(57)【要約】【課題】低コストでかつ簡単な方法で長期間保存が可能な微生物の保存方法及び保存容器を提供する。【解決手段】細菌，酵母菌等の微生物を生きた状態で保存する方法であって、水分調整機能を有する担体３に予め保護剤５を含浸させ、該担体３の表面に前記微生物６を塗布した後、常温常圧下で保存する。【選択図】      図２
2009171922.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌，酵母菌等の微生物を生きた状態で保存する方法であって、
水分調整機能を有する担体に予め保護剤を含浸させ、該担体の表面に前記微生物を塗布した後、常温常圧下で保存することを特徴とする微生物の保存方法。
【請求項２】
請求項１に記載の微生物の保存方法において、
前記担体を、乾燥させた後、密閉した状態で保存することを特徴とする微生物の保存方法。
【請求項３】
請求項１に記載の微生物の保存方法において、
前記担体を、吸湿剤もしくは、吸湿剤および脱酸素剤とともに密閉した状態で保存することを特徴とする微生物の保存方法。
【請求項４】
請求項１に記載の微生物の保存方法において、
前記担体は、吸水性及び蒸発性を有する繊維体，多孔質体から構成されていることを特徴とする微生物の保存方法。
【請求項５】
請求項４に記載の微生物の保存方法において、
前記担体は、濾紙又は不織布であることを特徴とする微生物の保存方法。
【請求項６】
請求項１に記載の微生物の保存方法において、
前記微生物は、細菌であり、前記保護剤は、グルタミン酸ナトリウム，アドニトール，システイン−塩酸を所定量配合したものであることを特徴とする微生物の保存方法。
【請求項７】
請求項１に記載の微生物の保存方法において、
前記微生物は、酵母菌であり、前記保護剤は、ポリビニルピロリドン，乳糖，アクトコール，グルタミン酸ナトリウムを所定量配合したものであることを特徴とする微生物の保存方法。
【請求項８】
細菌，酵母菌等の微生物を生きた状態で保存する保存容器であって、
収容部が形成された容器本体と、該収容部内に配設された水分調整機能を有する担体と、該担体に含浸された保護剤と、前記容器本体の収容部を密閉する着脱可能なフィルムとを備え、前記担体の表面に前記微生物が塗布されていることを特徴とする微生物の保存容器。
【請求項９】
請求項８に記載の微生物の保存容器において、
前記収容部は、前記容器本体に２つ以上形成されていることを特徴とする微生物の保存容器。
【請求項１０】
請求項８に記載の微生物の保存容器において、
前記収容部内には、吸湿剤もしくは、吸湿剤および脱酸素剤が配置されていることを特徴とする微生物の保存容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ関連産業，ライフサイエンス産業，あるいは医療産業等において利用される微生物の保存方法及び保存容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌や酵母菌等の微生物を生きたまま保存する場合、培地の上で菌を増殖させ、適宜植え継いでいく植え継ぎ法、菌をガラスアンプル内で凍結乾燥させる凍結乾燥法，あるいは凍結させずに液相状態にてガラスアンプル内で乾燥させるＬ−乾燥法が一般的に採用されている（例えば、特許文献１参照）。また、植え継ぎ法以外では、グリセリンなどを増殖した培地に加えて冷凍保存する凍結保存法、プラスミドを精製して保存しておき、必要に応じて細菌に戻す方法が採用されている。
【特許文献１】特開２００５−１６８４２４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ところで、前記従来の植え継ぎ法では、植え継ぎの準備を繰り返して行う必要があることから、手間がかかるとともに費用もかかる。前記凍結乾燥法やＬ−乾燥法では、真空乾燥機，アンプル作製装置等の大掛かりな設備を要し、しかも熟練した技術者を要する。またグリセリンを用いる場合には、凍結させることが必須であり、保存には冷凍庫を要する。このことにより保存スペースや電力コストの面で課題が生じる。また、停電による試料の損失や凍結融解時に菌の性質が変化するリスクを抱えることとなる。さらに一旦プラスミドの形で保存した後に実験を再開するには、まずプラスミドを細菌に導入して必要な性質を持った菌を再構築する必要があり、手間がかかる。
【０００４】
このように、前記従来の何れの保存方法においても、手間がかかるとともに、大掛かりな保存設備が必要であり、コストが上昇するという問題がある。
【０００５】
本発明は、前記従来の状況に鑑みてなされたもので、低コストでかつ簡単な方法で長期間保存が可能な微生物の保存方法及び保存容器を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
請求項１の発明は、細菌，酵母菌等の微生物を生きた状態で保存する方法であって、水分調整機能を有する担体に予め保護剤を含浸させ、該担体の表面に前記微生物を塗布した後、常温常圧下で保存することを特徴としている。
【０００７】
請求項２の発明は、請求項１に記載の微生物の保存方法において、前記担体を、乾燥させた後、密閉した状態で保存することを特徴としている。
【０００８】
請求項３の発明は、請求項１に記載の微生物の保存方法において、前記担体を、吸湿剤もしくは、吸湿剤および脱酸素剤とともに密閉させた状態で保存することを特徴としている。
【０００９】
請求項４の発明は、請求項１に記載の微生物の保存方法において、前記担体は、吸水性及び蒸発性を有する繊維体，多孔質体から構成されていることを特徴としている。
【００１０】
請求項５の発明は、請求項４に記載の微生物の保存方法において、前記担体は、濾紙又は不織布であることを特徴としている。
【００１１】
請求項６の発明は、請求項１に記載の微生物の保存方法において、前記微生物は、細菌であり、前記保護剤は、グルタミン酸ナトリウム，アドニトール，システイン−塩酸を所定量配合したものであることを特徴としている。
【００１２】
請求項７の発明は、請求項１に記載の微生物の保存方法において、前記微生物は、酵母菌であり、前記保護剤は、ポリビニルピロリドン，乳糖，アクトコール，グルタミン酸ナトリウムを所定量配合したものであることを特徴としている。
【００１３】
請求項８の発明は、細菌，酵母菌等の微生物を生きた状態で保存する保存容器であって、収容部が形成された容器本体と、該収容部内に配設された水分調整機能を有する担体と、該担体に含浸された保護剤と、前記容器本体の収容部を密閉する着脱可能なフィルムとを備え、前記担体の表面に前記微生物が塗布されていることを特徴としている。
【００１４】
請求項９の発明は、請求項８に記載の微生物の保存容器において、前記収容部は、前記容器本体に２つ以上形成されていることを特徴としている。
【００１５】
請求項１０の発明は、請求項８に記載の微生物の保存容器において、前記収容部内には、吸湿剤もしくは、吸湿剤および脱酸素剤が配置されていることを特徴としている。
【発明の効果】
【００１６】
請求項１の発明に係る保存方法によれば、水分調整機能を有する担体に保護剤を含浸させ、該担体の表面に微生物を塗布した後、常温常圧下で保存するので、微生物は保護剤中に分散されていないにも関わらず、生存に適した水分環境に保たれ、長期間の保存が可能となる。これにより、大掛かりな設備や手間のかかる作業を不要にでき、低コストでかつ簡単な方法で微生物を保存することが可能となる。
【００１７】
請求項２の発明では、担体を乾燥させた後、密閉して保存するので、外部からの影響により微生物が劣化するのを防止でき、保存期間を大幅に延長することができる。
【００１８】
請求項３の発明では、担体を吸湿剤，脱酸素剤とともに密閉させて保存するので、容器内を真空状態にせずとも微生物の劣化を防止でき、保存期間の大幅延長が可能となる。
【００１９】
請求項４の発明では、担体を、吸水性及び蒸発性を有する繊維体又は多孔質体から構成したので、担体の水分調整機能により微生物の生存に必要な水分環境を保持できる。
【００２０】
請求項５の発明では、担体を濾紙又は不織布により構成したので、担体を安価にでき、かつ濾紙，不織布自体が持つ水分調整機能を有効利用して微生物を生存に適した水分環境に保持することができる。
【００２１】
請求項６の発明では、保護剤を、グルタミン酸ナトリウム，アドニトール，システイン−塩酸を所定量配合して形成したので、細菌の長期保存に適した環境を構築できる。
【００２２】
請求項７の発明では、保護剤を、ポリビニルピロリドン，乳糖，アクトコール，グルタミン酸ナトリウムを所定量配合して形成したので、酵母菌の長期保存に適した環境を構築できる。
【００２３】
請求項８の発明にかかる保存容器によれば、容器本体に形成された収容部内に保護剤が含浸された担体を配置し、該担体の表面に微生物を塗布した状態でフィルムにより密閉したので、大掛かりな設備や手間のかかる作業を不要にでき、低コストでかつ誰にでもできる簡単な方法で微生物を保存することができる。
【００２４】
請求項９の発明では、容器本体に２つ以上の収容部を形成したので、１つの保存容器に大量の微生物を保存でき、かつ微生物を分類別，種類別に保存することができる。
【００２５】
請求項１０の発明では、収容部内に吸湿剤もしくは、吸湿剤および脱酸素剤を配置したので、何らかの原因で水分や空気が侵入した場合にも、微生物が死滅するのを防止でき、長期間の保存が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明する。
【００２７】
図１ないし図４は、本発明の一実施形態による微生物の保存容器を説明するための図であり、図１は保存容器の斜視図、図２は保存容器の断面図（図１のII-II線断面図）、図３は保存容器の収容部の拡大図、図４（ａ），（ｂ）は担体に含浸する保護剤及び担体に塗布された微生物を模式的に示す図である。
【００２８】
図において、１は微生物の保存容器を示しており、該保存容器１は、樹脂製の容器本体２と、該容器本体２に所定間隔をあけて凹設された３つの収容部２ａと、各収容部２ａ内に配置され、水分調整機能を有する担体３と、該各収容部２ａを独立して密閉する着脱可能なフィルム４とを備えている。
【００２９】
前記容器本体２は、厚さが２〜３ｍｍ程度の長方形板状のものであり、該容器本体２の長手方向一側には、前記各収容部２ａが形成され、他側には、保存する微生物のデータ等を書き込んだラベルを貼り付けるための表示部２ｂが形成されている。
【００３０】
また前記容器本体２には、周辺の湿度を表示するインジケータ部２ｃが設けられており、さらに容器本体２の各収容部２ａに対応する側縁部には、前記各フィルム４を剥がし易くするための切欠き凹部２ｄが形成されている。
【００３１】
前記容器本体２の各収容部２ａには、担体３をピンセット等で取り出すときの取り出し口２ｅが形成されている。
【００３２】
前記各担体３は、吸水性及び蒸発性を有するシート状の繊維体，多孔質体からなり、具体的には、セルロース系繊維からなる濾紙又は不織布により構成されている。
【００３３】
ここで、担体３に用いる素材としては、濾紙，不織布以外に、パルプ，木片，おが屑，あるいは藁等の採用が可能であり、また発泡させた澱粉や海草抽出物等の多孔質で親水的な表面性状を有するものであれば採用可能である。
【００３４】
また担体３の形状は、シート状に限るものではなく、裁断された紐状，おが屑状，粉末，粒状でもよい。
【００３５】
前記担体３には、保護剤５が含浸されている。該保護剤５は、担体３に浸した後、乾燥させることにより、前記担体３内に浸透し、該担体３の繊維に付着した状態となっている（図４（ａ），（ｂ）参照）。
【００３６】
この保護剤５には、微生物の種類に応じて適宜選定され、微生物が例えば、一般細菌，放線菌の場合には、グルタミン酸ナトリウム，アドニトール，システイン−塩酸を所定量配合したものが採用されている。詳細には、グルタミン酸ナトリウム3ｇ，アドニトール1.5ｇ，システイン−塩酸0.05ｇ，0.1M燐酸緩衝液（ｐH7.0）100mリットルを配合したものが好ましい。
【００３７】
また、微生物が酵母菌の場合には、ポリビニルピロリドン，乳糖，アクトコール，グルタミン酸ナトリウムを所定量配合したものが採用されている。詳細には、ポリビニルピロリドン6ｇ，乳糖5ｇ，アクトコール0．1ｇ，グルタミン酸ナトリウム3ｇ，1M燐酸緩衝剤10ｍリットル，蒸留水90mリットルを配合したものが好ましい。
【００３８】
前記保護剤５の含浸量は、担体３の吸水量を基に決定する。即ち、担体３自体の吸水量と同量の微生物液量を処理できることが必要とされる。保護剤５を濃縮液として用いることにより、製造上の乾燥時間が短縮できる。なお、微生物の水分量が少ない場合は、担体の吸水量の１／２０程度まで保護剤を減らすことができる。
【００３９】
そして前記担体３の表面には微生物６が塗布されており、該微生物６が塗布された担体３は前記フィルム４により密閉されている。この状態で保存容器１は、常温常圧下で保存される。
【００４０】
ここで微生物６は、保護剤５に直接触れた状態、あるいは保護剤５に触れることなく担体３の繊維に付着した状態となっている（図４（ａ），（ｂ）参照）。
【００４１】
前記保存容器１により微生物を保存するには、細菌，酵母菌に応じて準備した保護剤５を予め担体３に含浸させ、乾燥させる。へら等の用具により該担体３の表面に微生物６を塗布し、フィルム４を貼着して収容部２ａを密閉する。この状態で、常温常圧下にて保存する。
【００４２】
微生物６を取り出す場合には、フィルム４を剥がしてピンセット等により取り出し口２ｅから担体３を取り出す。このように取り出した担体３の微生物６を、適当な培地に移して増殖させる。また担体３ごと土壌，コンポストに混ぜたり、所定の溶液で希釈して散布したりする。
【００４３】
【表１】
2009171922.tif 000003
【００４４】
【表２】
2009171922.tif 000004
【００４５】
【表３】
2009171922.tif 000005
【００４６】
〔実験１〕
表１，表２は、本実施形態の保存方法による効果を確認するために行った実験結果を示す表である。
【００４７】
この実験では、分類別に選定した２５種類の細菌（試料Ｎｏ．〜２５）と、２種類の酵母菌（試料Ｎｏ．２６，２７）を採用し、各試料Ｎｏ．１〜２７を前述の保存容器１の担体３に塗布し、フィルム４で密閉した。そして保存温度を−２０℃，４℃，室温（RT）,３７℃とし、０．５ヶ月目，１ヶ月目，３ヶ月目の微生物の生存状態を確認した。生存状態の評価は、良好（○印）、やや良好（△印）、略死滅（×印）で表した。
【００４８】
表１からも明らかなように、室温で０．５ヶ月保存した場合には、試料Ｎｏ．３，７，８，１３の細菌以外は全て略良好な状態で生存しており、室温で１ヶ月保存した場合でも、試料Ｎｏ．２，３，７，８，１０，１２，１３，以外は全て良好又はやや良好な状態で生存している。
【００４９】
一方、室温で３ヶ月保存すると、半数以上の試料が死滅状態となるものの、４℃で保存した場合には、前記試料Ｎｏ．３，８，１０，１２，１３を除く何れの試料も生存状態は良好又はやや良好である。このことから、長期間保存する場合は、冷蔵庫等で低温保存することが好ましいことが分かる。
【００５０】
〔実験２〕
表３は、保護剤がある場合とない場合の出芽酵母の生菌数を調べた実験結果を示す表である。この生菌数は、平板培地上で菌集団（コロニー）をいくつ形成できるかで表した（菌集落形成数／マイクロリットル）。なお、代謝測定や染色剤の取り込みなどで生きた菌を数える方法もあるが、生きていても増殖できないこともあるので、厳密には生菌数は同一とならない。
【００５１】
表３からも明らかなように、乾燥前は両者とも同じ生菌数であるが、乾燥直後では、保護剤なしが９×１０5で、保護剤ありが３×１０4と若干差がでている。そして、３７℃の雰囲気下で１ヶ月保存した後では、保護剤がない場合は全滅しているものの、保護剤がある場合は２×１０5と集落形成数を満足していることが分かる。
【００５２】
〔実験３〕
この実験は、図５に示すように、大腸菌が分散された保護剤１０と、濾紙１１との間に、０．２２マイクロメートルのポア径を有するセルロース混合エステルの薄膜（ミリポア社製）１２を配置した状態で乾燥保存し、しかる後生菌数を測定した。また比較するために濾紙がない場合も同様の測定を行った。
【００５３】
その結果、濾紙がない場合は、生菌数が測定できないほど減少していたが、濾紙がある場合は、２×１０8（集落形成能力）の生存が確認できた。このように大腸菌の近傍に濾紙があることで生存率が高くなることが分かる。
【００５４】
〔実験４〕
この実験は、図６に示すように、小さい密閉容器12内に濾紙と、乾燥させた保護剤に分散させた細菌とを直接触れ合うことのないよう配置し、３７℃の雰囲気下で１ヶ月保存した後の生菌数を測定した。また比較するために、濾紙のない場合も同様の測定を行った。
【００５５】
その結果、濾紙がない場合の生菌数は６×１０8で、濾紙がある場合の生菌数は２×１０9であり、何れも集落形成数を満足している。これは、保護剤を乾燥させるとともに、容器に密閉させたことによる効果であると思われる。
【００５６】
このように本実施形態によれば、保護剤５が含浸された水分調整機能を有する担体３の表面に微生物６を塗布したので、微生物６は保護剤５中に分散されていないにも関わらず、生存に適した水分環境に保たれることとなり、長期間の保存が可能である。その結果、大掛かりな設備や手間のかかる作業を不要にでき、低コストでかつ簡単な方法で微生物を保存することができる。
【００５７】
即ち、凍結乾燥させた微生物は、乾燥し過ぎると死滅し易く、また外部環境によって水分が侵入して湿った状態になると死滅し易くなる。このため、微生物が生存するのに適した水分は、所定の範囲内に調整する必要がある。本実施形態では、水分調整機能としての吸水性及び蒸発性を有する担体３に保護剤５を含浸させておき、該担体３に微生物６を塗布することにより長期間の保存が可能となる。
【００５８】
また微生物は、浸透圧の変化にも生存状況が影響され易く、一定範囲内の浸透圧の中でしか生存し続けることができない。本実施形態では、担体３の表面に微生物６だけを塗布するので、試料中に持ち込む培地の量が少なく、浸透圧の変化に晒されるリスクが小さく、長期間の保存が可能となる。
【００５９】
前記担体３に塗布された微生物６は、該担体３を介して保護剤５が作用することから、保護剤５に直接触れていなくても高い生存率を有する。即ち、担体に水分調整機能がないものを採用すると、塗布した微生物のうち、保護剤に接触する一部の微生物しか生存できない。これに対して、水分調整機能を有する担体を採用すると、保護剤に接触していない微生物も一様に生存が保護されることとなる。これにより、真空ガラスアンプル作成装置や高度な技術がなくても微生物の長期保存が可能となる。
【００６０】
本実施形態では、担体３に水を加えることはないので、乾燥が短時間で済み、かつ乾燥と同時に微生物を安定した状態に保存できる。また、浸透圧やイオン組成の変化がほとんどないことから、微生物の種類ごとに保護剤を準備する必要はなく、少ない種類の保護剤で多種類の微生物に対応できる。
【００６１】
本実施形態では、前記担体３を乾燥させた後、フィルム４で密閉して保存したので、外部からの影響により微生物が劣化するのを防止でき、微生物の保存期間を大幅に延長できる。
【００６２】
本実施形態では、前記担体3を、吸水性及び蒸発性を有する繊維体，多孔質体からなる濾紙，不織布により構成したので、担体３の水分調整機能を有効利用して微生物を生存に適した水分環境に保持できる。
【００６３】
本実施形態では、一般細菌の場合には、保護剤をグルタミン酸ナトリウム，アドニトール，システイン−塩酸を所定量配合したものとしたので、細菌の長期保存に適した環境を形成できる。
【００６４】
また、酵母菌の場合は、保護剤をポリビニルピロリドン，乳糖，アクトコール，グルタミン酸ナトリウムを所定量配合したものとしたので、酵母菌の長期保存に適した環境を形成できる。
【００６５】
本実施形態の保存容器１によれば、容器本体２に形成された各収容部２ａ内に保護剤５が含浸された担体３を配置し、該担体３の表面に微生物６を塗布してフィルム４で密閉したので、大掛かりな設備や手間のかかる作業を不要にでき、低コストでかつ誰にでもできる簡単な方法で微生物を保存することができる。
【００６６】
本実施形態では、容器本体１に３つの収容部２aを形成したので、１つの保存容器1に微生物を大量に保存でき、かつ分類別，種類別に保存することができる。
【００６７】
ここで、容器本体２の収容部２ａ内に微生物とともに吸湿剤もしくは、吸湿剤および脱酸素剤を配置してもよい。このようにした場合には、保存中に収容部２ａ内に水分や空気が侵入しても、微生物が死滅するのを防止でき、従来の真空ガラスアンプル作成装置を用いた凍結乾燥法やＬ−乾燥法に匹敵した長期保存が可能となる。
【００６８】
本実施形態の保存容器１は、さまざまな用途が考えられ、例えば、担体３に保護剤５含浸させた状態、又は保護剤を乾燥させた状態で販売し、ユーザーが適宜微生物を塗布する。また農園芸で利用される酵母菌を予め塗布した状態で販売することも可能であり、この場合にはそのまま酵母菌を利用できる。
【００６９】
また本実施形態の保存容器１は、微生物を密閉した状態で保存することから、多数の保存容器１をケースに収納した状態で遠方に配送したり、ユーザーに配布したりすることができ、取り扱いに対する自由度が高い。
【００７０】
なお、前記実施形態では、担体３に濾紙，不織布を採用したが、本発明は、これに限られるものではない。例えば、パーライトのような多孔質体材料や細かく切断した藁に保護剤を含浸させ、これに菌液を散布して混練し、乾燥させた後、密閉包装する。この状態でユーザーに郵送することにより、コンポストの種菌，醗酵生産の種菌として販売することができる。また、澱粉やセルロースパウダーに保護剤を含浸させ、これに微生物を混合し、乾燥させた後、密閉包装する。この状態でユーザーに郵送し、ユーザーが水に溶いて土壌や植物に散布することで、土壌改良菌，病虫害予防菌として販売することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】本発明の一実施形態による微生物の保存容器の斜視図である。
【図２】前記保存容器の断面図（図１のII-II線断面図）である。
【図３】前記保存容器の収容部の拡大斜視図である。
【図４】前記微生物の保存状態の模式図である。
【図５】前記実施形態の効果を確認するために行った実験方法を示す図である。
【図６】前記実施形態の他の実験方法を示す図である。
【符号の説明】
【００７２】
１  保存容器
２  容器本体
２ａ  収容部
３  担体
４  フィルム
５  保護剤
６  微生物
【図１】
2009171922.tif 000006
【図２】
2009171922.tif 000007
【図３】
2009171922.tif 000008
【図４】
2009171922.tif 000009
【図５】
2009171922.tif 000010
【図６】
2009171922.tif 000011