(57)【要約】【課題】環境に魚類に対するグルココルチコイド系攪乱物質が存在するか否かを検出および測定するための手段および方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、魚類由来のグルココルチコイド受容体遺伝子発現ベクターと、グルココルチコイドの標的となる遺伝子のプロモーターを結合させた外来遺伝子を導入した細胞を提供する。また、当該細胞を使用することを特徴とする魚類に対するグルココルチコイド系攪乱物質の検出および測定法を提供する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚類に対するグルココルチコイド系攪乱物質の検出のための、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、または当該ＤＮＡもしくは当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルココルチコイド受容体活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む、グルココルチコイド受容体発現ベクター、及び該グルココルチコイドの標的となる遺伝子のプロモーターを結合させた外来遺伝子を導入した細胞。
【請求項２】
外来遺伝子がルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼから選択される少なくとも１種由来の遺伝子である、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
ＨＥＫ２９３細胞にグルココルチコイド受容体遺伝子発現ベクターおよび該グルココルチコイドの標的となる遺伝子のプロモーターを結合させた外来遺伝子を導入することを特徴とする、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の細胞を用いて、レポータージーンアッセイを行うことを特徴とする、魚類に対するグルココルチコイド系攪乱物質の測定方法。
【請求項５】
試験溶液を請求項１〜３のいずれかに記載の細胞に曝露する工程および外来遺伝子の発現量を測定して、試験溶液中の魚類に対するグルココルチコイド系攪乱物質の測定を行う工程を含む、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルココルチコイド受容体遺伝子を導入した遺伝子導入細胞、ならびにその細胞を使用する魚類に対するグルココルチコイド系攪乱物質の検出および測定法を提供する。本発明において、グルココルチコイド系攪乱物質とは、グルココルチコイド受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することによって生物の内分泌系を攪乱する物質を意味する。
【背景技術】
【０００２】
グルココルチコイドは、副腎皮質ホルモン（コルチコステロイド、コルチコイド）の一種で、糖質代謝に関係し、肝グリコーゲンの貯蔵、タンパク質、脂質からの糖質の生成などの作用を促進する一群の化合物をいい、血圧や血糖レベルを高め、免疫機能の低下や不妊をもたらし得る。グルココルチコイドには、コルチゾル（Ｆ）、コルチゾン（Ｅ）、コルチコステロン（Ｂ）など数種類のホルモンが同定されている。このうち、ＦおよびＢはストレスにより産生され、神経系を介して副腎皮質から分泌されるので、別名ストレスホルモンと呼ばれている。また、Ｅは、Ｆが肝や腎で生理的に不活化されたものである。グルココルチコイドは浸透度調節や呼吸、免疫反応、再生、成長、代謝といった魚類の生理的機能の調節に関与している（非特許文献１）。多くの研究によりコルチゾルは水中適応の重要なホルモンであることが明らかにされている（非特許文献２）。
【０００３】
コルチコイド作用は、このホルモンが、リガンド誘導性の転写因子である副腎皮質ステロイド（コルチコイド）レセプターと結合し、標的遺伝子の発現調節をすることを通して成し遂げられる。グルココルチコイドは、核内受容体であるグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）を通じて目的細胞に作用する。レセプターホモ二量体がグルココルチコイドに反応する遺伝子調整領域では、１５塩基対からなるグルココルチコイド応答配列（ＧＲＥ）と結合し、遺伝子トランス活性化につながる。
【０００４】
グルココルチコイド系攪乱物質が魚類に与える影響は多大であるにも拘わらず、その実用的な検出・測定法は存在しなかった。例えば、既知のグルココルチコイド系攪乱物質を検出・測定するためには、環境から水や土などの試料を採取し、試験溶液を調製して、例えばガスクロマトグラフィーなどの機器で分析することも可能であるが、このような機械的な方法では未知のグルココルチコイド系攪乱物質を測定・評価することが不可能であるため、真実その環境がグルココルチコイド系攪乱物質を含んでいないことを保証するものではない。
【非特許文献１】Mommsen et al., Fish Biol Fisheries 9, 211-268, 1999
【非特許文献２】Foskett et al., J Exp Biol 106, 255-281, 1983
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、魚類に対する未知のグルココルチコイド系攪乱物質の検出および測定が可能な方法が望まれる。さらには、魚類に影響を与える程度の低濃度の物質を検出することができ、またその濃度および影響の程度を、良好な精度で測定することができる方法が望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本願発明者らは、鋭意研究の結果、環境に魚類に対するグルココルチコイド系攪乱物質が存在するか否かを検討するにあたって、魚類由来のグルココルチコイド受容体遺伝子発現ベクターを組み込んだ細胞を設計し、当該細胞についてレポータージーンアッセイを行うことを見出した。
【０００７】
従って、具体的には、本願発明は、魚類由来のグルココルチコイド受容体遺伝子発現ベクターと、グルココルチコイドの標的となる遺伝子のプロモーターを結合させた外来遺伝子を導入した細胞（以下、本発明の細胞）、ならびに当該細胞を使用することを特徴とする魚類に対するグルココルチコイド系攪乱物質の検出および測定法（以下、本発明の方法）を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の細胞は、魚類由来のグルココルチコイド受容体遺伝子発現ベクターをそれぞれ組み込んだものであるため、細胞はグルココルチコイドに特異的に反応し、魚類に対するグルココルチコイド系攪乱未知物質の検出を行うことが可能である。また、本発明の方法によって、１０−７Ｍ程度のグルココルチコイド系攪乱物質の検出のみならず、定量的測定も可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
第１の態様において、本願発明は、魚類に対するグルココルチコイド系攪乱物質の検出のための、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、または当該ＤＮＡもしくは当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルココルチコイド受容体活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む、グルココルチコイド受容体発現ベクター、及び該グルココルチコイドの標的となる遺伝子のプロモーターを結合させた外来遺伝子を導入した細胞を提供する。
【００１０】
配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、または当該ＤＮＡもしくは当該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルココルチコイド受容体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、例えば、魚類の体組織、例えば血液からゲノムＤＮＡを抽出し、既知のグルココルチコイド受容体に共通する配列を参考にして設計したプライマーを合成し、当該プライマーを用いて、魚類から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ等の増幅を行うことによって、得ることができる。
【００１１】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子とは、所望の塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、例えば９５％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子が含まれる。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されないような条件をいい、例えば、ナトリウム濃度が１０〜３００ｍＭ、好ましくは２０〜１００ｍＭであり、温度が２５〜７０℃、好ましくは４２〜５５℃を意味する。
【００１２】
このようにして得られるＤＮＡを、常套の方法でベクターに挿入することができる。例えばベクターは市販のものを使用することができ、その挿入は添付のマニュアルに沿って行う。
【００１３】
グルココルチコイドの標的となる遺伝子のプロモーターは、種々のものを使用することができるが、例えば市販のベクター、例えばｐＭＳＧ（ファルマシア）からＬＴＲプロモーターを、例えばＮｈｅ  ＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩのような制限酵素を使用することによって得ることができる。ただし、ある種のプロモーターは特異的な転写因子との共存によってのみ発現する場合があるので、そのようなプロモーターを使用する場合には転写因子もしくは転写因子を含む細胞にプロモーターを導入する必要がある。
【００１４】
外来遺伝子は、特に限定されないが、ｍＲＮＡおよび発現したタンパク質の確認が容易なものが好ましい。好ましくは、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、βガラクシダーゼ、とりわけ好ましくはルシフェラーゼである。
【００１５】
ホルモンの標的となる遺伝子のプロモーターと、外来遺伝子は、常套の方法、例えば制限酵素を用いて、プロモーター部分と外来遺伝子との間に粘着末端を作成し、ＤＮＡリガーゼなどによって結合させることができる。
【００１６】
このようにして得られるベクターと、プロモーターを結合させた外来遺伝子を、培養細胞にコ−トランスフェクションし、Ｇ４１８のような選択薬剤を添加する。例えば薬剤添加の１週間後に培地を交換することができる。薬剤選択された細胞が十分増殖したことを確認し、例えば限界希釈法によってクローン化を行うことによって、本発明の細胞を得ることができる。細胞としては、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、Ｈｅｐａ−Ｔ１（ティラピア肝臓繊維芽細胞）、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｓ２、Ｓｆ９など、様々なものを使用することができ、好ましくはＨＥＫ２９３である。
【００１７】
第２の態様において本発明は、試験溶液を本発明の細胞に曝露する工程および外来遺伝子の発現量を測定する工程を含む、魚類に対するグルココルチコイド系攪乱物質の検出および測定法を提供する。
【００１８】
具体的には本発明の方法は、環境から得た試料を前処理してまたは前処理なしで得た試験溶液を、細胞を播種したプレートに添加した後、ＣＯ２インキュベーター内で、例えば２０〜２４時間、細胞を試験溶液に曝露する；曝露後、培地を取り除き、外来遺伝子発現タンパク質の基質溶液を加えて外来遺伝子の発現量を測定する；ことを含む。
【００１９】
試料は、大気、川や海の水、土壌、生物の組織などから得ることができる。得た試料をそのまま、または例えばエタノールのような溶媒で抽出することによって試験溶液とすることができる。得た試験溶液をさらにろ過し、メタノールおよび蒸留水でコンディショニングした固層（例えば、Ｓｅｐ−Ｐａｃｋ  Ｐｌｕｓ  ＰＳ−２、Ｗａｔｅｒｓ）に流速１０〜２０ｍｌ／分で通水し、窒素気流下で乾燥したのち、ジクロロメタンで溶出し、これを窒素気流下で蒸発堅固し、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に転溶して、前処理を行い得る。
【００２０】
外来遺伝子発現タンパク質の基質溶液とは、外来遺伝子が発現して生産されるタンパク質と結合することができるリガンドを含む溶液を意味する。基質溶液は、例えば外来遺伝子がルシフェラーゼである場合には、ルシフェリン溶液である。例えば外来遺伝子がルシフェラーゼの場合、ルシフェラーゼ基質を加えてルシフェラーゼ発現量（相対発光活性；ＲＬＡ）をルミノメーターで測定する。試験溶液濃度は、得られたＲＬＵからバックグラウンド（溶媒対照のＲＬＡ）を差し引くことによって求める。
【００２１】
外来遺伝子の発現量を測定する方法は、外来遺伝子の性質に応じて当業者が通常採用し得る手段を用いることができる。例えば発現量を発光強度によって測定する場合、ルミノメーターを使用することができるが、より好ましい態様において、フォトンカウンターを使用することができる。
【実施例】
【００２２】
グルココルチコイド受容体遺伝子発現ベクター導入細胞の製造
完全長メダカ（Oryzias latipes）グルココルチコイド受容体（ｏＧＲ）遺伝子よりＯＲＦをＥｃｏＲＩサイトを５’側に導入したプライマーにより、それぞれＲＴ−ＰＣＲ法により増幅した。得られたＤＮＡ断片を発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）のＥｃｏＲＩサイトへ導入し、受容体発現ベクターとした。ｏＧＲ遺伝子を導入した上記の発現ベクターとグルココルチコイド応答性ホタルルシフェラーゼレポーターベクターを、ヒト胎児腎臓由来の２９３細胞に導入した。
【００２３】
まず、１．５μｇのｏＧＲ導入発現ベクター（１．２０２μｇ／μｌ）と、３．０μｇのレポーターベクター（ＳＲＥ３−ＳＶ−ｌｕｃ）（１．６５６μｇ／μｌ）をウシ胎児血清を含まないＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）（以後、−ＦＣＳＤＭＥＭと記す。）１ｍｌに入れ、別チューブにリポフェクトアミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を同じく−ＦＣＳＤＭＥＭ１ｍｌに入れたものを作製し、この２本を混合し、１５分室温で静置し、これを、９ｃｍディッシュ（ＢＭ機器）で培養した２９３細胞に入れ、ＣＯ２インキュベーター（ＮＡＰＣＯ）にて３７℃で一晩培養し、トランスフェクションさせた。そして、−ＦＣＳＤＭＥＭから５％のウシ胎児血清を含むフェノールレッド入りのＤＭＥＭ（以後、ＦＣＳＤＭＥＭと記す。）に交換した。
【００２４】
トランスフェクションした２９３細胞を、薬剤によりスクリーニングし、レポーター及びレセプターが導入されている細胞を選択した。薬剤にはＧ４１８（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を使用した。Ｇ４１８（４００μｇ／ｍｌ）を、９ｃｍディッシュ１枚あたり１００μｌ入れた。薬剤選択は、計８日間行い、４日目に液変えし、Ｇ４１８を再度投与した。９日目に３７℃のＣＯ２インキュベーターでコロニー形成を待った。形成されたコロニーをキャップ法により採取し、２４穴プレート（ＢＭ機器）に各コロニーを１穴毎に入れ、３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養しクローン化した。次いで、９ｃｍディッシュから培養液を除き、グリスをつけたキャップを各コロニーに被せ、その中をトリプシン（ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｇｉｂｃｏ）処理した後、ＦＣＳＤＭＥＭで懸濁し、その液を２４穴プレートの各穴に移した。これをＦＣＳＤＭＥＭでコンフルーエントになるまで培養した。２種のクローン（ＧＲ３およびＧＲ４）を得た。
【００２５】
細胞を使用したグルココルチコイド系攪乱物質の検出
２４穴プレートにコンフルーエントとなったクローンを用いてレポーター、レセプターが導入され、ホルモンによるルシフェラーゼの発現が行われるか確認した。方法は、２４穴プレートの各クローンをＰＢＳで洗い、トリプシン処理し、デキストランチャコール処理によりステロイドが取り除かれたウシ胎児血清を５％含むフェノールレッドなしＤＭＥＭ（以降、ＦＣＳＤＭＥＭステロイドフリー）で９６穴プレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に１穴あたり１００μｌ移し、細胞が張りつくまで一日、３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。翌日コルチゾル含有（１００ｎＭ）ＦＣＳＤＭＥＭステロイドフリーを１穴あたり１００μｌ入れ、一日、３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。そして次の日、液を除き、各穴を室温で、ＰＢＳ１００μｌで懸濁し、測定用９６穴プレートに移し、基質であるルシフェリン（Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を１穴あたり１００μｌ加え、Luminescencer-JNR II AB-2300（ＡＴＴＯ）により発光を測定した。また、コルチゾル濃度を３濃度作製し、濃度によって発光に違いが出るか確認した。コントロールはエタノール、希釈にはＦＣＳＤＭＥＭステロイドフリーを使用した。結果を図１および２に示す。エストロゲン、プロゲスチンやアンドロゲンに曝露しても当該細胞は発光を示さず、グルココルチコイドに対して特異的に反応した。
【００２６】
グルココルチコイド受容体遺伝子発現ベクター導入細胞を使用した実測濃度による確認
天然グルココルチコイドであるコルチゾル（以下、Ｆと記す。）では、濃度依存的な転写活性化がみられ、用量−反応曲線はシグモイドカーブとなり、Ｐｒｉｓｍ４で算出したＥＣ５０は６．３×１０−７Ｍであった（図３）。コルチゾルを使用して、製造したグルココルチコイド受容体遺伝子発現ベクター導入細胞のアッセイ間変動係数およびアッセイ内変動係数を測定して、精度検定を行った。アッセイ間変動係数は、３回の別々のアッセイを行い、３つの濃度（１．５６×１０−８、６．２５×１０−８、２．５×１０−７Ｍ）のＦｏｌｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ（エタノール添加群の発光強度との比）における平均値と標準偏差（ＳＤ）を求め、ＣＶを算出した。アッセイ内変動係数は、１回のアッセイ内で、同一濃度でトリプリケイトにおけるＦｏｌｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎの平均値とＳＤを求め、ＣＶを算出した。結果を表１および２に示す。
【表１】
2009077659.tif 000003
【表２】
2009077659.tif 000004
アッセイ間変動係数およびアッセイ内変動係数のいずれにおいても、１５％以下と非常に精度が高く、安定した測定結果が得られた。
【００２７】
その他の薬剤の測定では天然グルココルチコイドであるコルチコステロンでＥＣ５０は５．０×１０−８Ｍ、ＲＬＡは４５．６％、デキサメタゾンでＥＣ５０は２．×１０−７Ｍ、ＲＬＡは３６０％と非常に強いアゴニスト活性が見られた。ミネラルコルチコイドであるアルドステロンでＥＣ５０は４１３．６Ｍ、ＲＬＡは５１％、合成プロゲスチンのメレンゲステロール酢酸塩のＥＣ５０は４．４×１０−８Ｍ、ＲＬＡは６９％であった。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】グルココルチコイド受容体遺伝子発現ベクター導入細胞のＧＲ３クローンのルシフェラーゼ転写活性を示す。
【図２】グルココルチコイド受容体遺伝子発現ベクター導入細胞のＧＲ４クローンのルシフェラーゼ転写活性を示す。
【図３】グルココルチコイド受容体遺伝子発現ベクター導入細胞について、Ｆの連続希釈溶液各々でルシフェラーゼ転写活性を測定した、用量−応答曲線を示す。
【図１】
2009077659.tif 000005
【図２】
2009077659.tif 000006
【図３】
2009077659.tif 000007
【配列表】
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