(57)【要約】【課題】ＤＮＡサンプルの分離を短い時間で行うことが出来る生体サンプル分析装置を提供する。【解決手段】分析プレートを回転させるための回転トレイと前記分析プレートを前記回転トレイ上で挟み込み保持するためのクランパとを備えた生体サンプル分析装置において、前記クランパは正負の接続電極を持つ蓄電部を備えた生体サンプル分析装置であり、さらには前記クランパの蓄電部に電圧を印加するための電圧印加手段を有し、前記クランパは前記電圧印加手段からの印加電圧を蓄電部の前記正負の接続電極に受電するための電圧印加手段接続部と前記分析プレートに設けられた正負の電極とを接続するためのプレート側接続部と、をさらに備えた請求項１に記載の生体サンプル分析装置。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析プレートを回転させるための回転トレイと前記分析プレートを前記回転トレイ上で挟み込み保持するためのクランパとを備えた生体サンプル分析装置において、
前記クランパは正負の接続電極を持つ蓄電部を備えた生体サンプル分析装置。
【請求項２】
前記生体サンプル分析装置は前記クランパの蓄電部に電圧を印加するための電圧印加手段を有し、
前記クランパは前記電圧印加手段からの印加電圧を蓄電部の前記正負の接続電極に受電するための電圧印加手段接続部と前記分析プレートに設けられた正負の電極とを接続するためのプレート側接続部と、をさらに備えた請求項１に記載の生体サンプル分析装置。
【請求項３】
前記蓄電部は、前記分析プレートの測定流路に対応して設けられた請求項２に記載の生体サンプル分析装置。
【請求項４】
前記蓄電部は、前記クランパの中心に前記蓄電部の正極同士を結合し、前記負極を前記中心に対して放射状に配置する請求項３に記載の生体サンプル分析装置。
【請求項５】
前記電圧印加手段接続部は、正極を前記正極同士の結合部とし、負極を前記蓄電部の負極とする請求項４に記載の生体サンプル分析装置。
【請求項６】
前記クランパにおいて、前記プレート側接続部の正負の電極は対応する前記電圧印加手段接続部の正負の電極に接続されている請求項５に記載の生体サンプル分析装置。
【請求項７】
前記蓄電部は、
少なくとも一つ以上の抵抗を直列結合した抵抗群と、
少なくとも一つ以上のコンデンサを並列結合したコンデンサ群と、
前記コンデンサ群に並列結合された少なくとも一つ以上のツェナーダイオードを直列結合したツェナーダイオード群とから構成され、
前記抵抗群と前記コンデンサ群を直列結合し、且つ前記抵抗群の開放端を前記正の接続電極とし前記コンデンサ群の開放端を前記負の接続電極とする請求項４に記載の生体サンプル分析装置。
【請求項８】
前記電圧印加手段からの出力電圧を前記クランパ上の正負の接続電極に送電するための電極針を前記クランパに接続あるいは非接続するための電極芯上下ユニットをさらに備えた請求項１に記載の生体サンプル分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光標識させたＤＮＡやタンパクその他の生体サンプルを緩衝液中で移動させ、その輸送反応を検出して生体サンプルを判別するのに好適な生体サンプル分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
緩衝液を満たした微細な流路の一部に生体サンプルを導入し、その流路の両端に電位勾配をかけ電気泳動により生体サンプルを移動させる。このとき、生体サンプルの分子量や電荷量によって電気泳動の速度が異なるため、流路の泳動方向に沿って分離されて生体サンプルの違いによる分布が生じる。この分布パターンを読み取ることにより、生体サンプルの種類の同定判別を行うことができる。このような電気泳動を行う分析装置としてはキャピラリー管を用いた生体サンプル分析装置が一般的によく使用されているが、近年ではキャピラリー管の代わりに生体サンプル分析プレートを用いた生体サンプル分析装置も報告されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
図９は、従来の生体サンプル分析装置の構成を示す図である。生体サンプル分析装置４００では、測定のために樹脂製の生体サンプル分析プレート１００（以下、単に「プレート」と称する。）を用いる。測定を行う際には、プレート１００のチャンバ内にＤＮＡサンプルと緩衝液として分離用ＤＮＡコンジュゲートとを注入したプレート１００をトレイ４０１上に載せる。次に、トレイ駆動手段４０２によりプレート１００を高速回転させて電気泳動流路にＤＮＡコンジュゲートを充填すると共に、ＤＮＡサンプルを前記充填された分離用ＤＮＡコンジュゲート中に定量添加する。ＤＮＡサンプルを定量した後、電圧印加手段４０３の電極プローブ４０４ａ〜４０４ｉを、駆動モータ４０６により電圧印加接触・離間手段４０５を下げ、プレート１００の表面に貼付された導電性フィルムに当接させる。この状態で所定時間電圧印加して前記分離用ＤＮＡコンジュゲートに所定の電位勾配をかける。そして所定時間経過後、前記電圧印加接触・離間手段４０５の駆動モータ４０６により、前記電極プローブ４０４ａ〜４０４ｉを所定位置まで上昇させる。その後、前記トレイ４０１をトレイ駆動手段４０２により低速回転させながら蛍光検出器４０７によりプレート１００の流路中を電気泳動するＤＮＡサンプルに標識した蛍光標識に励起光を照射して、前記蛍光標識が発する蛍光の強度分布を検出する。このようにしてＤＮＡサンプルの電気泳動と、蛍光の強度分布検出を交互に行い、ＤＮＡサンプルが分離する様子を検出していた。
【特許文献１】特開２００７−１８７５８６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、前記従来の構成では、蛍光の強度分布検出時にＤＮＡサンプルの電気泳動を行わないため、蛍光の強度分布検出時にＤＮＡサンプルの分離が進行せず、測定時間が長くなるという課題を有していた。
【０００５】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、ＤＮＡサンプルの分離を短い時間で行うことが出来る生体サンプル分析装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記従来の課題を解決するために、本発明の生体サンプル分析装置は、分析プレートを回転させるための回転トレイと前記分析プレートを前記回転トレイ上で挟み込み保持するためのクランパとを備えた生体サンプル分析装置において、前記クランパは正負の接続電極を持つ蓄電部とを備えることを特徴としたものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の生体サンプル分析装置によれば、蛍光の強度分布検出時においてもクランパ備えた蓄電部により、ＤＮＡサンプルの分離を短い時間で行うことが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下に、本発明の生体サンプル分析装置の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【０００９】
（実施の形態１）
図１は、本発明の実施の形態１で使用する生体サンプル分析プレートの構成図である。図１（ａ）は生体サンプル分析プレート１００の流路形成面を示す図である。生体サンプル分析プレート１００は微細な溝を形成した基板に、薄く光の透過性の良いフィルムを貼り付けることで８つの独立した密閉流路１０１を形成している。
【００１０】
図１（ｂ）は密閉流路１０１を拡大した図で、ＤＮＡコンジュゲートを密閉流路１０１の一部の流路に充填し、ＤＮＡサンプルを前記ＤＮＡコンジュゲート中に定量添加した状態である。図中の斜線はＤＮＡコンジュゲートを示し、黒く塗り潰している部分はＤＮＡサンプルを示す。定量チャンバ１０２に定量添加されたＤＮＡサンプルは陽極チャンバ１０３、陰極チャンバ１０４それぞれに、正電圧、負電圧を印加することで、図中実線の矢印の方向へ電気泳動する。そして、電気泳動するＤＮＡサンプルを検出流路１０５の領域で蛍光検出する。８つの検出流路はプレートの中心孔１０６を中心に同心円状に配置しており、生体サンプル分析プレート１００を回転させると１つの蛍光検出器で８つの検出流路全てをスキャンすることができる。
【００１１】
図２は生体サンプル分析プレートの導電フィルム面を示す。流路形成面の反対面（電極フィルム面）には導電性フィルムを貼り付けてある。そして、導電性フィルム１０７には各密閉流路の陽極チャンバを、導電性フィルム１０８ａ〜１０８ｈには各密閉流路の陰極チャンバを接続させている。
【００１２】
図３は、本発明の実施の形態１における生体サンプル分析装置１の主要な部分を示した構成図である。図２で説明した生体サンプル分析プレート１００を用い、そのフィルム面側を蛍光検出器２へ向けて生体サンプル分析装置１の回転トレイ３００に載せる。その後、生体サンプル分析プレート１００の上部に本発明のクランパ２００を載せ、回転トレイ３００と挟むように生体サンプル分析プレート１００を固定する。回転トレイ３００の上部には電極針１２があり、高電圧制御回路１４により発生した電圧を後述する回転トレイ３００に内蔵した蓄電部２０３に伝える。
【００１３】
モータ５により回転トレイ３００を回転させると、生体サンプル分析プレート１００はクランパ２００により回転トレイ３００と固定されているので、共に回転する。モータ５の回転数は、コントローラ６よりモータ制御回路７に対して設定し、モータ５の回転数の制御を行う。また、生体サンプル分析プレート１００が1回転したかどうかの確認にはインデックスセンサ８からの信号を用いれば良い。インデックスセンサ８からの信号は回転トレイ３００が１回転すると１個のパルスを発生し、インデックス検出回路９で２値化されコントローラ６へ信号が送られる。蛍光の強度分布検出を行う際にはインデックスセンサ８の検出位置からスキャン動作を行うことでどの検出流路をスキャンしているかの特定を行うことができる。
【００１４】
次に、生体サンプルの蛍光の強度分布を検出する手段について説明する。蛍光の強度分布検出は、生体サンプル分析プレート１００を低速で回転させながら、蛍光検出器２によって行う。蛍光検出器２は複数の光学部品より構成され、生体サンプル分析プレート１００へ励起光を照射し、蛍光標識させた生体サンプルからの蛍光を検出する。励起光パワーの設定は、発光量制御回路１０に対してコントローラ６より行う。発光量制御回路１０はコントローラ６で設定した電流値で蛍光検出器２の励起光発光素子を駆動する。また、励起光の照射によって発生した蛍光は、対物レンズ３で蛍光検出器２へと導入し、蛍光検出器２の受光素子で電気信号に変換させる。その後、光量検出回路４で変換された蛍光の微弱な電気信号を増幅し、コントローラ６によって信号処理して、図示していないホストコンピュータへ測定データを転送し、検出流路ごとに波形表示する。
【００１５】
次に本発明のクランパの詳細を説明する。図４（ａ）はクランパ２００の外観図、図４（ｂ）はトレイ３００の外観図を示す。生体サンプル分析プレート１００はトレイ３００にフィルム面を向けて搭載する。トレイ３００の嵌合ピン３０１、中心ピン３０２と生体サンプル分析プレート１００の嵌合孔１０９、中心孔１０６を嵌め合わせることで位置ずれなく正確に生体サンプル分析プレート１００をトレイ３００に固定することができる。また、トレイ３００には搭載した生体サンプル分析プレート１００に対して蛍光検出器２からの光を照射するために、開口部３０３を検出流路の数だけ設けてある。
【００１６】
クランパ２００の円周部分には、クランパ２００をトレイ３００に係止するためのクランパ突起部２０１が４つ備えられている。そして、クランパ２００は生体サンプル分析プレート１００を搭載した状態にあるトレイ３００上に配置し、トレイ３００に設けた係止部３０４と、クランパ突起部２０１とを嵌め合わせることで、生体サンプル分析プレート１００を挟み込み、保持する。
【００１７】
次に、生体サンプル分析プレート１００に電圧を印加する手段について説明する。図５は本発明の実施の形態１のクランパ２００の構成を示す図である。図５（ａ）はクランパ２００の全体の構成を、図５（ｂ）はクランパ２００を図５（ａ）のＡ−Ａ´断面で見たときの構成を、図５（ｃ）は蓄電部２０３の構成を示している。本発明の実施の形態１の生体サンプル分析装置１のクランパ２００は電極針側接続部２０２を９つ、蓄電部２０３を８つ、プレート側接続部２０４を９つ備える。そして、電極針側接続部２０２、蓄電部２０３、プレート側接続部２０４はプリント基板２０５に搭載した。プリント基板２０５は両面実装が可能な２層基板で、電極針側接続部２０２は、プリント基板２０５の電極針側の面に設けられたランドである。
【００１８】
プレート側接続部２０４は、先端が上下に可動するスプリング式コンタクトピンで、プリント基板２０５のプレート側の面に半田付けしてある。そして、クランパ２００を回転トレイ３００へ係止させる際は、プレート側接続部２０４を生体サンプル分析プレート１００の導電性フィルムに接触するように取り付ける。ここで、プレート側接続部１０４にはスプリング式のコンタクトプローブを使用しているため、生体サンプル分析プレート１００にソリがある場合でもコンタクトプローブの可動範囲内でコンタクトプローブの先端が上下し、プレート側接続部１０４すべてを対応した導電性フィルムに接触させることができる。
【００１９】
また、蓄電部２０３は、図５（ｃ）のように、抵抗と、コンデンサと、ツェナーダイオードから構成され、蓄電部２０３の陰極側には陰極の電極針側接続部、陰極のプレート側接続部を接続し、蓄電部２０３の陽極側には陽極の電極針側接続部、陽極のプレート側接続部を接続してある。本発明の実施例では、セラミックチップ抵抗（１キロオーム、定格電力０．５Ｗ）を１０個直列に接続して集合抵抗１０キロオームを生成し、ツェナーダイオード（Ｖｚ＝１０ボルト（ｔｙｐ）、ＩＲ＝０．０５マイクロアンペア）を１０個直列に接続して集合ツェナー電圧１００ボルトを生成し、セラミックチップコンデンサ（１マイクロファラッド、耐圧２００ボルト）を１０個並列に接続して集合静電容量１０マイクロファラッドを生成した。この接続は、抵抗、ツェナーダイオード、コンデンサの耐圧を考慮した構成であり、各素子の耐圧等のスペックにより接続構成は異なる。また、蓄電部２０３の集合抵抗値は、検出流路に充填した緩衝液（本実施例ではＤＮＡコンジュゲート）の抵抗値によって選択が異なるが、選択の目安としては、抵抗値であれば、緩衝液の抵抗値に対して十分小さい値（例えば１００分の１以下のもの）を選ぶ。集合静電容量はできるだけ大きいものが好ましく、耐圧、設置スペースの許す限り静電容量が大きくなるようコンデンサの選択、接続を工夫する。なお、８つの蓄電部２０３で集合静電容量、集合抵抗値、集合ツェナー電圧がバラつかないように抵抗、コンデンサ、ツェナーダイオードを選定し、構成することが好ましい。
【００２０】
以上のようなクランパ２００の構成により、クランパ２００の電極針側接続部２０２に電圧を印加すれば蓄電部２０３のツェナーダイオードで定めた任意の電圧を蓄電部２０３のコンデンサへ充電すると共に、プレート側接続部２０４により生体サンプル分析プレート１００の導電性フィルム１０７、導電性フィルム１０８ａ〜１０８ｈ間へ電圧印加することができる。また、任意の時間電極針側接続部２０２へ電圧印加した後、電極針側接続部２０２への電圧印加を停止しても、前記コンデンサへ充電させた電荷を放電してプレート側接続部２０４から生体サンプル分析プレート１００に備えた導電性フィルム１０７、導電性フィルム１０８ａ〜１０８ｈ間へ電圧印加を行うことができる。
【００２１】
次に、クランパ２００の電極針側接続部２０２へ電圧を印加する手段について説明する。
電極針側接続部２０２への電圧印加は、コントローラ６で電極針駆動回路１１に対して電極針１２が電極針側接続部２０２と接触する位置を設定し、電極針上下ユニット１３を駆動させ、電極針１２をクランパ２００の電極針側接続部２０２へ接触させる。その後、コントローラ６で高電圧制御回路１４に対して電圧を設定し、電極針１２に任意の電圧を印加する。
【００２２】
任意の時間電極針側接続部２０２へ電圧印加を行うと、コントローラ６は電極針駆動回路１１に対して電極針１２が電極針側接続部２０２と離間する位置を設定し、電極針上下ユニット１３を駆動させ、電極針１２を電極針側接続部２０２から離間させる。その後生体サンプル分析装置１は、生体サンプル分析プレート１００を低速回転させながら蛍光検出動作へと移る。前述したように、クランパ２００は極針側接続部２０２への電圧印加した後も、蓄電部２０３に充電した電荷を放電して生体サンプル分析プレート１００に電圧印加を行うことができるので、蛍光の強度分布検出中も、ＤＮＡサンプルを電気泳動してＤＮＡサンプルの分離を進行させることができる。
【００２３】
本発明の効果を示すために、従来の生体サンプル分析装置で測定したものを比較例とし、測定時間の比較を行った。なお、本比較例はＤＮＡコンジュゲートに対してアフィニティ強度が異なる２種類のＤＮＡサンプルを前記ＤＮＡコンジュゲート中で電気泳動して分離し、蛍光の強度分布検出を異なる時間で６回行い、分離の様子と測定時間を従来の生体サンプル分析装置４００と本発明の生体サンプル分析装置１とで比較したものである。
【００２４】
比較には、蛍光の強度分布検出を異なる時間で６回行い、ＤＮＡサンプルが分離していく様子を観測した。この時に、ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡサンプルのアフィニティ、ＤＮＡサンプルの電気泳動速度等を確認し、最適なＤＮＡコンジュゲートの条件（ｐＨ、塩濃度、温度、プローブＤＮＡの塩基数、粘度）で測定が行われているか、コンタミによるエラーは起きていないか等を確認して、より正確なＤＮＡサンプル測定を実施することができる。
【００２５】
装置の比較のために、ＤＮＡコンジュゲートと、ＤＮＡサンプル、生体サンプル分析プレートは生体サンプル分析装置１と生体サンプル分析装置４００で同じものを用いた。また、ＤＮＡコンジュゲートを生体サンプル分析用プレートの密閉流路の一部に充填し、前記ＤＮＡコンジュゲートに対してＤＮＡサンプルを定量添加する動作については両装置とも同一なので説明を省略する。
【００２６】
従来の生体サンプル分析装置４００では印加電圧１００ボルトを３０秒間生体サンプル分析プレートに印加し、その後、電圧印加を停止し、蛍光の強度分布検出を行う。電圧印加を停止し、蛍光の強度分布検出を行って再び電圧印加を行うまでは２０秒を要する。電圧印加３０秒、蛍光の強度分布検出２０秒を１セットとして合計６セット電圧印加と蛍光の強度分布検出を繰り返し、３００秒を要して図６の検出波形を得た。図６において縦軸は蛍光検出強度を相対的に示しており、横軸は検出流路の位置を測定ポイントで表示している。ここで、０は検出流路の始点を示し、２００は終点を示す。
【００２７】
本発明の生体サンプル分析装置１では、印加電圧１００ボルトを図７（ａ）のように電極針１２によってクランパ２００へ印加した。図７（ａ）において、波形が１００ボルトのときは電極針１２によってクランパ２００へ電圧印加を行っていることを示し、波形が０ボルトのときは電極針１２をクランパ２００から離間させてクランパ２００へ電圧印加していないことを示している。電極をクランパ２００から離間させている間（図７（ａ）中、波形が０ボルトの間）は、電極針１２を電極上下ユニット１３によって上昇させたり、生体サンプル分析プレート１００をインデックスセンサ８によってインデックス位置まで回転させたり、インデックス位置から生体サンプル分析プレート１００を低速回転させながら蛍光検出器２によって蛍光検出を行ったり、再び電極針１２を電極上下ユニット１３によって下降させてクランパ２００に接触させたりという動作を行っており、従来と同じく、２０秒を要する。
【００２８】
そして、クランパ２００からは生体サンプル分析プレート１００へ図７（ｂ）のような電圧が出力される。ここで、従来の生体サンプル分析装置４００では、１００ボルト、３０秒間を１セットとして電圧印加を行っているが、本発明の生体サンプル分析装置１では
図７（ｂ）に示す蛍光検出動作Ａから次の蛍光検出動作Ａ´までの印加電圧を時間で積分した値が従来と同じ電圧印加量（１００ボルト×３０秒＝３０００ボルト・秒）となるよう図７（ａ）に示す印加電圧時間を設定している。従来の生体サンプル分析装置４００と同様に本発明の生体サンプル分析装置１においても６セット、クランパ２００への電圧印加と蛍光の強度分布検出を交互に繰り返し、１９０秒で図８の検出波形を得た。
【００２９】
従来の検出波形図６と本発明の検出波形図８から分かるように、ＤＮＡサンプルが分離していく様子を検出する場合、従来の生体サンプル分析装置では、６回の検出を行うためにトータル３００秒要したのに対し、本発明の生体サンプル分析装置では、蛍光の強度分布検出中も生体サンプル分析プレートへ電圧印加が行えるため、ＤＮＡサンプルが電気泳動してＤＮＡサンプルの分離が進行し、トータル１９０秒（従来の約３分の２）の測定時間で従来と同じような６回の検出波形を得ることができた。このように、本発明の生体サンプル分析装置によれば、蛍光の強度分布検出中も生体サンプルの電気泳動を行えるため、測定時間を従来の生体サンプル分析装置より短縮することができる。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明にかかる生体サンプル分析装置は、蛍光の強度分布検出中も分析プレートに電圧印加できる蓄電部を備えたクランパを有し、ＤＮＡ等の生体サンプルの測定を迅速に行う生体サンプル分析装置として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の実施の形態１で使用する生体サンプル分析プレートの構成図
【図２】導電フィルム面から見た本発明の実施の形態１で使用する生体サンプル分析プレートの構成図
【図３】実施の形態１における生体サンプル分析装置の主要な部分を示した構成図
【図４】クランパ２００の外観図及びトレイ３００の外観図
【図５】クランパ２００の構成図
【図６】従来の生体サンプル分析装置の検出波形を示す図
【図７】クランパ２００への印加電圧波形とクランパ２００から生体サンプル分析プレートへ出力される電圧波形を示す図
【図８】本発明の生体サンプル分析装置の検出波形を示す図
【図９】従来の生体サンプル分析装置の構成を示す図
【符号の説明】
【００３２】
１  生体サンプル分析装置
２  蛍光検出器
３  対物レンズ
４  光量検出回路
５  モータ
６  コントローラ
７  モータ制御回路
８  インデックスセンサ
９  インデックス検出回路
１０  発光量制御回路
１１  電極針駆動回路
１２  電極針
１３  電極針上下ユニット
１４  高電圧制御回路
１００  生体サンプル分析プレート
１０１  密閉流路
１０２  定量チャンバ
１０３  陽極チャンバ
１０４  陰極チャンバ
１０５  検出流路
１０６  中心孔
１０７  導電性フィルム
１０８ａ〜１０８ｈ  導電性フィルム
１０９  嵌合孔
２００  クランパ
２０１  クランパ突起部
２０２  電極針側接続部
２０３  蓄電部
２０４  プレート側接続部
２０５  プリント基板
３００  回転トレイ
３０１  嵌合ピン
３０２  中心ピン
３０３  開口部
３０４  係止部
４００  従来の生体サンプル分析装置
４０１  トレイ
４０２  トレイ駆動手段
４０３  電圧印加手段
４０４  電極プローブ
４０５  電圧印加接触・離間手段
４０６  駆動モータ
４０７  蛍光検出器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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