(57)【要約】      （修正有）【課題】メラニン生成抑制活性の高い化合物を有効成分とするメラニン生成抑制剤や美白剤や皮膚外用剤を提供すること。【解決手段】マレイン酸は、メラニン生成抑制効果を有したが、マレイン酸と同様にジカルボン酸であるフマル酸やグルタコン酸やケリドン酸は、メラニン生成抑制効果を有さなかったことを確認し、マレイン酸又はその塩を有効成分とするメラニン生成抑制剤や、マレイン酸又はその塩を有効成分とする美白剤や、マレイン酸又はその塩を含む美白用皮膚外用剤を調製した。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マレイン酸及びその塩から選択される１種又は２種以上の化合物を有効成分とするメラニン生成抑制剤。
【請求項２】
マレイン酸及びその塩から選択される１種又は２種以上の化合物を有効成分とする美白剤。
【請求項３】
マレイン酸及びその塩から選択される１種又は２種以上の化合物を含む美白用皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マレイン酸又はその塩を有効成分とするメラニン生成抑制剤や、マレイン酸又はその塩を有効成分とする美白剤や、マレイン酸又はその塩を含む美白用皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
メラニン（melanin）は、動植物、菌界に広く見られる通常褐色〜黒色の色素であり、ヒトにおいては、肌色を決定する因子の１つであるとともに、紫外線の悪影響から体を守る重要な役割を担っているといわれているが、メラニンの過剰生成は色黒とされ、また、その不均一な分布とされるシミやソバカスなどの現象は、美容上の欠陥・肌の老化とされることもある。最近の研究でメラニンは、紫外線やストレスによって皮膚の中で生じた活性酸素の刺激によって、皮膚の内側の基底部に存在するメラノサイトにおいてチロシナーゼが活性化することで、チロシンを出発物質とするメラニン生成経路を通じて合成され、メラノソームと呼ばれる小胞に貯蔵された後、皮膚のケラチノサイトや毛母細胞に移送され、体色の変化を生じさせるということが明らかにされつつある。
【０００３】
それゆえ、メラニン生成を原因とする皮膚の暗色化の防止や美白を目的とする外用剤の開発は化粧品業界等において重要な課題となっており、メラニン生成経路における様々な作用を阻害、抑制するための成分を用いた製品が開発されている。例えば、還元作用を示す成分として、システイン（例えば、特許文献１及び特許文献２参照）やグルタチオン（例えば、特許文献２参照）や、チロシナーゼの活性を抑制・阻害活性を有する成分として、ハイドロキノン（例えば、特許文献３参照）やコウジ酸（例えば、特許文献４参照）や置換フェノキシプロパノールアミン類又はその塩（例えば、特許文献５参照）等を用いた化粧品や美白剤や皮膚外用剤などが提案されている。
【０００４】
一方、これらの化合物以外にも、特定の有機酸が、メラニン生成作用を阻害、抑制する化合物として報告されている。例えば、乳酸がメラニン生成阻害能を有すること（例えば、特許文献６参照）、Ｌ−アスコルビン酸が生成メラニンに対する還元作用を示すこと（例えば、特許文献７参照）が、報告されている。また、クエン酸回路の一構成要素であるフマル酸については、ビタミンＢ６、ビタミンＢ３を含む相乗的美白組成物への使用が提案されている（例えば、特許文献８参照）。
【０００５】
他方、フマル酸の幾何異性体であるマレイン酸は、リンゴ酸、コハク酸などの有機酸の原料として、また織物の染色仕上げ剤として用いられているが、その他、セラミド類又は擬セラミド類と共に含まれるジカルボン酸としての皮膚化粧料（例えば、特許文献９参照）や、ヒノキチオール化合物と共に含まれる有機酸としての香粧品（例えば、特許文献１０参照）への使用が提案されている。しかし、マレイン酸の美白効果・メラニン生成抑制作用に関する報告はされていない。
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−３１５９６２号公報
【特許文献２】特開平１１−２６９０５１号公報
【特許文献３】特開２００７−３１４５２８号公報
【特許文献４】特開平２−２００６２２号公報
【特許文献５】特開２００６−２８２６４５号公報
【特許文献６】特開２００５−３２５１０５号公報
【特許文献７】特開２００７−２７７１１９号公報
【特許文献８】特開２００７−５０９８９９号公報
【特許文献９】特許３２９９０５４号公報
【特許文献１０】特開２００２−４７１２３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
グルタチオン等の還元剤は美白効果が十分でなく、ハイドロキノン等のチロシナーゼ阻害剤は細胞毒性等の安全性が問題となる場合があり、コウジ酸は物性的に光曝露により着色する傾向があり、Ｌ−アスコルビン酸は酸化されやすく安定性が問題となる場合があり、前述の有機酸についても、充分な美白効果を得ることができない場合がある。本発明の課題は、メラニン生成抑制活性の高い化合物を有効成分とする安全性の高いメラニン生成抑制剤や美白剤や皮膚外用剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するため、コウジ酸等のチロシナーゼ阻害剤やＬ−アスコルビン酸等の還元剤など、従来のものとは異なるメラニン生成抑制作用を有する化合物を同定すべく鋭意研究を重ねていたところ、今回、ジカルボン酸の一種であるマレイン酸がメラニン生成抑制効果を有することをたまたま見い出し、本発明を完成するに至った。また、マレイン酸と同様にジカルボン酸であるフマル酸やグルタコン酸（glutaconic acid）やケリドン酸(chelidonic acid)は、メラニン生成抑制効果を奏さず、還元作用により美白効果があるといわれているＬ−アスコルビン酸は、マレイン酸と同濃度ではメラニン生成抑制効果を奏さないことを確認した。なお、マレイン酸のメラニン生成抑制効果は、チロシナーゼや還元剤が関与する反応以外の特有のメカニズムによって発揮されるものであると考えられる。
【０００９】
すなわち本発明は、マレイン酸及びその塩から選択される１種又は２種以上の化合物を有効成分とするメラニン生成抑制剤や、マレイン酸及びその塩から選択される１種又は２種以上の化合物を有効成分とする美白剤や、マレイン酸及びその塩から選択される１種又は２種以上の化合物を含む美白用皮膚外用剤に関する。その他、本発明は、マレイン酸及びその塩から選択される１種又は２種以上の化合物をメラニン生成抑制剤や美白剤や美白用皮膚外用剤として使用する方法や、メラニン生成抑制剤や美白剤や美白用皮膚外用剤の製造におけるマレイン酸及びその塩から選択される１種又は２種以上の化合物の使用方法や、マレイン酸及びその塩から選択される１種又は２種以上の化合物を美白剤として含む皮膚外用剤を包含する。
【発明の効果】
【００１０】
マレイン酸及びその塩から選択される１種又は２種以上の化合物を有効成分とする本発明のメラニン生成抑制剤は、メラニン生成を原因とするシミ、ソバカス等の改善・予防剤、美白剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のメラニン生成抑制剤や美白剤としては、マレイン酸及びその塩から選択される１種又は２種以上の化合物を有効成分とするものであれば特に制限されず、本発明の美白用皮膚外用剤としては、マレイン酸及びその塩から選択される１種又は２種以上の化合物を含むものであれば特に制限されず、上記本発明の美白用皮膚外用剤の種類としては、日焼け止め、化粧水、乳液、クリーム、美容液、パック等の顔、手足又はボディ用の基礎化粧料、ファンデーション、コンシーラー、白粉、頬紅、口紅、アイシャドウ等のメーキャップ化粧料などからなる化粧料を挙げることができ、またかかる美白用皮膚外用剤の剤型としては、液状、粉末状、固形状、棒状、水中油型・油中水型乳液状、クリーム状、ジェル状等を挙げることができる。なお、上記本発明の美白用皮膚外用剤の組成としては、マレイン酸及びその塩から選択される１種又は２種以上の化合物を美白剤として含まないもの、例えば、ヒノキチオール化合物ともに配合された場合や、特定のセラミド類又は擬セラミド類と共に配合される場合は除かれる。
【００１２】
上記マレイン酸とは、式（Ｉ）で表される鎖状不飽和ジカルボン酸の一種であり、ＩＵＰＡＣ名としては、cis-ブテン二酸（cis-butenedioic acid）で表される。
【００１３】
【化１】
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【００１４】
本発明のマレイン酸の塩としては、メラニン生成抑制活性がマレイン酸と同効のマレイン酸の塩であれば特に制限されず、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩等のカチオン塩、トリエタノールアミン塩、また、アルギニン、ヒスチジン、リジン等の塩基性アミノ酸との塩を挙げることができ、ナトリウム塩を好適に例示することができる。さらに鉄や銅等とのキレート錯体も適宜調製して用いることが可能である。なお、マレイン酸とその塩やキレート錯体は単独でも２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００１５】
本発明に用いられる上記式（Ｉ）で表されるマレイン酸及びその塩から選択される１種又は２種以上の化合物、あるいはマレイン酸精製過程における粗精製物等のマレイン酸含有組成物の製法や入手方法としては、公知の化学的に合成する方法であれば特に制限されず、例えば、五酸化バナジウムなどの触媒の存在下でベンゼンを気相酸化する反応により得られた反応物を水に吸収させるとマレイン酸を得ることができ、また、市販品を購入することもできる。
【００１６】
また、マレイン酸及びその塩から選択される１種又は２種以上の化合物を有効成分とする本発明のメラニン生成抑制剤や美白剤には、前述の化学的に合成する方法における精製過程における粗精製物が含まれる他、メラニン生成抑制活性を損なわない範囲において、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、希釈剤、緩衝剤、等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解補助剤等が配合された組成物が含まれる。
【００１７】
本発明のメラニン生成抑制剤におけるメラニンの生成抑制活性としては、メラニンの生成・蓄積に伴う皮膚等の体色の暗色化をもたらす作用を抑制する活性であれば特に制限されず、また、本発明の美白剤や美白用皮膚外用剤における美白作用には、肌を白くする積極的な美白作用のみならず、肌の黒化を抑制する消極的な美白作用も含まれ、例えば、シミ、ソバカス等の色素沈着を改善する美白作用のみならず、色素沈着を抑制する美白作用も含まれる。
【００１８】
上記本発明のメラニン生成抑制剤における阻害活性の有無の決定方法としては、例えば、６穴プレートに１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地を適量とり、Ｂ１６メラノーマ細胞を播種し、二酸化炭素濃度５ｖ／ｖ％において３７℃にて一日静置し、翌日、検体を可溶性溶媒に溶解して最終濃度の検体供試液として適宜調製し、かかる検体供試液を、上記Ｂ１６メラノーマ細胞を播種した培地に添加後、混和し、培養５日目に培地を交換して前記検体供試液を再度添加し、その翌日培地を取り除き、培養されていたＢ１６メラノーマ細胞をリン酸緩衝液にて洗浄し回収した後、検体を添加しなかった対照と比較したかかる細胞の白色化度を目視にて評価・判断する方法を挙げることができる。
【００１９】
本発明のメラニン生成抑制剤は、前記メラニン生成作用を原因とする状態を改善する手段として、例えば、シミ、ソバカス、日焼け等の改善・予防用の美白剤や美白用皮膚外用剤、医薬品や医薬部外品等の薬剤として用いてもよい。
【００２０】
また、本発明のメラニン生成抑制剤を医薬品、医薬部外品等として調製するに際しては、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、希釈剤、緩衝剤、等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解補助剤等の医薬品添加物と適宜混合、希釈又は溶解して配合してもよく、かかる剤型としては、軟膏、外用液剤、貼付剤、乳液、ローション、溶液、ゲル等の剤型やパック、パウダー、スティック等を挙げることができ、また、治療目的に応じて非経口的又は経口的に用いることができる。
【００２１】
さらに、本発明の美白用皮膚外用剤は、上記必須成分としてのマレイン酸の他に、通常美白用皮膚外用剤に配合される成分として、以下の油性成分、粉体成分、界面活性剤、水性成分、酸化防止剤、防腐剤、皮膚老化防止に効果があるといわれている化合物、紫外線防御剤、抗炎症剤成分から選択される１種又は２種以上を本発明の効果を妨げない範囲で適宜配合することができる。
【００２２】
本発明の美白用皮膚外用剤に、油性成分を配合することができる。かかる油性成分としては美白用皮膚外用剤に一般に用いられる油性成分であれば特に制限されず、例えば、動物油、植物油、合成油等を起源とする炭化水素類、油脂類、ロウ類、硬化油類、エステル油類、脂肪酸類、高級アルコール類、シリコーン油類、フッ素系油類、ラノリン誘導体類、油性ゲル化剤類などを挙げることができ、具体的には、流動パラフィン、スクワラン、ワセリン、ポリエチレンワックス、エチレン・プロピレンコポリマー、パラフィンワックス、モンタンワックス、フィッシャートロプシュワックス、ポリイソブチレン、ポリブテン、セレシンワックス、オゾケライトワックス等の炭化水素類、モクロウ、オリーブ油、ヒマシ油、ミンク油、マカデミアンナッツ油等の油脂類、ミツロウ、ゲイロウ、カルナウバワックス、キャンデリラワックス等のロウ類、ホホバ油、２−エチルヘキサン酸セチル、乳酸イソステアリル、乳酸オクチルドデシル、乳酸オレイル、乳酸ステアリル、ジイソステアリン酸グリセリル、トリイソステアリン酸ジグリセリル、リンゴ酸ジイソステアリル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ロジン酸ペンタエリトリットエステル、ジオクタン酸ネオペンチルグリコール、ジオクタン酸ネオペンチルグリコール、コレステロール脂肪酸エステル、フィトステロール脂肪酸エステル、トリグリセライド等のエステル類、ステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ベヘニン酸、イソステアリン酸、オレイン酸等の脂肪酸類、ステアリルアルコール、セチルアルコール、ラウリルアルコール、オレイルアルコール、イソステアリルアルコール、ベヘニルアルコール等の高級アルコール類、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、オクタメチルシクロテトラシロキサン、トリメチルシロキシケイ酸、高重合度メチルフェニルポリシロキサン、架橋型メチルポリシロキサン、ポリオキシアルキレン変性オルガノポリシロキサン、架橋型ポリエーテル変性メチルポリシロキサン、メタクリル変性ポリシロキサン、ステアリル変性メチルポリシロキサン、オレイル変性メチルポリシロキサン、ベヘニル変性メチルポリシロキサン、ポリビニルピロリドン変性メチルポリシロキサン、高重合度ジメチルポリシロキサン、ポリオキシアルキレン・アルキルメチルポリシロキサン・メチルポリシロキサン共重合体、アルコキシ変性ポリシロキサン、架橋型オルガノポリシロキサン、フッ素変性ポリシロキサン等のシリコーン類、パーフルオロデカン、パーフルオロオクタン、パーフルオロポリエーテル等のフッ素系油剤類、ラノリン、酢酸ラノリン、ラノリン脂肪酸イソプロピル、ラノリンアルコール等のラノリン誘導体、オクタン酸デキストリン、ラウリン酸デキストリン、パルミチン酸デキストリン、ミリスチン酸デキストリン、ステアリン酸デキストリン、ベヘニン酸デキストリン、ヤシ油脂肪酸デキストリン、（パルミチン酸／オクタン酸）デキストリン、蔗糖脂肪酸エステル、デンプン脂肪酸エステル、イソステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸カリウム、１２−ヒドロキシステアリン酸等の油性ゲル化剤類などを挙げることができる。
【００２３】
本発明の美白用皮膚外用剤に、粉体成分を配合することができる。かかる粉体としては、美白用皮膚外用剤に一般に用いられる粉体であれば、球状、板状、針状等の形状、煙霧状、微粒子、顔料級等の粒子径、多孔質、無孔質等の粒子構造等により特に制限されず、例えば、無機粉体類、光輝性粉体類、有機粉体類、色素粉体類、金属粉体類、複合粉体類等を挙げることができ、具体的には、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化セリウム、硫酸バリウム等の白色無機顔料、酸化鉄、カーボンブラック、チタン・酸化チタン焼結物、酸化クロム、水酸化クロム、紺青、群青等の有色無機顔料、タルク、白雲母、金雲母、紅雲母、黒雲母、合成雲母、絹雲母（セリサイト）、合成セリサイト、カオリン、炭化珪素、ベントナイト、スメクタイト、無水ケイ酸、酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、酸化ジルコニウム、珪ソウ土、ケイ酸アルミニウム、メタケイ酸アルミニウムマグネシウム、ケイ酸カルシウム、ケイ酸バリウム、ケイ酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、ヒドロキシアパタイト、窒化ホウ素等の白色体質粉体、二酸化チタン被覆雲母、二酸化チタン被覆オキシ塩化ビスマス、酸化鉄雲母チタン、紺青処理雲母チタン、カルミン処理雲母チタン、オキシ塩化ビスマス、魚鱗箔、ポリエチレンテレフタレート・アルミニウム・エポキシ積層末、ポリエチレンテレフタレート・ポリオレフィン積層フィルム末、ポリエチレンテレフタレート・ポリメチルメタクリレート積層フィルム末等の光輝性粉体、ポリアミド系樹脂、ポリエチレン系樹脂、ポリアクリル系樹脂、ポリエステル系樹脂、フッ素系樹脂、セルロース系樹脂、ポリスチレン系樹脂、スチレン−アクリル共重合樹脂等のコポリマー樹脂、ポリプロピレン系樹脂、シリコーン樹脂、ウレタン樹脂等の有機高分子樹脂粉体、ステアリン酸亜鉛、Ｎ−アシルリジン等の有機低分子性粉体、シルク粉末、セルロース粉末等の天然有機粉体、赤色２０１号、赤色２０２号、赤色２０５号、赤色２２６号、赤色２２８号、橙色２０３号、橙色２０４号、青色４０４号、黄色４０１号等の有機顔料粉体、赤色３号、赤色１０４号、赤色１０６号、橙色２０５号、黄色４号、黄色５号、緑色３号、青色１号等のジルコニウム、バリウム又はアルミニウムレーキ等の有機顔料粉体あるいは更にアルミニウム粉、金粉、銀粉等の金属粉体、微粒子酸化チタン被覆雲母チタン、微粒子酸化亜鉛被覆雲母チタン、硫酸バリウム被覆雲母チタン、酸化チタン含有二酸化珪素、酸化亜鉛含有二酸化珪素等の複合粉体などを挙げることができる。
【００２４】
本発明の美白用皮膚外用剤に、界面活性剤を配合することができる。かかる界面活性剤としては、美白用皮膚外用剤に一般に用いられる界面活性剤であれば特に制限されず、例えば、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤等を挙げることができ、具体的には、グリセリン脂肪酸エステル及びそのアルキレングリコール付加物、ポリグリセリン脂肪酸エステル及びそのアルキレングリコール付加物、ソルビタン脂肪酸エステル及びそのアルキレングリコール付加物、蔗糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシアルキレンアルキル共変性オルガノポリシロキサン、ポリエーテル変性オルガノポリシロキサン、レシチン等を挙げることができる。
【００２５】
本発明の美白用皮膚外用剤に、水性成分を配合することができる。かかる水性成分としては、美白用皮膚外用剤に一般に用いられる水及び水に可溶な成分であれば特に制限されず、例えば、低級アルコール、グリコール類、グリセロール類、植物抽出液、水溶性高分子等を挙げることができ、具体的には、水、エチルアルコール、ブチルアルコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、アロエベラ、ウイッチヘーゼル、ハマメリス、キュウリ、レモン、ラベンダー、ローズ、グアーガム、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、アラビアガム、アルギン酸ナトリウム、カラギーナン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、アルキル付加カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸ナトリウム等を挙げることができる。
【００２６】
本発明の美白用皮膚外用剤に、酸化防止剤や防腐剤を配合することができる。かかる酸化防止剤としては、例えば、α−トコフェロール、アスコルビン酸等を挙げることができ、防腐剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル、フェノキシエタノール等を挙げることができるが、美白用皮膚外用剤に一般に用いられる酸化防止剤や防腐剤であれば特に制限されない。
【００２７】
なお、本発明の美白用皮膚外用剤に、皮膚老化防止に効果があるといわれている化合物を配合することができる。かかる皮膚老化防止剤としては、美白用皮膚外用剤に一般に用いられる皮膚老化防止剤であれば特に制限されず、例えば、レチノール、レチノイン酸、コエンザイムＱ１０、スーパーオキサイドディスムターゼ、マンニトール、クエルセチン、カテキン及びその誘導体、ルチン及びその誘導体、ボタンピ抽出物、ヤシャジツ抽出物、メリッサ抽出物、羅漢果抽出物、カロチノイド等のビタミンＡ類、チアミン及びその誘導体、リボフラビン及びその誘導体、ピリドキシン及びその誘導体、ニコチン酸及びその誘導体等のビタミンＢ類、トコフェロール及びその誘導体等のビタミンＥ類、ジブチルヒドロキシトルエン並びにブチルヒドロキシアニソールを挙げることができる。
【００２８】
また、本発明の美白用皮膚外用剤に、紫外線防御剤を配合することが、紫外線によるメラニン生成を防ぐ点で好ましい。紫外線防御剤としては、美白用皮膚外用剤に一般に用いられる紫外線防御剤であれば特に制限されず、例えばベンゾフェノン系化合物、ＰＡＢＡ系化合物、ケイ皮酸系化合物、サリチル酸系化合物、４−ｔｅｒｔ−ブチル−４’−メトキシジベンゾイルメタン、ｐ−メトキシ桂皮酸−２−エチルへキシル、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン−５−硫酸ナトリウム、２−フェニル−ベンズイミダゾール−５−硫酸、酸化チタン、酸化亜鉛を挙げることができる。
【００２９】
また、本発明の美白用皮膚外用剤に、抗炎症剤を配合することが、皮膚の炎症を抑えて、チロシナーゼ等の活性を低下させるために望ましい。かかる抗炎症剤としては、美白用皮膚外用剤に一般に用いられる抗炎症剤であれば特に制限されず、例えば、アラントイン、イオウ及びその誘導体、グリチルリチン酸及びその誘導体、グリチルレチン酸及びその誘導体、アルテア抽出物、アシタバ抽出物、アルニカ抽出物、インチンコウ抽出物、イラクサ抽出物、オウバク抽出物、オトギリソウ抽出物、カミツレ抽出物、キンギンカ抽出物、クレソン抽出物、コンフリー抽出物、サルビア抽出物、シコン抽出物、シソ抽出物、シラカバ抽出物、ゲンチアナ抽出物等を挙げることができる。
【００３０】
本発明のマレイン酸の美白用皮膚外用剤中への配合割合としては、本発明の効果が奏される限り特に制限されないが、通常、０．０００１〜１０質量％が好ましく、０．０１〜３質量％がより好ましい。
【００３１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に制限されるものではない。
【実施例１】
【００３２】
（Ｂ１６メラノーマ培養細胞を用いたメラニン生成抑制効果及び細胞生存率試験）
マウス由来のＢ１６メラノーマ培養細胞を使用し、マレイン酸を検体として、メラニン生成抑制効果及び細胞生存率を調べた。
【００３３】
［メラニン生成抑制効果試験］
２枚の６穴プレートに１０ｖ／ｖ％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地（日水製薬株式会社製）を適量とり、Ｂ１６メラノーマ細胞を播種し、二酸化炭素濃度５ｖ／ｖ％において３７℃にて一日静置した。翌日、マレイン酸（和光純薬社製）を精製水に溶解し、その最終濃度が０（対照）、１０、３０、１００μｇ／ｍＬとなるように検体調製液として調製し、かかる検体調製液を、上記Ｂ１６メラノーマ細胞を播種した培地に添加後、混和し、培養５日目に培地を交換して前記検体調製液を再度添加し、その翌日培地を取り除いた。２枚のうち１枚のプレートに培養されていたＢ１６メラノーマ細胞をリン酸緩衝液にて洗浄し回収した後、目視にて白色化度を評価した。
【００３４】
［細胞生存率試験］
また残りの１枚のプレートについて、上記Ｂ１６メラノーマ細胞をホルマリンで固定後、０．１ｗ／ｖ％クリスタルバイオレット溶液に添加し染色した。各検体調製液の濃度における生存細胞数をモノセレーター（オリンパス社製）で測定し、対照濃度における生存細胞数との比率により生存細胞率（％）を算出した。結果を以下に示す。
【００３５】
【表１】
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（判定基準）
◎：対照に対して極めて白色である。
○：対照に対してあきらかに白色である。
△：対照に対してやや白色である。
−：対照と同じ黒色である。
【００３６】
［比較例］
マレイン酸と同様にジカルボン酸であるグルタコン酸及びケリドン酸、マレイン酸と同様にカルボン酸基を有するがトリカルボン酸であるcis-アコニット酸（cis-Aconitic Acid）、マレイン酸と同様に有機酸であって美白効果について報告されているＬ−アスコルビン酸、及び、チロシナーゼ阻害作用を有し、メラニン生成抑制効果を有する成分として美白剤等に広く配合されているコウジ酸につき、実施例１と同様に精製水に溶解してメラニン生成抑制効果（白色化度）及び細胞生存率について試験を行った。また、マレイン酸の幾何異性体であるフマル酸については、エタノールに溶解した以外は実施例１と同様にメラニン生成抑制効果（白色化度）及び細胞生存率について試験を行った。グルタコン酸、ケリドン酸、cis-アコニット酸、Ｌ−アスコルビン酸、フマル酸については表２に、コウジ酸については表３に結果を示す。
【００３７】
【表２】
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【００３８】
【表３】
2009221179.tif 000006
【００３９】
［結果］
マレイン酸は、１００μｇ／ｍＬにおいて、有意なメラニン生成抑制効果を示したが、マレイン酸の幾何異性体であるフマル酸、マレイン酸と同様にジカルボン酸であるケリドン酸やグルタコン酸については、メラニン生成抑制効果が確認されず、マレイン酸に類似する構造をその構造中に有するcis−アコニット酸については、わずかにメラニン生成抑制効果が認められたが、マレイン酸の効果には及ばなかった。また、美白効果について報告されているＬ−アスコルビン酸については、マレイン酸がメラニン抑制効果を奏する濃度と同一濃度では、十分なメラニン抑制効果が確認されなかった。さらに、ポジティブコントロールとして使用したコウジ酸は、メラニン生成抑制効果を示したが、マレイン酸はコウジ酸よりも顕著なメラニン抑制効果を示した。
【実施例２】
【００４０】
（チロシナーゼ阻害効果試験）
マレイン酸を精製水に溶解し、０．１、０．３、１．０、及び３．０ｍＭの各濃度の試料溶液として調製した。チロシナーゼ（シグマ社製、28,000単位）１０ｍｇを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）２０ｍＬに溶解し、酵素溶液として調製した。また、Ｌ−ドーパ（東京化成社製）１９８．０ｍｇを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）１００ｍＬに溶解し、基質溶液として調製した。各濃度の試料溶液に、上記酵素溶液０．１ｍＬを添加し、さらに０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を添加して４．０ｍＬとし、これを２５℃にて１０分間インキュベートした。その後あらかじめ２５℃に保温された上記基質溶液１．０ｍＬを添加し、１０分間反応させた。反応後、４７５ｎｍにおける吸光度（ＯＤＳ）を測定した。同様に、上記加熱失活させたチロシナーゼを添加したこと以外は、上記と同様のチロシナーゼ阻害効果試験を行った場合の吸光度をＯＤＨＥとし、酵素溶液を添加したが、試料溶液が無添加であること以外は、上記と同様のチロシナーゼ阻害効果試験を行った場合の吸光度（ＯＤＢ）と、試料溶液と加熱失活させたチロシナーゼを添加した時の吸光度（ＯＤＳＨＥ）と、加熱失活させた酵素を用いて反応させた時の吸光度（ＯＤＨＥ）を測定し、以下の式（１）よりチロシナーゼ活性の阻害率を算出した。この結果を図１に示す。
【００４１】
【数１】
2009221179.tif 000007
【００４２】
（式中：ＯＤＳ：試料及び酵素添加時の吸光度、ＯＤＢ：試料無添加で酵素添加時の吸光度、ＯＤＨＥ：加熱失活させた酵素を用いて反応させた時の吸光度、ＯＤＳＨＥ：試料と不活性化酵素添加時の吸光度）
【００４３】
［比較例］
フマル酸、グルタコン酸、トリカルボン酸であるcis−アコニット酸についても、上記同様チロシナーゼ阻害効果試験を行った。
【００４４】
［結果］
マレイン酸、フマル酸、グルタコン酸、cis−アコニット酸いずれについても、チロシナーゼ活性の阻害効果は観察されなかった（図１参照）。チロシナーゼを直接的に阻害するメカニズムとして、チロシナーゼに含有される銅イオンをキレートにより奪う薬剤が知られている。今回マレイン酸は、チロシナーゼを直接的に活性阻害しなかったことから、マレイン酸のメラニン生成抑制活性は、チロシナーゼの銅イオンを奪うキレート作用によるものではなく、細胞内で何らかのメカニズムによりメラニン産生を抑制する効果を有するものであることが確認された。
【実施例３】
【００４５】
マレイン酸及びその塩を用いて以下の化粧料を作製した。
【００４６】
［例１：化粧水１］
（製法）
Ａ．下記成分（３）〜（５）及び（１２）、（１３）を混合溶解した。
Ｂ．下記成分（１）、（２）、（６）〜（１１）及び（１４）を混合溶解した。
Ｃ．ＡとＢとを混合して、化粧水を得た。
（成分）                                                  （質量％）
（１）グリセリン                                             ５．０
（２）１，３−ブチレングリコール                             ６．５
（３）ポリオキシエチレン（２０Ｅ．Ｏ．）ソルビタン
モノラウリン酸エステル                                       １．２
（４）エチルアルコール                                     １２．０
（５）アスコルビン酸パルミチン酸エステル                     ０．１
（６）アスコルビン酸エステルナトリウム                       ０．５
（７）アスコルビン酸グルコシド                               ２．０
（８）乳酸                                                   ０．０５
（９）乳酸ナトリウム                                         ０．１
（１０）マレイン酸ナトリウム                                 ０．１
（１１）コラーゲン                                           １．０
（１２）防腐剤                                               適量
（１３）香料                                                 適量
（１４）精製水                                               残量
【００４７】
［例２：水中油型乳液１］
Ａ．下記成分（７）、（８）を下記成分（１２）に添加し膨潤後、下記成分（９）、（１１）を添加し混合して、７０℃に加温し水相を調製した。
Ｂ．下記成分（１）〜（６）を７０℃に加温した。
Ｃ．ＡにＢを添加して乳化した。
Ｄ．Ｃを室温まで冷却し、下記成分（１０）及び（１３）を添加し、均一に混合して乳液を得た。
（成分）                                                      （質量％）
（１）ポリオキシエチレン（１０Ｅ．Ｏ．）ソルビタン
モノステアレート                                          １．０
（２）ポリオキシエチレン（６０Ｅ．Ｏ．）ソルビット
テトラオレエート                                          ０．５
（３）グリセリルモノステアレート                                １．０
（４）ステアリン酸                                              ０．５
（５）ベヘニルアルコール                                        ０．５
（６）スクワラン                                                ８．０
（７）防腐剤                                                    ０．１
（８）カルボキシビニルポリマー                                  ０．１
（９）水酸化ナトリウム                                          ０．０５
（１０）エチルアルコール                                        ５．０
（１１）マレイン酸ナトリウム                                    ０．１
（１２）精製水                                                  残量
（１３）香料                                                    適量
【００４８】
［例３：洗顔料］
(製法)
Ａ．下記成分（１）〜（５）を加熱溶解した。
Ｂ．下記成分（６）〜（７）を加熱溶解した。
Ｃ．ＡにＢを添加し混合した。
Ｄ．さらに下記成分（８）〜（１１）を加熱溶解し、Ｃに添加し混合した。
Ｅ．Ｄを冷却後、下記成分（１２）〜（１４）を添加し混合して、洗顔料を得た。
（成分）                                                      （質量％）
（１）ラウリン酸                                                ５．０
（２）ミリスチン酸                                            １８．５
（３）ステアリン酸                                              ６．０
（４）グリセリン                                              １２．０
（５）ポリエチレングリコール１５００                            ５．０
（６）水酸化カリウム                                            ６．５
（７）精製水                                                    残量
（８）ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド                            ５．０
（９）ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム                      １．８
（１０）ポリオキシエチレン（７．５Ｅ．Ｏ．）ラウリルエーテル    ２．０
（１１）ジステアリン酸エチレングリコール                        １．０
（１２）ヒドロキシプロピルメチルセルロース１％水溶液            ５．０
（１３）マレイン酸                                              １．０
（１４）香料                                                    適量
【００４９】
［例４：化粧水２］
（製法）
Ａ．下記成分（１）〜（８）を混合溶解した。
Ｂ．下記成分（９）〜（１２）を混合溶解した。
Ｃ．ＡにＢを添加し混合して、化粧水を得た。
（成分）                                                        (質量％)
（１）クエン酸                                                  ０．０５
（２）クエン酸ナトリウム                                        ０．２
（３）ピロリドンカルボン酸ナトリウム（５０％）液                ０．５
（４）グリチルリチン酸ジカリウム                                ０．１
（５）グリセリン                                                ３．０
（６）１，３−ブチレングリコール                                ８．０
（７）マレイン酸カリウム                                        ０．０１
（８）精製水                                                    残量
（９）エチルアルコール                                        １０．０
（１０）香料                                                    適量
（１１）防腐剤                                                  適量
（１２）モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０Ｅ．Ｏ．）
ソルビタン                                              ０．５
【００５０】
［例５：水中油型乳液２］
（製法）
Ａ．下記成分（１）〜（１３）を加熱溶解し、７０℃に保った。
Ｂ．下記成分（１４）〜（１８）を加熱溶解し、７０℃に保った。
Ｃ．ＡにＢを添加し乳化し、さらに下記成分（１９）、（２０）を添加し混合した。
Ｄ．Ｃを冷却後、下記成分（２１）を添加し混合して、乳液を得た。
（成分）                                                      （質量％）
（１）ステアリン酸                                              １．０
（２）セタノール                                                ０．５
（３）親油型モノステアリン酸グリセリン                          ０．５
（４）流動パラフィン                                            ２．０
（５）スクワラン                                                ３．０
（６）ホホバ油                                                  ３．０
（７）パルミチン酸セチル                                        ０．２
（８）パルミチン酸レチノール                                    ０．２
（９）酢酸トコフェロール                                        ０．０５
（１０）防腐剤                                                  適量
（１１）モノステアリン酸ソルビタン                              ０．３
（１２）モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０Ｅ．Ｏ．）
ソルビタン                                              ０．５
（１３）ジブチルヒドロキシトルエン                              ０．１
（１４）ポリエチレングリコール６０００                          ０．５
（１５）トリエタノールアミン                                    ０．５
（１６）１，３−ブチレングリコール                            １５．０
（１７）グリセリン                                              ３．０
（１８）精製水                                                  残量
（１９）マレイン酸                                              ２．０
（２０）カルボキシビニルポリマー１％溶液                        ８．０
（２１）香料                                                    適量
【００５１】
［例６：水中油型クリーム］
（製法）
Ａ．下記成分（１）〜（１４）を加熱溶解し、７０℃に保った。
Ｂ．下記成分（１５）〜（２１）を加熱溶解し、７０℃に保った。
Ｃ．ＡにＢを添加し乳化して、さらに下記成分（２２）を添加し混合した。
Ｄ．Ｃを冷却後、下記成分（２３）を添加し混合して、クリームを得た。
（成分）                                                      （質量％）
（１）ステアリン酸                                              ２．５
（２）セタノール                                                ２．５
（３）親油型モノステアリン酸グリセリン                          ２．０
（４）ワセリン                                                  ２．０
（５）ジペンタエリトリット脂肪酸エステル                        ２．０
（６）ミリスチン酸イソトリデシル                                ５．０
（７）流動パラフィン                                            ８．０
（８）スクワラン                                                ５．０
（９）ミツロウ                                                  １．０
（１０）パルミチン酸セチル                                      ２．０
（１１）セスキオレイン酸ソルビタン                              ０．５
（１２）モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０Ｅ．Ｏ．）
ソルビタン                                                １．５
（１３）コエンザイムＱ１０                                      ０．１
（１４）防腐剤                                                  適量
（１５）マレイン酸                                              １．０
（１６）トリエタノールアミン                                    １．２
（１７）１，３−ブチレングリコール                              ８．０
（１８）グリセリン                                              ２．０
（１９）ポリエチレングリコール２００００                        ０．５
（２０）２，３−ジヒドロキシ安息香酸ナトリウム                  ２．０
（２１）精製水                                                  残量
（２２）カルボキシビニルポリマー１％水溶液                    １０．０
（２３）香料                                                    適量
【００５２】
［例７：油中水型日焼け止めクリーム］
（製法）
Ａ．下記成分（１）〜（８）を７０℃で加熱混合した。
Ｂ．下記成分（９）〜（１２）及び（１４）〜（１５）を５０℃で加温混合した。
Ｃ．ＡにＢを添加し乳化して、冷却後下記成分（１３）を添加し混合して、油中水型日焼け止めクリームを得た。
（成分）                                                      （質量％）
（１）ポリオキシアルキレン変性オルガノポリシロキサン＊１        ２．０
（２）パルミチン酸オクチル                                    １５．０
（３）デカメチルシクロペンタシロキサン                        ２０．０
（４）トリベヘン酸グリセリル                                    １．０
（５）微粒子酸化亜鉛                                          １２．０
（６）微粒子酸化チタン                                          ３．０
（７）パラメトキシケイ皮酸２−エチルヘキシル＊２                ７．０
（８）４−ｔｅｒｔブチル−４’−メトキシジベンゾイルメタン＊３  １．０
（９）ジプロピレングリコール                                    ５．０
（１０）エタノール                                              ５．０
（１１）ポリエチレン末                                          ３．０
（１２）防腐剤                                                  適量
（１３）香料                                                    適量
（１４）マレイン酸                                              ０．５
（１５）精製水                                                  残量
＊１：ＫＦ−６０１７（信越化学工業社製）
＊２：ユビナールＭＣ８０（ＢＡＳＦ社製）
＊３：ＰＡＲＳＯＬ  １７８９（Ｌ．Ｃ．ＵＮＩＴＥＤ社製）
【００５３】
［例８：パック化粧料］
（製法）
Ａ．下記成分（１）〜（５）及び（１５）を７０℃で加熱混合し、室温まで冷却した。
Ｂ．Ａに下記成分（６）〜（１４）を添加し混合して、パック化粧料を得た。
（成分）                                                      （質量％）
（１）ポリビニルアルコール                                    １５．０
（２）グリセリン                                              １０．０
（３）ポリオキシエチレン（１０）メチルグルコール                ３．０
（４）トリオクタン酸グリセリル                                  ５．０
（５）ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸ナトリウム        １．０
（６）エタノール                                              ２０．０
（７）カオリン                                                  ２．０
（８）酸化チタン                                                ２．０
（９）グリチルリチン酸ジカリウム                                ０．１
（１０）乳酸                                                    ０．２５
（１１）乳酸ナトリウム                                          ０．２５
（１２）防腐剤                                                  適量
（１３）香料                                                    適量
（１４）マレイン酸ナトリウム                                    ０．１
（１５）精製水                                                  残量
【００５４】
［例９：リキッドファンデーション］
（製法）
Ａ．下記成分（１）〜（７）を７０℃で加熱混合し、この混合物に下記成分（１４）〜（１８）を添加し混合して、７０℃に保った。
Ｂ．下記成分（８）〜（１３）を７０℃で加熱混合した。
Ｃ．ＢにＡを添加し乳化して、冷却後、下記成分（１９）〜（２０）を添加し混合してリキッドファンデーションを得た。
（成分）                                                      （質量％）
（１）ジペンタエリトリット脂肪酸エステル                        ２．０
（２）流動パラフィン                                            ５．０
（３）ステアリン酸                                              ２．０
（４）セタノール                                                １．０
（５）自己乳化型モノステアリン酸グリセリル                      １．０
（６）パラメトキシケイ皮酸２−エチルヘキシル                    ８．０
（７）防腐剤                                                    適量
（８）グリセリン                                                ５．０
（９）トリエタノールアミン                                      １．０
（１０）カルボキシメチルセルロース                              ０．２
（１１）ベントナイト                                            ０．５
（１２）マレイン酸                                              ０．１
（１３）精製水                                                  残量
（１４）酸化チタン                                              ６．０
（１５）微粒子酸化チタン                                        ２．０
（１６）微粒子酸化亜鉛                                          ４．０
（１７）マイカ                                                  ２．０
（１８）タルク                                                  ４．０
（１９）着色顔料                                                適量
（２０）香料                                                    適量
【００５５】
上記で調製した化粧料は、いずれも経時安定性に優れ、皮膚に適用することにより、美白効果をもたらすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】マレイン酸、フマル酸、cis−アコニット酸、グルタコン酸のチロシナーゼ活性阻害効果を示す図である。
【図１】
2009221179.tif 000008