(57)【要約】【課題】食習慣があり安全である植物由来成分を有効成分として、副作用が少なく、長期投与可能な破骨細胞分化抑制剤を提供することを目的とする。【解決手段】クズ（葛；Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｌｏｂａｔａ）の葉自体またはその抽出物を有効成分として含有することを特徴とする破骨細胞分化抑制剤、ならびにそれらを配合してなる破骨細胞分化異常促進に伴う疾患である関節リウマチ、骨粗鬆症などの予防および治療用医薬品または飲食品などを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クズ（Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｌｏｂａｔａ）葉またはその抽出物を有効成分として含有することを特徴とする破骨細胞分化抑制剤。
【請求項２】
クズ葉が細断物または粉末状物である請求項１記載の破骨細胞分化抑制剤。
【請求項３】
前記抽出物が抽出エキスあるいは粉末状物である請求項１記載の破骨細胞分化抑制剤。
【請求項４】
前記抽出物が、水、炭素数１〜４のアルコール類、ケトン類、酢酸エステル類、エーテル類および炭化水素類からなる群より選択される１種以上の抽出溶媒を用いて調製されることを特徴とする請求項１または３記載の破骨細胞分化抑制剤。
【請求項５】
前記抽出溶媒が、水、エタノール、または水とエタノールとの混合溶媒である請求項４記載の破骨細胞抑制剤。
【請求項６】
慢性関節リウマチ、骨粗鬆症、高カルシウム血症、ベーチェット病、薬物性骨代謝異常症および歯周病の予防・治療剤である請求項１記載の破骨細胞分化抑制剤。
【請求項７】
請求項１〜６いずれか１項記載の破骨細胞分化抑制剤を配合してなる医薬品。
【請求項８】
請求項１〜６いずれか１項記載の破骨細胞分化抑制剤を配合してなる飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クズ（葛；Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｌｏｂａｔａ）葉またはその抽出物を有効成分として含有することを特徴とする破骨細胞分化抑制剤、ならびにそれらを配合してなる関節リウマチ、高カルシウム血症、ベーチェット病、薬物性骨代謝異常症、歯周病及び骨粗鬆症の予防・治療用医薬品または飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
破骨細胞は、骨髄細胞から分化して生成する細胞であり、乳がんなどのがん細胞の骨転移、関節リウマチあるいは骨粗鬆症など、数多くの疾患に関わっていることが知られている。従って、骨髄細胞から破骨細胞への分化を抑制することができれば、前述した疾患に対して、優れた治療効果を挙げることができると考えられる。破骨細胞分化異常促進に伴う疾患である関節リウマチ、骨粗鬆症は、現在種々の薬物療法にて治療されているが、それは長期間の治療を要するのは事実である。従って、薬物療法をサポートするものとして、副作用が少なく安全性が高く、日常的に摂取可能で、関節リウマチや骨粗鬆症等のように長期的治療を要する症状を予防し、その進展を抑制し、さらには改善作用を有するような機能性食品も望まれている。
【０００３】
近年、予防的な観点から、ヒトの健康状態や食品機能を科学的に研究する機能性食品、特にその有効成分の研究が盛んになされている。クズの根および多年生茎にはイソフラボノイドが多く含まれており、その骨粗鬆症予防・治療用途につて報告されている（特許文献１、２、非特許文献１）。クズ葉についても、特許公報にて、イソフラボノイド類が含まれていることが報告されているが、その含量はクズ根や多年生茎と比較すると遥かに少ない量しか含まれておらず、さらにクズ葉またはその抽出物に関する生理活性については、全く試験例が示されていない（特許文献２、３）。一方では、クズ葉抽出物のアンジオテンシン変換機能抑制作用も報告されている（特許文献４）。
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−９５９７１号公報
【特許文献２】国際公開第２００５／１０５１２５号パンフレット
【特許文献３】特開２００５−１４３３６７号公報
【特許文献４】特公平７−１０００１６号公報
【非特許文献１】メタボリズム（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）、５４巻、１５３６−４１頁、２００５年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
クズ葉は、各種のビタミン、ミネラルとともに葉緑素が豊富に含まれ貧血等の改善に効果があると言われ、また抗酸化作用や上記のごとくアンジオテンシン変換機能抑制作用も報告されているが、一方では、若葉は茹でたり炒めることで人間の食用としても利用されている。更に葉は、良質の植物性たんぱく質を多く含んでいるが、上記のごとくイソフラボン含量は非常に少ないことが報告されている。本発明は、クズ葉またはその抽出物の新たな機能性を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、クズ葉またはその抽出物は、イソフラボン含量が非常に少ないにも拘わらず、以外にも強い破骨細胞分化抑制作用を見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）クズ（Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｌｏｂａｔａ）葉またはその抽出物を有効成分として含有することを特徴とする破骨細胞分化抑制剤、
（２）クズ葉が細断物または粉末状物である（１）記載の破骨細胞分化抑制剤、
（３）前記抽出物が抽出エキスあるいは粉末状物である（１）記載の破骨細胞分化抑制剤、
（４）前記抽出物が、水、アルコール類、ケトン類、酢酸エステル類、エーテル類および炭化水素類からなる群より選択される１種以上の抽出溶媒を用いて調製されることを特徴とする（１）または（３）記載の破骨細胞分化抑制剤、
（５）前記抽出溶媒が、水、エタノール、または水とエタノールとの混合溶媒である（４）記載の破骨細胞抑制剤、
（６）骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、高カルシウム血症、ベーチェット病、薬物性骨代謝異常症および歯周病の予防・治療剤である（１）記載の破骨細胞分化抑制剤、
（７）（１）〜（６）いずれかに記載の破骨細胞分化抑制剤を配合してなる医薬品、
（８）（１）〜（６）いずれかに記載の破骨細胞分化抑制剤を配合してなる飲食品、
などを提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、クズ葉またはその抽出物を有効成分として含有することを特徴とする破骨細胞分化抑制剤、ならびにそれらを配合してなる関節リウマチ、高カルシウム血症、ベーチェット病、薬物性骨代謝異常症、歯周病及び骨粗鬆症の予防・治療用医薬品および飲食品を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下において、本発明を詳細に説明する。本発明において、クズ（葛；Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｌｏｂａｔａ）の葉は、採取した葉を水洗し必要により乾燥したものを、細断または粉砕した細断物あるいは粉末状物のものが用いられる。本発明に用いられるクズ葉は、６月から１０月の緑色状態のものが好ましく、葉柄部分が含まれていてもよい。また、クズ葉抽出物としては、クズ葉の細断物あるいは粉末状物を水や有機溶媒、あるいはその混合物にて抽出したもの、あるいはその抽出液を濃縮して得られた濃縮物（エキス）、あるいはその濃縮物を真空乾燥、スプレー乾燥、凍結乾燥をして粉末化したものなどが用いられる。更には、クズ葉の抽出物を活性炭による脱色操作、異なる溶媒抽出操作やクロマトグラフィー操作等にて、精製されたクズ葉成分も用いられる。
【００１０】
クズ葉の乾燥法としては、自然乾燥をはじめ、熱風乾燥法、凍結乾燥法、マイクロ波乾燥法ならびに遠赤外・近赤外乾燥法等が用いられる。
【００１１】
細断あるいは粉砕は、破砕機、ミキサーをはじめとする任意の装置を用いた任意の方法ですることが出来る。また、破砕物は、ペースト、固体、粒状物、紛体、液体状（溶液、懸濁液など任意の状態を含む）など任意の形状であることができる。
【００１２】
クズ葉からの有効成分抽出手段として、溶媒抽出法と超臨界抽出法が用いられる。超臨界抽出法としては、通常、超臨界状態の二酸化炭素を使用してクズ葉から抽出することができる。
【００１３】
一方、溶媒抽出法に用いられる溶媒としては、水、ならびにアルコール類、ケトン類、酢酸エステル類、エーテル類および炭化水素類等の有機溶媒が用いられる。アルコール類としては、炭素数１〜４のアルコール類が好ましく、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールおよびイソブタノール等が好ましい。ケトン類としては、アセトン、メチルエチルケトンが好ましく、酢酸エステル類としては、酢酸メチル、酢酸エチルが好ましく、エーテル類としては、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテルが好ましく、炭化水素類としては、ヘキサン、トルエンが好ましい。これら溶媒は、単独でも２種類以上を混合して用いても良い。特に水およびエタノールを単独あるいはこれらを任意の比率で混合した混合溶媒系が安全性の点で好ましい。
【００１４】
抽出条件は任意に定めることができる。例えばクズ葉粉砕物を３〜１００倍程度の抽出溶媒に常温又は加熱下に１〜２４時間浸漬することにより抽出を行うことができる。抽出液は、ろ過または遠心分離により固形物を除去した後、そのまま使用しても良いが、公知の適当な方法で抽出溶媒を留去し、抽出エキスとして使用しても良く、または減圧乾燥あるいは凍結乾燥により粉末状物として得ることができる。
【００１５】
本発明のクズ葉または抽出物は、そのままの形で摂取することは可能であるが、各種飲食品に添加してあるいは医薬組成物として使用することができる。飲食品として用いる場合は、菓子類、冷菓類、パン類、麺類の固形食品あるいはジュースや健康茶等の飲料品に添加して使用することができ、または粉末状、顆粒状、カプセル状および錠剤などの形状の食品としても使用することができる。なお、各種飲食品に添加する場合、クズ葉を用いても良い。即ち、クズ葉をそのまま用いても良いが、細断あるいは粉末化したもの、ペースト状化したもの、ホモジナイズ化して不溶物をろ過したろ液、またはそのろ液を濃縮したもの等種々の形態のものが用いられる。医薬品として用いる場合は、その剤形は特に限定されず、例えば、カプセル状、粉末状、顆粒状および錠剤などの医薬品・医薬部外品等の組成物として用いることができる。製剤化においては、薬剤学的に許容される他の製剤素材、例えば、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、酸化防止剤、着色剤、安定化剤などを適宜添加して調製することができる。
【００１６】
本発明の破骨細胞分化抑制作用を示すクズ葉の活性成分に関して、本発明者らは、クズ葉エタノール抽出物をカラムクロマトグラフィーにて分離精製したところ、活性成分の例としてルチン、ケルセチン３−Ｏ−ロビノビオサイドおよびロビニン等のフラボノール類が比較的多量含有されていることを見出した。一方、イソフラボノイドは、フラボノール類と比較して非常に少ない量しか含まれていないことが判明した。クズ葉抽出物の有効成分はフラボノール類に限定するものではないが、ルチンやケルセチン等は破骨細胞分化抑制作用を有することが報告されている（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．  ３１９，３８３−９３（２００５））。なお、クズ葉抽出物には、ルチン、ケルセチン３−Ｏ−ロビノビオサイドおよびロビニンなどのフラボノール類が抽出物の約１０％（ｗ／ｗ）程度含有されていることを確認しているが、クズ葉の活性成分は、これらのフラボノール類に限定されず、フラボノール類以外に強い破骨細胞分化抑制作用を示す化合物が含まれていることが、破骨細胞抑制効果試験結果から推定される。
【００１７】
本発明のクズ葉またはその抽出物は強い破骨細胞分化抑制作用を示すが、この作用はインビトロで破骨細胞活性に対する直接作用を調べることにより容易に確認することができ、例えば特開２００７−２６９６８１号公報および本明細書の実施例に具体的に説明された方法に従って確認することができる。また、このような破骨細胞分化抑制作用を示すものの多くは、慢性関節リウマチ、高カルシウム血症、ベーチェット病、薬物性骨代謝異常症、歯周病及び骨粗鬆症などの予防・治療剤として使われることは良く知られている（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７１（６），８１８−２６（２００６））。
【００１８】
本発明のクズ葉またはその抽出物を治療目的あるいは予防的目的の医薬として用いる場合の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的および投与される患者の年齢、体重、症状によって異なるが、成人１日当たり好ましくは０．０１〜２０００ｍｇ／ｋｇ体重（乾燥重量）であり、より好ましくは０．１〜２００ｍｇ／ｋｇ体重（乾燥重量）である。
【００１９】
一方、クズ葉またはその抽出物を飲食品として用いる場合の有効成分の摂取量は、好ましくは０・００５〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重（乾燥重量）、より好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重（乾燥重量）である。
【実施例】
【００２０】
以下に、本発明を実施例に基づいて説明する。本発明は以下の実施例によってなんら限定されるものではなく、本発明の属する技術分野における通常の変更を加えて実施することが出来ることは言うまでもない。
【００２１】
実施例１（サンプルの調製）
収穫後、−８０℃で冷凍保存しておいたクズの葉をバイオメティカル社製のシェイクマスターで破砕した後、１００ｇずつ秤量（５検体）し、それぞれの検体に水、２５％エタノール水溶液（ｖ／ｖ）、５０％エタノール水溶液（ｖ／ｖ）、７５％エタノール水溶液（ｖ／ｖ）、エタノール各５００ｍＬを加えて撹拌後、１Ｌのメディウム瓶に移し、フタを締め、遮光下インキュベーターで１５０ｒｐｍ、２５℃で約１５時間撹拌抽出した。撹拌後、抽出液をろ過し、エタノール抽出液の場合は、ろ液を減圧下濃縮乾固した後減圧乾燥し、水、２５％、５０％、７５％エタノール抽出液の場合は、減圧濃縮後凍結乾燥すると、水抽出物は茶褐色粉末として６．４ｇ、２５％エタノール抽出物は黄褐色粉末として５．２ｇ、５０％エタノール抽出物は暗緑色アメ状として５．２ｇ、７５％エタノール抽出物は濃緑色アメ状として５．２ｇおよびエタノール抽出物は濃緑色アメ状として５．５ｇ得られた。
【００２２】
実施例２（破骨細胞分化抑制効果試験）
（１）試験方法
骨芽細胞様株化細胞であるＵＡＭＳ−３２細胞とマウス由来骨髄細胞の共存培養法を用いた。即ち、サンプルの破骨細胞分化抑制活性は破骨細胞（ＴＲＡＰ染色陽性）の形成した数をカウントして評価した。同時にＭＴＴ活性も測定しサンプルの細胞毒性の程度を測定した。
【００２３】
ＵＡＭＳ−３２細胞とマウス骨髄細胞を活性型ビタミンＤ３（１０−８Ｍ）およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）（１０−６Ｍ）を含むα−ＭＥＭ培地（ａｌｐｈａ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）で培養した。２枚の９６穴プレートを用いて培養を開始し、１枚はＴＲＡＰ染色用、もう１枚はＭＴＴ活性測定用とした。実施例１にて調製したサンプルのうち、水および２５％エタノール抽出物は水に、５０％、７５％および１００％エタノール抽出物はＤＭＳＯに溶解し、１０ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した後、終濃度の２倍濃度になるようにα−ＭＥＭ培地で希釈し、１００μＬを培養開始時に添加した。活性型ビタミンＤ３（１０−８Ｍ）、ＰＧＥ２（１０−６Ｍ）も同様に終濃度の２倍濃度に調製し、１００μＬを培養開始時に添加した。培養開始３日目に培地交換を行った。即ち、ウェル中の２００μＬのうち１５０μＬをマイクロピペットで除去し、新たにサンプルを含む培地７５μＬと活性型ビタミンＤ３とＰＧＥ２を含む培地７５μＬを添加した。さらに６日間培養した後、一枚のプレートは、培養液を除去し、ＰＢＳで洗浄後、細胞をウェルに固定し、酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色キットを用いて染色後、ウェル内の染色された細胞（破骨細胞）をカウントした。コントロールはサンプルを溶解しない水またはＤＭＳＯのみを添加したものであり、コントロールを１００とした相対的破骨細胞数にてサンプルの破骨細胞分化抑制活性を評価した。もう一枚のプレートにＭＴＴ活性測定試薬（３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウム）を加えて反応後、吸光度を測定して、コントロールを１００として、細胞生存率を測定し細胞毒性の程度を評価した。
【００２４】
（２）試験結果
エタノールおよび水抽出物の破骨細胞分化抑制効果および細胞毒性の試験結果を、それぞれ図１、図２に示す。図１および２から明らかなように、エタノール抽出物および水抽出物は、細胞毒性が低い濃度で用量依存的に破骨細胞分化抑制作用を示した。一方、２５％、５０％、７５％エタノール抽出物も、６．２５〜５０μｇ／ｍＬでコントロールと比較して、６０〜８０％の破骨細胞分化抑制効果を示した。
【００２５】
参考例（フラボノール類の単離）
−８０℃で冷凍保存しておいたクズの葉をバイオメティカル社製のシェイクマスターで破砕した後、１００ｇ秤量し、エタノール５００ｍＬを加えて撹拌後、１Ｌのメディウム瓶に移し、フタを締め、遮光下インキュベーターで１５０ｒｐｍ、２５℃で約１５時間撹拌抽出した。１５時間後、抽出液をろ過し、ろ液を減圧下濃縮乾固した。得られた抽出物４ｇにヘキサン８０ｍＬを加えて、超音波、ボルテックス等で懸濁し、４０ｍＬずつ５０ｍＬの遠心管２本に分けて、２０℃、２０００×ｇで１０分間遠心した。遠心後、上清をパスツールピペットで除去した。５０ｍＬの遠心管にさらに４０ｍＬずつヘキサンを加え、ボルテックスで沈殿を撹拌し、再度遠心分離を行い、上清を除去した。同様の作業を５回繰り返した。遠心管に残った沈殿物に少量のヘキサンを加え、パスツールピペットで吸い上げて３００ｍＬのナスフラスコに移し、減圧下濃縮乾固を行った。乾固物に１００ｍＬの純水を加えて、超音波で処理後、等量の酢酸エチルを加えて激しく分液した後、水層を分取し、酢酸エチル（１００ｍＬ）にて３回洗浄した。水層を減圧下約５０ｍＬに濃縮した後、ＨＰ−２０カラムクロマトグラフィー（φ６０×８０ｍｍ）に付し、純水（６００ｍＬ）で洗浄後、順次、同量の２５％ＥｔＯＨ、５０％ＥｔＯＨ、７５％ＥｔＯＨ、１００％ＥｔＯＨで溶出させた。各画分の一部を用いてＨＰＬＣ分析を行った。検出波長は２６０ｎｍとした。５０％ＥｔＯＨ画分（３２０ｍｇ）に３つの主要なピークが多く見られた。分取用ＨＰＬＣ（アジレント社製ＨＰＬＣ、ナカライテスク株式会社製カラム、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ、２０×２５０ｍｍ、Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ａ：アセトニトリル、Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｂ：０．１％ギ酸、グラジェント条件、０ｍｉｎ：１５％Ａ、１００ｍｉｎ：１７％Ａ）で各ピークの分取を行い、精製した各ピークについて１Ｈ−ＮＭＲと１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトル解析を行った結果、ロビニン、ケルセチン３−Ｏ−ロビノビオシド、ルチンであることが判明した。ロビニン、ルチンについては、標品（それぞれＩＮＤＯＦＩＮＥ社、和光純薬工業株式会社から購入）とＨＰＬＣ（ウォーターズ社製ＨＰＬＣ、ＧＬサイエンス株式会社製カラム、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３、４．６×２５０ｍｍ、Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ａ：アセトニトリル、Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｂ：０．１％ギ酸、グラジェント条件、０ｍｉｎ：１２％Ａ、２７ｍｉｎ：２１％Ａ、５７ｍｉｎ：２５％Ａ、７０ｍｉｎ：６５％Ａ）で一致した。
【００２６】
ケルセチン３−Ｏ−ロビノビオシドの分析データ：１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：７．６４（１Ｈ，ｄ，８．１５，Ｈ６’），７．５２（１Ｈ，ｓ，Ｈ２’），６．８１（１Ｈ，ｄ，７．５０，Ｈ５’），６．３８（１Ｈ，ｓ，Ｈ８），６．１７（１Ｈ，ｓ，Ｈ６），５．３１（１Ｈ，ｄ，７．５４，Ｈ１’’），４．４２（１Ｈ，ｓ，Ｈ１’’’），３．６０（１Ｈ，ｍ，Ｈ５’’’），３．５８（１Ｈ，ｔ，５．５０，Ｈ４’’’），３．５５（１Ｈ，ｔ，４．２５，Ｈ３’’），３．４４（１Ｈ，ｓ，Ｈ２’’’），３．３９（１Ｈ，ｍ，Ｈ５’’），３．３７（１Ｈ，ｍ，Ｈ４’’），３．３２（１Ｈ，ｄｄ，８．２８，Ｈ３’’’），３．２４（２Ｈ，ｑ，Ｈ６’’），３．１０（１Ｈ，ｔ，９．００，Ｈ２’’），１．０６（３Ｈ，ｄ，６．００，Ｈ６’’’）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：１７７．２（Ｃ４），１６４．８（Ｃ７），１６１．０（Ｃ９），１５６．３（Ｃ５），１５６．２（Ｃ２），１４８．５（Ｃ４’），１４４．８（Ｃ３’），１３３．３（Ｃ３），１２１．８（Ｃ６’），１２０．９（Ｃ１’），１１５．８（Ｃ５’），１１５．１（Ｃ２’），１０３．５（Ｃ１０），１０２．０（Ｃ１’’），９９．９（Ｃ１’’’），９８．８（Ｃ６），９３．５（Ｃ８），７３．４（Ｃ３’’），７３．０（Ｃ５’’），７１．８（Ｃ２’’），７１．０（Ｃ４’’’），７０．５（Ｃ３’’’），７０．３（Ｃ２’’’），６８．２（Ｃ４’’），６７．９（Ｃ５’’’），６５．０（Ｃ６’’），１７．８（Ｃ６’’’）．
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明により、クズ葉自体またはその水および／または有機溶媒抽出物を有効成分として含有することを特徴とする破骨細胞分化抑制剤、ならびにそれを配合してなる関節リウマチ、高カルシウム血症、ベーチェット病、薬物性骨代謝異常症、歯周病及び骨粗鬆症の予防・治療用医薬品および飲食品を提供された。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】クズ葉エタノール抽出物の破骨細胞形成数とＭＴＴ活性（細胞毒性）を示すが、破骨細胞分化抑制活性を示す図である。
【図２】クズ葉水抽出物の破骨細胞形成数とＭＴＴ活性（細胞毒性）を示すが、破骨細胞分化抑制活性を示す図である。
【図１】
2009215250.tif 000002
【図２】
2009215250.tif 000003