(57)【要約】【課題】本発明は、試料中のケイ酸含量の影響を受けることなく、精度よく、高感度かつ迅速にリン酸、ピロリン酸およびポリリン酸を測定する方法、並びにその利用を提供する。【解決手段】ルシフェラーゼとアデノシン３リン酸とが結合したＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体と、ルシフェリンと、試料とを反応させ、該反応により生じる発光を検出することにより、該試料中のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸を測定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸を測定する方法であって、
ルシフェラーゼとアデノシン３リン酸とが結合したＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体と、ルシフェリンと、試料とを反応させ、
該反応により生じる発光を検出することにより、上記試料中のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸を測定することを特徴とするリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の測定方法。
【請求項２】
上記ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体は、ルシフェラーゼとアデノシン３リン酸とがモル比で１：０．０００１〜１００の範囲で結合した複合体であることを特徴とする請求項１に記載のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の測定方法。
【請求項３】
上記ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体は、
ルシフェラーゼとアデノシン３リン酸とを、モル比で１：０．０００１〜１００の割合で混合し、４〜３０℃で、１０〜１０００分間インキュベーションし、
インキュベーション後、ルシフェラーゼと結合していないアデノシン３リン酸を除去することにより得られるＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体であることを特徴とする請求項１または２に記載のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の測定方法。
【請求項４】
上記のルシフェラーゼと結合していないアデノシン３リン酸は、上記ルシフェラーゼに対して１〜１０００倍モル量のルシフェリンを添加し、４〜３０℃で、１〜２０時間インキュベーションすることにより除去されることを特徴とする請求項３に記載のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の測定方法。
【請求項５】
上記ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体は、
ルシフェラーゼを発現する生物試料から、ヘキサメタリン酸、ピロリン酸、およびポリリン酸を含まない緩衝液を用いて精製したＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体であることを特徴とする請求項１または２に記載のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の測定方法。
【請求項６】
上記ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼまたはその変異型タンパク質であり、
上記ルシフェリンは、ホタルルシフェリンであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の測定方法。
【請求項７】
ルシフェラーゼとアデノシン３リン酸とが結合したＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体を含むことを特徴とするリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の測定キット。
【請求項８】
上記ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体は、ルシフェラーゼとアデノシン３リン酸とがモル比で１：０．０００１〜１００の範囲で結合した複合体であることを特徴とする請求項７に記載のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の測定キット。
【請求項９】
上記ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体は、
ルシフェラーゼとアデノシン３リン酸とを、モル比で１：０．０００１〜１００の割合で混合し、４〜３０℃で、１０〜１０００分間インキュベーションし、
インキュベーション後、ルシフェラーゼと結合していないアデノシン３リン酸を除去することにより得られるＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体であることを特徴とする請求項７または８に記載のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の測定キット。
【請求項１０】
上記のルシフェラーゼと結合していないアデノシン３リン酸は、上記ルシフェラーゼに対して１〜１０００倍モル量のルシフェリンを添加し、４〜３０℃で、１〜２０時間インキュベーションすることにより除去されることを特徴とする請求項９に記載のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の測定キット。
【請求項１１】
上記ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体は、
ルシフェラーゼを発現する生物試料から、ヘキサメタリン酸、ピロリン酸、およびポリリン酸を含まない緩衝液を用いて精製したＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体であることを特徴とする請求項７または８に記載のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の測定キット。
【請求項１２】
上記ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼまたはその変異型タンパク質であることを特徴とする請求項７〜１１のいずれか１項に記載のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の測定キット。
【請求項１３】
ルシフェラーゼとアデノシン３リン酸とを、モル比で１：０．０００１〜１００の割合で混合し、４〜３０℃で、１０〜１０００分間インキュベーションし、
インキュベーション後、ルシフェラーゼと結合していないアデノシン３リン酸を除去することを特徴とするＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体の製造方法。
【請求項１４】
上記のルシフェラーゼと結合していないアデノシン３リン酸は、上記ルシフェラーゼに対して１〜１０００倍モル量のルシフェリンを添加し、４〜３０℃で、１〜２０時間インキュベーションすることにより除去されることを特徴とする請求項１３に記載のＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体の製造方法。
【請求項１５】
ルシフェラーゼを発現する生物試料から、ヘキサメタリン酸、ピロリン酸、およびポリリン酸を含まない緩衝液を用いて精製することを特徴とするＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体の製造方法。
【請求項１６】
上記ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼまたはその変異型タンパク質であることを特徴とする請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン酸、ピロリン酸およびポリリン酸の測定方法、並びにその利用に関するものであって、より具体的には、ケイ酸の影響を受けることなく、精度よく、高感度かつ迅速にリン酸、ピロリン酸およびポリリン酸を測定することが可能なリン酸、ピロリン酸およびポリリン酸の測定方法、並びにその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
リンは全ての生命に必須な元素であり、リン酸およびリン酸化合物は生命現象の多くの局面で多様な役割を果たしている。例えば、エネルギー獲得プロセスやタンパク・脂質の二次代謝、核酸やリン脂質分子の骨格保持などリン酸は生命にとって非常に重要な物質である。また、生物におけるリン酸含有量は多く、環境中のリン酸濃度は数μｍｏｌ／ｌ程度と希薄であるのに対し、細胞中のリン酸濃度は数ｍｍｏｌ／ｌと環境中のリン酸濃度の１，０００倍にも達する。このように、リン酸は生物の生命活動と非常に密接な関係にある。
【０００３】
また、リン酸は、工業用水、生活排水、環境水、海水中等に含まれているが、環境への過剰なリン酸放出は、河川、海洋における富栄養化等の環境汚染を引き起こす。このような環境汚染を防止するため、リン酸値の環境基準が定められたり、リン酸放出に関して排水規制が行われたりしている。
【０００４】
このように、リン酸は、生物の生命活動にとって必須の化合物であるだけではなく、地球環境保全の観点からも注目される化合物である。そのため、環境分析や臨床検査等様々な分野において、リン酸の定量が行われる。
【０００５】
日本工業規格（ＪＩＳ）では、水中のリン酸の濃度を測定する方法として、測定物質と発色試薬の発色反応を利用する方法が規定されている。より具体的には、現在最も広く利用されているリン酸測定法として、モリブデン吸光光度法が挙げられる（非特許文献１を参照）。
【０００６】
モリブデン吸光光度法には、モリブデン黄法と、モリブデン青法とがある。モリブデン黄法では、リン酸イオンにモリブデン酸を加え、モリブデン酸錯体を生成させ、そのモリブデン酸錯体による光吸収（吸光度）を測定する。
【０００７】
一方、モリブデン青法は、試料中のリン酸濃度が低い場合に用いられる方法である。具体的には、モリブデン黄法におけるモリブデン酸錯体を、さらにアスコルビン酸で還元し、還元されたモリブデン酸錯体による光吸収（吸光度）を測定する。モリブデン吸光光度法はリン酸の定量性が高い。また、モリブデン青法によれば、感度が高いため、低濃度のリン酸を定量することができる。
【０００８】
ところで、ホタルルシフェラーゼは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を検出するために、一般的に広く用いられている酵素である（非特許文献２を参照）。ホタルルシフェラーゼは、ＡＴＰ、Ｍｇ２＋および酸素分子の存在下で、ホタルルシフェリンの酸化を触媒する。このとき、ホタルルシフェリンが酸化された結果生じるオキシルシフェリンが発光する。
【０００９】
このような生物発光は迅速、簡便かつ高感度であるため、ルシフェラーゼによるＡＴＰ検出法によれば、迅速、簡便かつ高感度にＡＴＰを検出することができる。そのため、ルシフェラーゼによるＡＴＰ検出法は、衛生検査の指針であるＨＡＣＣＰの標準法にもなっており、生化学や食品衛生、臨床検査の現場で広く用いられている。
【００１０】
また、ルシフェラーゼに関し、その有用性から、様々な改変型ルシフェラーゼが開発されている。例えば、本発明者らは、高感度にＡＴＰを検出することが可能なルシフェラーゼを開発し、該ルシフェラーゼは市販されている（特許文献１を参照）。
【特許文献１】特開２００７−１５９４４９号公報（平成１９（２００７）年６月２８日公開）
【非特許文献１】奥  修、吸光光度法ノウハウ  ケイ酸・リン酸・硝酸塩の定量分析  技報堂（２００２年１２月発行）
【非特許文献２】DeLuca,M.,and McElroy,W.D.,Kinetics of the firefly luciferase catalyzed reactions. Biochcmistry,26,912-925(1974)
【非特許文献３】Murphy, J. and J.P. Riley (1962): Modified single solution method for the determination of phosphate in natural water., Anal. Chim. Acta. 27, 31-36.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述したように、リン酸測定法としては、モリブデン吸光光度法が広く用いられている。しかしながら、モリブデン酸は、リン酸イオンだけではなく、ケイ酸イオンとも反応する。事実、モリブデン吸光光度法はケイ酸の測定法としても用いられる。そのため、ケイ酸を含有する試料中のリン酸を測定する場合、例えば、非特許文献３に記載されているように、酒石酸を添加して、ケイ酸塩の反応を抑制することが行われる。しかし、該試料中のリン酸の定量の誤差をより小さくするための技術が求められている。
【００１２】
また、モリブデン吸光光度法では、モリブデン酸錯体を形成させる必要がある。さらに、モリブデン青法では該モリブデン酸錯体をさらにアスコルビン酸で還元する必要がある。そのため、モリブデン吸光光度法によるリン酸測定は、迅速性に欠けるという問題がある。加えて、モリブデン吸光光度法でポリリン酸を測定する場合、モリブデン酸は、ポリリン酸イオンとは反応しないため、ポリリン酸をリン酸に加水分解した後、測定する必要がある。そのため、モリブデン吸光光度法を用いてポリリン酸を測定する場合、より多くの時間を要するという問題がある。
【００１３】
本発明は、上記問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、ケイ酸の影響を受けることなく、精度よく、高感度かつ迅速にリン酸、ピロリン酸およびポリリン酸を測定する方法、並びにその利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、特定の複合体を形成しているルシフェラーゼとルシフェリンと、リン酸、ピロリン酸またはポリリン酸とを反応させると、リン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の量に依存した強度の光を発することを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、以下の産業上有用な発明を包含する。
【００１５】
（１）試料中のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸を測定する方法であって、ルシフェラーゼとアデノシン３リン酸とが結合したＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体と、ルシフェリンと、試料とを反応させ、該反応により生じる発光を検出することにより、上記試料中のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸を測定することを特徴とするリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の測定方法。
【００１６】
（２）上記ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体は、ルシフェラーゼとアデノシン３リン酸とがモル比で１：０．０００１〜１００の範囲で結合した複合体であることを特徴とする（１）に記載のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の測定方法。
【００１７】
（３）上記ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体は、ルシフェラーゼとアデノシン３リン酸とを、モル比で１：０．０００１〜１００の割合で混合し、４〜３０℃で、１０〜１０００分間インキュベーションし、インキュベーション後、ルシフェラーゼと結合していないアデノシン３リン酸を除去することにより得られるＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体であることを特徴とする（１）または（２）に記載のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の測定方法。
【００１８】
（４）上記のルシフェラーゼと結合していないアデノシン３リン酸は、上記ルシフェラーゼに対して１〜１０００倍モル量のルシフェリンを添加し、４〜３０℃で、１〜２０時間インキュベーションすることにより除去されることを特徴とする（３）に記載のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の測定方法。
【００１９】
（５）上記ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体は、ルシフェラーゼを発現する生物試料から、ヘキサメタリン酸、ピロリン酸、およびポリリン酸を含まない緩衝液を用いて精製したＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体であることを特徴とする（１）または（２）に記載のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の測定方法。
【００２０】
（６）上記ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼまたはその変異型タンパク質であり、上記ルシフェリンは、ホタルルシフェリンであることを特徴とする（１）〜（５）のいずれかに記載のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の測定方法。
【００２１】
（７）ルシフェラーゼとアデノシン３リン酸とが結合したＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体を含むことを特徴とするリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の測定キット。
【００２２】
（８）上記ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体は、ルシフェラーゼとアデノシン３リン酸とがモル比で１：０．０００１〜１００の範囲で結合した複合体であることを特徴とする（７）に記載のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の測定キット。
【００２３】
（９）上記ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体は、ルシフェラーゼとアデノシン３リン酸とを、モル比で１：０．０００１〜１００の割合で混合し、４〜３０℃で、１０〜１０００分間インキュベーションし、インキュベーション後、ルシフェラーゼと結合していないアデノシン３リン酸を除去することにより得られるＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体であることを特徴とする（７）または（８）に記載のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の測定キット。
【００２４】
（１０）上記のルシフェラーゼと結合していないアデノシン３リン酸は、上記ルシフェラーゼに対して１〜１０００倍モル量のルシフェリンを添加し、４〜３０℃で、１〜２０時間インキュベーションすることにより除去されることを特徴とする（９）に記載のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の測定キット。
【００２５】
（１１）上記ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体は、ルシフェラーゼを発現する生物試料から、ヘキサメタリン酸、ピロリン酸、およびポリリン酸を含まない緩衝液を用いて精製したＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体であることを特徴とする（７）または（８）に記載のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の測定キット。
【００２６】
（１２）上記ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼまたはその変異型タンパク質であることを特徴とする（７）〜（１１）のいずれかに記載のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の測定キット。
【００２７】
（１３）ルシフェラーゼとアデノシン３リン酸とを、モル比で１：０．０００１〜１００の割合で混合し、４〜３０℃で、１０〜１０００分間インキュベーションし、インキュベーション後、ルシフェラーゼと結合していないアデノシン３リン酸を除去することを特徴とするＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体の製造方法。
【００２８】
（１４）上記のルシフェラーゼと結合していないアデノシン３リン酸は、上記ルシフェラーゼに対して１〜１０００倍モル量のルシフェリンを添加し、４〜３０℃で、１〜２０時間インキュベーションすることにより除去されることを特徴とする（１３）に記載のＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体の製造方法。
【００２９】
（１５）ルシフェラーゼを発現する生物試料から、ヘキサメタリン酸、ピロリン酸、およびポリリン酸を含まない緩衝液を用いて精製することを特徴とするＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体の製造方法。
【００３０】
（１６）上記ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼまたはその変異型タンパク質であることを特徴とする（１３）〜（１５）のいずれかに記載のＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体の製造方法。
【発明の効果】
【００３１】
本発明にかかるリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の測定方法は、以上のように、ルシフェラーゼとアデノシン３リン酸とが結合したＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体を用い、ルシフェリン存在下で試料と反応させる。このとき、試料中のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸は、ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体からＡＴＰを遊離させる。その結果、ＡＴＰとルシフェリンとが反応し、発光する。
【００３２】
上記ＡＴＰの遊離、すなわち発光量は、該試料中のリン酸においては０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ程度の範囲、ピロリン酸においては０．００１ｍＭ〜０．１ｍＭ程度の範囲、ポリリン酸においては０．００１ｍＭ〜１０ｍＭ程度の範囲でその量に比例する。
【００３３】
それゆえ、上記構成によれば、リン酸、ピロリン酸またはポリリン酸を測定することができるという効果を奏する。
【００３４】
また、ルシフェラーゼ触媒によるルシフェリンの酸化反応は、反応速度が速く、さらに、該反応により生じる発光は高感度に検出することができる。さらに、ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体から発光反応への推進は、ケイ酸イオンを含め、リン酸イオン以外の陰イオンでは行われない。
【００３５】
それゆえ、本発明にかかるリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の測定方法は、試料中に含まれるケイ酸の影響を受けることなく、高感度に、精度よく、かつ迅速にリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸を測定することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
本発明にかかる一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３７】
本発明にかかるリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の測定方法（以下、単に「本発明にかかる測定方法」ともいう）は、試料中のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸を測定する方法である。上記試料は、特に限定されるものではないが、液体試料であることが好ましい。リン酸、ピロリン酸またはポリリン酸を測定する試料が液体試料でない場合、該試料を溶解可能な溶媒に溶解して、得られた溶液を上記試料として用いることができる。
【００３８】
また、リン酸、ピロリン酸またはポリリン酸を測定する試料から、該試料中のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸を従来公知の方法で液体中に抽出し、該抽出液を上記試料として用いてもよい。
【００３９】
また、上記試料にリン酸、ピロリン酸およびポリリン酸のうち、複数が混合して含まれる場合、該試料の加水分解処理を行うことにより、該試料中の全リン酸量を測定することができる。
【００４０】
上記試料の加水分解処理方法は特に限定されるものではないが、例えば、ポリホスファターゼ（A soluble exopolyphosphatase of Saccharomyces cerevisiae. Purification and characterization. Wurst H, Kornberg A., J Biol Chem. 1994 Apr 15;269(15):10996-11001.を参照）で処理することにより、該試料中のポリリン酸を特異的にリン酸へと加水分解することができる。また、ピロホスファターゼ(Purification of yeast inorganic pyrophosphatase. HEPPEL LA, HILMOE RJ. J Biol Chem. 1951 Sep;192(1):87-94を参照)で処理することにより、該試料中のピロリン酸を特異的にリン酸へと加水分解することができる。したがって、このような方法を用いることにより、ピロリン酸とポリリン酸とを見分けることができる。
【００４１】
本明細書において、「リン酸」とは、液体中でリン酸イオンを生じるリン酸化合物、およびリン酸イオンが意図される。また、「ピロリン酸」とは、液体中でピロリン酸イオンを生じるピロリン酸化合物、およびピロリン酸イオンが意図される。さらに、「ポリリン酸」とは、液体中で、ポリリン酸イオン（（ＰＯ３−）ｎ（ｎは３以上の整数））を生じるポリリン酸化合物、およびポリリン酸イオンが意図される。
【００４２】
本発明にかかる測定方法を用いて測定可能なポリリン酸は特に限定されるものではないが、ポリリン酸に含まれるリン酸基の数ｎは、３〜１０００の整数であることが好ましい。上記範囲内であれば、定量性よくポリリン酸量を測定することができる。
【００４３】
本発明にかかる測定方法は、具体的には、アデノシン３リン酸（以下、「ＡＴＰ」ともいう）とルシフェラーゼとが結合したＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体と、上記試料と、ルシフェリンとを反応させ、該反応により生じる発光を検出する工程（以下、「発光検出工程」ともいう）を含んでいればよく、その他の具体的な構成は特に限定されるものではない。例えば、上記発光検出工程の前に、上記ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体を取得する工程（以下、「複合体取得工程」ともいう）を含んでいてもよい。
【００４４】
本発明にかかる測定方法の構成によれば、上記ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体と、上記試料と、ルシフェリンとは、迅速に反応する。該反応の結果、上記試料中のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸量に依存した強度の発光を発する。該発光は、従来公知の方法（詳細は後述する）で高感度に検出することができる。また、上記ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体は、リン酸、ピロリン酸またはポリリン酸とは反応するが、ケイ酸やその他の陰イオンとは反応しない。
【００４５】
したがって、本発明にかかる測定方法によれば、モリブデン吸光光度法のように試料中のケイ素の影響を受けることなく、高感度に、精度よく、かつ迅速に、試料中のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸を測定することができる。なお、本発明にかかる測定方法は、その感度は、モリブデン吸光光度法のそれと同等またはそれ以上である。つまり、本発明にかかる測定方法は、現在、最も汎用されるリン酸測定法であるモリブデン吸光光度法に代わるリン酸測定法として用いることができる。
【００４６】
以下、本発明にかかる測定方法を構成する上記複合体取得工程および発光検出工程について、より詳細に説明する。
【００４７】
＜Ｉ．複合体取得工程＞
複合体取得工程では、ＡＴＰとルシフェラーゼとが結合したＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体を取得する。本明細書において、「ルシフェラーゼ」とは、ＡＴＰを基質とするルシフェラーゼおよびそれらの変異型タンパク質が意図され、特に、ホタルルシフェラーゼまたはその変異型タンパク質であることが好ましい。
【００４８】
ホタルルシフェラーゼとしては、具体的には、例えば、ゲンジボタル（Luciola cruciata）、ヘイケボタル（Luciola lateralis）、東ヨーロッパのホタル（Luciola mingrelica）、および北アメリカのホタル（Photinus pyralis）等が挙げられる。これらのホタルルシフェラーゼは、それをコードするポリヌクレオチドが単離されており、大腸菌等の異種生物を用いて、組換えタンパク質を製造することができる。それゆえ、ルシフェラーゼタンパク質を容易に大量に取得することができる。
【００４９】
さらに、上記例示したようなホタルルシフェラーゼによれば、発光強度や、タンパク質の安定性を向上させた変異型タンパク質を製造することができる。
【００５０】
上記変異型タンパク質としては、具体的には、例えば、特開２００７−１５９４４９号公報に記載の高感度型ルシフェラーゼや、Kajiyama and Nakano， Biochemistry 32, pp.13795-13799, 1993に記載の熱安定性が向上したルシフェラーゼ等を挙げることができる。このような変異型タンパク質によれば、リン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の検出感度を向上させたり、再現性よくリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸を測定したりすることができる。
【００５１】
また、上記変異型タンパク質は、ルシフェラーゼと他のポリペプチドとが融合した融合タンパク質であってもよい。このような融合タンパク質としては、ルシフェラーゼと、該ルシフェラーゼを固定化するために用いられるポリペプチドとの融合タンパク質や、ルシフェラーゼまたはＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体を精製するために用いるタグが融合された融合タンパク質を挙げることができる。
【００５２】
また、本明細書において、「ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体」とは、ＡＴＰとルシフェラーゼとが結合した複合体が意図され、その結合様式については特に限定されるものではない。ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体において、ルシフェラーゼとＡＴＰとの結合モル比は特に限定されるものではないが、ルシフェラーゼとアデノシン３リン酸とがモル比で１：０．０００１〜１００の範囲で結合していることが好ましく、０．００１〜１：１の範囲で結合していることがより好ましい。
【００５３】
また、ルシフェラーゼにおいて、ＡＴＰが結合する部位についても特に限定されるものではなく、活性部位（触媒部位）でもよいし、それ以外の部位であってもよい。さらに、上記ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体は、リン酸、ピロリン酸またはポリリン酸、好ましくはポリリン酸、より好ましくはトリポリリン酸またはテトラポリリン酸が作用することにより、ＡＴＰとルシフェラーゼとに解離することが好ましい。
【００５４】
上記複合体取得工程において、ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体を取得する代表的な方法として、（ａ）ルシフェラーゼに対してＡＴＰを人為的に結合させることにより、ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体を取得する方法、（ｂ）ルシフェラーゼを発現する生物から、直接ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体を抽出し、ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体を取得する方法を挙げることができる。以下、方法（ａ）および方法（ｂ）について説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
【００５５】
（１）方法（ａ）
方法（ａ）では、まず、ルシフェラーゼを用意する。該ルシフェラーゼは、ルシフェラーゼ活性を有するものであればよいが、ＡＴＰを基質とするルシフェラーゼであることが好ましい。このようなルシフェラーゼであれば、ＡＴＰが結合していない状態のルシフェラーゼ、ＡＴＰが結合しているか否かが不明なルシフェラーゼ、およびＡＴＰが結合したルシフェラーゼ等、いかなる状態のルシフェラーゼであっても用いることができる。
【００５６】
上記ルシフェラーゼは、市販品であってもよいし、ルシフェラーゼを発現する生物から抽出することにより取得してもよい。ルシフェラーゼを発現する生物からルシフェラーゼを抽出する場合、該生物は特に限定されないが、ＡＴＰを基質とするルシフェラーゼを発現する生物であることが好ましい。
【００５７】
具体的には、例えば、ホタル等、ＡＴＰを基質とするルシフェラーゼを天然に発現する生物から、抽出して取得することが好ましい。また、ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能な宿主に導入し、宿主内で翻訳されて得られるルシフェラーゼを抽出して取得してもよい。
【００５８】
上記組換え発現ベクターは、プラスミドであってもよいが、プラスミドには限定されず、宿主に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。
【００５９】
宿主に外来ポリヌクレオチドを導入する場合、発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドを発現するように宿主内で機能するプロモーターが組み込まれていることが好ましい。組換え的に産生されたポリペプチドを精製する方法は、用いた宿主、ポリペプチドの性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のポリペプチドを精製することが可能である。
【００６０】
また、ルシフェラーゼを発現する生物から抽出したルシフェラーゼを用いる場合、該ルシフェラーゼは、部分精製または完全精製されていることが好ましい。ルシフェラーゼを発現する生物から、ルシフェラーゼを精製する方法は、特に限定されるものではなく、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製すればよい。
【００６１】
また、上記ルシフェラーゼを、無細胞タンパク質合成系（無細胞タンパク質合成法、無細胞タンパク質翻訳系とも呼ぶ）を用いて合成してもよい。無細胞タンパク質合成系としては、例えば、コムギ胚芽抽出液を用いる系、ウサギ網状赤血球抽出液を用いる系、大腸菌Ｓ３０抽出液を用いる系、および植物の脱液胞化プロトプラストから得られる細胞成分抽出液を用いる系が挙げられる。
【００６２】
一般的には、真核生物由来遺伝子の翻訳には真核細胞の系、すなわち、コムギ胚芽抽出液を用いる系またはウサギ網状赤血球抽出液を用いる系のいずれかが選択されるが、翻訳される遺伝子の由来（原核生物／真核生物）や、合成後のタンパク質の使用目的を考慮して、上記合成系から選択されればよい。
【００６３】
なお、無細胞タンパク質合成系を用いて、ルシフェラーゼを合成する場合、種々の市販のキットが用いることができる。さらに、上記ルシフェラーゼは、化学合成により合成してもよい。
【００６４】
また、上記ルシフェラーゼとして、変異型ルシフェラーゼを用いる場合、該変異型ルシフェラーゼは、天然に存在する変異型ルシフェラーゼであっても、人為的に作製された変異型ルシフェラーゼであってもよい。変異型ルシフェラーゼを人為的に作製する場合、その作製方法は、特に限定されるものではない。
【００６５】
例えば、部位特異的変異誘発法（例えば、Hashimoto-Gotoh, Gene 152, 271-275(1995)を参照）、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異ポリペプチドを作製する方法、またはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異ポリペプチド作製法を用いることによって、変異型ルシフェラーゼを作製することができる。なお、変異型ルシフェラーゼの作製には市販のキットを利用してもよい。
【００６６】
方法（ａ）では、次に、上記例示したような方法で調製したルシフェラーゼに対して、ＡＴＰを結合させる。具体的には、上記ルシフェラーゼとＡＴＰとを溶液中で混合し、得られた混合液をインキュベートすることにより、上記ルシフェラーゼとＡＴＰとを結合させる。上記混合液の溶媒は、特に限定されるものではないが、２価金属イオンを含有することが好ましい。
【００６７】
上記２価金属イオンとしては、具体的には、例えば、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋等を挙げることができ、中でも、Ｍｇ２＋であることが好ましい。上記２価金属イオンの濃度は特に限定されるものではないが、具体的には、０．１〜１００ｍＭであることが好ましく、１〜１０ｍＭであることがより好ましい。
【００６８】
また、上記溶媒は、ｐＨ４〜９の緩衝液であることが好ましく、ｐＨ７〜８の緩衝液であることがより好ましい。より具体的には、上記溶媒として、保存液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８ｍＭ ＭｇＣｌ２、５％トレハロース、ｐＨ７．４）、または、５０ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎ−ＮａＯＨ、５ｍＭ ＡｃＣｌ２、５％ トレハロース，ｐＨ ７．４を用いることが好ましい。上記溶媒によれば、ルシフェラーゼを安定化することができる。
【００６９】
また、上記混合液におけるルシフェラーゼとＡＴＰとの混合比率、インキュベーション温度およびインキュベーション時間は、特に限定されるものではなく、ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体を形成可能な混合比率、温度および時間であればよい。
【００７０】
具体的には、例えば、上記混合比率をモル比で１：０．００１〜１００、好ましくは１：０．１〜１とし、上記インキュベーション温度を４〜３０℃、好ましくは１８〜２８℃とし、さらに、上記インキュベーション時間を１０〜１０００分間、好ましくは３０〜６０分間とする実施形態が挙げられる。さらに、上記混合液におけるルシフェラーゼ濃度およびＡＴＰ濃度は特に限定されるものではない。
【００７１】
方法（ａ）では、次に、上記混合液をインキュベーションした後、ルシフェラーゼに結合していないＡＴＰを除去する。ＡＴＰを除去する方法は特に限定されるものではない。例えば、タンパク質と低分子化合物とを分離するクロマトグラフィー（例えば、脱塩カラムを用いたクロマトグラフィー）により、ＡＴＰを除去することができる。また、上記ルシフェラーゼに結合していないＡＴＰは、アピラーゼ等ＡＴＰ分解酵素によって、酵素的に除去することができる。
【００７２】
また、上記混合液に大過剰のルシフェリン、具体的には、例えば、ルシフェラーゼに対して１〜１０００倍モル量、好ましくは１〜１０倍モル量のルシフェリンを添加し、４〜３０℃、好ましくは４〜８℃で、１〜２０時間、好ましくは１２〜１６時間インキュベーションし、ルシフェラーゼに結合していないＡＴＰを該反応によって消費することによっても除去することができる。
【００７３】
上記例示したような方法で、上記混合液からＡＴＰを除去することにより、ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体を取得することができる。なお、上記ルシフェリンは、特に限定されるものではなく、上記ルシフェラーゼの基質となりうるルシフェリンを用いればよい。例えば、上記ルシフェラーゼとしてホタルルシフェラーゼまたはその変異型タンパク質を用いる場合、上記ルシフェリンとしてホタルルシフェリンを用いればよい。
【００７４】
（２）方法（ｂ）
方法（ｂ）では、ルシフェラーゼを発現する生物からＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体を直接抽出する。抽出後、さらに、該ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体を部分精製または完全精製することが好ましい。
【００７５】
方法（ｂ）では、ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体の抽出および精製の過程において、ヘキサメタリン酸、ピロリン酸、およびポリリン酸を含まない緩衝液を用いる。ヘキサメタリン酸、ピロリン酸、およびポリリン酸は、ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体をＡＴＰとルシフェラーゼとに解離させる。したがって、上記緩衝液を用いることにより、上記生物内に存在するＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体を、ＡＴＰとルシフェラーゼとに解離させることなく、ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体の状態で抽出および精製することができる。
【００７６】
特に、ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体の精製の最終段階では、緩衝液にリン酸を含有させないことが好ましい。これにより、ＡＴＰとルシフェラーゼとの解離をより効果的に抑制することができる。なお、上記ルシフェラーゼを発現する生物は、特に限定されるものではなく、上記例示したような生物、すなわち、ＡＴＰを基質とするルシフェラーゼを天然に発現する生物、および組換えルシフェラーゼタンパク質を発現する形質転換体生物を好ましく用いることができる。
【００７７】
以上、複合体取得工程について、詳細に説明したが、本発明には、該複合体取得工程、換言すれば、ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体の製造方法も含まれる。
【００７８】
＜ＩＩ．発光検出工程＞
発光検出工程では、上記複合体取得工程で取得したＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体と、ルシフェリンと、リン酸、ピロリン酸またはポリリン酸を測定する試料とを反応させる。そして、該反応により生じる発光を検出する。
【００７９】
上記発光検出工程において、上記反応は、溶液中で行うことが好ましい。該溶液の溶媒は特に限定されるものではなく、上記反応を進行させることが可能な溶媒であればよい。具体的には、２価金属イオンを含有し、ｐＨ４〜９、好ましくはｐＨ７〜８の緩衝液であることが好ましい。
【００８０】
上記２価金属イオンとしては、例えば、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋等を挙げることができ、中でも、Ｍｇ２＋であることが好ましい。上記２価金属イオンの濃度は特に限定されるものではないが、０．１〜１００ｍＭであることが好ましく、１〜１０ｍＭであることがより好ましい。
【００８１】
より具体的には、上記溶媒として、保存液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８ｍＭ ＭｇＣｌ２、５％トレハロース、ｐＨ７．４）を好ましく用いることができる。このような緩衝液を用いることにより、上記反応中、ｐＨが一定範囲に維持されるため、リン酸、ピロリン酸またはポリリン酸を安定に、かつ、再現性よく測定することができる。
【００８２】
また、上記反応は酸素と接する溶液中で行うことが好ましい。ルシフェラーゼが触媒する反応は、ルシフェリンの酸化反応である。つまり、上記反応には、酸素が必要である。したがって、上記のように、酸素と接する溶液中で反応を行うことにより、人為的に酸素を送り込まなくとも、溶液と酸素との接触界面から酸素が溶液中に溶解するため、上記反応を進行させることができる。
【００８３】
上記の反応系に加えるＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体の添加量は特に限定されるものではなく、ルシフェラーゼの活性や、試料中のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の量等に応じて、適宜設定されるものである。一般的には、約１００μｌ程のスケールで、０．１ｎｍｏｌ〜１０μｍｏｌ、好ましくは１ｎｍｏｌ〜４ｎｍｏｌのＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体を上記反応系に加える。
【００８４】
また、上記反応を溶液中で行う場合、その反応液中のＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体の濃度は、１μＭ〜１００ｍＭ、好ましくは１０μＭ〜４０μＭとする。上記範囲内でＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体を上記反応系に加えることにより、広い濃度範囲で、精度よく、リン酸、ピロリン酸またはポリリン酸を測定することができる。
【００８５】
上記反応の反応系に加えるルシフェリンは、特に限定されるものではなく、上記ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体を構成するルシフェラーゼの基質となりうるものであればよい。具体的には、例えば、ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体を構成するルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼである場合には、上記ルシフェリンとしてホタルルシフェリンを用いることが好ましい。また、上記ルシフェリンは、ルシフェリンを天然に合成する生物から取得してもよいし、化学合成により取得してもよい。もちろん、市販品を用いてもよい。
【００８６】
また、上記反応系に加えるルシフェリンの添加量は、ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体に対して過剰量であればよく特に限定されない。具体的には、ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体に対して、１〜１０００倍モル量のルシフェリンを添加することが好ましく、５〜３０倍モル量のルシフェリンを添加することがより好ましい。上記範囲内で、ルシフェリンを添加することにより、上記試料中に含まれるリン酸、ピロリン酸、またはポリリン酸を定量的に測定することができる。
【００８７】
上記発光検出工程において、リン酸、ピロリン酸またはポリリン酸を測定する試料の添加量は、特に限定されるものではない。具体的には、既知濃度のリン酸溶液またはポリリン酸溶液を用いて、本発明にかかる測定方法により検量線を作成し、該検量線において直線性のあるリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の濃度範囲に含まれるように、上記試料を適宜希釈または濃縮して添加すればよい。
【００８８】
試料中の特定の物質を定量する場合、このように、検量線を作成し、該特定の物質を測定する試料の測定値が、その検量線で直線性のある範囲に含まれるように、該試料を適宜希釈もしくは濃縮して添加することは、当業者が日常的に行う常套手段である。
【００８９】
また、上記反応の反応温度および反応時間は特に限定されるものではなく、発光が生じることが可能な反応温度および反応時間であればよい。一般的には、ルシフェラーゼの発光応答に要する時間は非常に短い。また、反応温度は、一般的には、１０〜２０℃とすることが好ましい。また、上記反応を行うための容器も特に限定されるものではなく、上記反応により生じる発光の検出を妨げないものであればよい。例えば、マイクロチューブ、マイクロプレートおよびマイクロチャネルチップ等を用いることができる。
【００９０】
また、上記発光検出工程において、上記発光の検出に用いる装置は、特に限定されるものではなく、光量を測定することが可能な装置であればよい。具体的には、例えば、ルミノメーター、ゲルマニウムフォトダイオード、ガリウムヒ素フォトダイオード、フォトトランジスタ、ＣＣＤ素子等を用いることができる。
【００９１】
また、発光の測定時間および測定温度は特に限定されない。測定時間は、一連の試料の測定において、同一すればよく、具体的な測定時間や、測定開始時期は特に限定されない。また、より測定精度を向上させるために、測定は複数回行い、その平均値を測定値として採用することが好ましい。また、測定温度は特に限定されるものではないが、一般的には室温、具体的には、１０〜２０℃で行えばよい。
【００９２】
本発明にかかる測定方法は、上記発光検出工程を少なくとも備えているため、上記発光検出工程における反応により生じる発光を検出することにより、リン酸、ピロリン酸またはポリリン酸を測定することができる。
【００９３】
本発明にかかる測定方法を用いて、試料中のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸を定量する場合、具体的には、まず、濃度が既知のリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸を含む標準溶液を作製し、該標準溶液を用いて、本発明にかかる測定方法を実施し、検量線を作成する。その後、リン酸、ピロリン酸またはポリリン酸を測定する試料を用いて、本発明にかかる測定方法を実施する。その結果得られた光量値を検量線に照らすことで、上記試料に含まれるリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸を定量することができる。
【００９４】
以上のように、本発明にかかる測定方法によれば、ルシフェラーゼを用いてリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸を定量することができる。ルシフェラーゼの触媒によるルシフェリンの酸化反応は、非常に反応速度が高いため、本発明にかかる測定方法によれば、従来汎用されるモリブデン吸光光度法よりも、迅速にリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸を測定することができる。
【００９５】
また、ルシフェリンの酸化反応により生じる発光は、高感度に検出することができるため、本発明にかかる測定方法によれば、試料中に含まれる微量なリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸を測定することができる。
【００９６】
さらに、本発明にかかる測定方法で用いるＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体は、リン酸とは反応するが、ケイ酸等の陰イオンとは反応しない。そのため、モリブデン吸光光度法とは異なり、本発明にかかる測定方法によれば、試料中に含まれるケイ酸の影響を受けずに、リン酸、ピロリン酸またはポリリン酸を精度よく測定することができる。
【００９７】
また、本発明にかかる測定方法では、ポリリン酸を加水分解せずにそのままの状態で測定することができる。そのため、モリブデン吸光光度法のような従来法と比較して、簡便にポリリン酸の測定を行うことができる。
【００９８】
以上、本発明の一実施形態としてリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の測定方法について説明したが、本発明は、別の実施形態として、本発明にかかる測定方法を実施するために好適に利用可能なリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の測定キット（以下、単に「本発明にかかる測定キット」ともいう）を提供する。
【００９９】
本発明にかかる測定キットは、本発明にかかる測定方法を実施するために用いる試薬、器具、および装置のうち、少なくとも１つを含むものであればよく、その具体的な構成は特に限定されるものではない。具体的には、例えば、上述したＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体を含むキットを挙げることができる。
【０１００】
また、別の実施形態としては、上記ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体に加えて、上記発光検出工程で用いるルシフェリン、緩衝液、反応容器（発光測定用容器）、および発光検出装置等を含むキットが挙げられる。
【０１０１】
本発明にかかるリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸の測定キットの構成品は、本発明にかかる測定方法に用いられるものであることを、本明細書を読んだ当業者には容易に理解されるものである。
【０１０２】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１０３】
本発明について、実施例および比較例、並びに図１〜図１３に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。
【０１０４】
〔実施例１：ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体の調製〕
北米産ホタル由来ルシフェラーゼ（以下、「野生型ルシフェラーゼ」ともいう）をコードする遺伝子および本発明者らが独自に取得した高感度型ルシフェラーゼ（以下、「ルシフェラーゼＦＭ」ともいう）をコードする遺伝子を、それぞれ、ｐＥＴ２８ａ（Novagen）に挿入した。
【０１０５】
得られた発現ベクターを大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株に形質転換した。該形質転換体大腸菌を、最終濃度５０μｇ／ｍｌのカナマイシン硫酸塩を添加した１ｌのTerrific培地（トリプトン１２ｇ、酵母エキス２４ｇ、グリセロール４ｍｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ２．３１ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４１２．５４ｇ）で培養し、対数増殖期に最終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加え、ルシフェラーゼの発現を誘導した。
【０１０６】
培養後、上記形質転換体大腸菌を集菌し、リン酸緩衝液Ａ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を菌体１ｇに対して１０ｍｌの割合で添加し、懸濁後、菌体を超音波破砕した。その後、３０，０００×ｇで３０分間遠心分離を行い、得られた上清に最終濃度０．１７ｍＭになるようにＰＭＳＦを添加して、さらに３０，０００×ｇで３０分間遠心分離を行った。その後、回収した上清を０．４５μｍのフィルターでろ過後、０．２μｍのフィルターで濾過した。
【０１０７】
こうして得られた濾液から野生型ルシフェラーゼおよびルシフェラーゼＦＭをニッケルカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製した。まず、His-Trap HP 5ml（GE Helthcare Biosciences）に対し、５０ｍｌの結合緩衝液Ａ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）を流速５ｍｌ／ｍｉｎで供し、カラムの平衡化を行った。
【０１０８】
菌体１５ｇ相当分の上記濾液を該カラムに供し、１００〜１５０ｍｌの結合緩衝液Ａを用いてカラムを平衡化後、上記結合緩衝液Ａと溶出緩衝液Ｂ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）とを用いて、イミダゾール濃度を１０分間で２０ｍＭから５００ｍＭに上昇させるリニアグラジェントにより、タンパク質を溶出した。回収した溶出画分を約２．５ｍｌずつＰＤ−１０（GE Helthcare Biosciences）に供し、緩衝液を保存液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ 、８ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０％トレハロース、ｐＨ７．４）に置換した。
【０１０９】
なお、ＰＤ−１０による緩衝液置換により、上記溶出画分の容量は、２倍量となった。こうして緩衝液が置換された上記溶出画分に対してアピラーゼを５００Ｕ添加し、３７℃で１時間保温して、再度上記と同様の方法で精製した。
【０１１０】
得られた溶出画分はＰＤ−１０に供し、緩衝液を、保存液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８ｍＭ ＭｇＣｌ２、５％トレハロース、ｐＨ７．４）に置換して、その後、最終濃度１．５ｍＭになるようにルシフェリンを添加し、北米産ホタル由来ルシフェラーゼとルシフェリンとを含む反応液（以下、「野生型ルシフェラーゼ反応液」ともいう）、および高感度型ルシフェラーゼとルシフェリンとを含む反応液（以下、「ルシフェラーゼＦＭ反応液」ともいう）を得た。
【０１１１】
なお、野生型ルシフェラーゼ反応液およびルシフェラーゼＦＭ反応液に含まれるルシフェラーゼ（ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体）を、以下、それぞれ、野生型ルシフェラーゼおよびルシフェラーゼＦＭと称する。上記野生型ルシフェラーゼ反応液およびルシフェラーゼＦＭ反応液中のルシフェラーゼ酵素量は、いずれも０．２５ｍｇ／ｍｌであった。
【０１１２】
〔比較例１、ＡＴＰ非結合型ルシフェラーゼの調製〕
上記と同じ高感度型ルシフェラーゼをコードする遺伝子をｐＥＴ２８ａ（Novagen）に挿入した。得られた発現ベクターを大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株に形質転換して、最終濃度５０μｇ／ｍｌのカナマイシン硫酸塩を添加した１ｌのTerrific培地（トリプトン１２ｇ、酵母エキス２４ｇ、グリセロール４ｍｌ、ＫＨ２ＰＯ４２．３１ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ １２．５４ｇ）で培養し、対数増殖期に最終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加え、ルシフェラーゼの発現を誘導した。
【０１１３】
培養後、該形質転換体大腸菌を集菌し、菌体１ｇに対して１０ｍｌのリン酸緩衝液Ｂ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭヘキサメタリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）を加え、菌体を懸濁後、超音波破砕した。その後、３０，０００×ｇで３０分間遠心分離を行い、得られた上清に最終濃度０．１７ｍＭとなるようにＰＭＳＦを添加して、さらに３０，０００×ｇで３０分間遠心分離を行った。回収した上清を０．４５μｍのフィルターでろ過後、０．２μｍのフィルターで濾過した。
【０１１４】
こうして得られた濾液から高感度型ルシフェラーゼを、ニッケルカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。His-Trap HP 1mlに対し、１０ｍｌの結合緩衝液Ｃ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、５ｍＭヘキサメタリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）を流速１ｍｌ／ｍｉｎで供し、カラムの平衡化を行った。
【０１１５】
その後、上記濾液をカラムに供し、１０ｍｌの結合緩衝液Ｃでカラムを洗浄後、２０〜３０ｍｌの結合緩衝液Ａでカラムの平衡化を行った。その後、１０分間のリニアグラジェントにより、結合緩衝液Ａから溶出緩衝液Ｂに溶液を置換し、タンパク質を溶出した。
【０１１６】
回収した溶出画分を約２．５ｍｌずつＰＤ−１０に供し、緩衝液を保存液に置換した後、最終濃度１．５ｍＭとなるようにルシフェリンを添加し、高感度型ルシフェラーゼとルシフェリンとを含む反応液（以下、「ルシフェラーゼＦＭ２反応液」ともいう）を得た。なお、ルシフェラーゼＦＭ２反応液に含まれる高感度型ルシフェラーゼ（ＡＴＰ非結合型ルシフェラーゼ）を、以下、ルシフェラーゼＦＭ２を称する。上記ルシフェラーゼＦＭ２反応液中のルシフェラーゼ酵素量は０．２５ｍｇ／ｍｌとした。
【０１１７】
なお、比較例１では、ヘキサメタリン酸によってルシフェラーゼからＡＴＰを遊離させ、ＡＴＰ非結合型ルシフェラーゼを取得したが、該ＡＴＰ非結合型ルシフェラーゼの調製方法の詳細については、上記特許文献１を参照されたい。
【０１１８】
〔実施例２：ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体のリン酸およびピロリン酸に対する応答〕
滅菌水（超純水を１２１℃、９０分間オートクレーブで滅菌処理したもの）を用いて、１Ｍリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）および１Ｍピロリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）を調製した。次に、１Ｍリン酸ナトリウム溶液および１Ｍピロリン酸ナトリウム溶液を滅菌水で希釈して、５００ｍＭ、１００ｍＭ、１０ｍＭ、１ｍＭ、１００μＭ、１０μＭ、および１μＭの希釈溶液を調製した。
【０１１９】
実施例１で調製した野生型ルシフェラーゼ反応液またはルシフェラーゼＦＭ反応液をルミチューブ（キッコーマン）に４５μｌずつ入れた。そこに、上記のリン酸ナトリウムまたはピロリン酸ナトリウムの希釈溶液を５μｌずつ加えて、１秒後にルミテスターＣ−１００（キッコーマン）で１０秒間発光値を測定した。測定は３回行い、平均値を求めた。図１および図２は、それぞれ、リン酸ナトリウム濃度と発光値との関係をグラフ化した図、およびピロリン酸ナトリウム濃度と発光値との関係をグラフ化した図である。
【０１２０】
図１に示すように、野生型ルシフェラーゼ反応液およびルシフェラーゼＦＭ反応液に滅菌水を添加したときの発光強度は、それぞれ、８２（ｒｌｕ）および９２（ｒｌｕ）であった。野生型ルシフェラーゼおよびルシフェラーゼＦＭは、ともに、リン酸を添加すると、発光応答を示した（図１を参照）。リン酸添加に対する発光応答による発光値は、野生型ルシフェラーゼおよびルシフェラーゼＦＭともに、リン酸濃度が１００ｍＭのときが最も高かった。
【０１２１】
また、１００μＭ〜１００ｍＭの濃度範囲では、添加するリン酸濃度の上昇に伴い、発光値が増加した。一方、１００ｍＭ以上の濃度のリン酸を添加すると、１００ｍＭリン酸を添加したときよりも逆に発光値は減少した。
【０１２２】
ピロリン酸添加に対しても、野生型ルシフェラーゼおよびルシフェラーゼＦＭは、ともに発光応答を示したが、その最大発光は、１ｍＭの濃度のピロリン酸を添加したときに観察された（図２を参照）。また、野生型ルシフェラーゼおよびルシフェラーゼＦＭともに、１００μＭ〜１ｍＭの濃度範囲では、添加するピロリン酸の濃度の増加に伴って発光値が上昇する傾向が見られた。一方、１ｍＭ以上の高濃度のピロリン酸を添加すると、１ｍＭのピロリン酸を添加したときよりも逆に発光値は減少した。
【０１２３】
〔実施例３：発光応答のリン酸およびピロリン酸に対する依存性の確認〕
実施例２と同様に、１Ｍリン酸ナトリウム溶液および１Ｍピロリン酸ナトリウム溶液を調製した。次に、１Ｍリン酸ナトリウム溶液を滅菌水で希釈して、１００ｍＭリン酸ナトリウム溶液を調製した。同様に、１Ｍピロリン酸ナトリウム溶液を滅菌水で希釈して、１ｍＭピロリン酸ナトリウム溶液を調製した。
【０１２４】
実施例１で調製したルシフェラーゼＦＭ反応液を、４５μｌずつルミチューブに入れ、そこに、１００ｍＭリン酸ナトリウム溶液または１ｍＭピロリン酸ナトリウム溶液を５μｌずつ加えて、１秒後から７０分間、１０分間隔で、ルミテスターＣ−１００により発光値を測定した。７０分後、各反応液（５０μｌ）にさらに１００ｍＭリン酸ナトリウム溶液または１ｍＭピロリン酸ナトリウム溶液を５μｌずつ添加して、１０秒間発光値を測定した。その結果を図３および図４に示す。なお、図３は、ルシフェラーゼＦＭに１００ｍＭリン酸ナトリウム溶液を添加後、経時的に発光値を測定し結果を示す図であり、図４は、ルシフェラーゼＦＭに１ｍＭピロリン酸ナトリウム溶液を添加後、経時的に発光値を測定した結果を示す図である。
【０１２５】
図３および図４に示すように、リン酸ナトリウムおよびピロリン酸ナトリウムのどちらの希釈溶液を添加した場合にも、約６０分経過後にはほぼ発光が終了した。すなわち、ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体のＡＴＰがすべて消費されたことを意味する。実際７０分間反応させた後、１００ｍＭリン酸ナトリウム溶液または１ｍＭのピロリン酸ナトリウム溶液を反応液に添加したが、発光は見られなかった。これはまた、観察された発光がリン酸溶液またはピロリン酸溶液に混入したＡＴＰによるものではないことを意味する。
【０１２６】
〔実施例４：リン酸およびピロリン酸の定量性の検証〕
実施例２と同様に、１Ｍリン酸ナトリウム溶液および１Ｍピロリン酸ナトリウム溶液を調製した。次に、１Ｍリン酸ナトリウム溶液を滅菌水で希釈して、５ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、５００μＭ、１００μＭ、５０μＭ、および１０μＭの希釈溶液を調製した。また、１Ｍピロリン酸ナトリウム溶液を滅菌水で希釈して、１００μＭ、５０μＭ、１０μＭ、５μＭ、２μＭ、および１μＭの希釈溶液を調製した。
【０１２７】
実施例１で調製したルシフェラーゼＦＭ反応液をルミチューブに４５μｌずつ入れ、そこに、上記のリン酸ナトリウムまたはピロリン酸ナトリウムの希釈溶液を５μｌずつ加えて１秒後にルミテスターＣ−１００で１０秒間発光値を測定した。測定は３回行い、平均値を求めた。そして、横軸をリン酸またはピロリン酸濃度、縦軸を発光強度として、測定した発光値をプロットし、近似線を作成した。
【０１２８】
その結果、図５に示すように、ルシフェラーゼＦＭ反応液に添加するリン酸濃度が１０μＭ〜５ｍＭの濃度範囲のとき、リン酸濃度と発光値とは直線関係にあった。最低では１μＭのリン酸の検出が可能であった。同様に、図６に示すように、ルシフェラーゼＦＭ反応液に添加するピロリン酸濃度が１μＭ〜１００μＭの濃度範囲のとき、ピロリン酸濃度と発光値は直線関係であった。最低では０．１μＭのピロリン酸の検出が可能であった。これらの結果から、本実施例の条件では、１μＭ〜５ｍＭの濃度範囲でリン酸を定量的に測定できることがわかった。また、ピロリン酸については、０．１μＭ〜１００μＭの濃度範囲で、定量的に測定できることがわかった。
【０１２９】
〔実施例５：各種陰イオンに対するＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体の応答〕
滅菌水を用いて、１Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）、１Ｍ硫酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）、１Ｍ硝酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）、１Ｍ炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）、１Ｍケイ酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）、および１Ｍリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）をそれぞれ調製した。その後、調製した各溶液を１２１℃、９０分間オートクレーブで滅菌処理した。滅菌処理後、各溶液を滅菌水で希釈し、１００ｍＭ、１０ｍＭ、１ｍＭ、１００μＭ、１０μＭ、および１μＭの希釈溶液を調製した。
【０１３０】
実施例１で調製した野生型ルシフェラーゼ反応液またはルシフェラーゼＦＭ反応液を、４５μｌずつルミチューブに入れ、そこで、上記の各種希釈溶液を５μｌずつ加えて１秒後にルミテスターＣ−１００で１０秒間発光値を測定した。測定は３回行い、平均値を求めた。
【０１３１】
その結果、図７および図８に示すように、リン酸イオン以外の陰イオン、具体的には、塩化物イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、炭酸イオン、およびケイ酸イオンに対しては、野生型ルシフェラーゼおよびルシフェラーゼＦＭともに、発光応答を示さなかった。このことから、野生型ルシフェラーゼおよびルシフェラーゼＦＭはともに、ケイ酸イオン等の陰イオンには発光応答せず、リン酸イオンに対して特異的に発光応答することがわかった。
【０１３２】
〔実施例６：各鎖長のリン酸に対するＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体の応答〕
滅菌水を用いて、１００ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）、１００ｍＭピロリン酸（Ｐｎ＝２）ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）、１００ｍＭトリポリリン酸（Ｐｎ＝３）ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）、１００ｍＭテトラポリリン酸（Ｐｎ＝４）ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）、１００ｍＭヘキサメタリン酸（Ｐｎ＝〜１３）ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）、および１００ｍＭポリリン酸（Ｐｎ＝〜６５）ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）を調製した。次に、調製した各溶液を滅菌水で希釈して、１００ｍＭ、１０ｍＭ、１ｍＭ、１００μＭ、１０μＭ、および１μＭの希釈溶液を調製した。
【０１３３】
実施例１で調製したルシフェラーゼＦＭ反応液を、４５μｌずつルミチューブに入れ、そこに、上記の各種希釈溶液を５μｌずつ加えて１秒後にルミテスターＣ−１００で１０秒間発光値を測定した。測定は３回行い、平均値を求めた。
【０１３４】
その結果、図９に示すように、全ての鎖長のポリリン酸において、リン酸やピロリン酸と同様の発光応答が見られた。各鎖長のポリリン酸のうち、トリポリリン酸およびテトラポリリン酸は、低濃度における発光値が最も高かった。また、リン酸鎖長が長くなるにつれて発光応答が減少する傾向が見られた。このように、ルシフェラーゼは、リン酸やピロリン酸だけではなく、ポリリン酸化合物に対しても発光応答を示した。このことから、本発明にかかる測定方法によれば、ポリリン酸をリン酸まで加水分解することなく、ポリリン酸のまま、直接測定できることがわかった。
【０１３５】
〔実施例７：ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体とＡＴＰ非結合型ルシフェラーゼとにおけるリン酸への応答の比較〕
滅菌水を用いて、１Ｍリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）を調製した。次に、１Ｍリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）を滅菌水で希釈して、１００ｍＭ、１０ｍＭ、１ｍＭ、１００μＭ、１０μＭ、および１μＭの希釈溶液を調製した。
【０１３６】
実施例１で調製したルシフェラーゼＦＭ反応液または比較例１で調製したルシフェラーゼＦＭ２（ＡＴＰ非結合型）反応液を、４５μｌずつルミチューブに入れ、そこに、１．６５ｎＭ、１６５ｐＭ、１６．５ｐＭ、１．６５ｐＭ、１６５ｆＭのＡＴＰ溶液を５μｌずつ加えて、１秒後にルミテスターＣ−１００で１０秒間発光値を測定した。これにより、ルシフェラーゼＦＭとルシフェラーゼＦＭ２との酵素活性を比較した。
【０１３７】
その結果、図１０に示すように、ＡＴＰに対する発光応答は、いずれのルシフェラーゼでも同等であった。したがって、ルシフェラーゼＦＭおよびルシフェラーゼＦＭ２は、ともに、同等の酵素活性を有することがわかった。
【０１３８】
次に、実施例１で調製したルシフェラーゼＦＭ反応液または比較例１で調製したルシフェラーゼＦＭ２反応液を、４５μｌずつルミチューブに入れ、そこに、上記のリン酸ナトリウム希釈溶液を５μｌずつ加えて１秒後にルミテスターＣ−１００で１０秒間発光値を測定した。測定は３回行い、平均値を求めた。
【０１３９】
その結果、図１１に示すように、リン酸に対して、ルシフェラーゼＦＭは発光応答を示したが、ルシフェラーゼＦＭ２は発光応答を示さなかった。比較例１に記載したように、ルシフェラーゼＦＭ２の精製段階には、ＡＴＰ非結合型にするヘキサメタリン酸を添加した緩衝液を用いたため、リン酸に応答しなかった。つまり、リン酸に対するルシフェラーゼの発光応答は、ＡＴＰが結合しているルシフェラーゼによる発光応答であると考えられる。
【０１４０】
以上の実施例１〜７、比較例１の結果から、野生型ルシフェラーゼおよびルシフェラーゼＦＭにはＡＴＰが結合しており、ルシフェリン存在下で、リン酸や高分子リン酸が添加されると、ルシフェラーゼに結合しているＡＴＰが遊離し、発光するものと考えられる。つまり、実施例１で調製した野生型ルシフェラーゼおよびルシフェラーゼＦＭは、本発明にかかるＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体である。
【０１４１】
また、野生型ルシフェラーゼおよびルシフェラーゼＦＭはルシフェリンが存在していても、リン酸や高分子リン酸を添加しないと発光しない。このことから、野生型ルシフェラーゼおよびルシフェラーゼＦＭに結合しているＡＴＰは、酵素活性中心とは別の領域に結合していることが考えられる。
【０１４２】
さらに、野生型ルシフェラーゼおよびルシフェラーゼＦＭは、リン酸イオン以外の各種陰イオンに対して発光応答しなかったことから、野生型ルシフェラーゼおよびルシフェラーゼＦＭに結合しているＡＴＰは、リン酸イオン以外の各種陰イオンの添加によっては遊離しないと考えられる。つまり、ＡＴＰの野生型ルシフェラーゼおよびルシフェラーゼＦＭへの結合は、静電的な結合様式によるものだけではないと考えられる。このことは、ＡＴＰのリン酸鎖長に近いトリポリリン酸やテトラポリリン酸に対して、最も強い発光応答を示したことからも示唆される。
【０１４３】
〔実施例８：市販品ルシフェラーゼＦＭ２を用いたＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体の調製、および該ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体を用いたリン酸測定〕
市販品ルシフェラーゼＦＭ−２（Lot No.0601004） １ｍｇ（luciferase 60kDa:17nmol）を９９０μｌの滅菌水に溶解し、ルシフェラーゼＦＭ−２溶液を得た。次に、そのルシフェラーゼＦＭ−２溶液に１６.５μｍｏｌ、１．６５μｍｏｌ、１６５ｎｍｏｌ、１６．５ｎｍｏｌ、１．６５ｎｍｏｌ、１６５ｐｍｏｌのＡＴＰを添加し、３０分間室温に放置した。これにより、ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体が形成される。
【０１４４】
その後、ＡＴＰとルシフェラーゼＦＭ−２との混合液（換言すれば、ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体を含有する溶液）のそれぞれに、最終濃度１．５ｍＭになるようにＤ−ルシフェリンを添加し、反応液の一部の５０μｌを用いて、ルミノメーターで発光を測定した。残りの反応液は、４℃で一晩保温した。これにより、ルシフェラーゼＦＭ−２に結合していないＡＴＰが除去される。次に、一晩４℃で保温した反応液から５０μｌを採取し、発光値を測定した。
【０１４５】
その結果、表１に示すように、ＡＴＰ／ルシフェラーゼが１〜１０といったモル比によるＡＴＰ添加では、複合体形成に関与しなかったＡＴＰが一晩の反応でも反応しきれずに残存していることが確認できた。
【０１４６】
一方、ＡＴＰ／ルシフェラーゼが１／１０〜１／１０００のモル比によるＡＴＰ添加では、複合体形成に関与しなかったＡＴＰが一晩の反応で、ほぼ除去された。このような条件で調製したＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体をリン酸の測定に用いると、バックグラウンドが高いため、高感度なリン酸検出ができない。したがって、これらのモル比によるＡＴＰ添加で得られたＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体は、リン酸測定に用いることができることが分かった。
【０１４７】
【表１】
2009050167.tif 000002
【０１４８】
また、４℃で一晩保温した残りの反応液（ＡＴＰ／ルシフェラーゼ＝１を除く）を、４５μｌずつルミチューブに入れ、そこに、実施例７と同様に調製した１μＭ〜１００ｍＭのリン酸ナトリウム溶液を５μｌずつ加えて１秒後にルミテスターＣ−１００で１０秒間発光値を測定した。４℃で一晩保温した残りの反応液（ＡＴＰ／ルシフェラーゼ＝１）は、ルミテスターＣ−１００に比べて低感度なＡＲＶＯ社製のプレートリーダーで測定した。
【０１４９】
その結果、図１２に示すように、ＡＴＰ／ルシフェラーゼ＝１のモル比によるＡＴＰ添加で得られたＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体が各リン酸濃度における発光応答が非常に高かった。ＡＴＰ／ルシフェラーゼが１／１００以下のモル比によるＡＴＰ添加で得られたＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体の発光応答が低いのは、複合体形成に関与するＡＴＰ量が少ないためであると考えられる。
【０１５０】
また、ＡＴＰ／ルシフェラーゼが１／１０以上のモル比によるＡＴＰ添加で得られたＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体の発光応答が低いのは、複合体形成に関与しなかったＡＴＰの除去反応で生じたＡＭＰやオキシルシフェリンによる酵素反応阻害によるものであると考えられる。
【０１５１】
以上の結果から、ＡＴＰ／ルシフェラーゼが１／１００のモル比によるＡＴＰ添加で得られたＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体によれば、もっとも高感度な検出が可能であることが分かった。
【０１５２】
〔実施例９：限外濾過によるＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体の調製およびリン酸による結合ＡＴＰ量測定〕
実施例１で調製したルシフェラーゼＦＭを用いて、ルシフェラーゼＦＭが滅菌水に溶解した溶液（濃度：１６．７ｎｍｏｌ／ｍｌ）を１ｍｌ調製した。その後、該溶液を、ＦＭ２緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ、５％トレハロース、ｐＨ７．８)で１００倍希釈し、終濃度０．１６７ｎｍｏｌ／ｍｌのルシフェラーゼＦＭ溶液を得た。
【０１５３】
次に、ＡＴＰ粉末１０．１ｍｇを滅菌水１ｍｌに溶解して、１６．７μｍｏｌ／ｍｌのＡＴＰ溶液を調製した。該ＡＴＰ溶液を、上記ＦＭ２緩衝液で１０３倍、１０４倍、１０５倍に希釈して、１６．７ｎｍｏｌ／ｍｌ、１．６７ｎｍｏｌ／ｍｌ、０．１６７ｎｍｏｌ／ｍｌのＡＴＰ溶液を得た。これらＡＴＰ溶液の濃度は、それぞれ、上記ルシフェラーゼＦＭ溶液の濃度の１００倍、１０倍、１倍であった。
【０１５４】
さらに、Ｄ−ルシフェリン溶液とリン酸溶液とを調製した。Ｄ−ルシフェリン溶液は、Ｄ−ルシフェリンカリウム２５．５ｍｇを滅菌水１ｍｌに溶解して調製した。また、リン酸溶液は、予め調製しておいた１００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４溶液と１００ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４溶液とを混合し、ｐＨ７．４に調製し、上記ＦＭ２緩衝液で１０倍希釈することにより。１０ｍＭリン酸溶液を調製した。
【０１５５】
上記のようにして調製したルシフェラーゼＦＭ溶液、ＡＴＰ溶液、およびＤ−ルシフェリン溶液を用いて、以下の方法で、ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体を調製した。
【０１５６】
上記ルシフェラーゼＦＭ溶液 １ｍｌ（ルシフェラーゼＦＭ：０．１６７ｎｍｏｌ）に上記各濃度のＡＴＰ溶液 １ｍｌ（それぞれＡＴＰ：１６．７ｎｍｏｌ、１．６７ｎｍｏｌ、０．１６７ｎｍｏｌ）を混合し、室温で３０分間反応させた。
【０１５７】
こうして得られた反応溶液のうち５０μｌを限外濾過チューブ（MILLPORE  ULTRAFREE - 0.5 BIOMAX  10K NMWL）に移し、１２，０００×ｇで２０分間遠心分離した。上記反応溶液の残りの溶液に、上記Ｄ−ルシフェリン溶液をＤ−ルシフェリンの最終濃度が２ｍＭになるように添加した。
【０１５８】
その後、アルミで遮光し、４℃で一晩反応させた。こうして一晩反応させた混合溶液５００μｌを限外濾過チューブ（MILLPORE  ULTRAFREE - 0.5 BIOMAX  10K NMWL）に添加し、１２，０００×ｇで２０分間遠心分離した。
【０１５９】
遠心分離後の限外濾過チューブのカップ内にＦＭ２緩衝液５００μｌを添加し、懸濁後、１２，０００×ｇで２０分間遠心分離し、濾液におけるＡＴＰ量を測定した。この操作を、上記濾液におけるＡＴＰが検出されなくなるまで繰り返し行い、ルシフェラーゼＦＭに結合していないＡＴＰをすべて除去した。これにより、ＡＴＰとルシフェラーゼＦＭとが結合したＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体を得た。
【０１６０】
こうして得られたＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体について、以下の方法により、該複合体に含まれるＡＴＰ量を測定した。
【０１６１】
上記濾液にＡＴＰが検出されなくなった後、限外濾過チューブのカップにリン酸溶液を５００μｌ添加後、よく懸濁し、１時間撹拌反応した。反応後１２，０００×ｇで２０分間遠心分離し、濾液のＡＴＰ量を測定した。リン酸により解離するＡＴＰがなくなったと判断されるまでこの操作を繰り返した。
【０１６２】
その結果、上記ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体におけるＡＴＰとルシフェラーゼＦＭとの比（ＡＴＰ／ルシフェラーゼ）は、約０．４であった。なお、上記各過程でのＡＴＰ量の変化を表２に示す。また、複合体から、リン酸処理により解離するＡＴＰ量を表３に示す。
【０１６３】
【表２】
2009050167.tif 000003
【０１６４】
【表３】
2009050167.tif 000004
【０１６５】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１６６】
本発明は、ＡＴＰ−ルシフェラーゼ複合体を用いて、リン酸、ピロリン酸およびポリリン酸を測定するため、試料中のケイ酸の影響を受けることなく、精度よく、高感度かつ迅速に、試料に含まれるリン酸、ピロリン酸およびポリリン酸を測定することができる。したがって、本発明は、環境分析や臨床検査等の分野に用いることができるだけではなく、医療分野、食品分野、農業分野、化学分野、および環境分野等、リン酸やピロリン酸、ポリリン酸を測定するあらゆる産業分野に広く応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
【図１】図１は、野生型ルシフェラーゼおよびルシフェラーゼＦＭのリン酸に対する発光応答を示す図である。
【図２】図２は、野生型ルシフェラーゼおよびルシフェラーゼＦＭのピロリン酸に対する発光応答を示す図である。
【図３】図３は、ルシフェラーゼＦＭの１００ｍＭリン酸に対する発光応答を経時的に測定した結果を示す図である。
【図４】図４は、ルシフェラーゼＦＭの１ｍＭピロリン酸に対する発光応答を経時的に測定した結果を示す図である。
【図５】図５は、ルシフェラーゼＦＭに添加するリン酸濃度と発光値との関係を示す図である。
【図６】図６は、ルシフェラーゼＦＭに添加するピロリン酸濃度と発光値との関係を示す図である。
【図７】図７は、各種陰イオンに対する野生型ルシフェラーゼの発光応答を示す図である。
【図８】図８は、各種陰イオンに対するルシフェラーゼＦＭの発光応答を示す図である。
【図９】図９は、各種鎖長のリン酸に対するルシフェラーゼＦＭの発光応答を示す図である。
【図１０】図１０は、ルシフェラーゼＦＭおよびルシフェラーゼＦＭ２の酵素活性を測定した結果を示す図である。
【図１１】図１１は、ルシフェラーゼＦＭおよびルシフェラーゼＦＭ２のリン酸に対する発光応答を示す図である。
【図１２】図１２は、ＡＴＰが結合したルシフェラーゼＦＭ−２のリン酸に対する発光応答を示す図である。
【図１３】図１３は、ＡＴＰが結合したルシフェラーゼＦＭ−２のリン酸に対する発光応答を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2009050167.tif 000012
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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