(57)【要約】【課題】人工的に分化させた組織、器官、細胞を用いた素子を利用し、組織、器官、細胞への刺激が与える影響を検出することを目的とする。【解決手段】胚細胞や人工多能性胚細胞を利用し、上皮組織など採取しやすい細胞から分化させた組織、器官、細胞を利用して細胞間相互作用を検出することで刺激に対する組織、器官、細胞への影響を検出する。ヒト皮膚上皮細胞１から分化させた上皮細胞由来分化細胞２に刺激３を添加し、刺激を受け取った細胞４から信号伝達物質５がギャップジャンクション６を経て異なる細胞へ伝達された状態を核酸７の転写や翻訳によって産生された翻訳産物８をもって検出する方法である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工的に作製した組織自体を素子としたバイオセンサであって、組織に与えた刺激に対する組織への作用を検出するバイオセンサ。
【請求項２】
人工的に作製した組織自体を素子としたバイオセンサを用いて、組織に与えた刺激に対する組織への作用を検出する刺激作用検出方法。
【請求項３】
組織を器官とした請求項２記載の刺激作用検出方法。
【請求項４】
組織を複数の細胞とした請求項２記載の刺激作用検出方法。
【請求項５】
組織を胚幹細胞由来とした請求項２乃至４のいずれかに記載の刺激作用検出方法。
【請求項６】
組織を人工多能性幹細胞由来とした請求項２乃至４のいずれかに記載の刺激作用検出方法。
【請求項７】
組織を個体由来とした請求項５または６記載の刺激作用検出方法。
【請求項８】
刺激を伝令リボ核酸の添加により与える請求項２乃至７のいずれかに記載の刺激作用検出方法。
【請求項９】
刺激をイオンの添加により与える請求項２乃至７のいずれかに記載の刺激作用検出方法。
【請求項１０】
刺激をホルモンの添加により与える請求項２乃至７のいずれかに記載の刺激作用検出方法。
【請求項１１】
刺激を転写因子の添加により与える請求項２乃至７のいずれかに記載の刺激作用検出方法。
【請求項１２】
刺激を栄養素の添加により与える請求項２乃至７のいずれかに記載の刺激作用検出方法。
【請求項１３】
刺激を神経伝達物質の添加により与える請求項２乃至７のいずれかに記載の刺激作用検出方法。
【請求項１４】
刺激を電気刺激とした請求項２乃至７または、１２のいずれかに記載の刺激作用検出方法。
【請求項１５】
組織への作用の検出は組織の遺伝子の転写産物を検出する請求項２乃至８のいずれかに記載の刺激作用検出方法。
【請求項１６】
検出方法を組織由来の電気信号とした請求項１４記載の刺激作用検出方法。
【請求項１７】
検出方法を組織の遺伝子の翻訳産物とした請求項２乃至８のいずれかに記載の刺激作用検出方法。
【請求項１８】
検出方法を組織の代謝活性とした請求項２乃至６のいずれかに記載の刺激作用検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサと、人工的に作製した組織をバイオセンサとして利用することで組織としての活動に対する物質の影響を見ることができる刺激作用検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来バイオセンサは生物由来の酵素タンパク質や免疫グロブリンなどの分子を用い、基質の存在や影響を検出する方法であった（例えば特許文献１参照）。
【０００３】
これは酵素タンパク質を固定膜などに固定し、基質と反応させるものである。酵素タンパク質は基質に対し、高い特異性を持っているため、基質の定性や定量方法として利用されている。酵素タンパク質は温度、ｐＨ、溶媒など特定の条件下での反応に限られており、条件次第では反応が進まない場合がある。そのため、特定の条件下での反応条件や結果に過ぎないものである。
【０００４】
また、特定の微生物を利用し、その酸素消費量や代謝能力から基質の存在や環境に対する影響を検出する方法もあった（例えば特許文献２参照）。
【０００５】
これは、微生物の基質に対する代謝能力を見ることで基質中の毒性などを判断するものであり、分子レベルの反応に比べ、より生体全体での判断に近い情報を得ることができる。
【特許文献１】特開平１０−１００６５号公報
【特許文献２】特開平１１−２５３１９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このような従来のバイオセンサは酵素タンパク質や免疫グロブリン、微生物、デオキシリボ核酸など生物由来の高分子を基質との反応部位である素子として利用し、基質の濃度や相補性を検出するものであり、高い特異性を特徴として備える高感度検出方法であるが、検出対象は基質に特定しているものであり、基質がどのように全体に影響を及ぼすのか、あるいは、基質がどのような経路で伝わっていくのかなど、組織全体に与える影響をみることはできなかった。また、酵素タンパク質や免疫グロブリンのように精製された分子は生体間で共通に保存されている情報であるが、組織全体としての機能、異常の有無を判断するためには、組織の異なる場所に存在する細胞同士が与える影響を把握する必要がある。そこで基質が組織全体に与える影響を見ることができる方法が要求されている。
【０００７】
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、直接、組織、細胞、器官を素子として利用したバイオセンサおよび刺激作用検出方法である。これは分化誘導した組織を利用することで種の違いだけでなく、個体の違いを把握することが可能となる。その結果、基質が与える組織、細胞、器官全体への影響を把握することができる方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の組織型バイオセンサおよび刺激作用検出方法は、上記課題を解決するために、組織自体を素子としたバイオセンサを用いることで刺激が組織または組織全体に与える影響、あるいは組織内の細胞同士あるいは器官同士が受ける影響を直接調べることができるようにしたセンサであることを特徴とする。
【０００９】
本発明の刺激作用検出方法は、上記課題を解決するために、組織を素子とすることで刺激が組織または組織全体に与える影響、あるいは組織内の細胞同士が受ける影響を直接調べることができるようにした方法であることを特徴とする。
【００１０】
本発明の刺激作用検出方法は、肝臓、腎臓、心筋、神経組織、膵臓、など各種器官単独、あるいは相互の影響を組織間で調べることができるようにしたことを特徴とする。
【００１１】
本発明の刺激作用検出方法は、多細胞組織において、それぞれの細胞同士が授受する影響を調べることができるようにしたことを特徴とする。
【００１２】
本発明の刺激作用検出方法は、胚幹細胞由来とすることで、各種器官に分化させた状態で使用できるため、個体から組織を採取することなく、刺激が組織または組織全体に与える影響、あるいは組織内の細胞同士が受ける影響を直接調べることができるようにしたことを特徴とする。
【００１３】
本発明の刺激作用検出方法は、人工多能性幹細胞由来とすることで、胚細胞に限らず各種器官に分化させることが可能となり、個体から組織を採取することなく、刺激が組織または組織全体に与える影響、あるいは組織内の細胞同士が受ける影響を直接調べることができるようにしたことを特徴とする。
【００１４】
本発明の刺激作用検出方法は、組織を個体由来とすることで個体差を調べることができるようにしたことを特徴とする。
【００１５】
本発明の刺激作用検出方法は、刺激として伝令リボ核酸を与えることで、組織または組織間におけるその発現を調べることを特徴とする。
【００１６】
本発明の刺激作用検出方法は、刺激としてイオンを与えることで、組織または組織間におけるその伝達を調べることを特徴とする。
【００１７】
本発明の刺激作用検出方法は、刺激として転写因子を与えることで、組織または組織間におけるデオキシリボ核酸の遺伝子発現を調べることを特徴とする。
【００１８】
本発明の刺激作用検出方法は、刺激として栄養素を与えることで組織または組織間における代謝の変動を見ることを特徴とする。
【００１９】
本発明の刺激作用検出方法は、刺激として神経伝達物質を与えることで、組織または組織間における神経の化学的シナプスの伝達を調べることを特徴とする。
【００２０】
本発明の刺激作用検出方法は、刺激として電気刺激を与えることで、神経組織または神経組織間などの電気伝導性を調べることを特徴とする。
【００２１】
本発明の刺激作用検出方法は、組織に与えた刺激によるデオキシリボ核酸上の遺伝子の転写を検出することを特徴とする。
【００２２】
本発明の刺激作用検出方法は、組織に与えた刺激による電気信号変化を検出することを特徴とする。
【００２３】
本発明の刺激作用検出方法は、組織に与えた刺激による代謝活性の変化を検出することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、組織自体を素子とすることで、組織に与えた刺激が組織全体に与える影響、組織間に与える相互作用を検出することができる。組織は複数の細胞とし、複数の細胞間での相互作用や器官内、あるいは器官間の相互作用を調べることで刺激が全体に与える影響を、個体を使うことなく検出可能となる。これにより、従来では基質に対する分子レベルでの特異性として利用されてきたバイオセンサに対し、組織自体を素子とすることで基質である刺激に対する組織全体の機能への影響、異常の有無を検出することができる。
【００２５】
また、用いる各種組織は、胚幹細胞や人工多能性幹細胞を利用することで個体への負担が小さい状態で検出可能となり、これらの幹細胞由来の組織は個体由来とすることができるため各個体ごとの影響を調べることができる。刺激としては、組織間に発達したギャップジャンクション間の移動として伝令リボ核酸や細胞に与えるイオンの影響、ホルモンの影響やそのレセプターの発現状況、転写因子が与えるデオキシリボ核酸上の遺伝子への影響、神経伝達物質の化学的シナプスの有効性、神経細胞への電気刺激の伝導など組織特有の効果、活動、影響を観察することが可能となり、擬似人体器官、あるいは擬似組織、あるいは擬似細胞として、より刺激に対する実際に起こり得る影響を調べることが可能となる。これにより、従来では、分子を利用した素子を用いた検出であるため、部分的な検出であったが、組織全体を素子とすることで細胞同士、組織間に与える影響を把握することができる。これらの検出方法として、電気信号の変化、遺伝子の翻訳、タンパク質の発現状況、糖やアミノ酸などの組織における代謝活性を指標とし、高感度、高精度な検出が可能となる組織型バイオセンサおよび刺激作用検出方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の請求項１記載の発明は、人工的に作製した組織自体を素子としたバイオセンサであって、加えた刺激に対する組織内の細胞間、または組織間の相互作用を検出することで、刺激が及ぼす組織全体への影響を調べることができるバイオセンサになるという作用を有する。
【００２７】
また、請求項２記載の発明は、人工的に作製した組織自体を用い、加えた刺激に対する組織内の細胞間、または組織間の相互作用を検出することで、刺激が及ぼす全体への影響を調べることができるという作用を有する。
【００２８】
また、請求項３記載の発明は、組織を器官とすることで各種臓器、脳幹、神経等の器官同士の刺激に対する組織全体に及ぼす影響を調べることができるという作用を有する。
【００２９】
また、請求項４記載の発明は、組織を複数細胞とすることで各種臓器、脳幹、神経等の細胞間の刺激に対する組織全体に及ぼす影響を調べることができるという作用を有する。
【００３０】
また、請求項５記載の発明は、組織を胚幹細胞由来とすることで、目的の組織へと分化させ、個体への負担が少ない状態で各種組織、または器官を得ることができ、各種組織の組み合わせが可能になるという作用を有する。
【００３１】
また、請求項６記載の発明は、組織を人工多能性幹細胞由来とすることで、胚細胞に限らない分化が可能となる。また、個体への負担が少ない状態で各種組織、または器官を得ることができ、各種組織の組み合わせが可能になるという作用を有する。
【００３２】
また、請求項７記載の発明は、組織を個体由来とすることで、個体ごとの影響を見ることが可能となるという作用を有する。
【００３３】
また、請求項８記載の発明は、当該刺激を伝令リボ核酸とすることで、細胞に導入された伝令リボ核酸が細胞間を移動し、異なる細胞で転写されることで、ギャップジャンクションなど細胞間接着装置の状態を調べることが可能となる。
【００３４】
また、請求項９記載の発明は、当該刺激をイオンとすることで、組織または組織間に与えるイオンの影響、イオンの添加に伴う伝達変化を調べることが可能となる。
【００３５】
また、請求項１０記載の発明は、当該刺激をホルモンとすることで、ホルモンに対する反応、ホルモン受容体の発達度合いを調べることが可能となる。
【００３６】
また、請求項１１記載の発明は、当該刺激を転写因子とすることで、組織または組織間におけるデオキシリボ核酸の遺伝子発現を調べることが可能となる。
【００３７】
また、請求項１２記載の発明は、当該刺激を栄養素とすることで組織または組織間における代謝の変動、その代謝物による組織または組織間における影響を調べることが可能となる。
【００３８】
また、請求項１３記載の発明は、当該刺激を神経伝達物質とすることで、神経組織間の伝達状態、神経伝達物質の産生、神経伝達物質受容体の発現状態を調べることが可能となる。
【００３９】
また、請求項１４記載の発明は、当該刺激を電気刺激とすることで、神経組織間の電気刺激伝導性、神経組織と各種組織に与える電気刺激の影響を調べることが可能となる。
【００４０】
また、請求項１５記載の発明は、組織または細胞間相互作用の検出方法を遺伝子の転写とすることで、転写因子や伝令リボ核酸など遺伝子の転写に関連する物質の、組織または細胞間での伝達性を調べることが可能となる。
【００４１】
また、請求項１６記載の発明は、検出方法を電気信号とすることで各種刺激に対する組織間、または細胞間での電気信号変化を調べることが可能となる。
【００４２】
また、請求項１７記載の発明は、検出方法を遺伝子の翻訳とすることで、翻訳されたタンパク質が他の組織、細胞へ与える影響を調べることが可能となる。
【００４３】
また、請求項１８記載の発明は、検出方法を組織の代謝活性とすることで、糖やアミノ酸などのエネルギー源の代謝に伴う他の組織、細胞へ与える影響を調べることが可能となる。
【００４４】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００４５】
（実施の形態１）
バイオセンサは酵素タンパク質や免疫グロブリン、微生物、デオキシリボ核酸など生物由来の高分子を利用し、基質の濃度や相補性を検出するものであり、高い特異性を特徴として備える高感度検出方法であるが、検出対象は基質に特定しているものであり、基質がどのように全体に影響を及ぼすのか、あるいは、基質がどのような経路で伝わっていくのかなど、組織全体に与える影響をみることはできなかった。また、近年の分子生物学の発展により、培養細胞や胚細胞、人工多能性幹細胞のように人工的に組織を形成させることが可能となったが、その組織全体が正確に分子を形成し、その分子構成が機能しうるかどうかをみることはできなかった。そのため、組織全体に与える各種刺激に対する影響を検出し、当該刺激による組織内の細胞間、または組織間の相互作用を検出する方法が求められている。
【００４６】
例えば、刺激に対する組織を見る手法として組織を器官とすることで、臓器、神経、脳幹など各種器官を素子として使用し、これらの臓器内、神経間、脳幹内などにおける刺激の影響を見ることができる。これらの影響を観察することで、器官内に発生した伝達経路などを正確に把握することが可能となる。また、組織については細胞数が複数であれば、その間に影響する刺激を確認することができる。これらの組織は生体から採取することも可能であるが、組織の種類によっては簡便に採取することが困難である。
【００４７】
また、臓器となると採取することができないものである。そこで、胚幹細胞や人工多能性幹細胞など、胚細胞や皮膚などの上皮細胞を分化させた細胞とすることで苦痛を伴わない素子の採取が可能となる。またこれらの幹細胞はエピジェネティックな処理により異なる組織へ分化させることが可能であり、ｉｎ  Ｖｉｔｒｏな環境下で様々な細胞採取が可能となり、それぞれの組織を利用した相互作用検出方法が可能となる。
【００４８】
また、組織を個体由来のものとすることで、同じ組織でも個体差が影響する場合、その個体に与える影響を把握することができる。個体を素子対象とすることでオーダーメイド素子による相互作用検出方法が可能となる。刺激については伝令リボ核酸を一つの細胞に導入した場合、それがギャップジャンクションなど細胞接着装置を経て異なる細胞に発現する。これによりギャップジャンクションの形成や伝令リボ核酸の伝達性を把握することが可能となる。刺激としてイオンを用いることでイオンの浸透による活動電位や静止電位など神経伝導に関する変化を検出する方法として有効である。
【００４９】
また、刺激として栄養素を利用することで単糖類、多糖類、アミノ酸、イミノ酸などの炭素源、窒素源、その他、リン源などの添加により、その栄養素を細胞が代謝し、代謝産物が異なる細胞へ影響を及ぼす場合を検出することができる。例えば、代謝産物の一つとして、膵臓のベータ細胞から内分泌されるインスリンなどは、組織内の糖濃度の向上に伴い、分泌され、細胞膜表面の糖輸送体を形成させ、細胞の糖取り込みを促進するものであり、また、糖新生の抑制、グリコーゲン合成促進などに効果を示す役割があり、これらは細胞間、組織間、器官間の相互作用が重要である。本発明は、その正常・異常を判断する手法として有効である。
【００５０】
また、刺激としてホルモン、転写因子、神経伝達物質など特定の細胞やデオキシリボ核酸中の遺伝子のプロモーターにのみ影響を示す要因を検出する方法が可能となる。これらの刺激は対象の細胞があるため、各種刺激が特定の細胞に正確に影響を及ぼすことができるかどうかを把握することができる。また、神経のように電気伝導性が重要な組織では電気刺激の影響性、伝導性を検出する方法として有効である。検出方法としては、伝令リボ核酸、ホルモンや転写因子などの導入時に転写が想定される遺伝子の転写状況を検出することで各刺激の影響を把握できる。
【００５１】
また、神経組織のように電気刺激を電気信号として検出することで刺激の伝導を観察することができる。遺伝子が転写された場合もセントラルドグマに至らず、翻訳されない場合があるため、翻訳されたかどうかを指標とすることで刺激が組織のタンパク質産生に影響するかどうかを把握することができる。また、組織が正常に機能する際は基質を代謝するがその代謝活性を把握することで刺激が及ぼす組織への相互作用を検出することが可能となる。
【００５２】
これにより、組織を素子としたバイオセンサとなり、刺激が組織全体に及ぼす影響を検出する方法が可能となる。
【実施例１】
【００５３】
以下、本発明の実施例について説明する。
【００５４】
本技術は人工多能性幹細胞や胚幹細胞などを分化させた細胞あるいは組織を直接使用し、全体に与える薬剤、電気刺激、遺伝子発現性、リボ核酸干渉、ギャップジャンクション発現性、心筋などの刺激伝達状態など、各種刺激を検出する方法である。人工多能性幹細胞や胚幹細胞などを肺臓、心臓、肝臓、腎臓、膵臓、胆嚢などの器官に分化させることで、器官が受ける各種刺激による影響を直接判断することが可能である。組織は器官に限らず、複数細胞の単位でも可能であり、例えば二細胞間の刺激伝達機構を検出することもできる。また、神経シナプス間、あるいは神経―筋伝達のように離れた組織も組み合わせることにより、これらの各種刺激による影響を判断することができる。これらの器官、組織、多細胞は、個体由来のものを使用することでその個体が受ける刺激に対する影響を判断することができる。個体の刺激に対する影響はＣｐＧアイランドやエピジェネティックな発現の違いなどにより個体差が生じているが、個体由来の細胞を分化させることで個体が受ける刺激の影響を正確に捉えることが可能となる。刺激の種類としては、伝令リボ核酸を使用することで組織間のギャップジャンクション形成度合いを検出することができる。ギャップジャンクションは、心筋や上皮組織などで形成されているが、ギャップジャンクションを経由して伝令リボ核酸の発現を隣接した組織で確認することでその形成、機能を確認することができる。また、イオンを刺激とすることで細胞表面のレセプター形成性を検出することができる。イオンとしては、カリウムイオン、カルシウムイオン、ナトリウムイオンなどの陽イオン、クロールイオンなどの陰イオン、炭酸水素イオン、酸素イオン、酸化窒素イオンなどのガス性イオン、銅イオン、亜鉛イオンなどの金属イオンなどが対象となる。刺激として、ホルモンも挙げられる。ホルモンはオートクライン、パラクライン、エンドクラインなど分泌物が他の細胞あるいは自己細胞に影響を及ぼすものであり、これらのホルモンを直接、組織、器官、細胞に与えることで検出することができるが、分泌組織、器官、細胞と検出組織、器官、細胞を組み合わせて直接細胞同士の信号伝達機構を検出することもできる。例えば、脳下垂体前葉より放出されるホルモンである甲状腺刺激ホルモンなどは、甲状腺に働きかけて、甲状腺ホルモンであるトリヨードチロニンやチロキシンなどを分泌させるホルモンであるが、分化させた脳下垂体前葉と甲状腺を組み合わせることでこれらの細胞組織間に起きる信号伝達機構を検出することができる。脳下垂体後葉より分泌されるバソプレシンは、抗利尿ホルモンであるが、これが分泌されると腎臓の尿細管による水分の吸収が阻害され血圧が向上する。この機構に異常がある場合、腎機能障害として判断されるが、本発明を利用し、脳下垂体後葉細胞と腎臓組織を組み合わせることで、この異常の有無を直接判断することができる。刺激はホルモンなど伝達物質を受けた後に発生する転写因子やセカンドメッセンジャーなどを対象とすることも有効である。栄養素自体の代謝は細胞の活性に重要であり、これらの影響を検出することで細胞間、組織間、器官間の情報伝達も変動する。栄養素としては単糖、多糖、アミノ酸、イミノ酸、などが炭素源、窒素源として挙げられるが、その他にリン源なども重要な要素である。これらの代謝は異なる器官由来のホルモンなど内分泌成分によって左右されるものであり、組織間の相互作用がその組織が正常に活動しているかどうかの指標となる。例えば、膵臓アルファ細胞から内分泌されるホルモンであるグルカゴンは、糖濃度が低下した際に分泌される内分泌液であるが、グルカゴンは肝臓のグリコーゲンの分解や糖新生を促進し、糖濃度を向上させる。この工程に異常がある場合、低血糖状態となるが、本発明を用いることでｉｎ  Ｖｉｔｒｏ状態で、かつ個体由来の組織、細胞、器官を利用して検出することが可能となる。転写因子は、甲状腺ホルモンとレセプターが結合した状態のものを添加したり、サイクリックアデニンモノフォスフェートなどのセカンドメッセンジャーを細胞に導入したりすることで遺伝子の転写を判断することができる。転写に異常がある場合、当該細胞、器官、組織を直接対象とすることで、転写異常の有無を判断することができる。刺激の一つとして神経伝達物質も挙げられる。神経伝達物質としては、グルタミン酸、γ−アミノ酪酸、アスパラギン酸、グリシンなどのようなアミノ酸、バソプレシン、ソマトスタチン、ニューロテンシンなどのようなペプチド系、ノルアドレナリン、ドーパミン、セロトニンのようなものアミン系、アセチルコリン、ヒスタミンなどが挙げられるが、これらを直接または間接的に当該細胞、組織、器官へ添加することで、細胞間同士、組織間同士、器官同士の信号伝達機構、エクソサイトーシスの異常、レセプター異常などの有無を判断することができる。神経伝達物質の場合、神経細胞や筋細胞が主な検出対象となるが、神経細胞や筋細胞の場合、電気刺激の伝導を刺激として、その影響を把握することが可能となる。信号伝達機構の上で、髄鞘など跳躍伝導に関与する構造異常が神経組織にある場合、刺激の伝導が悪くなるが、このような異常を判断することができる。以上のような各種刺激と各種細胞、組織、器官を組み合わせて使用することで一つあるいは複数の刺激が与える各種細胞、組織、器官への影響を総合的に判断することが可能となる。これらの刺激に対する各種細胞、組織、器官の応答の検出については、添加した伝令リボ核酸や転写因子、セカンドメッセンジャーなどの刺激が伝わったかどうか、あるいはホルモンなどがレセプターに結合し、伝達が間接的に伝わったかどうかを遺伝子の転写という観点で検出する方法である。遺伝子の転写は伝令リボ核酸の発現で把握することができる。また、電気信号を検出することで当該細胞、組織、器官の応答を検出するものである。電気信号の検出は心筋や神経、脳組織などで有効であり、これらの組織やこれらの組織由来の細胞における刺激に対する応答をみることで状態を把握することができる。また、遺伝子の翻訳状態を把握することで信号伝達状況を把握することが可能である。遺伝子の翻訳状態は、タンパク質の発現、酵素タンパク質の発現、あるいは酵素タンパク質の活性などを指標とすることで遺伝子の翻訳の有無を把握することができる。遺伝子の翻訳状態は、ゴルジ装置の発達の仕方によっても確認できる。例えばゴルジ装置が発達し、車軸核になっている場合を顕微拡��などで直接目視確認することでその状況を判断することができる。検出方法を組織の代謝活性とすることで、各種刺激が遺伝子の転写、翻訳のセントラルドグマなどに働きかけ、組織の代謝活性が変化することで、その刺激の影響を把握することができる。これらの刺激に対する伝達異常、伝導異常、転写異常、翻訳異常がある場合、組織全体に影響を与える場合が想定される。これらは従来個体由来の組織で行なうことはできなかったため、本手法により組織間の異常、組織発達異常、個体のバラツキなどの影響を考慮した検出が可能となる。
【００５５】
組織を素子としたバイオセンサの一態様を示す概念図で、細胞結合様式を検出する方法を図１に示す。
【００５６】
図１に示すように組織内の複数の細胞、若しくは組織、器官そのものにおけるギャップジャンクション間における信号伝達機構ならびにその異常について検出する方法である。組織内の複数の細胞、若しくは組織、器官そのものを、個体の指先のヒト皮膚上皮細胞１から採取し、培養するためシャーレに移し人工多能性胚細胞として分化処理する。目的の組織細胞であるヒト上皮細胞由来分化細胞２を得たら、そこへ当該刺激３を外部添加する。刺激としては、イオン、ホルモン、神経伝達物質などの化合物が挙げられる。イオンは、カリウムイオン、カルシウムイオン、ナトリウムイオンなどの陽イオン、クロールイオンなどの陰イオン、炭酸水素イオン、酸素イオン、酸化窒素イオンなどのガス性イオン、銅イオン、亜鉛イオンなどの金属イオンなどが対象となる。また、ホルモンとしては、間脳視床下部由来の放出ホルモン、下垂体由来の各種刺激ホルモンなどが挙げられる。また、膵臓、副腎、甲状腺、副甲状腺など各種ホルモンが刺激物質となる。また、神経伝達物質は、神経伝達物質としては、グルタミン酸、γ−アミノ酪酸、アスパラギン酸、グリシンなどのようなアミノ酸、バソプレシン、ソマトスタチン、ニューロテンシンなどのようなペプチド系、ノルアドレナリン、ドーパミン、セロトニンのようなものアミン系、アセチルコリン、ヒスタミンなどが挙げられる。また、栄養素としては単糖、多糖、アミノ酸、イミノ酸、などが炭素源、窒素源として挙げられる。シャーレ内で分化させたヒト上皮細胞由来分化細胞２の細胞を拡大した図を下部枠内に記す。下部枠内に示す通り、外部添加された刺激３は、細胞４に浸透し信号伝達物質５としてからギャップジャンクション６を経て、隣接した細胞へ伝わる。伝わった後、信号伝達物質５が転写因子そのもの、若しくは転写因子を活性化する信号として核に伝わり、相当する遺伝子から転写・翻訳が始まる。このセントラルドグマによって産生された翻訳産物８は細胞内あるいは細胞外へ放出されるが、これを検出するものである。翻訳産物８が酵素タンパク質である場合は、その活性を、タンパク質である場合は、その分子量などを検出することで翻訳が確認できる。
【００５７】
なお、伝令リボ核酸を刺激として使用する場合は、一部の細胞内に直接注入する。
【００５８】
なお、転写因子を刺激として使用する場合は、一部の細胞内に直接注入する。
【００５９】
なお、遺伝子の転写を確認する手段として、転写産物を指標とすることも可能である。
【００６０】
なお、転写産物、翻訳産物だけでなく、増殖の際に生ずる電気的変化を電気信号として、あるいは、組織、細胞、器官の代謝物の検査により異常の把握を行なうことも可能である。
【００６１】
図２に組織を素子としたバイオセンサの一態様で、電気刺激を与える場合の検出方法について示す。
【００６２】
図２に示すように組織内の、複数の細胞の一部へ電気刺激を与えた場合の伝導を検出する方法である。組織内の複数の細胞、若しくは組織そのものを、指先から採取したヒト皮膚上皮細胞１から採取し、人工多能性胚細胞として処理する。目的の組織細胞であるヒト上皮細胞由来分化細胞２を得たら、目的の組織９へと分化させる。その目的の組織の細胞へ電極１０を刺し、電気刺激を与え、その伝道を異なる細胞で検出するものである。シャーレ内で分化させたヒト上皮細胞由来分化細胞２の細胞を拡大した図を下部枠内に記す。電気刺激は、細胞内電圧が−６０から−９０ｍＶ程度であることからその前後である−４０から−１２０ｍＶの刺激を与え、組織９あるいは組織内の複数の細胞間に生じる電気刺激の伝導を検出するものである。
【００６３】
上記細胞内外の電圧の違いを調べる他に、例えば、神経細胞の場合、多くの神経細胞が軸索と樹状突起を介して物質のやり取りを行なっている。物質のやり取りに際し、電気信号の伝導などが起こり、信号を伝導している。信号の伝導において、有髄神経では、軸索に髄鞘があり、伝導を迅速化する、即ち跳躍伝導に関わっている。これに対し、ギランバレー症候群のように自己免疫異常などにより髄鞘破壊が生じた場合、この跳躍伝導が機能せず、神経細胞における伝導が正確に進まない場合がある。これらの起こりうる可能性について調べる手段としては、自己細胞を取ることはできないため、本手法が有効となる。上皮細胞由来の分化細胞を神経細胞とし、そこへ自己免疫関係の刺激を与えることで髄鞘の障害が生じるかどうかなどを図２に示す手法で事前に、また、ｉｎ  Ｖｉｔｒｏで検出することができる。
【００６４】
なお、電気刺激を与えない場合、一方に化学物質的刺激を与え、他方で電気信号を捕らえる手法としても利用できる。化学物質的刺激の付加としては、伝令リボ核酸、イオン、ホルモン、転写因子、神経伝達物質などが挙げられる。
【００６５】
図３に組織を素子としたバイオセンサの一態様を示す概念図で、細胞内での転写状態を検出する方法である。
【００６６】
図３に示すように組織に外部から与えた刺激が伝達する事例であって、刺激が細胞内の転写因子となり、目的の転写産物が産生されるかどうかを検出するものである。組織内の複数の細胞、若しくは組織、器官そのものを、指先から採取したヒト皮膚上皮細胞１から採取し、人工多能性胚細胞として処理する。目的の組織細胞であるヒト上皮細胞由来分化細胞２を得たら、そこへ当該刺激３を外部添加する。シャーレ内で分化させたヒト上皮細胞由来分化細胞２の細胞を拡大した図ならびに、更に細胞レベルで拡大した図を記す。外部添加された刺激３は組織９内の細胞に作用し、信号伝達物質５として細胞内へ浸透、レセプター１１と結合することで転写因子となる。転写因子は、核の該当遺伝子に働きかけ、転写、翻訳が開始され、最終的に翻訳産物８が産生される。翻訳産物８が酵素タンパク質である場合、この酵素タンパク質の基質を添加することでその反応性を見ることができる。反応性を確認することで翻訳が確認されることから信号伝達物質とレセプターの結合を検出が可能となる。これは即ち、刺激が伝達されたことを示す。
【００６７】
例えば、ホルモン系の刺激の場合、与えたホルモンがステロイド系のホルモンであると、このホルモンが細胞膜を浸透し、直接細胞質のレセプターあるいは、副甲状腺ホルモンのように核内に存在するレセプターと結合し、結合産物が転写因子として作用する。作用した転写因子により、目的のデオキシリボ核酸から転写が始まり、最終的に翻訳産物が翻訳される。翻訳された翻訳産物がエクソサイトーシスにより分泌された場合、この分泌物の活性あるいは、濃度を計測することでセントラルドグマの実施を判断できる。あるいは、転写因子が転写産物、例えばリボ核酸のようなものの場合、この濃度をポリメラーゼチェインリアクションや電気泳動法などで確認することでセントラルドグマの実施を検出できる。エクソサイトーシスによって分泌されない場合も、特定のタンパク質や酵素タンパク質を検出することで刺激に対する応答を判断できる。
【００６８】
図４に組織を素子としたバイオセンサの一態様を示す概念図で、組織内の細胞間に生じたギャップジャンクションを経た信号伝達状態を検出する方法である。
【００６９】
図４に示すように組織に外部から与えた刺激が伝達する事例であって、当該刺激が組織内に発達したギャップジャンクションを経て異なる細胞へ伝わる状態を検出するものである。ヒト指先から採取したヒト皮膚上皮細胞１を、胚幹細胞または人工多能性胚細胞として処理する。目的の組織細胞であるヒト上皮細胞由来分化細胞２をシャーレ内で分化させ、得られた組織、器官、細胞へ当該刺激３を外部添加する。当該刺激３は、組織９の細胞から隣の細胞、そして異なる場所へとギャップジャンクション６を経て伝わり、異なる細胞で例えば翻訳産物８が産生される。翻訳産物８を検出することで信号伝達を確認することができる。
【００７０】
例えば、ギャップジャンクションが発達した組織の一例として心臓がある。心臓はギャップジャンクションが発達しているため、その伝達状況が重要となり、本手法を利用することで異常部位、組織の確認が可能となる。
【００７１】
なお、ウイルスの感染が細胞に与える影響について検出することも可能である。この場合、組織に与える影響や、ウイルスがレトロトランスポゾンとして染色体内に保存されるかどうかを隣接する細胞間での感染性から判断するものである。
【００７２】
なお、ギャップジャンクションに限らず、タイトジャンクション、アドヘレンスジャンクション、デスモゾームなど、ギャップジャンクションとは異なり、細胞間の物質移動することを妨げる細胞接着装置の異常などを把握することも可能である。
【００７３】
なお、上皮細胞に限らず、分化可能な細胞であるならば利用できる。
【００７４】
なお、人に限らず、哺乳類、爬虫類、魚類での組織型センサとしても利用可能である。
【００７５】
なお、刺激は外部より添加する場合に限らず、内部に直接注入することで評価することも可能である。
【００７６】
なお、組織、器官、細胞が癌細胞である場合、その伝達異常や他の組織への転移のし易さなどを調べることも可能である。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明の組織型バイオセンサを用いることで、個体から組織や器官、細胞を直接採取し、その発達異常を検出することなく、上皮組織など採取しやすい場所からの組織回収、分化により、個体由来の組織や器官、細胞の状態を把握することができる相互作用検出方法である。これにより、苦痛が伴うことなく、組織間の状態や異常を把握するだけでなく、各個体特有の異常を把握することも可能である。また、限られた個数の器官なども分化・作製することで、器官全体に与える影響を把握することが可能となり、オーダーメイド検出センサや、正確な異常判断方法として有効な方法である。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】本発明の実施の形態１の組織内の細胞結合様式を検出するバイオセンサを示す図
【図２】同、組織の細胞に与えた電気刺激の伝導様式を検出するバイオセンサを示す図
【図３】同、組織の細胞に与えた信号伝達物質の伝達、翻訳様式を検出するバイオセンサを示す図
【図４】同、組織の細胞結合様式を検出する方法であって組織全体に渡る結合状態を検出するバイオセンサを示す図
【符号の説明】
【００７９】
１    ヒト皮膚上皮細胞
２    ヒト上皮細胞由来分化細胞
３    刺激
４    細胞
５    信号伝達物質
６    ギャップジャンクション
７    核
８    翻訳産物
９    組織
１０  電極
１１  レセプター
【図１】
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【図２】
2009250861.tif 000004
【図３】
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【図４】
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