(57)【要約】      （修正有）【課題】タンパク質とタンパク質間の相互作用、またはタンパク質とタンパク質以外の化合物との相互作用を正確に検出・解析できるタンパク質アレイを提供可能とし、しかも抗体等の分子量の大きいタンパク質との相互作用を検出しうるタンパク質アレイ基板を提供する。【解決手段】基板上に枠体を載置してゲルモノマー溶液を流入させ、ゲル化を水蒸気雰囲気下で行い、次いでゲル化水洗後の乾燥を水蒸気雰囲気下で行って、タンパク質アレイ基板を作製する。【選択図】図２
2009156767.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明基板と、該基板上に載置され、ゲルモノマー含有溶液を収容する枠体と、該枠体上部を覆うカバー部材からなり、該基版上において、上記枠体とカバー部材とにより、外気から遮断された状態でゲルモノマーの重合・ゲル化を行う空間が形成されることを特徴とする、タンパク質アレイ基板作製用装置。
【請求項２】
枠体が透明基板に密着性を有する材料で形成されていることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質アレイ基板作製用装置。
【請求項３】
枠体が、シリコンラバー、またはシリコンフィルムからなることを特徴とする請求項２に記載のタンパク質アレイ基板作製用装置。
【請求項４】
カバー部材が撥水処理された平板であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質アレイ基板作製用装置。
【請求項５】
ゲルモノマー含有溶液がアクリルアミド、その架橋剤、アミノ基含有ポリマー及び重合促進剤を含むことを特徴とする、請求項５に記載のタンパク質アレイ基板作製用装置。
【請求項６】
透明基板上に枠体を載置し、該枠体内にゲルモノマー含有溶液を流入させ、次いでカバー部材で枠体を覆い外気から遮断した状態でゲルモノマーを重合させゲル化させることを特徴とする、タンパク質アレイ基板の作製方法。
【請求項７】
ゲルモノマー含有溶液がアクリルアミド、その架橋剤、アミノ基含有ポリマー及び重合促進剤を含むことを特徴とする、請求項６に記載のタンパク質アレイ基板の作製方法。
【請求項８】
ゲルモノマーの重合が、水蒸気雰囲気下において恒温条件で行われることを特徴とする、請求項６または７に記載のタンパク質アレイ基板の作製方法。
【請求項９】
ゲルモノマーの重合後水洗し、さらに、容器中で水蒸気雰囲気下、恒温条件下でゲル基板表面の水分を除去することを特徴とする、請求項８に記載のタンパク質アレイ基板の作製方法。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれかに記載の作製方法により作製されたタンパク質アレイ基板にタンパク質を固定化したことを特徴とする、タンパク質アレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質とタンパク質の間の相互作用、または、タンパク質とタンパク質以外の生体分子や化合物との相互作用を光学的手段によって検出・解析するために用いるタンパク質アレイ基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質間の相互作用、あるいはタンパク質と低分子化合物その他の生体分子との相互作用を研究するため、生体内と比較的近い状態で、タンパク質の変性・失活を起こさない含水ゲルを使用するタンパク質アレイが知られている。
一方、このような含水ゲルタイプのタンパク質アレイであって、固定化されたタンパク質に結合する生体分子を透過光強度により検出するタイプのタンパク質アレイも知られており、このタンパク質アレイによれば、生体分子を標識する必要がなくなく、非標識で生体分子と固定化されたタンパク質の相互作用を定量的に検出することが可能である。
【０００３】
このような含水ゲルタイプのタンパク質アレイ基板の作製方法は、基板上にゲルモノマー混合溶液を滴下し、この上に、顕微鏡観察に用いるカバーガラス等のカバー部材を被せて重合させゲル化した後、平板を取りはずして上記アレイ基板を作製するもので、上記ゲル化後においては、未重合のモノマーを除去するため水洗し、次いで、乾燥させていた（特許願2006-546655号、図１）。しかし、このような従来のタンパク質アレイ基板の作製法には以下の問題があった。
【０００４】
すなわち、従来法は、基板にモノマー溶液を滴下し、この上にカバー部材を被せてゲル化するものであり、端部のモノマー溶液が外気と接触した状態でゲルの重合が行われるため、該溶液がカバー部材の外に漏れ出でて形成されるゲルの端部が盛り上がってしまったり、あるいは場所によってゲル化の進行度や乾燥の程度が異なることで凹凸が生じてしまったりするため、均一厚さで平面性の高いゲル基板を作製することは難しいものであった。このため、このような基板にタンパク質を固定化したアレイを使用して、他のタンパク質あるいは他の物質との相互作用を光学的手段により検出・解析する際に、ゲル基板の非均一性に起因する信号強度のバラツキが生じ、測定結果の解釈・解析が困難となっていた。また、上記従来法によれば、厚みのあるゲルを形成することも難しく、そのため基板の単位面積あたりに固定化できるタンパク質の量が少なく、それと相互作用する分子の数も少なくなってしまい、その結果弱い相互作用の場合は検出できないという問題点もあった。
【０００５】
さらに、従来法の場合、ゲルモノマーの濃度を下げたり架橋剤の含有率を変えたりすると、モノマーの重合が難しくなるほか、ゲルの一部分が乾燥したりするなどして、ゲルが形成しにくくなり、歩留まり、品質の再現性が悪く、しかも、孔径(pore size)の大きなゲルを有するゲル基板を作製することは困難であった。このため、抗体等の分子量の大きなタンパク質はゲルの中に拡散していくのが困難となり、その結果このような大きなタンパク質との相互作用を検出することは困難であった。また、従来法により作製したゲル基板にタンパク質を固定化したスポットを紫外線の透過光で撮影した結果、スポットの周縁部および内部にムラができていることが観察されたが、このことは、タンパク質が均一に固定化できていないことを示しており、測定結果を解析する上で問題を有していることが明らかとなった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、特に測定対象物質を標識することなく、透過光を測定するタイプのタンパク質アレイにおいて、上記従来法の問題点を解消することにあり、タンパク質とタンパク質間の相互作用、またはタンパク質とタンパク質以外の生体分子や化合物との相互作用を正確に検出・解析できるタンパク質アレイを提供可能とし、しかも抗体等の分子量の大きいタンパク質との相互作用を検出しうるタンパク質アレイ基板を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究の結果、特に、タンパク質アレイ基板作製用部材として、枠体を使用すること、ゲル化を水蒸気雰囲気下で行うこと、及びゲル化水洗後の乾燥を水蒸気雰囲気下で行うことにより、上記課題を解決しうることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下に示すとおりである。
【０００８】
（１）基板と、該基板上に載置され、ゲルモノマー含有溶液を収容する枠体と、該枠体上部を覆うカバー部材からなり、該基版上において、上記枠体とカバー部材とにより、外気から遮断された状態でゲルモノマーの重合・ゲル化を行う空間が形成されることを特徴とする、タンパク質アレイ基板作製用装置。
（２）枠体が基板に密着性を有する材料で形成されていることを特徴とする、上記（１）に記載のタンパク質アレイ基板作製用装置。
（３）枠体が、シリコンラバー、またはシリコンフィルムからなることを特徴とする上記（２）に記載のタンパク質アレイ基板作製用装置。
（４）カバー部材が撥水処理された平板であることを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のタンパク質アレイ基板作製用装置。
（５）ゲルモノマー含有溶液がポリアクリルアミド、その架橋剤、アミノ基含有ポリマー及び重合促進剤を含むことを特徴とする、上記（５）に記載のタンパク質アレイ基板作製用装置。
（６）基板上に枠体を載置し、該枠体内にゲルモノマー含有溶液を流入させ、次いでカバー部材で枠体を覆い外気から遮断した状態でゲルモノマーを重合させゲル化させることを特徴とする、タンパク質アレイ基板の作製方法。
（７）ゲルモノマー含有溶液がポリアクリルアミド、その架橋剤、アミノ基含有ポリマー及び重合促進剤を含むことを特徴とする、上記（６）に記載のタンパク質アレイ基板の作製方法。
（８）ゲルモノマーの重合が、水蒸気雰囲気下において恒温条件で行われることを特徴とする、上記（６）または（７）に記載のタンパク質アレイ基板の作製方法。
（９）ゲルモノマーの重合後水洗し、さらに、容器中で水蒸気雰囲気下、恒温条件下でゲル基板表面の水分を除去することを特徴とする、上記（８）に記載のタンパク質アレイ基板の作製方法。 
（１０）上記（６）〜（９）のいずれかに記載の作製方法により作製されたタンパク質アレイ基板にタンパク質を固定化したことを特徴とする、タンパク質アレイ。
【発明の効果】
【０００９】
本発明においては、タンパク質アレイ基板作製用装置として、枠体を用いており、基板上にこの枠体を載置し、ゲルモノマー混合液をこの枠体内に流入させて、カバーを被せてゲル化することにより、従来法のようにゲルモノマー溶液がカバー部材の外に漏れ出したりして端部が盛り上がったり、場所によってゲル化の進行度や乾燥の程度が異なってしまったりするのを防止できるようになり、また、水蒸気雰囲気にした容器の中、恒温条件でゲルモノマーを重合させることにより、ゲル表面の凹凸をなくすことができ、これらの結果、0.1mm〜0.5ｍｍの厚さの平面性の高いゲル基板が作製可能となる。このような厚みのあるゲル基板を作製できるようになったために、固定化可能なタンパク質の量が増大し、その結果、相互作用が弱く吸着数が少ない生体分子でも検出可能となる。
【００１０】
また、枠体を用いることで、固化前のゲルモノマー混合液と外気との接触を防ぐとともに上記容器中でゲル化を行うことにより、ゲルモノマー重合過程の条件を一定にすることが可能となり、これにより様々な濃度・架橋剤含有率のゲルが形成できる。一方、これに加えて  撥水処理したカバー部材を用いれば重合後カバー部材を取り除くときに起こりやすかったゲルの崩壊も防止でき、これらの改良により、濃度の低いゲルを形成可能になり、孔径(pore size)の大きなゲル基板を作製することが可能となる。その結果、抗体等分子量の大きな生体分子でもゲルの中に容易に拡散できるようになり、固定化タンパク質との相互作用を検出することが可能となる。また、ゲルモノマー重合過程の条件を一定にすることが可能となった結果、歩留まりが向上し、平面性を含めた品質の再現性が向上する。さらに、本発明においては、ゲル形成、水洗後の乾燥を水蒸気雰囲気下で行うため、ゲル内部は実質的には乾燥しておらず、均一な水分状態が保たれ、タンパク質をスポットする際、スポットの周縁部および内部にムラの少ない均一なタンパク質のスポットを作製することが可能となる。
【００１１】
以上の改良により、本発明においては、特に透過光によりタンパク質の間の相互作用、あるいはタンパク質と生理活性物質等の生体分子や化合物との間の相互作用を測定する含水ゲルタイプのタンパク質アレイにおいて、上記相互作用をそれが弱い場合でも正確に検出・解析でき、しかも、広範な大きさのタンパク質及び生体分子との相互作用を検出し得る含水ゲルタイプのタンパク質アレイを提供することが可能となる。
すなわち、現在のタンパク質アレイは、検出のために生体分子を標識する必要があるものがほとんどで、再現性・定量性に問題があり、また、このような標識する必要がない、透過光を用いるタイプの測定法に使用するタンパク質アレイもゲル表面の不均一性等に基づく問題を有していたが、本発明によれば、非標識で生体分子間の相互作用を正確に定量的に検出することが可能なタンパク質アレイを実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のタンパク質アレイ基板作製用装置は、基板、基板上に載置する枠体及び枠体を覆うカバー部材からなる。透明基板の材質は特に限定されないが、例えばガラス、石英ガラス、プラスチック等が挙げられるが、紫外線吸収能がないかあるいは低い材質からなるものが好ましい。
枠体は、上下開放した□形の部材からなり、透明基板上に載置することにより、ゲルモノマー溶液を貯留し、ゲルモノマーの重合を行う反応槽を形成する（図２）。枠体の材質は透明基板上に載置した場合、液漏れを起こさない材料であれば、特に限定されないが、撥水性の材料が好ましく、これには、例えば、シリコンゴム等が挙げられる。カバー部材は枠体を覆う平板状部材であり、上記形成された反応槽を密閉する機能を有し、その材質としては、ガラス、プラスチック等が挙げられるが、その表面は撥水処理されていることが好ましい。撥水処理は、例えば撥水処理用シランを表面にコーテイングすることにより行われる。
【００１３】
これらの部材の寸法は、自由に変更できるが、基板の場合、例えば、縦25〜40mm、横40〜80mmである。枠体の縦、横の寸法は基板よりも小さい寸法にするが、載置して貯留層が形成できれば特に限定されないが、上下方向の厚さは、例えば0.1〜0.5ｍｍに設定する。また、枠体の各辺の幅は、液漏れ起こさす、かつカバー部材を安定に載置し、これにより内部を密閉しうる寸法であれば特に限定はないが、例えば5mm〜10mmに設定するのが好ましい。カバー部材は枠体に載置されて、密閉空間を形成できる寸法であればよい。
【００１４】
以下、これらの部材を用いてタンパク質アレイ基板を作製する工程について詳細に説明する。
（１）まず、透明基板上に枠体を載置し、形成された貯留槽にゲルモノマー溶液を流入させる。次いで、該枠体上にカバー部材を載置する（図２）。このとき、カバー部材下面とゲルモノマー溶液上面との間に空間を形成しないようにするのが好ましい。
これらにより、モノマー溶液は貯留中及び重合中、外気との接触が妨げられるので、従来法のように、モノマー溶液の端部側がカバー部材に覆われていないため外気と接触していることに起因する重合反応の進行度の不均一さによって生ずる、ゲル表面の平面性の低下を防止することができる。
使用するゲルモノマー溶液は、含水ゲルを形成する成分を含み、含水ゲル形成モノマーの他に、架橋剤、反応促進剤等を含む。
【００１５】
含水ゲルとしては、例えば、架橋ポリアクリルアミドゲル等が挙げられ、含水ゲルが架橋ポリアクリルアミドゲルの場合、モノマー溶液中には、モノマーであるアクリルアミド、及びその架橋剤であるN,N’-ジアリル-L-酒石酸ジアミドもしくはビスアクリルアミド、それらの重合促進剤であるＴＥＭＥＤと過硫酸アンモニウム、そしてポリＬリジン等のアミノ基含有ポリマー、が含まれるが、その他のポリマー分子を含有させても良い。このアミノ基含有ポリマーは、ゲルを重合させた後、タンパク質のC末端とポリマーのアミノ基との間にアミド結合を形成させてタンパク質を固定化するために使用される。
【００１６】
本発明においては、モノマー濃度が低い溶液を使用してもゲル形成が可能であり、例えば上記架橋ポリアクリルアミドゲルを形成させる場合、アクリルアミドの溶液中の濃度は、重量濃度が5％であってもゲル形成可能である。したがって、アクリルアミドの濃度は、5〜10％に調製する。
【００１７】
（２）次に、透明基板上の枠体内にモノマー溶液を収容し、カバー部材で覆われたゲル形成用基板を、水蒸気雰囲気の容器、すなわち十分純水を含ませたキムワイプをいれておいた容器に収納し、容器全体を恒温インキュベータ等に入れて恒温下すなわち一定の反応温度下に置いてモノマーの重合反応を行う（図３）。反応温度は、モノマーが重合するのに好適な温度で行えばよいが、ポリアクリルアミドゲルを形成する場合は20〜30℃で行う。
この工程において、重合反応は、密閉され、水蒸気雰囲気下で行われるので、外気と完全に遮断され、また恒温下で行われるため、重合過程の条件がゲル形成のための最適条件を一定に維持できる。このため、ゲル歩留まりが向上し、ゲルの平面性を含めた品質の再現性が向上する。
【００１８】
（３）上記重合反応によるゲル形成後、カバー部材及び枠体を順次取り外し、ゲルが形成された透明基板を水洗し、未反応モノマー等の残存成分を除去する。
この場合、カバー部材を撥水処理することで。あるいはさらに枠体を撥水性材料により形成することにより、従来法では頻繁に起こっていた、取り外しの際のゲルの崩壊を効果的に防止できる。
【００１９】
（４）次いで、固定化するタンパク質をゲル中に吸収しやすくするため、水洗されたゲル基板の表面から水分を除去して、タンパク質アレイ用の基板を作製する。
本発明において表面水分の除去は、上記水洗されたゲル基板を、あらかじめ十分純水を含ませたキムワイプをいれておいた容器の中に入れて密封することにより水蒸気雰囲気を実現し、この容器全体を25℃に設定した恒温インキュベータの中において約１6時間程度放置することによって行った（図４）。これにより、ゲルの内部では水分は保持され、しかも、その表面の乾燥状態を均一にすることが可能となる。これにより従来法のように、ゲル表面の乾燥ムラが生じたり、あるいは部分的にゲル内部まで乾燥が進んだりすることがなく、このため、固定化するタンパク質吸着量の場所によるバラツキが防止され、タンパク質アレイとして使用する場合に得られるデータの信頼性が向上する。
【００２０】
（５）上記において作製したタンパク質アレイ基板上に順次タンパク質をスポットしていき、タンパク質アレイを作製する。本発明においては、スポットされたタンパク質は速やかにゲル中に吸収され、ゲルを構成する３次元編み目構造により形成され、水媒質で満たされた孔（ポア）中に捕捉され、その後アミノ基との間にアミド結合を形成させることにより固定化される。
この孔のサイズは、使用するゲルモノマー濃度に依存するので、該濃度を低く設定する必要があり、これによりゲルは形成しにくくなるが、本発明によれば上記したように、モノマー濃度は低くともゲル形成が可能となるので、ポアサイズを大きくすることが可能であるので、抗体等の分子サイズが大きいタンパク質もゲルの中に拡散できるようになり、それらと固定化したタンパク質との相互作用の検出も可能となる。
【００２１】
このように生体分子との相互作用を調べるにあたっては、まず上記作製したタンパク質アレイ基板に紫外光を照射し、透過光の強度を測定しておく。その後、タンパク質アレイ基板全体に、目的の生体分子を含む試料溶液を添加した後、非特異的に吸着した物質を洗浄除去し、特異的相互作用により吸着した生体分子のみを残しておいて、再び紫外光を照射し、透過光の強度を測定し、試料溶液を添加する前のそれと比較する。透過光の強度が減じたスポットは、そのスポットの固定化タンパク質に試料中の生体分子が吸着し、照射光を吸収していることを示しており、減少の程度は吸着した生体分子の量を反映している。このようにして、固定化タンパク質と、試料中の物質との相互作用を検出し、解析することができる。
【００２２】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明は実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００２３】
実施例１
タンパク質アレイ用基板の作製
タンパク質アレイ用基板の作製においては、先ず、ガラスとアクリルアミドを結合させる機能を持つシランカップラーであるバインドシランを石英ガラスの表面に導入し、次にシリコンフィルムの枠体をガラス表面に設置し、その後アミノ基を有するポリマーを含むアクリルアミド溶液を枠体の中に流し込み、撥水処理したカバーガラスを被せて、水蒸気雰囲気のシャーレの中で約16時間重合させることにより、タンパク質マイクロアレイ用のゲル基板を作製した。以下に各過程の詳細を記す。
バインドシラン（GEヘルスケアより購入）は石英ガラス（OPSQ-40S03-P、シグマ光機より購入）とアクリルアミド分子の両方と共有結合を形成することにより両者を強固に結合させることができるが、以下のようにして石英ガラスの表面に導入した。800μlのエタノール、20μlの酢酸、180μlの純水、1μlのバインドシラン液を混合した溶液を作製し、ドラフトチャンバーの中でこの溶液100μlを石英ガラスの表面一面に滴下し、キムワイプを用いて石英ガラス表面全体に塗り広げながらふき取り、1〜2時間乾燥させた。
【００２４】
厚さ0.3mmのシリコンフィルム（アズワンより購入）を30mm×30mmのサイズに切り取り、その中央部20mm×20mmの領域をカッターナイフで切り出した。このように作製した枠体を40mm×40mmの石英ガラスの上に載せ、上から軽くこすって密着させた。
アクリルアミド（バイオラッドより購入）と架橋剤であるN,N’-ジアリル-L-酒石酸ジアミド（DATD、和光純薬より購入）を純水に溶かし、濃度10％、架橋剤含有率15%のアクリルアミドのモノマー溶液を作製した。この溶液100μlにポリLリジン（分子量30,000〜70,000のポリLリジン、シグマ社より購入）及び純水を加え、最終的にポリアクリルアミドの濃度が5%、架橋剤含有率が15%、ポリLリジンの濃度が0.4%である溶液を200μl調製した。次に重合促進剤であるTEMEDを0.2μl、10％の過硫酸アンモニウム溶液を2μl加え、よく混ぜた後、この溶液150μlを石英ガラス上の枠体に流し込んだ。その後直ちに撥水処理したカバーガラス（24X24mm Thickness 0.12-0.17mm、松浪ガラスより購入）を気泡が入らないように被せた。カバーガラスの撥水処理は次のように行った。撥水処理用シランであるリピルシラン溶液（GEヘルスケアより購入）5mlの中にカバーガラスを約5分間浸した後取り出し、ドラフトチャンバーの中で約1分間放置した後キムワイプを用いて表面の余分なシランをふき取った。
【００２５】
このように石英板上の枠体の中にアクリルアミド溶液を流し込み、撥水処理したカバーガラスを被せた後、あらかじめ純水2mlを含ませたキムワイプをいれておいたシャーレの中に入れて密封することにより水蒸気雰囲気下においた。このシャーレを、25℃にセットした恒温インキュベータの中に約16時間入れて置いて、アクリルアミドの重合ゲル化を行った。
重合が完了した後、トランスイルミネーターを用いて、石英板全体に紫外線を約5分間照射した後、ピンセットを用いてカバーガラスを取り除き、シリコンラバーの枠体を取りはずした後、シャーレの中の純水に浸し約30分攪拌した。その後純水を3回交換し、計約2時間攪拌することで重合したゲル基板を洗浄し、未重合のモノマー等を除去した。その後、あらかじめ純水2mlを含ませたキムワイプをいれておいたシャーレの中に石英板全体を入れてから密封することにより水蒸気雰囲気下に置き、35℃にセットしたインキュベータの中に約16時間入れておくことにより、ゲル基板を乾燥させることなく表面の水分を除去し、固定化用タンパク質をスポット可能な状態にした。
【００２６】
実施例２
固定化用蛍光タンパク質のアレイ用基板への固定化
固定化用蛍光タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質のカルボキシ末端側に固定化用のアミノ酸配列を結合させたものを用いた。このアミノ酸配列をコードする遺伝子を人工合成し、発現ベクター（pUC18、東洋紡より購入）に組み込み、大腸菌に発現させ精製することによって目的タンパク質を作製した。なお、当業者であれば蛍光タンパク質をコードする遺伝子が入手できれば、同様の方法により容易に目的タンパク質を作製できる。
このように作製した固定化用蛍光タンパク質を最終濃度が4mg/mlとなるように10mM燐酸緩衝液(pH7.0)に溶解し、それを60nlずつ、3X3の格子状の9ポイントに1mmの間隔でスポットした。スポットには、専用のスポット用装置（武蔵エンジニアリング社より購入）を用いた。スポットした直後には、タンパク質溶液は表面上に約0.4mmの液滴を形成したが、その後速やかにゲルの中に吸収されていった。
【００２７】
このようにタンパク質をスポットさせた基板を、1mMのDTTを含む10mM燐酸緩衝液(pH7.0)に浸した状態で、約1時間37℃で放置し、タンパク質の還元反応を行った。その後シャーレの中で10mM燐酸緩衝液(pH7.0)に浸し洗浄した後、5mMの2−ニトロ-5-チオシアノ安息香酸(NTCB)を含む10mM燐酸緩衝液(pH7.0)に浸した状態で、約4間室温で放置し、シアノ化反応を行った。その後シャーレの中で10mM硼酸緩衝液(pH9.5)に浸し、室温で約24時間穏やかに攪拌することにより、固定化反応を行った。固定化反応終了後、シャーレの中で1MKClを含む10mM燐酸緩衝液(pH7.0)に浸し、約2時間穏やかに攪拌することによって、未反応タンパク質及び副反応生成物を除去した。
【００２８】
実施例３
固定化された緑色蛍光タンパク質の光学的手段による検出
以上のように作製した蛍光タンパク質アレイを専用のセルの中にセットし、10mM燐酸緩衝液(pH7.0)を満たした。このセルに、専用のキセノンランプを光源とする分光器（島津製作所より購入）により分光した280nmの紫外線を照射し、セルの中のタンパク質アレイを透過してくる光を紫外CCDカメラで撮影した（図５）。
これによれば、各々スポット内において280nmの紫外線の透過光が減少し黒く見えているので、固定化した蛍光タンパク質による280nmの光の吸収を検出できていることが示された。また、タンパク質アレイ中の各スポットあるいはスポット内における透過光の減少の程度はほぼ均一であり、蛍光タンパク質がアレイ基板上に均一に固定化されていることが分かる。
【００２９】
実施例４
固定化用抗体結合タンパク質のアレイ用基板への固定化
固定化用抗体結合タンパク質としては、Staphylococcus aureus 由来のプロテインAの抗体結合ドメインを2個連結させた配列のカルボキシ末端側に固定化用のアミノ酸配列を結合させたものを用いた。このアミノ酸配列をコードする遺伝子を人工合成し、発現ベクター（pUC18、東洋紡より購入）に組み込み、大腸菌に発現させ精製することによって目的タンパク質を作製した。
【００３０】
このように作製した固定化用抗体結合タンパク質の乾燥標品を、最終濃度が10mg/mlとなるように10mM燐酸緩衝液(pH7.0)に溶解し、それを60nlずつ、3X3の格子状の9ポイントに1.2mmの間隔でスポットしていった。その後、実施例2において示された方法によって固定化反応を行った後、次のようにして、ゲル基板内の未反応のアミノ基をアセチル化し電荷を喪失させた。基板を1mlの0.5M硼酸緩衝液(pH9.5)に浸し、室温で攪拌しながら10μlの無水酢酸を約10分毎に6回添加し、その後10mM燐酸緩衝液(pH7.0)で3回以上洗浄した。
このように作製した抗体結合タンパク質を固定化したアレイは、全体を10mM燐酸緩衝液(pH7.0)中に浸して4℃で保存することが可能である。
【００３１】
実施例５
抗体分子の添加及び吸着した抗体の光学的手段による検出
以上のように作製した抗体結合タンパク質アレイを専用のセルの中にセットし、10mM燐酸緩衝液(pH7.0)を満たした。このセルに、専用のキセノンランプを光源とする分光器（島津製作所より購入）により分光した280nmの紫外線を照射し、セルの中の抗体結合タンパク質アレイから透過してくる光を紫外CCDカメラで撮影した（図６A）。この段階では、スポットは観察されていない。これは、固定化した抗体結合タンパク質が、280nmの紫外線を吸収するアミノ酸残基を２個しか含んでいないため、ほとんど光吸収がないことが原因である。
その後、以下のようにして抗体分子をタンパク質アレイに添加し吸着した抗体分子を光学的手段により検出した。抗体分子（I4506、シグマ社より購入）を最終濃度が5μg/μlになるように10mM燐酸緩衝液(pH7.0)に溶解し、抗体結合タンパク質アレイをこの抗体溶液1.5ｍｌに浸し、約16時間穏やかに浸透させた。その後、1MKClを含む10mM燐酸緩衝液(pH7.0)に浸し、約2時間穏やかに攪拌することによって、特異的相互作用により吸着した抗体分子のみを残しておいて、非特異的に吸着した抗体分子を除去した。その後、この抗体結合タンパク質アレイを再び専用のセルの中にセットし、280nmの紫外線を照射し、タンパク質アレイから透過してくる紫外光をCCDカメラで撮影した（図６B）。各々スポットで透過光が抗体分子添加の後、減少して黒く見えていることが観察されているが、これは吸着した抗体分子が280nmの紫外線を吸収することによるものであり、抗体分子が抗体結合タンパク質と相互作用し吸着する様子を非標識で検出できていることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】従来のタンパク質アレイの作製用方法を表す図
【図２】本発明にタンパク質アレイ基板作製用装置の使用態様を示す図
【図３】本発明におけるタンパク質アレイ基板の作製工程中のゲルモノマーの重合工程を模式的に示す図
【図４】本発明におけるタンパク質アレイ基板の作製工程中の水分除去工程を模式的に示す図
【図５】本発明のタンパク質アレイ基板に緑色蛍光タンパク質を固定し、紫外線を照射し透過光を撮影した写真
【図６】抗体結合性蛋白を固定化した発明のタンパク質アレイに、抗体が結合する様子を、抗体添加前後の透過光の変化により検出したことを示す写真。Ａ；抗体添加前、Ｂ；抗体添加後
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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