(57)【要約】  【課題】  ジペプチドの製造法を提供する。  【解決手段】  本発明によれば、ジペプチド合成活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換された形質転換体、該形質転換体等を用いたジペプチド合成活性を有する蛋白質の製造法、ジペプチド合成活性を有する蛋白質を用いたジペプチドの製造法、およびジペプチド合成活性を有する蛋白質を生産する形質転換体または微生物の培養物等を酵素源に用いたジペプチドの製造法が提供される。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質。
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質
［３］配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質
【請求項２】
以下の［１］〜［３］のいずれかに記載のＤＮＡ。
［１］請求項１記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項３】
請求項２記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３記載の組換え体ＤＮＡを有する形質転換体。
【請求項５】
形質転換体が、微生物を宿主として得られる形質転換体である請求項４記載の形質転換体。
【請求項６】
微生物が、エシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物である請求項５記載の形質転換体。
【請求項７】
請求項１記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に該蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する請求項１記載の蛋白質の製造法。
【請求項８】
請求項１記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物が請求項４〜６のいずれか１項に記載の形質転換体である、請求項７記載の製造法。
【請求項９】
請求項１記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物もしくは該培養物の処理物、または請求項１記載の蛋白質と１種以上のアミノ酸とを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取するジペプチドの製造法。
【請求項１０】
請求項１記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物が請求項４〜６のいずれか１項に記載の形質転換体である、請求項９記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジペプチド合成活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換された形質転換体、ジペプチド合成活性を有する蛋白質の製造法、ジペプチド合成活性を有する蛋白質を用いたジペプチドの製造法、ジペプチド合成活性を有する蛋白質を生産する微生物または形質転換体を用いたジペプチドの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
L-アミノ酸のα位カルボキシル基でのペプチド結合形成活性によるジペプチド生成が知られている蛋白質としては、バチルス属に属する微生物由来のジペプチド抗生物質であるバシリシン合成酵素（特許文献１参照）、ストレプトマイセス・アルボラス（Streptomyces albulus）由来のジケトピペラジン合成酵素（特許文献２参照）およびラルストニア・ソラナセラム（Ralstonia solanacearum）由来の蛋白質（特許文献３参照）が知られている。
【０００３】
しかしながら、上記酵素の基質特異性に起因し、生成効率が十分でないジペプチドもあるため、該酵素とは基質特異性が異なる新たなジペプチド合成酵素が求められている。
インゲンかさ枯病細菌、シュードモナス・シリンゲ・パソバー・ファセオリコラ  1448A（Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 1448A）の染色体ＤＮＡの塩基配列は公知であり、該染色体ＤＮＡ中のＯＲＦが推定されている（非特許文献１参照）。また、シュードモナス・シリンゲ・パソバー・ファセオリコラ  NPS3121（Pseudomonas syringae pv. phaseolicola NPS3121）において、かさ枯病の原因物質であるファセオロトキシン（Phaseolotoxin）[Nδ(N’-sulfodiaminophosphinyl)-ornithyl-alanyl
-homoarginine]の生合成に関与する遺伝子群も同定されているが（非特許文献２参照）、PSPPH_4299にコードされる蛋白質の機能は知られておらず、またPSPPH_4299がジペプチド合成活性を有しているか否かについても知られていない。
【特許文献１】国際公開第2004/058960号パンフレット
【特許文献２】国際公開第2005/103260号パンフレット
【特許文献３】国際公開第2006/101023号パンフレット
【非特許文献１】J. Bacteriol., 187, 6488-98, 2005
【非特許文献２】J. Bacteriol., 189, 2834-43, 2007
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、ジペプチド合成活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換された形質転換体、該形質転換体等を用いたジペプチド合成活性を有する蛋白質の製造法、ジペプチド合成活性を有する蛋白質を用いたジペプチドの製造法、およびジペプチド合成活性を有する蛋白質を生産する形質転換体または微生物の培養物等を酵素源に用いたジペプチドの製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下の（１）〜（１０）に関する。
（１）  以下の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質。
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質
［３］配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質
（２）  以下の［１］〜［３］のいずれかに記載のＤＮＡ。
［１］上記（１）の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（３）  上記（２）のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
【０００６】
（４）  上記（３）の組換え体ＤＮＡを有する形質転換体。
（５）  形質転換体が、微生物を宿主として得られる形質転換体である上記（４）の形質転換体。
（６）  微生物が、エシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物である上記（５）の形質転換体。
【０００７】
（７）  上記（１）の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に該蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する上記（１）の蛋白質の製造法。
（８）  上記（１）の蛋白質を生産する能力を有する微生物が上記（４）〜（６）のいずれか１つの形質転換体である、上記（７）の製造法。
【０００８】
（９）  上記（１）の蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物もしくは該培養物の処理物、または上記（１）の蛋白質と１種以上のアミノ酸とを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取するジペプチドの製造法。
（１０）  上記（１）の蛋白質を生産する能力を有する微生物が上記（４）〜（６）のいずれか１つの形質転換体である、上記（９）の製造法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によりジペプチドを合成する活性を有する蛋白質を製造することができ、該蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する形質転換体または微生物を用いてジペプチドを製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
１．本発明の蛋白質
本発明の蛋白質としては、
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質、および
［３］配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質、
をあげることができる。
【００１１】
上記において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982) 、Gene, 34, 315 (1985) 、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985) 、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985) 等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
【００１２】
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
配列番号２で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよい。
【００１３】
アミノ酸の欠失または付加が可能なアミノ酸の位置としては、例えば配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端側およびＣ末端側の１〜数個のアミノ酸をあげることができる。
欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
【００１４】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
また、本発明の蛋白質がジペプチド合成活性を有するためには、配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有していることが望ましい。
【００１５】
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)] やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)] を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990) ］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００１６】
配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質もまた本発明の蛋白質である。
本発明の蛋白質が、ジペプチド合成活性を有する蛋白質であることを確認する手段としては、例えばＤＮＡ組換え法を用いて本発明の蛋白質を発現する形質転換体を作製し、該形質転換体を用いて本発明の蛋白質を製造した後、本発明の蛋白質、１種以上のアミノ酸、好ましくはL-アミノ酸およびグリシンから選ばれる２種のアミノ酸、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法をあげることができる。
２．本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡとしては、
［１］上記１の［１］〜［３］の本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ、
［２］配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ、および
［３］配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
をあげることができる。
【００１７】
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡであってもよい。
【００１８】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Methods for General and Molecular Bacteriology, ASM Press（1994）、Immunology methods manual, Academic press(Molecular)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
【００１９】
上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを50％ホルムアミド、5×SSC（750ｍMの塩化ナトリウム、75mMのクエン酸ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、および20μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で42℃で一晩、インキュベートした後、例えば約65℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば6×SSCE（20×SSCEは、3mol/lの塩化ナトリウム、0.2mol/lのリン酸二水素ナトリウム、0.02mol/lのEDTA、pH7.4）、0.5％のSDS、30％のホルムアミド、100μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベートした後、50℃の1×SSC、0.1％SDS溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば5×SSC）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
【００２０】
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したBLASTおよびFASTA等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号１で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。
【００２１】
上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることは、該ＤＮＡを発現する組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる微生物を培養し、得られる培養物から該蛋白質を精製し、該精製蛋白質を酵素源に用いて、該酵素源、並びに１種以上のアミノ酸、好ましくはL-アミノ酸およびグリシンから選ばれる２種のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法によって確認することができる。
３．本発明の製造法に用いられる微生物および形質転換体
本発明の製造法に用いられる微生物および形質転換体としては、本発明の蛋白質を生産する能力を有する微生物および形質転換体であれば特に限定されないが、該微生物としては、好ましくはシュードモナス（Pseudomonas）属に属する微生物、より好ましくはシュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）に属する微生物、さらに好ましくはPseudomonas syringaepv. phaseolicola 1448Aをあげることができ、該形質転換体としては、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体をあげることができる。
【００２２】
本発明の蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体としては、上記２のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを用い、宿主細胞を公知の方法で形質転換して得られる形質転換体をあげることができる。宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等のいずれを用いてもよいが、好ましくは細菌、より好ましくはエシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物をあげることができる。
４．本発明のＤＮＡの調製
本発明のＤＮＡは、例えば、配列番号１で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブを用いた、Pseudomonas属に属する微生物、好ましくはPseudomonas syringaeに属する微生物、より好ましくはPseudomonas syringae pv. phaseolicola 1448Aの染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、または配列番号１で表される塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、微生物、好ましくはPseudomonas属に属する微生物、より好ましくはPseudomonas syringaeに属する微生物、さらに好ましくはPseudomonas syringae pv. phaseolicola 1448Aの染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ[PCR Protocols, Academic Press (1990)]により取得することができる。
【００２３】
また、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する生物の染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等から上記した方法により本発明のＤＮＡ、または本発明の製造法に用いられるＤＮＡを取得することもできる。
【００２４】
取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)]あるいはABI3700DNAアナライザー（アプライド・バイオシステムズ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
【００２５】
本発明のＤＮＡを組み込むベクターとしては、pBluescriptII KS(+)（ストラタジーン社製）、pDIRECT[Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)]、pCR-Script Amp SK(+)（ストラタジーン社製）、pT7Blue（ノバジェン社製）、pCR II（インビトロジェン社製）およびpCR-TRAP（ジーンハンター社製）などをあげることができる。
宿主細胞としては、エシェリヒア属に属する微生物などをあげることができる。エシェリヒア属に属する微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli） XL1-Blue、エシェリヒア・コリ XL2-Blue、エシェリヒア・コリ DH1、エシェリヒア・コリ MC1000、エシェリヒア・コリ ATCC 12435、エシェリヒア・コリ W1485、エシェリヒア・コリ JM109、エシェリヒア・コリ HB101、エシェリヒア・コリ No.49、エシェリヒア・コリ W3110、エシェリヒア・コリ NY49、エシェリヒア・コリ MP347、エシェリヒア・コリ NM522、エシェリヒア・コリ BL21、エシェリヒア・コリ ME8415等をあげることができる。
【００２６】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
【００２７】
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
上記のようにして取得されるＤＮＡとして、例えば、配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
５．本発明の製造法に用いられる形質転換体および微生物の製造法
本発明のＤＮＡをもとにして、必要に応じて、本発明の蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産率が向上した形質転換体を取得することができる。
【００２８】
該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。
該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
【００２９】
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自律複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００３０】
発現ベクターとしては、pColdI(タカラバイオ社製)、pCDF-1b、pRSF-1b（いずれもノバジェン社製）、pMAL-c2x（ニューイングランドバイオラブス社製）、pGEX-4T-1（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、pTrcHis（インビトロジェン社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-30（キアゲン社製）、pET-3（ノバジェン社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200[Agric. Biol. Chem., 48, 669(1984)]、pLSA1[Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)]、pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)]、pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(-)（ストラタジーン社製）、pTrS30 [エシェリヒア・コリ JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製]、pTrS32 [エシェリヒア・コリ JM109/pTrS32(FERM BP-5408)より調製]、pPAC31 (WO98/12343)、pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)]、pSTV28(タカラバイオ社製)、pUC118（タカラバイオ社製）、pPA1（特開昭63-233798）等を例示することができる。
【００３１】
プロモーターとしては、エシェリヒア・コリ等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター、ＰSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００３２】
さらにバチルス属に属する微生物中で発現させるためのxylAプロモーター［Appl. Microbiol. Biotechnol., 35, 594-599 (1991)］やコリネバクテリウム（Corynebacterium）属に属する微生物中で発現させるためのP54-6プロモーター［Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 (2000)］なども用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば6〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
【００３３】
本発明のＤＮＡを発現ベクターに結合させた組換え体ＤＮＡにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
このような組換え体ＤＮＡとしては、例えばpET30Xa/LIC-PSPPH_4299をあげることができる。
【００３４】
原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア（Serratia）属、バチルス属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ミクロバクテリウム属（Microbacterium）、シュードモナス（Pseudomonas）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アリシクロバチルス属（Alicyclobacillus）、アナベナ（Anabena）属、アナシスティス（Anacystis）属、アスロバクター（Arthrobacter）属、アゾトバクター（Azotobacter）属、クロマチウム（Chromatium）属、エルビニア（Erwinia）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、フォルミディウム（Phormidium）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、ロドスピリウム（Rhodospirillum）属、セネデスムス（Scenedesmus）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、シネコッカス（Synechoccus）属、ザイモモナス（Zymomonas）属等に属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリXL1-Blue、エシェリヒア・コリ XL2-Blue、エシェリヒア・コリ DH1、エシェリヒア・コリ DH5α、エシェリヒア・コリ MC1000、エシェリヒア・コリ KY3276、エシェリヒア・コリ W1485、エシェリヒア・コリ JM109、エシェリヒア・コリ HB101、エシェリヒア・コリ No.49、エシェリヒア・コリ W3110、エシェリヒア・コリ NY49、エシェリヒア・コリ MP347 、エシェリヒア・コリ NM522、エシェリヒア・コリ BL21、バチルス・サチリス（Bacillus subtilis） ATCC33712、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）、ブレビバクテリウム・イマリオフィルム（Brevibacterium immariophilum） ATCC14068、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum） ATCC14066、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum） ATCC14067、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum） ATCC13869、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum） ATCC13032、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC14297、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Corynebacterium acetoacidophilum）ATCC13870、ミクロバクテリウム・アンモニアフィルム（Microbacterium ammoniaphilum） ATCC15354、セラチア・フィカリア（Serratia ficaria）、セラチア・フォンチコラ（Serratia fonticola）、セラチア・リケファシエンス（Serratia liquefaciens）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.） D-0110、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）、アグロバクテリウム・リゾジーンズ（Agrobacterium rhizogenes）、アグロバクテリウム・ルビ（Agrobacterium rubi）、アナベナ・シリンドリカ（Anabaena cylindrica）、アナベナ・ドリオルム（Anabaena doliolum）、アナベナ・フロスアクア（Anabaena flos-aquae）、アースロバクター・オーレッセンス（Arthrobacter aurescens）、アースロバクター・シトレウス（Arthrobacter citreus）、アースロバクター・グロブフォルミス（Arthrobacter globformis）、アースロバクター・ヒドロカーボグルタミカス（Arthrobacter hydrocarboglutamicus）、アースロバクター・ミソレンス（Arthrobacter mysorens）、アースロバクター・ニコチアナ（Arthrobacter nicotianae）、アースロバクター・パラフィネウス（Arthrobacter paraffineus）、アースロバクター・プロトフォルミエ（Arthrobacter protophormiae）、アースロバクター・ロセオパラフィナス（Arthrobacter roseoparaffinus）、アースロバクター・スルフレウス（Arthrobacter sulfureus）、アースロバクター・ウレアファシエンス（Arthrobacter ureafaciens）、クロマチウム・ブデリ（Chromatium buderi）、クロマチウム・テピダム（Chromatium tepidum）、クロマチウム・ビノサム（Chromatium vinosum）、クロマチウム・ワーミンギ（Chromatium warmingii）、クロマチウム・フルビアタティレ（Chromatium fluviatile）、エルビニア・ウレドバラ（Erwinia uredovora）、エルビニア・カロトバラ（Erwinia carotovora）、エルビニア・アナス（Erwinia ananas）、エルビニア・ヘリコラ（Erwinia herbicola）、エルビニア・パンクタタ（Erwinia punctata）、エルビニア・テレウス（Erwinia terreus）、メチロバクテリウム・ロデシアナム（Methylobacterium rhodesianum）、メチロバクテリウム・エクソトルクエンス（Methylobacterium extorquens）、フォルミディウム・エスピー（Phormidium sp.）  ATCC29409、ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、ロドシュードモナス・ブラスチカ（Rhodopseudomonas blastica）、ロドシュードモナス・マリナ（Rhodopseudomonas marina）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ロドスピリウム・リブラム（Rhodospirillum rubrum）、ロドスピリウム・サレキシゲンス（Rhodospirillum salexigens）、ロドスピリウム・サリナラム（Rhodospirillum salinarum）、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Streptomyces ambofaciens）、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Streptomyces aureofaciens） 、ストレプトマイセス・アウレウス（Streptomyces aureus）、ストレプトマイセス・フンジシディカス（Streptomyces fungicidicus）、ストレプトマイセス・グリセオクロモゲナス（Streptomyces griseochromogenes）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans、ストレプトマイセス・オリボグリセウス（Streptomyces olivogriseus）、ストレプトマイセス・ラメウス（Streptomyces rameus）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Streptomyces tanashiensis）、ストレプトマイセス・ビナセウス（Streptomyces vinaceus）、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）等をあげることができる。
【００３５】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)] 、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法 [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)] 等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEp13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS19、pHS15等を用いることができる。
【００３６】
プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、MFα1 プロモーター、CUP 1プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、シワニオマイミセス（Schwanniomyces）属、ピチア（Pichia）属、またはキャンディダ（Candida）属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、トリコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulans）、シワニオマイセス・アルビウス（Schwanniomyces alluvius）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、キャンディダ・ウティリス（Candida utilis）等をあげることができる。
【００３７】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法[Methods Enzymol., 194, 182 (1990)]、スフェロプラスト法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)] 、酢酸リチウム法 [J. Bacteriol., 153, 163 (1983)] 等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pcDNAI、pcDM8（フナコシ社より市販）、pAGE107（特開平3-22979）、pAS3-3（特開平2-227075）、pCDM8[Nature, 329, 840 (1987)]、pcDNAI/Amp（インビトロジェン社製）、pREP4（インビトロジェン社製）、pAGE103[J. Biochem, 101, 1307 (1987)]、pAGE210、pAMo、pAMoA等を用いることができる。
【００３８】
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（CMV）のIE（immediate early）遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【００３９】
宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa）細胞またはナマルバ KJM-1細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるCHO細胞、HBT5637（特開昭63-299）等をあげることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、SP2/0、NSO等、ラット・ミエローマ細胞としてはYB2/0等、ヒト胎児腎臓細胞としてはHEK293(ATCC CRL-1573)、ヒト白血病細胞としてはBALL-1等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはCOS-1、COS-7等をあげることができる。
【００４０】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法[Cytotechnology, 3, 133 (1990)]、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)] 、Virology, 52, 456 (1973) に記載の方法等をあげることができる。
【００４１】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばBaculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992) 、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Molecular Biology, A Laboratory Manual、Bio/Technology, 6, 47 (1988) 等に記載された方法によって、蛋白質を生産することができる。
【００４２】
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を生産させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII（いずれもインビトロジェン社製）等をあげることができる。
【００４３】
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 等を用いることができる。
昆虫細胞としては、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）の卵巣細胞、トリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）の卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。
【００４４】
スポドプテラ・フルギペルダの卵巣細胞としてはSf9、Sf21（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル）等、トリコプルシア・ニの卵巣細胞としてはHigh 5、BTI-TN-5B1-4（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはボンビクス・モリ（Bombyx mori） N4等をあげることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)] 等をあげることができる。
【００４５】
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Sプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
【００４６】
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）を用いる方法（特開昭59-140885、特開昭60-70080、WO94/00977）、エレクトロポレーション法（特開昭60-251887）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第2606856、特許第2517813）等をあげることができる。
６．本発明の蛋白質の製造法
上記５の方法で得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明の蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物から採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
【００４７】
本発明の蛋白質を製造するための上記形質転換体の宿主としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等いずれであってもよいが、好ましくは細菌、より好ましくはエシェリヒア属に属する微生物、さらに好ましくはエシェリヒア・コリに属する微生物をあげることができる。
酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
【００４８】
上記形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
エシェリヒア・コリ等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００４９】
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
【００５０】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常5時間〜7日間である。培養中pHは3.0〜9.0に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
【００５１】
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００５２】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地[J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)] 、イーグル（Eagle）のMEM培地 [Science, 122, 501 (1952)] 、DMEM培地 [Virology, 8, 396 (1959)] 、199培地 [Proc. Soc. Biol. Med., 73, 1 (1950)] またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
【００５３】
培養は、通常pH6〜8、25〜40℃、5％ＣＯ2存在下等の条件下で1〜7日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているTNM-FH培地(ファーミンジェン社製)、Sf-900 II SFM培地（ライフ・テクノロジーズ社製）、ExCell400、ExCell405[いずれもJRHバイオサイエンシーズ社製]、Grace's Insect Medium[Nature, 195, 788 (1962)]等を用いることができる。
【００５４】
培養は、通常pH6〜7、25〜30℃等の条件下で1〜5日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ(MS)培地、ホワイト(White)培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
【００５５】
培養は、通常pH5〜9、20〜40℃の条件下で3〜60日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明の蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、選択した方法に応じて、生産させる蛋白質の構造を変えることができる。
【００５６】
本発明の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法[J. Biol. Chem.，264, 17619 (1989)] 、ロウらの方法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989) 、Genes Develop., 4, 1288（1990)] 、または特開平05-336963、WO94/23021等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
【００５７】
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の蛋白質の活性部位を含む蛋白質の手前にシグナルペプチドを付加した形で生産させることにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平2-227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
【００５８】
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて本発明の蛋白質を製造することもできる。
本発明の蛋白質を生産する形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該蛋白質を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
【００５９】
動物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば公知の方法[Am. J. Clin. Nutr., 63, 639S (1996)、Am. J. Clin. Nutr., 63, 627S (1996) 、Bio/Technology, 9, 830 (1991)] に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に本発明の蛋白質を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、本発明のＤＮＡまたは本発明の製造法に用いられるＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、本発明の蛋白質を該動物中に生成、蓄積させ、該動物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。該動物中の該蛋白質を生成、蓄積させる場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭63-309192）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で機能するものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
【００６０】
植物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法[組織培養, 20 (1994)、組織培養, 21 (1995)、Trends Biotechnol., 15, 45 (1997)]に準じて栽培し、該蛋白質を該植物中に生成、蓄積させ、該植物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を生産する方法があげられる。
【００６１】
本発明の蛋白質を生産する形質転換体を用いて製造された本発明の蛋白質を単離・精製する方法としては、通常の酵素の単離、精製法を用いることができる。
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で生産された場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
【００６２】
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（DEAE）−セファロース、DIAION HPA-75（三菱化成社製)等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S−Sepharose FF（GEヘルスケアバイオサイエンス社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００６３】
また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して生産された場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該蛋白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。
該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
【００６４】
本発明の蛋白質またはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋白質またはその糖付加体等の誘導体を回収することができる。
即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【００６５】
このようにして取得される蛋白質として、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をあげることができる。
また、本発明の蛋白質を他の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合した蛋白質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。例えば、ロウらの方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989) 、Genes Develop., 4, 1288 （1990)] 、特開平5-336963、WO94/23021に記載の方法に準じて、本発明の蛋白質をプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
【００６６】
また、本発明の蛋白質をFlagペプチドとの融合蛋白質として生産し、抗Ｆｌａｇ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィー [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989) 、Genes Develop., 4, 1288（1990)] や、ポリヒスチジンとの融合蛋白質として生産し、ポリヒスチジンと高親和性を有する金属配位レジンを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製することもできる。更に、該蛋白質自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
【００６７】
上記で取得された蛋白質のアミノ酸配列情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法により、本発明の蛋白質を製造することができる。また、Advanced ChemTech社、パーキン・エルマー社、Pharmacia社、Protein Technology Instrument社、Synthecell-Vega社、PerSeptive社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
７．本発明のジペプチドの製造法
上記３の微生物または形質転換体の培養物もしくは該培養物の処理物、または上記１の本発明の蛋白質と１種以上のアミノ酸とを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取することにより、ジペプチドを製造することができる。
（１）本発明の蛋白質を酵素源として用いるジペプチドの製造法
本発明の製造法において、酵素源として本発明の蛋白質を用いる場合、基質に用いられる１種以上のアミノ酸、好ましくは１または２種のアミノ酸、より好ましくは２種のアミノ酸としては、アミノ酸、好ましくはL-アミノ酸、グリシン（Gly）およびβ-アラニン（β-Ala）からなる群より選ばれるアミノ酸であれば、いずれのアミノ酸をいずれの組み合わせで用いてもよい。Ｌ−アミノ酸としては、例えばL-アラニン（L-Ala）、L-グルタミン（L-Gln）、L-グルタミン酸（L-Glu）、L-バリン（L-Val）、L-ロイシン(L-Leu)、L-イソロイシン(L-Ile)、L-プロリン（L-Pro）、L-フェニルアラニン(L-Phe)、L-トリプトファン（L-Trp）、L-メチオニン（L-Met）、L-セリン（L-Ser）、L-スレオニン（L-Thr）、L-システイン（L-Cys）、L-アスパラギン（L-Asn）、L-チロシン（L-Tyr）、L-リジン（L-Lys）、L-アルギニン（L-Arg）、L-ヒスチジン（L-His）、L-アスパラギン酸（L-Asp）、L-Homoarginine(L-HomoArg)、L-α-Amino butyric acid、L- Azaserine、L-theanine、L-4-Hydroxyproline、L-3- Hydroxyproline、L-Ornithine、L-CitrullineおよびL-6-diazo-5-oxo-norleucineなどをあげることができる。
【００６８】
上記製造法に用いられる、好ましいアミノ酸としては、Gly、L-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-AspおよびL-HomoArgから選ばれる１種または２種のアミノ酸、より好ましいアミノ酸としては、L-Ala、L-Ser、L-Thr、L-CysおよびGlyより選ばれる1種のアミノ酸とL-Gln、L-Asn、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Phe、L-Trp、L-Tyr、L-Met、L-Lys、L-Arg、L-HisおよびL-HomoArgより選ばれる1種のL-アミノ酸との組み合わせ、L-AlaとL-Ser、L-Thr、L-CysおよびGlyより選ばれる1種のアミノ酸との組み合わせ、L-SerとL-Thr、L-CysおよびGlyより選ばれる1種のアミノ酸との組み合わせ、L-ThrとL-CysまたはGlyとの組み合わせ並びにL-CysとGlyとの組み合わせをあげることができ、さらに好ましいアミノ酸としては、L-Ala、L-Ser、L-Thr、L-CysおよびGlyより選ばれる1種のアミノ酸とL-Gln、L-Asn、L-Phe、L-Trp、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-HisおよびL-HomoArgより選ばれる1種のL-アミノ酸との組み合わせをあげることができ、最も好ましいアミノ酸としては、L-Ala、L-Ser、L-Thr、L-CysおよびGlyより選ばれる1種のアミノ酸とL-Gln、L-Asn、L-Lys、L-Arg、L-His、L-HomoArgより選ばれる1種のL-アミノ酸との組み合わせをあげることができる。
【００６９】
上記製造法において、本発明の蛋白質は、基質として用いるアミノ酸1mgあたり0.01〜100mg、好ましくは0.1mg〜10mg添加する。
上記製造法において、基質として用いるアミノ酸は、0.1〜500g/L、好ましくは0.2〜200g/Lの濃度になるように水性媒体中に初発または反応途中に添加する。
上記製造法において、エネルギー源としてＡＴＰを用いることができ、ＡＴＰは、0.5mmol〜10mol/Lの濃度で用いる。
【００７０】
上記製造法で用いられる水性媒体としては、ジペプチドの生成反応を阻害しない限り、いかなる成分、組成の水性媒体であってもよく、例えば、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液などをあげることができる。また、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類を含有していてもよい。
【００７１】
ジペプチドの生成反応は水性媒体中、pH5〜11、好ましくはpH6〜10、20〜50℃、好ましくは25〜45℃の条件で2〜150時間、好ましくは6〜120時間行う。
上記方法で製造されるジペプチドとしては、L-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、GlyおよびL-HomoArgから選ばれるアミノ酸がペプチド結合で連結したジペプチド、好ましくはL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-CysおよびGlyより選ばれる1種のアミノ酸とL-Gln、L-Asn、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Phe、L-Trp、L-Tyr、L-Met、L-Lys、L-Arg、L-HisおよびL-HomoArgより選ばれる1種のL-アミノ酸とがペプチド結合で連結したジペプチド、L-AlaとL-Ser、L-Thr、L-CysおよびGlyより選ばれる1種のアミノ酸とがペプチド結合で連結したジペプチド、L-SerとL-Thr、L-CysおよびGlyより選ばれる1種のアミノ酸とがペプチド結合で連結したジペプチド、L-ThrとL-CysまたはGlyとがペプチド結合で連結したジペプチド、並びにL-CysとGlyとがペプチド結合で連結したジペプチド、より好ましくは、L-Ala、L-Ser、L-Thr、L-CysおよびGlyより選ばれる1種のアミノ酸とL-Gln、L-Asn、L-Phe、L-Trp、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-HisおよびL-HomoArgより選ばれる1種のL-アミノ酸とがペプチド結合で連結したジペプチド、さらに好ましくはL-AlaとL-Gln、L-Asn、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Lys、L-Arg、L-HisおよびL-HomoArgより選ばれる1種のL-アミノ酸とがペプチド結合で連結したジペプチド、並びにL-Ser、L-ThrおよびGlyより選ばれる1種のアミノ酸とL-Lys、L-Arg、L-HisおよびL-Glnより選ばれる1種のL-アミノ酸とがペプチド結合で連結したジペプチドをあげることができ、特に好ましくは式Ｉ
【００７２】
【化１】
2009171948.tif 000002
【００７３】
（ただし、R1がL-AlaのときR2はL-Gln、L-Asn、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Lys、L-Arg、L-HisおよびL-HomoArgより選ばれる1種のL-アミノ酸であり、R1がL-Ser、L-ThrおよびGlyより選ばれる1種のアミノ酸であるときR2はL-Lys、L-Arg、L-HisおよびL-Glnより選ばれる1種のアミノ酸である）で表される２つのアミノ酸が連結したジペプチド、最も好ましくはL-Ala-L-Gln、L-Ala-L-Lys、L-Ala-L-Arg、L-Ala-L-His、L-Ala-L-HomoArg、Gly-L-His、L-Thr-L-Arg、L-Ser-L-GlnおよびL-Ser-L-Hisをあげることができる。
（２）微生物または形質転換体の培養物もしくは培養物の処理物を酵素源として用いるジペプチドの製造法
本発明の製造法において酵素源として用いられる微生物または形質転換体の培養物としては、該微生物または形質転換体を上記６の培養方法で培養して得られる培養物をあげることができる。微生物または形質転換体の培養物の処理物としては、該培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるもの、並びに該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、および当該処理した菌体から得られる粗酵素抽出物などをあげることができる。
【００７４】
形質転換体または微生物の培養物もしくは培養物の処理物を酵素源として用いる場合、基質に用いられる１種以上のアミノ酸としては、上記（１）と同様のアミノ酸をあげることができる。
該酵素源の量は、当該酵素源の比活性等により異なるが、例えば、基質として用いるアミノ酸1mgあたり湿菌体重量として5〜1000mg、好ましくは10〜400mg添加する。
基質として用いるアミノ酸は、上記（１）と同じように水性媒体中に添加することができる。上記（１）と同様、ＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、エネルギー源として用いることができる。
【００７５】
水性媒体としては、上記（１）の媒体を用いることができ、加えて酵素源に使用する微生物または形質転換体の培養物の培養上清も水性媒体として用いることもできる。
ジペプチドの生成反応の反応条件は、上記（１）と同様の条件をあげることができる。
上記方法で製造されるジペプチドとしては、上記（１）と同様のジペプチドをあげることができる。
【００７６】
上記（１）および（２）の製造法において、水性媒体中に生成、蓄積したジペプチドの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
以下に、実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００７７】
なお、以下の実施例においてジペプチドおよびアミノ酸のHPLCによる分析、定量は以下に示す方法により行った。
ジペプチドおよびアミノ酸は、１−フルオロ−２，４−ジニトロフェニル−５−Ｌ−アラニンアミドナトリウム（Ｎα−ＦＤＡＡ）を用いて誘導体化した後にＨＰＬＣで分析した。Ｎα−ＦＤＡＡを用いた誘導体化は、純水で希釈した試料100μlに、50μlの0.5％のＮα−ＦＤＡＡアセトン溶液と40μlの0.5mol/lの炭酸ナトリウム水溶液を加えて攪拌した後、40℃で60分間静置することにより行った。
【００７８】
次に、40μlの1mol/lの塩酸と770μlのメタノールを加えて攪拌したものを、ＦＤＡＡ化試料とした。
該ＦＤＡＡ化試料を、ＷＨ−Ｃ１８Ａカラム(日立サイエンスシステムズ、4×150mm)を用いて分析、定量した。ＨＰＬＣ分析の条件には、下記の条件を用いた。
移動相には、50mmol/lのリン酸カリウム緩衝液(pH2.7、リン酸でpH調整)とアセトニトリルおよびメタノ−ルの混合比が18:1:1の移動相Ａ、50mmol/lのリン酸カリウム緩衝液(pH2.7、リン酸でpH調整)とアセトニトリルおよびメタノ−ルの混合比が12:7:1の移動相Ｂ、アセトニトリルとテトラヒドロフランおよび水の混合比が３：１：１の移動相Ｃを用いた。移動相の流速は0.5ml/min、移動相Ａと移動相Ｂおよび移動相Ｃの混合比は、パターン1として、0〜24分は100:0:0から55:45:0への勾配、24〜30分は55:45:0の一定、30〜50分は55:45:0から0:100:0への勾配、50〜55分は0:100:0の一定で、55〜60分は0:100:0から0:0:100への勾配、60〜62分は0:0:100の一定、62〜62.1分は0:0:100から100:0:0への勾配、62.1〜80分は100:0:0の一定に変化させた。パターン2として、0〜40分は100:0:0から55:45:0への勾配、40〜50分は55:45:0の一定、50〜51分は55:45:0から0:100:0への勾配、51〜56分は0:100:0の一定で、56〜57分は0:100:0から0:0:100への勾配、57〜60分は0:0:100の一定、60〜61分は0:0:100から100:0:0への勾配、61〜81分は100:0:0の一定に変化させた。またパターン３として、0〜55分は100:0:0から55:45:0への勾配、55〜55.1分は55:45:0から0:100:0への勾配、55.1〜58分は0:100:0の一定で、58〜58.1分は0:100:0から0:0:100への勾配、58.1〜60分は0:0:100の一定、60〜60.1分は0:0:100から100:0:0への勾配、60.1〜80分は100:0:0の一定に変化させた。カラム温度は40℃、340nmの紫外吸収を測定した。産物に応じて、移動相の混合比（パターン1〜3）の組合せを変えて実施した。
【実施例１】
【００７９】
PSPPH_4299遺伝子発現株の造成
シュードモナス・シリンゲ・パソバー・ファセオリコラ  1448A（ATCC BAA-978）の染色体DNAより、配列番号１で表される塩基配列を有するDNAを以下の手順で取得した。
シュードモナス・シリンゲ・パソバー・ファセオリコラ  1448A株の染色体DNA（ATCC BAA-978D）は、American Type Culture Collection(ATCC)より購入した。
配列番号３および４で表される塩基配列を有する合成DNAをプライマーセットとして用い、シュードモナス・シリンゲ・パソバー・ファセオリコラ  1448A株の染色体DNAを鋳型として用いて、PCRを行った。PCRは、0.50pgの染色体DNA、0.3μmol/Lの各プライマー、1 unitのKOD plus DNAポリメラーゼ（東洋紡社製）、5μLのKOD plus DNAポリメラーゼ用×10緩衝液（東洋紡社製）、各200μmol/LのdNTP（dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP）を含む反応液50μLを調製し、94℃で120秒間加温した後、94℃で15秒間、50℃で30秒間、68℃で120秒間の工程を25回繰り返し、さらに68℃で5分間加温することにより行った。
【００８０】
該反応液の1/10量をアガロースゲル電気泳動し、該PCRにより約1.3kbのDNA断片が増幅していることを確認した。
次に、残りの反応液1.46μL、2.5mMのdGTP、5mMのジシオスレイトール(DTT)、1 unitのT4 DNA polymerase、2μLのT4 DNAポリメラーゼ用×10緩衝液を含む反応液20μLを調製し22℃で30分間反応した後、75℃20分間加温することで反応を停止した。
【００８１】
この反応液2μLとLIVベクターpET-30 Xa/LIC(Novagen社製) 1μLを混合して22℃で5分間反応した後に、1μLの25mM EDTAを加えてさらに22℃で分間反応した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリ JM109株を、カルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を25μg/mLのカナマイシンを含むLB寒天培地に塗布した後、30℃で一晩培養し形質転換株を選択した。
【００８２】
該形質転換株を20μg/mlのカナマイシンを含むＬＢ培地で終夜培養し、得られた培養液からアルカリＳＤＳ法によりプラスミドを調製した。
制限酵素切断解析を行い、該プラスミドは、pET-30 Xa/LICに上記で得られた約1.3kbのDNA断片が挿入された構造を有するプラスミドであることを確認した。該プラスミドをpET30Xa/LIC-PSPPH_4299と命名した。
【００８３】
pET30Xa/LIC-PSPPH_4299を用いてエシェリヒア・コリ BL21 (DE3)株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を25μg/mLのカナマイシンを含むLB寒天培地に塗布した後、30℃で一晩培養し形質転換株を選択した。
生育してきた形質転換体のコロニーよりアルカリSDS法によりプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析した結果、pET30Xa/LIC-PSPPH_4299が保持されていることを確認した。
【００８４】
上記で得られた形質転換株をエシェリヒア・コリBL21(DE3)/ pET30Xa/LIC-PSPPH_4299と命名した。
【実施例２】
【００８５】
ジペプチド合成活性を有する蛋白質の生産
実施例１で得られたエシェリヒア・コリBL21 (DE3)/pET30Xa/LIC-PSPPH_4299を30μg/mLのカナマイシンを含む3mLのＬＢ培地が入った試験管に接種し、37℃で5時間振盪培養した。得られた培養液のうち1mLを30μg/mLのカナマイシンを含むＬＢ培地100mLが入った500mL三角フラスコに接種し、37℃で1時間振盪培養後、0.1mmol/LになるようにIPTG を添加し、30℃で18時間振盪培養した。該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。
【００８６】
上記で得られた湿菌体を超音波処理により破砕した後、遠心分離して得られた上清から、HisTrap（アマシャム社製）を用いてジペプチド合成活性を有する蛋白質を精製した。
【実施例３】
【００８７】
ジペプチドの生産（１）
実施例２で得られたHisタグ付加蛋白質を1g/l、50mmol/lのTris-HCl緩衝液（pH8.0）、12.5mmol/lの硫酸マグネシウム、12.5mmol/lのATP、各12.5mmol/lのL-AlaとL-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Cys、L-Asn、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp 、GlyおよびL-homoarginine（L-HomoArg）から選ばれる1種のアミノ酸を含む反応液を調製し、30℃で20時間ジペプチド生産反応を行った。
【００８８】
反応終了後、反応液中の遊離リン酸量をデタミナーLIPを用いて測定した結果、L-Alaと、L-Arg、L-Gln、L-Val、L-Leu、L-Cys、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Asn、L-Lys、L-His、L-HomoArgより選ばれるL-アミノ酸との組み合わせについて、ジペプチド生産反応の進行が確認された。
次に、ジペプチド生産反応の進行が確認されたサンプルについて、LC/MS分析を行った。その結果、L-Alaと、L-Arg、L-Gln、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Asn、L-Lys、L-His、L-HomoArgより選ばれるL-アミノ酸とが結合したジペプチドの生成が確認された。
【００８９】
さらに、パターン１の条件を用いたHPLC分析により、L-Ala-L-Glnは0.6mmol/L、L-Ala-L-Argは4.6mmol/L、L-Ala-L-Lysは1.4mmol/L、L-Ala-L-Hisは4.9mmol/L、L-Ala-L-HomoArgが0.7mmol/L生成したことがわかった。
【実施例４】
【００９０】
ジペプチドの生産（２）
実施例２で得られたHisタグ付加蛋白質を1g/l、50mmol/lのTris-HCl緩衝液（pH8.0）、12.5mmol/lの硫酸マグネシウム、12.5mmol/lのATP、各12.5mmol/lのL-Ser、L-ThrおよびGlyより選ばれる1種のアミノ酸とL-Arg、L-Lys、L-HisおよびL-Glnより選ばれる1種のL-アミノ酸を含む反応液を調製し、30℃で20時間ジペプチド生産反応を行った。
【００９１】
反応終了後、反応液中の遊離リン酸量をデタミナーLIPを用いて測定した結果、全てのアミノ酸の組み合わせでジペプチド生産反応の進行が確認された。
その後、全ての反応液について、LC/MS分析を行った結果、L-Ser、L-ThrおよびGlyより選ばれる1種のアミノ酸とL-Arg、L-Lys、L-HisおよびL-Glnより選ばれる1種のL-アミノ酸とが結合したジペプチドの生成が確認された。
【００９２】
さらに、パターン２の条件を用いたHPLC分析によりL-Ser-L-Glnが0.1mmol/L、L-Ser-L-Hisが5.3mmol/L、L-Thr-L-Argが6.4mmol/L、パターン３の条件を用いたHPLC分析によりGly-L-Hisが0.2mmol/L生成したことがわかった。
以上により、本発明の蛋白質は、２種のアミノ酸をペプチド結合で結合させ、種々のジペプチドを生成する活性を有することがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明により、ジペプチド合成活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換された形質転換体、該形質転換体等を用いたジペプチド合成活性を有する蛋白質の製造法、ジペプチド合成活性を有する蛋白質を用いたジペプチドの製造法、およびジペプチド合成活性を有する蛋白質を生産する形質転換体または微生物の培養物等を酵素源に用いたジペプチドの製造法が提供される。
【配列表フリーテキスト】
【００９４】
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
2009171948000001.app