(57)【要約】【課題】新規癌特異的代謝経路を探索するとともに、これを標的とした癌診断のための検査方法、治療剤、そのスクリーニング方法および治療評価の方法の提供。【解決手段】個体から採取した試料における、アセチルＣｏＡシンセターゼ２の発現量または低酸素条件下での酢酸産生量を測定することを含む、該個体が癌に罹患しているか否かを判定する方法。個体における、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現またはその産物の活性を抑制することによる、癌の治療方法。アセチルＣｏＡシンセターゼ２発現細胞に被験物質を接触させ、該細胞における、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現を測定すること、および被験物質を接触させていない対照細胞と比較してアセチルＣｏＡシンセターゼ２の発現または活性を抑制した物質を、癌を治療しうる物質として選択することを含む、癌を治療する物質のスクリーニング方法。治療中または治療を受けた癌患者から経時的に採取した癌部位を含む試料における、アセチルＣｏＡシンセターゼ２の発現の推移を評価することを含む、癌患者に対する抗癌治療効果の評価方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体から採取した試料における、アセチルＣｏＡシンセターゼ２の発現量を測定することを含む、該個体が癌に罹患しているか否かを判定する方法。
【請求項２】
下記（ａ）または（ｂ）：
（ａ）アセチルＣｏＡシンセターゼ２の転写産物を特異的に検出し得る核酸プローブまたは核酸プライマー
（ｂ）アセチルＣｏＡシンセターゼ２を特異的に認識する抗体
を用いて発現量を測定することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
治療中または治療を受けた癌患者から経時的に採取した癌部位を含む試料における、アセチルＣｏＡシンセターゼ２の発現の推移を評価することを含む、癌患者に対する抗癌治療効果の評価方法。
【請求項４】
下記（ａ）または（ｂ）：
（ａ）アセチルＣｏＡシンセターゼ２の転写産物を特異的に検出し得る核酸プローブまたは核酸プライマー
（ｂ）アセチルＣｏＡシンセターゼ２を特異的に認識する抗体
を含有してなる、個体が癌に罹患しているか否かを判定するための剤。
【請求項５】
個体から採取した試料の、酢酸産生量を測定することを含む、該個体が癌に罹患しているか否かを判定する方法。
【請求項６】
低酸素条件下での酢酸産生量が測定される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
下記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）：
（ａ）アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸
（ｂ）アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ
（ｃ）アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸またはｓｉＲＮＡを生成し得る発現ベクター
のいずれかを含有してなる、癌の治療剤。
【請求項８】
アセチルＣｏＡシンセターゼ２発現細胞に被験物質を接触させること、該細胞におけるアセチルＣｏＡシンセターゼ２の発現を測定すること、および被験物質を接触させていない対照細胞と比較してアセチルＣｏＡシンセターゼ２の発現を抑制した物質を、癌を治療しうる物質として選択することを含む、癌を治療し得る物質のスクリーニング方法。
【請求項９】
アセチルＣｏＡシンセターゼ２に被験物質を接触させること、アセチルＣｏＡシンセターゼ２の活性を測定すること、および被験物質を接触させていない場合と比較して、アセチルＣｏＡシンセターゼ２の活性を抑制した物質を、癌を治療し得る物質として選択することを含む、癌を治療し得る物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
個体の細胞が取り込む放射性標識された酢酸量を測定することを含む、癌の判定方法。
【請求項１１】
放射性標識された酢酸を含む、癌細胞検出用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌特異的酢酸代謝またはアセチルＣｏＡシンセターゼ２をコードする遺伝子を標的とした癌の治療剤、治療剤のスクリーニング方法、検査方法、および治療評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌細胞は、一般に解糖系が亢進し、これにより優先的にエネルギーを得ている。そのため、糖代謝の亢進は、癌細胞のよいバイオマーカーになってきた。例えば、１８Ｆ標識２−ｆｌｕｏｒｏ−２−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ（ＦＤＧ）を用いた陽電子断層撮影（ＦＤＧ−ＰＥＴ）は、有用な癌細胞の診断法として確立している。（非特許文献１，２）。しかし、糖代謝を指標とした癌細胞の鑑別では、糖代謝の活発な正常細胞や炎症細胞と見分けがつかない、一部の組織の癌では鑑別が困難であるなどの欠点があった（非特許文献３）。
【非特許文献１】Ｉｓｒａｅｌ，  Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ４５，  ２０４５−２０５１  （２００４）
【非特許文献２】Ｄａｎｇ，  Ｃ．Ｖ．  ＆  Ｓｅｍｅｎｚａ，  Ｇ．Ｌ．  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２４，  ６８−７２  （１９９９）
【非特許文献３】寺内隆司ら：  ＰＥＴ検診の適応と限界．  コンセンサス癌治療  ２００６  ＶＯＬ．５  ＮＯ．３  へるす出版
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、新規癌特異的代謝経路を探索するとともに、これを標的とした癌診断のための検査方法、治療剤、そのスクリーニング方法および治療評価の方法について提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、癌細胞において細胞質性アセチルＣｏＡシンセターゼ２（以下、「Ａｃｓｓ２」と略記することもある）によって触媒される特異的酢酸代謝経路が亢進していることを見出した。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００５】
即ち、本発明は、
［１］個体から採取した試料における、アセチルＣｏＡシンセターゼ２の発現量を測定することを含む、該個体が癌に罹患しているか否かを判定する方法
［２］下記（ａ）または（ｂ）：
（ａ）アセチルＣｏＡシンセターゼ２の転写産物を特異的に検出し得る核酸プローブまたは核酸プライマー
（ｂ）アセチルＣｏＡシンセターゼ２を特異的に認識する抗体
を用いて発現量を測定することを特徴とする、上記［１］の方法
［３］治療中または治療を受けた癌患者から経時的に採取した癌部位を含む試料における、アセチルＣｏＡシンセターゼ２の発現の推移を評価することを含む、癌患者に対する抗癌治療効果の評価方法
［４］下記（ａ）または（ｂ）：
（ａ）アセチルＣｏＡシンセターゼ２の転写産物を特異的に検出し得る核酸プローブまたは核酸プライマー
（ｂ）アセチルＣｏＡシンセターゼ２を特異的に認識する抗体
を含有してなる、個体が癌に罹患しているか否かを判定するための剤
［５］個体から採取した試料の、酢酸産生量を測定することを含む、該個体が癌に罹患しているか否かを判定する方法
［６］低酸素条件下での酢酸産生量が測定される、上記［５］の方法
［７］下記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）：
（ａ）アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸
（ｂ）アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ
（ｃ）アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸またはｓｉＲＮＡを生成し得る発現ベクター
のいずれかを含有してなる、癌の治療剤
［８］アセチルＣｏＡシンセターゼ２発現細胞に被験物質を接触させること、該細胞におけるアセチルＣｏＡシンセターゼ２の発現を測定すること、および被験物質を接触させていない対照細胞と比較してアセチルＣｏＡシンセターゼ２の発現を抑制した物質を、癌を治療しうる物質として選択することを含む、癌を治療し得る物質のスクリーニング方法
［９］アセチルＣｏＡシンセターゼ２に被験物質を接触させること、アセチルＣｏＡシンセターゼ２の活性を測定すること、および被験物質を接触させていない場合と比較して、アセチルＣｏＡシンセターゼ２の活性を抑制した物質を、癌を治療し得る物質として選択することを含む、癌を治療し得る物質のスクリーニング方法
［１０］個体の細胞が取り込む放射性標識された酢酸量を測定することを含む、癌の判定方法
［１１］放射性標識された酢酸を含む、癌細胞検出用試薬
等を提供する。
【発明の効果】
【０００６】
癌特異的なアセチルＣｏＡシンセターゼ２の発現変動を調べることにより、迅速かつ簡便な癌の診断が可能となる。特に、癌特異的なアセチルＣｏＡシンセターゼ２は、低酸素条件下においては発現レベルが正常細胞と比較して顕著に異なるので、癌の判定がより容易に行える。さらに、癌におけるアセチルＣｏＡシンセターゼ２の発現を制御することにより、癌の治療が可能となる。また、この遺伝子もしくはその発現産物を用いて該遺伝子の発現もしくは該産物の活性を制御する物質を選択ことにより、癌に対する新規治療薬の探索が可能となる。あるいはまた、アセチルＣｏＡシンセターゼ２の発現をモニタリングすることにより、癌に対する治療効果の評価が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、個体から採取した試料における、アセチルＣｏＡシンセターゼ２の発現量を測定することを含む、該個体が癌に罹患しているか否かを判定する方法に関する。本発明の判定方法において発現量が測定されるアセチルＣｏＡシンセターゼ２は、ＡＴＰ＋ａｃｅｔａｔｅ＋ＣｏＡ⇔ＡＭＰ＋ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ＋ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡの反応を触媒し、細胞質における酢酸代謝に関与することが知られている。そのアセチルＣｏＡシンセターゼ２のヒトヌクレオチド配列（アミノ酸配列）は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＮＭ＿００１０７６５５２［配列番号１に対応］（ＮＰ＿００１０７００２０［配列番号２に対応］）およびＮＭ＿０１８６７７［配列番号３に対応］（ＮＰ＿０６１１４７［配列番号４に対応］）として、そのマウスヌクレオチド配列はアクセッション番号ＮＭ＿０１９８１１［配列番号５に対応］（ＮＰ＿０６２７８５［配列番号６に対応］）として登録されている。
【０００８】
本明細書中、癌の種類は特に限定されないが、例えば、癌としては、肺癌、皮膚癌、大腸癌、および乳癌が挙げられる。本発明の判定方法は上記の癌に好適に用いられる。
【０００９】
本発明の判定方法が適用できる個体は、特に制限されないが、例えば、癌に罹患しているおそれがある個体、もしくは罹患していることが疑われる個体、あるいは現に癌に罹患している個体、例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ等の哺乳動物が挙げられる。好ましくは、ヒトである。
【００１０】
本発明の判定方法に用いられる試料としては、被験対象である上記個体から採取されるものであって、検出対象である遺伝子産物（例、ＲＮＡ、蛋白質、その分解産物など）を含有し得る細胞または細胞を含有する組織等であれば特に制限されない。例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織、骨格筋などが挙げられる。
【００１１】
個体から採取した試料におけるアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現は、該試料からＲＮＡ（例：全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）画分を調製し、該画分中に含まれるアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の転写産物を検出することにより調べることができる。ＲＮＡ画分の調製は、グアニジン−ＣｓＣｌ超遠心法、ＡＧＰＣ法など公知の手法を用いて行うことができるが、市販のＲＮＡ抽出用キット（例：ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ；  ＱＩＡＧＥＮ製等）を用いて、微量試料から迅速且つ簡便に高純度の全ＲＮＡを調製することができる。ＲＮＡ画分中のアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の転写産物を検出する手段としては、例えば、ハイブリダイゼーション（ノーザンブロット、ドットブロット、ＤＮＡチップ解析等）を用いる方法、あるいはＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ、競合ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ等）を用いる方法などが挙げられる。微量試料から迅速且つ簡便に定量性よくアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現変動を検出できる点で競合ＰＣＲやリアルタイムＰＣＲなどの定量的ＰＣＲ法が好ましい。
【００１２】
ノーザンブロットまたはドットブロットハイブリダイゼーションによる場合、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の検出は、例えば、アセチルＣｏＡシンセターゼ２の転写産物を特異的に検出し得る核酸プローブを用いて行うことができる。１つの好ましい態様においては、本発明の判定方法に用いられる核酸プローブは、配列番号１、３または５のいずれかで表されるヌクレオチド配列に含まれる、約１５塩基以上、好ましくは約１８〜約５００塩基、より好ましくは約１８〜約２００塩基、いっそう好ましくは約１８〜約５０塩基の連続したヌクレオチド配列またはその相補配列をふくむポリヌクレオチドである。該核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。好ましくはＤＮＡが挙げられる。また、プローブとして用いられる核酸は、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、アンチセンス鎖を用いることができる。
【００１３】
また、本発明の判定方法に用いられる核酸プローブは、配列番号１、３または５のいずれかで表されるヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）第２版（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。ストリンジェントな条件としては、例えば、６×ＳＳＣ（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ／ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）中４５℃でのハイブリダイゼーション反応の後、０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中６５℃での一回以上の洗浄などが挙げられる。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。核酸プローブの長さは、通常約１５塩基以上、好ましくは約１８〜約５００塩基、より好ましくは約１８〜約２００塩基、更に好ましくは約１８〜約５０塩基である。
【００１４】
アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現を検出し得るプローブとして機能する核酸は、該遺伝子の転写産物の一部もしくは全部を増幅し得る後述するプライマーセットを用い、個体（例：ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット等）のあらゆる細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など］もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織、骨格筋など］由来のｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によって所望の長さの核酸を増幅するか、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション等により上記アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子もしくはｃＤＮＡをクローニングし、必要に応じて制限酵素等を用いて適当な長さの断片とすることにより取得することができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）第２版（前述）に記載の方法などに従って行なうことができる。あるいは、該核酸は、配列番号１、３または５のいずれかに示される塩基配列情報に基づいて、該塩基配列および／またはその相補鎖配列の一部もしくは全部を市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機等を用いて化学的に合成することによっても得ることができる。また、シリコンやガラス等の固相上で該核酸を直接ｉｎ  ｓｉｔｕ（ｏｎ  ｃｈｉｐ）合成することにより、該核酸が固相化されたチップを作成することもできる。
【００１５】
アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の転写産物の一部もしくは全部を増幅し得るプライマーとして機能する核酸は、配列番号１、３または５のいずれかに示される塩基配列情報に基づいて、該塩基配列およびその相補鎖配列の一部を市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機等を用いて化学的に合成することによって得ることができる。
【００１６】
該核酸は、標的核酸の検出・定量を可能とするために、標識剤により標識されていることが好ましい。標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔３２Ｐ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、プローブと標識剤との結合にビオチン−（ストレプト）アビジンを用いることもできる。
【００１７】
ノーザンハイブリダイゼーションによる場合は、上記のようにして調製したＲＮＡ画分をゲル電気泳動にて分離した後、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフロリド等のメンブレンに転写し、上記のようにして調製された標識プローブを含むハイブリダイゼーション緩衝液中、特異的にハイブリダイゼーションさせた後、適当な方法でメンブレンに結合した標識量をバンド毎に測定することにより、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現量を測定することができる。ドットブロットの場合も、ＲＮＡ画分をスポットしたメンブレンを同様にハイブリダイゼーション反応に付し、スポットの標識量を測定することにより、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現量を測定することができる。
【００１８】
ＤＮＡチップ解析による場合、例えば、上記のようにして調製したＲＮＡ画分から、逆転写反応によりＴ７プロモーター等の適当なプロモーターを導入したｃＤＮＡを合成し、さらにＲＮＡポリメラーゼを用いてｃＲＮＡを合成する（この時ビオチンなどで標識したモノヌクレオチドを基質として用いることにより、標識されたｃＲＮＡが得られる）。この標識ｃＲＮＡを、上記したプローブを固相化したチップと接触させてハイブリダイゼーション反応させ、固相上の各プローブに結合した標識量を測定することにより、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現量を測定することができる。
【００１９】
別の好ましい実施態様によれば、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現を測定する方法として定量的ＰＣＲ法が用いられる。定量的ＰＣＲとしては、例えば、競合ＰＣＲやリアルタイムＰＣＲなどがある。
ＰＣＲにおいてプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドのセットとしては、例えば、アセチルＣｏＡシンセターゼ２の転写産物を特異的に検出し得る核酸プライマーを挙げることができる。１つの好ましい態様においては、本発明の判定方法に用いられる核酸プライマーとしては、例えば、配列番号１、３または５のいずれかに示されるヌクレオチド配列に含まれる、約１５塩基以上、好ましくは約１５〜約５０塩基、より好ましくは約１５〜約３０塩基、いっそう好ましくは約１５〜約２５塩基の連続したヌクレオチド配列の長さを有し、約１００ｂｐ〜数ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅するようにデザインされたポリヌクレオチド（センス鎖）配列に相補的なポリヌクレオチド、及び前記のポリヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド（アンチセンス鎖）にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドのオリゴヌクレオチドのセットが挙げられる。
【００２０】
競合ＲＴ−ＰＣＲとは、目的のＤＮＡを増幅し得るプライマーのセットにより増幅され得る既知量の他の鋳型核酸をｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒとして反応液中に共存させて競合的に増幅反応を起こさせ、増幅産物の量を比較することにより、目的ＤＮＡの量を算出する方法をいう。したがって、競合ＲＴ−ＰＣＲによる場合、上記したプライマーセットに加えて、該プライマーセットで増幅でき、増幅後に標的核酸（すなわち、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の転写産物）の増幅産物と区別することができる（例えば、増幅サイズが異なる、制限酵素処理断片の泳動パターンが異なるなど）既知量のｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ核酸が用いられる。標的核酸とｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ核酸とはプライマーを奪い合って増幅が競合的に起こるので、増幅産物の量比が元の鋳型の量比を反映することになる。ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ核酸はＤＮＡでもＲＮＡでもよい。ＤＮＡの場合、上記のようにして調製されるＲＮＡ画分から逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した後に、上記プライマーセットおよびｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒの共存下でＰＣＲを行えばよく、ＲＮＡの場合は、ＲＮＡ画分にｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒを添加して逆転写反応を行い、さらに上記プライマーセットを添加してＰＣＲを実施すればよい。後者の場合、逆転写反応の効率も考慮に入れているので、元のｍＲＮＡの絶対量を推定することができる。
【００２１】
一方、リアルタイムＰＣＲは、蛍光試薬を用いて増幅量をリアルタイムでモニタリングする方法であり、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化した装置を必要とする。このような装置は市販されている。用いる蛍光試薬によりいくつかの方法があり、例えば、インターカレンター法、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ法、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ法等が挙げられる。いずれも、上記のようにして調製されるＲＮＡ画分から逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した後に、上記プライマーセットとＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、エチジウムブロマイド等の二本鎖ＤＮＡに結合することにより蛍光を発する試薬（インターカレーター）、上記プローブとして用いることができる核酸（但し、該核酸は増幅領域内で標的核酸にハイブリダイズする）の両端をそれぞれ蛍光物質（例：ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＦＩＴＣ等）および消光物質（例：ＴＡＭＲＡ、ＤＡＢＣＹＬ等）で修飾したもの（ＴａｑＭａｎＴＭプローブまたはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎプローブ）などの蛍光試薬（プローブ）とを、それぞれＰＣＲ反応系に添加するというものである。インターカレーターは合成された二本鎖ＤＮＡに結合して励起光の照射により蛍光を発するので、蛍光強度を測定することにより増幅産物の生成量をモニタリングすることができ、それによって元の鋳型ｃＤＮＡ量を推定することができる。ＴａｑＭａｎＴＭプローブは両端を蛍光物質と消光物質をそれぞれで修飾した、標的核酸の増幅領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドであり、アニーリング時に標的核酸にハイブリダイズするが消光物質の存在により蛍光を発せず、伸長反応時にＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により分解されて蛍光物質が遊離することにより蛍光を発する。従って、蛍光強度を測定することにより増幅産物の生成量をモニタリングすることができ、それによって元の鋳型ｃＤＮＡ量を推定することができる。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎプローブは両端を蛍光物質と消光物質をそれぞれで修飾した、標的核酸の増幅領域にハイブリダイズし得るとともにヘアピン型二次構造をとり得るオリゴヌクレオチドであり、ヘアピン構造をとっている時は消光物質の存在により蛍光を発せず、アニーリング時に標的核酸にハイブリダイズして蛍光物質と消光物質との距離が広がることにより蛍光を発する。従って、蛍光強度を測定することにより増幅産物の生成量をモニタリングすることができ、それによって元の鋳型ｃＤＮＡ量を推定することができる。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ＰＣＲの増幅量をリアルタイムでモニタリングできるので、電気泳動が不要で、より迅速にアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現を解析可能である。
【００２２】
あるいは、個体から採取した試料におけるアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現は、該試料から蛋白質画分を調製し、該画分中に含まれる該遺伝子の翻訳産物（即ち、アセチルＣｏＡシンセターゼ２）を検出することにより調べることができる。アセチルＣｏＡシンセターゼ２の検出は、アセチルＣｏＡシンセターゼ２を特異的に認識する抗体を用いて、免疫学的測定法（例：ＥＬＩＳＡ、ＦＩＡ、ＲＩＡ、ウェスタンブロット等）によって行うこともできるし、アセチルＣｏＡシンセターゼ２の有する酢酸代謝活性を、公知の手法を用いて測定することによっても行い得る。あるいはまた、アセチルＣｏＡシンセターゼ２の検出は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ等の質量分析法を用いても行うことができる。
【００２３】
アセチルＣｏＡシンセターゼ２を特異的に認識する抗体は、アセチルＣｏＡシンセターゼ２ポリペプチドやその抗原性を有する部分ペプチド、具体的には、配列番号２、４または６のいずれかに示されるペプチド配列の全部またはエピトープに当たる部分を有する部分ペプチドを免疫原として用い、既存の一般的な製造方法によって製造することができる。本明細書において、抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）等の天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体や一本鎖抗体、およびこれらの結合性断片が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又はこれらの結合性断片である。結合性断片とは、特異的結合活性を有する前述の抗体の一部分の領域を意味し、具体的には例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ等が挙げられる（Ｅｘｐ．  Ｏｐｉｎ．  Ｔｈｅｒ．  Ｐａｔｅｎｔｓ，  Ｖｏｌ．６，  Ｎｏ．５，  ｐ．４４１−４５６，  １９９６）。抗体のクラスは、特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。好ましくは、ＩｇＧ又はＩｇＭであり、精製の容易性等を考慮するとより好ましくはＩｇＧである。
【００２４】
個々の免疫学的測定法を本発明の検査方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてアセチルＣｏＡシンセターゼ２の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。例えば、入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」  Ｖｏｌ．  ７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ａ））、  同書  Ｖｏｌ．  ７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｂ））、  同書  Ｖｏｌ．  ７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｃ））、  同書  Ｖｏｌ．  ８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｄ  ：  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、  同書  Ｖｏｌ．  ９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｅ  ：  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ））、  同書  Ｖｏｌ．  １２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｉ  ：  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
【００２５】
本発明の判定方法は、上記手法により、癌と相関して発現が変動するアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現量を測定することによって、個体が癌に罹患しているか否かの判定を行う。後述の実施例に示すように、癌細胞では正常細胞よりもアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現レベルが高い。従って、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現レベルと個体の癌罹患率との間には正の相関関係があり、該遺伝子の発現レベルが高いほど、癌である確率が高いと判定することができる。
【００２６】
例えば、癌に罹患していないことが確認されている個体（ネガティブコントロール）及び、癌に罹患していると臨床医的に判断されている個体（ポジティブコントロール）から正常細胞（組織）および癌細胞（組織）を摘出し、対象個体から摘出された癌と疑われる細胞（組織）におけるアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現レベルがポジティブコントロール及びネガティブコントロールのそれと比較される。あるいは、試料におけるアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現レベルと臨床的に癌であると判断された率との相関図をあらかじめ作成しておき、対象個体から摘出された癌におけるアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現レベルをその相関図と比較してもよい。発現レベルの比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。
【００２７】
そして、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現レベルの比較結果より、測定対象のアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現レベルが相対的に高い場合には、癌である確率が相対的に高いと判定することができる。逆に、測定対象のアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現レベルが相対的に低い場合には、癌である確率が相対的に低いと判定することができる。
【００２８】
上記癌の判定方法を、癌に対する治療を施された患者や癌治療薬候補化合物を投与された実験動物（例、サル、イヌ、ラット、マウス等）に適用することにより、治療効果の評価を行うことができる。即ち、治療中または治療を受けた癌患者から経時的に採取した癌部位を含む試料におけるアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現をそれぞれ測定・比較し、治療前と比較して治療後のアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現増加が抑制される傾向を示せば、治療効果が認められると判定することができる。
【００２９】
本発明はまた、上記本発明の判定方法において好ましく使用され得る、癌を判定するための剤を提供する。該判定するための剤は、上記した（ａ）または（ｂ）：
（ａ）アセチルＣｏＡシンセターゼ２の転写産物を特異的に検出し得る核酸プローブまたは核酸プライマー
（ｂ）アセチルＣｏＡシンセターゼ２を特異的に認識する抗体
を含有してなる。該判定するための剤が２以上の上記核酸および／または抗体を含む場合、各核酸または抗体は互いにアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の塩基配列上の異なる部分を特異的に認識、またはアセチルＣｏＡシンセターゼ２の異なるエピトープを特異的に認識し得るものである。
【００３０】
本発明の剤が前記（ａ）の核酸を含有する試薬を構成として含む場合、該核酸としては、本発明の判定方法において前記したプローブ用核酸もしくはプライマー用オリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００３１】
アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現を検出し得る核酸は、乾燥した状態もしくはアルコール沈澱の状態で、固体として提供することもできるし、水もしくは適当な緩衝液（例：ＴＥ緩衝液等）中に溶解した状態で提供することもできる。標識プローブとして用いられる場合、該核酸は予め上記のいずれかの標識物質で標識した状態で提供することもできるし、標識物質とそれぞれ別個に提供され、用時標識して用いることもできる。
あるいは、該核酸は、適当な固相に固定化された状態で提供することもできる。固相としては、例えば、ガラス、シリコン、プラスチック、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフロリド等が挙げられるが、これらに限定されない。また、固定化手段としては、予め核酸にアミノ基、アルデヒド基、ＳＨ基、ビオチンなどの官能基を導入しておき、一方、固相上にも該核酸と反応し得る官能基（例：アルデヒド基、アミノ基、ＳＨ基、ストレプトアビジンなど）を導入し、両官能基間の共有結合で固相と核酸を架橋したり、ポリアニオン性の核酸に対して、固相をポリカチオンコーティングして静電結合を利用して核酸を固定化するなどの方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
該判定するための剤に含有される核酸は、同一の方法（例：ノーザンブロット、ドットブロット、ＤＮＡアレイ技術、定量ＲＴ−ＰＣＲ等）によりアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現を検出し得るように構築されていることが特に好ましい。
【００３３】
本発明の剤が前記（ｂ）の抗体を含有する試薬を構成として含む場合、該抗体としては、本発明の判定方法において前記した抗体が挙げられる。
【００３４】
本発明の剤を構成する試薬は、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現を検出し得る核酸や抗体に加えて、該遺伝子の発現を検出するための反応において必要な他の物質であって、共存状態で保存することにより反応に悪影響を及ぼさない物質をさらに含有することができる。あるいは、該試薬は、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現を検出するための反応において必要な他の物質を含有する別個の試薬とともに提供されてもよい。例えば、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現を検出するための反応がＰＣＲの場合、当該他の物質としては、例えば、反応緩衝液、ｄＮＴＰｓ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。競合ＰＣＲやリアルタイムＰＣＲを用いる場合は、ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ核酸や蛍光試薬（上記インターカレーターや蛍光プローブ等）などをさらに含むことができる。また、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現を検出するための反応が抗原抗体反応の場合、当該他の物質としては、例えば、反応緩衝液、ｃｏｍｐｅｐｔｉｔｏｒ抗体、標識された二次抗体（例えば、一次抗体がウサギ抗ヒトアセチルＣｏＡシンセターゼ２抗体の場合、ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼ等で標識されたマウス抗ウサギＩｇＧなど）、ブロッキング液等が挙げられる。
【００３５】
本発明はまた、個体から採取した試料の、酢酸産生量を測定することを含む、該個体が癌に罹患しているか否かを判定する方法に関する。本発明の判定方法が適用できる個体および試料は、上記と同様である。
【００３６】
個体から採取した試料の酢酸産生量は、例えば、試料を培地中で培養することにより、培地中に放出された酢酸を定量することにより調べることができる。酢酸量の測定には、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ，Ｔｈｉｎ  Ｌａｙｅｒ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ，Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いるなどの公知の方法を用いて行うことができるが、市販の定量用キット（例：Ｆ−ｋｉｔ；  Ｒ−Ｂｉｏｐｈａｒｍ  ＡＧ製等）を用いて、迅速且つ簡便に酢酸量を定量することができる。
【００３７】
癌特異的酢酸代謝は、単に、癌細胞において正常細胞と比較して代謝量が変動するというだけでなく、例えば、個体から採取した癌細胞と正常細胞を低酸素条件下に置くことにより、酢酸産生量の推移に顕著な相違が認められることを特徴とする。具体的には、後述の実施例で示されるように、低酸素条件下において、癌細胞において常酸素条件下よりも酢酸産生量が増大するため、癌細胞と正常細胞との酢酸産生量の差は、低酸素条件下でより大きくなる。従って、本発明の方法において、低酸素条件下で酢酸産生量を測定することにより、より明確に個体が癌に罹患しているか否かを判定することが出来る。ここで「常酸素条件」とは、大気酸素濃度に近い条件をいう。実施例では、ＣＯ２インキュベーターを用いて作成した９５％  空気、５％  ＣＯ２（２０％  Ｏ２，  ７４％  Ｎ２，  ５％  ＣＯ２に相当）の条件を常酸素条件とした。また「低酸素条件」とは、酸素濃度が常酸素条件より低濃度である状態（例えば２０％を下まわる濃度、好ましくは、１．０−１．５％）である条件をいう。実施例では、Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｍｕｌｔｉ  Ｇａｓ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ  （Ａｓｔｅｃ）を用いて作成した１．２％  Ｏ２、９３．８％  Ｎ２、５％  ＣＯ２の条件を低酸素条件とした。
【００３８】
本発明の判定方法は、上記手法により、癌と相関して発現が変動する酢酸産生量を測定することによって、個体が癌に罹患しているか否かの判定を行う。上記の通り、癌細胞では正常細胞よりも酢酸産生量が多い。従って、酢酸産生量と個体の癌罹患率との間には正の相関関係があり、酢酸産生量が多いほど、癌である確率が高いと判定することができる。
【００３９】
例えば、癌に罹患していないことが確認されている個体（ネガティブコントロール）及び、癌に罹患していると臨床医的に判断されている個体（ポジティブコントロール）から正常細胞（組織）および癌細胞（組織）を摘出し、対象個体から摘出された癌と疑われる細胞（組織）における酢酸産生量がポジティブコントロール及びネガティブコントロールのそれと比較される。あるいは、癌における酢酸産生量と臨床的に癌であると判断される率との相関図をあらかじめ作成しておき、対象個体から摘出された癌における酢酸産生量をその相関図と比較してもよい。発現レベルの比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。
【００４０】
そして、酢酸産生量の比較結果より、測定対象の酢酸産生量が相対的に高い場合には、癌である確率が相対的に高いと判定することができる。逆に、測定対象の酢酸産生量が相対的に低い場合には、癌である確率が相対的に低いと判定することができる。
【００４１】
前述のとおり、本発明のアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子は、癌細胞と正常細胞との間で、遺伝子発現の推移に顕著な相違が認められる。したがって、これらの遺伝子は単なる癌の診断マーカーではなく、癌の有望な治療ターゲット候補でもある。
すなわち、本発明はまた、個体における、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現またはその産物の活性を抑制することによる、癌の治療方法を提供する。
【００４２】
具体的には、上記方法は、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現またはそれらの産物の活性を抑制する物質の有効量を、癌の治療を必要とする個体に投与することを含む。したがって、本発明はまた、下記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）：
（ａ）アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸
（ｂ）アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ
（ｃ）アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸またはｓｉＲＮＡを生成し得る発現ベクター
のいずれかを含有してなる、癌の治療剤を提供する。
【００４３】
（ａ）アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸
本発明における、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸とは、該ｍＲＮＡの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸であって、標的ｍＲＮＡと特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することにより、蛋白質合成を抑制する機能を有するものである。ここで「実質的に相補的である」とは、塩基配列間で約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相補性を有することをいう。１つの好ましい態様においては、本発明におけるアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸は、以下のいずれかのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである：
（１）配列番号１、３または５のいずれかで表されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列
（２）転写後プロセッシングにより前記（１）のヌクレオチド配列を生じる初期転写産物のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列
（３）１５ヌクレオチド配列以上の前記（１）または（２）の部分配列であるヌクレオチド配列
アンチセンス核酸は、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシリボヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであってもよく、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えば蛋白質（例、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、α−アノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。このような修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオシドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、またはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
【００４４】
上記の通り、アンチセンス核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。アンチセンス核酸がＤＮＡの場合、標的ＲＮＡとアンチセンスＤＮＡとによって形成されるＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドは、内在性ＲＮａｓｅ  Ｈに認識されて標的ＲＮＡの選択的な分解を引き起こすことができる。したがって、ＲＮａｓｅ  Ｈによる分解を指向するアンチセンスＤＮＡの場合、標的配列は、ｍＲＮＡ中の配列だけでなく、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の初期翻訳産物におけるイントロン領域の配列であってもよい。ヒトやマウスにおいてはアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の染色体上の位置が明らかとなっているので、該遺伝子が存在する領域のゲノム配列と、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子のｃＤＮＡ（もしくはＥＳＴ）塩基配列とをＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等のホモロジー検索プログラムを用いて比較して、イントロン配列を決定することができる。
【００４５】
本発明のアンチセンス核酸の標的領域は、該アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子産物である蛋白質への翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、これら蛋白質をコードするｍＲＮＡの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約１０塩基程度、長いものでｍＲＮＡもしくは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性、細胞内移行性の問題等を考慮すれば、約１０〜約４０塩基、特に約１５〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいが、それに限定されない。具体的には、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域または３’端ヘアピンループなどが、アンチセンス核酸の好ましい標的領域として選択しうるが、それらに限定されない。
アンチセンス核酸中の標的ｍＲＮＡとハイブリダイズする部分のヌクレオチド配列は、標的配列の塩基組成によっても異なるが、生理的条件下でアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズし得るために、標的配列の相補配列に対して通常約９０％以上（好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％）の同一性を有するものである。ヌクレオチド配列における同一性は、例えば相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ−２（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（ギャップオープン＝５；ギャップエクステンション＝２；ｘ＿ドロップオフ＝５０；期待値＝１０；フィルタリング＝ＯＮ）にて計算することができる。
【００４６】
さらに、本発明のアンチセンス核酸は、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子のｍＲＮＡや初期転写産物とハイブリダイズして蛋白質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡであるこれらの遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ＲＮＡへの転写を阻害し得るもの（アンチジーン）であってもよい。
【００４７】
アンチセンス核酸を構成するヌクレオチド分子は、天然型のＤＮＡもしくはＲＮＡでもよいが、安定性（化学的および／または対酵素）や比活性（ＲＮＡとの親和性）を向上させるために、種々の化学修飾を含むことができる。例えば、ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンス核酸を構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各ヌクレオチドの糖（リボース）の２’位の水酸基を、−ＯＲ（Ｒは、例えばＣＨ３（２’−Ｏ−Ｍｅ）、ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ等を示す）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の５位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは２位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。
【００４８】
ＲＮＡの糖部のコンフォーメーションはＣ２’−ｅｎｄｏ（Ｓ型）とＣ３’−ｅｎｄｏ（Ｎ型）の２つが支配的であり、一本鎖ＲＮＡではこの両者の平衡として存在するが、二本鎖を形成するとＮ型に固定される。したがって、標的ＲＮＡに対して強い結合能を付与するために、２’酸素と４’炭素を架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをＮ型に固定したＲＮＡ誘導体であるＢＮＡ（ＬＮＡ）（Ｉｍａｎｉｓｈｉ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  １６５３−９，  ２００２；  Ｊｅｐｓｅｎ，  Ｊ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  １４，  １３０−４６，  ２００４）やＥＮＡ（Ｍｏｒｉｔａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，  ２２，  １６１９−２１，  ２００３）もまた、好ましく用いられ得る。
【００４９】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子のｃＤＮＡ配列もしくはゲノミックＤＮＡ配列に基づいてｍＲＮＡもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。また、上記した各種修飾を含むアンチセンス核酸も、いずれも自体公知の手法により、化学的に合成することができる。
【００５０】
（ｂ）アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ
短い二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入するとそのＲＮＡに相補的なｍＲＮＡが分解される、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が動物細胞でも広く起こることが確認されて以来［Ｎａｔｕｒｅ，  ４１１（６８３６）：  ４９４−４９８  （２００１）］、リボザイムの代替技術として汎用されている。ｓｉＲＮＡは標的となるｍＲＮＡの塩基配列情報に基づいて、市販のソフトウェア（例：ＲＮＡｉ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ；  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて適宜設計することができる。
【００５１】
ｓｉＲＮＡは、代表的には、標的遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列又はその部分配列（以下、標的ヌクレオチド配列）と相補的な配列を有するＲＮＡとその相補鎖からなる二本鎖オリゴＲＮＡである。また、ヘアピンループ部分を介して、標的ヌクレオチド配列に相補的な配列（第１の配列）と、その相補配列（第２の配列）とが連結された一本鎖ＲＮＡであって、ヘアピンループ型の構造をとることにより、第１の配列が第２の配列と２本鎖構造を形成するＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ：  ｓｈＲＮＡ）もｓｉＲＮＡの好ましい態様の１つである。本発明のｓｉＲＮＡの好ましい１つの態様としては、配列番号７，９，１１および１３のいずれかに示されるヌクレオチド配列（前記配列はｓｈＲＮＡとしての配列である）を含むポリヌクレオチドが挙げられ、それぞれ、配列番号８，１０，１２および１４に記載のヌクレオチド配列をＲＮＡｉ効果のための標的配列とするものである。従って、更に好ましい本発明のｓｉＲＮＡは、配列番号８，１０，１２および１４のいずれかに示されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが挙げられる。なお、配列番号７〜１４に示されるＲＮＡ配列は便宜上、ＤＮＡとして記載している。
【００５２】
ｓｉＲＮＡに含まれる、標的ヌクレオチド配列と相補的な部分の長さは、通常、約１５塩基以上、好ましくは１８塩基以上、より好ましくは約２０塩基以上（代表的には約２１〜２３塩基長）の長さであるが、ＲＮＡ干渉を引き起こすことが出来る限り、特に限定されない。ｓｉＲＮＡが２３塩基よりも長い場合には、該ｓｉＲＮＡは細胞内で分解されて、約２０塩基前後のｓｉＲＮＡを生じるので、理論的には標的ヌクレオチド配列と相補的な部分の長さの上限は、標的遺伝子のｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡもしくは初期転写産物）のヌクレオチド配列の全長である。しかし、合成の容易さや抗原性の問題等を考慮すると、該相補部分の長さは、例えば約２００塩基以下、好ましくは約５０塩基以下、より好ましくは約３０塩基以下である。即ち、該相補部分の長さは、例えば約１５塩基以上、好ましくは約１８〜約２００塩基、より好ましくは約２０〜約５０塩基、更に好ましくは約２０〜約３０塩基である。
【００５３】
また、ｓｉＲＮＡの全長も、通常、約１８塩基以上、例えば約２０塩基以上（代表的には約２１〜２３塩基長）の長さであるが、ＲＮＡ干渉を引き起こすことが出来る限り、特に限定されず、理論的にはｓｉＲＮＡの長さの上限はない。しかし、合成の容易さや抗原性の問題等を考慮すると、ｓｉＲＮＡの長さは、例えば約２００塩基以下、好ましくは約５０塩基以下、より好ましくは約３０塩基以下である。即ち、ｓｉＲＮＡの長さは、例えば約１８塩基以上、好ましくは約１８〜約２００塩基、より好ましくは約２０〜約５０塩基、更に好ましくは約２０〜約３０塩基である。なお、ｓｈＲＮＡの長さは、二本鎖構造をとった場合の二本鎖部分の長さとして示すものとする。
【００５４】
標的ヌクレオチド配列と、ｓｉＲＮＡに含まれるそれに相補的な配列とは、完全に相補的であることが好ましい。しかし、ｓｉＲＮＡの中央から外れた位置についての塩基の変異（少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上の同一性の範囲内であり得る）については、完全にＲＮＡ干渉による切断活性がなくなるのではなく、部分的な活性が残存し得る。他方、ｓｉＲＮＡの中央部の塩基の変異は影響が大きく、ＲＮＡ干渉によるｍＲＮＡの切断活性が極度に低下し得る。
【００５５】
ｓｉＲＮＡは、５’又は３’末端に塩基対を形成しない、付加的な塩基を有していてもよい。該付加的塩基の長さは、通常５塩基以下である。該付加的塩基は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、ＤＮＡを用いるとｓｉＲＮＡの安定性を向上させることができる。このような付加的塩基の配列としては、例えばｕｇ−３’、ｕｕ−３’、ｔｇ−３’、ｔｔ−３’、ｇｇｇ−３’、ｇｕｕｕ−３’、ｇｔｔｔ−３’、ｔｔｔｔｔ−３’、ｕｕｕｕｕ−３’などの配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５６】
ｓｈＲＮＡのヘアピンループのループ部分の長さは、ＲＮＡ干渉を引き起こすことが出来る限り、特に限定されないが、通常、５〜２５塩基程度である。該ループ部分のヌクレオチド配列は、ループを形成することができ、且つ、ｓｈＲＮＡがＲＮＡ干渉を引き起こすことができる限り、特に限定されない。
【００５７】
上述のポリヌクレオチドは、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子のｍＲＮＡ配列（例えば配列番号１、３または５のいずれかで表されるヌクレオチド配列）や染色体ＤＮＡ配列に基づいて標的配列を決定し、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的なヌクレオチド配列を合成することにより調製できる。ｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせることにより調製できる。また、相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラップするように合成して、これらをアニーリングさせた後リガーゼでライゲーションすることにより、より長い二本鎖ポリヌクレオチドを調製できる。また、ｓｉＲＮＡの前駆体となるショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を合成し、これをダイサー（ｄｉｃｅｒ）を用いて切断することにより調製することもできる。
【００５８】
（ｃ）アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸またはｓｉＲＮＡを生成し得る発現ベクター
本発明の治療剤は、上述の（ａ）または（ｂ）から選択されるいずれかのポリヌクレオチドを発現し得る（コードする）発現ベクターを有効成分とすることもできる。１つの好ましい態様においては、本発明におけるアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸またはｓｉＲＮＡを生成し得る発現ベクターは、以下のいずれかのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターである；
（１）配列番号１、３または５のいずれかで表されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列
（２）転写後プロセッシングにより前記（１）のヌクレオチド配列を生じる初期転写産物のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列
（３）１５ヌクレオチド配列以上の前記（１）または（２）の部分配列であるヌクレオチド配列
（４）配列番号８，１０，１２および１４のいずれかに示されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列
当該発現ベクターにおいては、上述のポリヌクレオチド又はそれをコードする核酸（好ましくはＤＮＡ）が、投与対象である個体（好ましくはヒト）の細胞（例えば、癌細胞）内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されている。
【００５９】
使用されるプロモーターは、投与対象である個体の細胞内で機能し得るものであれば特に制限はない。プロモーターとしては、ｐｏｌＩ系プロモーター、ｐｏｌＩＩ系プロモーター、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーター等を使用することができる。具体的には、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ等のウイルスプロモーター、β−アクチン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーター、並びにｔＲＮＡプロモーター等のＲＮＡプロモーター等が用いられる。
【００６０】
ｓｉＲＮＡの発現を意図する場合には、プロモーターとしてｐｏｌＩＩＩ系プロモーターを使用することが好ましい。ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターとしては、例えば、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター等を挙げることができる。
【００６１】
本発明の発現ベクターは、好ましくは上述のポリヌクレオチド又はそれをコードする核酸の下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有することもできる。
【００６２】
本発明において発現ベクターに使用されるベクターの種類は特に制限されないが、ヒト等の哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。このうち、アデノウイルスは、遺伝子導入効率が極めて高く、非分裂細胞にも導入可能である等の利点を有する。但し、導入遺伝子の宿主染色体への組込みは極めて稀であるので、遺伝子発現は一過性で通常約４週間程度しか持続しない。治療効果の持続性を考慮すれば、比較的遺伝子導入効率が高く、非分裂細胞にも導入可能で、且つ逆位末端繰り返し配列（ＩＴＲ）を介して染色体に組み込まれ得るアデノ随伴ウイルスの使用もまた好ましい。
【００６３】
アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸の他の好ましい例としては、該ｍＲＮＡをコード領域の内部で特異的に切断し得るリボザイムが挙げられる。「リボザイム」とは、狭義には、核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡをいうが、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りＤＮＡをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイムは、ＲＮＡのみを基質とするので、ゲノムＤＮＡを攻撃することがないというさらなる利点を有する。アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子  ｍＲＮＡが自身で二本鎖構造をとる場合には、ＲＮＡヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のＲＮＡモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９８（１０）：  ５５７２−５５７７  （２００１）］。さらに、リボザイムを、それをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２９（１３）：  ２７８０−２７８８  （２００１）］。
【００６４】
アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸は、リポソーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療に適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例、ホスホリピド、コレステロールなど）などの疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端または５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端または５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
【００６５】
これらの核酸の蛋白質発現阻害活性は、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子を導入した形質転換体、生体内や生体外の遺伝子発現系、または生体内や生体外の蛋白質翻訳系を用いて調べることができる。
【００６６】
本発明におけるアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現を抑制する物質は、上記のようなアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸に限定されず、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子蛋白質の産生を直接的または間接的に阻害する限り、低分子化合物などの他の物質であってもよい。そのような物質は、例えば、後述する本発明のスクリーニング方法により取得することができる。
【００６７】
本発明において「アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子産物の活性を抑制する物質」とは、いったん機能的に産生されたアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子産物の生理機能を抑制する限り、いかなるものであってもよい。具体的には、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子産物の活性を抑制する物質として、例えば、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子産物である蛋白質に対する中和抗体が挙げられる。該抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。これらの抗体は、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
好ましい一実施態様において、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子産物に対する抗体はヒトを投与対象とする医薬品として使用されることから、該抗体（好ましくはモノクローナル抗体）はヒトに投与した場合に抗原性を示す危険性が低減された抗体、具体的には、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス−ヒトキメラ抗体などであり、特に好ましくは完全ヒト抗体である。ヒト化抗体およびキメラ抗体は、常法に従って遺伝子工学的に作製することができる。また、完全ヒト抗体は、ヒト−ヒト（もしくはマウス）ハイブリドーマより製造することも可能ではあるが、大量の抗体を安定に且つ低コストで提供するためには、ヒト抗体産生マウスやファージディスプレイ法を用いて製造することが望ましい。
【００６８】
別の好ましい態様においては、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子産物の活性を阻害する物質は、該産物に対してアンタゴニスト活性を示す低分子化合物である。そのような化合物は、例えば、後述する本発明のスクリーニング法を用いて取得することができる。
【００６９】
本発明のアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、またはアンチセンス核酸もしくはｓｉＲＮＡを生成し得る核酸（前記「本発明のアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、またはアンチセンス核酸もしくはｓｉＲＮＡを生成し得る核酸」を以下においては「本発明のアンチセンス核酸等」と略記することがある）、またはアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子産物に対する中和抗体、もしくはアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子産物に対してアンタゴニスト活性を示す低分子化合物を含有する医薬は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは他の哺乳動物（例、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。
【００７０】
本発明のアンチセンス核酸等を上記癌の治療剤などの医薬として使用する場合、自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。即ち、本発明の治療剤を、単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどの適当な哺乳動物細胞用の発現ベクターに機能可能な態様で挿入した後、常套手段に従って製剤化することができる。該核酸は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することができる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。
さらに、体内動態の改良、半減期の長期化、細胞内取り込み効率の改善を目的に、前記核酸を単独またはリポソームなどの担体とともに製剤（注射剤）化し、静脈、皮下等に投与してもよい。
【００７１】
本発明のアンチセンス核酸等、またはアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子産物に対する中和抗体、もしくはアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子産物に対してアンタゴニスト活性を示す低分子化合物を含有する医薬は、それ自体を投与してもよいし、または適当な医薬組成物として投与してもよい。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明のアンチセンス核酸等、中和抗体もしくは低分子化合物またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであってよい。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
【００７２】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明のアンチセンス核酸等、中和抗体もしくは低分子化合物またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｃａｓｔｏｒ  ｏｉｌ）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記アンチセンス核酸等、中和抗体または低分子化合物を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されてもよい。
【００７３】
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
【００７４】
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。本発明の本発明のアンチセンス核酸等、中和抗体または低分子化合物は、例えば、投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇ含有されていることが好ましい。
【００７５】
本発明の本発明のアンチセンス核酸等、中和抗体または低分子化合物を含有する上記医薬または動物薬の投与量は、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の癌患者の場合、本発明のアンチセンス核酸を１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
【００７６】
なお、前記した各組成物は、本発明の本発明のアンチセンス核酸等、中和抗体または低分子化合物との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【００７７】
上述の通り、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現またはその産物の活性を抑制することにより、癌を治療し得る可能性がある。
したがって、本発明はまた、アセチルＣｏＡシンセターゼ２発現細胞に被験物質を接触させ、該細胞における、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現を測定すること、および被験物質を接触させていない対照細胞と比較してアセチルＣｏＡシンセターゼ２の発現を抑制した物質を、癌を治療しうる物質として選択することを含む、癌を治療する物質のスクリーニング方法を提供する。
【００７８】
アセチルＣｏＡシンセターゼ２発現細胞は、該細胞自体またはそれを含む任意のもの（例、血液、組織、臓器等）であれば特に制限はない。血液、組織、臓器等は、それらを生体から単離して培養してもよいし、あるいは生体自体に被験物質を投与し、一定時間経過後にそれら生体試料を単離してもよい。
【００７９】
被験物質としては、例えば蛋白質、ペプチド、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。
【００８０】
被験物質の上記細胞との接触は、単離した細胞・組織等を用いる場合は、例えば、該細胞・組織等の培養に適した培地（例えば、約５〜２０％の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、Ｆ１２培地など）や各種緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液など）の中に被験物質を添加して、細胞を一定時間インキュベートすることにより実施することができる。添加される被験物質の濃度は化合物の種類（溶解度、毒性等）により異なるが、例えば、約０．１ｎＭ〜約１００ｎＭの範囲で適宜選択される。インキュベート時間としては、例えば、約１０分〜約２４時間が挙げられる。
【００８１】
アセチルＣｏＡシンセターゼ２発現細胞におけるアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現量は、前記した本発明の検査用キットに含まれる試薬を用いるなどして、本発明の検査方法と同様にして測定することができる。
【００８２】
例えば、上記スクリーニング法において、被験物質の存在下におけるアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現量（ｍＲＮＡ量または蛋白質量）が、被験物質の非存在下における発現量に比べて、有意に阻害された場合、該被験物質を癌治療効果を有する物質の候補として選択することができる。
【００８３】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現抑制物質（遊離体であっても塩の形態であってもよい）を、癌を発症した個体に投与して、その症状の改善の有無を調べることにより、実際の癌治療効果の有無を確認することができる。
【００８４】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる物質を癌の治療剤として使用する場合、上記アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現もしくはその産物の活性を抑制するいずれかの物質と同様に製剤化することができ、同様の投与経路および投与量で、ヒトまたは他の哺乳動物に対して、経口的にまたは非経口的に投与することができる。
【００８５】
本発明はまた、アセチルＣｏＡシンセターゼ２発現細胞に被験物質を接触させ、該細胞における、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子産物の活性を測定すること、および被験物質を接触させていない対照細胞と比較してアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子産物の活性を抑制した物質を、癌を治療しうる物質として選択することを含む、癌を治療する物質のスクリーニング方法を提供する。本方法において用いられる細胞、被験物質の種類、被験物質と細胞との接触の態様などは、上記したアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現を指標とする方法と同様である。
【００８６】
上記のスクリーニング方法におけるアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子産物の活性の測定は、各蛋白質に応じて自体公知の方法を適宜選択して実施することができる。例えば、遺伝子産物と相互作用してその生理活性を発揮させる物質（例、リガンド）が公知である場合、標識した該物質の共存下、固相化したアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子産物に被験物質を接触させ、固液分離した後、固相に結合した標識量を測定することにより、該リガンド物質と競合的に該遺伝子産物に結合する物質（例、アゴニスト、アンタゴニスト）や、該遺伝子産物と該リガンド物質との結合性を変化させる物質を選択することができる。該遺伝子産物の生理活性（例、酵素活性など）を同時に測定することにより、該リガンド物質と競合的に該遺伝子産物に結合する物質がアゴニストであるかアンタゴニストであるかを同定することができる。
【００８７】
例えば、上記のスクリーニング方法において、被験物質の存在下におけるアセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子産物の活性が、被験物質の非存在下における活性に比べて、有意に阻害された場合に、該被験物質を、癌治療効果を有する物質の候補として選択することができる。
【００８８】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる、アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の活性抑制物質（遊離体であっても塩の形態であってもよい）は、癌を発症した個体に投与して、その症状の改善の有無を調べることにより、実際の癌治療効果の有無を確認することができる。
【００８９】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる物質を癌の治療剤として使用する場合、上記アセチルＣｏＡシンセターゼ２遺伝子の発現もしくはその産物の活性を抑制するいずれかの物質と同様に製剤化することができ、同様の投与経路および投与量で、ヒトまたは他の哺乳動物に対して、経口的にまたは非経口的に投与することができる。
【００９０】
本発明のアセチルＣｏＡシンセターゼ２はまた、一般に酢酸を細胞内に固定する酵素として知られる一方、ＡＴＰ＋ａｃｅｔａｔｅ＋ＣｏＡ⇔ＡＭＰ＋ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ＋ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡという可逆反応を触媒することから、癌において正常細胞と比較して、酢酸の取り込み量が増大する。そこで本発明はまた、個体の細胞が取り込む放射性標識された酢酸量を測定することを含む、癌の判定方法に関する。
【００９１】
本発明の判定方法の対象となる個体は、特に制限されないが、例えば、癌に罹患しているおそれがある個体、もしくは罹患していることが疑われる個体、あるいは現に癌に罹患している個体、例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ等の哺乳動物が挙げられる。好ましくは、ヒトである。
【００９２】
本発明の判定方法に用いられる細胞としては、癌に罹患しているおそれがある個体、もしくは罹患していることが疑われる個体、あるいは現に癌に罹患している個体の癌細胞または癌細胞を含む組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織、骨格筋またはそれらの細胞などが挙げられる。また、それらの細胞は、個体から採取されても、そのまま生体内に残っていてもよく、即ち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで本発明の方法が適用されてもよい。本発明の判定方法が適用できる癌は特に限定されないが、例えば肺癌、皮膚癌、大腸癌および乳癌が挙げられ、好ましく適用できる。
【００９３】
放射性標識される酢酸中の放射性同位元素としては、例えば、［３Ｈ］、［１８Ｏ］、［１１Ｃ］、［１４Ｃ］などが用いられるが、好ましくは、［１１Ｃ］、［１４Ｃ］が挙げられる。また、［１８Ｆ］で標識した［１８Ｆ］フルオロ酢酸も用いられる。
【００９４】
本発明の判定方法としては、陽電子放出断層写真法（ＰＥＴ）、単一光子放出計算断層写真法（ＳＰＥＣＴ）、陽電子を放出しない核種（［３Ｈ］,［１４Ｃ］等）の場合、液体シンチレーションカウンター・γカウンターが挙げられるが、酸素や炭素といった身体を構成している元素を標識した放射性薬剤を用いるため、生理学的生化学的機能を反映することができる点から、好ましくは陽電子放出断層写真法（ＰＥＴ）が挙げられる。
【００９５】
本発明の判定方法は、上記手法により、癌と相関して発現が変動する細胞の酢酸の取り込み量を測定することによって、個体が癌に罹患しているか否かの判定を行う。後述の実施例に示すように、癌細胞では正常細胞よりも酢酸の取り込みレベルが高い。従って、上記判定は、酢酸の取り込みレベルと個体の癌罹患率との間には正の相関関係があり、酢酸の取り込みレベルが高いほど、癌である確率が高いと判定することができる。
【００９６】
例えば、癌に罹患した、または癌であることを疑われるヒトに、放射性標識された酢酸を投与する。陽電子放出断層写真法（ＰＥＴ）により、特定の箇所における酢酸の取り込みレベルが周囲の正常細胞（組織）と比較し、映像等に出力された結果から癌であるか否かを判定することができる。取り込みレベルの比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。
【００９７】
そして、酢酸の取り込みレベルの比較結果より、測定対象の酢酸の取り込みレベルが相対的に高い場合には、癌である確率が相対的に高いと判定することができる。逆に、測定対象の酢酸の取り込みレベルが相対的に低い（周辺の正常組織と同程度のレベルである）場合には、癌である確率が相対的に低いと判定することができる。
【００９８】
本発明はまた、上記本発明の判定方法において好ましく使用され得る、放射性標識された酢酸を含む、癌細胞検出用試薬を提供する。
該試薬は、放射性標識された酢酸に加えて、該酢酸を検出するための反応において必要な他の物質であって、共存状態で保存することにより反応に悪影響を及ぼさない物質をさらに含有することができる。例えば、医薬用の担体として、アスコルビン酸等の安定化剤、酸、塩基等のｐＨ調整剤、リン酸緩衝液等の緩衝剤、または生理食塩液等の等張剤等を利用することができる。あるいは、該試薬は、該酢酸を検出するための反応において必要な他の物質を含有する別個の試薬とともに提供されてもよい。
【００９９】
本発明の検出試薬は、静脈注射による投与が最適であるが、その他一般的な非経口的手段（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）によって投与が可能である。その投与量は、患者の体重、年齢、性別及び検出装置に代表される測定機器等の諸条件によって適宜決められる。一般的に、成人患者の場合、放射能として１０ＭＢｑ〜２５ＭＢｑ、好ましくは１５ＭＢｑ〜２０ＭＢｑの範囲である。
【０１００】
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【０１０１】
実施例１  癌細胞の代謝特性
マウス由来癌細胞（ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ，  ＬＬＣ１（ＬＬＣ）；  ｍｅｌａｎｏｍａ，  Ｂ１６；  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ，  Ｃｏｌｏｎ−２６（Ｃｏｌｏｎ）；  ｍａｍｍａｒｙ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ，  Ｃ１２７Ｉ）およびコントロールとして正常細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ，  ＢＡＬＢ／３Ｔ３  ｃｌｏｎｅ  Ａ３１（３Ｔ３））を用いて、その代謝産物の測定を行った。まず、２４−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅを用い、１ｗｅｌｌあたり５×１０４細胞を１ｍＬのＤｕｌｂｅｄｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ（ＤＭＥ）培地（１０％  Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ，  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ添加）中、常酸素条件下（ＣＯ２培養庫，  ５％  ＣＯ２  ｉｎ  ａｉｒ，  ３７℃）で、２４ｈ前培養した。その後、新たなＤＭＥ培地に入れ替え、常酸素条件下および低酸素条件下（Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｍｕｌｔｉ  Ｇａｓ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ［Ａｓｔｅｃ］，  １．２％  Ｏ２，  ９３．８％  Ｎ２，  ａｎｄ  ５％  ＣＯ２）で２４ｈ培養した。培養培地を回収し、イオンクロマトグラフィー法［ｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）；  ＩＣＳｅｐ  ＩＯＮ−３００  ｉｏｎ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ（３００×７．８ｍｍ  ｉ．ｄ．，  Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）；  ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ  ０．４ｍＬ／ｍｉｎ；  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ７０℃；  ｅｌｕｅｎｔ  ０．００８５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４；  ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）２１０ｎｍ］を用い、有機酸や糖の含有をおおまかに確認した後、Ｆ−ｋｉｔ（Ｒ−Ｂｉｏｐｈａｒｍ  ＡＧ）を用いて、代謝物の定量解析を行った。
結果を図１に示す。癌細胞は、正常細胞に比べ、多く酢酸を産生することが明らかになった。また、癌細胞は、低酸素条件下におかれると、さらに多くの酢酸を産生することが示された。一方、正常細胞は、低酸素条件下でほとんど酢酸を産生しなかった。
【０１０２】
実施例２  癌細胞の遺伝子発現解析
実施例１の手順と同様に、常酸素条件下および低酸素条件下で培養した細胞（ＬＬＣ，  Ｂ１６，  Ｃｏｌｏｎ，  Ｃ１２７Ｉ，  ３Ｔ３）（１−６×１０６  ｃｅｌｌｓ）を回収し、Ｍｉｃｒｏ−ｔｏ−Ｍｉｄｉ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてＲＮＡの精製を行った。これを用い、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて遺伝子の発現解析を行った。解析には、ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ＣＴ  ｍｅｔｈｏｄ  を用い、内部標準にはβ−ａｃｔｉｎを用いた。また、反応は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行い、反応試薬にはＴａｑｍａｎ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｒｅａｇｅｎｔｓおよびＴａｑｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。
結果を図２に示す。様々な酢酸代謝に関係が予想される酵素の遺伝子発現を調べたところ、細胞質性のａｃｅｔｙｌ−ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ（ＣｏＡ）  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ２は癌細胞では高発現で、さらに低酸素下で発現が向上することが明らかとなった。その発現パターンは、酢酸産生のパターンと類似していた。
【０１０３】
実施例３  癌細胞の酢酸産生におけるＡｃｓｓ２の役割
癌細胞（ＬＬＣ，  Ｂ１６，  Ｃｏｌｏｎ，  Ｃ１２７Ｉ）においてＡｃｓｓ２が酢酸産生に寄与しているのか調べる目的で、Ａｃｓｓ２の抑制実験を行った。まず、細胞内で安定なＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を起こさせるために、Ｍｉｓｓｉｏｎ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＳＨＶＲＳ−ＮＭ  ０１９８１１；  Ｓｉｇｍａ）を用いて遺伝子導入を行い、Ａｃｓｓ２ノックダウン癌細胞株を作成した。Ａｃｓｓ２に対するｓｈＲＮＡとしては、配列表７，９，１１および１３に記載の配列からなるｓｈＲＮＡを用いた。また、コントロールにはＮｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｈＲＮＡ（ＳＨＣ００２Ｖ，  Ｓｉｇｍａ）を用いた。Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを用い、安定導入癌細胞をｓｅｌｅｃｔｉｏｎした。リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ法を用いてＡｃｓｓ２の遺伝子発現の抑制を確認した。各ｓｈＲＮＡは、いずれもＡｃｓｓ２に対する抑制効果を示したが、細胞種によって、抑制効果が異なった。具体的には、ＬＬＣは配列番号９、Ｂ１６は配列番号１１、Ｃｏｌｏｎは配列番号１３、Ｃ１２７Ｉは配列番号７に記載の配列からなるｓｈＲＮＡに高い抑制効果が見られた。こうして得られたＲＮＡｉ細胞株について、実施例１の方法に従い、酢酸産生を調べた。
結果を図３に示す。Ａｃｓｓ２をノックダウンされた全ての癌細胞株では、Ａｃｓｓ２の遺伝子発現が抑制され、それに伴い酢酸産生が減少することが明らかとなった。Ａｃｓｓ２は、一般に酢酸を細胞内に固定する酵素であると考えられてきたが、酵素学的には、［ＡＴＰ＋ａｃｅｔａｔｅ＋ＣｏＡ⇔ＡＭＰ＋ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ＋ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ］という可逆反応を触媒することも報告されている。本実施例から、癌細胞において、ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡをａｃｅｔａｔｅに変換するＡｃｓｓ２の逆反応、つまり酢酸エネルギー産生反応が見られることが明らかとなった。
【０１０４】
実施例４  癌細胞の低酸素生存におけるＡｃｓｓ２の役割−Ａｃｓｓ２  ＲＮＡｉの癌低酸素生存抑制効果−
実施例３において作成したＲＮＡｉ細胞株を用い、低酸素生存に関わるＡｃｓｓ２の役割を検討した。まず、２４−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅを用い、１ｗｅｌｌあたり５×１０４細胞を１ｍＬ  ＤＭＥ培地中に播き、２４ｈ常酸素条件下で培養した。その後、培地を交換し、低酸素条件に移した（０ｄａｙ）。その後、１日おきにあらかじめ低酸素処理したＤＭＥ培地に交換し、７日間培養を行った。細胞は、１日おきにｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ  ｄｙｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄにより細胞数を計測した。また、細胞の形態および生死を確認する目的でｔｗｏ−ｃｏｌｏｕｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｅｌｌ−ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙを行った（ＴｏｘＣｏｕｎｔ，  Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ）。
結果を図４に示す。Ａｃｓｓ２  ＲＮＡｉ細胞株では、コントロールＲＮＡｉ株に比べて低酸素生存期間が短縮した。このことは、Ａｃｓｓ２による酢酸代謝が、癌細胞の低酸素生存に有利に働いていることを示す。また、Ａｃｓｓ２の遺伝子ノックダウンが癌の低酸素生存に対し抑制効果があることを示している。なお、常酸素条件で培養した際は、細胞増殖に大きな違いは見られなかった。
【０１０５】
実施例５  Ａｃｓｓ２の腫瘍増殖における役割−Ａｃｓｓ２  ＲＮＡｉの腫瘍増殖抑制効果−
実施例３において作成したＲＮＡｉ癌細胞株をヌードマウスに植える移植実験を行った。実験には６週齢ＢＡＬＢ／ｃ  Ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕ  ｍａｌｅ  ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ（Ｊａｐａｎ  ＳＬＣ）を用いた。マウス大腿部皮下にＰＢＳに懸濁したＲＮＡｉ癌細胞［８×１０６（Ｃｏｌｏｎ）または１×１０７（ＬＬＣ，  Ｂ１６，  Ｃ１２７Ｉ）］をそれぞれ移植した。腫瘍サイズは３日おきに１２日間測定した。腫瘍体積（ｍｍ３）は（長径）×（短径）２×（６／π）として求めた。なお、動物実験は、福井大学動物実験指針に従って行った。
結果を図５に示す。調べた全ての細胞株で、Ａｃｓｓ２  ＲＮＡｉ細胞の腫瘍増殖は、Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＲＮＡｉ細胞よりも遅かった。このことは、Ａｃｓｓ２による酢酸代謝が腫瘍増殖に重要であることを示している。また、Ａｃｓｓ２の遺伝子抑制が腫瘍増殖抑制に効果があることを示している。
【０１０６】
実施例６  Ａｃｓｓ２の酢酸トレーサー取り込みへの寄与
実施例３の結果から、癌細胞においてＡｃｓｓ２が高発現し、その可逆性を利用した特異的な酢酸代謝経路が存在することが明らかになった。このことは、Ａｃｓｓ２が正反応と逆反応の動的平衡を制御する可逆的酵素であることを意味する。こうしたことから、発明者らは、放射性酢酸トレーサーの取り込みをみることで、癌細胞におけるＡｃｓｓ２の発現の亢進をモニターできるのではないかと考えた。そこで、［１４Ｃ］酢酸の癌細胞への取り込みとそれに対するＡｃｓｓ２の寄与について検討した。まず、細胞を２４−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播き、２４ｈ前培養した。このとき、増殖速度を考慮し、１ｗｅｌｌあたりＬＬＣ，Ｂ１６，Ｃｏｌｏｎは５×１０４細胞、Ｃ１２７Ｉは８×１０４細胞、３Ｔ３は１×１０５細胞とした。ＲＮＡｉ細胞は、１×１０５細胞播種した。細胞は、３７ｋＢｑ［１４Ｃ］酢酸添加ＤＭＥ培地に交換後１ｈ常酸素下で培養した。一方、低酸素条件下の実験では、前培養後にさらに２ｈまたは６ｈ低酸素処理を施した後、３７ｋＢｑ［１４Ｃ］酢酸添加培地に交換後、１ｈ低酸素下で培養した。その後、それぞれにつき培地を除去し、氷冷したＰＢＳで２回洗った後、０．５ｍｌ  ０．２Ｎ  ＮａＯＨを加え、２ｈ室温で細胞を溶解させた。これに９．５ｍＬ  ＡＣＳＩＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を加え、液体シンチレーションカウンター（ＬＳＣ−５０００，  Ａｌｏｋａ）を用いて放射能を測定した。
その結果、放射性酢酸トレーサーの取り込みパターンは、Ａｃｓｓ２の発現パターンとほぼ一致していた（図６）。また、Ａｃｓｓ２  ＲＮＡｉ細胞では、放射性酢酸トレーサーの取り込みが減少していた（図７，８）。このことから、Ａｃｓｓ２は放射性酢酸トレーサーの取り込みにも関与することが明らかとなった。これは、放射性酢酸トレーサーを用いることで、Ａｃｓｓ２の発現および癌特異的酢酸代謝の活性をモニターすることができることを意味している。放射性トレーサーは、一般に微量な集積でも検出が可能である。そのため、放射性トレーサーは、癌特異的酢酸代謝の検出・画像化に有用である。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明の判定方法は、迅速簡便な癌診断、特に、低酸素条件で容易に判断できる癌診断のための判定方法として、また、癌の治療に対する治療効果のモニタリング手段として有用である。また、本発明のＡｃｓｓ２遺伝子の発現／その産物の活性抑制物質は、癌治療薬の有望な候補となり得る。さらに、本発明のスクリーニング方法は、新規な癌治療薬の探索に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】マウス由来各種癌細胞および正常細胞を用いて、常酸素および低酸素条件下において、培地中の酢酸量をイオンクロマトグラフィーにより定量解析した図である。
【図２】マウス由来各種癌細胞および正常細胞を用いて、常酸素および低酸素条件下において、酢酸代謝に関係が予想される各種遺伝子の発現量をリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ法により定量解析した図である。図中、左のカラムからそれぞれ、Ａｃｓｓ２、Ａｃｏｔ、Ａｌｄｈに対応する。Ａｃｓｓ２，  アセチルＣｏＡシンセターゼ２；Ａｃｏｔ，  アルデヒドデヒドロゲナーゼ；Ａｌｄｈ，  アセチルＣｏＡヒドラーゼ
【図３】マウス由来各種癌細胞のＡｃｓｓ２ノックダウン細胞株を用いて、Ａｃｓｓ２遺伝子の発現量をリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ法、および培地中の酢酸産生量をイオンクロマトグラフィーにより定量解析した図である。図中、左カラムがＣｏｎｔｒｏｌ  ＲＮＡｉ、右カラムがＡｃｓｓ２  ＲＮＡｉに対応する。＊  Ｐ＜０．０１；  ＊＊  Ｐ＜０．００５；  ＊＊＊  Ｐ＜０．００１
【図４】ａ）マウス由来各種癌細胞のＡｃｓｓ２ノックダウン細胞株を用いて、低酸素条件下において、生存細胞数を１日おきに計測した結果を表す図である。＊  Ｐ＜０．００５；  ＊＊  Ｐ＜０．００１；  ↓  形態観察を実施した時期  ｂ）ａ）の細胞の形態観察および生死を確認するためにｔｗｏ−ｃｏｌｏｕｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｅｌｌ−ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙを行った結果の図である。
【図５】マウス由来各種癌細胞のＡｃｓｓ２ノックダウン細胞株をＢＡＬＢ／ｃ  Ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕ  ｍａｌｅ  ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅに移植し、３日おきに腫瘍サイズを測定した結果を示す図である。＊  Ｐ＜０．０３；  ＊＊  Ｐ＜０．０２；  ＊＊＊  Ｐ＜０．０１
【図６】マウス由来各種癌細胞および正常細胞を用いて、常酸素および低酸素条件下において、３７ｋＢｑ［１４Ｃ］酢酸の取り込みを液体シンチレーションカウンターにより測定した図である。＊  Ｐ＜０．０２；  ＊＊  Ｐ＜０．０１；  ＊＊＊  Ｐ＜０．００１  ｖｓ  ３Ｔ３  Ｎｏｒｍｏｘｉａ
【図７】マウス由来各種癌細胞（ＬＬＣ，  Ｂ１６）のＡｃｓｓ２ノックダウン細胞株を用いて、常酸素および低酸素条件下において、３７ｋＢｑ［１４Ｃ］酢酸の取り込みを液体シンチレーションカウンターにより測定した図である。＊  Ｐ＜０．０１；  ＊＊  Ｐ＜０．００１；  ＊＊＊  Ｐ＜０．０００１
【図８】マウス由来各種癌細胞（Ｃｏｌｏｎ，  Ｃ１２７Ｉ）のＡｃｓｓ２ノックダウン細胞株を用いて、常酸素および低酸素条件下において、３７ｋＢｑ［１４Ｃ］酢酸の取り込みを液体シンチレーションカウンターにより測定した図である。＊  Ｐ＜０．０１；  ＊＊  Ｐ＜０．００１；  ＊＊＊  Ｐ＜０．０００１
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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