つに記載のタンパク質に結合する抗体。
（８）項目４−６のいずれか１つに記載のタンパク質をコードする、核酸分子。
（９）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、および８９からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、項目８に記載の核酸分子。
（１０）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、および８９からなる群より選択されるヌクレオチド配列のフラグメントを含む、核酸分子。
（１１）  項目８〜１０のいずれか１つに記載の核酸分子に相補的なヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
（１２）  項目８〜１１のいずれか１つに記載の核酸分子に対して５０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
（１３）  高ストリンジェント条件下で、項目８〜１２のいずれか１つに記載の核酸分子にハイブリダイズし得る、核酸分子。
（１４）  項目１〜１３のいずれか１つに記載のタンパク質、核酸分子、または抗体を含む、組成物。
（１５）  ワクチン組成物または診断組成物である、項目１４に記載の組成物。
（１６）  医薬品としての使用のための、項目１４または１５に記載の組成物。
（１７）  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細菌、特にＮｅｉｓｓｅｒｉａ  Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに起因する感染の処置または予防のための医薬品の製造における、項目１４に記載の組成物の使用。
【０００９】
これはまた、本実施例で開示されるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓアミノ酸配
列と相同な（すなわち、配列同一性を有する）配列を含むタンパク質を提供する
。この特定の配列に依存して、配列同一性の程度は、好ましくは５０％よりも大
きい（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）。これ
らの相同なタンパク質は、本実施例で開示される配列の変異体および対立遺伝子
の改変体を含む。代表的には、２つのタンパク質の間の５０％の同一性またはそ
れより大きい同一性は、機能的に等価であることの表示であると考えられる。タ
ンパク質間の同一性は、好ましくはパラメーターｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌ
ｔｙ＝１２およびｇａｐ  ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１を有するａ
ｆｆｉｎｅ変換ギャップ検索を使用して，ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒ
ｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）において実行されるようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍ
ａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。
【００１０】
本発明はさらに、本実施例で開示されるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓアミノ
酸配列のフラグメントを含むタンパク質を提供する。このフラグメントは、その
配列由来の少なくともｎ個の連続したアミノ酸を含み、そしてその特定の配列に
依存して、ｎは７以上（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０以上）
である。好ましくはこのフラグメントは、その配列に由来するエピトープを含む
。
【００１１】
本発明のタンパク質は、もちろん、種々の手段（例えば、組換え発現、細胞培
養物からの精製、化学合成など）によっておよび種々の型で（例えば、天然型、
融合型など）調製され得る。これらは、好ましくは実質的に純粋な型で調製され
る（すなわち、他のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓタンパク質または宿主細胞タ
ンパク質を実質的に含まない）。
【００１２】
さらなる局面に従って、本発明は、これらのタンパク質に結合する抗体を提供
する。これらは、ポリクローナルまたはモノクローナルであり、そして任意の適
切な手段により産生され得る。
【００１３】
さらなる局面に従って、本発明は、本実施例で開示されるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉ
ｔｉｄｉｓヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。さらに、本発明は、本実施
例で開示されるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓヌクレオチド配列と相同な（すな
わち、配列同一性を有する）配列を含む核酸を提供する。
【００１４】
さらに、本発明は、本実施例で開示されるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ核酸
に、好ましくは「高ストリンジェンシー」な条件下で（例えば、０．１×ＳＳＣ
、０．５％ＳＤＳ溶液中６５℃）ハイブリダイズし得る核酸を提供する。
【００１５】
これらの配列のフラグメントを含む核酸もまた、提供される。これらは、Ｎ．
ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ配列由来の少なくともｎ個の連続するヌクレオチドを
含有すべきであり、そして特定の配列に依存して、ｎは１０以上（例えば、１２
、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０以上）である。
【００１６】
さらなる局面に従って、本発明は、本発明のタンパク質およびタンパク質フラ
グメントをコードする核酸を提供する。
【００１７】
本発明が上記の配列に相補的な配列を含む核酸を提供することもまた、認識さ
れるべきである（例えば、アンチセンスの目的またはプローブの目的において）
。
【００１８】
本発明に従う核酸は、もちろん、多くの様式（例えば、化学合成により、ゲノ
ムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、生物体自体などから）で調製
され得、そして種々の型（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プローブなど）
をとり得る。
【００１９】
さらに、用語「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡ、そしてまた改変された骨格を
含むＤＮＡおよびＲＮＡのようなそれらのアナログ、そしてまたペプチド核酸（
ＰＮＡ）などを含む。
【００２０】
さらなる局面に従って、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含むベクター
（例えば、発現ベクター）およびこのようなベクターで形質転換された宿主細胞
を提供する。
【００２１】
さらなる局面に従って、本発明は、本発明に従うタンパク質、抗体および／ま
たは核酸を含む組成物を提供する。これらの組成物は、例えばワクチンとして、
または診断用試薬として、または免疫原性組成物として適切であり得る。
【００２２】
本発明はまた、医薬品として（例えばワクチンとして）または診断用試薬とし
て使用するための、本発明に従う核酸、タンパク質、または抗体を提供する。ま
た、以下の製造における、本発明に従う核酸、タンパク質、または抗体の使用を
提供する：（ｉ）ナイセリア細菌に起因する感染の処置または予防のための医薬
品；（ｉｉ）ナイセリア細菌またはナイセリア細菌に対して惹起された抗体の存
在を検出するための診断用試薬；および／または（ｉｉｉ）ナイセリア細菌に対
する抗体を惹起し得る試薬。上記のナイセリア細菌は、任意の種または菌株であ
り得る（例えば、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）が、好ましくは、Ｎ．ｍｅｎｉ
ｎｇｉｔｉｄｉｓ、特に菌株Ａ、菌株Ｂ、または菌株Ｃである。
【００２３】
本発明はまた、治療的有効量の、本発明に従う核酸、タンパク質、および／ま
たは抗体を患者に投与する工程を含む、患者の処置の方法を提供する。
【００２４】
さらなる局面に従って、本発明は、種々のプロセスを提供する。
【００２５】
本発明のタンパク質を産生するためのプロセスであって、タンパク質の発現を
誘導する条件下において、本発明に従う宿主細胞を培養する工程を包含する、プ
ロセスが提供される。
【００２６】
本発明のタンパク質または核酸を産生するためのプロセスであって、ここでそ
のタンパク質または核酸は、化学的手段を使用して、一部または全体が合成され
るプロセスが提供される。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドを検出するためのプロセスであって、（ａ）本発明
に従う核プローブを、二重鎖を形成させるハイブリダイズの条件下で生物学的サ
ンプルと接触させる工程；および（ｂ）上記の二重鎖を検出する工程を包含する
、プロセスが提供される。
【００２８】
本発明のタンパク質を検出するためのプロセスであって、（ａ）本発明に従う
抗体を、抗体−抗原複合体の形成に適した条件下で生物学的サンプルと接触させ
る工程；および（ｂ）上記の複合体を検出する工程を包含する、プロセスが提供
される。
【００２９】
ＰＣＴ／ＩＢ９８／０１６６５に開示される配列とは異なり、本願に開示され
る配列は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに、いかなる有意なホモログも有しない
と考えられている。従って、本発明の配列はまた、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉ
ｓとＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅとの間を識別するための試薬の調製における用
途を見出す。
【００３０】
本発明を実行するために用いられ得る標準的な技術および手順（例えば、ワク
チン接種目的または診断目的のために、開示された配列を利用するための）の要
旨は以下の通りである。この要旨は、本発明に対する限定ではなく、むしろ使用
され得るが使用する必要があるわけではない例を与えるものである。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１Ａ】図１〜７は、それぞれＯＲＦ４０、３８、４４、５２、１１４、４１、および１２４を用いる、実施例１、２、３、７、１３、１６、および１９に関する生化学的データ、ならびに配列解析を示す。Ｍ１およびＭ２は分子量マーカーである。矢印は、ウェスタンブロッティングにおける主要な組換え産物の位置を示すか、または主要なＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ免疫活性バンドの位置を示す。ＴＰは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの総タンパク質抽出物を示す；ＯＭＶは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜ベシクル調製物を示す。殺菌性アッセイの結果において：菱形は、免疫前のデータを示し；三角形は、ＧＳＴコントロールデータを示し；丸は、組換えＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓタンパク質のデータを示す。コンピューター分析は、親水性プロット（上段）、抗原性指標プロット（中段）、およびＡＭＰＨＩ分析（下段）を示す。ＡＭＰＨＩプログラムは、Ｔ細胞エピトープを予測するために使用されており（Ｇａｏら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９６）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒ  １２：５９３；Ｑｕａｋｙｉら（１９９２）Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  補遺  １１：９）、そしてＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（１２２８  Ｓｏｕｔｈ  Ｐａｒｋ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７１５  ＵＳＡ）のＰｒｏｔｅａｎ  ｐａｃｋａｇｅで利用可能である。
【図１Ｂ】図１〜７は、それぞれＯＲＦ４０、３８、４４、５２、１１４、４１、および１２４を用いる、実施例１、２、３、７、１３、１６、および１９に関する生化学的データ、ならびに配列解析を示す。Ｍ１およびＭ２は分子量マーカーである。矢印は、ウェスタンブロッティングにおける主要な組換え産物の位置を示すか、または主要なＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ免疫活性バンドの位置を示す。ＴＰは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの総タンパク質抽出物を示す；ＯＭＶは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜ベシクル調製物を示す。殺菌性アッセイの結果において：菱形は、免疫前のデータを示し；三角形は、ＧＳＴコントロールデータを示し；丸は、組換えＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓタンパク質のデータを示す。コンピューター分析は、親水性プロット（上段）、抗原性指標プロット（中段）、およびＡＭＰＨＩ分析（下段）を示す。ＡＭＰＨＩプログラムは、Ｔ細胞エピトープを予測するために使用されており（Ｇａｏら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９６）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒ  １２：５９３；Ｑｕａｋｙｉら（１９９２）Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  補遺  １１：９）、そしてＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（１２２８  Ｓｏｕｔｈ  Ｐａｒｋ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７１５  ＵＳＡ）のＰｒｏｔｅａｎ  ｐａｃｋａｇｅで利用可能である。
【図１Ｃ】図１〜７は、それぞれＯＲＦ４０、３８、４４、５２、１１４、４１、および１２４を用いる、実施例１、２、３、７、１３、１６、および１９に関する生化学的データ、ならびに配列解析を示す。Ｍ１およびＭ２は分子量マーカーである。矢印は、ウェスタンブロッティングにおける主要な組換え産物の位置を示すか、または主要なＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ免疫活性バンドの位置を示す。ＴＰは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの総タンパク質抽出物を示す；ＯＭＶは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜ベシクル調製物を示す。殺菌性アッセイの結果において：菱形は、免疫前のデータを示し；三角形は、ＧＳＴコントロールデータを示し；丸は、組換えＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓタンパク質のデータを示す。コンピューター分析は、親水性プロット（上段）、抗原性指標プロット（中段）、およびＡＭＰＨＩ分析（下段）を示す。ＡＭＰＨＩプログラムは、Ｔ細胞エピトープを予測するために使用されており（Ｇａｏら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９６）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒ  １２：５９３；Ｑｕａｋｙｉら（１９９２）Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  補遺  １１：９）、そしてＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（１２２８  Ｓｏｕｔｈ  Ｐａｒｋ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７１５  ＵＳＡ）のＰｒｏｔｅａｎ  ｐａｃｋａｇｅで利用可能である。
【図１Ｄ】図１〜７は、それぞれＯＲＦ４０、３８、４４、５２、１１４、４１、および１２４を用いる、実施例１、２、３、７、１３、１６、および１９に関する生化学的データ、ならびに配列解析を示す。Ｍ１およびＭ２は分子量マーカーである。矢印は、ウェスタンブロッティングにおける主要な組換え産物の位置を示すか、または主要なＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ免疫活性バンドの位置を示す。ＴＰは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの総タンパク質抽出物を示す；ＯＭＶは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜ベシクル調製物を示す。殺菌性アッセイの結果において：菱形は、免疫前のデータを示し；三角形は、ＧＳＴコントロールデータを示し；丸は、組換えＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓタンパク質のデータを示す。コンピューター分析は、親水性プロット（上段）、抗原性指標プロット（中段）、およびＡＭＰＨＩ分析（下段）を示す。ＡＭＰＨＩプログラムは、Ｔ細胞エピトープを予測するために使用されており（Ｇａｏら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９６）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒ  １２：５９３；Ｑｕａｋｙｉら（１９９２）Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  補遺  １１：９）、そしてＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（１２２８  Ｓｏｕｔｈ  Ｐａｒｋ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７１５  ＵＳＡ）のＰｒｏｔｅａｎ  ｐａｃｋａｇｅで利用可能である。
【図１Ｅ】図１〜７は、それぞれＯＲＦ４０、３８、４４、５２、１１４、４１、および１２４を用いる、実施例１、２、３、７、１３、１６、および１９に関する生化学的データ、ならびに配列解析を示す。Ｍ１およびＭ２は分子量マーカーである。矢印は、ウェスタンブロッティングにおける主要な組換え産物の位置を示すか、または主要なＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ免疫活性バンドの位置を示す。ＴＰは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの総タンパク質抽出物を示す；ＯＭＶは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜ベシクル調製物を示す。殺菌性アッセイの結果において：菱形は、免疫前のデータを示し；三角形は、ＧＳＴコントロールデータを示し；丸は、組換えＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓタンパク質のデータを示す。コンピューター分析は、親水性プロット（上段）、抗原性指標プロット（中段）、およびＡＭＰＨＩ分析（下段）を示す。ＡＭＰＨＩプログラムは、Ｔ細胞エピトープを予測するために使用されており（Ｇａｏら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９６）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒ  １２：５９３；Ｑｕａｋｙｉら（１９９２）Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  補遺  １１：９）、そしてＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（１２２８  Ｓｏｕｔｈ  Ｐａｒｋ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７１５  ＵＳＡ）のＰｒｏｔｅａｎ  ｐａｃｋａｇｅで利用可能である。
【図２Ａ】図１〜７は、それぞれＯＲＦ４０、３８、４４、５２、１１４、４１、および１２４を用いる、実施例１、２、３、７、１３、１６、および１９に関する生化学的データ、ならびに配列解析を示す。Ｍ１およびＭ２は分子量マーカーである。矢印は、ウェスタンブロッティングにおける主要な組換え産物の位置を示すか、または主要なＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ免疫活性バンドの位置を示す。ＴＰは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの総タンパク質抽出物を示す；ＯＭＶは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜ベシクル調製物を示す。殺菌性アッセイの結果において：菱形は、免疫前のデータを示し；三角形は、ＧＳＴコントロールデータを示し；丸は、組換えＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓタンパク質のデータを示す。コンピューター分析は、親水性プロット（上段）、抗原性指標プロット（中段）、およびＡＭＰＨＩ分析（下段）を示す。ＡＭＰＨＩプログラムは、Ｔ細胞エピトープを予測するために使用されており（Ｇａｏら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９６）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒ  １２：５９３；Ｑｕａｋｙｉら（１９９２）Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  補遺  １１：９）、そしてＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（１２２８  Ｓｏｕｔｈ  Ｐａｒｋ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７１５  ＵＳＡ）のＰｒｏｔｅａｎ  ｐａｃｋａｇｅで利用可能である。
【図２Ｂ】図１〜７は、それぞれＯＲＦ４０、３８、４４、５２、１１４、４１、および１２４を用いる、実施例１、２、３、７、１３、１６、および１９に関する生化学的データ、ならびに配列解析を示す。Ｍ１およびＭ２は分子量マーカーである。矢印は、ウェスタンブロッティングにおける主要な組換え産物の位置を示すか、または主要なＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ免疫活性バンドの位置を示す。ＴＰは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの総タンパク質抽出物を示す；ＯＭＶは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜ベシクル調製物を示す。殺菌性アッセイの結果において：菱形は、免疫前のデータを示し；三角形は、ＧＳＴコントロールデータを示し；丸は、組換えＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓタンパク質のデータを示す。コンピューター分析は、親水性プロット（上段）、抗原性指標プロット（中段）、およびＡＭＰＨＩ分析（下段）を示す。ＡＭＰＨＩプログラムは、Ｔ細胞エピトープを予測するために使用されており（Ｇａｏら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９６）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒ  １２：５９３；Ｑｕａｋｙｉら（１９９２）Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  補遺  １１：９）、そしてＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（１２２８  Ｓｏｕｔｈ  Ｐａｒｋ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７１５  ＵＳＡ）のＰｒｏｔｅａｎ  ｐａｃｋａｇｅで利用可能である。
【図２Ｃ】図１〜７は、それぞれＯＲＦ４０、３８、４４、５２、１１４、４１、および１２４を用いる、実施例１、２、３、７、１３、１６、および１９に関する生化学的データ、ならびに配列解析を示す。Ｍ１およびＭ２は分子量マーカーである。矢印は、ウェスタンブロッティングにおける主要な組換え産物の位置を示すか、または主要なＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ免疫活性バンドの位置を示す。ＴＰは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの総タンパク質抽出物を示す；ＯＭＶは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜ベシクル調製物を示す。殺菌性アッセイの結果において：菱形は、免疫前のデータを示し；三角形は、ＧＳＴコントロールデータを示し；丸は、組換えＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓタンパク質のデータを示す。コンピューター分析は、親水性プロット（上段）、抗原性指標プロット（中段）、およびＡＭＰＨＩ分析（下段）を示す。ＡＭＰＨＩプログラムは、Ｔ細胞エピトープを予測するために使用されており（Ｇａｏら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９６）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒ  １２：５９３；Ｑｕａｋｙｉら（１９９２）Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  補遺  １１：９）、そしてＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（１２２８  Ｓｏｕｔｈ  Ｐａｒｋ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７１５  ＵＳＡ）のＰｒｏｔｅａｎ  ｐａｃｋａｇｅで利用可能である。
【図２Ｄ】図１〜７は、それぞれＯＲＦ４０、３８、４４、５２、１１４、４１、および１２４を用いる、実施例１、２、３、７、１３、１６、および１９に関する生化学的データ、ならびに配列解析を示す。Ｍ１およびＭ２は分子量マーカーである。矢印は、ウェスタンブロッティングにおける主要な組換え産物の位置を示すか、または主要なＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ免疫活性バンドの位置を示す。ＴＰは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの総タンパク質抽出物を示す；ＯＭＶは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜ベシクル調製物を示す。殺菌性アッセイの結果において：菱形は、免疫前のデータを示し；三角形は、ＧＳＴコントロールデータを示し；丸は、組換えＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓタンパク質のデータを示す。コンピューター分析は、親水性プロット（上段）、抗原性指標プロット（中段）、およびＡＭＰＨＩ分析（下段）を示す。ＡＭＰＨＩプログラムは、Ｔ細胞エピトープを予測するために使用されており（Ｇａｏら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９６）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒ  １２：５９３；Ｑｕａｋｙｉら（１９９２）Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  補遺  １１：９）、そしてＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（１２２８  Ｓｏｕｔｈ  Ｐａｒｋ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７１５  ＵＳＡ）のＰｒｏｔｅａｎ  ｐａｃｋａｇｅで利用可能である。
【図２Ｅ】図１〜７は、それぞれＯＲＦ４０、３８、４４、５２、１１４、４１、および１２４を用いる、実施例１、２、３、７、１３、１６、および１９に関する生化学的データ、ならびに配列解析を示す。Ｍ１およびＭ２は分子量マーカーである。矢印は、ウェスタンブロッティングにおける主要な組換え産物の位置を示すか、または主要なＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ免疫活性バンドの位置を示す。ＴＰは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの総タンパク質抽出物を示す；ＯＭＶは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜ベシクル調製物を示す。殺菌性アッセイの結果において：菱形は、免疫前のデータを示し；三角形は、ＧＳＴコントロールデータを示し；丸は、組換えＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓタンパク質のデータを示す。コンピューター分析は、親水性プロット（上段）、抗原性指標プロット（中段）、およびＡＭＰＨＩ分析（下段）を示す。ＡＭＰＨＩプログラムは、Ｔ細胞エピトープを予測するために使用されており（Ｇａｏら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９６）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒ  １２：５９３；Ｑｕａｋｙｉら（１９９２）Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  補遺  １１：９）、そしてＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（１２２８  Ｓｏｕｔｈ  Ｐａｒｋ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７１５  ＵＳＡ）のＰｒｏｔｅａｎ  ｐａｃｋａｇｅで利用可能である。
【図３Ａ】図１〜７は、それぞれＯＲＦ４０、３８、４４、５２、１１４、４１、および１２４を用いる、実施例１、２、３、７、１３、１６、および１９に関する生化学的データ、ならびに配列解析を示す。Ｍ１およびＭ２は分子量マーカーである。矢印は、ウェスタンブロッティングにおける主要な組換え産物の位置を示すか、または主要なＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ免疫活性バンドの位置を示す。ＴＰは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの総タンパク質抽出物を示す；ＯＭＶは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜ベシクル調製物を示す。殺菌性アッセイの結果において：菱形は、免疫前のデータを示し；三角形は、ＧＳＴコントロールデータを示し；丸は、組換えＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓタンパク質のデータを示す。コンピューター分析は、親水性プロット（上段）、抗原性指標プロット（中段）、およびＡＭＰＨＩ分析（下段）を示す。ＡＭＰＨＩプログラムは、Ｔ細胞エピトープを予測するために使用されており（Ｇａｏら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９６）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒ  １２：５９３；Ｑｕａｋｙｉら（１９９２）Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  補遺  １１：９）、そしてＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（１２２８  Ｓｏｕｔｈ  Ｐａｒｋ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７１５  ＵＳＡ）のＰｒｏｔｅａｎ  ｐａｃｋａｇｅで利用可能である。
【図３Ｂ】図１〜７は、それぞれＯＲＦ４０、３８、４４、５２、１１４、４１、および１２４を用いる、実施例１、２、３、７、１３、１６、および１９に関する生化学的データ、ならびに配列解析を示す。Ｍ１およびＭ２は分子量マーカーである。矢印は、ウェスタンブロッティングにおける主要な組換え産物の位置を示すか、または主要なＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ免疫活性バンドの位置を示す。ＴＰは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの総タンパク質抽出物を示す；ＯＭＶは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜ベシクル調製物を示す。殺菌性アッセイの結果において：菱形は、免疫前のデータを示し；三角形は、ＧＳＴコントロールデータを示し；丸は、組換えＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓタンパク質のデータを示す。コンピューター分析は、親水性プロット（上段）、抗原性指標プロット（中段）、およびＡＭＰＨＩ分析（下段）を示す。ＡＭＰＨＩプログラムは、Ｔ細胞エピトープを予測するために使用されており（Ｇａｏら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９６）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒ  １２：５９３；Ｑｕａｋｙｉら（１９９２）Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  補遺  １１：９）、そしてＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（１２２８  Ｓｏｕｔｈ  Ｐａｒｋ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７１５  ＵＳＡ）のＰｒｏｔｅａｎ  ｐａｃｋａｇｅで利用可能である。
【図３Ｃ】図１〜７は、それぞれＯＲＦ４０、３８、４４、５２、１１４、４１、および１２４を用いる、実施例１、２、３、７、１３、１６、および１９に関する生化学的データ、ならびに配列解析を示す。Ｍ１およびＭ２は分子量マーカーである。矢印は、ウェスタンブロッティングにおける主要な組換え産物の位置を示すか、または主要なＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ免疫活性バンドの位置を示す。ＴＰは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの総タンパク質抽出物を示す；ＯＭＶは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜ベシクル調製物を示す。殺菌性アッセイの結果において：菱形は、免疫前のデータを示し；三角形は、ＧＳＴコントロールデータを示し；丸は、組換えＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓタンパク質のデータを示す。コンピューター分析は、親水性プロット（上段）、抗原性指標プロット（中段）、およびＡＭＰＨＩ分析（下段）を示す。ＡＭＰＨＩプログラムは、Ｔ細胞エピトープを予測するために使用されており（Ｇａｏら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９６）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒ  １２：５９３；Ｑｕａｋｙｉら（１９９２）Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  補遺  １１：９）、そしてＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（１２２８  Ｓｏｕｔｈ  Ｐａｒｋ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７１５  ＵＳＡ）のＰｒｏｔｅａｎ  ｐａｃｋａｇｅで利用可能である。
【図３Ｄ】図１〜７は、それぞれＯＲＦ４０、３８、４４、５２、１１４、４１、および１２４を用いる、実施例１、２、３、７、１３、１６、および１９に関する生化学的データ、ならびに配列解析を示す。Ｍ１およびＭ２は分子量マーカーである。矢印は、ウェスタンブロッティングにおける主要な組換え産物の位置を示すか、または主要なＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ免疫活性バンドの位置を示す。ＴＰは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの総タンパク質抽出物を示す；ＯＭＶは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜ベシクル調製物を示す。殺菌性アッセイの結果において：菱形は、免疫前のデータを示し；三角形は、ＧＳＴコントロールデータを示し；丸は、組換えＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓタンパク質のデータを示す。コンピューター分析は、親水性プロット（上段）、抗原性指標プロット（中段）、およびＡＭＰＨＩ分析（下段）を示す。ＡＭＰＨＩプログラムは、Ｔ細胞エピトープを予測するために使用されており（Ｇａｏら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９６）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒ  １２：５９３；Ｑｕａｋｙｉら（１９９２）Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  補遺  １１：９）、そしてＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（１２２８  Ｓｏｕｔｈ  Ｐａｒｋ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７１５  ＵＳＡ）のＰｒｏｔｅａｎ  ｐａｃｋａｇｅで利用可能である。
【図４Ａ】図１〜７は、それぞれＯＲＦ４０、３８、４４、５２、１１４、４１、および１２４を用いる、実施例１、２、３、７、１３、１６、および１９に関する生化学的データ、ならびに配列解析を示す。Ｍ１およびＭ２は分子量マーカーである。矢印は、ウェスタンブロッティングにおける主要な組換え産物の位置を示すか、または主要なＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ免疫活性バンドの位置を示す。ＴＰは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの総タンパク質抽出物を示す；ＯＭＶは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜ベシクル調製物を示す。殺菌性アッセイの結果において：菱形は、免疫前のデータを示し；三角形は、ＧＳＴコントロールデータを示し；丸は、組換えＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓタンパク質のデータを示す。コンピューター分析は、親水性プロット（上段）、抗原性指標プロット（中段）、およびＡＭＰＨＩ分析（下段）を示す。ＡＭＰＨＩプログラムは、Ｔ細胞エピトープを予測するために使用されており（Ｇａｏら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９６）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒ  １２：５９３；Ｑｕａｋｙｉら（１９９２）Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  補遺  １１：９）、そしてＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（１２２８  Ｓｏｕｔｈ  Ｐａｒｋ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７１５  ＵＳＡ）のＰｒｏｔｅａｎ  ｐａｃｋａｇｅで利用可能である。
【図４Ｂ】図１〜７は、それぞれＯＲＦ４０、３８、４４、５２、１１４、４１、および１２４を用いる、実施例１、２、３、７、１３、１６、および１９に関する生化学的データ、ならびに配列解析を示す。Ｍ１およびＭ２は分子量マーカーである。矢印は、ウェスタンブロッティングにおける主要な組換え産物の位置を示すか、または主要なＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ免疫活性バンドの位置を示す。ＴＰは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの総タンパク質抽出物を示す；ＯＭＶは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜ベシクル調製物を示す。殺菌性アッセイの結果において：菱形は、免疫前のデータを示し；三角形は、ＧＳＴコントロールデータを示し；丸は、組換えＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓタンパク質のデータを示す。コンピューター分析は、親水性プロット（上段）、抗原性指標プロット（中段）、およびＡＭＰＨＩ分析（下段）を示す。ＡＭＰＨＩプログラムは、Ｔ細胞エピトープを予測するために使用されており（Ｇａｏら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９６）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒ  １２：５９３；Ｑｕａｋｙｉら（１９９２）Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  補遺  １１：９）、そしてＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（１２２８  Ｓｏｕｔｈ  Ｐａｒｋ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７１５  ＵＳＡ）のＰｒｏｔｅａｎ  ｐａｃｋａｇｅで利用可能である。
【図５】図１〜７は、それぞれＯＲＦ４０、３８、４４、５２、１１４、４１、および１２４を用いる、実施例１、２、３、７、１３、１６、および１９に関する生化学的データ、ならびに配列解析を示す。Ｍ１およびＭ２は分子量マーカーである。矢印は、ウェスタンブロッティングにおける主要な組換え産物の位置を示すか、または主要なＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ免疫活性バンドの位置を示す。ＴＰは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの総タンパク質抽出物を示す；ＯＭＶは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜ベシクル調製物を示す。殺菌性アッセイの結果において：菱形は、免疫前のデータを示し；三角形は、ＧＳＴコントロールデータを示し；丸は、組換えＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓタンパク質のデータを示す。コンピューター分析は、親水性プロット（上段）、抗原性指標プロット（中段）、およびＡＭＰＨＩ分析（下段）を示す。ＡＭＰＨＩプログラムは、Ｔ細胞エピトープを予測するために使用されており（Ｇａｏら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９６）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒ  １２：５９３；Ｑｕａｋｙｉら（１９９２）Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  補遺  １１：９）、そしてＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（１２２８  Ｓｏｕｔｈ  Ｐａｒｋ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７１５  ＵＳＡ）のＰｒｏｔｅａｎ  ｐａｃｋａｇｅで利用可能である。
【図６】図１〜７は、それぞれＯＲＦ４０、３８、４４、５２、１１４、４１、および１２４を用いる、実施例１、２、３、７、１３、１６、および１９に関する生化学的データ、ならびに配列解析を示す。Ｍ１およびＭ２は分子量マーカーである。矢印は、ウェスタンブロッティングにおける主要な組換え産物の位置を示すか、または主要なＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ免疫活性バンドの位置を示す。ＴＰは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの総タンパク質抽出物を示す；ＯＭＶは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜ベシクル調製物を示す。殺菌性アッセイの結果において：菱形は、免疫前のデータを示し；三角形は、ＧＳＴコントロールデータを示し；丸は、組換えＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓタンパク質のデータを示す。コンピューター分析は、親水性プロット（上段）、抗原性指標プロット（中段）、およびＡＭＰＨＩ分析（下段）を示す。ＡＭＰＨＩプログラムは、Ｔ細胞エピトープを予測するために使用されており（Ｇａｏら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９６）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒ  １２：５９３；Ｑｕａｋｙｉら（１９９２）Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  補遺  １１：９）、そしてＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（１２２８  Ｓｏｕｔｈ  Ｐａｒｋ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７１５  ＵＳＡ）のＰｒｏｔｅａｎ  ｐａｃｋａｇｅで利用可能である。
【図７】図１〜７は、それぞれＯＲＦ４０、３８、４４、５２、１１４、４１、および１２４を用いる、実施例１、２、３、７、１３、１６、および１９に関する生化学的データ、ならびに配列解析を示す。Ｍ１およびＭ２は分子量マーカーである。矢印は、ウェスタンブロッティングにおける主要な組換え産物の位置を示すか、または主要なＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ免疫活性バンドの位置を示す。ＴＰは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの総タンパク質抽出物を示す；ＯＭＶは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜ベシクル調製物を示す。殺菌性アッセイの結果において：菱形は、免疫前のデータを示し；三角形は、ＧＳＴコントロールデータを示し；丸は、組換えＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓタンパク質のデータを示す。コンピューター分析は、親水性プロット（上段）、抗原性指標プロット（中段）、およびＡＭＰＨＩ分析（下段）を示す。ＡＭＰＨＩプログラムは、Ｔ細胞エピトープを予測するために使用されており（Ｇａｏら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９６）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒ  １２：５９３；Ｑｕａｋｙｉら（１９９２）Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  補遺  １１：９）、そしてＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（１２２８  Ｓｏｕｔｈ  Ｐａｒｋ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７１５  ＵＳＡ）のＰｒｏｔｅａｎ  ｐａｃｋａｇｅで利用可能である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
（概説）
本発明の実施は、特に示されなければ、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ
、および免疫学の従来的な技術を使用し、これらは当該分野の当業者の技術範囲
内である。このような技術は以下の文献で十分説明されている（例えば、Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ  第２版（１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅ
ｓ  Ｉ  ａｎｄ  ｉｉ（Ｄ．Ｎ  Ｇｌｏｖｅｒ編  １９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕ
ｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編  １９８４）；Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓお
よびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編  １９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａ
ｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉ
ｎｓ編  １９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒ
ｅｓｈｎｅｙ編  １９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  
Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐ
ｒａｃｔｉａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１
９８４）；ｔｈｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｓｅｒｉｅ
ｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），特に１５４および１５５巻；
Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  
Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編  １９８７，Ｃ
ｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍａｙｅｒお
よびＷａｌｋｅｒ，編（１９８７），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｓｃｏｐｅｓ，（１９８７）Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒ
ａｃｔｉｃｅ，第２版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．）、および
Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，
Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌ
ｌ編  １９８６）。
【００３３】
ヌクレオチドおよびアミノ酸についての標準的な略語が、本明細書において使
用される。
【００３４】
本明細書中で引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は参考としてそ
の全体が援用される。特に、英国特許出願９８００７６０．２、９８１９０１５
．０、および９８２２１４３．５の内容が本明細書中に援用される。
【００３５】
（定義）
Ｘを含む組成物は、組成物中の全Ｘ＋Ｙの少なくとも８５重量％がＸであると
き、Ｙを「実質的に含まない」。好ましくは、Ｘは、組成物中の全Ｘ＋Ｙの少な
くとも９０重量％を、さらに好ましくは少なくとも約９５重量％または９９重量
％さえを含む。
【００３６】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」お
よび「からなる」を意味する。例えば、Ｘを「含む」組成物は、もっぱらＸから
なり得るか、またはＸ＋ＹのようなＸに付加したものも含み得る。
【００３７】
用語「異種」とは、天然では共に見られない２つの生物学的成分をいう。この
成分は、宿主細胞、遺伝子、調節領域（例えば、プロモーター）であり得る。異
種成分は天然では共に見られないが、遺伝子に対して異種のプロモーターがその
遺伝子に作動可能に連結されるときのように、それらは共に機能し得る。別の例
は、ナイセリア配列がマウス宿主細胞に対して異種であることである。さらなる
例は、天然においてみられない配置で単一タンパク質に組み立てられる同じタン
パク質または異なるタンパク質由来の２つのエピトープである。
【００３８】
「複製起点」とは、発現ベクターのような、ポリヌクレオチドの複製を開始お
よび調節するポリヌクレオチド配列である。複製起点は、細胞内でのポリヌクレ
オチド複製の自律性ユニットとして振る舞い、それ自体の制御下で複製し得る。
複製起点は、ベクターが特定の宿主細胞において複製するために必要であり得る
。特定の複製起点を有せば、発現ベクターは、細胞内の適切なタンパク質の存在
下で高いコピー数で再生され得る。起点の例は、酵母において有効な自律性複製
配列；およびＣＯＳ−７細胞で有効であるウイルスＴ抗原である。
【００３９】
「変異体」配列は、天然の配列または開示された配列とは異なるが配列同一性
を有するＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列またはアミノ酸配列として規定される。特定の
配列に依存して、天然の配列または開示された配列と変異体配列との間の配列同
一性の程度は、好ましくは５０％より大きい（例えば、上記記載のＳｍｉｔｈ−
Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して算出して６０％、７０％、８０％、９
０％、９５％、９９％またはそれ以上）。本明細書中で使用されるように、本明
細書で核酸分子配列が提供される核酸分子、または領域の「対立遺伝子改変体」
は、別のもしくは２番目の単離体のゲノム中の同じ遺伝子座で本質的に生ずる核
酸分子または領域および、例えば、変異または組換えにより生ずる天然変化に起
因して、類似するが、しかし同一でない核酸配列を有する核酸分子、または領域
である。コード領域の対立遺伝子改変体は、代表的には、比較される遺伝子によ
ってコードされるタンパク質の活性と類似した活性を有するタンパク質をコード
する。対立遺伝子改変体はまた、遺伝子の５’または３’非翻訳領域（例えば、
調節制御領域）での変化を含み得る（例えば、米国特許第５，７５３，２３５号
）。
【００４０】
（発現系）
ナイセリアヌクレオチド配列は、種々の異なる発現系；例えば、哺乳動物細胞
、バキュロウイルス、植物、細菌、および酵母と共に使用される発現系において
発現され得る。
【００４１】
（ｉ．哺乳動物系）
哺乳動物発現系は当該分野において公知である。哺乳動物プロモーターは、哺
乳動物ＲＮＡポリメラーゼを結合し得、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子
）のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロ
モーターは、転写開始領域（これはコード配列の５’末端の近位に通常位置する
）およびＴＡＴＡボックス（転写開始部位の２５〜３０塩基対（ｂｐ）上流に通
常位置する）を有する。ＴＡＴＡボックスは、その正しい部位においてＲＮＡポ
リメラーゼＩＩにＲＮＡ合成を開始させるよう指示すると考えられている。哺乳
動物プロモーターはまた、ＴＡＴＡボックスの１００〜２００ｂｐ上流以内に通
常位置する上流プロモーターエレメントを含む。上流プロモーターエレメントは
、転写が開始され、そしていずれかの方向において作用し得る速度を決定する（
Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｎｅｄ
Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版）
哺乳動物ウイルス遺伝子は、しばしば高度に発現され、そして広い宿主範囲を
有する；従って、哺乳動物ウイルス遺伝子をコードする配列は、特に有用なプロ
モーター配列を提供する。例は、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイル
スＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）
、および単純疱疹ウイルスプロモーターを含む。さらに、マウスのメタロチオネ
イン遺伝子のような非ウイルス性遺伝子に由来する配列もまた、有用なプロモー
ター配列を提供する。発現は、構成性であるかまたは調節される（誘導可能）か
のいずれかであり得る、プロモーターに依存して、ホルモン応答性細胞において
グルココルチコイドで誘導され得る。
【００４２】
上記に記載されるプロモーターエレメントと組み合わされるエンハンサーエレ
メント（エンハンサー）の存在は、通常発現レベルを増大させる。エンハンサー
は、相同性プロモーターまたは異種プロモーターに連結されるとき、転写を１０
００倍まで刺激し得る調節ＤＮＡ配列であり、合成は、通常のＲＮＡ開始部位で
開始する。エンハンサーはまた、それらが、通常方向もしくはｆｌｉｐｐｅｄ方
向のいずれかで転写開始部位より上流または下流に、もしくはプロモーターから
１０００ヌクレオチドを超える距離で位置するとき、活性である（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓら（１９８７）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２３７；Ａｌｂｅｒｔｓら（
１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，第
２版）。ウイルス由来のエンハンサーエレメントは、それらは通常、より広い宿
主範囲を有するため、特に有用であり得る。
【００４３】
例としては、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー（Ｄｉｊｋｅｍａら（１９８５
）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：７６１）およびラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ
）に由来するエンハンサー／プロモーター（Ｇｏｒｍａｎら（１９８２ｂ）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９：６７７７）およびヒトサイトメガウ
イルスに由来するエンハンサー／プロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）
Ｃｅｌｌ  ４１：５２１）が挙げられる。さらに、いくつかのエンハンサーは調
節可能であり、そしてホルモンまたは金属イオンのような誘導因子の存在下のみ
で活性になる（Ｓａｓｓｏｎｅ−ＣｏｒｓｉおよびＢｏｒｅｌｌｉ（１９８６）
Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．２：２１５；Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８７）Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ  ２３６：１２３７）。
【００４４】
ＤＮＡ分子は、哺乳動物細胞において細胞内で発現され得る。プロモーター配
列は、組換えタンパク質のＮ末端における最初のアミノ酸が常にＡＴＧ開始コド
ンによりコードされるメチオニンである場合、ＤＮＡ分子と直接連結され得る。
所望される場合、Ｎ末端は、臭化シアンとのインビトロでのインキュベーション
によりタンパク質から切断され得る。
【００４５】
あるいは、外来タンパク質もまた、哺乳動物細胞において外来タンパク質の分
泌を提供するリーダー配列フラグメントで構成される融合タンパク質をコードす
るキメラＤＮＡ分子を作製することにより、細胞から成長培地へ分泌され得る。
好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて切断され得る、リー
ダーフラグメントおよび外来遺伝子との間にコードされるプロセシング部位が存
在する。リーダー配列フラグメントは通常、細胞からのタンパク質の分泌を指示
する疎水性アミノ酸で構成される単一のペプチドをコードする。アデノウイルス
３分割リーダーは、哺乳動物細胞における外来タンパク質の分泌を提供するリー
ダー配列の例である。
【００４６】
通常、哺乳類細胞によって認識される転写終結配列およびポリアデニル化配列
は、翻訳終止コドンの３’側に存在する調節領域であり、従って、プロモーター
エレメントと共に、コード配列に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３’末端は、部位特
異的転写後切断およびポリアデニル化により形成される（Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌら
、（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４１：３４９；ＰｒｏｕｄｆｏｏｔおよびＷｈｉｔｅ
ｌａｗ（１９８８）「Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ３’ｅｎｄ  ｐｒｏｃ
ｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ＲＮＡ．」Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ
ｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＤ．Ｍ．Ｇｌｏ
ｖｅｒ編）；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９８９）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｓｃｉ．１４：１０５）。これらの配列は、ｍＲＮＡの転写を指示し、そのｍＲ
ＮＡは、そのＤＮＡにコードされるポリペプチドに翻訳され得る。転写終結／ポ
リアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０由来のシグナルが挙げられる（Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  
ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．」Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ
）。
【００４７】
通常、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および転写終結配列を含む上
記の構成要素は、発現構築物内に共に導入される。エンハンサー、機能的なスプ
ライス供与部位および受容部位を有するイントロン、ならびにリーダー配列もま
た、所望される場合、発現構築物内に含まれ得る。発現構築物はしばしば、哺乳
類細胞または細菌のような宿主内で安定して維持し得る染色体外エレメント（例
えば、プラスミド）のような、レプリコン内で維持される。哺乳類の複製系とし
ては、複製にトランス作用性の因子を必要とする、動物ウイルス由来の複製系が
挙げられる。例えば、ＳＶ４０（Ｇｌｕｚｍａｍ（１９８１）Ｃｅｌｌ  ２３：
１７５）、またはポリオーマウイルスのようなパポバウイルスの複製系を含むプ
ラスミドは、適切なウイルスのＴ抗原の存在下で極めて高いコピー数で複製する
。哺乳類レプリコンのさらなる例としては、ウシパピローマウイルスおよびエプ
スタイン−バーウイルス由来のレプリコンが挙げられる。さらに、このレプリコ
ンは、二つの複製系を有し得、従って、例えば、発現用の哺乳類細胞内で、なら
びにクローニングおよび増幅用の原核生物の宿主内で、そのレプリコンを維持す
ることが可能である。このような哺乳類−細菌シャトルベクターの例としては、
ｐＭＴ２（Ｋａｕｆｍａｎら．（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：
９４６）およびｐＨＥＢＯ（Ｓｈｉｍｉｚｕら．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ
．Ｂｉｏｌ．６：１０７４）が挙げられる。
【００４８】
使用される形質転換の手順は、形質転換される宿主に依存する。異種のポリヌ
クレオチドの哺乳類細胞への導入方法は、当該分野で公知であり、その方法とし
ては、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブ
レン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション
、リポソーム内でのポリヌクレオチドの封入、およびＤＮＡの核内への直接微量
注入が挙げられる。
【００４９】
発現用宿主として利用可能な哺乳類細胞株は、当該分野で公知であり、そのよ
うな細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細
胞、乳仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞
癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）および多くの他の細胞株を含むが、これらに限
定されない、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔ
ｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）から入手可能な
多くの不死化細胞株が含まれる。
【００５０】
（ｉｉ  バキュロウイルス系）
タンパク質をコードしているポリヌクレオチドはまた、適切な昆虫の発現ベク
ター内に挿入され得、そしてそのベクター内で、制御エレメントに作動可能に連
結される。ベクターの構築には、当該分野で公知の技術を使用する。一般に、そ
の発現系の構成要素として、以下のものが挙げられる：バキュロウイルスゲノム
のフラグメント、および発現させる異種遺伝子の挿入のための簡便な制限部位の
両方を含む転移ベクター（通常は細菌ベクター）；転移ベクター内のバキュロウ
イルスに特異的なフラグメントに相同性のある配列を有する野生型バキュロウイ
ルス（これは、バキュロウイルスゲノム内への異種遺伝子の相同組換えを可能に
する）；ならびに適切な昆虫宿主細胞および生育培地。
【００５１】
転移ベクターにタンパク質をコードするＤＮＡ配列を挿入した後、そのベクタ
ーおよび野生型ウイルスゲノムを、昆虫宿主細胞にトランスフェクトし、そこで
ベクターとウイルスゲノムを組換え可能にする。パッケージングされた組換えウ
イルスは発現され、そして組換えプラークが同定されそして精製される。バキュ
ロウイルス／昆虫細胞発現系の材料および方法は、特に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡからキット形態（「ＭａｘＢａｃ」キット）で市販
される。これらの技術は、一般に当業者に公知であり、そしてＳｕｍｍｅｒｓお
よびＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ
ｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）（以下、
「Ｓｕｍｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ」）に十分に記載されている。
【００５２】
タンパク質をコードするＤＮＡ配列をバキュロウイルスゲノムに挿入するのに
先立って、プロモーター配列、リーダー配列（所望される場合）、目的のコード
配列、および転写終結配列を含む上記の構成要素を、通常、中間転移構築物（転
移ベクター）に構築する。この構築物は、単一の遺伝子および作動可能に連結さ
れた調節エレメント；操作可能に連結された調節エレメントのセットを各々が所
有する複数の遺伝子；あるいは同じ調節エレメントのセットにより調節される複
数の遺伝子を含み得る。中間転移構築物は、しばしば、細菌のような宿主内で安
定的に維持し得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリ
コン内で維持される。レプリコンは、複製系を有しており、従って、それはクロ
ーニングおよび増幅用の適切な宿主内で維持され得る。
【００５３】
現在、外来遺伝子のＡｃＮＰＶへの導入のために最も一般に使用される転移ベ
クターは、ｐＡｃ３７３である。当業者に公知の多くの他のベクターもまた設計
される。これらのベクターとしては、例えば、ｐＶＬ９８５（ポリへドリンの開
始コドンをＡＴＧからＡＴＴに変化させ、そしてそのＡＴＴから３２塩基対下流
に、ＢａｍＨＩクローニング部位を導入する；（ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅ
ｒｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７：３１を参照のこと）が挙げられる。
【００５４】
このプラスミドも通常、ポリへドリンポリアデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅｒ
ら、（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４２：１７７）、お
よび原核生物のアンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子、およびＥ．ｃｏｌｉ．にお
ける選抜ならびに増殖のための複製起点を含む。
【００５５】
バキュロウイルス転移ベクターは通常、バキュロウイルスプロモーターを含む
。バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスＲＮＡポリメラーゼに結
合し、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（５’〜３
’）方向の転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、
コード配列の５’末端に近接して存在する転写開始領域を有する。この転写開始
領域は通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始点を含む。バキュロウ
イルス転移ベクターはまた、エンハンサーと呼ばれる第２のドメインを有し得、
存在する場合は、通常、構造遺伝子に対し遠位にある。発現は調節され得るか、
あるいは構成的であり得る。
【００５６】
ウイルスの感染周期の後期で大量に転写される構造遺伝子は、特に有用なプロ
モーター配列を提供する。例としては、ウイルス多面体タンパク質をコードする
遺伝子（Ｆｒｉｅｓｅｎら、（１９８６）「Ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏ
ｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，」：Ｔｈｅ  
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｗ
ａｌｔｅｒ  Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編）；ＥＰＯ公開番号第１２７８３９号および同
第１５５４７６号；ならびにｐ１０タンパク質をコードする遺伝子（Ｖｌａｋら
，（１９８８），Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７６５）由来の配列が挙げら
れる。
【００５７】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌昆虫タンパク質、あるいはバ
キュロウイルスポリへドリン遺伝子（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら，（１９９８）Ｇｅ
ｎｅ，７３：４０９）のような、分泌バキュロウイルスタンパク質の遺伝子に由
来し得る。あるいは、哺乳類細胞の翻訳後修飾（シグナルペプチド切断、タンパ
ク質分解性切断、およびリン酸化のような）のシグナルは、昆虫細胞に認識され
ると考えられ、そして分泌および核蓄積に必要なシグナルはまた、無脊椎動物細
胞および脊椎動物細胞間で保存されると考えられるために、ヒトインターフェロ
ンα（Ｍａｅｄａら，（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：５９２）；ヒトガ
ストリン放出ペプチド（Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら，（１９８８），
Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３１２９）；ヒトＩＬ−２（Ｓｍｉｔｈ
ら，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：８
４０４）；マウスＩＬ−３（Ｍｉｙａｊｉｍａら，（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５８
：２７３）；およびヒトグルコセレブロシダーゼ（Ｍａｒｔｉｎら，（１９８８
）ＤＮＡ、７：９９）をコードする遺伝子由来のような、非昆虫起源のリーダー
もまた、昆虫での分泌を与えるために使用され得る。
【００５８】
組換えポリペプチドあるいは組換えポリタンパク質は、細胞内に発現され得る
か、あるいは適切な調節配列と共に発現される場合、分泌され得る。非融合の外
来タンパク質の優れた細胞内発現は、通常、ＡＴＧ開始シグナルに先行する適切
な翻訳開始シグナルを含む、短いリーダー配列を完全に有する異種遺伝子が必要
である。所望であれば、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロでの
インキュベーションにより、成熟タンパク質から切断され得る。
【００５９】
あるいは、自然に分泌されない組換えポリタンパク質または組換えタンパク質
は、昆虫において外来タンパク質の分泌を与えるリーダー配列フラグメントを含
む、融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作成することにより、昆虫
細胞から分泌され得る。リーダー配列フラグメントは通常、タンパク質の小胞体
内へのトランスロケーションを指示する疎水性アミノ酸からなるシグナルペプチ
ドをコードしている。
【００６０】
タンパク質の発現産物前駆体をコードするＤＮＡ配列および／または遺伝子の
挿入後、昆虫細胞宿主に、転移ベクターの異種ＤＮＡおよび野生型バキュロウイ
ルスのゲノムＤＮＡを（通常は、同時トランスフェクションによって）同時形質
転換する。構築物のプロモーターおよび転写終結配列は、通常バキュロウイルス
ゲノムの２〜５ｋｂの区域を含む。バキュロウイルスウイルスの望ましい部位に
異種ＤＮＡを導入する方法は、当該分野で公知である（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳ
ｍｉｔｈ、前出；Ｊｕら（１９８７）；Ｓｍｉｔｈら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ
ｏｌ．（１９８３）３：２１５６；ならびにＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ
（１９８９）を参照のこと）。例えば、その挿入は、相同二重交差組換え（ｈｏ
ｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｄｏｕｂｌｅ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔ
ｉｏｎ）により、ポリへドリン遺伝子のような遺伝子内に対してであり得る；挿
入はまた、所望のバキュロウイルス遺伝子に設計された制限酵素部位内に対して
であり得る。Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８９）、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ４；９１。
発現ベクター内のポリへドリン遺伝子の代わりにクローン化される場合のＤＮＡ
配列は、５’側および３’側の両側でポリへドリン特異的配列に隣接し、そして
ポリへドリンプロモーターの下流に配置される。
【００６１】
新規に形成されたバキュロウイルス発現ベクターは続いて、感染性の組換えバ
キュロウイルス内にパッケージングされる。相同組換えは、低い頻度で起こる（
約１％と約５％との間）；それゆえ、同時トランスフェクション後に産生された
ウイルスの大半は、依然として野生型ウイルスである。従って、組換えウイルス
を同定するための方法が必要である。その発現系の利点は、組換えウイルスを区
別し得る可視的スクリーニングである。天然のウイルスにより産生されるポリへ
ドリンタンパク質は、ウイルス感染後の後期で、その感染された細胞の核内で非
常に高いレベルで産生される。蓄積されたポリへドリンタンパク質は、閉塞体を
形成し、またそれは包理された粒子を含む。これらの閉塞体は、最大１５μｍの
大きさで、高度に屈折性であり、明るく輝く外見を与え、容易に光学顕微鏡下で
可視化される。組換えウイルスに感染された細胞は、閉塞体を欠く。組換えウイ
ルスと野生型ウイルスとを区別するために、トランスフェクションの上清を、当
業者に公知の技術により昆虫細胞の単層にプラーク形成させた。すなわち、プラ
ークを、光学顕微鏡下で閉塞体の存在（野性型ウイルスを示す）または非存在（
組換えウイルスを示す）についてスクリーニングする。「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」第２巻（Ａｕｓｕｂｅｌら
編）１６．８（増補１０、１９９０）；ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、前出
；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）。
【００６２】
組換えバキュロウイルス発現ベクターは、いくつかの昆虫細胞への感染用に開
発された。例えば、組換えバキュロウイルスは、特に以下に示すもののために開
発された：Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏ
ｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇ
ａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈ
ｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（ＷＯ８９／０４６６９９；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら，（１
９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６：１５３；Ｗｒｉｇｈｔ（１９８６）Ｎａｔｕｒ
ｅ  ３２１：７１８；Ｓｍｉｔｈら，（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ
．３：２１５６；ならびにおよびＦｒａｓｅｒら，（１９８９）Ｉｎ  Ｖｉｔｒ
ｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５：２２５を一般に参照のこと）。
【００６３】
細胞および細胞培養培地は、バキュロウイルス／発現系における異種ポリペプ
チドの直接発現および融合物発現の両方のために市販される；細胞培養技術は、
一般に当業者に公知である。例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）
を参照のこと。
【００６４】
次いで、改変した昆虫細胞を、適切な栄養培地で増殖し得、このことは、その
改変した昆虫宿主内で存在するプラスミドの安定的維持を可能にする。発現産物
の遺伝子が、誘導性の制御下にある場合、宿主は高密度になるまで増殖され得、
そして発現は誘導され得る。あるいは、発現が構成的である場合、その産物は培
地中に連続的に発現され、そして栄養培地を連続的に循環させながら、目的産物
を取り出し、そして枯渇した栄養を補給しなければならない。その産物は、クロ
マトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー、イオ
ン交換クロマトグラフィーなど）；電気泳動；密度勾配遠心；溶媒抽出などのよ
うな技術により精製され得る。適切な場合、その産物をさらに精製し、必要なら
ば、培地中に分泌された、または昆虫細胞の溶解から生じた任意の昆虫タンパク
質を実質的に除去し、その結果、宿主細片（例えば、タンパク質、脂質および多
糖類）を少なくとも実質的に含まない産物を供給し得る。
【００６５】
タンパク質の発現を得るために、形質転換体に由来する組換え宿主細胞は、組
換えタンパク質をコードする配列の発現を可能にする条件下でインキュベートさ
れる。これらの条件は、選択された宿主細胞に依存して変動する。しかし、その
条件は、当該分野で公知のことに基づいて、当業者に容易に確かめられ得る。
【００６６】
（ｉｉｉ．植物系）
当該分野で公知の多くの植物細胞培養および全植物遺伝子発現系が存在する。
例示的な植物細胞遺伝子発現系としては、米国特許第５，６９３，５０６号；米
国特許第５，６５９，１２２号；および米国特許第５，６０８，１４３号のよう
な特許に記載されるものが挙げられる。植物細胞培養における遺伝子発現の別の
例は、Ｚｅｎｋ，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：３８６１−３８６３（
１９９１）に記載された。植物タンパク質のシグナルペプチドの記載は、上記の
参考文献に加え、以下に示すものの中においても見出され得る：Ｖａｕｌｃｏｍ
ｂｅら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０９：３３−４０（１９８７）；Ｃｈ
ａｎｄｌｅｒら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：４０
７−４１８（１９８４）；Ｒｏｇｅｒｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３
７３１−３７３８（１９８５）；Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎら，Ｇｅｎｅ  ５５：３５
３−３５６（１９８７）；Ｗｈｉｔｔｉｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  
Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：２５１５−２５３５（１９８７）；Ｗｉｒｓｅｌら，
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３：３−１４（１９８９）；
Ｙｕら，Ｇｅｎｅ  １２２：２４７−２５３（１９９２）。植物ホルモン（ジベ
レリン酸およびジベレリン酸により誘導される分泌酵素）による植物遺伝子発現
の調節の記載は、Ｒ．Ｌ．ＪｏｎｅｓおよびＪ．ＭａｃＭｉｌｌｉｎ，Ｇｉｂｂ
ｅｒｅｌｌｉｎｓ：Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｍ
ａｌｃｏｌｍ  Ｂ．Ｗｉｌｋｉｎｓ編、１９８４  Ｐｉｔｍａｎ  Ｐｕｂｌｉｓ
ｈｉｎｇ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，２１−５２頁の中に見出され得る。
他の代謝調節性遺伝子が記載される参考文献は：Ｓｈｅｅｎ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅ
ｌｌ，２：１０２７−１０３８（１９９０）；Ｍａａｓら，ＥＭＢＯ  Ｊ．９：
３４４７−３４５２（１９９０）；ＢｅｎｋｅｌおよびＨｉｃｋｅｙ、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：１３３７−１３３９（１９８７）。
【００６７】
代表的に、当該分野で公知の技術を使用して、所望のポリヌクレオチド配列は
、植物内で操作するために設計された遺伝子調節エレメントを含む発現カセット
の中に挿入される。その発現カセットは、植物宿主内での発現に適切な発現カセ
ットの上流および下流にコンパニオン配列を有する望ましい発現ベクターの中に
挿入される。そのコンパニオン配列は、プラスミドまたはウイルス起源のもので
あり、そしてそのベクターが、細菌のような本来のクローニング宿主から、所望
の植物宿主へとＤＮＡを移動させるために必要とされる特徴をベクターに提供す
る。基本的な細菌／植物ベクター構築物は、好ましくは、広い宿主範囲の原核生
物の複製起点；原核生物の選択マーカー；および、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
の形質転換については、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介移入のためのＴ  ＤＮ
Ａ配列を植物染色体に提供する。異種遺伝子が容易に検出できない場合は、好ま
しくは、その構築物はまた、植物細胞が形質転換されたかどうかを決定するため
に適した選択マーカー遺伝子を有する。適切なマーカーの一般的な総説は、例え
ば、イネ科のメンバーについては、ＷｉｌｍｉｎｋおよびＤｏｎｓ，１９９３，
Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｔｒ，１１（２）：１６５−１８５に見
られる。
【００６８】
植物ゲノムへの異種配列の組み込みを可能にするために適した配列もまた、推
奨される。これらは、相同組換えのためのトランスポゾン配列など、および植物
ゲノム内への異種発現カセットのランダム挿入を可能にするＴｉ配列を含み得る
。適切な原核生物選択マーカーとしては、アンピシリンまたはテトラサイクリン
のような抗生物質に対する耐性が挙げられる。さらなる機能をコードしている他
のＤＮＡ配列もまた、当該分野で公知のように、そのベクターの中に存在し得る
。
【００６９】
本発明の核酸分子は、目的のタンパク質の発現用の発現カセットに含まれ得る
。２つ以上も可能であるが、通常はただ一つの発現カセットである。組換え発現
カセットは、異種タンパク質のコード配列に加え、以下のエレメントを含む：プ
ロモーター領域、植物５’非翻訳配列、構造遺伝子がそれを備えているかどうか
に依存する開始コドン、ならびに転写および翻訳終結配列。そのカセットの５’
末端および３’末端の独特な制限酵素部位は、既存のベクター内への容易な挿入
を可能にする。
【００７０】
異種のコード配列は、本発明に関係する任意のタンパク質のための配列であり
得る。目的のタンパク質をコードする配列は、適切な場合には、そのタンパク質
のプロセシングおよびトランスロケーションを可能にするシグナルペプチドをコ
ードし、そして通常、本発明の所望のタンパク質の膜への結合を生じ得る任意の
配列を欠いている。転写開始領域は、大部分は、発芽中に発現およびトランスロ
ケーションされる遺伝子のためのものであるから、トランスロケーションを与え
るシグナルペプチドを使用することにより、目的のタンパク質のトランスロケー
ションもまた提供し得る。このようにして、目的のタンパク質は、それらが発現
される細胞からトランスロケーションされ、そして効率的に収集され得る。代表
的には、種子における分泌は、種子の胚乳内へ、アリューロン層または胚盤上皮
層を通過する。タンパク質を産生する細胞からそのタンパク質が分泌される必要
はないが、このことは組換えタンパク質の分離および精製を容易にする。
【００７１】
所望の遺伝子産物の最終的な発現が、真核生物細胞におけるものであるために
、クローン化した遺伝子の任意の部分が、宿主のスプライソソーム（ｓｐｌｉｃ
ｏｓｏｍｅ）機構により、プロセシングによりイントロンとして取り出される配
列を含むかどうかを決定することが望ましい。そのような場合、「イントロン」
領域の部位特異的変異誘発は、誤ったイントロンコードとして遺伝情報の一部を
欠失することを防ぐために実施され得る。ＲｅｅｄおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｃ
ｅｌｌ  ４１：９５−１０５、１９８５。
【００７２】
ベクターは、組換えＤＮＡを機械的に転移するためにマイクロピペットを用い
て植物細胞内に直接的に微量注入され得る（Ｃｒｏｓｓｗａｙ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ
．Ｇｅｎｅｔ，２０２：１７９−１８５、１９８５）。遺伝子物質はまた、ポリ
エチレングリコールを用いて植物細胞内に転移され得る（Ｋｒｅｎｓら、Ｎａｔ
ｕｒｅ，２９６、７２−７４、１９８２）。核酸部分の導入の別の方法は、小さ
いビーズまたは微粒子のいずれかのマトリックスの内部に、あるいは表面に核酸
を有する小さな微粒子による高速バリスティック（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）穿通法
である（Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３２７，７０−７３，１９８７ならびに
ＫｎｕｄｓｅｎおよびＭｕｌｌｅｒ，１９９１，Ｐｌａｎｔａ，１８５：３３０
−３３６は、大麦胚乳の粒子の照射（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）によりトランス
ジェニック大麦を作製することを教示している）。さらに別の導入方法は、他の
物体、いずれかのミニ細胞、細胞、リソソームあるいは他の易融な脂肪表面体と
のプロトプラストの融合である（Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，１８５９−１８６３，１９８２）。
【００７３】
ベクターはまた、エレクトロポレーションにより植物細胞内に導入され得る（
Ｆｒｏｍｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５８２
４，１９８５）。この技術において、植物プロトプラストは、遺伝子構築物を含
むプラスミドの存在下でエレクトロポレートされる。高い電界の強さの電気衝撃
により、生体膜を可逆的に通過できるようにし、プラスミドの導入を可能にする
。エレクトロポレートされた植物プロトプラストは細胞壁を再形成し、分裂し、
植物カルス形成する。
【００７４】
プロトプラストが単離され得、そして培養されて完全な再生植物を与え得る全
ての植物は、本発明により形質転換され得、転移した遺伝子を保持する完全な植
物が再生される。実際に、全ての植物は、さとうきび、甜菜、綿、果実および他
の樹木、マメ科植物および野菜の全ての主要な種を含むがそれらに限定されない
培養細胞あるいは組織から再生され得る。いくつかの適応した植物としては、例
えば、以下の属由来の種が挙げられる；Ｆｒａｇａｒｉａ，Ｌｏｔｕｓ，Ｍｅｄ
ｉｃａｇｏ，Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ，Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ，Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌ
ａ，Ｖｉｇｎａ，Ｃｉｔｒｕｓ，Ｌｉｎｕｍ，Ｇｅｒａｎｉｕｍ，Ｍａｎｉｈｏ
ｔ，Ｄａｕｃｕｓ，Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，Ｂｒａｓｓｉｃａ，Ｒａｐｈａｎ
ｕｓ，Ｓｉｎａｐｉｓ，Ａｔｒｏｐａ，Ｃａｐｓｉｃｕｍ，Ｄａｔｕｒａ，Ｈｙ
ｏｓｃｙａｍｕｓ，Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｏｎ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａ，Ｓｏｌａｎ
ｕｍ，Ｐｅｔｕｎｉａ，Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ，Ｍａｊｏｒａｎａ，Ｃｉｃｈｏｒ
ｉｕｍ，Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ，Ｌａｃｔｕｃａ，Ｂｒｏｍｕｓ，Ａｓｐａｒａ
ｇｕｓ，Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ，Ｈｅｒｅｒｏｃａｌｌｉｓ，Ｎｅｍｅｓｉａ
，Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ，Ｐａｎｉｃｕｍ，Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ，Ｒａｎｕ
ｎｃｕｌｕｓ，Ｓｅｎｅｃｉｏ，Ｓａｌｐｉｇｌｏｓｓｉｓ，Ｃｕｃｕｍｉｓ，
Ｂｒｏｗａａｌｉａ，Ｇｌｙｃｉｎｅ，Ｌｏｌｉｕｍ，Ｚｅａ，Ｔｒｉｔｉｃｕ
ｍ，Ｓｏｒｇｈｕｍ，およびＤａｔｕｒａ。
【００７５】
再生のための手法は、植物の種によって変化するが、しかし一般に異種遺伝子
のコピーを含む形質転換されたプロトプラストの懸濁液が最初に提供される。カ
ルス組織が形成され、そしてシュートがカルスから誘導され得、続いて発根され
得る。あるいは、胚形成がプロトプラスト懸濁液から誘導され得る。これらの胚
は、天然の胚として発芽し、植物を形成する。培養培地は、一般に種々のアミノ
酸、ならびにオーキシンおよびサイトカイニンのようなホルモンを含有する。ま
たグルタミン酸およびプロリンを培地に添加することは、特にコーンおよびアル
ファルファのような種にとって有用である。シュートおよび根は通常、同時に発
生する。効果的な再生は培地、遺伝子型、および培養遍歴に依存する。これらの
３つの変数が制御される場合は、再生は十分に再現性がありそして繰り返し可能
である。
【００７６】
いくつかの植物細胞培養系において、本発明の所望のタンパク質は排出され得
、あるいはこのタンパク質は植物全体から抽出され得る。本発明の所望のタンパ
ク質は培地内に分泌される場合、これは回収され得る。あるいは、胚および胚の
ない不完全な種子または他の植物組織は、機械的に破壊され細胞と組織との間の
任意の分泌されたタンパク質を放出し得る。その混合物は緩衝液に懸濁され、可
溶タンパクを回収し得る。次いで、従来のタンパク質単離および精製方法が組換
えタンパク質を精製するために使用される。時間、温度、ｐＨ、酸素、および容
量のパラメーターは、異種タンパク質の適切な発現および回収のために慣用的な
方法により調整される。
【００７７】
（ｉｖ．細菌系）
細菌の発現技術は、当該分野で公知である。細菌のプロモーターは、細菌のＲ
ＮＡポリメラーゼに結合し得、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流
方向（３’方向）へのｍＲＮＡへの転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。
プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に近接して存在する転写開始領域
を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写
開始部位を含む。細菌のプロモーターはまた、オペレーターと呼ばれる第二のド
メインを有し得、ＲＮＡ合成が始まる近接のＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重複
し得る。オペレーターは、遺伝子リプレッサータンパク質が、オペレーターに結
合し、そのため特定の遺伝子の転写を阻害し得るような、負の調節された（誘導
性の）転写を可能にする。構成的発現は、オペレーターのような負の調節エレメ
ントの非存在下で起こり得る。さらに、正の調節は、遺伝子アクチベータータン
パク質結合配列により達成され得、その配列が存在する場合は通常、ＲＮＡポリ
メラーゼ結合配列の（５’）側に近接している。遺伝子アクチベータータンパク
質の例としては、異化活性化タンパク質（ＣＡＰ）があり、それはＥｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）におけるｌａｃオペロンの転写の開始を
助ける（Ｒａｉｂａｕｄら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：
１７３）。調節される発現は、それゆえ正または負のいずれかであり、それによ
り、転写を増強するかまたは低下するかのいずれかをし得る。
【００７８】
代謝経路の酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する
。例としては、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）（Ｃｈａｎｇら．（１９９
７）Ｎａｔｕｒｅ  １９８：１０５６）、およびマルトースのような糖代謝の酵
素由来のプロモーター配列が挙げられる。さらなる例としては、トリプトファン
（ｔｒｐ）（Ｇｏｅｄｄｅｌら．（１９８０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８
：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら．（１９８１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅ
ｓ．９：７３１；米国特許第４，７３８，９２１号；ＥＰ−Ａ−００３６７７６
号およびＥＰ−Ａ−０１２１７７５）のような生合成酵素由来のプロモーター配
列が挙げられる。ｇ−ラクタマーゼ（ｇ−ｌａｏｔａｍａｓｅ）（ｂｌａ）プロ
モーター系（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）「Ｔｈｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ
Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｍｉｓｔａｋｅｓ．」Ｉｎｔｅ
ｒｆｅｒｏｎ３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ編））、バクテリオファージλＰＬ（Ｓｈ
ｉｍａｔａｋｅら．（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１２８）およびＴ５（
米国特許第４，６８９，４０６号）プロモーター系もまた有用なプロモーター配
列を提供する。
【００７９】
さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた、細菌のプロモーターとし
て機能する。例えば、あるバクテリアあるいはバクテリオファージプロモーター
の転写活性化配列は、別のバクテリアあるいはバクテリオファージプロモーター
のオペロン配列と結合し得、合成ハイブリッドプロモーターを形成する。（米国
特許第４，５５１，４３３号）。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｌａｃリプレ
ッサーにより調節されるｔｒｐプロモーター配列およびｌａｃオペロン配列の両
方から構成される、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターである（Ａｍａｎ
ｎら．（１９８３）Ｇｅｎｅ  ２５：１６７；ｄｅ  Ｂｏｅｒら．（１９８３）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２１）。さらに、ある細菌のプ
ロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼに結合し、そして転写を開始させる能
力を有する非細菌起源の天然に存在するプロモーターを含み得る。非細菌起源の
天然に存在するプロモーターはまた、原核生物内でいくらかの遺伝子の高いレベ
ルでの発現を生じるために、適合性のあるＲＮＡポリメラーゼと結合され得る。
バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、連結したプ
ロモーター系の例である（Ｓｔｕｄｉｅｒら．（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．１８９：１１３；Ｔａｂｏｒら．（１９８５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．８２：１０７４）。さらに、ハイブリッドプロモーターはまた、バ
クテリオファージプロモーターおよびＥ．ｃｏｌｉオペレーター領域から構成さ
れ得る（ＥＰＯ−Ａ−０２６７８５１）。
【００８０】
機能性のプロモーター配列に加え、効果的なリボソーム結合部位はまた、原核
生物における外来遺伝子の発現に有用である。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、リボソー
ム結合部位は、シャイン−ダルガノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、そして開始コドン（
ＡＴＧ）および開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流に位置する長さ３〜９ヌ
クレオチドの配列を含む（Ｓｈｉｎｅら．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５４：
３４）。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とＥ．ｃｏｌｉの１６ＳｒＲＮＡの３’側との間
の塩基対形成によりｍＲＮＡのリボソームへの結合を促進すると考えられている
（Ｓｔｅｉｔｚら．（１９７９）「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｉｇｎａｌｓ  ａｎｄ  
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮ
Ａ．」Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐ
ｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ編
））。弱いリボソーム結合部位を有する真核遺伝子および原核遺伝子の発現のた
めには（Ｓａｍｂｒｏｏｋら．（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃ
ｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．」Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）。
【００８１】
ＤＮＡ分子は、細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、直接的にそのＤ
ＮＡ分子と連結され得、この場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸は、常に、ＡＴＧ開
始コドンによりコードされるメチオニンである。所望される場合、Ｎ末端のメチ
オニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーション、あるいは細菌のメチ
オニンＮ末端ペプチダーゼとのインビボまたはインビトロのいずれかでのインキ
ュベーションによりタンパク質から切断され得る（ＥＰＯ−Ａ−０２１９２３７
）。
【００８２】
融合タンパク質は、直接的発現に代わるものを提供する。通常、内在性の細菌
のタンパク質、あるいは他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ
配列は、異種のコード配列の５’末端と融合される。発現の際に、この構築物は
、２つのアミノ酸配列の融合を提供する。例えば、バクテリオファージλ細胞遺
伝子は、外来遺伝子の５’末端と連結し得、そして細菌において発現され得る。
生じた融合タンパク質は、好ましくは、外来遺伝子由来のバクテリオファージタ
ンパク質を切断するためのプロセシング酵素（第Ｘａ因子）用の部位を保持する
（Ｎａｇａｉら．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：８１０）。融合タンパク
質はまた、ｌａｃＺ（Ｊｉａら．（１９８７）Ｇｅｎｅ  ６０：１９７）、ｔｒ
ｐＥ（Ａｌｌｅｎら．（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：９３；Ｍａ
ｋｏｆｆら．（１９８９）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３５：１１）、
およびＣｈｅｙ（ＥＰ−Ａ−０３２４６４７）遺伝子由来の配列を用いて作製さ
れ得る。２つのアミノ酸配列の接合部でのＤＮＡ配列は、切断部位をコードして
もよいし、あるいはコードしなくてもよい。別の例は、ユビキチン融合タンパク
質である。そのような融合タンパク質は、好ましくは、外来タンパク質からユビ
キチンを切断するためのプロセシング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセシ
ングプロテアーゼ）用の部位を保持するユビキチン領域と共に作製され得る。こ
の方法を通して、天然外来タンパク質は単離され得る（Ｍｉｌｌｅｒら．（１９
８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：６９８）。
【００８３】
あるいは、外来タンパク質はまた、細菌における外来タンパク質の分泌を提供
するシグナルペプチド配列フラグメントから構成される、融合タンパク質をコー
ドするキメラＤＮＡ分子を作製することによって、細胞から分泌され得る(米国
特許４，３３６，３３６）。シグナル配列フラグメントは、通常、細胞からのタ
ンパク質の分泌を指向する、疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドを
コードする。このタンパク質は、増殖培地（グラム陽性細菌）、または細胞の内
膜と外膜との間に位置する細胞周辺腔（グラム陰性細菌）のいずれかへ分泌され
る。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る、このシ
グナルペプチドフラグメントと外来遺伝子との間にコードされるプロセシング部
位がある。
【００８４】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ外膜タンパク質遺伝
子（ｏｍｐＡ）（Ｍａｓｕｉら（１９８３）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｔａｌ  Ｍａｎ
ｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｇｈｒａｙｅｂ
ら、（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２４３７）およびＥ．ｃｏｌｉアルカリホ
スファターゼシグナル配列（ｐｈｏＡ）（Ｏｋａら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：７２１２）のような、分泌性細菌タンパク質に
関する遺伝子由来であり得る。さらなる例として、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株由
来のα−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の異種
タンパク質を分泌するために使用され得る（Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ
.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ  ７９：５５８２；ＥＰ−Ａ−０２４４０４
２）。
【００８５】
通常、細菌によって認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンの３’側に位
置する調節領域であり、そして従って、プロモーターとともに、コード配列に隣
接する。これらの配列は、そのＤＮＡによってコードされるポリペプチドへと翻
訳され得るｍＲＮＡの転写を指向する。転写終結配列は、しばしば、転写の終結
を補助するステムループ構造を形成し得る、約５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を
含む。例は、強力なプロモーターを有する遺伝子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒ
ｐ遺伝子および他の生合成遺伝子）由来の転写終結配列を含む。
【００８６】
通常、上記の成分（プロモーター、シグナル配列（もし所望ならば）、目的の
コード配列、および転写終結配列を含む）は、ともに組み立てられて発現構築物
となる。発現構築物は、しばしば、宿主（例えば細菌）における安定な保持が可
能である染色体外エレメント（例えばプラスミド）のような、レプリコンに保持
される。このレプリコンは複製系を有し、従って、このことが、発現またはクロ
ーニングおよび増幅のいずれかのために、レプリコンが原核生物宿主において保
持されることを可能にする。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミドまた
は低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般
に約５〜約２００、そして通常約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有する。高
コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは少なくとも約１０個、そしてより
好ましくは少なくとも約２０個のプラスミドを含む。高コピー数ベクターまたは
低コピー数ベクターのいずれかが選択され得、それは、宿主に対するベクターお
よび外来タンパク質の効果に依存する。
【００８７】
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて、細菌のゲノムへ組み込
まれ得る。組み込みベクターは、通常、ベクターが組み込むのを可能にする、細
菌の染色体と相同な少なくとも１つの配列を含む。組み込みは、ベクターにおけ
る相同なＤＮＡと細菌の染色体との間の組換えから生じるようである。例えば、
種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株からのＤＮＡによって構築される組み込みベクターは
、Ｂａｃｉｌｌｕｓ染色体に組み込まれる（ＥＰ−Ａ−０  １２７  ３２８）。
組み込みベクターはまた、バクテリオファージまたはトランスポゾン配列から構
成され得る。
【００８８】
通常、染色体外発現構築物および組み込み発現構築物は、選択マーカーを含ん
で、形質転換された細菌株の選択を可能にし得る。選択マーカーは、細菌宿主に
おいて発現され得、そして細菌が薬物（例えば、アンピシリン、クロラムフェニ
コール、エリスロマイシン、カナマイシン（ネオマイシン）、およびテトラサイ
クリン）に耐性になるようにする遺伝子を含み得る（Ｄａｖｉｅｓら（１９７８
）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：４６９）。選択マーカーはま
た、ヒスチジン、トリプトファン、およびロイシンの生合成経路における生合成
遺伝子のような、生合成遺伝子を含み得る。
【００８９】
あるいは、上記の成分のいくつかは、形質転換ベクターにおいてともに組み立
てられ得る。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコンにおいて保
持されるか、または組み込みベクターへと開発されるかのいずれかの選択マーカ
ー（ｍａｒｋｅｔ）から構成され得る。
【００９０】
発現ベクターまたは形質転換ベクターは、染色体外レプリコンまたは組み込み
ベクターのいずれも、多くの細菌への形質転換のために開発されてきた。例えば
、発現ベクターは、とりわけ、以下の細菌のために開発されてきた：Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：５５８２；ＥＰ−Ａ−０  ０３６  ２５９およ
びＥＰ−Ａ−０  ０６３  ９５３；ＷＯ  ８４／０４５４１）、Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２
：１２８；Ａｍａｎｎら（１９８５）Ｇｅｎｅ  ４０：１８３；Ｓｔｕｄｉｅｒ
ら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；ＥＰ−Ａ−０  ０３６
７７６、ＥＰ−Ａ−０  １３６  ８２９およびＥＰ−Ａ−０  １３６  ９０７
）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｅｍｏｒｉｓ（Ｐｏｗｅｌｌら（１９８
８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５）；Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ（Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐ
ｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ（米国特許４，７４５，０５６）。
【００９１】
外来ＤＮＡを細菌宿主へ導入する方法は、当該分野において周知であり、そし
て通常、ＣａＣｌ2または他の薬剤（例えば、２価の陽イオンおよびＤＭＳＯ）
のいずれかで処理された細菌の形質転換を含む。ＤＮＡはまた、エレクトロポレ
ーションによって、細菌細胞へ導入され得る。形質転換の手順は、通常、形質転
換される細菌の種によって変化する。例えば以下を参照のこと：（Ｍａｓｓｏｎ
ら（１９８９）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６０：２７３；Ｐａ
ｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：
５５８２；ＥＰ−Ａ−０  ０３６  ２５９およびＥＰ−Ａ−０６３  ９５３；Ｗ
Ｏ  ８４／０４５４１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８５６；Ｗａｎｇら（１９９０）
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：９４９、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、（
Ｃｏｈｅｎら（１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９：２１
１０；Ｄｏｗｅｒら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：
６１２７；Ｋｕｓｈｎｅｒ（１９７８）「ＣｏｌＥ１由来のプラスミドによるＥ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの形質転換のための改良された方法」Ｇｅｎｅ
ｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉ
ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｈ．Ｗ．ＢｏｙｅｒおよびＳ．Ｎｉｃｏｓｉａ編）；Ｍａ
ｎｄｅｌら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：１５９；Ｔａｋｅｔｏ（
１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９４９：３１８；Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、（Ｃｈａｓｓｙら（１９８７）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．４４：１７３  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）；（Ｆｉｅｄ
ｌｅｒら（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １７０：３８、Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ）；（Ａｕｇｕｓｔｉｎら（１９９０）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．Ｌｅｔｔ．６６：２０３、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、（Ｂａｒａｎ
ｙら（１９８０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４４：６９８；Ｈａｒｌａｎｄｅ
ｒ（１９８７）「エレクトロポレーションによるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  
ｌａｃｔｉｓの形質転換」Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊ
．ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＲ．Ｃｕｒｔｉｓｓ  ＩＩＩ編）；Ｐｅｒｒｙら（１
９８１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５；Ｐｏｗｅｌｌら（１９８
８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５；Ｓｏｍｋ
ｕｔｉら（１９８７）Ｐｒｏｃ．４ｔｈ  Ｅｖｒ．Ｃｏｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ  １：４１２、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）。
【００９２】
（ｖ．酵母発現）
酵母発現系もまた、当業者に公知である。酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポ
リメラーゼに結合可能であり、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）からｍ
ＲＮＡへの下流の（３’側の）転写を開始し得る、任意のＤＮＡ配列である。プ
ロモーターは、通常、コード配列の５’末端の近位に位置する転写開始領域を有
する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（「ＴＡＴＡボ
ックス」）および転写開始部位を含む。酵母プロモーターはまた、上流アクチベ
ーター配列（ＵＡＳ）と呼ばれる第２のドメインを有し得、これは、もし存在す
るならば、通常、構造遺伝子とは遠位である。このＵＡＳは、調節される（誘導
できる）発現を可能にする。構成的発現は、ＵＡＳの非存在下で生じる。調節さ
れる発現は、正または負のいずれかであり得、それによって転写を増加させるか
または減少させるかのいずれかであり得る。
【００９３】
酵母は、活性な代謝経路を有する発酵性微生物であり、従って、代謝経路にお
ける酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例とし
ては、以下が挙げられる：アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（ＥＰ−Ａ−
０  ２８４  ０４４）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸
イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまた
はＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセ
リン酸ムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（ＥＰＯ−Ａ−０  ３２
９  ２０３）。酵母ＰＨＯ５遺伝子はまた、酸性ホスファターゼをコードし、有
用なプロモーター配列を提供する（Ｍｙａｎｏｈａｒａら（１９８３）Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：１）。
【００９４】
さらに、天然には生じない合成プロモーターもまた、酵母のプロモーターとし
て機能する。例えば、ある１つの酵母プロモーターのＵＡＳ配列は、別の酵母プ
ロモーターの転写活性化領域と連結され得、合成ハイブリッドプロモーターを生
成し得る。このようなハイブリッドプロモーターの例は、ＧＡＰ転写活性化領域
と連結されるＡＤＨ調節配列（米国特許第４，８７６，１９７号および同第４，
８８０，７３４号）を含む。ハイブリッドプロモーターの他の例は、ＡＤＨ２、
ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、またはＰＨＯ５遺伝子のいずれかの調節配列からなり、
ＧＡＰまたはＰｙＫ（ＥＰ−Ａ−０  １６４  ５５６）のような解糖酵素遺伝子
の転写活性化領域に結合されているプロモーターを含む。さらに、酵母プロモー
ターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼと結合し、そして転写を開始する能力を有する
、天然に生じる非酵母起源のプロモーターを含み得る。このようなプロモーター
の例としては、とりわけ、以下が挙げられる：（Ｃｏｈｅｎら、（１９８０）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：１０７８；Ｈｅｎｉｋｏ
ｆｆら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２８３：８３５；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（
１９８１）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９
６：１１９；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９７９）「酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける細菌の抗生物質耐性遺伝子の発現」、Ｐ
ｌａｓｍｉｄｓ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ
Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ（Ｋ．Ｎ．Ｔｉｍｍｉｓおよび
Ａ．Ｐｕｈｌｅｒ編）；Ｍｅｒｃｅｒａｕ−Ｐｕｉｇａｌｏｎら（１９８０）Ｇ
ｅｎｅ  １１：１６３；Ｐａｎｔｈｉｅｒら（１９８０）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ
．２：１０９；）。
【００９５】
ＤＮＡ分子は、酵母において、細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、
ＤＮＡ分子と直接連結され得、その場合、組換えタンパク質のＮ末端にある最初
のアミノ酸は常にＡＴＧ開始コドンによってコードされているメチオニンである
。もし所望ならば、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュ
ベーションによって、タンパク質から切断され得る。
【００９６】
融合タンパク質は、酵母発現系について、ならびに哺乳動物、バキュロウイル
ス、および細菌の発現系において、代替物を提供する。通常、内因性酵母タンパ
ク質、または他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列は、異
種コード配列の５’末端に融合される。発現において、この構築物は、２つのア
ミノ酸配列の融合物を提供する。例えば、酵母またはヒトのスーパーオキシドジ
スムターゼ（ＳＯＤ）遺伝子は、外来遺伝子の５’末端に連結され、そして酵母
において発現し得る。２つのアミノ酸配列の連結部にあるＤＮＡ配列は、切断部
位をコードしてもよいし、コードしなくてもよい。例えば、ＥＰ−Ａ−０  １９
６  ０５６を参照のこと。別の例はユビキチン融合タンパク質である。このよう
な融合タンパク質は、外来タンパク質からユビキチンを切断するプロセシング酵
素（例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ）のための部位を好ま
しくは保持する、ユビキチン領域を伴って作製される。従って、この方法を通じ
て、ネイティブな融合タンパク質は、単離され得る（例えば、ＷＯ８８／０２４
０６６）。
【００９７】
あるいは、外来タンパク質はまた、酵母における外来タンパク質の分泌を提供
する、リーダー配列フラグメントから構成される融合タンパク質をコードする、
キメラＤＮＡ分子を作製することによって、細胞から増殖培地へ分泌され得る。
好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る、リーダーフ
ラグメントと外来遺伝子との間にコードされるプロセシング部位が存在する。リ
ーダー配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を指向する、疎
水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドをコードする。
【００９８】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌性酵母タンパク質に関する遺
伝子由来であり得、その遺伝子は例えば、酵母インベルターゼ遺伝子（ＥＰ−Ａ
−０  ０１２  ８７３；ＪＰＯ．６２，０９６，０８６）およびＡ因子遺伝子（
米国特許第４，５８８，６８４号）である。あるいは、インターフェロンリーダ
ーのような、酵母における分泌もまた提供する、非酵母起源のリーダーが存在す
る（ＥＰ−Ａ−０  ０６０  ０５７）。
【００９９】
好ましいクラスの分泌リーダーは、酵母α因子遺伝子のフラグメントを使用す
るリーダーであり、これは「プレ」シグナル配列、および「プロ」領域の両方を
含む。用いられ得るこの型のα因子フラグメントは、完全長の、プレプロα因子
リーダー(約８３アミノ酸残基）ならびに短縮されたα因子リーダー（通常約２
５〜約５０アミノ酸残基）を含む（米国特許第４，５４６，０８３号および同第
４，８７０，００８号；ＥＰ−Ａ−０  ３２４  ２７４）。分泌を提供するα因
子リーダーフラグメントを使用するさらなるリーダーは、第１の酵母のプレ配列
を有するが、第２の酵母α因子からのプロ領域を有さないで作製される、ハイブ
リッドα因子リーダーを含む（例えば、ＷＯ８９／０２４６３を参照のこと）。
【０１００】
通常、酵母によって認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンの３’側に位
置する調節領域であり、そして従って、プロモーターと共にコード配列に隣接す
る。これらの配列は、そのＤＮＡによってコードされるポリペプチドへと翻訳さ
れ得る、ｍＲＮＡの転写を指向する。転写終結配列および他の酵母に認識される
終結配列の例は、例えば、解糖酵素をコードする転写終結配列である。
【０１０１】
通常、上記の成分（プロモーター、リーダー（もし所望であれば）、目的のコ
ード配列、および転写終結配列を含む）は、組み立てられて発現構築物になる。
発現構築物は、宿主（例えば、酵母または細菌）において安定に保持され得る染
色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコンにおいてしばし
ば保持される。このレプリコンは、２つの複製系を有し得、従って、レプリコン
が、例えば、発現のために酵母において、ならびにクローニングおよび増幅のた
めに原核生物宿主において保持されることを可能にする。このような酵母−細菌
シャトルベクターの例としては、以下が挙げられる：ＹＥｐ２４（Ｂｏｔｓｔｅ
ｉｎら（１９７９）Ｇｅｎｅ  ８：１７〜２４）、ｐＣｌ／１（Ｂｒａｋｅら（
１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：４６４２〜
４６４６）、およびＹＲｐ１７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら（１９８２）Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．１５８：１５７）。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミ
ドまたは低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは
、一般に約５〜約２００、そして通常約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有す
る。高コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは少なくとも約１０個、そし
てより好ましくは少なくとも約２０個を有する。高コピー数ベクターまたは低コ
ピー数ベクターのいずれかが選択され得、それは、宿主に対するベクターおよび
外来タンパク質の効果に依存する。例えば、Ｂｒａｋｅら、前出を参照のこと。
【０１０２】
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて、酵母のゲノムへ組み込
まれ得る。組み込みベクターは、通常、ベクターが組み込むのを可能にする、酵
母の染色体に相同な少なくとも１つの配列を含み、そして好ましくは、発現構築
物に隣接する２つの相同配列を含む。組み込みは、ベクターにおける相同なＤＮ
Ａと酵母の染色体との間の組換えから生じるようである（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒ
ら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：２２８〜２４
５）。組み込みベクターは、そのベクター中に含有するために適切な相同配列を
選択することによって、酵母における特定の遺伝子座に指向され得る。Ｏｒｒ−
Ｗｅａｖｅｒら、前出を参照のこと。１つ以上の発現構築物が組み込まれ得、産
生される組換えタンパク質のレベルにおそらく影響を与え得る（Ｒｉｎｅら（１
９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：６７５０）。
ベクターに含まれる染色体配列は、ベクターにおける単一セグメント（これは、
ベクター全体の組み込みを生じる）、または染色体における隣接セグメントに相
同でかつベクターにおける発現構築物に隣接する２つのセグメント（これは、発
現構築物のみの安定した組み込みを生じ得る）のいずれかとして生じ得る。
【０１０３】
通常、染色体外発現構築物および組み込み発現構築物は、選択マーカーを含み
得、形質転換された酵母株の選択を可能にする。選択マーカーは、酵母宿主にお
いて発現され得る生合成遺伝子を含み得、それは例えば、ＡＤＥ２、ＨＩＳ４、
ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、およびＡＬＧ７、ならびにＧ４１８耐性遺伝子であり、そ
れぞれ、酵母細胞においてツニカマイシンおよびＧ４１８に対して耐性を与える
。さらに、適切な選択マーカーはまた、金属のような毒性化合物の存在下におい
て増殖する能力を、酵母に提供し得る。例えば、ＣＵＰ１の存在は、酵母が、銅
イオンの存在下において増殖することを可能にする（Ｂｕｔｔら（１９８７）Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５１：３５１）。
【０１０４】
あるいは、上記成分のうちのいくつかは、組み立てられて形質転換ベクターに
なり得る。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコンにおいて保持
されるか、または組み込みベクターに開発されるかのいずれかである、選択マー
カーから構成される。
【０１０５】
発現ベクターおよび形質転換ベクターは、染色体外レプリコンまたは組み込み
ベクターのいずれかであり、多くの酵母への形質転換のために開発されてきた。
例えば、発現ベクターは、とりわけ、以下の酵母のために開発されてきた：Ｃａ
ｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．６：１４２）、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ（Ｋｕｎｚｅら（１
９８５）Ｊ.Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１）、Ｈａｎｓｅｎ
ｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６）Ｍ
ｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  
ｆｒａｇｉｌｉｓ（Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１
１６５）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ（Ｄｅ  Ｌｏｕｖｅｎｃ
ｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：７３７；Ｖａｎ  ｄ
ｅｎ  Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：１３５）、
Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．
Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１）、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏ
ｒｉｓ（Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６
；米国特許第４，８３７，１４８号および同第４，９２９，５５５号）、Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１９２９；Ｉｔｏら（１
９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ（１９８１）Ｎａ
ｔｕｒｅ  ３００：７０６）、およびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ
（Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３８０４７１；
Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９）。
【０１０６】
外来ＤＮＡを酵母宿主へ導入する方法は、当該分野において周知であり、そし
て通常、スフェロプラストの、またはアルカリ陽イオンで処置された無傷の酵母
細胞のいずれかの形質転換を含む。形質転換の手順は、通常、形質転換される酵
母の種によって変化する。例えば以下を参照のこと：（Ｋｕｒｔｚら（１９８６
）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２；Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂ
ａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１；Ｃａｎｄｉｄａ）；（Ｇｌｅｅ
ｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９；Ｒ
ｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０
２；Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）；（Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
１５８：１１６５；Ｄｅ  Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．１５４：１１６５；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉ
ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：１３５；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）；（Ｃ
ｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６；Ｋｕｎｚ
ｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１；米国特
許第４，８３７，１４８号および同第４，９２９，５５５号；Ｐｉｃｈｉａ）；
（Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７５：１９２９；Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１
６３  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）；（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ（１９８
１）Ｎａｔｕｒｅ  ３００：７０６；Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
）；（Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３９；Ｇａ
ｉｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９；Ｙａｒｒ
ｏｗｉａ）。
【０１０７】
（抗体）
本明細書中で使用される場合に、用語「抗体」とは、少なくとも１つの抗体結
合部位から構成されるポリペプチドまたはポリペプチド群をいう。「抗体結合部
位」は、抗原のエピトープの特徴に相補的な内部表面形状および電荷分布を有す
る、３次元結合空間であり、これが、抗体と抗原の結合を可能にする。「抗体」
は、例えば、脊椎動物抗体、ハイブリッド抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、変化
した抗体、一価抗体、Ｆａｂタンパク質、および単一ドメイン抗体を含む。
【０１０８】
本発明のタンパク質に対する抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、免
疫アッセイ、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａのタンパク質の識別／同定に有用である
。
【０１０９】
本発明のタンパク質に対する抗体（ポリクローナルおよびモノクローナルの両
方）は、従来の方法によって調製され得る。一般に、タンパク質は、最初に、適
切な動物、好ましくはマウス、ラット、ウサギ、またはヤギを免疫するために使
用される。ウサギおよびヤギは、得られ得る血清の容量、および標識された抗ウ
サギ抗体および抗ヤギ抗体の入手可能性に起因して、ポリクローナル血清の調製
のために好ましい。免疫は、一般的に、タンパク質を生理食塩水（好ましくはフ
ロイント完全アジュバントのようなアジュバント）に混合または乳化し、そして
混合物または乳化物を非経口的に（一般的に皮下、または筋肉内に）注射するこ
とによって、行われる。５０〜２００μｇ／注射の用量が、代表的に十分である
。免疫は、一般的に、２〜６週後に生理食塩水（好ましくはフロイント不完全ア
ジュバントを用いて）中のタンパク質の１回以上の注射でブーストされる。ある
いは、当該分野において公知の方法を使用するインビトロ免疫によって抗体を産
生し得る。これは、本発明の目的にとっては、インビボ免疫に等しいと考えられ
る。ポリクローナル抗血清は、免疫された動物からガラスまたはプラスチック製
容器へ採血し、その血液を２５℃で１時間インキュベートし、その後４℃で２〜
１８時間インキュベートすることによって得られる。この血清は、遠心分離（例
えば１，０００ｇ、１０分間）によって回収される。ウサギから、１回の採血に
つき約２０〜５０ｍｌが得られ得る。
【０１１０】
モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ
（１９７５）２５６：４９５〜９６）の標準的方法、またはその改変版を使用し
て調製される。代表的には、マウスまたはラットが、上記のように免疫される。
しかし、血清を抽出するために動物から採血するよりも、脾臓（および必要に応
じていくつかの大きなリンパ節）が取り出され、そして単細胞へ解離される。も
し所望ならば、脾臓細胞は、（非特異的付着細胞の回収後）細胞懸濁液をタンパ
ク質抗原でコーティングされたプレートまたはウェルへアプライすることによっ
て、スクリーニングされ得る。この抗原に特異的な膜結合免疫グロブリンを発現
するＢ細胞は、このプレートに結合し、そして残りの懸濁液によって、洗い落と
されない。生じるＢ細胞、または全ての解離された脾臓細胞は、次に骨髄腫細胞
と融合するように誘導されてハイブリドーマを形成し、そして選択培地（例えば
ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地、「ＨＡＴ」）において培養さ
れる。生じるハイブリドーマは、限界希釈によってプレーティングされ、そして
免疫する抗原に対して特異的に結合する（かつ関連しない抗原に結合しない）抗
体の産生についてアッセイされる。選択されるＭＡｂ分泌ハイブリドーマは、次
にインビトロ（例えば、組織培養瓶または中空繊維リアクター中で）、またはイ
ンビボ（マウスにおける腹水として）のいずれかで培養される。
【０１１１】
もし所望ならば、抗体は（ポリクローナルまたはモノクローナルいずれであっ
ても）、従来技術を使用して標識され得る。適切な標識としては、以下が挙げら
れる：発蛍光団、発色団、放射性原子（特に32Ｐおよび125Ｉ）、電子密度試薬
、酵素、および特異的結合パートナーを有するリガンド。酵素は、代表的に、そ
の活性によって検出される。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼは、通常、３
，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を青い色素（分光光度計
を用いて定量可能）へ変換するその能力によって、検出される。「特異的結合パ
ートナー」とは、高い特異性でリガンド分子に結合し得るタンパク質をいい、例
えば抗原およびそれに特異的なモノクローナル抗体の場合である。他の特異的結
合パートナーは、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧお
よびプロテインＡ、ならびに当該分野において公知の多くのレセプター−リガン
ド対を含む。同じ標識がいくつかの異なる様式で働き得るので、以上の記載が、
種々の標識を別個のクラスへ分類することを意味しないことは、理解されるべき
である。例えば、125Ｉは、放射性標識として、または電子密度試薬として働き
得る。ＨＲＰは、酵素として、またはＭＡｂについての抗原として働き得る。さ
らに、所望の効果のために、種々の標識を組合せ得る。例えば、ＭＡｂおよびア
ビジンはまた、本発明の実施において、標識を必要とする。従って、ＭＡｂをビ
オチンで標識して、そして125Ｉで標識したアビジン、またはＨＲＰで標識した
抗ビオチンＭＡｂで、その存在を検出し得る。他の置換および可能性は、当業者
に容易に明らかであり、そして本発明の範囲内に等しいと考えられる。
【０１１２】
（薬学的組成物）
薬学的組成物は、本発明のポリペプチド、抗体または核酸のいずれかを含み得
る。この薬学的組成物は、治療上有効な量の、本願発明のポリペプチド、抗体、
またはポリヌクレオチドのいずれかを含む。
【０１１３】
本明細書において使用される用語「治療上有効な量」とは、所望の疾患または
状態を処置、改善、または予防するための治療薬剤の量、または、検出可能な治
療効果または予防効果を示すための治療薬剤の量をいう。この効果は、例えば、
キメラマーカーまたは抗原レベルによって検出され得る。治療効果はまた、体温
低下のような、身体の症状における減少を含む。被験体に関する正確な有効量は
、被験体の大きさおよび健康、状態の性質および程度、および投与のために選択
される治療または治療の組合せに依存する。従って、あらかじめ正確な有効量を
特定することは有用ではない。しかし、所定状況のための有効量は、慣用的な実
験によって決定され得、そして臨床医の判断内である。
【０１１４】
本発明の目的のために、有効な用量は、ＤＮＡ構築物が投与される個体におい
て、ＤＮＡ構築物の約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇまたは０．０５ｍｇ
／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。
【０１１５】
薬学的組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。用語「薬学的
に受容可能なキャリア」とは、抗体またはポリペプチド、遺伝子、および他の治
療薬剤のような治療薬剤の投与のための、キャリアをいう。この用語は、この組
成物を受け取る個体に有害な抗体の産生をそれ自体誘導しない、任意の薬学的キ
ャリアをいい、そして、過度の毒性を伴わずに投与され得る。適切なキャリアは
、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コ
ポリマー、および不活性ウイルス粒子のように、大きく、緩徐に代謝される高分
子であり得る。このようなキャリアは、当業者に周知である。
【０１１６】
薬学的に受容可能な塩が、その中で使用され得る。例えば、塩酸塩、臭化水素
塩、リン酸塩、硫酸塩などのような鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マ
ロン酸塩、安息香酸塩などのような有機酸の塩である。薬学的に受容可能な賦形
剤の徹底的な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．１９９１）にて利用
可能である。
【０１１７】
治療組成物における薬学的に受容可能なキャリアは、水、生理食塩水、グリセ
ロールおよびエタノールのような液体を含み得る。さらに、湿潤剤または乳化剤
、ｐＨ緩衝物質などのような補助物質が、このようなビヒクルに存在し得る。代
表的には、治療組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかの、注射可能物質と
して調製される；注射前に液体ビヒクルに溶解または懸濁するのに適切な固体形
態もまた、調製され得る。リポソームは、薬学的に受容可能なキャリアの定義中
に含まれる。
【０１１８】
（送達方法）
一旦処方されると、本発明の組成物は、その被験体へ直接投与され得る。処置
される被験体は、動物であり得；特に、ヒト被験体が処置され得る。
【０１１９】
その組成物直接送達は、一般的に、皮下的に、腹腔内に、静脈内に、または筋
内のいずれかでの注入によって達成されるか、あるいは、組織の間隙空間へ送達
される。この組成物はまた、病巣へ投与され得る。他の投与様式には、経口投与
、および肺投与、坐剤、および経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）適用または経皮
（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）適用（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照
のこと）、針、および遺伝子銃またはハイポスプレー（ｈｙｐｏｓｐｒａｙ）が
含まれる。投薬処置は、単回用量スケジュール、または多数回用量スケジュール
であり得る。
【０１２０】
（ワクチン）
本発明に従うワクチンは、予防用（すなわち、感染を予防するため）または治
療用（すなわち、感染後の疾患を処置するため）のいずれかであり得る。
【０１２１】
このようなワクチンは、免疫抗原、免疫原、ポリペプチド、タンパク質または
核酸を、通常「薬学的に受容可能なキャリア」との組み合わせにおいて含み、こ
れは、キャリア自体は、その組成物を受ける個体に有害である抗体の産生を誘発
しない任意のキャリアを含む。適切なキャリアは、代表的に、大きく、緩徐に代
謝される高分子（例えば、タンパク質、ポリサッカリド、ポリ乳酸、ポリグリコ
ール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物（例えば、油小滴また
はリポソーム）、および不活性ウイルス粒子である。このようなキャリアは、当
業者に周知である。さらに、これらのキャリアは免疫刺激薬剤（「アジュバント
」）として機能し得る。さらに、この抗原または免疫原は、細菌毒素（例えば、
ジフテリア、破傷風、コレラ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉなどの病原因子からの毒素）と
結合体化され得る。
【０１２２】
この組成物の効力を増強するために好ましいアジュバントは、（１）アルミニ
ウム塩（「ミョウバン」）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム
、硫酸アルミニウムなど）、（２）水中油乳剤処方物（他の特定の免疫刺激薬剤
（例えば、ムラミルペプチド（以下を参照のこと）または細菌細胞壁成分）を伴
うか伴わない）を包含するが、それらに限定されず、例えば、以下：（ａ）５％
スクアレン、０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、および０．５％  Ｓｐａｎ８５（必
要に応じて、種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（以下を参照のこと）を含有するが、必要
ではない）を含み、モデル１１０Ｙ微小流体化器（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ
、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）のような微小流体化器を用いてμ未満の粒子へと処方さ
れたＭＦ５９TM（ＷＯ９０／１４８３７；Ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ：ｔｈ
ｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｐｏｗｅ
ｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５の第１０章）
；（ｂ）μ未満のエマルジョンへと微小流体化されたか、またはボルテックスし
て、より大きな粒子径エマルジョンを生成したかのいずれかである、１０％スク
アレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１
、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照のこと）を含有するＳＡＦ、ならびに（ｃ
）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、およびモノホスホリピドＡ（ＭＰ
Ｌ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）。好
ましくはＭＰＬおよびＣＷＳ（ＤｅｔｏｘTM）からなる群由来の１つ以上の細菌
細胞壁成分を含むＲｉｂｉTMアジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕ
ｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）；（３）サポニンアジュバント（例え
ば、ＳｔｉｍｕｌｏｎTM）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏ
ｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）を使用し得るか、またはそれから粒子（例えば、ＩＳＣ
ＯＭ（免疫刺激性複合体）を生成し得る；（４）完全フロイントアジュバント（
ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン
（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−
５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、γイ
ンターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死
因子（ＴＮＦ）など；および（６）その組成物の効力を増強するための免疫刺激
因子として作用する他の物質を包含するがそれらに限定されない。ミョウバンお
よびＭＦ５９TMが好ましい。
【０１２３】
上記で言及したように、ムラミルペプチドは、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−
スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラ
ミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラ
ミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’
−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチ
ルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などを包含するがそれらに限定されない。
【０１２４】
免疫原性組成物（例えば、免疫化抗原／免疫原／ポリペプチド／タンパク質／
核酸、薬学的に受容可能なキャリア、およびアジュバント）は、代表的に、希釈
剤（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなど）を含有する。さ
らに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）は、このよ
うなビヒクルにおいて存在し得る。
【０１２５】
代表的に、免疫原性組成物は、液体溶液または懸濁物のいずれかとして、注射
剤として調製され；注射前に液体ビヒクルにおける溶液または懸濁物として適切
な固体形態もまた調製され得る。この調製物はまた、薬学的に受容可能なキャリ
アの下で、上記に記載のように、アジュバント効果の増強のために乳化され得る
かまたはリポソーム中にカプセル化され得る。
【０１２６】
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的有効量の抗原性または
免疫原性のポリペプチド、および任意の他の上記の成分を必要に応じて含む。「
免疫学的有効量」とは、その量の個体への投与が、単回用量であれ、一連の一部
としてであれ、処置または予防に有効であることを意味する。この量は、処置さ
れる個体の健康および身体状態、処置される個体の分類学上の群（例えば、非ヒ
ト霊長類、霊長類など）、個体の免疫系が抗体を合成する能力、所望される防御
の程度、そのワクチンの処方、処置する医師の医療的状況の評価、および他の関
連する因子に依存して変動する。その量は、比較的広い範囲に入り、この量が慣
用的な試行を通して決定され得ることが予想される。
【０１２７】
免疫原性組成物は、従来のように、非経口的（例えば、皮下、筋肉内または経
皮（ｔｒａｎｓｕｄｅｒｍａｌｌｙ）／経皮（ｔｒａｎｓｕｃｕｔａｎｅｏｕｓ
ｌｙ）のいずれかでの注射による）（例えば、ＷＯ９８／２０７３４）に投与さ
れる）。他の投与様式に適切なさらなる処方物は、経口処方物および肺処方物、
坐剤、および経皮適用を含む。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは多数回
用量スケジュールであり得る。ワクチンは、他の免疫調節剤とともに投与され得
る。
【０１２８】
タンパク質ベースのワクチンの代替として、ＤＮＡワクチン接種を使用し得る
（例えば、ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＴｏｒｒｅｓ（１９９７）Ｓｅｍｉｎａｒｓ
ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９：２７１−２８３；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（１
９９７）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５：６１７−６４８；本明細書
中後半部を参照のこと）。
【０１２９】
（遺伝子送達ビヒクル）
哺乳動物における発現のためにその哺乳動物へ送達される、本発明の治療剤の
コード配列を含む構築物の送達のための遺伝子治療ビヒクルは、局所または全身
的のいずれかで投与され得る。これらの構築物は、ウイルスベクターアプローチ
または非ウイルスベクターアプローチを、インビボまたはエキソビボの様式で利
用し得る。このようなコード配列の発現は、内因性哺乳動物プロモーターまたは
異種プロモーターを用いて誘導され得る。このコード配列のインビボでの発現は
、構成性または調節性のいずれかであり得る。
【０１３０】
本発明は、意図された核酸配列を発現し得る遺伝子送達ビヒクルを含む。この
遺伝子送達ビヒクルは、好ましくは、ウイルスベクター、およびより好ましくは
レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡ
Ｖ）ベクター、ヘルペスウイルスベクターまたはアルファウイルスベクターであ
る。このウイルスベクターはまた、アストロウイルスベクター、コロナウイルス
ベクター、オルソミクソウイルスベクター、パポバウイルスベクター、パラミク
ソウイルスベクター、パルボウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター、ポ
ックスウイルスベクター、またはトガウイルスベクターであり得る。一般には、
Ｊｏｌｌｙ（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５１−
６４；Ｋｉｍｕｒａ（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：
８４５−８５２；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ（１９９５）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅ
ｒａｐｙ  ６：１８５−１９３；およびＫａｐｌｉｔｔ（１９９４）Ｎａｔｕｒ
ｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：１４８−１５３を参照のこと。
【０１３１】
レトロウイルスベクターは、当該分野で周知であり、そして本発明者らは、任
意のレトロウイルス遺伝子治療ベクターが本発明において使用可能であることを
意図する。これには、Ｂ型、Ｃ型およびＤ型のレトロウイルス、異種栄養性ウイ
ルス（例えば、ＮＺＢ−Ｘ１、ＮＺＢ−Ｘ２およびＮＺＢ９−１（Ｏ’Ｎｅｉｌ
ｌ（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５３：１６０を参照のこと）、多栄養性レトロ
ウイルス（ｐｏｌｙｔｒｏｐｉｃ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）（例えば、ＭＣＦお
よびＭＣＦ−ＭＬＶ（Ｋｅｌｌｙ（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：２９１を
参照のこと）、スプマウイルスおよびレンチウイルスが含まれる。ＲＮＡ  Ｔｕ
ｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓｅｓ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８５を参照のこと。
【０１３２】
レトロウイルス遺伝子治療ベクターの部分は、異なるレトロウイルスに由来し
得る。例えば、レトロウイルスＬＴＲは、マウス肉腫ウイルスに由来し得、ｔＲ
ＮＡ結合部位はラウス肉腫ウイルスに由来し得、パッケージングシグナルはマウ
ス白血病ウイルスに由来し得、そして第二鎖合成の起源はニワトリ白血病ウイル
スに由来し得る。
【０１３３】
これらの組換えレトロウイルスベクターを使用して、適切なパッケージング細
胞株へそれらを導入することによって形質導入コンピテントレトロウイルスベク
ター粒子を生成し得る（米国特許第５，５９１，６２４号を参照のこと）。レト
ロウイルスベクターは、レトロウイルス粒子へのキメラインテグラーゼ酵素の組
込みによって宿主細胞ＤＮＡへの部位特異的組込みのために構築され得る（ＷＯ
９６／３７６２６号を参照のこと）。この組換えウイルスベクターは複製欠損組
換えウイルスであることが好ましい。
【０１３４】
上記のレトロウイルスベクターに関する使用について適切なパッケージング細
胞株は、当該分野で周知であり、容易に調製され（ＷＯ９５／３０７６３号およ
びＷＯ９２／０５２６６号を参照のこと）、そしてこれを使用して、組換えベク
ター粒子の生産のためのプロデューサー細胞株（これは、ベクター細胞株または
「ＶＣＬ」とも称される）を作製し得る。好ましくは、このパッケージング細胞
株は、ヒトの親細胞（例えば、ＨＴ１０８０細胞）またはミンク親細胞株から作
製され、これは、ヒト血清における不活化を除去する。
【０１３５】
レトロウイルス遺伝子治療ベクターの構築のために好ましいレトロウイルスは
、ニワトリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、ミン
ク細胞フォーカス形成ウイルス、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルス、お
よびラウス肉腫ウイルスを含む。特に好ましいマウス白血病ウイルスは、４０７
０Ａおよび１５０４Ａ（ＨａｒｔｌｅｙおよびＲｏｗｅ（１９７６）Ｊ．  Ｖｉ
ｒｏｌ．１９：１９−２５）、Ａｂｅｌｓｏｎ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９９）、
Ｆｒｉｅｎｄ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２４５）、Ｇｒａｆｆｉ、Ｇｒｏｓｓ（ＡＴ
ＣＣ番号ＶＲ−５９０）、Ｋｉｒｓｔｅｎ、Ｈａｒｖｅｙ肉腫ウイルスおよびＲ
ａｕｓｃｈｅｒ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９８）およびモロニーマウス白血病ウイ
ルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１９０）を含む。このようなレトロウイルスは、寄託
機関または収集機関（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（「Ａ
ＴＣＣ」）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手し得るか、また
は一般に利用可能な技術を用いて公知の供給源から単離され得る。
【０１３６】
本発明において使用可能な例示的な公知のレトロウイルス遺伝子治療ベクター
は、特許出願ＧＢ２２００６５１、ＥＰ０４１５７３１、ＥＰ０３４５２４２、
ＥＰ０３３４３０１、ＷＯ８９／０２４６８；ＷＯ８９／０５３４９、ＷＯ８９
／０９２７１．ＷＯ９０／０２８０６、ＷＯ９０／０７９３６、ＷＯ９４／０３
６２２、ＷＯ９３／２５６９８、ＷＯ９３／２５２３４、ＷＯ９３／１１２３０
、ＷＯ９３／１０２１８、ＷＯ９１／０２８０５、ＷＯ９１／０２８２５、ＷＯ
９５／０７９９４、米国特許第５，２１９，７４０号、同４，４０５，７１２号
、同４，８６１，７１９号、同４，９８０，２８９号、同４，７７７，１２７号
、同５，５９１，６２４号に記載されるものを含む。Ｖｉｌｅ（１９９３）Ｃａ
ｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３：３８６０−３８６４；Ｖｉｌｅ（１９９３）Ｃａｎｃ
ｅｒ  Ｒｅｓ  ５３：９６２−９６７；Ｒａｍ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅ
ｓ  ５３（１９９３）８３−８８；Ｔａｋａｍｉｙａ（１９９２）Ｊ  Ｎｅｕｒ
ｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ３３：４９３−５０３；Ｂａｂａ（１９９３）Ｊ  Ｎｅｕｒ
ｏｓｕｒｇ  ７９：７２９−７３５；Ｍａｎｎ（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：１
５３；Ｃａｎｅ（１９８４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８１；６
３４９；およびＭｉｌｌｅｒ（１９９０）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ
ｙ  １もまた参照のこと。
【０１３７】
ヒトアデノウイルス遺伝子治療ベクターもまた当該分野で公知であり、そして
本発明において使用可能である。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ（１９８８）Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ（１９９１）Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ  ２５２：４３１；ならびにＷＯ９３／０７２８３、ＷＯ９３／０６２
２３、およびＷＯ９３／０７２８２を参照のこと。本発明において使用可能な例
示的な公知のアデノウイルス遺伝子治療ベクターは、上記に参照される文書およ
びＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ
９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４、ＷＯ９５／００６５５、ＷＯ９５／
２７０７１、ＷＯ９５／２９９９３、ＷＯ９５／３４６７１、ＷＯ９６／０５３
２０、ＷＯ９４／０８０２６、ＷＯ９４／１１５０６、ＷＯ９３／０６２２３、
ＷＯ９４／２４２９９、ＷＯ９５／１４１０２、ＷＯ９５／２４２９７、ＷＯ９
５／０２６９７、ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／２４２９９、ＷＯ９５／０
９２４１，ＷＯ９５／２５８０７、ＷＯ９５／０５８３５、ＷＯ９４／１８９２
２およびＷＯ９５／０９６５４において記載されるものを含む。あるいは、Ｃｕ
ｒｉｅｌ（１９９２）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４に記載
されるような殺傷したアデノウイルスに連結したＤＮＡの投与が使用され得る。
本発明の遺伝子送達ビヒクルはまた、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベ
クターを含む。本発明における使用のためのこのようなベクターの主要なおよび
好ましい例は、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ＷＯ９３／０９２３９に開示されるＡＡ
Ｖ−２ベースのベクターである。最も好ましいＡＡＶベクターは、２つのＡＡＶ
逆方向末端反復を含む。ここで、ネイティブＤ配列は、ヌクレオチドの置換によ
って改変され、その結果、少なくとも５つのネイティブなヌクレオチドから１８
までのネイティブヌクレオチド、好ましくは少なくとも１０のネイティブヌクレ
オチドから１８までのネイティブヌクレオチド、最も好ましくは１０のネイティ
ブヌクレオチドが維持され、そしてＤ配列の残りのヌクレオチドが欠失またはネ
イティブでないヌクレオチドで置換されている。ＡＡＶ逆方向末端反復のネイテ
ィブなＤ配列は、各ＡＡＶ逆方向末端反復において（すなわち、各末端に１つの
配列が存在する）２０の連続するヌクレオチドの配列であって、これは、ＨＰ形
成に関与しない。ネイティブでない置換ヌクレオチドは、同じ位置でのネイティ
ブなＤ配列に見出されるヌクレオチド以外の任意のヌクレオチドであり得る。他
の使用可能な例示的なＡＡＶベクターは、、ｐＷＰ−１９、ｐＷＮ−１であり、
これらは両方ともＮａｈｒｅｉｎｉ（１９９３）Ｇｅｎｅ  １２４：２５７−２
６２に開示される。このようなＡＡＶベクターの別の例は、ｐｓｕｂ２０１（Ｓ
ａｍｕｌｓｋｉ（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６を参照のこと）で
ある。別の例示的なＡＡＶベクターは、Ｄｏｕｂｌｅ−Ｄ  ＩＴＲベクターであ
る。Ｄｏｕｂｌｅ−Ｄ  ＩＴＲベクターの構築は、米国特許第５，４７８，７４
５号に開示される。なお他のベクターは、Ｃａｒｔｅｒ  米国特許第４，７９７
，３６８号およびＭｕｚｙｃｚｋａ  米国特許第５，１３９，９４１号、Ｃｈａ
ｒｔｅｊｅｅ  米国特許第５，４７４，９３５号ならびにＫｏｔｉｎ  ＷＯ９４
／２８８１５７に開示されるものである。本発明において使用可能なＡＡＶベク
ターのなおさらなる例は、ＳＳＶ９ＡＦＡＢＴＫｎｅｏであり、これは、ＡＦＰ
エンハンサーおよびアルブミンプロモーターを含み、そして肝臓において優性に
発現を指向する。その構造および構築は、Ｓｕ（１９９６）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎ
ｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：４６３−４７０に開示される。さらなるＡＡＶ遺伝子
治療ベクターは、米国特許第５，３５４，６７８号、同５，１７３，４１４号、
同５，１３９，９４１号、および同５，２５２，４７９号に開示される。
【０１３８】
本発明の遺伝子治療ベクターはまた、ヘルペスベクターを含む。主要なおよび
好ましい例は、チミジンキナーゼポリペプチドをコードする配列を含む単純ヘル
ペスウイルスベクター（例えば、米国特許第５，２８８，６４１号、およびＥＰ
０１７６１７０（Ｒｏｉｚｍａｎ）に開示されるもの）である。さらなる例示的
な単純ヘルペスウイルスベクターは、ＷＯ９５／０４１３９（Ｗｉｓｔａｒ  Ｉ
ｎｓｔｉｔｕｔｅ）に開示されるＨＦＥＭ／ＩＣＰ６−ｌａｃＺ、Ｇｅｌｌｅｒ
（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１６６７−１６６９ならびにＷＯ９０／
０９４４１およびＷＯ９２／０７９４５に記載されるｐＨＳＶｌａｃ、Ｆｉｎｋ
（１９９２）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：１１−１９に記載さ
れるＨＳＶ  Ｕｓ３：：ｐｇＣ−ｌａｃＺ、ならびにＥＰ０４５３２４２（Ｂｒ
ｅａｋｅｆｉｅｌｅｄ）に記載されるＨＳＶ  ７１３４、２ＲＨ  １０５および
ＧＡＬ４、ならびにＡＴＣＣに受託番号ＡＴＣＣ  ＶＲ−９７７およびＡＴＣＣ
ＶＲ−２６０として寄託されたものを含む。
【０１３９】
意図されるのはまた、本発明において使用され得るアルファウイルス遺伝子治
療ベクターである。好ましいアルファウイルスベクターは、シンドビスウイルス
ベクターである。トガウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７
；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ミッデルブルグ（Ｍｉｄｄｌｅｂｅｒｇ）ウイ
ルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７０）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７
３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）、ヴェネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣ
Ｃ  ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４９；Ａ
ＴＣＣ  ＶＲ−５３２）および米国特許第５，００９１，３０９号、同５，２１
７，８７９号、およびＷＯ９２／１０５７８に記載されるもの。より詳細には、
米国特許出願第０８／４０５，６２７号（１９９５年３月１５日出願）、ＷＯ９
４／２１７９２号、ＷＯ９２／１０５７８号、ＷＯ９５／０７９９４号、米国特
許第５，０９１，３０９号、および米国特許第５，２１７，８７９号に記載され
るそれらのアルファウイルスベクターが使用可能である。このようなアルファウ
イルスは、ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄのような寄託機関
または収集機関から入手し得るか、または一般的に利用可能な技術を用いて公知
の供給源から単離され得る。好ましくは、細胞傷害性が減少したアルファウイル
スベクターを使用する（米国特許出願番号０８／６７９６４０を参照のこと）。
【０１４０】
ＤＮＡベクター系（例えば、真核細胞層状発現系）もまた、本発明の核酸の発
現について有用である。真核生物層状発現系の詳細な説明についてはＷＯ９５／
０７９９４を参照のこと。好ましくは、本発明の真核細胞層状発現系はアルファ
ウイルスベクターに由来し、そして最も好ましくはシンドビスウイルスベクター
に由来する。
【０１４１】
本発明における使用に適切な他のウイルスベクターは、ポリオウイルス（例え
ば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−５８およびＥｖａｎｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ３３９（１９８９
）３８５およびＳａｂｉｎ（１９７３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａ
ｔｉｏｎ  １：１１５に記載されるもの；リノウイルス、例えば、ＡＴＣＣ  Ｖ
Ｒ−１１１０およびＡｒｎｏｌｄ（１９９０）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  
Ｌ４０１に記載されるもの；ポックスウイルス（例えば、カナリアポックスウイ
ルスまたはワクシニアウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１１１およびＡＴＣ
Ｃ  ＶＲ−２０１０ならびにＦｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈ（１９８９）Ｐｒｏｃ  Ｎ
ａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８６：３１７；Ｆｌｅｘｎｅｒ（１９８９）Ａｎｎ
ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ５６９：８６、Ｆｌｅｘｎｅｒ（１９９０）Ｖａｃ
ｃｉｎｅ  ８：１７；米国特許第４，６０３，１１２号および同第４，７６９，
３３０号ならびにＷＯ８９／０１９７３号に記載されるもの））；ＳＶ４０ウイ
ルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−３０５およびＭｕｌｌｉｇａｎ（１９７９）Ｎ
ａｔｕｒｅ  ２７７：１０８およびＭａｄｚａｋ（１９９２）Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉ
ｒｏｌ  ７３：１５３３に記載されるもの）；インフルエンザウイルス（例えば
、ＡＴＣＣ  ＶＲ−７９７および米国特許第５，１６６，０５７号およびＥｎａ
ｍｉ（１９９０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８７：３８０２−３
８０５；ＥｎａｍｉおよびＰａｌｅｓｅ（１９９１）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６５：２
７１１−２７１３およびＬｕｙｔｊｅｓ（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５９：１１０（
ＭｃＭｉｃｈａｅｌ（１９８３）ＮＥＪ  Ｍｅｄ  ３０９：１３ならびにＹａｐ
（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ  ２７３：２３８およびＮａｔｕｒｅ（１９７９）２
７７：１０８もまた参照のこと）に記載されるような逆遺伝子技術を使用して作
製した組換えインフルエンザウイルス）；ＥＰ−０３８６８８２およびＢｕｃｈ
ｓｃｈａｃｈｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１に記載されるよ
うなヒト免疫不全ウイルス；麻疹ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７およ
びＶＲ−１２４７ならびにＥＰ−０４４０２１９に記載されるもの）；アウラウ
イルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６８）；ベバルウイルス（例えば、ＡＴＣ
Ｃ  ＶＲ−６００およびＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４０）；カバス（Ｃａｂａｓｓｏ
ｕ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２２）；チクングンヤウイルス（例
えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６４およびＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４１）；フォートモー
ガン（Ｆｏｒｔ  Ｍｏｒｇａｎ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２４）
；ゲタウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６９およびＡＴＣＣ  ＶＲ−１２
４３）；キジラガハ（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  Ｖ
Ｒ−９２７）；マヤロウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６６）；ムカンボウ
イルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−５８０およびＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４４）；
ヌヅムウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７１）；ピクスナウイルス（例え
ば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７２およびＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４５）；トナテ（Ｔｏ
ｎａｔｅ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２５）；トリニティウイルス
（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−４６９）；ユナウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ
−３７４）；ワタロアウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２６）；Ｙ−６２
−３３ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７５）；オニオンウイルス、東部
ウマ脳脊髄炎ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６５およびＡＴＣＣ  ＶＲ−
１２４２）；西部ウマ脳脊髄炎ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−７０、ＡＴ
ＣＣ  ＶＲ−１２５１、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６２２およびＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５
２）；ならびにコロナウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−７４０およびＨａｍ
ｒｅ（１９６６）Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  １２１：１９
０に記載のもの）に由来のものを含む。
【０１４２】
本発明の組成物の細胞への送達は、上記に言及したウイルスベクターに限定さ
れない。他の送達方法および媒体が使用され得る（例えば、核酸発現ベクター、
殺傷したアデノウイルスに連結したかまたは連結してないポリカチオン性縮合Ｄ
ＮＡ単独（例えば、米国特許出願番号０８／３６６，７８７（１９９４年１２月
３０日出願）およびＣｕｒｉｅｌ（１９９２）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ３
：１４７−１５４を参照のこと）、リガンド連結ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ（１９８
９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４：１６９８５−１６９８７を参照のこと）
、真核生物細胞送達ビヒクル細胞（例えば、米国特許出願番号０８／２４０，０
３０（１９９４年５月９日出願）および米国特許出願番号０８／４０４，７９６
を参照のこと）、光重合化ヒドロゲル物質の沈着、手動の遺伝子送達粒子銃（米
国特許第５，１４９，６５５号に記載されるような）、米国特許第５，２０６，
１５２号およびＷＯ９２／１１０３３に記載されるような電離放射線、核酸電荷
中和または細胞膜との融合）。さらなるアプローチは、Ｐｈｉｌｉｐ（１９９４
）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４：２４１１−２４１８およびＷｏｆｆｅｎ
ｄｉｎ（１９９４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９１：１５８１−
１５８５に記載される。
【０１４３】
粒子媒介遺伝子転移が使用され得る（例えば、米国特許出願番号６０／０２３
，８６７を参照のこと）。手短には、配列を、高レベル発現のための従来の制御
配列を含む従来のベクターに挿入し得、次いで細胞標的化リガンド（例えば、ア
シアロオロソムコイド（ＷｕおよびＷｕ（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６２：４４２９−４４３２に記載されるような）、Ｈｕｃｋｅｄ（１９９０）
Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４０：２５３−２６３に記載されるよう
なインスリン、Ｐｌａｎｋ（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  
３：５３３−５３９に記載されるようなガラクトース、ラクトースまたはトラン
スフェリン）に連結された合成遺伝子転移分子（例えば、重合ＤＮＡ結合カチオ
ン様ポリリジン、プロタミンおよびアルブミン）とともにインキュベートされ得
る。
【０１４４】
裸のＤＮＡもまた使用され得る。例示的な裸のＤＮＡ導入方法は、ＷＯ９０／
１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載される。取り込み効率
は、生体分解性のラテックスビーズを用いて改良され得る。ＤＮＡコートラテッ
クスビーズは、ビーズによるエンドサイトーシス開始の後に効率よく細胞へと輸
送される。この方法は、ビーズを処理して疎水性を高め、それによってエンドソ
ームの破壊および細胞質へのＤＮＡの放出を容易にすることによってさらに改良
され得る。
【０１４５】
遺伝子送達ビヒクルとして作用し得るリポソームは、米国特許第５，４２２，
１２０号、ＷＯ９５／１３７９６、ＷＯ９４／２３６９７、ＷＯ９１／１４４４
５、およびＥＰ５２４，９６８に記載される。米国特許出願６０／０２３，８６
７に記載されるように、非ウイルス性送達において、ポリペプチドをコードする
核酸配列は、高レベル発現のための従来の制御配列を含む従来のベクターへと挿
入され得、次いで細胞標的化リガンド（例えば、アシアロオロソムコイド、イン
スリン、ガラクトース、ラクトースまたはトランスフェリン）に連結された、重
合性ＤＮＡ結合カチオン（例えば、ポリリジン、プロタミン、およびアルブミン
）のような合成遺伝子転移分子とともにインキュベートされ得る。他の送達系は
、種々の組織特異的または普遍的作用性のプロモーターの制御下に遺伝子を含む
ＤＮＡをカプセル化するためのリポソームの使用を含む。さらに、使用に適切な
非ウイルス送達は、機械的送達系（例えば、Ｗｏｆｆｅｎｄｉｎら（１９９４）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（２４）：１１５８１−
１１５８５に記載されるアプローチを含む。さらに、コード配列およびそのよう
なものの発現産物は、光重合化ヒドロゲル物質の沈着を介して送達され得る。コ
ード配列の送達について使用され得る、遺伝子送達のための他の従来の方法は、
例えば、手動の遺伝子転移粒子銃（米国特許第５，１４９，６５５号に記載され
るような）；移入された遺伝子を活性化するための電離放射線の使用（米国特許
第５，２０６，１５２号およびＷＯ９２／１１０３３に記載されるような）を含
む。
【０１４６】
例示的なリポソームおよびポリカチオン性遺伝子送達ビヒクルは、米国特許第
５，４２２，１２０号および同第４，７６２，９１５号；ＷＯ９５／１３７９６
；ＷＯ９４／２３６９７；およびＷＯ９１／１４４４５；ＥＰ−０５２４９６８
；およびＳｔｒｙｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３６−２４０頁（１９７
５）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；Ｓｚｏｋａ（１
９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ６００：１；Ｂａｙｅｒ
（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ５５０：４６４；Ｒ
ｉｖｎａｙ（１９８７）Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １４９：１１９；Ｗａｎｇ
（１９８７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８４：７８５１；Ｐｌａ
ｎｔ（１９８９）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １７６：４２０に記載されるもの
である。
【０１４７】
ポリヌクレオチド組成物は、治療有効量（この用語は上記に定義されるとおり
である）の遺伝子治療ビヒクルを含み得る。本発明の目的のために、有効用量は
、投与される個体において、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇまたは０．
０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇのＤＮＡ構築物である。
【０１４８】
（送達方法）
一旦処方されると、本発明のポリヌクレオチド組成物は、（１）被験体に直接
；（２）エキソビボで被験体由来の細胞に送達されて；または（３）組換えタン
パク質の発現のためにインビトロで、投与され得る。処置される被験体は、哺乳
動物または鳥類であり得る。ヒト被験体もまた処置され得る。
【０１４９】
この組成物の直接送達は、皮下、腹腔内、静脈内、または筋肉内の注射によっ
て、または組織の間質空間への送達のいずれかによって一般的に達成される。こ
の組成物はまた、病巣へ投与され得る。他の投与様式は、経口投与および肺投与
、坐剤、および経皮または経皮適用（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照のこ
と）、針、ならびに遺伝子銃またはハイポスプレーを含む。投薬処置は、単回用
量スケジュールまたは多数回用量スケジュールであり得る。
【０１５０】
エキソビボ送達および被験体への形質転換細胞の再移植のための方法は、当該
分野で公知であり、そして例えばＷＯ９３／１４７７８に記載されている。エキ
ソビボ適用に有用である細胞の例は、例えば、幹細胞、特に、造血細胞、リンパ
細胞、マクロファージ、樹状細胞または腫瘍細胞を含む。
【０１５１】
一般的に、エキソビボ適用およびインビトロ適用の両方のための核酸の送達は
、以下の手順：例えば、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシ
ウム沈降、ポリブレン媒介トランスフェクション、原形質融合、エレクトロポレ
ーション、ポリヌクレオチドのリポソーム内へのカプセル化、およびＤＮＡの核
への直接の微量注入（これらはすべて当該分野で周知である）で達成され得る。
【０１５２】
（ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの薬学的組成物）
上記に記載の薬学的に受容可能なキャリアおよび塩に加えて、以下のさらなる
薬剤がポリヌクレオチド組成物および／またはポリペプチド組成物とともに使用
され得る。
【０１５３】
（Ａ．ポリペプチド）
１つの例は、限定することなく以下を包含するポリペプチドである：アシアロ
オロソムコイド（ＡＳＯＲ）；トランスフェリン；アシアロ糖タンパク質；抗体
；抗体フラグメント；フェリチン；インターロイキン；インターフェロン；顆粒
球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子
（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、幹細胞因子
およびエリスロポエチン。ウイルス抗原（例えば、エンベロープタンパク質）も
また、使用され得る。また、他の侵襲性生物由来のタンパク質（例えば、ＲＩＩ
として知られるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの環境スポロゾイ
ト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）タンパク質由来の１７アミノ酸ペプチ
ド）。
【０１５４】
（Ｂ．ホルモン、ビタミンなど）
包含され得る他の群は、例えば、ホルモン、ステロイド、アンドロゲン、エス
トロゲン、甲状腺ホルモン、またはビタミン、葉酸である。
【０１５５】
（Ｃ．ポリアルキレン、ポリサッカリドなど）
また、ポリアルキレングリコールが、所望のポリヌクレオチド／ポリペプチド
とともに含有され得る。好ましい実施態様において、ポリアルキレングリコール
は、ポリエチレングリコールである。さらに、モノサッカリド、ジサッカリド、
またはポリサッカリドが含有され得る。この局面の好ましい実施態様において、
このポリサッカリドは、デキストランまたはＤＥＡＥデキストランである。また
、キトサンおよびポリ（乳酸−コ−グリコリド）。
【０１５６】
（Ｄ．脂質およびリポソーム）
所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドはまた、被験体またはそれに由来する
細胞への送達の前に、脂質中にカプセル化され得るか、またはリポソーム中にパ
ッケージングされ得る。
【０１５７】
脂質カプセル化は、一般的に核酸を安定に結合し得るか、または核酸を捕捉お
よび維持し得るリポソームを用いて達成される。縮合ポリヌクレオチドの脂質調
製物に対する比は、変動し得るが、一般的に約１：１（ｍｇＤＮＡ：マイクロモ
ル脂質）であるか、または脂質がより多いかである。核酸の送達のためのキャリ
アとしてのリポソーム使用の概説については、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔ（１
９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０９７：１−１７；Ｓ
ｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：５１２
−５２７を参照のこと。
【０１５８】
本発明における使用のためのリポソーム調製物は、カチオン性（正に荷電した
）、アニオン性（負に荷電した）および中性の調製物を含む。カチオン性リポソ
ームは、機能的な形態で、プラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒ（１９８７）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１６）；ｍ
ＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ  ８６：６０７７−６０８１；および精製した転写因子（Ｄｅｂｓ（１９９
０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１０１８９−１０１９２）の細胞内送達
を媒介することが示されている。
【０１５９】
カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジ
オレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭ
Ａ）リポソームは、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹから
の商標リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）の下で入手可能である（Ｆｅｌ
ｇｎｅｒ（前出）もまた参照のこと）。他の市販されているリポソームは、トラ
ンスフェクテース（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）および
ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）を含む。他のカチオン性リポソ
ームは、当該分野で周知の技法を使用して、容易に利用可能な物質から調製され
得る。例えば、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチ
ルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記載について、Ｓｚｏｋａ（１９
７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：４１９４−４１
９８；ＷＯ９０／１１０９２を参照のこと。
【０１６０】
同様に、アニオン性および中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌ
ａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から容易に入手可能である
か、または容易に入手可能な物質を使用してたやすく調製され得る。このような
物質には、とりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジル
エタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオ
イルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエ
タノールアミン（ＤＯＰＥ）が含まれる。これらの物質はまた、適切な比率のＤ
ＯＴＭＡおよびＤＯＴＡＰの出発物質と混合され得る。これらの物質を使用して
リポソームを作製する方法は、当該分野で周知である。
【０１６１】
このリポソームは、多重膜のベシクル（ＭＬＶ）、小さな単一膜ベシクル（Ｓ
ＵＶ）、または大きな単一膜のベシクル（ＬＵＶ）を含み得る。種々のリポソー
ム−核酸複合体は当該分野で公知の方法を使用して調製される。例えば、Ｓｔｒ
ａｕｂｉｎｇｅｒ（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０１：５１２−５
２７；Ｓｚｏｋａ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７５：４１９４−４１９８；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（１９７５）Ｂ
ｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ３９４：４８３；Ｗｉｌｓｏｎ（１
９７９）Ｃｅｌｌ  １７：７７）；ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ（１９７
６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏ
（１９７７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７６：
８３６；Ｆｒａｌｅｙ（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ  ７６：３３４８）；ＥｎｏｃｈおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ（１９７
９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：１４５；Ｆｒａｌ
ｅｙ（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；
ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１４５；ならびにＳｃｈａｅｆｅｒ−
Ｒｉｄｄｅｒ（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１５：１６６を参照のこと。
【０１６２】
（Ｅ．リポタンパク質）
さらに、リポタンパク質が、送達されるポリヌクレオチド／ポリペプチドとと
もに含まれ得る。利用されるリポタンパク質の例は、キロミクロン、ＨＤＬ、Ｉ
ＤＬ、ＬＤＬ、およびＶＬＤＬを含む。これらのタンパク質の変異体、フラグメ
ント、または融合物もまた、使用され得る。また、天然に存在するリポタンパク
質の改変体（例えば、アセチル化されたＬＤＬ）が使用され得る。これらのリポ
タンパク質は、リポタンパク質レセプターを発現する細胞へのポリヌクレオチド
の送達を標的化し得る。好ましくは、リポタンパク質が、送達されるポリヌクレ
オチドとともに含まれる場合、他の標的化リガンドはその組成物中には含まれな
い。
【０１６３】
天然に存在するリポタンパク質は、脂質部分およびタンパク質部分を含む。こ
のタンパク質部分は、アポタンパク質として知られる。現在では、アポタンパク
質Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥが単離および同定されている。少なくともこれらの
うちの２つはいくつかのタンパク質を含み、ローマ数字によって、ＡＩ、ＡＩＩ
、ＡＩＶ；ＣＩ、ＣＩＩ、ＣＩＩＩと命名されている。
【０１６４】
１つのリポタンパク質は、１より多くのアポタンパク質を含み得る。例えば、
天然に存在するキロミクロンはＡ、Ｂ、Ｃ、およびＥからなり、そして時間が経
てばこれらのリポタンパク質はＡアポタンパク質を欠失し、そしてＣおよびＥア
ポタンパク質を獲得する。ＶＬＤＬは、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＥアポタンパク質を
含み、ＬＤＬはアポタンパク質Ｂを含み；そしてＨＤＬはアポタンパク質Ａ、Ｃ
、およびＥを含む。
【０１６５】
これらのアポタンパク質のアミノ酸は公知であり、そして例えば、Ｂｒｅｓｌ
ｏｗ（１９８５）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５４：６９９；Ｌａｗ（
１９８６）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１５１：１６２；Ｃｈｅｎ（１
９８６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６１：１２９１８；Ｋａｎｅ（１９８０）
Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：２４６５；およびＵｔ
ｅｒｍａｎｎ（１９８４）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６５：２３２に記載されている
。
【０１６６】
リポタンパク質は、トリグリセリド、コレステロール（遊離およびエステル）
、およびリン脂質を含む、種々の脂質を含む。この脂質の組成は、天然に存在す
るリポタンパク質において変化する。例えば、キロミクロンは主としてトリグリ
セリドを含む。天然に存在するリポタンパク質の脂質含有物のより詳細な記載は
、例えば、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２８（１９８６）に見いだされ得る。
この脂質の組成は、レセプター結合活性についてアポタンパク質の立体構造にお
いて補助するために選択される。脂質組成はまた、ポリヌクレオチド結合分子と
の疎水性相互作用および会合を容易にするように選択され得る。
【０１６７】
天然に存在するリポタンパク質は、例えば、血清から超遠心分離によって単離
され得る。そのような方法は、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（前出）；Ｐｉｔａ
ｓ（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５５：５４５４−５４６０およびＭａｈ
ｅｙ（１９７９）Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ６４：７４３−７５０に記載さ
れる。リポタンパク質はまた、インビトロまたは所望の宿主細胞中のアポタンパ
ク質遺伝子の発現による組換え方法によって産生され得る。例えば、Ａｔｋｉｎ
ｓｏｎ（１９８６）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  １５：４０
３およびＲａｄｄｉｎｇ（１９５８）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔ
ａ  ３０：４４３を参照のこと。リポタンパク質はまた、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ
Ｔｅｃｈｎｉｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃ
ｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡのような商業的な供給者から購入され得る。さらなるリ
ポタンパク質の記載は、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４４６
５に見い出され得る。
【０１６８】
（Ｆ．ポリカチオン性薬剤）
ポリカチオン性薬剤は、送達される所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドを
有する組成物中に、リポタンパク質を伴って、またはリポタンパク質を伴わずに
含まれ得る。
【０１６９】
ポリカチオン性薬剤は、代表的には、生理的に適切なｐＨにおいて正味の正電
荷を示し、そして所望の位置への送達を容易にするために核酸の電荷を中和し得
る。これらの薬剤は、インビトロ、エキソビボ、およびインビボ適用のいずれも
を有する。ポリカチオン性薬剤は、生きている被験体に、筋肉内、皮下などのい
ずれかで核酸を送達するために使用され得る。
【０１７０】
以下は、ポリカチオン性薬剤として有用なポリペプチドの例である：ポリリジ
ン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、およびプロタミン。他の例は、ヒストン
、プロタミン、ヒト血清アルブミン、ＤＮＡ結合タンパク質、非ヒストン染色体
タンパク質、ＤＮＡウイルス由来のコートタンパク質（例えば、Ｘ１７４）を含
む。転写因子もまた、ＤＮＡに結合するドメインを含み、従って核酸縮合薬剤と
して有用であり得る。手短に言えば、転写因子（例えば、Ｃ／ＣＥＢＰ、ｃ−ｊ
ｕｎ、ｃ−ｆｏｓ、ＡＰ−１、ＡＰ−２、ＡＰ−３、ＣＰＦ、Ｐｒｏｔ−１、Ｓ
ｐ−１、Ｏｃｔ−１、Ｏｃｔ−２、ＣＲＥＰ、およびＴＦＩＩＤ）は、ＤＮＡ配
列に結合する塩基性ドメインを含む。
【０１７１】
有機ポリカチオン性薬剤は、スペルミン、スペルミジン、およびプトレシン（
ｐｕｒｔｒｅｓｃｉｎｅ）を含む。
【０１７２】
ポリカチオン性薬剤の大きさおよびその物理的特性は、上記の表から外挿され
て、他のポリペプチドポリカチオン性薬剤が構築され得るか、または合成ポリカ
チオン性薬剤が産生され得る。
【０１７３】
有用な合成ポリカチオン性薬剤は、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブ
レンを含む。ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎTM、およびｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥTMは
、ポリヌクレオチド／ポリペプチドと組み合わせた場合にポリカチオン性複合体
を形成するモノマーである。
【０１７４】
（免疫診断アッセイ）
本発明のＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原は、抗体レベルを検出するためのイムノアッ
セイにおいて使用され得る（または、逆に抗Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ抗体は抗原レベ
ルを検出するために使用され得る）。充分に規定された組換え抗原に基づくイム
ノアッセイは、侵襲性の診断方法と置き換えるために開発され得る。生物学的サ
ンプル（例えば、血液サンプルまたは血清サンプルを含む）内のＮｅｉｓｓｅｒ
ｉａタンパク質に対する抗体が検出され得る。このイムノアッセイの設計は、多
くのバリエーションの対象であり、そして種々のこれらは当該分野で公知である
。イムノアッセイのプロトコルは、例えば、競合アッセイ、または直接反応アッ
セイ、またはサンドイッチ型アッセイに基づき得る。プロトコルはまた、例えば
、固体支持体を使用し得、または免疫沈降によってなされ得る。ほとんどのアッ
セイは、標識された抗体またはポリペプチドの使用を含み、その標識は、例えば
、蛍光分子、化学発光分子、放射性分子、または色素分子であり得る。プローブ
からのシグナルを増幅するアッセイもまた公知である；これらの例は、ビオチン
およびアビジンを利用するアッセイ、ならびに酵素標識および酵素媒介イムノア
ッセイ（例えば、ＥＬＡＳＡアッセイ）である。
【０１７５】
免疫診断に適切でありそして適切な標識試薬を備えるキットは、適切な容器中
に、アッセイの実行に必要とされる残りの試薬および物質（例えば、適切な緩衝
液、塩溶液など）ならびに適切なアッセイのセットの説明書と共に、本発明の組
成物を含む適切な物質を詰めることによって構築される。
【０１７６】
（核酸ハイブリダイゼーション）
「ハイブリダイゼーション」とは、水素結合により２つの核酸配列が互いに会
合することをいう。代表的には、１つの配列は、固体支持体に固定され、そして
他方は溶液中で遊離している。次いで、２つの配列を水素結合に好ましい条件下
で互いに接触させる。この結合に影響を与える因子は以下を含む：溶媒のタイプ
および容量；反応温度；ハイブリダイゼーションの時間；撹拌；液体相の配列の
固体支持体への非特異的な付着をブロックする薬剤（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ試薬
またはＢＬＯＴＴＯ）；配列の濃縮；配列の会合の速度を増大させる化合物（硫
酸デキストランまたはポリエチレングリコール）の使用；およびハイブリダイゼ
ーション後の洗浄条件のストリンジェンシー。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）第２
巻、第９章、９．４７〜９．５７頁を参照のこと。
【０１７７】
「ストリンジェンシー」とは、異なる配列よりも非常に類似する配列の会合に
好ましいハイブリダイゼーション反応における条件をいう。例えば、研究中のハ
イブリッドの計算されたＴｍより約１２０〜２００℃低い、温度および塩濃度の
組み合わせが選択されるべきである。温度および塩条件はしばしば、フィルター
に固定したゲノムＤＮＡのサンプルが目的の配列にハイブリダイズし、次いで異
なるストリンジェンシーの条件下で洗浄される、予備的な実験において経験的に
決定され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、９．５０頁を参照のこと。
【０１７８】
例えば、サザンブロットを行う場合、考慮する変数は、（１）ブロットされる
ＤＮＡの複雑さ、および（２）プローブおよび検出される配列の間の相同性であ
る。研究されるフラグメントの全量は、プラスミドまたはファージ消化物につい
ての０．１〜１μｇから、高度に複雑な真核生物ゲノム中の単一コピーについて
は１０-9〜１０-8ｇまで、１０倍変化し得る。より低い複雑さのポリヌクレオチ
ドについては、実質的により短いブロッティング、ハイブリダイゼーション、お
よび曝露時間、より少量の出発ポリヌクレオチド、およびより低い比活性のプロ
ーブが使用され得る。例えば、単一コピーの酵母遺伝子は、１μｇの酵母ＤＮＡ
を用いて開始し、２時間ブロットし、そして４〜８時間１０8ｃｐｍ／μｇのプ
ローブを用いてハイブリダイズして、わずか１時間の曝露時間を用いて検出され
得る。単一コピーの哺乳動物遺伝子について、保守的なアプローチは、１０μｇ
のＤＮＡを用いて開始し、一晩ブロットし、そして１０8ｃｐｍ／μｇより多い
プローブを用いて１０％硫酸デキストランの存在下で一晩ハイブリダイズし、約
２４時間露光時間を生じる。
【０１７９】
いくつかの因子が、プローブと目的のフラグメントとの間のＤＮＡ−ＤＮＡハ
イブリッドの融解温度（Ｔｍ）、ならびに、結果として、ハイブリダイゼーショ
ンおよび洗浄についての適切な条件に影響を与え得る。多くの場合において、そ
のプローブはフラグメントに対して１００％相同なわけではない。他の共通して
直面する変化には、ハイブリダイズする配列の長さおよび全Ｇ＋Ｃ含量、ならび
にイオン強度およびハイブリダイゼーション緩衝液のホルムアミド含量が含まれ
る。これらのすべての因子の効果は、一つの式によって近似され得る：
Ｔｍ＝８１＋１６．６（ｌｏｇ10Ｃｉ）＋０．４［％（Ｇ＋Ｃ）］−０．６
（％ホルムアミド）−６００／ｎ−１．５（％ミスマッチ）。
ここでＣｉは塩濃度（一価イオン）であり、およびｎは塩基対内のハイブリッド
の長さである（ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．１３８：２６７〜２８４からわずかに改変した）。
【０１８０】
ハイブリダイゼーション実験の設計において、核酸ハイブリダイゼーションに
影響を与えるいくつかの因子が簡便に変更され得る。ハイブリダイゼーションお
よび洗浄の温度ならびに洗浄の間の塩濃度を調整するのが最も単純である。ハイ
ブリダイゼーション温度（すなわち、ストリンジェンシー）が上昇するにつれて
、非相同的な鎖の間で起こるハイブリダイゼーションは起こりにくくなるようで
あり、結果として、バックグラウンドが減少する。放射標識したプローブが固定
化されたフラグメントと完全に相同ではない場合（遺伝子ファミリーおよび種間
のハイブリダイゼーション実験における場合で頻繁であるように）、ハイブリダ
イゼーション温度は低下されなければならず、そしてバックグラウンドが増大す
る。洗浄の温度は、類似の様式で、ハイブリダイゼーションバンドの強度、およ
びバックグラウンドの程度に影響を与える。洗浄のストリンジェンシーはまた、
塩濃度の減少とともに増大する。
【０１８１】
一般的に、５０％ホルミアミドの存在下で都合よいハイブリダイゼーション温
度は、標的フラグメントに９５％〜１００％相同であるプローブについて４２℃
、９０％〜９５％相同性では３７℃、および８５％〜９０％相同性については３
２℃である。より低い相同性については、上記の式を用いて、適切にホルムアミ
ド含量が低減され、そして温度が調整されるべきである。プローブと標的フラグ
メントとの間の相同性が未知である場合、最も単純なアプローチは、ともにスト
リンジェントではないハイブリダイゼーション条件および洗浄条件で開始するこ
とである。オートラジオグラフィー後に非特異的バンドまたは高いバックグラウ
ンドが観察される場合、フィルターは高ストリンジェンシーで洗浄され得、そし
て再び露光され得る。露光のために必要な時間がこのアプローチを非実用的にす
る場合、いくつかのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄ストリンジェン
シーが並行して試験されるべきである。
【０１８２】
（核酸プローブアッセイ）
本発明に従う核酸プローブを利用する、ＰＣＲ、分枝ＤＮＡプローブアッセイ
、またはブロッティング技術のような方法は、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの存在を
決定し得る。プローブは、検出されるに十分に安定な、二重鎖または二本鎖複合
体を形成し得る場合に、本発明の配列に「ハイブリダイズする」といわれる。
【０１８３】
核酸プローブは、本発明のＮｅｉｓｓｅｒｉａヌクレオチド配列（センス鎖お
よびアンチセンス鎖の両方を含む）にハイブリダイズする。多くの異なるヌクレ
オチド配列がアミノ酸配列をコードするが、ネイティブなＮｅｉｓｓｅｒｉａ配
列は、細胞に存在する実際の配列であるので、好ましい。ｍＲＮＡは、コード配
列を表し、従ってプローブはコード配列に相補的であるべきであり、一本鎖ｃＤ
ＮＡはｍＲＮＡに相補的であり、従ってｃＤＮＡプローブは非コード配列に相補
的であるべきである。
【０１８４】
プローブ配列はＮｅｉｓｓｅｒｉａ配列（またはその相補物）に同一である必
要はない。核酸プローブが標的ヌクレオチドと検出され得る二重鎖を形成し得る
場合、配列および長さのいくらかの変動は、アッセイの感受性の増加をもたらし
得る。また、核酸プローブは、形成された二重鎖を安定化するためにさらなるヌ
クレオチドを含み得る。さらなるＮｅｉｓｓｅｒｉａ配列もまた、形成された二
重鎖を検出するための標識として役立ち得る。例えば、非相補的ヌクレオチド配
列が、そのプローブの５’末端に付着され得、ここでそのプローブ配列の残りは
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ配列に相補的である。あるいは、プローブ配列が、Ｎｅｉｓ
ｓｅｒｉａ配列とハイブリダイズし、そしてそれによって検出され得る二重鎖を
形成するためにＮｅｉｓｓｅｒｉａ配列との十分な相補性を有する場合、非相補
的塩基またはより長い配列が、プローブ中に分散され得る。
【０１８５】
プローブの正確な長さおよび配列は、ハイブリダイゼーション条件（例えば、
温度、塩条件など）に依存する。例えば、診断的適用については、分析物の配列
の複雑さに依存して、核酸プローブは、代表的には、少なくとも１０〜２０ヌク
レオチド、好ましくは１５〜２５、そしてより好ましくは少なくとも３０ヌクレ
オチドを含むが、これよりも短くもあり得る。短いプライマーは、一般的には、
鋳型との十分に安定なハイブリッド複合体を形成するのにより低い温度を必要と
する。
【０１８６】
プローブは、合成的手順（例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉらのトリエステル法、
（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８１）１０３：３１８５）、またはＵｒ
ｄｅａら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０：
７４６１）に従って、または市販の自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して、
生成され得る。
【０１８７】
プローブの化学的性質は、優先度に従って選択され得る。特定の適用について
は、ＤＮＡまたはＲＮＡが適切である。他の適用については、改変（例えば、ホ
スホロチオエートまたはメチルホスホネートのようなバックボーンの改変）が組
み込まれ得、インビボの半減期を増大させるため、ＲＮＡ親和性を変化させるた
め、ヌクレアーゼ耐性などを増大させるために使用され得る（例えば、Ａｇｒａ
ｗａｌおよびＩｙｅｒ（１９９５）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
６：１２−１９；Ａｇｒａｗａｌ（１９９６）ＴＩＢＴＥＣＨ  １４：３７６
−３８７を参照のこと）；ペプチド核酸のようなアナログもまた使用され得る（
例えば、Ｃｏｒｅｙ（１９９７）ＴＩＢＴＥＣＨ １５  ２２４−２２９；Ｂｕ
ｃｈａｒｄｔら（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：３８４−３８６を参照のこ
と）。
【０１８８】
あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、少量の標的核酸を検出する別
の周知の手段である。そのアッセイは、Ｍｕｌｌｉｓら、（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ．（１９８７）１５５：３３５−３５０）；米国特許第４，６８３，１９
５号および同第４，６８３，２０２号に記載されている。２つの「プライマー」
ヌクレオチドは、標的核酸とハイブリダイズし、そして反応を開始するために使
用される。このプライマーは、増殖標的（またはその相補物）の配列にハイブリ
ダイズしない、二重鎖の安定性を補助するための、または、例えば、都合のよい
制限部位を組み込むための配列を含み得る。代表的には、このような配列は、所
望のＮｅｉｓｓｅｒｉａ配列に隣接する。
【０１８９】
熱安定性のポリメラーゼは、もともとの標的核酸を鋳型として使用して、プラ
イマーから標的核酸のコピーを作製する。標的核酸の閾値量がポリメラーゼによ
って産生された後、それらはより従来的な方法（例えば、サザンブロット）によ
って検出され得る。サザンブロット法を使用する場合、標識されたプローブは、
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ配列（またはその相補物）にハイブリダイズする。
【０１９０】
また、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載される
、従来的なブロッティング技術によって検出され得る。ｍＲＮＡ、またはｍＲＮ
Ａからポリメラーゼ酵素を使用して生成されたｃＤＮＡは、ゲル電気泳動を使用
して精製および分離され得る。次いで、ゲル上のこの核酸は、ニトロセルロース
のような固体支持体にブロットされる。この固体支持体は、標識されたプローブ
に曝露され、次いですべてのハイブリダイズしていないプローブを洗浄して除去
する。次に、標識プローブを含む二重鎖を検出する。代表的には、そのプローブ
は、放射活性部分で標識される。
【実施例】
【０１９１】
（実施例）
本実施例は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓで同定された核酸配列を、それら
の推定の翻訳産物と共に記載する。すべての核酸配列が完全なわけではなく、す
なわち、それらは、全長の野生型タンパク質より短い配列をコードする。現在、
本明細書に記載されるＤＮＡ配列のいずれもＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの有意
なホモログを有するとは考えられていない。
【０１９２】
本実施例は一般的には以下の様式である：
・Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ｂ株）において同定されたヌクレオチド配
列
・この配列の推定の翻訳産物
・データベースの比較に基づく翻訳産物のコンピューター分析
・Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ａ株）において同定された対応する遺伝子
およびタンパク質配列
・適切に抗原性であることを示すタンパク質の性質の記載
・生化学的分析の結果（発現、精製、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳなど）。
【０１９３】
本実施例は、代表的には種および株の間の配列同一性の詳細を含む。配列にお
いて類似のタンパク質は、一般的に構造および機能の両方において類似し、そし
て配列相同性はしばしば、共通の進化の起源を示す。公知の機能のタンパク質の
配列との比較は、新しい配列に対する推定のタンパク質の機能の割り当てのため
の指針として広く使用され、そして、特に全ゲノム分析において有用であること
が証明されている。
【０１９４】
配列比較を、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＢＬＡＳＴｎ、ＢＬＡＳＴｐ、ｔＢ
ＬＡＳＴｎ、ＢＬＡＳＴｘ、およびｔＢＬＡＳＴｘの各アルゴリズム（例えば、
Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ
−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａ
ｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５：２２８９−３４０２もまた参照のこと）を使用して
、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）で行
った。検索を、以下のデータベースに対して行った：縮重しないＧｅｎＢａｎｋ
＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ配列および縮重しないＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  
翻訳物＋ＰＤＢ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ配列。
【０１９５】
ヌクレオチド配列中のドット（例えば、実施例１２中の２８８位）は、リーデ
ィングフレームを維持するために任意に導入したヌクレオチドを示す。同様に、
二重下線を付したヌクレオチドを取り除いた。小文字（例えば、実施例１２の５
８９位）は、独立した配列決定反応のアラインメントの間に生じたあいまいさを
示す（本実施例におけるヌクレオチド配列のいくつかは２つ以上の実験の結果を
合わせて得られる）。
【０１９６】
ヌクレオチド配列を全部で６つのリーディングフレームで走査して、Ｅｓｐｏ
ｓｔｉら（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｙｄｒ
ｏｐａｔｈｙ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９９０）Ｅｕｒ
Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９０：２０７−２１９）の統計学的な研究に基づくア
ルゴニズムを用いて、疎水性ドメインの存在を予測した。これらのドメインは、
潜在的な膜貫通領域または疎水性リーダー配列を表す。
【０１９７】
オープンリーディングフレームを、プログラムＯＲＦＦＩＮＤＥＲ（ＮＣＢＩ
）を使用して、フラグメント化されたヌクレオチド配列から予測した。
【０１９８】
下線を付したアミノ酸配列は、ＰＳＯＲＴアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗ
ｗ．ｐｓｏｒｔ．ｎｉｂｂ．ａｃ．ｊｐ）によって予測される、ＯＲＦ中の可能
な膜貫通ドメインまたはリーダー配列を示す。機能的なドメインもまた、ＭＯＴ
ＩＦＳプログラム（ＧＣＧ  ＷｉｓｃｏｎｓｉｎおよびＰＲＯＳＩＴＥ）を使用
して予測した。
【０１９９】
種々の試験を使用して、本実施例で同定されたタンパク質のインビボの免疫原
性を評価し得る。例えば、そのタンパク質は、組換え的に発現され得、そしてイ
ムノブロットによって患者の血清をスクリーニングするために使用し得る。タン
パク質と患者の血清との間の陽性反応は、この患者が以前に問題のタンパク質に
対する免疫応答を引き起こしたことを示す（すなわち、このタンパク質は免疫原
である）。この方法はまた、免疫優性タンパク質を同定するために使用され得る
。
【０２００】
この組み換えタンパク質をまた、例えばマウスで抗体を調製するために簡便に
使用し得る。タンパク質が細胞表面に局在することの直接的な確認のために、こ
れらを使用し得る。標識された抗体（例えば、ＦＡＣＳのための蛍光標識）をイ
ンタクトな細菌とインキュベートし得、そして細菌表面における標識の存在がこ
のタンパク質の局在を確認する。
【０２０１】
特に、以下の方法（Ａ）〜（Ｓ）を使用して、本発明のタンパク質の発現、精
製、および生化学的特徴付けを行った。
【０２０２】
（Ａ．染色体ＤＮＡ調製）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株２９９６を、１００ｍｌのＧＣ培地中で対数
増殖期まで増殖させ、遠心分離によって収集し、そして５ｍｌ緩衝液（２０％ス
クロース、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８）に再懸
濁した。氷上で１０分間インキュベーションした後、その細菌を１０ｍｌ溶解溶
液（５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  Ｎａ−サルコシル、５０μｇ／ｍｌ  プロテイ
ナーゼＫ）の添加によって溶菌し、そしてその懸濁液を３７℃で２時間インキュ
ベートした。２回のフェノール抽出（ｐＨ８に平衡化）および１回のクロロホル
ム／イソアミルアルコール（２４：１）抽出を行った。ＤＮＡを、０．３Ｍ  酢
酸ナトリウムおよび２容量のエタノールの添加によって沈殿させ、そして遠心分
離によって収集した。ペレットを、７０％エタノールで１回洗浄し、そして４ｍ
ｌ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８）に再溶解
した。ＤＮＡ濃度を、２６０ｎｍにおけるＯＤを読みとることによって測定した
。
【０２０３】
（Ｂ．オリゴヌクレオチド設計）
合成オリゴヌクレオチドプライマーを、（ａ）利用可能な場合にはｍｅｎｉｎ
ｇｏｃｏｃｃｕｓＢ配列、または（ｂ）ｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓ／ｍｅｎｉｎｇｏ
ｃｏｃｃｕｓＡ配列を使用して、必要に応じて、ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓの
好ましいコドン使用頻度に適合させて、各々のＯＲＦのコード配列に基づいて設
計した。予測されるリーダー配列の直後の下流の５’末端増幅プライマー配列を
推定することによって、任意の予測されるシグナルペプチドを除外した。
【０２０４】
５’プライマーは２つの制限酵素部位を含んだ（その遺伝子自体の制限パター
ンに依存して、ＢａｍＨＩ−ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ−ＮｈｅＩ、またはＥｃｏＲ
Ｉ−ＮｈｅＩ）；３’プライマーは、ＸｈｏＩ制限部位を含んだ。この手順を、
各々の増幅産物（各々のＯＲＦに一致する）のクローニングを２つの異なる発現
系：ｐＧＥＸ−ＫＧ（ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩまたはＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩのいず
れかを使用する）、およびｐＥＴ２１ｂ＋（ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩまたはＮｈｅＩ
−ＸｈｏＩのいずれかを使用する）に指向させるために確立した。
【０２０５】
５’末端プライマーテイル：ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧ      （Ｂａｍ
ＨＩ−ＮｄｅＩ）
ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＧＣ      （Ｂａｍ
ＨＩ−ＮｈｅＩ）
ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＡＧＣＴＡＧＣ  （Ｅｃｏ
ＲＩ−ＮｈｅＩ）
３’末端プライマーテイル：      ＣＣＣＧＣＴＣＧＡＧ        （ＸｈｏＩ
）。
【０２０６】
制限酵素認識配列を含むのと同様に、プライマーは、増幅される配列にハイブ
リダイズするヌクレオチドを含んだ。ハイブリダイズするヌクレオチドの数は、
プライマー全体の融解温度に依存し、そして各々のプライマーについて以下の式
を使用して決定した：
Ｔm＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）                                      
（テイルを除外）
Ｔm＝６４．９＋０．４１（％ＧＣ）−６００／Ｎ                        
（プライマー全体）
選択したオリゴの平均融解温度は、オリゴ全体について６５〜７０℃であり、そ
してハイブリダイズ領域単独では５０〜５５℃であった。
【０２０７】
表１は、各増幅のために使用される正方向および逆方向のプライマーを示す。
Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機によってオリゴを合
成し、２ｍｌのＮＨ4ＯＨ中でカラムから溶出し、そして５６℃での５時間のイ
ンキュベートにより脱保護した。このオリゴを０．３Ｍ  酢酸ナトリウムおよび
２容量のエタノールの添加によって沈殿させた。次に、このサンプル遠心分離し
、そしてそのペレットを１００μｌまたは１ｍｌの水のいずれかに再懸濁した。
ＯＤ260を、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｍｂｄａ  Ｂｉｏ分光光度計を使
用して決定し、濃度を決定し、そして２〜１０ｐｍｏｌ／μｌに調整した。
【０２０８】
（Ｃ．増幅）
標準ＰＣＲプロトコールは、以下のとおりである：５０〜２００ｎｇのゲノム
ＤＮＡを、２０〜４０μＭの各オリゴ、４００〜８００μＭのｄＮＴＰｓ溶液、
１×ＰＣＲ緩衝液（１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む）、２．５単位のＴａｑＩ  
ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＡｍｐｌｉＴａｑ、ＧＩＢＣ
Ｏ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ、Ｐｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ、またはＴａｋａｒａ  Ｓ
ｈｕｚｏ  Ｔａｑポリメラーゼを使用する）の存在下でテンプレートとして使用
した。
【０２０９】
いくつかの場合において、ＰＣＲを１０μｌのＤＭＳＯまたは５０μｌの２Ｍ
ベタインの添加によって最適化した。
【０２１０】
ホットスタート（全混合物を９５℃で予め３分間インキュベーションしている
間にポリメラーゼを添加する）の後に、各サンプルに二工程増幅を行った：最初
の５サイクルを、制限酵素のテールを除く１つのオリゴのハイブリダイゼーショ
ン温度を使用して行い、次にオリゴ全長のハイブリダイゼーション温度に従って
３０サイクルを行った。このサイクルの次に、７２℃で最後の１０分間の伸長工
程を行った。
【０２１１】
標準サイクルは、以下のとおりである：
変性      ハイブリダイゼーション      伸長
最初の５サイクル      ３０秒            ３０秒            ３０〜６０秒  
９５℃          ５０〜５５℃          ７２℃
最後の３０サイクル    ３０秒            ３０秒            ３０〜６０秒  
９５℃          ６５〜７０℃          ７２℃
伸長時間は、増幅されるＯＲＦの長さに従って変化する。
【０２１２】
増幅を９６００または２４００のいずれかのＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｇｅ
ｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステムを使用して行った。結果を確認するために、増幅容
量の１／１０を１〜１．５％アガロースゲルにロードし、そして各増幅フラグメ
ントのサイズをＤＮＡ分子量マーカーと比較した。
【０２１３】
増幅したＤＮＡを、１％アガロースゲルに直接ロードしたか、またはまずエタ
ノール沈殿し、そして適切な容量に再懸濁し、１％アガロースゲルにロードした
。次に、正確なサイズのバンドに対応するＤＮＡフラグメントを、Ｑｉａｇｅｎ
Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用し、製造業者の指示に従い、ゲ
ルから溶出して精製した。ＤＮＡフラグメントの最終容量は、水または１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５の、３０μｌまたは５０μｌのいずれかであった。
【０２１４】
（Ｄ．ＰＣＲフラグメントの切断）
増幅フラグメントに対応する精製ＤＮＡを２つのアリコートに分け、そして以
下を用いて二重に消化した：
−ｐＥＴ−２１ｂ＋へのクローニングおよびＣ末端Ｈｉｓ−タグ融合物としての
タンパク質のさらなる発現のためのＮｄｅＩ／ＸｈｏＩまたはＮｈｅＩ／Ｘｈｏ
Ｉ
−ｐＧＥＸ−ＫＧへのクローニングおよびＮ末端ＧＳＴ融合物としてのタンパク
質のさらなる発現のためのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩまたはＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ
−ｐＧｅｘ−ＨｉｓへのクローニングおよびＮ末端Ｈｉｓ−タグ融合物としての
タンパク質のさらなる発現のためのＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ／Ｓａｌ
Ｉ、ＳａｌＩ／ＰｓｔＩ。
【０２１５】
各精製ＤＮＡフラグメントを、各制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏ
ｌａｂｓ）２０単位を用い、適切な緩衝液の存在下の３０または４０μｌのいず
れかの最終容量中で、インキュベートした（３７℃で３時間〜オーバーナイト）
。次に、消化産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを使用して、製造業者
の指示に従い、精製し、そして、水または１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８
．５）のいずれかの３０または５０μｌの最終容量中で溶出した。最終ＤＮＡ濃
度を、適定した分子量マーカーの存在下での１％アガロースゲル電気泳動によっ
て決定した。
【０２１６】
（Ｅ）クローニングベクター（ｐＥＴ２２Ｂ、ｐＧＥＸ−ＫＧ、ｐＴＲＣ−Ｈ
ｉｓＡ、およびｐＧｅｘ−Ｈｉｓ）の消化）
１０μｇのプラスミドを、適切な緩衝液の存在下で、２００μｌの反応容量中
で、５０単位の各制限酵素を用いて、３７℃で一晩のインキュベーションで２重
に消化した。消化物全体を１％アガロースゲルにロードした後に、消化したベク
ターに対応するバンドを、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒ
ａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用してゲルから精製し、そのＤＮＡを５０μｌの１０
ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）中に溶出した。ＤＮＡ濃度をサンプルの
ＯＤ260を測定することにより評価し、そして５０μｇ／μｌに調整した。１μ
ｌのプラスミドを、各クローニング手順に使用した。
【０２１７】
ベクターｐＧＥＸ−Ｈｉｓは、トロンビン切断部位の上流に６つのヒスチジン
残基をコードする領域を有し、ベクターｐＴＲＣ９９（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の
多重クローニング部位を含有する改変したｐＧＥＸ−２Ｔベクターである。
【０２１８】
（Ｆ）クローニング）
以前に消化して精製した各ＯＲＦに対応するフラグメントを、ｐＥＴ２２ｂお
よびｐＧＥＸ−ＫＧの両方にライゲーションした。最終容量２０μｌ中で、分子
比３：１のフラグメント／ベクターを、０．５μｌのＮＥＢ  Ｔ４  ＤＮＡリガ
ーゼ（４００単位／μｌ）を使用して、製造業者から供給された緩衝液の存在下
でライゲーションした。この反応物を、室温で３時間、インキュベートした。い
くつかの実験において、ライゲーションを、Ｂｏｈｅｒｉｎｇｅｒの「Ｒａｐｉ
ｄ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」を使用して、製造業者の指示に従い、行った。
【０２１９】
適切な株に組換えプラスミドを導入するために、１００μｌのＥ．ｃｏｌｉ  
ＤＨ５コンピテント細胞を、リガーゼ反応溶液とともに、４０分間氷上でインキ
ュベートし、次に、３７℃で３分間インキュベートし、次に、８００μｌのＬＢ
ブロスを添加した後、再度３７℃で２０分間インキュベートした。次に細胞を、
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆの微量遠心機において最大速度で遠心分離し、そして約２０
０μｌの上清に再懸濁した。次に、その懸濁物をＬＢアンピシリン（１００ｍｇ
／ｍｌ）上にプレーティングした。
【０２２０】
組換えクローンのスクリーニングを、無作為に選択した５つのコロニーを、１
００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えた２ｍｌ（ｐＧＥＸまたはｐＴＣクローン
）または５ｍｌ（ｐＥＴクローン）のＬＢブロスのいずれかにおいて３７℃で一
晩増殖させて、行った。次に、細胞をペレットにして、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｐ
ｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを使用し、製造業者の指示に従い
、ＤＮＡを最終容量３０μｌに抽出した。各々個々のミニプレップ（約１ｇ）の
５μｌを、ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩまたはＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩのいずれかを用いて
消化し、そして全消化物を、１〜１．５％アガロースゲル（予想インサートのサ
イズに依存する）に、分子量マーカー（１Ｋｂ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ、ＧＩＢ
ＣＯ）と並行してロードした。陽性クローンのスクリーニングを、正確なインサ
ートのサイズに基づいて行った。
【０２２１】
（Ｇ）発現）
発現ベクターにクローニングした各ＯＲＦを、組換えタンパク質産物の発現に
適切な株に形質転換した。各構築物の１μｌを使用して、３０μｌのＥ．ｃｏｌ
ｉ  ＢＬ２１（ｐＧＥＸベクター）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０（ｐＴＲＣベク
ター）またはＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＤＥ３（ｐＥＴベクター）を、上記のよ
うに形質転換した。ｐＧＥＸ−Ｈｉｓベクターの場合、同一のＥ．ｃｏｌｉ株（
Ｗ３１１０）を初期のクローニングおよび発現のために使用した。単一の組換え
コロニーを２ｍｌのＬＢおよびアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）に接種し、３
７℃で一晩インキュベートし、次に、１００ｍｌのフラスコ中で２０ｍｌのＬＢ
およびアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）中に１：３０で希釈した（ＯＤ600の
範囲が０．１〜０．１５の間であることを確認する）。このフラスコをＯＤが発
現の誘導に適切な指数増殖期を示すまで（ｐＥＴおよびｐＴＲＣベクターについ
て、０．４〜０．８  ＯＤ；ｐＧＥＸおよびｐＧＥＸ−Ｈｉｓベクターについて
０．８〜１  ＯＤ）、回転型水浴振とう機中で３０℃でインキュベートした。ｐ
ＥＴ、ｐＴＲＣおよびｐＧＥＸ−Ｈｉｓベクターについて、タンパク質の発現を
１ｍＭ  ＩＰＴＧの添加によって誘導し、一方、ｐＧＥＸ系の場合、ＩＰＴＧの
最終濃度は、０．２ｍＭであった。３０℃での３時間のインキュベーションの後
、サンプルの最終濃度を、ＯＤによって確認した。発現を確認するために、１ｍ
ｌの各サンプルを取り出し、微量遠心機で遠心分離し、ペレットをＰＢＳ中で再
懸濁し、そしてクマシーブルー染色を用いる１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって
分析した。全サンプルを６０００ｇで遠心分離し、そしてペレットをさらなる使
用のためにＰＢＳ中に再懸濁した。
【０２２２】
（Ｈ）ＧＳＴ融合タンパク質の大規模精製）
単一のコロニーをＬＢおよびアンピシリンアガープレート上で３７℃で一晩増
殖させた。細菌を、水浴振とう機中の２０ｍｌのＬＢおよびアンピシリン液体培
養物中に接種し、一晩増殖させた。細菌を、６００ｍｌの新鮮な培地中に１：３
０に希釈し、最適な温度（２０〜３７℃）でＯＤ550０．８〜１まで増殖させた
。タンパク質の発現を０．２ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導し、続いて、３時間イ
ンキュベートした。培養物を８０００ｒｐｍで４℃で遠心分離した。上清を捨て
、細菌のペレットを７．５ｍｌの冷ＰＢＳ中に懸濁した。この細胞を、Ｂｒａｎ
ｓｏｎ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ  Ｂ−１５を使用し、氷上で、３０秒間、４０Ｗで超
音波処理して、破砕し、２回凍結融解して、再度遠心分離した。この上清を回収
し、１５０μｌのグルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ樹脂（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）（前もってＰＢＳで洗浄）と混合し、室温で３０分間インキュベートし
た。このサンプルを７００ｇで５分間４℃で遠心分離した。この樹脂を１０ｍｌ
の冷ＰＢＳを用いて、１０分間、２回洗浄し、１ｍｌの冷ＰＢＳに再懸濁し、そ
して使い捨てカラムにロードした。この樹脂をフロースルーが０．０２〜０．０
６のＯＤ280に到達するまで２ｍｌの冷ＰＢＳで２回洗浄した。ＧＳＴ融合タン
パク質を、７００μｌの冷グルタチオン溶出緩衝液（１０ｍＭ  還元グルタチオ
ン、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）の添加によって溶出し、そして画分をＯＤ28
0が０．１になるまで回収した。各画分の２１μｌを、Ｂｉｏｒａｄ  ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｂｒｏａｄ
ｒａｎｇｅ（Ｍ１）（２００、１１６．２５、９７．４、６６．２、４５、３
１、２１．５、１４．４、６．５ｋＤａ）またはＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｒａｉｎｂ
ｏｗ  Ｍａｒｋｅｒ（Ｍ２）（２２０、６６、４６、３０、２１．５、１４．３
ｋＤａ）のいずれかを標準として使用する１２％ＳＤＳゲル上にロードした。Ｇ
ＳＴの分子量が２６ｋＤａなので、この値を各ＧＳＴ融合タンパク質の分子量に
添加しなければならない。
【０２２３】
（Ｉ）Ｈｉｓ−融合物の溶解度分析）
Ｈｉｓ融合発現産物の溶解度を分析するために、３ｍｌ培養物のペレットを、
緩衝液Ｍ１［５００μｌ  ＰＢＳ  ｐＨ７．２］中に再懸濁した。２５μｌのリ
ゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、細菌を１５分間、４℃でインキュベート
した。このペレットを、Ｂｒａｎｓｏｎ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ  Ｂ−１５を使用し
、４０Ｗで３０秒間、超音波処理して、２回凍結融解して、次いで再度、遠心分
離工程によってペレットと上清に分離した。この上清を回収し、そしてこのペレ
ットを緩衝液Ｍ２［８Ｍ  尿素、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  イミダゾール
および０．１Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4］に再懸濁し、４℃で３〜４時間、インキュベー
トした。遠心分離の後、上清を回収し、そしてペレットを緩衝液Ｍ３［６Ｍ  グ
アニジニウム−ＨＣｌ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  イミダゾールおよび０
．１Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4］に４℃、一晩再懸濁した。全工程からの上清を、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥで分析した。
【０２２４】
（Ｊ）Ｈｉｓ−融合物の大規模精製）
単一のコロニーをＬＢおよびアンピシリンアガープレート上で３７℃で一晩増
殖させた。細菌を、２０ｍｌのＬＢおよびアンピシリン液体培養物中に接種し、
水浴振とう機中で一晩インキュベートした。細菌を、６００ｍｌの新鮮な培地中
に１：３０に希釈し、最適な温度（２０〜３７℃）でＯＤ550が０．６〜０．８
まで増殖させた。タンパク質の発現を１ｍＭのＩＰＴＧの添加によって誘導し、
そして、培養物をさらに３時間インキュベートした。培養物を４℃で８０００ｒ
ｐｍ、遠心分離した。上清を捨て、細菌のペレットを７．５ｍｌの（ｉ）可溶性
タンパク質について冷緩衝液Ａ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  リン酸緩衝
液、１０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ８）、または（ｉｉ）不溶性タンパク質につ
いて緩衝液Ｂ（尿素８Ｍ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  リン酸緩
衝液、ｐＨ８．８）中に懸濁した。
【０２２５】
この細胞を、Ｂｒａｎｓｏｎ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ  Ｂ−１５を使用し、氷上で
、３０秒間、４０Ｗで超音波処理して、破砕し、２回凍結融解して、そして再度
遠心分離した。
【０２２６】
不溶性タンパク質について、上清を−２０℃に保存し、一方、ペレットを２ｍ
ｌの緩衝液Ｃ（６Ｍ  塩酸グアニジン、１００ｍＭ  リン酸緩衝液、１０ｍＭ  
Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ、ｐＨ７．５）に再懸濁し、そしてホモジナイザーで１０サイ
クル処理した。この産物を１３０００ｒｐｍで４０分間遠心分離した。
【０２２７】
上清を回収し、１５０μｌのＮｉ2+−樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（適切なよ
うに、緩衝液Ａまたは緩衝液Ｂのいずれかで前もって洗浄する）と混合し、３０
分間、穏やかな撹拌をしながら、室温でインキュベートした。このサンプルを４
℃で５分間、７００ｇで遠心分離した。この樹脂を１０ｍｌの緩衝液ＡまたはＢ
を用いて１０分間、２回洗浄し、１ｍｌの緩衝液ＡまたはＢ中に再懸濁し、使い
捨てカラムにロードした。この樹脂を、（ｉ）２ｍｌの冷緩衝液Ａを用いて４℃
で、または（ｉｉ）２ｍｌの緩衝液Ｂを用いて室温でのいずれかで、フロースル
ーが０．０２〜０．０６のＯＤ280に達するまで洗浄した。
【０２２８】
この樹脂を、（ｉ）２ｍｌの冷２０ｍＭのイミダゾール緩衝液（３００ｍＭ  
ＮａＣｌ、５０ｍＭ  リン酸緩衝液、２０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ８）、また
は（ｉｉ）緩衝液Ｄ（尿素８Ｍ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  リ
ン酸緩衝液、ｐＨ６．３）のいずれかで、フロースルーが０．０２〜０．０６の
ＯＤ280に達するまで洗浄した。このＨｉｓ−融合タンパク質を、７００μｌの
（ｉ）冷溶出緩衝液Ａ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  リン酸緩衝液、２５
０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ８）、または（ｉｉ）溶出緩衝液Ｂ（尿素８Ｍ、１
０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  リン酸緩衝液、ｐＨ４．５）のいずれ
かの添加によって溶出し、ＯＤ280が０．１になるまで、画分を回収した。２１
μｌの各画分を、１２％ＳＤＳゲルにロードした。
【０２２９】
（Ｋ）Ｈｉｓ−融合タンパク質の再生）
１０％グリセロールを、変性タンパク質に添加した。次にこのタンパク質を透
析緩衝液Ｉ（１０％グリセロール、０．５Ｍ  アルギニン、５０ｍＭ  リン酸緩
衝液、５ｍＭ  還元型グルタチオン、０．５ｍＭ  酸化型グルタチオン、２Ｍ  
尿素、ｐＨ８．８）を使用して２０μｇ／ｍｌまで希釈し、同じ緩衝液に対して
、４℃で１２〜１４時間透析した。このタンパク質をさらに透析緩衝液ＩＩ（１
０％グリセロール、０．５Ｍ  アルギニン、５０ｍＭ  リン酸緩衝液、５ｍＭ  
還元型グルタチオン、０．５ｍＭ  酸化型グルタチオン、ｐＨ８．８）に対して
４℃で１２〜１４時間透析した。タンパク質濃度を、以下の式を用いて推定した
：
タンパク質（ｍｇ／ｍｌ）＝（１．５５×ＯＤ280）−（０．７６×ＯＤ260）。
【０２３０】
（Ｌ）Ｈｉｓ−融合物の大規模精製）
５００ｍｌの細菌培養物を誘導し、そして融合タンパク質を、上記の手順を使
用して、緩衝液Ｍ１、Ｍ２またはＭ３中で可溶化した。細菌の粗抽出物を、この
融合タンパク質の可溶化緩衝液に依存して、緩衝液Ｍ１、Ｍ２またはＭ３を用い
て平衡化したＮｉ−ＮＴＡスーパーフローカラム（Ｑｉａｇｅｎ）上にロードし
た。結合しない物質を、カラムを同一の緩衝液で洗浄することにより溶出した。
対応する５００ｍＭのイミダゾールを含有する緩衝液を用いて、特異的なタンパ
ク質を溶出し、イミダゾールを含有しない対応する緩衝液に対して、透析した。
各操作の後、このカラムを、少なくとも２カラム容量の０．５Ｍ  水酸化ナトリ
ウムを用いて洗浄することにより、消毒し、次の使用の前に再度平衡化した。
【０２３１】
（Ｍ）マウスの免疫化）
２０μｇの各精製タンパク質を使用して、マウスの腹腔内で免疫した。ＯＲＦ
４４の場合、ＣＤ１マウスを、Ａｌ（ＯＨ）3をアジュバントとして用いて、１
、２１および４２日目に免疫し、そして５６日目に採取したサンプルにおける免
疫応答をモニターした。ＯＲＦ４０について、ＣＤ１マウスを、ＡＬ（ＯＨ）3
ではなくフロイントアジュバントを用いて免疫し、そして免疫応答を５６日目で
はなく４２日目に測定したことを除いて、同一の免疫プロトコールを使用した。
同様に、ＯＲＦ３８について、ＣＤ１マウスをフロイントアジュバントを用いて
免疫したが、免疫応答を４９日目に測定した。
【０２３２】
（Ｎ）ＥＬＩＳＡアッセイ（血清分析））
無莢膜のＭｅｎＢ  Ｍ７株を、チョコレートアガープレート上にプレートし、
３７℃でオーバーナイトでインキュベートした。細菌のコロニーをアガープレー
トから滅菌ドラコン（ｄｒａｃｏｎ）スワブを使用して回収し、０．２５％グル
コースを含有する７ｍｌのＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス（Ｄｉｆｃｏ）
中に接種した。細菌の増殖を３０分毎に、ＯＤ620を追跡することによりモニタ
ーした。細菌をＯＤが０．３〜０．４の値に達するまで増殖させた。培養物を１
０分間１００００ｒｐｍで遠心分離した。上清を捨て、細菌をＰＢＳで１回洗浄
し、０．０２５％のホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中に再懸濁し、室温で２
時間インキュベートし、次に４℃でオーバーナイトで攪拌しながらインキュベー
トした。１００μｌの細菌細胞を、９６ウェルＧｒｅｉｎｅｒプレートの各ウェ
ルに添加し、そして４℃でオーバーナイトでインキュベートした。次にそのウェ
ルをＰＢＴ洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて３回
洗浄した。２００μｌの飽和緩衝液（水中に２．７％のポリビニルピロリドン  
１０）を各ウェルに添加し、そしてプレートを３７℃で２時間インキュベートし
た。ウェルをＰＢＴで３回洗浄した。２００μｌの希釈血清（希釈緩衝液：ＰＢ
Ｓ中に１％  ＢＳＡ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１％  ＮａＮ3）を各
ウェルに添加し、そしてそのプレートを３７℃で９０分間インキュベートした。
ウェルをＰＢＴで３回洗浄した。希釈緩衝液中に１：２０００に希釈した１００
μｌのＨＲＰ−結合体化ウサギ抗マウス（Ｄａｋｏ）血清を、各ウェルに添加し
、そのプレートを３７℃で９０分間インキュベートした。ウェルを、ＰＢＴ緩衝
液で３回洗浄した。１００μｌのＨＲＰのための基質緩衝液（２５ｍｌのクエン
酸緩衝液、ｐＨ５、１０ｍｇのＯ−フェニルジアミンおよび１０μｌのＨ2Ｏ）
を各ウェルに添加し、このプレートを室温に２０分間放置した。１００μｌのＨ
2ＳＯ4を各ウェルに添加し、ＯＤ490を追跡した。ＯＤ490が対応する免疫前血清
の２．５倍である場合、ＥＬＩＳＡが陽性であると考慮した。
【０２３３】
（Ｏ）ＦＡＣＳｃａｎ細菌結合アッセイ手順）
無莢膜ＭｅｎＢ  Ｍ７株をチョコレートアガープレートにプレートし、３７℃
でオーバーナイトでインキュベートした。細菌のコロニーをアガープレートから
滅菌ドラコン（ｄｒａｃｏｎ）スワブを使用して回収し、０．２５％グルコース
を含有する各々８ｍｌのＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス（Ｄｉｆｃｏ）を
含む４本のチューブに中に接種した。細菌の増殖を３０分毎に、ＯＤ620を追跡
することによりモニターした。細菌を、ＯＤが０．３５〜０．５の値に達するま
で増殖させた。培養物を１０分間４０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を捨て、
ペレットをブロッキング緩衝液（１％  ＢＳＡ、０．４％  ＮａＮ3）中に再懸
濁し、５分間４０００ｒｐｍで遠心分離した。細胞をＯＤ620が０．０７に達す
るようにブロッキング緩衝液に再懸濁した。１００μｌの細菌細胞を、Ｃｏｓｔ
ｅｒ９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。１００μｌの希釈（１：２００
）血清（ブロッキング緩衝液中）を各ウェルに添加し、そしてそのプレートを４
℃で２時間インキュベートした。細胞を５分間４０００ｒｐｍで遠心分離し、そ
の上清を吸引し、各ウェルに２００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液を添加す
ることにより、細胞を洗浄した。１００μｌのＲ−フィコエリトリン結合体化Ｆ
（ａｂ）2ヤギ抗マウス（１：１００希釈）を各ウェルに添加し、そしてプレー
トを１時間４℃でインキュベートした。細胞を、４０００ｒｐｍ５分間の遠心分
離によって遠心沈殿し、２００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液を添加するこ
とにより、洗浄した。その上清を吸引し、そして細胞を２００μｌ／ウェルのＰ
ＢＳ、０．２５％のホルムアルデヒドに再懸濁した。そのサンプルをＦＡＣＳｃ
ａｎチューブに移して、読み取った。ＦＡＣＳｃａｎ設定の条件は、以下のとお
りである：ＦＬ１  オン、ＦＬ２およびＦＬ３  オフ；ＦＳＣ−Ｈ閾値：９２；
ＦＳＣ  ＰＭＴ電圧：Ｅ  ０２；ＳＳＣ  ＰＭＴ：４７４；増幅利得  ７．１：
ＦＬ−２  ＰＭＴ：５３９；補償値：０。
【０２３４】
（Ｐ）ＯＭＶ調製）
細菌を５ＧＣプレート上でオーバーナイトで増殖させ、白金耳を用いて採取し
、そして１０ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに再懸濁した。５６℃、３０分
間の熱不活化を行い、そして細菌を１０分間氷上で超音波処理することにより破
壊した（５０％  衝撃係数、５０％  出力）。未破壊細胞を５０００ｇ、１０分
間の遠心分離によって除去し、そして全細胞エンベロープ画分を５００００ｇ、
４℃、７５分間の遠心分離によって回収した。細胞質膜タンパク質を粗外膜から
抽出するために、全画分を２％サルコシル（Ｓｉｇｍａ）中に再懸濁し、そして
室温で２０分間インキュベートした。この懸濁液を、１００００ｇで１０分間遠
心し、凝集物を除去し、そしてこの上清をさらに５００００ｇで７５分間、超遠
心分離して、外膜をペレット化した。この外膜を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８）に再懸濁し、そしてそのタンパク質濃度をＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔ
ｅｉｎアッセイによって、ＢＳＡを標準として用いて測定した。
【０２３５】
（Ｑ）全抽出物の調製）
細菌をＧＣプレート上でオーバーナイトで増殖させ、白金耳を用いて採取し、
そして１ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに再懸濁した。５６℃、３０分の熱
不活化を行った。
【０２３６】
（Ｒ）ウェスタンブロッティング）
ＭｅｎＢ株２９９６由来の精製タンパク質（５００ｎｇ／レーン）、外膜ベシ
クル（５μｇ）および全細胞抽出物（２５μｇ）を、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上
にロードし、ニトロセルロース膜上に転写した。この転写を、２時間、１５０ｍ
Ａ、４℃、転写緩衝液中（０．３％  Ｔｒｉｓ塩基、１．４４％  グリシン、２
０％  メタノール）で行った。この膜を飽和緩衝液（ＰＢＳ中の１０％  スキム
ミルク、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００）中での４℃のオーバーナイトのイ
ンキュベートにより飽和させた。この膜を洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の３％  スキム
ミルク、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００）を用いて２回洗浄し、洗浄緩衝液
中に１：２００に希釈したマウス血清とともに、２時間３７℃でインキュベート
した。この膜を２回洗浄し、１：２０００希釈の西洋わさびペルオキシダーゼ標
識化抗マウスＩｇとともに９０分間インキュベートした。この膜をＰＢＳ中の０
．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を用いて２回洗浄し、Ｏｐｔｉ−４ＣＮ基質キ
ット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、発色させた。この反応を水を添加して停止し
た。
【０２３７】
（Ｓ）殺菌性アッセイ）
ＭＣ５８株をチョコレートアガープレート上で、３７℃でオーバーナイトで増
殖させた。５〜７のコロニーを回収し、そして７ｍｌのＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎ
ｔｏｎブロスに接種するために使用した。この懸濁液を、旋回装置上で３７℃で
インキュベートし、ＯＤ620が０．５〜０．８になるまで増殖させた。この培養
物を滅菌１．５ｍｌエッペンドルフチューブに等分し、微量遠心機中で最大速度
で２０分間遠心分離した。このペレットをＧｅｙ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）中で１回
洗浄し、そして同一の緩衝液中でＯＤ620を０．５に再懸濁し、Ｇｅｙ緩衝液中
に１：２００００に希釈し、２５℃で保存した。
【０２３８】
５０μｌのＧｅｙ緩衝液／１％  ＢＳＡを９６ウェル組織培養プレートの各ウ
ェルに添加した。２５μｌの希釈マウス血清（Ｇｅｙ緩衝液／０．２％  ＢＳＡ
中に１：１００）を各ウェルに添加し、そのプレートを４℃でインキュベートし
た。上記記載の細菌懸濁液の２５μｌを各ウェルに添加した。熱不活化（５６℃
水浴中に３０分）または正常乳児ウサギ補体のいずれかの２５μｌを各ウェルに
添加した。乳児ウサギ補体の添加の直後に、１ウェルあたり２２μｌの各サンプ
ルをＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎアガープレート上にプレートした（時間０）
。この９６ウェルプレートを１時間３７℃で回転しながらインキュベートし、次
に、１ウェルあたり２２μｌの各サンプルをＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎアガ
ープレート上にプレートした（時間１）。オーバーナイトのインキュベートの後
、時間０および時間１に対応するコロニーを計数した。
【０２３９】
表２は、クローニング、発現および精製結果の概要を示す。
【０２４０】
（実施例１）
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓで同定された（配列
番号１）：
【０２４１】
【化１】
2009100781.tif 000002
これは、以下のアミノ酸配列（配列番号２；ＯＲＦ４０）に対応する：
【０２４２】
【化２】
2009100781.tif 000003
さらなる研究は、以下の完全ＤＮＡ配列を明らかにした（配列番号３）
【０２４３】
【化３】
2009100781.tif 000004
これは、以下のアミノ酸配列（配列番号４；ＯＲＦ４０−１）に対応する：
【０２４４】
【化４】
2009100781.tif 000005
さらなる研究は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＡ株における対応遺伝子を
同定した(配列番号５)：
【０２４５】
【化５】
2009100781.tif 000006
これは、以下のアミノ酸配列（配列番号６；ＯＲＦ４０ａ）を有するタンパク
質をコードする：
【０２４６】
【化６】
2009100781.tif 000007
初めに同定されたＢ系統部分配列（ＯＲＦ４０）は、ＯＲＦ４０ａとの２５４
アミノ酸重複にわたって６５．７％の同一性を示す：
【０２４７】
【化７】
2009100781.tif 000008
系統Ｂ完全配列（ＯＲＦ４０−１）およびＯＲＦ４０ａは、６０１アミノ酸重
複において８３．７％の同一性を示す：
【０２４８】
【化８】
2009100781.tif 000009
これらのアミノ酸配列のコンピューター解析は、以下の結果を与えた。
【０２４９】
（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（受託番号Ｕ４１８５２）のｂ型表面筋原繊維遺
伝子座によりコードされるＨｓｆタンパク質との相同性）
ＯＲＦ４０およびＨｓｆタンパク質は、２５１アミノ酸重複において５４％の
アミノ酸同一性を示す：
【０２５０】
【化９】
2009100781.tif 000010
ＯＲＦ４０ａはまた、Ｈｓｆに対しても相同性を示す：
【０２５１】
【化１０】
2009100781.tif 000011
Ｈｓｆとの相同性に基づいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のこのタン
パク質、ならびにそれらのエピトープは、ワクチンもしくは診断薬のための有用
な抗原になり得ることが予測された。
【０２５２】
ＯＲＦ４０−１（６１ｋＤａ）を上記のように、ｐＥＴベクターおよびｐＧｅ
ｘベクターにクローン化し、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。タンパク質発現
および精製の産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。図１ＡはＨｉｓ融合タ
ンパク質のアフィニティ−精製の結果を示し、そして図１ＢはＥ．ｃｏｌｉにお
けるＧＳＴ融合体の発現の結果を示す。精製Ｈｉｓ融合タンパク質を使用してマ
ウスを免疫し、その血清をＦＡＣＳ分析のため（図１Ｃ）、殺菌性アッセイのた
め（図１Ｄ）およびＥＬＩＳＡのため（陽性結果）に使用した。これらの実験は
、ＯＲＦ４０−１が表面露出タンパク質であり、そして有用な免疫原であること
を確認する。
【０２５３】
図１Ｅは、ＯＲＦ４０−１についての親水性、抗原性指標、およびＡＭＰＨＩ
領域のプロットを示す。
【０２５４】
（実施例２）
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された
（配列番号７）：
【０２５５】
【化１１】
2009100781.tif 000012
これは、アミノ酸配列（配列番号８；ＯＲＦ３８）に対応する：
【０２５６】
【化１２】
2009100781.tif 000013
さらなる研究が、完全ヌクレオチド配列（配列番号９）を明らかにした：
【０２５７】
【化１３】
2009100781.tif 000014
これは、以下のアミノ酸配列（配列番号１０；ＯＲＦ３８−１）に対応する：
【０２５８】
【化１４】
2009100781.tif 000015
このアミノ酸配列のコンピューター解析が、推定の原核生物膜リポタンパク質
の脂質付着部位（下線）を明らかにする。
【０２５９】
さらなる研究は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＡ系統における対応遺伝子
を同定した（配列番号１１）：
【０２６０】
【化１５】
2009100781.tif 000016
これは、以下のアミノ酸配列（配列番号１２；ＯＲＦ３８ａ）を有するタンパ
ク質をコードする：
【０２６１】
【化１６】
2009100781.tif 000017
初めに同定されたＢ系統部分配列（ＯＲＦ３８）は、ＯＲＦ３８ａとの１６５
アミノ酸重複にわたって９５．２％の同一性を示す：
【０２６２】
【化１７】
2009100781.tif 000018
Ｂ系統完全配列（ＯＲＦ３８−１）およびＯＲＦ３８ａは３２１アミノ酸の重
複内で９８．４％の同一性を示す：
【０２６３】
【化１８】
2009100781.tif 000019
これらのアミノ酸配列のコンピューター解析は、以下の結果を与えた。
【０２６４】
（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ（受託番号Ｘ８２４２７）のリポタンパク質（リポ）との
相同性）
ＯＲＦ３８およびリポは、９６アミノ酸の重複内で３８％のアミノ酸同一性を
示す：
【０２６５】
【化１９】
2009100781.tif 000020
この解析に基づいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のこのタンパク質、
ならびにそのエピトープは、ワクチンもしくは診断薬のための有用な抗原になり
得ることが予測された。
【０２６６】
ＯＲＦ３８−１（３２ｋＤａ）を上記のように、ｐＥＴベクターおよびｐＧｅ
ｘベクターにクローン化し、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。タンパク質発現
および精製の産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。図２ＡはＨｉｓ融合タ
ンパク質のアフィニティ−精製の結果を示し、そして図２ＢはＥ．ｃｏｌｉにお
けるＧＳＴ融合体の発現の結果を示す。精製Ｈｉｓ融合タンパク質を使用してマ
ウスを免疫し、その血清をウェスタンブロット分析のため（図２Ｃ）、およびＦ
ＡＣＳ分析のため（図２Ｄ）に使用した。これらの実験は、ＯＲＦ３８−１が表
面露出タンパク質であり、そして有用な免疫原であることを確認する。
【０２６７】
図２Ｅは、ＯＲＦ３８−１についての親水性、抗原性指標、およびＡＭＰＨＩ
領域のプロットを示す。
【０２６８】
（実施例３）
以下のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓＤＮＡ配列が、同定された（配列番号１
３）：
【０２６９】
【化２０】
2009100781.tif 000021
これは、以下のアミノ酸配列（配列番号１４；ＯＲＦ４４）に対応する：
【０２７０】
【化２１】
2009100781.tif 000022
このアミノ酸配列のコンピューター解析が、下線で示したリーダーペプチドを
推定した。
【０２７１】
さらなる研究は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＡ系統における対応遺伝子
を同定した（配列番号１５）：
【０２７２】
【化２２】
2009100781.tif 000023
これは、以下のアミノ酸配列（配列番号１６；ＯＲＦ４４ａ）を有するタンパ
ク質をコードする：
【０２７３】
【化２３】
2009100781.tif 000024
Ｂ系統の配列（ＯＲＦ４４）は、ＯＲＦ４４ａとの１２４アミノ酸の重複にわ
たって９９．２％の同一性を示す：
【０２７４】
【化２４】
2009100781.tif 000025
コンピューター分析は、以下の結果を与えた：
（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓのＬｅｃＡ付着因子（受託番号
Ｄ７８１５３）との相同性）
ＯＲＦ４４およびＬｅｃＡタンパク質は、９１アミノ酸の重複内で４５％のア
ミノ酸同一性を示す：
【０２７５】
【化２５】
2009100781.tif 000026
付着因子との相同性に基づいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のこのタ
ンパク質、ならびにそのエピトープは、ワクチンもしくは診断薬のための有用な
抗原になり得ることが予測された。
【０２７６】
ＯＲＦ４４−１（１１．２ｋＤａ）を上記のように、ｐＥＴベクターおよびｐ
Ｇｅｘベクターにクローン化し、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。タンパク質
発現および精製の産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。図３ＡはＨｉｓ融
合タンパク質のアフィニティ−精製の結果を示し、そして図３ＢはＥ．ｃｏｌｉ
におけるＧＳＴ融合体の発現の結果を示す。精製Ｈｉｓ融合タンパク質を使用し
てマウスを免疫し、その血清をＥＬＩＳＡのために使用し、陽性の結果を得、そ
して殺菌性アッセイのため（図３Ｃ）に使用した。これらの実験は、ＯＲＦ４４
−１が表面露出タンパク質であり、そして有用な免疫原であることを確認する。
【０２７７】
図３Ｄは、ＯＲＦ４４−１についての親水性、抗原性指標、およびＡＭＰＨＩ
領域のプロットを示す。
【０２７８】
（実施例４）
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された
（配列番号１７）：
【０２７９】
【化２６】
2009100781.tif 000027
これは、以下のアミノ酸配列（配列番号１８；ＯＲＦ４９）に対応する：
【０２８０】
【化２７】
2009100781.tif 000028
さらなる研究が、完全ヌクレオチド配列（配列番号１９）を明らかにした：
【０２８１】
【化２８】
2009100781.tif 000029
これは、以下のアミノ酸配列（配列番号２０；ＯＲＦ４９−１）に対応する：
【０２８２】
【化２９】
2009100781.tif 000030
コンピューター解析は、膜貫通ドメインを予想し、そしてまたＯＲＦ４９が、
公知のタンパク質と有意なアミノ酸相同性を有さないことを示す。しかし、Ｎ．
ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＡ系統由来の対応するＯＲＦが、同定された：
ＯＲＦ４９は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＡ系統由来のＯＲＦ（ＯＲＦ
４９ａ）と、１７３アミノ酸の重複にわたって、８６．１％の同一性を示す：
【０２８３】
【化３０】
2009100781.tif 000031
ＯＲＦ４９−１およびＯＲＦ４９ａは、４５７アミノ酸の重複内で８３．２％
の同一性を示す：
【０２８４】
【化３１】
2009100781.tif 000032
完全長ＯＲＦ４９ａのヌクレオチド配列（配列番号２１）は、以下である：
【０２８５】
【化３２】
2009100781.tif 000033
これは、以下のアミノ酸配列（配列番号２２）を有するタンパク質をコードす
る：
【０２８６】
【化３３】
2009100781.tif 000034
推定膜貫通ドメインの存在に基づいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の
これらのタンパク質およびこれらのエピトープは、ワクチンまたは診断のための
有用な抗原であり得ることが推定される。
【０２８７】
（実施例５）
以下の部分ＤＮＡ配列をＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓで同定した（配列番号
２３）。
【０２８８】
【化３４】
2009100781.tif 000035
これは、以下のアミノ酸配列（配列番号２４；ＯＲＦ５０）に対応する：
【０２８９】
【化３５】
2009100781.tif 000036
コンピューター分析は、２つの膜貫通ドメインを推定し、そしてまたＯＲＦ５
０が公知のタンパク質との有意なアミノ酸相同性を有さないことを示す。
【０２９０】
推定膜貫通ドメインの存在に基づいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の
このタンパク質、およびそのエピトープがワクチンまたは診断のために有用な抗
原であり得ることが推定される。
【０２９１】
（実施例６）
以下の部分配列をＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定した（配列番号
２５）。
【０２９２】
【化３６】
2009100781.tif 000037
これは、以下のアミノ酸配列（配列番号２６；ＯＲＦ３９）に対応する：
【０２９３】
【化３７】
2009100781.tif 000038
さらなる研究は、以下の完全ヌクレオチド配列（配列番号２７）を明らかにし
た：
【０２９４】
【化３８】
2009100781.tif 000039
これは、以下のアミノ酸配列（配列番号２８；ＯＲＦ３９−１）に対応する：
【０２９５】
【化３９】
2009100781.tif 000040
このアミノ酸配列のコンピュータ分析は、以下の結果を与えた；
（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（株Ａ）由来の推定ＯＲＦとの相同性）
ＯＲＦ３９は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの株Ａ由来のＯＲＦ（ＯＲＦ３
９ａと１６５アミノ酸重複にわたって１００％の同一性を示す：
【０２９６】
【化４０】
2009100781.tif 000041
ＯＲＦ３９−１およびＯＲＦ３９ａは、以下の７１０アミノ酸重複において９
９．４％の同一性を示す：
【０２９７】
【化４１】
2009100781.tif 000042
完全長ＯＲＦ３９ａヌクレオチド配列（配列番号２９）は、以下である：
【０２９８】
【化４２】
2009100781.tif 000043
これは、以下のアミノ酸配列（配列番号３０）を有するタンパク質をコードす
る：
【０２９９】
【化４３】
2009100781.tif 000044
ＯＲＦ３９ａは、以下のＡ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の細胞溶
解素と相同性である：
【０３００】
【化４４】
2009100781.tif 000045
（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ（
寄託番号Ｘ５３９５５）のＨｌｙＢロイコトキシン分泌ＡＴＰ結合タンパク質と
の相同性）
ＯＲＦ３９およびＨｌｙＢタンパク質は、Ｎ末端およびＣ末端領域でそれぞれ
、１６７および５５重複において７１％および６９％のアミノ酸同一性を示す。
【０３０１】
【化４５】
2009100781.tif 000046
この分析に基づいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のこのタンパク質お
よびこのエピトープがワクチンまたは診断のために有用な抗原であり得ることが
推定される。
【０３０２】
（実施例７）
以下の部分ＤＮＡ配列をＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定した（配
列番号３１）：
【０３０３】
【化４６】
2009100781.tif 000047
これは、以下のアミノ酸配列に対応する（配列番号３２、ＯＲＦ５２）：
【０３０４】
【化４７】
2009100781.tif 000048
さらなる研究は、以下の完全なヌクレオチド配列を明らかにした（配列番号３
３）：
【０３０５】
【化４８】
2009100781.tif 000049
これは、以下のアミノ酸配列（配列番号３４、ＯＲＦ５２−１）に対応する：
【０３０６】
【化４９】
2009100781.tif 000050
このアミノ酸配列のコンピュータ分析は、原核生物膜リポタンパク質脂質付着
部位（下線）を推定する。
【０３０７】
ＯＲＦ５２−１（７ｋＤａ）を上記のようにｐＧｅｘベクター中にクローン化
し、そしてＥ．ｃｏｌｉ中で発現した。タンパク質の発現および精製の産物をＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。図４Ａは、ＧＳＴ融合体のアフィニティー精
製の結果を示す。図４Ｂは、親水性、抗原性指標、およびＯＲＦ５２−１のＡＭ
ＰＨＩ領域のプロットを示す。
【０３０８】
この分析に基づいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のタンパク質および
このエピトープがワクチンまたは診断のための有用な抗原であり得ることが推測
される。
【０３０９】
（実施例８）
以下のＤＮＡ配列をＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定した（配列番
号３５）：
【０３１０】
【化５０】
2009100781.tif 000051
これは、以下のアミノ酸配列（配列番号３６、ＯＲＦ５６）に対応する：
【０３１１】
【化５１】
2009100781.tif 000052
さらなる研究は、以下の完全なヌクレオチド配列（配列番号３７）を明らかに
した：
【０３１２】
【化５２】
2009100781.tif 000053
これは、以下のアミノ酸配列（配列番号３８；ＯＲＦ５６−１）に対応する：
【０３１３】
【化５３】
2009100781.tif 000054
このアミノ酸配列のコンピュータ分析は、リーダーペプチド（下線）を推定し
、そしてＯＲＦ５６が膜タンパク質またはペリプラズミック（ｐｅｒｉｐｌａｓ
ｍｉｃ）なタンパク質であり得ることを示唆する。
【０３１４】
この分析に基づいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のこのタンパク質お
よびそのエピトープは、ワクチンまたは診断のための有用な抗原であり得ること
が推定される。
【０３１５】
（実施例９）
以下の部分ＤＮＡ配列をＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定した（配
列番号３９）：
【０３１６】
【化５４】
2009100781.tif 000055
これは、以下のアミノ酸配列（配列番号４０；ＯＲＦ６３）に対応する：
【０３１７】
【化５５】
2009100781.tif 000056
このアミノ酸配列のコンピュータ分析は、膜貫通領域を推測する。
【０３１８】
この分析に基づいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のこのタンパク質お
よびそのエピトープがワクチンまたは診断のための有用な抗原であり得ることを
推定する。
【０３１９】
（実施例１０）
以下の部分ＤＮＡ配列をＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定した（配
列番号４１）：
【０３２０】
【化５６】
2009100781.tif 000057
これは、以下のアミノ酸配列（配列番号４２；ＯＲＦ６９）に対応する：
【０３２１】
【化５７】
2009100781.tif 000058
このアミノ酸配列のコンピュータ分析は、膜貫通領域を推定する。
【０３２２】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの株Ａ由来の対応ＯＲＦもまた同定された：
（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（株Ａ）由来の推定ＯＲＦとの相同性）
ＯＲＦ６９は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの株Ａ由来のＯＲＦ（ＯＲＦ６
９ａ）と以下の７８アミノ酸重複にわたって９６．２％の同一性を示す：
【０３２３】
【化５８】
2009100781.tif 000059
ＯＲＦ６９ａヌクレオチド配列（配列番号４３）は、以下である：
【０３２４】
【化５９】
2009100781.tif 000060
これは、以下のアミノ酸配列（配列番号４４）を有するタンパク質をコードす
る：
【０３２５】
【化６０】
2009100781.tif 000061
この分析に基づいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のこのタンパク質お
よびそのエピトープがワクチンまたは診断のために有用な抗原であることが推定
される。
【０３２６】
（実施例１１）
以下のＤＮＡ配列をＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定した（配列番
号４５）：
【０３２７】
【化６１】
2009100781.tif 000062
これは、以下のアミノ酸配列（配列番号４６；ＯＲＦ７７）に対応する：
【０３２８】
【化６２】
2009100781.tif 000063
さらなる研究は、完全なヌクレオチド配列（配列番号４７）を明らかにした：
【０３２９】
【化６３】
2009100781.tif 000064
これは、アミノ酸配列（配列番号４８；ＯＲＦ７７−１）に対応する：
【０３３０】
【化６４】
2009100781.tif 000065
アミノ酸配列のコンピュータ分析は、推定リーダー配列およびいくつかの膜貫
通ドメインを明らかにする。
【０３３１】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの株Ａ由来の対応ＯＲＦもまた同定した：
（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（株Ａ）由来の推定ＯＲＦとの相同性）
ＯＲＦ７７は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの株Ａ由来のＯＲＦ（ＯＲＦ７
７ａ）と以下の１７３アミノ酸重複にわたって９６．５％の同一性を示す：
【０３３２】
【化６５】
2009100781.tif 000066
ＯＲＦ７７−１およびＯＲＦ７７ａは、以下の１８５アミノ酸重複において９
６．８％の同一性を示す：
【０３３３】
【化６６】
2009100781.tif 000067
以下のＯＲＦ７７ａ部分ヌクレオチド配列（配列番号４９）を同定した：
【０３３４】
【化６７】
2009100781.tif 000068
これは、以下のアミノ酸配列（配列番号５０）を有するタンパク質をコードす
る：
【０３３５】
【化６８】
2009100781.tif 000069
この分析に従って、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のこのタンパク質およ
びそのエピトープがワクチンまたは診断のための有用な抗原であり得ることが推
定される。
【０３３６】
（実施例１２）
以下の部分ＤＮＡ配列をＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定した（配
列番号５１）。
【０３３７】
【化６９】
2009100781.tif 000070
これは、以下のアミノ酸配列（配列番号５２；ＯＲＦ１１２）に対応する：
【０３３８】
【化７０】
2009100781.tif 000071
さらなる研究は、さらなる部分ヌクレオチド配列（配列番号５３）を明らかに
した：
【０３３９】
【化７１】
2009100781.tif 000072
これは、以下のアミノ酸配列（配列番号５４；ＯＲＦ１１２−１）に対応する
：
【０３４０】
【化７２】
2009100781.tif 000073
このアミノ酸配列のコンピュータ分析は、２つの膜貫通ドメインを推定する。
【０３４１】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの株Ａ由来の対応ＯＲＦもまた同定された：
（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（株Ａ）由来の推定ＯＲＦとの相同性）
ＯＲＦ１１２は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの株Ａ由来のＯＲＦ（ＯＲＦ
１１２ａ）と以下の１６６アミノ酸重複にわたって９６．４％の同一性を示す：
【０３４２】
【化７３】
2009100781.tif 000074
以下の部分ＯＲＦ１１２ａヌクレオチド配列（配列番号５５）を同定した：
【０３４３】
【化７４】
2009100781.tif 000075
これは、以下のアミノ酸配列（配列番号５６）を有するタンパク質をコードす
る：
【０３４４】
【化７５】
2009100781.tif 000076
ＯＲＦ１１２ａおよびＯＲＦ１１２−１は、以下の３２６アミノ酸重複にわた
って９６．３％の同一性を示す：
【０３４５】
【化７６】
2009100781.tif 000077
この分析に基づいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のこのタンパク質お
よびこのエピトープがワクチンまたは診断のための有用な抗原であり得ることが
推定される。
【０３４６】
（実施例１３）
以下の部分ＤＮＡ配列をＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定した（配
列番号５７）：
【０３４７】
【化７７】
2009100781.tif 000078
これは、以下のアミノ酸配列（配列番号５８；ＯＲＦ１１４）に対応する：
【０３４８】
【化７８】
2009100781.tif 000079
さらなる研究は、以下の完全なヌクレオチド配列（配列番号５９）を明らかに
した（配列番号５９）：
【０３４９】
【化７９】
2009100781.tif 000080
【０３５０】
【化８０】
2009100781.tif 000081
これは、以下のアミノ酸配列（配列番号６０；ＯＲＦ１１４−１）に対応する
：
【０３５１】
【化８１】
2009100781.tif 000082
このアミノ酸配列のコンピュータ分析は、膜貫通領域を推定し、そしてまた以
下の結果を与える：
（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（株Ａ）由来の推定ＯＲＦとの相同性）
ＯＲＦ１１４は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの株Ａ由来のＯＲＦ（ＯＲＦ
１１４ａ）と以下の２８４アミノ酸配列重複にわたって９１．９％の同一性を示
す：
【０３５２】
【化８２】
2009100781.tif 000083
完全長のＯＲＦ１１４ａヌクレオチド配列（配列番号６１）は、以下である：
【０３５３】
【化８３】
2009100781.tif 000084
【０３５４】
【化８４】
2009100781.tif 000085
これは、以下のアミノ酸配列（配列番号６２）を有するタンパク質をコードす
る：
【０３５５】
【化８５】
2009100781.tif 000086
ＯＲＦ１１４−１およびＯＲＦ１１４ａは、以下の１５６４アミノ酸重複にお
いて８９．８％の同一性を示す：
【０３５６】
【化８６】
2009100781.tif 000087
【０３５７】
【化８７】
2009100781.tif 000088
（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（受託番号ＡＦ０３０９４１）の推定分泌タ
ンパク質ｐｓｐＡとの相同性）
ＯＲＦ１１４およびｐｓｐＡタンパク質は、３０２アミノ酸の重複部分におい
て３６％のアミノ酸同一性を示す：
【０３５８】
【化８８】
2009100781.tif 000089
ＯＲＦ１１４ａはまた、ｐｓｐＡと相同である。
【０３５９】
【化８９】
2009100781.tif 000090
【０３６０】
【化９０】
2009100781.tif 000091
ＯＲＦ１１４−１のアミノ酸１〜１４２３を、上記のように、ｐＧｅｘベクタ
ーにクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ．中で発現させた。ＧＳＴ−融合発現をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥを用いて可視化した、そして図５は、ＯＲＦ１１４−１についての
親水性、抗原性指標およびＡＭＰＨＩ領域のプロットを示す。
【０３６１】
これらの結果（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの推定分泌タンパク質との相同
性を含む）および、膜貫通ドメインの存在に基づいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉ
ｄｉｓ由来のこのタンパク質およびそのエピトープが、ワクチンまたは診断剤の
ために有用な抗原であり得ることが予想される。
【０３６２】
（実施例１４）
以下の部分的なＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定さ
れた＜配列番号６３＞。
【０３６３】
【化９１】
2009100781.tif 000092
これは、アミノ酸配列＜配列番号６４；ＯＲＦ１１６＞と対応する。
【０３６４】
【化９２】
2009100781.tif 000093
このアミノ酸配列のコンピューター分析は、以下の結果を示した：
（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（受託番号ＡＦ０３０９４１）の推定分泌タ
ンパク質ｐｓｐＡとの相同性）
ＯＲＦ１１６およびｐｓｐＡタンパク質は、５０２アミノ酸の重複において３
８％のアミノ酸同一性を示す：
【０３６５】
【化９３】
2009100781.tif 000094
ｐｓｐＡとの相同性に基づいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のこのタ
ンパク質およびそのエピトープが、ワクチンまたは診断剤のための有用な抗原で
あり得ることが予想される。
【０３６６】
（実施例１５）
以下の部分的なＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定さ
れた＜配列番号６５＞。
【０３６７】
【化９４】
2009100781.tif 000095
これは、アミノ酸配列＜配列番号６６；ＯＲＦ１１８＞と対応する。
【０３６８】
【化９５】
2009100781.tif 000096
このアミノ酸配列のコンピューター分析は、２つの推定膜貫通ドメインを表す
。
【０３６９】
この分析に基づいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のこのタンパク質お
よびそのエピトープが、ワクチンまたは診断剤のための有用な抗原であり得るこ
とが予想される。
【０３７０】
（実施例１６）
以下の部分的なＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定さ
れた＜配列番号６７＞。
【０３７１】
【化９６】
2009100781.tif 000097
これは、アミノ酸配列＜配列番号６８；ＯＲＦ４１＞と対応する。
【０３７２】
【化９７】
2009100781.tif 000098
さらなる研究により、完全なヌクレオチド配列＜配列番号６９＞を明らかにし
た。
【０３７３】
【化９８】
2009100781.tif 000099
これは、アミノ酸配列＜配列番号７０；ＯＲＦ４１−１＞と対応する。
【０３７４】
【化９９】
2009100781.tif 000100
このアミノ酸配列のコンピューター分析は、膜貫通ドメインを予想し、そして
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ａ株）由来のＯＲＦとの相同性がまた見出され
た。
【０３７５】
ＯＲＦ４１は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＡ株由来のＯＲＦ（ＯＲＦ４
１ａ）と２７９アミノ酸の重複にわたって９２．８％の同一性を示す。
【０３７６】
【化１００】
2009100781.tif 000101
部分的なＯＲＦ４１ａヌクレオチド配列＜配列番号７１＞は以下である：
【０３７７】
【化１０１】
2009100781.tif 000102
これは、部分的アミノ酸配列＜配列番号７２＞を有するタンパク質をコードす
る：
【０３７８】
【化１０２】
2009100781.tif 000103
ＯＲＦ４１ａおよびＯＲＦ４１−１は、５９５アミノ酸の重複において９４．
８％の同一性を示す。
【０３７９】
【化１０３】
2009100781.tif 000104
ＯＲＦ４１−１のアミノ酸２５〜６１９を上記のように増幅した。図６は、Ｏ
ＲＦ４１−１についての親水性、抗原性指標、およびＡＭＰＨＩ領域のプロット
を示す。
【０３８０】
この分析に基づいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のこのタンパク質お
よびそのエピトープが、ワクチンまたは診断剤のための有用な抗原であり得るこ
とが予想される。
【０３８１】
（実施例１７）
以下のＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された＜配
列番号７３＞。
【０３８２】
【化１０４】
2009100781.tif 000105
これは、アミノ酸配列＜配列番号７４；ＯＲＦ５１＞と対応する。
【０３８３】
【化１０５】
2009100781.tif 000106
さらなる研究により、完全なヌクレオチド配列＜配列番号７５＞を明らかにし
た。
【０３８４】
【化１０６】
2009100781.tif 000107
これは、アミノ酸配列＜配列番号７６；ＯＲＦ５１−１＞と対応する。
【０３８５】
【化１０７】
2009100781.tif 000108
このアミノ酸配列のコンピューター分析は、３つの推定膜貫通ドメインを表す
。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＡ株由来の対応するＯＲＦをまた同定した。
【０３８６】
（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ａ株）由来の予想ＯＲＦとの相同性）
ＯＲＦ５１は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＡ株由来のＯＲＦ（ＯＲＦ５
１ａ）と１５０アミノ酸の重複にわたって９６．７％の同一性を示す。
【０３８７】
【化１０８】
2009100781.tif 000109
ＯＲＦ５１−１およびＯＲＦ５１ａは２５５アミノ酸の重複において９９．２
％の同一性を示す：
【０３８８】
【化１０９】
2009100781.tif 000110
完全長ＯＲＦ５１ａヌクレオチド配列＜配列番号７７＞は以下である：
【０３８９】
【化１１０】
2009100781.tif 000111
これは、アミノ酸配列＜配列番号７８＞を有するタンパク質をコードする：
【０３９０】
【化１１１】
2009100781.tif 000112
この分析に基づいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のこのタンパク質お
よびそのエピトープが、ワクチンまたは診断剤のための有用な抗原であり得るこ
とが予想される。
【０３９１】
（実施例１８）
以下の部分的なＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定さ
れた＜配列番号７９＞。
【０３９２】
【化１１２】
2009100781.tif 000113
これは、アミノ酸配列＜配列番号８０；ＯＲＦ８２＞と対応する。
【０３９３】
【化１１３】
2009100781.tif 000114
さらなる研究により、完全なヌクレオチド配列＜配列番号８１＞を明らかにし
た。
【０３９４】
【化１１４】
2009100781.tif 000115
これは、アミノ酸配列＜配列番号８２；ＯＲＦ８２−１＞と対応する。
【０３９５】
【化１１５】
2009100781.tif 000116
このアミノ酸配列のコンピューター分析は、予想リーダーペプチドを明らかに
する。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＡ株由来の対応するＯＲＦをまた同定し
た。
【０３９６】
（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ａ株）由来の予想ＯＲＦとの相同性）
ＯＲＦ８２は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＡ株由来のＯＲＦ（ＯＲＦ８
２ａ）と１７２アミノ酸の重複にわたって９７．１％の同一性を示す。
【０３９７】
【化１１６】
2009100781.tif 000117
ＯＲＦ８２ａおよびＯＲＦ８２−１は、２４２アミノ酸の重複において９９．
２％の同一性を示す：
【０３９８】
【化１１７】
2009100781.tif 000118
完全長ＯＲＦ８２ａヌクレオチド配列＜配列番号８３＞は以下である：
【０３９９】
【化１１８】
2009100781.tif 000119
これは、アミノ酸配列＜配列番号８４＞を有するタンパク質をコードする：
【０４００】
【化１１９】
2009100781.tif 000120
この分析に基づいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のこのタンパク質お
よびそのエピトープが、ワクチンまたは診断剤のための有用な抗原であり得るこ
とが予想される。
【０４０１】
（実施例１９）
以下の部分的ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定され
た＜配列番号８５＞。
【０４０２】
【化１２０】
2009100781.tif 000121
これは、アミノ酸配列＜配列番号８６；ＯＲＦ１２４＞と対応する。
【０４０３】
【化１２１】
2009100781.tif 000122
このアミノ酸配列のコンピューター分析は、膜貫通ドメインを予想する。
【０４０４】
さらなる研究により、完全なヌクレオチド配列＜配列番号８７＞を明らかにし
た。
【０４０５】
【化１２２】
2009100781.tif 000123
これは、アミノ酸配列＜配列番号８８；ＯＲＦ１２４−１＞と対応する。
【０４０６】
【化１２３】
2009100781.tif 000124
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＡ株由来の対応ＯＲＦをまた、同定した：
（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ａ株）由来の予想ＯＲＦとの相同性）
ＯＲＦ１２４は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＡ株由来のＯＲＦ（ＯＲＦ
１２４ａ）との１５２アミノ酸の重複にわたって８７．５％の同一性を示す：
【０４０７】
【化１２４】
2009100781.tif 000125
ＯＲＦ１２４ａおよびＯＲＦ１２４−１は、１５２アミノ酸の重複において８９
．５％の同一性を示す。
【０４０８】
【化１２５】
2009100781.tif 000126
完全長ＯＲＦ１２４ａのヌクレオチド配列＜配列番号８９＞は以下である：
【０４０９】
【化１２６】
2009100781.tif 000127
これは、アミノ酸配列＜配列番号９０＞を有するタンパク質をコードする。
【０４１０】
【化１２７】
2009100781.tif 000128
ＯＲＦ１２４−１を、上記のように増幅した。図７は、ＯＲＦ１２４−１につ
いての親水性、抗原性指標、およびＡＭＰＨＩ領域のプロットを示す。
【０４１１】
この分析に基づいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のこのタンパク質お
よびそのエピトープが、ワクチンまたは診断剤のための有用な抗原であり得るこ
とが予想される。
【０４１２】
本発明が実施例のみにより記載されたこと、およびその改変が本発明の精神お
よび範囲内にとどまったままでなされ得ることが理解される。
【０４１３】
【表１】
2009100781.tif 000129
【０４１４】
【表２】
2009100781.tif 000130
【図１Ａ】
2009100781.tif 000131
【図１Ｂ】
2009100781.tif 000132
【図１Ｃ】
2009100781.tif 000133
【図１Ｄ】
2009100781.tif 000134
【図１Ｅ】
2009100781.tif 000135
【図２Ａ】
2009100781.tif 000136
【図２Ｂ】
2009100781.tif 000137
【図２Ｃ】
2009100781.tif 000138
【図２Ｄ】
2009100781.tif 000139
【図２Ｅ】
2009100781.tif 000140
【図３Ａ】
2009100781.tif 000141
【図３Ｂ】
2009100781.tif 000142
【図３Ｃ】
2009100781.tif 000143
【図３Ｄ】
2009100781.tif 000144
【図４Ａ】
2009100781.tif 000145
【図４Ｂ】
2009100781.tif 000146
【図５】
2009100781.tif 000147
【図６】
2009100781.tif 000148
【図７】
2009100781.tif 000149
【配列表】
2009100781000001.app