(57)【要約】【課題】蛍光標識検体に対し励起光を照射し、この励起光の照射により蛍光標識検体から発せられた蛍光の光強度を検出する蛍光検出装置において、蛍光の光強度の検出値の信頼度を向上さる。【解決手段】蛍光検出装置１２０は、マイクロプレート１１０に対し励起光Ｌ１を照射する励起光照射部１２１と、蛍光標識検体１１１から発せられた蛍光の光強度を検出する分光センサー１２２と、制御部１２５とを備えている。また分光センサー１２２は、蛍光Ｌ２の光強度を検出する際に、同時に蛍光標識検体１１１で反射または散乱され、受光部１３０へ入射した励起光Ｌ３の光強度も検出する。蛍光強度補正部１２７では、蛍光Ｌ２の光強度を励起光Ｌ３の光強度で除算し、補正蛍光強度を算出する。【選択図】図１Ａ
2009180516.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光を発する検体に対し励起光を照射し、該検体が発する蛍光の光強度を検出する蛍光検出方法において、
単一の光センサーにより、前記蛍光の光強度の検出と同時に、該光センサーに入射する励起光の光強度を検出し、
前記光センサーで検出された蛍光の光強度を、前記光センサーで検出された励起光の光強度により補正することを特徴とする蛍光検出方法。
【請求項２】
前記蛍光を発する検体が、蛍光標識物質により標識された蛍光標識検体であることを特徴とする請求項１記載の蛍光検出方法。
【請求項３】
蛍光を発する検体に対し励起光を照射する励起光照射手段と、前記検体が発する蛍光の光強度を検出する光センサーとを備えてなる蛍光検出装置において、
前記光センサーが、該光センサー単体で、前記蛍光の光強度の検出と同時に、該光センサーに入射する励起光の光強度を検出するものであり、
前記光センサーで検出された蛍光の光強度を、前記光センサーで検出された励起光の光強度により補正する蛍光強度補正手段を備えたことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項４】
前記蛍光を発する検体が蛍光標識物質により標識された蛍光標識検体であることを特徴とする請求項３記載の蛍光検出装置。
【請求項５】
前記光センサーが、前記蛍光および前記励起光を透過するとともに、ゲート電圧が印加される電極膜と、その下部に絶縁膜を介して前記蛍光および前記励起光により発生した電子を捕獲する拡散層を設け、前記ゲート電圧を変化させ、前記拡散層中の電子を捕獲する該拡散層の表面からの深さを変化させて、それらの電子の量を示す電流を検出する受光部と、
該受光部で検出された複数の電流検出値と、予め入力された前記蛍光の波長および前記励起光の波長とに基づいて、前記蛍光の光強度および前記励起光の光強度を算出する光強度算出部とを備えた分光センサーであることを特徴とする請求項３および４記載の蛍光検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光を発する検体に対し励起光を照射し、該検体が発する蛍光の光強度を検出する蛍光検出方法および蛍光検出装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、例えば特許文献１に示すように、蛍光標識検体から発せられる蛍光を検出する蛍光検出装置が知られている。この蛍光検出装置によれば、蛍光を検出することによって、遺伝子配列、遺伝子の発現レベル、蛋白質の分離、同定、あるいは分子量、特性の評価などを行うことができる。
【０００３】
具体的には、例えば、電気泳動させるべき複数のＤＮＡ断片を含む溶液の中に、蛍光色素を加えた後に、複数のＤＮＡ断片をゲル支持体上で電気泳動させる。あるいは、蛍光色素を含有させたゲル支持体上で、複数のＤＮＡ断片を電気泳動させる。そしてこの複数のＤＮＡ断片を、ゲル支持体上で、電気泳動させた後に、ゲル支持体を蛍光色素を含んだ溶液に浸すなどして、電気泳動されたＤＮＡ断片を標識し、励起光により、蛍光色素を励起して、生じた蛍光を検出することによって、画像を生成し、ゲル支持体上のＤＮＡ分布を検出することができる。
【０００４】
あるいは、複数のＤＮＡ断片を、ゲル支持体上で電気泳動させた後に、ＤＮＡを変性し、次いで、サザン・ブロッティング法により、ニトロセルロースなどの転写支持体上に、変性ＤＮＡ断片の少なくとも一部を転写し、目的とするＤＮＡと相補的なＤＮＡもしくはＲＮＡを蛍光色素で標識して調製したプローブと変性ＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせ、プローブＤＮＡもしくはプローブＲＮＡと相補的なＤＮＡ断片のみを選択的に標識し、励起光によって蛍光色素を励起して、生じた蛍光を検出することにより画像を生成し、転写支持体上の目的とするＤＮＡ分布を検出することができる。
【０００５】
また、近年、生化学解析システムとしてマイクロアレイ解析システムが注目を集めている。例えば、蛍光物質を標識物質として利用したマイクロアレイ解析システムにおいては、スライドガラス板やメンブレンフィルタなどの担体表面上の異なる位置に、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他の蛋白質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなど、生体由来の物質と特異的に結合可能で、かつ、塩基配列や塩基の長さ、組成などが既知の特異的結合物質を、スポッター装置を用いて滴下して、多数の独立したスポットを形成し、次いで、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他の蛋白質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなど、抽出、単離などによって生体から採取され、あるいは、化学的、化学修飾などの処理が施された生体由来の物質であって、蛍光色素などの蛍光標識物質によって標識された物質を、ハイブリダイゼーションなどによって、特異的結合物質に、特異的に結合させたマイクロアレイに、励起光を照射して、蛍光物質、色素などの標識物質から発せられた蛍光などを光電的に検出して、生体由来の物質を解析することができる。
【０００６】
また、測定用のプレート上で、ＤＮＡの抽出から診断まで行う測定用プレートも知られている。
【０００７】
通常、このような測定に用いる蛍光検出装置においては、励起光の波長の光を透過しないフィルタにより、蛍光標識検体から発せられる検出光から励起光を除去して、蛍光のみをフォトディテクターにより検出している。しかしながら、励起光用の光源と検体との距離、光源に対する検体の配置あるいは光源と検体の間に存在する遮光物の有無等の影響により、検体に照射される励起光の光強度にバラツキが生じることがある。また、光源から射出される励起光の光強度そのものにバラツキが生じていることもある。このような場合、検体から発せられる蛍光の光強度は、検体に照射される励起光の光強度のバラツキの影響によりバラツクこととなり、蛍光の光強度の検出値の信頼性が低下する。
【０００８】
このため、例えば図８に示すように、蛍光の検出精度を向上させるために、励起光Ｌ５が照射された蛍光標識検体３０１から発せられる光Ｌ６を、蛍光Ｌ７と励起光の反射光Ｌ８とに分離して検出する装置が知られている。励起用青色ＬＥＤ３１０から射出された青色の励起光Ｌ５は、ハーフミラー３１１により直角方向へ反射され、検体３０１へ照射される。検体３０１から発せられた蛍光Ｌ７と、検体３０１で反射された励起光の反射光Ｌ８とを含む光Ｌ６は、ハーフミラー３１１を透過し、ミラー３１２により直角に反射され、ハーフミラー３０２により、半分は透過し、半分は直角方向へ反射される。ハーフミラー３０２を透過した光Ｌ６のうち蛍光Ｌ７の波長以外の光は、蛍光検出用のバンドパスフィルタ３０３によりカットされ、蛍光Ｌ７のみがフォトディテクター３０５へ入射する。また、また、ハーフミラー３０２で直角方向へ反射した光Ｌ６のうち励起光の波長である青色以外の光は、青色バンドパスフィルタ３０４によりカットされ、励起光の反射光Ｌ８のみがフォトディテクター３０８へ入射する。
【０００９】
フォトディテクター３０５により検出された蛍光Ｌ７の光強度は、信号処理回路３０６においてＩ／Ｖ変換、信号増幅およびＡ／Ｄ変換され、補正処理部３０７へ出力される。
【００１０】
フォトディテクター３０８により検出された励起光の反射光Ｌ８の光強度は、信号処理回路３０９においてＩ／Ｖ変換、信号増幅およびＡ／Ｄ変換され、補正処理部３０７へ出力される。補正処理部３０７では、蛍光Ｌ７の光強度を励起光の反射光Ｌ８の光強度を用いて補正した補正蛍光強度を算出する。
【特許文献１】特開平１１−０３８５３１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、上記の図８に示す蛍光検出装置においては、蛍光Ｌ７と励起光の反射光Ｌ８とを分離するための光学部材（ハーフミラー３０２、バンドパスフィルタ３０３および３０４）と、蛍光測定用のフォトディテクター３０５およびその信号処理回路３０６と、励起光の反射光測定用のフォトディテクター３０８およびその信号処理回路３０９などを使用する必要があり、蛍光検出装置の大型化およびコストアップを招くという問題がある。また、光学部材を多く使用するため、集光効率が悪化し、Ｓ／Ｎが低下するという問題もある。
【００１２】
本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、小型かつ安価な構成で、検体から発せられる蛍光の光強度の検出値の信頼性を向上させることのできる蛍光検出方法および蛍光検出装置を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明による蛍光検出方法は、蛍光を発する検体に対し励起光を照射し、該検体が発する蛍光の光強度を検出する蛍光検出方法において、
単一の光センサーにより、前記蛍光の光強度の検出と同時に、該光センサーに入射する励起光の光強度を検出し、
前記光センサーで検出された蛍光の光強度を、前記光センサーで検出された励起光の光強度により補正することを特徴とするものである。
【００１４】
前記蛍光を発する検体は、蛍光標識物質により標識された蛍光標識検体であってもよい。
【００１５】
本発明による蛍光検出装置は、蛍光を発する検体に対し励起光を照射する励起光照射手段と、前記検体が発する蛍光の光強度を検出する光センサーとを備えてなる蛍光検出装置において、
前記光センサーが、該光センサー単体で、前記蛍光の光強度の検出と同時に、該光センサーに入射する励起光の光強度を検出するものであり、
前記光センサーで検出された蛍光の光強度を、前記光センサーで検出された励起光の光強度により補正する蛍光強度補正手段を備えたことを特徴とするものである。
【００１６】
前記蛍光を発する検体は、蛍光標識物質により標識された蛍光標識検体であってもよい。
【００１７】
前記光センサーは、前記蛍光および前記励起光を透過するとともに、ゲート電圧が印加される電極膜と、その下部に絶縁膜を介して前記蛍光および前記励起光により発生した電子を捕獲する拡散層を設け、前記ゲート電圧を変化させ、前記拡散層中の電子を捕獲する該拡散層の表面からの深さを変化させて、それらの電子の量を示す電流を検出する受光部と、
該受光部で検出された複数の電流検出値と、予め入力された前記蛍光の波長および前記励起光の波長とに基づいて、前記蛍光の光強度および前記励起光の光強度を算出する光強度算出部とを備えた分光センサーであってもよい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の蛍光検出方法および蛍光検出装置によれば、蛍光を発する検体に対し励起光を照射し、該検体が発する蛍光の光強度を検出する際に、単一の光センサーにより、前記蛍光の光強度の検出と同時に、該光センサーに入射する励起光の光強度を検出し、前記光センサーで検出された蛍光の光強度を、前記光センサーで検出された励起光の光強度により補正するため、従来必要であった蛍光と励起光とを分離するための光学部材が不要になり、かつ蛍光の光強度と励起光の光強度をそれぞれ測定するために２系統必要であった光強度検出部および信号処理回路も一系統のみでよく、小型かつ安価な構成で、検体から発せられる蛍光の光強度の検出値の信頼度を向上させることができる。また、検体と光センサーの間に、蛍光と励起光とを分離するための光学部材を設ける必要がないので、光センサーを検体に近づけて配置することができ、光センサーにより検出する光強度のＳ／Ｎを向上させることができる。
【００１９】
前記光センサーが、前記蛍光および前記励起光を透過するとともに、ゲート電圧が印加される電極膜と、その下部に絶縁膜を介して前記蛍光および前記励起光により発生した電子を捕獲する拡散層を設け、前記ゲート電圧を変化させ、前記拡散層中の電子を捕獲する該拡散層の表面からの深さを変化させて、それらの電子の量を示す電流を検出する受光部と、該受光部で検出された複数の電流検出値と、予め入力された前記蛍光の波長および前記励起光の波長とに基づいて、前記蛍光の光強度および前記励起光の光強度を算出する光強度算出部とを備えた分光センサーであれば、予め蛍光の波長と励起光の波長とを入力することにより、容易に検体から発せられた蛍光の光強度および分光センサーの受光部へ入射した励起光の光強度を算出することができる。また、検体の種類が変更され、励起光の波長および蛍光の波長が変化した場合であっても、その検体へ照射する励起光の波長およびその検体から発せられる蛍光の波長を入力することにより、蛍光検出装置そのものを変更することなく、容易に蛍光の光強度を高い信頼度で検出することができる。また、分光センサーの受光部のゲート電圧の変更段数を増加することにより、多波長の光の光強度を検出することができる。例えば、検体が複数の波長の蛍光を発するような場合であっても、ゲート電圧を３段階変化させることにより、３波長の光の光強度を検出することができ、蛍光検出装置の利便性が向上する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、図面を参照して本発明の蛍光検出装置の実施の形態を詳細に説明する。図１Ａは本発明の蛍光検出装置を用いた第１の実施形態である蛍光検出システム１００を示す概略構成図である。図１Ａの蛍光検出システム１００は、マイクロプレート１１０と、該マイクロプレート１１０上に配置された、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体１１１に励起光Ｌ１を照射することにより、蛍光標識検体１１１から射出する蛍光Ｌ２の光強度を検出する蛍光検出装置１２０と、この蛍光検出装置１２０で検出され、補正された蛍光Ｌ２の補正蛍光強度を表示する表示部１４０とを有している。
【００２１】
マイクロプレート１１０は、格子状に配置された複数のスポット１１２を有し、この各スポット１１２には、異なる種類の特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体１１１が存在している。また、マイクロプレート１１０は蛍光の波長帯域の光を透過する素材から形成されている。
【００２２】
蛍光検出装置１２０は、マイクロプレート１１０に、図１Ａにおける斜め上方から励起光Ｌ１を照射する励起光照射部１２１と、該励起光照射部１２１により励起光Ｌ１が蛍光標識検体１１１に照射されたとき、蛍光標識検体１１１から射出された蛍光Ｌ２の光強度と、蛍光標識検体１１１で反射または散乱された励起光Ｌ３の光強度とを検出する分光センサー１２２と、分光センサー１２２で検出された蛍光の光強度を補正する蛍光強度補正部１２７を含み、また励起光照射部１２１および分光センサー１２２の動作を制御する制御部１２５と、該制御部１２５へ蛍光の波長や励起光の波長等を入力する入力部１２６とを備えている。
【００２３】
なお、図１Ｂは、マイクロプレート１１０および励起光照射部１２１を図１Ａにおける上方から見た概略構成図である。この図１Ｂに示すように、マイクロプレート１１０に対し、複数個の励起光照射部１２１が設けられている。
【００２４】
分光センサー１２２は、マイクロプレート１１０の各スポット１１２の下方に配置されている受光部１３０と、この受光部１３０で検出された複数の電流検出値と、予め入力された蛍光標識検体１１１から射出される蛍光Ｌ２の波長と励起光Ｌ１の波長とに基づいて、蛍光Ｌ２の光強度および励起光Ｌ３の光強度を算出する光強度算出部１２３を含むセンサー制御部１２４とを備えている。
【００２５】
は分光センサー１２２の受光部１３０の一部断面を示す斜視図である。この図において、１３１はｎ型シリコン基板（ｎ型基板）、１３２はｎ型シリコン基板１３１中に形成されるｐ型拡散層〔ｐ型ウェル（ｐ型ｗｅｌｌ）〕、１３３はｐ型拡散層２の部位に形成されるｎ＋ 拡散層、１３４はｐ型拡散層２上に形成されるシリコン酸化（ＳｉＯ２ ）膜、１３５はｎ＋ 拡散層１３３に接続されるとともに、基準電圧Ｖresが印加されるＡｌ電極、１３６はｐ型拡散層２に接続されるとともに接地される電極、１３７はシリコン酸化膜１３４の上部に形成され、不純物が添加された多結晶シリコン膜（ｐｏｌｙ−Ｓｉ）、１３８はその多結晶シリコン膜１３７に接続されるゲート電極であり、多結晶シリコン膜１３７はシリコン酸化膜１３４を介して光を透過できる電極として機能する。
【００２６】
そこで、電子を捕獲するｐ型拡散層２の表面からの深さ（位置）を変化させるためには、例えば、ｎ型シリコン基板１３１にｐ型拡散層１３２を設け、その上部に配置したシリコン酸化膜１３４を介して光を透過できる電極としての不純物が添加された多結晶シリコン膜（ｐｏｌｙ−Ｓｉ）１３７が配置された構造にする。光を透過できる不純物が添加された多結晶シリコン膜１３７のすぐ横には、捕獲した電子を外部に取り出すためｎ＋ 拡散層１３３が配置されている。ｐ型拡散層１３２、ｎ型シリコン基板１３１には、それらの電位を一定にするために配線を取り出すためのコンタクトが設けられている。
【００２７】
受光部１３０において、例えば、光強度Ａ１で波長λ１である蛍光Ｌ２と、光強度Ａ２で波長λ２である励起光Ｌ３とが同時に入射したとする。表面から電子の捕獲位置Ｗ１ の距離までに発生した電子による電流の測定値を測定したところ電流Ｉ１であり、次に電子の捕獲位置Ｗ２ の距離までに発生した電子による電流を測定したところ電流Ｉ２ であったとする。このことは以下の式で表すことができる。
【数１】
2009180516.tif 000003
【００２８】
ここで、各パラメータは次の通りである。
【００２９】
Ａ１：蛍光Ｌ２の光強度〔Ｗ／ｃｍ２ 〕
Ａ２ ：励起光Ｌ３の光強度〔Ｗ／ｃｍ２ 〕
Ｓ：センサー面積〔ｃｍ２ 〕
Ｗ１ 、Ｗ２ ：電子の捕獲位置〔ｃｍ〕
α１ 、α２ ：それぞれの波長の吸収係数〔ｃｍ−１〕
Ｉ１ ：電子の捕獲位置をＷ１ としたときの電流の実測値〔Ａ〕
Ｉ２ ：電子の捕獲位置をＷ２ としたときの電流の実測値〔Ａ〕
振動数ν１ ＝ｃ／λ１ 
振動数ν２ ＝ｃ／λ２ 
ここで、ｃは光速、Ｓは受光部の面積、ｈνは光のエネルギー、ｑは電子ボルトであり、光強度Ａ１ 、Ａ２ 以外は全て既知の値とみなすことができ、この２式から連立方程式を解くことにより、以下の式により光強度Ａ１ 、Ａ２ を求めることができる。
【数２】
2009180516.tif 000004
【００３０】
なお、この場合の各パラメータは次の通りである。
【数３】
2009180516.tif 000005
【００３１】
なお、ゲート電極１３８に印可するゲート電圧Ｖｇを変化させることにより、電子の捕獲位置を変化させることができる。電子捕獲位置の変化については、特開２００５−１０１  １４号公報に詳細な説明が開示されている。
【００３２】
光強度算出部１２３では、上記の式へ、受光部１３０で検出された電流Ｉ１と電流Ｉ２と、予め入力された蛍光の波長および励起光の波長とを代入することにより、蛍光の光強度および励起光の光強度を算出する。なお、光強度算出部１２３には、各ゲート電圧に対応する電子捕獲位置、センサー面積Ｓおよび各波長における吸収係数や、他の定数等が予め記憶されている。
【００３３】
以下、制御部１２５およびセンサー制御部１２４の動作を中心に、本蛍光検出装置1２０における蛍光強度の検出動作を簡単に説明する。蛍光強度の検出を行う前に、使用者は入力手段１２６を介して、励起光の波長および蛍光の波長を制御部１２５へ入力する。また電子の捕獲位置Ｗ１ に相当するゲート電圧Ｖｇ１および電子の捕獲位置Ｗ２ に相当するゲート電圧Ｖｇ２も、入力手段１２６を介して制御部１２５へ入力する。制御部１２５は、励起光の波長、蛍光の波長、ゲート電圧Ｖｇ１およびゲート電圧Ｖｇ２に関する情報をセンサー制御部１２４へ出力する。
【００３４】
制御部１２５の制御により、励起光照射部１２１から、設定された波長の励起光Ｌ１が射出される。なお、励起光照射部１２１としては、予め異なる波長の光を射出する複数の種類の光源を有し、制御部１２５の制御により適宜適切は光源を用いる、波長切替可能な励起光照射部を用いることが好ましい。マイクロプレート１１０のスポット１１２内に置かれた各蛍光標識検体１１１に励起光Ｌ１が照射されると、各蛍光標識検体１１１からは蛍光が発せられる。蛍光標識検体１１１から図１Ａにおける下方へ発せられた蛍光Ｌ２は、受光部１３０へ入射する。また励起光Ｌ１の一部は、蛍光標識検体１１１で反射あるいは散乱される。蛍光標識検体１１１により図１Ａにおける下方へ反射または散乱された励起光Ｌ３は、受光部１３０へ入射する。
【００３５】
センサー制御部１２４の制御により、受光部１３０のゲート電極１３８へゲート電圧Ｖｇ１が印可され、電子の捕獲位置Ｗ１ における電流Ｉ１が検出され、光強度算出部１２３へ出力されて、Ｉ／Ｖ変換、信号増幅およびＡ／Ｄ変換される。さらに、センサー制御部１２４の制御により、受光部１３０へゲート電圧Ｖｇ２が印可され、電子の捕獲位置Ｗ２ における電流Ｉ２が検出され、光強度算出部１２３へ出力され、Ｉ／Ｖ変換、信号増幅およびＡ／Ｄ変換される。
【００３６】
光強度算出部１２３では、受光部１３０で検出された電流Ｉ１および電流Ｉ２と、予め入力された蛍光の波長、励起光の波長、電子の捕獲位置Ｗ１および電子の捕獲位置Ｗ２に基づいて、各スポット１１２毎に蛍光Ｌ２の光強度および励起光Ｌ３の光強度を算出し、制御部１２５へ出力する。
【００３７】
制御部１２５では、蛍光強度補正部１２７において、各スポット１１２毎に蛍光Ｌ２の光強度を励起光Ｌ３の光強度により除算し、蛍光Ｌ２の光強度を補正した補正蛍光強度を算出する。制御部１２５は各スポット１１２毎の補正蛍光強度を、表示部１４０へ出力し、表示部１４０では、各スポット１１２の位置とこれらの補正蛍光強度を対応させて表示する。
【００３８】
各蛍光標識検体１１１へ照射される励起光Ｌ１の光強度にバラツキがあれば、該励起光Ｌ１により励起された蛍光標識検体１１１から発せられる蛍光の光強度がバラツキ、また蛍光各蛍光標識検体１１１で反射または散乱された励起光Ｌ３の光強度もバラツクこととなる。
【００３９】
図３〜図５は、励起光Ｌ１の光強度、励起光Ｌ３の光強度、蛍光Ｌ２の光強度および補正蛍光強度の関係を調べた模擬実験の結果を示す図である。濃度が異なる２本鎖ＤＮＡ１００ｕｌへ、蛍光標識としてSYBR Greenを付与し、その後、順次異なる光強度の励起光Ｌ１（５．２ｍＷおよび７．７ｍＷ）を横方から照射して、下方に配置された受光部１３０により蛍光Ｌ２および励起光Ｌ３を受光して、それぞれの光強度を検出した。なお、励起光の波長は４７０ｎｍであり、この励起光を照射されたSYBR Greenからは波長５２０ｎｍの蛍光が発せられる。図３は、２本鎖ＤＮＡ濃度と励起光Ｌ３の光強度との関係を示す図である。図４は２本鎖ＤＮＡ濃度と蛍光Ｌ２の光強度との関係を示す図である。また、図５は、２本鎖ＤＮＡ濃度と、それぞれの蛍光Ｌ２の光強度を同時に検出した励起光Ｌ３の光強度で除算した補正蛍光強度との関係を示す図である。まず、図３から励起光Ｌ３の光強度のバラツキは、ほぼ０．７：１となり、励起光Ｌ１の光強度のバラツキである５．２：７．７とほぼ等しいことがわかる。また、図５から、２本鎖ＤＮＡ濃度が同一の場合には、補正蛍光強度の値もほぼ等しい値となり、補正により蛍光強度の信頼性が向上していることがわかる。
【００４０】
以上の説明であきらかなように、蛍光検出システム１００において、蛍光標識検体１１１が発する蛍光Ｌ２の光強度を検出する際に、分光センサー１２２により、蛍光Ｌ２の光強度の検出と同時に、この分光センサー１２２の受光部１３０に入射する励起光Ｌ３の光強度を検出している。蛍光Ｌ２の光強度を、励起光Ｌ３の光強度により除算することにより、蛍光標識検体１１１に照射される励起光Ｌ１の光強度のバラツキに起因して生じた蛍光Ｌ２の光強度のバラツキを補正することができる。簡易な構成により蛍光標識検体１１１から発せられる蛍光の光強度の検出値の信頼度を向上させ、定量検出を行うことができる。また、励起光をカットするフィルタあるいは励起光と蛍光を分離する光分離手段等を設ける必要も無く、コンパクトな構成により信頼性の高い蛍光強度を検出することができる。また、また、蛍光標識検体１１１と分光センサー１２２の受光部１３０との間に、蛍光と励起光とを分離するための光学部材を設ける必要がないので、受光部１３０を蛍光標識検体１１１に近づけて配置することができ、分光センサー１２２により検出する光強度のＳ／Ｎを向上させることができる。
【００４１】
さらに、分光センサー１２２は、所望の波長の光強度を検出できるため、蛍光波長の異なる蛍光標識を用いた場合であって、励起光の波長および蛍光の波長を入力部１２６から入力することにより、分光センサーを変更することなく、信頼性の高い蛍光強度を検出することができる。
【００４２】
次に、図６および図７を参照して本発明の蛍光検出装置１２０を用いた第２の実施形態である蛍光検出システム２００について説明する。図６は、蛍光検出システム２００を示す概略構成図であり、図７は蛍光検出システム２００に用いたプレート２１０の平面図である。なおプレート２１０を除いた構成は、図１Ａに示した蛍光検出システム１００と同一であるため、説明は省略する。
【００４３】
プレート２１０には、検出用の複数のスポット２１１が設けられている。それぞれのスポット２１１には、試料液を送液する流路２１２および２１３が設けられている。各流路２１２は流路２１４へ接続され、流路２１４の端部には送液ポート２１５が設けられている。また、各流路２１３は流路２１６へ接続され、流路２１６には、複数の試薬ストック２１７が接続されている。各スポット２１１には、異なる種類の特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体１１１が存在している。また、プレート２１０は蛍光の波長帯域の光を透過する素材から形成されている。このように、プレート上にスポット２１１に加え、流路や試薬ストックなどが設けられている場合には、流路や試薬ストックにより励起光Ｌ１が反射あるいは散乱され、蛍光標識検体１１１へ照射される励起光Ｌ１の光強度に一層バラツキが生じる虞がある。
【００４４】
しかながら、蛍光検出システム２００においても、図１Ａに示す蛍光検出システム１００と動揺に、蛍光標識検体１１１が発する蛍光Ｌ２の光強度を検出する際に、分光センサー１２２により、蛍光Ｌ２の光強度の検出と同時に、この分光センサー１２２の受光部１３０に入射する励起光Ｌ３の光強度を検出している。このため、蛍光Ｌ２の光強度を、励起光Ｌ３の光強度により除算することにより、蛍光標識検体１１１に照射される励起光Ｌ１の光強度のバラツキに起因して生じた蛍光Ｌ２の光強度のバラツキを補正することができ、簡易な構成により蛍光標識検体１１１から発せられる蛍光の光強度の検出値の信頼度を向上させ、定量検出を行うことができる
なお、各実施の形態においては、励起光および蛍光が、それぞれ１波長である場合について説明したが、これに限定されるものではない。例えば２種類の蛍光標識を用いた場合であれば、２つの波長の励起光と、２つの波長の蛍光を検出することもできる。この場合には、分光センサー１２２の受光部１３０のゲート電極１３８へ印可するゲート電圧を４段回変化させ、各ゲート電圧に対応する電子の捕獲位置を用いて各励起光および蛍光の光強度を算出すればよい。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１Ａ】本発明の蛍光検出装置を用いた第１の実施形態である蛍光検出システムの概略構成図
【図１Ｂ】上記蛍光検出システムに使用するマイクロプレートの模式図
【図２】分光センサーの受光部の断面斜視図
【図３】２本鎖ＤＮＡ濃度と励起光の光強度の関係を示す図
【図４】２本鎖ＤＮＡ濃度と蛍光の光強度の関係を示す図
【図５】２本鎖ＤＮＡ濃度と補正蛍光強度の関係を示す図
【図６】本発明の蛍光検出装置を用いた第２の実施形態である蛍光検出システムの概略構成図
【図７】上記蛍光検出システムに使用するプレートの模式図
【図８】従来の蛍光検出装置の概略構成図
【符号の説明】
【００４６】
１００，２００    蛍光検出システム
１１０            マイクロプレート
１１１            蛍光標識検体
１２０            蛍光検出装置
１２１            励起光照射部
１２２            分光センサー
１２３            光強度算出部
１２４            センサー制御部
１２５            制御部
１２７            蛍光強度補正部
１３０            受光部
１３１            ｎ型シリコン基板
１３２            Ｐ型拡散層
１３３            ｎ+拡散層
１３４            シリコン酸化膜
１３７            多結晶シリコン膜
１３８            ゲート電極
２１０            プレート
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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