(57)【要約】【課題】蛍光標識分子と非蛍光標識分子が１：１で反応し反応体を形成している場合であっても、分子間相互作用の有無を、計測の精度及び迅速性に優れたＦＩＤＡにより判断するための方法の提供。【解決手段】蛍光色素を用いて標識した分子と非蛍光標識分子との分子間相互作用の有無を、蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）により蛍光強度を求めることにより判別する方法において、前記蛍光色素が、ラジカルと反応して退色しやすい蛍光色素であり、前記ＦＩＤＡを、退色防止剤の存在下において行うことを特徴とする分子間相互作用の解析方法、及び、前記退色防止剤がヒドロキシラジカル又はスーパーオキシドラジカル除去能を有する化合物である前記記載の分子間相互作用の解析方法、及び、前記蛍光色素が、退色しやすい蛍光色素である前記記載の分子間相互作用の解析方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光色素を用いて標識した分子と非蛍光標識分子との分子間相互作用の有無を、蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）により蛍光強度を求めることにより判別する方法において、
前記蛍光色素が、ラジカルと反応して退色しやすい蛍光色素であり、
前記ＦＩＤＡを、退色防止剤の存在下において行うことを特徴とする分子間相互作用の解析方法。
【請求項２】
前記蛍光色素が、フルオレセイン、４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン誘導体、フルオレセインイソチオシアナート、カルボキシフルオレセイン、テキサスレッド、オレゴングリーンからなる群より選択される色素であることを特徴とする請求項１記載の分子間相互作用の解析方法。
【請求項３】
前記退色防止剤が、ヒドロキシラジカル又はスーパーオキシドラジカル除去能を有する化合物であることを特徴とする請求項１又は２記載の分子間相互作用の解析方法。
【請求項４】
前記退色防止剤が、システアミン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、プロピルガレート、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル、２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジノル−１−オキシル、５，５−ジメチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシドからなる群より選択される１以上であることを特徴とする請求項１又は２記載の分子間相互作用の解析方法。
【請求項５】
蛍光色素を用いて標識した分子と非蛍光標識分子との分子間相互作用の有無を、蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）により蛍光強度を求めることにより判別する方法において、
前記蛍光色素が、退色しやすい蛍光色素であり、
前記ＦＩＤＡを、退色防止剤の存在下において行うことを特徴とする分子間相互作用の解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子間相互作用の有無を、蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）により迅速かつ精度よく判断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の光計測技術の発展は目覚ましく、蛍光一分子からの蛍光を測定・解析することができる一分子蛍光分析技術が多くの分野で応用されつつある。このような一分子蛍光分析技術には、蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＣＳ）や蛍光強度分布解析法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：ＦＩＤＡ）等がある。
【０００３】
一分子蛍光分析技術は、レーザー共焦点顕微鏡の光学系と、フォトンカウンティング（１光子検出）可能な超高感度の光検出装置とを用いて、溶液中の微小空間内の蛍光一分子レベルの蛍光シグナルを測定し、その蛍光シグナルの揺らぎや強度を、種々の方法により解析することにより、該蛍光分子の大きさや密度等の情報を得ることができる。このため、生物科学、医学、薬学等の分野では、一分子蛍光分析技術が、生体分子等の状態や運動の検出・観測に応用されており、例えば、タンパク質と核酸の結合反応や抗原抗体反応を解明する試みがなされている（例えば、特許文献１及び２並びに非特許文献１参照。）
【０００４】
ＦＣＳは、検出された蛍光シグナルから、蛍光分子の標識拡散する時間（並進拡散時間）を求めることができる解析法である。並進拡散時間は分子の大きさによって異なるため、分子の相互作用や分解、凝集等の大きさの変化をモニターするために主に用いられる解析法である。また、観測領域中に存在する蛍光分子の数を算出することができるため、試料溶液における蛍光分子の濃度を概算することが可能である。さらに、試料溶液中に２種類以上の大きさを持つ蛍光分子が存在している場合、それぞれの並進拡散時間を有する分子の数量及び割合を算出することもできる。例えば、分子間相互作用により複数の分子が結合している反応体は、相互作用していない分子よりも大きくなるため、該反応体の並進拡散時間はより長くなる。このため、並進拡散時間を求めることにより、分子間相互作用の有無を判別することができる。
【０００５】
ＦＩＤＡは、蛍光分子の一分子当たりの蛍光強度を求めることができる解析法であり、蛍光分子が他の分子と相互作用した結果、分子に結合している蛍光色素の発光効率等が変化したことに起因する蛍光強度の変化を検出することにより、分子間の相互作用を検出することができる。例えば、複数の蛍光標識分子が１の非蛍光標識分子と相互作用して形成された反応体の一分子当たりの蛍光強度は、相互作用していない蛍光標識分子よりも高くなる傾向がある。このため、蛍光強度を求めることにより、分子間相互作用の有無を判別することができる。
【特許文献１】特開２００３−２７５０００号公報
【特許文献２】特開２００５−３３７８０５号公報
【非特許文献１】カスク（Kask）、外３名、プロシーディング・オブ・ナショナルアカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ユナイテッドステーツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）、第９６巻第２４号、１３７５６〜１３７６１ページ、１９９９年。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述したように、並進拡散時間は蛍光分子の大きさに依存しているため、蛍光標識分子と非蛍光標識分子が１：１で反応し反応体を形成している場合であっても、分子間相互作用の有無を判別することができる。しかしながら、一試料当たりの計測時間が数十秒と長く、また、計測値のばらつきが大きいという問題がある。
【０００７】
一方で、ＦＩＤＡは、一試料当たりの計測時間が数秒と短く、また、計測値のばらつきも非常に小さいという利点を有する。しかしながら、蛍光標識分子と非蛍光標識分子が１：１で反応し反応体を形成している場合には、溶液中の蛍光分子の一分子当たりの蛍光強度に変化が起こりにくく、このため、分子間相互作用の有無を判別することができない、という問題がある。
【０００８】
本発明は、蛍光標識分子と非蛍光標識分子が１：１で反応し反応体を形成している場合であっても、分子間相互作用の有無を、計測の精度及び迅速性に優れたＦＩＤＡにより判断するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、蛍光色素を用いて標識した分子（蛍光標識分子）と非蛍光標識分子との分子間相互作用の有無を、蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）により蛍光強度を求める場合に、標識に用いる蛍光色素として、該蛍光色素による蛍光強度が、レーザー光の照射により退色し易いものを用い、かつ、ＦＩＤＡを、退色防止剤の存在下において行うことにより、蛍光標識分子と非蛍光標識分子が１：１で反応し反応体を形成している場合であっても、分子間相互作用の有無を判別し得ることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、蛍光色素を用いて標識した分子と非蛍光標識分子との分子間相互作用の有無を、蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）により蛍光強度を求めることにより判別する方法において、前記蛍光色素が、ラジカルと反応して退色しやすい蛍光色素であり、
前記ＦＩＤＡを、退色防止剤の存在下において行うことを特徴とする分子間相互作用の解析方法を提供するものである。
また、本発明は、前記蛍光色素が、フルオレセイン、４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン誘導体、フルオレセインイソチオシアナート、カルボキシフルオレセイン、テキサスレッド、オレゴングリーンからなる群より選択される色素であることを特徴とする前記記載の分子間相互作用の解析方法を提供するものである。
また、本発明は、前記退色防止剤が、ヒドロキシラジカル又はスーパーオキシドラジカル除去能を有する化合物であることを特徴とする前記記載の分子間相互作用の解析方法を提供するものである。
また、本発明は、前記退色防止剤が、システアミン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、プロピルガレート、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル、２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジノル−１−オキシル、５，５−ジメチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシドからなる群より選択される１以上であることを特徴とする前記記載の分子間相互作用の解析方法を提供するものである。
また、本発明は、蛍光色素を用いて標識した分子と非蛍光標識分子との分子間相互作用の有無を、蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）により蛍光強度を求めることにより判別する方法において、前記蛍光色素が退色しやすい蛍光色素であり、前記ＦＩＤＡを、退色防止剤の存在下において行うことを特徴とする分子間相互作用の解析方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の分子間相互作用の解析方法を用いることにより、蛍光標識分子と非蛍光標識分子が１：１で反応し反応体を形成している場合であっても、分子間相互作用の有無を迅速かつ高精度に判別することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
通常、ＦＩＤＡを始めとする蛍光分析を行う場合には、ＴＭＲ（テトラメチルローダミン）等のように、連続して光照射を行っても退色せず安定して蛍光を発する色素が用いられる。このような光照射の時間や回数の影響を受けにくい高安定性の蛍光色素を用いることにより、計測値ごとのばらつきを防止し、より安定した解析結果を得ることができると考えられているためである。
【００１３】
蛍光標識分子と非蛍光標識分子が１：１で分子間相互作用をする場合には、理論的には、蛍光標識分子単量体と、蛍光標識分子と非蛍光標識分子の結合反応体（以下、単に結合反応体ということがある。）の蛍光強度は同等である。実際に、常法に従い高安定性の蛍光色素を用いた場合には、蛍光標識分子単量体と、蛍光標識分子と非蛍光標識分子の反応体の判別は非常に困難である。
【００１４】
ＦＩＤＡにより蛍光標識分子と非蛍光標識分子との分子間相互作用の有無を判別するためには、蛍光標識分子単量体の蛍光強度と、蛍光標識分子と非蛍光標識分子との反応体の蛍光強度とにおいて、判別可能な程度の相違が観測される必要がある。ここで、蛍光標識分子単量体と結合反応体とは、レーザー光が照射される観測領域の通過時間が異なることから、観測領域の通過時間に応じて蛍光強度が変化する場合には、蛍光標識分子単量体と結合反応体の蛍光強度に、判別可能な程度の相違が生じるため、ＦＩＤＡによっても分子間相互作用の有無を迅速かつ高精度に判別することができる。
【００１５】
本発明の分子間相互作用の解析方法は、蛍光色素を用いて標識した分子と非蛍光標識分子との分子間相互作用の有無を、ＦＩＤＡにより蛍光強度を求めることにより判別する方法において、前記蛍光色素が退色しやすい蛍光色素であり、前記ＦＩＤＡを、退色防止剤の存在下において行うことを特徴とする。蛍光標識分子として退色し易い蛍光色素を用いて標識した分子を用いることにより、測定試料溶液中の蛍光標識分子と非蛍光標識分子が、１：１で分子間相互作用をする場合であっても、該分子間相互作用の結果形成された結合反応体の蛍光強度と、該蛍光標識分子単量体の蛍光強度とを、識別可能な程度に異ならせることができるため、該分子間相互作用の有無を判別することができる。
【００１６】
ある分子の観測領域の通過時間は、該分子の大きさに依存する。例えば、大きな分子は観測領域の通過時間が長く、小さな分子は観測領域の通過時間が短い。つまり、大きな分子ほどレーザー光が照射される時間が長くなる。したがって、標識に用いる蛍光色素を、退色しやすい蛍光色素（以下、易退色性蛍光色素ということがある。）とすることにより、測定試料中の蛍光分子の蛍光強度を、レーザー光が照射される観測領域の通過時間に応じて変化させることが可能となる。例えば、分子量が比較的大きい結合反応体のほうが、観測領域の通過時間が長く、長時間レーザー光が照射される結果、蛍光標識分子単量体よりも早く退色する。この結果、蛍光標識分子単量体と結合反応体の蛍光強度を相違させることが可能となる。
【００１７】
なお、本発明の分子間相互作用の解析方法において用いられる易退色性蛍光色素とは、一般的にレーザー光の照射により退色し易いとされている蛍光色素であれば、特に限定されるものではない。例えば、適した励起波長のレーザー光を５００μＷの強度で５秒間の照射を５回繰り返した場合に、５回目の照射時の蛍光強度が、１回目の照射時の蛍光強度の２０％以上減衰する蛍光色素であることが好ましい。
【００１８】
ここで、測定試料中に退色防止剤を添加することにより、観測される蛍光強度において、蛍光標識分子単量体と結合反応体とをより明確に相違させることができる。これは、退色防止剤により、蛍光標識分子単量体の退色が抑制されるためと推察される。
【００１９】
本発明の分子間相互作用の解析方法において用いられる易退色性蛍光色素は、分子間相互作用の結果形成された結合反応体中の蛍光色素と、蛍光標識分子の単量体中の蛍光色素が、蛍光強度において識別可能な程度に異ならせることができる程度に退色し易い蛍光色素であれば特に限定されるものではないが、ラジカルと反応して退色しやすい蛍光色素であることが好ましい。ここで、ラジカルと反応して退色しやすい蛍光色素とは、退色反応においてラジカルが関与している蛍光色素を意味する。例えば、ラジカルと直接反応することにより退色する蛍光色素であってもよく、退色反応においてラジカルが触媒として機能する蛍光色素であってもよい。
【００２０】
ラジカルと反応して退色しやすい蛍光色素として、例えば、フルオレセイン、４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン誘導体（ＢＯＤＩＰＹ）、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、テキサスレッド、オレゴングリーン等がある。これらの蛍光色素は、フルオレセインのように、退色反応にラジカルが関与していることが明らかになっているものであってもよく、ラジカル存在下で退色が促進されることが経験的に分かっているものであってもよい（例えば、ジョンソン（Johnson）、外５名、１９８２年、ジャーナル・オブ・イミュノロジカルメソッヅ（Journal of immunological methods）、第５５巻第２号、２３１〜２４２ページ参照。）。
【００２１】
本発明の分子間相互作用の解析方法において用いられる退色防止剤は、分子の標識に用いられる蛍光色素に対する光照射の影響を低減することができる化合物であれば特に限定されるものではなく、蛍光色素の種類等を考慮して適宜選択して用いることができる。ヒドロキシラジカル又はスーパーオキシドラジカル除去能を有する化合物であることがより好ましい。ヒドロキシラジカル等除去能を有する化合物であれば、フルオレセイン等のラジカルと反応して退色しやすい蛍光色素を用いた場合に、効果的に該蛍光色素の退色を防止することができる。
【００２２】
このようなヒドロキシラジカル等除去能を有する化合物は、システアミンのように、特定の蛍光色素の退色防止剤として機能し得ることが明らかになっているものであってもよく、退色防止効果を有することが経験的に分かっているものであってもよい（例えば、サージェイ（Sergey）、外２名、１９９９年、アナリティカルバイオケミストリー（Analytical Biochemistry）、第３０７巻第１号、８４〜９１ページ参照。）。また、光触媒においてスピントラップ剤として公知のものを用いることもできる。本発明の分子間相互作用の解析方法において用いられる退色防止剤としては、システアミン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、プロピルガレート、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（ＴＥＭＰＯ）、２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジノル−１−オキシル（ＴＥＭＰＯＬ）、５，５−ジメチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシド（ＤＭＰＯ）等であることが特に好ましい。
【００２３】
本発明の分子間相互作用の解析方法において用いられる蛍光標識分子は、易退色性の蛍光色素を用いて標識した分子であって、ＦＩＤＡによる解析に通常供される種類の分子であれば特に限定されるものではない。例えば、タンパク質であってもよく、ペプチドであってもよく、核酸であってもよく、糖であってもよく、ビオチン等の低分子化合物であってもよい。また、これらの分子は、生体分子であってもよく、合成された化合物であってもよいが、解析の精度をより向上させることができるため、精製された分子であることが好ましい。
【００２４】
蛍光標識分子としては、タンパク質やペプチドは、アミノ酸のみから構成されるものであってもよく、糖タンパク質やリポタンパク質であってもよい。また、生物試料から精製されたタンパク質等であってもよく、公知の発現系を用いて得られたリコンビナントタンパク質であってもよい。また、核酸は、ＤＮＡとＲＮＡのいずれであってもよく、１本鎖核酸であってもよく、２本鎖核酸であってもよい。また、核酸類似体であってもよい。該核酸として、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ＰＣＲ増幅等による合成ＤＮＡ、ＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成されたｃＤＮＡ等がある。
【００２５】
蛍光物質による標識の態様は、ＦＩＤＡに適するように、一分子当たりに標識される蛍光色素量が同等である限り、特に限定されるものではない。また、これらの分子の蛍光標識方法は、特に限定されるものではなく、各種類の分子を蛍光標識する場合に通常用いられる方法により蛍光標識することができる。例えば、ＥＤＡＣ（１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル) −カルボジイミド塩酸塩）法等により、分子に蛍光色素を化学的に結合させてもよく、蛍光標識された核酸やアミノ酸等を用いて合成と同時に標識してもよい。
【００２６】
本発明の分子間相互作用の解析方法において用いられる非蛍光標識分子は、ＦＩＤＡによる解析に通常供される種類の分子であれば特に限定されるものではなく、蛍光標識分子において挙げられた分子を用いることができる。また、蛍光標識分子と非蛍光標識分子は、同一種類の分子であってもよく、異種類の分子であってもよい。例えば、蛍光標識分子と非蛍光標識分子の双方をタンパク質とし、タンパク質間の相互作用を、蛍光標識分子を核酸とし、非蛍光標識分子をタンパク質とすることにより、核酸とタンパク質の相互作用を、それぞれ解析することができる。また、蛍光標識分子を抗原とし、非蛍光標識分子を抗体とすることにより、抗原抗体反応を解析することもできる。さらに、蛍光標識分子を薬効が期待される合成された低分子化合物とし、非蛍光標識分子を生体分子とすることにより、新規医薬品のスクリーニング等を行うこともできる。
【００２７】
本発明の分子間相互作用の解析方法を用いてある２種類の分子間の相互作用の有無を判断する場合に、いずれの種類の分子を蛍光標識分子とするかは、各分子の性質や大きさ、蛍光色素の標識方法等を考慮して、適宜決定することができるが、より小さい分子を蛍光標識分子とすることが好ましい。相互作用による蛍光強度の変化をより大きくすることができ、相互作用の有無の判別感度を向上し得るためである。
【００２８】
具体的には、まず、蛍光標識分子と非蛍光標識分子と退色防止剤とを、測定試料用バッファーに添加することにより測定試料を調製する。測定試料用バッファーは、蛍光標識分子や非蛍光標識分子、退色防止剤、蛍光シグナル等に対する影響が少ないバッファーであれば、特に限定されるものではなく、通常一分子蛍光分析において用いられるバッファーを用いることができる。該バッファーとして、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等のリン酸バッファーやトリスバッファー等がある。測定試料用バッファーに添加する蛍光標識分子や非蛍光標識分子の濃度は、特に限定されるものではないが、１ｎＭ〜１０μＭであることが好ましい。また、蛍光標識分子よりも非蛍光標識分子の濃度が高いことがより好ましい。その他、退色防止剤の濃度は、蛍光標識分子の種類や濃度、退色防止剤の種類等を考慮して、適宜決定することができる。
【００２９】
次に、該測定試料に、該蛍光標識分子の標識に用いた蛍光色素の分光特性に最適な波長の光を照射し、該蛍光標識分子からの蛍光シグナルを、高感度な検出装置を用いて経時的に検出し、該蛍光シグナルの揺らぎと強度を計測する。蛍光シグナルの検出は、例えば、ＭＦ２０（オリンパス社製）等の公知の一分子蛍光分析システム等を用いて行うことができる。計測された蛍光シグナルをＦＩＤＡにより解析し、各蛍光標識分子の蛍光強度を求める。
【００３０】
例えば、蛍光標識分子と退色防止剤の濃度を一定とし、非蛍光標識分子濃度を増減させた場合に、各測定試料から求められる蛍光強度が変動するか否かにより、蛍光標識分子と非蛍光標識分子の分子間相互作用の有無を判別することができる。例えば、非蛍光標識分子濃度を増大させた場合に、蛍光強度が減少する場合等、非蛍光標識分子濃度依存的に蛍光強度が変化する場合には、蛍光標識分子と非蛍光標識分子は相互作用していると判断することができる。逆に、非蛍光標識分子濃度を増減させた場合に、蛍光強度が特に変化しない場合には、蛍光標識分子と非蛍光標識分子は相互作用しないと判断することができる。
その他、ＦＩＤＡ解析では、測定試料中の蛍光分子の密度や数量も求めることができるため、相互作用をしている分子数を定量することも可能である。つまり、測定試料中の相互作用をしている分子数と、相互作用をしていない分子数の比率が求められるため、結合定数（Ｋｄ値）等の分子間相互作用の程度を示す指標等も求めることができる。
【００３１】
本発明の分子間相互作用の解析方法は、検出用の蛍光色素として易退色性の蛍光色素を用いること、及び測定試料中に該蛍光色素の退色防止剤を添加すること以外は公知の一分子蛍光分析を行うことにより、簡便に分子間相互作用の有無を判別することができる。また、解析方法としてＦＩＤＡを用いることにより、迅速かつ高精度に蛍光シグナルを解析することが可能である。特に従来ＦＩＤＡでは非常に困難であった蛍光標識分子と非蛍光標識分子が１：１で反応する場合でも、分子間相互作用の有無を判別することができる。
【実施例】
【００３２】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３３】
[実施例１]
フルオレセイン標識ビオチンと抗ビオチン抗体との反応を退色防止剤としてシステアミンを添加し計測を行った。
まず、フルオレセイン標識ビオチン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）を、ＰＢＳバッファー（ＳＩＧＭＡ社製）を用いて希釈し、８ｎＭのフルオレセイン標識ビオチン溶液を調製した。また、抗ビオチン抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を、同様に希釈して、０、４、４０、２００、４００、２０００、４０００、１２０００ｎＭの抗ビオチン抗体溶液をそれぞれ調製した。さらに、粉末のシステアミン（ＳＩＧＭＡ社製）を、ＰＢＳバッファー（ＳＩＧＭＡ社製）に溶解させ、８０ｍＭのシステアミン溶液を調製した。
次に、フルオレセイン標識ビオチン溶液と、各濃度の抗ビオチン抗体溶液又はＰＢＳバッファーをそれぞれ２５μＬずつ混合し、室温で１５分間反応させた後、システアミン溶液を５０μＬずつそれぞれ添加して混合し、測定試料を調製した。該測定試料を測定用プレートに分注し、ＭＦ２０（オリンパス社製）にセットした後、波長：４８８ｎｍ、レーザーパワー：２００μＷ、測定時間：３秒間で蛍光シグナルを検出し、ＦＩＤＡ解析を行い、各測定試料中の蛍光標識分子（フルオレセイン標識ビオチン）の蛍光強度を求めた。なお、システアミン溶液に代えてＰＢＳバッファーを５０μＬずつそれぞれ添加して混合したものを、対照試料とし、同様にＦＩＤＡ解析を行い、各対照試料中の蛍光標識分子の蛍光強度を求めた。
【００３４】
ＦＩＤＡ計測では、計測領域内の分子１つあたりの蛍光量（蛍光強度）を計測することが可能であり、その値はＱ（ｋＨｚ）で表される。図１（ａ）は、各測定試料から求められたＱ値を抗ビオチン抗体濃度ごとにプロットした図であり、図１（ｂ）は、各対照試料から求められたＱ値を抗ビオチン抗体濃度ごとにプロットした図である。各測定試料から求められたＱ値は、抗ビオチン抗体濃度依存的に低下する傾向が観察され、フルオレセイン標識ビオチンと抗ビオチン抗体が相互作用することが確認できた。一方、対照試料から求められたＱ値は、各試料とも２０ｋＨｚ弱とほぼ一定であり、抗ビオチン抗体未添加の測定試料のＱ値（約７０ｋＨｚ）よりもはるかに低く、抗ビオチン抗体濃度を増大させても変化しなかった。これは、対照試料では、退色防止剤であるシステアミンがないために、測定前からフルオレセインが退色してしまっているためと推察される。
以上の結果から、本発明の分子間相互作用の解析方法を用いることにより、ＦＩＤＡ計測により分子間相互作用の有無を判別し得ることが明らかである。
【００３５】
[参考例１]
実施例１で使用したフルオレセイン標識ビオチンと抗ビオチン抗体とが相互作用をすることを、従来法であるＦＣＳ計測により確認した。
具体的には、実施例１と同様に調製した各測定試料を、測定用プレートに分注し、ＭＦ２０（オリンパス社製）にセットした後、波長：４８８ｎｍ、レーザーパワー：１００μＷ、測定時間：１５秒間で蛍光シグナルを検出し、ＦＣＳ解析を行い、各測定試料中の蛍光標識分子（フルオレセイン標識ビオチン）の並進拡散時間を求めた。
図２は、各測定試料から求められた並進拡散時間（μｓ）を抗ビオチン抗体濃度ごとにプロットした図である。抗ビオチン抗体濃度依存的な並進拡散時間の増大が観察された。これは、フルオレセイン標識ビオチンと抗ビオチン抗体の結合により、一分子あたりの分子サイズが増大していることを表しており、この結果から、両者の間に相互作用があることが明らかである。したがって、実施例１において観測されたＱ値の変化も、両者の相互作用によって引き起こされたものであるということができる。
【００３６】
[比較例１]
ＴＭＲ標識ビオチンと抗ビオチン抗体との反応を退色防止剤としてシステアミンを添加し計測を行った。ＴＭＲは通常ＦＩＤＡ計測において用いられる色素であり、高安定性の蛍光色素である。なお、この実験で用いるＴＭＲ標識ビオチンと抗ビオチン抗体が相互作用をすることは、参考例１と同様のＦＣＳ計測により、確認されている。
具体的には、フルオレセイン標識ビオチンに代えてＴＭＲ標識ビオチン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いた以外は、実施例１と同様にして、測定試料及び対照試料をそれぞれ調製した後、各試料中のＱ値を測定した。
図３（ａ）は、各測定試料から求められたＱ値を抗ビオチン抗体濃度ごとにプロットした図であり、図３（ｂ）は、各対照試料から求められたＱ値を抗ビオチン抗体濃度ごとにプロットした図である。ＴＭＲ標識ビオチンでは、実施例１とは異なり、システアミンの添加、不添加に関わらず、抗ビオチン抗体濃度依存的なＱ値の変化は観察されなかった。つまり、抗ビオチン抗体の添加の有無によってＱ値が変化しないため、ＴＭＲ標識ビオチンと抗ビオチン抗体の相互作用の有無は判別することができなかった。これは、ＴＭＲは高安定性の蛍光色素であるため、抗ビオチン抗体との反応による蛍光退色が生じていないためと推察される。
【００３７】
以上の結果から、通常のＦＩＤＡ計測では非常に検出が困難であった分子間相互作用であっても、本発明の分子間相互作用の解析方法を用いることにより、該分子間相互作用の有無を判別し得ることが明らかである。
【００３８】
[実施例２]
本発明の分子間相互作用の解析方法を用いて、ビオチンと抗ビオチン抗体のＫｄ値を算出した。具体的には、ＦＩＴＣ標識ビオチンと抗ビオチン抗体との反応を、退色防止剤としてシステアミンを添加し計測を行い、得られた測定値からＫｄ値を算出した。
まず、フルオレセイン標識ビオチンに代えてＦＩＴＣ標識ビオチン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いた以外は実施例１と同様にして、８ｎＭのＦＩＴＣ標識ビオチン溶液を調製した。また、実施例１と同様にして、０、４、４０、２００、４００、２０００、４０００、１２０００ｎＭの抗ビオチン抗体溶液、８０ｍＭのシステアミン溶液を、それぞれ調製した。
次に、ＦＩＴＣ標識ビオチン溶液と、各濃度の抗ビオチン抗体溶液又はＰＢＳバッファーをそれぞれ２５μＬずつ混合し、室温で１５分間反応させた後、システアミン溶液を５０μＬずつそれぞれ添加して混合し、測定試料を調製した。該測定試料を測定用プレートに分注し、ＭＦ２０（オリンパス社製）にセットした後、波長：４８８ｎｍ、レーザーパワー：２００μＷ、測定時間：５秒間、１０回で蛍光シグナルを検出し、ＦＩＤＡ解析を行い、各測定試料中の蛍光標識分子（ＦＩＴＣ標識ビオチン）の蛍光強度Ｑ（ｋＨｚ）を求めた。なお、システアミン溶液に代えてＰＢＳバッファーを５０μＬずつそれぞれ添加して混合したものを、対照試料とし、同様にＦＩＤＡ解析を行い、各対照試料中の蛍光標識分子の蛍光強度Ｑ（ｋＨｚ）を求めた。
図４は、得られたＱ値を添加した抗ビオチン抗体の濃度ごとにプロットした図である。このプロット図から、以下の式（１）を用いてフィッティングを行うことにより、Ｋｄ値を算出した。なお、フィッティングは、Ｏｒｉｇｉｎ８．０(Ｏｒｉｇｉｎ  Ｌａｂ社製)を用いて行った。
この結果、ビオチンと抗ビオチン抗体の結合におけるＫｄ値は５．８３×１０−８Ｍと算出された。すなわち、実施例２の結果から、本発明の分子間相互作用の解析方法を用いて、Ｋｄ値を算出し得ることが明らかである。
【数１】
2009250721.tif 000002
【００３９】
Ｙ：計測値Ｑ（ｋＨｚ）、Ｂｏｔｔｏｍ：Ｙの最小値、Ｔｏｐ：Ｙの最大値、
[Ａ]０：ＦＩＴＣ標識ビオチンの濃度(ｎＭ)、[Ｂ]０：添加した抗体濃度(ｎＭ)。
【００４０】
［参考例２］
本発明の分子間相互作用の解析方法において用いられ得る蛍光色素であるオレゴングリーンと、高安定性蛍光色素であるＴＡＭＲＡとを用いて、蛍光色素の安定性評価法の一例を示した。
まず、オレゴングリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）と、ＴＡＭＲＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）とを、それぞれＰＢＳバッファー（ＳＩＧＭＡ社製）を用いて希釈し、２ｎＭ溶液を調製した。
次に、各３０μＬを測定用プレートに分注し、ＭＦ２０（オリンパス社製）にセットした後、レーザーパワー：５００μＷ、測定時間：５秒間、５回で蛍光シグナルを検出し、ＦＩＤＡ解析を行い、各測定試料の全体の蛍光強度Ｃｏｕｎｔｒａｔｅ（ｋＨｚ）を求めた。なお、測定波長は、ＴＡＭＲＡ溶液を測定する場合には５４３ｎｍとし、オレゴングリーン溶液を測定する場合には４８８ｎｍとした。
図５は、各測定時のＣｏｕｎｔｒａｔｅ（ｋＨｚ）を、測定時間ごとにプロットした図である。図中、「０ｓｅｃ」が１回目の照射時を意味しており、「２０ｓｅｃ」が５回目の照射時のＣｏｕｎｔｒａｔｅ（ｋＨｚ）を意味している。（ａ）はオレゴングリーン溶液の測定結果であり、（ｂ）はＴＡＭＲＡ溶液の測定結果である。この結果、ＴＡＭＲＡ溶液では各測定時においてＣｏｕｎｔｒａｔｅはほぼ一定であるのに対して、オレゴングリーン溶液では、測定回数が多くなるほど、すなわち、レーザー光の照射時間が長くなるほどＣｏｕｎｔｒａｔｅが低下する傾向が観察された。具体的には、０秒と２０秒のＣｏｕｎｔｒａｔｅ（ｋＨｚ）を比較すると、ＴＡＭＲＡ溶液では４４１．３ｋＨｚ（０秒）から４３５．８ｋＨｚ（２０秒）と約１．２％しか蛍光強度の減衰が観察されなかったのに対して、オレゴングリーン溶液では７９ｋＨｚ（０秒）から５７ｋＨｚ（２０秒）と約２６．６％もの蛍光強度の減衰が観察された。つまり、オレゴングリーンは、適した励起波長のレーザー光を５００μＷの強度で５秒間の照射を５回繰り返した場合に、５回目の照射時の蛍光強度が、１回目の照射時の蛍光強度の２０％以上減衰する蛍光色素であり、易退色性であることが明らかである。
【００４１】
本発明の分子間相互作用の解析方法を用いることにより、蛍光標識分子と非蛍光標識分子が１：１で反応し反応体を形成している場合であっても、分子間相互作用の有無をＦＩＤＡ計測により判別することができるため、主に、生物科学、医学、薬学等の分野において利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】実施例１において、各試料から求められたＱ値（ｋＨｚ）を抗ビオチン抗体濃度ごとにプロットした図である。（ａ）は各測定試料から求められたＱ値であり、（ｂ）は各対照試料から求められたＱ値である。
【図２】参考例１において、各測定試料から求められた並進拡散時間（μｓ）を抗ビオチン抗体濃度ごとにプロットした図である。
【図３】比較例１において、各試料から求められたＱ値（ｋＨｚ）を抗ビオチン抗体濃度ごとにプロットした図である。（ａ）は各測定試料から求められたＱ値であり、（ｂ）は各対照試料から求められたＱ値である。
【図４】実施例２において、各試料から求められたＱ値（ｋＨｚ）を抗ビオチン抗体濃度ごとにプロットした図である。
【図５】参考例２において、各測定時のＣｏｕｎｔｒａｔｅ（ｋＨｚ）を、測定時間ごとにプロットした図である。（ａ）はオレゴングリーン溶液の測定結果であり、（ｂ）はＴＡＭＲＡ溶液の測定結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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